(57)【要約】本発明は、生体液のプロテオームの同定、ならびに胎児の起源である母体の状態、染色体異数性ならびに胎児の成長および成熟に関連する胎児疾患をはじめとした母体／胎児の状態の状況を判定する際にそれらのプロテオームを使用することに関する。特に、本発明は、ヒトの羊水（ＡＦ）および子宮頸部膣液（ＣＶＦ）の網羅的プロテオーム解析ならびに様々な母体／胎児の病的状態（例えば、羊水内感染、早期陣痛および／または染色体の欠陥）と正常なプロテオームとの特徴的な変化の相関に関する。本発明はさらに、様々な妊娠関連障害の非侵襲性診断のために使用することができる生物学的マーカーおよび生物学的マーカー群の同定ならびにそのような生物学的マーカーを使用する診断アッセイに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
妊娠中の雌性哺乳動物被験体における子宮内感染の存在を判定するための方法であって：
（ａ）該被験体から得られた子宮頸部膣液のサンプルにおいて、ハプトグロビン前駆体（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ００７３８）；アルファ−１−酸糖タンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０２７６３）、表皮型脂肪酸結合タンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｑ０１４６９）およびインスリン様成長因子結合タンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０８８３３）からなる群から選択される２つ以上のタンパク質の存在量を、正常な子宮頸部液または子宮内感染を示していることが知られている子宮頸部液における存在量と比べて検査する工程；および
（ｂ）該存在量が、該正常な子宮頸部液における存在量と比べて統計学的有意差を示すか、または子宮内感染を示していることが知られている該子宮頸部液における存在量と比べて統計学的有意差を示さない場合に、子宮内感染が存在すると結論を下す工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記哺乳動物被験体が、ヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記タンパク質のうちの少なくとも３つの存在量を検査する工程を包含する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記タンパク質のうちの４つすべての存在量を検査する工程を包含する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
プロフィリン−１（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０７７３７）；血清アルブミン前駆体（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ２７６８）；カルグラニュリンＢ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０６７０２）；および扁平上皮癌抗原１（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ２９５０８）からなる群から選択される１つ以上のさらなるタンパク質の存在量を検査する工程をさらに包含する、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
アルファ−１−抗トリプシン前駆体（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０１００９）；フィブロネクチン前駆体（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０２７５１）；アネキシンＡ２（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０７３５５）；ビタミンＤ結合タンパク質前駆体（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０２７７４）からなる群から選択される１つ以上のさらなるタンパク質の存在量を検査する工程をさらに包含する、請求項２または請求項５に記載の方法。
【請求項７】
シスタチンＡ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０１０４０）；ムチン−５Ｂ前駆体（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｑ９ＨＣ８４）；小型プロリンリッチタンパク質３（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｑ９ＵＢＣ９）；リゾチームＣ前駆体（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ６１６２６）；およびセロトランスフェリン前駆体（Ｐ０２７８７）からなる群から選択される１つ以上のさらなるタンパク質の存在量を検査する工程をさらに包含する、請求項１または請求項５に記載の方法。
【請求項８】
シスタチンＡ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０１０４０）；ムチン−５Ｂ前駆体（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｑ９ＨＣ８４）；小型プロリンリッチタンパク質３（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｑ９ＵＢＣ９）；リゾチームＣ前駆体（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ６１６２６）；およびセロトランスフェリン前駆体（Ｐ０２７８７）からなる群から選択される１つ以上のさらなるタンパク質の存在量を検査する工程をさらに包含する、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記存在量が、イムノアッセイによって測定される、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記存在量が、質量分析によって測定される、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記存在量が、タンパク質アレイを用いて測定される、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
早期陣痛の症状を示している妊娠中の雌性哺乳動物被験体における早産の可能性を判定するための方法であって、
（ａ）該被験体から得られた子宮頸部膣液のサンプルにおいて、ハプトグロビン前駆体（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ００７３８）；アルファ−１−酸糖タンパク質１（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０２７６３）、表皮型脂肪酸結合タンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｑ０１４６９）およびインスリン様成長因子結合タンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０８８３３）からなる群から選択される２つ以上のタンパク質の存在量を、正常な子宮頸部液または子宮内感染を示していることが知られている子宮頸部液における存在量と比べて検査する工程；および
（ｂ）該存在量が、該正常な子宮頸部液における存在量と比べて統計学的有意差を示すか、または子宮内感染を示していることが知られている該子宮頸部液における存在量と比べて統計学的有意差を示さない場合に、早産の発生を予測する工程
を包含する、方法。
【請求項１３】
前記哺乳動物被験体が、ヒトである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記タンパク質のうちの少なくとも３つの存在量を検査する工程を包含する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記タンパク質のうちの４つすべての存在量を検査する工程を包含する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
プロフィリン−１（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０７７３７）；血清アルブミン前駆体（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ２７６８）；カルグラニュリンＢ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０６７０２）；および扁平上皮癌抗原１（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ２９５０８）からなる群から選択される１つ以上のさらなるタンパク質の存在量を検査する工程をさらに包含する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
アルファ−１−抗トリプシン前駆体（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０１００９）；フィブロネクチン前駆体（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０２７５１）；アネキシンＡ２（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０７３５５）；ビタミンＤ結合タンパク質前駆体（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０２７７４）からなる群から選択される１つ以上のさらなるタンパク質の存在量を検査する工程をさらに包含する、請求項１３または請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
シスタチンＡ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０１０４０）；ムチン−５Ｂ前駆体（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｑ９ＨＣ８４）；小型プロリンリッチタンパク質３（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｑ９ＵＢＣ９）；リゾチームＣ前駆体（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ６１６２６）；およびセロトランスフェリン前駆体（Ｐ０２７８７）からなる群から選択される１つ以上のさらなるタンパク質の存在量を検査する工程をさらに包含する、請求項１３または請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
シスタチンＡ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０１０４０）；ムチン−５Ｂ前駆体（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｑ９ＨＣ８４）；小型プロリンリッチタンパク質３（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｑ９ＵＢＣ９）；リゾチームＣ前駆体（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ６１６２６）；およびセロトランスフェリン前駆体（Ｐ０２７８７）からなる群から選択される１つ以上のさらなるタンパク質の存在量を検査する工程をさらに包含する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記存在量が、イムノアッセイによって測定される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
前記存在量が、質量分析によって測定される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】
前記存在量が、タンパク質アレイを用いて測定される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２３】
早産の発生を、前記検査に基づいて予測することができない場合に、フィブロネクチン前駆体（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０２７５１）の存在量について前記被験体をさらに検査し、該存在量が、前記正常な子宮頸部液における存在量と比べて統計学的有意差を示す場合に、早産の発生を予測する、請求項１３に記載の方法。
【請求項２４】
フィブロネクチン前駆体（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０２７５１）の存在量を前記工程（ａ）の前に測定する、請求項１３に記載の方法。
【請求項２５】
ハプトグロビン前駆体（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ００７３８）；アルファ−１−酸糖タンパク質１（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０２７６３）；表皮型脂肪酸結合タンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｑ０１４６９）；およびインスリン様成長因子結合タンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０８８３３）からなる群から選択される２つ以上のタンパク質を検出するための抗体および試薬を備えた、イムノアッセイキット。
【請求項２６】
プロフィリン−１（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０７７３７）；血清アルブミン前駆体（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ２７６８）；カルグラニュリンＢ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０６７０２）；扁平上皮癌抗原１（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ２９５０８）；アルファ−１−抗トリプシン前駆体（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０１００９）；フィブロネクチン前駆体（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０２７５１）；アネキシンＡ２（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０７３５５）；ビタミン−Ｄ結合タンパク質前駆体（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０２７７４）；シスタチンＡ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０１０４０）；ムチン−５Ｂ前駆体（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｑ９ＨＣ８４）；小型プロリンリッチタンパク質３（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｑ９ＵＢＣ９）；リゾチームＣ前駆体（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ６１６２６）；およびセロトランスフェリン前駆体（Ｐ０２７８７）；シスタチンＡ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０１０４０）；ムチン−５Ｂ前駆体（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｑ９ＨＣ８４）；小型プロリンリッチタンパク質３（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｑ９ＵＢＣ９）；およびリゾチームＣ前駆体（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ６１６２６）；およびセロトランスフェリン前駆体（Ｐ０２７８７）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質を検出するための抗体および試薬をさらに備えている、請求項２５に記載のイムノアッセイキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、生体液のプロテオームの同定、ならびに胎児の起源である母体の状態、染色体異数性ならびに胎児の成長および成熟に関連する胎児疾患をはじめとした母体／胎児の状態の状況を判定する際にそれらのプロテオームを使用することに関する。特に、本発明は、ヒトの羊水（ＡＦ）および子宮頸部膣液（ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｖａｇｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ）（ＣＶＦ）の網羅的プロテオーム解析ならびに様々な母体／胎児の病的状態（例えば、羊水内感染、早期陣痛および／または染色体の欠陥）と正常なプロテオームとの特徴的な変化の相関に関する。本発明はさらに、様々な妊娠関連障害の非侵襲性診断のために使用することができる生物学的マーカーおよび生物学的マーカー群の同定ならびにそのような生物学的マーカーを使用する診断アッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来技術の説明
プロテオミクス
現在のＤＮＡクローニングおよび遺伝子プロファイリングアプローチを補う重要かつ必要な解析として、タンパク質発現パターンの大規模解析が新たに出現してきた（非特許文献１）。ＤＮＡ配列情報は、ホモロジー法に基づいていくつかの構造的および潜在的なタンパク質修飾を推定する際に有益であるが、翻訳後修飾、タンパク質分解または区画化によるタンパク質機能の制御に関する情報を提供しない。
【０００３】
１次元および２次元ゲル電気泳動などの従来のゲルベースの方法は、小規模なタンパク質の検出（＜１，０００タンパク質）に有用であるが、これらには、大量のサンプルが必要である（非特許文献２）。この限界を克服するためのアプローチとしては、サンプル中のタンパク質の質量を示すプロファイルを正確に生成する、マトリックス支援または表面増強レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩまたはＳＥＬＤＩ）飛行時間型質量分析計が挙げられる。これらのパターンまたはプロファイルを使用することにより、様々な疾患を同定し、モニターすることができる。第２レベルの同定は、ペプチドフラグメントからアミノ酸配列情報を生成するタンデム質量分析とペプチドマッピングを組み合わせることによってもたらされる。これは、例えば、四重極飛行時間型ＭＳ（Ｑｑ−ＴＯＦ  ＭＳ）とＭＡＬＤＩ／ＳＥＬＤＩまたはＥＳＩを組み合わせることによって達成され得る。四重極飛行時間型ＭＳは、特定のペプチドの定量化にも使用することができる（ＩＣＡＴ技術）。
【０００４】
母体／胎児の病的状態の診断
妊娠中に発症し得るか、健康を損ない得るか、あるいは、いくつかの場合では母親および／または胎児もしくは新生児の生命を脅かし得る、数多くの母体および胎児の病的状態（例えば、羊水内感染（ＩＡＩ）、子癇前症、早産および早期陣痛ならびに染色体異数性）が存在する。そのような状態の早期診断は、時宜を得た処置および介入を可能にするために非常に重要である。残念なことに、その臨床的な徴候および症状が遅れて顕れ、しばしば非特異的であり、一貫性がないので、これらの状態のほとんどに対する早期診断は困難である。例えば、ＩＡＩの臨床的な症状としては、代表的には、母体の発熱および白血球増加が挙げられるが、これらの症状は、しばしば遅れて顕れ、知覚しうるものでもなく、特異的でもない。例えば、非ヒト霊長類モデルを利用した非特許文献３では、Ｂ群連鎖球菌属による実験上の羊水内感染の後に、発熱および白血球増加が、実験上の感染の２８〜４０時間後に生じる、感染症に誘発される早期陣痛の発生時点において５０％だけに現れることが証明された。ゆえに、診断の遅れを回避するために、疑いの高い指標および補助的な臨床検査を適切に使用することは当然のことである。ＩＡＩを診断するために通常使用される臨床基準としては、以下のもの：母体の白血球増加（≧１５，０００／ｍｍ３）、母体もしくは胎児の頻拍、子宮圧痛または悪臭のある羊水、のうちの２つ以上に加えた、母体の発熱（≧３７．８℃）が挙げられる。
【０００５】
臨床的特徴が一致しないので、ＩＡＩの診断を支援するために他の補助的な臨床検査が利用されている。これらとしては：母体のＣ反応性タンパク質の測定、白血球またはグラム染色に対する細菌についての羊水の直接的な検査、羊水培養、羊水中のグルコース濃度の測定、羊水中の白血球エステラーゼの検出、ガス液体クロマトグラフィによる細菌の有機酸の検出、様々な羊水または膣のサイトカイン（例えば、インターロイキン２、４、６、顆粒球コロニー刺激因子および腫瘍壊死因子−α）、マトリックスメタロプロテアーゼ−９、ラクトフェリンの測定、および超音波検査による胎児の活動（生物物理学的プロファイル）の評価が挙げられる。サイトカインまたは他の生化学的な因子の測定は、高価であり、一般に臨床的には利用できないものであり、主に研究ツールとして使用される。さらに、これらの検査の検査効率は、容易に利用可能な従来の検査（例えば、羊水のグラム染色および培養、羊水中のグルコース濃度ならびに羊水中の白血球エステラーゼの検出）よりも一貫して良くない。これらの検査の効率は、以前に広く概説されている（非特許文献４）。すべての検査が妥当な感度、特異性および予測値を有するにもかかわらず、そのどれもがＩＡＩの診断において臨床的特徴と無関係に利用できるのに十分な感度または特異性を有しない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ＰａｎｄｅｙおよびＭａｎｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ４０５：８３７−４６（２０００）
【非特許文献２】Ｌｉｌｌｅｙ  ＫＳ，Ｒａｚｚａｑ  Ａ，Ｄｕｐｒｅｅ  Ｐ：Ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｓａｍｐｌｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．６（１）：４６−５０，２００２
【非特許文献３】Ｇｒａｖｅｔｔら、Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．１７１：１６６０−７（１９９４）
【非特許文献４】Ｏｈｌｓｓｏｎ，Ａ．およびＷａｎｇ，Ｅ．：Ａｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｎｔｅｎａｔａｌ  ｔｅｓｔｓ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｔ  ｐｒｅｔｅｒｍ  ｒｕｐｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ  １６２：８０９，１９９０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、ＩＡＩおよび他の母体／胎児の病的状態、特に早期陣痛および早産を早期かつ正確に診断することができる新規アプローチが強く求められている。
【０００８】
染色体異数性の診断のために、新規の効率的な信頼性の高い非侵襲性の方法を開発することが特に望ましい。現在、母体の血清スクリーニングおよび超音波検査の後の染色体異数性の確定診断には、妊娠中期の遺伝学的な羊水穿刺検査が必要である。これは、０．５％という妊娠喪失のリスクを伴う侵襲性の手技である。さらに、羊水細胞の染色体解析は、大きな労働力を要し、最大２週間を必要とする時間のかかる手技である。ゆえに、母体血清または他の生体液からの染色体異数性の検出が改善され、母体スクリーニングの容認しがたい高偽陽性率が低下し、そして羊水穿刺後の羊水からの診断の速度および効率が高い、信頼性の高い検査が必要である。他の病的な異数性の状態（例えば、クラインフェルター症候群およびターナー症候群）は、超音波検査を用いたスクリーニングまたは従来の母体の血清スクリーニングによって完全に見落とされることがある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の要旨
本発明は、生体液のプロテオーム解析による胎児／母体の病的状態の早期診断、予後診断およびモニタリングのための非侵襲性かつ感度の高い方法を提供する。
【００１０】
本発明は、様々な胎児／母体の病的状態（例えば、羊水内感染（ＩＡＩ）、染色体異数性ならびに胎児の成長および成熟に関連する胎児疾患が挙げられるがこれらに限定されない）の診断、予後診断およびモニタリングを可能にする、羊水および母体血清などの生体液のプロテオミクスプロファイルをさらに提供する。特に、本発明は、ＩＡＩおよび染色体異数性に対する正常および病的なプロテオミクスプロファイルを提供する。正常なプロテオミクスプロファイルの測定は、非常に重要である。なぜなら、それが、対象となる胎児／母体の状態の排除（陰性診断）を可能にするからであり、それによって、その患者を不必要な処置または介入および潜在的に危険である処置または介入に供する必要がなくなる。
【００１１】
本発明はさらに、ＩＡＩおよび染色体異数性の存在および状態に対して特異的な生物学的マーカーを提供し、そのマーカーは、そのような病的状態が存在する場合に、羊水または母体血清などの生体液において異なって発現されるものである。
【００１２】
１つの局面において、本発明は、母体または胎児の状態の状況を判定するための方法に関し、この方法は、哺乳動物被験体から得られた生体液の試験サンプルのプロテオミクスプロファイルを、正常サンプルのプロテオミクスプロファイルまたはそのような状態に特徴的な少なくとも１つの特有の発現サイン（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）を含んでいる参照プロテオミクスプロファイルと比較する工程を包含する。
【００１３】
この方法の実施形態において、哺乳動物被験体は、妊娠中の雌性の、好ましくは霊長類またはヒトである。
【００１４】
別の実施形態において、母体の状態は、子宮内感染、子癇前症および早期陣痛からなる群から選択される。
【００１５】
さらなる実施形態において、胎児の状態は、染色体異数性、先天性奇形、在胎期間および胎児の成熟からなる群から選択され、ここで、染色体の異数性は、例えば、ダウン症候群、１３トリソミー、１８トリソミー、ターナー症候群またはクラインフェルター症候群であり得る。
【００１６】
本発明の方法を実施する際、任意の生体液を使用することができ、その体液としては、羊水、血清、血漿、尿、脳脊髄液、母乳、粘液および唾液、好ましくは、羊水または母体血清が挙げられるがこれらに限定されない。
【００１７】
さらなる実施形態において、試験サンプルのプロテオミクスプロファイルは、少なくとも２個のタンパク質または少なくとも５個のタンパク質または少なくとも１０個のタンパク質または少なくとも２０個のタンパク質または少なくとも５０個のタンパク質の情報を含む。
【００１８】
特定の実施形態において、プロテオミクスプロファイルは、質量スペクトルである。
【００１９】
別の実施形態において、質量スペクトルは、３〜５ｋＤの範囲の質量スペクトルにおける少なくとも１つの特有の発現サインを含む。
【００２０】
さらに別の実施形態において、質量スペクトルは、１０〜１２ｋＤの範囲の質量スペクトルにおける少なくとも１つの特有の発現サインを含む。
【００２１】
さらなる実施形態において、母体の状態は、羊水内感染であり、特有の発現サインは、試験サンプル中の１０〜１１ｋＤａの分子量範囲における特別なピークであり、それが羊水内感染を示唆する。
【００２２】
異なる実施形態において、プロテオミクスプロファイルは、ウエスタンブロット解析によって生成される。
【００２３】
別の実施形態において、生体液は、ヒトの生体液であり、プロテオミクスプロファイルは：マクロファージキャッピングタンパク質、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン、ミエロペルオキシダーゼ；Ｌ−プラスチン；アズロシジン（ａｚｕｒｏｃｉｄｉｎ）；抗菌性タンパク質ＦＡＬＬ−３９；Ｇｐ３４０バリアントタンパク質；エブナー唾液腺（Ｅｂｎｅｒ  ｓａｌｉｖａｒｙ  ｇｌａｎｄ）タンパク質ホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｅ）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号３５５３９２）；白血球エラスターゼインヒビター；カルグラニュリン（ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ）Ａ；カルグラニュリンＢ；コフィリン；モエシン（ｍｏｅｓｉｎ）；プロフィリンＩ、クロニン（ｃｒｏｎｉｎ）様タンパク質ｐ５７；アネキシンＩＩ、フィブロネクチン；グリア由来ネキシン；アンチトロンビン−ＩＩＩ；扁平上皮癌抗原１、扁平上皮癌抗原２；セルピン１２；シスタチンＡ；シスタチンＢ；シスタチンＣ；ＩＧＦＢＰ−１；ビタミンＤ結合タンパク質；アポリポタンパク質Ａ−Ｉ；１４−３−３タンパク質シグマ；１４−３−３タンパク質ゼータ／デルタ；ゲルゾリン；ラクトトランスフェリン；ホスホグリセリン酸キナーゼ１；ホスホグリセリン酸ムターゼ１；およびトランスケトラーゼ；またはそれらのフラグメント、前駆体もしくは天然に存在するバリアントからなる群から選択されるタンパク質のうちの１つ以上の発現の情報を含む。
【００２４】
さらなる実施形態において、プロテオミクスプロファイルは、マクロファージキャッピングタンパク質；好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン；ミエロペルオキシダーゼ；Ｌ−プラスチン；アズロシジン；抗菌性タンパク質ＦＡＬＬ−３９；白血球エラスターゼインヒビター；カルグラニュリンＡ；カルグラニュリンＢ；プロフィリンＩ、グリア由来ネキシン；セルピン１２；シスタチンＡ；およびＩＧＦＢＰ−１；またはそれらのフラグメント、前駆体もしくは天然に存在するバリアントからなる群から選択されるタンパク質のうちの１つ以上の発現の情報を含む。
【００２５】
前述の方法は、様々な胎児および母体の状態の診断に適しており、その状態としては、羊水内感染、発生上の欠陥（器官系の欠陥を含む）、骨格筋奇形および染色体異数性が原因の状態（例えば、ダウン症候群、１３トリソミー、１８トリソミー、ターナー症候群またはクラインフェルター症候群）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２６】
試験サンプルのプロテオミクスプロファイルが、正常サンプルのプロテオミクスプロファイルと本質的に同じである場合、その被験体は、上記の母体または胎児の状態を有しないと判定される。
【００２７】
プロテオミクスプロファイルが、罹患サンプルと本質的に同じ特有の発現サインを含んでいる場合、その患者は、対応する母体（ｍａｔｅｒａｌ）または胎児の状態を有すると診断される。
【００２８】
別の局面において、本発明は、羊水内感染を診断するための方法に関し、この方法は、
（ａ）妊娠中の雌性哺乳動物から得られた生体液の試験サンプルのプロテオミクスプロファイルを正常サンプルのプロテオミクスプロファイルまたは参照プロテオミクスプロファイルと比較する工程（ここで、そのプロテオミクスプロファイルは、サンプル中に存在するタンパク質またはそのタンパク分解性フラグメントの質量の情報を提供する）；および
（ｂ）試験サンプルのプロテオミクスプロファイルが、３〜５および／または１０〜１２ＫＤａの分子量範囲において特有の発現サインを示す場合に、その哺乳動物を、羊水内感染を有すると診断する工程
を包含する。
【００２９】
さらなる局面において、本発明は、羊水内感染を診断するための方法に関し、その方法は：
（ａ）妊娠中の雌性哺乳動物から得られた生体液の試験サンプルのプロテオミクスプロファイルを正常サンプルのプロテオミクスプロファイルと比較する工程；および
（ｂ）ＩＧＦＢ−１、プロフィリン、セルロプラスミン、Ｌ−プラスチンおよびカルグラニュリン（ｃａｌｇｒａｕｌｉｎ）またはそれらのフラグメント、前駆体もしくは天然に存在するバリアントからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質が、正常サンプルと比べて、試験サンプルにおいて異なって発現している場合に、その哺乳動物を、羊水内感染を有すると診断する工程
を包含する。
【００３０】
特定の実施形態において、ＩＧＦＢＰ−１、プロフィリン、セルロプラスミンおよびカルグラニュリンまたはそれらのフラグメント、前駆体もしくは天然に存在するバリアントのうちの少なくとも１つが、正常サンプルと比べて、試験サンプルにおいて過剰発現している。
【００３１】
別の実施形態において、Ｌ−プラスチンが、正常サンプルと比べて、試験サンプルにおいて過小発現している。
【００３２】
さらに別の実施形態において、ＩＧＦＢＰ−１の存在は、図１２に示されるタンパク分解性フラグメントまたはそのフラグメントを同定することによって検出される。
【００３３】
別の局面において、本発明は、染色体の異数性を診断するための方法に関し、この方法は：
（ａ）妊娠中の雌性哺乳動物から得られた生体液の試験サンプルのプロテオミクスプロファイルを正常サンプルのプロテオミクスプロファイルまたは参照プロテオミクスプロファイルと比較する工程（ここで、そのプロテオミクスプロファイルは、サンプル中に存在するタンパク質またはそのタンパク分解性フラグメントの質量の情報を提供する）；および
（ｂ）試験サンプルのプロテオミクスプロファイルが、４〜１５ＫＤａの分子量範囲において特有の発現サインを示す場合に、その哺乳動物を、染色体の異数性を有すると診断する工程を包含する。
【００３４】
異なる局面において、本発明は、胎児の発生上の欠陥を診断するための方法に関し、この方法は：
（ａ）妊娠中の雌性哺乳動物から得られた生体液の試験サンプルのプロテオミクスプロファイルを正常サンプルのプロテオミクスプロファイルまたは参照プロテオミクスプロファイルと比較する工程；および
（ｂ）少なくとも１つのアクチン調節タンパク質またはそれらのフラグメント、前駆体もしくは天然に存在するバリアントが、正常サンプルと比べて、試験サンプルにおいて異なって発現している場合に、発生上の欠陥の存在を確認する工程
を包含する。
【００３５】
この方法の特定の実施形態において、アクチン調節タンパク質は、モエシン、ｐ５７、ゲルゾリンおよび１４−３−３タンパク質からなる群から選択される。
【００３６】
さらなる局面において、本発明は、母体もしくは胎児の感染症または免疫応答関連障害を診断するための方法に関し、この方法は：
（ａ）妊娠中の雌性哺乳動物から得られた生体液の試験サンプルのプロテオミクスプロファイルを正常サンプルのプロテオミクスプロファイルまたは参照プロテオミクスプロファイルと比較する工程；および
（ｂ）マクロファージキャッピングタンパク質（ＭＣＰ）、白血球エラスターゼ、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ｌｉｐｃａｌｃｉｎ）（ＮＧＡＬ）、ミエロペルオキシダーゼ、Ｌ−プラスチン、カルグラニュリン、ＦＡＬＬ−３９、アズロシジン（ａｚｙｒｏｃｉｄｉｎ）（ＣＡＰ３７）、プロテアーゼおよびプロテアーゼインヒビターからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質が、正常サンプルと比べて、試験サンプルにおいて異なって発現している場合に、母体もしくは胎児の感染症または免疫応答関連障害の存在を確認する工程
を包含する。
【００３７】
なおもさらなる局面において、本発明は、新生児敗血症を診断するための方法に関し、その方法は、妊娠中の雌性哺乳動物から得られる生体液のプロテオミクスプロファイルにおいてＧｐ−３４０の存在を検出する工程を包含する。
【００３８】
さらに別の局面において、本発明は、マクロファージキャッピングタンパク質、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン、ミエロペルオキシダーゼ；Ｌ−プラスチン；アズロシジン；抗菌性タンパク質ＦＡＬＬ−３９；Ｇｐ３４０バリアントタンパク質；エブナー唾液腺タンパク質ホモログ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号３５５３９２）；白血球エラスターゼインヒビター；カルグラニュリンＡ；カルグラニュリンＢ；コフィリン；モエシン；プロフィリンＩ、クロニン様タンパク質ｐ５７；アネキシンＩＩ、フィブロネクチン；グリア由来ネキシン；アンチトロンビン−ＩＩＩ；扁平上皮癌抗原１、扁平上皮癌抗原２；セルピン１２；シスタチンＡ；シスタチンＢ；シスタチンＣ；ＩＧＦＢＰ−１；ビタミンＤ結合タンパク質；アポリポタンパク質Ａ−Ｉ；１４−３−３タンパク質シグマ；１４−３−３タンパク質ゼータ／デルタ；ゲルゾリン；ラクトトランスフェリン；ホスホグリセリン酸キナーゼ１；ホスホグリセリン酸ムターゼ１；およびトランスケトラーゼ；またはそれらのフラグメント、前駆体もしくは天然に存在するバリアントからなる群から選択される１つ以上のタンパク質の情報を含む生体液のプロテオミクスプロファイルに関する。
【００３９】
さらなる局面において、本発明は、マクロファージキャッピングタンパク質；好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン；ミエロペルオキシダーゼ；Ｌ−プラスチン；アズロシジン；抗菌性タンパク質ＦＡＬＬ−３９；白血球エラスターゼインヒビター；カルグラニュリンＡ；カルグラニュリンＢ；プロフィリンＩ、グリア由来ネキシン；セルピン１２；シスタチンＡ；およびＩＧＦＢＰ−１；またはそれらのフラグメント、前駆体もしくは天然に存在するバリアントからなる群から選択される１つ以上のタンパク質の情報を含む生体液のプロテオミクスプロファイルに関する。
【００４０】
本発明は、ＩＧＦＢ−１、プロフィリン、セルロプラスミン、Ｌ−プラスチンおよびカルグラニュリンからなる群から選択されるタンパク質の存在を確認する情報を含む羊水内感染に特徴的な生体液のプロテオミクスプロファイルにさらに関する。
【００４１】
別の局面において、本発明は、３〜５ＫＤａおよび／または１０〜１２ＫＤａの分子量範囲における特有の発現サインを含む生体液中に存在するタンパク質またはそのタンパク分解性フラグメントの分子量の情報を提供する形態で表された、羊水内感染に特徴的な生体液のプロテオミクスプロファイルに関する。
【００４２】
さらなる局面において、本発明は、本質的には図１Ａ〜１Ｃのいずれか１つに示されるような、または本質的には図２Ａ〜Ｃのいずれか１つに示されるような、または本質的には図３Ａ〜Ｃのいずれか１つに示されるような、または本質的には図４Ａもしくは４Ｂに示されるような、または本質的には図６〜１０のいずれか１つに示されるような、プロテオミクスプロファイルに関する。
【００４３】
特定の実施形態において、プロテオミクスプロファイルは、マイクロアレイ形式で解析される。
【００４４】
別の局面において、本発明は、妊娠中の雌性哺乳動物被験体における子宮内感染の存在を判定するための方法に関し、この方法は：
（ａ）前記被験体から得られた子宮頸部膣液のサンプルにおいて、ハプトグロビン前駆体（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ００７３８）；アルファ−１−酸糖タンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０２７６３）、表皮型脂肪酸結合タンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｑ０１４６９）およびインスリン様成長因子結合タンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０８８３３）からなる群から選択される２つ以上のタンパク質の存在量を、正常な子宮頸部液（ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｆｌｕｉｄ）または子宮内感染を示していることが知られている子宮頸部液における存在量と比べて検査する工程；および
（ｂ）前記存在量が、前記正常な子宮頸部液における存在量と比べて統計学的有意差を示すか、または子宮内感染を示していることが知られている前記子宮頸部液における存在量と比べて統計学的有意差を示さない場合に、子宮内感染が存在すると結論を下す工程
を包含する。その哺乳動物被験体は、好ましくはヒトである。様々な実施形態において、列挙されたタンパク質のうちの少なくとも３つまたは４つすべての存在量が検査される。
【００４５】
別の実施形態において、上記方法は、プロフィリン−１（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０７７３７）；血清アルブミン前駆体（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ２７６８）；カルグラニュリンＢ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０６７０２）；および扁平上皮癌抗原１（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ２９５０８）からなる群から選択される１つ以上のさらなるタンパク質の存在量を検査する工程を包含し得る。
