(57)【要約】  本発明は、蛍光色素分子、ｓｉＲＮＡ、ＤＮＡ、及び量子ドットを、培養下の細胞及びインビボの網膜及び眼組織に、透過及び送達する能力を備えるペプチド−ＰＯＤを提供する。ＰＯＤは、アデノウイルスベクターと結合することができ、特定細胞への指向性を高め、分子を眼及びその他の組織にインビボで送達するためのより安全でより有用な方法を潜在的に提供する。【選択図】図１８Ｃ
2010537632.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物を細胞又は組織に送達することにより該細胞又は該組織の細胞に導入する方法であって、
共役化合物を得るために、前記化合物に操作可能に結合する全送達ペプチド（ＰＯＤ）組成物を提供する工程を含み、
前記ＰＯＤが、タンパク質導入領域（ＰＴＤ）を含み、
前記方法はさらに、
前記細胞又は組織を前記共役化合物と接触させる工程を含み、
前記共役化合物が、前記細胞又は前記組織の細胞に導入されることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ＰＯＤが、アミノ酸配列（１２２２１１２１）ｘ又は１１１（１２２２１１２１）ｘを有し、中性の小さい残基が数字１として表記され、正電荷残基が数字２として表記され、ｘが１乃至８の全整数である数字記号によって示されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ＰＯＤが、アミノ酸配列（ＡＲＫＫＡＡＫＡ）ｘ又はＧＧＧ（ＡＲＫＫＡＡＫＡ）ｘを有し、アミノ酸の標準１文字表記によって表され、ｘが１乃至８の全整数であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記ＰＯＤが、アミノ酸配列（ＡＲＫＫＡＡＫＡ）ｘ又はＧＧＧ（ＡＲＫＫＡＡＫＡ）ｘを有し、ｘが３乃至５の全整数であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記方法が、前記接触工程後に、前記共役化合物が細胞膜を破壊せずに前記細胞又は前記組織の細胞に進入することを観察する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１乃至４いずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記共役化合物を細胞質内に局在化させる工程をさらに含むことを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記共役化合物を核内に導入する工程をさらに含むことを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項８】
前記接触工程前に、哺乳類の被験体における疾患を診断、予後、又は治療するための薬剤として前記共役化合物を製剤する工程を含むことを特徴とする請求項１乃至７いずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記化合物が、核酸であることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記核酸が、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及び低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の群から選択される少なくとも１つであることを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記化合物が、抗体を含むタンパク質、ペプチド、脂質、及び炭水化物の群から選択されることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１２】
前記化合物が、低分子量薬物であることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞又は組織が、眼、口腔、生殖器、軟骨性（軟骨細胞）、肝臓、腎臓、神経、脳、上皮、心臓、及び筋肉の群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞又は組織が、培養下にあることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞又は組織が、インビボにあることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
前記接触工程前に、前記化合物に結合されたＰＯＤ組成物をペグ化する工程を含むことを特徴とする請求項１乃至１５いずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記ペグ化工程が、１０ｋＤのポリエチレングリコールを追加するためのＰＥＧ試薬と反応する工程を含むことを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記接触工程が、前記細胞又は組織に少なくとも約１マイクロモルの前記共役化合物を提供する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１又は１６記載の方法。
【請求項１９】
前記接触工程が、前記細胞又は組織に少なくとも約４０μｇの前記共役化合物を提供する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１又は１６記載の方法。
【請求項２０】
前記接触工程が、約３７℃で培養する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１又は１６記載の方法。
【請求項２１】
前記接触工程が、経眼、硝子体内、局所、経皮、腹膜内、皮下、及び静脈からなる群から選択される経路によって、前記共役化合物を被験体に投与する工程をさらに含むことを特徴とする請求項８又は１６記載の方法。
【請求項２２】
タンパク質である前記共役化合物を提供する工程が、前記化合物のアミノ酸配列と前記ＰＯＤのアミノ酸配列との遺伝子融合をコードする核酸を合成する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項２３】
前記送達工程は、
前記細胞又は前記組織の細胞を、前記融合をコードする前記核酸に接触させる工程と、
前記核酸を前記細胞又は前記組織の細胞に発現させる工程とをさらに含むことを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記送達工程は、
発現系細胞を、前記融合をコードする前記核酸に接触させる工程と、
前記核酸を前記発現系細胞に発現させる工程と、
融合タンパク質を単離する工程と、
前記細胞又は前記組織の細胞を、単離された融合タンパク質に接触させる工程とをさらに含むことを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
タンパク質である前記共役化合物を提供する工程が、前記化合物を、前記ＰＯＤアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸に化学的に共役させる工程をさらに含むことを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項２６】
タンパク質である前記共役化合物が、免疫原又はワクチンを含むことを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項２７】
タンパク質である前記共役化合物を提供する工程が、前記化合物と前記ＰＯＤのアミノ酸配列との融合をコードするアミノ酸配列を化学的に合成する工程を含むことを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項２８】
化合物に共役することにより該化合物を組織又は細胞へと送達する組成物であって、
ＧＧＧ（ＡＲＫＫＡＡＫＡ）４ （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）及び（ＡＲＫＫＡＡＫＡ） ４ （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）の群から選択されるアミノ酸配列を含み、
前記化合物に共役された前記組成物が、細胞又は組織の細胞に導入されることを特徴とする組成物。
【請求項２９】
導入活性が、眼、口腔、生殖器、神経性、軟骨性（軟骨細胞）、肝臓、腎臓、上皮、心臓、及び筋肉の群から選択される細胞又は組織の細胞を対象とすることを特徴とする請求項２８記載の組成物。
【請求項３０】
前記眼細胞又は組織が、網膜、網膜色素上皮、網膜神経節、角膜、視神経、及び胚性網膜からなる群から選択されることを特徴とする請求項２９記載の組成物。
【請求項３１】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をさらに含むことを特徴とする請求項２８乃至３０いずれか記載の組成物。
【請求項３２】
化合物に共役することにより該化合物を細胞又は組織の細胞へと送達する組成物であって、
アミノ酸配列ＡＲＫＫＡＡＫＡ （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４） 又は ＧＧＧ（ＡＲＫＫＡＡＫＡ） （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を含むことを特徴とする組成物。
【請求項３３】
化合物と共役することにより該化合物を細胞又は組織の細胞へと送達する組成物であって、
アミノ酸配列ＡＲＫＫＡＡＫＡ （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４） 又は ＧＧＧ（ＡＲＫＫＡＡＫＡ） （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を含み、
前記アミノ酸配列が、ペグ化していることを特徴とする組成物。
【請求項３４】
共役物を合成するためのキットであって、
容器内に、アミノ酸配列ＧＧＧ（ＡＲＫＫＡＡＫＡ） （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２） 又はＡＲＫＫＡＡＫＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）の少なくとも１つの反復を有するペプチドと、該ペプチドを化合物に共役させるための使用説明書とを含むことを特徴とするキット。
【請求項３５】
共役物を合成するためのキットであって、
容器内に、ペグ化したアミノ酸配列ＧＧＧ（ＡＲＫＫＡＡＫＡ） （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）又はペグ化したＡＲＫＫＡＡＫＡ （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）の少なくとも１つの反復を有するペプチドと、該ペプチドを化合物に共役させるための使用説明書とを含むことを特徴とするキット。
【請求項３６】
前記キットが、前記配列を架橋結合する及び前記共役物を合成するための試薬をさらに含むことを特徴とする請求項３４又は３５記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国仮出願第６０／９６６，５９１号（２００７年８月２９日出願）の利益を主張し、引用することにより全開示を本願に援用する。
本発明は、細胞及び組織を透過するためにペプチド配列に共役する化合物を提供し、これにより、ワクチン及びその他の薬剤として化合物が送達される。また、本発明は、合成方法及びキットを提供する。
本発明は、NIH/NEI EY014991 及び EY013887の認可により部分的に支援されている。政府は、本発明の一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
感染、癌、自己免疫、及び炎症性疾患に起因する眼病及びその他組織の病気は、医薬品業界の進歩にもかかわらず、依然として重大な医学的問題である。特に、失明は、アメリカ合衆国において最も一般的な障害のうちの１つである。眼内炎疾患は、眼内の感染であり、現在の抗感染治療の到達性を複雑にする要因である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
低分子量物質からタンパク質までの範囲の薬物を含む大抵の薬物に対し、原形質膜は不浸透性バリアである。タンパク質導入領域（ＰＴＤ：Protein transduction domain）は、ウイルスゲノムから公知である。しかしながら、アミノ酸配列及び細胞内送達方法を改良且つ最適化することは未だ重大な問題であり、細胞内への薬物送達のためのこれら配列の使用を制限するものである。
薬物送達組成物及び方法の改良には、重大な医学的必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
したがって、本発明の一態様は、化合物を細胞又は組織に送達することにより細胞又は組織の細胞に導入する方法である。本方法は、共役化合物を得るために、化合物に操作可能に結合する全送達ペプチド（ＰＯＤ：peptide for overall delivery）組成物を提供する工程を含み、ＰＯＤが、タンパク質導入領域（ＰＴＤ：protein transduction domain）を含み、本方法はさらに、細胞又は組織を、共役化合物と接触させる工程を含み、共役化合物が細胞又は組織の細胞に導入される。用語「ＰＯＤ（全送達ペプチド）」とは、眼送達用のペプチドとしてそもそも考え出されたものである。しかしながら、ペプチドが、多くの種類の細胞及び組織への各種化合物の送達を向上させることを示すデータを考慮し、本用語は、本明細書では、全ての送達のためのペプチドを意味する。
【０００５】
一般的に、ＰＯＤは、表現（１２２２１１２１）ｘ又は１１１（１２２２１１２１）ｘで示されるアミノ酸配列を有し、中性の小さい残基が数字１として表記され、正電荷残基が数字２として表記され、ｘが１乃至８の全整数である数字記号によって示される。数字「１」は、ペプチド残基が、以下の中性（非荷電）の小さいアミノ酸のいずれかであることを示す：アラニン、グリシン、セリン、トレオニン、アスパラギン、及び同類のもの。そして、数字「２」は、ペプチド残基が、以下の正電荷アミノ酸のいずれかであることを示す：リジン及びアルギニン。例えば、ＰＯＤは、各アミノ酸がアミノ酸の標準１文字表記によって表され且つｘが１乃至８の全整数であるように、アミノ酸配列（ＡＲＫＫＡＡＫＡ）ｘ又はＧＧＧ（ＡＲＫＫＡＡＫＡ）ｘを有する。
【０００６】
さらに詳細には、ＰＯＤは、アミノ酸配列（ＡＲＫＫＡＡＫＡ）ｘ又はＧＧＧ（ＡＲＫＫＡＡＫＡ）ｘを有し、ｘが３乃至５の全整数である。
【０００７】
上述方法のいずれにおいても、関連実施形態は、接触工程後に、共役化合物が細胞膜を破壊せずに細胞又は組織の細胞に進入することを観察する工程をさらに含む。例えば、細胞質内における共役化合物の局在化をさらに観察する工程、又は核内における共役化合物の導入をさらに観察する工程である。
【０００８】
上述方法のその他の関連実施形態は、接触工程前に、哺乳類の被験体の疾患を診断、予後、又は治療するための薬剤として共役化合物を製剤する工程を含む。
【０００９】
本方法の一実施形態は、ＰＯＤを化合物に共役させることに関与し、この化合物とは核酸である。例えば、核酸は、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及び低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の群から選択される少なくとも１つである。
【００１０】
本方法の代替的な実施形態は、ＰＯＤを化合物に共役させることに関与し、この化合物とはタンパク質、脂質、及び炭水化物の群から選択される。
【００１１】
本方法の代替的な実施形態は、ＰＯＤを化合物に共役させることに関与し、この化合物とは低分子量薬物である。例えば、低分子量薬物は、１００−５，０００、又は２００−３，０００、又は３００−１，５００の範囲の分子量を有する。
【００１２】
一般的に、「標的」細胞又は組織細胞は、眼、口腔、生殖器、神経性、軟骨性（軟骨細胞）、肝臓、腎臓、神経、脳、上皮、心臓、及び筋肉の群から選択される。これにより、ほとんど全ての発生学的起源の組織の細胞が、ＰＯＤ及びそれに共役した化合物によって接触及び導入されることが可能である。
したがって、好適な標的は、培養下の細胞又は組織であり、例えば、細胞又は組織培養である。あるいは、細胞又は組織はインビボである。
【００１３】
本明細書に記載のいずれの方法の実施形態においても、接触工程は、細胞又は組織に少なくとも約１マイクロモルの共役化合物を提供する工程をさらに含み、例えば、少なくとも約２マイクロモル、５マイクロモル、１０マイクロモル、又は少なくとも約５０マイクロモルの共役化合物である。あるいは、接触工程は、細胞又は組織に少なくとも約４０μｇの共役化合物を提供する工程をさらに含み、例えば、少なくとも約１００μｇ又は少なくとも約４００μｇの化合物である。
【００１４】
一般的に、培養下又はインビボで細胞又は組織を接触させる両方において、接触工程は、細胞が恒常的温度であるように約３７℃で培養する工程をさらに含む。それにもかかわらず、特定の細胞又は組織はより低い又はより高い温度で接触されるが、これは、細胞が由来する有機体及び組織において通常の技術を有する生物学者に公知である如く行われる。
【００１５】
哺乳類の被験体において、接触工程は、経眼、硝子体内、局所、経皮、腹膜内、皮下、及び静脈からなる群から選択される経路によって、共役化合物を被験体に投与する工程をさらに含む。
【００１６】
共役化合物を提供する方法は、化合物がタンパク質である場合には、タンパク質を送達する幾つかの可能な方法にさらに関与する。例えば、まず化合物アミノ酸配列とＰＯＤのアミノ酸配列との遺伝子融合をコードする核酸を合成する工程による方法が挙げられる。
【００１７】
そして、化合物がタンパク質である場合、本方法は、さらに、細胞又は組織の細胞を融合のアミノ酸配列をコードする核酸に接触させる工程と、核酸を細胞又は組織の細胞に発現させる工程とによって送達することに関与する。
【００１８】
あるいは、化合物がタンパク質である場合、本送達方法は、さらに、発現系細胞を、融合をコードする核酸に接触させる工程と、核酸を発現系細胞に発現させる工程と、融合タンパク質を単離する工程と、細胞又は組織の細胞を、単離された融合タンパク質に接触させる工程とに関与する。
【００１９】
あるいは、化合物がタンパク質である場合、共役化合物を提供する工程は、ＰＯＤアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸に化学的に化合物を共役させる工程をさらに含む。化合物がタンパク質である本方法の実施形態において、タンパク質である共役化合物は免疫原又はワクチンを含み、例えば、化合物とＰＯＤのアミノ酸配列との融合をコードするアミノ酸配列を化学的に合成する工程によってタンパク質である共役化合物を提供する方法が挙げられる。
【００２０】
本明細書に提示される本発明のその他の態様は、化合物に共役することにより化合物を細胞又は組織へと送達する組成物である。この組成物は、化合物に共役した組成物が細胞又は組織の細胞に導入されるように、ＧＧＧ（ＡＲＫＫＡＡＫＡ）４ （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）及び（ＡＲＫＫＡＡＫＡ）４ （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）の群から選択されるアミノ酸配列を含む。導入活性は、例えば、眼、口腔、生殖器、神経性、軟骨性（軟骨細胞）、肝臓、腎臓、上皮、心臓、及び筋肉の群から選択される細胞又は組織の細胞を対象とする。
【００２１】
眼細胞又は組織は、網膜、網膜色素上皮、網膜神経節、角膜、視神経、及び胚性網膜からなる群から選択される。
【００２２】
また、化合物に共役することにより化合物を組織又は細胞へと送達する組成物が提供され、この組成物は、アミノ酸配列ＡＲＫＫＡＡＫＡ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４） 又は ＧＧＧ（ＡＲＫＫＡＡＫＡ） （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を含む。
【００２３】
本明細書に提示される本発明のその他の態様は、共役物を合成するためのキットであって、容器内に、アミノ酸配列ＧＧＧ（ＡＲＫＫＡＡＫＡ） （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２） 又はＡＲＫＫＡＡＫＡ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）の少なくとも１つの反復を有するペプチドと、ペプチドを化合物に共役させるための使用説明書とを含む。キットの関連実施形態は、配列を架橋結合する及び共役物を合成するための試薬をさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１Ａ】図１は、ＰＯＤが細胞透過性の非膜透過ペプチドであることを示す一連の顕微鏡写真及び折れ線グラフである。図１パネルＡは、リサミン（Lissamine, Liss）共役ＰＯＤ（Ｌ−ＰＯＤ）とともに１、５、及び６０分間培養した後にホルマリン固定したヒト胚性網膜芽細胞（FIXED）が、１分以内に細胞表面にＬ−ＰＯＤを凝集させ、５分以内に細胞質（矢印）又は点状（矢頭）パターンの状態でインターナライズすることを示す。挿入図は、リサミンのみで処理された細胞である。
【図１Ｂ】図１パネルＢは、Ｌ−ＰＯＤにさらされた生細胞（LIVE）が、ホルマリン固定細胞とは異なる局在化パターンを有することを示す。このパターンは、殆ど点状であり、リサミン取り込みの証拠はない。
【図１Ｃ】図１パネルＣは、Ｌ−ＰＯＤを用いた培養後、トリプシンを用いたＨＥＲ細胞の処置を示し、これがリサミン陽性細胞数を減少しなかったことは、Ｌ−ＰＯＤがインターナライズされており且つ単なる膜関連性ではないことを示している。
【図１Ｄ】図１パネルＤは、Ｌ−ＰＯＤの取り込みが温度依存性であることを示し、４℃よりも３７℃において実質的により効率的であったことを示す。
【図１Ｅ】図１パネルＥは、ＦＩＴＣ共役ＰＯＤの濃度が０乃至２ｎモルの範囲である際、ヨウ化プロピジウム陽性細胞の増加なく、ＦＩＴＣ陽性ＨＥＲ細胞数が増加した結果を示す。ＴＲは、１％Triton-X100である。
