(57)【要約】【課題】本発明は、末梢血液に存在するリンパ球を分離して、試験管内で増殖、活性化させる活性化リンパ球の製造方法に関する。【解決手段】本発明によると、ヒトの末梢血液リンパ球を、抗CD3抗体、IFN-γ及びIL-2が存在する状態で培養することにより、高効率の毒性細胞を大量培養することができる。本発明の製造方法により増殖された活性化リンパ球の場合、LAK cellの主成分であるCD3−CD56＋(ナチュラルキラー細胞マーカー)細胞と、CIK cellの主成分であるCD3＋CD56＋細胞とを全て含み、大量培養が可能であるため、LAK cellとCIK cellを単独使用した場合に比べ、著しく高い抗がん効果が期待できる。【選択図】図２
2010501173.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
末梢血液からリンパ球を採取して分離する段階と、
前記リンパ球を試験管内で、インターロイキン-2(IL-2)、インターフェロン-γ(IFN-γ)、及び抗CD3抗体の存在下で活性化リンパ球を培養する段階と、
前記活性化リンパ球を一定期間凍結保存する段階と、
前記凍結保存段階の細胞を融解、復元する段階と、を含む活性化リンパ球の製造方法。
【請求項２】
前記活性化リンパ球は、CD56＋及びNKG2D＋であることを特徴とする、請求項１に記載の活性化リンパ球の製造方法。
【請求項３】
前記活性化リンパ球は、CD56＋、NKG2D＋の他に、CD16＋をさらに含むことを特徴とする、請求項２に記載の活性化リンパ球の製造方法。
【請求項４】
前記活性化リンパ球は、CD4＋及びCD25＋の比率が3〜6％であることを特徴とする、請求項１に記載の活性化リンパ球の製造方法。
【請求項５】
前記抗CD3抗体は、培養容器に固形化して使用することを特徴とする、請求項１に記載の活性化リンパ球の製造方法。
【請求項６】
前記凍結保存は、凍結チューブ(tube)またはバッグ(bag)を使用して、0.5〜10.0×107細胞/凍結チューブ、0.05〜10.0×1010細胞/凍結バッグの細胞数として凍結することを特徴とする、請求項１に記載の活性化リンパ球の製造方法。
【請求項７】
抗CD3抗体、インターロイキン-2(IL-2)及びインターフェロン-γ(IFN-γ)を含む活性化リンパ球の培養用培地組成物。
【請求項８】
請求項１に記載の製造方法により増殖させた活性化リンパ球を有効成分として含有する細胞免疫治療剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性化リンパ球の製造方法に関し、さらに具体的に、ヒトの末梢血液に存在するリンパ球を分離し、試験管内(in vitro)でリンパ球を大量増殖及び活性化させて本人に投与するか、前記リンパ球を冷凍保存して、本人に免疫細胞の投与が必要な疾病の発生時、これを使用して細胞免疫治療剤として活用するための活性化リンパ球の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
人体内に存在する免疫細胞の中には、がん細胞またはウイルス感染細胞のように形質転換された細胞を認識して除去できるナチュラルキラー(NK)細胞とTリンパ球などが存在する。したがって、このような免疫細胞の機能を活用すれば、前記疾病に対する予防及び治療に効果があると期待される。しかし、癌患者の場合、手術、抗がん剤療法、放射線療法など、多様な抗がん治療により免疫体系が落ちているため、免疫細胞の機能が弱化されているか、その数があまりにも乏しいため、十分な抗がん効果を期待することは難しい。そのため、このような免疫細胞を体外で大量増殖及び活性化させて、再び患者本人に投与できれば、高い抗がん効果が得られると考えられる。抗がん活性化リンパ球(activated lymphocyte)細胞治療剤とは、体外でヒトの血液内に存在する免疫細胞を大量増殖及び活性化させて、再び本人に投与して癌を治療する抗がん免疫細胞治療剤の一つであって、樹状細胞(dendritic cells)を利用した抗がん免疫細胞治療剤と同様に、患者本人の免疫細胞を活性化して体内免疫を誘導する、個人個人に合わせた抗がん治療剤である。
【０００３】
腫瘍抗原が知られつつ、細胞毒性Tリンパ球(CTL)を利用して特異的に腫瘍細胞を除去することができるようになった[Rosenberg et al., 1999]。しかし、数々の癌種においてMHC class Iの発現が減少されており、このようなメカニズムにより、がん細胞は、CTLによる免疫監視(immune surveillance)から逃れる可能性があると知られている[Amiot et al., 1998]。その反面、 MHC class Iの欠如されたがん細胞は、NK細胞に対する感受性がさらに高くなる[Pawelec et al., 2004]。
【０００４】
NK細胞は、抗原認識無しに、がん細胞とウイルス感染細胞を除去することができる[Albertsson et al., 2003; Colucci et al., 2003; Smyth et al., 2002]。NK細胞の活性は、活性化受容体と抑制性受容体から発生する信号間の均衡によって調節される[Farag et al., 2003]。最もよく明かされた活性化リガンドは、NKG2Dリガンドである。この中、MHC class I-related chain A and B (MICA/B)の場合、熱衝撃(heat shock)、酸化的ストレス(oxidative stress)及びウイルス感染のようなストレスにより発現が誘導されて、UL-16 binding proteins (ULBPs)の場合、ウイルス感染により発現が誘導されると知られている[Vivier et al., 2002]。NKG2Dリガンドは、ストレスによる発現が誘導されて、種々の癌細胞株において多様な発現パターンを示す[Watzl et al., 2003]。
