(57)【要約】本発明は、分配特性が変化されたタンパク質抗体結合体を使用して抗体に結合する物質を分離する方法に関するもので、詳細には、抗体にタンパク質を結合させてタンパク質抗体結合体の分配特性を変化させた後、前記抗体に分子特異的に結合する物質を分離する親和性分離方法に関するものである。本発明の方法は、生物物質に安定な水性二相系抽出法と選別性が高い分子特異的結合力を使用することにより、安定で効果的な生物物質分離技法に広く活用することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）目標物質（Ｔ）に分子特異的に結合する親和性分子（Ｂ）に分配向上物質（Ｐ）を接合させて目標物質と異なる相に位置するようにＢの分配係数を変化させたＢ−Ｐ接合体を製造する工程と、
ｂ）工程ａ）の前記接合体をＴを含有した水溶性高分子物質の水溶液及び塩の水溶液で構成された水性二相系に投入する工程、及び
ｃ）工程ｂ）で投入後、生成されたＴ−Ｂ−Ｐ結合体を分離して取り出す工程
を含む、親和度による目標物質の分離方法。
【請求項２】
目標物質が、細胞、タンパク質、核酸分子、多糖類、糖蛋白質、糖脂質または脂質タンパク質であることを特徴とする、請求項１に記載の目標物質の分離方法。
【請求項３】
タンパク質が、ペプチドリガンド、酵素及び抗体からなる群から選択されるいずれかひとつであることを特徴とする、請求項２に記載の目標物質の分離方法。
【請求項４】
親和性分子が、抗体、抗原、酵素、基質、ペプチド、ヌクレオチド、アプタマー、染料及び金属イオンのようなリガンド及び受容体として作用可能な物質からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の目標物質の分離方法。
【請求項５】
分配向上物質が、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、アルカリフォスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、リゾチーム、ウシ血清アルブミンのようなポリペプチド及びペプチドからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の目標物質の分離方法。
【請求項６】
高分子物質が、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンポリプロピレンブロックコポリマー及びオリゴサッカライドからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の目標物質の分離方法。
【請求項７】
塩が、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸アンモニウム及び硫酸マグネシウムからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の目標物質の分離方法。
【請求項８】
目標物質が、抗ヒトＩｇＧで分子特異的結合力のある物質は、ヒトＩｇＧであることを特徴とする、請求項１に記載の目標物質の分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分配特性が変化したタンパク質抗体結合体を使用して、抗体に結合する物質を分離する方法に関するもので、より詳細には、抗体にタンパク質を結合させてタンパク質−抗体結合体の分配特性を変化させたあと、前記抗体に分子特異的に結合する物質を分離する親和性分離方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生物物質の分離は、日々拡大している生物医薬品、細胞治療剤産業から除外できない重要な技術である。しかし、生物物質は、化学物質に比べて変性の憂慮が高くて類似の物理、化学的性質を有する幾多の物質と共存するため、多くの精製工程を経なければならないという短所を有している。水性二相系を使用する生物分離技術は、有機溶媒を使用せずに生物物質の安定性確保に有利で、複雑な精製工程を減らすことができるので、このような生物物質の分離に有用である。水性二相系は、高分子物質または高分子物質と塩が一定濃度以上で存在する二つの水溶液で構成され、ここで、各物質間の静電気的反発力によって混じらない二つの層を形成する。
