(57)【要約】  本願発明は、腫瘍抗原に結合する無標識モノクローナル抗体と、同じ腫瘍抗原に結合する、NIRフルオレセイン標識で標識された二次モノクローナル抗体から成る組成物であって、上記の一次抗体と二次抗体が交差反応性を示さない組成物に関する。前記組成物は、こうした腫瘍抗原の過剰発現に関連する固形腫瘍を患っている患者の治療に使用され得る。本発明は、更に、前記の一次抗体と二次抗体の同時投与、並びに前述の組成物を用いた上述の患者の治療中の、こうした腫瘍又はこうした腫瘍に罹患している患者のNIR蛍光画像の取得方法に関する。
2010529060.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
a）腫瘍抗原に特異的に結合する無標識モノクローナル抗体、及び
b）前記腫瘍抗原と同じ腫瘍抗原に特異的に結合する、NIRフルオレセイン標識で標識された二次モノクローナル抗体、
を含んでなり、上記の一次抗体と二次抗体が交差反応性を示さないことを特徴とする医薬組成物。
【請求項２】
前記腫瘍抗原が、以下の：EGFR、HER2/neu、HER3、HER4、Ep-CAM、CEA、TRAIL、TRAIL受容体1、TRAIL受容体2、リンフォトキシンβ受容体、CCR4、CD19、CD20、CD22、CD28、CD33、CD40、CD80、CSF-1R、CTLA-4、繊維芽細胞活性化タンパク質（FAP）、ヘプシン、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（MCSP）、前立腺特異的膜抗原（PSMA）、VEGF受容体1、VEGF受容体2、IGF1-R、TSLP-R、TIE-1、TIE-2、TNF-α、TNF様弱アポトーシス誘導因子（TWEAK）、IL-1Rから成る群から選択され、好ましくは、EGFR、HER2/neu、CEA、CD20、又はIGF1-Rであることを特徴とする、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記無標識モノクローナル抗体が、抗HER2抗体であり、好ましくは、トラスツズマブ又はパーツズマブであることを特徴とする、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記無標識モノクローナル抗体が、抗EGFR抗体であり、好ましくは、セツキシマブ又はrhMab ICR62であることを特徴とする、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記無標識モノクローナル抗体が、抗IGF1R抗体であることを特徴とする、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記無標識モノクローナル抗体が、以下の：アレムツズマブ、アポリズマブ、セツキシマブ、エプラツズマブ、ガリキシマブ、ゲムツズマブ、イピリムマブ、ラベツズマブ、パニツムマブ、リツキシマブ、トラスツズマブ、ニモツズマブ、マパツムマブ、マツズマブ、パーツズマブ、及びrhMab ICR62から成る群から選択されることを特徴とする、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項７】
腫瘍抗原を過剰発現する固形腫瘍に罹患している患者の治療用医薬品の製造のための、当該腫瘍抗原に特異的に結合する無標識モノクローナル抗体の使用であって、当該無標識モノクローナル抗体が、前記腫瘍抗原と同じ腫瘍抗原に特異的に結合する、NIRフルオレセイン標識で標識された二次モノクローナル抗体と同時投与され、上記の一次抗体と二次抗体が交差反応性を示さないことを特徴とする使用。
【請求項８】
前記患者のNIR蛍光画像を取得することを特徴とする、請求項7に記載の使用。
【請求項９】
固形腫瘍の領域内の、前記腫瘍抗原と同じ腫瘍抗原に特異的に結合する、NIRフルオレセイン標識で標識された二次モノクローナル抗体のNIR蛍光シグナルを計測することを特徴とする、請求項7に記載の使用。
【請求項１０】
腫瘍抗原を過剰発現する固形腫瘍に罹患している患者の治療用医薬品の製造のための、当該腫瘍抗原に特異的に結合する無標識モノクローナル抗体の使用であって、当該無標識モノクローナル抗体と、前記腫瘍抗原と同じ腫瘍抗原に特異的に結合する、NIRフルオレセイン標識で標識された二次モノクローナル抗体を用いて事前治療され、それにより、上記事前治療の後に、固形腫瘍の領域内のNIR蛍光シグナルが、上記無標識モノクローナル抗体での上記事前治療の前の上記の固形腫瘍の領域内のNIR蛍光シグナルと比較して、少なくとも10%減少しており、上記の一次抗体と二次抗体が交差反応性を示さないことを特徴とする前記使用。
【請求項１１】
腫瘍抗原を過剰発現する固形腫瘍に罹患している患者の治療用医薬品の製造のための、当該腫瘍抗原に特異的に結合する無標識モノクローナル抗体の使用であって、上記医薬品の投与パターンが、以下のステップ：
a）上記患者が、前記腫瘍抗原と同じ腫瘍抗原に特異的に結合する、NIRフルオレセイン標識で標識された二次モノクローナル抗体の初回用量を摂取するステップ；
b）固形腫瘍の領域内の、上記のNIRフルオレセイン標識で標識された二次モノクローナル抗体のNIR蛍光シグナルを計測するステップ；
c）上記患者が、上記無標識モノクローナル抗体の初回用量を摂取するステップ；
d）上記患者が、上記のNIRフルオレセイン標識で標識された二次抗体の第二回用量を摂取するステップ；
e）上記の固形腫瘍の領域内の、上記のNIRフルオレセイン標識で標識された二次モノクローナル抗体のNIR蛍光シグナルを計測すると、b）の下で計測したシグナルと比較して、少なくとも10%減少しているステップ；
f）ステップe）の計測の結果に基づいて、上記患者が、上記無標識モノクローナル抗体の第二回用量を摂取するステップ、
を含んでなり；上記の一次抗体と二次抗体が交差反応性を示さないことを特徴とする前記使用。
【請求項１２】
腫瘍抗原に特異的に結合する無標識モノクローナル抗体の、上記腫瘍抗原を過剰発現する固形腫瘍の治療用医薬品の製造のための使用であって、前記腫瘍抗原と同じ腫瘍抗原に特異的に結合する、NIRフルオレセイン標識で標識された二次モノクローナル抗体を使用して、上記治療への応答を測定し、上記の一次抗体と二次抗体が交差反応性を示さないことを特徴とする使用。
【請求項１３】
前記腫瘍抗原が、以下の：EGFR、HER2/neu、HER3、HER4、Ep-CAM、CEA、TRAIL、TRAIL受容体1、TRAIL受容体2、リンフォトキシンβ受容体、CCR4、CD19、CD20、CD22、CD28、CD33、CD40、CD80、CSF-1R、CTLA-4、繊維芽細胞活性化タンパク質（FAP）、ヘプシン、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（MCSP）、前立腺特異的膜抗原（PSMA）、VEGF受容体1、VEGF受容体2、IGF1-R、TSLP-R、TIE-1、TIE-2、TNF-α、TNF様弱アポトーシス誘導因子（TWEAK）、IL-1Rから成る群から選択され、好ましくは、EGFR、HER2/neu、CEA、CD20、又はIGF1-Rであることを特徴とする、請求項7〜12のいずれか1項に記載の使用。
【請求項１４】
腫瘍抗原を過剰発現する固形腫瘍に罹患している患者であって、上記腫瘍抗原に特異的に結合する、無標識一次モノクローナル抗体の用量、及び前記腫瘍抗原と同じ腫瘍抗原に特異的に結合する、NIRフルオレセイン標識で標識された二次モノクローナル抗体の用量を摂取した患者のNIR蛍光画像の取得方法であって、固形腫瘍の領域内のNIR蛍光シグナルを計測し、上記の一次抗体と二次抗体が交差反応性を示さないことを特徴とする方法。
【請求項１５】
NIR蛍光画像の取得方法であって、固形腫瘍の領域内の、腫瘍抗原に特異的に結合する、NIR蛍光標識で標識されたモノクローナル抗体のシグナルを、腫瘍抗原を過剰発現する上記固形腫瘍に罹患している患者の、前記腫瘍抗原と同じ腫瘍抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体での治療中に計測し、上記の一次抗体と二次抗体が交差反応性を示さないことを特徴とする方法。
【請求項１６】
固形腫瘍の領域内の、腫瘍抗原に特異的に結合する、NIRフルオレセイン標識で標識されたモノクローナル抗体のNIR蛍光シグナルを、前記腫瘍抗原を過剰発現する固形腫瘍に罹患している患者の、前記腫瘍抗原と同じ腫瘍抗原に特異的に結合する無標識モノクローナル抗体を用いた治療中に、測定する方法であって、以下のステップ：
a）上記患者が、前記腫瘍抗原と同じ腫瘍抗原に特異的に結合する、NIRフルオレセイン標識で標識された二次モノクローナル抗体の初回用量を摂取するステップ、ここで、上記の一次抗体と二次抗体は交差反応性を示さない、
b）固形腫瘍の領域内の、上記のNIRフルオレセイン標識で標識された二次モノクローナル抗体のNIR蛍光シグナルを計測するステップ；
c）上記患者が、上記無標識モノクローナル抗体の初回用量を摂取するステップ；
d）上記患者が、上記のNIRフルオレセイン標識で標識された二次抗体の第二回用量を摂取するステップ；
e）上記の固形腫瘍の領域内の、上記のNIRフルオレセイン標識で標識された二次モノクローナル抗体のNIR蛍光シグナルを計測すると、b）の下で計測されたシグナルと比較して、少なくとも10%減少しているステップ；
f）ステップe）の計測の結果に基づいて、患者が、上記無標識モノクローナル抗体の第二回用量を摂取するステップ、
が実施され；上記の一次抗体と二次抗体が交差反応性を示さないことを特徴とする方法。
【請求項１７】
前記のシグナル／バックグラウンド比が、少なくとも1.5である、請求項14〜16のいずれか1項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、腫瘍抗原に結合する無標識モノクローナル抗体と、同じ腫瘍抗原に結合する、NIRフルオレセイン標識で標識された二次モノクローナル抗体から成る組成物であって、上記の一次抗体と二次抗体が交差反応性を示さない、組成物に関する。前記組成物は、こうした腫瘍抗原の過剰発現に関連する固形腫瘍を患っている患者の治療に使用され得る。本発明は、前記の一次及び二次抗体の併用投与、並びに前述の組成物又は上述の抗体の併用投与で治療中の、こうした腫瘍又はこうした腫瘍に罹患している患者のNIR蛍光画像の取得方法にさらに関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
治療におけるモノクローナル抗体
癌に対する治療学的手段を改善するための進行中の調査において、外科手術、化学療法、及び放射線治療法以外の第4の対抗手段、すなわち、標的療法が浮かび上がってきた。標的療法には、チロシンキナーゼ受容体阻害剤（イマチニブ、ゲフィチニブ、及びエルロチニブのような低分子阻害剤）、プロテアソーム阻害剤（ボルテゾミブ）、生物反応調節剤（デニロイキン・ディフティトックス（denileukin diftitox））、及びモノクローナル抗体（MAbs）が含まれる。標的療法としてのMAbsの顕著な特異性が、それらをヒト療法のための有望な作用物質にしている。MAbsは疾患に対抗する保護のために治療的に使用され得るだけでなく、それらはまた、様々な病気を診断するため、血清タンパク質及び薬物レベルを計測するため、組織及び血液をタイプ分けするため、並びに免疫応答にかかわる感染性物質と特異的細胞を特定するために使用される。開発中のすべてのバイオテクノロジー薬物の約4分の1が、MAbsであり、そして、約30個の製品が、使用中であるか、又は調査されている。MAbsの大部分が癌治療に使用されている（Gupta, N.; et al., Indian Journal of Pharmacology 38 (2006) 390-396；Funaro, A.; et al., Biotechnology Advances 18 (2000) 385-401；Suemitsu, N, et al., Immunology Frontier 9 (1999) 231-236）。
【０００３】
標識されたモノクローナル抗体と生体内における画像化
通常、抗体の標識された誘導体に基づく腫瘍組織における治療用抗体の定量化のために、いくつかの生体内における画像化方法が利用可能である。通常、こうした標識された抗体には、ポジトロン放射断層撮影（PET）での使用のための、例えば、124I、111In、64Cu、及びその他のもの（例えば、Robinson, M.K., et al., Cancer Res 65 (2005) 1471-1478；Lawrentschuk, N., et al, BJU International 97 (2006) 916-922；Olafsen, T., et al., Cancer Research 65 (2005) 5907-5916；及びTrotter, D. E., et al., Journal of Nuclear Medicine 45 (2004) 1237-1244を参照のこと）、単光子放出コンピュータ断層撮影（SPECT）での使用のための123I、1251や、99mTc、及びその他のもの（例えば、Orlova, A., et al., Journal of Nuclear Medicine 47 (2006) 512-519；Dietlein, M., et al., European Journal of Haematology 74 (2005) 348-352を参照のこと）などの放射性標識で標識された抗体が含まれる。
【０００４】
