(57)【要約】  ヒト対象への投与に十分な医薬品有効成分の精製方法は：  ラパマイシンまたはラパマイシン類似体である医薬品有効成分および不純物を含む反応生成組成物を得る段階；  クロマトグラフィーシステムの第１のカラムへ反応生成組成物を導入する段階；  第１のカラムからの第１の溶出液の第１の部分が医薬品有効成分より多くの不純物を含んでおり、前記第１の部分を廃棄に向ける段階；  第１のカラムからの第１の溶出液の第２の部分が不純物より多くの医薬品有効成分を含んでおり、前記第２の部分を第２のカラムに向ける段階；  医薬品有効成分を含む、第２のカラムからの第２の溶出液のファクションを集める段階；および  前記集めた画分を濃縮して９８％を超える医薬品有効成分の純度を得、約０．９５％以下が第１および第２の主要な不純物である段階を含むことができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラパマイシンまたはラパマイシン類似体である医薬品有効成分および不純物を含む反応生成組成物を得る段階；
クロマトグラフィーシステムの第１のカラムへ反応生成組成物を導入する段階；
第１のカラムからの第１の溶出液の第１の部分を廃棄に向ける段階；
第１のカラムからの第１の溶出液の第２の部分を、第２のカラムに入る前に第１の溶出液の前記第２の部分を処理することなく、第２のカラムに向ける段階；
医薬品有効成分を含む第２のカラムからの第２の溶出液のファクションを集める段階；および
前記集めた画分を濃縮して、９８％を超える医薬品有効成分の純度を得、約０．９５％以下が第１および第２の主要な不純物である段階を含む、ヒト対象への投与に十分な医薬品有効成分を精製する方法。
【請求項２】
医薬品有効成分がラパマイシン類似体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
医薬品有効成分が式１またはこの誘導体の化学構造：
【化１】
2010527935.tif 000010
を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
医薬品有効成分が式２またはこの誘導体の化学構造：
【化２】
2010527935.tif 000011
を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
第１の主要な不純物が逆アルドール生成物であり、第２の主要な不純物がＮ１−ルチジンテトラゾール付加物である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
クロマトグラフィーシステムが定組成溶媒系を有するカスケードシステムである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
定組成溶媒系がＴＨＦおよびヘプタンである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
濃縮医薬品有効成分が約９８．５％以上の純度を有し、第１の主要な不純物が約０．８５％以下であり、第２の主要な不純物が約０．１％以下である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
クロマトグラフィーシステムが段階グラジエント溶媒系を備えるカスケードシステムである、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
段階グラジエント溶媒系が、
第１のカラムへの反応生成組成物の導入と、第１のカラムからの第１の溶出液の第２の部分を第２のカラムへ向けることの間の第１の期間に、第１のカラムに導入される第１の溶媒；および
第１のカラムからの第１の溶出液の第２の部分を第２のカラムに向けた後の第２の期間に、第１のカラムに導入される第２の溶媒
を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
第１の溶媒が第１の比のＴＨＦ／ヘプテートを含み、第２の溶媒が第２の比のＴＨＦ／ヘプタンを含み、第１の比が第２の比より小さい、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
濃縮医薬品有効成分が約９９％以上の純度を有し、第１の主要な不純物が約０．４０％以下であり、第２の主要な不純物が約０．１％以下である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
ラパマイシン類似体および不純物を有する反応生成組成物を得る段階；
定組成溶媒系を備えるカスケードシステムの第１のカラムへ反応生成組成物を導入する段階；
第１のカラムからの第１の溶出液の第１の部分を廃棄に向ける段階；
第１のカラムからの第１の溶出液の第２の部分を、第２のカラムに入る前に第１の溶出液の前記第２の部分を処理することなく、第２のカラムに向ける段階；
医薬品有効成分を含む第２のカラムからの第２の溶出液のファクションを集める段階；および
前記集めた画分を濃縮して９８％を超える医薬品有効成分の純度を得、約０．９５％以下が第１および第２の主要な不純物である段階を含み、前記ラパマイシン類似体は式１またはこの誘導体の化学構造：
【化３】
2010527935.tif 000012
を有する、ヒト対象への投与に十分なラパマイシン類似体を精製する方法。
【請求項１４】
医薬品有効成分が式２またはこの誘導体の化学構造：
【化４】
2010527935.tif 000013
を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
第１の主要な不純物が逆アルドール生成物であり、第２の主要な不純物がＮ１−ルチジンテトラゾール付加物である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
定組成溶媒系がＴＨＦおよびヘプタンである、請求項５に記載の方法。
【請求項１７】
濃縮医薬品有効成分が約９８．５％以上の純度を有し、第１の主要な不純物が約０．８５％以下であり、第２の主要な不純物が約０．１％以下である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
ラパマイシン類似体および不純物を有する反応生成組成物を得る段階；
段階グラジエント溶媒系を備えるカスケードシステムの第１のカラムへ反応生成物組成物を導入する段階；
第１のカラムからの第１の溶出液の第１の部分を廃棄に向ける段階；
第１のカラムからの第１の溶出液の第２の部分を、第２のカラムに入る前に第１の溶出液の前記第２の部分を処理することなく、第２のカラムに向ける段階；
医薬品有効成分を含む第２のカラムからの第２の溶出液のファクションを集める段階；および
前記集めた画分を濃縮して９８％を超える医薬品有効成分の純度を得、約０．９５％以下が第１および第２の主要な不純物である段階を含み、
前記ラパマイシン類似体は式１またはこの誘導体の化学構造：
【化５】
2010527935.tif 000014
を有する、ヒト対象への投与に十分なラパマイシン類似体を精製する方法。
【請求項１９】
医薬品有効成分が式２またはこの誘導体の化学構造：
【化６】
2010527935.tif 000015
を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
第１の主要な不純物が逆アルドール生成物であり、第２の主要な不純物がＮ１−ルチジンテトラゾール付加物である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
段階グラジエント溶媒系が、
第１のカラムへの反応生成組成物の導入と、第１のカラムからの第１の溶出液の第２の部分を第２のカラムへ向けることの間の第１の期間に、第１のカラムに導入される第１の溶媒；および
第１のカラムからの第１の溶出液の第２の部分を第２のカラムに向けた後の第２の期間に、第１のカラムに導入される第２の溶媒
