(57)【要約】  本発明は、セルロース含有物質を分解又は変換するためのセルロース分解性タンパク質組成物、並びに当該組成物を作製及び使用する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
繊維状真菌宿主細胞であって、（ａ）セルロース分解性増強活性を有する天然型又は異種接合型ポリペプチドをコードする第一ポリヌクレオチド；（ｂ）天然型又は異種接合型ベータ−グルコシダーゼをコードする第二ポリヌクレオチド；及び（ｃ）天然型又は異種接合型のセルロース分解性酵素で、以下のトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）セロビオヒドロラーゼＩ（ＣＥＬ７Ａ）、トリコデルマ・リーゼイセロビオヒドロラーゼII（ＣＥＬ６Ａ)、及びトリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼＩ（ＣＥＬ７Ｂ）並びにその相同分子種又は変異体からなる群から選択される１以上（複数）のセルロース分解性酵素をコードする、１以上（複数）の第三ポリヌクレオチド、を含んでなる宿主細胞。
【請求項２】
前記セルロース分解性増強活性を有するポリペプチドが以下の、
（ａ）［ＩＬＭＶ］−Ｐ−Ｘ（４,５）−Ｇ−Ｘ−Ｙ−［ＩＬＭＶ］−Ｘ−Ｒ−Ｘ−［ＥＱ］−Ｘ（４）−［ＨＮＱ］及び［ＦＷ］−［ＴＦ］−Ｋ−［ＡＩＶ］（式中、Ｘが任意のアミノ酸、Ｘ（４,５）が４又は５の隣接位置での任意のアミノ酸、及びＸ（４）が４の隣接位置での任意のアミノ酸である）を含んでなる、セルロース分解性増強活性を有するポリペプチド、及び
（ｂ）［ＩＬＭＶ］−Ｐ−ｘ（４,５）−Ｇ−ｘ−Ｙ−［ＩＬＭＶ］−ｘ−Ｒ−ｘ−［ＥＱ］−ｘ（３）−Ａ−［ＨＮＱ］（式中、ｘが任意のアミノ酸、ｘ（４,５）が４又は５の隣接位置での任意のアミノ酸、及びＸ（３）が３の隣接位置での任意のアミノ酸である）を含んでなる、セルロース分解性増強活性を有するポリペプチドからなる群から選択され、
ここで、［ＩＬＭＶ］−Ｐ−Ｘ（４,５）−Ｇ−Ｘ−Ｙ−［ＩＬＭＶ］−Ｘ−Ｒ−Ｘ−［ＥＱ］−Ｘ（４）−［ＨＮＱ］及び［ＦＷ］−［ＴＦ］−Ｋ−［ＡＩＶ］を含んでなるセルロース分解性増強活性を有するポリペプチドは、
Ｈ−Ｘ（１,２）−Ｇ−Ｐ−Ｘ（３）−［ＹＷ］−［ＡＩＬＭＶ］、
［ＥＱ］−Ｘ−Ｙ−Ｘ（２）−Ｃ−Ｘ−［ＥＨＱＮ］−［ＦＩＬＶ］−Ｘ−［ＩＬＶ］、又は
Ｈ−Ｘ（１,２）−Ｇ−Ｐ−Ｘ（３）−［ＹＷ］−［ＡＩＬＭＶ］及び［ＥＱ］−Ｘ−Ｙ−Ｘ（２）−Ｃ−Ｘ−［ＥＨＱＮ］−［ＦＩＬＶ］−Ｘ−［ＩＬＶ］（式中、Ｘは任意のアミノ酸、Ｘ（１,２）は１又は２の隣接位置での任意のアミノ酸、Ｘ（３）は３の隣接位置での任意のアミノ酸、及びＸ（２）は２の隣接位置での任意のアミノ酸である）を任意にさらに含んでなる、請求項１に記載の繊維状真菌宿主細胞。
【請求項３】
前記セルロース分解性増強活性を有するポリペプチドが以下の、
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、又は配列番号１０、配列番号１２、又は配列番号１４の成熟ポリペプチドと、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、
（ｂ）（i）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、もしくは配列番号１３の成熟ポリペプチドコード配列、（ii）配列番号１、配列番号３、配列番号５、もしくは配列番号１１の成熟ポリペプチドコード配列に含有されるｃＤＮＡ配列、又は配列番号７、配列番号９、もしくは配列番号１３の成熟ポリペプチドコード配列を含んでなるゲノムＤＮＡ配列、又は（iii）（i）もしくは（ii）の全長相補鎖と、好ましくは少なくとも中ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中高ストリンジェンシー条件、及び最も好ましくは少なくとも高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズする、ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
（ｃ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、又は配列番号１３の成熟ポリペプチドコード配列と、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するヌクレオチド配列を含んでなるポリペプチドヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
（ｄ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、又は配列番号１０、配列番号１２、又は配列番号１４の成熟ポリペプチドの１以上（複数）のアミノ酸の、置換、削除、及び／又は挿入を含んでなる変異体、及び
（ｅ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、又は配列番号１０、配列番号１２、又は配列番号１４の成熟ポリペプチドを含んでなるか、前記成熟ポリペプチドからなる、セルロース分解性増強活性を有するポリペプチド、又はセルロース分解性増強活性を有するその断片、
からなる群から選択される、請求項１に記載の繊維状真菌宿主細胞。
【請求項４】
ベータ−グルコシダーゼがベータ−グリコシダーゼ融合タンパク質である、請求項１に記載の繊維状真菌宿主細胞。
【請求項５】
ベータ−グリコシダーゼ融合タンパク質が、（ａ）シグナルペプチドを含んでなる第一アミノ酸配列、（ｂ）少なくともエンドグルカナーゼの触媒ドメインを含んでなる第二アミノ酸配列、及び（ｃ）少なくともベータ−グルコシダーゼの触媒ドメインを含んでなる第三アミノ酸配列を含んでなり、ここで、第一アミノ酸配列のＣ末端は第二アミノ酸配列のＮ末端にインフレームで結合し、第二アミノ酸配列のＣ末端は第三アミノ酸配列のＮ末端にインフレームで結合する、請求項４に記載の繊維状真菌宿主細胞。
【請求項６】
ベータグルコシダーゼ融合タンパク質が、配列番号１０３又は配列番号１０５を含んでなるか、前記配列からなる、請求項５に記載の繊維状真菌宿主細胞。
【請求項７】
トリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼＩ（ＣＥＬ７Ａ）の相同分子種又は変異体が、以下の、
（ａ）配列番号５２の成熟ポリペプチドと、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、
（ｂ）（ｉ）配列番号５１の成熟ポリペプチドコード配列、（ii）配列番号５１の成熟ポリペプチドコード配列に含まれるｃＤＮＡ、もしくはそれを含んでなるゲノムＤＮＡ配列、又は（iii）（i）もしくは（ii）の全長相補鎖と、好ましくは少なくとも中ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中高ストリンジェンシー条件、及び最も好ましくは少なくとも高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
（ｃ）配列番号５１の成熟ポリペプチドコード配列と、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、及び
（ｄ）配列番号５２の成熟ポリペプチドの１以上（複数）のアミノ酸の置換、削除、及び／又は挿入を含んでなる変異体、
からなる群から選択される、請求項１に記載の繊維状真菌宿主細胞。
【請求項８】
トリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼＩ（ＣＥＬ７Ａ）が配列番号５２の成熟ポリペプチドを含んでなるか、前記成熟ポリペプチドからなる、請求項１に記載の繊維状真菌宿主細胞。
【請求項９】
トリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼII（ＣＥＬ６Ａ）の相同分子種又は変異体が、以下の、
（ａ）配列番号５４の成熟ポリペプチドと、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、
（ｂ）（ｉ）配列番号５３の成熟ポリペプチドコード配列、（ii）配列番号５３の成熟ポリペプチドコード配列に含まれるｃＤＮＡ、もしくはそれを含んでなるゲノムＤＮＡ配列、又は（iii）（i）もしくは（ii）の全長相補鎖と、好ましくは少なくとも中ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中高ストリンジェンシー条件、及び最も好ましくは少なくとも高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
（ｃ）配列番号５３の成熟ポリペプチドコード配列と、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、及び
（ｄ）配列番号５４の成熟ポリペプチドの１以上（複数）のアミノ酸の置換、削除、及び／又は挿入を含んでなる変異体、
からなる群から選択される、請求項１に記載の繊維状真菌宿主細胞。
【請求項１０】
トリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼII（ＣＥＬ６Ａ）が配列番号５４の成熟ポリペプチドを含んでなるか、前記成熟ポリペプチドからなる、請求項１に記載の繊維状真菌宿主細胞。
【請求項１１】
トリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼI（ＣＥＬ７Ｂ）の相同分子種又は変異体が、以下の、
（ａ）配列番号５６の成熟ポリペプチドと、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、
（ｂ）（ｉ）配列番号５５の成熟ポリペプチドコード配列、（ii）配列番号５５の成熟ポリペプチドコード配列に含まれるｃＤＮＡ、もしくはそれを含んでなるゲノムＤＮＡ配列、又は（iii）（i）もしくは（ii）の全長相補鎖と、好ましくは少なくとも中ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中高ストリンジェンシー条件、及び最も好ましくは少なくとも高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
（ｃ）配列番号５５の成熟ポリペプチドコード配列と、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、及び
（ｄ）配列番号５６の成熟ポリペプチドの１以上（複数）のアミノ酸の置換、削除、及び／又は挿入を含んでなる変異体、
からなる群から選択される、請求項１に記載の繊維状真菌宿主細胞。
【請求項１２】
トリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼI（ＣＥＬ７Ｂ）が、配列番号５６の成熟ポリペプチドを含んでなるか、前記成熟ポリペプチドからなる、請求項１に記載の繊維状真菌宿主細胞。
【請求項１３】
トリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼII（ＣＥＬ５Ａ）、トリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼIII（ＣＥＬ１２Ａ）、及びトリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼＶ（ＣＥＬ４５Ａ）、並びにこれらの相同分子種又は変異体からなる群から選択されるセルロース分解性酵素をコードする、１以上（複数）の第四ポリヌクレオチドをさらに含んでなる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の繊維状真菌宿主細胞。
【請求項１４】
トリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼII（ＣＥＬ５Ａ）の相同分子種又は変異体が、以下の、
（ａ）配列番号５８の成熟ポリペプチドと、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、
（ｂ）（ｉ）配列番号５７の成熟ポリペプチドコード配列、（ii）配列番号５７の成熟ポリペプチドコード配列に含まれるｃＤＮＡ、もしくはそれを含んでなるゲノムＤＮＡ配列、又は（iii）（i）もしくは（ii）の全長相補鎖と、好ましくは少なくとも中ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中高ストリンジェンシー条件、及び最も好ましくは少なくとも高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
（ｃ）配列番号５７の成熟ポリペプチドコード配列と、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、及び
（ｄ）配列番号５８の成熟ポリペプチドの１以上（複数）のアミノ酸の置換、削除、及び／又は挿入を含んでなる変異体、
からなる群から選択される、請求項１３に記載の繊維状真菌宿主細胞。
【請求項１５】
トリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼII（ＣＥＬ５Ａ）が、配列番号５８の成熟ポリペプチドを含んでなるか、前記成熟ポリペプチドからなる、請求項１３に記載の繊維状真菌宿主細胞。
【請求項１６】
トリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼIII（ＣＥＬ１２Ａ）の相同分子種又は変異体が、以下の、
（ａ）配列番号６０の成熟ポリペプチドと、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、
（ｂ）（ｉ）配列番号５９の成熟ポリペプチドコード配列、（ii）配列番号５９の成熟ポリペプチドコード配列に含まれるｃＤＮＡ、もしくはそれを含んでなるゲノムＤＮＡ配列、又は（iii）（i）もしくは（ii）の全長相補鎖と、好ましくは少なくとも中ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中高ストリンジェンシー条件、及び最も好ましくは少なくとも高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
（ｃ）配列番号５９の成熟ポリペプチドコード配列と、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、及び
（ｄ）配列番号６０の成熟ポリペプチドの１以上（複数）のアミノ酸の置換、削除、及び／又は挿入を含んでなる変異体、
からなる群から選択される、請求項１３に記載の繊維状真菌宿主細胞。
【請求項１７】
トリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼIII（ＣＥＬ１２Ａ）が、配列番号６０の成熟ポリペプチドを含んでなるか、前記成熟ポリペプチドからなる、請求項１３に記載の繊維状真菌宿主細胞。
【請求項１８】
トリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼＶ（ＣＥＬ４５Ａ）の相同分子種又は変異体が、以下の、
（ａ）配列番号６２の成熟ポリペプチドと、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、
（ｂ）（ｉ）配列番号６１の成熟ポリペプチドコード配列、（ii）配列番号６１の成熟ポリペプチドコード配列に含まれるｃＤＮＡ、もしくはそれを含んでなるゲノムＤＮＡ配列、又は（iii）（i）もしくは（ii）の全長相補鎖と、好ましくは少なくとも中ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中高ストリンジェンシー条件、及び最も好ましくは少なくとも高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズする、ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
（ｃ）配列番号６１の成熟ポリペプチドコード配列と、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、及び
（ｄ）配列番号６２の成熟ポリペプチドの１以上（複数）のアミノ酸の置換、削除、及び／又は挿入を含んでなる変異体、
からなる群から選択される、請求項１３に記載の繊維状真菌宿主細胞。
【請求項１９】
トリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼＶ（ＣＥＬ４５Ａ）が、配列番号６１の成熟ポリペプチドを含んでなるか、前記成熟ポリペプチドからなる、請求項１３に記載の繊維状真菌宿主細胞。
【請求項２０】
配列番号８のセルロース分解性増強活性を有するポリペプチドの成熟ポリペプチド、配列番号１０６のベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質、配列番号５２のトリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼＩ（ＣＥＬ７Ａ）の成熟ポリペプチド、配列番号５４のトリコデルマ・リーゼイセロビオヒドロラーゼII（ＣＥＬ６Ａ) の成熟ポリペプチド、及び配列番号５６のトリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼＩ（ＣＥＬ７Ｂ）の成熟ポリペプチドを含んでなる、セルロース分解性タンパク質組成物を作製する、請求項１に記載の繊維状真菌宿主細胞。
【請求項２１】
配列番号５８のトリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼII（ＣＥＬ５Ａ）、配列番号６２のトリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼＶ（ＣＥＬ４５Ａ）、及び配列番号６０のトリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼIII（ＣＥＬ１２Ａ）からなる群から選択される、１以上（複数）の酵素をさらに作製する、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の繊維状真菌宿主細胞。
【請求項２２】
配列番号６４のチエラビア・テレストリス（Thielavia terrestris）・セロビオヒドロラーゼの成熟ポリペプチドをさらに産生する、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の繊維状真菌宿主細胞。
【請求項２３】
セルロース分解性タンパク質組成物を作製する方法であって、（ａ）請求項１〜２２のいずれか１項に記載の宿主細胞を、ポリペプチドの作製に適する条件下で培養すること、及び（ｂ）ポリペプチドを回収することを含んでなる方法。
【請求項２４】
請求項２３の方法により得られるセルロース分解性タンパク質組成物。
【請求項２５】
セルロース分解性タンパク質組成物であって、（ａ）セルロース分解性増強活性を有するポリペプチド、（ｂ）ベータ−グルコシダーゼ、及び（ｃ）トリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼＩ（ＣＥＬ７Ａ）、トリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼII（ＣＥＬ６Ａ)、及びトリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼＩ（ＣＥＬ７Ｂ）、並びにそれらの相同分子種又は変異体からなる群から選択される１以上（複数）のセルロース分解性酵素、を含んでなる組成物。
【請求項２６】
セルロース分解性増強活性を有するポリペプチドが、以下の、
（ａ）［ＩＬＭＶ］−Ｐ−Ｘ（４,５）−Ｇ−Ｘ−Ｙ−［ＩＬＭＶ］−Ｘ−Ｒ−Ｘ−［ＥＱ］−Ｘ（４）−［ＨＮＱ］及び［ＦＷ］−［ＴＦ］−Ｋ−［ＡＩＶ］（式中、Ｘが任意のアミノ酸、Ｘ（４,５）が４又は５の隣接位置での任意のアミノ酸、及びＸ（４）が４の隣接位置での任意のアミノ酸である）を含んでなる、セルロース分解性増強活性を有するポリペプチド、及び
（ｂ）［ＩＬＭＶ］−Ｐ−ｘ（４,５）−Ｇ−ｘ−Ｙ−［ＩＬＭＶ］−ｘ−Ｒ−ｘ−［ＥＱ］−ｘ（３）−Ａ−［ＨＮＱ］（式中、ｘが任意のアミノ酸、ｘ（４,５）が４又は５の隣接位置での任意のアミノ酸、及びＸ（３）が３の隣接位置での任意のアミノ酸である）を含んでなる、セルロース分解性増強活性を有するポリペプチドからなる群から選択され、
ここで、［ＩＬＭＶ］−Ｐ−Ｘ（４,５）−Ｇ−Ｘ−Ｙ−［ＩＬＭＶ］−Ｘ−Ｒ−Ｘ−［ＥＱ］−Ｘ（４）−［ＨＮＱ］及び［ＦＷ］−［ＴＦ］−Ｋ−［ＡＩＶ］を含んでなるセルロース分解性増強活性を有するポリペプチドは、
Ｈ−Ｘ（１,２）−Ｇ−Ｐ−Ｘ（３）−［ＹＷ］−［ＡＩＬＭＶ］、
［ＥＱ］−Ｘ−Ｙ−Ｘ（２）−Ｃ−Ｘ−［ＥＨＱＮ］−［ＦＩＬＶ］−Ｘ−［ＩＬＶ］、又は
Ｈ−Ｘ（１,２）−Ｇ−Ｐ−Ｘ（３）−［ＹＷ］−［ＡＩＬＭＶ］及び［ＥＱ］−Ｘ−Ｙ−Ｘ（２）−Ｃ−Ｘ−［ＥＨＱＮ］−［ＦＩＬＶ］−Ｘ−［ＩＬＶ］（式中、Ｘは任意のアミノ酸、Ｘ（１,２）は１又は２の隣接位置での任意のアミノ酸、Ｘ（３）は３の隣接位置での任意のアミノ酸、及びＸ（２）は２の隣接位置での任意のアミノ酸である）を任意にさらに含んでなる、請求項２５に記載のセルロース分解性タンパク質組成物。
【請求項２７】
セルロース分解性増強活性を有するポリペプチドが、以下の、
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、又は配列番号１０、配列番号１２、又は配列番号１４の成熟ポリペプチドと、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、
（ｂ）（i）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、もしくは配列番号１３の成熟ポリペプチドコード配列、（ii）配列番号１、配列番号３、配列番号５、もしくは配列番号１１の成熟ポリペプチドコード配列に含有されるｃＤＮＡ配列、又は配列番号７、配列番号９、もしくは配列番号１３の成熟ポリペプチドコード配列を含んでなるゲノムＤＮＡ配列、又は（iii）（i）もしくは（ii）の全長相補鎖と、好ましくは少なくとも中ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中高ストリンジェンシー条件、及び最も好ましくは少なくとも高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
（ｃ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、又は配列番号１３の成熟ポリペプチドコード配列と、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するヌクレオチド配列を含んでなるポリペプチドヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
（ｄ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、又は配列番号１０、配列番号１２、又は配列番号１４の成熟ポリペプチドの１以上（複数）のアミノ酸の、置換、削除、及び／又は挿入を含んでなる変異体、及び
（ｅ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、又は配列番号１０、配列番号１２、又は配列番号１４の成熟ポリペプチドを含んでなるか、前記成熟ポリペプチドからなる、セルロース分解性増強活性を有するポリペプチド、又はセルロース分解性増強活性を有するその断片、
からなる群から選択される、請求項２５に記載のセルロース分解性タンパク質組成物。
【請求項２８】
ベータ−グルコシダーゼがベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質である、請求項２５に記載のセルロース分解性タンパク質組成物。
【請求項２９】
ベータ−グリコシダーゼ融合タンパク質が、（ａ）シグナルペプチドを含んでなる第一アミノ酸配列、（ｂ）少なくともエンドグルカナーゼの触媒ドメインを含んでなる第二アミノ酸配列、及び（ｃ）少なくともベータ−グルコシダーゼの触媒ドメインを含んでなる第三アミノ酸配列を含んでなり、ここで、第一アミノ酸配列のＣ末端は第二アミノ酸配列のＮ末端にインフレームで結合し、第二アミノ酸配列のＣ末端は第三アミノ酸配列のＮ末端にインフレームで結合する、請求項２８に記載のセルロース分解性タンパク質組成物。
【請求項３０】
ベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質が、配列番号１０３又は配列番号１０５を含んでなるか、前記配列からなる、請求項２９に記載のセルロース分解性タンパク質組成物。
【請求項３１】
トリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼＩ（ＣＥＬ７Ａ）の相同分子種又は変異体が、以下の、
（ａ）配列番号５２の成熟ポリペプチドと、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、
（ｂ）（ｉ）配列番号５１の成熟ポリペプチドコード配列、（ii）配列番号５１の成熟ポリペプチドコード配列に含まれるｃＤＮＡ、もしくはそれを含んでなるゲノムＤＮＡ配列、又は（iii）（i）もしくは（ii）の全長相補鎖と、好ましくは少なくとも中ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中高ストリンジェンシー条件、及び最も好ましくは少なくとも高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
（ｃ）配列番号５１の成熟ポリペプチドコード配列と、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、及び
（ｄ）配列番号５２の成熟ポリペプチドの１以上（複数）のアミノ酸の置換、削除、及び／又は挿入を含んでなる変異体、
からなる群から選択される、請求項２５に記載のセルロース分解性タンパク質組成物。
【請求項３２】
トリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼＩ（ＣＥＬ７Ａ）が配列番号５２の成熟ポリペプチドを含んでなるか、前記成熟ポリペプチドからなる、請求項２５に記載のセルロース分解性タンパク質組成物。
【請求項３３】
トリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼII（ＣＥＬ６Ａ）の相同分子種又は変異体が、以下の、
（ａ）配列番号５４の成熟ポリペプチドと、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、
（ｂ）（ｉ）配列番号５３の成熟ポリペプチドコード配列、（ii）配列番号５３の成熟ポリペプチドコード配列に含まれるｃＤＮＡ、もしくはそれを含んでなるゲノムＤＮＡ配列、又は（iii）（i）もしくは（ii）の全長相補鎖と、好ましくは少なくとも中ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中高ストリンジェンシー条件、及び最も好ましくは少なくとも高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
（ｃ）配列番号５３の成熟ポリペプチドコード配列と、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、及び
（ｄ）配列番号５４の成熟ポリペプチドの１以上（複数）のアミノ酸の置換、削除、及び／又は挿入を含んでなる変異体、
からなる群から選択される、請求項２５に記載のセルロース分解性タンパク質組成物。
【請求項３４】
トリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼII（ＣＥＬ６Ａ）が配列番号５４の成熟ポリペプチドを含んでなるか、前記成熟ポリペプチドからなる、請求項２５に記載のセルロース分解性タンパク質組成物。
【請求項３５】
トリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼI（ＣＥＬ７Ｂ）の相同分子種又は変異体が、以下の、
（ａ）配列番号５６の成熟ポリペプチドと、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、
（ｂ）（ｉ）配列番号５５の成熟ポリペプチドコード配列、（ii）配列番号５５の成熟ポリペプチドコード配列に含まれるｃＤＮＡ、もしくはそれを含んでなるゲノムＤＮＡ配列、又は（iii）（i）もしくは（ii）の全長相補鎖と、好ましくは少なくとも中ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中高ストリンジェンシー条件、及び最も好ましくは少なくとも高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
（ｃ）配列番号５５の成熟ポリペプチドコード配列と、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、及び
（ｄ）配列番号５６の成熟ポリペプチドの１以上（複数）のアミノ酸の置換、削除、及び／又は挿入を含んでなる変異体、
からなる群から選択される、請求項２５に記載のセルロース分解性タンパク質組成物。
【請求項３６】
トリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼI（ＣＥＬ７Ｂ）が、配列番号５６の成熟ポリペプチドを含んでなるか、前記成熟ポリペプチドからなる、請求項２５に記載のセルロース分解性タンパク質組成物。
【請求項３７】
トリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼII（ＣＥＬ５Ａ）、トリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼIII（ＣＥＬ１２Ａ）、及びトリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼＶ（ＣＥＬ４５Ａ）、並びにこれらの相同分子種又は変異体からなる群から選択されるセルロース分解性酵素をコードする、１以上（複数）の第四ポリヌクレオチドをさらに含んでなる、請求項２５〜３６のいずれか１項に記載のセルロース分解性タンパク質組成物。
【請求項３８】
トリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼII（ＣＥＬ５Ａ）の相同分子種又は変異体が、以下の、
（ａ）配列番号５８の成熟ポリペプチドと、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、
（ｂ）（ｉ）配列番号５７の成熟ポリペプチドコード配列、（ii）配列番号５７の成熟ポリペプチドコード配列に含まれるｃＤＮＡ、又はそれを含んでなるゲノムＤＮＡ配列、又は（iii）（i）もしくは（ii）の全長相補鎖と、好ましくは少なくとも中ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中高ストリンジェンシー条件、及び最も好ましくは少なくとも高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
（ｃ）配列番号５７の成熟ポリペプチドコード配列と、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、及び
（ｄ）配列番号５８の成熟ポリペプチドの１以上（複数）のアミノ酸の置換、削除、及び／又は挿入を含んでなる変異体、
からなる群から選択される、請求項３７に記載のセルロース分解性タンパク質組成物。
【請求項３９】
トリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼII（ＣＥＬ５Ａ）が、配列番号５８の成熟ポリペプチドを含んでなるか、前記成熟ポリペプチドからなる、請求項３７に記載のセルロース分解性タンパク質組成物。
【請求項４０】
トリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼIII（ＣＥＬ１２Ａ）の相同分子種又は変異体が、以下の、
（ａ）配列番号６０の成熟ポリペプチドと、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、
（ｂ）（ｉ）配列番号５９の成熟ポリペプチドコード配列、（ii）配列番号５９の成熟ポリペプチドコード配列に含まれるｃＤＮＡ、又はそれを含んでなるゲノムＤＮＡ配列、又は（iii）（i）もしくは（ii）の全長相補鎖と、好ましくは少なくとも中ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中高ストリンジェンシー条件、及び最も好ましくは少なくとも高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
（ｃ）配列番号５９の成熟ポリペプチドコード配列と、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、及び
（ｄ）配列番号６０の成熟ポリペプチドの１以上（複数）のアミノ酸の置換、削除、及び／又は挿入を含んでなる変異体、
からなる群から選択される、請求項３７に記載のセルロース分解性タンパク質組成物。
【請求項４１】
トリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼIII（ＣＥＬ１２Ａ）が、配列番号６０の成熟ポリペプチドを含んでなるか、前記成熟ポリペプチドからなる、請求項３７に記載のセルロース分解性タンパク質組成物。
【請求項４２】
トリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼＶ（ＣＥＬ４５Ａ）の相同分子種又は変異体が、以下の、
（ａ）配列番号６２の成熟ポリペプチドと、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、
（ｂ）（ｉ）配列番号６１の成熟ポリペプチドコード配列、（ii）配列番号６１の成熟ポリペプチドコード配列に含まれるｃＤＮＡ、又はそれを含んでなるゲノムＤＮＡ配列、又は（iii）（i）もしくは（ii）の全長相補鎖と、好ましくは少なくとも中ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中高ストリンジェンシー条件、及び最も好ましくは少なくとも高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
（ｃ）配列番号６１の成熟ポリペプチドコード配列と、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、及び
（ｄ）配列番号６２の成熟ポリペプチドの１以上（複数）のアミノ酸の置換、削除、及び／又は挿入を含んでなる変異体、
からなる群から選択される、請求項３７に記載のセルロース分解性タンパク質組成物。
【請求項４３】
トリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼＶ（ＣＥＬ４５Ａ）が、配列番号６１の成熟ポリペプチドを含んでなるか、前記成熟ポリペプチドからなる、請求項３７に記載のセルロース分解性タンパク質組成物。
【請求項４４】
配列番号８のセルロース分解性増強活性を有するポリペプチドの成熟ポリペプチド、配列番号１０６のベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質、配列番号５２のトリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼＩ（ＣＥＬ７Ａ）の成熟ポリペプチド、配列番号５４のトリコデルマ・リーゼイセロビオヒドロラーゼII（ＣＥＬ６Ａ)の成熟ポリペプチド、及び配列番号５６のトリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼＩ（ＣＥＬ７Ｂ）の成熟ポリペプチドを含んでなる、請求項２５に記載のセルロース分解性タンパク質組成物。
【請求項４５】
配列番号５８のトリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼII（ＣＥＬ５Ａ）、配列番号６２のトリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼＶ（ＣＥＬ４５Ａ）、及び配列番号６０のトリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼIII（ＣＥＬ１２Ａ）からなる群から選択される、１以上（複数）の酵素をさらに含んでなる、請求項２５〜４４のいずれか１項に記載のセルロース分解性タンパク質組成物。
【請求項４６】
配列番号６４のチエラビア・テレストリス・セロビオヒドロラーゼの成熟ポリペプチドをさらに含んでなる、請求項２５〜４５のいずれか１項に記載のセルロース分解性タンパク質組成物。
【請求項４７】
セルロール含有物質を分解又は変換する方法であって、請求項２５〜４６のいずれか１項に記載のセルロース分解性タンパク質組成物の有効量でセルロース含有物質を処理することを含んでなる方法。
【請求項４８】
ヘミセルラーゼ、エステラーゼ、プロテアーゼ、ラッカーゼ、ペルオキシダーゼ、又はこれらの混合物からなる群から選択される１以上（複数）の酵素の有効量で、セルロース含有物質を処理することをさらに含んでなる、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
分解したセルロース含有物質を回収することを含んでなる、請求項４７又は４８に記載の方法。
【請求項５０】
発酵物質を作製する方法であって、（ａ）請求項２５〜４６のいずれか１項に記載のセルロース分解性タンパク質の有効量で、セルロース含有物質を糖化すること、（ｂ）発酵物質を作製する１以上（複数）の発酵微生物で、ステップ（ａ）の糖化セルロース含有物質を発酵させること、及び（ｃ）当該発酵からの発酵物質を回収すること、を含んでなる方法。
【請求項５１】
ヘミセルラーゼ、エステラーゼ、プロテアーゼ、ラッカーゼ、ペルオキシダーゼ、又はこれらの混合物からなる群から選択される１以上（複数）の酵素の有効量でセルロース含有物質を処理することをさらに含んでなる、請求項５０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セルロース含有物質を分解又は変換するためのセルロース分解性タンパク質組成物、並びに当該組成物を作製及び使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発によりなされた発明についての権利に関する宣言
本発明は、ＮＲＥＬ下請契約番号ＺＣＯ−３００１７−０２、エネルギー省により承認された元契約ＤＥ−ＡＣ３６−９８ＧＯ１０３３７の下、政府支援を得てなされた。政府は本発明に特定の権利を有する。
【０００３】
配列表の参照
本出願はコンピュータ読取可能な形態の配列表を含む。コンピュータ解読可能な形態は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００４】
生物物質の寄託物の参照
本出願は、生物物質の寄託物の参照を含み、この寄託物は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００５】
関連技術の記載
セルロースは、ベータ１,４−結合により共有結合した単純な糖グルコースのポリマーである。多くの微生物はベータ結合グルカンを加水分解する酵素を産生する。これらの酵素には、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、及びベータ−グルコシダーゼが含まれる。エンドグルカナーゼは、無作為の場所でセルロースポリマーを分解し、セロビオヒドロラーゼによる攻撃に暴露する。セロビオヒドロラーゼはセルロースポリマーの末端からセロビオースの分子を連続的に切り離す。セロビオースは水溶性のベータ−１,４−結合したグルコースの二量体である。ベータ−グルコシダーゼは、セロビオースをグルコースに加水分解する。
【０００６】
セルロース原料のエタノールへの変換は、大量の原料が入手容易性、燃焼又は埋め立て物質回避の要請、及びエタノール燃料の清浄性という利点を有する。材木、農業廃棄物、草本作物、及び都市固形廃棄物は、エタノール製品の原料と考えられている。これらの物質は主にセルロース、ヘミセルロース、及びリグニンからなる。セルロースをグルコースに変換すると、グルコースは酵母によって容易にエタノールに発酵される。
【０００７】
国際公開第２００５／０７４６４７号は、チエラビア・テレストリス（Thielavia terrestris）由来のセルロース分解性増強活性を有する単離ポリペプチド及びそのポリヌクレオチドを開示する。国際公開第２００５／０７４６５６号は、サーモアスカス・オウランティアクス（Thermoascus aurantiacus）由来のセルロース分解性増強活性を有するポリペプチド及びそのポリヌクレオチドを開示する。米国特許出願第２００７／００７７６３０号は、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）由来のセルロース分解性増強活性を有する単離ポリペプチド及びそのポリヌクレオチドを開示する。
【０００８】
セルロース物質を分解又は変換するセルロース分解性タンパク質組成物の機能を向上させることは、当業界での利点となるはずである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、セルロース物質を分解又は変換する機能を増強させたセルロース分解性タンパク質組成物に関する。
【００１０】
本発明は、繊維状真菌宿主細胞であって、（ａ）セルロース分解性増強活性を有する天然型又は異種接合型ポリペプチドをコードする第一ポリヌクレオチド；（ｂ）天然型又は異種接合型ベータ−グルコシダーゼをコードする第二ポリヌクレオチド；及び（ｃ）天然型又は異種接合型のセルロース分解性酵素で、以下のトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）セロビオヒドロラーゼＩ（ＣＥＬ７Ａ）、トリコデルマ・リーゼイセロビオヒドロラーゼII（ＣＥＬ６Ａ)、及びトリコデルマ・リーゼイエンドグルカナーゼＩ（ＣＥＬ７Ｂ）並びにその相同分子種又は変異体からなる群から選択される１以上（複数）のセルロース分解性酵素をコードする、１以上（複数）の第三ポリヌクレオチド、を含んでなる宿主細胞に関する。
【００１１】
本発明はまた、セルロース分解性タンパク質組成物を作製する方法であって、（ａ）セルロース分解性タンパク質組成物の作製に適する条件下で当該繊維状真菌宿主細胞を培養すること、及び（ｂ）セルロース分解性タンパク質組成物を回収すること、を含んでなる方法に関する。本発明はまた、当該方法により得られるセルロース分解性タンパク質組成物に関する。
【００１２】
本発明はまた、セルロース分解性タンパク質組成物であって、（ａ）セルロース分解性増強活性を有するポリペプチド、（ｂ）ベータ−グルコシダーゼ、及び（ｃ）トリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼＩ（ＣＥＬ７Ａ）、トリコデルマ・リーゼイセロビオヒドロラーゼII（ＣＥＬ６Ａ)、及びトリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼＩ（ＣＥＬ７Ｂ）、並びにそれらの相同分子種又は変異体からなる群から選択される、１以上（複数）のセルロース分解性酵素、を含んでなる組成物に関する。
【００１３】
本発明はまた、セルロール含有物質を分解又は変換する方法であって、セルロース分解性タンパク質組成物の有効量でセルロース含有物質を処理することを含んでなる方法に関する。
【００１４】
本発明はまた、発酵物質を作製する方法であって、（ａ）セルロース分解性タンパク質組成物の有効量でセルロース含有物質を糖化すること、（ｂ）発酵物質を作製する１以上（複数）の発酵微生物で、ステップ（ａ）の糖化セルロース含有物質を発酵させること、及び（ｃ）当該発酵からの発酵物質を回収すること、を含んでなる方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、ｐＭＪ０４の制限酵素マップを示す。
【図２】図２は、ｐＣａＨｊ５２７の制限酵素マップを示す。
【図３】図３は、ｐＭＴ２１８８の制限酵素マップを示す。
【図４】図４は、ｐＣａＨｊ５６８の制限酵素マップを示す。
【図５】図５は、ｐＭＪ０５の制限酵素マップを示す。
【図６】図６は、ｐＳＭａｉ１３０の制限酵素マップを示す。
【図７】図７は、アスペルギラス・オリザエ（Aspergillus oryzae）・ベータ−グルコシダーゼの天然型シグナル配列のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を示す（配列番号９１及び９２）。
【図８】図８は、フミコラ・インソレンス（Humicola insolens）エンドグルカナーゼＶシグナル配列のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を示す（配列番号９５及び９６）。
【図９】図９は、ｐＳＭａｉ１３５の制限酵素マップを示す。
【図１０】図１０は、ｐＳＭａｉ１４０の制限酵素マップを示す。
【図１１】図１１は、ｐＳａＭｅ−Ｆ１の制限酵素マップを示す。
【図１２】図１２は、ｐＳａＭｅ−ＦＸの制限酵素マップを示す。
【図１３】図１３は、ｐＡＩＬｏ４７の制限酵素マップを示す。
【図１４】図１４は、ｐＳａＭｅ−ＦＨの制限酵素マップを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
セルロース分解性増強活性：
本明細書で「セルロース分解性増強活性」なる用語は、セルロース分解活性を有するタンパク質による、セルロース含有物質の加水分解を増強させる生物学的活性として定義される。本発明の目的に応じて、セルロース分解性増強活性は、以下の条件下で、セルロース分解性タンパク質によるセルロース含有物質の加水分解から得られる、還元糖の増加又はセロビオース及びグルコースの総量の増加を測定することにより決定する。条件：セルロース分解性増強活性を持たない当量のタンパク質でのコントロール加水分解との比較で、ＰＣＳ中、８０〜９９．５％ｗ／ｗセルロース分解性タンパク質を含有する１〜５０ｍｇの総タンパク質／１ｇのセルロース及び０．５〜２０％ｗ／ｗタンパク質のセルロース分解性増強活性、５０℃で１〜７日間（ＰＣＳ中、１〜５０ｍｇのセルロース分解性タンパク質／１ｇのセルロース）。好ましい態様によれば、セルラーゼタンパク質ローディングの、３％のアスペルギルス・オリザエ ベータ−グルコシダーゼ（国際公開第０２／０９５０１４号に従い、アスペルギルス・オリザエ中で、遺伝子組み換えで作製した）、又は３％のアスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus） ベータ−グルコシダーゼ（国際公開第０２／０９５０１４号の実施例２２に従い、アスペルギルス・オリザエ中で、遺伝子組み換えで作製した）の存在下で、ＣＥＬＬＵＣＬＡＳＴ（登録商標）１．５Ｌ（Novozymes AJS, Bagsvaerd, Denmar）の混合物を、セルロース分解活性の標準として使用する。
【００１７】
セルロース分解性増強活性を有するポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、又は１４の成熟ポリペプチドの、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、さらに最も好ましくは少なくとも１００％の
セルロース分解性増強活性を有する。
【００１８】
セルロース分解性増強活性を有するポリペプチドは、ある同じ加水分解度に到達するはずのセルロース分解性酵素の量を低減することにより、セルロース分解活性を有するタンパク質により触媒されるセルロース含有物質の加水分解を増強する。ここで、前記加水分解度は、好ましくは少なくとも０．１倍、より好ましくは少なくとも０．２倍、より好ましくは少なくとも０．３倍、より好ましくは少なくとも０．４倍、より好ましくは少なくとも０．５倍、より好ましくは少なくとも１倍、より好ましくは少なくとも３倍、より好ましくは少なくとも４倍、より好ましくは少なくとも５倍、より好ましくは少なくとも１０倍、より好ましくは少なくとも２０倍、さらにより好ましくは少なくとも３０倍、最も好ましくは少なくとも５０倍、さらに最も好ましくは少なくとも１００倍である。
【００１９】
セルロース分解活性：
本明細書で「セルロース分解活性」なる用語は、セルロース含有物質を加水分解する、セルラーゼ活性（例えば、（１又は複数の）エンドグルカナーゼ、（１又は複数の）セロビオヒドロラーゼ、（１又は複数の）、ベータ−グルコシダーゼ、又はこれらの組み合わせ）と定義される。セルロース分解性タンパク質は、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を加水分解でき、これによりインキュベーション混合物の粘性を低減する。粘性低減の結果は、振動粘度機（例えばＭＭ３０００、Sofraser製, France）により決定してもよい。セルラーゼ粘性単位（ＣＥＶＵ）で測定されるセルラーゼ活性の決定は、サンプルが、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）の溶液の粘性を低減させる能力を測定することにより、サンプルに存在する触媒活性量を定量化する。かかるアッセイはセルロース分解性タンパク質及び基質に適する温度及びｐＨで実施する。
【００２０】
本発明の目的に応じ、セルロース分解活性は、以下の条件下でセルロース分解性組成物によるセルロース含有物質の加水分解の増加を測定することにより決定する。条件：セルロース分解性タンパク質を添加しないコントロール加水分解との比較で、ＰＣＳ中、１〜５０ｍｇのセルロース分解性タンパク質／１ｇのセルロース、５０℃で１〜７日間。
【００２１】
エンドグルカナーゼ：
本明細書で「エンドグルカナーゼ」なる用語は、エンド−１,４−（１,３；１,４）−ベータ−Ｄ−グルカン ４−グルカノヒドロラーゼ（Ｅ.Ｃ. ３.２.１.４）と定義され、これは、セルロースの１,４−ベータ−Ｄ−グリコシド結合、セルロース誘導体（例えばカルボキシメチルセルロース及びヒドロキシエチルセルロース）、リケニン、穀物のベータ−Ｄ−グルカン又はキシログルカン等の混合されたベータ−１,３−グルカン中のベータ−１,４−結合、及び他の植物物質含有セルロース成分のエンド型加水分解を触媒する。本発明の目的に応じて、エンド型グルカナーゼ活性は、Ghose, 1987, Pure andAppl. Chem. 59: 257-268に記載の方法により、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）加水分解を用いて決定する。
【００２２】
セロビオヒドロラーゼ：
本明細書で「セロビオヒドロラーゼ」なる用語は、１,４−ベータ−Ｄ−グルカン セロビオヒドロラーゼ（Ｅ.Ｃ.３.２.１.９１）と定義され、これは、セルロース中の１,４−ベータ−Ｄ−グルコシド結合、セロオリゴ糖、又は任意のベータ−１,４−結合グルコース含有ポリマー、その鎖の還元又は非還元末端から放出されたセロビオースの加水分解を触媒する。本発明の目的に応じて、セロビオヒドロラーゼ活性は、Lever et al., 1972, Anal. Biochem. 47: 273-279 及び van Tilbeurgh et al., 1982, FEBS Letters 149: 152-156; van Tilbeurgh and Claeyssens, 1985, FEBS Letters 187: 283-288に記載の方法に従って決定する。本発明では、Lever等の方法を使用し、トウモロコシ茎葉におけるセルロースの加水分解を評価した。一方、van Tilbeurgh等の方法を使用し、蛍光二糖誘導体でセロビオヒドロラーゼ活性を決定した。
【００２３】
ベータ−グルコシダーゼ：
本明細書で「ベータ−グリコシダーゼ」なる用語は、ベータ−Ｄ−グルコシド グルコヒドロラーゼ（Ｅ.Ｃ.３.２.１.２１）と定義され、これは、ベータ−Ｄ−グルコースの放出を伴う非還元末端ベータ−Ｄ−グルコース残基の加水分解を触媒する。本発明の目的に応じて、本明細書で記載される異なる条件を使用する点以外は、Venturi et al., 2002, J. Basic Microbiol. 42: 55-66に記載の基本的方法に従って、ベータ−グルコシダーゼ活性を決定する。ベータ−グルコシダーゼ活性の１単位は、基質としての１００ｍＭクエン酸ナトリウム、０．０１％ ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０中の４ｍＭ ｐ−ニトロフェニル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシドから、５０℃、ｐＨ５で１分当たり作製される１．０μモルのｐ−ニトロフェノールと定義する。
【００２４】
ファミリー１、ファミリー３、ファミリー５、ファミリー６、ファミリー７、ファミリー９、ファミリー１２、ファミリー４５、ファミリー６１、又はファミリー７４グリコシドヒドロラーゼ：
本明細書で「ファミリー１、ファミリー３、ファミリー５、ファミリー６、ファミリー７、ファミリー９、ファミリー１２、ファミリー４５、ファミリー６１、又はファミリー７４グリコシドヒドロラーゼ」又は「ファミリー ＧＨ１、ファミリー ＧＨ３、ファミリー ＧＨ５、ファミリー ＧＨ６、ファミリー ＧＨ７、ファミリー ＧＨ９、ファミリーＧＨ １２、ファミリー ＧＨ４５、ファミリー ＧＨ６１、又はファミリー ＧＨ７４」なる用語はそれぞれ、Henrissat B., 1991 , A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities, Biochem. J. 280: 309-316、及び Henrissat B., and Bairoch A., 1996, Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases, Biochem. J. 316: 695-696に記載の、グリコシドヒドロラーゼファミリー１、ファミリー３、ファミリー５、ファミリー６、ファミリー７、ファミリー９、ファミリー１２、ファミリー４５、ファミリー６１、又はファミリー７４に分類されるポリペプチドとして定義される。現在のところ、Henrissatは、ＧＨ６１ファミリーについては、機序、触媒的求核／塩基、触媒的プロトン供与体、及び３−Ｄ構造等の特性がこのファミリーに属するポリペプチドとしては未知であることを示し、未分類のものとして記載する。
【００２５】
セルロース含有物質：
バイオマスの一次細胞壁中の主要な多糖はセルロースであり、二番目に豊富なものはヘミセルロースであり、三番目はペクチンである。細胞が生育を停止した後に作られる二次細胞壁も多糖を含有し、ヘミセルロースと共有的に架橋した重合リグニンにより補強されている。セルロースは、無水セロビオースのホモポリマー、すなわち直鎖のベータ−（１−４）−Ｄ−グルカンであり、一方ヘミセルロースは、様々な化合物、例えばキシラン、キシログルカン、アラビノキシラン、及びマンナン等を、多くのスペクトルを有する複雑な分岐構造で含む。一般的な多形であるが、セルロースは主に植物組織中で、平行なグルカン鎖の不溶性結晶マトリクスとして存在する。ヘミセルロースは通常、セルロース、及び他のヘミセルロースに水素結合し、これは細胞壁マトリクスを安定化するのに役立つ。
【００２６】
セルロース含有物質は、セルロースを含有する任意の物質を用いることができる。一般的にセルロースは、例えば、茎、葉、外皮、殻皮、及び植物又は葉の小塊、枝、及び木に存在する。セルロース含有物質は、限定するものではないが、草本物質、農業廃棄物、林業廃棄物、都市固形廃棄物、廃紙、並びに紙パルプ工場廃棄物があり得る。セルロース含有物質は、限定するものではないが、木材資源、都市固形廃棄物、廃紙、作物、作物廃棄物等の任意の種類のバイオマスがあり得る（例えば、Wiselogel er al., 1995, in Handbook on Bioethanol (Charles E. Wyman, editor), pp.105-118, Taylor & Francis, Washington D.C.; Wyman, 1994, Bioresource Technology 50: 3-16; Lynd, 1990, Applied Biochemistry and Biotechnology 24125: 695-719; Mosier et al., 1999, Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics, in Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, T. Scheper, managing editor, Volume 65, pp.23-40, Springer-Verlag, New Yorkを参照）。本明細書でセルロース含有物質とは、好ましくはリグノセルロース、例えば、リグニン、セルロース、及びヘミセルロースを混合マトリクスとして含有する、植物細胞の状態であると解される。
【００２７】
好ましい態様によれば、セルロース含有物質はトウモロコシ茎葉である。別の好ましい態様によれば、セルロース含有物質はトウモロコシ繊維である。別の好ましい態様によれば、セルロース含有物質はトウモロコシ小塊（cobs）である。別の好ましい態様によれば、セルロース含有物質はスイッチ草（switch grass）である。別の好ましい態様によれば、セルロース含有物質はイネわら（rice straw）である。別の好ましい態様によれば、セルロース含有物質は紙パルプ処理廃棄物である。別の好ましい態様によれば、セルロース含有物質は木又は草本の植物である。別の好ましい態様によれば、セルロース含有物質はバガスである。
【００２８】
セルロース含有物質は、そのまま使用しても、当業界で従来から既知の方法で前処理を施してもよい。例えば、物理的前処理技術としては、様々な種類の粉砕、照射、蒸気処理／蒸気爆発、及びハイドロ熱分解があり、化学的前処理技術としては、希酸、アルカリ、有機溶媒、アンモニア、二酸化硫黄、二酸化炭素、及びｐＨ制御ハイドロ熱分解があり、及び生物的前処理技術としては、リグニン可溶化微生物の塗布があり得る（例えば、Hsu, T.-A., 1996, Pretreatment of biomass, in Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, C. E., ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212; Ghosh, P., and Singh, A., 1993, Physicochemical and biological treatments for enzymatic/microbial conversion of lignocellulosic biomass, Adv. Appl. Microbiol. 39: 295-333; McMillan, J. D., 1994, Pretreating lignocellulosic biomass: a review, in Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production, Himmel, M. E, Baker, J. O., and Overend, R. P., eds., ACS Symposium Series 566, American Chemical Society, Washington, DC, chapter 15; Gong, C. S., Cao, N. J., Du, J., and Tsao, G. T., 1999, Ethanol production from renewable resources, in Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, T., ed., Springer- Verlag Berlin Heidelberg, Germany, 65: 207-241; Olsson, L., and Hahn-Hagerdal, B., 1996, Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanol production, Enz. Microb. Tech. 18: 312-331 ; and Vallander, L., and Eriksson, K.-E. L., 1990, Production of ethanol from lignocellulosic materials: State of the art, Adv. Biochem. Eng./Biotechnol. 42: 63-95を参照）。
【００２９】
前処理したトウモロコシ茎葉：
本明細書で「ＰＣＳ」又は「前処理トウモロコシ茎葉」なる用語は、熱及び希酸での処理による、トウモロコシ茎葉由来のセルロース含有物質として定義される。本発明の目的に応じて、ＰＣＳは本明細書に記載の方法で作製される。
【００３０】
全長ポリペプチド：
本明細書で「全長ポリペプチド」なる用語は、生物活性を有するポリペプチドの前駆体状態として定義され、ここでその前駆体は、シグナルペプチド領域、及び任意に細胞から分泌されるプロペプチド領域を含有し、かかるシグナルペプチドが切断され、任意にプロペプチドも切断されて、生物活性を有するポリペプチドを発生させる。
【００３１】
シグナルペプチド：
本明細書で「シグナルペプチド」なる用語は、ポリペプチドのアミノ末端にインフレームに結合したペプチドとして定義され、細胞の分泌経路にコードされたポリペプチドのことを指す。
【００３２】
シグナルペプチドコード配列：
本明細書で「シグナルペプチドコード配列」なる用語は、ポリペプチドのアミノ末端にインフレームに結合したアミノ酸配列をコードするペプチドコード領域として定義され、細胞の分泌経路にコードされたポリペプチドのことを指す。
【００３３】
プロペプチド：
本明細書で「プロペプチド」なる用語は、ポリペプチドのアミノ末端にインフレームに結合したペプチドとして定義される。得られたポリペプチドは、プロ酵素又はプロポリペプチド（又は場合によっては酵素原）として知られる。プロポリペプチドは一般的に不活性であるとともに、触媒又は自動触媒的なプロペプチドの切断により、プロポリペプチドから成熟活性型ポリペプチドに変換できる。シグナルペプチド及びプロペプチドのいずれの領域もポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、プロペプチド領域は、ポリペプチドのアミノ末端にインフレームに結合し、シグナルペプチド領域は、プロペプチド領域のアミノ末端にインフレームに結合する。
【００３４】
プロペプチドコード配列：
本明細書で「プロペプチドコード配列」なる用語は、プロ酵素又はプロポリペプチド（又は場合によっては酵素原）を形成するポリペプチドのアミノ末端に、インフレームに結合したアミノ酸配列をコードするペプチドコード領域と定義される。
【００３５】
触媒ドメイン：
本明細書で「触媒ドメイン」なる用語は、ベータ−グルコシダーゼ又はエンドグルカナーゼの触媒活性を有する、ベータ−グルコシダーゼ又はエンドグルカナーゼのアミノ酸配列の構造的部分又は領域と定義される。
【００３６】
ベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質：
本明細書で「ベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質」なる用語は、ベータ−グルコシダーゼ活性が存在する、及び少なくともベータ−グルコシダーゼ触媒領域及びエンドグルカナーゼ触媒領域の両方を含んでなるポリペプチドと定義される。
【００３７】
ベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質の成分：
本明細書で「ベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質の成分」なる用語は、ベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質の個々の（切断された）断片として定義され、ここで各断片はベータグルコシダーゼ活性を有すると共に、融合タンパク質のエンドグルカナーゼ及びベータ−グルコシダーゼ触媒ドメイン又はベータ−グルコシダーゼ触媒ドメインのいずれかを含む。例えば、融合タンパク質の成分のエンドグルカナーゼとベータ−グルコシダーゼとの間の、Ｋｅｘ２部位等の切断部位の存在により、エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド及びベータ−グルコシダーゼ活性を有する別のポリペプチド産物を得ることができる。
【００３８】
セルロース結合ドメイン：
本明細書で「セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）」なる用語は、エンドグルカナーゼのセルロース結合活性に関与する、エンドグルカナーゼ（セルラーゼ）のアミノ酸配列の部分と定義される。セルロース結合ドメインは一般的に、エンドグルカナーゼが、セルロース、セルロース誘導体、又はその多糖相当物に非共有的に結合することにより機能する。典型的なＣＢＤは、触媒ドメインと独立して機能する。
【００３９】
ベータ−グルコシダーゼ融合構築物：
本明細書で「ベータ−グルコシダーゼ融合構築物」なる用語は、作動的な結合における異なる遺伝子又はその部分から構成される核酸構築物のことを言う。かかる成分は、５'末端から、少なくとも１つのエンドグルカナーゼ触媒ドメインを含んでなるＤＮＡ分子及び少なくとも１つのベータ−グルコシダーゼ触媒ドメインを含んでなるＤＮＡ分子を含む。
【００４０】
単離ポリペプチド：
本明細書で「単離ポリペプチド」なる用語は、供給源から単離されたポリペプチドのことを言う。好ましい態様によれば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで決定するポリペプチドの純度は、少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％、より好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％である。
【００４１】
実質的に純粋なポリペプチド：
本明細書で「実質的に純粋なポリペプチド」なる用語は、最大で１０質量％、好ましくは最大で８質量％、より好ましくは最大で６質量％、より好ましくは最大で５質量％、より好ましくは最大で４質量％、より好ましくは最大で３質量％、さらにより好ましくは最大で２質量％、最も好ましくは最大で１質量％、さらに最も好ましくは最大で０．５質量％の、自然に又は遺伝子組み換えにより結合する他のポリペプチド物質を含有する、ポリペプチド調製物のことを指す。従って、実質的に純粋なポリペプチドは純度が、少なくとも９２質量％、好ましくは少なくとも９４質量％、より好ましくは少なくとも９５質量％、より好ましくは少なくとも９６質量％、より好ましくは少なくとも９６質量％、より好ましくは少なくとも９７質量％、より好ましくは少なくとも９８質量％、さらにより好ましくは少なくとも９９質量％、最も好ましくは少なくとも９９．５質量％、及びさらに最も好ましくは少なくとも１００質量％の総ポリペプチド物質が、調製物中に存在することが好ましい。本発明のポリペプチドは、好ましくは実質的に純粋な状態である。すなわち、かかるポリペプチド調製物は、自然に又は遺伝子組み換えにより結合する他のポリペプチド物質を本質的には含まない状態である。これは、例えば従来からの周知の遺伝子組み換え方法又は従来の精製方法によってポリペプチドを調製することにより達成できる。
【００４２】
成熟ポリペプチド：
本明細書で「成熟ポリペプチド」なる用語は、例えば酵素活性等の生物活性を有するポリペプチドと定義され、これは翻訳、及び例えばＮ−末端プロセシング、Ｃ−末端切断、グリコシル化、リン酸化等の任意の翻訳後修飾後の、その最終形態である。
【００４３】
成熟ポリペプチドコード配列：
本明細書で「成熟ポリペプチドコード配列」なる用語は、生物活性を有する成熟ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列として定義される。
【００４４】
相同性：
２つのアミノ酸配列間、又は２つのヌクレオチド配列間の関連性は「相同性」というパラメータで記載される。
【００４５】
本発明の目的に応じて、２つのアミノ酸配列の相同性の度合いは、Needleman-Wunschのアルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970, J. MoI. Biol. 48: 443-453）を、EMBOSS パッケージのNeedleプログラム（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16: 276-277）、好ましくはバージョン3.0.0以降を用いて決定される。使用される任意のパラメータは、ギャップ挿入時のペナルティーが１０、ギャップ伸長時のペナルティーが０．５、及びEBLOSUM62（BLOSUM62のEMBOSSバージョン）置換マトリクスである。Needle標識した「最長の相同（longest identity）」の出力（−nobriefオプション（-nobrief option）を用いて得られる）は、相同性の割合として使用され、以下の通りに計算される：
（相同な残基×１００）／（配列の長さ−配列中のギャップ総数）。
【００４６】
本発明の目的に応じて、２つのデオキシリボヌクレオチド酸配列の相同性は、Needleman-Wunschのアルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970, 上記と同じ）を、EMBOSS パッケージのNeedleプログラム（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, 上記と同様）、好ましくはバージョン3.0.0以降を用いて決定される。使用される任意のパラメータは、ギャップ挿入時のペナルティーが１０、ギャップ伸長時のペナルティーが０．５、及びEDNAFULL（NCBI NUC4.4のEMBOSSバージョン）置換マトリクスである。Needle標識した「最長の相同」の出力（−nobriefオプションを用いて得られる）は、相同性の割合として使用され、以下の通りに計算される：
（相同のデオキシリボヌクレオチド×１００）／（配列の長さ−配列中のギャップ総数）。
【００４７】
相同配列：
本明細書で「相同配列」なる用語は、ｂｌａｓｔｐ（タンパク質データベース）又はｔｂｌａｓｔｎ（核酸データベース）アルゴリズムを、BLOSUM62マトリクス、ワードサイズ（wordsize）３、ギャップ伸長時コスト１１、ギャップ伸長時コスト１、低い複雑性濾過なし（no low complexity filtration）、及びクエリー（query）としての成熟タンパク質配列と共に用いて、０．００１未満のＥ値（又は予期値（expectancy score））を有する配列と定義される。Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402を参照されたい。
【００４８】
ポリペプチド断片：
本明細書で「ポリペプチド断片」なる用語は、成熟ポリペプチド又はその相同配列のアミノ及び／又はカルボキシル末端から削除した、１以上（複数）のアミノ酸を有するポリペプチドとして定義され、ここでかかる断片はその成熟ポリペプチドと同じ活性を有する。
【００４９】
サブ配列：
本明細書で「サブ配列」なる用語は、成熟ポリペプチドコード配列又はその相同配列の５'及び／又は３'末端から削除した、１以上（複数）のヌクレオチドを有するヌクレオチド配列として定義され、ここでかかるサブ配列は、その成熟ポリペプチドと同じ活性を有するポリペプチド断片をコードする。
【００５０】
対立遺伝子多型：
本明細書で「対立遺伝子多型」なる用語は、同じ染色体座を占める遺伝子の２以上の相互変換可能な形態のいずれかのことを指す。対立遺伝子多型は、突然変異を介して自然に発生し、個体群内に多型性をもたらす可能性がある。遺伝子突然変異はサイレント（コードされたポリペプチドに変化が無い）でも、代替のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしてもよい。ポリペプチドの対立遺伝子多型は、遺伝子の対立遺伝子多型によりコードされるポリペプチドである。
【００５１】
単離ポリヌクレオチド：
本明細書で「単離ポリヌクレオチド」なる用語は、供給源から単離されたポリヌクレオチドとして使用される。好ましい態様によれば、アガロースゲル電気泳動で決定するポリヌクレオチドの純度は、少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％、より好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％である。
【００５２】
実質的に純粋なポリヌクレオチド：
本明細書で使用される「実質的に純粋なポリヌクレオチド」なる用語は、他の外来性又は不所望のヌクレオチドを含まず、遺伝子操作したタンパク質作製システム内での使用に適する状態のポリヌクレオチド調製物のことを言う。すなわち、実質的に純粋なポリヌクレオチドは、最大で１０質量％、好ましくは最大で８質量％、より好ましくは最大で６質量％、より好ましくは最大で５質量％、より好ましくは最大で４質量％、より好ましくは最大で３質量％、さらにより好ましくは最大で２質量％、最も好ましくは最大で１質量％、さらに最も好ましくは最大で０．５質量％の、自然に又は遺伝子組み換えにより結合する他のポリペプチド物質を含有する、ポリペプチド調製物のことを言う。ただし、実質的に純粋なポリヌクレオチドは、天然の５'及び３'非翻訳領域、例えばプロモーター及びターミネーターを含んでもよい。実質的に純粋なポリヌクレオチド、は純度が、少なくとも９２質量％、好ましくは少なくとも９４質量％、より好ましくは少なくとも９５質量％、より好ましくは少なくとも９６質量％、より好ましくは少なくとも９６質量％、より好ましくは少なくとも９７質量％、より好ましくは少なくとも９８質量％、さらにより好ましくは少なくとも９９質量％、最も好ましくは少なくとも９９．５質量％、及びさらに最も好ましくは少なくとも１００質量％の総ポリペプチド物質であることが好ましい。本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは実質的に純粋な状態、すなわち、かかるポリペプチド調製物が、自然に又は遺伝子組み換えにより結合する他のポリヌクレオチド物質を本質的に含まない状態である。ポリヌクレオチドは、ゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成、合成起源、又はこれらの任意の組み合わせのものであってもよい。