【０００３】
水性二相系による物質分離の原理は、ポリエチレングリコールのような高分子とリン酸塩を一定比率で混合すると密度にしたがって、上層はポリエチレングリコール相、下層はリン酸塩相で境界が分けられる。ここで、分離しようとする物質を入れると、二つの相の中で好む一方の相に多量存在するようになる。これは、各相を主に構成する物質の種類及び組成によってその相の物理的、化学的特性が相違しているからである。
【０００４】
水性二相系の構成に主に使われる高分子物質には、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、デキストラン、オリゴサッカライドなどがあり、塩では、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウムなどがある。このような水性二相系は、水の量が６５〜８０％以上で、生物物質の安定性を落とさないので、同時に多様な種類の物質で二相系を構成することができ、特に生物物質の分離に有利な長所がある。
【０００５】
今まで水性二相系を使用した生物物質分離では、分離しようとする目的物質によって系を構成する物質の濃度及び高分子の分子量などに変化を与える試みが多かった。特に、水性二相系構成以後、添加物に使用される塩は、水性二相系の疎水性や目的物質の表面特性を変化させて物質の分配特性変化に大きい影響を及ぼすので多様な種類の塩を使用しようとする試みが多くなされてきた。しかし、このような塩の添加は、溶液内の浸透圧を増加させて生物物質の安定性に阻害を与え得るので、選択性が低くて目的物質だけではなく他の物質の分配係数にも影響を与え得るため適切な濃度条件を決定するのが難しいという短所を有している。
【０００６】
このような短所を克服するために、生物学的または化学的親和性を水性二相系で使用しようとする試みが行なわれたことがある。水性二相系で親和性を付与するために使われた物質としては、抗体、ＤＮＡ、金属イオン、界面活性剤などがある。
【０００７】
これらの中で本発明と係わるもので、水性二相系内で抗体を使用した親和性分離としては、抗体にリガンドとして温度感受性高分子を接合させて特定温度で動物細胞を分離しようとする試みがあった（Ａ．Ｋｕｍａｒ等，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，２００５年，第７５巻，ｐ．５７０−５８０）。しかし、これは分離能を高めるために一定温度を維持しなければならないという点で生物物質の変性をもたらし得、リガンドに使用された高分子の有害性が検証されなかったという短所がある。
【０００８】
また、他の例では、抗体をＰＥＧ（ポリエチレングリコール）に接合させたＰＥＧ化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）した分子を使用した場合で（Ｋｉｍ  Ａ．Ｓｈａｒｐ等．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８５年，第１５４巻，ｐ．１１０−１１７）、これは、ＰＥＧ化するために必要な変形されたＰＥＧの価格が高く、変形されたＰＥＧ及び抗体の種類によってＰＥＧ化の成功率が大きく変わり得るという短所を有している。
【０００９】
そこで、本発明者らは、生物物質の安定性を阻害せず、多数存在する不純物から目的物質のみを選択的に分離するための方法として、抗体との結合によって大多数の抗体が存在する相とは反対の相に分配されるようにするタンパク質及び水性二相系条件を選定した後、選定された条件で不純物と混合した目的物質のみを他の相に分配させて回収が可能であることを確認することで、本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、リガンドとして生物物質に対して安全ながらも水性二相系内での分配調節が容易で抗体との接合効率が高く、これを通じた親和性分離が効果的に成り立つことができる、タンパク質を使用した水性二相系抽出工程内での親和性分離方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、
