(57)【要約】請求の範囲に記載されている発明は、生体内の様々な細胞への分化を促進し、更なる分化を可能にする多能、多能性、自己再生可能な細胞の生成に直接関係している。請求の範囲に記載されている発明は、望まれる移植可能の分化細胞集団、遺伝子組み換えされた細胞、これらの方法により改善されるであろう病気によって苦しんでいる患者の治療法に、直接関係する。本発明は、免疫不全ウィルス感染に関連した病気の予防や治療方法をも与える（ＨＩＶ−１，、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＦＩＶなど）。【特許請求の範囲】
【請求項１】
デコイ、合成オリゴヌクレオチド連鎖、合成オリゴヌクレオチドを含む、ＨＩＶ共受容体に直接対抗するｌｌｌＶ−ｌおよび／あるいはＩＩＩＶ−２の感染を減少させるベクター。
【請求項２】
合成オリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ連鎖グループから選択される合成オリゴヌクレオチド連鎖を含む請求項１のベクター。
【請求項３】
合成オリゴヌクレオチドの組み合わせを含む請求項１のベクターは分類される。
【請求項４】
ウィルスベクターである請求項１のベクター。
【請求項５】
ＨＩＶ酵素を標的にする合成オリゴヌクレオチドの請求項１のベクター。
【請求項６】
標的細胞においてプロモータ活性によって操作される合成オリゴヌクレオチドの請求項１のベクター。
【請求項７】
ＥＦ−１  ａｌｐｈａプロモータによって操作される合成オリゴヌクレオチドの請求項１のベクター。
【請求項８】
抗生たんぱく質または蛍光性たんぱく質を符号化するマーカー遺伝子を含む、請求項１のベクター。
【請求項９】
ＨＩＶ−Ｉおよび／あるいはＨＩＶ−２の感染を減少させる、デコイ合成オリゴヌクレオチド鎖と合成オリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ共受容体に対抗するＨＩＶ  ＲＲＥおよび／あるいはＴＡＲデコイ鎖を含むベクター。
【請求項１０】
ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ連鎖を含む合成オリゴヌクレオチドの請求項９のベクター。
【請求項１１】
合成オリゴヌクレオチドの組み合わせを含む請求項９のベクター。
【請求項１２】
ウィルスベクターである請求項９のベクター。
【請求項１３】
ＨＩＶ酵素も標的とする合成オリゴヌクレオチドの請求項９のベクター。
【請求項１４】
標的細胞においてプロモータ活性によって操作された合成オリゴヌクレオチドの請求項９のベクター。
【請求項１５】
合成オリゴヌクレオチドがＥＦ−Ｉ  ａｌｐｈａプロモータによって操作される請求項９のベクター。
【請求項１６】
抗生たんぱく質または蛍光性たんぱく質を符号化するようなマーカー遺伝子を含む、請求項９のベクター。
【請求項１７】
ＩＩＩＶ−Ｉおよび／あるいはＨ１Ｖ−２感染を減少させ、デコイ鎖がＨＩＶ−Ｉ  とＨＩＶ−２デコイ連鎖の組み合わせを表わすベクター。
【請求項１８】
合成オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ  またはｓｈＲＮＡ連鎖を含む請求項１７のベクター。
【請求項１９】
合成オリゴヌクレオチド鎖の組み合わせを含む請求項１７のベクター。
【請求項２０】
ベクターがウィルスベクターである請求項１７のベクター。
【請求項２１】
ＨＩＶ酵素を標的とする合成オリゴヌクレオチドの請求項１７のベクター。
【請求項２２】
標的細胞においてプロモータ活性によって操作された合成オリゴヌクレオチドの請求項１７のベクター。
【請求項２３】
合成オリゴヌクレオチドがＥＦ−Ｉ  ａｌｐｈａプロモータによって操作される請求項１７のベクター。
【請求項２４】
抗生たんぱく質また蛍光性たんぱく質を符号化するようなマーカー遺伝子を含む、請求項１７のベクター。
【請求項２５】
ＩＩＩＶ−Ｉ  および／あるいはＨ１Ｖ−２感染を減少させ、デコイ鎖がＨＩＶ−２  ＲＲＥ  ａｎｄ  ＨＩＶ−２  ＴＡＲ連鎖の組み合わせを表わすベクター。
【請求項２６】
合成オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ  あるいはｓｈＲＮＡ連鎖を含む請求項２５のベクター。
【請求項２７】
合成オリゴヌクレオチド鎖の組み合わせを含む請求項２５のベクター。
【請求項２８】
ベクターがウィルスベクターである請求項２５のベクター。
【請求項２９】
ＨＩＶ酵素を標的とする合成オリゴヌクレオチドの請求項２５のベクター。
【請求項３０】
標的細胞においてプロモータ活性によって操作された合成オリゴヌクレオチドの請求項２５のベクター。
【請求項３１】
合成オリゴヌクレオチドがＥＦ−Ｉ  ａｌｐｈａプロモータによって操作される請求項２５のベクター。．
【請求項３２】
抗生たんぱく質または蛍光性たんぱく質を符号化するようなマーカー遺伝子を含む、請求項２５のベクター。
【請求項３３】
ＨＩＶ−Ｉおよび／あるいはＨＩＶ−２の感染を減少させることのできる、ＨＩＶ共受容体、ＨＩＶ  ＲＲＥ、ＨＩＶ  ＴＡＲデコイ連鎖に直接対抗する合成オリゴヌクレオチドを含むベクター。
【請求項３４】
請求項３３のベクターは、合成オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ連鎖を含む。
【請求項３５】
合成オリゴヌクレオチド鎖の組み合わせを含む請求項３４のベクター。
【請求項３６】
ウィルスベクターである請求項３４のベクター。
【請求項３７】
ＨＩＶ酵素を標的とする合成オリゴヌクレオチドの請求項３４のベクター。
【請求項３８】
標的細胞においてプロモータ活性によって操作された合成オリゴヌクレオチドの請求項３４のベクター。
【請求項３９】
合成オリゴヌクレオチドがＥＦ−Ｉ  ａｌｐｈａプロモータによって操作される請求項３４のベクター。
【請求項４０】
抗生たんぱく質または蛍光性たんぱく質を符号化するようなマーカー遺伝子を含む、請求項３４のベクター。
【請求項４１】
ＨＩＶ−Ｉおよび／あるいはＨＩＶ−２の感染を減少させることのできる、ＨＩＶ共受容体や単一ＨＩＶ共受容体に直接対抗する合成オリゴヌクレオチドを含むベクター。
【請求項４２】
前記合成オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡあるいはｓｈＲＮＡ配列を含む請求項４１のベクター。
【請求項４３】
前記ベクターは合成オリゴヌクレオチド分類の組み合わせを含む請求項４１のベクター。
【請求項４４】
前ベクターがウイルスベクターである請求項４１のベクター。
【請求項４５】
前記合成オリゴヌクレオチドは、ＨＩＶの酵素のターゲットである請求項４１のベクター。
【請求項４６】
合成オリゴヌクレオチドのプロモーターの標的細胞に積極的で駆動される請求項４１のベクター。
【請求項４７】
合成オリゴヌクレオチドがＥＦ−Ｉアルファプロモータによって駆動される請求項４１のベクター。
【請求項４８】
前記ベクターが抗生物質抵抗たんぱく質あるいは蛍光たんぱく質を符号化するためのマーカー遺伝子などのマーカ遺伝子を含む請求項４１の方法。
【請求項４９】
ＣＸＣＲ４およびＣＣＲ５を含む請求項４９のＨＩＶコレセプタを標的とする合成ヌクレオチドを含むＨＩＶ−Ｉおよび／あるいはＨＩＶ−２感染を遅らせることができるベクター。
【請求項５０】
前記合成ヌクレオチドはｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡあるいはｓｈＲＮＡ配列を含む請求項４９のベクター。
【請求項５１】
前記ベクターは合成オリゴヌクレオチド分類の組み合わせを含む請求項４９のベクター。
【請求項５２】
前記ベクターはウイルスベクターである請求項４９のベクター。
【請求項５３】
前記合成オリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ酵素も標的とする請求項４９のベクター。
【請求項５４】
前記合成オリゴヌクレオチドは、前記標的細胞でアクティブなプロモーターによって駆動される請求項４９のベクター。
【請求項５５】
前記合成オリゴヌクレオチドはＥＦ−Ｉアルファプロモーターによって駆動される請求項４９のベクター。
【請求項５６】
前記ベクターは抗生物質耐性たんぱく質や蛍光たんぱく質を符号化するためのマーカー遺伝子などのマーカー遺伝子を含む請求項４９のベクター。
【請求項５７】
ＣＸＣＲ４およびＣＣＲ５を含む請求項４９のＨＩＶコレセプタを標的とする合成ヌクレオチドを含むＨＩＶ−Ｉおよび／あるいはＨＩＶ−２感染を遅らせることができるベクターであって、ＨＩＶコレセプタに対して指向される合成オリゴヌクレオチドがｍｉＲＮＡ配列であるベクター。
【請求項５８】
前記合成オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡあるいはｓｈＲＮΛ配列を含む請求項５７のベクター。
【請求項５９】
前記ベクターは、合成オリゴヌクレオチド分類の組み合わせを含む請求項５７のベクター。
【請求項６０】
前記ベクターは、ウイルスベクターである請求項５７のベクター。
【請求項６１】
前記合成オリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ酵素の標的でもある請求項５７のベクター。
【請求項６２】
前記合成オリゴヌクレオチドは、前記標的細胞でアクティブなプロモーターによって駆動される請求項５７のベクター。
【請求項６３】
前記合成オリゴヌクレオチドは、ＥＦ−Ｉアルファプロモーターによって駆動される請求項５７のベクター。
【請求項６４】
前記ベクターは抗生物質耐性たんぱく質や蛍光たんぱく質を符号化するためのマーカー遺伝子などのマーカー遺伝子を含む請求項５７のベクター。
【請求項６５】
デコイ合成ヌクレオチド配列およびＨＩＶコレセプタに対して指向される合成オリゴヌクレオチドを含むＨＩＶ−Ｉおよび／あるいはＨＩＶ−２感染を遅らせることができるベクターであって、ＨＩＶコレセプタに対して指向される合成オリゴヌクレオチドがｍｉＲＮＡ配列であるベクター。
【請求項６６】
前記合成オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡあるいはｓｈＲＮΛ配列を含む請求項６５のベクター。
【請求項６７】
前記ベクターは、合成オリゴヌクレオチド分類の組み合わせを含む請求項６５のベクター。
【請求項６８】
前記ベクターは、ウイルスベクターである請求項６５のベクター。
【請求項６９】
前記合成オリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ酵素の標的でもある請求項６５のベクター。
【請求項７０】
前記合成オリゴヌクレオチドは、前記標的細胞でアクティブなプロモーターによって駆動される請求項６５のベクター。
【請求項７１】
前記合成オリゴヌクレオチドは、ＥＦ−Ｉアルファプロモーターによって駆動される請求項６５のベクター。
【請求項７２】
前記ベクターは抗生物質耐性たんぱく質や蛍光たんぱく質を符号化するためのマーカー遺伝子などのマーカー遺伝子を含む請求項６５のベクター。
【請求項７３】
ＣＸＣＲ４に対して指向される複数のｍｉＲＮＡ配列と、ＣＣＲ５に対して指向される複数のｍｉＲＮＡ配列と、Ｉ１ＩＶ−２  ＲＲＥデコイ配列と、ＨＩＶ−２  ＦＡＲデコイ配列とを含み、前記ベクターがウイルスベクターであるベクター。
【請求項７４】
前記合成オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡあるいはｓｈＲＮΛ配列を含む請求項７３のベクター。
【請求項７５】
前記ベクターは、合成オリゴヌクレオチド分類の組み合わせを含む請求項７３のベクター。
【請求項７６】
前記ベクターは、ウイルスベクターである請求項７３のベクター。
【請求項７７】
前記合成オリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ酵素の標的でもある請求項７３のベクター。
【請求項７８】
前記合成オリゴヌクレオチドは、前記標的細胞でアクティブなプロモーターによって駆動される請求項７３のベクター。  
【請求項７９】
前記合成オリゴヌクレオチドは、ＥＦ−Ｉアルファプロモーターによって駆動される請求項７３のベクター。
【請求項８０】
前記ベクターは抗生物質耐性たんぱく質や蛍光たんぱく質を符号化するためのマーカー遺伝子などのマーカー遺伝子を含む請求項７３のベクター。
【請求項８１】
ＨＩＶ−２  ＲＲＥデコイ配列および／あるいはＨＩＶ−２  ＴＡＲ配列を含む免疫不全による感染を遅らせることができるベクター。
【請求項８２】
前記合成オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡあるいはｓｈＲＮΛ配列を含む請求項８１のベクター。
【請求項８３】
前記ベクターは、合成オリゴヌクレオチド分類の組み合わせを含む請求項８１のベクター。
【請求項８４】
前記ベクターは、ウイルスベクターである請求項８１のベクター。
【請求項８５】
前記合成オリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ酵素の標的でもある請求項８１のベクター。
【請求項８６】
前記合成オリゴヌクレオチドは、前記標的細胞でアクティブなプロモーターによって駆動される請求項８１のベクター。
【請求項８７】
前記合成オリゴヌクレオチドは、ＥＦ−Ｉアルファプロモーターによって駆動される請求項８１のベクター。
【請求項８８】
前記ベクターは抗生物質耐性たんぱく質や蛍光たんぱく質を符号化するためのマーカー遺伝子などのマーカー遺伝子を含む請求項８１のベクター。
【請求項８９】
患者の感染を改善するための方法であって、
１）免疫不全ウイルス感染を遅らせることができるベクターを生成するステップと、
２）臍帯血細胞、造血細胞、末梢血、骨髄、精原細胞、始原生殖細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、マクロファージ、Ｔ細胞の前駆細胞、マクロファージ単球前駆細胞、ＣＤの３４＋幹細胞あるいは前駆細胞および／または体外あるいは体内でＨＩＶ標的細胞に分化できる任意の細胞から選択される幹細胞あるいは前駆細胞をトランスフェクトするステップと、
３）トランスフェクトした細胞を患者の血液や骨髄に導入するステップとを含む方法。
【請求項９０】
前記幹／前駆細胞は、成長促進媒体で培養され、患者への循環に導入する前に前記細胞を拡張する請求項８９の方法。
【請求項９１】
マーカーたんぱく質の発現により、正常なトランスフェクションが監視される請求項８９の方法。
【請求項９２】
クレーム８９の方法は、選択された幹細胞／前駆細胞ドナーの臍帯血前駆細胞である、請求項８９の方法。
【請求項９３】
クレーム８９の方法は、選択された幹細胞／前駆細胞が自家末梢血の幹／前駆細胞である、請求項８９の方法。
【請求項９４】
前記選択された幹／前駆細胞が同系細胞から由来した、誘発した、あるいは再プログラミングされた多能性あるいは多能化幹細胞である請求項８９の方法。
【請求項９５】
患者のＨＩＶ感染を遅らせることができる方法であって、前記ウイルスベクターとを生成するステップと、前記ベクターから生成されたウイルスを患者の循環器に導入するステップとを含む方法。
【請求項９６】
デコイ合成オリゴヌクレオチド配列と、ＨＩＶコレセプタに対して指向された合成オリゴヌクレオチドとを含む免疫不全ウイルスによる感染を遅らせることができるベクターであって、前記デコイ配列は、ＨＩＶ−２  ＲＲＥデコイ配列および／あるいはＨＩＶ−２  ＦＡＲデコイ配列とを含み、前記ベクターは、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２配列に対して指向されたリボザイム配列を含むベクター。
【請求項９７】
デコイ合成オリゴヌクレオチド配列と、ＨＩＶコレセプタに対して指向された合成オリゴヌクレオチドとを含む免疫不全ウイルスによる感染を遅らせることができるベクターであって、前記デコイ配列は、ＨＩＶ−２  ＲＲＥデコイ配列および／あるいはＨＩＶ−２  ＦＡＲデコイ配列とを含み、前記デコイ配列は、Ｕ６プロモーターにより駆動されるベクター。
【請求項９８】
Ｓｏｘ２たんぱく質、Ｏｃｔ４たんぱく質、ＮＡＮＯＧたんぱく質、ＩＯＸＢ４たんぱく質、ＦＧＦたんぱく質、ＬＩＦ活性を有するたんぱく質、Ｎｏｔｃｈ活性を有するたんぱく質を符号化する配列から選択された配列を含む追加のヌクレオチド配列の他、哺乳類ｎｕｍｂたんぱく質の「長い」（ＲＲＲ挿入＋）アイソフォームを符号化するヌクレオチド配列を含む遺伝子ベクター。
【請求項９９】
前記ベクターは短いＮｕｍｂアイソフォームおよびＮｕｍｂｌｉｋｅを標的とする合成オリゴヌクレオチドを含む請求項９８のベクター。
【請求項１００】
哺乳類の長（ＰＲＲｉｎｓｅｒｔ＋）アイソフォームを符号化したヌクレオチド配列が、ナノ粒子の  Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｈｏｘｂ４、ＦＧＦ−  ４、ＬＩＦ、  ＬＩＦＲ、ＣＮＴＦ、オンコスタティン（ＯＳＭ）、オンコスタティン  受容体（ＯＳＭＲ）カーディオトロフィン−ｌ、ＩＬ−６、ＩＬ６Ｒ、  ｈｙｐｅｒ  ＩＬ−６、  ＩＬ−１  １、  ｇｐｌ３０、そして白血病抑制因子の活動を伴う他のたんぱく質や細胞表面の細胞表面のシグナル受容体遺伝子ファミリー（ノッチ）の活動のアークにより選り抜かれたヌクレオチド配列を含み付加されたヌクレオチド配列と同じくらいたんぱく質を鈍くするとする請求項９８のベクター。
【請求項１０１】
多能、多能性、及び／または選択した細胞から自己再生できる細胞を製造する方法は、以下のものを含む：骨髄、末梢血、胎盤の血液、羊水、臍帯血、皮膚、脂肪組織、非人間の胚細胞、造血細胞、精原細胞、精巣の始原生殖細胞、上皮細胞、白血球の循環、単球マクロファージ、その他の体細胞、遺伝子組み換え臍帯血細胞、遺伝子組み換え羊水中の幹細胞、遺伝子組み換え骨髄細胞、遺伝子組み換え末梢血細胞、遺伝子組み換えの皮膚細胞、遺伝子組み換え精原細胞、遺伝子組み換え精巣の始原生殖細胞、遺伝子組み換え末梢血の幹細胞、遺伝子組み換え上皮細胞、遺伝子組み換え白血球、遺伝子組み換え非人間の胚細胞、その他の遺伝子組み換え幹細胞／前駆細胞と体細胞からなる体細胞の種類と幹細胞／前駆細胞のグループから細胞を選択する；ノッチ活性を有する蛋白質とＬＩＦ活性を有する蛋白質、ＦＧＦ４蛋白質、Ｈ０ＸＢ４蛋白質、ＮＡＮＯＧ蛋白質、Ｏｃｔ４蛋白質、Ｓｏｘ２蛋白質をエンコーディングするヌクレオチド配列から選択した追加のヌクレオチド配列と哺乳類の蛋白質のアイソフォーム”ｌｏｎｇ”  （ＰＲＲ  ｉｎｓｅｒｔ  ＋）をエンコーディングするヌクレオチド配列を有する選択した細胞をトランスフェクションする；ＦｉＧＦ，  ｂＦＧＦ，  ＬＩＦ，  鋼因子、１１−６，  ｈｙｐｅｒ  ＩＬ−６，  ＩＬ−７，  オンコスタチン−Ｍ，  ｃａｒｄｉｏｔｒｏｐｈｉｎ−１、その他の成長率を高めるサイトカインから選択したサイトカインを構成する成長培地に選択した細胞を決まった率で拡大し成長させる；前記率は前記成長培地に選択した細胞の時間の２倍から決定される；そして目的の細胞数になるまで、前記培養条件下で細胞を維持する。
【請求項１０２】
成熟したメディアが遺伝子を超えた発現を誘導するために誘引剤をさらに構成するとする、請求項１０１の方法。
【請求項１０３】
体内でさらなる分化が可能な必要な分化細胞集団を提供する方法であって、前記必要な細胞は、分化造血細胞、神経細胞、ドーパミン系の細胞、セロトニン系の細胞、コリン作用性の細胞、ノルアドレナリン作用性の細胞、ＧＡＢＡ作動性の細胞、筋細胞、心筋細胞、内胚葉と膵臓ランゲルハンス島の細胞、細菌細胞、骨髄あるいはその他の必要な細胞を含む方法であって、骨髄、末梢血、胎盤の血液、羊水、臍帯血、皮膚、脂肪組織、非人間胚細胞、造血細胞精原細胞、精巣、上皮細胞の始原生殖細胞、循環白血球、単球マクロファージ、その他の体細胞、遺伝子組み換え臍帯血細胞、遺伝子組み換え羊水幹細胞、遺伝子組み換え骨髄細胞、遺伝子組み換え末梢血細胞、遺伝子組み換え脂肪細胞、遺伝子組み換え胎盤細胞、遺伝子組み換え造血細胞、遺伝子組み換え皮膚細胞、遺伝子組み換え精原細胞、遺伝子組み換え始原生殖細胞、遺伝子組み換え末梢血幹細胞、変更遺伝子組み換え上皮細胞、遺伝子組み換え白血球、遺伝子組み換え非人間胚細胞、その他の遺伝子組み換え幹／前駆細胞および体細胞の集団から細胞を選択し、選択された細胞を提供するステップと、
Ｓｏｘ２たんぱく質、Ｏｃｔ４たんぱく質、ＮＡＧＯＮたんぱく質、ＨＯＸＢ４たんぱく質、ＦＧＦ４たんぱく質、ＬＩＦ活性を有するたんぱく質、Ｎｏｔｃｈ活性を有するたんぱく質を符号化する配列から選択された配列を含む付加されたヌクレオチド配列の他、哺乳類のｎｕｍｂたんぱく質の「長い」（ＰＲＲ  挿入＋）アイソフォーム  を符号化するヌクレオチド配列で前記細胞をトランスフェクトするステップと、
前記選択された細胞を第１の成長速度で成長させるための成長媒体で前記選択された細胞を成長させるステップであって、前記第１の成長速度は前記成長培養媒体内で前記選択された細胞の２倍の時間から決定されるステップと、
目的の細胞数を達成するまで、成長培養媒体で前記細胞を維持するステップと、
前記選択された細胞を分化媒体の中で第２の成長時間で成長させるよう、前記分化媒体で前記選択された細胞を培養するステップであって、前記第２の成長速度は、前記成長培養媒体内で前記選択された細胞の２倍の時間から決定される、前記第２の成長速度は前記第１の成長速度の１０％から９０％の間で決定されるステップとを含み、
前記分化媒体は、分化あるいは前記選択された細胞を前記必要な分化細胞への変更を促進する上で効果的な少なくとも１つの分化促進剤を含み、
前記分化促進剤はレチノイン酸、神経成長因子、ジメチルスルホキシド、エキサメタジムアクリルアミド、前記必要な細胞型に適切なその他の分化促進剤からなる集団から選択される方法。
【請求項１０４】
請求項１０３の方法であって、
ｉ）ヌクレオチド配列と共に行われる核酸移入、特に転写調節因子はある細胞を望まれる細胞への分化を促すステップと、
ｉｉ）細胞をヌクレオチド配列と共に最も短い（Ｐｒｒ−／ＰＴＢ−）へ核酸移入することはアイソフォームを和らげるステップと、
ｉｉｉ）ＰＲＲ＋Ｎｕｍｂアイソフォームを標的にした合成オリゴヌクレオチド鎖により細胞を核酸移入するステップとを含む方法。
【請求項１０５】
望まれる細胞が心筋細胞であり、その細胞がＤＭＳＯやＮＢＳ、レチノ酸、またはオルカディオミオサイドを含む分化媒介物の中で培養されるとする、請求項１０３の方法。
【請求項１０６】
望まれる細胞が神経細胞であり、その細胞が神経成長因子やレチノイン酸から選択された分化作用物質を含む分化培養物の中で培養されるとする、請求項１０３の方法。
【請求項１０７】
望まれる細胞が筋細胞であり、その筋細胞がエキサメタジムアクリルアミド、またはジメチルスルホキシドから選択された分化作用物質を含む分化培養物の中で培養されるとする、請求項１０３の方法。
【請求項１０８】
体内でさらなる分化が可能な必要な細胞集団を提供する方法であって、
骨髄、末梢血、胎盤の血液、羊水、臍帯血、皮膚、脂肪組織、非人間胚細胞、造血細胞精原細胞、精巣、上皮細胞の始原生殖細胞、循環白血球、単球マクロファージ、その他の体細胞、遺伝子組み換え臍帯血細胞、遺伝子組み換え羊水幹細胞、遺伝子組み換え骨髄細胞、遺伝子組み換え末梢血細胞、遺伝子組み換え脂肪細胞、遺伝子組み換え胎盤細胞、遺伝子組み換え造血細胞、遺伝子組み換え皮膚細胞、遺伝子組み換え精原細胞、遺伝子組み換え始原生殖細胞、遺伝子組み換え末梢血幹細胞、変更遺伝子組み換え上皮細胞、遺伝子組み換え白血球、遺伝子組み換え非人間胚細胞、遺伝子組み換えその他の幹／前駆細胞および体細胞から由来する細胞などの幹／前駆細胞および体細胞型の集団から細胞を選択し、選択した細胞を提供するステップと、
目的の細胞数を達成するまで、成長培養媒体で前記細胞を維持するステップと、
前記細胞をヌクレオチド配列、特に転写因子でトランスフェクトするステップと、前記細胞の必要な細胞への分化開始を促進するステップと、
細胞を最も短い（Ｐｒｒ−／ＰＴＢ−）  ＮｕｍｂアイソフォームあるいはＮｕｍｂｌｉｋｅを符号化するヌクレオチド配列と共にトランスフェクトするステップと、
分化培養物の中で、少なくとも１つの効果的な分化作用物質が選択された細胞を望まれる分化をした細胞に、分化や改造培養されるよう促進するとされる培養するステップを含み、
分化作用物質はレチノインや神経成長因子、ジメチルスルホキシド、エキサメタジムアクリルアミド、または望まれる細胞タイプと同じくらい適した他の分化作用物質である方法。
【請求項１０９】
細胞が、最も短い（Ｐｒｒ−／ＰＴＢ−）  Ｎｕｍｂアイソフォームが符号化したヌクレオチド配列と共に培養されないとする請求項１０８の方法。
【請求項１１０】
望まれる細胞が筋細胞であり、その細胞が骨格筋細胞、平滑筋、心筋であるか否かに依存するＭｙｏＤ，ミオゲニン、ミオカルディン、Ｍｙｆ５、Ｍｙｆ６、Ｍｅｆ２Ａ、Ｇａｔａ５、Ｇａｔａ６を含む転写調整因子と共に培養されるとする請求項１０８の方法。
【請求項１１１】
ドーパミン作動性の神経が望む細胞であり、その細胞が分化培養物の中で培養されるために、Ｍａｓｈ１ｙａＮｇｎ２、Ｌｍｘｌｂ、またはＰｔｘ３を含む転写調整因子と共に核酸移入するとする請求項１０８の方法。
【請求項１１２】
セロトニン作用性の神経が望む細胞であり、その細胞が分化培養物の中で培養されるために転写調整因子と共に核酸移入されるとする請求項１０８の方法。
【請求項１１３】
Ｍａｓｈｌ、  Ｐｈｏｘ２ｂ、  Ｌｍｘｌｂ、Ｎｋｘ２．２、  Ｇａｔａ２、Ｇａｔａ３  、Ｐｅｔｌ  を含む転写調節因子請求項１１２の方法。
【請求項１１４】
コリン作用性の神経が望む細胞であり、その細胞が分化培養物の中で培養されるために、ＭＡＳＨｌ、  Ｐｈｏｘ２ａ  またＲＥＳＴ４を含む転写調節因子とともに培養されるとする請求項１０８の方法。
【請求項１１５】
ＧＡＢＡ神経が望む細胞であり、その細胞がＬｌＦ、ＮＴ３、ＮＧＦを引き起こす分化培養物の中で培養されるために、ＭＡＳＨｌ、Ｐｈｏｘ２ａ、ＲＥＳＴ４を含む転写調節因子とともに培養されるとする請求項１０８の方法。
【請求項１１６】
ノルアドレナリン神経が望む細胞であり、その細胞が分化培養物の中で培養されるために、Ｍａｓｈｌ、ｄｌＩ（ＨＡＮＤ２）、Ｐｈｏｘ２ａ、Ｐｈｏｘ２ｂ、Ｇａｔａ２  またＧａｔａ３を含む転写調節因子とともに培養されるとする請求項１０８の方法。
【請求項１１７】
ＧＡＢＡ神経が望む細胞であり、その細胞が分化培養物の中で培養されるために、ＰＩＴＸ２、Ｄｌｘ２、Ｄｌｘ５、Ｈｅｓ１をターゲットとするＲＮＡ  を含む転写調節因子とともに培養されるとする請求項１０８の方法。
【請求項１１８】
ノルアドレナリン神経が望む細胞であり、その細胞が分化培養物の中で培養されるために、Ｍａｓｈｌ、ｄｌＩ（ＨＡＮＤ２）、  Ｐｈｏｘ２ａ、Ｐｈｏｘ２ｂ。Ｇａｔａ２またＧａｔａ３を含む転写調節因子とともに培養されるとする請求項１０８の方法。
【請求項１１９】
膵臓ランゲルハンス島細胞、または内胚葉細胞が望む細胞であり、選択された細胞はＦｏｘａ２、Ｓｏｘｌ７、ＨＬＸＢ９またＰｄｘｌを含む転写調節因子と共に核酸移入する。そして付加された分化作用因子はソディウム酪酸、アクチビンＡ、レチノイン酸、上皮細胞成長因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、ノギン、インスリン様成長因子ＩＩ、ニコチンアミドから選ばれるとする請求項１０８の方法。
【請求項１２０】
必要な細胞は造血細胞であり、前記細胞はＲｕｎｘｌ／ＡＭＬｌを符号化するヌクレオチド配列とにトランスフェクトされ、分化分化作用因子は、必要な細胞型に適したＶＥＧＦ、血小板産生因子、コロニー刺激因子から選択される請求項１０８の方法。
【請求項１２１】
腹部機関や筋組織、心臓、中枢神経、血液、他の組織の不調を患っていて、治療が必要な患者に処置する方法であって、
祖先／種族の細胞と骨髄や末梢神経、胎盤の血液、羊水、臍帯血、肌、脂肪細胞、ヒト以外の胎芽、造血細胞、精原細胞、精巣の原始細胞、上皮細胞、循環白血球、単球マクロファージ、他の体細胞、そして遺伝子的に改造された骨髄や末梢神経、胎盤の血液、羊水、臍帯血、肌、脂肪細胞、ヒト以外の胎芽、造血細胞、精原細胞、精巣の原始細胞、上皮細胞、循環白血球、単球マクロファージから抽出された体細胞細胞を選択するステップと、
細胞が哺乳類の長（ＰＲＲ  ｉｎｓｅｒｔ  −＋）アイソフォームと共に起こる核酸移入は、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｈｏｘｂ４、ＦＧＦ−４、ＬＩＦ、ＬＩＦＲ、ＣＮＴＦ、オンコスタティンを含む付加されたヌクレオチド配列と同じくらいたんぱく質を和らげるステップと、
選択されだ細胞が最初の成長率で育ち、分化培養物の中で培養するステップと、
核酸移入は効果的な分化培養物の中で育つ選択された細胞は、その倍の成長率で成長させるステップと、成長媒介物と呼ばれる効果的な分化は、選択された細胞の２倍の時間と決められている成長率を伸ばす、というような効果的な成長過程で細胞を発達させるステップと、
そして望む個体数を獲得するまでこの環境で細胞を保存するステップと、
選択された細胞は異なる媒介物の中で第２の成長率で成長し、成長率は選択された細胞の２倍の時間がかかるとされており、第２の成長率は１０％から９０％の間の成長率であり、
このような効果的な発達過程で細胞を発達させるステップと、
分化作用物質は、レチノイン酸や神経成長因子、ジメチルスルホキシド、エキサメタジムアクリルアミド、他の望む細胞タイプに適した誘導体からなるステップを含む方法。。
【請求項１２２】
請求項１２１に記載の方法であって、
望まれる細胞へと分化させるよう促すヌクレオチド配列、特に転写調節因子と共に細胞を核酸移入させるステップと。
そして細胞を最も短い（Ｐｒｒ−／ＰＴＢ−）  ＮｕｍｂまたはＰＲＲ＋  ｎｕｍｂアイソフォームを符号化したヌクレオチド配列と共に核酸移入させるステップとを更に含む方法。
【請求項１２３】
選択された細胞は望まれる細胞の個体数を獲得した後に成長媒体から分離され、患者の循環組織、神経組織、他の細胞に注入されるとする請求項１２１の方法。
【請求項１２４】
（Ｐｒｒ＋）  ｎｕｍｂアイソフォーム、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ノッチ導入遺伝子、Ｈｏｘｂ４，ＦＧＦ−４、ＬＩＦ、ＬＩＦＲ、ＣＮＴＦを含む核酸、オンコスタティン、オンコスタティン受動体、心臓毒、ＩＬ−６、ＩＬ６Ｒ、ｈｙｐｅｒ  ＩＬ−６、Ｌ−１１、ｇｐｌ３０を含むたんぱく質が、選択された細胞へと導入され、自己再生、多能、多能性細胞の集団を獲得する方法。
【請求項１２５】
請求項１２４に記載の方法であって、前記トランスフェクション方法がは、電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいはレトロウィルス／レンチウィルスの統合を避ける別の方法、あるいは、または細胞遺伝子の恣意的な変質である方法。
【請求項１２６】
自己再生、多能、多能性細胞の集団を獲得する方法であって、単一の遺伝子あるいはその一部に対応する核酸あるいはたんぱく質が過剰発言あるいは誘発され、選択された細胞となる方法であって、これらの核酸あるいはたんぱく質が長（Ｐｒｒ＋）  Ｎｕｍｂアイソフォーム、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｎｏｔｃｈ活動を有するトランス遺伝子、Ｈｏｘｂ４、ＦＧＦ−４、  ＬＩＦ、  ＬＩＦＲ、  ＣＮＴＦ、ＯＳＭ、  ＯＳＭＲ、カーディオトロフィン−１  、  ＩＬ−６、ＩＬ６Ｒ、ｈｙｐｅｒ  ＩＬ−６、  ＩＬ−１  １、  ｇｐｌ３０を符号化する核酸あるいはたんぱく質から選択された１つに対応する方法。
【請求項１２７】
核酸移入の方法の利用は、電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいはレトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、または細胞遺伝子のランダムな変質である請求項１２１の方法。
【請求項１２８】
組織を作ることを目的とし、遺伝子的に発生させた自己再生、多能、多能化および／あるいは分化細胞を３次元または２次元で構成される請求項１２１の方法。
【請求項１２９】
組織を作ることを目的とし、遺伝子的に自己再生、多能、多能化細胞、または分化した細胞は、細胞膜形成器官か細胞膜形成組織が培養されるとする請求項１２１の方法。
【請求項１３０】
組織を作ることを目的とし、遺伝子的に自己再生、多能、多能性、またくは分化した細胞はインクジェット印刷の技術と合わせ利用するとする請求項１２１の方法。
【請求項１３１】
組織を作ることを目的とし、遺伝子的に自己再生、多能、多能化細胞、または分化した細胞は懸滴で分化されるとする請求項１２１の方法。
【請求項１３２】
神経細胞は遺伝子的に引き起こされる自己再生、多能、多能化細胞を供給するとする請求項１２１の方法。
【請求項１３３】
核酸は自己再生、多能、多能性細胞を低下させ、その配列は電気穿孔法、ナノカプセルまたナノヴォールトを利用して選択された細胞を促進させるとする請求項１２１の方法。
【請求項１３４】
自己再生、多能、多能性細胞を低下させる能力のために核酸をスクリーニングし、その配列が電気穿孔法、ナノカプセル、ナノヴォールトを利用して選択されだ細胞を促進させる分化を始めるとする請求項１０８の方法。
【請求項１３１】
分化細胞が所望され、所望な分化細胞中に通常存在する一つまたは一つより多い転写因子に対応する核酸またはタンパク質の過剰発現または導入による、遺伝子賛成、自己再生、多能、および／または多能性細胞から産生される、請求項１２１の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本国内段階での出願（35 U.S.C. § 371）は、国際出願PCT/US2008/065007（35
USC §120）（2008年5月29日出願）の継続であり、35 U.S.C. §119での米国仮出願60/932,020号（35 U.S.C. §119）（2007年5月29日出願）、米国仮出願60/933,133号（2007年6月5日出願）、米国仮出願60/933,670号（2007年6月8日出願）、米国仮出願61/006,449号（2008年1月14日出願）、米国仮出願61/064,761号（2008年3月25日出願）における利益を請求するものであり、各出願における内容全体は参考として本明細書に記載する。
【背景技術】
【０００２】
21世紀の医療における優れた挑戦は、損傷し擦り切れまたは遺伝子学的に損なわれた細胞を、再生するまでになっている。DNAへ明確に結ばれる転写調節因子は、遺伝子発現の調節において重要な役割をなしている。それは各細胞において転写調節因子の補完物であり、どの細胞プログラムが活性化され、どれが消去されているかを決定するものである。この機能で転写調節因子は、細胞の同一性を決定・維持し、同様に細胞の脆弱性を決定する役割がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
（発明の要約）
まだ多能化されず自己再生できない細胞から、増殖し自己再生し、多能で多能化できる細胞集団を得る能力は、細胞療法を利用する全ての分野において明らかに有益なものであろう。骨髄移植、輸血、遺伝子療法を含むこれらの分野により、患者独自の幹細胞や、その他望まれる種類の細胞の生成が可能になる。同様に、神経、筋肉、その他の様々な細胞集団への分化を始める能力は、医療や動物を含む商業面の過程にとって大きな価値を生むであろう。それに応じて本発明は、遺伝子生成、多能な細胞集団の利用、多能性の細胞集団の利用、神経細胞集団の利用、筋細胞集団の利用、またHIV耐性細胞のような他の望まれる細胞集団の利用の方法を提供する。
【０００４】
本発明の請求は、単独もしくは（Notch、NumbNumblikeなど）他の細胞運命デターミナントとの組み合わせによって、一時的（多能、多能性、自己再生可能）で（分化されたまたは肉体）細胞の遺伝子表現型の調整を可能にする相互転換する、特定の転写調節因子の有効的な介入または過剰発現についてである。
【０００５】
信頼できる遺伝子表現型の確実な転換や細胞の再プログラムの能力により、個々の患者に適応した幹細胞、代替細胞、組織、器官の生成が可能になる。
【０００６】
遺伝子治療技術や細胞培養技術に合わせて、細胞タイプの相互交換は、移植に適応できる、疾患に耐性があり、遺伝子学的に修復された細胞を生成することもできる。
【０００７】
本発明の目的は、増殖でき、自己再生可能で、多能および／あるいは多能性の細胞集団だけでなく、他の望まれる細胞集団を生成する方法を、癌遺伝子を使わずに分化した細胞または分化していない細胞から提供することである。分化した細胞集団は、特定に分類された細胞タイプと関連する全てのマーカーではないが、いくつかのマーカーを発現する細胞から成る。ここで述べられているように、適切な麻痺した、他の導入遺伝子（特に転写調整因子）との組み合わせによって発現するアイソフォームは、分化した、多能化した細胞集団または分化している細胞集団の生成を可能にする。さらに本発明における遺伝子ベクターは、遺伝子組み換えや(例：患者で遺伝子産物の不足が発現)、一時的もしくは永久的に増殖でき、自己再生でき、幹細胞や前駆細胞を生成するために使われ、それらの細胞は、生体内において内在性の細胞で作用し、普通ではこのような作用は見せない組織の中で発見されたものである。最後に、本発明における他の遺伝子ベクターは、（癌細胞など）異常な作用を見せる細胞で、遺伝子組み換えを行いおよび／あるいは増殖し、自己再生でき、または幹細胞／前駆細胞を防ぐのに用いられる。病気の過程を和らげるのを予想する、オリゴヌクレオチド鎖の発現を可能にする、治療上のベクターや細胞を生成することも本発明の目的である。例えば本発明では、有害なHIV遺伝子の発現を減少させ、他の免疫不全ウィルス感染、発現また拡大を防ぐ合成オリゴヌクレオチドの利用方法を明らかにする。
【０００８】
本発明は脊椎動物の細胞ならびに魚類、哺乳類、鳥類、両性類、爬虫類の細胞など、いかなる適した細胞にも利用できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】は、例13のベクター連鎖を図式化したベクターマップを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
（発明の詳細な説明）
全ての特許、特許出願、ならびに本出願書で引用された出版物は、そのまま参照し本論に引用されている。ここで論じられているように、「DNA」はデオキシリボ核酸を表わし、「RNA」はリボ核酸を表わす。ここで書かれている、「ｃDNA」は補足DNAを意味し、「ｍRNA」はメッセンジャーRNAを表わす。
【００１１】
「siRNA」は小妨害RNAを表わし、「shRNA」は小U字型RNAを表わす。「miRNA」は、単一ストランドRNA分子や、特に約20から30の原子核を持ち遺伝子の発現を規制する可能性があるマイクロRNAを表わす。（「decoy」「decoyRNA」ならびに「RNAdecoy」は、リガンドの自然に束ねられた形に良く似たRNA分子を表わす）
ここで記されたように「ameliorating（改善する）」は影響を減らし、損傷を少なくすることを意味する。それは例えば、疾患による有害な影響や状態を減らすことのように、動き、活動または機能などの衝撃を最小にすることを意味する。
【００１２】
ここで記されたように、「retarding（遅らせる」は影響または動きの進行を緩め減少させることを意味する。それは例えば、病気の進行を緩めたり、感染率を低下させたり、疾患または症状の経過あるいは進行を低下させるように作用することである。
【００１３】
ここで記されているように、「誘発剤」は動きを促進するための唯一の効果的な作用である。例えば、活動を誘引し増進させることによりプロモータに作用し、またプロモータの統制のもと遺伝子発現に影響する外生の作用物質は誘発剤と称されるだろう。例えば、テトラサイクリンは誘発剤として使われ、ドキシサイクリンも誘発剤として使われるであろう。
【００１４】
核酸鎖（ポリペプチドを符号化する核酸鎖など）は、第1の核酸鎖が第2の核酸鎖と機能的な関係のもとに配置された時に、他の核酸鎖（プロモータなど）に対して「実効的に関連する」と言われている。例えば、もし符号化された連鎖の転写または発現に、プロモータが影響を与えたら、プロモータは符号化された連鎖に実効的に関連するということである。ここで記されているように「操作される」という言葉は、遺伝子や符号化された連鎖がプロモータ連鎖に実効的に関連し、プロモータ連鎖が符号化された連鎖の転写または発現に影響を与えることを意味する。
【００１５】
ここで記されているように、「マーカー」は、探知できまたは探知できる分子の符号またはマーカーの存在を探知できる分子のことである。「マーカー・たんぱく質」あるいは「マーカー・ポリペプチド」は、研究室やクリニックにおいて探知でき、実施例において可視できる、たんぱく質あるいはポリペプチドのことである。「マーカー遺伝子」は、マーカー・たんぱく質またはマーカー・ポリペプチドを符号化するものである。
【００１６】
ここで記されているように、「HIV」はヒト免疫不全ウィルスのことを表わし、
例えば変異のHlV-I、HIV-2を含む。他の免疫不全ウィルスとしては、SIV（サル免疫不全ウィルス）やFIV（ネコ免疫不全ウィルス）などがある。HIVに関連する酵素は「HIV酵素」と呼ばれることもでき、例えばインテグラーゼ、プロテアーゼ、逆転写酵素、TAT（転写促進調節たんぱく質）などを含む。HIVによる感染は、「HIV受容体」と呼ばれる受容体が関わっていると考えられている。「HIV共受容体」として名づけられている複数の受容体があるであろう。ここで記されているように、「HIV共受容体」にはCXCR4やCCR5などがある。
【００１７】
本発明における理論上の論拠はここに記されているが、この議論は本発明を否定し制限するものではない。ここで記されている技術は、本発明の理論上の支持をするか否かを問わず、多くに利用されているものである。
【００１８】
実施の形態としては、細胞は、a)増殖しで多能でまた多能性の細胞集団を繁殖させ、b)神経細胞の集団、c)筋細胞、d)および／あるいは他の望まれる細胞集団を生成する目的で、アプローチしやすく分裂しているまたは分裂していない細胞集団から選択される。更に、生体外、生体内、および／あるいは生体内で組織に適切な、または部位で適切な一層の分化ができる。
【００１９】
本発明に用いられた選択された細胞の根源：選択された細胞は、本発明において利用可能であるすべての細胞を含んでいてもよい。本発明に使われた細胞（ここでは「選択された細胞」という）は、患者の内生的な細胞に由来し、他の器官システムから分化した細胞、または外生の根源から分化したもの（細胞株からの分化、低温保存された根源、貯蔵された根源、移植源を含む）である。細胞は、合成あるいは天然の核酸鎖と遺伝子組み換えされたものから選択されることもあるる。ここで使用されている「選択された細胞」とは、ヒト胎幹細胞は含まない。
【００２０】
本発明においては健康な組織を侵襲的に害することなく行う目的で、選択された細胞は容易に採取することができ(例：末梢血白血球、循環造血幹細胞、上皮細胞)、(例：口頬細胞(例：Michalczyk et al, 2004))、脂肪組織(例：Gimbleet al., 2007; Ma et al., 2007)、臍帯血液細胞(例：Zhao, et al., 2006; Tian et al., 2007)、など)を利用した。しかしながら骨髄幹細胞、精原細胞(例：Guanel al., 2006; Takahashi et al., 2007)、始原生殖細胞(PGC)、羊膜から分離した幹細胞(例：Ilancheran etal., 2007)、羊水 (例：De Coppi et al., 2007)、同様に皮膚から分離した細胞(例：Tumbar, 2006; Dunnwaldet al., 2001 ; Szudal'tseva et al., 2007)などは、本発明においても利用された。このような細胞は、この研究手法にてよく知られている組織から分離することができる。
【００２１】
精原細胞の酵素消化パーコール分離後のステップ2を使用して分離することができる。細胞を最小必須培地（MEM）のに再懸濁することができる106/mLの最終濃度にウシ血清アルブミンを補充。具体的には：尿細管の断片手術でアクセスされ、離れて前に治療に1ミリグラム/mlのトリプシン、ヒアルロニダーゼ、およびコラゲナーゼとからかわれるし、1ミリグラム/ mlのヒアルロニダーゼとコラゲナーゼは、MEMでの0.10％炭酸水素ナトリウム、4mM L -グルタミンを含む非必須アミノ酸、40マイクログラム/ mlのゲンタマイシン、100 KJ 100マイクログラム/ mlのペニシリンストレプトマイシン、および15mMのHEPES。精原細胞をさらに尿細管の断片から30倍の重力で遠心分離によって区切られている。 77ナイロンフィルタ - および/または55 - ミクロンの孔径を介してろ過した後、細胞を収集され、不連続パーコール密度勾配上にロードされる。純度の高い40％以上前駆/幹細胞/精原細胞を洗浄して、細胞と同等の濃度に10前駆細胞を再懸濁/幹細胞/ ml当たり精原細胞と分数。その後、細胞を培養すると/または任意の凍結保存技術は、芸術に知られて格納される。
【００２２】
精原細胞は二段階の酵素吸収に続くパーコール分化方法により分離できる。そして、これら細胞は106/mL の終末濃度までウシの血清アルブミンを補足した最小必須培養液（MEM）によって再懸濁される。具体的には：
選択された細胞は遺伝子組み換え細胞で、特に治療法または商業的に有利なデオキシリボ酸（DNA）またはリボ核酸（RNA）鎖を符号化するためこの研究手法にてよく知られている技術で遺伝子組み換えされた。
【００２３】
本発明の一つの側面によれば、選択された細胞から望まれる細胞集団を生成する方法がある(例：多能性、 神経、筋肉、など)。
【００２４】
多能で多能性および／あるいは自己再生可能な細胞集団の生成
増殖し自己再生できる多能性の細胞集団を、得るために、選択された細胞および／あるいはその結果である集団は、哺乳類の麻痺した遺伝子の「長」 (PRR insert +) アイソフォームを符号化するものを含むヌクレオチド配列によって核酸を入れられる。それとほぼ同時に選択された細胞は、短く麻痺したまたは麻痺したようなアイソフォームとを標的にした合成オリゴヌクレオチドによって核酸移入され、それから最適の成長速度で選択された細胞を成長させる環境下で培養される。選択された細胞はこのような環境下において、望まれる細胞数に達するまで保管される。細胞はLIF、鉄因子および／あるいは 11-6、hyper 1L-6、 IL-7、-オンコスタティンM および／あるいはカーディオトロフィン-1と等しい効力の濃度によって培養され得られた（最適な）成長速度、もしくは他のサイトカインを減少させる転写遺伝子の存在(例：多能性細胞を培養する条件、例： Guan et al., 2006)によって得られた成長速度によって培養された。成長速度は、培地によって2倍にされた細胞数によって決定される。同様に、米国特許6432711 と 5453357にある培養環境は、長(PRR+) Numbアイソフォームによって核酸が入れられた細胞の繁殖や拡大に最適な成長速度を与えられる。他の望まれるプロコトルやサイトカイン濃度は、（Koshimizuet al., 1996; Keller et al., 1996; Piquet-Pellorce, 1994; Rose et al., 1994;Park and Han, 2000; Guan et al., 2006; Dykstra et al., 2006; Zhang et al.,2007)に従った。しかしながら、本発明の実験は、これら技術の詳細に制限されない。