【００５３】
ｃＤＮＡ：
本明細書で「ｃＤＮＡ」なる用語は、真核細胞から入手される成熟スプライスｍＲＮＡ分子から逆転写により調製できる。ｃＤＮＡは、通常対応するゲノムＤＮＡに存在するイントロンを欠損している。その最初で且つ主要なＲＮＡ転写物は、成熟スプライスｍＲＮＡとして出現する前に一連のステップを通して処理される、ｍＲＮＡの前駆体である。これらのステップは、スプライシングと呼ばれるプロセスによるイントロン配列の除去を含む。従って、ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡは、任意のイントロン配列を欠損している。
【００５４】
核酸構築物：
本明細書で使用される「核酸構築物」なる用語は、一本鎖か二本鎖のいずれかの核酸分子のことを言い、これは天然の遺伝子から単離されるか、天然には他に存在しないであろう手法又は合成により核酸のセグメントを含むよう修正する。核酸構築物なる用語は、核酸構築物が本発明のコード配列の発現に必要な制御配列を含む場合は、「発現カセット」なる用語と同義である。
【００５５】
制御配列：
本明細書で「制御配列」なる用語には、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現のために必要な全ての成分を含むと定義される。各制御配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列由来でも異なる由来でも、又は互いに同じ由来でも異なる由来でもよい。当該制御配列には、限定するものではないが、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、及び転写ターミネーターが含まれる。制御配列は、少なくともプロモーター、並びに転写及び翻訳の停止シグナルを含む。制御配列には、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のコード領域で、制御配列のライゲーションを促進する特定の制限酵素部位を導入する目的でリンカーを提供してもよい。
【００５６】
作動的に結合した（する）：
本明細書で「作動的に結合した（する）」なる用語は、制御配列が、ポリペプチドのコード配列の発現を方向付けるポリヌクレオチド配列のコード配列に対して、適切な位置に置かれる配置のことを指す。
【００５７】
コード配列：
本明細書で使用される場合、「コード配列」は、そのタンパク質産物のアミノ酸配列を直接特定するヌクレオチド配列を意味する。一般的にコード配列の結合は、オープンリーディングフレームによって決定され、これは通常、ＡＴＧ開始コドン又はＧＴＧ及びＴＴＧ等の代替的開始コドンで開始し、ＴＡＡ、ＴＡＧ、及びＴＧＡ等の停止コドンで終了する。コード配列は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成、又は遺伝子組み換えのヌクレオチド配列でもよい。
【００５８】
発現：
「発現」なる用語には、以下に限定するものではないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、及びセレクション等のポリペプチドの生成に関与する任意のステップが含まれる。
【００５９】
発現ベクター：
本明細書で「発現ベクター」なる用語は、直鎖状又は環状のＤＮＡ分子であって、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなるとともに、その発現のために提供する追加のヌクレオチドに作動的に結合するＤＮＡ分子と定義される。
【００６０】
宿主細胞：
本明細書で使用される「宿主細胞」なる用語には、ポリヌクレオチドを含んでなる核酸構築物又は発現ベクターによる、形質転換、形質移入、形質導入等の影響を受けやすい任意の細胞タイプが含まれる。
【００６１】
改変：
本明細書で「改変」なる用語は、成熟ポリペプチド又はその相同配列についての任意の化学的改変、及び当該ポリペプチドをコードするＤＮＡの遺伝子操作を意味する。改変としては、１以上（複数）のアミノ酸の置換、削除及び／又は挿入、並びに１以上（複数）のアミノ酸側鎖の置換えがあり得る。
【００６２】
人工的変異体：
本明細書で使用される場合、「人工的変異体」なる用語は、成熟ポリペプチドコード配列又はその相同配列の改変核酸配列を発現する生物により産生されるポリペプチドを意味する。改変ヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド配列又はその相同配列の改変による、ヒトの介入を通して得られる。
【００６３】
本発明は、繊維状真菌宿主細胞であって、（ａ）セルロース分解性増強活性を有する天然型又は異種接合型ポリペプチドをコードする第一ポリヌクレオチド；（ｂ）天然型又は異種接合型ベータ−グルコシダーゼをコードする第二ポリヌクレオチド；及び（ｃ）天然型又は異種接合型のセルロース分解性酵素で、以下のトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）セロビオヒドロラーゼＩ（ＣＥＬ７Ａ）、トリコデルマ・リーゼイセロビオヒドロラーゼII（ＣＥＬ６Ａ)、及びトリコデルマ・リーゼイエンドグルカナーゼＩ（ＣＥＬ７Ｂ）並びにその相同分子種又は変異体からなる群から選択される１以上（複数）のセルロース分解性酵素をコードする、１以上（複数）の第三ポリヌクレオチド、を含んでなる宿主細胞に関する。
【００６４】
本発明はまた、セルロース分解性タンパク質組成物を作製する方法であって、（ａ）セルロース分解性タンパク質組成物の作製に適する条件下で当該繊維状真菌宿主細胞を培養すること、及び（ｂ）セルロース分解性タンパク質組成物を回収すること、を含んでなる方法に関する。本発明はまた、当該方法により得られるセルロース分解性タンパク質組成物に関する。
【００６５】
本発明はまた、セルロース分解性タンパク質組成物であって、（ａ）セルロース分解性増強活性を有するポリペプチド、（ｂ）ベータ−グルコシダーゼ、及び（ｃ）トリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼＩ（ＣＥＬ７Ａ）、トリコデルマ・リーゼイセロビオヒドロラーゼII（ＣＥＬ６Ａ)、及びトリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼＩ（ＣＥＬ７Ｂ）、並びにそれらの相同分子種又は変異体からなる群から選択される、１以上（複数）のセルロース分解性酵素、を含んでなる組成物に関する。
【００６６】
好ましい態様によれば、繊維状真菌宿主細胞は、配列番号８のセルロース分解性増強活性を有するポリペプチドの成熟ポリペプチド、配列番号１０６のベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質、配列番号５２のトリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼＩ（ＣＥＬ７Ａ）の成熟ポリペプチド、配列番号５４のトリコデルマ・リーゼイセロビオヒドロラーゼII（ＣＥＬ６Ａ) の成熟ポリペプチド、及び配列番号５６のトリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼＩ（ＣＥＬ７Ｂ）の成熟ポリペプチドを含んでなるセルロース分解性タンパク質組成物を産生する。好ましい態様によれば、繊維状真菌宿主細胞はトリコデルマ・リーゼイであり、特にトリコデルマ・リーゼイ・ＲｕｔＣ３０である。
【００６７】
別の好ましい態様によれば、繊維状真菌宿主細胞は、配列番号８のセルロース分解性増強活性を有するポリペプチドの成熟ポリペプチド、配列番号１０６のベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質、配列番号５２のトリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼＩ（ＣＥＬ７Ａ）の成熟ポリペプチド、配列番号５４のトリコデルマ・リーゼイセロビオヒドロラーゼII（ＣＥＬ６Ａ)の成熟ポリペプチド、及び配列番号５６のトリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼＩ（ＣＥＬ７Ｂ）の成熟ポリペプチドを含んでなるセルロース分解性タンパク質組成物を産生するとともに、配列番号５８のトリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼII（ＣＥＬ５Ａ）の成熟ポリペプチド、配列番号６２のトリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼＶ（ＣＥＬ４５Ａ）の成熟ポリペプチド、及び配列番号６０のトリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼIII（ＣＥＬ１２Ａ）の成熟ポリペプチドからなる群から選択される、１以上（複数）の酵素をさらに産生する。好ましい態様によれば、繊維状真菌宿主細胞はトリコデルマ・リーゼイであり、特にトリコデルマ・リーゼイ・ＲｕｔＣ３０である。
【００６８】
別の好ましい態様によれば、繊維状真菌宿主細胞は、配列番号８のセルロース分解性増強活性を有するポリペプチドの成熟ポリペプチド、配列番号１０６のベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質、配列番号５２のトリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼＩ（ＣＥＬ７Ａ）の成熟ポリペプチド、配列番号５４のトリコデルマ・リーゼイセロビオヒドロラーゼII（ＣＥＬ６Ａ)の成熟ポリペプチド、及び配列番号５６のトリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼＩ（ＣＥＬ７Ｂ）の成熟ポリペプチドを含んでなるセルロース分解性タンパク質組成物を産生するとともに、配列番号６４のチエラビア・テレストリス・セロビオヒドロラーゼの成熟ポリペプチドをさらに産生する。別の好ましい態様によれば、繊維状真菌宿主細胞はトリコデルマ・リーゼイであり、特にトリコデルマ・リーゼイ・ＲｕｔＣ３０である。
【００６９】
別の好ましい態様によれば、繊維状真菌宿主細胞は、配列番号８のセルロース分解性増強活性を有するポリペプチドの成熟ポリペプチド、配列番号１０６のベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質、配列番号５２のトリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼＩ（ＣＥＬ７Ａ）の成熟ポリペプチド、配列番号５４のトリコデルマ・リーゼイセロビオヒドロラーゼII（ＣＥＬ６Ａ)の成熟ポリペプチド、及び配列番号５６のトリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼＩ（ＣＥＬ７Ｂ）の成熟ポリペプチドを含んでなるセルロース分解性タンパク質組成物を産生するとともに、（１）配列番号５８のトリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼII（ＣＥＬ５Ａ）の成熟ポリペプチド、配列番号６２のトリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼＶ（ＣＥＬ４５Ａ）の成熟ポリペプチド、及び配列番号６０のトリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼIII（ＣＥＬ１２Ａ）の成熟ポリペプチドからなる群から選択される、１以上（複数）の酵素をさらに産生し、及び／又は（２）配列番号６４のチエラビア・テレストリス・セロビオヒドロラーゼの成熟ポリペプチドをさらに産生する。別の好ましい態様によれば、繊維状真菌宿主細胞はトリコデルマ・リーゼイであり、特にトリコデルマ・リーゼイ・ＲｕｔＣ３０である。
【００７０】
別の好ましい態様によれば、セルロース分解性タンパク質組成物は、配列番号８のセルロース分解性増強活性を有するポリペプチドの成熟ポリペプチド、配列番号１０６のベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質、配列番号５２のトリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼＩ（ＣＥＬ７Ａ）の成熟ポリペプチド、配列番号５４のトリコデルマ・リーゼイセロビオヒドロラーゼII（ＣＥＬ６Ａ) の成熟ポリペプチド、及び配列番号５６のトリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼＩ（ＣＥＬ７Ｂ）の成熟ポリペプチドを含んでなる。
【００７１】
別の好ましい態様によれば、セルロース分解性タンパク質組成物は、配列番号８のセルロース分解性増強活性を有するポリペプチドの成熟ポリペプチド、配列番号１０６のベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質、配列番号５２のトリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼＩ（ＣＥＬ７Ａ）の成熟ポリペプチド、配列番号５４のトリコデルマ・リーゼイセロビオヒドロラーゼII（ＣＥＬ６Ａ)の成熟ポリペプチド、及び配列番号５６のトリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼＩ（ＣＥＬ７Ｂ）の成熟ポリペプチドを含んでなるとともに、配列番号５８のトリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼII（ＣＥＬ５Ａ）の成熟ポリペプチド、配列番号６２のトリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼＶ（ＣＥＬ４５Ａ）の成熟ポリペプチド、及び配列番号６０のトリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼIII（ＣＥＬ１２Ａ）の成熟ポリペプチドからなる群から選択される、１以上（複数）の酵素をさらに含んでなる。
【００７２】
別の好ましい態様によれば、セルロース分解性タンパク質組成物は、配列番号８のセルロース分解性増強活性を有するポリペプチドの成熟ポリペプチド、配列番号１０６のベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質、配列番号５２のトリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼＩ（ＣＥＬ７Ａ）の成熟ポリペプチド、配列番号５４のトリコデルマ・リーゼイセロビオヒドロラーゼII（ＣＥＬ６Ａ)の成熟ポリペプチド、及び配列番号５６のトリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼＩ（ＣＥＬ７Ｂ）の成熟ポリペプチドを含んでなるとともに、配列番号６４のチエラビア・テレストリス・セロビオヒドロラーゼの成熟ポリペプチドをさらに含んでなる。
【００７３】
別の好ましい態様によれば、セルロース分解性タンパク質組成物は、配列番号８のセルロース分解性増強活性を有するポリペプチドの成熟ポリペプチド、配列番号１０６のベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質、配列番号５２のトリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼＩ（ＣＥＬ７Ａ）の成熟ポリペプチド、配列番号５４のトリコデルマ・リーゼイセロビオヒドロラーゼII（ＣＥＬ６Ａ)の成熟ポリペプチド、及び配列番号５６のトリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼＩ（ＣＥＬ７Ｂ）の成熟ポリペプチドを含んでなるとともに、（１）配列番号５８のトリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼII（ＣＥＬ５Ａ）の成熟ポリペプチド、配列番号６２のトリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼＶ（ＣＥＬ４５Ａ）の成熟ポリペプチド、及び配列番号６０のトリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼIII（ＣＥＬ１２Ａ）の成熟ポリペプチドからなる群から選択される、１以上（複数）の酵素をさらに含んでなり、及び／又は（２）配列番号６４のチエラビア・テレストリス・セロビオヒドロラーゼの成熟ポリペプチドをさらに含んでなる。
【００７４】
セルロース分解性増強活性を有するポリペプチド及びそのポリヌクレオチド
本発明の組成物中では、セルロース含有物質の処理に有用なセルロース分解性増強活性を有する任意のポリペプチドを使用できる。当該組成物を作製するために、セルロース分解性増強活性を有するこのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを使用できる。
【００７５】
第一の態様によれば、セルロース分解性増強活性を有する単離ポリペプチドは、以下のモチーフ、
［ＩＬＭＶ］−Ｐ−Ｘ（４,５）−Ｇ−Ｘ−Ｙ−［ＩＬＭＶ］−Ｘ−Ｒ−Ｘ−［ＥＱ］−Ｘ（４）−［ＨＮＱ］及び［ＦＷ］−［ＴＦ］−Ｋ−［ＡＩＶ］（式中、Ｘが任意のアミノ酸、Ｘ（４,５）が４又は５の隣接位置での任意のアミノ酸、及びＸ（４）が４の隣接位置での任意のアミノ酸である）
を含んでなる。
上記のモチーフを含んでなる単離ポリペプチドは、さらに、
Ｈ−Ｘ（１,２）−Ｇ−Ｐ−Ｘ（３）−［ＹＷ］−［ＡＩＬＭＶ］、［ＥＱ］−Ｘ−Ｙ−Ｘ（２）−Ｃ−Ｘ−［ＥＨＱＮ］−［ＦＩＬＶ］−Ｘ−［ＩＬＶ］、又はＨ−Ｘ（１,２）−Ｇ−Ｐ−Ｘ（３）−［ＹＷ］−［ＡＩＬＭＶ］及び［ＥＱ］−Ｘ−Ｙ−Ｘ（２）−Ｃ−Ｘ−［ＥＨＱＮ］−［ＦＩＬＶ］−Ｘ−［ＩＬＶ］（式中、Ｘは任意のアミノ酸、Ｘ（１,２）は１又は２の隣接位置での任意のアミノ酸、Ｘ（３）は３の隣接位置での任意のアミノ酸、及びＸ（２）は２の隣接位置での任意のアミノ酸である）
を含んでなる。上記モチーフにおいては、一般に承認されるＩＵＰＡＣのアミノ酸１文字表記を使用する。
【００７６】
好ましい実施態様によれば、セルロース分解性増強活性を有する単離ポリペプチドは、Ｈ−Ｘ（１,２）−Ｇ−Ｐ−Ｘ（３）−［ＹＷ］−［ＡＩＬＭＶ］をさらに含んでなる。別の好ましい実施態様によれば、セルロース分解性増強活性を有する単離ポリペプチドは、［ＥＱ］−Ｘ−Ｙ−Ｘ（２）−Ｃ−Ｘ−［ＥＨＱＮ］−［ＦＩＬＶ］−Ｘ−［ＩＬＶ］をさらに含んでなる。別の好ましい実施態様によれば、セルロース分解性増強活性を有する単離ポリペプチドは、Ｈ−Ｘ（１,２）−Ｇ−Ｐ−Ｘ（３）−［ＹＷ］−［ＡＩＬＭＶ］及び［ＥＱ］−Ｘ−Ｙ−Ｘ（２）−Ｃ−Ｘ−［ＥＨＱＮ］−［ＦＩＬＶ］−Ｘ−［ＩＬＶ］をさらに含んでなる。
【００７７】
第二の態様によれば、セルロース分解性増強活性を有する単離ポリペプチドは、以下のモチーフ、
［ＩＬＭＶ］−Ｐ−ｘ（４,５）−Ｇ−ｘ−Ｙ−［ＩＬＭＶ］−ｘ−Ｒ−ｘ−［ＥＱ］−ｘ（３）−Ａ−［ＨＮＱ］（式中、ｘが任意のアミノ酸、ｘ（４,５）が４又は５の隣接位置での任意のアミノ酸、及びＸ（３）が３の隣接位置での任意のアミノ酸である）
を含んでなる。上記モチーフにおいては、一般に承認されるＩＵＰＡＣのアミノ酸１文字表記を使用する。
【００７８】
第三の態様によれば、セルロース分解性増強活性を有する単離ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、又は配列番号１０、配列番号１２、又は配列番号１４の成熟ポリペプチドと、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％、さらに最も好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるか、それらからなる（本明細書では以下「相同ポリペプチド」）。好ましい態様によれば、かかる相同ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、又は配列番号１０、配列番号１２、又は配列番号１４の成熟ポリペプチドと異なるアミノ酸を、１０個まで、好ましくは５個まで、より好ましくは４個まで、さらにより好ましくは３個まで、最も好ましくは２個まで、さらに最も好ましくは１個まで、含んでなるか、前記個数の異なるアミノ酸からなる。
【００７９】
セルロース分解性増強活性を有するポリペプチドは、好ましくは配列番号２のアミノ酸又はその対立遺伝子多型、又はそのセルロース分解性増強活性を有する断片を含んでなる。好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号２の成熟ポリペプチドを含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸２０〜３２６、又はその対立遺伝子多型、又はセルロース分解性増強活性を有するその断片を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸２０〜３２６を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列、又はその対立遺伝子多型、又はセルロース分解性増強活性を有するその断片からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号２の成熟ポリペプチドからなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸２０〜３２６、又はその対立遺伝子多型、又はセルロース分解性増強活性を有するその断片からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは配列番号２のアミノ酸２０〜３２６からなる。
【００８０】
セルロース分解性増強活性を有するポリペプチドは、好ましくは配列番号４のアミノ酸配列、又はその対立遺伝子多型、又はセルロース分解性増強活性を有するその断片を含んでなる。好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号４の成熟ポリペプチドを含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸１８〜２４０、又はその対立遺伝子多型、又はセルロース分解性増強活性を有するその断片を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸１８〜２４０を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列、又はその対立遺伝子多型、又はセルロース分解性増強活性を有するその断片からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号４の成熟ポリペプチドからなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸１８〜２４０、又はその対立遺伝子多型、又はセルロース分解性増強活性を有するその断片からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは配列番号４のアミノ酸１８〜２４０からなる。
【００８１】
セルロース分解性増強活性を有するポリペプチドは好ましくは、配列番号６のアミノ酸配列、又はその対立遺伝子多型、又はセルロース分解性増強活性を有するその断片を含んでなる。好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号６の成熟ポリペプチドを含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸２０〜２５８、又はその対立遺伝子多型、又はセルロース分解性増強活性を有するその断片を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸２０〜２５８を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列、又はその対立遺伝子多型、又はセルロース分解性増強活性を有するその断片からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号６の成熟ポリペプチドからなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸２０〜２５８、又はその対立遺伝子多型、又はセルロース分解性増強活性を有するその断片からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは配列番号６のアミノ酸２０〜２５８からなる。
【００８２】
セルロース分解性増強活性を有するポリペプチドは好ましくは、配列番号８のアミノ酸配列、又はその対立遺伝子多型、又はセルロース分解性増強活性を有するその断片を含んでなる。好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号８の成熟ポリペプチドを含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸１９〜２２６、又はその対立遺伝子多型、又はセルロース分解性増強活性を有するその断片を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸１９〜２２６を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列、又はその対立遺伝子多型、又はセルロース分解性増強活性を有するその断片からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号８の成熟ポリペプチドからなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸１９〜２２６、又はその対立遺伝子多型、又はセルロース分解性増強活性を有するその断片からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは配列番号８のアミノ酸１９〜２２６からなる。
【００８３】
セルロース分解性増強活性を有するポリペプチドは好ましくは、配列番号１０のアミノ酸配列、又はその対立遺伝子多型、又はセルロース分解性増強活性を有するその断片を含んでなる。好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号１０の成熟ポリペプチドを含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸２０〜３０４、又はその対立遺伝子多型、又はセルロース分解性増強活性を有するその断片を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸２０〜３０４を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列、又はその対立遺伝子多型、又はセルロース分解性増強活性を有するその断片からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号１０の成熟ポリペプチドからなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸２０〜３０４、又はその対立遺伝子多型、又はセルロース分解性増強活性を有するその断片からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは配列番号１０のアミノ酸２０〜３０４からなる。
【００８４】
セルロース分解性増強活性を有するポリペプチドは好ましくは、配列番号１２のアミノ酸配列、又はその対立遺伝子多型、又はセルロース分解性増強活性を有するその断片を含んでなる。好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号１２のアミノ酸を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号１２の成熟ポリペプチドを含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号１２のアミノ酸２３〜２５０、又はその対立遺伝子多型、又はセルロース分解性増強活性を有するその断片を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号１２のアミノ酸２３〜２５０を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号１２のアミノ酸配列、又はその対立遺伝子多型、又はセルロース分解性増強活性を有するその断片からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号１２のアミノ酸配列からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号１２の成熟ポリペプチドからなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号１２のアミノ酸２３〜２５０、又はその対立遺伝子多型、又はセルロース分解性増強活性を有するその断片からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは配列番号１２のアミノ酸２３〜２５０からなる。
【００８５】
セルロース分解性増強活性を有するポリペプチドは好ましくは、配列番号１４のアミノ酸配列、又はその対立遺伝子多型、又はセルロース分解性増強活性を有するその断片を含んでなる。好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号１４のアミノ酸を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号１４の成熟ポリペプチドを含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号１４のアミノ酸２０〜２４９、又はその対立遺伝子多型、又はセルロース分解性増強活性を有するその断片を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号１４のアミノ酸２０〜２４９を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号１４のアミノ酸配列、又はその対立遺伝子多型、又はセルロース分解性増強活性を有するその断片からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号１４のアミノ酸配列からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号１４の成熟ポリペプチドからなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号１４のアミノ酸２０〜２４９、又はその対立遺伝子多型、又はセルロース分解性増強活性を有するその断片からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは配列番号１４のアミノ酸２０〜２４９からなる。
【００８６】
好ましくは、配列番号２の成熟ポリペプチドの断片は、アミノ酸残基を、少なくとも２７７個、より好ましくは少なくとも２８７個、最も好ましくは少なくとも２９７個含有する。好ましくは、配列番号４の成熟ポリペプチドの断片は、アミノ酸残基を、少なくとも１８５個、より好ましくは少なくとも１９５個、最も好ましくは少なくとも２０５個含有する。好ましくは、配列番号６の成熟ポリペプチドの断片は、アミノ酸残基を、少なくとも２００個、より好ましくは少なくとも２１２個、最も好ましくは少なくとも２２４個含有する。好ましくは、配列番号８の成熟ポリペプチドの断片は、アミノ酸残基を、少なくとも１７５個、より好ましくは少なくとも１８５個、最も好ましくは少なくとも１９５個含有する。好ましくは、配列番号１０の成熟ポリペプチドの断片は、アミノ酸残基を、少なくとも２４０個、より好ましくは少なくとも２５５個、最も好ましくは少なくとも２７０個含有する。好ましくは、配列番号１２の成熟ポリペプチドの断片は、アミノ酸残基を、少なくとも１７５個、より好ましくは少なくとも１９０個、最も好ましくは少なくとも２０５個含有する。好ましくは、配列番号１４の成熟ポリペプチドの断片は、アミノ酸残基を、少なくとも２００個、より好ましくは少なくとも２１０個、最も好ましくは少なくとも２２０個含有する。
【００８７】
好ましくは、配列番号１の成熟ポリペプチドコード配列のサブ配列は、ヌクレオチドを、少なくとも８３１個、より好ましくは少なくとも８６１個、及び最も好ましくは８９１個含有する。好ましくは、配列番号３の成熟ポリペプチドコード配列のサブ配列は、ヌクレオチドを、少なくとも５５５個、より好ましくは少なくとも５８５個、及び最も好ましくは６１５個含有する。好ましくは、配列番号５の成熟ポリペプチドコード配列のサブ配列は、ヌクレオチドを、少なくとも６００個、より好ましくは少なくとも６３６個、及び最も好ましくは６７２個含有する。好ましくは、配列番号７の成熟ポリペプチドコード配列のサブ配列は、ヌクレオチドを、少なくとも５２５個、より好ましくは少なくとも５５５個、及び最も好ましくは５８５個含有する。好ましくは、配列番号９の成熟ポリペプチドコード配列のサブ配列は、ヌクレオチドを、少なくとも７２０個、より好ましくは少なくとも７６５個、及び最も好ましくは８１０個含有する。好ましくは、配列番号１１の成熟ポリペプチドコード配列のサブ配列は、ヌクレオチドを、少なくとも５２５個、より好ましくは少なくとも５７０個、及び最も好ましくは６１５個含有する。好ましくは、配列番号１３の成熟ポリペプチドコード配列のサブ配列は、ヌクレオチドを、少なくとも６００個、より好ましくは少なくとも６３０個、及び最も好ましくは６６０個含有する。
【００８８】
第四の態様によれば、セルロース分解性増強活性を有する単離ポリペプチドは、（i）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、もしくは配列番号１３の成熟ポリペプチドコード配列、（ii）配列番号１、配列番号３、配列番号５、もしくは配列番号１１の成熟ポリペプチドコード配列に含有されるｃＤＮＡ配列、又は配列番号７、配列番号９、もしくは配列番号１３の成熟ポリペプチドコード配列を含んでなるゲノムＤＮＡ配列、（iii）（i）もしくは（ii）のサブ配列、又は（iv）（i）、（ii）もしくは（iii）の全長相補鎖と、好ましくは少なくとも超低ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも低ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中高ストリンジェンシー条件、さらにより好ましくは少なくとも高ストリンジェンシー条件、及び最も好ましくは少なくとも高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドによりコードされる（J J. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York）。配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、もしくは配列番号１３の成熟ポリペプチドコード配列のサブ配列は、連続するヌクレオチドを、少なくとも１００個又は好ましくは少なくとも２００個含有する。さらにサブ配列は、セルロース分解性増強活性を有するポリペプチド断片をコードしてもよい。好ましい態様によれば、成熟ポリペプチドコード配列は、配列番号１のヌクレオチド３８８〜１３３２であるか、配列番号３のヌクレオチド９８〜８２１であるか、配列番号５のヌクレオチド１２６〜９７８であるか、配列番号７のヌクレオチド５５〜６７８であるか、配列番号９のヌクレオチド５８〜９１２であるか、配列番号１１のヌクレオチド６７〜７９６であるか、配列番号１３のヌクレオチド７７〜７６６である。
【００８９】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、もしくは配列番号１３のヌクレオチド配列、又はそのサブ配列、並びに配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、又は配列番号１０、配列番号１２、又は配列番号１４のアミノ酸配列、又はその断片は、異なる属又は種の系統からセルロース分解性増強活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを同定及びクローン化する核酸プローブを設計するために使用してもよい。特に、当該プローブは、標準的なサザンブロッティング法の後、注目の属又は種のゲノム又はｃＤＮＡとハイブリダイゼーションするために使用でき、その中の対応する遺伝子を同定及び単離する。当該プローブは、完全配列よりかなり短くてもよいが、長さが、少なくとも１４ヌクレオチド、好ましくは少なくとも２５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも３５ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも７０ヌクレオチドであるべきである。ただし、核酸プローブの長さが、少なくとも１００ヌクレオチドであることが好ましい。例えば、核酸プローブの長さが、少なくとも２００ヌクレオチド、好ましくは少なくとも３００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも４００ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも５００ヌクレオチドでもよい。さらに長いプローブを使用してもよく、例えば、長さが、少なくとも６００ヌクレオチド、好ましくは少なくとも７００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも８００ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも９００ヌクレオチドである核酸プローブがある。ＤＮＡ及びＲＮＡプローブの両方が使用できる。プローブは、対応する遺伝子を検出するために典型的には標識される（例えば、32Ｐ、3Ｈ、35Ｓ、ビオチン、又はアビジンを用いる）。当該プローブは本発明に包含される。
【００９０】
従って、当該他の系統から調製されるゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーは、上記プローブとハイブリダイズするとともに、セルロース分解性増強活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡでスクリーニングしてもよい。当該他の系統から調製されるゲノム又は他のＤＮＡは、アガロース又はポリペプチドアクリルアミドゲルの電気泳動、又はその他の分離技術により分離してもよい。ライブラリーから得たＤＮＡ又は分離されたＤＮＡは、ニトロセルロース又はその他の好適な担体物質に移動又は固定させてもよい。配列番号１の相同体又はそのサブ配列である、クローン又はＤＮＡを同定するためには、好ましくは担体物質をサザンブロットで使用する。
【００９１】
本発明の目的に応じて、ハイブリダイゼーションとは、ヌクレオチド配列が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、もしくは配列番号１３の成熟ポリペプチドコード配列、配列番号１、配列番号３、配列番号５、もしくは配列番号１１の成熟ポリペプチドコード配列に含有されるｃＤＮＡ配列、又は配列番号７、配列番号９、もしくは配列番号１３の成熟ポリペプチドコード配列を含んでなるゲノムＤＮＡ配列、その全長相補鎖、又はそのサブ配列、に対応する標識核酸プローブに、超低〜超高ストリンジェンシー条件下で、ハイブリダイズすることを指す。これらの条件下で核酸プローブがハイブリダイズする分子は、例えばＸ線フィルムを用いて検出できる。
【００９２】
好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号１の成熟ポリペプチドコード配列である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号１のヌクレオチド３８８〜１３３２である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、又はそのサブ配列である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは配列番号１である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、Ｅ.ｃｏｌｉ. ＮＲＲＬ Ｂ−３０６９９に含まれるプラスミドｐＥＪＧ１２０に含まれるポリヌクレオチド配列であり、当該ポリヌクレオチド配列はセルロース分解性増強活性を有するポリペプチドをコードする。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、Ｅ.ｃｏｌｉ.ＮＲＲＬ Ｂ−３０６９９に含まれるプラスミドｐＥＪＧ１２０に含まれる成熟ポリペプチドコード領域である。
【００９３】
別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号３の成熟ポリペプチドコード配列である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号３のヌクレオチド９８〜８２１である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号４のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、又はそのサブ配列である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは配列番号３である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、Ｅ.ｃｏｌｉ.ＮＲＲＬ Ｂ−３０８１３に含まれるプラスミドｐＴｔｅｒ６１Ｃに含まれるポリヌクレオチド配列であり、当該ポリヌクレオチド配列はセルロース分解性増強活性を有するポリペプチドをコードする。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、Ｅ.ｃｏｌｉ.ＮＲＲＬＢ−３０８１３に含まれるプラスミドｐＴｔｅｒ６１Ｃに含まれる成熟ポリペプチドコード領域である。
【００９４】
別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号５の成熟ポリペプチドコード配列である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号５のヌクレオチド１２６〜９７８である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号６のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、又はそのサブ配列である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは配列番号５である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、Ｅ.ｃｏｌｉ.ＮＲＲＬ Ｂ−３０８１２に含まれるプラスミドｐＴｔｅｒ６１Ｄに含まれるポリヌクレオチド配列であり、当該ポリヌクレオチド配列はセルロース分解性増強活性を有するポリペプチドをコードする。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、Ｅ.ｃｏｌｉ.ＮＲＲＬＢ−３０８１２に含まれるプラスミドｐＴｔｅｒ６１Ｄに含まれる成熟ポリペプチドコード領域である。
【００９５】
別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号７の成熟ポリペプチドコード配列である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号７のヌクレオチド５５〜６７８である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号８のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、又はそのサブ配列である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは配列番号７である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、Ｅ.ｃｏｌｉ.ＮＲＲＬ Ｂ−３０８１４に含まれるプラスミドｐＴｔｅｒ６１Ｅに含まれるポリヌクレオチド配列であり、当該ポリヌクレオチド配列はセルロース分解性増強活性を有するポリペプチドをコードする。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、Ｅ.ｃｏｌｉ.ＮＲＲＬＢ−３０８１４に含まれるプラスミドｐＴｔｅｒ６１Ｅに含まれる成熟ポリペプチドコード領域である。
【００９６】
別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号９の成熟ポリペプチドコード配列である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号９のヌクレオチド５８〜９１２である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号１０のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、又はそのサブ配列である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは配列番号９である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、Ｅ.ｃｏｌｉ.ＮＲＲＬ Ｂ−３０８１１に含まれるプラスミドｐＴｔｅｒ６１Ｇに含まれるポリヌクレオチド配列であり、当該ポリヌクレオチド配列はセルロース分解性増強活性を有するポリペプチドをコードする。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、Ｅ.ｃｏｌｉ.ＮＲＲＬＢ−３０８１１に含まれるプラスミドｐＴｔｅｒ６１Ｇに含まれる成熟ポリペプチドコード領域である。
【００９７】
別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号１１の成熟ポリペプチドコード配列である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号１１のヌクレオチド６７〜７９６である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号１２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、又はそのサブ配列である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは配列番号１１である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、Ｅ.ｃｏｌｉ.ＮＲＲＬ Ｂ−３０７０４に含まれるプラスミドｐＤＺＡ２−７に含まれるポリヌクレオチド配列であり、当該ポリヌクレオチド配列はセルロース分解性増強活性を有するポリペプチドをコードする。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、Ｅ.ｃｏｌｉ.ＮＲＲＬＢ−３０７０４に含まれるプラスミドｐＤＺＡ２−７に含まれる成熟ポリペプチドコード領域である。
【００９８】
別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号１３の成熟ポリペプチドコード配列である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号１３のヌクレオチド７７〜７６６である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号１４のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、又はそのサブ配列である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは配列番号１３である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、Ｅ.ｃｏｌｉ.ＮＲＲＬ Ｂ−３０８７８に含まれるプラスミドｐＴｒ３３３に含まれるポリヌクレオチド配列であり、当該ポリヌクレオチド配列はセルロース分解性増強活性を有するポリペプチドをコードする。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、Ｅ.ｃｏｌｉ.ＮＲＲＬＢ−３０８７８に含まれるプラスミドｐＴｒ３３３に含まれる成熟ポリペプチドコード領域である。
【００９９】
少なくとも１００ヌクレオチド長の長いプローブのための、超低〜超高ストリンジェンシー条件とは、任意の１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング法の後に、４２℃で、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００μｇ／ｍｌのせん断及び変性サケ精子ＤＮＡ、並びに２５％ホルムアミド（超低から低ストリンジェンシー）、３５％ホルムアミド（中から中高のストリンジェンシー）、又は５０％ホルムアミド（高から超高ストリンジェンシー）のいずれかの中での、プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションと定義される。
【０１００】
少なくとも100ヌクレオチド長の長いプローブにおいて、当該担体物質は、２×ＳＳＣ、0.2％ＳＤＳを用いて、好ましくは少なくとも45℃（超低ストリンジェンシー）、より好ましくは少なくとも50℃（低ストリンジェンシー）、より好ましくは少なくとも55℃（中ストリンジェンシー）、より好ましくは少なくとも60℃（中高ストリンジェンシー）、さらにより好ましくは少なくとも65℃（高ストリンジェンシー）、及び最も好ましくは70℃（超高ストリンジェンシー）で、最終的に15分間ずつ３回洗浄する。
【０１０１】
約１５〜約７０ヌクレオチド長の短いプローブのための、ストリンジェンシー条件とは、任意の１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング法の後に、Ｂｏｌｔｏｎ及びＭｃＣａｒｔｈｙ（1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48:1390）による計算を用いて算出したＴm未満である約５℃〜約１０℃で、０．９Ｍ ＮａＣｌ、０．０９Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、６ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ ＮＰ−４０、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１ｍＭ ピロリン酸ナトリウム、１ｍＭ 第一リン酸ナトリウム、０．１ｍＭ ＡＴＰ、及び１ｍｌ当たり０．２ｍｇの酵母ＲＮＡ中で行う、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、及び洗浄プレハイブリダイゼーションと定義される。
【０１０２】
約１５〜約７０ヌクレオチド長の短いプローブにおいて、担体物質は、算出したＴm未満である約５℃〜約１０℃で、６×ＳＣＣ＋０．１％ＳＤＳ中で１５分間洗浄を１回、及び６×ＳＣＣを用いて１５分間洗浄を２回行う。
【０１０３】
第五の態様によれば、セルロース分解性増強活性を有する単離ポリペプチドは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、又は配列番号１３の配列の成熟ポリペプチドコード配列と、好ましくは、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％、さらに最も好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、又は９９％の相同性を有し、セルロース分解性増強活性を有するヌクレオチド配列を含んでなるか、それらからなるポリヌクレオチドによりコードされる。
【０１０４】
好ましい態様によれば、成熟ポリペプチドコード配列は、配列番号のヌクレオチド３８８〜１３３２、配列番号３のヌクレオチド９８〜８２１、配列番号５のヌクレオチド１２６〜９７８、配列番号７のヌクレオチド５５〜６７８、配列番号９のヌクレオチド５８〜９１２、配列番号１１のヌクレオチド６７〜７９６、又は配列番号１３のヌクレオチド７７〜７６６である。本明細書のポリヌクレオチドの項を参照されたい。
【０１０５】
第六の態様によれば、セルロース分解性増強活性を有する単離ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、又は配列番号１０、配列番号１２、又は配列番号１４の成熟ポリペプチドの１以上（複数）のアミノ酸配列、又はその相同配列の、置換、削除、及び／又は挿入を含んでなる人工的変異体である。好ましくは、アミノ酸変化は、影響の少ない性質であり、例えばタンパク質のホールディング及び／又は活性に大きな影響を与えない保存的アミノ酸置換又は挿入であり；わずかな削除、典型的には、約３０アミノ酸中の１個；わずかなアミノ又はカルボキシル末端の伸長、例えばアミノ末端メチオニン残基；最大で約２０〜２５残基の小さなリンカーペプチド；又は正味荷電もしくは別の機能を変化することにより精製を促進させるわずかな伸長、例えばポリヒスチジン部分（tract）、抗原エピトープ又は結合ドメイン等がある。
【０１０６】
保存的置換の例としては、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン及びバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）、及び小アミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、スレオニン及びメチオニン）の群の中での置換がある。一般的に特定の活性を変更しないアミノ酸置換は、当業者に既知であり、例えば、H. Neurath and R. L. Hill, 1979, In, The Proteins, Academic Press, New Yorkに記載がある。最も一般的にある交換は、Ala/Ser, Val/lle, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/lle, Leu/Val, Ala/Glu, 及び Asp/Glyである。
【０１０７】
２０個の標準アミノ酸に加え、非標準アミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン、６−Ｎ−メチルリジン、２−アミノイソブチル酸、イソバリン及びアルファ−メチルセリン等）を、野生型ポリペプチドのアミノ酸残基と置換してもよい。限定数の非保存的アミノ酸置換、遺伝コードにコードされていないアミノ酸が、及び非天然アミノ酸は、アミノ酸残基と置換してもよい。「非天然アミノ酸」は、タンパク質合成後に改変され、及び／又は標準的アミノ酸のものとは異なる（１以上の）側鎖中である化学構造を有する。非天然アミノ酸は、好ましくは化学的に合成できるが、市販されており、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロリン、３−及び４−メチルプロリン、及び３,３−ジメチルプロリンが含まれる。
【０１０８】
あるいは、アミノ酸変化には、ポリペプチドの物理化学的特性を変えるような性質のものがある。例えば、アミノ酸変化が、ポリペプチドの熱的安定性を向上させても、基質特異性を変化させても、最適ｐＨを変化させてもよい。
【０１０９】
起源ポリペプチド中の必須アミノ酸は、当業界で既知の方法により確認でき、例えば、部位特異的突然変異誘発法、又はアラニンスキャニング突然変異誘発法（Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085）等がある。最近の技術では、単一アラニン変異は、分子における全ての残基で導入され、得られた変異体分子は分子の活性に不可欠であるアミノ酸残基を確認するために生物活性を試験する。Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708も参照されたい。酵素又はその他の生物的相互作用の活性部位は、核磁気共鳴、結晶解析、電子線回折、又は光親和性標識などの技術により決定するのと同様に、構造の物理的解析により決定することもできる。例えば、de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. MoI. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64を参照されたい。必須アミノ酸の相同性は、本発明によるポリペプチドに関連するポリペプチドとの相同性の解析から推察することもできる。
【０１１０】
単一又は多型のアミノ酸置換、削除、及び／又は挿入は、関連するスクリーニング方法の後、既知の方法である突然変異誘導法、遺伝子組み換え、及び／又はシャッフリング（shuffling）を用いて作製及び試験され、例えば、Reidhaar-Olson and Sauer, 1988, Science 241 : 53-57; Bowie and Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sd. USA 86: 2152-2156、国際公開第９５／１７５１３号、又は国際公開第９５／２２６２５号等で開示される。使用できるその他の方法には、誤りやすいＰＣＲ、ファージディスプレイ（例えば、Lowman et al., 1991, Biochem. 30: 10832-10837、米国特許第５,２２３,４０９号、国際公開第９２／０６２０４号）、及び部位特異的変異導入法（Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner ef a/., 1988, DNA 7: 127）がある。
【０１１１】
変異導入法／シャッフリング法は、宿主細胞が発現したクローン化変異導入ポリペプチドの活性を検出する、ハイスループット自動化スクリーニング方法と組み合わせることができ（Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896）。活性ポリペプチドをコードする変異導入ＤＮＡ分子は、宿主細胞から回収でき、当業界で標準的な方法を用いて迅速に配列決定できる。これらの方法は、注目のポリペプチド中の個々のアミノ酸残基の重要性の迅速な決定が可能となり、未知の構造のポリペプチドに適用できる。
【０１１２】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、又は配列番号１０、配列番号１２、又は配列番号１４の成熟ポリペプチドにおける、アミノ酸置換、削除、及び／又は挿入の総数は、１０個、好ましくは９個、より好ましくは８個、より好ましくは７個、より好ましくは最大で６個、より好ましくは５個、より好ましくは４個、さらにより好ましくは３個、最も好ましくは２個、及びさらに最も好ましくは１個である。
【０１１３】
セルロース分解性増強活性を有するポリペプチドは、任意の属の微生物から得てもよい。本発明の目的に応じて、所与の供給源との関連で、本明細書で使用される「から得る」なる用語は、ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドが、供給源からのヌクレオチドが挿入される供給源又はある系統から作製されること意味するものとする。好ましい態様によれば、所与の供給源から得られるポリペプチドは、細胞外に分泌される。
【０１１４】
セルロース分解性増強活性を有するポリペプチドは、細菌ポリペプチドであってもよい。例えば、ポリペプチドは、グラム陽性細菌ポリペプチド、例えば、セルロース分解性増強活性を有する、バチルス（Bacillus）、ストレプトコッカス（Streptococcus）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、スタフィロコッカス（Staphylococcus）、エンテロコッカス（Enterococcus）、ラクトバチルス（Lactobacillus）、ラクトコッカス（Lactococcus）、クロストリジウム（Clostridium）、ゲオバチルス（Geobacillus）、又はオセアノバチルス（Oceanobacillus）のポリペプチド、又はグラム陰性細菌ポリペプチド、例えば、セルロース分解性増強活性を有する、Ｅ.ｃｏｌｉ、シュードモナス（Pseudomonas）、サルモネラ（Salmonella）、カンピロバクター（Campylobacter）、ヘリコバクター（Helicobacter）、フラボマクテリウム（Flavobacterium）、フソバクテリウム（Fusobacterium）、イリオバクター（Ilyobacter）、ネイセリア（Neisseria）、又はウレアプラズマのポリペプチドがある。
【０１１５】
好ましい態様によれば、ポリペプチドは、セルロース分解性増強活性を有する、バチルス・アルカロフィルス（Bacillus alkalophilus）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス・サークランス（Bacillus circulans）、バチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）、バチルス・コーグランス（Bacillus coagulans）、バチルス・ファームス（Bacillus firmus）、バチルス・ロートス（Bacillus lautus）、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）、バチルス・ステアロセルモフィルス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス・サブチリス（Bacillus subtiiis）、又はバチルス・サーリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）のポリペプチドである。
【０１１６】
別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、セルロース分解性増強活性を有する、ポリペプチドはストレプトコッカス・エクイシミリス（Streptococcus equisimilis）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・ウベリス（Streptococcus uberis）、ストレプトコッカス・エキ（Streptococcus equi）亜種、ゾエピデミクス（Zooepidemicus）のポリペプチドである。
【０１１７】
別の態様によれば、ポリペプチドは、セルロース分解性増強活性を有する、ストレプトマイセス・アクロモゲネス（Streptomyces achromogenes）、ストレプトマイセス・アベルミチリス（Streptomyces avermitilis）、ストレプトマイセス・コエリコロル（Streptomyces coelicolor）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、又はストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）のポリペプチドがある。
【０１１８】
セルロース分解性増強活性を有するポリペプチドには、真菌ポリペプチドもあり、より好ましくは酵母ポリペプチド、例えば、セルロース分解性増強活性を有する、カンジダ（Candida）、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）、ピキア（Pichia）、サッカロマイセス（Saccharomyces）、スキゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）、又はヤロウィア（Yarrowia）ペプチド；又はより好ましくは、繊維状真菌ポリペプチド、例えば、セルロース分解性増強活性を有する、アクレモニウム（Acremonium）、アガリクス（Agaricus）、アルタナリア（Alternaria）、アスペルギルス（Aspergillus）、オウレオバシジウム（Aureobasidium）、ボトリオスパエリア（Botryospaeria）、セリポリオプシス（Ceripopsis）、カエトミジウム（Chaetomidium）、クリソスポリウム（Chrysosporium）、クラビセプス（Claviceps）、コクリオボルス（Cochliobolus）、コプリノプシス（Coprinopsis）、コプトテルメス（Coptotermes）、コリナスカス（Corynascus）、クリホネクトリア（Cryptococcus）、クリプトコッカス（Cryphonectria）、ジプロディア（Diplodia）、エキシジア（Exidia）、フィリバシジウム（Filibasidium）、フサリウム（Fusarium）、ギベレラ（Gibberella）、ホロマスチゴトイデス（Holomastigotoides）、フミコラ（Humicola）、イルペックス（Irpex）、レンチヌラ（Lentinula）、レプトスパエリア（Leptospaeria）、マグナポルテ（Magnaporthe）、メラノカルプス（Melanocarpus）、メリピラス（Meripilus）、ムコール（Mucor）、ミセリオフトラ（Myceliophthora）、ネオカリマスティクス（Neocalllmastix）、ニューロスポラ（Neurospora）、パエシロマイセス（Paecilomyces）、ペンンルシリウム（Penlcillium）、ファネロカエテ（Phanerochaete）、ピロマイセス（Piromyces）、ポイトラシア（Poitrasia）、シュードプレクタニア（Pseudoplectania）、シュードトリコニンファ（Pseudotrichonympha）、リゾムコール（Rhizomucor）、スキゾフィラム（Schizophyllum）、スキタリジウム（Scytalidium）、タラロマイセス（Talaromyces）、サーモアスカス（Thermoascus）、チエラビア（Thielavia）、トリポダジウム（Tolypodadium）、トリコデルマ（Trichoderma）、トリコファエア（Trichophaea）、ベルチシリウム（Verticillium）、ボルバリエラ（Volvariella）、又はキシラリア（Xylaria）のポリペプチドがある。
【０１１９】
好ましい態様によれば、ポリペプチドは、セルロース分解性増強活性を有するサッカロマイセス・カリスベルゲンシス（Saccharomyces carisbergensis）、サッカロマイセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロマイセス・ジアスタチクス（Saccharomyces diastaticus）、サッカロマイセス・ドウグラシイ（Saccharomyces douglasii）、サッカロマイセス・クルイベリ（Saccharomyces kluyveri）、サッカロマイセス・ノルベンシス（Saccharomyces norbensis）、又はサッカロマイセス・オニフォルミス（Saccharomyces oviformis）のポリペプチドである。
【０１２０】
別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、セルロース分解性増強活性を有する、アクレモニウム・セルロリティクス（Acremonium cellulolyticus）、アスペルギルス・アクレタス（Aspergillus aculeatus）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・ホエチダス（Aspergillus foetidus）、アスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus japonicus）、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ニゲル（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）、クリソスポリウム・ケラチノフィルム（Chrysosporium keratinophilum）、クリソスポリウム・ルクノウェンセ（Chrysosporium lucknowense）、クリソスポリウム・トロピクム（Chrysosporium tropicum）、クリソスポリウム・メルダリウム（Chrysosporium merdarium）、クリソスポリウム・イノプス（Chrysosporium inops）、クリソスポリウム・パンニコラ（Chrysosporium pannicola）、クリソスポリウム・クエエンスランジクム（Chrysosporium queenslandicum）、クリソスポリウム・ゾナタム（Chrysosporium zonatum）、フサリウム・バクトリジオイデス（Fusarium bactridioides）、フサリウム・セレアリス（Fusarium cerealis）、フサリウム・クロオクウェレンセ（Fusarium crookwellense）、フサリウム・クルモルム（Fusarium culmorum）、フサリウム・グラミネアルム（Fusarium graminearum）、フサリウム・グラミヌム（Fusarium graminum）、フサリウム・ヘテロスポルム（Fusarium heterosporum）、フサリウム・ネグンジ（Fusarium negundi）、フサリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）、フサリウム・レチクラタム（Fusarium reticulatum）、フサリウム・レセウム（Fusarium roseum）、フサリウム・サンブシヌム（Fusarium sambucinum）、フサリウム・サルコクロウム（Fusarium sarcochroum）、フサリウム・スポロトリチオイデス（Fusarium sporotrichioides）、フサリウム・スルフレウム（Fusarium sulphureum）、フサリウム・トルロサム（Fusarium torulosum）、フサリウム・トリコテシオイデス（Fusarium trichothecioides）、フサリウム・ベネナタム（Fusarium venenatum）、フミコラ・グリセア（Humicola grisea）、フミコラ・インソレンス（Humicola insolens）、フミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa）、イルペックス・ラクテウス（Irpex lacteus）、ムコール・ミエヘイ（Mucor miehei）、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）、ネウロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）、ペニシリウム・フニクロスム（Penicillium funiculosum）、ペニシリウム・プルプロゲナム（Penicillium purpurogenum）、ファネロカエテ・クリソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium）、ファネロカエテ・クリソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium）、チエラビア・アクロマティカ（Thielavia achromatica）、チエラビア・アルボマイセス（Thielavia albomyces）、チエラビア・アルボピロサ（Thielavia albopilosa）、チエラビア・オウストラレインシス（Thielavia australeinsis）、チエラビア・フィメチ（Thielavia fimeti）、チエラビア・ミクロスポレ（Thielavia microspore）、チエラビア・オビスポラ（Thielavia ovispora）、チエラビア・ペルビアナ（Thielavia peruviana）、チエラビア・スペデドニウム（Thielavia spededonium）、チエラビア・セトサ（Thielavia setosa）、チエラビア・サブサーモフィラ（Thielavia subthermophila）、チエラビア・テレストリス（Thielavia terrestris）、トリコデルマ・ハルジアナム（Trichoderma harzianum）、トリコデルマ・クニンギイ（Trichoderma koningii）、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Trichoderma longibrachiatum）、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）、トリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）、又はトリコファエア・サクタ（Trichophaea saccata）のポリペプチドである。
【０１２１】
