(57)【要約】  ＦＡＢＰ４遺伝子のオリゴヌクレオチドはＦＡＢＰ４タンパク質発現の調節のために開発された。オリゴヌクレオチドの組成物は、特に、ＦＡＢＰ４をコードしている標的核酸のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。ＦＡＢＰ４発現調節の化合物の使用方法、及びＦＡＢＰ４の過剰発現に関連する疾患の治療方法を提供する。そのような疾患の例としては、メタボリックシンドローム、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、及び関節炎といった炎症状態がある。オリゴマーは、デオキシリボヌクレオシド又は核酸類似体、例えばロックド核酸（ＬＮＡ）、又はそれらの組み合わせを含んでいてもよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホ乳類ＦＡＢＰ４をコードする核酸の対応領域の連続核酸塩基と少なくとも８０％の相同性を有する合計１０−５０の連続核酸塩基配列を含む１０−５０核酸塩基長であり、該オリゴマーが、医薬又は医薬組成物として用いられるオリゴマー。
【請求項２】
ホ乳類ＦＡＢＰ４をコードする核酸の対応領域の連続核酸塩基配列が３つ以下、例えば２つ以下のミスマッチを含む請求項１記載のオリゴマー。
【請求項３】
ホ乳類ＦＡＢＰ４をコードする核酸の対応領域の連続核酸塩基配列が１つ以下のミスマッチを含む請求項２記載のオリゴマー。
【請求項４】
ホ乳類ＦＡＢＰ４をコードする核酸の対応領域の連続核酸塩基配列がミスマッチを含まない（すなわち相補的である）請求項３記載のオリゴマー。
【請求項５】
オリゴマーの核酸塩基配列が連続核酸塩基配列からなる請求項１−４のいずれか記載のオリゴマー。
【請求項６】
ホ乳類ＦＡＢＰ４をコードする核酸が、ヒトＦＡＢＰ４ヌクレオチド配列である、例えば配列番号１、又はその天然アレル変異体である請求項１−５のいずれか記載のオリゴマー。
【請求項７】
ホ乳類ＦＡＢＰ４をコードする核酸が、げっ歯類ＦＡＢＰ４、例えばマウスＦＡＢＰ４又はラットＦＡＢＰ４、及び非ヒト霊長類ＦＡＢＰ４、例えばチンパンジーＦＡＢＰ４又はイヌＦＡＢＰ４をコードする核酸からなる群から選択される請求項１−６のいずれか記載のオリゴマー。
【請求項８】
連続核酸塩基配列が、ヒトＦＡＢＰ４及び非ヒトＦＡＢＰ４の核酸配列の両方の対応領域に相補的である、例えば請求項７で言及したＦＡＢＰ４核酸配列といった請求項１−７のいずれか記載のオリゴマー。
【請求項９】
連続核酸塩基配列が、ヒトＦＡＢＰ４核酸配列である配列番号１及びマウスＦＡＢＰ４核酸配列である配列番号３の両方の対応領域に相補的である請求項１−８のいずれか記載のオリゴマー。
【請求項１０】
相補的ＦＡＢＰ４と二本鎖を形成する場合、標的ＲＮＡがリボヌクレアーゼＨを動員することができ、連続核酸塩基配列が、少なくとも７である核酸塩基部分である連続サブ配列を含む請求項１ないし９のいずれか記載のオリゴマー。
【請求項１１】
相補的ＦＡＢＰ４と二本鎖を形成する場合、標的ＲＮＡがリボヌクレアーゼＨを動員することができ、連続核酸塩基配列が、少なくとも８、少なくとも９、又は少なくとも１０である核酸塩基部分である連続サブ配列を含む請求項１０のいずれか記載のオリゴマー。
【請求項１２】
相補的ＦＡＢＰ４と二本鎖を形成する場合、標的ＲＮＡがリボヌクレアーゼＨを動員することができ、該連続的サブ配列が、少なくとも９又は少なくとも１０である核酸塩基長、例えば、少なくとも１２核酸塩基又は少なくとも１４核酸塩基長、例えば１４、１５又は１６の核酸塩基部分を含む請求項１０又は１１記載のオリゴマー。
【請求項１３】
該オリゴマーが、一つ以上の非核酸塩基化合物とコンジュゲートする請求項１−１２のいずれか記載のオリゴマー。
【請求項１４】
該オリゴマーが、１０−２２核酸塩基長である請求項１−１３のいずれか記載のオリゴマー。
【請求項１５】
該オリゴマーが、１２−１８核酸塩基長である請求項１−１３のいずれか記載のオリゴマー。
【請求項１６】
該オリゴマーが、１４、１５、又は１６核酸塩基長である請求項１−１３のいずれか記載のオリゴマー。
【請求項１７】
核酸配列に含まれる連続ヌクレオチド配列に対応する該連続核酸塩基配列が、配列番号１２及び２３、及び／又は配列番号５、６、７、８、９、１０及び１１からなる群から選択される請求項１−１６のいずれか記載のオリゴマー。
【請求項１８】
オリゴマー又は連続核酸塩基配列が、配列番号１１８、１２２、１１９、１２０、１２３、１１７、及び１２１からなる群から選択される、又は、オリゴマー又は連続核酸塩基配列が、配列番号１１８、１２２、１１９、１２０、１２３、１１７及び１２１から選択される核酸塩基配列と等価であるものからなる、又はこれを含む請求項１−１７のいずれか記載のオリゴマー。
【請求項１９】
該オリゴマーが一本鎖である請求項１−１８のいずれか記載のオリゴマー。
【請求項２０】
該連続核酸塩基配列が少なくとも１の親和性増大ヌクレオチド類似体を含む請求項１−１９のいずれか記載のオリゴマー。
【請求項２１】
連続核酸塩基配列が、合計２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０の親和性増大ヌクレオチド類似体、例えば５から８の親和性増大ヌクレオチド類似体を含む請求項２０記載のオリゴマー。
【請求項２２】
少なくとも１の親和性増大ヌクレオチド類似体を含み、残りの核酸塩基がＤＮＡヌクレオチド及びＲＮＡヌクレオチドから選択され、好ましくはＤＮＡヌクレオチドであるものを含む請求項１−２１のいずれか記載のオリゴマー。
【請求項２３】
オリゴマーが、５’から３’方向に、式Ａ−Ｂ−Ｃ、及び任意に式Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄの核酸塩基配列を含み：ここで
Ａ      は、少なくとも１のヌクレオチド類似体、例えば、１、２、３、４、５、又は
６のヌクレオチド類似体、好ましくは２−５のヌクレオチド類似体、好ましくは
２、３、又は４のヌクレオチド類似体、最も好ましくは２、３、又は４の連続ヌ
クレオチド類似体からなり、又はこれを含み、及び；
Ｂ      は、リボヌクレアーゼＨを動員することのできる少なくとも５の連続核酸塩基（
ＦＡＢＰ４ ｍＲＮＡ標的といった相補的ＲＮＡと二本鎖を形成する場合）、リ
ボヌクレアーゼＨを動員することのできる、例えばＤＮＡ核酸塩基、例えば、５          、６、７、８、９、１０、１１又は１２の連続核酸塩基からなり、又はこれを        含み、６−１０、又は７−９、例えば８の基からなり、又はこれを含み、及び；
Ｃ      は、少なくとも１のヌクレオチド類似体、例えば２、３、４、５、又は６ヌクレ        オチド類似体、好ましくは２−５のヌクレオチド類似体、例えば２、３又は４の        ヌクレオチド類似体、最も好ましくは２、３又は４のヌクレオチド類似体からな        り、又はこれを含み、及び；
Ｄ      が存在する場合には、１以上のＤＮＡヌクレオチド、例えば１−３又は１−２の        ＤＮＡヌクレオチドからなり、又はこれを含み、好ましくは、からなる請求項１−２２いずれか記載のオリゴマー。
【請求項２４】
領域Ａが、２、３、又は４の連続ヌクレオチド類似体からなる、又はこれを含む請求項２３記載のオリゴマー。
【請求項２５】
例えば、ＦＡＰＢ４ｍＲＮＡ標的といった相補的ＲＮＡと二本鎖を形成する場合、リボヌクレアーゼＨを動員することができ、領域Ｂが、７、８、９、又は１０の連続ＤＮＡヌクレオチド、又は等価な核酸塩基からなる、又はこれを含む請求項２２−２４のいずれか記載のオリゴマー。
【請求項２６】
２、３、又は４の連続ヌクレオチド類似体からなる、又はこれを含む請求項２２−２５のいずれか記載のオリゴマー。
【請求項２７】
領域Ｄが存在する場合には、１又は２のＤＮＡヌクレオチドからなる請求項２２−２６のいずれか記載のオリゴマー。
【請求項２８】
Ａ    が、３の連続ヌクレオチド類似体からなる、又はこれを含む；
Ｂ      が、例えばＦＡＰＢ４ｍＲＮＡ標的といった相補的ＲＮＡと二本鎖を形成する場        合、リボヌクレアーゼＨを動員することができる７、８、９、又は１０の連続Ｄ        ＮＡヌクレオチド又は等価な核酸塩基からなる、又はこれを含む；
Ｃ      ３の連続ヌクレオチド類似体からなる、又はこれを含む；
Ｄ      存在する場合には、１又は２のＤＮＡヌクレオチドからなる
請求項２７記載のオリゴマー。
【請求項２９】
Ｂが、Ｌ−α立体配置、例えば、Ｌ−α−オキシＬＮＡである、少なくとも１のＬＮＡ核酸塩基を含む請求項２２−２８のいずれか記載のオリゴマー。
【請求項３０】
ヌクレオチド類似体が、独立して、又は集合的に：ロックド核酸（ＬＮＡ）ユニット；２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡユニット、２’−ＯＭｅ−ＲＮＡユニット、２’−アミノ−ＤＮＡユニット、２’−フルオロ−ＤＮＡユニット、ＰＮＡユニット、ＨＮＡユニット、及びＩＮＡユニットからなる群から選択される請求項１−２９のいずれか記載のオリゴマー。
【請求項３１】
全てのヌクレオチド類似体が、ＬＮＡユニットである請求項３０記載のオリゴマー。
【請求項３２】
１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のＬＮＡユニット、例えば２から８のヌクレオチドのＬＮＡユニットを含む請求項１−３２のいずれか記載のオリゴマー。
【請求項３３】
ＬＮＡが、β−Ｄ、及びα−Ｌ立体配置又はそれらの組み合わせにおける、オキシ−ＬＮＡ、チオ−ＬＮＡ、及びアミノ−ＬＮＡから独立して選択される請求項３０−３２のいずれか記載のオリゴマー。
【請求項３４】
ＬＮＡが全てβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡである請求項３３記載のオリゴマー。
【請求項３５】
領域Ａ及びＣのヌクレオチド類似体、又は核酸塩基がβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡである請求項２２−３４のいずれか記載のオリゴマー。
【請求項３６】