非放射性標識、例えば、近赤外線（near-infrared）（NIR）フルオレセイン標識、活性化可能な色素、及び内在性レポーター基（GFP様タンパク質のような蛍光タンパク質、及び生物発光画像化法）、もまた、生体内における画像化技術について知られている（Licha, K., et al., Adv Drug Deliv Rev, 57 （2005) 1087-1108）。特に、NIR蛍光画像化法は、腫瘍組織における治療用抗体の定量化に使用される。現在使用されているその他の臨床画像化技術を上回る、近赤外線画像化の利点には、以下の：（分子画像化で重要な）複数の識別可能なプローブの同時利用の可能性；（機能的画像化で重要な）高い時間分解能；（生体内の顕微鏡法に重要な）高い空間分解能；及び（電離放射線がない）安全性、が含まれる。
【０００５】
NIR蛍光画像化法のために単剤として使用される、NIRフルオレセイン標識と共有結合させた様々なモノクローナル抗体が存在している（Hilger, I., et al, Eur Radiol (2004) 1124-1129；Ballou, B., et al., Cancer Immunol Immunother. 41 (4) (1995) 257-63；Ballou, B., et al., Proceedings of SPIE-The International Society for Optical Engineering 2680 (1996) 124-131；Ballou, B., et al., Biotechnol Prog. (1997) 649-58；Ballou, B., et al., Cancer detection and prevention (1998), 22 251-257 Becker, A., et al., Nature Biotechnology 19 (2001) 127-131；Montet, X., et al., Cancer Research 65 (2005), 6330-6336；Rosenthal, E.L., et al., The Laryngoscope 116 (2006) 1636-1641；EP 1619501、WO 2006/072580、WO 2004/065491、及びWO 2001/023005）。
【０００６】
NIR蛍光画像化法では、規定されたバンド幅を有するフィルター光又はレーザーが励起光源として使用される。励起光は、体組織を通り抜けて進む。それが近赤外線蛍光分子（「造影剤」）に遭遇するとき、励起光が吸収される。
【０００７】
そして、蛍光分子は、励起光からスペクトル的に識別可能な（わずかに長い波長の）光（蛍光）を放つ。近赤外線光による生物組織の良好な透過にもかかわらず、従来の近赤外線蛍光プローブ法は、低い標的／バックグラウンド比を含めた、他の造影剤が遭遇したのと同じ多く制限を受ける。
【０００８】
近赤外線波長（約640〜1300nm）は、内部組織の光学画像化で使用された、というのも、近赤外線が、最大6〜8センチメートルの組織透過性を示すからである。例えば、Wyatt, J.S., and Kirkpatrick, P.J., Phil. Trans. R. Soc. B 352 (1997) 701-705；Tromberg, et al., Phil. Trans. R. Soc. London B 352 (1997) 661-667を参照のこと。
【０００９】
使用される標識の異なった特徴及び側面に依存する、抗体‐標識複合体の適確な量が、生体内における画像化に使用した、例えば、NIRフルオレセイン標識について、その標識の量子収量が、使用される標識又は標識された抗体の量に関する基準の1つである（例えば、WO 2006/072580を参照のこと）。
【００１０】
モノクローナル抗体を用いた治療中の療法モニタリング
悪性疾患の療法の成功に影響する要因には、使用される抗体用量と投与スケジュール、抗体の半減期と速い血液クリアランス、循環抗原の存在、高値/mol.-wt.モノクローナル抗体（MAb）の乏しい腫瘍透過性、及びこれらの分子が異化代謝される方法が含まれる。現在のところ、抗体の生理機能と代謝の多くの側面に関して知識不足である（Iznaga-Escobar, N. et al, Meth. Find. Exp. Clin. Pharm. 26(2) (2004) 123-127）。そのため、こうした療法の経過をモニタリングすることが重要である。
【００１１】
こうした治療の成功は、通常、胸部X線写真、コンピュータ断層撮影法（CT）、コンピュータ体軸断層撮影法（CAT）、分子共鳴画像化法（molecular resonance imaging）（MRI）、ポジトロン放射断層撮影法（PET）、単光子放出コンピュータ断層撮影法（SPECT）、蛍光画像化法（FI）、及び生物発光画像化法（BLI）のような様々な画像化技術を使用することで評価される（例えば、Helms, M W, et al., Contributions to microbiology 13 (2006) 209-231及びPantel, K., et al., JNCI 91 (1999) 1113-1124を参照のこと）。それは多くの場合、治療への「応答」と規定される。RECIST基準によると、固形腫瘍に関する腫瘍反応（Therasse, et al., J. Nat. Cancer Institute. 92 (2000) 205-216）は、（例えば、CTによって計測される）腫瘍の体積の進行又は退縮の依存関係により以下の4つのレベル：完全奏功（CR）又は部分奏功（PR）、疾患安定（SD）及び疾患進行（PD）（表1を参照のこと）に分類される。さらに、欧州癌研究治療機関（EORTC）は、2-［18F］-フルオロ-2-デオキシグルコース・ポジトロン放射断層撮影法（FDG-PET）により計測される腫瘍の代謝の依存関係により4つのレベル：完全代謝反応（CMR）又は部分代謝反応（PMR）、及び代謝性疾患安定（SMD）又は代謝性疾患進行（PMD）（表2を参照のこと）、への分類を提案した（Young, H., et al, Eur J Cane 35 (1999) 1773-1782及びKelloff, G. J., et al, Clin Cane Res 11 (2005) 2785-2808）。最近、CTとPETとの併用評価が、ますます一般的になっている。CTが腫瘍サイズの進行に主に焦点を合わせているが、それは、腫瘍代謝に対する限られた情報だけを提供し、且つ、放射線照射にさらすことに関連する一方で、PET画像化法は、腫瘍代謝により多くの洞察を与えるが、それでも、放射性標識がこの技術に必要である。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、以下の：
a）腫瘍抗原に結合する無標識モノクローナル抗体、及び
b）同じ腫瘍抗原に特異的に結合する、NIRフルオレセイン標識で標識された二次モノクローナル抗体、
を含んでなり、上記の一次及び二次抗体が、交差反応性を示さないことを特徴とする医薬組成物を含んでなる。
【００１３】
こうした組成物は、両方の抗体を含んでなる1つのコンパートメント、又は一方が無標識モノクローナル抗体を含んでなり、もう一方が標識モノクローナル抗体を含んでなる、2つのコンパートメントで構成される。
【００１４】
好ましくは、前記無標識モノクローナル抗体は、抗HER2抗体、好ましくは、トラスツズマブ又はパーツズマブ（pertuzumab）である。
【００１５】
他の好ましい態様において、前記無標識モノクローナル抗体は、抗EGFR抗体、好ましくは、セツキシマブ又はrhMab ICR62である。
【００１６】
本発明の1つの態様は、腫瘍抗原に特異的に結合する無標識モノクローナル抗体の、上述の腫瘍抗原を過剰発現する固形腫瘍に罹患している患者の治療用医薬品の製造のための使用であって、上記無標識モノクローナル抗体が、同じ腫瘍抗原に特異的に結合する、NIRフルオレセイン標識を有する標識二次モノクローナル抗体と同時投与され、その一次抗体と二次抗体が、交差反応性を示さないことを特徴とする使用である。
【００１７】
本発明の他の態様は、腫瘍抗原に特異的に結合する無標識モノクローナル抗体の、上述の腫瘍抗原を過剰発現する固形腫瘍に罹患している患者の治療用医薬品の製造のための使用であって、上述の無標識モノクローナル抗体と、同じ腫瘍抗原に特異的に結合する、NIRフルオレセイン標識で標識された二次モノクローナル抗体を用いて事前治療され、それにより、上述の事前治療の後に、固形腫瘍の領域内の蛍光シグナルが、上述の無標識モノクローナル抗体を用いた上述の事前治療前の上述の固形腫瘍の領域内のNIR蛍光シグナルと比較して、少なくとも10%、好ましくは、少なくとも20%、より好ましくは、少なくとも30%減少しており；上記の一次抗体と二次抗体が交差反応性を示さないことを特徴とする前記使用である。
【００１８】
本発明の別の側面は、腫瘍抗原に特異的に結合する無標識モノクローナル抗体の、上述の腫瘍抗原を過剰発現する固形腫瘍に罹患している患者の治療用医薬組成物の製造のための使用であって、上記医薬品の投与パターンが、以下のステップ：
a）患者が、前記腫瘍抗原と同じ腫瘍抗原に特異的に結合する、NIRフルオレセイン標識で標識された二次モノクローナル抗体の初回用量を摂取するステップ；
b）固形腫瘍の領域内の、上述のNIRフルオレセイン標識で標識された二次モノクローナル抗体のNIR蛍光シグナルを計測するステップ；
c）患者が、上述の無標識モノクローナル抗体の初回用量を摂取するステップ；
d）患者が、上述のNIRフルオレセイン標識で標識された二次抗体の第二回用量を摂取するステップ；
e）上述の固形腫瘍の領域内の、上述のNIRフルオレセイン標識で標識された二次モノクローナル抗体のNIR蛍光シグナルを計測すると、b）の下で計測されたシグナルと比較して、少なくとも10%、好ましくは、少なくとも20%、より好ましくは、少なくとも30%減少しているステップ；
f）ステップe）の計測の結果に基づいて、患者が、上述の無標識モノクローナル抗体の第二回用量を摂取するステップ、
を含んでなり；上記の一次抗体と二次抗体が交差反応性を示さないことを特徴とする使用である。
【００１９】
本発明の別の側面は、腫瘍抗原に特異的に結合する、NIRフルオレセイン標識で標識されたモノクローナル抗体の、上述の腫瘍抗原を過剰発現する固形腫瘍に罹患している患者の治療用医薬組成物の製造のための使用である。
【００２０】
本発明の別の側面は、固形腫瘍の治療用医薬品の製造のための、腫瘍抗原に特異的に結合する無標識モノクローナル抗体の使用であって、前記治療中、同じ腫瘍抗原に特異的に結合する、NIRフルオレセイン標識で標識された二次モノクローナル抗体が、その治療をモニタリングするために使用されて、上記の一次抗体と二次抗体が交差反応性を示さないことを特徴とする使用である。
【００２１】
本発明の別の側面は、腫瘍抗原を過剰発現する固形腫瘍に罹患している患者であって、上述の腫瘍抗原に特異的に結合する、無標識の一次モノクローナル抗体の用量と、同じ腫瘍抗原に特異的に結合する、NIRフルオレセイン標識で標識された二次モノクローナル抗体の用量を摂取した患者のNIR蛍光画像の取得方法であって、上記固形腫瘍の領域内のNIR蛍光シグナルが計測されて、一次抗体と二次抗体が交差反応性を示さないことを特徴とする方法である。
【００２２】
本発明の別の側面は、NIR蛍光画像の取得方法であって、固形腫瘍の領域内の、腫瘍抗原に特異的に結合する、NIRフルオレセイン標識で標識されているモノクローナル抗体のシグナルが、腫瘍抗原を過剰発現する固形腫瘍に罹患している患者の、同じ腫瘍抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体を用いた治療中に計測され、上記の一次抗体と二次抗体が交差反応性を示さないことを特徴とする方法である。
【００２３】
本発明の別の側面は、腫瘍抗原を過剰発現する固形腫瘍に罹患している患者の、同じ腫瘍抗原に特異的に結合する無標識モノクローナル抗体を用いた治療中に、固形腫瘍の領域内の腫瘍抗原に特異的に結合する、NIRフルオレセイン標識で標識されたモノクローナル抗体のNIR蛍光シグナルの測定方法であって、以下のステップ：
a）患者が、前記腫瘍抗原と同じ腫瘍抗原に特異的に結合する、NIRフルオレセイン標識で標識された二次モノクローナル抗体の初回用量を摂取するステップ、ここで、上記の一次抗体と二次抗体は交差反応性を全く示さない；
b）固形腫瘍の領域内の、上述のNIRフルオレセイン標識で標識された二次モノクローナル抗体のNIR蛍光シグナルを計測するステップ；
c）患者が、上述の無標識モノクローナル抗体の初回用量を摂取するステップ；
d）患者が、上述のNIRフルオレセイン標識で標識された二次抗体の第二回用量を摂取するステップ；
e）上述の固形腫瘍の領域内の、上述のNIRフルオレセイン標識で標識された二次モノクローナル抗体のNIR蛍光シグナルを計測すると、b）の下で計測されたシグナルと比較して、少なくとも10%、好ましくは、少なくとも20%、より好ましくは、少なくとも30%減少しているステップ；
f）ステップe）の計測の結果に基づいて、患者が、上述の無標識モノクローナル抗体の第二回用量を摂取するステップ、
が実施され；上記の一次抗体と二次抗体が交差反応性を示さないことを特徴とする方法である。
【００２４】
発明の詳細な説明
「抗体」という用語は、これだけに制限されることなく、全抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、及び（モノクローナル抗体、キメラ抗体、又は組み換え抗体のような）遺伝子操作された抗体を含めた様々な形態の抗体、並びに本発明による特徴的な性質が保持されていれば、こうした抗体のフラグメントを網羅する。
【００２５】