より好ましい態様によれば、ポリペプチドは、セルロース分解性増強活性を有するチエラビア・テレストリス（Thielavia terrestris）ペプチドである。最も好ましい実施態様によれば、ポリペプチドは、セルロース分解性増強活性を有する、チエラビア・テレストリス ＮＲＲＬ ８１２６ポリペプチドであり、例えば、配列番号２、４、６、８、又は１０の成熟ポリペプチド、又はセルロース分解性増強活性を有するその断片である。
【０１２２】
別のより好ましい態様によれば、ポリペプチドは、セルロース分解性増強活性を有するサーモアスカス・オウランティクス（Thermoascus aurantiacus）ペプチドであり、例えば配列番号１２の成熟ポリペプチドがある。
【０１２３】
別のより好ましい態様によれば、ポリペプチドは、セルロース分解性増強活性を有するトリコデルマ・リーゼイペプチドである。別の最も好ましい態様によれば、ポリペプチドは、セルロース分解性増強活性を有するトリコデルマ・リーゼイＲｔＣ３０（ＡＴＣＣ ５６７６５）ペプチドであり、例えば、配列番号１４の成熟ポリペプチド、又はセルロース分解性増強活性を有するその断片がある。
【０１２４】
上記の種について、本発明は、完全及び不完全な状態、及び一般に知られる種名に関係なく、その他の分類学上同等物、例えばアナモルフを包含すると理解されるだろう。当業者は、適切な同等物の相同性を容易に理解するであろう。
【０１２５】
これらの種の系統は、多数の菌株保存施設、例えばAmerican Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH （ＤＳＭ）、Centraalbureau Voor Schimmelcultures （ＣＢＳ）、及びAgricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center （ＮＲＲＬ）等で一般に容易に入手可能である。
【０１２６】
さらに、当該ポリペプチドは、上記のプローブを用いて、天然物（例えば土壌、堆肥、廃棄物等）から単離される微生物等のその他の供給源から同定及び得ることができる。天然環境から微生物を単離する技術は、当業者に周知である。その後、ポリヌクレオチドを、当該微生物のゲノム又はｃＤＮＡライブラリーから同様にスクリーニングすることにより得てもよい。ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が（１以上の）プローブで検出されると、ポリヌクレオチドは、当業者に周知の技術を利用して、単離又はクローン化できる。（例えば、Sambrook et al, 1989, 上記と同様、を参照されたい）。
【０１２７】
セルロース分解性増強活性を有するポリペプチドにはまた、融合ポリペプチド、又はセルロース分解性増強活性を有するポリペプチド又はその断片のＮ−末端又はＣ−末端で、別のポリペプチドが融合する、切断可能な融合ポリペプチドが含まれる。融合ポリペプチドは、セルロース分解性増強活性を有するポリペプチドｈをコードするヌクレオチド配列（又はその部分）に、別のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（又はその部分）を融合することにより作製する。融合ポリペプチドを作製する技術は当業界で既知であり、これらはインフレームであり、且つ融合ポリペプチドの発現が同じ（１以上の）プロモーター及びターミネーターの制御下であるように、ポリペプチドをコードするコード配列とのライゲーションがある。
【０１２８】
セルロース分解性増強活性を有するポリペプチド及びそのポリヌクレオチドをさらに詳細にするため、国際公開第２００５／０７４６４７号、国際公開第２００５／０７４６５６号。及び米国特許出願第２００７／００７７６３０号を参照されたい。これらは参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２９】
セルロース分解性増強活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドは、本明細書で記載の通り、本発明の方法を実施するために単離及び利用できる。
【０１３０】
ポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、又は配列番号１３の成熟ポリペプチドコード配列と、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％、さらに最も好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、又は９９％の相同性を有し、セルロース分解性増強活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるか、前記ヌクレオチド配列からなる。
【０１３１】
好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、配列番号１を含んでなるか、前記配列からなる。別のより好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、エシェリキア・コリ（Escherichia coli） ＮＲＲＬ Ｂ−３０６９９に含まれるプラスミドｐＥＪＧ１２０に含まれる配列を含んでなるか、前記配列からなる。別の好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、配列番号１の成熟ポリペプチドコード領域を含んでなるか、前記成熟ポリペプチドコード領域からなる。別のより好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、エシェリキア・コリ ＮＲＲＬ Ｂ−３０６９９に含まれるプラスミドｐＥＪＧ１２０に含まれる成熟ポリペプチドコード領域を含んでなるか、前記成熟ポリペプチドコード領域からなる。本発明はまた、遺伝コードの縮重によって配列番号１又はその成熟ポリペプチドとは異なる、配列番号２のアミノ酸配列又はその成熟ポリペプチドを含んでなるか、前記成熟ポリペプチドからなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も包含する。本発明はまた、セルロース分解性増強活性を有する配列番号２の断片をコードする、配列番号１のサブ配列に関連する。
【０１３２】
別の好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、配列番号３を含んでなるか、前記配列からなる。別のより好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、エシェリキア・コリ ＮＲＲＬ Ｂ−３０８１３に含まれるプラスミドｐＴｔｅｒ６１Ｃに含まれる配列を含んでなるか、前記配列からなる。別の好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、配列番号３の成熟ポリペプチドコード領域を含んでなるか、前記成熟ポリペプチドコード領域からなる。別のより好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、エシェリキア・コリ ＮＲＲＬ Ｂ−３０８１３に含まれるプラスミドｐＴｔｅｒ６１Ｃに含まれる成熟ポリペプチドコード領域を含んでなるか、前記成熟ポリペプチドコード領域からなる。本発明はまた、遺伝コードの縮重によって配列番号３又はその成熟ポリペプチドとは異なる、配列番号４のアミノ酸配列又はその成熟ポリペプチドを含んでなるか、前記成熟ポリペプチドからなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も包含する。本発明はまた、セルロース分解性増強活性を有する配列番号４の断片をコードする、配列番号３のサブ配列に関連する。
【０１３３】
別の好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、配列番号５を含んでなるか、前記配列からなる。別のより好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、エシェリキア・コリ ＮＲＲＬ Ｂ−３０８１２に含まれるプラスミドｐＴｔｅｒ６１Ｄに含まれる配列を含んでなるか、前記配列からなる。別の好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、配列番号５の成熟ポリペプチドコード領域を含んでなるか、前記成熟ポリペプチドコード領域からなる。別のより好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、エシェリキア・コリ ＮＲＲＬ Ｂ−３０８１２に含まれるプラスミドｐＴｔｅｒ６１Ｄに含まれる成熟ポリペプチドコード領域を含んでなるか、前記成熟ポリペプチドコード領域からなる。本発明はまた、遺伝コードの縮重によって配列番号５又はその成熟ポリペプチドとは異なる、配列番号６のアミノ酸配列又はその成熟ポリペプチドを含んでなるか、前記成熟ポリペプチドからなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も包含する。本発明はまた、セルロース分解性増強活性を有する配列番号６の断片をコードする、配列番号５のサブ配列に関連する。
【０１３４】
別の好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、配列番号７を含んでなるか、前記配列からなる。別のより好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、エシェリキア・コリ ＮＲＲＬ Ｂ−３０８１４に含まれるプラスミドｐＴｔｅｒ６１Ｅに含まれる配列を含んでなるか、前記配列からなる。別の好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、配列番号７の成熟ポリペプチドコード領域を含んでなるか、前記成熟ポリペプチドコード領域からなる。別のより好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、エシェリキア・コリ ＮＲＲＬ Ｂ−３０８１４に含まれるプラスミドｐＴｔｅｒ６１Ｅに含まれる成熟ポリペプチドコード領域を含んでなるか、前記成熟ポリペプチドコード領域からなる。本発明はまた、遺伝コードの縮重によって配列番号７又はその成熟ポリペプチドとは異なる、配列番号８のアミノ酸配列又はその成熟ポリペプチドを含んでなるか、前記成熟ポリペプチドからなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も包含する。本発明はまた、セルロース分解性増強活性を有する配列番号８の断片をコードする、配列番号７のサブ配列に関連する。
【０１３５】
別の好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、配列番号９を含んでなるか、前記配列からなる。別のより好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、エシェリキア・コリ ＮＲＲＬ Ｂ−３０８１１に含まれるプラスミドｐＴｔｅｒ６１Ｇに含まれる配列を含んでなるか、前記配列からなる。別の好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、配列番号９の成熟ポリペプチドコード領域を含んでなるか、前記成熟ポリペプチドコード領域からなる。別のより好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、エシェリキア・コリ ＮＲＲＬ Ｂ−３０８１１に含まれるプラスミドｐＴｔｅｒ６１Ｇに含まれる成熟ポリペプチドコード領域を含んでなるか、前記成熟ポリペプチドコード領域からなる。本発明はまた、遺伝コードの縮重によって配列番号９又はその成熟ポリペプチドとは異なる、配列番号１０のアミノ酸配列又はその成熟ポリペプチドを含んでなるか、前記成熟ポリペプチドからなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も包含する。本発明はまた、セルロース分解性増強活性を有する配列番号１０の断片をコードする、配列番号９のサブ配列に関連する。
【０１３６】
別の好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、配列番号１１を含んでなるか、前記配列からなる。別のより好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、エシェリキア・コリ ＮＲＲＬ Ｂ−３０７０４に含まれるプラスミドｐＤＺＡ２−７に含まれる配列を含んでなるか、前記配列からなる。別の好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、配列番号１１の成熟ポリペプチドコード領域を含んでなるか、前記成熟ポリペプチドコード領域からなる。別のより好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、エシェリキア・コリ ＮＲＲＬ Ｂ−３０７０４に含まれるプラスミドｐＤＺＡ２−７に含まれる成熟ポリペプチドコード領域を含んでなるか、前記成熟ポリペプチドコード領域からなる。本発明はまた、遺伝コードの縮重によって配列番号１１又はその成熟ポリペプチドとは異なる、配列番号１２のアミノ酸配列又はその成熟ポリペプチドを含んでなるか、前記成熟ポリペプチドからなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も包含する。本発明はまた、セルロース分解性増強活性を有する配列番号１２の断片をコードする、配列番号１１のサブ配列に関連する。
【０１３７】
別の好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、配列番号１３を含んでなるか、前記配列からなる。別のより好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、エシェリキア・コリ ＮＲＲＬ Ｂ−３０８７８に含まれるプラスミドｐＴｒ３３３７に含まれる配列を含んでなるか、前記配列からなる。別の好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、配列番号１３の成熟ポリペプチドコード領域を含んでなるか、前記成熟ポリペプチドコード領域からなる。別のより好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、エシェリキア・コリ ＮＲＲＬ Ｂ−３０８７８に含まれるプラスミドｐＴｒ３３３７に含まれる成熟ポリペプチドコード領域を含んでなるか、前記成熟ポリペプチドコード領域からなる。本発明はまた、遺伝コードの縮重によって配列番号１３又はその成熟ポリペプチドとは異なる、配列番号１４のアミノ酸配列又はその成熟ポリペプチドを含んでなるか、前記成熟ポリペプチドからなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も包含する。本発明はまた、セルロース分解性増強活性を有する配列番号１４の断片をコードする、配列番号１３のサブ配列に関連する。
【０１３８】
本発明はまた、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、又は配列番号１３の成熟ポリペプチドコード配列中に、少なくとも１つの変異を含んでなる変異ポリヌクレオチドに関連し、ここで変異ヌクレオチド配列は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、又は配列番号１０、配列番号１２、又は配列番号１４の成熟ポリペプチドをコードする。好ましい態様によれば、成熟ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸２０〜３２６であるか、配列番号４のアミノ酸１８〜２４０であるか、配列番号６のアミノ酸２０〜２５８であるか、配列番号８のアミノ酸１９〜２２６であるか、配列番号１０のアミノ酸２０〜３０４であるか、配列番号１２のアミノ酸２３〜２５０であるか、配列番号１４のアミノ酸２０〜２４９である。別の好ましい態様によれば、成熟ポリペプチドコード配列は、配列番号１のヌクレオチド３８８〜１３３２であるか、配列番号３のヌクレオチド９８〜８２１であるか、配列番号５のヌクレオチド１２６〜９７８であるか、配列番号７のヌクレオチド５５〜６７８であるか、配列番号９のヌクレオチド５８〜９１２であるか、配列番号１１のヌクレオチド６７〜７９６であるか、配列番号１３のヌクレオチド７７〜７６６である。
【０１３９】
上記の通り、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離又はクローン化するために使用される技術は、当業者に既知であり、ゲノムＤＮＡからの単離、ｃＤＮＡからの調製、又はその組み合わせがある。
【０１４０】
ポリヌクレオチドはまた、（i）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、もしくは配列番号１３の成熟ポリペプチドコード配列、（ii）配列番号１、配列番号３、配列番号５、もしくは配列番号１１の成熟ポリペプチドコード配列に含有されるｃＤＮＡ配列、又は配列番号７、配列番号９、もしくは配列番号１３の成熟ポリペプチドコード配列を含んでなるゲノムＤＮＡ配列、又は（iii）（i）もしくは（ii）の全長相補鎖；又はその対立遺伝子多型及びサブ配列と、本明細書で定義の、好ましくは少なくとも超低ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも低ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中高ストリンジェンシー条件、さらにより好ましくは少なくとも高ストリンジェンシー条件、及び最も好ましくは少なくとも超高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズする、セルロース分解性増強活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるか、前記ヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチドであってもよい（Sambrook等、1989、上記と同様）。好ましい態様によれば、成熟ポリペプチドコード配列は、配列番号１のヌクレオチド３８８〜１３３２であるか、配列番号３のヌクレオチド９８〜８２１であるか、配列番号５のヌクレオチド１２６〜９７８であるか、配列番号７のヌクレオチド５５〜６７８であるか、配列番号９のヌクレオチド５８〜９１２であるか、配列番号１１のヌクレオチド６７〜７９６であるか、配列番号１３のヌクレオチド７７〜７６６である。
【０１４１】
ベータ−グルコシダーゼ及びそのポリヌクレオチド
セルロース含有物質の処理に有用なベータ−グルコシダーゼ活性を有する任意のポリペプチドは、本発明の組成物の成分となることができる。ベータ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、組成物を作製するために使用できる。
【０１４２】
第一の態様によれば、ベータ−グルコシダーゼ活性を有する単離ポリペプチドは、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、又は配列番号２８の成熟ポリペプチドと、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％、さらに最も好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、又は９９％の相同性を有し、ベータ−グルコシダーゼ活性を有するアミノ酸配列を含んでなるか、前記アミノ酸配列からなる（本明細書では以下「相同ポリペプチド」）。好ましい態様によれば、かかる相同ポリペプチドは、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、又は配列番号２８の成熟ポリペプチドと異なるアミノ酸を、１０個まで、好ましくは５個まで、より好ましくは４個まで、さらにより好ましくは３個まで、最も好ましくは２個まで、さらに最も好ましくは１個まで、含んでなるか、前記個数の異なるアミノ酸からなる。
【０１４３】
ベータ−グルコシダーゼ活性を有する単離ポリペプチドは、好ましくは配列番号１６のアミノ酸又はその対立遺伝子多型、又はそのベータ−グルコシダーゼ活性を有する断片を含んでなる。好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号１６のアミノ酸を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号１６の成熟ポリペプチドを含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号１６のアミノ酸２０〜８６１、又はその対立遺伝子多型、又はベータ−グルコシダーゼ活性を有するその断片を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号１６のアミノ酸２０〜８６１を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号１６のアミノ酸配列、又はその対立遺伝子多型、又はベータ−グルコシダーゼ活性を有するその断片からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号１６のアミノ酸配列からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号１６の成熟ポリペプチドからなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号１６のアミノ酸２０〜８６１、又はその対立遺伝子多型、又はベータ−グルコシダーゼ活性を有するその断片からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは配列番号１６のアミノ酸２０〜８６１からなる。
【０１４４】
ベータ−グルコシダーゼ活性を有する単離ポリペプチドは、好ましくは配列番号１８のアミノ酸又はその対立遺伝子多型、又はそのベータ−グルコシダーゼ活性を有する断片を含んでなる。好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号１８のアミノ酸を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号１８の成熟ポリペプチドを含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号１８のアミノ酸２０〜８６１、又はその対立遺伝子多型、又はベータ−グルコシダーゼ活性を有するその断片を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号１８のアミノ酸２０〜８６１を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号１８のアミノ酸配列、又はその対立遺伝子多型、又はベータ−グルコシダーゼ活性を有するその断片からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号１８のアミノ酸配列からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号１８の成熟ポリペプチドからなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号１８のアミノ酸２０〜８６１、又はその対立遺伝子多型、又はベータ−グルコシダーゼ活性を有するその断片からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは配列番号１８のアミノ酸２０〜８６１からなる。
【０１４５】
ベータ−グルコシダーゼ活性を有する単離ポリペプチドは、好ましくは配列番号２０のアミノ酸又はその対立遺伝子多型、又はそのベータ−グルコシダーゼ活性を有する断片を含んでなる。好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号２０の成熟ポリペプチドを含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸２０〜８６３、又はその対立遺伝子多型、又はベータ−グルコシダーゼ活性を有するその断片を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸２０〜８６３を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列、又はその対立遺伝子多型、又はベータ−グルコシダーゼ活性を有するその断片からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号２０の成熟ポリペプチドからなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸２０〜８６３、又はその対立遺伝子多型、又はベータ−グルコシダーゼ活性を有するその断片からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは配列番号２０のアミノ酸２０〜８６３からなる。
【０１４６】
ベータ−グルコシダーゼ活性を有する単離ポリペプチドは、好ましくは配列番号２２のアミノ酸又はその対立遺伝子多型、又はそのベータ−グルコシダーゼ活性を有する断片を含んでなる。好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号２２のアミノ酸を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号２２の成熟ポリペプチドを含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号２２のアミノ酸３７〜８７８、又はその対立遺伝子多型、又はベータ−グルコシダーゼ活性を有するその断片を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号２２のアミノ酸３７〜８７８を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号２２のアミノ酸配列、又はその対立遺伝子多型、又はベータ−グルコシダーゼ活性を有するその断片からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号２２のアミノ酸配列からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号２２の成熟ポリペプチドからなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号２２のアミノ酸３７〜８７８、又はその対立遺伝子多型、又はベータ−グルコシダーゼ活性を有するその断片からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは配列番号２２のアミノ酸３７〜８７８からなる。
【０１４７】
ベータ−グルコシダーゼ活性を有する単離ポリペプチドは、好ましくは配列番号２４のアミノ酸又はその対立遺伝子多型、又はそのベータ−グルコシダーゼ活性を有する断片を含んでなる。好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号２４のアミノ酸を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号２４の成熟ポリペプチドを含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号２４のアミノ酸３２〜７４４、又はその対立遺伝子多型、又はベータ−グルコシダーゼ活性を有するその断片を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号２４のアミノ酸３２〜７４４を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号２４のアミノ酸配列、又はその対立遺伝子多型、又はベータ−グルコシダーゼ活性を有するその断片からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号２４のアミノ酸配列からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号２４の成熟ポリペプチドからなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号２４のアミノ酸３２〜７４４、又はその対立遺伝子多型、又はベータ−グルコシダーゼ活性を有するその断片からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは配列番号２４のアミノ酸３２〜７４４からなる。
【０１４８】
ベータ−グルコシダーゼ活性を有する単離ポリペプチドは、好ましくは配列番号２６のアミノ酸又はその対立遺伝子多型、又はそのベータ−グルコシダーゼ活性を有する断片を含んでなる。好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号２６のアミノ酸を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号２６の成熟ポリペプチドを含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号２６のアミノ酸２０〜８６０、又はその対立遺伝子多型、又はベータ−グルコシダーゼ活性を有するその断片を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号２６のアミノ酸２０〜８６０を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号２６のアミノ酸配列、又はその対立遺伝子多型、又はベータ−グルコシダーゼ活性を有するその断片からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号２６のアミノ酸配列からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号２６の成熟ポリペプチドからなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号２６のアミノ酸２０〜８６０、又はその対立遺伝子多型、又はベータ−グルコシダーゼ活性を有するその断片からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは配列番号２６のアミノ酸２０〜８６０からなる。
【０１４９】
ベータ−グルコシダーゼ活性を有する単離ポリペプチドは、好ましくは配列番号２８のアミノ酸又はその対立遺伝子多型、又はそのベータ−グルコシダーゼ活性を有する断片を含んでなる。好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号２８のアミノ酸を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号２８の成熟ポリペプチドを含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号２８のアミノ酸２０〜８６０、又はその対立遺伝子多型、又はベータ−グルコシダーゼ活性を有するその断片を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号２８のアミノ酸２０〜８６０を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号２８のアミノ酸配列、又はその対立遺伝子多型、又はベータ−グルコシダーゼ活性を有するその断片からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号２８のアミノ酸配列からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号２８の成熟ポリペプチドからなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号２８のアミノ酸２０〜８６０、又はその対立遺伝子多型、又はベータ−グルコシダーゼ活性を有するその断片からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは配列番号２８のアミノ酸２０〜８６０からなる。
【０１５０】
好ましくは、配列番号１６の成熟ポリペプチドの断片は、アミノ酸残基を、少なくとも７２０個、より好ましくは少なくとも７６０個、最も好ましくは少なくとも８００個含有する。好ましくは、配列番号１８の成熟ポリペプチドの断片は、アミノ酸残基を、少なくとも７２０個、より好ましくは少なくとも７６０個、最も好ましくは少なくとも８００個含有する。好ましくは、配列番号２０の成熟ポリペプチドの断片は、アミノ酸残基を、少なくとも７７０個、より好ましくは少なくとも８００個、最も好ましくは少なくとも８３０個含有する。好ましくは、配列番号２２の成熟ポリペプチドの断片は、アミノ酸残基を、少なくとも７２０個、より好ましくは少なくとも７６０個、最も好ましくは少なくとも８００個含有する。好ましくは、配列番号２４の成熟ポリペプチドの断片は、アミノ酸残基を、少なくとも６２０個、より好ましくは少なくとも６５０個、最も好ましくは少なくとも６８０個含有する。好ましくは、配列番号２６の成熟ポリペプチドの断片は、アミノ酸残基を、少なくとも７２０個、より好ましくは少なくとも７６０個、最も好ましくは少なくとも８００個含有する。好ましくは、配列番号２８の成熟ポリペプチドの断片は、アミノ酸残基を、少なくとも７２０個、より好ましくは少なくとも７６０個、最も好ましくは少なくとも８００個含有する。
【０１５１】
好ましくは、配列番号１５の成熟ポリペプチドコード配列のサブ配列は、ヌクレオチドを、少なくとも２１６０個、より好ましくは少なくとも２２８０個、及び最も好ましくは２４００個含有する。好ましくは、配列番号１７の成熟ポリペプチドコード配列のサブ配列は、ヌクレオチドを、少なくとも２１６０個、より好ましくは少なくとも２２８０個、及び最も好ましくは２４００個含有する。好ましくは、配列番号１９の成熟ポリペプチドコード配列のサブ配列は、ヌクレオチドを、少なくとも２３１０個、より好ましくは少なくとも２４００個、及び最も好ましくは２４９０個含有する。好ましくは、配列番号２１の成熟ポリペプチドコード配列のサブ配列は、ヌクレオチドを、少なくとも２１６０個、より好ましくは少なくとも２２８０個、及び最も好ましくは２４００個含有する。好ましくは、配列番号２３の成熟ポリペプチドコード配列のサブ配列は、ヌクレオチドを、少なくとも１８６０個、より好ましくは少なくとも１９５０個、及び最も好ましくは２０４０個含有する。好ましくは、配列番号２５の成熟ポリペプチドコード配列のサブ配列は、ヌクレオチドを、少なくとも２１６０個、より好ましくは少なくとも２２８０個、及び最も好ましくは２４００個含有する。好ましくは、配列番号２７の成熟ポリペプチドコード配列のサブ配列は、ヌクレオチドを、少なくとも２１６０個、より好ましくは少なくとも２２８０個、及び最も好ましくは２４００個含有する。
【０１５２】
好ましい態様によれば、ベータ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドは、アスペルギルス・オリザエ ベータ−グルコシダーゼ遺伝子から得るポリヌクレオチドによりコードされる。最も好ましい実施態様によれば、ベータ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号１６の成熟ポリペプチドをコードする配列番号１５の成熟ポリペプチドコード配列を含んでなるアスペルギルス・オリザエ ベータ−グルコシダーゼ遺伝子から得るポリヌクレオチドによりコードされる。
【０１５３】
別の好ましい態様によれば、ベータ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドは、アスペルギルス・オリザエ ベータ−グルコシダーゼ変異遺伝子から得るポリヌクレオチドによりコードされる。最も好ましい実施態様によれば、ベータ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号１８の成熟ポリペプチドをコードする配列番号１７の成熟ポリペプチドコード配列を含んでなるアスペルギルス・オリザエ ベータ−グルコシダーゼ遺伝子から得るポリヌクレオチドによりコードされる。
【０１５４】
別の好ましい態様によれば、ベータ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドは、アスペルギルス・フミガタス ベータ−グルコシダーゼ遺伝子から得るポリヌクレオチドによりコードされる。最も好ましい実施態様によれば、ベータ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号２０の成熟ポリペプチドをコードする配列番号１９の成熟ポリペプチドコード配列を含んでなるアスペルギルス・フミガタス ベータ−グルコシダーゼ遺伝子から得るポリヌクレオチドによりコードされる。
【０１５５】
別の好ましい態様によれば、ベータ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドは、ペニシリウム・ブラシリアナム（Penicillium brasilianum）系統ＩＢＴ ２０８８８ ベータ−グルコシダーゼ遺伝子から得るポリヌクレオチドによりコードされる。最も好ましい実施態様によれば、ベータ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号２２の成熟ポリペプチドをコードする配列番号２１の成熟ポリペプチドコード配列を含んでなるペニシリウム・ブラシリアナム系統ＩＢＴ ２０８８８ ベータ−グルコシダーゼ遺伝子から得るポリヌクレオチドによりコードされる。
【０１５６】
別の好ましい態様によれば、ベータ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドは、トリコデルマ・リーゼイ系統ＱＭ９４１４番 ベータ−グルコシダーゼ遺伝子から得るポリヌクレオチドによりコードされる。最も好ましい実施態様によれば、ベータ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号２４の成熟ポリペプチドをコードする配列番号２３の成熟ポリペプチドコード配列を含んでなるトリコデルマ・リーゼイ系統ＱＭ９４１４番ベータ−グルコシダーゼ遺伝子から得るポリヌクレオチドによりコードされる（ＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号Ｕ０９５８０）。
【０１５７】
別の好ましい態様によれば、ベータ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドは、アスペルギルス・ニゲル ベータ−グルコシダーゼ遺伝子から得るポリヌクレオチドによりコードされる。最も好ましい実施態様によれば、ベータ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号２６の成熟ポリペプチドをコードする配列番号２５の成熟ポリペプチドコード配列を含んでなるアスペルギルス・ニゲル ベータ−グルコシダーゼ遺伝子から得るポリヌクレオチドによりコードされる（ＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号ＡＪ１３２３８６）。
【０１５８】
別の好ましい態様によれば、ベータ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドは、アスペルギルス・アクレアタス ベータ−グルコシダーゼ遺伝子から得るポリヌクレオチドによりコードされる。最も好ましい実施態様によれば、ベータ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号２８の成熟ポリペプチドをコードする配列番号２７の成熟ポリペプチドコード配列を含んでなるアスペルギルス・アクレアタス ベータ−グルコシダーゼ遺伝子から得るポリヌクレオチドによりコードされる（ＥＭＢＬ受託番号Ｄ６４０８８）。
【０１５９】
ベータ−グルコシダーゼ活性を有するアスペルギルス・オリザエ ポリペプチドは、国際公開第２００２／０９５０１４号により得ることができる。ベータ−グルコシダーゼ活性を有するアスペルギルス・オリザエ ポリペプチド変異体は、国際公開第２００４／０９９２２８号により得ることができる。ベータ−グルコシダーゼ活性を有するアスペルギルス・フミガタス ポリペプチドは、国際公開第２００５／０４７４９９号により得ることができる。ベータ−グルコシダーゼ活性を有するペニシリウム・ブラシリアナム ポリペプチドは、国際公開第２００７／０１９４４２号により得ることができる。ベータ−グルコシダーゼ活性を有するトリコデルマ・リーゼイ系統ＱＭ９４１４番ポリペプチドは、米国特許第６,０２２,７２５号により得ることができる。ベータ−グルコシダーゼ活性を有するアスペルギルス・ニゲル ポリペプチドは、Dan et al., 2000, J. Biol. Chem. 275: 4973-4980により得ることができる。ベータ−グルコシダーゼ活性を有するアスペルギルス・アクレアタス ポリペプチドは、Kawaguchi et al., 1996, Gene 173: 287-288により得ることができる。
【０１６０】
好ましい態様によれば、配列番号１６の成熟ポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＳＭ １４２４０に含まれるプラスミドに含まれるポリヌクレオチドによりコードされる。別の好ましい態様によれば、配列番号２０の成熟ポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉＮＲＲＬ Ｂ−３０６９５に含まれるプラスミドpＥＪＧ１１３に含まれるポリヌクレオチドによりコードされる。別の好ましい態様によれば、配列番号２２の成熟ポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉＮＲＲＬ Ｂ−３０８６０に含まれるプラスミドpＫＫＡＢに含まれるポリヌクレオチドによりコードされる。
【０１６１】
第二の態様によれば、ベータ−グルコシダーゼ活性を有する単離ポリペプチドは、（i）配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、もしくは配列番号２７の成熟ポリペプチドコード配列、（ii）配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、もしくは配列番号２７の成熟ポリペプチドコード配列に含有されるｃＤＮＡ、又はそれを含んでなるゲノムＤＮＡ配列、（iii）（i）もしくは（ii）のサブ配列、又は（iv）（i）、（ii）もしくは（iii）の全長相補鎖と、好ましくは少なくとも超低ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも低ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中高ストリンジェンシー条件、さらにより好ましくは少なくとも高ストリンジェンシー条件、及び最も好ましくは少なくとも超高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズする、ヌクレオチド配列を含んでなるか、前記ヌクレオチド配列からなる（J. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, 上記と同様）。配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、もしくは配列番号２７の成熟ポリペプチドコード配列のサブ配列は、少なくとも１００個の連続ヌクレオチド又は好ましくは少なくとも２００個の連続ヌクレオチドを含有する。さらに、サブ配列はベータ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド断片をコードしてもよい。
【０１６２】
配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、もしくは配列番号２７のヌクレオチド配列、又はそのサブ配列、並びに配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、又は配列番号２８のアミノ酸配列、又はその断片は、上記の異なる属又は種の系統からベータ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを同定及びクローン化する核酸プローブを設計するために使用してもよい。
【０１６３】
本発明の目的に応じて、ハイブリダイゼーションとは、ヌクレオチド配列を、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、もしくは配列番号２７の成熟ポリペプチドコード配列、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、もしくは配列番号２７の成熟ポリペプチドコード配列に含有されるｃＤＮＡ、又はそれを含んでなるゲノムＤＮＡ配列、その全長相補鎖、又はそのサブ配列に対応する標識核酸プローブと、上記と同様に超低から超高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることを示す。
【０１６４】
好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号１５の成熟ポリペプチドコード配列である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号１５のヌクレオチド５８〜２５８４である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号１６のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、又はそのサブ配列である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは配列番号１５である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、Ｅ.ｃｏｌｉ. ＤＳＭ １４２４０に含まれるポリヌクレオチド配列であり、当該ポリヌクレオチド配列はベータ−グリコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、Ｅ.ｃｏｌｉ. ＤＳＭ １４２４０に含まれる成熟ポリペプチドコード領域である。
【０１６５】
別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号１７の成熟ポリペプチドコード配列である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号１７のヌクレオチド５８〜２５８４である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号１８のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、又はそのサブ配列である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは配列番号１７である。
【０１６６】
別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号１９の成熟ポリペプチドコード配列である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号１９のヌクレオチド７３〜１４１３である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号２０のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、又はそのサブ配列である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは配列番号１９である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、Ｅ.ｃｏｌｉ. ＮＲＲＬ Ｂ−３０６９５に含まれるプラスミドｐＥＪＧ１１３に含まれるポリヌクレオチド配列であり、当該ポリヌクレオチド配列はベータ−グリコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、Ｅ.ｃｏｌｉ. ＮＲＲＬ Ｂ−３０６９５に含まれるプラスミドｐＥＪＧ１１３に含まれる成熟ポリペプチドコード領域である。
【０１６７】
別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号２１の成熟ポリペプチドコード配列である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号２１のヌクレオチド６７〜１３７７である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号２２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、又はそのサブ配列である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは配列番号２１である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、Ｅ.ｃｏｌｉ. ＮＲＲＬ Ｂ−３０８６０に含まれるプラスミドｐＫＫＡＢに含まれるポリヌクレオチド配列であり、当該ポリヌクレオチド配列はベータ−グリコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、Ｅ.ｃｏｌｉ. ＮＲＲＬ Ｂ−３０８６０に含まれるプラスミドｐＫＫＡＢに含まれる成熟ポリペプチドコード領域である。
【０１６８】
別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号２３の成熟ポリペプチドコード配列である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号２３のヌクレオチド８８〜２２３２である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号２４のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、又はそのサブ配列である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは配列番号２３である。
【０１６９】
別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号２５の成熟ポリペプチドコード配列である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号２５のヌクレオチド５９〜２５８０である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号２６のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、又はそのサブ配列である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは配列番号２５である。
【０１７０】
別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号２７の成熟ポリペプチドコード配列である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号２７のヌクレオチド５９〜２５８０である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号２８のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、又はそのサブ配列である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは配列番号２７である。
【０１７１】
少なくとも１００ヌクレオチド長の長いプローブのための、超低〜超高ストリンジェンシー条件は、本明細書での定義の通りである。
【０１７２】
少なくとも１００ヌクレオチド長の長いプローブにおいて、担体物質は、本明細書での定義の通り最終的に洗浄する。
【０１７３】
約１５ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチド長の短いプローブのための、ストリンジェンシー条件は、本明細書での定義の通りである。
【０１７４】
約１５ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチド長の短いプローブにおいて、担体物質は、本明細書での定義の通り最終的に洗浄する。
【０１７５】
第三の態様によれば、ベータ−グリコシダーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、もしくは配列番号２７の成熟ポリペプチドコード配列と、好ましくは、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％、さらに最も好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、又は９９％の相同性を有し、ベータ−グリコシダーゼ活性を有するヌクレオチド配列を含んでなるか、それらからなるポリヌクレオチドによりコードされる。
【０１７６】
第六の態様によれば、ベータ−グリコシダーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、又は配列番号２８の成熟ポリペプチドの１以上（複数）のアミノ酸配列、又はその相同配列の、置換、削除、及び／又は挿入を含んでなる人工的変異体である。当該人工的変異体の調製方法は、上記と同様である。
【０１７７】
配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、又は配列番号２８の成熟ポリペプチドにおける、アミノ酸の置換、削除、及び／又は挿入の総数は、１０個、好ましくは９個、より好ましくは８個、より好ましくは７個、より好ましくは最大で６個、より好ましくは５個、より好ましくは４個、さらにより好ましくは３個、最も好ましくは２個、及びさらに最も好ましくは１個である。
【０１７８】
別の好ましい態様によれば、ベータ−グリコシダーゼ活性を有するポリペプチドは、ファミリー１ベータ−グリコシダーゼ遺伝子から得るポリヌクレオチドによりコードされる。
【０１７９】
別の好ましい態様によれば、ベータ−グリコシダーゼ活性を有するポリペプチドは、ファミリー３ベータ−グリコシダーゼ遺伝子から得るポリヌクレオチドによりコードされる。
【０１８０】
別の好ましい態様によれば、ベータ−グリコシダーゼ活性を有するポリペプチドは、ファミリー５ベータ−グリコシダーゼ遺伝子から得るポリヌクレオチドによりコードされる。
【０１８１】
本発明においてポリヌクレオチドのための供給源として使用できる他のベータ−グリコシダーゼの例としては、限定するものではないが、アスペルギルス・オリザエ ベータ−グリコシダーゼ（国際公開第０２／０９５０１４号；国際公開第０４／０９９２２８号）；アスペルギルス・アクレアタス ベータ−グリコシダーゼ（Kawaguchi et al., 1996, Gene 173: 287-288）；アスペルギルス・アベナセウス（Aspergillus avenaceus）ベータ−グリコシダーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号ＡＹ９４３９７１）；アスペルギルス・フミガタス ベータ−グリコシダーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号ＸＭ７４５２３４）；アスペルギルス・カワチイ ベータ−グリコシダーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号ＡＢ００３４７０）；アスペルギルス・ニゲル ベータ−グリコシダーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号ＡＪ１３２３８６）；マグナポルテ・グリセア ベータ−グリコシダーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号ＡＹ８４９６７０）；ファネロカエテ・クリソスポリウム ベータ−グリコシダーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号ＡＢ２５３３２７）；タラロマイセス・エメルソニイ（Talaromyces emersonii）ベータ−グリコシダーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号ＡＹ０７２９１８）、及びトリコデルマ・リーゼイ ベータ−グリコシダーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号Ｕ０９５８０、ＡＢ００３１１０、ＡＹ２８１３７４、ＡＹ２８１３７５、ＡＹ２８１３７７、ＡＹ２８１３７８、及びＡＹ２８１３７９）がある。ベータ−グルコシダーゼの変異体は、国際公開第０４／０９９２２８号での記載と同じポリヌクレオチドのための供給源を使用してもよい。
【０１８２】
その他のベータ−グリコシダーゼは、more than 13 of the Glycosyl Hydrolase families using the classification according to Henrissat B., 1991, A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities, Biochem. J. 280: 309- 316, and Henrissat B., and Bairoch A., 1996, Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases, Biochem. J. 316: 695-696に開示されている。
【０１８３】
ベータ−グリコシダーゼ活性を有するポリペプチドは、任意の属の微生物から得てもよい。本発明の目的に応じて、「から得る」なる用語は本明細書での定義の通りに使用される。好ましい態様によれば、所与の供給源から得られるポリペプチドは、細胞外に分泌される。
【０１８４】
ベータ−グリコシダーゼ活性を有するポリペプチドは、細菌ポリペプチドであってもよい。例えば、ポリペプチドは、グラム陽性細菌ポリペプチド、例えば、ベータ−グリコシダーゼ活性を有するバチルス、ストレプトコッカス、ストレプトマイセス、スタフィロコッカス、エンテロコッカス、ラクトバチルス、ラクトコッカス、クロストリジウム、ゲオバチルス、又はオセアノバチルスのポリペプチド、又はグラム陰性細菌ポリペプチド、例えば、ベータ−グリコシダーゼ活性を有する、Ｅ.ｃｏｌｉ、シュードモナス、サルモネラ、カンピロバクター、ヘリコバクター、フラボマクテリウム、フソバクテリウム、イリオバクター、ネイセリア、又はウレアプラズマのポリペプチドがある。
【０１８５】
好ましい態様によれば、ポリペプチドは、ベータ−グリコシダーゼ活性を有する、バチルス・アルカロフィルス、バチルス・アミロリクエファシエンス、バチルス・ブレビス、バチルス・サークランス、バチルス・クラウジイ、バチルス・コーグランス、・ファームス、バチルス・ロートス、バチルス・レンタス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・メガテリウム、バチルス・プミルス、バチルス・ステアロセルモフィルス、・サブチリス、又はバチルス・サーリンギエンシスのポリペプチドである。
【０１８６】
別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、ベータ−グリコシダーゼ活性を有する、ストレプトコッカス・エクイシミリス、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッカス・ウベリス、ストレプトコッカス・エキ 亜種、ゾエピデミクスのポリペプチドである。
【０１８７】
別の態様によれば、ポリペプチドは、ベータ−グリコシダーゼ活性を有する、ストレプトマイセス・アクロモゲネス、ストレプトマイセス・アベルミチリス、ストレプトマイセス・コエリコロル、ストレプトマイセス・グリセウス、又はストレプトマイセス・リビダンスのポリペプチドである。
【０１８８】
別の態様によれば、ベータ−グリコシダーゼ活性を有するポリペプチドには、真菌ポリペプチドもあり、より好ましくは酵母ポリペプチド、例えば、ベータ−グリコシダーゼ活性を有する、カンジダ、クルイベロマイセス、ピキア、サッカロマイセス、スキゾサッカロマイセス、又はヤロウィアペプチド；又はより好ましくは、繊維状真菌ポリペプチド、例えば、ベータ−グリコシダーゼ活性を有する、アクレモニウム、アガリクス、アルタナリア、アスペルギルス、オウレオバシジウム、ボトリオスパエリア、セリポリオプシス、カエトミジウム、クリソスポリウム、クラビセプス、コクリオボルス、コプリノプシス、コプトテルメス、コリナスカス、クリホネクトリア、クリプトコッカス、ジプロディア、エキシジア、フィリバシジウム、フサリウム、ギベレラ、ホロマスチゴトイデス、フミコラ、イルペックス、レンチヌラ、レプトスパエリア、マグナポルテ、メラノカルプス、メリピラス、ムコール、ミセリオフトラ、ネオカリマスティクス、ニューロスポラ、パエシロマイセス、ペンンルシリウム、ファネロカエテ、ピロマイセス、ポイトラシア、シュードプレクタニア、シュードトリコニンファ、リゾムコール、スキゾフィラム、スキタリジウム、タラロマイセス、サーモアスカス、チエラビア、トリポダジウム、トリコデルマ、トリコファエア、ベルチシリウム、ボルバリエラ、又はキシラリアのポリペプチドがある。
【０１８９】
好ましい態様によれば、ポリペプチドは、ベータ−グリコシダーゼ活性を有するサッカロマイセス・カリスベルゲンシス、サッカロマイセス・セレビシアエ、サッカロマイセス・ジアスタチクス、サッカロマイセス・ドウグラシイ、サッカロマイセス・クルイベリ、サッカロマイセス・ノルベンシス、又はサッカロマイセス・オニフォルミスのポリペプチドである。
【０１９０】
別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、ベータ−グリコシダーゼ活性を有する、アクレモニウム・セルロリティクス、アスペルギルス・アクレタス、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・フミガタス、アスペルギルス・ホエチダス、アスペルギルス・ジャポニクス、アスペルギルス・ニデュランス、アスペルギルス・ニゲル、アスペルギルス・オリザエ、クリソスポリウム・ケラチノフィルム、クリソスポリウム・ルクノウェンセ、クリソスポリウム・トロピクム、クリソスポリウム・メルダリウム、クリソスポリウム・イノプス、クリソスポリウム・パンニコラ、クリソスポリウム・クエエンスランジクム、クリソスポリウム・ゾナタム、フサリウム・バクトリジオイデス、フサリウム・セレアリス、フサリウム・クロオクウェレンセ、フサリウム・クルモルム、フサリウム・グラミネアルム、フサリウム・グラミヌム、フサリウム・ヘテロスポルム、フサリウム・ネグンジ、フサリウム・オキシスポラム、フサリウム・レチクラタム、フサリウム・レセウム、フサリウム・サンブシヌム、フサリウム・サルコクロウム、フサリウム・スポロトリチオイデス、フサリウム・スルフレウム、フサリウム・トルロサム、フサリウム・トリコテシオイデス、フサリウム・ベネナタム、フミコラ・グリセア、フミコラ・インソレンス、フミコラ・ラヌギノサ、イルペックス・ラクテウス、ムコール・ミエヘイ、ミセリオフトラ・サーモフィラ、ネウロスポラ・クラッサ、ペニシリウム・フニクロスム、ペニシリウム・プルプロゲナム、ファネロカエテ・クリソスポリウム、ファネロカエテ・クリソスポリウム、チエラビア・アクロマティカ、チエラビア・アルボマイセス、チエラビア・アルボピロサ、チエラビア・オウストラレインシス、チエラビア・フィメチ、チエラビア・ミクロスポレ、チエラビア・オビスポラ、チエラビア・ペルビアナ、チエラビア・スペデドニウム、チエラビア・セトサ、チエラビア・サブサーモフィラ、チエラビア・テレストリス、トリコデルマ・ハルジアナム、トリコデルマ・クニンギイ、トリコデルマ・ロンギブラキアタム、トリコデルマ・リーゼイ、トリコデルマ・ビリデ、又はトリコファエア・サクタのポリペプチドである。
【０１９１】
上記の種について、本発明は、完全及び不完全な状態、及び一般に知られる種名に関係なく、その他の分類学上同等物、例えばアナモルフを包含すると理解されるだろう。当業者は、適切な同等物の相同性を容易に理解するであろう。
【０１９２】
これらの種の系統は、多数の菌株保存施設、例えばAmerican Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH （ＤＳＭ）、Centraalbureau Voor Schimmelcultures （ＣＢＳ）、及びAgricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center （ＮＲＲＬ）等で一般に容易に入手可能である。
【０１９３】
さらには、当該ポリペプチドは、本明細書に記載の通り、上記のプローブを用いて、天然物（例えば土壌、堆肥、廃棄物等）から単離される微生物等のその他の供給源から同定及び得ることができる。
【０１９４】
ベータ−グリコシダーゼ活性を有するポリペプチドには、別のポリペプチドがそのポリペプチド又はベータ−グリコシダーゼ活性を有するその断片のＮ−末端又はＣ−末端で融合する、融合ポリペプチド又は切断可能な融合ポリペプチドが含まれる。融合ポリペプチドは、本明細書で記載の通りに作製される。
【０１９５】
ベータ−グリコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるか、前記ヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドは、本発明の方法を実施するために、本明細書に記載の通り、単離及び利用できる。
【０１９６】
ポリヌクレオチドは、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、もしくは配列番号２７の成熟ポリペプチドコード配列と、好ましくは、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％、さらに最も好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、又は９９％の相同性を有し、ベータ−グリコシダーゼ活性を有するヌクレオチド配列を含んでなるか、前記ヌクレオチド配列からなる。
【０１９７】
好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、配列番号１５を含んでなるか、前記配列からなる。別のより好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、Ｅ.ｃｏｌｉ ＤＳＭ １４２４０に含まれる配列を含んでなるか、前記配列からなる。別の好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、配列番号１５の成熟ポリペプチドコード領域を含んでなるか、前記成熟ポリペプチドコード領域からなる。別の好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、配列番号１５のヌクレオチド５８〜２５８４を含んでなるか、前記ヌクレオチドからなる。別のより好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、Ｅ.ｃｏｌｉ ＤＳＭ １４２４０に含まれる成熟ポリペプチドコード領域を含んでなるか、前記成熟ポリペプチドコード領域からなる。本発明はまた、遺伝コードの縮重によって配列番号１５又はその成熟ポリペプチドコード配列とは異なる、配列番号１６のアミノ酸配列又はその成熟ポリペプチドを含んでなるか、前記成熟ポリペプチドからなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も包含する。本発明はまた、ベータ−グルコシダーゼ活性を有する配列番号１６の断片をコードする、配列番号１５のサブ配列に関連する。
【０１９８】
別の好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、配列番号１７を含んでなるか、前記配列からなる。別の好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、配列番号１７の成熟ポリペプチドコード領域を含んでなるか、前記成熟ポリペプチドコード領域からなる。別の好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、配列番号１７のヌクレオチド５８〜２５８４を含んでなるか、前記配列からなる。本発明はまた、遺伝コードの縮重によって配列番号１７又はその成熟ポリペプチドコード配列とは異なる、配列番号１８のアミノ酸配列又はその成熟ポリペプチドを含んでなるか、前記成熟ポリペプチドからなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も包含する。本発明はまた、ベータ−グルコシダーゼ活性を有する配列番号１８の断片をコードする、配列番号１７のサブ配列に関連する。
【０１９９】
別の好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、配列番号１９を含んでなるか、前記配列からなる。別のより好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、Ｅ.ｃｏｌｉ. ＮＲＲＬ Ｂ−３０６９５に含まれるプラスミドｐＥＪＧ１１３に含まれる配列を含んでなるか、前記配列からなる。別の好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、配列番号１９の成熟ポリペプチドコード領域を含んでなるか、前記成熟ポリペプチドコード領域からなる。別の好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、配列番号１９のヌクレオチド５８〜２５８０を含んでなるか、前記配列からなる。別のより好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、Ｅ.ｃｏｌｉ. ＮＲＲＬ Ｂ−３０６９５に含まれるに含まれるプラスミドｐＥＪＧ１１３成熟ポリペプチドコード領域を含んでなるか、前記成熟ポリペプチドコード領域からなる。本発明はまた、遺伝コードの縮重によって配列番号１９又はその成熟ポリペプチドコード配列とは異なる、配列番号２０のアミノ酸配列又はその成熟ポリペプチドを含んでなるか、前記成熟ポリペプチドからなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も包含する。本発明はまた、ベータ−グルコシダーゼ活性を有する配列番号２０の断片をコードする、配列番号１９のサブ配列に関連する。
【０２００】
別の好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、配列番号２１を含んでなるか、前記配列からなる。別のより好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、Ｅ.ｃｏｌｉ. ＮＲＲＬ Ｂ−３０８６０に含まれるプラスミドｐＫＫＡＢに含まれる配列を含んでなるか、前記成熟ポリペプチドコード領域からなる。別の好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、配列番号２１の成熟ポリペプチドコード領域を含んでなるか、前記成熟ポリペプチドコード領域からなる。別の好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、配列番号２１のヌクレオチド１０９〜２７５１を含んでなるか、前記ヌクレオチドからなる。別のより好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、Ｅ.ｃｏｌｉ. ＮＲＲＬ Ｂ−３０８６０に含まれるプラスミドｐＫＫＡＢに含まれる成熟ポリペプチドコード領域を含んでなるか、前記成熟ポリペプチドコード領域からなる。本発明はまた、遺伝コードの縮重によって配列番号２１又はその成熟ポリペプチドコード配列とは異なる、配列番号２２のアミノ酸配列又はその成熟ポリペプチドを含んでなるか、前記成熟ポリペプチドからなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も包含する。本発明はまた、ベータ−グルコシダーゼ活性を有する配列番号２２の断片をコードする、配列番号２１のサブ配列に関連する。
【０２０１】
別の好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、配列番号２３を含んでなるか、前記配列からなる。別の好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、配列番号２３の成熟ポリペプチドコード領域を含んでなるか、前記成熟ポリペプチドコード領域からなる。別の好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、配列番号２３のヌクレオチド８８〜２２３２を含んでなるか、前記ヌクレオチドからなる。本発明はまた、遺伝コードの縮重によって配列番号２３又はその成熟ポリペプチドコード配列とは異なる、配列番号２４のアミノ酸配列又はその成熟ポリペプチドを含んでなるか、前記成熟ポリペプチドからなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も包含する。本発明はまた、ベータ−グルコシダーゼ活性を有する配列番号２４の断片をコードする、配列番号２３のサブ配列に関連する。
【０２０２】