を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
第１の溶媒が第１の比のＴＨＦ／ヘプテートを含み、第２の溶媒が第２の比のＴＨＦ／ヘプタンを含み、第１の比が第２の比より小さい、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
濃縮医薬品有効成分が約９９％以上の純度を有し、第１の主要な不純物が約０．４０％以下であり、第２の主要な不純物が約０．１％以下である、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は化合物を精製するシステムおよび方法に関する。より詳しくは、本発明は、ラパマイシンおよび／またはラパマイシン類似体を精製するのに使用される、新規のクロマトグラフィーシステムおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
クロマトグラフィーは、組成物中に存在し得る他の不純物から所望の生成物を精製または分離するための一般的な実験技術である。通常、クロマトグラフィーは、移動相を共に形成する生成物および溶出溶媒を含む組成物の混合物を、クロマトグラフィー充填材などの固定相に通過させるものである。この結果、しばしば、ほとんど不純物を含まない非常に精製された生成物となる。クロマトグラフィーは分取でも分析でもよい。分取クロマトグラフィーは、さらに使用するために混合物の成分を分離しようとする（したがって、これは精製の一形態である）。分析クロマトグラフィーは、通常、より少量の材料で操作し、混合物中の分析種の相対的な比率を測定しようとする。分取クロマトグラフィー技術は分析で使用することができ、分析クロマトグラフィー技術は後の使用のために生成物を分離するために使用することができるので、これら２つは相互に排他的ではない。
【０００３】
カラムクロマトグラフィーは固定床がチューブ内にある分離技術である。固体の固定相の粒子または液体の固定相でコーティングされた担体を、チューブ（たとえば充填カラム）の内容積全体に充填する、またはチューブ（たとえば開管カラム）の中央部に、移動相のための開放的で無制限の行路を残して、チューブ内壁上にまたはこの壁に沿って濃縮してもよい。媒体を通る移動速度の違いは、サンプルの異なる保持時間に算定される。
【０００４】
現代のフラッシュクロマトグラフィーシステムは、予備充填したプラスチックカートリッジとして販売されており、溶媒はカートリッジを通してポンプで送り込まれる。システムはまた、検出器およびフラクションコレクターとリンクされて、自動化を提供し得る。グラジエントポンプを導入すると、より迅速な分離およびより少ない溶媒使用量となる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
クロマトグラフィーは、薬物として使用するための医薬品成分を精製するためにしばしば使用される。したがって、クロマトグラフィーは、薬物として使用するための十分な純度の非常に精製された生成物を提供することができる。このことは、不純物が医薬成分を汚染しないように除去されることを必要とする。しかしながら、すべてのクロマトグラフィー方法が、医薬成分を適切な純度にすべて精製することができるとは限らない。しばしば、特定の薬物に対する適切な純度を得るためには、精製の特定のクロマトグラフィーシステムおよび方法が利用されなければならない。特定の薬物のための適切なクロマトグラフィーシステムおよび方法を特定する際、クロマトグラフィーは、通常、相当な量の資源、時間、実験およびコストを必要とする。適切なクロマトグラフィーシステムおよび薬物を精製する方法が見出された場合でも、純度および／または収率はしばしば１００％未満である。このことにより、ほとんどのクロマトグラフィーシステムおよび方法において、改良の余地がある。
【０００６】
今まで、医薬の使用のためにラパマイシンおよび／またはラパマイシン類似体を精製するためにクロマトグラフィーシステムおよび方法が使用されてきた。現在まで、ラパマイシンおよび／またはラパマイシン類似体を精製する最も成功したクロマトグラフィーシステムおよび方法は容認できる最低限度を満たしているが、純度および収率において改良の余地が依然として有る。したがって、医薬の使用のためのラパマイシンおよび／またはラパマイシン類似体を精製する、改良されたクロマトグラフィーシステムおよび方法のニーズがある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（簡単な要旨）
一般的に、本発明は、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体などの医薬品有効成分を精製するシステムおよび方法を含む。本発明は、反応生成組成物または他の組成物からラパマイシンまたはこの類似体を精製することを含む。
【０００８】
一実施形態において、ヒト対象への投与に十分な医薬品有効成分を精製する方法は：ラパマイシンまたはラパマイシン類似体である医薬品有効成分および不純物を含む反応生成組成物を得る段階；クロマトグラフィーシステムの第１のカラムへ反応生成組成物を導入する段階；第１のカラムからの第１の溶出液の第１の部分が医薬品有効成分より多くの不純物を含んでおり、前記第１の部分を廃棄に向ける段階；第１のカラムからの第１の溶出液の第２の部分が不純物より多くの医薬品有効成分を含んでおり、前記第２の部分を第２のカラムに向ける段階；医薬品有効成分を含む、第２のカラムからの第２の溶出液のファクション（ｆａｃｔｉｏｎ）を集める段階；および前記集めた画分を濃縮して９８％を超える医薬品有効成分の純度を得、約０．９５％以下が第１および第２の主要な不純物である段階を含むことができる。本方法は式１のＮ１および／またはＮ２類似体を精製することができる。Ｎ１類似体は、精製するのに好ましいラパマイシン類似体（たとえばゾタロリムスまたはＡＢＴ−５７８）である。
【０００９】
一実施形態において、ヒト対象への投与に十分なラパマイシン類似体を精製する方法は：ラパマイシン類似体および不純物を有する反応生成組成物を得る段階；定組成溶媒系を備えるカスケードシステムの第１のカラムへ反応生成組成物を導入する段階；第１のカラムからの第１の溶出液の第１の部分が医薬品有効成分より多くの不純物を含んでおり、前記第１の部分を廃棄に向ける段階；第１のカラムからの第１の溶出液の第２の部分が不純物より多くの医薬品有効成分を含んでおり、前記第２の部分を第２のカラムに向ける段階；医薬品有効成分を含む第２のカラムからの第２の溶出液のファクションを集める段階；および前記集めた画分を濃縮して９８％を超える医薬品有効成分の純度を得、約０．９５％以下が第１および第２の主要な不純物である段階を含むことができる。ここで、前記ラパマイシン類似体は式１またはこの誘導体の化学構造を有する。
【００１０】
【化１】
2010527935.tif 000002
【００１１】
一実施形態において、ヒト対象への投与に十分なラパマイシン類似体を精製する方法は：ラパマイシン類似体および不純物を有する反応生成組成物を得る段階；段階グラジエント溶媒系を備えるカスケードシステムの第１のカラムへ反応生成組成物を導入する段階；第１のカラムからの第１の溶出液の第１の部分が医薬品有効成分より多くの不純物を含んでおり、前記第１の部分を廃棄に向ける段階；第１のカラムからの第１の溶出液の第２の部分が不純物より多くの医薬品有効成分を含んでおり、前記第２の部分を第２のカラムに向ける段階；医薬品有効成分を含む、第２のカラムからの第２の溶出液のファクションを集める段階；および前記集めた画分を濃縮して９８％を超える医薬品有効成分の純度を得、約０．９５％以下が第１および第２の主要な不純物である段階を含むことができる。ここで、前記ラパマイシン類似体は式１またはこの誘導体の化学構造を有する。
【００１２】
一実施形態において、溶媒系は、本質的にＴＨＦおよびヘプタンから成る定組成または段階グラジエント溶媒系である。しかし、他の周知の有機溶媒および溶媒系が使用されてもよい。
【００１３】
