(57)【要約】オルタナティブスプライシングは、ｍＲＮＡ前駆体上のスプライス部位の選択的使用を含む過程である。オルタナティブスプライシングにより、１つの遺伝子から多数のタンパク質を産生可能であり、それにより、異なる機能を有するタンパク質を生成可能である。オルタナティブスプライシング事象は、種々の方法（エキソンスキッピング、相互排他エキソンの使用、および５’および／または３’スプライス部位の差分選択が含まれる）によって起こり得る。オルタナティブスプライシングを調節するリボスイッチに関する方法および組成物を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
調節可能な遺伝子発現構築物であって、
コード領域に作動可能に連結されたリボスイッチを含むＲＮＡをコードする核酸分子を含み、該リボスイッチがＲＮＡのスプライシングを調節し、該リボスイッチおよび該コード領域が非相同であり、該スプライシングの調節が該ＲＮＡのプロセシングに影響を及ぼす、調節可能な遺伝子発現構築物。
【請求項２】
前記リボスイッチがオルタナティブスプライシング（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｉｃｉｎｇ）を調節する、請求項１に記載の構築物。
【請求項３】
前記リボスイッチがアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含み、該アプタマードメインおよび該発現プラットフォームドメインが非相同である、請求項１または２に記載の構築物。
【請求項４】
前記ＲＮＡがイントロンをさらに含み、前記発現プラットフォームドメインがスプライスジャンクションを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項５】
前記スプライスジャンクションが前記イントロン中に存在する、請求項４に記載の構築物。
【請求項６】
前記スプライスジャンクションがオルタナティブスプライスジャンクションである、請求項４または５に記載の構築物。
【請求項７】
前記スプライスジャンクションが前記イントロンの末端に存在する、請求項４に記載の構築物。
【請求項８】
前記スプライスジャンクションが、前記リボスイッチが活性化される場合に活性である、請求項４〜７のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項９】
前記スプライスジャンクションが、前記リボスイッチが活性化されない場合に活性である、請求項４〜７のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項１０】
前記リボスイッチがトリガー分子によって活性化される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項１１】
前記トリガー分子がＴＰＰである、請求項１０に記載の構築物。
【請求項１２】
前記リボスイッチがＴＰＰ応答性リボスイッチである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項１３】
前記リボスイッチが前記イントロンのスプライシングを活性化する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項１４】
前記リボスイッチがオルタナティブスプライシングを活性化する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項１５】
前記リボスイッチが前記イントロンのスプライシングを抑制する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項１６】
前記リボスイッチがオルタナティブスプライシングを抑制する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項１７】
前記ＲＮＡが分岐構造を有する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項１８】
前記ＲＮＡがｐｒｅ−ｍＲＮＡである、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項１９】
前記リボスイッチが前記ＲＮＡの３’非翻訳領域中に存在する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項２０】
前記イントロンが前記ＲＮＡの３’非翻訳領域中に存在する、請求項４〜１９のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項２１】
ＲＮＡプロセシング部位が前記イントロン中に存在する、請求項４〜２０のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項２２】
前記イントロンのスプライシングによって前記ＲＮＡから該ＲＮＡプロセシング部位が除去され、それにより、該ＲＮＡのプロセシングに影響を及ぼす、請求項２１に記載の構築物。
【請求項２３】
前記ＲＮＡのプロセシングに及ぼす前記影響が、該ＲＮＡプロセシング部位によって媒介される該ＲＮＡのプロセシングの排除を含む、請求項２２に記載の構築物。
【請求項２４】
前記ＲＮＡのプロセシングに及ぼす前記影響が、転写終結の変化を含む、請求項２２または２３に記載の構築物。
【請求項２５】
前記ＲＮＡのプロセシングに及ぼす前記影響が、該ＲＮＡ分解の増加を含む、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項２６】
前記ＲＮＡのプロセシングに及ぼす前記影響が、該ＲＮＡターンオーバーの増加を含む、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項２７】
前記リボスイッチが前記イントロンの３’スプライスジャンクションと重複する、請求項４〜２６のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項２８】
前記イントロンのスプライシングにより、前記リボスイッチが活性化される能力が低減または排除される、請求項２７に記載の構築物。
【請求項２９】
スプライシング調節を有する前記アプタマードメイン領域がＰ４ステムおよびＰ５ステム中に存在する、請求項３〜２８のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項３０】
スプライシング調節を有する前記アプタマードメイン領域がループ５中にも存在する、請求項２９に記載の構築物。
【請求項３１】
スプライシング調節を有する前記アプタマードメイン領域がステムＰ２中にも存在する、請求項２９または３０に記載の構築物。
【請求項３２】
スプライス部位が前記アプタマードメインの５’末端に対して−１３０と−１６０との間の位置に存在する、請求項３〜３１のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項３３】
前記ＲＮＡが第２のイントロンをさらに含み、該第２のイントロンの３’スプライス部位が前記アプタマードメインの５’末端に対して−２２０と−２７０との間の位置に存在する、請求項３〜３１のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項３４】
前記スプライスジャンクションが５’スプライスジャンクションである、請求項３〜３１のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項３５】
ＲＮＡのプロセシングに影響を及ぼす方法であって、該ＲＮＡにリボスイッチを含む構築物を導入する工程であって、該リボスイッチがＲＮＡのスプライシングを調節することができ、該ＲＮＡがイントロンを含み、該スプライシングの調節が該ＲＮＡのプロセシングに影響を及ぼす、導入工程を含む方法。
【請求項３６】
前記リボスイッチがアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含み、該アプタマードメインおよび該発現プラットフォームドメインが非相同である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記発現プラットフォームドメインがスプライスジャンクションを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記スプライスジャンクションが前記イントロン中に存在する、請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記スプライスジャンクションがオルタナティブスプライスジャンクションである、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記スプライスジャンクションが前記イントロンの末端に存在する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記スプライスジャンクションが、前記リボスイッチが活性化される場合に活性である、請求項３７〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記スプライスジャンクションが、前記リボスイッチが活性化されない場合に活性である、請求項３７〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記リボスイッチがトリガー分子によって活性化される、請求項３５〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記トリガー分子がＴＰＰである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記リボスイッチがＴＰＰ応答性リボスイッチである、請求項３５〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記リボスイッチがスプライシングを活性化する、請求項３５〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記リボスイッチがオルタナティブスプライシングを活性化する、請求項３５〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記リボスイッチがスプライシングを抑制する、請求項３５〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記リボスイッチがオルタナティブスプライシングを抑制する、請求項３５〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記スプライシングが天然に起こらない、請求項３５〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
スプライシング調節を有する前記アプタマードメイン領域がループ５中に存在する、請求項３６〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記構築物が前記イントロンをさらに含む、請求項３５〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記リボスイッチが前記ＲＮＡの３’非翻訳領域中に存在する、請求項３５〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記イントロンが前記ＲＮＡの３’非翻訳領域中に存在する、請求項３５〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
ＲＮＡプロセシング部位が前記イントロン中に存在する、請求項３５〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記イントロンのスプライシングによって前記ＲＮＡから該ＲＮＡプロセシング部位が除去され、それにより、該ＲＮＡのプロセシングに影響を及ぼす、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記ＲＮＡのプロセシングに及ぼす前記影響が、該ＲＮＡプロセシング部位によって媒介される該ＲＮＡのプロセシングの排除を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記ＲＮＡのプロセシングに及ぼす前記影響が、転写終結の変化を含む、請求項５６または５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記ＲＮＡのプロセシングに及ぼす前記影響が該ＲＮＡ分解の増加を含む、請求項５６〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記ＲＮＡのプロセシングに及ぼす前記影響が該ＲＮＡターンオーバーの増加を含む、請求項５６〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記リボスイッチが前記イントロンの３’スプライスジャンクションと重複する、請求項３７〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記イントロンのスプライシングにより、前記リボスイッチが活性化される能力が低減または排除される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
スプライシング調節を有する前記アプタマードメイン領域がステムＰ２中に存在する、請求項３６〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記スプライス部位が前記アプタマードメインの５’末端に対して−１３０と−１６０との間の位置に存在する、請求項３６〜６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
前記ＲＮＡが第２のイントロンをさらに含み、該第２のイントロンの３’スプライス部位が前記アプタマードメインの５’末端に対して−２２０と−２７０との間の位置に存在する、請求項３６〜６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
前記スプライス部位が５’スプライス部位である、請求項３６〜６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
前記リボスイッチのトリガー分子と接触し、それにより、前記ＲＮＡのプロセシングに影響を及ぼす工程をさらに含む、請求項３５〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連する出願への相互参照）
本願は、２００７年５月２９日に出願された米国仮特許出願第６０／９３２，１６４号の利益を主張する。２００７年５月２９日に出願された米国仮特許出願第６０／９３２，１６４号は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
（連邦政府の後援による研究に係る陳述）
本発明は、ＮＩＨによって授与された補助金番号ＧＭ０６８８１９、ＧＭ０７２２３およびＤＫ０７２２３および米国科学財団によって授与された補助金番号ＭＣＢ−０２３６２１０のもと、政府の援助を受けてなされた。政府は本発明における特定の権利を保有する。
（発明の分野）
本開示の発明は、一般に、遺伝子発現分野、具体的には、遺伝子発現の調節領域に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
細胞が種々の遺伝子発現パターンの変化による複数の生化学シグナルおよび環境信号に応答しなければならないので、正確な遺伝子調節は生物系の本質的特徴である。最も公知の遺伝子調節機構は、化学的または物理的な刺激を感知し、その後に関連するＤＮＡまたは伝令ＲＮＡ配列との選択的相互作用によって遺伝子発現を調整するタンパク質因子の使用を含む。タンパク質は、複合体形状を採用することができ、生物系がその化学的および物理的環境を正確に感知することができる種々の機能を実行する。代謝産物に応答するタンパク質因子は、典型的には、ＤＮＡに結合することによって転写開始を調整するか（例えば、ｌａｃリプレッサータンパク質；非特許文献１）、ＲＮＡに結合することによって転写終結（例えば、ＰｙｒＲタンパク質；非特許文献２）または翻訳（例えば、ＴＲＡＰタンパク質；非特許文献３）のいずれかを調節するように作用する。タンパク質因子は、アロステリック調整または翻訳後改変などの種々の機構によって環境刺激に応答し、高応答性遺伝子スイッチとしての機能を果たすためにこれらの機能を活用するのに長けている（例えば、非特許文献４を参照のこと）。
【０００３】
遺伝子調節におけるタンパク質因子の広範な関与に加えて、ＲＮＡが遺伝子調節で積極的な役割を果たし得ることも公知である。最近の研究により、小さな非コードＲＮＡが破壊のためのｍＲＮＡの選択的ターゲティングで役割を果たし、それにより、遺伝子発現が下方制御されるという実質的役割が明らかにされ始めている（例えば、非特許文献５およびそのリファレンスを参照のこと）。このＲＮＡ干渉過程は、短いＲＮＡがワトソン−クリック塩基相補性を介して意図するｍＲＮＡ標的を選択的に認識する能力を活用し、その後に結合したｍＲＮＡをタンパク質作用によって破壊する。新規であるが特異性の高いＲＮＡ結合部位を使用してタンパク質因子を生成するよりも進化過程によって新規の標的特異的ＲＮＡ因子を生成することの方がはるかに容易であるので、ＲＮＡはこの系における理想的な分子認識のための作用因子である。
【０００４】
タンパク質が、酵素、受容体、および構造機能についての、生物学が有するほとんどの要件を満たすにもかかわらず、ＲＮＡはこれらの能力でも役立ち得る。例えば、ＲＮＡは、相当な酵素力および正確な分子認識を示す多数のリボザイムドメイン（非特許文献６；非特許文献７）および受容体ドメイン（非特許文献８；非特許文献９）を形成するのに十分な構造可塑性を有する。さらに、これらの活性を組み合わせて、エフェクター分子によって選択的に調整されるアロステリックリボザイム（非特許文献１０；非特許文献１１）を作製することができる。
【０００５】
オルタナティブスプライシングは、ｍＲＮＡ前駆体上のスプライス部位の選択的使用を含む過程である。オルタナティブスプライシングにより、１つの遺伝子から多数のタンパク質を産生可能であり、それにより、異なる機能を有するタンパク質を生成可能である。オルタナティブスプライシング事象は、種々の方法（エキソンスキッピング、相互排他エキソンの使用、および５’および／または３’スプライス部位の差分選択が含まれる）によって起こり得る。多数の遺伝子（例えば、ホメオ遺伝子（ｈｏｍｅｏｇｅｎｅ）、癌遺伝子、神経ペプチド、細胞外マトリックスタンパク質、筋収縮タンパク質）について、オルタナティブスプライシングを、発生または組織特異的様式で調節する。したがって、オルタナティブスプライシングは、遺伝子発現で重要な役割を果たす。最近の研究により、複合有機体（ｃｏｍｐｌｅｘ  ｏｒｇａｎｉｓｍ）の発現ストラテジーにおけるオルタナティブスプライシングの重要性が明らかになっている。
【０００６】
ｍＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ−ｍＲＮＡ）のオルタナティブスプライシングは、哺乳動物遺伝子発現の調節で重要な役割を果たす。オルタナティブスプライシングの調節は種々の系列の細胞で起こり、多数の遺伝子の発現プログラムの一部である。最近、オルタナティブスプライシングが時折完全に異なる機能を有するタンパク質イソ型の産生を調節することが明らかとなった。細胞形質転換に対して異なる性質および時折拮抗的性質を有する癌遺伝子および癌原遺伝子のタンパク質イソ型は、オルタナティブスプライシングを介して産生される。この種の例は、非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５で見出される。また、オルタナティブスプライシングをしばしば使用して、Ｆａｓ、Ｂｃｌ−２、Ｂａｘ、およびＣｅｄ−４などのプログラム細胞死に関与するタンパク質の産生を調節する（非特許文献１６）。ｐｒｅ−ｍＲＮＡのオルタナティブスプライシングはリプレッサータンパク質を産生することができる一方で、異なる条件下で同一のｐｒｅ−ｍＲＮＡからアクチベーターを産生することができる（非特許文献１７；非特許文献１８）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ｋ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｊ．Ｃ．，１９９８，Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５８，１２７−１６４
【非特許文献２】Ｓｗｉｔｚｅｒ，Ｒ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６２，３２９−３６７
【非特許文献３】Ｂａｂｉｔｚｋｅ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｇｏｌｌｎｉｃｋ，Ｐ．，２００１，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８３，５７９５−５８０２
【非特許文献４】Ｐｔａｓｈｎｅ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｇａｎｎ，Ａ．（２００２）．Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｓｉｇｎａｌｓ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ
【非特許文献５】Ｈａｎｎｏｎ，Ｇ．Ｊ．２００２，Ｎａｔｕｒｅ  ４１８，２４４−２５１
【非特許文献６】Ｔｈｅ  ＲＮＡ  Ｗｏｒｌｄ  Ｒ．Ｆ．Ｇｅｓｔｅｌａｎｄ，Ｔ．Ｒ．Ｃｅｃｈ，Ｊ．Ｆ．Ａｔｋｉｎｓ，ｅｄｓ．，ｐｐ．３２１−３５０（１９９８）のＣｅｃｈ  ＆  Ｇｏｌｄｅｎ，Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ａ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ  ｕｓｉｎｇ  ｏｎｌｙ  ＲＮＡ．
【非特許文献７】Ｂｒｅａｋｅｒ，Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９７，３７１−３９０（１９９７）
【非特許文献８】Ｏｓｂｏｒｎｅ  ＆  Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｏｆ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９７，３４９−３７０（１９９７）
【非特許文献９】Ｈｅｒｍａｎｎ  ＆  Ｐａｔｅｌ，Ａｄａｐｔｉｖｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｐｔａｍｅｒｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７，８２０−８２５（２０００）
【非特許文献１０】Ｓｏｕｋｕｐ  ＆  Ｂｒｅａｋｅｒ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ＲＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｗｉｔｃｈｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６，３５８４−３５８９（１９９９）
【非特許文献１１】Ｓｅｅｔｈａｒａｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｒｉｂｏｓｗｉｔｃｈｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９，３３６−３４１（２００１）
【非特許文献１２】Ｍａｋｅｌａ，Ｔ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：３７３
【非特許文献１３】Ｙｅｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：５０７７
【非特許文献１４】Ｍｕｍｂｅｒｇ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．１９９１，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．５：１２１２
【非特許文献１５】Ｆｏｕｌｋｅｓ，Ｎ．Ｓ．ａｎｄ  Ｓａｓｓｏｎｅ−Ｃｏｒｓｉ，Ｐ．１９９２，Ｃｅｌｌ  ６８：４１１
【非特許文献１６】Ｊｉａｎｇ，Ｚ．Ｈ．ａｎｄ  Ｗｕ  Ｊ．Ｙ．，１９９９，Ｐｒｏｃ  Ｓｏｃ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ  ２２０：６４
【非特許文献１７】Ｂｌａｃｋ  Ｄ．Ｌ．２０００，Ｃｅｌｌ  １０３：３６７
【非特許文献１８】Ｇｒａｖｅｌｅｙ，Ｂ．Ｒ．２００１，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１７：１００
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
コード領域に作動可能に連結されたリボスイッチを含むＲＮＡをコードする核酸分子を含み、リボスイッチがＲＮＡのスプライシングを調節し、リボスイッチおよびコード領域が非相同であり、スプライシングの調節がＲＮＡのプロセシングに影響を及ぼす、調節可能な遺伝子発現構築物を本明細書中に開示する。リボスイッチは、ＲＮＡのオルタナティブスプライシングを調節することができる。リボスイッチは、アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含むことができ、アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインは非相同である。ＲＮＡは、イントロンをさらに含むことができる。リボスイッチは、ＲＮＡの３’非翻訳領域中に存在し得る。イントロンは、ＲＮＡの３’非翻訳領域中に存在し得る。ＲＮＡプロセシング部位は、イントロン中に存在し得る。イントロンのスプライシングによってＲＮＡからＲＮＡプロセシング部位を除去し、それにより、ＲＮＡのプロセシングに影響を及ぼすことができる。ＲＮＡのプロセシングに及ぼされる影響は、ＲＮＡプロセシング部位によって媒介されるＲＮＡのプロセシングの排除を含むことができる。ＲＮＡのプロセシングに及ぼされる影響は、転写終結の変化を含むことができる。ＲＮＡのプロセシングに及ぼされる影響は、ＲＮＡ分解の増加を含むことができる。ＲＮＡのプロセシングに及ぼされる影響は、ＲＮＡターンオーバーの増加を含むことができる。リボスイッチは、イントロンの３’スプライスジャンクションと重複することができる。イントロンのスプライシングにより、リボスイッチが活性化される能力が低減または排除され得る。スプライスジャンクションは、５’スプライスジャンクションであり得る。リボスイッチは、ＲＮＡのイントロン中に存在し得る。ＲＮＡプロセシングは、スプライシングの関与と無関係に、またはこれを使用せずに、調節され得るか影響を受けることもできる。
【０００９】
発現プラットフォームドメインは、イントロン中にスプライスジャンクションを含むことができる。発現プラットフォームドメインは、イントロンの末端にスプライスジャンクションを含むことができる（すなわち、５’スプライスジャンクションまたは３’スプライスジャンクション）。ＲＮＡは、イントロンをさらに含むことができ、発現プラットフォームドメインは、イントロン中に分岐部位を含む。スプライスジャンクションは、リボスイッチが活性化される場合に活性であり得る。スプライスジャンクションは、リボスイッチが活性化されない場合に活性であり得る。リボスイッチを、トリガー分子（チアミンピロリン酸（ＴＰＰ）など）によって活性化することができる。リボスイッチは、ＴＰＰ応答性リボスイッチであり得る。リボスイッチは、スプライシングを活性化することができる。リボスイッチは、スプライシングを抑制することができる。リボスイッチは、ＲＮＡのスプライシングを変化させることができる。ＲＮＡは、分岐構造を有することができる。ＲＮＡは、ｐｒｅ−ｍＲＮＡであり得る。スプライシング調節を有するアプタマー領域は、例えば、Ｐ４ステムおよびＰ５ステム中に存在し得る。スプライシング調節を有するアプタマー領域は、例えば、ループ５中にも見出すことができる。スプライシング調節を有するアプタマー領域は、例えば、ステムＰ２中にも見出すことができる。したがって、例えば、発現プラットフォームドメインは、Ｐ４およびＰ５配列、ループ５配列、および／またはＰ２配列と相互作用することができる。かかるアプタマー配列は、一般に、トリガー分子がアプタマードメインに結合しない場合に限り、発現プラットフォームドメインとの相互作用に利用可能である。スプライス部位および／または分岐部位は、例えば、アプタマーの５’末端に対して−１３０と−１６０との間の位置に存在することができる。ＲＮＡは、第２のイントロンをさらに含むことができ、第２のイントロンの３’スプライス部位は、アプタマードメインの５’末端に対して−２２０と−２７０との間の位置に存在する。
【００１０】
ＲＮＡのプロセシングに影響を及ぼす方法であって、ＲＮＡにリボスイッチを含む構築物を導入する工程であって、リボスイッチがＲＮＡのスプライシングを調節することができ、ＲＮＡがイントロンを含み、スプライシングの調節がＲＮＡのプロセシングに影響を及ぼす、導入工程を含む方法も開示する。リボスイッチは、アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含むことができ、アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインは、非相同である。リボスイッチは、ＲＮＡのイントロン中に存在し得る。リボスイッチを、トリガー分子（ＴＰＰなど）によって活性化することができる。リボスイッチは、ＴＰＰ応答性リボスイッチであり得る。リボスイッチは、スプライシングを活性化することができる。リボスイッチは、スプライシングを抑制することができる。リボスイッチは、ＲＮＡのスプライシングを変化させることができる。スプライシングは、非天然に起こり得る。スプライシング調節を有するアプタマー領域は、例えば、ループ５中に見出すことができる。スプライシング調節を有するアプタマー領域は、例えば、ステムＰ２中にも見出すことができる。スプライス部位は、例えば、アプタマーの５’末端に対して−１３０と−１６０との間の位置に存在することができる。構築物は、イントロンをさらに含むことができる。
【００１１】
（ａ）コード領域に作動可能に連結されたリボスイッチを含むＲＮＡをコードする核酸分子を含む構築物を含む細胞であって、リボスイッチがＲＮＡのスプライシングを調節し、リボスイッチおよびコード領域が非相同であり、スプライシングの調節がＲＮＡのプロセシングに影響を及ぼす、細胞と、（ｂ）有効量のリボスイッチのトリガー分子とを接触させ、それにより、遺伝子発現に影響を及ぼす、遺伝子発現に影響を及ぼす方法も開示する。リボスイッチは、ＴＰＰ応答性リボスイッチであり得る。トリガー分子は、チアミンまたはＴＰＰであり得る。
【００１２】
開示の方法および組成物のさらなる利点を以下の記載に一部示し、この記載から利点が一部理解される。あるいは、利点を、開示の方法および組成物の実施によって知ることができる。開示の方法および組成物の利点は、添付の特許請求の範囲で特に指摘した要素および組み合わせによって理解および達成される。上記の一般的記載および以下の詳細な記載の両方は例示および説明のみであり、特許請求の範囲に記載の本発明を制限するものではないと理解すべきである。
【００１３】
本明細書中に組み込まれ、且つ本明細書の一部を構成する添付の図面は、開示の方法および組成物のいくつかの実施形態を例示し、記載と共に、開示の方法および組成物の原理を説明するのに役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、ＴＰＰアプタマーが植物種で保存され、広く行き渡っていることを示す。（Ａ）種々の植物種由来のＴＰＰアプタマー配列のアラインメントにより、配列および構造が高度に保存されていることが明らかとなる。ステムＰ１〜Ｐ５を形成するヌクレオチドを濃淡をつけて強調し、アスタリスクは、全例の間で保存されているヌクレオチドを特定する。配列は、以下に由来する：Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ（Ａｔｈ、ＮＣ００３０７１；配列番号１）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｓａｔｉｖａ（Ｂｓａ、ＥＦ５８８０３８；配列番号２）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ（Ｂｏｌ、ＢＨ２５０４６２；配列番号３）、Ｂｏｅｃｈｅｒａ  ｓｔｒｉｃｔａ（Ｂｓｔ、ＤＵ６８１９７３；配列番号４）、Ｃａｒｉｃａ  ｐａｐａｙａ（Ｃｐａ、ＤＸ４７１００４；配列番号５）、Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ（Ｃｓｉ、ＤＹ３０５６０４；配列番号６）、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ（Ｎｔａ、ＥＦ５８８０３９；配列番号７）、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ（Ｎｂｅ、ＥＦ５８８０４０；配列番号８）、Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ（Ｐｔｒ、ＪＧＩ、ｐｏｐｕｌｕｓゲノム、ＬＧ＿ＩＸ：７８９７６９０−７８９７８０７；配列番号９）、Ｌｏｔｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ（Ｌｊａ、ＡＧ２４７５５１；配列番号１０）、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ（Ｌｅｓ、ＥＦ５８８０４１；配列番号１１）、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ（Ｓｔｕ、ＤＮ９４１０１０；配列番号１２）、Ｏｃｉｍｕｍ  ｂａｓｉｌｉｃｕｍ（Ｏｂａ、ＥＦ５８８０４２；配列番号１３）、Ｉｐｏｍｏｅａ  ｎｉｌ（Ｉｎｉ、ＢＪ５６６８９７；配列番号１４）、Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ（Ｖｖｉ、ＡＭ４４２７９５；配列番号１５）、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ（Ｏｓａ、ＮＣ００８３９６；配列番号１６）、Ｐｏａ  ｓｅｃｕｎｄａ（Ｐｓｅ、ＡＦ２６４０２１；配列番号１７）、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ（Ｔａｅ、ＣＤ８７９９６７；配列番号１８）、Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ（Ｈｖｕ、ＢＭ３７４９５９；配列番号１９）、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ（Ｓｂｉ、ＣＷ２５０９５１；配列番号２０）、Ｐｉｎｕｓ  ｔａｅｄａ（Ｐｔａ、ＣＣＧＢ、Ｃｏｎｔｉｇ１１６７２９  ＲＴＤＳ２＿８＿Ｅ１２．ｇ１＿Ａ０２１：５５１−６８６；配列番号２１）、およびＰｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ（Ｐｐａ、ｇｎｌ｜ｔｉ｜８５６９０１６７８（配列番号２２）、ｇｎｌ｜ｔｉ｜８９３５５３３５７（配列番号２３）、ｇｎｌ｜ｔｉ｜８７６２９７７１７（配列番号２４）、（Ｌａｎｇら、２００５））。Ｉ．ｎｉｌの配列は、ｃＤＮＡ由来のスプライスバリアントを示し、したがって、アプタマーの５’末端を欠く。これらの配列の左側のＰ１配列は、Ｐｐａ２配列（ＧＣＧＣＣである）およびＩｎｉ配列を除いてＧＣＡＣＣである。これらの配列の右側のＰ１配列は、Ｌｊａ配列（ＧＡＧＵＧＣである）およびＬｅｓ配列（ＧＣＧＵＧＣである）を除いてＧＵＧＵＧＣである。（Ｂ、Ｃ）植物（Ｂ；配列番号２５および２６）または細菌および古細菌種（Ｃ；配列番号２７〜２９）由来の全代表に基づいたＴＰＰリボスイッチアプタ���ーのコンセンサス配列および二次構造モデルは類似する。相互情報量は、ボックスで囲った塩基対の発生する確率を反映する。Ｐ５ステム中のボックスで囲った塩基対についてのｐ値は、０．１、０．１、０．０１、０．０１、および０．０１である（上から下）。Ｐ４ステム中のボックスで囲った塩基対についてのｐ値は、０．０１、０．０１、および０．１である（上から下）。Ｐ１ステムおよびＰ３ａステム中のボックスで囲った塩基対についてのｐ値は、０．０１である。Ｐ３ステム中のボックスで囲った塩基対についてのｐ値は、０．１、０．０１、０．０１、０．０１、０．０１、および０．０１である（左から右）。