オリゴマー中に存在する少なくとも１の核酸塩基が、５−メチルシトシン、イソシトシン、プソイドシトシン、５−ブロモウラシル、５−プロピニルウラシル、６−アミノプリン、２−アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、及び２−クロロ−６−アミノプリンからなる群から選択される修飾核酸塩基である、請求項１−３５のいずれか記載のオリゴマー。
【請求項３７】
該オリゴマーを少なくとも５０℃のＴｍにおいて対応するホ乳類ＦＡＢＰ４ ｍＲＮＡとハイブリダイズする請求項１−３６のいずれか記載のオリゴマー。
【請求項３８】
該オリゴマーを８０℃以下のＴｍにおいて対応するホ乳類ＦＡＢＰ４ ｍＲＮＡとハイブリダイズする請求項１−３７のいずれか記載のオリゴマー。
【請求項３９】
ヌクレオシド間結合が、独立して：ホスホジエステル、ホスホロチオエート及びボラノホスフェートからなる群から選択される請求項１−３８のいずれか記載のオリゴマー。
【請求項４０】
少なくとも１のホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む請求項３９記載のオリゴマー。
【請求項４１】
ヌクレオシド間結合が、ＤＮＡ又はＲＮＡユニットに隣接し又は間にあり、又は領域Ｂ内あり、ホスホロチオエート結合である請求項４１記載のオリゴマー。
【請求項４２】
少なくとも１対の連続ヌクレオチド類似体間の結合が、ホスホジエステル結合である請求項４０又は４１のいずれか記載のオリゴマー。
【請求項４３】
ヌクレオチド類似体間の結合が、ホスホジエステル結合である請求項４０又は４１のいずれか記載のオリゴマー。
【請求項４４】
ヌクレオチド類似体間の結合が、ホスホロチオエート結合である請求項４０記載のオリゴマー。
【請求項４５】
少なくとも１の非ヌクレオチド又は非ヌクレオチド部分が該化合物に共有結合している請求項１−４４のいずれか記載のオリゴマーを含むコンジュゲート。
【請求項４６】
請求項１−４４のいずれかに定義されるオリゴマー又は請求項４５に定義されるコンジュゲート、及び薬学的に許容される希釈剤、担体、塩又はアジュバント含む医薬組成物。
【請求項４７】
オリゴマーがプロドラッグとして構成されている、請求項４６記載の医薬組成物。
【請求項４８】
さらに：アポリポ蛋白Ｂ１００アンタゴマー（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）、ＰＣＳＫ９アンタゴマー（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）、スタチン、フィブラート、チアゾリジンジオン、抗炎症性化合物及び抗ウイルス性化合物からなる群から選択されるさらなる治療剤をさらに含む請求項４６又は４７記載の医薬組成物。
【請求項４９】
以下の群：炎症性疾患又は障害、関節炎、喘息、アルツハイマー病、代謝疾患又は障害、メタボリックシンドローム、糖尿病及びアテローム性動脈硬化症から選択される疾患又は障害の治療のための医薬を製造するための請求項１−４４のいずれかに定義されるオリゴマー又は請求項４５に定義されるコンジュゲートの使用。
【請求項５０】
該方法が、請求項１−４４のいずれかに定義されるオリゴマー、又は請求項４５に定義されるコンジュゲート、又は請求項４６−４８のいずれかに定義される医薬組成物を必要とする患者に投与することを含む炎症性障害、例えば、関節炎、喘息又はアルツハイマー病の治療方法。
【請求項５１】
方法が、ＦＡＢＰ４の発現が減少する又は阻害されるように、該細胞又は組織を、請求項１−４４のいずれかに定義される化合物、又は請求項４５に定義されるコンジュゲート、又は請求項４６−４８のいずれかに記載の医薬組成物と接触させる工程を含む細胞又は組織におけるＦＡＢＰ４の発現を減少させる又は阻害する方法。
【請求項５２】
方法が、請求項１−４４のいずれかに定義されるオリゴマー、又は請求項４５に定義されるコンジュゲート、又は請求項４６−４８のいずれかに記載の医薬組成物を患者に投与する工程を含む、患者における（ｉ）血清コレステロールレベルを減少させる、又はｉｉ）血清ＬＤＬコレステロールレベルを減少させる、又はｉｉｉ）ＨＤＬ／ＬＤＬ比を改善する方法。
【請求項５３】
患者における血清トリグリセリドレベルを低下させるため、その方法が、請求項１−４４のいずれかに定義されるオリゴマー、又は請求項４５に定義されるコンジュゲート、又は請求項４６−４８のいずれかに記載の医薬組成物を患者に投与する工程を含む患者における血漿中トリグリセリドを低下させる方法。
【請求項５４】
患者における体重を減少させるため、その方法が、請求項１−４４のいずれかに定義されるオリゴマー、又は請求項４５に定義されるコンジュゲート、又は請求項４６−４８のいずれかに記載の医薬組成物を、治療を必要とする患者に投与する工程を含む患者における肥満の治療方法。
【請求項５５】
患者のインスリン感受性を増大させるため、その方法が、請求項１−４４のいずれかに定義されるオリゴマー、又は請求項４５に定義されるコンジュゲート、又は請求項４６−４８のいずれかに記載の医薬組成物を、治療を必要とする患者に投与する工程を含む患者におけるインスリン耐性の治療方法。
【請求項５６】
該方法が、請求項１−４４のいずれかに定義されるオリゴマー又は請求項４５に定義されるコンジュゲート、又は請求項４６−４８のいずれかに記載の医薬組成物を患者に投与する工程を含む患者におけるＩＩ型糖尿病の治療方法。
【請求項５７】
該方法が、請求項１−４４のいずれかに定義されるオリゴマー又は請求項４５に定義されるコンジュゲート、又は請求項４６−４８のいずれかに記載の医薬組成物を必要とする患者に投与することを含む、患者における代謝障害、例えばメタボリックシンドローム、糖尿病又はアテローム性動脈硬化症の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＦＡＢＰ４の発現の調節を行う化合物、組成物及び方法を提供する。特に、本発明は、細胞内ＦＡＢＰ４ ｍＲＮＡを標的とする、ＦＡＢＰ４発現減少を導くオリゴマー化合物（オリゴマー）に関連する。ＦＡＢＰ４発現の減少は、代謝性及び炎症性疾患に有効である。
【背景技術】
【０００２】
細胞内脂質結合タンパク質の多重遺伝子族には、基質親和性及び組織発現性の異なる３０以上のメンバーがある。細胞内脂質結合タンパク質は、脂肪酸及び他の脂溶性の生体分子が結合するための高親和性の部位を提供する大きな疎水性の内空を有するという共通する構造的特徴を持つ。細胞内脂質結合タンパク質のサブクラスを脂肪酸結合タンパク質（ＦＡＢＰ）と呼ぶ。ＦＡＢＰは、細胞内脂質輸送、脂質の細胞膜間の輸送、脂質代謝酵素との相互作用、及び、おそらく細胞内脂肪酸の界面活性効果に対する細胞膜の保護にも関わっていると考えられている（Ｈｅｒｔｚｅｌ ａｎｄ Ｂｅｒｎｌｏｈｒ ２０００）。細胞質非エステル化脂肪酸のＦＡＢＰによる封鎖は、細胞を脂肪毒性から守るが、同じ作用機序で、細胞内シグナル伝達を妨げる。長鎖非エステル化脂肪酸は、核内受容体（ペルオキシソーム増殖因子関連タンパク質；ＰＰＡＲ）のリガンドであり、脂肪酸核内受容体の結合活性を妨げることによりＦＡＢＰの高発現によりＰＰＡＲの応答を鈍くする（Ｈｅｌｌｅｄｉｅ ｅｔ ａｌ． ２０００）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
脂肪酸結合タンパク質４（ＦＡＢＰ４、別名ＡＬＢＰ、Ａｐ２、及びＬｂｐｌ）は、脂肪細胞及びマクロファージに高発現する１５ｋＤａタンパク質である。当該タンパク質は、アテローム性動脈硬化症及び糖尿病の進行に関連していると考えられている。これは、ヒトの免疫学的データだけでなく、インビトロの実験及びＦＡＢＰ４欠損マウスから得られたデータによっても裏付けられている。ヒトにおいては、ＦＡＢＰ４タンパク質発現がより低くなるＦＡＢＰ４遺伝子多型が特定されているが、その代わりに有意に心血管疾患のリスクを減少させ、２型糖尿病の進展を一般人よりも遅らせることと関わっている。低レベルのＦＡＢＰ４ ｍＲＮＡ発現であることは、ＦＡＢＰ４遺伝子多型をもつ個体の脂肪組織からの針生検によって検出され、低脂肪組織ＦＡＢＰ４タンパク含量はインスリン感受性の増加と関係があることが見出された（Ｔｕｎｃｍａｎ ｅｔ ａｌ．２００６）。ＦＡＢＰ４が欠失したマウス（ＦＡＢＰ４欠損マウス）は野生型動物と比較して、全体としては食事への反応に形態学上の変化はなかった。高脂肪食を与え続けた場合、野生型動物に対して、ＦＡＢＰ４欠損動物は、より低い血漿トリグリセリド、コレステロール、インスリン、及び血糖値を示し、これはＦＡＢＰ４の欠失により食事誘導性のインスリン耐性の形成のリスクが低下することを示唆している（Ｈｏｔａｍｉｓｌｉｇｉｌ ｅｔ ａｌ．１９９６）。ＦＡＢＰ４欠損マウスに、様々なアテローム性動脈硬化症のモデルとして広く用いられている試験を行ったところ、アポＥ欠損マウスにおいて、結果は劇的であった。ＦＡＢＰ４の欠失によって、動物は強いアテローム硬化症のプラークの形成の進展を減少させアテローム硬化症から保護しているようであった（Ｍａｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．２００１）。効果は、脂肪細胞ではなくマクロファージ特異的であるようであった。ＦＡＢＰ４のマクロファージ骨髄移植実験により、強いアテローム硬化型プラーク形成の低下をもたらした（Ｍａｋｏｗｓｋｉ、Ｂｏｏｒｄ、Ｍａｅｄａ、Ｂａｂａｅｖ、Ｕｙｓａｌ、Ｍｏｒｇａｎ、Ｐａｒｋｅｒ、Ｓｕｔｔｌｅｓ、Ｆａｚｉｏ、Ｈｏｔａｍｉｓｌｉｇｉｌ、ａｎｄ Ｌｉｎｔｏｎ、２００１）。
【０００４】
脂質で満たされたマクロファージ、例えば、マクロファージ泡沫化細胞の出現は、アテローム性動脈硬化症の進展の特徴である。ヒトの単球／マクロファージ細胞株ＴＨＰ−１は、マクロファージ泡沫化細胞形成及び炎症の応答の研究に通常用いられるモデルである。この細胞型によるインビトロの実験で、ＦＡＢＰ４はマクロファージ泡沫化細胞形成及びマクロファージ炎症性応答を促進した；ＴＨＰ−１細胞におけるＦＡＢＰ４の過剰発現により、細胞内の中性脂質（コレステロール及びトリグリセリド）の蓄積をもたらすと同時に、細胞内脂質の取り込み及び蓄積に関わるタンパク質の上方制御（ＳＲ−Ａ１及びＡＣＡＴ１）、及び脂質の排出に関わるタンパク質（ＡＢＣＡ１）の下方制御を行うことが示された（Ｆｕ ｅｔ ａｌ．２００６）。また、トール様受容体アゴニスト、例えば、バクテリアエンドトキシンは、マクロファージにおけるＦＡＢＰ４発現を強く上方制御すると同時に細胞内脂質油滴形成を増加させ、さらに酸化ＬＤＬとのコインキュベーション（ｃｏ−ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）によって促進されることが示された。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の概要