ａ）目標物質（Ｔ）に分子特異的に結合する親和性分子（Ｂ）に分配向上物質（Ｐ）を接合させて目標物質と異なる相に位置するようにＢの分配係数を変化させたＢ−Ｐ接合体を製造する工程と、
ｂ）工程ａ）の前記接合体をＴを含有した水溶性高分子物質の水溶液及び塩の水溶液で構成された水性二相系に投入する工程、及び
ｃ）工程ｂ）で投入後生成されたＴ−Ｂ−Ｐ結合体を分離して取り出す工程とを含む、親和度による目標物質の分離方法を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明では、ＨＲＰが接合された抗体を使用した水性二相系内親和性分離方法を提示した。本発明において抗体−ＨＲＰ接合体は、高い効率の抗体、ＨＲＰ接合を通じて抗原−抗体反応に使用され、目的物質の特異的な分離を誘導することができるので、安全で効果的な水性二相系内物質分離に広く活用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１はタンパク質と接合された抗体を使用した水性二相系内親和性分離に対する概略図である。
【図２】図２はＰＥＧ（分子量１４５０、１０％、ｗ／ｗ）とリン酸カリウム溶液（１５％、ｗ／ｗ）、またはＰＥＧ（分子量８０００、５％、ｗ／ｗ）とデキストランＴ５００（分子量５０００００、５％、ｗ／ｗ）で構成された水性二相系でＨＲＰ、ｈＩｇＧ、ｈＩｇＧ−ＨＲＰそれぞれの分配係数差を示した図である。
【図３】図３はＰＥＧ（分子量１４５０、１０％、ｗ／ｗ）とリン酸カリウム溶液（１５％、ｗ／ｗ）で親和力があるｈＩｇＧ−ＨＲＰとウサギ（ｒａｂｂｉｔ）抗ヒトＩｇＧのモル比によるそれぞれの分配係数変化を示した図である。
【図４】図４はＰＥＧ（分子量８０００、５％、ｗ／ｗ）とデキストランＴ５００（分子量５０００００、５％、ｗ／ｗ）で親和力があるｈＩｇＧ−ＨＲＰとウサギ抗ヒトＩｇＧのモル比によるそれぞれの分配係数変化を示した図である。
【図５】図５はＰＥＧ（分子量１４５０、１０％、ｗ／ｗ）とリン酸カリウム溶液（１５％、ｗ／ｗ）で親和力がないｈＩｇＧ−ＨＲＰとヤギ抗マウスＩｇＧのモル比によるそれぞれの分配係数変化を示した図である。
【図６】図６はＰＥＧ（分子量８０００、５％、ｗ／ｗ）とデキストランＴ５００（分子量５０００００、５％、ｗ／ｗ）で親和力がないｈＩｇＧ−ＨＲＰ、ヤギ抗マウスＩｇＧのモル比によるそれぞれの分配係数変化を示した図である。
【図７】図７はＰＥＧ（分子量１４５０、１０％、ｗ／ｗ）とリン酸カリウム溶液（１５％、ｗ／ｗ）での親和性分離を示した図である。
【図８】図８はＰＥＧ（分子量８０００、５％、ｗ／ｗ）とデキストランＴ５００（分子量５０００００、５％、ｗ／ｗ）での親和性分離を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明で使用する用語を定義する。
水性二相系は、高分子物質または高分子物質と塩が一定濃度以上で存在する二つの水溶液で構成され、ここで、各物質間の静電気的反発力によって混じらない２個の層を形成する系を意味する。
【００１５】
目標物質（Ｔ、ｔａｒｇｅｔ）は、分離しようとする分離対象物質を意味する。
【００１６】
分配向上物質（Ｐ、ｐａｒｔｉｔｉｏｎ）は、目標物質に結合することができる親和性分子に接合して目標物質と親和性分子が異なる相に位置するように、親和性分子の分配係数を変化さる物質を意味する。
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
本発明は、
ａ）目標物質（Ｔ）に分子特異的に結合する親和性分子（Ｂ）に分配向上物質（Ｐ）を接合させて、目標物質と異なる相に位置するようにＢの分配係数を変化させたＢ−Ｐ接合体を製造する工程と、
ｂ）工程ａ）の前記接合体をＴを含有した水溶性高分子物質の水溶液及び塩の水溶液で構成された水性二相系に投入する工程、及び
ｃ）工程ｂ）で投入後、生成されたＴ−Ｂ−Ｐ結合体を分離して取り出す工程
