(57)【要約】  本発明は、ラクトバシラス・ジョンソニイＤ１１５の生菌として、予防剤として、または物質の表面処理剤としての、ヒトおよび動物の病原体、例えばブラキスピラ・ピロシコリ、ブラキスピラ・ハイオディセンテリア、シゲラ・ソンネ、ビブリオ・コレラ、ビブリオ・パラヘモリチカス、カンピロバクター・ジェジュニ、ストレプトコッカス・ニューモニエ、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、クロストリジウム・パーフリンジェンス、エルシニア・エンテロコリチカ、大腸菌、クレブシエラ・ニューモニエ、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ属の種、バチルス・セレウス、アスペルギルス・ニゲルおよびフザリウム・クラミドスポルムに対する使用の可能性を示した。そのタンパク質性抗微生物化合物は部分的に特性づけられ、１２１℃までにおいて１５分間耐熱性であり、ｐＨ１までにおいて４０℃で３０分間耐酸性であることが分かった。その化合物は酵素消化に対しても安定であり、ペプシンおよびトリプシンで処理した場合に６０％より多くの抗微生物活性を保持していることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｄ１１５として同定され、ＡＴＣＣに寄託番号ＰＴＡ−９０７９の下で寄託された、ラクトバシラス・ジョンソニイ株の分離された細菌。
【請求項２】
請求項１で定められた分離された細菌株であって、さらに配列ＩＤ  ＮＯ．１の配列を含む分離された細菌株。
【請求項３】
請求項２で定められた分離された細菌株であって、配列ＩＤ  ＮＯ．１の配列と少なくとも９０％の相同性を有する株。
【請求項４】
請求項１で定められた分離された細菌株であって、さらに配列ＩＤ  ＮＯ．２の配列を含む分離された細菌株。
【請求項５】
請求項４で定められた分離された細菌株であって、配列ＩＤ  ＮＯ．２のｔｕｆ遺伝子の配列に対して少なくとも９０％の相同性を有する株。
【請求項６】
次のものを含む組成物：
（ａ）１２１℃までの温度において少なくとも１５分間熱安定性であり、中性からｐＨ１までの範囲において少なくとも３０分間耐酸性である抗微生物性代謝産物を産生する、ラクトバシラス属ジョンソニイ種Ｄ１１５株の細菌細胞；ならびに
（ｂ）細菌細胞および代謝産物のための、経口投与に適した、生理的に許容できるキャリヤー。
【請求項７】
請求項６に記載の組成物であって、代謝産物がヒトおよび動物の病原体に対して抗微生物活性を有する組成物。
【請求項８】
請求項７に記載の組成物であって、ヒトおよび動物の病原体がブラキスピラ属の種、シゲラ属の種、ビブリオ属の種、カンピロバクター属の種、ストレプトコッカス属の種、エンテロコッカス属の種、リステリア属の種、クロストリジウム属の種、クレブシエラ属の種、スタフィロコッカス属の種、サルモネラ属の種、エルシニア・エンテロコリチカ、大腸菌、バチルス・セレウス、アスペルギルス・ニゲルおよびフザリウム・クラミドスポルムからなるグループから選択される組成物。
【請求項９】
ブラキスピラ属の種、シゲラ属の種、ビブリオ属の種、カンピロバクター属の種、ストレプトコッカス属の種、エンテロコッカス属の種、リステリア属の種、クロストリジウム属の種、クレブシエラ属の種、スタフィロコッカス属の種、サルモネラ属の種、エルシニア・エンテロコリチカ、大腸菌、バチルス・セレウス、アスペルギルス・ニゲルおよびフザリウム・クラミドスポルムからなるグループから選択される微生物の感染の効果の予防のための方法であって、有効量の請求項６の株の組成物またはその代謝産物を投与する工程を含む方法。
【請求項１０】
ブラキスピラ属の種、シゲラ属の種、ビブリオ属の種、カンピロバクター属の種、ストレプトコッカス属の種、エンテロコッカス属の種、リステリア属の種、クロストリジウム属の種、クレブシエラ属の種、スタフィロコッカス属の種、サルモネラ属の種、エルシニア・エンテロコリチカ、大腸菌、バチルス・セレウス、アスペルギルス・ニゲルおよびフザリウム・クラミドスポルムからなるグループから選択される微生物の感染の効果の予防のための方法であって、有効量の請求項６の株を投与する工程を含む方法。
【請求項１１】
ブラキスピラ属の種、シゲラ属の種、ビブリオ属の種、カンピロバクター属の種、ストレプトコッカス属の種、エンテロコッカス属の種、リステリア属の種、クロストリジウム属の種、クレブシエラ属の種、スタフィロコッカス属の種、サルモネラ属の種、エルシニア・エンテロコリチカ、大腸菌、バチルス・セレウス、アスペルギルス・ニゲルおよびフザリウム・クラミドスポルムからなるグループから選択される微生物による汚染を阻害するために物質を処理する方法であって、有効量の請求項６の株を物質に与える工程を含む方法。
【請求項１２】
ブラキスピラ属の種、シゲラ属の種、ビブリオ属の種、カンピロバクター属の種、ストレプトコッカス属の種、エンテロコッカス属の種、リステリア属の種、クロストリジウム属の種、クレブシエラ属の種、スタフィロコッカス属の種、サルモネラ属の種、エルシニア・エンテロコリチカ、大腸菌、バチルス・セレウス、アスペルギルス・ニゲルおよびフザリウム・クラミドスポルムからなるグループから選択される微生物の増殖を阻害するために物質を処理する方法であって、有効量の請求項６の株を物質に与える工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【関連する出願】
【０００１】
[0001]  この出願は、２００７年４月２４日に出願された米国特許出願シリアル番号６０／９２５，９３７に対して優先権を主張し、これを本明細書に援用する。
【技術分野】
【０００２】
[0002]  本発明は概して抗微生物活性を有する細菌に関し、より詳細には、抗菌および抗真菌活性の両方を有する、ラクトバシラス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）Ｄ１１５株を含むラクトバシラス・ジョンソニイの細菌に関する。
【背景技術】
【０００３】
[0003]  ブラキスピラ（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ）属（以前はトレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）およびセルプリナ（Ｓｅｒｐｕｌｉｎａ））は、いくつかの種、例えばブラキスピラ・イノセンス（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｉｎｎｏｃｅｎｓ）、Ｂ．マードシー（Ｂ．  ｍｕｒｄｏｃｈｉｉ）、Ｂ．インテルメディア（Ｂ．  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、Ｂ．ハイオディセンテリア（Ｂ．  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）およびＢ．ピロシコリ（Ｂ．  ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉ）からなる。これらの細菌はグラム陰性のスピロヘータ（ゆるくコイル状になった（ｃｏｉｌｅｄ）形態）であり、運動性で、酸素に耐性があり、血液寒天上で溶血活性を有する嫌気性菌である。全ての中で、Ｂ．ハイオディセンテリアおよびＢ．ピロシコリは、様々な動物種において重い下痢性疾患および虚弱な成長速度を引き起こし、結果としてかなりの生産性および経済上の損失をもたらすそれらの高い病原性のため、相当に重要である。ブタにおいて、Ｂ．ハイオディセンテリアおよびＢ．ピロシコリは、それぞれブタ赤痢およびブタ腸管スピロヘータ症の病因因子である。同じ属であるにも関わらず、Ｂ．ハイオディセンテリアおよびＢ．ピロシコリはそれらの溶血活性において異なり、それはそれぞれのスピロヘータにより引き起こされる結腸の疾患を明確に区別している。
【０００４】
[0004]  ブタ赤痢は高度に接触感染する下痢性疾患であり、それは全ての年齢のブタで起こる可能性があり、成長期および仕上げ期のブタにおいてより高い発生率で観察される。ブタ赤痢の最初の記述は１９２１年におけるもので、病因因子であるトレポネーマ・ハイオディセンテリアが明確に解明されたのは１９７１においてであった。その疾患は粘膜出血性大腸炎であり、大腸の粘膜層の炎症、過度の粘液産生、および壊死を特徴とする。原因因子であるＢ．ハイオディセンテリアに感染したブタは、臨床徴候、例えば体重の低下、抑うつ、食欲の減少、ならびにＢ．ハイオディセンテリアの強力なベータ溶血活性により最も顕著である顔の外見の暗褐色への変化（ブタ赤痢の始まり）および血性の下痢（重篤期）を示すであろう。死は通常は重い下痢による持続性の脱水症の結果である。感染したブタの回復が可能である場合は、ブタは遅い成長速度を有し、最も重要なことには、その生物を温存しており他のブタに感染を広める危険がある可能性がある。ブタ赤痢の発生はいくつかの国、例えばオーストラリア、イタリア、ドイツ、スイス、デンマーク、米国（ＵＳ）、イギリス（ＵＫ）およびチェコ共和国で報告されている。イギリスでは、ブタにおけるブタ赤痢の有病率は群れの約１１％であると見積もられた。オーストラリアでは、１年あたりに雌ブタあたり＄１００がその疾患で失われていると見積もられており、一方米国ではその疾患による１年間の損失は＄１１５２０万にもなると見積もられた。ブタ赤痢による重大な経済上の損失には、投薬のコスト、追加の動物のケア、低減した動物の成長速度、低減した飼料転換効率および高い死亡率が一因となっている。
【０００５】
[0005]  ブタ赤痢と比べると、ブタ腸管スピロヘータ症（ＰＩＳ）は、弱いベータ溶血性のＢ．ピロシコリにより引き起こされる、致命的ではないより穏やかな形の下痢性疾患である。その疾患は一般に４〜２０週目の離乳期および成長期のブタにおいて起こる。この疾患と関係する臨床徴候には、粘液を含み血性でない下痢、乏しい飼料転換および低下した成長速度が含まれる。ＰＩＳの発生はいくつかの国、例えばイギリス、オーストラリア、ブラジルおよびスウェーデンで報告されている。イギリスにおける最近の調査で、Ｂ．ピロシコリは８５頭のブタの内の４４頭における大腸炎の原因であったことが報告された。ブラジルにおける研究（８）で、１７個の飼育場の内の７個においてブタで下痢を引き起こす因子としてＢ．ピロシコリが同定された。ブタの他に、Ｂ．ピロシコリはヒト、イヌおよびトリにおいても疾患を引き起こすことが示されている。ニワトリにおいて、病原性スピロヘータの感染症はトリ腸管スピロヘータ症（ＡＩＳ）と呼ばれ、オーストラリアで多くの注目を受けてきた。
【０００６】
