(57)【要約】  本発明は、ビオチンまたはビオチン誘導体との少なくとも１つの共有結合を、還元末端に含む低分子量ヘパリンに関し、これらの調製方法およびそれらの治療的使用、ならびに前記ビオチン化低分子量ヘパリンの中和用にアビジンまたはストレプトアビジンを実行する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
３０００から７０００Ｄａの間の平均分子量を有し、構成多糖類がこれらの還元末端においてビオチンまたはビオチン誘導体と共有結合していることを特徴とする、低分子量ヘパリン。
【請求項２】
構成多糖類が、一般式（Ｉ）：
【化１４】
2010518238.tif 000017
［式中、
−ｉは０または１に等しく、
−Ｒ１は、式（ａ）または（ｂ）：
【化１５】
2010518238.tif 000018
｛式中、ｊおよびｋは、同一でありまたは異なってよく、１から１０の任意の値をとり得る整数である。｝の連鎖を表し、
−Ｂｉｏｔは、ビオチン基またはビオチン誘導体を表し、
−ＰＥは、ヘパリンの構成多糖類の一般構造を有する多糖類鎖を表し、
−ＸはＨまたはＳＯ３Ｎａを表し、
−ＹはＳＯ３ＮａまたはＣＯＣＨ３を表し、
−波線は、これが結合しているピラノース環平面の下または上のいずれかに位置する結合を表す。］、
に対応することを特徴とする、請求項１に記載のビオチン化低分子量ヘパリン
およびさらにこれらの薬学的に許容される塩。
【請求項３】
ｉが０に等しいことを特徴とする、請求項２に記載のビオチン化低分子量ヘパリン
およびさらにこれらの薬学的に許容される塩。
【請求項４】
ｉが１に等しく、ならびにＲ１が、式（ａ）（式中、ｊは５に等しい。）の連鎖を表すことを特徴とする、請求項２に記載のビオチン化低分子量ヘパリン
およびさらにこれらの薬学的に許容される塩。
【請求項５】
ｉが１に等しく、Ｒ１が、式（ｂ）（式中、ｊおよびｋは同一であり、５に等しい。）の連鎖を表すことを特徴とする、請求項２に記載のビオチン化低分子量ヘパリン
およびさらにこれらの薬学的に許容される塩。
【請求項６】
Ｂｉｏｔが式（ｃ）：
【化１６】
2010518238.tif 000019
のビオチン基を表すことを特徴とする、請求項２から５のいずれか一項に記載のビオチン化低分子量ヘパリン
およびさらにこれらの薬学的に許容される塩。
【請求項７】
構成多糖類の少なくとも６０％が、これらの還元末端にビオチンまたはビオチン誘導体との共有結合を有することを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載のビオチン化低分子量ヘパリン
およびさらにこれらの薬学的に許容される塩。
【請求項８】
構成多糖類の少なくとも８０％が、これらの還元末端にビオチンまたはビオチン誘導体との共有結合を有することを特徴とする、請求項７に記載のビオチン化低分子量ヘパリン
およびさらにこれらの薬学的に許容される塩。
【請求項９】
構成多糖類の少なくとも９０％が、これらの還元末端にビオチンまたはビオチン誘導体との共有結合を有することを特徴とする、請求項７または請求項８に記載のビオチン化低分子量ヘパリン
およびさらにこれらの薬学的に許容される塩。
【請求項１０】
前記低分子量ヘパリンが、エノキサパリン、アルデパリン、ベミパリン、パルナパリンおよびチンザパリンから選択されることを特徴とする、請求項１から９のいずれか一項に記載のビオチン化低分子量ヘパリン
ならびにさらにこれらの薬学的に許容される塩。
【請求項１１】
前記低分子量ヘパリンが、
−これらの構成多糖類の９％から２０％は、２０００Ｄａ未満の平均分子量を有し、
−これらの構成多糖類の５％から２０％は、８０００Ｄａを超える平均分子量を有し、
−これらの構成多糖類の６０％から８６％は、２０００から８０００Ｄａの間の平均分子量を有し、
−質量平均分子量と数平均分子量の間の比は、１．３から１．６の間であり、
−前記低分子量ヘパリンは、ヘパリンより優れた生物学的利用能および抗血栓活性を有し、約３５００から５５００Ｄａの間の平均分子量を有する、
ものであることを特徴とする、請求項１から９のいずれか一項に記載のビオチン化低分子量ヘパリン
およびさらにこれらの薬学的に許容される塩。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか一項に定義されたビオチン化低分子量ヘパリンの調製方法であって、以下のステップ：
ａ）アミン塩および還元剤の存在下で、温度２０から８０℃の間で、低分子量ヘパリンに還元的アミノ化を実施するステップ、
ｂ）その後、活性化基−（Ｒ１）ｉ−Ｂｉｏｔ−（式中、Ｒ１、ｉおよびＢｉｏｔは請求項２から６のいずれか一項に定義された通りである）を用いて、水性媒体または有機媒体中に塩基が存在する状態でアシル化を実施するステップ、
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項１３】
以下のステップ：
ａ）ハロゲン化アンモニウム塩および水素化ホウ素塩の存在下で、５０から８０℃の間の温度で、低分子量ヘパリンに還元的アミノ化を実施するステップ、
ｂ）その後、−（Ｒ１）ｉ−Ｂｉｏｔ基の活性化エステル型を用いて、水性媒体中に塩基が存在する状態で、アシル化を実施するステップ、
を含むことを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１から１１のいずれか一項に記載のビオチン化低分子量ヘパリンまたは前記ビオチン化低分子量ヘパリンの薬学的に許容される塩を含むことを特徴とする薬剤。
【請求項１５】
有効成分として、請求項１から１１のいずれか一項に記載のビオチン化低分子量ヘパリンまたは前記ビオチン化低分子量ヘパリンの薬学的に許容される塩およびさらに少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１から１１のいずれか一項に記載のビオチン化低分子量ヘパリンの、抗血栓剤としての使用。
【請求項１７】
静脈血栓症、動脈血栓障害（特に心筋梗塞または不安定狭心症の場合）、下肢の動脈疾患などの末梢動脈血栓症、大脳動脈血栓症または脳卒中の治療および予防のため、平滑筋細胞増殖、血管新生の予防および治療のため、ならびにアテローム性動脈硬化および動脈硬化症のための神経保護剤としての、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
請求項１から１１のいずれか一項に記載のビオチン化低分子量ヘパリンの中和を可能にすることを特徴とする、アビジンまたはストレプトアビジンを使用する方法。
【請求項１９】
請求項１から１１のいずれか一項に記載のビオチン化低分子量ヘパリンの中和用薬剤の調製のための、アビジンまたはストレプトアビジンの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビオチンまたはビオチン誘導体との少なくとも１つの共有結合を含む、低分子量ヘパリン、より一般的にはヘパリノイド系多糖類の混合物、に関し、さらにこれらの調製方法、これらを含む医薬組成物およびそれらの治療的使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘパリンは、動物起源の硫酸化ムコ多糖類の混合物であり、分子量およそ１５０００ダルトン（Ｄａ）ほどであり、特に、その抗凝血性および抗血栓性のために使用される。しかし、ヘパリンは、この使用条件が限られているという欠点がある。具体的には、その高い抗凝血活性（特にその高い抗第ＩＩａ因子活性）は、出血を引き起こすことがある（Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ、ｖｏｌ．５、ｓｕｐ．３、１９９９年）。
【０００３】
特にヘパリンエステルの塩基性解重合により得られ、現在市販されている、エノキサパリンなどの、例えば、３０００から７０００Ｄａの間、より特別には３５００から５５００ダルトンの間の低分子量ヘパリンもまた、高い抗第ＩＩａ因子活性を有する。
【０００４】
ヘパリン誘導体は、これらの望ましくない出血性副作用で知られている。しかし、上記の製品による血栓治療の分野において、目的は、血液の流動性を回復するまたは維持すると同時に、出血の誘導を避けることである。実際は、何らかの不測の理由で、治療下の患者に出血が誘発され得ることは周知である。抗血栓治療下の患者に外科手術の実施が必要となることがある。さらに、特定の外科手術の過程において、血液の凝固を防ぐために高用量の抗凝血剤が使用されることがあり、手術の終わりにこれらを中和することができることが有用である。したがって、いつでも抗凝血剤活性を停止するための、中和可能な抗血栓剤が必要である。