を含む親和度による目標物質の分離方法を提供する。
【００１９】
本発明者らは、水性二相系内で抗体を使用した親和性分離をするとき、抗体の分配係数を変えることができる接合タンパク質を検索した。その結果、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）の場合、抗体との接合方法が常用化していて、接合効率も高いということを確認することができた。しかし、実際に分離するためには、分配係数（Ｋ、上層に存在する物質の濃度／下層に存在する物質の濃度）に差がなければならない。ＨＲＰと接合された抗体が接合されない抗体と比べて互いに異なる分配係数を有しないこともあるので、多くの種類の水性二相系で実際にこのふたつが互いに異なる分配係数を有するかどうか実験した。
【００２０】
具体的に、目的タンパク質であるウサギ抗ヒトＩｇＧを分離するために、ＨＲＰと抗体と抗体−ＨＲＰ接合体は、ヒトＩｇＧ（ｈＩｇＧ）とヒトＩｇＧ  ＨＲＰ接合体（ｈＩｇＧ−ＨＲＰ）で選択し、水性二相系は、ＰＥＧ（分子量１４５０、１０％、ｗ／ｗ）とリン酸カリウム緩衝溶液（１５％、ｗ／ｗ）またはＰＥＧ（分子量８０００、５％、ｗ／ｗ）とデキストランＴ５００（分子量５０００００、５％、ｗ／ｗ）で構成した。それぞれの水性二相系にＨＲＰ、ｈＩｇＧ、ｈＩｇＧ−ＨＲＰが単独で存在する時に有する分配係数を調べた結果、ｈＩｇＧ−ＨＲＰが元々の構成タンパク質であるＨＲＰとｈＩｇＧに比べて上層となる傾向が示された（図２参照）。
【００２１】
また、水性二相系内でＨＲＰと接合された抗体と目的タンパク質のモル比による分配傾向を調べた。これを通じて目的タンパク質を分離するのに有利な条件（水性二相系構成物質の種類及び濃度、抗体−ＨＲＰ接合体と目的タンパク質のモル比など）を選定した。
【００２２】
その結果、ＰＥＧとリン酸カリウム緩衝溶液で構成された水性二相系では、ｈＩｇＧ−ＨＲＰ、ウサギ抗ヒトＩｇＧ、ヤギ抗マウスＩｇＧのモル比３：１：１、ＰＥＧとデキストランで構成された水性二相系では、モル比１：１：１が最適であることを確認した。
【００２３】
前記方法を通じて、本実験では、目的抗体が不純物である他の抗体と水性二相系の下層に存在する一方、上層に存在しようとする性質が強い抗体−ＨＲＰ接合体を使用して二物質間の親和性結合を通じて目的タンパク質を水性二相系の上層に誘導して、以後、水性二相系の上層を分離して取り出して目的物質と不純物を分離した。
【００２４】
前記方法で、目標物質は、細胞、タンパク質、核酸分子、多糖類、糖蛋白質、糖脂質または脂質タンパク質であることが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００２５】
前記方法で、分子特異的結合力のある物質は、抗体と抗原、酵素と基質、そしてペプチド、ヌクレオチド、アプタマー、染料、金属イオンなどリガンドとアセプターとして作用可能なすべての物質を使用することができ、分配向上物質は、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、アルカリフォスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、リゾチーム、ウシ血清アルブミンなどのすべてのポリペプチド及びペプチドを使用することができる。
【００２６】
工程ｃ）の高分子物質は、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンポリプロピレンブロックコポリマー及びオリゴサッカライドからなる群から選択されることが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００２７】
また、工程ｃ）の塩は、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸アンモニウム及び硫酸マグネシウムからなる群から選択されることが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００２８】
