(57)【要約】  本発明の実施形態は、単一指示薬系を用いて同時に２つの分析物を測定し得る光学センサーに向けられる。好ましい実施形態では、センサーは、レシオメトリックｐＨ感知を促す酸形態及び塩基形態を有する蛍光染料を含み、この場合、染料はグルコース結合部分とさらに会合され、そしてグルコースの濃度に伴って強度が変わるシグナルを生じる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つ又はそれより多くの分析物濃度を決定するためのデバイスであって、
第一分析物の濃度に応じて少なくとも第一及び第二の異なる形態で存在するフルオロフォアであって、前記異なる形態がそれらのそれぞれの第一の放出及び第二の放出に基づいて区別され得るフルオロフォアと
第二分析物を結合する結合部分であって、該結合部分が前記フルオロフォアと操作可能的に結合され、そして前記結合部分による前記第二分析物の結合が前記第二分析物の濃度に関連づけられる前記フルオロフォアの見掛けの濃度における光学的変化を引き起こす結合部分とを含む指示薬系を含み、前記第一の放出及び前記第二の放出の比は前記第二分析物の濃度とは無関係である、光学センサーと、
光源と、
検出器と、
を包含するデバイス。
【請求項２】
前記フルオロフォアが蛍光染料である請求項１記載のデバイス。
【請求項３】
前記蛍光染料が独立した化合物である請求項２記載のデバイス。
【請求項４】
前記蛍光染料がＨＰＴＳ、ＳＮＡＲＦ−１、ＳＮＡＦＬ−１、ＴＳＰＰ及びその誘導体から選択される請求項３記載のデバイス。
【請求項５】
前記蛍光染料が、ＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡ、ＨＰＴＳ−ＬｙｓＭＡ及びそれで構成されるポリマーから成る群から選択される請求項２記載のデバイス。
【請求項６】
前記結合部分が消光剤、及び第二分析物を可逆的に結合するための１つ又は複数の結合部位を含む請求項１記載のデバイス。
【請求項７】
前記消光剤がビオロゲンである請求項６記載のデバイス。
【請求項８】
前記１つ又は複数の結合部位がベンジルボロン酸基を含む請求項６記載のデバイス。
【請求項９】
前記結合部分がビオロゲン−ボロン酸付加物である請求項1記載のデバイス。
【請求項１０】
前記結合部分が３，３’−ｏＢＢＶ又はその誘導体である請求項１記載のデバイス。
【請求項１１】
前記光学センサーが生理学的適合性物質を含み、血管内配置のための大きさに作られる請求項１記載のデバイス。
【請求項１２】
前記第一分析物がＨ+（ｐＨ）である請求項１記載のデバイス。
【請求項１３】
前記第二分析物がポリヒドロキシル化合物である請求項１記載のデバイス。
【請求項１４】
前記ポリヒドロキシル化合物がグルコースである請求項１３記載のデバイス。
【請求項１５】
制御装置をさらに包含する請求項1記載のデバイス。
【請求項１６】
前記指示薬系が前記フルオロフォア及び前記結合部分を固定するための手段をさらに包含する請求項1記載のデバイス。
【請求項１７】
前記固定するための手段がヒドロゲルを包含する請求項１６記載のデバイス。
【請求項１８】
前記指示薬系の前記フルオロフォア及び結合部分が単一分子を含む請求項1記載のデバイス。
【請求項１９】
血中ｐＨ及びグルコース濃度を決定するためのデバイスであって、
血管内配置のための大きさに作られる光ファイバーを含むセンサーであって、
水不溶性ポリマーマトリックスであって、該ポリマーマトリックスはグルコースに対して透過性である水不溶性ポリマーマトリックス；
前記ポリマーマトリックスと会合される蛍光染料であって、該蛍光染料はｐＨに応じて少なくとも第一及び第二の異なる形態を示し、該異なる形態はそれらのそれぞれの第一の放出及び第二の放出に基づいて区別され得る蛍光染料；
血中グルコース濃度に関連づけられる量のグルコースを可逆的に結合するようになっている芳香族ボロン酸置換ビオロゲンを含む消光剤であって、該消光剤は前記ポリマーマトリックスと会合されかつ蛍光染料と操作可能的に結合され、そして該消光剤は結合ポリヒドロキシル化合物の量に関連づけられる前記蛍光染料により放出される光を調整するよう設計される、消光剤、
をさらに含むセンサーと、
少なくとも１つの励起光源と、
放出光検出器と、
を包含するデバイス。
【請求項２０】
一蛍光染料による血中ｐＨ及びグルコース濃度の決定方法であって、
請求項1〜１９のいずれかに記載のデバイスを提供するステップと、
血管内に前記センサーを挿入するステップと、
第一の励起波長で前記センサーを照射するステップと、
放出波長で前記センサーの第一の蛍光放出を検出するステップと、
第二の励起波長で前記センサーを照射するステップと、
前記放出波長で前記センサーの第二の蛍光放出を測定するステップと、
前記血中ｐＨをレシオメトリック決定するステップと、
ｐＨに関して補正された前記血中グルコース濃度を決定するステップと、
を包含する方法。
【請求項２１】
前記第一の蛍光放出及び前記第二の蛍光放出の強度の比を算定するステップと、
前記比をｐＨ標準曲線と比較することにより前記試料のｐＨを決定するステップと、
決定ｐＨに対応している標準グルコース応答曲線を選択するステップと、
前記第一の蛍光放出又は前記第二の蛍光放出を前記標準グルコース応答曲線と比較することによりグルコース濃度を決定するステップと、
をさらに包含する請求項２０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の実施形態は、単一指示薬系を用いて同時に２つの分析物を測定し得る光学センサーに関する。好ましい実施形態では、センサーは、レシオメトリックｐＨ感知を促す酸形態及び塩基形態を有する蛍光染料を含み、この場合、染料はグルコース結合部分とさらに会合され、そしてグルコースの濃度に伴って強度が変わるシグナルを生じるように構成される。
【背景技術】
【０００２】
体液中のポリヒドロキシル化合物（例えばグルコース）濃度を測定するための蛍光技法を用いるために、長年に亘って努力がなされており、今も進行中である。しかしその努力にもかかわらず、ｉｎ  ｖｉｖｏモニタリングのための実用的な系は開発されておらず、市販されていない。ボロン酸基と会合された染料を用いて蛍光によりグルコースを検出するためにいくつかの試みがなされてきた。ボロン酸塩部分は、グルコースを可逆的に結合する。ボロン酸官能基化蛍光染料がグルコースを結合する場合、グルコースの濃度に関連したシグナルが発生され、そして検出され得るよう、染料の特性は影響を及ぼされる。これらの変化は、グルコース濃度を測定するために従来用いられてきた。
【０００３】
Russell（特許文献１及び特許文献２）は、グルコースを結合し、グルコース濃度に関連したシグナルを発生するボロン酸官能基化染料を用いた。James他（特許文献３）は、同様の原理を用いたが、しかし単一複合体中で蛍光染料、アミン消光機能性及びボロン酸を組み合せた。複合体からの蛍光放出は、結合しているグルコースの量に伴って変化した。Van Antwerp他（特許文献４及び特許文献５）は、前に引用した参考文献の特徴を組み合せ、そして埋め込み可能であると主張されるデバイスを開示している。A.E. Colvin, Jr.（特許文献６）も、ボロン酸塩官能基化染料を利用するヒトにおけるｉｎ  ｓｉｔｕ感知のための光学ベースの感知デバイスを開示している。
【０００４】
血液又は体液を用いる或る測定可能なパラメーター、例えばｐＨ並びにＯ2、ＣＯ2、Ｎａ+、Ｋ+及びポリヒドロキシル化合物、例えばグルコースの濃度は、ｉｎ  ｖｉｖｏで決定されている。患者をモニタリングする場合、このような分析物をしばしば決定することが必要であるため、これらの測定をｉｎ  ｖｉｖｏで実行する能力は重要である。典型的には、各分析物に関する一センサーは、患者の血管（単数又は複数）中に配置されている。いくつかの分析物を測定することが望ましい場合、複数のセンサーがしばしば必要とされ、これが患者に対する付随的不快並びに電子モニタリング装置の複雑性を生じ得る。
【０００５】
ｉｎ  ｖｉｖｏモニタリングのための物理的寸法の制限により持ち出されるデザイン問題を解決しようと努力して、異なる染料を１つのデバイスに組み入れて、２つのパラメーターの同時読取を得た人達もいた。例えばAlder他（特許文献７）は、１つのセンサーで２つの異なる染料を用いて水性試料のｐＨ及びイオン強度を光学的に決定する方法を開示している。Gray他（特許文献８）は、固定化ｐＨ感受性染料及びカリウム又はカルシウム感受性蛍光染料を伴う親水性ポリマーを組み入れて、ｐＨと一緒に分析物濃度を測定する光ファイバーデバイスの使用を教示している。特許文献９において、Kaneも、血中のｐＨ及び酸素含量の同時測定のための複合膜中に埋め込まれた２つの染料の使用を開示している。しかしながら、単一センサー中への多数の染料の組み入れは、このようなセンサーの製造を複雑にする。
【０００６】
特に集中治療設定において、モニタリングされている各分析物に関する別個の留置センサー、並びに多染料センサーに関連した上記の問題に加えて、多数の染料ベースの分析物
センサーに関連した別の問題は、ｐＨ感受性である。ｐＨにおけるわずかな変化は、蛍光放出を変更するか又は弱め、そして不正確な読取を引き起こし得る。この問題は、その血中ｐＨが急速に変動し得る糖尿病患者における血中グルコースレベルをモニタリングするためには特に深刻である。正確な血中グルコースレベル測定はこれらの患者を治療するためには不可欠であるため、別個の留置型ｐＨ及び分析物センサー、又は多染料を有するセンサーを必要とせずに、ｐＨ作用の実時間補正を促すグルコースセンサーに対する有意の必要性が存在する。
【０００７】
蛍光染料（単数又は複数）を用いるレシオメトリックｐＨ決定が知られている。酸形態及び塩基形態を有するフルオロフォアを考えると、２つの形態の放出強度の比は、フルオロフォア濃度に対して非感受性であるｐＨの測定値として用いられ得る。例えば、特許文献１０（ＨＰＴＳ由来ｐＨ感受性染料を記載）（この記載内容の全体は参照により本明細書中で援用される）；非特許文献１（蛍光レシオメトリック測定のための指示薬としてのｐＨ感受性染料  メソ−５，１０，１５，２０−テトラ−（４−アリルオキシフェニル）ポルフィリン（ＴＡＰＰ）、並びに参照としてのｐＨ非感受性ベンゾチオキサンテン誘導体を記載）；非特許文献２（フルオロフォア、カルボキシセミナフトロダフルオル−１を用いる二重放出レシオメトリック画像法（その放出スペクトルのｐＨ依存性シフトを示す）を開示）；並びに非特許文献３（波長−レシオメトリック的方法でのｐＨに伴うスペクトルシフト及び強度変化を示す６−アミノキノリニウムボロン酸染料の使用を記載）参照。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第５，１３７，８３３号
【特許文献２】米国特許第５，５１２，２４６号
【特許文献３】米国特許第５，５０３，７７０号
【特許文献４】米国特許第６，００２，９５４号
【特許文献５】米国特許第６，０１１，９８４号
【特許文献６】米国特許第６，３０４，７６６号
【特許文献７】米国特許第５，９２２，６１２号
【特許文献８】米国特許第５，１７６，８８２号
【特許文献９】米国特許第４，７８５，８１４号
【特許文献１０】米国特許出願公開第２００５／００９００１４号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Niu C.G. et al. 2005 Anal. Bioanal. Chem. 383(2): 349-357
【非特許文献２】Turner N.G. et al. 1998 J. Investig. Dermatol. Symp. Proc. Aug 3(2): 110-3
【非特許文献３】Badugu R. et al. 2005 Talanta 66: 569-574