【０００５】
NKG2Dリガンドが、ストレスを受けた細胞あるいは形質転換された細胞を標識できる能力があることは、がん細胞のNK細胞に対する感受性が、活性化リガンドの発現調節によって制御できることを意味する。NKG2Dリガンドは、腫瘍細胞のNK細胞に対する感受性を増加させることができるため、MHC class I発現が正常的であっても、NKG2Dリガンドの発現が高いがん細胞を除去することができるようになる[Raulet et al., 2003]。したがって、NKG2Dリガンド発現量を増加させることができれば、NK, NKT, CD8+T及びγδ T細胞のようにNKG2D受容体を発現する細胞を利用した抗がん治療効果をさらに高めることができる。
【０００６】
1980年初、RosenbergグループがLAK細胞(lymphokine-activated killer cells: IL-2で活性化させたNK細胞)を利用して、黒色腫、腎細胞癌、淋巴腫、肺癌及び大腸癌などを対象として臨床試験を試みたが[Rosenberg et al., 1985]、LAK細胞の抗がん細胞毒性が比較的弱く、また大量の細胞を確保することが難しく、臨床に適用するには限界があった。これに対応し、Schmidt-Wolfらは、末梢血液単核球を、抗CD3抗体、IFN-γ、IL-1及びIL-2が存在する状態で培養することにより、高効率の毒性細胞を大量培養する技術を開発した[Schmidt-Wolf et al., 1991]。これをCIK (cytokine-induced killer)細胞というが、既存のLAK細胞に比べ、細胞毒性及び増殖速度が高い。この細胞群内で毒性効果を示す細胞は、CD56表面抗原に陽性の細胞であり、この中、CD3+CD56+細胞が全体の20〜30％程度であって、CD3-CD56+細胞(NK細胞の表面抗原)の比率は非常に低い(<10%)と知られている。しかし、CIK細胞を構成する細胞の腫瘍細胞に対する細胞毒性研究により、CD3+CD56+細胞よりCD3-CD56+細胞の殺害能力がさらに高いことが明かされた[Schmidt-Wolf et al., 1993; Lu et al., 1994; Scheffold et al., 1995]。したがって、LAK細胞とCIK細胞において抗がん効果が最も高い細胞は、NK細胞(CD3-CD56+)と判断される。
【０００７】
一方、MS Dilberらは、末梢血液単核球を、抗CD3抗体及びIL-2が存在する状態で培養することにより、CD3-CD56+細胞を大量培養する技術を開発した[Carlens et al., 2001]。これをCINK (cytokine-induced natural killer)細胞というが、既存のLAK細胞に比べ、増殖速度が高かった。しかし、この方法は、抗CD3抗体とIL-2が添加されたCellGro SCGM培地でのみ制限的にCD3-CD56+細胞を大量培養させることができた。
【０００８】
また、CD4+CD25+ regulatory T細胞は、一般に正常人の末梢血液単核球(PBMCs)に5%以下の比率で存在して、in vitroでT細胞の増殖を抑制すると知られている[K.E. Earle et al., 2005]。しかも、IL-2によりIn vitroで培養されたCIK細胞は、多い量のIL-10を分泌するCD4+CD25+ regulatory T細胞の増殖を誘導することにより、CTLの増殖を抑制して、細胞毒性を減少させることができる[Jan Schmidt et al., 2004]。特に、CD4+CD25+ regulatory T細胞は、CIKまたはNK細胞に発現されるNKG2D受容体の量を減少させて、活性化されたCD4+CD25+ regulatory T細胞により生成されるTGF-βがNK細胞の細胞毒性を抑制すると判明された[Francois G et al., 2005]。したがって、本発明では、PBMCから分化、増殖させた活性化自己リンパ球においてCD4+CD25+ regulatory T細胞の比率を5%以下に著しく低めることにより、体内で活性化自己リンパ球の機能向上を期待する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、本発明の主な目的は、ヒトの末梢血液から分離したリンパ球を、抗CD3抗体、IFN-γ及びIL-2が存在する状態で培養することにより、腫瘍細胞及びウイルス感染細胞に対する殺害能力に優れたCD56＋及びNKG2D＋細胞大量培養することができる活性化リンパ球の製造方法を提供することにある。
【００１０】
