(57)【要約】  本発明は、反発性ガイダンス分子（ＲＧＭ）タンパク質ファミリーのメンバーの骨形成タンパク質（ＢＭＰ）−結合ドメイン、それら由来のポリペプチド断片及び融合タンパク質の、同定及び使用に関する。本発明によるドメイン、即ちペプチド断片及び融合タンパク質は、個体の能動又は受動免疫付与のための物質として、又は、その原因もしくは進行において、ＲＧＭファミリーのメンバー及びこの分子と会合する細胞の受容体、例えば特にネオゲニン及び／又はＢＭＰなどが関与する、疾病又は病期に対する使用のための診断及び治療用の薬剤として、適切である。本発明はさらに、本発明による結合ドメインに対する、及びそれら由来のポリペプチドに対するモノクローナル及びポリクローナル抗体、及び本発明による、ポリペプチド、融合タンパク質及び抗体を作製するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
反発性ガイダンス分子（ＲＧＭ）の骨形成タンパク質（ＢＭＰ）結合ドメイン。
【請求項２】
哺乳動物のＲＧＭ由来の、請求項１に記載のＢＭＰ結合ドメイン。
【請求項３】
配列番号２に従うヒトＲＧＭ  Ａ、配列番号４に従うヒトＲＧＭ  Ｂ又は配列番号６に従うヒトＲＧＭ  Ｃ由来の、請求項１又は請求項２に記載のＢＭＰ結合ドメイン。
【請求項４】
およそ１７０以下の長さ及びＲＧＭ  Ａのフォンウィルブランド因子ドメインに対するＮ末端を有するアミノ酸配列範囲に位置する、請求項１から請求項３の一項に記載のＢＭＰ結合ドメイン。
【請求項５】
少なくとも１つのさらなる異なるアミノ酸配列との機能的連結において少なくとも１つのＢＭＰ結合ドメインを含有する、およそ３０から１５０アミノ酸基の長さを有する請求項４に記載のＢＭＰ結合ドメイン、その機能的誘導体及び融合タンパク質。
【請求項６】
配列番号７及び８に従う次の部分的配列の少なくとも１つを特徴とする、請求項１から請求項５の一項に記載のＢＭＰ結合ドメイン：
Ｘ１Ｃ（Ｋ／Ｒ）ＩＸ２（Ｋ／Ｒ）ＣＸ３（Ｓ／Ｔ／Ａ）（Ｅ／Ｄ）（Ｆ／Ｙ）Ｘ４ＳＸ５Ｔ（配列番号７）
（式中、Ｘ１からＸ５は、何らかのアミノ酸基を表す。）；又は
Ｘ６ＣＸ７ＡＬＲＸ８ＹＡＸ９ＣＴＸ１０ＲＴＸ１１（配列番号８）
（式中、Ｘ６からＸ１１は何らかのアミノ酸基を表す。）；
又は式：
（配列番号７）−Ｌｉｎｋ１−（配列番号８）
の部分配列（式中、Ｌｉｎｋ１は、１３から２８個の何らかの連続アミノ酸基を含有する配列番号７−及び８−架橋アミノ酸配列を表す。）。
【請求項７】
配列番号２の次のアミノ酸配列の１つ：
４７前後から１６８前後のアミノ酸位置
４７前後から９０前後のアミノ酸位置もしくは
７５前後から１２１前後のアミノ酸位置；
又は配列番号４の次のアミノ酸配列の１つ：
９４前後から２０９前後のアミノ酸位置
９４前後から１３７前後のアミノ酸位置もしくは
１２２前後から１６８前後のアミノ酸位置；
配列番号６の次のアミノ酸配列の１つ：
３６前後から１７２前後のアミノ酸位置
３６前後から９４前後のアミノ酸位置もしくは
８０前後から１２５前後のアミノ酸位置；
を含有する、請求項１から請求項６の一項に記載のＢＭＰ結合ドメイン又はその機能的ＢＭＰ結合断片。
【請求項８】
配列番号２に従う位置３１６前後から３８６前後の配列範囲からの、配列番号４に従う位置３５０前後から４２１前後の配列範囲からの、又は配列番号６に従う位置３１４前後から３６９前後の配列範囲からの、少なくとも１０連続アミノ酸基を含有する、請求項１から請求項３の一項に記載のＢＭＰ結合ドメイン又はその結合断片。
【請求項９】
配列番号２に従う位置４７前後から１６８前後の配列範囲からの、配列番号４に従う位置９４前後から２０９前後の配列範囲からの、又は配列番号６に従う位置３６前後から１７２前後の配列範囲からの、少なくとも１０連続アミノ酸基を含有する、請求項７に記載のＢＭＰ結合ドメイン又はその結合断片。
【請求項１０】
ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６及びＢＭＰ−１２から選択される少なくとも１つのＢＭＰに結合する、特にＢＭＰ−２及び／又はＢＭＰ−４に結合する、請求項１から請求項９の一項に記載のＢＭＰ結合ドメイン。
【請求項１１】
ネオゲニンにも結合する、請求項１０に記載のＢＭＰ結合ドメイン。
【請求項１２】
請求項１から請求項１１の一項に記載のＢＭＰ結合ドメインの抗原性ポリペプチド断片。
【請求項１３】
ＢＭＰ及び／又はネオゲニンへのＲＧＭの結合を調節する、免疫グロブリン分子の産生のために使用され得る、請求項１２に記載の抗原性ポリペプチド断片。
【請求項１４】
配列番号２、４又は６に従う配列の１つを有するペプチドの少なくとも１０連続アミノ酸基を含有する、請求項１２又は請求項１３に記載の抗原性ポリペプチド断片。
【請求項１５】
一価もしくは多価担体ポリペプチド又は第二の生物学的活性ポリペプチドから選択される第二のポリペプチドに操作可能に連結される、請求項１から請求項１１の一項に記載のＢＭＰ結合ドメインから選択される少なくとも１つの第一の生物学的活性ポリペプチドを含有する、融合タンパク質
【請求項１６】
多価担体が少なくとも１つのＦｃ又はＦｃ’’を含有し、その２本のポリペプチド鎖のそれぞれが、請求項１から請求項１０の一項に記載の同じ又は異なるＢＭＰ結合ドメインに操作可能に連結される、請求項１５に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
ＲＧＭに対するポリクローナル抗血清又はモノクローナル抗体を産生させるための、請求項１から請求項１１の一項に記載のＢＭＰ結合ドメインの使用又は請求項１２から請求項１４の一項に記載のポリペプチド断片の使用。
【請求項１８】
抗血清又は抗体が、ネオゲニン（ネオゲニン受容体）へのＲＧＭの結合を調節する、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
診断又は治療用途のための、請求項１７及び請求項１８の一項での定義に従う、ＲＧＭに対するポリクローナル抗血清又はモノクローナル抗体。
【請求項２０】
ＲＧＭ又はＲＧＭ断片とのネオゲニン受容体（ネオゲニン）の相互作用が介在する疾病又は病期の診断又は治療のための医薬品を調製するための、請求項１９に記載のポリクローナル抗血清又はモノクローナル抗体の使用。
【請求項２１】
疾病又は病期が、
ａ）頭蓋骨、脳及び脊髄への機械的損傷、
ｂ）神経変性、炎症又は自己免疫疾患から選択される慢性疾患、
ｃ）神経再生、軸索発芽、神経突起伸展及び神経可塑性の疾患、
ｄ）腫瘍性疾患及び腫瘍転移
から選択される、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
関連する受容体（ネオゲニン又はＢＭＰ）とのＲＧＭもしくはＲＧＭ断片の相互作用の異常又は障害が介在する疾病又は病期の診断又は治療用の薬剤を調製するための、請求項１から請求項１１の一項に記載のＢＭＰ結合ドメインの使用又は請求項１５及び請求項１６の一項に記載の融合タンパク質の使用。
【請求項２３】
疾病又は病期が、
ａ）過剰な神経突起発芽及び／又は病的シナプス形成により引き起こされる精神状態及び慢性疼痛状態における神経突起生成プロセスの変化；
ｂ）慢性疾患に伴う貧血、若年型ヘモクロマトーシスなどの鉄代謝障害に関連する疾患；
ｃ）骨の成長障害に関連する疾患；
ｄ）軟骨の退行性変化に関連する疾患；
ｅ）椎間板及び椎体への損傷に関連する疾患；
ｆ）無秩序で無制御の細胞移動プロセスに関連する疾患
から選択される、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
（ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６及び／又はＢＭＰ−１２への、特にＢＭＰ−２及び／又は４への結合による）ＢＭＰシグナル経路の刺激又は増幅により治療され得る疾患又は病期の診断用又は治療用の薬剤を調製するための、請求項１から請求項１１の一項に記載のＢＭＰ結合ドメインもしくはその結合断片の使用又は請求項１５及び請求項１６の一項に記載の融合タンパク質の使用。
【請求項２５】
骨成長障害が関与する疾患の治療のための、又は骨折の治療のための、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
自己免疫疾患、特に、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性リンパ球増殖症候群（ＡＬＰＳ）、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、ベーチェット病、類天疱瘡、心筋ミオパチー、セリアック病、疱疹状皮膚炎、慢性疲労免疫機能障害症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発神経障害（ＣＩＤＰ）、瘢痕性類天疱瘡、全身性硬化症（ＣＲＥＳＴ症候群）、寒冷凝集素症、クローン病、皮膚血管炎、デゴス病、皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、円板状紅斑性狼瘡、本態性混合性クリオグロブリン血症、線維筋痛、グッドパスチャー症候群、グレーブズ病、ギランバレー症候群、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、免疫グロブリンＡニューロパシー、インスリン依存性糖尿病、若年性関節炎、川崎病、扁平苔癬、膜性糸球体腎炎、メニエール病、混合結合組織病、多巣性運動ニューロパチー、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛、多発筋炎、皮膚筋炎、原発性低γグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、レイノー現象、ロイター症候群、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、血管炎、尋常性白斑及びウェゲナー肉芽腫症から選択されるもの；
又は脱毛性疾患、特に、円形脱毛症、全頭脱毛症、全身性脱毛症、男性型脱毛症、休止期脱毛症、成長期脱毛症及び化学療法誘発脱毛症から選択されるもの、の診断又は治療のための薬剤を調製するための、請求項１から請求項１１の一項に記載のＢＭＰ結合ドメインもしくはその結合断片の使用又は請求項１５及び１６の一項に記載の融合タンパク質の使用。
【請求項２７】
ＲＧＭ結合リガンドの検出又は同定のための標的としての、請求項１から請求項１１の一項に記載のＢＭＰ結合ドメインの使用。
【請求項２８】
能動又は受動免疫付与のための免疫原としての、請求項１から請求項１１の一項に記載のＢＭＰ結合ドメイン又は請求項１２から請求項１４の一項に記載の断片の使用。
【請求項２９】
請求項１から請求項１１の一項に記載のＢＭＰ結合ドメイン又は請求項１２から請求項１４の一項に記載のポリペプチド断片の抗原量で哺乳動物に免疫付与をすることにより獲得可能な、ポリクローナル抗血清。
【請求項３０】
請求項１から請求項１１の一項に記載のＢＭＰ結合ドメインに対するかもしくは請求項１２から請求項１４の一項に記載のポリペプチド断片に対するモノクローナル抗体；又はモノクローナル抗ＲＧＭ  Ａ抗体（ＲＧＭ  Ａへの該抗体の結合は、請求項１から請求項１１の一項に記載のＢＭＰ結合ドメインによるか又は請求項１２から請求項１４の一項に記載のポリペプチド断片により調節される。）；又は場合によってはヒト化型のその抗原結合断片。
【請求項３１】
ａ）請求項１から請求項１１の一項に記載のＢＭＰ結合ドメイン又は請求項１２から請求項１４の一項に記載のポリペプチド断片又は請求項１５及び請求項１６の一項に記載の融合タンパク質、
ｂ）請求項２９及び請求項３０の一項に記載のモノクローナル又はポリクローナル抗体
から選択される少なくとも１つの活性成分の医薬的に許容可能な担体を含有する、医薬品。
【請求項３２】
髄腔内、静脈内、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経口又は非経口、経皮、皮下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌ）、骨内（ｉｎｔｒａｏｓｓｅａｌ）、鼻腔、体外及び吸入投与のための、請求項３１に記載の医薬品。
【請求項３３】
液体、半固体又は固体担体中の、請求項１から請求項１１の一項に記載の少なくとも１つのＢＭＰ結合ドメイン又は請求項１５及び請求項１６の一項に記載の融合タンパク質を含有する、骨折の治療のための医薬品。
【請求項３４】
少なくとも１つの制御核酸配列に操作可能に連結される、請求項１から請求項１１の一項に記載のＢＭＰ結合ドメイン、請求項１５及び請求項１６の一項に記載の融合タンパク質又は請求項１２から請求項１４の一項に記載のポリペプチド断片に対する少なくとも１つのコード核酸配列を含有する発現ベクター。
【請求項３５】
請求項３４に記載の少なくとも１つのベクターを有する組み換え微生物。
【請求項３６】
請求項３０に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株。
【請求項３７】
請求項３５に記載の組み換え微生物が培養され、産生されるタンパク質産物が培養物から単離される、請求項１から請求項１１の一項に記載のＢＭＰ結合ドメイン、請求項１５及び請求項１６の一項に記載の融合タンパク質又は請求項１２から請求項１４の一項に記載のポリペプチド断片を作製するための方法。
【請求項３８】
請求項３６に記載のハイブリドーマ細胞株が培養され、産生されるタンパク質産物が培養物から単離される、請求項３０に記載のモノクローナル抗体を作製するための方法。
【請求項３９】
ＲＧＭ受容体、特にネオゲニンの受容体又はＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６及びＢＭＰ−１２から選択される少なくとも１つのＢＭＰを刺激するための医薬品を調製するための、請求項１から請求項１６の一項に記載のＢＭＰ結合ドメイン又は請求項１５及び請求項１６の一項に記載の融合タンパク質の使用。
【請求項４０】
特にネオゲニンなどのＲＧＭの受容体の活性化を阻止するための医薬品を調製するための、請求項３０に記載のモノクローナル抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、反発性ガイダンス分子（ＲＧＭ）タンパク質ファミリーのメンバーの骨形成タンパク質（ＢＭＰ）結合ドメイン及びそれ由来のポリペプチド断片及び融合タンパク質の同定及び使用に関する。本発明によるドメイン、即ちペプチド断片及び融合タンパク質は、個体の能動又は受動免疫付与のための物質として、又は、その原因もしくは進行においてＲＧＭファミリーのメンバー及びこの分子（特にネオゲニン及び／又はＢＭＰなど）に会合する細胞受容体が関与する疾病もしくは病期に対する使用のための診断及び治療薬として、適切である。本発明は、さらに、本発明による、結合ドメインに対する、及びそれら由来のポリペプチドに対する、モノクローナル及びポリクローナル抗体及び、本発明による、ポリペプチド、融合タンパク質及び抗体を作製するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＧＭタンパク質ファミリーのメンバーの機能は、最初、Ｍｏｎｎｉｅｒ、Ｐ．Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、４１９、ｐ３９２−３９５、２００２により記載された。このファミリーには、ＲＧＭ  Ａ、ＲＧＭ  Ｂ（ＤＲＡＧＯＮとも呼ばれる。）及びＲＧＭ  Ｃ（ヘモジュベリンとも呼ばれる。）と呼ばれる３種類の既に公知のメンバーが含まれる（Ｎｉｅｄｅｒｋｏｆｌｅｒ  Ｖ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４、８０８−１８、２００４）。これらは、脂質アンカーを介して原形質膜に結合する糖タンパク質である（グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー）。このタンパク質ファミリーのメンバーは、他のタンパク質に対して広範な配列相同性がなく、構造上の特色が基本的に次の領域、即ち、Ｎ−末端シグナルペプチド；ＲＧＤ配列；ＧＤＰＨアミノ酸配列のタンパク分解性切断部位；ウィルブランド因子ドメイン（ｖＷＦ  Ｄ）の構造的相同体；Ｃ末端の近傍の疎水性配列；及びＣ−末端ＧＰＩアンカーコンセンサス配列で同定されている（図２も参照）。
【０００３】
ヒトにおいて、ＲＧＭ  Ａに対するコード配列は第１５染色体に、ＲＧＭ  Ｂは第５染色体に、ＲＧＭ  Ｃは第１染色体上に位置する。ＲＧＭ  Ａ及びＢは、特に成人の脳及び脊髄で、ＲＧＭ  Ｃは、特に骨格筋、肝臓及び心筋で、ＲＧＭ  Ｂはまた軟骨組織でも発現されるという、特徴的な発現パターンが観察される。
【０００４】
ＲＧＭタンパク質は、元来、局所的ニューロン投射の形成において重要な役割を果たす候補タンパク質として同定された（Ｓｔａｈｌ  Ｂ．ら、Ｎｅｕｒｏｎ  ５：７３５−４３、１９９０；Ｍｕｅｌｌｅｒ  Ｂ．Ｋ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６、１４９７−１５０２、１９９６；Ｍｕｅｌｌｅｒ  Ｂ．Ｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ａｘｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ及びＮｅｒｖｅ  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｈ．Ｆｕｊｉｓａｗａ編、Ｊａｐａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ  Ｐｒｅｓｓ、２１５−２２９、１９９７）。ＲＧＭタンパク質が神経線維成長を妨げるか又は阻害する能力は、その単離、クローニング及び特性評価において重要な役割を果たす重大な機能的特色であった。その活性は、単純な細胞測定系において容易に明らかにすることができた。ＲＧＭタンパク質は、２種類の異なる細胞アッセイにおいて、妨害又は阻害効果を有した。虚脱試験において、成長神経線維にＲＧＭタンパク質が添加された。ＲＧＭ及びＲＧＭ受容体の結合により、神経細胞成長円錐の全ての膜成分が収縮させられる活発な反応が誘導される。手を広げたような元の形態の成長円錐が細い糸状に変換される。ＲＧＭの存在下で、神経線維は阻害されたままであり、強く収縮し、もはや成長を続けることはできない。
【０００５】
ＲＧＭタンパク質は、ＲＧＭ受容体ネオゲニンと結合することによりそれらの効果の一部を発揮する（ＲａｊａｇｏｐＡｌａｎ  Ｓ．ら、Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６、７５６−６２、２００４）。ネオゲニンは、大腸癌欠失遺伝子（ＤＣＣ）受容体と密接な関連がある。両受容体とも、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、細胞外、膜貫通及び細胞内ドメインを有する。両方とも、別のリガンド、ネトリン−１の受容体として記載されているが、ネオゲニンのみがＲＧＭタンパク質と結合し、ＤＣＣは結合しない。これらの受容体の細胞外ドメインは、４個の免疫グロブリン様ドメイン、それに続く６個のフィブロネクチン反復ドメインから構成される。
【０００６】
神経系におけるＲＧＭ  Ａの機能は最もよく理解されており、非常に低い濃度で神経線維の増殖を阻害する効果は特筆すべきである。成長中のヒト及び成体ラットにおける中枢神経系への損傷の結果、損傷部位でＲＧＭタンパク質が蓄積される（Ｓｃｈｗａｂ  Ｊ．Ｍ．ら、Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ、Ｖｏｌ．６２、１５６１−１５６８、２００５；Ｓｃｈｗａｂ  Ｊ．Ｍ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２１：３８７−９８、２００５）。このようにして損傷神経線維の新たな増殖が阻止され、その結果、永久に、損傷部位の位置によって程度の差はあるものの、重篤な機能障害が発生する。このＲＧＭの神経線維成長阻害活性には、受容体ネオゲニンへの結合が介在する（Ｒａｊａｇｏｐａｌａｎ  Ｓ．ら、前出）。同じ受容体は、ネトリン−１の結合を介して媒介するが、神経線維成長を刺激する逆の効果も媒介する。
【０００７】
ラットの脊髄損傷部位においてポリクローナル抗体によりＲＧＭ  Ａタンパク質が中和される場合、神経線維が損傷部位全体で再生し、新しいシナプス接触を形成し、その結果、顕著な機能的改善が起こる（Ｈａｔａ  Ｋ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１７３、４７−５８、２００６）。
【０００８】
最近の知見は、ＲＧＭタンパク質が、中枢及び末梢神経系において、鉄代謝の制御において、腫瘍性疾患及び炎症過程において、及び、骨及び軟骨組織の形成においても、重要な役割を果たすことを示す。
【０００９】
ＲＧＭファミリーのタンパク質の神経突起成長阻害ドメインは、ＷＯ２００７／０３９２５６から知られている。顕著な阻害活性は、例えば、配列範囲２６０−２９０の、ＲＧＭ  Ａに対して局在していた。
【００１０】
ＲＧＭ  Ａ、Ｂ及びＣが、ＢＭＰファミリーの様々なメンバーと相互作用することができることも知られている。ＢＭＰは、多数の生理学的及び病態生理学的プロセスに関与する、リガンドのＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーである。ＢＭＰは、特殊化したシグナル伝達経路を介してそれらの機能を果たし、この経路は、セリン／スレオニンキナーゼ受容体の２種類のタイプの組み合わせに対するＢＭＰリガンドの結合から始まる。ＲＧＭとの相互作用は、既に、ＢＭＰ−２、−４、−５、−６及び−１２に対して示されている（例えば、Ｂａｂｉｔｔ、Ｊ．Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２００６、Ｖｏｌ．４８、５、５３１−５３９；Ｂａｂｉｔｔ、Ｊ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００５、Ｖｏｌ．２８０、３３、２９８２０−２９８２７；Ｂａｂｉｔｔ、Ｊ．Ｌ．ら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、２００７、Ｖｏｌ．１１７、７、１９３３−１９３９；Ｓａｍａｄ、Ｔ．Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００５、Ｖｏｌ．２８０、１４、１４１２２−１４１２９；及びＨａｌｂｒｏｏｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ２、４、２００７（電子形態で公開）参照）。
【００１１】
ＲＧＭタンパク質のＢＭＰ結合ドメインはこれ以前には記載されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｍｏｎｎｉｅｒ、Ｐ．Ｐ．他、Ｎａｔｕｒｅ、４１９、２００２年、ｐ．３９２−３９５
【非特許文献２】Ｎｉｅｄｅｒｋｏｆｌｅｒ  Ｖ．他、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４、２００４年、ｐ．８０８−１８
【非特許文献３】Ｓｔａｈｌ  Ｂ．他、Ｎｅｕｒｏｎ  ５：１９９０年、ｐ．７３５−４３
【非特許文献４】Ｍｕｅｌｌｅｒ  Ｂ．Ｋ．他、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６、１９９６年、ｐ．１４９７−１５０２
【非特許文献５】Ｍｕｅｌｌｅｒ  Ｂ．Ｋ「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ａｘｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ｎｅｒｖｅ  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ」、Ｈ．Ｆｕｊｉｓａｗａ編、Ｊａｐａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ  Ｐｒｅｓｓ、１９９７年、ｐ．２１５−２２９
【非特許文献６】ＲａｊａｇｏｐＡｌａｎ  Ｓ．他、Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６、２００４年、ｐ．７５６−６２
【非特許文献７】Ｓｃｈｗａｂ  Ｊ．Ｍ．他、Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．、Ｖｏｌ．６２、２００５年、ｐ．１５６１−１５６８
【非特許文献８】Ｓｃｈｗａｂ  Ｊ．Ｍ．他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２１、２００５年、ｐ．３８７−９８
【非特許文献９】Ｈａｔａ  Ｋ．他、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１７３、２００６年、ｐ．４７−５８
【非特許文献１０】Ｂａｂｉｔｔ、Ｊ．Ｌ．他、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｖｏｌ．４８、５、２００６年、ｐ．５３１−５３９
【非特許文献１１】Ｂａｂｉｔｔ、Ｊ．Ｌ．他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、Ｖｏｌ．２８０、３３、２００５年、ｐ．２９８２０−２９８２７
【非特許文献１２】Ｂａｂｉｔｔ、Ｊ．Ｌ．他、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、Ｖｏｌ．１１７、７、２００７年、ｐ．１９３３−１９３９
【非特許文献１３】Ｓａｍａｄ、Ｔ．Ａ．他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、Ｖｏｌ．２８０、１４、２００５年、ｐ．１４１２２−１４１２９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
従って、本発明の目的は、ＲＧＭタンパク質のＢＭＰ結合ドメインの局在及びその特徴を調べることである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
驚くべきことに、上記の目的は、ヒトＲＧＭタンパク質のＢＭＰ結合ドメイン、特にＲＧＭ  Ａ及びその活性ポリペプチド断片を単離し、特徴を調べることにより達成された。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、ＲＧＭ  Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ＃ＮＰ＿０６４５９６．１）、ＲＧＭ  Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ＃ＮＰ＿００１０１２７７９）及びＲＧＭ  Ｃ（ＧｅｎＢａｎｋ＃ＮＰ＿９９８８１８．１）のヒト型の配列アラインメントを示す。
【図２】図２は、ＲＧＭ分子の構造の略図を示す。Ｎ−末端シグナルペプチドとＣ−末端ＧＰＩアンカーとの間に示されるのは、ＲＧＤ配列、フォンウィルブランド因子ドメイン（ｖＷＦ  Ｄ）及びアンカー領域の前のＣ−末端近傍における疎水性配列である。神経突起成長阻害ドメイン（ＯIＤ）は、位置２６０−２９０周囲の範囲の、ｖＷＦＤと疎水性領域との間にある。ヒトＲＧＭに対する対応するアミノ酸位置は、下記の図で示され、ヒトＲＧＭ  Ａに対するタンパク質分解性切断部位は、アミノ酸１６８と１６９との間にある。
【図３】図３は、ＢＭＰ４と様々な固定化ＲＧＭ  Ａ−Ｆｃ融合タンパク質との間でのインビトロ相互作用アッセイの結果を示す。
【図４】図４は、ＢＭＰ−４及びＢＭＰ−２との様々な固定化ＲＧＭ  Ａ−Ｆｃ融合タンパク質の相互作用の比較のためのインビトロ相互作用アッセイの結果を示す。
【図５】図５は、固定化ＢＭＰ−４と様々なＲＧＭ  Ａ−Ｆｃ融合タンパク質との間のインビトロ相互作用アッセイの結果を示す。
【図６Ａ】図６は、固定化ＢＭＰ−４と本発明による融合タンパク質４７−９０−Ｆｃ（図６Ａ）、４７−１６８−Ｆｃ（図６Ｂ）及び３１６−３８６−Ｆｃ（図６Ｃ）の様々な濃度との間のインビトロ相互作用アッセイの結果を示す。
【図６Ｂ】図６は、固定化ＢＭＰ−４と本発明による融合タンパク質４７−９０−Ｆｃ（図６Ａ）、４７−１６８−Ｆｃ（図６Ｂ）及び３１６−３８６−Ｆｃ（図６Ｃ）の様々な濃度との間のインビトロ相互作用アッセイの結果を示す。
【図６Ｃ】図６は、固定化ＢＭＰ−４と本発明による融合タンパク質４７−９０−Ｆｃ（図６Ａ）、４７−１６８−Ｆｃ（図６Ｂ）及び３１６−３８６−Ｆｃ（図６Ｃ）の様々な濃度との間のインビトロ相互作用アッセイの結果を示す。
【図７Ａ】図７は、ヒト神経芽細胞腫細胞（図７ＡのＳＨ−ＳＹ５Ｙ、図７ＢのＮＴｅｒａ）を用いた２種類の異なる神経突起成長試験の結果を示す。ｈＲＧＭ  Ａ断片、７８６（４７−１６８）及び７９０（３１６−３８６）の両者とも、非常により強い影響を有する断片４７−１６８−Ｆｃとともに神経突起成長を阻害する。
【図７Ｂ】図７は、ヒト神経芽細胞腫細胞（図７ＡのＳＨ−ＳＹ５Ｙ、図７ＢのＮＴｅｒａ）を用いた２種類の異なる神経突起成長試験の結果を示す。ｈＲＧＭ  Ａ断片、７８６（４７−１６８）及び７９０（３１６−３８６）の両者とも、非常により強い影響を有する断片４７−１６８−Ｆｃとともに神経突起成長を阻害する。
【図８Ａ】図８Ａは、モノクローナル抗体４Ａ９との免疫ブロッティング実験の結果を示す。ＭＡＢ  ４Ａ９は、ヒトＲＧＭ  Ａの断片４７−１６８（レーン５）を認識する。４Ａ９はまた、さらなるｈＲＧＭ  Ａ断片、７０−１２０（レーン２）及び断片４７−９０（レーン４）とも結合し、全長ｈＲＧＭ  Ａ（４７−４２２）（レーン６及び９）を認識する。分子量標準物質をレーン１で示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ＥＬＩＳＡ実験の結果を示し、全長ｈＲＧＭ  Ａ及びｈＢＭＰ−４の相互作用は、ＭＡＢ４Ａ９により用量依存的に完全に阻害される。
【図９】図９は、様々な濃度（０から５０ｎｇ／ｍＬ）のｒｈＢＭＰ−２でのＣ３Ｈ−Ｂ１２の処理後の結果であるルシフェラーゼ活性の用量依存性反応を示す。
【図１０】図１０は、２４時間にわたり試験化合物の様々な濃度にＣ３Ｈ−Ｂ１２を曝露し、個々の細胞ルシフェラーゼ活性の変化を監視することにより調べた場合の、ＢＲＥ−Ｌｕｃアッセイを用いたＢＭＰシグナル伝達におけるｈＲＧＭ  Ａのペプチド断片のアンタゴニスト効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
Ｉ．一般用語の説明