【００４６】
さらに別の実施形態において、以下の群から選択される少なくとも１つのさらなるタンパク質の存在量が検査される：アルファ−１−抗トリプシン前駆体（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０１００９）；フィブロネクチン前駆体（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０２７５１）；アネキシンＡ２（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０７３５５）；ビタミンＤ結合タンパク質前駆体（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０２７７４）。
【００４７】
さらなる実施形態において、以下の群から選択される少なくとも１つのさらなるタンパク質の存在量が検査される：シスタチンＡ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０１０４０）；ムチン−５Ｂ前駆体（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｑ９ＨＣ８４）；小型プロリンリッチタンパク質３（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｑ９ＵＢＣ９）；リゾチームＣ前駆体（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ６１６２６）；およびセロトランスフェリン（ｓｅｒｏｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）前駆体（Ｐ０２７８７）。
【００４８】
なおもさらなる実施形態において、以下の群から選択される少なくとも１つのさらなるタンパク質の存在量が検査される：シスタチンＡ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０１０４０）；ムチン−５Ｂ前駆体（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｑ９ＨＣ８４）；小型プロリンリッチタンパク質３（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｑ９ＵＢＣ９）；リゾチームＣ前駆体（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ６１６２６）；およびセロトランスフェリン前駆体（Ｐ０２７８７）。
【００４９】
そのようなタンパク質の存在量は、当該分野で公知の任意の方法（例えば、イムノアッセイ、質量分析による方法またはタンパク質アレイを用いる方法）によって測定され得る。
【００５０】
さらなる局面において、本発明は、早期陣痛の症状を示している妊娠中の雌性哺乳動物被験体における早産の可能性を判定するための方法に関し、この方法は、
（ａ）その被験体から得られた子宮頸部膣液のサンプルにおいて、ハプトグロビン前駆体（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ００７３８）；アルファ−１−酸糖タンパク質１（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０２７６３）、表皮型脂肪酸結合タンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｑ０１４６９）およびインスリン様成長因子結合タンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０８８３３）からなる群から選択される２つ以上のタンパク質の存在量を、正常な子宮頸部液または子宮内感染を示していることが知られている子宮頸部液における存在量と比べて検査する工程；および
（ｂ）その存在量が、前記正常な子宮頸部液における存在量と比べて統計学的有意差を示すか、または子宮内感染を示していることが知られている子宮頸部液における存在量と比べて統計学的有意差を示さない場合に、早産の発生を予測する工程
を包含する。
【００５１】
前の局面のとおり、上記方法は、上で列挙されたタンパク質などの１つ以上のさらなるタンパク質の存在量を検査する工程を包含し得る。
【００５２】
さらなる実施形態において、早産の発生を、上に記載されたように行われる検査に基づいて予測することができない場合、フィブロネクチン前駆体（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０２７５１）の存在量についてその被験体をさらに検査し、そのような存在量が、正常な子宮頸部液における存在量と比べて統計学的有意差を示す場合に、早産の発生が予測される。
【００５３】
特定の実施形態において、フィブロネクチン前駆体（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０２７５１）の存在量は、工程（ａ）の前に測定される。
【００５４】
さらなる局面において、本発明は、ハプトグロビン前駆体（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ００７３８）；アルファ−１−酸糖タンパク質１（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０２７６３）；表皮型脂肪酸結合タンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｑ０１４６９）；およびインスリン様成長因子結合タンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０８８３３）からなる群から選択される２つ以上のタンパク質を検出するための抗体および試薬を備えたイムノアッセイキットに関する。
【００５５】
１つの実施形態において、上記イムノアッセイキットは、プロフィリン−１（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０７７３７）；血清アルブミン前駆体（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ２７６８）；カルグラニュリンＢ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０６７０２）；扁平上皮癌抗原１（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ２９５０８）；アルファ−１−抗トリプシン前駆体（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０１００９）；フィブロネクチン前駆体（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０２７５１）；アネキシンＡ２（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０７３５５）；ビタミンＤ結合タンパク質前駆体（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０２７７４）；シスタチンＡ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０１０４０）；ムチン−５Ｂ前駆体（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｑ９ＨＣ８４）；小型プロリンリッチタンパク質３（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｑ９ＵＢＣ９）；リゾチームＣ前駆体（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ６１６２６）；およびセロトランスフェリン前駆体（Ｐ０２７８７）；シスタチンＡ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０１０４０）；ムチン−５Ｂ前駆体（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｑ９ＨＣ８４）；小型プロリンリッチタンパク質３（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｑ９ＵＢＣ９）；およびリゾチームＣ前駆体（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ６１６２６）；およびセロトランスフェリン前駆体（Ｐ０２７８７）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質を検出するための抗体および試薬をさらに備える。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１Ａ】霊長類の羊水における、感染に誘導される差次的なタンパク質発現。既知組成の順相チップアレイに結合している羊水抽出物のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ解析。Ａ）ピーク強度の差を示している、２３５レーザー強度において回収された全体のスペクトル。Ｂ）コントロールと感染との間で１０〜１２ＫＤａ領域において差を示している詳細なスペクトル。Ｃ）コントロールと感染との間で３〜５ＫＤａ領域において差を示している詳細なスペクトル。実線は、診断検査を開発するために使用され得る発現の有意差（特有の発現サイン）を示すために使用した。
【図１Ｂ】霊長類の羊水における、感染に誘導される差次的なタンパク質発現。既知組成の順相チップアレイに結合している羊水抽出物のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ解析。Ａ）ピーク強度の差を示している、２３５レーザー強度において回収された全体のスペクトル。Ｂ）コントロールと感染との間で１０〜１２ＫＤａ領域において差を示している詳細なスペクトル。Ｃ）コントロールと感染との間で３〜５ＫＤａ領域において差を示している詳細なスペクトル。実線は、診断検査を開発するために使用され得る発現の有意差（特有の発現サイン）を示すために使用した。
【図１Ｃ】霊長類の羊水における、感染に誘導される差次的なタンパク質発現。既知組成の順相チップアレイに結合している羊水抽出物のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ解析。Ａ）ピーク強度の差を示している、２３５レーザー強度において回収された全体のスペクトル。Ｂ）コントロールと感染との間で１０〜１２ＫＤａ領域において差を示している詳細なスペクトル。Ｃ）コントロールと感染との間で３〜５ＫＤａ領域において差を示している詳細なスペクトル。実線は、診断検査を開発するために使用され得る発現の有意差（特有の発現サイン）を示すために使用した。
【図２】感染（ＧＢＳ）に応答した霊長類羊水の経時的な解析。細菌接種の前および感染後は連続的に羊水を回収し、以下に記載するようなＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ解析に供した。図２Ａ：感染前；２Ｂ：感染の１２時間後；２Ｃ：感染の３６時間後。
【図３Ａ】ヒト羊水中における、感染に誘導される差次的なタンパク質発現。既知組成の順相チップアレイに結合している羊水抽出物のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ解析。Ａ）ピーク強度の差を示している、２３５レーザー強度において回収された全体のスペクトル。Ｂ）コントロールと感染との間で、１０〜１２ＫＤａの領域において差を示している詳細なスペクトル。Ｃ）コントロールと感染との間で、３〜５ＫＤａの領域において差を示している詳細なスペクトル。Ｄ）コントロールと感染とを区別する、ピーク強度に基づいたクラスター。
【図３Ｂ】ヒト羊水中における、感染に誘導される差次的なタンパク質発現。既知組成の順相チップアレイに結合している羊水抽出物のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ解析。Ａ）ピーク強度の差を示している、２３５レーザー強度において回収された全体のスペクトル。Ｂ）コントロールと感染との間で、１０〜１２ＫＤａの領域において差を示している詳細なスペクトル。Ｃ）コントロールと感染との間で、３〜５ＫＤａの領域において差を示している詳細なスペクトル。Ｄ）コントロールと感染とを区別する、ピーク強度に基づいたクラスター。
【図３Ｃ】ヒト羊水中における、感染に誘導される差次的なタンパク質発現。既知組成の順相チップアレイに結合している羊水抽出物のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ解析。Ａ）ピーク強度の差を示している、２３５レーザー強度において回収された全体のスペクトル。Ｂ）コントロールと感染との間で、１０〜１２ＫＤａの領域において差を示している詳細なスペクトル。Ｃ）コントロールと感染との間で、３〜５ＫＤａの領域において差を示している詳細なスペクトル。Ｄ）コントロールと感染とを区別する、ピーク強度に基づいたクラスター。
【図４Ａ】ヒトのＡ）子宮内感染を有しないコントロールおよびＢ）子宮内感染を有するサンプルからの羊水を用いた、一般的なＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計において取得された質量スペクトル。
【図４Ｂ】ヒトのＡ）子宮内感染を有しないコントロールおよびＢ）子宮内感染を有するサンプルからの羊水を用いた、一般的なＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計において取得された質量スペクトル。
【図５】ＳＤＳ−ＰＡＧＥのクマシー（Ｃｏｍｍａｓｓｉｅ）ブルーで染色したゲル。Ａ）４個のプールされたコントロールヒトＡＦサンプル；Ｂ）個別のコントロールＡＦサンプル；Ｃ）４個のプールされたヒト感染ＡＦサンプル；Ｄ）個別の感染ＡＦサンプル。
【図６】ヒト羊水における差次的なタンパク質発現の検出。Ａ）コントロールＡＦサンプル（プールされたもの）；Ｂ）感染ＡＦサンプル（プールされたもの）。
【図７】ヒト羊水における差次的なタンパク質発現の検出。Ａ）コントロールＡＦサンプル（プールされたもの）；Ｂ）感染ＡＦサンプル（プールされたもの）。
【図８】図８は、ヒト羊水および母体血清における差次的なタンパク質発現の検出を示している。Ａ）コントロールサンプル（プールされたもの）；Ｂ）感染サンプル（プールされたもの）。
【図９】図９は、タンパク質アレイを使用した、母体血清において異なって発現しているタンパク質の検出を示している。１）対応するタンパク質とそれらの抗体との結合を示しているタンパク質アレイの疑似カラー像；２）そのアレイを拡大したもの；３）カルグラニュリンＩＰのウエスタンブロット。
【図１０】図１０は、トリソミーを区別する特有プロファイルを有する母体血清における差次的なタンパク質発現パターンを示している。
【図１１】羊水タンパク質のデノボタンパク質配列同定の概略図。ＰＲＯ１＿ＨＵＭＡＮ（Ｐ０７７３７）プロフィリンＩ（配列番号：５〜１１）。
【図１２】ＩＧＦＢＰ−１デノボタンパク質同定およびタンパク分解性フラグメント配列（配列番号：１）。Ｍｓ／ＭＳを用いてサンプル０４２６ｓｅ＿Ｈ１＿１２および０４２５ｓｅ＿Ｈ１＿１３において見出されたペプチド配列を小文字で示している（配列番号：２および３。これらは、トリプシン消化し、ＭＳ／ＭＳ解析に供した１−Ｄゲルバンドにおいて行ったときの感染羊水に由来したものである。感染羊水由来のトリプシン消化された約１０．５〜１２ＫＤａバンドの、１−Ｄゲル（ｄｅｌｓ）（低分子量範囲、図５）、ウエスタンブロット（図６）およびＭＳ／ＭＳ解析（図１３）において検出されたＩＧＦ−ＢＰ−１のタンパク分解性フラグメントを、下線が引かれた配列の領域に表している（配列番号：４）。
【図１３】感染羊水からの１０．５〜１１ｋＤ  ＩＤゲルバンドのトリプシン消化物のＬＣＱ−ＭＳプロファイル。ＬＣＱ−ＭＳは、サンプル中に存在する潜在的なタンパク質を代表する親イオンを示している。
【図１４】図１３に示される、１７．５５〜１８．２１分の保持時間におけるピークに対する質量スペクトル。
【図１５】図１４に示される４３４．９ピークの親イオンに対するＭＳ／ＭＳスペクトル。
【図１６Ａ】すべてのサンプルから取得したＬＣ／ＭＳ／ＭＳスペクトル（１６ａ−Ｉ）を、図１６ｂに示されているバイオインフォマティクスワークフローを用いて処理した。個別のサンプルからのタンパク質同定（１６ａ−ＩＩ）を網羅的なタンパク質リストに統合した（１６ａ−ＩＩＩ）。その網羅的リスト由来の少なくとも３個の特有ペプチドヒットを有したすべてのタンパク質を、手作業での確認なしに表４に含めることを認めた（１６ａ−ＩＶ）。最も多い２つの特有のペプチドヒットを有した網羅的リスト内のタンパク質を、方法の項に概説した基準を用いて手作業で確認した（１６ａ−ＩＶ）。手作業確認を通過した２つの特有のペプチドヒットを有するすべてのタンパク質を表４に加えた（１６ａ−ＩＶ）。手作業確認を通過した単一のペプチドヒットを有したタンパク質を表５に加えた（図１６ａ−ＩＶ）。図１６ｂは、タンパク質およびペプチドを同定するためのバイオインフォマティクスワークフローを示している。サンプルからのＬＣ／ＭＳ／ＭＳスペクトルを同位体除去し（ｄｅｉｓｏｔｏｐｅｄ）、セントロイドした（ｃｅｎｔｒｉｏｄｅｄ）（１６ｂ−Ｉ）。ＴｕｒｂｏＳｅｑｕｅｓｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、Ｘ！Ｔａｎｄｅｍ（Ｆｅｎｙｏ，Ｄ．；ら、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ２００３，７５，（４），７６８−７４）およびＯｐｅｎＳｅａ  Ｓｅａｒｌｅ，Ｂ．Ｃ．，ら、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ２００４，７６，（８），２２２０−３０；Ｓｅａｒｌｅ，Ｂ．Ｃ．ｅｔ  ａ．，Ｊ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ  ２００５，４，（２），５４６−５４．）を用いて、組み合わされたタンパク質データベース（方法の項を参照のこと）に対して、前処理されたＭＳ／ＭＳスペクトルを検索することによって、サンプル中のペプチドおよびタンパク質を同定した。３つすべてのプログラムからのペプチドヒットおよびタンパク質ヒットを、Ｓｃａｆｆｏｌｄソフトウェア（Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）を用いて統合した。
【図１６Ｂ】すべてのサンプルから取得したＬＣ／ＭＳ／ＭＳスペクトル（１６ａ−Ｉ）を、図１６ｂに示されているバイオインフォマティクスワークフローを用いて処理した。個別のサンプルからのタンパク質同定（１６ａ−ＩＩ）を網羅的なタンパク質リストに統合した（１６ａ−ＩＩＩ）。その網羅的リスト由来の少なくとも３個の特有ペプチドヒットを有したすべてのタンパク質を、手作業での確認なしに表４に含めることを認めた（１６ａ−ＩＶ）。最も多い２つの特有のペプチドヒットを有した網羅的リスト内のタンパク質を、方法の項に概説した基準を用いて手作業で確認した（１６ａ−ＩＶ）。手作業確認を通過した２つの特有のペプチドヒットを有するすべてのタンパク質を表４に加えた（１６ａ−ＩＶ）。手作業確認を通過した単一のペプチドヒットを有したタンパク質を表５に加えた（図１６ａ−ＩＶ）。図１６ｂは、タンパク質およびペプチドを同定するためのバイオインフォマティクスワークフローを示している。サンプルからのＬＣ／ＭＳ／ＭＳスペクトルを同位体除去し（ｄｅｉｓｏｔｏｐｅｄ）、セントロイドした（ｃｅｎｔｒｉｏｄｅｄ）（１６ｂ−Ｉ）。ＴｕｒｂｏＳｅｑｕｅｓｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、Ｘ！Ｔａｎｄｅｍ（Ｆｅｎｙｏ，Ｄ．；ら、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ２００３，７５，（４），７６８−７４）およびＯｐｅｎＳｅａ  Ｓｅａｒｌｅ，Ｂ．Ｃ．，ら、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ２００４，７６，（８），２２２０−３０；Ｓｅａｒｌｅ，Ｂ．Ｃ．ｅｔ  ａ．，Ｊ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ  ２００５，４，（２），５４６−５４．）を用いて、組み合わされたタンパク質データベース（方法の項を参照のこと）に対して、前処理されたＭＳ／ＭＳスペクトルを検索することによって、サンプル中のペプチドおよびタンパク質を同定した。３つすべてのプログラムからのペプチドヒットおよびタンパク質ヒットを、Ｓｃａｆｆｏｌｄソフトウェア（Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）を用いて統合した。
【図１７】ＳＣＸ画分において同定された特有ペプチドの数の分布。ヒトＣＶＦ  ２Ｄ−ＬＣサンプル中の１画分あたりに同定された特有ペプチドの総数は、従来のゲルベースの電気泳動手法に対する本手法の利点を示している。
【図１８】異なる検索エンジン間でのスペクトルおよびタンパク質同定の重複。（Ａ）Ｓｅｑｕｅｓｔ、Ｘ！ＴａｎｄｅｍおよびＯｐｅｎＳｅａ検索エンジンを用いて、ヒトＣＶＦ  ２Ｄ−ＬＣ実験からの合計９，５０７個のＭＳ／ＭＳスペクトルを検索した。３つの独立した検索エンジンを使用するとき、サンプル中の合計５６０１個（５９％）のＭＳ／ＭＳスペクトルが、２つの特有ペプチド同定閾値において、タンパク質にマッチした。同定されたスペクトル（閾値より大きかったもの）の、検索エンジン間のパーセンテージの分布は、複数の独立した検索エンジンを使用することによって、サンプルにおいてより多くのＭＳ／ＭＳスペクトルが同定されたことを示している。（Ｂ）３つすべての検索エンジンを使用して、単一のヒトＣＶＦ  ２Ｄ−ＬＣサンプルからのＭＳ／ＭＳスペクトルを解析したとき、合計１１８個の候補タンパク質が同定された。３個の検索エンジン間における候補タンパク質ヒットの数の分布は、複数の独立した検索エンジンを使用することによって、より多くのタンパク質が同定されたことを示している。
【図１９】生物学的複製物におけるタンパク質ＩＤの分布。このベン図は、２Ｄ−ＬＣを用いて解析されたＣＶＦ生物学的複製物間のタンパク質同定の分布を示している。同定された合計１４７個のタンパク質のうち、１０２個のタンパク質が、両方のサンプルに存在し、４５個のタンパク質が、一方のサンプルまたは他方のサンプルに存在した。
【図２０】異なる解析アプローチにおけるタンパク質ＩＤの分布。タンパク質同定の割合は、生物学的複製物および実験的複製物を解析に加えることによって増加した。合計１５０個のタンパク質のうち、６２個のタンパク質が、１ＤＧＥ手法と２Ｄ−ＬＣ手法の両方によって検出され、８５個が、２Ｄ−ＬＣのみによって検出され、３個（このすべてが少なくとも２個の特有ペプチド同定を有した）が、１ＤＧＥのみによって検出された。
【図２１】ヒトＣＶＦにおけるタンパク質のトリプシンペプチドプロファイル。ＣＶＦにおいて同定されたタンパク質のトリプシンペプチドプロファイルは、同定の８９％超が少なくとも２個の特有ペプチド同定を有したことを示している；しかしながら、多岐にわたるトリプシンペプチド産物を有するタンパク質が、ＣＶＦにおいて同定された。
【図２２】ヒトＣＶＦプロテオームの機能的分類。ＤＡＶＩＤバイオインフォマティクスリソースＤｅｎｎｉｓ，Ｇ．，Ｊｒ．ら、ＧｅｎｏｍｅＢｉｏｌ  ２００３，４，Ｐ３において利用可能な機能的分類ツールを用いて、ヒトＣＶＦタンパク質の機能アノテーションを行った。合計１５０個の同定されたタンパク質のうち、３２％は、代謝に関与し、２２％は、免疫応答に関与し、１１％は、細胞分化に関与し、９％は、輸送に関与し、８％は、細胞の組織化に関与し、６％は、酵素の制御に関与し、３％は、シグナル伝達に関与し、３％は、細胞増殖に関与していた。同定されたタンパク質の６％に対しては、ＤＡＶＩＤデータベースにおいて、関連性のある機能アノテーション＊は見出されなかった。
【図２３】ＣＶＦにおいて発現していたタンパク質の機能アノテーションおよび細胞内局在。アノテーションデータベース（ＤＡＶＩＤ，バージョン２．０，ＮＩＡＩＤ）を用いて、ＧｅｎｅＯｎｔｏｌｏｇｙターム（ＧＯターム）について、ＭｕｄＰＩＴおよびゲルベース分画を用いて同定された２０５個のタンパク質を解析した。全タンパク質の８％が、既知の機能アノテーションを示さなかった。
【図２４】非ヒト霊長類ＣＶＦおよびＡＦサンプルにおけるＵｒｅａｐｌａｓｍａ  ｐａｒｖｕｍ誘導性の差次的タンパク質レベルのマトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）タンパク質プロファイル。１０．８ｋＤａのピークを示しているプロファイルが、（Ａ）実験的ＩＡＩの前および（Ｂ）実験的ＩＡＩの後に採取されたコントロールサンプルにおいて示されている。３〜５ｋＤａ  ＭＷ範囲においてペプチドを示しているプロファイルが、Ｃ）実験的ＩＡＩの前に採取されたコントロールサンプルおよびＤ）実験的ＩＡＩの後に採取されたサンプルにおいて示されている。ベースライン除去およびＳａｖｉｔｓｋｙ−Ｇｏｌａｙスムージングのために、１０Ｄａ／チャネルにおいて５サイクルの処理をスペクトルに対して行った。３０００〜２０００の範囲のｍ／ｚを示すスペクトルを、コントロールと感染との間で異なって発現していたピークを指し示す矢印とともに示している。
【図２５】ＩＡＩに対するＣＶＦ生物学的マーカーの免疫検出。ハプトグロビンは、制御されていないコントロールマーカーである。ＩＧＦＢＰ−１バンドは、完全なタンパク質（約３０ｋＤａ）およびタンパク分解性フラグメント（約１９ｋＤａ）を示している。
【図２６】ＰＴＬ、ＰＴＢおよびコントロールＣＶＦサンプルの２Ｄ  ＤＩＧＥ解析。Ａ．ＰＴＢ（緑色）とコントロール（赤色）とのオーバーレイ、（Ｂ）ＰＴＬ（緑色）およびコントロール（赤色）ならびに（Ｃ）ＰＴＢ（緑色）およびＰＴＬ（赤色）。Ｄ．ＰＴＢとＰＴＬとの間において異なる量で存在していたタンパク質のマップ。（Ｄ）パネルＣの差次的なスポットマップ。緑色の輪郭で示されているスポットは、ＰＴＢにおいて＞２倍多いことを示し、赤色の輪郭で示されているスポットは、ＰＴＬに対してＰＴＢにおいて＞２倍少ないことを示す。このスポットマップは、Ｐｈｏｒｅｔｉｘ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎによって生成された。同定されたタンパク質に番号を付け、それらを表９に示す。
【図２７】ヒトＣＶＦにおける自然早産の生物学的マーカーの免疫検出。各サンプル群を代表する５０μｇのＣＶＦタンパク質をブロットし、特異的な抗体をプローブに用いた。ＩＧＦＢＰ−１バンドは、完全なタンパク質（約３０ｋＤａ）およびタンパク分解性フラグメント（約１６および約１１ｋＤａ）を示している。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
好ましい実施形態の詳細な説明
Ｉ．定義
別段定義されない限り、本明細書中で使用される専門用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解されている意味と同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  １９９４）では、本願において使用される用語の多くに対する全般的な規準が当業者に提供されている。
【００５８】
用語「プロテオーム」は、所与の時点における生物学的サンプル中のかなりの部分のタンパク質のことを記述するために本明細書中で使用される。プロテオームという概念は、ゲノムとは基本的に異なるものである。ゲノムが実質的に静的なものである一方で、プロテオームは、内部および外部の事象に応答して絶えず変化するものである。
【００５９】
用語「プロテオミクスプロファイル」は、所与の時点における生物学的サンプル中、例えば、生体液中の複数のタンパク質の発現パターンを表しているものを指すために使用される。プロテオミクスプロファイルは、例えば、質量スペクトルとして表され得るが、タンパク質の任意の物理化学的または生化学的な特性に基づいた他の表現もまた含まれる。従って、プロテオミクスプロファイルは、例えば、２次元ゲル電気泳動、例えば、２−Ｄ  ＰＡＧＥによって判定されるようなタンパク質の電気泳動的特性の差に基づき得、例えば、２次元電気泳動ゲルにおける複数のスポットとして表され得る。差次的発現プロファイルは、詳細に同定されたタンパク質の非存在下においてでさえも重要な診断価値を有し得る。そして、単一タンパク質のスポットは、例えば、免疫ブロット法によって検出され得、複数のスポットまたはタンパク質は、タンパク質マイクロアレイを用いて検出され得る。プロテオミクスプロファイルは、代表的には、いくつかのピークから５０以上のピークを表す複雑なプロファイルまでにわたり得る情報を表しているか、または含んでいる。従って、例えば、プロテオミクスプロファイルは、少なくとも２個、または少なくとも５個、または少なくとも１０個、または少なくとも１５個、または少なくとも２０個、または少なくとも２５個、または少なくとも３０個、または少なくとも３５個、または少なくとも４０個、または少なくとも４５個、または少なくとも５０個、または少なくとも６０個、または少なくとも６５個、または少なくとも７０個、または少なくとも７５個、または少なくとも８０個、または少なくとも８５個、または少なくとも８５個、または少なくとも９０個、または少なくとも９５個、または少なくとも１００個、または少なくとも１２５個、または少なくとも１５０個、または少なくとも１７５個、または少なくとも２００個のタンパク質を含み得るか、または表し得る。
【００６０】
用語「病的状態」は、最も広い意味において使用され、被験体の健康を損なうすべての変化および現象を包含する。母体の病的状態としては、羊水内感染、胎児または母体の起源の状態、例えば、子癇前症ならびに早期陣痛および早産が挙げられるがこれらに限定されない。胎児の病的状態としては、ダウン症候群などの染色体の欠陥（異数性）ならびに在胎期間および胎児の成熟におけるすべての異常が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６１】
用語「［母体または胎児の］病的状態の状況」は、最も広い意味において本明細書中で使用され、病的状態が存在していないこと、存在すること、その程度、ステージ、性質、進行または後退のことを指す。
【００６２】
用語「特有の発現サイン」は、対応する正常な生物学的サンプル（同じタイプの起源、例えば、生体液から得られたもの）のプロテオミクスプロファイルと統計学的に有意な様式で異なる生物学的サンプル（例えば、参照サンプル）のプロテオミクスプロファイル内の特有の特徴またはモチーフのことを記述するために使用される。
【００６３】
用語「羊水内感染（ＩＡＩ）」、「羊水感染」、「羊膜炎」および「臨床的絨毛羊膜炎」は、交換可能に使用され、妊娠中の羊水および子宮内の内容物の急性感染（例えば細菌が挙げられるがこれに限定されない）のことを指す。
【００６４】
「患者の応答」は、患者の利益を示唆する任意のエンドポイントを用いて評価され得、そのエンドポイントとしては、（１）病的状態の進行の少なくともある程度の阻害、（２）病的状態の予防、（３）病的状態に関連する１つ以上の症状の少なくともある程度の軽減；（４）処置後の生存時間の延長；および／または（５）処置後の所与の時点における死亡率の低下が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６５】
用語「処置」とは、治療的な処置と、予防的または防止的な措置との両方のことを指し、ここで、その目的は、標的にされている病的状態または障害を予防するかまたは遅らせる（小さくする）ことである。処置の必要な者としては、その障害をすでに有している者ならびにその障害を有する傾向のある者またはその障害が予防されるべき者が挙げられる。
【００６６】
「先天性奇形」は、非遺伝性であるが出生時に存在している異常である。
【００６７】
任意の特定のタンパク質の表示は、本明細書中で使用されるとき、その指し示されているタンパク質の他の種における天然の配列ホモログ（天然に存在するバリアントのすべてを含む）に加えて、そのタンパク質のフラグメント、前駆体（ｐｒｅｃｕｒｓｅｒ）および天然に存在するバリアント（例えば、選択的スプライシングされたバリアントおよび対立遺伝子バリアント）およびアイソフォームならびに可溶型のすべてを包含する。従って、例えば、ハプトグロビン前駆体（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ００７３８）の存在量が検査されると記載されているとき、その記載は、具体的には、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ００７３８として列挙されるタンパク質の任意のフラグメント、前駆体または天然に存在するバリアント、ならびに被験体が非ヒトである場合、その非ヒトホモログおよびその天然に存在するバリアントの検査を包含する。
【００６８】
ＩＩ．詳細な説明
本発明は、母体または胎児の生体液のプロテオミクスプロファイルに基づいた母体および胎児の状態の早期の、信頼性の高い、非侵襲性の検査のための方法および手段に関する。本発明は、例えば、以下の教科書（その内容は、本明細書において明示的に参考として援用される）に記載されているような当該分野で周知のプロテオミクス技術を利用するものである：Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ：Ｎｅｗ  Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ），Ｍ．Ｒ．Ｗｉｌｋｉｎｓら、ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，１００７；２−Ｄ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｎｄｒｅｗ  Ｌ  Ｌｉｎｋ編，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９；Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ：Ｔｗｏ−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ），Ｔ．Ｒａｂｉｌｌｏｕｄ編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，２０００；Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ：Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ），Ｐ．Ｊａｍｅｓ編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，２００１；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，Ｄ．Ｃ．Ｌｉｅｂｌｅｒ編，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２００２；Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｉｎ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒ．Ｗｅｓｔｅｒｍｅｉｅｒら、ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，２００２。
【００６９】
当業者は、本発明の実施において使用され得る本明細書中に記載される方法および材料と類似または等価な多くの方法および材料を認識するだろう。実際に、本発明は、記載される方法および材料に何ら限定されない。
【００７０】
１．生体液中で発現しているタンパク質およびポリペプチドの同定
本発明によれば、生体液のプロテオミクス解析は、当該分野で公知の種々の方法を用いて実施され得る。
【００７１】
代表的には、正常な生体液（正常サンプル）および試験生体液（試験サンプル）などの異なる起源由来のサンプルのタンパク質パターン（プロテオームマップ）を比較することによって、ある疾患においてアップレギュレートまたはダウンレギュレートされているタンパク質が検出される。そして、これらのタンパク質を、同定および完全な特徴付けのために、例えば、ペプチド質量フィンガープリンティングおよび／または質量分析ならびに配列決定法を用いて取り出すか、または正常なプロテオームマップおよび／もしくは疾患特異的プロテオームマップを、目的の疾患の診断のために直接使用することができるか、または疾患の有無を確認するために直接使用することができる。
【００７２】
比較解析では、タンパク質の相対存在量を正確に示すためおよび正確な結果を得るために、正常サンプルと試験サンプルとを正確に同じ方法で処理することが重要である。必要とされる総タンパク質の量は、使用する分析技術に左右され、当業者が容易に決定することができる。生物学的サンプル中に存在するタンパク質は、代表的には、そのｐＩおよび分子量に従って２次元ゲル電気泳動（２−ＤＥ）によって分離される。まず、等電点電気泳動（１次元ゲル電気泳動）を用いてタンパク質の電荷によってタンパク質を分離する。この工程は、例えば、市販の固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ストリップを用いて行われ得る。二次元目は、通常のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析であり、その泳動されたＩＰＧストリップをサンプルとして使用する。２−ＤＥ分離後、クマシーブルーのような従来の色素または銀染色を用いて、タンパク質を可視化することができ、また、公知の手法および装置（例えば、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＧＳ８００デンシトメーターおよびＰＤＱＵＥＳＴソフトウェア（両方とも市販されている））を用いて撮像することができる。そして、個別のスポットをゲルから切り出し、脱染し、トリプシン消化に供する。ペプチド混合物を質量分析（ＭＳ）によって解析することができる。あるいは、ペプチドを例えばキャピラリー高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）によって分離することができ、そして個別にまたはプールとしてＭＳで解析することができる。
【００７３】
質量分析計は、イオン源、質量分析器、イオン検出器およびデータ収集ユニットからなる。まず、ペプチドをイオン源においてイオン化する。次いで、そのイオン化されたペプチドを質量分析器において質量電荷比に従って分離し、別個のイオンを検出する。質量分析は、特にマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ｉｏｎｉｓａｔｉｏｎ）／飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）およびエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法の発明以来、タンパク質解析において広く使用されている。質量分析器には、いくつかのバーションがあり、例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦおよび三重極型もしくは四重極型−ＴＯＦ、またはＥＳＩと組み合わされたイオントラップ質量分析器が挙げられる。従って、例えば、Ｑ−Ｔｏｆ−２質量分析計は、質量スペクトルの全範囲にわたるイオンの同時検出が可能な直交飛行時間型分析器を利用する。さらなる詳細として、例えば、Ｃｈｅｍｕｓｅｖｉｃｈら、Ｊ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．３６：８４９−８６５（２００１）を参照のこと。
【００７４】
所望であれば、ペプチドフラグメントおよび究極的にはそのフラグメトが由来するタンパク質のアミノ酸配列を、当該分野で公知の手法（例えば、質量分析のある特定の変法）またはエドマン分解によって決定することができる。
【００７５】
２．早期かつ非侵襲性の診断の利益を享受する胎児−母体の状態
羊水内感染