【００２５】
一つの好適な実施例において、選択された細胞は標準的な培地において培養された(例：補完が有るまたは無い最少必須培養(例：グルタミン、ベータ・ メルカプトエタノール)。培地は、基本的な繊維芽細胞成長因子bFGF、鉄因子、白血病抑制因子LIFおよび／あるいはLIF活性がある因子(例：LIF、LIF受容体(LIFR)、 繊毛状神経栄養因子(CNTF)、 オンコスタティン M (OSM)、 OSM 受容体(OSMR)、 カーディオトロフィン、 IL-6、hyper IL-6、GP 130インターロイキン、その他(IL))、ウマの血清を含む。LIFのみではなくLIF活性がある因子は、細胞の自発的な分化を防止する。このような環境下で、PRR+Numb アイソフォームとその結果である集団によって核酸を入れられた選択された細胞は、多能、多能性および／あるいは自己再生能力を得ることが期待されている。
【００２６】
一つの好適な実施例において、選択された細胞および／あるいはその結果である集団は、「長」 (PRR insert +) Numb アイソフォームを符号化するヌクレオチド鎖のみならず、他の導入遺伝子を符号化する鎖によって核酸に入れられる。これら導入遺伝子の多くは、NCBI連鎖データベースに、それぞれの識別番号に基づいて挙げられる。
【００２７】
別の好適な実施例において、選択された細胞および／あるいはその結果である細胞は、他の導入遺伝子を符号化する連鎖と同様に、「長」(PRR insert +) Numb アイソフォームを符号化するヌクレオチド鎖によって核酸を入れられる。これらの導入遺伝子の多くは、それぞれの識別（取得）番号（コード）に基づいてNCBI連鎖データベースに分類される。一つの好適な実施例において、選択された細胞やその結果である細胞は、LIFなどの他の導入遺伝子を符号化する連鎖と同様に、連鎖を符号化する長(PRR+)Numbアイソフォームによって核酸に入れられる。
【００２８】
一つの好適な実施例において、LIF活性を含む他の導入遺伝子の符号化された連鎖と同様に、長(PRR+) Numb アイソフォームによって連鎖を符号化して、選択された細胞および／あるいはその結果である細胞は核酸を入れられる。一つの好適な実施例において、LIFRを含む他の導入遺伝子の符号化された連鎖と同様に、長(PRR+)Numb アイソフォームによって連鎖を符号化して、選択された細胞および／あるいはその結果である細胞は核酸が入れられる。
【００２９】
一つの好適な実施例において、オンコンスタティンM（OSM）を含む他の導入遺伝子の符号化された連鎖と同様に、長(PRR+) Numb アイソフォームによって連鎖を符号化して、選択された細胞および／あるいはその結果である細胞は核酸が入れられる。
【００３０】
一つの好適な実施例において、オンコンスタティンM受容体（OSMR）を含む他の導入遺伝子の符号化された連鎖と同様に、長(PRR+) Numb アイソフォームによって連鎖を符号化して、選択された細胞やその結果である細胞は核酸が入れられる。一つの好適な実施例において、カーディオトロフィン-１を含む他の導入遺伝子の符号化された連鎖と同様に、長(PRR+) Numb アイソフォームによって連鎖を符号化して、選択された細胞やその結果である細胞は核酸が入れられる。
【００３１】
一つの好適な実施例において、CNTFを含む他の導入遺伝子の符号化された連鎖と同様に、長(PRR+) Numb アイソフォームによって連鎖を符号化して、選択された細胞やその結果である細胞は核酸が入れられる。
【００３２】
一つの好適な実施例において、OCT3/4やSOX2を含む他の導入遺伝子の符号化された連鎖と同様に、長 (PRR+) Numb アイソフォームによって連鎖を符号化して、選択された細胞やその結果である細胞は核酸を入れられる。
【００３３】
一つの好適な実施例において、NANOGやOCT3/4、SOX2を含む他の導入遺伝子の符号化された連鎖と同様に、長 (PRR+) Numb アイソフォームによって連鎖を符号化して、選択された細胞やその結果である細胞は核酸が入れられる。
【００３４】
一つの好適な実施例において、OCT3/4やSOX2、LIF活性を伴う導入遺伝子を含む他の導入遺伝子の符号化された連鎖と同様に、長(PRR+) Numb アイソフォームによって連鎖を符号化して、選択された細胞および／あるいはやその結果である細胞は核酸が入れられる。
【００３５】
一つの好適な実施例において、Notchを含む他の導入遺伝子の符号化された連鎖と同様に、長(PRR+) Numb アイソフォームによって連鎖を符号化して、選択された細胞および／あるいはその結果である細胞は核酸が入れられる（例：Gaianoet al., 2000）。
【００３６】
一つの好適な実施例において、OCT3/4やSOX2、Notchを含む他の導入遺伝子の符号化された連鎖と同様に、長 (PRR+) Numb アイソフォームによって連鎖を符号化して、選択された細胞および／あるいはその結果である細胞は核酸が入れられる(例：notch1 および／あるいはnotch 2)。
【００３７】
一つの好適な実施例において、OCT3/4、SOX2、NanogまたNotchを含む他の導入遺伝子の符号化された連鎖と同様に、長(PRR+) Numb アイソフォームによって連鎖を符号化して、選択された細胞および／あるいはその結果である細胞は核酸が入れられる。
【００３８】
一つの好適な実施例において、選択された細胞および／あるいはその結果である細胞は、OCT3/4、SOX2、NANOG、またLIF活性の遺伝子などの導入遺伝子を符号化するのと同様に、長 (PRR+) Numb アイソフォームを符号化して核酸が入れられる。一つの好適な実施例において、選択された細胞その結果である細胞は、OCT3/4、SOX2、NANOG、LIF活性がある多重導入遺伝子などの導入遺伝子を符号化するのと同様に、長(PRR+)Numbアイソフォームを符号化して核酸が入れられる。
【００３９】
一つの好適な実施例において、選択された細胞および／あるいはその結果である細胞は、他のOCT3/4、 Notch,、 HOXB4 、またSOX2などの導入遺伝子を符号化するのと同様に、長(PRR+) Numb アイソフォームを符号化して核酸が入れられる。
【００４０】
さらに、他のここで記されたものから分化した遺伝子の組み合わせは、多能で、多能性で、自己再生できるか分化を始める細胞を引き起こす可能性があるかもしれない。しかしながら、本特許出願はいかなる核酸細胞またはたんぱく質の電気穿孔法 ( Gagne et al., 1991 ; Saito et al., 2001 ; Yuan, 2008; Huang etal., 2007; Xia and Zhang, 2007; Cemazar and Sersa 2007; lsaka and Imai, 2007;Luxembourg et al., 2007; Van Tendeloos, 2007; Takahashi, 2007; etc.参照)、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトを適応する「遺伝子再プログラミング」(Goldberg et al., 2007; Li et al., 2007参照)および／あるいはウィルスウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチに使用でき、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変質である。それは安全性と効率の向上を意味する。さらに当然として、ランダムな遺伝子交替の分類には、、ゲノムの特定の場所においてDNAを導入または取り除くために設計された遺伝子ターゲティングならびに部位特異的方法がある。
【００４１】
同様にして、本特許出願は核酸またはたんぱく質の電気穿孔法を利用するいかなる核酸細胞の遺伝子再プログラムにも適応でき、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールト、その他、および／あるいは、レトロウィルスの／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチに使用でき、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変質である。それは安全性や効率の向上を意味する。このようなアプローチや手法は、本特許出願において実用的な技術として知られている。
【００４２】
一つの好適な実施例において、単一の遺伝子やその一部に(特にここで挙げられたもので、ここで挙げられた手法によって発見され、以下の他の方法により発見されたもの;または多能で多能性で、自己再生可能であるもの)対応する核酸またはたんぱく質が唯一の過剰発現した、および／あるいは選択された細胞から多能、多能性または自己再生細胞を生成するよう導入された、および／あるいは、唯一の核酸またはたんぱく質である。一つの好適な実施例において、単一の遺伝子やその一部に(特にここで挙げられたもので、ここで挙げられた手法によって発見され、以下の他の方法により発見されたもの;または多能で多能性で、自己再生可能であるもの)対応する核酸またはたんぱく質が、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう過剰発現した、および／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変質である。
【００４３】
別の好適な実施例において、他の核酸またはたんぱく質は、単一の遺伝子やその一部(特にここで挙げられたもので, ここで挙げられた手法によって発見され、以下の他の方法により発見されたもの; もしくは多能で多能分化し、自己再生可能であるもの)に対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞の中から、多分能、多能性および／あるいは自己再生細胞が生成されている限り使用できる。
【００４４】
別の好適な実施例において、他の核酸またはたんぱく質は単一の遺伝子やその一部(特にここで挙げられたもので、ここで挙げられた手法によって発見され、以下の他の方法により発見されたもの、もしくは多分可能で万能分化し、自己再生可能であるもの)に対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から、多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成ている限り使用される。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルスの／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変質である。
【００４５】
一つの好適な実施例において、Nanogに対応する核酸またはたんぱく質が、選択された細胞から、多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう過剰発現したおよび／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変質である。
【００４６】
別の好適な実施例において、他の核酸またはたんぱく質はNanogに対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から、多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成される限り使用できる。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールト、および／あるいは、ウィルスウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変質である。
【００４７】
別の好適な実施例において、Oct4 とSox2に対応する核酸またはたんぱく質が、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう過剰発現したおよび／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、ウィルスウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、またはその他の細胞ゲノムランダムな変質である。
【００４８】
別の好適な実施例において、他の核酸またはたんぱく質はOct4/Sox2に対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から、多能、多能性および／あるいは自己再生細胞の集団が生成されている限り使用できる。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、ウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変質である。
【００４９】
別の好適な実施例において、長(PRR+) Numbアイソフォームに対応する核酸またはたんぱく質が、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう過剰発現した、および／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、ウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変質である。
【００５０】
別の好適な実施例において、選択された細胞から、長(PRR+) Numbアイソフォームに対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から、多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成される限り使用できる。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、ウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変質である。
【００５１】
一つの好適な実施例において、Nanogに対応する核酸またはたんぱく質が、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するために過剰発現した、および／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。
【００５２】
一つの好適な実施例において、Nanogに対応する核酸またはたんぱく質が、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう過剰発現した、および／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変質である。
【００５３】
別の好適な実施例において、Nanogに対応する核酸またはたんぱく質が、多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう選択された細胞から過剰発現した、および／あるいは、導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変質である。
【００５４】
一つの好適な実施例において、LIF活性を利用して遺伝子に対応する核酸またたんぱく質が、多能で多能化で自己再生細胞を生成するよう選択された細胞から過剰発現および／あるいは導入された唯一の核酸またはたんぱく質である。
【００５５】
一つの好適な実施例において、LIF活性のある遺伝子に対応する核酸またはたんぱく質が、多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう選択された細胞から過剰発現した、および／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変質である。
【００５６】
別の好適な実施例において、他の核酸またはたんぱく質は、LIF活性がある遺伝子に対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞の集団が生成されている限り、使用する事ができる。
【００５７】
別の好適な実施例において、他の核酸またはたんぱく質は、LIF活性がある遺伝子に対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞の集団が生成されている限り、使用する事ができる。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変質である。
【００５８】
一つの好適な実施例において、Oct4に対応する核酸またはたんぱく質が、多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう選択された細胞から過剰発現した、および／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。
【００５９】
一つの好適な実施例において、Oct4に対応する核酸またはたんぱく質が、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう過剰発現した、および／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変質である。
【００６０】
別の好適な実施例において、他の核酸またはたんぱく質はOct4に対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選ばれた細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞の集団が生成されている限り、使用する事ができる。
【００６１】
別の好適な実施例において、他の核酸またはたんぱく質はOct4に対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選ばれた細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞の集団が生成されている限り、使用する事ができる。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／1エンチ・ウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変質である。
【００６２】
一つの好適な実施例において、Sox2に対応する核酸またはたんぱく質は、選ばれた細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう過剰発現した、および／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。
【００６３】
一つの好適な実施例において、Sox2に対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう、過剰発現したおよび／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいはレトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチまたは細胞ゲノムのその他ランダムな変質である。
【００６４】
別の好適な実施例において、Sox2に対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう導入された細胞集団が生成されている限り、他の核酸またはたんぱく質は使用する事ができる。
【００６５】
別の好適な実施例において、Sox2に対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞の中から、多能、多能性および／あるいは自己再生の再蔵を生成するよう導入された細胞の集団が生成されている限り、他の核酸またはたんぱく質は使用する事ができる。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、または細胞ゲノムのその他ランダムな変質である。
【００６６】
一つの好適な実施例において、Iin28に対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう、過剰発現したおよび／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。
【００６７】
一つの好適な実施例において、Iin28に対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう、過剰発現したおよび／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう1つのアプローチ、または細胞ゲノムのその他ランダムな変質である。
【００６８】
別の好適な実施例において、Iin28に対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう導入された細胞の集団が生成されている限り、他の核酸またはたんぱく質は使用する事ができ、そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、またはそ細胞ゲノムのその他ランダムな変質である。
【００６９】
一つの好適な実施例において、c-mycに対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から多能、多能性および・あるいは自己再生細胞を生成するよう、過剰発現したおよび／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。、実施の形態としては、c-mycに対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から多能、多能性および・あるいは自己再生細胞を生成するよう、過剰発現したおよび／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質であり、使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、または細胞ゲノムのその他ランダムな変質である。別個の実施の形態としては、c-mycに対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう導入された細胞の集団が生成されている限り、他の核酸またはたんぱく質は使用する事ができる。
【００７０】
別の好適な実施例において、c-mycに対応する核酸または、たんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう導入された細胞の集団が生成されている限り、他の核酸またはたんぱく質は使用する事ができ、そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、または細胞ゲノムのその他ランダムな変質である。実施の形態としては、Oct4とSox2に対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう、過剰発現したおよび／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。
【００７１】
別の好適な実施例において、Oct4とSox2に対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から多能、多能性および・あるいは自己再生細胞を生成するよう、過剰発現したおよび／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質であり、選使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、または細胞ゲノムのその他ランダムな変質である。
【００７２】
別の好適な実施例において、Oct4とSox2に対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう導入された細胞の集団が生成されている限り、他の核酸またはたんぱく質は使用する事ができる。
【００７３】
別の好適な実施例において、Oct4とSox2に対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう導入された細胞の集団が生成されている限り、他の核酸またはたんぱく質は使用する事ができ、使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、または細胞ゲノムのその他ランダムな変質である。
【００７４】
別の好適な実施例において、長（PRR+）Numb アイソフォームに対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう、過剰発現したおよび／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。
【００７５】
別の好適な実施例において、長（PRR+）Numb アイソフォームに対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう、過剰発現したおよび／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質であり、使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、または細胞ゲノムのその他ランダムな変質である。
【００７６】
別の好適な実施例において、長（PRRX+） Numb アイソフォームに対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう導入された細胞の集団が生成されている限り、他の核酸またはたんぱく質は使用する事ができる。
【００７７】
別の好適な実施例において、長（PRRX+） Numb アイソフォームに対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう導入された細胞の集団が生成されている限り、他の核酸またはたんぱく質は使用する事ができ、使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、または細胞ゲノムのその他ランダムな変質である。
【００７８】
別の好適な実施例において、Oct4、 Sox2とNanogに対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう、過剰発現した、および／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。
【００７９】
別の好適な実施例において、Oct4、 Sox2とNanogに対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう、過剰発現した、および／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質であり、使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、または細胞ゲノムのその他ランダムな変質である。
【００８０】
別の好適な実施例において、Oct4, Sox2とNanogに対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう導入された細胞の集団が生成されている限り、他の核酸またはたんぱく質は使用する事ができる。
【００８１】
別の好適な実施例において、Oct4, Sox2とNanonに対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう導入された細胞の集団が生成されている限り、他の核酸またはたんぱく質は使用する事ができ、使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、または細胞ゲノムのその他ランダムな変質である。
【００８２】
別の好適な実施例において、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう導入された、長（PRR+）Numb アイソフォームに対応する核酸またはたんぱく質が過剰発現したおよび／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質であり、
別の好適な実施例において、長(PRR+) Numb アイソフォームに対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から、多能、多能性および／あるいは自己再生の細胞を生成するよう、過剰発現および／あるいは導入され、使用されている手法は電気穿孔法、リボソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいはレトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう1つのアプローチ、または細胞ゲノムのその他ランダムな変質である。。
【００８３】
別の好適な実施例において、長 (PRR+)Numb アイソフォームに対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう導入された細胞集団が生成されている限り、他の核酸またはたんぱく質は使用する事ができる。
【００８４】
別の好適な実施例において、長 (PRR+)Numb アイソフォームに対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう導入された細胞の集団が生成されている限り、他の核酸またはたんぱく質は使用する事ができ、使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、または細胞ゲノムのその他ランダムな変質である。
【００８５】
ここに示される核酸またはたんぱく質の連鎖のあらゆる組み合わせは、望まれる細胞集団または習性が得られる限り、Numbおよび／あるいはNumblikeに対応する核酸またはたんぱく質を除外することで操作できる。
【００８６】
同様にここで示される分化を開始する方法は、誘発されたまたは誘発されなかった、多能、多能性、自己再生する幹細胞、他の前駆細胞、または他の選択された細胞、あるいはここにある手法で得られた細胞だけでなく適応できる。ここに示される核酸またたんぱく質の連鎖のあらゆる組み合わせは、望まれる細胞集団または習性が得られる限り、Numbおよび／あるいはNumblikeに対応する核酸またはたんぱく質を除外することで操作できる。
【００８７】
別の好適な実施例において、ここに示される核酸またたんぱく質の様々な組み合わせは、Numblikeおよび／あるいはNumb アイソフォームに対応する核酸またはたんぱく質を除外することで使用できる。
【００８８】
好ましい実施態様では、選択されたセルおよび/またはその子孫が遺伝的に、事前に変更されているセルです。
【００８９】
好ましい実施態様では、トランスフェクションの手順をここに一時的なトランスフェクションを表す説明する。さらに好ましい実施態様ではこのような一時的なトランスフェクションを使用して達成されるは、ホストゲノムへのウイルスベクターを統合しないでください。
【００９０】
別の好適な実施例において、かかる一時的なトランスフェクションは、標準のトランスフェクション技術（電気穿孔法、化学的に調節されたトランスフェクション、融合誘導または非融合誘導リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトなど）を用いて達成される。時間の経過に従い、ここに示されるものとは異なる他の遺伝子組み合わせで、多能、多能性、自己再生可能または分化できる細胞が示され、あるいは発見されるであろう。しかしながら本特許出願は、またあらゆる核で生成される細胞で、核酸またはたんぱく質の電気穿孔法（例：手法についてはGagne et al., 1991 ; Saito et al., 2001; Yuan, 2008; Huang et al.,2007; Xia and Zhang, 2007; Cemazar and Sersa 2007; Isaka and Imai, 2007;Luxembourg et al., 2007; Van Tendeloos, 2007; Takahashi, 2007;その他を参照）、電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいはウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、または細胞ゲノムのその他ランダムな変質などは安全性と効率を上げる。
【００９１】
別の好ましい実施態様では長い（ペンシルバニア鉄道で、トランスフェクション+）麻痺アイソフォームのエンコーディング配列（および/または合成オリゴヌクレオチド）numblikeと短い感覚のアイソフォームターゲットに伴ってのものでも、これらのエンコーディングヒトLIFから選択など、他のシーケンスを一時的または永続的なトランスフェクションに置き換えられます（例：杜の市、1996年）オンコスタチン-Mのcardiotrophin - 1のIL -私リットルのIL - 6、IL6R、ハイパーのIL - 6、LIFR、gpl30、OCT3（OCT4）、nanogの、Sox2の、および/またはFGF- 4。これらの異なる遺伝子配列の任意のサブセットとの同時トランスフェクション任意の単一遺伝子ベクターを使用するなど、芸術に知られることを意味し、複数の遺伝的ベクトル、シリアルトランスフェクションと選択の明確なマーカータンパク質および/または抗生物質耐性に基づいて行うことができます。
【００９２】
別の好ましい実施態様では、細胞間で（ペンシルバニア鉄道+）麻痺アイソフォーム（s）は、細胞培養で培養されるよう、上記のよう最適成長率を促進するトランスフェクトし、EGFの、bFGF、オンコスタチン、LIFの含まれています（ドゥとの始皇帝例えば、1996）、鉄鋼因子のIL - 11、cardiotrophin - 1、IL - 6の、ハイパーのIL - 6、CNTF、および/または水溶性gpl30。.
可能性と分化の評価
多能性と多能は次の分野に有用であるといえる。1) 移植、2) 類胚芽腫体の形成を促進状態する培養、3) 動物の胚盤胞期胚芽への細胞導入とその後の成長、4) 分化、多能、多複性など（Guanet al., 2006を参照）に関連した遺伝子発現のRNA発現検査（例：RI-PCR法ならびにマイクロアレイ法に基づいた分析）、5)コロニー形成のみならずES細胞類似形態。ここで説明する、選択された細胞および／あるいはその結果の多能性を知るための1つの方法としては、蛍光タンパク遺伝子に結び付けられたNanogプロモータを使ってトランスフェクションを評価するというものがある。これによりNanog発現細胞は、蛍光活性細胞分別（FACS）などを使って特定し集積することができる。
【００９３】
実施の形態としては、内因細胞（例：火傷または怪我をした部分の周りの細胞）が長（PRR+）Numb アイソフォームを符号化した遺伝子ベクターのみと、あるいはここで名前を挙げた他の導入遺伝子と共に生体内でトランスフェクションし、一時的に細胞の再生を促進したり、増殖の効率を高める。この手法は再生不良組織、幹／前駆細胞が異常に激減したりする疾患、また他のこの手法が有効であろうと考えられる疾患に対して臨床的に用いることができる。
【００９４】
分化する細胞集団を得る
生体内で環境的に制限された状態で b) 神経、c) 筋肉、d) その他の部位の細胞集団がさらに分化するには、選択された細胞および／あるいはその結果の子細胞が、長（PPR+）Numbアイソフォーム配列および／あるいは合成されたオリゴヌクレオチド配列のトランスフェクション任意的に受け、（上記の如く）試験管内で十分な時間をもって望まれる量の前駆細胞を得て増補される。この任意の手順を踏むことで、選択された細胞および／あるいはその結果の子細胞からサイトカインと拡大／最高の成長媒体の因子を取り除き、、任意にNumblike遺伝子および／あるいは「短」（PRR-）Numbアイソフォームおよび／あるいは（PRR+）アイソフォームを対象とする合成オリゴヌクレオチドを符号化したヌクレオチド配列など (例： Zaehres etal., 2005)とトランスフェクションした。そして選択された細胞を望まれる細胞タイプに分化させるのを促進させる状況下で培養した。
【００９５】
殆どの例において、細胞は5から10％の胎児ウシ血清と、選択された細胞および／あるいはその結果の子細胞を分化させるのを促進させる因子が存在するという条件下で培養された。胎児ウシ血清と媒体が存在することにより、最大成長（または拡大）率よりも低い割合で成長あるいは増殖し、望まれる細胞集団に分化させることができた。媒体と培養した環境の細かい内容は、望まれる細胞集団により選ばれ下のように表わされる。
【００９６】
神経細胞集団を得る
望まれる細胞集団が神経細胞集団の時は、トランスフェクションが成功した細胞が、細胞を神経細胞に分化させるのを促進する因子が存在し、最も望ましい割合よりも低い割合で成長を促進する条件下で培養された。ニューロンへの分化を促進する条件については、次のような数多くの文献で説明されている（Benninger et al., 2003; Chung et al. 2005; Harkany et al., 2004;Ikeda et al., 2004; Ikeda et al., 2005; Wernig et al., 2002; and Wernig et al.,2004）。さらには加えたサイトカインとレチノイン酸露出を組み合わせることで、特定の神経細胞タイプが試験管内で分化する（例：Soundararajan etal., 2006; Soundararajan et al., 2007; U.S. Patent 6432711）。
【００９７】
実施の形態としては、試験管内でニューロンまた神経細胞を分化するには50ng/mlの神経成長因子（NGF）が必要であった。
【００９８】
一つの好適な実施例において、神経細胞集団が望まれる細胞集団である時、短アイソフォーム（および／あるいはNumblike）を符号化した配列とのトランスフェクションが、Nurrl、REN、ネウロジェニン1、ネウロジェニン2、ネウロジェニック、Mash1、Phox2b、Phox2a、dlland、Gata3、Shh、FGF8、Lmxlb、Nkx2.2、Petl、Lbxlおよび／あるいはRnxを符号化したものから選ばれた配列を含む他の配列と、一時的または永続的なトランスフェクションを伴うか置き換えられる。
【００９９】
別の好適な実施例において、ドーパミン作動性ニューロンが望まれる神経細胞集団である時、短Numb アイソフォーム（および／あるいはNumblike）を符号化した配列とのトランスフェクションが、Mash1、Ngn2、Nurrl、Lmxlbおよび／あるいはPtx-3を符号化したものから選ばれた配列を含む他の配列と、一時的または永続的なトランスフェクションを伴うか置き換えられる。
【０１００】
別の好適な実施例において、セロトニン作動性ニューロンが望まれる神経細胞集団である時に、短Numb アイソフォーム（および／あるいはNumblike）を符号化した配列とのトランスフェクションが、Mashl、Phox2b、Lmxlb、Nkx2.2、 Gata2、 Gata3、 および／あるいはPetlを符号化したものから選ばれた配列を含む他の配列と、一時的または永続的なトランスフェクションを伴うか置き換えられる。
【０１０１】
別の好適な実施例において、コリン作用性ニューロンが望まれる神経細胞集団である時、短Numb アイソフォーム（および／あるいはNumblike）を符号化した配列とのトランスフェクションが、MASII1、Phox2aおよび／あるいはRKST4を符号化したものから選ばれた配列を含む他の配列と、一時的または永続的なトランスフェクションを伴うか置き換えられる。
【０１０２】
別の好適な実施例において、GABA作動性ニューロンが望まれる神経細胞集団である時、短Numb アイソフォーム（および／あるいはNumblike）を符号化した配列とのトランスフェクションが、MASIIl、Phox2aおよび／あるいはREST4を符号化したものから選ばれた配列を含む他の配列で、任意的にLIF、Neurotrophi 3(NT3)および／あるいは神経成長因子（NGF）が補足された媒体の培養により、と、一時的または永続的なトランスフェクションを伴うか置き換えられる。
【０１０３】
別の好適な実施例において、ノルアドレナリン・ニューロンが望まれる神経細胞集団の時、短Numb アイソフォーム（および／あるいはNumblike）を符号化した配列とのトランスフェクションが、Mashl、 dlland、Phox2a、 Phox2b、Gata2 および／あるいは Gata3対象とすを符号化したものから選ばれたを配列を含む他の配列と、一時的または永続的なトランスフェクションを伴うか置き換えられる。
【０１０４】
別の好適な実施例において、GABA作動性ニューロンが望まれる神経細胞集団である時、短Numb アイソフォーム（および／あるいはNumblike）とトランスフェクションした細胞が、P1TX2、Dlx2、Dlx5、アンチセンスHeslRNAおよび／あるいはその他のHES1を対象にした合成オリゴヌクレオチドを符号化したものから選ばれた配列を含む他の配列と、一時的又は永続的なトランスフェクションを伴うか置き換えられる。
【０１０５】
上で説明したような分化を中程度に促進させる環境で培養された。その際、次の因子を1つまたはそれ以上加えた：レチノイン酸、NT3、NGF、GDNF、IFN-γ
筋細胞集団を得る
ときは、目的のセルの人口筋肉の人口は、正常にトランスフェクトした細胞を、エージェントの存在下でのレートでより最適な速度よりも筋細胞や成長に変えて細胞の分化を促進する培養です。条件を筋細胞への分化を促進また、以前に（中村ら説明されている、2003;パルとカンナ、2005;パイプら、2005; Albilezヌら、2006;パルとカンナ、2007; Behfarヌら、2007;米国特許64327 '1 1）。さらに、選択したセルを暴露/またはヘキサメチレンビス - アクリルアミドまたはジメチルスルホキシドに自分たちの子孫の関連性サイトカインの存在下でのinvitroで筋肉型分化の開始を支持する。
【０１０６】
一つの好適な実施例において、心筋細胞が望まれる細胞集団である時、短(PRR-) Numb アイソフォーム(および／あるいはNumblike)と共に核酸が入れられた細胞は、心筋細胞(He et al.,2003; Guan et al., 2007;その他)への分化を促進するか、心筋細胞の分化を促進する濃度の仲介物(例：0.75%- 1 % dimethylsulfoxideジメチル・スルホキシド (DMSO)が含まれるか、20%の標準ウシ血清(NBS)、10(-7) mM レチノイン酸(RA) 、20% 心筋細胞状況の培養地(Hua et al., 2006)などにて培養される。
【０１０７】
別の好適な実施例において、心筋細胞集団が望まれる細胞集団の時、それら細胞はGata 4、Gata 5、 and Gata 6と符号化された選択された細胞を含むヌクレオチド鎖と共に核酸が入れれる。
【０１０８】
一つの好適な実施例において、筋細胞集団が望まれる細胞集団である時、短Numbアイソフォーム (および／あるいはNumblike)を符号化する連鎖による核酸の移入は、筋タイプ特定 bHLH-符号化連鎖、MyoD、ミオゲニン、Myf5、Myf6、 Mef2、ミオカーディン、Ifrdl や他の筋肉転写因子を符号化するこれらから、選択された物質を含む他の連鎖によって、一時的もしくは永久的な核酸の移入によって併発され置き換えられる。
【０１０９】
一つの好適な実施例において、平滑筋細胞集団が望まれる細胞集団である時、短Numbアイソフォーム (および／あるいはNumblike)を符号化する連鎖による核酸の移入は、筋タイプ特定ミオカーディンヌクレオチド鎖を符号化するこれらから選択された物質を含む他の連鎖によって、一時的もしくは永久的な核酸の移入によって併発され置き換えられる。
【０１１０】
一つの好適な実施例において、骨格筋細胞集団が望まれる細胞集団である時、短Numbアイソフォーム(および／あるいはNumlike)を符号化する連鎖による核酸の移入は、筋タイプ特定MyoDとミオゲニンヌクレオチド鎖を符号化するこれらから選択された物質を含む他の連鎖によって、一時的もしくは永久的な核酸の移入によって併発され置き換えられる。
【０１１１】
一つの好適な実施例において、oligodensrocyte細胞集団が望まれる細胞集団である時、短Numbアイソフォーム(および／あるいはNumlike)を符号化する連鎖による核酸の移入は希突起膠細胞の特有の-OLlGl、 OLIG2、またZfp488 ヌクレオチド鎖を符号化するこれらから選択された物質を含む他の連鎖によって、一時的もしくは永久的な核酸の移入によって併発され置き換えられる。
【０１１２】
これらの異なる遺伝子配列を上記の任意のサブセットとの同時トランスフェクションは、複数の遺伝子のベクトルを使用し、シリアルトランスフェクションだけでなく、選択の異なるマーカータンパク質および/または抗生物質耐性に基づいなどの芸術に既知の手段によって達成することができます。ときに、目的の細胞集団造血細胞集団が、分化中濃度の造血前駆細胞への分化を促進では、特定のエージェントが含まれます（表示等（例えば、Ohmizono、1997トロンボポイエチン血管内皮細胞増殖因子（VEGF）、例えば、Wangらは、2005; Srivastavaさんら、2007; Gupta氏ら、2007）、または分化造血細胞の型（メソッドは、芸術に未分化または多能性幹細胞から分化造血細胞を提供するための既知のによれば）。
【０１１３】