用語「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」は、本明細書中では、単一アミノ酸組成物から成る抗体分子の調製物を指す。従って、「ヒト・モノクローナル抗体」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変及び定常領域を持つ単一結合特異性を示す抗体を指す。1つの態様において、ヒト・モノクローナル抗体は、不死化細胞と融合させた、トランスジェニックされたヒト以外の動物、例えば、ヒト重鎖の導入遺伝子とヒト軽鎖の導入遺伝子を含むゲノムを持つトランスジェニック・マウスから得られたB細胞を含めたハイブリドーマによって産生される。
【００２６】
「キメラ抗体」という用語は、組み換えDNA技術によって通常調製される、ある種又は起源からの可変領域、すなわち、結合領域と、違う起源又は種から得られた定常領域の少なくとも一部を含んでなるモノクローナル抗体を指す。マウス可変領域とヒト定常領域を含んでなるキメラ抗体が、特に好まれる。こうしたマウス／ヒト・キメラ抗体は、マウス免疫グロブリン可変領域をコードするDNAセグメントと、ヒト免疫グロブリン定常領域をコードするDNAセグメントを含んでなる発現された免疫グロブリン遺伝子の産物である。本発明で網羅される「キメラ抗体」の他の形態は、クラス又はサブクラスが本来の抗体のものから修飾されているか、又は変えられたものである。こうした「キメラ」抗体はまた、「クラススイッチした抗体」とも呼ばれる。キメラ抗体を作製する方法は、現在、当該技術分野で周知の従来の組み換えDNA技術及び遺伝子トランスフェクション技術を伴う。例えば、Mormon, S.L., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81 (1984) 6851-6855；US 5,202,238、及びUS 5,204,244を参照のこと。
【００２７】
用語「ヒト化抗体」は、フレームワーク又は「相補性決定領域」（CDR）が親免疫グロブリンのものと比較して、異なった特異性の免疫グロブリンのCDRを含んでなるように修飾された抗体を指す。好ましい態様において、マウスCDRは、「ヒト化抗体」を調製するためにヒト抗体のフレームワーク領域に繋ぎ合わせられる。例えば、Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327；及びNeuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270を参照のこと。特に好ましいCDRsは、キメラ及び二機能性抗体について先に述べた抗原を認識する配列を表すものに相当する。
【００２８】
「ヒト抗体」という用語、本明細書中では、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変及び定常領域を持つ抗体が含まれるものとする。ヒト抗体は、最先端技術で周知である（van Dijk, M.A., and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374）。こうした技術に基づいて、様々な標的に対するヒト抗体が作製される。ヒト抗体の例は、例えば、Kellermann, S. A., et al, Curr Opin Biotechnol. 13 (2002) 593-597に記載されている。
【００２９】
「組み換えヒト抗体」という用語は、本明細書中では、NS0若しくはCHO細胞などの宿主細胞、又はヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックされた動物（例えば、マウス）から単離された抗体、あるいは、宿主細胞内に形質移入された組み換え発現ベクターを使用することで発現された抗体などの、組み換え手段によって調製されるか、発現されるか、作製されるか、又は単離されるすべてのヒト抗体を含むものとする。こうした組み換えヒト抗体は、再配列された形態のヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変及び定常領域を持つ。本発明による組み換えヒト抗体は、生体内における体細胞超変異を受けた。よって、組み換え抗体のVH及びVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列VH及びVL配列に由来し、且つ、関連しているが、生体内においてヒト抗体生殖系列のレパートリー内に天然に存在し得ない配列である。
【００３０】
本明細書中、「特異的に結合」とは、（抗体が特異的である）腫瘍抗原に特異的に結合する抗体を指す。好ましくは、結合親和力が、10-8mol/l（例えば、10-9mol/l）以上のKD値のもの、好ましくは、10-9mol/l以上のKD値、より好ましくは、10-10mol/l以上のKD値を有するものである。結合親和力は、表面プラズモン共鳴技術（Biacore（登録商標））などの標準的な結合アッセイを用いて測定される。
【００３１】
「核酸分子」という用語は、本明細書中では、DNA分子とRNA分子を含むものとする。核酸分子は、一本鎖であっても、二本鎖であってもよいが、好ましくは、二本鎖DNAである。
【００３２】
「定常ドメイン」は、抗原への抗体の結合に直接的に関与しないが、エフェクター機能（ADCC、補体結合、及びCDC）に関与する。
【００３３】
「可変領域」（軽鎖の可変領域（VL）、重鎖の可変領域（VH））は、本明細書中では、抗原への抗体の結合に直接的に関与する、軽鎖と重鎖のそれぞれの組を意味する。可変ヒト軽鎖及び重鎖のドメインは同じ一般構造を持ち、そして、各ドメインは、3つの「超可変領域」（又は、相補性決定領域、CDRs）で接続された、その配列が広く保存されている4つのフレームワーク（FR）領域を含んでなる。フレームワーク領域は、β-シート立体構造を取り、そして、CDRsは、そのβ-シート構造を接続するループを形成することができる。各鎖におけるCDRsは、フレームワーク領域によってそれらの三次元構造に保持され、そして、別の鎖の抗原結合部位からのCDRsと一緒に形成される。抗体の重鎖及び軽鎖CDR3領域は、本発明による抗体の結合特異性／親和性において特に重要な役割を果たし、そのため、本発明のさらなる目的を提供する。
【００３４】
本明細書で使用する場合、「超可変領域」又は「抗体の抗原結合性部分」という用語は、抗原結合に関与する、抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」又は「CDRs」からのアミノ酸残基を含んでなる。「フレームワーク」又は「FR」領域は、本明細書中に規定される超可変領域残基以外のそれらの可変ドメイン領域である。そのため、抗体の軽鎖及び重鎖は、C末端からN末端までのドメインFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、及びFR4を含んでなる。特に、重鎖のCDR3は、抗原結合に最も貢献する領域である。CDR及びFR領域は、カバットらの標準定義（Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)）、及び／又は「超可変ループ」からのそれらの残基に従って決定される。
【００３５】
「腫瘍抗原」には、本明細書中では、当該技術分野で知られている意味が含まれ、それには、腫瘍細胞の発癌性特徴に寄与することが知られているか、又はそう考えられている腫瘍細胞で発現される（又は腫瘍細胞の発生に関連する）あらゆる分子が含まれる。多数の腫瘍抗原が、当該技術分野で知られている。分子が腫瘍抗原であるか否かは、例えば、クローン形成アッセイ、形質転換アッセイ、試験管内若しくは生体内における腫瘍形成アッセイ、ゲル移動アッセイ、遺伝子ノックアウト分析等といった当業者にとって周知の技術及びアッセイによって決定されることもできる。好ましくは、「腫瘍抗原」という用語は、本明細書中で使用されるとき、ヒト膜透過タンパク質、すなわち、細胞の脂質二重層に固定される細胞膜タンパク質を指す。ヒト膜透過タンパク質は、本明細書で使用する場合、「細胞外ドメイン」；親油性膜透過ドメイン、保存された細胞内ドメイン、チロシンキナーゼ・ドメイン、及びリン酸化され得るいくつかのチロシン残基を抱えているカルボキシル末端シグナル伝達ドメイン、を通常含んでなり、それがリガンドに結合し得る。腫瘍抗原には、EGFR、HER2/neu、HER3、HER4、Ep-CAM、CEA、TRAIL、TRAIL受容体1、TRAIL受容体2、リンフォトキシンβ受容体、CCR4、CD19、CD20、CD22、CD28、CD33、CD40、CD80、CSF-1R、CTLA-4、繊維芽細胞活性化タンパク質（FAP）、ヘプシン、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（MCSP）、前立腺特異的膜抗原（PSMA）、VEGF受容体1、VEGF受容体2、IGF1-R、TSLP-R、TIE-1、TIE-2、TNF-α、TNF様弱アポトーシス誘導因子（TWEAK）、IL-1Rなどの分子が含まれ、好ましくは、EGFR、HER2/neu、CEA、CD20、又はIGF1-Rであり；より好ましくは、HER2/neu又はEGFRであり、より一層好ましくは、HER2/neuである。
【００３６】
「過剰発現された」腫瘍抗原又は腫瘍抗原の「過剰発現」という用語は、患者の特定の組織又は臓器内の固形腫瘍のような疾患領域からの細胞における腫瘍抗原の（その組織又は臓器からの正常細胞における発現レベルと相対的に）異常な発現レベルを示すものとする。腫瘍抗原の過剰発現を特徴とする固形腫瘍を患っている患者は、当該技術分野で知られている標準的なアッセイによって判定される。好ましくは、過剰発現は、免疫組織化学的（1HC）検出を使用することで、冷凍又はパラフィン包埋組織切片の固定細胞において計測される。組織学染色と併用した場合、標的タンパク質の局在を、測定することができ、且つ、腫瘍内でのその発現の程度を、質的及び半定量的の両方で計測することができる。こうしたIHC検出アッセイは、当該技術分野で知られていて、例えば、臨床試験アッセイ（CTA）、HER2抗原についての市販のLabCorp 4D5テスト、及びHER2腫瘍抗原についての市販のDAKO HercepTest（登録商標）（DAKO、Carpinteria, Calif.）が含まれる。後者のアッセイは、HER2タンパク質の過剰発現がある癌を特定するのに、特定の範囲の0〜3＋細胞染色（0が正常発現であり、3＋が最も強い陽性発現を示す）を使用する（Herceptin（登録商標）（トラスツズマブ）の全処方情報；1998年9月；Genentech, Inc.、San Francisco, Calif.）。よって、例えば、1＋、2＋、又は3＋の範囲、好ましくは、2＋又は3＋、より好ましくは、3＋のHER2腫瘍抗原の過剰発現を特徴とする固形腫瘍を患っているHER2腫瘍抗原患者は、本発明の療法の方法から恩恵を受ける。あるいは、こうした過剰発現は、前記腫瘍抗原に特異的に結合する、NIRフルオレセイン標識で標識されたモノクローナル抗体の固形腫瘍の領域内のNIR蛍光シグナルの定量、そして、前記の固形腫瘍の領域内の上述のNIR蛍光シグナル又は画像の、非腫瘍組織又は上述の腫瘍抗原を過剰発現しない他の腫瘍のNIR蛍光シグナル又は画像との比較によって検出される（例えば、実施例1及び2、図1及び2を参照のこと）。
【００３７】
用語「一次抗体と二次抗体が交差反応性を示さない」は、腫瘍抗原に特異的に結合する無標識一次モノクローナル抗体と、同じ腫瘍抗原に特異的に結合する、NIRフルオレセイン標識で標識された二次モノクローナル抗体であって、これらの2つの抗体が、上述の腫瘍抗原に関して交差反応性を示さない、抗体を指す。同じ腫瘍抗原に関するこれらの2つの抗体の交差反応性は、競合アッセイを用いて検出できる。このために、例えば、エンザイム・イムノアッセイ法を用いて、一次抗体が、固定された腫瘍抗原への結合のために二次抗体と競合する程度が試験される。このために、適切に固定された腫瘍抗原が、アッセイの目的のために検出可能な部分に結合させた一次抗体と、過剰な二次抗体がインキューベートされる。検出可能な部分には、直接的に検出可能なシステムと、間接的に検出可能なシステムが含まれる。結合された標識の検出によって、確かめられて、問題の抗体が、結合部位から既知の抗体を置き換える程度を容易に確認できる。同じ濃度又は高濃度にて、好ましくは、既知の抗体に当てはまる二次抗体の105倍の過剰の場合では、10%超、好ましくは、20%超の置き換えがあるとき、その2つの抗体が交差反応性を示す。それは、その2つの抗体が同じ又は重複するエピトープに結合することを意味する。（非交差反応及び交差反応の実施例、例えば、実施例3、4、及び5、図3、4、及び5を参照のこと）。
【００３８】
交差反応性を示さないこうした一次抗体と二次抗体の使用によって、交差反応性を示す一次抗体と二次抗体のシグナル／バックグラウンド比（例えば、実施例3：1.06＝530MFI/500MFI‐トラスツズマブ治療後のCy5標識トラスツズマブ‐図3aを参照のこと）と比較して、明らかに改善された（＝より高い）シグナル／バックグラウンド比が実現される（例えば、実施例3：2.88＝1440MFI/500MFI‐トラスツズマブ治療後のCy5標識パーツズマブ‐図3bを参照のこと）。交差反応抗体の使用に比べて；より少ないNIRF標識抗体が与えられたとしても、これは、腫瘍の領域のより良好な局在を可能にする。よって交差反応性を示さないこうした一次抗体と二次抗体の使用によって、有効な
【００３９】
よって、本発明の1つの態様において、交差反応性を示さないこうした一次抗体と二次抗体の使用によるシグナル／バックグラウンド比は、少なくとも1.5であり、好ましくは、少なくとも2.0である。
【００４０】
略語MFIは、平均NIR蛍光（NIRF）シグナル強度［任意の単位］を指す。NIR蛍光シグナル強度は、着目の領域（ROI）内のピクセル数とシグナル強度を合計することによって定量化される。