羊水内感染（ＩＡＩ）は、妊娠中の羊水および子宮内の内容物の急性の細菌感染である。前向き研究によって、ＩＡＩが全分娩の４％〜１０％において発生すると示唆されている（Ｎｅｗｔｏｎ，Ｅ．Ｒ．，Ｐｒｉｈｏｄａ，Ｔ．Ｊ．ａｎｄ  Ｇｉｂｂｓ，Ｒ．Ｓ．：Ｌｏｇｉｓｔｉｃ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｉｎｔｒａ−ａｍｎｉｏｔｉｃ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．７３：５７１，１９８９；Ｓｏｐｅｒ，Ｄ．Ｅ．，Ｍａｙｈａｌｌ，Ｃ．Ｇ．，ａｎｄ  Ｄａｌｔｏｎ，Ｈ．Ｐ．：Ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｉｎｔｒａａｍｎｉｏｔｉｃ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：ａ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｅｐｉｄｅｍｉｃｏｌｏｇｉｃ  ｓｔｕｄｙ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ  １６１：５６２，１９８９；ａｎｄ  Ｌｏｐｅｚ−Ｚｅｎｏ，Ｊ．Ａ．，Ｐｅａｃｅｍａｎ，Ａ．Ｍ．，Ａｄａｓｈｅｋ，Ｊ．Ａ．，ａｎｄ  Ｓｏｃｏｌ，Ｍ．Ｌ．：Ａ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｌａｂｏｒ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２６：４５０，１９９２）。ＩＡＩを記述するために使用される他の用語としては、羊水感染、羊膜炎および臨床的絨毛羊膜炎が挙げられる。羊水内感染は、母体の発熱、子宮の圧痛、白血球増加および胎児の頻拍によって臨床的に診断され、組織学的絨毛羊膜炎と区別されるべきである。羊水内感染は、母体および新生児の罹患の重要な原因である。羊水内感染は、周産期における有熱性の病的状態の症例の１０〜４０％を占め、早期の新生児敗血症および肺炎の症例の２０〜４０％に関連する（Ｎｅｗｔｏｎ，Ｅ．Ｒ．：Ｃｈｏｒｉｏａｍｎｉｏｎｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｉｎｔｒａａｍｎｉｏｔｉｃ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｃｌｉｎ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．３６：７９５，１９９３）。母体の菌血症は、ＩＡＩを有する患者の２〜６％において発生し、分娩後の感染性の罹患率は、上昇する。ＩＡＩを有する患者では、機能不全の分娩および帝王切開分娩のリスクも高い。Ｄｕｆｆらは、分娩時に羊水内感染を発症していた患者のうち、機能不全の分娩は７５％の発生率であり、帝王切開分娩は３４％の発生率であったことを報告した（Ｄｕｆｆ，Ｐ．，Ｓａｎｄｅｒｓ，Ｒ．およびＧｉｂｂｓ，Ｒ．Ｓ．：Ｔｈｅ  ｃｏｕｒｓｅ  ｏｆ  ｌａｂｏｒ  ｉｎ  ｔｅｒｍ  ｐｒｅｇｎａｎｃｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ｃｈｏｒｉｏａｍｎｉｏｎｉｔｉｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ  １４７：３９１，１９８３）。羊水内感染もまた、新生児（特に早期陣痛新生児）の高罹患率および高死亡率と関連する。一般に、ＩＡＩを有する母体から誕生した出生時体重の軽い新生児では、周産期の死亡率が３〜４倍高い（Ｇｉｂｂｓ，Ｒ．Ｓ．，Ｃａｓｔｉｌｌｏ，Ｍ．Ａ．およびＲｏｄｇｅｒｓ，Ｐ．Ｊ．：Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｃｕｔｅ  Ｃｈｏｒｉｏａｍｎｉｏｎｉｔｉｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ  １３６：７０９，��９８０；Ｇｉｌｓｔｒａｐ，Ｌ．Ｃ．，ＩＩＩ，Ｌｅｖｅｎｏ，Ｋ．Ｊ．，Ｃｏｘ，Ｓ．Ｍ．，Ｂｕｒｒｉｓ，Ｊ．Ｓ．，Ｍａｓｈｂｕｒｎ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｃ．Ｒ．：Ｉｎｔｒａｐａｒｔｕｍ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｃｈｏｒｉｏａｍｎｉｏｎｉｔｉｓ：ｉｍｐａｃｔ  ｏｎ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｓｅｐｓｉｓ．Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．１５９：５７９，１９８８）。呼吸窮迫症候群、脳室内出血および新生児敗血症も高い。Ｍｏｒａｌｅｓ，Ｗ．Ｊ．：Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｃｈｏｒｉｏａｍｎｉｏｎｉｔｉｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｏｆ  ｐｒｅｔｅｒｍ  ｉｎｆａｎｔｓ  ａｔ  ｏｎｅ  ｙｅａｒ．Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ  ７０：１８３，１９８７）。近年、ＩＡＩは、新生児の脳室周囲白質軟化症および脳性麻痺と関係付けられた；大脳白質損傷および脳性麻痺のリスクは、羊水内感染において９倍高い。Ｂｅｊａｒ，Ｒ．，Ｗｏｚｎｉａｋ，Ｐ．，Ａｌｌａｒｄ，Ｍ．，Ｂｅｎｉｒｓｃｈｋｅ，Ｋ．，Ｖａｕｃｈｅｒ，Ｙ．，Ｃｏｅｎ，Ｒ．，Ｂｅｒｒｙ，Ｃ．，Ｓｃｈｒａｇｇ，Ｐ．，Ｖｉｌｌｅｇａｓ，Ｉ．ａｎｄ  Ｒｅｓｎｉｋ，Ｒ．：Ａｎｔｅｎａｔａｌ  ｏｒｉｇｉｎ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃ  ｄａｍａｇｅ  ｉｎ  ｎｅｗｂｏｒｎ  ｉｎｆａｎｔｓ．Ｉ．Ｐｒｅｔｅｒｍ  ｉｎｆａｎｔｓ．Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．１５９：３５７，１９８８；Ｇｒｅｔｈｅｒ，Ｊ．Ｋ．ａｎｄ  Ｎｅｌｓｏｎ，Ｋ．Ｂ．：Ｍａｔｅｒｎａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｐａｌｓｙ  ｉｎ  ｉｎｆａｎｔｓ  ｏｆ  ｎｏｒｍａｌ  ｂｉｒｔｈ  ｗｅｉｇｈｔ．ＪＡＭＡ  ２７８：２０７，１９９７）。最終的には、完全な胎膜での早期陣痛において少なくとも１０％の女性が無症状のＩＡＩを有していたことが見出されたことから、ＩＡＩが、早熟児の重要かつ潜在的に予防可能な原因であると示唆される（Ｒｏｍｅｒｏ，Ｒ．，Ａｖｉｌａ，Ｃ．，Ｂｒｅｋｕｓ，Ｃ．Ａ．，ａｎｄ  Ｍｏｒｏｔｔｉ，Ｒ．：Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ａｎｄ  ｉｎｔｒａｕｔｅｒｉｎｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｒｅｔｅｒｍ  ｐａｒｔｕｒｉｔｉｏｎ．Ａｎｎｕａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ６２２：３５５，１９９１）。Ｎｅｗｔｏｎによる文献レビューから、臨床的ＩＡＩの発生率は、２７週未満の在胎期間において４１％、２７〜３７週の在胎期間において１５％、および３８週以上の妊娠期間において２％であることが証明された（Ｎｅｗｔｏｎら、前出）。下部生殖管に常在する細菌もまた、羊水内感染の臨床的徴候がなく完全な胎膜での早期陣痛を有したすべての女性のうちの１０〜２０％の羊水から回収されており（Ｒｏｍｅｒｏら、前出）、２３〜２４週で妊娠が終了し早期陣痛を有した最大６７％の女性の羊水から回収された（Ｗａｔｔｓ，Ｄ．Ｈ．，Ｋｒｏｈｎ，Ｍ．Ａ．，Ｈｉｌｌｉｅｒ，Ｓ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｅｓｃｈｅｎｂａｃｈ，Ｄ．Ａ．：Ｔｈｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｃｃｕｌｔ  ａｍｎｉｏｔｉｃ  ｆｌｕｉｄ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｇｅｓｔａ��ｉｏｎａｌ  ａｇｅ  ａｎｄ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ａｍｏｎｇ  ｗｏｍｅｎ  ｉｎ  ｐｒｅｔｅｒｍ  ｌａｂｏｒ．Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  ７９：３５１，１９９２）。これらの患者のほとんどが、早く分娩し、多くの患者において臨床的に明らかなＩＡＩを発症する。これらの観察結果から、初期は無症状である上昇性の子宮内感染が、早期陣痛より先に生じ、極端な早産の重要な原因であり得るという仮説が支持される。
【００７６】
子癇前症
子癇前症は、タンパク尿、浮腫またはその両方とともに起きる母体の高血圧症と定義されるものであり、第１三半期において終結しない妊娠の７％において生じる。その原因は不明であるが、極端な出産年齢、母体の糖尿病、多胎妊娠ならびに母体の腎疾患およびまたは高血圧症の既往が共通している。子癇前症は、周産期死亡率の上昇と関連しており、母体のてんかんおよび母体の高死亡率を特徴とする子癇をもたらし得る。現在、子癇前症に対する主要な治療法は、分娩および硫酸マグネシウムを含む抗痙攣薬による予防である。硫酸マグネシウム治療を開始する前に、観察された母体の死亡率は、２０〜３０％であった。しかしながら、迅速な診断を行い、硫酸マグネシウムを含む抗痙攣薬による治療、抗高血圧および分娩が可能になると、母体の死亡率は、ゼロ近くまで減少した。
【００７７】
残念なことに、一般に認識されている症状および徴候に基づいた子癇前症の診断は、困難であることが多く、疾患の経過の後期に行われることが多い。しばしば、胎児の成長または健康が損なわれていることが、最初に認識される子癇前症の所見である。子癇前症に対する研究室マーカーとしては、タンパク尿の定量化および尿酸またはクレアチニンの高血清濃度が挙げられる。現在、初期の子癇前症に対する血清マーカーまたは今後、子癇前症を発症する女性を同定するマーカーで、利用可能なものはない。近年、１つの研究において、レプチンおよび尿酸をはじめとしたプロスペクティブな血清マーカーが、その後に起きる子癇前症と関連していた（Ｇｕｒｓｏｙ  Ｔら、Ｐｒｅｅｃｌａｍｐｓｉａ  ｄｉｓｒｕｐｔｓ  ｔｈｅ  ｎｏｒｍａｌ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｌｅｐｔｉｎ．：Ａｍ  Ｊ  Ｐｅｒｉｎａｔｏｌ．１９（６）：３０３−１０，２００２）が、これらの知見を確かめるために、さらに研究する必要がある。治療および介入によって、新生児および母体の予後を最も良好にすることができるようになるために、子癇前症に対する信頼性の高い早期マーカーの開発が肝要である。
【００７８】
早期陣痛および早産
早産は、３７週が完了する前の妊娠期間での出生と定義される。米国における早産の発生率は、全出生の１０〜１１％であり、早期陣痛の積極的な処置にもかかわらず、増え続けている。全般的に言えば、早熟およびその結果は、先天性奇形に起因しない周産期死亡の８０％に関与し、国家の医療予算に年間約５０億ドルを追加させている。早産に対する危険因子としては、有色人種、低年齢、不良な社会経済的状況、５５ｋｇ未満の母体体重、未経産、第１三半期における出血、多胎妊娠が挙げられる（Ｍｅｉｓ  ＰＪ，Ｍｉｃｈｉｅｌｕｔｔｅ  Ｒ，Ｐｅｔｅｒｓ  ＴＪら、Ｆａｃｔｏｒｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｒｅｔｅｒｍ  ｂｉｒｔｈ  ｉｎ  Ｃａｒｄｉｆｆ，Ｗａｌｅｓ：ＩＩ．Ｉｎｄｉｃａｔｅｄ  ａｎｄ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｐｒｅｔｅｒｍ  ｂｉｒｔｈ．Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  １７３：５９７−６０２，１９９５）。
【００７９】
残念なことに、自然発症の早産に対するリスクを有する患者の予測は、一般に期待を裏切るものである（Ｃｒｅａｓｙ  ＲＫ，Ｉａｍｓ  ＪＤ．Ｐｒｅｔｅｒｍ  ｌａｂｏｒ  ａｎｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｍａｔｅｒｎａｌ−Ｆｅｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｃｒｅａｓｙ  ＲＫ，Ｒｅｓｎｉｋ  Ｒ（ｅｄｓ．）．Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ  ４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９９．４９８−５３１頁）。早産に対して最も高いリスクの集団を定義し、それによって初期の介入の利益を潜在的に享受させる際の以前の試みとしては、リスクのスコアリング指標、子宮頸部の胎児フィブロネクチンの生化学的検出、子宮頸管長の超音波測定および家庭内での子宮活動モニタリングが挙げられた。これらのプログラムは、いずれも高価であり、どの患者が早期の介入または予防の利益を享受し得るのかを正確に予測することが不可能であったことが足かせとなっていた。すべての人が、約３０％という低い陽性の予測値に苦しみ、「リスク有り」と同定された患者の大部分が期間の満了時に分娩した。子宮の収縮を阻害する薬理学的処置を含む介入は、効果的であるが、早期かつ信頼性の高い早期陣痛の診断に依存する。それゆえ、莫大なコストを下げ、早産に関連する新生児の死亡率および罹患率を低下させるために、早産のリスクが最も高い患者を同定する信頼性の高い早期マーカーが必要である。
【００８０】
染色体異数性
染色体の異常は、周産期の罹患率および死亡率のよくある原因である。染色体の異常は、２００出生のうちの１出生の発生率で起きる。これらの異常の主な原因は、両親から受け継いだ異常な数の染色体である染色体の異数性である。最も多い染色体異数性の１つは、２１トリソミー（ダウン症候群）であり、これは、８００出生のうちの１出生の発生率で起きる（Ｈｏｏｋ  ＥＢ，Ｈａｍｅｒｔｏｎ  ＪＬ：Ｔｈｅ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ  ｄｅｔｅｃｔｅｄ  ｉｎ  ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅ  ｎｅｗｂｏｒｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ：Ｒｅｓｕｌｔｓ  ｂｙ  ｓｅｘ  ａｎｄ  ｂｙ  ｓｅｖｅｒｉｔｙ  ｏｆ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ．Ｈｏｏｋ  ＥＢ，Ｐｏｒｔｅｒ  ＩＨ（ｅｄｓ）：Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，ｐｐ  ６３-７９．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９７８）。２１トリソミーに対する主要な危険因子は、３５歳を超える母体の年齢であるが、２１トリソミーを有する小児の８０％は、３５歳未満の女性から生まれている。他の一般的な異数性の状態としては、１３トリソミーおよび１８トリソミー、ターナー症候群ならびにクラインフェルター症候群が挙げられる。
【００８１】
２１トリソミーを有する小児の８０％が、３５歳未満の女性から生まれているので、母体の年齢のみに基づいて設計される出生前の診断スクリーニングプログラムは、役に立たない。ゆえに、出生前スクリーニングプログラムには、胎児の染色体の異数性に関連する検体に対して母体の血清スクリーニング、超音波検査またはその両方の組み合わせが補われている。広く利用されている血清マーカー候補としては、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、非抱合エストリオール、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｃｈｏｒｉｏｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｈｉｃ）ホルモン（ｈＨＣＧ）およびインヒビン−Ａが挙げられる。しかしながら、スクリーニングの陽性率は２〜５％であり、２１トリソミーおよび他の異数性に対する検出率は、たった７０〜８６％という検出率であり、失望させるものであった（Ｃｕｃｋｌｅ  Ｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｄｏｗｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｂｉｏｌ．９２（１）：９７−１０１，２０００）。さらに、検査の真陽性率、すなわち、スクリーニング検査で陽性であったもののうち２１トリソミーであったものは、たった１〜２％であったことから、全体で、９８％を超える偽陽性率がもたらされることになる。
【００８２】
母体の血清スクリーニングおよび超音波検査の後の染色体異数性の確定診断には、妊娠中期の遺伝学的な羊水穿刺検査が必要である。これは、０．５％という妊娠喪失のリスクを伴う侵襲性の手技である。さらに、羊水細胞の染色体解析は、大きな労働力を要し、最大２週間を必要とする時間のかかる手技である。ゆえに、母体血清からの染色体異数性の検出が改善され、母体スクリーニングの容認しがたい高偽陽性率が低下し、そして羊水穿刺後の羊水からの診断の速度および効率が高い、信頼性の高い検査が必要である。
【００８３】
３．生体液のプロテオミクスプロファイルを用いた母体／胎児の状態の診断
本発明は、生体液（例えば、羊水、血清、血漿、子宮頸部膣液（ＣＶＦ）、尿、脳脊髄液、母乳、粘液または唾液）のプロテオーム解析によって前述および他の同様の母体／胎児の状態を診断するための信頼性の高い、早期の非侵襲性の方法を提供する。
【００８４】
先に述べたように、本発明の文脈において、用語「プロテオミクスプロファイル」は、所与の時点における生物学的サンプル中、例えば、生体液中の複数のタンパク質の発現パターンを表すものを指すために使用される。プロテオミクスプロファイルは、例えば、質量スペクトルとして表され得るが、タンパク質の任意の物理化学的または生化学的な特性に基づいた他の表現もまた含まれる。生体液のプロテオーム中に存在するタンパク質の全部または一部を同定し、配列決定することは、可能であるが、本発明に従って生成されるプロテオミクスプロファイルの診断的な用途には必要ない。特定疾患の診断は、正常なプロテオミクスプロファイルと、同じ状況下において得られた同じ生体液の、診断される疾患または病的状態が存在するときのプロテオミクスプロファイルとの特徴的な差異（特有の発現サイン）に基づき得る。その特有の発現サインは、同じタイプの起源から得られた、対応する正常な生物学的サンプルのプロテオミクスプロファイルと、統計学的に有意な様式で異なる、生物学的試験サンプルまたは生物学的参照サンプルのプロテオミクスプロファイル内の任意の特有の特徴またはモチーフであり得る。例えば、プロテオミクスプロファイルが質量スペクトルの形式で表されている場合、特有の発現サインは、代表的には、対応する正常サンプルの質量スペクトルと定性的または定量的に異なるピークまたはピークの組み合わせである。従って、質量スペクトルにおける新しいピークの出現もしくは新しいピークの組み合わせの出現、あるいは既存のピークもしくは既存のピークの組み合わせの大きさまたは形状の任意の統計学的に有意な変化、あるいは質量スペクトルにおける既存のピークの消失は、特有の発現サインと考えられ得る。哺乳動物被験体から得られた試験サンプルのプロテオミクスプロファイルを、母体または胎児の病的状態に特徴的な特有の発現サインを含む参照サンプルのプロテオミクスプロファイルと比較するとき、それが参照サンプルと特有の発現サインを共有する場合、その哺乳動物被験体は、そのような病的状態を有すると診断される。
【００８５】
特定の母体／胎児の病的状態は、診断される被験体から得られた生体液のプロテオミクスプロファイルを、同じ種類の正常な生体液の、同じ様式で得て処理されたプロテオミクスプロファイルと比較することによって診断され得る。試験サンプルのプロテオミクスプロファイルが正常サンプルのプロテオミクスプロファイルと本質的に同じである場合、その被験体は、母体／胎児の病的状態を有しないと考えられる。試験サンプルのプロテオミクスプロファイルが正常サンプルのプロテオミクスプロファイルと比べて特有の発現サインを示す場合、その被験体は、対象の母体／胎児の状態を有すると診断される。
【００８６】
あるいはまたはさらに、試験サンプルのプロテオミクスプロファイルを、対象の母体／胎児の病的状態を有すると独立して診断された被験体の生体液から得られた参照サンプルのプロテオミクスプロファイルと比較してもよい。この場合、その試験サンプルのプロテオミクスプロファイルが、参照サンプルのプロテオミクスプロファイルと、特有の発現サインを表している少なくとも１つの特徴または特徴の組み合わせを共有する場合、その被験体は、病的状態を有すると診断される。
【００８７】
本発明の方法において、正常な生物学的サンプルのプロテオミクスプロファイルは、診断上の重要な役割を果たす。上に記載したように、試験サンプルのプロテオミクスプロファイルが、正常な生物学的サンプルのプロテオミクスプロファイルと本質的に同じである場合、その患者は、特定される母体／胎児の病的状態を有しないと診断される。この「陰性」診断は、非常に重大である。なぜなら、それによって、潜在的な副作用を有し得るか、または患者、胎児もしくは新生児に別途リスクをもたらし得る、不必要な処置または介入に患者を供する必要性が排除されるからである。そのデータは、統計学的有意差の有無を判定するために解析される。
【００８８】
従来のタンパク質分離方法を用いて、解析の前に、本質的に同じ発現レベルにおいて正常プロテオームと罹患プロテオームの両方に見られるタンパク質（共通のタンパク質、例えば、アルブミンおよび免疫グロブリン）を除去することによって、本発明の診断方法の感度が高まり得る。特有の発現サインの一部ではないそのような共通のタンパク質の除去によって、感度および診断の精度が改善される。あるいはまたはさらに、共通のタンパク質の発現サインを、代表的には、診断コールを作成する機械指向のスペクトル選択アルゴリズムを用いて、それらの結果のコンピュータ解析中に除外することができる（またはシグナルを除去することができる）。
【００８９】
下記の実施例に詳述される結果は、羊水（ＡＦ）または子宮頸部膣液（ＣＶＦ）の正常なプロテオミクスプロファイルと統計学的に有意な様式で異なる、羊水内感染（ＩＡＩ）および早期陣痛に特徴的なプロテオミクスプロファイルを示す。さらに、それらの実施例は、ＩＡＩ、早産、ダウン症候群および他の母体もしくは胎児の状態に特徴的な発現マーカーおよび特有の発現サインを示す。
【００９０】
本発明の非侵襲性の診断方法を実施するために特に有利な生体液は、子宮頸部膣液（ＣＶＦ）である。ＣＶＦは、水、電解質、低分子量の有機化合物（グルコース、アミノ酸および脂質）、細胞（白血球、リンパ球および上皮細胞）ならびに子宮頸内膜によって主に合成される多数のタンパク質およびタンパク分解性酵素からなる複雑な生体液である（Ｂｌａｎｄａｕら、Ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｒｖｉｘ．Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｉｃａｇｏ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃｈｉｃａｇｏ，１９７３；ｐ  ｘｉ，４５０ｐ。ＣＶＦは、ムチン、ディフェンシン、補体因子、免疫グロブリン、ラクトフェリンおよびコレクチンをはじめとした膣細胞からの分泌物も含む（Ｂｌａｎｄａｕら、前出）。ＣＶＦは、膣、子宮頸部および子宮の領域を含む雌性生殖輸管全体から流れ出て、それらを潤滑するものである。ＣＶＦは、外部の病原体に対する防御の最前線を形成し、受精能をシグナル伝達し、媒精、妊娠および分娩を助ける（Ｂｌａｎｄａｕら、前出；Ｂｉｇｅｌｏｗ，Ｊ．Ｌ．ら、Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ  ２００４，１９，（４），８８９−９２）。ＣＶＦは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ  ｖａｇｉｎａｌｉｓなどの細菌叢も含む。この細菌叢からの分泌物によってＣＶＦが低ｐＨとなり、その抗病原体活性が増強される（Ｂｌａｎｄａｕら、前出）。膣の細菌叢の任意の不均衡または外部の細菌叢の侵入によって、細菌性の腟疾患が生じる。細菌性の腟疾患に応答して、子宮頸部および膣の内上皮（ｅｎｄｏｅｐｉｔｈｅｌｉａ）によるＣＶＦへのいくつかのサイトカイン（例えば、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１０、ＩＬ−６およびＴＮＦ−α）の分泌が変化する（Ｍａｔｔｓｂｙ−Ｂａｌｔｚｅｒ，Ｉら、Ａｃｔａ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｓｃａｎｄ  １９９８，７７，（７），７０１−６；Ｅｓｃｈｅｎｂａｃｈ，Ｄ．Ａ．ら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １９８９，２７，（２），２５１−６）。細菌性の腟疾患を抑制しないことは、子宮頸癌（Ｍｉｋａｍｏ，Ｈら、Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  １９９９，５，（２），８２−８５）、骨盤内炎症性疾患（Ｎｅｓｓ，Ｒ．Ｂ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ  ２００５，１６２，（６），５８５−９０．）、子宮内膜炎（Ｈａｇｇｅｒｔｙ，Ｃ．Ｌ．ら、Ｃｌｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ２００４，３９，（７），９９０−５；Ｍｏｒｒｉｓ，Ｍ．ら、Ｂｊｏｇ  ２００１，１０８，（５），４３９−５０）および卵管不妊（Ｍｏｒｒｉｓら、前出）と正に相関する。妊娠中の女性における細菌性の腟疾患は、高リスクの早期陣痛および早期分娩と相関する（Ｇｒａｖｅｔｔ，Ｍ．Ｇ．ら、Ｊａｍａ  １９８６，２５６，（１４），１８９９−９０３）。
【００９１】
ＣＶＦ中に存在するサイトカインおよび他の防御分子もまた、膣における性感染の免疫不全ウイルス（例えば、ＨＩＶ）および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）の感染、複製および増殖に重要な役割を果たす（Ｐｏｌｉ，Ｇ．ら、ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ  Ｈｕｍ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  １９９２，８，（２），１９１−７；Ｚａｒａ，Ｆ．ら、Ｓｅｘ  Ｔｒａｎｓｍ  Ｉｎｆｅｃｔ  ２００４，８０，（２），１０８−１２；Ｊｏｈｎ，Ｍ．ら、Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ２００５，１９２，（１０），１７３１−４０）。ＣＶＦのカチオン性ポリペプチド分画の解析によって、抗ＨＩＶ活性に寄与する２０個のポリペプチドが同定された（Ｖｅｎｋａｔａｒａｍａｎ，Ｎ．ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００５，１７５，（１１），７５６０−７）。以前の研究によって、ＨＩＶビリオンの捕捉、それによる感染予防におけるＣＶＦに対する役割も同定されている（Ｍａｈｅｒ，Ｄ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００５，１０２，（３２），１１５０４−９；Ｑｕｉｎｏｎｅｓ−Ｍａｔｅｕ，Ｍ．Ｅら、Ａｉｄｓ  ２００３，１７，（１６），Ｆ３９−４８）。最近の研究から、ＣＶＦ中のいくつかの免疫応答分子と早産に導く無症状の前期破水（ＰＲＯＭ）の発生率との間に相関が検出されている（Ｈｅｌｍｉｇ，Ｂ．Ｒ．ら、Ｊ  Ｍａｔｅｒｎ  Ｆｅｔａｌ  Ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｍｅｄ  ２００２，１２，（４），２３７−４６；Ｏｇｉｎｏ，Ｍ．ら、Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎａｅｃｏｌ  Ｒｅｓ  ２００５，３１，（５），４２１−６）。妊娠中、ＣＶＦは、絨毛膜脱落膜界面の破損またはそれに平行した分泌に起因して、子宮由来の羊水（ＡＦ）を含み得る。このＣＶＦへのＡＦの「漏出」は、女性における早期陣痛を予測するために使用されている胎児フィブロネクチンの存在に対する現在の非侵襲性診断の根拠を提供する（Ｓｗａｍｙ，Ｇ．Ｋ．ら、Ｊ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｍｅｄ  ２００５，５０，（１１），８５１−６）。
【００９２】
ＣＶＦは、ＡＦ、すなわち、羊水の穿刺検査と比べて最小限の侵襲性の回収方法であることから、妊娠中の女性における母体および胎児の健康をモニターするために、重要かつ有望な診断部位である。本明細書中に提供されるＣＶＦプロテオームにおいて発現しているタンパク質の網羅的な一覧は、妊娠中または膣の病態における合併症に寄与するかまたは合併症を反映する様々なＣＶＦタンパク質の潜在的な役割についてよりよい洞察を可能にする。
【００９３】
プロテオミクスプロファイルを比較するための統計学的方法は、当該分野で周知である。例えば、質量スペクトの場合、プロテオミクスプロファイルは、スペクトルの横軸に沿って、重要な質量／電荷（Ｍ／Ｚ）の位置におけるピーク振幅値によって定義される。従って、特徴的なプロテオミクスプロファイルは、例えば、所与のＭ／Ｚ値（ｖａｌｅｓ）におけるスペクトル振幅の組み合わせによって形成されるパターンによって特徴付けられ得る。特徴的な発現サインの有無または２つのプロファイルの実質的な同一性は、適切なアルゴリズムを用いて、試験サンプルのプロテオミクスプロファイル（パターン）を参照サンプルまたは正常サンプルのプロテオミクスプロファイル（パターン）と対応させることによって判定され得る。プロテオームパターンを解析するための統計学的方法は、例えば、Ｐｅｔｒｉｃｏｉｎ  ＩＩＩら、Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  ３５９：５７２−７７（２００２）．；Ｉｓｓａｑら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２９２：５８７−９２（２００２）；Ｂａｌｌら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １８：３９５−４０４（２００２）；およびＬｉら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ，４８：１２９６−１３０４（２００２）に開示されている。
【００９４】
４．薬物スクリーニングアッセイ
本発明のプロテオミクスプロファイルは、特定の母体／胎児の状態を処置するための候補薬物を同定するスクリーニングアッセイにおける有用性を見出す。そのようなスクリーニングアッセイは、試験分子が、処置される母体／胎児の状態に特徴的な発現サインを含むプロテオミクスプロファイルを、その発現サインを欠いているプロテオミクスプロファイルに変換する能力に基づくものである。１つの特定の実施形態では、試験化合物が病的な発現プロファイルを正常な発現プロファイルに変換する能力を試験する。別の実施形態において、スクリーニングアッセイは、試験化合物が病的状態に特徴的な特有の発現サインを対応する正常な発現サインに変換する能力を試験する。
【００９５】
そのようなスクリーニングアッセイは、生物学的罹患サンプルの処理およびその処理の前後のプロテオミクス発現プロファイルの比較によって、インビトロにおいて実施され得る。あるいはまたはさらに、薬物スクリーニングは、標的の母体／胎児の病的状態を示している実験動物を試験化合物で処置し、処置の前後においてその動物の生体液のサンプルを採取し、そしてその２つのサンプルのプロテオミクスプロファイルを比較することによって実施され得る。このアッセイでは、処置後の様々な時点における生体液のサンプルを採取することもでき、処置の経過を追跡することができる。これらの方法は、医薬品の毒物学を特徴付けるため、ならびに特定の治療に対する最適な候補を同定するためにも適用され得る。
【００９６】
その試験化合物は、例えば、ペプチド、非ペプチド有機小分子、タンパク質、ポリペプチド、抗体（抗体フラグメントを含む）、アンチセンス分子、オリゴヌクレオチドデコイおよび以前から薬物または候補薬物として使用されている他の任意のクラスの分子であり得る。
【００９７】
生体液は、例えば、羊水、血清（例えば、母体の血清）、血漿、尿、脳脊髄液、母乳、粘液または唾液であり得る。
【００９８】
同定された治療的に活性な化合物は、従来の医薬製剤に製剤化され得る。当該分野で公知の製剤に関する概論は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，最新版，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに見られる。この手引書に対する参考文献は、当該分野において通例のものである。
【００９９】
５．タンパク質アレイ
上で記載した診断アッセイとスクリーニングアッセイの両方が、タンパク質アレイを用いて行われ得る。近年、タンパク質アレイは、タンパク質の検出、その発現レベルのモニターならびにタンパク質の相互作用および機能の研究に対する強力なツールとして広く認識されている。タンパク質アレイは、自動化された手段を用いて多数の測定を同時に行うことができるとき、ハイスループットのタンパク質解析が可能となる。元々はＤＮＡアレイに対して開発されたマイクロアレイまたはチップの形式において、そのような測定を、大量のデータを生成するにもかかわらず最少の材料を使用して、行うことができる。
【０１００】
上に記載されたような２Ｄゲル電気泳動および質量分析によるプロテオーム解析が非常に有効であるが、そのようなプロテオーム解析は、必要とされる感度の高さを必ずしも提供するわけではなく、少ない存在量で発現している多くのタンパク質を見逃すことがある。タンパク質マイクロアレイは、高効率に加えて、高感度を提供する。
【０１０１】
タンパク質アレイは、当該分野で周知の種々の共有結合化学および非共有結合化学を用いて、タンパク質を固体表面（例えば、ガラス、ケイ素、マイクロウェル、ニトロセルロース、ＰＶＤＦ膜およびマイクロビーズ）上に固定化することによって形成される。その固体支持体は、結合手順の前後において化学的に安定でなければならないし、良好なスポット形態を可能にするし、最小の非特異的結合を示すし、検出システムにおけるバックグラウンドに寄与するべきでないし、様々な検出システムに適合可能でなければならない。
【０１０２】
一般に、タンパク質マイクロアレイは、ＤＮＡアレイの読み出しに通常使用される方法と同じ検出方法を使用する。同様に、ＤＮＡマイクロアレイを読み出すために使用されるものと同じ器械をタンパク質アレイに適用することができる。
【０１０３】
従って、捕捉アレイ（例えば、抗体アレイ）は、２つの異なる起源（例えば、正常生体液および罹患生体液）由来の蛍光標識されたタンパク質をプローブとして使用することができる。この場合、読み出しは、標的タンパク質の発現レベルの変化を反映するものとしての蛍光シグナルの変化に基づく。代替の読み出し方法としては、蛍光共鳴エネルギー転移、表面プラズモン共鳴、ローリングサークルＤＮＡ増幅、質量分析、共鳴光散乱および原子間力顕微鏡法が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１０４】
さらなる詳述として、例えば、Ｚｈｏｕ  Ｈ，ら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：Ｓ３４−９（２００１）；Ｚｈｕら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．５：４０−４５−（２００１）；Ｗｉｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｎｏｃｋ，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ４２：４９４−５００（２００３）；およびＳｃｈｗｅｉｔｚｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｎｇｓｍｏｒｅ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １３：１４−９（２００２）を参照のこと。生体分子アレイは、２００２年６月１８日発行の米国特許第６，４０６，９２１号（その開示全体が本明細書によって明示的に参考として援用される）にも開示されている。
【０１０５】
６．イムノアッセイ
本発明の診断アッセイは、当該分野で周知である様々なイムノアッセイ形式の形態で行われ得る。イムノアッセイには、ホモジニアスおよびヘテロジニアスという２つの主要なタイプがある。ホモジニアスイムノアッセイでは、抗原と抗体との免疫学的反応と検出との両方が、同種の反応において行われる。ヘテロジニアスイムノアッセイは、反応産物と未反応試薬との区別を可能にする、少なくとも１つの分離工程を包含する。
【０１０６】
ＥＬＩＳＡは、ヘテロジニアスイムノアッセイであり、１９７０年代前半から研究室業務において広く使用されている。このアッセイを使用することによって、様々な形式で抗原を検出することができる。
【０１０７】
「サンドイッチ」形式において、アッセイされる抗原は、２つの異なる抗体の間に保持される。この方法では、まず、固体表面を固相抗体でコーティングする。次いで、測定される抗原（すなわち、診断タンパク質）を含む試験サンプルを加え、上記の結合している抗体と反応させる。任意の未結合の抗原を洗い流す。次いで、酵素で標識された既知量の抗体を、上記の結合している抗原と反応させる。その反応後に、任意の過剰の未結合の酵素結合抗体を洗い流す。次いで、そのアッセイに使用される酵素に対する基質を加えると、その基質と酵素との反応によって色の変化がもたらされる。視覚的な色の変化の量は、酵素が結合体化された、結合している特異的抗体の直接的な測定値であり、その結果として、サンプル中に存在する抗原が試験される。
【０１０８】
ＥＬＩＳＡは、競合アッセイとしても使用され得る。競合アッセイ形式では、測定される抗原を含む試験検体を、酵素標識された正確な量の抗原と混合し、その両方を、固体表面に接着している抗−抗原抗体に対する結合について競合させる。酵素に対する基質を加える前に、過剰な遊離酵素標識抗原を洗い流す。酵素と基質との相互作用から生じる色の強さの量は、試験されるサンプル中の抗原の量の尺度となる。
【０１０９】
ホモジニアスイムノアッセイとしては、例えば、酵素増幅免疫測定法（ＥＭＩＴ）が挙げられ、これは、代表的には、測定される化合物を含む生物学的サンプル、その測定される化合物の酵素標識分子、その測定される化合物に結合する特異的抗体、および特異的酵素色素生産性基質を含む。代表的なＥＭＩＴでは、過剰の特異的抗体が生物学的サンプルに加えられる。その生物学的サンプルが、検出されるべきタンパク質を含んでいる場合、そのようなタンパク質は、その抗体に結合する。次いで、一定量の対応する酵素標識タンパク質がその混合物に加えられる。サンプル中のタンパク質の分子によって占有されていない抗体の結合部位が、上記の加えられた酵素標識タンパク質の分子で占有される。結果として、遊離酵素標識タンパク質だけが基質に対して作用できるので、酵素活性は低下する。無色の形態から有色の形態に変換される基質の量は、混合物中に残存している遊離酵素の量を決定する。サンプル中の検出されるタンパク質の濃度が高いほど、読み出される吸光度が高くなる。サンプル中のタンパク質が少ないほど、酵素活性は低くなり、その結果として、読み出される吸光度が低くなる。Ａｇ−酵素複合体がＡｂ結合型であるときの酵素標識の不活性化が、ＥＭＩＴを特有システムにし、他のイムノアッセイ方法で必要であるような未結合化合物から結合化合物を分離することなく試験を行うことができる。
【０１１０】
本発明の一部は、（ａ）特定の母体／胎児の状態（例えば、羊水内感染または早産）の診断において使用されるポリペプチドに対して結合特異性を有するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体；および（ｂ）抗抗体免疫グロブリンを別個の容器で備えているイムノアッセイキットでもある。このイムノアッセイキットは、本明細書中に提供される様々な方法の実施のために利用され得る。上記モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体ならびに抗抗体免疫グロブリンは、約０．００１ｍｇ〜１００グラムの量、およびより好ましくは約０．０１ｍｇ〜１グラムの量で提供され得る。抗抗体免疫グロブリンは、ポリクローナル免疫グロブリン、プロテインＡもしくはプロテインＧまたはそれらの機能的フラグメントであり得、それらは、当該分野で公知の方法によって、使用前に標識され得る。特定の母体／胎児の状態の診断において使用されるポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体は、当該分野において利用可能かつ適当な読み出しデバイスを用いた比色定量検出または荷電状態検出を利用する迅速なスポット定量化に適合され得る。
【０１１１】
７．質量分析ベースのアッセイ
近年の質量分析の進歩（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｌ．ａｎｄ  Ｈｕｎｔｅｒ  Ｃ．Ｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２００６  Ａｐｒ；５（４）：５７３−８８）のおかげで、質量選択（ｍａｓｓ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）によって特定のイオンをモニターして特定のタンパク質およびポリペプチドを定量化することができるようになった。これらのアッセイでは、質量選択を使用することにより、絶対的特異性がもたらされ、第１選択（ＭＳ１）では、親イオンを捕捉し、そして第２工程では、親イオンの特定のフラグメントを捕捉し（多重反応モニタリング（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ），ＭＲＭ）、検出および定量化される。特定タンパク質に対する適切な標準を用いることにより、ＭＲＭアッセイは、被検体の信頼性の高い定量化を提供し、様々な疾患特異的バイオマーカーをモニターすることができる。母体の胎児の疾患（ｄｉｅａｓｅｓ）のマーカーに対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を使用することにより、ＭＲＭアッセイによる捕捉および解析が可能になる。
【０１１２】
８．診断方法および処置方法
