(57)【要約】  アルツハイマー病およびアミロイド−β病態／アミロイドーシスなどの神経系障害の処置ならびに診断における新規な薬物および方法を提供する。より詳しくは、Ａβペプチド関連脳障害の処置のためのエリスロポエチンおよびその類縁体の使用を記載する。さらに、アルツハイマー病およびアルツハイマー病の進行のそれぞれのバイオマーカーとしてのクラウジン−５およびそのバリアントの使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における神経系障害またはアミロイドーシスの処置、改善または予防のための、エリスロポエチン（ＥＰＯ）またはその生物学的に活性な断片もしくは類縁体を含む医薬組成物。
【請求項２】
前記障害が脳内の微小血管内皮の損傷を伴う、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
微小血管内皮の損傷が、クラウジン−５の細胞膜分離および／またはクラウジン−５のタンパク質レベルの低下を特徴とする、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記障害がアミロイドーシスと関連している、請求項１または３いずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記障害がアミロイドβ（Ａβ）病態と関連している、請求項１〜４いずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記障害が、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のアミロイド形成性プロセッシングに起因している、請求項１〜５いずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記神経系障害がアルツハイマー病である、請求項１〜６いずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
ＥＰＯまたはその活性断片もしくは類縁体が外来的に適用されるか、または標的細胞内で発現されるように設計された、請求項１〜７いずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記標的細胞が脳内の毛細血管内皮細胞である、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記ＥＰＯがヒトＥＰＯまたはその生物学的に活性な断片である、請求項１〜９いずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記ＥＰＯまたはその活性断片もしくは類縁体が、天然ヒトＥＰＯと比べて過剰グリコシル化されている、請求項１〜１０いずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記ＥＰＯまたはその活性断片もしくは類縁体がダルベポエチンである、請求項１〜１１いずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
全身投与されるように設計された、請求項１〜１２いずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
対象のヘモグロビンレベルを有意に上昇させることなく治療有効量で投与されるように設計された、請求項１〜１３いずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
対象のヘマトクリットを有意に上昇させることなく治療有効量で投与されるように設計された、請求項１〜１４いずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
約１ＵＩ／ｋｇ〜１０００ＵＩ／ｋｇ未満の用量で投与されるように設計された、請求項１〜１５いずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
最大１００ＵＩ／ｋｇの用量で投与されるように設計された、請求項１〜１６いずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
毎週投与されるように設計された、請求項１〜１７いずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
抗Ａβ抗体またはそれと等価なＡβ結合分子をさらに含むか、或いは該抗Ａβ抗体またはそれと等価なＡβ結合分子を含む医薬組成物と併せて投与されるように設計された、請求項１〜１８いずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
アルツハイマー治療における同時、別々または逐次使用のための抗Ａβ抗体またはそれと等価なＡβ結合分子或いはその併用調製物を含む、請求項１〜１９いずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
対象に、請求項１〜１２いずれか１項に記載のＥＰＯまたはその活性断片もしくは類縁体を最大１０００ＵＩ／ｋｇまたはそれ以下の用量で投与し、それにより、神経系障害の重症度を抑制または低減させることを含む、前記対象の神経系障害の処置、改善または予防のための方法。
【請求項２２】
クラウジン−５の細胞膜分離および／またはクラウジン−５のタンパク質レベルの低下を特徴とする対象の脳内の損傷微小血管内皮の処置、改善または予防のための方法であって、前記対象に、請求項１〜１２いずれか１項に記載のＥＰＯまたはその活性断片もしくは類縁体を投与し、それにより、該損傷の重症度を抑制または低減させることを含む方法。
【請求項２３】
体液試料中のクラウジン−５またはそのバリアント、好ましくは約１６ｋＤａの種のレベルを測定することを含み、ここで、健常対象由来の試料の参照値と比べたときのクラウジン−５レベルの減少および／または前記バリアントのレベルの増加は、個体がアルツハイマー病に罹患しているか、または罹患するリスクがあることを示す、アルツハイマー病をインビトロで評価するための方法。
【請求項２４】
体液試料中のクラウジン−５またはそのバリアント、好ましくは約１６ｋＤａの種のレベルを測定することを含み、ここで、クラウジン−５または前記バリアントのレベルの以前の測定値と比較して、クラウジン−５レベルの減少および／または前記バリアントのレベルの増加は、アルツハイマー病の進行を示す、アルツハイマー病の進行をモニタリングするためのインビトロ方法。
【請求項２５】
体液が脳脊髄液または血液である、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２６】
アルツハイマー病のバイオマーカーとしてのクラウジン−５またはそのバリアントの使用。
【請求項２７】
アルツハイマー病の進行のバイオマーカーとしてのクラウジン−５またはそのバリアントの使用。
【請求項２８】
クラウジン−５またはそのバリアントを測定するための手段または薬剤を含む、請求項２４〜２６いずれか１項に記載の方法における使用のためのキット。
【請求項２９】
さらに、個体がアルツハイマー病に罹患するリスクの判定に関するいずれかの測定値の結果を解釈するためのユーザーズマニュアルを含む、請求項２９に記載のキット。
【請求項３０】
本明細書において特に前述の実施例に関して実質的に記載した医薬組成物、方法、使用およびキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経系障害およびその処置のための方法の技術分野に関する。より詳しくは、本発明は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）および特にアミロイドβ（Ａβ）ペプチドのアミロイド形成性プロセッシングと関連している障害の処置に関する。さらに、本発明は、アルツハイマー病のバイオマーカーならびにアルツハイマー病の進行のバイオマーカーとしてのクラウジン−５（Ｃｌａｕｄｉｎ−５）およびそのバリアントの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
重篤なさまざまな神経変性疾患に対し、有効な治療剤または治癒法は存在しない。例えば、最も一般的な神経変性疾患であり、認知症の最も多い原因であるアルツハイマー病では、進行性の記憶力減退および側頭連合野および頭頂連合野の変性により、言語障害および協調低下ならびに、場合によっては、情動障害がもたらされる。アルツハイマー病は、一般的に、長年にわたって進行し、患者は徐々に動けなくなり、衰弱し、肺炎に易罹患性となる。アミロイドカスケード仮説によると、アミロイドβペプチド（Ａβ）の蓄積は、ＡＤにおいて中心的な役割を果たしている（ＨａｒｄｙおよびＳｅｌｋｏｅ，２００２）。ＡＤ脳内には、２つの型のＡβ病態：灰白質内のＡβ沈着物である老人斑、および脳および髄膜の血管内のＡβ沈着物である脳のアミロイド血管症（ＣＡＡ）が存在している。Ａβの異常蓄積は、神経細線維のもつれの形成、シナプスおよびニューロンの減少を引き起こし、脳機能の破壊をもたらすと考えられている。したがって、Ａβ関連介入は、現在、ＡＤ治療剤の開発の中心となっている。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、神経系障害、特に、アルツハイマー病またはアミロイドβ（Ａβ）病態およびアミロイドーシスとの関連疾患と関連している障害の処置、改善および予防のそれぞれにおけるエリスロポエチン（ＥＰＯ）およびエリスロポエチン様薬剤の使用に関する。特に、本発明は、ＥＰＯの全身性投与により、老人斑およびＣＡＡのＡＤ様アミロイド病態を有し、若年齢で行動欠陥が現れたトランスジェニックマウスにおいて、初期のＡβ病態および微小血管の不完全性が改善され得るという驚くべき知見を利用するものである。したがって、本発明は、ＡＰＰのアミロイド形成性プロセッシングおよび脳内のＡβの存在のそれぞれ、ならびにクラウジン−５の細胞膜分離およびそのタンパク質レベルの低下を特徴とする微小血管の不完全性によって示されるアルツハイマー病の処置用の治療有効成分として、ＥＰＯを含む医薬を初めて提供するものである。これに関連して、本発明はまた、試料中のクラウジン−５またはそのバリアント、好ましくは約１６ｋＤａの種のレベルを測定することを含み、ここで、健常対象由来の試料の参照値と比べたときのクラウジン−５レベルの減少および／または前記そのバリアントのレベルの増加は、前記個体がアルツハイマー病に罹患しているか、または罹患するリスクがあることを示す、アルツハイマー病の存在および状態のそれぞれを評価するための方法に関するものである。
本発明の他の実施形態は、以下の説明から自明となろう。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１】図１は、ｒＨｕＥＰＯによってＡβ病態が改善されることを示す図である。チオフラビン−Ｓ染色により、ｔｇ  ｃｔｒの皮質において小さなＡβ斑が示された（Ａ）。皮質のチオフラビン−Ｓ斑の数は、ＥｐｏＬ（Ｂ）およびＥｐｏＨ（Ｃ）において有意に少なかった。スケールバーは１００μｍである。（Ｄ）ｔｇ  ｃｔｒと比較すると、平均斑数は、ＥｐｏＬおよびＥｐｏＨにおいて４０％超少なかった（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、ＬＳＤ）。
【図２】図２は、ｒＨｕＥＰＯが、Ａβ沈着物に応答して星状細胞活性をモジュレートすることを示す図である。矢状面の脳切片における６Ｅ１０（赤色）および抗ＧＦＡＰ抗体（緑色）での二重免疫蛍光染色により、ｔｇ  ｃｔｒの皮質において、強い星状細胞増加関連Ａβ斑が示された（ＡおよびＤ）。ＥｐｏＬ（ＢとＥ）およびＥｐｏＨ（ＣとＦ）はともに、有意に少ない数のＡβ斑を有し、星状細胞増加は弱かった。実質内のＡβ斑関連星状細胞増加は、ｔｇ  ｃｔｒ  と比べＥｐｏＬ（Ｈ）およびＥｐｏＨ（Ｉ）において著しく低かった（Ｇ）。スケールバーは１００μｍ。
【図３】図３は、ｒＨｕＥＰＯによりＣＡＡが改善されることを示す図である。８ヶ月齢の時点で、ａｒｃＡβマウスには、既に軟髄膜の血管および実質の血管の両方において、顕著なＣＡＡが発生していた（ＡおよびＢ）。ｔｇ  ｃｔｒ（●）では、皮質のチオフラビン−Ｓ斑の負過量が、チオフラビン−Ｓ陽性血管が見られたことと正に相関していた（ｒ＝０．７２５、Ｐ＜０．０５）が、ＥｐｏＬ（□）（Ｐ＝０．２５３）およびＥｐｏＨ（△）ではどちらもそうではなかった（Ｐ＝０．６４７、スピアマンのρ相関係数検定）（Ｃ）。正常な状態では、星状細胞は脳血管と密接に結合している。ｔｇ  ｃｔｒでは、血管に重度にＡβを負荷すると、星状細胞が血管壁から剥離した（Ｄ）。対照的に、ＥｐｏＬおよびＥｐｏＨでは、依然として星状細胞エンドフィートが、Ａβ負荷血管壁を覆っていた（ＥおよびＦ）。スケールバーは１００μｍ。
【図４】図４は、ｒＨｕＥＰＯによって脳内および血清中のＡβが減少することを示す図である。Ａβ４０およびＡβ４２に特異的なＥＬＩＳＡを使用した。（Ａ）ＲＩＰＡ画分における脳内Ａβ４０は、４ヶ月齢のａｒｃＡβマウス（ｔｇ若年齢、ｎ＝３）と比べ、ｔｇ  ｃｔｒ（ｎ＝９）においてほんのわずか増加していたが、ＳＤＳ画分およびＦＡ画分のＡβ４０は、それぞれ、４倍および４０倍増加していた。ｒＨｕＥＰＯにより、ＥｐｏＬ（ｎ＝１１）およびＥｐｏＨ（ｎ＝１２）において、ＳＤＳ画分およびＦＡ画分中の脳内Ａβ４０レベルが４０％より大きく低下した。（Ｂ）また、ｒＨｕＥＰＯにより、ＲＩＰＡ画分およびＦＡ画分中の脳内Ａβ４２レベルも４０％より大きく低下した。（Ｃ）ピアソン相関解析は、皮質のチオフラビン−Ｓ斑の負過量と脳内Ａβレベルとの強い関係を示し（Ａβ４０のＳＤＳおよびＦＡ画分およびＡβ４２のＲＩＰＡ画分とＦＡ画分；Ｐ＜０．００１）、そのうち、ＳＤＳ画分（ｒ＝０．７９１）における皮質の斑の負過量と脳内Ａβ４０関係が、（□）ＥｐｏＨ、（＋）ＥｐｏＬおよび（△）ｔｇ  ｃｔｒについて最も強いことを示す。（Ｄ）ｒＨｕＥＰＯにより、処置マウスの血清中のＡβ４０レベルが有意に低減された。ｔｇ  ｃｔｒと比較すると、Ｐ＃＜０．０１（両側スチューデントｔ−検定による）、およびＰ＊＝０．０５５、＊＊＜０．０５、＊＊＊＜０．０１（ＬＳＤによる）。