【図２】図２は、ＴＨＩＣ  ３’ＵＴＲ構造が保存されていることを示す。（Ａ）ＴＨＩＣ遺伝子の３’領域の組成および由来する転写物の型は類似している。第１のボックスは、コード領域の最後のエクソンを示し、終止コドンＵＡＡを示した。終止コドンにイントロンが続き（イントロンが終止コドンの直前に存在するＬ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍを除く）、このイントロンは、典型的には、全転写物型（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ）でスプライスされる。ＧＵおよびＡＧという表記は、それぞれ５’および３’スプライス部位を特定する。１〜６の番号を付けた太線は、その長さが（Ｂ）に記載のように分析されたＲＮＡ転写物の６つの領域を示す。破線（ｄａｓｈｅｄ  ｌｉｎｅ）はスプライス事象を示し、菱形の記号は転写物プロセシング部位を示す。（Ｂ）（Ａ）で定義した領域中のヌクレオチド数は、７つの植物種で類似している。領域６の重ねたバーは、異なる長さの転写物の同一部分（ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｉｔｏｎ）を示す。（Ｃ）ポリＴプライマーを使用して生成したｃＤＮＡ由来のＴＨＩＣ  ３’ＵＴＲのＰＣＲ増幅により、試験した全種でＩＩ型ＲＮＡのみが得られる。ＲＴ−ＰＣＲ産物を、１．５％アガロースゲル電気泳動を使用して分離し、臭化エチジウム染色およびＵＶ照射によって視覚化した。「Ｍ」は、１００塩基対ずつ増加するＤＮＡを含むマーカーレーンを示す。（Ｄ）Ｉ型およびＩＩＩ型ＲＮＡの３’ＵＴＲに特異的なプライマー組み合わせを使用して（Ｃ）と同一のｃＤＮＡを使用してＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。（Ｅ）異なるＲＴプライマーを使用して生成したＡ．ｔｈａｌｉａｎａ  ｃＤＮＡ由来のＩ型およびＩＩＩ型ＲＮＡ由来の３’ＵＴＲのＲＴ−ＰＣＲ産物。ＲＴのために使用したプライマーは、示すように、ポリＴ、ランダムヘキサマー、またはＴＨＩＣの注釈付き末端（アプタマー末端の２２１ｎｔ下流）付近またはさらなる下流（アプタマー末端の８８２ｎｔ下流）に結合する配列特異的プライマーであった。ＲＴなし（Ｎｏ  ＲＴ）は、テンプレート供給源として逆転写を使用しないでＲＮＡを使用したコントロール反応を示す。
【図３】図３は、ＴＨＩＣ転写物型がＡ．ｔｈａｌｉａｎａにおけるチアミンレベルの変化に対して異なって反応することを示す。（Ａ）０、０．１、および１ｍＭチアミンを補足した培地上で１４日間成長させたＡ．ｔｈａｌｉａｎａ実生（ｓｅｅｄｌｉｎｇ）由来のＴＨＩＣ転写物に対してｑＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。異なるプライマー組み合わせを使用して、全ＴＨＩＣ転写物を検出し、Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型ＲＮＡを個別に検出した。ｃＤＮＡを、ポリＴプライマーまたはＩ型ＲＮＡの検出のためのランダムヘキサマーを使用して生成した。発現を、チアミンを補足しない培地（白抜きのバー）を使用して測定した値に対して各プライマー組み合わせについて正規化した。値は３つの独立した試験の平均であり、エラーバーは標準偏差を示す。（Ｂ）（Ａ）に記載の同一サンプル由来のＴＨＩＣ転写物のノーザンブロット分析。レーンあたり２０μｇの総ＲＮＡをロードし、ＴＨＩＣのコード領域、Ｉ型およびＩＩＩ型ＲＮＡの伸長した３’ＵＴＲ、またはコントロール転写物ＥＩＦ４Ａ１に結合するプローブを使用して分析した。ＴＨＩＣプローブのシグナルを、２ｋｂと３ｋｂとの間のサイズ範囲で示す。３’ＵＴＲプローブによって弱いシグナルが得られ、曝露時間は、他のプローブの１日曝露と比較して３日間に延長された。（Ｃ）Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ由来のＴＨＩＣ転写物に及ぼすチアミン処理の時間依存性の影響のｑＲＴ−ＰＣＲ分析。実生を無チアミン培地上で１４日間成長させ、その後に５０μＭチアミンおよび０．２５ｍｇ／ｍｌＴｗｅｅｎ８０を噴霧した。コントロール実生を、Ｔｗｅｅｎ８０のみを含む溶液で処理した。サンプルを４時間後および２６時間後に回収し、ｑＲＴ−ＰＣＲ分析に供した。ポリＴプライマーを使用して生成したｃＤＮＡ由来のＴＨＩＣ転写物の量を分析し、チアミンを適用しなかったコントロールサンプルの値（白抜きのバー）に対して正規化した。値は３つの独立した実験の平均であり、エラーバーは標準偏差を示す。（Ｄ）野生型（ＷＴ）およびチアミンピロホスホキナーゼダブルノックアウト（ＴＰＫ−ＫＯ）Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ植物におけるＴＨＩＣ転写物型レベルの相対的変化。実生を無チアミン培地上で１２日間成長させ、ＴＨＩＣ転写物型の量をｑＲＴ−ＰＣＲによって分析した。データをＷＴサンプルの値に対して正規化し、これは３つの反復由来の平均を反映し、エラーバーは標準偏差を示す。
【図４】図４は、ＴＨＩＣの長い３’ＵＴＲによってアプタマー機能と無関係に遺伝子発現が低減することを示す。（Ａ）Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ由来のＴＨＩＣ  ＩＩＩ型ＲＮＡにおけるスプライシング後に生成されたＴＰＰアプタマーの二次構造モデル（配列番号３０および３１）。ステムＰ１およびＰ２中の灰色の影を付けたヌクレオチドは、元の非スプライシングアプタマーと比較して核酸塩基の変化が認められる。黒で囲んだヌクレオチドは、示すように、ＴＰＰに結合しない変異体Ｍ１およびＭ２を生成するように変化した。（Ｂ）（Ａ）に示したスプライスされたアプタマーによるＴＰＰ結合のインライン探索分析（ｉｎ−ｌｉｎｅ  ｐｒｏｂｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓ）。レーンは、未反応後（ＮＲ）、ＲＮアーゼＴ１での部分消化後（Ｔ１）、またはアルカリ（−ＯＨ）での部分消化後にロードしたＲＮＡを含む。部位１および２を、（Ｃ）に示すように、定量してＫＤを確立した。（Ｃ）（Ｂ）における部位１および２についての自発的に切断されたＲＮＡの正規化画分対ＴＰＰ濃度を示すプロット。（Ｄ）ホタルルシフェラーゼ（ＬＵＣ）のコード領域の３’末端に融合したＡ．ｔｈａｌｉａｎａＩＩ型およびＩＩＩ型ＲＮＡの３’ＵＴＲを含むレポーター構築物のｉｎ  ｖｉｖｏ発現分析。構築物Ｍ１およびＭ２は、ＩＩＩ型ＲＮＡの３’ＵＴＲに基づくが、（Ａ）に示す変異を含む。ＬＵＣ−ＩＩＩ  Ｍ１’は、構築物ＬＵＣ−ＩＩＩ  Ｍ１の逆３’ＵＴＲ配列を含む。レポーター構築物を一過性Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ発現アッセイで分析し、値をＲｅｎｉｌｌａ由来の同時発現ルシフェラーゼ遺伝子に対して標準化した。発現を、ＩＩ型ＲＮＡの３’ＵＴＲを含む融合構築物に対して正規化した。示したデータは、３つの独立した実験の平均値であり、エラーバーは標準偏差を示す。（Ｅ）一過性発現アッセイにおける発現後のＡ．ｔｈａｌｉａｎａ（Ａｔ）またはＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ（Ｎｂ）のいずれか由来のＴＨＩＣ  ＩＩ型またはＩＩＩ型ＲＮＡの３’ＵＴＲを含むＥＧＦＰレポーター融合物のｑＲＴ−ＰＣＲ分析。発現を、同時発現したＤｓＲＥＤレポーター遺伝子に対して標準化し、ＩＩ型３’ＵＴＲを含む構築物に対して正規化した。示したデータは、２つの代表的な実験の平均値であり、エラーバーは標準偏差を反映する。
【図５】図５は、リボスイッチ機能のｉｎ  ｖｉｖｏ分析を示す。（Ａ）ＥＧＦＰの３’末端に融合したＡｔＴＨＩＣの完全な３’領域のレポーター融合物を発現する安定に形質転換したＡ．ｔｈａｌｉａｎａ系（ｌｉｎｅ）由来の葉を離脱し、葉柄と共に水中または０．０２％チアミンを補足した水中でインキュベートした。処理開始から０時間後、４８時間後、および７２時間後にＥＧＦＰ蛍光を評価した。３つの反復実験由来のデータのうちの１つの代表的な組を示し、数値は１つのトランスジェニック系由来の異なる葉を特定する。（Ｂ）３つの時点での（Ａ）に示す葉のＥＧＦＰ蛍光の定量。データは、各葉の平均蛍光強度および標準偏差を示す。プロットはまた、ＷＴ葉の平均バックグラウンド蛍光を示す。（Ｃ）水または０．０２％チアミン中で７２時間インキュベートした葉由来の総ＥＧＦＰおよびＴＨＩＣ転写物のｑＲＴ−ＰＣＲ分析。転写物量を、内部標準転写物に対して標準化し、水処理サンプル中の転写物存在量に対して正規化した。値は、異なるトランスジェニック系を使用した４つの独立した実験の平均であり、エラーバーは標準偏差を示す。（Ｄ、Ｅ）外因性チアミンの非存在下で成長したＡ．ｔｈａｌｉａｎａレポーター形質転換体由来のＥＧＦＰおよびＴＨＩＣ転写物型の異なる３’ＵＴＲのＲＴ−ＰＣＲ分析。ｃＤＮＡ生成のために、ポリＴプライマー、ランダムヘキサマー、または２つの異なる遺伝子特異的プライマー（アプタマーの末端の２２１ｎｔ下流または８８２ｎｔ下流のいずれかに結合する）を表示のように使用した。順方向プライマーは、ＥＧＦＰ（左）またはＴＨＩＣ（右）のコード領域の最後のエクソンの末端に特異的であったのに対して、逆方向プライマーは、ポリＴプライマー（Ｄ）であったか、アプタマーの末端の２２１ｎｔ下流の領域に相同であった（Ｅ）。図２に記載のように、ＲＴ−ＰＣＲ産物を分離し、視覚化した。Ｍは、１００塩基対ずつ増加するＤＮＡを含むマーカーレーンを示す。ＲＴなし（Ｎｏ  ＲＴ）は、テンプレート供給源として逆転写を使用しないでＲＮＡを使用したコントロール反応を示す。Ｉ−１およびＩ−２は、それぞれスプライスされていない、またはスプライスされた終止コドン後の上流イントロンを有するＩ型ＲＮＡを示す。（Ｅ）中のポリＴ反応中の最も下のバンドは、ＲＴ反応由来の残存するポリＴプライマーを有するＴＨＩＣ  ＩＩ型ＲＮＡの増幅に起因する。さらなるマークしていないバンドは、全ＲＴ−ＰＣＲ産物のクローニングおよび配列決定によって確認された非特異的増幅物に対応する。
【図６】図６は、リボスイッチ機能に及ぼすアプタマー変異の影響を示す。（Ａ）Ａ．ｔｈａｌｉａｎａゲノム配列に由来し、ＥＧＦＰに融合したＴＨＩＣの３’領域中に存在するＷＴ  ＴＰＰアプタマーの二次構造モデルおよび配列（配列番号３２および３３）。黒で囲んだヌクレオチドは、示すように、ＴＰＰ結合を損なった変異体Ｍ２、Ｍ３、およびＭ４を生成するように変化した。（Ｂ）ＷＴアプタマー配列または変異バージョンであるＭ２、Ｍ３、およびＭ４を含むレポーター構築物を発現するＡ．ｔｈａｌｉａｎａ形質転換体由来の葉中のＥＧＦＰ蛍光の定量。葉を切り取り、蛍光分析前にその葉柄と共に水または０．０２％チアミン中で７２時間インキュベートした。値は、異なるトランスジェニック系を使用した少なくとも３つの独立した実験の平均である。エラーバーは標準偏差を示す。（Ｃ）（Ｂ）に記載のＡ．ｔｈａｌｉａｎａ形質転換体中のＥＧＦＰ転写物およびＴＨＩＣ転写物の量のｑＲＴ−ＰＣＲ分析。転写物量（基準転写物を使用して標準化した）を、水処理したサンプル中の転写物の存在量に対して正規化した。値は、異なるトランスジェニック系を使用した２〜４つの独立した実験の平均である。エラーバーは標準偏差を示す。（Ｄ、Ｅ）変異Ｍ２またはＭ３を有するＡ．ｔｈａｌｉａｎａ形質転換体由来のＥＧＦＰ転写物およびＴＨＩＣ転写物の３’ＵＴＲのＲＴ−ＰＣＲ分析。ＲＴ−ＰＣＲ分析を、図５Ｄおよび５Ｅの説明に記載のように行った。順方向プライマーは、ＥＧＦＰまたはＴＨＩＣのコード領域の最後のエクソンの末端に相同であり、逆方向プライマーは、ポリＴプライマー（Ｄ）であったか、アプタマーの末端の２２１ｎｔ下流の領域に相補的であった（Ｅ）。Ｋｂｐは、キロ塩基対を示す。
【図７】図７は、植物におけるリボスイッチ機能の機構を示す。（Ａ）ＴＰＰにより、５’スプライス部位付近のＲＮＡ構造が変化し、この構造変化はＴＨＩＣ  ＩＩＩ型ＲＮＡの形成に重要である。インライン探索のために、５’スプライス部位の１４ｎｔ上流（＋１）から開始し、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ由来のＴＰＰアプタマー（ヌクレオチド−１４〜２６１）の３’末端まで伸長する５’３２Ｐ標識ＲＮＡを、１０μＭ  ＴＰＰの非存在下（−）または存在下（＋）でインキュベートし、得られた自発的切断産物を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離した。マーカーは、ＲＮアーゼＴ１（Ｔ１）またはアルカリ（−ＯＨ）で部分的に消化したＲＮＡである。グラフは、示したレーン中の相対バンド強度を示す。（Ｂ）５’スプライス部位領域とＴＰＰアプタマーのＰ４〜Ｐ５ステムとの間の塩基対合可能性（配列番号３４〜４７；相補ヌクレオチドに影を付けている）。一続きの相補ヌクレオチドは、利用可能な全ての他の植物ＴＨＩＣ  ｍＲＮＡ配列中にも存在する。（Ｃ）植物におけるＴＨＩＣ  ＴＰＰリボスイッチ機能のモデルは、転写物のスプライシングおよびオルタナティブ３’末端プロセシングの調節を含む。ＴＰＰ濃度が低い場合（左）、ステムＰ４およびＰ５の一部は５’スプライス部位と相互作用し、それにより、スプライシングを防止する。５’スプライス部位とＴＰＰアプタマーとの間に存在する転写物プロセシング部位が保持され、その使用により、高発現を可能にする短い３’ＵＴＲを有する転写物が形成される。高濃度のＴＰＰの存在下で（右）、ＴＰＰは同時転写的にアプタマーと結合し、それによって構造が変化し、５’スプライス部位との相互作用が防止される。スプライシングが起こって転写物プロセシング部位が除去される。転写が継続され、伸長した３’ＵＴＲ中のオルタナティブプロセシング部位によりＴＨＩＣ  ＩＩＩ型ＲＮＡが生じる。長い３’ＵＴＲによってＲＮＡ分解が増加し、それによってＴＨＩＣ発現が低減する。
【図８−１】図８は、異なる植物種由来のＴＨＩＣ遺伝子中のＴＰＰリボスイッチのゲノムＤＮＡ配列構成を示す（配列番号４８〜５４）。
【００１５】
【化１】
2010528616.tif 000002
は、ＴＨＩＣ読み取り枠の終止コドンを特定する。
【００１６】
【化２】
2010528616.tif 000003
は、第１のイントロンの５’および３’スプライス部位を示す（斜体で示す）。
【００１７】
【化３】
2010528616.tif 000004
は、ＩＩＩ型ＲＮＡの生成のために使用されるスプライス部位を特定する。ＩＩ型ＲＮＡの３’ＵＴＲに下線を引き、アプタマー配列は太字にして下線を引いている。示した配列の３’末端は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａおよびＯｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａの遺伝子注釈づけに対応する。他の植物種について、示した配列は、ＲＴ−ＰＣＲによって同定された３’末端に従う。
【図８−２】図８は、異なる植物種由来のＴＨＩＣ遺伝子中のＴＰＰリボスイッチのゲノムＤＮＡ配列構成を示す（配列番号４８〜５４）。
【００１８】
【化１】
2010528616.tif 000005
は、ＴＨＩＣ読み取り枠の終止コドンを特定する。
【００１９】
【化２】
2010528616.tif 000006
は、第１のイントロンの５’および３’スプライス部位を示す（斜体で示す）。
【００２０】
【化３】
2010528616.tif 000007
は、ＩＩＩ型ＲＮＡの生成のために使用されるスプライス部位を特定する。ＩＩ型ＲＮＡの３’ＵＴＲに下線を引き、アプタマー配列は太字にして下線を引いている。示した配列の３’末端は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａおよびＯｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａの遺伝子注釈づけに対応する。他の植物種について、示した配列は、ＲＴ−ＰＣＲによって同定された３’末端に従う。
【図８−３】図８は、異なる植物種由来のＴＨＩＣ遺伝子中のＴＰＰリボスイッチのゲノムＤＮＡ配列構成を示す（配列番号４８〜５４）。
【００２１】
【化１】
2010528616.tif 000008
は、ＴＨＩＣ読み取り枠の終止コドンを特定する。
【００２２】
【化２】
2010528616.tif 000009
は、第１のイントロンの５’および３’スプライス部位を示す（斜体で示す）。
【００２３】
【化３】
2010528616.tif 000010
は、ＩＩＩ型ＲＮＡの生成のために使用されるスプライス部位を特定する。ＩＩ型ＲＮＡの３’ＵＴＲに下線を引き、アプタマー配列は太字にして下線を引いている。示した配列の３’末端は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａおよびＯｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａの遺伝子注釈づけに対応する。他の植物種について、示した配列は、ＲＴ−ＰＣＲによって同定された３’末端に従う。
【図８−４】図８は、異なる植物種由来のＴＨＩＣ遺伝子中のＴＰＰリボスイッチのゲノムＤＮＡ配列構成を示す（配列番号４８〜５４）。
【００２４】
【化１】
2010528616.tif 000011
は、ＴＨＩＣ読み取り枠の終止コドンを特定する。
【００２５】
【化２】
2010528616.tif 000012
は、第１のイントロンの５’および３’スプライス部位を示す（斜体で示す）。
【００２６】
【化３】
2010528616.tif 000013
は、ＩＩＩ型ＲＮＡの生成のために使用されるスプライス部位を特定する。ＩＩ型ＲＮＡの３’ＵＴＲに下線を引き、アプタマー配列は太字にして下線を引いている。示した配列の３’末端は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａおよびＯｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａの遺伝子注釈づけに対応する。他の植物種について、示した配列は、ＲＴ−ＰＣＲによって同定された３’末端に従う。
【図９】図９は、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ由来のＴＨＩＣプロモーターがチアミン補足後のＴＨＩＣ発現の下方制御を担わないことを示す。Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ由来のＴＨＩＣプロモーターの１５９５ｂｐフラグメントからなる構築物を、レポーター遺伝子β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）に融合し、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａに形質転換した。ＧＵＳ転写物およびＴＨＩＣ転写物の量をｑＲＴ−ＰＣＲによって分析し、チアミンを含まない培地または１００μＭチアミンを補足した培地上で成長させた９日齢の実生中の基準転写物ｅＥＦ−１αの発現に対して正規化した。データは、３つの異なるトランスジェニック系および３つの独立した実験由来の平均値である。エラーバーは標準偏差を示す。
【図１０】図１０は、ＴＨＩＣのサーカディアン発現を示す。（Ａ）連続照明下で４８時間インキュベートした植物由来の全ＴＨＩＣ転写物のｑＲＴ−ＰＣＲ分析。植物を、チアミンを含まない培地または１００μＭチアミンを補足した培地上で明暗周期（１６時間／８時間）で１１日間成長させた。１２日目の朝、植物を連続照明に移し、サンプルを３時間毎に採取した。発現を、無チアミン培地上で成長させた植物由来の時点０でのサンプルの値に対して正規化した。エラーバーは３連のｑＲＴ−ＰＣＲ分析の標準偏差を示す。エラーバーが存在しないものは、エラーバーがデータポイントの直径よりも小さいことを示す。（Ｂ）ＴＨＩＣ  ＩＩＩ型ＲＮＡのｑＲＴ−ＰＣＲ分析。植物材料およびデータ正規化は、（Ａ）について記載の通りである。
【図１１】図１１は、レポーター遺伝子発現に及ぼす異なるＴＨＩＣ転写物型由来の３’ＵＴＲの影響を示す。（Ａ）ＥＧＦＰおよびＡ．ｔｈａｌｉａｎａ由来のＴＨＩＣ−ＩＩまたはＴＨＩＣ−ＩＩＩ  ＲＮＡ由来の３’ＵＴＲからなるレポーター融合構築物を一過性葉浸潤アッセイ（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｌｅａｆ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）を使用して発現し、４８時間後および９６時間後に蛍光を測定した。結果は、ルシフェラーゼレポーター構築物を使用して認められた結果と類似していた。一過性発現系によって転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）を行うことができることが公知である（ＪｏｈａｎｓｅｎおよびＣａｒｒｉｎｇｔｏｎ、２００１；Ｖｏｉｎｎｅｔら、２００３）。ＰＴＧＳの可能な影響を評価するために、２つの３’ＵＴＲバリアントの相対発現を、Ｐ１９（遺伝子サイレンシングの公知のサプレッサー）の非存在下または存在下で決定した。ＴＨＩＣ−ＩＩの３’ＵＴＲを含む構築物についての値に対して蛍光を標準化した。データは４つの独立した実験の平均であり、エラーバーは標準偏差を示す。２つの構築物の活性の比は、Ｐ１９の同時発現後に不変であった。これは、ＰＴＧＳが認められた相違に関与しないことを示す。（Ｂ）葉浸潤アッセイにおける発現後のＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ  ＴＨＩＣ  ＩＩ型およびＩＩＩ型ＲＮＡ由来の３’ＵＴＲを含むＥＧＦＰレポーター構築物の相対蛍光。発現を、ＴＨＩＣ  ＩＩ型ＲＮＡの３’ＵＴＲを含む構築物の値に対して正規化した。値は、２つの独立した実験の平均であり、エラーバーは標準偏差を示す。結果は、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ由来の３’ＵＴＲに基づいた構築物を使用して認められた結果と同等である。
【図１２】図１２は、アプタマーの５’隣接配列中のＴＰＰ誘導性調整を示す。５’スプライス部位の１４ｎｔ上流から開始し、アプタマー（−１４〜２６１）の末端まで伸長するＲＮＡを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写および３２Ｐで標識した５’末端によって産生した。１０μＭ  ＴＰＰの非存在下または存在下でのインライン探索反応後、切断産物をｐａｇｅによって分離した。マーカーを、ＲＮアーゼＴ１処理（Ｔ１）または部分的アルカリ消化（−ＯＨ）によって生成した。５’スプライス部位のＧ残基を、１位およびアプタマーＳＰＡＮＳｎｔ１４６〜２５６と定義する。アプタマー外側のＴＰＰ依存性調整は、主に、５’スプライス部位の隣の領域中で認められる。しかし、さらなる構造の変化により、５’フランク中の他の場所でのリガンド依存性調整が５’スプライス部位構造の調節に重要であり得ることが明らかとなる。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
発明の詳細な説明
以下の特定の実施形態の詳細な記載およびそこに含まれる実施例、ならびに添付の図面および前および後の記載を参照して、開示の方法および組成物をより容易に理解することができる。
【００２８】
伝令ＲＮＡは、典型的には、タンパク質または小さなＲＮＡ調節因子によって、および翻訳過程の間のリボゾームによって作用する遺伝子情報の受動的キャリアと考えられている。一定のｍＲＮＡが天然のアプタマードメインを保有し、これらのＲＮＡドメインへの特異的代謝産物の直接結合によって遺伝子発現が調整されることが発見された。天然リボスイッチは、典型的には天然ＲＮＡと関連しない２つの驚くべき機能を示す。第１に、ｍＲＮＡエレメントは異なる構造状態を採用することができ、一方の構造は、その標的代謝産物の正確な結合ポケットとしての機能を果たす。第２に、構造状態間の代謝産物誘導性アロステリック相互交換により、いくつかの異なる機構のうちの１つによって遺伝子発現レベルが変化する。リボスイッチを、典型的には、以下の２つの個別のドメインに分けることができる：１つは標的に選択的に結合するドメイン（アプタマードメイン）および他方は遺伝子調節に影響を及ぼすドメイン（発現プラットフォーム）。これらの２ドメイン間の動的相互作用により遺伝子発現が代謝産物依存性にアロステリック調節される。
【００２９】
異なるクラスのリボスイッチが同定されており、活性化化合物（本明細書中でトリガー分子と呼ぶ）を選択的に認識することが示されている。例えば、補酵素Ｂ１２、グリシン、チアミンピロリン酸（ＴＰＰ）、およびフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）は、これらの化合物の代謝経路または輸送経路における重要な酵素をコードする遺伝子中に存在するリボスイッチを活性化する。各リボスイッチクラスのアプタマードメインは、高度に保存されたコンセンサス配列および構造に適合する。したがって、配列相同性検索を使用して、関連するリボスイッチドメインを同定することができる。リボスイッチドメインは、細菌、古細菌、および真核生物由来の種々の生物で発見されている。
【００３０】
１２種より多いリボスイッチの構造クラスが１０種の異なる代謝産物を感知する真正細菌で報告されている（Ｍａｎｄａｌ  ２００４；Ｗｉｎｋｌｅｒ  ２００５；Ｂｒｅａｋｅｒ  ２００６；Ｆｕｃｈｓ  ２００６；Ｒｏｔｈ）。キューオシン（ｑｕｅｕｏｓｉｎｅ）前駆体ｐｒｅＱ１に選択性を示す真正細菌リボスイッチは、通常、異常に小さなアプタマードメインを含み（Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００７））、多数の他のクラスは現在特徴づけられているところである。各リボスイッチのアプタマードメインは、そのヌクレオチド配列（Ｒｏｄｉｏｎｏｖ  ２００２；Ｖｉｔｒｅｓｃｈａｋ  ２００２；Ｖｉｔｒｅｓｃｈａｋ  ２００３）および折り畳まれた構造（Ｎａｈｖｉ  ２００４；Ｂａｔｅｙ  ２００４；Ｓｅｒｇａｎｏｖ  ２００４；Ｍｏｎｔａｎｇｅ  ２００６；Ｔｈｏｒｅ  ２００６；Ｓｅｒｇａｎｏｖ  ２００６；Ｅｄｗａｒｄｓ  ２００６）によって識別され、これらは、遠縁の生物間でさえも依然として高度に保存されている。発現プラットフォームは、配列、構造、および調節機構が広範に異なり得るにもかかわらず、リボスイッチは、通常、アプタマーによる代謝産物結合に応答して遺伝子発現を調整する発現プラットフォームを含む。
【００３１】
例外的なアプタマー保存レベルにより、バイオインフォマティクスを使用して多様な生物中の類似の代表的なリボスイッチを同定することができる。現在、ＴＰＰリボスイッチアプタマーコンセンサスに従う配列のみが、３つ全ての生物の領域で同定されている（Ｓｕｄａｒｓａｎ  ２００３）。真菌（Ｓｕｄａｒｓａｎ  ２００３；Ｇａｌａｇａｎ  ２００５）（図５）および植物由来のいくつかの予想される真核生物ＴＰＰアプタマーがＴＰＰに結合することが示されているにもかかわらず（Ｓｕｄａｒｓａｎ  ２００３Ｙａｍａｕｃｈｉ）、代謝産物結合が遺伝子発現を調節する正確な機構はこれまで知られていなかった。真菌では、各ＴＰＰアプタマーは、ｍＲＮＡの５’非翻訳領域（ＵＴＲ）またはタンパク質コード領域中のイントロン内に存在し、これは、ｍＲＮＡスプライシングが代謝産物結合によって調節されることを意味する（Ｓｕｄａｒｓａｎ  ２００３；Ｋｕｂｏｄｅｒａ  ２００３）。植物では、各ＴＰＰアプタマーは、ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）またはタンパク質コード領域内に存在する。植物ＴＰＰ応答性リボスイッチが、このリボスイッチが存在するＲＮＡのプロセシングに影響を及ぼすことが発見された。
【００３２】
Ａ．リボスイッチＲＮＡの一般的構成
細菌リボスイッチＲＮＡは、特定のｍＲＮＡの主なコード領域の５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）内に主に存在する遺伝子調節エレメントである。構造探索研究（以下でさらに考察）により、リボスイッチエレメントは一般に以下の２つのドメインから構成されることが明らかである：リガンド結合ドメインとしての機能を果たす天然のアプタマー（Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｎ，Ｄ．Ｊ．Ｐａｔｅｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０００，２８７，８２０；Ｌ．Ｇｏｌｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９５，６４，７６３）および遺伝子発現に関与するＲＮＡエレメント（例えば、シャイン−ダルガルノ（ＳＤ）エレメント；転写終結ステム）を妨害する「発現プラットフォーム」である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成したアプタマードメインが発現プラットフォームの非存在下で適切なリガンドに結合するという観察から、これらの結論を導いている（米国特許出願公開第２００５−００５３９５１号の実施例２、３、および６を参照のこと）。さらに、構造探索調査により、ほとんどのリボスイッチのアプタマードメインが個別に試験した場合に特定の二次構造および三次構造の折り畳みを採用し、全５’リーダーＲＮＡの関係において試験した場合にアプタマー構造と本質的に同一であることが示唆される。これは、多くの場合、アプタマードメインが発現プラットフォームと無関係に折り畳まれるモジュラー単位であることを示す（米国特許出願公開第２００５−００５３９５１号の実施例２、３、および６を参照のこと）。
【００３３】
最終的に、アプタマードメインのリガンド結合状態または非結合状態は発現プラットフォームを介して解釈され、それは遺伝子発現の際に影響を及ぼす。モジュラーエレメントとしてのリボスイッチの投影は、アプタマードメインが種々の生物の間（およびＴＰＰリボスイッチについて認められるように、界の間でさえも）で高度に保存されるのに対して（Ｎ．Ｓｕｄａｒｓａｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ  ２００３，９，６４４）、発現プラットフォームは、付加された読み取り枠（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｌａｍｅ）の発現が調節される配列、構造、および機構で変化するという事実によってさらに支持される。例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのｔｅｎＡ  ｍＲＮＡのＴＰＰリボスイッチへのリガンド結合によって転写が終結する（Ａ．Ｓ．Ｍｉｒｏｎｏｖ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２００２，１１１，７４７）。この発現プラットフォームは、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のｔｈｉＭ  ｍＲＮＡ中のＴＰＰリボスイッチの発現プラットフォームと比較して配列および構造が異なり、ＴＰＰ結合はＳＤ遮断機構によって翻訳を阻害する（米国特許出願公開第２００５−００５３９５１号の実施例２を参照のこと）。ＴＰＰアプタマードメインは容易に認識可能であり、これらの２つの転写単位の間で機能的特徴がほぼ同一であるが、これらを実施する遺伝子調節機構および発現プラットフォームは非常に異なる。
【００３４】
リボスイッチＲＮＡのアプタマードメインは、典型的には、約７０〜１７０ｎｔ長の範囲である（米国特許出願公開第２００５−００５３９５１号の図１１）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化実験でかなりより短く構造が複雑である多種多様な小分子結合アプタマーが同定されたことを考慮すると、この観察はいくらか予想外であった（Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｎ，Ｄ．Ｊ．Ｐａｔｅｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０００，２８７，８２０；Ｌ．Ｇｏｌｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９５，６４，７６３；Ｍ．Ｆａｍｕｌｏｋ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９９９，９，３２４）。人工アプタマーと比較した天然アプタマー配列の複雑さおよび情報量の実質的増加についての理由が依然として証明されていないにもかかわらず、この複雑さは、高い親和性および選択性で機能するＲＮＡ受容体を形成するのに必要であるとみられる。リガンド−リボスイッチ複合体の見かけ上のＫＤ値は、低ナノモル（ｎａｎｏｍｏｌａｒ）から低マイクロモル（ｍｉｃｒｏｍｏｌａｒ）までの範囲である。いくつかのアプタマードメインは、追加発現プラットフォームから単離した場合、インタクトなリボスイッチよりも改良された標的リガンドに対する親和性を示す（約１０〜１００倍）ことも注目に値する（米国特許出願公開第２００５−００５３９５１号の実施例２を参照のこと）。おそらく、完全にインタクトなリボスイッチＲＮＡによって必要とされる複数の異なるＲＮＡ高次構造のサンプリングにはエネルギーコストがかかり、リガンド親和性の喪失が反映される。アプタマードメインは分子スイッチとしての機能を果たさなければならないので、これは、天然のアプタマーに対する機能的要求を付加することもでき、この付加は、そのより精巧な構造を合理化するのに役立ち得る。
【００３５】
Ｂ．ＴＰＰリボスイッチ