本発明の診断方法は、開業医が迅速な処置の決断をくだすための価値あるツールであり、しばしば、乳児（ｉｎｆａｃｔ）および／または母親の生存（ｓｕｒｖｉｖｉａｌ）に極めて重要となる。従って、例えば、妊娠中の女性が早期陣痛の症状を示す場合、子宮内感染が存在するかどうかを判定するための診断検査を行うことが重要である。本明細書中の迅速かつ非侵襲性の診断検査によって、子宮内感染の存在が確認された場合、医師は、早産が必ず起きると想定しなければならないし、早産児（ｐｒｅ−ｔｅｒｍ  ｉｎｆａｃｔ）の生存の可能性を改善し、母体の健康のリスクを制限する工程を即座に行う必要がある。
【０１１３】
子宮内感染に対する検査が陰性である場合でも、早産が予想される疑議が残る。現在、時折、この目的で、単一マーカーである胎児フィブロネクチン（ｆＦＮ）検査が使用される。妊娠中の患者のＣＶＦ中にｆＦＮが存在しないことは、少なくともさらに２週間その妊娠が継続するという良好な指標である。しかしながら、ｆＦＮの存在（陽性検査）に基づいて、早産が起きる可能性があるかどうかを確かに予測することはできない。本発明の複数マーカーによる診断検査は、陰性および陽性の検査結果の両方の場合において、早産の可能性の信頼性の高い予測の判断材料を提供する。
【０１１４】
あるいは、患者が、早産の症状を示し、そして診断検査（本明細書中の検査または診療において使用される他の任意の検査）を使用して早産の可能性を評価する場合、子宮内感染に対する検査は、より詳細な情報を得るための経過観察として行われ得、そのおかげで医師がより良い処置の判断をくだすことができるようになる。
【０１１５】
本発明のさらなる詳細は、以下の非限定的な実施例から明らかになろう。
【実施例】
【０１１６】
実施例１
羊水内感染の診断マーカーを測定するために羊水のプロテオーム解析において使用されるプロトコル
下記の実施例２〜１３に記載される羊水のプロテオーム解析において、以下のプロトコルを使用した。
【０１１７】
羊水内感染の霊長類モデル
このプロトコルは、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｉｍａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＣｅｎｔｅｒのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認されたものであり、ヒト（ｈｕｍａｎｅ）を治療するためのガイドラインに従ったものである。妊娠期間中の３頭の妊娠中のアカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）に、以前に報告されたように（Ｈａｌｕｓｋａ  ＧＪら、Ｔｅｍｐｏｒａｌ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｕｔｅｒｉｎｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ＲＵ  ４８６  ｉｎ  ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ  ｉｎ  ｌａｔｅ  ｇｅｓｔａｔｉｏｎ，Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  １５７：１４８７−９５（１９８７）；およびＧｒａｖｅｔｔ  ＭＧら、Ａｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｉｎｔｒａｍｎｉｏｔｉｃ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｅｔｅｒｍ  ｌａｂｏｒ  ｉｎ  ｒｈｅｓｕｓ  ｍｏｎｋｅｙｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  １７１：１６６０−７（１９９４））長期間カテーテルを挿入した。簡潔には、妊娠期間の約１１０日目（妊娠期間は１６７日である）に、妊娠中の動物をジャケットおよび係留システムに慣れさせた（Ｄｕｃｓｓａｙ  ＣＡら、Ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｖｅｓｔ  ａｎｄ  ｔｅｔｈｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃａｌｌｙ  ｃａｔｈｅｔｅｒｉｚｅｄ  ｐｒｅｇｎａｎｔ  ｒｈｅｓｕｓ  ｍｏｎｋｅｙｓ．Ｌａｂ．Ａｎｉｍ  Ｓｃｉ  ３８：３４３−４（１９８８））。慣れさせた後、妊娠期間の１１９〜１２６日目に通常の麻酔下において子宮内の手術を行った。母体の大腿動脈カテーテルおよび大腿静脈カテーテル、胎児の動脈カテーテルおよび静脈カテーテル、２本の開放型の羊水内の圧迫カテーテル、子宮筋層の電気筋運動記録用の電極ならびに胎児の心電図用の電極を外科的に挿入した。子宮の被刺激性を制御するための手術の１〜５日後に、すべての動物に硫酸テルブタリンを投与した（１日２回の３〜５時間にわたる１ｍｇの静脈内投与）。また、動物にセファゾリンを投与し（１２時間ごとの２５０ｍｇの静脈内投与）、この投与を細菌接種の少なくとも４８時間前に中断した。
【０１１８】
手術後、８〜１３日間（妊娠期間の１２６〜１３８日目）安定させた後、Ｂ群連鎖球菌属ＩＩＩ型（Ｔｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔブロス中で一晩培養して生育し、遠沈し、洗浄し、そして０．５ｍｌの食塩水溶液に懸濁した１０６コロニー形成単位（ｃｆｕ））（ｎ＝３頭）、ブロス中で生育した、１０７ｃｆｕのＵｒｅａｐｌａｓｍａ  ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ（１頭）またはＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ（１頭）を羊水内に接種することによって、羊水内感染を確立した。定量的な細菌培養、血球計算板による白血球解析ならびにサイトカインおよびプロスタグランジンの濃度測定のために、研究期間中、連続的にすべての動物から羊水サンプルを回収した（接種前の毎日および接種後の４〜１２時間ごと）（以前の報告−Ｇｒａｖｅｔｔ  ＭＧ，ら、Ａｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｉｎｔｒａ−ａｍｎｉｏｔｉｃ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｅｔｅｒｍ  ｌａｂｏｒ  ｉｎ  ｒｈｅｓｕｓ  ｍｏｎｋｅｙｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  １７１：１６６０−７（１９９４））。
【０１１９】
胎児の心電図および子宮活動（電気筋運動記録および羊水内の圧力）を、手術から分娩まで連続的に記録した。子宮の収縮を、１時間あたりの収縮曲線下面積として記録し、１時間ごとの収縮面積（ＨＣＡ）（単位：ミリメートル水銀×秒／時）として表した。
【０１２０】
感染前およびその後は連続的に、母体の子宮頸部を経膣的に触診した。各検査時において、粘度、頸管の成熟度および拡張を記録した。１頭を除くすべての動物では帝王切開術による分娩および１頭は経膣的な分娩の後、感染を確認するために脱落膜、胎盤および膜間の細菌培養物を感染動物から得て、そして病理組織学的研究を行った。
【０１２１】
羊水アッセイ
羊水サンプル（３ｍｌ）を回収後すぐに３，０００ｒｐｍおよび４℃において２０分間、遠心分離した。その沈渣は、細胞解析のために保存し、上清は、発熱物質が存在しない滅菌バイアル中で、アッセイするまで−２０℃において保存した。
【０１２２】
ヒトでの研究
以前に報告されたように（Ｈｉｔｔｉ  Ｊ，ら、Ａｍｎｉｏｔｉｃ  ｆｌｕｉｄ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−α  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｄｉｓｔｒｅｓｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ａｍｏｎｇ  ｐｒｅｔｅｒｍ  ｉｎｆａｎｔｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  １７７：５０−６（１９９７）、１９９１年６月２５日から１９９７年６月３０日に、完全な胎膜での早期陣痛でＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＣｅｎｔｅｒまたはＳｅａｔｔｌｅにある関連病院に入院していた３０９人の女性から研究集団を選んだ。すべての女性が書面によるインフォームドコンセントを提供し、研究プロトコルは、すべての参加病院に対してＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄｓが承認したものであった。参加者は、最後の月経周期または最初の利用可能な超音波検査から２２〜３４週の在胎期間であった。すべての参加者が、研究登録時に完全な胎膜を有していた。早期陣痛を、記録された子宮頸部の変化または１センチメートルの子宮頸部の拡張もしくは５０％の頸管成熟度を伴う１０分間隔での規則的な子宮の収縮と定義した。入院時に４センチメートルを超える子宮頸部の拡張または膜の破裂を有していた女性は除外した。多胎妊娠、頸管縫縮術、前置胎盤、常位胎盤早期剥離、糖尿病、高血圧症および子癇前症を有する女性は、別途研究基準を満たしている場合、適格であるとみなした。
【０１２３】
すべての研究参加者に対して超音波誘導のもとで経腹的羊水穿刺を行い、登録時に静脈穿刺によって母体の静脈血も採取した。本研究集団から、サブセット（表１ＡおよびＢ）を、本明細書中で報告するようなプロテオーム解析のために遡及的に特定した。このサブセットは、子宮内感染の証拠を有していた１１人の患者（羊水から微生物の病原体が回収されたことまたは羊水のＩＬ−６濃度が＞２，０００ｐｇ／ｍｌであったことによって定義される）、および子宮内感染を有していなかったが早産であった１１人の患者のランダムに選択されたサブセット、および感染しておらず、子宮収縮抑制薬治療に反応性の早期陣痛を有していて、その後満期産だった１１人の患者を含んでいた。これらの患者が、この報告に対する研究集団を構成している。
【０１２４】
この研究集団を３群に分けた：１）羊水から微生物が回収されたことまたは羊水のＩＬ−６濃度が＞２，０００ｐｇ／ｍｌであったことに基づいて子宮内感染の証拠を有していた患者；２）子宮内感染の証拠がなく、妊娠期間の３５週より前の早期陣痛および早産だった患者；ならびに３）子宮収縮抑制薬治療に反応性の早期陣痛を有し、妊娠期間の３５週を超えて分娩した患者。これらの３群間で母体の年齢、人種または出産歴に差はなかった（表１ＡおよびＢ）。しかしながら、子宮内感染を有していた患者は、登録時の在胎期間がいくらか早く（ｐ＝０．１０）、感染していなくて早産だった患者または満期産だった患者と比べて有意に早い妊娠期間で分娩した（２７．３＋０．９週  対  それぞれ２９．８＋１．０週および３７．０＋０．９週，ｐ＜０．０００１）。さらに、子宮内感染を有していた患者は、登録から分娩までの間隔が有意に短かった（他の２群の８．４＋６．３日および４６．９＋５．６日に対して２．１＋５．６日，ｐ＜０．０００１）。子宮内感染を有していた患者の９１パーセントが、登録の７日以内に分娩した。
【０１２５】
感染を有していた１１人の患者のうち、４人から微生物が回収された（２人がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、１人がＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、そして１人が嫌気性菌の混合を有していた）；これらの患者全員が、７日以内に分娩した。他の７人の患者は、２，０００ｐｇ／ｍｌを超える羊水中のＩＬ−６濃度に基づいて同定された。羊水中のインターロイキン−６の平均濃度は、感染なしで早産だった患者の０．６８＋０．２０ｎｇ／ｍｌおよび早期陣痛かつ満期産だった患者の０．２５＋０．１３ｎｇ／ｍｌに対して、上記患者では２７．７＋７．８ｎｇ／ｍｌだった（ｐ＜０．０１）。
【０１２６】
研究集団の特徴を表１Ａに示している。表１Ａでは、データを平均値の標準偏差として表した。連続データについてはＡＮＯＶＡおよびカテゴリカルデータについてはカイ２乗によって解析した。省略形：ＰＭＤ，３５週未満の未熟産；ＩＵＩ，子宮内感染；ＰＭＬ，分娩を伴わない早発性陣痛。
【０１２７】
スクリーニング結果を表１Ｂに示している。
【０１２８】
表１Ａおよび１Ｂでは、データを平均値の標準偏差として表している。連続データについてはＡＮＯＶＡおよびカテゴリカルデータについてはカイ２乗によって解析した。省略形：ＰＭＤ，３５週未満の未熟産；ＩＵＩ，子宮内感染；ＰＭＬ，分娩を伴わない早発性陣痛。表１Ｃは、スクリーニング試験の結果に対するフィッシャー検定の有意値を示している。
【０１２９】
羊水のプロテオーム解析
１次元（１−Ｄ）ゲル電気泳動解析
ヨードアセトアミドを用いて還元した後の１００μｇの羊水を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードした。８０Ｖで電気泳動を行い、サンプル中のタンパク質を分離した。電気泳動後、そのゲルをクマシー（Ｃｏｏｍａｓｉｅ）ブルーＲ−２５０で染色し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＧＳ８００デンシトメーターおよびＰＤＱＵＥＳＴソフトウェアを用いて像を収集した。個別のバンドをゲルから切り出し、脱染し、トリプシンを用いて３７℃において２４〜４８時間、ゲル内消化した。そのペプチドを、０．１％ＴＦＡを用いて抽出し、スピードバック（ｓｐｅｅｄｖａｃ）において乾燥させた。その抽出物を０．１％ＴＦＡに溶解し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製のＺｉｐ  Ｔｉｐｃ１８ピペットチップを用いて精製した。（Ｍａｒｖｉｎ  Ｌ．ら、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｏｎｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ−ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ  ｔａｎｄｅｍ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１４（１４）：１２８７−９２，２０００）．
２次元（２−Ｄ）ゲル電気泳動解析
アルブミン除去を行ったか、または行っていない、羊水（４００〜２０００μｇ）を、ＩＥＦ緩衝液に溶解し、室温で１２時間、２４ｃｍのＩＰＧストリップ（ｐＨ３〜１０）上で再水和した。再水和後、そのＩＰＧストリップを７０〜９０ｋＶ時において１次元電気泳動に供した。次いで、ＩＰＧストリップを連続して１５分間、ＤＴＴ平衡緩衝液ＩおよびＩＡＡ平衡緩衝液ＩＩで平衡化した後、２次元目のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を行った。次いで、ＩＰＧストリップを４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上にロードし、１２０Ｖにおいて１２時間、電気泳動を行うことにより、２次元目においてタンパク質を分離した。そのゲルをクマシーブルーＲ−２５０で染色し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＧＳ８００デンシトメーターおよびＰＤＱＵＥＳＴソフトウェアを用いて画像化した。個別のスポットをゲルから切り出し、脱染し、そしてトリプシンを用いて３７℃において２４〜４８時間、ゲル内消化した。そのペプチドを、０．１％ＴＦＡを用いて抽出し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製のＺｉｐ  Ｔｉｐｃ１８ピペットチップを用いて精製した（２−Ｄ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：１１２，１９９９）。
【０１３０】
ＨＰＬＣ分画
アルブミンおよびＩｇＧを除去した後のヒト羊水サンプル（１〜１５ｍｇタンパク質）を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５に溶解した。オートサンプラーおよびＵＶ吸光度検出器を備えたＷａｔｅｒｓ  １５２５  ＨＰＬＣにおいてＴＳＫゲルＤＥＡＥ−５ＰＷカラムを用いて、陰イオン交換クロマトグラフィを行った。線形の塩溶出勾配を用いて、タンパク質を分画した。１分間隔で画分を回収した。画分をプールし、トリプシンで消化し、そして質量分析計（Ｑ−Ｔｏｆ−２）を用いてペプチド混合物を解析した。
【０１３１】
質量分析解析
（１）Ｑ−Ｔｏｆ−２
ゲル内消化後のサンプルを、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＣａｐＬＣに接続されたＭｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｑ−Ｔｏｆ−２質量分析計において解析した。Ｑ−Ｔｏｆ−２に規格のＺ−スプレー源またはナノスプレー源を装着し、そしてＩｎｔｅｇｒａｆｒｉｔ  Ｃ１８  ７５ｕｍ  ＩＤ×１５ｃｍ融合シリカキャピラリーカラムに接続した。Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）  ＮＴおよびＭａｓｓＬｙｎｘ  ３．５ソフトウェアを備えたＣｏｍｐａｑワークステーションによって上記装置を制御し、そのワークステーションにおいてデータを取得した。Ｑ−Ｔｏｆ−２は、ＣａｐＬＣへの直接的な注入または注射により、Ｇｌｕ１フィブリノペプチドＢを用いて較正された。ＭＳ／ＭＳＭＳ調査方法を用いて、ＭＳ／ＭＳＭＳスペクトルを取得した。質量４００〜１５００をＭＳ調査のためにスキャンし、質量５０〜１９００をＭＳＭＳのためにスキャンした。Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）  ２０００ならびにＳＥＱＵＥＳＴ（バージョン１．３）および／またはＬＵＴＥＦＩＳＫを備えたＰＣにおいて主要なデータ解析を行った。ピークの取得のために、内蔵されている自動機能を使用し、そしてセントロイドフィッティング（ｃｅｎｔｒｏｉｄ−ｆｉｔｔｉｎｇ）を各ピークに適用して、ピークのリストを生成した。
【０１３２】
（２）ＬＣＱ−ＭＳ
乾燥したクマシーブルー染色ゲルからタンパク質スポットを切り出し、３０分間、０．５ｍｌの２０ｍＭ重炭酸アンモニウム、５０％アセトニトリル溶液中で再水和／洗浄した。次いで、ゲル領域を真空遠心分離によって乾燥し、ＣｏｕｒｃｈｅｓｎｅおよびＰａｔｔｅｒｓｏｎの方法（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｍａｓｓｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１２：４８７−５１１（１９９９））を用いて、２０ｎＭの配列決定グレードの修飾トリプシン（ＰｒｏＭｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）中において切片上で再水和することによって消化した。次いで、トリプシン消化物を真空遠心分離によって濃縮し、逆相クロマトグラフィで分離し、そしてペプチドを、あるモデルのＬＣＱイオントラップ質量分析計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で解析した。Ｚｏｒｂａｘ  Ｃ−１８  ０．５ｍｍ×１５０ｍｍマイクロボアカラムを用いて、１０μＬ分−１の流速および０〜４０％の勾配のＢ（７５％アセトニトリル水溶液）を用い、１時間にわたって、１１００ＣａｐｉｌｌａｒｙＬＣ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して、サンプルを分離した。ペプチドを標準的なＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎエレクトロスプレー源に直接導入した。標準的なＬＣＱソフトウェアを用いて自動形式でＭＳ／ＭＳスペクトルを取得し、次いで、ＳＥＱＵＥＳＴ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ）をさらに使用して解析した。さらなる詳細については、Ｃｏｕｒｃｈｅｓｎｅ，Ｐ．Ｌ．およびＰａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｓ．Ｄ．，前出を参照のこと。
【０１３３】
データ解析
（１）ＳｅｑｕｅｓｔおよびＤＴＡＳｅｌｅｃｔ
タンデム質量スペクトル（ＭＳ／ＭＳ）の自動解析を、Ｙａｔｅｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１２：５５３−６９（１９９９）に記載されているように、ＳＥＱＵＥＳＴソフトウェア（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ）を用いて行った。ＳＥＱＵＥＳＴは、連続したタンデム質量スペクトルをデータベースのペプチド配列とマッチさせる。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（公表日時）およびＳｗｉｓｓＰｒｏｔ（公表日時）から得られたタンパク質配列の、組み合わされたインデックス付き非冗長データベースを使用し、デフォルトのパラメータを用いて検索を実行した。そのデータベースは、Ｘｃａｌｉｂｕｒ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｍａｎａｇｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ）を用いて構築されたものである。Ｓ−カルボキシアミド化されたシステインだけを修飾とみなした。
【０１３４】
ＤＴＡＳｅｌｅｃｔ（Ｔｈｅ  Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｔａｂｂ，２００２）を用いてＳｅｑｕｅｓｔ結果をさらに解析した。ＤＴＡＳｅｌｅｃｔは、ＳＥＱＵＥＳＴ同定を系統立て、選別する。以下を除いてデフォルトのパラメータを使用した：１）タンパク質の説明中にストリング「ケラチン」を含む、データベース中のマッチした任意のものを除外、および２）二重荷電イオンに対して２．４という相互相関スコアのカットオフでＬＣＱ質量分析計からのスペクトルを選別した。ＤＴＡＳｅｌｅｃｔによって選択された各スペクトルおよび提案された配列対を視覚的に調べ、最終結果を管理のためにスプレッドシート（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ）またはデータベース（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ａｃｃｅｓｓ）に入力した。
【０１３５】
さらなる詳細については：Ｔａｂｂ  ＤＬら、ＤＴＡＳｅｌｅｃｔ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒａｓｔ：Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｒｏｍ  Ｓｈｏｔｇｕｎ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ．１：２１−２６（２００２）もまた参照のこと。
【０１３６】
（２）Ｌｕｔｅｆｉｓｋ
コンピュータプログラムＬｕｔｅｆｉｓｋ  １９００ｖ１．２．５（Ｔａｙｌｏｒ  ＪＡ，Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＲＳ．Ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｕｓｅｓ  ｏｆ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｄｅ  ｎｏｖｏ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  ｔａｎｄｅｍ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ７３（１１）：２５９４−６０４（２００１）を用いてすべてのスペクトルの自動新規配列決定を行った。Ｌｕｔｅｆｉｓｋは、ホモロジーベースの配列検索のために十分に詳細であるいくつかのスペクトルに対してペプチド配列を生成する。修飾、アクリルアミド、カルバミドメチル化（ｃａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）およびリン酸化を考慮した。
【０１３７】
ＭＡＬＤＩ検出のプロトコルおよびパラメータ
２段階の遅延引き出し源（ｄｅｌａｙｅｄ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｓｏｕｒｃｅ）を備えた、注文製の飛行時間型リフレクター質量分析計（Ｊｅｎｓｅｎ  ＯＮら、Ｄｉｒｅｃｔ  ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＵＶ−ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｂｙ  ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ  ７（６）：４９６−５０１（１９９３））においてＭＡＬＤＩ質量分析を行った。約１μＬのサンプル溶液を１μＬのＳＡ（６０：４０水／アセトニトリル０．１％ＴＦＡ最終濃度中のシナピン酸（Ｓｉｎａｐｉｎｉｃ  ａｃｉｄ））と混合した。この被検体／マトリックス溶液の１．０μＬの液滴を、マトリックスの予め結晶化されたサンプルプローブ上に沈積し、風乾させた。そのサンプルに（３５５ｎｍ）Ｎｄ：ＹＡＧレーザー（Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｐｈｙｓｉｃｓ）を照射し、７００ｎｓ／１．０ｋＶ遅延で２３ｋＶにおいてイオン源を作動させることによって、質量スペクトルを生成した。２０の連続したスペクトルの合計としてすべての質量スペクトルを記録し、各々を単一パルスの光子によって生成した。加えられた標準物質からのイオンを質量較正に使用した。
【０１３８】
羊水のＳＥＬＤＩ解析
羊水サンプルからの合計０．５〜３．０μｇのタンパク質を、順相ＮＰ２０（ＳｉＯ２表面）、逆相Ｈ４（疎水性表面：Ｃ−１６（長鎖脂肪族）または固定化ニッケル（ＩＭＡＣ）ＳＥＬＤＩ  ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレイ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）上にスポットした。室温で１時間インキュベートした後、ＮＰ１チップおよびＨ４チップを５μｌの水による洗浄に供することにより、未結合タンパク質および干渉物質（すなわち、緩衝液、塩、洗浄剤）を除去した。２〜３分間風乾させた後、５０％アセトニトリル（ｖ／ｖ）、０．５％トリフルオロ酢酸（ｖ／ｖ）中のシナピン酸の飽和溶液０．５μｌを２回塗布し、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＩＩ（ＰＢＳ  ＩＩ）における飛行時間型質量分析によって質量解析を行った。Ｉｓｓａｑ，Ｊ．Ｈ，ら：Ｔｈｅ  ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．５：２９２（３）：５８７−９２，２０００
実施例２
羊水において発現しているタンパク質およびポリペプチドの同定
実施例１に記載された材料および方法を用いて、正常な羊水および感染している羊水中で発現しているタンパク質およびポリペプチドを同定した。ヒトおよび霊長類の羊水サンプル（プールしたものおよび個別のもの）を、実施例１に記載されたようにタンパク質分離技術（１−Ｄ、２−ＤおよびＨＰＬＣ分画）に供した。分離したタンパク質（ゲルバンド、スポットおよび画分）をトリプシンで消化して、ペプチドプールを調製した。そのペプチドプールを、タンデムＭＳを用いて解析することにより、それらのアミノ酸配列およびアミノ酸組成を解読した。
【０１３９】
スペクトル検証プログラムを用いて、５０００個のＭＳスペクトルを選択した。これらのスペクトルファイルを、デノボ配列決定プログラム（Ｌｕｔｅｆｉｓｋ，Ｐｅａｋｓ）を用いて解析することにより、各ペプチドに対応するアミノ酸配列を生成した。ペプチドプールから生成されたデノボ配列を使用して、実施例１に記載されたようにタンパク質データベースおよびＤＮＡデータベースを検索した。
【０１４０】
ホモロジーマップおよび配列の検証を用いて、種々のタンパク質の発現が羊水中で見出された。検出されたタンパク質を、既知の構造上の類似性（配列相同性マップ）に基づいて潜在的な機能について解析した。多岐にわたる疾患に関与する重要な機能クラスに属しているタンパク質が見出された。ヒト羊水において初めて見出されたタンパク質およびポリペプチドを、これらの潜在的な機能カテゴリーに従って添付の表２に列挙する。
【０１４１】
イムノアッセイによっても異なって発現していると示されたタンパク質および感染羊水中により多くまたは独特に示されたタンパク質を別々にマークした。この文脈において、相対存在量は、参照サンプルに対する、試験サンプル中のある特定のポリペプチドまたはタンパク質を代表するペプチドの量と定義する。従って、同じタンパク質から得られたより多くのペプチドが、羊水の非感染参照サンプルよりも感染羊水中に存在する場合、タンパク質は、感染羊水中により多く示される。
【０１４２】
羊水中に存在することがこれまでに知られているタンパク質およびポリペプチドを表３に列挙しており、それらの存在は、本アッセイによって再確認された。感染に関連する事象に対する公知のマーカーであるタンパク質を別々にマークしている。
【０１４３】
子宮内の状態に対する診断マーカー：
診断マーカーの公知の生物学的機能に鑑みて、前述の表に列挙したいくつかのタンパク質は、子宮内の状態を検出し、モニターするための有望な候補である。そのような状態のいくつかの例および対応するタンパク質マーカーを以下で詳細に説明する。
【０１４４】
発生上の欠陥のマーカーとしてのアクチン調節タンパク質およびアクチン関連タンパク質：
表２において構造タンパク質に列挙されているモエシン（膜構成伸長スパイクタンパク質）は、アクチン細胞骨格と膜貫通タンパク質との連結に関与し、様々な細胞シグナル伝達経路と関係していることが知られている（Ｓｐｅｃｋ  Ｏ，ら：Ｍｏｅｓｉｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃａｌｌｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｒｈｏ  ｐａｔｈｗａｙ  ｔｏ  ｍａｉｎｔａｉｎ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ  ２：４２１（６９１８）：８３−７，２００３）。アクチン改変分子（例えば、コフィリンおよびプロフィリン）（表２に構造タンパク質としても列挙されている）の活性を調節し、その結果細胞骨格の変化をもたらすＲｈｏ−ファミリーＧＴＰアーゼおよびそれらのエフェクターが成長円錐の伸長または収縮に関連することが示されている（Ｔａｎｇ  ＢＬ．Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  Ｉｎｔ，４２（３）：１８９−２０３，２００３）。コロニン（Ｃｏｒｏｎｉｎ）様タンパク質ｐ５７（表２に列挙されているさらに別の構造タンパク質）もまた、アクチンの架橋およびキャッピングに関与し（Ｗｅｉｔｚｄｏｅｒｆｅｒ  Ｒら：Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｔｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ２／３  ｉｎ  ｆｅｔａｌ  Ｄｏｗｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２９３：８３６，２００２）、公知の発生上の欠陥において調節不全である。別のアクチン調節タンパク質であるゲルゾリン（表２にトランスポーター／結合タンパク質として列挙されているゲルゾリン前駆体を参照のこと）もまた、発生的に制御されており、器官系において重要であることが知られている（Ａｒａｉ  Ｍ，Ｋｗｉａｔｋｏｗｓｋｉ  ＤＪ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｌｓｏｌｉｎ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ．Ｄｅｖ  Ｄｙｎ，２１５，２９７，１９９９）。１４−３−３タンパク質もまた、シグナル伝達および分化経路に関与する公知の上皮マーカーであり、脳および他の重要臓器の正常な発生に不可欠である（Ｗｕ  Ｃ，Ｍｕｓｌｉｎ  ＡＪ．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  １４−３−３  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｅａｒｌｙ  Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｍｅｃｈ  Ｄｅｖ，１１９，４５，２００２）。
【０１４５】
従って、ヒト羊水において初めて同定された、発生中に重要な役割を有する、列挙されたアクチン調節タンパク質および他の関連分子を使用することにより、例えば、染色体の異数体が原因であり得る、様々な器官系の発生上の欠陥（例えば、中枢神経系、心臓血管系および他の骨格筋の奇形）を検出することができる。これは、感染羊水において異なって発現すると示されていて、その異なる発現がイムノアッセイによって確認されているプロフィリン（Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）Ｉについて特にあてはまる。
【０１４６】
感染および免疫応答に関連する障害のマーカー：
感染羊水中のマクロファージキャッピングタンパク質、白血球エラスターゼ、好中球ゼラチナーゼ（ｇｅｌａｔｅｎａｓｅ）関連リポカリン（ｌｉｐｏｃａｌｉｃｎ）、ミエロペルオキシダーゼ（ｍｙｌｅｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、Ｌ−プラスチン（リンパ球サイトゾルタンパク質）およびカルグラニュリン（表２の免疫応答関連遺伝子のリストを参照のこと）の検出は、羊水内感染におけるこれらのタンパク質の存在および制御の初めての証明である。これらのタンパク質のうちのいくつかは、感染、炎症およびストレスに応答する免疫細胞の公知のレスポンダーである。マクロファージキャッピングタンパク質（ＭＣＰ）は、アクチンフィラメントを調節するＣａ（２＋）感受性タンパク質であり、炎症性プロセスに関与する（Ｄａｂｉｒｉ  ＧＡ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃａｐｐｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃＤＮＡ．Ａ  ｕｎｉｑｕｅ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｌｓｏｌｉｎ／ｖｉｌｌｉｎ  ｆａｍｉｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｐｒｉｍａｒｉｌｙ  ｉｎ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １５；２６７（２３）：１６５４５−５２，１９９２）。同様に、カルグラニュリンは、損傷および創傷治癒に関与することが知られているカルシウム結合タンパク質である（Ｔｈｏｒｅｙ  ＩＳ．ら、Ｔｈｅ  Ｃａ２＋−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｓ１００Ａ８  ａｎｄ  Ｓ１００Ａ９  ａｒｅ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ  ｎｏｖｅｌ  ｉｎｊｕｒｙ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２１；２７６（３８）：３５８１８−２５，２００１）。白血球エラスターゼおよび好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ｌｉｐｏｃａｌｃｉｎ）（ＮＧＡＬ）は、静菌性および溶菌（ｂａｃｅｔｅｒｏｌｙｓｉｓ）のメカニズムに関与する（Ｇｏｅｔｚ  ＤＨ．ら、Ｔｈｅ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｌｉｐｏｃａｌｉｎ  ＮＧＡＬ  ｉｓ  ａ  ｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｔｉｃ  ａｇｅｎｔ  ｔｈａｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｓ  ｗｉｔｈ  ｓｉｄｅｒｏｐｈｏｒｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｒｏｎ  ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  １０（５）：１０３３−４３，２００２）。
【０１４７】
上記の免疫調節物質に加えて、本発明者らは、２つの抗菌性タンパク質Ｆａｌｌ−３９およびアズロシジンも感染羊水において初めて見出した。抗菌性タンパク質Ｆａｌｌ−３９（ＬＬ−３７）は、細菌のリポ多糖類（ｌｐｓ）に結合し、骨髄、精巣および好中球において発現する。Ｆａｌｌ−３９は、マスト細胞の脱顆粒を刺激し、マスト細胞に対する強力な走化性因子である。Ｆａｌｌ−３９は、その抗菌活性に加えて、マスト細胞を炎症病巣にリクルートする能力を有し得る。基本培地Ｅの存在下において、合成ＦＡＬＬ−３９は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｄ２１およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ  Ｂｍ１１に対して非常に活性であった。皮膚バリアの完全性が損傷を受けたときの防御的役割がＦａｌｌ３９に対して提唱されており、それは防御の最前線に関与し、微生物の局所的な感染および全身性の侵入を防ぐという役割である（Ａｇｅｒｂｅｒｔｈ  Ｂ，ら：ＦＡＬＬ−３９，ａ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｈｕｍａｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ，ｉｓ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｆｒｅｅ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ａｎｄ  ｔｅｓｔｉｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，３：９２（１）：１９５−９，１９９５）。
【０１４８】
アズロシジン（ＣＡＰ３７）は、ヒト好中球から単離されたカチオン性抗微生物タンパク質であり、宿主防御および炎症において重要な意味を有する。アズロシジンは、炎症中に放出され、単球／マクロファージの機能（例えば、走化性）、長い生存時間および分化を制御する（Ｐｅｒｅｉｒａ  ＨＡ．ＣＡＰ３７，ａ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｍｅｄｉａｔｏｒ．Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  ５７（６）：８０５−１２，１９９５）。
【０１４９】
プロテアーゼおよびプロテアーゼインヒビターは、タンパク質の制御において重要な役割を果たし、それ故、いくつかの重要な生理学的メカニズムを支配する。本発明者らは、羊水内感染を含むヒト羊水において初めてプロテアーゼのセルピンファミリー（セルピン、扁平上皮癌抗原１および２、グリア由来ネキシン）の発現を同定した。このセリンプロテイナーゼインヒビターのセルピンスーパーファミリーは、多くの生物学的経路においてプロテイナーゼを支配する際に中心的役割を有し、コンフォメーション病（例えば、アミロイドーシス、プリオン脳症ならびにハンチントン病およびアルツハイマー病）に関与する（Ｌｏｍａｓ  ＤＡ，Ｃａｒｒｅｌｌ  ＲＷ，Ｓｅｒｐｉｎｏｐａｔｈｉｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｍｅｎｔｉａｓ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ；３：７５９，２００２）。
【０１５０】
さらに、羊水内感染において、本発明者らは、免疫調節に関連する周知のプロテイナーゼインヒビターであるシスタチンの発現を同定した（Ｖｒａｙ  Ｂ，Ｈａｒｔｍａｎｎ  Ｓ，Ｈｏｅｂｅｋｅ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｃｙｓｔａｔｉｎｓ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ：５９（９）：１５０３−１２，２００２）。
【０１５１】
列挙されたタンパク質は、感染および／または免疫応答に関連する障害の有望なマーカーである。
【０１５２】
マクロファージキャッピングタンパク質、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン、ミエロペルオキシダーゼ前駆体、Ｌ−プラスチン、アズロシジン、抗菌性タンパク質Ｆａｌｌ−３９、カルグラニュリンＡ、プロフィリンＩ、グリア由来ネキシン、セルピンＩ２およびシスタチンＡを代表するペプチドが、正常な羊水よりも感染羊水において多くもしくは独特に検出されたことおよび／またはイムノアッセイにおいて異なる発現を示したことは、注目に値する。従って、これらのタンパク質は、羊水内感染および／または免疫応答に関連する障害のマーカーとして特に重要である。