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、ｐＨ及びグルコースの連続血管内モニタリング（この場合、グルコース測定値はｐＨ作用に関して補正され得る）を提供するよう適合されたセンサーに対する実質的に満たされていない必要性についての本発明者の認識にもかかわらず、フルオロフォア濃度と無関係であるレシオメトリックｐＨ測定を実行するのに適した特性を示す単一フルオロフォアを含むセンサーを用いる（この場合、同一フルオロフォアはグルコースを結合し、そしてその強度がグルコース濃度と関連するシグナルを生じるよう官能基化される）ことを開示した人はいないし、示唆することさえなされていない。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の好ましい実施の形態によれば、２つ又はそれより多くの分析物濃度を決定するためのデバイスが開示される。デバイスは、光学センサーであって、第一分析物の濃度に応じて少なくとも第一及び第二の異なる形態で存在するフルオロフォアであって、異なる形態がそれらのそれぞれの第一の放出及び第二の放出に基づいて区別され得るフルオロフォア；第二分析物を結合する結合部分であって、結合部分がフルオロフォアと操作可能的に結合され、そして結合部分による第二分析物の結合が第二分析物の濃度に関連づけられるフルオロフォアの見掛けの濃度における光学的変化を引き起こす結合部分を含む指示薬系を含む光学センサーであって、第一の放出及び第二の放出は第二分析物の濃度とは実質的に無関係である、センサーと、光源と、検出器とを包含する。
【００１２】
いくつかの実施の形態では、フルオロフォアが蛍光染料である。いくつかの実施の形態では、蛍光染料が独立した化合物である。いくつかの好ましい別個の蛍光染料がＨＰＴＳ、ＳＮＡＲＦ−１、ＳＮＡＦＬ−１、ＴＳＰＰ及びその誘導体から選択され得る。
【００１３】
いくつかの実施の形態では、好ましい蛍光染料がＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡ、ＨＰＴＳ−ＬｙｓＭＡ及びそれで構成されるポリマーから成る群から選択される。
【００１４】
いくつかの実施の形態による結合部分が消光剤並びに第二分析物を可逆的に結合するための１つ又は複数の結合部位を含む。消光剤が好ましくはビオロゲンである。１つ又は複数の結合部位が好ましくはベンジルボロン酸基を含む。いくつかの実施の形態では、結合部分がビオロゲン−ボロン酸付加物である。好ましい一実施の形態では、結合部分が３，３’−ｏＢＢＶ又はその誘導体である。
【００１５】
好ましい実施の形態では、光学センサーが生理学的適合性物質を含み、血管内配置のための大きさに作られる。
【００１６】
一実施の形態では、第一分析物がＨ+（ｐＨ）である。別の実施の形態では、第二分析物がポリヒドロキシル化合物、好ましくはグルコースである。
【００１７】
いくつかの実施の形態では、デバイスは制御装置をさらに包含する。
【００１８】
特定の好ましい実施の形態による指示薬系がフルオロフォア及び結合部分を固定するための手段をさらに包含する。固定手段が好ましくはヒドロゲルを包含する。一実施の形態では、指示薬系のフルオロフォア及び結合部分が単一分子を含む。
【００１９】
本発明の好ましい一実施の形態では、血中ｐＨ及びグルコース濃度を決定するためのデバイスが開示される。デバイスは、血管内配置のための大きさに作られる光ファイバーを含むセンサーを包含する。該センサーは、水不溶性ポリマーマトリックスであって、該ポリマーマトリックスはグルコースに対して透過性である、水不活性ポリマーマトリックス；該ポリマーマトリックスと会合される蛍光染料であって、該蛍光染料はｐＨに応じて少なくとも第一及び第二の異なる形態を示し、この場合、異なる形態はそれらのそれぞれの第一の放出及び第二の放出に基づいて区別され得る蛍光染料；血中グルコース濃度に関連づけられる量のグルコースを可逆的に結合するようになっている芳香族ボロン酸置換ビオロゲンを含む消光剤であって、該消光剤はポリマーマトリックスと会合されるか又は蛍光染料と操作可能的に結合され、そしてまた該消光剤は結合ポリヒドロキシル化合物の量に関連づけられる蛍光染料により放出される光を調整するよう設計される、消光剤を包含し、少なくとも１つの励起光源と、放出光検出器とをさらに包含する。
【００２０】
一蛍光染料による血中ｐＨ及びグルコース濃度の決定方法も開示される。方法は、上述
したデバイスのいずれかを提供するステップと、血管内にセンサーを挿入するステップと、第一の励起波長でセンサーを照射するステップと、放出波長でセンサーの第一の蛍光放出を検出するステップと、第二の励起波長でセンサーを照射するステップと、放出波長でセンサーの第二の蛍光放出を測定するステップと、血中ｐＨをレシオメトリック決定するステップと、ｐＨに関して補正された血中グルコース濃度を決定するステップとを包含する。
【００２１】
一変形では、方法はまた、第一の蛍光放出及び第二の蛍光放出の強度の比を算定するステップと、比をｐＨ標準曲線と比較することにより試料のｐＨを決定するステップと、標準グルコース応答曲線を選択するステップであって、該標準グルコース応答曲線は決定ｐＨに対応している、選択するステップと、第一の蛍光放出又は第二の蛍光放出を標準グルコース応答曲線と比較することによりグルコース濃度を決定するステップとを包含し得る。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の一実施形態の感知メカニズムを示すフローチャートである。
【図２】本発明の好ましい一実施形態に従ったグルコース及びｐＨセンサー、並びに２つの励起光源及び２つの検出器を含む光学系を示す図である。
【図３】異なるｐＨでのＨＰＴＳの吸収スペクトルを示す図である。
【図４】Ｉ(塩基)／Ｉ(等吸収点)比を用いるＨＰＴＳ／ＭＡＢＰ４を用いたレシオメトリックｐＨ感知の、グルコース濃度からの独立性を示す図である。４５４ｎｍ（塩基）及び４２２ｎｍ（等吸収点）での励起に対応する蛍光放出対種々のグルコース濃度でのｐＨの比として、データをプロットする。
【図５】異なるｐＨで４２２ｎｍ（等吸収点）で励起されるＨＰＴＳ／ＭＡＢＰ４に関するグルコース応答曲線を示す図である。
【図６】溶液中の異なるｐＨでのＳＮＡＲＦ−１の吸収スペクトルを示す図である。
【図７】５１４ｎｍで励起され／５８７ｎｍで放出される異なるｐＨで溶液中でのＳＮＡＲＦ−１／３，３’−ｏＢＢＶに関するグルコース応答曲線を示す図である。
【図８】５１４ｎｍで励起され／６２５ｎｍで放出される異なるｐＨで溶液中でのＳＮＡＲＦ−１／３，３’−ｏＢＢＶに関するグルコース応答曲線を示す図である。
【図９】Ｉ(塩基)／Ｉ(酸)比を用いる溶液中のＳＮＡＲＦ−１／３，３’−ｏＢＢＶによる異なるグルコース濃度でのｐＨのレシオメトリック感知を示す図である。
【図１０】異なるｐＨでのＨＰＴＳ−トリＬｙｓＭＡ／３，３’−ｏＢＢＶ／ＤＭＡＡに関するグルコース応答曲線を示す図である。
【図１１】Ｉ(塩基)／Ｉ(酸)比を用いるＨＰＴＳ−トリＬｙｓＭＡ／３，３’−ｏＢＢＶ／ＤＭＡＡを用いた異なるグルコース濃度でのｐＨのレシオメトリック感知を示す図である。
【図１２】指示薬系がＩ(塩基)／Ｉ(酸)比を用いて光ファイバーの末端上に固定されるＨＰＴＳ−トリＣｙｓＭＡ／３，３’−ｏＢＢＶ／ＤＭＡＡを用いた異なるグルコース濃度でのｐＨのレシオメトリック感知を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
好ましい一実施形態において、本発明は、単一指示薬系を用いて２つの分析物を測定し得る光学センサーに向けられる。さらに詳細には、好ましいセンサーは、以下のために単一フルオロフォア（例えば蛍光染料）を用いる：（１）レシオメトリック法により、第一分析物、例えばＨ+（ｐＨ）の濃度を決定するため（この場合、このような決定はフルオロフォアの濃度と無関係である）；そして（２）見掛けのフルオロフォア濃度（例えば励起時のフルオロフォアの放出強度）を測定することにより、第二分析物、例えばポリヒドロキシル化合物（例えば好ましくはグルコース）の濃度を決定するため（この場合、見掛けのフルオロフォア濃度は第二分析物の濃度に依存する）。さらに、第二分析物濃度の測
定値が第一分析物濃度に応じて決まる場合（例えばグルコース測定値がｐＨに伴って変わる光学系において−この分野における共通問題）には、本発明の好ましい一実施形態に従って、測定第二分析物濃度は第一分析物濃度の寄与のために補正され得る。センサーは、好ましくは水性媒質（例えば生理学的媒質、血液、間質液等）中で安定であり、さらに好ましくは、センサーは、それが或る期間留置したままであり得る血管中に挿入されるよう設計される。したがって本発明の好ましい一実施形態に従って、血管内配置のために設計される光学センサーが開示され、このセンサーは、単一指示薬系を用いて２つの分析物（好ましくはｐＨ及びグルコース）を測定し、そしてｐＨの任意の寄与に関してグルコース測定値を補正し得る。
【００２４】
センサーの好ましい実施形態は、とりわけ、レシオメトリックｐＨ感知に向けられるが、しかしその濃度が第一分析物の濃度と関連する少なくとも２つの形態で存在するフルオロフォアを指示薬系が含み、そしてその放出比がフルオロフォア濃度と無関係である限り、本発明のより広範な範囲に従って、他の第一分析物濃度は決定され得る。同様に、グルコースは本明細書中では第二分析物例として用いられるが、しかし溶液中の他のポリヒドロキシル含有有機化合物（炭水化物、１，２−ジオール、１，３−ジオール等）の濃度は、第二分析物を結合する結合部分と操作可能的に結合されるフルオロフォアを指示薬系が含む限り、本発明の実施形態を用いて決定され得ると理解される（この場合、フルオロフォアのシグナル強度は第二分析物の濃度に伴って変わる）。いくつかの実施形態では、第二分析物の濃度は、非炭水化物を含み得る。
【００２５】
指示薬系
本発明の好ましい実施形態に従って用いられる指示薬系は、分析物結合部分と操作可能的に結合されるフルオロフォアを含み、この場合、分析物結合はフルオロフォア濃度における見掛けの光学的変化（例えば放出強度）を引き起こす。さらに、レシオメトリックｐＨ感知が可能にされ得るよう、フルオロフォアはスペクトル特性における検出可能な差を示す異なる酸形態及び塩基形態を有する、ということが望ましい。例えば、ＨＰＴＳ−トリＬｙｓＭＡ（以下で詳細に記載される）のような蛍光染料と操作可能的に結合されるグルコース結合部分、例えば３，３’−ｏＢＢＶ（以下で詳細に記載される）は、蛍光染料の放出強度を抑制するが、この場合、消光の程度はグルコース結合時に低減され、グルコース濃度に関連した放出強度の増大を生じる。好ましい実施形態では、指示薬系は、少なくとも２つの陰イオン基を有する染料、及び少なくとも２つのボロン酸を有する消光剤を含む。さらなる好ましい実施形態では、反応（消光）するために互いに十分に物理的に近いままであるよう、指示薬系は感知部分（例えば染料−消光剤）を固定するための手段も含む。ｉｎ  ｖｉｖｏ感知が望ましい場合、このような固定化手段は、好ましくは水性環境（例えば血管内）中で不溶性であり、標的分析物に対して透過性であり、そして感知部分に対して不透過性である。典型的には、固定化手段は、水不溶性有機ポリマーマトリックスを含む。例えばＨＰＴＳ−トリＬｙｓＭＡ染料及び３，３’−ｏＢＢＶ消光剤は、ＤＭＡＡ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）ヒドロゲルマトリックス（以下で詳細に記載される）内で有効に固定され、これがｉｎ  ｖｉｖｏでのｐＨ及びグルコース感知を可能にする。
【００２６】
いくつかの例示的及び好ましいフルオロフォア、分析物結合部分及び固定するための手段は、以下でさらに詳細に記述される。
【００２７】
フルオロフォア