本発明の他の目的は、前記製造方法により増殖させた活性化リンパ球を有効成分として含有する細胞免疫治療剤組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、前記従来技術の問題点を克服するために鋭意研究した結果、本発明では、インターロイキン-2(IL-2)、インターフェロンγ(IFN-γ)、及び抗CD3抗体の存在下で活性化リンパ球を培養する場合、腫瘍細胞及びウイルス感染細胞に対する殺害能力に優れたCD56＋及びNKG2D＋細胞を大量培養することができることを確認し、本発明を完成した。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の一様態によると、本発明は、末梢血液からリンパ球を採取して分離する第1段階と、前記リンパ球を試験管内で、インターロイキン-2(IL-2)、インターフェロン−γ(IFN-γ)、及び抗CD3抗体の存在下で活性化リンパ球を培養する第2段階と、前記活性化リンパ球を一定期間凍結保存する第3段階と、前記凍結保存段階の細胞を融解、復元する第4段階とを含むことを特徴とする活性化リンパ球の製造方法を提供する。前記第3段階と第4段階の場合、前記第1段階と第2段階を通じて製造した活性化リンパ球の長期保存が必要な時に活用する。
【００１３】
本発明の前記第１段階は、末梢血液からリンパ球を採取して分離する段階を意味し、この場合、疾患または健康な状態における自分の末梢血液からリンパ球を採取し、採血方法としては、腕の静脈での採血が簡便且つ好ましいが、リンパ球を含有するものなら制限はない。採血量としては、０．００１ｍｌ乃至５００ｍｌ程度の末梢血液がよく、実用的には、１０ｍｌ乃至１００ｍｌ程度の範囲内の末梢血液の採取が好ましい。
【００１４】
本発明の前記第１段階で採血した末梢血液には、凝固が起こらないようにヘパリン、EDTAまたはクエン酸を添加することができる。採取した末梢血液からリンパ球を分離して、これを体外培養(in vitro上における培養)を通じて増殖、活性化することにより、本発明の活性化リンパ球を得ることができる。
【００１５】
本発明の前記第2段階は、前記第１段階で分離したリンパ球を活性化、増殖させる培養段階をいうが、第１段階で採取したリンパ球の培養法は、特に限定されるものではないが、IL-2、IFN-γ及び抗CD3抗体のいずれかを単独またはこれらを組み合わせて存在させることにより培養する。この場合、前記IL-2、IFN-γまたは抗CD3抗体を単独処理して培養するより、これらを組み合わせて存在させて培養することが抗がん効果にさらに優れた効果を発揮することができるため、IL-2、IFN-γと抗CD3抗体を組み合わせて培養した場合が最も好ましく、適当な抗原などを使用して、抗原特異的なTリンパ球などを誘導した後、さらにCD3抗体またはC28抗体または各種マイトジェン(mitogen)を使用して、抗原特異的な活性化リンパ球を得ることもできる。また、前記抗原は、抗原として精製されたものだけではなく、がん細胞やウイルスからの抽出物、がん細胞やウイルスそれ自体、またはこれらと交差反応性を有する類似抗原に対しても使用でき、この場合、リンパ球を増殖、活性化させる機能を有する物質ならいずれも使用できる。一方、上記のIL-2の代わりにIL-15を組み合わせて培養することも可能である。
【００１６】
本発明の前記第2段階で使用したIL-2とIFN-γは、市販のものが使用でき、培養用培地液に1〜2000U/mlの濃度で使用することが好ましく、生理食塩水、リン酸塩緩衝溶液、RPMI-1640, DMEM, IMDM, AIM-V(GIBGO,米国), X-Vivo(Cambrex), LGM, KBM-306(コージンバイオ(株)), CellGro(CellGenix) など、一般に広く使用される細胞培養用培地液に溶解して使用できる。一度溶解したものは、活性の低下を防止するために、冷蔵または冷凍保存が必要である。一方、培養用培地液としては、リンパ球細胞の培養に適合したものであれば特に制限はなく、RPMI-1640、DMEM、IMDM、AIM-V、X-Vivo、LGM、KBM及びCellGroなどが好ましく挙げられるが、AIM-V、CellGro、KGM及びX-Vivoなどのような無血清培地が特に好ましい。
【００１７】
前記第2段階で使用する培養用培地に血清を添加して使用することが増殖効果の面で好ましく、ここでは市販の牛の胎児及び正常人血清だけではなく、自己血清を使用することもできる。また、血清を含有しない無血清培地を使用することも可能である。培養は、一般的な細胞培養方法、例えば、CO2インキュベーター内で行うことができる。CO2濃度は、1〜10%範囲内であり、好ましくは、3〜7%範囲内にして、温度は、30〜40℃範囲内にして、特に35〜38℃が好ましい。
【００１８】
前記培養において、日数には特に制限がないが、抗CD3抗体の刺激情報が細胞に伝達されるのが前提とされるため、2〜28日程度が好ましく、特に3〜8日間行うことが、細胞に対して安定した刺激情報伝達ができると共に、培養効率の観点で理想的である。前記培養期間内には、顕微鏡で細胞状態を観察し、適当な細胞数を計測しつつ培養液を適宜添加することが、培養効率のために最も好ましい。また、前記培養では、通常培養開始1〜4日目には細胞増殖がないが、それ以後からは、細胞増殖が観察され、順調に増殖が起こって培養液がオレンジ色から黄色に変わり、培養液の追加添加量は、添加前の培養の培地液の量に対して0.1〜5倍程度の追加添加が好ましい。一方、前記追加添加の周期は、培養液の劣化及びIL-2活性の低下を防止するために、1〜7日、好ましくは2〜4日に1回ずつすることが必要である。