補酵素チアミンピロリン酸（ＴＰＰ）は、ビタミンＢ１（多数のタンパク質触媒反応での不可欠な関連物質（ｐａｒｔｉｃｉｐａｎｔ））の活性形態である。３つ全ての生物の領域（細菌、植物、および真菌が含まれる）は、チアミンおよびそのリン酸化誘導体の移入または合成を担う遺伝子を調節するためのＴＰＰ感知リボスイッチを使用する。このことがこのリボスイッチクラスを代謝産物感知ＲＮＡ調節系の最も広範に分布したメンバーにしている。構造により、折り畳まれたＲＮＡが明らかになり、このＲＮＡは、一方のサブドメインがＴＰＰの４−アミノ−５−ヒドロキシメチル−２−メチルピリミジン部分のための挿入ポケットを形成するのに対して、他方のサブドメインがリガンドのピロリン酸部分と接触して架橋する２価の金属イオンおよび水分子を使用するより広いポケットを形成する。２つのポケットは、広がった高次構造中のＴＴＰを認識する分子測定デバイスとして機能するように配置される。中央のチアゾール部分はＲＮＡによって認識されず、このことは、何故抗菌化合物であるピリチアミンピロリン酸がこのリボスイッチを標的にして、チアミン代謝遺伝子の発現を下方制御するのかを説明している。天然のリガンドおよびその薬物様アナログの両方は、リボスイッチによって利用される二次構造エレメントおよび三次構造エレメントを安定化して、ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の合成を調整する。さらに、この構造により、どのようにして折り畳まれたＲＮＡがタンパク質遺伝因子によって形成される結合ポケットと競合する正確な結合ポケットを形成することができるのかについての実態が提供される。
【００３６】
３つのＴＰＰリボスイッチを糸状菌Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａにおいて試験し、ｍＲＮＡスプライシングの調節によって遺伝子発現を１つが活性化し、２つが抑制することが見出された（Ｃｈｅａｈ  ２００７）。ＴＰＰ代謝に関与するタンパク質をコードする前駆体ＮＭＴ１  ｍＲＮＡについてのリボスイッチ媒介性塩基対合の変化およびオルタナティブスプライシング調節に関与する詳細な機構が解明された（Ｃｈｅａｈ  ２００７）。これらの結果は、真核細胞が重要な生化学過程の調節に重要なＲＮＡスプライシング事象を調節するために代謝産物結合ＲＮＡを使用することを証明する。
【００３７】
ＴＰＰリボスイッチが、試験した全植物種のチアミン生合成遺伝子ＴＨＩＣの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）中に存在することが発見された。ＴＨＩＣ  ＴＰＰリボスイッチは、オルタナティブな３’ＵＴＲ長を有する転写物の形成を調節し、これはｍＲＮＡの安定性およびタンパク質産生に影響を及ぼす。オルタナティブ３’末端プロセシングのリボスイッチ媒介性調節は、ＴＨＩＣ発現のＴＰＰ依存性フィードバック調節に重要であることが証明されている。データにより、ＲＮＡ折り畳みの代謝産物依存性の変化が、ｍＲＮＡのスプライシングおよびオルタナティブ３’末端プロセシングを調節する機構が明らかとなる。
【００３８】
ＴＰＰリボスイッチは、種々の植物種中に存在し、チアミン代謝遺伝子ＴＨＩＣの３’ＵＴＲ中に存在する。オルタナティブな３’ＵＴＲ長を有するＴＨＩＣ転写物の形成は、リボスイッチ機能に依存し、細胞ＴＰＰレベルの変化に応答してＴＨＩＣ発現のフィードバック調節を媒介する。データは、３’ＵＴＲ長が転写物の安定性と相関し、それにより、オルタナティブ３’末端プロセシングによる遺伝子調節の基盤が確立されることを示す。植物におけるＴＰＰリボスイッチ機能の詳細な機構を示し（実施例１）、この機構は、ＴＨＩＣ  ｍＲＮＡのスプライシングおよび差分的３’末端プロセシングのアプタマー媒介性調節を含む。
【００３９】
植物種Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ、およびＰｏａ  ｓｅｃｕｎｄａ由来のＴＨＩＣ遺伝子の３’ＵＴＲ中に高度に保存されたＴＰＰ結合アプタマーが存在することが、以前に報告されている（Ｓｕｄａｒｓａｎら、２００３）。代表的な植物ＴＰＰアプタマー群（ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を、さらなる植物種由来のＴＨＩＣ遺伝子の配列決定およびＴＰＰアプタマーコンセンサスに従うヌクレオチド配列のデータベース検索の実施によって拡大した。ｃＤＮＡ配列を得た後、各種のゲノムＤＮＡ由来の対応する領域をクローン化し、配列決定し（詳細については、実験手順を参照のこと）、それによって、初期およびプロセシングされたｍＲＮＡ分子の両方の配列が得られる。
【００４０】
植物由来の全ての利用可能なＴＰＰアプタマー配列のアラインメントにより、高レベルのヌクレオチド配列保存およびステムＰ１〜Ｐ５からなる二次構造が明らかとなる（図１Ａ）。植物（図１Ｂ）および糸状菌（Ｃｈｅａｈら、２００７）由来の真核生物ＴＰＰリボスイッチアプタマーをそれらの細菌および古細菌の対応物（図１Ｃ）（Ｗｉｎｋｌｅｒら、２００２；Ｒｏｄｉｏｎｏｖら、２００２）と比較した場合の主な相違点は、代表的な細菌に頻繁に存在するＰ３ａステムが一貫して存在しないこと、および真核細胞におけるＰ３ステムの長さが可変であることである。いずれの領域もＴＰＰ結合に関与せず（ＥｄｗａｒｄｓおよびＦｅｒｒｅ−Ｄ’Ａｍａｒｅ、２００６；Ｓｅｒｇａｎｏｖら、２００６；Ｔｈｏｒｅら、２００６；Ｃｈｅａｈら、２００７）、したがって、これらの相違はリガンド結合特異性に影響を及ぼさないはずである。
【００４１】
ＴＰＰアプタマーは、単子葉植物、双子葉植物、および針葉樹Ｐｉｎｕｓ  ｔａｅｄａ由来の全ての公知のＴＨＩＣの例の３’ＵＴＲ中に見出される。興味深いことに、蘚類Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓでは、ＴＰＰアプタマーはＴＨＩＣの３’ＵＴＲ中に存在し（Ｐｐａ１）、チアミン生合成遺伝子ＴＨＩ４に相同な２つの遺伝子の３’領域中にも存在する（Ｐｐａ２、Ｐｐａ３）。この後者の所見、および真菌が複数の異なる遺伝子に関連するＴＰＰアプタマーも有するという所見（Ｃｈｅａｈら、２００７）は、真核生物が種々の濃度の重要な代謝産物に応答して複数の遺伝子を調節するために同一のリボスイッチクラスのバリアントを使用する可能性が高いことを示す。
【００４２】
植物由来のＴＰＰアプタマーの特筆すべき特徴は、高レベルのヌクレオチド配列保存である。約８０％のヌクレオチド（Ｐ３ステムを除く）が、全ての植物例で保存されている。対照的に、糸状菌では４０％未満しか保存されていない。植物ＴＰＰアプタマー間のほとんどの相違はＰ３ステム中で見出され、長さおよび配列の両方が異なる。また、Ｐ３ステムの長さは、Ｐ．ｐａｔｅｎｓ（図１Ａ）で認められるように、同種の代表的なＴＰＰアプタマー間で異なる。ＴＨＩＣ中の伸長したＰ３ステムおよびＴＨＩ４中の非常に短いＰ３ステムの両方の存在は、このアプタマー成分に種特異的要件が存在しないことを示す。
【００４３】
植物におけるＴＰＰリボスイッチ調節は、ｍＲＮＡ転写物のスプライシングおよびオルタナティブ３’末端プロセシングの代謝産物媒介性調節を含む（図７Ｃ）。細胞中のＴＰＰ濃度が低い場合、アプタマーは、５’スプライス部位と相互作用してスプライシングを防止する。このイントロンは、転写物の切断およびポリアデニル化を可能にする主なプロセシング部位を保有する。この部位由来のプロセシングにより、短い３’ＵＴＲを保有し、且つＴＨＩＣ遺伝子を高発現するＴＨＩＣ−ＩＩ転写物が産生される。
【００４４】
ＴＰＰ濃度が高い場合、アプタマーへのＴＰＰ結合により、５’スプライス部位への対合が防止される。結果として、５’スプライス部位が接近可能となり、主なプロセシング部位を除去するスプライシング事象で使用される。転写は、その後、１ｋｂまで拡大し、下流に存在するプロセシング部位の使用により、はるかに長い３’ＵＴＲを保有するＴＨＩＣ−ＩＩＩ  ＲＮＡが得られる。長い３’ＵＴＲによって転写物分解が増加し、ＴＨＩＣ発現が低減する。以前の研究では、転写の拡大は転写物プロセシングの非存在下で起こり、したがって、これらのプロセスの相互関連性（ｉｎｔｅｒｃｏｎｎｅｃｔｉｖｉｔｙ）が明らかとなったことが示されている（Ｂｕｒａｔｏｗｓｋｉ、２００５；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ、２００４；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔら、２００２）。
【００４５】
ＴＰＰリボスイッチは、米国特許出願公開第２００５−００５３９５１号（その全体が本明細書中で援用され、特に、ＴＴＰリボスイッチの構造、機能、および使用におけるその記載のための参考としても援用される）にも記載されている。米国特許出願公開第２００５−００５３９５１号の任意の主題および記載ならびに、特に、米国特許出願公開第２００５−００５３９５１号のＴＴＰリボスイッチの構造、機能、および使用の任意の記載を、本明細書中に開示の他の主題に含めるか排除することができることを特に意図する。
【００４６】
他で特定しない限り、開示の方法および組成物は、特定の合成方法、特定の分析技術、または特定の試薬に制限されず、それ自体、変化することができると理解するべきである。本明細書中で使用した専門用語は特定の実施形態のみを記載することを目的とし、制限することを意図しないとも理解するべきである。
【００４７】
材料
開示の方法および組成物のために使用することができるか、これらと併せて使用することができるか、これらの調製で使用することができるか、または、これらの生成物である、材料、組成物、および成分を開示する。これらおよび他の材料を本明細書中に開示し、特にこれらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、群などを開示する場合、これらの化合物の種々の個々および集合的組み合わせおよび順列（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）のそれぞれに関する特別な言及は明確に開示できず、それぞれ、本明細書中で具体的に意図および記載されると理解される。例えば、リボスイッチまたはアプタマードメインを開示および考察し、多数の分子（リボスイッチまたはアプタマードメインが含まれる）に作製することができる多数の改変物を考察する場合、それとは反対であると具体的に示されない限り、リボスイッチまたはアプタマードメインおよび可能な改変物の各々および全ての組み合わせおよび順列を特に意図する。したがって、分子Ａ、Ｂ、およびＣのクラスを開示し、ならびに分子Ｄ、Ｅ、およびＦのクラス、および組み合わせ分子の例（Ａ−Ｄ）も開示する場合、各々を個別に引用しない場合でさえも、各々を個別または集合的に意図する。したがって、この例では、Ａ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−Ｅ、およびＣ−Ｆの各組み合わせを特に意図し、Ａ、Ｂ、およびＣ；Ｄ、Ｅ、およびＦ；ならびに組み合わせ例Ａ−Ｄの開示から開示されると見なすべきである。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせも特に意図および開示される。したがって、例えば、Ａ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、およびＣ−Ｅの下位集団（ｓｕｂ−ｇｒｏｕｐ）を特に意図し、Ａ、Ｂ、およびＣ；Ｄ、Ｅ、およびＦ；および組み合わせ例Ａ−Ｄの開示から開示されると見なすべきである。この概念を、本出願の全局面（開示の組成物を作製および使用する方法における工程が含まれるが、これらに限定されない）に適用する。したがって、実施することができる種々のさらなる工程が存在する場合、これらのさらなる工程の各々を開示の方法の任意の特定の実施形態または実施形態の組み合わせを使用して実施することができ、それぞれのかかる組み合わせが特に意図され、開示されると見なすべきであると理解される。
【００４８】
Ａ．リボスイッチ
リボスイッチは、発現するＲＮＡ分子の一部であり、トリガー分子によって結合した場合に状態が変化する発現調節エレメントである。リボスイッチを、典型的には、以下の２つの個別のドメインに分けることができる：１つは標的に選択的に結合するドメイン（アプタマードメイン）および他は遺伝子調節に影響を及ぼすドメイン（発現プラットフォームドメイン）である。遺伝子発現が代謝産物依存性にアロステリック調節されるこれらの２ドメイン間の動的相互作用がもたらされる。単離および組換えリボスイッチ、かかるリボスイッチを含む組換え構築物、かかるリボスイッチに作動可能に連結された非相同配列、かかるリボスイッチを保有する細胞およびトランスジェニック生物、リボスイッチ組換え構築物、ならびに非相同配列に作動可能に連結されたリボスイッチを開示する。非相同配列は、例えば、目的のタンパク質またはペプチド（レポータータンパク質またはペプチドが含まれる）をコードする配列であり得る。好ましいリボスイッチは、天然に存在するリボスイッチであり得るか、これに由来し得る。例えば、アプタマードメインは、天然に存在するリボスイッチのアプタマードメインであり得るか、これに由来し得る。リボスイッチは、人工アプタマーを含むか、任意選択的に排除することができる。例えば、人工アプタマーには、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化および／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択を介してデザインまたは選択されるアプタマーが含まれる。リボスイッチは、天然に存在するリボスイッチのコンセンサス配列を含むことができる。種々のリボスイッチのコンセンサス配列は、米国特許出願公開第２００５−００５３９５１号に記載されている（図１１中など）。植物ＴＰＰ応答性リボスイッチのコンセンサス配列を図１Ｂに示し、特定の例を図１Ａに示す。
【００４９】
コード領域に作動可能に連結されたリボスイッチを含むＲＮＡをコードする核酸分子を含み、リボスイッチがＲＮＡのスプライシングを調節し、リボスイッチおよびコード領域が非相同であり、スプライシングの調節がＲＮＡのプロセシングに影響を及ぼす、調節可能な遺伝子発現構築物を本明細書中に開示する。リボスイッチは、ＲＮＡのオルタナティブスプライシングを調節することができる。リボスイッチは、アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含むことができ、アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインは非相同である。ＲＮＡは、イントロンをさらに含むことができる。リボスイッチは、ＲＮＡの３’非翻訳領域中に存在し得る。イントロンは、ＲＮＡの３’非翻訳領域中に存在し得る。ＲＮＡプロセシング部位は、イントロン中に存在し得る。イントロンのスプライシングによってＲＮＡからＲＮＡプロセシング部位を除去し、それにより、ＲＮＡのプロセシングに影響を及ぼすことができる。ＲＮＡのプロセシングに及ぼされる影響は、ＲＮＡプロセシング部位によって媒介されるＲＮＡのプロセシングの排除を含むことができる。ＲＮＡのプロセシングに及ぼされる影響は、転写終結の変化を含むことができる。ＲＮＡのプロセシングに及ぼされる影響は、ＲＮＡ分解の増加を含むことができる。ＲＮＡのプロセシングに及ぼされる影響は、ＲＮＡターンオーバーの増加を含むことができる。リボスイッチは、イントロンの３’スプライスジャンクションと重複することができる。イントロンのスプライシングにより、リボスイッチが活性化される能力が低減または排除され得る。スプライスジャンクションは、５’スプライスジャンクションであり得る。リボスイッチは、ＲＮＡのイントロン中に存在し得る。ＲＮＡプロセシングは、スプライシングの関与と無関係に、またはこれを使用せずに、調節され得るか影響を受けることもできる。
【００５０】
発現プラットフォームドメインは、イントロン中にスプライスジャンクションを含むことができる。発現プラットフォームドメインは、イントロンの末端にスプライスジャンクションを含むことができる（すなわち、５’スプライスジャンクションまたは３’スプライスジャンクション）。ＲＮＡはイントロンをさらに含むことができ、発現プラットフォームドメインはイントロン中に分岐部位を含む。スプライスジャンクションは、リボスイッチが活性化される場合に活性であり得る。スプライスジャンクションは、リボスイッチが活性化されない場合に活性であり得る。リボスイッチを、トリガー分子（チアミンピロリン酸（ＴＰＰ）など）によって活性化することができる。リボスイッチは、ＴＰＰ応答性リボスイッチであり得る。リボスイッチは、スプライシングを活性化することができる。リボスイッチは、スプライシングを抑制することができる。リボスイッチは、ＲＮＡのスプライシングを変化させることができる。ＲＮＡは、分岐構造を有することができる。ＲＮＡは、ｐｒｅ−ｍＲＮＡであり得る。スプライシング調節を有するアプタマー領域は、例えば、Ｐ４ステムおよびＰ５ステム中に存在し得る。スプライシング調節を有するアプタマー領域は、例えば、ループ５中にも見出すことができる。スプライシング調節を有するアプタマー領域は、例えば、ステムＰ２中にも見出すことができる。したがって、例えば、発現プラットフォームドメインは、Ｐ４およびＰ５配列、ループ５配列、および／またはＰ２配列と相互作用することができる。かかるアプタマー配列は、一般に、トリガー分子がアプタマードメインに結合しない場合に限り、発現プラットフォームドメインとの相互作用に利用可能であり得る。スプライス部位および／または分岐部位は、例えば、アプタマーの５’末端に対して−１３０と−１６０との間の位置に存在することができる。ＲＮＡは、第２のイントロンをさらに含むことができ、第２のイントロンの３’スプライス部位は、アプタマードメインの５’末端に対して−２２０と−２７０との間の位置に存在する。
【００５１】
ＲＮＡのプロセシングに影響を及ぼす方法であって、ＲＮＡにリボスイッチを含む構築物を導入する工程であって、リボスイッチがＲＮＡのスプライシングを調節することができ、ＲＮＡがイントロンを含み、スプライシングの調節がＲＮＡのプロセシングに影響を及ぼす、導入工程を含む方法も開示する。リボスイッチは、アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含むことができ、アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインは、非相同である。リボスイッチは、ＲＮＡのイントロン中に存在し得る。リボスイッチを、トリガー分子（ＴＰＰなど）によって活性化することができる。リボスイッチは、ＴＰＰ応答性リボスイッチであり得る。リボスイッチは、スプライシングを活性化することができる。リボスイッチは、スプライシングを抑制することができる。リボスイッチは、ＲＮＡのスプライシングを変化させることができる。スプライシングは、非天然に起こり得る。スプライシング調節を有するアプタマー領域は、例えば、ループ５中に見出すことができる。スプライシング調節を有するアプタマー領域は、例えば、ステムＰ２中にも見出すこともできる。スプライス部位は、例えば、アプタマーの５’末端に対して−１３０と−１６０との間の位置に存在することができる。構築物は、イントロンをさらに含むことができる。
【００５２】
（ａ）コード領域に作動可能に連結されたリボスイッチを含むＲＮＡをコードする核酸分子を含む構築物を含む細胞であって、リボスイッチがＲＮＡのスプライシングを調節し、リボスイッチおよびコード領域が非相同であり、スプライシングの調節がＲＮＡのプロセシングに影響を及ぼす、細胞と、（ｂ）有効量のリボスイッチのトリガー分子とを接触させ、それにより、遺伝子発現に影響を及ぼす、遺伝子発現に影響を及ぼす方法も開示する。リボスイッチは、ＴＰＰ応答性リボスイッチであり得る。トリガー分子は、チアミンまたはＴＰＰであり得る。
【００５３】
リボスイッチは、ＲＮＡのスプライシングを変化させることができる。例えば、リボスイッチの活性化により、スプライシングを許容するか促進し、オルタナティブスプライシングを許容するか促進し、スプライシングもしくは優勢スプライシング（ｐｒｅｄｏｍｉｎａｔｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ）を防止または低減させ、オルタナティブスプライシングを防止または低減させ、またはスプライシングもしくは優勢スプライシングを許容するか促進することができる。他の例として、非活性化されたリボスイッチまたはリボスイッチの非活性化により、オルタナティブスプライシングを許容するか促進し、スプライシングもしくは優勢スプライシングを防止または低減させ、オルタナティブスプライシングを防止または低減させ、またはスプライシングもしくは優勢スプライシングを許容または促進することができる。一般に、スプライシング調節形態を、ＲＮＡ分子中のスプライスジャンクション、オルタナティブスプライスジャンクション、および分岐部位に対するリボスイッチの物理的関係によって決定することができる。例えば、リボスイッチの活性化／非活性化は、一般に、ＲＮＡ中のオルタナティブな二次構造（例えば、塩基対合ステム）の形成および／または破壊を含み、この構造の変化を使用して、機能的ＲＮＡ配列を隠すか露出することができる。リボスイッチの発現プラットフォームドメインは、一般に、かかる機能的ＲＮＡ配列を含む。したがって、例えば、リボスイッチが活性化または非活性化されるかその逆となるようにスプライスジャンクションまたは分岐部位が交互に隠されるか露出するような方法で、リボスイッチの発現プラットフォームドメイン中にスプライスジャンクションまたは分岐部位を含めることにより、ＲＮＡのスプライシングを調節するか影響を及ぼすことができる。
【００５４】
スプライシングの調節により、スプライシングが調節されるＲＮＡのプロセシングに影響を及ぼすことができる。例えば、ＲＮＡ中のイントロンは、ＲＮＡプロセシングシグナルまたはＲＮＡプロセシング部位を含むことができる。ＲＮＡのスプライシングにより、プロセシングシグナルまたはプロセシング部位を排除することができる。例えば、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ中の転写終結シグナルまたはＲＮＡ切断部位が、ＲＮＡからスプライスされるイントロン中に存在する場合、これをＲＮＡから欠失することができる。したがって、本明細書中に記載のリボスイッチによるそのイントロンのスプライシングの調節は、ＲＮＡのプロセシングに影響を及ぼし得る。別の例として、ＲＮＡプロセシングシグナルまたはＲＮＡプロセシング部位を、ＲＮＡプロセシング系のイントロンまたは異なるエレメントのスプライシングによって作製することができ、シグナルまたは部位を、イントロンのスプライシングによって作動可能な配置にするかそこから解除することができる。別の例として、ＲＮＡプロセシングシグナルまたはＲＮＡプロセシング部位を、ＲＮＡの他のエレメントと作動可能に近接させるかそこから解除することができる。
【００５５】
スプライシングの調節による媒介を用いずに、リボスイッチによってＲＮＡプロセシングに直接的に影響を及ぼすこともできる。例えば、ＲＮＡプロセシングシグナルまたはＲＮＡプロセシング部位は、リボスイッチの発現プラットフォームドメイン中に存在し得る。この方法では、リボスイッチの活性化による発現プラットフォームの（およびそれによるＲＮＡプロセシングシグナルまたはＲＮＡプロセシング部位の）構造上の関係の変化により、ＲＮＡプロセシングシグナルまたはＲＮＡプロセシング部位が操作する能力に影響を及ぼすことによってプロセシングに影響を及ぼすことができる。
【００５６】
リボスイッチは、ＲＮＡプロセシングに影響を及ぼすことができる。「ＲＮＡプロセシングに影響を及ぼす」は、リボスイッチが、ＲＮＡに対してＲＮＡプロセシングを引き起こすことを可能にするか、刺激するか、低減させるか、防止するように直接または間接的に（例えば、スプライシングの調節によって）作用することができることを意味する。これは、例えば、任意のプロセシングを引き起こすことを可能にすることを含むことができる。これにより、リボスイッチを使用せずに起こるプロセシング事象数と比較して、プロセシングを１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％またはそれを超えて増加または低減させることができる。
【００５７】
ＲＮＡプロセシングは、例えば、転写終結、ＲＮＡの３’末端の形成、ポリアデニル化、およびＲＮＡの分解またはターンオーバーを含むことができる。本明細書中で使用する場合、ＲＮＡプロセシングシグナルまたはＲＮＡプロセシング部位は、ＲＮＡプロセシングの事象または条件を媒介するか、シグナル伝達するか、そのために必要とされる配列、構造、または位置である。例えば、一定の配列または構造は、転写終結、ＲＮＡ切断、またはポリアデニル化をシグナル伝達することができる。
【００５８】
リボスイッチは、スプライシングを活性化または抑制することができる。「スプライシングを活性化する」は、リボスイッチが直接的または間接的のいずれかでＲＮＡに作用してスプライシングを起こさせることを意味する。これは、例えば、任意のスプライシングを起こさせること（スプライスなしに対する１つのスプライスなど）またはオルタナティブスプライシングを起こさせることを含み得る。これは、リボスイッチなしで起こるスプライシング事象数と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％またはそれを超えるスプライシングを増加することができる。
【００５９】
「スプライシングを抑制する」は、リボスイッチが直接的または間接的のいずれかでＲＮＡに作用してスプライシングを抑制することを意味する。これは、例えば、任意のスプライシングの開始防止またはスプライシングの開始の減少（１つのスプライスに対するスプライスなしなど）またはオルタナティブスプライシングの開始の防止または減少を含み得る。これは、リボスイッチなしで起こるオルタナティブスプライシング事象数と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％のオルタナティブスプライシングを減少させることができる。
【００６０】
リボスイッチは、オルタナティブスプライシングを活性化または抑制することができる。「オルタナティブスプライシングを活性化する」は、リボスイッチが直接的または間接的のいずれかでＲＮＡに作用してオルタナティブスプライシングを起こさせることを意味する。これは、リボスイッチなしで起こるオルタナティブスプライシング事象数と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％またはそれを超えるオルタナティブスプライシングを増加することができる。
【００６１】
「オルタナティブスプライシングを抑制する」は、リボスイッチが直接的または間接的のいずれかでＲＮＡに作用してオルタナティブスプライシングを抑制することを意味する。これは、リボスイッチなしで起こるオルタナティブスプライシング事象数と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％のオルタナティブスプライシングを減少させることができる。
【００６２】
リボスイッチは、ＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現に影響を及ぼすことができる。例えば、スプライシングまたはオルタナティブスプライシングの調節により、ＲＮＡが翻訳される能力に影響を与え得、コード領域を変化させる、または翻訳の開始または終結を変化させることができる。オルタナティブスプライシングは、例えば、開始コドンまたは終止コドン（または両方）を通常はプロセシングした転写物中に存在しないプロセシングした転写物中に出現させることができる。別の例として、オルタナティブスプライシングにより、通常の開始コドンまたは終止コドンを、プロセシングした転写物から除去することができる。ＲＮＡによってコードされたタンパク質発現を調節するためのリボスイッチ調節スプライシングの有用な使用様式は、リボスイッチをＲＮＡの５’非翻訳領域中のイントロンに導入し、イントロン中の開始コドンがオルタナティブスプライシングされたＲＮＡ中の第１の開始コドンであるようにイントロン中に開始コドンを含めるかこれを使用することである。ＲＮＡによってコードされたタンパク質発現を調節するためのリボスイッチ調節スプライシングの別の有用な使用様式は、リボスイッチをＲＮＡの５’非翻訳領域中のイントロンに導入し、読み取り枠がオルタナティブスプライシングされたＲＮＡ中に最初に出現するようにイントロン中に短い読み取り枠を含めるかこれを使用することである。
【００６３】
ＲＮＡ分子は、分岐構造を有することができる。例えば、真菌のＴＰＰリボスイッチでは（Ｃｈｅａｈ  ２００７）、ＴＰＰ濃度が低い場合、新規に転写されたｍＲＮＡは第２の５’スプライス部位を塞ぐ構造を採用する一方で、スプライシングに利用可能な分岐部位を遊離する。５’スプライス部位由来のｐｒｅ−ｍＲＮＡスプライシングにより、ｍＲＮＡのＩ−３形態が産生され、ＮＭＴ１タンパク質が発現される。ＴＰＰ濃度が高い場合、ＴＰＰアプタマーへのリガンド結合により、ＲＮＡ折り畳みがアロステリックに変化して第２の５’スプライス部位付近の構造可塑性が増加し、分岐部位付近のヌクレオチドが塞がれる。
【００６４】
開示のリボスイッチ（その誘導体および組換え形態が含まれる）は、一般に、任意の供給源（天然に存在するリボスイッチおよびｄｅ  ｎｏｖｏでデザインしたリボスイッチが含まれる）に由来し得る。任意のかかるリボスイッチは、これらがオルタナティブスプライシングを調節すると決定されている限り、開示の方法で使用するか開示の方法と共に使用することができる。しかし、異なるリボスイッチ型を定義することができ、いくつかのかかるサブタイプは、特定の方法で有用であるか、特定の方法と共に有用であり得る（一般に、本明細書中の他所に記載）。リボスイッチ型には、例えば、天然に存在するリボスイッチ、天然に存在するリボスイッチの誘導体および改変形態、キメラリボスイッチ、および組換えリボスイッチが含まれる。天然に存在するリボスイッチは、天然で見出されるリボスイッチの配列を有するリボスイッチである。かかる天然に存在するリボスイッチは、天然で起こる天然に存在するリボスイッチの単離形態または組換え形態であり得る。すなわち、リボスイッチは、同一の一次構造を有するが、新規の遺伝子または核酸状況で単離または操作されている。キメラリボスイッチを、例えば、任意のリボスイッチのまたは特定のクラスもしくは型のリボスイッチのリボスイッチの一部および同一のリボスイッチのまたは任意の異なるクラスもしくは型のリボスイッチの異なるリボスイッチの一部；任意のリボスイッチのまたは特定のクラスもしくは型のリボスイッチのリボスイッチの一部および任意の非リボスイッチ配列または成分で構成することができる。組換えリボスイッチは、新規の遺伝子または核酸状況で単離または操作されているリボスイッチである。
【００６５】
リボスイッチは、１つまたは複数のアプタマードメインを有することができる。複数のアプタマードメインを有するリボスイッチ中のアプタマードメインは、トリガー分子の協同的結合を示すことができるか、トリガー分子の協同的結合を示すことができない（すなわち、アプタマーは協同的結合を示す必要がない）。後者の場合、アプタマードメインは、非依存性結合剤であるということができる。複数のアプタマーを有するリボスイッチは、１つまたは複数の発現プラットフォームドメインを有することができる。例えば、トリガー分子の協同的結合を示す２つのアプタマードメインを有するリボスイッチを、両方のアプタマードメインによって調節される１つの発現プラットフォームドメインに連結することができる。複数のアプタマーを有するリボスイッチは、リンカーを介して結合した１つまたは複数のアプタマーを有することができる。かかるアプタマーがトリガー分子の協同的結合を示す場合、リンカーは協同的リンカーであり得る。
【００６６】
ｘとｘ−１との間のヒル係数ｎを有する場合（ｘは、協同的結合について分析されるアプタマードメイン数（またはアプタマードメイン上の結合部位数）である）、アプタマードメインは協同的結合を示すということができる。したがって、例えば、リボスイッチが２と１との間のヒル係数を有する場合、２つのアプタマードメインを有するリボスイッチ（グリシン応答性リボスイッチなど）は協同的結合を示すということができる。使用した値ｘが協同的結合について分析したアプタマードメイン数（必ずしもリボスイッチ中のアプタマードメインの存在数ではない）に依存すると理解すべきである。一部のみしか協同的結合を示さない場合にリボスイッチが複数のアプタマードメインを有することができるので、これは理解される。
【００６７】
非相同アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含むキメラリボスイッチを開示する。すなわち、キメラリボスイッチは、ある供給源由来のアプタマードメインおよび別の供給源由来の発現プラットフォームドメインから構成される。非相同供給源は、例えば、異なる特異的リボスイッチ、異なるリボスイッチ型、または異なるリボスイッチクラスに由来し得る。非相同アプタマーは、非リボスイッチアプタマーにも由来し得る。非相同発現プラットフォームドメインは、非リボスイッチ供給源にも由来し得る。
【００６８】
改変リボスイッチまたは誘導体リボスイッチを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択および進化技術を使用して産生することができる。一般に、リボスイッチに適用されるｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化技術は、リボスイッチ配列の一部が変化している一方で、リボスイッチの他の部分が一定に保持されている改変（ｖａｒｉａｎｔ）リボスイッチ組の産生を含む。次いで、改変リボスイッチ組の活性化、非活性化、または遮断（または他の機能的もしくは構造的基準）を評価することができ、目的の基準を満たす改変リボスイッチを使用またはさらなる進化ラウンドのために選択する。改変体生成に有用な基盤リボスイッチは、本明細書中に開示の特異的およびコンセンサスリボスイッチである。コンセンサスリボスイッチを使用して、どのリボスイッチ部分がｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択および進化のために変化するかについての情報を提供することができる。植物ＴＰＰ応答性リボスイッチのコンセンサス配列を図１Ｂに示す。
【００６９】
調節が変化した改変リボスイッチも開示する。リボスイッチの調節を、リボスイッチ（キメラリボスイッチである）の発現プラットフォームドメインへのアプタマードメインの作動可能な連結によって変化させることができる。次いで、アプタマードメインは、例えば、アプタマードメインのためのトリガー分子の作用によってリボスイッチの調節を媒介することができる。アプタマードメインを、任意の適切な様式で（例えば、リボスイッチの通常または天然のアプタマードメインの新規のアプタマードメインとの置換によるものが含まれる）、リボスイッチの発現プラットフォームドメインに作動可能に連結することができる。一般に、アプタマードメインが由来するリボスイッチを活性化、誘導体化、または遮断することができる任意の化合物または条件を使用して、キメラリボスイッチを活性化、誘導体化、または遮断することができる。
【００７０】
不活化リボスイッチも開示する。リボスイッチの共有結合の変化（例えば、リボスイッチの一部の架橋または化合物のリボスイッチへのカップリング）によってリボスイッチを不活化することができる。この様式でのリボスイッチの不活化は、例えば、リボスイッチに対しトリガー分子の結合を防止するか、トリガー分子の結合の際にリボスイッチの状態の変化を防止するか、リボスイッチの発現プラットフォームドメインがトリガー分子の結合の際に発現に影響を及ぼすのを防止する変化に起因し得る。