一実施形態において、濃縮医薬品有効成分は約９８．５％以上の純度を有し、第１の主要な不純物は約０．８５％以下であり、第２の主要な不純物は約０．１％以下である。
【００１４】
一実施形態において、第１の主要な不純物は逆アルドール生成物であり、第２の主要な不純物はＮ１−ルチジンテトラゾール付加物（Ｎ１−ＬＴＡ）である。一実施形態において、溶媒系は下記を含むことができる段階グラジエント溶媒系である：第１のカラムへの反応生成組成物の導入と、第１のカラムからの第１の溶出液の第２の部分を第２のカラムへ向けることの間の第１の期間に、第１のカラムに導入される第１の溶媒；および第１のカラムからの第１の溶出液の第２の部分を第２のカラムに向ける前の、間の、または後の、第２の期間に、第１のカラムに導入される第２の溶媒。場合によって、第１の溶媒は第１の比のＴＨＦ／ヘプテート（ｈｅｐｔａｔｅ）を含み、第２の溶媒は第２の比のＴＨＦ／ヘプタンを含み、第１の比が第２の比より小さい、またはこの逆である。
【００１５】
一実施形態において、濃縮医薬品有効成分は約９９％以上の純度を有し、第１の主要な不純物は約０．４０％以下であり、第２の主要な不純物は約０．１％以下である。
【００１６】
一実施形態において、段階グラジエント溶媒系は、第１のカラムから溶出されている不純物のピークの終端部を検出した時または後、第１の溶媒組成から第２の溶媒組成への変更を含む。代替として、第１のカラムからの溶出液が、不純物より多くの医薬品有効成分を含む前に、第１の溶媒は第２の溶媒に変更される。別の代替形態においては、医薬品有効成分が第１のカラムから溶出し始めるとき、第１の溶媒は第２の溶媒に変更される。別の代替形態においては、実質的に、バルブを切り替えて第１の溶出液を廃棄から第２のカラムに再度向けるとき、第１の溶媒は第２の溶媒に変更される。
【００１７】
一実施形態において、第１のカラムは第２のカラムに流体的に結合されている。代替として、第１のカラムは、第２のカラムに流体的に結合されているバルブに流体的に結合されていて、バルブは第１のカラムを第２のカラムに流体的に結合している。別の代替形態において、第１のカラムは、第２のカラムおよび廃液貯蔵部に流体的に結合されているバルブに流体的に結合されている。別の代替形態においては、第１の溶出液の第１の部分を第１のカラムから廃棄へ向けるのは、直接的または間接的のどちらかである。すなわち、第２のカラムの代わりに廃棄に直接的に向けられ、また第２のカラムを通過した後に廃棄に間接的に向けられる。別の代替形態において、第１のカラムからの第１の溶出液の第２の部分を第２のカラムに入る前に処理せずに、第１の溶出液の前記第２の部分を第２のカラムへ向けられる。
【００１８】
一実施形態において、第１の溶出液は、第１の溶出液の第２の部分を第２のカラムにいつ向けるか判断するようにモニターされる。場合によって、第１の溶出液は、ＵＶ、光吸収、光線透過率、分光法、質量分光法、ＨＰＬＣ、ＴＬＣなどでモニターされる。また、第２のカラムからの第２の溶出液は、同様に第３のカラム、廃棄または回収に関してモニターすることができる。
【００１９】
本発明のこれらの実施形態および特徴ならびに他の実施形態および特徴は、以下の説明および添付された特許請求の範囲からより完全に明瞭になり、または以下に述べられるような本発明の実施によって知ることもできる。
【００２０】
本発明の上記の利点および特徴、ならびに他の利点および特徴をさらに明確にするために、本発明のより詳しい説明を添付図面で示した特別な実施形態を参照して行う。これらの図面は単に本発明の代表的な実施形態であるに過ぎず、本発明の範囲を限定するものと考えるべきではないことが認識される。添付図面を使用して付加的な特定事項とともに本発明を詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ＡＰＩのクロマトグラフィーの分離および精製のためのカスケードシステムの実施形態の略図である。
【図２Ａ】定組成クロマトグラフィーの分離の実施形態の溶媒プロファイルの略図である。
【図２Ｂ】段階グラジエントクロマトグラフィーの分離の実施形態の溶媒プロファイルの略図である。
【図２Ｃ】連続グラジエントクロマトグラフィーの分離の実施形態の溶媒プロファイルの略図である。
【図３】単一カラムのみを備える定組成クロマトグラフィーシステムの実施形態の溶出プロファイルを図示するグラフである。
【図４】カラム間のＡＰＩを含有する溶出液の処理を伴う代表的な２つのカラムクロマトグラフィーシステムのシステムおよび工程の略図である。
【図５】（１）単一カラムのみを備える定組成クロマトグラフィーシステムの実施形態の溶出プロファイルおよび（２）カスケードクロマトグラフィーシステムを備える定組成カスケードクロマトグラフィーシステムの実施形態の溶出プロファイルを示す重ね合わせたグラフである。
【図６Ａ】定組成カスケードクロマトグラフィーシステムの実施形態において第１のカラムの溶出プロファイルを示すグラフである。
【図６Ｂ】図６Ａのグラフを与える第１のカラムを備える定組成カスケードクロマトグラフィーシステムの実施形態の略図である。
【図６Ｃ】図６Ｂの定組成カスケードクロマトグラフィーシステム全体の溶出プロファイル（ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅ）を示すグラフである。
【図７Ａ】段階グラジエントカスケードクロマトグラフィーシステムの実施形態の略図である。
【図７Ｂ】図７Ａの段階グラジエントカスケードクロマトグラフィーシステムのための溶出プロファイルを示すグラフである。
【図８】ラパマイシンからラパマイシン類似体を調製する化学反応プロセスの例の概略図である。
【図９Ａ】主要生成物から分離すべき試薬および生成物の不純物を示す、図８に示した反応から得られた副反応生成物および試薬不純物の化学構造の概略図（ｄｉａｇｒａｐｈｓ）である。
【図９Ｂ】主要生成物から分離すべき試薬および生成物の不純物を示す、図８に示した反応から得られた副反応生成物および試薬不純物の化学構造の概略図である。
【図９Ｃ】主要生成物から分離すべき試薬および生成物の不純物を示す、図８に示した反応から得られた副反応生成物および試薬不純物の化学構造の概略図である。
【図９Ｄ】主要生成物から分離すべき試薬および生成物の不純物を示す、図８に示した反応から得られた副反応生成物および試薬不純物の化学構造の概略図である。
【図９Ｅ（ｉ）】主要生成物から分離すべき試薬および生成物の不純物を示す、図８に示した反応から得られた副反応生成物および試薬不純物の化学構造の概略図である。
【図９Ｅ（ｉｉ）】主要生成物から分離すべき試薬および生成物の不純物を示す、図８に示した反応から得られた副反応生成物および試薬不純物の化学構造の概略図である。
【図９Ｅ（ｉｉｉ）】主要生成物から分離すべき試薬および生成物の不純物を示す、図８に示した反応から得られた副反応生成物および試薬不純物の化学構造の概略図である。
【図９Ｆ】主要生成物から分離すべき試薬および生成物の不純物を示す、図８に示した反応から得られた副反応生成物および試薬不純物の化学構造の概略図である。
【図９Ｇ】主要生成物から分離すべき試薬および生成物の不純物を示す、図８に示した反応から得られた副反応生成物および試薬不純物の化学構造の概略図である。
【図９Ｈ】主要生成物から分離すべき試薬および生成物の不純物を示す、図８に示した反応から得られた副反応生成物および試薬不純物の化学構造の概略図である。
【図９Ｉ】主要生成物から分離すべき試薬および生成物の不純物を示す、図８に示した反応から得られた副反応生成物および試薬不純物の化学構造の概略図である。
【図９Ｊ】主要生成物から分離すべき試薬および生成物の不純物を示す、図８に示した反応から得られた副反応生成物および試薬不純物の化学構造の概略図である。
【図１０】主要生成物および不純物の溶出を同定する、不純物および図８に示した反応の生成物の溶出プロファイルを示すグラフである。
【図１１Ａ】カラム間の溶出生成物を濃縮する一般的な技術を使用する、２カラムクロマトグラフィーシステムおよび方法による第１のカラムの溶出プロファイルを示すグラフである。