[0006]  ブラキスピラ属の種の伝染および感染の経路は、主に感染した動物からの糞便物質の摂取によるものである（４１）。疾患の拡大は、糞便物質が汚染されたブーツおよび乗り物を通して移動する；または動物の飲み水に入る場合にさらに促進される（４８）。研究はＢ．ハイオディセンテリアおよびＢ．ピロシコリがブタの糞便中で１０℃においてそれぞれ１１２および２１０日間まで生存することができたことを示した。早期の研究は、Ｂ．ハイオディセンテリアが赤痢のブタの糞便中で、３７および２５℃においてそれぞれ１および７日間まで生きられたことを示した。ブタ赤痢の最初の徴候はブタがその生物に感染した５〜１０日後であると報告された（２３，２９）。Ｂ．ピロシコリにより引き起こされる下痢性疾患の潜伏期間は４〜９日間（５２）、より最近の研究では９〜２４日間（２５）であることが分かった。関係の正確な機構は完全には解明されていないが、これらの細菌の病原性および下痢を引き起こす能力は腸管の粘膜との関係に見出される。ブラキスピラ・ハイオディセンテリア（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）は粘液の方へ走化性の反応を有することが示されており、他の腸内細菌と比べて粘液中で高い運動性を有し、これは溶血素が放出され得る場合に粘膜中への侵入を促進し、それは疾患の発病における重要な因子である（２２，２８，２９，３７）。出血、フィブリン、粘液、浮腫、壊死および充血の存在は、結腸におけるＢ．ハイオディセンテリアの感染の一般的な巨視的徴候である（２２）。疾患の重さとは対照的に、Ｂ．ピロシコリにより引き起こされる肉眼的病変は比較的穏やかであり、結腸内容物が緑色がかった〜緑色がかった灰色であり、血液または増大した粘液生産の証拠は無い（２５）。ブラキスピラ・ピロシコリ（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉ）は管腔の上皮への端と端とを合わせた（ｅｎｄ−ｏｎ）付着により大腸でコロニー形成し、スピロヘータ細胞の偽の刷子縁を形成し、これはＢ．ハイオディセンテリアの非特異的な付着とは異なる（２５）。
【０００７】
[0007]  ブラキスピラ属の種により引き起こされる下痢性疾患の処置および制御は、抗生物質、例えばタイロシン、チアムリン、リンコマイシン、ゲンタマイシンおよびバルネムリンの使用に重く頼っている（１４，４１）。しかし、抗生物質の使用は常にブラキスピラ属の種における抗微生物物質耐性の発現の問題の周りを巡ってきた。いくつかの研究が、ブラキスピラ属の種の株のタイロシン、リンコマイシン、テトラサイクリンおよびゲンタマイシンに対する増大した耐性について報告した（１４，１６，１９，２７，４１，４９）。加えて、動物で見つかったブラキスピラ属の種の株の高い遺伝的多様性が問題をさらに複雑にしている（４２）。
【０００８】
[0008]  細菌性赤痢は毎年世界中で３００，０００を越える症例の原因となっており、致死率は一部の株では１０〜１５％もの高さである可能性がある。しかし、この疾患は動物ではめったに起こらない；それは主にヒトおよび他の霊長類、例えばサルおよびチンパンジーの疾患である。シゲラの感染によるアウトブレイク（ｏｕｔｂｒｅａｋ）は、それらの低い感染用量のせいで食い止めるのが難しい。共同体における、散発性に見える増大した数の症例は、実際には認識されていないアウトブレイクによるものである可能性がある。細菌性赤痢はシゲラの４種類の種、すなわちシゲラ・ディセンテリア（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、シゲラ・フレクスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、シゲラ・ボイディ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｂｏｙｄｉｉ）およびシゲラ・ソンネ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ）のいずれかにより引き起こされる。これらの中で、シゲラ・ソンネは工業先進国で最も流行している（７７％）種であり、発展途上国で２番目に流行しており、その次がシゲラ・フレクスネリである。一部の株はエンテロトキシンおよび志賀毒素を産生することが知られている（１１）。その生物はしばしばヒトの糞便で汚染された水ならびにサラダ（ジャガイモ、マグロ、小エビ、マカロニ、およびニワトリ）、生野菜、牛乳および乳製品のような食品中で見つかり、家禽は糞便−口の経路を通って汚染され得る。
【０００９】
[0009]  ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属はグラム陰性のまっすぐな、または曲がった桿菌からなり、単一極性の鞭毛を用いて運動する。それは世界の地表水において最もありふれた生物の１つである。それらは海洋の、および淡水の生息場所の両方に、水生動物と関連して生息している。一部の種は生物発光性であり、魚類および他の海洋生物と相利共生的に関連して生きている。他の種は魚類、ウナギ、カエルおよび霊長類にとって病原性である。Ｖ．コレラ（Ｖ．  ｃｈｏｌｅｒａｅ）およびＶ．パラヘモリチカス（Ｖ．  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）はヒトの病原体である。両方が下痢をもたらすが、そのやり方は全く異なる。Ｖ．パラヘモリチカスは主に結腸に影響を与える侵入性生物である；Ｖ．コレラは非侵入性であり、エンテロトキシンの分泌を通して小腸に影響を与える（１１）。感染はしばしば穏やかであるか症状が無いが、時々それは重症になり得る。感染した人のおおよそ２０人に１人は、大量の水様下痢、嘔吐、および足の痙攣を特徴とする重い疾患を有する。これらの人では、急激な体液の喪失が脱水症およびショックにつながる。処置しなければ、数時間の内に死亡し得る。コレラ下痢は、その長い流行の歴史から国際保健規則の下でＷＨＯへの連絡を必要とする３種類の疾患の１つである。例えば、１９９４年にコンゴ民主共和国のゴマの難民キャンプにおいて重大な流行が起こった。１ヶ月の内に推定５８０００〜８００００件の症例および２３８００件の死亡が起きた。同様に、１９６１年にインドネシアのスラウェシにおいて、その疾患はアジア、ヨーロッパおよびアフリカの他の国に、そして最終的には１９９１年にラテンアメリカへと急速に広まり、４０００００件近くの報告された症例および４０００件を越える報告された死亡をその年に引き起こした。症例の１年間の概算は４００，０００件であり、死亡の１年間の概算は５，０００件であった。
【００１０】
[0010]  １９９０年代より前は、バンコマイシン耐性エンテロコッカス（ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ）はバンコマイシンが長年使われてきた病院にのみ存在すると考えられていた。しかし、バンコマイシン耐性エンテロコッカスはアボパルシンを与えられた飼育場の動物から容易に取り出されることが段々と明らかになった（１，９，３０）。エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）はより一般的な人における疾患の原因であるが、バンコマイシンに対する耐性はＥ．フェシウム（Ｅ．  ｆａｅｃｉｕｍ）分離株の間でより頻発する。１９９５年から２０００年までのデンマークの抗微生物耐性のモニタリングのプログラムの一部として、ブタからの総計６７３株のエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）および１，０８８株のエンテロコッカス・フェカリス分離株、およびブロイラーからの８５６株のＥ．フェシウム分離株を分離し、成長促進に用いられる４種類の抗微生物薬剤への感受性に関して試験した。Ｅ．フェシウム分離株の間でのエリスロマイシン耐性は最大で１９９７年に７６．３％に達したが、２０００年にはその薬物の使用制限に伴い１２．７％まで減少したことが分かった。ヴァージニアマイシンの使用は１９９５年から１９９７年まで増加し、それに続いてブロイラーにおけるＥ．フェシウム分離株の間でのヴァージニアマイシン耐性の発生が１９９５年の２７．３％から１９９７年の６６．２％まで増加した。１９９８年１月にデンマークでヴァージニアマイシンの使用が禁止され、ヴァージニアマイシン耐性の発生は２０００年には３３．９％まで減少した。アビラマイシンの使用は１９９５年から１９９６年まで増加し、それに続いてブロイラーからのＥ．フェシウム分離株の間でのアビラマイシン耐性が１９９５年の６３．６％から１９９６年の７７．４％まで増加した。
【００１１】
[0011]  ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）はグラム陽性の被包性双球菌である。多糖類（ＰＳ）莢膜の組成の違いに基づいて、９０種類の血清型が同定されている（１８）。この莢膜は不可欠な病原性因子である。Ｓ．ニューモニエ（Ｓ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）はヒトの上気道の通常の居住者である。その細菌は、通常は大葉性の肺炎、副鼻腔炎および中耳炎、または髄膜炎を引き起こす可能性があり、それは通常は前者の感染症の１つの２次的なものである。それは骨髄炎、敗血症性関節炎、心内膜炎、腹膜炎、蜂巣炎および脳膿瘍も引き起こす。２０００年までに、Ｓ．ニューモニエの感染は毎年６０，０００件の症例の侵入性疾患を引き起こし、これらの４０％までは少なくとも１種類の薬剤に感受性の無い肺炎球菌（ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｉ）により引き起こされた。これらの数字は、子供への肺炎球菌の結合型ワクチンの導入の後にかなり減少した。２００２年には、３７，０００件の侵入性肺炎球菌疾患の症例があった。これらの内で、３４％は少なくとも１種類の薬物に対して感受性の無い肺炎球菌により引き起こされ、１７％は３種類以上の薬物に対して感受性の無い株によるものであった（ＣＤＣ）。侵入性疾患を有する入院した成人の１４％が死亡し、人から人への伝染が起こり得る。入手可能なデータに基づくと、Ｓ．ニューモニエは毎年世界中で１００万人近い５歳未満の子供を、特に肺炎球菌が乳児期の最も重大な細菌性病原体の１つである発展途上国において殺していると見積もられる（ＷＨＯ）。Ｓ．ニューモニエは厳密なヒトの病原体ではない；それはいくつかの動物種において鼻咽頭にコロニー形成し、呼吸器の疾患および髄膜炎を引き起こすことも知られている。
【００１２】