【０００５】
ビオチン化合成多糖類などの中和可能な抗血栓剤が、特許出願ＷＯ０２／２４７５４およびＷＯ０６／０３０１０４に記載されている。上記多糖類それ自体にではなく、これらの多糖類の保護された同等物に実施された、特にビオチンまたはビオチン誘導体をグラフトすることを含むそれらの合成は、本発明の化合物には適用できない。この理由は、ヘパリン系多糖類の混合物であり、したがって不均一生成物である最終生成物にビオチン化を実施することが望ましく、上述の特許出願に記載されたビオチンの最終生成物へのグラフトは、グラフト位置の十分な位置選択性を誘導できず、低分子量ヘパリンの官能化可能な多糖類鎖を全てビオチン化することはできないということである。
【０００６】
Ｏｓｍｏｎｄらのチームは、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３１（２００２）１９９−２０７頁に、ブタヘパリンのビオチン化に関するいくつかの技術を記載し、このうちの１つは、還元的アミノ化およびこれに続くビオチンとのカップリングを介した、ヘパリンの還元末端におけるビオチンのカップリングを含むと記載されている。しかし、前記文献に記載された操作条件では、ビオチン化ヘパリンを完全および再生可能に得ることはできず、これらの操作条件は、ヘパリンの構造多様性および市販のヘパリンに存在する、多糖類鎖の実際の構造を考慮に入れていない。後者のヘパリンは、還元末端に分解グリコセリン（ｇｌｙｃｏｓｅｒｉｎｅ）を含む多糖類鎖の大部分を含み、これはＯｓｍｏｎｄらにより記載されたプロトコルに従ってビオチンを用いて官能化することはできない。したがって、前記公報に記載された、ブタヘパリンのビオチン化に関する操作条件では、効果的な中和を可能にするために十分なビオチン化度などの、期待された特性を有しつつ、完全にまたは再生可能に得られるようにヘパリンをビオチン化できない。
【０００７】
Ｔｓｅｎｇらのチームは、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２７（２００６）、２６２７−２６３６頁に、ヘパリンを、ビオチンを用いて官能化した後、アビジンとの相互作用によってフィルム上にヘパリンを固定する技術を記載している。ヘパリンのビオチン化は、ヨウ素を用いた酸化、これに続くラクトンの形成、次いでビオチン２−（４−アミノフェニル）エチルアミン誘導体とのカップリングを介して実施される。しかし、Ｔｓｅｎｇらにより提示された操作条件は、還元末端においてビオチン化されたヘパリンの、完全な作製および再生可能な作製を前提としておらず、特に、酸化ステップが還元末端に関して選択的であり得る、またはヘパリンの生物活性がそのような処理後に保存されることを全く示していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第０２／２４７５４号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０６／０３０１０４号パンフレット
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ、ｖｏｌ．５、ｓｕｐ．３、１９９９年
【非特許文献２】Ｏｓｍｏｎｄら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３１（２００２）１９９−２０７頁
【非特許文献３】Ｔｓｅｎｇら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２７（２００６）、２６２７−２６３６頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、本出願者は、アビジンまたストレプトアビジンにより中和され得、出発低分子量ヘパリンに匹敵する、生物特性、特に、抗第Ｘａ因子活性および抗第ＩＩａ因子活性を有する、新規な低分子量ヘパリンを提供することそれ自体を目的として設定した。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、これ以降「ビオチン化低分子量ヘパリン」と称される、新規な修飾された低分子量ヘパリンに関し、これらは３０００から７０００Ｄａの間の平均分子量を有し、これらの構成多糖類は、これらの還元末端においてビオチンまたはビオチン誘導体と共有結合していることを特徴とする。
【００１２】
驚くことに、ビオチンまたはビオチン誘導体の、多糖類鎖の還元末端における導入は、低分子量ヘパリンの薬理学的活性を修飾しない。特に本発明の目的である新規なビオチン化低分子量ヘパリンは、ネイティブな低分子量ヘパリン、すなわちビオチン化される前のヘパリンに匹敵する抗血栓活性を有する。
【００１３】
前記新規なビオチン化低分子量ヘパリンは、ネイティブな低分子量ヘパリンを上回るかなりの有利性を有し、緊急の場合、前記新規なビオチン化低分子量ヘパリンは特定の解毒剤を用いて迅速に中和され得る。この特定の解毒剤は、四量体または単量体のアビジンまたはストレプトアビジンであり、それぞれ約６６０００、１６４００および６００００Ｄａに等しい質量を有する（Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ、第１２版、１９９６年、Ｍ．Ｎ．９２０、１５１−１５２頁；改訂Ｐｉｅｒｃｅ  Ａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ）。
【００１４】
前記新規なビオチン化低分子量ヘパリンは、使用される用量が多くなっても、同時に出血の危険性は低減されるという、治療指標において有用な有利性をさらに有し、したがって、前記新規なビオチン化低分子量ヘパリンは動脈治療の分野において有用であり得る。
【００１５】
本発明の文脈において、「低分子量ヘパリン」という用語は、ヘパリンの構成多糖類の一般的構造を有する硫酸化多糖類の混合物を意味し、これらは３０００から７０００Ｄａの平均分子量を有し、ヘパリンの解重合によって得られる。本文においてこれ以降、「低分子量ヘパリン」または「ネイティブな低分子量ヘパリン」という用語はビオチン化される前の多糖類混合物を表し、それに対して「ビオチン化低分子量ヘパリン」という用語は、ビオチンまたはこれの誘導体との共有結合を含む、本発明に従った化合物を表す。
【００１６】
「還元末端」という用語は、末端のグルコサミンまたはマンノサミン（グルコサミンの塩基性媒体におけるエピマー化によりもたらされるマンノサミン）が、以下の式（ＩＩ）：
【００１７】
【化１】
2010518238.tif 000002
［式中、
−Ｘは、ＨまたはＳＯ３Ｎａを表し、
−Ｙは、ＣＯＣＨ３またはＳＯ３Ｎａを表し、
−波線は、これが結合しているピラノース環平面の下または上のいずれかに位置する結合を表す（下：グルコサミン、上：マンノサミン）。］
に対応する、環状ヘミアセタール官能基を有する多糖類鎖の末端を表す。
【００１８】
本発明に使用できる低分子量ヘパリンの中で、これらのいくつかは、これらの多糖類鎖の少なくとも７５％が、これらの還元末端にヘミアセタール型のグルコサミンを含むようであり得、それらは混合物の官能化可能な多糖類である。混合物中に存在する特定の多糖類鎖は、２５％以下の含有量までは、１，６−無水型であってもよく、このような多糖類はビオチンまたはビオチン誘導体により官能化できない。
【００１９】
混合物の「官能化可能な構成多糖類」という用語は、式（ＩＩ）で定義されるヘミアセタール型のグルコサミンを、還元末端に含む多糖類を意味する。
【００２０】
「ヘパリンの構成多糖類」という用語は、ウロン酸残基（Ｄ−グルコロン酸またはＬ−イズロン酸）およびＤ−グルコサミン残基を含む二糖類単位の反復を特徴とする多糖類を意味し、Ｄ−グルコサミンはＮ−硫酸化またはＮ−アセチル化されていてもよい。また、二糖類単位は、Ｄ−グルコサミンのＣ６および／またはＣ３位において、ならびにウロン酸のＣ２位において、Ｏ−硫酸化されていてもよい（Ｈｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｈ．Ｅｄｗａｒｄ  Ｃｏｎｒａｄ、１９９８年、１頁）。
【００２１】