【図１１Ｂ】カラム間の溶出生成物を濃縮する一般的な技術を使用する、２カラムクロマトグラフィーシステムおよび方法による第２のカラムの溶出プロファイルを示すグラフである。
【図１２】定組成カスケードクロマトグラフィーシステムの実施形態の溶出プロファイルを示すグラフである。
【図１３】段階グラジエントカスケードクロマトグラフィーシステムの実施形態の溶出プロファイルを示すグラフである。
【図１４】単一カラム段階グラジエントクロマトグラフィーシステムの実施形態の溶出プロファイルを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
全般的に、本発明は、様々な治療および予防に使用する医薬品有効成分（ＡＰＩ）であり得る化合物を精製する、改良されたシステムおよび方法を含む。この種の使用は、狭窄および／または再狭窄を予防および／または治療するために使用することができる、薬剤溶出性ステントを形成するためにステントに配備することを含むことができる。したがって、本発明はラパマイシンおよび／またはラパマイシン類似体を精製するために使用する、新規のクロマトグラフィーシステムおよび方法を含む。したがって、ＡＰＩを精製するシステムおよび方法は、適切な形態のＡＰＩを製造するように構成することができ、または、ヒト患者などの対象に投与することができるようにさらに処理することができる。改良されたシステムおよび方法は、今まで入手可能なものより純度を増加させたＡＰＩを提供する。
【００２３】
本発明は、化学反応から得られたＡＰＩを他の反応副産物または試薬不純物から精製するまたは分離する、システムおよび方法を含む。ＡＰＩはラパマイシンまたはラパマイシン類似体であってよく、医薬として内部人工器官、配備システムにおいて、および、再狭窄を阻止することができる量のＡＰＩを内部人工器官から搬送する方法において使用するために適している純度へ精製することができる。より詳しくは、本発明は、ラパマイシン類似体（たとえばゾタロリムスまたはＡＢＴ−５７８）を、反応混合物中に存在する反応副産物および他の不純物から分離するシステムおよび方法の使用を含む。本システムおよび方法は、冠状動脈の再狭窄の阻止に使用するために対象に投与するまたはステントに適用することができるように、ラパマイシン類似体を精製することができる。
【００２４】
（Ｉ．はじめに）
一実施形態において、本発明は、反応、分離および回収を含む全化学プロセスを含み、分離は本明細書に記載されるシステムを使用する分離方法である。第１に、治療薬としての使用のための生成物として有用とするために精製し、集めることが求められる目標ＡＰＩを含有する組成物の形態の反応生成物を製造するために、反応または一連の反応が行われる。次いで、反応生成物は、カスケードシステム、定組成カスケードシステム、段階グラジエントカスケードシステム、連続グラジエントカスケードシステム、段階グラジエント単一カラムシステムなどのクロマトグラフィーシステムに装入される。次いで、希薄溶液中のＡＰＩはクロマトグラフィーシステムによって処理および精製をした後に集められる。次いで、ＡＰＩは、ろ過、析出、濃縮、乾燥、凍結乾燥、冷凍乾燥、これらの組合せおよび／または溶液から目標ＡＰＩを得るための他の公知法によって溶液から集められる。
【００２５】
本明細書で使用する、「２カラム」クロマトグラフィーシステムはカスケードシステムとは考えられない。代表的な２カラムシステム（また、複数のカラムを備えるシステムであってもよい。）において、カラムは流体的に結合されず、第１のカラムからの溶出液は、第２のカラムに向けられる前に相当処理される。従来の２カラムクロマトグラフィーシステムにおいて、第１のカラムの溶出液は第２のカラムへ導入される前に濃縮されるが、それは、本明細書に記載されるように、不利である。しかし、他の処理もまた、カラム間で行う場合がある。
【００２６】
本明細書では、「カスケードシステム」は、ＡＰＩを精製するために複数のカラムの使用を含むクロマトグラフィーシステムおよび方法を指すことを意味する。しかし、カラム間で得られた溶出液は、再構成、濃縮および／または他の方法で処理されることなく、次のカラムへ導入される。このことは、肯定的にカラム間のＡＰＩを再構成および／または濃縮（たとえば処理）する、他の複数カラムシステムおよび方法とは区別できる。カスケードシステムの一例は、図１に示され、中断されない方式で第２のカラム２に連続的にまたは流体的に結合される第１のカラム１を図示するが、第１のカラムと第２のカラムの間にバルブまたは他の液体流動システムのデバイス、または構成要素を配置することができる。すなわち、カラム１の生成物および溶出液は、直接カラム２に、場合によってカラム２から任意の追加のカラムに流れ込む。必要または所望の場合、追加のカラムをカラム２の後に加えることができる。また、カラム１からの溶出液は、カラム２に直接流れ込むのを一時的に抑制することができる。たとえば、カラム１からの溶出液は、カラム２へ導入される前に、集めることができるが、カラム２へ導入される前に、溶出液が著しく変更、濃厚化、濃縮にされず、または実質的に他の方法で処理または操作されないということを注意しておく。
【００２７】
本明細書では、「定組成カスケードシステム」は、ＡＰＩを精製するための定組成溶媒および複数カラムの使用を含むクロマトグラフィーシステムおよび方法を指すことを意味する。溶媒は、分離および精製の全体を通して同じ組成物特性を有している、実質的に一定の組成物とするために定組成とする。定組成カスケードシステムのための溶媒プロファイルの一例は、図２Ａで示される。
【００２８】
本明細書では、「段階グラジエントカスケードシステム」は、少なくとも第１の期間の第１の溶媒組成物および少なくとも第２の期間の第２の溶媒組成物、およびＡＰＩを精製する複数のカラムの使用を含むクロマトグラフィーシステムおよび方法を指すことを意味する。段階グラジエントカスケードシステムは、一時点において溶媒が段階グラジエントという点を除いて、定組成カスケードシステムと実質的に類似している。段階グラジエントカスケードシステムの溶媒プロファイルの一例は、図２Ｂで示される。
【００２９】
本明細書では、「連続グラジエントカスケードシステム」は、分離または精製の間、一定または様々な勾配で絶えず変化する溶媒組成の使用を含み、またＡＰＩを精製する複数のカラムを使用するクロマトグラフィーシステムおよび方法を指すことを意味する。溶媒が絶えず時間にわたって変わるという点を除いて、連続グラジエントカスケードシステムは定組成カスケードシステムと実質的に類似している。段階グラジエントカスケードシステムの溶媒プロファイルの一例は、図２Ｃで示される。
【００３０】
（ＩＩ．クロマトグラフィーシステムおよび方法）
一実施形態において、本発明は、他の物質からＡＰを分離するためにカスケードシステムを使用するシステムおよび方法を含む。本明細書に記載された溶媒系を使用するカスケードシステムおよび方法は、少なくとも下記の点で有益になり得る：ＡＰＩの収率を増加させる；不純物からのＡＰＩの分離効率を増加させる；溶媒の使用量を大幅に減少させる；および、サイクルタイムを減少させて精製したＡＰＩがより速い速度で得られる。カスケードシステムおよび方法は、カラム間のＡＰＩを濃縮および／または再構成する他のプロセスと比較して、著しく少量の溶媒の使用を可能にする。また、ＡＰＩを濃縮および／または再構成しないので、精製されたＡＰＩを得る時間を著しく減少させ、収率を著しく増加させる。カラム間のＡＰＩを濃縮および／または再構成する、以前のシステムおよび方法においては、ＡＰＩが次のカラムに装入される前に濃縮されるので、多くの溶媒が使用される。本カスケードシステムおよび工程では、ＡＰＩは１度だけ濃縮されるが、それは工程が完了した後で、ＡＰＩは最終カラムから希薄溶液として得られる。
【００３１】