本発明は、ここで該連続塩基配列が、ホ乳類ＦＡＢＰ４をコードする対応する領域と少なくとも８０％の相同性があるものである合計１０−５０核酸塩基の連続塩基配列を含む、１０−５０塩基長のオリゴマーを提供する。
【０００６】
具体的態様としては、オリゴマーが医薬又は医薬組成物として使用される。
【０００７】
本発明は、更に本発明のオリゴマーの塩基配列が、例えば、オリゴマーの核酸塩基配列に加え、少なくとも１の非−ヌクレオチド又は非−ポリヌクレオチド残基が本発明のオリゴマーと共有結合したオリゴマーを含むコンジュゲートを提供する。
【０００８】
本発明は、オリゴマー又は本発明でコンジュゲートと定義されるもの、及び、薬学的に許容される希釈剤、担体、塩、又は補助剤を含む医薬組成物を提供する。
【０００９】
本発明は、医薬に使用するための本発明によるオリゴマーをさらに提供する。
【００１０】
本発明は、更に、本明細書中に記載の疾患から選択される群：例えば、メタボリックシンドローム、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、炎症性疾患、関節炎、喘息、及びアルツハイマー病、の１つ以上の治療のための医薬の製造のための本発明のオリゴマーの使用を提供する。
【００１１】
本発明は、更に、本明細書中に記載の疾患から選択される群：例えば、メタボリックシンドローム、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、炎症性疾患、関節炎、喘息、及びアルツハイマー病、の１つ以上の治療のための本発明のオリゴマーの使用を提供する。
【００１２】
本発明は、それを必要とする患者に対し、該方法が、本発明のオリゴマー、コンジュゲート、又は、医薬組成物を投与することを含む、炎症性疾患、例えば、関節炎、喘息、又はアルツハイマー病の治療方法を提供する。
【００１３】
本発明は、該細胞又は組織を本発明のオリゴマー、コンジュゲート、又は、医薬組成物に接触させることにより、ＦＡＢＰ４の発現を阻害又は減少させることを含む、該細胞又は組織内ＦＡＢＰ４発現を阻害又は減少させる方法を提供する。
【００１４】
本発明は、該方法が、オリゴマー又はコンジュゲート又は医薬組成物を患者に投与するステップを含み、(ｉ)血清中コレステロールレベルを減少させる、又はｉｉ）血清中ＬＤＬ−コレステロールを減少させる、又はｉｉｉ）患者のＨＤＬ／ＬＤＬ比を改善する方法を提供する。
【００１５】
本発明は、該方法が、患者に本発明のオリゴマー又はコンジュゲート又は医薬組成物を患者に投与することにより患者の血漿中トリグリセリド濃度を低下させるステップを含む患者の血漿中トリグリセリド濃度を低下させる方法を提供する。
【００１６】
本発明は、該方法が、治療を必要とする患者に本発明のオリゴマー又はコンジュゲート又は医薬組成物を患者に投与することにより患者の体重を減らすステップを含む、患者の肥満の治療方法を提供する。
【００１７】
本発明は、該方法が、患者に本発明のオリゴマー又はコンジュゲート又は医薬組成物を患者に投与することにより患者のインスリン感受性を高めるステップを含む、患者のインスリン耐性の治療方法を提供する。
【００１８】
本発明は、該方法が、２型糖尿病に罹患している患者に本発明のオリゴマー又はコンジュゲート又は医薬組成物を患者に投与するステップを含む、２型糖尿病の治療方法を提供する。
【００１９】
本発明は、該方法が、治療を必要としている患者に、本発明のオリゴマー又はコンジュゲート又は医薬組成物を患者に投与するステップを含む、代謝疾患の治療方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１  マウスの肝１−６細胞に、リポフェクタミンを用いてＦＡＢＰ４を標的とする異なるオリゴヌクレオチドをトランスフェクションさせた。ｑＰＣＲを行った場合、トランスフェクションから２４時間後にＦＡＢＰ４ ｍＲＮＡ発現が観測された。ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対して標準化し、モック対照と比較して表している。
【図２】図２  ヒトＰＣ３細胞に、リポフェクタミンを用いて、ヒトＰＣ３細胞にＦＡＢＰ４を標的とする異なるオリゴヌクレオチドをトランスフェクションさせた。ｑＰＣＲによって測定し、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対して標準化し、モック対照と比較して表している。
【図３】図３  マクロファージにおいてはＦＡＢＰ４の機能が知られているので、ＦＡＢＰ４オリゴヌクレオチドをインビトロで、マウスマクロファージ様ＲＡＷ２６４．７細胞を用いて効力のスクリーニングを行った。リポフェクタミンを用いて細胞にトランスフェクションし、２４時間後に分析した。ｑＰＣＲによって測定し、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対して標準化し、モック対照と比較して表している。
【図４】図４  ヒト及びマウスのＦＡＢＰ４ ｃＤＮＡ配列のシークエンスアラインメントである。好ましい「標的」配列である、配列番号５、６、７、８、９、１０及び１１を太字で表した。
【図５】図５  ヒト及びマウスのＦＡＢＰ４のアミノ酸及び標的ポリヌクレオチド配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
発明の詳細な説明
ＦＡＢＰ４標的オリゴマー
【００２２】
本発明では、ホ乳類ＦＡＢＰ４をコードする核酸分子（ここではオリゴマーと言う）の機能の調節のため、オリゴマー化合物、例えば、配列番号２（ヒト）又は配列番号４（マウス）に示すＦＡＢＰ４タンパク質、及び、ホ乳類ＦＡＢＰ４をコードするそれらの核酸分子の天然アレル変異体を用いた。
【００２３】
１つの態様としては、オリゴマーは、ホ乳類のＦＡＢＰ４をコードする核酸の対応領域において少なくとも８０％の相同性がある核酸塩基配列を含む。
【００２４】
オリゴマーは、連続核酸塩基配列を含む又はからなる。
【００２５】
１つの態様としてはオリゴマーの核酸塩基配列は、連続核酸塩基配列からなる。
【００２６】
しかし、オリゴマーは、ホ乳類のＦＡＢＰ４をコードする核酸の対応領域において８０％の相同性を有する連続核酸塩基配列であり、さらに１以上の核酸塩基、例えば、１から６までのさらなる核酸塩基、例えば、１、２、３、４、５又は６のさらなる核酸塩基が、例えば、連続して５’末端又は３’末端である核酸塩基の連続核酸塩基配列であるものを含むことも予想できる。そのようなさらなる核酸塩基又は塩基は、本明細書中の文脈のギャップマーオリゴマーにおける領域Ｄと等価であると考えられる。１つの態様としては、１つ以上の更なる核酸塩基はオリゴマーをインビボで安定化する、例えば、オリゴマーをヌクレアーゼ分解から保護する、例えば、本明細書中に記載したヌクレオチド類似体がある。１つの態様としては、１以上の核酸塩基がオリゴマーをインビボで安定化するヌクレオチド類似体、例えばオリゴマーをヌクレアーゼ分解から保護する、例えば本明細書中に記載したヌクレオチド類似体である。
【００２７】
ホ乳類ＦＡＢＰ４は、好ましくはヒト又はマウスＦＡＢＰ４からなる群において選択される。好ましくは、ホ乳類ＦＡＢＰ４はヒトＦＡＢＰ４である。
【００２８】
好ましい態様としては、ホ乳類ＦＡＢＰ４をコードする核酸は、ヒトＦＡＢＰ４ ｃＤＮＡ配列が配列番号１で示される配列、及び／又はマウスＦＡＢＰ４ ｃＤＮＡ配列が配列番号３で示される配列、又はそのアレル変異体である。
【００２９】
ホ乳類 ＦＡＢＰ４をコードする核酸は、センス又はアンチセンス配向であり得る。
【００３０】
非常に好ましくは、本発明のオリゴマーは、ＲＮＡアンタゴニスト、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又はｓｉＲＮＡであり、好ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００３１】
それゆえ、非常に好ましい態様は、本発明の「標的」オリゴマーはＦＡＢＰ４ ｍＲＮＡである。この態様において、オリゴマーはアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はｓｉＲＮＡであり、ＦＡＢＰ４遺伝子を発現する細胞に導入される場合、ＦＡＢＰ４ ｍＲＮＡレベルの減少が起こり、細胞におけるＦＡＢＰ４の発現レベルの減少が起こる。
【００３２】
ＦＡＢＰ４ ｍＲＮＡを標的とするオリゴマーは、標的ｍＲＮＡ核酸、例えば、５’非翻訳リーダー、エクソン、イントロン及び３’非翻訳末端のいずれかの部位にもハイブリダイズし得る。しかし、ＦＡＢＰ４ ｍＲＮＡを標的とするオリゴマーは、標的核酸の成熟ｍＲＮＡ形態にハイブリダイズするのが好ましい。
【００３３】
ＲＮＡアンタゴニストとして設計する場合、例えば、本発明のオリゴマーは標的核酸に結合し、その同族（ｃｏｇｎａｔｅ）タンパク質の発現を調節する。好ましくは、かかる調節により、通常の発現レベルと比較して少なくとも１０％又は２０％の発現の阻害、より好ましくは通常の発現レベルと比較して少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％の阻害が生じる。適切には、５−２５ｎＭの濃度の本発明の化合物を用いた場合にかかる調節が見られる。同じ又は異なる態様における同様の場合、発現の阻害は、１００％未満、例えば、９８％阻害未満、９５％阻害未満、９０％阻害未満、８０％阻害未満、例えば、７０％阻害未満である。発現レベルの調節は、タンパク質レベルの測定によって、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次いで標的タンパク質に対する適切な抗体を用いたウェスタンブロットを行うなどの方法によって測定する。あるいは、発現レベルの調節は、ｍＲＮＡのレベルを測定することによって、例えばノーザン・ブロット又は定量的ＲＴ−ＰＣＲによって測定することができる。ｍＲＮＡレベルを介して測定する場合、適切な用量、例えば５−２５ｎＭ濃度を用いる場合の下方制御レベルは、１つの態様としては、典型的には本発明の化合物の非存在下において通常レベルの１０−２０％のレベルである。