望まれる細胞集団が遺伝子細胞集団である時、分化培養地は遺伝子細胞への分化を促進させる濃度において特定の仲介物を含む（例Nayerniaら2006a、2006b）。望まれた細胞集団が、すい臓内胚葉島細胞集団の時、分化培養地は、すい臓内胚葉島細胞集団への分化を促進させる濃度において特定の仲介物を含む（例：徐ら、2006;デネールら、2007;シムら、2007;江ら、2007）。
【０１１４】
一つの好適な実施例において、選択された細胞および/あるいはその結果として集団の分化は、分化培養地において、Numblike、短麻痺idsoフォームや他の導入遺伝子の核酸の移入なしに起こる。また培養地は変えられない。
【０１１５】
実施例では、単一のベクトルは、塩基配列の発現をコントロール（秒）でエンコードを利用される""（ペンシルバニア鉄道+）（s）は哺乳動物の感覚の遺伝子（および/または合成オリゴヌクレオチドまたは次の短い感覚のアイソフォームnumblikeターゲットアイソフォーム）長下に1つの調節性のプロモーター（tetracycラインなどのプロモーター規制）、一方Numblikeと短い麻痺アイソフォーム（および/または合成オリゴヌクレオチドは長い（ペンシルバニア鉄道ターゲット+）アイソフォーム）を別の、別個の制御下で発現しているだけでなく、調節性プロモーター。したがって、長い（ペンシルバニア鉄道+）麻痺アイソフォーム（秒）で表現することができます（および/または短絡）は、選択したセルの拡大と誘発剤（例えばテトラサイクリン）が必要です成長培地に追加され抑圧されたアイソフォーム;以降とnumblike短期アイソフォーム（および/またはlong型（ペンシルバニア鉄道+）麻痺アイソフォーム（秒）抑圧された）が差別化が望まれる表現することができます。
実施の形態としては、単一ベクターは、
また、タンパク質やペプチド麻痺アイソフォーム、ノッチ、OCT3 / 4、Sox2のには、対応すると他のDNAここに類似の方法で選択したセルを適用することが記載さシーケンス/またはエレクトロポレーション法（例えば、を介してその子孫浩賢ら、1994;リッチーとギルロイ、1998）、ナノ粒子、カチオン性脂質、融合リポソームを使用して（例えば、吉川ら、2005;2007）、等の代わりに、または組み合わせで遺伝子トランスフェクションした。一般的に、エレクトロポレーション高いトランスフェクション効率のための遺伝子のゲノム統合せずに、目的の細胞（および効率的な生産）とできるため、より高い安全性に関連付けられている。DNA やRNAのエンコーディングタンパク質（s）またはポリペプチド（秒）の増殖、multipotentiality、pluripotentiality または選択された細胞の分化を促進するに従って、標準的な遺伝子工学的手法（たとえば、分離されるかもしれませんが、のcDNAライブラリーからこのようなDNAを分離することによって特定のセルライン）とそれを配置し、それを選択したセルにトランスフェクトされ、適切な発現ベクターに。別の好ましい実施態様では、内胚葉と膵島細胞（および/または）numblike希望の人口、およびシーケンスの短い感覚のアイソフォームのエンコーディングでトランスフェクション伴っているものでも、これらのエンコーディングFoxa2、Soxl7から選択など、他のシーケンスを一時的または永続的なトランスフェクションに置き換え、HLXB9および/またはPdxl。
【０１１６】
一つの好適な実施例において、肝細胞が望まれる集団であり短麻痺アイソフォーム（および/あるいはNumlike）を符号化する連鎖によって起こる核酸の移入は、肝胞核因子（hnf hnf用の）私は、IINF - 3 、IINF - 4、hnf hnf用の- 6ならびに転写調節因子結合たんぱく質を符号化するこれらから選択された物質を含む他の連鎖によって、一時的もしくは永久的な核酸の移入によって併発され置き換えられる。
【０１１７】
別の好適な実施例において、造血性細胞が望まれる細胞集団である時、短麻痺アイソフォーム（および/あるいはNumlike）を符号化する連鎖によって起こる核酸の移入は、Runxl / AMLlと11月（CCN3）および/あるいは望まれる細胞集団のコロニー刺激因子がある細胞培養を符号化するこれらから選択された物質を含む他の連鎖によって、一時的もしくは永久的な核酸の移入によって併発され置き換えられる。Runxl/ AMLlアイソフォームは、移植が望まれる時に、Bのアイソフォームは分化が望まれる時に（Creemersらされる導入され導入、2006）。
【０１１８】
別の好適な実施例において、軟骨細胞が望まれる集団であった時、短麻痺アイソフォーム（および/あるいはNumlike）を符号化する連鎖によって起こる核酸の移入は、Sox9、転写調節因子結合たんぱく質、Gatao、および/あるいはRunx2を符号化するこれらから選択された物質を含む他の連鎖によって、一時的もしくは永久的な確執の移入によって併発され置き換えられる。
【０１１９】
別の好適な実施例において、骨胞（特に造骨細胞）が望まれる細胞集団である時、短麻痺アイソフォーム（および/あるいはNumlike）を符号化する連鎖によって起こる核酸の移入は、含む他の連鎖によって、一時的もしくは永久的な核酸の移入が併発され置き換えられる。
【０１２０】
別の好適な実施例において、κ麻痺アイソフォームを符号化する遺伝子ベクターは、過渡的に標準的なプロモータの操作によって、一時的に細胞の増殖を起こす目的で生体内の内在細胞にされる導入。
【０１２１】
別の好適な実施例において、内生細胞（例：中枢神経系の上衣ゾーン細胞）は生体内において、遺伝子ベクターによって核酸が移入される。そのベクターは、短麻痺アイソフォームまたは独立したNumblikeたんぱく質のみまたはここで名づけられているような他の導入遺伝子を、一過性あるいは永久的に細胞の分化や増殖を促進させるために符号化する。この再生または増殖は、分化に関連したマーカーの遺伝子発現を見せる細胞の数によって計測される。これは遺伝子ベクターを器官システムに、この目的のために適した方法を用いて導入されることにより完成する。実施の形態としては、内生細胞（例：中枢神経系の上衣ゾーン細胞）は、生体内において、幹細胞集団の再生または増殖を促進する目的で、κ麻痺アイソフォームおよび/あるいはここで名づけられた他の導入遺伝子を符号化する遺伝子ベクターである。この再生または増殖は、その結果である集団の分化に関連し、マーカーの遺伝子発現を見せる細胞の数によって計測される。これは遺伝子ベクターを器官システムに、それに適した方法を用いて導入して達成される。
【０１２２】
同様に、この方法は、他の組織（皮膚など）における他の幹細胞集団からの再度のまたは増加する分化、を起こすためにも適している。この方法は、例えば中枢神経障害、通常の分化または移動が不十分で、形成異常疾患、その他の疾患においてアプローチが容易な場合にされる適応。
【０１２３】
好ましい実施態様では、核酸（s）またはタンパク質（s）は、単一の遺伝子またはその一部には、（特に記載の名前を発見した方法を、ここに記載によると、対応する発見された他の公開方法に応じて、及び/または既知の差別化の目的の方法で開始する）能力がある唯一の核酸（s）またはタンパク質（秒）が過剰発現および/または選択された細胞の分化を開始するために導入。
実施の形態としてうは、単一遺伝子やその一部（特に記載の名前、メソッド、ここに記載によると、発見発見された他の公開方法に応じて、及び/または既知の分化の目的の方法を開始することができると）に対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞において分化を誘導するように発現され導入された唯一の核酸またはたんぱく質である。
【０１２４】
好ましい実施態様では、核酸（s）またはタンパク質（s）は、単一の遺伝子またはその一部には、（特に記載の名前を発見した方法を、ここに記載によると、対応する発見された他の公開方法に応じて、及び/または既知の差別化の目的の方法で開始する）能力がある唯一の核酸（s）またはタンパク質（秒）が過剰発現および/または選択したセル内のメソッドを利用し分化を開始するために導入、エレクトロポレーション、リポソームは、ナノカプセル、nanovaults、および/または、別のアプローチをレトロウイルスを避ける/レンチ統合したり、細胞のゲノムの他のランダムな変化。別の好ましい実施態様においては、他の核酸（s）または秒）コンサートでは、核酸（掲載に利用することができる蛋白質（）やタンパク質（s）は、単一の遺伝子またはその一部には、（特にここに、名前に対応するメソッドを、ここに記載によると、発見された他の公開方法によると、発見された、及び/または既知の分化のが望ましい方法を開始することができると）ので、長い分化細胞の集団としては、選択したセルから生成されます。
【０１２５】
別の好ましい実施態様においては、他の核酸（s）または秒）コンサートでは、核酸（掲載に利用することができる蛋白質（）やタンパク質（s）は、単一の遺伝子またはその一部には、（特にここに、名前に対応するメソッドを、ここに記載によると、発見された他の公開方法によると、発見された、及び/または既知の分化のが望ましい方法を開始することができると）ので、長い分化細胞の集団として、選択したセルからメソッドを利用し生産され、エレクトロポレーションです。リポソーム、ナノカプセル、nanovaults、および/または別のアプローチをレトロウイルスを避ける/レンチ統合したり、細胞のゲノムの他のランダムな変化。
【０１２６】
は、核酸や蛋白質の任意の組み合わせのシーケンス記載の目的の細胞集団または動作を実現しています麻痺および/またはNumblikeに限り、これらに対応するものを除くによって変更することができます説明を理解するためだ。
ここで記されているどの核酸ならびに鎖の組み合わせも、麻痺および/あいはNumblikeに対応する組み合わせを除き、望まれる細胞集団または習性が達成される限り、操作できるたんぱく質。
【０１２７】
同様にして、ここに記されている分化を促すための方法は、いかなる誘導されたもしくは誘導されていない多能、多能化または自己再生できる幹細胞、または他のここで記されている方法で得られた細胞だけでない選択された細胞にすることができる利用。
【０１２８】
選択された細胞の根源
選択された細胞の集団は、様々な幹細胞、前駆細胞また体細胞から得られるであろう。しかしながら細胞核が欠損している体細胞（例：成長したヒトの赤血球細胞）は、とりわけ排除された。選択された幹細胞は、存在する細胞株または貯蔵、バンク化、または低温保存されていたものから得られるであろう。典型的な幹細胞の根源は、骨髄、末梢血、胎盤血、羊水（例：投稿者コッピら、2007）、靭帯血（例：趙ら、2006;田ら、2007）、脂肪組織（例：Gimbleら、2007;馬ら、2007）、ヒト以外の胎芽などである。循環白血球や他の幹細胞ではない細胞は、同様に、上記に記されたような培養地で培養され、結果として多能、多能化および/あるいは自己再生能力を得ることになる。本発明において利用できる他の体細胞の例には、リンパ球、上皮細胞（例：頬）が含まれる。本発明のためにされた細胞は、技術として知られている選択いかなる方法にも使われるだろう。
【０１２９】
動物に関する実施例では、前立腺、精巣、胎児脳、腸から独立した幹細胞は、選択された細胞の好まれる根源であると明らかにれているさ。
【０１３０】
一つの好適な実施例において、選択された細胞および/あるいはその結果である子細胞は3次元の型で培養されている。
【０１３１】
本発明の更なる目的は、患者に互換性があり、かかる器官または組織が必要をされる患者の特定の組織や臓器の移植に利用できる細胞を生成することである。ここにある方法によって与えられた多能、多能化および/あるいは分化する細胞は、そのような器官および/あるいは組織の生成のための技術に共用できることが明らかにている（例：ボーランドらなっも、2006。徐ら、2006;キャンベルとワイス、2007）。そのような利用方法は、本発明により明確にされているカバー。例えば、ここで記された方法により生成され扱われた多能、多能化および/あるいは分化する細胞は、正常な組織構造および/あるいは臓器構造の再生のためにされた足場において成長していることなどが挙げられる（例：Yarlagadaら3次元もしくは2次元の設計。、2005; Kimら、1998; WO/2003/070084; EP1482871; WO03070084;米国特許2395698、7297540、6995013、6800753;アイゼンバーグら、2006）。
【０１３２】
同様に、多能的で、多能性のある、および/あるいは分化する細胞によって占領される足場は、死体臓器あるいは組織（骨、心臓、腎臓、肝臓、肺など）が、宿主免疫細胞が対象の組織に常駐し、その他の不要あるいは付随する宿主細胞が除去される（乖離放射線、殺菌（ムロツら、2006など）などにより）ように、および/あるいは各種脱細胞方法（米国特許6734018 ; 6962814、6479064、6376244、米パット。番5032508、4902508、4956178、5281422、5554389、6099567、および6206931、4361552および6576618、6753181、米国出願Ser。第11 / 162、715; WO/2001/048153; WO/2002/024244; WO003002165; WO/2001/049210;WO/2007/025233;欧州特許EP1482871、EP1246903、EP1244396、EP0987998、EP1244396;プレミアリーグ333870;Riederらら、2004;オットら、2008; Taylorら、1998）において治療できうる後に死体臓器あるいは組織から派生されうる。
【０１３３】
同様にして、多能、多能化および/あるいは分化する細胞にされた足場は、死体の器官または組織における免疫細胞や他の望まれないまたは付属する細胞が除去さえるように処置されたあと占領の、死体の器官または組織から得られるだろう。
【０１３４】
同様にして、本発明における多能、多能化および/あるいは分化する細胞が、ヒト組織工学におけるインクジェット式印刷に（例：。ボーランドら応用されるだろうも、2006。徐ら。 、2006;キャンベルら、2007）。それゆえに、ここで記された方法によりそのような目的のために生成され扱われた細胞も、ここで触れられている。
【０１３５】
別の好適な実施例において、選択された細胞やその結果の集団は、懸滴のなかで培養される。
【０１３６】
本発明の別の側面によれば、選択された細胞を望まれる細胞集団に分化させることを促進すると、選択された細胞は、前もって遺伝子的に組み換えられることができる。本発明の別の側面によれば、選択された細胞はのDNAまたはRNAのを符号化した、細胞を望まれる細胞集団に分化させることを促進するたんぱく質またはポリペプチドにより組み換えられてることができる。
【０１３７】
細胞集団の検査
一つの実施例では、本発明による方法は、細胞株、ドナー源、臍帯血から細胞をスクリーニングし、自己あるいはドナーの骨髄、血液、精原細胞、構成する始原生殖細胞、口腔細胞、あるいは本発明に置いて効果的なその他の細胞源からの細胞のスクリーニングが含まれる。選択した細胞は、先行技術（関ら、2006;米国特許6,432,71 1）において公知の方法により、有益な配列による分化の開始の他、トランスフェクションや治療用ベクターの成功を確認するためにスクリーニングできる。いくつかの実施例では、標準的なPCR法および核酸ハイブリダイゼーションベースの方法を用いて、あるいは急速な入力方法を用いて、これらの細胞はスクリーニングされる。好適な実施例では、レポーター遺伝子の発現に応じて細胞がスクリーニングされる。いくつかの実施例では、抗生物質抵抗性遺伝子や蛍光たんぱく質（GFPのなど）遺伝子などのトランス遺伝子発現ベクターにより符号化されたマーカー遺伝子の発現によって細胞はスクリーニングされる。
【０１３８】
本発明の一実施例によれば、選択された細胞は、有効な連鎖や治療ベクターとの核酸の移入を成功させるため検査される（関ら、2006;米国特許6,432,71 1）。 いくつかの実施の形態としては、
治療ベクターと有効な連鎖細胞の検査は、特定連鎖の探知として知られている技術を用いて、有効な連鎖と治療ベクターの存在を確認される。それぞれ細胞サンプルは、同時に様々な連鎖について調べられる。あるいは、多数のサンプルは、同時に検査される。
【０１３９】
細胞の分化は、（私は）形而学的評価、（ＩＩ）逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を利用した（アングル - のPCR法）、ノーザンブロット（遺伝子発現における変化を監視するためのマイクロアレイ技術）、（ＩＩＩ） βチューブリン3世など（神経細胞など）（小澤ら、1985）などいくつかの手段によって監視できる。いくつかの実施例では、細胞の分化を正常にのために細胞型特異的な開始マーカーや遺伝子マーカー発現にてFACSソートを使用細胞の種類に固有のプロモーターの制御下筋ミオシンのプロモーターなどの抗生物質耐性や蛍光たんぱく質の発現など上映される細胞、人間の心臓のα-心筋の基づいアクチンのプロモーター、インスリン産生細胞のインスリンプロモーター、ニューロン特異的エノラーゼ（NSE）ののニューロンの分化や、神経伝達物質の関連するプロモーターのプロモーターのドーパミン作動性ニューロンのチロシン水酸化酵素プロモーター等）いくつかの実施例では、細胞の標準的なPCR法と核酸ハイブリダイゼーションベースの方法を使用してスクリーニングされる。特に実施態様では、細胞の急速な入力方法使用してスクリーニングされる好ましい。
【０１４０】
HLAタイプの検査
特定の実施の形態としては、選択された細胞はHLAタイピングに適合するように選択される。HLAの遺伝子型は、当業者にとって既知の手段により決定される。
【０１４１】
検査に利用される細胞は、ドナーから直接採取された細胞配列、またはドナー細胞から作られた細胞株、または実用できる細胞源の中に存在する。細胞は実用的な連鎖および/あるいは治療ベクター、またHLAタイプを瞬時にそれぞれ検査される。これらの細胞は、実用的な連鎖と共にが移入されはHLA遺伝子型を見せ、核酸患者への移植を可能にする。
【０１４２】
特定の実施の形態としては、核酸が移入された細胞ははHLAタイピングすることなく移植される。他の実施の形態としては、細胞は適応するようにHLAタイピングされる。
【０１４３】
細胞の表現型を促進させる仲介物の検査
本発明はまた、表現型の変化あるいは選択された細胞および/あるいはその子孫の必要な細胞集団への分化を誘発する能力のためのたんぱく質およびエージェントをスクリーニングする方法を提供する。簡単に言えば、適切なcDNAをライブラリから相補のDNA（cDNA）のを符号化するベクターは選択した細胞および/あるいはその子孫にトランスフェクトされる。分化あるいはその他の表現型の変化を誘発する固有のcDNAのが特定されると、このようなcDNAのは孤立化され、適切な細胞（のCOS細胞など）でたんぱく質を生成するための適切な表現ベクターに複製される。
【０１４４】
その後、上清を含むたんぱく質は、このような細胞から分泌された任意のたんぱく質が分化を誘発するかどうかを決めるのに選択した細胞の培養に適用できる。あるいは、候補者エージェントは、このような細胞から分泌された任意のたんぱく質が分化を誘発するかどうかを決めるのに選択した細胞の培養に適用できる（米国特許6432711参照）。本発明はまた、多能性、多能化および/あるい自己再生できるようあるい選択された細胞および/あるいその子孫の分化を開始できるよう核酸をスクリーニングを行うための方法を提供する。
【０１４５】
これらの方法では、曳気穿孔法、ナノカプセル、ナノボールト、リポソーム、レトロウイルス、レンチウイルス、および/あるいはその他の適用可能なトランスフェクション手段を用いて、選択されたcDNAの（あるいは適切なcDNAのライブラリからのcDNAのあるいはその他の配列）を符号化するベクターは、選択された細胞および/あるいはその子孫にトランスフェクトされる。表現型の変化、多能性、多能化および/あるい自己再生を誘発する固有のcDNAのが特定されると、このようなcDNAのは孤立化され、適切な表現ベクターにしたアッセイ。このようなへかを決定するアッセイには、本明細書の他の項で説明される複製が含まれる。同様に、上清をふくむたんぱく質が選択された細胞の培養に可能であり、必要な変化を誘発しうるかを決定するのに適用、体外の適切な細胞（のCOS細胞など）で特定されたcDNAのに対応するたんぱく質が生成される。
【０１４６】
最後にたんぱく質は、曳気穿孔法、ナノカプセル、ナノヴォールト、リポソーム、レトロウィルス、レンチウィルスおよび/あるいはトランスフェクションのその他の実用的な方法、多能、多能性、自己再生または分化の開始としてここに記される。
【０１４７】
患者への細胞移植
検査后、選択された細胞および/あるいはその結果である集団は、低温保存され、培養する細胞株として維持されるか、患者に与えられる。選択された細胞は、将来の移植術のために保存されよく知られている手法により、低温保存され維持することができる。
できれば、検査される細胞は、容易に採取できるものがよい。
【０１４８】
抗HIV陽性細胞の生成に関して：本発明における標的となる体細胞および幹細胞はエイズに感染しうる細胞に分化できる種類では、HIVの転写および/あるいは複写を維持でき、HIVの免疫反応を変更でき、エイズへの信仰を送らせうる種類の細胞でありうる。このような幹細胞には、精原細胞由来多能性細胞、始原生殖細胞、造血干細胞、末梢血液細胞、胎盤の血液細胞、羊水細胞、靭帯血細胞、口腔細胞、脂肪組織の細胞（これらの組織から派生した幹細胞を含む）、書き換え細胞、多能性細胞誘導、誘発多能化細胞、人間のもの以外の胚細胞、血液や免疫細胞は、HIV標的細胞およびその他の細胞を形成できるその他の細胞型が含まれる（これに限定されない）。
【０１４９】
治療ベクターは、核酸を移入した細胞または感染細胞のHIVの再生能力や転写の能力を減少させる"にな配列"を表現する。その遺伝子ベクターは、そのようなベクターから得られるいかなるウィルスと同様有用、"有用な配列"を表現し、ここでは"治療ベクター"と名づけられている。
【０１５０】
検査后、望まれる治療ベクターに（HLA遺伝型と同様にもしくはそれ無し）は、細胞を分裂させ安定的な細胞株を保たせるための標準を移入し、有用な配列を表現している細胞核酸的な培養方法（米国特許643271 1 5453357参照として引用）によって生体外で拡張される。その代わりに、これらの細胞は、患者やその生体内にすることができる投与。
【０１５１】
選択された細胞は、この技術として良く知られた方法で低温保存され、将来の移植術のためにされる保存。
【０１５２】
患者への特定細胞集団の移植
特定の実施の形態としては、細胞集団は移植に先立って幹細胞のためにさせられる増殖。幹細胞を選択する様々な方法は、この手法では良く知られている。例えば、細胞サンプルを、分化していない血液性の幹細胞（例：、CD34陽性、CD59、Thyl、CD38低く、c - kitと低く、林マイナス）を判別し、蛍光活性のある細胞種類（FACS）を分類するため、細胞表面のマーカー蛍光性のラベルをされた単クローンの抗体によって増強する。その他の実施の形態としては、選択された細胞のサンプルは、増殖させられることなく移植することである。
【０１５３】
いくつかの実施の形態としては、骨髄の内生幹細胞は、治療幹細胞の移植に先立って排除されるか減少される。治療幹細胞は、有用な配列または治療ベクターを含む幹細胞として定められる。いくつかの実施の形態としては、移植過程は、以下の段階を含む。
（1）前処置、（2）肝細胞注入、（3）好中球減少性段階、（4）生着段階、そして（5）生着完了段階。
【０１５４】
いくつかの実施の形態としては、一般的に望まれる細胞（例：。骨髄干細胞）を生成する内在性の幹細胞は、に移植先立って排除または減少される。化学療法、放射線などおよび/あるいは米国特許6217867にあるものに類似した、方法は、移植に最適な生着のために骨髄の状態と整える手法として利用されるだろう。最終的には治療幹細胞は、この技術に関してよく知られている方法を用いて患者にされるだろう移植。
【０１５５】
麻痺/Numblikeとその他の導入遺伝子を符号化したベクターの設計は、
ある実施の形態としては、Numblike /麻痺アイソフォームを符号化した核酸鎖の核酸の移入は、ウィルスの核酸の移入を介して完成される。"麻痺/Numblike符号化ベクター"単語は、核酸鎖というを符号化したNumblike/麻痺アイソフォームおよび/あるいは合成オリゴヌクレオチドがNumblikeまたは麻痺アイソフォームだけでなく、あらゆる付加的な導入遺伝子鎖、合成オリゴヌクレオチドなど、およびそれらベクター鎖と合体する関連ウィルス浮遊物を標的とするベクターである。
【０１５６】
麻痺/Numblike符号化ベクターは、遺伝子発現ベクターから成りうる。
最適な遺伝子発現ベクターはは、DNAまたはRNAのを真核細胞への核酸の移入のために。そのようなベクターは、これらに限られるわけではないが、例えばバクテリアベクター、真核されるものだろう使用ベクターなどの原核細胞ベクター、例えばイーストベクター、真菌性ベクター、またアデノウィルスベクター、アデノ関連ウィルスベクター、レトロウィルスベクターなどのウィルスベクターがある。動因されるレトロウィルスベクターの例としては、これらに限られるわけではないが、モロニーマウス白血病ウィルス、モロニーマウス肉腫ウィルスや、ラウス肉腫ウィルス、FIVは、HIV、SIVの、混成ベクターなどを含む。
【０１５７】
麻痺/Numblike符号化ベクターが生体内および/あるいは生体外の細胞への核酸の移入にも用いられることが明らかにている。核酸の移入は、この技術では良く知られた方法により行われ、なっ特にウィルス包括細胞から生成されたウィルスを用いて行われる。このようなウィルスは、様々なウィルスタイプにできるよう感染にキャプシド形成させられる。言うまでも無く、選択された細胞タイプおよび/あるいはその結果である集団の感染を認めるキャプシド形成技術は、本発明における状況において実用的である。
【０１５８】
ヒト免疫不全ウィルス対（HIV）の遺伝子治療用ベクターの設計
"治療用ベクター"は発現ベクターを含んでいてもよい。適切な発現ベクターはのDNAあるいはRNAのを真核細胞にするのにトランスフェクト採用できるベクターである。このようなベクターには、例えば、アデノ
有効な連鎖は、HIVウィルスが細胞に感染する、ウィルスDNAを転写する、または感染した細胞内で複製する能力を減少させるまたはHIV感染ウィルスを中和する能力を高めるものだろう。
【０１５９】
特定の実施例においては、、有効な連鎖とはHIVウィルスの侵入を妨げる合成オリゴヌクレオチドで、siRNΛ、shRNA、アンチセンスRNA またはmiRNAが、いかなるHIV受容体（CXCR4、CCR5、CCR2b、 CCR3、 およびCCRlなどに限らず）に対抗することができる。
【０１６０】
一つの実施例では、治療用ベクターとは、CXCR4、CCR5、CCRl、CCR2、CCR3、CXCR6および／あるいは BOBなどのHIV共受容体の1つまたはそれ以上を標的にする、合成オリゴヌクレオチドを含む。
【０１６１】
別の実施例では、治療用ベクターは主要なHIVウィルス共受容体であるCXCR4 とCCR5を標的にする、合成オリゴヌクレオチドなどがある。
【０１６２】
更なる実施例では、合成オリゴヌクレオチドを含む治療用ベクターは、1つまたはそれ以上のHIV逆転写酵素、インテグラーゼ、タンパク分解酵素などのHIV酵素を標的にするとある。
【０１６３】
合成オリゴヌクレオチドとして適切な連鎖は、１）コンピュータのアルゴリズムにより、標的連鎖の減少に効果的であると予想でき、２）標準の定量的RNA分析検査および、酵素活性検査で70パーセント以上、または劣っていても治療的である度合いで標的酵素を減少させる能力のあるものである。
【０１６４】
「標的配列」という言葉は、特定の配列が、ウイルスゲノムのヌクレオチド配列と少なくとも70%一致するヌクレオチド塩基を有しているあるいは対応するRNA配列であることを示す。本発明の特定の実施例においては、この言葉は、配列が、オリゴヌクレオチドが指向される特定のウイルスのウイルスゲノム配列あるいはその相補配列と少なくとも70%一致することを示す。合成オリゴヌクレオチドの様々な種類のいずれも、治療用ベクターのトランスフェクションを介して発現されてもよい。また、本発明はこのようなオリゴヌクレオチドのあらゆる可能な組み合わせに関する。
【０１６５】
一つの好適な実勢例において、合成オリゴヌクレオチドの配列を標的細胞は、特定のプロモーターにより駆動される。別の好ましい実施態様では、合成オリゴヌクレオチド配列U6プロモーターにより駆動される。
【０１６６】
合成オリゴヌクレオチドは、デコイRNAと同じ治療用ベクターに含まれる。
【０１６７】
デコイRNAは、特定のたんぱく質を結びつけ、機能を抑制するのに効果を示すRNAの連鎖である。
【０１６８】
一つの実施例では、治療用ベクターは、集合デコイRNA連鎖から成る。
【０１６９】
更なる実施例では、デコイRNA連鎖は、デコイ連鎖の安定性を与えるために提供された連鎖によって配置される。
【０１７０】
その他の実施例では、デコイRNA連鎖はRREおよび/あるいは TARデコイ連鎖である。
【０１７１】
一つの実施例では、RREと TARデコイ連鎖は、HIV-2から操作されるTARと RRE連鎖である。他の実施の形態としては、デコイ連鎖は、Psi要素デコイをも含むという。
【０１７２】
一つの実施例では、デコイ連鎖はそれぞれU6プロモータによって操作される。
【０１７３】
別個の実施の形態としては、デコイ連鎖は標的細胞の特定プロモータによって操作されている。実施の形態としては、治療用ベクターは、HIV生命サイクルの一次的な段階を標的とし、HIV-2 TAR および／あるいは RREデコイ連鎖を組み合わせて合成ヌクレオチド鎖を符号化している。
【０１７４】
別個の実施の形態としては、ベクターはmiRNAオリゴヌクレオチド鎖を含む。
【０１７５】
別個の実施の形態としては、ベクターはshRNΛオリゴヌクレオチド鎖を含む。
【０１７６】
別個の実施の形態としては、ベクターはsi RNAオリゴヌクレオチド鎖を含む。
【０１７７】
別個の実施の形態としては、ベクターはRNAiオリゴヌクレオチド鎖を含む。
【０１７８】
別個の実施の形態としては、ベクターはリボザイム鎖を含む。
【０１７９】
別個の実施の形態としては、ベクターは合成オリゴヌクレオチド鎖の組み合わせを含む。更なる実施の形態としては、合成ヌクレオチド鎖は、CCR5、 CXCR4などのHIV共受容体を標的にする。
【０１８０】
更なる実施の形態としては、合成ヌクレオチド鎖はインテグラーゼ、プロテアーゼ、逆転写酵素、TATなどのHIV酵素を標的にする。
【０１８１】
更なる実施例としては、リボザイム鎖は、CCR5、CXCR4などのHIV共受容体や、インテグラーゼ、プロテアーゼ、逆転写酵素、TATなどのHIV酵素を標的にする。
【０１８２】
一つの実施例では、ウィルスは療用のベクターを用いて生成され、シュードダイピングされる。
【０１８３】
一つの実施例では、ウィルスは治療用ベクターを用いて生成され、ウィルスはシュードタイプされずに、HIVトロピズムを見せる。
【０１８４】
一つの実施例では、治療用ベクターは、ウィルスベクターである。実施の形態としては、治療用ベクターは、レンチウィルスベクターである。
【０１８５】
一つの実施例では、治療用ベクターは第三世代のレンチウィルスベクターである。一つの実施例では、治療用ベクターは、合成ヌクレオチド鎖を含む。
【０１８６】
一つの実施例では、合成ヌクレオチド鎖の遺伝子配列は、EF-I alphaプロモータまたは他の標的細胞の適正なプロモータによって操作される。
【０１８７】
一つの実施例では、合成ヌクレオチド鎖の遺伝子発現は、1)6プロモータまたは他の標的細胞の適正なプロモータによって操作される。
【０１８８】
一つの実施例では、合成ヌクレオチド鎖の遺伝子発現は、EF-I alpha と U6の組み合わせや、他の標的細胞の適正なプロモータによって操作される。実施の形態としては、HF-I alphaは、U6プロモータがRNAデコイの遺伝子発現を操作する一方で、miRNAの遺伝子発現を操作する。
【０１８９】
一つの実施例では、HF-I alphaは、U6プロモータがRNAデコイの遺伝子発現を操作する一方で、siRNA鎖の遺伝子発現を操作している。
【０１９０】
一つの実施例では、EF-I alphaは、U6プロモータがRNAデコイの遺伝子発現を操作する一方で、shRNA鎖の遺伝子発現を操作している。
【０１９１】
好ましい実施態様では、治療上のベクター、複数のmiRNAの配列は、CCR5、I1IV - 2 RREデコイ配列とは、HIV - 2のTARデコイ配列、およびベクターに対する監督のウイルスベクターは、複数のmiRNAの配列CXCR4に対する監督が含まれます。好ましい実施態様では、治療の治療vcctor（掲載を含む）薬理学的治療を含む抗レトロウイルス療法の他のモードと結合される。治療用ベクターとの組み合わせに適した抗レトロウイルス療法は、治療用ベクターとの組み合わせにおける添加および相乗効果のある治療である。
【０１９２】
HIVの遺伝子治療のための細胞には、末梢血Tリンパ球、単球、組織マクロファージ、T細胞の前駆細胞、マクロファージ単球前駆細胞、および/あるいは臍帯血、末梢血、および占領骨髄スペースなどの多能性造血幹細胞が含まれる、これらに限定されない。
【０１９３】
本発明は、CD4+ T細胞、マクロファージ、T細胞の前駆細胞、マクロファージ単球前駆細胞、CDの34+幹細胞/前駆細胞および/またはその他の静止細胞分裂する細胞で、対外あるいは体内でHIV感染の標的細胞に分化可能な幹細胞や前駆細胞、CD4 + T細胞、マクロファージ、T細胞の前駆細胞、マクロファージ単球前駆細胞、および/またはCD34 +幹細胞/前駆細胞のトランスフェクションに関する。そのため、トランスフェクトされた細胞は、元の位置にある外因性の細胞あるいは、他の身体部位、あるいはその他の個々のドナーから取り出した外因性の細胞となりうる。この目的のために選択された細胞を本明細書では「選択された細胞」と呼ぶ。
【０１９４】
同様に、自己再生可能で、多能性があり、多能化可能な幹細胞の多能性（書き換され、誘発された多能性細胞を含む）は、HIVの遺伝子治療のための別の論理的なターゲットを表し、その使用は、特に本発明の対象となっている。本プロセスの一実施例では、選択された細胞（造血幹細胞、皮膚幹細胞、臍帯細胞、始原生殖細胞（PGC）、精原細胞、アクセス可能な任意の体細胞など）は、1）培養中に1つあるいは複数のサイトカイン（造血幹細胞因子、白血病抑制因子（LIF）、カーディオトロピック1、IL-11、IL-6R、GP-130、CNTF、IGF-I、bFGF、および/あるいはオンコンスタチン-M）を用いて培養され、2）当該技術分野（本明細書で参考として追加されたUSPatent 5677139方法など）で既知の方法を用いた、あるいはその他の標的細胞に関して、US Patent 5677139に類似した方法による分化の前に治療用ベクターまたは有益な配列でトランスフェクトされる。
【０１９５】
別の実施例では、核酸移入の前段階としてさまざまな段階を経るかもしれない。別個の実施の形態としては、多能性の幹細胞を生成する目的で、培養の段階だけが行われることが望ましい。
【０１９６】
その他の細胞培養条件の他、幹細胞および前駆細胞のL1Fおよび造血幹細胞因子の適切な濃度についてはすでに説明している（本明細書において参考用に引用されているUS Patent6432711および5453357）。その他の適切な基準および参考となるサイトカイン濃度については、Koshimizu et al.、1996; Kelleret al.、1996; Piquet-Pellorce、1994; Rose et al.、1994; Park and Han、2000; Guan etal.、2006; Dykstra et al., 2006において説明されている。
【０１９７】
標的細胞の集団は、体細胞、幹細胞、前駆細胞を含むであろう。幹細胞はおそらく、既存する細胞集団や採取される培養、貯蔵、低温保存された材料から分離されたものである。幹細胞の望まれる材料は、骨髄、末梢血管、胎盤血、羊水液、臍帯血、脂肪性組織、ヒト以外の胎芽などである。
【０１９８】
体細胞、特に白血球やその他のnon-progenitor/stem細胞の循環も同様の幹細胞については、上記/前駆細胞は、幹細胞を取得する/結果として、前駆細胞のプロパティの効果的な説明は、同じ培養条件にさらされることがある。
【０１９９】
本発明は、1I1V感染および／あるいはHIV複製へ相対的に抵抗するために作られた幹細胞／前駆細胞から標的細胞を生成することも明らかにする（USPatent Application 20030099621など)。
【０２００】
一つの実施例では、治療用ウィルスベクターは、ネイティブHIV株から1つないしそれ以上の包膜たんぱく質を伴い、ネイティブHIV株が感染しえるあらゆる細胞に対し感染する能力を持つ治療用ウィルスを与える。
【０２０１】
本発明のために選択された細胞は、一般的にアクセスしやすいとされる細胞である(（帯血幹細胞、骨髄幹細胞、精巣の精原細胞、原始細菌細胞、羊水液から独立された幹細胞、皮膚から独立された幹細胞など）。これら細胞はこの研究方法にてよく知られている方法により、組織から取り除くことができる。
【０２０２】
他の選択された細胞は、再プログラムされた細胞、誘導された多能細胞、多能化細胞から成るであろう。
【０２０３】
本発明の一つの側面によれば、選択した細胞から、目的の細胞株、細胞型、あるいは細胞分類を生成する方法が提供される。一般的に、この方法は、最適な成長速度で選択した細胞の成長を促進する条件下での選択した細胞および/あるいはその子孫の培養を含む。次に、生成された細胞集団は通常最適な速度未満の速度で、および細胞の必要な細胞株、細胞型、細胞分類（CD4 + T細胞など）への分化を促進する促進剤の存在下で細胞の成長を促進する条件下で培養される。本発明はこの他に、治療用ベクターによるトランスフェクション前あるいは後に当該技術分野（US Patent Application 20060099177など）で既知の手段によって、選択した細胞および/または培養中の子孫の増殖を開示する。このような方法はまた、LIF、造血幹細胞因子、11-6、IL-7、オンコンスタチン-Mおよび/あるいはカーディオトロピックI、およびその他の成長促進サイトカインなどによる培養を含む。本発明はさらに、適切なサイトカインおよびM-CSF(CSF-I )、GM-CSF、L-7、CD4+ T 細胞分化を促進する任意のサイトカインなどコロニーを刺激する因子などの成長因子を含む媒介での更なる培養により治療用ベクターで必要な細胞型にトランスフェクトされた細胞の定方向分化も開示する。
【０２０４】
選択した細胞および標的細胞のトランスフェクション遺伝子組み換えは、外因性の細胞あるいは内因性の細胞であるかに関係なく、当該技術分野（U.S. Pat. Nos. 6,432,711, U.S. 05,593,875, U.S. 05,783,566, U.S.5,928,944, U.S. 05,910,488, U.S. 05,824,547など）において既知であり、公開済みあるいは未公開の方法、あるいはその他の一般的に通用する手段によって実施可能である。宿主細胞を変換するための適切な方法は、Sambrooket al （Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring HarborLaboratory press （1989））およびその他の研究室の教科書に記載されている。
【０２０５】
正常にトランスフェクトした細胞を選択プロトコルRNAの発現アッセイと形態素解析に加えて、抗生物質耐性遺伝子などのマーカーを含むことによって識別できる。適切なレベルで外因性のDNAを発現する正常にトランスフェクトした細胞から生成されたクローンは、凍結保存（当該技術分野で既知の適切な冷凍保存方法を用いて）によって細胞株として保存できる。
【０２０６】
選択可能なマーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）は、G418、ハイグロマイシン、アンピシリンとブラストサイジンなどの薬に耐性を与えるマーカーを含んでいてもよい。対象となる遺伝子を含む細胞は、選択可能なマーカー遺伝子が生き残り、それ以外のマーカーは死滅する薬品選択によって特定できる。
【０２０７】
本発明の実施の形態における理論上の根拠は、ここで記されている通りである。しかしながら、ここでの議論は本発明を制限し否定するものではない。ここでの手法の技術は、本発明の理論上の根拠を記すために用いられたモデルに関わらず実用的に使用されるものである。
【０２０８】
本発明は、以下の例に従い尊敬の念をこめて書かれた。しかしながら、本発明における視野は、これらに限定して示されたわけではない。
【実施例】
【０２０９】
例１．本発明に最適な導入遺伝子ベクターの構築
つの遺伝子私日成Vの- EGFPの- HSAを例に適していますEGFPの、麻痺しHGFP - Numblikc、およびEGFPの- Xのレンチウイルスベクター（ここでXは任意の遺伝子本発明で説明）の適切なウイルス性ベクターにクローニングによって生成されることができますベクター（ライザーら、2000））。アダプタのプライマーNumblikeと麻痺アイソフォームcDNAおよびクローンのPCR増幅のために遺伝的ベクターに選択することができます。クローン作成の準備では、遺伝子ベクターの酵素で消化される。その後、各遺伝子のcDNAネフ地域は、以前私はISAのcDNAを占領コーディングに挿入される。EGFPの（強化緑色蛍光たんぱく質）と細胞集団に適切なプロモーター（CMVすなわちまたはEFlアルファなど）は、以前は、ウイルスのコード領域に挿入されたこと。遺伝子ベクターのバックボーンを含むことがあり、これはプロモーターoperably異種核酸配列にリンクを調節する転写を構築します。
【０２１０】
が採用される可能性がありますレトロウイルスベクターの例を含むがこれに限定されない場合は、それらMoloneyマウス白血病ウイルス、Moloneyマウス肉腫ウイルス、およびラウス肉腫ウイルス、FIVとHIV感染から派生した。適切な発現ベクター、これらは、真核生物の細胞にDNAまたはRNAのトランスフェクションに雇用されることがあります。このようなベクターを含むがこれに限定されないが、例えば、細菌のベクター;真核生物のベクターなどのような原核生物のベクターは、例えば、酵母のベクターと真菌のベクターおよびウイルスベクターなどが、これに限定されない、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターに関連し、レトロウイルスベクター。レプリケーション無能pcDNA 6.2/EmGFP-Bsd/V5-DESTベクターの適切な発現ベクター（Invitrogen社）の一例であり、合成オリゴヌクレオチドの式（の miRNAなどができます）は、pcDNA 6.2重量から転送/のmiRベクターは、切断する能力を持ってターゲット配列。これらのベクターからループ配列miRNAの内因性の長いpol IIの転写産物から（事前のmiRNA）は、人工miRNAの切除を直接に隣接しています。
【０２１１】
特定の内生RNA種に対抗する複合的なmiRNA連鎖の結合は、標的細胞配列の遺伝子発現を減少させる過程の成功を促進させる可能性がある。miRNA連鎖は、手術可能な組織の特定プロモータに関連しているかもしれない。
【０２１２】
遺伝子発現のためにレンチウィルスベクターを使用することによって、Numb / Numblike符号化ベクターおよび／あるいは本発明における他の導入遺伝子ベクターは、分化細胞と非分化細胞のいずれにも安定的な形質導入能力を生む。
【０２１３】
実施の形態としては、結果として生じるNumb / Numblike符号化ベクターおよび／あるいは本発明に用いられる他の導入遺伝子ベクターは、特定のNumbアイソフォームおよび／あるいはNumblikeを減少させるために、1つまたはそれ以上のプロモータによて操作された複合的な合成ヌクレオチド鎖を含む。例２：他の適したベクターの例は、レトロウィルスベクターである。レトロウィルスは、RNAゲノムを含むRNAウィルスである。Gag、pol、 env遺伝子は、LTR配列によって配置される。5' と3' LTR配列は、mRNAの転写とポリアデルニ化を促進する。
【０２１４】
レトロウィルスベクターは、標準的なトランス活性エレメント、IRHS、選択マーカー、標準プロモータによって操作された標的異種性遺伝子を与えることができる。
【０２１５】
また、複数の配列を、複数のプロモーターの制御下で表現されることがあります。最後に、レトロウイルスベクターシスを含む可能性があります配列を逆転写と統合のために必要な演技。感染時には、RNAの逆のDNAには、効率的にホストゲノムに統合され転写される。本発明の組換えレトロウイルスの遺伝子組み換えなどの方法では、一部のネイティブなウイルスのレトロウイルス、感染症の遺伝子が削除されている特定のインスタンスではなく、ターゲットと細胞の遺伝子改変のための核酸配列に置き換え変更される。配列外因性の可能性がありますDNAまたはRNAは、その自然のまたは変更されたフォームです。例3：麻痺の発生の例方法/Numblike符号化ベクター（s）、および/または他の遺伝子組み換えベクター本発明（s）の
麻痺結果/Numblike符号化ベクター（sの生成のための方法）、および/または他の遺伝子ベクター、本発明のこれらのInvitrogen社のウイルスパワーレンチウイルス発現システムマニュアル、2007年に教えています。簡潔に、EmGFP- bsdのカセットPmIlとしてクローン化されてBIpIフラグメントpLenti6/R4R2/V5-DESTベクターに一方、工場長（ペンシルバニア鉄道+）麻痺アイソフォームかのmiR-短い感覚アイソフォーム/ numblikeカセットを同時に血圧によって転送されるpDONR221に反応。その後、調節性のプロモーター（s）とのmiR -アイソフォームカセットマルチサイトのlrされている変更に渡ったpLenti6/EmGFP-bsd/R4R2-DESTvector。複数のベクターは、この方法で合成オリゴヌクレオチドと遺伝子カセットのさまざまな組み合わせで構成で生成することができます。
【０２１６】
pLenti6/R4R2/V5-DESTベクター配列：
【０２１７】
【化１】
2010528613.tif 000002
【０２１８】
【化２】
2010528613.tif 000003
【０２１９】
例４：治療用ベクターの生成の追加的方法
「包括細胞ライン」は、ウィルス gag、 pol、  env構造遺伝子によって、通常細胞が核酸移入されたまたは感染されたことに由来するヒトおよび／あるいは動物の繊維芽細胞から得られる。
その一方で、包括細胞株は、psi配列のRNA欠陥を生む。従って、包括細胞から生成されたウィルス粒子は、gag、pol、env遺伝子を含まない。一度、psi配列を含むベクターのDNAが包括細胞に導入されると、核酸移入ならびに感染のために、包括細胞は治療用のRNAを最終標的細胞(例：.a CD4+細胞)へ移送する様々な能力を生成する。