本明細書中で別段の定義がない限り、本発明に関して使用される科学用語及び技術用語は、当業者により一般に理解される意味を有する。これらの用語の意味及び範囲は明確であるが、しかし、何らかの潜在的な曖昧性がある場合には、本明細書中で提供される定義が、あらゆる辞書又は付帯的な定義よりも優先される。さらに、内容により必要とされない限り、単数形である語は、複数性を含み、複数形の語は単数性を含む。本願において、「又は」の使用は、別段の断りがない限り、「及び／又は」を意味する。さらに、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」などのその他の形態の使用は限定ではない。また、別段の断りがない限り、「要素」又は「成分」などの用語は、１単位を含む要素及び成分及び複数のサブユニットを含む要素及び成分の両方を包含する。
【００１７】
一般に、本明細書中に記載の、細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学及びタンパク質及び核酸化学及びハイブリッド形成と関連して使用される命名法及びそれらの技術は当技術分野で周知であり一般に使用されるものである。本発明の方法及び技術は、一般に、別段の指示がない限り、当技術分野で周知の従来法に従い、本願を通じて引用され考察される様々な一般的及びより具体的な参考文献に記載のように、行われる。酵素反応及び精製技術は、当技術分野で一般に完遂されるように又は本明細書中に記載のように、製造者の仕様書に従い行われる。本明細書中に記載の、分析化学、合成有機化学及び医学及び製薬化学と関連して使用される命名法及びそれらの検査法及び技術は、当技術分野で周知であり、一般に使用される。化学合成、化学分析、医薬調製、処方及び送達ならびに患者の治療に対して標準的技術が使用される。
【００１８】
本発明がより容易に理解され得るように、選択した用語を下記で定義する。
【００１９】
「ポリペプチド」という用語は、本明細書中で使用される場合、何らかのアミノ酸のポリマー鎖を指す。「ペプチド」及び「タンパク質」という用語はポリペプチドという用語と交換可能に使用され、また、アミノ酸のポリマー鎖も指す。「ポリペプチド」という用語は、ネイティブ又は人工タンパク質、タンパク質断片及びタンパク質配列のポリペプチド類似体を包含する。ポリペプチドは単量体又はポリマー性であり得る。
【００２０】
「単離タンパク質」又は「単離ポリペプチド」という用語は、誘導物のその起源又は源に基づいて、そのネイティブの状態においてそれに付随する天然に会合される成分と会合していないタンパク質又はポリペプチドであるか；同じ種由来のその他のタンパク質を実質的に含まないか；異なる種由来の細胞により発現されるか；又は天然では生じないものである。このようにして、化学的に合成されるか又はそれが天然に由来する細胞とは異なる細胞株で合成されるポリペプチドは、その天然で会合する成分から「単離」されている。タンパク質はまた、当技術分野で周知のタンパク質精製技術を用いて、単離によって、天然で会合する成分を実質的に含まないようにされているものであり得る。
【００２１】
「回収する」という用語は、本明細書中で使用される場合、例えば当技術分野で周知のタンパク質精製技術を用いて、単離によって、ポリペプチドなどの化学種が、天然に会合する成分を実質的に含まないようにされるプロセスを指す。
【００２２】
本発明の範囲内で、「受容体」という用語は、特に、可溶性であるリガンドと相互作用することができる細胞膜に結合する表面分子を指し、例えば、この相互作用の結果、例えば細胞の内部に対するシグナル（又はシグナルカスケード（「シグナル伝達」とも呼ばれる。））を引き起こすことができる。
【００２３】
「リガンド」は、天然、即ちインビボで生成されるか又は合成される、「受容体」に対する、低分子又は高分子結合パートナーを指す。リガンドは、好ましくは細胞外環境で自由に移動することができる。
【００２４】
「免疫原」は、免疫原に対する抗体の形成を誘導するのに適切な、グリコシル化されているか又はグリコシル化されていない形態の本発明によるペプチド断片を指す。（ハプテンの形態の）免疫原の高分子基質への結合は有利であり得る。
【００２５】
「エピトープ」又は抗原決定基は、抗体特異性を決定する、例えばタンパク質などの抗原の領域を指す。このエピトープがタンパク質のセグメントで新規に形成されるか又は例えば、タンパク質とリガンドの相互作用などの外部影響の結果として、接触可能な分子表面で発現される場合、これは特に「ネオエピトープ」と呼ばれ、「エピトープ」又は「抗原決定基」という用語は、免疫グロブリン又はＴ細胞受容体に特異的に結合することができるあらゆるポリペプチド決定基を含む。ある実施形態において、エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル又はスルホニルなどの分子の化学的活性表面基を含み、ある実施形態において、特異的な三次元構造特性及び／又は特異的電荷特性を有し得る。エピトープは、抗体が結合する抗原の領域である。ある実施形態において、抗体は、タンパク質及び／又は巨大分子の複雑な混合物中で抗体がその標的抗原を選択的に認識する場合、抗原に特異的に結合すると言われる。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、「中和する」という用語は、結合タンパク質が標的タンパク質に特異的に結合する場合、標的タンパク質の生物学的活性の中和を指す。好ましくは、結合タンパク質を中和することは、ＲＧＭ  Ａ、Ｂ又はＣ分子への結合の結果、前記ＲＧＭ分子の生物学的活性の阻害が起こる抗体を中和することである。好ましくは、中和結合タンパク質は、ＲＧＭに結合し、少なくとも約２０％、４０％、６０％、８０％、８５％以上、ＲＧＭの生物学的活性を低下させる。中和結合タンパク質によるＲＧＭの生物学的活性の阻害は、当技術分野で周知のＲＧＭの生物学的活性の１以上の指標を測定することにより評価され得る。
【００２７】
「活性」という用語は、抗原に対する抗体の結合特異性／親和性（例えばＲＧＭ抗原に結合する抗ＲＧＭ抗体）及び／又は抗体の中和能（例えば、ＲＧＭ  Ａへのその結合によりＲＧＭ  Ａの生物学的活性が阻害される、抗ＲＧＭ  Ａ抗体）などの活性を含む。
【００２８】
タンパク質又は抗体の「ドメイン」は、例えばα−ヘリックス及び／又はβシートエレメントなどの構造エレメントによって形成される、タンパク質内で区切られる複雑な構造を指す。
【００２９】
別段の指示がない限り、「本発明によるＲＧＭタンパク質」という用語は、ＢＭＰ結合ドメインならびにポリペプチド、それらからの誘導体、ＲＧＭ分子のファミリーメンバー、特にＲＧＭ  Ａ、Ｂ及びＣを包含する。特に、ＢＭＰシグナル伝達経路を「刺激する」機能的ポリペプチド断片が含まれる。本発明によるポリペプチドはまた、「阻害性活性のある」ポリペプチド、特にネオゲニンに結合するもの、又は神経線維成長を阻害する活性を有するものも包含し得る。（本明細書中に記載の神経突起成長試験によって明らかにされる。）。
【００３０】
本発明によるドメイン又はポリペプチドの「結合」は、例えばＢＭＰ又はネオゲニンなどの結合パートナーとの何らかのタイプの場合によっては時間の関数として限定される相互作用として最も広い意味で理解される。結合は、特異的又は非特異的、好ましくは特異的であり得る。このような結合は、本明細書中の実験セクションに記載の結合試験などの適切な結合アッセイを用いて検出される。特に、本発明によるドメイン又はポリペプチドは、例えばイオン性及び／又は疎水性相互作用などの共有又は非共有相互作用を形成することによって、特定の結合パートナーと接触させられ得る。特に、相互作用は、生物学的機能（例えば第三のパートナーとの結合パートナーの相互作用）などの結合パートナーが介在する特徴を促進するか又は部分的もしくは完全に阻害するように、調節する、即ち正又は負の影響を与えるのに十分であり得る。
【００３１】
本発明による結合は、特に、様々な結合パートナー又は様々な結合パートナークラスの量が数的に制限される場合、「特異的」である。特に、この結合は、１０（例えば１、２、３、４又は５など）を超えるの様々な結合パートナー又は様々な結合パートナークラスとは起こりえない。例えば、ＢＭＰは、結合パートナークラスを表す。複数の結合パートナーと相互作用が起こるが、その相互作用が、結合パートナーの限られた数とのみ上記の意味で生物学的機能に影響を及ぼすのに十分な強度を有する場合、特異性が同様に存在する。例えば、特にＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６及びＢＭＰ−１２から選択される少なくとも１つのＢＭＰを含有する本発明によるドメイン又はポリペプチドが特にＢＭＰ−２及び／又はＢＭＰ−４に結合し；及び／又はネオゲニンに結合する場合、特異性が存在する。
【００３２】
「阻害する」又は「阻害性活性」ポリペプチドは、本明細書中に記載の神経細胞成長試験における神経細胞の成長を低下させるか又は完全に阻害するものである。
【００３３】
上述の「刺激する」及び「阻害性」活性は、ある一定のポリペプチドに対して独立して互いに特定化され得るが；しかし、ＢＭＰシグナル経路「刺激性」活性が常に存在し、神経細胞成長「阻害性」活性が存在するのは場合によるものであることが好ましい。
【００３４】
「ＢＭＰシグナル伝達」刺激性活性は、ＢＭＰ−２、−４、−５、−６及び−１２から選択される少なくとも１つのＢＭＰタンパク質により引き起こされ得る活性である。この刺激性活性は、本明細書中に記載のインビトロ結合試験により明らかにされる本発明によるＢＭＰ結合ポリペプチドが、ＢＭＰ−２、−４、−５、−６及び−１２から選択される少なくとも１つのＢＭＰ分子と相互作用する場合、存在する。
【００３５】
別段の指示がない限り、「ＲＧＭ」は、ＲＧＭ  Ａ、Ｂ及びＣ、特にＲＧＭ  Ａを表す。
【００３６】
「ネオゲニン」及び「ネオゲニン受容体」は同義語であり、特に、哺乳動物ネオゲニン、特にヒトネオゲニンを指す。
【００３７】
別のアミノ酸配列とのＢＭＰ結合ドメイン又はＢＭＰ結合ポリペプチドの「機能的連結」は、特に、共有、例えば、ＢＭＰ−２、−４、−５、−６及び−１２及び／又はネオゲニンから選択される少なくとも１つのＢＭＰ分子へのドメイン又はポリペプチドの結合を可能にするペプチド性結合として理解されたい。「制御する（ｒｅｇｕｌａｔｅ）」及び「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」という用語は交換可能に使用され、本明細書中で使用される場合、関心のある分子の活性（例えばＲＧＭ  Ａの生物学的活性）の変化又は変更を指す。調節は、関心のある分子のある種の活性又は機能の大きさの向上又は低下であり得る。分子の代表的な活性及び機能には、以下に限定されないが、結合特性、酵素活性、細胞受容体活性化及びシグナル伝達が含まれる。
【００３８】
相応して、「調節物質」という用語は、本明細書中で使用される場合、関心のある分子の活性又は機能を変化又は変更させることができる化合物である（例えばＲＧＭ  Ａの生物学的活性）。例えば、調節物質は、その調節物質の非存在下で観察される活性又は機能の大きさと比較して、分子のある種の活性又は機能の大きさを向上又は低下をさせ得る。ある実施形態において、調節物質は阻害剤であり、これは、分子の少なくとも１つの活性又は機能の大きさを低下させる。代表的な阻害剤には、以下に限定されないが、タンパク質、ペプチド、抗体、ペプチボディ、炭水化物又は低分子の有機分子が含まれる。ペプチボディは例えば国際出願公開ＷＯ０１／８３５２５に記載されている。
【００３９】
「アゴニスト」という用語は、本明細書中で使用される場合、関心のある分子と接触した場合に、アゴニストの非存在下で観察される活性又は機能の大きさと比較して、分子のある種の活性又は機能の大きさを向上させる調節物質を指す。関心のある特定のアゴニストには、以下に限定されないが、ＲＧＭ  Ａポリペプチド又は、ＲＧＭ  Ａに結合する、ポリペプチド、核酸、炭化水素又は何らかのその他の分子が含まれ得る。
【００４０】
「アンタゴニスト」又は「阻害剤」という用語は、本明細書中で使用される場合、関心のある分子と接触した場合に、アンタゴニストの非存在下で観察される活性又は機能の大きさと比較して、分子のある種の活性又は機能の大きさを低下させる調節物質を指す。関心のある特定のアンタゴニストには、ＲＧＭ  Ａの生物学的又は免疫学的活性を阻止又は調節するものが含まれる。ＲＧＭ  Ａのアンタゴニスト及び阻害剤には、以下に限定されないが、ＲＧＭ  Ａに結合する、タンパク質、核酸、炭化水素又は何らかのその他の分子が含まれ得る。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、「有効量」という用語は、疾患又はその１以上の症候の、重症度及び／又は持続時間を低下させるか又は改善するか、疾患の進行を予防するか、疾患の軽減を引き起こすか、疾患に付随する１以上の症候の再発、発現、発症もしくは進行を予防するか、疾患を検出するか、又は別の治療薬（例えば予防薬又は治療薬）の予防的もしくは治療的効果を促進もしくは向上させるのに十分である治療薬の量を指す。
【００４２】
「試料」という用語は、本明細書中で使用される場合、その最も広い意味で使用される。「生体試料」とは、本明細書中で使用される場合、以下に限定されないが、生物由来の又は死亡した生物由来の物質の何らかの量が含まれる。このような生物には、以下に限定されないが、ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ウサギ及びその他の動物が含まれる。このような物質には、以下に限定されないが、血液、血清、尿、滑液、細胞、器官、組織、骨髄、リンパ節、脳脊髄液及び脾臓が含まれる。
【００４３】
ＩＩ．本発明の特定の主題
本発明の第一の目的は、グリコシル化又は特に非グリコシル化型における、好ましくは哺乳動物ＲＧＭ由来の（例えば、ヒト、ラット又はマウス又は家禽例えばニワトリ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）結合ドメイン又は反発性ガイダンス分子（ＲＧＭ）の結合ペプチド断片に関する。別段の指示がない限り、「結合ドメイン」という用語は、ＲＧＭ由来の少なくとも１つのＢＭＰに結合する何らかのポリペプチドを包含する。
【００４４】
ある好ましい実施形態は、配列番号２に従うヒトＲＧＭ  Ａ、配列番号４に従うヒトＲＧＭ  Ｂ又は配列番号６に従うヒトＲＧＭ  Ｃ由来のＢＭＰ結合ドメインに関する。結合ドメインは、特に、ＲＧＭの、具体的にはｖＷＦドメインに関してＮ末端の又はＲＧＭ（特にＲＧＭ  Ａなど）の神経線維成長阻害ドメイン（ＯＩＤ）に関してＣ末端の、アミノ酸配列範囲からの、又は配列アラインメントにより引き出され得るＲＧＭ  Ｂ及びＣの対応する配列範囲からの、１７０以下、例えば、１２５以下、１００以下、８０以下、６０以下、５０以下、４０以下、３０以下、２０以下又は１０以下の好ましくは連続アミノ酸基の長さを有するアミノ酸配列を包含する。
【００４５】
本発明の主題は、特に、およそ３０から１５０連続アミノ酸基の長さを有するＢＭＰ結合ドメインならびに、異なる少なくとも１つのさらなるアミノ酸配列との機能的連結において少なくとも１つのＢＭＰ結合ドメインを含有するその機能的誘導体及び融合タンパク質に関する。
【００４６】
本発明の主題は、また、配列番号７及び８に従う次の部分配列の少なくとも１つを特徴とするＢＭＰ結合ドメインにも関する：
Ｘ１Ｃ（Ｋ／Ｒ）ＩＸ２（Ｋ／Ｒ）ＣＸ３（Ｓ／Ｔ／Ａ）（Ｅ／Ｄ）（Ｆ／Ｙ）Ｘ４ＳＸ５Ｔ（配列番号７）
（式中、Ｘ１からＸ５は何らかのアミノ酸基を表す。）；又は
Ｘ６ＣＸ７ＡＬＲＸ８ＹＡＸ９ＣＴＸ１０ＲＴＸ１１（配列番号８）
（式中、Ｘ６からＸ１１は何らかのアミノ酸基を表す。）；
又は式：
（配列番号７）−Ｌｉｎｋ１−（配列番号８）
の部分配列（式中、Ｌｉｎｋ１は、１０から４５、例えば１３から２８の何らかの連続アミノ酸基を含有する配列番号７−及び８−架橋アミノ酸配列を表す。）。
【００４７】
特に、
Ｘ１はＰｒｏ又はＧｌｎを表し、
Ｘ２はＬｅｕ又はＧｌｎを表し、
Ｘ３はＡｓｎ又はＴｈｒを表し、
Ｘ４はＶａｌ又はＴｒｐを表し、
Ｘ５はＳｅｒ、Ａｌａ又はＬｅｕを表し、
Ｘ６はＰｈｅ又はＬｅｕを表し、
Ｘ７はＡｌａ、Ｌｙｓ又はＡｒｇを表し、
Ｘ８はＳｅｒ又はＡｌａを表し、
Ｘ９はＬｅｕ又はＧｌｙを表し、
Ｘ１０はＡｒｇ又はＧｌｎを表し、及び／又は
Ｘ１１はＡｌａ又はＳｅｒを表す。
【００４８】
配列番号７の次の具体例を挙げる：
【００４９】
【化１】
2010537655.tif 000002
【００５０】
配列番号８次の具体例を挙げる：
【００５１】
【化２】
2010537655.tif 000003
【００５２】
Ｌｉｎｋ１リンカーの次の具体例を挙げる：
【００５３】
【化３】
2010537655.tif 000004
【００５４】
ＢＭＰ結合ドメインの例には、配列番号２に従うアミノ酸位置３０から１８０の範囲、配列番号４に従うアミノ酸位置８０から２３０の範囲又は配列番号６に従うアミノ酸位置２０から１５０の範囲のアミノ酸配列又はその機能的ネオゲニン受容体結合断片が含まれる。これらの結合ドメイン（及びそれ由来の断片）はまた、高親和性ＢＭＰ結合ドメインとも呼ばれる。特に、高親和性ＢＭＰ結合ドメインはまた、ネオゲニンとの高親和性相互作用も有し得、従って、高親和性ネオゲニン結合ドメインとも呼ばれ得る。一方、低親和性ネオゲニン結合ドメインの一例は、ＷＯ２００７／０３９２５６（その開示は本明細書中で明示的に参照される。）に記載の配列番号２に従うＲＧＭ  Ａ断片２１８-２８４である。それらに限定されないが、例えばＫＤ（解離定数）＞１μＭ（例えば２から１０μＭなど）である場合は低親和性結合となり得；例えばＫＤ＜１０ｎＭ（例えば１から９ｎＭ）である場合は高親和性結合となり得る。
【００５５】
高親和性ＢＭＰ結合ドメインの例は、配列番号２の次のアミノ酸配列の１つを含有するものである：
４７前後から１６８前後もしくは４１前後から１６８前後のアミノ酸位置
４７前後から９０前後もしくは４１前後から９０前後のアミノ酸位置又は
７５前後から１２１前後のアミノ酸位置；
又は、配列番号４の次のアミノ酸配列の１つ：
９４前後から２０９前後のアミノ酸位置
９４前後から１３７前後のアミノ酸位置又は
１２２前後から１６８前後のアミノ酸位置；
配列番号６の次のアミノ酸配列の１つ：
３６前後から１７２前後のアミノ酸位置
３６前後から９４前後のアミノ酸位置又は
８０前後から１２５前後のアミノ酸位置；
又は、その機能的ＢＭＰ結合断片、例えば上記配列の１つの断片（これに対して、ＢＭＰ結合能（本明細書中に記載の結合試験で検出可能。）を喪失することなく、Ｃ及び／又はＮ末端において、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５又は２０アミノ酸基が短縮され得る。）。
【００５６】
本発明によるドメインのその他の具体例は、配列番号２に従う位置４７前後から１６８前後の配列範囲からの、配列番号４に従う位置９４前後から２０９前後の配列範囲からの、又は配列番号６に従う位置３６前後から１７２前後の配列範囲からの、少なくとも１０連続アミノ酸基、例えば１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、２、４３、４４又は４５連続基を含有するＢＭＰ結合ドメイン又はその結合断片である。
【００５７】
これは、さらに、配列番号２を参照することにより、明細書の最後に添付される表Ａで例示される。
【００５８】
アミノ酸位置６０から１２０の範囲の適切な断片の例の非限定数を下記で述べる（最初及び最後のアミノ酸残基を与える。）：
６０−１２０、６１−１２０、６２−１２０、６４−１２０、６５−１２０、６６−１２０、６７−１２０、６８−１２０、６９−１２０、７０−１２０；
６０−１１９、６１−１１９、６２−１１９、６４−１１９、６５−１１９、６６−１１９、６７−１１９、６８−１１９、６９−１１９、７０−１１９；
６０−１１８、６１−１１８、６２−１１８、６４−１１８、６５−１１８、６６−１１８、６７−１１８、６８−１１８、６９−１１８、７０−１１８；
６０−１１７、６１−１１７、６２−１１７、６４−１１７、６５−１１７、６６−１１７、６７−１１７、６８−１１７、６９−１１７、７０−１１７；
６０−１１６、６１−１１６、６２−１１６、６４−１１６、６５−１１６、６６−１１６、６７−１１６、６８−１１６、６９−１１６、７０−１１６；
６０−１１５、６１−１１５、６２−１１５、６４−１１５、６５−１１５、６６−１１５、６７−１１５、６８−１１５、６９−１１５、７０−１１５；
６０−１１４、６１−１１４、６２−１１４、６４−１１４、６５−１１４、６６−１１４、６７−１１４、６８−１１４、６９−１１４、７０−１１４；
６０−９０、６１−９０、６２−９０、６４−９０、６５−９０、６６−９０、６７−９０、６８−９０、６９−９０、７０−９０；
６０−８９、６１−８９、６２−８９、６４−８９、６５−８９、６６−８９、６７−８９、６８−８９、６９−８９、７０−８９；
６０−８８、６１−８８、６２−８８、６４−８８、６５−８８、６６−８８、６７−８８、６８−８８、６９−８８、７０−８８；
６０−８７、６１−８７、６２−８７、６４−８７、６５−８７、６６−８７、６７−８７、６８−８７、６９−８７、７０−８７；
６０−８６、６１−８６、６２−８６、６４−８６、６５−８６、６６−８６、６７−８６、６８−８６、６９−８６、７０−１１９；
６０−８５、６１−８５、６２−８５、６４−８５、６５−８５、６６−８５、６７−８５、６８−８５、６９−８５、７０−８５；
６０−８４、６１−８４、６２−８４、６４−８４、６５−８４、６６−８４、６７−８４、６８−８４、６９−８４、７０−８４；
６０−８３、６１−８３、６２−８３、６４−８３、６５−８３、６６−８３、６７−８３、６８−８３、６９−８３、７０−８３；
６０−８２、６１−８２、６２−８２、６４−８２、６５−８２、６６−８２、６７−８２、６８−８２、６９−８２、７０−８２；
６０−８１、６１−８１、６２−８１、６４−８１、６５−８１、６６−８１、６７−８１、６８−８１、６９−８１、７０−８１；
６０−８０、６１−８０、６２−８０、６４−８０、６５−８０、６６−８０、６７−８０、６８−８０、６９−８０、７０−８０；
６０−７９、６１−７９、６２−７９、６４−７９、６５−７９、６６−７９、６７−７９、６８−７９、６９−７９、７０−７９；
６０−７８、６１−７８、６２−７８、６４−７８、６５−７８、６６−７８、６７−７８、６８−７８、６９−７８；
６０−７７、６１−７７、６２−７７、６４−７７、６５−７７、６６−７７、６７−７７、６８−７７；
６０−７６、６１−７６、６２−７６、６４−７６、６５−７６、６６−７６、６７−７６；
６０−７５、６１−７５、６２−７５、６４−７５、６５−７５、６６−７５；
６０−７４、６１−７４、６２−７４、６４−７４、６５−７４；
６０−７３、６１−７３、６２−７３、６４−７３；
６０−７２、６１−７２、６２−７２；
６０−７１、６１−７１；
６０−７０；
６０−６９。
【００５９】
同様の断片は、同じようにして、図１の配列アラインメントに基づき、配列番号４及び配列番号６の対応する部分から誘導可能である。
【００６０】
本発明のさらなる主題は、ＯＩＤに対して例えばＣ末端にあるＢＭＰ結合ドメインに関する（図２参照）。これらの結合ドメイン（及びそれら由来の断片）はまた低親和性ＢＭＰ結合ドメインとも呼ばれるが、これは、上述の高親和性ＢＭＰ結合ドメインに対するそれらの結合親和性が同等の試験条件下で低いものであり得るからである。
【００６１】
従って、本発明の主題はまた、配列番号２６及び２７に従う次の部分配列の少なくとも１つを特徴とするＢＭＰ結合ドメインにも関する：
ＬＸ２０ＬＣ（Ｖ／Ｌ）Ｘ２１ＧＣＰ（配列番号２６）（式中、Ｘ２０及びＸ２１は何らかのアミノ酸基を表す。）；又は
ＴＡＸ２２Ｘ２３Ｘ２４Ｃ（Ｋ／Ｈ）ＥＸ２５（Ｌ／Ｍ）ＰＶ（Ｅ／Ｋ）ＤＸ２６Ｙ（Ｆ／Ｙ）（Ｑ／Ｈ）（Ａ／Ｓ）ＣＶＦＤ（Ｖ／Ｌ）ＬＸ２７（Ｔ／Ｓ）Ｇ（配列番号２７）（式中、Ｘ２２からＸ２７は何らかのアミノ酸基を表す。）；
又は式
（配列番号２６）−Ｌｉｎｋ２−（配列番号２７）
の部分配列（式中、Ｌｉｎｋ２は、１０から４５、例えば１９前後から３８の何らかの連続アミノ酸基を含有する、配列番号２６及び２７架橋アミノ酸配列を表す。）。
【００６２】
特に、
Ｘ２０は、Ｔｙｒ又はＧｌｎを表し
Ｘ２１は、Ａｒｇ、Ａｓｎ又はＧｌｙを表し
Ｘ２２は、Ａｒｇ、Ａｓｎ又はＶａｌを表し、
Ｘ２３は、Ａｌａ、Ｔｈｒ又はＡｒｇを表し
Ｘ２４は、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ又はＬｅｕを表し
Ｘ２５は、Ｌｙｓ又はＧｌｙを表し
Ｘ２６は、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ又はＡｌａを表し、及び／又は
Ｘ２７は、Ｔｈｒ又はＩｌｅを表す。
【００６３】
配列番号２６の次の具体例を挙げる：
【００６４】
【化４】
2010537655.tif 000005
【００６５】
配列番号２７の次の具体例を挙げる：
【００６６】
【化５】
2010537655.tif 000006
【００６７】
Ｌｉｎｋ２リンカーの次の具体例を挙げる：
【００６８】
【化６】
2010537655.tif 000007
【００６９】
本発明による低親和性ドメインの例は、配列番号２に従う位置３１６前後から３８６前後の配列範囲からの、配列番号４に従う位置３５０前後から４２１前後の配列範囲からの、又は配列番号６に従う位置３１４前後から３６９の配列範囲からの、少なくとも１０連続アミノ酸基を含有するＢＭＰ結合ドメイン又はその結合断片である。
【００７０】
上述の「少なくとも１０アミノ酸基を含有する結合断片」の例は、例えば、上述のペプチド又は配列範囲の１つからの、１０−５０、１０−４０、１０−３０、１０−２５、１０−２０又は１０−１５、特に１０、１１、１２、１３、１４又は１５連続アミノ酸基を含有するものである。
【００７１】
本発明の主題は、特に、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６及びＢＭＰ−１２、特にＢＭＰ−２及び／又はＢＭＰ−４から選択される少なくとも１つのＢＭＰに結合するＢＭＰ結合ドメイン；及びネオゲニンにも結合するＢＭＰ結合ドメインに関する。
【００７２】
本発明のさらなる主題は、上記定義に従うＢＭＰ結合ドメインの抗原性ポリペプチド断片に関する。特に、免疫グロブリン分子を作製するために使用され得る及びＢＭＰ受容体分子へのＲＧＭの結合を調節する、特に、ネオゲニンへの受容体の結合を部分的又は完全に刺激するか（ａｇｏｎｉｚｅ）又はこれに拮抗（ａｎｔａｇｏｎｉｚｅ）し、場合によっては調節する、特にこれに部分的又は完全に拮抗する、抗原性ポリペプチド断片は、本発明の主題に相当する。例として、配列番号２由来の又は同様に配列番号４又は６由来の、上記ペプチド又は添付の表Ａで述べられるペプチドの１つの、少なくとも１０、例えば１０−３０、１０−２５、１０−２０又は１０−１５、例えば１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４又は４５連続アミノ酸基を含有する抗原性ポリペプチド断片が挙げられる。
【００７３】
本発明のさらなる主題は、ＲＧＭに対するポリクローナル抗血清又はモノクローナル抗体を作製するための、上記定義に従うＢＭＰ結合ドメインの使用又は上記定義に従うポリペプチド断片の使用に関し、この場合、抗血清又は抗体は、特に、ネオゲニン受容体に対するＲＧＭの結合を、調節、好ましくはそれに部分的又は完全に拮抗する。
【００７４】
本発明の主題はまた、診断又は治療用途に対する上記定義に従うＲＧＭに対するポリクローナル抗血清又はモノクローナル抗体にも関する。
【００７５】
本発明のさらなる主題は、一価もしくは多価担体ポリペプチド又は第二の生物学的活性ポリペプチドから選択される第二のポリペプチドに操作可能に（即ちＮ又はＣ末端に）連結される、上記定義に従うＢＭＰ結合ドメインから選択される、少なくとも１つの第一の生物学的活性ポリペプチドを含有する融合タンパク質に関する。特に、多価担体は、特に哺乳動物からの（特にヒト免疫グロブリン由来など）、免疫グロブリンの少なくとも１つのＦｃ又はＦｃ’’分子を含有し、この場合、その２本のポリペプチド鎖のそれぞれは、上記定義に従う同じ又は異なるＢＭＰ結合ドメインに操作可能に連結される。
【００７６】
本発明のさらなる主題は、ネオゲニンに対するＲＧＭの結合（即ちネオゲニン受容体）を調節する、ＲＧＭに対するポリクローナル抗血清又はモノクローナル抗体を作製するための、上記定義に従うＢＭＰ結合ドメインの使用又は上記定義に従うポリペプチドの使用に関する。
【００７７】
本発明の主題はまた、診断又は治療用途のための、上記定義に従うＲＧＭに対するポリクローナル抗血清又はモノクローナル抗体にも関する。
【００７８】
本発明の主題はまた、ネオゲニン受容体（ネオゲニン）と、ＲＧＭ又はＲＧＭ断片との相互作用が介在する疾病及び病期の診断又は治療用の医薬品を調製するための、上記定義に従うポリクローナル抗血清又はモノクローナル抗体の使用に関し、特に疾患又は病期は、
ａ）頭蓋骨、脳及び脊髄への機械的損傷、
ｂ）神経変性、炎症又は自己免疫疾患から選択される慢性疾患、
ｃ）神経再生、軸索発芽、神経突起伸展及び神経可塑性の疾患、
ｄ）腫瘍性疾患及び腫瘍転移
から選択される。
【００７９】
本発明の主題は、さらに、疾患又は病期が特に次のもの：
ａ）過剰な神経突起発芽及び／又は病的シナプス形成により引き起こされる精神状態及び慢性疼痛状態における神経突起生成プロセスの変化；
ｂ）鉄代謝障害に関連する疾病；
ｃ）骨の成長障害に関連する疾病；
ｄ）軟骨の退行性変化に関連する疾病；
ｅ）椎間板及び椎体への損傷に関連する疾病；
ｆ）無秩序な無制御の細胞移動プロセスに関連する疾病
から選択される場合の、ＲＧＭ又はＲＧＭ断片と関連受容体（例えば、ネオゲニン又はＢＭＰ）との相互作用の異常又は障害が介在する疾患又は病期の診断又は治療のための薬剤を調製するための、上記定義に従うＢＭＰ受容体結合ドメイン又は上記定義に従う融合タンパク質の使用に関する。
【００８０】
本発明のさらなる主題は、（ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６及び／又はＢＭＰ［−１２］、特にＢＭＰ−２及び／又は４への結合による）ＢＭＰシグナル経路の刺激又は増幅により治療され得る疾病又は病期の診断又は治療用の、特に骨の成長障害を含む疾病の治療用の、又は骨折の治療用の薬剤を調製するための、上記定義に従うＢＭＰ結合ドメイン又はその結合断片又は上記定義に従う融合タンパク質の使用に関する。
【００８１】