【図２Ａ】図２は、細胞培養下の小及び大分子のＰＯＤ媒介性送達を示す一連の棒グラフ及び顕微鏡写真である。図２パネルＡは、Ｎａ２ＨＰ０４緩衝液におけるシステイン含有ＰＯＤ（Ｃ−ＰＯＤ）がプラスミドＤＮＡをヒト胚性網膜芽細胞（ＨＥＲ：human embryonic retinoblast）へと送達可能であることを示す。
【図２Ｂ】図２パネルＢは、５％デキストロース（Dextrose）又はＮａ２ＨＰ０４緩衝液のいずれかにおいてプラスミドＤＮＡと複合したＣ−ＰＯＤの電子顕微鏡を示す。水平バーは１μｍに相当する。
【図２Ｃ】図２パネルＣは、Ｃ−ＰＯＤがｓｉＲＮＡをＨＥＲ細胞に送達してＧＦＰ発現を封じ、これは、ｓｉＲＮＡを単独で用いた時よりも効率的であったことを示す。
【図２Ｄ】図２パネルＤは、ストレプトアビジン架橋を介して量子ドット(Quantum dot)に共役したビオチン共役ＰＯＤ（Ｂ−ＰＯＤ）が、１５分以内の量子ドットの取り込みを可能とすることを示す。
【図２Ｅ】図２パネルＥは、Ｂ−ＰＯＤがない場合、ＨＥＲ細胞において１２０分時点で量子ドット(Quantum dot)の取り込みの証拠がないと観察されたことを示す。
【図３Ａ】図３は、ＰＯＤの取り込みが細胞表面プロテオグリカンの影響を受け、ＰＯＤが殺菌作用を有することを示す折れ線グラフ及び棒グラフである。図３パネルＡは、リサミン共役ＰＯＤ（Ｌ−ＰＯＤ）をヘパラン硫酸又はコンドロイチン硫酸のいずれかを用いて前培養することがＬ−ＰＯＤの取り込みを減らすことを示し、これら同じプロテオグリカンがインテグリン結合ＲＧＤ含有ＴＲＩＴＣ標識ペプチドの取り込みに殆ど影響を及ぼさないことを示す。
【図３Ｂ】図３パネルＢは、プレーティング前にシステイン含有ＰＯＤ（Ｃ−ＰＯＤ）をE coliとともに培養することが、濃度依存的にプレート当りのコロニー数を減少させたことを示す。
【図４Ａ】図４は、ＰＯＤがインビボで網膜組織までカーゴを透過及び運搬することを示す一連の顕微鏡写真である。図４パネルＡは、リサミン共役ＰＯＤ（Ｌ−ＰＯＤ）の成体マウスへの網膜下(subretinal)注入が、約２時間後に神経網膜の約４０％を導入し（４倍（４ｘ））、網膜(retina)の幾つかの層において見られた（２０倍）ことを示す。Ｌ−ＰＯＤは、網膜色素上皮（ＲＰＥ）、内節及び外節（ＩＳ、ＯＳ）、外顆粒層における細胞体（ＯＮＬ）、内顆粒層における細胞（ＩＮＬ）及び神経節細胞（ＧＣ）−４０倍を透過した。
【図４Ｂ】図４パネルＢは、Ｌ−ＰＯＤの硝子体内(intravitreal)注射が約２時間以内に神経網膜の約８５％を導入したことを示す（４倍）。導入は、主にＧＣＬ、ＩＮＬ（２０倍）及び樹状突起において観察され、ＲＰＥ又はＯＮＬにおいて有意な導入は見られなかった（４０倍）。
【図４Ｃ】図４パネルＣは、２時間後のビオチン共役ドット（ＱＤＰＯＤ）の網膜下への送達が桿体外節への結合を可能とし、ＯＮＬによる有意な取り込みがないことを示す。より長い２０時間の培養は、ＲＰＥ及びＯＮＬによる有意な取り込みをもたらした。挿入図は、類似の時間点におけるＰＯＤなしの対照量子ドットである。
【図４Ｄ】図４パネルＤは、ＱＤＰＯＤの硝子体内注射から得られた結果を示し、２時間後の内境界膜とＧＣＬへの結合、及び２０時間以内の取り込みが観察された。挿入図は、類似の時間点におけるＰＯＤなしの対照量子ドットから得られた結果を示す。ＢＦは明視野（brightfield）を意味する。
【図５Ａ】図５は、ＰＯＤがインビボにおける局所塗布によって眼組織を透過することを示す一連の写真及び顕微鏡写真である。図５パネルＡは、インビボで４５分間マウスの全眼(whole eye)を用いたリサミン共役ＰＯＤ（Ｌ−ＰＯＤ）の培養から得られたデータを示す。Ｌ−ＰＯＤは、角膜、強膜、及び視神経(optic nerve)を含む殆どの外眼組織を導入した。リサミンのみは角膜と強膜をわずかに染色し、視神経は染色しなかった。
【図５Ｂ】図５パネルＢは、パネルＡの眼の断面から得られたデータを示し、眼の外面の全てがＬ−ＰＯＤによって導入されたことが観察された。
【図５Ｃ】図５パネルＣは、パネルＢにおけるＡとＢでマークされた領域の詳しい検査を示し、Ｌ−ＰＯＤが角膜(cornea)上皮及び強膜(sclera)／脈絡膜(CH)によって取り込まれたことを結論づけるものである。
【図５Ｄ】図５パネルＤは、視神経の長手方向断面を示し、４５分の時間点において、視神経の外層がＬ−ＰＯＤによって導入されるがリサミンによっては導入されないことを示す。挿入図は、リサミンのみの対照である。
【図６Ａ】図６は、ＰＯＤを用いた偽型アデノウイルスベクターが、指向性の変化を表すことを示す一連の図面及び棒グラフである。図６パネルＡは、アデノウイルス血清型ｐＩＸのＣ末端、及びG11（ＡＲＫＫＡＡＫＡ）３を含むｐＩＸ融合タンパク質又はｐＩＸ−ＰＯＤとの比較、及びヘキソン間のｐＩＸ−ＰＯＤ三量体の配置図を示す。
【図６Ｂ】図６パネルＢは、図６パネルＡに示されるウイルスによるＣｈａｎｇ Ｃ又はＨＥＲ９１１細胞の感染後のタンパク質導入を示す一連の棒グラフであり、コンドロイチン硫酸又はヘパラン硫酸を用いて前培養したもの又はしていないものを示す。
【図７Ａ】図７は、デノボ合成されたＰＯＤ−ＧＦＰ融合タンパク質が核に局在化することを示す一連の顕微鏡写真である。図７パネルＡは、対照ｐＧＦＰＨｉｓでトランスフェクトされたＨＥＲ細胞を示す。
【図７Ｂ】図７パネルＢは、ｐＰＯＤＧＦＰＨｉｓでトランスフェクトされたＨＥＲ細胞を示す。これらのプラスミドは、Ｈｉｓ標識ＧＦＰの対照又はＰＯＤ−ＧＦＰを夫々発現する。データは、ＧＦＰが細胞質及び核に局在することを示し（図７パネルＡ）、ＰＯＤ−ＧＦＰが主に核に局在することを示す（図７パネルＢ）。さらに、ＰＯＤ−ＧＦＰは、核内コンパートメントに集中しているようである（図７パネルＢ、矢頭）。ＢＦは明視野（brightfield）を意味する。
【図８Ａ】アデノウイルス感染ＨＥＲ細胞からのＰＯＤ−ＧＦＰの精製を示す図面及び一連の写真である。ＰＯＤ−ＧＦＰ又は対照ＧＦＰをコードする発現カセットは、第一世代アデノウイルスベクターの欠損Ｅ１領域（△Ｅ１）にクローンされた。ＰＯＤは、弾力性を有するポリグリシンリンカーを介してＧＦＰに融合された（図８パネルＡ）。
【図８Ｂ】図８パネルＢにおいて、左側の写真は精製タンパク質の銀染色(silver stain)を示し、これは、ＰＡＧＥによる分析後にＰＯＤ−ＧＦＰとＧＦＰの予測分子量の主要バンドを示すものである。抗ＧＦＰウエスタンブロット法(Anti-GFP Western)は、これらのタンパク質がＧＦＰを含むことを確認した（パネルＢ、右側写真）。夫々、ＣＭＶはサイトメガロウイルスであり、６ＸＨｉｓはＨｉｓ標識であり、ＢＧＨ ｐＡはウシ成長ホルモンポリアデニル化信号であり、ＩＴＲは逆方向末端反復であり、ＭＬＴは主要後期転写ユニットであり、Ｅ１−Ｅ４は初期領域１−４である。
【図９Ａ】図９は、インビトロのＰＯＤ−ＧＦＰの導入特性を示す一連の顕微鏡写真と棒グラフである。図９パネルＡは、ＨＥＲ細胞と２時間培養されたＰＯＤ−ＧＦＰ又は対照ＧＦＰタンパク質、及びＦＡＣＳによって数えられたＧＦＰ陽性細胞(positive cell)を示す棒グラフである。
【図９Ｂ】図９パネルＢは、ＰＯＤ−ＧＦＰが細胞に進入し且つ部分的にリソトラッカー(LysoTracker)を用いて共局在化することを示し、後期エンドソームは赤色でマーカーされる。
【図１０Ａ】図１０は、インビボ(In Vivo)で網膜下注入後のＰＯＤ−ＧＦＰの導入特性を示す一連の顕微鏡写真である。ＰＯＤ−ＧＦＰ又は対照ＧＦＰタンパク質が、成体マウスの網膜下腔へと注入された。図１０パネルＡのデータは、対照ＧＦＰがバックグラウンド自己蛍光を超えて殆ど検出できなかったことを示す。
【図１０Ｂ】図１０パネルＢは、ＰＯＤ−ＧＦＰが、ＲＰＥとＯＮＬ内の光受容体細胞体とに侵入したことを示す。ＰＯＤ−ＧＦＰは、核周囲及び点状様態（矢頭）両方において光受容体核に局在化した。ＯＮＬは外顆粒層、ＩＮＬは内顆粒層、ＧＣＬは神経節細胞層、ＲＰＥは網膜色素上皮である。
【図１１Ａ】図１１は、インビボで硝子体内注射後のＰＯＤ−ＧＦＰの導入特性を示す一連の顕微鏡写真である。ＰＯＤ−ＧＦＰ又はＧＦＰタンパク質は成体マウスの硝子体腔内に注入され、眼は６時間後に摘出された。図１１パネルＡのデータは、対照ＧＦＰがバックグラウンド自己蛍光を超えて検出できなかったことを示す。
【図１１Ｂ】図１１パネルＢは、ＰＯＤ−ＧＦＰが、神経節細胞、内顆粒層（ＩＮＬ：矢頭）の細胞サブセット、及び内網膜（矢印）の樹状突起において検出されたことを示す。ＯＮＬは外顆粒層、ＩＮＬは内顆粒層、ＧＣＬは神経節細胞層、ＲＰＥは網膜色素上皮である。
【図１２Ａ】図１２は、インビボでマウス角膜にＰＯＤ−ＧＦＰを硝子体内注射及び局所塗布(Topical Application)した後の水晶体嚢の導入を示す一連の顕微鏡写真及び写真である。図１２パネルＡは、ＰＯＤ−ＧＦＰ又は対照ＧＦＰタンパク質が成体マウスの硝子体腔に注入され、目が６時間後に摘出され、水晶体(lens)から調製された凍結切片が、水晶体嚢へのＰＯＤ−ＧＦＰの有意な結合を明らかに示したことを示す。組換えＰＯＤ−ＧＦＰ又は対照ＧＦＰタンパク質が麻酔成体マウスの目に適用され、目が洗浄され、４５分後に摘出された。データは、対照ＧＦＰが実質的に眼組織に結合せず且つインターナライズされず、ＰＯＤ−ＧＦＰが全角膜表面に結合し、角膜全載において容易に検出可能であることを示した。
【図１２Ｂ】図１２パネルＢのデータは、角膜横断面から得たものであり、ＰＯＤ−ＧＦＰが角膜上皮に局在化していることを示す。
【図１３Ａ】図１３は、インビボで、剃毛した皮膚(skin)にＰＯＤ−ＧＦＰを局所塗布した一連の顕微鏡写真を示す。ＰＯＤ−ＧＦＰ又は対照ＧＦＰタンパク質が皮膚に２４時間塗布された。図１３パネルＡのデータは、ＧＦＰが自己発光を超えて皮膚に結合しないことを示す。
【図１３Ｂ】図１３パネルＢのデータは、ＰＯＤ−ＧＦＰが表皮に結合することを示す。毛髪及び毛乳頭もまたＰＯＤ−ＧＦＰにさらされた切片においてＧＦＰ陽性であったが、この信号のかなりの部分は自己蛍光によるものであった。Ｅは表皮、Ｐは乳頭である。
【図１４Ａ】図１４は、細胞透過性ペプチドｃＰＯＤがインビトロでは静止細胞へと遺伝子を送達できるが、インビボでは送達できないことを示す一連の棒グラフ及び顕微鏡写真である。図１４パネルＡは、４８時間の前血清(serum)飢餓がある場合とない場合に、ｃ−ＰＯＤ／ｐＣＭＶＧＦＰ複合体でトランスフェクトされたＡ５４９細胞を示し、その後、ＦＡＣＳによってＧＦＰ陽性細胞数が数えられた。細胞数と全ＧＦＰ強度（intensity）は、有糸分裂を抑制する条件下において実質的に減少した。
【図１４Ｂ】図１４パネルＢは、パネルＡにおいてｃ−ＰＯＤ／ｐＣＡＧＬｕｃ複合体でトランスフェクトされたＡ５４９細胞から得られた相対的な光強度値（ＲＬＵ:Relative Light Unit）の棒グラフであり、タンパク質レベルを定量化するためのものである。発現は血清飢餓細胞において凝縮後に増加した（ｐ＜０．０５）が、分裂細胞における発現（ｐ＜０．００５）よりも有意に少ないことが観察された。
【図１４Ｃ】図１４パネルＣは、ｃ−ＰＯＤがルシフェラーゼトランスジーンを外植片の初代細胞に送達できるが、インビボで静止眼組織内に注入された時には送達できないことを示す。ｐＣＡＧＬｕｃは、２つの異なるＮ：Ｐ比率において眼組織の外植片に加えられた。凝縮は、ＲＰＥ／強膜外植片におけるプラスミド単独と比較して、ルシフェラーゼ発現をＮ：Ｐ比率８．６（ｐ＜０．０５）において有意に増加させたが、Ｎ：Ｐ４．３（ｐ＞０．０５）においてはしなかった。トランスフェクションに関するインビボアッセイは、０．２μｇのｐＣＡＧＬｕｃを２μｌで網膜下に注入することによって実施される。凝縮プラスミドを用いたインビボのルシフェラーゼ発現において有意な増加はなかった。
【図１５Ａ】図１５は、ｃＰＯＤのペグ化が凝集を減少させる一方、ＤＮＡを凝縮する能力を維持していることを示す一連の顕微鏡写真及び写真である。図１５パネルＡは、ｃＰＯＤ／ＤＮＡ複合体が細胞培養下において大きな凝集を形成することを示す。ローダミン(Rhodamine)標識ＤＮＡは、ｃ−ＰＯＤと複合し、培養下のＨＥＲ細胞に添加され、２４時間後に観察された。
【図１５Ｂ】図１５パネルＢは、ｃ−ＰＯＤのペグ化が、タンパク質バンドのゲルシフトをもたらすことを示す。ｃＰＯＤは〜３．５ｋＤペプチドとなり、五量体として〜１７．５ｋＤに移動することが観察された。１０ｋＤのＰＥＧ追加は、分子量をまず２７．５ｋＤまで増大させ、これはより高等な種でもみられた。このことは、ＰＥＧ分子は、その大部分が五量体内の１つのｃＰＯＤのみに加えられることを示す。
【図１５Ｃ】図１５パネルＣは、ペグｃＰＯＤ（ＰＥＧ−ＰＯＤ）がＤＮＡを凝縮可能であり、この凝縮は、トリプシン(trypsin)によるペプチドの前分解時に緩和されたことを示す。
【図１５Ｄ】図１５パネルＤは、ＰＥＧ−ＰＯＤ／ローダミン標識ＤＮＡナノ粒子(Nanoparticle)が細胞全域に拡散染色を形成したこと、及びペグ化が大きな凝集の形成を減少したことを示す。スケールバー＝５０μｍ。
【図１６】ＰＥＧ−ＰＯＤがＤＮＡを凝縮して小さく分離したナノ粒子を形成することを示す一連の顕微鏡写真及び棒グラフである。透過電子顕微鏡法は、ｐＰＯＤ／ＤＮＡが小さく凝縮したナノ粒子を形成することを明らかにした。５％デキストロース緩衝液、プラスミド単独、又は凝縮プラスミドの夫々の添加は、酢酸ウラニル染色を用いて視覚化された。プラスミドＤＮＡは大きく不規則な凝集を形成した。ＰＥＧ−ＰＯＤ／ＤＮＡナノ粒子は、より小さく球形であり、大きさがより均一であった。
【図１７】ＰＥＧ−ＰＯＤナノ粒子が、ｃＰＯＤ凝縮ＤＮＡと比較して、インビボで異なる局在化を有することを示す一連の顕微鏡写真である。ＰＥＧ−ＰＯＤ（ＰＥＧ−ＰＯＤ〜ＲｈｏＤＮ）又はｃＰＯＤ（ｃＰＯＤ〜ＲｈｏＤＮＡ）で凝縮されたローダミン標識ＤＮＡは、網膜下に注入され、２時間後摘出された。ＰＥＧ−ＰＯＤ〜ＲｈｏＤＮＡ粒子は、点状に拡散して現れ、ＲＰＥ細胞層内で染色された。ｃＰＯＤ〜ＲｈｏＤＮＡは、ＲＰＥ細胞表面のみに結合し、網膜下腔との分離が見られた。
【図１８Ａ】図１８は、ＰＥＧ−ＰＯＤ〜Ｌｕｃナノ粒子が、網膜下注入後のインビボの眼組織をその他のＣＰＰよりも効果的にトランスフェクトし、また用量依存的であることを示す一連の棒グラフである。サンプルは注入後４８時間時点で分析された。１．２μｇのＤＮＡ ＰＥＧ−ＰＯＤ〜Ｌｕｃナノ粒子は成体ＢＡＬＢ／Ｃマウスの網膜下腔に注入され、１．２μｇのＤＮＡ単独（ｐ＜０．０００１）又は非注入対照（ｐ＜０．０００１）よりも有意に高いレベルで発現した。ＰＥＧ−ＰＯＤナノ粒子を０．６μｇのみ、同体積に注入した場合には、非注入対照（ｐ＜０．００１）及び１．２μｇの裸のＤＮＡ（ｐ＜０．０５）よりも依然として発現の有意な増加が観察され、１．２μｇのＰＥＧ−ＰＯＤナノ粒子（ｐ＜０．０５）と比較して有意な減少が見られた。ＰＥＧ−ＴＡＴ〜Ｌｕｃは、１．２μｇＤＮＡ単独（ｐ＜０．０５）及び非注入対照（ｐ＜０．００５）と比較して有意に増加した。ＰＥＧ−ＣＫ３０〜Ｌｕｃは、３つの細胞透過性ペプチド中で最も低い発現を示したが、それでも１．２μｇＤＮＡ単独（ｐ＜０．０５）及び非注入対照（ｐ＜０．００５）よりも有意に増加した。ＰＥＧ−ＰＯＤナノ粒子は、ＰＥＧ−ＣＫ３０と比較してトランスフェクションの有意な増加を示した（ｐ＜０．００５）。ＰＥＧ−ＴＡＴナノ粒子は、ＰＥＧ−ＰＯＤ又はＰＥＧ−ＣＫ３０のいずれかによって形成されたものと有意な差はなかった（ｐ＞０．０５）。これら結果は、全ての３つの細胞透過性ペプチドがＤＮＡ単独と比較してインビボでペプチドのトランスフェクションを有意に増加させることを示す。図１８パネルＡは、各個別の注入の結果を示し、ＲＬＵ／ｍｇで表される。点線は、平均＋３標準偏差（ＳＤ）に相当する。
【図１８Ｂ】図１８パネルＢは、注入の平均値を示し、ＲＬＵ／ｍｇで表される。平均＋３ＳＤを下回るＰＥＧ−ＣＫ３０注入からのデータは含めなかった。
【図１８Ｃ】図１８パネルＣは、１．２μｇの裸のＤＮＡと比較したナノ粒子注入の倍増を示す。
【図１９】ＰＥＧ−ＰＯＤ、ＰＥＧ−ＴＡＴ、及びＰＥＧ−ＣＫ３０凝縮ＬａｃＺナノ粒子が、ＲＰＥ細胞をトランスフェクトすることを示す一連の写真である。β−ガラクトシダーゼ発現を検査するために、夫々１．２μｇのＰＥＧ−ＰＯＤ〜ＬａｃＺ、ＰＥＧ−ＴＡＴ〜ＬａｃＺ、又はＰＥＧ−ＣＫ３０〜ＬａｃＺナノ粒子がＢＡＬＢ／ＣＪマウスの網膜下に注入され、発現が注入４８時間後に分析された。分析は、ＲＰＥにおける染色の点状パッチを示し、これは、強膜と脈絡膜を通して見え、各ペプチドを用いた相対的なルシフェラーゼレベルと相関している。切片は、発現がＲＰＥに局在化したことを示す。β−ガラクトシダーゼ発現は、対照の目のいずれにおいても検出されなかった。眼に注入された代表的な緩衝液が示される。
【図２０Ａ】図２０は、ＤＮＡ凝縮が、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）を防ぎ、静脈注射中のインビボでトランスフェクションを増加させることを示す電気泳動図の写真及び棒グラフである。図２０パネルＡは、ＰＥＧ−ＰＯＤがＤＮａｓｅＩ消化からＤＮＡを保護したことを示す。血清ヌクレアーゼ活性はプラスミドＤＮＡの半減期を減少させる。プロナーゼ（pronase）が含まれないのみであるｐＣＡＧＬｕｃ（裸のプラスミド）は、アガロースゲルに移動することが可能である一方、ナノ粒子ＰＥＧ−ＰＯＤ〜Ｌｕｃはウェル内で凝縮したままであった。プロナーゼを用いて１０分間培養した後、ｐＣＡＧＬｕｃ及びＰＥＧ−ＰＯＤ〜Ｌｕｃ ＤＮＡの夫々がゲルに移動したことが観察された。ＤＮＡ又はナノ粒子は、ＤＮａｓｅＩを用いて１５分間、続いてプロナーゼで１０分間培養された。これにより、ＰＥＧ−ＰＯＤの分解による凝縮ＤＮＡの視覚化が可能となった。０．２５ＵのＤＮａｓｅＩを添加した後、ｐＣＡＧＬｕｃは分解の兆候を見せ始めたが、ｐ−ＰＯＤは依然として損傷を受けなかった。２．５ＵのＤＮａｓｅＩというより高い濃度では、ｐＣＡＧＬｕｃが完全に分解し、もはや視認不可能であったが、ｐＰＯＤ〜Ｌｕｃは微量な分解のみを示した。
【図２０Ｂ】図２０パネルＢは、ＰＥＧ−ＰＯＤ〜Ｌｕｃが肺内のトランスフェクション効率性を増大させたことを示す。ＢＡＬＢ／Ｃマウスは、４０μｇのｐＣＡＧＬｕｃ、１０μｇのＰＥＧ−ＰＯＤ〜Ｌｕｃ、又は４０μｇのＰＥＧ−ＰＯＤ〜Ｌｕｃのいずれかを含む５％デキストロース緩衝液を１５０μｌ注入された。ルシフェラーゼ発現は、１０μｇのＰＥＧ−ＰＯＤ〜Ｌｕｃ（ｐ＜０．０５）又は４０μｇのＰＥＧ−ＰＯＤ〜Ｌｕｃが注入された（ｐ＜０．０００１）時に、バックグラウンドを超えて有意に増大したことが観察された。１０μｇから４０μｇへの注入ＰＥＧ−ＰＯＤ〜Ｌｕｃ量の増加は、ルシフェラーゼ発現に有意な増加をもたらした（ｐ＜０．０００１）。裸のプラスミド単独では、非注入マウスの肺を超えてルシフェラーゼを有意に発現しなかった（ｐ＞０．０５）。
【図２１Ａ】図２１は、ＰＥＧ−ＰＯＤナノ粒子が非毒性であることを機能分析によって示す折れ線グラフ及び棒グラフである。マウスは、１μｌに０．７μｇのｐＰＯＤ〜Ｌｕｃ（ｎ＝４）又は１μｌの５％デキストロース（ｎ＝４）のどちらかを用いて網膜下腔に注入され、ナノ粒子と同じ緩衝液が用いられ、成体（６−８週齢）のＣ５７オスが使用された。４８時間後、ＥＲＧが２つの対数強度において実施された。ＰＥＧ−ＰＯＤ〜Ｌｕｃ及びモック（偽）が注入された目の両方は、定義されたＡ及びＢ波を備える正常波を有していた。図２１パネルＡは、−０対数光強度における４８時間後のマウスからの代表的な出力記録を示す。
【図２１Ｂ】図２１パネルＢは、Ａ及びＢ波振幅に関して分析され且つ対数光強度によってプロットされた波から得られたデータを示す。全ての試験条件下において、ナノ粒子と緩衝液注入の間に有意な差はなかった（ｐ＞０．０５）。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
国立衛生研究所によると、失明をもたらす眼疾患は、アメリカ合衆国における身体障害の最も一般的な原因の１つである[National Eye Institute (1999-2003). A Report of the National Eye Council, National Institutes of Health]。網膜のよく見られる病気は、加齢関連黄斑変性（ＡＭＤ）、網膜色素変性（ＲＰ）、及び緑内障を含む。これらは、網膜色素上皮、光受容体、及び網膜神経節細胞の変性に夫々関連し、Hartong, DT et al. 2006 Lancet 368:1795-1809; Rattner A et al. 2006 Nat Rev Neurosci 7: 860-872に記載されている。また、移植角膜輪の感染、ジストロフィー、又は拒絶反応も、視力喪失の一般的な原因に共通するものである[Moffatt SL et al. 2005 Clin Experiment Ophthalmol33: 642-657]。ヒトの平均余命を長くしてきた健康管理の改善は、皮肉にも、ＡＭＤ等の病気の頻発性を有意に増大させるという予測をもたらし、又はＲＰ等の現在治療不可能な病気に関連する負荷を長引かせることになる[National Eye Institute (1999-2003). A Report of the National Eye Council, National Institutes of Health]。したがって、遺伝性及び後天性眼疾患を治療するための遺伝子及び薬物送達技術を開発する必要性は大きい。
【００２６】