【００７１】
バイオセンサーリボスイッチも開示する。バイオセンサーリボスイッチは、その同系のトリガー分子の存在下で検出可能なシグナルを産生する操作リボスイッチである。有用なバイオセンサーリボスイッチを、閾値レベルまたは閾値レベルを超えるトリガー分子で誘発することができる。バイオセンサーリボスイッチを、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの使用のためにデザインすることができる。例えば、シグナルとしての機能を果たすかシグナル産生に関与するタンパク質をコードするレポーターＲＮＡに作動可能に連結されたバイオセンサーリボスイッチを、細胞または生物にリボスイッチ／レポーターＲＮＡをコードする核酸構築物を保有させるように操作することによってｉｎ  ｖｉｖｏで使用することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用するバイオセンサーリボスイッチの例は、高次構造依存性標識（リボスイッチの活性化状態に応じて変化するシグナル）を含むリボスイッチである。かかるバイオセンサーリボスイッチは、好ましくは、天然に存在するリボスイッチからの或いはそれに由来するアプタマードメインを使用する。バイオセンサーリボスイッチを、種々の状況およびプラットフォームで使用することができる。例えば、バイオセンサーリボスイッチを、固体支持体（プレート、チップ、ストリップ、およびウェルなど）と共に使用することができる。
【００７２】
新規のトリガー分子を認識する改変リボスイッチまたは誘導体リボスイッチも開示する。新規のトリガー分子を認識する新規のリボスイッチおよび／または新規のアプタマーを、公知のリボスイッチのために選択するか、公知のリボスイッチからデザインするか、公知のリボスイッチから誘導することができる。例えば、リボスイッチ中のアプタマー改変体組を産生する工程、目的の化合物の存在下での改変リボスイッチの活性化を評価する工程、活性化された改変リボスイッチ（または、例えば、最高にまたは最も選択的に活性化されたリボスイッチ）の選択、および所望の活性、特異性、活性と特異性との組み合わせ、または特性の他の組み合わせの改変リボスイッチが得られるまでこれらの工程を繰り返すことによってこれを行うことができる。
【００７３】
一般に、発現プラットフォームドメイン中の調節された鎖をアプタマードメインの調節鎖に相補的であるようにデザインまたは適合させることによって、任意のアプタマードメインを任意の発現プラットフォームドメインと共に使用するために適合させることができる。あるいは、調節鎖が発現プラットフォーム中の機能的に重要な配列に相補的であるように、アプタマーの配列およびアプタマードメインの調節鎖を適合させることができる。
【００７４】
非相同リボスイッチおよびコード領域を含むＲＮＡ分子を開示する。すなわち、かかるＲＮＡ分子は、ある供給源由来のリボスイッチおよび別の供給源由来のコード領域から構成される。非相同供給源は、例えば、異なるＲＮＡ分子、異なる転写物、異なる遺伝子由来のＲＮＡまたは転写物、異なる細胞由来のＲＮＡまたは転写物、異なる生物由来のＲＮＡまたは転写物、異なる種由来のＲＮＡまたは転写物、天然の配列および人工または操作された配列、特異的リボスイッチ、異なるリボスイッチ型、または異なるリボスイッチクラスに由来し得る。
【００７５】
本明細書中に開示する場合、用語「コード領域」は、アミノ酸をコードする核酸の任意の領域をいう。これは、コドンまたはコドンのテンプレートを含む核酸鎖および二本鎖核酸分子の場合のかかる核酸鎖の相補物の両方を含むことができる。コード領域でない核酸領域を、非コード領域ということができる。転写される伝令ＲＮＡ分子は、典型的には、５’末端および３’末端の両方に非コード領域を含む。真核生物ｍＲＮＡ分子は、イントロンなどの内部非コード領域も含むことができる。いくつかのＲＮＡ分子型は、ｔＲＮＡ分子およびｒＲＮＡ分子などの機能的コード領域を含まない。
【００７６】
１．アプタマードメイン
アプタマーは、特定の化合物および化合物クラスに選択的に結合することができる核酸セグメントおよび構造である。リボスイッチは、トリガー分子の結合の際にリボスイッチの状態または構造が変化するアプタマードメインを有する。機能的リボスイッチでは、アプタマードメインに連結した発現プラットフォームドメインの状態または構造は、トリガー分子がアプタマードメインに結合した場合に変化する。リボスイッチのアプタマードメインは、任意の供給源（例えば、天然リボスイッチのアプタマードメイン、人工アプタマー、操作された、選択された、進化した、または誘導されたアプタマーまたはアプタマードメインが含まれる）に由来し得る。リボスイッチ中のアプタマーは、一般に、ステム構造の形成などによって連結した発現プラットフォームドメイン部分と相互作用することができる少なくとも１つの部分を有する。このステム構造は、トリガー分子の結合の際に形成されるか破壊されるかのいずれかである。
【００７７】
種々の天然リボスイッチのコンセンサスアプタマードメインを、米国特許出願公開第２００５−００５３９５１号の図１１および本明細書中の他所に示す。これらのアプタマードメイン（本明細書中に具体化された全てのダイレクト改変体（ｄｉｒｅｃｔ  ｖａｒｉａｎｔ）が含まれる）を、リボスイッチ中で使用することができる。コンセンサス配列および構造は、配列および構造の変形を示す。示した変形内のアプタマードメインを本明細書中でダイレクト改変体という。これらのアプタマードメインを、改変（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）または改変（ｖａｒｉａｎｔ）アプタマードメインが産生されるように改変することができる。保存的改変には、対の中のヌクレオチドが相補性を維持するような塩基対合ヌクレオチドの任意の変化が含まれる。中等度の改変には、示した長さ範囲の２０％以下のまたは等しい（長さまたは長さの範囲を示す）ステムまたはループの長さの変化が含まれる。コンセンサス構造が特定の長さのステムまたはループを示す場合、または、長さの範囲が列挙または表示される場合、ループおよびステムの長さを、「示す」と見なす。中等度の改変には、示した長さ範囲の４０％以下のまたは等しい（長さまたは長さの範囲を示さない）ステムまたはループの長さの変化が含まれる。中等度の改変には、アプタマードメインの非特定部分の機能的改変体も含まれる。
【００７８】
開示のリボスイッチのアプタマードメインを、任意の他の目的、および任意の他の状況のためにアプタマーとして使用することもできる。例えば、アプタマーを使用して、リボザイム、他の分子スイッチ、および構造の変化がＲＮＡの機能に影響を及ぼし得る任意のＲＮＡ分子を調節することができる。
【００７９】
２．発現プラットフォームドメイン
発現プラットフォームドメインは、リボスイッチを含むＲＮＡ分子の発現に影響を及ぼすリボスイッチの一部である。発現プラットフォームドメインは、一般に、ステム構造の形成などによって連結したアプタマードメインの一部と相互作用することができる少なくとも１つの部分を有する。このステム構造は、トリガー分子の結合の際に形成されるか破壊されるかのいずれかである。ステム構造は、一般に、発現調節構造を形成するか、これの形成を防止するかのいずれかである。発現調節構造は、構造を含むＲＮＡ分子の発現を許容するか、防止するか、増強するか、阻害する構造である。例には、シャイン−ダルガノ配列、開始コドン、転写ターミネーター、および安定性シグナル（ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｓｉｇｎａｌ）、ならびにプロセシングシグナル（ＲＮＡスプライシングジャンクションおよび調節エレメントまたはポリアデニル化シグナルおよび３’末端シグナルなど）が含まれる。スプライシングの調節のために、発現プラットフォームドメイン中にスプライスジャンクション、オルタナティブスプライスジャンクション、および／またはイントロンの分岐部位を含めることが有用である。リボスイッチのアプタマードメイン中の配列とのかかるプラットフォーム発現ドメインの相互作用を、発現プラットフォームドメインとアプタマードメインとの間の相補配列によって媒介することができる。
【００８０】
Ｂ．調節構築物
本明細書中の他の場所に記載のように、リボスイッチを使用して、ＲＮＡ分子の発現を調節し、影響を及ぼすことができる。発現プラットフォームドメインを、かかる制御および調節を可能にするか、媒介するか、容易にするように作動可能に連結することができる。発現プラットフォームドメイン配列中、その周辺、またはこれと共に特定の配列および構造を組み合わせることが有用であり得る。例えば、開示のＴＰＰリボスイッチは、ＲＮＡの３’ＵＴＲ中に存在し、且つ３’ＵＴＲ中のイントロンと会合することができる。これらの配列の組み合わせを、リボスイッチ調節構築物または調節構築物ということができる。これに関連して、調節構築物は、リボスイッチ（アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインから構成される）、調節イントロン（発現プラットフォームドメインおよびアプタマードメインの一部を含むことができる）、および他のエクソン３’ＵＴＲ配列を含むことができる。エクソン３’ＵＴＲ配列は、リボスイッチ由来の配列を含んでいても含んでいなくてもよい。これは、例えば、リボスイッチおよび調節構築物のデザイン、イントロンのスプライシングが起こるかどうか、またはどのようにしてＲＮＡプロセシングが影響を受けるのかに依存し得る。便宜上、選択肢の１つ、すなわちＲＮＡの活性なおよび／または支配的な形態中の３’ＵＴＲ配列を、活性な３’ＵＴＲ配列ということができる。例として、ＴＨＩＣ  ＲＮＡの形態ＩＩ中の３’ＵＴＲ配列は、これらのＲＮＡの活性な３’ＵＴＲ配列である。開示のリボスイッチおよび構築物はＲＮＡプロセシングを調節して影響を及ぼすことができるので、調節構築物は、リボスイッチ、イントロン、または活性な３’ＵＴＲ配列の一部ではない他の配列を含むこともできる。例えば、開示のＴＨＩＣ  ＲＮＡは、活性な３’ＵＴＲ配列の３’末端配列とリボスイッチのアプタマードメインとの間の配列を含む（図８を参照のこと）。かかる配列を、スペーサー３’ＵＴＲ配列ということができる。
【００８１】
開示の構築物およびＲＮＡは、リボスイッチ、イントロン、活性な３’ＵＴＲ配列、およびスペーサー３’ＵＴＲ配列を含むことができる。上記および本明細書中の他の場所に記載のように、これらのエレメントおよび配列のいくつかは重複し得る。かかる構築物の例を、実施例１に記載し、図８に示す。図８は、かかる調節構築物の天然に存在する形態の例を示す。同一の天然に存在する調節構築物由来のリボスイッチ、イントロン、活性な３’ＵＴＲ配列、およびスペーサー３’ＵＴＲ配列を使用することが有用である。したがって、例えば、天然に存在する遺伝子中の終止コドンからリボスイッチの３’末端までの全領域を、非相同コード配列に作動可能に連結された調節構築物中で共に使用することができる。かかる構築物の例を実施例１に記載する。あるいは、異なる調節構築物由来の異なる配列を置換することができるか、異なるか誘導されたリボスイッチまたはアプタマードメインを、他のイントロン、活性な３’ＵＴＲ配列、および／またはスペーサー３’ＵＴＲ配列と組み合わせることができる。例えば、コンセンサスまたは誘導されたアプタマードメインを、調節構築物中で使用することができる。
【００８２】
Ｃ．トリガー分子
トリガー分子は、リボスイッチを活性化することができる分子および化合物である。これには、リボスイッチの天然または通常のトリガー分子およびリボスイッチを活性化することができる他の化合物が含まれる。天然または通常のトリガー分子は、所与の天然のリボスイッチのためのトリガー分子であるかまたはいくつかの非天然リボスイッチの場合、リボスイッチがデザインされるためのトリガー分子か、それと共にリボスイッチが選択される（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択技術またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化技術など）トリガー分子である。
【００８３】
Ｄ．化合物
リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断することができる化合物およびかかる化合物を含む組成物も開示する。リボスイッチは、トリガー分子の結合または除去によって遺伝子発現を調節するように機能する。化合物を使用して、リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断することができる。リボスイッチのトリガー分子（ならびに他の活性化化合物）を使用して、リボスイッチを活性化することができる。トリガー分子以外の化合物を使用して、一般に、リボスイッチを非活性化または遮断することができる。リボスイッチを、例えば、リボスイッチの存在からのトリガー分子の除去によって非活性化することもできる。リボスイッチを、例えば、リボスイッチを活性化しないトリガー分子のアナログの結合によって遮断することができる。
【００８４】
ＲＮＡ分子（ＲＮＡのスプライシングまたはプロセシングの変化などによる）またはＲＮＡ分子（ＲＮＡ分子はリボスイッチを含む）をコードする遺伝子の発現を変化させるための化合物も開示する。化合物のＲＮＡ分子との接触によってこれを行うことができる。リボスイッチは、トリガー分子の結合または除去によって遺伝子発現を調節するように機能する。したがって、リボスイッチを含む目的のＲＮＡ分子を、リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断する条件に供して、ＲＮＡの発現を変化させるために用いることができる（ＲＮＡのスプライシングまたはプロセシングの変化などによる）。例えば、転写の終結またはＲＮＡへのリボゾーム結合遮断の結果として発現を変化させることができる。トリガー分子の結合は、リボスイッチの性質に応じて、ＲＮＡ分子の発現を減少または防止することができるか、ＲＮＡ分子の発現を促進または増加することができる。
ＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子をコードする遺伝子の発現を調節するための化合物も開示する。リボスイッチの活性化、非活性化、または遮断によってリボスイッチを含む天然に存在する遺伝子またはＲＮＡの発現を調節するための化合物も開示する。遺伝子がこの遺伝子を保有する細胞または生物の生存に不可欠である場合、リボスイッチの活性化、非活性化、または遮断により、細胞または生物が死滅、静止、または衰弱し得る。
【００８５】
リボスイッチの活性化、非活性化、または遮断によってリボスイッチを含む単離遺伝子、操作遺伝子、もしくは組換え遺伝子またはＲＮＡの発現を調節するための化合物も開示する。本明細書中に開示のリボスイッチがオルタナティブスプライシング、活性化、非活性化、または遮断を調節するので、リボスイッチは遺伝子発現を調節することができる。かかる調節（ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）の一次調節（ｃｏｎｔｒｏｌ）としてのリボスイッチの利点は、リボスイッチトリガー分子が小さな非抗原性分子であり得ることである。
【００８６】
リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断する化合物を同定する方法も開示する。例えば、リボスイッチを活性化する化合物を、試験化合物とリボスイッチとの接触させる工程およびリボスイッチの活性化を評価する工程によって同定することができる。リボスイッチが活性化される場合、試験化合物を、リボスイッチを活性化する化合物と同定する。リボスイッチの活性化を、任意の適切な様式で評価することができる。例えば、リボスイッチをレポーターＲＮＡに連結することができ、レポーターＲＮＡの発現、発現レベル、または発現レベルの変化を、試験化合物の存在下および非存在下で測定することができる。別の例として、リボスイッチは、高次構造依存性標識（リボスイッチの活性化状態に応じて変化するシグナル）を含むことができる。かかるリボスイッチは、好ましくは、天然に存在するリボスイッチに由来するか、これから誘導するアプタマードメインを使用する。認められるように、調節アッセイまたは測定を使用するか調節アッセイまたは測定を使用しないで、リボスイッチの活性化を評価することができる。
【００８７】
リボスイッチを非活性化する化合物の同定方法を、類似の方法で行うことができる。リボスイッチを遮断する化合物の同定を、任意の適切な様式で行うことができる。例えば、リボスイッチを活性化または非活性化することが公知の化合物の存在下および試験化合物の存在下でリボスイッチの活性化または非活性化を評価するためのアッセイを行うことができる。試験化合物の非存在下で観察されるように活性化または非活性化が認められない場合、試験化合物を、リボスイッチの活性化または非活性化を遮断する化合物と同定する。
【００８８】
リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断する化合物の同定および同定された化合物の製造によって作製された化合物も開示する。例えば、本明細書中の他所に開示の化合物同定方法と同定された化合物の製造方法との組み合わせにより、これを行うことができる。例えば、試験化合物とリボスイッチとの接触、リボスイッチの活性化の評価、および試験化合物によってリボスイッチが活性化された場合の化合物としてのリボスイッチを活性化する試験化合物の製造によって化合物を作製することができる。
【００８９】
化合物によるリボスイッチの活性化、非活性化、または遮断のチェックおよびチェックした化合物の製造によって作製された化合物も開示する。例えば、本明細書中の他所に開示の化合物の活性化、非活性化、または遮断評価方法とチェックした化合物の製造方法との組み合わせによってこれを行うことができる。例えば、試験化合物とリボスイッチとの接触、リボスイッチの活性化の評価、および試験化合物によってリボスイッチが活性化された場合の化合物としてのリボスイッチを活性化する試験化合物の製造によって化合物を作製することができる。化合物がリボスイッチを活性化、非活性化、または遮断する能力についての化合物のチェックは、リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断することを以前には知られていない化合物の同定および化合物がリボスイッチを活性化、非活性化、または遮断することが既に知られていた場合のリボスイッチを活性化、非活性化、または遮断する化合物の能力の評価の両方をいう。
【００９０】
リボスイッチを活性化するために使用することができる特異的化合物も開示する。ＴＰＰ応答性リボスイッチにとって有用な化合物には、式：
【００９１】
【化４】
2010528616.tif 000014
（式中、化合物はＴＰＰ応答性リボスイッチまたはその誘導体に結合することができ、Ｒ１は正電荷であり、Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、Ｃ、Ｏ、またはＳであり、Ｒ４は、ＣＨ３、ＮＨ２、ＯＨ、ＳＨ、Ｈであるか、存在せず、Ｒ５は、ＣＨ３、ＮＨ２、ＯＨ、ＳＨ、またはＨであり、Ｒ６はＣまたはＮであり、
【００９２】
【化５】
2010528616.tif 000015
は、それぞれ独立して、単結合または二重結合を示す）を有する化合物が含まれる。Ｒ１がホスフェート、ジホスフェート、またはトリホスフェートである上記定義の化合物も意図する。
【００９３】
上記定義内のあらゆる化合物は、本明細書中に具体的に開示されていることを意図するか、見なされるべきである。さらに、上記定義内で同定することができるあらゆる下位集団は、本明細書中に具体的に開示されていることを意図するか、見なされるべきである。結果として、任意の化合物または化合物の下位集団が特に使用のために含まれるか使用から排除されるか、化合物リスト中に含まれるか化合物リストから排除されることを特に意図する。例えば、１つの選択肢として、各化合物が上記のように定義されるが、ＴＰＰ、ＴＰ、またはチアミンではない化合物群が意図される。別の例として、各化合物が上記のように定義され、且つＴＰＰ応答性リボスイッチを活性化することができる化合物群が意図される。チアミンピロリン酸（ＴＰＰ）は、ＴＰＰ応答性リボスイッチのトリガー分子であり、ＴＰＰ応答性リボスイッチを活性化することができる。ピリチアミンピロリン酸は、ＴＰＰ応答性リボスイッチを活性化することができる。ピリチアミンおよびピリチアミンピロリン酸を、本明細書中に開示の化合物、トリガー分子、および方法に独立して且つ具体的に含めるか排除することができる。チアミンおよびチアミンピロリン酸を、本明細書中に開示の化合物、トリガー分子、および方法に独立して且つ具体的に含めるか排除することができる。
【００９４】
Ｅ．構築物、ベクター、および発現系
開示のリボスイッチを、任意の適切な発現系と共に使用することができる。組換え発現を、通常、プラスミドなどのベクターを使用して行う。ベクターは、リボスイッチコード配列および発現するＲＮＡ（例えば、タンパク質をコードするＲＮＡ）に作動可能に連結されたプロモーターを含むことができる。ベクターはまた、転写および翻訳に必要な他のエレメントを含むことができる。本明細書中で使用する場合、ベクターは、外因性ＤＮＡを含む任意のキャリアをいう。したがって、ベクターは、分解することなく細胞に外因性核酸を輸送する作用物質（ａｇｅｎｔ）であり、送達された細胞中で核酸を発現させるプロモーターを含む。ベクターには、プラスミド、ウイルス核酸、ウイルス、ファージ核酸、ファージ、コスミド、および人工染色体が含まれるが、これらに限定されない。リボスイッチ調節構築物の輸送に適切な種々の原核生物および真核生物発現ベクターを産生することができる。かかる発現ベクターには、例えば、ｐＥＴ、ｐＥＴ３ｄ、ｐＣＲ２．１、ｐＢＡＤ、ｐＵＣ、および酵母ベクターが含まれる。ベクターを、例えば、種々のｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ状況で使用することができる。
【００９５】
ウイルスベクターには、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、ＡＩＤＳウイルス、神経向性ウイルス（ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｔｒｏｐｈｉｃ  ｖｉｒｕｓ）、シンドビスウイルスおよび他のＲＮＡウイルス（ＨＩＶバックボーンを有するこれらのウイルスが含まれる）が含まれる。ベクターとしての使用が適切となるこれらのウイルスの性質を共有する任意のウイルスファミリーも有用である。Ｖｅｒｍａ（１９８５）に記載のレトロウイルスベクターには、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｕｒｉｎｅ  Ｍａｌｏｎｅｙ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ）（ＭＭＬＶ）、およびベクターとしてＭＭＬＶの所望の性質を発現するレトロウイルスが含まれる。典型的には、ウイルスベクターは、非構造初期遺伝子、構造後期遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写物、複製およびキャプシド形成に必要な逆末端反復、およびウイルスゲノムの転写および複製を調節するためのプロモーターを含む。ベクターとして操作する場合、ウイルスは、典型的には、１つまたは複数の初期遺伝子を除去し、除去したウイルスＤＮＡの代わりに遺伝子または遺伝子／プロモーターカセットをウイルスゲノム中に挿入する。
【００９６】
「プロモーター」は、一般に、転写開始部位に対して比較的固定した位置に存在する場合に機能するＤＮＡ配列である。「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子の基本的相互作用に必要なコアエレメントを含み、上流エレメントおよび応答エレメントを含むことができる。
【００９７】
「エンハンサー」は、一般に、転写開始部位から固定していない距離で機能し、転写単位に対して５’側（Ｌａｉｍｉｎｓ，１９８１）または３’側（Ｌｕｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３）であり得るＤＮＡ配列をいう。さらに、エンハンサーは、イントロン内に存在することができ（Ｂａｎｅｒｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３）、コード配列自体の内部にも存在することができる（Ｏｓｂｏｒｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４）。これらは、通常、１０ｂｐ長と３００ｂｐ長との間であり、シスで機能する。エンハンサーは、近接するプロモーターからの転写を増加させるように機能する。エンハンサーはまた、プロモーターと同様に、転写調節を媒介する応答エレメントをしばしば含む。エンハンサーは、しばしば、発現調節を決定する。
【００９８】
真核生物宿主細胞（酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞、ヒト細胞、または有核細胞）で使用される発現ベクターはまた、ｍＲＮＡ発現に影響を及ぼし得る転写終結に必要な配列を含むことができる。これらの領域は、組織因子タンパク質をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分中でポリアデニル化セグメントとして転写される。３’非翻訳領域は、転写終結部位も含む。転写単位がポリアデニル化領域も含むことが好ましい。この領域の利点の１つは、転写単位がｍＲＮＡのようにプロセシングおよび輸送される可能性が増加することである。発現構築物中でのポリアデニル化シグナルの同定および使用は十分に確立されている。相同ポリアデニル化シグナルを導入遺伝子構築物中で使用することが好ましい。
【００９９】
ベクターは、マーカー産物をコードする核酸配列を含む。このマーカー産物を使用して、遺伝子が細胞に送達されたかどうか、および一旦送達されると発現するかどうかを決定する。好ましいマーカー遺伝子は、β−ガラクトシダーゼおよび緑色蛍光タンパク質をコードするＥ．Ｃｏｌｉ  ｌａｃＺ遺伝子である。
【０１００】
いくつかの実施形態では、マーカーは選択可能なマーカーであり得る。かかる選択可能なマーカーが宿主細胞に首尾よく導入された場合、形質転換された宿主細胞は選択圧下においた場合に生存することができる。２つの広く使用されている異なるカテゴリーの選択レジメが存在する。第１のカテゴリーは、細胞の代謝および補充培地と無関係に増殖する能力を欠く変異細胞の使用に基づく。第２のカテゴリーは、任意の細胞型で使用される選択スキームをいい、変異細胞系統の使用を必要としない優性選択である。これらのスキームは、典型的には、宿主細胞の増殖を停止させるための薬物を使用する。新規の遺伝子を有するそれらの細胞は、薬物耐性を伝達するタンパク質を発現し、選択を生き抜く。かかる優性選択の例は、薬物であるネオマイシン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇ，１９８２）、ミコフェノール酸（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇ，１９８０）、またはハイグロマイシン（Ｓｕｇｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５）を使用する。
【０１０１】
遺伝子材料（プラスミド、ウイルスベクター、ウイルス核酸、ファージ核酸、ファージ、コスミド、および人工染色体であるが、これらに限定されない）の直接移入の使用またはカチオニックリポソームなどの細胞またはキャリア中の遺伝子材料の移入を介して、遺伝子を移入することができる。かかる方法は当該分野で周知であり、本明細書中に記載の方法での使用に容易に適応することができる。移入ベクターは、細胞に遺伝子を送達させるために使用される任意のヌクレオチド構築物（例えば、プラスミド）または一般的な遺伝子送達ストラテジーの一部（例えば、組換えレトロウイルスまたはアデノウイルスの一部）（Ｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：８３−８８，（１９９３））であり得る。適切なトランスフェクション手段（ウイルスベクター、化学的トランスフェクタント、または物理的機械的方法（エレクトロポレーションおよびＤＮＡの直接拡散など）が含まれる）は、例えば、Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１４６５−１４６８，（１９９０）；ａｎｄ  Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．Ｎａｔｕｒｅ，３５２，８１５−８１８，（１９９１）に記載されている。
【０１０２】
１．ウイルスベクター
好ましいウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、ＡＩＤＳウイルス、神経向性ウイルス、シンドビスウイルスおよび他のＲＮＡウイルス（ＨＩＶバックボーンを有するこれらのウイルスが含まれる）である。ベクターとしての使用が適切となるこれらのウイルスの性質を共有する任意のウイルスファミリーも好ましい。好ましいレトロウイルスには、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、およびベクターとしてＭＭＬＶの所望の性質を発現するレトロウイルスが含まれる。レトロウイルスベクターは、他のウイルスベクターより高い遺伝子負荷量（すなわち、導入遺伝子またはマーカー遺伝子）を輸送することができ、この理由のために、一般的に使用されるベクターである。しかし、これらは、非増殖細胞で有用ではない。アデノウイルスベクターは、比較的安定であり、作業が容易であり、高力価を有し、エアゾール処方物中で送達させることができ、非分裂細胞にトランスフェクトすることができる。ポックスウイルスベクターは、巨大であり、いくつかの遺伝子挿入部位を有し、熱安定性を示し、室温で保存することができる。好ましい実施形態は、ウイルス抗原によって誘発される宿主生物の免疫応答を抑制するように操作されたウイルスベクターである。この型の好ましいベクターは、インターロイキン８または１０のコード領域を保有する。
【０１０３】
ウイルスベクターは、細胞に遺伝子を導入するためのほとんどの化学的方法または物理的方法よりも高い処理能力（遺伝子導入能力）を有する。典型的には、ウイルスベクターは、非構造初期遺伝子、構造後期遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写物、複製およびキャプシド形成に必要な逆末端反復、およびウイルスゲノムの転写および複製を調節するためのプロモーターを含む。ベクターとして操作する場合、ウイルスは、典型的には、１つまたは複数の初期遺伝子を除去し、除去したウイルスＤＮＡの代わりに遺伝子または遺伝子／プロモーターカセットをウイルスゲノム中に挿入する。この構築物型は、約８ｋｂまでの外来遺伝子材料を保有することができる。除去された初期遺伝子の必要な機能を、典型的には、トランスで初期遺伝子の遺伝子産物を発現するように操作された細胞系統によって供給される。
【０１０４】
ｉ．レトロウイルスベクター
レトロウイルスは、レトロウイルス科のウイルスファミリー（任意の型、亜科、属、向性が含まれる）に属する動物ウイルスである。レトロウイルスベクターは、一般に、Ｖｅｒｍａ，Ｉ．Ｍ．，Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ−１９８５，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｐ．２２９−２３２，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，（１９８５）（本明細書中で参考として援用される）に記載されている。遺伝子治療のためのレトロウイルスベクターの使用方法の例は、米国特許第４，８６８，１１６号および同第４，９８０，２８６号；ＰＣＴ出願国際公開第９０／０２８０６号および国際公開第８９／０７１３６号；およびＭｕｌｌｉｇａｎ，（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２（１９９３））（その教示が本明細書中で参考として援用される）に記載されている。
【０１０５】
レトロウイルスは、本質的に、核酸カーゴ（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｃａｒｇｏ）に詰められたパッケージである。核酸カーゴは、パッケージングシグナルを保有し、これらのパッケージングシグナルは、複製された娘分子がパッケージコート内に効率的に詰められることを確実にする。パッケージシグナルに加えて、複製および複製されたウイルスのパッケージングのためにシスで必要な多数の分子が存在する。典型的には、レトロウイルスゲノムは、タンパク質コートの作製に関与するｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子を含む。これは、典型的には標的細胞に移入される外来ＤＮＡと置換されるｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子である。レトロウイルスベクターは、典型的には、パッケージコートへの組み込みのためのパッケージングシグナル、ｇａｇ転写単位の開始をシグナル伝達する配列、逆転写に必要なエレメント（逆転写のｔＲＮＡプライマーに結合するプライマー結合部位が含まれる）、ＤＮＡ合成中にＲＮＡ鎖のスイッチを導く末端反復配列、第２のＤＮＡ合成鎖の合成のためのプライミング部位としての機能を果たすプリンリッチ配列である５’→３’ＬＴＲ、および宿主ゲノムに挿入するためのレトロウイルスのＤＮＡ状態を挿入することができるＬＴＲの末端付近の特異的配列を含む。ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子の除去により、約８ｋｂの外来配列がウイルスゲノムに挿入され、逆転写するようになり、複製の際に新規のレトロウイルス粒子に詰められる。この核酸量は、各転写物のサイズに応じて、１つから多数の遺伝子の送達に十分である。挿入物中に他の遺伝子と共に正または負の選択マーカーのいずれかを含めることが好ましい。
【０１０６】
ほとんどのレトロウイルスベクター中の複製機構およびパッケージングタンパク質が除去されているので（ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ）、典型的には、パッケージング細胞系統へのこれらの配置によってベクターを生成する。パッケージング細胞系統は、複製およびパッケージング機構を含むが、いかなるパッケージングシグナルも欠くレトロウイルスを使用してトランスフェクションまたは形質転換した細胞系統である。選択のＤＮＡを保有するベクターをこれらの細胞系統にトランスフェクションする場合、目的の遺伝子を含むベクターを複製し、ヘルパー細胞によってシスで提供される機構によって新規のレトロウイルス粒子にパッケージングする。必要なシグナルを欠くので、この機構のゲノムはパッケージされない。
【０１０７】
ｉｉ．アデノウイルスベクター