「フルオロフォア」は、特定波長での光に照らされた場合、より長い波長での光を放出する、即ちそれが蛍光発光する物質を指す。フルオロフォアとしては有機染料、有機金属化合物、金属キレート化合物、蛍光共役ポリマー、量子ドット又はナノ粒子、並びに上記のものの組み合せが挙げられるが、これらに限定されない。フルオロフォアは、ポリマー
に結合される別個の部分又は置換基であり得る。
【００２８】
好ましい実施形態に用いられ得るフルオロフォアは、約４００ｎｍ以上の波長の光により励起され、励起及び放出波長が少なくとも１０ｎｍだけ分離可能であるのに十分に大きいストークスシフトを有する。いくつかの実施形態では、励起及び放出波長間の分離は約３０ｎｍ以上であり得る。これらのフルオロフォアは、好ましくは、電子受容体分子、例えばビオロゲンによる消光に対して感受性であり、そして光退色に対して抵抗性である。それらはさらにまた、好ましくは、光酸化、加水分解及び生分解に対して安定である。
【００２９】
いくつかの実施形態では、フルオロフォアは独立した化合物であり得る。
【００３０】
いくつかの実施形態では、フルオロフォアは、約１００００ダルトン以上の分子量を有し、染料−ポリマー単位を構成する水溶性又は水分散性ポリマー中のペンダント基又は鎖単位であり得る。一実施形態では、このような染料−ポリマー単位はさらにまた、水不溶性ポリマーマトリックスＭ1と非共有的に会合され、そしてポリマーマトリックスＭ1（ここで、Ｍ1は分析物溶液に透過性であるか、又はそれと接触する）内に物理的に固定される。別の実施形態では、染料−ポリマー単位上の染料は負に荷電され、そして染料−ポリマー単位は陽イオン性水溶性ポリマーとの複合体として固定され得るが、この場合、上記複合体は、分析物溶液に透過性であるか又はそれと接触する。一実施形態では、染料は、ヒドロキシピレン・トリスルホン酸の高分子誘導体の１つであり得る。高分子染料は、水溶性、水膨潤性又は水分散性であり得る。いくつかの実施形態では、高分子染料はさらにまた架橋され得る。好ましい実施形態では、染料は負電荷を有する。
【００３１】
他の実施形態では、染料分子は、水不溶性ポリマーマトリックスＭ1と共有結合され得るが、この場合、上記Ｍ1は分析物溶液に透過性であるか又はそれと接触する。Ｍ1と結合される染料分子は、構造Ｍ1−Ｌ1−染料を構成し得る。Ｌ1は、感知部分をポリマー又はマトリックスに共有的に接続する加水分解的に安定な共有結合リンカーである。Ｌ1の例としては、スルホンアミド（−ＳＯ2ＮＨ−）、アミド−（Ｃ＝Ｏ）Ｎ−、エステル−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、エーテル−Ｏ−、スルフィド−Ｓ−、スルホン（−ＳＯ2−）、フェニレン−Ｃ6Ｈ4−、ウレタン−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、尿素−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、チオ尿素−ＮＨ（Ｃ＝Ｓ）−ＮＨ−、アミド−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、アミン−ＮＲ−（ここで、Ｒは１〜６個の炭素原子を有するアルキルと定義される）等、又はその組み合せから選択される１つ又は複数の二価結合基で任意に末端化されるか又はそれらにより中断される低級アルキレン（例えばＣ1〜Ｃ8アルキレン）が挙げられる。一実施形態では、染料は、スルホンアミド官能基を介してポリマーマトリックスに結合される。
【００３２】
いくつかの実施形態では、有用な染料としては、ピラニン誘導体（例えばヒドロキシピレントリスルホンアミド誘導体等）が挙げられるが、これは以下の式を有する：
【００３３】
【化１】
2010518397.tif 000003
【００３４】
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3は各々−ＮＨＲ4であり、Ｒ4は−ＣＨ2ＣＨ2（−ＯＣＨ2ＣＨ2−）nＸ1であって；ここで、Ｘ1は−ＯＨ、−ＯＣＨ3ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ2、−ＳＯ3Ｈ、−ＮＨ2又はＯＭｅであり；そしてｎは約７０〜１００００である）。一実施形態では、染料はスルホンアミド官能基を介してポリマーに結合され得る。他の実施形態では、染料はヒドロキシピレントリスルホン酸の高分子誘導体のうちの１つであり得る。
【００３５】
いくつかの実施形態では、蛍光染料は、８−ヒドロキシピレン−１，３，６−トリスルホネート（ＨＰＴＳ）であり得る。対イオンは、Ｈ+又は任意の他の陽イオンであり得る
。ＨＰＴＳは、約４５０ｎｍ及び約４０５ｎｍの２つの励起波長を示し、これは、酸及びその共役塩基の吸収波長に対応する。励起波長におけるシフトは、ＨＰＴＳ上のヒドロキシル基のｐＨ依存性イオン化のためである。ｐＨが増大すると、ＨＰＴＳは、約４５０ｎｍでの吸光度の増大、及び約４２０ｎｍより低い吸光度の低減を示す。吸収極大でのｐＨ依存性シフトは、生理学的範囲での二重励起レシオメトリック検出を可能にする。この染料は５００ダルトン未満の分子量を有し、したがってそれはポリマーマトリックス内に留まらないが、それは陰イオン排除膜と共に用いられ得る。
【００３６】
【化２】
2010518397.tif 000004
（ＨＰＴＳのＮａ+塩−「ピラニン」）
【００３７】
別の実施形態では、蛍光染料は８−アセトキシ−ピレン−１，３，６−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−トリス−（メタクリルプロピルアミドスルホンアミド）（アセトキシ−ＨＰＴＳ−ＭＡ）であり得る：
【００３８】
【化３】
2010518397.tif 000005
【００３９】
陰イオン基を有さないアセトキシ−ＨＰＴＳ−ＭＡ（上記）のような染料は、ビオロゲン消光剤、特に単一ボロン酸部分のみを有するビオロゲン消光剤と操作可能に結合される場合、非常に強力なグルコース応答を示し得ない、ということが注目される。
【００４０】
別の実施形態では、蛍光染料は８−ヒドロキシ−ピレン−１，３，６−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−トリス−（カルボキシプロピルスルホンアミド）（ＨＰＴＳ−ＣＯ2）であり得る：
【００４１】
【化４】
2010518397.tif 000006
【００４２】
別の実施形態では、蛍光染料は８−ヒドロキシ−ピレン−１，３，６−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−トリス−（メトキシポリエトキシエチル（〜１２５）スルホンアミド）（ＨＰＴＳ−ＰＥＧ）であり得る：
【００４３】
【化５】
2010518397.tif 000007
【００４４】
陰イオン基を有さないＨＰＴＳ−ＰＥＧ（上記）のような染料は、ビオロゲン消光剤、特に単一ボロン酸部分のみを有するビオロゲン消光剤と操作可能に結合される場合、非常に強力なグルコース応答を示し得ない、ということが注目される。
【００４５】
独立した化合物としての代表的染料は、８−アセトキシピレン−１，３，６−トリスルホニルクロリド（ＨＰＴＳ−Ｃｌ）をアミノ酸、例えばアミノ酪酸と反応させることにより形成されるトリス付加物である。ポリマーに結合され、そして１つ又は複数の陰イオン基を保有するヒドロキシピレントリスルホンアミド染料、例えば８−ヒドロキシピレン−１−Ｎ−（メタクリルアミドプロピルスルホンアミド）−Ｎ’，Ｎ’’−３，６−ビス（カルボキシプロピルスルホンアミド）  ＨＰＴＳ−ＣＯ2−ＭＡとＨＥＭＡ、ＰＥＧＭＡ等とのコポリマーが最も好ましい。
【００４６】
別の実施形態では、蛍光染料はＨＰＴＳ−トリＣｙｓ−ＭＡであり得る：
【００４７】
【化６】
2010518397.tif 000008
【００４８】
この染料は、ボロン酸を含む消光剤、例えば３，３’−ｏＢＢＶと共に用いられ得る。
【００４９】
もちろん、いくつかの実施形態では、ＨＰＴＳコア上のＣｙｓ−ＭＡ以外の置換は、該置換が負に帯電し、且つ重合性基を有する限り、本発明の態様と一致する。システインのＬ又はＤ立体異性体が用いられ得る。いくつかの実施形態では、スルホン酸のうちの１又は２つのみが置換され得る。同様に、上記のＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡに対する変形形態では、ＮＢｕ4+と並んで他の対イオン、例えば正荷電金属、例えばＮａ+が用いられ得る。他の変形形態では、スルホン酸基は、例えばリン酸基、カルボン酸基等の官能基と取り替えられ得る。
【００５０】
別の適切な染料はＨＰＴＳ−ＬｙｓＭＡであって、これは以下のように図示される：
【００５１】
【化７】
2010518397.tif 000009
【００５２】
他の例としては、８−アセトキシピレン−１，３，６−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−トリス（メタクリルアミドプロピルスルホンアミド）とＨＥＭＡ、ＰＥＧＭＡ又は他の親水性コモノマーとの水溶性コポリマーとが挙げられる。染料中のフェノール置換基は、重合完了後に加水分解により除去され得るブロッキング基によって重合中に保護される。このような適切なブロッキング基、例えばアセトキシ、トリフルオロアセトキシ等は、当該技術分野でよく知られている。
【００５３】
蛍光染料、例えばＨＰＴＳ及びその誘導体は既知であり、そして多くが分析物検出に用いられてきた。例えば米国特許第６，６５３，１４１号、同第６，６２７，１７７号、同第５，５１２，２４６号、同第５，１３７，８３３号、同第６，８００，４５１号、同第６，７９４，１９５号、同第６，８０４，５４４号、同第６，００２，９５４号、同第６，３１９，５４０号、同第６，７６６，１８３号、同第５，５０３，７７０号及び同第５，７６３，２３８号；並びに同時係属中の米国特許出願第１１／２９６，８９８号、及び同第６０／８３３，０８１号（これらの記載内容の全体は参照により本明細書中に援用される）を参照のこと。
【００５４】
ＳＮＡＲＦ及びＳＮＡＦＬ染料（Molecular Probes）も、本発明の態様に従って有用なフルオロフォアであり得る。ＳＮＡＲＦ−１及びＳＮＡＦＬ−１の構造を以下に示す：
【００５５】
【化８】
2010518397.tif 000010
【００５６】
付加的には、波長−レシオメトリック及び比色的に、ｐＨに伴うスペクトルシフト及び強度変化を示す６−アミノキノリニウム及びボロン酸部分の両方を基礎にした一組の異性体水溶性蛍光プローブは、本発明のいくつかの実施形態に従って有用であり得る（例えばBadugu, R. et al. 2005 Talanta 65(3): 762-768；及びBadugu, R. et al. 2005 Bioorg. Med. Chem. 13(1): 113-119参照）（これらの記載内容の全体は参照により本明細書中に援用される）。
【００５７】
ｐＨ及び糖類感受性であり得る蛍光染料の別の例は、テトラキス（４−スルホフェニル）ポルフィン（ＴＳＰＰ）（以下に示す）である。ＴＳＰＰは、ポルフィリン環が或る金属イオン、例えば第二鉄イオンと反応し得る血中では最適に働かず、非蛍光性になる。
【００５８】
【化９】
2010518397.tif 000011
【００５９】
本発明のセンサーにおけるｐＨ及びグルコースの同時決定のために有用であり得るｐＨ感受性蛍光表示器のさらなる例は、米国特許出願第２００５／０２３３４６５号及び米国特許出願第２００５／００９００１４号（これらの記載内容の全体は各々、参照により本明細書中に援用される）に記載されている。
【００６０】
分析物結合部分−消光剤