その他の組織と同様に、細胞内の眼の標的に対して用いられるタンパク質又は薬物は、容易に投与可能であるように十分極性を有する必要がある[Kelder J et al. 1999 Pharm Res 16: 1514-1519]。しかしながら、このような分子の大部分において、原形質膜は不浸透性バリアを意味する。注目すべきことに、数個の選択的タンパク質、例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のＴａｔ[Frankel AD et al.1988 Cell 55: 1189-1193]、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のＶＰ２２[Phelan A et al. 1998 Intercellular delivery of functional p53 by the herpesvirus protein VP22 [コメント参照] Nat Biotechnol 16: 440-443]、及びキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）・アンテナペディアホメオドメイン[Derossi D et al. 1994 J Bioi Chem 269: 10444-10450]は、無傷な生体膜を横断する能力を所有する。このようなタンパク質構造の疑問は、これらタンパク質が「タンパク質導入」特性を付与する分子を含むという仮説をもたらした。それ故に、このような配列は一般的にタンパク質導入領域（ＰＴＤ）と称され、[Dietz GP et al. 2004 Mol Cell Neurosci 27: 85-131]に掲載されている。ＰＴＤは、単離されて異種タンパク質及びペプチド内に組み込まれることができ、このような組換え分子に新規のタンパク質導入特性を与えることになる。ＰＴＤの使用における幾つかのグループによる初期実験は、それら特性と作用機序に関してデータの不一致及び実質的な論議を生じさせた[Lundberg M et al. 2001 Nat Biotechnol19: 713-714; Falnes PO et al. 2001 Biochemistry 40: 4349-4358]。対処された問題の一部は、タンパク質導入の現象が実際に存在するのか、又は固定アーチファクトにすぎないのか、そして、導入は受容体、エネルギー、及び／又は温度依存性であるのか否かであった[Richard JP et al. 2003 J Bioi Chem 278: 585-590]。ＨＩＶのＴａｔ[Cashman SM et al. 2003 Mol Ther 8: 130-142]及びＨＳＶのＶＰ２２ [Cashman SM et al. 2002 Mol Ther 6: 813-823]の両方のＰＴＤが有効な導入特性を有していることは、眼細胞株及び組織に示された。
【００２７】
本明細書の実施例は、ＰＴＤ特性を有することが今まで知られていない新規のペプチドであるＧＧＧ（ＡＲＫＫＡＡＫＡ）４、分子量（ｍｗ）＝３．５Ｋｄが、蛍光プローブとｓｉＲＮＡを含む小分子、及びプラスミドＤＮＡと量子ドットを含む大分子を、培養下の細胞とインビボのマウス眼細胞に効率的に送達可能であるか否かを決定しようとするものであった。結果は、ＧＧＧ（ＡＲＫＫＡＡＫＡ）４が、インビトロとインビボの両方で、原形質膜を横断する小及び大分子の効率的な「眼送達ペプチド（ＰＯＤ：peptide for ocular deliver）」であり、それ故に、遺伝子と薬物をヒト眼組織に送達する潜在性を有する可能性があることを示す。
【００２８】
遺伝性網膜変性の原因となる２００近い異なる遺伝子座と１３０の異なる遺伝子がこれまでに同定されてきており、網膜変性を、ヒトにおける主な異種遺伝性疾患のうちの１つとしている（www.retnet.org）。これら遺伝子の多くは、光受容体又は網膜神経細胞にのみ発現する。網膜細胞への治療用タンパク質の効率的な送達は、現在のところＤＮＡ発現カセット送達用の組換えウイルスの使用に限られている−潜在的に有害な手法であり、特定の事例では宿主ゲノムの不可逆的再配置をもたらす可能性がある[Donsante A et al. 2007 Science 317: 477]。したがって、ヒトへの遺伝子送達の使用前に、比較的集中した且つ有意に長期な前臨床試験が実施される必要がある。網膜変性に関与する多くの遺伝子を考えると、各遺伝子への遺伝子治療法の前臨床試験は、法外な費用と時間がかかることになる。したがって、多数の網膜変性のための治療開発に対する開発の加速化は、理論的にはタンパク質送達の危険性が低い手法によって実現できる可能性がある−即ち、いかなる有害事象の初回観察時でもタンパク質送達の投与を容易に終了することができるものである。
【００２９】
例えば、網膜変性の動物モデルへの毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）のウイルス媒介性遺伝子導入は、有害であるとして文書化されてきた[Buch PK et al. 2006 Mol Ther 14: 700-709]が、第１相試験は、網膜色素変性症患者の眼区画から容易に除去可能なカプセル化ＣＮＴＦ産生細胞を使用することにより、安全に完了している［Sieving  PA et al. 2006 Proc Natl Acad Sci U S A 103: 3896-3901]。ＣＮＴＦのウイルス遺伝子導入がこれら試験で行われてきたとすると、患者への推定される危険性はより大きく且つ不可逆的である可能性がある。幾つかの網膜変性、例えば、ロドプシン又はペリフェリン／ＲＤＳ関連網膜色素変性（ＲＰ）において、治療遺伝子産物の過剰発現は有害となりうる。これは、ウイルス遺伝子導入[Sarra  GM et al. 2001 Hum Mol Genet 10: 2353-2361]とトランスジェニックマウス[Tan E et al. 2001 Invest Ophthalmol Vis Sci 42: 589-600]の両方において観察されてきた如くである。したがって、ＲＰ患者を治療するための遺伝子送達の試みは、理論的には、任意の治療がない場合よりも、光受容体変性の更なる高速化を促進する可能性がある。このような疾患は、典型的には強いウイルスプロモーター又は切断型細胞特異的プロモーターに依存する大半の遺伝子治療手法によって、容易に回復できない可能性がある。網膜変性（典型的には緩徐進行性疾患である）の文脈において、本明細書では、治療用タンパク質の長期送達のための徐放製剤又は持続性薬剤の使用が想定される。しかしながら、網膜変性に関与する（さらに言えば任意の疾患に対する）殆どの大分子は、原形質膜を容易に横断せず、網膜等の神経組織をあまり効率よく透過しない。
【００３０】
脂質二重層を横断するという普通ではない特性を発揮するタンパク質は、異種タンパク質、抗体、及び酵素に、化学的に架橋されることが可能なＰＴＤを含み、原形質膜を横断するそれらの輸送を促進する[Fawell S et al. 1994 Proc Natl Acad Sci USA 91: 664-668; Anderson DC et al. 1993 Biochem Biophys Res Commun 194: 876-884]。タンパク質導入は、１０年前にGreenとFrankelによって初めて報告された。GreenとFrankelは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のＴＡＴタンパク質が、周囲培地に加えられた時に細胞に進入可能であることを独立して証明した[Frankel AD et al. 1988 Cell 55: 1189-1193; Green M et al. 1988 Cell 55: 1179-1188]。最も集中して研究されているＰＴＤは、ショウジョウバエ・ホメオティック転写因子ＡＮＴＰ（アンテナペディア遺伝子によってコードされる）、及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のＶＰ２２[Joliot A et al. 1991 Proc Natl Acad Sci USA 88: 1864-1868; Joliot AH et al. 1991 New Biol 3: 1121-1134; Elliott G et al. 1997 Cell 88: 223-233]である。各種の追加的な細胞透過性ペプチドがその後発見されてきた[Vives E et al. 2008. Cell-penetrating and cell-targeting peptides in drug delivery. Biochim Biophys Acta]。ＨＩＶのＴＡＴは別として、インビボで神経組織におけるＰＴＤの能力について利用できる情報は非常に限られたものである。
【００３１】
本実施例の目的は、生体関連巨大分子（例えば全タンパク質）のＰＯＤへの遺伝的融合の潜在性を検査することであり、これにより、新規の導入特性が、網膜光受容体及び介在ニューロンへの送達に関して、組換え融合タンパク質に付与されるか否かを決定することができる。原理証明のために、網膜細胞へのＰＯＤ−ＧＦＰ融合タンパク質の送達がインビトロとインビボで試験された。本明細書の実施例によると、ＰＯＤ融合タンパク質は、網膜細胞及び組織への巨大分子の透過及び分散を可能とするために、失明を含むＣＮＳの各種疾患への有意な治療的応用性を有する可能性があることが示されている。
【００３２】
本明細書の実施例は、ＰＯＤが、細胞の導入を向上させるために、組換えアデノウイルスベクターにタンパク質導入特性を付与することにも有用であることを示す。アデノウイルスの進入は、２段階工程であり、第１工程は、コクサッキーアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）への線維ノブドメインの結合に関与する[Bergelson JM et al. 1997 Science 275: 11320-1323]。第２工程は、細胞表面αｖβ５インテグリンとアデノウイルスペントンベースにあるＲＧＤモチーフとの相互作用に関与し、受容体媒介性エンドサイトーシスによるウイルス進入を可能とする[Wickham TJ et al. 1993 Cell 73: 309-319]。ＰＯＤをビリオン表面に示すために、我々は、アデノウイルス骨格を遺伝的に修飾することにより、外被タンパク質ＩＸ（ｐＩＸ）を発現する代わりに、組換えウイルスが、可塑性ポリグリシンリンカーによって結合されるｐＩＸとＰＯＤからなる融合タンパク質を発現するようにした（図６パネルＡ）。ｐＩＸは各ヘキソン間に三量体としてビリオンに組み込まれるために、理論的には２４０のＰＯＤがビリオン表面に存在することになる。完全長のｐＩＸ−ＰＯＤ融合タンパク質（即ち、ｐＩＸ−Ｇ１１（ＡＲＫＫＡＡＫＡ）４ （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３））を備えるビリオンは、レスキューされなかったが、ｐＩＸ−Ｇ１１（ＡＲＫＫＡＡＫＡ）３（即ち、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の３つの反復を運ぶプラスミド）を示すビリオンはレスキューされた。この組換えウイルスはまた、欠失Ｅ１領域におけるチキンβ−アクチンプロモータによって制御されるＧＦＰ発現カセットを含んでいた-Ａｄ５ｐＩＸＰＯＤ。
【００３３】
エンドサイトーシスによるウイルスのインターナリゼーションに関与するＲＧＤ−αｖβ５インテグリン相互作用が無い場合に、ビリオン外被に対するＰＯＤの潜在的役割を検査するために、ウイルスが、ペントンベースのＲＧＤドメインにおける欠失と組み合わせて上記の修飾を用いてレスキューされた−Ａｄ５ｐＩＸＰＯＤΔＲＧＤ。親対照ウイルスは、同じＧＦＰ発現カセットを含むが、ｐＩＸ又はペントンベースに任意の修飾がない（Ａｄ５ＣＡＧＧＦＰ）。ＨＥＲ細胞は、生産性の高いウイルス感染及び複製を可能とするので、導入は、ヒト結膜Ｃｈａｎｇ Ｃ細胞を、上述の各ウイルスを用いて検査した。データは、Ａｄ５ＣＡＧＧＦＰがＣｈａｎｇ Ｃ細胞の２４．９４±２．６６％を導入したのに対し、Ａｄ５ｐＩＸＰＯＤ及び Ａｄ５ｐＩＸＰＯＤΔＲＧＤが同じ感染効率（moi）において３８．１６±５．０７及び３３．３８±６．４９％の細胞をそれぞれ導入したことを示す。アデノウイルス外被表面に表れるＰＯＤがＰＯＤ偽型ウイルスによってＣｈａｎｇ Ｃ細胞の導入を向上させたことが結論付けられた。コンドロイタン（chondroitan）硫酸を用いた各ウイルスの前培養は、ＰＯＤペプチドで見られた減少と同様に、各ウイルスによってＣｈａｎｇ Ｃ細胞の感染を減少させた。コンドロイタン硫酸を用いた前培養は、Ａｄ５ＣＡＧＧＦＰ、Ａｄ５ｐＩＸＰＯＤ、及びＡｄ５ｐＩＸＰＯＤΔＲＧＤで感染された時に、夫々１７．１９±１．１３％、１６．６５±０．６１％、及び２０．８５±３．４１％のＧＦＰ陽性Ｃｈａｎｇ Ｃ細胞をもたらした。これらデータは、これらウイルスが細胞進入中にＰＯＤを使用可能であることを示した。同様に、ヘパラン硫酸を用いた培養もまた、各ウイルスによってＣｈａｎｇ Ｃ細胞の感染を減少させ、Ａｄ５ＣＡＧＧＦＰ、Ａｄ５ｐＩＸＰＯＤ、及びＡｄ５ｐＩＸＰＯＤΔＲＧＤに対して、夫々２９．１２、４２．５９、３４．０４％減少させた。全ての３つのウイルスの感染率の有意な減少は、プロテオグリカンがインテグリンよりもウイルス感染には大きい役割を果たしていることを示している。
【００３４】
ＨＥＲ細胞であるウイルス複製を可能とする細胞株において、我々は、各ウイルスに対して、より大きな割合の感染を観察した。Ａｄ５ＣＡＧＧＦＰ、Ａｄ５ｐＩＸＰＯＤ、及びＡｄ５ｐＩＸＰＯＤΔＲＧＤは、夫々、細胞の７８．５４±８．８％、８３．４７±８．１１％、及び６９．６７±３．８６％を感染した。プロテオグリカンからの感染率減少は、Ｃｈａｎｇ Ｃ細胞と比較すると、ＨＥＲ細胞ではあまり顕著ではなかった。コンドロイタン硫酸を用いた前培養は、Ａｄ５ＣＡＧＧＦＰ、Ａｄ５ｐＩＸＰＯＤ、及びＡｄ５ｐＩＸＰＯＤΔＲＧＤに対して夫々、７５．７３±１．８８％、６９．８２±０．６１％、及び３７．７５±５．２４％まで感染細胞数を減少させた。Ａｄ５ｐＩＸＰＯＤ及びＡｄ５ｐＩＸＰＯＤΔＲＧＤの結果のみが有意であり、Ａｄ５ｐＩＸＰＯＤΔＲＧＤのみが実質的に抑制された。ヘパリン硫酸は、Ａｄ５ＣＡＧＧＦＰ及びＡｄ５ｐＩＸＰＯＤウイルスに対して類似の結果であり、ウイルス感染した細胞の６９．４６±５．１８％（有意性なし）及び５９．１９±３．６１%（ｐ、０．０５）であった。しかしながら、ヘパリン硫酸は、Ａｄ５ｐＩＸＰＯＤΔＲＧＤのウイルス感染を向上させるように見え、８１．０２±２．５８％の陽性細胞をもたらした。
【００３５】
本明細書の実施例の１つの目的は、網膜等の眼組織にインビボでＰＴＤとして効率的に影響を及ぼすペプチドを同定することであった。このようなペプチドは、網膜に豊富に存在するタンパク質のグリコサミノグリカン結合領域に類似しているはずであると想定されている。２つのこのようなタンパク質は、酸性及び塩基性の線維芽細胞増殖因子（fibroblast growth factor）であるａＦＧＦ及びｂＦＧＦを夫々含む［Bugra K et al. 1997 J Mol Neurosci 9: 13-25]。グリコサミノグリカンコンドロイタン硫酸は、成体の網膜に豊富に存在することが知られている。ヘパラン硫酸は成長期に豊富に発現するが、その発現は成体の網膜では実質的に減少する。ａＦＧＦ及びｂＦＧＦのタンパク質−グリコサミノグリカン相互作用の分子モデリングは、これらａＦＧＦ及びｂＦＧＦが、ＸＢＢＢＸＸＢＸ（ＸとＢは夫々ヒドロパシー及び塩基性残基である）の形式である塩基性ヘパリン結合領域を含むことを示す[Cardin AD et al. 1989 Arteriosclerosis 9: 21-32]。これら観察に続き、Verrechio及びその同僚[Verrecchio A et al. 2000 J Bioi Chem 275: 7701-7707]は、 (ＸＢＢＢＸＸＢＸ)ｎ及び（ＸＢＢＸＢＸ）ｎ（ｎ＝１乃至６）の形式であるペプチドがヘパランと結合することを示した。さらに、円偏光二色性は、ヘパラン結合ペプチドが、ヘパラン結合時に荷電コイルからα−へリックスへと変換されることを示した。本明細書の実施例は、このようなペプチドがタンパク質導入特性を有しているか否かを検査する。タンパク質導入用の各種配列が、本明細書の実施例に示されるＰＯＤの詳細な検査の前に検査された。
【００３６】
米国特許第６，８５５，８０１号（２００５年２月１５日発行：発明者San Antonioら）は、ヘパリンと相互作用するグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）及びプロテオグリカン（ＰＧ）に強い親和性を有するペプチドを示す。ペプチドの配列は、広範囲な既知のヘパリン結合タンパク質の分析から得られたコンセンサス配列ＸＢＢＸＢＸ及びＸＢＢＢＸＸＢＸに基づき、これら配列の６回もの反復単位を使用したものであった。San Antonioらは、これらのペプチドを、天然又は合成表面への細胞接着を提供するのに使用する方法を開示する。この方法は、ヘパリンの取り込みとクリアランスを阻害するためのヘパリン結合を対象とし、各種ＰＧ及びＧＡＧの作用を調節するものである。
【００３７】
米国特許第７，２５９，１４０号（２００７年８月２１日発行：San Antonioら）は、第６，８５５，８０１号に記載されたものと類似した更なるペプチドを開示し、このペプチドは、システイン及びプロリン等の追加的な残基を有する。これらは、ヘパリンに結合し、例えば、被験体における血漿ヘパリンレベルを減少させるための方法、又はマスト細胞セリンプロテアーゼ関連疾患の治療に使用される。
【００３８】
タンパク質導入の現象を取り巻く初期論争のために、本明細書では、ＰＯＤが固定を必要とせずに細胞内に進入することが示される（とはいえ、固定は実際のところＰＯＤの細胞局在に関してアーチファクトをもたらすものではある）。細胞質局在化は、ホルマリン固定細胞では５分以内に主に観察された。その一方で、ＰＯＤは、点状に出現し、うまくいけば生細胞のエンドサイトーシス小胞に６０分後でさえ局在が見られた。興味深いことに、ＰＯＤを用いた培養１分後時点で、細胞は５５８ｎｍの励起に不透明となった−潜在的に、ＰＯＤ結合の際の細胞表面プロテオグリカンの凝集又はキャッピングによるものである[Martinho RG et al. 1996 Mol Bioi Cell 7: 1771-1788]。取り込みであって単なる原形質膜結合ではない証拠は、生細胞をトリプシン処理することによって証明され、ＰＯＤ−導入細胞に関連した蛍光を減少させなかった。また、取り込みは温度依存性であることが示された。ＰＯＤ等のペプチドを眼の遺伝子又は薬物送達に用いる１つの懸念は、細胞膜を横断する過程中の潜在的な毒性である。この問題に取り組むために、ＰＯＤを用いた培養後に細胞によるヨウ化プロピジウムの取り込みが検査され、取り込みの増加は観察されなかった。これらの初期結果は、毒性がないことを示す。本明細書に記載のデータは、温度依存性機構を支持しており、ペプチド取り込みの減少は、エンドサイトーシスのインヒビター存在下では観察されなかった。クロルプロマジンは、報告によれば、クラスリンでコーティングされたピット依存性エンドサイトーシスを阻害し、ゲニステイン及びフィリピンはカベオラのインヒビターとして知られている。しかしながら、Ｌ−ＰＯＤの取り込みにおける有意な減少は、これらのインヒビターを用いて発見されていない。
【００３９】
原形質膜を効率的に横断するｓｉＲＮＡのような小分子のＰＯＤ送達は、ヒトの眼病の治療に応用できる。現在、幾つかの進行中の臨床試験は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）又はＡＭＤ治療用受容体のいずれかに関連するｍＲＮＡの分解を標的としている[Michels S et al. 2006 Expert Opin Investig Drugs 15:779-793]。確かに、ヒト眼病の治療へのｓｉＲＮＡの使用は、他の病気と比較して、特に開発が非常に進行した段階にある[Check E 2004 Nature 430:819]。ｓｉＲＮＡの標的が細胞内であるために、非毒性の態様で原形質膜を横断する効率的な送達は、非常に望ましいものである。ＰＯＤは、網膜へのｓｉＲＮＡ送達を潜在的に向上させるので、低濃度のｓｉＲＮＡの使用が可能となり、例えば非特異的ｓｉＲＮＡ媒介性サイレンシングに関連する毒性副作用を低減する結果となる。現在ＡＭＤ治療においてＶＥＧＦを標的とするのに使用されているアプタマーマクジェン等のＲＮＡ分子[Ng EW et al. 2006 Nat Rev Drug Discov 5: 123-132]の送達向上もまた、潜在的に実現可能となる。ＰＯＤは、細胞培養下のｓｉＲＮＡ及びＤＮＡを送達するのに使用可能であり、これにより多様な細胞内プロセスが研究される。
【００４０】
本発明の実施例は、網膜下腔及び硝子体腔へのＰＯＤ送達が、網膜において多様な細胞型の透過を可能とすることを示す。光受容体の導入は、ＲＰ等の病気の治療に応用される一方、ＲＰＥ細胞の導入は、ＡＭＤの治療に応用されることになる。反対に、硝子体内注入は、神経節細胞（その変性は緑内障に関連する）の標的化を可能にする。神経節細胞への増殖因子又は抗アポトーシス因子のＰＯＤ媒介性送達は、このような細胞の変性速度を遅くする可能性がある。量子ドットは、網膜を透過するのにＬ−ＰＯＤよりも実質的に長く時間がかかり、これはおそらくそれらのサイズが大きいためである。このような大分子の送達の実証によって、網膜への生物学的製剤の送達におけるＰＯＤの潜在的な使用がさらに支持される。このような生物学的製剤は、抗体又は抗体フラグメント、例えば夫々アバスチン及びルセンティス、を含むことができ、これらは現在ＡＭＤの治療に使用される[Pieramici DJ et al. 2006 Expert Opin Biol Ther 6: 1237-1245]。網膜組織の高速且つ向上した透過性のために、ＰＯＤを用いた融合タンパク質を想定することもできる。
【００４１】
驚くべきことに、局所的に投与されたＬ−ＰＯＤは、４５分以内に視神経に到達する。本明細書のこの発見は、レーバー遺伝性視神経萎縮症又は虚血性視神経症等の病気の治療への有用性を示す。全強膜の（及び潜在的には脈絡膜の）透過は、脈絡膜血管及び内皮細胞（その増殖はＡＭＤを含む各種の眼病に関与する）への薬物又は遺伝子の非侵襲的送達を可能にする。角膜へのＰＯＤ共役薬物の局所投与は、角膜上皮及び前房内への薬物の送達を向上させることができる。このことは、現在では局所投与後の眼組織への薬物透過性が１％未満であることを考えれば、特に有用となりうる[Shell JW 1984 Surv Ophthalmol 29: 117-128]。
【００４２】
本明細書の実施例は、アデノウイルスベクターがＰＯＤで修飾されることにより、ヒト結膜Ｃｈａｎｇ Ｃ細胞によるアデノウイルスの取り込みが向上されることを示す。これら実施例は、多様な眼病及び非眼病の治療に価値がある。アデノウイルスベクターは、今までに２つの臨床試験において、遺伝子をヒト眼組織へと送達する実行可能且つ有効な方法として示されてきた[Campochiaro PA et al. 2006 Hum Gen Ther 17: 167-176; Chevez-Barrios P et al. 2005 J Clin Oncol 23: 7927-7935]。ヘパラン硫酸のレベルが罹患網膜において増加するため[Landers RA et al. 1994 J Neurochem 63: 737-750]、この報告に記載されるベクターは多様な網膜変性の治療に応用できる可能性がある。