【図５】図５は、ｒＨｕＥＰＯにより、ＡＰＰの非アミロイド形成性プロセッシングが促進されることを示す図である。Ｃ末端ＡＰＰに対する抗体をウエスタンブロッティングに使用した（ＡおよびＢ）。これは、完全長ＡＰＰ（ＦＬ−ＡＰＰ）ならびにβ−切断のＣ末端断片（β−ＣＴＦ）およびα−切断のＣ末端断片（α−ＣＴＦ）を認識するものである。野生型では、α−切断のみが検出可能であったが、β−切断は、ａｒｃＡβマウス（ｔｇ  ｃｔｒおよびＥｐｏＨ）において顕著であった。β−ＣＴＦのレベルは、ＥｐｏＨよりもｔｇ  ｃｔｒにおいて明らかに高かった。デンシトメトリー測定に基づいたＦＬ−ＡＰＰに対するβ−ＣＴＦの比は、ｔｇ  ｃｔｒ（ｎ＝７）、と比べ、ＥｐｏＨにおいて３４％有意に低減された（ｐ＊＜０．０１、スチューデントｔ−検定）。  これらの結果は、ｒＨｕＥｐｏに供された、Ｓｗｅｄｉｓｈ型変異を含むヒトＡＰＰ６９５を過剰発現するＳｗｅＡＰＰ２９３細胞で確認される。ＳｗｅＡＰＰ細胞におけるα−ＣＴＦおよびβ−ＣＴＦレベルは、ウエスタンブロットにおいてほぼ等しかった（Ｃ）。種々の濃度のｒＨｕＥＰＯにより、α−ＣＴＦ／β−ＣＴＦは著しく増大し、１ＵＩ／ｍｌのときα−ＣＴＦ／β−ＣＴＦが２．６のピークに達した。しかしながら、確立されたγ−切断インヒビターであるＤＡＰＴでは、ｒＨｕＥＰＯによるα−ＣＴＦ／β−ＣＴＦの増大は阻止されなかった（Ｄ）。また、α−切断の細胞外断片であるｓＡＰＰαもｒＨｕＥＰＯ処置細胞の馴化培地中で増加していた（Ｅ）。したがって、ａｒｃＡβマウスおよびＳｗｅＡＰＰ２９３細胞において、ｒＨｕＥＰＯによりＡＰＰの非アミロイド形成性プロセッシングが誘導された。
【図６】図６は、ｒＨｕＥＰＯにより微小血管内皮細胞に対するＡβ毒性が抑制されることを示す図である。単離した脳の微小血管の免疫蛍光染色により、野生型ではクラウジン−５の均一な分布が示された（Ａ）が、ｔｇ  ｃｔｒのＡβ負荷血管では、クラウジン−５のまばらな分布または完全な消失が示された（Ｂ）。クラウジン−５分布の破壊は、ｒＨｕＥＰＯ処置マウスではあまり重症ではなかった（Ｃ）。赤色はクラウジン−５、緑色は６Ｅ１０、青色はＤＡＰＩのものである。対照的に、微小血管内皮細胞において、Ａβ沈着はＣＤ３１発現に影響を及ぼさなかった（Ｄ、赤色は６Ｅ１０、緑色はＣＤ３１および青色はＤＡＰＩ）。野生型において血管壁に沿ったクラウジン−５の均一な分布に示されるように、星状細胞は健常脳の微小血管を完全に覆っていた（Ｅ、赤色はクラウジン−５および緑色はＧＦＡＰ）。ｔｇ  ｃｔｒでは、星状細胞との密着の減少とともに、微小血管内のクラウジン−５染色が低かった（Ｆ、赤色はクラウジン−５および緑色はＧＦＡＰ）。スケールバーは２０μｍ。
【図７】図７は、ｒＨｕＥＰＯにより、内皮細胞においてＡβによって誘導される膜クラウジン−５の減少が抑制されることを示す図である。内皮細胞株ｂＥｎｄ５は、マウス脳の微小血管から確立されたものである。（Ａ）２週間培養後、細胞膜において多量のクラウジン−５が発現され（赤色）、これはＣＤ３１と共局在していた（緑色、青色はＤＡＰＩ）。しかしながら、１０μＭの新鮮調製Ａβ４２中で２４時間培養後、ｂＥｎｄ５細胞では細胞膜のクラウジン−５が完全に消失していた。ＣＤ３１は依然として細胞膜において発現されていたが、クラウジン−５は細胞質内に蓄積されていた。１ＵＩ／ｍｌのｒＨｕＥＰＯを１０μＭのＡβ４２とともに添加すると、クラウジン−５の細胞膜発現が保持された。しかしながら、１ＵＩ／ｍｌのｒＨｕＥＰＯ単独では、クラウジン−５の細胞膜分布もＣＤ３１の細胞膜分布も変化しなかった。スケールバーは２０μｍ。（Ｂ）ウエスタンブロットでは、対照、１０μＭのＡβ４２、１ＵＩ／ｍｌのｒＨｕＥＰＯ、および両処理細胞の組合せ間で、クラウジン−５レベルの差は示されていない。しかしながら、１０μＭのＡβ４２処理細胞では小さなＣ末端断片が見られ、増加していた。１ＵＩ／ｍｌのｒＨｕＥＰＯ処理単独では、このようなＣ末端断片に対する効果はなかったが、Ａβによって誘導されたＣ末端小断片の量は有意に少なかった。
【図８】図８は、ウエスタンブロットにより、認知症患者および健常対照由来の側頭葉皮質内のクラウジン−５のレベルが示されていることを示す図である。認知症の臨床診断のみを有する対象（被検体）に＋を表示し、臨床的に認知症でない対象に−を表示した。神経細線維のもつれの重症度は、Ｂｒａａｋ  ａｎｄ  Ｂｒａａｋ  Ｓｔａｇｅ（Ｂ＆Ｂ病期）によって示した。また、各対象のアポリポタンパク質Ｅ遺伝子型も表示した。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
特に記載のない限り、本明細書で用いる用語の定義は、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７（２０００年改定および２００３年再版、ＩＳＢＮ  ０  １９  ８５０６７３  ２）に示された定義である。
【０００６】
「薬剤」、「試薬」、または「化合物」は、該用語を本明細書で用いる場合、一般的に、細胞、組織、体液、または検査対象の任意の生物学的系もしくは任意のアッセイ系の状況におけるものに対してプラスまたはマイナスの生物学的効果を有する任意の物質、化学物質、組成物または抽出物を示す。これは、標的のアゴニスト、アンタゴニスト、部分アゴニストまたはインバースアゴニストであり得る。かかる薬剤、試薬または化合物は、核酸、天然もしくは合成ペプチドもしくはタンパク質複合体、または融合タンパク質であり得る。また、抗体、有機または無機系の分子または組成物、小分子、薬物および上記の前記薬剤のいずれかの任意の組合せであり得る。これらは、試験目的、診断目的または治療目的に使用され得る。
【０００７】
別の記載がない限り、用語「化合物」、「物質」および「（化学物質の）組成物」は、本明細書において互換的に使用され、限定されないが、治療用薬剤（または潜在的治療用薬剤）、食品添加物および栄養補助食品が挙げられる。また、動物用治療剤または潜在的動物用治療剤であってもよい。
【０００８】
「有機小分子」は、該用語を本明細書で用いる場合、３キロダルトン未満、好ましくは１．５キロダルトン未満の分子量を有する有機化合物［または無機化合物（例えば、金属）と複合体形成された有機化合物］を示す。さらに、用語「合成有機分子」は、合成有機分子が人工的に作製されたもの、および天然にみられないものである以外は、特に記載のない限り、用語「有機小分子」と互換的に使用することがあり得る。
【０００９】
用語「処置」、「処置すること」などは、本明細書において、一般的に、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを意味するために用いる。該効果は、疾患またはその症状を完全に、もしくは一部妨げる点では予防的であり得る、および／または疾患および／または疾患に起因する有害効果を一部もしくは完全に治癒させる点では治療的であり得る。用語「処置」は、本明細書で用いる場合、哺乳動物、特にヒトの疾患の任意の処置を包含し、（ａ）疾患に対して素因を有しているかもしれないが未だ該疾患を有すると診断されていない対象において、該疾患が生じるのを妨げること；（ｂ）疾患を抑制すること、すなわち、その発症を停止させること；または（ｃ）疾患を軽減すること、すなわち、疾患の後退を引き起こすことが挙げられる。
【００１０】
さらに、用語「対象（被検体）」は、本明細書で用いる場合、アルツハイマー病などの神経系障害の治療、例えば、改善、処置および／または予防を必要とする動物に関する。最も好ましくは、前記対象はヒトである。
【００１１】
一般的な手法
本発明の実施に有用な一般的な手法のさらなる詳細については、実施担当者は、標準的な教科書ならびに細胞生物学および組織培養の概説を参照するとよい。本実施例で挙げた参考文献も参照のこと。分子細胞生化学における一般的な方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００１）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４版（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９９）；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｂｏｌｌａｇら、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９６）；Ｎｏｎ−ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｗａｇｎｅｒら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９９）；Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｋａｐｌｉｔｔ  ＆  Ｌｏｅｗｙ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ（Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９７）；およびＣｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄｏｙｌｅ  ＆  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９８）などの標準的な教科書をみるとよい。本開示において言及した遺伝子操作のための試薬、クローニングベクターおよびキットは、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈおよびＣｌｏｎＴｅｃｈなどの市販供給元から入手可能である。
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）によって、アルツハイマー病トランスジェニックモデルマウスにおいて脳実質および血管のアミロイド病態が改善され得、脳内および血清中のＡβレベルが低減され得、行動異常が逆転され得という驚くべき知見に関し、これは、ＥＰＯが、急性および慢性の神経系障害およびアミロイド形成性疾患、例えば限定されないが、アルツハイマー病、ダウン症候群、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、緑内障、ＨＩＶ関連認知症、多発性硬化症、パーキンソン病、神経因性疼痛、封入体筋炎、および特に、散発性および家族性形態の脳のアミロイド血管症（ＣＡＡ）などの予防および処置に有用であり得ることを示す。
【００１３】
エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、貧血の処置のための臨床的使用の他に、虚血および炎症性疾患によって引き起こされる脳の損傷を改善する。しかしながら、アルツハイマー病（ＡＤ）におけるＥＰＯの役割は未知である。本明細書の本実施例に開示するように、ＥＰＯは、全身性投与した場合、ＡＰＰトランスジェニックマウスにおいてＡＤ様病態を予防または逆転させ得る。特に、ＥＰＯがアルツハイマー病（ＡＤ）において保護的役割を有するかどうかを調べるため、ＡＤマウスモデルとして、若年齢でＡβ斑および脳のアミロイド血管症（ＣＡＡ）が現れた３ヶ月齢のａｒｃＡβマウスを、１８ＵＩまたは１．８ＵＩ（それぞれ、６０または６００ＵＩ／ｋｇに相当）の組換えヒトＥＰＯ（ｒＨｕＥＰＯ）で、腹腔内注射により５ヶ月間毎週処置した。
【００１４】
本実施例に示すように、脳内Ａβ斑の負過量は、ｒＨｕＥＰＯ処置ａｒｃＡβマウスにおいて４０％超有意に少なかった。また、これらのマウスが有するＡβ斑と関連しているＣＡＡおよび星状細胞増加の重症度は低かった。整合して、ＥＬＩＳＡでは、ＲＩＰＡ不溶性画分の脳内Ａβレベルならびに血清中のＡβ４０レベルの有意な低減が示された。さらに、完全長ＡＰＰに対するβ−切断のＣ末端断片の比は、ｒＨｕＥＰＯ処置マウスにおいて有意に低減され、ｒＨｕＥＰＯによるＡＰＰプロセッシングの非アミロイド形成性経路へのシフトを示唆する。ＣＡＡに加え、ａｒｃＡβマウスはまた、脳内の微小血管内皮細胞に、クラウジン−５の傍細胞分布の崩壊およびタンパク質レベルの低下を特徴とする接着結合障害を有した。ｒＨｕＥＰＯは、一部、正常なクラウジン−５分布を保持していた。さらに、ｒＨｕＥＰＯによるクラウジン−５に対するＡβ毒性の抑制が、マウス脳の微小血管から採取した内皮細胞株において確認された。総合すると、本試験は、ｒＨｕＥＰＯが脳内Ａβレベルを低下させ、微小血管の損傷の抑制したことを実証する。これは、ｒＨｕＥＰＯのＡＤの処置剤としての潜在的を示唆する。
【００１５】
さらに調べると、ｒＨｕＥＰＯ処置により、ＡＰＰトランスジェニックマウスモデルにおいて行動欠陥が改善され得る。また、本明細書において実施例６に開示するように、該処置によって赤血球生成の増大はもたらされず、ＥＰＯ処置関連有害事象は観察されなかった。総合すると、本試験は、Ａβ関連病態および行動異常の改善に対するｒＨｕＥＰＯの有益な役割を示唆する。
【００１６】
このような知見に基づき、本発明は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）経路を誘導することにより、対象の神経系障害を処置、改善および予防する方法を提供する。したがって、本発明は、神経系障害および／またはアミロイドーシス、特に、アルツハイマー病またはアミロイドβ（Ａβ）病態および／またはアミロイドーシスと関連している障害の処置、改善または予防のためのエリスロポエチン（ＥＰＯ）ならびにその活性断片および類縁体に関する。
【００１７】
エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、低酸素に応答して主に成体哺乳動物の腎臓で産生されるＩ型サイトカインである。組換えヒトＥＰＯ（ｒＨｕＥＰＯ）は、貧血患者の生活の質を改善するために広く使用されている。広範囲の非赤血球系細胞、例えば、星状細胞、ニューロンおよび脳の毛細血管内皮細胞は、豊富な量の機能性のＥＰＯ受容体（ＥｐｏＲ）を発現する（Ｙａｍａｊｉら、１９９６）。種々の脳の損傷に応答して星状細胞により産生されるＥＰＯは、罹患ニューロンの生存に非常に重要である（Ｃｈｏｎｇら、２００５；Ｎａｄａｍら、２００７）。数多くの研究により、ＥＰＯは、神経保護的であるとともに、神経発生、シナプスの可塑性および新血管形成の促進に有効であることが示されている（Ｂｕｅｍｉら、２００２；ＢｒｉｎｅｓおよびＣｅｒａｍｉ、２００５；Ｌｕら、２００５；Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ、２００６；Ｔｓａｉら、２００６）。また、系統的ｒＨｕＥＰＯは血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することができ（Ｂｒｉｎｅｓら、２０００）、脳卒中患者に充分耐容性である（Ｅｈｒｅｎｒｅｉｃｈら、２００２）。したがって、ｒＨｕＥＰＯは、中枢神経系（ＣＮＳ）の疾患のための潜在的薬物であり得る。しかしながら、アルツハイマー病（ＡＤ）におけるｒＨｕＥＰＯの役割は、これまで実証されていなかった。
【００１８】
もちろん、大成功している生物薬剤の１つであることに鑑み、ＥＰＯは、あらゆる種類の疾患または障害（例えば、アルツハイマー病に伴う神経系障害は最も顕著な一例である）のほぼ任意の処置における使用について特許請求されている。例えば、国際特許出願公開公報ＷＯ２００７／０６０２１３（その開示内容は、本発明の教示に従って有用であり得ることが考えられ得る本明細書に記載のＥＰＯポリペプチドに関する本出願書類の記載を補足する目的で、引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