同時に、工程ｃ）の高分子物質の水溶液及び塩の水溶液で構成される水性二相系は、ＰＥＧとリン酸カリウム緩衝溶液またはＰＥＧとデキストラン以外のポリビニルアルコール、デキストラン、ポリエチレンポリプロピレンブロックコポリマー、オリゴサッカライド、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸アンモニウム及び硫酸マグネシウムなど水性二相系構成が可能なすべての物質が使用可能である。
【００２９】
以下、本発明を実施例を通じて詳しく説明する。但し、下記の実施例は本発明を例示するためだけのものであって、本発明の内容を制限するものではない。
【００３０】
＜実施例１＞抗体−ＨＲＰ接合体と目的タンパク質、不純物各々の分配係数
本実験で使用した抗体−ＨＲＰ接合体、目的タンパク質及び不純物は、それぞれＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が接合されたヒトＩｇＧ（ｈＩｇＧ−ＨＲＰ）、これと親和性があるウサギ抗ヒトＩｇＧ及び親和性がないヤギ抗マウスＩｇＧである（全てＰｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，米国から購入）。
【００３１】
本実験で使用した水性二相系は、ＰＥＧ（分子量１４５０、１０％、ｗ／ｗ）とリン酸カリウム緩衝溶液（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ、１５％、ｗ／ｗ）、またはＰＥＧ（分子量８０００、５％、ｗ／ｗ）とデキストランＴ５００（分子量５０００００、５％、ｗ／ｗ）で、二つの水性二相系でｈＩｇＧ−ＨＲＰは、上層を（ｌｏｇＫが０より大きい）、ウサギ抗ヒトＩｇＧとヤギ抗マウスＩｇＧは、下層（ｌｏｇＫが０より小さい）となる傾向が示された（表１）。
【００３２】
水性二相系の構成のために最終濃度に比べて二倍濃縮された濃度の母液４種（ＰＥＧ溶液（分子量１４５０、２０％、ｗ／ｗ）、リン酸カリウム緩衝溶液（３０％、ｗ／ｗ）、ＰＥＧ溶液（分子量８０００、１０％、ｗ／ｗ）、デキストランＴ５００溶液（分子量５０００００、１０％、ｗ／ｗ））をまず調製した。以後、分子量１４５０のＰＥＧ溶液とリン酸カリウム溶液または分子量８０００のＰＥＧ溶液とデキストラン溶液をそれぞれ０．５ｇずつ混ぜることにより、総重量１ｇの水性二相系溶液（ＰＥＧ（分子量１４５０、１０％、ｗ／ｗ）とリン酸カリウム緩衝溶液（１５％、ｗ／ｗ）、そして、ＰＥＧ（分子量８０００、５％、ｗ／ｗ）とデキストランＴ５００（分子量５０００００、５％、ｗ／ｗ））を調製した。母液を混ぜた後には、３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離をした後、１時間常温において相を安定化した。
【００３３】
表１：水性二相系内ｈＩｇＧ−ＨＲＰ、ウサギ抗ヒトＩｇＧ、ヤギ抗マウスＩｇＧの分配係数
【表１】
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【００３４】
＜実施例２＞モル比によるｈＩｇＧ−ＨＲＰとウサギ抗ヒトＩｇＧ、ｈＩｇＧ−ＨＲＰとヤギ抗マウスＩｇＧの分配係数変化
前記実施例１にみられるように、ｈＩｇＧ−ＨＲＰとウサギ抗ヒトＩｇＧ、ヤギ抗マウスＩｇＧが互いに異なる相となる傾向が分かり、本発明では、ｈＩｇＧ−ＨＲＰとウサギ抗ヒトＩｇＧ、ｈＩｇＧ−ＨＲＰとヤギ抗マウスＩｇＧそれぞれの二つの物質が混じるモル比がこれらの分配係数に及ぼす影響を調べた。
【００３５】
＜２−１＞ｈＩｇＧ−ＨＲＰとウサギ抗ヒトＩｇＧのモル比による親和性分配係数変化
ＰＥＧ（分子量１４５０、１０％、ｗ／ｗ）とリン酸カリウム緩衝溶液（１５％、ｗ／ｗ）または  ＰＥＧ（分子量８０００、５％、ｗ／ｗ）とデキストランＴ５００（分子量５０００００、５％、ｗ／ｗ）の二つの水性二相系で、ｈＩｇＧ−ＨＲＰ及び抗ヒトＩｇＧのモル濃度を変えて実験した結果、ｈＩｇＧ−ＨＲＰのモル濃度が高くなるほど、これと親和性があるウサギ抗ヒトＩｇＧの分配係数が上昇し、一方、ウサギ抗ヒトＩｇＧのモル濃度が高くなるほどｈＩｇＧ−ＨＲＰの分配係数が減少した（図３及び図４）。これを通じて本発明では、抗体−ＨＲＰ接合体を使用した目的物質の親和性分離が可能であり、特に二つの物質間のモル比が分離効率に影響を与えることを確認した。