【００４３】
幾つかの細胞透過性ペプチドは殺菌作用を有し、天然に生じる抗菌ペプチドと構造的及び科学的な類似性を有する[Jung HJ et al. 2006 Biochem Biophys Res Commun 345: 222-228; Zhu WL et al. 2006 Biochem Biophys Res Commun 349: 769-774; Palm C et al. 2006 Peptides 27: 1710-1716]。ＨＩＶのＴＡＴは、３−２４μＭの濃度において、ペプチド結合核酸及び細胞周期の破壊に関与する抗真菌活性を有す[Jung HJ et al. 2006 Biochem Biophys Res Commun 345: 222-228]。同様に、Ｐｅｐ−１−Ｋ（特に微生物を標的とするように設計されたＰｅｐ−１の類似物）は、１−２μＭの最小抑制濃度を有し、グラム陽性及びグラム陰性細菌の培養下で強い抗菌性を示した[Zhu WL et al. 2006 Biochem Biophys Res Commun 349: 769-774]。Ｐｅｐ−１−Ｋに類似したＰＯＤは、培養下のグラム陰性細菌の数を有意に減少させ、コロニー数の有意な減少がここで見られ、その他のペプチドで報告されたものよりもＰＯＤの濃度はかなり低かった。０．３μＭまで低い濃度はＥ.ｃｏｌｉの生存を減少させるのに十分であり、これは、ＰＯＤの用量が低くなれば臨床的に応用可能となりやすいため、価値のある発見である。治療薬に共役したＰＯＤの注入は、侵襲的な臨床手段に起因した感染症に対してさらなる予防を提供する可能性がある。さらに、ＰＯＤの抗菌活性は、ＰＯＤが非複合体形態で治療薬であることを示す。
【００４４】
幾つかの最近の研究は、眼病を含む広範囲の疾患を正すための遺伝子治療の使用において有望である。これら研究の大半は、遺伝子送達のためのウイルスベクターを使用しており、網膜色素変性[Ali RR et al. 2000 Nat Genet 25: 306-310; Takahashi M et al. 1999 J Virol 73: 7812-7816; Bennett J 2000 Curr Opin Mol Ther  2: 420-425]、レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）[Acland GM et al. 2001 Nat Genet 2001; 28: 92-95; Le Meur G et al. 2007 Gene Ther 14: 292-303; Narfstrom K et al. 2003 Invest Ophthalmol Vis Sci  44: 1663-1672; Dejneka NS  et al. 2003 Adv Exp Med Biol 533: 415-422]、及び加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）［Reich SJ et al. 2003 Curr Opin Genet Dev  13: 317-322]等の広範囲な疾患にわたってマウスモデルの効果的なレスキューを示してきた。しかしながら、ウイルス適用の副作用は、挿入変異及び発癌性を含み[Baum C et al. 2006 Hum Gene Ther 17: 253-263]、同様に、炎症及び免疫原性を含み[Muruve DA 2004 Hum Gene Ther 15: 1157-1166; Reichel MB et al. 1998 Gene Ther  5: 1038-1046]、それら適用を制限する。その他の懸案事項は、例えばトランスジーンの大きさの制限[Verma IM et al. 1997 Nature 389: 239-242]、及び中和抗体の開発[Bennett J et al. 1999 Proc Natl Acad Sci USA  96: 9920-9925]であり、これもまた使用を制限するものである。
【００４５】
非ウイルスベクターの開発には実質的な関心が存在するが、従来の取り組みは、インビボでの効率性が欠けるために妨げられてきた。目は、多様な特徴の病気、区分化構造、及び有糸分裂後細胞集団を有するために、遺伝子送達ベクターを研究するには理想的な器官である[Bainbridge JW et al. 2006 Gene Ther 13: 1191-1197]。細胞培養トランスフェクション技術、例えば、エレクトロポレーション[Bainbridge JW et al. 2006 Gene Ther 13: 1191-1197; Kachi S et al. 2005 Gene Ther 12: 843-851; Bejjani RA et al. 2007 Surv Ophthalmol  52: 196-208]、陽イオン性脂質[Kachi S et al. 2005 Gene Ther 12: 843-851; Brown MD et al. 2001 Int J Pharm 229: 1-21]、及びポリエチレンイミン等の合成高分子[Godbey WT et al. 2001  Biomaterials  22: 471-480; Bieber T et al. 2002 J Control Release 82: 441-454]は、インビボで眼に使用するために修飾され、幾つかの有用性の証拠を示しているが、これら技術は頻繁に有意な毒性をもたらす。
【００４６】
小さい正電荷を有するペプチドは、ＤＮＡに結合すること及びプラスミドを分解から保護することが示されてきた[Ziady AG et al. 2003 Mol Ther 8: 936-947; Thomas M et al. 2003 Appl Microbiol Biotechnol 62: 27-34]。ペグ化リジン３０−マー（ＣＫ３０ＰＥＧ)は、肺内の分裂細胞にゆっくりとトランスフェクトすることが初めに示され[Ziady AG et al. 2003 Mol Ther 8: 936-947]、その後、有糸分裂後の眼組織における有用性を証明した[Farjo R et al. 2006 PLoS ONE  1: e38]。その他の有望な戦略は、短い正電荷タンパク質の群（細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）として知られている）を用い、これは、原形質膜を横断可能であり、インビボとインビトロで生物学的活性分子を送達することが示されてきた[Lindgren M et al. 2000 Trends Pharmacol Sci  21: 99-103]。ＣＰＰ実験の結果は、これらがウイルスベクターの送達と比較して多数の利点を有していることを提示しており、調製の容易性、高速な取り込み、低い毒性及び免疫応答を含む[Jones SW et al. 2005 Br J Pharmacol 145: 1093-1102]。ＨＩＶのＴａｔは、ＤＮＡを凝縮して培養下の細胞まで送達することが知られているＣＰＰである[Ignatovich IA et al. 2003 J Biol Chem  278: 42625-42636]。しかしながら、インビボでＣＰＰ単独を用いて成功した遺伝子導入が可能であることを示す証拠は殆どなかった [Lindgren M et al. 2000 Trends Pharmacol Sci  21: 99-103]。
【００４７】
本明細書では、新規の合成カチオン性ペプチドが示され、ＰＯＤ又は「眼送達ペプチド（protein for ocular delivery）」として称され、原形質膜を透過すること及びＤＮＡとＲＮＡをインビトロで送達することが可能である[Johnson LN et al. 2008 Mol Ther 16: 107-114]。これらの結果は、ＰＯＤが小及び大分子をインビトロで送達することが可能であり、インビボにおけるＤＮＡ送達の理想的な候補となりうることを示す。
【００４８】
インビボにおける遺伝子送達には幾つかの妨げとなるものがある：細胞外空間における安定性、原形質膜を横断する輸送、エンドソームからの逃避、及び最後には、核孔を横断する移行である。この目的のために、ＰＯＤは、これら障害を効果的に克服することによるインビボにおける有糸分裂後細胞の核へのＤＮＡの送達能力が調査された。本明細書の実施例は、ペグＰＯＤ、ＴＡＴ、及びポリリシンが、細胞を、インビボでプラスミド単独よりも高いレベルでトランスフェクト可能であり、インビボで異なる有用性を示すよう出現することを示す。これら発見は、ペグ化細胞透過性ペプチドを新規の遺伝子送達ベクターとして使用することを強調する。
【００４９】
幾つかの最近の研究は、眼病を含む広範囲の疾患を正すための遺伝子治療の使用において有望である。これら研究の大半は、遺伝子送達のためのウイルスベクターを使用しており、網膜色素変性[Ali RR et al. 2000 Nat Genet 25: 306-310; Takahashi M et al. 1999 J Virol 73: 7812-7816; Bennett J 2000 Curr Opin Mol Ther  2: 420-425]、レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）[Acland GM et al. 2001 Nat Genet 2001; 28: 92-95; Le Meur G et al. 2007 Gene Ther 14: 292-303; Narfstrom K et al. 2003 Invest Ophthalmol Vis Sci  44: 1663-1672; Dejneka NS  et al. 2003 Adv Exp Med Biol 533: 415-422]、及び加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）［Reich SJ et al. 2003 Curr Opin Genet Dev  13: 317-322]等の広範囲な疾患にわたってマウスモデルの効果的なレスキューを示してきた。しかしながら、ウイルス適用の副作用は、挿入変異及び発癌性を含み[Baum C et al. 2006 Hum Gene Ther 17: 253-263]、同様に、炎症及び免疫原性を含み[Muruve DA 2004 Hum Gene Ther 15: 1157-1166; Reichel MB et al. 1998 Gene Ther  5: 1038-1046]、それら適用を制限する。その他の懸案事項は、例えばトランスジーンの大きさの制限[Verma IM et al. 1997 Nature 389: 239-242]、及び中和抗体の開発[Bennett J et al. 1999 Proc Natl Acad Sci USA  96: 9920-9925]であり、これもまた使用を制限するものである。
【００５０】
非ウイルスベクターの開発には実質的な関心が存在するが、従来の取り組みは、インビボでの効率性が欠けるために妨げられてきた。目は、多様な特徴の病気、区分化構造、及び有糸分裂後細胞集団を有するために、遺伝子送達ベクターを研究するには理想的な器官である[Bainbridge JW et al. 2006 Gene Ther 13: 1191-1197]。細胞培養トランスフェクション技術、例えば、エレクトロポレーション[Bainbridge JW et al. 2006 Gene Ther 13: 1191-1197; Kachi S et al. 2005 Gene Ther 12: 843-851; Bejjani RA et al. 2007 Surv Ophthalmol  52: 196-208]、陽イオン性脂質[Kachi S et al. 2005 Gene Ther 12: 843-851; Brown MD et al. 2001 Int J Pharm 229: 1-21]、及びポリエチレンイミン等の合成高分子[Godbey WT et al. 2001  Biomaterials  22: 471-480; Bieber T et al. 2002 J Control Release 82: 441-454]は、インビボで眼に使用するために修飾され、幾つかの有用性の証拠を示しているが、これら技術は頻繁に有意な毒性をもたらす。
【００５１】
小さい正電荷を有するペプチドは、ＤＮＡに結合すること及びプラスミドを分解から保護することが示されてきた[Ziady AG et al. 2003 Mol Ther 8: 936-947; Thomas M et al. 2003 Appl Microbiol Biotechnol 62: 27-34]。ペグ化リジン３０−マー（ＣＫ３０ＰＥＧ)は、肺内の分裂細胞にゆっくりとトランスフェクトすることが初めに示され[Ziady AG et al. 2003 Mol Ther 8: 936-947]、その後、有糸分裂後の眼組織における有用性を証明した[Farjo R et al. 2006 PLoS ONE  1: e38]。その他の有望な戦略は、短い正電荷タンパク質の群（細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）として知られている）を用い、これは、原形質膜を横断可能であり、インビボとインビトロで生物学的活性分子を送達することが示されてきた[Lindgren M et al. 2000 Trends Pharmacol Sci  21: 99-103]。ＣＰＰ実験の結果は、これらがウイルスベクターの送達と比較して多数の利点を有していることを提示しており、調製の容易性、高速な取り込み、低い毒性及び免疫応答を含む[Jones SW et al. 2005 Br J Pharmacol 145: 1093-1102]。ＨＩＶのＴａｔは、ＤＮＡを凝縮して培養下の細胞まで送達することが知られているＣＰＰである[Ignatovich IA et al. 2003 J Biol Chem  278: 42625-42636]。しかしながら、インビボでＣＰＰ単独を用いて成功した遺伝子導入が可能であることを示す証拠は殆どなかった [Lindgren M et al. 2000 Trends Pharmacol Sci  21: 99-103]。
【００５２】
本明細書では、新規の合成カチオン性ペプチドが示され、ＰＯＤ又は「眼送達ペプチド（protein for ocular delivery）」として称され、原形質膜を透過すること及びＤＮＡとＲＮＡをインビトロで送達することが可能である[Johnson LN et al. 2008 Mol Ther 16: 107-114]。これらの結果は、ＰＯＤが小及び大分子をインビトロで送達することが可能であり、インビボにおけるＤＮＡ送達の理想的な候補となりうることを示す。
【００５３】
インビボにおける遺伝子送達には幾つかの妨げとなるものががある：細胞外空間における安定性、原形質膜を横断する輸送、エンドソームからの逃避、及び最後には、核孔を横断する移行である。この目的のために、ＰＯＤは、これら障害を効果的に克服することによるインビボにおける有糸分裂後細胞の核へのＤＮＡの送達能力が調査された。本明細書の実施例は、ペグＰＯＤ、ＴＡＴ、及びポリリシンが、細胞を、インビボでプラスミド単独よりも高いレベルでトランスフェクト可能であり、インビボで異なる有用性を示すよう出現することを示す。これら発見は、ペグ化細胞透過性ペプチドを新規の遺伝子送達ベクターとして使用することを強調する。
【００５４】
本発明は、米国仮特許出願第６０／９６６，５９１号に続いて、「Cell Penetrating Peptide for Enhanced Delivery of Nucleic Acids, Drugs and Adenovirus to Ocular Tissues including Retina and Cornea」と題する論文（Leslie N. Johnson, Siobhan M. Cashman 及び Rajendra Kumar-Singh著、the journal Molecular Therapy, 2007, 116:107-114内）において部分的に出版された。追加的な実施例は、本明細書内と「Cell Penetrating Peptide POD Mediates Delivery of Recombinant Proteins to Retina, Cornea and Skin」と題する論文（これら著者によって２００８年にjournal Molecular Therapyに提出されたものであり、引用することによりその全体を本願に援用する）内に見つけられる。
【００５５】
当業者であれば理解できることではあるが、本発明のペプチドは、ペプチド・シンセサイザー、又は合成的に（例えば、固相法によって）製造されたカスタムペプチドの任意の商業用供給元から得ることができる。例えば、ペプチド合成は、各種の固相技術[Roberge et al. 995 Science 269:202]を用いて実施されることができ、自動合成は、例えば、製造業者によって供給された説明書に基づき、４３１Ａペプチド・シンセサイザー（Applied Biosystems of Foster City, カリフォルニア州、から入手可能）を用いて実現されることができる。
【００５６】
（医薬組成物）
本発明の一実施形態では、医薬組成物が提供され、これら組成物は、最適な標的分子に共有結合したペプチドを含み、任意で、薬学的に許容可能な担体を含む。特定の実施形態では、これらの組成物は、任意で、さらに１以上の追加的な治療薬を含む。特定の実施形態では、最適な標的物及び／又は追加的な治療薬は、成長因子、抗炎症薬、昇圧薬、コラゲナーゼ阻害剤、局所ステロイド、マトリクス・メタロプロテイナーゼ阻害剤、アスコルビン酸塩、アンジオテンシンＩＩ、アンジオテンシンＩＩＩ、カルレティキュリン、テトラサイクリン、フィブロネクチン、コラーゲン、トロンボスポンジン、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、Neu分化因子（ＮＤＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ビオチン等のビタミンＢ、及びヒアルロン酸からなる群から選択される。
【００５７】
本明細書で使用される際、用語「薬学的に許容可能な担体」は、任意及び全ての溶媒、希釈剤、又はその他の液体媒体（liquid vehicle）、分散又は懸濁補助剤、界面活性剤、
等張剤、増粘剤又は乳化剤、保存料、固体結合剤、滑剤、及び同等のものを含み、所望の特定の投与形態に好適なものである。「Remington's Pharmaceutical Sciences Ed. by Gennaro, Mack publishing, Easton, PA, 1995」は、医薬組成物を調製するのに使用される各種の異なる担体、及び調製に用いられる公知技術を記載する。薬学的に許容可能な担体の材料の幾つかの例は、グルコース及びスクロース等の糖；コーンスターチ及びジャガイモデンプン等のスターチ；セルロース及びその誘導体（カルボキシルメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、及び酢酸セルロース等）；トラガント粉末；麦芽；ゼラチン；タルク；ココアバター及び坐剤蝋(suppository wax)のような賦形剤；ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、及びダイズ油のような油類；プロピレングリコールのようなグリコール類；エチルオレエートおよびエチルラウレートのようなエステル類；アガー；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムのような緩衝剤；アルギン酸；パイロジェンを含まない水；等張生理食塩水；リンゲル液；エチルアルコール；及びリン酸緩衝溶液等を含み、さらに、ラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウム等のその他の非毒性適合潤剤を含み、さらに、着色剤、解除剤、コーティング剤、甘味料、香味料、香料、保存料、及び酸化防止剤も含まれるがこれらに限定されず、処方者の判断によって組成物に含まれることが可能である。
【００５８】
（治療的に効果的な用量）
その他の態様において、本発明の治療方法は、眼疾患の治療又はその他の器官又は組織に影響を与える疾患の治療を含み、例えば、本明細書に記載される医薬組成物を目に接触させることによって実施される。したがって、本発明は、これを必要とする被験体に、ペプチド共役物含有活性薬剤を含む医薬組成物を治療的に効果的な量、投与する工程を含む眼疾患の治療法を提供し、所望の結果を得るのに必要な量及び時間で実施される。これは、独創的な薬剤を治療手段として投与することにより角膜及び結膜面への涙液層の広がりを促進する、又は予防対策として投与することにより眼疾患に関連する合併症を最小限にすること（例えば、抗ヒスタミン剤を用いる炎症性疾患の手術中及び／又は手術後又は治療のための傷洗浄液として用いる）を包含することは理解できるはずである。本発明のある実施形態では、医薬組成物の「治療的に効果的な量」とは、疾患の治癒及び／又は改善を促進するのに効果的な量である。本発明の方法に基づき、組成物は、細胞、組織、又は器官を治療するのに効果的な任意の量及び任意の経路で投与されることができる。したがって、表現「疾患を治療するのに効果的な量」とは、本明細書で用いられる際、治癒を促進するとともに、細胞、組織、又は器官の生理機能を正常に戻すための組成物の効果的な量を意味する。正確な用量は、治療される患者を考慮して個別の医者によって選択される。用量及び投与は、十分なレベルの活性薬剤を提供可能となるように又は所望の効果を維持できるように調整される。考慮が可能な更なる要因は、病態の重症度、例えば、疾患内容、病歴；患者の年齢、体重、及び性別；摂取する食事、時間、及び頻度；薬物との組み合わせ；反応感度；及び治療への耐性／応答性である。長く作用する医薬組成物は、特定の組成物の半減期及びクリアランス速度に応じて、１日のうち数回の時間点、毎日、３−４日ごと、毎週、又は２週間に１回投与されることが可能である。
【００５９】