複製欠損アデノウイルスの構築は記載されている（Ｂｅｒｋｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６１：１２１３−１２２０（１９８７）；Ｍａｓｓｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８７２−２８８３（１９８６）；Ｈａｊ−Ａｈｍａｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５７：２６７−２７４（１９８６）；Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６１：１２２６−１２３９（１９８７）；Ｚｈａｎｇ  ”Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｂｙ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＰＣＲ  ａｎａｌｙｓｉｓ”  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １５：８６８−８７２（１９９３））。ベクターとしてのこれらのウイルスの使用の利点は、これらのウイルスが最初の感染細胞内で複製することができるが新規の感染ウイルス粒子を形成できないので、他の細胞型に拡大することができる範囲が制限されていることである。組換えアデノウイルスは、気道上皮、肝細胞、血管内皮、ＣＮＳ実質、および多数の他の組織部位への直接的なｉｎ  ｖｉｖｏ送達後に高効率の遺伝子移入を達成することが示されている（Ｍｏｒｓｙ，  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：１５８０−１５８６（１９９３）；Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍ，  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：３８１−３８７（１９９３）；Ｒｏｅｓｓｌｅｒ，  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：１０８５−１０９２（１９９３）；Ｍｏｕｌｌｉｅｒ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４：１５４−１５９（１９９３）；Ｌａ  Ｓａｌｌｅ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：９８８−９９０（１９９３）；Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘ，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２５１２９−２５１３４（１９９２）；Ｒｉｃｈ，  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：４６１−４７６（１９９３）；Ｚａｂｎｅｒ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６：７５−８３（１９９４）；Ｇｕｚｍａｎ，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７３：１２０１−１２０７（１９９３）；Ｂｏｕｔ，  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：３−１０（１９９４）；Ｚａｂｎｅｒ，  Ｃｅｌｌ  ７５：２０７−２１６（１９９３）；Ｃａｉｌｌａｕｄ，  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ５：１２８７−１２９１（１９９３）；ａｎｄ  Ｒａｇｏｔ，  Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７４：５０１−５０７（１９９３））。組換えアデノウイルスは、特異的細胞表面受容体への結合によって遺伝子形質導入を達成し、その後、野生型または複製欠損アデノウイルスと同一の様式で、受容体媒介エンドサイトーシスによってウイルスを内在化する  （Ｃｈａｒｄｏｎｎｅｔ  ａｎｄ  Ｄａｌｅｓ，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４０：４６２−４７７（１９７０）；Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｂｕｒｌｉｎｇｈａｍ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １２：３８６−３９６（１９７３）；Ｓｖｅｎｓｓｏｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｓｓｏｎ，  Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５５：４４２−４４９（１９８５）；Ｓｅｔｈ，ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．  ５１：６５０−６５５（１９８４）；Ｓｅｔｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌ��．Ｂｉｏｌ．  ４：１５２８−１５３３（１９８４）；Ｖａｒｇａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６５：６０６１−６０７０（１９９１）；Ｗｉｃｋｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ７３：３０９−３１９（１９９３））。
【０１０８】
好ましいウイルスベクターは、Ｅ１遺伝子が除去されたアデノウイルスに基づいたウイルスベクターであり、これらのヴィロン（ｖｉｒｏｎ）をヒト２９３細胞系統などの細胞系統中で生成する。別の好ましい実施形態では、Ｅ１およびＥ３遺伝子の両方をアデノウイルスゲノムから除去する。
【０１０９】
別のウイルスベクター型は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づく。この欠損パルボウイルスは、多数の細胞型に感染することができ、ヒトに非病原性を示すので、好ましいベクターである。ＡＡＶ型ベクターは、約４〜５ｋｂを輸送することができ、野生型ＡＡＶは、第１９染色体に安定に挿入されることが公知である。この部位特異的組み込み特性を含むベクターが好ましい。このベクター型の特に好ましい実施形態は、Ａｖｉｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ製のＰ４．１  Ｃベクターである。これは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、ＨＳＶ−ｔｋ、および／またはマーカー遺伝子（緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子など）を含むことができる。
【０１１０】
ウイルスおよびレトロウイルス中の挿入遺伝子は、通常、所望の遺伝子産物の発現の調節を補助するためのプロモーターおよび／またはエンハンサーを含む。プロモーターは、一般に、転写開始部位に関して比較的固定した位置に存在する場合に機能する配列またはＤＮＡ配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子の基本的相互作用に必要なコアエレメントを含み、上流エレメントおよび応答エレメントを含むことができる。
【０１１１】
２．ウイルスプロモーターおよびエンハンサー
哺乳動物宿主細胞中のベクターからの転写を調節する好ましいプロモーターを、種々の供給源（例えば、ポリオーマ、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、および最も好ましくはサイトメガロウイルスなどのウイルスゲノム）、または非相同哺乳動物プロモーター（例えば、βアクチンプロモーター）から得ることができる。ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターを、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含むＳＶ４０制限フラグメントとして得ることが都合が良い（Ｆｉｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２７３：  １１３（１９７８））。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターを、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限フラグメントとして得ることが都合が良い（Ｇｒｅｅｎｗａｙ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １８：  ３５５−３６０（１９８２））。勿論、宿主細胞または関連種由来のプロモーターも本明細書中で有用である。
【０１１２】
エンハンサーは、一般に、転写開始部位から固定していない距離で機能し、転写単位に対して５’側（Ｌａｉｍｉｎｓ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：  ９９３（１９８１））または３’側（Ｌｕｓｋｙ，Ｍ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．３：  １１０８（１９８３））のいずれかであり得るＤＮＡ配列をいう。さらに、エンハンサーは、イントロン内に存在することができ（Ｂａｎｅｒｊｉ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ３３：  ７２９（１９８３））、ならびにコード配列自体の内部にも存在することができる（Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｔ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．４：  １２９３（１９８４））。これらは、通常、１０ｂｐ長と３００ｂｐ長との間であり、シスで機能する。エンハンサーは、近接するプロモーターからの転写を増加させるように機能する。エンハンサーはまた、転写調節を媒介する応答エレメントをしばしば含む。プロモーターはまた、転写調節を媒介する応答エレメントを含む。エンハンサーは、しばしば、遺伝子の発現調節を決定する。哺乳動物遺伝子由来の多数のエンハンサー配列が現在知られているが（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、およびインスリン）、典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用する。好ましい例は、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーである。
【０１１３】
プロモーターおよび／またはエンハンサーを、その機能を誘発する軽度または特異的な化学事象のいずれかによって特異的に活性化することができる。系を、テトラサイクリンおよびデキサメタゾンなどの試薬によって調節することができる。ガンマ線照射などの照射への曝露またはアルキル化化学療法薬によってウイルスベクター遺伝子発現を増強する方法も存在する。
【０１１４】
プロモーターおよび／またはエンハンサー領域が全ての真核細胞型で活性であることが好ましい。この型の好ましいプロモーターは、ＣＭＶプロモーター（６５０塩基）である。他の好ましいプロモーターは、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（全長プロモーター）、およびレトロウイルスベクターＬＴＦである。
【０１１５】
全ての特異的調節エレメントをクローン化し、これを使用して、黒色腫細胞などの特定の細胞型で選択的に発現する発現ベクターを構築することができることが示されている。グリア線維酸性タンパク質（ｇｌｉａｌ  ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ａｃｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＧＦＡＰ）プロモーターを使用して、神経膠起源の細胞中の遺伝子が選択的に発現されている。
【０１１６】
真核生物宿主細胞（酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞、ヒト細胞、または有核細胞）で使用される発現ベクターはまた、ｍＲＮＡ発現に影響を及ぼし得る転写終結に必要な配列を含むことができる。これらの領域は、組織因子タンパク質をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分中でポリアデニル化セグメントとして転写される。３’非翻訳領域は、転写終結部位も含む。転写単位がポリアデニル化領域も含むことが好ましい。この領域の利点の１つは、転写単位がｍＲＮＡのようにプロセシングおよび輸送される可能性が増加することである。発現構築物中でのポリアデニル化シグナルの同定および使用は十分に確立されている。相同ポリアデニル化シグナルを導入遺伝子構築物中で使用することが好ましい。転写単位の好ましい実施形態では、ポリアデニル化領域は、ＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナルに由来し、約４００塩基からなる。転写された単位は、他の標準的な配列のみを含むか、上記配列と組み合わせて構築物からの発現または構築物の安定性を改善することも好ましい。
【０１１７】
３．マーカー
ベクターは、マーカー産物をコードする核酸配列を含み得る。このマーカー産物を使用して、遺伝子が細胞に送達され、一旦送達されると発現するかどうかを決定する。好ましいマーカー遺伝子は、β−ガラクトシダーゼおよび緑色蛍光タンパク質をコードするＥ．Ｃｏｌｉ  ｌａｃＺ遺伝子である。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、マーカーは選択可能なマーカーであり得る。哺乳動物細胞に適切な選択可能なマーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシンアナログＧ４１８、ヒドロマイシン（ｈｙｄｒｏｍｙｃｉｎ）、およびピューロマイシンである。かかる選択可能なマーカーが哺乳動物宿主細胞に首尾よく移入された場合、形質転換された哺乳動物宿主細胞は選択圧下においた場合に生存することができる。２つの広く使用されている異なるカテゴリーの選択レジメが存在する。第１のカテゴリーは、細胞の代謝および補充培地と無関係に増殖する能力を欠く変異細胞系統の使用に基づく。２つの例は以下である：ＣＨＯ  ＤＨＦＲ−細胞およびマウスＬＴＫ−細胞である。これらの細胞は、チミジンまたはヒポキサンチンなどの栄養素を添加せずに増殖する能力を欠く。これらの細胞が完全なヌクレオチド合成経路に必要な一定の遺伝子を欠くので、これらの細胞は、補充培地中に欠けているヌクレオチドを供給しない限り生存できない。培地の補充の代替は、インタクトなＤＨＦＲ遺伝子またはＴＫ遺伝子を各遺伝子を欠く細胞に導入し、それによってその増殖要件を変化させることである。ＤＨＦＲ遺伝子またはＴＫ遺伝子で形質転換しなかった各細胞は、非補充培地で生存できない。
【０１１９】
第２のカテゴリーは、任意の細胞型で使用される選択スキームをいい、変異細胞系統の使用を必要としない優性選択である。これらのスキームは、典型的には、宿主細胞の増殖を停止させるための薬物を使用する。薬物耐性を伝達するタンパク質を発現する細胞は、選択を生き抜く。かかる優性選択の例は、薬物であるネオマイシン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｐ．ａｎｄ  Ｂｅｒｇ，Ｐ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：  ３２７（１９８２））、ミコフェノール酸（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．ａｎｄ  Ｂｅｒｇ，Ｐ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０９：  １４２２（１９８０））、またはハイグロマイシン（Ｓｕｇｄｅｎ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：  ４１０−４１３（１９８５））を使用する。３つの例は、真核生物調節下で細菌遺伝子を使用して、適切な薬物Ｇ４１８もしくはネオマイシン（ジェネテシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）、またはハイグロマイシンに対する耐性を伝達する。他には、ネオマイシンアナログＧ４１８およびピューラマイシン（ｐｕｒａｍｙｃｉｎ）が含まれる。
【０１２０】
Ｆ．バイオセンサーリボスイッチ
バイオセンサーリボスイッチも開示する。バイオセンサーリボスイッチは、その同系トリガー分子の存在下で検出可能なシグナルを産生する操作されたリボスイッチである。有用なバイオセンサーリボスイッチを、閾値レベルまたは閾値レベルを超えるトリガー分子で誘発することができる。バイオセンサーリボスイッチを、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの使用のためにデザインすることができる。例えば、シグナルとしての機能を果たすかシグナル産生に関与するタンパク質をコードするレポーターＲＮＡに作動可能に連結することができるオルタナティブスプライシングを調節するリボスイッチを、細胞または生物にリボスイッチをコードする核酸構築物を保有させるように操作することによってｉｎ  ｖｉｖｏで使用することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用するバイオセンサーリボスイッチの例は、高次構造依存性標識（リボスイッチの活性化状態に応じて変化するシグナル）を含むリボスイッチである。かかるバイオセンサーリボスイッチは、好ましくは、天然に存在するリボスイッチに由来するか誘導されたアプタマードメインを使用する。
【０１２１】
Ｇ．レポータータンパク質およびペプチド
リボスイッチの活性化の評価またはバイオセンサーリボスイッチの評価のために、レポータータンパク質またはペプチドを使用することができる。レポータータンパク質またはペプチドをＲＮＡによってコードすることができ、その発現はリボスイッチによって調節される。実施例は、いくつかの特異的レポータータンパク質の使用を記載している。レポータータンパク質およびペプチドの使用は周知であり、リボスイッチとの使用のために容易に適応することができる。レポータータンパク質は、検出することができるか検出可能なシグナルを産生する任意のタンパク質またはペプチドであり得る。好ましくは、タンパク質またはペプチドの存在を、標準的な技術（例えば、放射免疫アッセイ、放射性標識、免疫アッセイ、酵素活性のためのアッセイ、吸光度、蛍光、発光、およびウェスタンブロット）を使用して検出することができる。より好ましくは、レポータータンパク質レベルを、低レベルでさえも、標準的な技術を使用して容易に定量可能である。有用なレポータータンパク質には、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、およびそれらの誘導体（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ由来のホタルルシフェラーゼ（ＦＬ）およびＲｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のウミシイタケルシフェラーゼ（ＲＬ）など）が含まれる。
【０１２２】
Ｈ．高次構造依存性標識
高次構造依存性標識は、標識が会合した分子または化合物（リボスイッチなど）の形態または高次構造の変化に基づいて蛍光強度または波長が変化する全ての標識をいう。プローブおよびプライマーとの関係において使用される高次構造依存性標識の例には、分子ビーコン、アンプリフォー（Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒ）、ＦＲＥＴプローブ、切断性ＦＲＥＴプローブ、ＴａｑＭａｎプローブ、スコーピオンプライマー、蛍光三重鎖オリゴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｔｒｉｐｌｅｘ  ｏｌｉｇｏ）（三重鎖分子ビーコンまたは三重鎖ＦＲＥＴプローブが含まれるが、これらに限定されない）、蛍光水溶性複合ポリマー、ＰＮＡプローブ、およびＱＰＮＡプローブが含まれる。かかる標識を、特に、その機能の原理を、リボスイッチと共に使用するために適応させることができる。いくつかの高次構造依存性標識型は、Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｎｇｓｍｏｒｅ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：２１−２７（２００１）中に概説されている。
【０１２３】
ステム消光標識（ｓｔｅｍ  ｑｕｅｎｃｈｅｄ  ｌａｂｅｌ）（高次構造依存性標識の一形態）は、ステム構造を形成する場合に標識からの蛍光が消光されるように消光部分が近接するような核酸上に配置された蛍光標識である。ステムが破壊される場合（標識を含むリボスイッチが活性化する場合など）、消光部分はもはや蛍光標識に近接せず、蛍光が増加する。この効果の例を、分子ビーコン、蛍光三重鎖オリゴ、三重鎖分子ビーコン、三重鎖ＦＲＥＴプローブ、およびＱＰＮＡプローブで見出すことができ、その操作原理をリボスイッチと共に使用するために適応させることができる。
【０１２４】
ステム活性化標識（高次構造依存性標識の一形態）は、ステム構造の形成によって蛍光が増加するか変化する標識または標識対である。ステム活性化標識には、受容体および供与体が近接する場合（標識を含む核酸鎖がステム構造を形成する場合）に供与体から受容体への蛍光共鳴エネルギー転移によって受容体が蛍光を発するような受容体蛍光標識および供与体部分が含まれ得る。ステム活性化標識は、典型的には、核酸分子中でステム構造を形成する場合に受容体および供与体が近接するような核酸分子（リボスイッチなど）上に配置された標識対である。ステム活性化標識の供与体部分自体が蛍光標識である場合、この標識は、受容体に近接しない場合（すなわち、ステム構造を形成しない場合）に蛍光（典型的には、受容体の蛍光よりも異なる波長で）としてエネルギーを放出することができる。ステム構造を形成する場合、全体的な効果としては、供与体蛍光が減少し、受容体蛍光が増加する。ＦＲＥＴプローブはステム活性化標識の使用例であり、その操作上の原理をリボスイッチと共に使用するために適応することができる。
【０１２５】
Ｉ．検出標識
リボスイッチの活性化、非活性化、もしくは遮断、またはリボスイッチの活性化、非活性化、もしくは遮断の際に産生された核酸またはタンパク質の発現の検出および定量を補助するために、検出標識を、検出プローブまたは検出分子に組み込むか、発現した核酸またはタンパク質に直接組み込むことができる。本明細書中で使用する場合、検出標識は、核酸またはタンパク質と直接または間接的に会合することができ、それにより、測定可能な検出シグナルが直接的または間接的のいずれかで得られる任意の分子である。多数のかかる標識は、当業者に公知である。開示の方法での使用に適切な検出標識の例は、放射性同位体、蛍光分子、リン光分子、酵素、抗体、およびリガンドである。
【０１２６】
適切な蛍光標識の例には、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、５，６−カルボキシメチルフルオレセイン、テキサスレッド、ニトロベンズ２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル（ＮＢＤ）、クマリン、塩化ダンシル、ローダミン、アミノ−メチルクマリン（ＡＭＣＡ）、エオシン、エリスロシン、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）、カスケードブルー（登録商標）、オレゴングリーン（登録商標）、ピレン、リサミン、キサンテン、アクリジン、オキサジン、フィコエリトリン、クォンタムダイＴＭ（ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｙｅＴＭ）などのランタニドイオンの大環状キレート、チアゾールオレンジ−エチジウムヘテロ二量体などの蛍光エネルギー転移染料、ならびにシアニン染料Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７が含まれる。他の特定の蛍光標識の例には、３−ヒドロキシピレン５，８，１０−トリスルホン酸、５−ヒドロキシトリプタミン（５−ＨＴ）、酸性フクシン、アリザリンコンプレクソン、アリザリンレッド、アロフィコシアニン、アミノクマリン、ステアリン酸アントロイル（ａｎｔｈｒｏｙｌ  ｓｔｅａｒａｔｅ）、アストラゾンブリリアントレッド４Ｇ、アストラゾンオレンジＲ、アストラゾンレッド６Ｂ、アストラゾンイエロー７ＧＬＬ、アタブリン、オーラミン、オーロホスフィン、オーロホスフィンＧ、ＢＡＯ９（ビスアミノフェニルオキサジアゾール）、ＢＣＥＣＦ、硫酸ベルベリン、ビスベンズアミド、ブランコホルＦＦＧ溶液、ブランコホルＳＶ、ボディピー  Ｆ１（Ｂｏｄｉｐｙ  Ｆ１）、ブリリアントスルホフラビンＦＦ、カルカインブルー（ｃａｌｃｉｅｎ  ｂｌｕｅ）、カルシウムグリーン、カルコフロールＲＷ溶液、カルコフロールホワイト、カルコホールホワイトＡＢＴ溶液、カルコホールスタンダード溶液、カルボスチリル、カスケードイエロー、カテコールアミン、キナクリン（ｃｈｉｎａｃｒｉｎｅ）、コリホスフィンＯ、クマリン−ファロイジン、ＣＹ３．１  ８、ＣＹ５．１  ８、ＣＹ７、ダンス（１−ジメチルアミノナファリン５スルホン酸）、ダンサ（ジアミノナフチルスルホン酸）、ダンシルＮＨ−ＣＨ３、ジアミノフェニルオキシジアゾール（ＤＡＯ）、ジメチルアミノ−５−スルホン酸、ジピロメテンホウ素二フッ化物（ｄｉｐｙｒｒｏｍｅｔｈｅｎｅｂｏｒｏｎ  ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ）、ジフェニルブリリアントフラビン７ＧＦＦ、ドーパミン、エリスロシンＩＴＣ、オイクリシン、ＦＩＦ（ホルムアルデヒド誘導蛍光）、フラゾオレンジ、フルオ３、フルオレスカミン、フラ−２、ゲナクリルブリリアントレッドＢ、ゲナクリルブリリアントイエロー１０ＧＦ、ゲナクリルピンク３Ｇ、ゲナクリルイエロー５ＧＦ、ｇｌｏｘａｌｉｃ  ａｃｉｄ、グラニュラーブルー、ヘマトポルフィリン、インド−１、イントラホワイトＣｆ液、リューコフォーＰＡＦ（Ｌｅｕｃｏｐｈｏｒ  ＰＡＦ）、リューコフォーＳＦ、リューコフォーＷＳ、リサミンローダミンＢ２００（ＲＤ２００）、ルシフェルイエローＣＨ、ルシフェルイエローＶＳ、マグダラレッド、マリーナブルー、マキシロンブリリアントフラビン１０ＧＦＦ、マキシロンブリリアントフラビン８ＧＦＦ、ＭＰＳ（メチルグリーンピロニンスチルベン）、ミトラマイシン、ＮＢＤ���ミン、ニトロベンゾキサジドール、ノルアドレナリン、ヌクレアーファストレッド、ヌクレアーイエロー、ナイロサンブリリアントフラビンＥ８Ｇ、オキサジアゾール、パシフィックブルー、パラローザニリン（ホイルゲン）、ホルウィットＡＲ溶液、ホルウィットＢＫＬ、ホルウィットＲｅｖ、ホルウィットＲＰＡ、ホスフィン３Ｒ、フタロシアニン、フィコエリトリンＲ、ポリアザインダセンポントクロームブルーブラック、ポルフィリン、プリムリン、プロシオンイエロー、ピロニン、ピロニンＢ、ピロザールブリリアントフラビン７ＧＦ、キナクリンマスタード、ローダミン１２３、ローダミン５ＧＬＤ、ローダミン６Ｇ、ローダミンＢ、ローダミンＢ２００、ローダミンＢエキストラ、ローダミンＢＢ、ローダミンＢＧ、ローダミンＷＴ、セロトニン、セブロンブリリアントレッド２Ｂ、セブロンブリリアントレッド４Ｇ、セブロンブリリアントレッドＢ、セブロンオレンジ、セブロンイエローＬ、ＳＩＴＳ（プリムリン）、ＳＩＴＳ（スチルベンイソチオスルホン酸）、スチルベン、スナーフ１、スルホローダミンＢ  Ｃａｎ  Ｃ、スルホローダミンＧエキストラ、テトラサイクリン、チアジンレッドＲ、チオフラビンＳ、チオフラビンＴＣＮ、チオフラビン５、チオライト、チオゾールオレンジ、チノポールＣＢＳ、トゥルーブルー、ウルトラライト、ウラニンＢ、ユビテックスＳＦＣ、キシレンオレンジ、およびＸＲＩＴＣが含まれる。
【０１２７】
有用な蛍光標識は、フルオレセイン（５−カルボキシフルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、ローダミン（５，６−テトラメチルローダミン）、ならびにシアニン染料Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７である。これらの蛍光体の吸収および発光の極大は、ＦＩＴＣ（４９０ｎｍ；５２０ｎｍ）、Ｃｙ３（５５４ｎｍ；５６８ｎｍ）、Ｃｙ３．５（５８１ｎｍ；５８８ｎｍ）、Ｃｙ５（６５２ｎｍ：６７２ｎｍ）、Ｃｙ５．５（６８２ｎｍ；７０３ｎｍ）およびＣｙ７（７５５ｎｍ；７７８ｎｍ）であり、したがって、同時検出が可能である。フルオレセイン染料の他の例には、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、２’，４’，１，４，−テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、２’，４’，５’，７’，１，４−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシローダミン（ＪＯＥ）、２’−クロロ−５’−フルオロ−７’，８’−融合フェニル−１，４−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＮＥＤ）および２’−クロロ−７’−フェニル−１，４−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＶＩＣ）が含まれる。蛍光標識は、種々の商業供給者（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ；およびＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏが含まれる）から得ることができる。
【０１２８】
目的とするさらなる標識には、それらが関連するプローブが標的分子に特異的に結合する場合にのみシグナルを提供するものが含まれ、かかる標識には、Ｔｙａｇｉ  ＆  Ｋｒａｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９６）１４：３０３および欧州特許第００７０６８５  Ｂ１号に記載の「分子ビーコン」が含まれる。目的とする他の標識には、米国特許第５，５６３，０３７号、国際公開第９７／１７４７１号、および国際公開第９７／１７０７６号に記載されているものが含まれる。
【０１２９】
標識ヌクレオチドは、合成の間に発現核酸へ直接組み込むための検出標識の有用な形態である。核酸に組み込むことができる検出標識の例には、ＢｒｄＵｒｄ（５−ブロモデオキシウリジン、Ｈｏｙ  ａｎｄ  Ｓｃｈｉｍｋｅ，Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２９０：２１７−２３０（１９９３））、アミノアリルデオキシウリジン（Ｈｅｎｅｇａｒｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：３４５−３４８（２０００））、５−メチルシトシン（Ｓａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ９５１：１５７−１６５（１９８８））、ブロモウリジン（Ｗａｎｓｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １２２：２８３−２９３（１９９３））などのヌクレオチドアナログ、およびビオチン（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：６６３３（１９８１））またはジゴキシゲニン（ｄｉｇｏｘｙｇｅｎｉｎ）（Ｋｅｒｋｈｏｆ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０５：３５９−３６４（１９９２））などの適切なハプテンで改変したヌクレオチドが含まれる。適切な蛍光標識ヌクレオチドは、フルオレセイン−イソチオシアネートｄＵＴＰ、シアニン−３−ｄＵＴＰおよびシアニン−５−ｄＵＴＰである（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２２：３２２６−３２３２（１９９４））。ＤＮＡに好ましいヌクレオチドアナログ検出標識は、ＢｒｄＵｒｄ（ブロモデオキシウリジン、ＢｒｄＵｒｄ、ＢｒｄＵ、ＢＵｄＲ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ）である。検出標識のＤＮＡへの組み込みに有用な他のヌクレオチドアナログは、ＡＡ−ｄＵＴＰ（アミノアリル−デオキシウリジントリホスフェート、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）および５−メチル−ｄＣＴＰ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）である。検出標識のＲＮＡへの組み込みに有用なヌクレオチドアナログは、ビオチン−１６−ＵＴＰ（ビオチン−１６−ウリジン−５’−トリホスフェート、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）である。フルオレセイン、Ｃｙ３およびＣｙ５は、直接標識のためにｄＵＴＰに結合することができる。Ｃｙ３．５およびＣｙ７は、ビオチン−またはジゴキシゲニン標識プローブの二次検出用のアビジンまたは抗ジゴキシゲニン結合体として利用可能である。
【０１３０】
ビオチンなどの核酸に組み込まれる検出標識を、その後に当該技術で周知の感度のよい方法を使用して検出することができる。例えば、ビオチンは、ビオチンに結合しているストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ結合体（Ｔｒｏｐｉｘ，Ｉｎｃ．）を使用して検出することができ、その後に適切な基質（例えば、化学発光基質ＣＳＰＤ：３−（４−メトキシスピロ−〔１，２，−ジオキセタン−３−２’−（５’−クロロ）トリシクロ〔３．３．１．１３，７〕デカン〕−４−イル）フェニルリン酸二ナトリウム；Ｔｒｏｐｉｘ，Ｉｎｃ．）の化学発光により検出することができる。標識はまたは、例えば、化学シグナル増幅により、または発光シグナルを生じる酵素（例えば、化学発光１，２−ジオキセタン基質）もしくは蛍光シグナルを生じる酵素への基質を使用することにより検出することができる、アルカリホスファターゼ、ダイズペルオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびポリメラーゼなどの酵素であり得る。
【０１３１】
２個以上のこれらの検出標識を組み合わせる分子も検出標識と見なされる。既知の検出標識のいずれかを、開示されているプローブ、タグ、分子、および方法と共に使用して、開示の方法で産生された活性化または非活性化リボスイッチ、または核酸、またはタンパク質を標識および検出することができる。検出標識により生成されたシグナルを検出および測定する方法も、当業者に公知である。例えば、放射性同位体を、シンチレーションカウンティングまたは直接可視化により検出することができ、蛍光分子を、蛍光分光光度計を使用して検出することができ、リン光分子を、分光光度計またはカメラによる直接可視化により検出することができ、酵素を、酵素により触媒された反応の産物の検出または可視化により検出することができ、抗体を、抗体に結合した二次検出標識を検出することによって検出することができる。本明細書で使用する場合、検出分子は、検出する化合物または組成物と相互作用し、１つまたは複数の検出標識をカップリングする分子である。