【００１９】
神経系障害の処置について考慮されるとしても、ＥＰＯが、アルツハイマー病またはＡβ病態などの神経系障害または神経変性障害の原因となっている機構のいずれかに関与しているか、または改善できることは示されておらず、まして、実際にそのような障害の本質的な処置に有用であることは証明されていなかった。しかしながら、神経変性障害はかなり複雑であり、択一的および／または累積的な原因およびリスクファクターの結果であるため、提案されている神経系の薬物のどれが、好ましくはどのようにして病理学的経路を標的化するかを知ることは、非常に重要である。これは、特にアルツハイマー病およびアミロイド形成性障害の場合に該当する。
【００２０】
アルツハイマー病の状況において、これまで、ＥＰＯは日本特許出願ＪＰ５０９２９２８において、特に、頭蓋内中隔野内への直接注入によってアルツハイマー型記憶障害を処置するため、ニューロンの細胞内カルシウムレベルを上昇させ、コリンアセチルトランスフェラーゼ活性を増強することが示唆されていた。明らかに、これは、本発明の実施形態ではなく、添付の特許請求の範囲に含まれるとみなされるかもしれないＪＰ５０９２９２８に開示された実施形態はいずれも、本発明では特許請求しない。
【００２１】
また、ＥＰＯは、ほぼ常に、特許出願書類に挙げられる細胞増殖因子およびサイトカインのいわゆる洗い出しリストのうちで、医薬組成物に製剤化された場合の提案される治療上活性な薬剤に補足的なものである。例えば、国際特許出願公開公報ＷＯ２００５／０２８５１１およびＷＯ２００６／０３９４７０を参照のこと。添付の特許請求の範囲に含まれるかどうかが考慮される場合、これらの具体的な「併用調製物」は、本発明では特許請求しない。したがって、添付の実施例から明らかなように、ＥＰＯは、好ましくは、アルツハイマー病およびＡβ病態のそれぞれのための処置のための単独の治療用薬剤であり得る。
【００２２】
本発明によれば、アミロイドカスケード、すなわち、アミロイドβペプチド（Ａβ）の蓄積がＡＤにおいて中心的な役割を果たしており（ＨａｒｄｙおよびＳｅｌｋｏｅ、２００２）、結果として、シナプスおよびニューロンの減少、神経細線維のもつれの形成および脳の機能不全が引き起こされると考えられる。ＡＤ脳内には、２つの型のＡβ病態：灰白質内のＡβ沈着物である老人斑、ならびに脳および髄膜の血管内のＡβ沈着物である脳のアミロイド血管症（ＣＡＡ）が存在している。ＡＤの老人斑およびＣＡＡのアミロイド病態を模倣するトランスジェニックマウスを使用し（Ｋｎｏｂｌｏｃｈ、２００６）、本発明により、全身性投与されたｒＨｕＥＰＯによって、脳内Ａβレベルが低減され得、Ａβに関連する脳の微小血管の損傷が改善され得ることを初めて示すことができた。
【００２３】
したがって、本発明は、アルツハイマー病ならびにＡβ病態および脳の微小血管の損傷を伴う他の神経系障害のそれぞれの処置における治療的介入ための医薬組成物におけるＥＰＯを初めて提供するものである。
【００２４】
本発明の医薬組成物は、当該技術分野でよく知られた方法に従って製剤化され得る。例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ＰｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２０００）、ＩＳＢＮ  ０−６８３−３０６４７２を参照のこと。好適な医薬用担体の例は当該技術分野でよく知られており、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、エマルジョン（油／水エマルジョンなど）、種々の型の湿潤剤、滅菌溶液などが挙げられる。かかる担体を含む組成物は、よく知られた従来の方法によって製剤化され得る。このような医薬組成物は対象に、適当な用量で投与され得る。適当な組成物の投与は、種々の様式、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、経表面または皮内投与によって行なわれ得る。経鼻スプレー製剤などのエアロゾル製剤には、活性剤の精製された水溶液または他の溶液が、保存剤および等張剤とともに含まれる。かかる製剤は、好ましくは、鼻粘膜に適合性のｐＨおよび等張性状態に調整される。経直腸または経膣投与のための製剤は、適当な担体を用いた坐剤として提示され得る。
【００２５】
投薬レジメンは、担当医師および臨床因子によって決定される。医学分野でよく知られているように、任意の一患者に対する投薬量は、多くの要素、例えば、患者の体格、体表面積、年齢、投与する具体的な化合物、性別、投与の期間と経路、一般健康状態、および同時に投与されている他の薬物に依存する。典型的な用量は、例えば、０．００１〜１０００ｍｇの範囲（この範囲における発現または発現阻害では核酸の用量）であり得る。しかしながら、特に上述の要素を考慮し、この例示的な範囲より下または上の用量も想定される。一般的に、該医薬組成物の通常投与としてのレジメンは、１μｇ〜１０ｍｇ単位／日の範囲であるのがよい。また、該レジメンが連続注入である場合、それぞれ１μｇ〜１０ｍｇ単位／キログラム体重／分の範囲であるのがよい。進行は、定期的評価によってモニタリングされ得る。非経口投与のための調製物としては、滅菌された水性または非水性の液剤、懸濁剤、および乳剤が挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（オリーブ油など）、および注射用有機エステル（オレイン酸エチルなど）である。水性担体としては、水、アルコール性溶液／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液、例えば、生理食塩水および緩衝媒体が挙げられる。非経口用ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液、または固定油が挙げられる。静脈内用ビヒクルとしては、流動性の栄養補給物、電解質補給物（リンゲルデキストロース系のものなど）などが挙げられる。また、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤、および不活性ガスなどの保存料および他の添加剤を存在させてもよい。さらに、本発明の医薬組成物は、該医薬組成物の意図される用途に応じて、ドーパミン薬または精神薬理作用薬などのさらなる薬剤を含むものであってもよい。さらに、該医薬組成物はまた、例えば、本発明の医薬組成物が受動免疫のための抗Ａβ抗体を含む場合、ワクチンとして製剤化されたものであり得る。
【００２６】
また、他の薬剤の共投与または逐次投与が望ましいことがあり得る。治療上有効な用量または量は、症状または病状を改善するのに充分な活性成分の量をいう。かかる化合物の治療有効性および毒性は、標準的な製薬手順によって細胞培養物または実験動物において、例えば、ＥＤ５０（集団の５０％で治療上有効な用量）およびＬＤ５０（集団の５０％に対して致死性の用量）で判定され得る。治療効果と毒性効果の用量比は治療指数であり、これは、ＬＤ５０／ＥＤ５０比で表示され得る。
【００２７】
本発明による医薬組成物は、神経系障害および／またはアミロイドーシス、例えば限定されないが、アルツハイマー病、脳のアミロイド血管症（ＣＡＡ）、ダウン症候群、軽度の認知障害、オランダ型およびアイスランド型アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血、レヴィー小体型認知症、血管性認知症、進行性核上性麻痺、多系統萎縮症、大脳皮質基底核変性症、第１７染色体に連鎖し、パーキンソニズムを伴う前頭側頭型変性、前頭側頭型認知症、失語症、ベル麻痺、クロイツフェルト・ヤコブ病、癲癇、脳炎、ハンチントン病、神経筋障害、神経腫瘍、神経免疫疾患、神経耳科疾患、小児神経疾患、恐怖症睡眠障害、トゥレット症候群、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、封入体筋炎、多発性硬化症、ＨＩＶ関連認知症、ＨＩＶ関連神経障害、神経因性疼痛、片頭痛、緑内障、薬物中毒、薬物禁断症状、薬物依存性、鬱病、不安症、パーキンソン病、他の運動障害または一般的な中枢神経系（ＣＮＳ）の疾患の処置のために使用され得る。
【００２８】
重要なことに、本発明により得られたデータは、Ａβ病態発生におけるｒＨｕＥＰＯの直接的な関与を示唆する。本データは、持続的ｒＨｕＥＰＯ処置により、ＡＤマウスにおいて、Ａβ病態の初期段階で脳内Ａβ斑の負過量および血清Ａβレベルが低減されたことを示す。ＡＰＰプロセッシングにおけるｒＨｕＥＰＯの直接的な関与を除外するものではなく、理論に拘束されることを望まないが、ＥＰＯが全身性投与され、内皮細胞内のＥｐｏＲはＥＰＯに対してニューロンおよび星状細胞より１０倍高い親和性を有するため（ＢｒｉｎｅｓおよびＣｅｒａｍｉ、２００５）、本発明によれば、ＥＰＯがＡβクリアランスに直接関与しており、脳内でのＥＰＯの主な標的は毛細血管内皮細胞であったと考えられる。ｒＨｕＥＰＯで刺激されると、内皮細胞は、増殖し、マトリックスメタロプロテイナーゼ−２（ＭＭＰ−２）およびＭＭＰ−９を産生し、分泌する（Ｒｉｂａｔｔｉら、１９９９；Ｗａｎｇら、２００６ａ）。ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９は、Ａβ分解酵素であることが示唆されている（Ｒｏｈｅｒら、１９９４；Ｂａｃｋｓｔｒｏｍら、１９９６）。実際、ＭＭＰ−９の酵素活性はＡＤにおいて低いことが示されている（Ｂａｃｋｓｔｒｏｍら、１９９６；Ｔｈｉｒｕｍａｎｇａｌａｋｕｄｉら、２００６）。この概念は、ＭＭＰ−９により、インビボでＡβ原線維が分解され得たとともに、Ａβ斑が縮小され得たことを示す最近の研究によって裏付けられている（Ｙａｎら、２００６）。本発明により、ｒＨｕＥＰＯ処置マウスが有するＣＡＡの重症度は低いことを示すことができた。したがって、毛細血管内皮細胞におけるＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２の産生および活性の向上が、血管内のβ−アミロイド沈着物のレベルの低下に寄与し得ると推測することは妥当である。
【００２９】
星状細胞および小膠細胞は、ｒＨｕＥＰＯの考えられ得る別の標的である。例えば、星状細胞は、ＥＰＯとＥｐｏＲの両方を発現し、脳の毛細血管と密接に関連している（Ｂｒｉｎｅｓら、２００４）。正常な生理学的条件下では、脳の微小血管は、ＢＢＢの維持に重要な役割を果たしている星状細胞によって完全に覆われている（Ｗｉｌｌｉｓら、２００４ｂ）。他方において、活性化された星状細胞によって分泌される炎症促進性サイトカイン（ＩＬ−６および単球走化性タンパク質１など）は、ＢＢＢの破壊を引き起こすことがあり得る。本発明により、Ａβ負荷血管からの星状細胞の解離が、ａｒｃＡβマウスにおいて観察された。これは、星状細胞エンドフィートに対する直接的なＡβ毒性、またはＡβによって誘導されたＢＢＢの漏損のいずれかによって引き起こされたことであり得る。本実施例において行ない、記載した実験は、Ａβ蓄積によって引き起こされたＢＢＢの漏損は、少なくとも一部は、クラウジン−５の移動によるものであることを示唆する。これは、本明細書において、ｒＨｕＥＰＯによってクラウジン−５に対するＡβ毒性が妨げらることが示され得たように、ｒＨｕＥＰＯがある役割を果たしているかもしれない場合である。結果として、星状細胞と微小血管間との密接な接触がｒＨｕＥＰＯによって保持された。さらに、ｒＨｕＥＰＯは、星状細胞の増殖を促進し、Ａβによって誘導される炎症促進性サイトカインの分泌を抑制することが知られている（Ｖｉｌｌａら、２００３）。総合すると、本発明の知見は、Ａβによる損傷時の正常な微小血管機能の維持におけるｒＨｕＥＰＯの有益な役割を強く裏付ける。
【００３０】
したがって、本発明により、ＥＰＯは、微小血管、星状細胞およびニューロンからなる神経血管単位のモジュレーターとしての機能を果たし得ることが提案されるが、この理論に拘束されないものとする。したがって、適正に適用された場合、ＥＰＯは、ＡＤならびに他の神経系障害またはアミロイドーシスの潜在的治療アプローチとなり得る。
【００３１】
以下の実施例に示す結果と総合すると、ＥＰＯは、必ずしも外来的に供給される（例えば、該実施例に従って行なわれる全身投与によって）ものである必要はなく、記載の神経血管単位と関連している標的細胞、特に、内皮細胞および／または星状細胞あるいは他の細胞内で発現されるものであってもよいことが想定される。したがって、本発明による治療的使用の２つの択一的な実施形態において、ＥＰＯまたはその活性断片もしくは類縁体は、外来的に適用されるか、または標的細胞内で発現されるように設計されたものであり、好ましくは、前記標的細胞は脳内の毛細血管内皮細胞または星状細胞である。
【００３２】
エリスロポエチン、ならびにその活性断片および類縁体の多くの形態が、本発明の方法において有用であり得る。一実施形態において、前記ＥＰＯまたはその活性断片は、ヒトＥＰＯまたはその活性断片である。別の実施形態において、限定されないが、ペプチド、ペプチド模倣物、小分子または核酸ＥＰＯ類縁体であり得るＥＰＯ類縁体が使用され得る。さらなる実施形態において、本発明は、ＥＰＯ受容体に対して天然ヒトＥＰＯよりも少なくとも１０倍高い親和性を有するＥＰＯまたはその活性断片もしくは類縁体を用いて実施される。別の実施形態において、本発明は、オリゴマー（例えば、二量体）であるＥＰＯまたはその活性断片もしくは類縁体を用いて実施される。
【００３３】
またさらなる実施形態において、本発明は、天然ヒトＥＰＯの半減期より長い半減期を有するＥＰＯまたはその活性断片もしくは類縁体を用いて実施される。さらなる実施形態において、本発明は、天然ヒトＥＰＯと比べて過剰グリコシル化されたＥＰＯまたはその活性断片もしくは類縁体を用いて実施される。またさらなる実施形態において、本発明はダルベポエチンを用いて実施される。本発明の任意の実施形態において、例えば、ＥＰＯまたはその活性断片もしくは類縁体の半減期を延ばすため、さらに可溶性ＥＰＯ受容体を含めてもよい。
【００３４】
本明細書で用いる場合、用語「エリスロポエチン」は「ＥＰＯ」と同義であり、実質的に、天然に存在するヒトＥＰＯまたはそのホモログのアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。本発明において有用なＥＰＯとしては、ヒトおよび他の霊長類のＥＰＯ、哺乳動物のＥＰＯ（ウシ、ブタ、マウスおよびラットのホモログなど）ならびに他の脊椎動物のホモログ（ゼブラフィッシュのホモログなど）が挙げられる。したがって、用語ＥＰＯは、成熟ヒトＥＰＯ配列の種ホモログ、選択的スプライシングフォーム、アイソタイプおよびグリコシル化バリアントならびに前駆体を包含する。
【００３５】