一実施形態において、本発明は、他の物質からＡＰＩを分離するための定組成カスケードシステムを使用するシステムおよび方法を含む。定組成分離システムおよび方法は、溶媒比がクロマトグラフィー分離の全体にわたって実質的に一定に保たれる工程を含む。すなわち、溶媒は、分離の全体にわたって実質的に同じに保たれる。溶媒が最初に実質的に純粋な溶媒である場合、定組成の方法は溶媒を実質的に同じに保つ。図２Ａは、定組成クロマトグラフィーの精製での溶媒プロファイルの略図を示す。溶媒が２種以上の異なる溶媒の混合物である場合、溶媒は最初の溶媒比で最初に存在し、この溶媒比は、定組成分離工程の全体にわたって実質的に同じに保たれる。これは、分離中の一時点で溶媒比を変える段階グラジエント（図２Ｂを参照）、または分離の全体にわたって実質的に絶えず溶媒比を変える連続的なグラジエントとは異なる（図２Ｃを参照）。
【００３２】
図３は、２６５ｎｍおよび３１０ｎｍで吸光度によって溶出生成物を示す単一カラムシステムのクロマトグラフィー分離プロファイルを図示するグラフである。カラムは、５０％ＴＨＦ／ヘプタンである溶媒を用いる定組成単一カラムとして運転された。３１０ｎｍの吸光度は、カットオフである第１の主要なピーク、および溶出生成物の約１０００ｍｌから１５００ｍｌの間の第２の主要なピークを有することが示される。矢印４でグラフの一部に見ることができるように、不純物は、大多数の不純物６および大多数の生成物８を同定するライン間の溶出液中の生成物と共に、共溶出する。すなわち、ライン８の後の溶出液の大多数は生成物である。矢印４によって同定された中間の部分では、不純物は生成物と共に共溶出し、結果としてＡＰＩの５−１０％を損失する。この５−１０％の損失は、ＡＰＩの分離が十分でない単一カラムの結果である。
【００３３】
図４は、代表的な２カラムクロマトグラフィーシステム１０のシステムおよび工程の略図を含む。２カラムクロマトグラフィーシステムは以下のように運転する：目標ＡＰＩを含む反応生成物溶液を、５０％ＴＨＦ／ヘプテートである溶媒を用いてカラム１へ導入する；画分を集めるためにカラム１に通して溶液を処理する；場合によって、目標ＡＰＩを含む画分を同定するために画分を分析する；場合によって、画分を貯留する；ＡＰＩを含む画分を濃縮する；３０％アセトンおよび７０％ヘプタンの溶媒でカラム２へ濃縮ＡＰＩを導入する；濃縮ＡＰＩをカラム２に通して処理し、画分を集める；場合によって、目標ＡＰＩを含む画分を同定するために画分を分析する；場合によって、画分を貯留する；ＡＰＩを含む画分を濃縮する；および、ＡＰＩ生成物を得る。この従来のシステムに関する問題のうちのいくつかは以下のとおりである：先頭の領域の分離が純粋なＡＰＩを集めるのを妨害する；長くテーリングするＡＰＩピークがある；装入する混合物がカラム充填材と反応する恐れがある；および、第２のカラム前のＡＰＩの濃縮に時間がかかり、結果として生成物の損失をもたらす場合がある。たとえば、２カラムシステムにおいて、個々の画分はＡＰＩの量および純度に関して通常試験されるが、この試験は時間とコストがかかる。十分に純粋な画分は合わせることができるが、生成物の著しい損失につながる。中間の濃縮段階は、すべての画分の溶出液の、非常に大きな容積の結果である。たとえば、ＡＰＩを含む溶出液容積は約１０００リットルとなる場合があり、次いで、カラム２に装入される前に約１または２リットルまで濃縮される。カラム２の溶出液は集められ、試験を実施して十分なＡＰＩを含有する画分を選択し、これらの画分は貯留、濃縮される。図４の工程は時間とコストがかかる。
【００３４】
図５は、本発明による定組成カスケードシステム（破線）のクロマトグラフィープロファイルと共に、図３に示される単一カラムシステム（実線）のクロマトグラフィープロファイルを含むグラフである。重ね合わせたグラフは、単一カラムが矢印１２によってこぶを不純物であると同定する第２のピークを与えることを示す。したがって、単一カラムでは、大多数の不純物６および大多数の生成物８を同定するライン間の溶出液中に、矢印４によって示される生成物と共に不純物が共溶出することを示す。したがって、グラフは、最初の溶出で約５−１０％のＡＰＩ生成物の損失を示す。生成物のこの種の損失は、２カラムシステムの第２のカラムによって複合され増加する。
【００３５】
しかし、定組成カスケードシステム（破線）では、大多数の不純物が生成物から分離される最初の主要なピーク、次いで実質的に溶媒のみが溶出される谷を示し、緩い傾斜（円で囲まれた領域１４）、次いでＡＰＩ生成物であると同定されるメインピークが続く。破線の円で囲まれた領域１４は、分離するのが難しいＡＰＩ生成物からの不純物の分離を示す。したがって、カスケードシステムによって、不純物がＡＰＩ生成物から分離されることが可能になる。円で囲まれた領域１４の不純物を分離する能力は、純度および収率の両方において実質的増加を可能にする。
【００３６】
図６Ａは、図６Ｂで示されるカスケードシステム２０の第１のカラム２２の溶出プロファイルを示す。図６Ｂは、バルブ２４に流体的に結合され、次にバルブ２４が第２のカラム２６（カラム２）に流体的に結合される、第１のカラム２２（カラム１）を含むカスケードシステム２０を図示する。バルブ２４は、さらにＵＶ検出器２８に流体的に結合され、ＵＶ検出器２８は廃液貯蔵部３０または生成物を集めるフラクションコレクター３２に流体的に結合される。運転中、ＡＰＩを含む反応生成物は第１のカラム２２へ導入される。次いで、生成物が特定の量、または特定の純度でＡＰＩを含むか否かを判断するために、第１のカラム２２の溶出液を、溶出液のうちのいくらかをＵＶ検出器に向けるバルブ２４を通して通過させる。第１のカラム２２からの溶出液は廃棄３０に向ける、またはフラクションコレクター３２で集めることができる。ほとんどの状況において、第１のカラム２２からの溶出液は廃液貯蔵部３０に行く。ある時点では、バルブ２４は第１のカラム２２から第２のカラム２６への溶出液を向けるように切り替えられる。第２のカラム２６からの溶出液は、溶出液のどの画分を廃棄３０に送り、どの画分をフラクションコレクター３２で集めるべきか判断する、同一であるまたは異なるＵＶ検出器２８によってモニターされる。たとえば、最初の時点３４では、第１のカラム２２の溶出液を廃棄３０に向けるように、バルブ２４は切り替えられる。後の時点３６では、第１のカラム２２の溶出液が第２のカラム２６に向けられるように、バルブ２４は切り替えられる。図６Ａは、第１のカラム２２の溶出液のピークが上昇し始める場合、第２のカラム２６に溶出液を送るために、バルブ２４は切り替えられることを示す。図６Ｃは、ＡＰＩ生成物がカスケードシステム２０によって精製された、第１のカラム２２および第２のカラム２６の溶出プロファイルを示す。さらに、クロマトグラフィー運転、溶出液同定および回収のための様々な他の周知の手段を、本発明により使用することができる。
【００３７】
図５のカスケードシステムの溶出プロファイルグラフをもう一度参照すると、約１０００ミリリットルで突然、第２のピークがほぼゼロに達するのがわかるが、このときが、バルブ２４が第２のカラム２６に切り替えられるときである。このことによって、目標ＡＰＩの効率的な分離および純度が可能になる。それに応じて、第１のピークは廃棄に送られ、第２のピークは第２のカラムに送られる。図５の円で囲まれた領域１４は、第２のカラムによってＡＰＩから分離されている不純物を示す。溶出液の最初の１０００ミリリットルはカラム１のみを通過し、廃棄に向けられる。最初の１０００ミリリットルの後、バルブは切り替えられ、これによってＡＰＩはカラム１およびカラム２によって精製される。これにより、より多くの困難および費用を加える長いカラムを備える必要が無い長さへカラム長さを本質的に増加させる。長い単一カラムでは、バルブが廃棄およびカラム２の間で切り替わることを不可能にする場合があり、さらに分離を複雑にする恐れがある。
【００３８】