【０１５３】
ヒト羊水において検出された他の疾患（感染症）特異的タンパク質
表２に列挙されているＧｐ−３４０バリアントタンパク質は、ヒトの感染羊水において検出されており、以前に肺において同定されたスカベンジャーレセプターである。このタンパク質は、細菌（連鎖球菌属および変種）に結合することが知られている。感染羊水においてこのタンパク質が検出されたことは、ＩＡＩに対する生物学的マーカーを同定するための、本発明の感度の高いプロテオミクスのアプローチを補完する。従って、感染羊水において同定されたＧｐ−３４０バリアントタンパク質は、新生児敗血症の検出に適している）。
【０１５４】
ＩＧＦＢＰ−１（タンパク分解性フラグメント）
表２に示されるように、ＩＧＦＢＰ−１は、感染羊水において異なって発現すると示されている。インスリン様成長因子（ＩＧＦ）系は、胎児および胎盤の成長に強く関与しており、オートクライン／パラクリンメカニズムを介して子宮内膜におけるステロイドホルモンの作用を調節する。ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩは、増殖および分化を刺激し、いくつかの細胞型において分化細胞の機能をインビトロにおいて維持する。子宮内膜のストローマ細胞は、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩならびに高親和性ＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）を産生する。６つの高親和性ＩＧＦＢＰのｍＲＮＡは、ＩＧＦ作用を調節することができ、ヒトの子宮内膜において発現する。ヒトの子宮内膜において最も多いＩＧＦＢＰは、ＩＧＦＢＰ−１であり、これは、前脱落膜化／脱落膜化された子宮内膜のストローマ細胞によって分泌期後期および妊娠中に分泌される。このことは、臨床の産科学および婦人科学に対して意味があり、ここで、子癇前症、子宮内の成長制限、多嚢胞性卵巣症候群ならびにトロホブラストおよび子宮内膜の新生物におけるＩＧＦＢＰ−１の病態生理学的役割に対する証拠が存在する。
【０１５５】
ヒト羊水および母体血清におけるＩＧＦＢＰ−１タンパク分解性フラグメントの存在および制御によって、妊娠に関連する子宮内および母体の状態をモニターするための新しい方法が開拓される。
【０１５６】
さらなる詳細については、下記の実施例１２も参照のこと。
【０１５７】
実施例３
子宮内感染後の霊長類の羊水のタンパク質発現プロファイル
子宮内感染後の霊長類の羊水のタンパク質発現プロファイルを、対応する正常な発現プロファイルと比較して図１Ａ〜Ｃに示す。
【０１５８】
図１Ａ〜Ｃに示されているように、コントロール羊水と感染羊水とでは、タンパク質発現プロファイルが全体的に異なっている。より小さい質量範囲における羊水プロファイルの詳細なスペクトル（図１Ｂおよび１Ｃ）は、およそ３〜５ＫＤａおよび１０〜１２ＫＤａの範囲において、コントロールサンプルと感染サンプルのタンパク質発現プロファイル間で異なっていて、かつ特徴的な差を示している。これは、子宮内感染に応答したタンパク質発現の全体的な制御および子宮内感染の診断となる特有の発現サインの検出能力を説明している。
【０１５９】
実施例４
霊長類の羊水における感染の診断パターン／プロファイルの早期検出
図２Ａ〜Ｃは、感染（ＧＢＳ）に応答した霊長類の羊水の経時的解析を示している。細菌の接種前および感染後は続けて羊水を回収し、実施例１に記載されたようにＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ解析に供した。図２Ａは、感染前のタンパク質発現プロファイルを示しており、図２Ｂは、感染の１２時間後のタンパク質発現プロファイルを示しており、図２Ｃは、感染の３６時間後のタンパク質発現プロファイルを示している。
【０１６０】
図２Ｃに示されるように、子宮内感染の特徴的なピークの１つ（１０〜１１ＫＤａ）は、急性感染の３６時間以内に高レベルの発現に明らかに達している。このことから、特徴的なタンパク質プロファイルは、疾患状態および処置に対する応答をモニターするために使用することができると証明される。
【０１６１】
実施例５
子宮内感染後のヒト羊水のタンパク質発現プロファイル
図３Ａ〜Ｃは、既知組成の順相チップアレイに結合した羊水抽出物のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ解析の結果を示している。図３Ａは、２３５レーザー強度における全体のスペクトルを示している。図３Ｂは、１０〜１２ｋＤａ領域における感染サンプルとコントロールサンプルとの差を示している詳細なスペクトルである。図３Ｃは、３〜５ｋＤａ領域における感染サンプルとコントロールサンプルとの特徴的な差を示している詳細なスペクトルである。
【０１６２】
図３Ａ〜Ｃに示されるように、コントロール羊水と感染羊水とでは、タンパク質発現プロファイルが全体的に異なる。より小さい質量範囲における羊水プロファイルの詳細なスペクトル（図３ＢおよびＣ）は、コントロールサンプルと感染サンプルの間で、異なって過剰発現しているタンパク質（３〜５ＫＤａおよび１０〜１２ＫＤａの範囲）を示している。タンパク質ピークの相対強度の解析から、２つの異なる特徴的なクラスター（１０〜１２ｋＤａおよび３〜５ｋＤａの範囲）の存在が示唆される。このことから、子宮内感染に応答するタンパク質発現の全体的な制御およびヒトと霊長類モデルの両方において子宮内感染の診断となる特有の発現サインを検出する能力が説明される。
【０１６３】
ヒト羊水の特徴的なパターンが、霊長類羊水の特徴的なパターンとうまく一致していることは注目に値する（実施例３および４）。
【０１６４】
実施例６
様々な質量分析計を使用することによる診断プロファイルの生成
特徴的なタンパク質発現プロファイルは、様々なタイプの質量分析計を用いて検出され得る。異なる質量分析計が、同様の特徴的なプロファイルを生成するか否かを調べた。特徴的なプロファイルが、質量分析計のタイプと実質的に無関係である場合、羊水において検出された差次的なタンパク質発現は、子宮内感染に対する診断サインを提供し得る。
【０１６５】
図４Ａおよび４Ｂは、子宮内感染を有しないヒトコントロールからの羊水（Ａ）および子宮内感染を有するサンプル（Ｂ）を用いて、一般的なＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計（Ｊｅｎｓｅｎ  ＯＮら、Ｄｉｒｅｃｔ  ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＵＶ−ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｂｙ  ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ  ７（６）：４９６−５０１（１９９３））において取得された質量スペクトルを示している。
【０１６６】
図４ＡおよびＢに示されるように、代替の質量分析計を使用して検出された１０〜１２ＫＤａの範囲における子宮内感染の特徴的なプロファイルは、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ装置を用いて検出されたプロファイルと類似している。このことから、差次的なタンパク質発現プロファイルがロバストであり、多岐にわたる現行の質量分析計を用いて検出され得ることが示唆される。
【０１６７】
まとめると、羊水のタンパク質およびポリペプチドが、疾患状態の診断となる差次的な発現パターンを示すことが見出された。本明細書中に示される結果から、複数の質量分析アプローチを使用して、疾患特異的で特徴的なパターンを検出することができると証明される。そのパターンまたはタンパク質発現プロファイルは、ヒトと霊長類との間で類似している。それらのプロファイルを用いることにより、経時的な（感染または処置）効果をモニターすることができる。
【０１６８】
実施例７
診断モニタリングおよび予後モニタリングのための羊水におけるタンパク質およびポリペプチドの発現の定量化
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：
塩濃度の高いヒト羊水（ＡＦ）由来のタンパク質を、アセトンを用いて沈殿させた。１００μｇの羊水タンパク質を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。そのゲルをクマシーブルーＲ−２５０で染色した。Ｂｉｏ−Ｒａｄゲルスキャナーでゲル画像をスキャンした。
【０１６９】
図５は、Ａ）４つのプールされたヒトコントロールＡＦサンプル；Ｂ）個別のコントロールＡＦサンプル；Ｃ）４つのプールされたヒト感染ＡＦサンプル；およびＤ）個別の感染ＡＦサンプル、のＳＤＳ−Ｃｏｏｍｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ染色ゲルを示している。
【０１７０】
図５は、１０〜１５ＫＤａの範囲において、コントロールタンパク質発現レベルと感染タンパク質発現レベルとの間で有意差を示している。上記質量分析計を用いて検出されたこの質量におけるタンパク質およびタンパク分解性フラグメントのいくつかが、タンパク質発現レベルを反映している特徴的なプロファイルに関与しており、診断的および予後診断的な有用性を有すると結論付けられる。
【０１７１】
実施例８
子宮内感染の羊水のウエスタンブロット解析
１００μｇのＡＦタンパク質を、２００Ｖにおいて６０分間、４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、９０ｍＭにおいて７５分間、ＰＶＤＦ膜に転写した。その膜を５％乳ＰＢＳＴで４５分間、ＲＴにおいてブロッキングし、１μｇ／ｍｌの１次抗体（Ｓａｎｔａ  ＣｒｕｚおよびＤａｋｏ）とともに４℃において一晩インキュベートした。ＴＢＳＴで３回洗浄した後、その膜を２次抗体ＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ）とともに９０分間、ＲＴにおいてインキュベートし、そしてＥＣＬ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて可視化した。
【０１７２】
その結果を図６に示す：Ａ）コントロールＡＦサンプル（プール）；Ｂ）感染ＡＦサンプル（プール）。図６は、ＩＧＦＢＰ１（１１ＫＤａ）、プロフィリンおよびセルロプラスミン（１３０ＫＤａ）が、非感染ＡＦよりも感染ＡＦにおいてのほうが高レベルで発現されていることを示している。Ｌ−プラスチンレベルは、コントロールＡＦサンプルよりも感染サンプルにおけるほうが低かった。これらのタンパク質は、ＭＳアプローチ（デノボ配列決定方法）を用いてヒト感染サンプルからも同定され、上の実施例２に列挙されている。
【０１７３】
実施例９
子宮内感染の羊水の免疫沈降解析
２マイクログラムの１次抗体を６００μｇのＡＦタンパク質と混合し、４℃において一晩インキュベートした。１５μｌのプロテインＧセファロースビーズを加え、室温で６０分間、シェーカー上でインキュベートした。そのビーズをＩＰ緩衝液で６回洗浄した。
【０１７４】
その結果を図７に示し、ここで、（Ａ）は、コントロール羊水サンプル（プール）を示しており、（Ｂ）は、感染羊水サンプルを示している。図７は、セルロプラスミン（約１３０ＫＤａ）およびカルグラニュリン（約１６ＫＤａ）が、コントロール羊水よりも感染羊水において高レベルで発現されていることを示している。
【０１７５】
実施例１０
ヒト羊水および母体血清における差次的なタンパク質発現の検出
羊水において異なって発現していたタンパク質を、母体血清において類似のタンパク質を測定するためにリードとして使用することができるか否かを調べた。これによって、診断およびモニタリングのための迅速かつ非侵襲性の検査の開発が可能になる。その結果を図８に示し、ここで、（Ａ）は、コントロールサンプル（プール）であり、（Ｂ）は、感染サンプル（プール）である。図８は、ＩＧＦＢＰ−１のより小さいタンパク分解性フラグメントが、子宮内感染に応答してＡＦと母体血清との両方において一貫して異なって発現していることを示している。
【０１７６】
実施例１１
子宮内感染の羊水のタンパク質マイクロアレイ解析
抗体：ＩＧＦＢＰ−１（ＤＳＬ）；補体Ｃ３、デスミン、好中球エラスターゼ、ＮＳＥ抗体（ＤＡＫＯ）；カルグラニュリン、セルロプラスミン、ＴＩＭＰ−１、プラスチンおよびプロフィリン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）。
【０１７７】
抗体スポット：１００μｇ／ｍｌの濃度で抗体を４０％グリセロール、６０％ＰＢＳ，ｐＨ７．５に溶解し、Ａｒｒａｙｅｒ（Ｃａｒｔｅｓｉａｎ）を用いてアルデヒドスライド上にスポットした。
【０１７８】
室温の多湿のチャンバー内で３時間インキュベートした後、そのスライドを、室温の１％ＢＳＡ（ｗ／ｖを含んでいるＰＢＳ，ｐＨ７．５の溶液中において静かに撹拌しながら１時間インキュベートした。
【０１７９】
タンパク質のビオチン化：ビオチン−ＮＨＳを５０ｍｇ／ｌでＤＤ水に溶解した。１０μｌのこの溶液を母体の血清タンパク質溶液（１０ｍＭ  ＰＢ，ｐＨ８．５中５ｍｇ／ｍｌ）に加え、シェーカー上で３時間インキュベートした。５μｌのエタノールアミンを加えることにより、反応を停止した。ビオチン化タンパク質を２００μｌのＴＮＢ緩衝液に希釈し、抗体アレイに加え、４℃において一晩インキュベートした。ＴＮＴ緩衝液中で３回洗浄した後、ストレプトアビジン−ＨＲＰを加え、室温で３０分間インキュベートした。Ｃｙ５−チラミド（ｔｙｒａｍｉｄｅ）蛍光を用いて、抗原−抗体相互作用を検出した。定量化のために、スライドをＰＥ蛍光スキャナーにおいてスキャンした。画像解析プログラムを用いて、コントロールスライドおよび感染スライドの画像をオーバーレイすることにより、相対存在量に対する疑似カラー表示を生成した。その結果を図９に示し、これは、対応するタンパク質とその抗体との結合を示しているタンパク質アレイの疑似カラー像である。緑色は、感染サンプルを示しており、赤色は、コントロールサンプルを示している。パートＩＩは、感染血清サンプルにおいてカルグラニュリン発現（緑色）がより強いことを示しているアレイを拡大したものである。パートＩＩＩは、感染羊水サンプル中で同様に発現が増大していることを示しているカルグラニュリンＩＰのウエスタンブロットである。
【０１８０】
実施例１２
感染羊水の特有の診断サインにおいて示されるタンパク質のさらなる解析
コントロール羊水および感染羊水のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦプロファイルが、１０〜１２ＫＤａの質量の範囲において、明確に感染したサンプルに典型的な特有サインを示すことが証明された（図１、２および３）。１−Ｄゲルで分離されたコントロール羊水および感染羊水（図５）は、そのプールされた感染羊水サンプルまたは独立した感染羊水サンプルにおいてより多い、１０〜１２ＫＤａの質量範囲における多くのバンドが存在することを示している。図１３に示されるように、これらの１−Ｄゲルバンドの単離およびＬＣＱ−ＭＳを用いたさらなる解析によって、ＩＧＦ−ＢＲ−１およびＳ−１００カルシウム結合タンパク質に相当するペプチドが同定された。
【０１８１】
図８に示されるように、抗ＩＧＦ−ＢＰ１抗体を使用したコントロール羊水および感染羊水のウエスタンブロット解析もまた、感染羊水におけるタンパク分解性フラグメント（約１１ＫＤａ）の差次的な発現を証明している。
【０１８２】
羊水ポリペプチドの配列決定により、感染羊水におけるＩＧＦ−ＢＰ１およびカルグラニュリンの存在も同定された（表３）。
【０１８３】
同定されたＩＧＦＢＰ−１の新規のタンパク分解性フラグメントの配列を図１２に示す（配列番号：１）。この図において、感染羊水の１−Ｄゲル電気泳動、トリプシン消化ならびにＭＳ／ＭＳ解析の後のサンプル「０４２６ｓｅｑ＿ＨＩ＿１２」および「０４２５ｓｅｑ＿ＨＩ−１１３」において見られるペプチド配列を小文字で示している（配列番号：２および３）。１−Ｄゲルにおいて検出されたＩＧＦ−ＢＰ−１のタンパク分解性フラグメント（低分子量の範囲、図５）、ウエスタンブロット（図６）および感染羊水由来のトリプシン消化された約１０．５〜１２ＫＤａのバンドのＭＳ／ＭＳ解析（図１３）が、下線の配列の領域に示されている（配列番号：４）。
【０１８４】
実際に、ＭＳ／ＭＳ解析および配列検索結果から、図１３に示される質量スペクトルにおける親イオン４３４．８９が、ＩＧＦ−ＢＰ−１タンパク分解性フラグメントの図１２の配列マップにも示されているＩＧＦ−ＢＰ−１配列（ＲＳＰＧＳＰＥＩＲ）に相当することが証明された。親イオン１０８２．９７は、Ｓ−１００カルシウム結合タンパク質（すなわち、カルグラニュリンＡおよびＢ）に相当し、また、ＡＦのデノボ配列決定によって独立して同定される（表２および３）。
【０１８５】
図１４は、図１３に示された１７．５５〜１８．２１分の保持時間のピークに対する質量スペクトルを示している。主要なピークが、質量４３４．９に見られることが明らかである。
【０１８６】
図１５は、図１４に示された４３４．９ピークの親イオンに対するＭＳ／ＭＳスペクトルを示している。データベース検索に基づいて、その親イオンは、ＩＧＦＢＰ−１の部分配列に対応する。
【０１８７】
実施例１３
染色体異数性に特徴的な診断的プロファイル
母体の血清スクリーニングを用いて２１トリソミーをより正確に同定するために、プロテオミクスのプロファイリングの有用性を調べた。コントロール（ｎ＝６）、２１トリソミー（ｎ＝６）および１８トリソミー（ｎ＝４）のパネル、十分に特徴付けられた母体血清サンプル（同じ症例に対する羊水サンプルを標準的な染色体マッピング方法によって検査し、トリソミーが存在すると確認されたもの）を用いて本研究を行い、上に記載されたようなＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ方法を用いて子宮内感染モデルについて解析した。
【０１８８】
図１０は、トリソミーを区別する特有のプロファイルを有する母体血清における、差次的なタンパク質発現パターンを示している。１マイクログラムの母体血清（タンパク質分離カラム，ＢｉｏＲａｄ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓを用いてアルブミンおよび免疫グロブリンを除去した後のもの）を用いて、上記の方法に記載されたように既知組成の順相チップアレイに結合させた母体の血清抽出物のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ解析を行った。ピーク強度の差を示す２３５−レーザー強度で全体のスペクトルを回収した。Ａ）コントロール血清；Ｂ）２１トリソミー（ダウン症）血清；Ｃ）１８トリソミー血清。詳細なスペクトルは、各症例に対して４〜１５ＫＤａの領域において特有の差を示している。矢印は、アルゴリズムを組み立てるために組み合わせて使用することによって診断スクリーニング検査を開発することができる特徴的なピークを指し示している。
【０１８９】
実施例１４
ヒト子宮頸部膣液の網羅的なプロテオーム解析において使用されるプロトコル
サンプルの回収および処理
本研究は、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ＆  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙにおけるＩＲＢ委員会によって承認されたものである。先を見越してすべての被験体を同定し、その被験者らは、本研究に参加するために、書面によるインフォームドコンセントを提出した。平均在胎期間（ＧＡ）１８．５週＋／−２．１週（標準偏差）の７人の被験体を募集した。２本の６インチの滅菌Ｄａｃｒｏｎ付きプラスチックアプリケーター（Ｓｏｌｏｎ，Ｓｋｏｗｈｅｇａｎ，ＭＥ）を後膣円蓋に挿入し、滅菌された腟鏡で検査しながらそれを１５秒間回転させることによって、ＣＶＦサンプルを回収した。回収後、プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）を含むリン酸緩衝食塩水中にタンパク質を抽出した。抽出後、サンプルを遠心することにより、任意の残骸および細胞材料を除去し、上清を−７０℃で保存した。ＧＡが対応するサンプルを組み合わせることによって、２つのプールサンプル（ＧＡ１６〜１８週、１９〜２１週）を調製した（各プールについてｎ＝３）。各プールサンプルから合計５３０μｇのタンパク質をアセトン沈殿し、２Ｄ−ＬＣ解析のために１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．５に溶解した。２つの個別のサンプル由来の各々１００μｇを１次元ゲル電気泳動（１ＤＧＥ）に使用した。
【０１９０】
多次元液体クロマトグラフィ（２Ｄ−ＬＣ）
各プールサンプルから５３０μｇのタンパク質を乾燥させ、８Ｍ尿素、１Ｍ  Ｔｒｉｓ塩基、１００ｍＭメチルアミンおよび１０ｍＭ  ＣａＣｌ２（ｐＨ８．５）を含んでいる１００μｌの消化緩衝液に溶解した。サンプルを還元し、まず１２．５μｌの０．９Ｍ  ＤＴＴ中で１５分間、５０℃においてインキュベートし、次いで、２５μｌの１．０Ｍヨードアセトアミド中、暗黒下でさらに１５分間、室温においてインキュベートすることによってアルキル化した。さらに１２．５μｌの０．９Ｍ  ＤＴＴを２１０μｌの水および１Ｎ  ＮａＯＨとともにその溶液に加えることによって、ｐＨを８．５に調整した。サンプル（Ｓａｍｐｅｌｓ）を、３７℃において一晩、４０μｌの１ｍｇ／ｍｌトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）液で消化した。４０μｌのギ酸を用いて消化を停止し、Ｃ１８  ＳｅｐＰａｋ  Ｐｌｕｓカートリッジを用いて脱塩した。消化物（１ｍｌ）をポリスルホエチル強陽イオン交換カラム（２．１ｍｍ  ＩＤ×１００ｍｍ、５μｍ粒径および３００Åポアサイズ（Ｔｈｅ  Ｎｅｓｔ  Ｇｒｏｕｐ，Ｓｏｕｔｈｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）上に注入し、そしてＵＶ検出器および画分回収器を備えたＨＰＬＣを用いて分画した。溶媒Ａは、２５％アセトニトリル（ＡＣＮ）を含む１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ３）であり、溶媒Ｂは、２５％ＡＣＮを含む、１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ３）、３５０ｍＭ  ＫＣｌであった。２００μｌ／分の流速での９５分間の勾配をペプチドの分画に使用した。合計８０個の画分を回収し、蒸発させ、そして９６ウェルＶｙｄａｃ  Ｃ１８シリカスピンプレート（Ｔｈｅ  Ｎｅｓｔ  Ｇｒｏｕｐ，Ｓｏｕｔｈｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）を用いて脱塩するために１００μｌの０．１％ＴＦＡに再懸濁した。画分を８０％ＡＣＮ／０．１％ギ酸（ＦＡ）中に溶出し、蒸発させ、２０μｌの５％ＦＡに再懸濁し、そして５μｌの各画分を、ＣａｐＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）に接続されたＱ−Ｔｏｆ−２質量分析計において解析した。
【０１９１】
１次元（１−Ｄ）ゲル電気泳動解析
２つの各サンプルから１００μｇのタンパク質をヨードアセトアミドで還元し、そしてＴｒｉｓ−トリシン、１０〜２０％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて分離した。そのゲルをクマシーブルーＲ−２５０で染色した。各レーンを２５個の個別のバンドに切り出し、脱染し、トリプシンを用いて３７℃において２４時間、ゲル内消化した。そのペプチドを重炭酸アンモニウム中に抽出し、次いで、０．２２μｍ  ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）で濾過した。濾過された溶液を乾燥させ、５％ギ酸中で再構成し、ＣａｐＬＣを備えたＱ−Ｔｏｆ−２質量分析計（Ｗａｔｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）において解析した。
【０１９２】
質量分析
Ｎａｎｏｅａｓｅ  Ｃ１８  ７５μｍ  ＩＤ×１５ｃｍ溶融シリカキャピラリーカラム（Ｗａｔｅｒｓ  Ｉｎｃ．，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）および９５分間の水／ＡＣＮ勾配を用いて、２Ｄ−ＬＣ画分およびゲル消化物をさらに分離した。その質量分析計は、Ｇｌｕ１フィブリノペプチドＢを用いて較正された。ＭＳ／ＭＳＭＳ測定方法を用いて、スペクトルを取得した。ｍ／ｚ４００〜１５００の質量をＭＳ測定のためにスキャンし、ｍ／ｚ５０〜１９００の質量をＭＳＭＳ測定のためにスキャンした。合計１０，８２４個のＭＳ／ＭＳスペクトルを２Ｄ−ＬＣ画分から取得した。ＰｒｏｔｅｉｎＬｙｎｘ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｓｅｒｖｅｒ  ｖ．２．１ソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ  Ｉｎｃ．，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いて、生ＭＳ／ＭＳスペクトルを前処理した。
【０１９３】
タンパク質およびペプチドの同定
図１６ＡおよびＢは、タンパク質およびペプチドの同定のワークフローを示している。生データから同位体除去し（ｄｅ−ｉｓｏｔｏｐｉｎｇ）、セントロイドする（ｃｅｎｔｒｏｉｄｉｎｇ）ことによって、２Ｄ−ＬＣサンプルまたは１ＤＧＥサンプルからの生ＭＳ／ＭＳスペクトルをさらに処理した。サンプルの様々な画分からの前処理されたＭＳ／ＭＳスペクトルをさらなる解析のためにプールした。プールしたＭＳ／ＭＳスペクトルを、既知の夾雑物を含む組み合わされたタンパク質データベースならびにヒト種用に選択されたＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース（バージョン４６．６）からのフォワードエントリーおよびリバースエントリーとマッチさせることによってサンプル中に存在するペプチドを同定した。３つの独立した検索エンジン：ＴｕｒｂｏＳｅｑｕｅｓｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、Ｘ！ＴａｎｄｅｍおよびＯｐｅｎＳｅａを用いて、ペプチド同定検索を行った。ＳｅｑｕｅｓｔおよびＸ！Ｔａｎｄｅｍは、実験スペクトルを、タンパク質データベースの理論的な酵素消化物から生成される理論的なスペクトルとマッチさせるデータベース検索エンジンである。ＯｐｅｎＳｅａは、的確でないデノボ配列とデータベース内のタンパク質配列との間のエラートレラントなマッチを行うデノボ配列ベースの検索エンジンである。Ｐｅａｋｓソフトウェア（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｏｎｔａｒｉｏ，ＣＡ）を使用して、ＯｐｅｎＳｅａ検索エンジンにデノボ配列を提供した。サンプル処理の還元工程およびアルキル化工程によって、そのタンパク質中のすべてのシステイン残基上に一定のカルバミドメチル化（ｃａｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）修飾を導入する。それ故、すべてのシステイン残基に対して標準的な質量として改変されたシステイン質量（１６０．０３Ｄａ）を使用するようにすべてのプログラムを設定した。モノアイソトピック質量（ｍｏｎｏｉｓｏｔｏｐｉｃ  ｍａｓｓ）を用いて親イオン質量およびフラグメントイオン質量を計算するために、デノボシークエンサーおよびすべての検索エンジンを設定した。親イオン質量およびフラグメントイオン質量の許容範囲にそれぞれ０．２Ｄａおよび０．１Ｄａを使用するように、Ｐｅａｋｓソフトウェアを設定した。各ＭＳ／ＭＳスペクトルについてＰｅａｋｓソフトウェアによって報告された上位５つのデノボ配列候補を、エラートレラントなデータベースマッチングを行うためにＯｐｅｎＳｅａに送った。フラグメントイオン質量の許容範囲として０．２５Ｄａを使用するようにＯｐｅｎＳｅａを設定した。Ｓｅｑｕｅｓｔ検索のために、親イオン質量許容範囲として２．０Ｄａを用いて親イオン質量を計算した。親イオンおよびフラグメントイオンに対してそれぞれ０．５Ｄａおよび０．２５Ｄａという質量許容範囲を使用するようにＸ！Ｔａｎｄｅｍを設定した。Ｓｅｑｕｅｓｔ検索を高速化するために、任意の不定の改変に対して検索するように設定しなかった。一方、本発明者らのこれまでの経験に基づいて、サンプル処理またはペプチド断片化メカニズムからのアーチファクトとしてＭＳ／ＭＳスペクトル中に存在し得る不定の改変（すなわち、メチオニンの��化、Ｎ末端におけるピログルタミン酸の形成、Ｎ末端のカルバミル化、内部のセリン、トレオニン、アスパラギン酸およびグルタミン酸残基の脱水、ならびにグルタミンおよびアスパラギンのアミド分解中間体）について検索するようにＸ！ＴａｎｄｅｍおよびＯｐｅｎＳｅａを設定した。Ｓｃａｆｆｏｌｄ（Ｖｅｒｓｉｏｎ：１．３．２，Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）において実行される確率的なタンパク質同定アルゴリズムを用いて、個別の検索エンジンからの同定ペプチドを同定タンパク質と組み合わせた。
【０１９４】
少なくとも１つの特有で、高度に信頼性の高い（確率≧０．９）同定ペプチドを有する同定タンパク質は、サンプル中に存在する可能性があると考えられた。あるタンパク質が、高度に信頼できる３つの特有のペプチドヒットを用いてサンプルの少なくとも１つにおいて確信して同定される場合、そのタンパク質は、手作業で確認することなく網羅的なリストに含められることが認められた。この選別の判定基準を満たさないタンパク質は、手作業で確認された。参考文献（Ｗｉｌｍａｒｔｈ，Ｐ．Ａ．ら、Ｊ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ  ２００４，３，（５），１０１７−２３）に列挙されているすべての基準、アスパラギン酸に対してＣ末端の断片化の促進（Ｇｕ，Ｃ．，ら、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ２０００，７２，（２３），５８０４−１３）および低質量のインモニウム（ｉｍｍｏｎｉｕｍ）イオン（プロリン、バリン、イソロイシン、ロイシン、ヒスチジン、フェニルアラニンおよびチロシン）の存在（ペプチド配列中にこれらの残基が存在しているときは必ず）を用いて、手作業での確認を行った。
【０１９５】
実施例１５
ヒト子宮頸部膣液（ＣＶＦ）の網羅的なプロテオーム解析
解析
実施例１４に記載されたプロトコルに従って、２つの異なるプロテオミクス技術：２Ｄ−ＬＣおよび１ＤＧＥを用いてヒトＣＶＦを解析した。２つのプールサンプルをトリプシン処理し、ＳＣＸ分画に供したところ、合計４０個の画分が得られた。２つの個別のサンプルを、１ＤＧＥを用いて分画し、得られたバンドをゲル内トリプシン消化に供した。ＬＣ−ＥＳＩ−ｑＴＯＦ質量分析計においてすべての画分を解析することによって、合計２７，３９７個のＭＳ／ＭＳスペクトルを回収した。Ｓｅｑｕｅｓｔ、Ｘ！ＴａｎｄｅｍおよびＯｐｅｎＳｅａを用いてすべてのＭＳ／ＭＳスペクトルを検索した。Ｓｃａｆｆｏｌｄを用いて、すべてのプログラムからの同定ペプチドを同定タンパク質に構築した。
【０１９６】
最も低いペプチド同定の確率閾値（０．２）を使用したとき、単一ペプチドによる同定レベルにおいて合計８３１個のタンパク質が同定された。同定されたタンパク質の３０％が偽陽性の同定だった（リバースデータベースエントリー）。いくつかのタンパク質アイソフォームおよび他のタンパク質のサブセットであるタンパク質が本リスト中に存在した。さらに、低スコア（ペプチド同定確率＜０．９）の同定ペプチドは、方法の項に列挙した手作業による確認の判定基準を満たす必要な特徴を示さなかった。タンパク質ヒットの大部分（５４％）は、単一ペプチドによる同定でもあった。単一ペプチドによるタンパク質同定は、偽陽性である可能性が高く、それゆえそれらはタンパク質の定量化および病理学的機能の推測にとって不十分であるので、０．９というペプチド同定確率を最低の判定基準として定めることにより、高度に信頼できる同定ペプチドおよび同定タンパク質のみを検討した。縮重した同定タンパク質をまとめてグループ化して、１エントリーとして報告し、他のタンパク質のサブセットである任意のタンパク質を解析から排除した。
【０１９７】
すべての実験から合計２０６個の特有タンパク質を、上に記載した選別を適用した後、実験ＭＳ／ＭＳスペクトルの５５％にマッピングした。そのリスト中の同定されたタンパク質の３％および１５％が、それぞれ偽陽性同定および単一ペプチドによる同定である。ケラチン、トリプシンおよびウシカゼインなどの夾雑物を除去した後、合計１７７個のタンパク質が残った。少なくとも１回の実験において少なくとも３個の特有ペプチドヒットを有していた１０５個のタンパク質をさらなる手作業確認なしに認めた。方法の項に列挙した基準を用いて、残りの同定タンパク質を手作業で確認した。さらに４５個のタンパク質が、手作業確認を通過した；そのうち２９個が、少なくとも２個の特有ペプチドヒットを有し、１６個が単一ペプチドヒットを有していた。これにより、少なくとも２個の異なるペプチドヒットを用いて同定されたタンパク質の数が１３４に増加し、少なくとも１つの異なるペプチドヒットを用いて同定されたタンパク質の数が１５０に増加した。
【０１９８】
タンパク質同定の信頼性を確実にするために、フォワード配列の末端に付加されたデータベースのリバースエントリーを用いて構築された組み合わされたデータベースを用いてすべての検索を行った。タンパク質同定に対してすべての基準を満たしたリバースデータベースエントリーの数は、方法の項に概説したタンパク質同定基準の信頼性を反映すると考えられた。いずれのリバースエントリーもこれらの基準を満たさなかったので、そのタンパク質同定の信頼性は、１００％であると推定される。
【０１９９】
ＭＳ／ＭＳスペクトルカウンティングは、通常、タンパク質存在量を測定するための、感度の高い半定量的な方法であると考えられている（Ｏｌｄ，Ｗ．Ｍ．，ら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．２００５，４，（１０），１４８７−５０２．Ｅｐｕｂ  ２００５  Ｊｕｎ  ２３）。しかしながら、相同タンパク質は、配列類似性が高いので、正確なＭＳ／ＭＳスペクトルカウントの表示に対して大きな問題を提起する。相同タンパク質のＭＳ／ＭＳスペクトルカウントの膨張または収縮を回避するために、最終的なレベルの選別を行うことにより、５０％を超える配列相同性を共有するタンパク質ホモログのＭＳ／ＭＳスペクトルカウントを統合した。例えば、扁平上皮癌１抗原および２抗原は、９０％を超える配列相同性を共有する。本発明者らは、両方のタンパク質がサンプル中に存在することを示唆するペプチドヒットを同定したが、それらのＭＳ／ＭＳスペクトルカウントを統合して、単一エントリーとして示した。この判定基準のもとで統合されたタンパク質は、ＩＧＨＡ１およびＩＧＨＡ２、ＩＧＨＧ１、ＩＧＨＧ２およびＩＧＨＧ４、ＳＣＣＡ１およびＳＣＡＡ２ならびにＳＰＲ２Ａ、ＳＰＲ２ＢおよびＳＰＲ２Ｄであった。高い配列相同性を共有しないタンパク質に共通のペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルカウントを、サンプル中に存在する可能性が最も高い（ペプチドヒットの数がより多い）と考えられるタンパク質に対して引いた。最終的には、各タンパク質に対する統合ＭＳ／ＭＳスペクトルは、すべての実験においてタンパク質の各ＭＳ／ＭＳスペクトルカウントを統合することによって確立された。その統合ＭＳ／ＭＳスペクトルカウントを、すべての実験において０．９という単一ペプチド確率閾値において非夾雑物タンパク質とマッチした総ＭＳ／ＭＳスペクトル数（１２，８２７）で補正した。補正されたスペクトルカウントは、厳密には定量的でないが、サンプル中に存在するタンパク質の互いに対する相対存在量を評価するために使用することができる。
【０２００】
少なくとも２個の特有ペプチドヒットを有し、手作業で確認された最終的な１３４個のタンパク質を、補正されたＭＳ／ＭＳスペクトルカウントの降順で添付の表４に列挙している。
【０２０１】
ヒトＣＶＦプロテオーム。ヒトＣＶＦにおいて見られた少なくとも２個の同定ペプチドを有するタンパク質をそのＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＴｒＥｍｂｌアクセッション番号ａおよび説明とともに列挙する。相同な同定タンパク質を単一エントリーとしてまとめてグループ化した。ＳｗｉｓｓＰｒｏｔウェブサイト上のＣａｌＰＩ／ＭＷツール（Ｇａｓｔｅｉｇｅｒ，Ｅ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２００３，３１，（１３），３７８４−８）を用いて、理論上のＰＩｂおよびモノアイソトピック分子量ｃを計算した。ＤＡＶＩＤデータベース（Ｄｅｎｎｉｓ，Ｇ．，Ｊｒ．ら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ  ２００３，４，（５），Ｐ３）バイオインフォマティクスリソースを用いて、機能アノテーションｄを行った。１ＤＧＥ実験と２Ｄ−ＬＣ実験の両方からの同定タンパク質の各々に対する統合スペクトルカウントを、全サンプルにおいて０．９という単一ペプチド確率閾値においてマッチした（非夾雑物タンパク質）ＭＳ／ＭＳスペクトルの総数（１２，８２７）で補正したｅ。表中のタンパク質は、補正されたスペクトルカウントの降順で並べられている。ｆＡＦ（Ａ）および／または血清（Ｓ）にも見られたタンパク質にしかるべくメークを付けた。
【０２０２】
単一ペプチドヒットを有し、手作業確認を通過した１６個のタンパク質を添付の表５に統合ＭＳ／ＭＳスペクトルカウントの降順で列挙する。このように、表５において、方法の項に列挙されている手作業による確認基準を通過したヒトＣＶＦ中に見られた単一ペプチドによる同定タンパク質を、それらのＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＴｒＥｍｂｌアクセッション番号ａおよび説明とともに列挙する。相同な同定タンパク質を単一エントリーとしてまとめてグループ化する。ＳｗｉｓｓＰｒｏｔウェブサイト上のＣａｌＰＩ／ＭＷツールを用いて、理論上のＰＩｂおよびモノアイソトピック分子量ｃを計算した。ＤＡＶＩＤデータベースバイオインフォマティクスリソースを用いて機能アノテーションｄを行った。この表中のタンパク質は、１ＤＧＥと２Ｄ−ＬＣの両方の実験からの同定タンパク質の各々に対する統合スペクトルカウントｅの降順で並んでいる。ｆＡＦ（Ａ）および／または血清（Ｓ）にも見られたタンパク質にしかるべくマークを付けた（考察の文章を参照のこと）。
【０２０３】
表４および５に列挙しているタンパク質は、アノテーション、可視化および統合された発見（Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）（ＤＡＶＩＤ）（Ｄｅｎｎｉｓ，Ｇ．，Ｊｒ．，ら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ  ２００３，４，（５），Ｐ３）に対するデータベースからの分類に基づいて機能的にアノテートされている。
【０２０４】
本研究において見出されたＣＶＦタンパク質は、高度に信頼できるＨＵＰＯ血漿プロテオーム（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｎ．Ｌ．ら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２００４，３，（４），３１１−２６；Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．ら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００６，２４，（３），３３３−８）およびＡＦプロテオーム（Ｐａｒｋ，Ｓ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２００６，６，（１），３４９−６３；Ｍｉｃｈｅｌ，Ｐ．Ｅ．ら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２００６，２７，（５−６），１１６９−８１）と相互参照される。可能性があるものはどの部分であってもＩＰＩデータベース加入タンパク質をＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＴｒＥｍｂｌ加入タンパク質に変換し、ケラチンのような共通の夾雑物を除去することによって、ＨＵＰＯ血漿プロテオームをさらにキュレート（ｃｕｒａｔｅｄ）した。異なるアイソフォームを分離し得る直接的なＭＳ／ＭＳスペクトルの証拠がないので、ＨＵＰＯ血漿プロテオームにおいて報告されたタンパク質アイソフォームを単一タンパク質エントリーにまとめた。キュレートされたＨＵＰＯ血漿プロテオーム（５２６個のタンパク質）を、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、２００４，前出に列挙されている１９５個のタンパク質と組み合わせることにより、非冗長の、高度に信頼できるＨＵＰＯ血漿プロテオームが作製された（データ示さず）。同定ＣＶＦタンパク質を、キュレートされたＨＵＰＯ血漿プロテオームおよびＡＦプロテオームと、それらのＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＴｒＥｍｂｌタンパク質アノテーションに基づいて比較し、対応する表の最後の欄にしかるべくマークをつけた（Ａ−羊水中に見られたもの、Ｓ−血清中に見られたもの）。
【０２０５】
考察