本発明の広範な態様に従って、分析物結合部分は、分析物結合の量に関連したやり方で、分析物と結合することができ且つフルオロフォアの見掛けの濃度（例えば放出シグナル強度の変化として検出される）を調整することができる少なくとも二重の機能性を提供する。好ましい実施形態では、分析物結合部分は、消光剤と会合される。「消光剤」は、その存在下で、フルオロフォアの放出を低減する化合物を指す。消光剤（Ｑ）は、独立した化合物、例えば、第二の独立した化合物に、又は重合性化合物に転化可能である反応性中間体から選択されるか、或いはＱは、上記反応性中間体又は重合性化合物から調製されるポリマー中のペンダント基又は鎖単位であって、このポリマーは水溶性又は水分散性であるか、或いは不溶性ポリマーであり、上記ポリマーは任意に架橋される。
【００６１】
一例では、実施形態におけるグルコース認識を提供する部分は、芳香族ボロン酸である。ボロン酸は、共役窒素含有複素環式芳香族ビス−オニウム構造（例えばビオロゲン）と共有結合する。「ビオロゲン」は、一般的に、窒素含有共役Ｎ−置換複素環式芳香族ビス−オニウム塩の基本構造を有する化合物、例えば２，２’−、３，３’−又は４，４’−Ｎ，Ｎ’ビス−（ベンジル）ビピリジウム二ハロゲン化物（即ち二塩化物、臭化物、塩化物）等を指す。ビオロゲンは、置換フェナントロリン化合物も包含する。ボロン酸置換消光剤は、好ましくは約４〜９のｐＫａを有し、そして約６．８〜７．８のｐＨの水性媒質
中でグルコースと可逆的に反応して、ボロン酸エステルを形成する。反応の程度は、媒質中のグルコース濃度に関連する。ボロン酸エステルの形成は、ビオロゲンによるフルオロフォア（fluorphore）の消光を減少させて、グルコース濃度に応じた蛍光の増大を引き起こす。有用なビス−オニウム塩は分析物溶液と相溶性であり、そして検出されるべき分析物の存在下で染料の蛍光放出における検出可能な変化を生じ得る。
【００６２】
本発明の実施形態におけるビス−オニウム塩は、共役複素環式芳香族二窒素化合物から調製される。共役複素環式芳香族二窒素化合物は、ジピリジル、ジピリジルエチレン、ジピリジルフェニレン、フェナントロリン及びジアザフルオレンから選択され、この場合、窒素原子は異なる芳香族環中に存在し、そしてオニウム塩を形成し得る。両方の窒素が置換され得る上記共役複素環式芳香族二窒素化合物の異性体は全て、本発明において有用である、と理解される。一実施形態では、消光剤は、３，３’−ジピリジル、４，４’−ジピリジル及び４，７−フェナントロリンに由来するビス−オニウム塩のうちの１つであり得る。
【００６３】
いくつかの実施形態では、ビオロゲン−ボロン酸付加物は約４００ダルトン以上の分子量を有する独立した化合物であり得る。他の実施形態では、それは、約１００００ダルトンより大きい分子量を有する水溶性又は水分散性ポリマーのペンダント基又は鎖単位でもあり得る。一実施形態では、消光剤−ポリマー単位はポリマーマトリックスと非共有的に会合され得るし、そしてその中に物理的に固定される。さらに別の実施形態では、消光剤−ポリマー単位は、負電荷水溶性ポリマーとの複合体として固定され得る。
【００６４】
他の実施形態では、ビオロゲン−ボロン酸部分は、平衡を確立させるのに十分に分析物（例えばグルコース）に対して透過性である架橋親水性ポリマー又はヒドロゲル中のペンダント基又は鎖単位であり得る。
【００６５】
他の実施形態では、消光剤は、構造Ｍ2−Ｌ2−Ｑにより表わされ得る第２の水不溶性ポリマーマトリックスＭ2と共有結合し得る。Ｌ2は、低級アルキレン（例えばＣ1〜Ｃ8アルキレン）、スルホンアミド、アミド、第四級アンモニウム、ピリジニウム、エステル、エーテル、スルフィド、スルホン、フェニレン、尿素、チオ尿素、ウレタン、アミン及びその組み合せから成る群から選択されるリンカーである。消光剤は、いくつかの実施形態では、１つ又は２つの部位でＭ2に連結され得る。
【００６６】
高分子消光剤前駆体に関しては、ボロン酸部分、及び重合性基又はカップリング基であり得る反応性基を、ヘテロ芳香族中心位置基中の２つの異なる窒素と結合させるために、多くの選択肢が利用可能である。これらは以下のものである：
ａ）第１の芳香族部分上の反応性基は１つの窒素と結合され、そして少なくとも１つの−Ｂ（ＯＨ）2基を含有する第二芳香族基は第二窒素と結合される；
ｂ）１つ又は複数のボロン酸基は、１つの窒素と結合される第一芳香族部分と結合され、そして１つのボロン酸及び反応性基は第二窒素と結合される第二芳香族基に結合される；
ｃ）１つのボロン酸基及び反応性基は１つの窒素と結合される第一芳香族基の第一芳香族部分と結合され、そしてボロン酸基及び反応性基は第二窒素と結合される第二芳香族部分と結合される；そして
ｄ）１つのボロン酸は各窒素と結合され、そして反応性基はヘテロ芳香族環と結合される。
【００６７】
好ましい実施形態は、２つのボロン酸部分及び１つの重合性基又はカップリング基を含み、この場合、芳香族基は窒素と結合されるベンジル置換基であり、そしてボロン酸基はベンジル環と結合され、オルト−、メタ又はパラ−位であり得る。
【００６８】
いくつかの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ感知のために有用な独立した化合物としてのボロン酸置換ビオロゲンは、以下の式のうちの１つにより表され得る：
【００６９】
【化１０】
2010518397.tif 000012
【００７０】
（式中、ｎ＝１〜３であり、Ｘはハロゲンであり、且つＹ1及びＹ2は、独立して、フェニルボロン酸（ｏ−、ｍ−又はｐ−異性体）及びナフチルボロン酸から選択される）。別の実施形態では、消光剤は、ビオロゲンの複素環上の置換基としてボロン酸基を含み得る。
【００７１】
ＴＳＰＰと共に用いられる特定の例は、ｍ−ＢＢＶである：
【００７２】
【化１１】
2010518397.tif 000013
【００７３】
センサーの製造に適した消光剤前駆体は、以下のものから選択され得る：
【００７４】
【化１２Ａ】
2010518397.tif 000014
【化１２Ｂ】
2010518397.tif 000015
【化１２Ｃ】
2010518397.tif 000016
【００７５】
本発明の好ましい態様に従って、消光剤前駆体３，３’−ｏＢＢＶは、ＨＰＴＳ−ＬｙｓＭＡ又はＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡと共に用いられて、ヒドロゲルを作製し得る。
【００７６】
好ましい消光剤は、ベンジルボロン酸基を用いて窒素上で、重合性基又はカップリング基を用いてジピリジル環上の他の位置で置換される３，３’−ジピリジルに由来するビオロゲンを含む前駆体から調製される。代表的ビオロゲンとしては以下のものが挙げられる：
【００７７】
【化１３】
2010518397.tif 000017
【００７８】
（式中、Ｌは、Ｌ１又はＬ２であり、且つ連結基であり；
Ｚは、反応性基であり；且つ
Ｒ’は、ベンジル環上のオルト−、メタ−又はパラ−位における−Ｂ（ＯＨ）2であり、そしてＲ’’はＨ−であり；或いは任意にＲ’’は、本明細書中で定義されるようなカップリング基、又はボロン酸の酸性を改質するために特定的に用いられる置換基、例えばフルオロ−又はメトキシ−である）。
【００７９】
Ｌは、ビオロゲンをポリマー又はマトリックスに結合するために用いられる反応性基に感知部分を共有結合する二価部分である。Ｌの例としては、直接結合、或いは１〜８個の炭素原子を有し、任意にスルホンアミド（−ＳＯ2ＮＨ−）、アミド−（Ｃ＝Ｏ）Ｎ−、エステル−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、エーテル−Ｏ−、スルフィド−Ｓ−、スルホン（−ＳＯ2−）、フェニレン−Ｃ6Ｈ4−、ウレタン−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、尿素−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、チオ尿素−ＮＨ（Ｃ＝Ｓ）−ＮＨ−、アミド−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、アミン−ＮＲ−（ここで、Ｒは１〜６個の炭素原子を有するアルキルと定義される）等から選択される１つ又は複数の二価結合基で末端化されるか又はそれにより中断される低級アルキレンから各々独立して選択されるものが挙げられる。
【００８０】
Ｚは、メタクリルアミド−、アクリルアミド−、メタクリロイル−、アクリロイル−、又はスチリル−（これらに限定されない）から選択される重合可能なエチレン性不飽和基であり、或いは任意にＺは、ポリマー又はマトリックスと共に共有結合を形成し得る反応性官能基である。このような基としては、−Ｂｒ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯ2Ｈ及び−ＮＨ2が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８１】
ボロン酸置換ポリビオロゲンは、別のクラスの好ましい消光剤である。ポリビオロゲンという用語は、以下のものを包含する：連結基により互いに共有結合される２つ以上のビオロゲンから成る独立した化合物、鎖中のビオロゲン反復単位から成るポリマー、鎖にぶら下がったビオロゲン基を有するポリマー、好ましくはビオロゲン末端基を含めたビオロゲン単位から成るデンドリマー、好ましくはビオロゲン末端基を含めたビオロゲン単位から成るオリゴマー、並びにその組み合せ。ビオロゲン基単体が小量成分を成すポリマーは含まれない。好ましい消光剤は、センサーの一部として機能するのに十分にグルコースに対して透過性である水溶性又は水分散性ポリマー、或いは架橋親水性ポリマー、或いはヒドロゲルである。代替的には、ポリビオロゲンボロン酸は、不活性基質に直接結合され得る。
【００８２】
ビオロゲン反復単位から成るポリマーとしてのポリビオロゲン消光剤は、次式を有する：
【００８３】
【化１４】
2010518397.tif 000018
【００８４】
別の実施形態では、ポリビオロゲンボロン酸付加物は、２つ以上のビオロゲン／ボロン酸中間体を共有的に連結することにより形成される。架橋基は、典型的には、各ビオロゲン中の１つの窒素に、或いは各ビオロゲンの芳香族環中の炭素に結合される小型二価ラジカルであるか、或いは１つの結合は１つのビオロゲン中の環炭素に対し、且つ別のビオロゲン中の窒素に対するものであってもよい。２つ以上のボロン酸基は、ポリビオロゲンと結合される。任意に、ポリビオロゲンボロン酸付加物は、ビオロゲンに又は架橋基に直接結合する重合性基又はカップリング基で置換される。好ましくはポリビオロゲン部分は、このような基を１つだけ含む。好ましくは架橋基は、グルコースとのボロン酸の協同的結合を増強するために選択される。
【００８５】
カップリング部分は上記のような連結基であるが、但し、連結基は任意に、ボロン酸、重合性基、付加的カップリング基でさらに置換されるか、或いはビオロゲンが鎖単位、ペンダント基又はその任意の組み合せであるポリマー鎖中の一セグメントである。
【００８６】
固定化手段
いくつかの実施形態では、動いている流れを包含しないｉｎ  ｖｉｔｒｏで用いるために、感知構成成分は個々の（別個の）構成成分として用いられる。染料及び消光剤は液体溶液中に一緒に混合され、分析物が付加され、蛍光強度における変化が測定され、そして構成成分が廃棄される。滲出を防止するために感知構成成分を閉じ込めるために用いられ得る高分子マトリックスは、存在する必要がない。任意に、感知構成成分が固定され、これが移動流中の分析物を測定するためのそれらの使用を可能にする。
【００８７】
ｉｎ  ｖｉｖｏ適用に関しては、センサーは、１つ又は複数のポリヒドロキシル有機化合物を含有する生理学的流体の移動流中で用いられるか、或いは上記化合物を含有する筋肉のような組織中に埋め込まれる。したがって、センサー部分は何れもセンサーアセンブリーから抜け出さないことが好ましい。したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏでの使用に関しては、感知構成成分は、好ましくは、有機ポリマー感知アセンブリーの一部である。可溶性染料及び消光剤は、分析物の通過を可能にするが感知部分の通過を遮断する半透膜により限定され得る。これは、感知部分として、分析物分子より実質的に大きい可溶性分子（分析物の分子量より少なくとも２倍の、或いは１０００倍より大きい、好ましくは５０００倍より大きい分子量）を用い且つ感知部分が定量的に保持されるよう、２つの間の特定分子量カットオフを有する透析又は限外濾過膜のような選択的半透性膜を用いることにより、実現され得る。