本発明のさらなる主題は、自己免疫疾患、特に、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性リンパ球増殖症候群（ＡＬＰＳ）、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、ベーチェット病、類天疱瘡、心筋ミオパチー、セリアック病、疱疹状皮膚炎、慢性疲労免疫機能障害症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発神経障害（ＣＩＤＰ）、瘢痕性類天疱瘡、全身性硬化症（ＣＲＥＳＴ症候群）、寒冷凝集素症、クローン病、皮膚血管炎、デゴス病、皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、円板状紅斑性狼瘡、本態性混合性クリオグロブリン血症、線維筋痛、グッドパスチャー症候群、グレーブズ病、ギランバレー症候群、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、免疫グロブリンＡニューロパシー、インスリン依存性糖尿病、若年性関節炎、川崎病、扁平苔癬、膜性糸球体腎炎、メニエール病、混合結合組織病、多巣性運動ニューロパチー、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛、多発筋炎、皮膚筋炎、原発性低γグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、レイノー現象、ロイター症候群、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、血管炎、尋常性白斑及びウェゲナー肉芽腫症から選択されるもの；
又は脱毛性疾患、特に円形脱毛症、全頭脱毛症、全身性脱毛症、男性型脱毛症、休止期脱毛症、成長期脱毛症及び化学療法誘発脱毛症から選択されるものの、診断又は治療用の薬剤の調製のための、上記定義に従うＢＭＰ結合ドメイン又はその結合断片又は上記定義に従う融合タンパク質の使用に関する。
【００８２】
本発明の主題はまた、ＲＧＭ結合リガンドの検出又は同定のための標的としての、上記定義に従うＢＭＰ結合ドメインの使用にも関する。
【００８３】
本発明のさらなる主題は、能動又は受動免疫付与のための免疫原としての、上記定義に従うＢＭＰ結合ドメインの使用又は上記定義に従う断片の使用に関する。
【００８４】
本発明のさらなる主題は、上記定義に従うＢＭＰ結合ドメイン又は上記定義に従うポリペプチド断片の抗原量での哺乳動物の免疫付与により得ることができるポリクローナル抗血清に関する。
【００８５】
本発明の主題はまた、上記定義に従うＢＭＰ結合ドメインに対するかもしくは上記定義に従うポリペプチド断片に対するモノクローナル抗体又はＲＧＭ  Ａへのその抗体の結合が上記で定義されるようなＢＭＰ結合ドメインにより又は上記で定義されるようなそのポリペプチド断片により調節されるモノクローナル抗ＲＧＭ  Ａ抗体；又はその抗原結合断片（場合によってはヒト化形態）にも関する。本発明の主題は、
ａ）上記定義に従うＢＭＰ結合ドメイン、上記定義に従うポリペプチド断片又は上記定義に従う融合タンパク質、
ｂ）上記定義に従うモノクローナル又はポリクローナル抗体
から選択される少なくとも１つの活性成分の医薬的に許容可能な担体を含有する医薬品に関する。
【００８６】
本発明に従う特に適切なものは、髄腔内、静脈内、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経口又は非経口、経皮、皮下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌ）、骨内（ｉｎｔｒａｏｓｓｅａｌ）、鼻腔、体外及び吸入投与のための、医薬品である。
【００８７】
本発明によるさらなる医薬品は、骨折の治療に適切であり、液体、半固形又は固形担体中の、少なくとも１つの上記定義に従うＢＭＰ結合ドメイン又は上記定義に従う融合タンパク質を含有する。
【００８８】
本発明によるさらなる医薬品は、鉄代謝障害（例えば、慢性疾患に伴う貧血、若年型ヘモクロマトーシス）の治療に適切であり、液体、半固体又は固体担体中の、上記定義に従う少なくとも１つのＢＭＰ結合ドメイン又は上記定義に従う融合タンパク質を含有する。
【００８９】
本発明のさらなる主題は、少なくとも１つの制御核酸配列に操作可能に連結される、上記定義に従うＢＭＰ結合ドメイン、上記定義に従う融合タンパク質又は上記定義に従うポリペプチド断片に対する、少なくとも１つのコード核酸配列を含有する発現ベクターに関する。
【００９０】
本発明は、さらに、次のものに関する。
【００９１】
−上記定義に従う、少なくとも１つのベクターを含む組み換え微生物。
【００９２】
−上記定義に従う、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株。上記定義に従うハイブリドーマ細胞株が培養され、産生されるタンパク質産物が培養物から単離される。
【００９３】
−上記定義に従う組み換え微生物が培養され、産生されるタンパク質産物が培養物から単離される、上記定義に従うＢＭＰ結合ドメイン又は上記定義に従うポリペプチド断片もしくは融合タンパク質を産生させるための方法。
【００９４】
本発明のさらなる主題は、上記定義に従うハイブリドーマ細胞株が培養され、産生されるタンパク質産物が培養物から単離される、上記定義に従うモノクローナル抗体を産生させるための方法である。
【００９５】
本発明のさらなる主題は、ＲＧＭ受容体、特にネオゲニン、又はＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６及びＢＭＰ−１２から選択されるＢＭＰを刺激するための医薬品を製造するための、上記定義に従うＢＭＰ結合ドメイン又は上記定義に従う融合タンパク質の使用に関する。
【００９６】
最後に、本発明は、特にネオゲニンなどのＲＧＭ受容体の活性化を阻止するための医薬品を製造するための、上記定義に従うモノクローナル抗体の使用に関する。
【００９７】
ＩＩＩ．本発明を行うためのさらなる情報
１．ポリペプチド
本発明の主題は、特に、ＲＧＭファミリーのタンパク質のＢＭＰ結合ドメイン、及びこれらのドメイン由来のペプチド断片に関する。ＲＧＭ  Ａ及びその結合ドメイン及びそれ由来の断片が本発明により特に詳細に調べられたが、本発明の主題はまた、相同的なタンパク質、例えば、特にＲＧＭ  Ｂ及びＲＧＭ  ＣなどのＲＧＭファミリーの相同的なメンバーの対応するドメイン及び断片にも関する。
【００９８】
本発明の範囲内で、具体的に開示されるＲＧＭドメイン又はペプチドの「機能的同等物」又は類似体は、配列番号２、４又は６に従うタンパク質のＢＭＰ結合ドメインに対して１００％未満の相同性であるポリペプチドなど、それらとは異なるが、所望の生物学的活性を有しているポリペプチドである。特に、これらの機能的同等物は、少なくとも１つのＢＭＰと結合することができるべきであり、及び／又は本明細書に記載の結合試験において結合を示し、また、場合によっては、本明細書中に記載の神経線維成長試験で阻害効果を示し、神経繊維の増殖を統計学的に有意に（ｐ＜＝０．０５）、部分的又は完全に阻害する。
【００９９】
本発明によると、「機能的同等物」は、特に、上述の特定の配列の配列位置の少なくとも１つにおいて、具体的に言及されるアミノ酸と異なるが、それにもかかわらず本明細書中で言及される生物学的活性の１つを有する異なる形態であるアミノ酸を含有する突然変異であると理解されたい。従って、「機能的同等物」は、１以上のアミノ酸の付加、置換、欠失及び／又は逆位を通じて得ることができる突然変異を包含し、この変化は、それらが、本発明に従う特性プロファイルを有する突然変異をもたらす限り、あらゆる配列位置において生じ得る。突然変異体と未変化ポリペプチドとの間の反応性パターンが定性的に一致する場合、特に機能的同等物が存在し、即ち、例えば、同一の生物学的効果が観察されるが、発現レベルが非常に異なっている。アミノ酸残基の適切な置換の具体例は以下の通りである。
【０１００】
元の残基  置換の例
Ａｌａ  Ｓｅｒ
Ａｒｇ  Ｌｙｓ
Ａｓｎ  Ｇｌｎ；Ｈｉｓ
Ａｓｐ  Ｇｌｕ
Ｃｙｓ  Ｓｅｒ
Ｇｌｎ  Ａｓｎ
Ｇｌｕ  Ａｓｐ
Ｇｌｙ  Ｐｒｏ
Ｈｉｓ  Ａｓｎ；Ｇｌｎ
Ｉｌｅ  Ｌｅｕ；Ｖａｌ
Ｌｅｕ  Ｉｌｅ；Ｖａｌ
Ｌｙｓ  Ａｒｇ；Ｇｌｎ；Ｇｌｕ
Ｍｅｔ  Ｌｅｕ；Ｉｌｅ
Ｐｈｅ  Ｍｅｔ；Ｌｅｕ；Ｔｙｒ
Ｓｅｒ  Ｔｈｒ
Ｔｈｒ  Ｓｅｒ
Ｔｒｐ  Ｔｙｒ
Ｔｙｒ  Ｔｒｐ；Ｐｈｅ
Ｖａｌ  Ｉｌｅ；Ｌｅｕ
【０１０１】
前記の意味における「機能的同等物」は、記載のペプチドの前駆体ならびにポリペプチドの機能的誘導体及び塩でもある。「塩」という用語は、本発明によるタンパク質分子のカルボキシル基の塩ならびにアミノ基の酸付加塩を意味すると理解されたい。カルボキシル基の塩は、それ自体公知の方法で調製され得、無機塩、例えばナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄及び亜鉛塩、ならびに、有機塩基、例えばトリエタノールアミン、アルギニン、リジン、ピペリジンなどのアミン、との塩が含まれる。酸付加塩、例えば塩酸又は硫酸などの鉱酸との塩及び酢酸及びシュウ酸などの有機酸との塩は、同様に本発明の主題である。本発明によるポリペプチドの「機能的誘導体」もまた、公知の技術を用いて、機能的アミノ酸側基、又はそのＮ−又はＣ−末端において提供され得る。このような誘導体には、例えば、カルボン酸基の脂肪族エステル、アンモニアとの、又は一級もしくは二級アミンとの反応によって得ることができるカルボン酸基のアミド；アシル基との反応によって調製される遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体；又はアシル基との反応によって調製される遊離ヒドロキシ基のＯ−アシル誘導体が含まれる。
【０１０２】
言うまでもなく、「機能的同等物」にはまた、他の生物から得られるポリペプチドならびに天然の変異体も含まれる。例えば、相同配列の領域の範囲は、配列比較によって確認することができ、同等の酵素は、本発明の特定の要件に従い判定することができる。
【０１０３】
「機能的同等物」はまた、前記ポリペプチド配列又はそれに由来する機能的同等物の１つ、及び機能的Ｎ−又はＣ−末端結合においてそれらと機能的に異なる（即ち、融合タンパク質の一部の重要な相互機能障害）、少なくとも１つのさらなる異なる異種配列を有する融合タンパク質である。このような異種配列の非限定例には、酵素及び免疫グロブリンが含まれる。
【０１０４】
本発明により包含される「機能的同等物」には、具体的に開示されるタンパク質、即ちペプチドに対する相同体が含まれる。これらの機能的同等物は、少なくとも４０％又は少なくとも５０％又は少なくとも６０％、例えば７５％、又は特に少なくとも８５％、例えば９０％、９５％又は９９％の、例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．、Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８５（８）、１９８８、２４４４−２４４８により開発されたアルゴリズムに従い計算される、具体的に開示される配列の１つに対する相同性を有する。本発明による相同ポリペプチドの相同性のパーセンテージは、特に、本明細書中で具体的に開示されるアミノ酸配列の１つの完全長に対する、アミノ酸基の％同一性を意味する。
【０１０５】
別段の指示がない限り、本発明に従い、「由来する」アミノ酸配列は、最初の配列と、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、特には９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％及び９９％の同一性を有する配列を意味する。
【０１０６】
２つの配列間の「同一性」又は「相同性」は、個々の配列の全長にわたるアミノ酸残基の同一性、例えば、下記のパラメータでの、クラスタル法（Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｄ．Ｇ．及びＳｈａｒｐ  Ｐ．Ｍ．、Ｆａｓｔ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ  ｏｎ  ａ  ｍｉｃｒｏｃｏｍｐｕｔｅｒ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１９８９、５（２）：１５１−１）を用いたＩｎｆｏｒｍａｘ（米国）のＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ｓｕｉｔｅ  ７．１ソフトウェアを用いた比較により計算される同一性を意味する：
複数のアラインメントパラメータ
ギャップオープニングペナルティ  １０
ギャップエクステンションペナルティ  １０
ギャップセパレーションペナルティ範囲  ８
ギャップセパレーションペナルティ  切
アラインメントディレイに対する％同一性  ４０
残基特異的ギャップ  切
親水性残基ギャップ  切
遷移計量  ０
ペアワイズ配列パラメータ：
ＦＡＳＴアルゴリズム  入
Ｋ−チュプルサイズ  １
ギャップペナルティ  ３
ウィンドウサイズ  ５
最良のダイアゴナルの数  ５。
【０１０７】
タンパク質のグリコシル化の可能性がある場合、同等物には、グリコシル化パターンを変化させることにより得られ得る、脱グリコシル化又はグリコシル化型の、及び修飾型の、上述のタイプのタンパク質が包含される。
【０１０８】
本発明によるペプチドの相同体は、例えば短縮型変異体の変異体のコンビナトリアルライブラリをスクリーニングすることによって同定され得る。例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物の酵素連結などにより、核酸レベルでのコンビナトリアル突然変異誘発によりペプチド変異体の多様なライブラリが作製され得る。縮重オリゴヌクレオチド配列由来の潜在的な相同体のライブラリを作製するために使用され得る多数の方法がある。縮重遺伝子配列の化学合成は、ＤＮＡ合成装置により行われ得、次いで、合成遺伝子は、適切な発現ベクターにおいて連結され得る。縮重遺伝子のセットを使用することによって、混合物において調製されるべき潜在的なタンパク質配列に対する所望のセットをコードする全ての配列を供給することが可能になる。縮重オリゴヌクレオチドを合成するための方法は当業者にとって公知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ、Ｓ．Ａ．（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８：１０５６；Ｉｋｅら（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１１：４７７）。
【０１０９】
２．核酸
本発明のさらなる主題は、さらに、上述のＢＭＰ結合ドメイン及びポリペプチドに対するコード核酸配列、特に、上述のペプチド断片をコードする、配列番号１、３及び５ならびにそれら由来の核酸配列又は部分配列に関する。
【０１１０】
本発明による核酸配列は全て（１本鎖及び２本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡ配列、例えば、ｃＤＮＡ及びｍＲＮＡ）、例えば、二重らせんの個々に重複する相補的な核酸構造単位の断片縮合によるヌクレオチド構造単位からの化学合成などを通じてそれ自体公知である。オリゴヌクレオチドの化学合成は、例えばホスホラミダイト法（Ｖｏｅｔ、Ｖｏｅｔ、第２版、Ｗｉｌｅｙ  Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、８９６−８９７頁）に従い、公知のように行われ得る。合成的オリゴヌクレオチドの付加及びＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗ断片及び連結反応を用いたギャップの埋め込みならびに一般的クローニング法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓに記載されている。
【０１１１】
別段の断りがない限り、本発明に従い、「由来する」核酸配列は、最初の配列と、少なくとも８０％又は少なくとも９０％、特に９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％及び９９％の同一性を有する配列を意味する。
【０１１２】
２つの核酸間の「同一性」は、核酸の各全長にわたる核酸の同一性、特に、クラスタル法（上記参照）を用いたＩｎｆｏｒｍａｘ（米国）からのＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ｓｕｉｔｅ  ７．１ソフトウェアを用いた比較により計算される同一性を意味する。
【０１１３】
本発明の主題はまた、上記ペプチドの１つ及びその機能的同等物をコードし、例えば人工ヌクレオチド類似体を用いて得ることができる、核酸配列にも関する。
【０１１４】
本発明は、本発明による、ペプチド又はその生物学的活性セグメントをコードする単離核酸分子、ならびに、例えば本発明によるコード核酸を同定又は増幅するためのハイブリッド形成試料又はプライマーとして用いられ得る核酸断片に関する。
【０１１５】
本発明による核酸分子はまた、コード遺伝子領域の３’及び／又は５’末端の非翻訳配列も含有し得る。
【０１１６】
「単離（された）」核酸分子は、その核酸の天然源に存在する他の核酸分子から分離され、また、組み換え技術を用いて生成される場合、他の細胞物質又は培地を基本的に含み得ないか、又は化学合成される場合、化学的前駆体又は他の化学物質を含み得ない。
【０１１７】
本発明による核酸分子は、分子生物学の標準的技術、及び本発明により提供される配列情報を用いて単離され得る。例えば、ｃＤＮＡはハイブリッド形成試料として具体的に開示される完全配列又はそのセグメントを用い、標準的ハイブリッド形成技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ、Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９に記載のものなど）を用いることにより、適切なｃＤＮＡライブラリから単離され得る。さらに、この配列に基づいて作製されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により、本発明による配列又はそのセグメントの１つを含む核酸分子が単離され得る。このようにして増幅された核酸を適切なベクターにクローニングし、ＤＮＡ配列分析により特徴を調べ得る。本発明によるオリゴヌクレオチドはまた、標準合成方法を用いて、例えば、ＤＮＡ合成装置を用いて作製することもできる。
【０１１８】
本発明はまた、具体的に記載されるヌクレオチド配列に相補的である核酸分子又はそのセグメントを包含する。
【０１１９】
本発明によるヌクレオチド配列によって、他の細胞タイプ及び生物において、相同配列を同定及び／又はクローニングするために用いられ得る試料及びプライマーを作製することが可能となる。このような試料又はプライマーは、通常、厳密な（ストリンジェントな）条件下で、本発明による核酸配列のセンス鎖又は対応するアンチセンス鎖の少なくともおよそ１２、好ましくは少なくともおよそ２５、例えばおよそ４０、５０又は７５の連続ヌクレオチドとハイブリッド形成するヌクレオチド配列領域を含む。
【０１２０】
本発明によるその他の核酸配列は、本発明によるＲＧＭドメイン及びペプチドに対するコード配列に由来し、１以上のヌクレオチドの付加、置換、挿入又は欠失によりそれらとは異なるが、所望の特性プロファイルを有するペプチドをコードしている。
【０１２１】
本発明は、いわゆるサイレント突然変異を含むか、又は元の特定の生物又は宿主生物、ならびに天然の変異体、例えばスプライス変異又は対立遺伝子多型のコドン使用に対応して、具体的に指定される配列と比較して修飾される核酸配列も含む。本発明の主題はまた、保存的ヌクレオチド置換により得られる配列（即ち、関連するアミノ酸の、同じ電荷、大きさ、極性及び／又は溶解性のアミノ酸による置換）にも関する。
【０１２２】
本発明の主題はまた、配列多型による具体的に開示される核酸に由来する分子に関する。これらの遺伝的多型は、自然変動による集団内の個体間で存在し得る。これらの自然変異の結果、通常、遺伝子のヌクレオチド配列において１〜５％の変異が起こる。
【０１２３】
本発明はまた、上記コード配列とハイブリッド形成するか又はそれに相補的である核酸配列も包含する。これらのポリヌクレオチドは、ゲノム又はｃＤＮＡライブラリを標本抽出することにより見出すことができ、場合によっては、適切なプライマーを用いたＰＣＲにより増幅させ、次いで適切な試料を用いてそれから単離され得る。別の可能性は、本発明によるポリヌクレオチド又はベクターを用いた適切な微生物の形質転換、微生物の増殖及び従ってポリヌクレオチドの増殖、及び続くその単離である。本発明によるポリヌクレオチドを化学的に合成することもできる。
【０１２４】
ポリヌクレオチドと「ハイブリッド形成」することができる特性は、厳密な（ストリンジェントな）条件下で、基本的に相補的な配列に結合するポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの能力を意味するが、一方、これらの条件下では非相補的パートナーの間の非特異的結合が起こらない。この目的のため、配列は、７０〜１００％、特に９０〜１００％、例えば、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％相補的であるべきである。互いに特異的に結合する相補的配列の特性は、例えば、ノーザンもしくはサザンブロッティング法において、又はＰＣＲもしくはＲＴ−ＰＣＲにおけるプライマー結合において用いられる。この目的のために、３０塩基対の長さで始まるオリゴヌクレオチドが通常は用いられる。「厳密な（ストリンジェントな）条件下」とは、例えば、ノーザンブロッティング法においては、非特異的にハイブリッド形成するｃＤＮＡ試料又はオリゴヌクレオチドを溶出するためなどの５０〜７０℃、好ましくは６０〜６５℃の温度での、例えば、０．１％ＳＤＳを含む０．１ｘＳＳＣバッファー（２０ｘＳＳＣ：３Ｍ  ＮａＣｌ、０．３Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）などの洗浄溶液の使用を意味する。前述したように、相補性の程度が高い核酸のみが互いに結合したままである。厳密な（ストリンジェントな）条件の設定は当業者にとって公知であり、例えば、Ａｕｓｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）、６．３．１−６．３．６で開示されている。
【０１２５】
本発明のさらなる態様はアンチセンス核酸に関する。アンチセンス核酸は、コード「センス」核酸に相補的であるヌクレオチド配列を含む。アンチセンス核酸は完全なコード鎖又はその一部とのみ相補的であり得る。さらなる実施態様において、アンチセンス核酸分子は、ヌクレオチド配列のコード鎖の非コード領域に対してアンチセンスである。「非コード領域」という用語は５’−及び３’−非翻訳領域と呼ばれる配列部分に関する。
【０１２６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、およそ５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０ヌクレオチド長であり得る。本発明によるアンチセンス核酸は、当技術分野で公知の方法を用いて、化学合成及び酵素連結反応により構築され得る。アンチセンス核酸は、天然のヌクレオチド、又は、それらが分子の生物学的安定性を向上させるか又はアンチセンスとセンス核酸との間に形成される二重鎖の物理的安定性を向上させるような配列を有する多様に修飾されたヌクレオチドを用いて化学的に合成され得る。例えば、ホスホロチオエート誘導体及びアクリジン−置換ヌクレオチドが使用され得る。アンチセンス核酸を作製するために用いられ得る修飾ヌクレオチドの例には、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルケオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（Ｖ）、ワイブトキソシン、シュードウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）−ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ及び２，６−ジアミノプリンが含まれる。アンチセンス核酸はまた、核酸がアンチセンス方向にサブクローニングされた発現ベクターを用いることにより、生物学的に作製され得る。
【０１２７】
３．発現コンストラクト及びベクター
本発明はのさらなる主題は、調節核酸配列の遺伝子制御下での、本発明によるＲＧＭペプチド又は機能的同等物又は免疫グロブリンをコードする核酸配列を含有する発現コンストラクト；ならびにこれらの発現コンストラクトの少なくとも１つを含むベクターに関する。
【０１２８】
本発明によるこのようなコンストラクトは、好ましくは、特定のコード配列からの５’−上流のプロモーター及び場合によっては３’−下流の終結配列及びその他の一般的な制御エレメントを含み、特異的に、それぞれ、コード配列に操作可能に連結される。「操作可能な連結」は、各制御エレメントが、コード配列の発現においてその機能を適正に達成することができるような、プロモーター、コード配列、終結因子及び場合によってはその他の制御エレメントの連続した配列を意味する。操作可能に連結可能な配列の例は、標的配列ならびにエンハンサー、ポリアデニル化シグナルなどである。さらなる制御エレメントには、選択可能マーカー、増幅シグナル、複製起点などが含まれる。適切な制御配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）に記載されている。
【０１２９】
人工的制御配列に加え、実際の構造遺伝子の前に天然の制御配列が存在し得る。必要であれば、この天然制御は遺伝子改変によって排除することができ、遺伝子の発現が増加又は減少し得る。しかし、遺伝子コンストラクトはまた、より簡単な構造も有し得、即ち、構造遺伝子の前にさらなる制御シグナルが挿入されず、その制御とともに天然のプロモーターが除去されない。代わりに、制御が起こらずに遺伝子発現が向上又は低下するように、天然の制御配列を突然変異させる。核酸配列は、遺伝子コンストラクト中の１以上のコピーに含有され得る。
【０１３０】
用いられ得るプロモーターの例は、次のとおりである：グラム陰性菌において好都合に使用される、ｃｏｓ、ｔａｃ、ｔｒｐ、ｔｅｔ、ｔｒｐｔｅｔ、ｌｐｐ、ｌａｃ、ｌｐｐｌａｃ、ｌａｃｌｑ、Ｔ７、Ｔ５、Ｔ３、ｇａｌ、ｔｒｃ、ａｒａ、ＳＰ６、λ−ＰＲ又はλ−ＰＬプロモーター；ａｍｙ及びＳＰＯ２グラム陽性菌プロモーターに加えて、ＡＤＣ１、ＭＦα、ＡＣ、Ｐ−６０、ＣＹＣ１又はＧＡＰＤＨ酵母プロモーター、植物プロモーターＣａＭＶ／３５Ｓ、ＳＳＵ、ＯＣＳ、ｌｉｂ４、ｕｓｐ、ＳＴＬＳ１、Ｂ３３又は非植物プロモーター又はユビキチン又はファセオリンプロモーターである。誘導性プロモーター、例えば、光、及び特に、ＰｒＰｌプロモーターなどの温度誘導性プロモーターの使用が特に好ましい。原則として、それらの制御配列を有する全ての天然プロモーターが使用され得る。合成プロモーターもまた有利に使用され得る。
【０１３１】
前記制御配列は、核酸配列の標的とされる発現及びタンパク質発現を可能にするものを意図する。宿主生物に依存して、これは、例えば、遺伝子が誘導後にのみ発現もしくは過剰発現されるか又は遺伝子が直ちに発現及び／又は過剰発現されることを意味し得る。
【０１３２】
制御配列又は因子は、好ましくは正方向に影響し、従って発現を増加又は低下させる。従って、制御エレメントの増強は、プロモーター及び／又はエンハンサーのような強力な転写シグナルを用いることにより、転写レベルで有利に引き起こされ得る。しかし、例えば、ｍＲＮＡの安定性を向上させることにより、転写を増強させることも可能である。
【０１３３】
適切なプロモーターを適切なコードヌクレオチド配列及び終結シグナル又はポリアデニル化シグナルに融合することにより、発現カセットが作製される。例えば、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９）及びＴ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ、Ｍ．Ｌ．Ｂｅｒｍａｎ及びＬ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８４）及びＡｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．及びＷｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）に記載されるように、一般的組み換え及びクローニング技術がこの目的に用いられる。
【０１３４】
適切な宿主生物における発現のため、組み換え核酸コンストラクト即ち遺伝子コンストラクトが、宿主における遺伝子の最適な発現を可能にする宿主特異的ベクターに有利に挿入される。ベクターは当業者にとって周知であり、例えば、「Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ」（Ｐｏｕｗｅｌｓ  Ｐ．Ｈ．ら編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ−Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ−Ｏｘｆｏｒｄ、１９８５）に記載されている。ベクターは、プラスミドのみならず、当業者にとって公知のその他の全てのベクター、例えば、ファージ、ＳＶ４０、ＣＭＶ、バキュロウイルス及びアデノウイルスなどのウイルス、トランスポゾン、ＩＳエレメント、ファスミド、コスミド及び直鎖又は環状ＤＮＡを意味するものと理解されたい。これらのベクターは、宿主生物における自発的複製又は染色体複製を受け得る。
【０１３５】
適切な発現ベクターの例は次のとおりである：
グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ−結合タンパク質又はプロテインＡが組み換え標的タンパク質に融合させられる、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ、Ｄ．Ｂ．及びＪｏｈｎｓｏｎ、Ｋ．Ｓ．（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ及びＢｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）及びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）などの従来の融合発現ベクター、
ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎら（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６９：３０１−３１５）及びｐＥＴ  １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９０）６０−８９）などの非融合タンパク質発現ベクター、
ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら（１９８７）Ｅｍｂｏ  Ｊ．６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ及びＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ（１９８２）Ｃｅｌｌ  ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら（１９８７）Ｇｅｎｅ  ５４：１１３−１２３）及びｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）などのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓ．セレビシエ）酵母における発現のための酵母発現ベクターである。糸状菌などのその他の真菌において用いるのに適切なベクター及びベクター構築法は、ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｎｄｅｌ、Ｃ．Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｊ．及びＰｕｎｔ、ＰＪ．（１９９１）「Ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  ｖｅｃｔｏｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｎｇｉ」、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｆｕｎｇｉ、Ｊ．Ｆ．Ｐｅｂｅｒｄｙら編、ｐ．１−２８、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃａｍｂｒｉｄｇｅに詳細に開示されるものを含む。
【０１３６】
培養昆虫細胞（例えばＳｆ９細胞）でのタンパク質の発現を可能にするバキュロウィルスベクターには、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈら（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）及びＰＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ及びＳｕｍｍｅｒｓ（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０：３１−３９）が含まれる。
【０１３７】
Ｂｅｃｋｅｒ、Ｄ．、Ｋｅｍｐｅｒ、Ｅ．、Ｓｃｈｅｌｌ、Ｊ．及びＭａｓｔｅｒｓｏｎ、Ｒ．（１９９２）「Ｎｅｗ  ｐｌａｎｔ  ｂｉｎａｒｙ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｌｏｃａｔｅｄ  ｐｒｏｘｉｍａｌ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｌｅｆｔ  ｂｏｒｄｅｒ」、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０：１１９５−１１９７；及びＢｅｖａｎ、Ｍ．Ｗ．（１９８４）「Ｂｉｎａｒｙ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｐｌａｎｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：８７１１−８７２１）に詳細に開示されるものなどの植物発現ベクター。
【０１３８】
ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ、Ｂ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：８４０）及びｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１８７−１９５）などの哺乳動物発現ベクター。
【０１３９】
原核及び真核細胞に対するさらなる適切な発現系は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ、Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９の第１６及び１７章に記載されている。
【０１４０】
４．組み換え宿主生物
本発明によるベクターの使用により、例えば、本発明による少なくとも１つのベクターを用いて形質転換された組み換え生物を生成させ得、本発明によるドメイン又はポリペプチドを生成させるために使用し得る。本発明による上述の組み換えコンストラクトは、適切な宿主系に有利に導入され発現される。特定の発現系において前記の核酸の発現を誘発するために、当業者にとって公知の一般的なクローニング及び遺伝子移入法、例えば、共沈、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、レトロウイルス遺伝子移入などが、好ましくは用いられる。適切な系は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９７又はＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９に記載されている。
【０１４１】
原則として、適切な宿主生物は、本発明による核酸、その対立遺伝子多型、その機能的同等物又は誘導体を発現することができる全ての生物である。「宿主細胞」は、例えば、細菌、真菌、酵母又は植物もしくは動物細胞を意味するものと理解されたい。好ましい生物は、例えば、大腸菌などのエシェリキア属、ストレプトミセス属、バチルス属又はシュードモナス属などの細菌、サッカロミセス・セレビシエ、アスペルギルス属などの真核微生物、例えばＳｆ９、ＣＨＯ又はＨＥＫ２９３細胞などの、動物又は植物由来の高等真核細胞である。
【０１４２】
首尾よく形質転換された生物は、ベクター又は発現カセット中に同様に含有されるマーカー遺伝子の使用によって選択され得る。このようなマーカー遺伝子の例は、抗生物質耐性に対する遺伝子及び発色反応を触媒し、形質転換細胞の染色を生じる酵素に対する遺伝子である。次いで、これらのマーカー遺伝子は、自動細胞選別を用いて選択され得る。対応する抗生物質耐性遺伝子（例えばＧ４１８又はハイグロマイシン）を有するベクターで首尾よく形質転換された微生物は、適切な抗生物質を含有する培地又は培養液を用いて選択され得る。細胞表面に提示されるマーカータンパク質は、アフィニティークロマトグラフィーを用いた選択に使用され得る。
【０１４３】
必要に応じて、遺伝子産物はまた、例えば、特にマウス、ヒツジなどの遺伝子移入動物、又は遺伝子移入植物などの遺伝子移入生物中で発現させられ得る。
【０１４４】
本発明のさらなる主題は、ペプチド産生組み換え宿主生物が培養され、場合によってはポリペプチドの発現が誘導され、これらのポリペプチドが培養物から単離される、本発明によるＲＧＭドメイン又はポリペプチド、又はその機能的、生物学的活性断片の組み換え産生法に関する。必要に応じて、ペプチドは、この方法により工業的スケールで作製することもできる。
【０１４５】
組み換え宿主は、公知の方法に従い培養し発酵させ得る。細菌は、例えば、ＴＢ又はＬＢ培地中で、２０から４０℃の温度及び６から９のｐＨで、増殖させ得る。適切な培養条件は、例えば、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９）で詳細に記載されている。
【０１４６】
ポリペプチドが培地中に分泌されない場合、細胞を破壊し、公知のタンパク質単離方法により溶解物から生成物が回収される。細胞は、場合によっては、高周波数超音波、高圧により（例えばフレンチプレッシャーセルを用いて）、浸透圧溶解により、界面活性剤、溶解酵素又は有機溶媒の作用を通じて、均質化により、又は上記方法のいくつかの組み合わせにより破壊され得る。
【０１４７】
ペプチドは、例えば、Ｑ−セファロースクロマトグラフィーなどの分子ふるいクロマトグラフィー（ゲルろ過）、イオン交換クロマトグラフィー及び疎水性クロマトグラフィーなどの公知のクロマトグラフィー法及び、超遠心、結晶化、塩析、透析及び非変性ゲル電気泳動などのその他の通常の方法によって精製され得る。適切な方法は、例えば、Ｃｏｏｐｅｒ、Ｆ．Ｇ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｃｈｅ  Ａｒｂｅｉｔｓｍｅｔｈｏｄｅｎ［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｒｏｃｅｄｕｒａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ］、Ｖｅｒｌａｇ  Ｗａｌｔｅｒ  ｄｅ  Ｇｒｕｙｔｅｒ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ又はＳｃｏｐｅｓ、Ｒ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｂｅｒｌｉｎに記載されている。
【０１４８】
組み換えペプチドの分離のために、例えば、ある種のヌクレオチド配列によりｃＤＮＡを伸長し、それによって修飾ポリペプチド又は融合タンパク質（精製を容易にするために使用される。）をコードする、ベクター系又はオリゴヌクレオチドを使用することが特に適切である。この適切な修飾の例は、例えば、ヘキサ−ヒスチジンアンカーとして知られる修飾、又は抗体の抗原として同定され得るエピトープなどのアンカーとして作用する、いわゆるタグである（例えば、Ｈａｒｌｏｗ、Ｅ．及びＬａｎｅ、Ｄ．、１９８８、Ａｎｂｉｔｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（Ｎ．Ｙ．）Ｐｒｅｓｓに記載）。これらのアンカーは、クロマトグラフィーカラム中に充填され得るポリマーマトリクスなどの固定基質にペプチドを付着させるために使用し得るか、又は、マイクロタイタープレート又は何らかのその他の基質上で使用され得る。
【０１４９】
同時に、これらのアンカーは、ペプチドの同定のために使用され得る。ペプチドの同定の場合、蛍光色素などの従来のマーカー、基質との反応後に検出可能な反応生成物を形成する酵素マーカー又は放射標識マーカーを、単独で又はペプチドの誘導体化のためのアンカーと組み合わせて、使用し得る。
【０１５０】
５．免疫グロブリン
５．１定義
本発明の主題は、本発明によるＲＧＭタンパク質又はその誘導体／同等物と特異的に結合するモノクローナル又はポリクローナル抗体、即ち、本発明によるＲＧＭタンパク質又はその誘導体／同等物に対して特異性を有する抗体に関する。本発明の主題は、さらに、これらの抗体の一部、特にその抗原結合部位、即ち、本発明によるＲＧＭタンパク質又はその誘導体／同等物と結合する抗体断片に関する。
【０１５１】
本発明による抗体は、好ましくは、本発明によるＲＧＭタンパク質又はその誘導体／同等物に対する特異的結合に対する特定の結合キネティクス（例えば、高親和性、低解離、低解離速度（ｋｏｆｆ）、強い中和活性）を有するように選択される。
【０１５２】
従って、本発によるＲＧＭタンパク質又はその誘導体／同等物に対し、ＫＤ＝１０−６から１０−１２Ｍの範囲の親和力を有する抗体が提供され得る。
【０１５３】
さらなる態様によると、本発明による抗体は、０．１ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度定数でＲＧＭタンパク質又はその誘導体／同等物にそれらが結合するように選択され得る。
【０１５４】
抗体は好ましくは単離抗体である。さらなる態様によると、抗体は中和抗体である。本発明による抗体には、特にモノクローナル及び組み換え抗体が含まれる。本発明による抗体は、完全に単一の種に由来し、従って例えばヒト抗体はラット抗体又はマウス抗体であり得るアミノ酸配列を含有し得る。さらなる実施態様によると、抗体は、キメラ抗体又はＣＤＲグラフト抗体又はヒト化抗体のその他の形態でもあり得る。
【０１５５】
「抗体」という用語は、４本のポリペプチド鎖、即ち２本の重（Ｈ）鎖及び２本の軽（Ｌ）鎖から形成される免疫グロブリン分子を指す。この鎖は、通常、ジスルフィド結合によって互いに連結される。各重鎖は、この鎖の可変領域（本明細書においてＨＣＶＲ又はＶＨと略される。）及び重鎖の定常領域から構成される。重鎖の定常領域は、３個のドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３から形成される。各軽鎖は、軽鎖の可変領域（本明細書においてＬＣＶＲ又はＶＬと略される。）及び軽鎖の定常領域からなる。軽鎖の定常領域は、ＣＬドメインから形成される。ＶＨ及びＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域にさらに分割され得、フレームワーク領域と呼ばれる保存領域（ＦＲ）が散在する。各ＶＨ及びＶＬ領域は、３個のＣＤＲ及び４個のＦＲから形成され、Ｎ末端からＣ末端に、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配置される。
【０１５６】
抗体の「抗原結合部分」（又は単に「抗体部分」）という用語は、本発明によるＲＧＭタンパク質又はその誘導体／同等物に対して特異性を有し、抗体の１以上の断片（断片は、ＲＧＭタンパク質又はその誘導体／同等物に特異的に結合する能力を有し続けている。）を指す。抗体の抗原結合機能が、完全抗体の断片から確認され得ることが分かった。抗体の「抗原結合部分」という用語の意味における結合断片の例は、（ｉ）Ｆａｂ断片、即ち、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価の断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、即ち、ジスルフィド架橋を介してヒンジ領域において互いに連結される２つのＦａｂ断片を含有する二価の断片；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｖ）ＶＨドメイン又はＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＤＨ３又はＶＨ、ＣＨ２、ＣＨ３からなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）；及び（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）である。Ｆｖ断片の２つのドメイン、即ちＶＬ及びＶＨは、別個の遺伝子によってコードされ、それらは、組み換え法に従う合成リンカーを用いて一緒に連結され得るが、この方法においては、ＶＬ及びＶＨ領域が一価の分子を形成するために一緒に存在する場合に、単一のタンパク質鎖として産生され得る（単一鎖ＦＶ（ＳｃＦｖ）として知られる。例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；及びＨｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３を参照のこと。）。このような１本鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」という用語内に包含される。「ダイアボディ」などの１本鎖抗体のその他の形態は、同様にその中に含まれる。ダイアボディは、ＶＨ及びＶＬドメインが単一ポリペプチド鎖上で発現され（２つのドメインが同じ鎖上で一緒に存在するには短すぎるリンカーを用いる場合を除く。）、それにより、これらのドメインが他の鎖の相補性ドメインと対形成させられ、２つの抗原部位が形成される、２価の二重特異性抗体である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ、Ｐ．ら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｌｊａｋ、Ｒ．Ｊ．ら（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３を参照）。
【０１５７】
さらに、抗体又はその抗原結合部分は、大きな免疫付着分子の一部であり得、これは、１以上のさらなるタンパク質又はペプチとの抗体又は抗体部分の共有又は非共有結合により形成される。このような免疫付着分子は、４量体ｓｃＦｖ分子を作製するためのストレプトアビジンコア領域の使用を含み（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ、Ｓ．Ｍ．ら（１９９５）「Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ」６：９３−１０１）、二価及びビオチニル化ｓｃＦｖ分子を作製するためのシステイン残基、マーカーペプチド及びＣ−末端ポリヒスチジンタグの使用を含む（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ、Ｓ．Ｍ．ら（１９９４）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：１０４７−１０５８）。
【０１５８】
Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片などの抗体部分は、パパイン又はペプシンを用いた消化などの従来の技術を用いることにより、全抗体から作製され得る。標準化組み換えＤＮＡ技術を用いることにより、抗体、抗体部分及び免疫付着分子を得ることもできる。「本発明によるＲＧＭタンパク質又はその誘導体／同等物に対する特異性を有する単離抗体」は、基本的に異なる抗原特異性を有するその他の抗体を含まない、本発明によるＲＧＭタンパク質又はその誘導体／同等物に対する特異性を有する抗体を包含する。
【０１５９】
「中和抗体」という用語は、特定の抗原に対するその結合の結果、抗原の生物学的活性が阻害される抗体を表す。この、抗原の生物学的活性の阻害は、適切なインビトロ又はインビボアッセイを用いて、抗原の生物学的活性に対する１以上の指標を測定することにより評価され得る。
【０１６０】
「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマに由来する抗体（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎによる標準化ハイブリドーマ法などのハイブリドーマ技術を用いて作製されるハイブリドーマにより分泌される抗体）を指す。従って、本発明によるＲＧＭタンパク質又はその誘導体／同等物に対する特異性を有し、ハイブリドーマに由来する抗体はモノクローナル抗体と呼ばれる。
【０１６１】
「組み換え抗体」という用語は、組み換え手段を用いて、発現、生成又は単離される抗体、例えば、宿主細胞に遺伝子移入される組み換え発現ベクターを使用して発現される抗体；組み換えコンビナトリアル抗体ライブラリから単離される抗体；ヒト免疫グロブリン遺伝子を用いて遺伝子導入された動物（例えば、マウス）から単離される抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ、Ｌ．Ｄ．ら（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：６２８７−６２９５参照）；又は特定の免疫グロブリン遺伝子配列（ヒト免疫グロブリン遺伝子配列など）がその他のＤＮＡ配列と組み合わせられる、何らかのその他の方法において、発現、生成又は単離される抗体を表す。組み換え抗体には、例えば、キメラ、ＣＤＲグラフト及びヒト化抗体が含まれる。
【０１６２】
「ヒト抗体」という用語は、例えばＫａｂａｔらにより記載されるものなど、その可変及び定常領域が、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に対応するか又はそれに由来する抗体を指す（Ｋａｂａｔら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２参照）。しかし、本発明によるヒト抗体は、例えば、ＣＤＲ及び特にＣＤＲ３において、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸基を含有し得る（例えば、インビトロでの無作為もしくは部位特異的突然変異誘発又はインビボでの体細胞突然変異により導入される突然変異）。本発明による組み換えヒト抗体は、可変領域を有し、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する定常領域を含有し得る（Ｋａｂａｔ、Ｅ．Ａ．ら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２を参照のこと。）。しかし、ある実施態様によると、このような組み換えヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列のＶＨ及びＶＬ配列に関連するか又はそれらに由来するにしても組み換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列がインビボにおけるヒト抗体生殖細胞系列レパートリー内で天然に存在しない配列であるように、インビトロにおける突然変異誘発を受ける（又はヒトＩｇ配列のために遺伝子導入される動物が用いられる場合、体細胞に対してインビボ突然変異誘発が行われる。）。ある実施態様によると、このような組み換え抗体は、選択的変異誘発又は復帰突然変異又はその両方の結果である。
【０１６３】
「復帰突然変異」という用語は、ヒト抗体の体細胞突然変異アミノ酸のいくつか又は全てが、相同的な生殖細胞系列抗体配列の対応する生殖細胞系列残基により置換される方法を指す。最大の相同性を有する配列を同定するために、本発明によるヒト抗体の重鎖及び軽鎖に対する配列をＶＢＡＳＥデータベースの生殖細胞系列配列と別個に比較する。本発明によるヒト抗体における相違は、このような異なるアミノ酸をコードする定義されたヌクレオチド位置において突然変異させることによる生殖細胞系列配列に起因する。抗原結合に対する復帰突然変異のための候補としてこのように同定される各アミノ酸の直接的又は間接的重要性を調べ、変異後にヒト抗体の所望の特性を損なうアミノ酸は、最終的ヒト抗体に含めない。復帰突然変異のためのアミノ酸の数を最小限に留めるために、それらが次の生殖細胞系列配列とは異なるが、第二の生殖細胞系列の対応するアミノ酸配列と同一であるアミノ酸位置は不変のままであり得る（ただし、第二の生殖細胞系列配列は、本発明によるヒト抗体の配列に対して、問題となるアミノ酸の両方の側で、少なくとも１０個、好ましくは１２個のアミノ酸と、同一であり、同一線上である。）。復帰突然変異は、抗体最適化のあらゆる段階で行い得る。
【０１６４】
「キメラ抗体」という用語は、分子の個別の部分が異なる種由来である抗体を包含する。従って、キメラ抗体は、それらに限定されないが、例えば、１つの種由来の重鎖及び軽鎖の可変領域に対する配列を含有し、ＶＨ及び／又はＶＬ由来のＣＤＲ領域の１以上の配列が別の種のＣＤＲ配列により置換される抗体である。このような抗体は、マウス由来の重鎖及び軽鎖の可変領域を含有し得、マウスＣＤＲ（例えばＣＤＲ３）の１以上がヒトＣＤＲ配列により置換される。
【０１６５】
「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト種（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、ラクダ、ヤギ）由来の重鎖及び軽鎖の可変領域配列を含有する抗体を表すが、しかし、ここで、ＶＨ及び／又はＶＬ配列の少なくとも一部が、「ヒト様」になるように修飾されており、即ち、ヒト生殖細胞系列の可変領域により類似するように修飾されている。ヒト化抗体のあるタイプは、非ヒトＶＨ及びＶＬ配列にヒトＣＤＲ配列を挿入することによって対応する非ヒトＣＤＲ配列が置換されるＣＤＲグラフト抗体である。
【０１６６】
抗体の結合反応速度を測定するためのある方法は、いわゆる表面プラズモン共鳴に基づく。「表面プラズモン共鳴」という用語は、例えばＢｉａコアシステムを用いて、バイオセンサーマトリックスを用いたタンパク質濃度における変化を検出することにより、分析されるべき生物特異的相互作用を解析することを可能にする光学現象を指す（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ及びＰｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）。さらなる情報については、Ｊｏｎｓｓｏｎ、Ｕ．ら（１９９３）Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．５１：１９−２６；Ｊｏｎｓｓｏｎ、Ｕ．ら（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １１：６２０−６２７；Ｊｏｈｎｓｓｏｎ、Ｂ．ら（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．８：１２５−１３１；及びＪｏｈｎｎｓｏｎ、Ｂ．ら（１９９１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８：２６８−２７７）を参照のこと。
【０１６７】
「Ｋｏｆｆ」という用語は、抗体／抗原複合体由来の抗体の解離についての解離速度定数を表す。
【０１６８】
「Ｋｄ」という用語は、ある種の抗体−抗原相互作用の解離定数を表す。
【０１６９】
本発明による抗体の結合親和性は、ＥＬＩＳＡ又はＢｉａｃｏｒｅ分析などの、標準化インビトロ免疫アッセイを用いることにより評価され得る。
【０１７０】
５．２  免疫グロブリンの作製
５．２．１  ポリクローナル抗体の作製
本発明は、本発明によるＲＧＭドメイン及びポリペプチドに対するポリクローナル抗体、及びその作製に関する。
【０１７１】
この目的のため、本発明による少なくとも１つのＲＧＭタンパク質又は誘導体／同等物で宿主に免疫付与し、免疫に対する反応としての抗体含有血清を宿主から回収する。
【０１７２】
用いられるべきＲＧＭポリペプチドが免疫原性を有しないか免疫原性が弱い場合、それらの免疫原性は、担体、好ましくはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、リムラス・ポリフェムスヘモシアニン（ＬＰＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又はオボアルブミン（ＯＶＡ）などの担体タンパク質とそれらをカップリングすることによって向上させ得る。一般に公知である多くのカップリングの選択肢が当業者にとって利用可能である。例えば水又は水性溶媒中で適切なペプチド又はペプチド混合物とＲＧＭタンパク質を温置することによる、例えば、グルタルアルデヒドとの反応が実際的であり得る。この反応は、好都合に、大気温度（通常は室温を意味する。）で行われ得る。しかし、冷却又は穏やかな加熱を行うことは有用であり得る。この反応により、通常、数時間以内に所望の結果が得られ、例えば、２時間の反応時間は標準的な範囲である。グルタールアルデヒド濃度は通常、ｐｐｍから％の範囲であり、有利には１０ｐｐｍから１％、好ましくは１００ｐｐｍから０．５％である。反応パラメータの最適化は当業者の範囲内である。
【０１７３】
抗原に加え、組成物は通常、さらに補助物質、特に免疫化に通常用いられるアジュバント、例えば、フロイントのアジュバントを含有する。特に、最初の免疫付与に対してフロイントの完全アジュバントが用いられるが、一方、全てのさらなる免疫付与は、フロイントの不完全アジュバントを用いて行われる。免疫付与カクテルは、補助物質に対して抗原（免疫原）を好ましくは前述の成分混合物の形態で添加することにより調製される。この場合、通常、抗原は乳化される。
【０１７４】
げっ歯類又はウサギは特に宿主として適している。これらの、又はその他の適切な宿主に、免疫付与カクテルを好ましくは皮下注射する。抗体力価は免疫アッセイを用いて、例えば、宿主ＩｇＧに対するヒツジ抗血清及び標識されたＲＧＭタンパク質を用いて競合的に測定することができる。従って、免疫付与終了時に、ある種の宿主が抗体回収に適しているか否かについて判定し得る。例えば、４回の免疫付与が行われる場合、３回目の免疫付与後に抗体力価を測定し、十分な抗体力価を示す動物から抗体を回収することができる。
【０１７５】
産生された抗体を回収するために、数週間又は数ヶ月にわたり、好ましくは宿主から採血する。次いで、宿主から全採血され得る。このように回収された血液から、所望の抗体を含有する血清をそれ自体公知の方法で回収し得る。その中に含有される抗体画分、特にＲＧＭタンパク質認識抗体を濃縮するために、必要に応じて、この方法により得られた全血清を、当業者に公知の方法でさらに精製し得る。
【０１７６】
本発明の特定のある特定の実施態様によると、免疫原として用いられるＲＧＭタンパク質又はその誘導体／同等物を特異的に認識する血清から、少なくとも１種の抗体が選択される。これに関連し、「特異性」とは、特に免疫原関連であるその他のタンパク質に対するよりも免疫原に対して抗体の結合親和性がより高いことを意味する。
【０１７７】
５．２．２  モノクローナル抗体の作製
本発明により使用され得る免疫グロブリンは、それ自体公知の方法を用いて得ることができる。従って、ハイブリドーマ技術によって、関心のある抗原に対して単一特異性抗体を作製することが可能になる。さらに、抗体ライブラリのインビトロスクリーニングなどの組み換え抗体技術が開発され、これにより、このような特異抗体が同様に産生される。
【０１７８】
従って、例えば、関心のある抗原を有する動物に免疫付与し得る。このインビボアプローチはまた、動物のリンパ球又は脾臓細胞由来の一連のハイブリドーマを確立し、抗原に特異的に結合するある抗体を分泌するハイブリドーマを選択することもまた含み得る。免疫付与される動物は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、ラクダ又はヒツジであり得るか、又は前記動物のトランスジェニック型、例えば、抗原刺激後にヒト抗体を産生するヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスであり得る。免疫付与され得る動物のその他のタイプには、ヒト末梢血単核球を用いるか（キメラｈｕ−ＰＢＭＣ−ＳＣＩＤマウス）又はリンパ球もしくはその前駆体を用いて再構成された重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）罹患マウスならびに致死量で全身照射され、次いで重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）罹患マウス由来の骨髄細胞を用いて放射線から保護し、次いで機能的ヒトリンパ球を移植したマウス（いわゆるトリメラ系）が含まれる。免疫付与されるべきさらなる動物のタイプは、そのゲノムにおいて、関心のある抗原をコードする内在性遺伝子が、抗原を用いて免疫付与した後にこの動物が抗原を外来物質として認識するように、例えば相同組み換えにより、排除されている（ノックアウト）動物（例えばマウス）である。この方法により作製されるポリクローナル又はモノクローナル抗体が、以下に限定されないがＥＬＩＳＡ技術を含む公知のスクリーニング方法を用いることにより特徴が調べられ、選択されることは当業者にとって明らかである。
【０１７９】