２Ｄ−ＬＣ技術は、従来のゲルベースの電気泳動方法よりも多くの分画をもたらすことが知られている。図１７は、２Ｄ−ＬＣ分画からの１ＳＣＸ画分あたりの同定された特有ペプチドの数を示している。この技術による多くの分画が、ＲＰ−ＨＰＬＣと組み合わされるとき、１ＳＣＸ画分あたりの特有ペプチドのより多い数の同定およびそのサンプルにおける全体的に多いタンパク質同定に明らかに寄与した。
【０２０６】
最近の研究から、ＭＳ／ＭＳデータセット内のペプチドを同定するために、そのデータセットを複数の検索エンジンを使用することによって完全に特徴付けることができることが示された（Ｒｅｓｉｎｇ，Ｋ．Ａ．ら、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ２００４，７６，（１３），３５５６−６８）。あるデータセットにおいて、異なる検索エンジンを使用してペプチドを同定するとき、それらの検索エンジンは、対応する検索エンジンにおいてエンコードされるヒューリスティックスの相違に起因して、異なるセットのＭＳ／ＭＳスペクトルが同定される。従って、同じデータセットにおいて異なる検索エンジンを組み合わせた結果は、より網羅的な同定ペプチドのリストを与える。本研究において、本発明者らは、３つの異なる検索エンジン：Ｓｅｑｕｅｓｔ、Ｘ！ＴａｎｄｅｍおよびＯｐｅｎＳｅａを使用して、サンプル中に存在するペプチドを同定した。この組み合わせのアプローチを用いて、本発明者らは、２Ｄ−ＬＣ実験の１つにおいて取得したＭＳ／ＭＳスペクトルの５９％を同定することができた。３つのプログラム間のスペクトル同定の割合（対応するプログラムのスコアカットオフを超えるもの）の分解（図１８Ａ）によって、スペクトルのたった３８％が３つすべてのプログラムによって同定された一方で、スペクトルの２１％が、それらのプログラムのうちの１つのみによって独自に同定されたことが示される。興味深いことに、上記スペクトルの１５％が、ＯｐｅｎＳｅａ検索エンジンによって単独で同定された。これは、ＯｐｅｎＳｅａが、フラグメントイオンおよび予想外の配列改変を見逃してスペクトルを同定するという能力に起因する。サンプルにおいて同定された候補タンパク質の総数は、検索手法の組み合わせに起因して増加した。図１８Ｂに示されるように、合計１１８個の候補同定タンパク質のうち、６６％が、３つすべてのプログラムによって同定された一方で、１３％が、プログラムのうちの１つだけによって独自に同定された。従って、本研究において使用された、検索手法の組み合わせによって、データセットからより多くのペプチドおよび候補同定タンパク質が同定された。
【０２０７】
妊娠期間中において、様々な体液の組成、特にＣＶＦの組成は、経時的に変化する。２Ｄ−ＬＣ実験からの２つの生物学的な複製物（ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ）において同定されたタンパク質の重複を図１９に示す。これらのタンパク質の６９％が、両方の生物学的複製物において同定されたのに対し、それらのタンパク質の３１％が、一方の複製物において単独で同定された。両方のサンプルはＧＡが２週異なるので、このことは、予想外のことではなかった。質量分析計による低存在量のタンパク質のランダムなサンプリングもまた、上述の差に寄与し得る。１ＤＧＥの技術的な複製物によって同定された６５個のタンパク質のうち、６９％が、両方の複製物において同定されたのに対し、３１％が一方の複製物において独自に同定された。このことは、プロテオームを特徴付けるときに生物学的および技術的な複製物を有することの重要性を強調するものである。この解析に実験を加えたときの同定タンパク質の数の全体的な増加を図２０にまとめる。単一の１ＤＧＥ実験を用いるときの本発明者らのタンパク質同定基準によって、合計４０個のタンパク質を同定した。単一の１ＤＧＥの技術的な複製物、２Ｄ−ＬＣ実験およびその対応する生物学的複製物がその解析に加えられるとき、それぞれ１５、６９および１６個の同定タンパク質の増加が観察された。これは、種々の解析プログラム、技術的な複製物、生物学的複製物および実験方法を使用してヒトＣＶＦのプロテオームを特徴付けた、最初の網羅的なプロテオミクス研究である。
【０２０８】
本研究において適用された、組み合わされたプロテオミクスアプローチは、ＣＶＦ中に存在するとこれまで知られていなかった多数のタンパク質を明らかにすることによって、妊娠中のＣＶＦのプロテオミクスの組成を特徴付けた。表４および表５に、生殖領域のホメオスタシスおよび胎児の保護に関与する、ＣＶＦに存在する広範囲のタンパク質のセットを列挙している。表４に列挙されているタンパク質のトリプシンペプチドプロファイルを図２１に示す。それらのタンパク質のうちの８９％を超えるタンパク質が、少なくとも２個の特有の同定ペプチドを有した。このペプチドプロファイルは、ＣＶＦが、多岐にわたるトリプシンペプチド産物を有する種々のタンパク質を含むことも示している。図２２は、妊娠中のＣＶＦプロテオームの機能的分類を示している。ＣＶＦ中の主要な機能的な群は、免疫および防御関連分子（例えば、カルグラニュリンＡおよびＢ）ならびに代謝性分子（カテプシンＢおよびＧのようなプロテアーゼからＨＳＰ９０−αのようなシャペロンに及ぶ）である。
【０２０９】
本研究において見出された免疫応答タンパク質は、３つのカテゴリー：炎症性反応分子、抗炎症性反応分子および抗微生物分子に分類された。通常存在する免疫グロブリンのほかに、ＣＶＦ中に見られる最も注目すべき炎症性反応分子は、Ｓ１００ファミリーの２つのカルシウム結合タンパク質、カルグラニュリンＡおよびＢである。これらのタンパク質は、Ｃａ＋２イオンによって媒介されるヘテロ二量体を形成し、通常、急性期の炎症反応と慢性の炎症反応の両方に関係づけられる（Ｋｅｒｋｈｏｆｆ，Ｃ．ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １９９８，１４４８，（２），２００−１１）。アルブミンと比べたときのコントロールＣＶＦサンプル中のこれらのタンパク質の相対存在量（表４）から、膣の感染と闘う際の極めて重大な役割が示唆される。カルグラニュリンＡおよびＢは、羊水内感染中の羊水内においても見られ（Ｇｒａｖｅｔｔ，Ｍ．Ｇ．ら、Ｊａｍａ  ２００４，２９２，（４），４６２−９．；Ｒｕｅｔｓｃｈｉ，Ｕ．ら、Ｊ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ  ２００５，４，（６），２２３６−４２）、これによって早期陣痛および早産がもたらされ得ることも興味深い。抗炎症性反応分子は、妊娠中において、母体の免疫応答をダウンレギュレートするためおよび胎児の免疫拒絶を防ぐためまたは子癇前症（ｐｒｅｅｃｌａｍｐａｓｉａ）を回避するために不可欠である（Ｌａｃｈａｐｅｌｌｅ，Ｍ．Ｈ．ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９６，１５６，（１０），４０２７−３４；Ｂｏｒｚｙｃｈｏｗｓｋｉ，Ａ．Ｍ．ら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００５，３５，（１０），３０５４−６３）。本発明者らがＣＶＦにおいて検出したタンパク質のいくつか（最も明白にはインターロイキン１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ１−ｒａ）および熱ショックタンパク質７０ｋＤａ（ＨＳＰ７０））は、妊娠中に発現されると免疫応答のダウンレギュレーションを助ける分子の群に属する。膣の感染によって複雑になる、妊娠中のＣＶＦへのＨＳＰ７０の分泌は、ＩＬ１−ｒａの発現を誘導する（Ｇｅｎｃ，Ｍ．Ｒ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  ２００５，１９２，（３），９１６−２１）。おそらく、これは、感染の有害作用であるにもかかわらず免疫調節性レベルにおいて妊娠を保つためのメカニズムである。
【０２１０】
抗微生物のタンパク質は、細菌および真菌の病原体からの膣感染の予防において重要な役割を果たす。本発明者らは、以前の報告（ＭａｓＣａｓｕｌｌｏ，Ｖ．ら、Ｖｉｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００５，１８，（４），５９５−６０６）を確認したところ、ＣＶＦ中に好中球ディフェンシン１（ディフェンシンファミリー）およびラクトトランスフェリンを検出し、これらは、抗微生物特性を有することが知られており、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｅ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅおよびＨＳＶのような感染から膣を保護し得る（ＭａｓＣａｓｕｌｌｏら、前出）。さらに、本発明者らはまた、ヒストンファミリー由来のいくつかのタンパク質（Ｈ４、Ｈ２Ａ、Ｈ２ＢおよびＨ１．２）も検出した。伝統的に、ヒストンは、核内のクロマチン配置に関与する細胞内のタンパク質であると考えられている。しかしながら、最近の研究では、分泌型の好中球細胞外トラップ（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｒａｐｓ）（ＮＥＴｓ）がヒストンを含み（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，Ｖ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００４，３０３，（５６６３），１５３２−５；Ｂｕｃｈａｎａｎ，Ｊ．Ｔ．ら、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  ２００６，１６，（４），３９６−４００）、分泌型ヒストンは、幅広い抗微生物特性を有する（Ｖｅｎｋａｔａｒａｍａｎ，Ｎ．ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００５，１７５，（１１），７５６０−７；Ｓｉｌｐｈａｄｕａｎｇ，Ｕ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２００６，３４０，（２），６４８−５５；Ｊａｃｏｂｓｅｎ，Ｆ．ら、Ｊ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ２００５，５５，（５），７３５−４１；Ｋｉｍ，Ｈ．Ｓ．ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００２，１６８，（５），２３５６−６４；Ｒｏｓｅ，Ｆ．Ｒ．ら、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  １９９８，６６，（７），３２５５−６３）と示唆されている。様々な抗微生物の分子に加えて多岐にわたる炎症性応答分子および抗炎症性反応分子の検出から、ＣＶＦが、先天免疫応答の複雑な環境を有することが示唆される。
【０２１１】
本研究において見出されたタンパク質の主要な割合（３２％）が、炎症制御、タンパク質分解およびプロテアーゼ阻害のような様々な代謝活性（図２２）に関連する。本発明者らが観察した炎症制御タンパク質は、熱ショックタンパク質９０−アルファ（ＨＳＰ９０−Ａ）、ブラジキニン（キニノーゲン１前駆体）およびカリクレイン（カリクレイン１１前駆体および１３前駆体）である。ＨＳＰ９０−Ａは、炎症性ブラジキニン−カリクレイン複合体の細胞媒介性の活性化に関与すると最近報告された（Ｊｏｓｅｐｈ，Ｋ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００２，９９，（２），８９６−９００）。そのような細胞性免疫は、下部雌性生殖管に感染する病原体からの防御における重要な因子であることが示されている（Ｐｕｄｎｅｙ，Ｊ．ら、Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  ２００５，７３，（６），１２５３−６３）。プロテアーゼとプロテアーゼインヒビターとの均衡は、健常な組織の維持にとって非常に重要であり、不均衡は、しばしば、重篤な子宮頸部の上皮病態に導く。本発明者らがＣＶＦにおいて観察したいくつかのプロテアーゼおよびアンチプロテアーゼのうち、興味深い１対は、カテプシンＢおよびα１抗トリプシン（Ａ１ＡＴ）である。子宮頸癌の場合、ＣＶＦ中のカテプシンＢのレベルは高く、Ａ１ＡＴのレベルは変化しない（Ｂｈｕｖａｒａｈａｍｕｒｔｈｙ，Ｖ．ら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９９５，１４４，（１），３５−４３；Ｍａｋａｒｅｗｉｃｚ，Ｒ．ら、Ｎｅｏｐｌａｓｍａ  １９９５，４２，（１），２１−４；Ｂｅｎｉｔｅｚ−Ｂｒｉｂｉｅｓｃａ，Ｌ．ら、Ａｒｃｈ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｍｅｄ（Ｍｅｘ）１９８０，１１，（４），５２３−４５）。従って、子宮頸部におけるプロテアーゼの発現と抗プロテアーゼの発現との不均衡によって、侵襲性の子宮頸癌がもたらされ得る。ＣＶＦにおける上述の代謝性タンパク質の検出によって、ＣＶＦは、炎症性応答の制御から子宮頸部組織の健康状態の維持に及ぶ種々の機能を制御する酵素を含むことが示唆される。
【０２１２】
免疫応答タンパク質および代謝性タンパク質のほかに、本発明者らは、細胞分化（１１％）、輸送（９％）、細胞の組織化（８％）、酵素の制御（６％）、シグナル伝達（３％）および細胞増殖（３％）を助けるタンパク質も見出した。ある１つのタンパク質は、その環境に応じて複数の機能を有し得る。例えば、ＤＡＶＩＤ機能アノテーションツールによれば、ヒストンは、細胞の組織化に関与するタンパク質と分類される。しかしながら、先に述べたように、それらは、細胞外に分泌されると抗微生物特性も有する。このように、妊娠中のＣＶＦに見られる他のタンパク質のほとんどの役割が、いまだ不明であり、さらなる研究を正当化する。
【０２１３】
本研究の前までは、妊娠中のＣＶＦに存在するタンパク質の相対存在量は、ほとんど知られていなかった。表４中のタンパク質は、補正されたスペクトルカウントの降順で並べられている。本発明者らの解析におけるＩｇＧ／ＩｇＡタンパク質の一般的な存在比は、以前の研究と十分に一致している（Ｍｅｓｔｅｃｋｙ，Ｊ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００５，５３，（５），２０８−１４）。ＣＶＦおよび血清のタンパク質存在量プロファイルが有意に異なることは、注目すべきである。上位１５個の多く存在するＣＶＦタンパク質のうち、６個のタンパク質は、外来性であり、そして／または血清において低存在量であることが知られている（扁平上皮癌抗原、カルグラニュリンＡおよびＢ、小型プロリンリッチタンパク質３、表皮型脂肪酸結合タンパク質ならびにムチン５Ｂ）（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｎ．Ｌ．ｅｔ  ｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２００４，３，（４），３１１−２６；Ｗｉｌｍａｒｔｈ，Ｐ．Ａ．ら、Ｊ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ  ２００４，３，（５），１０１７−２３；Ｑｉｎ，Ｓ．ら、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２００５，５，（１２），３１８３−９２；Ｋａｔｚ，Ａ．Ｂ．ら、Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  １９９９，１１２，（５），８１８−２１）。さらに、血清中で中程度の存在量であることが知られているタンパク質（補体因子Ｃ４、補体因子Ｈおよびアポリポタンパク質Ａ−１）が、ＣＶＦにおいて低存在量であることが見出された（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、前出）。表４を検討することにより、ＣＶＦ中の上位１０個の最も多く存在するタンパク質の４０％が、炎症性応答分子であることが示唆される。このことは、ＣＶＦが、病原に対処するために有効かつ攻撃的なサイトカイン反応系を有するという断定をさらに裏付ける。
【０２１４】
ＡＦ、血清およびＣＶＦの間で重複しているプロテオームの定量的解析を行い、表４および表５における最後の欄に、ＡＦ（Ａ）および血清（Ｓ）でも観察されたＣＶＦタンパク質を記載した。能動的な血清輸送および局所合成は、子宮頸部における血清タンパク質の起源であると知られている（Ｂａｒｄ，Ｅ．ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ  ２００２，２３，（２），１４５−６２）。このことを確かめたところ、本発明者らは、子宮頸部において局所的に合成されるｓＩｇＡ複合体を見出した（Ｈｏｃｉｎｉ，Ｈ．ら、Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９５，４２，（２），２６９−７４）。さらに、本発明者らは、血清アルブミン、アルファ−１−抗トリプシン前駆体、アポリポタンパク質Ａ１前駆体、セロトランスフェリン、ラクトトランスフェリン、アポリポタンパク質Ａ１前駆体、アルファ−２−ＨＳ糖タンパク質、Ｉｇγ１、２および４鎖Ｃ領域ならびにベータ−２−糖タンパク質（ｇｌｙｃｏｐｏｔｅｉｎ）１前駆体のような、ＣＶＦ中に多量に存在するいくつかの血清タンパク質（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｎ．Ｌ．ら、前出；Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊら、前出；Ｂａｒｄ，Ｅ．ら、前出）を検出した。本発明者らは、小型プロリンリッチタンパク質３、ＣＤ５９糖タンパク質前駆体、シスタチンＡ、シスタチンＢ、コルフィニン（ｃｏｒｎｉｆｉｎ）Ａ、インボルクリン、チオレドキシンのような、ＡＦに見られるが血清に見られないいくつかのタンパク質もＣＶＦにおいて検出したことは興味深い。絨毛膜−脱落膜の平行分泌は、ＣＶＦにおけるこれらのタンパク質の起源であり得る。３つすべての生体液に存在したタンパク質のうち、Ａ１ＡＴおよびセルロプラスミン（銅トランスポーター）は、診断上の重要性を有することが知られている。母体の膣分泌物および血清中のセルロプラスミンの存在量は、前期破水（ＰＲＯＭ）の発生頻度と逆に相関し（Ｏｇｉｎｏ，Ｍ．ら、Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎａｅｃｏｌ  Ｒｅｓ  ２００５，３１，（５），４２１−６；Ｋｉｉｌｈｏｌｍａ，Ｐ．ら、Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９８４，１７，（４），１９４−２０１）、血清中のＡ１ＡＴの高発現は、子宮頸癌と相関する（Ｂｅｎｉｔｅｚ−Ｂｒｉｂｉｅｓｃａ，Ｌ．；ら、Ａｒｃｈ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｍｅｄ（Ｍｅｘ）１９８０，１１，（４），５２３−４５）。このことから、ＣＶＦまたは血清のような容易に入手可能な体液の連続的な評価が、母体および胎児の健康状態の診断に使用することができたことが示唆される。
【０２１５】
まとめると、本発明者らは、複数の生物学的複製物を用い、組み合わせたプロテオミクスアプローチを使用し、そして本研究において、タンパク質分画およびペプチド分画に対する複数の実験手法ならびにデータマイニングのための複数の検索エンジンを使用することにより、ＣＶＦプロテオームを特徴付けた。この複合的なアプローチによって、ＣＶＦに存在することが以前に知られていなかった大きなタンパク質セットが同定された。ＣＶＦプロテオームの機能的な分類により、病原体と闘い、胎児を保護する際に極めて重要な役割を果たす多岐にわたるサイトカイン反応タンパク質の存在が示唆された。血清、ＡＦおよびＣＶＦの間で重複しているプロテオームの定量的解析によって、妊娠中のＣＶＦに存在するいくつかの血清タンパク質およびＡＦタンパク質が同定された。それらのタンパク質のいくつかの差次的発現は、すでにＰＲＯＭおよび子宮頸癌と関係づけられている。しかしながら、妊娠中のＣＶＦにおいて見出された新規タンパク質の大部分の正確な役割は、いまだ不明であり、さらに詳細な研究が必要である。大規模ハイスループットプロテオミクス技術は、妊娠中のＣＶＦプロテオームのさらなる理解ならびに母体および胎児の健康状態をモニターするための有望な診断ツールとしての開発に不可欠である。
【０２１６】
実施例１６
多次元タンパク質同定技術（ＭｕｄＰＩＴ）を用いた非ヒト霊長類実験的ＩＡＩモデルにおけるＣＶＦプロテオームのグローバル解析のためのプロトコル
非ヒト霊長類における実験的ＩＡＩ
このプロトコルは、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ＆  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認されたものである。妊娠期間中の４頭の妊娠中のアカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）に、以前に報告されたように（Ｇｒａｖｅｔｔ，Ｍ．Ｇ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  １９９４，１７１，（６），１６６０−７）妊娠期間の１２０日目に（妊娠期間は１６７日である）長期間カテーテルを挿入した。１０Ｂ培養液において生育された１０７コロニー形成単位の臨床的な低継代数の（ｌｏｗ−ｐａｓｓａｇｅ）Ｕｒｅａｐｌａｍｓａ  ｐａｒｖｕｍ血清型１を羊水内に接種することによって実験的ＩＡＩを確立した（Ｎｏｖｙ  ＭＪら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｐｒｉｍａｔｅ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｃｈｏｒｉｏａｍｎｉｏｎｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｐｒｅｔｅｒｍ  ｌａｂｏｒ．Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，２００１，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｃａｎａｄａ，Ｍａｒｃｈ  １４−１７，２００１）。各動物をそれ自身のコントロールとして用いた。接種の前後において、ＡＦサンプルおよびＣＶＦサンプルを、以前に報告されたように（Ｇｒａｖｅｔｔら、前出，Ｎｏｖｙら、前出）定量的な細菌培養、白血球解析ならびにサイトカインおよびプロスタグランジンの濃度のためそしてプロテオーム解析のために連続的に回収した。滅菌Ｄａｃｒｏｎスワブ（Ｓｏｌｏｎ，カタログ＃３６８１６）を用いて後膣円蓋からＣＶＦを回収し、次いでそれを、プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｔｉｃｓ，カタログ＃１１８３６）を含んでいるリン酸緩衝食塩水中に入れた。タンパク質を抽出した後、サンプルを遠心することによって細胞の残骸を除去し、アッセイするまで上清を−７０℃で保存した。これらのアッセイのために、感染前および感染の２４〜７２時間後に得られたサンプルからプールされたＣＶＦサンプルを利用した。子宮の収縮を、羊水圧曲線下面積として記録し、１時間ごとの収縮面積（ＨＣＡ；ｍｍＨｇ×秒／ｐｅｒ）として表した。感染動物からの帝王切開による分娩後に、胎児、脱落膜、胎盤および細菌培養物を得て、感染を確認し、病理組織学的研究を行うことにより、組織学的絨毛羊膜炎を確認した。
【０２１７】
ＣＶＦおよびＡＦのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳプロファイリング
ＣＶＦおよびＡＦから合計０．５〜３．０μｇの未分画タンパク質を、パルスイオン抽出源（ｐｕｌｓｅｄ−ｉｏｎ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｓｏｕｒｃｅ）を備えたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦ質量分析計（ＡｕｔｏＦＬＥＸ  ＩＩ  ＴＯＦ／ＴＯＦ，Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）において解析した。簡潔には、１μｌのサンプルを４μｌの５０％アセトニトリル（ＡＣＮ）／０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）および５μｌのマトリックス溶液（５０％ＡＣＮ／０．５％ＴＦＡ中の飽和シナピン酸）で希釈した。サンプルを四つ組で３８２ウェルのグラウンドスチールＳｃｏｕｔターゲット（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）上にスポットした（２μｌ）。＋２０ｋＶで電圧を上げながら線形モードにおいてＡｕｔｏｆｌｅｘを用いた。パルスイオン電圧降下（ｐｕｌｓｅｄ−ｉｏｎ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｄｒｏｐ  ｖｏｌｔａｇｅ）は、３５０ｎｓの遅れ時間で１５００Ｖとした。最大イオンゲーティング設定（ｍａｘｉｍｕｍ  ｉｏｎ  ｇａｔｉｎｇ  ｓｅｔｔｉｎｇ）を用いて、マトリックスイオンを最大３０００Ｄａに抑えた。サンプリングレートは、２．０ＧＨｚであり、各プロファイルスペクトルは、１０個の異なる位置において当てられた５００レーザーショットの合計を表す。５０Ｈｚで作動する窒素レーザー（λ＝３３７ｎｍ）を用いてサンプルに照射した。レーザーの出力エネルギーは、６２％のオフセットおよび３６％の範囲で減衰する約１１０μＪであった。３０％のレーザー出力においてサンプルに照射し、２０％のレーザー出力において標準物質に照射した。一定のレーザー出力において、ｍ／ｚが３０００〜２００００のスペクトルを手作業で回収した。以下：インスリン（ｍ／ｚ  ５７３４．６）、ユビキチン（ｍ／ｚ  ８５６５．９）、シトクロムｃ（ｍ／ｚ  １２３６１．９）およびミオグロビン（ｍ／ｚ  １６９５２．６）を含んでいるタンパク質較正標準物質Ｉ混合物（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を用いた外部の較正によってスペクトルを較正し、そしてＣｌｉｎＰｒｏｔソフトウェアバージョン２．０（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を用いて解析した。
【０２１８】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析に組み合わされた１次元ＰＡＧＥ
コントロールサンプルおよび感染サンプルから１００μｇのＣＶＦタンパク質を、ヨードアセトアミドを用いて還元し、そしてＴｒｉｓ−トリシン、１０〜２０％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて分離した。そのゲルをクマシーブルーＲ−２５０で染色し、各レーンからの異なるバンドをゲルから切り出し、脱染し、ＣｏｕｒｃｈｅｓｎｅおよびＰａｔｔｅｒｓｏｎの方法（Ｃｏｕｒｃｈｅｓｎｅ，Ｐ．Ｌ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９９９，１１２，４８７−５１１）を用いて３７℃において２４時間、トリプシンでゲル内消化した。次いで、０．１％ＴＦＡを用いてペプチドを抽出し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製のＺｉｐ−Ｔｉｐ  ｃ１８ピペットチップを用いて精製した。ゲル内消化後、ＣａｐＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）に連結されたＱ−Ｔｏｆ−２質量分析計（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＵＫ  Ｌｔｄ，Ｕｎｉｔｅｄ  ｋｉｎｇｄｏｍ）においてサンプルを解析した。４００〜１５００Ｄａの質量をＭＳ測定のためにスキャンし、５０〜１９００Ｄａの質量をＭＳ／ＭＳのためにスキャンした。ＭｕｄＰＩＴ解析において、以下に記載されるように、タンパク質同定のためにデータ解析を行った。
【０２１９】
ＭｕｄＰＩＴタンパク質同定およびスペクトルカウンティング
ＣＶＦのＭｕｄＰＩＴ解析のために、４つのコントロールサンプルおよび感染サンプルの各々から１００μｇをプールすることによって、各条件から０．４ｍｇのサンプルを調製した。タンパク質を、８Ｍ尿素、１Ｍ  Ｔｒｉｓ塩基、８０ｍＭメチルアミンおよび８ｍＭ  ＣａＣｌ２（ｐＨ８．５）を含んでいる１００μｌの消化緩衝液に溶解した。システイン残基の還元およびアルキル化のために、まず、サンプルを１２．５μｌの０．９Ｍ  ＤＴＴ中で５０℃において１５分間インキュベートし、次いで、２５μｌの１．０Ｍヨードアセトアミド中、暗黒下でさらに１５分間、室温においてインキュベートした。さらなる１２．５μｌの０．９Ｍ  ＤＴＴを２１０μｌの水および１Ｎ  ＮａＯＨとともに加えることによって、その溶液をｐＨ８．５に調整した後、４０μｌの質量分析グレードのトリプシン（１μｇ／μｌ；Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）を加えた。次いで、サンプルを完全に混合し、３７℃で一晩インキュベートした。４０μｌのギ酸を加えることによって消化を停止した。ＭｕｄＰＩＴ解析の前に、Ｃ１８  Ｓｅｐ−Ｐａｋカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いて消化物を脱塩した。
【０２２０】
脱塩した消化物（１ｍｌ）をポリスルホエチル強陽イオン交換カラム（２．１ｍｍ  ＩＤ×１００ｍｍ、５μｍ粒子および３００μポアサイズ（Ｎｅｓｔ  Ｇｒｏｕｐ，Ｓｏｕｔｈｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）上に注入し、ＵＶ検出器および画分回収器を備えたＨＰＬＣを用いて分画した。溶媒Ａは、２５％アセトニトリル（ＡＣＮ）を含む５．６ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ３）であり、溶媒Ｂは、２５％ＡＣＮを含む、５．６ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ３）および３５０ｍＭ  ＫＣｌであった。２００μｌ／分の流速での９５分間の勾配をペプチドの分画に使用した：１０分間の１００％Ａ、４５分間にわたって５０％Ｂに勾配、１５分間にわたって１００％Ｂに勾配、そして０．１分間で１００％Ａに戻る勾配、１００％Ａで２０分間保持。合計８０個の画分を回収し、−２０℃で保存した。９６ウェルスピンカラム（Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８シリカ：Ｎｅｓｔ  Ｇｒｏｕｐ，Ｓｏｕｔｈｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）を用いて脱塩するために、それらの画分を蒸発させ、１００μｌの０．１％ＴＦＡに再懸濁した。８０％ＡＣＮ／０．１％ギ酸（ＦＡ）中に溶出した後、画分を４３個の画分に統合し、蒸発させ、２５μｌの５％ＦＡに再懸濁した。
【０２２１】
ＣａｐＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｉｎｃ．，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）に接続されたＱ−Ｔｏｆ−２質量分析計においてＳＣＸ画分（各５μｌ）を解析した。そのＱ−Ｔｏｆ−２は、ナノスプレー源を備えていた。Ｎａｎｏｅａｓｅ  Ｃ１８  ７５μｍ  ＩＤ×１５ｃｍ溶融シリカキャピラリーカラム（Ｗａｔｅｒｓ  Ｉｎｃ．，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）および９５分間の水／ＡＣＮ勾配を用いて、各ＳＣＸ画分を分離した。上記質量分析計は、Ｇｌｕ１フィブリノペプチドＢを用いて較正された。ＭＳ／ＭＳＭＳ測定方法を用いて、スペクトルを取得した。ｍ／ｚが４００〜１５００の質量をＭＳ測定のためにスキャンし、ｍ／ｚが５０〜１９００の質量をＭＳＭＳのためにスキャンした。ＰｒｏｔｅｉｎＬｙｎｘ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｓｅｒｖｅｒ  ｖ．２．１ソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ  Ｉｎｃ．，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いてＭＳ／ＭＳスペクトルを処理した。
【０２２２】
コントロールサンプルからは合計３，１２０個のＭＳ／ＭＳスペクトルおよびＩＡＩサンプルからは２，８００個のＭＳ／ＭＳスペクトルを、公知の夾雑物ならびにＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔヒトデータベース（バージョン４６．６）のフォワードエントリーおよびリバースエントリーを含む組み合わされたデータベースに対して、３つの独立した検索エンジン：ＯｐｅｎＳｅａ、ＴｕｒｂｏＳｅｑｕｅｓｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）およびＸ！Ｔａｎｄｅｍを用いて検索した。ＰＥＡＫＳソフトウェア（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｏｎｔａｒｉｏ，ＣＡ）を用いてＯｐｅｎＳｅａ検索エンジン用のデノボ配列を生成した。個別の検索エンジンの結果からの同定タンパク質を、Ｓｃａｆｆｏｌｄソフトウェア（Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）において実行される確率的タンパク質同定アルゴリズムを用いて統合した。コントロールサンプルからのスペクトルの５２％およびＩＡＩサンプルからのスペクトルの５０％が、少なくとも１つの信頼できる同定ペプチド（確率≧０．８）を有するタンパク質に割り当てられた。少なくとも２個の独立した同定ペプチドを有する同定タンパク質（確率≧０．８）を、サンプル中に存在する可能性があるとみなした。
【０２２３】
ポリクローナル抗体およびウエスタン免疫ブロット法
免疫原性のペプチドおよび／または組換えタンパク質を使用して、ウサギおよびヤギのポリクローナル抗体を作製した（ＤＳＬ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｂｓｔｅｒ，ＴＸ）。次いで、アフィニティ精製した抗体をウエスタンブロットに使用した。１００μｇのＣＶＦタンパク質を４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて分離し、ＰＶＤＦ膜に転写した。その膜を、ＰＢＳＴ中の５％無脂肪乳で４５分間、室温においてブロッキングし、１μｇ／ｍｌの１次抗体（ＩＧＦＢＰ−１、アズロシジン、カルグラニュリン−Ａ、カルグラニュリン−Ｂ、アネキシンＩＩ、リポカリン、プロフィリン）とともに４℃において一晩インキュベートした。ＴＢＳＴで３回洗浄した後、その膜をＩｇＧ−ＨＲＰ２次抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）とともにインキュベートし、高感度化学発光（Ｐｉｅｒｃｅ）で可視化した。
【０２２４】
統計解析
スペクトルカウンティングを用いて、コントロールＭｕｄＰＩＴサンプルと感染ＭｕｄＰＩＴサンプルとの間で異なって発現しているタンパク質を測定した。スペクトルカウンティングを用いたタンパク質定量化のために、２個よりも多い信頼できる同定ペプチドを有するすべてのタンパク質を検討した。同種のタンパク質（例えば、免疫グロブリン、α−１−酸−糖タンパク質１および２ならびに妊娠特異的糖タンパク質）に対するスペクトルカウントを単一エントリーにまとめることによって、同定されたタンパク質リストをさらにキュレートした。似ていないタンパク質間の同一のペプチドのスペクトルカウントを、タンパク質間において等比で分割した。両方のサンプルに対するキュレートされたタンパク質リストをマージし、サンプル間における各タンパク質に対するスペクトルカウントにおける独立性２×２χ２検定を用いて、それらの間で異なって存在するタンパク質を見出した。異なって多く存在するタンパク質の偽陽性率を低下させるために、ｐ値＜０．１を有し、かつ、サンプルの少なくとも１つにおいて少なくとも４個のＭＳ／ＭＳスペクトルにマッチする（確率＞０．８）少なくとも２個の独立したペプチドを有するタンパク質だけを統計学的に有意であるとみなした。スペクトルカウント比を計算するために公開されている式（Ｏｌｄ，Ｗ．Ｍ．ら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２００５，４，（１０），１４８７−５０２）を用いて、上記の基準を満たすタンパク質が何倍変化したかを判定した。
【０２２５】
実施例１７
多次元タンパク質同定技術（ＭｕｄＰＩＴ）を用いた非ヒト霊長類実験ＩＡＩモデルにおけるＣＶＦプロテオームのグローバル解析
実施例１６に記載されたプロトコルを用いて、以下の結果を得た。
【０２２６】
結果
Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｐａｒｖｕｍ感染後の実験的ＩＡＩ
羊水内の接種後に、すべての動物において速やかに感染を確立した。Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｐａｒｖｕｍ接種の平均５４時間後（３４〜７２時間後の範囲）に、基礎レベルの１００ＨＣＡから３，０００〜６，０００ＨＣＡを超えるレベルまでの子宮の収縮性の増強が生じ、ビショップスコアによって測定される進行性の子宮頸部の変化がもたらされた。以前に報告されているように（Ｇｒａｖｅｔｔ，Ｍ．Ｇ．，ら、Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  １９９４，１７１，（６），１６６０−７；Ｎｏｖｙ  ＭＪ，ら：Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｐｒｉｍａｔｅ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｃｈｏｒｉｏａｍｎｉｏｎｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｐｒｅｔｅｒｍ  ｌａｂｏｒ．  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．  ２００１，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｃａｎａｄａ，Ｍａｒｃｈ  １４−１７，２００１）、子宮の収縮性の増強の前に、炎症性サイトカインのＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−８ならびにプロスタグランジンＥ２およびＦ２αが有意に上昇した。子宮の収縮性の最初の増強の時点で、ＩＡＩの他の臨床的徴候を有する動物はいなかった。分娩後、病理組織学的検査により、すべての症例において絨毛羊膜炎が確認された。
【０２２７】
多次元タンパク質同定技術（ＭｕｄＰＩＴ）を用いた非ヒト霊長類実験的ＩＡＩモデルにおけるＣＶＦプロテオームのグローバル解析
質量分析ベースのペプチド同定および定量化の方法の信頼性が高まったことによって、ＭＳ／ＭＳと組み合わされた、大規模かつ様々な多次元的ペプチド分離の開発が開始された。そのような「ショットガン」ペプチドシークエンスの試みによって、信頼性の高いタンパク質同定、ならびに平行して解析されるサンプルセットを比較するための相対的定量的情報がもたらされる。
【０２２８】
ＭｕｄＰＩＴおよびゲルベースの分画（ＬＣ−タンデム質量分析に組み合わされる１Ｄ  ＰＡＧＥ）解析を用いて、ＣＶＦにおいて合計２０５個の特有タンパク質（表６）を同定した。ＧｅｎｅＯｎｔｏｌｏｇｙターム（ＤＡＶＩＤ  Ｖ２．１）を用いたＣＶＦプロテオームの機能アノテーション（図２３Ａ）によって、それらの大部分が代謝（２５％）および免疫応答（２３％）に関連することが示された。ＣＶＦから同定されたタンパク質の予測される細胞内位置の解析（図２３Ｂ）によって、アノテーションされたタンパク質が、細胞質（２４％）、分泌型（１８％）、細胞骨格系（１４％）および核（１４％）のカテゴリー由来であることが示された。同定されたタンパク質のうちの１３％の細胞内の位置に関する情報は入手できなかった。
【０２２９】
感染の環境における差次的なタンパク質レベルを解析するために、実験的ＩＡＩの前後に得られたＣＶＦサンプルをトリプシンで消化し、ＭｕｄＰＩＴ解析に供した。ＭｕｄＰＩＴ解析から得られたＭＳ／ＭＳスペクトルによって、コントロールサンプルおよび感染サンプルにおいて、それぞれ１４９個および１５１個のタンパク質の信頼性の高い同定（２以上のペプチド／タンパク質）がもたらされた。偽陽性タンパク質を同定する比率を下げるために、３つの独立した検索エンジンを用いて、公知の夾雑物（すなわち、トリプシン、ケラチンおよび血清アルブミン）ならびにＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔヒトおよび霊長類データベースからのフォワードとリバースの両方のペプチド配列エントリーを含んでいるデータベースに対して、ＭＳ／ＭＳスペクトルを検索した。確率に基づくアルゴリズムであるＳｃａｆｆｏｌｄ（Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）を用いて、３つの検索エンジンからの結果を結合した。複数の検索アルゴリズムを使用すると、偶然生じるペプチド同定が減少することによって、報告される同定の信頼性が上がる。上で報告された同定タンパク質数は、２つ以上の特有ペプチド同定を有した。
【０２３０】