別の好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、配列番号２５を含んでなるか、前記配列からなる。別の好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、配列番号２５の成熟ポリペプチドコード領域を含んでなるか、前記成熟ポリペプチドコード領域からなる。別の好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、配列番号２３のヌクレオチド８８〜２２３２を含んでなるか、前記ヌクレオチドからなる。本発明はまた、遺伝コードの縮重によって配列番号２５又はその成熟ポリペプチドコード配列とは異なる、配列番号２６のアミノ酸配列又はその成熟ポリペプチドを含んでなるか、前記成熟ポリペプチドからなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も包含する。本発明はまた、ベータ−グルコシダーゼ活性を有する配列番号２６の断片をコードする、配列番号２５のサブ配列に関連する。
【０２０３】
別の好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、配列番号２７を含んでなるか、前記配列からなる。別の好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、配列番号２７の成熟ポリペプチドコード領域を含んでなるか、前記成熟ポリペプチドからなる。別の好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、配列番号２３のヌクレオチド８８〜２２３２を含んでなるか、前記ヌクレオチドからなる。本発明はまた、遺伝コードの縮重によって配列番号２７又はその成熟ポリペプチドコード配列とは異なる、配列番号２８のアミノ酸配列又はその成熟ポリペプチドを含んでなるか、前記成熟ポリペプチドからなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も包含する。本発明はまた、ベータ−グルコシダーゼ活性を有する配列番号２８の断片をコードする、配列番号２７のサブ配列に関連する。
【０２０４】
本発明はまた、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、もしくは配列番号２７の成熟ポリペプチドコード配列中に、少なくとも１つの変異を含んでなる変異ポリヌクレオチドに関連し、ここで変異ヌクレオチド配列は、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、又は配列番号２８の成熟ポリペプチドをコードする。
【０２０５】
上記の通り、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離又はクローン化するために使用される技術は、当業者に既知であり、ゲノムＤＮＡからの単離、ｃＤＮＡからの調製、又はその組み合わせがある。
【０２０６】
ポリヌクレオチドはまた、（i）配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、もしくは配列番号２７の成熟ポリペプチドコード配列、（ii）配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、もしくは配列番号２７の成熟ポリペプチドコード配列に含有されるｃＤＮＡ、又はそれを含んでなるゲノムＤＮＡ配列、（iii）（i）もしくは（ii）のサブ配列、又はその対立遺伝子多型及びサブ配列と、本明細書で定義の通りの、好ましくは少なくとも超低ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも低ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中高ストリンジェンシー条件、さらにより好ましくは少なくとも高ストリンジェンシー条件、及び最も好ましくは少なくとも超高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズする、ヌクレオチド配列を含んでなるか、前記ヌクレオチド配列からなる（Sambrook et al., 1989, 上記と同様）。
【０２０７】
上記の好ましい態様の各々によれば、成熟ポリペプチドは、配列番号１６のアミノ酸２０〜８６１であるか、配列番号１８のアミノ酸２０〜８６１であるか、配列番号２２のアミノ酸２０〜８６３であるか、配列番号２２のアミノ酸３７〜８７８であるか、配列番号２４のアミノ酸３２〜７４４であるか、配列番号２６のアミノ酸２０〜８６０であるか、もしくは配列番号２８のアミノ酸２０〜８６０であり、又は配列番号１５のアミノ酸５８〜２５８４であるか、配列番号１７のアミノ酸５８〜２５８４であるか、配列番号１９のアミノ酸７３〜１４１３であるか、配列番号２１のアミノ酸６７〜１３７７であるか、配列番号２３のアミノ酸８８〜２２３２であるか、配列番号２５のアミノ酸５９〜２５８０であるか、配列番号２７のアミノ酸５９〜２５８０である。
【０２０８】
ベータ−グルコシダーゼ融合ポリペプチド及びそのポリヌクレオチド
ベータ−グルコシダーゼは、ベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質の状態であることもできる。ベータ−グルコシダーゼ融合ポリペプチドは、ベータ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（又はその部分）を、エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（又はその部分）、及びエンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（又はその部分）と作動的に結合したシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列と融合することにより作製する。融合ポリペプチドを作製するための技術は、当業界で既知であり、例えば、これらはインフレームであり、且つ融合ポリペプチドの発現が同じ（１以上の）プロモーター及びターミネーターの制御下であるように、ポリペプチドをコードするコード配列を連結するものがある。融合タンパク質はまた、融合体が翻訳後に作られるインテイン技術を用いて構築してもよい（Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779）。
【０２０９】
少なくともインフレームでシグナルペプチドと結合したエンドグルカナーゼの触媒ドメインを含んでなる、ベータ−グルコシダーゼ活性を有する融合タンパク質は、少なくともエンドグルカナーゼの触媒ドメインが不存在である状態と比較して、融合タンパク質分泌を増加させる。かかるベータ−グルコシダーゼ活性を有する融合タンパク質分泌の増加は、少なくともエンドグルカナーゼの触媒ドメインが不存在である状態と比較して、少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも１００％、さらにより好ましくは少なくとも１５０％、さらにより好ましくは少なくとも２００％、最も好ましくは少なくとも５００％、及びさらに最も好ましくは少なくとも１０００％である。
【０２１０】
以下の好ましい態様の各々によれば、ベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質構築物の成分は、構築物の５'末端から３'末端に作動的に結合される。
【０２１１】
好ましい態様によれば、ベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質構築物は、シグナルペプチドをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド；エンドグルカナーゼの触媒ドメインをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド；及びベータ−グルコシダーゼの触媒ドメインをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド、を含んでなる。
【０２１２】
別の好ましい態様によれば、ベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質構築物は、シグナルペプチドをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド；エンドグルカナーゼの成熟ペプチドをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド；及びベータ−グルコシダーゼの触媒ドメインをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド、を含んでなる。
【０２１３】
別の好ましい態様によれば、ベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質構築物は、シグナルペプチドをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド；エンドグルカナーゼの触媒ドメインをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド；及びベータ−グルコシダーゼの成熟ペプチドをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド、を含んでなる。
【０２１４】
別の好ましい態様によれば、ベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質構築物は、シグナルペプチドをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド；エンドグルカナーゼの成熟ペプチドをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド；及びベータ−グルコシダーゼの成熟ペプチドをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド、を含んでなる。
【０２１５】
別の好ましい態様によれば、ベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質構築物は、シグナルペプチドをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド；エンドグルカナーゼの触媒ドメインをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド；及びベータ−グルコシダーゼの全長ポリペプチドをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド、を含んでなる。
【０２１６】
別の好ましい態様によれば、ベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質構築物は、シグナルペプチドをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド；エンドグルカナーゼの成熟ポリペプチドをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド；及びベータ−グルコシダーゼの全長ポリペプチドをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド、を含んでなる。
【０２１７】
別の好ましい態様によれば、ベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質構築物は、エンドグルカナーゼの全長ポリペプチド（単一ペプチド又は成熟ポリペプチド）をコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド；及びベータ−グルコシダーゼの全長ポリペプチドをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド、を含んでなる。
【０２１８】
別の好ましい態様によれば、ベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質構築物は、シグナルペプチドをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド；エンドグルカナーゼの触媒ドメイン、及び任意にリンカー及び／又はセルロース結合ドメインをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド；及びベータ−グルコシダーゼの触媒ドメインをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド、を含んでなる。
【０２１９】
別の好ましい態様によれば、ベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質構築物は、シグナルペプチドをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド；エンドグルカナーゼの成熟ポリペプチド、及び任意にリンカー及び／又はセルロース結合ドメインをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド；及びベータ−グルコシダーゼの触媒ドメインをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド、を含んでなる。
【０２２０】
別の好ましい態様によれば、ベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質構築物は、シグナルペプチドをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド；エンドグルカナーゼの触媒ドメイン、及び任意にリンカー及び／又はセルロース結合ドメインをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド；及びベータ−グルコシダーゼの成熟ポリペプチドをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド、を含んでなる。
【０２２１】
別の好ましい態様によれば、ベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質構築物は、シグナルペプチドをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド；エンドグルカナーゼの成熟ポリペプチド、及び任意にリンカー及び／又はセルロース結合ドメインをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド；及びベータ−グルコシダーゼの成熟ポリペプチドをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド、を含んでなる。
【０２２２】
別の好ましい態様によれば、ベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質構築物は、シグナルペプチドをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド；エンドグルカナーゼの触媒ドメイン、及び任意にリンカー及び／又はセルロース結合ドメインをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド；及びベータ−グルコシダーゼの全長ポリペプチドをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド、を含んでなる。
【０２２３】
別の好ましい態様によれば、ベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質構築物は、シグナルペプチドをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド；エンドグルカナーゼの成熟ポリペプチド、及び任意にリンカー及び／又はセルロース結合ドメインをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド；及びベータ−グルコシダーゼの全長ポリペプチドをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド、を含んでなる。
【０２２４】
別の好ましい態様によれば、ベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質構築物は、シグナルペプチドをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド；エンドグルカナーゼの触媒ドメインをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド；別のシグナルペプチドをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド；及びベータ−グルコシダーゼの触媒ドメインをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド、を含んでなる。
【０２２５】
別の好ましい態様によれば、ベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質構築物は、シグナルペプチドをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド；エンドグルカナーゼの成熟ポリペプチドをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド；別のシグナルペプチドをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド；及びベータ−グルコシダーゼの触媒ドメインをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド、を含んでなる。
【０２２６】
別の好ましい態様によれば、ベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質構築物は、シグナルペプチドをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド；エンドグルカナーゼの触媒ドメインをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド；別のシグナルペプチドをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド；及びベータ−グルコシダーゼの成熟ポリペプチドをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド、を含んでなる。
【０２２７】
別の好ましい態様によれば、ベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質構築物は、シグナルペプチドをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド；エンドグルカナーゼの成熟ポリペプチドをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド；別のシグナルペプチドをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド；及びベータ−グルコシダーゼの成熟ポリペプチドをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド、を含んでなる。
【０２２８】
別の好ましい態様によれば、ベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質構築物は、シグナルペプチドをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド；エンドグルカナーゼの触媒ドメイン、及び任意にリンカー及び／又はセルロース結合ドメインをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド；別のシグナルペプチドをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド；及びベータ−グルコシダーゼの触媒ドメインをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド、を含んでなる。
【０２２９】
別の好ましい態様によれば、ベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質構築物は、シグナルペプチドをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド；エンドグルカナーゼの成熟ポリペプチド、及び任意にリンカー及び／又はセルロース結合ドメインをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド；別のシグナルペプチドをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド；及びベータ−グルコシダーゼの触媒ドメインをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド、を含んでなる。
【０２３０】
別の好ましい態様によれば、ベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質構築物は、シグナルペプチドをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド；エンドグルカナーゼの触媒ドメイン、及び任意にリンカー及び／又はセルロース結合ドメインをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド；別のシグナルペプチドをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド；及びベータ−グルコシダーゼの成熟ペプチドをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド、を含んでなる。
【０２３１】
別の好ましい態様によれば、ベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質構築物は、シグナルペプチドをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド；エンドグルカナーゼの成熟ポリペプチド、及び任意にリンカー及び／又はセルロース結合ドメインをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド；別のシグナルペプチドをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド；及びベータ−グルコシダーゼの成熟ペプチドをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド、を含んでなる。
【０２３２】
上記の好ましい態様の各々によれば、ベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質構築物の成分は、プロモーター領域をさらに含んでなる。
【０２３３】
ベータ−グルコシダーゼ活性又はエンドグルカナーゼ活性を有する、触媒ドメイン、成熟ポリペプチド、又は全長ポリペプチドのポリヌクレオチドは、任意の起源から得てもよい。本発明の目的に応じて、「ポリペプチド」なる用語は、全長ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又は触媒ドメイン；又はベータ−グルコシダーゼ又はエンドグルカナーゼ活性を有するその部分又は断片を含むと解される。「から得る」なる用語は、本明細書での定義の通りに使用される。
【０２３４】
多くのエンドグルカナーゼは、リンカーペプチドによりセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）から分離した触媒ドメインからなるマルチドメイン構造を有する（Suurnakki et al., 2000, Cellulose 7: 189-209）。触媒部位は、酵素のセルロースへの結合によりＣＢＤがセルロースと相互作用する場である活性部位を含む（van Tilbeurgh et al., 1986, FEBS Letters 204: 223-227; Tomme et al., 1988, European Journal of Biochemistry 170: 575-581）。
【０２３５】
ベータ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドについては、既に記載している。
【０２３６】
エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、細菌ポリペプチドをコードする遺伝子から得てもよい。例えば、ポリペプチドには、グラム陽性細菌ポリペプチドがあり、限定するものではないが、例えば、バチルス、ストレプトコッカス、ストレプトマイセス、スタフィロコッカス、エンテロコッカス、ラクトバチルス、ラクトコッカス、クロストリジウム、ゲオバチルス、又はオセアノバチルスのポリペプチドがあり、例えば、バチルス・アルカロフィルス、バチルス・アミロリクエファシエンス、バチルス・ブレビス、バチルス・サークランス、バチルス・コーグランス、・ファームス、バチルス・ロートス、バチルス・レンタス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・メガテリウム、バチルス・ステアロセルモフィルス、・サブチリス、バチルス・サーリンギエンシス、ストレプトコッカス・エクイシミリス、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッカス・ウベリス、ストレプトコッカス・エキ 亜種、ゾエピデミクス、ストレプトマイセス・リビダンス、又はストレプトマイセス・ムリナス（Streptomyces murinus）のポリペプチドがあり、あるいは、グラム陰性細菌ポリペプチドがあり、限定するものではないが、例えば、Ｅ.ｃｏｌｉ、シュードモナス、サルモネラ、カンピロバクター、ヘリコバクター、フラボマクテリウム、フソバクテリウム、イリオバクター、ネイセリア、又はウレアプラズマのポリペプチドがある。
【０２３７】
本発明の方法におけるポリヌクレオチドのための供給源として使用できる細菌エンドグルカナーゼの例としては、限定するものではないが、アシドサーマス（Acidothermus）セルロース分解性エンドグルカナーゼ（国際公開第９１／０５０３９号、国際公開９３／１５１８６号、米国特許第５,２７５,９４４号；国際公開第９６／０２５５１号；米国特許第５,５３６,６５５号、国際公開第００／７００３１号、国際公開第０５／０９３０５０号）；サーモビフィダ・フスカ（Themobifida fusca）・エンドグルカナーゼIII（国際公開第０５／０９３０５０号）；及びサーモビフィダ・フスカ・エンドグルカナーゼＶ（国際公開第０５／０９３０５０号）がある。
【０２３８】
エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、真菌ポリペプチド、より好ましくは酵母ポリペプチドをコードする遺伝子から得てもよく、例えば、カンジダ、クルイベロマイセス、ピキア、サッカロマイセス、スキゾサッカロマイセス、又はヤロウィアペプチド；又はより好ましくは、繊維状真菌ポリペプチド、例えば、アクレモニウム、アガリクス、アルタナリア、アスペルギルス、オウレオバシジウム、ボトリオスパエリア、セリポリオプシス、カエトミジウム、クリソスポリウム、クラビセプス、コクリオボルス、コプリノプシス、コプトテルメス、コリナスカス、クリホネクトリア、クリプトコッカス、ジプロディア、エキシジア、フィリバシジウム、フサリウム、ギベレラ、ホロマスチゴトイデス、フミコラ、イルペックス、レンチヌラ、レプトスパエリア、マグナポルテ、メラノカルプス、メリピラス、ムコール、ミセリオフトラ、ネオカリマスティクス、ニューロスポラ、パエシロマイセス、ペンンルシリウム、ファネロカエテ、ピロマイセス、ポイトラシア、シュードプレクタニア、シュードトリコニンファ、リゾムコール、スキゾフィラム、スキタリジウム、タラロマイセス、サーモアスカス、チエラビア、トリポダジウム、トリコデルマ、トリコファエア、ベルチシリウム、ボルバリエラ、又はキシラリアのポリペプチドがある。
【０２３９】
好ましい態様によれば、エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、アクレモニウム・セルロリティクス、アスペルギルス・アクレタス、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・フミガタス、アスペルギルス・ホエチダス、アスペルギルス・ジャポニクス、アスペルギルス・ニデュランス、アスペルギルス・ニゲル、アスペルギルス・オリザエ、クリソスポリウム・ケラチノフィルム、クリソスポリウム・ルクノウェンセ、クリソスポリウム・トロピクム、クリソスポリウム・メルダリウム、クリソスポリウム・イノプス、クリソスポリウム・パンニコラ、クリソスポリウム・クエエンスランジクム、クリソスポリウム・ゾナタム、フサリウム・バクトリジオイデス、フサリウム・セレアリス、フサリウム・クロオクウェレンセ、フサリウム・クルモルム、フサリウム・グラミネアルム、フサリウム・グラミヌム、フサリウム・ヘテロスポルム、フサリウム・ネグンジ、フサリウム・オキシスポラム、フサリウム・レチクラタム、フサリウム・レセウム、フサリウム・サンブシヌム、フサリウム・サルコクロウム、フサリウム・スポロトリチオイデス、フサリウム・スルフレウム、フサリウム・トルロサム、フサリウム・トリコテシオイデス、フサリウム・ベネナタム、フミコラ・グリセア、フミコラ・インソレンス、フミコラ・ラヌギノサ、イルペックス・ラクテウス、ムコール・ミエヘイ、ミセリオフトラ・サーモフィラ、ネウロスポラ・クラッサ、ペニシリウム・フニクロスム、ペニシリウム・プルプロゲナム、ファネロカエテ・クリソスポリウム、チエラビア・アクロマティカ、チエラビア・アルボマイセス、チエラビア・アルボピロサ、チエラビア・オウストラレインシス、チエラビア・フィメチ、チエラビア・ミクロスポレ、チエラビア・オビスポラ、チエラビア・ペルビアナ、チエラビア・スペデドニウム、チエラビア・セトサ、チエラビア・サブサーモフィラ、チエラビア・テレストリス、トリコデルマ・ハルジアナム、トリコデルマ・クニンギイ、トリコデルマ・ロンギブラキアタム、トリコデルマ・リーゼイ、トリコデルマ・ビリデ、又はトリコファエア・サクタのポリペプチドをコードする遺伝子から得てもよい。
【０２４０】
本発明の方法においてポリヌクレオチドの供給源として使用できる真菌エンドグルカナーゼの例には、限定するものではないが、トリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼI（Penttila et at., 1986, Gene 45: 253-263; ＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号 Ｍ１５６６５）；トリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼII（Saloheimo, et al., 1988, Gene 63:11-22; ＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号 Ｍ１９３７３）；トリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼIII（Okada et al., 1988, Appl. Environ. Microbiol. 64: 555-563ＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号ＡＢ００３６９４）；トリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼIV（Saloheimo et al., 1997, Eur. J. Biochem. 249: 584-591; ＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号Ｙ１１１１３）；及びトリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼＶ（Saloheimo et al., 1994, Molecular Microbiology 13: 219-228; ＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号Ｚ３３３８１）；アスペルギルス・アクレアタス・エンドグルカナーゼ（Ooi et at., 1990, Nucleic Acids Research 18: 5884）；アスペルギリス・カワチイ・エンドグルカナーゼ（Sakamoto et al., 1995, Current Genetics 27: 435-439）；クリソスポリウム種Ｃ１（米国特許第６,５７３,０８６号；ＧｅｎＰｅｔ受託番号ＡＡＱ３８１５０）；コリナスカス・ヘテロタリクス（Corynascus heterothallicus）（米国特許第６,８５５,５３１号；ＧｅｎＰｅｔ受託番号ＡＡＹ００８４４）；エルウィニア・カロトバラ（Erwinia carotovara）エンドグルカナーゼ（Saarilahti et al., 1990, Gene 90: 9-14）；フサリウム・オキシスポラム・エンドグルカナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号Ｌ２９３８１）；フミコラ・グリセア変種サーモイデア（thermoidea）・エンドグルカナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号ＡＢ００３１０７）；メラノカルプス・アルボマイセス・エンドグルカナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号ＭＡＬ５１５７０３）；ニューロスポラ・クラッサ・エンドグルカナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号ＸＭ−３２４４７７）；ピロマイセス・エキ（Eberhardt et al., 2000, Microbiology 146: 1999-2008；ＧｅｎＰｅｔ受託番号ＣＡＢ９２３２５）；リゾプス・オリザエ（Moriya et al., 2003, J. Bacteriology 185: 1749-1756；ＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号ＡＢ０４７９２７、ＡＢ０５６６６７、及びＡＢ０５６６６８）；及びチエラビア・テレストリス（国際公開第２００４／０５３０３９号；ＥＭＢＬ受託番号ＣＱ８２７９７０）がある。
【０２４１】
その他のエンドグルカナーゼは、more than 13 of the Glycosyl Hydrolase families using the classification according to Henrissat B., 1991 , A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities, Biochem. J. 280: 309- 316, and Henrissat B., and Bairoch A., 1996, Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases, Biochem. J. 316: 695-696に開示されている。
【０２４２】
エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離又はクローン化するために使用される技術は、当業者に既知であり、ゲノムＤＮＡからの単離、ｃＤＮＡからの調製、又はその組み合わせがある。当該ゲノムＤＮＡからのポリヌクレオチドのクローニングは、例えば周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は共有の構造特性でクローン化ＤＮＡ断片を検出する発現ライブラリーの抗体スクリーニングを用いることにより達成できる。例えば、lnnis et at., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New Yorkを参照されたい。その他の核酸増幅方法、例えばリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、連結活性化転写（ligated activated transcription（ＬＡＴ））、及び核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）を使用してもよい。
【０２４３】
上記の種について、本発明は、完全及び不完全な状態、及び一般に知られる種名に関係なく、その他の分類学上同等物、例えばアナモルフを包含すると理解されるだろう。当業者は、適切な同等物の相同性を容易に理解するであろう。
【０２４４】
これらの種の系統は、多数の菌株保存施設、例えばAmerican Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH （ＤＳＭ）、Centraalbureau Voor Schimmelcultures （ＣＢＳ）、及びAgricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center （ＮＲＲＬ）等で一般に容易に入手可能である。
【０２４５】
好ましい態様によれば、エンドグルカナーゼの全長ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又は触媒ドメインは、エンドグルカナーゼＩ遺伝子から得られるポリヌクレオチドによりコードされる。
【０２４６】
別の好ましい態様によれば、エンドグルカナーゼの全長ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又は触媒ドメインは、エンドグルカナーゼII遺伝子から得られるポリヌクレオチドによりコードされる。
【０２４７】
別の好ましい態様によれば、エンドグルカナーゼの全長ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又は触媒ドメインは、エンドグルカナーゼIII遺伝子から得られるポリヌクレオチドによりコードされる。
【０２４８】
別の好ましい態様によれば、エンドグルカナーゼの全長ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又は触媒ドメインは、エンドグルカナーゼIV遺伝子から得られるポリヌクレオチドによりコードされる。
【０２４９】
別の好ましい態様によれば、エンドグルカナーゼの全長ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又は触媒ドメインは、エンドグルカナーゼＶ遺伝子から得られるポリヌクレオチドによりコードされる。より好ましい実施態様によれば、エンドグルカナーゼの全長ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又は触媒ドメインは、フミコラ・インソレンス・エンドグルカナーゼＶ遺伝子から得られるポリヌクレオチドによりコードされる。最も好ましい実施態様によれば、エンドグルカナーゼの全長ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又は触媒ドメインは、配列番号３０のポリペプチドをコードする配列番号２９を含んでなる、フミコラ・インソレンス・エンドグルカナーゼＶ遺伝子から得られるポリヌクレオチドによりコードされる。
【０２５０】
別の好ましい態様によれば、エンドグルカナーゼの全長ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又は触媒ドメインは、エンドグルカナーゼＶI遺伝子から得られるポリヌクレオチドによりコードされる。
【０２５１】
別の好ましい態様によれば、エンドグルカナーゼの全長ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又は触媒ドメインは、ファミリー５エンドグルカナーゼ遺伝子から得られるポリヌクレオチドによりコードされる。より好ましい実施態様によれば、エンドグルカナーゼの全長ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又は触媒ドメインは、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）ＣＢＳ１１７．６５エンドグルカナーゼ遺伝子から得られるポリヌクレオチドによりコードされる。最も好ましい実施態様によれば、エンドグルカナーゼの全長ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又は触媒ドメインは、配列番号３２のポリペプチドをコードする配列番号３１を含んでなる、ミセリオフトラ・サーモフィラＣＢＳ１１７．６５エンドグルカナーゼ遺伝子から得られるポリヌクレオチドによりコードされる。別の最も好ましい実施態様によれば、エンドグルカナーゼの全長ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又は触媒ドメインは、バシジオミセートＣＢＳ４９５．９５エンドグルカナーゼ遺伝子から得られるポリヌクレオチドによりコードされる。別の最も好ましい実施態様によれば、エンドグルカナーゼの全長ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又は触媒ドメインは、配列番号３４のポリペプチドをコードする配列番号３３を含んでなる、バシジオミセートＣＢＳ４９５．９５エンドグルカナーゼ遺伝子から得られるポリヌクレオチドによりコードされる。別の最も好ましい実施態様によれば、エンドグルカナーゼの全長ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又は触媒ドメインは、バシジオミセートＣＢＳ４９４．９５エンドグルカナーゼ遺伝子から得られるポリヌクレオチドによりコードされる。別の最も好ましい実施態様によれば、エンドグルカナーゼの全長ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又は触媒ドメインは、配列番号３６のポリペプチドをコードする配列番号３５を含んでなる、バシジオミセートＣＢＳ４９４．９５エンドグルカナーゼ遺伝子から得られるポリヌクレオチドによりコードされる。
【０２５２】
別の好ましい態様によれば、エンドグルカナーゼの全長ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又は触媒ドメインは、ファミリー６エンドグルカナーゼ遺伝子から得られるポリヌクレオチドによりコードされる。別のより好ましい態様によれば、エンドグルカナーゼの全長ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又は触媒ドメインは、チエラビア・テレストリスＮＲＲＬ８１２６ＣＥＬ６Ｂエンドグルカナーゼ遺伝子から得られるポリヌクレオチドによりコードされる。別の最も好ましい実施態様によれば、エンドグルカナーゼの全長ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又は触媒ドメインは、配列番号３８のポリペプチドをコードする配列番号３７を含んでなる、チエラビア・テレストリスＮＲＲＬ８１２６ＣＥＬ６Ｂエンドグルカナーゼ遺伝子から得られるポリヌクレオチドによりコードされる。別のより好ましい実施態様によれば、エンドグルカナーゼの全長ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又は触媒ドメインは、チエラビア・テレストリスＮＲＲＬ８１２６ＣＥＬ６Ｃエンドグルカナーゼ遺伝子から得られるポリヌクレオチドによりコードされる。別の最も好ましい実施態様によれば、エンドグルカナーゼの全長ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又は触媒ドメインは、配列番号４０のポリペプチドをコードする配列番号３９を含んでなる、チエラビア・テレストリスＮＲＲＬ８１２６ＣＥＬ６Ｃエンドグルカナーゼ遺伝子から得られるポリヌクレオチドによりコードされる。
【０２５３】
別の好ましい態様によれば、エンドグルカナーゼの全長ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又は触媒ドメインは、ファミリー７エンドグルカナーゼ遺伝子から得られるポリヌクレオチドによりコードされる。別のより好ましい実施態様によれば、エンドグルカナーゼの全長ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又は触媒ドメインは、チエラビア・テレストリスＮＲＲＬ８１２６ＣＥＬ７Ｃエンドグルカナーゼ遺伝子から得られるポリヌクレオチドによりコードされる。別の最も好ましい実施態様によれば、エンドグルカナーゼの全長ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又は触媒ドメインは、配列番号４２のポリペプチドをコードする配列番号４１を含んでなる、チエラビア・テレストリスＮＲＲＬ８１２６ＣＥＬ７Ｃエンドグルカナーゼ遺伝子から得られるポリヌクレオチドによりコードされる。別のより好ましい実施態様によれば、エンドグルカナーゼの全長ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又は触媒ドメインは、チエラビア・テレストリスＮＲＲＬ８１２６ＣＥＬ７Ｅエンドグルカナーゼ遺伝子から得られるポリヌクレオチドによりコードされる。別の最も好ましい実施態様によれば、エンドグルカナーゼの全長ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又は触媒ドメインは、配列番号４４のポリペプチドをコードする配列番号４３を含んでなる、チエラビア・テレストリスＮＲＲＬ８１２６ＣＥＬ７Ｅエンドグルカナーゼ遺伝子から得られるポリヌクレオチドによりコードされる。別のより好ましい実施態様によれば、エンドグルカナーゼの全長ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又は触媒ドメインは、チエラビア・テレストリスＮＲＲＬ８１２６ＣＥＬ７Ｆエンドグルカナーゼ遺伝子から得られるポリヌクレオチドによりコードされる。別の最も好ましい実施態様によれば、エンドグルカナーゼの全長ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又は触媒ドメインは、配列番号４６のポリペプチドをコードする配列番号４５を含んでなる、チエラビア・テレストリスＮＲＲＬ８１２６ＣＥＬ７Ｆエンドグルカナーゼ遺伝子から得られるポリヌクレオチドによりコードされる。別のより好ましい実施態様によれば、エンドグルカナーゼの全長ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又は触媒ドメインは、クラドリナム・フォエクンジシマム（Cladorrhinum foecundissimum）ＡＴＣＣ６２３７３ＣＥＬ７Ａエンドグルカナーゼ遺伝子から得られるポリヌクレオチドによりコードされる。別の最も好ましい実施態様によれば、エンドグルカナーゼの全長ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又は触媒ドメインは、配列番号４８のポリペプチドをコードする配列番号４７を含んでなる、クラドリナム・フォエクンジシマムＡＴＣＣ６２３７３ＣＥＬ７Ａエンドグルカナーゼ遺伝子から得られるポリヌクレオチドによりコードされる。
【０２５４】
別の最も好ましい実施態様によれば、エンドグルカナーゼの全長ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又は触媒ドメインは、配列番号５０のポリペプチドをコードする配列番号４９を含んでなる、トリコデルマ・リーゼイ系統番号ＶＴＴ−Ｄ−８０１３３エンドグルカナーゼから得られたポリヌクレオチドによりコードされる（ＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号Ｍ１５６６５）。
【０２５５】
別の好ましい態様によれば、エンドグルカナーゼの全長ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又は触媒ドメインは、ファミリー９エンドグルカナーゼ遺伝子から得られるポリヌクレオチドによりコードされる。
【０２５６】
別の好ましい態様によれば、エンドグルカナーゼの全長ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又は触媒ドメインは、ファミリー１２エンドグルカナーゼ遺伝子から得られるポリヌクレオチドによりコードされる。
【０２５７】
別の好ましい態様によれば、エンドグルカナーゼの全長ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又は触媒ドメインは、ファミリー４５エンドグルカナーゼ遺伝子から得られるポリヌクレオチドによりコードされる。別のより好ましい態様によれば、エンドグルカナーゼの全長ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又は触媒ドメインは、ファミリー４５エンドグルカナーゼ遺伝子から得られるポリヌクレオチドによりコードされる。別の最も好ましい態様によれば、ファミリー４５エンドグルカナーゼの全長ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又は触媒ドメインは、配列番号３０のポリペプチドをコードする配列番号２９、又はその相同分子種を含んでなる、フミコラ・インソレンス・エンドグルカナーゼＶ遺伝子から得られるポリヌクレオチドによりコードされる、遺伝子から得られるポリヌクレオチドによりコードされる。その他の好ましいファミリー４５エンドグルカナーゼ及びそのポリヌクレオチドは、クリソスポリウム種Ｃ１（米国特許第６,５７３,０８６号；ＧｅｎＰａｔ受託番号ＡＡＱ３８１５０）；クリナスクス・ヘテロタイリクス（Corynascus heterothailicus）（米国特許第６,８５５,５３１号；ＧｅｎＰａｔ受託番号ＡＡＹ００８４４）；ピロマイセス・エキ（Eberhardt et al., 2000, Microbiology 146: 1999-2008; ＧｅｎＰａｔ受託番号ＣＡＢ９２３２５）；及びリゾプス・オリザエ（Moriya et al., 2003, J. Bacteriology 185: 1749-1756; ＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号ＡＢ０４７９２７、ＡＢ０５６６６７及びＡＢ０５６６６８）から得る。
【０２５８】
別の好ましい態様によれば、エンドグルカナーゼの全長ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又は触媒ドメインは、ファミリー７４エンドグルカナーゼ遺伝子から得られるポリヌクレオチドによりコードされる。
【０２５９】
別の好ましい態様によれば、ベータ−グルコシダーゼの全長ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又は触媒ドメインは、ファミリー１ベータ−グルコシダーゼ遺伝子から得られるポリヌクレオチドによりコードされる。
【０２６０】
別の好ましい態様によれば、ベータ−グルコシダーゼの全長ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又は触媒ドメインは、ファミリー３ベータ−グルコシダーゼ遺伝子から得られるポリヌクレオチドによりコードされる。
【０２６１】
別の好ましい態様によれば、ベータ−グルコシダーゼの全長ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又は触媒ドメインは、ファミリー５ベータ−グルコシダーゼ遺伝子から得られるポリヌクレオチドによりコードされる。
【０２６２】
別の好ましい態様によれば、ベータ−グルコシダーゼの全長ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又は触媒ドメインは、アスペルギルス・オリザエ・ベータ−グルコシダーゼ遺伝子から得られるポリヌクレオチドによりコードされる。最も好ましい実施態様によれば、ベータ−グルコシダーゼの全長ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又は触媒ドメインは、配列番号１６のポリペプチドをコードする配列番号１５、又は配列番号１８のポリペプチドをコードする配列番号１７を含んでなる、アスペルギルス・オリザエ・ベータ−グルコシダーゼ遺伝子から得られるポリヌクレオチドによりコードされる。
【０２６３】
別の好ましい態様によれば、ベータ−グルコシダーゼの全長ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又は触媒ドメインは、アスペルギルス・フミガタス・ベータ−グルコシダーゼ遺伝子から得られるポリヌクレオチドによりコードされる。最も好ましい実施態様によれば、ベータ−グルコシダーゼの全長ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又は触媒ドメインは、配列番号２０のポリペプチドをコードする配列番号１９を含んでなる、アスペルギルス・フミガタス・ベータ−グルコシダーゼ遺伝子から得られるポリヌクレオチドによりコードされる。
【０２６４】
別の好ましい態様によれば、ベータ−グルコシダーゼの全長ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又は触媒ドメインは、ペニシリウム・ブラシリアナム（Penicillium brasilianum）系統ＩＢＴ２０８８８ベータ−グルコシダーゼ遺伝子から得られるポリヌクレオチドによりコードされる。最も好ましい実施態様によれば、ベータ−グルコシダーゼの全長ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又は触媒ドメインは、配列番号２２のポリペプチドをコードする配列番号２１を含んでなる、ペニシリウム・ブラシリアナム系統ＩＢＴ２０８８８ベータ−グルコシダーゼ遺伝子から得られるポリヌクレオチドによりコードされる。
【０２６５】
別の好ましい態様によれば、ベータ−グルコシダーゼの全長ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又は触媒ドメインは、トリコデルマ・リーゼイ系統番号ＱＭ９４１４ベータ−グルコシダーゼ遺伝子から得られるポリヌクレオチドによりコードされる。別の最も好ましい実施態様によれば、ベータ−グルコシダーゼの全長ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又は触媒ドメインは、配列番号２４のポリペプチドをコードする配列番号２３を含んでなる、トリコデルマ・リーゼイ系統番号ＱＭ９４１４ベータ−グルコシダーゼ遺伝子から得られるポリヌクレオチドによりコードされる（ＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号Ｕ０９５８０）。
【０２６６】
別の好ましい態様によれば、ベータ−グルコシダーゼの全長ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又は触媒ドメインは、アスペルギルス・ニゲル・ベータ−グルコシダーゼ遺伝子から得られるポリヌクレオチドによりコードされる。別の最も好ましい実施態様によれば、ベータ−グルコシダーゼの全長ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又は触媒ドメインは、配列番号２６のポリペプチドをコードする配列番号２５を含んでなる、アスペルギルス・ニゲル・ベータ−グルコシダーゼ遺伝子から得られるポリヌクレオチドによりコードされる。
【０２６７】
別の好ましい態様によれば、ベータ−グルコシダーゼの全長ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又は触媒ドメインは、アスペルギルス・アクレアタス・ベータ−グルコシダーゼ遺伝子から得られるポリヌクレオチドによりコードされる。別の最も好ましい実施態様によれば、ベータ−グルコシダーゼの全長ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又は触媒ドメインは、配列番号２８のポリペプチドをコードする配列番号２７を含んでなる、アスペルギルス・アクレアタス・ベータ−グルコシダーゼ遺伝子から得られるポリヌクレオチドによりコードされる。
【０２６８】
別の好ましい態様によれば、ベータ−グルコシダーゼは自然に分泌される。別の好ましい態様によれば、ベータ−グルコシダーゼは自然に分泌されない。
【０２６９】
別の好ましい態様によれば、エンドグルカナーゼの全長ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又は触媒ドメインは、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、又は配列番号５０の全長ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又は触媒ドメインのアミノ酸配列と、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％、さらに最も好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、又は９９％の相同性を有し、エンドグルカナーゼ活性を有するアミノ酸配列を含んでなるか、前記アミノ酸配列からなる相同ポリペプチドをコードする遺伝子から得られるポリヌクレオチドによりコードされる。好ましい態様によれば、かかる相同ポリペプチドは、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、又は配列番号５０の全長ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又は触媒ドメインのアミノ酸配列と、アミノ酸の相違が１０個まで、好ましくは５個まで、より好ましくは４個まで、さらにより好ましくは３個まで、最も好ましくは２個まで、さらに最も好ましくは１個まであるアミノ酸配列を有する。
【０２７０】
別の好ましい態様によれば、ベータ−グルコシダーゼの全長ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又は触媒ドメインは、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、又は配列番号２８の全長ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又は触媒ドメインのアミノ酸配列と、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％、さらに最も好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、又は９９％の相同性を有し、エンドグルカナーゼ活性を有するアミノ酸配列を含んでなるか、前記アミノ酸配列からなる相同ポリペプチドをコードする遺伝子から得られるポリヌクレオチドによりコードされる。好ましい態様によれば、かかる相同ポリペプチドは、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、又は配列番号２８の全長ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又は触媒ドメインのアミノ酸配列と、アミノ酸の相違が１０個まで、好ましくは５個まで、より好ましくは４個まで、さらにより好ましくは３個まで、最も好ましくは２個まで、さらに最も好ましくは１個まであるアミノ酸配列を有する。
【０２７１】
別の好ましい態様によれば、エンドグルカナーゼの全長ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又は触媒ドメインは、（i）配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、もしくは配列番号４９、（ii）配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、もしくは配列番号４９に含有されるｃＤＮＡ、又はそれを含んでなるゲノムＤＮＡ配列、（iii）（i）又は（ii）のサブ配列、又は（iv）（i）、（ii）もしくは（iii）の全長相補鎖と、好ましくは少なくとも超低ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも低ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中高ストリンジェンシー条件、さらにより好ましくは少なくとも高ストリンジェンシー条件、及び最も好ましくは少なくとも超高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズする、ヌクレオチド配列を含んでなるか、前記ヌクレオチド配列からなる（J. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York）。配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、又は配列番号４９のサブ配列は、連続ヌクレオチドを少なくとも１００個、又は好ましくは少なくとも２００個含有する。
【０２７２】
別の好ましい態様によれば、ベータ−グルコシダーゼの全長ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又は触媒ドメインは、（i）配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、もしくは配列番号２７、（ii）配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、もしくは配列番号２７に含有されるｃＤＮＡ、又はそれを含んでなるゲノムＤＮＡ配列、（iii）（i）又は（ii）のサブ配列、又は（iv）（i）、（ii）もしくは（iii）の全長相補鎖と、好ましくは少なくとも超低ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも低ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中高ストリンジェンシー条件、さらにより好ましくは少なくとも高ストリンジェンシー条件、及び最も好ましくは少なくとも超高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズする、ヌクレオチド配列を含んでなるか、前記ヌクレオチド配列からなる（J. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York）。配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、又は配列番号２７のサブ配列は、連続ヌクレオチドを少なくとも１００個、又は好ましくは少なくとも２００個含有する。
【０２７３】
配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、もしくは配列番号４９のヌクレオチド配列、又はそのサブ配列、並びに配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、もしくは配列番号５０のアミノ酸配列、又はエンドグルカナーゼのためのその断片、及び配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、もしくは配列番号２７のヌクレオチド配列、又はそのサブ配列、並びに配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、もしくは配列番号２８のアミノ酸配列、又はベータ−グルコシダーゼのためのその断片は、上記の通りに、異なる属又は種の系統から、エンドグルカナーゼ又はベータ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを同定及びクローン化する核酸プローブを設計するために使用してもよい。
【０２７４】
本発明の目的に応じて、ハイブリダイゼーションとは、上記の通り、超低から超高ストリンジェンシー条件下で、核酸配列を、上記のヌクレオチド配列の１つに対応する標識核酸プローブとハイブリダイズすることを示す。
【０２７５】
少なくとも１００ヌクレオチド長の長いプローブのための、超低〜超高ストリンジェンシー条件は、本明細書での定義の通りである。
【０２７６】
少なくとも１００ヌクレオチド長の長いプローブにおいて、担体物質は、本明細書での定義の通り最終的に洗浄する。
【０２７７】
約１５ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチド長の短いプローブのための、ストリンジェンシー条件は、本明細書での定義の通りである。
【０２７８】
約１５ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチド長の短いプローブにおいて、担体物質は、本明細書での定義の通り最終的に洗浄する。
【０２７９】
別の好ましい態様によれば、「セロビオヒドラーゼ又はエンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド及びそのポリヌクレオチド」の節で記載のエンドグルカナーゼの全長ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又は触媒ドメインは、ベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質を構築するためにも使用できる。
【０２８０】
好ましい態様によれば、ベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質は、配列番号１０４を含んでなるか、前記配列からなる。別の好ましい態様によれば、ベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質は、配列番号１０３を含んでなるか、前記配列からなるポリヌクレオチドによりコードされる。別の好ましい態様によれば、ベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質は、配列番号１０６を含んでなるか、前記配列からなる。別の好ましい態様によれば、ベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質は、配列番号１０５を含んでなるか、前記配列からなるポリヌクレオチドによりコードされる。
【０２８１】
上記の通り、多くのエンドグルカナーゼは、セルロース結合ドメインから、リンカーペプチドにより分離された触媒ドメインからなるマルチドメイン構造を有する。本発明の方法においては、ベータ−グルコシダーゼ融合構築物は、３'からエンドグルカナーゼ触媒ドメインを含む配列、及び５'からベータ−グルコシダーゼ触媒ドメインを含む配列を位置づけるリンカーをさらに含んでなる。
【０２８２】
かかるリンカーは、エンドグルカナーゼの触媒ドメインと同じ遺伝子、又は異なるエンドグルカナーゼ遺伝子から得ることができる。一方、当該リンカーは合成により得ることができる。
【０２８３】
本発明の方法において使用できるリンカーの例としては、限定するものではないが、トリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼI（Srisodsuk et al., 1993, Journal of Biological Chemistry 268: 20765-20761）；ヒポクレア・ジェコリナ（Hypocrea jecorina）（元はトリコデルマ・リーゼイ）（Mulakala et al., 2005, Proteins 60: 598-605）；フミコラ・インソレンス・エンドグルカナーゼＶ；及びチエラビア・テレストリスＮＲＲＬ８１２６ＣＥＬ７Ｃエンドグルカナーゼの遺伝子から得るリンカーがある。
【０２８４】
好ましい態様によれば、リンカーは、フミコラ・インソレンス・エンドグルカナーゼ遺伝子から得る。別の好ましい態様によれば、リンカーは、トリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼ遺伝子から得る。さらに好ましい態様によれば、リンカーは、フミコラ・インソレンス・エンドグルカナーゼＶ（ｅｇ５）遺伝子から得る。
【０２８５】
別の好ましい態様によれば、リンカーはチエラビア・テレストリス・エンドグルカナーゼの遺伝子から得る。別のより好ましい態様によれば、リンカーはチエラビア・テレストリスＮＲＲＬ８１２６ＣＥＬ７Ｃエンドグルカナーゼの遺伝子から得る。
【０２８６】
好ましい態様によれば、リンカーは少なくとも５アミノ酸残基である。より好ましい態様によれば、リンカーは少なくとも１５アミノ酸残基である。最も好ましい態様によれば、リンカーは少なくとも２５アミノ酸残基である。
【０２８７】
好ましい態様によれば、リンカーは５〜６０アミノ酸残基である。より好ましい態様によれば、リンカーは１５〜５０アミノ酸残基である。最も好ましい態様によれば、リンカーは２５〜４５アミノ酸残基である。
【０２８８】
炭水化物結合ドメインは多数の型について報告があるが、その多くは一般的にセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）として言及される。典型的なセルロース結合ドメインは、セルラーゼに存在する。同様に他のＣＢＤのサブクラスは、例えばキチン結合ドメイン（典型的にはキチナーゼに存在するＣＢＤ）、キシラン結合ドメイン（典型的にはキシラナーゼに存在するＣＢＤ）、マンナン結合ドメイン（典型的にはマンナナーゼに存在するＣＢＤ）、及びスターチ結合ドメインを包含する。
【０２８９】
ＣＢＤは、２以上のポリペプチドアミノ酸配列領域からなる巨大なポリペプチド又はタンパク質、特に、基質加水分解のための活性部位を含む触媒ドメイン、及び問題の炭水化物に結合する炭水化物結合ドメイン（ＣＢＤ）を典型的に含んでなる加水分解酵素（ヒドロラーゼ）の必須部分として存在する。当該酵素は、１以上の触媒ドメイン、及び２又は３つのＣＢＤを含んでなり、任意に、（１又は複数の）ＣＢＤを（１又は複数の）ドメインに結合させる１以上（複数）のポリペプチドアミノ酸配列領域をさらに含んでなる。ここで後者の型は、通常「リンカー」のことを指す。
【０２９０】
ＣＢＤを含んでなる加水分解酵素の例としては、セルラーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、アセチルエステラーゼ及びキチナーゼがある（P. Tomme et al., Cellulose-Binding Domains - Classification and Properties in Enzymatic Degradation of Insoluble Carbohydrates, John N. Saddler and Michael H. Penner (Eds.を参照されたい）。既知のＣＢＤのほとんどは、セルラーゼ及びキシラナーゼ由来である。
【０２９１】
ＣＢＤは、ＮもしくはＣ末端に位置しても、タンパク質もしくはポリペプチドの内部に位置してもよい。ＣＢＤを構成するポリペプチド又はタンパク質の領域は、典型的には約３０で且つ２５０アミノ酸未満からなる。例えば、Tomme et al., 1996（上記と同じ）に従ってファミリー１に列挙及び分類されるＣＢＤは、３３〜３７アミノ酸残基からなり、ファミリーIIａに列挙及び分類されるＣＢＤは、９５〜１０８アミノ酸残基からなり、ファミリーVIに列挙及び分類されるＣＢＤは、８５〜９２アミノ酸残基からなる。一方、ファミリーVIIに列挙及び分類される１つのＣＢＤ（クロストリジウム・サーモセラム（Clostridium thermocellum）からのセルラーゼ由来）は、２４０アミノ酸残基からなる。従って、ＣＢＤを構成するアミノ酸配列の分子量は、典型的には約４ｋＤａ〜約４０ｋＤａの範囲、通常は約３５ｋＤａ未満である。
【０２９２】
本発明の方法において、任意のＣＢＤを使用してよい。ＣＢＤは、エンドグルカナーゼと元々関連があっても、エンドグルカナーゼとは無関係であってもよい。
【０２９３】
好ましい態様によれば、ＣＢＤは、トリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼ（ＥＧ）遺伝子から得る。より好ましい態様によれば、ＣＢＤは、トリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼＥＧＩ遺伝子から得る。別のより好ましい態様によれば、ＣＢＤは、トリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼＥＧII遺伝子から得る。別のより好ましい態様によれば、ＣＢＤは、トリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼＥＧＶ遺伝子から得る。
【０２９４】
別の好ましい態様によれば、ＣＢＤは、トリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼ（ＣＢＭ)遺伝子から得る。別の好ましい態様によれば、ＣＢＤは、トリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼＣＢＨＩ遺伝子から得る（Terri et al., 1987, Gene 51: 42-52; Under and Teeri, 1996, Biochemistry 93: 12251-12255）。別の好ましい態様によれば、ＣＢＤは、トリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼＣＢＨII遺伝子から得る。
【０２９５】
別の好ましい態様によれば、ＣＢＤは、チエラビア・テレストリス・エンドグルカナーゼ遺伝子から得る。別の好ましい態様によれば、ＣＢＤは、チエラビア・テレストリスＮＲＲＬ８１２６ＣＥＬ７Ｃエンドグルカナーゼ遺伝子から得る。
【０２９６】