【０１３２】
Ｊ．配列類似性
本明細書中で考察するように、用語相同性および同一性の使用は類似性と同一であることを意味すると理解される。したがって、例えば、用語相同性を２配列間（例えば、非天然配列）で使用する場合、これは必ずしもこれら２配列間の進化的関係を示しているわけではなく、むしろ、それらの核酸配列間の類似性または関連性に注目していると理解される。２つの進化的に関連した分子間の相同性の多数の決定方法を、これらが進化的に関連するかどうかと無関係に、配列類似性を測定するために任意の２つ以上の核酸またはタンパク質に日常的に適用する。
【０１３３】
一般に、本明細書中に開示のリボスイッチ、アプタマー、発現プラットフォーム、遺伝子、およびタンパク質の任意の公知の改変体および誘導体または生じ得るものを定義する１つの方法は、公知の特異的配列に対する相同性に関する改変体および誘導体の定義によると理解される。本明細書中に開示の特定の配列のこの同一性も、本明細書中の他所で考察する。一般に、本明細書中に開示のリボスイッチ、アプタマー、発現プラットフォーム、遺伝子、およびタンパク質の改変体は、典型的には、定められた配列または天然配列に対して少なくとも約７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の相同性を有する。当業者は、２つのタンパク質または核酸（遺伝子など）の相同性の決定方法を容易に理解する。例えば、相同性がその最高レベルとなるような２つの配列のアラインメント後に相同性を計算することができる。
【０１３４】
相同性の別の計算方法を、公開されたアルゴリズムによって行うことができる。比較のための最適な配列アラインメントを、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ  Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．ＭｏＬ  Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４（１９８８）の類似性検索方法、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、または調査によって行うことができる。
【０１３５】
例えば、Ｚｕｋｅｒ，Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：４８−５２，１９８９，Ｊａｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：７７０６−７７１０，１９８９，Ｊａｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：２８１−３０６，１９８９（少なくとも核酸アラインメントに関する材料について本明細書中で参考として援用される）に開示のアルゴリズムによって、核酸についての同型の相同性を得ることができる。典型的には任意の方法を使用することができると理解され、場合によってはこれらの種々の方法の結果が異なり得ると理解されるが、当業者は、これらの方法の少なくとも１つを使用して同一性を見出す場合、配列は定められた同一性を有するといわれると理解する。
【０１３６】
例えば、本明細書中で使用する場合、別の配列に対して特定の相同率を有するものとして列挙される配列は、１つまたは複数の上記の計算方法のいずれかによって計算した列挙した相同性を有する配列をいう。例えば、本明細書中で定義するように、Ｚｕｋｅｒ計算法を使用して第１の配列が第２の配列に対して８０％相同性を有すると計算される場合、任意の他の計算法によって計算した場合に第１の配列が第２の配列に対して８０％相同性を持たない場合でさえ、第１の配列は第２の配列に対して８０％相同性を有する。別の例として、本明細書中で定義するように、Ｚｕｋｅｒ計算法およびＰｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ計算法の両方を使用して第１の配列が第２の配列に対して８０％相同性を有すると計算される場合、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎの計算法、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈの計算法、Ｊａｅｇｅｒの計算法、または任意の他の計算法によって計算した場合に第１の配列が第２の配列に対して８０％相同性を持たない場合でさえ、第１の配列は第２の配列に対して８０％相同性を有する。さらに別の例として、本明細書中で定義するように、各計算法を使用して第１の配列が第２の配列に対して８０％相同性を有すると計算される場合、第１の配列は第２の配列に対して８０％相同性を有する（しかし、実際には、異なる計算法により、しばしば、異なる相同率の計算値が得られる）。
【０１３７】
Ｋ．ハイブリッド形成および選択的ハイブリッド形成
用語「ハイブリッド形成」は、典型的には、少なくとも２つの核酸分子（プライマーまたはプローブとリボスイッチまたは遺伝子など）の間の配列駆動相互作用を意味する。配列駆動相互作用は、２つのヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド誘導体の間でヌクレオチド特異的様式にて起こる相互作用を意味する。例えば、Ｃと相互作用するＧおよびＴと相互作用するＡは、配列駆動相互作用である。典型的には、配列駆動相互作用は、ヌクレオチドのワトソン−クリック面またはフーグスティーン面上で起こる。２つの核酸のハイブリッド形成は、当業者に公知の多数の条件およびパラメータに影響を受ける。例えば、塩濃度、ｐＨ、および反応温度の全てが２つの核酸分子がハイブリッド形成するかどうかに影響を及ぼす。
【０１３８】
２つの核酸分子間の選択的ハイブリッド形成のパラメータは、当業者に周知である。例えば、いくつかの実施形態では、選択的ハイブリッド形成条件を、ストリンジェントなハイブリッド形成条件と定義することができる。例えば、ハイブリッド形成のストリンジェンシーを、ハイブリッド形成工程および洗浄工程のいずれかまたは両方の温度および塩濃度の両方によって調節する。例えば、選択的ハイブリッド形成を達成するためのハイブリッド形成条件は、高イオン強度溶液（６×ＳＳＣまたは６×ＳＳＰＥ）中でＴｍ（分子の半分がそのハイブリッド形成パートナーから解離する融点）より約１２〜２５℃低い温度でのハイブリッド形成およびそれに続く洗浄温度がＴｍより約５℃〜２０℃低いように選択された温度と塩濃度との組み合わせによる洗浄を含むことができる。温度および塩条件は、フィルター上に固定した参照ＤＮＡサンプルを目的の標識核酸とハイブリッド形成させ、次いで、異なるストリンジェンシー条件下で洗浄する予備実験において実験的に容易に決定される。ハイブリッド形成温度は、典型的には、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッド形成についてはより高い。上記の条件または当該分野で公知の条件を使用して、ストリンジェンシーを達成することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９；Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８７：１５４：３６７，１９８７（少なくとも核酸のハイブリッド形成に関連する材料について本明細書中で参考として援用される））。ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッド形成のための好ましいストリンジェントなハイブリッド形成条件は、約６８°Ｃ（水溶液中）の６×ＳＳＣまたは６×ＳＳＰＥおよびそれに続く６８℃での洗浄であり得る。ハイブリッド形成および洗浄のストリンジェンシーを、必要に応じて、所望の相補度が減少するのに合わせて、さらに、変動性が検索される任意の領域のＧ−ＣまたはＡ−Ｔの豊富さに応じて減少させることができる。同様に、ハイブリッド形成および洗浄のストリンジェンシーを、必要に応じて、所望の相同性が増加するのに合わせて、さらに、高相同性が望まれる任意の領域のＧ−ＣまたはＡ−Ｔの豊富さに応じて増加させることができ、これらは全て当該分野で公知である。
【０１３９】
別の選択的ハイブリッド形成を定義する方法は、他の核酸に結合した核酸の１つの量（比率）の検索による。例えば、いくつかの実施形態では、選択的ハイブリッド形成条件は、少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％の制限核酸が非制限核酸に結合する場合である。典型的には、非制限核酸は、例えば、１０、または１００、または１０００倍過剰である。このアッセイ型を、制限核酸および非制限核酸の両方が、例えば、それらのｋｄよりも１０倍、または１００倍、または１０００倍を下回る条件下、または核酸分子の一方のみが１０倍、または１００倍、または１０００倍である条件下、または核酸分子の一方または両方がそれらのｋｄを超える条件下で行うことができる。
【０１４０】
別の選択的ハイブリッド形成を定義する方法は、所望の酵素操作を促進するためにハイブリッド形成が必要な条件下で酵素的に操作される核酸の比率の検索による。例えば、いくつかの実施形態では、選択的ハイブリッド形成条件は、少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％の核酸が、酵素操作を促進する条件下で酵素的に操作される場合である。例えば、酵素操作がＤＮＡ伸長である場合、選択的ハイブリッド形成条件は、少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％の核酸分子が伸長される場合である。好ましい条件には、製造者によって示唆される条件または当該分野で操作を実行する酵素に適切であることが示された条件も含まれる。
【０１４１】
相同性と同様に、２つの核酸分子の間のハイブリッド形成レベルを決定するための本明細書中に開示の種々の方法が多数存在すると理解される。これらの方法および条件により、２つの核酸分子間で異なる比率でハイブリッド形成を提供し得るが、他で示さない限り、任意の方法のパラメータを満たすことで十分であると理解される。例えば、８０％ハイブリッド形成が必要である場合、およびこれらの方法のいずれか１つにおける必要なパラメータ内でハイブリッド形成が起こる限り、本明細書中に開示されると見なされる。
【０１４２】
当業者は、組成物または方法が集合的または単独にハイブリッド形成の決定のためのこれらの基準のうちのいずれか１つを満たす場合、この組成物または方法は本明細書中に開示される組成物または方法であると理解すると理解される。
【０１４３】
Ｌ．核酸
核酸ベースである種々の分子（例えば、リボスイッチ、アプタマー、ならびにリボスイッチおよびアプタマーをコードする核酸が含まれる）を本明細書中に開示する。開示の核酸は、例えば、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、またはヌクレオチド置換物から構成され得る。これらの分子および他の分子の制限されない例は、本明細書中に述べられている。例えば、ベクターを細胞中で発現させる場合、発現したｍＲＮＡは、典型的には、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＵで構成されると理解される。同様に、例えば、外因性送達によって核酸分子を細胞または細胞環境に導入する場合、細胞環境下で核酸分子の分解を減少させるヌクレオチドアナログから核酸分子が構成されることが有利であると理解される。
【０１４４】
それらの関連する機能が維持される限り、リボスイッチ、アプタマー、発現プラットフォーム、および任意の他のオリゴヌクレオチドおよび核酸は、改変ヌクレオチド（ヌクレオチドアナログ）から構成され得るかまたはそれを含むことができる。多くの改変ヌクレオチドが知られており、オリゴヌクレオチドおよび核酸で使用することができる。ヌクレオチドアナログは、塩基、糖、またはリン酸部分にいくつかの修飾型を含むヌクレオチドである。塩基部分に対する改変には、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ／Ｕ、ならびに異なるプリンまたはピリミジン塩基の天然および合成改変が含まれる（ウラシル−５−イル、ヒポキサンチン−９−イル（Ｉ）および２−アミノアデニン−９−イルなど）。改変塩基には、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニジンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニジンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換のアデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換のウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンが含まれるが、これらに限定されない。さらなる塩基改変を、例えば、米国特許第３，６８７，８０８号、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３およびＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ  ２８９−３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．ｅｄ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３で見出すことができる。一定のヌクレオチドアナログ（５置換ピリミジン、６−アザピリミジン、およびＮ−２、Ｎ−６、およびＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、５−プロピニルシトシン、および５−メチルシトシンが含まれる）など）は、二重鎖形成の安定性を増大させることができる。他の改変塩基は、ユニバーサル塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅ）として機能するものである。ユニバーサル塩基には、３−ニトロピロールおよび５−ニトロインドールが含まれる。ユニバーサル塩基は、通常の塩基の代わりになるが、塩基対合に対して偏りがない。すなわち、ユニバーサル塩基は、任意の他の塩基と塩基対合することができる。塩基改変は、しばしば、例えば２’−Ｏ−メトキシエチルなどの糖改変と組み合わせて、二重鎖の安定性の増加などの特有の特性を得ることができる。塩基改変の範囲を詳述し、記載する、多数の米国特許（第４，８４５，２０５号、第５，１３０，３０２号、第５，１３４，０６６号、第５，１７５，２７３号、第５，３６７，０６６号、第５，４３２，２７２号、第５，４５７，１８７号、第５，４５９，２５５号、第５，４８４，９０８号、第５，５０２，１７７号、第５，５２５，７１１号、第５，５５２，５４０号、第５，５８７，４６９号、第５，５９４，１２１号、第５，５９６，０９１号、第５，６１４，６１７号および第５，６８１，９４１号など）が存在する。これらの特許は、それぞれその全体が、特に、塩基改変、それらの合成、それらの使用、ならびにそれらのオリゴヌクレオチドおよび核酸への組み込みについて本明細書中で参照として援用される。
【０１４５】
ヌクレオチドアナログは、糖部分の改変を含むこともできる。糖部分の改変には、リボースおよびデオキシリボースの天然改変、ならびに合成改変が含まれる。糖改変には、２’位での以下の改変が含まれるが、これらに限定されない：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキル（ここで、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、Ｃ１〜Ｃ１０置換または非置換のアルキルまたはＣ２〜Ｃ１０置換または非置換のアルケニルおよびアルキニルであり得る）。２’糖改変には、−Ｏ〔（ＣＨ２）ｎＯ〕ｍＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−ＯＮＨ２および−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２（ここで、ｎおよびｍは、１〜約１０である）も含まれるが、これらに限定されない。
【０１４６】
２’位での他の改変には、Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルもしくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、介入物質、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善する基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善する基、および同様な特性を有する他の置換基が含まれるが、これらに限定されない。類似の改変を、糖の他の位置、特に３’末端ヌクレオチド上または２’−５’結合オリゴヌクレオチド内の糖の３’位、および５’末端ヌクレオチドの５’位で行うこともできる。改変糖には、架橋環酸素での改変（ＣＨ２およびＳなど）を含むものも含まれる。ヌクレオチド糖アナログは、ペントフラノシル糖の代わりに、シクロブチル部分などの糖模倣物を有することもできる。かかる改変糖構造の調製を教示する多数の米国特許（第４，９８１，９５７号、第５，１１８，８００号、第５，３１９，０８０号、第５，３５９，０４４号、第５，３９３，８７８号、第５，４４６，１３７号、第５，４６６，７８６号、第５，５１４，７８５号、第５，５１９，１３４号、第５，５６７，８１１号、第５，５７６，４２７号、第５，５９１，７２２号、第５，５９７，９０９号、第５，６１０，３００号、第５，６２７，０５３号、第５，６３９，８７３号、第５，６４６，２６５号、第５，６５８，８７３号、第５，６７０，６３３号および第５，７００，９２０号など）が存在し、それぞれその全体が、特に、改変糖構造、それらの合成、それらの使用、ならびにそれらのヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよび核酸への組み込みについての記載が、本明細書中で参考として援用される。
【０１４７】
ヌクレオチドアナログは、リン酸部分を改変することもできる。改変リン酸部分には、２つのヌクレオチド間の架橋が、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび他のアルキルホスホネート（３’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートが含まれる）、ホスフィネート、ホスホルアミデート（３’−アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートが含まれる）、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、およびボラノホスフェートを含むように改変できるものが含まれるが、これらに限定されない。２つのヌクレオチド間のこれらのリン酸または改変リン酸架橋は、３’−５’架橋または２’−５’架橋を介することができ、および架橋は、３’−５’から５’−３’までまたは２’−５’から５’−２’までなどの逆の極性を含むことができることが理解される。種々の塩、混合塩および遊離酸形態も含まれる。多数の米国特許が改変リン酸を含むヌクレオチドをどのように作製し、使用するかを教示しており、第３，６８７，８０８号、第４，４６９，８６３号、第４，４７６，３０１号、第５，０２３，２４３号、第５，１７７，１９６号、第５，１８８，８９７号、第５，２６４，４２３号、第５，２７６，０１９号、第５，２７８，３０２号、第５，２８６，７１７号、第５，３２１，１３１号、第５，３９９，６７６号、第５，４０５，９３９号、第５，４５３，４９６号、第５，４５５，２３３号、第５，４６６，６７７号、第５，４７６，９２５号、第５，５１９，１２６号、第５，５３６，８２１号、第５，５４１，３０６号、第５，５５０，１１１号、第５，５６３，２５３号、第５，５７１，７９９号、第５，５８７，３６１号および第５，６２５，０５０号が含まれるが、これらに限定されない（それぞれその全体が、特に、改変リン酸、それらの合成、それらの使用、ならびにそれらのヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよび核酸への組み込みについての記載が、本明細書中で参考として援用される）。
【０１４８】
ヌクレオチドアナログは単一の改変しか含む必要がないが、１つの部分の中にまたは異なる部分の間に、複数の改変を含むこともできることが理解される。
【０１４９】
ヌクレオチド置換物は、ヌクレオチドと同様の機能的性質を有するが、リン酸部分を含まない分子である（ペプチド核酸（ＰＮＡ）など）。ヌクレオチド置換物は、ワトソン・クリックまたはフーグスティーン様式で相補核酸を認識し、それにハイブリダイズする（塩基対合する）分子であるが、リン酸部分以外の部分を介して一緒に結合する分子である。ヌクレオチド置換物は、適切な標的核酸と相互作用する場合、二重らせん型構造に調和することもできる。
【０１５０】
ヌクレオチド置換物は、リン酸部分および／または糖部分が置換されたヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログである。ヌクレオチド置換物は、標準的なリン原子を含まない。リン酸の置換物は、例えば、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間架橋、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間架橋、または１つまたは複数の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環ヌクレオシド間架橋であり得る。これらには、モルホリノ架橋（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成されている）；シロキサン骨格；硫化物、スルホキシドおよびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファミン酸骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホン酸およびスルホンアミド骨格；アミド骨格を有するもの、ならびに混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２成分部分を有する他のものが含まれる。多数の米国特許がこれらの種類のリン酸置換体をどのように作製し、使用するかを開示しており、第５，０３４，５０６号、第５，１６６，３１５号、第５，１８５，４４４号、第５，２１４，１３４号、第５，２１６，１４１号、第５，２３５，０３３号、第５，２６４，５６２号、第５，２６４，５６４号、第５，４０５，９３８号、第５，４３４，２５７号、第５，４６６，６７７号、第５，４７０，９６７号、第５，４８９，６７７号、第５，５４１，３０７号、第５，５６１，２２５号、第５，５９６，０８６号、第５，６０２，２４０号、第５，６１０，２８９号、第５，６０２，２４０号、第５，６０８，０４６号、第５，６１０，２８９号、第５，６１８，７０４号、第５，６２３，０７０号、第５，６６３，３１２号、第５，６３３，３６０号、第５，６７７，４３７号、および第５，６７７，４３９号が含まれるが、これらに限定されない（それぞれその全体が、特に、リン酸置換体、それらの合成、それらの使用、ならびにそれらのヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよび核酸への組み込みについての記載が、本明細書中で参考として援用される）。
【０１５１】
また、ヌクレオチドの糖とリン酸の両方の部分を、例えばアミド型架橋（アミノエチルグリシン）（ＰＮＡ）で置換することができることが、核酸置換物において理解される。米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，７１４，３３１号および同第５，７１９，２６２号は、ＰＮＡ分子をどのように作製し、使用するかを教示しており、それぞれ本明細書中で参考として援用される。（Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１４９７−１５００（１９９１）も参照すること）。
【０１５２】
オリゴヌクレオチドおよび核酸をヌクレオチドから構成することができ、異なるヌクレオチド型または同一のヌクレオチド型から構成することができる。例えば、オリゴヌクレオチドにおける１つまたは複数のヌクレオチドが、リボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、またはリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドの混合物であり得るか、ヌクレオチドの約１０％〜約５０％が、リボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、またはリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドの混合物であり得るか、ヌクレオチドの約５０％以上が、リボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、またはリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドの混合物であり得るか、あるいは全てのヌクレオチドが、リボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、またはリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドの混合物であり得る。かかるオリゴヌクレオチドおよび核酸を、キメラオリゴヌクレオチドおよびキメラ核酸と呼ぶことができる。
【０１５３】
Ｍ．固体支持体
固体支持体は、分子（トリガー分子など）およびリボスイッチ（または開示の方法で使用されるか開示の方法によって産生された他の成分）を会合することができる固体状態の基質または支持体である。リボスイッチおよび他の分子を、固体支持体と直接または間接的に会合することができる。例えば、分析物（例えば、トリガー分子、試験化合物）を、固体支持体表面に結合することができるか、固体支持体上に固定した捕捉剤（例えば、分析物に結合する化合物または分子）と会合することができる。別の例として、リボスイッチを、固体支持体表面に結合することができるか、固体支持体上に固定したプローブと会合することができる。アレイは、複数のリボスイッチ、プローブ、または他の分子がアレイ、グリッド、または他の組織化されたパターンに会合された固体支持体である。
【０１５４】
固体支持体で使用する固体状態の基質には、成分を直接または間接的に会合することができる任意の固体材料が含まれ得る。これには、アクリルアミド、アガロース、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、金、ポリスチレン、ポリエチレンビニルアセテート、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリエチレンオキシド、ポリシリケート、ポリカーボネート、テフロン（登録商標）、フルオロカーボン、ナイロン、シリコンラバー、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルソエステル、官能性シラン、ポリプロピルフメレート、コラーゲン、グリコサミノグリカン、およびポリアミノ酸などの材料が含まれる。固体状態の基質は、任意の有用な形態（薄膜、膜、ボトル、皿、ファイバー、織り繊維、成形ポリマー、粒子、ビーズ、微粒子、またはこれらの組み合わせが含まれる）を有することができる。固体状態の基質および固体支持体は、多孔質または非多孔質であり得る。チップは、矩形または四角の材料小片である。固体状態の基質の好ましい形態は、薄膜、ビーズ、またはチップである。有用な固体状態の基質の形態はマイクロタイターディッシュである。いくつかの実施形態では、マルチウェルガラススライドを使用することができる。
【０１５５】
アレイは、固体支持体上の規定または所定の位置に固定した複数のリボスイッチ、トリガー分子、他の分子、化合物、またはプローブを含むことができる。固体支持体上のそれぞれの所定の位置は、一般に、１種の成分型を有する（すなわち、その位置の全成分は同一である）を有する。あるいは、固体支持体上の同一の所定の位置に複数の成分型を固定することができる。各位置は、所与の成分の複数のコピーを有する。固体支持体上の異なる成分の空間的分離により、個別に検出および同定が可能である。
【０１５６】
有用であるにもかかわらず、固体支持体は単一の単位または構造である必要はない。リボスイッチ、トリガー分子、他の分子、化合物、および／またはプローブの組を、多数の固体支持体の一面に分布させることができる。例えば、ある極端な場合では、各成分を個別の反応管または反応容器中、または個別のビーズまたは微粒子上に固定することができる。
【０１５７】
オリゴヌクレオチドの固体状態の基質への固定方法は十分に確立されている。オリゴヌクレオチド（アドレスプローブおよび検出プローブが含まれる）を、確立されたカップリング法を使用して基質にカップリングすることができる。例えば、適切な付着方法は、Ｐｅａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１（１１）：５０２２−５０２６（１９９４）およびＫｈｒａｐｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（Ｍｏｓｋ）（ＵＳＳＲ）２５：７１８−７３０（１９９１）に記載されている。カゼイン被覆スライド上の３’−アミンオリゴヌクレオチドの固定方法は、Ｓｔｉｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：６３７９−６３８３（１９９５）に記載されている。オリゴヌクレオチドの固体状態の基質への有用な付着方法は、Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：５４５６−５４６５（１９９４）に記載されている。
【０１５８】
固体支持体上に固定した各成分（例えば、リボスイッチ、トリガー分子、または他の分子）を、固体支持体の異なる所定の領域に配置することができる。異なる位置は、異なる反応チャンバーであり得る。異なる所定の領域それぞれを、相互の異なる領域から物理的に分離することができる。固体支持体の異なる所定の領域の間の距離は、固定されていても変化しても良い。例えば、アレイでは、各成分を、相互に固定した距離に配置することができる一方で、ビーズに会合した成分は固定した空間的関係にない。特に、複数の固体支持体単位（例えば、複数のビーズ）の使用により、距離が変化する。
【０１５９】
成分を、任意の密度で固体支持体上に会合または固定することができる。成分を、立方センチメートルあたり４００種を超える異なる成分を含む密度で固体支持体に固定することができる。成分アレイは、多数の成分を有することができる。例えば、アレイは、固体支持体上に固定した少なくとも１，０００種の異なる成分、固体支持体上に固定した少なくとも１０，０００種の異なる成分、固体支持体上に固定した少なくとも１００，０００種の異なる成分、または固体支持体上に固定した少なくとも１，０００，０００種の異なる成分を有することができる。
【０１６０】
Ｎ．キット
上記の材料および他の材料を、開示の方法の実施または実施の補助に有用なキットとして任意の適切な組み合わせで一緒に包装することができる。所与のキット中のキット構成成分を、開示の方法で一緒に使用するためにデザインおよび適合することが有用である。例えば、化合物検出のためのキット、１つまたは複数のバイオセンサーリボスイッチを含むキットを開示する。キットはまた、リボスイッチの活性化の検出のための試薬および標識を含むことができる。
【０１６１】
Ｏ．混合物
開示の方法の実施または実施のための調製によって形成された混合物を開示する。例えば、リボスイッチおよびトリガー分子を含む混合物を開示する。
【０１６２】
方法が組成物、または成分、または試薬の混合または接触を含むときはいつでも、方法の実施により、多数の異なる混合物が作製される。例えば、方法が３つの混合工程を含む場合、工程を個別に実施する場合にこれらの各工程後に固有の混合物が形成される。さらに、工程の実施方法と無関係に、全工程の完了時点に混合物が形成される。本開示は、開示の方法の実施によって得られたこれらの混合物および任意の開示の試薬、組成物、または成分（例えば、本明細書中に開示）を含む混合物を意図する。
【０１６３】
Ｐ．系
開示の方法の実施または実施における補助に有用な系を開示する。系は、一般に、構造、機械、およびデバイスなどならびに組成物、化合物、材料などの製品の組み合わせを含む。開示または開示から明らかなかかる組み合わせを意図する。例えば、バイオセンサーリボスイッチ、固体支持体、および信号読み取りデバイスを含む系を開示および意図する。
【０１６４】
Ｑ．データ構造およびコンピュータ制御
開示の方法で使用されるか、開示の方法によって生成されるか、開示の方法から生成されるデータ構造を開示する。データ構造は、一般に、組成物または媒体中に回収され、組織化され、保存され、そして／または統合された任意の形態のデータ、情報、および／またはオブジェクトである。電子的形態（ＲＡＭ中または保存ディスク上など）で保存されたリボスイッチ構造および活性化の測定値は、１つのデータ構造型である。
【０１６５】
開示の方法、その任意の一部、またはその調製を、コンピュータ制御によって調節、管理、または支援することができる。かかるコンピュータ制御を、コンピュータ制御されたプロセスまたは方法によって実施することができ、データ構造を使用および／または生成することができ、コンピュータプログラムを使用することができる。かかるコンピュータ制御、コンピュータ制御されたプロセス、データ構造、およびコンピュータプログラムが意図され、本明細書中に開示されると理解すべきである。
方法
ＲＮＡのプロセシングに影響を及ぼす方法であって、ＲＮＡにリボスイッチを含む構築物を導入する工程であって、リボスイッチがＲＮＡのスプライシングを調節することができ、スプライシングの調節がＲＮＡのプロセシングに影響を及ぼす、導入工程を含む方法を本明細書中に開示する。リボスイッチは、例えば、オルタナティブスプライシングを調節することができる。リボスイッチは、アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含むことができ、アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインが非相同である。リボスイッチはＲＮＡのイントロンにあり得る。リボスイッチを、トリガー分子（ＴＰＰなど）によって活性化することができる。リボスイッチは、ＴＰＰ応答性リボスイッチであり得る。リボスイッチは、オルタナティブスプライシングを活性化することができる。リボスイッチは、オルタナティブスプライシングを抑制することができる。スプライシングは非天然で起こり得る。オルタナティブスプライシング調節を有するアプタマー領域は、例えば、ループ５中に見出すことができる。オルタナティブスプライシング調節を有するアプタマー領域は、例えば、ステムＰ２中にも見出すことができる。スプライス部位は、例えば、アプタマーの５’末端に対して−１３０と−１６０との間の位置に存在することができる。