【００４１】
「シグナル／バックグラウンド比」という用語は、着目の領域（ROI）、例えば、固形腫瘍の領域、の中の（MFIとして測定される）それぞれのNIR蛍光シグナルと、（MFIとして測定される）それぞれのNIR蛍光バックグラウンド・シグナル、例えば、非腫瘍組織で計測されるシグナルから成るシグナル／バックグラウンド比を指す。
【００４２】
先の競合アッセイにおいて、（アッセイ目的だけのために）一次抗体に結合された直接的に検出可能な部分には、例えば、色素体（蛍光又は発光基、及び色素）、酵素、NMR活性基、又は金属粒子が含まれ、ハプテン、例えば、ジゴキシゲニンは、検出可能な標識の例である。間接的な検出システムは、例えば、検出試薬、例えば、検出抗体が、バイオアフィン（bioaffine）結合対のうちの一次パートナー（a first partner）で標識されるシステムを含んでなる。好適な結合対の例は、ハプテン又は抗原／抗体、ビオチン又はビオチン類似体、例えば、アミノビオチン、イミノビオチン、又はデスチオビオチンなど／アビジン又はストレプトアビジン、糖／レクチン、核酸又は核酸類似体／相補的な核酸、及び受容体／リガンド、例えば、ステロイド・ホルモン受容体／ステロイド・ホルモンである。好ましい一次結合対メンバーには、ハプテン、抗原、及びホルモンが含まれる。特に好ましいものは、ジゴキシンのようなハプテン、及びビオチンとその類似体である。こうした結合対の二次パートナー、例えば、抗体、ストレプトアビジンなどは、通常、例えば、先に触れた標識によって、直接的な検出を可能にするために標識される。検出可能な標識はまた、光励起性架橋基、例えば、アジド又はアジリン基であってもよい。電気化学発光によって検出され得る金属キレートもまた、好ましいシグナル放出基であり、ルテニウム・キレート、例えば、ルテニウム（ビスピリジル）32＋キレート、が特別に選好される。好適なルテニウム標識基は、例えば、EP 0 580 979、WO 90/05301、WO 90/11511、及びWO 92/14138に記載されている。
【００４３】
交差反応性を示さない、同じ腫瘍抗原に結合するこうした一次抗体と二次抗体の例は、2つの抗HER2抗体、トラスツズマブとパーツズマブ、又は2つの抗EGFR抗体、セツキシマブとrhMab ICR62である。けれども、当業者は、例えば、EGFR、HER2/neu、HER3、HER4、Ep-CAM、CEA、TRAIL、TRAIL受容体1、TRAIL受容体2、リンフォトキシンβ受容体、CCR4、CD19、CD20、CD22、CD28、CD33、CD40、CD80、CSF-1R、CTLA-4、線維芽細胞活性化タンパク質（FAP）、ヘプシン、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（MCSP）、前立腺特異的膜抗原（PSMA）、VEGF受容体1、VEGF受容体2、IGF1-R、TSLP-R、TIE-1、TIE-2、TNF-α、TNF様弱アポトーシス誘導因子（TWEAK）、IL-1Rなど、好ましくは、EGFR、HER2/neu、CEA、CD20、又はIGF1-Rなどの腫瘍抗原に対する、さらなる非交差反応抗体を容易に製造することができる。このために、例えば、その後のキメラ化、及び／又はヒト化を伴って、（Henderikx et al. Cancer Res. 58 (1998) 4324-4332；Huse et al. Science 246 (1989) 1275-1281又はKang et al. PNAS 88 (1991) 11120-11123に記載のとおり）ファージ・ディスプレイ技術が使用できる。免疫化技術もまた、当該技術分野で周知であり、よって、こうした抗体を製造するために、関連腫瘍抗原（例えば、それらのDNA、そのタンパク質又はフラグメント）での免疫化が使用される。例えば、IGF-1Rに対するヒト抗体は、以下の手順に従って作出され得る。
【００４４】
抗IGF-IR抗体を産生するハイブリドーマ細胞株の作出
ハイブリドーマの培養
発生したHuMabハイブリドーマは、2mMのL-グルタミン（BioWhittaker）及び4%のOrigen Cloning Factor（Igen、France）を補ったHybridoma Express Medium（PAA Laboratories GmbH、Austria）中、37℃及び5%のCO2にて；又はFetal Clone Serum（50ml：Hyclone、Utah）及びOrigen Hybridoma Cloning Factor（30ml：Igen、Gaithersburg MD）を補ったIscoves Modified Dulbeco’s Medium（500ml：BioWhittaker Europe、Belgium）中、37℃、5%のCO2にて培養される。
【００４５】
トランスジェニック・マウスの免疫
10匹のHCo7トランスジェニック・マウス（雄4匹と雌6匹）、系統GG2201（Medarex、San Jose, CA, USA）は、IGF IRのための発現ベクターで形質移入された1×106個のNIH 3T3細胞と、20μgのIGF IRの可溶性細胞外ドメインとで交互に免疫される。3回が、IGF IR発現細胞での腹腔（IP）免疫、及び3回が、組み換えタンパク質での尾基部における皮下（SC）免疫の、合計で6回の免疫が実施された。最初の免疫のために、100μlの1×106個のNIH 3T3 IGF-IR細胞が、100μlの完全Freunds’アジュバント（CFA；Difco Laboratories、Detroit, USA）の）と混合された。その他のすべての免疫のために、100μlのPBS中の細胞が使用されたか、又は組み換えタンパク質が、100μlの不完全Freunds’アジュバント（ICFA；Difco）と混合された。
【００４６】
抗原特異的ELISA
免疫されたマウスの血清中の抗IGF IR力価は、抗原特異的ELISAによって測定される。PBS中、1μg/mlの濃度にてIGF-IR可溶性細胞外ドメインが、96ウェル・プレートに、4℃にて一晩、又は37℃にて2時間コートされた。その後、ウェルは、PBSTC（0.05%のTween（登録商標）-20と2%のニワトリ血清（Gibco BRL）を補ったPBS）で室温にて1時間（h）ブロッキングされた。最初のタップ（tap）の血清は、PBSTC中、1/50に希釈し、その他のすべてのタップからの血清は、PBSTC中、1/100に前希釈し、そして、1/6400まで連続的に希釈された。希釈した血清は、前記ウェルに加えられ、37℃にて1時間インキューベートされた。タップ前血清が、陰性対照として使用される。200ng/mlのヤギ抗ヒトIGF-IR（100μg/ml）が、陽性対照として使用された。それに続いて、プレートは、PBSTで2回洗浄され、そして、PBSTC中、1/2000に希釈されたセイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ（HRP）結合ラット抗ヒトIgG F（ab’）2（DAKO）と一緒に37℃にて1時間インキューベートされる。ウェルは、PBSTで2回洗浄され、そして、アッセイは、新たに調製したABTSR溶液（1mg/ml）（ABTS：2,2’-アジノ・ビス（3-エチルベンズチアゾリン-6-スルホン酸）を用いて暗闇の中、室温（RT）にて30分間展開された。吸収度は、405nmで計測される。
【００４７】
FACS分析
抗原特異的ELISAによる定量に加えて、免疫されたマウスの血清中の抗IGF-IR力価はまた、FACS分析によっても測定される。NIH 3T3 IGF-IR細胞と親NIH 3T3細胞は、希釈した血清と一緒に4℃にて30分間インキューベートされる。交互のIPとSC免疫は、IP免疫から開始して2週間の間隔で実施された。タップ前血清（親NIH 3T3細胞）が、陰性対照として使用された。最初に、200ng/mlのヤギ抗ヒトIGF-IRが、陽性対照として使用された。細胞は、1%のウシ血清アルブミンと0.01%のアジ化合物を補ったPBSで3回洗浄される。それに続いて、細胞は、FACSバッファーで1/100に希釈した、フルオレセイン・イソチオシアネート（FITC）を結合したラット抗ヒト・ヒトIgGの抗原結合フラグメント（F（ab’）2フラグメント）と一緒に4℃にて30分間インキューベートされる。細胞は、FACSバッファーで2回洗浄され、そして、サンプルが、FACSCalibur（Becton Dickinson、Erembodegem-Aalst, Belgium）で分析された。
【００４８】
マウスの追加免疫
抗IGF-IRの血清力価が十分であることがわかっているとき、マウスは、200μlのPBS中、15μgのIGF-IR細胞外ドメインで、融合の4及び3日前に静脈内に（i.v.）2回、追加免疫される。
【００４９】
ハイブリドーマの作出
マウスは屠殺され、そして、腹大動脈と大静脈の側面に位置する脾臓とリンパ節が、回収された。脾細胞及びリンパ節細胞と、融合相手のSP2.0細胞の融合は、標準的な操作法に従って実施される。
【００５０】
κ-ELISA
融合から生じたハイブリドーマがヒト抗体を産出するか否かに関係なく、測定のために、κ-ELISAが実施される。ELISAプレートは、PBS中、1/1000に希釈したラット抗ヒトIgG κ軽鎖抗体（DAKO）4℃での一晩のインキュベーションによってコーティングされる。ウェル内容物を捨てた後に、プレートは、PBSTCとの室温にて1時間のインキュベーションによってブロッキングされる。その後、ウェルは、PBSTC中、1/2に希釈されたハイブリドーマ培養上清とインキューベートされる。PBSTC中、1/2に希釈された培地が、陰性対照として使用され、PBSTC中、1/100に希釈されたκ-軽鎖陽性マウス血清が、陽性対照としての役割を果たす。‘HRPによって結合された状態で、それに続いて、ウェルは、3回洗浄され、そして、PBSTC中、1/2000に希釈したラット抗ヒトIgG F（ab’）2（DAKO）と37℃にて1時間インキューベートされた。ウェルは、3回洗浄され、そして、アッセイが、新たに調製したABTS（登録商標）溶液（1mg/ml）を用いて暗所内、室温（RT）にて30分間進められる。吸収度は、ELISAプレート・リーダーにより405nmにて計測される。
このように、抗IGF-IR抗体ライブラリーが作製できる。
【００５１】
（この技術、又は別の免疫又はファージ・ディスプレイ技術のどちらかによって作製される）こうしたライブラリー中のすべての抗体が、例えば、エンザイム・イムノアッセイ法（先の一般的な定義、同様に、先のIGF-IR抗原特異的ELISAの例も参照のこと）を用いて、それらが同じ腫瘍抗原に対して交差反応性を示すかどうか、後に試験され得る。このような方法で、当業者は、交差反応性を示さない、同じ腫瘍抗原に特異的に結合する一次抗体と二次抗体の組を容易に作出する。
【００５２】
例えば、このようにこの免疫化技術を使用した、無標識一次抗体と同じ、以下の：アレムツズマブ、アポリズマブ、セツキシマブ、エプラツズマブ、ガリキシマブ、ゲムツズマブ、イピリムマブ（ipilimumab）、ラベツズマブ（labetuzumab）、パニツムマブ（panitumumab）、リツキシマブ、トラスツズマブ、ニモツズマブ、マパツムマブ、マツズマブ、rhMab ICR62、及びパーツズマブから成る群から選択される腫瘍抗原に特異的に結合する非交差反応性二次抗体を作出することは、当業者の範疇にある。次に、こうした非交差反応性二次抗体は、NIRF標識（例えば、Cy5）で標識され、そして、本発明の態様の1つに使用され得る。
【００５３】
「腫瘍」という用語は、本明細書中では、典型的に無秩序な細胞増殖を特徴とする、哺乳動物の生理的条件を指すか、又は記載する。腫瘍の例には、これだけに制限されることなく、癌腫、リンパ腫、（髄芽腫と網膜芽細胞腫を含めた）芽細胞腫瘍、（脂肪肉腫と滑液細胞肉腫を含めた）肉腫、（類癌腫、ガストリン産生腫瘍、及び小島細胞癌を含めた）神経内分泌腫瘍、中皮腫、（聴神経腫を含めた）シュワン腫、髄膜腫、腺癌、及び黒色腫が含まれる。
【００５４】
「固形腫瘍」という用語は、本明細書中で使用されるとき、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽腫、子宮頚癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜若しくは子宮の癌腫、唾液腺癌腫、腎臓（kidney若しくはrenal）癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝臓癌腫、肛門癌腫、陰茎癌腫、精巣癌、食道癌、胆道の腫瘍、及び頭頚部癌から成る群から選択される腫瘍を指し、好ましくは、乳癌を指す。
【００５５】
「固形腫瘍の領域」という用語は、本明細書中で使用されるとき、固形腫瘍を含んでなる区域を指す。固形腫瘍の領域は、固形腫瘍全体、又はそれの局所部分のみのいずれかを含んでなる。前述の固形腫瘍の領域内のNIR蛍光シグナルが計測され、そして、例えば、周囲の非腫瘍組織との比較により又は基準としてのいろいろな時点におけるNIR蛍光シグナル若しくは画像との比較により、対応するNIR蛍光画像が、二次元若しくは三次元の形態のいずれかで取得される。
【００５６】