一実施形態において、１つのカラムからの溶出液が次のカラムの入口に直接流れ込むように、本クロマトグラフィーシステムおよび方法はカスケード型の複数カラムを備える。したがって、ＡＰＩはカラム間で処理されずに、複数カラムを介して処理され、ＡＰＩがより少ない段階でより高い収率で得られることを可能にする。たとえば、第１のカラムからの溶出液は、ＡＰＩ含量が無いまたは非常に低いときは廃棄に、または十分なＡＰＩ含量が溶出液中にある場合、次のカラムに移す。溶出液はカラム間で濃縮されず、カスケード型のすべてのカラムによって精製／不純物から分離された後にのみ、濃縮される。しかし、化学分析またはモニタリングの他の公知法は溶出液をモニターするために使用することができる。
【００３９】
一実施形態において、本発明のシステムおよび方法は、第１のカラムからの溶出液をモニターするためにカラム間においてＵＶセンサーを利用する。ＵＶ検出器によって、ＡＰＩを含まないまたは十分な量のＡＰＩを含まない溶出液を廃棄に移すことが可能になり、またＡＰＩをまたは十分な量のＡＰＩを含む溶出液を次のカラムに移すことが可能になる。最終溶出液を廃棄またはＡＰＩを集めるための回収に向けるために、ＵＶセンサーはまた、ＡＰＩ同定／特性決定の機能を行うために、最後のカラムの出口の後に入れることもできる。これによって、不純物を含む溶出液を廃棄に送ることが可能になる。
【００４０】
一実施形態において、クロマトグラフィーシステムに装入されるＡＰＩを含有する組成物の量は固定される。すなわち、最初の量が装入され、その後装入はしない。このことによって、以下のようにクロマトグラフィーシステムがＡＰＩの容積中の不純物を除去することを可能にする：（１）カラム間のバルブを開き、溶出液をＵＶ検出器に通し、不純物を含む溶出液を廃液容器に移す；（２）溶出液から最初の不純物を除去した後、次いで、第１のカラムからの溶出液が第２のカラムを介して処理されるように、バルブが切り替えられる。
【００４１】
一実施形態において、第１のカラムへの全投入量は、溶出液がカラム間で廃棄に送られることなくまたは処理されることなく、カスケードクロマトグラフィーシステム全体を通して処理される。これによって、最初の不純物を廃棄に送る代わりに、カスケードシステムによって溶出液中の最初の不純物がさらに分離されることが可能になる。次いで、不純物はカスケードシステムから最終的に溶出された後、廃棄に送られる。
【００４２】
一実施形態において、本発明のシステムおよび方法は、バルブが切り替えられるか、さもなければ第１のカラムからの溶出液が次のカラムの入口に直接流れ込むように構成される場合、精製／分離中のある時点で溶媒が変えられるような段階グラジエントカスケードクロマトグラフィーシステムを含む。すなわち、段階グラジエントは、溶出液が第２のカラムに向けられる前、この間、またはこの後に用いる。あるいは、段階グラジエントは、ＡＰＩを含有する溶出液が次のカラムに受け取られる時点で用いてもよく、バルブの切り替えを必要としない。インライン型ＵＶ検出器または他のモニターは、段階グラジエントを変えるための時点を提供することができる。また、複数の段階グラジエントを使用することができる。複数の段階グラジエントは、以下の時点の任意の１つまたは複数で変えることができる：最初の不純物がＡＰＩから分離された後；最初の不純物が後のカラムに入る前、またはこの時に；ＡＰＩが最初のカラムから溶出し始めるとき；ＡＰＩが後のカラムに入り始めるとき；後の不純物が最初のカラムから溶出した後；後の不純物が後のカラムに入るとき；など。
【００４３】
一実施形態において、ＵＶによって同定される最初の第１のピークが第１のカラムから溶出する時点で、溶出液が第２のカラムの入口に向けられるように、バルブが切り替えられる。この時点では、溶媒は、定組成工程で一定に保持されるまたは段階グラジエントで変えることができる。たとえば、第１のピークが溶出されるとき、バルブは、第２のカラムに溶出液を送る設定をされ、実質的に同時に第１のカラムへ投入される溶媒は段階グラジエント方式で変えられる。段階グラジエントカスケードクロマトグラフィーシステム４０の例は図７Ａに見ることができ、図６Ｂで示されるものとわずかに異なる配置で構成要素をすべて実質的に含む。図７Ａの段階グラジエントカスケードクロマトグラフィーシステム４０の溶出プロファイルは図７Ｂに見られ、バルブ切り替え時点４２および回収期間４４を示す。また、図７Ｂは、段階グラジエント溶媒変更時点４６は実質的にバルブ切り替え時点４２と同じ時点であることを示す。
【００４４】
一実施形態において、本発明は段階グラジエント単一カラムクロマトグラフィーシステムを含む。単一カラムの段階グラジエントの実施がＡＰＩの純度を改良し不純物の合計量を減少させることができることが示された。たとえば、ゾタロリムスは、段階グラジエント単一カラムクロマトグラフィー技術の実施により、分離が難しい２つの主要な反応副産物から成功裡に分離することができる。段階グラジエントは本明細書に記載されるように実施することができる。たとえば、段階グラジエントは、以下の時点のいずれかに実施することができる：最初の不純物が溶出され、それによってＡＰＩから分離された後；最初の不純物がＡＰＩから分離し始めた後でＡＰＩの溶出の前に；ＡＰＩがカラムから溶出し始めるとき；など。
【００４５】
（ＩＩＩ．医薬品有効成分）
一実施形態において、本発明のシステムおよび方法はラパマイシンまたはラパマイシン類似体を精製するために使用することができる。本発明で精製することができる１つの具体的なラパマイシン類似体はゾタロリムスであり、ＡＢＴ−５７８とも呼ばれる。
【００４６】
一実施形態において、本明細書に記載されたシステムおよび方法は式１、式２（４２−（１−テトラゾリル）−ラパマイシン（より極性の異性体））、式３（４２−（２−テトラゾリル）−ラパマイシン（それほど極性でない異性体））またはこれらの組合せの構造を有するラパマイシン類似体を精製することができる。
【００４７】
【化２】
2010527935.tif 000003
2010527935.tif 000004
【００４８】
式２のラパマイシン類似体はゾタロリムスまたはＡＢＴ−５７８と呼ぶことができる。さらに、ＡＰＩはラパマイシン類似体の任意の薬学的に受容できる塩またはプロドラッグであってもよい。ゾタロリムスなどの生物活性剤の、薬学的に受容できる塩類および／またはプロドラッグの調製は当技術分野で周知である。
【００４９】
一実施形態において、精製または分離するラパマイシン類似体は式１−３に示される類似体の誘導体であってもよい。誘導体は、ヒドロキシル化、メチル化、エチル化、そうでなければごくわずかに置換基を変更することなどの軽微な置換を行うことにより調製することができる。しかし、本発明によるラパマイシン類似体の任意の誘導体は、本明細書に記載される細胞移動を阻害しないが、再狭窄を阻害する特性を有するべきである。
【００５０】
さらに、式１−３のラパマイシン類似体は、式４Ａ−４Ｂで示される別の類似体を含む溶液中に平衡状態で存在することができる。式４Ａのラパマイシン類似体はまた式２−３（たとえば式４Ｂ）の対応する類似体であってもよい。したがって、式４Ａ（および式４Ｂなどの式２−３の等価物）のラパマイシン類似体は、本発明のシステムおよび方法で精製することができる。
【００５１】
【化３】
2010527935.tif 000005
【００５２】
一実施形態において、本発明のシステムおよび方法は、式１のラパマイシン類似体を、ラパマイシン類似体を含む反応生成混合物中に存在する不純物から精製するために利用される。
【００５３】
一実施形態において、本発明のシステムおよび方法は、式２のラパマイシン類似体を、ラパマイシン類似体を含む反応生成混合物中に存在する不純物から精製するために利用される。
【００５４】
一実施形態において、本発明のシステムおよび方法は、式３のラパマイシン類似体を、ラパマイシン類似体を含む反応生成混合物中に存在する不純物から精製するために利用される。
【００５５】
一実施形態において、本発明のシステムおよび方法は、式４Ａおよび／または式４Ｂのラパマイシン類似体を、ラパマイシン類似体を含む反応生成混合物中に存在する不純物から精製するために利用される。
【００５６】