本発明に従ったビオチン化低分子量ヘパリンは、これらの構成多糖類が、式（Ｉ）：
【００２２】
【化２】
2010518238.tif 000003
［式中、
−ｉは０または１に等しく、
−Ｒ１は、式（ａ）または（ｂ）：
【００２３】
【化３】
2010518238.tif 000004
｛式中、ｊおよびｋは、同一でありまたは異なってよく、１から１０の任意の値をとり得る整数である。｝の連鎖を表し、
−Ｂｉｏｔは、ビオチン基またはビオチン誘導体を表し、
−ＰＥは、ヘパリンの構成多糖類の一般式を有する多糖類鎖を表し、
−ＸはＨまたはＳＯ３Ｎａを表し、
−ＹはＳＯ３ＮａまたはＣＯＣＨ３を表し、
−波線は、これが結合しているピラノース環平面の下または上のいずれかに位置する結合を表す。］
およびこれらの薬学的に許容される塩、
に対応することを有利に特徴とする。
【００２４】
上述のビオチン（Ｂｉｏｔ）基は、ヘキサヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−ペンタン酸に由来する基である。有利なことに、本発明に従った一般式（Ｉ）のＢｉｏｔ基は、式（ｃ）：
【００２５】
【化４】
2010518238.tif 000005
に対応する。
【００２６】
ビオチン誘導体は、市販されており、（「Ｐｉｅｒｃｅ」ビオチン−アビジン製品カタログ、２００５年、７−１１頁）または当業者に公知の標準的方法を使用して調製できる。特に、特許出願ＷＯ０２／２４７５４に述べられたビオチン誘導体を挙げることができる。
【００２７】
本発明に従ったビオチン化低分子量ヘパリンにおいて、添字ｉは、０に等しくてもよく、この場合ビオチンまたはビオチン誘導体との結合は、多糖類鎖の還元末端の単糖類単位により担持されるアミン官能基に直接行われる。
【００２８】
または、ｉは１に等しくてもよく、ビオチン基またはビオチン誘導体との結合は、例えば、上記の式（ａ）の連鎖からなっていてもよく、式中、ｊは５に等しい、または、上記の式（ｂ）の連鎖からなっていてもよく、式中、ｊおよびｋは同一であり、５に等しい。したがって、上記の式（Ｉ）において、Ｒ１は、例えば、式−ＣＯ−（ＣＨ２）５−ＮＨまたは−ＣＯ−（ＣＨ２）５−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）５−ＮＨ−の連鎖を表し得る。
【００２９】
本発明に従ったビオチン化低分子量ヘパリンは、これらの構成多糖類の少なくとも６０％、有利には少なくとも８０％、さらにより有利には少なくとも９０％が、還元末端に、ビオチンまたはビオチン誘導体との共有結合を有するものである。
【００３０】
本発明に使用される低分子量ヘパリンは、例えば、エノキサパリン、アルデパリン、ベミパリン、パルナパリンおよびチンザパリンから選択され得る。
【００３１】
特許ＵＳ５３８９６１８およびＵＳ  ＲＥ３８７４３に定義されているように、本発明に使用される低分子量ヘパリンは、特に：
−これらの構成多糖類の９％から２０％は、２０００Ｄａ未満の平均分子量を有し、
−これらの構成多糖類の５％から２０％は、８０００Ｄａを超える平均分子量を有し、
−これらの構成多糖類の６０％から８６％は、２０００から８０００Ｄａの間の平均分子量を有し、
−質量平均分子量と数平均分子量の間の比は、１．３から１．６の間であり、
−前記低分子量ヘパリンは、ヘパリンより優れた生物学的利用能および抗血栓活性を有し、約３５００から５５００Ｄａの間の平均分子量を有する、
ものであり得る。
【００３２】
本発明は、ビオチン化低分子量ヘパリンであって、これらの薬学的に許容される塩のいかなるものの形態のものも目的とする。
【００３３】
本発明の目的は、さらに、
ａ）アミン塩および還元剤の存在下で、温度２０から８０℃の間で、上記に定義された低分子量ヘパリンに還元的アミノ化を実施すること、
ｂ）その後、活性化基−（Ｒ１）ｉ−Ｂｉｏｔ−（式中、Ｒ１、ｉおよびＢｉｏｔは上記の式（Ｉ）に関して定義された通りである）を用いて、水性媒体または有機媒体中に塩基が存在する状態でアシル化を実施すること、
を特徴とする、上述のビオチン化低分子量ヘパリンの調製方法である。
【００３４】
上記の調製方法のステップは、分析的なＨＰＬＣモニタリング、特にＳＡＸ型によって、例えば、特許出願ＷＯ２００４／０２７０８７に記載された方法を使用して、または場合によってＬＣ−ＭＳを介して、例えば、Ｒｏｂｅｒｔ  Ｊ．ＬｉｎｈａｒｄｔによりＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００４、２７９（４）、２６０８−２６１５頁に記載された方法を使用して検査され得る。
【００３５】
ビオチン化低分子量ヘパリンは、Ｐｉｅｒｃｅ社から販売されている、支持された単量体アビジンに対するアフィニティークロマトグラフィーにより、供給業者により記載された分析条件に従って分析および特徴づけされ得る。
【００３６】
還元的アミノ化のステップａ）の後で、前記低分子量ヘパリンの構成的多糖類の少なくとも９０％が、これらの還元末端に−ＮＨ２官能基を担持することが、特に確認される（アミノ還元多糖類）。
【００３７】
アシル化のステップｂ）の後で、前記アミノ還元多糖類の少なくとも９０％がビオチン化されることが、特に確認されている。
【００３８】
本発明に従ったビオチン化低分子量ヘパリンの調製方法の全収率は、したがって少なくとも８０％、有利には少なくとも９０％である。
【００３９】
本発明に従った化合物の調製方法は、出発低分子量ヘパリン（「ネイティブな」低分子量ヘパリン）として、以前に文献に報告された通りに調製された低分子量ヘパリンを使用する。特に、エノキサパリンに関しては特許ＵＳ  ＲＥ３８７４３、アルデパリンに関してはＵＳ４７５７０５７、ベミパリンに関してはＥＰ０２９３５３９、パルナパリンに関してはＵＳ４７９１１９５およびチンザパリンに関してはＵＳ５１０６７３４を参照されたい。
【００４０】
上記の調製方法の還元的アミノ化のステップａ）において、アミン塩は、四量体アミン塩であってよく、式ＮＨ４Ｚ（式中、Ｚは塩素、フッ素、臭素またはヨウ素原子などのハロゲン原子を表す）に対応するハロゲン化アンモニウム塩であることが有利である。
【００４１】
上記の調製方法の還元的アミノ化のステップａ）において、還元剤は、水素化ホウ素塩、例えばシアノ水素化ホウ素塩であってよい。
【００４２】
上記の調製方法の還元的アミノ化のステップａ）において、温度は５０から８０℃の間が有利である。
【００４３】
上記の調製方法のアシル化のステップｂ）において、塩基は、炭酸塩または炭酸水素塩、特にナトリウム塩またはカリウム塩の形態であってよく、または当業者に公知の任意の水溶性または有機物可溶性の有機塩基であってよい。
【００４４】
上記の調製方法のアシル化のステップｂ）において、「有機媒体」という用語は、例えば、ジクロロメタンまたはジメチルホルムアミドを意味する。
【００４５】
本発明に従ったビオチン化低分子量ヘパリンの調製方法は、以下のステップ：
ａ）ハロゲン化アンモニウム塩および水素化ホウ素塩の存在下で、温度５０から８０℃の間で、低分子量ヘパリンに還元的アミノ化を実施するステップ、
ｂ）その後、上で定義された−（Ｒ１）ｉ−Ｂｉｏｔ基の活性化エステル型を用いて、水性媒体中に塩基が存在する状態で、アシル化を実施するステップ、
を有利に含む。
【００４６】
上記で定義されたビオチン化誘導体−（Ｒ１）ｉ−Ｂｉｏｔは、活性化エステルの形態でアシル化反応に直接使用でき、インサイツで、当業者に公知の標準的カップリング条件を使用して、実施または生成できる。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド誘導体または３−スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド誘導体の形態の活性化エルテルが、特に使用できる。
【００４７】
本発明に従った調製方法をスキーム１に例示する。
【００４８】
【化５】
2010518238.tif 000006
【００４９】
スキーム１によれば、低分子量ヘパリンは還元的アミノ化に供され、還元末端に遊離のアミノ官能基を含む誘導体Ａが、アミン塩および水素化ホウ素塩などの還元剤の存在下で、生成される。
【００５０】