本発明の活性薬剤は、好ましくは、投与の容易性及び投与量の均一性のために、用量単位形態に調剤される。表現「用量単位形態」は、本明細書で使用される際、治療を受ける患者に適切である活性薬剤の物理的な不連続の単位を意味する。しかしながら、本発明の組成物の全体的な毎日の用量は、正常な医学的判断の範囲内で主治医によって決定されることになる。任意の活性薬剤において、治療的に効果的な用量は、初めは細胞培養試験下又は動物モデル（本明細書の実施例で示される如く、通常はマウス、ウサギ、イヌ、又はブタである）のいずれかにおいて推定されることができる。動物モデルは、所望の濃度範囲と投与経路を実現するためにも使用される。目への直接的適用が投与経路として想定されているが、その後、このような情報は、ヒトに投与するための有用な用量及び更なる経路を決定するために使用されることができる。治療的に効果的な用量とは、症状又は疾患を改善する活性薬剤の量を意味する。治療的な有効性及び毒性は、細胞培養下又は実験動物における標準的薬学的手法、例えば、ＥＤ５０（集団の５０％において治療的に効果的な量）及びＬＤ５０（集団の５０％において致死的である量）によって決定されることが可能である。治療効果への毒性の用量比は、治療指数であり、比率ＬＤ５０／ＥＤ５０として表されることができる。高い治療指数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養試験及び動物実験から得られたデータは、ヒトで使用されるための用量範囲を構築するのに用いられる。
【００６０】
（医薬組成物の投与）
所望の用量で適切な薬学的に許容可能な担体とともに調剤した後、本明細書の医薬組成物は、ヒト及びその他の哺乳類に、例えば経眼等局所的に投与される（例えば、粉末、軟膏、又は滴下によって）、即ち目に直接的に適用される。代替的な更なる経路は、治療される疾患の重症度に応じて、例えば、経口、直腸、非経口、嚢内、腟内、腹腔内、頬内、又は経鼻等が想定される。
【００６１】
経眼投与のための液体剤形は、緩衝剤及び可溶化剤、好ましい希釈剤（例えば水）、保存料（例えばチモソール（thymosol））、及び、溶液を調整するための１以上の生体高分子又は高分子（例えば、ポリエチレングリコール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒアルロン酸ナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、又はタマリンドガム）を含む。
【００６２】
経口投与のための液体剤形は、薬学的に許容可能なエマルション、マイクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップ剤、及びエリキシル剤を含むがこれらに限定されない。活性薬剤に追加して、液体用量形態は、技術的によく用いられる不活性希釈剤を含むことができ、例えば、水又はその他の溶媒、可溶化剤及び乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油類（特に、綿実、ナンキンマメ、コーン、胚芽、オリーブ、ヒマシ油、セサミオイル）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、ソルビタンの脂肪酸エステル、又はその混合物である。不活性希釈剤に加えて、経口組成物は、補助剤を含むこともでき、例えば、湿潤剤、乳化及び懸濁剤、甘味料、香味料、及び香料である。
【００６３】
本明細書の医薬組成物の局所又は経皮投与のための剤形は、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ジェル、粉末、溶液、スプレー、吸入、又はパッチを含む。活性薬剤は、滅菌条件下で薬学的に許容可能な担体と、必要に応じて保存料又は緩衝液と混合される。例えば、眼又は皮膚感染は、水性滴下物、噴霧、エマルション、又はクリームで治療されることができる。投与は、治療用又は予防用であることができる。予防のための製剤は、潜在的な外傷部分、又は外傷源、例えば、コンタクトレンズ、コンタクトレンズ洗浄及びすすぎ液、コンタクトレンズ保存又は輸送用の容器、コンタクトレンズを取り扱う機械、点眼薬、外科的洗浄溶液、点耳薬、眼帯、及び眼領域の化粧品（クリーム、ローション、マスカラ、アイライナー、及びアイシャドウ等）、そして眼科装置、外科装置、聴覚装置、又は本明細書の組成物を含む製品（例えば、包帯ガーゼ又は帯状ガーゼ）、及びこれら装置又は製品を製造又は用いる方法に適用される。これらの装置は、本明細書の組成物で、コーティング、含浸、結合される、又はその他の方法で処理されることができる。
【００６４】
軟膏、ペースト、クリーム、及びジェルは、本発明の活性薬剤に加えて、賦形剤、例えば動物性及び植物性脂肪、油類、ワックス、パラフィン、スターチ、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルク、酸化亜鉛、又はその混合物を含むことができる。
【００６５】
粉末及びスプレーは、本発明の薬剤に加えて、賦形剤、例えば、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、ポリアミド粉末、又はこれら物質の混合物を含むことができる。スプレーは追加的に、クロロフルオロ炭化水素等の慣習的な噴霧剤を含むことができる。
【００６６】
経皮パッチは、身体への活性成分の送達の制御を提供するという追加的な利点を有する。このような剤形は、化合物を好適な媒体に溶解させる又は分散させることによって作製可能である。吸収促進薬は、皮膚にわたる化合物の流動を増加させるのに使用されることができる。速度は、速度制御膜を提供するか、化合物をポリマーマトリックスもしくはゲルに分散させるかのいずれかによって制御可能である。
【００６７】
注射用製剤、例えば無菌の注射可能な水性又は油性懸濁液は、従来技術に基づき、好適な分散又は湿潤剤、及び懸濁液を用いて製剤可能である。無菌の注射可能な製剤は、非毒性の非経口で許容可能な希釈剤又は溶媒中における、無菌の注射可能な溶液、懸濁液、又はエマルションであることができ、例えば、１，３−ブタンジオールにおける溶液であることができる。許容可能な賦形剤及び溶媒において、使用可能であるものは、水、リンゲル液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．及び生理食塩水である。さらに、無菌の固定油類は、従来から溶媒又は懸濁媒体として用いられている。この目的において、任意の無菌固定油が使用可能であり、合成モノ又はジグリセリドを含む。さらに、脂肪酸、例えばオレイン酸が、注射可能な物質の調製に使用される。注射可能な製剤は、例えば、細菌保持フィルタを通る濾過によって、あるいは、使用前に、滅菌水又はその他の無菌注射可能媒体に溶解又は分散可能な無菌固体組成物形態において滅菌剤を加えることによって、無菌化することが可能である。活性薬剤のインビボの効果を長引かせるために、皮下注射又は筋肉内注射から薬剤の吸収を遅くすることが大抵の場合望ましい。非経口で投与された活性薬剤の遅延吸収は、薬剤を油媒体に溶解又は懸濁することによって実現できる可能性がある。注射可能なデポー形態は、薬物のマイクロカプセルマトリックスを、例えばポリ乳酸−ポリグリコリド等の生分解性高分子に形成することによって作られる。高分子への活性薬剤の比率と、使用される特定の高分子の特質に応じて、活性薬剤の放出速度が制御可能となる。その他の生分解性高分子の例は、ポリ（オルトエステル）及びポリ（無水物）である。デポー注射製剤もまた、体内組織と適合するリポソーム又はマイクロエマルション内に薬剤を取り込むことによって調製される。
【００６８】
直腸又は膣内投与のための組成物は、好ましくは、本明細書の組成物の活性薬剤を好適な非刺激賦形剤又は担体（例えばココアバター、ポリエチレングリコール、又は坐薬ワックス）と混合することによって調製されることができる坐薬であり、大気温度で固体であるが体内温度で液体となることによって直腸又は膣腔内で溶解し活性薬剤を放出する。
【００６９】
経口投与のための固体剤形は、カプセル、錠剤、ピル、粉末、及び顆粒を含む。このような固体剤形では、活性薬剤は少なくとも１つの不活性の薬学的に許容可能な賦形剤又は担体、たとえば、クエン酸ナトリウム又は第二リン酸カルシウムとともに混合される、及び／又は（ａ）スターチ、スクロース、グルコース、マンニトール、及びケイ酸等の充填剤又は増量剤、（ｂ）カルボキシメチルセルロース、アルギン酸、ゼラチン、ポリビニルピロリジノン、スクロース、及びアカシア等の結合剤、（ｃ）グリセロール等の保湿剤、（ｄ）アガー−アガー、炭酸カルシウム、ジャガイモ又はタピオカスターチ、アルギン酸、特定のケイ酸塩、及び炭酸ナトリウム等の崩壊剤、（ｅ）パラフィン等の溶液遅延剤、（ｆ）第４級アンモニウム化合物等の吸収促進剤、（ｇ）セチルアルコール及びグリセロールモノステアレート等の湿潤剤、（ｈ）カオリン及びベントナイト粘土等の吸収剤、及び（ｉ）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム等の潤滑剤、及びこれらの混合物と混合される。
【００７０】
類似の種類の固体組成物は、乳糖のような賦形剤とともに高分子量のポリエチレングリコール等を用いて、柔らかく又は硬く充填したゼラチンカプセル内の充填剤として使用することもできる。固体剤形である錠剤、糖衣錠、カプセル、ピル、及び顆粒は、コーティング及びシェル化、例えば、腸溶コーティング、放出制御コーティング、及び薬学的調製技術においてよく知られているその他のコーティングにより調製可能である。このような固体剤形において、活性薬剤は、スクロース又はスターチ等の少なくとも１つの非活性希釈剤とともに混合されることができる。このような剤形は、通常の慣行として、不活性希釈剤以外の追加的な物質を含むことができ、例えば、錠剤化滑剤及びその他の錠剤化補助剤、例えばステアリン酸マグネシウム及び微結晶性セルロース等である。カプセル、錠剤、及びピルの場合、剤形は、緩衝剤を含むこともできる。これらは、任意で、乳白剤を含むことができ、活性薬剤のみを放出する組成物となることもでき、又は優先的に腸管の特定の部分で、任意に遅延形態で放出することもできる。使用可能な包埋組成物は、重合物質及びワックスを含む。
【００７１】
＜実施例＞
以下の材料及び試薬は、本明細書に記載の実施例にわたって使用された。
（材料及び試薬）
ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヨウ化プロピジウムは、Sigmaから購入された。GFP Duplex Iは、Dharmacon (ラフィーエット、コロラド州)から購入され、pd2-EGFPNIはClontech (マウンテンビュー、カリフォルニア州)から購入された。ＧＧＧ（ＡＲＫＫＡＡＫＡ）４を備えるＮ末端共役ペプチド（リサミン、ビオチン、システイン）は、Sigma Genosys (ウッドランド、テキサス州)を用いて、カスタム合成及びＨＰＬＣ精製された。Ｎ末端ＦＩＴＣ共役ＧＧＧ（ＡＲＫＫＡＡＫＡ）４は、University of Utah peptide facilityによって合成された。全てのその他の市販材料及び試薬（Qdot655ストレプトアビジン共役物を含む）は、特に記載がない限り、Invitrogen（カールズバッド、カリフォルニア州）から購入された。
【００７２】
（ＰＯＤの細胞透過特性）
他に特に記載されない限り、全ての実験は、少なくとも３つ組で２回実施された。ＨＥＲ細胞をLab Tek-IIチャンバーのスライド上に蒔き、〜７０％コンフルエンスまで成長させた。細胞はＰＢＳで２回洗浄され、１ｎモルのＬ−ＰＯＤで０、５、１５、３０、４５、及び６０分、又は１ｎモルのリサミンのみを用いて６０分間培養した。細胞は、室温で１５分間ホルマリン固定された。生存下で撮像するための細胞は、２４ウェルプレート上で成長させ、２ｎモルのＬ−ＰＯＤを用いて培養された。培養後、細胞は、ＰＢＳで３回洗浄され、２％のＦＢＳが補充されたフェノールレッドを含まないＤＭＥＭ内で培養された。細胞は、ＤＩＣ、ＲＦＰ、及びＧＦＰフィルタとともに、Olympus IX51（生細胞）又はOlympus BX51（固定細胞）のいずれかを用いた光及び蛍光顕微鏡法によって視覚化された。画像は、Retiga 2000R FASTカメラ及びQCapture Pro 5.0 (QImaging、ブリティッシュコロンビア州、カナダ)を用いて得られた。トリプシン存在下のＬ−ＰＯＤ取り込みを測定するために、０．２×１０６ＨＥＲ細胞は、２．０ｎモルのＬ−ＰＯＤとともに培地中で１５分間３７℃で培養され、その後、２．５ｍｇ／ｍｌのトリプシン内で１２分間３７℃で培養された。４℃における取り込みを分析するために、ペプチド追加の前に細胞が４℃まで４５分間冷却され、低温（４℃）試薬がペプチド投与のために使用された。ペプチドとともに培養した後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＦＡＣＳ分析のためのＰＢＳ内で回転させ、再懸濁させた。膜透過性の測定のために、ＨＥＲ細胞は２．０ｎモルのＦＩＴＣ−ＨＢＰを用いて３７℃で３０分間培養され、２回洗浄され、単離され、及び１μＭのＰＩを含むＰＢＳ内で懸濁された。ＰＩ−陽性細胞の数は、ＦＡＣＳによって分析された。ＦＡＣＳ分析はFACSCalibur (Becton Dickinson)を用いて実施された。実験は３つ組で実施され、サンプルごとに１００００事象が数えられた。結果は、CellQuest Pro software (Becton Dickinson)を用いて分析された。
【００７３】
（インビトロにおけるｓｉＲＮＡ、ＤＮＡ、及び量子ドットのＰＯＤ媒介性送達）
ｐＣＡＧＲＦＰは、４００ペプチド／プラスミド分子の比率でＣ−ＰＯＤを用いて凝縮された。簡潔に、２〜ｇのＤＮＡ及び好適な濃度のペプチドがそれぞれ、１００μＭリン酸ナトリウム又は５％デキストロース緩衝液のどちらかの１５〜Ｌに懸濁された。ペプチド及びＤＮＡ溶液は、ＨＥＲ細胞を添加する前に、混合され３０分間室温で培養された。４８時間後、細胞は、ＦＡＣＳ分析のためにＰＢＳ内で再懸濁された。電子顕微鏡法のために、ペプチド／ＤＮＡ複合体は、上述の如く調製された。粒子は、グロー放電銅グリッドに結合され、酢酸ウラニルで染色され、Digital Micrograph software（Gatan, Inc）を用いてＣＭＩＯ透過型電子顕微鏡（Philips）上で視覚化された。Ｃ−ＰＯＤは、ｐｄ２−ＥＧＦＰ−ＮＩ及びＧＦＰ ＤｕｐｌｅｘＩの両方を、１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液において４５０粒子／ＤＮＡ分子及び２５粒子／二本鎖分子の夫々の濃度で凝集するために使用され、上述で記載されたものと同じ手順が用いられた。ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ内に希釈された２μｇの凝縮ｐｄ２−ＥＧＦＰ−ＮＩ ＤＮＡ及び７０ｐモルのＧＦＰＤｕｐｌｅｘ Ｉが、同時に４時間ＨＥＲ細胞に追加された。その後、細胞に生育培地が加えられ、さらに４４時間培養が続けられた。細胞は、上述の如く、単離され、ＰＢＳ内でＦＡＣＳ分析のために再懸濁された。量子ドットの送達のために、５０ｐモルのＱｄｏｔ６５５ストレプトアビジン共役物(Invitrogen、カールズバッド、カリフォルニア州)が、５ｎモルのＰＢＳ中のビオチン共役ＰＯＤ(Ｂ−ＰＯＤ)に加えられ、室温で穏やかに揺動することにより１時間混合した。Ｑｄｏｔ（量子ドット）−ペプチド複合体(ＱＤＰＯＤ)は、５０Ｋ Ultrafree(Millipore)カラムを用いてＰＢＳ内で透析され、１５分間又は２時間のいずれかの間、０．２×１０６ＨＥＲ細胞に加えられた。Ｑｄｏｔ−ペプチド複合体から得られる蛍光量は、蛍光光度計を用いて決定され、当量の非結合Ｓｔｒｅｐ−Ｑｄｏｔが対照とは別に加えられた。細胞は、３回ＰＢＳで洗浄され、上述の如く固定され、ＤＡＰＩで染色された。Ｑｄｏｔの取り込みは、上述の如く蛍光顕微鏡法によって決定された。
【００７４】
（プロテオグリカンによるＰＯＤの取り込みの阻害及びＰＯＤ関連殺菌作用）
リサミン共役ＰＯＤ（Ｌ−ＰＯＤ）、及びヘパラン硫酸又はコンドロイタン硫酸のいずれかは、モル比１：３．３３、１：６．６７、及び１：８でともに、水中において室温で３０分間培養された。複合体は、ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳに希釈され、０．２×１０６ＨＥＲ細胞に５分間３７℃で添加された。培養後、細胞はトリプシン処理され、ＰＢＳ内で懸濁され、上述の如くＦＡＣＳ分析に用いられた。Ｃ−ＰＯＤの殺菌作用を測定するために、ＸＬ−Ｉ ブルー細胞（Stratagene、ラ・ホーヤ、カリフォルニア州）が中対数期（ＯＤ６００＝０．６００）まで成長し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）及び５ｍＭグルコースの溶液で２回洗浄された。細胞は、１０ｍＬの同じ溶液に再懸濁され、５ｍｌの懸濁液はＣ−ＰＯＤとともに培養され、最終的な量は５０μＬであった。ペプチド／細菌細胞溶液は、３７℃で２時間揺動された。ペプチド処理された細菌は、ＬＢ培地で１：４５００に希釈され、寒天上にプレーティングされ、３７℃で一晩成長させた。次の日、各プレート上の細菌のコロニーは、成長におけるペプチド関連減少を定量化するために数えられた。
【００７５】
（インビボにおける眼組織への分子のＰＯＤ媒介性送達）
本研究における動物の使用は、「ARVO Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research」に基づくものである。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、Jackson Laboratoriesから購入され、１２時間の明暗サイクルで飼育及び維持され、連邦政府、州、及び地方条例に基づき世話された。各実験では少なくとも４匹のマウス（８つの目）が検査され、大体類似の結果が得られた。マウスは、キシラジン（１０ｍｇ／ｍｌ）／ケタミン（１ｍｇ／ｍｌ）の硝子体内注射によって麻酔された。網膜下又は硝子体内注入は、５μｌのガラス注射筒(Hamilton)に取り付けられた３２Ｇニードルを用いて、経強膜経脈絡膜法によって実施され、０．２５ｎモルのＬ−ＰＯＤを各目に送達した。角膜への局所的送達のために、６週齢のオスＣ５７ＢＬ６／６Ｊマウスが、ケタミン／キシラジンの腹腔内注射によって麻酔され、１０ｎモルのＬ−ＰＯＤ又はリサミンのみのいずれかが角膜上に滴下され、４５分間又は２４時間培養された。治療完了時、動物はＣＯ２吸入後頸椎脱臼によって犠牲となり、目が摘出され、ＰＢＳで３回洗浄された。蛍光性及び明視野画像は、固定前に、Nikon C-FMC顕微鏡を用いて夫々の目に対して撮影された。目は４℃で４％パラホルムアルデヒドにおいて一晩固定され、最適切削温度化合物（Optimal Cutting Temperature Compound）に埋め込まれ、１４μｍの切片がMicrom 550クリオスタットを用いて採集された。
【００７６】
（アデノウイルスコンストラクト及びグリコサミノグリカン阻害）
コンストラクトＡｄ５ｐＩＸＰＯＤ及びＡｄ５ｐＩＸＰＯＤΔＲＧＤが、ｐシャトルの修飾によって２工程で生成され[He et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95: 2509-2514]、これにより停止コドンは合成オリゴヌクレオチドによって置き換えられた:
5’CGCCAAGCTTGCTCGTAAGAAGGCTGCTAAGGCTGCCCGCAAGAAGGCCGCCAAGGCCGCACGAAAGAAGGCAGCGAAGGCGTGAGC 3’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）, 及び
5’GGCCGCTCACGCCTTCGCTGCCTTCTTTCGTGCGGCCTTGGCGGCCTTCTTGCGGGCAGCCTTAGCAGCCTTCTTACGAGCAAGCTT GG 3’, （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）。
この結果、ｐＩＸ−ＰＯＤ融合が生じた。これらの組換えシャトルプラスミドは、pAdEasy-1[He et al. 1998 Proc Natl Acad Sci USA 95: 2509-2514]、又はペントン塩基のＲＧＦ領域に欠損を含むpAdEasy−1のいずれかを用いて組換えされた。結果として得られるウイルスは、Adenopure kit (Puresyn, Inc、モルヴァン、ペンシルベニア州)を用いて精製された。上記ウイルスに対するプロテオグリカンの影響を測定するために、ウイルスは、Ｃｈａｎｇ Ｃ又は９１１細胞を添加する前に、ヘパラン硫酸又はコンドロイタン硫酸のいずれかで培養された。ＡｄＣＡＧＧＦＰ、Ａｄ５ｐＩＸＰＯＤ又はＡｄ５ｐＩＸＰＯＤΔＲＧＤの各１×１０８粒子の全ては、１６ｎモルのヘパラン硫酸又はコンドロイタン硫酸のいずれかと３０分間室温で培養された。ウイルス−ペプチド混合物は、実験培地中の細胞に加えられ、最終的な感染多重度(moi)は５００であった。感染４８時間後、細胞は、ＰＢＳ内で単離及び再懸濁され、ＦＡＣＳ分析に用いられた。
【００７７】
（細胞培養及びトランスフェクション）
ヒト胚性網膜芽細胞（ＨＥＲ）細胞は、以前に開示された方法を用いて培養された[Fallaux FJ et al. 1996  Hum.Gene Ther. 7: 215-222]。癌性ヒト肺胞基底上皮細胞(A549、American Type Culture Collection、マナッサス、ヴァージニア州)は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）が補充されたＤＭＥＭ培地で７０−８０％コンフルエンスまで成長させた。全ての実験細胞培養手順は、２％ＦＢＳが補充されたＤＭＥＭにおいて実施された。プラスミドのトランスフェクションは、２：１のμｌリポフェクタミン：μｇプラスミド（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地中）を用いて実施された。トランスフェクション４８時間後、細胞が固定され、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色された。
【００７８】
（プラスミド及びアデノウイルスの構築）