本明細書で使用する場合、「同時投与」、「同時投与される」、又は「同時投与している」という用語は、標識モノクローナル抗体が、無標識モノクローナル抗体と共に投与されることを意味する。無標識抗体を伴った標識抗体の投与は、1つの単一製剤として、又は2つの別個の製剤（一方が無標識抗体のため、そして、一方が標識抗体のため）として実施され得る。同時投与は、同時に行うことも、又はいずれかの順序で連続して行うこともできるが、腫瘍がそのときまだ存在していて、且つ、腫瘍が上述の腫瘍抗原を過剰発現する限り、両モノクローナル抗体が固形腫瘍上の同じ腫瘍抗原に同時に結合する時間があることが好ましい。1つの単一製剤が使用されるなら、2つの抗体が同時に同時投与される。2つの別々の製剤（一方が無標識抗体のため、一方が標識抗体のための）が使用されるなら、2つの抗体は、同時に（例えば、1つの単一持続注入を通して、又は、同時に2つの別々の持続注入を通して）に、又は連続して同時投与される。両抗体が連続して同時投与されるとき、標識抗体は、2回の別々の投与によりその日のうちに、無標識抗体の前又は後に投与され得る、例えば、NIR蛍光画像を取得するために、標識抗体が1日目に投与され、そして、その後、例えば、2日目〜7日目に、無標識抗体が同時投与される。そして、特定の期間、例えば、（無標識抗体のさらなる投与を含むことができる）1〜5週間、の後に、NIR蛍光画像を取得するために、NIRフルオレセイン標識で標識された抗体を再び投与する。
【００５７】
同じ条件（例えば、同じ量の標識抗体、投与後の同じ時点、及び同じ取得時間など）を使用した固形腫瘍の領域内で好ましくは取得されるこれらのNIR蛍光画像の比較に基づいて、NIR蛍光シグナルが少なくとも10%、好ましくは少なくとも20%、そして、より好ましくは少なくとも30%減少したときに、無標識抗体のさらなる投与が与えられるだろう。「用量(dose)」という用語は、本明細書中で使用されるとき、モノクローナル抗体の投与(administration)を指す。無標識モノクローナル抗体の「用量」は、例えば、約0.05mg/kg〜10mg/kg体重の範囲内であり得る。よって、約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg、又は10mg/kg体重の用量の１又は複数回の持続的な投与が患者に行われ得る。そういった用量が、例えば、（例えば、患者に、約2〜約20個、例えば、トラスツズマブとパーツズマブのそれぞれ約6個の用量が与えられるような）毎週、2週間ごと、又は3週間ごとに断続的に投与されてもよい。同様に、初回に高負荷用量を、その後１又は複数回低用量を投与してもよい。NIRフルオレセイン標識で標識されたモノクローナル抗体は、本明細書により、少なくとも0.001mg/kg体重、好ましくは少なくとも0.01mg/kg体重、より好ましくは少なくとも0.01mg/kgの体重の量又は用量で同時投与される。適確な量又は「用量」は、例えば、標識及びその量子収量によって、変化し得るので、それらに依存する。無標識モノクローナル抗体とNIRフルオレセイン標識で標識されたモノクローナル抗体の量又は「用量」は、簡単な日常的な実験により当業者によって規定される。
【００５８】
「医薬品の投与パターン」という用語は、本明細書中で使用されるとき、前述の医薬品の投与中の好ましい連続したステップを指し、それは、それ自体の投与、固形腫瘍の領域内のNIR蛍光シグナルの測定、例えば、無標識モノクローナル抗体の投与前後の、同じ条件下で計測された同じ固形腫瘍の領域内での異なったNIR蛍光シグナルの比較、同じ固形腫瘍の領域内でのNIR蛍光シグナルが治療中に減少したという所見に基づくさらなる用量の無標識モノクローナル抗体の投与、を含んでもよい。
【００５９】
無標識一次モノクローナル抗体での「前記治療中」という用語は、本明細書で使用する場合、同時又はいずれかの順序の連続したものであり得るNIRフルオレセイン標識で標識された二次モノクローナル抗体の同時投与を指し、腫瘍がそのときまだ存在していて、且つ、腫瘍が上述の腫瘍抗原を過剰発現する限り、両モノクローナル抗体が固形腫瘍上の同じ腫瘍抗原に同時に結合する時間があることが好ましい。無標識一次モノクローナル抗体での「前記治療中」という用語に関して、上述の無標識一次モノクローナルの治療期間は、初回用量から開始し、（そして、上述の一次抗体のいくつかの連続した投与を含むことができるものの、患者体内には、かなりの量（好ましくは、治療的に有効な量）の上述の抗体が常に存在している）、そして、上述の一次抗体の最後の投与後に、上述の一次抗体が患者体内で完全に分解された（好ましくは、残留量が治療的に有効な量を下回るまで、上述の一次抗体が分解された）時点で終了する。
【００６０】
用語「以前に前述の無標識モノクローナル抗体で治療された、前述の腫瘍抗原を過剰発現する固形腫瘍に罹患している患者」とは、本明細書で使用する場合、上述の無標識モノクローナル抗体の上述の少なくとも１回の投与が、両モノクローナル抗体によるその患者の治療前に上述の患者に投与されたことを意味する。
【００６１】
研究者、獣医師、医師、又は他の臨床医によって模索されている組織、系、動物、又はヒトの生物学的又は医学的な応答を引き起こす対象の化合物又は組み合わせ物の量であるところの治療的に有効な量で、無標識抗体が患者に投与されることは自明である。
【００６２】
「患者」という用語は、本明細書で使用する場合、好ましくは、癌、又は前癌状態若しくは病巣を治療するための処置を必要としているヒトを指す。しかしながら、「患者」という用語はまた、ヒト以外の動物、好ましくは、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、及びヒト以外の霊長類の動物などの哺乳動物、とりわけ、治療を必要としているものを指す。
【００６３】
用語「NIRフルオレセイン標識で標識された抗体」、「標識抗体」、又は「標識モノクローナル抗体」は、本明細書中では、NIRフルオレセイン標識に結合されているモノクローナル抗体を指す。結合技術は、この数年間で顕著に成熟し、そして、素晴らしい総説が、Aslam, M., and Dent, A., Bioconjugation, London (1998) 216-363に、及びTijssen, P. "Practice and theory of enzyme immunoassays" (1990) 22l-278 Elsevier, Amsterdam中の「Macromolecule conjugation」という章に与えられている。
【００６４】
「無標識抗体」という用語は、本明細書中では、NIRフルオレセイン標識で標識されておらず、別の部分（moiety）に結合されてもいないモノクローナル抗体を指す。
【００６５】
「NIR」という用語は、本明細書中では、近赤外線を意味する。
【００６６】
本発明は、以下の：
a）腫瘍抗原に特異的に結合する無標識モノクローナル抗体、及び
b）同じ腫瘍抗原に特異的に結合する、NIRフルオレセイン標識で標識された二次モノクローナル抗体、
を含んでなり、上記の一次抗体と二次抗体が、交差反応性を示さないことを特徴とする医薬組成物を含んでなる。
【００６７】
こうした組成物は、1つの単一製剤中に両抗体を含んでなる1つのコンパートメントか、又は一次製剤中に無標識モノクローナル抗体を含んでなる1つと、二次製剤中に標識モノクローナル抗体を含んでなる1つの2つのコンパートメントから構成され得る。こうした組成物は、そのような無標識モノクローナル抗体と標識モノクローナル抗体の同時投与を目的としている。
【００６８】
1つの態様において、前述の腫瘍抗原は、EGFR、HER2/neu、HER3、HER4、Ep-CAM、CEA、TRAIL、TRAIL受容体1、TRAIL受容体2、リンフォトキシンβ受容体、CCR4、CD19、CD20、CD22、CD28、CD33、CD40、CD80、CSF-1R、CTLA-4、線維芽細胞活性化タンパク質（FAP）、ヘプシン、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（MCSP）、前立腺特異的膜抗原（PSMA）、VEGF受容体1、VEGF受容体2、IGF1-R、TSLP-R、TIE-1、TIE-2、TNF-α、TNF様弱アポトーシス誘導因子（TWEAK）、IL-1Rから成る群から選択され、好ましくは、EGFR、HER2/neu、CEA、CD20、又はIGF1-Rであり、より好ましくは、HER2/neu又はEGFRであり、より一層好ましくは、HER2/neuである。
【００６９】
他の態様において、前記無標識モノクローナル抗体は、抗HER2抗体であり、好ましくは、トラスツズマブ又はパーツズマブであり、より好ましくは、トラスツズマブである。
【００７０】
他の態様において、前記無標識モノクローナル抗体は、抗EGFR抗体であり、好ましくは、セツキシマブ、rhMab ICR62、ニモツズマブ、又はマツズマブであり、より好ましくは、セツキシマブ又はrhMab ICR62である。
【００７１】
他の態様において、前記無標識モノクローナル抗体は、抗IGF1R抗体である。
【００７２】
他の態様において、前記無標識モノクローナル抗体は、以下の群：アレムツズマブ、アポリズマブ、セツキシマブ、エプラツズマブ、ガリキシマブ、ゲムツズマブ、イピリムマブ、ラベツズマブ、パニツムマブ、リツキシマブ、トラスツズマブ、ニモツズマブ、マパツムマブ、マツズマブ、rhMab ICR62、及びパーツズマブから選択され、好ましくは、トラスツズマブ、セツキシマブ、rhMab ICR62、及びパーツズマブであり、より好ましくは、トラスツズマブである。
【００７３】
前記組成物は、少なくとも0.001mg/kg体重、好ましくは、少なくとも0.01mg/kg体重、より好ましくは、少なくとも0.01mg/kg体重の量で、NIRフルオレセイン標識で標識された抗体を通常含んでなる。適確な量は、例えば、標識とその量子収量によって、変化し得るので、それらに依存する。その量は、簡単な日常的な実験により当業者によって規定される。
【００７４】
（Herceptin（登録商標）という商品名で販売されている）トラスツズマブは、HER2過剰発現／HER2遺伝子が増幅された転移乳癌の治療に使用される組み換え型ヒト化抗HER2モノクローナル抗体である。トラスツズマブは、Hudziak, R.M., et al., Mol. Cell. Biol. 9 (1989) 1165-1172に記載のマウス抗HER2抗体4D5と同じHER2のエピトープに特異的に結合する。トラスツズマブは、（rhuMAb 4D5又はトラスツズマブとも呼ばれる）マウス抗HER2抗体4D5の組み換え型ヒト化バージョンであり、そして、大規模な前抗癌療法を受けた、HER2を過剰発現している転移乳癌を患っている患者で臨床的に活性であった（Baselga, J., et al, J. Clin. Oncol. 14 (1996) 737-744）。トラスツズマブ及びその調製方法は、US 5,821,337中に記載されている。
【００７５】
パーツズマブ（Omnitarg（登録商標））は、HER2陽性癌の治療に使用される別の組み換え型ヒト化抗HER2モノクローナル抗体である。パーツズマブは、トラスツズマブと異なるHER2の細胞外ドメイン上のエピトープである、2C4エピトープに特異的に結合する。パーツズマブは、HER二量体化阻害剤（HDIs）の新しいクラスの最初のものである。HER2細胞外ドメインに結合することを通して、パーツズマブは、HER2と他のHERファミリー・メンバーとの、リガンドが活性化するヘテロ二量体化を妨げ、その結果、腫瘍の増殖と進行に関連している下流のシグナル伝達経路と細胞過程を抑制する（Franklin, M.C., et al. Cancer Cell 5 (2004) 317-328及びFriess, T, et al. Clin Cancer Res 11 (2005) 5300-5309）。パーツズマブは、（rhuMAb 2C4又はパーツズマブと呼ばれる）マウス抗HER2抗体2C4の組み換え型ヒト化バージョンであり、それは、それぞれの調製方法と一緒にWO 01/00245及びWO 2006/007398に記載されている。
【００７６】
トラスツズマブとパーツズマブは、同じ腫瘍抗原に特異的に結合する一次モノクローナル抗体と二次モノクローナル抗体の例であり、上記の一次抗体と二次抗体は交差反応性を示さないことを特徴としている。さらなる例には、2つの抗-EGFR抗体、セツキシマブとrhMab ICR62が含まれる。
【００７７】
セツキシマブは、EGFR発現性腫瘍の治療に使用するためのキメラ・モノクローナル抗EGFR抗体225である（c MAb 225、US 4,943,533及びEP 0 359 282）。前記C225抗体（セツキシマブ）は、EGF媒介性腫瘍細胞カスケードを抑制することが実証された。
別の抗EGFR抗体であるrhMab ICR62は、ラットICR62抗体の組み換え型ヒト化バージョンであり、WO 2006/082515に記載されている。
【００７８】
前記の2つの抗EGFR抗体、セツキシマブ及びrhMab ICR62は、同じ腫瘍抗原に特異的に結合して、一次モノクローナル抗体と二次モノクローナル抗体のさらなる例を表し、上記の一次抗体と二次抗体は交差反応性を示さないことを特徴としている。
【００７９】
本発明の別の側面は、前述の腫瘍抗原を過剰発現する固形腫瘍に罹患している患者の治療用医薬品の製造のための、腫瘍抗原に特異的に結合する無標識モノクローナル抗体の使用であって、上記無標識モノクローナル抗体は、同じ腫瘍抗原に特異的に結合する、NIRフルオレセイン標識で標識された二次モノクローナル抗体と同時投与され、上記の一次抗体と二次抗体が交差反応性を示さないことを特徴とする使用である。
【００８０】
本発明の1つの側面において、腫瘍抗原に特異的に結合する無標識モノクローナル抗体の、上述の腫瘍抗原を過剰発現する固形腫瘍に罹患している患者の治療用医薬品の製造のための使用は、上述の患者のNIR蛍光画像が取得されることを特徴とする。
【００８１】
本発明の他の側面において、こうした使用は、固形腫瘍の領域内の同じ腫瘍抗原に特異的に結合する、前記のNIRフルオレセイン標識で標識された二次モノクローナル抗体のNIR蛍光シグナルが計測されることを特徴とする。
【００８２】