【０２２０】
治療ベクターの「感染しやすい範囲」は、包括細胞株によって決められる。
包括細胞株の数が、ヒトの細胞タイプに感染しやすい範囲のウィルス生成に役立てられる。これらの包括細胞株は、それでも普段自然に存在し他の動物種に感染しやすいウィルスから得られるウィルスベクターのキャプシド形成ができる。例えば、SIV またはMMLVから分割したベクターは、GP 120キャプシド形成細胞株により包括される。治療用ベクターの補完物を生成する例のプルコトルは以下の方法で得られる。
【０２２１】
１．20マイクログラムのレトロウィルスベクターが、一般的なプラスチック・チューブのIIepes緩衝生理食塩水0.8‐1ミリののタッピングによって選別できるマーカー遺伝子を含まれた2‐3マイクログラムのウィルスDNAと混ぜ合わせられる。
２．70マイクロリットルの2MCaClが、一般的なタッピングを繰り返しながら混合液に入れられる。
３．チューブの中に、青い沈殿が初めて起こったら、生成物は包括細胞の30%の密集した層に生成される(いかなる数の商業用ベンダーから)。DNA混合液は、包括細胞から最初に媒体を除いた後に得られる。
４．包括細胞は、室温25度の部屋で20−30分培養してから、36‐38度の孵化機に3.5時間入れられる。
５．3.5-4ミリの15%グリセロールを含むヘペス緩衝液に3分間加えて、細胞をDulbecco's 修正Eagle's 媒体(DMEM)+! 0% FBS x2で洗浄する。
６．DMKM+10% FBSにもどし、37度で20時間培養する。
７．取り除き、治療用のウィルスを含む培養液をフィルターする。
【０２２２】
過剰なウィルスの上澄みは、瞬時に貯蓄され摂氏80度の培養に集められる。上澄みは、5から8マイクログラムのポリブレンとともに保存され、標的細胞感染の効果を増加させる。別の方法で、ポリブレンは感染させる前に取り除かれるであろう。
【０２２３】
安定的な生産者ラインは、
8。安定的な生産ライン20に分割パッケージング細胞ライン1、または1から40と、その後に、これらの細胞の培養に10日間（）によって媒体選択薬を含む（特定の抗生物質をトランスフェクトした抵抗性遺伝子に対応する例の中3日ごとに変化を確立することができます）。
【０２２４】
10日培養されたのちに取り出され、一定分量に分けられ保存のために冷凍される。
【０２２５】
アッセイレトロウイルス感染性の/滴融合"テストの層にウイルス上清の定義されたボリュームのアプリケーションで実現しています"細胞のようなNIII 3T3細胞20％の合流点にメッキ。NIHのための後、2〜3の細胞分裂回（24-36時間3T3細胞）"テスト"のコロニーの細胞系抗生物質には37度を含む培地で培養カウントされる。清の力価、これらの植民地から推定されている次の算式によりカウント：
コロニー形成単位/mlの=植民地Xの0.5（分割要因）を同定/ウイルスの量（）mlの
この推定値の精度は、大量のテストによって増加は、"テスト"細胞の多くはプレート上清。
この見積りの正確性は、「試験」細胞より多くのより多くの上澄みをテストすることで増加する。
【０２２６】
治療用ウィルスの上澄みのアプリケーションは、治療での状況に適した様々な方法により成される。
【０２２７】
例５：選択された細胞のための成長培養環境
選択されたセルを拡大することができます/ダルベッコの修正最小必須培地（DMEM培地）で栽培さグルタミンで補足し、β-メルカプトエタノール、10％ウマ血清量（）、ヒト遺伝子組換え白血病抑制因子（LIF）のが。LIF および、多能性、未分化または多能性の状態では、このような細胞をダルベッコの修正最小必須培地で維持することができます選択したセルを維持するために不可欠である細胞のフィーダー層（これも）採用される可能性があります上を維持し、選択したセルの必要性を置き換える（DMEMに）グルタミンと、補完β-メルカプトエタノール、10％ウマ血清量（）、ヒト遺伝子組換え白血病抑制因子（LIF）のが。 LIFおよび未分化状態を米国特許6432711（一部屋あたり）細胞の維持に不可欠な細胞のフィーダー層（これも）採用される可能性があります上のセルを維持するため必要が置き換えられます。
【０２２８】
ためには、細胞をトリプシンている神経細胞には、選択した細胞の分化を開始するとLIF無料で洗浄し、DMEMに置か10％牛胎児血清（FBS）を補充。 DMEM培地に再懸濁と10％のFBSをした後、IXlO5細胞を5mlのDMEMに、10％FBSを、0.5ミクロンのレチノイン酸では、細胞の小さな集合体を形成すると予想されている60ミリメートルフィッシャー細菌学生のペトリ皿で、メッキされる。適切な細胞の分化の集約に役立ちます。適切な神経細胞の転写因子を持つ高効率トランスフェクションの前またはDMEM培地、FBSを、レチノイン酸のめっき後に発生することができます。（追加の詳細については）米国特許643271 1 5453357してください。
【０２２９】
例６：HLAマッチング  標的細胞(例：例：臍帯血、その他の適する根源および／あるいはその結果からの臍帯血または細胞.)は検査され、遺伝子組み換えされ（オプション）、増殖させられ、望まれる細胞タイプ（オプション）への分化のために誘導される。それら細胞は、標準的な幹細胞移植プロコトルに従って移植される。確かな例として、細胞はHLAマッチングなしに移植される。例７：ごくまれな例では、生体内における細胞分化を刺激し促進させる目的で、導入遺伝子を符号化するベクターを患者に導入することは適切であるとされている。
【０２３０】
例８：選択された細胞の遺伝子組み換え
体外では外因性の細胞や、患者の内因性の細胞の遺伝子改変のいずれかまたは未発表の方法は、アート（米国パットなどに知られて公開さに応じて実行することができます。番6,432,71 1、米国05593875、米国05783566、米国5928944、米国05910488、米国05824547など）や、他の一般に受け入れられたことを意味し。宿主細胞に変換するために適した方法をSambrookらで発見することができます。 （分子クローニング：実験室マニュアル第2版、コールドスプリングハーバー研究所を押します（1989））、および他の研究室の教科書。正常にトランスフェクトした細胞を選択プロトコルRNAの発現アッセイと形態素解析に加えて、抗生物質耐性遺伝子などのマーカーを含む識別される。正常にトランスフェクトした細胞からクローンは、適切なレベルでは、適切な外因性のDNAを表現する凍結保存によってセルの行（）として凍結保存の芸術に知られている任意の適切な方法を活用し維持することができま
選択マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）、これらG418、ハイグロマイシンとメトトレキサートなどの薬に耐性を授与などがあります。細胞の関心のある薬剤選択によって識別されることができる遺伝子を含む場所のセルには、選択可能なマーカー遺伝子の生き残る設立しており、他の人死ぬ。
【０２３１】
現在の発明"とは、発明の選択されたセル"とは、遺伝子組み換え細胞の選択を開示する。長期的遺伝子改変細胞の遺伝子の改変に選択したセルを、天然または合成の核酸を導入することを指します/またはその子孫、または不死化細胞株および/または任意の芸術に既知の手段によってその子孫。また培養条件は、遺伝子発現パターンの永続的な変化を誘発する本遺伝子改変を表すために考えられている。幹細胞の改造かどうかは、ホストの脳から派生する、内因性ドナー源、外因性のドナー源、またはセルの行を、特に人間の神経システムの特定の人間の病気の治療に実行可能なアプローチを表しています。
【０２３２】
遺伝的変更は、この情報開示の対象が、これらに限定されていません：遺伝的改良in vivoでの実行;変更は、アクティビティや代謝酵素の内因性または外因性の選択したセルを発現量を変更する/またはその子孫;変更は、活動の量を変更する細胞たんぱく質の、または抗原;は、アクティビティや蛋白質のシグナル伝達経路に関与する量を変更する変更、修正は、HLAのタイプを変更する;は、細胞の分化を変更変更;は、腫瘍の可能性を変更する修正;は、細胞の分化を変更変更;変更は、変更する量や構造たんぱく質の活性;は、量や膜関連たんぱく質の活性を変更する変更（構造や酵素）;変更は、アクティビティやたんぱく質、DNA修復および染色体の維持に関与する量を変える;変更は、アクティビティやたんぱく質の量を変更する細胞輸送に関与する;変更は、アクティビティや酵素の量を変える;変更は、アクティビティや蛋白質のシナプスの形成と維持に関与する量を変える;変更は、アクティビティやたんぱく質の神経突起伸長や軸索伸長や形成に関与する量を変える;変更は、セル内の量や抗酸化物質を生成酵素の活性を変える;は、変更後の細胞内たんぱく質の翻訳後修飾につながる変更;は、アクティビティやたんぱく質の細胞修復の他の側面に関与する量、これは寿命の増加変更変更変更細胞テロメラーゼの生産（など）。これら上記のようにこのような蛋白質、DNAやRNAによるヒトゲノムや他の動物、植物、ウイルス、または細菌ゲノムから派生したエンコードされることがあります。また、配列ノボド設計をカバーこの発明は。
【０２３３】
加えて、本発明に関連して、選択したセルとのin - situ、遺伝子組み換え技術で/またはその子孫細胞は病気の治療のために。内因性の細胞に直接注入やDNAまたはRNAベクター、ウイルス、レトロウイルスなどのアプリケーションでその場で変更することが幹細胞は、組織の物質にリポソーム等、または脳室系の適切な部分に。1992年以来、我々は、この方法で、幹細胞の数千/前駆細胞や何千もの子孫細胞を更新している。私たちのデータを表示、変更、セルの種類の非常に様々な神経システム全体の前駆細胞の結果を変更する副作用のような結果はないが、この方法、および。例9：遺伝子ベクターの導入は、ホストに。
【０２３４】
好ましい実施態様では、内因性細胞のベクターと、これらのような本in vivoでのホストの血液、組織、中枢神経系への治療のベクター（s）の導入によって、骨髄などの最大の利点は変更することによって達成される可能性があります説明トランスフェクトされる内因性の標的細胞の数が多い。これは、適切に、デバイスのように、または静脈や動脈循環には、治療のベクターを注入する針、筋肉組織、または中枢神経系になどの特定の組織にカテーテルのサイズを使用することによって達成されることがあります。好ましい実施態様では、ウイルスVSVの偽型は- gをエンベロープ糖たんぱく質とネイティブのHIV -私envたんぱく質。
【０２３５】
例10：注射神経系の移植を選択したセルに成長や分化のメディア（のいずれか）は胎児の神経系や内因性の胎児の細胞の遺伝的ベクターを利用した遺伝子組み換え技術により、次の方法で達成される可能性があります：無菌状態の下では、子宮や胎児を超音波やによって視覚化され放射性物質の指導、他。で胎児の頭蓋骨のランドマークの直接の識別を容易にする別の方法としては、子宮手術で公開されることがあります。選択されたセルを注射によって（使用して適切にカテーテルや針の大きさ）は、心室のシステムは、胚ゾーン（掲載に）導入することができますまたは中枢神経系の物質に。注射特定のインスタンスでは、母親の腹壁を介して実行されるかもしれませんが、胎児に子宮壁と胎児の膜。注射の精度を直接観察、超音波、コントラスト、または放射性同位体に基づく方法、またはその他の手段によって監視されて指導を芸術に知られ放射線。
【０２３６】
腹部の壁は、胎児に子宮壁と胎児の膜。注射の精度を直接観察、超音波、コントラスト、または放射性同位体ベースの方法、または指導art.Under適切な無菌状態のことが知られ放射線、胎児の頭蓋骨のランドマークの直接の身分証明書を視覚的にも達成されるのは他の手段によって監視されて物理的な検査や触診で結合によって定位と指導放射線。細胞培養後、選択、または分化細胞の適切な量を注射または他の手段によって心室のシステムは、胚のゾーン、または中枢神経系の物質に導入することができます。注射の精度を直接観察、超音波、またはによって監視されることが放射性物質の指導、他の。
【０２３７】
ハンチントン病やパーキンソン病、脳の特定部分の細胞のような大人の特定の、神経の病気では中枢神経系、選択的に影響を受けます。パーキンソン病の場合には、黒質のドーパミン作動性細胞です。無菌状態の下で細胞分化の地域特有の疾患の細胞の、ローカライズされた移植大人に影響を与えるX線写真により実現されるように誘導された移植します。放射線技術指導、CTおよび/またはMRIの使用を含めることが注入された材料を監視する利点は、コントラストや同位体比を用いた手法を取ることがあります。
【０２３８】
特定の神経系の病気では、いくつかの代謝貯蔵障害などの細胞は神経系の多様な地域間、そして最大の利点は影響を受けている遺伝子組み換えによって達成される可能性があります成長文化（いずれかから、内因性の細胞または本発明の選択されたセルの導入を変更するびまん性の方法で、大量に組織にメディアや差別化中）。中枢神経系では、これらの疾患の最高の心室内注射によって（適切に、デバイス、または針）の開発の初期段階（特に）では、びまん性内因性のセルを変更または選択したセルの拡散engraflment分離できるようになるカテーテルのサイズを使用して接近する可能性がありますの成長および/または分化のメディアから。それにもかかわらず、同じ目的のために循環系への細胞の注入も覆われている。しかし、すべての障害、複数の臓器や体のびまん性（）リソソーム貯蔵障害、hemoglobinpathies、筋ジストロフィーなどに影響を与える点で、細胞の成長および/または分化メディアからの分離にも優先的に直接循環および/または臓器に導入される可能性があります肝臓、腎臓、腸、脾臓、副腎、膵臓、肺などの臓器は、胸腺を使用して指導し、任意の適切な、デバイスのように、全身の細胞のびまん性移植できるだけでなく、特定のカテーテルのサイズの内視鏡導入と細胞の浸潤、選択された臓器に。
【０２３９】
例11：血液循環の流れと器官への注入による細胞輸送
1つの器官系の病気別々の器官系から遺伝子組み換え細胞を治療できる可能性があります。また、いくつかのインスタンスで、その選択したセルを統合することがありますが独自に生体内、十分な数字で区別する場合は、血流は動脈、静脈または肝、に成長との培養後に注入され、/または明らかになる可能性があります分化メディア。このアプローチは、本発明で覆われている。びまん性筋の治療（）、（遺伝性球状赤血球例えば、鎌状赤血球貧血、他のhemoglobinopathies等）は、例えば、細胞の成長をメディアや差別から分離されたの注入を伴うことがあります器官、組織、または血液疾患筋ジストロフィーなど患者にメディア、特に、患者の循環。このアプローチは、また、心筋梗塞、脳卒中などの虚血性傷害を改善するだけでなく、脳や他の組織への外傷と考えられています。針やカテーテルによる血流中にそのような細胞は、現在の発明により生産の射出、直接ように、細胞の"ホーム"は、骨髄、筋肉を有効にして、腎臓、肺、および/またはその他の他の器官系、骨髄空間にだけでなく、注射液を直接、本発明の練習用に適しています。とや、超音波、放射線や透視また、本発明の練習用に適していますせずに、損傷部位に細胞を同様に注射を直接。
【０２４０】
本発明において有効な選択された細胞を独立させる方法は、Zhao et al., 2006によって書かれているものを含む。
【０２４１】
実施の形態としては、Numblike および／あるいはNumbアイソフォームを符号化する遺伝子ベクターは、Numb またはNumblike導入遺伝子の術法によりアプローチ可能なプロモータにより成る。
【０２４２】
別個の実施の形態としては、核酸移入のモードは、Numblike とNumbアイソフォームの永久的な遺伝子発現よりも、一過性の遺伝子発現を誘導する核酸移入から選択されることができる。
【０２４３】
例12：遺伝子組み換えの例
これは、病気の数百の臨床条件ができると考えられて扱われることをおよび/または含む本発明の方法によって、改善さないようにカナバン病（ASP）に限る。テイサックス病（HEXAの）;レッシュナイハン症候群（HRPT）;ハンチントン病（HTTの）;スライ症候群;タイプAとBのニーマンピック病型;サンドホフ（HEXB）病、ファブリー病（総賃貸）; C型ニーマンピック病（NPCl）;ゴーシェ病（ GBアドバンス）;パーキンソン病（PARK2等）フォンヒッペルリンダウ病、鎌状赤血球貧血（HBB）およびその他のサラセミアなどと同じような病気。これらの導入遺伝子のコーディング領域、または通常の遺伝子のコーディング領域の一部を表すことがあります。は、特定の実施態様および例は、上記に限定されることが理解されるためには、しかし、その発明の範囲ではありません。発明以外の練習になるかもしれません、特に説明しても、添付の特許請求の範囲内である。
【０２４４】
例13：多能化細胞を提供し、長Numbアイソフォーム、Oct-4、Sox-2、 EmGFP核酸鎖を発現するベクターの配列の例は、
【０２４５】
【化３】
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【０２４６】
【化４】
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【０２４７】
【化５】
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【０２４８】
【化６】
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【０２４９】
【化７】
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【０２５０】
【化８】
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【０２５１】
上のベクター配列に対応する図式化マップは、図１に示されている。
【０２５２】
ベクターを完全にdenovoの遺伝子合成、または一部を麻痺、ソックスとOCT3のクローン技術で構築される可能性があります/位置LacZのでインビトロジェンpcDNA4tolacZベクターの中で占領に4cDNA配列。同様に、tetR遺伝子インビトロジェンpcDNA6/TRベクターの中で発見される。遺伝子を参照の配列を符号化もpcDNA41acZベクターにクローニングに適しています。
【０２５３】
代わりにtetR遺伝子は標的細胞に、pcDNA6/TRベクターを、tetR遺伝子とそのPCMVプロモータを除いた配列により構成されるベクターとの組み合わせにより核酸移入されるだろう。
【０２５４】
同様に、複数のベクターに限り、要素要素に似て採用される可能性があります上記の配列に含まれて存在している。このプロモーターの競争の可能性を減らすことができます。は、他の条件のプロモーター要素は、テトラサイクリン感受性のプロモーター要素の代わりに使用されることが理解されるためだ。
同様に、複合的なベクターは
例14  ここに記された方法（または公表された方法）により生成された、静脈内および投薬内の多能性の幹細胞は、移植細胞が老年期の患者において寿命または健康を増進させるであろう投薬に1回かそれ以上与えられることを期待されている。
【０２５５】
例15  遺伝子細胞の生成
本発明は、ここで記されている方法（またはその他の公表された方法）により生成された多能、多能性、自己再生できる幹細胞から遺伝子細胞を誘導することについて触れている。このような遺伝子細胞の生成は、不妊の治療ならびに生体外での胎芽の生成に適すると考えられている。(例：. Hubner et al., 2003; Kehler et al., 2005;Nayernia et al., 2006a; Nayernia et al., 2006b; Drusenheimer et al., 2007;Moore et al., 2007; etc.)
例16：形質転換動物の形成
本発明は、形質転換動物の形成についても触れている。ここで記されている方法（またはその他の公表された方法）により生成された多能性細胞は、本発明に関して知られている方法により形質転換動物を形成することに有効利用されるだろう。
【０２５６】
例17：治療用ベクターの構築
が採用される可能性がありますレトロウイルスベクターの例を含むがこれに限定されない場合は、それらMoloneyマウス白血病ウイルス、Moloneyマウス肉腫ウイルスから派生した、
とラウス肉腫ウイルス、FIVや、HIV。適切な発現ベクターは、真核生物の細胞にDNAまたはRNAのトランスフェクションに雇用されることがあります。このようなベクターが含まれますが原核生物のベクターには、例えば、細菌のベクター;真核生物のベクターなどのような制限はありませんが、例えば、酵母のベクターと真菌のベクターおよびウイルスベクターなどが、これに限定されない、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターに関連し、レトロウイルスベクター。
【０２５７】
レトロウィルスの例は、ここに挙げるものに限られないが、モロニーマウス白血病ウィルス、モロニーマウス肉腫ウィルスや、ラウス肉腫ウィルス、FIV、 HIVから得られたものがある。適した遺伝子発現ベクターは、DNAまたはRNAを真核生物細胞に核酸移入するために動因される。そのようなベクターには、ここに挙げるものに限られないが、含まれる。
【０２５８】
レプリケーション無能pcDNA 6.2重量/ミールとpcDNA 6.2/EmGFP-Bsd/V5- destにベクターを適切な発現ベクター（インビトロジェン社）の例ですと、合成オリゴヌクレオチドの式（miRNAの例を許可）は、ターゲット配列を切断する能力があります。これらのベクターからループ配列miRNAの内因性の長いpolIIの転写産物から（事前のmiRNA）は、人工miRNAの切除を直接に隣接しています。
【０２５９】
代わりに、HIVpsi配列の包含は、治療用ベクターにネイティブのHIV遺伝子と戦い、ウィルス粒子だけでなく抑制性のHIV輸送物質に包括することを許可する。
【０２６０】
単一の標的に対抗する複合的miRNA鎖の結合は、標的連鎖発現を減少させる成功率を上昇させる。miRNA連鎖は、EF-I alphaプロモータ、いかなる Tcell 特定プロモータのような特定組織のプロモータまたは望まれる細胞での発現を誘導するマクロファージの特定プロモータに手術によりリンクする。
【０２６１】
遺伝子発現のためのDESTベクターを利用すると、結果として生まれた治療用ベクターは、分割した細胞と分割していない細胞の両方の安定的な形質導入を可能にする。
【０２６２】
実施の形態としては、治療用ベクターは、CXCR4、CCR5および／あるは標的細胞におけるHIV感染の共受容体に作用すると知られている他の細胞たんぱく質の発現を減少させるための、1つないしそれ以上のプロモータにより操作される複合的な合成オリゴヌクレオチド連鎖を含む。
【０２６３】
ある治療用ベクターでは(2006年に構築)、CXCR4 とCCR5の共受容体を標的にする4つのmiRNA連鎖が、HIV -2 TAR とRRE を標的にするRNA連鎖に従って、pcDNA6.2 GW/miRベクターにクローンされる。
【０２６４】
遺伝子の構築は、ベクターの背景、異種核酸連鎖の手術によりアクセスできるプロモータを生成するトランス活性化因子を含む。
【０２６５】
他の適したベクターの例としては、レトロウィルスベクターがある。レトロウィルスは、RNA遺伝子を含むRNAウィルスである。gag、 pol、  env 遺伝子は、LTR連鎖によって配置される。5' と 3'LTR連鎖は、転写とRNAのプロアデニル化を促進させる。
【０２６６】
レトロウイルスベクターは、ターゲットの異種遺伝子調節性プロモーターによって運営さ調節できるtransactivating要素は、内部リボソームリエントリー部位（IRES）、選択マーカーを提供することがあります。
【０２６７】
また、複数の配列を、複数のプロモーターの制御下で表現されることがあります。最後に、レトロウイルスベクターシスを含む可能性があります配列を逆転写と統合のために必要な演技。感染時には、RNAの逆のDNAには、効率的にホストゲノムに統合され転写される。本発明の組換えレトロウイルスの遺伝子組み換えなどの方法では、一部のネイティブなウイルスのレトロウイルス、感染症の遺伝子を削除し、変更された実施の形態ではなく、ターゲットと細胞の遺伝子改変のための核酸配列に置き換えています。配列外因性の可能性がありますDNAまたはRNAは、その自然のまたは変更されたフォームです。
【０２６８】
例18：治療用ベクターを生成する方法の例
治療用ベクターを生成する方法は、Invitrogen's Viral Power Lentiviral Expression Systems Manualに記されている通りのものを含む。簡潔に言えば、EmGFP-bsdカセットは、miR-dccoyカセットが同時にBP反応によってpDONR221に輸送される際に、PmII-BIpI断片として複写されpLenti6/R4R2/V5-DESTベクターとなる。それから、EFIaプロモータとmiR-decoyは、修正されたpLenti6/KmGFP-bsd/R4R2-DESTベクターに交配する多部位LRである。
pLenti6/R4R2/V5-DESTベクター配列：
【０２６９】
【化９】
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【０２７０】
【化１０】
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【０２７１】
【化１１】
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【０２７２】
【化１２】
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【０２７３】
例19：生体内で増殖/増殖性の幹細胞/前駆細胞のための方法
順）HIV感染症とは、比較的1に耐性のある標的細胞の大量取得する/または2）HIVの複製および/または3）HIVの転写、前駆細胞/細胞をダルベッコの修正最小必須培地（DMEM培地）で補完成長することができます幹グルタミンとβ-メルカプトエタノール、10％ウマ血清量（）、ヒト遺伝子組換え白血病抑制因子（LIF）のが。 LIFおよび前駆細胞の維持に不可欠である前駆細胞を維持するための必要性/細胞のフィーダー層（これも）採用される可能性があります上の幹細胞を置き換える/未分化状態の幹細胞。
【０２７４】
例20：幹細胞は個人から集められ、細胞は治療用ベクターによって核酸移入され、HLAタイピングやマッチングを伴うか否かで一般的な方法により移植の準備をする。
【０２７５】
例21：臍帯血サンプルは臍帯血バンクから得られる。細胞は、有用な配列の治療用ベクターに核酸移入され、HLAタイピングやマッチングを伴うか否かで一般的な方法により移植の準備をする。例22：治療用ベクターの細胞含有物に適する合成オリゴヌクレオチド配列の例
70%以上のたんぱく質発現を減少させるいかなる合成オリゴヌクレオチド鎖も本発明により言及されている。
【０２７６】
任意の合成オリゴヌクレオチド配列が正常に標的細胞の能力を"70％以上をHIVに感染複製を維持するために削減が低い"の70％が治療の学位またはHIVウイルスの活動やしかし、治療の程度低いまた、この発明によりカバーされています。
【０２７７】
Examplesof miRNA sequences include miRNA sequences derived by IVGN
【０２７８】
【化１３】
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【０２７９】
Similarly,miRNΛ sequences targeting the CCR5 gene include top strand: 5'-
【０２８０】
【化１４】
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【０２８１】
例23：治療用ベクターにおける細胞含有物に適したデコイRNAの例
すべての桜が正常に標的細胞の能力を"70％またはITIV複製を維持するために削減する配列が低い"の70％が治療の学位またはHIVウイルスの活動やしかし、治療の程度低い本発明でカバーされています。
【０２８２】
例TARをデコイ配列です。
【０２８３】
【化１５】
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【０２８４】
Anexample RRE decoy sequence is 例RREデコイ配列です。
【０２８５】
【化１６】
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【０２８６】
例24：RNAデコイの安定性を提供する側面連鎖
RNAデコイに適した側面連鎖の例は以下に挙げられる。
【０２８７】
【化１７】
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【０２８８】
以前は、それはとりのいずれかの側にヘアピン、19ヌクレオチドの5'側のU6のRNAの（したNTDS）も3'幹、直ちにPOEIII用ポリターミネータの前に並ぶ配列、実証されたより高い安定性を示した。この配置は3'-5'エキソヌクレアーゼの攻撃から保護するものと期待されている3'トレーラーを挿入するRNAの折り畳みに干渉する可能性を低減する。は、最初の3年/4 tRNAの配列は、挿入の5'末端に存在して保護されるべきであるし、核からの輸出を阻止する必要があります（グッドら、1997）。
【０２８９】
例25：治療用のベクターの受け入れ先への導入
実施の形態としては、血液幹／前駆細胞、標的細胞は、生体内において治療用ベクターの受け入れ先血液や組織、骨髄への導入により治療用ベクターによって核酸移入される。最大の有効点は、より多くの標的幹細胞／子細胞を組み換えることによって得られる。これは、適したサイズのカテーテルのような装置を用いて、また治療用ベクターを静脈や循環動脈に注入するための針などを利用して行われる。
【０２９０】
例26：受け入れ先への遺伝子組み換えされた細胞の導入
成長した末梢血管Tリンパ球、単球、マクロファージ、T細胞子細胞、マクロファージ単球子細胞、および／あるいは多能性の造血幹細胞などの血液細胞は、他の幹細胞/前駆細胞と同様に、生体外において治療用ベクターを用いて核酸移入される。治療用ベクターの適切な濃度は、Browninget al., 1999と一致したものである。その後、治療用ベクターによって核酸移入された細胞は、骨髄や他の組織で"本拠地化"できる。
【０２９１】
ここで書かれている例や実施の形態は、説明的な目的であり、様々な組み換えまたは変化が起こると考えられる。全ての引用された出版物、特許、特許出願は、すべての目的において、ここで編入されたことを理解されなくてはならない。
【０２９２】
例27：本発明を利用し発現、標的にされた導入遺伝子の例
本発明を実行するのに有効な導入遺伝子配列は、本発明への利用に有効である。適したヌクレオチド連鎖は、望まれる細胞の活性が得られる限り、どの種からも採取される。このような連鎖の呼称方法は、ここで記された小さなものから重要なものまで、特別な種類は表わさない。NCBIデータベースに保存される連鎖は、上記の本アプリケーションにあるような例を表わす。これらは、本発明に有効な連鎖を符号化する特定導入遺伝子の例でもある。
【０２９３】
【化１８】
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【０２９４】
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【０３２５】
【化５０】
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【０３２６】
【化５１】
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【０３２７】
挿話として引用されている全刊行物の内容および次のアメリカ合衆国における特許は、そのま記載および追加されている。5453357, U.S. 05,593,875, U.S. 05,783,566, U.S. 5,928,944, U.S.05,910,488, U.S. 05,824,547
【図１】
2010528613.tif 000053
【配列表】
2010528613000001.app
【誤訳訂正書】
【提出日】平成22年4月20日(2010.4.20)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
２１世紀の医療における優れた挑戦は、損傷し擦り切れまたは遺伝子学的に損なわれた細胞を、置換することであろう。ＤＮＡへ明確に結ばれる転写調節因子は、遺伝子発現の調節において重要な役割をなしている。どの細胞プログラムが活性化され、どれが止められているかを決定するものは各細胞における転写調節因子の特定の補完物である。この機能で転写調節因子は、細胞の同一性を決定・維持し、同様に細胞の脆弱性を決定する役割がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００２】
（発明の要約）
まだ多能化されず自己再生できない細胞から、増殖し自己再生し、多能で多能化できる細胞集団を得る能力は、細胞療法を利用する全ての分野において明らかに有益なものであろう。これらの分野は、骨髄移植、輸血、遺伝子療法を含み、患者独自の幹細胞や、その他望まれる種類の細胞の生成が可能になる。同様に、神経、筋肉、その他の様々な望ましい細胞集団への分化を始める能力は、医療や動物を含む商業面の過程にとって大きな価値を生むであろう。それに応じて本発明は、遺伝子生成の方法、多能な細胞集団の利用、多能性の細胞集団の利用、神経細胞集団の利用、筋細胞集団の利用、またＨＩＶ耐性細胞集団のような他の望まれる細胞集団の利用を提供する。
【０００３】
本発明の請求は、単独もしくは（ｎｏｔｃｈ、ｎｕｍｂおよびｎｕｍｂｌｉｋｅなどの）他の細胞運命デターミナントとの組み合わせによって、一時的（多能、多能性、および／または自己再生可能）な、または固定された（分化されたまたは体）細胞の表現型であると考えられるものの変換を可能にする、特定の転写調節因子の有効的な導入または過剰発現についてである。
【０００４】
信頼できる表現型の転換や細胞の再プログラムの能力により、個々の患者に適応した幹細胞、代替細胞、組織、器官の生成が可能になる。
【０００５】
遺伝子治療技術や細胞培養技術に合わせて、細胞タイプの相互変換は、移植に適応できる、疾患に耐性があり、遺伝子学的に修復された細胞を生成することもできる。
【０００６】
本発明の目的は、増殖でき、自己再生可能で、多能および／あるいは多能性の細胞集団だけでなく、他の望まれる細胞集団を生成する方法を、癌遺伝子を使わずに分裂した細胞または分裂していない細胞から提供することである。分化した細胞集団は、特定に分類された細胞タイプと関連する全てのマーカーではないが、いくつかのマーカーを発現する細胞から成る。ここで述べられているように、他の導入遺伝子（特に転写調整因子）との組み合わせによって発現する適切なＮｕｍｂアイソフォームは、分裂した、多能化した細胞集団または分化している細胞集団の生成を可能にする。さらに本発明における遺伝子ベクターは、遺伝子改変（例：患者で欠損している遺伝子産物が発現）を生み出すため、および、一時的もしくは永久的に増殖でき、自己再生できる細胞の性質または、幹細胞や前駆細胞の性質をインビボで内在性細胞中に誘導するために使われ得るが、具体的には、それらの内在性細胞は、普通ではこのような性質は見せないかもはや見せない組織の中で発見されるものである。最後に、本発明における他の遺伝子ベクターは、（癌細胞など）異常な作用を見せる細胞で、遺伝子改変を行い、および／あるいは増殖、自己再生、または幹細胞／前駆細胞の性質を防ぐのに用いられる。病気の過程を和らげることが予想される、合成オリゴヌクレオチド配列の発現を可能にする、治療上のベクターや細胞を生成することも本発明の目的である。例えば本発明では、ＨＩＶおよび他の免疫不全ウィルス感染、増殖また拡大に重要な遺伝子の発現を低減させるための合成オリゴヌクレオチドの利用を明らかにする。
【０００７】
本発明は脊椎動物の細胞ならびに魚類、哺乳類、鳥類、両性類、爬虫類の細胞など、いかなる適した細胞にも利用できる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、実施例１３のベクター配列に対応するベクターマップを示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
（発明の詳細な説明）
全ての特許、特許出願、ならびに本出願書で引用された出版物は、そのまま参照し本論に引用されている。ここで論じられているように、「ＤＮＡ」はデオキシリボ核酸を表わし、「ＲＮＡ」はリボ核酸を表わす。ここで書かれている、「ｃＤＮＡ」は相補的ＤＮＡを意味し、「ｍＲＮＡ」はメッセンジャーＲＮＡを表わす。
【００１０】
「ｓｉＲＮＡ」は小干渉ＲＮＡを表わし、「ｓｈＲＮＡ」は小ヘアピンＲＮＡを表わす。「ｍｉＲＮＡ」は、単一ストランドＲＮＡ分子や、特に約２０から３０の長さのヌクレオチドを持ち遺伝子の発現を調節する可能性があるマイクロＲＮＡを表わす。「ｄｅｃｏｙ」および「ｄｅｃｏｙ  ＲＮＡ」ならびに「ＲＮＡ  ｄｅｃｏｙ」は、リガンドに対する天然の結合ドメインを模倣したＲＮＡ分子を表わす。
ここで用いているように、用語「ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｎｇ（改善する）」は影響を減らし、または損傷を少なくし、または作用、活性または機能の効果もしくは衝撃を最小にすることを意味し、例えば、疾患または状態による有害な影響を減らすことを含む。
【００１１】
ここで用いているように、用語「ｒｅｔａｒｄｉｎｇ（遅らせる」は影響または作用の進行を緩めるかまたは減少させることを意味する。それは例えば、病気の進行を緩めたり、感染率を低下させたり、疾患または症状の発達あるいは進行を緩やかにするかまたは低下させるように作用することである。
【００１２】
ここで用いているように、「誘発剤」は作用を促進することを助けるかあるいは単独で効果的な作用物質である。例えば、活性を誘引するかまたは増進させることによりプロモータに作用し、またプロモータの統制のもと遺伝子発現に影響する外生の作用物質は誘発剤と称されるだろう。例えば、テトラサイクリンは誘発剤として使われ、ドキシサイクリンも誘発剤として使われるであろう。
【００１３】
核酸配列（ポリペプチドをコードする核酸配列など）は、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的な関係のもとに配置された時に、他の核酸配列（プロモータなど）に対して「作動可能に連結する」と言われている。例えば、もしコード配列の転写または発現に、プロモータが影響を与えたら、プロモータはコード配列に作動可能に連結するということである。ここで用いられているように「駆動される」という言葉は、遺伝子やコード配列がプロモータ配列に作動可能に連結し、プロモータ配列がコード配列の転写または発現に影響を与えることを意味する。
【００１４】
ここで用いているように、「マーカー」は、探知できる分子または探知できる分子のコードまたはマーカーの存在を探知できるような他の分子上の作用のことである。「マーカーたんぱく質」あるいは「マーカーポリペプチド」は、研究室や臨床的環境において探知でき、実施形態において可視できる、たんぱく質あるいはポリペプチドのことである。「マーカー遺伝子」は、マーカーたんぱく質またはマーカーポリペプチドをコードするものである。
【００１５】
ここで用いているように、「ＨＩＶ」はヒト免疫不全ウィルスのことを表わし、例えばＨｌＶ−Ｉ、ＨＩＶ−２などの変異体を含む。他の免疫不全ウィルスとしては、ＳＩＶ（サル免疫不全ウィルス）やＦＩＶ（ネコ免疫不全ウィルス）などがある。ＨＩＶに関連する酵素は「ＨＩＶ酵素」と呼ばれることもでき、例えばインテグラーゼ、プロテアーゼ、逆転写酵素、ＴＡＴ（トランス活性化調節たんぱく質）などを含む。ＨＩＶによる感染は、「ＨＩＶ受容体」と呼ばれる受容体が関わっていると考えられている。「ＨＩＶ共受容体」として名づけられ得る複数のそのような受容体があるであろう。ここで記されているように、「ＨＩＶ共受容体」にはＣＸＣＲ４やＣＣＲ５などがある。
【００１６】
本発明の実施形態における理論上の論拠はここに記されているが、この議論は本発明を縛るか制限するものではない。当業者は、本発明の理論上の支持を説明するために用いられるモデルであるにもかかわらず、本発明の様々な実施形態が実施され得ることを理解する。
【００１７】
好ましい実施の形態としては、細胞は、ａ）増殖している多能または多能性の細胞集団、分化しているｂ）神経細胞の集団、ｃ）筋細胞の集団、ｄ）および／あるいは他の望まれる細胞集団を生成する目的で、利用しやすく分裂しているまたは分裂していない細胞集団から選択される。更に、所望の細胞集団は、生体外、生体内でさらなる分化が可能であり得、および／あるいは生体内で組織に適切な、および部位で適切な一層の分化ができる。
【００１８】
本発明に用いるための選択された細胞の供給源：選択された細胞は、本発明において利用可能であるすべての細胞を含んでいてもよい。本発明で使うために選択した細胞（ここでは「選択された細胞」という）は、他の器官システムに由来した細胞を含む患者の内生的な細胞に由来するか、または外生の供給源から由来した細胞（細胞株、低温保存された供給源、貯蔵された供給源、およびドナー由来のものを含む）であってよい。細胞は、合成あるいは天然の核酸配列を用いて遺伝子改変された細胞から選択されることもある。ここで使用されている「選択された細胞」とは、ヒト胎児性幹細胞は含まない。
【００１９】
本発明の実施形態においては侵襲的な手段の関与なしで単離し得るための選択された細胞は好ましくは容易に採取することができる細胞（例：末梢血白血球、循環造血幹細胞、上皮細胞）、（例：口頬細胞（例：Ｍｉｃｈａｌｃｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ，  ２００４））、脂肪組織（例：Ｇｉｍｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；  Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）、臍帯血液細胞（例：Ｚｈａｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６；  Ｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）、など）を利用した。しかしながら骨髄幹細胞、精原細胞（例：Ｇｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６；  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）、始原生殖細胞（ＰＧＣ）、羊膜から分離した幹細胞（例：Ｉｌａｎｃｈｅｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）、羊水  （例：Ｄｅ  Ｃｏｐｐｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）、同様に皮膚から分離した細胞（例：Ｔｕｍｂａｒ，  ２００６；  Ｄｕｎｎｗａｌｄｅｔ  ａｌ．，  ２００１  ；  Ｓｚｕｄａｌ’ｔｓｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）などは、本発明においても利用された。このような細胞は、当該分野で知られている任意の手段によって、それが存在する組織から分離することができる。
【００２０】
精原細胞は、二段階の酵素消化とそれに続くパーコール分離を使用して分離することができる。細胞をウシ血清アルブミンを補充した最小必須培地（ＭＥＭ）に１０６／ｍＬの最終濃度に再懸濁することができる。具体的には：細管の断片を手術で入手し、掻き裂いた後に、０．１０％炭酸水素ナトリウム、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸、４０マイクログラム／ｍｌのゲンタマイシン、１００ＩＵ〜１００マイクログラム／ｍｌのペニシリン−ストレプトマイシン、および１５ｍＭのＨＥＰＥＳを含むＭＥＭ中で１ミリグラム／ｍｌのトリプシン、ヒアルロニダーゼ、およびコラゲナーゼで処理し、続いて１ミリグラム／ｍｌのヒアルロニダーゼとコラゲナーゼで処理する。精原細胞をさらに細管の断片から３０倍の重力で遠心分離によって分離する。７７ミクロンおよび／または５５ミクロンの孔径を有するナイロンフィルターを介してろ過した後、細胞は収集され、不連続パーコール密度勾配上にロードされる。純度が４０％を超える前駆細胞／幹細胞／精原細胞を含む分画を洗浄して、１０６個の前駆細胞／幹細胞／精原細胞と等価な細胞濃度に懸濁する。その後、細胞は培養され、さらに／または当該分野で公知の任意の凍結保存技術によって保存される。
【００２１】
選択された細胞は遺伝子改変細胞であってよく、特に治療上または商業的に有利なデオキシリボ酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）配列をコードするため当該分野で知られている任意の技術で遺伝子改変された。
【００２２】
本発明の一つの側面によれば、選択された細胞から望まれる細胞集団（例：多能性、  神経、筋肉、など）を生成する方法が提供される。
【００２３】
多能、多能性および／あるいは自己再生可能な細胞集団の生成
ａ）増殖し自己再生できる多能性の細胞集団を得るために、選択された細胞および／あるいはその子孫細胞は、哺乳類のｎｕｍｂ遺伝子の「長」  （ＰＲＲ  ｉｎｓｅｒｔ  ＋）  アイソフォームをコードするものを含むヌクレオチド配列によってトランスフェクトされる。それとほぼ同時に選択された細胞は、短いＮｕｍｂアイソフォームおよびＮｕｍｂｌｉｋｅとを標的にした合成オリゴヌクレオチドによってトランスフェクトされ、それから最適の成長速度で選択された細胞を成長させる環境下で培養され得る。選択された細胞はこのような環境下において、望まれる細胞数に達するまでの十分な期間維持される。細胞はＬＩＦ、鉄因子および／あるいは  Ｉｌ−６、ｈｙｐｅｒ  １Ｌ−６、ＩＬ−７、オンコスタティン−Ｍおよび／あるいはカーディオトロフィン−１と等しい効力の濃度によって培養され得られた（最適な）成長速度で成長し、もしくは成長を増強する他のサイトカインの存在（例：多能性細胞を培養する条件、例：  Ｇｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）によって得られた成長速度によって成長する。成長速度は、前記の成長培地中での選択された細胞の倍加時間よって決定される。同様に、米国特許６４３２７１１と５４５３３５７にある培養環境は、長（ＰＲＲ＋）Ｎｕｍｂアイソフォームによってトランスフェクトされた細胞が最適な成長速度で増殖や拡大するのに適切であり得る。他の適切なプロコトルや参照のサイトカイン濃度は、Ｋｏｓｈｉｍｉｚｕｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｋｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｐｉｑｕｅｔ−Ｐｅｌｌｏｒｃｅ，  １９９４；Ｒｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｐａｒｋ  ａｎｄ  Ｈａｎ，  ２０００；Ｇｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６；  Ｄｙｋｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６；  Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００７によって教示されている。しかしながら、本発明の実施は、これら教示の詳細に制限されない。