ＰＯＤタンパク質導入をコードするオリゴヌクレオチドＰＯＤ−上流及びＰＯＤ−下流は、ＳａｃＩ／ＥｃｏＲＩ消化型ｐＱＢＩ２５ｆＡ１(Qbiogene、カールスバッド、カリフォルニア州)にクローンされることにより、ｐＰＯＤＧＦＰを産生した。ｐＰＯＤＧＦＰＨｉｓ及びｐＧＦＰＨｉｓは、オリゴヌクレオチドＨｉｓ上流及びＨｉｓ下流をＣｌａＩ／ＭｌｕＩ消化型ｐＰＯＤＧＦＰ及びｐＱＢＩ２５ｆＡ１に夫々、本明細書に示される如く挿入することによってクローンされた。ｐＰＯＤＧＦＰＨｉｓ及びｐＧＦＰＨｉｓは、ＢｇｌＩＩ及びＸｍｎＩを用いて消化され、ＢｇｌＩＩ／ＥｃｏＲＶ消化型ｐシャトルでライゲーションされた。対応するｐシャトルプラスミドは、ＰｍｅＩで線形化され、ゲル精製され、E.coli ＢＪ５１８３細胞内へpAdEasy−1でコトランスフェクトされた。組換えプラスミドは、ＰａｃＩで消化され、ＨＥＲ細胞内にトランスフェクトされた。ＡｄＰＯＤＧＦＰＨｉｓ及びＡｄＧＦＰＨｉｓは、ウイルス精製キット(Puresyn、マルヴァーン、ペンシルベニア州)を用いて単離された。
【００７９】
2010537632.tif 000003
【００８０】
太字で示された配列は、ＰＯＤ及びＨｉｓタグ特異的である。
【００８１】
（タンパク質の単離及び精製）
ＨＥＲ細胞は、ＡｄＰＯＤＧＦＰＨｉｓ又はＡｄＧＦＰＨｉｓのどちらかを用いて、２００ウイルス粒子／細胞の感染多重度（ＭＯＩ：multiplicity of infection）において感染された。細胞は、蛍光顕微鏡で判断した時に９０％を超える細胞がＧＦＰ陽性である時に採取され、これは、感染後約９６時間の時点で生じた。細胞質及び核は、NuCLEAR Extraction Kit (Sigma、セントルイス、ミズーリ州)を用いて、タンパク質精製のために単離及び溶解された。融合タンパク質は、Ｈｉｓ-セレクトキット(Sigma)及び２５０ｍＭのイミダゾールを用いて、製造業者の取扱説明書に基づき単離された。最終タンパク質溶出液は、１０Ｋ Ultrafreeカラム（Millipore、ビルリカ、マサチューセッツ州）を用いて、ＰＢＳ内で透析された。タンパク質濃度は、Bradfordアッセイ(Bio-Rad、エルキュール、カリフォルニア州)を用いて測定された。タンパク質調製においてウイルス汚染の可能性を排除するために、融合タンパク質は、７０℃で５分間加熱されることにより全ての残余ウイルスを不活性化し、ＨＥＲ細胞内の細胞変性効果が試験された。
【００８２】
（ＰＯＤＧＦＰＨｉｓの細胞取り込み及び局在化）
ＰＯＤ融合タンパク質の細胞透過性を評価するために、ＨＥＲ細胞をＬａｂ Ｔｅｋ−ＩＩチャンバーのスライド上に蒔き、１０μｇのＰＯＤ−ＧＦＰ又はＧＦＰとともに２時間培養した。固定後、細胞は、光及び蛍光顕微鏡を用いて視覚化され、これには、微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）を備えるOlympus BX51顕微鏡及び好適な蛍光フィルタが用いられた。画像は、Retiga 2000R FASTカメラ及びQCapture Pro 5.0(QImaging、ブリティッシュコロンビア州、カナダ)を用いて撮像された。タンパク質の取り込みを定量化するために、０．２×１０６のＨＥＲ又はＡ５４９細胞のいずれかが、１０μｇのＰＯＤ−ＧＦＰ又はＧＦＰとともに２時間培養された。細胞は、ＰＢＳとともに洗浄され、ＰＢＳ内でペレット化及び再懸濁され、ＦＡＣＳ分析に用いられた。細胞膜の完全性は、融合タンパク質の存在下で、ヨウ化プロピジウム(１μＭ)陽性細胞の割合を測定することによって評価された。タンパク質の取り込み及び毒性のＦＡＣＳ分析が、FACSCAlibur (Becton Dickinson、フランクリンレークス、ニュージャージー州)を用いて実施され、結果がCellQuest Pro (Becton Dickinson)を用いて分析された。１０，０００の事象が各実験で数えられ、これは、３つ組で繰り返して実施された。
【００８３】
ＨＥＲ及びＡ５４９細胞は、次に続くリソトラッカー、ＥＲトラッカー(Molecular Probes、カールスバッド、カリフォルニア州)、又はＤＡＰＩの追加のために、上述の如く処理され、１時間培養された。これら試薬は除去され、細胞は撮像のためにホルマリン固定された。
【００８４】
（銀染色及びウエスタンブロット法）
タンパク質分析のために、１μｇのＰＯＤ−ＧＦＰ及び２５０ｎｇの組換えＧＦＰが１２％のＴｒｉｓ−ＨＣｌゲル(Bio-Rad)にロードされた。銀染色は、Silver Stain Plus Kit (BioRad、ハーキュリーズ、カリフォルニア州)を用いて実施された。ウエスタンブロット法のために、タンパク質はＰＶＤＦ膜に移動され、抗ＡＦＰ ５００１ １１Ｅ５モノクローナル抗体(MP Biomedicals、ソロン、オハイオ州)及びＨＲＰ共役ヤギ抗マウス二次抗体を用いて、ＧＦＰ発現がプローブされた。信号は、SuperSignal West Pico化学発光基質(Pierce、ロックフォード、イリノイ州)を用いて検出された。
【００８５】
（インビボにおける眼組織へのＰＯＤ−ＧＦＨｉｓの送達）
本研究における動物の使用は、「ARVO Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research」に基づくものである。融合タンパク質の網膜下及び硝子体内注入は、Cashman et al. 2006 Invest Opthalmol Vis Sci 47:3496-3504に記載の技術を用いて実施された。簡潔に述べると、８．５μｇのＰＯＤ−ＧＦＰ又は６．６μｇのＧＦＰタンパク質は、６−８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの網膜下腔又は硝子体腔に夫々注入された。４つの独立した注入が実施され、略同一の結果が得られた。注入６時間後、マウスはＣＯ２吸入及び頸椎脱臼によって犠牲となった。ＰＯＤ−ＧＦＰＨｉｓ又はＧＦＰ−Ｈｉｓの局所的送達のために、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスがキシラジン／ケタミンで麻酔され、４０μｇのタンパク質を含む２μｌが角膜表面に滴下された。投与４５分後、マウスは上述の如く犠牲となり、目が摘出され、ＰＢＳで２回洗浄され、４％パラホルムアルデヒドで一晩固定された。目は最適切削温度化合物(Sakura Finetek、トランス、カリフォルニア州)に埋め込まれ、１４μｍの切片がMicrom550クリオスタットを用いて採集された。
【００８６】
（経皮塗布）
成体マウスは、上述の如く麻酔され、皮膚の２．２５ｃｍ２の領域を出すように腹部が剃られた。４０μｇ用量のタンパク質が皮膚に２４時間塗布された。治療完了時、動物は犠牲となり、治療された皮膚は解離され、４％のパラホルムアルデヒドで一晩固定され、横断面が本明細書に記載される如く得られた。
【００８７】
（プラスミド、ペプチド、及び細胞株）
ｐＣＡＧＬｕｃは、ｐＧＬ３-コントロール(Promega)からのルシフェラーゼｃＤＮＡをｐブルースクリプトＩＩ ＫＳ(Stratagene)へと、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩを用いて移すことによってクローンされた。このプラスミドのＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ断片は、ｐＣＡＧＥＮ（親切にもC. Cepkoから提供された）へと挿入された。
【００８８】
ｐＣＭＶｂのＳｍａＩ／ＮｏｔＩ断片(Clontech)は、ｐＣＡＧＬａｃＺを産生するためにＥｃｏＲＶ／ＮｏｔＩ消化型ｐＣＡＧＥＮへとクローンされた。プラスミドｐＣＡＧＧＦＰは、寛大にもC. Cepkoから提供された。Ｃｐｏｄ, CＧＧＧ（ＡＲＫＫＡＡＫＡ）４は、タフツユニバーシティ・ペプチドシンセシス・コアファシリティにおいて生成され、ＨＰＬＣによって精製された。肺上皮Ａ５４９細胞(ATCC)及びヒト胚性網膜芽細胞(ＨＥＲ; Fallaux et al 1996)の両方が、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ; Invitrogen）が補充されたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）内で成長した。
【００８９】
（ＰＯＤ／ＤＮＡ複合体のインビボ送達）
動物に関与する実験は、「Association for Research in Vision and Ophthalmology」によって立案された「Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research」に基づき実施された。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ及びＢＡＬＢ／ＣＪマウスは、Jackson Laboratoriesから購入され、連邦政府、州、及び地方条例に基づき、１２時間の明暗サイクルで維持された。マウスは、キシラジン（１０ｍｇ／ｍｌ）／ケタミン（１ｍｇ／ｍｌ）の腹腔内注射によって麻酔された。網膜下注入は、３２Ｇニードル(Becton Dickinson)及び５μｌのガラス注射筒(Hamilton)を用いて、経強膜経脈絡膜法によって実施された。動物はＣＯ２吸入後、頸椎脱臼によって犠牲となった。
【００９０】
（ｃＰＯＤ／ＤＮＡ凝縮：インビトロ及びインビボ送達）
ｐＣＡＧＧＦＰ又はｐＣＡＧＬｕｃは、前に記載される如く[Johnson L et al. 2007 Mol Therapy 16: 107-114]、ｃＰＯＤを用いて凝縮された。簡潔に述べると、１．８ｎモルのｃＰＯＤは、２μｇのＤＮＡ(窒素:リン酸 (Ｎ／Ｐ)比率が８．６)をリン酸ナトリウム（１００ｍモル／ｌ）中で凝縮するために使用され、２×１０５のＡ５４９細胞の培地に加えられた。血清飢餓条件において、細胞は、トランスフェクション前に、血清を含まないＤＭＥＭとともに２４時間培養された。４８時間後、細胞は、ＧＦＰのＦＡＣＳ分析のために、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）内で再懸濁された、又は製造業者のプロトコル(Promega)に基づきルシフェラーゼアッセイ用に調製された。生細胞は、光及び蛍光顕微鏡を用いて視覚化され、これには、微分干渉コントラストを備えるOlympus IX51及び好適な蛍光フィルタが用いられた。画像は、Retiga 2000R FASTカメラ及びQCapture Pro 5.0(QImaging、ブリティッシュコロンビア州、カナダ)を用いて撮像された。ＦＡＣＳ分析は、FACSCalibur (Becton Dickinson)を用いて実施され、CellQuest Pro software (Becton Dickinson)を用いて分析された。実験は、３つ組みで実施され、１５，０００の事象がサンプルごとに記録された。外植片及びインビボ注入において使用するために、ｃＰＯＤ／ＤＮＡ複合体が上述の如く、４．３及び８．６のＮ：Ｐ比率で調製された。外植片は、６−８週齢のＣ５７野生型マウスから、前房の摘出及び除去を行うことによって調製された。網膜及びＲＰＥ／強膜は、分離され、平板化され、１０％ＦＢＳと１００Ｕ／ｍＬのPen-Strepとともに５００μｌの５％ＣＯ２平衡ＤＭＥＭ上に置かれた。２μｇの凝縮ｐＣＡＧＬｕｃ又はプラスミド単独が、外植片に加えられ、４８時間培養された（４．３Ｎ：Ｐ比率、ｎ＝８、８．６Ｎ：Ｐ比率、ｎ＝３）。インビボの注入には、０．２μｇの凝縮ＤＮＡ又は裸のＤＮＡが網膜下に注入された（全ての条件でｎ＝４）。目は４８時間後に摘出され、前房が除去された。外植片及びインビボ注入両方において、組織はVWR PowerMax AHS 200ホモジナイザーを用いて、均質化緩衝液(５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ)内で均質化され、Glomax 20/20ルミノメーター(Promega)を用いて、製造業者(Promega)のプロトコルに基づき、ルシフェラーゼ発現が分析された。タンパク質濃度は、Quick Start Bradford Protein Assay (Bio-Rad)を用い、対応する緩衝液におけるウシ血清アルブミン(Bio-Rad)標準と比較して測定された。
【００９１】
（ペグ化ｃＰＯＤ、ＴＡＴ、及びＣＫ３０ナノ粒子の調製及び特性）
ペグ化するために、ペプチドは、０．１Ｍリン酸ナトリウム(ｐＨ７．２)内で再懸濁され、５ｍＭのＥＤＴＡを用いて２０ｍｇ／ｍｌ溶液とした。メトキシ−ＰＥＧマレイミドの等モル量−１０ｋＤ(Nektar Transforming Therapeutics)が同等量のＤＭＳＯに再懸濁された。ＰＥＧは、液滴でペプチドに〜１０分間加えられ、滴下間はボルテックスした。溶液は室温で一晩振盪され、Bio-gel P6カラム(Bio-Rad)を用いて、ＰＯＤとＴＡＴ用の０．１％トリフルオロ酢酸内、及びＣＫ３０用の５０ｍＭ酢酸アンモニウム内に透析された[Ziady AG et al. 2003 Mol Ther 8: 936-947]。ペグ化ＰＯＤ（ＰＥＧ−ＰＯＤ）は、ｃＰＯＤ標準曲線を用いて、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌゲル(Bio-Rad)のクマシー染色によって定量化された。ＣＫ３０及びＴＡＴの両方がクマシー染色の検出可能な範囲内ではないため、タンパク質濃度は、非ペグ化ペプチドを用いることにより標準曲線を作り出すBCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific)を使用して実施された。ＤＮＡは、プラスミドを最終濃度が０．２μｇ／ｍｇとなるまで水に希釈することによって凝縮され、ＰＥＧ−ＰＯＤ又はＰＥＧ−ＴＡＴ(最終比率１．８ｎモルペプチド:２μｇＤＮＡ)に液滴として加え、ボルテックスして混合した。ナノ粒子は、５％デキストロースにおいてBiomax 1０Ｋ遠心ろ過機(Millipore)を用いて３回透析され、４℃で保存された。ＰＥＧ−ＣＫ３０粒子は、以前に記載されたプロトコル[Ziady AG et al. 2003 Mol Ther 8: 936-947; Liu G et al. 2003 J Biol Chem 278: 32578-32586]に従い凝縮された。しかしながら簡潔に述べると、０．９ｍＬのＤＮＡ（２００μｇ／ｍｌ）が、０．１ｍｌの７．１ｍｇ／ｍｌのＰＥＧ−ＣＫ３０に、０．１ｍｌのアリコートで〜２分間かけて２５℃で加えられた。凝縮されたＤＮＡは、０．９％フィルタ済ＮＡＣｌ内、４℃で一晩透析され(Tube-O-Dialyzer, G-Biosciences、セントルイス、ミズーリ州)、遠心分離(Ultrafree, Millipore、NMWL 100kD)によって濃縮された。各ペプチドのプラスミド凝縮は、１％アガロースゲル(Invitrogen)を通して流動性を低下させることによって確かめられ、これは、０．２５％トリプシン(Invitrogen)を用いて３７℃で１５分間培養した後に緩和された。ＰＥＧ−ＰＯＤ粒子は、グロー放電フォームバー（Formvar）銅グリッド(Electron Microscopy Sciences)上で培養されることによって分析され、０．４％酢酸ウラニルで染色され、Digital Micrograph software(Gatan、プレザントン、カリフォルニア州)を用いてＣＭ１Ｏ透過型電子顕微鏡（FEI、ヒルズバロ、オレゴン州）上で視覚化された。ＰＥＧ−ＰＯＤ粒子及び対照サンプルは、０．２ｍｇ／ｍｌまで希釈され、BIC BI-200 SM リサーチ・ゴニオメーター、及びレーザー光散乱システム(Brookhaven Instruments Corporation、ホルツビル、ニューヨーク州)を用い、５３２ｎｍのレーザー光を使用して２５℃で分析した。データは、各サンプルに対し５分間で集められ、平均粒径は、製造業者によって供給されたソフトウェアを用いた二次フィットによって決定された。
【００９２】
（インビトロ及びインビボにおける凝縮ＤＮＡの局在化）
ローダミン標識ＤＮＡ(pGeneGrip、Gene Therapy Systems)は、上述の如く、ｃＰＯＤ又はＰＥＧ−ＰＯＤのいずれかで凝縮された。凝縮物はＨＥＲ細胞に加えられ、血清を含まないＤＭＥＭにおけるLab Tek-IIチャンバースライド上に〜８０％コンフルエンシー（集密度）まで成長させ、最終濃度０．６６μｇ／ｍｌとし、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間培養させた（各条件に対し、ｎ＝４）。細胞は、１５分間室温で４％ホルマリン固定された。インビボの局在化のために、０．１μｇの凝縮プラスミドが、６−８週齢のＣ５７マウスの網膜下に注入され、２時間後に採取され、４％パラホルムアルデヒドで一晩固定された。目は、脱水され、最適切削温度化合物（Sakura）に埋め込まれ、１４μｍの切片がMicrom 550クリオスタットを用いて採集された。撮像は、上述の如く、Olympus BX51顕微鏡を用いて実施された（各条件に対し、ｎ＝４）。
【００９３】
（インビボにおけるＰＥＧ−ペプチド／ＤＮＡナノ粒子トランスフェクション）
網膜下注入が上述の如く実施され、ルシフェラーゼ活性がｃＰＯＤ凝縮に関して分析された。全ての注入は、２μｌ全量で実施された。非注入、ＤＮＡのみ（DNA only）、及び０．６μｇＰＯＤはｎ＝４であり、１．２μｇＰＯＤはｎ＝８であり、１．２μｇＴＡＴ及びＣＫ３０はｎ＝６であった。尾静脈注射について、凝縮又は裸のＤＮＡが全量２００μｌで、０．０１％のファーストグリーン(Fisher)とともに注入され、これには、２５Ｇニードル(Becton Dickinson)が使用された。非注入はｎ＝２、４０μｇの裸のＤＮＡはｎ＝６、１０μｇのＰＥＧ−ＰＯＤ〜Ｌｕｃはｎ＝３、４０μｇのＰＥＧ−ＰＯＤ〜Ｌｕｃはｎ＝４である。注入４８時間後、マウスはＣＯ２を用いて犠牲とされ、８００μｌのＰＢＳで左室を通ってかん流された。器官は摘出され、５００μｌのLuciferase Cell Culture Lysis Reagent (Promega)に、２０μｌ／ｍｌのプロテアーゼ阻害剤カクテル(Sigma)とともに置かれ、２０秒間均質化された。均質化は、４℃で１０分間、１２，０００×ｇで遠心分離され、製造業者の取扱説明書(Promega)に基づきルシフェラーゼ活性が分析され、上述の如くタンパク質濃度が分析された。ルミノメーター用の標準曲線値は、QuntiLum Recombinant Luciferase (Promega)を用いて決定された。相対的な光強度値（ＲＬＵ）からｐｇへの転換は以下の如く計算された：ルシフェラーゼ（ｐｇ）＝（３．６９６×１０−５×ＲＬＵ）−０．０８１５（Ｒ２＝０．９９９９）。β−ガラクトシダーゼ発現において、１．２μｇの凝縮又は裸のｐＣＡＧＬａｃＺのいずれかがＢＡＬＢ／ＣＪマウスに網膜下に注入された。４８時間後、目は摘出され、０．２５％グルタルアルデヒドで３０分間固定された。目は、X-Gal Working Solution (ジメチルホルムアミドにおける０．７５ｍＬ ４０ｍｇ／ｍｌ X-Gal (Fisher)、１．５ｍｌの２０×ＫＣ溶液[０．８２ｇ Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６、１．０５ｇ Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ）６−３Ｈ２０]、０．０１５ｍｌの１Ｍ ＭｇＣｌ２, ２８ｍｌのＰＢＳ)において１６−１８時間培養され、その後リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で４５分間洗い流された。目は２４時間、４％ＰＦＡにおいて固定され、脱水され、埋め込まれ、１８μｍ切片が採集された。全ての目の明視野画像は、切片化の前に、Ｃ−ＦＭＣ顕微鏡を用いて撮影された。全ての条件に対し、ｎ＝４であった。
【００９４】
（血清存在下のＤＮＡ安定性分析）
ＰＥＧ−ＰＯＤ ７００ｎｇの凝縮又は裸のｐＣＡＧＬｕｃ（７００ｎｇ）が２．５Ｕ又は０．２５ＵのＤＮａｓｅＩ(Sigma)で、３７℃１５分間で処理され、その後、１０μｇのプロナーゼ(Sigma)が添加され、さらに３７℃で１０分間培養された。サンプルはその後、ＤＮＡ分解を調査するために、１％アガロースゲル電気泳動によって分析された。
【００９５】
（網膜電図写真）
マウスは、１μｌのＰＥＧ−ＰＯＤ〜Ｌｕｃのナノ粒子(７００ｎｇ)又は１μｌの５％デキストロース緩衝液を用いて網膜下に注入され、網膜電図写真（ＥＲＧ）によって４８時間後に次の如く分析された：一晩暗順応させた後、マウスは上述の如く麻酔され、瞳孔が１％トロピカミド(Akorn, Inc)で拡大され、暗順応のＥＲＧが、３つの異なる光強度(−２から０ｄＢ)で記録され、これには、コンタクトレンズ電極、及びBigShot ganzfeld (LKC Technologies, Inc)を備えるＵＴＡＳシステムが用いられた。各動物において、５−１０回のフラッシュが高−低強度の平均であった。全ての条件に対し、ｎ＝４であった。
【００９６】
（統計的分析）
データは、対数変換平均±標準誤差（ＳＥＭ）として示される。データ分析は、Prism Software 4 (GraphPad Software, Inc.)を用いて実施された。データ分析中、平均依存的なデータセットの分散間で高い有意差（ｐ＜０．０００１）となることが示された。このことは、サンプル間の等分散性を想定するスチューデントのｔ検定による分析を排除する。データ（ＲＬＵ／ｍｇ）は、更にガウス分布を作成するために対数的に変換され、データセット分散間の変動を排除し、パラメトリックのｔ検定[Armitage P et al.  2002 J.N.S. Statistical Methods in Medical Research. Blackwell Science, London]の使用を可能とした。網膜下注入は変数法であり、我々は成功した注入から失敗した注入を区別することを望んだ。このような実験が生のＲＬＵがバックグラウンドを超えて増加することを示したため、我々は、これは、注入が成功している間はＲＬＵが上昇すべきであることを意味すると捉えた。これは、例え僅かな差でさえ、ブランク単独が測定された時の平均を超える３標準偏差（ＳＤ）によって得られる [Ziady AG et al. 2003 Mol Therapy  8: 936-947]。全てのデータポイントが示される一方で、ブランク＋３ＳＤを超えるもののみがこの統計的分析に用いられ、平均が計算された。
【００９７】
（実施例１  ＰＯＤは、細胞透過性且つ非膜透過ペプチドである）