別の記載がない限り、用語「ヒト組換えＥＰＯ」および「ｒＨｕＥＰＯ」のそれぞれ、ならびに「ＥＰＯ」は、その本発明による治療的使用の記載に関して本明細書において互換的に使用することがあり得る。
【００３６】
ＥＰＯおよびＥｐｏＲに関する一般的な情報は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔなどの公共のデータベースから検索することができる。例えば、ＥＰＯのアミノ酸配列については、プライマリーアクセッション番号Ｐ０１５８８およびセカンダリーアクセッション番号Ｑ２Ｍ２Ｌ６、Ｑ５４９Ｕ２、Ｑ９ＵＤＺ０、Ｑ９ＵＥＺ５およびＱ９ＵＨＡ０ならびにそこに挙げられた参考文献を参照のこと。ヒトＥＰＯ遺伝子のクローニングおよび組換え発現は、欧州特許出願ＥＰ０１４８６０５Ａ２に記載されている。
【００３７】
エリスロポエチン（ＥＰＯ）（エポエチンと同義）は、赤血球分化の調節および循環赤血球量の生理学的レベルの維持に関与している主要なホルモンである。最初に、ＥＰＯは、貧血の処置における使用について報告された。医薬等級のＥＰＯ調製物は、例えば、Ｅｐｏｇｅｎ（Ａｍｇｅｎ）、Ｅｐｏｇｉｎ（Ｃｈｕｇａｉ）、Ｅｐｏｍａｘ（Ｅｌａｎｅｘ）、Ｅｐｒｅｘ（Ｊａｎｓｓｅｎ−Ｃｉｌａｇ）、ＮｅｏＲｅｃｏｒｍｏｎまたはＲｅｃｏｒｍｏｎ（Ｒｏｃｈｅ）、およびＰｒｏｃｒｉｔ（Ｏｒｔｈｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）の名称で市販されている。これらの製剤は、ＥＰＯのグリコシル化パターンの差異によって識別される。Ｅｐｏｇｅｎ、Ｅｐｏｇｉｎ、ＥｐｒｅｘおよびＰｒｏｃｒｉｔは、一般的にエポエチンアルファとして知られており、ＮｅｏＲｅｃｏｒｍｏｎおよびＲｅｃｏｒｍｏｎはエポエチンベータとして、Ｅｐｏｍａｘはエポエチンオメガとして知られている。
【００３８】
また、エリスロポエチン受容体（ＥＰＯ−Ｒ、ＥｐｏＲ）も当業者によく知られている。例えば、ＥＰＯ−Ｒのアミノ酸配列については、プライマリーアクセッション番号Ｐ１９２３５ならびにセカンダリーアクセッション番号Ｑ１５４４３およびＱ２Ｍ２０５ならびにそこに挙げられた参考文献を参照のこと。ＥＰＯ−Ｒは、ＥＰＯに対する受容体であり、ＥＰＯ誘導性の赤芽球の増殖と分化を媒介する。ＥＰＯで刺激されると、ＥＰＯ−Ｒは二量体化し、ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ５シグナル伝達カスケードを惹起する。一部の細胞型では、ＥＰＯ−Ｒはまた、ＳＴＡＴ１とＳＴＡＴ３を活性化することがあり得、ＬＹＮチロシンキナーゼを活性化することもあり得る。
【００３９】
また、本発明に従って使用され得るＥＰＯ類縁体は、先行技術においても報告されている。例えば、Ｌｏｎｇら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３４（２００６）、６９７−７０４には、操作されたＥＰＯシステイン類縁体へのマレイミド−ＰＥＧの標的化結合による、インビトロ生理活性が保持された均一なモノペグ化ＥＰＯ類縁体の設計が記載されている。ＥＰＯ融合類縁体（ヒト血清アルブミン（ＥＰＯａ−ｈＳＡ）融合タンパク質およびヒトＩｇＧ（ＥＰＯ−ＩｇＧ）融合タンパク質など）ならびにその作製方法は、国際特許出願公開公報ＷＯ９９／６６０５４およびＷＯ２００５／０７９２３２のそれぞれにに記載されている。
【００４０】
また、過剰グリコシル化ＥＰＯ類縁体およびその作製方法は、例えば、国際特許出願公開公報ＷＯ００／２４８９３に記載されている。
【００４１】
さらに、アゴニストとして作用し、ＥＰＯ受容体の二量体化を行ない、したがってシグナル伝達開始を行なうＥＰＯ類縁体が報告されている。例えば、国際特許出願公開公報ＷＯ９６／４０７７２を参照のこと。エリスロポエチン受容体アゴニスト、バッファーおよび糖を含み、該バッファーおよび糖がエリスロポエチン受容体アゴニストを凝集に対して安定化させる粒子製剤が、国際特許出願公開公報ＷＯ２００６／０１７７７３に開示されている。これに記載されたＥｐｏＲアゴニストは、単独、またはこれに記載の製剤のいずれかで、本発明により使用され得る。
【００４２】
さらに、ＥＰＯから直接誘導されたものでないＥＰＯのＥＰＯ類縁体が報告されている。例えば、二量体ＥＰＯ受容体に結合せず、赤血球生成活性のないＥＰＯ類縁体（例えば、カルバミル化ＥＰＯ（ＣＥＰＯ））が入手可能である。例えば、Ｆｉｏｒｄａｌｉｓｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０２（２００５）、２０４６−２０５１およびそこに挙げられた参考文献を参照のこと。また、ＥＰＯ受容体は、Ｆ−ｇｐ５５（Ｆｒｉｅｎｄ脾フォーカス形成ウイルス糖タンパク質）の結合により活性化され、細胞増殖のシグナル伝達を行ない得る。例えば、Ｂａｒｂｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４（１９９４）、２２５７−２２６５を参照のこと。したがって、ＥＰＯ断片および類縁体はそれぞれ、通常、ＥｐｏＲに対して天然ＥＰＯと実質的に同じ活性を有する。
【００４３】
種々の種類のＥＰＯおよびＥｐｏＲ、活性断片およびその類縁体ならびに本発明の解釈上の用語「ＥＰＯ」に含まれる核酸に基づいたＥＰＯの適用の概要の詳細は、国際特許出願公開公報ＷＯ０３／１０３６０８の第２３頁、第１４行目〜第３４頁、第２６行目（その開示内容は、引用により本明細書に組み込まれる）に示されている。
【００４４】
しかしながら、特許請求の範囲および本明細書において、特定の神経系の病状、医学的使用、処置レジメン、用量および／または標的細胞から既に明らかでない場合、明確にする目的で、すべてではないがほとんどの実施形態において、本発明は、国際特許出願公開公報ＷＯ０３／１０３６０８（その開示は、本明細書において、特許請求の範囲に記載の発明の範囲から除外されることを明示する）に開示および教示されているような、刺激性障害の時点に近い時点またはその後にニューロン細胞内でインスリン様成長因子（ＩＧＦ）シグナル伝達経路を誘導し、それにより、ニューロン細胞内に相乗的急性神経保護効果をもたらすことによる急性神経保護を提供する方法を包含しないことを理解されたい。
【００４５】
したがって、本発明によれば、用語「ＥＰＯ」は、任意の種類のＥＰＯ、活性断片およびその類縁体のそれぞれ、特に、上記および本明細書の実施例に記載のようなＥＰＯについて初めて見い出された本質的に影響を受けていない生物学的活性、すなわち、
（ａ）皮質のＡβ斑の負過量の低減；
（ｂ）可溶性および不溶性脳内Ａβレベルの低下；
（ｃ）血清Ａβレベルの低下；
（ｄ）脳のアミロイド血管症（ＣＡＡ）の改善；
（ｅ）Ａβ斑関連星状細胞増加の低減；
（ｆ）アミロイド形成性ＡＰＰプロセッシングの抑制；
（ｇ）完全長クラウジン−５の正常な分布の実質的な維持または回復、および
（ｈ）異常行動の改善
の１つ以上を保持しているものを包含する。
【００４６】
このようなＥＰＯの新規な生物学的活性は、例えば、ａｒｃＡβマウス（Ｋｎｏｂｌｏｃｈら、“Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ａｂｅｔａ  ａｎｄ  ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  ｄｅｆｉｃｉｔｓ  ｐｒｅｃｅｄｅ  ｂｅｔａ−ａｍｙｌｏｉｄ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ａｒｃＡｂｅｔａ  ｍｉｃｅ”［出版前に電子公開］Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ａｇｉｎｇ  ２００６  Ｊｕｌ  ２８；Ｓ１５５８−１４９７）において、本実施例に記載のようにして本発明により試験され得る。他方において、本発明による有用なＥＰＯ類縁体は、本明細書に開示したような神経系障害の治療に必要とされないＥＰＯの効果（例えば、血栓形成の効果）がないものであってもよい。
【００４７】
上記および本実施例の論考に説明したように、本発明の基礎となる理論の１つは、
ＥＰＯのＡβ低減効果が、ＥＰＯによってモジュレートされる星状細胞と毛細血管内皮細胞の相乗的活性化によるものであるということである。したがって、本発明によるＥＰＯ類縁体はまた、星状細胞および／または毛細血管内皮細胞のモジュレーター、特に、アクチベーター／アゴニストであり得る。星状細胞および毛細血管内皮細胞のアクチベーターおよびアゴニストは、当該技術分野で知られており、さらに、常套的な方法によって同定され得る。例えば、米国特許第５，７２８，５３４号およびＳｅｌｍａｊら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４（１９９０）、１２９−１３５（その開示内容は、引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
【００４８】
本発明による重要な知見は、ａｒｃＡβマウスにおいて、ｒＨｕＥＰＯにより脳内Ａβレベルが有意に低減されたことであり、これは、脳内の斑負過量とＣＡＡの低減によってなされたものである。理論によって拘束されることを望むが、Ａβの低減は、ｒＨｕＥＰＯによって誘導されたＡＰＰの非アミロイド形成性プロセッシングによるものと考えられる。ａｒｃＡβマウスは、脳内のＳｗｅｄｉｓｈ型とＡｒｃｔｉｃ型の両方の変異の場合で、ヒトＡＰＰを発現する。これにより、脳内でのＢＡＣＥ１の高い活性のため、ＡＰＰは主に、α−切断ではなくβ−切断を受けることになる。この状況下において、β−ＣＴＦが少なくなることは、ＡＰＰのアミロイド形成性プロセッシングのための基質が少なくなり、最終的にＡβ生成物が少なくなることを意味する。実際、β−ＣＴＦの有意な減少が、ｒＨｕＥＰＯ処置マウスにおいて低減された。本実施例では、細胞培養実験で、ｓｗＡＰＰ２９３細胞をｒＨｕＥＰＯ処置すると、β−ＣＴＦに対するα−ＣＴＦの比および培養培地中の分泌ｓＡＰＰαのレベルが大きく増大することが示された。これは、ｒＨｕＥＰＯがβ−切断よりもα−切断に有利であることをさらに示唆する。ＡＰＰのβ−切断の線に従うと、ｒＨｕＥＰＯが、その抗低酸素機能によってＡＰＰプロセッシングに影響を及ぼすと推測することは妥当である。低灌流はＡＤの一般的な特徴であり、これは、脳への酸素とエネルギーの供給が不充分となる原因である（Ｉａｄｅｃｏｌａ、２００４）。低酸素は、低酸素誘導因子（ＨＩＦ−１）（例えば、ＢＡＣＥ１（これは、ＡＰＰトランスジェニックマウスにおいてアミロイド形成に役割を果たしている））によって、多くの遺伝子の発現を調節する（Ｓｕｎら、２００６）。したがって、理論に拘束されないが、本発明によれば、Ａβ蓄積によって引き起こされた脳の血管構造の損傷が低灌流と低酸素をもたらし、これがさらに、ＢＡＣＥ１生成とアミロイド形成を誘導するという悪循環が存在すると考えられる。ＥＰＯは、虚血によって損傷された脳の局所血流を改善し（Ｌｉら、２００７）、新血管形成を促進し（Ｊａｑｕｅｔら、２００２）、それにより、酸素とエネルギーの供給の障害が改善される。低酸素状態を改善することにより、ｒＨｕＥＰＯが低酸素誘導性ＢＡＣＥ１に対して負の調節を行なう可能性があり、それによりＡβ生成が低減される可能性がある。また、ｒＨｕＥＰＯ処置マウスにおける血清Ａβレベルの低下によっても、Ａβ生成の調節におけるｒＨｕＥＰＯの役割が間接的に示唆された。
【００４９】
したがって、特定の一実施形態において、本発明は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のアミロイド形成性プロセッシングを抑制するため、したがって関連障害の処置のためのＥＰＯに関する。
【００５０】
本明細書の実施例に開示するように、ＥＰＯまたはその活性断片もしくは類縁体は、例えば、腹腔内注射によって簡便に全身投与され得る。しかしながら、上記のものなどの他の投与経路も使用され得る。脳の損傷に対する報告した有益な効果にもかかわらず、ｒＨｕＥＰＯの有害効果の可能性は無視されるべきでない。
【００５１】
過剰な赤血球生成は、学習障害を引き起こし（Ｒｉｆｋｉｎｄら、１９９９）、寿命を短くする（Ｏｇｕｎｓｈｏｌａら、２００６）。ｒＨｕＥＰＯに応答した赤血球の生成は、用量および投与頻度に依存性であることがわかっている。マウスにおいて、５０００ＵＩ／ｋｇのｒＨｕＥＰＯを毎週ｉｐ注射すると、ヘマトクリットは有意に上昇しなかったが、１２５ＵＩ／ｋｇのｒＨｕＥＰＯを週３回で５週間にわたってｉｐ注射すると、ヘマトクリットの中程度の上昇がわずかに得られた（Ｅｇｒｉｅら、２００３）。したがって、このような有害効果を回避するためには、適正な投与が非常に重要である。本発明により、６００ＵＩ／ｋｇまたは６０ＵＩ／ｋｇのｒＨｕＥＰＯを毎週受けたａｒｃＡβマウスは、野生型対照と類似したヘマトクリットを有するが、生理食塩水処置ａｒｃＡβマウスよりもわずかに高いヘモグロビンレベルを有することがわかった。したがって、マウスにおいて、ｒＨｕＥＰＯは、過剰な赤血球生成を誘導することなく、Ａβ病態および微小血管の不完全性を改善することを示すことができた。マウスからヒトへの相対拡大縮小法では、多くの場合、１０倍単位で拡大縮小されるため、ヒトにおける有効用量は、マウスで決定された有効用量よりも少ないであろうと推測することは妥当である。
【００５２】
したがって、例えば、アルツハイマー病の処置におけるＥＰＯまたはその活性断片もしくは類縁体の治療的使用の具体的な利点の１つは、処置対象のヘモグロビンレベルおよびヘマトクリットが有意に上昇しないか、または対象に対する治療効果と比べて少なくとも許容範囲の程度にすぎない治療有効用量で投与され得ることである。したがって、本発明は、好ましくは、最大１０００Ｕ／ｋｇの用量のＥＰＯまたはその活性断片もしくは類縁体を投与することにより実施され得る。特定の実施形態において、本発明は、最大７５０Ｕ／ｋｇ、５００Ｕ／ｋｇ、２５０Ｕ／ｋｇ、１００Ｕ／ｋｇ、９０Ｕ／ｋｇ、８０Ｕ／ｋｇ、７０Ｕ／ｋｇ、６０Ｕ／ｋｇ、５０Ｕ／ｋｇ、４０Ｕ／ｋｇ、３０Ｕ／ｋｇ、２０Ｕ／ｋｇ、１０Ｕ／ｋｇ、５Ｕ／ｋｇ、２．５Ｕ／ｋｇまたは１Ｕ／ｋｇの用量のＥＰＯまたはその活性断片もしくは類縁体を投与することにより実施される。上記および本実施例において説明するように、単回投薬単位および投与レジメンのそれぞれとは無関係に、ＥＰＯまたはその活性断片もしくは類縁体は、以前に観察され、かつ最大１０００ＵＩ／ｋｇと計算された用量よりも少ない治療用量で、または特に、ＥＰＯまたはその活性断片もしくは類縁体を含む医薬組成物が毎週投与される場合（これは、本発明による好ましい投与レジメンの１例である）は、マウスからヒトへの換算係数を考慮して、最大１００ＵＩ／ｋｇ、好ましくは最大６０ＵＩ／ｋｇ、最も好ましくは最大１０ＵＩ／ｋｇの治療用量で投与され得る。したがって、本発明の一実施形態において、ＥＰＯまたはその活性断片もしくは類縁体を含む医薬組成物は、上記のように最大１０００ＵＩ／ｋｇ、好ましくは最大５００ＵＩ／ｋｇ、より好ましくは最大１００ＵＩ／ｋｇ、最も好ましくは最大５０ＵＩ／ｋｇまたはそれ以下の用量で、週１回基準で、単回処置または連続処置のいずれかで投与されるように設計されたものである。