【００２４】
一つの好適な実施形態において、選択された細胞は標準的な成長培地において培養される（例：補完（例：グルタミン、ベータ・  メルカプトエタノール）が有るまたは無い最少必須培地。培地は、基本的な繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、鉄因子、白血病抑制因子（ＬＩＦ）および／あるいはＬＩＦ活性がある因子（例：ＬＩＦ、ＬＩＦ受容体（ＬＩＦＲ）、  繊毛状神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、  オンコスタティン  Ｍ  （ＯＳＭ）、ＯＳＭ  受容体（ＯＳＭＲ）、カーディオトロフィン、ＩＬ−６などのインターロイキン（ＩＬ）、ｈｙｐｅｒ  ＩＬ−６、ＧＰ  １３０など）、ウマの血清を含む。ＬＩＦのみではなくＬＩＦ活性がある他の因子は、細胞の自発的な分化を防止する。このような環境下で、ＰＲＲ＋Ｎｕｍｂ  アイソフォームでトランスフェクトされた選択された細胞およびその子孫細胞は、多能、多能性および／あるいは自己再生能力を得ることが期待されている。
【００２５】
一つの好適な実施形態において、選択された細胞および／あるいはその子孫細胞は、「長」  （ＰＲＲ  ｉｎｓｅｒｔ  ＋）  Ｎｕｍｂ  アイソフォームをコードするヌクレオチド配列のみならず、他の導入遺伝子をコードする配列によってトランスフェクトされる。これら導入遺伝子の多くは、ＮＣＢＩ配列データベースに、それぞれの対応する識別番号（アクセッション番号）に基づいて列挙される。
【００２６】
別の好適な実施形態において、選択された細胞および／あるいはその子孫細胞は、他の導入遺伝子をコードする配列と同様に、「長」（ＰＲＲ  ｉｎｓｅｒｔ  ＋）  Ｎｕｍｂ  アイソフォームの部分をコードするヌクレオチド配列によってトランスフェクトされる。これらの導入遺伝子の多くは、それぞれの対応する識別（アクセッション）番号（コード）に基づいてＮＣＢＩ配列データベースに列挙される。一つの好適な実施形態において、選択された細胞やその子孫細胞は、ＬＩＦなどの他の導入遺伝子をコードする配列と同様に、長（ＰＲＲ＋）Ｎｕｍｂアイソフォームをコードする配列によってトランスフェクトされる。
【００２７】
一つの好適な実施形態において、ＬＩＦ活性を有する導入遺伝子を含む他の導入遺伝子をコードする配列と同様に、長（ＰＲＲ＋）  Ｎｕｍｂ  アイソフォームをコードする配列によって、選択された細胞および／あるいはその子孫細胞はトランスフェクトされる。一つの好適な実施形態において、ＬＩＦＲを含む他の導入遺伝子をコードする配列と同様に、長（ＰＲＲ＋）Ｎｕｍｂ  アイソフォームをコードする配列によって、選択された細胞および／あるいはその子孫細胞はトランスフェクトされる。
【００２８】
一つの好適な実施形態において、オンコンスタティンＭ（ＯＳＭ）を含む他の導入遺伝子の符号化された連鎖と同様に、長（ＰＲＲ＋）  Ｎｕｍｂ  アイソフォームによって連鎖を符号化して、選択された細胞および／あるいはその結果である細胞は核酸が入れられる。
【００２９】
一つの好適な実施形態において、オンコンスタティンＭ受容体（ＯＳＭＲ）を含む他の導入遺伝子をコードする配列と同様に、長（ＰＲＲ＋）  Ｎｕｍｂ  アイソフォームをコードする配列によって、選択された細胞やその結果である細胞は核酸が入れられる。一つの好適な実施例において、カーディオトロフィン−１を含む他の導入遺伝子の符号化された連鎖と同様に、長（ＰＲＲ＋）  Ｎｕｍｂ  アイソフォームによって連鎖を符号化して、選択された細胞やその子孫細胞はトランスフェクトされる。
【００３０】
一つの好適な実施形態において、ＣＮＴＦを含む他の導入遺伝子をコードする配列と同様に、長（ＰＲＲ＋）  Ｎｕｍｂ  アイソフォームをコードする配列によって、選択された細胞やその子孫細胞はトランスフェクトされる。
【００３１】
一つの好適な実施形態において、ＯＣＴ３／４やＳＯＸ２を含む他の導入遺伝子をコードする配列と同様に、長  （ＰＲＲ＋）  Ｎｕｍｂ  アイソフォームをコードする配列によって、選択された細胞やその子孫細胞はトランスフェクトされる。
【００３２】
一つの好適な実施形態において、ＮＡＮＯＧやＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２を含む他の導入遺伝子をコードする配列と同様に、長  （ＰＲＲ＋）  Ｎｕｍｂ  アイソフォームをコードする配列によって、選択された細胞やその子孫細胞はトランスフェクトされる。
【００３３】
一つの好適な実施形態において、ＯＣＴ３／４やＳＯＸ２を含む他の導入遺伝子および、ＬＩＦ活性を伴う導入遺伝子をコードする配列と同様に、長（ＰＲＲ＋）  Ｎｕｍｂ  アイソフォームをコードする配列によって、選択された細胞および／あるいはその子孫細胞はトランスフェクトされる。
一つの好適な実施形態において、選択された細胞および／またはその子孫細胞は、ＯＣＴ３／４およびＳＯＸ２を含む他の導入遺伝子、ならびにＬＩＦ活性を伴う導入遺伝子をコードする配列でトランスフェクトされる。
【００３４】
一つの好適な実施形態において、Ｎｏｔｃｈを含む他の導入遺伝子をコードする配列と同様に、長（ＰＲＲ＋）  Ｎｕｍｂ  アイソフォームをコードする配列によって、選択された細胞および／あるいはその子孫細胞はトランスフェクトされる（例：Ｇａｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）。
【００３５】
一つの好適な実施形態において、ＯＣＴ３／４やＳＯＸ２、Ｎｏｔｃｈを含む他の導入遺伝子をコードする配列と同様に、長  （ＰＲＲ＋）  Ｎｕｍｂ  アイソフォームをコードする配列によって、選択された細胞および／あるいはその子孫細胞はトランスフェクトされる（例：ｎｏｔｃｈ１  および／あるいはｎｏｔｃｈ  ２）。
【００３６】
一つの好適な実施形態において、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧまたＮｏｔｃｈを含む他の導入遺伝子をコードする配列と同様に、長（ＰＲＲ＋）  Ｎｕｍｂ  アイソフォームによって連鎖を符号化して、選択された細胞および／あるいはその結果である細胞は核酸が入れられる。
【００３７】
一つの好適な実施形態において、選択された細胞および／あるいはその子孫細胞は、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧを含む他の導入遺伝子、またＬＩＦ活性を伴う導入遺伝子をコードする配列と同様に、長  （ＰＲＲ＋）  Ｎｕｍｂ  アイソフォームをコードする配列によってトランスフェクトされる。一つの好適な実施形態において、選択された細胞および／あるいはその子孫細胞は、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧを含む他の導入遺伝子、およびＬＩＦ活性がある多重導入遺伝子をコードするのと同様に、長（ＰＲＲ＋）Ｎｕｍｂアイソフォームをコードする配列によってトランスフェクトされる。
【００３８】
一つの好適な実施形態において、選択された細胞および／あるいはその子孫細胞は、ＯＣＴ３／４、  Ｎｏｔｃｈ，、  ＨＯＸＢ４  、またＳＯＸ２を含む他の導入遺伝子をコードする配列と同様に、長（ＰＲＲ＋）  Ｎｕｍｂ  アイソフォームをコードする配列によってトランスフェクトされる。
【００３９】
さらに、他のここで記されたものとは異なる遺伝子の組み合わせが、細胞を、多能、多能性とならせることができ、自己再生することができるかまたは分化を始めるようにすることができることが記載または発見されるかもしれない。しかしながら、本特許出願は核酸またはたんぱく質の電気穿孔法（Ｇａｇｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｓａｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｙｕａｎ，２００８；Ｈｕａｎｇ  ｅｔａｌ．，２００７；  Ｘｉａ  ａｎｄ  Ｚｈａｎｇ，２００７；Ｃｅｍａｚａｒ  ａｎｄ  Ｓｅｒｓａ  ２００７；ｌｓａｋａ  ａｎｄ  Ｉｍａｉ，２００７；  Ｌｕｘｅｍｂｏｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｖａｎ  Ｔｅｎｄｅｌｏｏｓ，２００７；Ｔａｋａｈａｓｈｉ，２００７；など参照）、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトなどを適応する任意の有核細胞の「遺伝子再プログラミング」（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；  Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７参照）および／あるいはウィルスの組込み、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変換を避ける別のアプローチなどを包含する。なぜなら、それらの方法は、安全性と効率を向上させるからである。
さらに当然として、ゲノムの特定の場所においてＤＮＡを導入または取り除くために設計された遺伝子ターゲティングならびに部位特異的方法はランダム変換のカテゴリーから除外される。
【００４０】
同様にして、本特許出願は、核酸またはたんぱく質の電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトなどを用いる任意の有核細胞の遺伝子再プログラミングおよび／あるいは、レトロウィルスの／レンチウィルスの組込み、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変換を避ける別のアプローチを包含する。なぜならそれらの方法は、安全性や効率の向上を意味するからである。を意味する。このようなアプローチや手法は、すべて当該分野で公知であり、本発明において実施可能である。
【００４１】
一つの好適な実施形態において、単一の遺伝子またはその一部（特にここで挙げられたもので、ここで挙げられた手法によって発見され、他の公表された方法により発見されたもの；または多能、多能性、自己再生を誘導することが知られているもの）に対応する核酸またはたんぱく質が、選択された細胞から多能、多能性および／または自己再生細胞を生成するよう過剰発現した、および／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。
一つの好適な実施形態において、単一の遺伝子またはその一部に（特にここで挙げられたもので、ここで挙げられた手法によって発見され、他の公表された方法により発見されたもの；または多能、多能性、または自己再生を誘導することが知られているもの）に対応する核酸またはたんぱく質が、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう過剰発現した、および／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの組込みまたはその他の細胞ゲノムのランダムな変換を避けるもう１つのアプローチである。
【００４２】
別の好適な実施形態において、他の核酸またはたんぱく質は、単一の遺伝子やその一部（特にここで挙げられたもので、ここで挙げられた手法によって発見され、他の公表された方法により発見されたもの；  もしくは多能で、多能分化し、または自己再生を誘導することが知られているもの）に対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から、多分能、多能性および／あるいは自己再生細胞の集団が生成されている限り使用できる。
【００４３】
別の好適な実施形態において、他の核酸またはたんぱく質は単一の遺伝子またはその一部（特にここで挙げられたもので、ここで挙げられた手法によって発見され、他の公表された方法により発見されたもの、もしくは多能で多能分化し、または自己再生を誘導することが知られているもの）に対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から、多能、多能性および／あるいは自己再生細胞の集団を生成する限り、そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルスの／レンチウィルスの組込みまたはその他の細胞ゲノムのランダムな変換を避けるもう１つのアプローチである限り、使用することができる。
【００４４】
一つの好適な実施形態において、Ｎａｎｏｇに対応する核酸またはたんぱく質が、選択された細胞から、多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう過剰発現したおよび／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの組込み、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変換を避けるもう１つのアプローチである。
【００４５】
別の好適な実施形態において、他の核酸またはたんぱく質はＮａｎｏｇに対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から、多能、多能性および／あるいは自己再生細胞の集団を生成される限り、そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールト、および／あるいは、ウィルスの組込み、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変換を避けるもう１つのアプローチである限り、使用できる。
【００４６】
別の好適な実施形態において、Ｏｃｔ４  とＳｏｘ２に対応する核酸またはたんぱく質が、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう過剰発現したおよび／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、ウィルスの組込み、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変換を避けるもう１つのアプローチである。
【００４７】
別の好適な実施形態において、他の核酸またはたんぱく質はＯｃｔ４／Ｓｏｘ２に対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から、多能、多能性および／あるいは自己再生細胞の集団が生成されている限り、そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、ウィルスの組込み、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変換を避けるもう１つのアプローチである限り、使用する。
【００４８】
別の好適な実施形態において、長（ＰＲＲ＋）  Ｎｕｍｂアイソフォームに対応する核酸またはたんぱく質が、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう過剰発現した、および／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、ウィルスの組込み、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変換を避けるもう１つのアプローチである。
【００４９】
別の好適な実施形態において、他の核酸またはタンパク質は、長（ＰＲＲ＋）  Ｎｕｍｂアイソフォームに対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から、多能、多能性および／あるいは自己再生細胞の集団を生成される限り、そしてその手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、ウィルスの組込み、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変換を避けるもう１つのアプローチである限り、使用する。
【００５０】
一つの好適な実施形態において、Ｎａｎｏｇに対応する核酸またはたんぱく質が、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するために過剰発現した、および／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。
【００５１】
一つの好適な実施形態において、Ｎａｎｏｇに対応する核酸またはたんぱく質が、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう過剰発現した、および／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの組込み、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変換を避けるもう１つのアプローチである。
【００５２】
別の好適な実施形態において、Ｎａｎｏｇに対応する核酸またはたんぱく質が、選択された細胞から、多能、多能性および／あるいは自己再生細胞の集団を生成する限り、他の核酸またはたんぱく質を使用することができる。
別の好適な実施形態において、Ｎａｎｏｇに対応する核酸またはたんぱく質が、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞の集団を生成する限り、他の核酸またはたんぱく質を使用することができる。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの組込み、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変換を避けるもう１つのアプローチである。
【００５３】
一つの好適な実施形態において、ＬＩＦ活性をもつ遺伝子に対応する核酸またはたんぱく質が、多能、多能化、および／あるいは自己再生細胞を生成するよう選択された細胞から過剰発現および／あるいは導入された唯一の核酸またはたんぱく質である。
【００５４】
一つの好適な実施形態において、ＬＩＦ活性のある遺伝子に対応する核酸またはたんぱく質が、多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう選択された細胞から過剰発現した、および／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの組込み、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変換を避けるもう１つのアプローチである。
【００５５】
別の好適な実施形態において、他の核酸またはたんぱく質は、ＬＩＦ活性がある遺伝子に対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞の集団が生成されている限り、使用する事ができる。
【００５６】
別の好適な実施形態において、他の核酸またはたんぱく質は、ＬＩＦ活性がある遺伝子に対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞の集団が生成されている限り、そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの組込み、、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変換を避けるもう１つのアプローチである限り、使用することができる。
【００５７】
一つの好適な実施形態において、Ｏｃｔ４に対応する核酸またはたんぱく質が、多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう選択された細胞から過剰発現した、および／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。
【００５８】
一つの好適な実施形態において、Ｏｃｔ４に対応する核酸またはたんぱく質が、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう過剰発現した、および／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの組込み、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変換を避けるもう１つのアプローチである。
【００５９】
別の好適な実施形態において、他の核酸またはたんぱく質はＯｃｔ４に対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選ばれた細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞の集団が生成されている限り、使用する事ができる。
【００６０】
別の好適な実施形態において、他の核酸またはたんぱく質はＯｃｔ４に対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選ばれた細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞の集団が生成されている限り、そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの組込み、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変換を避けるもう１つのアプローチである限り、使用することができる。
【００６１】
一つの好適な実施形態において、Ｓｏｘ２に対応する核酸またはたんぱく質は、選ばれた細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう過剰発現した、および／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。
【００６２】
一つの好適な実施形態において、Ｓｏｘ２に対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう、過剰発現したおよび／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいはレトロウィルス／レンチウィルスの組込み、または細胞ゲノムのその他のランダムな変換を避けるもう１つのアプローチである。
【００６３】
別の好適な実施形態において、Ｓｏｘ２に対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞の集団を生成する限り、他の核酸またはたんぱく質は使用する事ができる。
【００６４】
別の好適な実施形態において、Ｓｏｘ２に対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から、多能、多能性および／あるいは自己再生細胞の集団が生成されている限り、そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの組込み、または細胞ゲノムのその他のランダムな変換を避けるもう１つのアプローチである限り、他の核酸またはたんぱく質は使用する事ができる。
【００６５】
一つの好適な実施形態において、ｌｉｎ２８に対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう、過剰発現したおよび／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。
【００６６】
一つの好適な実施形態において、ｌｉｎ２８に対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう、過剰発現したおよび／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの組込み、または細胞ゲノムのその他ランダムな変換を避けるもう１つのアプローチである。
【００６７】
別の好適な実施形態において、ｌｉｎ２８に対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞の集団を生成する限り、そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの組込み、または細胞ゲノムのその他ランダムな変換を避けるもう１つのアプローチである限り、他の核酸またはたんぱく質は使用する事ができる。
【００６８】
一つの好適な実施形態において、ｃ−ｍｙｃに対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう、過剰発現したおよび／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。
一つの好ましい実施の形態としては、ｃ−ｍｙｃに対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう、過剰発現したおよび／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質であり、使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの組込み、または細胞ゲノムのその他ランダムな変換を避けるもう１つのアプローチである。
別個の好ましい実施の形態としては、ｃ−ｍｙｃに対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成する限り、他の核酸またはたんぱく質は使用する事ができる。
【００６９】
別の好適な実施形態において、ｃ−ｍｙｃに対応する核酸または、たんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう導入された細胞の集団が生成されている限り、そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの組込み、または細胞ゲノムのその他ランダムな変換を避けるもう１つのアプローチである限り、他の核酸またはたんぱく質は使用する事ができる。
別の好適な実施の形態としては、Ｏｃｔ４とＳｏｘ２に対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう、過剰発現したおよび／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。
【００７０】
別の好適な実施形態において、Ｏｃｔ４とＳｏｘ２に対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう、過剰発現したおよび／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質であり、使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの組込み、または細胞ゲノムのその他ランダムな変換を避けるもう１つのアプローチである。
【００７１】
別の好適な実施形態において、Ｏｃｔ４とＳｏｘ２に対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞の集団が生成されている限り、他の核酸またはたんぱく質が使用される。
【００７２】
別の好適な実施形態において、Ｏｃｔ４とＳｏｘ２に対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞の集団が生成されている限り、および、使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの組込み、または細胞ゲノムのその他ランダムな変換を避けるもう１つのアプローチである限り、他の核酸またはたんぱく質が使用される。
【００７３】
別の好適な実施形態において、長（ＰＲＲ＋）Ｎｕｍｂ  アイソフォームに対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう、過剰発現したおよび／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。
【００７４】
別の好適な実施形態において、長（ＰＲＲ＋）Ｎｕｍｂ  アイソフォームに対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう、過剰発現したおよび／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質であり、使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの組込み、または細胞ゲノムのその他ランダムな変換を避けるもう１つのアプローチである。
【００７５】
別の好適な実施形態において、長（ＰＲＲ＋）  Ｎｕｍｂ  アイソフォームに対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞の集団が生成されている限り、他の核酸またはたんぱく質は使用する。
【００７６】
別の好適な実施形態において、長（ＰＲＲ＋）  Ｎｕｍｂ  アイソフォームに対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞の集団が生成されている限り、さらに使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの組込み、または細胞ゲノムのその他ランダムな変換を避けるもう１つのアプローチである限り、他の核酸またはたんぱく質は使用される。
【００７７】
別の好適な実施形態において、Ｏｃｔ４、  Ｓｏｘ２とＮａｎｏｇに対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう、過剰発現した、および／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。
【００７８】
別の好適な実施形態において、Ｏｃｔ４、  Ｓｏｘ２とＮａｎｏｇに対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう、過剰発現した、および／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質であり、使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの組込み、または細胞ゲノムのその他ランダムな変換を避けるもう１つのアプローチである。
【００７９】
別の好適な実施形態において、Ｏｃｔ４，  Ｓｏｘ２とＮａｎｏｇに対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞の集団が生成されている限り、他の核酸またはたんぱく質は使用する。
【００８０】
別の好適な実施形態において、Ｏｃｔ４，  Ｓｏｘ２とＮａｎｏｇに対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞の集団が生成されている限り、さらに使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの組込み、または細胞ゲノムのその他ランダムな変換を避けるもう１つのアプローチである限り、他の核酸またはたんぱく質は使用される。
【００８１】
別の好適な実施形態において、長（ＰＲＲ＋）Ｎｕｍｂ  アイソフォームに対応する核酸またはたんぱく質が、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう、過剰発現したおよび／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。
別の好適な実施形態において、長（ＰＲＲ＋）  Ｎｕｍｂ  アイソフォームに対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から、多能、多能性および／あるいは自己再生の細胞を生成するよう、過剰発現および／あるいは導入され、使用されている手法は電気穿孔法、リボソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいはレトロウィルス／レンチウィルスの組込みまたは細胞ゲノムのその他ランダムな変換を避けるもう１つのアプローチである。
【００８２】
別の好適な実施形態において、長  （ＰＲＲ＋）Ｎｕｍｂ  アイソフォームに対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞集団が生成されている限り、他の核酸またはたんぱく質は使用する。
【００８３】
別の好適な実施形態において、長  （ＰＲＲ＋）Ｎｕｍｂ  アイソフォームに対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞の集団が生成されている限り、他の核酸またはたんぱく質は使用する事ができ、使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの組込みまたは細胞ゲノムのその他ランダムな変換を避けるもう１つのアプローチである。
【００８４】
ここに示される核酸またはたんぱく質の配列のあらゆる組み合わせは、望まれる細胞集団または性質が得られる限り、Ｎｕｍｂおよび／あるいはＮｕｍｂｌｉｋｅに対応する核酸またはたんぱく質の配列を除外することで改変できるということが理解されるべきである。
【００８５】
同様にここで示される分化を開始する方法は、ここにある手法で得られた細胞に対してだけでなく、誘発されたまたは誘発されなかった、多能、多能性、または自己再生する幹細胞、他の前駆細胞、または他の選択された細胞に対し適応できることが理解されるべきである。ここに示される核酸またはたんぱく質の配列のあらゆる組み合わせは、望まれる細胞集団が得られる限り、Ｎｕｍｂおよび／あるいはＮｕｍｂｌｉｋｅに対応する核酸またはたんぱく質を除外することで改変できることが理解されるべきである。
【００８６】
別の好適な実施形態において、ここに示される核酸またはたんぱく質の様々な組み合わせは、Ｎｕｍｂｌｉｋｅおよび／あるいはＮｕｍｂ  アイソフォームに対応する核酸またはたんぱく質を除外することで使用できる。
【００８７】
好ましい実施態様では、選択された細胞および／またはその子孫が遺伝的に、事前に変更されている細胞である。
【００８８】
好ましい実施態様では、ここに説明するトランスフェクションの手順は、一時的なトランスフェクションを表す。さらに好ましい実施態様ではこのような一時的なトランスフェクションは、ホストゲノムへの組込みがないウイルスベクターを使用して達成される。
【００８９】
別の好適な実施形態において、かかる一時的なトランスフェクションは、標準のトランスフェクション技術（電気穿孔法、化学的に媒介されたトランスフェクション、融合性または非融合性リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトなど）を用いて達成される。
時間の経過に従い、ここに示されるものとは異なる他の遺伝子組み合わせで、細胞に対し、多能、多能性、自己再生可能になるようもたらすかまたは分化開始をもたらすことができることが示され、あるいは発見されるであろう。しかしながら本特許出願は、核酸またはたんぱく質の電気穿孔法（例：手法についてはＧａｇｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｓａｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｙｕａｎ，２００８；  Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｘｉａ  ａｎｄ  Ｚｈａｎｇ，２００７；Ｃｅｍａｚａｒ  ａｎｄ  Ｓｅｒｓａ  ２００７；Ｉｓａｋａ  ａｎｄ  Ｉｍａｉ，２００７；Ｌｕｘｅｍｂｏｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；Ｖａｎ  Ｔｅｎｄｅｌｏｏｓ，２００７；Ｔａｋａｈａｓｈｉ，２００７；その他を参照）、電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいはウィルスの組込みまたは細胞ゲノムのその他ランダムな変換を避けるもう１つのアプローチ（それらの手技は安全性と有効性を向上させるので）を用いる任意の有核細胞の遺伝子再プログラミングも包含する。
【００９０】
別の好ましい実施態様では長（ＰＲＲ＋）ｎｕｍｂアイソフォームをコードする配列（および／または合成オリゴヌクレオチドｎｕｍｂｌｉｋｅと短ｎｕｍｂアイソフォーム）が、ヒトＬＩＦ（例えば、Ｄｕ  ａｎｄ  Ｓｈｉ，１９９６）、オンコスタチン−Ｍ、ｃａｒｄｉｏｔｒｏｐｈｉｎ-１、ＩＬ−１１、ＩＬ−６、ＩＬ６Ｒ、Ｈｙｐｅｒ  ＩＬ−６、ＬＩＦＲ、ｇｐｌ３０、ＯＣＴ３（ＯＣＴ４）、Ｎａｎｏｇ、ＳＯＸ２、および／またはＦＧＦ−４をコードするものから選択される配列を含む他の配列で、一時的または永久的なトランスフェクションを伴うかまたはそれによって置換される。
これらの異なる導入遺伝子配列の任意のサブセットでの同時トランスフェクションは、単一遺伝子ベクター、複数の遺伝的ベクター、シリアルトランスフェクションと異なるマーカータンパク質および／または抗生物質耐性に基づく選択を含む当該分野で公知の手段によって達成することができる。
【００９１】
別の好ましい実施態様では、長（ＰＲＲ＋）ｎｕｍｂアイソフォームでトランスフェクトされた細胞は、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、オンコスタチン（例えば、Ｄｕ  ａｎｄ  Ｓｈｉ，１９９６）、ＬＩＦ、鉄因子、ＩＬ−１１、ｃａｒｄｉｏｔｒｏｐｈｉｎ−１、ＩＬ−６、Ｈｙｐｅｒ  ＩＬ−６、ＣＮＴＦ、および／または水溶性ｇｐｌ３０を含む、上記のような最適成長速度を促進する細胞培養で培養される。
効力と分化の評価
多能性と多能は次を含むその分野で公知の手法によって評価できる。１）移植、２）胚様体の形成を促進する条件での培養、３）動物の胚盤胞期胚芽への細胞注入とその後の成長、４）分化、多能、多能性など（Ｇｕａｎｅｔ  ａｌ．，２００６を参照）に関連した遺伝子発現のＲＮＡ発現検査（例：ＲＴ−ＰＣＲ法ならびにマイクロアレイ法に基づいた分析）、５）コロニー形成のみならずＥＳ細胞類似形態による。ここで説明する、選択された細胞および／あるいはその子孫細胞の多能性を知るための１つの方法としては、蛍光タンパク遺伝子に作動可能に結び付けられたＮａｎｏｇプロモータを含む構築物を使うトランスフェクションが含まれる。これによりＮａｎｏｇ発現細胞は、蛍光活性化細胞分別（ＦＡＣＳ）などを使って特定し富化することができる。
【００９２】
実施の形態としては、内因細胞（例：火傷または怪我をした部分の周りの細胞）が長（ＰＲＲ＋）ｎｕｍｂ  アイソフォームをコードする遺伝子ベクターのみと、あるいはここで名前を挙げた他の導入遺伝子と共に生体内でトランスフェクションし、一時的に細胞再生したかあるいは増加した細胞の増殖を促進する。この手法は低形成組織、幹／前駆細胞が異常に欠損する疾患、また他のこの手法が有効であることが示され得る疾患に対して臨床的に用いることができる。
【００９３】
分化する細胞集団を得る
ｂ）  神経細胞集団、ｃ）  筋肉細胞集団、ｄ）  その他の細胞集団がさらに生体内で環境的に制御されて分化が可能になるようにするには、選択された細胞および／あるいはその子孫細胞が、長（ＰＰＲ＋）Ｎｕｍｂアイソフォーム配列および／あるいは合成されたオリゴヌクレオチド配列でのトランスフェクションを任意に受け、（上記の如く）試験管内で十分な時間をもって増加が拡大し望まれる数の子孫細胞が達成される。
この任意の手順に続いて、選択された細胞および／あるいはその子孫細胞を洗浄して拡大／最適の成長培地を構成するサイトカインと因子を取り除き、任意にＮｕｍｂｌｉｋｅ遺伝子および／あるいは「短」（ＰＲＲ−）Ｎｕｍｂアイソフォームおよび／あるいは長（ＰＲＲ＋）アイソフォームなどを標的とする合成オリゴヌクレオチドをコードするヌクレオチド配列など  （例：Ｚａｅｈｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）でトランスフェクションした。そして選択された細胞を望まれる細胞タイプに分化させるのを促進させる状況下で培養した。
【００９４】
殆どの例において、細胞は５から１０％の胎仔ウシ血清と、選択された細胞および／あるいはその結果の子孫細胞を望まれる細胞集団に分化させるのを促進させる因子が存在するという条件下で培養された。胎仔ウシ血清とその因子が存在することにより、最適（または拡大）成長速度よりも低い速度で成長あるいは増殖し、望まれる細胞集団に分化するのに好都合である。因子と正確な培養条件は、下記で描写された所望の細胞集団により選ばれる。
【００９５】
ニューロンまたは神経細胞集団を得る
望まれる細胞集団が神経細胞集団の時は、トランスフェクションが成功した細胞が、細胞を神経細胞に分化させるのを促進する因子が存在し、最適速度よりも低い速度で成長を促進する条件下で培養される。ニューロンへの分化を促進する条件については、次のような数多くの文献で説明されている（Ｂｅｎｎｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；  Ｃｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００５；Ｈａｒｋａｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｉｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４；  Ｉｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｗｅｒｎｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；およびＷｅｒｎｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。さらには加えたサイトカインの存在とレチノイン酸曝露を組み合わせることは、特定の神経細胞タイプが試験管内で分化するのに有利である（例：Ｓｏｕｎｄａｒａｒａｊａｎ  ｅｔａｌ．，  ２００６；  Ｓｏｕｎｄａｒａｒａｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔｅｎｔ  ６４３２７１１）。
【００９６】
実施の形態としては、試験管内でニューロンまたは、神経細胞の分化は５０ｎｇ／ｍｌの神経成長因子（ＮＧＦ）の存在下でおこる。
【００９７】
一つの好適な実施形態において、神経細胞集団が望まれる細胞集団である時、短ｎｕｍｂアイソフォーム（および／あるいはｎｕｍｂｌｉｋｅ）をコードする配列とのトランスフェクションが、Ｎｕｒｒｌ、ＲＥＮ、ネウロジェニン１、ネウロジェニン２、ネウロジェニン３、Ｍａｓｈ１、Ｐｈｏｘ２ｂ、Ｐｈｏｘ２ａ、ｄＨａｎｄ、Ｇａｔａ３、Ｓｈｈ、ＦＧＦ８、Ｌｍｘｌｂ、Ｎｋｘ２．２、Ｐｅｔｌ、Ｌｂｘｌおよび／あるいはＲｎｘをコードしたものから選ばれた配列を含む他の配列と、一時的または永続的なトランスフェクションを伴うか置き換えられる。
【００９８】
別の好適な実施形態において、ドーパミン作動性ニューロンが望まれるニューロン集団である時、短ｎｕｍｂアイソフォーム（および／あるいはｎｕｍｂｌｉｋｅをコードした配列とのトランスフェクションが、Ｍａｓｈ１、Ｎｇｎ２、Ｎｕｒｒｌ、Ｌｍｘｌｂおよび／あるいはＰｔｘ−３をコードしたものから選ばれた配列を含む他の配列と、一時的または永続的なトランスフェクションを伴うか置き換えられる。
【００９９】
別の好適な実施形態において、セロトニン作動性ニューロンが望まれるニューロン集団である時に、短ｎｕｍｂアイソフォーム（および／あるいはｎｕｍｂｌｉｋｅ）をコードした配列とのトランスフェクションが、Ｍａｓｈｌ、Ｐｈｏｘ２ｂ、Ｌｍｘｌｂ、Ｎｋｘ２．２、  Ｇａｔａ２、  Ｇａｔａ３、  および／あるいはＰｅｔｌをコードしたものから選ばれた配列を含む他の配列と、一時的または永続的なトランスフェクションを伴うか置き換えられる。
【０１００】
別の好適な実施形態において、コリン作動性ニューロンが望まれるニューロン集団である時、短ｎｕｍｂアイソフォーム（および／あるいはｎｕｍｂｌｉｋｅ）をコードした配列とのトランスフェクションが、ＭＡＳＨ１、Ｐｈｏｘ２ａおよび／あるいはＲＥＳＴ４をコードしたものから選ばれた配列を含む他の配列と、一時的または永続的なトランスフェクションを伴うか置き換えられる。
【０１０１】
別の好適な実施形態において、ＧＡＢＡ作動性ニューロンが望まれるニューロン集団である時、短ｎｕｍｂアイソフォーム（および／あるいはｎｕｍｂｌｉｋｅ）をコードした配列とのトランスフェクションが、ＭＡＳＨ１、Ｐｈｏｘ２ａおよび／あるいはＲＥＳＴ４をコードしたものから選ばれた配列を含む他の配列で一時的または永続的なトランスフェクションを伴うか置き換えられ、任意的にＬＩＦ、Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ  ３（ＮＴ３）および／あるいは神経成長因子（ＮＧＦ）が補足された媒体での培養が続く。
【０１０２】
別の好適な実施形態において、ノルアドレナリン作動性ニューロンが望まれるニューロン集団の時、短ｎｕｍｂアイソフォーム（および／あるいはｎｕｍｂｌｉｋｅ）を符号化した配列とのトランスフェクションが、Ｍａｓｈｌ、ｄＨａｎｄ、Ｐｈｏｘ２ａ、  Ｐｈｏｘ２ｂ、Ｇａｔａ２  および／あるいは  Ｇａｔａ３をコードしたものから選ばれたを配列を含む他の配列と、一時的または永続的なトランスフェクションを伴うか置き換えられる。
【０１０３】