[0012]  カンピロバクテラセアエ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）ファミリーはグラム陰性の微好気性菌を含み、それは世界中で重大な動物由来感染症の（ｚｏｏｎｏｔｉｃ）病原体である。ヒトの食物系感染症に関わっていることが示されている２種類の最も重要な種はＣ．ジェジュニ（Ｃ．  ｊｅｊｕｎｉ）およびＣ．コリ（Ｃ．  ｃｏｌｉ）である。カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｓ）は世界中に及ぶ細菌性の下痢の主要な要因であり、西ヨーロッパの人口の推定１％が感染しており、罹患率が１００，０００人あたり３７０人であると報告されている（２１）ニュージーランドにおける重要な公衆衛生の関心事である。一般的な症状には、血性の下痢、腹部の痛み、熱、吐き気、倦怠感および、まれに嘔吐が含まれる。より長い期間において、Ｃ．ジェジュニの感染はギランバレーおよびミラーフィッシャー症候群につながり得る（３８）。カンピロバクター症（ｃａｍｐｙｌｏｂａｔｅｒｉｏｓｉｓ）の抗生物質による処置は、報告によれば増大する抗微生物耐性につながり得る。カンピロバクテラセアエは広い範囲の動物で見つかっており、一部は家禽、ブタ、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、鳥類、ミンク、ウサギおよびウマにおいて消化管および生殖器系の感染症を引き起こす。動物は汚染された環境、例えば水との接触によりその細菌を得ると考えられる。家禽は、汚染されたニワトリによりもたらされるヒトの健康に対して最も大きな危険を有するカンピロバクターの主な源である。特定の食物、例えば生のニワトリの肉は、極めて高いカンピロバクター数（死骸あたり＞１０７細胞）を有し得る（２６）。従って、死骸の汚染の発生率およびレベルの両方を低減させる切迫した需要が存在する。スカンジナビアにおいて厳しい生物保安策は収容した鳥（ｈｏｕｓｅｄ  ｂｉｒｄｓ）でのカンピロバクターの発生を制御するいくらかの助けとなったが、その策が異なる気候およびより大きな家禽産業を有する世界の他の地域でどれだけうまく行くかはまだ分からない。それに対し、健康でバランスのとれた消化管のミクロフローラまたは摂生（ｅｕｂｉｏｓｉｓ）の状態は、動物をカンピロバクターのような腸の病原体による負荷に対して守るために重要である。有用な生菌の細菌またはそれらが作り出す細菌に対して特異的な生理活性分子のどちらかの導入は、動物およびヒトの両方におけるカンピロバクター症の、さらに生鮮品および食品におけるカンピロバクターの根絶における効果的な抑制策である可能性がある。
【００１３】
[0013]  糸状構造の糸状菌（Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｍｏｌｄｓ）および酵母は、食物および飼料生産物、さらに貯蔵された作物および飼料、例えば干し草および貯蔵牧草の一般的な腐敗性生物である。さらに、菌類で汚染された食物および飼料生産物はマイコトキシン類による汚染の可能性を有する（２，４４）。同様に、動物飼料は潜在的に収穫、飼料ミルにおける加工の間に、または貯蔵の間に食物系サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）で汚染された状態になる可能性がある。これらの段階の間に飼料と接触する、それもまた汚染菌を有するあらゆる環境は、理論上飼料を汚染し得る。これは飼料が飼料ミルにおいて混合される際に飼料と混ぜ合わされる成分に関しても当てはまる。動物飼料は、動物に食べさせられる間のサルモネラを含む媒介者および環境上の源からの交叉汚染に関する潜在的な貯蔵所（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）でもある（３６）。糸状菌の増殖に特に貢献する条件、例えば未熟な、または湿った作物、傷ついた穀物、および最適より下の貯蔵条件、例えば高い熱または湿度の下では、糸状菌および細菌の阻害剤の使用が必要となる。現在利用できる、農業飼料におけるサルモネラおよび糸状菌の増殖の処置および抑制は、プロピオン酸およびギ酸のような有機酸の使用に重く頼っている。抗微生物物質を用いた食物および飼料の保存は、十分に文書で裏付けられている。しかし、食物および飼料の細菌および菌類による汚染の両方に対する保存のための細菌の使用の文献は存在しない。本発明は、食物および飼料の細菌および菌類による汚染に対する予防および処置の可能性を証明する。さらに、本発明はヒトおよび動物の病原体両方に対する表面および生体内の両方の予防および処置に適用可能である。
【発明の概要】
【００１４】
[0014]  本発明は抗菌および抗真菌活性の両方を有する細菌からなる。細菌はラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属の種であり、ラクトバシラス属ジョンソニイ種の細菌細胞を含み、それは抗微生物性代謝産物（ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ（ｓ））を産生し、それは周囲（約２０℃）から少なくとも１２１℃までの範囲を通して少なくとも１５分間熱安定性であり、中性からｐＨ１までの範囲を通して少なくとも３０分間耐酸性である。細菌は好ましくはラクトバシラス・ジョンソニイＤ１１５株のものである。
【００１５】
本発明の細菌は、グラム陽性およびグラム陰性の病原体の両方、例えばブラキスピラ・ピロシコリ、Ｂ．ハイオディセンテリア、シゲラ・ソンネ、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ）、Ｖ．パラヘモリチカス、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、エンテロコッカス・フェシウム、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、エルシニア・エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、サルモネラ属の種およびバチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、さらにリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ、エンテロコッカス・フェカリス、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）に対して広いスペクトルの試験管内での抗菌活性を有し、それは試験管内でアスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）およびフザリウム・クラミドスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｈｌａｍｙｄｏｓｐｏｒｕｍ）に対しても有効である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】[0015]  図１は乳酸菌Ｄ１１５株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列である（配列ＩＤ  ＮＯ．１）。
【図２】[0016]  図２は乳酸菌Ｄ１１５ｎ株のＥＦ−Ｔｕ遺伝子配列である（配列ＩＤ  ＮＯ．２）。
【図３】[0017]  図３はラクトバシラス・ジョンソニイＤ１１５のブラキスピラ・ピロシコリに対する効果のグラフである。
【図４】[0018]  図４はラクトバシラス・ジョンソニイＤ１１５のブラキスピラ・ハイオディセンテリアに対する効果のグラフである。
【図５】[0019]  図５はラクトバシラス・ジョンソニイＡＴＣＣ１１５０６のブラキスピラ・ハイオディセンテリアに対する効果のグラフである。
【図６】[0020]  図６はラクトバシラス・ジョンソニイＡＴＣＣ１１５０６のブラキスピラ・ピロシコリに対する効果のグラフである。
【図７】[0021]  図７はラクトバシラス・ジョンソニイＤ１１５のサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）に対する効果のグラフである。
【図８】[0022]  図８はラクトバシラス・ジョンソニイＤ１１５のサルモネラ・エンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）に対する効果のグラフである。
【図９】[0023]  図９はラクトバシラス・ジョンソニイＤ１１５のクロストリジウム・パーフリンジェンスに対する効果のグラフである。
【図１０】[0024]  図１０は、Ｌ．ジョンソニイＤ１１５（ｃおよびｆ）のＡ．ニゲル（Ａ．  ｎｉｇｅｒ）に対する、陰性対照（ａおよびｄ）およびＬ．ジョンソニイＡＴＣＣ１１５０６（ｂおよびｅ）と比較したそれぞれ１４および２１日間の抗真菌活性を示す抗真菌アッセイである。
【図１１】[0025]  図１１はビブリオ・コレラに対するウェル拡散アッセイ（ｗｅｌｌ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ａｓｓａｙ）である。（ａ）１００μｌのＬ．ジョンソニイ（Ｌ．  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）Ｄ１１５無細胞（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ）培養培地、（ｂ）０．１８％乳酸を含むＭＲＳ、および（ｃ）Ｌ．ジョンソニイＡＴＣＣ１１５０６無細胞培養培地の指示生物に対する抗微生物効果。Ｄ１１５無細胞培地（ａ）の抗微生物効果が、対照（ｂおよびｃ）と比較して明確に分かることができる。
【図１２】[0026]  図１２はビブリオ・パラヘモリチカス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）に対するウェル拡散アッセイである。（ａ）１００μｌのＬ．ジョンソニイＤ１１５無細胞培養培地、（ｂ）０．１８％乳酸を含むＭＲＳ、および（ｃ）Ｌ．ジョンソニイＡＴＣＣ１１５０６無細胞培養培地の指示生物に対する抗微生物効果。Ｄ１１５無細胞培地（ａ）の抗微生物効果が、対照（ｂおよびｃ）と比較して明確に分かることができる。
【図１３】[0027]  図１３はシゲラ・ソンネに対するウェル拡散アッセイである。（ａ）１００μｌのＬ．ジョンソニイＤ１１５無細胞培養培地、（ｂ）０．１８％乳酸を含むＭＲＳ、および（ｃ）Ｌ．ジョンソニイＡＴＣＣ１１５０６無細胞培養培地の指示生物に対する抗微生物効果。Ｄ１１５無細胞培地（ａ）の抗微生物効果が、対照（ｂおよびｃ）と比較して明確に分かることができる。
【図１４】[0028]  図１４はカンピロバクター・ジェジュニに対するウェル拡散アッセイである。（ａ）１００μｌのＬ．ジョンソニイＤ１１５無細胞培養培地、（ｂ）０．１８％乳酸を含むＭＲＳ、および（ｃ）Ｌ．ジョンソニイＡＴＣＣ１１５０６無細胞培養培地の指示生物に対する抗微生物効果。Ｄ１１５無細胞培地（ａ）の抗微生物効果が、対照（ｂおよびｃ）と比較して明確に分かることができる。
【図１５】[0029]  図１５はストレプトコッカス・ニューモニエに対するウェル拡散アッセイである。（ａ）１００μｌのＬ．ジョンソニイＤ１１５無細胞培養培地、（ｂ）０．１８％乳酸を含むＭＲＳ、および（ｃ）Ｌ．ジョンソニイＡＴＣＣ１１５０６無細胞培養培地の指示生物に対する抗微生物効果。Ｄ１１５無細胞培地（ａ）の抗微生物効果が、対照（ｂおよびｃ）と比較して明確に分かることができる。