【００５３】
上記において説明し、本実施例で実証するように、対象のＡβ病態を抑制または低減させる本発明の方法は、一部において、ＥＰＯは、他の疾患の処置に関して以前に観察された用量より少ない用量で、この目的に治療上活性であることが予測され得る知見というに基づく。したがって、本発明は、対象に、上記に規定のＥＰＯまたはその活性断片もしくは類縁体を、好ましくは最大１０００ＵＩ／ｋｇ（すなわち、これより少なくてもよい）の用量で投与し、それにより、神経系障害またはアミロイドーシスの重症度を抑制または低減させることを含む、対象の神経系障害の処置、改善または予防のための方法に関する。しかしながら、上記のように、副作用（例えば、赤血球新生）が無視され得る状態で治療効果を得るために必要な場合、または医学的に正当であり得る場合は、より高用量、すなわち、１２５０、１５００、２０００ＵＩ／ｋｇまたはさらにそれ以上の用量も、適用されることがあり得る。
【００５４】
さらに、本発明の基礎となっている非拘束的理論の１つによれば、アルツハイマー病の処置におけるＥＰＯの有用な治療効果は、特に、ＥＰＯが脳実質および血管のアミロイドーシスならびに脳内および血清中のＡβレベルを低減できる能力に関連して、星状細胞および／または毛細血管内皮細胞の活性化によるものである。したがって、一実施形態において、ＥＰＯの治療的使用は、星状細胞および毛細血管内皮細胞のそれぞれ、または両方をＥＰＯまたはその活性断片もしくは類縁体と接触させ、それにより、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）特に、ＭＭＰ−２および／またはＭＭＰ−９の産生および活性のそれぞれを誘導または向上させることを含む。
【００５５】
特定の一態様において、本発明は、対象に、ＥＰＯまたはその活性断片もしくは類縁体を上記規定の治療有効量で投与し、それにより、脳内Ａβ斑の負過量または脳内および血清中のＡβレベルのそれぞれを抑制または低減させることにより、対象の神経系障害またはアミロイドーシスを改善または処置する方法を提供する。特定の好ましい実施形態において、ＥＰＯまたはその活性断片もしくは類縁体の治療的使用は、脳のアミロイド血管症（ＣＡＡ）の処置をもたらすＡβの血管内沈着の選択的低減を特徴とする。
【００５６】
アルツハイマー病およびアミロイドーシスのそれぞれを処置するための本発明の治療アプローチは、ＡＰＰプロセッシングおよびＡβの直接的な標的化に依存しないため、Ａβ関連介入（先行技術において報告されているものなど）に一般的に使用されている薬物に加えて、または該薬物と組合せてＥＰＯおよびＥＰＯ様薬剤が使用される場合、好都合な相乗的でさえある効果が期待され得る。好ましくは、追加の薬物は、抗Ａβ抗体またはそれと等価な結合分子である。抗Ａβ抗体および他のＡβ結合分子は、先行技術においてよく知られている。好ましいヒト抗Ａβ抗体およびそれと等価な結合分子は、本出願人の同時係属中の国際特許出願、出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００００５３「疾患特異的結合分子および標的を提供する方法（“Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ  ｄｉｓｅａｓｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ａｎｄ  ｔａｒｇｅｔｓ”）、２００８年１月７日出願（代理人整理番号：ＮＥ３０Ａ０６／Ｐ−ＷＯ）（その開示内容は、引用により本明細書に組み込まれる）に開示されている。もちろん、神経系障害、特に、アルツハイマー病の処置に有用であると考えられる他の薬物もＥＰＯおよびＥＰＯ様分子と組み合せて使用され得る（例えば、Ｋｌａｆｋｉら、Ｂｒａｉｎ  １２９（２００６）、２８４０−２８５５（２００６年１０月３日電子公開）；Ｍｅｌｉｎｋｏｖａ、Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｆｏｒ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．６（２００７）、３４１−３４２；Ｐｉｐｅｌｉｎｅ  ａｎｄ  Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  Ｉｎｓｉｇｈｔ：Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｂｅｔａ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｈｏｒｉｚｏｎ；Ａ  Ｄａｔａｍｏｎｉｔｏｒ  Ｒｅｐｏｒｔ、出版：１１月５日；製品コード：ＤＭＨＣ２１２に記載のもの）。
【００５７】
したがって、一実施形態において、本発明は、本明細書において上記のＥＰＯまたはＥＰＯ様分子と、Ａβ特異的薬物、好ましくは抗Ａβ抗体とを含む併用薬物調製物に関する。当然、該併用薬物調製物は、特に、上記において記載の障害、特に、アルツハイマー病およびアミロイドーシスの処置に有用である。
【００５８】
さらなる実施形態において、本発明の治療的使用および方法は、本明細書において上記のＥＰＯまたはＥＰＯ様分子を含む医薬組成物を、Ａβ特異的薬物、好ましくは抗Ａβ抗体または同等の結合分子を含む医薬組成物と併せて投与することを含む。２種類以上の医薬組成物の投与は、任意の様式で同時または逐次であり得る。
【００５９】
本実施例において実証するように、ｒＨｕＥＰＯによって、脳の微小血管の完全性が改善された。微小血管構造の損傷は、ＢＢＢの破壊を引き起こす。内皮細胞間に形成される接着結合により、傍細胞透過性が低く、電気抵抗が高いというＢＢＢの性質が規定される。接着結合は、３種類の主要なタンパク質群、オクルディン、結合性接着分子−１およびクラウジンファミリーで構成されており、そのうちクラウジン−５は、主として脳の微小血管内において発現される。クラウジン−５は、炎症性変化（Ｇｕｒｎｅｙら、２００６）および低酸素（Ｋｏｔｏら、２００７）によって負に調節される。プロテインキナーゼＡによるクラウジン−５のリン酸化は、血液脳関門の機能に非常に重要であると考えられている（Ｓｏｍａら、２００４）。マウスでは、血管構造は、Ａβ斑と密接に関連しているだけでなく（Ｋｕｍａｒ−Ｓｉｎｇｈら、２００５）、Ａβによる損傷を特に受けやすい（Ｐａｒｋら、２００４）。Ａβ４２原線維は、脳の内皮細胞において原形質膜から細胞質へのクラウジン−５の移動を誘導する（ＭａｒｃｏおよびＳｋａｐｅｒ、２００６）。本発明により、さらに、１０μＭの新鮮調製Ａβ４２が、ｂＥｎｄ５細胞において細胞膜から細胞質へのクラウジン−５の移動を既に誘導していたことが実証された。また、Ａβ４２処理細胞におけるウエスタンブロットにおいて、６〜１６ｋＤａのサイズを有する４種類のＣ末端断片が観察された（図７Ｂ）。相当な量のＣ末端断片が見られたことにより、クラウジン−５の異常に高い代謝回転、およびＡβ４２によって誘導された接着結合の不安定化が示された。実際、フルオレセインナトリウム塩（３７６Ｄａ）のＢＢＢ透過性は、検出可能な微小出血のないａｒｃＡβマウスにおいて劇的に増大した。本データならびに他のデータ（Ｗｉｌｌｉｓら、２００４ａ）は、微小血管構造の損傷およびＢＢＢの漏損の早期マーカーとしてのクラウジン−５を示唆する。ＡＤにおける脳の微小血管構造の損傷は非常によく見られ、ＡＤ患者の８０〜９０％はＣＡＡを有する。したがって、ＡＤにおけるクラウジン−５の重要な役割を期待することは妥当であり、血管構造の病変が該疾患の強力な因子であるという仮説を強く裏付ける。
【００６０】
より重要なことには、本発明により、ｒＨｕＥＰＯが、インビトロおよびインビボの両方で、クラウジン−５に対するＡβ毒性を改善し、したがってヒト脳の微小血管内皮細胞において保護的効果を有すると思われることを実証することができた。したがって、クラウジン−５の正常な分布がｒＨｕＥＰＯによって一部回復された。ｒＨｕＥＰＯによるクラウジン−５に対するＡβ毒性の抑制は、マウス脳の微小血管内皮細胞株において、さらに確認された。理論に拘束されることを意図しないが、本発明の知見により、ＥＰＯが、クラウジン媒介性細胞接着の破壊による微小血管の不完全性を改善するために使用され得ると予測することは妥当である。したがって、本発明はまた、クラウジン媒介性細胞接着の状態、特に、神経系障害と関連している病状の処置、改善または予防のための、エリスロポエチン（ＥＰＯ）またはその活性断片もしくは類縁体を含む医薬組成物に関する。したがって、本発明はまた、ＥＰＯを投与することを含む、接着結合形成活性または上皮もしくは内皮のバリア機能活性の増大を、それを必要とする対象において行なうための方法を包含する。一部の実施形態において、ＥＰＯは、血液脳関門透過性を増大させるために使用され得、したがって、脳内で効果を発揮させることが意図される他の薬物とともに投与され得る。
【００６１】
なおさらなる態様において、本発明は、体液試料中のクラウジン−５またはそのバリアントのレベルを測定することを含み、ここで、健常対象由来の試料の参照値と比べたときのクラウジン−５レベルの減少および／またはその約１６ｋＤａのバリアントのレベルの増加は、前記個体がアルツハイマー病に罹患しているか、または罹患するリスクがあることを示す、インビトロでアルツハイマー病を評価するための方法に関する。本実施例において実証し、図８にも示されるように、ＡＤ認知症患者では、完全長形態のクラウジン−５が存在しなかったが、少量の１６ｋＤａのバンドが主要形態として検出された。認知症患者と健常対照での完全長クラウジン−５のレベルおよび低分子量形態の出現の違いは、クラウジン−５およびその１６ｋＤａのバリアントが、アルツハイマー病における脳血管構造の損傷の主要なマーカーであることを示す。
【００６２】
したがって、本発明は、さらに、体液試料中のクラウジン−５またはそのバリアントのレベルを測定することを含み、ここで、クラウジン−５または前記そのバリアントのレベルの以前の測定値と比較して、クラウジン−５レベルの減少および／またはその約１６ｋＤａのバリアントのレベルの増加は、アルツハイマー病の進行を示す、アルツハイマー病の進行をモニタリングするためのインビトロ方法に関する。体液は脳脊髄液または血液であり得る。
【００６３】
体液試料中の１種類以上のタンパク質またはそのコードする核酸のレベルを測定するための一般的な手段および方法は、当業者によく知られている。例えば、本明細書および本実施例に挙げた一般的な教科書およびマニュアルを参照のこと。例えば、国際特許出願公開公報ＷＯ２００７／１４０９７１には、体液試料中のミエリン関連糖タンパク質前駆体（ＭＡＧ）、コンタクチン関連タンパク質１前駆体、ミエリン乏突起膠細胞糖タンパク質前駆体１（ＭＯＧ）などのレベルを測定することを含み、ここで、前記タンパク質の１種類のレベルの変化は、前記個体がアルツハイマー病に罹患していることを示す、アルツハイマー病をインビトロで評価するための方法が記載されている。このような方法は、クラウジン−５またはそのバリアントのレベルを測定するために、本発明に従って適用および適合され得、その目的のため、国際特許出願公開公報ＷＯ２００７／１４０９７１の開示内容は、引用により本明細書に組み込まれる。
【００６４】
また、本発明は、クラウジン−５またはそのバリアントを測定するための手段または薬剤、例えば、上記の方法における使用のための抗体または核酸プローブなど（付随の本実施例も参照のこと）を備えたキットに関する。キットは、さらに、個体がアルツハイマー病に罹患するリスクの判定に関するいずれかの測定値の結果を解釈するためのユーザーズマニュアルを備えていてもよい。
【００６５】
したがって、本発明は、実質的に、先に本明細書において特に以下の実施例に関して前述した医薬組成物、方法、使用およびキットに関する。
【００６６】
これらおよび他の実施形態は、本発明の説明および実施例に開示および包含される。本発明に従って使用される、材料、方法、使用および化合物のいずれかに関するさらなる文献は、公共の図書館およびデータベースから、例えば、電子デバイスを用いて検索され得る。例えば、米国立衛生研究所の米国立バイオテクノロジー情報センターおよび／または米国立医学図書館が提供している公共のデータベース「Ｍｅｄｌｉｎｅ」が利用され得る。さらなるデータベースおよびウェブアドレス（欧州分子生物学研究所（ＥＭＢＬ）の一部門である欧州バイオインフォマティクス研究所（ＥＢＩ）のものなど）は、当業者にわかり、インターネット検索エンジンを用いて入手することもできる。バイオテクノロジーにおける特許情報、ならびに遡り検索およびカレント・アウェアネスに有用な特許情報の関連情報源の調査の総覧は、Ｂｅｒｋｓ、ＴＩＢＴＥＣＨ１２（１９９４）、３５２−３６４に示されている。
【００６７】
上記の開示は、本発明を一般的に記載したものである。本明細書の本文中で、いくつかの文献を挙げている。充分な書誌的記載は、特許請求の範囲の直前の本明細書の最後を見るとよい。引用したすべての参考文献（本明細書中に挙げた参考文献、発行済特許、公開特許出願および製造業者の仕様書、使用説明書などを含む）の内容は、引用により明示的に本明細書に組み込まれる。しかしながら、引用した文献はいずれも、実際は本発明の先行技術であると是認するものではない。以下の具体的な実施例を参照することによって、より完全な理解を得ることができよう。この実施例は、本明細書において例示の目的のためだけに提供し、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【００６８】
本発明の実施には、特に記載のない限り、当該技術分野の範囲内である細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の常法が使用される。
【００６９】