【００３４】
核酸塩基の連続配列（すなわち核酸塩基配列）からなる本発明の化合物は、非核酸塩基成分、例えば、本明細書において称するコンジュゲートをさらに含み得ることが認識されるであろう。
【００３５】
例えば、ｓｉＲＮＡの産生において、本発明の化合物は相補的配列の二本鎖、すなわち二本鎖オリゴヌクレオチドからなり得ることが認識され、ここで二本鎖の配列のそれぞれは本発明の化合物に沿って規定されるとおりである。典型的には、かかるｓｉＲＮＡは、典型的には、どちらの末端にも２ヌクレオチドの３’オーバーハングを有する、２つの相補的な短いＲＮＡ（又は同等の核酸塩基）配列、例えば２１−２３ヌクレオチド長配列を含む。インビボにおける更新（ｕｐｄａｔｅ）を促進するために、ｓｉＲＮＡはコンジュゲートされ得る、例えば、ステロール、例えばコレステロール群とコンジュゲートされ得る（典型的には片方又は両方の鎖の３’又は５’末端において）。ｓｉＲＮＡはヌクレオチド類似体、例えば、国際公開第２００５／０７３３７８号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）に記載のようなＬＮＡを含み得る。
【００３６】
本発明の一局面において、オリゴマーは本質的に二本鎖ではない、例えばｓｉＲＮＡではない。
【００３７】
オリゴマー（又は連続核酸塩基配列）の長さは、標的の阻害が起こる長さによって決定されるであろう。標的との完全なマッチにおいて、８塩基という短さの連続ヌクレオチド配列又はオリゴマーで十分であり得るが、一般にはより長い、例えば１０又は１２、好ましくは１２−１６塩基であろう。オリゴマーの最大サイズは、因子、例えば生産費用及び簡便性、そのオリゴマーを操作して標的ｍＲＮＡを担持する細胞へそのオリゴマーを導入できるかどうか、さらに所望の結合親和性及び標的特異性などの因子によって決定されるであろう。長すぎる場合、増加した数のミスマッチに望まずして耐える場合があり、これにより非特異的結合が生じ得る。
【００３８】
１つの態様としては、オリゴマーに存在する少なくとも１つの核酸塩基は、５−メチルシトシン、イソシトシン、プソイドイソシトシン（ｐｓｅｕｄｏｉｓｏｃｙｔｏｓｉｎｅ）、５−ブロモウラシル、５−プロピニルウラシル、６−アミノプリン、２−アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン及び２−クロロ−６−アミノプリンからなる群から選択される修飾核酸塩基である。
【００３９】
親和性増大ヌクレオチド類似体を、オリゴマー核酸塩基配列、例えば、ＬＮＡ又は２’−置換糖、好ましくはＬＮＡに組み込むと、特異的に結合するオリゴヌクレオチドのサイズを減少させることができ、また非特異的又は異所性の結合が起こる前にオリゴヌクレオチドのサイズの上限を減少させ得る。親和性増大ヌクレオチド類似体は、オリゴマーの核酸塩基配列に挿入した場合に、親和性増大ヌクレオチド類似体の代わりにＤＮＡヌクレオチドを含む同等のオリゴマーと比較して、相補的ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ標的）と二本鎖を形成した際のオリゴマーのＴｍ上昇がおこるものの１つである。
【００４０】
本発明のオリゴマーは、典型的には、１０−５０核酸塩基、例えば１０−３０核酸塩基からなる、又はこれを含む。
【００４１】
特に好ましい化合物は、約１０−約３０核酸塩基、又は１２−２５核酸塩基を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドからなり、最も好ましくは、１３−１８核酸塩基、例えば、１３、１４、１５、１６又は１７核酸塩基を含むアンチセンス化合物である。
【００４２】
１つの態様としては、本発明によるオリゴマーは、２２以下の核酸塩基、例えば、２０以下の核酸塩基、例えば、１８以下の核酸塩基、例えば、１５、１６又は１７核酸塩基からなり、必要に応じて１以上の非核酸塩基要素、例えばコンジュゲートしている。
【００４３】
１つの態様としては、本オリゴマー又は連続核酸塩基配列は１０−２２核酸塩基長を有する。
【００４４】
１つの態様としては、本オリゴマー又は連続核酸塩基配列は１０−１８核酸塩基長を有する。
【００４５】
１つの態様としては、本オリゴマー又は連続核酸塩基配列は１０−１６核酸塩基長を有する。
【００４６】
１つの態様としては、本オリゴマー又は連続核酸塩基配列は１２−１６核酸塩基長を有する。
【００４７】
１つの態様としては、本オリゴマー又は連続核酸塩基配列は１２−１４核酸塩基長を有する。
【００４８】
１つの態様としては、本オリゴマー又は連続核酸塩基配列は１４−１６核酸塩基長を有する。
【００４９】
１つの態様としては、本オリゴマー又は連続核酸塩基配列は１４−１８核酸塩基長を有する。
【００５０】
１つの態様としては、本オリゴマー又は連続核酸塩基配列は１４、１５、又は１６核酸塩基長である。
【００５１】
１つの態様としては、本オリゴマー又は連続核酸塩基配列は２０核酸塩基長未満である。
【００５２】
好ましい配列
本発明の標的配列は、非限定的な１つの態様としては、以下のように同定され得る。第１の工程において、標的遺伝子における保存されている領域を同定する。それらの保存されている領域のうち、多形性を有する配列はいずれも、この領域の標的配列に結合するよう設計されたオリゴマーの結合特異性及び／又は親和性に影響する可能性があるので、通常除外される（特別な目的で必要でない限り）。パリンドローム又は繰り返し配列を有する領域はいずれも通常は除外される。次いで、残りの領域を解析し、適切な長さ（例えば、本明細書において称するオリゴマー／連続核酸塩基配列の長さ）、例えば１０−５０核酸塩基、好ましくは１０−２５核酸塩基、より好ましくは１０、１１、１２、１３、１４、１５又は１６核酸塩基の候補標的配列を同定する。コンピューター解析に基づいて、ダイマー又はヘアピン構造などの構造を形成しやすい標的配列は通常は除外される。
【００５３】
好ましくはこれらの候補標的配列は、動物界を通して、又は少なくとも前臨床試験に必要そうな動物の間で高度の配列相同性を示す。このことは、動物モデルにおいて試験すべき、同定されたオリゴマー配列、及び対応するオリゴマー、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を可能にする。特に有用なのは、ヒト、チンパンジー、イヌ、ラット、マウス、最も好ましくはヒト及びマウス（及び／又はラット）において保存されている標的配列である。
【００５４】
１つの態様としては、本発明の化合物はポリヌクレオチド領域（典型的には核酸塩基／ヌクレオチドが連続配列からなる）、すなわち核酸塩基領域、及びさらなる非核酸塩基領域の両方を含み得る。核酸塩基配列からなる本発明の化合物を言及する場合、その化合物は非核酸塩基成分、例えばコンジュゲート成分を含み得る。
【００５５】
あるいは、本発明の化合物は完全に（連続）核酸塩基領域からなり得る。
【００５６】
１つの態様としては、本発明のオリゴマーは、配列番号５、６、７、８、９、１０、及び１１からなる群から選択される、又はその相補鎖に対応する連続ヌクレオチド配列であり、該オリゴマー（又はその連続核酸塩基部分）が該選択された配列に対して、任意に１、２、又は３のミスマッチを含んでいてもよい（連続）核酸塩基配列、例えば１２、１３、１４、１５、１６、１７又は１８核酸塩基を含む、又はからなる。
【００５７】
好ましいオリゴマーは、配列番号５、６、７、８、９、１０、及び１１から選択される配列に含まれる連続ヌクレオチド配列に対して相補的であり、該オリゴマー（又はその連続核酸塩基部分）が該選択された配列に対して、任意に１、２、又は３のミスマッチを含んでいてもよい（連続）核酸塩基配列である１２−１８の連続核酸塩基長、例えば１２、１３、１４、１５、１６、１７、又は１８連続核酸塩基を含む、又はからなる。
【００５８】
他の好ましいオリゴマーは、核酸塩基配列が、配列番号５、６、７、及び８、又はその相補鎖核酸塩基配列であり、該オリゴマー（又はその連続核酸塩基部分）が該選択された配列に対して、任意に１、２、又は３のミスマッチを含んでいてもよい（連続）核酸塩基配列である、例えば１４、１５、又は１６の連続核酸塩基長である核酸塩基配列を含む。
【００５９】
１つの態様としては、オリゴマー（又はその連続核酸塩基部分）は、１つの配列が配列番号１２ないし配列番号１１６からなる群から選択される、又は少なくともその１０の連続核酸塩基のサブ配列、例えばその１１、１２、１３、１４、１５、又は１６からなる群から選択される配列の１の連続核酸塩基であり、該オリゴマー（又はその連続核酸塩基部分）が該選択された配列に対して、任意に１、２、又は３のミスマッチを含んでいてもよい核酸塩基配列から選択され、又はこれを含む。
【００６０】
１つの態様としては、オリゴマー（又はその核酸塩基部分）は、以下の：配列番号１２、１５、１８、１９、２３、２４、及び２７、又は、その少なくとも１０の連続核酸塩基のサブ配列、例えばその１１、１２、１３、１４、１５、又は１６からなる群から選択される配列の１の連続核酸塩基であり、該オリゴマー（又はその連続核酸塩基部分）が該選択された配列に対して、任意に１、２、又は３のミスマッチを含んでいてもよい核酸塩基配列から選択され、又はこれを含む。
【００６１】
１つの態様としては、オリゴマー（又はその核酸塩基部分）は、核酸塩基配列は以下からなる群：配列番号１２ないし１１６、又はその配列に存在する少なくとも１２、１３、１４、１５、又は１６連続核酸塩基の配列からなる、又はこれに対応し、オリゴマー中に存在するヌクレオチドは対応するヌクレオチド類似体によって置換され得、また該オリゴマーは任意にその選択された配列に対して１、２、又は３ミスマッチを含んでいてもよい核酸塩基配列からなる、又はこれを含む。
【００６２】
１つの態様としては、本発明によるオリゴマーは、配列番号１２、例えば配列番号１１８核酸塩基配列からなる、又はこれを含む。
【００６３】
１つの態様としては、本発明によるオリゴマーは、配列番号１５、例えば配列番号１２２核酸塩基配列からなる、又はこれを含む。
【００６４】
１つの態様としては、本発明によるオリゴマーは、配列番号１８、例えば配列番号１１９核酸塩基配列からなる、又はこれを含む。