【００８８】
好ましくは感知部分は、グルコースに対して自由に透過可能である不溶性ポリマーマトリックス中に固定される。ポリマーマトリックスは、有機、無機ポリマー又はそのポリマーの組み合せから成る。マトリックスは、生体適合性物質で構成され得る。代替的には、マトリックスは、対象の分析物に対して透過性である第二生体適合性ポリマーで被覆され
る。
【００８９】
ポリマーマトリックスの機能は、フルオロフォア及び消光剤部分を一緒に保持し、固定する一方で、同時に、分析物と接触させ、そして分析物をボロン酸と結合することである。この作用を達成するために、マトリックスは、密接に関連して、マトリックス及び分析物溶液間に高表面積界面を確立することにより、媒質中で不溶性でなければならない。例えば超薄皮膜又は微小孔支持マトリックスが用いられる。代替的には、マトリックスは分析物溶液中で膨潤性であり、例えばヒドロゲルマトリックスは水性系のために用いられる。いくつかの例では、感知ポリマーは、表面、例えば光導管の表面に結合されるか、又は微小孔膜中に含浸される。全ての場合に、２つの相間で平衡が確立され得るよう、マトリックスは結合部位への分析物の輸送を妨げてはならない。超薄皮膜、微小孔ポリマー、微小孔ゾル−ゲル及びヒドロゲルを調製するための技法は、当該技術分野で確立されている。有用なマトリックスは全て、分析物透過性であると定義される。
【００９０】
ヒドロゲルポリマーは、いくつかの実施形態で用いられる。ヒドロゲルという用語は、本明細書中で用いる場合、実質的に膨潤性であるが、水中に溶解しないポリマーを指す。このようなヒドロゲルは、線状、分枝鎖、又は網状ポリマー、或いは高分子電解質複合体であり得るが、但し、それらは可溶性又は滲出可能分画を含有しない。典型的には、ヒドロゲル網状構造は架橋工程により調製され、これは、それらが膨潤性であるがしかし水性媒質中に溶解しないよう、水溶性ポリマーに関して実施される。代替的には、ヒドロゲルポリマーは、水膨潤性網状ポリマーを得るために、親水性及び架橋モノマーの混合物を共重合することにより調製される。このようなポリマーは、付加又は縮合重合により、或いは組み合せ法により形成される。これらの場合、感知部分は、網状構造形成モノマーと組み合せてモノマー誘導体を用いる共重合により、ポリマー中に組み入れられる。代替的には、反応性部分は、後重合反応を用いてすでに調製されたマトリックスと結合される。上記の感知部分は、ポリマー鎖又は鎖に結合されたペンダント基中の単位である。
【００９１】
本発明において有用なヒドロゲルは、モノリス型ポリマー、例えば染料及び消光剤がともに共有結合される単一網状構造、又は多成分ヒドロゲルでもある。多成分ヒドロゲルとしては、相互侵入網目、高分子電解質複合体、並びにヒドロゲルマトリックス及び交互ミクロ層アセンブリー中の二次ポリマーの分散を含む水膨潤性複合体を得るための２つ以上のポリマーの種々の他の配合物が挙げられる。
【００９２】
モノリス型ヒドロゲルは、典型的には、親水性モノマーの混合物のフリーラジカル共重合により形成され、例としてはＨＥＭＡ、ＰＥＧＭＡ、メタクリル酸、ヒドロキシエチルアクリレート、Ｎ−ビニルピロリドン、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアクリルアミド等が挙げられるが、これらに限定されず、イオン性モノマーとしては、メタクリロイルアミノプロピルトリメチルアンモニウムクロリド、ジアリルジメチルアンモニウムクロリド、ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリド、ナトリウムスルホプロピルメタクリレート等が挙げられ、架橋剤としては、エチレンジメタクリレート、ＰＥＧＤＭＡ、トリメチロールプロパントリアクリレート等が挙げられる。モノマーの比は、当該技術分野で十分に確立された原則を用いて、透過性、膨潤指数及びゲル強度を含めた網目特性を最適化するよう選択される。一実施形態では、染料部分は、染料分子のエチレン性不飽和誘導体、例えば８−アセトキシピレン−１，３，６−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−トリス（メタクリルアミドプロピルスルホンアミド）より得られ、消光剤部分は、エチレン性不飽和ビオロゲン、例えば４−Ｎ−（ベンジル−３−ボロン酸）−４’−Ｎ’−（ベンジル−４エテニル）−ジピリジニウム二ハロゲン化物（ｍ−ＳＢＢＶ）より得られ、そしてマトリックスはＨＥＭＡ及びＰＥＧＤＭＡから作られる。染料の濃度は、放出強度を最適にするよう選択される。消光剤対染料の比は、所望の測定可能シグナルを生じるのに十分な消光を提供するよう調整される。
【００９３】
いくつかの実施形態では、モノリス型ヒドロゲルは縮合重合により形成される。例えばアセトキシピレントリスルホニルクロリドを、余分量のＰＥＧジアミンと反応させて、非反応ジアミン中に溶解されたトリス−（アミノＰＥＧ）付加物を得る。余分量のトリメソイルクロリド及び酸受容体の溶液を４−Ｎ−（ベンジル−３−ボロン酸）−４’−Ｎ’−（２ヒドロキシエチル）ビピリジニウム二ハロゲン化物と反応させて、ビオロゲンの酸塩化物機能性エステルを得る。例えば一方の混合物の薄い皮膜を成形し、そしてそれを他方に浸漬することにより、２つの反応性混合物を互いに接触させて、反応させ、ヒドロゲルを形成する。
【００９４】
他の実施形態では、染料が一成分中に組み入れられ、そして消光剤が別の成分中に組み入れられる多成分ヒドロゲルが、本発明のセンサーの製造のために好ましい。さらに、これらの系は、任意に分子インプリントされて、成分間の相互反応を増強し、そして他のポリヒドロキシ分析物を上回るグルコースに対する選択性を提供する。好ましくは多成分系は、相互侵入ポリマー網目（ＩＰＮ）又は半相互侵入ポリマー網目（半ＩＰＮ）である。
【００９５】
ＩＰＮポリマーは、典型的には、逐次重合により作られる。先ず、消光剤を含む網目が形成される。次に網目は、染料モノマーを含むモノマーの混合物で膨潤され、そして二次重合が実行されて、ＩＰＮヒドロゲルを得る。
【００９６】
消光剤モノマーを含めたモノマーの混合物中に染料部分を含有する可溶性ポリマーを溶解し、その混合物を重合することによって、半ＩＰＮヒドロゲルを形成する。いくつかの実施形態では、ポリヒドロキシル化合物を自由に透過可能である不溶性ポリマーマトリックスにより、感知部分を固定する。ヒドロゲル系に関する付加的詳細は、米国特許出願公開第２００４／００２８６１２号及び同第２００６／００８３６８８号（これらの記載内容の全体は参照により本明細書中に援用される）に開示されている。
【００９７】
ポリマーマトリックスは、有機ポリマー、無機ポリマー又はそのポリマーの組み合せで構成される。マトリックスは、生体適合性物質から成り得る。代替的には、マトリックスは、対象の分析物に対して透過性である第二生体適合性ポリマーで被覆される。ポリマーマトリックスの機能は、蛍光染料及び消光剤部分を一緒に保持し、固定する一方で、同時に、分析物（例えばポリヒドロキシル化合物、Ｈ+及びＯＨ―）と接触させ、そしてポリヒドロキシル化合物をボロン酸と結合することである。したがってマトリックスは、密接に関連して、マトリックス及び分析物溶液間に高表面積界面を確立することにより、媒質中で不溶性である。２つの相間で平衡が確立され得るよう、マトリックスはさらにまた結合部位への分析物の輸送を妨げない。一実施形態では、超薄皮膜又は微小孔支持マトリックスが用いられ得る。別の実施形態では、分析物溶液中で膨潤性であるマトリックス（例えばヒドロゲルマトリックス）が、水性系のために用いられ得る。いくつかの実施形態では、感知ポリマーは、表面、例えば光導管の表面に結合されるか、又は微小孔膜中に含浸される。超薄皮膜、微小孔ポリマー、微小孔ゾル−ゲル及びヒドロゲルを調製するための技法は、従来技術で確立されている。
【００９８】
好ましい一実施形態では、ボロン酸置換ビオロゲンは、蛍光染料と共有結合され得る。付加物は、重合性化合物又はポリマー中の一単位であり得る。例えばこのような一付加物は、先ず、ベンジル−３−ボロン酸基を一方の窒素に結合し、そしてアミノエチル基を他の窒素原子に結合することにより４，４’−ジピリジルから非対称ビオロゲンを形成することにより調製され得る。ビオロゲンは、先ず、１：１モル比で８−アセトキシ−ピレン−１，３，６−トリスルホニルクロリドと順次縮合され、その後、余分量のＰＥＧジアミンと反応されて、プレポリマー混合物を得る。副産物である酸を捕捉する（scavange）ために、酸受容体が両方の工程に含まれる。ポリイソシアネートとの反応によりプレポリマ
ー混合物を架橋して、ヒドロゲルを得る。生成物を塩基で処理して、アセトキシ・ブロッキング基を除去する。さらなる使用の前に、脱イオン水を用いた網羅的抽出により、不完全反応生成物及び非反応出発物質をヒドロゲルから濾し取る。生成物は、本明細書中に記載したような感知構成成分として用いられる場合、グルコースに対して応答性である。
【００９９】
代替的には、このような付加物は、エチレン性不飽和モノマー誘導体である。例えばジメチルビス−ブロモメチルベンゼンボロネートを、余分量の４，４’−ジピリジルと反応させて、半ビオロゲン付加物を形成する。余分量のジピリジルを除去後、付加物をさらに余分量のブロモエチルアミン塩酸塩と反応させて、ビス−ビオロゲン付加物を形成する。この付加物を、酸受容体の存在下で１：１モル比で８−アセトキシピレン−トリススルホニルクロリドとの反応と、その後の余分量のアミノプロピルメタクリルアミドとの反応により、ピラニン染料とカップリングさせる。最後に、任意の残留アミノ基をメタクリロールクロリドと反応させ得る。精製後、染料／ビオロゲンモノマーをＨＥＭＡ及びＰＥＧＤＭＡと共重合させて、ヒドロゲルを得る。
【０１００】
レシオメトリックｐＨ感知
レシオメトリックｐＨ感知は知られている。例えば米国特許出願公開第２００６／０１０５１７４号；同第２００５／００９００１４号（これらの記載内容の全体は参照により本明細書中で援用される）参照。２つの形態（酸形態及び塩基形態）で存在するフルオロフォアを含む指示薬系（例えば蛍光指示薬染料）を考えると、２つの波長での放出強度の比は、フルオロフォア濃度のｐＨ非依存性を測定するために用いられ得る。レシオメトリックｐＨ感知に適した蛍光指示薬染料は、以下のものであり得る：（１）二重励起波長（酸形態及び共役塩基形態に対応する）及び単一放出波長を示す染料（例えばＨＰＴＳ染料）；（２）単一励起波長及び二重放出波長（酸形態及び塩基形態）；或いは（３）二重励起−二重放出染料。いくつかの染料、例えばＳＮＡＲＦ又はＳＮＡＦＬ染料は、二重放出特性及び二重励起特性の両方を有し得る。しかしながら二重−二重染料、例えばＳＮＡＲＦは、単一−二重又は二重−単一として用いられ得る。
【０１０１】
セミナフトフルオレセイン及びカルボキシナフトフルオロセインを基礎にした二重放出光ファイバーセンサーが記載されており、これは迅速に且つ信頼可能的に、強度比をｐＨと相関させる。例えばそれぞれ、Xu, Z., A. Rollins, et al. (1998) "A novel fiber-optic pH sensor incorporating carboxy SNAFL-2 and fluorescent wavelength-ratiometric detection" Journal of Biomedical Materials Research 39: 9-15及びSong, A., S.