分子遺伝学および遺伝子操作における方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌの現行版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ  ａｎｄ  Ａｌａｎ，Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（ＭｉｌｌｅｒおよびＣａｌｏｓ編）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３版（Ａｕｓｕｂｅｌら編）；ならびにＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ（Ｗｕ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）。Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（ＭｉｌｌｅｒおよびＣａｌｏｓ編、１９８７、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１５４巻および第１５５巻（Ｗｕら編）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第Ｉ〜ＩＶ巻（ＷｅｉｒおよびＢｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６）に一般的に記載されている。この開示において言及した遺伝子操作のための試薬、クローニングベクターおよびキットは、市販の供給元（ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、およびＣｌｏｎｔｅｃｈなど）から入手可能である。細胞培養および培地の回収における一般的な手法は、Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｈｕら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８（１９９７）、１４８）；Ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  Ｍｅｄｉａ（Ｋｉｔａｎｏ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７（１９９１）、７３）；Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２（１９９１）、３７５）；およ���Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｂｉｒｃｈら、Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９（１９９０）、２５１）；Ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｃＤＮＡ  ａｒｒａｙｓ、Ｈｅｒｚｅｌら、ＣＨＡＯＳ  １１（２００１）、９８−１０７に概説されている。
【００７０】
補足的方法
トランスジェニックマウス
マウスＰｒｐプロモーターの制御下でＳｗｅｄｉｓｈ型（Ｋ６７０Ｎ−Ｍ６７１Ｌ）およびＡｒｃｔｉｃ型（Ｅ６９３Ｇ）変異を有するヒトＡＰＰ６９５を発現するａｒｃＡβマウスを、Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２の混合型背景において交配した。遺伝子型を、尾部のゲノムＤＮＡのＰＣＲによって判定した。マウスを２２℃で１２時間の明／暗サイクルで維持した。飼料ペレットおよび水は随意に摂取させた。この動物試験は当該地域の動物試験委員会によって承認されたものである。
【００７１】
ＥＰＯ処置
３ヶ月齢のａｒｃＡβマウスに、ｒＨｕＥＰＯ（Ｅｐｒｅｘ、Ｊａｎｓｓｅｎ−Ｃｉｌａｇ  ＡＧ、Ｂａａｒ、Ｓｗｉｚｔｅｒｌａｎｄ）を、１．８ＵＩ／マウス（ＥｐｏＬ、ｎ＝１１）もしくは１８ＵＩ／マウス（ＥｐｏＨ、ｎ＝１２）の用量で、または生理食塩水（ｔｇ  ｃｔｒ、ｎ＝１０）を毎週腹腔内（ｉｐ）注射した。また、野生型マウスの群も生理食塩水で処置した（ｗｔ、ｎ＝１３）。すべての群は年齢が適合しており、性別のバランスもとれていた。処置を終了した１週間後にマウスを屠殺した。
【００７２】
Ｙ字形迷路行動試験
処置の３ヶ月後、マウスを、Ｙ字形迷路行動パラダイム（Ｗｏｌｆｅｒら、２００４；Ｋｎｏｂｌｏｃｈら、２００６）において試験した。試験前の２週間、動物を、逆１２時間明／暗サイクルに置いた。試験期間中、検査担当者は処置に対して盲検的とした。マウスの一般健康状態は、ミニ神経系検査によって評価した（Ｋｎｏｂｌｏｃｈら、２００６）。
【００７３】
組織の調製
マウスを、深度麻酔下で（１．２５％ケタミンおよび０．２５％キシラジン、１０μｌ／ｇ体重）、１０ｍｌの５０ｍＭ  ＴｒｉｓＣｌ（ｐＨ７．４）および６ｍＭ  ＥＧＴＡを経心的に灌流した。血液を採取し、室温で４０分間凝固させた。次いで、血清を採取し、２，０００ｇ、４℃で１０分間の遠心分離後、−８０℃で保存した。脳を取り出し、左半球をドライアイス上でスナップ凍結させ、右半球は、４％パラホルムアルデヒド含有ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、４℃で２４時間浸漬固定した。次いで、固定した脳をパラフィン中に包埋した。ミクロトームで５μｍ厚の矢状面の連続切片を作製した。
【００７４】
Ａβ斑の定量
小さなＡβ斑が、標準的なチオフラビン−Ｓ染色によって測定され、ＬＡＴ０ｍｍ〜ＬＡＴ−１ｍｍの脳領域を均一に含む５つの連続切片において計数した。
【００７５】
ヘマトクリットの測定
午前１０時〜１１時に採取した尾部血液の赤血球ヘマトクリットを、遠心分離後にマイクロキャピラリーを用いて測定し、充填赤血球量に対する容積割合で定量した。尾部血液のヘモグロビンは、キュベットヘモグロビンキット（ＨｅｍｏＣｕｅ  ＡＢ，Ｂａｕｍａｎｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＡＧ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて測定した。
【００７６】
組織化学的検査
ペルオキシダーゼ／ＤＡＢ染色のための二次抗体はＶｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）製、免疫蛍光染色のための二次抗体はＪａｃｋｓｏｎ（Ｍｉｌａｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃ，Ｆｒｉｂｏｕｒｇ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）製のものであった。マウスモノクローナル抗体６Ｅ１０（Ｓｉｇｎｅｔ，Ｄｅｄｈａｍ，ＵＳＡ）１：４００；ＣＤ３１に対するラットモノクローナル抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）１：１００；ＧＦＡＰに対するウサギポリクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）１：４００およびクラウジン−５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂａｓｅｌ）１：１００を、免疫組織化学検査に使用した。第二鉄は、Ｐｅｒｌｓ染色により、標準的なプロトコルに従って検出した。
【００７７】
免疫組織化学的染検査
免疫組織化学的染色に使用した一次抗体および希釈液は、マウスモノクローナル抗体６Ｅ１０（Ｓｉｇｎｅｔ，Ｄｅｄｈａｍ，ＵＳＡ）１：４００；Ｃ末端アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）に対するウサギポリクローナル抗体１：５００、および抗ＧＦＡＰ  １：４００（Ｓｉｇｍａ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）であった。ペルオキシダーゼ／ＤＡＢ染色に使用した二次抗体は、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）製のものであり、免疫蛍光染色に使用した二次抗体は、Ｊａｃｋｓｏｎ（Ｍｉｌａｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃ，Ｆｒｉｂｏｕｒｇ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）製のものであった。
【００７８】
タンパク質抽出物およびウエスタンブロッティング
各左半球を、ガラス製テフロン（登録商標）加工ホモジナイザーを使用し、１５容量のＲＩＰＡバッファー（０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＮａ３ＶＯ４、１ｍＭのＮａＦ、１×プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｓｉｇｍａ）および１ｍＭのＡＥＢＳＦ）中でホモジナイズした。１００，０００ｇで４℃にて４０分間の遠心分離後、上清みをＲＩＰＡ画分として回収した。ペレットを０．７ｍｌのＲＩＰＡバッファー中に懸濁させ、１００，０００ｇで４℃にて３０分間の遠心分離後に再度回収した。次いで、ペレットを、０．５ｍｌのＲＩＰＡ、２ｍＭのＥＤＴＡおよび２％のＳＤＳ中に懸濁させた。１００，０００ｇで８℃にて４０分間の遠心分離後、上清みをＳＤＳ画分として回収した。次いで、ペレットを７５μｌの７０％ギ酸に再溶解させた。この懸濁剤を１．５ｍｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓで中和させ（ｐＨ１１）、２０，０００ｇ、４℃で３０分間遠心分離した。次いで、上清みをＦＡ画分として回収した。各画分の抽出物を１０〜２０％トリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース膜上にブロットさせ、ＰＢＳ中で５分間煮沸した。一次抗体には、６Ｅ１０（１：３００）、ＣＤ３１（１：５０）、クラウジン−５に対するウサギポリクローナル抗体（１：１００）、Ｃ末端ＡＰＰ（Ｓｉｇｍａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，１：２，０００）およびＰＫＡα  ｃａｔ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，１：１００）、β−アクチンに対するマウスモノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ，１：３，０００）およびＧＡＰＤＨ（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ，Ｆｒｉｂｏｕｒｇ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，１：３０００）を含めた。標的タンパク質を、ペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体およびＥＣＬ反応（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｏｔｅｌｆｉｎｇｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によって可視化した。
【００７９】
ＥＬＩＳＡ
ｈＡｍｙｌｏｉｄ  β４０  ＥＬＩＳＡキット（Ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）をＡβ４０のレベルの定量に、およびＩＮＮＯＴＥＳＴ（登録商標）（Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｈｅｉｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）をＡβ４２のレベルの定量に使用した。脳抽出物および血清は、以前の滴定試験に従って希釈した。
【００８０】
微小血管の取り出し
脳の微小血管は、確立された方法（Ｂａｎｋｓ、１９９９）に基づいて（わずかに修正した）単離した。簡単には、小脳を除いた脳から、氷冷ＨＢＳＳ中で目に見える血管と髄膜を除き、次いで、１％のデキストランを含有する５ｍｌの氷冷ＤＭＥＭ：Ｆ−１２（ＧＩＢＣＯ、３２５００−０３５，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中で、外科用メスを用いてほぼ１ｍｍ３に細分した。次いで、細かく切断した組織を氷冷ＤＭＥＭ−Ｆ−１２中で、７ｍｌ容Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザー（大型旋回内筒で３０回の後、小型旋回内筒で２５回）にてホモジナイズした。得られたホモジネートを、２００ｇ、４℃で５分間遠心分離した。ペレットを１５ｍｌの２０％デキストラン−ＤＭＥＭ−Ｆ１２中に再懸濁させ、４，５００ｇ、４℃で１５分間遠心分離した。ペレットを、１％デキストランＤＭＥＭ−Ｆ−１２中に再懸濁させ、４０μｍメッシュ膜に通した。この膜を２５ｍｌのＨＢＳＳで洗浄した後、１０００ｇ、４℃で５分間遠心分離することにより、微小血管を回収した。次いで、微小血管を４％ＰＦＡ中に室温で１０分間固定し、使用まで４℃で、０．０５％のＮａＮ３を含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に保存した。
【００８１】
細胞の培養と処理
マウス内皮細胞株であるｂＥｎｄ３細胞およびｂＥｎｄ５細胞は、ポリオーマウイルス中型Ｔ−抗原を用いてマウス脳の微小血管から確立され、不死化させた脳内皮細胞株であり、欧州動物細胞培養収集機関（ＥＣＡＣＣ）または米国組織培養収集機関（ＡＴＣＣ）などの商業用細胞バンクから入手できる。Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｃｅｌｌ  ５７（１９８９）、１０５３±１０６３も参照のこと。これらの細胞をペトリ皿において、１０％ＦＣＳ（熱不活化したもの）、４ｍＭのＬ−グルタミン、１×ＭＥＭ非必須アミノ酸、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび５０μＭのβメルカプトエタノールを含有するＤＭＥＭ（４．５ｇ／Ｌのグルコース）中、５×１０４／ｃｍ２の密度で３７℃および５％ＣＯ２にて２週間（週２回の培地交換を伴う）培養した。次いで、ペトリ皿上の細胞を、１０μＭの新鮮調製合成Ａβ４２（Ｂａｃｈｅｍ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）または１ＵＩ／ｍｌのｒＨｕＥＰＯまたは両方で、ＰＢＳ中にて２４時間処理した。対照培養物は等容量のＰＢＳで処理した。次いで、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ドライアイス上で即座に凍結させた。次いで、細胞を氷上２００μｌのＲＩＰＡ中で剥がし取った。細胞懸濁液を回収し、３０秒間超音波処理した後、１４，０００ｒｐｍ、４℃で３０分間の遠心分離に供した。上清みを回収し、使用まで、アリコートに分けて−８０℃で保存した。免疫細胞化学試験のため、細胞を多チャンバ培養スライドにて培養した。
【００８２】