本発明の他の態様は、腫瘍抗原に特異的に結合する無標識モノクローナル抗体の、上述の腫瘍抗原を過剰発現する固形腫瘍に罹患している患者の治療用医薬品の製造のための使用であって、上述の無標識モノクローナル抗体と、同じ腫瘍抗原に特異的に結合する、NIRフルオレセイン標識で標識された二次モノクローナル抗体を用いて事前治療され、それにより、上述の事前治療の後に、固形腫瘍の領域内のNIR蛍光シグナルが、上述の無標識モノクローナル抗体を用いた上述の事前治療前の上述の固形腫瘍の領域内のNIR蛍光シグナルと比較して、少なくとも10%、好ましくは、少なくとも20%、より好ましくは、少なくとも30%減少しており；上記の一次抗体と二次抗体が交差反応性を示さないことを特徴とする使用である。
【００８３】
本発明の別の側面は、腫瘍抗原に特異的に結合する無標識モノクローナル抗体の、上述の腫瘍抗原を過剰発現する固形腫瘍に罹患している患者の治療用医薬品の製造のための使用であって、上記医薬品の投与パターンが、以下のステップ：
a）患者が、上述の無標識モノクローナル抗体の初回用量を摂取するステップ；
b）上述の無標識モノクローナル抗体の上述の初回用量の後に、同じ腫瘍抗原に特異的に結合する、NIRフルオレセイン標識で標識された二次抗体のNIR蛍光シグナルが、固形腫瘍の領域内において、上述の無標識モノクローナル抗体の上述の初回用量以前の固形腫瘍の上述の領域内のNIR蛍光シグナルと比較して、少なくとも10%、好ましくは、少なくとも20%、より好ましくは、少なくとも30%減少しているステップ；
c）患者が、ステップb）の測定の結果に基づいて、上述の無標識モノクローナル抗体の第二回用量を摂取するステップ、
を含んでなり；上記の一次抗体と二次抗体が交差反応性を示さないことを特徴とする使用である。
【００８４】
好ましくは、前記ステップa）〜c）は、連続したステップa）、b）、そしてc）として実施される。
【００８５】
本発明の別の側面は、腫瘍抗原に特異的に結合する無標識モノクローナル抗体の、上述の腫瘍抗原を過剰発現する固形腫瘍に罹患している患者の治療用医薬品の製造のための使用であって、上記医薬品の投与パターンが、以下のステップ：
a）患者が、前記腫瘍抗原と同じ腫瘍抗原に特異的に結合する、NIRフルオレセイン標識で標識された二次モノクローナル抗体の初回用量を摂取するステップ；
b）固形腫瘍の領域内の、上述のNIRフルオレセイン標識で標識された二次モノクローナル抗体のNIR蛍光シグナルを計測するステップ；
c）患者が、上述の無標識モノクローナル抗体の初回用量を摂取するステップ；
d）患者が、上述のNIRフルオレセイン標識で標識された二次抗体の第二回用量を摂取するステップ；
e）上述の固形腫瘍の領域内の、上述のNIRフルオレセイン標識で標識された二次モノクローナル抗体のNIR蛍光シグナルを計測すると、b）の下で計測されたシグナルと比較して、少なくとも10%、好ましくは、少なくとも20%、より好ましくは、少なくとも30%減少しているステップ；
f）ステップe）の計測の結果に基づいて、患者が、上述の無標識モノクローナル抗体の第二回用量を摂取するステップ、
を含んでなり；上記の一次抗体と二次抗体が交差反応性を示さないことを特徴とする使用である。
【００８６】
好ましくは、前記ステップa）〜f）は、連続したステップa）、b）、c）、d）、e）、そして、f）として実施される。
【００８７】
本発明の別の側面は、腫瘍抗原に特異的に結合する、NIRフルオレセイン標識で標識されたモノクローナル抗体の、上述の腫瘍抗原を過剰発現する固形腫瘍に罹患している患者の治療用医薬組成物の製造のための使用である。
【００８８】
本発明の別の側面は、上述の腫瘍抗原を過剰発現する固形腫瘍の治療用医薬品の製造のための、腫瘍抗原に特異的に結合する無標識モノクローナル抗体の使用であって、同じ腫瘍抗原に特異的に結合する、NIRフルオレセイン標識で標識された二次モノクローナル抗体が、上述の治療に対する応答を判定するために使用されて、上記の一次抗体と二次抗体が交差反応性を示さないことを特徴とする使用である。
【００８９】
用語「前記治療に対する応答を判定するため」は、本明細書で使用する場合、無標識モノクローナル抗体を用いた腫瘍抗原を過剰発現する固形腫瘍に罹患している患者の治療中のNIR蛍光シグナル又は画像の取得を指す。例えば、前記治療のいろいろな時点における固形腫瘍の領域内においていくつかの計測が実施される。又は、腫瘍抗原を過剰発現する固形腫瘍に罹患している患者に関するいくつかのNIR蛍光画像が、取得され得る。そして、治療に対する「応答」が、固形腫瘍の前述の領域内のNIR蛍光シグナルの減少（増大）の依存関係により、前述の腫瘍抗原を過剰発現する固形腫瘍を分類し、それは、固形腫瘍の上述の領域における腫瘍抗原の発現の減少（増大）に関係する（例えば、実施例4、図4を参照のこと）。これに関連して、本発明の別の好ましい側面は、固形腫瘍の治療用医薬品の製造のための腫瘍抗原に特異的に結合する、無標識モノクローナル抗体の使用であって、同じ腫瘍抗原に特異的に結合する、NIRフルオレセイン標識で標識された二次モノクローナル抗体が上述の腫瘍抗原の発現を測定するのに使用され、上記の一次抗体と二次抗体が交差反応性を示さないことを特徴とする使用である。
【００９０】
好ましくは、先に記載したような医薬組成物の製造のための、腫瘍抗原に特異的に結合する無標識モノクローナル抗体の使用、並びに以下で記載した方法は、両モノクローナル抗体が特異的に結合する上述の腫瘍抗原が、以下の：EGFR、HER2/neu、HER3、HER4、Ep-CAM、CEA、TRAIL、TRAIL受容体1、TRAIL受容体2、リンフォトキシンβ受容体、CCR4、CD19、CD20、CD22、CD28、CD33、CD40、CD80、CSF-1R、CTLA-4、線維芽細胞活性化タンパク質（FAP）、ヘプシン、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（MCSP）、前立腺特異的膜抗原（PSMA）、VEGF受容体1、VEGF受容体2、IGF1-R、TSLP-R、TIE-1、TIE-2、TNF-α、TNF様弱アポトーシス誘導因子（TWEAK）、IL-1Rから成る群から選択され、好ましくは、EGFR、HER2/neu、CEA、CD20、又はIGF1-Rであり、より好ましくは、HER2/neuであることを特徴とする。
【００９１】
本発明の別の側面は、腫瘍抗原を過剰発現する固形腫瘍に罹患している、上述の腫瘍抗原に特異的に結合する、無標識の一次モノクローナル抗体の用量と、同じ腫瘍抗原に特異的に結合する、NIRフルオレセイン標識で標識された二次モノクローナル抗体の用量を摂取した患者のNIR蛍光画像の取得方法であって、上記固形腫瘍の領域内のNIR蛍光シグナルが計測されて、一次抗体と二次抗体が交差反応性を示さないことを特徴とする方法である。
【００９２】
本発明の別の側面は、NIR蛍光画像の取得方法であって、固形腫瘍の領域内の、腫瘍抗原に特異的に結合する、NIRフルオレセイン標識で標識されているモノクローナル抗体のシグナルが、腫瘍抗原を過剰発現する固形腫瘍に罹患している患者の、同じ腫瘍抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体を用いた治療中に計測され、上記の一次抗体と二次抗体が交差反応性を示さないことを特徴とする方法である。
【００９３】
本発明の別の側面は、腫瘍抗原を過剰発現する固形腫瘍に罹患している患者の、同じ腫瘍抗原に特異的に結合する無標識モノクローナル抗体を用いた治療中に、固形腫瘍の領域内の腫瘍抗原に特異的に結合する、NIRフルオレセイン標識で標識されたモノクローナル抗体のNIR蛍光シグナルの測定方法であって、以下のステップ： 
a）患者が、前記腫瘍抗原と同じ腫瘍抗原に特異的に結合する、NIRフルオレセイン標識で標識された二次モノクローナル抗体の初回用量を摂取するステップ、ここで、上記の一次抗体と二次抗体は交差反応性を全く示さない；
b）固形腫瘍の領域内の、上述のNIRフルオレセイン標識で標識された二次モノクローナル抗体のNIR蛍光シグナルを計測するステップ；
c）患者が、上述の無標識モノクローナル抗体の初回用量を摂取するステップ；
d）患者が、上述のNIRフルオレセイン標識で標識された二次抗体の第二回用量を摂取するステップ；
e）上述の固形腫瘍の領域内の、上述のNIRフルオレセイン標識で標識された二次モノクローナル抗体のNIR蛍光シグナルを計測すると、b）の下で計測されたシグナルと比較して、少なくとも10%、好ましくは、少なくとも20%、より好ましくは、少なくとも30%減少しているステップ；
f）ステップe）の計測の結果に基づいて、患者が、上述の無標識モノクローナル抗体の第二回用量を摂取するステップ、
が実施され；上記の一次抗体と二次抗体が交差反応性を示さないことを特徴とする方法である。
【００９４】
好ましくは、前記のステップa）〜f）は、連続したステップa）、b）、c）、d）、e）、そして、f）として実施される。
【００９５】
好ましくは、こうした方法において、シグナル／バックグラウンド比は、少なくとも1.5であり、好ましくは、2.0である。
【００９６】
前述の「NIRフルオレセイン標識で標識されたモノクローナル抗体」は、固形腫瘍の領域内でのNIR蛍光画像の取得に好適な近赤外線（NIR）フルオレセイン標識で標識される。
【００９７】
近赤外線スペクトル、すなわち、640〜1300nm、好ましくは、640〜1200nm、そして、より好ましくは、640〜900nmに励起及び発光波長を有するNIR蛍光標識が使用される。電磁スペクトルのこの部分の使用が、組織透過性を最大限にし、且つ、ヘモグロビン（＜650nm）や水（＞1200nm）などの生理学的に豊富な吸収物質による吸収を最小限にする。生体内における使用のための理想的な近赤外線蛍光色素は、以下の：
（1）狭い分光特性
（2）高感度（量子収量）
（3）生物学的適合性、及び
（4）吸収及び励起スペクトルの分離、
を示す。
【００９８】
様々な近赤外線（NIR）フルオレセイン標識が、市販されているので、本願発明に従ってプローブを調製するために使用できる。代表的なNIRF標識には、以下の：Cy5.5、Cy5、及びCy7（Amersham、Arlington Hts., IL）；IRD41及びIRD700（LI-COR、Lincoln, NE）；NIR-1（Dejindo、Kumamoto, Japan）；Lajolla Blue（Diatron、Miami, FL）；インドシアニン・グリーン（ICG）、及びその類似体（Licha, K., et al., Proc. SPIE-Int. Soc. Opt. Eng. 2927 (1996) 192-198；Ito et al., US 5,968,479）；インドトリカルボシアニン（ITC；WO 98/47538）；及びキレート化ランタニド化合物が含まれる。蛍光ランタニド金属には、ユーロピウム及びテルビウムが含まれる。ランタンの蛍光特性は、Lackowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy 2nd Ed. Kluwar Academic New York (1999)に記載されている。
【００９９】
従って、前述の「NIRフルオレセイン標識で標識されたモノクローナル抗体」は、好ましくは、Cy5.5、Cy5、Cy7、IRD41、IRD700、NIR-1、Lajolla Blue、インドシアニン・グリーン（ICG）、インドトリカルボシアニン（ITC）、並びにSF64、5-29、5-36、及び5-41（WO 2006/072580より）から成る群から選択されるNIRフルオレセイン標識によって標識され、より好ましくは、上述の抗体は、Cy5.5、Cy5、及びCy7から成る群から選択されるNIRF標識で標識される。
【０１００】
NIRフルオレセイン標識の連結に使用される方法は、当該技術分野で周知である。抗体へのNIRフルオレセイン標識の結合技術は、ここ数年間で顕著に成熟しており、そして、素晴らしい総説が、Aslam, M., and Dent, A., Bioconjugation, London (1998) 216-363に、及びTijssen, P. "Practice and theory of enzyme immunoassays" (1990) 22l-278 Elsevier, Amsterdam中の「Macromolecule conjugation」という章に与えられている。
【０１０１】
適切な連結化学反応は、先に引用した引用文献（Aslam、前掲）により知られている。NIRフルオレセイン標識は、どの連結部分がそこに存在しているかにより、水性又は有機媒体中で抗体と直接反応させることができる。連結部分は、抗体への蛍光色素標識の化学的に連結するのに使用される反応性基又は活性基である。前記蛍光色素標識は、抗体に直接取り付けられるか、又は抗体とNIRフルオレセイン標識を含んでなるNIRフルオレセイン標識複合体を形成するようにスペーサを介して抗体に接続される。使用されるスペーサは、本質的に、適当に長い生体内における持続性（半減期）を有するように選択されても、又は設計されてもよい。
【０１０２】
固形腫瘍の領域内のNIR蛍光シグナルの「計測」又は「測定」は、患者への標識抗体の投与後に実施される。あるいは、本発明による組成物が使用される場合、患者への無標識抗体と標識抗体から成る組成物の投与後である。計測は、投与後の規定された時点、例えば、1日、2日間、若しくは3日間かさらに長い期間、又は固形腫瘍の領域内の比較できるNIR蛍光シグナル又は画像を取得するために適正なその他の時点で実施され得る。計測の継続又は投与後の時点は、適切なNIR蛍光シグナル又は画像を得る方法で当業者によって調整され得る。
【０１０３】