Parus, et al. (1997) "High-performance fiber-optic pH microsensors for practical physiological measurements using a dual-emission sensitive dye" Analytical Chemistry 69: 863-867参照。これらの染料に関して観察される広範な光褪色はレシオメトリック・アプローチにより説明され得るが、しかしそれは依然としてセンサーの有用な寿命を限定する。
【０１０２】
蛍光染料８−ヒドロキシ−１，３，６−ピレントリスルホン酸三ナトリウム塩（ＨＰＴＳ）は、３つのスルホン酸基及び１つのヒドロキシル基を有するピレンコアから成り、これが約７．３のｐＫａほどのｐＨ感受性を付与する（Wolfbeis, O.S., E. Fuerlinger, et al. (1983). "Fluorimetric analysis. 1. Study on fluorescent indicators for measuring near neutral ('physiological') pH values." Fresneius' Z. Anal. Chem. 314(2): 119-124）；Wolfbeis等は固定化ＨＰＴＳに関するいくつかの特許も有する。YafusoとHuiは、米国特許第４，８８６，３３８号（この記載内容の全体は参照により本明細書中で援用される）において別の固定化蛍光染料ｐＨセンサーを記載している。ＨＰＴＳは、酸及びその共役塩基に対応する２つの励起波長（１つは４０５ｎｍそして１つは４５７ｎｍ）を示す（Agayn, V.I. and Dr. R. Walt (1993) "Fiber-optic sensor for continuous monitoring of fermentation pH." Biotechnology 72(6): 6-9）。最大約７．３のｐ
Ｋａの励起におけるその後のｐＨ依存性シフトは、生理学的範囲における二重励起／単一放出レシオメトリック検出を可能にする。これは、低毒性（Lutty, G.A. (1978). "The acute intravenous toxicity of stains, dyes, and other fluorescent substances." Toxical Pharmacol. 44: 225-229）及び酸素濃度に対する非感受性（Zhujun, Z. and W.R. Seitz (1984). "A fluorescence sensor for quantifying pH in the range from 6.5 to
8.5." Analytical Chimica Acta 160: 47-55）と共に、ＨＰＴＳを生理学的及びバイオプロセスｐＨ測定のための適切なプローブにする。
【０１０３】
３つの強陰イオン性スルホン酸基の存在は、イオン結合により陽イオン性支持体にＨＰＴＳを固定させる。現在まで、ＨＰＴＳの共有結合は、スルホンアミドカップリングによるものであった（米国特許第４，７９８，７３８号）。染料を固定し、ｐＨ感受性を存続させるのに有効である一方、ポリマー基質は、第一級アミンを含有するものに限定される。さらに、カップリング後に基質上に残存するアミン基は、ポリマーマトリックス内部の局所的ｐＨに影響を及ぼす。染料は、中性及び酸性環境で、並びに血管内血中ガスモニタリング系（この場合、それはｐＨ及びｐＣＯ2検出の両方のために用いられた）で操作する蛍光ベースのｐＨセンサーの開発(Gehrich, J.I., D.W. Lubbers, et al. (1986). "Optical fluorescence and its application to an intravascular blood gas monitoring system." IEE TBio-med Eng BME-33: 117-132)）において、制御細孔ガラス（Offenbacher, H., O.S. Wolfbeis, et al. (1986). "Fluorescence optical sensors for continuous determination of near-neutral pH values." Sensor Actuator 9: 73-84）及びアミノエチルセルロース（Schulman, S.G., S. Chen, et al. (1995). "Dependence of the fluorescence of immobilized 1-hydroxypyrene-3.6.8-trisulfonate on solution pH: extension of the range of applicability of a pH fluorosensor. "Anal Chim Acta 304: 165-170）と共有結合されてきた。光ファイバーｐＨセンサーは、陰イオン交換膜（Zhujun, Z. and W.R. Seitz (1984)）又は樹脂（Zhang, S., S. Tanaka, et al. (1995). "Fibre-optical sensor based on fluorescent indicator for monitoring physiological pH values." Med Biol Eng Comput 33: 152-156）に結合され、そして光ファイバーの先端に取り付けられたＨＰＴＳと共に記載されている。
【０１０４】
例えば米国特許第５，１１４，６７６号（この記載内容の全体は参照により本明細書中で援用される）は、粒子と又は微晶質セルロース繊維と共有結合され得る蛍光指示薬を有するｐＨセンサーを提供する。センサーは、光学的に透明な基質、熱可塑性層及びヒドロゲルを包含する。それに結合された指示薬を有する粒子の一部は、基質上に被覆されると共に熱及び圧力を用いて機械的に接着される熱可塑性層中に埋め込まれる。粒子／指示薬の大多数は、熱可塑性層上に適用されるヒドロゲル層内に埋め込まれる。ｐＨセンサーは、光学導波管の先端に適用される。
【０１０５】
さらに、低コストＵＶ  ＬＥＤの近年の利用可能性に伴って、ＵＶ及び青色ＬＥＤ及びフォトダイオードモジュールを組み合せる相対的に安価な計器使用により測定され得る。このような手順は、発酵媒質中に直接溶解されたＨＰＴＳにより高処理量マイクロバイオリアクター系のｐＨを検出するために記載されている（Kostov, Y., P. Harms, et al. (2001). "Low-cost microbioreactor for high-throughput bioprocessing." Biotechnol Bioeng 72: 346-352）。
【０１０６】
本発明の一実施形態では、好ましい感知デバイスは、少なくとも１つの光源と、検出器と、蛍光レポーター染料系を含むセンサーとを包含する。一実施形態では、蛍光レポーター染料系は、分析物結合消光剤と操作可能的に結合される蛍光染料を含む。染料は、消光剤と共有結合されるか、又は単に消光剤と会合され得る。染料及び消光剤は好ましくは操作可能的に結合され、これは、操作に際して、消光剤がその蛍光と相互作用し、そして調整するのに十分に染料にごく近接して存在する、ということを意味する。一実施形態では
、染料及び消光剤は、分析物透過性ヒドロゲル又は他の高分子マトリックス内に一緒に閉じ込められ得る。適切な波長の光により励起される場合、蛍光染料は光を放出する（例えば蛍光発光する）。光の強度は、結合している分析物の量に伴って変わる消光の程度に応じて決まる。他の実施形態では、蛍光染料及び消光剤は、互いの代わりに、ヒドロゲル又は他の高分子マトリックスと共有結合され得る。
【０１０７】
一実施形態では、２つの染料系がセンサー中に一緒に（例えばヒドロゲル中に）固定されるよう、別個のｐＨ指示薬染料は、分析物結合部分を用いて官能基化される異なる染料と組み合される。
【０１０８】
いくつかの蛍光ｐＨ指示薬分子は、特定波長で光を吸収し、そして第二のより長い波長で光を放出する。それらのｐＨ指示機能は、典型的には、プロトン付加及び脱プロトン化を包含する。これは、これらの蛍光ｐＨ指示薬が、或るｐＨ範囲では分子の一部を構成する（分子に結合される）水素原子（プロトン、Ｈ+）を含むが、しかし別のｐＨ範囲内では、プロトンが分子から解離される、ということを意味する。プロトンが分子から解離されると、分子は負の電荷を呈し、これは、指示薬を有する溶液中の正荷電イオン（例えばＮａ+）により釣り合いを保たれる。この配列は、方程式１（Ｒ−−Ｈ・Ｒ-＋Ｈ+）で示される。
【０１０９】
Ｒが蛍光分子を表す場合、それは一般的に、それがＲ−−Ｈ形態であるかＲ-形態であるかに基づいて、異なる波長での蛍光を示す（非常に異なる色として目に見える）。Ｒにより表されるほとんどの分子に関して、この変化は一般的に、非常に狭いｐＨ範囲内で全く突然に起こって、Ｒを非常に簡単な且つ信頼できるｐＨ指示薬として役立たせる。溶液中に置かれた場合、或るものは非常に異なる色（そのＲ−−Ｈ形態と関連した色）を、そして別のものはそのＲ-と関連した非常に別個の色を示す。
【０１１０】
例えば、その優れた光安定性、高収量、二重励起、大ストークス・シフト及び長い蛍光放出のため、８−ヒドロキシル−１，３，６−ピレントリスルホネート（ＨＰＴＳ）は、ｐＨ決定のための最良の潜在的指示薬の１つと考えられてきた。この指示薬の望ましい特徴は、酸性（会合ＨＰＴＳ形態）及び塩基性（解離ＰＴＳ-）形態が４０６ｎｍ及び４６０ｎｍで異なる励起波長を有し、等吸収点は４１８ｎｍであるが、しかし５１５ｎｍで同様の蛍光放出最大を示すということである。二重励起及び単一放出は、ＨＰＴＳをｐＨのレシオメトリック検出に適したものにする。酸形態に関する４０６ｎｍでの蛍光強度は低減するが、しかし塩基形態に関する４６０ｎｍでの強度は、ｐＨが染料の酸性形態から塩基性形態への変換に伴って上がるにつれて高められる。
【０１１１】
ＨＰＴＳ及びその誘導体のような染料上のヒドロキシル（−ＯＨ）基のため、これらの染料は環境のｐＨ変化に感受性である。ヒドロキシル基のｐＨ依存性イオン化は、これらのピラニン誘導体にその酸性形態及び塩基性形態で異なる吸収最大を有するｐＨ依存性吸収スペクトルを持たせる。一次吸収最大は第一の励起波長であり、そして二次吸収最大は第二の励起波長である。第一の励起波長及び第二の励起波長で蛍光染料により吸収される光の量は、蛍光染料が接触している媒質のｐＨによるか又は関連する。放出波長で染料により放出される光（例えば蛍光放出）の量は、染料が励起波長で照射される場合、光吸収の量に応じて決まる。吸収は媒質のｐＨにより影響を及ぼされるため、蛍光放出はｐＨによっても影響される。これは、ｐＨ決定のための基礎を提供し、一方で、ポリヒドロキシル化合物濃度を測定し得る。
【０１１２】
本発明の好ましい一実施形態では、レシオメトリックｐＨ感知は、光ファイバーの近位末端領域に操作可能的に連結された少なくとも１つの励起光源を包含する光学センサーを用いて成し遂げられるが、この場合、ファイバーはファイバーの光路内のその遠位末端領
域に沿って配置され、指示薬系は励起光に応答して検出可能な放出シグナルを発生するよう設計される。センサーの好ましい実施形態は、放出シグナルを検出器に送るための光学手段をさらに包含する。このような光学手段は当該技術分野でよく知られており、そして例えば光を戻すための鏡、フィルター、レンズ、ビームスプリッター、及び光ファイバー束及び分割形状を包含し得る。