【図１６】[0030]  図１６はエンテロコッカス・フェシウムに対するウェル拡散アッセイである。（ａ）１００μｌのＬ．ジョンソニイＤ１１５無細胞培養培地、（ｂ）０．１８％乳酸を含むＭＲＳ、および（ｃ）Ｌ．ジョンソニイＡＴＣＣ１１５０６無細胞培養培地の指示生物に対する抗微生物効果。Ｄ１１５無細胞培地（ａ）の抗微生物効果が、対照（ｂおよびｃ）と比較して明確に分かることができる。
【図１７】[0031]  図１７Ａおよび１７Ｂは、Ｌ．ジョンソニイＤ１１５（Ａ）またはＬ．ジョンソニイＡＴＣＣ１１５０６（Ｂ）の様々な濃度の再構成した上清によるＹ．エンテロコリチカ（Ｙ．  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）の試験管内での増殖阻害のチャートである；増殖は３７℃において自動化されたＢｉｏｓｃｒｅｅｎ  Ｃ  Ａｎａｌｙｓｅｒで６００ｎｍにおける光学密度を測定することにより監視された。
【図１８】[0032]  図１８はアスペルギルス・ニゲルに対するウェル拡散アッセイである。（ａ）１００μｌのＬ．ジョンソニイＤ１１５無細胞培養培地、（ｂ）０．１８％乳酸を含むＭＲＳ、および（ｃ）Ｌ．ジョンソニイＡＴＣＣ１１５０６無細胞培養培地の指示生物に対する抗微生物効果。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
[0026]  本発明は、広いスペクトルの抗微生物活性を有する熱安定性およびｐＨ耐性代謝産物を産生するラクトバシラス・ジョンソニイの株を含む。本発明は、その代謝産物、Ｌ．ジョンソニイ株の生菌としての投与も含み、それはそれが投与された動物またはヒトの胃腸管で生育し、そこでそれは代謝産物を産生し、ならびにグラム陽性およびグラム陰性の細菌ならびに菌類の感染の効果の予防のための代謝産物の投与も含む。その株および代謝産物は、ブラキスピラ・ピロシコリ、Ｂ．ハイオディセンテリア、リステリア・モノサイトゲネス、シゲラ・ソンネ、ビブリオ・コレラ、Ｖ．パラヘモリチカス、カンピロバクター・ジェジュニ、ストレプトコッカス・ニューモニエ、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、クロストリジウム・パーフリンジェンス、エルシニア・エンテロコリチカ、大腸菌、クレブシエラ・ニューモニエ、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ属の種、バチルス・セレウス、アスペルギルス・ニゲルおよびフザリウム・クラミドスポルムに対して有効である。
【００１８】
[0027]  代謝産物は熱安定性であり、それにより代謝産物が時間をかけた熱処理にさらされてなおその抗微生物特性を維持していることが分かったことを意味する。代謝産物は、約２０℃の周囲温度から１２１℃を含むまでの範囲を通した熱処理にさらされた際に、その熱処理が少なくとも１５分間以上の時間をかけて適用された際に、その活性を維持していることが分かった。
【００１９】
[0028]  代謝産物はｐＨ耐性でもあり、それにより代謝産物が酸性条件下での時間をかけた処理にさらされてなおその抗微生物特性を維持していることが分かったことを意味する。代謝産物は、中性からｐＨ１を含むまでの範囲を通した酸性条件にさらされた際に、その酸性条件が少なくとも３０分間以上の時間をかけて適用された際に、その活性を維持していることが分かった。
【００２０】
[0029]  本発明は、有効量の１種類以上の細菌株の経口投与により、対象の代謝産物が生体内で関心の微生物に対して拮抗的であるレベルで産生されるように実行されてよい。当業者は個々の用途のための有効量を周知の方法により決定することができるであろう。有効量は１日あたりおおよそ１０６ＣＦＵ〜１０１２ＣＦＵの範囲の用量を含むことが予想される。
【００２１】
[0030]  本発明は、関心の微生物に拮抗効果をもたらすために有効な量の代謝産物の経口投与により実行されてもよい。当業者は個々の用途のための有効量を周知の方法により決定することができるであろう。
【００２２】
[0031]  本発明は、関心の微生物による汚染を防ぐ、またはそれの増殖を阻害するために有効な量の１種類以上の細菌株を食物または飼料に添加することにより実行されてもよい。当業者は個々の用途のための有効量を周知の方法により決定することができるであろう。
【実施例】
【００２３】
[0032]  実施例１
[0033]  材料および方法
[0034]  乳酸菌（ＬＡＢ）Ｄ１１５株の培養条件。乳酸菌Ｄ１１５株を、ｄｅＭａｎ  Ｒｏｇｏｓａ  Ｓｈａｒｐｅブロス（ＭＲＳ，ｐＨ６．３）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ＵＳＡ）中で、３７℃において嫌気性条件下で２４時間増殖させた。一夜培養液をＭＲＳ寒天上にストリークし、生じた純粋なコロニーをＭＲＳブロス中で、記述したものと同じ条件を用いて２次培養した。長期保管のため、培養液を２０％グリセロール中で−８０℃で保存した。
【００２４】
[0035]  ブラキスピラ属の種の培養条件。ブラキスピラ・ハイオディセンテリアＡＴＣＣ２７１６４およびＢ．ピロシコリＡＴＣＣ５１１３９を、１０％ウシ胎仔血清（ＨｙＣｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ，  ＵＳＡ）、０．０５％Ｌ−システイン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，  シュタインハイム、ドイツ）および０．２％グルコース（Ｍｅｒｃｋ，  ダルムシュタット、ドイツ）を補ったＢｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎブロス（Ｏｘｏｉｄ  Ｌｔｄ，  ベイジングストーク、ハンプシャー、イギリス）中で増殖させ、３７℃で厳しい嫌気性条件の下で４〜６日間培養した。長期保管のため、培養液を４０％グリセロール中で−８０℃で保存した。
【００２５】
[0036]  １６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列決定による細菌の同定。Ｄ１１５株の分離されたコロニーを、塩基配列決定作業のためにシンガポールのＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｐｔｅ  Ｌｔｄに送った。ほぼ完全長の１６Ｓ  ｒＲＮＡを、順方向プライマー２７Ｆおよび逆方向プライマーユニバーサル１４９２Ｒを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。精製したＰＣＲ産物を、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１００  ＤＮＡシークエンサーおよびＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ＢｉｇＤｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｒｅａｄｙ−ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔを用いて塩基配列決定した。プライマー２７Ｆ、５３０Ｆ、９２６Ｆ、５１９Ｒ、９０７Ｒおよび１４９２Ｒ４４を採用して１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の両方の鎖を塩基配列決定した。最終的に配列をまとめて図１の完全長配列（配列ＩＤ  ＮＯ．１）を生成し、完全長配列をＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋのデータベースに対して照合した。
【００２６】
[0037]  ＥＦ−Ｔｕ遺伝子配列による細菌の同定。おおよそ９００ｂｐのｔｕｆ遺伝子断片を、２種類のオリゴヌクレオチドプライマー、すなわちＴＵＦ−１（ＧＡＴＧＣＴＧＣＴＣＣＡＧＡＡＧＡ）およびＴＵＦ−２（ＡＣＣＴＴＣＴＧＧＣＡＡＴＴＣＡＡＴＣ）を用いてＰＣＲ増幅した。得られたＰＣＲ産物をＱｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１００  ＤＮＡシークエンサーおよびＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｒｅａｄｙ−ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔを用いて塩基配列決定した。２種類の追加のプライマー（ＴＵＦ−ｆ２−  ＴＧＣＴＴＣＴＧＧＴＣＧＴＡＴＣＧＡＣＣＧＴおよびＴＵＦ−ｒ２−  ＧＧＴＣＡＣＣＴＴＣＡＡＧＴＧＣＣＴＴＣ）を設計し、ＴＵＦ−１およびＴＵＦ−２プライマーと一緒にＰＣＲ産物の両方向における塩基配列決定のために用いた。最終的に、配列をまとめて得られた配列を
ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋのデータベースで入手可能な全ての他の配列と比較した。乳酸菌Ｄ１１５株のＥＦ−Ｔｕ遺伝子配列を図２に示す（配列ＩＤ  ＮＯ．２）。
【００２７】
[0038]  拮抗アッセイ（Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ  ａｓｓａｙ）。ラクトバシラス・ジョンソニイＤ１１５、ブラキスピラ・ハイオディセンテリアおよびＢ．ピロシコリの培養液を、別々に４２００×ｇで１５分間遠心分離した後、それぞれをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の中に再懸濁した。Ｌ．ジョンソニイＤ１１５のペレットをＰＢＳで２回洗浄した後再懸濁した。Ｂ．ハイオディセンテリアおよびＢ．ピロシコリの１ｍｌの懸濁液をＬ．ジョンソニイＤ１１５の細胞中に添加して拮抗効果を調べた。Ｂ．ハイオディセンテリアおよびＢ．ピロシコリの増殖は、Ｌ．ジョンソニイＤ１１５非存在下でもモニターした。Ｌ．ジョンソニイＤ１１５の細胞および／またはブラキスピラ属の種が入った他のセットの試料フラスコにおいて、０．０５％システインを添加し、過酸化水素の生成が無い状態でＬ．ジョンソニイＤ１１５の阻害効果を測定した。全ての試料フラスコを３７℃において嫌気性条件および７５ｒｐｍにおける振とうの下で培養した。試料を０，２ならびに４時間の間隔で、ＭＲＳ寒天ならびに５％脱フィブリンヒツジ血液（Ｏｘｏｉｄ  Ｌｔｄ，  ベイジングストーク、ハンプシャー、イギリス）、１２．５ｍｇ／ｌリファンピシンおよび２００ｍｇ／ｌスペクチノマイシンを補ったＢｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ寒天の両方の上に撒いた。ＭＲＳ寒天および血液寒天のプレートを、それぞれ３０℃において５％ＣＯ２の下で、および３７℃において嫌気性条件下で培養した。