コントロールサンプルとＩＡＩサンプルとを定量的に比較するために、スペクトルカウンティング方法を実行した。スペクトルカウンティングでは、複雑なディファレンシャルラベリング実験（Ｚｙｂａｉｌｏｖ  ２００５）に頼ることなく２つのサンプルプール間の存在量の差を迅速に検出することができる。コントロールおよびＩＡＩからのキュレートされたタンパク質リストをコンパイルし、各タンパク質のスペクトルカウントに対する独立なχ２検定を行った。計算されたχ２値が２．７０６を超えていた（９０％信頼区間）タンパク質を表７に報告する。
【０２３１】
その表には、コントロールサンプルおよびＩＡＩサンプルに対して所与のタンパク質にマッチするスペクトルカウントおよびＭＳ／ＭＳペプチドスペクトルの数が含まれている。重要なタンパク質の各々についてコントロールとＩＡＩとの間で何倍の変化があったかも計算した。スペクトルカウンティングによってコントロールとＩＡＩとの間で異なって存在していることが見出された２７個のタンパク質のうち、１９個のタンパク質が、９９％信頼区間におけるχ２値を有しており、８個のタンパク質が、９５％信頼区間におけるχ２値を有していた。タンパク質分離（１Ｄ  ＰＡＧＥ  ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を用いて行われた定量的なプロテオミクス研究と比べて、スペクトルカウンティングによって見出された１５個のタンパク質が、１−Ｄゲルベース実験において見られた差次的なトレンドと対応した。有望な低存在量血清タンパク質マーカーの同定は、ＭｕｄＰＩＴ解析の利益の１つである。多次元的なフロントエンドのペプチド分離（ＳＣＸおよびＲＰ−ＬＣ）によって、ゲルベースプロテオーム解析ならびにＭＡＬＤＩプロファイリング技術よりも広いダイナミックレンジな濃度の照合が可能になる。
【０２３２】
表７にまとめた、ＩＡＩを検出するための、ＣＶＦ中の有望な生物学的マーカーは、主に免疫調節タンパク質であった。これらのうちのいくつか（カルグラニュリンＡおよびＢ、アズロシジンならびにＩＧＦＢＰ−１を含む）は、ＩＡＩ  ＡＦ中で異なって存在し、ＩＡＩ  ＣＶＦにおいてアップレギュレートされることも見出された。総ＩＧＦＢＰ−１の差次的な存在量（表７）は、図２４Ａ〜Ｄにおけるウエスタンブロットによって同定された完全な３０ｋＤａタンパク質とタンパク分解性フラグメントの両方を反映した。しかしながら、ＩＡＩの環境において存在するＩＧＦＢＰ−１の大部分は、タンパク分解性フラグメントを含んでいた（図２４）。羊水内または下部生殖管の感染に対するマーカーとして以前に同定されたディフェンシンは、３〜５ｋＤａのピークにおいても同定された。しかしながら、コントロールおよびＩＡＩ  ＣＶＦ中のそれらの差次的な存在は、スペクトル解析によって統計的有意性に達しなかった。興味深いことに、免疫調節性ペプチドのうちのいくつかの基礎レベルは、正常な無菌の羊膜腔よりも、微生物が多い下部生殖管におけるより慢性的な炎症性環境と一致して、ＡＦよりもＣＶＦにおいて高かった。
【０２３３】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによるＩＡＩタンパク質プロファイルの同定
ＣＶＦおよびＡＦタンパク質抽出物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ解析により、３〜５ｋＤａおよび１１〜１２ｋＤａ領域において、感染霊長類と非感染霊長類およびヒトＣＶＦとヒトＡＦとの間においていくつかのピーク強度の差が明らかになり（図２４Ａ〜Ｄ）、それは、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦによって得られた、ＡＦにおける以前に報告されていたタンパク質サイン（Ｇｒａｖｅｔｔ，Ｍ．Ｇ．ら、Ｊａｍａ  ２００４，２９２，（４），４６２−９）と類似していた。
【０２３４】
１０．８ｋＤａのクラスターは、すべての症例の感染ＣＶＦおよび感染羊水において一貫してアップレギュレートされていた。興味深いことに、このピークの相対強度は、感染後のＡＦサンプル間よりもＣＶＦサンプル間のほうが高く、これは、下部生殖管環境の基礎的状態が炎症促進性であるという仮説と一致する。ＩＡＩに応答しての３〜５ｋＤａのクラスターの高発現は、ＣＶＦよりもＡＦにおいてよりロバストである。質量が３４３２Ｄａおよび４１２８Ｄａのタンパク質は、一般に、ＩＡＩの存在下においてＡＦおよびＣＶＦにおいて過剰発現していた。これらの質量は、先に報告されているように（Ｂｕｈｉｍｓｃｈｉ，Ｉ．Ａ．；ら、Ｂｊｏｇ  ２００５，１１２，（２），１７３−８１）ディフェンシンであり得る。Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｐａｒｖｕｍ感染後の長期的なサンプリングによって、１０．８ｋＤａのクラスターの強度が接種の２４時間後に増加し、ＣＶＦサンプルとＡＦサンプルの両方において感染動物のＨＣＡの増加が先行したことが明らかになった（データ示さず）。
【０２３５】
ＩＡＩ生物学的マーカーの免疫検出
ＩＡＩにおいて同定されたタンパク質の差次的な発現を確認するために、本発明者らは、ＭｕｄＰＩＴ解析から同定されたマーカーのうち５つを選択した。カルグラニュリンＡおよびＢ、ＩＧＦＢＰ−１、アズロシジン、リポカリン、アネキシンＩＩならびに未制御（ｕｎｒｅｇｕｌａｔｅｄ）タンパク質（ハプトグロビン）に対する抗体を作製することにより、有望なＩＡＩ生物学的マーカーの差次的な存在量を確かめた。図２５に示されるように、ウエスタンブロット解析によって、これらの生物学的マーカーのすべての差次的な存在が確認され、これは、ＩＡＩ  ＣＶＦに対して行われたタンパク質同定実験と一致する差次的なレベルを表した。
【０２３６】
考察
無症状のＩＡＩが、極度の早産の少なくとも５０％において存在し、その場合、新生児の罹患率および死亡率が、異常に高い（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ｌ．ら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０００，３４２，（２０），１５００−７）。ＩＡＩの徴候および症状が感染に遅れて顕在化するという事実によって、ＩＡＩの早期の臨床診断は困難になる。さらに、利用可能な非侵襲性の診断検査（例えば、母体の白血球数またはＣ反応性タンパク質）は、予測値に限界がある。ＡＦのグルコース、白血球、インターロイキン−６の測定またはグラム染色をはじめとした他の検査は羊水穿刺を必要とし、さらに、ＡＦ培養の場合では、その結果が、臨床的に最適な時間枠を超えて遅れる。
【０２３７】
雌において観察される経過に平行するＩＡＩと早産との因果関係は、非ヒト霊長類実験的モデルにおいて証明されている（Ｇｒａｖｅｔｔ，Ｍ．Ｇ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  １９９４，１７１，（６），１６６０−７）。前の実施例に記載した研究において、本発明者らは、実験的ＩＡＩを有するアカゲザル由来ならびに無症状のＩＡＩおよび早産を有する女性由来のＡＦにおけるタンパク質プロファイルを特徴付けるために、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を利用した（Ｇｒａｖｅｔｔ，Ｍ．Ｇ．ら、Ｊａｍａ  ２００４，２９２，（４），４６２−９もまた参照のこと）。本発明者らは、感染後のすべてのＡＦサンプルでは３〜５ｋＤａおよび１０．８ｋＤａの分子量範囲において高レベルのペプチドを有し、感染前に得られたＡＦではそのようなペプチドを有しなかった特有のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦプロファイルを同定した。同様に、この特有のタンパク質プロファイルが、ＩＡＩおよび早産を有するすべての女性において観察され、感染しておらず早期陣痛を有していてその後満期産だった女性では観察されなかった。これらの質量の範囲内のタンデム質量分析によって同定されたタンパク質には、カルグラニュリンＡおよびＢならびにＩＧＦＢＰ−１の特有のタンパク分解性フラグメントが含まれていた。これらの知見は最近確かめられ、ＩＡＩの他のタンパク質生物学的マーカーが、Ｂｕｈｉｍｓｃｈｉら、Ｂｊｏｇ  ２００５，１１２，（２），１７３−８１によって同定された。
【０２３８】
本研究において、本発明者らは、初めてＣＶＦのプロテオームを特徴づけ、そして、以前に報告されたもの（Ｇｒａｖｅｔｔ，Ｍ．Ｇ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  １９９４，１７１，（６），１６６０−７；Ｎｏｖｙ  ＭＪ，ら、：Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｐｒｉｍａｔｅ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｃｈｏｒｉｏａｍｎｉｏｎｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｐｒｅｔｅｒｍ  ｌａｂｏｒ．  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．２００１，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｃａｎａｄａ，Ｍａｒｃｈ  １４−１７，２００１；Ｇｒａｖｅｔｔ，Ｍ．Ｇ．ら、Ｊａｍａ  ２００４，２９２，（４），４６２−９）と同じ実験的モデルを利用して、実験的ＩＡＩを有するアカゲザル由来のＣＶＦ中のタンパク質プロファイルを特徴づけ、そしてＡＦのものと比較しようとした。これは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析および多次元タンパク質同定技術（ＭｕｄＰＩＴ）を利用してＣＶＦのタンパク質プロファイルを特徴付け、そしてより到達可能な母体のサンプリング部位からサンプルを連続的に非侵襲性で回収できる部位に存在するＩＡＩに対する新規生物学的マーカーを同定した初めての報告である。これにより、ＩＡＩの病因において子宮内感染をさかのぼってリスクの予測または診断が可能になり得、また、母体の血清および胎児のＡＦサンプリングと比較することによって、ＩＡＩの病原論に新たな知見がもたらされ得る。本発明者らは、実験的ＩＡＩがＵｒｅａｐｌａｓｍａ  ｐａｒｖｕｍを羊水内接種することによって引き起こされる十分に確立された非ヒト霊長類モデルを利用した。本発明者らは、組織学的絨毛羊膜炎を有する女性の胎盤から（Ｈｉｌｌｉｅｒ，Ｓ．Ｌ．ら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  １９８８，３１９，（１５），９７２−８）、または完全な胎膜での早期陣痛の女性のＡＦから最もよく単離される微生物が、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ種（Ｕ．ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍおよびＵ．ｐａｒｖｕｍ）であるので、この病原体を選択した。Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ種は、分娩後の子宮内膜筋層炎、新生児敗血症、髄膜炎および新生児の気管支肺異形成症にも関係づけられている（Ｃｈａｉｍ，Ｗ．ら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｂｉｏｌ  ２００３，１０９，（２），１４５−８；Ｖｉｓｃａｒｄｉ，Ｒ．Ｍ．ら、Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｄｅｖ  Ｐａｔｈｏｌ  ２００２，５，（２），１４１−５０；Ｙｏｏｎ，Ｂ．Ｈ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  ２０００，１８３，（５），１１３０−７）。
【０２３９】
本発明者らは、本研究において２つの非常に異なるプロテオミクスのアプローチを利用した：異なる発現プロファイルを生成し、詳細なタンパク質同定とともに迅速なスクリーニングアッセイの開発にかなう、迅速なタンパク質フィンガープリンティングアプローチ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）、および従来のイムノアッセイによる同定に適した生物学的マーカーを同定する定量化アプローチ（ＬＣ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ，ＭｕｄＰＩＴ）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳベースのプロファイリング手法は、そのロバストネス、使用しやすさおよびハイスループット性に対して標的化されている。現在までのプロファイリング研究の大部分は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳと組み合わされたクロマトグラフィ技術を用いた血清分画を含むＭＡＬＤＩ−ＭＳタンパク質プロファイリング方法を用いて疾患状態を評価するものであった。本研究からのＭＳタンパク質プロファイルは、正常サンプルと撹乱されているサンプルとを区別することができる特有の質量を同定し得るが、使用した方法は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳタンパク質ｍ／ｚ値だけに基づいて、見出されたタンパク質分類子を同定することができないし、確認することもできない。
【０２４０】
差次的なタンパク質発現パターンを検出するために通常使用される２次元ゲル電気泳動（２−ＤＥ）（Ｔｓａｎｇａｒｉｓ，Ｇ．；ら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２００５，２６，（６），１１６８−７３；Ｐｉｅｐｅｒ，Ｒ．ら、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２００３，３，（７），１３４５−６４）は、低存在量タンパク質を検出する能力は限定的で、高存在量タンパク質の検出に偏っている（Ｇｏｒｇ，Ａ．，ら、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２００４，４，（１２），３６６５−８５）。ＭＳ／ＭＳと組み合わされた多次元的ＬＣアプローチの進歩（Ｍｕｌｔｉ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＭｕｄＰＩＴ）によって、複雑な混合物のトリプシン消化物からの全体的なタンパク質発現の変化を研究するための、より良好なサンプルの濃縮、分離および詳細なペプチド範囲を可能にした（Ｗａｓｈｂｕｒｎ，Ｍ．Ｐ．ら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００１，１９，（３），２４２−７．；Ｓｃｈｉｒｍｅｒ，Ｅ．Ｃ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００３，３０１，（５６３８），１３８０−２．；Ｌｅ  Ｒｏｃｈ，Ｋ．Ｇ．ら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  ２００４，１４，（１１），２３０８−１８；Ｐｅｎｇ，Ｊ．ら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００３，２１，（８），９２１−６；Ｉｄｅｋｅｒ，Ｔ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００１，２９２，（５５１８），９２９−３４）。最近、複雑なペプチド混合物からのＭＳ／ＭＳスペクトルのサンプリングが、相対的定量的情報の出所としてみなされている。スペクトルカウンティングを用いることにより、ＭｕｄＰＩＴによって解析される複雑なペプチド混合物におけるペプチド同定の総数が、１００倍の濃度範囲においてタンパク質の存在量と直線的に相関すること、および質量分析から得られるイオンクロマトグラムよりも広いダイナミックレンジで、より再現性があることが見出された（Ｏｌｄ，Ｗ．Ｍ．ら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２００５，４，（１０），１４８７−５０２；Ｌｉｕ，Ｈ．ら、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ２００４，７６，（１４），４１９３−２０１；Ｚｙｂａｉｌｏｖ，Ｂ．ら、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ２００５，７７，（１９），６２１８−２４）。
【０２４１】
ＭｕｄＰＩＴ解析を用いてコントロールおよびＩＡＩにおけるＣＶＦ中で発現しているタンパク質を特徴付けることによって、ＩＡＩにおいてアップレギュレートされるかなりの数の免疫応答／防御関連タンパク質が明らかになった。ＩＡＩのＡＦとＣＶＦとに異なって多量に存在するタンパク質の間にかなりの程度の重複が存在する。本発明者らの研究において、カルグラニュリン、アズロシジン、リポカリン、Ｌ−プラスチンおよびその他のもの（ＩＡＩに対する、羊水中の有望な生物学的マーカーであると以前に同定されたもの）もまた、ＣＶＦ中に異なって存在していた。上記の免疫調節物質に加えて、感染に応答したＣＶＦ中の抗菌性タンパク質アズロシジンの検出から、子宮内の免疫応答に新たな知見がもたらされる。アズロシジン（ＣＡＰ３７）は、宿主防御および炎症において潜在的に重要な作用を有する、ヒト好中球から単離されたカチオン性の抗微生物タンパク質である（Ｇａｂａｙ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９８９，８６，（１４），５６１０−４）。ＩＡＩにおいて高発現している別の抗微生物タンパク質は、カテリン（ｃａｔｈｅｌｉｎ）であり、これは、細菌の感染に対して活性なＣ末端の３７残基のアルファヘリックスペプチドを有する（Ｚｈａｏ，Ｃ．ら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ２００１，４５，（１０），２６９５−７０２）。感染ＣＶＦ中の高レベルのアネキシンは、ＣＶＦ特異的ＩＡＩ応答に関し得る。アネキシンは、炎症性および防御応答に関連するＣａ２＋結合タンパク質の１つの群である。アネキシンＡ２は、ウイルスで形質転換された細胞株およびヒト腫瘍においてアップレギュレートされる（Ｆｉｌｉｐｅｎｋｏ，Ｎ．Ｒ．ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００４，２７９，（１０），８７２３−３１）。アネキシン１は、ステロイドホルモンの抗炎症性作用を調節する（Ｃａｓｔｒｏ−Ｃａｌｄａｓ，Ｍ．ら、Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  Ｉｎｆｌａｍｍ  ２００１，１０，（５），２４５−５１）。マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）は、多くの炎症状態において発現し、結合組織の損傷の一因となる亜鉛依存性エンドペプチダーゼの１ファミリーである。パラクリンシグナルまたはオートクラインシグナルのように、細菌の産物ならびに／または炎症性サイトカインＩＬ−１ベータおよびＴＮＦ−アルファは、羊膜絨毛膜細胞がＭＭＰ発現を誘導するのを引き起こし得ると提唱されている（Ｖａｄｉｌｌｏ−Ｏｒｔｅｇａ，Ｆ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  ２００２，１８６，（１），１２８−３８；Ｖａｄｉｌｌｏ−Ｏｒｔｅｇａ，Ｆ．ら、Ｂｊｏｇ  ２００５，１１２  Ｓｕｐｐｌ  １，１９−２２。
【０２４２】
第２のアプローチにおいて、本発明者らは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを利用し、実験的霊長類ＩＡＩの環境においてＣＶＦ中で有意に過剰発現される１０．８ｋＤａのクラスターを検出した。これは、本発明者らの以前の研究（Ｇｒａｖｅｔｔ，Ｍ．Ｇ．ら、Ｊａｍａ  ２００４，２９２，（４），４６２−９）において観察されたＡＦプロテオームプロファイルと類似しており、このサインプロファイルの、ＣＶＦ中のＩＡＩの検出に対する特異性を確かめるものである。この過剰発現される特有のクラスターにおいて同定されたタンパク質の１セット、すなわち、カルグラニュリンは、急性炎症性組織におけるマクロファージおよび上皮細胞によって発現されるＳ−１００カルシウム結合タンパク質ファミリーのメンバーであるので、この過剰発現される特有のクラスターは、感染に対する基本的な子宮内の免疫応答を表し得る。このクラスターからの第２の候補（ＩＧＦＢＰ−１のタンパク分解性フラグメント）は、感染に応答する潜在的なプロテアーゼ関連メカニズムを示唆する。完全なＩＧＦＢＰ−１は、ＡＦにおいて見られる主要なＩＧＦＢＰであり、胎膜と母体の脱落膜の両方によって合成される。しかしながら、特に、このサインは、相対的に低濃度でありながらもＣＶＦサンプル中に存在するが、感染前のＡＦサンプルには存在しない。これらの免疫調節性ペプチドのより高い基礎レベルは、羊水の基本的な炎症性の特徴と比べて、膣環境の基本的な炎症性の特徴を反映し得る。羊水は、正常では無菌であり、最低濃度の炎症性マーカーを有する。対照的に、膣は、炎症促進性で微生物が多い環境を特徴とする。従って、ＣＶＦサンプルは、非侵襲性のサンプリングが容易であるという利点を有し得るが、その結果は、細菌性の腟疾患などの局所的な炎症状態によって混乱し得る。
【０２４３】
ＣＶＦプロテオームの特徴付けおよびＩＡＩにおいて異なって発現されるかなりの数のタンパク質の同定は、生物学的マーカーを同定するために使用される感度の高いプロテオミクスのアプローチおよびＩＡＩに対する非侵襲性検査を開発する際のそれらの潜在的価値を補完するものである。ＣＶＦ、ＡＦおよび母体血清由来の一時的および定量的なサンプルの解析によってＩＡＩの病原に関して多くのことを知ることができる。他の子宮頸部−膣の炎症性生物学的マーカー（例えば、炎症性サイトカインおよび胎児フィブロネクチン）の調査によって、類似の問題が生じている（Ｒｉｚｚｏ，Ｇ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  １９９６，１７５，（４  Ｐｔ  １），８１２−７；Ｈｏｌｓｔ，Ｒ．Ｍ．ら、Ａｃｔａ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｓｃａｎｄ  ２００５，８４，（６），５５１−７；Ｄｉ  Ｎａｒｏ，Ｅ．ら、Ａｃｔａ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｓｃａｎｄ  ２００３，８２，（１２），１０７２−９；Ｙｏｏｎ，Ｂ．Ｈ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  ２００１，１８５，（５），１１３７−４２）。これらの観察結果および本発明者らの観察結果は、感染に関連する早産において、絨毛膜脱落膜界面で細胞外マトリックスが破壊されているという仮説、およびおそらく子宮頸部バリアの破壊に関連して、この界面において産生される炎症性メディエーターが膣円蓋部貯留に達するという仮説と一致する。
【０２４４】
まとめると、本発明者らは、子宮頸部−膣のタンパク質の全体的な発現を特徴づけ、子宮頸部膣液中のＩＡＩの有望な生物学的マーカーを同定するために、２つの補完的な（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）プロテオミクスのアプローチを利用した。実験的ＩＡＩ後にＣＶＦ中で異なって発現する異なる免疫調節性ペプチドが同定された。これらのペプチドの差次的な発現は、イムノアッセイを用いて確認され、ＩＡＩを診断するための非侵襲性で信頼性の高い検査の開発の機会を提供する。
【０２４５】
実施例１８
多次元タンパク質同定技術（ＭｕｄＰＩＴ）を用いたＩＡＩにおけるヒトＣＶＦプロテオームのグローバル解析
実施例１４に記載したプロトコルを用いて、以下の結果を得た。
【０２４６】
結果
上記ヒト研究から、患者のサブセットを、本明細書中で報告するようなプロテオーム解析のために遡及的に特定した。このサブセットは、子宮内感染の証拠を有していた２０人の患者（羊水から微生物の病原体が回収されたことまたは羊水のＩＬ−６濃度が＞２，０００ｐｇ／ｍｌであったことによって定義される）、および子宮内感染を有していなかったが早産であった２０人の患者のランダムに選択されたサブセット、および感染しておらず、子宮収縮抑制薬治療に反応性の早期陣痛を有していて、その後満期産だった２０人の患者を含んでいた。これらの患者が、本研究に対する研究集団を構成している。
【０２４７】
２本の６インチの滅菌Ｄａｃｒｏｎ付きプラスチックアプリケーター（Ｓｏｌｏｎ，Ｓｋｏｗｈｅｇａｎ，ＭＥ）を後膣円蓋に挿入し、滅菌された腟鏡で検査しながらそれを１５秒間回転させることによって、ヒトＣＶＦサンプルを回収した。回収後、プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）を含むリン酸緩衝食塩水中にタンパク質を抽出した。抽出後、サンプルを遠心することにより、任意の残骸および細胞材料を除去し、上清を−７０℃で保存した。
【０２４８】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析と組み合わされた１次元ＰＡＧＥ
各群のサンプルからプールされた１００ｍｇのＣＶＦタンパク質をヨードアセトアミドで還元し、そしてＴｒｉｓ−トリシン、１０〜２０％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて分離した。そのゲルをクマシーブルーＲ−２５０で染色し、各レーンの異なるバンドをゲルから切り出し、脱染し、トリプシンを用いて３７℃において２４時間、ゲル内消化した。次いで、ペプチドを０．１％ＴＦＡで抽出し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製のＺｉｐ−Ｔｉｐ  ｃ１８ピペットチップを用いて精製した。ゲル内消化後、ＣａｐＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）に連結されたＱ−Ｔｏｆ−２質量分析計（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＵＫ  Ｌｔｄ，Ｕｎｉｔｅｄ  ｋｉｎｇｄｏｍ）においてサンプルを解析した。４００〜１５００Ｄａの質量をＭＳ測定のためにスキャンし、５０〜１９００Ｄａの質量をＭＳ／ＭＳ測定のためにスキャンした。ＭｕｄＰＩＴ解析において以下に記載されるように、タンパク質同定のためにデータ解析を行った。
【０２４９】
ＭｕｄＰＩＴタンパク質同定およびスペクトルカウンティング
ＣＶＦのＭｕｄＰＩＴ解析のために、各サンプル（各群ｎ＝２０）からの５０μｌをプールすることによって、各条件から０．６ｍｇのサンプルを調製した。タンパク質を、８Ｍ尿素、１Ｍ  Ｔｒｉｓ塩基、８０ｍＭメチルアミンおよび８ｍＭ  ＣａＣｌ２（ｐＨ８．５）を含んでいる１００ｍｌの消化緩衝液に溶解した。システイン残基の還元およびアルキル化のために、まず、サンプルを１２．５ｍｌの０．９Ｍ  ＤＴＴ中で５０℃において１５分間インキュベートし、次いで、２５ｍｌの１．０  Ｍヨードアセトアミド中、暗黒下でさらに１５分間、室温においてインキュベートした。さらなる１２．５ｍｌの０．９Ｍ  ＤＴＴを２１０ｍｌの水および１Ｎ  ＮａＯＨとともに加えることによって、その溶液をｐＨ８．５に調整した後、４０ｍｌの質量分析グレードのトリプシン（１ｍｇ／ｍｌ；Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）を加えた。次いで、サンプルを完全に混合し、３７℃で一晩インキュベートした。４０ｍｌのギ酸を加えることによって消化を停止した。ＭｕｄＰＩＴ解析の前に、Ｃ１８  Ｓｅｐ−Ｐａｋカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いて消化物を脱塩した。
【０２５０】
脱塩した消化物（１ｍｌ）をポリスルホエチル強陽イオン交換カラム（２．１ｍｍ  ＩＤ×１００ｍｍ、５ｍｍ粒子および３００−ｍポアサイズ（Ｎｅｓｔ  Ｇｒｏｕｐ，Ｓｏｕｔｈｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）上に注入し、ＵＶ検出器および画分回収器を備えたＨＰＬＣを用いて分画した。溶媒Ａは、２５％アセトニトリル（ＡＣＮ）を含む５．６ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ３）であり、溶媒Ｂは、２５％ＡＣＮを含む、５．６ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ３）および３５０ｍＭ  ＫＣｌであった。２００ｍｌ／分の流速での９５分間の勾配をペプチドの分画に使用した：１０分間の１００％Ａ、４５分間にわたって５０％Ｂに勾配、１５分間にわたって１００％Ｂに勾配、そして０．１分間で１００％Ａに戻る勾配、１００％Ａで２０分間保持。合計８０個の画分を回収し、−２０℃で保存した。９６ウェルスピンカラム（Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８シリカ：Ｎｅｓｔ  Ｇｒｏｕｐ，Ｓｏｕｔｈｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）を用いて脱塩するために、それらの画分を蒸発させ、１００ｍｌの０．１％ＴＦＡに再懸濁した。８０％ＡＣＮ／０．１％ギ酸（ＦＡ）中に溶出した後、画分を４３個の画分に統合し、蒸発させ、２５ｍｌの５％ＦＡに再懸濁した。
【０２５１】
ＣａｐＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｉｎｃ．，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）に接続されたＱ−Ｔｏｆ−２質量分析計においてＳＣＸ画分（各５μｌ）を解析した。そのＱ−Ｔｏｆ−２は、ナノスプレー源を備えていた。Ｎａｎｏｅａｓｅ  Ｃ１８  ７５ｍｍ  ＩＤ×１５ｃｍ溶融シリカキャピラリーカラム（Ｗａｔｅｒｓ  Ｉｎｃ．，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）および９５分間の水／ＡＣＮ勾配を用いて、各ＳＣＸ画分を分離した。上記質量分析計は、Ｇｌｕ１フィブリノペプチドＢを用いて較正された。ＭＳ／ＭＳＭＳ測定方法を用いて、スペクトルを取得した。ｍ／ｚが４００〜１５００の質量をＭＳ測定のためにスキャンし、ｍ／ｚが５０〜１９００の質量をＭＳＭＳのためにスキャンした。ＰｒｏｔｅｉｎＬｙｎｘ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｓｅｒｖｅｒ  ｖ．２．１ソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ  Ｉｎｃ．，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いてＭＳ／ＭＳスペクトルを処理した。
【０２５２】
各群から平均２，８００個のＭＳ／ＭＳスペクトルを、既知の夾雑物ならびにＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔヒトデータベース（バージョン４６．６）のフォワードエントリーおよびリバースエントリーを含んでいる組み合わされたデータベースに対して、３つの独立した検索エンジン：ＯｐｅｎＳｅａ  １４、１５、ＴｕｒｂｏＳｅｑｕｅｓｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）およびＸ！Ｔａｎｄｅｍ１６を用いて検索した。ＰＥＡＫＳソフトウェア（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｏｎｔａｒｉｏ，ＣＡ）を使用して、ＯｐｅｎＳｅａ検索エンジン用にデノボ配列を生成した。個別の検索エンジンの結果からのタンパク質同定を、Ｓｃａｆｆｏｌｄソフトウェア（Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）において実行される確率的タンパク質同定アルゴリズムを用いて統合した。少なくとも２個の独立した同定ペプチドを有する同定タンパク質（確率＞０．８）を、サンプル中に存在する可能性があるとみなした。
【０２５３】
結果
ＰＴＬ  対  ＩＡＩ。ＰＴＬとＩＡＩとの比較から、統計学的に有意に（ｐ＜０．０５）異なる存在量の３３個のタンパク質が示された（表１０）。これらのタンパク質の存在量の差は、＋４５倍から−８．７倍までに及んだ。扁平上皮癌抗原１（ＳＣＣＡ−１）、アネキシンＡ２（アネキシンＩＩ）、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ７（ソリアシン（Ｐｓｏｒｉａｓｉｎ））、ペリプラキン（Ｐｅｒｉｐｌａｋｉｎ）、熱ショック同族７１ｋＤａタンパク質、インボルクリン、表皮型脂肪酸結合タンパク質（Ｅ−ＦＡＢＰ）、チオレドキシン（ＡＴＬ由来因子）（ＡＤＦ）、ヒストンＨ４、神経芽細胞分化関連タンパク質ＡＨＮＡＫ、アネキシンＡ１（アネキシンＩ）（リポコルチンＩ）、アクチン、細胞質１（ベータ−アクチン）、熱ショックタンパク質ベータ−１（ＨｓｐＢ１）、フルクトース二リン酸アルドラーゼＡ（ＥＣ４．１．２．１３）、ムチン−５Ｂ前駆体、小型プロリンリッチタンパク質２Ａ（ＳＰＲ−２Ａ）（２−１）、シスタチンＡ（ステフィン（Ｓｔｅｆｉｎ）Ａ）（シスタチンＡＳ）、ミエロペルオキシダーゼ前駆体（ＥＣ１．１１．１．７）（ＭＰＯ）、コルフィニンＡ（小型プロリンリッチタンパク質ＩＡ）（ＳＰＲ−ＩＡ）、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン前駆体を含む２１個のタンパク質は、ＩＡＩよりもＰＴＬにおいて多く存在した。ヘモペキシン前駆体（ベータ−１Ｂ−糖タンパク質）、セロトランスフェリン前駆体（トランスフェリン）カタラーゼ（ＥＣ１．１１．１．６）、リゾチームＣ前駆体（ＥＣ３．２．１．１７）、マトリックスメタロプロテアーゼ−９前駆体（ＭＭＰ−９）ｋＤａマトリックスメタロプロテアーゼ−９］、ハプトグロビン前駆体、プロフィリン−１（プロフィリンＩ）、血清アルブミン前駆体、フィブロネクチン前駆体（ＦＮ）（低温不溶性グロブリン）、脳酸可溶型タンパク質１（ＢＡＳＰ１タンパク質）、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素、ビタミンＤ結合タンパク質前駆体（ＤＢＰ）を含む１２個のタンパク質は、ＩＡＩにおいて有意に多く存在した。
【０２５４】
ＩＡＩを有しない早産  対  ＩＡＩを有する早産。ＩＡＩを有しないＰＴＢとＩＡＩを有するＰＴＢとの比較により、統計学的に有意に（ｐ＜０．０５）異なる存在量の２７個のタンパク質が示された（表１１）。ハプトグロビン前駆体、プロフィリン−１（プロフィリンＩ）、脳酸可溶型タンパク質１（ＢＡＳＰ１タンパク質）、フルクトース二リン酸アルドラーゼＡ、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素、カタラーゼ（ＥＣ１．１１．１．６）、アルファ−アクチニン４（非筋肉アルファ−アクチニン４）、ミオシン−９（ミオシン重鎖、非筋肉型ＩＩａ）、血清アルブミン前駆体、ビタミンＤ結合タンパク質前駆体（ＤＢＰ）、マトリックスメタロプロテアーゼ−９前駆体（ＭＭＰ−９）ｋＤａマトリックスメタロプロテアーゼ−９］、カルグラニュリンＣ（ＣＡＧＣ）（ＣＧＲＰ）（好中球Ｓ１００タンパク質）、サイモシンベータ−４（Ｔベータ４）、リゾチームＣ前駆体（ＥＣ３．２．１．１７）、シスタチンＢ（肝臓チオールプロテイナーゼインヒビター）、セロトランスフェリン前駆体（トランスフェリン）、アルファ−１−酸糖タンパク質１前駆体（ＡＧＰ１）、ベータ−２−糖タンパク質Ｉ前駆体（アポリポタンパク質Ｈ）、非分泌性リボヌクレアーゼ前駆体、アルファ−２−ＨＳ−糖タンパク質前駆体（フェチュイン−Ａ）、アルファ−１Ｂ−糖タンパク質前駆体（アルファ−１−Ｂ糖タンパク質）、ペプチドグリカン認識タンパク質前駆体（ＳＢＢＩ６８）（ＰＧＲＰ−Ｓ）、アネキシンＡ３（アネキシンＩＩＩ）（リポコルチンＩＩＩ）を含む２３個のタンパク質は、ＩＡＩを有するＰＴＢにおいてより多く存在した。Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ２（Ｓ−１００Ｌタンパク質）（ＣＡＮ１９）、トロポミオシンアルファ３鎖（トロポミオシン３）、ラクトトランスフェリン前駆体（ラクトフェリン）、小型プロリンリッチタンパク質３（コルフィニンベータ）、カリクレイン１３前駆体、表皮型脂肪酸結合タンパク質（Ｅ−ＦＡＢＰ）、ヒストンＨ４、熱ショックタンパク質ベータ−１（ＨｓｐＢ１）（熱ショック２７ｋＤａタンパク質）、アネキシンＡ１（アネキシンＩ）（リポコルチンＩ）、チオレドキシン（ＡＴＬ由来因子）（ＡＤＦ）、ペリプラキン（１９５ｋＤａ角化膜前駆体タンパク質）、熱ショック同族７１ｋＤａタンパク質（熱ショック７０ｋＤａタンパク質８）、ムチン−５Ｂ前駆体（ムチン５サブタイプＢ、気管気管支）、インボルクリン、神経芽細胞分化関連ＡＨＮＡＫ、フィブロネクチン前駆体（ＦＮ）（低温不溶性グロブリン）（ＣＩＧ）、アネキシンＡ２（アネキシンＩＩ）（リポコルチンＩＩ）、扁平上皮癌抗原１（ＳＣＣＡ−１），Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ７（ソリアシン）は、ＩＡＩを有しないＰＴＢにおいてより多く存在した。
【０２５５】
考察
上で述べたように、ＣＶＦプロテオームの特徴付けおよびＩＡＩにおいて異なって発現されるかなりの数のタンパク質の同定は、生物学的マーカーを同定するために使用される感度の高いプロテオミクスのアプローチおよびＩＡＩに対する非侵襲性検査を開発する際のそれらの潜在的価値を補完するものである。ＣＶＦ、ＡＦおよび母体血清由来の一時的および定量的なサンプルの解析によってＩＡＩの病原に関して多くのことを知ることができる。本発明者らの観察結果は、感染に関連する早産において、絨毛膜脱落膜界面で細胞外マトリックスが破壊されているという仮説、およびおそらく子宮頸部バリアの破壊に関連して、この界面において産生される炎症性メディエーターが膣円蓋部貯留に達するという仮説と一致する。
【０２５６】
まとめると、本発明者らは、子宮頸部−膣のタンパク質の全体的な発現を特徴づけ、子宮頸部膣液中のＩＡＩの有望な生物学的マーカーを同定するために、２つの補完的なプロテオミクスのアプローチを利用した。実験的ＩＡＩ後にＣＶＦ中で異なって発現する異なる免疫調節性ペプチドが同定された。これらのペプチドの差次的な発現は、イムノアッセイを用いて確認され、ＩＡＩを診断するための非侵襲性で信頼性の高い検査の開発の機会を提供する。
【０２５７】
実施例１９
ヒト子宮頸部膣液（ＣＶＦ）中の早産の新規タンパク質生物学的マーカーを同定するためのプロトコル
サンプルの回収および処理
本研究は、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ＆  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄによって承認されたものである。すべての被験体が、先を見越して同定され、本研究に参加するために、書面によるインフォームドコンセントを提出した。ＰＴＬを、３７週の妊娠期間の前の規則的な子宮の活動と子宮頸部拡張との組み合わせと定義し、早産を３７週の妊娠期間の前に生じる自然分娩と定義した。患者は、羊水内感染の臨床上の証拠を有しなかった。
【０２５８】
平均ＧＡ２６．９週±７．５ＳＤ（１５．８〜３５．９の範囲）の１８人の被験体（各群ｎ＝６）を募集した。母体の平均出産歴は、０．８であり、被験体の２０％が以前に早産を経験していた。２本の６インチの滅菌Ｄａｃｒｏｎ付きプラスチックアプリケーター（Ｓｏｌｏｎ，Ｓｋｏｗｈｅｇａｎ，ＭＥ）を後膣円蓋に挿入し、滅菌された腟鏡で検査しながらそれを１５秒間回転させることによって、ＣＶＦサンプルを回収した。回収後、プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）を含むリン酸緩衝食塩水中にタンパク質を抽出した。抽出後、サンプルを遠心することにより、任意の残骸および細胞材料を除去し、上清を−７０℃で保存した。
【０２５９】
ＭｕｄＰＩＴ解析のために、コントロール、早産を伴わないＰＴＬおよび感染を有しないＳＰＴＢの各々５つの母体ＣＶＦサンプル（１００μｌ×５）を個別にプールし、アセトン沈殿した。４９０μｇの各プールサンプルを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．５に溶解した。２−Ｄ−ＤＩＧＥ実験では、各５０μｇのＧＡ一致コントロール、ＰＴＬおよびＳＰＴＢ（ＧＡ２９〜３４週）サンプルを使用した。
【０２６０】
蛍光２次元ディファレンシャルゲル内電気泳動（２Ｄ−ＤＩＧＥ）
ＧＡ一致コントロール／ＰＴＬ／ＳＰＴＢ（２９〜３４週）サンプル対を選択した。各サンプルに対して、５０ｍｇのＣＶＦタンパク質を、ＣｙＤｙｅ  ＤＩＧＥ  Ｆｌｕｏｒミニマルダイ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）で、４００ｐｍ色素／５０ｍｇタンパク質の濃度において標識した。Ｃｙ２、Ｃｙ３およびＣｙ５色素を使用して、それぞれコントロール、ＰＴＬおよびＳＰＴＢを標識し、標識された３つすべてのサンプルを多重化し、１枚のゲルにおいて分離した。標識タンパク質をアセトン沈殿により精製し、ＩＥＦ緩衝液に溶解し、室温において１２時間、２４ｃｍＩＰＧストリップ（ｐＨ４〜７）上に再水和した。そのＩＰＧストリップを６５〜７０ｋＶ時で１次元電気泳動に供し、次いで、１５分間、ＤＴＴおよびＩＡＡ平衡緩衝液で順次平衡化した。８０〜９０Ｖにおいて１８時間、２次元８〜１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った