【０１１３】
好ましい実施形態では、指示薬系は、少なくとも２つの異なる形態、並びにこれらの異なる形態間のｐＨ依存性シフト（ここで、このシフトは単一波長での又は２つの異なる波長での放出強度の変化として検出され得る）を示すフルオロフォアを含む。例えば、レシオメトリックｐＨ感知のための或る指示薬系は、染料がその酸形態であるか又は塩基形態であるかによって２つの異なる波長最大（λ酸及びλ塩基）で光を吸収する蛍光染料（例えばＨＰＴＳ）を含み、そしてそれは単一のより長い放出波長で光を放出する。さらに特定的には、ｐＨが増大されると、ＨＰＴＳは、λ塩基に対応する吸光度の増大、及びλ酸に対応する吸光度の低減を示す。これらの変化は、ヒドロキシル基のｐＨ依存性イオン化に起因する。ＨＰＴＳに関する放出スペクトルはｐＨと無関係であり、約５１１ｎｍのピーク放出波長を有するが、しかし放出光の強度は吸収される光の量に応じて決まる（これはｐＨ及び励起波長に伴って変わる）。したがって、例えば一次波長（例えばλ酸）の光で所定のｐＨでＨＰＴＳを励起する場合、単一放出波長で放出強度を測定し得る；強度は、染料の形態（即ち、イオン化の程度−これはｐＨに応じて決まる）による。二次波長（例えばλ塩基）で励起し、同一所定ｐＨで放出強度を測定することもできる。放出強度の比はｐＨに関連し、そして染料の、並びに系中の或る光学的人工産物の量とは無関係である。任意の励起波長はレシオメトリック感知のために用いられ得るが、しかしλ酸及びλ塩基は本発明の一実施形態に従って選択される、ということに留意されたい。吸収が染料の酸形態及び塩基形態に関して同一である波長は、等吸収点と呼ばれる−この波長（λiso）での励起も、本発明に対するその他の好ましい変更に従って、レシオメトリック感知に用いられ得る。放出強度の比（例えばＩ塩基／Ｉiso又はＩ塩基／Ｉ酸）がｐＨに対してプロットされる場合、標準曲線又は較正曲線が作成される（例えば図３、図５及び図９参照）。用いられる染料が二重エキサイター−単一エミッター（例えばＨＰＴＳ）であるか、単一エキサイター−二重エミッターであるか、又は二重エキサイター−二重エミッターであるか否かに拘わらず、スペクトル特性における検出可能な変化を生じる形態でのｐＨ感受性シフトを染料が受ける限り、レシオメトリック法は同様である。
【０１１４】
光学的グルコース感知
蛍光染料、例えばＨＰＴＳ及びその誘導体を含む指示薬系は、分析物検出に用いられてきた。例えば米国特許第６，６５３，１４１号、同第６，６２７，１７７号、同第５，５１２，２４６号、同第５，１３７，８３３号、同第６，８００，４５１号、同第６，７９４，１９５号、同第６，８０４，５４４号、同第６，００２，９５４号、同第６，３１９，５４０号、同第６，７６６，１８３号、同第５，５０３，７７０号、及び同第５，７６３，２３８号；並びに同時係属中の米国特許出願第１１／２９６，８９８号及び同第６０／８３３，０８１号（これらの記載内容の全体は各々、参照により本明細書中で援用される）参照。特にいくつかの好ましい蛍光染料、消光剤／分析物結合部分、並びにポリヒドロキシル化合物濃度を光学的に決定するための方法に関連した詳述は、米国特許第６，６５３，１４１号及び第６，６２７，１７７号、並びに米国特許出願第１１／２９６，８９８号及び第６０／８３３，０８１号に開示されている。
【０１１５】
ｐＨ及びグルコースの血管内決定のためのデバイス
一実施形態では、方法及びセンサーは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで媒質のｐＨ並びに分析物の濃度をモニタリングする。別の実施形態では、方法及びセンサーは、ｉｎ  ｖｉｖｏでｐＨ及び分析物濃度をモニタリングする。別の実施形態では、測定ｐＨ値は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏでグルコース濃度をより正確に決定するためにも用いられ得る。
特定的には、ｐＨ値及びグルコース濃度の同時測定は、グルコース応答のシグナルの実時間補正を可能にする。しかしながら、いくつかの実施形態によるデバイスはｐＨ又は分析物を決定するためにだけ用いられ得るセンサーを包含すると理解される（ｐＨに関するその補正は、慣用的な２つのセンサー技術により、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで血中ｐＨを試験することにより実行され得る）。
【０１１６】
一実施形態は、ｐＨ及びポリヒドロキシル化合物の濃度を同時に決定するためのデバイスであって、消光剤と操作可能的に結合される蛍光染料を含むセンサーと、１つ又は複数の励起波長を上記センサーに送達するための手段と、上記センサーからの蛍光放出を検出するための手段とを包含するデバイスを提供する。
【０１１７】
別の実施形態は、生理学的流体中のｐＨ及びポリヒドロキシル化合物濃度を決定するためのデバイスであって、水不溶性ポリマーマトリックスであって、該ポリマーマトリックスはポリヒドロキシル化合物に対して透過性である、水不溶性ポリマーマトリックス；該ポリマーマトリックスと会合される蛍光染料であって、該蛍光染料は第一の励起波長及び第二の励起波長で光を吸収するよう、そして放出波長で光を放出するよう設計される、蛍光染料；ポリヒドロキシル化合物濃度に依存する量のポリヒドロキシル化合物を可逆的に結合するようになっている芳香族ボロン酸置換ビオロゲンを含む消光剤であって、該消光剤は上記ポリマーマトリックスと会合され、そして蛍光染料と操作可能的に結合され、また、消光剤は結合ポリヒドロキシル化合物の量と関連した上記蛍光染料により放出される光強度を低減するよう設計される、消光剤、少なくとも１つの励起光源と、放出光検出器とを包含するデバイスを提供する。
【０１１８】
一態様において、本発明は、生理学的ｐＨ又はそれに近いｐＨでの水性媒質中のポリヒドロキシル化合物、例えばグルコースの存在に応答性である一クラスの蛍光消光性化合物を包含する。言い換えれば、消光効率は、媒質中のこれらの化合物の濃度により制御される。好ましい消光剤は、少なくとも１つのボロン酸基で置換されるビオロゲンを含むが、この場合、付加物がポリマー中に固定されるか又はポリマーと共有結合される。消光剤、染料及びポリマーも、互いに共有結合され得る。別の態様では、本発明は、ビオロゲン／ボロン酸付加物による消光に感受性である一クラスの蛍光染料を包含する。
【０１１９】
蛍光染料及び消光剤は、ポリヒドロキシル化合物感知のために互いに操作可能的に結合される。染料及び消光剤は、いくつかの実施形態ではポリマー主鎖を介して連結され得る。他の実施形態では、染料及び消光剤は、蛍光染料の消光が生じるよう互いにごく近接して存在し、それにより染料の蛍光放出を低減し得る。ポリヒドロキシル化合物（例えばグルコース）がボロン酸と結合してボロン酸エステルを形成する場合、ボロン酸エステルはビオロゲンと相互作用して、ポリヒドロキシル化合物結合の程度に応じてその消光効力を変更する。その結果、より多くのポリヒドロキシル化合物が消光剤と結合されるにつれ、蛍光放出の強度は増大する。
【０１２０】
好ましい一実施形態では、デバイスは、その中に配置されたキャビティを含むと共にキャビティ内に上記のような指示薬系（例えばグルコース結合部分／消光剤に操作可能的に結合されたフルオロフォア、及び固定化高分子マトリックス）を固定されている光ファイバーを包含する。デバイスはさらに、光源及び検出器を包含する。
【０１２１】
ｐＨ及びグルコースを同時決定するための方法
一実施形態は、蛍光染料を用いてｐＨ及びポリヒドロキシル化合物濃度を決定するための方法であって、消光剤と操作可能的に結合される蛍光染料を含むセンサーを提供するステップと、上記センサーを試料と接触させるステップと、第一の励起波長で上記センサーを照射するステップと、放出波長で上記センサーの第一の蛍光放出を検出するステップと
、第二の励起波長で上記センサーを照射するステップと、上記放出波長で上記センサーの第二の蛍光放出を測定するステップと、第一の放出及び第二の放出の比をｐＨ較正曲線と比較して試料のｐＨを決定するステップと、放出消光を既知のｐＨで標準曲線と相関させて上記試料中のポリヒドロキシル化合物濃度を決定するステップとを包含する方法を提供する。もちろん、他のアルゴリズムがレシオメトリックｐＨ感知に関して知られており、そして本発明の実施形態に従って用いられ得る。制御装置、例えばコンピューター又は専用デバイスは、いくつかの実施形態では、励起光の適用、検出器シグナルのモニタリング、比の決定、比を較正曲線と相関させること、グルコースシグナルを標準曲線と相関させること、ｐＨ変化に関して補正すること、ルーチンセンサー較正操作を実行すること、オペレーター動作を促すこと、正確性を保持するためにプログラムされたようにユーザーデータ入力を組み込むこと（例えばフィンガースティック・グルコース測定）等を含めた操作を制御するために用いられ得る。
【０１２２】
図１に関して、本発明の一実施形態による感知装置１００は、少なくとも１つの光源１１（例えば励起光源）、検出器１５（例えば放出光検出器）、並びに消光剤及び光学的ポリマーマトリックスに操作可能的に結合される蛍光染料を含むセンサー１３を包含する。いくつかの実施形態では、光源１１は、蛍光染料の励起のために２又はそれより多くの異なる波長を選択的に送達するよう適合され得る。この型の光源は、波長可変光源であり得る。他の実施形態では、波長を減衰させるために、1つ又は複数の光源が光ファイバー１２と一緒に用いられ得る。他の実施形態では、１つより多くの光源１１を用いて、異なる励起波長を送達し得る。このような光源は、第一の励起波長及び第二の励起波長をセンサーに送達するための一手段でもある。
【０１２３】
センサー１３は、染料が消光剤と操作可能的に結合される場合、媒質のｐＨ及びポリヒドロキシル化合物（例えば糖又はグルコース）濃度の両方に感受性である蛍光染料を包含する。このような蛍光染料は、蛍光染料の局所的環境のｐＨにおける対応するシフトに伴って励起波長最大でのシフトを示す。局所的環境のｐＨが変わると、第一の励起波長での吸収は増大し、一方、第二の励起波長での吸収は低減するか、或いはその逆もある。選択波長での吸収の変化は蛍光放出のレベルに影響を及ぼし、したがって最終的にはｐＨ検出を可能にし得る。ｐＨ検出は、環境中のポリヒドロキシル化合物の濃度とは無関係である。適切な蛍光染料は、ビオロゲンのような分子による消光にも感受性である。蛍光染料が消光剤（例えばビオロゲン）と操作可能的に結合される場合、蛍光放出は減衰される。消光剤は、グルコース認識を提供し得る芳香族ボロン酸部分を有し得る。ボロン酸は、水性媒質中でグルコースと可逆的に反応して、ボロン酸エステルを形成し、このような反応の程度は媒質中のグルコース濃度に関連する。より多くのグルコースが消光剤と反応するのに利用可能である場合、染料から電子を受け取る消光剤の能力は減少する。その結果、消光剤による蛍光放出の減衰は、検出されるべきポリヒドロキシル化合物（例えばグルコース）の濃度に依存する。
【０１２４】