この誘導体は、その後、上で定義された活性化ビオチン誘導体、−（Ｒ１）ｉ−Ｂｉｏｔとの反応を介して、塩基の存在下でアシル化され、ビオチン化誘導体Ｂが提供され得る。この反応は、例えば、Ｒ１が−ＣＯ−（ＣＨ２）５−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）５−ＮＨの連鎖を表す場合、エステルである３−スルホスクシンイミジル６−ビオチンアミドヘキサノイルヘキサノエートのナトリウム塩を用いて、Ｒ１が−ＣＯ−（ＣＨ２）５−ＮＨ−の連鎖を表す場合、エステルである３−スルホスクシンイミジル６−ビオチンアミドヘキサノエートのナトリウム塩を用いて、またはＲ１が存在しない場合（ｉ＝０）、ビオチノイル−３−スルホスクシンイミジルエステルのナトリウム塩を用いて、実施され得る。
【００５１】
スキーム１において、誘導体ＡおよびＢは、実際には多糖類鎖の混合物の低分子量ヘパリンであるので、理論表示であることを理解されたい。
【００５２】
本文においてこれ以降、本発明に従ったビオチン化低分子量ヘパリンの合成例およびこれらを得るために有用である様々な中間体の合成例を、例示として詳述する。
【００５３】
以下の略語が使用される：
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー、
ＳＡＸ：強陰イオン交換クロマトグラフィー、
ＬＣ−ＭＳ：液体クロマトグラフィー−質量分析法、
ｑｓ：十分量、
ＬＣ：長鎖、６−アミノヘキサノイルの連鎖に対応する
ＬＣ−ＬＣ：２つのＬＣの連鎖を表し、アミドヘキサノイル−６−アミノヘキサノイルの連鎖に対応する、
スルホ−ＮＨＳ：３−スルホスクシンイミジルエステルのナトリウム塩、
ヘパリナーゼ１：フラボバクテリウム・ヘパリナム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈｅｐａｒｉｎｕｍ）由来のヘパリン・リアーゼＩ酵素（ＥＣ４．２．２．７）
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】実施例１に従った、エノキサパリンの変換の、ＨＰＬＣ  ＳＡＸによる反応モニタリングを例示した図である。
【図２】アビジン単量体を支持したカラムに、実施例１に従って得られた生成物を通した後に得られたビオチン化分画および非ビオチン化分画の、ＨＰＬＣ  ＳＡＸによる分析を例示した図である。
【図３】アビジン単量体を支持したカラムに、実施例２に従って得られた生成物を通した後に得られたビオチン化分画および非ビオチン化分画の、ＨＰＬＣ  ＳＡＸによる分析を例示した図である。
【図４】アビジン単量体を支持したカラムに、実施例３に従って得られた生成物を通した後に得られたビオチン化分画および非ビオチン化分画の、ＨＰＬＣ  ＳＡＸによる分析を例示した図である。
【実施例１】
【００５５】
ＮＨ  ＬＣビオチノイルエノキサパリン
エノキサパリンは、特許ＵＳ  ＲＥ３８７４３に記載された方法に従って得られた低分子量ヘパリンである。これは、スキーム２の反応順序に従って、ビオチン化誘導体に変換される。つまり、エノキサパリンは、還元的アミノ化反応を介して、還元末端にアミノ官能基を有する化合物１に変換され、この誘導体は、その後、３−スルホスクシンイミジル６−ビオチンアミドヘキサノエートのナトリウム塩との反応を介して、ビオチン化化合物２に変換される。
【００５６】
【化６】
2010518238.tif 000007
【００５７】
１．１：１−アミノエノキサパリン
１ｇのエノキサパリンを、４０ｍｌの５Ｍの塩化アンモニウム水溶液に溶解する。１ｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを、得られた溶液に加える。混合物を、６０℃で２４時間維持する。溶液を、約２０℃の温度に冷却し、水で希釈する（ｑｓ  １００ｍｌ）。得られたろ液を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ１０カラムで脱塩し、その後凍結乾燥する。８２４ｍｇの白い凍結乾燥物が得られる。実際の収率は８２％である。生成物は、ＨＰＬＣ  ＳＡＸ（図１を参照されたい。）により検査され、さらなる精製をせずにビオチン化ステップに使用される。
【００５８】
１．２：ＮＨ  ＬＣ  ビオチノイルエノキサパリン
２００ｍｇの１−アミノエノキサパリンを、５ｍｌの０．５Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液に、約２０℃の温度で溶解する。１３６ｍｇのスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンを、得られた溶液に加える。溶液を、約２０℃の温度で１時間攪拌する。得られた懸濁液を、１０ｍｌの０．５Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液で希釈する。１３６ｍｇのスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンを加え、得られた混合物を、１８時間攪拌する。さらに１３６ｍｇのスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンを加え、反応混合物を１時間攪拌する。さらに７０ｍｇのスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンを加え、反応混合物を３時間攪拌する。得られた反応媒体を、水（ｑｓ  ２００ｍｌ）で希釈し、０．４５μｍのメンブランでろ過し、その後Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ１０カラムで脱塩する。得られた分画を、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに注入する。生成物を水およびその後過塩素酸ナトリウムで勾配をかけて溶出する。回収された分画を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ１０カラムで脱塩する。得られた生成物をＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを通すことによって、再度精製し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ１０で脱塩する。回収された最終分画を凍結乾燥する。１９０ｍｇの白い凍結乾燥物が得られる。実際の収率は８７％である。
Ｄ２Ｏ（２５℃，δ（ｐｐｍ））中でのオリゴ糖混合物の１Ｈ  ＮＭＲスペクトル：１．３−１．８（１２Ｈ，ｍ）、２．０５（ＣＨ３ＣＯ，ｓ）、２．２５（２ＣＨ２ＣＯビオチン，ｍ）、２．８０（１Ｈ，ｄ，１２Ｈｚ）、３．０３（１Ｈ，ｄｄ，１２および５Ｈｚ）、３．１５−５．６５（多糖類プロトン）、５．９９（１Ｈ，ｄ，４Ｈｚ）。
【００５９】
得られた生成物はＨＰＬＣ  ＳＡＸによって検査される。図１（図面１／４）は、還元的アミノ化反応を介して、エノキサパリンが、還元末端にアミノ官能基を有する誘導体１へ変換されたことのＨＰＬＣ  ＳＡＸによる反応モニタリングを例示する（スキーム２を参照されたい。）。その後、この誘導体は、３−スルホスクシンイミジル６−ビオチンアミドヘキサノエートのナトリウム塩との反応を介して、ビオチン化誘導体２に変換される。使用された分析方法は、特許出願国際公開第２００４／０２７０８７号パンフレットに記載されている。図１は、官能化可能なグルコサミンを含む種が、９０％を超える変換度で、還元末端にアミノ官能基を含む誘導体に変換され、１−アミノエノキサパリンが得られたことを示す。図１はまた、還元末端にアミノ官能基を含む種が、３−スルホスクシンイミジル６−ビオチンアミドヘキサノエートのナトリウム塩との反応を介して、９０％を超える変換度で、ビオチン化誘導体に変換され、ＮＨ  ＬＣビオチノイルエノキサパリンが得られたことも示す。
【００６０】
例として、図１は、実施例１に従って得られたオリゴ糖混合物中に存在する、主要化合物に対応するピークを示し、その構造を以下に表す（使用された命名法は、特許出願国際公開第２００４／０２７０８７号パンフレットの命名法と同じである）。
【００６１】