ヒト胚性網膜（ＨＥＲ）９１１細胞[Fallaux FJ et al. 1996 Hum.Gene Ther. 7: 215-222]は、２ｎモル（８μＭ）リサミン共役ＰＯＤ（Ｌ−ＰＯＤ）とともに培養し、続いてホルマリン固定すると、１分以内に５５８ｎｍの励起に不透明となり（５８３ｎｍで測定した放出）、明視野で正常となった（図１パネルＡ）。５分以内に、Ｌ−ＰＯＤが、細胞質内拡散パターン及び僅かな点状のパターンの両方とともに、細胞質内に見られた（図パネルＡ）。細胞の大部分が６０分後に細胞質染色を示した。さらに、リサミンのみを取り込む証拠は示されなかった（挿入図、図１パネルＡ）。固定されなかった細胞（即ち、生細胞）は、Ｌ−ＰＯＤ取り込みにおいて類似する割合を示し、１５分と６０分の両方において略独占的に点状である局在化パターンを示した。ここでもまた、リサミンのみを取り込む証拠は示されなかった（図１パネルＢ）。
【００９８】
Ｌ−ＰＯＤが原形質膜と非特異的に関連するというよりはむしろインターナライズするか否かを決定するために、２ｎモル（８μＭ）のＬ−ＰＯＤで１５分間培養されたＨＥＲ細胞が、リサミン陽性細胞をＦＡＣＳによって数える前に、３７℃でトリプシン処理された。細胞の計９０．１０±１．８９％又は９２．２３±０．６５％が、夫々トリプシンを用いた培養あり又は培養なしのリサミン陽性細胞であり（図１、パネルＣ）、大部分のＬ−ＰＯＤがインターナライズされ、殆ど膜に関連しなかったことを示す。トリプシン媒介性消化へのＰＯＤペプチドの感受性は、アクリルアミドゲル（挿入図、図１パネルＣ）にロードする前に、２．５ｎモルのＣ−ＰＯＤをトリプシンとともに培養することによって確認された。ＨＥＲ細胞の９２．２３±０．６５％は、Ｌ−ＰＯＤとともに３７℃で培養された時にリサミン陽性であるが、細胞の４８．７４±２．３２％のみがＬ−ＰＯＤとともに４℃で培養された時にリサミン陽性であった（図１パネルＤ）。したがって、Ｌ−ＰＯＤの取り込みは、温度依存性であることが判明した。
【００９９】
ＰＯＤの取り込みが原形質膜破壊を必要とするか否かを決定するために、ＨＥＲ細胞が、ＦＩＴＣ共役ＰＯＤ（Ｆ−ＰＯＤ）の増加濃度（０．２乃至２．０μＭの範囲）とともに培養された後、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で培養することによって透過性細胞の数がＦＡＣＳ測定された。本実施形態では、Ｆ−ＰＯＤがＬ−ＰＯＤよりも、ＰＩへのリサミン信号の流出を減らすために使用された。平均３．９８±０．７０％の細胞が、Ｆ−ＰＯＤと前培養された時にはＰＩ陽性であることが確認され、これは任意のペプチドがない時のＰＩ陽性細胞の数（５．１８±３．００％）と類似していた（図１パネルＥ）。対照的に、細胞の９１．４４±９．６６％が、細胞透過剤である１％のTriton-Xl00ともに培養された時にＰＩ陽性であった（図１パネルＥ）。これらデータは、Ｆ−ＰＯＤが、原形質膜を実質的に破壊せずにＨＥＲ細胞に進入することを示す。
【０１００】
（実施例２．細胞培養における小及び大分子のＰＯＤ媒介性送達）
小さい及び比較的大きい分子を培養下の細胞に送達することについて、Ｎ末端ビオチン化ＰＯＤ（Ｂ−ＰＯＤ）ペプチド、又はＮ末端システイン含有ＰＯＤ（Ｃ−ＰＯＤ）ペプチドの潜在的な使用が試験された。原理証明を構築するために、以下の標的クラスがここで試験された：ｓｉＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ、及びストレプトアビジンでコーティングされたＣｄＳｅ量子ドット。ビオチンの使用は、ストレプトアビジン架橋を介してＰＯＤへの広範囲な生物学的関連化合物の将来的な共役を提供し（本明細書では量子ドットに関して示される）、又は、遊離スルフヒドリル結合を介してシステインへの直接的な化学結合が可能である。
【０１０１】
初めの実施例において、赤色蛍光タンパク質発現カセットを含む５．５ｋｂプラスミド(ｐＣＡＧＲＦＰ)が、５％デキストロースにおいてＣ−ＰＯＤと静電的に複合され、ＨＥＲ９１１細胞とともに培養され、ＦＡＣＳによって４８時間後に分析された。ここで、ｐＣＡＧＲＦＰ単独、又はＣ−ＰＯＤと複合したｐＣＡＧＲＦＰが、夫々、２．４５±０．３１％及び２．２０±０．４６％のみのＲＦＰ陽性細胞をもたらしたことが観察された（図２パネルＡ）。対照的に、Ｎａ２ＨＰ０４緩衝液においてｐＣＡＧＲＦＰがＣ−ＰＯＤと複合した時、ＨＥＲ細胞の５５．５８±８．２３％が、ＲＦＰ陽性細胞となることが観察された（図２パネルＡ）。このことは、Ｃ−ＰＯＤ及び特異的な緩衝液が、遺伝子送達複合体には重要な要素であることを示した。Ｃ−ＰＯＤ／ｐＣＡＧＲＦＰ複合体の検査は、２つの異なる性能の緩衝液中において電子顕微鏡法により実施され、Ｎａ２ＨＰ０４において調製された複合体が平均領域６３．３１ｎｍ２を有する一方、デキストロースで調製されたものは、２９．６６ｎｍ２であった（図２パネルＢ）。この差は、２つの緩衝液における遺伝子送達の異なる速度の役割を部分的に果たしている可能性がある。
【０１０２】
その後、Ｃ−ＰＯＤは、緑色蛍光タンパク質（ｐＥＧＦＰ）用の発現カセットを含むプラスミド(ｐＥＧＦＰ)をＨＥＲ細胞に送達するのに使用され、４９．１３±２．２３％のＧＦＰ陽性細胞が得られた（図２パネルＣ）。トランスフェクトされた細胞は、その後、遊離ｓｉＲＮＡ二本鎖又はＣ−ＰＯＤと複合されたｓｉＲＮＡ二本鎖のいずれかとともに培養され、夫々、３９．８６±２．２０％、及び２４．７９±１．１８％のＧＦＰ陽性細胞が得られた（図２パネルＣ）。これらのデータは、Ｃ−ＰＯＤによるｓｉＲＮＡの送達が、ｓｉＲＮＡ単独の時よりも向上したことを示し、また、本手法が、遺伝子発現のノックダウンを促進するために、ｓｉＲＮＡを送達する有用な非毒性の方法である可能性があることを示す。
【０１０３】
ＰＯＤを使用してより大きなカーゴを送達する潜在性を試験するために、我々はＢ−ＰＯＤを、ストレプトアビジンでコーティングされた量子ドットと共役させた（ＱＤＰＯＤ）。ＨＥＲ細胞はＱＤＰＯＤとともに培養され、ＱＤＰＯＤ関連蛍光性を１５分以内にもたらした。ＱＤＰＯＤはまた、１２０分時点で細胞内に点状パターンが観察された（図２パネルＤ）。対照的に、Ｂ−ＰＯＤを含まないストレプトアビジンコーティング量子ドットは、ＨＥＲ細胞によって取り込まれなかった（図２パネルＥ）。
【０１０４】
（実施例３  ＰＯＤの取り込みがプロテオグリカンによって阻害され、ＰＯＤは殺菌作用を有する）
Ｌ−ＰＯＤが、結合及び細胞進入のために細胞表面プロテオグリカンを使用するか否かを決定するために、ＨＥＲ細胞への追加前に、Ｌ−ＰＯＤが各種比率のコンドロイチン硫酸又はヘパラン硫酸のいずれかで前培養された。予備的研究から得られたデータに基づき、Ｌ−ＰＯＤ：プロテオグリカンの比率は、１：３．３３、１：６．６７、及び１：８が選択された。
【０１０５】
任意のプロテオグリカンとのＬ−ＰＯＤの前培養がない場合には、細胞の９０．０７±０．６４％がリサミン陽性であるが、コンドロイチン硫酸の比率を増大させると、Ｌ−ＰＯＤの取り込みは、１：３．３３、１：６．６７、及び１：８モル比において、夫々７１．２４±１．７７％、５９.４３±１．５５％、及び３４．３８±３．１３％まで減少した（図３パネルＡ）。同様に、Ｌ−ＰＯＤをヘパラン硫酸と前培養すると、上述と同じ比率において夫々、７８.６０±０．３５％、５７．７８±２．８３％、及び４４．３７±２．１７％まで取り込みが減少した（図３パネルＡ）。対照的に、インテグリン結合ＲＧＤモチーフを含むＴＲＩＴＣ共役ペプチドの取り込みは、どちらのプロテオグリカンと前培養しても影響を受けなかった（図３パネルＡ）。
【０１０６】
眼内炎（目内の感染）は、通常は、眼組織への薬物送達における複雑性要因である[Ho J et al. 2007 Int Ophthalmol Clin 47: 199-208]ために、我々は、Ｃ−ＰＯＤの潜在的な殺菌作用を試験した。中対数期まで成長したE. coliの細胞は、Ｈ２０のみ、又はＣ−ＰＯＤが０．０３μＭ乃至６０μＭの範囲の濃度において懸濁したＨ２０のいずれかを用いて培養され、細胞数は、サンプルをＬＢ寒天にプレーティングすることによって決定された。細胞成長の有意な抑制が、０．３０μＭのＣ−ＰＯＤ濃度において観察され（図３パネルＢ）、殆ど完全な抑制が２４．０μＭのＣ−ＰＯＤにおいて観察された。Ｃ−ＰＯＤの濃度が高くなると、細胞成長を完全に排除した。したがって、我々は、Ｃ−ＰＯＤは殺菌活性を有し、この活性は濃度依存性であると結論付ける。
【０１０７】
（実施例４  インビボにおける網膜への小及び大分子のＰＯＤ媒介性送達）
成体Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの網膜下腔（流体の送達後の光受容体と網膜色素上皮（ＲＰＥ）との間に作られる空間）へのＬ−ＰＯＤの送達の２時間後、組織を採取した結果、神経網膜の約４０％に導入が生じた（図４パネルＡ、４倍率）。この領域内で、ＲＰＥを含む網膜の複数層の実質的な導入が見られた（図４パネルＡ、２０倍率）。さらに詳しく検査すると、光受容体細胞体、光受容体内節、内顆粒層細胞、神経節細胞の有意な導入が明らかとなる（図４パネルＡ、４０倍率）。上述の細胞培養実験において、核は強度に陽性ではなかったが、インビボの網膜導入は、Ｌ−ＰＯＤが、ＲＰＥ導入の場合には核に局在化することを示した（矢頭、図４パネルＡ、４０倍率）。光受容体細胞の核が細胞体と比較して大きいため、細胞質局在化に対する核局在化は、これら細胞に関して区別することができなかった。
【０１０８】
硝子体腔（レンズと網膜との間の領域）へのＬ−ＰＯＤの送達は、２時間以内に神経網膜の約８５％を導入した（図４パネルＢ、４倍率）。神経節細胞層、内網状層、及び内顆粒層において、強い染色が見られた（図４パネルＢ、２０倍率）。さらに詳しく検査すると、神経節細胞、及び内網状層に関連する樹状突起の有意な導入が明らかとなった（矢頭、図４パネルＢ、４０倍率）。硝子体腔内注入後２時間時点において、網膜の外層には有意な導入が見られなかった。網膜下の送達後、網膜外層に加わった網膜内層の誘導について、網膜下内腔から硝子体へのＬ−ＰＯＤの漏れに起因するか、又はＬ−ＰＯＤによる２時間以内の網膜の直接的な透過性に起因するかのいずれであるかは、決定することができなかった。
【０１０９】
Ｌ−ＰＯＤとは対照的に、有意により大きいＱＤＰＯＤ複合体の網膜内腔又は硝子体腔への送達は、細胞結合を可能にするように見えたが、注入後２時間の間にはそれ自体の取り込みはなかった（図４パネルＣ及び４パネルＤ）。しかしながら、より長い培養期間である２０時間では、網膜下注入後の外顆粒層へのＱＤＰＯＤの取り込み（図４パネルＣ）又は硝子体内注入時の網膜の内層へのＱＤＰＯＤの取り込み（図４パネルＤ）を明らかにした。
【０１１０】
対照的に、ストレプトアビジンのみでコーティングされた対照量子ドットは、２時間時点においてＲＰＥによる弱い取り込みのみを示し、２０時間時点においてＲＰＥによる僅かに大きいが依然最小限である取り込みを示した（挿入図、図４パネルＣ）。同様に、硝子体腔投与時において、有意でないレベルの対照量子ドットの取り込みが示された（挿入図、図４パネルＤ）。
【０１１１】
（実施例５  インビボにおける局所塗布による眼組織へのカーゴのＰＯＤ媒介性送達）
角膜への局所投与を介して薬物を眼組織に送達することは、一般的な方法であって、多量の薬物の排出が涙管を介して生じる。
【０１１２】
Ｌ−ＰＯＤを用いた角膜と強膜の透過性を評価するために、全体的なマウスの目がインビボで１０ｎモルのＬ−ＰＯＤとともに４５分間培養され、眼組織が採取された。
【０１１３】
４５分以内に観察されたデータは、Ｌ−ＰＯＤが角膜、強膜、及び予想外にも視神経へと強固に結合したことを示す（図５パネルＡ）。対照的に、リサミンのみは角膜及び強膜を弱く染色し、視神経を染色しなかった（図５パネルＡ）。これら目の凍結断面は、リサミンとは対照的に、全体的な外層表面がＬ−ＰＯＤに陽性であり、これら組織を弱くのみ染色したことを明らかにした（図５パネルＢ）。角膜及び強膜をさらに詳細に調査すると、４５分間の時間内で、角膜上皮及び強膜／脈絡膜の強い染色が示された（図５パネルＣ）。視神経の長手方向断面は、視神経の外層が４５分時点においてＬ−ＰＯＤで導入されたことを示した（図５パネルＤ）。類似の実験において、リサミンのみを用いた時には染色が観察されなかった（図５パネルＤ）。
【０１１４】
（実施例６  デノボ合成ＰＯＤ−ＧＦＰが核に局在化する）
ｐＧＦＰＨｉｓ（Ｈｉｓ標識ＧＦＰを発現するプラスミド）を用いたヒト胚性網膜芽細胞（ＨＥＲ）細胞のトランスフェクション[Fallaux FJ et al. 1996 Hum.Gene Ther. 7: 215-222]は、組換えＧＦＰの比較的拡散した細胞性及び核の局在化をもたらした（図７パネルＡ）。対照的に、ｐＰＯＤＧＦＰＨｉｓ（Ｈｉｓ標識ＰＯＤ−ＧＦＰ融合タンパク質を発現するプラスミド）を用いたＨＥＲ細胞のトランスフェクションは、比較的弱い細胞性及び集中した核の局在化をもたらした（図７パネルＢ）。さらに、ＰＯＤ−ＧＦＰは、核内コンパートメントにおいて集中するように見られた（図７パネルＢ、矢頭）。
【０１１５】
ＰＯＤ−ＧＦＰに関連する局在化のこのパターンは、ここでは、外から加えられたリサミン共役ＰＯＤペプチド（Ｌ−ＰＯＤ）のものと比較して観察され、この実施例では、まず細胞質において点状に局在化し、エンドサイトーシスを連想させた[Johnson LN et al. 2007 Mol Ther 16: 107-114]。
【０１１６】
これらのデータは、内因性発現したＰＯＤは、ＰＯＤ融合タンパク質に対する核局在化信号として作用することを示す。
【０１１７】
（実施例７  アデノウイルス感染ＨＥＲ細胞からのＰＯＤ−ＧＦＰの精製）
外から与えられたＰＯＤ−ＧＦＰによるタンパク質導入を検査するために、ＣＭＶプロモーターによって制御されるＨｉｓ標識ＰＯＤ−ＧＦＰ又はＧＦＰをコードする発現カセットが、Ｅ１／Ｅ３欠損ヒトアデノウイルス血清型５ベクター内にクローンされ、夫々ＡｄＰＯＤＧＦＰＨｉｓ及びＡｄＧＦＰＨｉｓである（図８パネルＡ）。ＰＯＤ−ＧＦＰ及びＧＦＰは、アデノウイルス感染ＨＥＲ細胞から精製され、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌアクリルアミドゲル上に電気泳動された。銀染色後、主要なバンドが約３２及び２８ｋｄにおいて同定され、夫々ＰＯＤ−ＧＦＰ及びＧＦＰの予測分子量とおおよそ一致した（図８パネルＢ）。各タンパク質に対し、僅かに大きな分子量の微量なバンドもまた、銀染色によって検出された。
【０１１８】
ＧＦＰに特異的に結合するモノクローナル抗体を用いた精製タンパク質分画のウェスタンブロット分析は、ＧＦＰ及びＰＯＤ−ＧＦＰに夫々対応する主要バンドを示した（図８パネルＢ）。
【０１１９】
これらのデータは、組換えアデノウイルスベクターが、ヒト細胞で発現した時に、ＰＯＤ−融合タンパク質の比較的純粋な調製を生じさせることを示す。
【０１２０】
（実施例８  インビボにおけるＰＯＤ−ＧＦＰの導入特性）
ＰＯＤ−ＧＦＰの導入性能を決定するために、約０．２×１０６ヒト肺癌上皮細胞（Ａ５４９）又はＨＥＲ細胞の夫々を、１０μｇの精製組換えＰＯＤ−ＧＦＰ又は対照ＧＦＰタンパク質の夫々とともに２時間培養し、ＧＦＰ陽性細胞数がＦＡＣＳによって数えられた。Ａ５４９細胞の計３５．３±０．９％及び１．４±０．４％が、ＰＯＤ−ＧＦＰ又はＧＦＰと夫々培養された時にＧＦＰ陽性であった。同様に、ＨＥＲ細胞の計３４．２±３．４％及び１．８±０．４％が、ＰＯＤ−ＧＦＰ又はＧＦＰと夫々培養された時にＧＦＰ陽性であった（図９パネルＡ）。
【０１２１】
タンパク質導入中の細胞への毒性の程度が、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の取り込みによって測定された。計２．８±３．８％又は３．２±２．７％のＨＥＲ細胞が、ＰＯＤ−ＧＦＰ又はＧＦＰと夫々培養された後に、ＰＩ陽性であり、これは、非導入細胞のもの（３．６±３．８％）と類似していた。
【０１２２】
内在性遺伝子発現とは対照的に、本実施例のＰＯＤ−ＧＦＰは、ＨＥＲ細胞の細胞質に点状パターンとして現れた（図９パネルＢ）。これは、Ｌ−ＰＯＤペプチドを用いた上述の実施例で観察されたものと類似しており、また取り込みのエンドサイトーシス機構で観察されたものと類似していた。ＰＯＤ−ＧＦＰはＥＲトラッカー又はＤＡＰＩを用いて共局在化することができず、リソトラッカーを用いて部分的に共局在化することが確認された（図９パネルＢ）。モデルと一致する後期エンドソームのマーカーを用いて、ＰＯＤ−ＧＦＰは、１以上の機構によって細胞に進入する。
【０１２３】
これらのデータは、ＰＯＤ−ＧＦＰが培養下の細胞を導入し、進入時に有意に原形質膜を損傷しなかったことを示し、核酸ベクターから内因性発現によって送達されたタンパク質とは対照的に、ＰＯＤは後期エンドソームを用いて部分的に共局在化したことを示す。
【０１２４】
（実施例９  インビボにおけるＰＯＤ−ＧＦＰの導入特性）
インビトロにおけるＰＯＤ−ＧＦＰの導入特性を決定するために、８．５μｇの精製ＰＯＤ−ＧＦＰ又は対照ＧＦＰタンパク質の夫々が、６週齢のオスＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスの網膜下腔（即ち、網膜色素上皮（ＲＰＥ）及び光受容体の間）に注入された。６時間後に目が採取され、凍結切片が蛍光顕微鏡によって試験された。
【０１２５】
データは、対照ＧＦＰタンパク質の注入に関連するＧＦＰ−蛍光性が、網膜下腔において検出されたことを示し、その量は、バックグラウンド自己蛍光を超えてかろうじて認識できた。さらに、網膜の任意のその他の部分には、自己蛍光を超える量のＧＦＰの証拠がなかった（図１０パネルＡ）。
【０１２６】
対照的に、ＰＯＤ−ＧＦＰは網膜下腔に局在し、またＲＰＥに検出され、外顆粒層（ＯＮＬ）（即ち、光受容体細胞体の位置（図１０パネルＢ））に豊富に存在した。注入手順中に生成された網膜剥離の程度に依存して、ＯＮＬの導入が網膜表面の４０％まで発見された。偶発的なＧＦＰ陽性細胞もまた、網膜下注入後、神経線維層及び神経節細胞層（ＧＣＬ）において発見された。ＯＮＬにおける光受容体細胞体をさらに詳しく調査すると、核周囲空間又は原形質膜においてＰＯＤ−ＧＦＰの局在化を示し、点状及び膜結合パターンの両方をみせた（図１０パネルＢ、矢頭）。
【０１２７】
計６．６μｇの精製ＰＯＤ−ＧＦＰ又は対照ＧＦＰタンパク質が６週齢のオスＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスの硝子体腔（即ち、レンズと神経網膜との間）に注入され、目が６時間後に採取され、冷凍切片が蛍光顕微鏡検査法によって検査された。データは、硝子体腔注入後、対照ＧＦＰタンパク質の注入に関連するＧＦＰ−蛍光がバックグラウンドの自己蛍光を超えて網膜細胞において検出されなかったことを示す（図１１パネルＡ）。対照的に、ＰＯＤ−ＧＦＰは、神経節細胞（図１１パネルＢ）、及び内顆粒層（ＩＮＬ：図１１パネルＢ、矢頭）における細胞亜集団において、容易に検出された。網膜内腔注入とは異なって、ＰＯＤ−ＧＦＰ信号は、外顆粒層又はＲＰＥにおいて、バックグラウンド自己蛍光を超えて検出可能ではなく、ＧＦＰ陽性細胞の総数は網膜内腔注入によって実現されるものよりも少なかった。網膜内層をさらに詳しく検査すると、多数の樹状突起もまたＰＯＤ−ＧＦＰを含んでいることが明らかになった（図１１パネルＢ、矢）。
【０１２８】
さらなるデータは、硝子体腔注入後の水晶体嚢が、ＰＯＤ−ＧＦＰに対して非常に強い親和性を有しているが、ＧＦＰに対しては有していないことを示した（図１２パネルＡ）。水晶体へのＰＯＤ−ＧＦＰの親和性は、網膜導入に利用可能なタンパク質の量を減少させる可能性がある。このことは、網膜内腔経路と比較して水晶体内経路を介した神経網膜の導入がより弱いことの主な原因である可能性がある。要約すると、このデータは、硝子体腔へと送達されるＰＯＤ−ＧＦＰが、神経節細胞、及びＩＮＬ内の限定された細胞数、また水晶体嚢にも導入したことを示す。対照的に、網膜下腔へのＰＯＤ−ＧＦＰの送達は、ＲＰＥと光受容体細胞を誘導する。
【０１２９】
（実施例１０）インビボにおける角膜へのＰＯＤ−ＧＦＰの局所塗布
計４０μｇの精製ＰＯＤ−ＧＦＰ又は対照ＧＦＰタンパク質が、麻酔された６週齢のオスＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスに局所塗布された。そして、目が４５分後に採取され、切片用とされた。全体的なマウスの目を４７４ｎｍの光で励起させると、対照ＧＦＰは、洗い流され、目の外表面には存在しないことが明らかとなった。対照的に、ＰＯＤ−ＧＦＰは、殆どの眼表面において検出された（図１２パネルＢ）。
【０１３０】
ＰＯＤ−ＧＦＰの局在化をさらに検査するために、前眼組織が解離され、角膜が平面実装又は断面化され、蛍光顕微鏡によって再検査された。データは、対照ＧＦＰ蛍光性が、ＧＦＰの局所塗布を行ったマウスから調製された平面状標本（flat mount）においては検出可能でないことを示した。対照的に、ＧＦＰ−蛍光性は、ＰＯＤ−ＧＦＰの局所塗布を受けたマウスからの角膜の平面状標本及び断面の両方において容易に検出された（図１２パネルＢ）。横断面(transverse)は、ＰＯＤ−ＧＦＰに関連するＧＦＰ−蛍光性の大部分が、角膜上皮から、及び最小限には基質から、生じていることを明らかにした（図１２パネルＢ）。対照ＧＦＰの局所塗布を受けたマウスから調製された角膜の断面において検出されるＧＦＰ信号はなかった。
【０１３１】
これらデータは、眼組織へのＰＯＤ−ＧＦＰの局所塗布が、角膜上皮への結合を可能とすることを示す。
【０１３２】
（実施例１１  インビボにおける皮膚へのＰＯＤ−ＧＦＰの局所塗布）
ＰＯＤの特性を示す本明細書のデータ及び実施例は、主に網膜又は眼組織上に集中した。角膜への局所塗布が成功したことは、治療用タンパク質のための送達の本様式の潜在性と同様に、その他の組織にこの種類を応用することに関する調査を促した。
【０１３３】
これら観察をその他の臓器系へと広げるために、ＰＯＤ融合タンパク質の経皮送達の潜在性が検査された。ＰＯＤ−ＧＦＰは局所的に塗布され（４０μｇ）、又は対照ＧＦＰも、成体Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスの剃った皮膚へと塗布された。動物は、２４時間後に犠牲となり、処理領域の凍結切片が蛍光顕微鏡によって検査された。
【０１３４】