【００３６】
前記結果を考慮する時、ｈＩｇＧ−ＨＲＰ、ウサギ抗ヒトＩｇＧ、ヤギ抗マウスＩｇＧのモル比が塩基に基づく水性二相系では３：１：１、デキストランに基づく水性二相系では１：１：１の時、分離するのに最適条件であることを確認した。
【００３７】
＜２−２＞ｈＩｇＧ−ＨＲＰとヤギ抗マウスＩｇＧのモル比による非親和性分配係数変化
実施例２−１と同様に、ＰＥＧ（分子量１４５０、１０％、ｗ／ｗ）とリン酸カリウム緩衝溶液（１５％、ｗ／ｗ）またはＰＥＧ（分子量８０００、５％、ｗ／ｗ）とデキストランＴ５００（分子量５０００００、５％、ｗ／ｗ）の二つの水性二相系で、ｈＩｇＧ−ＨＲＰ及びヤギ抗マウスＩｇＧのモル濃度を１０：１、５：１、１：１、１：５、１：１０にして実験した結果、ｈＩｇＧ−ＨＲＰのモル濃度が高くなるほどこれと親和性がないヤギ抗マウスＩｇＧの分配係数も多少上昇し、ヤギ抗マウスＩｇＧのモル濃度が高くなるほどｈＩｇＧ−ＨＲＰの分配係数が多少減少した（図５及び図６参照）。
【００３８】
これは、ヤギ抗マウスＩｇＧとｈＩｇＧ−ＨＲＰ間の交差反応によるもので、元来、親和性がない物質の場合、ｈＩｇＧ−ＨＲＰによって水性二相系の上層で物質の移動する現象がないと予想したが、二つの物質間に非特異的な親和性が弱く存在して前記のような結果を示した。しかし、その傾向は先で詳しくみたウサギ抗ヒトＩｇＧに比べて軽微であり、溶液内にウサギ抗ヒトＩｇＧと同時に存在する場合、相互競争によって結合するようになるので、非特異的結合が実際分離過程に及ぼす影響は軽微であると判断される。
【００３９】
＜実施例３＞親和性分配を使用した水性二相系内での親和性分離
本発明の最終目的は、ｈＩｇＧ−ＨＲＰを使用して目的物質であるウサギ抗ヒトＩｇＧの上層への分配を誘導し、それを通じてより高い効率と純度のウサギ抗ヒトＩｇＧ分離を遂行するものである。前記結果で選定されたモル濃度の割合でウサギ抗ヒトＩｇＧの分配係数及び純度を測定するために下記のような実験を実施した。
【００４０】
＜３−１＞ＰＥＧ（分子量１４５０、１０％、ｗ／ｗ）とリン酸カリウム溶液（１５％、ｗ／ｗ）での親和性分離
実施例２−１、２−２の結果を基にウサギ抗ヒトＩｇＧの分配を上層に誘導することができるｈＩｇＧ−ＨＲＰ、ウサギ抗ヒトＩｇＧ、ヤギ抗マウスＩｇＧのモル比を３：１：１に選定した。この割合で親和性分離を試みた結果、ウサギ抗ヒトＩｇＧの分配係数は、ｈＩｇＧ−ＨＲＰによって−０．３５から０．５０に大きく上昇して上層にたくさん存在した。一方、ヤギ抗マウスＩｇＧの分配係数は、−０．６８から−０．０８に多少上昇したが相変らず下層に多く存在することが示された（図７）。上層に存在するウサギ抗ヒトＩｇＧの純度は７２．３７％で、これを通じてウサギ抗ヒトＩｇＧの親和性分離が可能であることを確認した。純度は、上層に存在するウサギ抗ヒトＩｇＧの量を上層に存在するｈＩｇＧ−ＨＲＰ、ウサギ抗ヒトＩｇＧ、ヤギ抗マウスＩｇＧの合計で割った後に１００を掛けて計算した。
【００４１】
＜３−２＞ＰＥＧ（分子量８０００、５％、ｗ／ｗ）とデキストランＴ５００（分子量５０００００、５％、ｗ／ｗ）での親和性分離
実施例２−１、２−２の結果を基にウサギ抗ヒトＩｇＧの分配を上層に誘導することができるｈＩｇＧ−ＨＲＰ、ウサギ抗ヒトＩｇＧ、ヤギ抗マウスＩｇＧのモル比を１：１：１に選定した。その結果、ウサギ抗ヒトＩｇＧの分配係数は−０．３０から０．７５に上昇し、ヤギ抗マウスＩｇＧの分配係数は−０．０４から−０．１７に、むしろ下層に存在する量が増加したことが示された（図８）。上層に存在するウサギ抗ヒトＩｇＧの純度は、８７．６８％であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2010501552.tif 000010
【図８】
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【国際調査報告】
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