ベータ−グルコシダーゼ融合構築物は、切断部位をさらに含むことができる。好ましくは、切断部位は、少なくともエンドグルカナーゼ触媒ドメインを含む配列の後、及びベータ−グルコシダーゼ触媒ドメインを含む配列の前に位置する。ベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質の分泌の際に、当該部位は、融合タンパク質からベータ−グルコシダーゼを有するポリペプチドを切り離す。
【０２９７】
切断部位の例としては、限定するものではないが、ジペプチドLys−ArgをコードするＫｅｘ２部位（(Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568- 76; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251 ; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; and Contreras et al., 1991 , Biotechnology 9: 378-381）、アルギニン残基の後ろで因子Ｘａプロテアーゼにより切断されるHe-(Glu又はAsp)-Gly-Arg部位（(Eaton et al., 1986, Biochem. 25: 505-512）；リジンの後ろでエンテロキナーゼにより切断されるAsp-Asp-Asp-Asp-Lys部位（Collins- Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987）；ゲネラーゼＩにより切断されるHis-Tyr-Glu部位又はHis-Tyr-Asp部位（Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248）；Argの後ろでスロンビンにより切断されるLeu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser部位（Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35- 48）；Glnの後ろでＴＥＶプロテアーゼにより切断されるGlu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly部位（Stevens, 2003、上記と同様）；及びGlnの後ろでヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼの遺伝子改変体により切断されるLeu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro部位がある（Stevens, 2003、上記と同様）。
【０２９８】
セロビオヒドロラーゼ又はエンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド及びそのポリヌクレオチド
本発明によれば、セロビオヒドロラーゼ又はエンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド及びそのポリヌクレオチドは、好ましくは、トリコデルマ・リーゼイセロビオヒドロラーゼＩ（ＣＥＬ７Ａ）、トリコデルマ・リーゼイセロビオヒドロラーゼII（ＣＥＬ６Ａ)、及びトリコデルマ・リーゼイエンドグルカナーゼＩ（ＣＥＬ７Ｂ）、及びその相同分子種又は変異体からなる群から選択されると共に、さらにトリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼII（ＣＥＬ５Ａ）、トリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼIII（ＣＥＬ１２Ａ）、及びトリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼＶ（ＣＥＬ４５Ａ）、及びその相同分子種又は変異体からなる群から選択される。
【０２９９】
第一の態様によれば、セロビオヒドロラーゼＩ活性を有する単離ポリペプチドは、配列番号５２（トリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼＩ；ＣＥＬ７Ａ）の成熟ポリペプチドと、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％、さらに最も好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、又は９９％の相同性を有し、セロビオヒドロラーゼＩ活性を有するアミノ酸配列を含んでなるか、前記アミノ酸配列からなる（以下、「相同ポリペプチド」）。好ましい態様によれば、相同ポリペプチドは、配列番号５２のアミノ酸配列と、アミノ酸の相違が１０個まで、好ましくは５個まで、より好ましくは４個まで、さらにより好ましくは３個まで、最も好ましくは２個まで、さらに最も好ましくは１個まであるアミノ酸配列を有する。
【０３００】
セロビオヒドロラーゼＩ活性を有するポリペプチドは、好ましくは配列番号５２のアミノ酸又はその対立遺伝子多型、又はセロビオヒドロラーゼＩ活性を有するその断片を含んでなる。好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号５２のアミノ酸配列を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号５２の成熟ポリペプチドを含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号５２のアミノ酸１８〜５１４、又はその対立遺伝子多型、又はセロビオヒドロラーゼＩ活性を有するその断片を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号５２のアミノ酸１８〜５１４を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号５２のアミノ酸からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号５２のアミノ酸又はその対立遺伝子多型、又はセロビオヒドロラーゼＩ活性を有するその断片からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号５２の成熟ポリペプチドからなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号５２のアミノ酸１８〜５１４、又はその対立遺伝子多型、又はセロビオヒドロラーゼＩ活性を有するその断片からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号５２のアミノ酸１８〜５１４からなる。
【０３０１】
別の第一の態様によれば、セロビオヒドロラーゼII活性を有する単離ポリペプチドは、配列番号５４（トリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼII；ＣＥＬ６Ａ）の成熟ポリペプチドと、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％、さらに最も好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、又は９９％の相同性を有し、セロビオヒドロラーゼＩ活性を有するアミノ酸配列を含んでなるか、前記アミノ酸配列からなる（以下、「相同ポリペプチド」）。好ましい態様によれば、相同ポリペプチドは、配列番号５４のアミノ酸配列と、アミノ酸の相違が１０個まで、好ましくは５個まで、より好ましくは４個まで、さらにより好ましくは３個まで、最も好ましくは２個まで、さらに最も好ましくは１個まであるアミノ酸配列を有する。
【０３０２】
セロビオヒドロラーゼII活性を有するポリペプチドは、好ましくは配列番号５４のアミノ酸又はその対立遺伝子多型、又はセロビオヒドロラーゼII活性を有するその断片を含んでなる。好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号５４のアミノ酸配列を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号５４の成熟ポリペプチドを含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号５４のアミノ酸２５〜４７１、又はその対立遺伝子多型、又はセロビオヒドロラーゼII活性を有するその断片を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号５４のアミノ酸２５〜４７１を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号５４のアミノ酸又はその対立遺伝子多型、又はセロビオヒドロラーゼII活性を有するその断片からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号５４のアミノ酸からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号５４の成熟ポリペプチドからなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号５４のアミノ酸２５〜４７１、又はその対立遺伝子多型、又はセロビオヒドロラーゼII活性を有するその断片からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号５４のアミノ酸２５〜４７１からなる。
【０３０３】
別の第一の態様によれば、エンドグルカナーゼI活性を有する単離ポリペプチドは、配列番号５６（トリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼI；ＣＥＬ７Ｂ）の成熟ポリペプチドと、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％、さらに最も好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、又は９９％の相同性を有し、エンドグルカナーゼI活性を有するアミノ酸配列を含んでなるか、前記アミノ酸配列からなる（以下、「相同ポリペプチド」）。好ましい態様によれば、相同ポリペプチドは、配列番号５６のアミノ酸配列と、アミノ酸の相違が１０個まで、好ましくは５個まで、より好ましくは４個まで、さらにより好ましくは３個まで、最も好ましくは２個まで、さらに最も好ましくは１個まであるアミノ酸配列を有する。
【０３０４】
エンドグルカナーゼI活性を有するポリペプチドは、好ましくは配列番号５６のアミノ酸又はその対立遺伝子多型、又はエンドグルカナーゼI活性を有するその断片を含んでなる。好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号５６のアミノ酸配列を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号５６の成熟ポリペプチドを含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号５６のアミノ酸２３〜４５９、又はその対立遺伝子多型、又はエンドグルカナーゼI活性を有するその断片を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号５６のアミノ酸２３〜４５９を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、好ましくは配列番号５６のアミノ酸又はその対立遺伝子多型、又はエンドグルカナーゼI活性を有するその断片からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号５６のアミノ酸からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号５６の成熟ポリペプチドからなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号５６のアミノ酸２３〜４５９、又はその対立遺伝子多型、又はエンドグルカナーゼI活性を有するその断片からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号５６のアミノ酸２３〜４５９からなる。
【０３０５】
別の第一の態様によれば、エンドグルカナーゼII活性を有する単離ポリペプチドは、配列番号５８（トリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼII；ＣＥＬ５Ａ）の成熟ポリペプチドと、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％、さらに最も好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、又は９９％の相同性を有し、エンドグルカナーゼII活性を有するアミノ酸配列を含んでなるか、前記アミノ酸配列からなる（以下、「相同ポリペプチド」）。好ましい態様によれば、相同ポリペプチドは、配列番号５８のアミノ酸配列と、アミノ酸の相違が１０個まで、好ましくは５個まで、より好ましくは４個まで、さらにより好ましくは３個まで、最も好ましくは２個まで、さらに最も好ましくは１個まであるアミノ酸配列を有する。
【０３０６】
エンドグルカナーゼII活性を有するポリペプチドは、好ましくは配列番号５８のアミノ酸又はその対立遺伝子多型、又はエンドグルカナーゼII活性を有するその断片を含んでなる。好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号５８のアミノ酸配列を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号５８の成熟ポリペプチドを含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号５８のアミノ酸２２〜４１８、又はその対立遺伝子多型、又はエンドグルカナーゼII活性を有するその断片を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号５８のアミノ酸２２〜４１８を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、好ましくは配列番号５８のアミノ酸又はその対立遺伝子多型、又はエンドグルカナーゼII活性を有するその断片からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号５８のアミノ酸からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号５８の成熟ポリペプチドからなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号５８のアミノ酸２２〜４１８、又はその対立遺伝子多型、又はエンドグルカナーゼII活性を有するその断片からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号５８のアミノ酸２２〜４１８からなる。
【０３０７】
別の第一の態様によれば、エンドグルカナーゼIII活性を有する単離ポリペプチドは、配列番号６０（トリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼIII；ＣＥＬ１２Ａ）の成熟ポリペプチドと、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％、さらに最も好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、又は９９％の相同性を有し、エンドグルカナーゼIII活性を有するアミノ酸配列を含んでなるか、前記アミノ酸配列からなる（以下、「相同ポリペプチド」）。好ましい態様によれば、相同ポリペプチドは、配列番号６０のアミノ酸配列と、アミノ酸の相違が１０個まで、好ましくは５個まで、より好ましくは４個まで、さらにより好ましくは３個まで、最も好ましくは２個まで、さらに最も好ましくは１個まであるアミノ酸配列を有する。
【０３０８】
エンドグルカナーゼIII活性を有するポリペプチドは、好ましくは配列番号６０のアミノ酸又はその対立遺伝子多型、又はエンドグルカナーゼIII活性を有するその断片を含んでなる。好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号６０のアミノ酸配列を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号６０の成熟ポリペプチドを含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号６０のアミノ酸１７〜２３４、又はその対立遺伝子多型、又はエンドグルカナーゼIII活性を有するその断片を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号６０のアミノ酸１７〜２３４を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、好ましくは配列番号６０のアミノ酸又はその対立遺伝子多型、又はエンドグルカナーゼIII活性を有するその断片からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号６０のアミノ酸からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号６０の成熟ポリペプチドからなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号６０のアミノ酸１７〜２３４、又はその対立遺伝子多型、又はエンドグルカナーゼIII活性を有するその断片からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号６０のアミノ酸１７〜２３４からなる。
【０３０９】
別の第一の態様によれば、エンドグルカナーゼＶ活性を有する単離ポリペプチドは、配列番号６２（トリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼＶ；ＣＥＬ４５Ａ）の成熟ポリペプチドと、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％、さらに最も好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、又は９９％の相同性を有し、エンドグルカナーゼＶ活性を有するアミノ酸配列を含んでなるか、前記アミノ酸配列からなる（以下、「相同ポリペプチド」）。好ましい態様によれば、相同ポリペプチドは、配列番号６２のアミノ酸配列と、アミノ酸の相違が１０個まで、好ましくは５個まで、より好ましくは４個まで、さらにより好ましくは３個まで、最も好ましくは２個まで、さらに最も好ましくは１個まであるアミノ酸配列を有する。
【０３１０】
エンドグルカナーゼＶ活性を有するポリペプチドは、好ましくは配列番号６２のアミノ酸又はその対立遺伝子多型、又はエンドグルカナーゼＶ活性を有するその断片を含んでなる。好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号６２のアミノ酸配列を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号６２の成熟ポリペプチドを含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号６２のアミノ酸１８〜２４２、又はその対立遺伝子多型、又はエンドグルカナーゼＶ活性を有するその断片を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号６２のアミノ酸１８〜２４２を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、好ましくは配列番号６２のアミノ酸又はその対立遺伝子多型、又はエンドグルカナーゼＶ活性を有するその断片からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号６２のアミノ酸からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号６２の成熟ポリペプチドからなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号６２のアミノ酸１８〜２４２、又はその対立遺伝子多型、又はエンドグルカナーゼＶ活性を有するその断片からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号６２のアミノ酸１８〜２４２からなる。
【０３１１】
別の第一の態様によれば、セロビオヒドロラーゼII活性を有する単離ポリペプチドは、配列番号６４（トリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼII；ＣＥＬ６Ａ）の成熟ポリペプチドと、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％、さらに最も好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、又は９９％の相同性を有し、セロビオヒドロラーゼII活性を有するアミノ酸配列を含んでなるか、前記アミノ酸配列からなる（以下、「相同ポリペプチド」）。好ましい態様によれば、相同ポリペプチドは、配列番号６４のアミノ酸配列と、アミノ酸の相違が１０個まで、好ましくは５個まで、より好ましくは４個まで、さらにより好ましくは３個まで、最も好ましくは２個まで、さらに最も好ましくは１個まであるアミノ酸配列を有する。
【０３１２】
セロビオヒドロラーゼII活性を有するポリペプチドは、好ましくは配列番号６４のアミノ酸又はその対立遺伝子多型、又はセロビオヒドロラーゼII活性を有するその断片を含んでなる。好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号６４のアミノ酸配列を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号６４の成熟ポリペプチドを含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号６４のアミノ酸１８〜４８１、又はその対立遺伝子多型、又はセロビオヒドロラーゼII活性を有するその断片を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号６４のアミノ酸１８〜４８１を含んでなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、好ましくは配列番号６４のアミノ酸又はその対立遺伝子多型、又はセロビオヒドロラーゼII活性を有するその断片からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号６４のアミノ酸からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号６４の成熟ポリペプチドからなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号６４のアミノ酸１８〜４８１、又はその対立遺伝子多型、又はセロビオヒドロラーゼII活性を有するその断片からなる。別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号６４のアミノ酸１８〜４８１からなる。
【０３１３】
好ましくは、配列番号５２の成熟ポリペプチドの断片は、少なくとも４２５アミノ酸残基、より好ましくは４５０アミノ酸残基、最も好ましくは４７５アミノ酸残基を含む。好ましくは、配列番号５４の成熟ポリペプチドの断片は、少なくとも３９０アミノ酸残基、より好ましくは４１０アミノ酸残基、最も好ましくは４３０アミノ酸残基を含む。好ましくは、配列番号５６の成熟ポリペプチドの断片は、少なくとも３７０アミノ酸残基、より好ましくは３９０アミノ酸残基、最も好ましくは４１０アミノ酸残基を含む。好ましくは、配列番号５８の成熟ポリペプチドの断片は、少なくとも３４０アミノ酸残基、より好ましくは３６０アミノ酸残基、最も好ましくは３８０アミノ酸残基を含む。好ましくは、配列番号６０の成熟ポリペプチドの断片は、少なくとも１９０アミノ酸残基、より好ましくは２００アミノ酸残基、最も好ましくは２１０アミノ酸残基を含む。好ましくは、配列番号６２の成熟ポリペプチドの断片は、少なくとも１９０アミノ酸残基、より好ましくは２００アミノ酸残基、最も好ましくは２１０アミノ酸残基を含む。好ましくは、配列番号６４の成熟ポリペプチドの断片は、少なくとも４００アミノ酸残基、より好ましくは４２０アミノ酸残基、最も好ましくは４４０アミノ酸残基を含む。
【０３１４】
好ましくは、配列番号５１の成熟ポリペプチドコード配列は、少なくとも１２７５ヌクレオチド、より好ましくは１３５０ヌクレオチド、最も好ましくは１４２５ヌクレオチドを含む。好ましくは、配列番号５３の成熟ポリペプチドコード配列は、少なくとも１１７０ヌクレオチド、より好ましくは１２３０ヌクレオチド、最も好ましくは１２９０ヌクレオチドを含む。好ましくは、配列番号５５の成熟ポリペプチドコード配列は、少なくとも１１１０ヌクレオチド、より好ましくは１１７０ヌクレオチド、最も好ましくは１２３０ヌクレオチドを含む。好ましくは、配列番号５７の成熟ポリペプチドコード配列は、少なくとも１０２０ヌクレオチド、より好ましくは１０８０ヌクレオチド、最も好ましくは１１４０ヌクレオチドを含む。好ましくは、配列番号５９の成熟ポリペプチドコード配列は、少なくとも５７０ヌクレオチド、より好ましくは６００ヌクレオチド、最も好ましくは６３０ヌクレオチドを含む。好ましくは、配列番号６１の成熟ポリペプチドコード配列は、少なくとも５７０ヌクレオチド、より好ましくは６００ヌクレオチド、最も好ましくは６３０ヌクレオチドを含む。好ましくは、配列番号６３の成熟ポリペプチドコード配列は、少なくとも１２００ヌクレオチド、より好ましくは１２６０ヌクレオチド、最も好ましくは１３２０ヌクレオチドを含む。
【０３１５】
第二の態様によれば、セロビオヒドロラーゼＩ活性を有する単離ポリペプチドは、(i）配列番号５１の成熟ポリペプチド、（ii）配列番号５１の成熟ポリペプチドコード配列に含有されるｃＤＮＡ、又はそれを含んでなるゲノムＤＮＡ配列、（iii）（i）又は（ii）のサブ配列、又は（iv）（i）、（ii）もしくは（iii）の全長相補鎖と、好ましくは少なくとも超低ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも低ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中高ストリンジェンシー条件、さらにより好ましくは少なくとも高ストリンジェンシー条件、及び最も好ましくは少なくとも超高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズする、ヌクレオチド配列を含んでなるか、前記ヌクレオチド配列からなる（J. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatus, 1989, 上記と同様）。配列番号５１の成熟ポリペプチドコード配列のサブ配列は、連続ヌクレオチドを少なくとも１００個、又は好ましくは少なくとも２００個含有する。さらに、サブ配列は、セロビオヒドロラーゼＩ活性を有するポリペプチド断片をコードしてもよい。
【０３１６】
別の第二の態様によれば、セロビオヒドロラーゼII活性を有する単離ポリペプチドは、(i）配列番号５３の成熟ポリペプチド、（ii）配列番号５３の成熟ポリペプチドコード配列に含有されるｃＤＮＡ、又はそれを含んでなるゲノムＤＮＡ配列、（iii）（i）又は（ii）のサブ配列、又は（iv）（i）、（ii）もしくは（iii）の全長相補鎖と、好ましくは少なくとも超低ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも低ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中高ストリンジェンシー条件、さらにより好ましくは少なくとも高ストリンジェンシー条件、及び最も好ましくは少なくとも超高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズする、ヌクレオチド配列を含んでなるか、前記ヌクレオチド配列からなる（J. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatus, 1989, 上記と同様）。配列番号５３の成熟ポリペプチドコード配列のサブ配列は、連続ヌクレオチドを少なくとも１００個、又は好ましくは少なくとも２００個含有する。さらに、サブ配列は、セロビオヒドロラーゼII活性を有するポリペプチド断片をコードしてもよい。
【０３１７】
別の第二の態様によれば、エンドグルカナーゼＩ活性を有する単離ポリペプチドは、(i）配列番号５５の成熟ポリペプチド、（ii）配列番号５５の成熟ポリペプチドコード配列に含有されるｃＤＮＡ、又はそれを含んでなるゲノムＤＮＡ配列、（iii）（i）又は（ii）のサブ配列、又は（iv）（i）、（ii）もしくは（iii）の全長相補鎖と、好ましくは少なくとも超低ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも低ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中高ストリンジェンシー条件、さらにより好ましくは少なくとも高ストリンジェンシー条件、及び最も好ましくは少なくとも超高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズする、ヌクレオチド配列を含んでなるか、前記ヌクレオチド配列からなる（J. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatus, 1989, 上記と同様）。配列番号５５の成熟ポリペプチドコード配列のサブ配列は、連続ヌクレオチドを少なくとも１００個、又は好ましくは少なくとも２００個含有する。さらに、サブ配列は、セロビオヒドロラーゼII活性を有するポリペプチド断片をコードしてもよい。
【０３１８】
別の第二の態様によれば、エンドグルカナーゼII活性を有する単離ポリペプチドは、(i）配列番号５７の成熟ポリペプチド、（ii）配列番号５７の成熟ポリペプチドコード配列に含有されるｃＤＮＡ、又はそれを含んでなるゲノムＤＮＡ配列、（iii）（i）又は（ii）のサブ配列、又は（iv）（i）、（ii）もしくは（iii）の全長相補鎖と、好ましくは少なくとも超低ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも低ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中高ストリンジェンシー条件、さらにより好ましくは少なくとも高ストリンジェンシー条件、及び最も好ましくは少なくとも超高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズする、ヌクレオチド配列を含んでなるか、前記ヌクレオチド配列からなる（J. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatus, 1989, 上記と同様）。配列番号５７の成熟ポリペプチドコード配列のサブ配列は、連続ヌクレオチドを少なくとも１００個、又は好ましくは少なくとも２００個含有する。さらに、サブ配列は、エンドグルカナーゼII活性を有するポリペプチド断片をコードしてもよい。
【０３１９】
別の第二の態様によれば、エンドグルカナーゼIII活性を有する単離ポリペプチドは、(i）配列番号５９の成熟ポリペプチド、（ii）配列番号５９の成熟ポリペプチドコード配列に含有されるｃＤＮＡ、又はそれを含んでなるゲノムＤＮＡ配列、（iii）（i）又は（ii）のサブ配列、又は（iv）（i）、（ii）もしくは（iii）の全長相補鎖と、好ましくは少なくとも超低ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも低ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中高ストリンジェンシー条件、さらにより好ましくは少なくとも高ストリンジェンシー条件、及び最も好ましくは少なくとも超高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズする、ヌクレオチド配列を含んでなるか、前記ヌクレオチド配列からなる（J. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatus, 1989, 上記と同様）。配列番号５９の成熟ポリペプチドコード配列のサブ配列は、連続ヌクレオチドを少なくとも１００個、又は好ましくは少なくとも２００個含有する。さらに、サブ配列は、エンドグルカナーゼIII活性を有するポリペプチド断片をコードしてもよい。
【０３２０】
別の第二の態様によれば、エンドグルカナーゼＶ活性を有する単離ポリペプチドは、(i）配列番号６１の成熟ポリペプチド、（ii）配列番号６１の成熟ポリペプチドコード配列に含有されるｃＤＮＡ、又はそれを含んでなるゲノムＤＮＡ配列、（iii）（i）又は（ii）のサブ配列、又は（iv）（i）、（ii）もしくは（iii）の全長相補鎖と、好ましくは少なくとも超低ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも低ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中高ストリンジェンシー条件、さらにより好ましくは少なくとも高ストリンジェンシー条件、及び最も好ましくは少なくとも超高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズする、ヌクレオチド配列を含んでなるか、前記ヌクレオチド配列からなる（J. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatus, 1989, 上記と同様）。配列番号６１の成熟ポリペプチドコード配列のサブ配列は、連続ヌクレオチドを少なくとも１００個、又は好ましくは少なくとも２００個含有する。さらに、サブ配列は、エンドグルカナーゼＶ活性を有するポリペプチド断片をコードしてもよい。
【０３２１】
別の第二の態様によれば、セロビオヒドロラーゼII活性を有する単離ポリペプチドは、(i）配列番号６３の成熟ポリペプチド、（ii）配列番号６３の成熟ポリペプチドコード配列に含有されるｃＤＮＡ、又はそれを含んでなるゲノムＤＮＡ配列、（iii）（i）又は（ii）のサブ配列、又は（iv）（i）、（ii）もしくは（iii）の全長相補鎖と、好ましくは少なくとも超低ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも低ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中高ストリンジェンシー条件、さらにより好ましくは少なくとも高ストリンジェンシー条件、及び最も好ましくは少なくとも超高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズする、ヌクレオチド配列を含んでなるか、前記ヌクレオチド配列からなる（J. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatus, 1989, 上記と同様）。配列番号６３の成熟ポリペプチドコード配列のサブ配列は、連続ヌクレオチドを少なくとも１００個、又は好ましくは少なくとも２００個含有する。さらに、サブ配列は、セロビオヒドロラーゼII活性を有するポリペプチド断片をコードしてもよい。
【０３２２】
好ましい態様によれば、成熟ポリペプチドコード配列は、配列番号５１のヌクレオチド５２〜１５４２であるか、配列番号５３のヌクレオチド７３〜１４１３であるか、配列番号５５のヌクレオチド６７〜１３７７であるか、配列番号５７のヌクレオチド６４〜１２５４であるか、配列番号５９のヌクレオチド４９〜７０２であるか、配列番号６１のヌクレオチド５２〜７２６であるか、又は配列番号６３のヌクレオチド５２〜１４４３である。
【０３２３】
配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、もしくは配列番号６３のヌクレオチド配列、又はそのサブ配列、並びに配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、もしくは配列番号６４のアミノ酸配列、又はその断片は、上記の通り、異なる属又は種の系統から、セロビオヒドロラーゼ又はエンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを同定及びクローン化する核酸プローブを設計するために使用してもよい。
【０３２４】
本発明の目的に応じて、ハイブリダイゼーションとは、ヌクレオチド配列を、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、もしくは配列番号６３の成熟ポリペプチドコード配列、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、もしくは配列番号６３の成熟ポリペプチドコード配列に含有されるｃＤＮＡ、又はそれを含んでなるゲノムＤＮＡ配列、その全長相補鎖、又はそのサブ配列と、上記の、超低〜超高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズさせることを指す。
【０３２５】
好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号５１の成熟ポリペプチドコード配列である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号５１のヌクレオチド５２〜１５４２である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号５２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、又はそのサブ配列である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号５１である。
【０３２６】
好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号５３の成熟ポリペプチドコード配列である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号５３のヌクレオチド７３〜１４１３である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号５４のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、又はそのサブ配列である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号５３である。
【０３２７】
好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号５５の成熟ポリペプチドコード配列である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号５５のヌクレオチド６７〜１３７７である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号５６のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、又はそのサブ配列である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号５５である。
【０３２８】
好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号５７の成熟ポリペプチドコード配列である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号５７のヌクレオチド６４〜１２５４である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号５８のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、又はそのサブ配列である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号５７である。
【０３２９】
好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号５９の成熟ポリペプチドコード配列である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号５９のヌクレオチド４９〜７０２である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号６０のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、又はそのサブ配列である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号５９である。
【０３３０】
好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号６１の成熟ポリペプチドコード配列である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号６１のヌクレオチド５２〜７２６である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号６２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、又はそのサブ配列である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号６１である。
【０３３１】
好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号６３の成熟ポリペプチドコード配列である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号６３のヌクレオチド５２〜１４４３である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号６４のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、又はそのサブ配列である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、配列番号６３である。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、Ｅ.ＣｏｌｉＮＲＲＬ Ｂ−３０８０２に含まれるプラスミドｐＴｔｅｒ６Ａに含まれるポリヌクレオチド配列であり、ここでそのポリヌクレオチド配列はセロビオヒドロラーゼ活性を有する。別の好ましい態様によれば、核酸プローブは、Ｅ.ＣｏｌｉＮＲＲＬ Ｂ−３０８０２に含まれるプラスミドｐＴｔｅｒ６Ａに含まれる、成熟ポリペプチドコード領域である。
少なくとも１００ヌクレオチド長の長いプローブのための、超低〜超高ストリンジェンシー条件は、本明細書での定義の通りである。
【０３３２】
少なくとも１００ヌクレオチド長の長いプローブにおいて、担体物質は、本明細書での定義の通り最終的に洗浄する。
【０３３３】
約１５ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチド長の短いプローブのための、ストリンジェンシー条件は、本明細書での定義の通りである。
【０３３４】
約１５ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチド長の短いプローブにおいて、担体物質は、本明細書での定義の通り最終的に洗浄する。
【０３３５】
第三の態様によれば、セロビオヒドロラーゼ又はエンドグルカナーゼ活性を有する単離ポリペプチドは、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、もしくは配列番号６３の成熟ポリペプチドコード配列、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、もしくは配列番号６３の成熟ポリペプチドコード配列と、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％、さらに最も好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、又は９９％の相同性を有し、活性ポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなるか、前記核酸配列からなる相同ポリペプチドをコードする遺伝子から得られるポリヌクレオチドによりコードされる。
【０３３６】
好ましい態様によれば、成熟ポリペプチドコード配列は、配列番号５１のヌクレオチド５２〜１５４２であるか、配列番号５３のヌクレオチド７３〜１４１３であるか、配列番号５５のヌクレオチド６７〜１３７７であるか、配列番号５７のヌクレオチド６４〜１２５４であるか、配列番号５９のヌクレオチド４９〜７０２であるか、配列番号６１のヌクレオチド５２〜７２６であるか、又は配列番号６３のヌクレオチド５２〜１４４３である。本明細書のポリヌクレオチドの節を参照されたい。
【０３３７】
第六の態様によれば、セロビオヒドロラーゼ又はエンドグルカナーゼ活性を有する単離ポリペプチドは、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、もしくは配列番号６４の成熟ポリペプチドの１以上（複数）のアミノ酸配列、又はその相同配列の、置換、削除、及び／又は挿入を含んでなる人工的変異体である。当該人工的変異体の調製方法は、上記と同様である。
【０３３８】
配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、もしくは配列番号６４の成熟ポリペプチドにおける、アミノ酸の置換、削除、及び／又は挿入の総数は、１０個、好ましくは９個、より好ましくは８個、より好ましくは７個、より好ましくは最大で６個、より好ましくは５個、より好ましくは４個、さらにより好ましくは３個、最も好ましくは２個、及びさらに最も好ましくは１個である。
【０３３９】
セロビオヒドロラーゼ又はエンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドは、任意の属の微生物から得てもよい。本発明の目的に応じて、「から得る」なる用語は本明細書での定義の通りに使用される。好ましい態様によれば、所与の供給源から得られるポリペプチドは、細胞外に分泌される。
【０３４０】
セロビオヒドロラーゼ又はエンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドは、細菌ポリペプチドであってもよい。例えば、ポリペプチドは、グラム陽性細菌ポリペプチド、例えば、セロビオヒドロラーゼ又はエンドグルカナーゼ活性を有する、バチルス、ストレプトコッカス、ストレプトマイセス、スタフィロコッカス、エンテロコッカス、ラクトバチルス、ラクトコッカス、クロストリジウム、ゲオバチルス、又はオセアノバチルスのポリペプチド、又はグラム陰性細菌ポリペプチド、例えば、セロビオヒドロラーゼ又はエンドグルカナーゼ活性を有する、Ｅ.ｃｏｌｉ、シュードモナス、サルモネラ、カンピロバクター、ヘリコバクター、フラボマクテリウム、フソバクテリウム、イリオバクター、ネイセリア、又はウレアプラズマのポリペプチドがある。
【０３４１】
好ましい態様によれば、ポリペプチドは、セロビオヒドロラーゼ又はエンドグルカナーゼ活性を有する、バチルス・アルカロフィルス、バチルス・アミロリクエファシエンス、バチルス・ブレビス、バチルス・サークランス、バチルス・クラウジイ、バチルス・コーグランス、・ファームス、バチルス・ロートス、バチルス・レンタス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・メガテリウム、バチルス・プミルス、バチルス・ステアロセルモフィルス、・サブチリス、又はバチルス・サーリンギエンシスのポリペプチドである。
【０３４２】
別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、セロビオヒドロラーゼ又はエンドグルカナーゼ活性を有する、ストレプトコッカス・エクイシミリス、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッカス・ウベリス、ストレプトコッカス・エキ 亜種、ゾエピデミクスのポリペプチドである。
【０３４３】
別の態様によれば、ポリペプチドは、セロビオヒドロラーゼ又はエンドグルカナーゼ活性を有する、ストレプトマイセス・アクロモゲネス、ストレプトマイセス・アベルミチリス、ストレプトマイセス・コエリコロル、ストレプトマイセス・グリセウス、又はストレプトマイセス・リビダンスのポリペプチドである。
【０３４４】
セロビオヒドロラーゼ又はエンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドには、真菌ポリペプチドもあり、より好ましくは酵母ポリペプチド、例えば、セロビオヒドロラーゼ又はエンドグルカナーゼ活性を有する、カンジダ、クルイベロマイセス、ピキア、サッカロマイセス、スキゾサッカロマイセス、又はヤロウィアペプチド；又はより好ましくは、繊維状真菌ポリペプチド、例えば、セロビオヒドロラーゼ又はエンドグルカナーゼ活性を有する、アクレモニウム、アスペルギルス、オウレオバシジウム、クリプトコッカス、フィリバシジウム、フサリウム、フミコラ、マグナポルテ、ムコール、ミセリオフトラ、ネオカリマスティクス、ニューロスポラ、パエシロマイセス、ペンンルシリウム、ピロマイセス、スキゾフィラム、タラロマイセス、サーモアスカス、チエラビア、トリポダジウム、又はトリコデルマのポリペプチドがある。
【０３４５】
好ましい態様によれば、ポリペプチドは、セロビオヒドロラーゼ又はエンドグルカナーゼ活性を有するサッカロマイセス・カリスベルゲンシス、サッカロマイセス・セレビシアエ、サッカロマイセス・ジアスタチクス、サッカロマイセス・ドウグラシイ、サッカロマイセス・クルイベリ、サッカロマイセス・ノルベンシス、又はサッカロマイセス・オニフォルミスのポリペプチドである。
【０３４６】
別の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、セロビオヒドロラーゼ又はエンドグルカナーゼ活性を有する、アスペルギルス・アクレタス、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・フミガタス、アスペルギルス・ホエチダス、アスペルギルス・ジャポニクス、アスペルギルス・ニデュランス、アスペルギルス・ニゲル、アスペルギルス・オリザエ、コプリナス・シネレウス、ジプロディア・ゴシピナ（Diplodia gossyppina）、フサリウム・バクトリジオイデス、フサリウム・セレアリス、フサリウム・クロオクウェレンセ、フサリウム・クルモルム、フサリウム・グラミネアルム、フサリウム・グラミヌム、フサリウム・ヘテロスポルム、フサリウム・ネグンジ、フサリウム・オキシスポラム、フサリウム・レチクラタム、フサリウム・レセウム、フサリウム・サンブシヌム、フサリウム・サルコクロウム、フサリウム・スポロトリチオイデス、フサリウム・スルフレウム、フサリウム・トルロサム、フサリウム・トリコテシオイデス、フサリウム・ベネナタム、フミコラ・インソレンス、フミコラ・ラヌギノサ、マグナポルテ・グリセア、ムコール・ミエヘイ、ミセリオフトラ・サーモフィラ、ネウロスポラ・クラッサ、ペニシリウム・プルプロゲナム、ファネロカエテ・クリソスポリウム、シュードプレクタニア・ニグレラ、サーモアスカス・オウランティアクス（Thermoascus aurantiacus）、チエラビア・テレストリス、トリコデルマ・ハルジアナム、トリコデルマ・クニンギイ、トリコデルマ・ロンギブラキアタム、トリコデルマ・リーゼイ、トリコデルマ・ビリデ、又はトリコファエア・サクタのポリペプチドである。
【０３４７】
最も好ましい態様によれば、ポリペプチドは、セロビオヒドロラーゼ又はエンドグルカナーゼ活性を有する、トリコデルマ・リーゼイのポリペプチドである。別の最も好ましい態様によれば、ポリペプチドは、セロビオヒドロラーゼ又はエンドグルカナーゼ活性を有する、トリコデルマ・リーゼイＲｕｔＣ３０（ＡＴＣＣ５６７６５）のポリペプチドであり、例えば配列番号５２、又は５４の成熟ポリペプチド、又はセロビオヒドロラーゼ活性を有するその断片、及び配列番号５６、５８、６０、又は６２の成熟ポリペプチド、又はエンドグルカナーゼ活性を有するその断片がある。
【０３４８】
別の最も好ましい態様によれば、ポリペプチドは、セロビオヒドロラーゼ活性を有するチエラビア・テレストリスのポリペプチドである。別の最も好ましい態様によれば、ポリペプチドは、セロビオヒドロラーゼII活性を有するチエラビア・テレストリス（ＮＲＲＬ８１２６）のポリペプチドであり、例えば配列番号６４の成熟ポリペプチド、又はセロビオヒドロラーゼ活性を有するその断片がある。
【０３４９】
上記の種について、本発明は、完全及び不完全な状態、及び一般に知られる種名に関係なく、その他の分類学上同等物、例えばアナモルフを包含すると理解されるだろう。当業者は、適切な同等物の相同性を容易に理解するであろう。
【０３５０】
これらの種の系統は、多数の菌株保存施設、例えばAmerican Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH （ＤＳＭ）、Centraalbureau Voor Schimmelcultures （ＣＢＳ）、及びAgricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center （ＮＲＲＬ）等で一般に容易に入手可能である。
【０３５１】
さらに当該ポリペプチドは、本明細書に記載の通り、上記のプローブを用いて、天然物（例えば土壌、堆肥、廃棄物等）から単離される微生物等のその他の供給源から同定及び得ることができる。
【０３５２】
セロビオヒドロラーゼ又はエンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドには、別のポリペプチドがそのポリペプチド又はセロビオヒドロラーゼ又はエンドグルカナーゼ活性を有するその断片のＮ−末端又はＣ−末端で融合する、融合ポリペプチド又は切断可能な融合ポリペプチドが含まれる。融合ポリペプチドは、本明細書で記載の通りに作製される。
【０３５３】
セロビオヒドロラーゼ又はエンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるか、前記ヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドは、本発明の方法を実施するために、本明細書に記載の通り、単離及び利用できる。
【０３５４】
ポリヌクレオチドは、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、もしくは配列番号６３の成熟ポリペプチドコード配列と、好ましくは、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％、さらに最も好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、又は９９％の相同性を有し、セロビオヒドロラーゼ又はエンドグルカナーゼ活性を有するヌクレオチド配列を含んでなるか、前記ヌクレオチド配列からなる。
【０３５５】
好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、配列番号５１を含んでなるか、前記配列からなる。別の好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、配列番号５１の成熟ポリペプチドコード領域を含んでなるか、前記成熟ポリペプチドコード領域からなる。本発明はまた、遺伝コードの縮重によって配列番号５１とは異なる、配列番号５２のアミノ酸配列又はその成熟ポリペプチドを含んでなるか、前記成熟ポリペプチドからなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も包含する。本発明はまた、セロビオヒドロラーゼＩ活性を有する配列番号５２の断片をコードする、配列番号５１のサブ配列に関連する。
【０３５６】
別の好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、配列番号５３を含んでなるか、前記配列からなる。別の好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、配列番号５３の成熟ポリペプチドコード領域を含んでなるか、前記成熟ポリペプチドコード領域からなる。本発明はまた、遺伝コードの縮重によって配列番号５３とは異なる、配列番号５４のアミノ酸配列又はその成熟ポリペプチドを含んでなるか、前記成熟ポリペプチドからなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も包含する。本発明はまた、セロビオヒドロラーゼII活性を有する配列番号５４の断片をコードする、配列番号５３のサブ配列に関連する。
【０３５７】
別の好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、配列番号５５を含んでなるか、前記配列からなる。別の好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、配列番号５５の成熟ポリペプチドコード領域を含んでなるか、前記成熟ポリペプチドコード領域からなる。本発明はまた、遺伝コードの縮重によって配列番号５５とは異なる、配列番号５６のアミノ酸配列又はその成熟ポリペプチドを含んでなるか、前記成熟ポリペプチドからなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も包含する。本発明はまた、エンドグルカナーゼＩ活性を有する配列番号５６の断片をコードする、配列番号５５のサブ配列に関連する。
【０３５８】
別の好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、配列番号５７を含んでなるか、前記配列からなる。別の好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、配列番号５７の成熟ポリペプチドコード領域を含んでなるか、前記成熟ポリペプチドコード領域からなる。本発明はまた、遺伝コードの縮重によって配列番号５７とは異なる、配列番号５８のアミノ酸配列又はその成熟ポリペプチドを含んでなるか、前記成熟ポリペプチドからなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も包含する。本発明はまた、エンドグルカナーゼII活性を有する配列番号５８の断片をコードする、配列番号５７のサブ配列に関連する。
【０３５９】
別の好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、配列番号５９を含んでなるか、前記配列からなる。別の好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、配列番号５９の成熟ポリペプチドコード領域を含んでなるか、前記成熟ポリペプチドコード領域からなる。本発明はまた、遺伝コードの縮重によって配列番号５９とは異なる、配列番号６０のアミノ酸配列又はその成熟ポリペプチドを含んでなるか、前記成熟ポリペプチドからなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も包含する。本発明はまた、エンドグルカナーゼIII活性を有する配列番号６０の断片をコードする、配列番号５９のサブ配列に関連する。
【０３６０】
別の好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、配列番号６１を含んでなるか、前記配列からなる。別の好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、配列番号６１の成熟ポリペプチドコード領域を含んでなるか、前記成熟ポリペプチドコード領域からなる。本発明はまた、遺伝コードの縮重によって配列番号６１とは異なる、配列番号６２のアミノ酸配列又はその成熟ポリペプチドを含んでなるか、前記成熟ポリペプチドからなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も包含する。本発明はまた、エンドグルカナーゼＶ活性を有する配列番号６２の断片をコードする、配列番号６１のサブ配列に関連する。
【０３６１】
別の好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、配列番号６３を含んでなるか、前記配列からなる。別のより好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、Ｅ.ｃｏｌｉＮＲＲＬ Ｂ−３０８０２に含まれるプラスミドｐＴｔｅｒ６Ａに含まれる配列を含んでなるか、前記配列からなる。別の好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、配列番号６３の成熟ポリペプチドコード領域を含んでなるか、前記成熟ポリペプチドコード領域からなる。別の好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、配列番号６３のヌクレオチド５２〜１４４３を含んでなるか、前記配列からなる。別のより好ましい態様によれば、ヌクレオチド配列は、Ｅ.ｃｏｌｉＮＲＲＬ Ｂ−３０８０２に含まれるプラスミドｐＴｔｅｒ６Ａに含まれる成熟ポリペプチドコード領域を含んでなるか、前記成熟ポリペプチドコード領域からなる。本発明はまた、遺伝コードの縮重によって配列番号６３又はその成熟ポリペプチドコード配列とは異なる、配列番号６４のアミノ酸配列又はその成熟ポリペプチドを含んでなるか、前記成熟ポリペプチドからなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も包含する。本発明はまた、セロビオヒドロラーゼII活性を有する配列番号６４の断片をコードする、配列番号６３のサブ配列に関連する。
【０３６２】
本発明はまた、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、もしくは配列番号６３の成熟ポリペプチドコード配列中に、少なくとも１つの変異を含んでなる変異ポリヌクレオチドに関連し、ここで変異ヌクレオチド配列は、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、もしくは配列番号６４の成熟ポリペプチドをコードする。好ましい態様によれば、成熟ポリペプチドは、配列番号５２のアミノ酸１８〜５４１であるか、配列番号５４のアミノ酸２５〜４７１であるか、配列番号５６のアミノ酸２３〜４５９であるか、配列番号５８のアミノ酸２２〜４１８であるか、配列番号６０のアミノ酸１７〜２３４であるか、配列番号６２のアミノ酸１８〜２４２であるか、又は配列番号６４のアミノ酸１８〜４８１である。別の好ましい態様によれば、成熟ポリペプチドコード配列は、配列番号５１のヌクレオチド５２〜１５４２であるか、配列番号５３のヌクレオチド７３〜１４１３であるか、配列番号５５のヌクレオチド６７〜１３７７であるか、配列番号５７のヌクレオチド６４〜１２５４であるか、配列番号５９のヌクレオチド４９〜７０２であるか、配列番号６１のヌクレオチド５２〜７２６であるか、配列番号６３のヌクレオチド５２〜１４４３である。
【０３６３】
既に記載の通り、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離又はクローン化するために使用される技術は、当業者に既知であり、ゲノムＤＮＡからの単離、ｃＤＮＡからの調製、又はその組み合わせがある。
【０３６４】
ポリヌクレオチドはまた、（i）配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、もしくは配列番号６３の成熟ポリペプチドコード配列、（ii）配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、もしくは配列番号６３の成熟ポリペプチドコード配列に含有されるｃＤＮＡ、又はそれを含んでなるゲノムＤＮＡ配列、（iii）（i）もしくは（ii）のサブ配列、又はその対立遺伝子多型及びサブ配列と、本明細書で定義の通りの、好ましくは少なくとも超低ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも低ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中高ストリンジェンシー条件、さらにより好ましくは少なくとも高ストリンジェンシー条件、及び最も好ましくは少なくとも超高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズする、ヌクレオチド配列を含んでなるか、前記ヌクレオチド配列からなる（Sambrook et al., 1989, 上記と同様）。好ましい態様によれば、成熟ポリペプチドは、配列番号５１のヌクレオチド５２〜１５４２であるか、配列番号５３のヌクレオチド７３〜１４１３であるか、配列番号５５のヌクレオチド６７〜１３７７であるか、配列番号５７のヌクレオチド６４〜１２５４であるか、配列番号５９のヌクレオチド４９〜７０２であるか、配列番号６１のヌクレオチド５２〜７２６であるか、又は配列番号６３のヌクレオチド５２〜１４４３である。
【０３６５】
核酸構築物
セルロース分解性増強活性を有するポリペプチド、ベータ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド、ベータ−グルコシダーゼ融合ポリペプチド、エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド、セロビオヒドロラーゼ活性を有するポリペプチド、又はセルロース分解酵素活性を有するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドは、ポリペプチド発現のために提供される様々な方法で操作することができ、コントロール配列と同じ条件下で、好適な宿主細胞中で、そのコード配列の発現を方向付ける１以上（複数）のコントロール配列に作動的に結合するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを含んでなる核酸構築物を構築することにより行う。ポリヌクレオチドの配列をベクターに挿入する前の操作は、発現ベクターに応じて所望されるか必要とされる。組み換えＤＮＡ法を利用するポリヌクレオチド配列改変の技術は、当業界で周知である。
【０３６６】
コントロール配列は、かかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現のための宿主細胞により認識されるヌクレオチド配列である、適切なプロモーター配列でもよい。プロモーター配列は、ポリペプチドの発現を媒介する転写コントロール配列を含む。プロモーターは、最適な宿主細胞において、変異、トランケート、及びハイブリッドのプロモーター等の転写活性を示す任意のヌクレオチド配列であっても、宿主細胞とは同種接合型又は異種接合型のいずれかで、細胞外又は細胞内でポリペプチドをコードする遺伝子から得てもよい。
【０３６７】
繊維状真菌宿主細胞における核酸構築物の転写を方向付けるための好適なプロモーターの例としては、アスペルギルス・オリザエ・ＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイ・アスパラギンプロテイナーゼ、アスペルギルス・ニゲル・ニュートラル・アルファ−アミラーゼ、アスペルギルス・ニゲル・酸安定アルファ−アミラーゼ、アスペルギルス・ニゲル又はアスペルギルス・アワモリ・グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、リゾムコール・ミエヘイ・リパーゼ、アスペルギルス・オリザエ・アルカリプロテアーゼ、アスペルギルス・オリザエ・トリオースリン酸イソメラーゼ、アスペルギルス・ニデュランス・アセトアミダーゼ、フサリウム・ベネナタム・アミログルコシダーゼ（国際公開第００／５６９００号）、フサリウム・ベネナタム・ダリア（国際公開第００／５６９００号）、フサリウム・ベネナタム・キン（Fusarium venenatum Quinn）（国際公開第００／５６９００号）、フサリウム・オキシスポラム・トリプシン様プロテアーゼ（国際公開第９６／００７８７号）、トリコデルマ・リーゼイ・ベータ−グルコシダーゼ、トリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼＩ、トリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼII、トリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼＩ、トリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼII、トリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼIII、トリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼIV、トリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼＶ、トリコデルマ・リーゼイ・キシラナーゼＩ、トリコデルマ・リーゼイ・キシラナーゼII、トリコデルマ・リーゼイ・ベータ−キシロシダーゼ、及びＮＡ２−ｔｐｉプロモーター（アスペルギルス・ニゲル・ニュートラル・アルファ−アミラーゼ及びアスペルギルス・オリザエ・トリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子由来のプロモーターのハイブリッド）の遺伝子；及びその変異、トランケート、及びハイブリッドのプロモーターから得る。
【０３６８】
コントロール配列はまた、転写の終結が宿主細胞により認識される配列である、好適な転写ターミネーター配列であってもよい。ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の３'末端に作動的に結合する。本発明では、最適な宿主細胞中で機能的な任意のターミネーターを使用できる。
【０３６９】
繊維状真菌宿主細胞のための好ましいターミネーターには、アスペルギルス・オリザエ・ＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・ニゲル・グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニデュランス・アントラニル酸シンターゼ、アスペルギルス・ニゲル・アルファ−グルコシダーゼ、及びフサリウム・オキシスポラム・トリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得る。
【０３７０】
コントロール配列は、宿主細胞により翻訳されるために重用であるｍＲＮＡの非翻訳領域である、好適なリーダー配列でもよい。リーダー配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の５'末端に作動的に結合する。本発明では、最適な宿主細胞中で機能的な任意のリーダー配列を使用できる。
【０３７１】
繊維状真菌宿主細胞のための好ましいリーダーには、アスペルギルス・オリザエ・ＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・ニデュランス・トリオースリン酸イソメラーゼがある。
【０３７２】
コントロール配列は、ヌクレオチド配列の３'末端に作動的に結合するとともに、転写されると、転写ｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付すシグナルとして宿主細胞に認識される配列である、ポリアデニル化配列でもよい。本発明では、最適な宿主細胞中で機能的な任意のポリアデニル化配列を使用できる。
【０３７３】
繊維状真菌宿主細胞のための好ましいポリアデニル化配列には、アスペルギルス・オリザエ・ＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・ニゲル・グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニデュランス・アントラニル酸シンターゼ、フサリウム・オキシスポラム・トリプシン様プロテアーゼ、及びアスペルギルス・ニゲル・アルファ−グルコシダーゼの遺伝子から得る。
【０３７４】
コントロール配列は、ポリペプチドのアミノ末端と結合するアミノ酸配列のためにコード化するとともに、細胞の分泌経路にコードされたポリペプチドを導く、シグナルペプチドコード領域でもよい。ヌクレオチド配列のコード配列の５'末端は、分泌ポリペプチドをコードするコード領域のセグメントを有する翻訳リーディングフレームで、自然に結合するシグナルペプチドコード領域を固有に含有する。あるいは、コード配列の５'末端は、コード配列とは無関係のシグナルペプチドコード領域を含有してもよい。この無関係なシグナルペプチドコード領域は、コード配列がシグナルペプチドコード領域を生来含有しない場合に必要とされることがある。あるいは、かかる無関係なシグナルペプチドコード領域は、ポリペプチドの分泌を向上させるために、天然のシグナルペプチドコード領域と単に置き換えてもよい。ただし、最適な宿主細胞の分泌経路で発現されるポリペプチド、すなわち、培養培地中に分泌されるポリペプチドを方向付ける任意のシグナルペプチドコード領域を、本発明で使用してもよい。
【０３７５】
繊維状真菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード領域は、アスペルギルス・オリザエ・ＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・ニゲル・ニュートラル・アミラーゼ、アスペルギルス・ニゲル・グルコアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイ・アスパラギン・プロテイナーゼ。フミコラ・インソレンス・セルラーゼ、フミコラ・インソレンス・エンドグルカナーゼＶ、及びフミコラ・ラヌギノサ・リパーゼの遺伝子から得るシグナルペプチドコード領域である。