【００６５】
１つの態様としては、本発明によるオリゴマーは、配列番号１９、例えば配列番号１２０核酸塩基配列からなる、又はこれを含む。
【００６６】
１つの態様としては、本発明によるオリゴマーは、配列番号２３、例えば配列番号１２３核酸塩基配列からなる、又はこれを含む。
【００６７】
好ましくは、本発明によるオリゴマーは、配列番号２４、例えば配列番号１１７核酸塩基配列からなる、又はこれを含む。
【００６８】
好ましくは、本発明によるオリゴマーは、配列番号２７、例えば配列番号１２１核酸塩基配列からなる、又はこれを含む。
【００６９】
１つの態様としては、本発明のオリゴマーの連続核酸塩基配列は、少なくともヒトＦＡＢＰ４の標的ｍＲＮＡに対しては、１００％相補的であり、さらに少なくとも１のほ乳類、例えば、イヌ、ラット、マウス、チンパンジーＦＡＭＰ４ ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ配列の標的ｍＲＮＡに対して相補的である。しかし、そのようなオリゴマーには、１または２のミスマッチが生じることが予測される。ヒト、及び／又は他の標的ホ乳類の連続核酸塩基配列には、ミスマッチが生じることが予想されたが、しかし、好ましくはミスマッチが存在しないことである。この観点から、図４はヒト及びマウスのＦＡＢＰ４ポリペプチドをコードするヒト及びマウスのそれぞれの核酸間のアライメントを示す。表１は、ＮＣＢＩ遺伝子バンクアクセッション番号により提供される適切なＦＡＢＰ４ポリヌクレオチドおよび対応するポリペプチドを提供する。他の哺乳類種からの特定の既知のアレル変異体および既知の相同体は、表１にて参照する配列を用いてＢＬＡＳＴ検索を行うことにより容易に同定され得る。
【００７０】
好ましい態様としては、本発明のオリゴマーは、例えば少なくとも１２、例えば少なくとも１３、例えば少なくとも１４、例えば少なくとも１５、例えば少なくとも１６、例えば少なくとも１７、例えば少なくとも１８、例えば１２、１３、１４、１５、１６、１７、又は１８の連続核酸塩基からなり、又はこれを含み、これらはヒト及び／又はマウスのいずれのＦＡＢＰ４をコードする核酸にも（対応領域において）相補的であり、例えば配列番号１（ヒト）、及び３（マウス）である−図４参照。
【表１】
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【００７１】
相補性及びミスマッチ
好ましくは、オリゴマーは、ほ乳類ＦＡＢＰ４をコードする核酸の対応領域において相補的な核酸塩基配列を含む、すなわちアンチセンス核酸塩基配列を含むことである。
【００７２】
特に好ましくは、オリゴマーは、ほ乳類ＦＡＢＰ４をコードする核酸中の１０−３０ヌクレオチドに相補的な連続核酸塩基配列又は１及び／又は３、又はそれらの変異アレル等価体からなる、又はこれを含む。
【００７３】
しかし、ある態様としては、オリゴマーは、標的配列をハイブリダイズする際、及び標的に十分結合し、例えば、標的の下方制御といった望ましい効果を示すのに、１、２、３、４、又は４（又はそれより多数）のミスマッチに耐えうる。ミスマッチは、例えば、オリゴマー核酸塩基配列長の増加、及び／又は、例えばＬＮＡといった類似体の増加が核酸塩基配列中に存在することにより補われうる。
【００７４】
１つの態様としては、連続核酸塩基配列は、ホ乳類ＦＡＢＰ４をコードする対応核酸領域において、例えば３つ以下、例えば２つ以下のミスマッチである。
【００７５】
１つの態様としては、連続核酸塩基配列は、ホ乳類ＦＡＢＰ４をコードする対応核酸領域において、例えば１つ以下のミスマッチである。
【００７６】
１つの態様としては、オリゴマーは、連続核酸塩基配列は、ホ乳類ＦＡＢＰ４をコードする対応核酸領域の相補鎖において、すなわち少なくとも８０％の相同性を有し、例えば、例えば１よりも多いミスマッチを含まない。例えば、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９３１/３％、９３．７５％、９４％、９５％、９６％又は少なくとも９７％の相同性、例えば９８％、例えばコードする対応核酸領域の相補鎖において、１００％相補的（完全に相補的）である。
【００７７】
「相補的（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」とは、相補性の割合の指標がないため、完全に相補的であることを１００％相補性があると言い、理解する。
【００７８】
１つの態様としては、本発明のオリゴマーは、ホ乳類ＦＡＢＰ４をコードする対応核酸領域において、１００％相補的な連続核酸塩基配列からなり、例えば配列番号１、及び／又は３又はその天然アレル変異体である。
【００７９】
しかし、１つの態様としては、オリゴマー又は連続核酸塩基配列は、ＦＡＢＰ４ポリペプチドをコードする核酸と比較した場合に、１つ以上のミスマッチを含みうると考えられる。
【００８０】
１つの態様としては、本発明のオリゴマーは好ましくは、ＦＡＢＰ４ポリペプチドをコードする核酸、例えば、配列番号２の天然アレル変異体に存在する配列の対応領域において、４つ以下、例えば３つ以下、例えば２以下、例えば１以下のミスマッチである。
【００８１】
ヌクレオチド類似体
ヌクレオチドのみからなる好ましいヌクレオチド配列モチーフ又はヌクレオチド配列を参照する場合、その配列により規定される本発明のオリゴマーは、その配列に存在する１つ以上のヌクレオチドのかわりに、オリゴマー／標的二本鎖の二本鎖安定性／Ｔｍを上昇させる対応するヌクレオチド類似体（すなわち親和性増大ヌクレオチド類似体）、例えば、ＬＮＡユニット又は他のヌクレオチド類似体を含み得ることが認識されるであろう。
【００８２】
さらに、ヌクレオチド類似体はインビボにおいて、オリゴマーの安定性を増大させ得る。
【００８３】
適切な好ましいヌクレオチド類似体の例は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ２００６／０００５１２号に提供され、又は参照されている。
【００８４】
オリゴマー核酸塩基配列、例えば、ＬＮＡ又は２’−置換糖、好ましくはＬＮＡに、親和性増大ヌクレオチド類似体を組み込むと、特異的に結合するオリゴヌクレオチドのサイズを減少させることができ、また非特異的又は異所性の結合が起こる前にオリゴヌクレオチドのサイズの上限を減少させることもできる。
【００８５】
適切には、オリゴマーの核酸塩基配列又は連続核酸塩基配列がＦＡＢＰ４標的配列の対応する領域に対して完全には相補的でない場合に、１つの態様としては、オリゴマーが親和性増大ヌクレオチド類似体を含む場合は、かかるヌクレオチド類似体は、ＦＡＢＰ４標的におけるそれらの対応するヌクレオチドとの相補体を形成する。
【００８６】
よって、そのオリゴマーは、天然ヌクレオチド（好ましくは２’−デオキシヌクレオチド（本明細書において一般に「ＤＮＡ」と称する）であるが、リボヌクレオチド（本明細書において一般に「ＲＮＡ」と称する）もあり得る）の単純配列を含み得、又はからなり得、又は１以上のヌクレオチド「類似体」を含み得る（場合により完全に１以上のヌクレオチド「類似体」からなり得る）。
【００８７】
ヌクレオチド「類似体」は糖及び／又は塩基及び／又はリン酸塩部分の修飾により生じる天然ＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオチドの変異体である。用語「核酸塩基」は、天然（ＤＮＡ又はＲＮＡタイプ）ヌクレオチドならびにそれらのかかる「類似体」を包括するために用いられ得る。類似体は原則的に、オリゴヌクレオチドの文脈において天然ヌクレオチドに対して単に「サイレント」又は「同等（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）」であり得る、すなわち、そのオリゴヌクレオチドがβカテニン発現に対して作用する際に何ら機能的影響を有さない。かかる「同等」類似体は、例えば、それらがより簡単に又は安価に製造することができる、又は保管又は製造条件においてより安定である、又はタグ又は標識を表すものであっても、依然として有用であり得る。しかしながら、好ましくは、その類似体は、オリゴマーが発現を阻害するように作用する際に、例えば、標的に対する増大した結合親和性、及び／又は細胞内ヌクレアーゼに対する増大した耐性、及び／又は細胞内への輸送の増大した簡便性を生ずることによる機能的効果を有するであろう。
【００８８】
ヌクレオチドのかかる修飾の例には、２’−置換基を生じさせる、又は、結合親和性を促進し、おそらくいくつかの増大したヌクレアーゼ耐性も提供する架橋（ｂｒｉｄｇｅｄ）（ロックド核酸）構造を生じさせる、糖部分の修飾；通常のリン酸ジエステルから、ヌクレアーゼによる攻撃に対して、より耐性のもの、例えば、ホスホロチオエート又はボラノホスフェート（これら２つはリボヌクレアーゼＨにより切断可能であり、βカテニン発現の調節におけるアンチセンス阻害経路も可能とする）までのヌクレオチド間結合の修飾が含まれる。
【００８９】
好ましくは、ヌクレオチド類似体はＬＮＡ、例えばβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、α−Ｌ−オキシ−ＬＮＡ、β−Ｄ−アミノ−ＬＮＡ、及びβ−Ｄ−チオ−ＬＮＡであり、最も好ましくはβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡである。
【００９０】
いくつかの態様において、オリゴマーは３−８ヌクレオチド類似体、例えば６又は７ヌクレオチド類似体を含む。圧倒的にもっとも好ましい態様において、ヌクレオチド類似体の少なくとも１つはロックド核酸（ＬＮＡ）である；例えばヌクレオチド類似体の少なくとも３又は少なくとも４、又は少なくとも５、又は少なくとも６、又は少なくとも７、又は８は、ＬＮＡであり得る。いくつかの態様において、全てのヌクレオチド類似体はＬＮＡであり得る。
【００９１】
いくつかの態様において、本発明のオリゴマー内の本明細書にて言及される領域Ａ及びＣに存在するヌクレオチド類似体は、例えば以下から独立して選択される：２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡユニット、２’−アミノ−ＤＮＡユニット、２’−フルオロ−ＤＮＡユニット、ＬＮＡユニット、アラビノ核酸（ＡＮＡ）ユニット、２’−フルオロ−ＡＮＡユニット、ＨＮＡユニット、ＩＮＡ（インターカレート核酸）ユニット及び２’ＭＯＥユニット。また、本発明のオリゴマーに存在するヌクレオチド類似体は全て同様に塩基変化を許容するものであると考えられる。