検出器１５は蛍光放出を検出するために用いられ、好ましい実施形態では、分析のために電子制御装置２０に連結され得る。光フィルター、例えば１４は、波長選択のためにセンサー１３と検出器１５の間に配置され得る。他の光学部品、例えば鏡、照準及び／又は焦点レンズ、ビームスプリッター等も利用され得る。光フィルターは、選択波長をセンサーに送達するために、そしてセンサーからの蛍光放出を検出器に送達するために用いられ得る。光源及び検出器は、コンピューターのような電子制御装置２０により制御され得る。
【０１２５】
本発明の一実施形態は、単一蛍光染料を用いてｐＨ及びポリヒドロキシル化合物濃度を測定するための方法を提供する。測定は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで実行され得る。一次測定を実施する前に、センサーを較正することが必要であり得る。これは、
先ず、種々のｐＨでセンサーの吸光度スペクトルを得て、等吸収点並びに酸形態及び塩基形態に関する吸収最大が生じる波長を決定し、次に少なくとも１つの既知のｐＨ及びグルコース濃度でこれらの波長のうちの少なくとも２つから放出シグナルを獲得することにより実行され得る。
【０１２６】
ｐＨ及びポリヒドロキシル濃度測定に関して、センサー１３が先ず試料と接触して配置される。次にセンサー１３は第一の励起波長で、その後、第二の励起波長で照射される。第一の励起波長及び第二の励起波長は典型的には、蛍光染料の酸性形態に関しては吸収最大の波長（λ酸）、塩基性形態の蛍光染料に関しては吸収最大の波長（λ塩基）、或いは等吸収点の波長（λiso）又はその他の選択波長の近くで選択される。第一の励起波長及び第二の励起波長からの放出の比を用いて、試料ｐＨを決定する。第一の放出及び第二の放出は、ｐＨに関して一旦補正されると、試料グルコース濃度を決定するために用いられ得る。
【０１２７】
図１に示した感知デバイスに対する変更に際して、検出器は、標準フォトダイオード検出器であり得る。２つのダイオード検出器（参照シグナルに関するものと、放出シグナルに関するもの）が存在し得る。ダイオード検出器の代わりに、光ファイバー保有センサー出力（蛍光放出及び／又は反射励起光）は、分光分析計又はマイクロ分光計に入力を直接提供し得る。好ましい一実施形態では、検出器は、マイクロ分光計、例えばＵＶ／ＶＩＳマイクロ分光計モジュール（製造：Boehringer Ingelheim）を包含する。
【０１２８】
図２は、本発明の好ましい態様に従って用いられ得る光学系の一実施形態を示す。図２を参照すると、或る実施形態は、少なくとも２つの光源３０１Ａ及び３０１Ｂを包含する。光源は、コリメーターレンズ３０２Ａ及び３０２Ｂを通して送られ得る（図示されているように）励起光を発生する。或る実施形態では、その結果生じるコリメーターレンズからの光は、（図示されているように）干渉フィルター３０３Ａ及び３０３Ｂに送られ得る。或る実施形態では、その結果生じる干渉フィルターからの光は、焦点レンズ３０４Ａ及び３０４Ｂにより、光ファイバーライン３０５Ａ及び３０５Ｂに集められ得る（図示されているように）。或る実施形態では、光ファイバーラインは、埋め込み指示薬系３０７Ａを有するセンサー３０７と連続する単一ファイバー３０６に合流する。ファイバーの横断面は、（図示されているように）中心光ファイバー３０６Ａを取り囲むファイバーの束から単一ファイバー３０７Ａに変わり得る。
【０１２９】
或る実施形態では（図示されているように）、指示薬系３０７Ａにより発生される放出光シグナル、並びに励起光シグナルは、鏡３０８により反射されて、センサーから光ファイバーライン３０９及び３０９Ａに送り戻される。図示された系では、出口ラインは２つの干渉フィルター３１２Ａ、３１２Ｂ及び２つの検出器３１３Ａ、３１３Ｂを含めることにより増す。好ましい実施形態では、干渉フィルター３１２Ａは、励起光を遮断し、放出光を検出器３１３Ａに通させて、ここで放出光が検出されるよう設計される。或る実施形態では、検出器３１３Ａにより作り出されるシグナルは増幅器３１４Ａにより増幅され、そしてアナログ−デジタル変換器３１５Ａによりデジタルシグナルに変換されて、コンピューター３１６に送られる。或る実施形態では、干渉フィルター３１２Ｂは、放出光を遮断し、励起光を検出器３１３Ｂに通させて、ここで励起光が測定されるよう設計される。或る実施形態では、検出器３１３Ｂにより作り出されるシグナルは増幅器３１４Ｂにより増幅され、そしてアナログ−デジタル変換器３１５Ｂによりデジタルシグナルに変換されて、コンピューター３１６に送られる。レシオメトリック計算を用いて、放出光の強度に影響を及ぼす非グルコース関連因子を実質的に除去又は低減し得る；これらの方法は、同時係属中の米国特許仮出願第      号（表題「血管内フルオロフォアセンサーを用いるグルコースのレシオメトリック測定のための光学系及び方法（Optical systems and methods for ratiometric measurement of glucose using intravascular fluorophore sensors
）」）（本明細書と同一日に提出）（この記載内容の全体は参照により本明細書中で援用される）に詳細に開示されている。
【実施例】
【０１３０】
実施例１
図３は、蛍光染料（この場合はＨＰＴＳ）の励起／吸収スペクトルの一例を示す。異なるｐＨで得られた蛍光染料の吸収スペクトルから、λ酸、λ塩基及びλisoが決定され得る。より低いｐＨ（例えばより酸性の条件）では、約４０５ｎｍでのピークは約４６０ｎｍでのピークより高く、したがって酸性形態の蛍光染料に関する吸収最大である。より高いｐＨ（例えばより塩基性の条件）では、約４６０ｎｍでのピークは約４０５ｎｍでのピークより高く、したがって塩基性形態の蛍光染料に関する吸収最大である。λisoは、吸収がｐＨと無関係である波長であり、そしてそれは、例えばＨＰＴＳに関しては約４２２ｎｍである。
【０１３１】
第一の励起波長（例えばλ酸、λ塩基又はλiso）での照射の結果として生じる放出波長での第一の蛍光放出強度（Ｉx、これはＩ酸、Ｉ塩基又はＩisoであり得る）は次に検出器により測定され、そして結果は電子制御装置に保存される。次に、センサーは再び第二の励起波長で照射される。第二の励起波長は第一の励起波長とは異なり、そしてこれもλ酸、λ塩基又はλisoから選択され得る。検出器は次に、第二の励起波長（例えばλ酸、λ塩基又はλiso）での照射の結果として生じる第二の蛍光放出強度（Ｉy、これはＩ酸、Ｉ塩基又はＩisoであり得る）を検出し／測定する。次に、第一の蛍光放出及び第二の蛍光放出の比（Ｉx／Ｉy）がコンピューター計算され得る。Ｉx／Ｉyはポリヒドロキシル濃度とは無関係であるため、ｐＨ標準曲線（Ｉx／Ｉy対ｐＨ）は、ポリヒドロキシル濃度の作用を考慮することなくプロットされ得る。
【０１３２】
実施例２（ＨＰＴＳ／ＭＡＢＰ４）
図４は、Ｉ(塩基)／Ｉ(iso)比を用いるＨＰＴＳ／ＭＡＢＰ４を用いたレシオメトリックｐＨ感知がグルコース濃度と無関係であることを示す。ＭＡＢＰ４の構造を以下に示す：
【０１３３】
【化１５】
2010518397.tif 000019
【０１３４】
データは、種々のグルコース濃度での４５４ｎｍ（塩基）及び４２２ｎｍ（等吸収点）での励起に対応する蛍光放出対ｐＨの比としてプロットされる。グルコース濃度の変化は、各特定ｐＨでのＩ塩基／Ｉisoの値に識別可能な影響を及ぼさない。したがって、試料中のポリヒドロキシル化合物濃度にかかわらず、試料のｐＨはＩx／Ｉy対ｐＨの標準曲線を用いて測定され得る。測定Ｉx／Ｉyを標準曲線と相関させるか又は比較することにより、測定中の試料のｐＨを決定し得る。
【０１３５】
図５は、異なるｐＨで、４２２ｎｍ（等吸収点）で励起されたＨＰＴＳ／ＭＡＢＰ４に関するグルコース応答曲線を示す。種々のグルコースレベル（Ｉ）でのＩx／Ｉy対ゼログルコース濃度（Ｉ0）でのＩx／Ｉyの比をグルコース濃度に対してプロットすることにより、標準ポリヒドロキシル応答曲線を用いて、測定Ｉ／Ｉ0値から試料中のグルコース濃度を決定し得る。しかしながら、Ｉ／Ｉ0値は試料のｐＨに依存するため、標準グルコース応答曲線は異なるｐＨにより影響を及ぼされ得る。これを回避するために、生理学的範囲内の異なるｐＨでのいくつかの標準グルコース応答曲線がプロットされ、そして電子制御装置又はセンサーデバイスのオペレーターによる選択のために利用可能である。試料のＩx／Ｉy測定値が利用可能である場合、電子制御装置又はオペレーターは標準Ｉx／Ｉy対ｐＨ曲線から試料のｐＨを知り、そして正しい標準ポリヒドロキシル応答曲線（例えばグルコース応答曲線）が正確なグルコース濃度を決定するために用いられ得る。図に示された例はグルコース濃度の決定に関するが、しかし本発明の方法及びデバイスの適用はグルコース濃度を検出することに限定されない。蛍光系はポリヒドロキシル化合物に応答し、同様に、それはグルコースに応答するため、センサーデバイスを用いて、同時に任意のポリヒドロキシル化合物濃度及びｐＨを検出し得る。
【０１３６】
実施例３（ＳＮＡＲＦ−１）
図６は、溶液中の異なるｐＨでのＳＮＡＲＦ−１の吸収スペクトルを示す。ＳＮＡＲＦは、Molecular Probes, Inc.からの市販染料の一クラスに関する商標名である。ＳＮＡＲＦ−１を用いて、これらの実験を実行した。図７及び図８は、５１４ｎｍ励起／５８７ｎｍ放出（図７）又は５１４ｎｍ励起／６２５ｎｍ放出（図８）で決定された異なるｐＨでの溶液中のＳＮＡＲＦ−１／３，３’−ｏＢＢＶに関するグルコース応答曲線を示す。図９は、５１４ｎｍの単一励起波長並びに５８７ｎｍ及び６２５ｎｍの放出波長で決定されたＩ(塩基)／Ｉ(酸)比を用いた溶液中のＳＮＡＲＦ−１／３，３’−ｏＢＢＶに関する異なるグルコース濃度でのｐＨのレシオメトリック感知を示す。したがって、消光剤３，３’−ｏＢＢＶ（溶液中）と操作可能的に結合された二重−二重染料ＳＮＡＲＦ−１を単一エキサイター−二重エミッター・フルオロフォアとして用いて、ｐＨ（レシオメトリック）及びグルコースを共に決定し得る。
【０１３７】
実施例４（ＨＰＴＳ−トリＬｙｓＭＡ／３，３’−ｏＢＢＶ／ＤＭＡＡ）
図１０は、異なるｐＨでのＨＰＴＳ−トリＬｙｓＭＡ／３，３’−ｏＢＢＶ／ＤＭＡＡ指示薬系のグルコース応答を示す。図１１は、Ｉ(塩基)／Ｉ(酸)比を用いたＨＰＴＳ−トリＬｙｓＭＡ／３，３’−ｏＢＢＶ／ＤＭＡＡに関する異なるグルコース濃度でのｐＨのレシオメトリック感知を示す。この指示薬系は、生理学的ｐＨ範囲に亘って線形ｐＨ曲線を示すことが分かる。
【０１３８】
実施例５（ＨＰＴＳ−トリＣｙｓＭＡ／３，３’−ｏＢＢＶ／ＤＭＭＡ）
図１２は、Ｉ(塩基)／Ｉ(酸)比を用いたＨＰＴＳ−トリＣｙｓＭＡ／３，３’−ｏＢＢＶ／ＤＭＭＡ指示薬系に関する異なるグルコース濃度でのｐＨのレシオメトリック感知を示す。この指示薬系は、生理学的ｐＨ範囲に亘って線形ｐＨ曲線を提供することが分かる。この実施例に関しては、光ファイバーの末端に埋め込まれたヒドロゲル中に、指示薬系を固定した。手で持てる大きさの検出器を用いて、酸及び塩基放出シグナルを測定した。
【０１３９】
本発明の多数の好ましい実施形態及びその変形を詳細に記載してきたが、その他の修正並びにその使用方法及び医学的適用は当業者には明らかである。したがって、本発明の精神或いは特許請求の範囲を逸脱しない限り、種々の適用、修正及び置換が均等物から成され得る、と理解されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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