本発明で精製することができるラパマイシン類似体のさらなる例は、米国特許出願公開第２００８／００８５８８０に示され、参照によりこの全体が本明細書に組み込まれる。
【００５７】
一実施形態において、本発明のシステムおよび方法は、他のラパマイシン類似体を式２のラパマイシン類似体から精製するために利用される。すなわち、他のラパマイシン類似体はこの種の分離において不純物と考えられる。この種の分離は、より詳細に以下に記載される。
【００５８】
一実施形態において、本発明のシステムおよび方法は、他のラパマイシン類似体を式３のラパマイシン類似体から精製するために利用される。すなわち、他のラパマイシン類似体はこの種の分離において不純物と考えられる。この種の分離は、より詳細に以下に記載される。
【００５９】
（ＩＶ．薬剤溶出性ステント）
一実施形態において、本発明のシステムおよび方法は内部人工器官に施すことができるＡＰＩを精製するために使用することができる。これはステントまたは大静脈フィルタなどの薬物を溶出する内部人工器官の調製に使用することができる。
【００６０】
一実施形態において、本発明は、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体の精製のシステムおよび方法を含み、内部人工器官、配備システムで、およびラパマイシンまたはラパマイシン類似体を送達する方法で使用することができる。したがって、本発明は、内部人工器官によって投与に十分な純度を提供するようにラパマイシン類似体ゾタロリムス（たとえばＡＢＴ−５７８）を精製するシステムおよび方法を含む。したがって、本発明は、血栓症を阻止するために病変の再内皮化を促進するために、細胞移動を阻害せずに、再狭窄を阻止する応用分野で使用されるゾタロリムスを精製するシステムおよび方法を提供する。
【００６１】
したがって、本発明による精製されたラパマイシン類似体は、実質的に血栓症感受性を増加させることなく、内膜の平滑筋細胞過形成、再狭窄および血管閉塞などの過増殖の血管疾患の治療および／または予防に使用することができる。この種の過増殖の血管疾患は生物学上または機械的に媒介した血管損傷に続いて生じることがあり、血栓症を引き起こさずに、本明細書に記載される薬物を溶出する内部人工器官の使用によって治療または予防することができる。
【００６２】
実施例
【実施例１】
【００６３】
以下のタイプのシリカを本明細書に記載される検討で使用した：シリカゲル５ＭＢ７０、富士シリシア化学株式会社、細孔直径＝７０Ａ、ＰＳＤ＝２０−４５マイクロ；シリカゲルＭＢ７０、富士シリシア化学株式会社、細孔直径＝７０Ａ、ＰＳＤ＝２０−４５マイクロ；およびシリカゲル６０、Ｄ（９０）＝４０−６３マイクロ、細孔直径＝７０Ａ。さらに、他の相分離充填材を本発明のクロマトグラフィーシステムおよび方法で使用することができる。
【００６４】
Ｋｎｏｂｅｓから購入したガラスカラム、Ｃｈｒｏｍａｆｌｅｘを本明細書に記載される検討で使用した。しかし、本発明のクロマトグラフィーシステムおよび方法において、任意の適切なカラムも使用することができることを認識するべきである。
【００６５】
乾式またはスラリー式の充填カラムのいずれをも使用することができる。スラリー充填手順：１リットルの予備混合した５０％のＴＨＦおよびヘプタン溶液を準備する。シリカ２５０グラムを反応器内で予備混合した５０％のＴＨＦおよびヘプタン溶液の約１リットルと混合する。ガラスカラムへ内容物を移す。流出液の流れに気泡が検出されなくなるまで、カラムに予備混合した５０％のＴＨＦおよびヘプタンをポンプで送り込む。乾式充填手順：シリカ２５０グラムを量りとりガラスカラムへ移す。この後に、流出液の流れに気泡が検出されなくなるまで、カラムに予備混合した５０％のＴＨＦおよびヘプタン溶液をポンプで送り込む。
【００６６】
本明細書に記載される検討は、Ａｋｔａ  Ｐｕｒｉｆｉｅｒ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈによる自動クロマトグラフィーの設備一式）で行った。しかし、本発明のクロマトグラフィーシステムおよび方法において、任意の適切なクロマトグラフィーの設備一式を使用することができることを認識するべきである。
【実施例２】
【００６７】
ラパマイシン類似体を合成した。手短に言えば、予備乾燥した反応器にラパマイシン３．５グラムを加え、続いて、同じ反応器に１４グラムの予備乾燥したジクロロメタンを加える。固形分が溶けるまで、この溶液を撹拌する。０．８２グラムの２，６−ルチジンを加え、次いで反応混合物を−３０℃に冷却する。１．３５グラムのトリフルオロメタンスルホン無水物を、内部温度をＮＭＴの−３０℃に維持しながらゆっくり加える。反応混合物は、−３０℃で維持し少なくとも１５分間撹拌する。次いで、０．６７グラムの１Ｈ−テトラゾールを、続いて２．４８グラムのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを加える。結果として生じる反応混合物を２５℃で６時間激しく撹拌する。この溶液は、分離用クロマトグラフィーカラムに装入する準備ができている。反応混合物には２種の主要な異性体、Ｎ１（すなわち式２）およびＮ２（すなわち式３）異性体がある。所望の異性体はＮ１である。反応概略図は図８に見ることができる。
【実施例３】
【００６８】
実施例２の反応生成物を反応によって発生した不純物から分離する。記載されたように、カラムを充填し調整してから、反応混合物をカラムに装入する。流出液を自動フラクションコレクターに集める。次いで、各画分の生成内容物をＴＬＣプレートで分析する。ＴＬＣの読取りに基づいて、生成物を有する画分の混合物を集めてＨＰＬＣ法によって分析する。ＵＶ分析も使用することができる。
【００６９】
主要な反応生成物がＡＢＴ−５７８（すなわちゾタロリムス）である場合、反応不純物をＡＢＴ−５７８から分離する。反応不純物は図９Ａ−９Ｉで示され、下記を含む：（図９Ａ）ＡＢＴ−５７８のアルデヒドフラグメント；（図９Ｂ）ＡＢＴ−５７８のＮ１異性体の開環型酸；（図９Ｃ）デス−メチルＡＢＴ−５７８；（図９Ｄ）主要な生成物として本明細書に記載される、精製することができるＡＢＴ−５７８のＮ２異性体（図９Ｄ）；（図９Ｅ（ｉ）−９Ｅ（ｉｉｉ））ＡＢＴ−５７８の３種のエピマー；（図９Ｆ）ＡＢＴ−５７８のジ−エピマー；（図９Ｇ）逆アルドール生成物；および（図９Ｈ）Ｎ１−ＬＴＡ（すなわちＮ１−ルチジンテトラゾールアダク（ａｄｄｕｃ））；（図９Ｉ）Ｎ２−ＬＴＡ。さらに、未反応のラパマイシン（図９Ｊ）も反応生成物ＡＢＴ−５７８から分離される。
【００７０】
図１０は、単一カラムからの反応生成物溶出プロファイルを示す。溶出プロファイルによって示されるように、反応不純物はＡＢＴ−５７８から以下のように分離される：ＡＢＴ−５７８のＮ２異性体（図９Ｄ）およびＮ２−ＬＴＡ（図９Ｉ）は、位置１００での溶出液中に存在することを示している；ラパマイシン（図９Ｊ）は、位置１０２での溶出液中に存在することを示している；逆アルドール生成物（図９Ｇ）、ＡＢＴ−５７８のＮ１異性体の開環型酸（図９Ｂ）およびデス−メチルＡＢＴ−５７８（図９Ｃ）、ＡＢＴ−５７８の３種のエピマー（図９Ｅ（ｉ）−９Ｅ（ｉｉｉ））、ＡＢＴ−５７８のジ−エピマー（図９Ｆ）およびＡＢＴ−５７８のアルデヒドフラグメント（図９Ａ）は、位置１０４での溶出液中に存在することを示している；Ｎ１−ＬＴＡ（図９Ｈ）は、位置１０６での溶出液中に存在することを示している；および、反応生成物ＡＢＴ−５７８は、位置１０８での溶出液中に存在することを示している。反応生成物ＡＢＴ−５７８は、本発明のシステムおよび方法を使用して、残りの不純物から分離することができる。
【００７１】
特に示さなかったが、Ｎ２異性体は反応生成物であって、他の反応不純物から分離することができる。これは、ひとつには、Ｎ１異性体が約３．５ベッドボリューム（ＢＶ）で溶出し始める一方で、Ｎ２異性体が約２ＢＶで溶出するからである。
【実施例４】
【００７２】