ＳｗｅＡＰＰ２９３細胞、すなわち、Ｓｗｅｄｉｓｈ型の二重変異を有するβアミロイド前駆体タンパク質を発現するＨＥＫ２９３細胞（例えば、Ｓｗｅｄｉｓｈ型の変異型ＡＰＰ６９５安定ＨＥＫ細胞株である２０Ｅ２細胞株（Ｑｉｎｇら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１８（２００４）、１５７１−１５７３）を参照のこと）を、１０％のＦＣＳ、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００ｕｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ中（６ｃｍペトリ皿にて）、２．５×１０４／ｃｍ２の密度で３７℃および５％ＣＯ２にて培養した。８時間後、培養培地を種々の濃度（０、０．０００１、０．０１、０．１、１および１０ＵＩ／ｍｌ）のｒＨｕＥＰＯにて、または１μＭのＤＡＰＴ（γ−セクレターゼインヒビターＩＸ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）とともにリフレッシュさせた。馴化培地を２４時間後および４６時間後に回収した後、４℃、２５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。細胞をまずドライアイス中で凍結させ、次いで２００μｌのＲＩＰＡバッファー中で剥がし取った。次いで、この細胞懸濁液を３０秒間の超音波処理に供した。４℃、１４，０００ｒｐｍで３０分間の遠心分離後、全細胞タンパク質抽出物を回収した。馴化培地および細胞タンパク質抽出物を、使用まで−８０℃で保存した。
【００８３】
ヒトの脳試料調製物
ＡＤ患者および健常対照の凍結させた側頭葉皮質（死後３．５時間以内）を、ＲＩＰＡバッファー中でホモジナイズした。４℃、２２０００×ｇで４０分間の遠心分離後に上清みを回収し、タンパク質含量をＢｉｏＲａｄ  ＤＣ−アッセイによって定量した。上清みおよびペレットは、使用まで−８０℃で保存した。
【００８４】
統計
データは、ＳＰＳＳバージョン１１．５によって解析した。一元配置ＡＮＯＶＡを用いて処置群間の差を評価した後、ＬＳＤ多重比較を行ない、有意レベルを０．０５とした。２つの群間の差の評価には、スチューデントのｔ−検定を使用し、有意レベルを０．０５とした。２つの変量間の相関は、ピアソンまたはスピアマンのρ相関によって試験し、ピアソンにおいてＰ＜０．０１およびスピアマンのρ検定においてＰ＜０．０５の場合、有意であるとみなした。
【００８５】
実施例１：ｒＨｕＥＰＯは、脳内のＡβ斑の数およびＡβ斑関連星状細胞増加を低減させる。
８ヶ月齢の時点で、ａｒｃＡβマウスには、既に脳実質および軟髄膜および実質の血管内に顕著なＡβ沈着物が発生しており、これらは、６Ｅ１０免疫蛍光染色によって示された。６Ｅ１０陽性Ａβ沈着物のほとんどは、チオフラビン−Ｓ染色によって老人斑として確認された（図１Ａ、ＢおよびＣ）。チオフラビン−Ｓ斑は、主に皮質内に見られた（５．０±１．０９／切片）が、海馬内にも稀に見られた。斑の数は、ＥｐｏＬおよびＥｐｏＨにおいて４０％より多く減少した（それぞれ、２．６±０．６／切片および２．０±０．３／切片；Ｐ＜０．０５および０．０１、ＬＳＤ、図１Ｄ）。脳実質内のＡβ蓄積に応答した星状細胞増加は、既に８ヶ月齢のｔｇ  ｃｔｒにおいて顕著であった（図２Ｄ）。対照的に、Ａβ斑関連星状細胞増加は、ＧＦＡＰ陽性細胞の数および各６Ｅ１０陽性Ａβ斑周囲の蛍光強度によって測定されたように、ＥｐｏＬ（図２Ｅ）およびＥｐｏＨ（図２Ｆ）において著しく低かった。（図２Ａ、ＢおよびＣ）。これは、ＥｐｏＬ（図２Ｈ）およびＥｐｏＨ（図２１）において、類似した大きさの斑の周囲で星状細胞増加の顕著な低減が検出されたため、斑の大きさの縮小によるものではないと思われた。したがって、ａｒｃＡβマウスの脳内で、持続的ｒＨｕＥＰＯ処置により、Ａβ斑の数および関連する星状細胞増加が低減された。
【００８６】
実施例２：ｒＨｕＥＰＯは、ＣＡＡを低減させ、星状細胞と血管間の密着を維持する
また、チオフラビン−Ｓ染色により、８ヶ月齢のａｒｃＡβマウスの軟髄膜および皮質の両方において有意なＣＡＡが示された（図３ＡおよびＢ）。チオフラビン−Ｓ染色血管が見られたことは、皮質内のチオフラビン−Ｓ斑の数と正に相関していた（Ｐ＜０．０５、ｒ＝０．７２５、スピアマンのρ相関係数、図３Ｃ）。しかしながら、チオフラビン−Ｓ染色血管は、ＥｐｏＬおよびＥｐｏＨではあまり顕著でなかった（それぞれ、１１匹のうち５匹および１２匹のうち７匹）。興味深いことに、ＥｐｏＬおよびＥｐｏＨマウスにおいて、チオフラビン−Ｓ斑の数と、チオフラビン−Ｓ血管が見られたこととの間に関連性はかった（それぞれ、Ｐ＝０．２５３および０．６４７、図３Ｃ）。しかしながら、第二鉄のＰｅｒｌｓ染色では、４つの群すべての脳内において微小出血は全く検出されなかった（未公表データ）。これは、微小出血が、ａｒｃＡβマウスにおいてＣＡＡの発生よりも後に起こったことを示す。また、高度にＧＦＡＰ反応性であるにもかかわらず、星状細胞は、ほとんどがＡβ負荷血管から剥離した（図３Ｄ）。対照的に、ＧＦＡＰ陽性星状細胞は、ＥｐｏＬ（図３Ｅ）およびＥｐｏＨ（図３Ｆ）の両方において、Ａβ負荷血管と密着したままであった。したがって、持続的ｒＨｕＥＰＯ処置により、ａｒｃＡβマウスにおいて、血管からの星状細胞の分離が抑制され、ＣＡＡが低減された。
【００８７】
実施例３：ｒＨｕＥＰＯは、脳内および血清中のＡβレベルを低下させる
ＲＩＰＡ画分、ＳＤＳ画分およびＦＡ画分において、ＥＬＩＳＡによって脳内Ａβを定量した。脳内に検出可能なＡβ斑がなかった４ヶ月齢のａｒｃＡβマウスと比較すると、８ヶ月齢のｔｇ  ｃｔｒマウスでは、ＲＩＰＡ画分におけるＡβ４０の増加はほんのわずかであった（Ｐ＝０．２１０）が、ＳＤＳ画分では４倍増加およびＦＡ画分では４０倍増加であった（Ｐ＜０．０１、図４Ａ）。持続的ｒＨｕＥＰＯ処置により、ＲＩＰＡ画分において、低減されたＡβ４０レベルはほんのわずかであった（Ｐ＝０．２１１、図４Ａ）が、可溶性の低い画分では４０％より大きく、劇的に低減された。Ａβ４０の低減は、ＥｐｏＬのＳＤＳ画分ならびにＥｐｏＨのＦＡ画分において有意であった（Ｐ＜０．０５、図４Ａ）。ｒＨｕＥＰＯ処置マウスにおける脳内Ａβ４２のレベルは同程度低減され、この低減は、ＥｐｏＨのＲＩＰＡ画分とＦＡ画分において有意であった（Ｐ＜０．０５、図４Ｂ）。さらなる解析により、すべてのＲＩＰＡ不溶性画分において、チオフラビン−Ｓ斑の数が脳内Ａβレベルと正に関連しており（Ｐ＜０．００１、ピアソン相関）、この関連は、ＳＤＳ画分におけるＡβ４０レベルの場合に最も強い（ｒ＝０．７９１、Ｐ＜０．００１、図４Ｃ）ことが示された。また、ＥｐｏＬおよびＥｐｏＨにおいて、血清Ａβ４０でも４０％より大きな減少が見られた（Ｐ＜０．０１、図４Ｄ）。したがって、持続的ｒＨｕＥＰＯ処置により、ａｒｃＡβマウスにおいて、ＲＩＰＡ不溶性画分における脳内Ａβレベルおよび血清Ａβ４０が有意に低減された。
【００８８】
実施例４：ｒＨｕＥＰＯは、ＡＰＰの非アミロイド形成性プロセッシングを活性化する
β−セクレターゼＢＡＣＥ１によるＡＰＰのβ−切断は、ＡＰＰのアミロイド形成性プロセッシング、したがってアミロイド形成の第１段階である。したがって、β−切断のＣ末端断片β−ＣＴＦのレベルは、マウスにおけるＡβ生成の程度を間接的に反映する。ｔｇ  ｃｔｒマウスにおけるβ−ＣＴＦのレベルは、ウエスタンブロットによって示されるように、明らかにＥｐｏＨマウスよりも高かった（図５）。これがＡＰＰ合成の差によるものである可能性を排除するため、β−ＣＴＦのデンシトメトリー測定を、同じウエスタンブロット上で、個々の各マウスの完全長ＡＰＰ（ＦＬ−ＡＰＰ）のものに標準化した。ＦＬ−ＡＰＰに対するβ−ＣＴＦの比は、ｔｇ  ｃｔｒ（ｎ＝７）と比べ、ｒＨｕＥＰＯ処置マウス（ＥｐｏＨ）において３４％有意に低減された（スチューデント検定、ｐ＜０．０１）。この結果は、ｒＨｕＥｐｏに供された、Ｓｗｅｄｉｓｈ型変異を含むヒトＡＰＰ６９５を過剰発現するＳｗｅＡＰＰ２９３細胞で確認することができた。ＳｗｅＡＰＰ細胞におけるα−ＣＴＦとβ−ＣＴＦのレベルは、ウエスタンブロットにおいてほぼ等しかった（Ｃ）。種々の濃度のｒＨｕＥＰＯにより、α−ＣＴＦ／β−ＣＴＦは著しく増大し、１ＵＩ／ｍｌのときα−ＣＴＦ／β−ＣＴＦが２．６のピークに達した。しかしながら、確立されたγ−切断インヒビターであるＤＡＰＴでは、ｒＨｕＥＰＯによるα−ＣＴＦ／β−ＣＴＦの増大は阻止されなかった（Ｄ）。また、α−切断の細胞外断片であるｓＡＰＰαもｒＨｕＥＰＯ処置細胞の馴化培地中で増加していた（Ｅ）。したがって、ｒＨｕＥＰＯは、ａｒｃＡβマウスおよびＳｗｅＡＰＰ２９３細胞において、ＡＰＰの非アミロイド形成性プロセッシングに有利に作用した。
【００８９】
実施例５：ｒＨｕＥＰＯは、微小血管内皮細胞に対するＡβ毒性を抑制する
ＣＡＡ以外に、ａｒｃＡβマウスは、脳の微小血管の完全性の重症な損傷も有していた。クラウジン−５は、脳の微小血管における接着結合の主要な成分である。ウエスタンブロットにより、ａｒｃＡβマウスにおいて脳内クラウジン−５の低減傾向が示され、この低減は、両方のｒＨｕＥＰＯ処置群で一部回復した。クラウジン−５は脳の微小血管内に豊富に存在するため、脳の微小血管を、さらに、野生型、ｔｇ  ｃｔｒマウスおよびｒＨｕＥＰＯ処置マウスから採取した。野生型では、微小血管は、２つの隣接する核の間隔が約４０μｍの内皮細胞で構成されていた。クラウジン−５は血管壁に沿って均一に分布していたが、Ａβは存在しなかった（図６Ａ）。しかしながら、ａｒｃＡβマウスから単離されたＡβ負荷微小血管の血管壁では、隣接する内皮細胞の核間の間隔は大きい場合が多く（図６Ｄ）、場合によっては、内皮細胞の減損が明らかであった（図６Ｂ）。しかしながら、別の内皮マーカーである血小板内皮細胞接着分子−１（ＰＥＣＡＭ−１／ＣＤ３１）の分布は、Ａβ負荷微小血管においてさえも影響はなかった（図６Ｄ）。野生型では、微小血管は星状細胞によって完全に覆われていた（図６Ｅ）が、ｔｇ  ｃｔｒでは覆われていない場合が多く、クラウジン−５の分布も不均一であった（図６Ｆ）。興味深いことに、ｒＨｕＥＰＯにより、Ａβ負荷微小血管においてクラウジン−５の正常な分布が一部回復された（図６Ｃ）。
クラウジン−５に対するＡβの毒性効果を、マウス脳の微小血管から確立された内皮細胞株であるｂＥｎｄ５細胞においてさらに試験した。クラウジン−５は、主に、ｂＥｎｄ５細胞の細胞膜において発現された（図７Ａ）。この細胞を、１０μＭの新鮮調製Ａβ４２中で２４時間培養すると、クラウジン−５は、細胞膜から分離し、細胞質内に蓄積された。１ＵＩ／ｍｌのｒＨｕＥＰＯを１０μＭのＡβ４２とともに添加すると、膜結合クラウジン−５は保持されたが、依然として細胞質内にもクラウジン−５が存在した。しかしながら、１ＵＩ／ｍｌのｒＨｕＥＰＯ単独では、クラウジン−５の正常な分布パターンは変化しなかった。Ａβ４２によって細胞膜からクラウジン−５が完全に消失したにもかかわらず、クラウジン−５のタンパク質レベルの有意な低減はみられなかった（図７Ｂ）。さらに、Ａβ４２により、クラウジン−５のＣ末端断片のレベルの有意な増加が誘導された（該断片は、対照およびｒＨｕＥＰＯ処置細胞ではほとんど検出不可能であった）が、１ＵＩ／ｍｌのｒＨｕＥＰＯを添加すると、これらのＣ末端断片は著しく減少した（図７Ｂ）。総合すると、これらのデータは、クラウジン−５がインビボとインビトロの両方でＡβに対して感受性であることを示唆した。ｒＨｕＥＰＯにより、マウスとｂＥｎｄ５細胞の両方においてクラウジン−５に対するＡβ毒性が抑制された。
【００９０】
実施例６：持続的ｒＨｕＥＰＯ処置は、ａｒｃＡβマウスにおいて一般生理条件に影響を及ぼさない
ａｒｃＡβマウスにおいて毎週のｒＨｕＥＰＯ処置が赤血球生成の増大と関連しているかどうかを評価するため、ヘモグロビンとヘマトクリットのレベルを、４つの群すべてにおいて測定した。両パラメータとも、ＥｐｏＬ処置群およびＥｐｏＨ処置群において変化がなかった（それぞれ、ｐ＝０．３８７およびｐ＝０．４６５）。一般生理条件をミニ神経系検査によってモニタリングした。この検査は、パラメータとして、皮膜外観、体重、体温、分泌徴候、体位ならびに基本的な反射（まばたき、瞳孔反射、屈曲反射および立直り反射など）を測定するものである。握力として示す筋力はバネ秤で測定した。ｔｇ  ｃｔｒマウスとｒＨｕＥＰＯ処置マウスとの間に有意差は観察されず、正常であり、生理食塩水処置野生型同腹子と同等のようであった。したがって、６００ＵＩまたは６０ＵＩ／ｋｇのｒＨｕＥＰＯの毎週のｉｐ注射ではヘマトクリットは有意に増大せず、明白な有害効果も生じなかった。
【００９１】
実施例７：クラウジン−５は、アルツハイマー病における脳血管構造の損傷のマーカーである
ウエスタンブロットは、認知症患者および健常対照由来の側頭葉皮質内のクラウジン−５のレベルを示す。認知症の臨床診断のみを有する対象（被検体）に＋を表示し、臨床的に認知症でない対象に−を表示した。神経細線維のもつれの重症度は、Ｂｒａａｋ  ａｎｄ  Ｂｒａａｋ  Ｓｔａｇｅ（Ｂ＆Ｂ病期）によって示した。また、各対象のアポリポタンパク質Ｅ遺伝子型も表示した。すべての認知症患者で、完全長形態のクラウジン−５は存在しなかったが、１６ｋＤａの小さなバンドが主要形態として検出された。図８参照。認知症患者と健常対照での完全長クラウジン−５のレベルおよび低分子量形態の出現の違いは、クラウジン−５が、アルツハイマー病における脳血管構造の損傷の顕著なマーカーであることを強く示唆する。
【００９２】
本発明は、ＡＤモデルマウスにおけるｒＨｕＥＰＯの有益な役割を実証する最初の開示であるが、ｒＨｕＥＰＯは、齧歯類において、低酸素性虚血（Ｋｕｍｒａｌら、２００４）、グルタミン酸興奮毒性（Ｍｉｕら、２００４）および外傷性脳損傷（Ｌｕら、２００５）によって引き起こされる重症な脳の損傷および記憶障害の予防に好成績で使用されていた。ａｒｃＡβマウスは、２つの主な病態生理学的特徴：
（１）脳実質内および血管内の両方におけるＡβ蓄積；
（２）脳の微小血管の完全性の障害
を有する。
【００９３】
このマウスモデルの使用により、ｒＨｕＥＰＯが脳内Ａβレベルを低下させ、脳の微小血管の完全性を改善することを示すことができた。要約すると、ＡＤマウスにおいて、全身性ｒＨｕＥＰＯ処置により脳内Ａβレベルが低下し、脳の微小血管の完全性が改善されたことを初めて開示しており、したがって、ＡＤの処置に対する新規なアプローチが切り開かれる。また、ＡＤの新規なバイオマーカーであるクラウジン−５およびその１６ｋＤａのバリアントフォームを同定することができた。
【００９４】
参考論文
Banks WA (1999) Characterization of interleukin-1alpha binding to mouse brain endothelial cells. J Pharmacol Exp Ther 291:665-670.
Brines M, Cerami A (2005) Emerging biological roles for erythropoietin in the nervous system. Nat Rev Neurosci 6:484-494.