さらなる実施態様によると、抗原を用いて組み換え抗体ライブラリをスクリーニングする。組み換え抗体ライブラリは、例えば、バクテリオファージの表面、酵母細胞の表面又は細菌細胞の表面で発現され得る。組み換え抗体ライブラリは、例えばｓｃＦｖライブラリ又はＦａｂライブラリであり得る。さらなる実施態様によると、抗体ライブラリは、ＲＮＡ−タンパク質融合物として発現され得る。
【０１８０】
本発明による抗体の産生のためのさらなるアプローチは、インビボ及びインビトロのアプローチの組み合わせを含む。例えば、インビボにおいて動物に抗原で免疫付与し、次いで、インビトロで抗原を用いて、動物のリンパ球細胞から産生された組み換え抗体ライブラリ、又は単一ドメイン抗体ライブラリ（例えば、重鎖及び／又は軽鎖を用いて）をスクリーニングすることにより、抗体レパートリー上で抗原が作用し得る。別のアプローチによると、インビボで動物に抗原で免疫付与し、次いで動物のリンパ球細胞から作製された組み換え抗体ライブラリ又は単一ドメイン抗体ライブラリを親和性成熟に供することによって、抗原が抗体レパートリーにおいて作用し得る。別のアプローチによると、インビボにおいて動物に抗原で免疫付与し、次いで、関心のある抗体を分泌する個々の抗体産生細胞を選択し、これらの選択された細胞から重鎖及び軽鎖の可変領域に対するｃＤＮＡを回収し（例えば、ＰＣＲを用いる。）、哺乳動物宿主細胞内でインビトロで重鎖及び軽鎖の可変領域を発現させ（リンパ球−抗体選択法、又はリンパ球抗体選択法（ＳＬＡＭ）と呼ばれる。）、選択された抗体遺伝子配列をさらに選択し、操作することにより、抗原が抗体レパートリーにおいて作用し得る。さらに、モノクローナル抗体は、哺乳動物細胞内で重鎖及び軽鎖に対する抗体遺伝子を発現させ、所望の結合親和性を有する抗体を分泌する哺乳動物細胞を選択することによる発現クローニングによって、選択され得る。
【０１８１】
本発明によると、定義された抗原は、ＲＧＭ結合ドメイン又はポリペプチドの形態で、スクリーニング及びカウンタースクリーニングに対して提供される。従って、本発明によると、上記で定義されるような本発明に従う所望の特性プロファイルを有するポリクローナル及びモノクローナル抗体が選択され得る。
【０１８２】
本発明に従う方法を使用して、様々なタイプの抗体を作製し得る。これらには、基本的にヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体及びＣＤＲグラフト抗体ならびにそれらの抗原結合部分が含まれる。
【０１８３】
本発明による抗体を作製するための方法を特に以下に記載する。この点について、インビボでのアプローチ、インビトロでのアプローチ又は両者の組み合わせを分ける。
【０１８４】
インビボでのアプローチ：
インビボで作製される抗体産生細胞から開始し、元々Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎにより記載されたハイブリドーマ技術などの標準化技術を用いて、モノクローナル抗体が作製され得る（１９７５、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７）（Ｂｒｏｗｎら（１９８１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２７：５３９−４６；Ｂｒｏｗｎら（１９８０）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２５５：４９８０−８３；Ｙｅｈら（１９７６）ＰＮＡＳ  ７６：２９２７−３１；及びＹｅｈら（１９８２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ２９：２６９−７５を参照のこと。）。モノクローナル抗体ハイブリドーマを作製するための技術は周知である（一般的に、Ｒ．Ｈ．Ｋｅｎｎｅｔｈ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  Ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）；Ｅ．Ａ．Ｌｅｒｎｅｒ（１９８１）Ｙａｌｅ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、５４：３８７−４０２；Ｍ．Ｌ．Ｇｅｆｔｅｒら（１９７７）Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．、３：２３１−３６を参照のこと）。この目的のために、不死化細胞株（通常は骨髄腫）を、本発明によるＲＧＭタンパク質又はその誘導体／同等物で免疫付与した哺乳動物のリンパ球（通常、脾臓細胞、リンパ節細胞又は末梢血リンパ球）と融合させ、本発明によるＲＧＭタンパク質又はその誘導体／同等物に対して特異性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定するために、得られたハイブリドーマ細胞の培養上清をスクリーニングする。この目的のために、リンパ球及び不死化細胞株を融合するために、多くの公知のプロトコールの何れかのプロトコールを用い得る（Ｇ．Ｇａｌｆｒｅら（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ  ２６６：５５０−５２；前出のＧｅｆｔｅｒら、Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ；前出のＬｅｒｎｅｒ、Ｙａｌｅ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．；前出のＫｅｎｎｅｔｈ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓを参照のこと。）。さらに、当業者は、同様に用いられ得るこのような方法の多くの変法を知っている。不死化細胞株（例えば骨髄腫細胞株）は通常、リンパ球と同じ哺乳動物種に由来する。例えば、本発明による免疫原性調製物で免疫付与したマウス由来のリンパ球を、不死化マウス細胞株と融合させることにより、マウスハイブリドーマが確立され得る。好ましい不死化細胞株は、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含有する培地（ＨＡＴ培地）に対して感受性があるマウス骨髄腫細胞株である。多くのもののうち何れの骨髄腫細胞株も、標準的な方法で融合パートナーとして用いられ得る（例えば、Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３又はＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４骨髄腫株）。これらの骨髄腫細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤから入手可能である。通常、ＨＡＴ感受性マウス骨髄腫細胞は、ポチエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いてマウス脾臓細胞と融合される。次いで、ＨＡＴ培地を用いて、融合により得られたハイブリドーマ細胞を選択し、これにより、非���合又は非産生融合骨髄腫細胞を死滅させる（非融合脾臓細胞は、形質転換されていないので、数日後に死滅する）。本発明によるＲＧＭタンパク質又は誘導体／同等物を特異的に認識するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞は、例えば、本発明によるＲＧＭタンパク質又はその誘導体／同等物と特異的に結合することができる抗体を選択するために標準的ＥＬＩＳＡアッセイを用いることによってこのような抗体においてハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることにより、同定される。
【０１８５】
所望の抗体のタイプに依存し、種々の宿主動物がインビボ免疫付与のために使用される。それ自身関心のある抗原の内在性の形態を発現する宿主が使用され得る。あるいは、関心のある抗原の内在性の形態を欠損するようにされた宿主が使用され得る。例えば、ある内在性タンパク質に対する対応する内在性遺伝子が相同組み換えにより欠損するようにされているマウス（即ちノックアウトマウス）は、マウスに免疫付与されたタンパク質に対する液性反応を引き起こし、その結果、そのタンパク質に対する高親和性のモノクローナル抗体を産生させるために使用され得ることが分かっている（例えば、Ｒｏｅｓ、Ｊ．ら（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８３：２３１−２３７；Ｌｕｎｎ、Ｍ．Ｐ．ら（２０００）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７５：４０４−４１２を参照のこと。）。
【０１８６】
本発明によるＲＧＭタンパク質又はその誘導体／同等物に対する非ヒト抗体の産生の場合、抗体産生のための宿主として多くの非ヒト哺乳動物が適切である。これらには、マウス、ラット、ニワトリ、ラクダ、ウサギ及びヤギ（及びそれらのノックアウト形態）が含まれるが、ハイブリドーマ作製にはマウスが好ましい。さらに、二重特異性を有するヒト抗原に対する、基本的にヒト抗体の産生の場合、ヒト抗体レパートリーを発現する非ヒト宿主動物が使用され得る。このような非ヒト動物には、以下に詳細に記載する、ヒト免疫グロブリントランス遺伝子を有するトランスジェニック動物（例えばマウス）（ｈｕ−ＰＢＭＣ−ＳＣＩＤキメラマウス）及びヒト／マウス放射線キメラが含まれる。
【０１８７】
ある実施態様によると、本発明によるＲＧＭタンパク質又はその誘導体／同等物で免疫付与される動物は、抗原刺激後に非ヒト哺乳動物がヒト抗体を産生するように、ヒト免疫グロブリン遺伝子を用いてトランスジェニック化されている、非ヒト哺乳動物、好ましくはマウスである。通常、ヒト生殖細胞系列構成を有する重鎖及び軽鎖に対する免疫グロブリントランス遺伝子は、このような動物、重鎖及び軽鎖に対する内在性遺伝子座が不活性となるように修飾されている動物に挿入される。抗原により（例えばヒト抗原により）このような動物が刺激される場合、ヒト免疫グロブリン配列（即ちヒト抗体）由来の抗体が産生される。ヒトモノクローナル抗体は、標準化ハイブリドーマ技術を用いて、このような動物のリンパ球から産生され得る。ヒト免疫グロブリンを用いてトランスジェニック化されたマウス及びヒト抗体の産生におけるその使用についてのさらなる説明は、例えば、米国特許第５，９３９，５９８号、ＷＯ９６／３３７３５、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９８／２４８９３及びＷＯ９９／５３０４９（Ａｂｇｅｎｉｘ  Ｉｎｃ．）及び米国特許第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，６６１，０１６号、同第５，７７０，４２９号、同第５，８１４，３１８号、同第５，８７７，３９７号及びＷＯ９９／４５９６２（Ｇｅｎｐｈａｒｍ  Ｉｎｃ．）；同様にまた、ＭａｃＱｕｉｔｔｙ、Ｊ．Ｊ．及びＫａｙ，Ｒ．Ｍ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：１１８８；Ｔａｙｌｏｒ、Ｌ．Ｄ．ら（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：６２８７−６２９５；Ｌｏｎｂｅｒｇ、Ｎ．ら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９；Ｌｏｎｂｅｒｇ、Ｎ．及びＨｕｓｚａｒ、Ｄ．（１９９５）Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３；Ｈａｒｄｉｎｇ、Ｆ．Ａ．及びＬｏｎｂｅｒｇ、Ｎ．（１９９５）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６−５４６；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ、Ｄ．Ｍ．ら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１；Ｍｅｎｄｅｚ、Ｍ．Ｊ．ら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６；Ｇｒｅｅｎ、Ｌ．Ｌ．及びＪａｋｏｂｏｖｉｔｓ、Ａ．（１９９８；Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：４８３−４９５；Ｇｒｅｅｎ、Ｌ．Ｌ．（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１１−２３；Ｙａｎｇ、Ｘ．Ｄ．ら（１９９９）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．６６：４０１−４１０；Ｇａｌｌｏ、Ｍ．Ｌ．ら（２０００）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：５３４−５４０を参照のこと。
【０１８８】
さらなる実施態様によると、本発明によるＲＧＭタンパク質又はその誘導体／同等物で免疫付与される動物は、ヒト末梢血単核球もしくはリンパ球細胞又はそれらの前駆体で再構成された重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）罹患マウスであり得る。ｈｕ−ＰＢＭＣ−ＳＣＩＤキメラマウスと呼ばれるこのようなマウスは、抗原刺激後に確かなヒト免疫グロブリン反応を引き起こす。これらのマウス及び抗体産生のためのそれらの使用のさらなる説明については、例えば、Ｌｅａｄｅｒ、Ｋ．Ａ．ら（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ７６：２２９−２３４；Ｂｏｍｂｉｌ、Ｆ．ら（１９９６）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ．１９５：３６０−３７５；Ｍｕｒｐｈｙ、Ｗ．Ｊ．ら（１９９６）Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：２３３−２４１；Ｈｅｒｚ、Ｕ．ら（１９９７）Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１３：１５０−１５２；Ａｌｂｅｒｔ、Ｓ．Ｅ．ら（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：１３９３−１４０３；Ｎｇｕｙｅｎ、Ｈ．ら（１９９７）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４１：９０１−９０７；Ａｒａｉ、Ｋ．ら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２１７：７９−８５；Ｙｏｓｈｉｎａｒｉ、Ｋ．及びＡｒａｉ、Ｋ．（１９９８）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １７：４１−４５；Ｈｕｔｃｈｉｎｓ、Ｗ．Ａ．ら（１９９９）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １８：１２１−１２９；Ｍｕｒｐｈｙ、Ｗ．Ｊ．ら（１９９９）Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９０：２２−２７；Ｓｍｉｔｈｓｏｎ、Ｓ．Ｌ．ら（１９９９）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：１１３−１２４；Ｃｈａｍａｔ、Ｓ．ら（１９９９）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  １８０：２６８−２７７；及びＨｅａｒｄ、Ｃ．ら（１９９９）Ｍｏｌｅｃ．Ｍｅｄ．５：３５−４５を参照のこと。
【０１８９】
さらなる実施態様によると、本発明によるＲＧＭタンパク質又はその誘導体／同等物で免疫付与される動物は、致死的全身照射を受け、次いで重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）罹患マウス由来の骨髄細胞を用いて放射線から保護し、次いで、機能的ヒトリンパ球の移植を受けているマウスである。トリメラ系と呼ばれるこのキメラタイプは、関心のある抗原でマウスに免疫付与し、次いで、標準化ハイブリドーマ技術を用いてモノクローナル抗体を産生させることにより、ヒトモノクローナル抗体を産生させるために使用される。これらのマウス及び抗体産生のためのそれらの使用のさらなる説明については、例えば、Ｅｒｅｎ、Ｒ．ら（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９３：１５４−１６１；Ｒｅｉｓｎｅｒ、Ｙ．及びＤａｇａｎ、Ｓ．（１９９８）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：２４２−２４６；Ｉｌａｎ、Ｅ．ら（１９９９）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２９：５５３−５６２；及びＢｏｃｈｅｒ、Ｗ．Ｏ．ら（１９９９）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９６：６３４−６４１を参照のこと。
【０１９０】
インビトロでのアプローチ：
免疫付与及び選択による本発明による抗体の産生についての代替法として、本発明によるＲＧＭタンパク質又はその誘導体／同等物に対して特異的に結合する免疫グロブリンライブラリのメンバーを単離するために、本発明によるＲＧＭタンパク質又はその誘導体／同等物を用いて組み換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリをスクリーニングすることによって、本発明による抗体が同定され単離され得る。ディスプレイライブラリを作製しスクリーニングするためのキットは市販されている（例えば、ＰｈａｒｍａｃｉａからのＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号２７−９４００−０１；及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅからののＳｕｒｆＺＡＰ（Ｒ）ファージディスプレイキット、カタログ番号２４０６１２）。多くの実施態様において、ディスプレイライブラリはＳｃＦｖライブラリ又はＦａｂライブラリである。組み換え抗体ライブラリをスクリーニングするためのファージディスプレイは既に記載されている。抗体ディスプレイライブラリを作製し、スクリーニングするための特に有利な方法において使用され得る方法及び化合物の例は、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、ＷＯ９２／０１０４７、米国特許第５，９６９，１０８号及び欧州特許第５８９８７７号（特にｓｄＦｖのディスプレイを記載）、Ｌａｄｎｅｒら米国特許第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５７１，６９８号、同第５，８３７，５００号及び欧州特許第４３６５９７号（例えばＰＩＩＩ融合を記載。）；Ｄｏｗｅｒら、ＷＯ９１／１７２７１、米国特許第５，４２７，９０８号、同第５，５８０，７１７号及び欧州特許第５２７８３９号（特にＦａｂのディスプレイを記載。）；Ｗｉｎｔｅｒら、ＷＯ９２／２０７９１及び欧州特許第３６８，６８４号（特に免疫グロブリン可変ドメインに対する配列のクローニングを記載）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、米国特許第５，８８５，７９３号及び欧州特許第５８９８７７号（特に組み換えライブラリを用いたヒト抗原に対するヒト抗体の単離を記載）；Ｇａｒｒａｒｄら、ＷＯ９２／０９６９０（特にファージ発現技術を記載）；Ｋｎａｐｐｉｋら、ＷＯ９７／０８３２０（ＨｕＣａｌヒト組み換え型抗体ライブラリを記載）；Ｓａｌｆｅｌｄら、ＷＯ９７／２９１３１（ヒト抗原（ヒト腫瘍壊死因子α）に対する組み換えヒト抗体の産生及び組み換え抗体のインビトロ親和性成熟を記載）及びＳａｌｆｅｌｄら、米国特許仮出願第６０／１２６，６０３号及びそれに基づく特許出願（同様に、ヒト抗原（ヒトインターロイキン−１２）に対する組み換えヒト抗体の産生及び組み換え抗体のインビトロ親和性成熟をを記載）で見出すことができる。
【０１９１】
組み換え抗体ライブラリのスクリーニングさらなる記載は、Ｆｕｃｈｓら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７０−１３７２；Ｈａｙら（１９９２）Ｈｕｍ  Ａｎｔｉｂｏｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３：８１−８５；Ｈｕｓｅら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５−７３４；Ｈａｗｋｉｎｓら（１９９２）Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６；Ｃｌａｒｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８；Ｇｒａｍら（１９９２）ＰＮＡＳ  ８９：３５７６−３５８０；Ｇａｒｒａｄら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７３−１３７７；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９１）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１９：４１３３−４１３７；Ｂａｒｂａｓら（１９９１）ＰＮＡＳ  ８８：７９７８−７９８２；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４８：５５２−５５４；及びＫｎａｐｐｉｋら（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７−８６．などの科学刊行物で見出される。
【０１９２】
バクテリオファージディスプレイ系の使用の代替法として、酵母細胞又は細菌細胞の表面上で組み換え抗体ライブラリを発現させ得る。酵母細胞の表面上で発現されるライブラリを作製しスクリーニングするための方法は、ＷＯ９９／３６５６９に記載されている。細菌細胞の表面上で発現されるライブラリを作製しスクリーニングするための方法は、ＷＯ９８／４９２８６に詳細に記載されている。
【０１９３】
コンビナトリアルライブラリから関心のある抗体が同定されたらすぐに、分子生物学の標準化技術を用いて、例えば、ライブラリのスクリーニングの間に単離されたディスプレイパッケージ（例えばファージ）からのＤＮＡのＰＣＲ増幅によって、抗体の軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡが単離される。ＰＣＲプライマーを作製するために使用され得る軽鎖及び重鎖抗体に対する遺伝子のヌクレオチド配列は、当業者にとって公知である。これらのタイプの多くの配列は、例えば、Ｋａｂａｔ、Ｅ．Ａ．ら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  第９１−３２４２号及びヒト生殖細胞系列の配列に対するＶＢＡＳＥデータベースに記載されている。
【０１９４】
本発明による抗体又は抗体部分は、宿主細胞において、軽鎖及び重鎖免疫グロブリンに対する遺伝子を組み換え発現させることよって作製され得る。抗体を組み換え発現させるために、宿主細胞中で軽鎖及び重鎖が発現され、好ましくは宿主細胞が培養される培地に分泌されるように、抗体の軽鎖及び重鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡ断片を有する１以上の組み換え発現ベクターが宿主細胞に遺伝子移入される。抗体は、この培地から回収され得る。重鎖及び軽鎖抗体に対する遺伝子を得て、これらの遺伝子を組み換え発現ベクターに挿入し、このベクターを宿主細胞に導入するために、標準化組み換えＤＮＡ法が使用される。このような方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＭａｎｉａｔｉｓ（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）、Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．ら（編）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９８９）及びＢｏｓｓらによる米国特許第４，８１６，３９７号に記載されている。
【０１９５】
関心のある抗体のＶＨ及びＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片が得られたらすぐに、例えば、可変領域に対する遺伝子を、全長抗体鎖に対する遺伝子に、Ｆａｂ断片に対する遺伝子に又はｓｃＦｖ遺伝子に変換するために、標準化組み換えＤＮＡ技術を用いて、これらのＤＮＡ断片がさらに操作され得る。これらの操作において、ＶＬ−又はＶＨ−をコードするＤＮＡ断片は、別のタンパク質、例えば、抗体の定常領域又はフレキシブルリンカーをコードするさらなるＤＮＡ断片と操作可能に連結される。この場合、「操作可能に連結」という用語は、２個のＤＮＡ断片によってコードされるアミノ酸配列の読み枠がずれない（インフレーム）ように、２個のＤＮＡ断片が一緒に連結されることを意味する。
【０１９６】
ＶＨ領域をコードする単離ＤＮＡは、重鎖（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）の定常領域をコードする別のＤＮＡ分子と、ＶＨ領域をコードするＤＮＡを操作可能に連結することにより、全長重鎖に対する遺伝子に変換され得る。ヒトの重鎖の定常領域に対する遺伝子配列は周知であり（例えば、Ｋａｂａｔ、Ｅ．Ａ．ら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ及びＨｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２を参照）、これらの領域にわたるＤＮＡ断片は、標準化ＰＣＲ増幅を用いて得られ得る。重鎖の定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＤからなる定常領域であり得、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４からなる定常領域が好ましい。重鎖のＦａｂ断片に対する遺伝子を得るために、重鎖の定常領域ＣＨ１のみをコードするさらなるＤＮＡ分子とＶＨをコードするＤＮＡを操作可能に連結し得る。
【０１９７】
軽鎖の定常領域ＣＬをコードするさらなるＤＮＡ分子と、ＶＬをコードするＤＮＡを操作可能に連結することによって、ＶＬ領域をコードする単離ＤＮＡは、全長軽鎖に対する遺伝子（ならびにＦａｂ軽鎖に対する遺伝子）に変換され得る。ヒトの軽鎖の定常領域に対する遺伝子配列は周知であり（例えば、Ｋａｂａｔ、Ｅ．Ａ．ら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ及びＨｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２を参照のこと。）、これらの領域にわたるＤＮＡ断片は、標準化ＰＣＲ増幅によって得られ得る。軽鎖の定常領域は、定常κ又はλ領域であり得、定常κ領域が好ましい。
【０１９８】
ｓｃＦＶ遺伝子を得るために、ＶＨ及びＶＬ配列が、連続的な１本鎖タンパク質として発現され、ＶＬ及びＶＨ領域がフレキシブルリンカーを介して連結されるように、フレキシブルリンカー、例えば、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３をコードするさらなるコード断片と、操作可能に連結され得る（Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４８：５５２−５５４を参照のこと。）。
【０１９９】
本発明によるＲＧＭタンパク質又はその誘導体／同等物に対する特異性を有する、ＶＨ及びＶＬの単一ドメインは、前述の方法を用いることにより単一ドメインライブラリから単離され得る。所望の特異性を有する、２本のＶＨ単一ドメイン鎖（ＣＨ１を有するか又は有しない。）又は２本のＶＬ鎖又はＶＨ鎖及びＶＬ鎖からなるペアは、本発明によるＲＧＭタンパク質又はその誘導体／同等物を結合させるために使用され得る。
【０２００】
本発明による組み換え抗体又は抗体部分を発現させるために、部分的又は全長の軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入して、それにより、転写及び翻訳制御配列とその遺伝子を操作可能に連結させ得る。これに関連し、「操作可能に連結」という用語は、ベクター内の転写及び翻訳制御配列が抗体遺伝子の転写及び翻訳を制御するために意図される機能を満足するように、抗体遺伝子がベクターにおいて連結されることを意味する。
【０２０１】
発現ベクター及び発現制御配列は、それらが発現のために使用される宿主細胞と適合するように選択される。抗体の軽鎖に対する遺伝子及び抗体の重鎖に対する遺伝子は、異なるベクターに挿入され得るか、又は両方の遺伝子が同じ発現ベクターに挿入され得る（通常のケース）。抗体遺伝子は、標準化方法（例えば、抗体遺伝子断片及びベクターにおける相補的な制限切断部位の連結又は、制限切断部位が存在しない場合、平滑末端の連結）を用いて、発現ベクターに挿入される。発現ベクターは、軽鎖及び重鎖に対する配列が挿入される前に、抗体定常領域に対する配列を有し得る。例えば、あるアプローチにおいて、重鎖及び軽鎖に対する定常領域を既にコードする発現ベクターに配列を挿入する（それによりベクター内のＣＨセグメントとのＶＨセグメントの操作可能な連結及びまたベクター内のＣＬセグメントとのＶＬセグメントの操作可能な連結が得られる。）ことにより、ＶＨ及びＶＬ配列が全長の抗体遺伝子に変換される。さらに又はあるいは、組み換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードし得る。抗体鎖に対する遺伝子は、ベクターにクローニングされ得、それにより、読み枠内でシグナルペプチドが抗体鎖に対する遺伝子のＮ末端に連結される。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチド又は異種シグナルペプチド（即ち、非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）であり得る。抗体鎖に対する遺伝子に加えて、本発明による発現ベクターは、宿主細胞内で抗体鎖に対する遺伝子の発現を制御する制御配列を有し得る。「制御配列」という用語は、抗体鎖に対する遺伝子の転写又は翻訳を制御するプロモーター、エンハンサー及びその他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を包含する。このような制御配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）に記載されている。制御配列の選択を含む発現ベクターの設計が形質転換されるべき宿主細胞の選択、タンパク質の所望の発現強度などの因子に依存し得ることは、当業者にとって公知である。哺乳動物宿主細胞における発現のための好ましい制御配列には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（ＣＭＶプロモーター／エンハンサーなど）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーなど）、アデノウイルス（例えばアデノウイルス主要後期プロモーター（アデノウイルスの主要後期プロモーターについてＡｄＭＬＰ））及びポリオーマ由来のプロモーター及び／又はエンハンサーなどの、哺乳動物細胞において強力なタンパク質発現をもたらすウイルスエレメントが含まれる。ウイルス制御エレメント及びその配列についてのさらなる記載は、例えば、Ｓｔｉｎｓｋｉの米国特許第５，１６８，０６２号、Ｂｅｌｌらの同第４，５１０，２４５号、及びＳｃｈａｆｆｎｅｒらの同第４，９６８，６１５号を参照のこと。