【００２８】
[0039]  拮抗アッセイ。ラクトバシラス・ジョンソニイＤ１１５、Ｃ．パーフリンジェンス（Ｃ．  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、サルモネラ・エンテリティディスおよびＳ．チフィムリウム（Ｓ．  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の一夜培養液を、別々に４２００×ｇで１５分間遠心分離した。Ｌ．ジョンソニイＤ１１５のペレットをＰＢＳで２回洗浄した後、ペレットを１０ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で再懸濁し、１０１０ＣＦＵ／ｍｌ培養液を得た。指示生物をＰＢＳで再懸濁し、１０７ＣＦＵ／ｍｌ培養液を得た。Ｃ．パーフリンジェンスまたはサルモネラ・エンテリティディスまたはＳ．チフィムリウムの１ｍｌ懸濁液を、５０ｍｌディスポーザブルＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）コニカルボトムディスポーザブルプラスチックチューブ中の９ｍｌのＬ．ジョンソニイＤ１１５培養液にそれぞれ添加した。Ｌ．ジョンソニイＤ１１５もしくはＣ．パーフリンジェンスもしくはサルモネラ・エンテリティディスもしくはＳ．チフィムリウムのみの培養液、またはＬ．ジョンソニイＤ１１５およびＣ．パーフリンジェンスもしくはサルモネラ・エンテリティディスもしくはＳ．チフィムリウムの培養液のいずれかを含む個々のチューブに、０．０５％システインを対照として含めた。嫌気性条件下にあったＣ．パーフリンジェンスを除いた全ての培養液を、３７℃において好気性条件および７５ｒｐｍにおける振とうの下で培養した。１ｍｌの試料をそれぞれの混合培養液から０および４時間の間隔で移し、９倍系列希釈を実施した後、試料をＭＲＳ寒天および／またはパーフリンジェンス寒天および／または酵母抽出物を補ったＴｒｙｐｔｏｎｅ  Ｓｏｙ  Ａｇａｒ（Ｏｘｏｉｄ，  ベイジングストーク、ハンプシャー、イギリス）上に撒いた。３７℃において嫌気性条件下で培養したパーフリンジェンス寒天を除き、培養液を３７℃において好気性条件下で培養した。
【００２９】
[0040]  過酸化水素の生成の測定。過酸化水素の生成は、拮抗アッセイの間に０，２および４時間の間隔でＦＯＸ−２（第１鉄−酸化−キシレノール２）法を用いて測定された。細胞懸濁液を４２００×ｇで１５分間遠心分離した後、上清の１９０μｌの体積を、続くＦＯＸ−２試薬との反応のために１０μｌのメタノールを含む別のマイクロ遠心チューブに移した。試薬は、２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチフェノール（２，６−ｄｉ−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ−４−ｍｅｔｈｙｐｈｅｎｏｌ）（＞９９％，Ｍｅｒｃｋ  Ｓｃｈｕｃｈａｒｄｔ  ドイツ）、ＨＰＬＣグレードのメタノール（Ｍｅｒｃｋ，ドイツ）、キシレノールオレンジナトリウム塩（ＡＣＳ試薬、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，セントルイス，  ＭＯ）、硫酸第１鉄アンモニウム（＞９９％，ＡＣＳ試薬，Ａｌｄｒｉｃｈ，  ＵＳＡ）、および硫酸（９５〜９７％，Ｍｅｒｃｋ，ダルムシュタット，ドイツ）から調製した。１）細菌の上清およびカタラーゼ、２）ＰＢＳおよびメタノール、ならびに３）ＰＢＳおよびカタラーゼ（１０００Ｕ／ｍｌ）を含む３種類の陰性対照も組み込んだ。それぞれの処理に対して、８００μｌの体積のＦＯＸ−２試薬を添加し、撹拌により十分に混合した後、４２００×ｇで１０分間遠心分離した。光学密度（ＯＤ）の読みを、メタノールのブランクに対して、分光光度計のセットを用いて、５６０ｎｍの波長において記録し、標準曲線から過酸化水素の濃度を決定した。
【００３０】
[0041]  過酸化水素のブラキスピラ属の種に対する効果。拮抗アッセイにおいて２および４時間の間隔で、ラクトバシラス・ジョンソニイＤ１１５により産生される過酸化水素の平均濃度を測定した。過酸化水素の１０ｍＭストック溶液を、純度３０％の過酸化水素（Ｍｅｒｃｋ，ドイツ）から、ＰＢＳを用いて調製した。ストック溶液を、前もってＰＢＳ中で再懸濁したブラキスピラ属の種の培養液中に添加し、言及したような過酸化水素の予め決定した濃度を得た。過酸化水素の添加無しのブラキスピラ属の種を対照として用いた。試料を３７℃において嫌気性条件下で２時間培養した。ブラキスピラ属の種のプレート計数は、５％脱フィブリンヒツジ血液を補ったＢｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ寒天を用いて実施した。
【００３１】
[0042]  Ｄ１１５の有効代謝産物の抽出および分離。乳酸菌Ｄ１１５株を、ｄｅＭａｎ  Ｒｏｇｏｓａ  Ｓｈａｒｐｅブロス（ＭＲＳ，ｐＨ６．３）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ＵＳＡ）中で、３７℃において嫌気性条件下で２４時間増殖させた。培養液を４２００×ｇで１５分間遠心分離した。上清をジエチルエーテルを用いて３回抽出し、有機相を集めた。集めた有機相を回転蒸発器を用いて蒸発させ、ＰＢＳを用いて再構成した。抽出した化合物を、ウェル拡散アッセイを用いるブラキスピラ・ハイオディセンテリア、Ｂ．ピロシコリ、Ｃ．パーフリンジェンス、サルモネラ・エンテリティディスおよびＳ．チフィムリウムに対する有効性の試験を受けさせた。抽出していない培養ブロスを対照として含めた。
【００３２】
[0043]  有効代謝産物に対する熱の効果。乳酸菌Ｄ１１５株を、ｄｅＭａｎ  Ｒｏｇｏｓａ  Ｓｈａｒｐｅブロス（ＭＲＳ，ｐＨ６．３）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ＵＳＡ）中で、３７℃において５％ＣＯ２の下で４８時間増殖させた。培養液を４２００×ｇで１５分間遠心分離した。上清を集め、１２１℃および１００℃の湿熱に１５分間さらした。処理した上清を室温に冷却し、ブラキスピラ・ハイオディセンテリア、Ｂ．ピロシコリ、Ｃ．パーフリンジェンス、サルモネラ・エンテリティディスおよびＳ．チフィムリウムに対するウェル拡散アッセイにおいて用いた。熱処理した接種していないブロスを対照として含めた。
【００３３】
[0044]  有効代謝産物に対するｐＨの効果。乳酸菌Ｄ１１５株を、ｄｅＭａｎ  Ｒｏｇｏｓａ  Ｓｈａｒｐｅブロス（ＭＲＳ，ｐＨ６．３）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ＵＳＡ）中で、３７℃において５％ＣＯ２の下で４８時間増殖させた。培養液を４２００×ｇで１５分間遠心分離した。上清を集め、４０℃におけるｐＨ１および２の処理にそれぞれ３０分間さらした。処理した上清をブラキスピラ・ハイオディセンテリア、Ｂ．ピロシコリ、Ｃ．パーフリンジェンス、サルモネラ・エンテリティディスおよびＳ．チフィムリウムに対するウェル拡散アッセイにおいて用いた。ｐＨ処理した接種していないブロスを対照として含めた。
【００３４】
[0045]  Ｄ１１５の抗真菌効果。乳酸菌Ｄ１１５株およびラクトバシラス・ジョンソニイＡＴＣＣ１１５０６株の培養液を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ，ｐＨ７．４）を用いてマックファーランド等量（ＭｃＦａｒｌａｎｄ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）０．５ユニットに調整した。酵母抽出物を補ったＴｒｙｐｔｏｎｅ  Ｓｏｙ  Ａｇａｒのそれぞれの半分に、それぞれ乳酸菌Ｄ１１５株およびラクトバシラス・ジョンソニイＡＴＣＣ１１５０６株をプレートに広げる技法を用いて接種した。プレートを３７℃で４８時間培養した。プレートの他方の半分に、アスペルギルス・ニゲルおまたはフザリウム・クラミドスポルムのどちらかを点接種した。プレートを３０℃で７（Ｆ．クラミドスポルム（Ｆ．  ｃｈｌａｍｙｄｏｓｐｏｒｕｍ））または２１（Ａ．ニゲル）日間までの間再培養した。
【００３５】
結果
[0041]  乳酸菌Ｄ１１５株をニワトリの胃腸管の十二指腸切片から分離した。生化学試験を用いた予備的な細菌の同定（ＡＰＩ  ５０  ＣＨＬ）は、細菌の正体がラクトバシラス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）であることを明らかにした。最新の研究において、１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列決定の結果は、Ｄ１１５株は乳酸菌グループに属するが別の種、最もありそうなのはラクトバシラス・ジョンソニイに属することを示している（図１および表１）。Ｄ１１５株はＮＣＢＩ  Ｇｅｎｂａｎｋデータベースにおいて、ラクトバシラス・ジョンソニイＮＣＣ５３３と最も高い遺伝子配列の相同性（１００％）を、ラクトバシラス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）と最も低い相同性（９９．４％）を示した（表１）。ｔｕｆ遺伝子の塩基配列決定の結果は、Ｄ１１５株が乳酸菌グループおよび最もありそうなのはラクトバシラス・ジョンソニイに属していることを確証した（図２および表２）。Ｄ１１５株はＮＣＢＩ  Ｇｅｎｂａｎｋデータベースにおいて、ラクトバシラス・ジョンソニイＮＣＣ５３３と最も高いｔｕｆ遺伝子配列の相同性（９９．９５％）を、ラクトバシラス・ジェンセニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｅｎｓｅｎｉｉ）ＡＴＣＣ２５２５８と最も低い相同性（９１．２０％）を示した。従って、１６Ｓ  ｒＲＮＡおよびｔｕｆ遺伝子の塩基配列決定は微生物を同定し分類するためのより信頼でき、単純で安価なやり方として広く受け入れられてきたため、Ｄ１１５株の正体をラクトバシラス・ジョンソニイとすることをその後の研究で採用した。
【００３６】
表１．乳酸菌Ｄ１１５株の、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｂａｎｋデータベースにおける既知の種に対する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の配列の同一性の調査
【００３７】
【表１】
2010527236.tif 000002
【００３８】