【００９２】
２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ（２’ＭＯＥ）、２’−フルオロ−ＤＮＡモノマー及びＬＮＡは好ましいヌクレオチド類似体であり、よって本発明のオリゴヌクレオチドはこれらの３タイプの類似体から独立して選択されるヌクレオチド類似体を含み得、又は３タイプから選択される類似体のうち１つのみを含み得る。
【００９３】
好ましくは、本発明のオリゴマーは、少なくとも１のロックド核酸（ＬＮＡ）ユニット、例えば１、２、３、４、５、６、７、又は８ＬＮＡユニット、好ましくは４ないし８のＬＮＡユニット、最も好ましくは４、５、及び６ＬＮＡユニットである。適切には、オリゴマーは、オリゴマーは、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、及び１つ以上の以下のＬＮＡユニットの両方を含む：チオ−ＬＮＡ、アミノ−ＬＮＡ、オキシ−ＬＮＡ、ｅｎａ−ＬＮＡ及び／又はα−ＬＮＡ、β−Ｄ、又はα−Ｌいずれの立体配置であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。
【００９４】
本発明の１つの態様としては、オリゴマーは、ＬＮＡ及びＤＮＡユニットを含んでいてもよい。好ましくは、ＬＮＡ、ＤＮＡユニットである。好ましくは、合計のＬＮＡ及びＤＮＡユニットは、１０−２５である、好ましくは１０−２０、更に好ましくは１２−１６である。
【００９５】
本発明の１つの態様としては、オリゴマーの核酸塩基配列、例えば、連続核酸塩基配列は、少なくとも１つのＬＮＡからなり、残りの核酸塩基がＤＮＡである。
【００９６】
ある態様としては、本発明のオリゴマーは、例えば、ＬＮＡ、全てのＬＮＡ Ｃユニットは、５’メチルシトシンであるアンチセンスオリゴヌクレオチドである。ある態様としてはすべてのヌクレオチド類似体がＬＮＡである。
【００９７】
最も好ましい態様は、オリゴマーがＬＮＡヌクレオチド類似体及びヌクレオチドのみを含む（ＲＮＡ又はＤＮＡ、最も好ましくは、任意に修飾した核酸塩基間結合、例えばホスホロチオエート結合ＤＮＡヌクレオチド）。
【００９８】
いくつかの態様において、少なくとも１のそのヌクレオチド類似体は２’−ＭＯＥ−ＲＮＡである、例えば、２、３、４、５、６、７又は８の２’−ＭＯＥ−ＲＮＡ核酸塩基ユニットである。
【００９９】
いくつかの態様において、少なくとも１つの該ヌクレオチド類似体は、２’−フルオロＤＮＡである、例えば、２、３、４、５、６、７又は８の２’−フルオロ−ＤＮＡ核酸塩基ユニットである。
【０１００】
本発明のオリゴマーにおいて用いられ得るヌクレオシド類似体の具体例は、例えばＦｒｅｉｅｒ＆Ａｌｔｍａｎｎ； Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．， １９９７，２５，２９−４４４３及びＵｈｌｍａｎｎ； ＣＵＲＲ． Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ, ２０００, ３（２）, ２９３−２１３及びスキーム１に記載されている：
【化１】
2010537958.tif 000003
【０１０１】
用語「ＬＮＡ」は「ロックド核酸」として知られる二環式ヌクレオチド類似体を意味する。それはＬＮＡモノマーを意味する場合もあり、又は「ＬＮＡオリゴヌクレオチド」の文脈において用いる場合、１以上のかかる二環式ヌクレオチド類似体を含有するオリゴヌクレオチドを意味する場合もある。本発明のオリゴヌクレオチド化合物において用いるＬＮＡは好ましくは以下の一般式の構造を有する：
【化２】
2010537958.tif 000004
［式中、Ｘ及びＹは−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｈ）−、Ｎ(Ｒ)−、−ＣＨ２−又はＣＨ−（二重結合の一部の場合）、−ＣＨ２−Ｏ−、−ＣＨ２−Ｓ−、−ＣＨ２−Ｎ（Ｈ）−、−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−、−ＣＨ２−ＣＨ２−又はＣＨ２−ＣＨ−（二重結合の一部の場合）、−ＣＨ＝ＣＨ−からなる群から独立して選択され、ここでＲは水素及びＣ１−４−アルキルから選択され；
Ｚ及びＺ＊はヌクレオシド間結合、末端基又は保護基から独立して選択され；
Ｂは天然又は非天然ヌクレオチド塩基部分を構成し；不斉基はいずれかの配向にて見られ得る］。
【０１０２】
好ましくは、本発明のオリゴマーに用いられるＬＮＡは以下のいずれかの式による少なくとも１つのＬＮＡユニットを含む：
【化３】
2010537958.tif 000005
［式中、Ｙは−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、又はＮ（ＲＨ）であり；Ｚ及びＺ＊はヌクレオシド間結合、末端基又は保護基から独立して選択され;Ｂは天然又は非天然ヌクレオチド塩基部分を構成し、ＲＨは水素及びＣ１−４−アルキルから選択される］。
【０１０３】
好ましくは、本発明のオリゴマーに用いるＬＮＡは−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ、Ｓ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）２−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ、Ｓ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）２−Ｓ−、−Ｏ−ＰＯ（ＲＨ）−Ｏ−、Ｏ−ＰＯ（ＯＣＨ３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＮＲＨ）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｓ−Ｒ）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＢＨ３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＮＨＲＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、ＮＲＨ−ＣＯ−Ｏ−から選択されるヌクレオシド間結合を含み、ここでＲＨは水素及びＣ１−４−アルキルから選択される。
【０１０４】
特に好ましいＬＮＡユニットをスキーム２に示す：
【化４】
2010537958.tif 000006
【０１０５】
用語「チオ−ＬＮＡ」は、上記一般式において少なくとも１つのＸ又はＹがＳ又はＣＨ２−Ｓ−から選択されるロックドヌクレオチドを含む。チオ−ＬＮＡはβ−Ｄ−及びα−Ｌ−立体配置の両方の形態であり得る。
【０１０６】
用語「アミノ−ＬＮＡ」は、上記の一般式において少なくとも１つのＸ又はＹが−Ｎ(Ｈ)−、Ｎ(Ｒ)−、ＣＨ２−Ｎ(Ｈ)−及びＣＨ２−Ｎ(Ｒ)−から選択され、ここでRが水素及びＣ１−４−アルキルから選択される、ロックドヌクレオチドを含む。アミノ−ＬＮＡはβ−Ｄ−及びα−Ｌ−立体配置の両方の形態であり得る。
【０１０７】
用語「オキシ−ＬＮＡ」は、上記の一般式において少なくとも１つのＸ又はＹが−Ｏ−又はＣＨ２−Ｏ−を表すロックドヌクレオチドを含む。オキシ−ＬＮＡはβ−Ｄ−及びα−Ｌ−立体配置の両方の形態であり得る。
【０１０８】
用語「ｅｎａ−ＬＮＡ」は、上記の一般式においてＹが−ＣＨ２−Ｏ−であるロックドヌクレオチド（ここで−ＣＨ２−Ｏ−の酸素原子は塩基Ｂに対して２’位に結合している）を含む。
【０１０９】
好ましい態様において、ＬＮＡはβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、アルファ−Ｌ−オキシ−ＬＮＡ、β−Ｄ−アミノ−ＬＮＡ及びβ−Ｄ−チオＬＮＡ、特にβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡから選択される。
【０１１０】
間隔について記述「の間（ｂｅｔｗｅｅｎ）」を用いる場合は、例えば「３から９の間のヌクレオチド類似体」、例えば「３から９の間のヌクレオチド類似体」又は「２−８の間」、又は「１２−２０の間」両方が最初及び最後の「ヌクレオチド類似体」、記述された間隔の、両方の最初と最後の数字を含む。
【０１１１】
好ましくは、本発明のオリゴマーは少なくとも１つのヌクレオチド類似体、例えばロックド核酸（ＬＮＡ）ユニット、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のヌクレオチド類似体、例えばロックド核酸（ＬＮＡ）ユニット、好ましくは、３から９のヌクレオチド類似体、例えばＬＮＡユニット、例えば４−８のヌクレオチド類似体、例えばＬＮＡユニット、例えば６−９ヌクレオチド類似体、例えばＬＮＡユニット、好ましくは６、７、又は８ヌクレオチド類似体、例えば、ＬＮＡユニットである。
【０１１２】
本発明のオリゴマー、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５のヌクレオチド類似体、例えばＬＮＡユニット、特に３、４、５、６、７、８、９、又は１０ヌクレオチド類似体、例えばＬＮＡユニット、例えば１から１０の間のヌクレオチド類似体、例えばＬＮＡユニット、例えば２から８の間のヌクレオチド類似体、例えばＬＮＡユニットを含んでいてもよい。
【０１１３】
好ましくは、ＬＮＡユニットは、少なくとも１つのβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡユニット、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡユニットを含む。
【０１１４】
本発明の化合物、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１タイプより多いＬＮＡユニットを含み得る。適切には、本化合物はβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、及び１以上の以下のＬＮＡユニットの両方を含み得る：β−Ｄ−又はＬ−アルファ立体配置又はそれらの組み合わせにおける、チオ−ＬＮＡ、アミノ−ＬＮＡ、オキシ−ＬＮＡ、ｅｎａ−ＬＮＡ及び／又はアルファ−ＬＮＡ。