【０１６６】
「ＲＮＡスプライシングの調節」は、ＲＮＡのスプライシングを調節し、それにより、異なるｍＲＮＡ分子、潜在的には（しかし、常にではない）、異なるタンパク質を形成することができるリボスイッチを意味する。リボスイッチは、例えば、オルタナティブスプライシングを調節することができる。「ＲＮＡプロセシングに影響を及ぼす」は、ＲＮＡプロセシングに影響を及ぼし、それにより、異なるｍＲＮＡ分子を形成させ、潜在的に（必ずではないが）ＲＮＡ発現を変化させることができるリボスイッチを意味する。リボスイッチは、例えば、転写終結、ＲＮＡの３’末端の形成、またはＲＮＡのポリアデニル化を調節することができる。
【０１６７】
ＲＮＡのスプライシングを調節し、そして／またはＲＮＡプロセシングに影響を及ぼすリボスイッチを活性化、非活性化、または遮断する方法をさらに開示する。かかる方法は、例えば、リボスイッチと、リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断することができる化合物またはトリガー分子とを接触させる工程を含むことができる。リボスイッチは、トリガー分子の結合または除去によって遺伝子発現を調節するように機能する。化合物を使用して、リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断することができる。リボスイッチのトリガー分子（ならびに他の活性化化合物）を使用して、リボスイッチを活性化することができる。トリガー分子以外の化合物を使用して、一般に、リボスイッチを非活性化または遮断することができる（ＴＰＰなど）。リボスイッチを、例えば、リボスイッチの存在からのトリガー分子の除去によって非活性化することもできる。したがって、開示のリボスイッチの非活性化方法は、例えば、リボスイッチの存在または接触からトリガー分子（または他の活性化化合物）を除去する工程を含むことができる。リボスイッチを、例えば、リボスイッチを活性化しないトリガー分子のアナログの結合によって遮断することができる。
【０１６８】
化合物のＲＮＡ分子との接触によってスプライシングを調節するリボスイッチをＲＮＡ分子が含む、ＲＮＡ分子の発現またはＲＮＡ分子をコードする遺伝子の発現を変化させる方法も開示する。リボスイッチは、例えば、ＲＮＡ分子のオルタナティブスプライシングを調節し、そして／またはＲＮＡ分子のプロセシングに影響を及ぼすことができる。リボスイッチは、トリガー分子の結合または除去によって遺伝子発現を調節するように機能する。したがって、リボスイッチを含む目的のＲＮＡ分子を、リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断する条件に供して、ＲＮＡの発現を変化させるために用いることができる。例えば、転写の終結またはＲＮＡへのリボゾーム結合の遮断の結果として発現を変化させることができる。トリガー分子の結合は、リボスイッチの性質および生じるスプライシングまたはプロセシングの型に応じて、ＲＮＡ分子の発現を減少または防止することができるか、またはＲＮＡ分子の発現を促進または増加することができる。
【０１６９】
リボスイッチの活性化、非活性化、または遮断によってスプライシングを調節するリボスイッチを含む天然に存在する遺伝子またはＲＮＡの発現を調節する方法も開示する。リボスイッチは、例えば、ＲＮＡのオルタナティブスプライシング（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｉｃｉｎｇ）を調節することができる。遺伝子がこの遺伝子を保有する細胞または生物の生存に不可欠である場合、リボスイッチの活性化、非活性化、または遮断により、細胞または生物が死滅、静止、または衰弱し得る。例えば、植物の生存に不可欠な天然に存在する遺伝子中の天然に存在するリボスイッチの活性化により、植物が死滅することがある（リボスイッチの活性化がオルタナティブスプライシングを調節し、そして／またはＲＮＡプロセシングに影響を及ぼし、それにより、極めて重要なタンパク質を上方制御または下方制御する場合）。
【０１７０】
スプライシングを調節するリボスイッチを活性化、非活性化、または遮断することができる化合物を選択および同定する方法も開示する。リボスイッチは、例えば、オルタナティブスプライシング（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｉｃｉｎｇ）を調節することができる。リボスイッチの活性化は、トリガー分子の結合の際のリボスイッチの状態の変化をいう。リボスイッチを、トリガー分子以外の化合物およびトリガー分子の結合以外の方法で活性化することができる。用語トリガー分子を、本明細書中で、リボスイッチを活性化することができる分子および化合物をいうために使用する。これには、リボスイッチおよびリボスイッチを活性化することができる他の化合物のための天然または通常のトリガー分子が含まれる。天然または通常のトリガー分子は、所与の天然のリボスイッチのトリガー分子またはいくつかの非天然リボスイッチの場合、リボスイッチがデザインされるか、リボスイッチが選択される（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択技術またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化技術など）トリガー分子である。非天然トリガー分子を、非天然トリガー分子ということができる。
【０１７１】
スプライシングを調節し、そして／またはＲＮＡプロセシングに影響を及ぼすリボスイッチを活性化、非活性化、または遮断する化合物を同定する方法も開示する。例えば、リボスイッチを活性化する化合物を、試験化合物とリボスイッチとの接触およびＲＮＡのスプライシングおよび／またはプロセシングの測定によるリボスイッチの活性化の評価、またはスプライシング事象および／またはプロセシング事象の結果として発現された異なるタンパク質レベルの測定によって、同定することができる。リボスイッチが活性化される場合、試験化合物を、リボスイッチを活性化する化合物と同定する。リボスイッチの活性化を、任意の適切な様式で評価することができる。例えば、リボスイッチをレポーターＲＮＡに連結することができ、レポーターＲＮＡの発現、発現レベル、または発現レベルの変化を、試験化合物の存在下および非存在下で測定することができる。別の例として、リボスイッチは、高次構造依存性標識（リボスイッチの活性化状態に応じて変化するシグナル）を含むことができる。かかるリボスイッチは、好ましくは、天然に存在するリボスイッチに由来するか、これから誘導したアプタマードメインを使用する。認められるように、調節アッセイまたは測定を使用するかあるいは調節アッセイまたは測定を使用しないで、リボスイッチ活性化の評価を実施することができる。リボスイッチを非活性化する化合物の同定方法を、類似の方法で行うことができる。
【０１７２】
本明細書中の他の場所に開示の方法に加えて、スプライシングを調節し、そして／またはＲＮＡプロセシングに影響を及ぼすリボスイッチを遮断する化合物の同定を、任意の適切な様式で行うことができる。例えば、リボスイッチを活性化または非活性化することが公知の化合物の存在下および試験化合物の存在下でリボスイッチの活性化または非活性化を評価するためのアッセイを行うことができる。試験化合物の非存在下において認められないのと同様に活性化または非活性化が認められない場合、試験化合物を、リボスイッチの活性化または非活性化を遮断する化合物と同定する。
【０１７３】
オルタナティブスプライシングを調節するバイオセンサーリボスイッチを使用した化合物の検出方法も開示する。本方法は、試験サンプルとバイオセンサーリボスイッチとを接触させる工程およびバイオセンサーリボスイッチの活性化を評価する工程を含むことができる。バイオセンサーリボスイッチの活性化は、試験サンプル中のバイオセンサーリボスイッチのためのトリガー分子の存在を示す。バイオセンサーリボスイッチは、その同系トリガー分子の存在下で検出可能なシグナルを産生する操作されたリボスイッチである。有用なバイオセンサーリボスイッチを、トリガー分子の閾値レベルまたは閾値レベルを超えて誘発することができる。バイオセンサーリボスイッチを、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの使用のためにデザインすることができる。例えば、オルタナティブ結合を調節するバイオセンサーリボスイッチを、細胞または生物にリボスイッチ／レポーターＲＮＡをコードする核酸構築物を保有させるように操作することによってｉｎ  ｖｉｖｏで使用することができるシグナルとしての機能を果たすかシグナル産生に関与するタンパク質をコードするレポーターＲＮＡに作動可能に連結することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用するバイオセンサーリボスイッチの例は、高次構造依存性標識（リボスイッチの活性化状態に応じて変化するシグナル）を含むリボスイッチである。かかるバイオセンサーリボスイッチは、好ましくは、天然に存在するＴＰＰリボスイッチに由来するか誘導したアプタマードメインを使用する。
【０１７４】
リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断する化合物の同定および同定された化合物の製造によって作製された化合物も開示する。例えば、本明細書中の他所に開示の化合物同定方法と同定された化合物の製造方法との組み合わせにより、これを行うことができる。例えば、試験化合物とリボスイッチとの接触工程、リボスイッチの活性化の評価工程、および試験化合物によってリボスイッチが活性化された場合の化合物としてのリボスイッチを活性化する試験化合物の製造工程によって化合物を作製することができる。
【０１７５】
化合物によるリボスイッチの活性化、非活性化、または遮断のチェック工程およびチェックした化合物の製造工程によって作製された化合物も開示する。例えば、本明細書中の他所に開示したように化合物の活性化、非活性化、または遮断の評価方法とチェックした化合物の製造方法との組み合わせによってこれを行うことができる。例えば、試験化合物とリボスイッチとの接触工程、リボスイッチ活性化の評価工程、および試験化合物によってリボスイッチが活性化された場合の化合物としてのリボスイッチを活性化する試験化合物の製造工程によって化合物を作製することができる。化合物がリボスイッチを活性化、非活性化、または遮断する能力についての化合物のチェックは、リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断することを以前に知られていない化合物の同定および化合物がリボスイッチを活性化、非活性化、または遮断することが既に知られていた場合のリボスイッチを活性化、非活性化、または遮断する化合物の能力の評価の両方をいう。
【０１７６】
化合物の非存在下での同一のリボスイッチアッセイと比較して（すなわち、コントロールアッセイと比較して）、化合物の存在下のリボスイッチアッセイにおけるシグナルが少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、５０％、７５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、４００％、または５００％増加する場合に、化合物がリボスイッチを活性化すると同定することができるか、リボスイッチ活性化活性を有すると決定することができる。リボスイッチアッセイを、任意の適切なリボスイッチ構築物を使用して行うことができる。リボスイッチ活性化アッセイに特に有用なリボスイッチ構築物を、本明細書中の他所に記載している。１つまたは複数の特定のリボスイッチ、リボスイッチ構築物、またはリボスイッチクラスに関して、化合物を、リボスイッチを活性化するかリボスイッチ活性化活性を有すると同定することができる。便宜上、オルタナティブスプライシングを調節するリボスイッチを活性化すると同定された化合物を、そのように特定のリボスイッチについて同定することができる。
【実施例】
【０１７７】
Ａ．（実施例１）ｍＲＮＡのオルタナティブ３’末端プロセシングによる植物における遺伝子発現のリボスイッチ調節
生物の３つ全てのドメイン由来の生物で見出される最も一般的なリボスイッチクラスは、ビタミンＢ１の誘導体である補酵素チアミンピロリン酸（ＴＰＰ）に反応する。ＴＰＰリボスイッチが試験した全植物種のチアミン生合成遺伝子ＴＨＩＣの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）中に存在することが発見された。ＴＨＩＣ  ＴＰＰリボスイッチは、オルタナティブな３’ＵＴＲ長を有する転写物の形成を調節し、ｍＲＮＡの安定性およびタンパク質産生に影響を及ぼす。オルタナティブ３’末端プロセシングのリボスイッチ媒介性調節がＴＨＩＣ発現のＴＰＰ依存性フィードバック調節に重要であることが証明されている。データにより、ＲＮＡ折り畳みの代謝産物依存性の変化がｍＲＮＡのスプライシングおよびオルタナティブ３’末端プロセシングを調節する機構が明らかとなる。これらの所見は植物中のリボスイッチによる代謝産物検知の重要性を強調し、真核生物における遺伝子調節機構としてのオルタナティブ３’末端プロセシングの有意性をさらに明らかにする。
【０１７８】
リボスイッチは、典型的には伝令ＲＮＡの非コード部分に存在する代謝産物検知遺伝子調節エレメントである。これまで、細菌において１２の構造クラスのリボスイッチが、小さな有機化合物（補酵素、アミノ酸、およびヌクレオチド塩基が含まれる）（Ｍａｎｄａｌ  ａｎｄ  Ｂｒｅａｋｅｒ，２００４；Ｓｏｕｋｕｐ  ａｎｄ  Ｓｏｕｋｕｐ，２００４；Ｗｉｎｋｌｅｒ  ａｎｄ  Ｂｒｅａｋｅｒ，２００５；Ｆｕｃｈｓら，２００６；Ｒｏｔｈら，２００７）またはマグネシウムイオン（Ｃｒｏｍｉｅら，２００６）を検知すると特徴づけられている。ほとんどの例では、リボスイッチを、アプタマーおよび発現プラットフォーム領域に分けることができ、これらは、それぞれリガンド結合および遺伝子調節を担う２つの機能的に異なるが通常は物理的に重複したドメインを示す。
【０１７９】
アプタマーによって形成された構造の複雑さおよびそのリガンド認識機構は、いくつかのリボスイッチクラス（グアニンおよびアデニン（Ｂａｔｅｙら，２００４；Ｓｅｒｇａｎｏｖら，２００４）、Ｓ−アデノシルメチオニン（Ｍｏｎｔａｎｇｅ  ａｎｄ  Ｂａｔｅｙ，２００６）、ＴＰＰ（Ｅｄｗａｒｄｓ  ａｎｄ  Ｆｅｒｒｅ−Ｄ’Ａｍａｒｅ，２００６；Ｓｅｒｇａｎｏｖら，２００６；Ｔｈｏｒｅら，２００６）、およびグルコサミン−６−リン酸（Ｋｌｉｎｅ  ａｎｄ  Ｆｅｒｒｅ−Ｄ’Ａｍａｒｅ，２００６；Ｃｏｃｈｒａｎｅら，２００７）に結合するクラスが含まれる）についてのＸ線結晶学によって解明された原子分解能モデル試験で明らかである。各アプタマークラスのリガンド結合コアおよび支持構造のヌクレオチド配列は、たった４つのヌクレオチド型を使用して特異的リガンドのための正確な受容体を形成する必要があることの結果として、異なる種間で高度に保存されている。対照的に、リボスイッチの発現プラットフォームは、種間または１つの生物における複数の代表的なリボスイッチクラスの間でさえも非常に変化し得る。
【０１８０】
高レベルのアプタマー保存により、研究者は、新規のリボスイッチ候補を同定するため（例えば、Ｇｒｕｎｄｙ  ａｎｄ  Ｈｅｎｋｉｎ，１９９８；Ｇｅｌｆａｎｄら，１９９９；Ｂａｒｒｉｃｋら，２００４；Ｃｏｒｂｉｎｏら，２００５；Ｗｅｉｎｂｅｒｇら，２００７）および種々の生物における公知のリボスイッチクラスの分布を決定するため（例えば、Ｒｏｄｉｏｎｏｖら，２００２；Ｖｉｔｒｅｓｃｈａｋら，２００３；Ｎａｈｖｉら，２００４；Ａｂｒｅｕ−Ｇｏｏｄｇｅｒ  ａｎｄ  Ｍｅｒｉｎｏ，２００５）にバイオインフォマティクス法を使用することが可能である。今まで、これらの研究により、ＴＰＰ検知リボスイッチクラスのメンバーのみが生物の３つ全てのドメインに存在することが明らかとなっている（Ｓｕｄａｒｓａｎら，２００３）。真核生物では、ＴＰＰアプタマーは、植物および糸状菌由来のチアミン代謝遺伝子中で見出されたが、リボスイッチ機能の機構は依然として推測のままであった（Ｋｕｂｏｄｅｒａら，２００３；Ｓｕｄａｒｓａｎら，２００３）。真菌Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａでは、ＴＰＰアプタマーはＮＭＴ１  ｍＲＮＡの５’領域内のイントロン中に存在し、最近、該アプタマーによるＴＰＰ結合がオルタナティブスプライシングの調節によってＮＭＴ１遺伝子発現を調節することが示されている（Ｃｈｅａｈら，２００７）。具体的には、リボスイッチによるＴＰＰ結合により、上流読み取り枠（主なＯＲＦの発現を不可能にするｕＯＲＦ）を保有するイントロン配列の除去が防止される。
【０１８１】
ＴＰＰリボスイッチが種々の植物種中に認められ、チアミン代謝遺伝子ＴＨＩＣの３’ＵＴＲ中に存在することを本明細書中に報告する。オルタナティブな３’ＵＴＲ長を有するＴＨＩＣ転写物の形成は、リボスイッチ機能に依存し、細胞ＴＰＰレベルの変化に応答してＴＨＩＣ発現のフィードバック調節を媒介する。データは、３’ＵＴＲ長が転写物の安定性と相関し、それにより、オルタナティブ３’末端プロセシングによる遺伝子調節の基盤が確立されることを示す。植物におけるＴＰＰリボスイッチ機能の詳細な機構を示し、この機構は、ＴＨＩＣ  ｍＲＮＡのスプライシングおよび差分的３’末端プロセシングのアプタマー媒介性調節を含む。本研究は、生物の異なるドメイン由来の生物におけるリボスイッチ調節の多用途性をさらに明らかにし、これまで知られていなかった真核生物遺伝子調節の態様における本発明者らの知識を広げる。
１．結果と考察
ｉ．ＴＰＰアプタマーは植物種で広範に分布する。
【０１８２】
植物種Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ、およびＰｏａ  ｓｅｃｕｎｄａ由来のＴＨＩＣ遺伝子の３’ＵＴＲ中に高度に保存されたＴＰＰ結合アプタマーが存在することが以前に報告されている（Ｓｕｄａｒｓａｎら，２００３）。代表的な植物ＴＰＰアプタマー群を、さらなる植物種由来のＴＨＩＣ遺伝子の配列決定およびＴＰＰアプタマーコンセンサスに従うヌクレオチド配列のデータベース検索によって拡大した。ｃＤＮＡ配列を得た後、各種のゲノムＤＮＡ由来の対応する領域をクローン化し、配列決定し（詳細については、実験手順を参照のこと）、したがって、初期およびプロセシングされたｍＲＮＡ分子の両方の配列が得られる。
【０１８３】
植物由来の全ての利用可能なＴＰＰアプタマー配列のアラインメントにより、高レベルのヌクレオチド配列保存およびステムＰ１〜Ｐ５からなる二次構造が明らかとなる（図１Ａ）。植物（図１Ｂ）および糸状菌（Ｃｈｅａｈら，２００７）由来の真核生物ＴＰＰリボスイッチアプタマーをその細菌および古細菌の対応物（図１Ｃ）（Ｗｉｎｋｌｅｒら，２００２；Ｒｏｄｉｏｎｏｖら，２００２）と比較した場合の主な相違点は、代表的な細菌で頻繁に存在するＰ３ａステムが一貫して存在しないことおよび真核細胞におけるＰ３ステムの長さが可変であることである。いずれの領域もＴＰＰ結合に関与せず（Ｅｄｗａｒｄｓ  ａｎｄ  Ｆｅｒｒｅ−Ｄ’Ａｍａｒｅ，２００６；Ｓｅｒｇａｎｏｖら，２００６；Ｔｈｏｒｅら，２００６；Ｃｈｅａｈら，２００７）、したがって、これらの相違はリガンド結合特異性に影響を及ぼさないはずである。
【０１８４】
ＴＰＰアプタマーは、単子葉植物、双子葉植物、および針葉樹Ｐｉｎｕｓ  ｔａｅｄａ由来の全ての公知のＴＨＩＣの例の３’ＵＴＲ中に見出される。興味深いことに、蘚類Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓでは、ＴＰＰアプタマーはＴＨＩＣの３’ＵＴＲ中に存在し（Ｐｐａ１）、チアミン生合成遺伝子ＴＨＩ４に相同な２つの遺伝子の３’領域中にも存在する（Ｐｐａ２、Ｐｐａ３）。この後者の所見および真菌が複数の異なる遺伝子に関連するＴＰＰアプタマーも有するという所見（Ｃｈｅａｈら，２００７）は、真核生物が種々の濃度の重要な代謝産物に応答して複数の遺伝子を調節するために同一のリボスイッチクラスのバリアントを使用する可能性が高いことを示す。
【０１８５】
植物由来のＴＰＰアプタマーの特筆すべき特徴は、高レベルのヌクレオチド配列保存である。約８０％のヌクレオチド（Ｐ３ステムを除く）は、全ての植物例で保存されている。対照的に、糸状菌では４０％未満が保存されている。植物ＴＰＰアプタマー間のほとんどの相違はＰ３ステム中で見出され、長さおよび配列の両方が変化する。また、Ｐ３ステムの長さは、Ｐ．ｐａｔｅｎｓ（図１Ａ）で認められるように、同種の代表的なＴＰＰアプタマー間で変化する。ＴＨＩＣ中の伸長したＰ３ステムおよびＴＨＩ４中の非常に短いＰ３ステムの両方の存在により、このアプタマー成分の種特異的要件が存在しないことが示唆される。
ｉｉ． ＴＨＩＣ  ３’ＵＴＲは長さおよび配列が変化する
６つの植物種からクローン化したかＧｅｎＢａｎｋ（Ｏ．ｓａｔｉｖａ）から得たＴＨＩＣ  ｍＲＮＡの３’領域のヌクレオチド配列を分析した（図８；詳細については実験手順も参照のこと）。興味深いことに、ＴＨＩＣ遺伝子の３’領域のゲノム組成はこれら７つの種で保存されており、種々の３’ＵＴＲ長を有する３つの主なプロセシングＲＮＡ転写物型の形成を常に見出される（図２Ａ）。ＴＨＩＣ  ＯＲＦの終止コドンに、一般に、典型的には３つ全てのＲＮＡ型でスプライスするイントロンが続く。Ｉ型（ＴＨＩＣ−Ｉ）ＲＮＡは、完全なアプタマーを保有し、その３’末端で種々の長さに伸長することができる。ＩＩＩ型（ＴＨＩＣ−ＩＩＩ）ＲＮＡは、ＴＰＰアプタマーの一部を除去する別のイントロンのスプライシング後のＩ型に対応するのに対して、ＩＩ型（ＴＨＩＣ−ＩＩ）ＲＮＡは、アプタマーの上流で終結する。
【０１８６】
これらの種のＴＨＩＣ  ３’ＵＴＲ内の種々の領域（１〜６と指定する）の長さの定量により、いくつかの領域（２〜５）がＵＴＲ内の重要な特徴を橋渡しするヌクレオチドの数を非常に保存していることが明らかになる（図２Ｂ）。対照的に、第１のイントロン（領域１）の長さならびにＴＨＩＣ−ＩおよびＴＨＩＣ−ＩＩＩのほとんどの３’部分（領域６）の長さは高度に変化する。例えば、ＴＨＩＣ−ＩおよびＴＨＩＣ−ＩＩＩは、その３’末端で１ｋｂを超えて伸長することができる。一定の特徴的な３’ＵＴＲの間の距離の保存は、ＴＰＰ媒介性遺伝子調節に重要であり得る。
【０１８７】
逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して、ＴＨＩＣ転写物型の量を定量することができる。ポリＴプライマーおよびＴＨＩＣ  ＯＲＦに特異的なプライマー（全ＴＨＩＣ転写物型を増幅する）を使用したＲＴ−ＰＣＲにより、ＴＨＩＣ−ＩＩが主に増幅する（図２Ｃ）。これは、短い転写物の形態が試験した全種で最も豊富であることを証明する。ＴＨＩＣ  ｍＲＮＡのコード領域に結合するプローブを使用したノーザンブロット分析により、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ由来のＴＨＩＣ−ＩＩのサイズに対応する１つの主なシグナルも得られる（以下のさらなる考察を参照のこと）。
【０１８８】
ＴＨＩＣ−ＩおよびＴＨＩＣ−ＩＩＩを、伸長した３’領域に特異的であり、且つＴＨＩＣ−ＩＩ  ＲＮＡを認識しない逆方向プライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲによって検出した（図２Ｄ）。各種の最も低いＰＣＲ産物バンドがＴＨＩＣ−ＩＩＩに対応するのに対して、さらなるバンドは３’ＵＴＲの一方または両方のイントロンが依然として保持されているＴＨＩＣ−Ｉに由来する産物を示すか、少数のスプライシングバリアントを示す。Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ由来のＴＨＩＣ−ＩおよびＴＨＩＣ−ＩＩＩの３’ＵＴＲに特異的なプローブを使用したノーザンブロット分析により、これらの転写物型が低コピー数で存在することが確認され（以下のさらなる考察を参照のこと）、転写物の長さの不均一性も明らかとなった。
【０１８９】
３’末端プロセシングがＡ．ｔｈａｌｉａｎａの種々の転写物型で異なるかどうかを評価するために、転写物の特異的領域を増幅可能なプライマーを使用してＲＴ−ＰＣＲを行った。ポリＴまたはランダムヘキサマープライマーのいずれかを使用して生成したｃＤＮＡは、ＴＨＩＣ−ＩＩ（データ示さず）およびＴＨＩＣ−ＩＩＩの増幅の相違を示さなかった（図２Ｅ）。しかし、ＴＨＩＣ−Ｉ  ＰＣＲ産物の相対存在量は、ポリＴ由来ｃＤＮＡと比較して、ランダムヘキサマープライマーを使用して生成したｃＤＮＡからの増幅後に非常に増加した（図２Ｅ）。これは、ほとんどのＴＨＩＣ−Ｉ  ＲＮＡがポリアデニル化されず、それにより、非プロセシングＴＨＩＣ前駆体転写物を示すことを示す。また、アプタマー配列のはるか下流に結合するプライマーを使用して生成したｃＤＮＡはＰＣＲ増幅産物を生成した（図２Ｅ）。これは、ＴＨＩＣ−ＩおよびＴＨＩＣ−ＩＩＩがＡ．ｔｈａｌｉａｎａにおけるＴＨＩＣの注釈付き末端の１ｋｂを超えて下流を伸長することができることを示す。非常に長い３’ＵＴＲを有する類似のＴＨＩＣ  ｍＲＮＡも、ＧｅｎＢａｎｋにおける全長ｃＤＮＡ注釈づけにしたがってＯ．ｓａｔｉｖａについて認められた（ＡＫ０６８７０３、ＡＫ０６５２３５、ＡＫ１２０２３８）。長い３’ＵＴＲを有するｍＲＮＡの形成は、３’末端プロセシングおよび転写終結の低下を示す。
ｉｉｉ．チアミンはＴＨＩＣ転写物レベルに影響を及ぼす
ＴＨＩＣ転写物の量を定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を使用して定め、転写物レベルがチアミン濃度の増加に反応するかどうかを考慮した。Ａ．ｔｈａｌｉａｎａの実生に種々の量のチアミンを補足し、異なるＴＨＩＣ転写物型を特定のプライマー組み合わせを使用して検出した。ＴＨＩＣ−ＩＩを増幅するプライマー組み合わせは、第１の３’ＵＴＲイントロンのスプライシングを受けたＴＨＩＣ−Ｉ  ＲＮＡのサブセットに結合することもできる。しかし、後者の増幅産物の寄与は小さい。これは、ポリＴプライマーを使用してｃＤＮＡを生成した場合、ＴＨＩＣ−Ｉ転写物ははるかに少なく、ほとんど検出不可能であるからである（図２Ｅ）。
【０１９０】
１ｍＭチアミンを含む培地上での実生の成長後、ＴＨＩＣ転写物の総量は、チアミンを補足せずに実生を成長させた場合に測定した総量の約２０％に低減する（図３Ａ）。ＴＨＩＣ−ＩＩ転写物は同等の低減を示すが、ＴＨＩＣ−Ｉ転写物およびＴＨＩＣ−ＩＩＩ転写物の両方は、コピー数がほとんどまたは全く変化しない。同一サンプルのノーザンブロット分析を使用して、ＴＨＩＣ−ＩＩレベルが減少し、ＴＨＩＣ−Ｉ量が比較的不変であり、ＴＨＩＣ−ＩＩＩ  ＲＮＡレベルが比較的不変であることが確認された（図３Ｂ）。
【０１９１】
転写レベルのチアミン媒介変化が起こる時間間隔を、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａの実生へのチアミン溶液の噴霧後のいくつかの時点でＴＨＩＣ転写物のｑＲＴ−ＰＣＲを行うことによって評価した（図３Ｃ）。チアミン適用の４時間後、総ＴＨＩＣ  ＲＮＡおよびＴＨＩＣ−ＩＩ量は、チアミンを添加しないで測定した量の５０％に低減した。２６時間後、これらのレベルはなおさらに減少した。興味深いことに、チアミンを培地に添加した場合のこの分析で観察される小さなＴＨＩＣ−ＩＩＩの増加（図３Ａ）は、反応初期でより顕著である。異なる転写物型がチアミン処理に対して逆の反応を示すので、調節機構はＲＮＡプロセシングに関与する可能性が最も高く、フィードバック機構がプロモーター調節レベルで作用しそうにない。実際、トランスジェニック系においてＡ．ｔｈａｌｉａｎａ由来のＴＨＩＣプロモーターによって駆動するレポーター遺伝子の発現は、チアミン補足後に変化しなかった（図９）。
【０１９２】
細胞に取り込まれるほとんどのチアミンは、連続的リン酸化反応によってＴＰＰに変換して、この補酵素の濃度が非リン酸化ビタミン濃度よりはるかに高くなると予想される（Ａｊｊａｗｉら，ｉｎ  ｐｒｅｐ）。したがって、植物アプタマーへのＴＰＰ結合が起こることが知られていることを考慮すると、認められた総ＴＨＩＣ  ＲＮＡレベルの減少は、ほぼ確実に、ＴＰＰ濃度の増加に対するリボスイッチ媒介性応答を反映する（Ｓｕｄａｒｓａｎら，２００３；Ｔｈｏｒｅら，２００６）。この場合、ＴＰＰ濃度が、チアミンを補足しない培地で成長した植物中のＴＰＰ濃度と比較して減少する場合、逆効果が生じるはずである（リボスイッチのダイナミックレンジがこのＴＰＰ濃度範囲に及ぶと予想される）。
【０１９３】
これを、野生型（ＷＴ）Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ植物におけるＴＨＩＣ発現とチアミンピロホスホキナーゼ（ＴＰＫ）のダブルノックアウトを保有する植物のＴＨＩＣ発現との比較によって試験した。これらの変異体は、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａに存在する両ＴＰＫイソ型で欠損し、したがって、チアミンをＴＰＰに変換できない（Ａｊｊａｗｉら，ｉｎ  ｐｒｅｐ）。ＴＰＫダブルノックアウト（ＴＰＫ−ＫＯ）植物が発芽２週間以内に種子中の貯蔵されたＴＰＰを大半消耗し、植物がその生活環を完了するためにＴＰＰ補足に依存することが示されている（Ａｊｊａｗｉら，ｉｎ  ｐｒｅｐ）。予想通り、１２日齢ＴＰＫ−ＫＯ実生由来のＴＨＩＣ  ＲＮＡのｑＲＴ−ＰＣＲ分析により、ＷＴと比較してＴＨＩＣ−ＩＩ量が増加し、ＴＨＩＣ−ＩＩＩが顕著に減少することが明らかとなる（図３Ｄ）。
【０１９４】
実生におけるＴＨＩＣ発現が典型的な明暗周期から連続光までの植物の移行後に保持される概日リズムに続いて起こり、このリズムはチアミン処置に影響を受けないことに注目すべきである（図１０）。総ＴＨＩＣ  ＲＮＡおよびＴＨＩＣ−ＩＩＩの両方について、同一のリズム段階（ｒｈｙｔｈｍ  ｐｈａｓｅ）が認められた。これは、リボスイッチ媒介性フィードバック調節がＴＨＩＣ発現の概日リズムに影響を及ぼさないことを証明する。
ｉｖ．３’ＵＴＲの長さが遺伝子発現レベルを規定する
異なるＴＨＩＣ  ＲＮＡ型の存在および種々のチアミンレベルに応答したその存在量の変化により、ＴＰＰアプタマーがＲＮＡプロセシングを調節し得、異なる３’ＵＴＲを有する転写物が差分的に発現し得ることが示唆される。Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ由来の全長アプタマーが約５０ｎＭの見かけ上の解離定数（ＫＤ）でＴＰＰに結合し（Ｓｕｄａｒｓａｎら，２００３）、その三次構造（Ｔｈｏｒｅら，２００６）が細菌ＴＰＰアプタマーの三次構造と類似することが以前に示されている（Ｅｄｗａｒｄｓ  ａｎｄ  Ｆｅｒｒｅ−Ｄ’Ａｍａｒｅ，２００６；Ｓｅｒｇａｎｏｖら，２００６）。前駆体ＲＮＡ（ＴＨＩＣ−Ｉ）は完全なアプタマーを保有し、したがって、ＴＰＰに結合すると予想される。
【０１９５】
対照的に、ＴＨＩＣ−ＩＩＩはほとんどのコンセンサスＴＰＰアプタマー配列を含むが、３’ＵＴＲ中の第２のイントロンのスプライシングのために５’末端の最初の７つのヌクレオチドが除去され、異なるヌクレオチドに置換されている（図４Ａ、灰色で影を付けた配列）。インライン探索（Ｓｏｕｋｕｐ  ａｎｄ  Ｂｒｅａｋｅｒ，１９９９）を使用して、この変化したアプタマーがＴＰＰ結合活性を保持するかどうかを決定した。このアッセイは、代謝産物結合の際の自発的ＲＮＡ分解パターンの変化のモニタリングによってＴＰＰアプタマー構造の変化を明らかにするために以前に使用されている（Ｓｕｄａｒｓａｎら，２００３；Ｗｉｎｋｌｅｒら，２００２）。変化したＴＰＰのアプタマーの見かけ上のＫＤは約６０μＭであり（図４Ｂおよび４Ｃ）、これは、リガンド結合親和性が３桁を超えて喪失している。さらに、チアミンは変化したアプタマーに結合せず（データ示さず）、このアプタマーによって他のチアミン誘導体を結合することができる可能性は低い。これは、スプライシングの際に交換されるアプタマー領域はリガンド認識に直接関与しないからである（Ｅｄｗａｒｄｓ  ａｎｄ  Ｆｅｒｒｅ−Ｄ’Ａｍａｒｅ，２００６；Ｓｅｒｇａｎｏｖら，２００６；Ｔｈｏｒｅら，２００６）。これらの所見は、一旦３’ＵＴＲの第２のイントロンのスプライシングが起こると、ＴＨＩＣ−ＩＩＩ中の残りのＴＰＰアプタマーはもはや機能しないことを示す。
【０１９６】
遺伝子発現に及ぼす２つの主なＴＨＩＣ  ３’ＵＴＲ形態の影響の可能性を評価するために、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ由来のＴＨＩＣ−ＩＩ（１８８ｎｔ）およびＴＨＩＣ−ＩＩＩ（４０８ｎｔ）由来の３’ＵＴＲ配列を、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）のコード領域に融合し、これらの構築物を、構成性プロモーターおよびターミネーターエレメントの調節下にて植物中で発現させた。ＴＨＩＣ−ＩＩＩは、３’末端で種々の長さに伸長することができるが、最も豊富で最短のバージョン（ＧｅｎＢａｎｋエントリーＮＭ１７９８０４に対応する）を、発現分析のために使用した。ＴＨＩＣ−ＩＩＩ由来の３’ＵＴＲを含む融合構築物により、ＴＨＩＣ−ＩＩ由来の３’ＵＴＲを保有する構築物と比較して、約１０％のＬＵＣ活性しか得られなかった（図４Ｄ）。ＩＩＩ型構築物中のＴＰＰアプタマーの変化に関与する可能性を、ＴＰＰ結合を完全に無効にするが、ＬＵＣ発現を低下させない変異Ｍ１およびＭ２の導入によって除外した。また、ＴＨＩＣ−ＩＩＩ  ３’ＵＴＲ配列の逆相補配列の使用によってＬＵＣ活性は有意に変化しなかった。これらのデータは、伸長し且つ変化していないＴＰＰアプタマーは、ＩＩＩ型ＲＮＡ由来の３’ＵＴＲを含む構築物の抑制で役割を果たすことを示す。ＬＵＣの代わりにレポーター遺伝子ＥＧＦＰを含む構築物を使用して同等の結果が得られ、サイレンシングサプレッサーＰ１９の同時発現は、認められた相違がレポーターシステムにおけるサイレンシング効果に起因する可能性を排除した（図１１）。
【０１９７】
レポーター活性の相違も転写物量に反映されるのかどうかも評価した。ｑＲＴ−ＰＣＲを使用して、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａまたはＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａのいずれか由来のＴＨＩＣ−ＩＩまたはＴＨＩＣ−ＩＩＩ由来の３’ＵＴＲを含むレポーター構築物の相対量を決定した（図４Ｅ）。両種由来のＩＩＩ型ＲＮＡの長い３’ＵＴＲを含む構築物は、短いＩＩ型３’ＵＴＲを保有した構築物と比較して存在量が低かった。全レポーター構築物が構成性プロモーターおよびターミネーターの調節下で発現したので、転写の開始および終結は全構築物で同一なはずである。
【０１９８】
所見により、長い３’ＵＴＲによって転写物ターンオーバーが増加することが示唆される。したがって、伸長した３’ＵＴＲを有するｍＲＮＡの産生を好むようなＲＮＡプロセシングのリボスイッチ媒介性再指示によってＴＨＩＣ発現が低減するはずである。この仮説は、酵母（Ｍｕｈｌｒａｄ  ａｎｄ  Ｐａｒｋｅｒ，１９９９）および植物（Ｋｅｒｔｅｓｚら，２００６）において長い３’ＵＴＲがナンセンス変異依存分解機構（ＮＭＤ）を誘導することを示す以前の研究と一致する。後者の研究では、３’ＵＴＲの長さとＮＭＤ効率との間に相関関係が認められたように、２００ｎｔを超える３’ＵＴＲ長を有するｍＲＮＡの存在量の低減が認められた。さらに、結果から、この機構がｍＲＮＡの品質監視（ｑｕａｌｉｔｙ  ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ）に関与するだけでなく（Ｆａｓｋｅｎ  ａｎｄ  Ｃｏｒｂｅｔｔ，２００５）、植物における遺伝子発現の調節でも役割を果たすことが示唆される。