ＬＣ−ＭＳ分析により、これらの化合物の構造を、酸性型の生成物に対応する質量分析を介して確認することができる：Δｌｓｌｓｌｄ  ｍ／ｚ＝１１５４；Δｌｓｌｓｌｄｌｓｌｄ  ｍ／ｚ＝１７３１；Δｌｓｌｓｌｄｌｓｌｄｌｓｌｄ  ｍ／ｚ＝２３０８；Δｌｓｌｓｌｄ１，６−ａｎｈｙｄｒｏ  ｍ／ｚ＝１０５６；Δｌｓｌｓｌｄｌｓｌｄ１，６−ａｎｈｙｄｒｏ  ｍ／ｚ＝１６３３；Δｌｓｌｓｌｄｌｓｌｄｌｓｌｄ１，６−ａｎｈｙｄｒｏ  ｍ／ｚ＝２２１０；Δｌｓｌｓｌｄ  ＮＨ２  ｍ／ｚ＝１１５５；Δｌｓｌｓｌｄｌｓｌｄ  ＮＨ２  ｍ／ｚ＝１７３２；Δｌｓｌｓｌｄｌｓｌｄｌｓｌｄ  ＮＨ２  ｍ／ｚ＝２３０９；Δ  ｌｓｌｓｌｄ  ＮＨ  ＬＣ  Ｂｉｏｔ  ｍ／ｚ＝１４９４；Δｌｓｌｓｌｄｌｓｌｄ  ＮＨ  ＬＣ  Ｂｉｏｔ  ｍ／ｚ＝２０７１；Δ  ｌｓｌｓｌｄｌｓｌｄｌｓｌｄ  ＮＨ  ＬＣ  Ｂｉｏｔ  ｍ／ｚ＝２６４８。
【００６２】
【化７】
2010518238.tif 000008
【００６３】
さらに、実施例１に従って得られた生成物は、アビジン単量体を支持したカラムに注入され得る。供給業者のＰｉｅｒｃｅにより記載された条件に従って、溶出を実施する。このようにして得られた、ビオチン化分画（アビジンに対する親和性を有する）および非ビオチン化分画（アビジンに対する親和性はない。）は、その後、ＨＰＬＣ  ＳＡＸに注入される（図２、図面２／４を参照されたい。）。図２は、アビジン単量体を支持したカラムに通した後に得られた、ビオチン化分画および非ビオチン化分画の、ＨＰＬＣ  ＳＡＸによる分析を例示している。図２は、官能化可能なグルコサミンを含む種が、９０％を超える変換度で、対応するビオチン化種に変換されていることを示す。親和性のない分画は、主に１，６−無水誘導体で構成され、これらの１，６−無水誘導体は性質上、ビオチン化誘導体には変換され得ない。主要なピークのいくつかの構造は、得られた生成物を特徴づける例として示す（上に例示された構造を参照されたい。）。
【実施例２】
【００６４】
ＮＨビオチノイルエノキサパリン
米国再発行特許第３８７４３号明細書に記載された方法に従って得られた低分子量ヘパリンである、エノキサパリンは、スキーム３に記載された反応順序に従ってビオチン化誘導体に変換される。つまり、エノキサパリンは、還元的アミノ化反応を介して、その還元末端にアミノ官能基を含む化合物１に変換され、その後、この誘導体は、ビオチノイル−３−スルホスクシンイミジルエステルのナトリウム塩との反応を介して、ビオチン化化合物３に変換される。
【００６５】
【化８】
2010518238.tif 000009
【００６６】
２００ｍｇの１−アミノエノキサパリンを、５ｍｌの０．５Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液に、約２０℃の温度で溶解する。１０７ｍｇのスルホ−ＮＨＳ−ビオチンを、得られた溶液に加える。溶液を、約２０℃の温度で１時間３０分攪拌する。得られた懸濁液を、１０ｍｌの０．５Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液で希釈する。１０７ｍｇのスルホ−ＮＨＳ−ビオチンを加え、得られた混合物を、３時間攪拌する。得られた反応媒体を、水（ｑｓ  １５０ｍｌ）で希釈し、０．４５μｍのメンブランでろ過し、その後、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに注入する。生成物を水および次いで過塩素酸ナトリウムで勾配をかけて溶出する。回収された分画を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ１０カラムで脱塩する。回収された分画を凍結乾燥する。１９０ｍｇの白い凍結乾燥物が得られる。実際の収率は９０％である。
【００６７】
得られた生成物はＨＰＬＣ  ＳＡＸによって検査され（図３、図面３／４「包括的」グラフを参照されたい。）、還元末端にアミノ官能基を含む種が、ビオチノイル−３−スルホスクシンイミジルエステルのナトリウム塩との反応を介して、９０％を超える変換度で、ビオチン化誘導体に変換されていることが確認されている。
Ｄ２Ｏ（２５℃，δ（ｐｐｍ））中でのオリゴ糖混合物の１Ｈ  ＮＭＲスペクトル：１．４−１．８（６Ｈ，ｍ）、２．０５（ＣＨ３ＣＯ，ｓ）、２．３（ＣＨ２ＣＯビオチン，ｍ）、２．８０（１Ｈ，ｄｄ，１２および７Ｈｚ）、３．０３（１Ｈ，ｍ）、３．２０−５．６５（多糖類プロトン）、５．９８（１Ｈ，ｄ，４Ｈｚ）。
【００６８】
実施例２に従って得られた生成物は、アビジン単量体を支持したカラムに注入される。供給業者のＰｉｅｒｃｅにより記載された条件に従って、溶出を実施する。得られたビオチン化分画（アビジンに対する親和性を有する）および非ビオチン化分画（アビジンに対する親和性はない。）は、その後、ＨＰＬＣ  ＳＡＸに注入される（図３、図面３／４を参照されたい。）。親和性のない分画は、主に１，６−無水誘導体で構成され、これらの１，６−無水誘導体は性質上、ビオチン化誘導体には変換され得ない。
【００６９】
例として、図３に、オリゴ糖混合物の特定の主要化合物の構造を記載する。参照される構造を以下に表す。
【００７０】
ＬＣ−ＭＳ分析により、それらの化合物の構造を、酸性型の生成物に対応する質量分析を介して確認することができる：Δｌｓｌｓｌｄ１，６−ａｎｈｙｄｒｏ  ｍ／ｚ＝１０５６；Δｌｓｌｓｌｄｌｓｌｄｌ，６−ａｎｈｙｄｒｏ  ｍ／ｚ＝１６３３；Δｌｓｌｓｌｄｌｓｌｄｌｓｌｄｌ，６−ａｎｈｙｄｒｏ  ｍ／ｚ＝２２１０；Δｌｓｌｓｌｄ  ＮＨ  Ｂｉｏｔ  ｍ／ｚ＝１３８１；Δｌｓｌｓｌｄｌｓｌｄ  ＮＨ  Ｂｉｏｔ  ｍ／ｚ＝１９５８；Δｌｓｌｓｌｄｌｓｌｄｌｓｌｄ  ＮＨ  Ｂｉｏｔ  ｍ／ｚ＝２５３５。
【００７１】
【化９】
2010518238.tif 000010
【実施例３】
【００７２】
ＮＨ−ＬＣ−ＬＣ  ビオチノイルエノキサパリン
米国再発行特許第３８７４３号明細書に記載された方法に従って得られた低分子量ヘパリンである、エノキサパリンは、スキーム４に記載された反応順序に従ってビオチン化誘導体に変換される。つまり、エノキサパリンは、還元的アミノ化反応を介して、還元末端にアミノ官能基を含む化合物１に変換され、その後、この誘導体は、エステルの３−スルホスクシンイミジル６−ビオチンアミドヘキサノイルヘキサノエートのナトリウム塩との反応により、ビオチン化化合物４に変換される。
【００７３】
【化１０】
2010518238.tif 000011
【００７４】
２００ｍｇの１−アミノエノキサパリンを、５ｍｌの０．５Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液に、約２０℃の温度で溶解する。１６４ｍｇのスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチンを、得られた溶液に加える。溶液を、約２０℃の温度で２時間攪拌する。懸濁液を、１０ｍｌの０．５Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液で希釈する。１６４ｍｇのスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチンを加え、得られた混合物を、５時間攪拌する。得られた反応媒体を、水（ｑｓ  １５０ｍｌ）で希釈し、０．４５μｍのメンブランでろ過し、その後Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに注入する。生成物を水および次いで過塩素酸ナトリウムで勾配をかけて溶出する。回収された分画を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ１０カラムで脱塩する。回収された分画を凍結乾燥する。２１０ｍｇの白い凍結乾燥物が得られる。実際の収率は９２％である。
【００７５】
得られた生成物はＨＰＬＣ  ＳＡＸによって検査され（図４、図面４／４「包括的」グラフを参照されたい。）、還元末端にアミノ官能基を含む種が、３−スルホスクシンイミジル６−ビオチンアミドヘキサノイルヘキサノエートのナトリウム塩との反応を介して、９０％を超える変換度で、ビオチン化誘導体に変換されていることが確認されている。
Ｄ２Ｏ（２５℃，δ（ｐｐｍ））中でのオリゴ糖混合物の１Ｈ  ＮＭＲスペクトル：１．３−１．８（１６Ｈ，ｍ）、２．０５（ＣＨ３ＣＯ，ｓ）、２．２５（６Ｈ，ｍ）、２．８０（１Ｈ，ｄｄ，１２および７Ｈｚ）、３．０３（１Ｈ，ｍ）、３．２０−５．６５（多糖類プロトン）、５．９８（１Ｈ，ｄ，４Ｈｚ）。
【００７６】