別の好適な実施形態において、ＧＡＢＡ作動性ニューロンが望まれるニューロン集団である時、短ｎｕｍｂアイソフォーム（および／あるいはｎｕｍｂｌｉｋｅ）をコードする配列とのトランスフェクションした細胞が、ＰＩＴＸ２、Ｄｌｘ２、Ｄｌｘ５、アンチセンスＨｅｓｌ  ＲＮＡおよび／あるいはその他のＨＥＳ１を標的にした合成オリゴヌクレオチドをコードしたものから選ばれた配列を含む他の配列と、一時的又は永続的なトランスフェクションを伴うか置き換えられる。
【０１０４】
他の実施形態において、ニューロンまたは神経細胞集団が所望の集団である場合、短（ＰＲＲ−）ｎｕｍｂアイソフォーム（および／またはｎｕｍｂｌｉｋｅ）でトランスフェクトされた細胞は、上記のような、および１つまたは複数の次の因子：レチノイン酸、ＮＴ３、ＮＧＦ、グリア細胞株由来成長因子（ＧＤＮＦ）およびインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）を含む、分化を促進する細胞培養培地中で培養される。
筋細胞集団を得る
望まれる細胞集団が筋細胞集団である場合、形質移入に成功した細胞は、細胞が筋細胞でと分化し、しかも最適速度未満の速度で成長するよう促進する因子の存在下で培養される。筋細胞への分化を促進する条件は以前に記載した（Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｐａｌ  ａｎｄ  Ｋｈａｎｎａ，２００５；Ｐｉｐｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ａｌｂｉｌｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｐａｌ  ａｎｄ  Ｋｈａｎｎａ，２００７；Ｂｅｈｆａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｕ．ＳＰａｔｅｎｔ  ６４３２７１１）。さらに、選択した細胞および／またはそれらの子孫細胞を追加のサイトカインの存在下でヘキサメチレンビス−アクリルアミドまたはジメチルスルホキシドに曝露することは、インビトロで筋タイプの分化の開始に有利である。
【０１０５】
一つの好適な実施形態において、心筋細胞集団が望まれる細胞集団である時、短（ＰＲＲ−）  ｎｕｍｂアイソフォーム（および／あるいはｎｕｍｂｌｉｋｅでトランスフェクトされた細胞は、心筋細胞（ｃａｒｄｉｏｍｙｃｙｔｅｓ）（Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；  Ｇｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；その他）への分化を促進する細胞倍地中で培養するか、心臓細胞の分化を促進する濃度の特定の因子（例：０．７５％−  １  ％  ジメチルスルホキシド  （ＤＭＳＯ）、２０％の正常ウシ血清（ＮＢＳ）、１０（−７）  ｍＭ  レチノイン酸（ＲＡ）  、２０％  心筋細胞の訓化培地（Ｈｕａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）を含む細胞培地にて培養される。
【０１０６】
別の好適な実施形態において、心筋細胞集団が望まれる細胞集団の時、それら細胞はＧａｔａ  ４、Ｇａｔａ  ５、およびＧａｔａ  ６をコードする配列から選択された配列を含むヌクレオチド配列でトランスフェクトされる。
【０１０７】
一つの好適な実施形態において、筋細胞集団が望まれる細胞集団である時、短ｎｕｍｂアイソフォーム  （および／あるいはｎｕｍｂｌｉｋｅ）をコードする配列による核酸のトランスフェクションは、筋タイプ特定  ｂＨＬＨ−符号化連鎖、ＭｙｏＤ、ミオゲニン、Ｍｙｆ５、Ｍｙｆ６、  Ｍｅｆ２、ミオカーディン、Ｉｆｒｄｌや他の筋肉転写因子をコードするこれらから、選択された配列を含む他の配列と、一時的もしくは永久的なトランスフェクションを伴うか置き換えられる。
【０１０８】
一つの好適な実施形態において、平滑筋細胞集団が望まれる細胞集団である時、短ｎｕｍｂアイソフォーム  （および／あるいはｎｕｍｂｌｉｋｅ）をコードする配列によるトランスフェクションは、筋タイプ特定ミオカーディンヌクレオチド配列をコードするこれらから選択された配列を含む他の配列と、一時的もしくは永久的なトランスフェクションを伴うか置き換えられる。
【０１０９】
一つの好適な実施形態において、骨格筋細胞集団が望まれる細胞集団である時、短ｎｕｍｂアイソフォーム（および／あるいはｎｕｍｂｌｉｋｅ）をコードする配列によるトランスフェクションは、筋タイプ特定ＭｙｏＤとミオゲニンヌクレオチド鎖を符号化するこれらから選択された配列を含む他の配列と、一時的もしくは永久的なトランスフェクションを伴うか置き換えられる。
【０１１０】
一つの好適な実施形態において、ｏｌｉｇｏｄｅｎｓｒｏｃｙｔｅ細胞集団が望まれる細胞集団である時、短ｎｕｍｂアイソフォーム（および／あるいはｎｕｍｂｌｉｋｅ）をコードする配列によるトランスフェクションは希突起膠細胞の特有の−ＯＬＩＧｌ、  ＯＬＩＧ２、またＺｆｐ４８８  ヌクレオチド配列をコードするこれらから選択された配列を含む他の配列と、一時的もしくは永久的なトランスフェクションを伴うか置き換えられる。
【０１１１】
上記のこれらの異なる導入遺伝子配列の任意のサブセットでの同時トランスフェクションは、複数の遺伝子のベクター、シリアルトランスフェクションだけでなく、異なるマーカータンパク質および／または抗生物質耐性に基づく選択の使用を含む当分野で既知の任意の手段によって達成することができる。所望の細胞集団が造血細胞集団である場合、分化培地は、造血前駆細胞（例えば、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、トロンボポイエチンなど（例えば、Ｏｈｍｉｚｏｎｏ、１９９７、Ｗａｎｇら、２００５；  Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら、２００７；  Ｇｕｐｔａら、２００７）、または分化造血細胞の型（未分化または多能性細胞から分化した造血細胞型を提供するための当分野で既知の方法による）に分化を促進する濃度で特定の因子を含む。
【０１１２】
望まれた細胞集団が生殖細胞集団である時、分化培地は生殖細胞への分化を促進させる濃度において特定の因子を含む（例Ｎａｙｅｒｎｉａら２００６ａ、２００６ｂ）。望まれた細胞集団が、内胚葉およびすい臓島細胞の時、分化培地は、内胚葉およびすい臓島細胞への分化を促進させる濃度において特定の因子を含む（例：徐ら、２００６；デネールら、２００７；シムら、２００７；江ら、２００７）。
【０１１３】
一つの好適な実施形態において、選択された細胞および／あるいはその子孫細胞の分化は、分化培地において、ｎｕｍｂｌｉｋｅ、短Ｎｕｍｂ  ｉｄｓｏフォームや他の導入遺伝子でのトランスフェクションなしだが培地を変更しない場合、起こり得る。
複数の実施形態において、単一のベクターを利用するが、このものは、一つの調節可能なプロモーター（例えば、テトラサイクリン調節プロモーター）のもとで、哺乳動物ｎｕｍｂ遺伝子の「長」（ＰＲＲ＋）をコードするヌクレオチド配列（単数または複数）（および／またはｎｕｍｂｌｉｋｅまたは短ｎｕｍｂアイソフォームを標的とする合成オリゴヌクレオチド）の発現を調節し、その一方、Ｎｕｍｂｌｉｋｅおよび短Ｎｕｍｂアイソフォーム（および／または長（ＰＲＲ＋）アイソフォームを標的とする合成オリゴヌクレオチド）が、別の、異なるが、調節可能でもあるプロモーターの調節下で発現される。従って、長（ＰＲＲ＋）ｎｕｍｂアイソフィオーム（単数または複数）は、選択された細胞の拡大が望まれ、誘導因子（例えばテトラサイクリン）が成長培池に添加される場合、発現できる（および／または短アイソフォームが抑制される）。分化が望ましい場合、後でｎｕｍｂｌｉｋｅおよび短アイソフォームは発現できる（および／または長（ＰＲＲ＋）ｎｕｍｂアイソフォーム（単数または複数）は抑制される）。
【０１１４】
あるいは、本明細書に列挙するＮｕｍｂアイソフォーム、Ｎｏｔｃｈ、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２および他のＤＮＡ配列に対応するタンパク質およびペプチドは、ナノ粒子、陽イオン性脂質、融合性リポソーム（例えば、Ｙｏｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；２００７）などを用いるか、代わりに、または遺伝子トランスフェクションと組合わせた、電気穿孔法（例えば、Ｋｏｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４：Ｒｉｔｃｈｉｅ  ａｎｄ  Ｇｉｌｒｏｙ，  １９９８）を介して選択した細胞および／またはそれらの子孫細胞に、類似の様式で適用してよい。一般に、電気穿孔法は、導入遺伝子をゲノムへ組込むことなしに、高いトランスフェクション効率（および所望の細胞の効率的な生産）をもたらすので、それゆえ、安全性向上が伴う。
【０１１５】
選択した細胞の増殖、多能力、多能性力、または分化を促進するタンパク質（単数または複数）またはポリペプチド（単数または複数）をコードするＤＮＡまたはＲＮＡは、標準的な遺伝子工学技法（例えば、特定の細胞系統のｃＤＮＡライブラリーからそのようなＤＮＡを単離することによって）に従って単離し、それを適当な発現ベクターに入れることができ、その後、選択した細胞にトランスフェクトする。
【０１１６】
別の好ましい実施形態において、内胚葉およびランゲルハンス島細胞は所望の集団であり、短ｎｕｍｂアイソフォーム（および／またはｎｕｍｂｌｉｋｅ）は、Ｆｏｘａ２、Ｓｏｘ１７、ＨＬＸＢ９および／またはＰｄｘ１をコードするこれらから選ばれる配列を含む他の配列と、一時的または永続的なトランスフェクションを伴うかそれによって置換される。
【０１１７】
一つの好適な実施形態において、肝細胞が望まれる集団であり短ｎｕｍｂアイソフォーム（および／あるいはｎｕｍｂｌｉｋｅ）をコードする配列によるトランスフェクションは、肝核因子（ＨＮＦ）−１、ＨＮＦ−３  、ＨＮＦ−４、ＨＮＦ−６ならびにｃｒｅｂ結合たんぱく質をコードするこれらから選択された配列を含む他の配列と、一時的もしくは永久的なトランスフェクションを伴うかまたは置き換えられる。
【０１１８】
別の好適な実施形態において、造血細胞が望まれる細胞集団であり、短ｎｕｍｂアイソフォーム（および／あるいはｎｕｍｂｌｉｋｅ）をコードする配列でのトランスフェクションは、Ｒｕｎｘｌ／ＡＭＬｌとＮＯＶ（ＣＣＮ３）をコードするこれらのものおよび／あるいは望まれる細胞集団に特異的なコロニー刺激因子の存在下での細胞培養物から選択された配列を含む他の配列と、一時的もしくは永久的なトランスフェクションを伴うかまたは置き換えられる。Ｒｕｎｘｌ／  ＡＭＬ１ａアイソフォームは、移植が望まれる時に、ｂアイソフォームは分化が望まれる時に導入される（Ｃｒｅｅｍｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）。
【０１１９】
別の好適な実施形態において、軟骨細胞が望まれる集団であり、短ｎｕｍｂアイソフォーム（および／あるいはｎｕｍｂｌｉｋｅ）を符号化する配列によるトランスフェクションは、Ｓｏｘ９、ＣＲＥＢ結合たんぱく質、Ｇａｔａ６、および／あるいはＲｕｎｘ２をコードする配列含む他の配列と、一時的もしくは永久的なトランスフェクションを伴うか置き換えられる。
【０１２０】
別の好適な実施形態において、骨細胞（特に骨芽細胞）が望まれる細胞集団であり、短ｎｕｍｂアイソフォーム（および／あるいはｎｕｍｂｌｉｋｅ）をコードする配列によるトランスフェクションは、Ｒｕｎｘ２を含む他の配列の、一時的もしくは永久的なトランスフェクションが伴うかまたは置き換えられる。
【０１２１】
別の好適な実施形態において、長Ｎｕｍｂアイソフォームをコードする遺伝子ベクターは、過渡的にまたは制御可能なプロモータの調節のもとで、一時的にそれらの細胞の増殖を起こす目的で生体内の内在細胞に導入される。
【０１２２】
別の好適な実施形態において、内生細胞（例：中枢神経系の上衣層細胞）は生体内において、中枢神経系における前駆細胞／上衣細胞の再生したまたは増加した分化（特にニューロンの分化）および遊走を一過性あるいは永久的に促進するための、最短ｎｕｍｂアイソフォームまたはｎｕｍｂｌｉｋｅタンパク質のいずれか一方をコードする、遺伝子ベクター単独でまたはここで名付けられているような他の導入遺伝子とともにトランスフェクトされる。この再生または増加は、分化に関連したマーカーの新規発生の発現を見せる細胞の数によって計測される。これは遺伝子ベクターを器官システムに、この目的のために適した方法を用いて導入されることにより達成され得る（実施例を参照）。
実施の形態としては、内生細胞（例：中枢神経系の上衣層細胞）は、生体内において、再生または増加した幹細胞の増殖を一過性に促進する目的（引き続く子孫細胞の分化を伴う）で、長ｎｕｍｂアイソフォームおよび／あるいはここで名づけられた他の導入遺伝子をコードする遺伝子ベクターでトランスフェクトされる。この再生または増加は、分裂している前駆細胞に関連したマーカーの新規発生の発現を見せる細胞の数によって計測される。これは遺伝子ベクターを器官システムに、その目的に適した方法を用いて導入して達成され得る（実施例を参照）。
【０１２３】
同様に、この方法は、他の組織（皮膚など）における他の幹細胞集団から、再生または増加した分化を起こすためにも適している。この方法は、例えば中枢神経系の傷害、通常の分化または遊走が不十分な他の組織の障害、形成異常疾患、本アプローチが有益な他の障害の場合に臨床的に用いることができる。
【０１２４】
好ましい実施態様では、単一の遺伝子またはその一部（具体的、本明細書で命名されたもの、本明細書で記載された方法に従って発見われたもの、他の公表された方法に従って発見されたもの、および／または所望する分化の様式を開始することができることが知られているもの）に対応する核酸またはタンパク質は、選択された細胞において分化を誘導するように過剰発現されるかまたは導入される唯一の核酸またはタンパク質である。
好ましい一つの実施形態において、単一の遺伝子またはその一部に対応する核酸（単数または複数）またはタンパク質（単数または複数）、（具体的には、本明細書で命名されたもの、本明細書に記した方法によって発見されたもの、他の公表された方法によって発見されたもの、および／または所望する分化の様式を開始できることが公知のもの）は、選択された細胞において分化を開始するために過剰発現および／または導入された唯一の核酸（単数または複数）またはタンパク質（単数または複数）であり、さらに、用いる方法は、電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールト、および／またはレトロウイルス／レンチウイルスの組込みまたは他の細胞のゲノムのランダムな変換を避ける別のアプローチである。
別個の好ましい実施形態において、分化している細胞の集団が、選択される細胞から産生する限り、他の核酸（単数または複数）またはタンパク質（単数または複数）は、単一の遺伝子またはその一部に対応する核酸（単数または複数）またはタンパク質（単数または複数）と協力して使用することができる（具体的には、本明細書で命名したもの、本明細書に記載の方法によって発見されたもの、他の公表された方法によって発見されたもの、および／または望ましい分化の様式を開始できることが公知のもの）。
別個の好ましい実施形態において、分化している細胞の集団が、選択される細胞から産生し、さらに用いる方法が、電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールト、および／またはレトロウイルス／レンチウイルスの組込みまたは他の細胞のゲノムのランダムな変換を避ける別のアプローチである限り、他の核酸（単数または複数）またはタンパク質（単数または複数）は、単一の遺伝子またはその一部に対応する核酸（単数または複数）またはタンパク質（単数または複数）と協力して使用することができる（具体的には、本明細書で命名したもの、本明細書に記載の方法によって発見されたもの、他の公表された方法によって発見されたもの、および／または望ましい分化の様式を開始できることが公知のもの）。
【０１２５】
ここで記されているどの核酸またはタンパク質配列の組み合わせも、Ｎｕｍｂおよび／あるいはＮｕｍｂｌｉｋｅに対応する配列を除くことで、望まれる細胞集団または性質が達成される限り、改変できることが理解されるべきである。
【０１２６】
同様にして、ここ（または別のところ）に記されている分化を開始するための方法は、ここで記されている様式で得られた細胞だけでなくいかなる誘導されたもしくは誘導されていない多能、多能性または自己再生する幹細胞、または他の選択された細胞に利用することができることも理解すべきである。
【０１２７】
選択された細胞の供給源
選択された細胞の集団は、様々な幹細胞、前駆細胞また体細胞から得られるであろう。しかしながら核が欠損している体細胞（例：成熟したヒトの赤血球細胞）は、とりわけ排除された。選択された幹細胞は、存在する細胞株から得られるかまたは貯蔵されている、バンク化されている、または凍結保存されている供給源から単離されるであろう。典型的な幹細胞の供給源は、骨髄、末梢血、胎盤血、羊水（例：Ｄｅ  Ｃｏｐｐｉ  ｅｔ  ａｌ．２００７）、靭帯血（例：Ｚｈａｏ，ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）、脂肪組織（例：Ｇｉｍｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）、ヒト以外の胚などである。循環白血球や他の幹細胞ではない細胞は、同様に、選択され、結果として多能、多能性および／あるいは自己再生能力を得る効果的な上記に記されたような培養条件におかれる。本発明において有用なたやすく利用できる他の体細胞の例には、リンパ球、上皮細胞（例：頬）が含まれる。本発明の中で利用するために選択された細胞の単離および収集は、当分野で知られているいかなる方法によって実施されてもよい。
【０１２８】
動物に関する実施形態では、前立腺、精巣、胎児脳、腸から単離された幹細胞は、選択された細胞の好まれる供給源であるとして明らかにれている。
【０１２９】
一つの好適な実施形態において、選択された細胞および／あるいはその子孫細胞は３次元の型で培養される。
【０１３０】
本発明の更なる目的は、かかる器官または組織を必要とするとみなされる患者に移植するための患者に適合性があり、患者に特異的な組織や器官の生産に利用するための細胞を提供することである。ここにある方法（または同様の方法）によって与えられた多能性、多能および／あるいは分化する細胞は、そのような器官および／あるいは組織の生成のための技術とともに使用されることが明らかにている（例：Ｂｏｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００６．Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓ，２００７）。そのような利用は、本発明により明確にされているカバー。例えば、ここで記された方法（または他の公表された方法）により生成されあるいは処理された多能性、多能および／あるいは分化する細胞は、正常な組織構造および／あるいは器官構造の再生のためにされた足場に関連して成長し得る（例：Ｙａｒｌａｇａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５；  Ｋｉｍら、１９９８；  ＷＯ／２００３／０７００８４；  ＥＰ１４８２８７１；  ＷＯ０３０７００８４；米国特許２３９５６９８、７２９７５４０、６９９５０１３、６８００７５３；アイゼンバーグら、２００６）。
【０１３１】
同様に、多能性、多能および／あるいは分化する細胞によって占領される足場は、死体の器官あるいは組織（例えば、骨、心臓、腎臓、肝臓、肺など）において宿主免疫細胞や他の望まれないまたは付属する宿主細胞が除去されるように処置され得たあとの、死体の器官または組織から得られてよい。（例えば、放射線、滅菌（Ｍｒｏｚら、２００６）により、および／あるいは各種脱細胞方法（米国特許６７３４０１８；６９６２８１４、６４７９０６４、６３７６２４４、米国特許第５０３２５０８、４９０２５０８、４９５６１７８、５２８１４２２、５５５４３８９、６０９９５６７、および６２０６９３１、４３６１５５２および６５７６６１８、６７５３１８１、米国出願第１１／１６２，７１５；ＷＯ／２００１／０４８１５３；ＷＯ／２００２／０２４２４４；ＷＯ  ００３００２１６５；ＷＯ／２００１／０４９２１０；ＷＯ／２００７／０２５２３３；欧州特許ＥＰ１４８２８７１、ＥＰ１２４６９０３、ＥＰ１２４４３９６、ＥＰ０９８７９９８、ＥＰ１２４４３９６；ＥＰ１３３３８７０；Ｒｉｅｄｅｒら、２００４；Ｏｔｔら、２００８；Ｔａｙｌｏｒら、１９９８））。
【０１３２】
同様にして、本発明における多能性、多能および／あるいは分化する細胞が、組織工学におけるインクジェット式印刷を利用する応用において用いられる（例：Ｂｏｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６．  Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６；Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）。それゆえに、ここで記された方法により生成されるかあるいは扱われる細胞のような使用も、包含される。
【０１３３】
別の好適な実施形態において、選択された細胞および／あるいはそれらの子孫細胞は、ハンギングドロップ法で培養される。
【０１３４】
本発明の別の側面によれば、選択された細胞は、前もって遺伝子的に改変することができる。本発明の別の側面によれば、細胞を望まれる細胞集団に分化させることを促進するタンパク質またはポリペプチドをコードする選択された細胞はＤＮＡまたはＲＮＡで改変することもできる。
【０１３５】
細胞集団の検査
一つの実施形態では、本発明による方法は、細胞株、ドナー源、臍帯血からの細胞のスクリーニング、および自己あるいはドナーの骨髄、血液、精原細胞、始原生殖細胞、口腔細胞、あるいは本発明において効果的なその他の細胞源からの細胞のスクリーニングが含まれる。選択した細胞は、有益な配列または治療ベクターを用いたトランスフェクションの成功を確認するため、ならびに問う分野で公知の任意の方法による分化の開始の成功を確認するために検査され得る（Ｇｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６；米国特許６，４３２，７１  １）。いくつかの実施形態では、標準的なＰＣＲ法および核酸ハイブリダイゼーションベースの方法を用いて、あるいは急速なタイピング方法を用いて、これらの細胞はスクリーニングされる。好適な実施形態では、レポーター遺伝子の発現に応じて細胞がスクリーニングされる。いくつかの実施形態では、抗生物質抵抗性遺伝子や蛍光たんぱく質（ＧＦＰなど）遺伝子などの導入遺伝子発現ベクターによりコードされたマーカー遺伝子の発現によって細胞はスクリーニングされる。
治療ベクターおよび有益な配列のスクリーニング
治療ベクターと有益な配列について、特定配列の検出のための当分野で知られている任意の方法を用いて、細胞がスクリーニングされ得る。それぞれ細胞サンプルは、同時に配列の多様性について調べられ得る。あるいは、多数のサンプルは、同時に検査され得る。
【０１３６】
細胞の分化は、（ｉ）形態学的評価、（ｉｉ）逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応を利用した（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロットまたは遺伝子発現における変化を監視するためのマイクロアレイ技術、（ｉｉｉ）  βチューブリンＩＩＩ（ニューロンに対する）（Ｏｚａｗａら、１９８５）などの特異的マーカーの細胞発現をアッセイすることを含むいくつかの手段によって監視できる。いくつかの実施形態において、細胞は、筋細胞中のミオシンプロモーター；ヒト心筋細胞における心臓α−アクチンプロモーター；インシュリン産生細胞におけるインシュリンプロモーター；ニューロン分化のためのニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター、またはドパミン作動性ニューロンにおけるチロシンヒドロキシラーゼプロモーターのような神経伝達物質関連のプロモーターなど）のような細胞型特異的プロモーターの調節下で細胞型特異的マーカーまたはトランスジェニックマーカーの発現（例えば、抗生物質耐性または蛍光タンパク質発現）に基づくＦＡＣＳソーティングを用いた分化開始の成功についてスクリーニングする。いくつかの実施形態では、細胞は標準的なＰＣＲ法と核酸ハイブリダイゼーションベースの方法を使用してスクリーニングされる。特に好ましい実施態様では、細胞は急速なタイピング方法を使用してスクリーニングされる。
【０１３７】
ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）タイプの検査
特定の実施の形態としては、選択された細胞はＨＬＡタイピングに適合するように選択される。ＨＬＡの遺伝子型は、当業者にとって既知の任意の方法により決定される。
【０１３８】
検査に利用される細胞は、ドナーから直接採取された細胞、またはドナー細胞から作られた細胞株由来の細胞、または実用できる細胞源由来の細胞からなってよい。細胞は有益な配列および／あるいは治療ベクター、またＨＬＡタイプを一度にまたは個々に検査され得る。有益な配列でうまくトランスフェクトされ、適当なＨＬＡ遺伝子型を示すこれらの細胞は、患者への移植のために調製することができる。
【０１３９】
特定の実施の形態としては、トランスフェクトされた細胞は、ＨＬＡタイピングすることなく移植される。他の実施の形態としては、細胞は適応するようにＨＬＡタイピングされる。
【０１４０】
細胞の表現型を促進させる作用物質の検査
本発明はまた、選択された細胞および／あるいはその子孫細胞の望まれる細胞集団への表現型の変化あるいは分化を誘発する能力についてたんぱく質および因子をスクリーニングする方法を提供する。簡単に言えば、適切なｃＤＮＡライブラリから相補のＤＮＡ（ｃＤＮＡ）をコードするベクターは選択した細胞および／あるいはその子孫細胞にトランスフェクトされる。分化あるいはその他の表現型の変化を誘発する固有のｃＤＮＡのが特定されると、このようなｃＤＮＡは単離され、インビトロで適切な細胞（ＣＯＳ細胞など）でたんぱく質を生成するための適切な発現ベクターにクローン化され得る。
【０１４１】
その後、上清を含むたんぱく質は、このような細胞から分泌された任意のたんぱく質が分化を誘発するかどうかを決めるのに選択した細胞培養物に適用できる。あるいは、候補の因子は、このような細胞から分泌された任意のたんぱく質が分化を誘発するかどうかを決めるのに選択した細胞培養物に適用できる（米国特許６４３２７１１参照）。本発明はまた、多能、多能性および／あるい自己再生を誘導する能力あるいは選択された細胞および／あるいその子孫細胞の分化を開始する能力について、核酸をスクリーニングするための方法を提供する。
【０１４２】
これらの方法では、電気穿孔法、ナノカプセル、ナノヴォールト、リポソーム、レトロウイルス、レンチウイルス、および／あるいはその他の適用可能なトランスフェクション手段を用いて、選択されたｃＤＮＡ（あるいは適切なｃＤＮＡのライブラリからのｃＤＮＡあるいはその他の配列）をコードするベクターは、選択された細胞および／あるいはその子孫細胞に導入される。表現型の変化、多能、多能性および／あるい自己再生を誘発する固有のｃＤＮＡのが特定されると、このようなｃＤＮＡは単離され、適切な発現ベクターにクローン化され得る。このような変化を決定するアッセイには、本明細書の他のところで説明されるものが含まれる。同様に、上清をふくむたんぱく質が選択された細胞培養物に適用可能であるか、所望の変化を誘発するかを決定するのに適用、インビトロの適切な細胞（ＣＯＳ細胞など）で特定されたｃＤＮＡに対応するたんぱく質が生成されてよい。
【０１４３】
最後にたんぱく質は、電気穿孔法、ナノカプセル、ナノヴォールト、リポソーム、レトロウィルス、レンチウィルスおよび、あるいは任意のトランスフェクションのその他の実用的な方法を用いて選択された細胞および／あるいはそれらの子孫細胞に導入してよく、さらにその結果得られた細胞は、多能、多能性、自己再生または分化の開始について、本明細書に記載したとおりに評価される。
【０１４４】
患者への細胞移植
検査後、選択された細胞および／あるいはそれらの子孫細胞は、凍結保存され、培養する細胞株として維持されるか、患者に与えられ得る。選択された細胞は、当該分野で知られている任意の手法により、凍結保存されまたは維持され、将来の移植術のために保存される。
できれば、検査される細胞は、容易に採取できる、入手が容易な供給源から得る。
【０１４５】
ＨＩＶ抵抗性細胞の生成に関して：本発明における標的となる体細胞および幹細胞はＨＩＶに感染しうる細胞に分化できるあらゆる種類であり得、ＨＩＶの転写および／あるいは複製を維持でき、ＨＩＶの免疫反応を変更でき、エイズへの進行を遅らせうる種類の細胞でありうる。このような幹細胞には、精原細胞、始原生殖細胞、造血幹細胞、末梢血液細胞、胎盤の血液細胞、羊水細胞、臍帯血細胞、口腔細胞、脂肪組織の細胞（これらの組織由来幹細胞を含む）、再プログラムされた細胞、誘導多能細胞、誘導多能性細胞など、人間以外の胚細胞、および／または血液や免疫細胞は、ＨＩＶ標的細胞およびその他の細胞を形成できるその他の細胞型に由来する多能性細胞が含まれるが、これに限定されない。
【０１４６】
「有益な配列」を発現する治療ベクターは、ＨＩＶの複製や転写を維持する能力がより少ないトランスフェクトした細胞または感染細胞をもたらすことを意図する。「有益な配列」を発現する遺伝子ベクターは、そのようなベクターから得られるいかなるウィルスと同様、ここでは“治療ベクター”と名づけられている。
【０１４７】
検査後、望まれる治療ベクターでトランスフェクトし、有益な配列を発現している細胞（ＨＬＡ遺伝型と適合性を有するかまたは有しない）は、細胞を分裂させ安定的な細胞株として保たせる標準の培養法を用いて（米国特許６４３２７１１および５４５３３５７を参照として本明細書に引用）生体外（試験管内）で拡大され得る。その代わりに、これらの細胞は、患者に投与することができ、さらに生体内で拡大することができる。
【０１４８】
選択された細胞は、この技術分野で良く知られた任意の方法で低温保存され、将来の移植術のために保存することができる。
【０１４９】
患者への望ましい細胞集団の移植
特定の実施の形態としては、細胞集団は移植に先立って幹細胞のために富化される。幹細胞を選択する様々な方法は、この技術分野では良く知られている。例えば、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）を介して分取するため、細胞サンプルを、分化していない造血幹細胞（例：、ＣＤ３４、ＣＤ５９、Ｔｈｙｌ、ＣＤ３８  ｌｏｗ、ｃ-ｋｉｔ  ｌｏｗ、ｌｉｎ−ｍｉｎｕｓ）を認識する単クローンの抗体によって富化することができる。その他の実施の形態としては、選択された細胞のサンプルは、富化させられることなく移植される。
【０１５０】
いくつかの実施の形態としては、骨髄の内生幹細胞は、治療幹細胞の移植に先立って排除されるか減少される。治療幹細胞は、有用な配列または治療ベクターを含む幹細胞として定められる。いくつかの実施の形態としては、移植過程は、以下の段階を含んでよい。
（１）訓化、（２）幹細胞注入、（３）好中球減少段階、（４）移植段階、そして（５）移植後期間。
【０１５１】
いくつかの実施の形態としては、一般的に望まれる細胞（例：骨髄幹細胞）を生成する内在性の幹細胞は、移植に先立って排除または減少される。化学療法、放射線などおよび／あるいは米国特許６２１７８６７にあるものに類似した方法は、移植術に適切な移植のために骨髄の状態を整える手法として利用してよい。最終的には治療幹細胞は、この技術分野で知られている任意の方法を用いて患者に移植してよい。
【０１５２】
Ｎｕｍｂ／Ｎｕｍｂｌｉｋｅとその他の導入遺伝子をコードするベクターの設計
ある実施の形態としては、ｎｕｍｂｌｉｋｅ／ｎｕｍｂアイソフォームをコードする核酸配列でのトランスフェクションは、ウィルストランスフェクションを介して完成される。「Ｎｕｍｂ／Ｎｕｍｂｌｉｋｅをコードするベクター」という用語は、ｎｕｍｂｌｉｋｅ／ｎｕｍｂアイソフォームおよび／あるいはｎｕｍｂｌｉｋｅまたはｎｕｍｂアイソフォームを標的とする合成オリゴヌクレオチドをコードする核酸配列だけでなく、あらゆる付加的な導入遺伝子配列、合成オリゴヌクレオチドなど、およびそれらのベクター配列に組み込まれた任意の関連ウィルス上清を組み込んでいるベクターのことを指す。
【０１５３】
Ｎｕｍｂ／Ｎｕｍｂｌｉｋｅをコードするベクターは、発現ベクターを含みうる適切な発現ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡを真核細胞へトランスフェクトするために用いることができる。そのようなベクターは、これらに限られるわけではないが、例えばバクテリアベクター、真核細胞ベクター、例えばイーストベクター、真菌ベクターなど、またそれらに限定されないが、アデノウィルスベクター、アデノ関連ウィルスベクター、レトロウィルスベクターなどのウィルスベクターがある。用いることができるレトロウィルスベクターの例としては、これらに限られるわけではないが、モロニーマウス白血病ウィルス、モロニーマウス肉腫ウィルスや、ラウス肉腫ウィルス、ＦＩＶ、ＨＩＶ、ＳＩＶ、および混成ベクター由来のものを含む。
【０１５４】
Ｎｕｍｂ／Ｎｕｍｂｌｉｋｅをコードするベクターが生体外および／あるいは生体内の細胞へトランスフェクトするためにも用いられ得ることが明らかにされている。トランスフェクションは、この技術分野では知られた任意の方法により行うことができ、特にウィルスパッケージ細胞から生成されたウィルスを用いて行うことができる。このようなウィルスは、様々な細胞タイプに感染できるようキャプシド形成することができる。言うまでも無く、選択された細胞タイプおよび／あるいはその子孫細胞の感染を可能にする任意のキャプシド形成技術は、本発明における状況において実用的である。
【０１５５】
ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）の遺伝子治療ベクターの設計
“治療用ベクター”は発現ベクターを含んでいてもよい。適切な発現ベクターはＤＮＡあるいはＲＮＡを真核細胞にトランスフェクトするために使用できるベクターである。このようなベクターには、それらに限定されないが、例えば、細菌ベクター；例えばイーストベクターおよび真菌ベクターなどの真核細胞ベクター；および、それらに限定されないが、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、およびレトロウイルスベクターなどのウイルスベクターが挙げられる。使用できるレトロウイルスベクターの例は、モロニーマウス白血病ウイルス、モロニーマウス肉腫ウイルス、およびラウス肉腫ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ＨＩＶ、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）およびハイブリッドベクターが含まれるが、これらに限定されない。
治療的ベクター（単数または複数）を用いて試験管内および／あるいは生体内で標的細胞にトランスフェクトできることが本明細書に開示される。トランスフェクションは、当技術分野で公知の任意の手技によって、とりわけ、ウイルスパッケージ細胞から産生されるウイルスを介して実施できる。そのようなウイルスは、ＣＤ３４＋細胞および／またはＣＤ４＋細胞に感染できるようにカプセル形成されてよい。しかしながら、幾つかの例において、他の細胞形がＣＤ４またはＣＤ３４タンパク質が関与しない手段でトランスフェクトされる。それにもかかわらず、そのような細胞型への感染を可能にする任意のカプセル形成技法が、従って、本発明の開示に含まれ得る。
異なるエンベロープタンパク質を用いる仮タイピングは、ウイルスベクターおよび治療用ベクターによって形質導入が可能になる宿主細胞の範囲を拡大し、特に、水疱性口内炎ウイルスのエンベロープ糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）で仮タイピングする場合、ウイルスを高力価に濃縮することができる（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８；Ｒｅｉｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）。
ベクター構築
本発明に用いられるウイルスベクターは、ハイブリッドベクターを含む様々な種類があるだろう。例えば、ベクターは天然ゲノムのとても小さな断片だけを含む（Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）、第三世代のレンチウイルスであろう。導入遺伝子をコードするベクターの生成は、標的細胞への感染のあとに全長ベクターＲＮＡの生成を  排除する、自己不活化転移ベクター（Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８；  Ｍｉｙｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）も含み得る。
ウイルスベクターは、複製に必要である、ある種のウイルスプロテインを発現し損なうことによる、複製不可能なものを利用されるだろう。しかしながら、ヘルパーウイルスが治療用ウイルス複製を可能にすることも考えられる。この可能性は自己不活性化ベクターを使用することで減じることができる。
好ましい実施の形態にて、導入遺伝子配列はユビチキンプロモーター、，Ｕ６プロモーター、ＥＦｌ  アルファプロモーター、ＣＭＶプロモーター、調節可能なプロモーターおよび、あるいは、望まれる細胞タイプの特定なプロモーターによって駆動される。
ウイルス向性
好ましい１つの実施の形態としては、本発明のＮｕｍｂ  アイソフォーム／  Ｎｕｍｂｌｉｋｅをコードするベクター、治療用ベクターおよび、あるいはその他のトランスジェニックベクターに由来するウイルスは、水疱性口内炎ウイルスエンベロープ糖タンパク質によって仮タイピングし、ウイルス濃度を高力価にすることができ、ＣＤ３４＋細胞の感染を促進する。
配列選択
ＮＵＭＢまたはＮｕｍｂｌｉｋｅ配列（Ｅｎｔｒｅｚ−Ｐｕｂｍｅｄ  データベースを用いて検索可能）として参照される任意の配列に７０％以上同一である（または相補性である）任意の配列の使用は、本発明により書かれた方法により利用されるならば、本発明によって包含される。
本発明は、ＨＩＶ  １  とＨＩＶ−２ウィルス（両方とも本明細書ではＨＩＶと呼ぶ）による哺乳類細胞の感染のしやすさを顕著に減少させることができる配列を誘導する遺伝子ベクターに一部関係する。
本発明は、有害なＨＩＶ／ＡＩＤＳ病の過程に重要な遺伝子発現を減少させる新規の合成オリグヌクレオチドの組み合わせを明らかにする。
共受容体に「ノックダウン」をもたらす合成オリゴヌクレオチドとＴＡＲおよびＲＲＥデコイ配列の発現との組合せの望ましいところは、個々の細胞において、１）ＨＩＶ感染、２）ＨＩＶ転写、および３）ＨＩＶ複製を同時に標的とする組合せの複数の遺伝子治療アプローチが、これらの単独でのアプローチのどのものよりも高い治療的有益性を生み出すらしいという、本明細書で述べた命題に起因している。
治療用ベクターは、ＨＩＶの複製や転写の持続性を減少させるようトランスフェクトされた細胞または感染細胞に対しもたらすことを意図した、「有益な配列」を発現する。「有益な配列」を発現する遺伝子ベクターならびに、そのような遺伝子ベクターに由来するいかなるウィルスは、「治療用ベクター」とここで名づけられている。
本発明では、一部にはＨＩＶ感染に対し感受性が強いかまたはＨＩＶを伝播できる細胞への遺伝子改変に向けられている。そのような細胞は、ここでは「標的細胞」と名づけられている。
本発明は、成熟したまたは未成熟の標的細胞、白血球、血液細胞、あらゆる幹／前駆細胞、および／あるいはそれらの子孫細胞のＨＩＶ感染に対する感受性を減少させる組成物と治療用のウィルスベクターの使用方法を与える。
また本発明は、再プログラムされた細胞、誘発された多能細胞、誘発された多能性細胞および／あるいはそれらの子孫細胞のＨＩＶ感染に対する感受性を減少させる組成物と治療用のウィルスベクターの利用方法を与える。
本発明の更なる目的は成熟したあるいは未成熟の標的細胞、幹／前駆細胞（再プログラムされた細胞、誘発された多能細胞、誘発された多能性細胞を含む）および／あるいはそれらの子孫細胞が免疫不全ウィルスの複製や転写を維持する能力を減少させることである。
本発明のもう１つの目的は、成熟または未成熟の標的細胞、その他の静止状態の細胞、幹／前駆細胞および／あるいはそれらの子孫細胞において有効で長期的に治療用配列発現することである。
ある局面では本発明は、ＨＩＶ感染を予防しまたは治療する方法も提供する。その方法は、治療用ベクターまたは配列をトランフェクトされた幹細胞を、ＨＩＶに感染した患者に移植することを含む。
有効な配列は、ＨＩＶウィルスが細胞に感染する能力、ウィルスＤＮＡを転写する能力、または感染した細胞内で複製する能力を減少させるまたはＨＩＶ感染を中和する細胞の能力を高めるものだろう。
【０１５６】
特定の実施形態においては、、有効な配列とはＨＩＶの侵入を妨げる合成オリゴヌクレオチドを示し、いかなるＨＩＶ共受容体（ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ２ｂ、  ＣＣＲ３、  およびＣＣＲｌなどに限らず）に対抗するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡまたはｍｉＲＮＡが挙げられる。
【０１５７】
好ましい実施形態では、治療用ベクターとは、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲｌ、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＸＣＲ６および／あるいは  ＢＯＢなどのＨＩＶ共受容体の１つまたはそれ以上を標的にする、合成オリゴヌクレオチドを含む。
【０１５８】
別の好ましい実施形態では、治療用ベクターは主要なＨＩＶ共受容体であるＣＸＣＲ４  とＣＣＲ５を標的にする、合成オリゴヌクレオチドなどがある。
【０１５９】
更なる好ましい実施形態では、治療用ベクターは、１つまたはそれ以上のＨＩＶ逆転写酵素、インテグラーゼ、タンパク分解酵素などのＨＩＶ酵素を標的にする合成オリゴヌクレオチドを含む。
【０１６０】
合成オリゴヌクレオチドとして適切な配列は、１）コンピュータのアルゴリズムにより、標的配列の減少に効果的であると予想でき、２）標準の定量的ＲＮＡ分析検査および、酵素活性検査で７０パーセントを超えるか、またはそれより劣っていても治療的である度合いで標的酵素の量を減少させる能力のあるものである。
【０１６１】
「標的配列」という言葉は、特定の配列が、ウイルスゲノムのヌクレオチド配列と少なくとも７０％一致するヌクレオチド塩基配列を有しているあるいはその補足物（例えば、そのようなウイルスゲノム配列に同じかまたは相補性である）、あるいは対応するＲＮＡ配列であることを示す。本発明の特定の実施形態においては、この言葉は、配列が、オリゴヌクレオチドが指向される特定のウイルスのウイルスゲノム配列あるいはその相補配列と少なくとも７０％一致することを示す。
合成オリゴヌクレオチドの様々な種類のいずれも、治療用ベクターのトランスフェクションを介して発現されてもよい。また、本発明はこのようなオリゴヌクレオチドのあらゆる可能な組み合わせに関する。
【０１６２】
一つの好適な実施形態において、合成オリゴヌクレオチドの配列は標的細胞、特定のプロモーターにより駆動される。別の好ましい実施態様では、合成オリゴヌクレオチド配列はＵ６プロモーターにより駆動される。
【０１６３】
合成オリゴヌクレオチドは、デコイＲＮＡと同じ治療用ベクターに含めてよい。
デコイＲＮＡ
【０１６４】
デコイＲＮＡは、特定のたんぱく質に結合して、その機能を抑制するのに効果を示すＲＮＡの配列である。
【０１６５】
一つの好ましい実施形態では、治療用ベクターは、複数のデコイＲＮＡ配列から成る。
【０１６６】
更なる実施形態では、デコイＲＮＡ配列は、デコイ配列の安定性を与える配列に隣接する。
【０１６７】
その他の好ましい実施形態では、デコイＲＮＡ配列はＲＲＥおよび／あるいは  ＴＡＲデコイ配列である。
【０１６８】
一つの実施形態では、ＲＲＥとＴＡＲデコイ配列は、ＨＩＶ−２から操作されるＴＡＲとＲＲＥ配列である。他の好ましい実施の形態としては、デコイ配列は、Ｐｓｉ要素デコイ配列をも含む。
【０１６９】
一つの好ましい実施形態では、デコイ配列はそれぞれＵ６プロモータによって駆動される。
【０１７０】
別個の好ましい実施の形態としては、デコイ配列は標的細胞の特定プロモータによって駆動される。
一つの好ましい実施の形態としては、治療用ベクターは、ＨＩＶ−２  ＴＡＲ  および／あるいはＲＲＥデコイ配列を組み合わせて合成ヌクレオチド配列をコードすることによって、ＨＩＶのライフサイクルの複数の段階を標的とする。
【０１７１】
別個の好ましい実施の形態としては、ベクターはｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチド配列を含む。
【０１７２】
別個の好ましい実施の形態としては、ベクターはｓｈＲＮＡオリゴヌクレオチド配列を含む。
【０１７３】
別個の好ましい実施の形態としては、ベクターはｓｉ  ＲＮＡオリゴヌクレオチド配列を含む。
【０１７４】
別個の好ましい実施の形態としては、ベクターはＲＮＡｉオリゴヌクレオチド配列を含む。
【０１７５】
別個の好ましい実施の形態としては、ベクターはリボザイム配列を含む。
【０１７６】
別個の好ましい実施の形態としては、ベクターは合成オリゴヌクレオチドクラスの組み合わせを含む。
更なる実施の形態としては、合成ヌクレオチド配列は、ＣＣＲ５、  ＣＸＣＲ４などのＨＩＶ共受容体を標的にする。
【０１７７】
更なる実施の形態としては、合成ヌクレオチド配列はインテグラーゼ、プロテアーゼ、逆転写酵素、ＴＡＴなどのＨＩＶ酵素を標的にする。
【０１７８】
更なる実施形態としては、リボザイム配列は、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４などのＨＩＶ共受容体や、インテグラーゼ、プロテアーゼ、逆転写酵素、ＴＡＴなどのＨＩＶ酵素を標的にする。
【０１７９】
一つの好ましい実施形態では、ウィルスは治療用ベクターを用いて生成され、ウィルスはシュードダイピングされる。
【０１８０】