表２．乳酸菌Ｄ１１５株の、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｂａｎｋデータベースにおける既知の種に対するｔｕｆ遺伝子の配列の同一性の調査
【００３９】
【表２】
2010527236.tif 000003
【００４０】
[0042]  ブラキスピラ属の種に対する拮抗アッセイにおいて、Ｌ．ジョンソニイＤ１１５による過酸化水素の産生を０，２および４時間の間隔で監視した。得られた結果は、培養期間に渡るＤ１１５株による増大する過酸化水素の産生の傾向を示しており、Ｂ．ピロシコリおよびＢ．ハイオディセンテリアに対する拮抗アッセイの両方において、４時間の培養の後におおよそ３，０００μＭが検出された（表３および４）。しかし、Ｌ．ジョンソニイＤ１１５の細胞をブラキスピラ属の種と一緒に培養した場合、２時間の間隔において前者の細菌により産生される高い量の過酸化水素（平均３，４００μＭ）が観察されたが、その後で４時間までの続く培養において濃度が減少した（表３および４）。Ｄ１１５株を還元剤であるシステインと一緒に培養した場合、過酸化水素の産生は観察されなかった（表３および４）。Ｌ．ジョンソニイＤ１１５の両方のブラキスピラ属の種に対する明確な阻害効果がこの試験で観察された（図３および４）。
【００４１】
表３．ブラキスピラ・ピロシコリの存在下でのラクトバシラス・ジョンソニイＤ１１５の過酸化水素の産生
【００４２】
【表３】
2010527236.tif 000004
【００４３】
ａ  Ｌ．ジョンソニイＤ１１５の細胞は全ての試料においてｍｌあたり１０９ＣＦＵで落ち着かせた。
ｂ  過酸化水素の産生はシステインを含む試料では検出されなかった。
【００４４】
表４．ブラキスピラ・ハイオディセンテリアの存在下でのラクトバシラス・ジョンソニイＤ１１５の過酸化水素の産生
【００４５】
【表４】
2010527236.tif 000005
【００４６】
ａ  Ｌ．ジョンソニイＤ１１５の細胞は全ての試料においてｍｌあたり１０９ＣＦＵで落ち着かせた。
ｂ  過酸化水素の産生はシステインを含む試料では検出されなかった。
【００４７】
[0043]  過酸化水素を産生する株Ｄ１１５の存在下で、Ｂ．ピロシコリおよびＢ．ハイオディセンテリアの細菌の数は、共に２時間の培養の後に５対数減少し、４時間の培養の後に完全な阻害が観察された（図３および４）。４時間後に内容物を血液寒天上に撒いた際に、ブラキスピラ属の種の細胞も溶血活性も観察されなかった（データは示していない）。興味深いことに、これらの疾患を引き起こすスピロヘータは、例え過酸化水素がシステインにより除去されてもＬ．ジョンソニイＤ１１５による阻害に感受性があることも分かった。ブラキスピラ・ピロシコリおよびＢ．ハイオディセンテリアは、過酸化水素の非存在下ではそれぞれ細菌数の３および５対数の減少を被る（図３および４）。この場合、Ｂ．ハイオディセンテリアはＤ１１５株により産生されるこの追加の抗微生物化合物に対してより感受性があるようである。
【００４８】
[0044]  過酸化水素のブラキスピラ属の種に対する死滅効果をさらに確証して関係付けるため、我々は拮抗アッセイにおいてＬ．ジョンソニイＤ１１５により産生されたものに類似する落ち着かせた濃度の過酸化水素の作用液中でのこれらの生物の生存可能性を評価した。結果は、おおよそ３，０００μＭの過酸化水素が、拮抗アッセイにおいて見られた阻害効果と同様に、Ｂ．ピロシコリおよびＢ．ハイオディセンテリアの数をそれぞれ４および５対数減少させたことを示している（表５および６）。過酸化水素に追加される抗微生物化合物に関して我々は、ブラキスピラ属の種を阻害し得るＬ．ジョンソニイＤ１１５の阻害効果は乳酸の産生とは関係ないことを示した。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いた分析試験は、Ｌ．ジョンソニイＤ１１５およびブラキスピラ属の種の両方を含む培養懸濁液中に乳酸が存在しない、または無視してよい微量しかないことを示した（データは示していない）。
【００４９】
表５．２時間の培養に渡るブラキスピラ・ピロシコリに対する過酸化水素の効果
【００５０】
【表５】
2010527236.tif 000006
【００５１】
ａ  過酸化水素の濃度は３３００μＭで落ち着かせた。
表６．２時間の培養に渡るブラキスピラ・ハイオディセンテリアに対する過酸化水素の効果
【００５２】
【表６】
2010527236.tif 000007
【００５３】
ａ  過酸化水素の濃度は３１００μＭで落ち着かせた。
[0045]  ブラキスピラ・ピロシコリおよびＢ．ハイオディセンテリアに対してラクトバシラス・ジョンソニイＡＴＣＣ１１５０６株を用いて実施された拮抗アッセイにおいて、図７および８に示したように病原性細菌の１対数未満の減少が観察された。過酸化水素の産生が抑制された場合、ブラキスピラ・ピロシコリおよびＢ．ハイオディセンテリアの減少はほとんど観察されなかった。
【００５４】
[0046]  Ｄ１１５株を拮抗アッセイを用いてサルモネラ・チフィムリウムに対して試験した場合、図９に示したように病原性細菌の２．５対数の減少が観察された。過酸化水素の産生を還元剤で抑制した場合、なおサルモネラ・チフィムリウムの１対数の減少が観察され、これは阻害効果がＤ１１５株による追加の抗微生物化合物の産生によるものであったことを示している。
【００５５】
[0047]  Ｄ１１５株を拮抗アッセイを用いてサルモネラ・エンテリティディスに対して試験した場合、図１０に示したように病原性細菌の２対数の減少が観察された。過酸化水素の産生を還元剤で抑制した場合、なおサルモネラ・エンテリティディスの２対数の減少が観察され、これは阻害効果がＤ１１５株による追加の抗微生物化合物の産生によるものであったことを示している。
【００５６】
[0048]  Ｄ１１５株を拮抗アッセイを用いてクロストリジウム・パーフリンジェンスに対して試験した場合、図１１に示したように病原性細菌の７対数の減少が観察された。過酸化水素の産生を還元剤で抑制した場合、なおクロストリジウム・パーフリンジェンスの２．５対数の減少が観察され、これは阻害効果がＤ１１５株による追加の抗微生物化合物の産生によるものであったことを示している。
【００５７】
[0049]  Ｄ１１５株からの２４時間培養ブロスを１２１℃および１００℃にそれぞれ１５分間さらした。処理した培養ブロスを、ブラキスピラ・ハイオディセンテリア、Ｂ．ピロシコリ、サルモネラ・エンテリティディス、Ｓ．チフィムリウムおよびクロストリジウム・パーフリンジェンスに対する阻害効果に関して、ウェル拡散アッセイで試験した。表７に示したように、熱処理した培養ブロスはブラキスピラ・ハイオディセンテリア、Ｂ．ピロシコリ、サルモネラ・エンテリティディス、Ｓ．チフィムリウムおよびクロストリジウム・パーフリンジェンスに対してなお阻害効果を示した。Ｄ１１５株からの２４時間培養ブロスをｐＨ１および２の処理に４０℃において３０分間さらした場合、表８に示したように、処理した培養ブロスはウェル拡散アッセイにおいてブラキスピラ・ハイオディセンテリア、Ｂ．ピロシコリ、サルモネラ・エンテリティディス、Ｓ．チフィムリウムおよびクロストリジウム・パーフリンジェンスに対してなお阻害効果を示した。
【００５８】
表７．熱処理した培養ブロスの阻害効果
【００５９】
【表７】
2010527236.tif 000008
【００６０】
表８．ｐＨ処理した培養ブロスの阻害効果
【００６１】
【表８】
2010527236.tif 000009
【００６２】
[0050]  ２４時間のＤ１１５培養物は、図１０において、アスペルギルス・ニゲルおよびフザリウム・クラミドスポルムに対してもＬ．ジョンソニイＡＴＣＣ１１５０６株のプレートと比較して阻害を示し、Ｄ１１５と一緒に接種（ｃｏ−ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ）したプレート上でＡ．ニゲルの増殖が抑制された。これは抗真菌化合物（類）の培養寒天をまたいだ拡散によるものである可能性がある。一方で、ＰＢＳを用いた対照プレート上のアスペルギルス・ニゲルは、寒天プレートをまたいだ真菌の増殖および拡散を示した。Ｌ．ジョンソニイＤ１１５は、表９に示したように、フザリウム・クラミドスポルムに対しても７日目においてＬ．ジョンソニイＡＴＣＣ１１５０６と比較して阻害を示した。
【００６３】
表９
【００６４】
【表９】
2010527236.tif 000010
【００６５】
[0051]  比較によると、Ｄ１１５と一緒に培養したフザリウム・クラミドスポルムは、Ｌ．ジョンソニイＡＴＣＣ１１５０６と比較して大きさの１３．７％の抑制を示した。
論考
[0052]  Ｄ１１５株は、以前にＡＰＩ５０ＣＨＬ試験を用いてラクトバシラス・ファーメンタムであると特徴づけられたのとは異なり、１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列決定を用いてラクトバシラス・ジョンソニイであると同定された。通常、１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列決定は生化学的プロフィールと比較してより高い信頼性を有することが受け入れられている。２００５年においてＳｏｗら、および２０００年においてＮｉｇａｔｕらは、ラクトバシラス属の同定および識別におけるＡＰＩ５０ＣＨＬの不十分性を示し、より有効な特徴づけのための遺伝子型解析（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）の技法の必要性を強調した（５０，４０）。ラクトバシラス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクト．ファーメンタム（Ｌａｃｔ．  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクト．ラムノサス（Ｌａｃｔ．  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクト．サケ（Ｌａｃｔ．  ｓａｋｅ）、ラクト．パラブフネリ（Ｌａｃｔ．  ｐａｒａｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ラクト．ガリナラム（Ｌａｃｔ．  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、ラクト．カゼイ（Ｌａｃｔ．  ｃａｓｅｉ）、ワイセラ・ミノー（Ｗｅｉｓｅｅｌｌａ  ｍｉｎｏｒ）ならびにｋｏｃｈｏおよびｔｅｆ．から分離された関連する分類群を識別するための、ＲＡＰＤならびにＡＰＩ５０ＣＨのパターンの数値分析の評価  Journal of Apllied Microbiology 89(6): 969-978)。これは、表現型の特性は時々不安定であり、発現は進化および環境変化、例えば増殖の基質、温度およびｐＨに影響される可能性があるからである（２４，５０）。延長因子Ｔｕ（ｔｕｆ）遺伝子の塩基配列決定は、Ｄ１１５株の正体がラクトバシラス属ジョンソニイ種の下にあることをさらに確証した。ｔｕｆ遺伝子は進化を通して高度に保存されおり、機能不変性を示すと報告されている（３５，３４）。延長因子Ｔｕからのタンパク質配列に基づいた系統発生学は、ｒＲＮＡ遺伝子配列データと十分な一致を示し（３５）、ラクトバシラス属の中での種の同定に関して正確である（５３）。