実施例３に従って得られた生成物は、アビジン単量体を支持したカラムに注入される。供給業者のＰｉｅｒｃｅにより記載された条件に従って、溶出を実施する。得られたビオチン化分画（アビジンに対する親和性を有する）および非ビオチン化分画（アビジンに対する親和性はない。）は、その後、ＨＰＬＣ  ＳＡＸに注入される（図４を参照されたい。）。親和性のない分画は、主に１，６−無水誘導体で構成され、これらの１，６−無水誘導体は性質上、ビオチン化誘導体には変換され得ない。
【００７７】
主要化合物の構造は、ＬＣ−ＭＳカップリングにより確認される。
【００７８】
例として、図４に、オリゴ糖混合物の特定の主要化合物の構造を記載する。参照される構造を以下に表す。
【００７９】
ＬＣ−ＭＳ分析により、上記の化合物の構造を、酸性型の生成物に対応する質量分析を介して確認することができる：Δｌｓｌｓｌｄ１，６−ａｎｈｙｄｒｏ  ｍ／ｚ＝１０５６；Δｌｓｌｓｌｄｌｓｌｄ１，６−ａｎｈｙｄｒｏ  ｍ／ｚ＝１６３３；Δｌｓｌｓｌｄｌｓｌｄｌｓｌｄ１，６−ａｎｈｙｄｒｏ  ｍ／ｚ＝２２１０；
Δｌｓｌｓｌｄ  ＮＨ  ＬＣ  ＬＣ  Ｂｉｏｔ  ｍ／ｚ＝１６０７；Δｌｓｌｓｌｄｌｓｌｄ  ＮＨ  ＬＣ  ＬＣ  Ｂｉｏｔ  ｍ／ｚ＝２１８４；Δｌｓｌｓｌｄｌｓｌｄｌｓｌｄ  ＮＨ  ＬＣ  ＬＣ  Ｂｉｏｔ  ｍ／ｚ＝２７６１。
【００８０】
【化１１】
2010518238.tif 000012
【実施例４】
【００８１】
ＮＨ−ＬＣ  ビオチノイルチンザパリン
ヘパリナーゼ１を用いた処理により得られる、約６０００ダルトンの低分子量ヘパリンである、チンザパリンもまた、スキーム５に記載された反応順序に従ってビオチン化誘導体に変換され得る。つまり、チンザパリンは、還元的アミノ化反応を介して、還元末端にアミノ官能基を含む化合物５に変換され、その後、この誘導体は、３−スルホスクシンイミジル６−ビオチンアミドヘキサノエートのナトリウム塩との反応を介して、ビオチン化化合物６に変換される。
【００８２】
【化１２】
2010518238.tif 000013
【００８３】
４．１：１−アミノチンザパリン
２５０ｍｇのチンザパリンを、１０ｍｌの５Ｍの塩化アンモニウム水溶液に溶解する。２５０ｍｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを、得られた溶液に加える。混合物を、７０℃で２０時間維持する。溶液を約２０℃の温度に冷却し、水で希釈する（ｑｓ  ２０ｍｌ）。得られたろ液を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ１０カラムで脱塩し、その後凍結乾燥する。２１５ｍｇの白い凍結乾燥物が得られる。実際の収率は８６％である。
Ｄ２Ｏ（２５℃，δ（ｐｐｍ））中でのオリゴ糖混合物の１Ｈ  ＮＭＲスペクトル：２．０５（ＣＨ３ＣＯ，ｓ）、３．１０および３．４０（各１Ｈ，ｍ，ＣＨ２ＮＨ２）、３．２０−５．６５（多糖類プロトン）、５．９８（１Ｈ，ｄ，４Ｈｚ）。
【００８４】
化合物は、実施例１において先に概説された方法を使用して、ＨＰＬＣ  ＳＡＸ（図１を参照されたい。）により検査できる。
【００８５】
生成物は、さらなる精製をせずにビオチン化ステップに使用される。
【００８６】
４．２：ＮＨ  ＬＣビオチノイルチンザパリン
１００ｍｇの１−アミノチンザパリンを、２．５ｍｌの０．５Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液に、約２０℃の温度で溶解する。４７ｍｇのスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンを、得られた溶液に加える。溶液を、約２０℃の温度で１時間４５分攪拌する。得られた懸濁液を、５ｍｌの０．５Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液で希釈する。４７ｍｇのスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンを加え、得られた混合物を、６時間攪拌する。さらに４７ｍｇのスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンを加え、反応混合物を２０時間攪拌する。懸濁液を、１ｍｌの０．５Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液で再度希釈し、さらに４７ｍｇのスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンを加える。反応混合物を２０時間攪拌する。懸濁液を６．５ｍｌの０．５Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液で再度希釈し、さらに４７ｍｇのスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンを加える。反応混合物を２２時間攪拌し、その後、水（ｑｓ  １００ｍｌ）で希釈し、０．４５μｍのメンブランでろ過し、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに注入する。生成物を水および次いで過塩素酸ナトリウムで勾配をかけて溶出する。回収された分画を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ１０カラムで脱塩する。回収された最終分画を凍結乾燥する。１１０ｍｇの白い凍結乾燥物が得られる。実際の収率は定量的である。
Ｄ２Ｏ（２５℃，δ（ｐｐｍ））中でのオリゴ糖混合物の１Ｈ  ＮＭＲスペクトル：１．３−１．８（１２Ｈ，ｍ）、２．０５（ＣＨ３ＣＯ，ｓ）、２．２５（４Ｈ，ｍ）、２．８０（１Ｈ，ｄｄ，１２および７Ｈｚ）、３．０３（１Ｈ，ｍ）、３．２０−５．６５（多糖類プロトン）、５．９８（１Ｈ，ｄ，４Ｈｚ）。
【００８７】
化合物１−アミノチンザパリンおよび得られたＮＨ  ＬＣビオチノイルチンザパリンもまた、実施例１において先に使用したＨＰＬＣ  ＳＡＸ法を介して特徴づけることができる。このＨＰＬＣ検査により、官能化可能なグルコサミンを含む種が、９０％を超える変換度で、還元末端にアミノ官能基を含む誘導体に変換され、１−アミノチンザパリンが得られることが示されている。さらに、このＨＰＬＣ検査により、還元末端にアミノ官能基を含む種が、３−スルホスクシンイミジル６−ビオチンアミドヘキサノエートのナトリウム塩との反応を介して、９０％を超える変換度で、ビオチン化誘導体に変換され、ＮＨ  ＬＣビオチノイルチンザパリンが得られることも示されている。
【００８８】
実施例１と同じ手法で、ＬＣ−ＭＳ分析により、主要化合物の構造を、確認することができる。
【００８９】
得られた生成物は、さらにアビジン単量体を支持したカラムに注入され得る。供給業者のＰｉｅｒｃｅにより記載された条件に従って、溶出を実施する。得られた、ビオチン化分画（アビジンに対する親和性を有する）および非ビオチン化分画（アビジンに対する親和性はない。）は、ＨＰＬＣ  ＳＡＸにより検査できる。
【実施例５】
【００９０】
ＮＨ  ＬＣビオチノイルベミパリン
アルカリ解重合を介して得られる、約３５００ダルトンの低分子量ヘパリンである、ベミパリンもまた、以下のスキーム６に記載された反応順序に従ってビオチン化誘導体に変換され得る。つまり、ベミパリンは、還元的アミノ化反応を介して、還元末端にアミノ官能基を含む化合物７に変換され、その後、この誘導体は、３−スルホスクシンイミジル６−ビオチンアミドヘキサノエートのナトリウム塩との反応を介して、ビオチン化化合物８に変換される。
【００９１】
【化１３】
2010518238.tif 000014
【００９２】
５．１：１−アミノベミパリン：
２５０ｍｇのベミパリンを、１０ｍｌの５Ｍ塩化アンモニウム水溶液に溶解する。２５０ｍｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを、得られた溶液に加える。混合物を、７０℃で２０時間維持する。溶液を約２０℃の温度に冷却し、水で希釈する（ｑｓ  ２０ｍｌ）。得られた溶液を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ１０カラムで脱塩し、その後凍結乾燥する。２２７ｍｇの白い凍結乾燥物が得られる。実際の収率は９１％である。
Ｄ２Ｏ（２５℃，δ（ｐｐｍ））中でのオリゴ糖混合物の１Ｈ  ＮＭＲスペクトル：２．０５（ＣＨ３ＣＯ，ｓ）、３．１０および３．４０（各１Ｈ，ｍ，ＣＨ２ＮＨ２）、３．２０−５．８０（多糖類プロトン）、５．９８（１Ｈ，ｄ，４Ｈｚ）。