一つの好ましい実施形態では、ウィルスは治療用ベクターを用いて生成され、ウィルスはシュードタイプされずに、天然のＨＩＶトロピズムを見せる。
【０１８１】
一つの好ましい実施形態では、治療用ベクターは、ウィルスベクターである。
【０１８２】
一つの好ましい実施の形態としては、治療用ベクターは、レンチウィルスベクターである。
【０１８３】
一つの好ましい実施形態では、治療用ベクターは第三世代のレンチウィルスベクターである。一つの好ましい実施形態では、治療用ベクターは、合成ヌクレオチドクラスの組合せを含む。
【０１８４】
好ましい一つの実施形態では、合成ヌクレオチド配列の発現は、ＥＦ−１  ａｌｐｈａプロモータまたは他の標的細胞の適正なプロモータによって駆動される。
【０１８５】
一つの好ましい実施形態では、合成ヌクレオチド配列の発現は、Ｕ６プロモータまたは他の標的細胞の適正なプロモータによって駆動される。
【０１８６】
一つの好ましい実施形態では、合成ヌクレオチド配列の発現は、ＥＦ−１  ａｌｐｈａとＵ６の組み合わせおよび／あるいは、他の標的細胞の適正なプロモータによって駆動される。
【０１８７】
一つの好ましい実施の形態としては、ＥＦ−１  ａｌｐｈａは、Ｕ６プロモータがＲＮＡデコイの遺伝子発現を操作する一方で、ｍｉＲＮＡの遺伝子発現を駆動する。
好ましい一つの実施形態では、ＥＦ−１  ａｌｐｈａは、Ｕ６プロモータがＲＮＡデコイの発現を駆動する一方で、ｓｉＲＮＡ配列の発現を駆動している。
【０１８８】
好ましい一つの実施形態では、ＥＦ−１  ａｌｐｈａは、Ｕ６プロモータがＲＮＡデコイの発現を駆動する一方で、ｓｈＲＮＡ配列の発現を駆動している。
【０１８９】
好ましい実施態様では、治療用のベクターはＣＸＣＲ４に向けられた複数のｍｉＲＮＡ配列、ＣＣＲ５に向けられた複数のｍｉＲＮＡ配列、ＨＩＶ−２  ＲＲＥデコイ配列および、ＨＩＶ−２のＴＡＲデコイ配列を含み、およびベクターはウイルスベクターである。
好ましい実施態様では、治療用ｖｃｃｔｏｒ含む治療は、薬理学的治療を含む抗レトロウイルス療法の他のモードと組合わされる。治療用ベクターとの組み合わせに適した抗レトロウイルス療法は、治療用ベクターとの組み合わせにおける付加または相乗効果のある治療である。
【０１９０】
ＨＩＶの遺伝子治療のための標的となる細胞には、成熟末梢血Ｔリンパ球、単球、組織マクロファージ、Ｔ細胞の前駆細胞、マクロファージ−単球前駆細胞、および／あるいは臍帯血、末梢血、および占有骨髄スペース中に見出されるような多能造血幹細胞が含まれ得るが、これらに限定されない。
【０１９１】
本発明は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞、マクロファージ、Ｔ細胞の前駆細胞、マクロファージ−単球前駆細胞、ＣＤ３４＋幹細胞／前駆細胞および／またはその他の任意の静止細胞、分裂細胞で、体外あるいは体内でＨＩＶ標的細胞に分化可能な幹細胞または前駆細胞、ＣＤ４  ＋  Ｔ細胞、マクロファージ、Ｔ細胞の前駆細胞、マクロファージ−単球前駆細胞、および／またはＣＤ３４  ＋幹細胞／前駆細胞のトランスフェクションに関する。そのため、トランスフェクトされた細胞は、インサイチュでの内因性の細胞あるいは、他の身体部位、あるいはその他の個々のドナーから取り出した外因性の細胞であってよい。この目的のために選択された細胞を本明細書では「選択された細胞」と呼ぶ。
【０１９２】
同様に、自己再生、多能、および／あるいは多能性幹細胞（再プログラムされ、誘発された多能性細胞を含む）は、ＨＩＶの遺伝子治療のための別の論理的なターゲットを表し、その使用は、特に本発明に包含される。本プロセスの一実施形態では、選択された細胞（スチールファクター、皮膚幹細胞、臍帯細胞、始原生殖細胞（ＰＧＣ）、精原細胞、アクセス可能な任意の体細胞など）は、１）培養中に１つあるいは複数のサイトカイン（造血幹細胞因子、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、カーディオトロピン−１、ＩＬ−１１、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＧＰ−１３０、ＣＮＴＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ｂＦＧＦ、および／あるいはオンコンスタチン−Ｍなど）を用いて培養され、２）当該技術分野（本明細書で参考として援用されたＵＳＰａｔｅｎｔ  ５６７７１３９に記載されたものなど）で既知の任意の方法を用いた、あるいはその他の標的細胞に関して、ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ５６７７１３９に類似した方法による分化の前に治療用ベクターまたは有益な配列でトランスフェクトされる。
【０１９３】
別の実施形態では、トランスフェクションの前にさまざまな段階を実施することが望ましいかもしれない。別個の実施の形態としては、多能性の幹細胞集団を生成する目的で、上記の培養の段階だけが行われることが望ましい。
【０１９４】
その他の細胞培養条件の他、幹細胞および前駆細胞の増殖／増殖のためのＬ１Ｆおよび造血幹細胞因子の適切な濃度についてはすでに説明している（例えば、本明細書において参考用に引用されているＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ６４３２７１１および５４５３３５７）。その他の適切なプロトコルおよび参照のサイトカイン濃度については、Ｋｏｓｈｉｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ．、１９９６；  Ｋｅｌｌｅｒｅｔ  ａｌ．、１９９６；  Ｐｉｑｕｅｔ−Ｐｅｌｌｏｒｃｅ、１９９４；  Ｒｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．、１９９４；  Ｐａｒｋ  ａｎｄ  Ｈａｎ、２０００；  Ｇｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００６；  Ｄｙｋｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６において説明されている。
【０１９５】
標的細胞の集団は、体細胞、幹細胞、前駆細胞を含むであろう。幹細胞はおそらく、既存の細胞株に由来するか、貯蔵、バンク化、または低温保存された供給源から分離されたものである。幹細胞の典型的な供給源は、骨髄、末梢血、胎盤血、羊水液、臍帯血、脂肪組織、ヒト以外の胎芽などである。
【０１９６】
体細胞、特に循環白血球やその他の非前駆細胞／幹細胞も同様に幹細胞／前駆細胞について有効な上記したと同じ培養条件におかれてよく、結果として、それらの細胞は幹細胞／前駆細胞の性質を得る。
【０１９７】
本発明は、ＨＩＶ感染および／あるいはＨＩＶ複製へ相対的に抵抗性があるよう作られ得る幹細胞／前駆細胞から標的細胞を生成することも明らかにする（ＵＳＰａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ２００３００９９６２１など）。
しかしながら、以前に増やした幹細胞／前駆細胞／白血球を所望の細胞に分化させる任意の方法は、ＨＩＶ感染および／あるいはＨＩＶ複製および／あるいはＨＩＶ転写に対し相対的に抵抗性のある機能的標的細胞が生成される限り、本発明の範囲内で働き得る。
【０１９８】
好ましい一つの実施形態では、治療用ウィルスベクターは、ネイティブＨＩＶ株が感染し得るあらゆる細胞に対し感染する能力を治療用ウィルスに与えるネイティブＨＩＶウイルスからの１つないしそれ以上のエンベロープたんぱく質でパックされる。
【０１９９】
本発明で使用するために選択された細胞は、幾つかの例では手に入りやすい細胞である（例えば、臍帯幹細胞、骨髄幹細胞、精巣の精原細胞、および始原生殖細胞、羊水液から単離された幹細胞、皮膚から単離された幹細胞など）。これら細胞はこの技術分野で知られている任意の方法により、それらが存在する組織から単離することができる。
【０２００】
他の選択された細胞は、再プログラムされた細胞、誘導された多能細胞、誘導された多能化細胞などから成るであろう。
【０２０１】
本発明の一つの側面によれば、選択した細胞から、目的の細胞株、細胞型、あるいは細胞クラスを生成する方法が提供される。一般的に、この方法は、最適な成長速度で選択した細胞の成長を促進する条件下での選択した細胞および／あるいはその子孫細胞の培養を含む。
次に、生成された細胞集団は通常最適な速度未満の速度で、および細胞の必要な細胞株、細胞型、細胞クラス（ＣＤ４  ＋  Ｔ細胞など）への分化を促進する因子の存在下で細胞の成長を促進する条件下で培養される。
発明はこの他に、治療用ベクターによるトランスフェクション前あるいは後に当該技術分野で既知の手段（ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ２００６００９９１７７など）によって、選択した細胞および／または子孫細胞の培養での増殖を開示する。このような方法はまた、ＬＩＦ、スチールファクター、Ｉｌ−６、ＩＬ−７、オンコンスタチン−Ｍおよび／あるいはカーディオトロピン−Ｉ、およびその他の成長促進サイトカインなどによる培養を含む。
本発明はさらに、適切なサイトカインおよびＭ−ＣＳＦ（ＣＳＦ−１）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−７、ＣＤ４＋Ｔ細胞分化を促進する任意のサイトカインなどコロニー刺激因子などの成長因子を含む培地での更なる培養により治療用ベクターでトランスフェクトされた細胞の所望の細胞型への定方向分化も開示する。
【０２０２】
トランスフェクション
選択した細胞および標的細胞の遺伝子改変は、それらが外因性の細胞あるいは内因性の細胞であるかに関係なく、当該技術分野において既知であり、公開済みあるいは未公開の方法（Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏｓ．  ６，４３２，７１１，  Ｕ．Ｓ．  ０５，５９３，８７５，  Ｕ．Ｓ．  ０５，７８３，５６６，  Ｕ．Ｓ．５，９２８，９４４，  Ｕ．Ｓ．  ０５，９１０，４８８，  Ｕ．Ｓ．  ０５，８２４，５４７など）、あるいはその他の一般的に通用する手段によって実施可能である。宿主細胞を形質転換するための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ  （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ  （１９８９））およびその他の研究室の教科書に記載されている。
【０２０３】
うまくトランスフェクトした細胞をＲＮＡの発現アッセイと形態学的解析に加えて、抗生物質耐性遺伝子などのマーカーを含む選択プロトコルによって識別できる。適切なレベルで適切な外因性のＤＮＡを発現するうまくトランスフェクトした細胞から生成されたクローンは、凍結保存（当該技術分野で既知の適切な冷凍保存方法を用いて）によって細胞株として保存できる。
【０２０４】
選択可能なマーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）は、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、アンピシリンとブラストサイジンなどの薬に耐性を与えるマーカーを含んでいてもよい。対象となる遺伝子を含む細胞は、選択可能なマーカー遺伝子を組み込んだ細胞が生き残り、それ以外の細胞は死滅する薬品選択によって特定できる。
【０２０５】
本発明の実施の形態における理論上の根拠は、ここで記されている通りである。しかしながら、ここでの議論は本発明を縛るとか制限するものではない。当業者は、本発明の理論上の根拠を記すために用いられたモデルに関わらず本発明の様々な実施形態が実施可能であることを理解するであろう。
【０２０６】
本発明は、以下の例に関して記載され例示されるであろう。しかしながら、本発明の範囲は、これらに限定して示されたわけではない。
【実施例】
【０２０７】
例１．本発明において使用するための適切なトランスジェニックベクターの構築
適切なＥＧＦＰ−ＮｕｍｂおよびＥＧＦＰ−Ｎｕｍｂｌｉｋｅ、およびＥＧＦＰ−Ｘレンチウイルスベクター（ここでＸは本発明で説明した任意の導入遺伝子）は適切なウイルスベクターにクローニングによって生成されることができる（例えば、二つの遺伝子ＨＩＶ−ＥＧＦＰ−ＨＳＡベクター）（ライザーら、２０００））。アダプタプライマーは、ＮｕｍｂｌｉｋｅとＮｕｍｂアイソフォームｃＤＮＡのＰＣＲ増幅のためおよび遺伝的ベクター中へのクローニングのために選択することができる。クローニングのための準備では、遺伝子ベクターは酵素で消化される。その後、各導入遺伝子のｃＤＮＡは、先にＨＳＡのｃＤＮＡで占められたネフコーディングに挿入される。ＥＧＦＰ（強化緑色蛍光たんぱく質）と細胞集団に適切なプロモーター（すなわちＣＭＶまたはＥＦｌアルファなど）は、その前に、ウイルスコード領域に挿入された。遺伝子構築物は、ベクターバックボーンを含むおよび異種核酸配列に作動可能に連結するプロモーターを調節するトランスアクチベーターを含むことができる。
【０２０８】
採用してよいレトロウイルスベクターの例は、これらに限定されないが、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス肉腫ウイルス、およびラウス肉腫ウイルス、ＦＩＶとＨＩＶ由来のものを含む。適切な発現ベクターは、真核生物の細胞にＤＮＡまたはＲＮＡのトランスフェクションに使用してよい発現ベクターである。このようなベクターには、これらに限定されないが、例えば、細菌のベクター；真核生物のベクター（例えば、酵母のベクターと真菌のベクター）；およびウイルスベクター（これらに限定されないが、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター）が含まれる。
複製能のないｐｃＤＮＡ  ６．２／ＥｍＧＦＰ−Ｂｓｄ／Ｖ５−ＤＥＳＴベクターは、適切な発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の一例であり、標的配列を開裂する能力をもつｐｃＤＮＡ  ６．２ＧＷ／ｍｉＲベクターから転移した合成オリゴヌクレオチド（例えば、ｍｉＲＮＡ）の発現を可能にする。これらのベクターには、より長いｐｏｌ  ＩＩの転写産物（プレｍｉＲＮＡ）からの操作されたｍｉＲＮＡの切断を指向するための内因性ｍｉＲＮＡ由来の隣接配列およびループ配列が含まれる。
【０２０９】
特定の内生ＲＮＡ種に対して向けられた複数のｍｉＲＮＡ配列の組合せは、標的細胞配列の遺伝子発現を減少させる成功を促進させる可能性がある。ｍｉＲＮＡ配列は、調節可能なまたは組織特異的プロモータに作動可能に連結していてよい。
【０２１０】
遺伝子発現のためにレンチウィルスベクターを使用することによって生じる本発明の、Ｎｕｍｂ  ／  Ｎｕｍｂｌｉｋｅコードベクターおよび／あるいは他のトランスジェニックベクターは、分裂細胞型と非裂細胞型のいずれにも安定的な形質導入することができるようになる。
【０２１１】
好ましい実施の形態としては、結果として生じる本発明のＮｕｍｂ  ／  Ｎｕｍｂｌｉｋｅコードベクターおよび／あるいは他のトランスジェニックベクターは、特定のｎｕｍｂアイソフォームおよび／あるいはｎｕｍｂｌｉｋｅの発現を減少させるかぎり、１つまたはそれ以上のプロモータによて駆動された複数の合成ヌクレオチド配列を含む。
例２：他の適したベクターの例は、レトロウィルスベクターである。レトロウィルスは、ＲＮＡゲノムを含むＲＮＡウィルスである。Ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ遺伝子は、末端長反復（ＬＴＲ）配列によって隣接される。５’  と３’  ＬＴＲ配列は、ｍＲＮＡの転写とポリアデルニ化を促進する。
【０２１２】
レトロウィルスベクターは、調節可能なトランス活性化エレメント、内部リボソーム再侵入部位（ＩＲＥＳ）、選択マーカー、調節可能なプロモータによって操作された標的異種性遺伝子を与えることができる。
【０２１３】
また、複数の配列を、複数のプロモーターの制御下で発現することができる。最後に、レトロウイルスベクターは、逆転写と組込みのために必要なシス作用配列を含んでいてよい。感染時には、ＲＮＡは、効率的にホストゲノムに組み込まれるＤＮＡに逆転写される。本発明の組換えレトロウイルスは、ネイティブなウイルスのレトロウイルス遺伝子、感染性遺伝子のいくつかが削除され、特定の例では、その代わりに細胞の遺伝子改変のための標的核酸配列に置き換えられるような方法で遺伝子改変される。配列は、天然型またはその変形型において、ＤＮＡまたはＲＮＡであってよい。
例３：本発明のＮｕｍｂ／Ｎｕｍｂｌｉｋｅコードベクター、および／または他のトランスジェニックベクターの生成のための例示の方法
本発明の、得られるＮｕｍｂ／Ｎｕｍｂｌｉｋｅコードベクター、および／または他のトランスジェニックベクターは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のウイルスパワーレンチウイルス発現システムマニュアル、２００７年に教えているものを含む。簡潔には、ＥｍＧＦＰに基づくカセットＰｍｌＩ−ＢＩｐＩフラグメントとしてｐＬｅｎｔｉ６／Ｒ４Ｒ２／Ｖ５−ＤＥＳＴベクターにクローン化され、一方、ｍｉＲ−長（ＰＲＲ＋）ｎｕｍｂアイソフォームかまたはｍｉＲ−短ｎｕｍｂアイソフォーム／  ｎｕｍｂｌｉｋｅカセットは、
同時にＢＰ反応によってｐＤＯＮＲ２２１に移入される。その後、調節可能なプロモーターとｍｉＲ  −アイソフォームカセットは、改変されたｐＬｅｎｔｉ６／ＥｍＧＦＰに基づく／Ｒ４Ｒ２−ＤＥＳＴベクター中にマルチサイトＬＲ交差される。複数のベクターは、合成オリゴヌクレオチドと導入遺伝子カセットのさまざまな組み合わせを含むこの方法で生成することができる。
【０２１４】
ｐＬｅｎｔｉ６／Ｒ４Ｒ２／Ｖ５−ＤＥＳＴベクター配列：
【０２１５】
【化１】
2010528613.tif 000054
【０２１６】
【化２】
2010528613.tif 000055
【０２１７】
例４：治療用ベクターの生成の追加的方法
「パッケージ細胞株」は、ウィルスのｇａｇ、  ｐｏｌ、  ｅｎｖ構造遺伝子によって、正常細胞株にトランスフェクトしたまたは感染させて生じたヒトおよび／あるいは動物の繊維芽細胞株から得られる。その一方で、パッケージ細胞株は、ｐｓｉ配列のＲＮＡ欠陥を生む。従って、パッケージ細胞から生成されたウィルス粒子は、ｇａｇ、ｐｏｌ、またはｅｎｖ遺伝子を含まない。一度、ｐｓｉ配列を含む治療用ベクターのＤＮＡが、トランスフェクションまたは感染によって、パッケージ細胞に導入されると（治療用遺伝子とともに）、パッケージ細胞は治療用のＲＮＡを最終標的細胞（例：ＣＤ４＋細胞）へ移送する様々な能力を生成することができる。
【０２１８】
治療用ベクターの「感染しやすい範囲」は、パッケージ細胞株によって決められる。
多くのパッケージ細胞株が、広範囲のヒトの細胞タイプに感染するのに適したウィルス生成のために入手できる。これらのパッケージ細胞株は、それでも普段自然では他の動物種に感染するウィルスから得られるキャプシド形成ができるウィルスベクターである。例えば、ＳＩＶ  またはＭＭＬＶ由来のベクターは、ＧＰ  １２０キャプシド形成細胞株によりパッケージされ得る。
治療用ベクターの上清を生成する例のプルコトルは以下の方法で得られる。
【０２１９】
１．２０マイクログラムのレトロウィルスベクターが、１．５ｍｌのプラスチック・チューブ中でＨｅｐｅｓ緩衝生理食塩水（ｐＨ＝７．０５）０．８‐１ミリリットルのゆるやかなタッピングによって選別できるマーカー遺伝子（例えば、抗生物質耐性遺伝子）を含む２‐３マイクログラムのウィルスＤＮＡと混ぜ合わせられる。
２．７０マイクロリットルの２ＭＣａＣｌ２が、ゆるやかなタッピングを繰り返しながら混合液に入れられる。
３．チューブの中に、青い沈殿が初めて起こったら、生成物はパッケージ細胞（商業用ベンダーのいくつからでも）の３０％の密集した層にゆるやかに適用すべきであるＤＮＡ混合物は、パッケージ細胞から最初に培地を除いた後にのみ適用すべきである。
４．パッケージ細胞は、室温（２５℃）に置いて２０−３０分培養してから、３６‐３８度のインキュベーターに３．５時間入れられる。
５．３．５−４ミリリットルの１５％グリセロールを含むヘペス緩衝化生理食塩水を３分間加えて、次に細胞をＤｕｌｂｅｃｃｏの改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）＋１０％  ＦＢＳ  ｘ２で洗浄する。
６．ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳをもどして加え、３７度で２０時間細胞を培養する。
７．取り除き、治療用のウィルス粒子を含む培養液を取り除いてろ過する。
【０２２０】
過剰なウィルスの上澄みは、瞬時に保存されるかまたは濃縮され摂氏−８０度で保存される。上澄みは、標的細胞感染効率を増加させるため、５から８マイクログラムのポリブレンとともに保存される。別の方法で、ポリブレンは除かれるかまたは感染させる前に加えてよい。
【０２２１】
安定的な生産者ラインは、
８．安定的な生産ラインは、分割パッケージ細胞株を１から２０、または１から４０に分割し、その後に、これらの細胞を最大１０日間（３日ごとに培地を交換する）選択薬（トランスフェクトした耐性遺伝子に対応する特定の抗生物質）を含む培地中で培養することによって確立することができる。
【０２２２】
９．１０日のちに単離したコロニーは選びとられ、成長させて一定分量に分けられ保存のために冷凍される。
【０２２３】
レトロウイルスの感染性／滴定アッセイは、２０％集密度で置かれたＮＩＨ  ３Ｔ３細胞などの「テスト」細胞のコンフルエントな層にウイルス上清の規定ボリュームを適用して実施する。２〜３回の細胞分裂（ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞については２４−３６時間）の後、抗生物質を含む培地中で３７℃で培養された“テスト”細胞のコロニーがカウントされる。上清の力価は、これらのコロニー数から次の式により推定され：
コロニー形成単位／ｍｌ＝同定されたコロニーＸの０．５（分割因子）／ウイルスの液量（ｍｌ）
この推定値の精度は、“テスト”細胞の多くのプレートにわたり大液量の上清を試験することによって上昇する。
【０２２４】
治療用ウィルスの上澄みの標的細胞へのアプリケーションは、臨床の状況に適した様々な方法により成される。
【０２２５】
例５：選択された細胞のための成長培地
選択された細胞は、グルタミン、β−メルカプトエタノール、１０％（体積で）ウマ血清、ヒト遺伝子組換え白血病抑制因子（ＬＩＦ）で補充したダルベッコの改変最小必須培地（ＤＭＥＭ）で増殖／成長させることができる。ＬＩＦによって、細胞のフィーダー層上で選択した細胞を維持する必要がなくなり、（それもまた使用してもよく）、さらに、未分化、多能、または多能性の状態にある選択された細胞を維持するために必須であり、このような細胞をグルタミン、β−メルカプトエタノール、１０％（体積で）ウマ血清、およびヒト遺伝子組換え白血病抑制因子（ＬＩＦ）を補充したダルベッコの改変最小必須培地（ＤＭＥＭ）で維持することができる。ＬＩＦにより、細胞のフィーダー層上で細胞を維持する必要がなくなり、（それもまた使用してもよく）、さらに未分化状態にある細胞を維持するために必須である（米国特許６４３２７１１によって）。
【０２２６】
選択した細胞をニューロン細胞へと分化開始するためには、細胞をトリプシン処理し、洗浄してＬＩＦを除き、１０％牛胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したＤＭＥＭ中に置く。  ＤＭＥＭおよび１０％のＦＢＳ中に再懸濁した後、１×ｌＯ６細胞を６０ミリメートルフィッシャー細菌学的グレードのペトリ皿中の、５ｍｌのＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、０．５マイクロモル（ｍｉｃｒｏ  Ｍ）のレチノイン酸中におくが、そこでは細胞が小さな集合体を形成すると予想される。集合は、適切な細胞の分化に役立つ。適切なニューロン転写因子による高効率トランスフェクションが、ＤＭＥＭ培地、ＦＢＳ、およびレチノイン酸中におく前かその後におこることができる。（追加の詳細については米国特許６４３２７１１および５４５３３５７を参照）。
【０２２７】
例６：ＨＬＡマッチング。  選択した細胞（例：臍帯血、またはその他の適する供給源および／あるいはそれらの子孫細胞からの細胞．）は検査され、遺伝子が改変され（オプション）、増殖させられ、望まれる細胞タイプ（オプション）への分化開始のために誘導することができる。それら細胞は、標準的な幹細胞移植プロコトルに従って移植される。特定の例として、細胞はＨＬＡマッチングなしに移植してよい。
例７：ごくまれな例では、生体内における細胞分裂または細胞分化を刺激するか抑制する目的で、導入遺伝子をコードするベクターを患者に導入することは適切であろう。
【０２２８】
例８：選択された細胞の遺伝子改変
体外では外因性の細胞や、患者の内因性の細胞の遺伝子改変のいずれかを当技術分野で公知の公表されたか未公表の方法（米国特許第６，４３２，７１１、同第０５５９３８７５、同第０５７８３５６６、同第５９２８９４４、同第０５９１０４８８、同第０５８２４５４７など）または、他の一般に受け入れられた手順によって実施することができる。宿主細胞を形質転換するために適した方法をＳａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ（１９８９））、および他の研究室の教科書に発見することができる。うまくトランスフェクトした細胞はＲＮＡの発現アッセイと形態学的解析に加えて、抗生物質耐性遺伝子などのマーカーを含む選択プロトコルによって識別される。適切なレベルで適切な外因性のＤＮＡを発現するうまくトランスフェクトした細胞からクローンは、凍結保存（当技術分野で公知の任意の適切な凍結保存方法を用いて）によって細胞株として凍結保存することができる。
選択マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）として、Ｇ４１８、ハイグロマイシンとメトトレキサートなどの薬に耐性を与えるものなどを挙げることができる。関心のある遺伝子を含む細胞を、選択可能なマーカー遺伝子を組み込んだ細胞は生き残るが、そうでない細胞は死滅する薬剤選択によって識別することができる。
【０２２９】
本発明は、本発明の「選択された細胞」としての、遺伝子改変の選択を開示する。遺伝子改変という用語は、当技術分野で公知の手段によって、天然または合成の核酸を選択した細胞および／またはその子孫細胞に、または不死化した細胞株および／またはその子孫細胞に導入することによって細胞の遺伝子型を変えることを指す。また遺伝子発現パターンの永続的な変化を誘発する培養条件は、本明細書においては遺伝子改変を表すことと考えられている。幹細胞の改変は、それらが宿主の脳、内因性ドナー源、外因性のドナー源、または細胞株に由来するものであろうと、特定の人間の病気、特に人間の神経系の病気、の治療に実行可能なアプローチを表している。
【０２３０】
本開示に包含される遺伝的改変は、これらに限定されないが：ｉｎ  ｖｉｖｏで実行される遺伝子改変；変更は、内因性または外因性の選択した細胞および／またはその子孫細胞が発現する代謝酵素の活性または量、；変更は、改変細胞たんぱく質の活性、量、または抗原性を変更する；シグナル伝達経路に関与するたんぱく質の活性または量を変更する改変；ＨＬＡのタイプを変更する改変；細胞の分化を変更する改変；腫瘍の可能性を変更する改変；細胞の分化を変更する改変；構造たんぱく質の量または活性を変更する改変；膜関連たんぱく質（構造または酵素的）の量または活性を変更する改変；活性やたんぱく質、ＤＮＡ修復および染色体の維持に関与するたんぱく質の活性または量を変える改変；細胞輸送に関与するたんぱく質の活性または量を変更する改変；酵素の活性または量を変える改変；シナプスの形成と維持に関与するたんぱく質の活性または量を変える改変；神経突起伸長または軸索伸長や形成に関与するたんぱく質の活性または量を変える改変；細胞内の抗酸化物質生成酵素の量または活性を変える改変；細胞たんぱく質の翻訳後修飾の変更につながる改変；細胞修復の他の側面に関与するたんぱく質の活性または量を変更する改変、および細胞の寿命を増加させる変更（テロメラーゼの生産など）が含まれる。上記たんぱく質のようなこのような蛋白質は、ヒトゲノムや他の動物、植物、ウイルス、または細菌ゲノム由来のＤＮＡやＲＮＡによりコードされることがある。本発明はまた、デノボ設計された配列包含する。
【０２３１】
加えて、本発明は、病気の治療のための選択した細胞および／またはその子孫細胞のｉｎ  −  ｓｉｔｕ遺伝子改変に関連する。内因性幹細胞は、組織の物質への、または脳の脳室システムの適当な部分へのウイルス、レトロウイルス、リポソームなどを含むＤＮＡまたはＲＮＡベクターを直接の注入または適用することによってインサイチュで改変してよい。１９９２年以来、本発明者らは、この方法で、数千の幹細胞／前駆細胞や何千もの子孫細胞を改変している。本発明者らのデータは、前駆細胞を改変するこの方法が、神経系全体においてきわめて多くの種類の改変細胞をもたらすが、有害作用は決してもたらさなかったことを示している。
例９：遺伝子ベクターの宿主への導入
【０２３２】
好ましい実施形態において、治療用ベクター（単数または複数）を宿主の血液、組織、神経性、骨髄などに導入することによって、本明細書に記載のベクターなどのベクターでインビボでトランスフェクトされる。最大の利益は、多数の内因性標的細胞を改変することによって達成することができる。これは、治療用ベクター（単数または複数）を静脈または動脈循環、筋肉組織などの特定の組織、または神経系に注射するための適当な大きさに作られたカテーテル様のデバイスまたはニードルを用いることによって実施してよい。好ましい実施形態において、ウイルスはＶＳＶ−Ｇエンベロープ糖タンパク質および天然ＨＩＶ−１  ｅｎｖタンパク質でシュードタイプされる。
【０２３３】
例１０：神経系への注射
選択した細胞（成長培池または分化培池の何れか由来）の胎児神経系への移植または遺伝子ベクターを用いる内因性胎児細胞の遺伝子改変は、以下の様式で実施することができる：無菌状態の下では、子宮や胎児を超音波や放射線学の指針によって視覚化される。あるいは、胎児の頭蓋骨のランドマークの直接の識別を容易にするため、子宮が手術で露出されることがある。次に選択された細胞を注射によって（適切な大きさに作られたカテーテルまたは針を用いて）、脳室のシステム、胚ゾーンまたは神経系の物質に導入することができる。注射は、特定の場合では、母親の腹壁、子宮壁と胎児の膜を介して胎児になされることがある。注射の精度を直接観察、超音波、コントラスト、または放射性同位体に基づく方法、または当技術分野で公知の放射線学の指針のその他の任意の手段によって監視する。
【０２３４】
適切な無菌の条件下では、胎児の頭蓋骨のランドマークの直接の同定は、定位および放射線学の指針と結びついた身体の検査および触診によるのと同様視覚的にも達成される。細胞培養後、選択された細胞または分化細胞の適切な量を注射または他の手段によって脳室のシステムは、胚のゾーン、または神経系の物質に導入することができる。注射の精度を直接観察、超音波、または他の放射線学の指針によって監視することができる。
【０２３５】
ハンチントン病やパーキンソン病などの成人の神経系の特定の神経学的疾患では、脳の特定部分の細胞は、選択的に影響を受ける。パーキンソン病の場合には、それは黒質のドーパミン作動性細胞である。成人を冒す局所特異的な疾患において、局所への細胞移植は、無菌条件の下で放射線学で指針化された分化細胞の移植で達成することができる。放射線学の指針には、ＣＴおよび／またはＭＲＩの使用を含めることができ、注入された材料を監視するためのコントラストや同位体に基づく手法に利益をもたらし得る。
【０２３６】
幾つかの代謝貯蔵障害などの特定の神経疾患では、細胞が神経系の多様な領域に渡って冒されるので、最大の利益は、内因性細胞を遺伝子改変することによって、または本発明の選択された細胞（成長培池または分化培池由来の何れか）を拡散様式で多数を組織に導入することによって達成されるだろう。中枢神経系では、これらの疾患は、脳室内注射によって（適切な大きさに作られたカテーテル様デバイス、または針を用いて）（特に開発の初期段階では最初にアプローチされるであろう。）脳室内注射は、広範な内因性細胞を改変または成長培地および／または分化培地から単離した選択した細胞の広範な移植を可能にする。それにもかかわらず、同じ目的のために循環系への細胞の注入も包含されている。しかし、複数の臓器または体を広範に冒す（例えば、リソソーム貯蔵障害、ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｐａｔｈｉｅｓ、筋ジストロフィー）すべての障害に関し、成長培地および／または分化培地から単離した細胞は、優先的に直接循環器官および／または内臓器官（肝臓、腎臓、消化管、脾臓、副腎、膵臓、肺などの臓器および胸腺）に、内視鏡ガイダンスおよび適切な大きさに作られたカテーテル様デバイスを用いて導入し、選択された器官への細胞の特異的な導入および浸潤と同じく、体全体に広範な細胞の移植を可能にする。
【０２３７】
例１１：血液循環の流れと器官への注入による細胞送達
１つの器官系の病気は、別々の器官系から遺伝子改変細胞で治療できる可能性がある。また、いくつかの場合、選択した細胞を、成長培地および／または分化培地で培養した後、血流（動脈、静脈または肝のいずれか）に注入されるならば、その選択した細胞はインビボで十分な量組み込んでそれら自身で分化し得ることが明らかになるだろう。このアプローチは、本発明により包含される。びまん性筋（例えば、筋ジストロフィー）、器官、組織または血液障害（例えば、遺伝性球状赤血球症、鎌状赤血球貧血、他のｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｏｐａｔｈｉｅｓ等）は、例えば、成長培地または分化培地から分離された細胞の患者への、特に患者の循環への注入を伴う。このアプローチは、また、心筋梗塞、脳卒中などの虚血性傷害を改善するだけでなく、脳や他の組織への外傷を改善すると考えられている。針やカテーテルによる血流中に本発明によって生成したそのような細胞の直接の注入により、細胞が骨髄、筋肉、腎臓、肺、および／またはその他の他の任意の器官系に「帰る」ことが可能となり、同様に、骨髄空間に直接注射することは、本発明の実施に適している。同様に、超音波、放射線または蛍光透視指針を用いるか用いないで、損傷部位に細胞を直接注射することも本発明の実施に適している。
【０２３８】
本発明において有用な選択された細胞を単離する方法は、Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６によって書かれているものを含む。
【０２３９】
好ましい実施の形態としては、ｎｕｍｂｌｉｋｅ  および／あるいはｎｕｍｂアイソフォームをコードする遺伝子ベクターは、Ｎｕｍｂ  またはｎｕｍｂｌｉｋｅ導入遺伝子に作動可能に連結している調節可能なプロモータを含む。
【０２４０】
別個の好ましい実施の形態としては、トランスフェクションのモードは、ｎｕｍｂｌｉｋｅ  とｎｕｍｂアイソフォームの永久的な発現よりも、一過性の発現を提供するトランスフェクションのモードから選択することができる。
【０２４１】
例１２：遺伝子改変の例
カナバン病（ＡＳＰ）；テイサックス病（ＨＥＸＡ）；レッシュナイハン症候群（ＨＲＰＴ）；ハンチントン病（ＨＴＴ）；スライ症候群；タイプＡとＢのニーマンピック病；サンドホフ病（ＨＥＸＢ）、ファブリー病（ＧＬＡ）；  Ｃ型ニーマンピック病（ＮＰＣｌ）；ゴーシェ病（ＧＢＡ）；パーキンソン病（ＰＡＲＫ２等）フォンヒッペルリンダウ病、鎌状赤血球貧血（ＨＢＢ）およびその他のサラセミアならびに同じような病気を含むが、これらに限定されない数百の病気や臨床状態が、本発明の方法によって治療および／あるいは改善することができる。これらの導入遺伝子は、正常遺伝子のコーディング領域、またはコーディング領域の一部を表すことがある。しかしながら、本発明の範囲は、特定の実施態様および、上記の例に限定されないことが理解されるべきである。本発明は、具体的に記載したものとは別のように実施してもよく、それらは添付の特許請求の範囲内である。
【０２４２】
例１３：テトラサイクリン感受性プロモーターの調節下で細胞を多能性にし、長Ｎｕｍｂアイソフォーム、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、およびＥｍＧＦＰ核配列を発現することが可能なベクターの配列の例は、
【０２４３】
【化３】
2010528613.tif 000056
【０２４４】
【化４】
2010528613.tif 000057
【０２４５】
【化５】
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【０２４６】
【化６】
2010528613.tif 000059
【０２４７】
【化７】
2010528613.tif 000060
【０２４８】
【化８】
2010528613.tif 000061
【０２４９】
上のベクター配列に対応する図式化マップは、図１に示されている。
【０２５０】
ベクターを完全にｄｅ  ｎｏｖｏの遺伝子合成を通じて、または一部をＮｕｍｂ、ＳｏｘとＯＣＴ３／４  ｃＤＮＡ配列のクローニングを通じて、インビトロジェンｐｃＤＮＡ４ｔｏｌａｃＺベクターの中にＬａｃＺで占められる位置に構築してよい。同様に、ｔｅｔＲ遺伝子インビトロジェンｐｃＤＮＡ６／ＴＲベクターの中に見出される。参照した遺伝子のコード配列もｐｃＤＮＡ４１ａｃＺベクターのクローニングに適している。
【０２５１】
代わりにｔｅｔＲ遺伝子はｐｃＤＮＡ６／ＴＲベクターを、ｔｅｔＲ遺伝子とそのＰＣＭＶプロモータを除いたここでの配列を含むベクターと組み合わせて用いることにより標的細胞に個々にトランスフェクトすることができる。
【０２５２】
同様に、複数のベクターは、上記配列に含まれる要素に類似の要素が存在する限り、使用することができる。これはプロモーターの競合の可能性を減らすことができる。他の暫定的なプロモーター要素は、テトラサイクリン感受性のプロモーター要素の代わりに使用できることが理解されるべきである。
例１４  一回もしくは複数回、ここに記された方法（またはその他の公表された方法）により生成された多能性の幹細胞の、静脈内投与および他の投与は、体に細胞の置換を提供し、そのような投与が加齢性老化の患者において寿命を延ばすかまたは健康増進に役立ち得ることが期待される。
【０２５３】
例１５  生殖細胞の生成
本発明は、ここで記されている方法（またはその他の公表された方法による）により生成された多能、多能性、および／または自己再生できる幹細胞からの生殖細胞の誘導を包含する。このような生殖細胞の生成は、不妊の治療ならびに生体外での胎芽の生成に適するであろう。（例：  Ｈｕｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３；  Ｋｅｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５；Ｎａｙｅｒｎｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６ａ；  Ｎａｙｅｒｎｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６ｂ；  Ｄｒｕｓｅｎｈｅｉｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；  など）
例１６：トランスジェニック動物の形成
本発明は、トランスジェニック動物の形成を包含する。他の多能性細胞を用いる場合、ここで記されている方法（またはその他の公表された方法）により生成された多能性細胞は、当技術分野で知られている任意の方法によりトランスジェニック動物を生成するために利用することができる。
【０２５４】
例１７：治療用ベクターの構築
用いることができるレトロウイルスベクターの例は、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス肉腫ウイルスとラウス肉腫ウイルス、ＦＩＶや、ＨＩＶに由来するベクターを含むがそれらに限定されない。適切な発現ベクターは、真核生物の細胞にＤＮＡまたはＲＮＡのトランスフェクションに用いることができるものである。このようなベクターには、原核生物のベクター（例えば、細菌のベクターなど；真核生物のベクター（例えば、酵母のベクターと真菌のベクターなど、およびウイルスベクター（限定されないが、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターおよび、レトロウイルスベクターなど）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２５５】
レプリケーション無能なｐｃＤＮＡ  ６．２ＧＷ／ｍｉＲとｐｃＤＮＡ  ６．２／ＥｍＧＦＰ−Ｂｓｄ／Ｖ５−ＤＥＳＴベクターは、適切な発現ベクター（インビトロジェン社）の例であり、ターゲット配列を切断する能力がある合成オリゴヌクレオチド（例えば、ｍｉＲＮＡ）の発現が可能である。これらのベクターには、より長いｐｏｌＩＩの転写産物（プレｍｉＲＮＡ）由来の操作されたｍｉＲＮＡの切除を誘導するための内因性ｍｉＲＮＡ由来の隣接配列およびループ配列がふくまれる。
【０２５６】
代わりに、ＨＩＶｐｓｉ配列の包含は、治療用ベクターが、ウイルス粒子を形成することに関してネイティブのＨＩＶゲノムと競合し、ＨＩＶの伝播もそがいすることを可能にする。
【０２５７】
単一の標的に対抗する複数のｍｉＲＮＡ配列の組合せは、標的配列の発現を減少させる成功の可能性を上昇させる。ｍｉＲＮＡ配列は、ＥＦ−１  ａｌｐｈａプロモータ、任意のＴ細胞特異的プロモータ、または望まれる細胞型での発現を確実にするマクロファージ特異的プロモータなどの組織特異的プロモータに作動可能に連結することができる。
【０２５８】
遺伝子発現のためのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのレンチウイルス表記（ＤＥＳＴ）ベクターを利用すると、結果として生まれた治療用ベクターは、分裂する細胞と分裂しない細胞型の両方の安定的な形質導入が可能になる。
【０２５９】
好ましい実施の形態としては、治療用ベクターは、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５および／あるは標的細胞におけるＨＩＶ感染の共受容体として作用することが知られている他の任意の細胞たんぱく質の発現を減少させるかぎり、１つないしそれ以上のプロモータにより駆動される複数の合成オリゴヌクレオチド配列を含む。
【０２６０】
ある治療用ベクターでは（２００６年に構築）、ＣＸＣＲ４  とＣＣＲ５の共受容体を標的にする４つのｍｉＲＮＡ配列が、ＨＩＶ  −２  ＴＡＲ  とＲＲＥ  を標的にするデコイＲＮＡ配列とともに、ｐｃＤＮＡ６．２  ＧＷ／ｍｉＲベクターにクローン化された。
【０２６１】
遺伝子構築物は、ベクターのバックボーンおよび、異種核酸配列に作動可能に連結するプロモータを調節するトランス活性化因子を含み得る。
【０２６２】
他の適したベクターの例としては、レトロウィルスベクターがある。レトロウィルスは、ＲＮＡゲノムを含むＲＮＡウィルスである。ｇａｇ、  ｐｏｌ、  ｅｎｖ  遺伝子は、末端長反復（ＬＴＲ）配列によって隣接される。５’  と  ３’ＬＴＲ配列は、ｍＲＮＡの転写とポリアデニル化を促進させる。
【０２６３】
レトロウイルスベクターは、調節可能なトランス活性化エレメント、内部リボソームリエントリー部位（ＩＲＥＳ）、選択マーカーおよび、調節可能なプロモータによって操作される標的の異種遺伝子を提供することができる。
【０２６４】
あるいは、複数の配列を、複数のプロモーターの制御下で発現することができる。最後に、レトロウイルスベクターは、逆転写と組込みのために必要なシス作用配列を含むことができる。感染時には、ＲＮＡは逆転写されてＤＮＡになり、効率的にホストゲノムに組み込まれる。本発明の組換えレトロウイルスは、天然ウイルスのレトロウイルス性の感染性の遺伝子のいくつかを削除し、実施形態において、細胞の遺伝子改変のかわりに標的核酸配列に置き換えるような方法で遺伝子改変される。配列は、天然型または変形型において外因性ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。
【０２６５】
例１８：治療用ベクターを生成する方法の例
治療用ベクターを生成する方法は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ’ｓ  Ｖｉｒａｌ  Ｐｏｗｅｒ  Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍａｎｕａｌに記されている通りのものを含む。簡潔に言えば、ＥｍＧＦＰに基づくカセットは、ＰｍｌＩ−ＢｌｐＩ断片としてｐＬｅｎｔｉ６／Ｒ４Ｒ２／Ｖ５−ＤＥＳＴベクター中にクローン化され、一方、ｍｉＲデコイカセットが同時にＢＰ反応によってｐＤＯＮＲ２２１に輸送される。それから、ＥＦ１ａプロモータとｍｉＲデコイは、改変されたｐＬｅｎｔｉ６／ＥｍＧＦＰ−ｂｓｄ／Ｒ４Ｒ２−ＤＥＳＴベクターに交差するＭｕｌｔｉｓｉｔｅ  ＬＲである。
ｐＬｅｎｔｉ６／Ｒ４Ｒ２／Ｖ５−ＤＥＳＴベクター配列：
【０２６６】
【化９】
2010528613.tif 000062
【０２６７】
【化１０】
2010528613.tif 000063
【０２６８】
【化１１】
2010528613.tif 000064
【０２６９】
【化１２】
2010528613.tif 000065
【０２７０】
例１９：生体内で増殖する／増殖する幹細胞／前駆細胞のための方法
１）ＨＩＶ感染症、２）ＨＩＶの複製および／または３）ＨＩＶの転写に比較的耐性のある多数の標的細胞を取得するため、前駆細胞／幹細胞をグルタミン、β−メルカプトエタノール、１０％（体積で）ウマ血清、およびヒト組換え白血病抑制因子（ＬＩＦ）を補充したダルベッコの改変最小必須培地（ＤＭＥＭ）で成長させることができる。ＬＩＦにより、前駆細胞／幹細胞を細胞のフィーダー層（使用しても構わない）上で維持する必要がなくなるが、ＬＩＦは、未分化状態の前駆細胞／幹細胞を維持するために必須である。
【０２７１】
例２０：幹細胞は個人から集められ、細胞は治療用ベクターによってトランスフェクトされ、次にＨＬＡタイピングやマッチングを伴うか伴わない標準的な方法により移植のため調製される。
【０２７２】
例２１：臍帯血サンプルは臍帯血コードバンクから得られる。細胞は、次に有用な配列の治療用ベクターでトランスフェクトされ、次にＨＬＡタイピングやマッチングを伴うか伴わない標準的な方法により移植のために調製される。
例２２：治療用ベクターに含有させるのに適する合成オリゴヌクレオチド配列の例