【００６６】
[0053]  ラクトバシラス・ジョンソニイは、それに関して生菌の役割がよく報告されているアシドフィルス（Ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）グループのメンバーである（４５）。その細菌は１９９２年にラクトバシラス・アシドフィルスから別の種として再分類された（１７）。ラクトバシラス・ジョンソニイの様々な株の中で、ＮＣＣ５３３（Ｌａ１株としても知られる）（１０）は、その生菌の活性、例えば病原体の阻害、上皮細胞接着および免疫修飾に関して最もよく報告されている細菌である（１２，２０，３９）。その細菌はランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）に対して拮抗し、寄生生物に誘発される粘膜の損傷に対して保護することが分かった（２０）。特に家禽において、ラクトバシラス・ジョンソニイＦ１９７８５はクロストリジウム・パーフリンジェンスのコロニー形成を競争的排除により抑制することができることが報告された（３２）。これらの報告は、Ｄ１１５株のブラキスピラ属の種に対する生菌としての使用の可能性を支持する。
【００６７】
[0054]  我々の最新の研究は、Ｌ．ジョンソニイＤ１１５のブラキスピラ属の種に対する、過酸化水素の産生および第２の推定される抗微生物化合物の存在を通した２種類の阻害作用を示した。研究は、ラクトバシラス属の種が好気性環境において過剰な過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を産生し、それにより、カタラーゼのようなＨ２Ｏ２排除酵素をほとんどまたは全く産生しない他の望ましくない病原性細菌の増殖を防ぐことができることを示した（５，１５，３１）。条件的嫌気性菌である乳酸菌は、それらのＮＡＤＨ酸化酵素系を通して分子の酸素を過酸化水素に変換する（５，４７）。カタラーゼが存在しないため、これらの細菌はＮＡＤＨペルオキシダーゼのみに依存して過酸化水素をサブ阻害（ｓｕｂ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ）濃度レベルで保つ（４７）。この場合、Ｌ．ジョンソニイＤ１１５により産生される過酸化水素の濃度はＢ．ハイオディセンテリアおよびＢ．ピロシコリの両方に対して阻害的であることが示された。Ｐｈｉｌｉｐｓらによる研究（２００３）も、ニワトリの糞便中のＢ．ピロシコリを不活性化するための過酸化水素の強力な消毒剤としての使用を示した（４３）。過酸化水素の強力な抗微生物特性は、その細菌中のＤＮＡの破壊を引き起こす能力によるものである（４，５１）。過酸化水素の産生とは別に、Ｌ．ジョンソニイＤ１１５の第２の阻害作用は、抗微生物化合物の産生によるものであると起因されると考えられ、ＨＰＬＣ分析に支持されるように、これは乳酸ではない。実際、乳酸菌による有機酸に加えて他の抗微生物化合物の産生が一般的に報告されている（７，１３，３３）。特に、ラクトバシラス・ジョンソニイＬａ１はスタフィロコッカス・アウレウス、リステリア・モノサイトゲネス、Ｓ．チフィムリウム、シゲラ・フレクスネリ、クレブシエラ・ニューモニエ、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、およびエンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）に対して狭い阻害スペクトルを有するバクテリオシンを産生することも示された（１０）。
【００６８】
[0055]  Ｌ．ジョンソニイＤ１１５はサルモネラ属の種およびＣ．パーフリンジェンスに対しても阻害的であることが、拮抗アッセイを用いて示された。還元剤がアッセイ中に添加された場合でもなお、全ての実験においてサルモネラ属の種およびＣ．パーフリンジェンスに対する阻害を見ることができ、これは過酸化水素以外の抗微生物化合物（類）の存在を示している。抗微生物化合物（類）は、Ｓ．チフィムリウムと比較してサルモネラ・エンテリティディスに対してより有効である。
【００６９】
[0056]  ラクトバシラス・ジョンソニイＤ１１５はアスペルギルス・ニゲルに対しても阻害的であることが示された。Ｄ１１５株の２４時間経った培養プレートをＡ．ニゲルと一緒に培養した場合、Ａ．ニゲルの増殖の抑制が観察された。これは培養寒天に渡って拡散した抗真菌化合物（類）に起因すると考えることができる。Ｌ．ジョンソニイＡＴＣＣ１１５０６、Ａ．ニゲルを一緒に培養したものを含む培養プレートは、真菌の増殖の抑制を示さなかった。ＰＢＳおよび真菌のみを含む対照プレートも、真菌に対して抑制効果を示さず、真菌の培養物は培養プレートに渡って増殖して広がった。加えて、Ｌ．ジョンソニイＤ１１５はペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｎ）に対して阻害を示さないことが観察された。現在、Ｌ．ジョンソニイによる抗アスペルギルスおよび抗フザリウム活性の報告は存在しない。
【００７０】
[0057]  全般的に言えば、この研究はＬ．ジョンソニイＤ１１５のブラキスピラ属の種に対する抗微生物剤としての使用の可能性を支持する期待できる結果を与える。最も重要なことだが、これらの腸管スピロヘータの阻害における乳酸菌の使用のアイデアは新規であり、ブタ赤痢およびブタ腸管スピロヘータ症の処置および予防における抗生物質の使用に対して優れた代替の解決法を提供する。加えて、結果はＬ．ジョンソニイＤ１１５のサルモネラ属の種、Ｃ．パーフリンジェンス、アスペルギルス属の種およびフザリウム属の種に対する抗微生物剤としての使用の可能性も示している。サルモネラ属の種、Ｃ．パーフリンジェンス、アスペルギルス属の種およびフザリウム属の種の汚染の予防または阻害のために、乳酸菌を食物、飼料および動物への、またはその中での適用において用いるアイデアは新規である。
【００７１】
結論
[0058]  この研究は、ラクトバシラス・ジョンソニイＤ１１５のブラキスピラ・ハイオディセンテリアおよびＢ．ピロシコリの両方に対する使用の可能性を示した。ラクトバシラス・ジョンソニイＤ１１５は、その過酸化水素および別の抗微生物化合物の産生により両方のスピロヘータを阻害することが示された。ブタ赤痢およびブタ腸管スピロヘータ症の処置および予防における有益な細菌の使用は新規であり、病原性細菌の増大する抗生物質耐性の現状を緩和する可能性がある。また、ラクトバシラス・ジョンソニイＤ１１５はサルモネラ属の種およびＣ．パーフリンジェンスに対する阻害作用を有することが示された。さらに、Ｄ１１５株からの抗微生物化合物は１２１℃に１５分間まで耐熱性であり、ｐＨ１に４０℃において３０分間まで耐酸性である。結果はラクトバシラス・ジョンソニイＤ１１５およびその抗微生物性代謝産物がアスペルギルス・ニゲルおよびフザリウム・クラミドスポルムに対しても阻害的であることも示している。
【００７２】
実施例２
材料および方法
[0059]  乳酸菌（ＬＡＢ）Ｄ１１５株の培養条件。乳酸菌Ｄ１１５株を、ｄｅＭａｎ  Ｒｏｇｏｓａ  Ｓｈａｒｐｅブロス（ＭＲＳ，ｐＨ６．３）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ＵＳＡ）中で、３７℃において嫌気性条件下で２４時間増殖させた。一夜培養液をＭＲＳ寒天上にストリークし、生じた純粋なコロニーをＭＲＳブロス中で、記述したものと同じ条件を用いて２次培養した。長期保管のため、培養液を２０％グリセロール中で−８０℃で保存した。
【００７３】
[0060]  指示生物の培養条件。カンピロバクター・ジェジュニ（ＡＴＣＣ３５９１８）、大腸菌（ＡＴＣＣ２５９２２）、クレブシエラ・ニューモニエ（臨床分離株、国立大学病院、シンガポール）、リステリア・モノサイトゲネス（ＡＴＣＣ７６４４）、シゲラ・ソンネ（臨床分離株、国立大学病院、シンガポール）、ビブリオ・コレラ（臨床分離株、国立大学病院、シンガポール）、ビブリオ・パラヘモリチカス（臨床分離株、国立大学病院、シンガポール）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（臨床分離株、国立大学病院、シンガポール）、エンテロコッカス・フェカリス（臨床分離株、国立大学病院、シンガポール）、エンテロコッカス・フェシウム（臨床分離株、国立大学病院、シンガポール）、アスペルギルス・ニゲル（ＡＴＣＣ２４１２６）およびフザリウム・クラミドスポルム（ＡＴＣＣ２００４６８）を、指示生物として用いた。クレブシエラ・ニューモニエ、大腸菌およびアスペルギルス・ニゲルの個々の分離されたコロニーを、栄養寒天上にそれぞれストリークした。カンピロバクター・ジェジュニ、シゲラ・ソンネ、ビブリオ・コレラおよびビブリオ・パラヘモリチカスの個々の分離されたコロニーを、微好気性条件下で、Ｃａｍｐｙｇｅｎ  Ｐａｋ  （Ｏｘｏｉｄ）を用いて、それぞれ血液寒天（Ｂｉｏｍｅｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ，  ＢＢＬ）上にストリークした。カンピロバクター・ジェジュニを４２℃で４８時間培養した。ストレプトコッカス・ニューモニエの単一の分離されたコロニーを血液寒天上にストリークした。リステリア・モノサイトゲネスの単一の分離されたコロニーをＢｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ寒天（Ｏｘｏｉｄ）上にストリークした。エンテロコッカス・フェカリスおよびエンテロコッカス・フェシウムの個々の分離されたコロニーをＭＲＳ上にそれぞれストリークした。全ての培養物を、別途記載しない限り３７℃で２４時間培養した。
【００７４】
[0061]  ウェル拡散アッセイ。それぞれの指示生物の分離されたコロニーを、リン酸緩衝生理食塩水に再懸濁し、マクファーランド０．１番標準液に合わせたＡ．ニゲル以外をマクファーランド０．５番標準液に合わせた。Ａ．ニゲル接種物を、血球計算板を用いた計数を受けさせ、最初の密度が１０６分生子／ｍｌであることを確かめた。無菌の綿棒をそれぞれの個々の試料調製物の中に浸し、それらのそれぞれの増殖用寒天の上に均一に広げた。無菌のコルクボーラー（５番）を用いて寒天の中にウェルを作った。１００μｌのＬ．ジョンソニイＤ１１５無細胞培地をそれぞれのウェルの中に入れた。Ｌ．ジョンソニイＡＴＣＣ１１５０６無細胞培地およびそれぞれの接種していない増殖培地を対照として含めた。
【００７５】