【００９３】
化合物は、実施例１において先に概説された方法を使用して、ＨＰＬＣ  ＳＡＸにより検査できる。
【００９４】
得られた生成物は、さらなる精製をせずにビオチン化ステップに使用される。
【００９５】
５．２：ＮＨ  ＬＣビオチノイルベミパリン：
１００ｍｇの１−アミノベミパリンを、５ｍｌの０．５Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液に、約２０℃の温度で溶解する。８０ｍｇのスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンを、得られた溶液に加える。溶液を、約２０℃の温度で２時間攪拌する。得られた懸濁液を、１０ｍｌの０．５Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液で希釈する。８０ｍｇのスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンを加え、得られた混合物を、２時間攪拌する。さらに４０ｍｇのスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンを加え、反応混合物を２０時間攪拌する。得られた反応媒体を水（ｑｓ  ５０ｍｌ）で希釈し、その後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ１０カラムで脱塩する。得られた分画を、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに注入する。生成物を水および次いで過塩素酸ナトリウムで勾配をかけて溶出する。回収された分画を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ１０カラムで脱塩する。得られた生成物を、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを通して再度精製し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ１０カラムで脱塩する。回収された最終分画を凍結乾燥する。１０１ｍｇの白い凍結乾燥物が得られる。実際の収率は９２％である。
Ｄ２Ｏ（２５℃，δ（ｐｐｍ））中でのオリゴ糖混合物の１Ｈ  ＮＭＲスペクトル：１．３−１．８（１２Ｈ，ｍ）、２．０５（ＣＨ３ＣＯ，ｓ）、２．２５（４Ｈ，ｍ）、２．８０（１Ｈ，ｄｄ，１２および７Ｈｚ）、３．０３（１Ｈ，ｍ）、３．２０−５．６５（多糖類プロトン）、５．９８（１Ｈ，ｄ，４Ｈｚ）。
【００９６】
化合物１−アミノベミパリンおよび得られたＮＨ  ＬＣビオチノイルベミパリンもまた、実施例１において先に使用したＨＰＬＣ  ＳＡＸ法を介して特徴づけることができる。このＨＰＬＣ検査により、官能化可能なグルコサミンを含む種が、９０％を超える変換度で、それらの還元末端にアミノ官能基を含む誘導体に変換され、１−アミノベミパリンが得られることが示される。さらに、このＨＰＬＣ検査により、還元末端にアミノ官能基を含む種が、３−スルホスクシンイミジル６−ビオチンアミドヘキサノエートのナトリウム塩との反応を介して、９０％を超える変換度で、ビオチン化誘導体に変換され、ＮＨ  ＬＣビオチノイルベミパリンが得られることも示される。
【００９７】
実施例１と同じ手法で、ＬＣ−ＭＳ分析により、主要化合物の構造を、確認することができる。
【００９８】
得られた生成物は、さらにアビジン単量体を支持したカラムに注入され得る。供給業者のＰｉｅｒｃｅにより記載された条件に従って、溶出を実施する。得られた、ビオチン化分画（アビジンに対する親和性を有する）および非ビオチン化分画（アビジンに対する親和性はない。）は、ＨＰＬＣ  ＳＡＸにより検査できる。
【００９９】
本発明に従った化合物は、生化学的研究および薬理学的研究に供された。
【０１００】
１．抗第ＩＩａ因子活性および抗第Ｘａ因子活性の測定
ヒト血漿またはバッファー系における、抗第ＩＩａ因子（抗ＦＩＩａ）活性および抗第Ｘａ因子（抗ＦＸａ）活性を、発色法を介して分析する。つまり、抗第ＩＩａ因子活性を、発色基質Ｓ−２２３８、α−トロンビンおよびヒトＡＴＩＩＩ（抗トロンビンＩＩＩ）を含む、Ａｃｔｉｃｈｒｏｍｅ  ｈｅｐａｒｉｎ  ａｎｔｉ−ｆａｃｔｏｒ  ＩＩａ  ｋｉｔ  （Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）を用いて検査する。抗ＦＸａ活性は、自動凝固装置ＡＣＬ７０００（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を用いて、ＡＴＩＩＩ、第Ｘａ因子および発色基質Ｓ−２７６５を含む、Ｈｅｐａｒｉｎ  ｋｉｔ（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を使用して測定する。２種の分析は、製造業者の指示書に従って、実施する。
【０１０１】
以下の標準品を、ヒト血漿およびバッファー系におけるビオチン化低分子量ヘパリンの分画のインビトロ活性の測定のための、標準較正曲線を定めるために使用する：
−低分子量ヘパリンのための第１標準品（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫ、１９８７年承認、コード番号８５／６００）
−低分子量ヘパリンのための第２標準品  （Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫ、１９８７年承認、コード番号０１／６０８、２００６年６月から使用）
−エノキサパリン（Ｃｌｅｘａｎｅ（登録商標）、ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）を、内部標準として使用。
【０１０２】
抗ＦＩＩａ活性の測定のために、１０μｌの試料または国際低分子量ヘパリン標準品を、ヒト血漿または０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、０．１５４Ｍ  ＮａＣｌを含む、ｐＨ７．４のバッファー系の抗トロンビンを用いて１：１６に希釈する。１０μｌのこの溶液を、９６ウェルのマイクロ滴定プレートに加える。測定は３回（３つのウェルに関して）繰り返す。このマイクロ滴定プレートを、３００ｒｐｍで攪拌しながら３７℃に維持する。４０μｌのトロンビンを、各ウェルに加え、正確に２分間インキュベートする。４０μｌのスペクトロザイム（Ｓｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ）を加える。９０秒後、反応を、４０μｌの酢酸を加えることによって停止させる。吸収を、４０５ｎｍにおいて、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ３４０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して測定する。
【０１０３】
抗ＦＸａ活性の測定のために、試料または国際低分子量ヘパリン標準品を、ヒト血漿または０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、０．１５４Ｍ  ＮａＣｌを含む、ｐＨ７．４のバッファー系において希釈する。血漿またはバッファー中にヘパリノイドを含む試料を、ＡＴＩＩＩを含むワーキングバッファーで１：２０に再度希釈し、プローブローターの中に２重に配置する。第Ｘａ因子試薬および発色基質を、自動凝固装置ＡＣＬ７０００の示された容器に注ぐ。
【０１０４】
抗ＦＸａ活性の測定を、ＡＣＬ７０００のソフトウェアに統合された「ヘパリン」プロトコルを用いて実施する。分析中、（ワーキングバッファーで希釈された）５０μｌの試料を、５０μｌの第Ｘａ因子試薬と混合する。３７℃において６０秒インキュベートした後で、濃度１．１ｍＭの、５０μｌの発色基質を加え、時間の関数としての吸収の変化を、波長４０５ｎｍにおいて測定する。
【０１０５】
得られた結果を、特に表１に記載する。
【０１０６】
【表１】
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【０１０７】
この表において、ＭＭは、平均モル質量（ダルトンで）を表し、「補正」活性は、測定において、容積希釈効果を補正できる。補正活性は、以下のように計算される：