５５０〜６００のＰＭＴ電圧セットを用い、適切なレーザーおよびフィルターを使用して、ゲルをＴｙｐｈｏｏｎ  ９４００スキャナー（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）においてスキャンした。疑似カラーを用いて異なるチャネルにおける画像をオーバーレイし、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェア（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて差を可視化した。Ｐｈｏｒｅｔｉｘ  ２Ｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，バージョン２００５（Ｎｏｎ−Ｌｉｎｅａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｌｔｄ．）を用いて、異なる量で存在するタンパク質スポットを同定する２Ｄ−ゲル画像解析を行った。一定面積をすべてのゲルから選択し、クロスステイン（ｃｒｏｓｓ−ｓｔａｉｎ）解析プロトコルを行った。「ノンスポットモード（ｍｏｄｅ  ｏｆ  ｎｏｎ  ｓｐｏｔ）」法を用いてバックグラウンド除去を行い、スポットのマッチングを最大にするために画像をワーピングした（ｗｒａｐｐｅｄ）。レシオメトリック補正アルゴリズムを適用して、タンパク質標識の潜在的な濃度差を明らかにした。Ｃｙ５およびＣｙ３チャネルにおける、補正されたタンパク質スポットを内標準（Ｃｙ２）と比較して相対量の比を生成した。タンパク質スポットの強度の差の統計的有意性を、各群に対する平均ゲルについてのｔ検定によって判定した。相対比が＞２．０であり、ｔ検定の値が＜０．０５であるタンパク質スポットを有意であるとみなした。
【０２６１】
目的のスポットにおけるタンパク質の同定に向けて、７００μｇのＣＶＦタンパク質を用いて分取用２Ｄ電気泳動（２ＤＥ）を行い、ゲルをクマシーブルーＲ−２５０で染色するか、または銀染色した。個別のスポットをゲルから切り出し、脱染し、３７℃において１６〜１８時間、トリプシンによるゲル内消化に供した。ペプチドを重炭酸アンモニウム中に抽出し、次いで、０．２２ｍｍ  ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）で濾過した。濾過された溶液を乾燥させ、質量分析による解析のために５％ギ酸中で再構成した。
【０２６２】
ポリクローナル抗体およびウエスタン免疫ブロット法。免疫原性のペプチドおよび／または組換えタンパク質を使用して、ウサギおよびヤギのポリクローナル抗体を作製した（ＤＳＬ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｂｓｔｅｒ，ＴＸ）。次いで、アフィニティ精製した抗体をウエスタンブロットに使用した。５０μｇのＣＶＦタンパク質を４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて分離し、ＰＶＤＦ膜に転写した。膜を、Ｓｅａ  Ｂｌｏｃｋ（Ｐｉｅｒｃｅ）中でブロッキングし、１μｇ／ｍｌの１次抗体（ＩＧＦＢＰ−１、カルグラニュリン−Ａ、カルグラニュリン−Ｂ、アネキシンＶまたはプロフィリン１）とともに４℃において一晩インキュベートした。ＴＢＳＴで３回洗浄した後、その膜をＣｙ色素でタグ化された適切な２次抗体とともに１時間、一定にゆすりながら暗黒下でインキュベートし、その後洗浄した。Ｔｙｐｈｏｏｎ  ９４００バリアブルモード画像装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて、特定のタンパク質バンドの可視化を行った。
【０２６３】
多次元的液体クロマトグラフィタンデム質量分析（ＬＣ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ；ＭｕｄＰＩＴ）解析
各４９０μｇの個別にプールされたコントロール、ＰＴＬおよび非感染ＳＰＴＢのＣＶＦサンプルを乾燥させ、８Ｍ尿素、１Ｍ  Ｔｒｉｓ塩基、１００ｍＭメチルアミンおよび１０ｍＭ  ＣａＣｌ２（ｐＨ８．５）を含んでいる１００μｌの消化緩衝液に溶解した。サンプルを還元し、そしてまず、１２．５μｌの０．９Ｍ  ＤＴＴ中で１５分間、５０℃においてインキュベートし、次いで、２５μｌの１．０Ｍヨードアセトアミド中、暗黒下でさらに１５分間、室温においてインキュベートすることによってアルキル化した。さらに１２．５μｌの０．９Ｍ  ＤＴＴを２１０μｌの水および１Ｎ  ＮａＯＨとともにその溶液に加えることによって、ｐＨを８．５に調整した。サンプルを、３７℃において一晩、４０μｌの１ｍｇ／ｍｌトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）液で消化した。４０μｌのギ酸を用いて消化を停止し、Ｃ１８  ＳｅｐＰａｋ  Ｐｌｕｓカートリッジを用いて脱塩した。消化物（１ｍｌ）をポリスルホエチル強陽イオン交換カラム（２．１ｍｍ  ＩＤ×１００ｍｍ、５μｍ粒径および３００Åポアサイズ（Ｔｈｅ  Ｎｅｓｔ  Ｇｒｏｕｐ，Ｓｏｕｔｈｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）上に注入し、そしてＵＶ検出器および画分回収器を備えたＨＰＬＣを用いて分画した。溶媒Ａは、２５％アセトニトリル（ＡＣＮ）を含む１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ３）であり、溶媒Ｂは、２５％ＡＣＮを含む、１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ３）、３５０ｍＭ  ＫＣｌであった。２００ｍｌ／分の流速での９５分間の勾配をペプチドの分画に使用した。合計８０個の画分を回収し、蒸発させ、そして９６ウェルＶｙｄａｃ  Ｃ１８シリカスピンプレート（Ｔｈｅ  Ｎｅｓｔ  Ｇｒｏｕｐ，Ｓｏｕｔｈｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）を用いて脱塩するために１００ｍｌの０．１％ＴＦＡに再懸濁した。画分を８０％ＡＣＮ／０．１％ギ酸（ＦＡ）中に溶出し、蒸発させ、２０ｍｌの５％ＦＡに再懸濁し、そして５ｍｌの各画分を、ＣａｐＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）に接続されたＱ−Ｔｏｆ−２質量分析計において解析した。
【０２６４】
質量分析
Ｎａｎｏｅａｓｅ  Ｃ１８  ７５μｍ  ＩＤ×１５ｃｍ溶融シリカキャピラリーカラム（Ｗａｔｅｒｓ  Ｉｎｃ．）および９５分間の水／ＡＣＮ勾配を用いて、２Ｄ−ＬＣ画分およびゲル消化物をさらに分離した。その質量分析計は、Ｇｌｕ１フィブリノペプチドＢを用いて較正された。ＭＳ／ＭＳＭＳ研究方法を用いて、スペクトルを取得した。ｍ／ｚが４００〜１５００の質量をＭＳ測定のためにスキャンし、ｍ／ｚが５０〜１９００の質量をＭＳＭＳ測定のためにスキャンした。合計１０，８２４個のＭＳ／ＭＳスペクトルを２Ｄ−ＬＣ画分から取得した。ＰｒｏｔｅｉｎＬｙｎｘ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｓｅｒｖｅｒ  ｖ．２．１ソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ  Ｉｎｃ．）を用いて、生ＭＳ／ＭＳスペクトルを前処理した。
【０２６５】
各サンプルからの平均３，６４５個のＭＳ／ＭＳスペクトルを、公知の夾雑物（ケラチンおよびアルブミン）、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔヒトデータベース（バージョン４６．６）のフォワードエントリーおよびリバースエントリーを含んでいる、組み合わせたデータベースに対して検索した。ペプチド同定検索は、３つの独立した検索エンジン：ＴｕｒｂｏＳｅｑｕｅｓｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、Ｘ！Ｔａｎｄｅｍ（Ｃｒａｉｇ，Ｒ．ａｎｄ  Ｂｅａｖｉｓ，前出）およびＯｐｅｎＳｅａ（Ｗｅｎｓｔｒｏｍ，Ｋ．Ｄ．，Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  １７５，８３０−３（１９９６）；Ｇｈｉｄｉｎｉ，Ａ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３７，２２７−３１（１９９７）を用いて行われた。ＳｅｑｕｅｓｔおよびＸ！Ｔａｎｄｅｍは、タンパク質データベースの理論的な酵素消化物から生成される理論的なスペクトルと実験スペクトルとをマッチさせるデータベース検索エンジンである。ＯｐｅｎＳｅａは、的確でないデノボ配列とデータベース内のタンパク質配列との間のエラートレラントなマッチを行うデノボ配列ベースの検索エンジンである。Ｐｅａｋｓソフトウェア（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｏｎｔａｒｉｏ，ＣＡ）を使用して、ＯｐｅｎＳｅａ検索エンジンにデノボ配列を提供した。個別の検索エンジンの結果からのペプチド同定を、Ｓｃａｆｆｏｌｄ（バージョン：１．３．２，Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）において実行される確率的タンパク質同定アルゴリズムを用いて同定タンパク質に統合した。少なくとも２個の独立した同定ペプチド（確率＞＝０．９）を有した同定タンパク質を、サンプル中に存在するとみなした。
【０２６６】
スペクトルカウントおよび統計解析を用いた定量化
特定のタンパク質にマッチしたＭＳ／ＭＳスペクトルの総数であるスペクトルカウンティングを用いて、サンプル中のその相対存在量を入手した。Ｌｉｕ，Ｈ．，ら、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．７６，４１９３−２０１．（２００４）；Ｚｙｂａｉｌｏｖ，Ｂ．，ら、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．７７，６２１８−２４．（２００５）；Ｏｌｄ，Ｗ．Ｍ．ら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．４，１４８７−５０２．Ｅｐｕｂ  ２００５  Ｊｕｎ  ２３．（２００５））。この方法を用いて、同位体標識に頼ることなく２つのサンプル間でのタンパク質の存在量の差を効率的に検出した（Ｊｕｌｋａ，Ｓ．＆  Ｒｅｇｎｉｅｒ，Ｆ．Ｊ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ  ３，３５０−６３（２００４））。２個より多い信頼できる同定ペプチドを有したサンプル中のすべてのタンパク質を、スペクトルカウントを用いたタンパク質定量化のために考慮に入れた。同種のタンパク質（例えば、免疫グロブリン、α−１−酸糖タンパク質１および２など）のスペクトルカウントを単一エントリーにまとめることによって、そのサンプルのタンパク質リストをさらにキュレートした。
【０２６７】
群（コントロール、ＰＴＬまたはＳＰＴＢ）間で各タンパク質に対するスペクトルカウントの有意差があるか否かを評価するχ２適合度検定を用いて対比較を行った。誤発見率（ＦＤＲ）法（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ，Ｙ．＆  Ｈｏｃｈｂｅｒｇ，Ｙ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｂ，２８９−３００（１９９５））を介して多重比較のために補正した後、各タンパク質に対する統計的有意性を判定し、有意水準は、０．０５に設定した（ＳＡＳバージョン９．１）。異なる量で存在するタンパク質の偽陽性率を低下させるために、サンプルの少なくとも１つにおいて少なくとも４個のＭＳ／ＭＳスペクトル（確率≧０．８）にマッチした少なくとも２個の独立したペプチドを有した統計学的に有意なタンパク質だけを、真に異なる量で存在するとみなした。スペクトルカウント比を計算するための公開されている式（Ｏｌｄ，Ｗ．Ｍ．ら、前出）を用いて、上記基準を満たすタンパク質が何倍変化していたかを判定した。
【０２６８】
対数リンク関数およびポアソン分布エラー（すなわち、ポアソン回帰）を用いた一般化線形回帰モデル（Ａｇｒｅｓｔｉ，Ａ．Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃａｔｅｇｏｒｉｃａｌ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９６）を当てはめることによって、コントロール群、ＰＴＬ群、ＳＰＴＢ群からの各タンパク質の相対存在量の進行的な差を評価した。直交多項式対比を用いて、順序的な被験体群において増加傾向または減少傾向があるか否かを検定した。有意水準を０．０５に設定し、上記と同様に、ＦＤＲ法によって多重比較のための補正を行った。ＰＴＬ群  対  コントロール群およびＳＰＴＢ群  対  コントロール群の回帰係数（すなわち、モデルベースで何倍変化したか）を評価することによって、有意な傾向が確認された。これらの解析は、ＳＡＳバージョン９．１におけるＧＥＮＭＯＤの手法を用いて行われた。
【０２６９】
実施例２０
ヒト子宮頸部膣液（ＣＶＦ）における早産の新規タンパク質生物学的マーカーの同定
実施例１９に記載されたプロトコルに従って、以下の結果を得た。
【０２７０】
結果
ＣＶＦプロテオーム。複数の検索エンジンを用いた合計１０，８２４個のＭＳ／ＭＳスペクトルの解析によって、添付の表６に列挙されている、ＣＶＦ中の２０５個の特有タンパク質が同定された。これらのタンパク質の機能アノテーションから、代謝（２５％）、免疫応答（２３％）および輸送（１８％）が、ＣＶＦにおいて示される主要なカテゴリーであることが明らかになった。
【０２７１】
コントロールとＰＴＬとの比較から、統計学的に有意に（ｐ＜０．０５）異なる存在量の２１個のタンパク質が示された。これらのタンパク質は、＋２８倍から−１８倍の範囲で異なって存在していた。８個のタンパク質（Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ７、ムチン−５Ｂ前駆体、カルギザリン（ｃａｌｇｉｚｚａｒｉｎ）、ヒストンＨ２Ｂ、ヒストンＨ１．２（ヒストンＨ１ｄ）、Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼＡ鎖、ｒｈｏ  ＧＤＰ解離インヒビター２および１４−３−３δ）が、ＰＴＬにおいて３倍超アップレギュレートされた。発生および細胞分化タンパク質であるＳ１００カルシウム結合タンパク質Ａ７は、コントロールと比べてＰＴＬにおいて最も有意に過剰発現されたタンパク質（２８倍）であった。３つのタンパク質（デスモプラキン（ｄｅｓｍｏｐｌａｎｋｉｎ）（−１８倍）、ペリプラキン（−４倍）およびジャンクションプラコグロビン（ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｐｌａｋｏｇｌｏｂｉｎ）（デスモプラキンＩＩＩ）（−３倍））が、ＰＴＬにおいて有意にダウンレギュレートされた。
【０２７２】
コントロール  対  ＳＰＴＢ。コントロールとＳＰＴＢとの比較から、統計学的に有意に（ｐ＜０．０５）異なる存在量の３０個のタンパク質が示された。７個のタンパク質（α−１−抗トリプシン前駆体、カルグラニュリンＣ、アネキシンＡ５（アネキシンＶ）、ｒｈｏ  ＧＤＰ解離インヒビター２、ビタミンＤ結合タンパク質前駆体（ＤＢＰ）、α−１−酸糖タンパク質１前駆体およびＬ−プラスチン（リンパ球サイトゾルタンパク質１））が、ＳＰＴＢにおいて３倍超アップレギュレートされた。プロテアーゼインヒビターであるアルファ−１−抗トリプシンは、ＳＰＴＢにおいて最も有意に過剰発現されたタンパク質（１６倍）であり、そしてカルグラニュリンＣ（約１６倍）およびアネキシンＡ５（８．５倍）が続いた。６個のタンパク質（デスモプラキン（ＤＰ）、ペプチジル−プロリルｃｉｓ−ｔｒａｎｓイソメラーゼＡ、ジャンクションプラコグロビン（デスモプラキンＩＩＩ）、熱ショックタンパク質β−１、ペリプラキンおよび表皮型脂肪酸結合タンパク質）が、ＳＰＴＢにおいて３倍超ダウンレギュレートされた。
【０２７３】
分娩を伴わないＰＴＬ  対  ＳＰＴＢ。ＰＴＬとＰＴＢとの比較から、統計学的に有意に（ｐ＜０．０５）異なる存在量の２５個のタンパク質が示された。４個のタンパク質（α−１−抗トリプシン前駆体（８．５倍）、カルグラニュリンＣ（６．２倍）、アネキシンＡ５（アネキシンＶ）（４．９倍）およびキニノーゲン（ｋｉｎｎｉｎｏｇｅｎ）（４．５倍））が、ＰＴＢ  ＣＶＦにおいて３倍超アップレギュレートされた。８個のタンパク質（Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ７（−１３倍）、１４−３−３σ（−１０．１倍）、ヒストンＨ２Ｂ（−９．２倍）、ペプチジル−プロリルｃｉｓ−ｔｒａｎｓイソメラーゼＡ（−８．３倍）、Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼＡ鎖（−７．４倍）、ヒストンＨ１．２（−４．６倍）、シスタチンＢ（−４．２倍）およびヒストンＨ４（−４．１倍））が、ＰＴＬと比べてＳＰＴＢにおいて３倍超ダウンレギュレートされた。
【０２７４】
トレンド解析。コントロール、ＰＴＬおよびＳＰＴＢにおいて見られる共通のタンパク質の相対存在量の傾向および線形性を推定するために、対数リンク関数およびポアソン分布エラー（すなわち、ポアソン回帰）を用いた一般化線形回帰モデルを当てはめることによって、ＧＥＮＭＯＤ線形回帰モデル（ＳＡＳバージョン９．１）を使用した。有意水準を０．０５に設定し、ＦＤＲ法によって多重比較のための補正を行った。１６個のタンパク質が、３つすべてのサンプルにおいて異なって（ｐ＜０．００３）存在すると見出された（表８）。１３個のタンパク質が、ＳＰＴＢ＞分娩を伴わないＰＴＬ＞コントロールの順で統計学的に有意な増加を一貫して示した。３つのタンパク質、表皮型脂肪酸結合タンパク質、熱ショックタンパク質ベータ−１およびデスモプラキンだけが、ＳＰＴＢ＜分娩を伴わないＰＴＬ＜コントロールの順で減少を示した。
【０２７５】
コントロール、ＰＴＬおよびＳＰＴＢ  ＣＶＦの２Ｄ−ＤＩＧＥ解析  ２次元ゲル電気泳動は、癌および他の疾患に対する生物学的マーカーを同定するために血清プロテオームを特徴付けるために広く使用されている（Ｃｈｒｏｍｙ，Ｂ．Ａ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３，１１２０−７（２００４））。広範なダイナミックレンジでの感度、再現性および検出を高めるために、本発明者らは、蛍光シアニン色素でタンパク質を標識する複合プロテオーム解析アプローチを利用した。ＧＡが一致した３つのコントロール、ＰＴＬおよびＳＰＴＢ  ＣＶＦ（ＧＡ２９〜３４週）をそれぞれＣｙ３、Ｃｙ５およびＣｙ２で標識した。標識された各ＧＡ一致サンプル対を同じゲルにおいて分離した。緑色または赤色の強度は、異なる量で存在するタンパク質レベルを示唆し、黄色は、比較的同じ存在量を表す。コントロール／ＰＴＬ／ＳＰＴＢゲルマップの疑似カラーによる可視化（ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）から、ＰＴＬ／ＳＰＴＢにおいてタンパク質がアップレギュレートされた明瞭なパターンが示された（図２６Ａ、２６Ｂおよび２６Ｃ）。
【０２７６】
Ｐｈｏｒｅｔｉｘ  ２Ｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎソフトウェアを用いて、２Ｄ−ＤＩＧＥによって分解されたＣＶＦプロテオームの定量的解析を行った。第３チャネルとして内標準（Ｃｙ２）を使用することが、スポットの補正およびマッチングに参照を提供することによって、解析の質が向上させた。スポット−定量化プロトコルは、対比較において平均５９０スポットをマッチさせた。１７個のタンパク質が、分娩を伴わないＰＴＬおよびＳＰＴＢのＣＶＦサンプルにおいて２倍超異なって存在した。
【０２７７】
分娩を伴わないＰＴＬと比べると、ＳＰＴＢにおいて、１１個のタンパク質がアップレギュレートされ、６個のタンパク質がダウンレギュレートされた。ゲルスポットからのタンパク質同定によって、１４−３−３δすなわちストラティフィン（ｓｔｒａｔｉｆｉｎ）が、最も高い過剰発現（１１倍）を示し、そしてアネキシンＡ２（７．５倍）、シスタチンＡ（５．７倍）、カルグラニュリンＢ（４倍）および細胞レチノイン酸結合タンパク質２（３．９倍）が続いた。インボルクリンは、ＳＰＴＢサンプル中で高度にダウンレギュレートされ（１５倍）、そして表皮型脂肪酸結合タンパク質（６．３倍）および細胞質アクチン２（２．９倍）が続いた。
【０２７８】
ＭｕｄＰＩＴ実験から、高い信頼性で（＞９０％）異なる量で存在する多くのＳＰＴＢ生物学的マーカーが明らかになり、それらのうちのいくつかは、２Ｄ−ＤＩＧＥ実験に対して補完的であった。２Ｄ−ＤＩＧＥとＭｕｄＰＩＴとで共通の、異なる量で存在するタンパク質は、１４−３−３δ、カルグラニュリンＢ、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ７、α−１−抗トリプシンおよびシスタチンＡであった。ＭｕｄＰＩＴは、２Ｄゲル条件を用いた分離および可視化が困難な、より少量の異なる量で存在する多くのタンパク質をさらに同定した。さらに、すべての液体分画の結果として、２Ｄゲル実験よりもＭｕｄＰＩＴにおいて同定されたタンパク質の多くに対して、より良好な配列範囲が得られた。カルグラニュリン、アネキシンＶおよびプロフィリン１に対して特異的な抗体を用いた免疫ブロット法から、ＭｕｄＰＩＴ解析において観察された一貫した傾向が確認された（図２７）。ＩＧＦＢＰ−１は、ＳＰＴＢにおいて明瞭なタンパク分解性パターンおよび高レベルの発現を示した。検出されたＩＧＦＢＰ−１の大部分は、羊水内感染に対する羊水生物学的マーカーとして以前に報告された低分子量１１ｋＤａタンパク分解性フラグメント（Ｇｒａｖｅｔｔ，Ｍ．Ｇ．ら、Ｊａｍａ  ２９２，４６２−９（２００４））に対応した。
【０２７９】
考察
自然早産（ＳＰＴＢ）は、世界的規模の周産期医療における主要な問題であり、先天性奇形に起因しない周産期死亡の主な原因である。１年間でおよそ８００万の周産期死亡が起きており、その原因は、主に早熟および新生児敗血症である（Ｌａｗｎ，Ｊ．，ＭｃＣａｒｔｈｙ，Ｂ．＆  Ｒｏｓｓ，ｓ．Ｔｈｅ  Ｈｅａｌｔｈｙ  Ｎｅｗｂｏｒｎ：ａ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎａｇｅｒｓ．（ｅｄ．Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｃ．）（Ａｔｌａｎｔａ，２００１）；ＷＨＯ．２００１  Ｅｓｔｉｍａｔｅｓ  ｉｎ：Ｓａｖｉｎｇ  Ｎｅｗｂｏｒｎ  Ｌｉｖｅｓ．Ｓｔａｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｗｏｒｌｄ’ｓ  Ｎｅｗｂｏｒｎｓ．１−４９（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ／Ｓａｖｅ  ｔｈｅ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ  Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ−ＵＳ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，２００１）。ＳＰＴＢの割合は、医療が改善されたにもかかわらず、過去３０年間低下しておらず（Ｓｍｉｔｈ，Ｒ．，ら、Ｒｅｇｕｌ  Ｐｅｐｔ  １０８，１５９−６４（２００２））、米国では、ＳＰＴＢの割合は、過去２５年間にわたって連続して上昇しており、２００４年には１２．５％に達している（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｖｉｔａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ２００４）。数多くの研究が、ＳＴＰＢのマーカーの同定を試みている。疫学的危険因子、子宮頸長、子宮頸部−膣胎児フィブロネクチン（ｆＦＮ）単一ヌクレオチド多型、母体の病状、膣感染ならびに羊水および他の生物学的体液中のタンパク質生物学的マーカーの関連が、ＳＰＴＢを積極的に予測するための有用なモデルの開発を試みる際に解析されている。しかしながら、現在のところ、一般的な臨床上の用途のためのロバストなマーカーは、確認されていない。
【０２８０】
ＣＶＦ、唾液および／または血漿をはじめとしたいくつかの生体液がすべて、ＳＰＴＢに対するマーカーを検出するための起源として使用された。しかしながら、早産の良好な予測物となるこれらのマーカーは見出されなかった。ＳＰＴＢの有望な生物学的マーカーとして、唾液中の様々なホルモンが評価されている。これらのうち、唾液エストリオールだけが、妊娠期間が通常３２週を超えるＳＰＴＢに対するマーカーであると示されている（Ｒａｍｓｅｙ，Ｐ．Ｓ．＆  Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｃｌｉｎ  Ｐｅｒｉｎａｔｏｌ  ３０，７０１−３３（２００３）；ＭｃＧｒｅｇｏｒ，Ｊ．Ａ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  １７３，１３３７−４２（１９９５）；Ｈｅｉｎｅ，Ｒ．Ｐ．ら、Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  ９６，４９０−７（２０００））。妊娠期間が３２週を超えて分娩された乳児は、もっと早期のＧＡにおいて分娩された乳児と比べて新生児の罹患および死亡のリスクが低いので、このマーカーの臨床上の有用性は限定的である。血清または血漿中の成分が、ＳＰＴＢのマーカーについて広く評価されている。Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇら（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ｌ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  １８５，６４３−５１（２００１）；Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ｌ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  １８２，６２５−３０（２０００））は、７５パーセンタイルを超える血清顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）レベルおよび９０パーセンタイルを超える血清フェリチンレベルが、ＳＰＴＢの最も強力な予測物であることを示している。高レベルのα−フェトプロテイン、アルカリホスファターゼおよび高レベルのコルチコトロピン放出ホルモンもまた、ＳＰＴＢの有望な血清マーカーである（Ｍｏａｗａｄ，Ａ．Ｈ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  １８６，９９０−６（２００２）；ＭｃＬｅａｎ，Ｍ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  １８１，２０７−１５（１９９９））。ＣＶＦ中のいくつかの物質が、ＳＰＴＢに対する、可能性のある生物学的マーカーとしてこれまでに評価されてきた。現在までのすべてのマーカーのうち、子宮頸部または膣におけるｆＦＮだけが、早期ＰＴＬの症状を有する女性の妊娠期間約２４〜２６週におけるＳＰＴＢに対する信頼性の高い陰性予測物であると示されている（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ｌ．ら、Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  ８７，６４３−８（１９９６））。しかしながら、他の在胎期間、特に２４週より前の在胎期間においては、ｆＦＮは、ＳＰＴＢに対して低感度である（＜２０％）。Ｈｏｎｅｓｔ，Ｈ．，ら、Ｂｍｊ  ３２５，３０１（２００２））。
【０２８１】
本研究において使用された複数のプロテオミクスのアプローチから、ＳＰＴＬを有し、満期産した女性と比べて、早産の女性のＣＶＦにおいて異なる量で存在した明らかなタンパク質セットが同定された（表９および表１０）。ＰＴＬを有する無症状のコントロールとＳＰＴＢとの初めての対比較から、ＳＰＴＢと異なるＰＴＬに対する特有マーカーセットの存在が明らかになった（表９）。これらの有望なＰＴＬマーカーのさらなる研究は、ＰＴＬのメカニズムのより良い理解を助け、治療のための新規手段を提供する可能性がある。
【０２８２】
連続的な解析（トレンド解析）から、無症状のコントロールからＳＰＴＢに徐々に増加すると示したマーカーの潜在的なリストが明らかになった。これらのマーカーは、連続的な測定を通してＳＰＴＢのリスクをモニターするのに有益であり得る。トレンド解析から、有意な統計的有意差を示す分子の１群としてＳ１００タンパク質が同定された。Ｓ１００タンパク質であるカルグラニュリンＡ、ＢおよびＣは、以前に、ＳＰＴＢを有する女性の母体血清および羊水中に異なって存在すると報告されており、それらは、一般に、感染および炎症の環境においてアップレギュレートされる（Ｇｒａｖｅｔｔ，Ｍ．Ｇ．ら、Ｊａｍａ  ２９２，４６２−９（２００４））。Ｓ１００タンパク質は、カルシウム結合を介して生物学的活性を調節すると考えられ（Ｉｋｕｒａ，Ｍ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  ２１，１４−７（１９９６））、新生児のＣＳＦ、血液および尿における高レベルのＳ１００タンパク質は、新生児の脳損傷と関連する（Ｂｌｅｎｎｏｗ，Ｍ．，ら、Ａｃｔａ  Ｐａｅｄｉａｔｒ  ９０，１１７１−５（２００１）；Ｓｅｌｌｍａｎ，Ｍ．ら、Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ  ２６，３９−４５（１９９２））。本発明者らの研究におけるＳ１００タンパク質の差次的な存在量は、満期産に進む女性と比べて、ＳＰＴＢをもたらすＰＴＬを有する女性における無症状性の羊水内感染および炎症の有病率の上昇を反映し得る。本発明者らのいずれの患者も、羊水内感染の臨床上の証拠を有しなかったが、羊水穿刺を行わずに、この可能性を排除した。同様に、トレンド解析も、ＳＰＴＢの陰性予測物（例えば、表皮型脂肪酸結合タンパク質、熱ショックタンパク質ベータ−１およびデスモプラキンが挙げられる）の存在を示した（表９）。アップレギュレートされたタンパク質とダウンレギュレートされたタンパク質の両方を評価するイムノアッセイによって、ＳＰＴＢの診断に対してより高い感度および特異性がもたらされる可能性がある。
【０２８３】
重要な急性期の反応物は、本発明者らの対比較およびトレンド解析において存在量の増加を示した（表８および９）。これらは、−１−酸糖タンパク質（Ａ１ＡＧ）、α−１−抗トリプシン前駆体ならびにアネキシンＡ３（アネキシンＩＩＩ）およびＡ５（アネキシンＶ）を含んだ。以前に、アカゲザルの分娩前の高レベルのＡ１ＡＧが報告されている（Ｇｏｌｕｂ，Ｍ．Ｓ．＆  Ｋａａｅｋｕａｈｉｗｉ，Ｍ．Ａ．Ｃｌｉｎ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ  ２６２，２９−３７（１９９７））が、炎症性刺激に応答して白血球によって放出される糖タンパク質プロテアーゼインヒビターであるα−１−抗トリプシンは、子宮表面の維持および胎盤の付着において重要な役割を果たすとみられる（Ｇｅｉｓｅｒｔ，Ｒ．Ｄ．，ら、Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  １２６，６２１−７（２００３））。ヒト栄養膜組織によってα−１−抗トリプシンが産生されることは、証明されている（Ｂｅｒｇｍａｎ，Ｄ．ら、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ａｌｐｈａ  １−ａｎｔｉｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ  ａｎｄ  ａｌｐｈａ  １−ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ．Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｒｅｓ  ３４，３１２−７（１９９３））。アネキシンＩＩＩの生理学的役割は、十分に確定されていない；しかしながら、その機能が細胞内のカルシウムシグナル伝達および膜貫通型のカルシウム輸送のメディエーターとして提唱されており、それが胎盤および好中球に存在すること（Ｌｅ  Ｃａｂｅｃ，Ｖ．，ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  １８９，１４７１−１４７６（１９９２））は、ＳＰＴＢの病態生理学においてこのタンパク質の果たし得る役割を支持する。アネキシンＶは、妊娠喪失（Ｒａｎｄ，Ｊ．，Ｅｅｒｄｅｎ，ら、Ｔｈｒｏｍｂ  Ｒｅｓ  １１５  Ｓｕｐｐｌ  １，７７−８１（２００５））、子癇前症および子宮内の成長の制限（Ｂｒｅｔｅｌｌｅ，Ｆ．ら、Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ８９，４８６−９２（２００３））に関与しており、このことから、脱落膜の梗塞／胎盤媒介性のＰＴＬにおけるアネキシン５に対する機構的な役割の可能性が示唆される。
【０２８４】
ＰＴＬおよびＳＰＴＢにおいて異なる量で存在したいくつかのＣＶＦタンパク質は、細胞骨格の構造、配置および運動性に不可欠である。プロフィリン−１、ｒｈｏ  ＧＤＩ  ２およびサイモシンβ−４のすべてが、アクチン細胞骨格の組織化およびバイオジェネシスに関与し、ＳＰＴＢにおいてアップレギュレートされた。プロフィリン−１、ｒｈｏ  ＧＤＩ  ２およびサイモシンもまた、アクチン重合の阻害またはアクチン細胞骨格の破壊に関与している（Ｈｏｎｏｒｅ，Ｂ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ３３０，１５１−５（１９９３））。また、プロフィリン−１は、ポリ−Ｌ−プロリンモチーフに結合することが知られており（Ｗｉｔｋｅ，Ｗ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４，４６１−９（２００４））、宿主−病原体の相互作用と関与している。Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌およびＳｈｉｇｅｌｌａ細菌は、隣接する細胞への侵入に宿主細胞の細胞骨格を使用することを可能にするプロフィリン−１結合タンパク質を産生する（Ｗｉｔｋｅ，前出）。インボルクリンは、上皮の構造タンパク質であり、表皮細胞の初期分化のマーカーである。インボルクリンは、化学的予防治験において子宮頸部における初期の分化の生物学的マーカーとして使用されている（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｍ．Ｆ．ら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｕｐｐｌ  ２３，１０４−１２（１９９５））。
【０２８５】
本研究は、満期産のＰＴＬの被験体およびＳＰＴＢであった被験体に対する、無症状のコントロール被験体のＣＶＦの差次的なタンパク質プロファイルの現在における最も網羅的な解析を提供する。ＭｕｄＰＩＴと２Ｄ−ＤＩＧＥの両方が、ＰＴＬサンプルおよびＳＰＴＢサンプルにおいて有意に異なる量で存在したいくつかのタンパク質を明らかにした。しかしながら、本研究の知見は、限られた数のサンプルに基づくものであり、より大きなコホートにおいて確認されなければならない。さらに、本発明者らの観察結果のいくつかの生物学的なもっともらしさにもかかわらず、本発明者らの知見の一部は、ランダムな生物学的変異に起因するという可能性が存在する。この可能性を最小にするために、本発明者らは、スペクトルカウントおよびその変化がｐ値＜．００１をもたらしたタンパク質だけを考慮に入れ、コントロール群とＰＴＬ群とＳＰＴＢ群との間での対比較ならびにトレンド解析を行い、コントロール＜ＰＴＬ＜ＳＰＴＢの順で差次的な発現を同定した。これらのタンパク質の１つ以上が、臨床上の用途のためにモデル化され得る場合、本研究の知見は、産科の臨床行為に対して有望な意味を有する。現在、最も広く利用されているＳＰＴＢに対する子宮頸部−膣マーカーは、特異性は良好であるが低感度の生物学的マーカーであるｆＦＮである。ｆＦＮと比べて、本発明者らは、無症状群とＰＴＬ群の両方をＳＰＴＢ群と比べたとき、ｆＦＮよりも大きな差次的発現を有するいくつかのタンパク質を同定した。これらは、上で考察したタンパク質のうちのいくつかであり、それらとしては、カルグラニュリンＣ、α−１−酸糖タンパク質、α−１−抗トリプシン前駆体およびアネキシンＶが挙げられる。
【０２８６】
ＳＰＴＢの新規のタンパク質生物学的マーカーの同定は、早産をもたらす生理学的な撹乱（ｐｅｒｔｕｒｂａｎｃｅｓ）の理解を進める際に重要な工程である。本発明者らは、本発明者らの知見が、より大きなコホートにおいて確証されるまでは予備的なものであるとみなされるべきであり、これらのマーカーの有用性が、臨床的に有意であるためには、実際に現在利用可能な検査よりも良好でなければならないことを認める。しかしながら、米国においてＳＰＴＢの割合が着実に上昇しているとみられている過去２５年間の傾向を逆転させるために、早産に対して高リスクの女性の信頼性の高い同定に基づいた革新的な処置ストラテジーが開発されなければならない。
【０２８７】
前述の説明全体を通して、ある特定の実施形態を参照して本発明を論じてきたが、本発明は、そのように限定されない。実際は、前述の説明から、本明細書中において示されたものおよび説明されたものに加えて、本発明の様々な改変が当業者に明らかになるであろうし、それらは、添付の請求項の範囲内に含められる。
【０２８８】
本説明を通して引用されたすべての参考文献およびそれに引用されている参考文献は、それらの全体が本明細書によって明示的に参考として援用される。
【０２８９】
【表１−１】
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【０２９０】
【表１−２】
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【０２９１】
【表１−３】
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【０２９２】
【表１−４】
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【０２９３】
【表２−１】
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【０２９４】
【表２−２】
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【０２９５】
【表３】
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【０２９６】
【表４−１】
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【０２９７】
【表４−２】
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【０２９８】
【表４−３】
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【０２９９】
【表４−４】
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【０３００】
【表４−５】
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【０３０１】
【表５】
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【０３０２】
【表６−１】
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【０３０３】
【表６−２】
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【０３０４】
【表６−３】
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【０３０５】
【表６−４】
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【０３０６】
【表６−５】
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【０３０７】
【表６−６】
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【０３０８】
【表７】
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【０３０９】
【表８−１】
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【０３１０】
【表８−２】
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【０３１１】
【表９】
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【０３１２】
【表１０】
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【０３１３】
【表１１−１】
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【０３１４】
【表１１−２】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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