【００１９】
本発明の前記第2段階における培養は、IL-2とIFN-γを含有する培養用培地液に単核球細胞を浮遊させて、前記抗CD3抗体を固体化した培養容器に入れて培養を開始することができる。さらにこの場合、必要に応じて、培養液中に各種サイトカインとマイトジェンを添加して使用すると、前記リンパ球の増殖、活性化の効率がさらに向上する。また、前記リンパ球細胞の刺激に使用する前記抗CD3抗体は、動物または細胞で生産した抗体を精製して使用することができ、市販用OKT-3抗体を使用することもできる。しかし、これ以外も、前記リンパ球の増殖、活性化が促進できる抗体であれば特に制限はなく、抗CD28抗体なども使用できる。
【００２０】
本発明の前記第3段階は、前記活性化リンパ球を一定期間冷凍保管する凍結保存段階を言うが、保存するリンパ球は、その大きさなどによって、細胞保存液に懸濁する密度を適宜選択することができるが、1×103 個/ml〜1×1010 個/ml密度で保存液中に懸濁して、凍結保存することが求められる。また、この場合に使用される細胞保存液の量も定められていないが、便宜性を考慮すれば、0.1ml〜1000mlの範囲内で使用できるが、0.5ml〜100mlの範囲がより好ましい。本発明の前記第3段階における凍結保存液は、市販の細胞保存液を使用することができ、または自家調製して使用することもできる。細胞保存液の成分は、適当な緩衝液または基礎培地に血清やたんぱく質、多糖類などの高分子物質とジメチルスルホキシド(以下、DMSOという)を含むものが使用でき、保存される細胞によって、列挙した物質が必ずしも必要なわけではない。つまり、細胞保存が可能な保存液であれば、その組成に制限はない。リンパ球は、適切な細胞保存液に懸濁されて低温下に凍結保存される。製造された凍結保存液は、製造後から使用時まで冷蔵庫(4℃)に保存することができる。
【００２１】
本発明の活性化リンパ球の製造方法において、前記活性化リンパ球は、CD56＋及びNKG2D＋であることを特徴とする活性化リンパ球の製造方法であることが好ましい。本発明において、前記CD56＋は、殺害細胞(killer cell)マーカーであり、NKG2D＋は、リンパ球活性化受容体マーカーである。
【００２２】
本発明の実施例3の結果で示される図2のグラフのx軸は、CD3(T-リンパ球マーカー)を標識したもので、y軸は、CD56を標識したものであって、各グラフは、四つの区画に分かれて分析されるが、四つの区画の左上区画(O1領域)がCD3陰性、CD56陽性のNK細胞を表示する部分であり、右上区画(O2領域)が、CD3とCD56とが全て陽性であるリンパ球を表示する部分である。この二つの区画(01、02領域)の細胞が、抗がん効果を有するリンパ球を示す。したがって、このような分析によると、本発明の実施例通りにIL-2, IFN-γ及びCD3抗体を組み合わせて培養した場合、全ての実験群(G1〜G4)において殺害細胞表面細胞のCD56の発現比率が60%以上であった。また、全ての実験群(G1〜G4)において、T-リンパ球マーカーのCD3陰性の細胞の比率は50%以上であった。このような結果から、本発明で使用したAIM-V, CellGro, X-Vivo及びKBM培地の全てが、抗がん効果に優れた殺害細胞を大量培養するに有用であることが分かる。
【００２３】
一方、図3では、NK, NKT, CD8T, γδ T cellのようなリンパ球の活性化に関与すると知られている活性化受容体の一つであるNKG2D受容体の発現程度を調べた。図3のグラフのx軸は、NKG2Dを標識したもので、y軸は、CD56を標識したものであって、各グラフは、四つの区画で分かれて分析されるが、四つの区画の右上(O2領域)及び右下(O4領域)の二つの区画がNKG2D陽性のリンパ球を表示する部分であり、特に右上区画が、NKG2DとCD56とが全て陽性である活性化リンパ球を表示する部分である。したがって、このような分析によると、本発明の実施例通りにIL-2, IFN-γ及びCD3抗体を組み合わせて培養した場合、全ての実験群(G1〜G4)でNKG2Dに陽性のリンパ球数が90%以上であって、ほとんどの殺害細胞(CD56陽性細胞)でNKG2Dが陽性であった。このような結果から、本発明の製造方法通りに培養した活性化リンパ球は、腫瘍細胞やウイルス感染された細胞に対して高い活性を示すと判断される。
【００２４】
本発明の活性化リンパ球の製造方法において、前記活性化リンパ球は、CD56+、NKG2D+の他に、CD16+をさらに含むことを特徴とする活性化リンパ球の製造方法であることが好ましい。本発明において、前記CD16+は、Fc gamma RIIIマーカーである。
【００２５】
本発明の実施例3の結果で示される図4のグラフのｘ軸は、CD16を標識したもので、y軸は、CD56を標識したものであって、各グラフは、四つの区画に分かれて分析されるが、四つの区画の右上区画(P2領域)が、CD16とCD56とが全て陽性のリンパ球を表示する部分である。CD16表面抗原の場合、抗原依存性細胞性細胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxocity, ADCC)を誘導すると知られている。したがって、本発明の実施例通りに製造した細胞の場合、CD16表面抗原を発現している細胞の比率が、全ての実験群において40%以上であるため、CD16表面抗原がほぼ発現されていないと知られているCIK cellより著しく強力な抗がん効果を示すと判断される。