Brines M, Grasso G, Fiordaliso F, Sfacteria A, Ghezzi P, Fratelli M, Latini R, Xie QW, Smart J, Su-Rick CJ, Pobre E, Diaz D, Gomez D, Hand C, Coleman T, Cerami A (2004) Erythropoietin mediates tissue protection through an erythropoietin and common beta-subunit heteroreceptor. Proc Natl Acad Sci U S A 101:14907-14912.
Brines ML, Ghezzi P, Keenan S, Agnello D, de Lanerolle NC, Cerami C, Itri LM, Cerami A (2000) Erythropoietin crosses the blood-brain barrier to protect against experimental brain injury. Proc Natl Acad Sci U S A 97:10526-10531.
Buemi M, Cavallaro E, Floccari F, Sturiale A, Aloisi C, Trimarchi M, Grasso G, Corica F, Frisina N (2002) Erythropoietin and the brain: from neurodevelopment to neuroprotection. Clin Sci (Lond) 103:275-282.
Carmichael ST (2006) Cellular and molecular mechanisms of neural repair after stroke: making waves. Ann Neurol 59:735-742.
Chong ZZ, Li F, Maiese K (2005) Erythropoietin requires NF-kappaB and its nuclear translocation to prevent early and late apoptotic neuronal injury during beta-amyloid toxicity. Curr Neurovasc Res 2:387-399.
Egrie JC, Dwyer E, Browne JK, Hitz A, Lykos MA (2003) Darbepoetin alfa has a longer circulating half-life and greater in vivo potency than recombinant human erythropoietin. Exp Hematol 31:290-299.
Ehrenreich H, Hasselblatt M, Dembowski C, Cepek L, Lewczuk P, Stiefel M, Rustenbeck HH, Breiter N, Jacob S, Knerlich F, Bohn M, Poser W, Ruther E, Kochen M, Gefeller O, Gleiter C, Wessel TC, De Ryck M, Itri L, Prange H, Cerami A, Brines M, Siren AL (2002) Erythropoietin therapy for acute stroke is both safe and beneficial. Mol Med 8:495-505.
Gurney KJ, Estrada EY, Rosenberg GA (2006) Blood-brain barrier disruption by stromelysin-1 facilitates neutrophil infiltration in neuroinflammation. Neurobiol Dis 23:87-96.
Hardy J, Selkoe DJ (2002) The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science 297:353-356.
Iadecola C (2004) Neurovascular regulation in the normal brain and in Alzheimer's disease. Nat Rev Neurosci 5:347-360.
Jaquet K, Krause K, Tawakol-Khodai M, Geidel S, Kuck KH (2002) Erythropoietin and VEGF exhibit equal angiogenic potential. Microvasc Res 64:326-333.
Koto T, Takubo K, Ishida S, Shinoda H, Inoue M, Tsubota K, Okada Y, Ikeda E (2007) Hypoxia disrupts the barrier function of neural blood vessels through changes in the expression of claudin-5 in endothelial cells. Am J Pathol 170:1389-1397.
Kumar-Singh S, Pirici D, McGowan E, Serneels S, Ceuterick C, Hardy J, Duff K, Dickson D, Van Broeckhoven C (2005) Dense-core plaques in Tg2576 and PSAPP mouse models of Alzheimer's disease are centered on vessel walls. Am J Pathol 167:527-543.
Kumral A, Uysal N, Tugyan K, Sonmez A, Yilmaz O, Gokmen N, Kiray M, Genc S, Duman N, Koroglu TF, Ozkan H, Genc K (2004) Erythropoietin improves long-term spatial memory deficits and brain injury following neonatal hypoxia-ischemia in rats. Behav Brain Res 153:77-86.
Li Y, Lu Z, Keogh CL, Yu SP, Wei L (2007) Erythropoietin-induced neurovascular protection, angiogenesis, and cerebral blood flow restoration after focal ischemia in mice. J Cereb Blood Flow Metab 27:1043-1054.
Lu D, Mahmood A, Qu C, Goussev A, Schallert T, Chopp M (2005) Erythropoietin enhances neurogenesis and restores spatial memory in rats after traumatic brain injury. J Neurotrauma 22:1011-1017.
Marco S, Skaper SD (2006) Amyloid beta-peptide1-42 alters tight junction protein distribution and expression in brain microvessel endothelial cells. Neurosci Lett 401:219-224.
Miu AC, Olteanu AI, Chis I, Heilman RM (2004) Have no fear, erythropoietin is here: erythropoietin protects fear conditioning performances after functional inactivation of the amygdala. Behav Brain Res 155:223-229.
Nadam J, Navarro F, Sanchez P, Moulin C, Georges B, Laglaine A, Pequignot JM, Morales A, Ryvlin P, Bezin L (2007) Neuroprotective effects of erythropoietin in the rat hippocampus after pilocarpine-induced status epilepticus. Neurobiol Dis 25:412-426.
Ogunshola OO, Djonov V, Staudt R, Vogel J, Gassmann M (2006) Chronic excessive erythrocytosis induces endothelial activation and damage in mouse brain. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 290:R678-684.
Park L, Anrather J, Forster C, Kazama K, Carlson GA, Iadecola C (2004) Abeta-induced vascular oxidative stress and attenuation of functional hyperemia in mouse somatosensory cortex. J Cereb Blood Flow Metab 24:334-342.
Rifkind JM, Abugo OO, Peddada RR, Patel N, Speer D, Balagopalakrishna C, Danon D, Ingram DK, Spangler EL (1999) Maze learning impairment is associated with stress hemopoiesis induced by chronic treatment of aged rats with human recombinant erythropoietin. Life Sci 64:237-247.
Soma T, Chiba H, Kato-Mori Y, Wada T, Yamashita T, Kojima T, Sawada N (2004) Thr(207) of claudin-5 is involved in size-selective loosening of the endothelial barrier by cyclic AMP. Exp Cell Res 300:202-212.
Sun X, He G, Qing H, Zhou W, Dobie F, Cai F, Staufenbiel M, Huang LE, Song W (2006) Hypoxia facilitates Alzheimer's disease pathogenesis by up-regulating BACE1 gene expression. Proc Natl Acad Sci U S A 103:18727-18732.
Tsai PT, Ohab JJ, Kertesz N, Groszer M, Matter C, Gao J, Liu X, Wu H, Carmichael ST (2006) A critical role of erythropoietin receptor in neurogenesis and post-stroke recovery. J Neurosci 26:1269-1274.
Villa P, Bigini P, Mennini T, Agnello D, Laragione T, Cagnotto A, Viviani B, Marinovich M, Cerami A, Coleman TR, Brines M, Ghezzi P (2003) Erythropoietin selectively attenuates cytokine production and inflammation in cerebral ischemia by targeting neuronal apoptosis. J Exp Med 198:971-975.
Wang L, Zhang ZG, Zhang RL, Jiao ZX, Wang Y, Pourabdollah-Nejad DS, LeTourneau Y, Gregg SR, Chopp M (2006) Neurogenin 1 mediates erythropoietin enhanced differentiation of adult neural progenitor cells. J Cereb Blood Flow Metab 26:556-564.
Willis CL, Leach L, Clarke GJ, Nolan CC, Ray DE (2004a) Reversible disruption of tight junction complexes in the rat blood-brain barrier, following transitory focal astrocyte loss. Glia 48:1-13.
Willis CL, Nolan CC, Reith SN, Lister T, Prior MJ, Guerin CJ, Mavroudis G, Ray DE (2004b) Focal astrocyte loss is followed by microvascular damage, with subsequent repair of the blood-brain barrier in the apparent absence of direct astrocytic contact. Glia 45:325-337.
Yamaji R, Okada T, Moriya M, Naito M, Tsuruo T, Miyatake K, Nakano Y (1996) Brain capillary endothelial cells express two forms of erythropoietin receptor mRNA. Eur J Biochem 239:494-500.
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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