【０１１５】
好ましくは、本化合物、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドは、両方のヌクレオチド類似体、例えばＬＮＡユニット及びＤＮＡユニットを含み得る。好ましくは、核酸塩基、例えばＬＮＡ及びＤＮＡユニットの合わせた合計は、１２−２０、例えば、１４−２０、例えば、１５−１８、例えば、１５、１６又は１７核酸塩基ユニットであり、又は本明細書にて称するショートマーである。好ましくは本発明のオリゴマー化合物に存在するＤＮＡに対するヌクレオチド類似体の比率は、０．３から１、より好ましくは０．４から０．９、例えば０．５から０．８である。
【０１１６】
ＬＮＡを用いる利点及び、ＬＮＡ及びＬＮＡヌクレオチドを製造し精製する方法は、ＰＣＴ／ＤＫ２００６／０００５１２に開示されており、ここに参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１１７】
１つの態様としては、本発明のオリゴマーはいかなるＲＮＡユニットも含まない。等価なヌクレオチドに比べて、オリゴマー／標的核酸標的のＴｍを増加させるヌクレオチド類似体が好ましい（親和性増大ヌクレオチド類似体）。
【０１１８】
好ましい１つの態様としては、オリゴヌクレオチドは、標的核酸、例えば、対応するＦＡＢＰ４ ｍＲＮＡにハイブリダイズし、少なくとも３７℃、例えば、少なくとも４０℃、少なくとも５０℃、少なくとも５５℃、又は少なくとも６０℃のＴｍを有する二本鎖を形成することができる。一局面において、Ｔｍは３７℃から８０℃、例えば、５０から７０℃、又は４０から６０℃、又は４０から７０℃である。１つの態様としては、Ｔｍは８０℃より低く、例えば、７０℃より低い、又は６０℃より低い、又は５０℃より低い。
【０１１９】
リボヌクレアーゼＨ動員及びギャップマーオリゴヌクレオチド
オリゴマー又は連続核酸塩基ユニットは、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６の核酸塩基を含む、少なくとも６核酸塩基残基、例えば少なくとも７、例えば少なくとも８又は少なくとも９核酸塩基残基の連続的な（連続）配列を含み、哺乳類ＦＡＢＰ４をコードするポリヌクレオチドのそれぞれに対応する相補的標的ＲＮＡと二本鎖を形成する場合、リボヌクレアーゼＨを動員することができるものが好ましい。そのような領域は、本明細書中においてはサブ配列と言及する。１つの態様としては、本明細書中、ギャップマーの文脈において言及される場合、サブ領域は領域Ｂである。
【０１２０】
欧州特許出願公開第１２２２３０９号明細書は、リボヌクレアーゼＨ活性を測定するためのインビトロにおける方法を提供しており、それはリボヌクレアーゼＨを動員する能力を決定するのに用いられ得る。オリゴマーは、相補的ＲＮＡ標的を与えられた時に、欧州特許出願公開第１２２２３０９号明細書の実施例９１−９５に提供されている方法論を用いて測定して、２’置換を有さず、オリゴヌクレオチド内の全てのヌクレオチド間にホスホロチオエート結合基を有する同等のＤＮＡのみのオリゴヌクレオチドの少なくとも１％、例えば、少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％の初速度（ｐｍｏｌ／ｌ／／/分）、又は２０％未満の初速度を有する場合に、リボヌクレアーゼＨを動員することが可能であると見なされる。
【０１２１】
オリゴマーは、相補的ＲＮＡ標的及びリボヌクレアーゼＨを与えられた時に、欧州特許出願公開第１２２２３０９号明細書の実施例９１−９５に提供されている方法論によって測定されたそのリボヌクレアーゼＨの初速度（ｐｍｏｌ／ｌ／／分）が、２’置換を有さず、オリゴヌクレオチド内の全てのヌクレオチド間にホスホロチオエート結合基を有する同等のＤＮＡのみのオリゴヌクレオチドを用いて測定された初速度の１％未満、例えば、５％未満、例えば、１０％未満又は２０％未満である場合に、リボヌクレアーゼＨを動員する能力が実質的にないと見なされる。
【０１２２】
典型的には、ＦＡＢＰ４の相補的標的ＲＮＡと二本鎖を形成する場合、連続核酸塩基ユニットを形成するオリゴマー領域はリボヌクレアーゼＨを動員することができ、ＲＮＡ標的をもつＤＮＡ／ＲＮＡ様二本鎖を形成する核酸塩基ユニットであり、及びα−Ｌ立体配置にあるＤＮＡユニット及びＬＮＡユニットの両方、特に好ましくはα−Ｌ−オキシ−ＬＮＡ、を有する。
【０１２３】
本発明のオリゴマーは、ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体の両方を含む核酸塩基配列を含み得、ギャップマー、ヘッドマー（ｈｅａｄｍｅｒ）又はミックスマー（ｍｉｘｍｅｒ）の形態であり得る。
【０１２４】
ヘッドマーは５’末端のヌクレオチド類似体の連続鎖、及び３’末端に向けて続くリボヌクレアーゼＨによって認識及び切断可能なＤＮＡ又は修飾核酸塩基ユニットの連続鎖（例えば少なくとも7のかかる核酸塩基）により規定され、テイルマー（ｔａｉｌｍｅｒ）はリボヌクレアーゼＨによって認識及び切断可能な５’末端のＤＮＡ又は修飾モノマーの連続鎖（例えば、少なくとも7のかかる核酸塩基）、及び３’末端に向けて続くヌクレオチド類似体の連続鎖により規定される。本発明による他のキメラは、リボヌクレアーゼＨにより認識及び切断可能なＤＮＡ又は修飾モノマーとヌクレオチド類似体の交互の組成からなるミックスマーと呼ばれる。いくつかのヌクレオチド類似体は、リボヌクレアーゼＨ結合及び切断を媒介することも可能であり得る。α−Ｌ−ＬＮＡはリボヌクレアーゼＨ活性をある程度動員するので、ギャップマーコンストラクトのためにリボヌクレアーゼＨにより認識及び切断可能なＤＮＡ又は修飾モノマーのより小さいギャップが要求される可能性があり、ミックスマーコンストラクトにおいてより高い柔軟性が導入され得る。
【０１２５】
好ましくは、本発明の化合物はギャップマーであるアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【０１２６】
好ましくは、ギャップマーは、式（５’から３’に向けて）Ａ−Ｂ−Ｃ（及び必要に応じてＤ）の（ポリ）核酸塩基配列を含む；ここで
【０１２７】
Ａ（５’領域）は、少なくとも１つのヌクレオチド類似体、例えば少なくとも１つのＬＮＡユニット、例えば、１−６ヌクレオチド類似体、例えば、ＬＮＡユニット、好ましくは２−５ヌクレオチド類似体、例えば、２−５ＬＮＡユニット、例えば、２、３、又は４ヌクレオチド類似体、例えば、２、３又は４ＬＮＡユニットからなる、又はこれを含む、及び；
【０１２８】
Ｂ（中央ドメイン）は、好ましくは直接Ａの３’に接し（すなわち連続）、リボヌクレアーゼＨを動員することができる少なくとも５の連続核酸塩基、例えば、５−１２連続核酸塩基、例えば５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２の連続核酸塩基からなる、又はこれを含む；
【０１２９】
Ｃ（３’領域）は好ましくは直接Ｂの３’に接し、少なくとも１つのヌクレオチド類似体、例えば、少なくとも１つのＬＮＡユニット、例えば、１−６ヌクレオチド類似体、例えば２−５ヌクレオチド類似体、例えば２−５ＬＮＡユニット、最も好ましくは２、３又は４ヌクレオチド類似体、例えば２、３又は４ＬＮＡユニットからなる、又はこれを含む。
【０１３０】
Ｄ（任意に３’末端であってもよく）、１つ又は２つのヌクレオチド、例えばＤＮＡヌクレオチドからなるものであってよい。
【０１３１】
好ましいギャップマー設計は国際公開第２００４／０４６１６０号パンフレットに開示されている。
好ましいギャップマー設計には以下の場合が含まれる：
Ａ  ２、３又は４連続ヌクレオチド類似体からなる、又はこれを含む
Ｂ  リボヌクレアーゼＨを動員することができる７、８、９、又は１０連続ＤＮＡヌクレオチド又は同等の核酸塩基からなる、又はこれを含む
Ｃ  ２、３又は４連続ヌクレオチド類似体からなる、又はこれを含む
Ｄ  存在する場合、１つのＤＮＡヌクレオチドからなる。
又は、
Ａ  ３又は４連続ヌクレオチド類似体からなる、又はこれを含む
Ｂ  リボヌクレアーゼＨを動員することができる７、８、９、又は１０連続ＤＮＡヌクレオチド又は同等の核酸塩基からなる、又はこれを含む
Ｃ  ３又は４連続ヌクレオチド類似体からなる、又はこれを含む
Ｄ  存在する場合、１つのＤＮＡヌクレオチドからなる。
又は、
Ａ  ３連続ヌクレオチド類似体からなる、又はこれを含む
Ｂ  リボヌクレアーゼＨを動員することができる９連続ＤＮＡヌクレオチド又は同等の核酸塩基からなる、又はこれを含む
Ｃ  ３連続ヌクレオチド類似体からなる、又はこれを含む
Ｄ  存在する場合、１つのＤＮＡヌクレオチドからなる。
又は、
Ａ  ４連続ヌクレオチド類似体からなる、又はこれを含む
Ｂ  リボヌクレアーゼＨを動員することができる８連続ＤＮＡヌクレオチド又は同等の核酸塩基からなる、又はこれを含む
Ｃ  ４連続ヌクレオチド類似体からなる、又はこれを含む
Ｄ  存在する場合、１つのＤＮＡヌクレオチドからなる。
【０１３２】
１つの態様としては、領域Ａ及び／又はＣは特定の数のヌクレオチド類似体からなる。
【０１３３】
１つの態様としては、領域Ａ及び／又はＣは、また５’末端ヌクレオチドユニット（ヌクレオチド類似体ではない）を含んでいてもよく−例えば、さらに１、２、３、又は４ヌクレオチド−これらは領域Ａ又はＣの特定の核酸塩基に付加的に含んでいてもよいことが認識できる。しかし、好ましくは領域Ａ及びＣは定義された核酸塩基からなる。
【０１３４】
Ｂは、ＤＮＡユニットを含む、又はからなる。１つの態様としては、Ｂ（中央ドメイン）は、少なくとも１つのＤＮＡ糖ユニット、例えば１−１２ＤＮＡユニット、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２ＤＮＡユニット、好ましくは４−１２ＤＮＡユニット、より好ましくは６−１０ＤＮＡユニット、例えば７−１０ＤＮＡユニット、最も好ましくは、８、９、又は１０ＤＮＡユニットである。
【０１３５】
１つの態様としては、同じでも異なっていてもよいが、領域Ｂは、リボヌクレアーゼＨを動員することができる特定の数の核酸塩基からなる。
【０１３６】