【００２６】
本発明の活性化リンパ球の製造方法において、前記活性化リンパ球は、好ましくは、CD4+及びCD25+の比率が3〜6％、さらに好ましくは、5％以下であることを特徴とする。
【００２７】
癌患者の末梢血液には、CD4及びCD25陽性の細胞が正常人に比べ2.5倍高く存在すると知られており[Anna Maria Wolf et al, 2003]、癌患者だけではなく、正常人の末梢血液から培養して得たCIK(cytokine-induced killer)細胞においても、CD4及びCD25が陽性の細胞が増加すると知られている。即ち、正常人のCIKであっても、抗CD3抗体(またはOKT-3)とIL-2を添加して培養すると、CD4及びCD25が陽性である細胞の比率が、培養前は0.5±0.07%であったが、14日間培養後35.5±8.4%まで増加すると報告されている(図6参照)[Jan Schmit et al., 2004]。しかし、本発明では、癌患者の末梢血液から分離したリンパ球において、CD4及びCD25陽性の細胞が10%以上であったが、IFN-γ、抗CD3抗体及びIL-2を添加して21日間培養した活性化リンパ球では、CD4及びCD25陽性の細胞の比率が5%以下で、正常水準に減少した(図7参照)。
【００２８】
本発明の活性化リンパ球の製造方法において、前記抗CD3抗体は、培養容器に固形化して使用することを特徴とする活性化リンパ球の製造方法であることが好ましい。
【００２９】
本発明の前記抗CD3抗体は、培養用培地液に含有させて使用することが好ましいが、リンパ球の増殖効率、操作容易性の観点で、固形化して使用してもよい。抗体を固形化する器具としては、ガラス、ポリウレタン、ポリオレフィン、ポリスチレンなどの材質の培養容器が挙げられる。この場合、入手容易なものとして、市販用プラスチック製の細胞培養フラスコなどを使用することもでき、その大きさは、適宜選択できる。固形化は、前記抗CD3抗体の希釈液を前記固形化した器具に添加して、例えば、4〜37℃で2〜24時間放置して使用することができる。また、前記抗CD3抗体の固形化には、滅菌したリン酸塩緩衝液などの生理的な緩衝液中に抗CD3抗体を0.1〜30μg/mlの濃度で希釈して使用する。固形化後、使用時まで冷房と冷蔵庫(4℃)に保存することができ、この場合は、使用時、液を除去して、必要に応じ常温の前記リン酸塩緩衝液などの生理的な緩衝液に洗浄して使用できる。
【００３０】
本発明の図１は、培養6、10、15、21日目に活性化リンパ球数を計測した結果である。培養条件別に、G1及びG5は、AIM-V、G2及びG6は、CellGro、G3及びG7は、X-Vivo、そしてG4及びG8は、KBM培地を培養培地として使用した。培養21日目に活性化リンパ球数を計測した結果、培養初期のリンパ球数に比べ、抗CD3抗体を培養用培地に含有させて培養した時(G1〜G4)、活性化リンパ球数が平均168倍増加して、抗CD3抗体の固形化フラスコで培養した時(G5〜G8)、平均338倍増加した。上記の結果のように、抗CD3抗体の固形化フラスコで培養した時、細胞増殖率が2倍程度高く、AIM-V、CellGro、X-Vivo及びKBM培地のいずれにおいても活性化リンパ球の大量培養が可能であった。
【００３１】
また、抗CD3抗体の固形化フラスコを利用した場合と、抗CD3抗体を培養用培地液に含有させて培養した場合との細胞増殖及び活性化程度を比較してみた。抗CD3抗体の固形化フラスコで培養した時、増殖程度が2倍程度高く、培養21日目にCD3、CD16、CD56及びNKG2Dに対する表面抗原を分析した時、培養条件による差異はほとんどなかった。
【００３２】
本発明の活性化リンパ球の製造方法において、前記凍結保存は、凍結チューブ(tube)またはバッグ(bag)を使用して凍結する細胞数は、0.5〜10.0 × 107細胞/凍結チューブ、0.05〜10.0×1010細胞/凍結バッグであることを特徴とする活性化リンパ球の製造方法であることが好ましい。
【００３３】
本発明の凍結細胞が保存される凍結容器は、市販の細胞凍結チューブまたはバッグのいずれも使用可能であり、その大きさは適宜選択できる。凍結する細胞の数は、各凍結チューブ当たり、0.5〜10.0× 107個が適しており、凍結するチューブの数は、採血量によって異なってくるが、2〜1000個の単位数まで保存可能である。凍結バックの場合、各凍結バッグ当たり、0.05〜10.0×1010個が適しており、凍結するバッグの数は、採血量によって異なってくるが、1〜10個の単位数まで保存可能である。そして、使用時にこれを解凍、融解して復元して投与する。特別な場合は、解凍、融解後すぐに投与することも可能である。
【００３４】
本発明の活性化リンパ球の製造方法において、前記一定期間は、最大15年であって、必要に応じて、適切な時期に解凍、融解及び復元することができ、長期間凍結保存できることを特徴とする活性化リンパ球の製造方法であることが好ましい。前記凍結保存された活性化リンパ球は、当業者が実施できるあらゆる細胞凍結保存方法により保管可能であるが、本発明の実施例のように、controlled rate freezing systemを利用して、一次的に凍結容器の温度を−70〜−90 ℃(−1℃/minずつ減少)まで落とした後、窒素タックに移して保管する場合、15年以上保管が可能である。