【０３７６】
好ましい態様によれば、シグナルペプチドは、配列番号２のアミノ酸１〜１９を含んでなるか、前記アミノ酸からなる。別の好ましい態様によれば、シグナルペプチドコード領域は、配列番号１のヌクレオチド３３０〜３８７を含んでなるか、前記ヌクレオチドからなる。
【０３７７】
別の好ましい態様によれば、シグナルペプチドは、配列番号４のアミノ酸１〜１７を含んでなるか、前記アミノ酸からなる。別の好ましい態様によれば、シグナルペプチドコード領域は、配列番号３のヌクレオチド４７〜９７を含んでなるか、前記ヌクレオチドからなる。
【０３７８】
別の好ましい態様によれば、シグナルペプチドは、配列番号６のアミノ酸１〜１９を含んでなるか、前記アミノ酸からなる。別の好ましい態様によれば、シグナルペプチドコード領域は、配列番号５のヌクレオチド６９〜１２５を含んでなるか、前記ヌクレオチドからなる。
【０３７９】
別の好ましい態様によれば、シグナルペプチドは、配列番号８のアミノ酸１〜１８を含んでなるか、前記アミノ酸からなる。別の好ましい態様によれば、シグナルペプチドコード領域は、配列番号７のヌクレオチド１〜５４を含んでなるか、前記ヌクレオチドからなる。
【０３８０】
別の好ましい態様によれば、シグナルペプチドは、配列番号１０のアミノ酸１〜１９を含んでなるか、前記アミノ酸からなる。別の好ましい態様によれば、シグナルペプチドコード領域は、配列番号９のヌクレオチド１〜５７を含んでなるか、前記ヌクレオチドからなる。
【０３８１】
別の好ましい態様によれば、シグナルペプチドは、配列番号１２のアミノ酸１〜２２を含んでなるか、前記アミノ酸からなる。別の好ましい態様によれば、シグナルペプチドコード領域は、配列番号１１のヌクレオチド１〜６６を含んでなるか、前記ヌクレオチドからなる。
【０３８２】
別の好ましい態様によれば、シグナルペプチドは、配列番号１４のアミノ酸１〜１９を含んでなるか、前記アミノ酸からなる。別の好ましい態様によれば、シグナルペプチドコード領域は、配列番号１３のヌクレオチド２０〜７６を含んでなるか、前記ヌクレオチドからなる。
【０３８３】
コントロール配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコード化する、ポリペプチドコード領域でもよい。得られたポリペプチドは、プロ酵素又はプロポリペプチド（又は酵素原という場合もある）として知られている。一般的にプロポリペプチドは、不活性であり、プロポリペプチド由来のポリペプチドの触媒的又は自動的な切断により、成熟活性ポリペプチドに変換できる。プロペプチドコード領域は、サッカロマイセス・セレビシアエ・アルファ−因子、リゾムコール・ミエヘイ・アスパラギン・プロテイナーゼ、及びミセリオフトラ・サーモフィラ・ラッカーゼ（国際公開第９５／３３８３６号）の遺伝子から得てもよい。
【０３８４】
シグナルペプチド及びプロペプチド領域がポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、プロペプチド領域は、ポリペプチドのアミノ末端の隣に位置し、シグナルペプチド領域は、プロペプチド領域のアミノ末端の隣に位置する。
【０３８５】
宿主細胞の成長に関連するポリペプチドの発現の調整をする調整配列の付加が所望されてもよい。調整システムの例としては、遺伝子の発現を、調整化合物の存在等の化学的又は物理的刺激への応答で、開始又は停止させるものがある。繊維状真菌における調整システムには、ＴＡＫＡアルファ−アミラーゼ・プロモーター、アスペルギルス・ニゲル・グルコアミラーゼ・プロモーター、及びアスペルギルス・オリザエ・グルコアミラーゼ・プロモーターが含まれ、これらを調整配列として使用してもよい。調整配列のその他の例には、遺伝子増幅をさせるものがある。真核系においては、これらの調整配列には、メトトレキサートの存在下で増幅するジヒドロフォレート・レダクターゼ遺伝子、及び重金属で増幅されるメタロチオネイン遺伝子がある。これらの場合、ポリペプチドをコードするヌクレオチドは、調整配列と作動的に結合するはずである。
【０３８６】
発現ベクター
本明細書で記載される様々な核酸及びコントロール配列は、セルロース分解性増強活性を有するポリペプチド、ベータ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド、ベータ−グルコシダーゼ融合ポリペプチド、エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド、セロビオヒドロラーゼ活性を有するポリペプチド、又はセルロース分解酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、プロモーター、並びに転写及び翻訳停止シグナルを含んでなる組み換え発現ベクターの作製にも共に加わる。発現ベクターは、１以上（複数）の都合のよい制限酵素部位を含み、当該部位でポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の挿入又は置換が可能となる。あるいは、かかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列又は発現用の適切なベクター中に当該配列を含んでなる核酸構築物を挿入することにより発現してもよい。発現ベクターを作製において、コード配列が発現用の適切なコントロール配列と作動的に結合するように、コード配列を置く。
【０３８７】
組み換え発現ベクターは、組み換えＤＮＡ法を都合よく受けられるとともに、ヌクレオチド配列の発現を誘発できる任意のベクター（例えば、プラスミド又はウイルス）でもよい。ベクターの選択は、典型的にはベクターが導入される宿主細胞とベクターの適合性に依存する。ベクターは、直線又は閉環のプラスミドがあり得る。
【０３８８】
ベクターは、自発的に複製するベクター、例えば染色体外の構成要素として存在するベクターでもよく、その複製は、染色体複製、例えばプラスミド、染色体外要素、ミニ染色体、又は人工的染色体に依存する。ベクターは、自己複製を確保するための任意の手段を有していてもよい。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入される場合、ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれる（１又は複数の）染色体と共に複製されるものでもよい。さらに、宿主細胞のゲノムに導入される全ＤＮＡを共に含有する、単一のベクターもしくはプラスミド、又は２以上のベクターもしくはプラスミド、又はトランスポゾンを使用してもよい。
【０３８９】
ベクターは好ましくは、形質転換、形質移入、形質導入等された細胞の容易なセレクションを可能にする、１以上（複数）の選択可能なマーカーを含有する。選択可能なマーカーは、殺生物剤、又はウイルス耐性、重金属耐性、栄養要求体への原栄養性等を提供する、遺伝物質である。
【０３９０】
繊維状真菌宿主細胞における使用のための選択可能なマーカーは、限定するものではないが、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルボモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ヒグモマイシントランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５'−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、及びｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、並びにその同等物がある。アスペルギルス細胞における好ましい使用は、アスペルギルス・ニデュランス又はアスペルギルス・オリザエのａｍｄＳ及びｐｙｒＧ遺伝子、及びストレプトマイセス・ヒグロスコピクス（Streptomyces hygroscopicus）のｂａｒ遺伝子である。
【０３９１】
好ましくは、ベクターは、宿主細胞中でのベクターの取り込み、又はゲノムから独立した細胞でのベクターの複製を可能とする（１又は複数の）要素を含有する。
【０３９２】
宿主細胞ゲノムでの取り込みに関して、ベクターは、ポリペプチドをコードするポリペプチドの配列、又は同種接合もしくは非同種接合の組み換えによるゲノムへの取り込みのためのベクターの、任意のその他の要素に依存してもよい。あるいは、ベクターは、（１又は複数の）染色体における（１又は複数の）正確な位置で、同種接合型組み換えによって宿主細胞のゲノムに取り込みを方向付けるための、追加のヌクレオチド配列を含有してもよい。正確な位置での取り込み可能性を増加させるために、取り込み要素は、同種接合型組み換えの確率を向上させるよう、対応する標的配列への高い相同性を有する十分な数の核酸、例えば１００〜１０，０００塩基対、好ましくは４００〜１０，０００塩基対、及び最も好ましくは８００〜１０，０００塩基対を含むことが好ましい。取り込み要素は、宿主細胞のゲノムにおける標的配列をと同種接合型である任意の配列であってもよい。さらに、取り込み要素は、ヌクレオチド配列をコードしてもしなくてもよい。一方、ベクターは、非同種接合型組み換えにより宿主細胞のゲノムに取り込まれてもよい。
【０３９３】
自動的複製に関して、ベクターは、ベクターが問題の宿主細胞において自動的に複製できる、複製の基（origin）をさらに含んでもよい。複製の基は、細胞で機能する、自動的な複製を媒介する任意のプラスミド複製因子でもよい。本明細書で「複製の基」又は「プラスミド複製因子」なる用語は、インビボ（in vivo）で、プラスミド又はベクターが複製できるヌクレオチド配列と定義する。
【０３９４】
繊維状真菌細胞において有用である複製の基の例には、ＡＭＡ１及びＡＮＳ１（Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Research 15: 9163-9175; 国際公開第００／２４８８３号）がある。ＡＭＡ１遺伝子及び当該遺伝子を含んでなるプラスミド又はベクター構築物の単離は、国際公開第００／２４８８３号に開示される方法に従って達成できる。
【０３９５】
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの１以上のコピーは、ポリペプチド産物を増加させるよう、宿主細胞に挿入してもよい。ポリヌクレオチドのコピー数の増加は、宿主細胞内に少なくとも１つの追加の配列コピーを取り込むことにより、又は選択可能なマーカー遺伝子の増幅されたコピーを含有する場合には、ポリヌクレオチドと共に増幅可能な選択可能なマーカー遺伝子を含むことにより得ることがでる。従って当該ポリヌクレオチドの追加のコピーは、適切な選択可能な剤の存在下での細胞培養により選択できる。
【０３９６】
組み換え発現ベクターを構築するための、上記の要素の結合に使用される方法は、当業者に周知である（例えば、Sambrook er al., 1989,（上記と同様）を参照されたい）。
【０３９７】
宿主細胞
セルロース分解性増強活性を有するポリペプチド、ベータ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド、ベータ−グルコシダーゼ融合ポリペプチド、エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド、セロビオヒドロラーゼ活性を有するポリペプチド、又は他のセルロース分解酵素活性を有するポリペプチドを含んでなる、組み換え繊維状真菌宿主細胞は、ポリペプチドの組み換え体作製において有利に使用できる。かかるポリヌクレオチドを含んでなるベクターは、既に記載の通り、ベクターが染色体成分として、又は自己複製染色体外ベクターとして維持されるよう、宿主細胞に導入される。「宿主細胞」なる用語は、複製中に生じる突然変異のために親細胞とは異なる、親細胞の任意の子孫を包含する。宿主細胞の選択肢は、ポリペプチドをコードする遺伝子及びその供給源に依存して広範に及ぶ。
【０３９８】
「繊維状真菌」は、真菌類及び卵菌類の準型の全ての繊維状体を含む（Hawksworth et at., 1995,（上記と同様）に記載される通りである）。一般的に繊維状真菌は、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、及びその他の多糖複合体から構成される菌糸壁を特徴とする。栄養増殖は菌糸伸長によるものであり、炭素異化は偏性好気性である。対照的に、サッカロマイセス・セレビシアエ等の酵母による栄養増殖は、単細胞葉状体の発芽によるものであり、炭素異化は発酵性である。
【０３９９】
好ましい態様によれば、繊維状真菌宿主細胞は、アクレモニウム、アスペルギルス、オウレオバシジウム、ブジェルカンデラ（Bjerkandera）、セリポリオプシス、クリソスポリウム、コプリナス、コリオルス（Coriolus）、クリプトコッカス、フィリバシジウム、フサリウム、フミコラ、マグナポルテ、ムコール、ミセリオフトラ、ネオカリマスティクス（Neocallimastix）、ニューロスポラ、パエドロマイセス（Paedlomyces）、ペニドリウム（Penidllium）、ファネロカエテ、フレビア（Phlebia）、ピロマイセス、プレウロタス（Pleurotus）、スキゾフィラム、タラロマイセス、サーモアスカス、チエラビア、トリポダジウム、トラメテス（Trametes）、又はトリコデルマの細胞がある。
【０４００】
より好ましい態様によれば、繊維状真菌宿主細胞は、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・フミガタス、アスペルギルス・ホエチダス、アスペルギルス・ジャポニクス、アスペルギルス・ニデュランス、アスペルギルス・ニゲル、又はアスペルギルス・オリザエ、ブジェルカンデラ・アダスタ（Bjerkandera adusta）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ceriporiopsis aneirina）、セリポリオプシス・アネイリナ、セリポリオプシスカレギエア（Ceriporiopsis caregiea）、セリポリオプシス・ギルベッセンス（Ceriporiopsis gilvescens）、セリポリオプシス・パンノシンタ（Ceriporiopsis pannocinta）、セリポリオプシス・リブロサ（Ceriporiopsis rivulosa）、セリポリオプシス・スブルファ（Ceriporiopsis subrufa）、セリポリオプシス・スブベルミスポラ（Ceriporiopsis subvermispora）、クリソスポリウム・ルクノウェンセ（Chrysosporium lucknowense）、コプリナス・シネレウス、コリオルス・ヒルスタス（Coriolus hirsutus）、フサリウム・バクトリジオイデス、フサリウム・セレアリス、フサリウム・クロオクウェレンセ、フサリウム・クルモルム、フサリウム・グラミネアルム、フサリウム・グラミヌム、フサリウム・ヘテロスポルム、フサリウム・ネグンジ、フサリウム・オキシスポラム、フサリウム・レチクラタム、フサリウム・レセウム、フサリウム・サンブシヌム、フサリウム・サルコクロウム、フサリウム・スポロトリチオイデス、フサリウム・スルフレウム、フサリウム・トルロサム、フサリウム・トリコテシオイデス、フサリウム・ベネナタム、フミコラ・インソレンス、フミコラ・ラヌギノサ、ムコール・ミエヘイ、ミセリオフトラ・サーモフィラ、ネウロスポラ・クラッサ、ペニシリウム・プルプロゲナム、ファネロカエテ・クリソスポリウム、フレビア・ラディアタ（Phlebia radiata）、プレウロタス・エリンギイ（Pleurotus eryngii）、チエラビア・テレストリス、トラメテス・ビルトサ（Trametes viltosa）、トラメテス・ベルシコロル（Trametes versicolor）、トリコデルマ・ハルジアナム、トリコデルマ・クニンギイ、トリコデルマ・ロンギブラキアタム、トリコデルマ・リーゼイ、トリコデルマ・ビリデの細胞がある。
【０４０１】
最も好ましい態様によれば、繊維状真菌宿主細胞は、アスペルギルス・オリザエである。別の最も好ましい態様によれば、繊維状真菌宿主細胞は、トリコデルマ・リーゼイの細胞である。別の最も好ましい態様によれば、繊維状真菌宿主細胞は、フサリウム・ベネナタムの細胞である。別の最も好ましい態様によれば、繊維状真菌宿主細胞は、クリソスポリウム・ルクノウェンセの細胞である。
【０４０２】
真菌細胞は、プロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、及びそれ自体既知の手順での細胞壁の再生により、形質転換してもよい。アスペルギルス及びトリコデルマ宿主細胞の形質転換のための好適な方法は、欧州特許第２３８０２３号、及びYelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470-1474に記載されている。フサリウム種を形質転換するための好適な方法は、Malardier er al., 1989, Gene 78: 147-156、及び国際公開第９６／００７８７号に記載されている。酵母は、Becker and Guarente, In Abelson, J.N. and Simon, M. I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York; lto et al., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; 及び Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920に記載の方法を用いて形質転換してもよい。
【０４０３】
作製方法
本発明のセルロース分解性タンパク質組成物を作製する方法は、（ａ）その野生型
がポリペプチドを作製できる繊維状真菌細胞を、ポリペプチドの作製を促進する条件下で培養すること；及び（ｂ）ポリペプチドを回収すること、を含んでなる。
【０４０４】
あるいは、本発明のセルロース分解性タンパク質組成物を作製する方法は、（ａ）組み換え繊維状真菌細胞を、ポリペプチドの作製を促進する条件下で培養すること；及び（ｂ）ポリペプチドを回収すること、を含んでなる。
【０４０５】
作製方法については、繊維状真菌細胞を、当業界で周知の方法を用いてポリペプチドの作製に適する栄養培地で培養する。例えば、細胞は、振とうフラスコ培養により、及び好適な培地中でポリペプチドを発現及び／又は単離させる条件下で、実験室又は工業的な発酵槽での小スケール又は大スケールの発酵（連続式、バッチ式、流加式、又は個体状態の発酵）により培養してもよい。培養は、当業界で既知の方法を用いて、炭素及び窒素源並びに無機塩を含んでなる好適な栄養培地中で行われる。好適な培地は、供給業者から購入しても、発表された組成物（例えば、American Type Culture Collectionのカタログで）に従って調製してもよい。タンパク質成分が栄養培地中に分泌される場合は、培地から直接回収できる。分泌されない場合は、細胞ライセートから回収する。
【０４０６】
組成物のタンパク質成分は、本明細書に記載の方法又は当業界で既知の任意の方法を用いて検出できる。
【０４０７】
得られたセルロース分解性タンパク質組成物は、当業界で既知の方法を用いて回収できる。例えば、セルロース分解性タンパク質組成物は従来手法により栄養培地から回収してもよく、限定するものではないが、遠心分離、濾過、抽出、噴霧乾燥、エバポレーション、又は沈降法等がある。
【０４０８】
組成物のタンパク質成分は当業界で既知の様々な方法により精製してもよく、限定するものではないが、クロマトグラフィ（例えば、イオン交換、親和性、疎水性、等電点電気泳動、及びサイズ排除）、電気泳動法（例えば、調製用等電点電気泳動）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、又は抽出（例えば、Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989を参照されたい）等により、実質的に純粋なポリペプチドを得る。
【０４０９】
セルロース−含有物質を処理する方法
本発明はまた、セルロース含有物質を分解又は変換する方法に関し、当該方法は、本発明のセルロース分解性タンパク質組成物の有効量で、セルロース含有物質を処理することを含んでなる。
【０４１０】
さらに本発明は、発酵産物を作製する方法に関し、当該方法は、（ａ）本発明のセルロース分解性タンパク質組成物の有効量で、セルロース含有物質を糖化すること；（ｂ）発酵産物を作製する、１以上（複数）の発酵微生物でを用いて、ステップ（ａ）の糖化セルロース含有物質を発酵させること；及び（ｃ）発酵による発酵産物を回収すること、を含んでなる。
【０４１１】
本発明の方法は、例えばリグノセルロース等のセルロース含有物質を加水分解（糖化）して発酵可能な糖にするとともに、当該発酵可能な糖を、例えば化学物質及び燃料等の多くの有用物質に変換するために使用できる。典型的にはセルロース含有物質から得られる所望の発酵産物の製造には、前処理、酵素的加水分解（糖化）、及び発酵が含まれる。
【０４１２】
本発明によるセルロース含有物質の処理は、当業界で既知のプロセスを用いて達成できる。さらに、本発明の方法は、本発明に従って作動するよう設定された、任意のバイオマス処理装置を用いて実行できる。
【０４１３】
加水分解（糖化）及び発酵は、別々でも同時でもよく、限定するものではないが、分離型の加水分解及び発酵（separate hydrolysis and fermentation）（ＳＨＦ）、同時型の糖化及び発酵（simultaneous saccharification and fermentation）（ＳＳＦ）、同時型の糖化及び共発酵（simultaneous saccharification and cofermentation）（ＳＳＦＣ）、ハイブリッド型の加水分解及び発酵（hybrid hydrolysis and fermentation）（ＨＨＦ）、分離型の加水分解及び共発酵（separate hydrolysis and co-fermentation）（ＳＨＣＦ）、ハイブリッド型の加水分解及び発酵（hybrid hydrolysis and fermentation）（ＨＨＣＦ）、及び直接微生物変換（direct microbial conversion）（ＤＭＣ）がある。本明細書では、前処理、酵素的加水分解（糖化）、発酵、又はこれらの組み合わせを含んでなる当業界で既知の任意の方法が、本発明の方法の実施で使用できると解される。
【０４１４】
従来の装置としては、流加式攪拌反応器（fed-batch stirred reactor）、バッチ式攪拌反応器、限外濾過を伴う連続流攪拌反応器、及び／又は連続プラグ流カラム反応器（Fernanda de Castilhos Corazza, Flavio Faria de Moraes, Gisella Maria Zanin and Ivo Neitzel, 2003, Optimal control in fed-batch reactor for the cellobiose hydrolysis, Acta Sdentiarum. Technology 25: 33-38; Gusakov, A. V., and Sinitsyn, A. P., 1985, Kinetics of the enzymatic hydrolysis of cellulose: 1. A mathematical model for a batch reactor process, Em. Microb. Technol. 7: 346-352）、摩擦反応器（Ryu, S. K., and Lee, J. M., 1983, Byconversion of waste cellulose by using an attrition bioreactor, Biotechnol. Bioeng. 25: 53-65）、又は電磁場により誘導される集中攪拌を伴う反応器（Gusakov, A. V., Sinitsyn, A. P., Davydkin, I. Y., Davydkin, V. Y., Protas, O. V., 1996, Enhancement of enzymatic cellulose hydrolysis using a novel type of bioreactor with intensive stirring induced by electromagnetic field, Appl. Biochem. Biotechnol. 56: 141-153）を挙げることができる。追加の反応器の型としては、例えば、加水分解及び／又は発酵用の、流動層、上方流被覆（upflow blanket）、固定化、及び押し出し機型反応器がある。
【０４１５】
前処理
本発明の方法を実施する際、セルロース含有物質の植物細胞壁成分を破壊するために、当業界で既知の任意の前処理を使用できる。セルロース含有物質は、当業界で既知の方法を用いて、予浸、湿潤化、又は前処理の前の前処置を施すことができる。従来の前処理には、限定するものではないが、蒸気前処理（爆発の存在下又は不存在下）、希酸前処理、熱水前処理、ライム（lime）前処理、湿式酸化、湿式爆発、アンモニア繊維爆発、オルガノソルブ前処理、及び生物的前処理がある。追加の前処理としては、超音波、エレクトロポレーション、マイクロ波、超臨界ＣＯ2、超臨界Ｈ2Ｏ、及びアンモニア・パーコレーションがある。
【０４１６】
セルロース含有物質は、加水分解及び／又は発酵の前に前処理できる。前処理は、加水分解の前に行うことが好ましい。あるいは、前処理は加水分解と同時に行うことができ、例えば、セルロース含有物質を、１以上のセルロース分解性酵素、又はその他の酵素活性物で同時に処理し、グルコース及び／又はマルトース等の発酵可能な糖を放出させることができる。多くの場合、前処理ステップそれ自身が、バイオマスを発酵可能な糖へ変換させる（酵素の不存在下でも）。
【０４１７】
蒸気前処理
蒸気前処理において、セルロース含有物質は、植物細胞壁成分、例えばリグニン、ヘミセルロース、及びセルロース等を破壊すると共に、酵素が、セルロース及び他のフラクション、例えばヘミセルラーゼを利用し易くなるようにする。セルロース物質は、反応容器を移動するかそれを通過し、ここで蒸気は、温度所望の温度及び圧力に上昇させるよう注入されるとともに、そこで所望の反応時間を保持する。蒸気前処理の最適な温度範囲は化学触媒の添加に依存するが、好ましくは１４０〜２３０℃、より好ましくは１６０〜２００℃、及び最も好ましくは１７０〜１９０℃でなされる。蒸気前処理の最適滞留時間は、温度範囲及び科学触媒の添加に依存するが、好ましくは１〜１５分、より好ましくは３〜１２分、及び最も好ましくは４〜１０分である。蒸気前処理により、一般的にセルロース含有物質が前処理の間に単に湿性となるだけで、比較的高固体のロードが可能となる。蒸気前処理は、この前処理の後、蒸気爆発として知られる物質の爆発性の放電と組み合わせることが多く、これは大気圧及び物質の乱流を急速に上昇させ、発酵による影響を受けやすい表面を増加させる（Duff and Murray, 1996, Bioresource Technology 855: 1-33; Galbe and Zacchi, 2002, Appl. Microbiol. Biotechnol. 59: 618-628；米国特許出願第２００２０１６４７３０号）。
【０４１８】
Ｈ2ＳＯ4又はＳＯ2等の触媒（典型的には０．３〜３％ｗ／ｗ）は、蒸気前処理の前に添加されることが多く、これは時間及び温度を低減し、回収量を増加させ、及び酵素的加水分解を改善する（Ballesteros et al., 2006, Appl. Biochem. Biotechnol. 129-132: 496-508; Varga et al.. 2004, Appl. Biochem. Biotechnol. 113-116: 509-523; Sassner et al., 2006, Enzyme Microb. Technol. 39: 756-762）。
【０４１９】
化学的前処理
「化学的前処理」なる用語は、セルロース、ヘミセルロース、及び／又はリグニンの分離及び／又は放出を促進する、任意の化学的前処理のことを言う（好適な化学的前処理プロセスの例としては、例えば、希酸前処理、ライム前処理、湿式酸化、アンモニア繊維／凍結爆発（ＡＦＥＸ)、アンモニア・パーコレーション（ＡＰＲ）、及びオルガノソルブ前処理がある）。
【０４２０】
希酸前処理においては、セルロース含有物質を、希酸、典型的にはＨ2ＳＯ4、及び水と混合しスラリーにし、所望の温度まで蒸気で加熱し、滞留時間経過の後に、大気圧まで一気に戻す。希酸前処理は、多数の反応器設計、例えばプラグ流反応器、向流反応器、又は連続向流収縮床（continuous counter-current shrinking bed）反応器で行うことができる（Duff and Murray, 1996, 上記と同様; Schell et al., 2004, Bioresource Technol. 91 : 179-188; Lee et al., 1999, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 65: 93-115）。
【０４２１】
アルカリ条件下での複数の前処理法も使用できる。これらのアルカリ前処理には、限定するものではないが、ライム前処理、湿式酸化、アンモニア前処理（ＡＰＲ）、及びアンモニア繊維／凍結爆発（ＡＦＥＸ）がある。
【０４２２】
ライム前処理は、炭酸カルシウム、水酸化ナトリウム、又はアンモニアを用い、８５〜１５０℃の低温で１日〜数日の滞留時間で実施する（Wyman et al., 2005, Bioresource Technol. 96: 1959-1966; Mosier et al., 2005, Bioresource Technol. 96: 673-686）。国際公開第２００６／１１０８９１号、２００６／１１８９９号、２００６／１１９００号、及び２００６／１１０９０１号は、アンモニアを使用する前処理方法を開示する。
【０４２３】
湿式酸化は、熱前処理であって、典型的には１８０〜２００℃で５〜１５分間、過酸化水素等の酸化剤の添加、又は酸素加圧状態で実施する（Schmidt and Thomsen, 1998, Bioresource Technol. 64: 139-151; Palonen et al., 2004, Appl. Biochem. Biotechnol. 117: 1-17; Varga et al., 2004, Biotechnol. Bioeng. 88: 567-574; Martin et al., 2006, J. Chem. Technol. Biotechnol. 81: 1669-1677）。当該前処理は、好ましくは１〜４０％の乾燥物質、より好ましくは２〜３０％の乾燥物質、及び最も好ましくは５〜２０％のの乾燥物質で、多くの場合初期ｐＨを炭酸ナトリウム等のアルカリの添加により上昇させて行う。
【０４２４】
湿式爆発として知られる湿式酸化前処理法の修正法（湿式酸化及び蒸気爆発の組み合わせ）は、３０％の乾燥物質を扱うことができる。湿式爆発においては、特定の滞留時間後、調製の間に酸化剤を導入する。その後当該前処理は、一気に大気圧に戻すことにより停止させる（国際公開第２００６／０３２２８２号）。
【０４２５】
アンモニア繊維爆発（ＡＦＥＸ）では、セルロース含有物質を、液体又は気体アンモニアで、９０〜１００℃程度の適当な温度、１７〜２０ｂａｒ程度の高圧で５〜１０分間処理することが必要であり、ここで乾燥物質含量は６０％程度でよい（Gollapalli et al., 2002, Appl. Biochem. Biotechnol. 98: 23-35; Chundawat et al., 2007, Biotechnol. Bioeng. 96: 219-231; Alizadeh et al., 2005, Appl. Biochem. Biotechnol. 121 :1133-1141; Teymouri et al., 2005, Bioresource Technol. 96: 2014-2018）。
【０４２６】
オルガノソルブ前処理は、水性エタノール（４０〜６０％エタノール）を用い、１６０〜２００℃で３０〜６０分間抽出することによりセルロース含有物質を脱リグニン化（delignify）する（Pan et al., 2005, Biotechnol. Bioeng 90: 473-481; Pan et al., 2006, Biotechnol. Bioeng. 94: 851-861; Kurabi et al., 2005, Appl. Biochem. Biotechnol. 121:219-230）。通常、硫酸は触媒として添加される。オルガノソルブ前処理においては、ヘミセルロースの大部分が除去される。
【０４２７】
好適な前処理法のその他の例は、Schell et al., 2003, Appl. Biochem. and Biotechnol. Vol. 105-108, p. 69-85, 及び Mosier et al., 2005, Bioresource Technology 96: 673-686, 及び 米国特許出願第２００２／０１６４７３０号、に記載されている。
【０４２８】
ある態様によれば、化学的前処理は、好ましくは酸処理で、より好ましくは連続的希酸及び／又は弱酸処理で行う。酸としては、典型的には硫酸であるが、その他の酸も使用でき、例えば酢酸、クエン酸、硝酸、リン酸、酒石酸ｍ、コハク酸、塩化水素又はこれらの混合物がある。弱酸処理は、ｐＨ範囲が、好ましくは１〜５、より好ましくは１〜４、及び最も好ましくは１〜３で実施される。ある態様によれば、当該酸濃度は、好ましくは０．０１〜２０質量％の酸、より好ましくは０．０５〜１０質量％、さらにより好ましくは０．１〜５質量％、及び最も好ましくは０．２〜２．０質量％の範囲である。当該酸を、セルロース含有物質と接触させ、ある温度、例えば１６０〜２００℃、好ましくは１６５〜１９５℃で、秒から分の範囲の時間、例えば１秒〜６０分そのままにする。
【０４２９】
別の態様によれば、前処理はアンモニア繊維爆発ステップ（ＡＦＥＸ前処理ステップ）として実施される。
【０４３０】
別の態様によれば、前処理は水性スラリー中で行われる。好ましい態様によれば、前処理の間、セルロース含有物質は、好ましくは１０〜８０質量％、より好ましくは２０〜７０質量％、最も好ましくは３０〜６０質量％、例えば約５０質量％で存在する。前処理したセルロース含有物質は、洗浄しなくても、例えば水を用いる等の当業界で既知の任意の方法を用いて洗浄してもよい。
【０４３１】
機械的前処理
「機械的前処理」なる用語は、様々な型の破砕（grinding）又は粉砕（milling）のことを言う（例えば、乾式粉砕、湿式粉砕、又は振動ボール粉砕）
【０４３２】
物理的前処理
「物理的前処理」なる用語は、セルロース含有物質からの、セルロース、ヘミセルロース、及び／又はリグニンの分離及び／又は放出を促進させる任意の前処理のことを言う。例えば、物理的前処理には、照射（例えば、マイクロ波照射）、蒸気処理／蒸気爆発、熱水分解（hydrothermolysis）、及びこれらの組み合わせがある。
【０４３３】
物理的前処理には、高圧及び／又は高温（蒸気爆発）が必要となり得る。ある態様によれば、高圧とは、好ましくは３００〜６００ｐｓｉ、より好ましくは３５０〜５５０ｐｓｉ、及び最も好ましくは４００〜５００ｐｓｉ、例えば約４５０ｐｓｉを意味する。別の態様によれば、高温とは、約１００〜３００℃、好ましくは約１４０〜２３５℃を意味する。より好ましい態様によれば、機械的前処理は、バッチ処理、蒸気ガン加水分解システムで行われ、これは上記定義の通りの高圧及び高温で行われ、例えばSunds Defibrator AB, SwedenのSunds Hydrolyzerがある。
【０４３４】
物理的及び化学的前処理の組み合わせ
セルロース含有物質は、物理的にも化学的にも前処理できる。例えば、前処理ステップには、希酸又は弱酸処理及び高温及び／又は高圧処理を入れることができる。物理的及び化学的前処理は、連続的でも同時でも所望の通りに行うことができる。機械的前処理も含めることができる。
【０４３５】
従って、好ましい態様によれば、セルロース含有物質は、機械的、化学的、又は物理的前処理、又はその任意の組み合わせで処理され、セルロース、ヘミセルロース、及び／又はリグニンを分離及び／又は放出する。
【０４３６】
生物的前処理
「生物的前処理」なる用語は、セルロース含有物質から、セルロース、ヘミセルロース、及び／又はリグニンの分離及び／又は放出を促進する任意の生物的前処理のことを言う。生物的前処理技術には、リグニン可溶化微生物の適用が含まれる（例えば以下を参照されたい。Hsu, T.-A.. 1996, Pretreatment of biomass, in Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, C. E., ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179- 212; Ghosh and Singh, 1993, Physicochemical and biological treatments for enzymatic/microbial conversion of lignocellulosic biomass, Adv. Appl. Microbiol. 39: 295- 333; McMillan, J. D., 1994, Pretreating lignocellulosic biomass: a review, in Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production, Himmel, M. E., Baker, J. O., and Overend, R. P., eds., ACS Symposium Series 566, American Chemical Society, Washington, DC, chapter 15; Gong, C. S., Cao, N. J., Du, J., and Tsao, G. T., 1999, Ethanol production from renewable resources, in Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, T., ed., Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Germany, 65: 207-241 ; Olsson and Hahn-Hagerdal, 1996, Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanol production, Enz. Microb. Tech. 18: 312-331 ; and Vallander and Eriksson, 1990, Production of ethanol from lignocellulosic materials: State of the art, Adv. Biochem. Eng./Biotechnol. 42: 63-95）。
【０４３７】
糖化
糖化としても知られる加水分解ステップにおいては、前処理したセルロース含有物質が、加水分解されセルロースに分解し、あるいはへミセルロースも、グルコース、キシロース、キシルロース、アラビノース、マルトース、マンノース、ガラクトース、及び／又は可溶性オリゴ糖等の発酵可能な糖に分解する。加水分解は、本発明のセルロース分解性タンパク質組成物を用いて、酵素的に実施できる。当該組成物の酵素成分はまた、連続的に添加できる。
【０４３８】
酵素的加水分解は、当業者によって容易に決定できる条件下で、好ましくは好適な水性環境中で実施される。好ましい態様によれば、加水分解は、（１以上の）酵素の活性に適する、すなわち（１以上の）酵素に最適な条件下で実施される。加水分解は、流加式又は連続式プロセスとして行われ、ここで前処理したセルロース含有物質（基質）は、例えば加水分解溶液を含有する酵素に徐々に送り込まれる。
【０４３９】
一般的に糖化は、攪拌タンクの反応器又は発酵機の中で、制御したｐＨ、温度、及び混合条件下で実施される。当業者は、好適な処理時間、温度、及びｐＨ条件を容易に決定できる。例えば、糖化は、最大で２００時間継続できるが、典型的には、好ましくは約１２時間〜約９６時間、より好ましくは約１６時間〜約７２時間、及び最も好ましくは約２４時間〜約４８時間行われる。温度は、好ましくは約２５℃〜約７０℃、より好ましくは約３０℃〜約６５℃、及びより好ましくは約４０℃〜約６０℃、特に約５０℃の範囲である。ｐＨは、好ましくは約３〜８、より好ましくは約３．５〜７、及び最も好ましくは約４〜約６の範囲、特にｐＨが約５である。乾燥固体成分は、好ましくは約５〜約５０質量％、より好ましくは約１０〜約４０質量％、及び最も好ましくは約２０〜約３０質量％の範囲である。
【０４４０】
セルロース分解活性を有する酵素及びポリペプチドの最適な量は、複数の因子に依存し、限定するものではないが、セルロース分解性タンパク質成分の混合物、セルロース基質、セルロース基質の濃度、セルロース基質の（１又は複数の）前処理、温度、時間、ｐＨ、及び発酵生物の混合がある（例えば、同時型の糖化及び発酵）。
【０４４１】
好ましい態様によれば、セルロース含有物質に対する（１又は複数の）セルロース分解性タンパク質の有効量は、セルロース含有物質１ｇ当たり、約０．５〜約５０ｍｇ、好ましくは約０．５〜約４０ｍｇ、より好ましくは約０．５〜約２５ｍｇ、より好ましくは約０．７５〜約２０ｍｇ、より好ましくは約０．７５〜約１５ｍｇ、さらにより好ましくは約０．５〜約１０ｍｇ、及び最も好ましくは約２．５〜１０ｍｇである。
【０４４２】
別の好ましい態様によれば、セルロース含有物質に対するセルロース分解性増強活性を有するポリペプチドの有効量は、セルロース含有物質１ｇ当たり、約０．５〜約５０ｍｇ、好ましくは約０．５〜約４０ｍｇ、より好ましくは約０．５〜約２５ｍｇ、より好ましくは約０．７５〜約２０ｍｇ、より好ましくは約０．７５〜約１５ｍｇ、さらにより好ましくは約０．５〜約１０ｍｇ、及び最も好ましくは約２．５〜１０ｍｇである。
【０４４３】
別の好ましい態様によれば、セルロース含有物質に対する、セルロース分解性増強活性を有する（１又は複数の）ポリペプチドの有効量は、セルロース含有物質１ｇ当たり、約０．０１〜約５０．０ｍｇ、好ましくは約０．０１〜約４０ｍｇ、より好ましくは約０．０１〜約３０ｍｇ、より好ましくは約０．０１〜約２０ｍｇ、より好ましくは約０．０１〜約１０ｍｇ、より好ましくは約０．０１〜約５ｍｇ、より好ましくは約０．０２５〜約１．５ｍｇ、より好ましくは約０．０５〜約１．２５ｍｇ、より好ましくは約０．０７５〜約１．２５ｍｇ、より好ましくは約０．１〜約１．２５ｍｇ、さらにより好ましくは約０．１５〜約１．２５ｍｇ、及び最も好ましくは約０．２５〜１．０ｍｇである。
【０４４４】
別の好ましい態様によれば、（１又は複数の）セルロース分解性タンパク質に対するセルロース分解性増強活性を有する（１又は複数の）ポリペプチドの有効量は、セルロース含有物質１ｇ当たり、約０．００５〜約１．０ｇ、好ましくは約０．０１〜約１．０ｇ、より好ましくは約０．１５〜約０．７５ｇ、より好ましくは約０．１５〜約０．５ｇ、より好ましくは約０．１〜約０．５ｇ、さらにより好ましくは約０．１〜約０．５ｇ、及び最も好ましくは約０．０５〜約０．２ｇである。
【０４４５】
発酵
前処理され、加水分解されたセルロース含有物質から得られる発酵可能な糖は、１以上の発酵微生物が、当該糖を直接的又は間接的に所望の発酵産物に発酵できることから、発酵がきる。「発酵」又は「発酵プロセス」は発酵ステップを含んでなる任意の発酵プロセス又は任意のプロセスのことを言う。発酵プロセスには、バイオ燃料産業、消費アルコール産業（例えばビール及びワイン）、日用品産業（例えば、発酵した日用品）、革産業、及びタバコ産業において使用される発酵プロセスが含まれる。発酵条件は、所望の発酵産物及び発酵生物に依存し、当業者は容易にこれを決定できる。
【０４４６】
発酵ステップにおいて、前処理及び酵素的加水分解ステップの結果としてのセルロース含有物質から放出される糖は、例えば酵母等の発酵生物により、例えばエタノール等の産物に発酵される。加水分解（糖化）及び発酵は、別々にも同時にも行うことができる。当該方法には、限定するものではないが、分離型の加水分解及び発酵（ＳＨＦ）、同時型の糖化及び発酵（ＳＳＦ）、同時型の糖化及び共発酵（ＳＳＦＣ）、ハイブリッド型の加水分解及び発酵（ＨＨＦ）、分離型の加水分解及び共発酵（ＳＨＣＦ）、ハイブリッド型の加水分解及び発酵（ＨＨＣＦ）、及び直接微生物変換（ＤＭＣ）がある。
【０４４７】
任意の好適な加水分解されたセルロース含有物質は、本発明を実施する際に発酵ステップで使用できる。物質は一般的に所望の発酵産物、すなわち発酵から得られる物質に基づいて選択され、使用されるプロセスは、当業界で周知である。
【０４４８】
本明細書で「発酵培地」なる用語は、（１又は複数の）発酵微生物が添加される前の培地のことを言い、例えば、糖化プロセスから得られる培地、並びに例えば同時型の糖化及び発酵プロセス（ＳＳＦ）で使用される培地がある。
【０４４９】
「発酵微生物」は、細菌及び真菌微生物等であって、発酵産物を作製するための所望の発酵プロセスでの使用に適する任意の微生物のことを言う。発行生物は、Ｃ6／又はＣ5発酵生物、又はその組み合わせがあり得る。Ｃ6及びＣ5いずれの発酵生物も、当業界で周知である。好適な発酵微生物は、例えばグルコース、キシロース、キシルロース、アラビノース、マルトース、マンノース、ガラクトース、又はオリゴ糖等の糖を、直接的又は間接的に所望の発酵産物に発酵、すなわち変換できる。
【０４５０】
エタノールを作製する細菌又は真発酵生物の例は、Un et. al., 2006, Appl. Microbiol. Botechnol. 69: 627-642に記載がある。
【０４５１】
Ｃ6糖を発酵できる発酵微生物の例には、酵母等の細菌及び真菌生物が含まれる。好ましい酵母には、サッカロマイセス属が含まれ、好ましくはサッカロマイセス・セレビシアエである。
【０４５２】
Ｃ5糖を発酵できる発酵微生物の例には、酵母等の細菌及び真菌生物が含まれる。好ましいＣ5発酵酵母には、ピキア属が含まれ、好ましくはピキア・ストピティス（Pichia stipitis）、例えばピキア・ストピティスＣＢＳ５７７３；カンジダ系統、好ましくはカンジダ・ボイジニイ（Candida boidinii）、カンジダ・ブラシカエ（Candida brassicae）、カンジダ・シェアタエ（Candida sheatae）、カンジダ・ジッデンシイ（Candida diddensii）、カンジダ・シュードトロピカリス（Candida pseudotropicalis）、又はカンジダ・ウチリス（Candida utilis）がある。
【０４５３】
他の発酵生物には、ジモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）等のジモモナス系統；ハンセヌラ・アノマラ（Hansenula anomala）等のハンセヌラ；Ｋ.フラジリス（K. fragilis）等のクリベロマイセス（Klyveromyces）；Ｓ.ポンベ（S. pombe）等のスキゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）；及びＥ.ｃｏｌｉ、特にエタノールの収量を向上させるよう遺伝子改変したＥ.ｃｏｌｉ系統がある。
【０４５４】
好ましい態様によれば、酵母はサッカロマイセス種である。より好ましい態様によれば、酵母はサッカロマイセス・セレビシアエである。別のより好ましい態様によれば、酵母はサッカロマイセス・ジスタティクス（Saccharomyces distaticus）である。別のより好ましい態様によれば、酵母はサッカロマイセス・ウバルム（Saccharomyces uvarum）である。別のより好ましい態様によれば、酵母はクルイベロマイセス（Kluyveromyces）である。別のより好ましい態様によれば、酵母はクルイベロマイセス・マルクスラナス（Kluyveromyces marxlanus）である。別のより好ましい態様によれば、酵母はクルイベロマイセス・フラジリスである。別のより好ましい態様によれば、酵母はカンジダである。別のより好ましい態様によれば、酵母はカンジダ・ボイジニイである。別のより好ましい態様によれば、酵母はカンジダ・ブラシカエである。別のより好ましい態様によれば、酵母はカンジダ・ジデンシイ（Candida diddensii）である。別のより好ましい態様によれば、酵母はカンジダ・シュードトロプルカリス（Candida pseudotroplcalis）である。別のより好ましい態様によれば、酵母はカンジダ・ウチリスである。別のより好ましい態様によれば、酵母はクラビスポラである。別のより好ましい態様によれば、酵母はクラビスポラ・ルシタニアエ（Clavispora lusitaniae）である。別のより好ましい態様によれば、酵母はクラビスポラ・オプンチアエ（Clavispora opuntiae）である。。別のより好ましい態様によれば、酵母はパキソレン（Pachysolen）である。別のより好ましい態様によれば、酵母はパキソレン・タンノフィルス（Pachysolen tannophilus）である。別のより好ましい態様によれば、酵母はピキアである。別のより好ましい態様によれば、酵母はピキア・スチピチス（Pichia stipitis）である。別のより好ましい態様によれば、酵母はブレタノマイセス（Bretannomyces）である。別のより好ましい態様によれば、酵母はブレタノマイセス・クラウセニイ（Bretannomyces clausenii）である（Philippidis, G. P., 1996, Cellulose byconversion technology, in Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, C. E., ed., Taylor & Francis, Washington, DC1 179-212）。
【０４５５】
ヘキソース及びペントースをエタノールに効率的に発酵できる細菌には、例えば、ジモモナス・モビリス及びクロストリジウム・サーモセラム（Clostridium thermocellum）がある（Philippidis, 1996, 上記と同様）。
【０４５６】
好ましい態様によれば、細菌はジモモナスである。より好ましい態様によれば、細菌はジモモナス・モビリスである。別の好ましい態様によれば、細菌は、クロストリジウムである。別のより好ましい態様によれば、細菌はクロストリジウム・サーモセラムである。
【０４５７】
エタノール製造に適する市販の酵母には、例えば、ＥＴＨＡＮＯＬ ＲＥＤ（商標）酵母（Fermentis/Lesaffre, USAから入手可能）、ＦＡＬＩ（商標）（Fleischmann's Yeast, USAから入手可能）、ＳＵＰＥＲＳＴＡＲＴ（商標）及びＴＨＥＲＭＯＳＡＣＣ（商標）fresh 酵母（Ethanol Technology, Wl1 USAから入手可能）、ＢＩＯＦＥＲＭ（商標）ＡＦＴ及びＸＲ（NABC - North American Byproducts Corporation, GA, USAから入手可能）、ＧＥＲＴ ＳＴＲＡＮＤ（商標）（Gert Strand AB, Swedenから入手可能）、及びＦＥＲＭＩＯＬ（商標）（DSM Specialtiesから入手可能）がある。
【０４５８】
好ましい態様によれば、発酵微生物は、ペントース糖を発酵する能力を提供するよう遺伝的に改変されており、例えば、キシロース利用性、アラビノース利用性、及びキシロース及びアラビノース共利用性の微生物がある。
【０４５９】
様々な発酵微生物への移植により、異種接合型遺伝子を、ヘキソース及びペントースをエタノールに変換（共発酵）できる微生物構築物にすることができた（Chen and Ho, 1993, Cloning and improving the expression of Pichia stipitis xylose reductase gene in Saccharomyces cerevisiae, Appl. Biochem. Biotechnol. 39-40: 135-147; Ho ef al., 1998, Genetically engineered Saccharomyces yeast capable of effectively cofermenting glucose and xylose, Appl. Environ. Microbiol. 64: 1852-1859; Kotter and Ciriacy, 1993, Xylose fermentation by Saccharomyces cerevisiae, Appl. Microbiol. Biotechnol. 38: 776-783; Walfridsson et al., 1995, Xylose- metabolizing Saccharomyces cerevisiae strains overexpressing the TKL1 and TAL1 genes encoding the pentose phosphate pathway enzymes transketolase and transaldolase, Appl. Environ. Microbiol. 61 : 4184-4190; Kuyper ef al., 2004, Minimal metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficient anaerobic xylose fermentation: a proof of principle, FEMS Yeast Research 4: 655-664; Beall et al., 1991 , Parametric studies of ethanol production from xylose and other sugars by recombinant Escherichia coli, Biotech. Bioeng. 38: 296-303; Ingram et al.. 1998, Metabolic engineering of bacteria for ethanol production, Biotechnol. Bioeng. 58: 204-214; Zhang er al., 1995, Metabolic engineering of a pentose metabolism pathway in ethanologenic Zymomonas mobilis. Science 267: 240-243; Deanda et al., 1996, Development of an arabinose-fermenting Zymomonas mobilis strain by metabolic pathway engineering, Appl. Environ. Microbiol. 62: 4465-4470）
【０４６０】
好ましい態様によれば、遺伝的に改変された発酵微生物は、サッカロマイセス・セレビシアエである。別の好ましい態様によれば、遺伝的に改変された発酵微生物は、ジモモナス・モビリスである。別の好ましい態様によれば、遺伝的に改変された発酵微生物は、エシェリキア・コリである。別の好ましい態様によれば、遺伝的に改変された発酵微生物は、クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）である。
【０４６１】
（１又は複数の）発酵微生物を、典型的には分解されたセルロース又は加水分解物に添加し、発酵は、約８〜約９６時間、例えば約２４〜約６０時間実施される。温度は典型的には、約２６℃〜約６０℃であり、特に約３２℃又は約５０℃であり、ｐＨは約３〜約８であり、例えばｐＨはおよそ４〜５、６、又は７である。
【０４６２】
好ましい態様によれば、（１又は複数の）発酵微生物を、分解されたセルロース又は加水分解物に添加し、発酵は、約１２〜約９６時間、例えば約２４〜約６０時間実施される。好ましい態様によれば、温度は、好ましくは約２０℃〜約６０℃、より好ましくは約２５℃〜約５０℃、及び最も好ましくは約３２℃〜約５０℃であり、ｐＨは、一般的には、約ｐＨ３〜約ｐＨ７、好ましくは約ｐＨ４〜７である。ただし、いくつかのもの、例えば細菌発酵生物がは、より高い発酵最適温度を有する。（１又は複数の）発酵微生物は、発酵ブロス１ｍＬ当たりの生細胞カウントが、好ましくは、およそ１０5〜１０12の量で、好ましくはおよそ１０7〜１０10、特におよそ２×１０8である。さらに、発酵のための酵母の使用についてのガイダンスは、例えば、「The Alcohol Textbook」（Editors K. Jacques, T.P. Lyons and D.R. Kelsall, Nottingham University Press, United Kingdom 1999）で見ることができ、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【０４６３】
エタノール製造のために、発酵後に、発酵したスラリーを希釈してエタノールを抽出する。本発明により得られるエタノールは、例えば、燃料エタノール、飲用エタノール、すなわち、携帯用中性スピリッツ、又は工業用エタノールとして使用できる。
【０４６４】
発酵刺激因子は、本明細書で記載の任意の酵素プロセスとの組み合わせで、発酵プロセス、特に発酵微生物の機能、例えば速度向上及びエタノール産生等をさらに改善するために使用できる。「発酵刺激因子」は、発酵微生物、特に酵母の増殖のための刺激因子のことを言う。好ましい増殖用の発酵刺激因子には、ビタミン及びミネラルが含まれる。ビタミンの例としては、マルチビタミン、ビオチン、パントテン酸塩、ニコチン酸、メソ−イノシトール、チアミン、ピリドキシン、パラ−アミノ安息香酸、葉酸、リボフラビン、及びビタミンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥがある。例えば、Alfenore et al., Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae by a vitamin feeding strategy during fed-batch process, Springer-Verlag (2002)を参照されたい。これは参照により本明細書に組み込まれる。ミネラルの例としては、Ｐ、Ｋ、Ｍｇ、Ｓ、Ｃａ、Ｆｅ、Ｚｎ、Ｍｎ、及びＣｕを含んでなる栄養素を補給できる、ミネラル及びミネラル塩がある。
【０４６５】
発酵産物
発酵産物は、発酵から得られる任意の物質があり得る。発酵産物は、限定するものではないが、アルコール（例えば、アラビニトール、ブタノール、エタノール、グリセロール、メタノール、１,３−プロパンジオール、ソルビトール、及びキシリトール）；有機酸（例えば、酢酸、アセトン酸、アジピン酸、アスコルビン酸、クエン酸、２,５−ジケト−Ｄ−グルコン酸、ギ酸、フマル酸、グルカル酸、グルコン酸、グルクロン酸、グルタル酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、イタコン酸、乳酸、リンゴ酸、マロン酸、硝酸、プロピオン酸、コハク酸、及びキシロン酸）；ケトン（例えば、アセトン）；アルデヒド（例えば、ホルムアルデヒド）；アミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、リジン、セリン、及びスレオニン）；及びガス（例えば、メタン、水素（Ｈ2）、二酸化炭素（ＣＯ2）、及び一酸化炭素（ＣＯ））がある。発酵産物はまた、高価値産物としてのタンパク質があり得る。
【０４６６】
好ましい態様によれば、発酵産物はアルコールである、「アルコール」なる用語は、１又は複数のヒドロキシル部分を含む物質を包含する。より好ましい態様によれば、アルコールはアラビニトールである。より好ましい態様によれば、アルコールはブタノールである。より好ましい態様によれば、アルコールはエタノールである。より好ましい態様によれば、アルコールはグリセロールである。より好ましい態様によれば、アルコールはメタノールである。より好ましい態様によれば、アルコールは１,３−プロパンジオールである。より好ましい態様によれば、アルコールはソルビトールである。より好ましい態様によれば、アルコールはキシリトールである。例えば、Gong, C. S., Cao, N. J., Du, J., and Tsao, G. T., 1999, Ethanol production from renewable resources, in Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, T., ed., Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Germany, 65: 207-241 ; Silveira, M. M., and Jonas, R., 2002, The biotechnological production of sorbitol, Appl. Microbiol. Biotechnol. 59: 400-408; Nigam, P., and Singh, D., 1995, Processes for fermentative production of xylitol - a sugar substitute, Process Biochemistry 30 (2): 117-124; Ezeji, T. C, Qureshi, N. and Blaschek, H. P., 2003, Production of acetone, butanol and ethanol by Clostridium beijerinckli BA101 and In situ recovery by gas stripping, World Journal of Microbiology and Biotechnology 19 (6): 595-603を参照されたい。
【０４６７】
別の好ましい態様によれば、発酵産物は有機酸である。別の好ましい態様によれば、有機酸は酢酸である。別の好ましい態様によれば、有機酸はアセトン酸である。別のより好ましい態様によれば、有機酸はアジピン酸である。別のより好ましい態様によれば、有機酸はアスコルビン酸である。別のより好ましい態様によれば、有機酸はクエン酸である。別のより好ましい態様によれば、有機酸は２,５−ジケト−Ｄ−グルコン酸である。別のより好ましい態様によれば、有機酸はギ酸である。別のより好ましい態様によれば、有機酸はフマル酸である。別のより好ましい態様によれば、有機酸はグルカル酸である。別のより好ましい態様によれば、有機酸はグルコン酸である。別のより好ましい態様によれば、有機酸はグルクロン酸である。別のより好ましい態様によれば、有機酸はグルタル酸である。別のより好ましい態様によれば、有機酸は３−ヒドロキシプロピオン酸である。別のより好ましい態様によれば、有機酸はイタコン酸である。別のより好ましい態様によれば、有機酸は乳酸である。別のより好ましい態様によれば、有機酸はリンゴ酸である。別のより好ましい態様によれば、有機酸はマロン酸である。別のより好ましい態様によれば、有機酸は硝酸である。別のより好ましい態様によれば、有機酸はプロピオン酸である。別のより好ましい態様によれば、有機酸はコハク酸である。別のより好ましい態様によれば、有機酸はキシロン酸である。例えば、Chen, R., and Lee, Y. Y., 1997, Membrane-mediated extractive fermentation for lactic acid production from cellulosic biomass, Appl. Biochem. Biotechnol. 63-65: 435-448を参照されたい。
【０４６８】
別の好ましい態様によれば、発酵産物はケトンである。「ケトン」なる用語は、１又は複数のケトン部分を含む物質を包含すると解される。別のより好ましい態様によれば、ケトンはアセトンである。例えば、Qureshi and Blaschek, 2003（上記と同様）を参照されたい。
【０４６９】
別の好ましい態様によれば、発酵産物はアルデヒドである。別のより好ましい態様んよれば、アルデヒドはホルムアルデヒドである。
【０４７０】
別の好ましい態様によれば、発酵産物はアミノ酸である。別のより好ましい態様によれば、有機酸はアスパラギン酸である。別のより好ましい態様によれば、アミノ酸はグルタミン酸である。別のより好ましい態様によれば、アミノ酸はグリシンである。別のより好ましい態様によれば、アミノ酸はリジンである。別のより好ましい態様によれば、アミノ酸はセリンである。別のより好ましい態様によれば、アミノ酸はスレオニンである。例えば、Richard, A., and Margaritis, A., 2004, Empirical modeling of batch fermentation kinetics for poly(glutamic acid) production and other microbial biopolymers, Biotechnology and Bioengineering 87 (4): 501-515 を参照されたい。
【０４７１】
別の好ましい態様によれば、発酵産物はガスである。別のより好ましい態様によれば、ガスはメタンである。別のより好ましい態様によれば、ガスはＨ2である。別のより好ましい態様によれば、ガスはＣＯ2である。別のより好ましい態様によれば、ガスはＣＯである。例えば、Kataoka, N., A. Miya, and K. Kiriyama, 1997, Studies on hydrogen production by continuous culture system of hydrogen-producing anaerobic bacteria, Water Science and Technology 36 (6-7): 41-47; and Gunaseelan V.N. in Biomass and Bioenergy, Vol. 13 (1-2), pp. 83-114, 1997, Anaerobic digestion of biomass for methane production: A review、を参照されたい。
【０４７２】
回収
（１又は複数の）発酵産物は、当業界で周知の任意の方法を用いて、発酵培地から任意に回収でき、方法としては、限定するものではないが、例えばクロマトグラフィ（例えば、イオン交換、親和性、疎水性、等電点電気泳動、及びサイズ排除）、電気泳動（例えば、調製等電点電気泳動）、溶解性の違い（例えば、アンモニウム硫酸沈降法）、蒸留、又は抽出がある。例えば、エタノールは、発酵したセルロース含有物質から分離されい、従来の蒸留法で精製される。約９６体積％までの純度を有するエタノールを得ることができ、例えば、燃料用エタノール、飲用エタノール、すなわち携帯用中性スピリッツ、又は工業用エタノールとして使用できる。
【０４７３】
本発明は、以下の実施例によりさらに詳細に記載するが、これは本発明の範囲を限定するものと解すべきではない。
【０４７４】
実施例
バッファ及び基質（substrate）として使用される化学物質は、少なくとも試薬グレードの市販品である。
【０４７５】
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列決定は、dye terminator chemistry（Giesecke et al., 1992, Journal of Virol. Methods 38: 47-60）を用いる、Applied Biosystems Model 3130X Genetic Analyzer（Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）を用いて実施した。配列特異的プライマーと共にphred/phrap/consed（University of Washington, Seattle, WA, USA）を用いて配列を組み立てた。
【０４７６】
培地及び溶液
ＹＰ培地を、１Ｌ当たり、１０ｇ酵母エキス（yeast extract）及び２０ｇのbactoトリプトンで組成した。
セルラーゼ誘導培地を、１Ｌ当たり、２０ｇのセルロース、１０ｇのトウモロコシ浸漬固体（corn steep solids）、１．４５ｇの（ＮＨ4）2ＳＯ4、２．０８ｇのＫＨ2ＰＯ4、０．２８ｇのＣａＣｌ2、０．４２ｇのＭｇＳＯ4Ｈ2Ｏ、及び０．４２ｍｌの微量金属溶液で組成した。
微量金属溶液を、１Ｌ当たり、２１６ｇのＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ、５８ｇのＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、２７ｇのＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ、１０ｇのＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、２．４ｇのＨ3ＢＯ3、及び３３６ｇのクエン酸で組成した。
ＳＴＣを、１Ｍ ソルビトール、１０ｍＭ ＣａＣｌ2、及び１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌで、ｐＨ ７．５で組成した。
【０４７７】
ＣＯＶＥプレートを、１Ｌ当たり、３４２ｇのスクロース、１０ｍＬのＣＯＶＥ塩溶液、１０ｍＬの１Ｍ アセトアミド、１０ｍＬの１．５Ｍ ＣｓＣｌ、及び２５ｇのノーブル寒天（Noble agar）で組成した。
ＣＯＶＥ塩溶液を、１Ｌ当たり、２６ｇのＫＣｌ、２６ｇのＭｇＳＯ4、７６ｇのＫＨ2ＰＯ4、及び５０ｍＬのＣＯＶＥ微量金属溶液で組成した。
ＣＯＶＥ微量金属溶液を、１Ｌ当たり、０．０４ｇのＮａ2Ｂ4Ｏ7・１０Ｈ2Ｏ、０．４ｇのＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、１．２ｇのＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．７ｇのＭｎＳＯ4. Ｈ2Ｏ、０．８ｇのＮａ2ＭｏＯ2. Ｈ2Ｏ、及び１０ｇのＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏで組成した。
【０４７８】
ＣＯＶＥ２プレートを、１Ｌ当たり、３０ｇのスクロース、２０ｍＬのＣＯＶＥ塩溶液、２５ｇのノーブル寒天、及び１０ｍＬの１Ｍ アセトアミドで組成した。
ＰＤＡプレートを、１Ｌ当たり、３９ｇのポテトデキストロース寒天で組成した。
ＬＢ培地を、１Ｌ当たり、１０ｇのトリプトン、５ｇの酵母エキス、５ｇの塩化ナトリウムで組成した。
２×ＹＴ−Ａｍｐプレートを、１Ｌ当たり、１０ｇのトリプトン、５ｇの酵母エキス、５ｇの塩化ナトリウム、及び１５ｇのBacto Agarで組成し、オートクレーブ後に２ｍＬのフィルター滅菌溶液の５０ｍｇ／ｍＬアンピシリンを添加した。
【０４７９】
ＭＤＵ２ＢＰ培地を、１Ｌ当たり、４５ｇのマルトース、１ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１ｇのＮａＣｌ2、２ｇのＫ2ＨＳＯ4、１２ｇのＫＨ2ＳＯ4、２ｇのウレア、及び５００μｌのＡＭＧ微量金属溶液で組成し、ｐＨを５．０に調整し、その後０．２２μｍフィルターユニットでフィルター滅菌した。
ＡＭＧ微量金属溶液を、１Ｌ当たり、１４．３ｇのＺｎＳｏ4・７Ｈ2Ｏ、２．５ｇのＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、０．５ｇのＮｉＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、１３．８ｇのＦｅＳＯ4・Ｈ2Ｏ、８．５ｇのＭｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、及び３ｇのクエン酸で組成した。
【０４８０】
最小培地プレートを、１Ｌ当たり、６ｇのＮａＮＯ3、０．５２ｇのＫＣｌ、１．５２ｇのＫＨ2ＰＯ4、１ｍＬのＣＯＶＥ微量金属溶液、２０ｇのノーブル寒天、２０ｍｌの５０％グルコース、２．５ｍｌの２０％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、及び２０ｍｌのビオチンストック溶液で組成した。
ビオチンストック溶液を、１Ｌ当たり、０．２ｇのビオチンで組成した。
【０４８１】
ＳＯＣ培地を、２％トリプトン、０．５％酵母エキス、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、及び１０ｍＭ ＭｇＳＯ4で組成し、オートクレーブ後に、フィルター滅菌グルコースを２０ｍＭとなるよう添加した。
マンデルの培地を、１Ｌ当たり、１．４ｇの（ＮＨ4）2ＳＯ4、２．０ｇのＫＨ2ＰＯ4、０．３ｇのウレア、０．３ｇのＣａＣｌ2、０．３ｇのＭｇＳＯ4.７Ｈ2Ｏ、５ｍｇのＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１．６ｍｇのＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ、１．４ｍｇのＺｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ、及び２ｍｇのＣｏＣｌ2で組成した。
【０４８２】
実施例１：ｐＭＪ０４発現ベクターの構築
発現ベクターｐＭＪ０４を、以下に示すプライマー９９３４２９（アンチセンス）及び９９３４２８（センス）を用いて、トリコデルマ・リーゼイＲｕｔＣ３０ゲノムＤＮＡから、トリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼ１遺伝子（ｃｂｈ１、ＣＥＬ７Ａ）ターミネーターをＰＣＲ増幅することにより構築した。アンチセンスプライマーは、センスプライマーの、５'末端にＰａｃＩ部位、及び３'末端にＳｐｅＩ部位を有するように設計された。
プライマー９９３４２９（アンチセンス）：
5'-AACGTTAATTAAGGAATCGTTTTGTGTTT-S' (配列番号: 65) 
プライマー９９３４２８（センス）：
5'-AGTACTAGTAGCTCCGTGGCGAAAGCCTG-31 (配列番号: 66)
【０４８３】
トリコデルマ・リーゼイＲｕｔＣ３０ゲノムＤＮＡを、DNEASY（登録商標）Plant Maxi Kit（QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA）を用いて単離した。
【０４８４】