７０％を超える標的配列のたんぱく質発現をうまく減少させるいかなる合成オリゴヌクレオチド配列も本発明に包含される。
【０２７３】
標的細胞がＨＩＶ複製を維持する能力を７０％を超えるかそれよりも少ないが治療的程度にまで、または、標的細胞がＨＩＶのウイルス活性を維持する能力を７０％を超えるかそれよりも少ないが治療的程度にまでうまく減じる任意の合成オリゴヌクレオチド配列もまた本発明に包含される。
【０２７４】
ｍｉＲＮＡ配列の例には、ＩＶＧＮアルゴリズム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に由来するｍｉＲＮＡが含まれる。ＣＸＣＲ４遺伝子を標的とするｍｉＲＮＡ配列は最上段の鎖を含む：
【０２７５】
【化１３】
2010528613.tif 000066
【０２７６】
同様に、ＣＣＲ５遺伝子を標的とするｍｉＲＮＡ配列は最上段の鎖を含む：
【０２７７】
【化１４】
2010528613.tif 000067
【０２７８】
例２３：治療用ベクターに含有されるのに適したデコイＲＮＡの例
標的細胞がＨＩＶ複製を維持する能力を７０％を超えるかそれよりも少ないが治療的程度にまで、または、標的細胞がＨＩＶのウイルス活性を維持する能力を７０％を超えるかそれよりも少ないが治療的程度にまでうまく減じる任意のデコイ配列もまた本発明に包含される。
【０２７９】
例のＴＡＲデコイ配列は、
【０２８０】
【化１５】
2010528613.tif 000068
【０２８１】
例のＲＲＥデコイ配列は、
【０２８２】
【化１６】
2010528613.tif 000069
【０２８３】
例２４：ＲＮＡデコイの安定性を提供するフランキング配列
ＲＮＡデコイに適したフランキング配列の例は以下に挙げられる：
【０２８４】
【化１７】
2010528613.tif 000070
【０２８５】
５’サイドのＵ６  ＲＮＡの１９ヌクレオチド（ｎｔｄｓ）ならびにＰｏＬＩＩＩに対するポリＵターミネータがすぐに先行する３’ステムの何れかのサイドにおいてヘアピンで隣接されたデコイ配列は、より大きな安定性を示すことが以前に実証されている。この配置は３’−５’エキソヌクレアーゼの攻撃から保護するものと期待され、挿入ＲＮＡの折り畳みに干渉する３’トレーラー（ｔｒａｉｌｅｒ）の機会を低減することが期待される。最初の３／４のｔＲＮＡ配列のみが存在するので、挿入の５’末端は保護されるはずであるし、核からの輸送が阻止されるはずである（グッドら、１９９７）。
【０２８６】
例２５：治療用のベクターの宿主への導入
好ましい実施の形態としては、血液幹細胞／前駆細胞、および標的細胞は、治療用ベクター（または随伴の治療用ウイルス）の宿主血液や組織、または骨髄などへの導入により、生体内において治療用ベクターを用いてトランスフェクトされる。最大の利点は、多くの内因性標的細胞および幹細胞／子孫細胞を改変することによって得られる。これは、適したサイズのカテーテルのような装置またはニードルを用いて、治療用ベクターを静脈循環または動脈循環に注入することによって達成することができる。好ましい実施形態において、ウイルスはＶＳＶ−Ｇエンベロープ糖たんぱく質および天然ＨＬＶ−１  ｅｎｖたんぱく質でシュードタイプされる。
【０２８７】
例２６：宿主への遺伝子改変細胞の導入
成熟した末梢血Ｔリンパ球、単球、マクロファージ、Ｔ細胞前駆細胞、マクロファージ単球前駆細胞、および／あるいは多能性の造血幹細胞（臍帯血および占有骨髄空間にみられるものなど）などの血液細胞は、他の幹細胞／前駆細胞と同様に、生体外において治療用ベクターを用いてトランスフェクトすることができる。治療用ベクターの適切な濃度は、Ｂｒｏｗｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９と一致したものであってよい。その後、細胞は、生体外で拡張（増殖）され、続いて、細胞は、静脈内用針またはカテーテルを用いて静脈循環または動脈循環に細胞を導入することを介して宿主に移入される。その後、治療用ベクターによってトランスフェクトされた細胞は、骨髄や他の組織に「帰る」ことができる。
【０２８８】
ここで書かれている例や実施の形態は、説明的な目的のみであり、それに照らした様々な改変または変更が当業者に示唆され、本出願の精神および範囲内および添付の特許請求の範囲内に含まれることが理解される。本明細書で引用された全ての出版物、特許、特許出願は、すべての目的において、その全てが参照により本明細書に援用される。
【０２８９】
例２７：本発明において利用した発現、または標的にされた導入遺伝子の例
本発明を実行するのに有効な任意の導入遺伝子配列は、本発明における利用に適切である。適したヌクレオチド配列は、望まれる細胞または性質が得られる限り、どの種からも採取されてよい。このような配列の呼称方法は、同様に、本明細書において小文字または大文字のいずれも、特別な種類は表わさない。ＮＣＢＩデータベース（アクセッション番号で列挙される）に保存される以下の配列は、本出願で上記で引用した配列の例を表わす。これらは、本発明に用いるのに適した配列（ｃｄｓ）をコードする特定遺伝子の例でもあるが、いずれの場合であっても、本発明の実施を制限するものではない。
【０２９０】
【化１８】
2010528613.tif 000071
【０２９１】
【化１９】
2010528613.tif 000072
【０２９２】
【化２０】
2010528613.tif 000073
【０２９３】
【化２１】
2010528613.tif 000074
【０２９４】
【化２２】
2010528613.tif 000075
【０２９５】
【化２３】
2010528613.tif 000076
【０２９６】
【化２４】
2010528613.tif 000077
【０２９７】
【化２５】
2010528613.tif 000078
【０２９８】
【化２６】
2010528613.tif 000079
【０２９９】
【化２７】
2010528613.tif 000080
【０３００】
【化２８】
2010528613.tif 000081
【０３０１】
【化２９】
2010528613.tif 000082
【０３０２】
【化３０】
2010528613.tif 000083
【０３０３】
【化３１】
2010528613.tif 000084
【０３０４】
【化３２】
2010528613.tif 000085
【０３０５】
【化３３】
2010528613.tif 000086
【０３０６】
【化３４】
2010528613.tif 000087
【０３０７】
【化３５】
2010528613.tif 000088
【０３０８】
【化３６】
2010528613.tif 000089
【０３０９】
【化３７】
2010528613.tif 000090
【０３１０】
【化３８】
2010528613.tif 000091
【０３１１】
【化３９】
2010528613.tif 000092
【０３１２】
【化４０】
2010528613.tif 000093
【０３１３】
【化４１】
2010528613.tif 000094
【０３１４】
【化４２】
2010528613.tif 000095
【０３１５】
【化４３】
2010528613.tif 000096
【０３１６】
【化４４】
2010528613.tif 000097
【０３１７】
【化４５】
2010528613.tif 000098
【０３１８】
【化４６】
2010528613.tif 000099
【０３１９】
【化４７】
2010528613.tif 000100
【０３２０】
【化４８】
2010528613.tif 000101
【０３２１】
【化４９】
2010528613.tif 000102
【０３２２】
【化５０】
2010528613.tif 000103
【０３２３】
【化５１】
2010528613.tif 000104
【０３２４】
挿話として引用されている全刊行物の内容および次のアメリカ合衆国における特許は、その全てを参照として記載および援用する：  ７２１１２４７，  ５６７７１３９，  ６４３２７１１および５４５３３５７，  Ｕ．Ｓ．  ０５，５９３，８７５，  Ｕ．Ｓ．  ０５，７８３，５６６，  Ｕ．Ｓ．  ５，９２８，９４４，  Ｕ．Ｓ．０５，９１０，４８８，  Ｕ．Ｓ．  ０５，８２４，５４７
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＩＶ共受容体に対して向けられたデコイ、合成オリゴヌクレオチド配列および、合成ヌクレオチドを含む、ＨＩＶ−ｌおよび／あるいはＨＩＶ−２の感染を阻止することができるベクター。
【請求項２】
前記合成オリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ配列、ｍｉＲＮＡ配列、ｓｈＲＮＡ配列群から選択されるオリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
合成オリゴヌクレオチドクラスの組み合わせを含む、請求項１に記載のベクターは分類される。
【請求項４】
ウィルスベクターである、請求項１に記載のベクター。
【請求項５】
合成オリゴヌクレオチドはまた、ＨＩＶ酵素を標的にする、請求項１に記載のベクター。
【請求項６】
前記合成オリゴヌクレオチドは、標的細胞において活性なプロモータによって駆動される、請求項１に記載のベクター。
【請求項７】
前記合成オリゴヌクレオチドは、ＥＦ−１  ａｌｐｈａプロモータによって駆動される、請求項１に記載のベクター。
【請求項８】
抗生物質耐性たんぱく質または蛍光たんぱく質に対してコードするマーカー遺伝子のようなマーカー遺伝子を含む、請求項１に記載のベクター。
【請求項９】
ＨＩＶ共受容体に向けられたデコイ合成オリゴヌクレオチド配列と合成オリゴヌクレオチドを含む、ＨＩＶ−１および／あるいはＨＩＶ−２の感染を阻止することができるベクターであって、ここで該デコイ配列は、ＨＩＶ  ＲＲＥ配列および／あるいはＴＡＲデコイ配列を含む、ベクター。
【請求項１０】
前記合成オリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ配列、ｍｉＲＮＡ配列またはｓｈＲＮＡ配列を含む、請求項９に記載のベクター。
【請求項１１】
合成オリゴヌクレオチドクラスの組み合わせを含む、請求項９に記載のベクター。
【請求項１２】
ウィルスベクターである、請求項９に記載のベクター。
【請求項１３】
合成オリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ酵素も標的とする、請求項９に記載のベクター。
【請求項１４】
前記合成オリゴヌクレオチドは、標的細胞において活性なプロモータによって駆動される、請求項９に記載のベクター。
【請求項１５】
前記合成オリゴヌクレオチドがＥＦ−１  ａｌｐｈａプロモータによって駆動される、請求項９に記載のベクター。
【請求項１６】
抗生物質耐性たんぱく質または蛍光たんぱく質に対してコードするマーカー遺伝子のようなマーカー遺伝子を含む、請求項９に記載のベクター。
【請求項１７】
ＨＩＶ−１および／あるいはＨＩＶ−２感染を阻止することができ、デコイ配列がＨＩＶ−１デコイ配列とＨＩＶ−２デコイ配列の組み合わせを表わす、ベクター。
【請求項１８】
合成オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡ配列、ｍｉＲＮＡ配列またはｓｈＲＮＡ配列を含む、請求項１７に記載のベクター。
【請求項１９】
合成オリゴヌクレオチドクラスの組み合わせを含む、請求項１７に記載のベクター。
【請求項２０】
ウィルスベクターである、請求項１７に記載のベクター。
【請求項２１】
合成オリゴヌクレオチドが、ＨＩＶ酵素も標的とする、請求項１７に記載のベクター。
【請求項２２】
前記合成オリゴヌクレオチドは、標的細胞において活性なプロモータによって駆動される、請求項１７に記載のベクター。
【請求項２３】
前記合成オリゴヌクレオチドがＥＦ−１  ａｌｐｈａプロモータによって駆動される、請求項１７に記載のベクター。
【請求項２４】
抗生物質耐性たんぱく質また蛍光たんぱく質に対しコードするマーカー遺伝子のようなマーカー遺伝子を含む、請求項１７に記載のベクター。
【請求項２５】
ＨＩＶ共受容体に対して向けられたデコイ合成オリゴヌクレオチド配列および合成オリゴヌクレオチドを含む、ＨＩＶ−１および／あるいはＨＩＶ−２感染を阻止することができるベクターであって、該デコイ配列がＨＩＶ−２  ＲＲＥデコイ配列およびＨＩＶ−２  ＴＡＲデコイ配列を含む、ベクター。
【請求項２６】
前記合成オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡ配列、ｍｉＲＮＡ配列あるいはｓｈＲＮＡ配列を含む、請求項２５に記載のベクター。
【請求項２７】
合成オリゴヌクレオチドクラスの組み合わせを含む、請求項２５に記載のベクター。
【請求項２８】
ウィルスベクターである、請求項２５に記載のベクター。
【請求項２９】
合成オリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ酵素も標的とする、請求項２５に記載のベクター。
【請求項３０】
前記合成オリゴヌクレオチドは、標的細胞において活性なプロモータによって駆動される、請求項２５に記載のベクター。
【請求項３１】
前記合成オリゴヌクレオチドがＥＦ−１  ａｌｐｈａプロモータによって駆動される請求項２５に記載のベクター。
【請求項３２】
抗生物質耐性たんぱく質または蛍光たんぱく質に対しコードするマーカー遺伝子のようなマーカー遺伝子を含む、請求項２５に記載のベクター。
【請求項３３】
ＨＩＶ−１および／あるいはＨＩＶ−２の感染を阻止することのできるベクターであって、ＨＩＶ共受容体に対して向けられた合成オリゴヌクレオチドおよび、ＨＩＶ  ＲＲＥデコイ配列、ＨＩＶ  ＴＡＲデコイ配列を含む、ベクター。
【請求項３４】
前記合成オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡ配列、ｍｉＲＮＡ配列またはｓｈＲＮＡ配列を含む、請求項３３に記載のベクター。
【請求項３５】
合成オリゴヌクレオチドクラスの組み合わせを含む、請求項３４に記載のベクター。
【請求項３６】
ウィルスベクターである、請求項３４に記載のベクター。
【請求項３７】
合成オリゴヌクレオチドはＨＩＶ酵素も標的とする、請求項３４に記載のベクター。
【請求項３８】
前記合成オリゴヌクレオチドは標的細胞において活性なプロモータによって駆動される、請求項３４に記載のベクター。
【請求項３９】
前記合成オリゴヌクレオチドがＥＦ−１  ａｌｐｈａプロモータによって駆動される、請求項３４に記載のベクター。
【請求項４０】
抗生物質耐性たんぱく質または蛍光たんぱく質に対しコードするマーカー遺伝子のようなマーカー遺伝子を含む、請求項３４に記載のベクター。
【請求項４１】
ＨＩＶ共受容体に対し向けられた合成オリゴヌクレオチドを含むＨＩＶ−１および／あるいはＨＩＶ−２の感染を阻止することのできるベクターであって、複数の合成オリゴヌクレオチドが単一ＨＩＶ共受容体に対し向けられる、ベクター。
【請求項４２】
前記合成オリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ配列、ｍｉＲＮＡ配列あるいはｓｈＲＮＡ配列を含む、請求項４１に記載のベクター。
【請求項４３】
合成オリゴヌクレオチドクラスの組み合わせを含む、請求項４１に記載のベクター。
【請求項４４】
ウイルスベクターである、請求項４１に記載のベクター。
【請求項４５】
合成オリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ酵素も標的とする、請求項４１に記載のベクター。
【請求項４６】
前記合成オリゴヌクレオチドは標的細胞において活性なプロモータによって駆動される、請求項４１に記載のベクター。
【請求項４７】
前記合成オリゴヌクレオチドがＥＦ−１アルファプロモータによって駆動される、請求項４１に記載のベクター。
【請求項４８】
抗生物質耐性たんぱく質あるいは蛍光たんぱく質に対しコードするマーカー遺伝子などのマーカー遺伝子を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４９】
ＣＸＣＲ４およびＣＣＲ５を含むＨＩＶ共受容体を標的とする合成ヌクレオチドを含むＨＩＶ−１および／あるいはＨＩＶ−２感染を阻止することができるベクター。
【請求項５０】
合成オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡ配列、ｍｉＲＮＡ配列あるいはｓｈＲＮＡ配列を含む、請求項４９に記載のベクター。
【請求項５１】
合成オリゴヌクレオチドクラスの組み合わせを含む、請求項４９に記載のベクター。
【請求項５２】
ウイルスベクターである、請求項４９に記載のベクター。
【請求項５３】
合成オリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ酵素も標的とする、請求項４９に記載のベクター。
【請求項５４】
前記合成オリゴヌクレオチドは、標的細胞において活性なプロモーターによって駆動される、請求項４９に記載のベクター。
【請求項５５】
前記合成オリゴヌクレオチドはＥＦ−１アルファプロモーターによって駆動される、請求項４９に記載のベクター。
【請求項５６】
抗生物質耐性たんぱく質または蛍光たんぱく質に対しコードするマーカー遺伝子などのマーカー遺伝子を含む、請求項４９に記載のベクター。
【請求項５７】
ＨＩＶ共受容体に対し向けられた合成オリゴヌクレオチドを含むＨＩＶ−１および／あるいはＨＩＶ−２感染を阻止することができるベクターであって、ＨＩＶ共受容体に対し向けられた合成オリゴヌクレオチドがｍｉＲＮＡ配列である、ベクター。
【請求項５８】
前記合成オリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ配列、ｍｉＲＮＡ配列あるいはｓｈＲＮＡ配列を含む、請求項５７に記載のベクター。
【請求項５９】
合成オリゴヌクレオチドクラスの組み合わせを含む、請求項５７に記載のベクター。
【請求項６０】
ウイルスベクターである、請求項５７に記載のベクター。
【請求項６１】
合成オリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ酵素も標的とする、請求項５７に記載のベクター。
【請求項６２】
前記合成オリゴヌクレオチドは、標的細胞において活性なプロモーターによって駆動される、請求項５７に記載のベクター。
【請求項６３】
前記合成オリゴヌクレオチドは、ＥＦ−１アルファプロモーターによって駆動される、請求項５７に記載のベクター。
【請求項６４】
抗生物質耐性たんぱく質または蛍光たんぱく質に対しコードするマーカー遺伝子などのマーカー遺伝子を含む、請求項５７に記載のベクター。
【請求項６５】
デコイ合成ヌクレオチド配列およびＨＩＶ共受容体に対して向けられた合成オリゴヌクレオチドを含むＨＩＶ−１および／あるいはＨＩＶ−２感染を阻止することができるベクターであって、ＨＩＶ共受容体に対して向けられた合成オリゴヌクレオチドがｍｉＲＮＡ配列である、ベクター。
【請求項６６】
前記合成オリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ配列、ｍｉＲＮＡ配列あるいはｓｈＲＮＡ配列を含む、請求項６５に記載のベクター。
【請求項６７】
合成オリゴヌクレオチドクラスの組み合わせを含む、請求項６５に記載のベクター。
【請求項６８】
ウイルスベクターである、請求項６５に記載のベクター。
【請求項６９】
合成オリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ酵素も標的とする、請求項６５に記載のベクター。
【請求項７０】
前記合成オリゴヌクレオチドは、標的細胞において活性なプロモーターによって駆動される、請求項６５に記載のベクター。
【請求項７１】
前記合成オリゴヌクレオチドは、ＥＦ−１アルファプロモーターによって駆動される、請求項６５に記載のベクター。
【請求項７２】
抗生物質耐性たんぱく質または蛍光たんぱく質に対しコードするマーカー遺伝子などのマーカー遺伝子を含む、請求項６５に記載のベクター。
【請求項７３】
ＣＸＣＲ４に対して向けられた複数のｍｉＲＮＡ配列と、ＣＣＲ５に対して向けられた複数のｍｉＲＮＡ配列と、ＨＩＶ−２  ＲＲＥデコイ配列と、ＨＩＶ−２  ＴＡＲデコイ配列とを含むＨＩＶ−１および／あるいはＨＩＶ−２感染を阻止することができるベクターであって、前記ベクターがウイルスベクターである、ベクター。
【請求項７４】
合成オリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ配列、ｍｉＲＮＡ配列あるいはｓｈＲＮＡ配列を含む、請求項７３に記載のベクター。
【請求項７５】
合成オリゴヌクレオチドクラスの組み合わせを含む、請求項７３に記載のベクター。
【請求項７６】
ウイルスベクターである、請求項７３に記載のベクター。
【請求項７７】
合成オリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ酵素も標的にする、請求項７３に記載のベクター。
【請求項７８】
前記合成オリゴヌクレオチドは、標的細胞において活性なプロモーターによって駆動される、請求項７３に記載のベクター。  
【請求項７９】
前記合成オリゴヌクレオチドは、ＥＦ−１アルファプロモーターによって駆動される、請求項７３に記載のベクター。
【請求項８０】
抗生物質耐性たんぱく質または蛍光たんぱく質に対しコードするマーカー遺伝子などのマーカー遺伝子を含む、請求項７３に記載のベクター。
【請求項８１】
ＨＩＶ−２  ＲＲＥデコイ配列および／あるいはＨＩＶ−２  ＴＡＲ配列を含む免疫不全ウイルスによる感染を阻止することができるベクター。
【請求項８２】
合成オリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ配列、ｍｉＲＮＡ配列あるいはｓｈＲＮＡ配列を含む、請求項８１に記載のベクター。
【請求項８３】
合成オリゴヌクレオチドクラスの組み合わせを含む、請求項８１に記載のベクター。
【請求項８４】
ウイルスベクターである、請求項８１に記載のベクター。
【請求項８５】
合成オリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ酵素も標的とする、請求項８１に記載のベクター。
【請求項８６】
前記合成オリゴヌクレオチドは、標的細胞において活性なプロモーターによって駆動される、請求項８１に記載のベクター。
【請求項８７】
前記合成オリゴヌクレオチドは、ＥＦ−１アルファプロモーターによって駆動される、請求項８１に記載のベクター。
【請求項８８】
抗生物質耐性たんぱく質または蛍光たんぱく質に対しコードするマーカー遺伝子などのマーカー遺伝子を含む、請求項８１に記載のベクター。
【請求項８９】
患者の感染を改善するための方法であって、
１）免疫不全ウイルス感染を阻止することができるベクターを生成するステップと、
２）臍帯血細胞、造血細胞、末梢血、骨髄、精原細胞、始原生殖細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、マクロファージ、Ｔ細胞の前駆細胞、マクロファージ単球前駆細胞、ＣＤ３４＋幹細胞／前駆細胞および／または体外あるいは体内でＨＩＶ標的細胞に分化できる任意の細胞から選択される自己のまたはドナーの幹細胞／前駆細胞をトランスフェクトするステップと、
３）トランスフェクトした細胞を患者の血行または骨髄に導入するステップとを含む方法。
【請求項９０】
前記幹細胞／前駆細胞は、成長促進培地で培養され、前記患者の血行に導入する前に前記細胞を拡張する、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
マーカーたんぱく質の発現により、成功したトランスフェクションが監視される請求項８９に記載の方法。
【請求項９２】
前記選択された幹細胞／前駆細胞はドナーの臍帯前駆細胞である、請求項８９に記載の方法。
【請求項９３】
前記選択された幹細胞／前駆細胞が自己の末梢血の幹細胞／前駆細胞である、請求項８９に記載の方法。
【請求項９４】
前記選択された幹細胞／前駆細胞が自己由来の、誘発した、あるいは再プログラミングされた多能あるいは多能性幹細胞である、請求項８９に記載の方法。
【請求項９５】
患者のＨＩＶ感染を阻止する方法であって、ウイルスベクターを生成するステップと、前記ベクターから生成されたウイルスを該患者の血行に導入するステップとを含む、方法。
【請求項９６】
デコイ合成オリゴヌクレオチド配列と、ＨＩＶ共受容体に対して向けられた合成オリゴヌクレオチドとを含む免疫不全ウイルスによる感染を阻止することができるベクターであって、前記デコイ配列は、ＨＩＶ  ＲＲＥデコイ配列および／あるいはＴＡＲデコイ配列とを含み、前記ベクターは、ＨＩＶ−１配列およびＨＩＶ−２配列に対して向けられたリボザイム配列も含む、ベクター。
【請求項９７】
デコイ合成オリゴヌクレオチド配列と、ＨＩＶ共受容体に対して向けられた合成オリゴヌクレオチドとを含む免疫不全ウイルスによる感染を阻止することができるベクターであって、前記デコイ配列は、ＨＩＶ  ＲＲＥデコイ配列および／あるいはＴＡＲデコイ配列とを含み、前記デコイ配列は、Ｕ６プロモーターにより駆動される、ベクター。
【請求項９８】
Ｓｏｘ２たんぱく質、Ｏｃｔ４たんぱく質、ＮＡＮＯＧたんぱく質、ＨＯＸＢ４たんぱく質、ＦＧＦ４たんぱく質、ＬＩＦ活性を有するたんぱく質、Ｎｏｔｃｈ活性を有するたんぱく質をコードする配列から選択された配列を含む追加のヌクレオチド配列の他、哺乳類ｎｕｍｂたんぱく質の「長」（ＰＲＲ挿入＋）アイソフォームをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子ベクター。
【請求項９９】
短ＮｕｍｂアイソフォームおよびＮｕｍｂｌｉｋｅを標的とする合成オリゴヌクレオチドも含む、請求項９８に記載のベクター。
【請求項１００】
哺乳類のｎｕｍｂたんぱく質の「長」（ＰＲＲ挿入＋）アイソフォームをコードする前記ヌクレオチド配列ならびに、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｈｏｘｂ４、ＦＧＦ−４、ＬＩＦ、ＬＩＦＲ、ＣＮＴＦ、オンコスタチン（ＯＳＭ）、オンコスタチン受容体（ＯＳＭＲ）カーディオトロフィン−ｌ、ＩＬ−６、ＩＬ６Ｒ、  ｈｙｐｅｒ  ＩＬ−６、  ＩＬ−１１、  ｇｐｌ３０、ＬＩＦ活性を有する他のたんぱく質および／あるいはＮｏｔｃｈ活性を有するたんぱく質をコードする配列から選択される配列を含む追加のヌクレオチド配列が、条件付きで発現され、テトラサイクリン感受性プロモーターなどの条件付きプロモーターによって駆動される、請求項９８に記載のベクター。
【請求項１０１】
多能、多能性、及び／または選択した細胞から自己再生できる細胞を製造する方法は、以下のものを含む：骨髄、末梢血、胎盤の血液、羊水、臍帯血、皮膚、脂肪組織、ヒト以外の胚細胞、造血細胞、精原細胞、精巣の始原生殖細胞、上皮細胞、循環白血球、単球マクロファージ、その他の体細胞、遺伝子改変臍帯血細胞、遺伝子改変羊水幹細胞、遺伝子改変骨髄細胞、遺伝子改変末梢血細胞、遺伝子改変脂肪細胞、遺伝子改変胎盤細胞、遺伝子改変造血細胞、遺伝子改変皮膚細胞、遺伝子改変精原細胞、遺伝子改変精巣の始原生殖細胞、遺伝子改変末梢血幹細胞、遺伝子改変上皮細胞、遺伝子改変白血球、遺伝子改変ヒト以外の胚細胞、その他の遺伝子改変幹細胞／前駆細胞と選択した細胞を提供するための体細胞に由来する細胞などの幹細胞／前駆細胞および体細胞型の群から細胞を選択する；Ｎｏｔｃｈ活性を有する蛋白質とＬＩＦ活性を有する蛋白質、ＦＧＦ４蛋白質、ＨＯＸＢ４蛋白質、ＮＡＮＯＧ蛋白質、Ｏｃｔ４蛋白質、Ｓｏｘ２蛋白質をコードするヌクレオチド配列から選択した追加のヌクレオチド配列と哺乳類のｎｕｍｂ蛋白質の「長」（ＰＲＲ挿入＋）アイソフォームをコードするヌクレオチド配列で選択した細胞をトランスフェクトする；ＥＧＦ，  ｂＦＧＦ，  ＬＩＦ，  スチールファクター、ＩＬ−６，  ｈｙｐｅｒ  ＩＬ−６，  ＩＬ−７，  オンコスタチン−Ｍ，  カーディオトロフィン−１、および選択した細胞がある速度で拡張するのに効率的な他の成長を高めるサイトカインから選択したサイトカインを含む成長培地中で選択した細胞を成長させるがここで前記速度は前記成長培地中で選択した細胞の倍加時間から決定される；そして目的の細胞数になるまで、これらの培養条件下で細胞を維持する。
【請求項１０２】
前記成長培地が条件つきの導入遺伝子発現を誘導するための誘導剤をさらに含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
生体内でさらなる分化が可能な所望の分化細胞集団を提供する方法であって、前記所望の細胞は、分化造血細胞、神経細胞、ドーパミン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、コリン作動性ニューロン、ノルアドレナリン作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、筋細胞、心筋細胞、内胚葉と膵臓ランゲルハンス島の細胞、生殖細胞または他の所望の細胞を含み、該方法は、骨髄、末梢血幹、胎盤の血液、羊水、臍帯血、皮膚、脂肪組織、ヒト以外の胚、造血細胞、精原細胞、精巣の始原生殖細胞、上皮細胞、循環白血球、単球マクロファージ、その他の体細胞、遺伝子改変臍帯血細胞、遺伝子改変羊水幹細胞、遺伝子改変骨髄細胞、遺伝子改変末梢血細胞、遺伝子改変脂肪細胞、遺伝子改変胎盤細胞、遺伝子改変造血細胞、遺伝子改変皮膚細胞、遺伝子改変精原細胞、遺伝子改変精巣の始原生殖細胞、遺伝子改変末梢血幹細胞、遺伝子改変上皮細胞、遺伝子改変白血球、遺伝子改変ヒト以外の胚細胞、選択された細胞を提供するためのその他の遺伝子改変幹細胞／前駆細胞および体細胞由来の細胞などの幹細胞／前駆細胞および体細胞型の群から細胞を選択するステップと、
Ｓｏｘ２たんぱく質、Ｏｃｔ４たんぱく質、ＮＡＮＯＧたんぱく質、ＨＯＸＢ４たんぱく質、ＦＧＦ４たんぱく質、ＬＩＦ活性を有するたんぱく質および、Ｎｏｔｃｈ活性を有するたんぱく質をコードする配列から選択された配列を含む付加的なヌクレオチド配列の他、哺乳類のｎｕｍｂたんぱく質の「長」（ＰＲＲ  挿入＋）アイソフォームをコードするヌクレオチド配列で前記細胞をトランスフェクトするステップと、
前記選択された細胞が第１の成長速度で成長するのに有効な成長培地で前記選択された細胞を成長させるステップであって、前記第１の成長速度は前記成長培地内で前記選択された細胞の倍加時間から決定されるステップと、
目的の細胞数を達成するまで、これらの培養条件下で前記細胞を維持するステップと、
前記選択された細胞が分化培地の中で第２の成長速度で成長する有効な前記分化培地で前記選択された細胞を培養するステップであって、前記第２の成長速度は、前記分化培地内で前記選択された細胞の倍加時間から決定され、前記第２の成長速度は前記第１の成長速度の約１０％から約９０％の間の成長速度であり、
前記分化培地は、前記選択された細胞を前記所望の分化細胞への分化又は改変を促進する上で効果的な少なくとも１つの分化作用物質を含み、さらに
前記分化作用物質はレチノイン酸、神経成長因子、ジメチルスルホキシド、およびヘキサメチレンビスアクリルアミド、または前記所望の細胞型に適切なその他の分化作用物質からなる群から選択される、方法。
【請求項１０４】
請求項１０３に記載の方法であって、
ｉ）前記細胞をヌクレオチド配列、特に転写因子でトランスフェクトすることによって該細胞のいくつかを望まれる細胞への分化を開始するよう促すステップと、
ｉｉ）前記細胞を最も短い（Ｐｒｒ−／ＰＴＢ−）ＮｕｍｂアイソフォームまたはＮｕｍｂｌｉｋｅをコードするヌクレオチド配列でトランスフェクトするステップと、
ｉｉｉ）前記細胞をＰＲＲ＋ｎｕｍｂアイソフォームを標的にした合成オリゴヌクレオチド配列によりトランスフェクトするステップのうち１つまたは複数のステップをさらに含む、方法。
【請求項１０５】
前記望まれる細胞が心筋細胞であり、その細胞がＤＭＳＯやＮＢＳ、レチノイン酸、および／または心筋細胞の訓化培地を含む分化培地の中で培養される、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０６】
前記望まれる細胞が神経細胞であり、その細胞が神経成長因子やレチノイン酸から選択された分化作用物質を含む分化培地の中で培養される、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０７】
前記望まれる細胞が筋細胞であり、その細胞がヘキサメチレンビスアクリルアミド、またはジメチルスルホキシドを含む分化培地の中で培養される、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０８】
生体内でさらなる分化が可能な所望の細胞集団を提供する方法であって、
骨髄、末梢血幹、胎盤の血液、羊水、臍帯血、皮膚、脂肪組織、ヒト以外の胚、造血細胞、精原細胞、精巣の始原生殖細胞、上皮細胞、循環白血球、単球マクロファージ、その他の体細胞、遺伝子改変臍帯血細胞、遺伝子改変羊水幹細胞、遺伝子改変骨髄細胞、遺伝子改変末梢血細胞、遺伝子改変脂肪細胞、遺伝子改変胎盤細胞、遺伝子改変造血細胞、遺伝子改変皮膚細胞、遺伝子改変精原細胞、遺伝子改変精巣の始原生殖細胞、遺伝子改変末梢血幹細胞、遺伝子改変上皮細胞、遺伝子改変白血球、遺伝子改変ヒト以外の胚細胞、選択した細胞を提供するためのその他の遺伝子改変幹細胞／前駆細胞および体細胞に由来する細胞などの幹細胞／前駆細胞および体細胞型の群から細胞を選択するステップと、
目的の細胞数を達成するまで、成長培地で前記細胞を維持するステップと、
前記細胞をヌクレオチド配列、特に転写因子でトランスフェクトして、前記細胞の所望の細胞への分化開始を促進するステップと、
前記細胞を最も短い（Ｐｒｒ−／ＰＴＢ−）  ＮｕｍｂアイソフォームあるいはＮｕｍｂｌｉｋｅをコードするヌクレオチド配列でトランスフェクトするステップと、
前記選択された細胞を望まれる分化をした細胞へと、分化または改変を促進するのに効果的な少なくとも１つの分化作用物質を含む分化培地中で培養するステップとを含み、さらに
前記分化作用物質はレチノイン酸、神経成長因子、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチレンビスアクリルアミド、または前記望まれる細胞タイプに適した他の分化作用物質からなる群から選択される、方法。
【請求項１０９】
前記細胞が、前記最も短い（Ｐｒｒ−／ＰＴＢ−）  ＮｕｍｂアイソフォームまたはＮｕｍｂｌｉｋｅをコードするヌクレオチド配列でトランスフェクトされない、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記望まれる細胞が筋細胞であり、該細胞がＭｙｏＤ，ミオゲニン、ミオカルディン、Ｍｙｆ５、Ｍｙｆ６、Ｍｅｆ２Ａ、Ｇａｔａ４、Ｇａｔａ５、およびＧａｔａ６から選択される因子を含む転写因子でトランスフェクトされる方法であって、該望まれる細胞が骨格筋細胞、平滑筋、または心筋であるか否かに依存する、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１１】
ドーパミン作動性ニューロンが前記望まれる細胞であり、その細胞が前記分化培地の中で培養する前に、Ｍａｓｈ１、Ｎｇｎ２、Ｎｕｒｒ１、Ｌｍｘｌｂ、および／またはＰｔｘ３から選択された因子を含む転写因子でトランスフェクトされる、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１２】
セロトニン作動性ニューロンが前記望まれる細胞であり、その細胞が前記分化培地の中で培養する前に転写因子でトランスフェクトされる、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１３】
前記転写因子は、Ｍａｓｈｌ、  Ｐｈｏｘ２ｂ、  Ｌｍｘｌｂ、Ｎｋｘ２．２、  Ｇａｔａ２、Ｇａｔａ３およびＰｅｔｌ  を含む、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
コリン作動性のニューロンが前記望まれる細胞であり、その細胞が前記分化培地の中で培養する前に、ＭＡＳＨｌ、  Ｐｈｏｘ２ａおよびＲＥＳＴ４から選択される因子を含む転写因子でトランスフェクトされる、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１５】
ＧＡＢＡ作動性ニューロンが前記望まれる細胞であり、その細胞がＬＩＦ、ＮＴ３、およびＮＧＦから選択される分化作用物質を含む分化培地の中で培養する前に、ＭＡＳＨｌ、Ｐｈｏｘ２ａ、およびＲＥＳＴ４から選択される因子を含む転写因子でトランスフェクトされる、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１６】
ノルアドレナリン作動性ニューロンが前記望まれる細胞であり、その細胞が、Ｍａｓｈｌ、Ｈａｎｄ（ＨＡＮＤ２）、Ｐｈｏｘ２ａ、Ｐｈｏｘ２ｂ、Ｇａｔａ２およびＧａｔａ３から選択される因子を含む転写因子でトランスフェクトされる、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１７】
ＧＡＢＡ作動性ニューロンが前記望まれる細胞であり、その細胞が、ＰＩＴＸ２、Ｄｌｘ２、Ｄｌｘ５、およびＨｅｓ１をターゲットとするＲＮＡから選択される因子を含む転写因子でトランスフェクトされる請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１８】
ニューロンが前記望まれる細胞であり、その細胞がＰＩＴＸ２、Ｄｌｘ２、Ｄｌｘ５、Ｎｕｒｒ１、ＲＥＮ、ニューロゲニン１、ニューロゲニン２、ニューロゲニン３、Ｍａｓｈｌ、Ｐｈｏｘ２ｂ、Ｐｈｏｘ２ａ、ｄＨａｎｄ、Ｇａｔａ３、Ｓｈｈ、ＦＧＦ８、Ｌｍｘ１ｂ、Ｎｋｘ２．２、Ｐｅｔ１、Ｌｂｘ１、Ｒｎｘおよび／またはアンチセンスＨｅｓ１  ＲＮＡから選択される因子を含む転写因子でトランスフェクトされる、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１９】
膵臓ランゲルハンス島細胞、または内胚葉細胞が前記望まれる細胞であり、前記選択された細胞はＦｏｘａ２、Ｓｏｘｌ７、ＨＬＸＢ９およびＰｄｘｌから選択される因子を含む転写因子でトランスフェクトされ；そして追加の分化作用物質は酪酸ナトリウム、アクチビンＡ、レチノイン酸、上皮細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、ノギン、インスリン様成長因子ＩＩ、ニコチンアミドから選ばれる、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１２０】
前記望まれる細胞は造血細胞であり、前記細胞はＲｕｎｘｌ／ＡＭＬｌをコードするヌクレオチド配列でトランスフェクトされ、前記分化作用物質は、望まれる細胞型に適したＶＥＧＦ、トロンボポエチン、およびコロニー刺激因子から選択される、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１２１】
内臓器官、筋系、心臓、中枢神経系、血液、他の組織の障害を患っていて、治療が必要な患者に処置する方法であって、骨髄、末梢血液幹、胎盤の血液、羊水、臍帯血、皮膚、脂肪組織、ヒト以外の胚、造血細胞、精原細胞、精巣の始原生殖細胞、上皮細胞、循環白血球、単球マクロファージ、他の体細胞、遺伝子改変臍帯血細胞、遺伝子改変羊水幹細胞、遺伝子改変骨髄細胞、遺伝子改変末梢血細胞、遺伝子改変脂肪細胞、遺伝子改変胎盤細胞、遺伝子改変造血細胞、遺伝子改変皮膚細胞、遺伝子改変精原細胞、遺伝子改変精巣の始原生殖細胞、遺伝子改変末梢血幹細胞、遺伝子改変上皮細胞、遺伝子改変白血球、遺伝子改変ヒト以外の胚細胞、選択した細胞を提供するための他の遺伝子改変幹細胞／前駆細胞および体細胞に由来する細胞などの幹細胞／前駆細胞および体細胞型の群から細胞を選択するステップと、前記細胞を哺乳類のｎｕｍｂたんぱく質の「長」（ＰＲＲ挿入＋）アイソフォームならびに、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｈｏｘｂ４、ＦＧＦ−４、ＬＩＦ、ＬＩＦＲ、ＣＮＴＦ、オンコスタチン、カーディオトロフィン−１，ＩＬ−６，ＩＬ−６Ｒ，ｈｙｐｅｒ  ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ｇｐ１３０、ＬＩＦ活性を有する他のたんぱく質、およびＮｏｔｃｈ活性を有するたんぱく質をコードする配列から選択される配列を含む追加のヌクレオチド配列でトランスフェクトするステップと、
前記選択された細胞が分化培地中で第２の成長速度で成長するのに有効な分化培地の中で培養し、ここで該第２の成長速度は該分化培地の中での該選択された細胞の倍加時間から決定され、さらに該第２の成長速度は第１の成長速度の約１０％から約９０％の間の成長速度であり、該分化培地は、該選択された細胞の分化または改変を促進して分化細胞にするのに効果的なジメチルスルホキシド、およびヘキサメチレンビスアクリルアミドからなる群から選択される少なくとも１つの分化作用物質を含むステップと、該分化細胞を前記患者の血行、器官、神経系、または他の組織に注入し、それにより前記障害が改善または治療されるステップとを含む、方法。
【請求項１２２】
請求項１２１に記載の方法であって、前記細胞を前記望まれる細胞へと分化を開始するよう促進するヌクレオチド配列、特に転写因子で該細胞をトランスフェクトするステップと
前記細胞を最も短い（Ｐｒｒ−／ＰＴＢ−）  ＮｕｍｂアイソフォームまたはＮｕｍｂｌｉｋｅをコードするヌクレオチド配列またはＰＲＲ＋  ｎｕｍｂアイソフォームを標的にする配列でトランスフェクトするステップから選択されるステップを更に含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１２３】
選択された細胞は望まれる細胞数を達成した後に前記成長培地から単離され、前記患者の血行、器官、神経系、または他の組織に注入され、それによって前記障害が改善されるか治療される、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２４】
核酸またはたんぱく質が選択した細胞の中で過剰発現するかまたは導入されており、これらの核酸またはたんぱく質は、長（Ｐｒｒ＋）  ｎｕｍｂアイソフォーム、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｎｏｔｃｈ活性を有する導入遺伝子、Ｈｏｘｂ４，ＦＧＦ−４、ＬＩＦ、ＬＩＦＲ、ＣＮＴＦ、オンコスタチン、オンコスタチン受容体、カーディオフィリン−１、ＩＬ−６、ＩＬ６Ｒ、ｈｙｐｅｒ  ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ｇｐｌ３０およびＬＩＦ活性を有する他の導入遺伝子をコードするものから選択されたものを含む自己再生、多能、および／または多能性細胞の集団を獲得する方法。
【請求項１２５】
請求項１２４に記載の方法であって、用いるトランスフェクションの方法は、電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいはレトロウィルス／レンチウィルスの組込み、または他の細胞のゲノムのランダムな変換を避ける別の方法である方法。
【請求項１２６】
自己再生、多能、および／または多能性細胞の集団を獲得する方法であって、単一の遺伝子あるいはその一部に対応する核酸あるいはたんぱく質が選択された細胞の中に過剰発現あるいは導入され、これらの核酸あるいはたんぱく質が長（Ｐｒｒ＋）  Ｎｕｍｂアイソフォーム、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｎｏｔｃｈ活性を有する導入遺伝子、Ｈｏｘｂ４、ＦＧＦ−４、ＬＩＦ、ＬＩＦＲ、ＣＮＴＦ、ＯＳＭ、ＯＳＭＲ、カーディオトロフィン−１、ＩＬ−６、ＩＬ６Ｒ、ｈｙｐｅｒＩＬ−６、ＩＬ−１１、ｇｐｌ３０をコードするものから選択された１つに対応する方法。
【請求項１２７】
用いるトランスフェクションの方法は、電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいはレトロウィルス／レンチウィルスの組込みまたは他の細胞のゲノムのランダムな変換を避けるもう１つのアプローチである、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２８】
遺伝子的に生産した自己再生細胞、多能細胞、多能性細胞および／あるいは分化細胞を、組織工学の目的で、３次元または２次元の足場で培養する、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２９】
遺伝子的に生産した自己再生細胞、多能細胞、多能性細胞、および／または分化細胞を、組織工学の目的で、脱細胞化器官か脱細胞化組織中で培養する、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１３０】
遺伝子的に生産した自己再生細胞、多能細胞、多能性細胞、および／または分化細胞を、組織工学の目的で、インクジェット印刷の技術と合わせ利用する、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１３１】
遺伝子的に生産した自己再生細胞、多能細胞、多能性細胞、および／または分化細胞をハンギングドロップで培養する、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１３２】
生殖細胞を遺伝子的に生産した自己再生細胞、多能細胞、および／または、多能性細胞から生産する、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１３３】
核酸が多能、多能性、自己再生を誘導する能力、および／または分化を開始する能力について、核酸をスクリーニングするための、請求項１２１に記載の方法であって、その配列は電気穿孔法、ナノカプセルまたナノヴォールトを利用して選択された細胞に導入される、方法。
【請求項１３４】
多能、多能性、自己再生を誘導する能力、および／または分化を開始する能力について核酸をスクリーニングするための、請求項１０８に記載の方法であって、その配列が電気穿孔法、ナノカプセル、またはナノヴォールトを利用して選択された細胞に導入される、方法。
【請求項１３５】
分化細胞が、所望な分化細胞中に通常存在する一つまたは一つより多い転写因子に対応する核酸またはタンパク質の過剰発現または導入による、遺伝子的に生産された、自己再生細胞、多能細胞、および／または多能性細胞から所望され産生される、請求項１２１に記載の方法。
【国際調査報告】
2010528613.tif 000105
2010528613.tif 000106
2010528613.tif 000107