実施例２の反応生成物を、定組成溶媒系を有する２カラムシステムを使用して精製し、第１のカラムからの溶出液は第２のカラムへ導入する前に濃縮される。反応生成混合物を第１のカラムに装入し、ヘプタン溶媒中５０％ＴＨＦを用いて溶出する。集めた各画分はＴＬＣで分析し、ＴＬＣの読取りに基づいて、生成物を有する画分の混合物を集めＨＰＬＣ法によって分析する。次いで、規格に適合したＨＰＬＣ結果を有する混合物は合わせ、ロータリーエバポレータを使用して濃縮、乾固させる。乾燥が完了したら、ラパマイシン類似体を含有する固形残留物を溶かすために適正量のジクロロメタンを加えた。次いで、ジクロロメタン中の生成物を、第２カラムに装入しヘプタン溶媒中３０％アセトンで溶出した。なおまた、集めた各画分はＴＬＣで分析し、ＴＬＣの読取りに基づいて、生成物を有する画分の混合物を集めＨＰＬＣ法によって分析する。
【００７３】
図１１Ａは、第１のカラム（ヘプタン中５０％ＴＨＦ）の代表的な溶出プロファイルである：第２の溶出ピークは主として生成物を含んでいるが、第１の主要な溶出は生成物に関連する不純物である。図１１Ｂは、第２のカラム（ヘプタン中３０％アセトン）からの代表的な溶出プロファイルである。表１は、ＡＰＩを中間に濃縮をして２カラム精製した後の、代表的な回収率および純度の結果の要約である（出所：２０ランの平均）。ＰＡはＡＰＩの純度であり、９７．７％である。主要な不純物は不純物＃１（逆アルドール生成物）および不純物＃２（Ｎ１−ＬＴＡ）として示される。
【００７４】
【表１】
2010527935.tif 000006
【実施例５】
【００７５】
実施例２の反応生成物を、５０％ＴＨＦおよびヘプタンの定組成溶出溶媒を用いるカスケードシステムを使用して精製する。手短に言えば、反応混合物は第１のカラムに装入し、ヘプタン溶媒中５０％ＴＨＦで溶出させる。第１の溶出されたピークの端部が検出されたら直ちに、第２のカラムにつなげる（すなわち、第１のカラム溶出の出口は、廃棄系統から第２のカラムの入口に向け切り替える。）。集めた各画分は、ＴＬＣで分析しＴＬＣの読取りに基づいて、生成物を含む画分の混合物を集め、ＨＰＬＣ法によって分析する。溶出液は第２のカラムから得られた後にのみ濃縮する。
【００７６】
図１２は、ヘプタン中５０％ＴＨＦを用いる定組成溶出を備えるカスケードによる溶出プロファイルの代表的な溶出プロファイルである。表２は、この実施例のカスケードシステムと比較して、実施例４の２カラムシステムの代表的な回収率および純度の結果の要約である。カラム間の濃縮段階を含まない定組成カスケードシステムの使用により、ラパマイシン類似体の全体の純度が実質的に増加することがわかる。不純物＃１がわずかに増加しているが、不純物の全体の量は減少する。
【００７７】
【表２】
2010527935.tif 000007
【００７８】
Ｎ１−ＬＴＡ反応副産物のレベルが完全に定組成カスケードシステムによって除去されたことにここで留意すべきである。しかし、別の反応副産物（逆アルドール生成物）は、わずかに定組成カスケードシステムから増加する。この不純物は、生成物およびカラムに充填するシリカとの間の反応から生成することが見出された。したがって、次には、段階グラジエントシステムは、カラム中の生成物の滞留時間を減少させる（すなわち、生成物およびシリカの間の接触時間を減少させる。）ことにより、（次の実施例中の）生成物分解を減少させることが評価される。
【実施例６】
【００７９】
実施例２の反応生成物は段階グラジエント溶出溶媒を用いるカスケードシステムを使用して精製する。段階グラジエント溶媒は以下のとおりである：１）５０％ＴＨＦおよびヘプタンから６０％ＴＨＦおよびヘプタンへの切り替え；および２）ヘプタン中５０％ＴＨＦからヘプタン中３０％アセトンへの切り替え。反応混合物を第１のカラムに装入し、ヘプタン溶媒中５０％ＴＨＦを用いて溶出させる。第１の溶出ピークが終了するとすぐに、第２のカラムにつなげ、それと同時に溶出溶媒をヘプタン中５０％ＴＨＦからヘプタン中６０％ＴＨＦに切り替える。集めた各画分はＴＬＣを用いて分析する。ＴＬＣの読取りに基づいて、生成物を含む画分の混合物を集めＨＰＬＣ法によって分析する。第１のカラムからの溶出液は、第２のカラムへ導入する前に濃縮または処理しない。５０％ＴＨＦから３０％アセトンへの切り替えのシステムはうまく働かず、低い品質の材料を生じることを注目するべきである。図１３は段階グラジエント溶出溶媒を使用するカスケードシステムを用いる代表的な溶出プロファイルである。表３は代表的な回収率および純度の結果の要約で、他のシステムと比較して段階グラジエントカスケードシステムを用いると、逆アルドール生成物（不純物＃１）のレベルが減少することを示す。
【００８０】
【表３】
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【実施例７】
【００８１】
実施例２の反応生成物を、ヘプタン中５０％ＴＨＦからヘプタン中６０％ＴＨＦへの切り替えの段階グラジエント溶媒を用いる単一カラムを使用して精製する。カスケード段階グラジエントシステムの成功と共に、単一カラムの段階グラジエントシステムを評価する。反応混合物を第１のカラムに装入し、ヘプタン溶媒中５０％ＴＨＦを用いて溶出させる。第１の溶出ピークの端部が検出されたら直ちに、溶出溶媒をヘプタン中５０％ＴＨＦからヘプタン中６０％ＴＨＦに切り替える。集めた各画分をＴＬＣで分析する。ＴＬＣの読取りに基づいて、生成物を含む画分の混合物を集めＨＰＬＣ法によって分析する。図１４は単一カラムを使用する段階グラジエントを用いた代表的な溶出プロファイルである。表４は、ヘプタン中５０％ＴＨＦからヘプタン中６０％ＴＨＦへの切り替えの段階グラジエント溶媒を用いた単一カラムの、代表的な純度の結果の要約である。
【００８２】
【表４】
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【００８３】
本発明はこの精神または本質的特質から外れずに、他の特定の形態で具体化することができる。記載された実施形態は、すべての点において、例示的であって限定的でないものと考慮されたい。したがって、本発明の範囲は先の説明によってではなく添付された特許請求の範囲によって示される。特許請求の範囲の等価の意味および範囲内に生じる変更はすべて、本発明の範囲内に包含されるべきものである。本明細書に記載された参考文献はすべて、具体的参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
2010527935.tif 000023
【図６Ｂ】
2010527935.tif 000024
【図６Ｃ】
2010527935.tif 000025
【図７Ａ】
2010527935.tif 000026
【図７Ｂ】
2010527935.tif 000027
【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
2010527935.tif 000030
【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ（ｉ）】
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【図９Ｅ（ｉｉ）】
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【図９Ｅ（ｉｉｉ）】
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【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図９Ｈ】
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【図９Ｉ】
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【図９Ｊ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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