【０２０２】
抗体鎖及び制御配列に対する遺伝子に加えて、本発明による組み換え発現ベクターは、宿主細胞内でベクターの複製を制御する配列（例えば複製起点）及び選択可能マーカー遺伝子などのさらなる配列を含有し得る。選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を単純に促進する（例えば、全てＡｘｅｌらの、米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，６３４，６６５号及び同第５，１７９，０１７号を参照のこと。）。例えば、選択可能マーカー遺伝子が、ベクターが導入された宿主細胞を、Ｇ４１８、ハイグロマイシン又はメトトレキセートなどの活性物質に対して耐性にすることは一般的である。好ましい選択可能マーカー遺伝子には、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＲＦ）に対する遺伝子（メトトレキセートを選択／増幅でのｄｈｆｒ−宿主細胞における使用のため）及びｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８の選択のため）が含まれる。
【０２０３】
軽鎖及び重鎖の発現のために、標準化技術を用いて、重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクターを宿主細胞に遺伝子移入する。「遺伝子移入」という用語の種々の形態は、外来ＤＮＡを原核又は真核宿主細胞に導入するために通常用いられる多くの技術、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどを包含する。原核又は真核宿主細胞の何れでも、本発明による抗体を発現させることは理論的に可能であるが、正確に折り畳まれ免疫学的に活性な抗体がこのような真核細胞、特に哺乳動物細胞において組み合わせられ分泌される可能性が原核細胞よりも高いので、真核細胞、特に哺乳動物宿主細胞における抗体の発現が好ましい。抗体遺伝子の原核細胞発現に関して、活性抗体の高収量産生のためには効率的でないことが報告されている（Ｂｏｓｓ、Ｍ．Ａ．及びＷｏｏｄ、Ｃ．Ｒ．（１９８５）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ６：１２−１３）。
【０２０４】
本発明による組み換え抗体の発現のために好ましい哺乳動物宿主細胞には、ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ及びＣｈａｓｉｎ（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０に記載されており、例えば、Ｒ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ及びＰ．Ａ．Ｓｈａｒｐ（１９８２）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１に記載の、ＤＨＦＲ選択可能マーカーとともにいられる、ｄｈｆｒ−ＣＨＯを含む。）、ＮＳ０骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞及びＳＰ２細胞が含まれる。抗体遺伝子をコードする組み換え発現ベクターが哺乳動物宿主細胞に導入される場合、宿主細胞内で抗体が発現されるまで、又は、好ましくは、宿主細胞が増殖する培地中に抗体が分泌されるまで宿主細胞を培養することにより、抗体が産生される。抗体は、タンパク質を精製するための標準化方法を用いることにより、培地から回収され得る。
【０２０５】
無傷抗体の一部、例えば、Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖ分子を作製するためにも宿主細胞が使用され得る。言うまでもなく、既に記載の手順の変法は本発明に包含される。例えば、本発明による抗体の軽鎖又は重鎖の何れか（両方ではない。）をコードするＤＮＡで宿主細胞に遺伝子移入することが望ましいものであり得る。関心のある抗原の結合のために不必要である軽鎖又は重鎖が存在する場合、このような軽鎖又はこのような重鎖の何れか又はその両方をコードするＤＮＡは、組み換えＤＮＡ技術を用いて部分的又は完全に除去され得る。このような短縮ＤＮＡ分子により発現される分子は、同様に本発明による抗体に含まれる。さらに、１本の重鎖及び１本の軽鎖が本発明による抗体を構成する二官能性抗体が作製され得、標準化された化学的方法を用いて本発明による抗体を二次抗体と架橋することにより、他方の重鎖及び軽鎖は、関心のある抗原以外の抗原に対する特異性を有する。
【０２０６】
本発明による抗体、その抗原結合部分の組み換え発現のためのある好ましい系において、抗体重鎖及び抗体軽鎖の両方をコードする組み換え発現ベクターが、リン酸カルシウムが介在する遺伝子移入により、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞に導入される。組み換え発現ベクター内で、遺伝子の強力な転写を達成するために、抗体重鎖及び軽鎖に対する遺伝子はそれぞれ調節性ＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーターエレメントと操作可能に連結される。組み換え発現ベクターはまた、メトトレキセート選択／増幅を用いることにより、ベクターを遺伝子移入されるＣＨＯ細胞が選択され得るＤＨＦＲ遺伝子も含む。抗体重鎖及び軽鎖が発現され、インタクト抗体が培地から回収されるように、選択された形質転換宿主細胞を培養する。組み換え発現ベクターを作製し、宿主細胞に遺伝子移入し、形質転換体を選択し、宿主細胞を培養し、培地から抗体を回収するために、分子生物学の標準化技術が使用される。従って、本発明は、本発明による組み換え抗体が合成されるまで適切な培地中で本発明による宿主細胞を培養することによる、本発明による組み換え抗体を合成するための方法に関する。この方法はまた、培地からの組み換え抗体の単離も含む。
【０２０７】
ファージディスプレイによる組み換え抗体ライブラリのスクリーニングの代替法として、本発明による抗体を同定するために、大きなコンビナトリアルライブラリのスクリーニングのために当業者に公知のその他の方法が使用され得る。その他の発現系のあるタイプにおいて、組み換え抗体ライブラリは、Ｓｚｏｓｔａｋ及びＲｏｂｅｒｔｓのＷＯ９８／３１７００及びＲｏｂｅｒｔｓ、Ｒ．Ｗ．及びＳｚｏｓｔａｋ，Ｊ．Ｗ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１２２９７−１２３０２に記載のように、ＲＮＡ−タンパク質融体の形態で発現される。この系において、共有結合融合体は、ｍＲＮＡ及びそれがコードするペプチド又はタンパク質の間の、３’末端にペプチジルアクセプター抗生物質ピューロマイシンを有する合成ｍＲＮＡのインビトロ翻訳によって作製される。従って、コードされるペプチド又はタンパク質（例えば抗体又はその一部）の特性、例えば、抗体又はその一部の、本発明によるＲＧＭタンパク質又はその誘導体／同等物に対する結合に基づき、ｍＲＮＡの複合混合物由来の特異的ｍＲＮＡ（例えばコンビナトリアルライブラリ）が濃縮され得る。抗体又はその一部をコードし、このようなライブラリのスクリーニングから回収される核酸配列は、記載の方法で（例えば哺乳動物宿主細胞内で）組み換え手段を用いて発現され得、さらなる回においてｍＲＮＡ−ペプチド融合体をスクリーニングするか（この場合、当初の選択された配列に変異が導入される。）、又は前述のように組み換え抗体のインビトロ親和性成熟のためのその他の方法を用いることにより、さらに、さらなる親和性成熟にも曝露され得る。
【０２０８】
インビボ及びインビトロアプローチの組み合わせ：
本発明による抗体はまた、インビボ及びインビトロにおけるアプローチの組み合わせ、例えば最初に本発明によるＲＧＭタンパク質又はその誘導体／同等物が、ＲＧＭタンパク質−又はその誘導体／同等物−結合抗体の産生を促進するために宿主動物においてインビボで抗体レパートリーに対して機能することを可能にし、次いで、さらなる抗体の選択及び／又は抗体成熟（即ち最適化）が、１以上のインビトロ技術を用いて行われる方法を使用することによっても作製され得る。ある実施態様によると、このような組み合わせ法は、最初に、抗原に対する抗体反応を刺激するために非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、ラクダ、ヤギ又はそれらのトランスジェニック動物又はキメラマウス）を、本発明によるＲＧＭタンパク質又はその誘導体／同等物で免役付与し、次いで、ＲＧＭタンパク質又はその誘導体／同等物の作用によりインビボで刺激されているリンパ球由来の免疫グログリン配列を用いてファージディスプレイ抗体ライブラリを作製及びスクリーニングすることを含み得る。この組み合わせ手順の最初の段階は、インビボアプローチに対して上記で述べたように行われ得るが、この手順の第二の段階は、インビトロアプローチに対して上記で述べたように行われ得る。刺激されたリンパ球から作製されたファージディスプレイライブラリのインビトロスクリーニングに続く、非ヒト動物の過剰免疫付与のための好ましい方法には、ＢｉｏＳｉｔｅ  Ｉｎｃ．により記載される方法が含まれ、例えば、ＷＯ９８／４７３４３、ＷＯ９１／１７２７１、米国特許第５，４２７，９０８号及び同第５，５８０，７１７号を参照のこと。
【０２０９】
さらなる実施態様によると、組み合わせ法は、最初に、ＲＧＭタンパク質又はその誘導体／同等物に対する抗体反応を刺激するために非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、ラクダ、ヤギ又はそれらのノックアウト及び／又はトランスジェニック動物又はキメラマウス）を、本発明によるＲＧＭタンパク質又はその誘導体／同等物で免疫付与し、ハイブリドーマ（例えば免疫付与された動物から作製される。）をスクリーニングすることにより、所望の特異性を有する抗体を産生するリンパ球を選択することを含む。抗体又は単一ドメイン抗体に対する遺伝子は、選択されたクローンから単離され（逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応などの標準化クローニング法を用いて）、選択された抗体の結合特性を向上させるために、インビトロ親和性成熟を受ける。この手順の最初の段階は、インビボアプローチに対して上記で述べたように行い得るが、この手順の第二の段階は、インビトロアプローチに対して上記で述べたように、特に、ＷＯ９７／２９１３１及びＷＯ００／５６７７２に記載されたようなインビトロ親和性成熟のための方法を使用することにより行い得る。
【０２１０】
さらなる組み合わせ法において、組み換え抗体は、リンパ球抗体選択法（ＳＬＡＭ）として当業者に公知であり、米国特許第５，６２７，０５２号、ＷＯ９２／０２５５１及びＢａｂｃｏｃｋ、Ｊ．Ｓ．ら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：７８４３−７８４８に記載されている方法を用いることによって個々のリンパ球から作製される。この方法において、ＲＧＭタンパク質又はその誘導体／同等物に対する免疫反応を刺激するために、非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、ラクダ、ヤギ又はそれらのトランスジェニック動物又はキメラマウス）にインビボで最初に本発明によるＲＧＭタンパク質又はその誘導体／同等物で免疫付与し、次いで、抗原特異的溶血プラークアッセイ使用することによって関心のある個々の抗体分泌細胞を選択する。この目的のために、ビオチンなどのリンカーを用いて、本発明によるＲＧＭタンパク質又はその誘導体／同等物、又は構造的に関連のある関心のある分子をヒツジ赤血球と結合することができ、それによって、溶血プラークアッセイを用いることにより適切な特異性の抗体を分泌する個々の細胞を同定することができる。関心のある抗体を分泌する細胞の同定後、軽鎖及び重鎖の可変領域に対するｃＤＮＡを逆転写酵素−ＰＣＲによって細胞から回収し、次いで、これらの可変領域を、適切な免疫グロブリン定常領域（例えばヒト定常領域）とともに、ＣＯＳ又はＣＨＯ細胞などの哺乳動物宿主細胞内で発現させ得る。次に、例えば遺伝子移入細胞を増殖させ、所望の特異性を有する抗体を発現させる細胞を単離することによって、インビボで選択するリンパ球に由来する増幅免疫グロブリンで遺伝子移入された宿主細胞をさらなるインビトロ分析及び選択に供する。増幅させた免疫グロブリン配列はさらにインビトロで操作され得る。
【０２１１】
６．医薬品
６．１  概略
本発明の主題はまた、本発明によるタンパク質（ＲＧＭタンパク質；ＲＧＭタンパク質結合リガンド、抗ＲＧＭタンパク質抗体など）又はコードＲＧＭタンパク質核酸配列及び場合によっては医薬的に許容可能な担体を活性物質として含有する医薬品（組成物）にも関する。本発明による医薬組成物はまた、少なくとも１つのさらなる治療剤、例えば本明細書中に記載の疾病の１つを治療するための１以上のさらなる治療剤も含有し得る。
【０２１２】
医薬的に許容可能な担体には、生理学的適合性であるならば、全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤、等張化剤及び吸収遅延剤などが含まれる。
【０２１３】
医薬的に許容可能な担体には、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸、トラガカントゴム、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ及びメチルセルロースが含まれる。製剤はまた、滑剤、例えばタルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱油など；湿潤剤、乳化剤及び懸濁化剤；保存剤、例えばメチル及びプロピルヒドロキシ安息香酸など；抗酸化剤；抗刺激剤；キレート剤；コーティング剤；乳化安定剤；フィルム形成剤；ゲル形成剤、臭気マスキング剤；香味料；樹脂：親水コロイド；溶媒；可溶化剤；中和剤；浸透促進剤；顔料；四級アンモニウム化合物；保湿剤及び皮膚軟化剤；軟膏、クリーム又は又は油基剤；シリコーン誘導体；展着助剤；安定化剤；滅菌剤；坐剤用基剤；錠剤用賦形剤、例えば、結合剤、充填剤、滑沢剤、崩壊剤又はコーティングなどの；噴射剤；乾燥剤；乳白剤；増粘剤、ワックス；柔軟剤；ホワイトオイルなどの、薬学的に許容可能な担体又は一般的なアジュバントも含まれ得る。この点に関するデザインは、例えば、Ｆｉｅｄｌｅｒ、Ｈ．Ｐ．、Ｌｅｘｉｋｏｎ  ｄｅｒ  Ｈｉｌｆｓｓｔｏｆｆｅ  ｆｕｒ  Ｐｈａｒｍａｚｉｅ、Ｋｏｓｍｅｔｉｋ  ｕｎｄ  ａｎｇｒｅｎｚｅｎｄｅ  Ｇｅｂｉｅｔｅ、第４版、Ａｕｌｅｎｄｏｒｆ：ＥＣＶ−Ｅｄｉｔｉｏ−Ｃａｎｔｏｒ−Ｖｅｒｌａｇ、１９９６に記載のような熟練者の知識に基づく。また、Ｈａｇｅｒ’ｓ  Ｈａｎｄｂｕｃｈ  ｄｅｒ  Ｐｈａｒｍａｚｅｕｔｏｓｃｈｅｎ  Ｐｒａｘｉｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇを参照のこと。
【０２１４】
医薬組成物は、例えば、非経口投与に適切であり得る。この目的のために、活性物質、例えば抗体は、好ましくは０．１から２５０ｍｇ／ｍＬの活性物質含有量を含む注射用溶液の形態で調製される。注射用溶液は、投与形態として、フリントガラス又はバイアル、アンプル又は充填注射器中の液体又は凍結乾燥形態で提供され得る。
【０２１５】
緩衝液は、Ｌ−ヒスチジン（１から５０ｍＭ、好ましくは５から１０ｍＭ）を含有し得、５．０から７．０、好ましくは６．０のｐＨを有し得る。以下に限定されないが、さらに適切な緩衝液には、コハク酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム又はコハク酸カリウム緩衝液が含まれる。
【０２１６】
溶液の浸透圧を調整するために、０から３００ｍＭの濃度まで（液体投与形態の場合、好ましくは１５０ｍＭ）塩化ナトリウムを使用し得る。凍結乾燥投与形態の場合、スクロース（例えば０から１０％、好ましくは０．５から１．０％（ｗ／ｗ））などの抗凍結剤が組み込まれ得る。その他の適切な抗凍結剤には、トレハロース及びラクトースが含まれる。凍結乾燥投与形態の場合、マンニトール（例えば、１から１０％、好ましくは２から４％（ｗ／ｗ））などの充填剤が組み込まれ得る。液体ならびに凍結乾燥投与形態で、Ｌ−メチオニン（例えば、５１から５０ｍＭ、好ましくは５から１０ｍＭ）などの安定化剤を用いることもできる。その他の適切な充填剤には、グリシン及びアルギニンが含まれる。例えばポリソルベート８０（例えば、０から０．０５％、好ましくは０．００５から０．０１％（ｗ／ｗ））などの界面活性剤も使用され得る。その他の界面活性剤には、ポリソルベート２０及びＢｒｉｊ界面活性剤が含まれる。
【０２１７】
本発明による組成物は、多くの種類の形態が想定され得る。これらには、液体、半固体及び固体投与形態、例えば、溶液（例えば、注射用及び輸液用溶液、ローション、点眼薬及び点耳薬）、リポソーム、分散剤又は懸濁液、固体形態、例えば、食餌、粉末、顆粒剤、錠剤、トローチ、サシェ、カプセル（ｃａｃｈｅｔｓ）、糖衣錠、カプセル（硬及び軟ゼラチンカプセルなど）、坐剤もしくは膣用製剤、又は半固体製剤形態、例えば、軟膏、クリーム、ヒドロゲル、ペースト又は硬膏などが含まれる。埋め込み送達装置も、本発明による活性物質を投与するために使用され得る。好ましい形態は、投与の意図する形態及び治療用途に依存する。通常、注射用又は輸液用溶液の形態における組成物が好ましい。ある適切な投与経路の例は非経口投与（例えば、静脈注射、皮下注射、腹腔内注射、筋肉内注射）である。ある好ましい実施態様によると、活性物質は、静脈内点滴又は注射によって投与される。さらに好ましい実施態様によると、活性物質は、筋肉内又は皮下注射により投与される。
【０２１８】
治療用組成物は、通常、無菌であり、製造及び保管条件下で安定でなければならない。本組成物は、高活性物質濃度に対して適切な、溶液、マイクロエマルジョン、分散剤、リポソーム構造又はその他の規則正しい構造の形態で処方され得る。滅菌注射用溶液は、場合によっては上記成分のの１つ又は組み合わせと共に、必要量の活性化合物（例えば抗体など）を適切な溶媒に導入し、次いでろ過滅菌を行うことによって、調製され得る。分散剤は、通常、基本的な分散媒体を含有し、場合によってはその他の必要な成分を含有する滅菌ビヒクルに活性化合物を導入することによって調製される。滅菌注射用溶液を調製するために、滅菌凍結乾燥粉末が使用される場合、既にろ過滅菌されている溶液から活性成分及び場合によってはその他の所望の成分の粉末を得るための好ましい製造方法は、真空乾燥及び噴霧乾燥である。溶液の適正な流動特性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって維持され得、分散剤の場合、必要な粒子サイズが維持されるか又は界面活性剤が使用される。注射用組成物の長期吸収は、例えばモノステアリン酸塩及びゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤を組成物に導入することにより達成され得る。
【０２１９】
本発明による活性物質は、当業者にとって公知である多くの方法を用いて投与され得るが、多くの治療用途の場合、皮下注射、静脈内注射又は輸液が、多くの治療用途に対する好ましい投与タイプである。当業者は、投与の経路及び／又はタイプが所望の結果に依存することを認識する。ある実施態様によると、埋め込み、経皮パッチ及びマイクロカプセル化送達系を含む例えば制御放出製剤など、急速な放出から化合物を保護する担体を用いて活性化合物が調製され得る。エチレン−酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを使用し得る。このような製剤を調製するための方法は一般に当業者にとって公知であり、例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７８を参照のこと。
【０２２０】
ある実施態様によると、本発明による活性物質は、例えば、不活性希釈剤又は吸収可能な食用担体中で、経口投与され得る。活性物質（及び必要に応じてその他の成分）はまた、硬又は軟ゼラチンカプセル中に封入されるか、錠剤に圧縮されるか、又は食物に直接加えることもできる。経口的治療投与の場合、活性物質は、賦形剤と混合し、噛み砕ける錠剤、口腔錠剤、カプセル、エリキシル剤、懸濁剤、シロップなどの形態で使用され得る。本発明による活性物質が、非経口以外の経路を介して投与されようとする場合、活性物質の不活性化を防止する物質からコーティングを選択することが必要であり得る。
【０２２１】
本発明による活性物質は、上述の疾病の治療において適切である１以上のさらなる治療剤と一緒に投与され得る。
【０２２２】
本発明の医薬組成物は、通常、少なくとも１つの本発明による活性物質の治療的有効量又は予防的有効量を含有する。投与計画は、例えば、所望の処置又は治療的もしくは予防的処置が所望されるか否かに依存して選択及び適合することができる。例えば、治療状況の要求性に依存して、１回の投与、長時間にわたる複数回の分割投与、又は漸増用量又は減量投与量を投与し得る。投与を簡素化し、投与の均一性を確実にするために、特に単一投与形態での非経口的組成物を処方することは有利である。
【０２２３】
担当医師は、投与形態、投与のタイプ及び特定の治療及び特定の活性物質に最も適切な投与量を容易に決定することができる。
【０２２４】
本発明による活性物質の治療又は予防的有効量は、以下に限定されないが、例えば、０．１から２０ｍｇ／ｋｇの範囲、好ましくは１から１０ｍｇ／ｋｇであり得る。言うまでもなく、軽減すべき状態の性質及び重症度に依存してこれらの量は変化し得る。
【０２２５】
６．２  ワクチン
本発明によるＲＧＭタンパク質及びその誘導体／同等物は、治療されるべき患者のワクチン接種のための免疫原として使用され得る。
【０２２６】
この目的のために、適切なワクチンは、一般に、少なくとも１つの本発明によるＲＧＭタンパク質及び／又は少なくとも１つのそれらの誘導体／同等物を含有する医薬組成物である。この組成物は、生理学的に許容可能な担体及び場合によってはさらなるアジュバント、例えば免疫刺激剤も含有し得る。
【０２２７】
原則として適切な担体は所望のように選択することができるが、担体のタイプは一般に投与経路により決定される。従って本発明によるワクチンは、特に、非経口、例えば、静脈内投与、筋肉内投与及び皮下投与に適切な形態で処方され得る。これらの場合、担体は、好ましくは水、生理食塩水、アルコール、脂肪、ワックス及び／又は緩衝液を含有する。
【０２２８】
本発明によるワクチンにおいて、何らかの多くの免疫刺激剤が使用され得る。例えば、アジュバントが組み込まれ得る。殆どのアジュバントは、急速な分解から抗原を保護するように意図されている物質、例えば、水酸化アルミニウム又は鉱油ならびに脂質Ａ、百日咳菌又はヒト型結核菌由来のタンパク質を含有する。適切なアジュバントは、通常市販されており、例えば、完全もしくは不完全フロイントアジュバント；ＡＳ−２；水酸化アルミニウム（場合によってはゲル形態）もしくはリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩；カルシウム、鉄又は亜鉛塩；アシル化チロシンの不溶性懸濁液；アシル化糖；陽イオン性又は陰イオン性誘導体化多糖類；ポリホスファゼン；生体分解性ミクロスフェア；又はモノホスホリル−脂質Ａである。ＧＭ−ＣＳＦ又はインターロイキン−２、−７又は−１２などのサイトカインもまたアジュバントとして使用され得る。
【０２２９】
７．治療法
７．１．神経性疾患の治療
中枢神経系に対する損傷において、損傷部位でＲＧＭタンパク質の蓄積が観察されることが先行技術（Ｓｃｈｗａｂら（前出）を参照）から知られている。同時に、これにより、神経線維の新たな増殖が妨害される。ポリクローナルＲＧＭ  Ａ特異的抗体の使用によるラットでの脊髄損傷モデルにおけるＲＧＭ  Ａの中和の結果、再生及び機能回復が起こった（Ｈａｔａ  Ｋ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７３：４７−５８、２００６）。神経線維の増殖における損傷及び抑制効果には、受容体分子ネオゲニンへのＲＧＭ  Ａの結合が介在する（Ｃｏｎｒａｄ  Ｓ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２：１６４２３−１６４３３、２００７）。従って、ＲＧＭと受容体分子ネオゲニンとの間の相互作用の調節、特に阻害は、神経線維の増殖におけるＲＧＭの阻害活性を阻止するのに適している。
【０２３０】
７．２．腫瘍性疾患の治療
長い間、ネオゲニンが、腫瘍性疾患の発現及び／又は進行に原因として関係していることが示されてきた。例えば、Ｍｅｙｅｒｈａｒｄｔらは、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（１９９７）１４、１１２９−１１３６において、研究した、膠芽細胞腫、髄芽細胞腫、神経芽細胞腫細胞株を含む５０種を超える様々な癌細胞株ならびに結腸直腸癌、乳癌、膵臓癌及び子宮癌の細胞株においてネオゲニンが検出可能であることを報告した。ネオゲニンの過剰発現はまた、食道癌細胞株においても観察されている（Ｈｕｅら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００１）７、２２１３−２２２１）。２１１人の肺腺癌患者における３５８８個の遺伝子の発現プロフィールの最近の系統的な分析から、腫瘍性疾患の発現及び進行におけるネオゲニンの関与に関するさらなる情報が得られた（Ｂｅｒｒａｒら、Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．（２００５）１２（５）、５３４−５４４）。
【０２３１】
ＲＧＭは、腫瘍細胞に関連するネオゲニン受容体への結合によって細胞死を阻止することができるという潜在的な発癌促進効果を有することも知られているので（ＭａｔｓｕｎａｇａらＮａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６、７４９−７５５、２００４）、ＲＧＭ−ネオゲニン相互作用を調節することにより、特に、特異的抗−ＲＧＭ抗体を用いた相互作用の妨害によって、腫瘍性疾患の治療のための新規治療アプローチがもたらされ得る。
【０２３２】
一方、ネオゲニン受容体を活性化するヒトＲＧＭ  Ａタンパク質の断片は、腫瘍細胞移動又はネオゲニン陽性腫瘍細胞の転移を阻害し得る。この腫瘍細胞移動の阻害は、神経線維成長の阻害と同様に起こり得る。神経線維はまた侵襲性にも成長するが、腫瘍細胞とは異なり、一般に、制御される侵襲性である。これは、古典的ホジキンリンパ腫における潜在的腫瘍抑制因子候補として最近ｈＲＧＭ  Ａが同定されたことにより支持される（Ｆｅｙｓら、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  ２００７、Ｖｏｌ．９２、９１３−２０）。
【０２３３】
７．３．鉄代謝障害の治療
ヘモジュベリンとしても知られるＲＧＭ  Ｃは、ヒト及び動物の体内における鉄代謝に非常に重要である。若年性ヘモクロマトーシスは、生物における鉄の過剰負荷として現れる遺伝性の比較的稀な鉄代謝性障害である。この疾患は、ヘモジュベリン分子における突然変異によって起こる（Ｈｕａｎｇら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ（２００５）１１５、２０８７−２０９１）。従って、本発明による機能ＲＧＭタンパク質又はその活性ドメインの投与は、このような鉄代謝障害を緩和するための有用な治療的アプローチである。慢性疾患における貧血の場合、炎症又は悪性経過の結果、例えば腫瘍壊死因子αなどのある一定のサイトカインの非常に大きな上方制御が起こる（Ｗｅｉｓｓ  Ｍ．Ｄ．及びＧｏｏｄｎｏｕｇｈ、Ｌ．Ｔ．、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５２：１０１１−１０２２、２００５）。これらのサイトカインは、鉄代謝の最も重要な制御因子の強力な誘導因子、ペプチドホルモンヘプシジンであり、ヘプシジンの過剰産生又は蓄積は、慢性疾患における貧血の発症機序に対する重要な理由とみなされる。マウスに対する最近のインビボデータから、Ｆｃ−結合ＲＧＭ  Ｃ（Ｆｃヘモジュベリン）がヘプシジン発現を阻害し、血清鉄レベルを上昇させることが示される（Ｂａｂｉｔｔ、Ｊ．Ｌ．ら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、２００７、Ｖｏｌ．１１７、７、１９３３−１９３９）。ＢＭＰタンパク質とのＲＧＭタンパク質の相互作用は、この制御における重要な因子である（Ｂａｂｉｔｔ、Ｊ．Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２００６、Ｖｏｌ．４８、５、５３１−５３９）。従って、ＢＭＰタンパク質と相互作用する、Ｆｃ結合ＲＧＭ  Ｃ又は、ＲＧＭ  Ｃ、ＲＧＭ  Ａもしくは［ＲＧＭ］  ＢのＦｃ結合断片は、慢性疾患における貧血の治療用の治療剤として使用され得る。
【０２３４】
７．４．骨組織形成の促進