NIR蛍光の計測のために、様々なデバイス及び技術が使用される、例えば、乳房の腫瘍のような外部固形腫瘍のために、ART Advanced Research Technologies Inc.（http：//www.art.ca/en/products/softscan.html）製のSoftScan（登録商標）装置が好適である（Intes X, Acad. Radiol. 12 (2005) 934-947）。結腸直腸癌又は肺癌のような内科疾患区域のために、内視鏡的技術又は顕微手術‐内視鏡検査の組み合わせが使用できる。
【０１０４】
本願発明の実施で有用なNIR蛍光測定のための画像システムは、3つの基本的構成要素：（1）近赤外線光源、（2）蛍光色素の励起に使用される光と蛍光発光を分離するか又は識別する手段、及び（3）検出システム、が通常含まれる。
【０１０５】
前記光源は、単色（実質的に、単色）の近赤外線光を提供する。前記光源は、好適なフィルターを通した白色光、すなわち、広帯域光源からの帯域通過光である。例えば、150ワットのハロゲン・ランプからの光は、Omega Optical（Brattleboro, VT）から市販されている好適な帯域通過フィルターを通過させることができる。いくつかの態様において、前記光源はレーザーである。例えば、Boas, D.A., et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 4887-4891；Ntziachristos, V., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 2000 2767-2772；Alexander, W., 1991, J. Clin. Laser Med. Surg. 9 416-418を参照のこと。
【０１０６】
ハイパス・フィルター（700nm）は、励起光から蛍光発光を分離するのに使用できる。好適なハイパス・フィルターは、Omega Opticalから市販されている。
通常、光検出システムには、光収集／画像形成部品と、光検出／画像記録部品が含まれると見なされる。光検出システムは両部品を組み込む単独の集積デバイスであってもよいが、光収集／画像形成部品と光検出／画像記録部品については、別々に議論されるだろう。
【０１０７】
特に有用な光収集／画像形成部品は、内視鏡である。腹膜（Gahlen, J., et al., J. Photochem. Photobiol. B 52 (1999) 131-135）、卵巣癌（Major, A.L., et al., Gynecol. Oncol. 66 (1997) 122-132）、結腸（Mycek, M.A., et al., Gastrointest. Endoscopy. 48 (1998) 390-394；Stepp, H., et al., Endoscopy 30 (1998) 379-386）、胆管（Izuishi, K., et al., Hepatogastroenterology 46 (1999) 804-807）、胃（Abe, S., et al., Endoscopy 32 (2000) 281-286）、膀胱（Kriegmair, M., et al., Urol. Int. 63 (1999) 27-31；Riedl, C.R., et al., J. Endourol. 13 755-759）、及び脳（Ward, H.A., J. Laser Appl. 10 (1998) 224-228）を含めた多数の組織及び臓器の生体内における光学画像に使用された内視鏡デバイス及び技術が、本発明の実施に利用できる。
【０１０８】
本発明に有用な他のタイプの光収集部品は、ファイバー・オプティクス・デバイスを含めたカテーテル・ベースのデバイスである。こうしたデバイスは、血管内の画像化に特に好適である。例えば、Tearney, G.J., et al., Science 276 (1997) 2037-2039；Boppart, S.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997) 4256-4261を参照のこと。
【０１０９】
フェーズドアレイ技術（Boas, D.A., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. 19 USA 91 (1994)4887-4891；Chance, B., Ann. NY Acad. Sci. 838 (1998) 29-45）、拡散光学断層撮影法（Cheng, X., et al., Optics Express 3 (1998) 118-123；Siegel, A., et al., Optics Express 4 (1999) 287-298）、生体顕微鏡検査（Dellian, M., et al., Br.LT. Cancer 82 (2000) 1513-1518；Monsky, WX., et al., Cancer Res. 59 (1999) 4129-4135；Fukumura, D., et al., Cell 94 (1998) 715-725）、及び共焦点画像化法（Korlach, J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (1999) 8461-8466；Rajadhyaksha, M., et al., J. Invest. Dermatol. 104 (1995)946-952；Gonzalez, S., et al., J. Med. 30 (1999) 337-356）を含めたさらに他の画像技術が、本発明の実施に利用できる。
【０１１０】
あらゆる好適な光検出／画像記録部品、例えば、電荷結合素子（CCD）システム又は写真フィルム、が本発明に使用できる。光検出／画像記録部品の選択は、使用される光収集／画像形成部品のタイプを含めた要素次第であるだろう。好適な部品を選択し、それらを近赤外線画像化システムに組み立て、そして、そのシステムを操作することは、当業者の範疇である。
【０１１１】
例えば、NIR蛍光画像を取得するための有用な装置は、ART Advanced Research Technologies Inc.製のSoftScan（登録商標）装置； Image Station In-Vivo F；Image Station In-Vivo FX；Molecular Imaging Systems, Carestream Health, Inc.（元Kodak Molecular Imaging Systems）製のIn-Vivo Imaging System FX Pro；LI-COR Biosciences製のAerius Automated Infrared Imaging System及びOdyssey Infrared Imaging System；BERTHOLD TECHNOLOGIES製のLB 983 NightOWL II、又は他の適切なデバイスである。
【０１１２】
本発明の理解を助けるために、以下の実施例及び図面を提供し、本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に記載されている。本発明の趣旨から逸脱することなく記載されている手順に変更が加えられ得ることは理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】HER2腫瘍抗原を過剰発現する、及び過剰発現しない様々な固形腫瘍のNIR蛍光画像：  以下のマウスにおいて    a）BT474 s.c（皮下）モデル、強くHER2を過剰発現する腫瘍モデル（DAKO HercepTest（登録商標）による3＋）（図1a）、    b）A549 s.c.モデル、HER2過剰発現のない腫瘍モデル（DAKO HercepTest（登録商標）による0）（図1b）、及び    c）腫瘍のないマウス（図1c）において、Cy5で標識されたパーツズマブを、マウス1匹あたり20マイクログラムの単回投与にて静脈内（i.v.）注射し、そして、NIR蛍光シグナルを24時間後に計測した。取得時間は2秒であった。NIR蛍光画像は：図1aにおいて、i）BT474腫瘍細胞は、HER2腫瘍抗原を過剰発現し、且つ、ii）非腫瘍組織と比較して、固形腫瘍の領域内の有意なNIR蛍光シグナルが計測され得ること；図1bにおいて、i）A549腫瘍細胞は、HER2腫瘍抗原の過剰発現を示さず、且つ、ii）非腫瘍組織と比較して、固形腫瘍の領域内で有意なNIR蛍光シグナルは検出できなかったこと；図1cにおいて、i）腫瘍のないマウスにおける非腫瘍細胞は、HER2腫瘍抗原の有意な過剰発現を示さず、且つ、ii）有意なNIR蛍光シグナルが検出できなかったことを示している。
【図２】HER2腫瘍抗原を過剰発現する固形腫瘍のNIR蛍光画像：  強くHER2を過剰発現する腫瘍モデル（DAKO HercepTest（登録商標）による3＋）である、KPL4モデルを有する4匹のマウスにおいて、すべてマウス1匹あたり50マイクログラムの単回投与にて、Cy5で標識されたトラスツズマブ（図2a）を2匹のマウスに静脈内（i.v.）注射し、及びCy5で標識されたパーツズマブ（図2b）を他の2匹のマウスに静脈内（i.v.）注射し、そして、NIR蛍光シグナルを24時間後に計測した。取得時間は4秒であった。NIR蛍光画像は、i）KPL4腫瘍細胞がHER2腫瘍抗原を過剰発現し、且つ、ii）Cy5で標識されたトラスツズマブ（図2a）又はCy5で標識されたパーツズマブ（図2b）を使用した非腫瘍組織と比較して、固形腫瘍の領域内で有意なNIR蛍光シグナルが計測されなかったことを示している。
【図３】（最初のトラスツズマブ適用の48時間後‐初期の）無標識トラスツズマブでの患者治療中のHER2腫瘍抗原を過剰発現する固形腫瘍のNIR蛍光画像‐NIR蛍光画像化のための（トラスツズマブと交差反応性がない）Cy5で標識されたパーツズマブの使用  強くHER2を過剰発現する腫瘍モデル（DAKO HercepTest（登録商標）による3＋）であるKPL4モデルにおいて、一次投与で、無標識トラスツズマブが、30mg/kgの単回用量で腹腔内（i.p.）注射され、そして、48時間後に、二次投与で、Cy5で標識されたトラスツズマブ（図3a）又はCy5で標識されたパーツズマブ（図3b）が、マウス1匹あたり50マイクログラムの単回投与で静脈内（i.v.）注射され、そして、NIR蛍光シグナルが、上記二次投与の24時間後に計測された。取得時間は4秒であった。NIR蛍光画像は、i）トラスツズマブでの、HER2腫瘍抗原を過剰発現する固形腫瘍（又はHER2腫瘍抗原を過剰発現する固形腫瘍に罹患している患者）の治療中の、（無標識トラスツズマブと交差反応性である）Cy5で標識されたトラスツズマブが、固形腫瘍の領域内での有意なNIR蛍光シグナルの検出に好適ではないこと（図3a）；ii）トラスツズマブでの、HER2腫瘍抗原を過剰発現する固形腫瘍の治療中の、（無標識トラスツズマブと交差反応性を示さない）Cy5で標識されたパーツズマブが、固形腫瘍の領域内での有意なNIR蛍光シグナルの検出に好適であること（図3b）を示している。
【図４】（二次パーツズマブ適用後の）無標識パーツズマブでの毎週の治療中の、HER2腫瘍抗原を過剰発現する固形腫瘍のNIR蛍光画像‐NIR蛍光画像化のための（パーツズマブと交差反応性がない）Cy5で標識されたトラスツズマブの使用  KPL-4モデルにおいて、パーツズマブが、毎週2回に腹腔内（i.p.）注射された。一次注射（負荷量）は30mg/kgであり、そして、二次適用（維持量）は15mg/kgであった。対照動物にはPBSを与えた。二次投与の48時間後に、両群のマウスに、Cy5で標識されたトラスツズマブを注射し、そして、4日間後に、3秒の取得時間を使用してNIR蛍光シグナルが計測された。NIR蛍光画像は、i）パーツズマブで処置したマウスにおけるNIR蛍光シグナル（図4a）は、PBSで処置されたマウスにおけるNIR蛍光シグナル（図4b）と比較して、減少したこと、そして、ii）よって、HER2を過剰発現するKPL-4固形腫瘍では、HER2に特異的に結合するパーツズマブでの治療に対する応答が検出可能であることを示している。
【図５】無標識セツキシマブで治療中の、EGFR腫瘍抗原を発現する固形腫瘍のNIR蛍光画像化‐NIR蛍光画像化のための（セツキシマブと交差反応性がない）Cy5で標識されたrhMab ICR62の使用  Calu3腫瘍を担持する雌Balb/cヌードマウスに、セツキシマブを2.5mg/kgの用量にて週一回、4週間、腹腔内（i.p.）注射した。最後の処置の2日後に、マウスに、2mg/kgのCy5で標識されたrhMab ICR62を与えた。その24時間後に、4秒の取得時間を用いてNIR蛍光シグナルが計測された。結果は、Cy5で標識されたrhMab ICR62が適用された場合に、無標識セツキシマブの前注射が、その後のEGFR発現腫瘍細胞、及び腫瘍組織の適確な局在性の検出を可能にすることを実証している。これは、rhMab ICR62がセツキシマブによって認識されるエピトープと異なるエピトープに結合することを示しているので、セツキシマブとrhICR62が同じEGFR腫瘍抗原に対して交差反応性を示さないことを示している。よって、前記NIR蛍光画像は、EGFRを発現するCalu3固形腫瘍において、HER2に特異的に結合するセツキシマブを用いた治療に対する応答が、非交差反応性のCY5標識rhMab ICR62を用いて検出可能であることを示している。
【実施例】
【０１１４】
序論
現在の研究は、腫瘍抗原に特異的に結合する、NIRフルオレセイン標識で標識されたモノクローナル抗体の、単独での、あるいは、上述の腫瘍抗原が過剰発現している又は過剰発現していない様々なヒト異種移植モデルにおいて、同じ腫瘍抗原に特異的に結合する無標識モノクローナル抗体を用いた事前治療後、又は事前治療中の（ここで、上記の一次抗体と二次抗体は交差反応性を示さない）、NIR蛍光画像化を調べた。