補正活性＝（測定活性×調製された化合物のＭＭ）／出発物質のＭＭ、
式中、
調製された化合物のＭＭ：調製された化合物の理論的平均モル質量、
出発物質のＭＭ：出発低分子量ヘパリンの平均モル質量。
【０１０８】
これらの結果により、本発明に従ったビオチン化低分子量ヘパリンが、ネイティブな低分子量ヘパリンに匹敵する、抗第Ｘ因子活性および抗第ＩＩａ因子活性を保存していることが示される。したがって、これらの生物特性が保存されることにより、本発明に従ったビオチン化低分子量ヘパリンは治療的に使用可能になる。
【０１０９】
２．アビジンによる中和の後の、抗ＦＸａ活性の測定
溶液中における、ビオチン化生成物の効果のアビジンによる中和
生成物依存性の抗ＦＸａまたはＦＩＩａの抗トロンビン活性を、この活性に、生成物のビオチンにアビジンが結合することが及ぼす影響を測定するために、漸増濃度のアビジンの存在下で測定する。
【０１１０】
試験生成物を０．９％のＮａＣｌを含む水に、１ｍｇ／ｍｌで溶解する。その後、生成物を、第Ｘａ因子（Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ  Ｍｉｌａｎ、Ｉｔａｌｙ）の活性または第ＩＩａ因子（Ｆａｃｔｏｒ  ＩＩａ，  ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ  ｄｕ  ｓａｎｇ［Ｂｌｏｏｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ］、Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ）の活性の５０％を、抗トロンビン（ヒト抗トロンビン、Ｍｉｌａｎ、Ｉｔａｌｙ）の存在下で阻害できる生成物濃度を得るように希釈する。その後、この阻害を、漸減濃度のアビジン（Ｓｉｇｍａ、卵白由来のアビジン、Ｒｅｆ．  Ａ−９２７５、ＮａＣｌ中で希釈）：３００、３０、３、０．３、０．０３、０．００３、０μｇ／ｍｌの存在下で測定する。第Ｘａ因子（または第ＩＩａ因子）の残存活性の分析を、第Ｘａ因子に関しては特異的発色基質Ｓ２２２２（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ、Ｍｉｌａｎ、Ｉｔａｌｙ）および第ＩＩａ因子に関しては基質Ｓ２２３８（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ、Ｍｉｌａｎ、Ｉｔａｌｙ）を加えることによって実施する。
【０１１１】
吸光度を、４０５ｎｍにおいて読み取る。
【０１１２】
バッファー中でビーズに結合されたアビジンに、ビオチン化生成物が結合することの実証
生成物のアビジン結合能を評価するために、生成物を、ビーズに結合されたアビジンと接触して配置する。混合物を遠心分離にかけた後で、抗ＦＸａ活性または抗ＦＩＩａ活性を、上清中で測定する。この活性は、媒体に残存する濃度を決定でき、したがって、混合物を遠心分離にかけた後のペレットに捕捉された生成物の割合を決定できる。
【０１１３】
試験生成物を、０．９％ＮａＣｌ溶液中に、１ｍｇ／ｍｌで溶解する。生成物を、試験物中に存在する、抗ＦＸａ活性または抗ＦＩＩａ活性の８０％を阻害できるように希釈する。ビーズ溶液を、２０ｍＭトリスマレイン酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．３５の洗浄バッファーで希釈することによって１ｍｇ／ｍｌにする。溶液をかき混ぜ、１００μｌの、ビーズを含む溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を、エッペンドルフチューブに入れる。５００μｌのバッファーを加える。チューブを、１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離機にかける。上清を取り除いた後で、ペレットを５００μｍのバッファーに溶解する。攪拌後、２回目の遠心分離を行い、上清を再度捨てる。次に、生成物の溶液を、生成物のμｇ／アビジン（ＳｉｇｍａのアビジンＲｅｆ．Ａ−９２７５、回分にもよるが、約３ｍｇ／ｍｌの溶液）１μｇで表される、生成物／ビーズの比を、１、０．１、０．０１および０．００１で有するようなビーズを含む様々な溶液と接触して置く。次に、混合物をかき混ぜて、１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離機にかける前に、立てて１時間放置する。次に、上清を取り出し、上清中に残存する生成物の濃度を決定するために、抗ＦＸａ活性を分析する。抗ＦＸａ活性または抗ＦＩＩａ活性は、Ｔｅｉｅｎ  Ａ．Ｎ  ａｎｄ  Ｌｉｅ  Ｍ．、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９７７、１０、３９９−４１０頁により記載された方法を修正した方法に従って分析する。得られた結果を特に、表２に記載する。
【０１１４】
【表２】
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【０１１５】
したがって、低分子量ヘパリンが、８０％を超えるビオチン化度で、ビオチンにより実際に官能化されており、アビジンにより実際に中和され得ることがわかる。
【０１１６】
本発明に従ったビオチン化低分子量ヘパリンは、薬剤の調製に使用できる。特に、抗血栓剤として使用できる。したがって、本発明の別の態様によれば、本発明の目的は、上で定義されたビオチン化低分子量ヘパリンを含む薬剤である。これらの薬剤は、治療における使用、特に、静脈血栓症、動脈血栓障害（特に心筋梗塞または不安定狭心症の場合）、下肢の動脈疾患などの末梢動脈血栓症、大脳動脈血栓症および脳卒中の治療および予防における使用が見出される。それらの薬剤はまた、平滑筋細胞増殖、血管新生の予防および治療において、ならびにアテローム性動脈硬化および動脈硬化症のための神経保護剤としても有用である。
【０１１７】
本発明の別の態様によれば、本発明はまた、上述の病態の治療方法にも関し、この方法は本発明に従った化合物またはこれらの薬学的に許容される塩の有効量を、患者に投与することを含む。したがって、上記で定義されたビオチン化低分子量ヘパリンの、上述の病態の治療および予防のための使用は、本発明の一部を形成し、前記ビオチン化低分子量ヘパリンの、これらの病態の治療または予防用薬剤の製造のための使用も本発明の一部を形成する。
【０１１８】
本発明の別の態様によれば、本発明の目的は、有効成分として本発明に従ったビオチン化低分子量ヘパリンまたはこれらの薬学的に許容される塩およびさらに少なくとも１種の薬学的に許容される不活性な賦形剤を含む医薬組成物である。前記賦形剤は、所望の剤形および投与方法、例えば、経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、経粘膜的、局所または直腸経路に従って選択される。
【０１１９】
各投与単位において、有効成分は、所望の予防効果または治療効果を得るために、想定される１日量に適した量で存在する。各投与単位は、２０から１５０ｍｇ、有利には４０から１００ｍｇの有効成分を含み得る。抗凝血化合物のこれらの投与量は、静脈注射、ボーラスまたは点滴として、０．２ｇから２ｇまでのアビジンまたはストレプトアビジンの用量により中和できる。
【０１２０】
より多いまたは少ない投与量が適切である特別な場合もあり、このような投与量は、本発明の文脈外である。通常のプラクティスによれば、各患者に適した投与量は、投与方法ならびに前記患者の体重および反応に従って、医師によって決定される。
【０１２１】
本発明に従った化合物はまた、抗血栓剤、抗凝固剤または抗血小板凝集剤などの、所望の治療に有用である、１種または複数種の他の有効成分と組み合わせて使用することもできる。
【０１２２】
本発明の目的はまた、本発明に従ったビオチン化低分子量ヘパリンの中和を可能にすることを特徴とするアビジンまたはストレプトアビジンを使用する方法でもある。したがって、アビジンまたはストレプトアビジンは、本発明に従ったビオチン化低分子量ヘパリンの中和用薬剤の調製のために使用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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