先行技術から、ＤＲＡＧＯＮという名称でも知られているタンパク質のＲＧＭファミリーのメンバー、即ちＲＧＭ  Ｂが、骨の形態形成に関与しているという情報が得られている。例えば、Ｓａｍａｄらは、ＪＢＣ論文、２００５、Ｖｏｌ．２８０．１４１２２−１４１２９において、ＤＲＡＧＯＮと、タイプＩ及びタイプＩＩの骨形成タンパク質（ＢＭＰ）受容体との間の相互作用を記載する。従って、本発明によるＲＧＭポリペプチドを投与することにより、骨成長促進効果、及びこれによる骨成長疾患又は骨損傷の治療のための新規治療アプローチが考えられ得る。３種類全てのＲＧＭタンパク質（ＲＧＭ  Ａ、Ｂ、Ｃ）は、様々なＢＭＰファミリーのメンバーと相互作用し、ＢＭＰシグナル経路の活性化を向上させる（Ｂａｂｉｔｔ、Ｊ．Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２００６、Ｖｏｌ．４８、５、５３１−５３９；Ｂａｂｉｔｔ、Ｊ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００５、Ｖｏｌ．２８０、３３、２９８２０−２９８２７；Ｂａｂｉｔｔ、Ｊ．Ｌ．ら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、２００７、Ｖｏｌ．１１７、７、１９３３−１９３９；Ｓａｍａｄ、Ｔ．Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００５、Ｖｏｌ．２８０．１４、１４１２２−１４１２９；Ｈａｌｂｒｏｏｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ２、４：２００７（電子形態で公開））。
【０２３５】
７．５  自己免疫疾患の治療
本発明による活性物質が自己免疫疾患の治療に適切であり得るという指摘は、次の刊行物で見出される：Ｕｒｉｓｔら、Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．１９８５、Ｖｏｌ．１８７：７７−９６；Ｌｏｒｉｅｓ及びＬｕｙｔｅｎ、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ＆  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２００５、Ｖｏｌ．１６、２８７−２９８。
【０２３６】
８．診断方法
上記定義に従うＲＧＭタンパク質及び誘導体／同等物ならびにこれらに対する抗体は、特に本発明による診断試薬と呼ばれる。
【０２３７】
従って、本発明は、疾患に典型的な抗原又は抗体を検出することにより、上記で定義される病的状態を、質的又は量的改善をもって決定することを可能にする。
【０２３８】
この決定は、好ましくは免疫学的方法を用いて行われる。原則として、これは、抗体が使用される何らかの分析的又は診断的試験方法を用いて達成され得る。これらには、凝集及び沈降技術、免疫学的アッセイ、免疫組織化学法及び、例えばウェスタンブロッティング又はドットブロット法などの免疫ブロッティング技術が含まれる。画像検査法などのインビボ法も含まれる。
【０２３９】
免疫アッセイにおける使用は有利である。競合的免疫アッセイ、即ち、抗体結合に対する抗原及び標識抗原（トレーサー）の競合ならびにサンドイッチ免疫アッセイ、即ち特異的抗体の抗原への結合は、通常は標識されている二次抗体を用いて検出される。これらのアッセイは、均一、即ち、固相及び液相に分離しないアッセイ、又は不均一、即ち、例えば固相に結合した抗体を用いて、結合した標識が非結合標識から分離されるものであり得る。様々な不均一及び均一免疫アッセイ形式は、例えば、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫アッセイ（ＦＩＡ）、発光免疫アッセイ（ＬＩＡ）、時間分解ＦＩＡ（ＴＲＦＩＡ）、免疫活性化（ＩＭＡＣ）、酵素多型免疫試験（ＥＭＩＴ）、免疫比濁法（ＴＩＡ）及び免疫−ＰＣＲ（Ｉ−ＰＣＲ）などの標識及び測定方法に依存して、特定のクラスに割り当てられる。
【０２４０】
競合的免疫アッセイは、本発明による抗原の検出に好ましい。標識された抗原（トレーサー）は、用いられる抗体に対する結合に対して定量化すべき試料抗原と競合する。試料中の抗原の量、即ち抗原量は、標準曲線を用いて、置換されたトレーサーの量から決定され得る。
【０２４１】
これらの目的のために利用可能な標識のうち、酵素が有利であることが分かった。例えば、ペルオキシダーゼ、特にホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ及びβ−Ｄ−ガラクトシダーゼに基づく系が使用され得る。これらの酵素について特異的な基質が利用可能であり、それらの反応は、例えば測光法により追跡され得る。適切な基質系は、アルカリホスファターゼに対して、ｐ−ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）、ファーストレッド／ナフトールＡＳ−ＴＳホスフェート；ペルオキシダーゼに対して、２，２−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、ｏ−ジアニシジン、５−アミノサリチル酸、３−ジメチルアミノ安息香酸（ＤＭＡＢ）及び３−メチル−２−ベンゾチアゾリンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）；β−Ｄ−ガラクトシダーゼに対して、ｏ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトシド（ＯＮＰＧ）、ｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトシド及び４−メチルウンベリフェニルβ−Ｄ−ガラクトシド（ＭＵＧ）に基づく。多くの場合、これらの基質系は、即時使用状態で、例えば、有用な緩衝剤などのさらなる試薬も含有し得る錠剤の形態で市販されている。
【０２４２】
トレーサーを調製するためのペプチド又は抗体に標識をそれ自体公知のようにカップリングさせ得る。さらに、タンパク質に対する結合のために役立つように修飾された多くの標識、例えば、ビオチン、アビジン、エクストラアビジン又はストレプトアビジン−結合酵素、マレイミド−活性化酵素などが利用可能である。これらの標識は本発明に従って使用される分子と直接反応させ得る。
【０２４３】
不均一免疫アッセイ形式が選択される場合、分離の目的のために、例えば、担体に結合させた抗−イディオタイプ抗体、例えばウサギＩｇＧに対する抗体などを用いて、抗原−抗体複合体を基質に結合させ得る。対応する抗体により被覆される支持層、特にマイクロタイタープレートは公知であり、市販されている。
【０２４４】
本発明のさらなる主題は、上述の少なくとも１つの抗体及びさらなる成分を含有する免疫アッセイセットに関する。これらのセットは、通常は、本発明による検出を行うための試薬のパッケージ化単位形態を集めたものである。可能な限り操作を簡素化するために、これらの試薬は、好ましくは、基本的に即時使用形態で提供される。ある有利な設計において、免疫アッセイはキットの形態で提供される。キットは、通常、成分を個別に提供するための複数の容器を含む。成分は全て、即時使用の希釈剤で、希釈のための濃縮物として、又は溶解もしくは縣濁のための凍結乾燥物として、提供され得、個々の成分又はこれら全ては、凍結状態であるか又は使用まで周囲温度で保管され得る。血清は、好ましくは−２０℃で、好ましくは急速冷凍され、例えばこのような場合、免疫アッセイは好ましくは使用前に凍結温度で保存しなければならない。
【０２４５】
免疫アッセイとともに含まれ得るさらなる成分には、次のもの：標準タンパク質、トレーサー；対照血清、マイクロタイタープレート（好ましくは抗体で被覆）、緩衝液（例えば、試験用、洗浄用又は基質反応用）及び酵素基質そのものが含まれる。
【０２４６】
免疫アッセイの一般的原理及び抗体の作製及び使用研究及び臨床に役立つものとしての抗体の使用は、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｈａｒｌｏｗ、Ｅ．及びＬａｎｅ、Ｄ．編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８８）に記載されている。
【０２４７】
９．スクリーニング法
本発明の主題はさらに、ＲＧＭ受容体（ネオゲニン及び／又はＢＭＰ）のエフェクターを検出するための方法に関し、この方法において、エフェクターである疑いがある試料をＲＧＭタンパク質又はポリペプチドと温置し、エフェクター−ＲＧＭタンパク質複合体の形成に関してアッセイが分析される。
【０２４８】
このようなエフェクターは、アゴニスト作用、部分的アゴニスト作用、アンタゴニスト作用又は逆アゴニスト作用を有し得る。これらは、合成低分子物質、合成ペプチド、天然もしくは合成抗体分子又は天然物質であり得る。
【０２４９】
本発明によるこのような方法は、通常、将来の使用に関して最も普及されると思われる物質が、多くの様々な物質から選択され得るインビトロスクリーニング法として行われる。
【０２５０】
例えば、コンビナトリアル化学によって、多数の潜在的な活性物質を含有する広範囲の物質ライブラリが作製され得る。所望の活性を有する物質に対してコンビナトリアル物質ライブラリのサンプリングを自動化することができる。好ましくはマイクロタイタープレート上で提供される個々のアッセイを効率的に評価するためにスクリーニングロボットが使用される。従って、本発明はまた、スクリーニング法、即ち、好ましくは、後述する少なくとも１つの方法が用いられる、一次及び二次スクリーニング法の両方にも関する。複数の方法が使用される場合、分析しようとする物質の１種の試料又は様々な試料に対して、同時に又は異なる時点で、これが行われ得る。
【０２５１】
このような方法を行うためのある効率的な技術は、活性物質のスクリーニングの分野において公知である、シンチレーション近接アッセイ（又はＳＰＡと省略される。）である。このアッセイを行うためのキット及び成分は、例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈから市販されている。本方法は、シンチレーション物質を含有する小さな蛍光ミクロスフェア上で可溶化されるか又は膜結合した受容体を固定化するという原則に基づき機能する。例えば、放射性リガンドが固定化受容体に結合する場合、シンチレーション物質及び放射性リガンドは空間的に近接しているので、シンチレーション物質が励起され発光する。
【０２５２】
このような方法を行うための別の効率的な技術は、活性物質のスクリーニングの分野において公知である、ＦｌａｓｈＰｌａｔｅ（Ｒ）技術である。このアッセイを行うためのキット及び成分は、例えば、ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓから市販されている。操作の原理は、同様にシンチレーション物質で被覆されたマイクロタイタープレート（９６ウェル又は３８４ウェル）に基づく。
【０２５３】
これらの方法を用いて同定され得る物質又は物質の混合物の一部は同様に本発明の主題である。
【０２５４】
以下の非限定的な生成及び使用の実施例を参照し、本発明をさらに詳細に説明する。
【０２５５】
実験セクション
１．一般的手順
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
タンパク質の分子量に従い、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルでタンパク質を分離した（４−２０％トリスグリシンゲル：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＥＣ６０２５ＢＯＸ；１０−２０％トリシンゲル：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃ＥＣ６６２５ＢＯＸ）。還元剤を用いてＮｕＰａｇｅ  ＳＤＳ試料緩衝液（４ｘ）と試料を混合した。サーモミキサーにおいて９５℃にて１０分間温置した後、トリスグリシン又はトリシンＳＤＳランニング緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、１２５Ｖで試料を展開させた。Ｓｅｅ  Ｂｌｕｅ又はＢｌｕｅ  Ｐｌｕｓ  ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を分子量標準タンパク質として使用した。クーマシー染色でゲルを染色するか又はニトロセルロース（ニトロセルロース膜ろ紙サンドイッチ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃ＬＣ２００１））に転写した。
【０２５６】
クーマシー染色
ポリアクリルアミドゲルでのタンパク質の検出のために、ゲルに流した後、タンパク質をクーマシー染色により染色した。膜上で（０．２−μｍ孔）ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  Ｓａｆｅｓｔａｉｎ染色溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、又は、あるいは、コロイドクーマシー染色（０．２５％クーマシーブルーＲ２５０／Ｌ、４５％メタノール、１０％酢酸）中で、１時間ゲルを染色した。タンパク質バンドが明確に見えるようになるまで、脱イオン水又は脱色液（４０％メタノール、１０％酢酸）を用いて脱色を行った。
【０２５７】
ウエスタンブロット
ろ紙及びニトロセルロースを２０％メタノール入りのＮｏｖｅｘトランスファー緩衝液に１０分間浸した。室温で２時間にわたり、定電流（１００ｍＡ）でＮｏｖｅｘチャンバー中でブロッティング処理を行った。
【０２５８】
ドットブロット
ＴＴＢＳ緩衝液中の様々な濃度の２μＬタンパク質を乾燥ニトロセルロース膜上に軽く叩くように添加した。次の希釈液を使用した：
希釈液：
ａ）１００μｇ／ｍＬ＝２００ｎｇ／スポット
ｂ）５０μｇ／ｍＬ＝１００ｎｇ／スポット
ｃ）１０μｇ／ｍＬ＝２０ｎｇ／スポット
ｄ）５μｇ／ｍＬ＝１０ｎｇ／スポット
ｅ）１μｇ／ｍＬ＝２ｎｇ／スポット
ｆ）５００μｇ／ｍＬ＝１ｎｇ／スポット
試料添加後、室温で１０分間膜を乾燥させ、その後免疫検出プロトコールを開始した。
【０２５９】
ＨＥＫ２９３Ｆ細胞におけるＲＧＭ  Ａ断片の遺伝子移入及び発現
このために、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞の遺伝子移入に対してＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより開発されたプロトコールを使用した。２−３日間にわたり、Ｆｒｅｅ  Ｓｔｙｌｅ  ２９３発現培地中で細胞を培養し、次いで４００ｘｇで遠心し、上清を捨てた。培地中で細胞ペレットを再懸濁し、２８ｍＬの新鮮培地中で３ｘ１０７個の細胞になるように調整した。１２５ｍＬエレンマイヤーフラスコに細胞ペレットを移し、１５０ｒｐｍのオービタル振盪機上で遺伝子移入混合液が生成するまで３７℃、８％ＣＯ２の恒温槽中で温置した。
【０２６０】
２９３フェクチンＤＮＡ複合体との遺伝子移入混合液を次のように調製した：
（１）１０００μＬの総体積になるまで３０μg  ＤＮＡをＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉで希釈し、混合した（１０００μＬ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉを対照として使用した。）。
【０２６１】
（２）１０００μＬの総体積になるまで、３５μＬ  ２９３フェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃１２３４７−０１９；１ｍＬ）をＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉで希釈し、混合し、室温で５分間温置した。
【０２６２】
（３）段階１からのＤＮＡ混合液及び２９３フェクチン溶液を新しい試験チューブに移し、慎重に混合し、室温で２５分間温置した後にエレンマイヤーフラスコ中の細胞に添加した。
【０２６３】
この細胞移入混合液とともに、１５０ｒｐｍのオービタル振盪機上の、３７℃、８％ＣＯ２の恒温槽中で上述のように４０時間から４８時間、細胞を温置した。４００ｘｇで１０分間遠心することによって、細胞上清を回収した。
【０２６４】
Ｎｉキレートアフィニティー（Ｎｉ−ＮＴＡ）を用いたタンパク質の精製
Ｎｉ−ＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗビーズ（Ｑｉａｇｅｎ＃１０１８６１１）を使用した。１３，５００ｒｐｍでビーズ上清を遠心することにより、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で３分間、ビーズを洗浄した。上清を捨て、新鮮ＰＢＳ中でビーズを再懸濁した。細胞培養上清３０ｍＬに対してビーズ縣濁液２００μＬを使用した。ビーズをペレット化するために、振盪機（６０ｒｐｍ）上で、４℃で一晩、細胞培養上清とともにビーズを温置し、温置後遠心した（１０分間、３０００ｒｐｍ）。上清を捨て、ＰＢＳで３回ビーズを洗浄した。２５０μＬ溶出緩衝液（ＰＢＳ、１６０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５０ｍＭ  イミダゾール）を用いて、結合タンパク質をビーズから溶出した。振盪機上で室温にて３０分間温置した後、遠心（３分間、１３，５００ｒｐｍ）によってビーズをペレット化した。上清を回収した。さらなる分析のために、溶出タンパク質を−２０℃で凍結した。
【０２６５】
免疫検出
ニトロセルロース上での固定化タンパク質の免疫検出のために、室温又は４℃で、ＴＴＢＳ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、トリス緩衝食塩水溶液（ＴＢＳ））中で一晩、ブロットを１時間温置することによって、タンパク質の非特異的結合を阻止（ブロッキング処理）した。室温にて２時間にわたり、ＴＴＢＳ中の１０μｇ／ｍの濃度で一次抗体を使用した。ＴＴＢＳ中で３回、ブロットを洗浄し、ＴＴＢＳ中１：５０００の二次抗体（アルカリホスファターゼ結合抗マウスＩｇＧ抗体；Ｓｉｇｍａ）で希釈し、次いで室温で１時間温置した。ＴＴＢＳ中で３回、ブロットを洗浄し、染色溶液でブロットを被覆することにより、３分間、ＡＰ基質ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（Ｒｏｃｈｅ、１０ｍＬ精製水により１錠の錠剤を溶解）で発色させた。ブロットに精製水を添加することにより染色反応を停止させた。
【０２６６】
試験方法１：ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を用いた、神経突起成長アッセイにおけるＲＧＭペプチドの効果の説明
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は、ヒト神経芽細胞腫細胞である。芽細胞腫は、組織及び器官形成中に由来する胚性腫瘍である。初期胚の状態では多くの細胞の分化がまだ未熟であるため、芽細胞腫細胞の起源は未知である場合が多く、即ち、芽細胞腫細胞は不均一な細胞集団である。神経芽と呼ばれる神経芽細胞腫の細胞は、自律神経組織からの神経堤（胚性状態の構造）由来であり、実際には未熟な段階で停止している。この場合の細胞は、神経芽細胞腫の転移がある４歳女児の骨髄バイオプシーで１９７０年に単離された神経上皮腫細胞株ＳＫ−Ｎ−ＳＨのクローン性の継代培養由来であった［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｓｍｚ．ｄｅ／ｈｕｍａｎ＿ａｎｄ＿ａｎｉｍａｌ＿ｃｅｌｌ＿ｌｉｎｅｓ］。
【０２６７】
【表１】
2010537655.tif 000008
【０２６８】
Ｎｕｎｃ５００ｍＬフィルターを用いて培地をろ過滅菌し、使用するまで４℃の冷蔵庫中で保存した。使用前に培地を水浴中で３７℃に加熱した。
【０２６９】
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は、単層でゆっくりと接着性に成長し、１００％のコンフルエンシーには到達しない（最大８０％）、上皮、神経様細胞である。細胞培養物を週に２回、１：３に分割（継代）した。細胞の分離には、恒温槽中で１から３分間、トリプシンで温置することが必要である。
【０２７０】
これは、依然として未熟な前駆細胞の集団であるので、細胞のある一定の％が神経突起様の伸長を行うように、レチノイン酸を用いて細胞を分化させることが可能である。この目的のために、試験に応じて、３日間、培養皿又はフラスコ中で直接１０μＭレチノイン酸が添加された培地中で培養物を温置した。
【０２７１】
マイクロタイタープレート（９６ウェル）（コラーゲン１被覆プレートを含有する。）をｈＲＧＭ  Ａ断片でさらに被覆した。ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞を播種した。１８から２４時間後、培養物を固定し、染色した。定量分析において、ｈＲＧＭ  Ａ断片上で成長させたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、コラーゲンＩのみの上で成長させたＳＨ−ＳＹ５Ｙと比較した。細胞の神経突起の長さを自動的に測定し、分析に対して使用した。
【０２７２】
試験方法２：ＮＴｅｒａ−２細胞を用いた神経突起成長試験におけるＲＧＭペプチドの効果の説明
細胞培養モデルとして、ヒト多能性癌細胞株ＮＴｅｒａ２（ＤＳＭＺ  ＡＣＣ５２７）を確立する。神経突起は、細胞集合体から成長し、特定の集団の周囲で神経突起の冠を形成する。
【０２７３】
ＮＴｅｒａ−２細胞は、ヒト胚性奇形癌細胞である。癌腫は癌性腫瘍であり、奇形腫又は奇形癌は、様々な分化及び未分化組織から構成される生殖細胞の混合性腫瘍であり、従って、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ培養物の場合、不均一な集団を含む。腫瘍は通常、毛髪、皮膚、歯、筋肉及び神経組織などの様々なタイプの被嚢性形態で存在する。この腫瘍は、通常、卵巣、精巣、腹腔又は脳由来である。この細胞株は、２２歳の白人男性の転移性奇形癌から得られたＴｅｒａ−２株からクローニングされた。［ｈｔｔｐ：／／ｄｅ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／］［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｓｍｚ．ｄｅ／ｈｕｍａｎ＿ａｎｄ＿ａｎｉｍａｌ＿ｃｅｌｌ＿ｌｉｎｅｓ］。
【０２７４】
ＮＴｅｒａ−２細胞は、単層を形成する、上皮性の接着性に成長する細胞である。それらが含有する顆粒状粒子が大量であるゆえに、ＮＴｅｒａ−２細胞は、その他の細胞から容易に差別化され得る。週に２回１：５に分割（継代）することによって細胞を培養した。この混合培養物の細胞は、神経細胞においてレチノイン酸を用いて分化させ得る。
【０２７５】
【表２】
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【０２７６】
Ｎｕｎｃ５００ｍＬフィルターを用いて培地をろ過滅菌し、使用するまで、４℃の冷蔵庫中で保存した。使用前に培地を水浴中で３７℃に加熱した。
【０２７７】
ＮＴｅｒａ−２の分化
細胞を分化させるために、細胞を同じ培養フラスコ中で３週間にわたり維持することから、細胞株の培地に抗生物質を導入することが必要であった。前もって、未分化培養物をトリプシン処理して剥離（ｄｅｔｒｙｐｓｉｎａｔｅｄ）し、Ｎｅｕｂａｕｅｒ計数チャンバーを用いて細胞数を調べた。２５ｍＬ培地とともに２．５百万個の細胞を新しい培養フラスコに移した。薄暗い条件下で２５μＬのレチノイン酸（１０μＭ）を培地に再び添加した。冷蔵庫中で分注して（１０Ｍ）培養物を保存し、使用前にサーモミキサー中で２２℃にて再懸濁した。
【０２７８】
【表３】
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【０２７９】
５％ＣＯ２ガスの３７℃の恒温槽中で培地を保存し、週の初めと終わりに培地を交換した。徐々に細胞が単層の形態ではもはや増殖しなくなったが、代わりに細胞集団の小さな積み重なりが形成され、光学顕微鏡を用いずに、細胞層上で光の点として見られた。さらなる培養に対して、古い培地を吸引除去し、１０ｍＬ  ＰＢＳで洗浄し、次いでレチノイン酸に２５ｍＬの新鮮な培地を添加することによって培地交換した。３週間後、細胞を分化させ、実験で使用できる状態にした。
【０２８０】
ＮＴｅｒａ−２に対するプレート被覆
ポリ−Ｌ−リジン／ラミニンで被覆することにより、培養皿のベースにおいてＮＴｅｒａ−２細胞の成長が促進された。この試験に対して様々なプレート方式を使用した。タンパク質の単離のために、十分な量を回収するための６ウェルのプレートが必要であった。ＲＮＡ単離及び免疫蛍光の場合は、２４ウェルプレートが的確であり、一方、最初に９６ウェルプレートでアッセイを確立した。表で示されるように、ウェルの収容能に対応して、コーティング及び洗浄液の様々な体積を使用した。
【０２８１】
最初に、ウェル中にポリ−Ｌ−リジン溶液（１００μｇ／ｍＬ）を入れ、室温で１５分間温置した。次に、溶液を吸引除去し、ＰＢＳで５−１０分間、３回、ウェルを洗浄した。次いで、滅菌Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ水を用いて洗浄段階を行った。
【０２８２】
洗浄後、ラミニン溶液（２０μｇ／ｍＬ）をピペットで採取してウェルに入れ、３７℃、５％ＣＯ２ガス状態で恒温槽中で２時間プレートを温置した。５−１０分間もう一度３回、ＰＢＳでの洗浄を行い、最終的に、ペニシリン／ストレプトマイシンあり又は無しのニューロベーサル（ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ）液でＰＢＳを置換した。
【０２８３】
【表４】
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【０２８４】
ＮＴｅｒａ−２を用いた神経突起伸長
分化３週間後、神経細胞を選択するために、６本のフラスコへ培養物を１：６に分割（継代）した。この時点で、培地にはレチノイン酸を添加していなかった。次の２日間内に、及び第３日に、細胞を回収し、好ましくは、その他の非神経細胞上で神経細胞を沈降させるが、しかし、強力には接着しなかったので、トップ層としてそれらは容易に除去され得た。この目的のために、培地を除去し、およそ１０ｍＬ  ＰＢＳで洗浄し、１０ｍＬ  ＰＢＳをフラスコに再添加した。瓶の側面を軽く叩くと、細胞が徐々に払い落とされた。しかし、非神経細胞は接着し続けると想定されたので、光学顕微鏡下で目視チェックを場合によっては行った。それらの明るく光る縁及び非常に丸い形態によって神経細胞を同定した。神経細胞が過剰に強固に成長した場合、これらは、除去後、短い時間、神経突起を保持する。３本のフラスコのそれぞれの中のＰＢＳ−細胞溶液を５０ｍＬ遠心管で合わせ、室温にて１０００ｒｐｍで５分間、細胞を遠心した。次に、２本の試験管に上清を吸引除去して添加し、ニューロベーサル液１０ｍＬ中でペレットを再懸濁し、即ち１０ｍＬ中で混合した。
【０２８５】
Ｎｅｕｂａｕｅｒ計数チャンバーを用いて細胞数を調べた。ニューロベーサル液は、既に分化したＮＴｅｒａ−２細胞のさらなる培養に対して特化された培地である。
【０２８６】
【表５】
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【０２８７】
分化したＮＴｅｒａ−２を用いた集合体の形成
細胞集合体の形成のために、細胞数計数後、ニューロベーサル液中で剥離させた分化細胞（前出セクション参照）をおよそ百万個の細胞／ｍＬの濃度になるようにニューロベーサル液で希釈した。この細胞縣濁液の２０ｍＬを１００ｍＬの使い捨て滅菌振盪フラスコに移し、３７℃及び５％ＣＯ２ガスの恒温槽中で一定に撹拌させながら一晩温置した。液体の循環が起こらず、細胞が満足する集団を形成しないので、２０ｍＬの体積を超えないことは重要であった。
【０２８８】
ポリリジン／ラミニンで被覆された９６ウェルプレートを、ｈＲＧＭ  Ａ断片でさらに被覆した。ＰＢＳで２回洗浄した後、ＮＴｅｒａ集団を播種した。１８から２４時間後、培養物を固定し染色した。定量分析において、ｈＲＧＭ  Ａ断片上で成長させたＮＴｅｒａ集団を、ポリリジン／ラミニンのみの上で成長させたＮＴｅｒａ集団と比較した。Ｌｉｎｇｏｒら（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、２００７、電子形態で公開）により記載の方法に従い、ＮＴｅｒａ集団の神経突起の長さを自動的に測定した。
【０２８９】
試験しようとする物質の様々な濃度を添加することにより、ＲＧＭペプチド及び断片の阻害効果を分析した。あるいは、ＲＧＭ断片を基質として提供した。
【０２９０】
試験方法３：ＲＧＭ  Ａ-ネオゲニン結合試験
ａ）材料
・イムノプレート：Ｃｅｒｔ．Ｍａｘｉ  Ｓｏｒｐ  Ｆ９６（ＮＵＮＣ、４３９４５４）
・組み換えヒトＲＧＭ  Ａ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｐｒｏｄ．＃２４９５−ＲＭ（２６０μｇ／ｍＬ）
・組み換えヒトネオゲニンＦｃ、Ａｂｂｏｔｔ；Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ（ＡＬＵ  １５１４／１２２；４２５μｇ／ｍＬ）
・ペルオキシダーゼ−結合、アフィニティ精製マウス抗−ヒトＩｇＧ  Ｆｃ断片ＡＫ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃｏｄｅ：２０９−０３５−０９８）（０．８ｍｇ／ｍＬ）
・現像剤基質：ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ  ＴＭＢ基質キット（Ｐｉｅｒｃｅ、＃３４０２１）
・硫酸（Ｍｅｒｃｋ、＃４．８０３５４．１０００）
ｂ）方法：
１．イムノプレートへのＲＧＭ  Ａ結合：
・５０ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３中の２．５μｇ／ｍＬ  ＲＧＭ  Ａ（Ｒ＆Ｄ）（５０μＬ／ウェル）
・３７℃で１時間温置
２．洗浄段階：
・ＰＢＳ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄（１００μＬ／ウェル）
３．非特異的結合部位のブロッキング処理：
・ＰＢＳ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ中の３％ＢＳＡでのブロッキング処理（２００μＬ／ウェル）
・３７℃で１時間温置
４．ネオゲニン結合：
・１％ＢＳＡ  ＰＢＳ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ中の希釈液（最初の濃度１μｇ／ｍＬ）中にネオゲニンの添加（最初の濃度１μｇ／ｍＬ）
・３７℃で１時間温置
５．洗浄段階：
・ＰＢＳ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄（１００μＬ／ウェル）
６．結合ネオゲニンの抗体検出：
・ＨＲＰカップリングマウス抗−ヒトＩｇＧ  Ｆｃ断片ＡＫ（ＰＢＳ／１％ＢＳＡ中で１：２５００に希釈）の添加（５０μＬ／ウェル）
・３７℃で１時間温置
７．洗浄段階：
・ＰＢＳ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄（１００μＬ／ウェル）
８．現像