【００３５】
本発明の凍結保存の場合、冷凍庫、超低音冷凍庫または窒素タックなどにより凍らせることができるが、リンパ球の安定性と増殖効率の面でcontrolled rate freezing systemを使用することが好ましい。前記controlled rate freezing systemは、市販のものが使用できるが、直接開発して使用することもできる。また、前記controlled rate freezing systemで凍結細胞を保管する期間は、0〜30日範囲内であり、好ましくは、0〜7日の範囲にすることが好ましい。ここで0日とは、controlled rate freezing systemで凍結保管期間が1〜24時間であることを意味する。上記の期間とは、活性化リンパ球を長期間保管できる窒素タンクに移す直前の予備凍結(preliminary freezing)期間を意味する。前記controlled rate freezing systemから窒素タンクに移す時は、caneや凍結チューブボックスを含めて窒素タックにはいれるものなら、いずれの市販のものを使用してもよい。
【００３６】
本発明の他の様態によると、本発明は、抗CD3抗体、インターロイキン-2(IL-2)及びインターフェロン-γ(IFN-γ)を含む活性化リンパ球の培養用培地組成物を提供する。従来のCD3-CD56+細胞を培養する技術は、抗CD3抗体とIL-2が添加されたCellGro SCGM培地でのみ制限的に培養することができるが、本発明では、IL-2及び抗CD3抗体の他にIFN-γを新たに追加して、CellGro SCGMの他に、AIM-V、CellGro DC、KBM-306及びX-Vivo培養培地でもCD3-CD56+細胞を大量培養することができる。
【００３７】
本発明の他の様態によると、本発明の製造方法により増殖させた活性化リンパ球を有効成分として含有する細胞免疫治療剤組成物を提供する。
【００３８】
本発明における細胞免疫治療剤とは、体外で人の血液内に存在する免疫細胞を大量増殖及び活性化させて、再び本人に投与して癌を治療する抗がん免疫細胞治療剤の一つであって、樹状細胞(dendritic cells)を利用した抗がん免疫細胞治療剤と同様に、患者本人の免疫細胞を活性化して体内免疫を誘導する、個人個人に合わせた抗がん治療剤である。
【００３９】
本発明では、正常人だけではなく、末期がん患者の末梢血液リンパ球を抗CD3抗体、IFN-γ及びIL-2が存在する状態で培養した時、ほぼ等しい活性を有する活性化リンパ球を大量増殖することができた。また、本発明の製造方法により得られた活性化リンパ球を長期間凍結保管しておいてから融解、復元した時、細胞生存率及び活性度が維持された。したがって、本発明は、疾患者及び健康なヒトの末梢血液に存在するリンパ球を分離し、試験管内(in vitro)で増殖及び活性化させて患者本人に投与するか、前記リンパ球を冷凍保存して、本人に免疫細胞の投与が必要な疾病の発生時、これを融解、復元して細胞免疫治療剤として活用することができる。
【００４０】
本発明の細胞免疫治療剤組成物は、当業界に一般的な剤形、例えば、注射剤の形で製造でき、外科手術的に癌部位に直接移植するか、静脈に投与され癌部位に移動することができる。本発明の組成物は、疾病の類型、投与経路、患者の年齢及び性、並びに疾病の程度によって変わるが、好ましくは、平均成人の場合、1 ×107〜1011細胞を投与する。
【００４１】
本発明によると、ヒトの末梢血液リンパ球を抗CD3抗体、IFN-γ及びIL-2が存在する状態で培養することにより、高効率の毒性細胞を大量培養することができる。本発明の製造方法により増殖された活性化リンパ球の場合、LAK cellの主成分であるCD3-CD56+(NK細胞マーカー)細胞と、CIK cellの主成分であるCD3+CD56+細胞とを全て含み、大量培養することができるため、LAK cell及びCIK cellを単独使用した場合より、著しく高い抗がん効果が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】活性化リンパ球の培養6、10、15、21日目に活性化リンパ球数を計測した結果である。
【図２】フローサイトメトリーを利用して、培養条件別に活性化リンパ球のCD3及びCD56に対する表面抗原を検査したグラフである。
【図３】フローサイトメトリーを利用して、培養条件別に活性化リンパ球のNKG2D及びCD56に対する表面抗原を検査したグラフである。
【図４】フローサイトメトリーを利用して、培養条件別に活性化リンパ球のCD16及びCD56に対する表面抗原を検査したグラフである。
【図５】フローサイトメトリーを利用して、活性化リンパ球の凍結前・後のCD3及びCD56、NKG2D及びCD56、CD16及びCD56に対する表面抗原を検査したグラフである。
【図６】フローサイトメトリーを利用して、培養0日、14日、21日目に活性化リンパ球のCD4及びCD25に対する表面抗原を分析した結果である。
【図７】正常人のCIK(cytokine-induced killer)細胞において、抗CD3抗体とIL-2を添加して培養した時、CD4及びCD25が陽性である細胞の比率を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明がこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４４】