増幅反応物（５０μｌ）を、１×ThermoPol 反応バッファ（ThermoPol Reaction Buffer）（New England Biolabs. Beverly, MA, USA）、０．３ｍＭ ｄＮＴＰ、１００ｎｇのトリコデルマ・リーゼイＲｕｔＣ３０ゲノムＤＮＡ、０．３μＭ プライマー９９３４２９、０．３μＭ プライマー９９３４２８、及び２単位のVent DNAポリメラーゼ（New England Biolabs, Beverly, MA1 USA）で組成した。反応は、EPPENDORF（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）5333（Eppendorf Scientific, Inc., Westbury, NY, USA）を用い、９４℃３０秒、５０℃で３０秒、及び７２℃で６０秒を各々５サイクル行い、その後９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、及び７２℃で１２０秒を２５サイクル（最終伸長は５分）でプログラムしインキュベートした。反応生成物は、４０ｍＭ Ｔｒｉｓベースの２０ｍＭ酢酸ナトリウム−１ｍＭ二ナトリウムＥＤＴＡ（ＴＡＥ）バッファを用いる、１．０％アガロースゲル電気泳動により単離した。ここで、２２９ｂｐの生成物バンドをゲルから抽出し、QIAQUICK（登録商標）ゲル抽出キット（Gel Extraction Kit） （QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA）を用い、その製品指示書に従い精製した。
【０４８５】
得られたＰＣＲ断片を、ＰａｃＩ及びＳｐｅＩで制限酵素処理し、同じ制限酵素で処理したｐＡＩＬｏ１（国際公開第０５／０６７５３１号）に、Rapid Ligation Kit （Roche, Indianapolis, IN, USA）を用いてライゲーションし、ｐＭＪ０４（図１）を作製した。
【０４８６】
実施例２：ｐＣａＨｊ５６８の構築
プラスミドｐＣａＨｊ５６８を、ｐＣａＨｊ１７０（米国特許第５,７６３,２５４号）及びｐＭＴ２１８８から構築した。プラスミドｐＣａＨｊ１７０は、フミコラ・インソレンス・エンドグルカナーゼＶ（ＣＥＬ４５Ａ）全長コード領域（配列番号１５で、配列番号１６のアミノ酸配列をコードする）を含んでなる。ｐＭＴ２１８８の構築は、以下に示すプライマー１４２７７９及び１４２７８０を用いてｐＣＡＨｊ４８３（国際公開第９８／００５２９号）から、複製のｐＵＣ１９基（origin）をＰＣＲ増幅することにより開始した。プライマー１４２７８０は、そのＰＣＲ断片にＢｂｕＩ部位を導入する。
プライマー１４２７７９:
5'-TTGAATTGAAAATAGATTGATTTAAAACTTC-3' (配列番号: 67) 
プライマー１４２７８０:
5'-TTGCATGCGTAATCATGGTCATAGC-3' (配列番号: 68)
【０４８７】
EXPAND（登録商標）PCR System（Roche Molecular Biochemicals, Basel, Switzerland）を、この増幅のための製品指示書に従って使用した。ＰＣＲプライマーを、アガロースゲル上で分離し、１１６０ｂｐの断片を単離し、Jetquick ゲル抽出スピンキット（Gel Extraction Spin Kit） (Genomed, Wielandstr, Germany)で精製した。
【０４８８】
ＵＲＡ３遺伝子を、一般的な、サッカロマイセス・セレビシアエ・クローニングベクターｐＹＥＳ２から、EXPAND（登録商標）PCR Systemを用い、以下に示すプライマー１４０２８８及び１４２７７８を用いて増幅した。プライマー１４０２８８は、ＰＣＲ断片にＥｃｏＩ部位を導入する。
プライマー１４０２８８：
5'-TTGAATTCATGGGTAATAACTGATAT-3' (配列番号: 69) 
プライマー１４２７７８：
5'-AAATCAATCTATTTTCAATTCAATTCATCATT-3' (配列番号: 70)
【０４８９】
ＰＣＲ産物を、アガロースゲル上で分離し、１１２６ｂｐの断片を単離し、Jetquick ゲル抽出スピンキットを用いて精製した。
【０４９０】
２つのＰＣＲ断片を、混合することにより融合させ、重複スプライシング法（Horton er al., 1989, Gene 77: 61-68）により、上に示すプライマー１４２７８０及び１４０２８８を用いて増幅させた。ＰＣＲ産物をアガロースゲル上で分離し、２２６３ｂｐの断片を単離し、Jetquick ゲル抽出スピンキットを用いて精製した。
【０４９１】
得られた断片を、ＥｃｏＩ部位で制限酵素処理し、同じ制限酵素で処理したｐＣａＨｊ４８３の最も大きな断片と、標準的プロトコルを用いてライゲーションした。ライゲーション混合物を、Mandel and Higa, 1970, J. Mol. Biol. 45: 154による、ｐｙｒＦ−陰性Ｅ.ｃｏｌｉ系統ＤＢ６５０７（ＡＴＣＣ ３５６７３）作製コンピテントに形質転換した。形質転換体を、１Ｌ当たり、１ｇのカザミノ酸、５００μｇのチアミン、及び１０ｍｇのカナマイシンを添加した、固形Ｍ９培地（Sambrook er al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press）上でセレクションした。１つの形質転換体から得られるプラスミドを単離し、ｐＣａＨｊ５２７（図２）とした。
【０４９２】
ｐＣａＨｊ５２７に存在するＮＡ２−ｔｐｉプロモーターは、製品指示書に従い、EXPAND（登録商標）PCR Systemを用いるＰＣＲで、部位特異的突然変異誘発に供した。ヌクレオチド１３４〜１４４を、以下に示す変異誘発プライマー１４１２２３を用いて、GTACTAAAACC（配列番号７１）からCCGTTAAATTT（配列番号７２）に変換した。
プライマー１４１２２３:
5'-GGATGCTGTTGACTCCGGAAATTTAACGGTTTGGTCTTGCATCCC-3' (配列番号: 73)
ヌクレオチド４２３〜４３５を、以下に示す変異誘発プライマー１４１２２２を用いて、ATGCAATTTAAACT（配列番号７４）からCGGCAATTTAACGG（配列番号７５）に変換した。
プライマー１４１２２２：
5'-GGTTTGTCCTGCAGACGGCAATTTAACGGCTTCTGCGAATCGC-3' (配列番号:76)
得られたプラスミドをｐＭＴ２１８８（図３）とした。
【０４９３】
フミコラ・インソレンス・エンドグルカナーゼＶコード領域を、ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片としてのｐＣａＨｊ１７０から、ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで処理したｐＭＴ２１８８に移行し、ｐＣａＨｊ５６８（図４）を作製した。プラスミドｐＣａＨｊ５６８は、フミコラ・インソレンス・エンドグルカナーゼＶ全長コード配列に作動的に結合した変異ＮＡ２−ｔｐｉプロモーターを含んでなる。
【０４９４】
実施例３：ｐＭＪ０５の構築
プラスミドｐＭＪ０５を、以下に示すプライマーＨｉＥＧＶ−Ｆ及びＨｉＥＧＶ−Ｒを用いて、ｐＣａＨｊ５６８からの９１５ｂｐフミコラ・インソレンス・エンドグルカナーゼＶ全長コード領域を、ＰＣＲ増幅することにより構築した。
プライマーＨｉＥＧＶ−Ｆ（センス）:
5'-AAGCTTAAGCATGCGTTCCTCCCCCCTCC-3' (配列番号: 77) 
プライマーＨｉＥＧＶ−Ｒ（アンチセンス）：
5'-CTGCAGAATTCTACAGGCACTGATGGTACCAG-3' (配列番号: 78)
増幅反応物（５０μｌ）を、１×ThermoPol 反応バッファ（New England Biolabs. Beverly, MA, USA）、０．３ｍＭ ｄＮＴＰ、１０ｎｇ／μｌのｐＣａＨｊ５６８、０．３μＭのＨｉＥＧＶ−Ｆプライマー、０．３μＭ のＨｉＥＧＶ−Ｒプライマー、及び２単位のVent DNAポリメラーゼ（New England Biolabs, Beverly, MA1 USA）で組成した。反応は、EPPENDORF（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）5333（Eppendorf Scientific, Inc., Westbury, NY, USA）を用い、９４℃３０秒、５０℃で３０秒、及び７２℃で６０秒を各々５サイクル行い、その後９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、及び７２℃で１２０秒を２５サイクル（最終伸長は５分）でプログラムしインキュベートした。反応生成物は、ＴＡＥバッファを用いる、１．０％アガロースゲル電気泳動により単離した。ここで、９３７ｂｐの生成物バンドをゲルから抽出し、QIAQUICK（登録商標）ゲル抽出キット （QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA）を用い、その製品指示書に従い精製した。
９３７ｂｐの精製断片を、以下のプライマーと共に後継の増幅のためのテンプレートＤＮＡとして用いた。
プライマーＨｉＥＧＶ−Ｒ（アンチセンス）:
5'-CTGCAGAATTCTACAGGCACTGATGGTACCAG-3' (配列番号: 79) 
プライマーＨｉＥＧＶ−Ｆ−重複（センス）:
5'-ACCGCGGACTGCGCATCATGCGTTCCTCCCCCCTCC-3' (配列番号: 80) 
プライマー配列のイタリック体部分（ACCGCGGACTGCGCATC）は、トリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子（ｃｂｈ１）プロモーターの１７ｂｐと相同であり、プライマー配列の下線部はフミコラ・インソレンス・エンドグルカナーゼＶコード領域の２９ｂｐと相同である。プロモーターとコード領域の３６ｂｐの重複により、トリコデルマ・リーゼイｃｂｈ１プロモーターを含んでなる９９４ｂｐの断片から、フミコラ・インソレンス・エンドグルカナーゼＶコード領域を含んでなる９１８ｂｐの正確な融合が可能となる。
【０４９５】
増幅反応物（５０μｌ）を、１×ThermoPol 反応バッファ（New England Biolabs. Beverly, MA, USA）、０．３ｍＭ ｄＮＴＰ、１μｌの精製９３７ｂｐＰＣＲ断片、０．３μＭのＨｉＥＧＶ−Ｆ−重複プライマー、０．３μＭ のＨｉＥＧＶ−Ｒプライマー、及び２単位のVent DNAポリメラーゼ（New England Biolabs, Beverly, MA1 USA）で組成した。反応は、EPPENDORF（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）5333（Eppendorf Scientific, Inc., Westbury, NY, USA）を用い、９４℃３０秒、５０℃で３０秒、及び７２℃で６０秒を各々５サイクル行い、その後９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、及び７２℃で１２０秒を２５サイクル（最終伸長は５分）でプログラムしインキュベートした。反応生成物は、ＴＡＥバッファを用いる、１．０％アガロースゲル電気泳動により単離した。ここで、９４５ｂｐの生成物バンドをゲルから抽出し、QIAQUICK（登録商標）ゲル抽出キット （QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA）を用い、その製品指示書に従い精製した。
【０４９６】
以下に示すプライマーを用い、トリコデルマ・リーゼイＲｕｔＣ３０ゲノムＤＮＡからの遺伝子のＡＴＧ開始コドンの９９４ｂｐ上流から伸長する、トリコデルマ・リーゼイｃｂｈ１プロモーター配列を増幅するため、分離ＰＣＲを実施した（配列プライマーは、５'末端のＳａｌＩ制限酵素処理部位を有するように設計された）。トリコデルマ・リーゼイＲｕｔＣ３０ゲノムＤＮＡを、DNEASY（登録商標）Plant Maxi Kitを用いて単離した。
プライマーＴｒＣＢＨＩｐｒｏ−Ｆ（センス）：
5'-AAACGTCGACCGAATGTAGGATTGTTATC-3' (配列番号: 81) 
プライマーＴｒＣＢＨＩｐｒｏ−Ｒ（アンチセンス）：
5'-GATGCGCAGTCCGCGGT-3' (配列番号: 82)
増幅反応物（５０μｌ）を、１×ThermoPol 反応バッファ（New England Biolabs. Beverly, MA, USA）、０．３ｍＭ ｄＮＴＰ、１００ｎｇ／μｌのトリコデルマ・リーゼイＲｕｔＣ３０ゲノムＤＮＡ、０．３μＭのＴｒＣＢＨＩｐｒｏ−Ｆプライマー、０．３μＭ のＴｒＣＢＨＩｐｒｏ−Ｒプライマー、及び２単位のVent DNAポリメラーゼ（New England Biolabs, Beverly, MA1 USA）で組成した。反応は、EPPENDORF（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）5333（Eppendorf Scientific, Inc., Westbury, NY, USA）を用い、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、及び７２℃で１２０秒を３０サイクル（最終伸長は５分）でプログラムしインキュベートした。反応生成物は、ＴＡＥバッファを用いる、１．０％アガロースゲル電気泳動により単離した。ここで、９９８ｂｐの生成物バンドをゲルから抽出し、QIAQUICK（登録商標）ゲル抽出キットを用い、その製品指示書に従い精製した。
【０４９７】
精製した９９８ｂｐのＰＣＲ断片を、以下に示すプライマーを用いて後継の増幅のためのテンプレートＤＮＡとして使用した。
プライマーＴｒＣＢＨＩｐｒｏ−Ｆ:
5'-AAACGTCGACCGAATGTAGGATTGTTATC-3' (配列番号: 83) 
プライマーＴｒＣＢＨＩｐｒｏ−Ｒ−重複：
5'-GGAGGGGGGAGGAACGCATGATGCGCAGTCCGCGGT-3' (配列番号: 84)
配列のイタリック体部分（GATGCGCAGTCCGCGGT）は、トリコデルマ・リーゼイｃｂｈ１プロモーターの１７ｂｐと相同であり、配列の下線部は、フミコラ・インソレンス・エンドグルカナーゼＶコード領域の２９ｂｐと相同である。プロモーターとコード領域の３６ｂｐの重複により、トリコデルマ・リーゼイｃｂｈ１プロモーターを含んでなる９９４ｂｐの断片から、フミコラ・インソレンス・エンドグルカナーゼＶ全長コード領域を含んでなる９１８ｂｐの正確な融合が可能となる。
【０４９８】
増幅反応物（５０μｌ）を、１×ThermoPol 反応バッファ（New England Biolabs. Beverly, MA, USA）、０．３ｍＭ ｄＮＴＰ、１μｌの精製９９８ｂｐＰＣＲ断片、０．３μＭのＴｒＣＢＨＩｐｒｏ−Ｆプライマー、０．３μＭ のＴｒＣＢＨＩｐｒｏ−Ｒ重複プライマー、及び２単位のVent DNAポリメラーゼ（New England Biolabs, Beverly, MA1 USA）で組成した。反応は、EPPENDORF（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）5333（Eppendorf Scientific, Inc., Westbury, NY, USA）を用い、９４℃３０秒、５０℃で３０秒、及び７２℃で６０秒を各々５サイクル行い、その後９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、及び７２℃で１２０秒を２５サイクル（最終伸長は５分）でプログラムしインキュベートした。反応生成物は、ＴＡＥバッファを用いる、１．０％アガロースゲル電気泳動により単離した。ここで、１０１７ｂｐの生成物バンドをゲルから抽出し、QIAQUICK（登録商標）ゲル抽出キットを用い、その製品指示書に従い精製した。
【０４９９】
１０１７ｂｐのトリコデルマ・リーゼイｃｂｈ１プロモーターＰＣＲ断片、及び９４５ｂｐフミコラ・インソレンス・エンドグルカナーゼＶ ＰＣＲ断片を、以下のプライマーを用い、後継の増幅のためのテンプレートＤＮＡとして使用し、ＰＣＲを用いて、９９４ｂｐのｃｂＭプロモーターを９１８ｂｐのエンドグルカナーゼＶ全長コード領域に正確に融合させた。
プライマーＴｒＣＢＨＩｐｒｏ−Ｆ:
5'-AAACGTCGACCGAATGTAGGATTGTTATC-3' (配列番号: 85) 
プライマーＨｉＥＧＶ−Ｒ:
5'-CTGCAGAATTCTACAGGCACTGATGGTACCAG-3' (配列番号: 86)
【０５００】
増幅反応物（５０μｌ）を、１×ThermoPol 反応バッファ（New England Biolabs. Beverly, MA, USA）、０．３μＭのＴｒＣＢＨＩｐｒｏ−Ｆプライマー、０．３μＭ のＨｉＥＧＶ−Ｒプライマー、及び２単位のVent DNAポリメラーゼ（New England Biolabs, Beverly, MA1 USA）で組成した。反応は、EPPENDORF（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）5333（Eppendorf Scientific, Inc., Westbury, NY, USA）を用い、９４℃３０秒、５０℃で３０秒、及び７２℃で６０秒を各々５サイクル行い、その後９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、及び７２℃で１２０秒を２５サイクル（最終伸長は５分）でプログラムしインキュベートした。反応生成物は、ＴＡＥバッファを用いる、１．０％アガロースゲル電気泳動により単離した。ここで、１９２６ｂｐの生成物バンドをゲルから抽出し、QIAQUICK（登録商標）ゲル抽出キットを用い、その製品指示書に従い精製した。
【０５０１】
得られた１９２６ｂｐ断片を、ZEROBLUNT（登録商標）TOPO（登録商標）ＰＣＲクローニングキット（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）を用い製品指示書に従って、ｐＣＲ（登録商標）−Ｂｌｕｎｔ−II−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（Invitrogen, Carlsbad, CA1 USA）にクローニングした。得られたプラスミドを、ＮｏｔＩ及びＳａｌＩで制限酵素処理し、１９２６ｂｐの断片んをQIAQUICK（登録商標）ゲル抽出キットを用いてゲル精製し、及びＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Roche, Indianapolis, IN, USA）を用いて同じ２つの制限酵素で処理したｐＭＪ０４にライゲーションし、ｐＭＪ０５（図５）を作製した。プラスミドｐＪＭ０５は、フミコラ・インソレンス・エンドグルカナーゼＶ全長コード領域に作動的に結合する、トリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼＩプロモーター及びターミネーターを含んでなる。
【０５０２】
実施例４：ｐＳＭａｉ１３０発現ベクターの構築
アスペルギルス・オリザエ・ベータ−グルコシダーゼ全長コード領域のＡＴＧ開始コドンからＴＡＡ停止コドンに及ぶ２５６８ｂｐのＤＮＡ断片（ｃＤＮＡ配列は配列番号１５、推定アミノ酸配列は配列番号１６；Ｅ.ｃｏｌｉ １４２４０）を、以下に示すプライマー９９３４６７（センス）及び９９３４５６（アンチセンス）を用いて、テンプレートとしてのｐＪａＬ６６０（国際公開第２００２／０９５０１４号）から、ＰＣＲにより増幅した。ライゲーションを促進するようにアンチセンスプライマーの５'末端に、ＳｐｅＩ部位を設計した。配列のイタリック体部分（ATAGTCAACCGCGGACTGCGCATC）は、トリコデルマ・リーゼイｃｂｈ１プロモーターの２４ｂｐと相同であり、配列の下線部は、アスペルギルス・オリザエ・ベータ−グルコシダーゼコード領域の２２ｂｐと相同である。
プライマー９９３４６７:
5'-ATAGTCAACCGCGGACTGCGCATCATGAAGCTTGGTTGGATCGAGG-3' (配列番号: 87) 
プライマー９９３４５６:
5'-ACTAGTTTACTGGGCCTTAGGCAGCG-3' (配列番号: 88)
【０５０３】
増幅反応物（５０μｌ）を、Ｐｆｘ増幅バッファ（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）、０．２５ｍＭ ｄＮＴＰ、１０ｎｇのｐＪａＬ６６０、６．４μＭのプライマー９９３４６７、３．２μＭ のプライマー９９３４５６、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、及び２．５単位のＰｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）で組成した。反応は、EPPENDORF（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）5333（Eppendorf Scientific, Inc., Westbury, NY, USA）を用い、９４℃で１分、５５℃で１分、及び７２℃で３分を３０サイクル（最終伸長は１５分）でプログラムしインキュベートした。反応生成物は、ＴＡＥバッファを用いる、１．０％アガロースゲル電気泳動により単離した。ここで、２５６８ｂｐの生成物バンドをゲルから抽出し、QIAQUICK（登録商標）ゲル抽出キットを用い、その製品指示書に従い精製した。
【０５０４】
以下に示すプライマー９９３４５３（センス）及びプライマー９９３４６３（アンチセンス）を用いて、遺伝子のＡＴＧ開始コドンの１０００ｂｐ上流から伸長するトリコデルマ・リーゼイｃｂｈ１プロモーターを増幅するためように、分離ＰＣＲを実施し、１０００ｂｐのＰＣＲ断片を作製した。
プライマー９９３４５３：
5'-GTCGACTCGAAGCCCGAATGTAGGAT-3' (配列番号: 89)
プライマー９９３４６３:
5'-CCTCGATCCAACCAAGCTTCATGATGCGCAGTCCGCGGTTGACTA-3' (配列番号: 90)
配列のイタリック体部分（GATGCGCAGTCCGCGGTTGACTA）は、トリコデルマ・リーゼイｃｂｈ１プロモーターの２４ｂｐと相同であり、配列の下線部は、アスペルギルス・オリザエ・ベータ−グルコシダーゼ全長コード領域の２２ｂｐと相同である。４６ｂｐの重複により、トリコデルマ・リーゼイｃｂｈ１プロモーターを含んでなる１０００ｂｐの断片から、アスペルギルス・オリザエ・ベータ−グルコシダーゼコード領域を含んでなる２５８６ｂｐの正確な融合が可能となる。
【０５０５】
増幅反応物（５０μｌ）を、Ｐｆｘ増幅バッファ（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）、０．２５ｍＭ ｄＮＴＰ、１００ｎｇのトリコデルマ・リーゼイＲｕｔＣ３０ゲノムＤＮＡ、６．４μＭのプライマー９９４５３、３．２μＭ のプライマー９９３４３、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、及び２．５単位のＰｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）で組成した。反応は、EPPENDORF（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）5333（Eppendorf Scientific, Inc., Westbury, NY, USA）を用い、９４℃で１分、５５℃で１分、及び７２℃で３分を３０サイクル（最終伸長は１５分）でプログラムしインキュベートした。反応生成物は、ＴＡＥバッファを用いる、１．０％アガロースゲル電気泳動により単離した。ここで、１０００ｂｐの生成物バンドをゲルから抽出し、QIAQUICK（登録商標）ゲル抽出キットを用い、その製品指示書に従い精製した。
【０５０６】
精製断片は、上に示すプライマー９９３４５３（センス）及びプライマー９９３４５６（アンチセンス）を用いる重複ＰＣＲによる、後継の増幅のためのテンプレートＤＮＡとして使用され、１０００ｂｐのトリコデルマ・リーゼイｃｂｈ１プロモーターを、２５８６ｂｐのアスペルギルス・オリザエ・ベータ−グルコシダーゼ全長コード領域を含んでなる断片に、正確に融合させた。
【０５０７】
増幅反応物（５０μｌ）を、Ｐｆｘ増幅バッファ、０．２５ｍＭ ｄＮＴＰ、６．４μＭのプライマー９９３５３、３．２μＭ のプライマー９９３４５６、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、及び２．５単位のＰｆｘ ＤＮＡポリメラーゼで組成した。反応は、EPPENDORF（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）5333を用い、９４℃で１分、６０℃で１分、及び７２℃で４分を３０サイクル（最終伸長は１５分）でプログラムしインキュベートした。
【０５０８】
得られた３６８６ｂｐの断片を、ＳａｌＩ及びＳｐｅＩで制限酵素処理し、同じ２つの制限酵素で処理したｐＭＪ０４にライゲーションし、ｐＳＭａｉ１３０（図６）を作製した。プラスミドｐＳＭａｉ１３０は、アスペルギルス・オリザエ天然ベータ−グルコシダーゼシグナル配列及びコード配列（すなわち全長アスペルギルス・オリザエ・ベータ−グルコシダーゼコード領域）に作動的に結合する、トリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子プロモーター及びターミネーターを含んでなる。
【０５０９】
実施例５：ｐＳＭａｉ１３５の構築
アスペルギルス・オリザエ・ベータ−グルコシダーゼ成熟コード領域（天然のシグナル配列がない、図７参照；シグナルペプチド及びそのコード配列の配列番号：９１及び９２）のＬｙｓ−２０からＴＡＡ停止コドンを、以下に示すプライマー９９３７２７（センス）及びプライマー９９３７２７（アンチセンス）を用いて、テンプレートとしてのｐＪａＬ６６０から、ＰＣＲ増幅した。
プライマー９９３７２８:
5'-TGCCGGTGTTGGCCCTTGCCAAGGATGATCTCGCGTACTCCC-3' (配列番号: 93)
プライマー９９３７２７:
5'-GACTAGTCTTACTGGGCCTTAGGCAGCG-3' (配列番号: 94) 
配列のイタリック体部分（TGCCGGTGTTGGCCCTTGCC）は、フミコラ・インソレンス・エンドグルカナーゼＶシグナル配列の２０ｂｐと相同であり、配列の下線部は、アスペルギルス・オリザエ・ベータ−グルコシダーゼコード領域の２２ｂｐと相同である。ＳｐｅＩ部位を、アンチセンスプライマーの５'末端に設計した。
【０５１０】
増幅反応物（５０μｌ）を、Ｐｆｘ増幅バッファ、０．２５ｍＭ ｄＮＴＰ、１０ｎｇ／μｌのｐＪａＬ６６０、６．４μＭのプライマー９９３７２８、３．２μＭ のプライマー９９３７２７、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、及び２．５単位のＰｆｘ ＤＮＡポリメラーゼで組成した。反応は、EPPENDORF（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）5333を用い、９４℃で１分、５５℃で１分、及び７２℃で３分を３０サイクル（最終伸長は１５分）でプログラムしインキュベートした。ＴＡＥバッファを用いる、１．０％アガロースゲル電気泳動により単離した。ここで、２５２３ｂｐの生成物バンドをゲルから抽出し、QIAQUICK（登録商標）ゲル抽出キットを用い、その製品指示書に従い精製した。
【０５１１】
以下に示すプライマー９９３７２４（センス）及びプライマー９９３７２９（アンチセンス）を用いて、１０００ｂｐのトリコデルマ・リーゼイｃｂｈ１プロモーター、及び６３ｂｐのフミコラ・インソレンス・エンドグルカナーゼＶシグナル配列（ＡＴＧ開始コドンからAla−２１、図８、配列番号９５及び９６）を増幅するため、分離ＰＣＲ増幅を実施した。
プライマー９９３７２４:
5'-ACGCGTCGACCGAATGTAGGATTGTTATCC-3' (配列番号: 97)
プライマー９９３７２９:
5'-GGGAGTACGCGAGATCATCCTTGGCAAGGGCCAACACCGGCA-3' (配列番号: 98)
配列のイタリック体部分（GGCAAGGGCCAACACCGGCA）は、フミコラ・インソレンス・エンドグルカナーゼＶシグナル配列の２０ｂｐと相同であり、配列の下線部は、アスペルギルス・オリザエ・ベータ−グルコシダーゼコード領域の２２ｂｐと相同である。
【０５１２】
ｃｂｈ１プロモーターの制御下でフミコラ・インソレンス・エンドグルカナーゼＶコード領域を含んでなるプラスミドｐＭＪ０５は、トリコデルマ・リーゼイ・ｃｂｈ１プロモーター及びフミコラ・インソレンス・エンドグルカナーゼＶシグナル配列断片を含んでなる１０６３ｂｐの断片を作製するため、テンプレートとして使用した。４２ｂｐの重複は、トリコデルマ・リーゼイ・ｃｂｈ１プロモーター及びフミコラ・インソレンス・エンドグルカナーゼＶシグナル配列及びアスペルギルス・オリザエ・ベータ−グルコシダーゼ成熟コード領域配列で共有され、２５２３ｂｐのアスペルギルス・オリザエ・ベータ−グルコシダーゼコード領域の、プロモーター及びＡＴＧ開始コドンの間の完全な結合を提供する。
【０５１３】
増幅反応物（５０μｌ）を、Ｐｆｘ増幅バッファ、０．２５ｍＭ ｄＮＴＰ、１０ｎｇ／μｌのｐＭＪ０５、６．４μＭのプライマー９９３７２８、３．２μＭ のプライマー９９３７２７、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、及び２．５単位のＰｆｘ ＤＮＡポリメラーゼで組成した。反応は、EPPENDORF（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）5333を用い、９４℃で１分、６０℃で１分、及び７２℃で４分を３０サイクル（最終伸長は１５分）でプログラムしインキュベートした。ＴＡＥバッファを用いる、１．０％アガロースゲル電気泳動により単離した。ここで、１０６３ｂｐの生成物バンドをゲルから抽出し、QIAQUICK（登録商標）ゲル抽出キットを用い、その製品指示書に従い精製した。
【０５１４】
精製重複断片を、上に記載のプライマー９９３７２４（センス）及びプライマー９９３７２７（アンチセンス）を用いる増幅のためのテンプレートとして使用し、トリコデルマ・リーゼイｃｂｈ１プロモーター及びフミコラ・インソレンス・エンドグルカナーゼＶシグナル配列を含んでなる１０６３ｂｐ断片を、アスペルギルス・オリザエ・ベータ−グルコシダーゼ成熟コード領域フレームを含んでなる２５２３ｂｐ断片と、重複ＰＣＲにより正確に融合させた。
【０５１５】
増幅反応物（５０μｌ）を、Ｐｆｘ増幅バッファ、０．２５ｍＭ ｄＮＴＰ、６．４μＭのプライマー９９３７２４、３．２μＭ のプライマー９９３７２７、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、及び２．５単位のＰｆｘ ＤＮＡポリメラーゼで組成した。反応は、EPPENDORF（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）5333を用い、９４℃で１分、６０℃で１分、及び７２℃で４分を３０サイクル（最終伸長は１５分）でプログラムしインキュベートした。ＴＡＥバッファを用いる、１．０％アガロースゲル電気泳動により単離した。ここで、３５９１ｂｐの生成物バンドをゲルから抽出し、QIAQUICK（登録商標）ゲル抽出キットを用い、その製品指示書に従い精製した。
【０５１６】
得られた３５９１ｂｐ断片を、ＳａｌＩ及びＳｐｅＩで制限酵素処理し、同じ制限酵素で処理したｐＭＪ０４にライゲーションし、ｐＳＭａｉ１３５（図９）を作製した。プラスミドｐＳＭａｉ１３５は、フミコラ・インソレンス・エンドグルカナーゼＶシグナル配列及びアスペルギルス・オリザエ・ベータ−グルコシダーゼ成熟コード配列と作動的に結合した、トリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子プロモーターを含んでなる。
【０５１７】
実施例６：フミコラ・インソレンス・エンドグルカナーゼＶ分泌シグナルを有するアスペルギルス・オリザエ・ベータ−グルコシダーゼの発現
フミコラ・インソレンス・エンドグルカナーゼＶ分泌シグナルと結合した成熟アスペルギルス・オリザエ・ベータ−グルコシダーゼをコードする、プラスミドｐＳＭａｉ１３５（図８）を、ＰＥＧ介在型の形質転換により、トリコデルマ・リーゼイ・ＲｕｔＣ３０に導入した（Penttila et al., 1987, Gene 61 155-164）。当該プラスミドは、形質転換体が唯一の窒素源としてアセトアミドで増殖できるように、アスペルギルス・ニデュランスａｍｄＳ遺伝子を含有した。
【０５１８】
トリコデルマ・リーゼイＲｕｔＣ３０を、２％（w/v）グルコース及び１０mＭ ウリジンを添加した２５ｍｌのＹＰ培地で、２７℃、９０ｒｐｍで１７時間培養した。菌糸を、真空駆動型ディスポーザブル濾過システム（Vacuum Driven Disposable Filtration System）（Millipore, Bedford, MA1 USA）を用いる濾過により回収し、脱イオン化水で２回、及び１．２Ｍソルビトールで２回洗浄した。１ｍｌ当たり１５ｍｇのGLUCANEX（登録商標）（Novozymes AJS, Bagsvasrd, Denmark）、及び１ｍｌ当たり０．３６単位のキチナーゼ（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA）を含有する、２０ｍｌの１．２Ｍソルビトール中で洗浄した菌糸を懸濁させること、及び１５〜２５分間３４℃、９０ｒｐｍで穏やかに振とうさせながらインキュベーションすることにより、プロトプラストを作製した。プロトプラストを、７分間、４００×ｇで遠心分離することにより回収し、冷１．２Ｍソルビトールで２回洗浄した。プロトプラストを、血球計数器を用いて計数し、ＳＴＣ中に再懸濁させ、終濃度を１ｍＬ当たり１×１０8プロトプラストとした。過剰なプロトプラストは、Cryo 1°C Freezing Container（Nalgene, Rochester, NY, USA）中で、−８０℃で保存した。
【０５１９】
ＰｍｅＩで制限酵素処理したおよそ７μｇのｐＳＭａｉ１３５を、１００μｌのプロトプラスト溶液に添加し、穏やかに混合し、２６０μｌのＰＥＧバッファを添加し、混合し、３０分間室温でインキュベートした。その後ＳＴＣ（３ｍｌ）を添加し、混合し、形質転換溶液を、アスペルギルス・ニデュランスａｍｄＳセレクションを用いてＣＯＶＥプレート上に捲いた。プレートを２８℃で５〜７日間インキュベートした。形質転換体を、ＣＯＶＥ２プレートで継代培養し、２８℃で生育させた。
【０５２０】
ｐＳＭａｉ１３５と共に得られ、ＳＭＡ１３５とされた６７の形質転換体を、アセトアミド含有の新鮮なプレート上で継代培養し、７日間２８℃で胞子形成させた。
【０５２１】
６７個のＳＭＡ１３５ トリコデルマ・リーゼイ形質転換体を、形質転換体の胞子を播種するとともに、２８℃、２００ｒｐｍで７日間インキュベートした、ｐＨ６．５の２５ｍｌのセルラーゼ含有培地を含む、１２５ｍＬバッフル付振とうフラスコで培養した。トリコデルマ・リーゼイＲｕｔＣ３０を、コントロールとして用いた。培養ブロスサンプルを７日目に除去した。各培養ブロスの１ｍｌを、１５，７００×ｇで５分間、微量遠心機で遠心分離し、上清を新たな管に移した。サンプルを、酵素アッセイを行うまで、４℃で保存した。以下に記載の通りに、上清について、ｐ−ニトロフェニル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシドを基質として用いて、ベータ−グルコシダーゼ活性を評価した。
【０５２２】
ベータ−グルコシダーゼ活性は、基質である、５０ｍＭ コハク酸塩、ｐＨ５.０中の２００μｌの０.５ｍｇ／ｍｌ ｐ−ニトロフェニル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド中で、５０ｍＭ コハク酸塩、ｐＨ５.０中の１：１０で希釈した２５μｌの培養上清を使用し、室温で決定できる。１５分のインキュベーション後、１００μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ８.０を添加することにより、反応を停止させ、４０５ｎｍでの分光測定で吸収を測定した。ベータ−グルコシダーゼ活性の１単位は、ｐＨ５.０、室温での１μモルのｐ−ニトロフェニル／分／リットルの産生に対応させた。アスペルギルス・ニゲル・ベータ−グルコシダーゼ（NOVOZYM（登録商標） 188, Novozymes A/S, Bagsvaerd, Denmark）を酵素標準として使用した。
【０５２３】
多数のＳＭＡ１３５形質転換体は、トリコデルマ・リーゼイＲｕｔＣ３０から分泌されるよりも、数倍高いベータ−グルコシダーゼ活性を示した。分泌されたＳＭＡ１３５形質転換体のうち、形質転換体１３５−０４が最も高いベータ−グルコシダーゼ活性を示した。
【０５２４】
CRITERION（登録商標）Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（５％分解（resolving））ゲル（Bio-Rad, Hercules, CA, USA）を、CRITERION（登録商標）システム（Bio-Rad, Hercules, CA, USA）と共に用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。７日目の５μｌの上清（上記を参照）を、２×濃度のLaemmliサンプルバッファ（Bio-Rad, Hercules, CA, USA）中に懸濁させ、５％のベータ−メルカプトエタノールの存在下、３分回ボイルした。上清サンプルを、ポリアクリルアミドゲルにロードし、ラニングバッファとして１×Ｔｒｉｓ／Ｇｌｙｃｉｎｅ／ＳＤＳ（Bio-Rad, Hercules, CA, USA）での電気泳動に供した。泳動後のゲルを、BIO- SAFE（登録商標）クマシー染色（Bio-Rad, Hercules, CA, USA）で染色した。
【０５２５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した３８種のトリコデルマ・リーゼイＳＭＡ１３５形質転換体のうち、２６種が、コントロールであるトリコデルマ・リーゼイＲｕｔＣ３０では見られないおよそ１１０ｋＤａのタンパク質を示した。形質転換体トリコデルマ・リーゼイＳＭＡ１３５−０４は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで見られた１１０ｋＤａのバンドが存在しなかったので、最も高レベルのベータ−グルコシダーゼ活性を示した。
【０５２６】
実施例７：発現ベクターｐＳＭａｉ１４０の構築
発現ベクターｐＳＭａｉ１４０は、アスペルギルス・オリザエ・ベータ−グルコシダーゼ変異体ＢＧ４１全長コード領域（配列番号１７で、これは配列番号１８のアミノ酸をコードする）を保有する、ＮｃｏＩで制限酵素処理されたプラスミドｐＳＡＴｅ１１１ＢＧ４１（国際公開第０４／０９９２２８号）により構築した。得られた１２４３ｂｐの断片を、ＴＡＥバッファを用いる１.０％アガロースゲル電気泳動で単離し、QIAQUICK（登録商標） ゲル抽出キットを用い、製品指示書に従って精製した。
【０５２７】
発現ベクターｐＳＭＡｉ１３５をＮｃｏＩで制限酵素処理し、８２８６ｂｐの断片を、ＴＡＥバッファを用いる１.０％アガロースゲル電気泳動で単離し、QIAQUICK（登録商標） ゲル抽出キットを用い、製品指示書に従って精製した。その後、アスペルギルス・オリザエ・ベータ−グルコシダーゼ変異体ＢＧ４１をＮｃｏＩで処理した１２４３ｂｐを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Roche, Indianapolis, IN, USA）を用い、製造業者のプロトコルに従って、８２８６ｂｐのベクター断片とライゲーションし、発現ベクターｐＳＭａｉ１４０（図１０）を作製した。プラスミドｐＳＭａｉ１４０は、フミコラ・インソレンス・エンドグルカナーゼＶシグナル配列、及びアスペルギルス・オリザエ・ベータ−グルコシダーゼ変異体成熟コード配列に作動的に結合した、トリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼＩ（ＣＥＬ７Ａ）を含んでなる。
【０５２８】
実施例８：ｐＳＭａｉ１４０でのトリコデルマ・リーゼイＲｕｔＣ３０の形質転換
実施例６に記載の通り、プラスミドｐＳＭａｉ１４０を、ＰｍｅＩで直線化し、トリコデルマ・リーゼイＲｕｔＣ３０系統に形質転換した。１００の形質転換の全ては、４つの独立した形質転換実験から得られ、全てのベータ−グルコシダーゼ活性を、実施例６に記載の通り、形質転換体の培養培地から測定した。多数のトリコデルマ・リーゼイＳＭＡ１４０の形質転換体が、トリコデルマ・リーゼイＲｕｔＣ３０のものよりも数倍高いベータ−グルコシダーゼ活性を示した。
【０５２９】
アスペルギルス・オリザエ・ベータ−グルコシダーゼ変異体ＢＧ４１タンパク質が培養培地中に存在することは、実施例６に記載の通り、酵素活性を評価した同じ１３個の培養上清から、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びクマシー染色を用いて検出した。高いβ−グルコシダーゼ活性を有する１３個全ての形質転換体はまた、およそ１１０ｋＤａのアスペルギルス・オリザエ・ベータ−グルコシダーゼ変異体ＢＧ４１を様々な収率で発現した。
【０５３０】
ベータ−グルコシダーゼ活性アッセイ及びＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で評価される。形質転換体の発現が最も高いベータ−グルコシダーゼ変異体は、トリコデルマ・リーゼイＳＭＡ１４０−４３とされた。
【０５３１】
実施例９：発現ベクターｐＳａＭｅ−Ｆ１の構築
２０９ｂｐのトリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子プロモーター、及びフミコラ・インソレンス・エンドグルカナーゼＶ遺伝子のコア領域（配列番号１５のヌクレオチド１〜７０２、これは配列番号１６のアミノ酸１〜２３４をコードする；国際公開第９１／１７２４３号）を含有するＤＮＡ断片は、テンプレートとしてのｐＭＪ０５及び以下に示すプライマーを用いてＰＣＲ増幅される。
プライマー９９５１０３:
5'-cccaagcttagccaagaaca-3' (配列番号: 99)
プライマー９９５１３７:
5'-gggggaggaacgcatgggatctggacggc-3' (配列番号: 100)
【０５３２】
増幅反応物（５０μｌ）を、１×Ｐｆｘ増幅バッファ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ、５０ｍＭ ＭｇＳＯ4、１０ｎｇ／μｌのｐＭＪ０５、５０ピコモラーの９９５１０３プライマー、５０ピコモラーの９９５１３７プライマー、及び２単位のＰｆｘ ＤＮＡポリメラーゼで組成した。反応は、EPPENDORF（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）5333を用い、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、及び７２℃で６０秒を３０サイクル（最終伸長は３分）でプログラムしインキュベートした。
【０５３３】
ＴＡＥバッファを用いる、１．０％アガロースゲル電気泳動により単離した。ここで、９１１ｂｐの生成物バンドをゲルから抽出し、QIAQUICK（登録商標）ゲル抽出キットを用い、その製品指示書に従い精製した。
【０５３４】
８０６ｂｐのアスペルギルス・オリザエ・ベータ−グルコシダーゼ変異体ＢＧ４１遺伝子を含有するＤＮＡ断片を、テンプレートとしてのｐＳＭａｉ１４０及び以下に示すプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。
プライマー９９５１３３:
5"-gccgtccagatccccatgcgttcctccccc-3' (配列番号: 101) 
プライマー９９５１１１: 
5'-ccaagcttgttcagagtttc-3' (配列番号: 102)
【０５３５】
増幅反応物（５０μｌ）を、１×Ｐｆｘ増幅バッファ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ、５０ｍＭ ＭｇＳＯ4、１００ｎｇのｐＳＭａｉ１４０、５０ピコモラーの９９５１３３プライマー、５０ピコモラーの９９５１１１プライマー、及び２単位のＰｆｘ ＤＮＡポリメラーゼで組成した。反応は、EPPENDORF（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）5333を用い、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、及び７２℃で６０秒を３０サイクル（最終伸長は３分）でプログラムしインキュベートした。
【０５３６】
ＴＡＥバッファを用いる、１．０％アガロースゲル電気泳動により単離した。ここで、８０６ｂｐの生成物バンドをゲルから抽出し、QIAQUICK（登録商標）ゲル抽出キットを用い、その製品指示書に従い精製した。
【０５３７】
その後上記２つのＰＣＲ断片を、重複ＰＣＲに供する。好ましい重複断片は、上記のプライマー９９５１０３（センス）及びプライマー９９５１１１（アンチセンス）を用いて増幅のためのテンプレートとして使用され、２０９ｂｐのトリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子プロモーター及びフミコラ・インソレンス・エンドグルカナーゼＶコア配列を含んでなる７０２ｂｐの断片を、アスペルギルス・オリザエ・ベータ−グルコシダーゼ変異体ＢＧ４１コード領域の部分を含んでなる８０６ｂｐの断片と、重複ＰＣＲにより正確に融合させた。
【０５３８】
増幅反応物（５０μｌ）を、１×Ｐｆｘ増幅バッファ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ、５０ｍＭ ＭｇＳＯ4、２.５μｌの各断片（２０ｎｇ／μｌ）、５０ピコモラーの９９５１０３プライマー、５０ピコモラーの９９５１１１プライマー、及び２単位の高フィデリティＰｆｘ ＤＮＡポリメラーゼで組成した。反応は、EPPENDORF（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）5333を用い、初期の変性を９５℃で３分、その後、変性を１分、６０℃でのアニーリングを１分、及び７２℃での伸長を３分、これを３０サイクルでプログラムし、インキュベートした。
【０５３９】
ＴＡＥバッファを用いる、１．０％アガロースゲル電気泳動により単離した。ここで、１.７ｋｂの生成物バンドをゲルから抽出し、QIAQUICK（登録商標）ゲル抽出キットを用い、その製品指示書に従い精製した。
【０５４０】
この１.７ｋｂの断片を、製品指示書に従って、ｐＣＲ（登録商標）４ Bluntベクター（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）にライゲーションした。その後構築物を、製品の迅速化学的形質転換法に従って、ONE SHOT（登録商標）TOP10 Chemically Competent E. coli細胞（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）に形質転換した。プラスミドの単離、及びＨｉｎｄIIIでの制限酵素処理により、コロニーを選択及び分析し、１.７ｋｂ重複ＰＣＲ断片を放出させた。
【０５４１】
プラスミドｐＳＭａｉ１４０も、ＨｉｎｄIIIで制限酵素処理し、プラスミドを直線化した。処理された断片は両方とも、Rapid DNA Ligation Kitを用い、製品指示書に従って、ライゲーション反応に組み込まれ、ｐＳａＭｅ−Ｆ１（図１１）を作製した。
【０５４２】
Ｅ.ｃｏｌｉ ＸＭ−Ｂｌｕｅサブクローニンググレードコンピテント細胞（Stratagene, La JoIIa, CA, USA）をライゲーション産物で形質転換した。トリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子プロモーター、フミコラ・インソレンス・エンドグルカナーゼＶシグナル配列、フミコラ・インソレンス・エンドグルカナーゼＶコア、フミコラ・インソレンス・エンドグルカナーゼＶシグナル配列、アスペルギルス・オリザエ・ベータ−グルコシダーゼ変異体ＢＧ４１、及び形質転換したＥ.ｃｏｌｉから精製したプラスミドからのトリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子ターミネーター構築物、の相同性をＤＮＡ配列決定により確認した。組み換えプラスミドを含有する１のクローンは、ｐＳａＭｅ−Ｆ１とした。プラスミドｐＳａＭｅ−Ｆ１は、トリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子プロモーター及びターミネーター、並びに、フミコラ・インソレンス・エンドグルカナーゼＶシグナルペプチドに直接的に融合し、アスペルギルス・オリザエ・ベータ−グルコシダーゼ変異体ＢＧ４１成熟コード領域に直接結合する、フミコラ・インソレンス・エンドグルカナーゼＶコアポリペプチドに直接結合するフミコラ・インソレンス・エンドグルカナーゼＶコアシグナルペプチドである。アスペルギルス・オリザエ・ベータ−グルコシダーゼ変異体ＢＧ融合タンパク質のＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列を、それぞれ配列番号１０３及び１０４に示す。
【０５４３】
実施例１０：ｐＳａＭｅ−Ｆ１でのトリコデルマ・リーゼイＲｕｔＣ３０の形質転換
２％グルコース及び１０ｍＭ ウリジンを添加した２５ｍｌのＹＰ培地を含有する振とうフラスコに、トリコデルマ・リーゼイＲｕｔＣ３０の５×１０7胞子を播種した。その後、一晩、およそ１６時間、２７℃、９０ｒｐｍでインキュベーションし、Vacuum Driven Disposable Filtration Systemを用いて菌糸を回収した。菌糸を１００ｍｌの脱イオン化水で２回、１.２Ｍ ソルビトールで２回洗浄した。プロトプラストを実施例６での記載の通りに作製した。
【０５４４】
ＰｍｅＩで直線化したｐＳａＭｅ−Ｆ１ ＤＮＡの２つの微生物、１００μｌのトリコデルマ・リーゼイＲｕｔＣ３０プロトプラスト、及び５０％ＰＥＧ（４０００）を混合し、３０分間室温でインキュベートした。その後、３ｍｌのＳＴＣを添加し、内容物を、１０ｍＭウリジンを添加したＣＯＶＥプレートに注ぎ出した。その後、プレートを２８℃でインキュベートした。６日目までに形質転換体が出現し始め、これをＣＯＶＥ２プレートに取り、２８℃で６日間生育させた。２２個のトリコデルマ・リーゼイ形質転換体を回収した。
【０５４５】
形質転換体を、セルラーゼ含有培地上、振とうフラスコ中で培養し、ベータ−グルコシダーゼ活性を実施例６での記載の通りに測定した。多数のｐＳａＭｅ−Ｆ１形質転換体が、ベータ−グルコシダーゼ活性を示した。トリコデルマ・リーゼイＳａＭｅＦ１−９とされたある形質転換体は、最大量のベータ−グルコシダーゼを作製し、これはアスペルギルス・オリザエ・ベータ−グルコシダーゼ変異体を発現する系統（実施例９）の活性の２倍であった。
【０５４６】
エンドグルカナーゼ活性を、Beguin, 1983, Analytical Biochem. 131(2): 333-336に従い、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）オーバーレイアッセイを用いて評価した。５つのブロスサンプル（これらのベータ−グルコシダーゼ活性は最高である）から得た総タンパク質中の５μｇを、Native Sample Buffer (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)中で希釈し、１０×Ｔｒｉｓ／ｇｌｙｃｉｎｅラニングバッファー（Bio-Rad, Hercules, CA1 USA）を用いるCRITERION（登録商標）８〜１６％ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌゲル（Bio-Rad, Hercules, CA, USA）で上で泳動させ、その後、そのゲルを１％カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）含有プレートの上に置いた。３７℃で１時間インキュベーション後、ゲルを、０.１％コンゴーレッド（Congo Red）で２０分間染色した。その後、エンドグルカナーゼ活性を明確に示す領域を確認するため、１Ｍ ＮａＣｌを用いてプレートを脱染色した。２つの明確な領域、１１０ｋＤａ付近の上方領域の一方と２５ｋＤａ付近の下方領域が見えた。２つのタンパク質が切断されておらず、単一のポリペプチド状態を維持していれば、フミコラ・インソレンス・エンドグルカナーゼＶ及びアスペルギルス・オリザエ・ベータ−グルコシダーゼ変異体ＢＧ４１融合体の予想されるタンパク質サイズは、１１８ｋＤａである：個々のエンド愚グルカナーゼＶコアドメイン及びベータ−グルコシダーゼのグリコシル化は、当初の配列から予想されるよりも高い分子量で個々のタンパク質が泳動されることになる。２つのタンパク質が切断されると予想サイズは、フミコラ・インソレンス・エンドグルカナーゼＶコア領域が２４ｋＤａ、及びアスペルギルス・オリザエ・ベータ−グルコシダーゼ変異体ＢＧ４１が９４ｋＤａとなる。１１０ｋＤに明確な領域が存在したことから、この結果は、単一の巨大タンパク質として未変性状態を維持するエンドグルカナーゼ及びベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質の量は最小限であることを示した。より下方の明確な領域は、内因性のエンドグルカナーゼ活性を表している可能性が高く、さらに、おそらくフミコラ・インソレンス・エンドグルカナーゼＶコアドメインの部分的な切断物由来、アスペルギルス・オリザエ・ベータ−グルコシダーゼ由来を表している。
【０５４７】
その結果は、フミコラ・インソレンス・エンドグルカナーゼＶコアが、それがアスペルギルス・オリザエ・ベータ−グルコシダーゼと結合しているにもかかわらず、活性状態であることを実証した。さらに、ベータ−グルコシダーゼ活性の増加は、非融合ベータ−グルコシダーゼの分泌効率に関連するタンパク質の分泌の増加による結果のようにみえる。アスペルギルス・オリザエ・ベータ−グルコシダーゼ変異体ＢＧ４１配列を、効率的に分泌されたフミコラ・インソレンス・エンドグルカナーゼＶコアと結合させることにより、より多くのベータ−グルコシダーゼを分泌した。
【０５４８】
実施例１１：ｐＳａＭｅ−ＦＸの構築
プラスミドｐＳａＭｅ−ＦＸを、ｐＳａＭｅ−Ｆ１を改変することにより構築した。プラスミドｐＳａＭｅ−Ｆ１を、ＢｓｔＺ１７及びＥｃｏＲ１で制限酵素処理し、ベータ−グルコシダーゼ変異体ＢＧ４１コード配列を含有する１ｋｂの断片、及びプラスミドの残部を含有する９.２ｋｂの断片を作製した。ＴＡＥバッファを用いる１.０％アガロースゲル電気泳動により断片を分離し、その９.２ｋｂの断片を、QIAQUICK（登録商標） ゲル抽出キットを用い、製品指示書に従い抽出及び精製した。プラスミドｐＳＭａｉ１３５も、ＢｓｔＺ１７及びＥｃｏＲ１で処理し、アスペルギルス・オリザエ・ベータ−グルコシダーゼ変異体ＢＧ４１コード配列に相同な塩基を含有する１ｋｂの断片、及びプラスミドの残部を含有する８.５ｋｂの断片を作製した。当該１ｋｂの断片は上記と同様に単離及び精製した。
【０５４９】
９．２ｋｂ及び１ｋｂの断片を、Rapid DNA Ligation Kitを用い、製品指示書に従って、ライゲーションにより組み合わせ、ｐＳａＭｅ−Ｆｘを作製した。これは、変異体成熟コード配列ではなく、野生型ベータ−グルコシダーゼ成熟コード配列を含有する点以外はｐＳａＭｅ−Ｆ１と同じである。
【０５５０】
Ｅ.ｃｏｌｉ ＳＵＲＥ細胞（Stratagene, La JoIIa, CA, USA）をライゲーション産物で形質転換した。形質転換したＥ.ｃｏｌｉから精製されたプラスミド由来の、構築物の相同性を、トリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子プロモーター、フミコラ・インソレンス・エンドグルカナーゼＶシグナル配列、フミコラ・インソレンス・エンドグルカナーゼＶコア配列、フミコラ・インソレンス・エンドグルカナーゼＶシグナル配列、アスペルギルス・オリザエ・ベータ−グルコシダーゼ成熟コード配列、及びトリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子ターミネーター配列のＤＮＡ配列決定により確認した。組み換えプラスミドを含有する１つのクローンは、制限酵素処理したｐＳａＭｅ−ＦＸ（図１２）である。アスペルギルス・オリザエ・ベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質のＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列を、それぞれ配列番号１０５及び１０６に示す。
【０５５１】
実施例１２：トリコデルマ形質転換体の形質転換及び発現
ｐＳａＭｅ−ＦＸ構築物をＰｍｅＩで直線化し、実施例１０で記載の通りにトリコデルマ・リーゼイ・ＲｕｔＣ３０系統に形質転換した。１回の形質転換で総数６３個の形質転換体を得た。形質転換体を、セルラーゼ誘導培地を入れた振とうフラスコ中で培養し、実施例６に記載の通りにベータ−グルコシダーゼ活性を測定した。多数のｐＳａＭｅ−ＦＸ形質転換体がベータ−グルコシダーゼ活性を示した。ＳａＭｅ−ＦＸ１６とされたある形質転換体は、トリコデルマ・リーゼイ・ＳａＭｅ１−９（実施例１０）と比較して、２倍のベータ−グルコシダーゼ活性を示した。
【０５５２】
実施例１３：トリコデルマ・リーゼイ形質転換体の分析
フミコラ・インソレンス・エンドグルカナーゼＶコア（自身の生来のシグナル配列を含有する）を、フミコラ・インソレンス・エンドグルカナーゼＶシグナル配列と結合したアスペルギルス・オリザエ・ベータ−グルコシダーゼ変異体ＢＧ４１成熟コード配列と融合させることにより、融合タンパク質を実施例９に記載の通りに構築した。この融合構築物は、フミコラ・インソレンス・エンドグルカナーゼＶシグナル配列と結合したアスペルギルス・オリザエ・ベータ−グルコシダーゼ変異体ＢＧ４１成熟コード配列と比較して、ベータ−グルコシダーゼ活性が２倍の増加となった。フミコラ・インソレンス・エンドグルカナーゼＶシグナル配列と結合したアスペルギルス・オリザエ野生型ベータ−グルコシダーゼコード配列と融合した、フミコラ・インソレンス・エンドグルカナーゼＶコア（自身のシグナル配列を含有する）からなる実施例１１に記載の通りに、第二の融合構築物を作製した。野生型融合体で形質転換された系統は、ベータ−グルコシダーゼ変異体ＢＧ４１融合体で形質転換された系統と比較して、分泌されたベータ−グルコシダーゼ活性が２倍であった。
【０５５３】
実施例１４：ベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質コード配列のアスペルギルス・オリザエ発現ベクターへの移植（cloning）
以下に示す２つの合成オリゴヌクレオチドプライマーを、ベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質をコードするｐＳａＭｅＦＸからの全長オープンリーディングフレームをＰＣＲ増幅するために設計した。
ＰＣＲ順方向プライマー：
5'-GGACTGCGCAGCATGCGTTC-S' (配列番号: 107) 
ＰＣＲ逆方向プライマー：
5'-ATTAATTAATTACTGGGCCTTAGGCAGCG-3' (配列番号: 108)
太文字（順方向ATGCGTT、逆方向TTACTGGGCCTTAGGCAGCG）は、コード配列を表す。順方向プライマー中の下線を引いた"G"は、ＳｐｈＩ制限酵素部位を作り出すよう導入された塩基の変化を表す。残りの配列は、ｐＳａＭｅＦＸの挿入部位と比較して配列相同性を有する。逆方向プライマー中の配列の下線部は、発現ベクターｐＡＩＬｏ２への移植を促進するように追加された、ＰａｃＩ制限酵素部位を表す（国際公開第０４／０９９２２８号）
【０５５４】
上記のプライマーの各々５０ピコモルを、５０ｎｇのｐＳａＭｅＦＸ ＤＮＡ、１×Ｐｆｘ増幅バッファ、６μｌの１０ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＣＴＰのブレンド、２．５単位のPLATINUM（登録商標）Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ、及び１μｌの５０ｍＭ ＭｇＳＯ4を、最終用量５０μｌ中に含むＰＣＲ反応で使用した。EPPENDORF（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）5333を、９８℃で２分を１サイクル；及び９６℃で３０秒、６１℃で３０秒、及び６８℃で３分を３５サイクルでプログラムし、断片を増幅するよう使用した。３５サイクルの後、反応を６８℃で１０分インキュベートし、その後さらなる処理まで１０℃で冷却した。３．３ｋｂのＰＣＲ反応産物を、ＴＡＥバッファ及び１ｍｌ当たり０．１μｇの臭化エチジウムを用いて、０．８％ＧＴＧ−アガロースゲル（Cambrex Bioproducts One Meadowlands Plaza East Rutherford, NJ, USA）上で単離した。ＤＮＡを、ＵＶ誘導性変異を回避するDARK READER（商標）（Clare Chemical Research, Dolores, CO, USA）の酸を用いて可視化した。３．３ｋｂのＤＮＡバンドを、使い捨ての剃刀で切り取り、ULTRAFREE（登録商標）−ＤＡスピンカップ（Miilipore, Billerica, MA, US）を用い製品の指示書に従って精製した。
【０５５５】
精製した３．３ｋｂのＰＣＲ産物をｐＣＲ（登録商標）４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）に移植した。４マイクロリットルの精製したＰＣＲ産物を、１μｌの２Ｍ 塩化ナトリウム溶液及び１μｌのＴＯＰＯ（登録商標）ベクターと混合した。反応物を室温で１５分間インキュベートし、その後、One Shot（登録商標）ＴＯＰ１０Chemically Competent Ｅ.ｃｏｌｉ細胞を形質転換するため製品の指示書に従い、２μｌの反応物を使用した。８３μｌの形質転換反応物の各々３つを、１ｍｌ当たり１００μｇのアンピシリンを添加した、３つの１５０ｍｍ２×ＹＴプレートに広げ、３７℃で一晩インキュベートした。
【０５５６】
１ｍｌ当たり１００μｇのアンピシリンを添加した、３ｍｌのＬＢ培地を含む液体培地に播種するため、８つの組み換えコロニーを使用した。BIOROBOT（登録商標）9600（QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA）を用いて、この培養物からプラスミドＤＮＡを調製した。ＰａｃＩでの制限酵素処理によりクローンを分析した。各クローンから得たプラスミドＤＮＡをＰａｃＩで処理し、ＴＡＥバッファを用いて１．０％アガロースゲル電気泳動で分析した。８つ全てのクローンは、予想通りの制限酵素パターンを有していた。移植された挿入物に変異がないことを確認する配列決定をするために、クローン５、６、７、及び８を選択した。５'及び３'末端の配列解析から、４つ全てのクローンが正しい配列であることが示された。さらなる配列決定のためにクローン５及７を選択した。いずれのクローンも配列決定し、ＰＣＲ誘導性のエラーが無いことを保証するＰｈｒｅｄ Ｑ値が４０超であった。クローン５及び７は、予想通りの配列を示し、ｐＡＩＬｏ２への再移植用としてクローン５を選択した。
【０５５７】
クローン５由来のプラスミドＤＮＡをＳｐｈＩでの処理により直線化した。その後、１．２μｌの１０ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＣＴＰのブレンド、並びに６単位のＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（New England Bioloabs, Inc., Ipswich, MA, USA）を添加することにより、直線化クローンを平滑末端化した。混合物を、１２℃で２０分インキュベートし、その後、１μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡを添加するとともに、７５℃で２０分加熱して酵素を不活性化することにより、反応を停止させた。ベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質をコードする３．３ｋｂの断片を、上記の通り、ゲル電気泳動及び限外濾過により精製した。
【０５５８】
ベクターｐＡＩＬｏ２をＮｃｏＩでの処理により直線化した。その後、０．５μｌの１０ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＣＴＰのブレンド、並びに１単位のＤＮＡポリメラーゼＩを添加することにより、直線化クローンを平滑末端化した。混合物を、２５℃で１５分インキュベートし、その後、１μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡを添加するとともに、７５℃で１５分加熱して酵素を不活性化することにより、反応を停止させた。その後、ベクターをＰａｃＩで処理した。平滑末端化されたベクターを、上記の通り、ゲル電気泳動及び限外濾過により精製した。
【０５５９】
ベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質をコードする３．３ｋｂ断片の、直線化し精製したｐＡＬｏ２への移植を、Rapid Ligation Kitで行った。製品の指示書に従い、Ｅ.ｃｏｌｉ ＸＬ１０ SOLOPACK（登録商標）Gold cells（Stratagene, La JoIIa, CA, USA）を形質転換するため、１μｌサンプルの反応物を用いた。回復期の後、形質転換反応物から１００μｌずつの２つを、１ｍｌ当たり１００μｇのアンピシリンを添加した、２つの１５０ｍｍの２×ＹＴプレートに蒔き、３７℃で一晩インキュベートした。組み換えクローンと推定される８つのセットを、セレクションプレートから無作為に選択し、BIOROBOT（登録商標）9600を用いて、各々からプラスミドＤＮＡを調製した。接合ベクター／挿入物が正しい配列を有することを確認するため、ｐＡＩＬｏ２特異的プライマーで配列決定するために、クローン１〜４を選択した。クローン３は、完全なベクター／挿入物接合を有しており、これをｐＡＩＬｏ４７（図１３）とした。
【０５６０】
マーカー未含有の発現系統を作り出すため、発現構築物の残りから、殺生物性アンピシリンへの耐性を与えるｂｌａＡ遺伝子を分離する、エンドヌクレアーゼの制限酵素処理を行った。３０マイクログラムのｐＡＩＬｏ４７をＰｍｅＩで処理した。その後、処理されたＤＮＡバンドを、アガロースゲル電気泳動で、上記の通りに精製した。発現構築物を含有するが、ｂｌａＡ遺伝子を欠損している６．４ｋｂのＤＮＡバンドを、剃刀で切り取り、QIAQUICK（登録商標）ゲル抽出キットで精製した。
【０５６１】
実施例１５：アスペルギルス・オリザエＪａＬ３５５での、フミコラ・インソレンス／アスペルギルス・オリザエ細胞１４５Ａコア−ｃｅｌ３融合遺伝子の発現
アスペルギルス・オリザエＪａＬ３５５（国際公開第００／２４０６９４号）プロトプラストを、Christensen et ai, 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422の方法に従って調製した。アスペルギルス・オリザエＪａＬ３５５プロトプラストを形質転換するため、実施例１４の精製発現構築物の１０マイクロリットルを使用した。アスペルギルス・オリザエＪａＬ３５５の形質転換により、およそ９０個の形質転換体を得た。５０個の形質転換体を個別のＰＤＡプレートに単離し、３４℃で５日間インキュベートした。
【０５６２】
４８個のコンフルエントな胞子プレートを、３ｍｌの０．０１％ ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０で洗浄し、１２５ｍｌガラス振とうフラスコ中の２５ｍｌのＮＤＵ２ＢＰ培地に胞子懸濁物を播種した。形質転換培養物を、３４℃、２００ｒｐｍで一定の振とうを与えながらインキュベートした。５日後、各培養物１ｍｌを１２，０００×ｇで遠心分離し、上清を回収した。各上清５μｌを、当量の２×ローディングバッファ（１０％ベータ−メルカプトエタノール）と混合し、１．５ｍｍ ８％〜１６％のＴｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードし、BIO-SAFE（登録商標）クマシーブルーＧ２５０タンパク質染色（Coomassie Blue G250 protein stain）（(Bio-Rad, Hercules, CA, USA）で染色した。培養ブロスのＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイルは、４８個の形質転換体のうち３３個が、予想される１１８ｋＤａに非常に近い見かけ分子量で新規タンパク質を発現できることを示した。形質転換体２１は最良の収率であり、さらなる研究のために選択された。
【０５６３】
実施例１６：アスペルギルス・オリザエＪａＬ３５５形質転換体２１の単一胞子単離
アスペルギルス・オリザエＪａＬ３５５形質転換体２１をＰＤＡ２１プレートに広げ、３４℃で５日間インキュベートした。コンフルエントな胞子プレートを、０．５ｍｌの０．０１％ ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０で洗浄し、胞子を再懸濁させた。１００μｌの胞子懸濁物を、終濃度５ｍｌとなるように０．０１％ ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０で希釈した。血球計数器を用いて胞子濃度を決定し、終濃度を１マイクロリットル当たり０．１胞子となるよう希釈した。２００μｌの胞子希釈物を１５０ｍｍの最小培地プレートに広げ、３４℃で２〜３日インキュベートした。出現してきたコロニーをプレートから切り出し、ＰＤＡプレートに移し、３４℃で３日間インキュベートした。その後、胞子をプレートに広げ、再び３４℃で５日間インキュベートした。
【０５６４】
コンフルエントな胞子プレートを、３ｍｌの０．０１％ ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０で洗浄し、１２５ｍｌガラス振とうフラスコ中の２５ｍｌのＮＤＵ２ＢＰ培地に胞子懸濁物を播種した。単一胞子培養物を、３４℃、２００ｒｐｍで一定の振とうを与えながらインキュベートした。５日後、各培養物１ｍｌを１２，０００×ｇで遠心分離し、上清を回収した。各上清５μｌを、当量の２×ローディングバッファ（１０％ベータ−メルカプトエタノール）と混合し、１．５ｍｍ ８％〜１６％のＴｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードし、BIO-SAFE（登録商標）クマシーブルーＧ２５０タンパク質染色（Coomassie Blue G250 protein stain）（(Bio-Rad, Hercules, CA, USA）で染色した。培養ブロスのＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイルは、８個の形質転換体全てがベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質を非常に高レベルで発現できたので、最良の収量であった培養物の１つを、アスペルギルス・オリザエＪａＬ３５５ＡＩＬｏ４７とした。
【０５６５】
実施例１７：ｐＣＷ８７の構築
プラスミドｐＤＺＡ２−７（国際公開第２００５／０７４６５６号）から、サーモアスカス・オウランティアクスＧＨ６１Ａポリペプチド遺伝子をＰＣＲ増幅するように、以下に示す２つの合成オリゴヌクレオチドプライマーを設計した。順方向プライマーは、平滑化５'末端となり、逆方向プライマーは３'末端にＰａｃＩ部位を組み込んだ。
順方向プライマー：
5'-ATGTCCTTTTCCAAGATAATTGCTACTG-3' (配列番号: 109) 
逆方向プライマー：
5'-GCTTAATTAACCAGTATACAGAGGAG-3' (配列番号: 110)
【０５６６】
上記のプライマーの各々５０ピコモルを、５０ｎｇのｐＤＺＡ２−７、１μｌの１０ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＣＴＰのブレンド、５μｌの１０×ＡＣＣＵＴＡＱ（商標）ＤＮＡポリメラーゼバッファ（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA）、及び５単位のＡＣＣＵＴＡＱ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO1 USA）、を、最終用量５０μｌ中に含むＰＣＲ反応で使用した。EPPENDORF（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）5333を、９８℃で３分を１サイクル；９４℃で４５秒、５５℃で６０秒、及び７２℃で１分を３０サイクルでプログラムし、ＤＮＡ断片を増幅するよう使用した。２５サイクルの後、反応を７２℃で１０分インキュベートし、その後さらなる処理まで４℃で冷却した。サーモアスカス・オウランティアクスＧＨ６１ＡＰＣＲ断片の３'末端をＰａｃＩで処理した。MINELUTE（商標）Reaction Cleanup Kit（QIAGEN Inc., Valencia, CA1 USA）を用い、製品の指示書に従って処理産物を精製した。
【０５６７】
平滑化された５'末端のＮｃｏＩ部位及び３'末端のＰａｃＩ部位を用いて、ＧＨ６１Ａ断片を直接ｐＳＭａｉ１５５（国際公開第２００５／０７４６４７号）に移植した。プラスミドｐＳＭａｉ１５５を、ＮｃｏＩ及びＰａｃＩで処理した。その後、５'陥凹ＮｃｏＩ部位を埋めるために、クレノー（Klenow）酵素を用いてＮｃｏＩ部位を平滑化した。クレノー反応物は、２０μｌのｐＳｍａ１５５制限酵素処理反応混合物に、１ｍＭ ｄＮＴＰ及び１μｌのクレノー酵素を加えたものからなり、これを室温で短時間インキュベートした。MINELUTE（商標）Reaction Cleanup Kitを用い、製品の指示書に従って、新たに直線化されたｐＳＭａｉ１５５プラスミドを精製した。これらの反応により、新たに作製されたＧＨ６１Ａ断片に対応できる、５'平滑末端及び３'ＰａｃＩ部位を作り出した。その後、Rapid DNA Ligation Kit (Roche, Indianapolis, IN, USA)を用い、製品の指示書に従い、ＧＨ６１Ａ断片をｐＳＭａｉ１５５発現ベクターに移植した。Ｅ.ｃｏｌｉ ＸＬ１ブルー サブクローニンググレードコンピテントセル（Stratagene, La JoIIa, CA, USA）を、ライゲーション産物で形質転換した。形質転換したＥ.ｃｏｌｉから精製したプラスミドから得られる、ＧＨ６１Ａコード配列のＤＮＡ配列決定により、構築物の相同性を確認した。組み換えプラスミドを含有するＥ.ｃｏｌｉクローンをｐＣＷ０８７−８とした。