[0062]  マイクロタイタープレート増殖アッセイ。Ｌ．ジョンソニイＤ１１５の上清のいくつかの細菌に対する抗微生物物質としての有効性を定量するため、マイクロタイタープレート中での自動化された増殖阻害アッセイをＢｉｏｓｃｒｅｅｎ  Ｃ  Ａｎａｌｙｓｅｒ  （Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｏｙ，フィンランド）を用いて実施した。この方法において、６００ｎｍの波長における濁度を定期的に測定し、微生物の増殖を示すものとして記録した。Ｌ．ジョンソニイＤ１１５の上清１２５μＬを１２５μＬの試験微生物（Ｍ．Ｏ．）と混合してＨｏｎｅｙｃｏｍｂマイクロタイタープレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ）の個々のウェルの中に入れ、結果としてウェルあたり２５０μＬの総体積を得た。陰性対照は１２５μＬの試験生物および１２５μＬの無菌蒸留水で構成された。ブランクは１２５μＬの培養培地（Ｍ．Ｏ．無し）および１２５μＬの無菌蒸留水で構成された。培養温度は細菌に関して３７℃に設定され、振盪の後、１０分間隔で測定した。データは、微生物の増殖速度によって２０〜４８時間の期間に渡って集めた。
【００７６】
[0063]  ディスク拡散アッセイ−微好気性および嫌気性細菌。細胞を、ヒツジ血液を補ったｔｒｙｐｔｏｎｅ  ｓｏｙ  ａｇａｒ（ＴＳＡ）プレート上で、微好気性または嫌気性条件下で３７℃において４８時間増殖させた。それぞれのプレートから細胞を集め、３ｍＬの生理食塩水（１％ペプトン、８．５％ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００）に再懸濁した。上記のようにそれぞれの懸濁液のＯＤ６２５を測定して０．０８に合わせた。１００μＬのそれぞれの標準化した培養液を、ヒツジ血液を補ったＴＳＡプレート上に撒き、乾燥させた。５枚の無菌の紙製ディスクをプレートの上に置いた。１０μＬの再構成したＬ．ジョンソニイＤ１１５の上清またはＬ．ジョンソニイＡＴＣＣ１１５０６の上清（陰性対照）をディスクの上にスポットした。プレートを４℃で４時間、適切な雰囲気条件（微好気性または嫌気性）において保った後、３７℃で一夜培養した。
【００７７】
結果
[0064]  様々なグラム陽性およびグラム陰性微生物の、Ｌ．ジョンソニイＤ１１５無細胞培地の存在下での生存度を、試験管内で、ウェル拡散アッセイを用いて試験した。試験した全ての細菌は、Ｌ．ジョンソニイＤ１１５により産生される抗微生物化合物（類）に、異なる程度の感受性で感受性があることが分かった（図１１〜１６）。平均乳酸濃度は１８００ｐｐｍまたは０．１８％であることが分かったため、０．１８％乳酸を含むＭＲＳを陰性対照として含めた。
【００７８】
[0065]  マイクロタイタープレート増殖アッセイ。マイクロタイタープレートのそれぞれのウェルのＯＤを、１０分間ごとに２０〜４８時間（微生物の増殖速度による）測定した。ＯＤ６００の増加の遅れは、抗微生物溶液による細胞増殖の阻害を示す。マイクロタイタープレート増殖アッセイの結果によれば、得られた増殖曲線は、Ｌ．ジョンソニイＤ１１５の上清の存在下ではＹ．エンテロコリチカの増殖がＬ．ジョンソニイ１１５０６の上清の存在下での増殖と比較して低減されたことを示している（図１７ＡおよびＢ）。
【００７９】
[0066]  ウェル拡散アッセイを用いた抗真菌スクリーニングは、前に実施例１で観察されたように、Ｌ．ジョンソニイＤ１１５が一般的な飼料腐敗真菌、例えばアスペルギルス・ニゲルの増殖に対して有効であることを確証した（図１８）。
【００８０】
[0067]  ディスク拡散アッセイ。増殖阻害領域の直径を定規を用いて測定した。阻害が観察されなかった場合、直径は６ｍｍ、すなわち紙製ディスクの直径であった。結果を表１０および１１に示す。
【００８１】
表１０．Ｄ１１５の上清を様々な細菌に対してスクリーニングするディスク拡散アッセイの結果
【００８２】
【表１０】
2010527236.tif 000011
【００８３】
１Ｌ．ジョンソニイ、Ｄ１１５株
２Ｌ．ジョンソニイＡＴＣＣ１１５０６
論考
[0068]  ウェル拡散アッセイの方法を用いて、シゲラ・ソンネ、ビブリオ・コレラ、ビブリオ・パラヘモリチカス、カンピロバクター・ジェジュニ、ストレプトコッカス・ニューモニエおよびエンテロコッカス・フェシウムを含むいくつかの細菌がＬ．ジョンソニイＤ１１５の上清中に含まれる推定される抗微生物物質に感受性があることが示された。
【００８４】
[0069]  ウェル拡散アッセイの方法を用いて、Ｌ．ジョンソニイＤ１１５の上清の抗真菌活性をさらにＡ．ニゲルに対して示した（図１８）。Ｌ．ジョンソニイＡＴＣＣ１１５０６の無細胞培養培地からわずかな抗真菌活性が見られたが、Ｌ．ジョンソニイＤ１１５の無細胞培養培地を用いて検出された阻害領域は明確で輪郭がはっきりした（ｄｅｆｉｎｅｄ）真菌の阻害を示した。結果は、Ｌ．ジョンソニイＤ１１５の上清がこれらの微生物に対して、Ｌ．ジョンソニイ１１５０６の上清と比較して増殖阻害活性を有していることを示した。その効果は乳酸菌に一般的な乳酸の産生によるものではなかった；この抗微生物効果は第２の代謝産物の産生によるものであった。
【００８５】
[0070]  ディスク拡散アッセイ法を用いて、サルモネラ・モンテビデオ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｍｏｎｔｅｖｉｄｅｏ）、Ｓ．センフテンベルク（Ｓ．  ｓｅｎｆｔｅｎｂｅｒｇ）、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）、バチルス・セレウスおよびＹ．エンテロコリチカを含むいくつかの細菌がＬ．ジョンソニイＤ１１５の上清に含まれる代謝産物に感受性があることが示された。
【００８６】
[0071]  全般的に言えば、下記の表１１に要約したように、Ｌ．ジョンソニイＤ１１５は広いスペクトルの抗微生物および抗真菌活性を示した。
表１１．Ｌ．ジョンソニイＤ１１５の抗微生物活性の結果の要約
【００８７】
【表１１】
2010527236.tif 000012
【００８８】
[0072]  ラクトバシラス・ジョンソニイ分離株Ｄ１１５は、ブダペスト条約の条項の下で、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）  １０８０１、Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ大学、マナサス、Ｖａ．  ２０１１０−２２０９において、２００８年３月７日に、ＰＴＡ−９０７９として寄託された。
【００８９】
[0073]  前述の記述および図は、本発明の説明的な態様を含む。本明細書で記述された前述の態様および方法は、当業者の能力、経験、および好みに基づいて変化してよい。単に方法の工程を特定の順序で列挙することは、方法の工程の順序にいかなる制限も構成しない。前述の記述および図は本発明を単に説明および図説するものであり、特許請求の範囲がそう限定する場合を除き、本発明はそれに限定されない。それらより前の開示を有する当業者は、本発明の範囲から逸脱することなくそれに修正および変更を加えることができるであろう。
【００９０】
結論
[0074]  この研究は、Ｌ．ジョンソニイＤ１１５の広いスペクトルの抗微生物および抗真菌活性を示した。スタフィロコッカス・アウレウス、リステリア・モノサイトゲネス、Ｓ．エンテリティディス、Ｓ．チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、Ｅ．フェカリス、大腸菌に対する阻害効果を有する他のＬ．ジョンソニイ株、例えばＬ．ジョンソニイＬａ１について報告されたことに加え、Ｌ．ジョンソニイＤ１１５株は、シゲラ・ソンネ、ビブリオ・コレラ、Ｖ．パラヘモリチカス、カンピロバクター・ジェジュニ、ストレプトコッカス・ニューモニエ、エンテロコッカス・フェシウム、エルシニア・エンテロコリチカ、バチルス・セレウス、アスペルギルス・ニゲルおよびフザリウム・クラミドスポルムに対して阻害的であることが分かった。これは、Ｌ．ジョンソニイＤ１１５の生菌として、予防剤としてまたは物質の表面処理剤としての、ヒトおよび動物の病原体、例えばシゲラ・ソンネ、ビブリオ・コレラ、Ｖ．パラヘモリチカス、カンピロバクター・ジェジュニ、ストレプトコッカス・ニューモニエ、エンテロコッカス・フェシウム、エルシニア・エンテロコリチカ、バチルス・セレウス、Ｓ．モンテビデオおよびＳ．センフテンベルクならびに菌類であるアスペルギルス・ニゲルおよびフザリウム・クラミドスポルムに対する使用の可能性を示す。
【００９１】
参考文献
【００９２】
【化１−１】
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【００９３】
【化１−２】
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【００９４】
【化１−３】
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【００９５】
【化１−４】
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【図１】
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【図２】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１２ｃ】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１３ｃ】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１４ｃ】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１５ｃ】
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【図１６ａ】
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【図１６ｂ】
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【図１６ｃ】
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【図１８ａ】
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【図１８ｂ】
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【図１８ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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