・５０μＬ発色基質／ウェルの添加（ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ  ＴＭＢ基質、Ｐｉｅｒｃｅ）
・室温で１〜３０分間温置
・５０μＬの２．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４／ウェルを用いて反応停止
【０２９１】
試験方法４：ＲＧＭ  Ａ及びＢＭＰ−２及び−４の間の相互作用を調べるためのインビトロ相互作用試験
下記のように相互作用試験を行った：
変法Ａ：ＢＭＰ−２／又は−４タンパク質の固定化及び様々なＲＧＭ  Ａ−Ｆｃ融合タンパク質の結合の検出
１．プレート：
・Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ  Ｃｅｒｔ．ＭａｘｉＳｏｒｐ  Ｆ９６（Ｎｕｎｃ、４３９４５４）
２．被覆：
組み換えヒトＢＭＰ−２、カタログ番号３５５−ＢＭ  会社：Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；組み換えヒトＲＧＭ  Ａ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；製品番号２４９５−ＲＭ又は組み換えヒトＢＭＰ−４、カタログ番号３１４−ＢＭ、会社：Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；
・濃度：１０μｇ／ｍＬ
・使用量：Ｎａ２ＣＯ３中２．５μｇ／ｍＬ；添加：５０μＬ／ウェル
・湿潤チャンバー中３７℃で１時間
３．洗浄段階：
ＰＢＳ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄
４．ブロッキング処理：
・ＰＢＳ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ中の３％ＢＳＡ、湿潤チャンバー中、３７℃で１時間；添加：２００μＬ／ウェル
５．ＲＧＭ  Ａペプチド：
ＲＧＭ  Ａ−Ｆｃ断片
・１μｇ／ｍＬ開始濃度、次いでＰＢＳ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を用いて１：２に希釈。
・室温で１時間温置
・湿潤チャンバー中、３７℃で１時間
６．洗浄段階：
・ＰＢＳ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄
７．抗体：
・ビオチン抗ヒトＦｃ（Ｒ＆Ｄ−Ｓｙｓｔｅｍｓ）、カタログ番号７０９０６５；１ｍｇ／ｍＬ；
・０．６％ＢＡＳ／ＰＢＳ−Ｔ（０．０２％Ｔｗｅｅｎ）中で１：２００
・添加：５０μＬ／ウェル
・湿潤チャンバー中、３７℃で１時間
８．二次抗体：Ｓｔｒｅｐ．ＰＯＤ（Ｒｏｃｈｅ）；カタログ番号１１０８９１５３００１
・５００Ｕ；０．６％ＢＡＳ／ＰＢＳ−Ｔ（０．０２％Ｔｗｅｅｎ）中１：５０００
・添加：５０μＬ／ウェル
・湿潤チャンバー中、３７℃で１時間
９．洗浄段階：
・ＰＢＳ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄
１０．基質：
・ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ  ＴＭＢ基質キット；Ｐｉｅｒｃｅ、＃３４０２１
・発色時間：およそ１−３０分、ＰＢＳ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０の１：１混合物；添加：５０μＬ／ウェル
１１．停止：
・２．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４；添加：５０μＬ／ウェル
変法Ｂ：様々なＲＧＭ  Ａ−Ｆｃ融合タンパク質の固定化及びＢＭＰ−２／又は−４タンパク質の結合の検出
１．プレート：
Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ  Ｃｅｒｔ．ＭａｘｉＳｏｒｐ  Ｆ６（Ｎｕｎｃ、４３９４５４）
２．コーティング：
ＲＧＭ  Ａ−Ｆｃ断片
・使用量：Ｎａ２ＣＯ３中２．５μｇ／ｍＬ；添加：５０μＬ／ウェル、
・湿潤チャンバー中、３７℃で１時間
３．洗浄段階：
・ＰＢＳ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄
４．ブロッキング処理：
・ＰＢＳ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ中３％ＢＳＡ、湿潤チャンバー中、３７℃で１時間
・添加：２００μＬ／ウェル、温置：湿潤チャンバー中、３７℃で１時間
５．ＢＭＰペプチド：
組み換えヒトＢＭＰ−２、カタログ番号３５５−ＢＭ、会社：Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；又は組み換えヒトＲＧＭ  Ａ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；製品番号２４９５−ＲＭ、組み換えヒトＢＭＰ−４、カタログ番号３１４−ＢＭ、会社：Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；各場合の濃度：１０μｇ／ｍＬ
希釈段階：各場合、ＰＢＳ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０で１：２
６．洗浄段階：
・ＰＢＳ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄
７．抗体：
抗ヒトＢＭＰ−４ビオチン抗体；カタログ番号ＢＡＭ７５７２、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ｔ中１：２００
８．洗浄段階：
・ＰＢＳ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄
９．二次抗体：
Ｓｔｒｅｐ．ＰＯＤ（Ｒｏｃｈｅ）
カタログ番号１１０８９１５３００１；５００Ｕ；０．６％ＢＡＳ／ＰＢＳ−Ｔ（０．０２％Ｔｗｅｅｎ）中１：５０００
添加：５０μＬ／ウェル
・湿潤チャンバー中、３７℃で１時間
１０．洗浄段階：
・ＰＢＳ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄
１１．基質：
ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ  ＴＭＢ基質キット；（Ｐｉｅｒｃｅ、＃３４０２１）
・発色時間：およそ１−３０分間
・ＰＢＳ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０の１：１混合物；添加：５０μＬ／ウェル
１２．停止：
・２．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４；添加：５０μＬ／ウェル
変法Ｃ：ＭＡＢ  ４Ａ９によるＢＭＰ−４への全長ヒトＲＧＭ  Ａの結合の阻害
１．プレート：Ｉｍｍｕｎｏ  Ｐｌａｔｅ  Ｃｅｒｔ．Ｍａｘｉ  Ｓｏｒｐ  Ｆ９６（Ｆａ．ＮＵＮＣ、４３９４５４）
２．被覆：
組み換えヒトＢＭＰ−４  Ｃａｎｔｏ．：３１４−ＢＰ
入手元：Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ
濃度：１０μｇ／ｍＬ
使用量：中２．５μｇ／ｍＬ（Ｎａ２ＣＯ３）／５０μＬ／ウェル
湿潤チャンバー中、３７℃で1時間温置
３．洗浄：３ｘＰＢＳ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０
４．ブロッキング処理：ＰＢＳ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ中３％ＢＳＡ、湿潤チャンバー中、３７℃で１時間温置、２００μＬ／ウェル
５．ｈＲＧＭ  Ａ：
＃７８８  ＲＧＭＡ（４７−４２２）２９０μｇ／ｍＬ
ＡＬＵ  ２８２１／１１７  １１．１２．０７断片０．５μｇ／ｍＬ一定（５０μl）
＋
ＭＡＢ  ４Ａ９開始濃度：１０μｇ／ｍＬ、１：２希釈（５０μＬ）
６．洗浄：３ｘＰＢＳ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０
７．一次検出抗体：
ビオチン抗ヒトＦｃ  １ｍｇ／ｍＬ
Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（カタログ番号：７０９−０６５−１４９）１．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ−Ｔ中で１：１０００希釈、７５μＬ／ウェル
湿潤チャンバー中、３７℃で１時間温置
８．洗浄：３ｘＰＢＳ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０
９．二次検出ツール：
ストレプトアビジンカップリングペルオキシダーゼ（Ｒｏｃｈｅ）
カタログ番号：１１０８９１５３００１、５００Ｕ
１．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ−Ｔ（０．０２％Ｔｗｅｅｎ）７５μＬ／ウェル中で１：５０００、
湿潤チャンバー中、３７℃で１時間温置
１０．洗浄：３ｘＰＢＳ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０
１１．基質：Ｉｍｍｕｎｏ  Ｐｕｒｅ  ＴＭＢ基質キット（Ｐｉｅｒｃｅ、＃３４０２１）発色時間：１−３０分間、１：１混合
１２．停止：２．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４
【０２９２】
２．調製実施例
調製実施例１：哺乳動物細胞におけるＲＧＭ  Ａタンパク質断片の調製
活性ＲＧＭ  Ａの特徴を調べるために、次のＲＧＭ  Ａ分子をＦｃ融合タンパク質の形態で哺乳動物細胞（ＨＥＫ２９３）において発現させた。
４１−１６８／Ｘａ
４７−９０
４７−１６８
３１６−３８６
１−４５０
【０２９３】
この目的のために、ベクター：ｐｃＤＮＡ３．１（＋）Ｚｅｏ  ＩｇＫ／Ｘａ／ｈＩｇＧλ  ｈｃ  ２５７−停止）ｘＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ／ホスファターゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、特定分子をコードするＤＮＡをクローニングした。この目的のために、ＲＺＰＤクローン（クローンＡＬ１３６８２６（ＤＫＦＺｐ４３４Ｄ０７２７）；公開されたＲＺＰＤ配列：ＢＣ０１５８８６、ＡＬ１３６８２６）から、ＰＣＲを用いて、特定の断片領域をコードするＤＮＡを増幅した。この目的のために、下記で挙げられ、公開されたＲＧＭＡ配列由来である、オリゴヌクレオチドプライマー（公開配列：ＮＭ＿０２０２１１）を使用した。
【０２９４】
上述のＲＺＰＤクローンｐＳｐｏｒｔ−１ＤＫＦＺｐ４３４Ｄ０７２７においてこれらのプライマー及びＡｃｃｕＰｒｉｍｅポリメラーゼを用いて、各場合においてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物の精製、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩでの消化及び得られるバンドの溶出後、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）Ｚｅｏ  ＩｇＫ／Ｘａ／ｈＩｇＧλｈｃ２５７−停止）ｘＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ／ホスファターゼにおいて、所望の断片を結合（ライゲーション）した。ＮＥＢＴｕｒｂｏ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）又はＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換するために、得られた産物を使用した。配列決定によって、得られた配列の正確さについて、得られたクローンを調べた。
【０２９５】
４１−１６８／Ｘａ：
ＡＭ１３１：
【０２９６】
【化７】
2010537655.tif 000013
ＨｉｎｄＩＩＩセグメントを有するアミノ酸Ｆ４１で始まるｈＲＧＭ  Ａセンスプライマー。
【０２９７】
ＡＭ１３２：
【０２９８】
【化８】
2010537655.tif 000014
第Ｘａ因子及びＥｃｏＲＩ切断部位のあるアミノ酸Ｄ１６８までのｈＲＧＭ  Ａアンチセンスプライマー。
【０２９９】
ＮＥＢＴｕｒｂｏ細胞への形質転換；
プラスミド名：ｐｃＤＮＡ３．１（＋）Ｚｅｏ  ＩｇＫ／ｈＲＧＭ  Ａ  ４１−１６８／Ｘａ／Ｘａ／ｈＩｇＧλ  ｈｃ  ２５７−停止（ａｔｔなし）
４７−９０：
ＡＭ１６９：
【０３００】
【化９】
2010537655.tif 000015
ＨｉｎｄＩＩＩセグメントを有するアミノ酸Ｐ４７で始まるｈＲＧＭ  Ａセンスプライマー。
【０３０１】
ＡＭ１７１：
【０３０２】
【化１０】
2010537655.tif 000016
ＥｃｏＲＩ切断部位があるアミノ酸Ａ９０までのｈＲＧＭ  Ａアンチセンスプライマー
ＴＯＰ１０細胞、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｊｏｕｒｎａｌ  ＡＬＵ２１６３／５への形質転換
プラスミド名：ｐｃＤＮＡ３．１（＋）Ｚｅｏ  ＩｇＫ／ｈＲＧＭ  Ａ４７−９０／Ｘａ／ｈＩｇＧλ  ｈｃ  ２５７−停止（ａｔｔなし）
４７−１６８：
ＡＭ１６９：
【０３０３】
【化１１】
2010537655.tif 000017
ＨｉｎｄＩＩＩセグメントがあるアミノ酸Ｐ４７で始まるｈＲＧＭＡセンスプライマー
ＡＭ１７５：
【０３０４】
【化１２】
2010537655.tif 000018
ＥｃｏＲＩ切断部位があるアミノ酸Ｄ１６８までのｈＲＧＭＡアンチセンスプライマー
ＴＯＰ１０細胞への形質転換
プラスミド名：ｐｃＤＮＡ３．１（＋）Ｚｅｏ  ＩｇＫ／ｈＲＧＭＡ４７−１６８／Ｘａ／ｈＩｇＧλ  ｈｃ  ２５７−停止（ａｔｔなし）
３１６−３８６：
ＡＭ１８１：
【０３０５】
【化１３】
2010537655.tif 000019
ＨｉｎｄＩＩＩセグメントがあるアミノ酸Ｌ３１６で始まるｈＲＧＭＡセンスプライマー
ＡＭ１８２：
【０３０６】
【化１４】
2010537655.tif 000020
ＥｃｏＲＩ切断部位があるアミノ酸Ｇ３８６までのｈＲＧＭＡアンチセンスプライマー
ＴＯＰ１０細胞への形質転換
プラスミド名：ｐｃＤＮＡ３．１（＋）Ｚｅｏ  ＩｇＫ／ｈＲＧＭＡ  １６６−３８６／Ｘａ／ｈＩｇＧλ  ｈｃ  ２５７−停止（ａｔｔなし）
１−４５０：
Ｍｅｙ  ７４４：
【０３０７】
【化１５】
2010537655.tif 000021
開始ＡＴＧがあるｈＲＧＭＡプライマー。
【０３０８】
Ｍｅｙ７４５：
【０３０９】
【化１６】
2010537655.tif 000022
停止のないアミノ酸Ｃ４５０までのｈＲＧＭＡアンチセンスプライマー。
【０３１０】
比較のために、さらなるＲＧＭＡを用いて同様にして次のＦｃ融合タンパク質を作製したが、それらの作製は個別には説明しない。
【０３１１】
２６６−２８４
７０−１２０
１１０−１６９
１６９−４２２
２６６−３３５
４７−４２２  Ｍｙｃ  Ｈｉｓ
ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（ＤＳＭＺ番号ＡＣＣ３０５）にプラスミドを遺伝子移入し、発現された融合タンパク質を上記のように単離した。
【０３１２】
上記の方法を用いて、タンパク質の分析及び濃度測定を行った。
【０３１３】
３．操作実施例
操作実施例１
ＢＭＰ−４とのインビトロ相互作用アッセイ；ＲＧＭＡとの様々なＲＧＭＡ断片の比較
試験した融合タンパク質：
ＲＧＭＡ−Ｆｃ
４７−１６８−Ｆｃ（「断片０」）
２１８−２８４−Ｆｃ（「断片２」）
２６６−３３５−Ｆｃ（「断片３」）
１６９−４２２−Ｆｃ（「断片６」）
上記の試験方法４、変法Ｂに従い、融合タンパク質（１ｍｇ／ｍＬ）の固定化によって、試験を行った。抗ＢＭＰ−４ビオチン抗体を用いてＢＭＰ−４の結合を検出した。
【０３１４】
図３で結果を図示する。４７−１６８断片との驚くべきより顕著な結合に加えて、ＲＧＭＡとのＢＭＰ−４の顕著な結合が観察された。
【０３１５】
操作実施例２
ＢＭＰ−４及びＢＭＰ−２とのインビトロ相互作用アッセイ；ＲＧＭＡに対するＲＧＭＡ断片４７−１６８の比較
試験された融合タンパク質：
ＲＧＭ  Ａ−Ｆｃ
４７−１６８−Ｆｃ（「断片０」）
上記の試験方法４、変法Ｂに従い、融合タンパク質（１ｍｇ／ｍＬ）の固定化によって、試験を行った。抗ＢＭＰ−４及び抗ＢＭＰ−２ビオチン抗体をそれぞれ用いてＢＭＰ−４及び−２の結合を検出した。
【０３１６】
図４で結果を図示する。４７−１６８断片との驚くべきより顕著な結合に加えて、ＲＧＭＡとのＢＭＰ−４及び−２の顕著な結合が観察された。ＢＭＰ−２及び４は、各場合で、ほぼ同じ強さで結合した。
【０３１７】
操作実施例３
ＢＭＰ−４とのインビトロ相互作用アッセイ；様々なＲＧＭＡ断片の比較
試験した融合タンパク質：
４７−９０−Ｆｃ（＃７８５）
４７−１６８−Ｆｃ（＃７８６）
３１６−３８６−Ｆｃ（＃７９０）
１６９−４２２−Ｆｃ（＃７６９）
７０−１２０−Ｆｃ（＃７７９）
１１０−１６９−Ｆｃ（＃７８０）
２６６−３３５−Ｆｃ（＃７８９）
４７−４２２ＭｙＣ−ＨＩＳ（＃８０１）
上記の試験方法４、変法Ａに従い、ＢＭＰ−４（１ｍｇ／ｍＬ）の固定化によって、試験を行った。抗ヒトＦｃ又は抗Ｍｙｃ抗ウサギ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）抗体を用いて、融合タンパク質の結合を検出した。
【０３１８】
添付の図５で結果を示す。
【０３１９】
本発明による、断片＃７８５、＃７８６及び＃７９０の顕著な濃度依存性結合が観察されたが、＃７８６結合が最も強かった。
【０３２０】
操作実施例４
ＢＭＰ−４とのインビトロ相互作用アッセイ；様々な結合ＲＧＭ  Ａ断片の比較
試験した融合タンパク質：
４７−９０−Ｆｃ（＃７８５）
４７−１６８−Ｆｃ（＃７８６）
３１６−３８６−Ｆｃ（＃７９０）
上記の試験方法４、変法Ａに従い、ＢＭＰ−４（１ｍｇ／ｍＬ）の固定化によって、試験を行った。抗ヒト抗体を用いて、融合タンパク質の結合を検出した。
【０３２１】
図６Ａ、Ｂ及びＣで結果を図示する。この結果は、例示的な実施形態３の知見の確証となるものである。
【０３２２】
操作実施例５
神経線維成長試験での合成ＲＧＭＡ断片の研究
ヒトＮＴｅｒａ神経細胞又はヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を用いて、調製実施例１に従い作製される下記で挙げるＲＧＭＡ断片：
４７−１６８−Ｆｃ（＃７８６）
３１６-３８６−Ｆｃ（＃７９０）
を神経突起成長試験での阻害活性について試験した（上記試験方法１及び２参照）。図７Ａ（ＳＨ−ＳＹ５Ｙに対して）及び７Ｂ（ＮＴｅｒａに対して）で結果を示す。
【０３２３】
４７−１６８−Ｆｃ（＃７８６）は、顕著により高い活性を示す。
【０３２４】
本説明セクションで引用される文書の開示を明確に参照する。
【０３２５】
操作実施例６
ｈＲＧＭ  Ａ断片４７−１６８に結合するモノクローナル抗体４Ａ９の作製及び特性評価
別段の断りがない限り、抗体作製及び特性評価の標準的な方法を使用した。
【０３２６】
ａ）作製及び免疫ブロッティング
全長ヒトＲＧＭ  Ａタンパク質を用いてラットに免疫付与した。
【０３２７】
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに免疫付与し、ヒトＲＧＭ  Ａでの皮下注射により追加免疫した。完全フロイントアジュバント中２５μｇの最初の注射で開始し、不完全フロイントアジュバント中２５μｇの追加免疫注射を行い、動物に３週間ごとに注射した。融合の４日前に、融合のために選択されたラットに食塩水中の２５μｇ  ｈＲＧＭ  Ａを皮下注射した。免疫付与動物から脾臓を取り出し、単一細胞縣濁液を調製した。ＳＰ２／０骨髄腫細胞を培養物から回収し、洗浄した。標準的技術を使用して５０％ＰＥＧ３０００を用いて、５：１の比で脾臓細胞及び腫瘍細胞を混合し、融合させた（Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５）。２．５ｘ１０５個の脾臓細胞／ウェルの密度で、選択培地中で、９６ウェルプレートに融合細胞を播種した。７から１０日間、３７℃で融合物を温置した。肉眼で見えるコロニーを観察し、上清を除去し、ｈＲＧＭ  Ａ  ＥＬＩＳＡで試験した。
【０３２８】
限界希釈法によって、所望の特徴を有するｍＡｂを産生していたハイブリドーマをサブクローニングした。ｈＲＧＭ  Ａを遺伝子移入したＨＥＫ２９３細胞を用いて、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣｓによって、ｈＲＧＭ  Ａへの結合について、サブクローンを含有する上清をアッセイした。
【０３２９】
全長ヒトＲＧＭ  Ａ及びその断片を用いたハイブリドーマスクリーニング後、ウエスタンブロットにおいてそれが断片４７−１６８（レーン５）を認識するので、ＭＡＢ  ４Ｆ９を単離した（図８Ａ）。この抗体は、固相ＥＬＩＳＡアッセイにおいてＢＭＰ−４及び全長ヒトＲＧＭ  Ａの相互作用を阻止した（図８Ｂ）。
【０３３０】
ｂ）４Ａ９のエピトープマッピング
抗体の固定化：
ＭＡＢ  ４Ａ９のエピトープを正確に説明するために、エピトープマッピング実験を行った。この目的に対して、４Ａ９をＣＮＢｒ−活性化セファロースレジンに結合させた。４Ａ９溶液のおよそ５−６ｎｍｏｌ（５．７６ｍｇ／ｍＬの１４１μＬ）を緩衝液Ａ（１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８）中のセファロースレジン２０ｍｇに添加し、室温で４時間混合した。緩衝液Ｂ（１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８）で抗体結合レジンを３回洗浄した後、ｈＲＧＭ  Ａ断片４７−１６８Ｆｃ（１．１８ｍｇ／ｍＬ、１．５ｎｍｏｌ）を２００μＬ緩衝液Ｂとともにレジンに添加した。混合物を回転器上で４℃で一晩温置した。抗体４Ａ９及び抗原ｈＲＧＭ  Ａ４７−１６８を含有するレジンを緩衝液Ｂで３回洗浄し、トリプシンでのエピトープ切断に対して使用した。
【０３３１】
エピトープ切断：
この目的に対して、ＭＡＢ及び抗原を含有するレジンを２００μＬ緩衝液Ｂ中で縣濁した。０．１μｇ／μＬの濃度になるように、再懸濁緩衝液（５０ｍＭ  ＨＯＡｃ）２００μＬ中でトリプシン２０μｇ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）を溶解させた。それぞれトリプシン０．６μｇ及び０．３５μｇを用いて、１：１００及び１：２００の比（ｗ／ｗ）の酵素：抗原で、抗原切断を行った。ＧＣオーブン中にて３７℃で回転させながら、７．５時間、反応を行った。消化後、緩衝液Ｂでレジンを２回洗浄した。
【０３３２】
エピトープ放出：
２％ギ酸２００μＬずつで３回レジンを洗浄することによって、ＭＡＢに依然として結合した残りの抗原ペプチドを放出させ、各溶出分画を個々に回収した（溶出液１、２及び３）。溶出された分画は、ＭＡＢ  ４Ａ９エピトープを構成するペプチドを含有すると予想される。
【０３３３】
質量分析（ＭＳ）によるペプチド分析：
脱塩後、トリプシン消化からの溶出分画を質量分析に供した。α−シアノ−４−ヒドロキシけい皮酸（ＣＨＣＡ）マトリクス（飽和、５０％アセトニトリル、０．３％ＴＦＡ中）を用いて、Ｖｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−Ｐｒｏ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）においてマトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）ＭＳを行った。Ａｇｉｌｅｎｔ６５１０ＱＴＯＦ  ＭＳを用いて、ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳを行った。８μＬの注入を使用し、特定のＭＳシグナル基準に合致する上位３種類のイオンにおいてＭＳ／ＭＳを行った。ＭＡＳＣＯＴ（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてデータを検索したが、データの殆どは手動で判断した。
【０３３４】
全ての洗浄及び溶出分画を最初にＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析し、多くのものをＭＡＬＤＩ−ＭＳにより分析したが、得られたデータは溶出１分画に相当する。
【０３３５】
結果：
トリプシンエピトープ切断実験の溶出１分画において、ｈＲＧＭ  Ａの断片４７−１６８のペプチド５０−８９及び９６−１２６を同定した。ヒトＲＧＭ  ＡにおけるＭＡＢ４Ａ９ペプチドの位置を下記に示す。ｈＲＧＭ  Ａの断片４７−１６８を太字で示す。ＭＡＢ  ４Ａ９保護ペプチドとして同定される２つのペプチドに下線を付す。これらのペプチドの１つの中に正確なエピトープが位置し、その他のペプチドがジスルフィド結合を介して連結され得る。
【０３３６】
＞ｈＲＧＭＡ−ＮＰ０６４５９６
【０３３７】
【化１７】
2010537655.tif 000023
【０３３８】
ｃ）ペプチドスキャニングを介したエピトープマッピング
ＭＡＢ  ４Ａ９のエピトープを同定するために、領域１５から１６８に広がるネスト化された重複ペプチド１５アミノ酸長を使用した。ＥＬＩＳＡによってペプチドの結合を評価し、このために、このペプチドでポリスチレンプレートを被覆した。次に、ＭＡＢ  ４Ａ９を用いてペプチドを調べ、ペルオキシダーゼ結合抗ラットＦｃ抗体及びＴＭＢ基質を用いて、ＥＬＩＳＡによって結合を可視化した。
【０３３９】
ＭＡＢ  ４Ａ９に対してある反応性ペプチドが観察されたが、このペプチドを下記で示す。
【０３４０】
５１  ＬＫＣＮＳＥＦＷＳＡ  ＴＳＧＳＨＡＰＡＳＤ  ＤＴＰＥＦＣＡＡＬＲ  ＳＹＡＬＣＴＲＲＴＡ  ＲＴＣＲＧＤＬＡＹＨ  ＳＡＶＨＧＩＥＤＬＭ  ＳＱＨＮＣＳＫＤＧＰ  ＴＳＱＰＲＬＲＴＬＰ  ＰＡＧＤＳＱＥＲＳＤ  ＳＰＥＩＣＨＹＥＫＳ  ＦＨＫＨＳＡＴＰＮＹ  ＴＨＣＧＬＦＧＤ  １６８
ＭＡＢ  ４Ａ９は、太字で下線を付して強調した文字のペプチドに結合する。このペプチドはアミノ酸６６−８０内にあり、エピトープ切断及び質量分析解析により同定されるペプチドの１つによく合致した。
【０３４１】
操作実施例７
ＢＲＥ−Ｌｕｃアッセイを用いたＢＭＰシグナル伝達におけるｈＲＧＭ  Ａのアゴニスト性又はアンタゴニスト性効果の評価
ａ）材料：
・２００μｇ／ｍＬで３種類の化合物を提供した。
断片＃７８５；断片＃７８６及び断片＃７８８（ＩｇＫ／ｈＲＧＭ  Ａ４７−４２２／Ｘａ切断部位／Ｆｃ）
・Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｅｕｒｏｐｅ、Ｌｉｌｌｅ、Ｆｒａｎｃｅから、組み換えｈＢＭＰ−２（ＣＨＯ細胞より；＃３５５−ＢＭ）及びモノクローナル抗ヒトＢＭＰ２／４抗体（＃ＭＡＢ３５５２）を得た。
・ＰｒｏｍｅｇａからＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイキットを購入した。
【０３４２】
ｂ）細胞培養：
ＢＭＰ−反応性Ｃ３Ｈ１０−Ｂ１２（Ｌｏｇｅａｒｔ−Ａｖｒａｍｏｇｌｏｕ  Ｄ、Ｂｏｕｒｇｕｉｇｎｏｎ  Ｍ、Ｏｕｄｉｎａ  Ｋ、Ｔｅｎ  Ｄｉｊｋｅ  Ｐ、Ｐｅｔｉｔｅ  Ｈ。分化プロモーター−ルシフェラーゼコンストラクトの阻害剤を遺伝子移入した細胞を用いた生物学的活性骨形成タンパク質の判定のためのアッセイ。Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２００６；３４９：７８−８６）を４ｘ１０４細胞／ｃｍ２の密度で９６ウェルプレートに播種し、湿度を与えた３７℃、５％ＣＯ２／９５％大気環境中で２４時間、ＢＭＥ（ＢＭＥ＝イーグル基礎培地）（１０％ＦＢＳ添加）中で培養した。細胞をＰＢＳで２回すすぎ、ｒｈＢＭＰ−２（５０ｎｇ／ｍＬ）あり又は無しで、試験される各ＡＳ化合物又は抗ヒトＢＭＰ２／４抗体（０．０１から１０,０００ｎｇ／ｍＬ）の何れかを含有するＢＭＥ／０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ下で２４時間培養し、その後、含有されるルシフェラーゼ活性についてアッセイした。実験は全て、トリプリケート（各３回測定）で行い、時間をおいて２回繰り返した。
【０３４３】
ｃ）結果：
固相ＥＬＩＳＡ実験において、ＭＡＢ  ４Ａ９は、ＢＭＰ−４に対する全長ヒトＲＧＭ  Ａの結合を完全に阻止するが、これは、４７−１６８ヒトＲＧＭ  Ａ断片内にある４Ａ９のドメインがＢＭＰ−４との相互作用に重要であるという明確な例となる。
【０３４４】
細胞アッセイにおいて、様々な濃度（０から５０ｎｇ／ｍＬ）のｒｈＢＭＰ−２でのＣ３Ｈ−Ｂ１２の処理後に得られたルシフェラーゼ活性の用量依存性反応を図９で示す。
【０３４５】
試験化合物の様々な濃度にＣ３Ｈ−Ｂ１２を２４時間曝露し、個々の細胞ルシフェラーゼ活性の変化を監視することによって、ＢＲＥ−Ｌｕｃアッセイを用いたＢＭＰシグナル伝達における試験ポリペプチドのアゴニスト性効果を調べた（図１０）。３種類の試験化合物の何れも、それら自身においてルシフェラーゼ活性を誘導した。
【０３４６】
ｒｈＢＭＰ−２（５０ｎｇ／ｍＬ）と組み合わせられた場合、断片＃７８５は、ＢＭＰ−２−誘導性ルシフェラーゼ活性をあまり変化させなかった。対して、断片＃７８６及び＃７８８は、化合物が１０μｇ／ｍＬで使用された場合、ｒｈＢＭＰ−２−誘導性活性の阻害の８８％及び９３％に達するルシフェラーゼ活性の用量依存性阻害を示した。断片＃７８６及び＃７８８は、ＢＭＰ−２アンタゴニスト対照として使用される抗ｒｈＢＭＰ−２抗体と同様の阻害効果を示した。断片＃７８６及び＃７８８及び抗−ＢＭＰ−２Ａｂに対する阻害の５０％に対する同等用量（ＥＤ５０）値は、それぞれ１００ｎｇ／ｍＬ、〜８０ｎｇ／ｍＬ及び〜５０ｎｇ／ｍＬであった。
【０３４７】
ｄ）結論
それら自身における試験化合物はＢＭＰシグナル伝達経路を誘導せず、結果として、ＢＭＰアゴニストとしてみなされ得ない。対して、ｒｈＢＭＰ−２と組み合わせられた場合、これらのうち２つ（断片＃７８６及び＃７８８）は、用量依存的にｒｈＢＭＰ−２−誘導性活性を阻害した。ＢＭＰ−２タンパク質とのこのような化合物の複合体形成は、細胞膜受容体へのＢＭＰ−２の結合が損なわれ得、続いて、ＢＭＰ−介在シグナル伝達が阻止され得る。しかし、この実験に対して使用される細胞モデルを考慮すると、ＢＭＰ−２シグナル伝達経路における試験化合物の直接的細胞内阻害効果は除外され得ない。
【０３４８】
本明細書中で引用される文献の開示は、参照により組み込まれる。
【０３４９】
【表６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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