【０５６８】
実施例１８：ｐＳａＭｅ−Ｔａ６１Ａの構築
ａｍｄＳ選択可能なマーカーを提供するプラスミドｐＭＪ０９（国際公開第２００５／０５６７７２号）を、２．７ｋｂのａｍｄＳ断片を遊離させるＮｓｉＩで制限酵素処理することにより、発現ベクターｐＳａＭｅ−Ｔａ６１を構築した。その後、ＴＡＥバッファを用いる１．０％アガロースゲル電気泳動で２．７ｋｂのａｍｄＳ断片を単離し、QIAQUICK（登録商標）ゲル抽出キットを用いて精製した。
【０５６９】
ＮｓｉＩで発現ベクターｐＣＷ０８７を処理し、ＴＡＥバッファを用いる１．０％アガロースゲル電気泳動で４．７ｋｂの断片を単離し、QIAQUICK（登録商標）ゲル抽出キットを用いて精製した。その後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Roche, Indianapolis, IN, USA）を用い、製品の指示書に従って、２．７ｋｂのａｍｄＳ断片を４．７ｋｂのベクター断片に結合させ、発現ベクターｐＳａＭｅ−Ｔａ６１Ａを作り出した。プラスミドｐＳａＭｅ−Ｔａ６１Ａは、サーモアスカス・オウランティアクスＧＨ６１Ａ成熟コード配列に作動的に結合した、トリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼＩ（ＣＥＬ７Ａ）遺伝子プロモーター及びターミネーターを含んでなる。
【０５７０】
実施例１９：トリコデルマ・リーゼイ系統ＳａＭｅ−ＭＦ２６８の構築
プラスミドｐＳａＭｅ−ＦＸ及びｐＳａＭｅ−Ｔａ６１Ａを、トリコデルマ・リーゼイＲｕｔＣ３０に導入するため、共形質転換を使用した。ＰＥＧ介在形質転換（Penttila et al., 1987, 上記と同様）により、プラスミドｐＳａＭｅ−ＦＸ及びｐＳａＭｅ−Ｔａ６１Ａを、トリコデルマ・リーゼイＲｕｔＣ３０に導入した。各プラスミドは、アスペルギルス・ニデュランスａｍｄＳ遺伝子を含有するので、形質転換体は、唯一の窒素源としてのアセトアミドで生育できる。
【０５７１】
トリコデルマ・リーゼイＲｕｔＣ３０を、２％（w/v）グルコース及び１０mＭ ウリジンを添加した２５ｍｌのＹＰ培地で、２７℃、９０ｒｐｍで１７時間培養した。菌糸を、真空駆動型ディスポーザブル濾過システム（Vacuum Driven Disposable Filtration System）（Millipore, Bedford, MA1 USA）を用いる濾過により回収し、脱イオン化水で２回、及び１．２Ｍソルビトールで２回洗浄した。１ｍｌ当たり１５ｍｇのGLUCANEX（登録商標）（Novozymes AJS, Bagsvasrd, Denmark）、及び１ｍｌ当たり０．３６単位のキチナーゼ（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA）を含有する、２０ｍｌの１．２Ｍソルビトール中で洗浄した菌糸を懸濁させること、及び１５〜２５分間３４℃、９０ｒｐｍで穏やかに振とうさせながらインキュベーションすることにより、プロトプラストを作製した。プロトプラストを、７分間、４００×ｇで遠心分離することにより回収し、冷１．２Ｍソルビトールで２回洗浄した。プロトプラストを、血球計数器を用いて計数し、ＳＴＣ中に再懸濁させ、終濃度を１ｍＬ当たり１×１０8プロトプラストとした。過剰なプロトプラストは、Cryo 1°C Freezing Container（Nalgene, Rochester, NY, USA）中で、−８０℃で保存した。
【０５７２】
各々およそ４μｇのプラスミドｐＳａＭｅ−ＦＸ及びｐＳａＭｅ−Ｔａ６１ＡをＰｍｅＩで制限酵素処理し、殺生物マーカーであるａｍｐＲの除去を促進した。ＰｍｅＩでの制限酵素処理後、ＴＡＥバッファを用いる１％アガロースゲルを行い、直線断片を様々な断片に分離した。ｐＳａＭｅ−ＦＸ由来の７．５ｋｂの断片及びｐＳａＭｅ−Ｔａ６１Ａ由来の４．７ｋｂの断片をゲルから切り出し、QIAquick ゲル抽出キットを用い、製品の指示書に従って精製した。これらの精製断片は、ａｍｄＳ選択可能なマーカーカセット、トリコデルマ・リーゼイｃｂｈ１遺伝子プロモーター及びターミネーターを含有し、さらに、断片は、フミコラ・インソレンスＥＧＶコア／アスペルギルス・オリザエＢＧ融合コード配列か、又はＴ.オウランティアクスＣＨ６１Ａコード配列を含有する。ａｍｐＲ断片をこのゲル精製ステップにより除去したので、形質転換で使用される断片は殺生物耐性マーカーを含まない。その後、精製断片を１００μｌのプロトプラスト溶液に添加し、穏やかに混合し、２６０μｌのＰＥＧバッファを添加後に、混合し、室温で３０分間インキュベートした。その後、ＳＴＣ（３ｍｌ）を添加し、混合し、ａｍｄＤセレクションを用いるＣＯＶＥプレートに形質転換溶液を蒔いた。プレートを２８℃で５〜７日間インキュベートした。形質転換体をＣＯＶＥプレートで継代培養し、２８℃で生育させた。
【０５７３】
アセトアミド含有の新鮮なプレート上で４００超の形質転換体を継代培養し、２８℃で７日間胞子形成させた。
【０５７４】
形質転換体の胞子を播種した、２５ｍｌのセルラーゼ誘導培地、ｐＨ６．０を含有する、１２５ｍｌのバッフル付振とうフラスコで、トリコデルマ・リーゼイ形質転換体を培養し、２８℃、２００ｒｐｍで５日間インキュベートした。トリコデルマ・リーゼイＲｕｔＣ３０はコントロールとして用いた。培養ブロスサンプルを５日目に除去した。１ｍｌの各培養ブロスを、１５，７００×ｇで５分間、微量遠心分離機で遠心分離し、上清を新しい管に移した。
【０５７５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、CRITERION（登録商標）システムで、CRITERION（登録商標）Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（５％分解）を用いて行った。５つの上清（上記参照）の５μｌを、２×濃度のLaemmliサンプルバッファ（Bio-Rad, Hercules, CA, USA）中に懸濁させ、５％ベータ−メルカプトエタノール中で３分間ボイルした。上清サンプルを、ポリアクリルアミドゲルにロードし、１×Ｔｒｉｓ／Ｇｌｙｃｉｎｅ／ＳＤＳをラニングバッファ（Bio-Rad, Hercules, CA, USA）として電気泳動に供した。得られたゲルを、BIO-SAFE（登録商標）クマシー染色で染色した。その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でバンドの可視化により見られる、サーモアスカス・オウランティアクスＧＨ６１Ａポリペプチド、及びアスペルギルス・オリザエ・ベータ−グルコシダーゼと融合したフミコラ・インソレンス・エンドグルカナーゼＶコア（Ｃｅｌ４５Ａ）からなる融合タンパク質の両方の発現を示す形質転換体を、最良の加水分解ブロスを作製する系統を確認するため、ＰＣＳ加水分解反応で試験した。
【０５７６】
実施例２０：トリコデルマ・リーゼイ系統ＳａＭｅ−ＭＦ２６８の同定
サーモアスカス・オウランティアクスＧＨ６１Ａポリペプチド、及びアスペルギルス・オリザエ・ベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質の両方の発現を示す形質転換体を、形質転換体の胞子を播種した、２５ｍｌのセルラーゼ誘導培地、ｐＨ６．０を含有する、１２５ｍｌのバッフル付振とうフラスコで、２８℃、２００ｒｐｍで５日間インキュベートした。
【０５７７】
振とうフラスコ培養ブロスを６０００×ｇで遠心分離し、加水分解の前に、STERICUP（商標）EXPRESS（商標）（Millipore, Bedford, MA, USA）の０．２２μｍを用いて濾過した。ＰＣＳを加水分解し、且つ糖を作製する能力は、その還元末端の化学アッセイにより検出可能であり、これにより培養ブロスの活性を測定した。
【０５７８】
トウモロコシ茎葉は、米国エネルギー省の再生可能エネルギー研究所（ＮＲＥＬ）)（Boulder, CO, USA）で希硫酸を用いて、調製された。前処理として以下の条件を使用した：０．０４８ｇ硫酸／１ｇの乾燥バイオマス、１９０℃、２５％w/w乾燥固体で約１分。前処理したトウモロコシ茎葉（ＰＣＳ)中の水不溶性固体は、５９．２％のセルロースを含有していることが、ＰＣＳの限定分解によるグルコース及びセロビオースの放出から決定された。酵素加水分解の前に、ＰＣＳを大容量の二回脱イオン化水（double deionized water）で洗浄し、水洗浄したＰＣＳの乾燥重量が、１７．７３％であることがわかった。
【０５７９】
１ｋｇのＰＣＳを、およそ２０リットルの二回脱イオン化水に懸濁させ、ＰＣＳを定着させた後、水を静かに注いだ。これを、水がｐＨ４．０超になるまで繰り返し、この時点で還元糖は１リットル当たり０．０６ｇ未満であった。小容量アッセイ（例えば１ｍｌ）のために、定着スラリーを１００メッシュ篩で篩過し、ピペット採取ができるようにした。洗浄ＰＣＳの乾燥重量含量割合は、サンプルを１０５℃のオーブンで少なくとも２４時間乾燥させ（一定質量になるまで）、湿重量と比較することにより決定した。
【０５８０】
ＰＣＳ加水分解は、ALPS 300（商標）自動ラボプレートシーラー（automated lab plate sealer）（ABgene Inc., Rochester, NY, USA）を用いてヒートシールした、１ｍｌ容量の９６−ディープウェルプレート（Axygen Scientific）中で行った。ＰＣＳ濃度は、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５.０中、１リットル当たり１０ｇであった。ＰＣＳ加水分解は、上記の通りサンプル採取中を除いては、追加の攪拌なしで、５０℃で行った。各反応は３重に行った。放出された還元糖を、以下に記載の通りｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド（ＰＨＢＡＨ）試薬で分析した。
【０５８１】
０．８ｍｌ容量のＰＣＳ（水１リットル当たり１２．５ｇ）を、ピペット採取により９６−ディープウェルプレートの各ウェルに入れ、その後０．１０ｍｌの０．５Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５.０、その後０．１０ｍｌの希釈酵素溶液を添加し、最終反応物容量が１．０ｍｌでＰＣＳ濃度が１リットル当たり１０ｇで反応を開始した。プレートは密封した。反応混合物を加水分解開始の時点及び各サンプル採取時点の前にディープウェルプレートを反転することにより混合した。各サンプル採取時点で、プレートを混合し、その後、ディープウェルプレートを、２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し（Sorvall RT7、RTH-250ローターを用いた）、その後２０μｌの加水分解物（上清）を除去し、１８０μｌの０．４％ ＮａＯＨを９６ディープウェルプレートに添加した。必要な場合は、この停止溶液を還元糖の適切な範囲になるようさらに希釈した。放出された還元糖をパラヒドロキシ安息香酸ヒドラジド試薬（PHBAH, Sigma、４−ヒドロキシベンジヒドラジド）を用いて評価した：５０μｌのＰＨＢＡＨ試薬（１．５％）を、１００μｌのサンプルと、Ｖ底９６ウェルTHERMOWELL（商標）プレート（Costar 6511）中で混合し、９５℃で１０分間、加熱ブロックしながらプレート上でインキュベートし、その後５０μｌの二回脱イオン化水を各ウェルに添加し、混合し、１００μｌを別の平底９６ウェルプレート（Costar 9017）に移し、４１０ｎｍでの吸収を測定した。同じ条件下でのグルコース・キャリブレーション曲線を用いて、還元糖を計算した。セルロースの還元糖への変換割合は、
変換割合（％）＝還元糖（ｍｇ／ｍｌ）／（添加セルロース（ｍｇ／ｍｌ）×1.11）
として計算した。因子1.11は、セルロースをグルコースに加水分解する際の重量増分を補正するためのものである。
【０５８２】
１ｍｌのＰＣＳ加水分解試験の後、最も可能性ある候補を、２リットルの発酵機中で二倍に増殖させた。
【０５８３】
振とうフラスコ培地を、１リットル当たり、２０ｇのデキストロース、１０ｇのトウモロコシス浸漬固体、１．４５ｇの（ＮＨ4）2ＳＯ4、２．０８ｇのＫＨ2ＰＯ4、０、３６ｇのＣａＣｌ2、０．４２ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、及び０．４２ｍｌの微量金属溶液で組成した。微量金属溶液を、１リットル当たり、２１６ｇのＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ、５８ｇのＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、２７ｇのＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ、１０ｇのＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、２．４ｇのＨ3ＢＯ3、及び３３６ｇのクエン酸で組成した。
【０５８４】
１０ｍｌの振とうフラスコ培地を、５００ｍｌの振とうフラスコに添加した。振とうフラスコに、固形プレートから２つのプラグを用いて播種し、環状振とう機で２００ｒｐｍ、２８℃で４８時間インキュベートした。振とうフラスコブロスの５０ｍｌを、３リットルの発酵容器に播種するために使用した。
【０５８５】
発酵バッチ培地を、１リットル当たり、３０ｇのセルロース、４ｇのデキストロース、１０ｇのトウモロコシ浸漬固体、３．８ｇの（ＮＨ4）2ＳＯ4、２．８ｇのＫＨ2ＰＯ4、２．６４ｇのＣａＣｌ2、１．６３ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１．８ｍｌの消泡剤、及び０．６６ｍｌの微量金属溶液で組成した。微量金属溶液を、１リットル当たり、２１６ｇのＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ、５８ｇのＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、２７ｇのＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ、１０ｇのＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、２．４ｇのＨ3ＢＯ3、及び３３６ｇのクエン酸で組成した。発酵供給（feed）培地を、デキストロース及びセルロースで組成した。
【０５８６】
総容量１．８リットルの発酵バッチ培地を、３リットルの発酵機に添加した。発酵供給培地を、０〜４ｇ／ｌ／時間の速度で、１６５時間にわたって投与した。発酵容器を温度２８℃に維持し、ｐＨは、４．７５＋／−０．１の設定点で制御した。空気は、１ｗｍの速度で容器中に送られ、ブロスは、Rushton回転羽根車を用いて１１００〜１３００ｒｐｍで攪拌された。発酵の終了時点で、全てのブロスを容器から回収し、バイオマスを除去するために３０００ｒｐｍ×ｇで遠心分離した。上清を滅菌濾過し、３５〜４０℃で保存した。
【０５８７】
総タンパク質濃度を決定し、ブロスを以下に記載の通り、５０ｇのＰＣＳ加水分解反応で再試験した。各実験の前に、４０℃で保存される酵素ストック溶液から酵素希釈物を調製した。
【０５８８】
ＰＣＳの加水分解は、１２５ｍｌスクリュートップ三角フラスコ（VWR, West Chester, PA, USA）を用い、総反応物の５０ｇを用いて、ＮＲＥＬ Laboratory Analytical Protocol００８番に従って行われた。このプロトコルにおいて、ＰＣＳの加水分解（ＰＣＳ中およそ１１．４％、及び５０ｍＭ酢酸ナトリウム水溶液、ｐＨ５．０バッファ中６．８％セルロース）を、２リットルの発酵ブロスサンプルの、異なるタンパク質ローディングを用いて行った。ＰＣＳ加水分解能力の試験を、５０℃で、INNOVA（登録商標）4080インキュベーター（New Brunswick Scientific, Edison, NJ, USA）を用いて１５０ｒｐｍで環状振とうしながら行った。加水分解の過程で、７２、１２０、及び１６８時間で、一定分量を採取し、遠心分離し、上清液をMULTISCREEN（登録商標）ＨＶ0.45μｍメンブレン（Millipore, Billerica, MA, USA）を用い、SORVALL（登録商標）ＲＴ７平面遠心機（plate centrifuge）（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）を使用して２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより濾過した。すぐに使用しない場合は、濾過した糖含有の一定分量を、−２０℃で凍結した。０．００５Ｍ Ｈ2ＳＯ4で希釈したサンプルの糖濃度は、純粋糖サンプルでキャリブレートしたCHEMSTATION（登録商標） AGILENT（登録商標） 1100 HPLC (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)を用いて、屈折率検出からのグルコースとセロビオースのシグナルの積分による計量により、６５℃での4.6×250ｍｍ AMINEX（登録商標）HPX−87Hカラム（Bio-Rad, Hercules, CA, USA）からの、流速0.4ｍｌ／分での０．００５Ｍ Ｈ2ＳＯ4の溶出の後に測定した。得られた同じ物を、各反応のセルロース変換割合を計算するために使用した。
【０５８９】
セルロースのグルコース＋セロビオース糖への変換度（変換割合、％）を、以下の等式を用いて計算した。
【数１】
2010528624.tif 000002
この等式において、因子1.111は、セルロースをグルコースに変換する際の重量増分を反映しており、因子1.053はセルビオースをグルコースに変換する際の重量増分を反映する。
【０５９０】
上記の５０ｇフラスコアッセイでのＰＣＳ加水分解反応の結果を、表１に示す。最高機能のブロスを作製するある系統を、トリコデルマ・リーゼイＳａＭｅ−ＭＦ２６８とした。
表１：１６８時間の時点での糖への変換割合
【表１】
2010528624.tif 000003
【０５９１】
実施例２１：ベクターｐＳａＭｅ−ＦＨの構築
発現ベクターｐＳａＭｅ−ＦＨ（図１４）は、プラスミドｐＳＭａｉ１５５（国際公開第２００５／０７４６４７号）及びプラスミドｐＳａＭｅ−ＦＸ（実施例１１）をＢｓｐ１２０１及びＰａｃＩで、制限酵素処理することにより構築された。ｐＳＭａｉ１５５由来の５．５ｋｂ断片、及びｐＳａＭｅ−ＦＸ由来の３．９ｋｂ断片を、ＴＡＥバッファを用いる１．０％アガロースゲル電気泳動により単離し、QIAQUICK（登録商標） ゲル抽出キットを用いて精製した。その後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用い、製品のプロトコルに従って、２つの断片を結合させた。このライゲーション産物で、Ｅ.ｃｏｌｉ ＳＵＲＥ（登録商標）コンピテントセルを形質転換した。構築物の相同性を、形質転換Ｅ.ｃｏｌｉから精製したプラスミドから得た、トリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子プロモーター、フミコラ・インソレンス・エンドグルカナーゼＶシグナル配列、フミコラ・インソレンス・エンドグルカナーゼＶコア配列、フミコラ・インソレンス・エンドグルカナーゼＶシグナル配列、アスペルギルス・オリザエ・ベータ−グルコシダーゼ成熟コード配列、及びトリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子ターミネーターのＤＮＡ配列決定により確認した。組み換えプラスミドを含有する１のクローンをｐＳａＭｅ−ＦＨとした。プラスミドｐＳａＭｅ−ＦＨは、フミコラ・インソレンスＣｅｌ４５Ａコア／アスペルギルス・オリザエ・βグルコシダーゼの遺伝子融合体と作動的に結合する、トリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼＩ（ＣＥＬ７Ａ）遺伝子プロモーター及びターミネーターを含んでなる。プラスミドｐＳａＭｅ−ＦＨは、ａｍｄＳ選択可能なマーカーが除去され、ヒグロマイシン耐性選択マーカーに置き換えられた以外は、ｐＳａＭｅ−ＦＸと同じである。
【０５９２】
実施例２２：セルラーゼ産物の増加及び前処理トウモロコシ茎葉（ＰＣＳ）分解能力を向上させるトリコデルマ・リーゼイＳＭＡ１３５−０４の変異体の単離
ＰＣＳ（実施例２０）を、セルロース分解性酵素アッセイのセルロース基質として、セレクションプレート用に使用した。アッセイの前に、濾液のｐＨが４．０超になるまで、大量の蒸留脱イオン水でＰＣＳを洗浄した。１００ＭＦ金属篩を用いて、粒子を除去するためにＰＣＳを篩過した。また、洗浄し、篩過したＰＣＤを、蒸留水に再懸濁させ、濃度６０ｍｇ／ｍｌの懸濁物とし、４０℃で保存した。
【０５９３】
トリコデルマ・リーゼイ系統ＳＭＡ１３５−０４（実施例６）を、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO1 USA）での突然変異誘導処理に供した。これは、主に塩基置換及びいくつかの欠損を誘導する化学的変異誘導物質である（Rowlands, 1984, Enzyme Microb. Technol. 6: 3-10）。一定時間の暴露と様々な用量のＮＴＧ、及び一定濃度のＮＴＧと異なる時間の暴露で、生存曲線実験を行い、生存率１０％を得た。この生存率を得るためには、分生子懸濁物を、０．２ｍｇ／ｍｌのＮＴＧで、２０分、３７℃で、穏やかに回転させながら処理した。分生子をＮＴＧで処理しない場合、各実験はコントロールで行い、これを非変異誘導性培養物よりも競争力ある変異体の生育のためのコントロールとして用いた。
【０５９４】
変異体の初期セレクションを、ＮＴＧ処理の後に行った。変異誘導で生き残った総数８×１０6の分生子を、０．５％ペプトン、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００及び１．５ｇの寒天を含有する３０ｍｌのマンデル培地中で混合した。その後、この懸濁物をディーププレート（直径１５０ｍｍ、深さ２５ｍｍ、Corning Inc, NY, USA）に添加し、寒天を室温で硬化させた。寒天の硬化後、０．５％ペプトン、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１．５ｇの寒天、及び１．０％のＰＣＳを含有する２００ｍｌのマンデル培地を添加した。寒天の硬化後に、プレートを２８℃でインキュベートした。インキュベーションの３〜５日後に、未処理コントロール系統の前に、ＰＣＳセレクション層を貫通した７００個のコロニーを第二セレクションに使用した。
【０５９５】
第二セレクションのために、各単離物からの３白金耳量の分生子を、２５ｍｌのセルラーゼ誘導培地を含む１２５ｍｌの振とうフラスコに添加し、２８℃、２００ｒｐｍで５日間インキュベートし、セルラーゼの発現及び分泌を誘導した。１ｍｌの各培養ブロスを、微量遠心分離機で４００×ｇで５分間遠心分離し、上清をＰＣＳの加水分解活性で評価し、総タンパク質収量を求めた。
【０５９６】
「ロボット」ＰＣＳ加水分解アッセイを、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０で、振とうフラスコブロスサンプルを１：２０で希釈することにより行った。希釈サンプルを、希釈前のＰＣＳ１ｇ当たり４００μｌサンプルで、アッセイプレート（９６ウェル平底プレート）に添加した。BIOMEK（登録商標） FX (Beckman Coulter, Fullerton, CA)を用いて、ＰＣＳを１リットル当たり１０ｇのＰＣＳで添加し、その後、５０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０を加え、総容量を１８０μｌにした。アッセイプレートを、２５０ｒｐｍで振とうさせた加湿ボックス中、３０℃で５日間インキュベートした。アッセイの統計的精度を上げるため、各サンプルにつき６回の反復を行った。ただし、２回の反復は、１：２０サンプル希釈物で行った。インキュベーション５日後に、加水分解されたＰＣＳサンプル中の還元糖（ＲＳ）の濃度を、９６ウェルマイクロプレートで形式用に修正及び適応させたＰＨＢＡＨアッセイ用いて測定した。ORCA（商標） ロボット (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA)を用いて、生育プレートを、BIOMEK（登録商標） FXに移し、９μｌのブロスサンプルをアッセイプレートから除去し、一定量を９６ウェルＶ底プレート（MJ Research, Waltham, MA, USA）に入れた。２％水酸化ナトリウム中の１３５μｌの0.533％ＰＨＢＡＨを添加することにより、反応を開始した。各アッセイプレートをTETRAD（登録商標）サーマルサイクラー（Thermal Cycler）（MJ Research, Waltham, MA, USA）を用いて９５℃で１０分間加熱し、室温まで冷却した。インキュベーション後、４０μｌの反応サンプルを、１６０μｌの脱イオン化水で希釈し、９６ウェル平底プレートに移した。その後、SPECTRAMAX（登録商標） 250 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)を用いて、４０５ｎｍでの吸収でサンプルを測定した。サンプルと同様に処理した６つのグルコース標準（0.000, 0.040, 0.800, 0.120, 0.165, 及び0.200 mg/mlの脱イオン水）で作られた標準曲線を用いて、Ａ405の値をグルコース相当量に変換した。標準曲線のための平均相関係数は、０．９８超であった。還元糖へのセルロース変換度（ＲＳ収率、％）を、実施例２０に記載の等式を用いて計算した。
【０５９７】
総タンパク質収量を、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイを用いて決定した。サンプルを水で１：８に希釈し、濃度を適切な範囲にした。アルブミン標準（ＢＳＡ）を、水中で、濃度2.0 mg/mlから0.25 mg/mlまで様々なレベルで希釈した。BIOMEK（登録商標） FXを用いて、標準を含む２０μｌの各希釈物を、９６ウェル平底プレートに移した。各ウェルに２００マイクロリットルのＢＣＡ基質溶液（BCA Protein Assay Kit, Pierce, Rockford, IL, USA）を添加し、その後３７℃で４５分間インキュベートした。インキュベーションの完了時に、SPECTRAMAX（登録商標） 250を用いて、９６ウェルプレートの５６２ｎｍの光学密度を測定した。サンプル濃度を、マイクロソフト・エクセル（Microsoft Excel）(Microsoft Corporation, Redmond, WA）により作製した標準曲線から外挿することにより決定した。
【０５９８】
選択した初期の単離物のうち２０個が、系統ＳＭＡ１３５−０４から得たブロスと比較した場合に、向上したＰＣＳ加水分解活性を示すブロスを作った。これらの単離物は、親系統と比較して、５〜１５％高い還元糖作製ができる、セルロース分解性ブロスを作る。例えば、いくつかの単離物は、ＳＭａｉ−Ｍ１０４は、ブロス容量当たりのセルロースＰＣＳの加水分解における機能の向上を示し、さらに総タンパク質を高レベルで分泌した。
【０５９９】
最高機能のトリコデルマ・リーゼイ・変異系統、ＳＭａｉ−Ｍ１０４のセレクションは、発酵により作製されたブロスの、セルラーゼ機能を評価することにより決定された。実施例２０で記載した通り、発行を７日間行った。スクリューキャップ付の１２５ｍｌ三角フラスコ（VWR, West Chester, PA, USA）中での５０ｇのＰＣＳ加水分解で、発酵サンプルを試験した。反応条件は、6.7％のセルロース・ローディング；６及び１２mg/gセルロースの酵素・ローディング；５０ｇの総反応物；５０℃でｐＨ５．０である。この実験を開始するため、各振とうフラスコ及びキャップの質量を計り、所望量のＰＣＳを振とうフラスコに添加し、総質量を記録した。１０ｍｌの蒸留水を各振とうフラスコに添加し、その後全ての振とうフラスコを１２１℃で３０分間オートクレーブした。オートクレーブ後に、フラスコを室温まで冷却させた。５０グラムでの各フラスコの総質量を得るために、５ｍｌの０．５Ｍ 酢酸ナトリウムｐＨ5.0を、その後所望の添加を達成するようセルラーゼブロスを添加し、その後、５０ｇの所望最終重量に達するように適切な量の蒸留水を添加した。その後、インキュベーター振とう機（incubator shaker）（New Brunswick Scientific, Edison, NJ, USA）で、５０℃、１３０ｒｐｍとした中にフラスコを置いた。３、５及び７日目に、各フラスコから１ｍｌのサンプルを採取し、９６ウェルディープウェルプレートに添加した（総容量が2.0ｍｌ）。その後９６ウェルプレートを、SORVALL（登録商標） RT7 平面遠心分離機（plate centrifuge）(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)を用いて３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。遠心分離後に、２００μｌの上清を、９６ウェルの0.45μｍポアサイズ濾過プレート（96-well 0.45 μm pore size filtration plate）（Millipore, Bedford, MA, USA）に移し、濾液を回収するために真空にした。その後、濾液を、還元糖の適切な範囲にするため、0.4％ ＮａＯＨで希釈し、ＰＨＢＡＨ試薬（1.5％）を用いて、以下の通りに測定した。５０ｕｌのＰＨＢＡＨ試薬及び１００μｌのサンプルをＶ底９６ウェルプレートに添加し、９５℃で１０分間インキュベートした。反応の完了のために、５０μｌ蒸留水を各ウェルに添加し、サンプルを攪拌後に、Ａ410での分光光度測定値を得るため、１００μｌの混合物を別の平底９６ウェルプレートに移した。還元糖の量を、グルコース・キャリブレーション曲線を用いて計算し、分解割合を、
【数２】
2010528624.tif 000004
として計算した。ここで、因子1.11は、セルロースをグルコースに変換する際の重量増分を反映する。
【０６００】
ＰＣＳ加水分解アッセイの結果は、ＳＭａｉ−Ｍ１０４とした１の変異体は、親系統ＳＭＡ１３５−０４よりわずかに秀でており（グルコースの増加がおよそ５％）、特に高ローディング（12 mg/gグルコース）においてそれが示された。
【０６０１】
実施例２３：トリコデルマ・リーゼイ系統ＳＭａｉ２６−３０の構築
プラスミドｐＣＷ０８５（国際公開第２００６／０７４４３５号）、ｐＳａＭｅ−ＦＨ、及びｐＣＷ０８７（実施例１７）を、トリコデルマ・リーゼイＳＭａｉ−Ｍ１０４に導入するために、共形質転換を使用した。プラスミドｐＣＷ０８５は、チエラビア・テレストリスＮＲＲＬ ８１２６セロビオヒドロラーゼ（ＶＥＬ６Ａ）用の発現ベクターである。３つ全てのプラスミドを、ＰＥＧ介在性形質転換（Penttila et al., 1987、上記と同様）によりトリコデルマ・リーゼイＳＭａｉ−Ｍ１０４に導入した。各プラスミドは、形質転換体がヒグロマイシンＢで生育できる、エシェリキア・コリ・ヒグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｈ）遺伝子を含有する。
【０６０２】
トリコデルマ・リーゼイＳＭａｉ−Ｍ１０４を、２％（w/v）グルコース及び１０mＭ ウリジンを添加した２５ｍｌのＹＰ培地で、２７℃、９０ｒｐｍで１７時間培養した。菌糸を、真空駆動型ディスポーザブル濾過システムを用いる濾過により回収し、脱イオン化水で２回、及び１．２Ｍソルビトールで２回洗浄した。１ｍｌ当たり１５ｍｇのGLUCANEX（登録商標）（Novozymes AJS, Bagsvasrd, Denmark）、及び１ｍｌ当たり０．３６単位のキチナーゼ（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA）を含有する、２０ｍｌの１．２Ｍソルビトール中で洗浄した菌糸を懸濁させること、及び１５〜２５分間３４℃、９０ｒｐｍで穏やかに振とうさせながらインキュベーションすることにより、プロトプラストを作製した。プロトプラストを、７分間、４００×ｇで遠心分離することにより回収し、冷１．２Ｍソルビトールで２回洗浄した。プロトプラストを、血球計数器を用いて計数し、ＳＴＣ中に再懸濁させ、終濃度を１ｍＬ当たり１×１０8プロトプラストとした。過剰なプロトプラストは、Cryo 1°C Freezing Container（Nalgene, Rochester, NY, USA）中で、−８０℃で保存した。
【０６０３】
およそ１０μｇの各プラスミドｐＣＷ０８５、ｐＳａＭｅ−ＦＨ及びｐＣＷ０８７を、ＰｍｅＩで制限酵素処理し、１００μｌのプロトプラスト溶液に添加し、穏やかに混合し、その後、２６０μｌのＰＥＧバッファを添加し、混合し、室温で３０分間インキュベートした。その後、ＳＴＣ（３ｍｌ）を添加し、混合し、１Ｍスコース（sucose）及び１０ｍＭウリジン含有のＰＤＡに、形質転換溶液を蒔いた。プレートを２８℃で１６時間インキュベートし、その後、ヒグロマイシンＢ（終濃度３０μｇ／ｍｌ）含有の寒天オーバーレイ（agar overlay）を添加し、４〜６日間インキュベーションを継続した。８０個の形質転換体を、ＰＤＡプレートで継代培養し、２８℃で生育させた。
【０６０４】
形質転換体の胞子を播種した、２５ｍｌセルラーゼ誘導培地、ｐＨ６．０を含有する１２５ｍｌバッフル付振とうフラスコ中で、トリコデルマ・リーゼイ形質転換体を培養し、２８℃、２００ｒｐｍで５日間インキュベートした。トリコデルマ・リーゼイＳＭａｉ−Ｍ１０４をコントロールとして使用した。培養ブロスサンプルを５日目に除去した。１ｍｌの培養ブロスを、微量遠心分離機で、１５，７００×ｇで５分間、遠心分離し、上清を新規な管に移した。
【０６０５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、CRITERION（登録商標） システムで、CRITERION（登録商標） Tris-HCl (5% 分解)ゲルを用いて行った。５μｌの５つの上清（上記を参照）を、２×濃度のLaemiサンプルバッファに懸濁させ、５％ベータ−メルカプトエタノールの存在下で３分間ボイルした。上清サンプルを、ポリアクリルアミドゲルにロードし、１×Ｔｒｉｓ／Ｇｌｙｃｉｎｅ／ＳＤＳをラニングバッファ（Bio-Rad, Hercules, CA, USA）として電気泳動に供した。得られたゲルを、BIO-SAFE（登録商標）クマシー染色で染色した。その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でバンドの可視化により見られる、サーモアスカス・オウランティアクスＧＨ６１Ａポリペプチド、及びアスペルギルス・オリザエ・ベータ−グルコシダーゼ及びチエラビア・テレストリス・セロビオヒドロラーゼIIと融合したフミコラ・インソレンス・エンドグルカナーゼＶコア（Ｃｅｌ４５Ａ）からなる融合タンパク質の両方の発現を示す形質転換体を、最良の加水分解ブロスを作製する系統を確認するため、ＰＣＳ加水分解反応で試験した。最高機能のブロスを作製する１の形質転換体を、トリコデルマ・リーゼイＳＭａｉ２６−３０とした。
【０６０６】
トリコデルマ・リーゼイＳＭａｉ２６−３０によるＰＣＳの加水分解を、実施例２０に記載に以下の修正を加えて行った。ＰＣＳのロットは、実施例２０で使用したものとは異なるが、同じ条件下で調製されたものである。このプロトコルにおいて、ＰＣＳの加水分解（ＰＣＳ中およそ11.3％、及び５０ｍＭクエン酸ナトリウム水溶液、ｐＨ５．０バッファ中6.7％セルロース）は、トリコデルマ・リーゼイＳＭａｉ２６−３０発酵ブロスの異なるタンパク質添加（セルロース１ｇ当たりのタンパク質ｍｇとして表現される）を用いて行われた。加水分解の過程中、４８、１２０及び１６８時間で一定量を採取した。上記の５０ｇフラスコアッセイにおけるＰＣＳ加水分解反応の結果を、表２に示す。
表２：４８、７２及び１６８時間の時点での糖への変換割合
【表２】
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【０６０７】
生物物質の寄託
以下の生物物質を、ブダペスト条約の条件の下、Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, Illinoisに寄託し、以下の受託番号を得た。
【表３】
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【０６０８】
当該系統は、米国特許法施行規則第1.14条及び米国特許法第122条の下、特許商標局長官により資格を有すると決定された者に、本特許出願の係属中に当該培養物の入手が可能であることを保証する条件の下で寄託されている。寄託物は、寄託系統の実質的に純粋な培養物を表す。寄託物は、必要に応じて、対象出願の対応出願、又はその係属出願が提出される国において、外国の特許法による要請に従って利用可能である。ただし、寄託物の利用可能性は、行政措置により付与された特許権を逸脱した、対象発明の実施権を構成するものではないと解されるべきである。
【０６０９】
本明細書で記載及び請求される発明は、本明細書で開示される特定の態様によりその範囲を限定されるものではなく、当該態様は、当該発明の複数の態様を例示することを目的としている。任意の同等な態様は、本発明の範囲内であることを意図している。実際、これまでの記載から、本明細書中で示され且つ記載されたものに加え、本発明の様々な修正は、当業者に明らかになるだろう。かかる修正は、添付の請求の範囲にも含まれることを意図する。矛盾が生じる場合には、定義を含む本開示が制御する。
【０６１０】
様々な参考文献が本明細書で引用されるが、かかる開示はその全体で参照として組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年1月28日(2010.1.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
繊維状真菌宿主細胞であって、（ａ）セルロース分解性増強活性を有する天然型又は異種接合型ポリペプチドをコードする第一ポリヌクレオチド；（ｂ）天然型又は異種接合型ベータ−グルコシダーゼ又はその融合タンパク質をコードする第二ポリヌクレオチド；及び（ｃ）天然型又は異種接合型のセルロース分解性酵素で、以下のトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）セロビオヒドロラーゼＩ（ＣＥＬ７Ａ）、トリコデルマ・リーゼイセロビオヒドロラーゼII（ＣＥＬ６Ａ)、及びトリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼＩ（ＣＥＬ７Ｂ）並びにその相同分子種又は変異体からなる群から選択される１以上（複数）のセルロース分解性酵素をコードする、１以上（複数）の第三ポリヌクレオチド、を含んでなる宿主細胞。
【請求項２】
前記セルロース分解性増強活性を有するポリペプチドが以下の、
（ａ）［ＩＬＭＶ］−Ｐ−Ｘ（４,５）−Ｇ−Ｘ−Ｙ−［ＩＬＭＶ］−Ｘ−Ｒ−Ｘ−［ＥＱ］−Ｘ（４）−［ＨＮＱ］及び［ＦＷ］−［ＴＦ］−Ｋ−［ＡＩＶ］（式中、Ｘが任意のアミノ酸、Ｘ（４,５）が４又は５の隣接位置での任意のアミノ酸、及びＸ（４）が４の隣接位置での任意のアミノ酸である）を含んでなる、セルロース分解性増強活性を有するポリペプチド、
（ｂ）［ＩＬＭＶ］−Ｐ−ｘ（４,５）−Ｇ−ｘ−Ｙ−［ＩＬＭＶ］−ｘ−Ｒ−ｘ−［ＥＱ］−ｘ（３）−Ａ−［ＨＮＱ］（式中、ｘが任意のアミノ酸、ｘ（４,５）が４又は５の隣接位置での任意のアミノ酸、及びＸ（３）が３の隣接位置での任意のアミノ酸である）を含んでなる、セルロース分解性増強活性を有するポリペプチドからなる群から選択され、
ここで、［ＩＬＭＶ］−Ｐ−Ｘ（４,５）−Ｇ−Ｘ−Ｙ−［ＩＬＭＶ］−Ｘ−Ｒ−Ｘ−［ＥＱ］−Ｘ（４）−［ＨＮＱ］及び［ＦＷ］−［ＴＦ］−Ｋ−［ＡＩＶ］を含んでなるセルロース分解性増強活性を有するポリペプチドは、
Ｈ−Ｘ（１,２）−Ｇ−Ｐ−Ｘ（３）−［ＹＷ］−［ＡＩＬＭＶ］、
［ＥＱ］−Ｘ−Ｙ−Ｘ（２）−Ｃ−Ｘ−［ＥＨＱＮ］−［ＦＩＬＶ］−Ｘ−［ＩＬＶ］、又は
Ｈ−Ｘ（１,２）−Ｇ−Ｐ−Ｘ（３）−［ＹＷ］−［ＡＩＬＭＶ］及び［ＥＱ］−Ｘ−Ｙ−Ｘ（２）−Ｃ−Ｘ−［ＥＨＱＮ］−［ＦＩＬＶ］−Ｘ−［ＩＬＶ］（式中、Ｘは任意のアミノ酸、Ｘ（１,２）は１又は２の隣接位置での任意のアミノ酸、Ｘ（３）は３の隣接位置での任意のアミノ酸、及びＸ（２）は２の隣接位置での任意のアミノ酸である）を任意にさらに含んでなり、
（ｃ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、又は配列番号１０、配列番号１２、又は配列番号１４の成熟ポリペプチドと、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、
（ｄ）（i）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、もしくは配列番号１３の成熟ポリペプチドコード配列、（ii）配列番号１、配列番号３、配列番号５、もしくは配列番号１１の成熟ポリペプチドコード配列に含有されるｃＤＮＡ配列、又は配列番号７、配列番号９、もしくは配列番号１３の成熟ポリペプチドコード配列を含んでなるゲノムＤＮＡ配列、又は（iii）（i）もしくは（ii）の全長相補鎖と、好ましくは少なくとも中ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中高ストリンジェンシー条件、及び最も好ましくは少なくとも高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズする、ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
（ｅ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、又は配列番号１３の成熟ポリペプチドコード配列と、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するヌクレオチド配列を含んでなるポリペプチドヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
（ｆ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、又は配列番号１０、配列番号１２、又は配列番号１４の成熟ポリペプチドの１以上（複数）のアミノ酸の、置換、削除、及び／又は挿入を含んでなる変異体、及び
（ｇ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、又は配列番号１０、配列番号１２、又は配列番号１４の成熟ポリペプチドを含んでなるか、前記成熟ポリペプチドからなる、セルロース分解性増強活性を有するポリペプチド、又はセルロース分解性増強活性を有するその断片、
からなる群から選択される、請求項１に記載の繊維状真菌宿主細胞。
【請求項３】
ベータ−グリコシダーゼ融合タンパク質が、（ａ）シグナルペプチドを含んでなる第一アミノ酸配列、（ｂ）少なくともエンドグルカナーゼの触媒ドメインを含んでなる第二アミノ酸配列、及び（ｃ）少なくともベータ−グルコシダーゼの触媒ドメインを含んでなる第三アミノ酸配列を含んでなり、ここで、第一アミノ酸配列のＣ末端は第二アミノ酸配列のＮ末端にインフレームで結合し、第二アミノ酸配列のＣ末端は第三アミノ酸配列のＮ末端にインフレームで結合する、請求項１に記載の繊維状真菌宿主細胞。
【請求項４】
ベータグルコシダーゼ融合タンパク質が、配列番号１０３又は配列番号１０５を含んでなるか、前記配列からなる、請求項３に記載の繊維状真菌宿主細胞。
【請求項５】
異種接合型ベータ−グルコシダーゼが、アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus） ベータ−グルコシダーゼ遺伝子及び／又はペニシリウム・ブラシリアナム（Penicillium brasilianum） ベータ−グルコシダーゼ遺伝子から得るポリヌクレオチドによりコードされる、請求項１に記載の繊維状真菌宿主細胞。
【請求項６】
トリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼＩ（ＣＥＬ７Ａ）が配列番号５２の成熟ポリペプチドを含んでなるか、前記成熟ポリペプチドからなり、トリコデルマ・リーゼイセロビオヒドロラーゼII（ＣＥＬ６Ａ) が配列番号５４の成熟ポリペプチドを含んでなるか、前記成熟ポリペプチドからなり、及びトリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼＩ（ＣＥＬ７Ｂ）が配列番号５６の成熟ポリペプチドを含んでなるか、前記成熟ポリペプチドからなる、請求項１に記載の繊維状真菌宿主細胞。
【請求項７】
トリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼＩ（ＣＥＬ７Ａ）の相同分子種又は変異体が、以下の、
（ａ）配列番号５２の成熟ポリペプチドと、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、
（ｂ）（ｉ）配列番号５１の成熟ポリペプチドコード配列、（ii）配列番号５１の成熟ポリペプチドコード配列に含まれるｃＤＮＡ、もしくはそれを含んでなるゲノムＤＮＡ配列、又は（iii）（i）もしくは（ii）の全長相補鎖と、好ましくは少なくとも中ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中高ストリンジェンシー条件、及び最も好ましくは少なくとも高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
（ｃ）配列番号５１の成熟ポリペプチドコード配列と、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、
（ｄ）配列番号５２の成熟ポリペプチドの１以上（複数）のアミノ酸の置換、削除、及び／又は挿入を含んでなる変異体、
からなる群から選択され、及び
トリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼII（ＣＥＬ６Ａ）の相同分子種又は変異体が、以下の、
（ａ）配列番号５４の成熟ポリペプチドと、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、
（ｂ）（ｉ）配列番号５３の成熟ポリペプチドコード配列、（ii）配列番号５３の成熟ポリペプチドコード配列に含まれるｃＤＮＡ、もしくはそれを含んでなるゲノムＤＮＡ配列、又は（iii）（i）もしくは（ii）の全長相補鎖と、好ましくは少なくとも中ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中高ストリンジェンシー条件、及び最も好ましくは少なくとも高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
（ｃ）配列番号５３の成熟ポリペプチドコード配列と、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、及び
（ｄ）配列番号５４の成熟ポリペプチドの１以上（複数）のアミノ酸の置換、削除、及び／又は挿入を含んでなる変異体、
からなる群から選択され、及び
トリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼI（ＣＥＬ７Ｂ）の相同分子種又は変異体が、以下の、
（ａ）配列番号５６の成熟ポリペプチドと、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、
（ｂ）（ｉ）配列番号５５の成熟ポリペプチドコード配列、（ii）配列番号５５の成熟ポリペプチドコード配列に含まれるｃＤＮＡ、もしくはそれを含んでなるゲノムＤＮＡ配列、又は（iii）（i）もしくは（ii）の全長相補鎖と、好ましくは少なくとも中ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中高ストリンジェンシー条件、及び最も好ましくは少なくとも高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
（ｃ）配列番号５５の成熟ポリペプチドコード配列と、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、及び
（ｄ）配列番号５６の成熟ポリペプチドの１以上（複数）のアミノ酸の置換、削除、及び／又は挿入を含んでなる変異体、
からなる群から選択される、請求項１に記載の繊維状真菌宿主細胞。
【請求項８】
トリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼII（ＣＥＬ５Ａ）、トリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼIII（ＣＥＬ１２Ａ）、及びトリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼＶ（ＣＥＬ４５Ａ）、並びにこれらの相同分子種又は変異体からなる群から選択されるセルロース分解性酵素をコードする、１以上（複数）の第四ポリヌクレオチドをさらに含んでなる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の繊維状真菌宿主細胞。
【請求項９】
トリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼII（ＣＥＬ５Ａ）が配列番号５８の成熟ポリペプチドを含んでなるか、前記成熟ポリペプチドからなり、トリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼIII（ＣＥＬ１２Ａ）が配列番号６０の成熟ポリペプチドを含んでなるか、前記成熟ポリペプチドからなり、及びトリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼＶ（ＣＥＬ４５Ａ）が配列番号６２の成熟ポリペプチドを含んでなるか、前記成熟ポリペプチドからなる群から選択される、請求項８に記載の繊維状真菌宿主細胞。
【請求項１０】
トリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼII（ＣＥＬ５Ａ）の相同分子種又は変異体が、以下の、
（ａ）配列番号５８の成熟ポリペプチドと、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、
（ｂ）（ｉ）配列番号５７の成熟ポリペプチドコード配列、（ii）配列番号５７の成熟ポリペプチドコード配列に含まれるｃＤＮＡ、もしくはそれを含んでなるゲノムＤＮＡ配列、又は（iii）（i）もしくは（ii）の全長相補鎖と、好ましくは少なくとも中ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中高ストリンジェンシー条件、及び最も好ましくは少なくとも高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
（ｃ）配列番号５７の成熟ポリペプチドコード配列と、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、及び
（ｄ）配列番号５８の成熟ポリペプチドの１以上（複数）のアミノ酸の置換、削除、及び／又は挿入を含んでなる変異体、
からなる群から選択され、
トリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼIII（ＣＥＬ１２Ａ）の相同分子種又は変異体が、以下の、
（ａ）配列番号６０の成熟ポリペプチドと、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、
（ｂ）（ｉ）配列番号５９の成熟ポリペプチドコード配列、（ii）配列番号５９の成熟ポリペプチドコード配列に含まれるｃＤＮＡ、もしくはそれを含んでなるゲノムＤＮＡ配列、又は（iii）（i）もしくは（ii）の全長相補鎖と、好ましくは少なくとも中ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中高ストリンジェンシー条件、及び最も好ましくは少なくとも高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
（ｃ）配列番号５９の成熟ポリペプチドコード配列と、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、及び
（ｄ）配列番号６０の成熟ポリペプチドの１以上（複数）のアミノ酸の置換、削除、及び／又は挿入を含んでなる変異体、
からなる群から選択され、及び
トリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼＶ（ＣＥＬ４５Ａ）の相同分子種又は変異体が、以下の、
（ａ）配列番号６２の成熟ポリペプチドと、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、
（ｂ）（ｉ）配列番号６１の成熟ポリペプチドコード配列、（ii）配列番号６１の成熟ポリペプチドコード配列に含まれるｃＤＮＡ、もしくはそれを含んでなるゲノムＤＮＡ配列、又は（iii）（i）もしくは（ii）の全長相補鎖と、好ましくは少なくとも中ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中高ストリンジェンシー条件、及び最も好ましくは少なくとも高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズする、ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
（ｃ）配列番号６１の成熟ポリペプチドコード配列と、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、及び
（ｄ）配列番号６２の成熟ポリペプチドの１以上（複数）のアミノ酸の置換、削除、及び／又は挿入を含んでなる変異体、
からなる群から選択される、請求項８に記載の繊維状真菌宿主細胞。
【請求項１１】
配列番号８のセルロース分解性増強活性を有するポリペプチドの成熟ポリペプチド、配列番号１０６のベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質、配列番号５２のトリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼＩ（ＣＥＬ７Ａ）の成熟ポリペプチド、配列番号５４のトリコデルマ・リーゼイセロビオヒドロラーゼII（ＣＥＬ６Ａ) の成熟ポリペプチド、及び配列番号５６のトリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼＩ（ＣＥＬ７Ｂ）の成熟ポリペプチドを含んでなる、セルロース分解性タンパク質組成物を作製する、請求項１に記載の繊維状真菌宿主細胞。
【請求項１２】
配列番号５８のトリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼII（ＣＥＬ５Ａ）、配列番号６２のトリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼＶ（ＣＥＬ４５Ａ）、及び配列番号６０のトリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼIII（ＣＥＬ１２Ａ）からなる群から選択される、１以上（複数）の酵素をさらに作製する、請求項１０に記載の繊維状真菌宿主細胞。
【請求項１３】
配列番号６４のチエラビア・テレストリス（Thielavia terrestris）・セロビオヒドロラーゼの成熟ポリペプチドをさらに産生する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の繊維状真菌宿主細胞。
【請求項１４】
セルロース分解性タンパク質組成物を作製する方法であって、（ａ）請求項１〜１３のいずれか１項に記載の宿主細胞を、組成物の作製に適する条件下で培養すること、及び（ｂ）組成物を回収することを含んでなる方法。
【請求項１５】
セルロース分解性タンパク質組成物であって、（ａ）セルロース分解性増強活性を有するポリペプチド、（ｂ）ベータ−グルコシダーゼ又はその融合タンパク質、及び（ｃ）トリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼＩ（ＣＥＬ７Ａ）、トリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼII（ＣＥＬ６Ａ)、及びトリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼＩ（ＣＥＬ７Ｂ）、並びにそれらの相同分子種又は変異体からなる群から選択される１以上（複数）のセルロース分解性酵素、を含んでなる組成物。
【請求項１６】
セルロース分解性増強活性を有するポリペプチドが、以下の、
（ａ）［ＩＬＭＶ］−Ｐ−Ｘ（４,５）−Ｇ−Ｘ−Ｙ−［ＩＬＭＶ］−Ｘ−Ｒ−Ｘ−［ＥＱ］−Ｘ（４）−［ＨＮＱ］及び［ＦＷ］−［ＴＦ］−Ｋ−［ＡＩＶ］（式中、Ｘが任意のアミノ酸、Ｘ（４,５）が４又は５の隣接位置での任意のアミノ酸、及びＸ（４）が４の隣接位置での任意のアミノ酸である）を含んでなる、セルロース分解性増強活性を有するポリペプチド、
（ｂ）［ＩＬＭＶ］−Ｐ−ｘ（４,５）−Ｇ−ｘ−Ｙ−［ＩＬＭＶ］−ｘ−Ｒ−ｘ−［ＥＱ］−ｘ（３）−Ａ−［ＨＮＱ］（式中、ｘが任意のアミノ酸、ｘ（４,５）が４又は５の隣接位置での任意のアミノ酸、及びＸ（３）が３の隣接位置での任意のアミノ酸である）を含んでなる、セルロース分解性増強活性を有するポリペプチドからなる群から選択され、
ここで、［ＩＬＭＶ］−Ｐ−Ｘ（４,５）−Ｇ−Ｘ−Ｙ−［ＩＬＭＶ］−Ｘ−Ｒ−Ｘ−［ＥＱ］−Ｘ（４）−［ＨＮＱ］及び［ＦＷ］−［ＴＦ］−Ｋ−［ＡＩＶ］を含んでなるセルロース分解性増強活性を有するポリペプチドは、
Ｈ−Ｘ（１,２）−Ｇ−Ｐ−Ｘ（３）−［ＹＷ］−［ＡＩＬＭＶ］、
［ＥＱ］−Ｘ−Ｙ−Ｘ（２）−Ｃ−Ｘ−［ＥＨＱＮ］−［ＦＩＬＶ］−Ｘ−［ＩＬＶ］、又は
Ｈ−Ｘ（１,２）−Ｇ−Ｐ−Ｘ（３）−［ＹＷ］−［ＡＩＬＭＶ］及び［ＥＱ］−Ｘ−Ｙ−Ｘ（２）−Ｃ−Ｘ−［ＥＨＱＮ］−［ＦＩＬＶ］−Ｘ−［ＩＬＶ］（式中、Ｘは任意のアミノ酸、Ｘ（１,２）は１又は２の隣接位置での任意のアミノ酸、Ｘ（３）は３の隣接位置での任意のアミノ酸、及びＸ（２）は２の隣接位置での任意のアミノ酸である）を任意にさらに含んでなり、
（ｃ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、又は配列番号１０、配列番号１２、又は配列番号１４の成熟ポリペプチドと、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、
（ｄ）（i）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、もしくは配列番号１３の成熟ポリペプチドコード配列、（ii）配列番号１、配列番号３、配列番号５、もしくは配列番号１１の成熟ポリペプチドコード配列に含有されるｃＤＮＡ配列、又は配列番号７、配列番号９、もしくは配列番号１３の成熟ポリペプチドコード配列を含んでなるゲノムＤＮＡ配列、又は（iii）（i）もしくは（ii）の全長相補鎖と、好ましくは少なくとも中ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中高ストリンジェンシー条件、及び最も好ましくは少なくとも高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
（ｅ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、又は配列番号１３の成熟ポリペプチドコード配列と、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するヌクレオチド配列を含んでなるポリペプチドヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
（ｆ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、又は配列番号１０、配列番号１２、又は配列番号１４の成熟ポリペプチドの１以上（複数）のアミノ酸の、置換、削除、及び／又は挿入を含んでなる変異体、及び
（ｇ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、又は配列番号１０、配列番号１２、又は配列番号１４の成熟ポリペプチドを含んでなるか、前記成熟ポリペプチドからなる、セルロース分解性増強活性を有するポリペプチド、又はセルロース分解性増強活性を有するその断片、
からなる群から選択される、請求項２５に記載のセルロース分解性タンパク質組成物。
【請求項１７】
ベータ−グリコシダーゼ融合タンパク質が、（ａ）シグナルペプチドを含んでなる第一アミノ酸配列、（ｂ）少なくともエンドグルカナーゼの触媒ドメインを含んでなる第二アミノ酸配列、及び（ｃ）少なくともベータ−グルコシダーゼの触媒ドメインを含んでなる第三アミノ酸配列を含んでなり、ここで、第一アミノ酸配列のＣ末端は第二アミノ酸配列のＮ末端にインフレームで結合し、第二アミノ酸配列のＣ末端は第三アミノ酸配列のＮ末端にインフレームで結合する、請求項１５に記載のセルロース分解性タンパク質組成物。
【請求項１８】
ベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質が、配列番号１０３又は配列番号１０５を含んでなるか、前記配列からなる、請求項１７に記載のセルロース分解性タンパク質組成物。
【請求項１９】
異種接合型ベータ−グルコシダーゼタンパク質が、アスペルギルス・フミガタス及び／又はペニシリウム・ブラシリアナム・ベータ−グルコシダーゼ由来である、請求項１５に記載のセルロース分解性タンパク質組成物。
【請求項２０】
トリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼＩ（ＣＥＬ７Ａ）が配列番号５２の成熟ポリペプチドを含んでなるか、前記成熟ポリペプチドからなり、トリコデルマ・リーゼイセロビオヒドロラーゼII（ＣＥＬ６Ａ) が配列番号５４の成熟ポリペプチドを含んでなるか、前記成熟ポリペプチドからなり、及びトリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼＩ（ＣＥＬ７Ｂ）が配列番号５６の成熟ポリペプチドを含んでなるか、前記成熟ポリペプチドからなる、請求項１５に記載の繊維状真菌宿主細胞。
【請求項２１】
トリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼＩ（ＣＥＬ７Ａ）の相同分子種又は変異体が、以下の、
（ａ）配列番号５２の成熟ポリペプチドと、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、
（ｂ）（ｉ）配列番号５１の成熟ポリペプチドコード配列、（ii）配列番号５１の成熟ポリペプチドコード配列に含まれるｃＤＮＡ、もしくはそれを含んでなるゲノムＤＮＡ配列、又は（iii）（i）もしくは（ii）の全長相補鎖と、好ましくは少なくとも中ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中高ストリンジェンシー条件、及び最も好ましくは少なくとも高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
（ｃ）配列番号５１の成熟ポリペプチドコード配列と、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、及び
（ｄ）配列番号５２の成熟ポリペプチドの１以上（複数）のアミノ酸の置換、削除、及び／又は挿入を含んでなる変異体、
からなる群から選択され、及び
トリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼII（ＣＥＬ６Ａ）の相同分子種又は変異体が、以下の、
（ａ）配列番号５４の成熟ポリペプチドと、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、
（ｂ）（ｉ）配列番号５３の成熟ポリペプチドコード配列、（ii）配列番号５３の成熟ポリペプチドコード配列に含まれるｃＤＮＡ、もしくはそれを含んでなるゲノムＤＮＡ配列、又は（iii）（i）もしくは（ii）の全長相補鎖と、好ましくは少なくとも中ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中高ストリンジェンシー条件、及び最も好ましくは少なくとも高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
（ｃ）配列番号５３の成熟ポリペプチドコード配列と、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、及び
（ｄ）配列番号５４の成熟ポリペプチドの１以上（複数）のアミノ酸の置換、削除、及び／又は挿入を含んでなる変異体、
からなる群から選択され、及び
トリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼI（ＣＥＬ７Ｂ）の相同分子種又は変異体が、以下の、
（ａ）配列番号５６の成熟ポリペプチドと、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、
（ｂ）（ｉ）配列番号５５の成熟ポリペプチドコード配列、（ii）配列番号５５の成熟ポリペプチドコード配列に含まれるｃＤＮＡ、もしくはそれを含んでなるゲノムＤＮＡ配列、又は（iii）（i）もしくは（ii）の全長相補鎖と、好ましくは少なくとも中ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中高ストリンジェンシー条件、及び最も好ましくは少なくとも高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
（ｃ）配列番号５５の成熟ポリペプチドコード配列と、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、及び
（ｄ）配列番号５６の成熟ポリペプチドの１以上（複数）のアミノ酸の置換、削除、及び／又は挿入を含んでなる変異体、
からなる群から選択される、請求項１５に記載のセルロース分解性タンパク質組成物。
【請求項２２】
トリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼII（ＣＥＬ５Ａ）、トリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼIII（ＣＥＬ１２Ａ）、及びトリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼＶ（ＣＥＬ４５Ａ）、並びにこれらの相同分子種又は変異体からなる群から選択されるセルロース分解性酵素をコードする、１以上（複数）の第四ポリヌクレオチドをさらに含んでなる、請求項１５〜２１のいずれか１項に記載のセルロース分解性タンパク質組成物。
【請求項２３】
トリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼII（ＣＥＬ５Ａ）が配列番号５８の成熟ポリペプチドを含んでなるか、前記成熟ポリペプチドからなり、トリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼIII（ＣＥＬ１２Ａ）が配列番号６０の成熟ポリペプチドを含んでなるか、前記成熟ポリペプチドからなり、及びトリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼＶ（ＣＥＬ４５Ａ）が配列番号６２の成熟ポリペプチドを含んでなるか、前記成熟ポリペプチドからなる群から選択される、請求項８に記載の繊維状真菌宿主細胞。
【請求項２４】
トリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼII（ＣＥＬ５Ａ）の相同分子種又は変異体が、以下の、
（ａ）配列番号５８の成熟ポリペプチドと、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、
（ｂ）（ｉ）配列番号５７の成熟ポリペプチドコード配列、（ii）配列番号５７の成熟ポリペプチドコード配列に含まれるｃＤＮＡ、又はそれを含んでなるゲノムＤＮＡ配列、又は（iii）（i）もしくは（ii）の全長相補鎖と、好ましくは少なくとも中ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中高ストリンジェンシー条件、及び最も好ましくは少なくとも高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
（ｃ）配列番号５７の成熟ポリペプチドコード配列と、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、及び
（ｄ）配列番号５８の成熟ポリペプチドの１以上（複数）のアミノ酸の置換、削除、及び／又は挿入を含んでなる変異体、
からなる群から選択され、
トリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼIII（ＣＥＬ１２Ａ）の相同分子種又は変異体が、以下の、
（ａ）配列番号６０の成熟ポリペプチドと、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、
（ｂ）（ｉ）配列番号５９の成熟ポリペプチドコード配列、（ii）配列番号５９の成熟ポリペプチドコード配列に含まれるｃＤＮＡ、又はそれを含んでなるゲノムＤＮＡ配列、又は（iii）（i）もしくは（ii）の全長相補鎖と、好ましくは少なくとも中ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中高ストリンジェンシー条件、及び最も好ましくは少なくとも高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
（ｃ）配列番号５９の成熟ポリペプチドコード配列と、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、及び
（ｄ）配列番号６０の成熟ポリペプチドの１以上（複数）のアミノ酸の置換、削除、及び／又は挿入を含んでなる変異体、
からなる群から選択され、及び
トリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼＶ（ＣＥＬ４５Ａ）の相同分子種又は変異体が、以下の、
（ａ）配列番号６２の成熟ポリペプチドと、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、
（ｂ）（ｉ）配列番号６１の成熟ポリペプチドコード配列、（ii）配列番号６１の成熟ポリペプチドコード配列に含まれるｃＤＮＡ、又はそれを含んでなるゲノムＤＮＡ配列、又は（iii）（i）もしくは（ii）の全長相補鎖と、好ましくは少なくとも中ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中高ストリンジェンシー条件、及び最も好ましくは少なくとも高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
（ｃ）配列番号６１の成熟ポリペプチドコード配列と、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、及び
（ｄ）配列番号６２の成熟ポリペプチドの１以上（複数）のアミノ酸の置換、削除、及び／又は挿入を含んでなる変異体、
からなる群から選択される、請求項２２に記載のセルロース分解性タンパク質組成物。
【請求項２５】
配列番号８のセルロース分解性増強活性を有するポリペプチドの成熟ポリペプチド、配列番号１０６のベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質、配列番号５２のトリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼＩ（ＣＥＬ７Ａ）の成熟ポリペプチド、配列番号５４のトリコデルマ・リーゼイセロビオヒドロラーゼII（ＣＥＬ６Ａ)の成熟ポリペプチド、及び配列番号５６のトリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼＩ（ＣＥＬ７Ｂ）の成熟ポリペプチドを含んでなる、請求項１５に記載のセルロース分解性タンパク質組成物。
【請求項２６】
配列番号５８のトリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼII（ＣＥＬ５Ａ）、配列番号６２のトリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼＶ（ＣＥＬ４５Ａ）、及び配列番号６０のトリコデルマ・リーゼイ・エンドグルカナーゼIII（ＣＥＬ１２Ａ）からなる群から選択される、１以上（複数）の酵素をさらに含んでなる、請求項２５に記載のセルロース分解性タンパク質組成物。
【請求項２７】
配列番号６４のチエラビア・テレストリス・セロビオヒドロラーゼの成熟ポリペプチドをさらに含んでなる、請求項１５〜２６のいずれか１項に記載のセルロース分解性タンパク質組成物。
【請求項２８】
セルロール含有物質を分解又は変換する方法であって、請求項１５〜２７のいずれか１項に記載のセルロース分解性タンパク質組成物でセルロース含有物質を処理することを含んでなる方法。
【請求項２９】
発酵物質を作製する方法であって、（ａ）請求項１５〜２７のいずれか１項に記載のセルロース分解性タンパク質の有効量で、セルロース含有物質を糖化すること、（ｂ）発酵物質を作製する１以上（複数）の発酵微生物で、ステップ（ａ）の糖化セルロース含有物質を発酵させること、及び（ｃ）当該発酵からの発酵物質を回収すること、を含んでなる方法。
【国際調査報告】
2010528624.tif 000021
2010528624.tif 000022
2010528624.tif 000023
2010528624.tif 000024
2010528624.tif 000025