データは、組織内の毛包及び毛髪が、ＰＯＤ−ＧＦＰとの接触後に自己蛍光したことを示す。コントラストにおいて最小限のＧＦＰ−蛍光性のみが、対照ＧＦＰの局所塗布を用いて観察された（図１３パネルＡ）。ＰＯＤ−ＧＦＰを受けたマウスから調製された皮膚の上皮は、有意にＧＦＰ陽性であった（図１３パネルＢ）。取り込みは、点状及び拡散して見られ、上皮に略独占的に関連しており、皮膚の深い層には関連しなかった（図１３パネルＢ）。毛包周囲に観察された結合は、自己発光から確実に分離することができなかった。
【０１３５】
これらのデータは、対照ＧＦＰが有意にマウスの皮膚に結合せず、ＰＯＤ−ＧＦＰは少なくとも２４時間の間結合するだけでなく、表皮によって取り込まれたことを示す。
【０１３６】
（実施例１２  ｃＰＯＤ（細胞透過性ペプチド）は、ＤＮＡをインビトロで静止細胞へと送達可能であるが、インビボでは不可能である）
ここでは、ｃ−ＰＯＤ（システイン−ＰＯＤ）が、核酸を凝縮し、その電荷を中和し、インビトロの有糸分裂ＨＥＲ細胞へと送達することが示される。この観察を非有糸分裂細胞（インビボの細胞の大多数の状態である）へと広げるために、Ａ５４９細胞が、ＧＦＰを発現するプラスミド（ｐＣＡＧＧＦＰ）を含むｃ−ＰＯＤ／ｐＣＡＧＧＦＰ複合体の添加前に、２４時間血清飢餓とされた。
【０１３７】
データは、Ａ５４９細胞が有糸分裂を受けると、６．０５％がＧＦＰ陽性となったが、活性有糸分裂が阻害されると、Ａ４５９細胞の＜１％がＧＦＰ陽性となったことを示す（ｐ＜０．０００５）（図１４パネルＡ）。さらに、平均細胞ＧＦＰ強度(Mean cell intensity)が、血清／有糸分裂の存在下及び不在下で夫々、１６８３から１６．５３へと減少した（ｐ＜０．０００１）。
【０１３８】
導入細胞における機能的組換えタンパク質レベルを定量化するために、Ａ５４９細胞が、ルシフェラーゼを発現するプラスミド（ｐＣＡＧＬｕｃ）を含むＣ−ＰＯＤ／ｐＣＡＧＬｕｃ複合体でトランスフェクトされた。結果は、ＧＦＰを用いた時と相関しており、ｃＰＯＤは、分裂細胞におけるトランスジーン発現を、対照プラスミド単独に対して略６桁（ｐ＜０．００５）、及び非分裂細胞のｃＰＯＤに対して４桁（ｐ＜０．００５)増大させた。図１４パネルＢを参照されたい。しかしながら、ｃＰＯＤは非分裂細胞とともに使用され、トランスジーン発現はＤＮＡ単独よりも高かった（ｐ＜０．０５）。
【０１３９】
データは、ｃＰＯＤが非分裂細胞を導入するが、ＧＦＰを用いた検出能を下回る発現レベルであることを示す。したがって、データは血清自身が導入を向上させる可能性を排除しないものの、活性有糸分裂細胞は非有糸分裂細胞よりもｃ−ＰＯＤ／ＤＮＡによる導入の影響を受け易いとして、我々は結論付ける。これら観察を初代細胞に広げるために、Ｃ５７の目が摘出され、前房が除去され、ＲＰＥ／強膜及び網膜が分離された。これらの外植片が、ｃＰＯＤ凝縮ｐＣＡＧＬｕｃを用いて４８時間エクスビボで培養される時、有意なトランスフェクションが、予想外にも、Ｎ：Ｐ比率４．３（ＲＬＵ＝１．０×１０５±７．７×１０４、ｐ＜０．０００１)と８．６（ＲＬＵ＝１．４×１０４±９．１×１０３、ｐ＜０．０００１）の両方に関し、ＲＰＥ／強膜において見られた（図１４パネルＣ）が、網膜においては見られなかった（データ示さず）。しかしながら、これら同じ実験がインビボで実施された時、どちらの凝縮においてもバックグラウンドを超える有意なルシフェラーゼ活性は検出されなかった（ｐ＞０．０５）（図１４パネルＣ）。したがって、我々は、ｃ−ＰＯＤが、ＤＮＡを凝縮し培養下の有糸分裂細胞及びエクスビボにおける外植片の初代細胞へと送達できる一方、インビボにおいては送達できないと結論付ける。
【０１４０】
（実施例１３  ペグ化によるｃ−ＰＯＤの官能基化は、ＤＮＡ結合を保持する一方、粒子凝集を阻害する）
活性分裂細胞と静止細胞との間の１つの重要な違いは、有糸分裂中に、核膜が崩壊し、ＤＮＡ等の大分子を核に容易にアクセス可能とすることである。インビボの有糸分裂後細胞における無傷な核膜は、非ウイルス遺伝子導入には有意なバリアであると考えられている。この実施例は、大きいｃ−ＰＯＤ／ＤＮＡ凝集物の形成が遺伝子導入を阻害する役割を果たすか否かを試験する。この仮説を検査するために、ローダミン標識プラスミドＤＮＡが、ｃ−ＰＯＤを用いて凝縮され、この複合体がＨＥＲ細胞とともに２時間培養液中で培養された。確かに、光学顕微鏡レベルにおいてさえ大きいｃ−ＰＯＤ／ＤＮＡ凝集物が容易に視認可能であり（図１５パネルＡ）、１０−１００μｍのサイズの範囲であることが観察された。凝集のこのレベルの減少を試みるために、ｃ−ＰＯＤのシステイン上への遊離スルフヒドリル結合が、１０ｋＤのＰＥＧ−マレイミド基で官能基化された。合成後のｃ−ＰＯＤモノマーの質量分光法による予測分子量は、３．５ｋＤであったが、特有のバンドが、クマシー染色ゲル上の約１７ｋＤに対応する位置に観察された（図１５パネルＢ）。このことは、ｃ―ＰＯＤが溶液中で五量体を形成することを示す。１０ＫのＰＥＧを用いたこの１７ｋＤ生成物の官能基化は、ゲルを予測される２７ｋＤへとシフトさせた。微量の生成物もまた、３７ｋＤにおいて検出され、幾つかのｃ−ＰＯＤ五量体が２つの１０ｋＤのＰＥＧ分子によって官能基化されたことを示す。ｃ−ＰＯＤと同様に[Johnson LN et al. 2008 Mol Ther 16: 107-114]、ペグ化ＰＯＤ（ＰＥＧ−ＰＯＤ）もまた、ＤＮＡを凝縮し、アガロースゲルへのＤＮＡ移動を遅延させた。このことは、ｃ−ＰＯＤペプチドをトリプシンで前消化することによって軽減することが可能であった（図１５パネルＣ）。ｃ−ＰＯＤとは異なり、ＰＥＧ−ＰＯＤは、ＤＮＡと複合されてＨＥＲ細胞と２時間培養された時に、大きな凝集体は形成しなかった（図１５パネルＤ）。我々は、プラスミドＤＮＡと静電的に混合する前にｃ−ＰＯＤをペグ化することは、凝集生成物の形成を有意に減少させると結論付ける。
【０１４１】
（実施例１４  ＰＥＧ−ＰＯＤは、ＤＮＡを凝縮し、小さく分離したナノ粒子を形成する）
ＰＯＤ〜Ｌｕｃ複合体を透過電子顕微鏡法によってさらに詳しく検査すると、これら複合体が、比較的均質な１００−２００ｎｍの球状ナノ粒子から構成されることが明らかになった（図１６）。拡散光散乱法（ＤＬＳ）による粒子サイズ（particle size）の独立した測定により、１３６ｎｍ±２７．２ｎｍが確認された。対照的に、対照（即ち、緩衝液(buffer)又は非凝縮ＤＮＡ単独）は、夫々１．６ｎｍ±０ｎｍ及び１２２１ｎｍ±７５３．４ｎｍとなることがＤＬＳによって決定された。ＤＬＳが２ｎｍ−２０００ｎｍの範囲の球状粒子に対してそもそも正確であると考えると、ＤＮＡ（大きな回転半径を有する）の大きな標準偏差が予測される。
【０１４２】
（実施例１５  ＰＥＧ−ＰＯＤ〜ＲｈｏＤＮＡ及びｃＰＯＤ〜ＲｈｏＤＮＡ粒子は、インビボで組織において異なる局在化を有する）
ＰＥＧ−ＰＯＤ／ＤＮＡ複合体が、ｃ−ＰＯＤ／ＤＮＡ複合体よりもより効果的に組織を透過するか否かを決定するために、ＰＥＧＰＯＤ（ＰＥＧ−ＰＯＤ〜ＲｈｏＤＮＡ）又はｃ−ＰＯＤ（ｃ−ＰＯＤ〜ＲｈｏＤＮＡ）を用いて凝縮されたローダミン標識ＤＮＡ（１００ｎｇ）のナノ粒子が、８週齢のＣ５７オスのマウスの網膜内腔へと注入され、２時間後に採取された。網膜内腔へと残ったｃＰＯＤ〜ＲｈｏＤＮＡ粒子とは対照的に、ＰＥＧ−ＰＯＤ〜ＲｈｏＤＮＡ粒子は、網膜色素上皮内で点状染色として現れた（図１７、第１と第３に比較して第２と第４）。
【０１４３】
（実施例１６  ＰＥＧ−ＰＯＤ〜Ｌｕｃ粒子は、インビボにおいて眼組織をトランスフェクト可能である）
ＰＥＧ−ＰＯＤ〜Ｌｕｃナノ粒子は、成体（６−７週）ＢＡＬＢ／Ｃマウスの網膜内腔へと注入され、４８時間後に採取され、ルシフェラーゼ活性が分析された。ＲＬＵを正常にするため、ｍｇタンパク質あたりのＲＬＵを収集してプロットしたタンパク質濃度が定量化された（図１８パネルＡ及びＢ）。１．２μｇのＤＮＡ(１．５１×１０７±３．８３×１０６ＲＬＵ／ｍｇ)を含むＰＥＧ−ＰＯＤナノ粒子を用いたトランスフェクションは、１．２μｇのＤＮＡ単独（５．５４×１０４±１．４７×１０４ＲＬＵ／ｍｇ、ｐ＜０．０００１）又は非注入対照（１．０９×１０４±１．０４×１０３ＲＬＵ／ｍｇ、ｐ＜０．０００１）よりも有意に高い発現レベルを示した。ＤＮＡ単独の発現は、非注入対照をも有意に超えていた（ｐ＜０．０５）。０．６μｇのＰＥＧ−ＰＯＤナノ粒子のみが同量で注入された時には、非注入対照（ｐ＜０．００１）及び１．２μｇの裸のＤＮＡ（ｐ＜０．０５）を超えて、発現に有意な増加（１．１７×１０６±５．４８×１０５ＲＬＵ／ｍｇ）が依然として見られた。図１８パネルＣ。しかしながら、１．２μｇのＰＥＧ−ＰＯＤナノ粒子（ｐ＜０．０５）の注入と比較して、平均発光において９．８倍という有意な減少が見られた。これらデータから、ＰＥＧ−ＰＯＤナノ粒子は、ＤＮＡ単独と比較して効果的にトランスジーンをインビボで送達可能であり、この特性は、試験した濃縮において用量依存性であることが結論付けられた。
【０１４４】
組換えルシフェラーゼ(Promega)が使用されることにより、ＲＬＵ値に関する標準曲線を作成した（Ｒ２＝０．９９９９）。裸のｐＣＡＧＬｕｃプラスミドの発現は、１．９１５±０．５４４９ｐｇ／ｍｇを産生し、０．６μｇのＰＥＧ−ＰＯＤ〜Ｌｕｃは４３．２３±２０．２６ｐｇ／ｍｇを産生し、及び１．２μｇのＰＥＧ−ＰＯＤ〜Ｌｕｃは４２５．２±１４１．７ｐｇ／ｍｇのルシフェラーゼタンパク質を産生した。
【０１４５】
（実施例１７  ＰＥＧ−ＰＯＤは、その他のペグ化細胞透過性ペプチドと比較してトランスフェクションを増加させる）
ＰＥＧ−ＰＯＤに追加して、その他の構築された細胞透過性ペプチド（ＴＡＴ及びＣＫ３０（３０マーのポリリシン）を含む）の有用性が試験された。ＣＫ３０は、米国特許出願番号第１０／６５６，１９２号（出願日２００３年９月８日、Cooper et al）に記載されている。
【０１４６】
同じプロトコルを用いて、これらのペプチドが夫々ペグ化され、ＰＥＧ−ＴＡＴ及びＰＥＧ−ＣＫ３０を作製した。ＰＥＧ−ＴＡＴは、細胞培養下でＤＮＡを凝縮することが示されてきた [Ignatovich IA et al. 2003 J Biol Chem  278: 42625-42636; Rudolph C et al. 2003 J Biol Chem 278: 11411-11418]が、それ自身がプラスミドＤＮＡをインビボで送達するのに使われたことはなかった。各種のＰＥＧ−ＴＡＴ：ＤＮＡ比率が使用され、凝縮は、ゲル電気泳動によって評価された。ＰＥＧ−ＴＡＴは、完全にプラスミドＤＮＡを１．８ｎモルペプチド：２μｇＤＮＡにおいて凝縮することが観察され、同じ比率がＰＥＧ−ＰＯＤにも使用された。ＰＥＧ−ＴＡＴナノ粒子は、ＰＥＧ−ＰＯＤナノ粒子と同じプロトコルを用いて作製された。ＰＥＧ−ＣＫ３０ナノ粒子は、以前から作製されており、インビボにおいて有効性を示すことが文書化されている[Ziady AG et al. 2003 Mol Ther 8: 936-947; Farjo R et al. 2006 PLoS ONE  1: e38; Liu G et al. 2003 J Biol Chem 278: 32578-32586]ために、これら研究において概説される比率及びプロトコルは、[Ziady AG et al. 2003 Mol Ther 8: 936-947]に従い、ゲル電気泳動によって完全に凝縮されたＤＮＡが生じた。
【０１４７】
ＢＡＬＢ／Ｃマウスは、１．２μｇのＰＥＧ−ＴＡＴ〜Ｌｕｃ又はＰＥＧ−ＣＫ３０〜Ｌｕｃのいずれかとともに網膜下に注入され、目が４８時間後に採取された（図１８パネルＡ）。ＰＥＧ−ＴＡＴ〜Ｌｕｃは、高レベルの発現（２．８４９×１０６±１．２９８×１０６）を示し、これは、１．２μｇＤＮＡ単独（ｐ＜０．０５）及び非注入対照（ｐ＜０．００５）と比較して有意に増加した。ＰＥＧ−ＣＫ３０〜Ｌｕｃ注入において、１つが非注入対照の平均ＲＬＵ／ｍｇ＋３標準偏差（図１８パネルＡ、点線）を下回った。これは、裸のＤＮＡ又はナノ粒子ＤＮＡのいずれかの注入のみであり、ルシフェラーゼの増加を示さなかったため、この注入は、データの最終分析（図１８パネルＢ）には数えられなかった。ＰＥＧ−ＣＫ３０〜Ｌｕｃは、３つの細胞透過性ペプチドのうち最も低い発現を示した（８．３７９×１０５±４．３１０×１０５)が、依然として、１．２μｇＤＮＡ単独（ｐ＜０．０５）及び非注入対照(ｐ＜０．００５)を超えて有意な増加を示した。ＰＥＧ−ＰＯＤナノ粒子は、ＰＥＧ−ＣＫ３０（ｐ＜０．００５）と比較して、平均して有意な１６．４倍の増加を示した。ＰＥＧ−ＴＡＴナノ粒子は、ＰＥＧ−ＰＯＤ又はＰＥＧ−ＣＫ３０（ｐ＞０．０５）のいずれかによって形成されたものとは有意に違いがなかった。これらの結果は、全ての３つの細胞透過性ペプチドが、ＤＮＡ単独と比較して、インビボでペプチドトランスフェクションを増加させることを示す。同じ量のＤＮＡのみを注入したものと比較して、ＰＥＧ−ＰＯＤはプラスミドＤＮＡの発現を２１５±６３倍、ＰＥＧ−ＴＡＴは５６．５２±２１．３３、及びＰＥＧ−ＣＫ３０は２４．７３±１５．３０増加させた（図１８パネルＣ）。また一方で、ＰＥＧ−ＰＯＤは、網膜下注入による最も効果的な誘導を引き起こすように見られる。
【０１４８】
（実施例１８  細胞透過性ペプチドナノ粒子は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）をトランスフェクトする）
発現を局在化するために、ナノ粒子が、β−ガラクトシダーゼを発現するプラスミド（ｐＣＡＧＬａｃＺ）を含むペグ化細胞透過性ペプチドの夫々を用いて作製され、１．２μｇがＢＡＬＢ／Ｃマウス内に網膜下に注入された。４８時間後、目が採取され、β−ガラクトシダーゼ活性が染色された（図１９）。β−ガラクトシダーゼ活性の量は、前に観察されたルシフェラーゼの値（図１８）と相関しており、全ての注入においてＲＰＥ細胞層に局在化していた。全ての３つの細胞透過性ペプチドがＲＰＥを導入可能であったが、最も強い染色はＰＥＧ−ＰＯＤ〜ＬａｃＺを用いたものに見られ、最も弱い染色はＰＥＧ−ＣＫ３０〜ＬａｃＺを用いたものであった。対照の目は、非注入、又は同量の非凝縮ＤＮＡ、ルシフェラーゼナノ粒子、ｐｅｇＰＯＤ単独、もしくは緩衝液を用いた注入のいずれかによるものであった。対照の目のいずれにおいても、β−ガラクトシダーゼ染色は検出されなかった（データ示さず）。
【０１４９】
（実施例１９  ＰＥＧ−ＰＯＤは、プラスミドＤＮＡをＤＮａｓｅＩ消化から保護する）
血清ヌクレアーゼ活性は、プラスミドＤＮＡの半減期を有意に減少させるのに示される。マウスに静脈注入されたＤＮＡは１０分以内に分解される[Kawabata K et al. 1995 Pharm Res 12: 825]ために、分解から保護することは、静脈注入によって遺伝子をインビボで成功して送達させるために重要な特性である。デオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮａｓｅＩ）は、ヒト血清及び身体内の多様な組織において発見されたエンドヌクレアーゼである[Love J et al. 1979 J Bio Chem  254: 12588]。既に、ＤＮａｓｅＩ特異的な中和抗体がヒト血清に加えられた時に、ヌクレアーゼ活性が完全に阻害されることが示されており、これは、血清ヌクレアーゼ活性がＤＮａｓｅＩに起因することを示している[Takeshita H et al. 2004 Clinical Chemistry 50: 446-448]. 血清及び膵臓ＤＮａｓｅＩは実質的に同じ特性を発揮する [Love J et al. 1979 J Bio Chem  254: 12588]。そして、酵素は容易に膵臓から精製されるために、膵臓ＤＮａｓｅＩがペグ化ＰＯＤ／ＤＮＡナノ粒子の潜在的な血清安定性を試験するのに使用された（図２０パネルＡ）。プロナーゼが存在しない時、ｐＣＡＧＬｕｃ（裸のプラスミド）のみがゲルへと移動可能であり、その一方、ｐＰＯＤ〜Ｌｕｃナノ粒子はゲルのウェル内で凝縮されたままであった。プロナーゼとともに１０分間培養した後、ｐＣＡＧＬｕｃ及びｐＰＯＤ〜Ｌｕｃ ＤＮＡの両方がゲルへと移動した。ＤＮａｓｅＩ耐性を試験するために、ＤＮＡ又はナノ粒子がＤＮａｓｅＩを用いて１５分間培養され、その後プロナーゼを用いて１０分間培養された。これにより、ｐＰＯＤの分解による凝縮ＤＮＡの視覚化が可能となった。０．２５ＵのＤＮａｓｅＩを添加した後、ｐＣＡＧＬｕｃは分解の兆候を見せ始めたが、ｐＰＯＤ〜Ｌｕｃはまだ損傷を受けなかった。２．５ＵのＤＮａｓｅＩというより高い濃度において、ｐＣＡＧＬｕｃは完全に分解し、もはやゲル上で検出することができなかったが、ｐＰＯＤ〜Ｌｕｃはほんの微量の分解のみであった。ｐ−ＰＯＤ／ＤＮＡ複合体は、ＤＮａｓｅＩ分解から保護されていると結論付けられた。
【０１５０】
（実施例２０  肺ではｐＰＯＤ〜ＬｕｃがｐＣＡＧＬｕｃよりも高いトランスフェクション効果を有しているが、静脈送達後の肝臓ではｐＣＡＧＬｕｃがより高い。）
ｐＰＯＤはＤＮＡをＤＮａｓｅＩ消化から保護するため、この保護がインビボにおける静脈送達の間にトランスフェクションを増大させるか否かが試験された。ＢＡＬＢ／Ｃマウスに、４０μｇのｐＣＡＧＬｕｃ又は４０μｇのｐＰＯＤ〜Ｌｕｃのいずれかを含む１５０μＬの５％デキストロース緩衝液が注入された（図１７パネルＢ）。４０μｇのｐＣＡＧＬｕｃが静脈で送達された時、肺におけるルシフェラーゼのレベルは、６２３．７±１．３９．１ＲＬＵ／ｍｇとなると決定された。対照的に、４０μｇのｐＰＯＤ〜Ｌｕｃが静脈で送達された時、ルシフェラーゼのレベルは、４．４４５×１０４±８０８２ ＲＬＵ／ｍｇで有意に高かった(ｐ＜０．０００１)。図２０パネルＢを参照。１０μｇのｐＰＯＤ〜Ｌｕｃの送達もまた、より高いレベルのルシフェラーゼ活性をもたらした（１６７０±４３０．５ ＲＬＵ／ｍｇ（ｐ＜０．０５））。要約すると、１０μｇから４０μｇへの注入ｐＰＯＤ〜Ｌｕｃの増加は、ルシフェラーゼ発現において有意な増加をもたらした(ｐ＜０．０００１)が、裸のプラスミド単独は、非注入マウスを超えて、肺においてルシフェラーゼを有意に発現しなかった（ｐ＜０．０５）。
【０１５１】
（実施例２１  ｐＰＯＤ〜Ｌｕｃは機能分析による毒性を生じさせない。）
インビボにおけるｐＣＡＧ〜Ｌｕｃナノ粒子の毒性を検査するために、我々は、１μｌにおける０．７μｇのｐＰＯＤ〜Ｌｕｃ（ｎ＝４）又は１μｌの５％デキストロース（ｎ＝４）（ナノ粒子と同じ緩衝液）のいずれかを用いて、成体（６−８週）のＣ５７オスの網膜口腔へと注入した。４８時間後、網膜電図（ＥＲＧ）が２つの異なる光強度で記録された。ｐＰＯＤ〜Ｌｕｃ及びモック（偽）注入された目の両方が、明確なＡ及びＢ波を備える正常のＥＲＧを有していた（代表的な例は、図２１パネルＡの−０対数光強度（Log Light Intensity）において示されている）。これら波は、Ａ及びＢ波振幅に関して分析され、対数光強度によってプロットされた（図２１パネルＢ）。任意の試験条件下の注入間で有意差はなかった（ｐ＞０．０５）。
【０１５２】
本発明の更なる実施形態及び実施例は、請求の範囲に記載されるが、説明を目的としたものであり、更なる制限として解釈されるものではない。本明細書に引用された全ての論文は、引用することによりその全体を本願に援用する。
【図１Ａ】
2010537632.tif 000004
【図１Ｂ】
2010537632.tif 000005
【図１Ｃ】
2010537632.tif 000006
【図１Ｄ】
2010537632.tif 000007
【図１Ｅ】
2010537632.tif 000008
【図２Ａ】
2010537632.tif 000009
【図２Ｂ】
2010537632.tif 000010
【図２Ｃ】
2010537632.tif 000011
【図２Ｄ】
2010537632.tif 000012
【図２Ｅ】
2010537632.tif 000013
【図３Ａ】
2010537632.tif 000014
【図３Ｂ】
2010537632.tif 000015
【図４ａ】
2010537632.tif 000016
【図４ｂ】
2010537632.tif 000017
【図４Ｃ】
2010537632.tif 000018
【図４Ｄ】
2010537632.tif 000019
【図５ａ】
2010537632.tif 000020
【図５ｂ】
2010537632.tif 000021
【図５ｃ】
2010537632.tif 000022
【図５ｄ】
2010537632.tif 000023
【図６Ａ】
2010537632.tif 000024
【図６Ｂ】
2010537632.tif 000025
【図７Ａ】
2010537632.tif 000026
【図７Ｂ】
2010537632.tif 000027
【図８Ａ】
2010537632.tif 000028
【図８Ｂ】
2010537632.tif 000029
【図９Ａ】
2010537632.tif 000030
【図９Ｂ】
2010537632.tif 000031
【図１０Ａ】
2010537632.tif 000032
【図１０Ｂ】
2010537632.tif 000033
【図１１Ａ】
2010537632.tif 000034
【図１１Ｂ】
2010537632.tif 000035
【図１２Ａ】
2010537632.tif 000036
【図１２Ｂ】
2010537632.tif 000037
【図１３Ａ】
2010537632.tif 000038
【図１３Ｂ】
2010537632.tif 000039
【図１４Ａ】
2010537632.tif 000040
【図１４Ｂ】
2010537632.tif 000041
【図１４Ｃ】
2010537632.tif 000042
【図１５Ａ】
2010537632.tif 000043
【図１５Ｂ】
2010537632.tif 000044
【図１５Ｃ】
2010537632.tif 000045
【図１５Ｄ】
2010537632.tif 000046
【図１６】
2010537632.tif 000047
【図１７】
2010537632.tif 000048
【図１８Ａ】
2010537632.tif 000049
【図１８Ｂ】
2010537632.tif 000050
【図１８Ｃ】
2010537632.tif 000051
【図１９】
2010537632.tif 000052
【図２０Ａ】
2010537632.tif 000053
【図２０Ｂ】
2010537632.tif 000054
【図２１Ａ】
2010537632.tif 000055
【図２１Ｂ】
2010537632.tif 000056
【配列表】
2010537632000001.app
【国際調査報告】
2010537632.tif 000057
2010537632.tif 000058