実施例１：採血及びリンパ球の分離
ヒトの静脈から末梢血液を10〜100ml採血し、無菌状態で血液を採取した。この際、採血容器としては、ヘパリンまたはEDTAのような抗凝固剤が含まれた採血チューブまたはバッグを利用した。その後、50ml遠心管に注入して、同量のリン酸塩緩衝液(PBS)を添加してよく混合した。Histopaque-1077溶液(Sigma)を、50ml遠心管にリン酸塩緩衝液で希釈した血液と1：2〜1：4の比率となるように入れた後、リン酸塩緩衝液で希釈した血液を遠心管に液面を乱さないように徐々に入れて、回転数400×g、常温条件下で30分間遠心分離した後、リンパ球画分を分離した。その後、適当量のリン酸塩緩衝液で3回遠心洗浄した。最後の遠心洗浄後、上澄み液を除去して、リンパ球を、リン酸塩緩衝液でリンパ球沈殿物をよく浮遊させてtrypan blue溶液を利用してリンパ球数を測定した結果、総細胞数は、2.0× 107〜2.0×108個であった。
【００４５】
実施例２：抗CD3抗体の固形化フラスコの調製
リン酸塩緩衝液に5μg/mlに調製した抗CD3抗体(オルソクローンOKT3注射液、製造者：Ortho Biothech)10mlを底面積225cm2の培養用フラスコに入れて、底面に溶液が均一に広がるようにした。翌日、フラスコの抗体溶液を吸引機で吸い込み、リン酸塩緩衝液で3回洗浄して、抗CD3抗体の固形化フラスコを調製した。
【００４６】
実施例３：活性化リンパ球の培養
本発明では、培養条件による活性化リンパ球増殖率及び活性化程度を比較してみた。そこで、培養条件別に培養培地の種類を異ならせて、前記リンパ球懸濁液を、1000U/ml IFN-γ(Leucogen, LG生命科学)と1〜5％ヒト血清が含有された適切な培地(G1: AIM-V(GIBGO, 米国)、G2: CellGro(CellGenix)、G3: KBM(コージンバイオ(株))、G4: X-Vivo(Cambrex))50ml内にそれぞれ入れて、よく転倒混和して、細胞培養用フラスコ容器にそれぞれ入れて、37℃、5% CO2存在下で培養した。培養24時間以後、フラスコ容器内の培養液を回収して、新しいT225cm2フラスコ容器に移して、500U/ml IL-2(Proleukin, CHIRON)と50ng/ml 抗CD3抗体(Orthoclone, Ortho Biotech)をそれぞれのフラスコ容器に添加した。一方、培養条件別に、前記実施例2で製造した抗CD3抗体の固形化フラスコを利用した場合と、抗CD3抗体を培養用培地液に含有させて培養した場合との細胞増殖及び活性化程度を比較してみた。5日後、培養条件別にフラスコ容器内の培養液を回収して、新しいT225cm2 フラスコ容器に移して、IL-2が含まれた培養用培地(以下、培養培地という)を50mlずつ追加して、37℃、5% CO2存在下で培養した。また、4日後、培養培地をそれぞれのフラスコに100mlずつ添加して、37℃、5%濃度の炭酸ガス存在下で培養した。培養期間中、2〜3日間隔で500U/mlインターロイキン2を添加して、活性化リンパ球の過密度現象を防ぐために培養14〜15日目にフラスコ容器の数を増やしつつ、37℃、5% CO2存在下で21日間培養することにより、活性化リンパ球5.0×108〜5.0×1010個を得た。
【００４７】
図2〜4は、フローサイトメトリーを利用して、培養条件別に培養21日目に活性化リンパ球の表面抗原を調べた結果であるが、図2は、CD3及びCD56、図3は、NKG2D及びCD56、図4は、CD16及びCD56に対する表面抗原を分析した結果である。図2〜4において、G1は、AIM-V、G2は、CellGro、G3は、X-Vivo、G4は、KBM培地を培養培地として使用した。また、抗CD3抗体の固形化フラスコを利用して、条件別に培養21日目に活性化リンパ球のCD3及びCD56、NKG2D及びCD56、CD16及びCD56に対する表面抗原を調べた結果、各表面抗原の発現程度が、抗CD3抗体を培養用培地液に含有させて培養した時とほぼ等しかった。
【００４８】
本発明の製造方法により活性化リンパ球を製造する時、凍結、保存しておいた末梢血液リンパ球を、抗CD3抗体、IL-2及びIFN-γが存在する状態で培養しても、リンパ球の増殖及び活性化がよくなされた。
【００４９】
実施例４：活性化リンパ球における免疫抑制T細胞CD4＋/CD25＋の比率
本発明では、免疫寛容を誘導する免疫抑制T細胞の一つであるCD4＋/CD25＋の発現程度を、フローサイトメトリーを利用して培養時期別に調べた。図6は、フローサイトメトリーを利用して、培養0日、14日、21日目に活性化リンパ球のCD4及びCD25に対する表面抗原を分析した結果である。CD4及びCD25の発現程度は、培養するにつれて減少して、21日間培養後には、正常水準(5%以下)に減少した(図6)。
【００５０】
実施例５：活性化リンパ球の凍結保存
培養条件別に前記第3段階で得られた培養21日目の活性化リンパ球を回収して、遠心分離した後、それぞれの前記培養用培地を除去して、活性化リンパ球沈殿物を得た。前記活性化リンパ球沈殿物を細胞保存液(7〜15% DMSO, 0.1〜10% penta-starch, 0.1〜10 % heparin及び1〜20% albuminが含まれたMedium199)とよく混合した後、培養条件別に10個の1.8mlの細胞保存用チューブ(corning)にそれぞれ1.0mlずつ分株した。その後、controlled rate freezing systemを利用して凍結チューブの温度を−90℃(−1℃/minずつ減少)まで落とし、窒素タンクに移して保管した。