【０１１５】
細胞株と培養条件
J. Kureabashiによって快く提供されたヒト乳癌細胞株KPL-4を、炎症性皮膚転移癌を患っていて、且つ、ErbBにファミリー受容体を過剰発現する乳癌患者の悪性胸膜の滲出物から樹立した（Kurebayashi, J., et al, Br. J. Cancer 79 (1999) 707-17）。腫瘍細胞を、10%のウシ胎仔血清（PAA）及び2mMのL-グルタミン（Gibco）を補ったDMEM培地（PAA Laboratories、Austria）中、5%のCO2の水飽和雰囲気中、37℃にてごく普通に培養した。培養継代を、2倍／週に分割してトリプシン/EDTA 1×（PAA）を用いて実施される。細胞継代P6を、生体内における研究に使用した。
【０１１６】
Her2を過剰発現するヒト乳癌細胞株BT474を、ATCCから得た。その細胞を、10%のFBS（PAA）、2mMのL-グルタミン、1mMのピルビン酸Na、及び10mMのHepesを含むRPMI 1640培地中、5%のCO2の水飽和雰囲気中、37℃にて試験管内培養した。3回目の継代の細胞を、マウスへの皮下注射に使用した。
【０１１７】
Her2陰性ヒトA549肺癌細胞をDSMZから得た。その細胞を、BT474細胞株のものと同じプロトコールを使用して、しかし、Hepesの添加なしに、ごく普通に培養した。培養継代を、2倍／週に分割してトリプシン/EDTA 1×（PAA）を用いて実施する。細胞継代P3を、生体内における研究に使用した。
【０１１８】
EGF1R陽性ヒトCalu3肺腫瘍細胞を、Roche、Kamakuraから得た。その細胞を、Earle’s BSS、10%のFCS、1mMのピルビン酸Na、及び0.1mMのNEAAを含むEagle’s MEM中、5%のCO2の水飽和雰囲気中、37℃にて試験管内培養した。3回目の継代の細胞を、マウスへの皮下注射に使用した。
【０１１９】
動物
雌SCIDベージュ（C.B.-17）マウス及び雌Balb/cヌードマウス；10〜12週齢；体重18〜20g（Charles River、Sulzfeld, Germany）を、国際的なガイドライン（GV-Solas；Feiasa；TierschG）に従って12時間の明／12時間の暗の一日サイクルを持つ、特定病原体を含まない条件下で飼育した。到着後、動物を、動物飼育施設の検疫部に1週間収容して、新しい環境とモニタリングに慣れさせる。連続した健康モニタリングを定期的に実施する。ダイエット食品（Alltromin）と水（酸性化pH 2.5〜3）を不断給餌で提供する。
【０１２０】
腫瘍細胞の注射
腫瘍細胞を、培養フラスコ（Greiner TriFlask）から集菌し（トリプシン‐EDTA）、そして、50mlの培地中に移し、1回洗浄し、そして、PBS中に再懸濁した。PBSでの追加の洗浄ステップ、そして、濾過（細胞濾過器；Falcon 100μm）の後に、最終的な細胞力価を適切に調整した。腫瘍細胞懸濁液を、細胞凝集を避けるために、ホールピペットを用いて慎重に混合した。麻酔を、閉鎖型循環システム内にプレインキュベーション・チャンバー（プラキシガラス）、別個の口と鼻マスク（シリコン）、及びイソフルラン（Pharmacia-Upjohn、Germany）を備えた小動物用Stephens's吸入ユニットを使用して実施した。注射の2日前に、動物の毛皮を剃った。
【０１２１】
KPL-4腫瘍細胞（20μlのPBS中、3×10e6個）を、それぞれの麻酔されたマウスの右側の終わりから二番目の鼠径部乳房脂肪体（i.m.f.p.）に同所注射した。この同所移植のために、前記細胞懸濁液を、乳頭の下の皮膚を貫いて注射された。腫瘍細胞の注射は、実験の1日目に相当する。
【０１２２】
BT474腫瘍細胞（5×10e6個）を、100μlマトリゲル（Becton Dickinson）中、動物の右脇腹に皮下注射した。17βエストラジオールを、飲料水によって補った。最初、研究の1日目〜33日目までは、飲料水に、2.5μgの17βエストラジオール/ml水を補った。
A549腫瘍（100μlのPBS中、1×10e7個）を、動物の右脇腹に皮下注射した。
Calu3腫瘍細胞（100μlのPBS中、5×10e6個）を、動物の右脇腹に皮下注射した。
【０１２３】
臨床的症状と体重のモニタリング
臨床的症状の有害影響を検出するために、動物を毎日管理した。実験を通じたモニタリングのために、動物の体重を、毎週2回記録した。
【０１２４】
NIR蛍光画像の取得
NIR蛍光シグナルの非侵襲的計測又は測定は、適切なNIR蛍光標識でモノクローナル抗体を標識することによって達成され得る。例えば、固形腫瘍担持マウスへの静脈内（i.v.）注射後に、抗体の取得NIR蛍光画像をモニターするため、並びに上述の固形腫瘍の発生、及び上述の腫瘍で元々過剰発現されていた腫瘍抗原の発現を、上述の腫瘍抗原に特異的に結合する無標識抗体での治療中にモニタリングするために、様々なモノクローナル抗体をCy5、Cy5.5、又はCy7色素で標識した。その後の様々な時点での抗体の適用の後に、NIR蛍光測定を、Siemens Medizintechnik, Germany製のBonSAI画像システムを使用することで実施した。固形腫瘍の領域内のピクセルの平均強度をまとめることによって、例えば、腫瘍抗原の発現レベル、特定のNIR蛍光画像で標識された抗体、取得時間、標識抗体の適用後の時間、及び上述の固形腫瘍の治療を目的とした無標識抗体の適用後の時間、の依存関係により、固形腫瘍に特異的であるNIR蛍光シグナルを決定することができる。
【０１２５】
結果
実施例1：HER2腫瘍抗原を過剰発現する、及び過剰発現しない様々な固形腫瘍のNIR蛍光画像化
BT474又はA549腫瘍を担持する雌SCIDベージュ・マウスに、腫瘍サイズが約500mm3になった時点で、20μg/マウスのパーツズマブの単回投与を、静脈内（i.v.）注射した。腫瘍を含まないSCIDベージュ・マウスにもまた、標識モノクローナル抗体を注射し、そして、それは対照としての役割を果たした。その後のある日、NIR蛍光シグナルを、BonSAIシステム（Siemens Medizintechnik）を使用することで計測した。取得時間は、常に2秒であった。図1aに描かれた結果は、Cy5で標識されたモノクローナル抗体、パーツズマブが、Her2を過剰発現する腫瘍細胞、BT474の検出を可能にすることを示している。対照的に、Her2抗原を発現しないA549細胞（図1b）に関して、NIR蛍光シグナルは検出できず、そして、同様に、NIR蛍光シグナルは、腫瘍を含まないマウス（図1c）においても作り出されることはできなかった。
【０１２６】
実施例2：HER2腫瘍抗原を過剰発現する固形腫瘍のNIR蛍光画像化
KPL-4腫瘍を担持する雌SCIDベージュ・マウスに、Cy5で標識されたトラスツズマブ（図2a）又はCy5で標識されたパーツズマブ（図2b）を注射した。標識抗体を、50μg/マウスの用量で静脈内（i.v.）注射した。その後のある日、NIR蛍光シグナルを、4秒の取得時間で計測した。結果（図2）は、Cy5標識トラスツズマブ（図2a）又はCy5標識パーツズマブ（図2b）を使用すると、同程度のNIR蛍光シグナルが、Her2を過剰発現する細胞株、KPL-4において検出可能であったことを示している。
【０１２７】
実施例3：無標識トラスツズマブを用いた患者の治療中（初期‐最初のトラスツズマブ適用の48時間後）のHER2腫瘍抗原を過剰発現する固形腫瘍のNIR蛍光画像化‐NIR蛍光画像化のための（トラスツズマブと交差反応性がない）Cy5で標識されたパーツズマブの使用
KPL-4腫瘍を担持する雌SCIDベージュ・マウスに、30mg/kgのトラスツズマブの単回投与を、腹腔内（i.p.）注射した。その2日間後に、一方のマウス群に、Cy5標識トラスツズマブを与え（図3a）、第二群のマウスに、Cy5標識パーツズマブを注射した（図3b）。前記の2つの群には、腫瘍サイズの有意差が全くなかったので、50μg/マウスの投薬量にて、標識抗体を腹腔内（i.v.）投与した。NIR蛍光シグナルを、その24時間後に4秒の取得時間で計測した。4秒の取得時間で計測したバックグラウンド・シグナルは、500MFI（平均NIR蛍光（NIRF）シグナル強度［任意の単位］）であった。NIR蛍光強度を、着目の領域内（ROI）のピクセルの数及びシグナル強度をまとめることによって定量化した。腫瘍の領域内において530MFIのシグナルが計測され、それは、500MFIのバックグラウンド・シグナルをわずかに超えるだけであったので、前記の結果は、Cy5標識トラスツズマブが適用されたとき、無標識トラスツズマブの事前注射が、Her2発現腫瘍細胞のその後の有意な検出を妨げることを実証している（図3a）。
【０１２８】
よって、有意なNIR蛍光シグナルが、トラスツズマブでの事前治療後に検出できず、その結果、Cy5標識トラスツズマブは、トラスツズマブでの患者の治療中の療法モニタリングに好適でない。対照的に、（別のエピトープに結合するので、トラスツズマブと交差反応性でない）Cy5標識パーツズマブの適用は、腫瘍の領域内において1440MFIのシグナルを与えた（図3b）。よって、トラスツズマブでの事前治療後に、有意なNIR蛍光シグナルを検出でき、その結果、1.06（＝530MFI/500MFI‐トラスツズマブ治療後にCy5標識トラスツズマブ）のシグナル／バックグラウンド比と比較して、2.88（＝1440MFI/500MFI‐トラスツズマブ治療後にCy5標識パーツズマブ）の明らかに改善されたシグナル／バックグラウンド比に示すので、Cy5標識パーツズマブは、トラスツズマブでの治療中の療法モニタリングに好適であった。
【０１２９】
これは、交差反応性抗体の使用によるものと比べて、さらに少ないNIRF標識抗体しか与えられない場合であっても、腫瘍の領域の明らかにより良好な局在性を可能にする。結果はまた、パーツズマブが、トラスツズマブによって認識されるエピトープと異なるエピトープに結合することを明確に示しているので、よって、トラスツズマブとパーツズマブが、同じHER2腫瘍抗原に対して交差反応性を示さないことを示している（しかし一方で、トラスツズマブとCy5標識トラスツズマブは交差反応性を示すので、トラスツズマブでの事前治療後に有意なNIR蛍光シグナルが検出できない、その結果、Cy5標識トラスツズマブは、トラスツズマブでの治療中の療法モニタリングに好適でない）。
【０１３０】
実施例4：（二次パーツズマブ適用の48時間後の）無標識パーツズマブでの毎週の治療中の、HER2腫瘍抗原を過剰発現する固形腫瘍のNIR蛍光画像‐NIR蛍光画像化のための（パーツズマブと交差反応性がない）Cy5で標識されたトラスツズマブの使用
KPL-4腫瘍を担持する雌SCIDベージュ・マウスを、毎週2回に腹腔内（i.p.）注射されるパーツズマブで治療した。一次注射（負荷量）は30mg/kgであり、そして、二次適用（維持量）は15mg/kgであった（図4a）。対照動物にはPBSのみを与えた（図4b）。48時間後に、両群のマウスに、50μg/マウスのCy5標識トラスツズマブを注射し、そして、4日間後に、3秒の取得時間を使用してNIR蛍光シグナルが計測された。図4aは、パーツズマブで処置したマウスのNIR蛍光シグナルが、PBSで処置したマウスのNIR蛍光シグナル（図4b）と比較して、減少したことを示している。よって、HER2を過剰発現するKPL-4固形腫瘍では、HER2に特異的に結合するパーツズマブでの治療に対する応答が検出可能である。
【０１３１】
実施例5：無標識セツキシマブでの患者の治療中の、EGFR腫瘍抗原を発現する固形腫瘍のNIR蛍光画像化‐NIR蛍光画像化のための（セツキシマブと交差反応性がない）Cy5で標識されたrhMab ICR62の使用
Calu3腫瘍を担持する雌Balb/cヌードマウスに、セツキシマブを2.5mg/kgの用量にて週一回、5週間、腹腔内（i.p.）注射した。最後の処置の2日後に、マウスに、2mg/kgのCy5で標識されたrhMab ICR62を静脈内（i.v.）に与えた（図5）。その24時間後に、4秒の取得時間を用いてNIR蛍光シグナルが計測された。結果は、Cy5で標識されたrhMab ICR62が適用された場合に、無標識セツキシマブの前注射が、その後のEGFR発現腫瘍細胞、及び腫瘍組織の適確な局在性の検出を可能にすることを実証している（図5）。これは、rhMab ICR62がセツキシマブによって認識されるエピトープと異なるエピトープに結合することを示しているので、セツキシマブとrhICR62が同じEGFR腫瘍抗原に対して交差反応性を示さないことを示している。よって、前記NIR蛍光画像は、EGFRを発現するCalu3固形腫瘍において、HER2に特異的に結合するセツキシマブを用いた治療に対する応答が、非交差反応性のCY5標識rhMab ICR62を用いて検出可能であることを示している。
【図１ａ】
2010529060.tif 000003
【図１ｂ】
2010529060.tif 000004
【図１ｃ】
2010529060.tif 000005
【図２ａ】
2010529060.tif 000006
【図２ｂ】
2010529060.tif 000007
【図３ａ】
2010529060.tif 000008
【図３ｂ】
2010529060.tif 000009
【図４ａ】
2010529060.tif 000010
【図４ｂ】
2010529060.tif 000011
【図５】
2010529060.tif 000012
【国際調査報告】
2010529060.tif 000013
2010529060.tif 000014
2010529060.tif 000015
2010529060.tif 000016
2010529060.tif 000017