ｖ．チアミンフィードバック反応におけるリボスイッチ機能
スプライス修飾ＴＰＰアプタマーがプロセシングされたＴＨＩＣ−ＩＩＩ  ＲＮＡの発現に影響を及ぼさないにもかかわらず、不変ＴＰＰアプタマーは、単独でＴＨＩＣ  ｍＲＮＡ転写物のプロセシングを調節して異なる３’ＵＴＲ長を有するＲＮＡを得ることができるリボスイッチの一部であり得る。安定に形質転換されたＡ．ｔｈａｌｉａｎａ植物におけるＴＨＩＣの完全なゲノム３’領域（終止コドンの約２．２ｋｂ下流）と融合されたＥＧＦＰを含むレポーター構築物の発現の分析によってこれを調査した。チアミン適用により、ロゼット期（ｒｏｓｅｔｔｅ  ｓｔａｇｅ）由来の葉中のＥＧＦＰ蛍光が減少した（図５Ａおよび５Ｂ）。ｑＲＴ−ＰＣＲ分析を使用して、ＥＧＦＰおよび内因性ＴＨＩＣ転写物の両方の量がチアミン供給後のコントロールレベルの約２０％まで低減し（図５Ｃ）、この量はＡ．ｔｈａｌｉａｎａの実生で認められた量と類似する（図３）ことが見出された。
【０１９９】
形質転換体由来のＥＧＦＰ融合物およびＴＨＩＣ転写物の３’ＵＴＲ配列を、ＲＴ−ＰＣＲによって増幅し（図５Ｄおよび５Ｅ）、クローン化し、配列決定した。配列分析により、ＥＧＦＰおよびＴＨＩＣの等価な転写物プロセシング型の形成が確認された（図２も参照のこと）。ＴＨＩＣおよびＥＧＦＰの総転写物量の相違を、導入遺伝子調節のための強力なプロモーターの使用によって説明することができる。レポーター遺伝子構築物とＴＨＩＣとの間のチアミン応答およびプロセシングされたＲＮＡが同一であったので、ＥＧＦＰに融合した領域の上流のさらなる配列が遺伝子調節機構に関与しないと結論づけた。
【０２００】
チアミン調節の影響がＴＰＰリボスイッチによって媒介されるかどうかを決定するために、変異Ｍ２、Ｍ３、およびＭ４をアプタマーに導入して（図６Ａ）、ＴＰＰ結合親和性を低減させた。Ｍ２およびＭ４変異は、ＴＰＰアプタマーのステムＰ５およびＰ２の形成をそれぞれ妨害する。Ｍ３を使用して、ＴＰＰのピリミジン部分との直接相互作用に関与することが公知の３つのヌクレオチド（Ｅｄｗａｒｄｓ  ａｎｄ  Ｆｅｒｒｅ−Ｄ’Ａｍａｒｅ，２００６；Ｓｅｒｇａｎｏｖら，２００６；Ｔｈｏｒｅら，２００６）を変異する。これらのバリアントを保有するＴＨＩＣの３’領域をＥＧＦＰに融合し、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ植物に安定に形質転換した。
【０２０１】
予想通り、変異アプタマーを保有するレポーター遺伝子構築物を含む植物は、ＷＴ構築物と比較して、チアミン適用に対する反応性の低減（Ｍ２）または完全な喪失（Ｍ３およびＭ４）を示す（図６Ｂ）。これらの所見を、ｑＲＴ−ＰＣＲを使用した転写物の相対レベルの測定によって確認した（図６Ｃ）。さらに、Ｐ２形成を修復する（それにより、ＴＰＰ結合が修復される）代償性変異（ｃｏｍｐｅｎｓａｔｏｒｙ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）を含むＭ４のレポーター構築物バリアントは、ＷＴに類似の活性を示す（データ示さず）。これらの結果は、アプタマーによるＴＰＰ結合が細胞におけるＴＰＰレベルの変化に対する応答の媒介に不可欠であることを示す。しかし、Ｍ２構築物によって示された小さなチアミン応答性により、変異体がＴＰＰに対するアプタマーの親和性の減少だけによることなくリボスイッチ機能に影響を及ぼし得ることが示唆される（以下のさらなる考察を参照のこと）。
【０２０２】
ＥＧＦＰ−リボスイッチ融合物から生成されたｍＲＮＡの３’末端のＲＴ−ＰＣＲ分析により、ＷＴ構築物に典型的であるように、変異構築物がＩＩ型ＲＮＡの高い発現レベルを維持することが明らかとなる（図６Ｄ）。しかし、変異体とＷＴリボスイッチとの間のＩ型およびＩＩＩ型ＲＮＡの２つの主な相違は明らかである。第１に、ＩＩＩ型ＲＮＡ量はＭ２構築物で実質的に低減し、Ｍ３構築物から検出不可能であった（図６Ｅ）。第２に、アプタマーのはるか下流に伸長する転写物の相当な減少が両変異体で認められた（図６Ｅ、８８２ｎｔレーン、図５Ｅ中のＷＴも参照のこと）。これらの結果により、適切なリボスイッチ機能が異なる３’ＵＴＲの配列および長さを有するｍＲＮＡの産生に必要であり、この産生により、遺伝子発現がチアミン依存性に下方制御されることが明らかとなる。
ｖｉ．リボスイッチ機能の機構
インライン探索を使用して、どのようにしてＴＰＰリボスイッチがＡ．ｔｈａｌｉａｎａ由来のＴＨＩＣ  ｍＲＮＡの３’末端プロセシングを調節することができるのかを調査した。第２の３’ＵＴＲイントロンの５’スプライス部位の１４ｎｔ上流を含んでいるアプタマー構築物は、スプライス部位のすぐ８ｎｔ上流にＴＰＰ依存性の構造調整を示した（図７Ａ）。具体的には、ＴＰＰ付加により、５’スプライス部位付近のヌクレオチドの構造的柔軟性が増加する。したがって、リガンド結合により、スプライソソームへのスプライス部位の接近性を増大させ、それにより、このイントロンを除去することができる。
【０２０３】
いくつかの植物種由来の５’スプライス部位ヌクレオチドとＴＨＩＣ遺伝子のアプタマーヌクレオチドの調節配列間の塩基対合の潜在性を調査した。試験した全ての種では、Ｐ４−Ｐ５ステムの５’側は、５’スプライス部位のすぐ上流（時折、含まれる）のヌクレオチドに相補的である（図７Ｂ）。この塩基対合の潜在性の保存により、リボスイッチが低ＴＰＰ濃度下で５’スプライス部位をマスクするか、高ＴＰＰ濃度下でスプライス部位を露出する構造の相互排他的形成によってスプライシングを調節することが示唆される（図７Ｃ）。
【０２０４】
このモデルは、本研究で得たｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏデータ（Ｍ２バリアントを使用して認められた部分的チアミン応答性が含まれる）と一致する。Ｍ２は、アプタマーのＰ５ステムを破壊する２つの変異を保有し（図６Ａ）、これらの変異はそのＴＰＰとの相互作用を弱めてチアミン応答性を破壊するはずである。しかし、これらの変異は５’スプライス部位領域との塩基対合も弱め、それにより、ＴＰＰ親和性の低減が予想されるにもかかわらず、ＴＰＰ結合がこのオルタナティブ対合と有効に競合し得る。植物ＴＰＰリボスイッチの１つの注目に値する特徴は、リボスイッチ調節下の５’スプライス部位がＴＰＰアプタマー中の相補領域の２００ｎｔを超えて上流に存在するという点である（図２Ａ）。相補領域間の配列の複雑な構造的構成（図１２）は、これらの部位がその相互作用を容易にするために空間的に接近するために重要であり得、このことにより、種々の植物由来のＴＨＩＣ  ＵＴＲの特徴の間の長さの保存を説明することもできる（図２Ａ）。
【０２０５】
興味深いことに、ＴＰＰリボスイッチはまた、部分的に５’スプライス部位付近のヌクレオチドと非占有ＴＰＰアプタマーのＰ４−Ｐ５領域との間のリガンド媒介性塩基対合の形成によって真菌のＮＭＴ１遺伝子のオルタナティブスプライシングを調節する（Ｃｈｅａｈら，２００７）。これらの真核生物の例と対照的に、細菌は、典型的に、アプタマーの下流に存在する発現プラットフォームと調和するためにＰ１ステム中のヌクレオチドを使用する（Ｓｕｄａｒｓａｎら，２００５；Ｗｉｎｋｌｅｒら，２００２）。リガンド結合の際のＴＰＰアプタマー構造の実質的変化を考慮して、Ｐ１ステムおよびＰ４−Ｐ５ステムの一部のみを使用して今まで研究されたＴＰＰリボスイッチにおける発現プラットフォーム機能を調節することは驚くべきことである。これについての１つの理由は、迅速なリガンド検知を容易にするために一定のアプタマー下部構造の事前組織化（ｐｒｅｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）が必要なことであり得る。
ｖｉｉ．植物におけるＴＰＰリボスイッチ機能のモデル
以前の研究では、細菌で見出された転写ターミネーターに類似の転写ターミネーターが真核生物中にも存在し得ることが示された（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，１９８９）。興味深いことに、植物における全ての公知のＴＰＰリボスイッチの例において、ポリウリジン区域（ｔｒａｃｔ）はアプタマーの直後に続き（図８を参照のこと）、このエレメントは、細菌における固有の転写ターミネーターに対するポリメラーゼ放出アナログに関与し得る（Ｙａｒｎｅｌｌ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９９；Ｇｕｓａｒｏｖ  ａｎｄ  Ｎｕｄｌｅｒ，１９９９）。しかし、真正細菌様転写終結が起こった場合に予想される産物と一致するＲＮＡ転写物は同定されなかった。
【０２０６】
ｍＲＮＡ転写物のスプライシングおよびオルタナティブ３’末端プロセシングの代謝産物媒介性調節を含む植物におけるＴＰＰリボスイッチ調節のための異なるモデルを提案する（図７Ｃ）。細胞中のＴＰＰ濃度が低い場合、アプタマーは、５’スプライス部位と相互作用してスプライシングを防止する。このイントロンは、転写物の切断およびポリアデニル化を可能にする主なプロセシング部位を保有する。この部位由来のプロセシングにより、短い３’ＵＴＲを保有し、且つＴＨＩＣ遺伝子を高発現するＴＨＩＣ−ＩＩ転写物が産生される。
【０２０７】
ＴＰＰ濃度が高い場合、アプタマーへのＴＰＰ結合により、５’スプライス部位への対合が防止される。結果として、５’スプライス部位が接近可能となり、主なプロセシング部位を除去するスプライシング事象で使用される。転写は、その後、１ｋｂまで拡大し、下流に存在するプロセシング部位の使用により、はるかにより長い３’ＵＴＲを保有するＴＨＩＣ−ＩＩＩ  ＲＮＡが得られる。長い３’ＵＴＲによって転写物分解が増加し、ＴＨＩＣ発現が低減する。以前の研究では、転写の拡大は転写物プロセシングの非存在下で起こり、したがって、これらのプロセスの相互関連性（ｉｎｔｅｒｃｏｎｎｅｃｔｉｖｉｔｙ）が明らかとなったことが示されている（Ｂｕｒａｔｏｗｓｋｉ，２００５；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，２００４；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔら，２００２）。
【０２０８】
どのようにして真核生物において転写物のプロセシングおよび転写終結が連携するのかについて２つの異なるモデルが提案されている。「アンチターミネーター（ａｎｔｉｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）」モデルにより、終結部位の転写によって転写複合体の高次構造が変化し、それによって終結することが示唆される（Ｌｏｇａｎら，１９８７）。対照的に、「魚雷」モデルは、切断事象が転写終結の必要条件であることを示す（Ｃｏｎｎｅｌｌｙ  ａｎｄ  Ｍａｎｌｅｙ，１９８８）。他の転写終結機構も存在し得る。最近の報告では、いくつかの遺伝子中のプロセシング部位の下流で起こるさらなる同時転写切断事象が終結の調節で役割を果たし得ることが示されている（Ｄｙｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，２００１；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，２００４；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔら，２００２）。さらに、自己触媒性ＲＮＡ切断が転写物３’末端形成に関与し得ることが証明されている（Ｔｅｉｘｅｉｒａら，２００４；Ｖａｄｅｒら，１９９９）。他の機構を除外することができないにもかかわらず、転写終結を調節するためにＴＨＩＣ  ＴＰＰリボスイッチがスプライシングおよびプロセシング部位の接近を調節するという所見は、魚雷モデルと一致する。
ｖｉｉｉ．結論
所見により、どのようにしてＴＰＰ検知リボスイッチが植物において遺伝子発現を調節することができ、どのようにしてフィードバック調節がＴＰＰレベルを維持するのかということについての機構が明らかとなる。さらに、本研究は、リボスイッチを使用して遺伝子発現を調節する公知の多様な機構にさらに拡大される。Ａ．ｔｈａｌｉａｎａにおけるＴＰＰリボスイッチは、代謝産物結合を活用してＲＮＡスプライシングを調節し、それによってオルタナティブ３’末端プロセシングの運命が決定され、最終的にｍＲＮＡの安定性を規定する。種々の植物のＴＨＩＣ遺伝子内の重要な３’ＵＴＲの特徴の間の配列、構造エレメント、および間隔の広範な保存は、このリボスイッチ機構が多様な植物種で維持されることを示す。リボスイッチ媒介性調節と無関係に、オルタナティブ３’末端プロセシングの調節による遺伝子調節の可能性は高いようであり、したがって、この一般的機構は真核生物ではるかに一般的であり得る。
【０２０９】
予備的所見は、植物においてＴＨＩＣ過剰発現が有害な影響を引き起すことを示す。これは植物におけるチアミン産生調節の重要性を強調し、最近発見された植物耐病性のアクチベーターとしての役割にも関与し得る（Ａｈｎら，２００５；Ａｈｎら，２００７；Ｗａｎｇら，２００６）。植物がビタミンＢ１の主な栄養源としての機能を果たすので、植物におけるチアミン生合成の調節についてのより深い理解はまた、代謝操作の目的に有用であり得る。
【０２１０】
真菌および細菌中のその位置と比較した植物遺伝子の３’領域中のＴＰＰリボスイッチの固有の位置は、異なる生物に必要な特異的調節への適応を反映し得る。ほぼ全ての公知のリボスイッチは、細菌の５’ＵＴＲ中（Ｍａｎｄａｌ  ａｎｄ  Ｂｒｅａｋｅｒ，２００４；Ｓｏｕｋｕｐ  ａｎｄ  Ｓｏｕｋｕｐ，２００４；Ｗｉｎｋｌｅｒ  ａｎｄ  Ｂｒｅａｋｅｒ，２００５）または真菌の５’ＵＴＲのイントロンまたはコード領域中（Ｃｈｅａｈら，２００７）に存在し、しばしば遺伝子発現をほぼ完全に抑制することができる。しかし、植物で認められるリボスイッチ調節レベルはよりわずかである。植物がチアミンを効率的に取り込むことができるにもかかわらず、ほとんどの要求は内因性合成によって供給されなければならない。植物の独立栄養性の生存様式と対照的に、真菌および細菌は、時折、取り込みによってチアミンのような化合物についての全ての要求を満たすことが可能な栄養豊富な条件下で増殖するので、異なる生物の領域由来の生物で見出される異なる範囲の調節についていくつかの論理的根拠が得られる。
２．実験手順
ｉ．植物および植物組織
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ生態型Ｃｏｌｕｍｂｉａ−０植物を、他で示さない限り、１６／８時間（明／暗）の光周期、湿度６０％、２３℃において土壌を使用して栽培箱中で成長させた。実生実験のために、他で特定しない限り、植物を、２％スクロースおよび種々の濃度のチアミンを補足した基本ＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ，１９６２）にて連続光下で成長させた。葉浸潤アッセイのためのＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物を、土壌にて連続光下で３〜５週間成長させた。他の種由来の植物材料は、市販の種子から成長させた実生に由来した。
ｉｉ．ＲＮＡの単離およびＲＴ−ＰＣＲ分析
総ＲＮＡを、製造者の説明書にしたがってＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔミニキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して凍結植物組織から抽出した。２〜５μｇの総ＲＮＡをＤＮアーゼ処理に供し、その後に製造者の説明書にしたがってＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して逆転写した。ｃＤＮＡ生成のために、遺伝子特異的プライマー（他で特定しない場合）またはポリＴプライマー（ＤＮＡ１）を使用した。ｃＤＮＡを、ＴＨＩＣおよびＥＧＦＰレポーター転写物のＰＣＲ増幅のためのテンプレートとして使用した。得られた全産物をＴＯＰＯ−ＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、配列決定（ＨＨＭＩ  Ｋｅｃｋ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ａｔ  Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）によって分析した。
【０２１１】
Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００リアルタイムＰＣＲシステムおよびＰｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してｑＲＴ−ＰＣＲを行った。テンプレートを連続希釈して、全プライマー組み合わせについてのプライマー効率を決定した。各反応を三連で行い、増幅産物をアガロースゲル電気泳動および融解曲線分析によって試験した。相対標準曲線法（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｃｕｒｖｅ  ｍｅｔｈｏｄ）を使用してデータを分析し、標的転写物の存在量を、ＡＴ１Ｇ１３３２０遺伝子（ＰＰ２Ａ  触媒サブユニット）、ＡＴ５Ｇ６０３９０遺伝子（ＥＦ−１α）、およびＡｔ１Ｇ１３４４０遺伝子（ＧＡＰＤＨ）由来の以前に報告された基準転写物（Ｃｚｅｃｈｏｗｓｋｉら，２００５）に対して正規化した。
ｉｉｉ．植物由来のＴＨＩＣ転写物およびゲノム配列の増幅
ＴＨＩＣ−ＩＩ  ＲＮＡ由来の３’ＵＴＲを、ポリＴプライマーおよび終止コドン付近のコード配列の保存部分をターゲティングする縮重プライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲの使用によってクローン化した。ＴＨＩＣ−ＩＩＩ転写物について、特異的プライマーの組み合わせを使用してポリＴ生成ｃＤＮＡ由来の２つのフラグメント中で３’ＵＴＲを増幅した。各３’ＵＴＲの５’部分を、コード領域をターゲティングする縮重プライマーおよびＴＰＰアプタマーをターゲティングするプライマーを使用してＰＣＲ増幅した。３’ＵＴＲの３’部分を、アプタマーをターゲティングするプライマーおよびポリＴプライマーの使用によって得た。ＰＣＲ産物をクローン化し（ＴＯＰＯ−ＴＡ）、いくつかの独立したクローンを配列決定した。合わせた配列情報を使用して、対応するゲノム配列の増幅のためのプライマー対をデザインした。製造者の説明書にしたがってＰｌａｎｔ  ＤＮＡｚｏｌ試薬（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を使用してゲノムＤＮＡを単離し、得られたＰＣＲ産物をクローン化し、配列決定した。
ｉｖ．ノーザンブロット分析
Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ実生由来の転写物を、以前に記載のようにノーザンブロット分析によって分析した（Ｎｅｗｍａｎら，１９９３）。プローブは、ＴＨＩＣのコード領域，ＴＨＩＣ  Ｉ型およびＩＩＩ型ＲＮＡの伸長３’ＵＴＲ，またはコントロール転写物ＥＩＦ４Ａ１中の領域に特異的であった。
ｖ．アグロバクテリウム媒介性葉浸潤アッセイ
一過性遺伝子発現分析のために、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉を、（Ｃａｚｚｏｎｅｌｌｉ  ａｎｄ  Ｖｅｌｔｅｎ，２００６）により記載されたように葉浸潤アッセイによって形質転換した。種々のレポーター構築物を保有するアグロバクテリウム株をＬＢ培地中で一晩成長させ、遠心分離し、ペレット化した細胞をＨ２Ｏ中に再懸濁した。ＯＤ６００を、異なる構築物を保有する細胞と同一の値（約０．８）に調整し、アグロバクテリアを構築物の同時形質転換のために同量で混合した。ホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）もしくはウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のルシフェラーゼまたは蛍光タンパク質ＥＧＦＰおよびＤｓＲｅｄ２のいずれかを、レポータータンパク質として使用した。
【０２１２】
ルシフェラーゼ活性を、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して測定した。葉材料を、典型的には、浸潤６０時間後に回収し、液体窒素（約１００ｍｇ／サンプル）中で凍結した。粉砕後、１００μｌ  １×Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加し、サンプルと強く撹拌した。サンプルを氷上で１時間インキュベートし、その後に１３，０００ｇで２０分間遠心分離した。得られた上清を４０倍希釈し、プレート読み取り照度計（Ｗａｌｌａｃ）へのデュアルルシフェラーゼアッセイ緩衝液のその後の添加によってルシフェラーゼ活性を測定した。ホタルルシフェラーゼ活性を、ウミシイタケ由来の同時発現ルシフェラーゼの活性に対して正規化したか（またはその逆）、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイ（ＢｉｏＲａｄ）によって決定された総タンパク質量と比較した。
【０２１３】
蛍光定量のために、Ｔｙｐｈｏｏｎ  Ｔｒｉｏ＋レーザースキャナ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、浸潤後のいくつかの時点で葉をスキャンした。ＥＧＦＰの設定は、４８８ｎｍでの励起および５２０ｎｍ  ＢＰ  ４０での検出であった。ＤｓＲｅｄ２を、５３２ｎｍで励起し、５８０ｎｍ  ＢＰ３０で検出した。葉は、スキャニングによって有意に損傷せず、励起後に葉柄と共に水中でインキュベートした。
ｖｉ．Ｆｌｏｒａｌ  Ｄｉｐ法によるＡ．ｔｈａｌｉａｎａの安定な形質転換
Ａ．ｔｈａｌｉａｎａを、以前に記載のｆｌｏｒａｌ  ｄｉｐ法によって形質転換した（Ｃｌｏｕｇｈ  ａｎｄ  Ｂｅｎｔ，１９９８）。形質転換後、５０  μｇ／ｍｌ−１カナマイシン（形質転換体を選択するため）および２００μｇ／ｍｌ−１セフォタキシム（細菌増殖を防止するため）を含む培地上にて種子を無菌条件下で成長させた。生存植物を土壌に２〜３週間移し、さらなる成長後に導入遺伝子の発現を決定した。
ｖｉｉ．ＤＮＡ構築物のクローニング
全レポーター構築物は、構成性ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを含むプラスミドｐＢｉｎＡＲ（Ｈｏｅｆｇｅｎ  ａｎｄ  Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ，１９９２）に基づいていた。Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ（ホタル）由来ルシフェラーゼのコード配列をプライマーＤＮＡ４４およびＤＮＡ４５を使用して増幅し、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩでの制限後、ｐＢｉｎＡＲの適切な部位にクローン化してｐＢｉｎＡＲＦＬＵＣを得た。ｐＢｉｎＡＲＦＬＵＣでは、ルシフェラーゼのＣ末端でのペルオキシソームターゲティング配列を、アミノ酸配列「ＩＡＶ」と置換して、ペルオキシソーム局在化を防止した。ｐＢｉｎＡＲＲｉＬＵＣを調製するために、ウミシイタケＲｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来ルシフェラーゼのイントロン含有バージョン（Ｃａｚｚｏｎｅｌｌｉ  ａｎｄ  Ｖｅｌｔｅｎ，２００３）を、プライマーＤＮＡ４６およびＤＮＡ４７を使用して増幅し、制限後、ｐＢｉｎＡＲのＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ部位にクローン化した。レポーターとして蛍光タンパク質を含むプラスミドを調製するために、ＥＧＦＰおよびＤｓＲｅｄ２のコード配列を、プライマーＤＮＡ４８／４９およびＤＮＡ  ５０／５１をそれぞれ使用して増幅した。ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩでの制限後、産物をｐＢｉｎＡＲの適切な部位にクローン化した。
【０２１４】
Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ  ＴＨＩＣ  ＩＩ型およびＩＩＩ型ＲＮＡ由来の３’ＵＴＲ配列を、プライマーＤＮＡ２／５２およびＤＮＡ２／３をそれぞれ使用して増幅し、ｐＢｉｎＡＲレポータープラスミドのＳａｌＩ部位にクローン化した。Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ由来のＴＨＩＣ配列に基づいた対応する構築物のクローニングのために、ＩＩ型およびＩＩＩ型ＲＮＡ由来の３’ＵＴＲを、プライマーＤＮＡ  ５３／５４およびＤＮＡ５３／５５をそれぞれ使用して増幅した。レポーター融合構築物中のＴＨＩＣ  ３’ＵＴＲの配列および配向を、配列決定によって確認した。
【０２１５】
アプタマー変異体Ｍ１およびＭ２（ＩＩＩ型ＲＮＡの文脈で）の生成のために、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ由来のＴＨＩＣ−ＩＩＩの野生型  ３’ＵＴＲ配列を、ＤＮＡ２およびＤＮＡ３を使用して増幅し、ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してクローン化した。ＴＯＰＯ  ＴＡベクター中のＴＨＩＣ−ＩＩＩ  ３’ＵＴＲに対してＰＣＲ変異誘発を行い、配列決定によってヌクレオチドの変化を確認した。次いで、３’ＵＴＲ配列をＳａｌＩでの制限によってベクターから放出させ、レポータープラスミドの適切な部位にクローン化した。
【０２１６】
そのゲノムの文脈においてリボスイッチを含む構築物を調製するために、ＴＨＩＣの転写終止コドンから開始する２２４２ｂｐフラグメントを、プライマーＤＮＡ６０およびＤＮＡ６１を使用してＡ．ｔｈａｌｉａｎａゲノムＤＮＡから増幅し、ＴＯＰＯ  ＴＡベクターにクローン化した。ｐＢｉｎＡＲがリボスイッチ機能を妨害し得るアグロバクテリウム由来オクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）ターミネーターを含むので、ＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩでの制限によってＯＣＳ配列を除去し、適切な制限部位を有する２つの相補オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ６２、ＤＮＡ６３）からなるリンカーを使用してベクターに再連結して、ベクターｐＢｉｎＡＲ−ｔｅｒｍを得た。ターミネーター配列を持たないこのベクターを、その後のクローニングのために使用した。ＥＧＦＰのコード配列を、プライマーＤＮＡ４８およびＤＮＡ４９を使用して増幅し、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩでの制限後、ｐＢｉｎＡＲ−ｔｅｒｍの適切な部位にクローン化した。第２の工程では、ゲノムＴＨＩＣフラグメントを、ＳａｌＩ消化によってＴＯＰＯ  ＴＡベクターから放出させ、ｐＢｉｎＡＲＥＧＦＰ−ｔｅｒｍのＳａｌＩ部位にクローン化した。ＴＨＩＣフラグメントの配列および配向を、配列決定によって確認した。アプタマー変異体Ｍ２、Ｍ３、およびＭ４の生成のために、ＴＨＩＣ  ３’フラグメントを含むＴＯＰＯ  ＴＡプラスミドに対してＰＣＲ変異誘発を行い、配列確認後、ＳａｌＩフラグメントをｐＢｉｎＡＲＥＧＦＰ−ｔｅｒｍの適切な部位にクローン化した。また、ＴＨＩＣフラグメントの配列および配向を配列決定によって確認した。
ｖｉｉｉ．ＲＮＡのインライン探索
本質的に以前に記載のようにインライン探索アッセイを行った（Ｓｕｄａｒｓａｎら，２００３；Ｗｉｎｋｌｅｒら，２００２）。ｃＤＮＡからのＰＣＲ増幅によってｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写のためのＤＮＡテンプレートを得て、順方向プライマーへの含有によってＴ７プロモーターを導入した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によるＲＮＡ精製およびＲＮＡの５’３２Ｐ標識を、以前に記載のように行った（Ｓｅｅｔｈａｒａｍａｎら，２００１）。インライン探索分析のために、標識ＲＮＡを、種々の濃度のＴＰＰの非存在下または存在下、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３、２３℃）、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および１００ｍＭ  ＫＣｌ中にて室温で４０時間インキュベートした。切断産物を変性１０％ＰＡＧＥによって分離し、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって視覚化し、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアを使用して定量した。見かけ上のＫＤ値（ＲＮＡ構造を最大値の半分を調整するのに必要なＴＰＰの濃度を反映する）を、ＲＮＡ切断の正規化割合対ＴＰＰ濃度の対数のプロッティングによって決定した。
【０２１７】
【表１−１】
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【０２１８】
【表１−２】
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【０２１９】
【表１−３】
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【０２２０】
【表１−４】
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「＊」は、ｑＲＴ−ＰＣＲにおけるプライマーとプローブとの組み合わせの効率を増加させるために導入されたヌクレオチドを識別する。順方向プライマーおよび逆方向プライマーを、それぞれ「ｆｏｒ」および「ｒｅｖ」と指定する。
【０２２１】
開示の方法および組成物が記載の特定の方法、プロトコール、および試薬に制限されず、これらは変化し得ると理解される。本明細書中で使用した専門用語が特定の実施形態の記載のみを目的とし、本発明の範囲を制限することを意図せず、本発明は添付の特許請求の範囲のみに制限されるとも理解すべきである。
【０２２２】
本明細書中および添付の特許請求の範囲で使用する場合、他で明確に示さない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には複数形が含まれることに留意しなければならない。したがって、例えば、「ａ  ｒｉｂｏｓｗｉｔｃｈ」は複数のかかるリボスイッチが含まれ、「ｔｈｅ  ｒｉｂｏｓｗｉｔｃｈ」は１つまたは複数のリボスイッチおよび当業者に公知のその等価物などをいう。
【０２２３】
「任意選択的な」または「任意選択的に」は、その後に記載する事象、環境、または材料が出現または存在してもしなくてもよいことを意味し、ならびに記載には、事象、環境、または材料が出現または存在する例およびそれが出現しないかまたは存在しない例が含まれることを意味する。
【０２２４】
範囲を、本明細書中で、「約」１つの特定の値から、および／または「約」別の特定の値までと示すことができる。かかる範囲を示す場合、他で具体的に示さない限り、一方の特定の値からおよび／または他方の特定の値までの範囲も具体的に意図され、開示されると見なされる。同様に、値を先行詞「約」の使用によって近似値で示す場合、特定の値が別の具体的に意図される実施形態を形成し、他で具体的に示されない限り、開示されたと見なすべきであると理解される。他で具体的に示されない限り、各範囲の終点（ｅｎｄｐｏｉｎｔ）が他の終点に関して有意であり、且つ他の終点に依存しないとさらに理解される。最終的に、例示的に開示された範囲内の全ての各値および値の部分的範囲も具体的に意図され、他で具体的に示さない限り、開示されると見なすべきであると理解すべきである。特定の場合にこれらの実施形態のいくつかまたは全てが例示的に開示されるかどうかと無関係に、上記を適用する。
【０２２５】
他で定義しない限り、本明細書中で使用した全ての技術用語および科学用語は、開示の方法および組成物が属する分野の当業者に一般的に理解される意味を有する。本明細書中に記載のものに類似するか等価な任意の方法および材料を本発明の方法および組成物の実施または試験で使用することができるにもかかわらず、特に有用な方法、デバイス、および材料は記載の通りである。本明細書中で引用した刊行物および刊行物が引用した材料は、特に本明細書中で参考として援用される。本発明は、先行発明によるかかる開示に先行する権利がないと承認していると解釈されない。いかなるリファレンスも先行技術を構成していると承認していない。リファレンスの考察はその著者の主張を記載し、出願人が引用した書類の正確性および適切性に挑む権利を留保する。多数の刊行物が本明細書で参照されているにもかかわらず、かかるリファレンスは任意のこれらの書類が当該分野の一般的知識の一部を形成することを承認しないことが明確に理解される。
【０２２６】
本明細書の記載および特許請求の範囲を通して、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」およびこの用語の変形形態（「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」など）は、「含むが、これらに限定されない」を意味し、例えば、他の添加物、成分、整数、または工程を排除することを意図しない。
【０２２７】
当業者は、日常的な実験しか使用せずに、本明細書中に記載の方法および組成物の特定の実施形態に対する多数の等価物を認識するか、確認することができる。かかる等価物は、以下の特許請求の範囲に含まれることが意図される。
【０２２８】
リファレンス
【０２２９】
【化６】
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【０２３０】
【化７】
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【０２３１】
【化８】
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【０２３２】
【化９】
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【０２３３】
【化１０】
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【０２３４】
【化１１】
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【０２３５】
【化１２】
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【０２３６】
【化１３】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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