【００５１】
実施例６：凍結保存活性化リンパ球の融解、検査
保管60日後、前記第4段階で凍結保存しておいたチューブを、培養条件別に三つの凍結チューブをそれぞれ取り出して、25〜37℃恒温水槽で1〜4分間解凍して、細胞保存液を除去するために、培地を利用して3回洗浄し、前記培養用培地で懸濁した。その後、trypan blue溶液を利用して生存率を測定した結果、生存率は、培養条件別に70〜80％の範囲を示した(表１)。一方、前記活性化リンパ球懸濁液を、培養条件別にそれぞれT75cm2フラスコ容器で37℃、5% CO2存在下で2〜3日間培養後、活性化リンパ球の生存率を検査した結果、生存率は95%以上であって、CD3、CD16、CD56とNKG2Dに対する表面抗原分析結果、凍結保存前・後の各表面抗原に対する比率がほぼ類似であった。このような結果から、長期間の凍結保存が活性化リンパ球の活性度にあまり影響を及ぼさないことが分かる(図5)。
【００５２】
【表１】
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【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明によると、既存の活性化リンパ球の製造上の限界点を克服するために、ヒトの末梢血液から分離したリンパ球を、抗CD3抗体、IFN-γ及びIL-2が存在する状態で培養することにより、腫瘍細胞及びウイルス感染細胞に対する殺害能力に優れたCD56＋及びNKG2D＋細胞を大量培養することができる製造方法を開発した。したがって、上記の方法により増殖及び活性化させた活性化リンパ球を細胞免疫治療剤として活用することにより、抗癌効果を著しく高めることができる。また、本人の健康な時の末梢血液リンパ球で増殖及び活性化させた活性化リンパ球を長期間冷凍、保管することにより、以後、免疫細胞の投与が必要な疾病の発生時、それを細胞免疫治療剤として活用して疾病を治療することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年12月5日(2008.12.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
末梢血液からリンパ球を採取して分離する段階と、
前記リンパ球を試験管内で、インターロイキン-2(IL-2)、インターフェロン-γ(IFN-γ)、及び抗CD3抗体の存在下で活性化リンパ球を培養する段階と、
前記活性化リンパ球を一定期間凍結保存する段階と、
前記凍結保存段階の細胞を融解、復元する段階において、
前記活性化リンパ球は、４７％以上のCD3-CD56+、３〜６％CD4+CD25+を含むことを特徴とする、活性化リンパ球の製造方法。
【請求項２】
前記活性化リンパ球は、NKG2D＋をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の活性化リンパ球の製造方法。
【請求項３】
前記活性化リンパ球は、CD16＋をさらに含むことを特徴とする、請求項２に記載の活性化リンパ球の製造方法。
【請求項４】
前記抗CD3抗体は、培養容器に固形化して使用することを特徴とする、請求項１に記載の活性化リンパ球の製造方法。
【請求項５】
前記凍結保存は、凍結チューブ(tube)またはバッグ(bag)を使用して、0.5〜10.0×107細胞/凍結チューブ、0.05〜10.0×1010細胞/凍結バッグの細胞数として凍結することを特徴とする、請求項１に記載の活性化リンパ球の製造方法。
【請求項６】
請求項１に記載の製造方法により増殖させた活性化リンパ球を有効成分として含有する細胞免疫治療剤組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
本発明の実施例3の結果で示される図2のグラフのx軸は、CD3(T-リンパ球マーカー)を標識したもので、y軸は、CD56を標識したものであって、各グラフは、四つの区画に分かれて分析されるが、四つの区画の左上区画(O1領域)がCD3陰性、CD56陽性のNK細胞を表示する部分であり、右上区画(O2領域)が、CD3とCD56とが全て陽性であるリンパ球を表示する部分である。この二つの区画(01、02領域)の細胞が、抗がん効果を有するリンパ球を示す。したがって、このような分析によると、本発明の実施例通りにIL-2, IFN-γ及びCD3抗体を組み合わせて培養した場合、全ての実験群(G1〜G4)において殺害細胞表面細胞のCD56の発現比率が60%以上であった。また、全ての実験群(G1〜G4)において、T-リンパ球マーカーのCD3陰性の細胞の比率は50%以上で、CD3-CD56＋NKの細胞の比率は４７％以上であった。このような結果から、本発明で使用したAIM-V, CellGro, X-Vivo及びKBM培地の全てが、抗がん効果に優れた殺害細胞を大量培養するに有用であることが分かる。
【国際調査報告】
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