中央ドメイン（Ｂ）における１以上のＤＮＡヌクレオチドは、１つ以上において置換され得、又はさらには全てのＤＮＡヌクレオチドが、リボヌクレアーゼＨを動員することができるヌクレオチド類似体を含む、核酸塩基によって置換され得る。α−Ｌ立体配置の形態のＬＮＡ核酸塩基、例えばα−Ｌ−オキシ−ＬＮＡは、リボヌクレアーゼＨを動員できるので、領域Ｂに組み込みうる特に好ましいヌクレオチド類似体である。この観点から、領域Ｂは、α−Ｌ−ＬＮＡ及びＤＮＡユニットの両方を含みうる。領域Ｂは、例えば、領域Ｂの（３’又は５’末端から決定して）１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２位において、α−Ｌ−ＬＮＡユニットを含んでいてもよく、１つの態様としては、領域Ｂの残りの核酸塩基がＤＮＡである、又は、領域Ｂが、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１位において１つ以上のさらなるα−Ｌ−ＬＮＡユニットを含んでいてもよい。１つの態様としては、領域Ｂは２つのα−Ｌ−ＬＮＡユニットを含み、残りの核酸塩基ユニットがＤＮＡである。さらなる態様としては、領域Ｂは３のα−Ｌ−ＬＮＡユニットを含み、残りの核酸塩基ユニットがＤＮＡである。α−Ｌ−ユニットは、１つの態様としては、領域Ｂの５’及び、又は３’位、及び／又は領域Ｂの非末端部分に位置していてもよい。１つより多くのα−Ｌ−ＬＮＡユニットが領域Ｂに存在する場合、領域Ｂは、α−ＬＮＡユニットが隣り合わせである配列（すなわち少なくとも５’−ＬＮＡ−ＬＮＡ−３’）、及び／又はα−ＬＮＡユニットが、隣り合わせでない場合、すなわち少なくとも１つの、すなわち１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０の代わりの核酸塩基、又はヌクレオチド、例えばＤＮＡユニットによって分断される配列を含む。
【０１３７】
上述の態様において、ギャップマー設計に言及する場合、ギャップ領域「Ｂ」はある態様では、７、８、９、又は１０、又はそれより多くの連続ＤＮＡヌクレオチド、又は等価な核酸塩基リボヌクレアーゼＨを動員することができる。
【０１３８】
領域Ａ及び／又はＣは、１つの態様としては、１０を超えない連続核酸塩基長である。
【０１３９】
領域Ａ及び／又はＣは、１つの態様としては、８を超えない連続核酸塩基長である。
【０１４０】
領域Ａ及び／又はＣは、１つの態様としては、６を超えない連続核酸塩基長である。
【０１４１】
領域Ｂは、１つの態様としては、２０を超えない連続核酸塩基長である。
【０１４２】
領域Ｂは、１つの態様としては、１５を超えない連続核酸塩基長である。
【０１４３】
領域Ｂは、１つの態様としては、１２を超えない連続核酸塩基長である。
【０１４４】
ギャップマーオリゴヌクレオチドにおいて、好ましくは上記の中央ドメイン（Ｂ）内にはミスマッチが何も存在せず、又は好ましくは上述のＤＮＡユニット、又はα−ＬＮＡユニットを含む、又はからなる中央ドメインから少なくとも７の連続的な核酸塩基、例えば、７、８又は９又は１０連続核酸塩基外に存在するのが非常に好ましい。
【０１４５】
ギャップマーオリゴマーにおいて、あらゆるミスマッチはギャップマーの５’又は３’末端に向けて位置するのが好ましい。それ故、標的ｍＲＮＡに対してミスマッチを含むギャップマーオリゴヌクレオチドにおいて、かかるミスマッチが５’（Ａ）及び／又は３’（Ｃ）領域のいずれかに位置し、及び／又は該ミスマッチがそのギャップマーオリゴヌクレオチドと標的分子の５’又は３’ヌクレオチドユニット間に存在するのが好ましい。
【０１４６】
しかし、ある態様としては、ギャップ領域はミスマッチを含んでいてもよく、例えば、ギャップ領域（Ｂ）の中央又は中央の２つ又は３つの核酸塩基を含んでもよい。
【０１４７】
１つの態様としては、式Ａ−Ｂ−Ｃのギャップマーは、オリゴマー化合物の３’領域（Ｃ）の末端の１以上のＤＮＡ糖残基、例えば、１から３ＤＮＡ糖残基、１及び２ＤＮＡ糖残基、最も好ましくは１ＤＮＡ糖残基からなる、又はこれを含む、好ましくはからなり、さらに領域Ｄを含む。
【０１４８】
１つの態様としては、本発明による化合物、ＬＮＡを含む、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、ＬＮＡ Ｃ残基は全て５’メチル−シトシンである。
【０１４９】
好ましくは、本発明の化合物、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドといった、オリゴマーのＬＮＡユニットは、１以上の以下のものから選択される：β−Ｄ−又はα−Ｌ−立体配置又はそれらの組み合わせのいずれかの形態の、チオ−ＬＮＡ、アミノ−ＬＮＡ、オキシ−ＬＮＡ、ｅｎａ−ＬＮＡ及び／又はアルファ−ＬＮＡ。β−Ｄ−オキシ−、又はα−Ｌ−ＬＮＡは、本発明のオリゴマーにおいて用いるのに好ましいＬＮＡである。チオ−ＬＮＡも、本発明のオリゴマーにおいて用いるのに好ましい可能性がある。アミノ−ＬＮＡも本発明のオリゴマーにおいて用いるのに好ましい可能性がある。オキシ−ＬＮＡも本発明のオリゴマーにおいて用いるのに好ましい可能性がある。Ｅｎａ−ＬＮＡも本発明のオリゴマーにおいて用いるのに好ましい可能性がある。アルファ−ＬＮＡも本発明のオリゴマーにおいて用いるのに好ましい可能性がある。
【０１５０】
ヌクレオシド間結合
適切なヌクレオシド間結合には、国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ２００６／０００５１２号明細書に記載のもの、例えば国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ２００６／０００５１２号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）の３４頁の第一段落に記載のヌクレオシド間結合が含まれる。
【０１５１】
上記に記載の適切な硫黄（Ｓ）含有ヌクレオシド間結合が好ましい場合がある。ホスホロチオエートヌクレオチド間結合も、特にギャップマーのギャップ領域（Ｂ）において好ましい。ホスホロチオエート結合もフランキング領域（Ａ及びＣ、及びＣからＤへの結合、及びＤ）に用いることができる。しかしながら、特に、例えばヌクレオチド類似体の使用により領域Ａ及びＣ内のヌクレオシド間結合がエンドヌクレアーゼ分解から保護される場合、例えば、領域Ａ及びＣがＬＮＡ核酸塩基を含む場合に、領域Ａ、Ｂ及びＣは、ホスホロチオエート、例えばリン酸ジエステル結合以外のヌクレオシド間結合を含み得る。
【０１５２】
標的ＲＮＡのリボヌクレアーゼＨ切断を可能にするために、オリゴマー内の核酸塩基間結合は、リン酸ジエステル、ホスホロチオエート又はボラノホスフェートであり得る。ホスホロチオエートは、改善されたヌクレアーゼ耐性及び他の理由、例えば製造の簡便性において好ましい。
【０１５３】
本発明のオリゴマーの一局面において、核酸塩基（ヌクレオチド及び／又はヌクレオチド類似体）はホスホロチオエート基によって互いに連結する。
【０１５４】
いくつかの態様において、領域Ａは、２つのヌクレオチド類似体ユニット、又はヌクレオチド類似体ユニット及び領域Ｂの核酸塩基ユニット間に少なくとも１つのリン酸ジエステル結合を含む。いくつかの態様において、領域Ｃは２つのヌクレオチド類似体ユニット、又はヌクレオチド類似体ユニット及び領域Ｂの核酸塩基ユニット間に少なくとも１つのリン酸ジエステル結合を含む。
【０１５５】
いくつかの態様において、領域Ｃはヌクレオチド類似体ユニット及び領域Ｄの核酸塩基ユニット間に少なくとも１つのリン酸ジエステル結合を含む。
【０１５６】
いくつかの態様において、領域Ａの３’ヌクレオチド類似体及び領域Ｂの５’核酸塩基間の核酸塩基間結合はリン酸ジエステルである。
【０１５７】
いくつかの態様において、領域Ｂの３’核酸塩基及び領域Ｃの５’ヌクレオチド類似体間の核酸塩基間結合はリン酸ジエステルである。
【０１５８】
いくつかの態様において、領域Ａの５’末端における２つの隣接するヌクレオチド類似体間の核酸塩基間結合はリン酸ジエステルである。
【０１５９】
いくつかの態様において、領域Ｃの３’末端における２つの隣接するヌクレオチド類似体間の核酸塩基間結合はリン酸ジエステルである。
【０１６０】
いくつかの態様において、領域Ａの３’末端における２つの隣接するヌクレオチド類似体間の核酸塩基間結合はリン酸ジエステルである。
【０１６１】
いくつかの態様において、領域Ｃの５’末端における２つの隣接するヌクレオチド類似体間の核酸塩基間結合はリン酸ジエステルである。
【０１６２】
いくつかの態様において、領域Ａは４ヌクレオチド長類似体を有し、領域Ａの２つの中間のヌクレオチド類似体間の核酸塩基間結合は、リン酸ジエステルである。
【０１６３】
いくつかの態様において、領域Ｃは４ヌクレオチド長類似体を有し、領域Ｃの２つの中間のヌクレオチド類似体間の核酸塩基間結合はリン酸ジエステルである。
【０１６４】
いくつかの態様において、本発明の化合物に存在するヌクレオチド類似体間の全ての核酸塩基間結合はリン酸ジエステルである。
【０１６５】
いくつかの態様において、例えば、上記の態様において、適切であるが具体的に示されていないのであるが、全ての残りの核酸塩基間結合は、リン酸ジエステル又はホスホロチオエート、又はそれらの混合のいずれかである。
【０１６６】
いくつかの態様において、全ての核酸塩基間結合基はホスホロチオエートである。
【０１６７】
特定のギャップマーオリゴヌクレオチド配列、例えば、本明細書において提供するものを言及する場合、１つの態様としては、結合がホスホロチオエート結合である場合、特にヌクレオチド類似体、例えば、ＬＮＡユニット間の結合において、別の結合、例えば本明細書において開示するものが用いられ得る、例えばリン酸塩（リン酸ジエステル）結合が用いられ得ると理解されるであろう。同様に、特定のギャップマーオリゴヌクレオチド配列、例えば本明細書において提供するものを言及する場合、Ｃ残基が５’メチル修飾シトシンと注釈される場合は、１つの態様としては、オリゴヌクレオチドに存在する１以上のＣｓは非修飾のＣ残基であり得る。
【０１６８】
本発明のオリゴマーの同定及び調製法：
標的の発現を調節する本発明のオリゴマーは、実験によって、又は標的の配列情報及び所望の標的に対してオリゴマー化合物をいかに最適に設計するかについての技術知識に基づく合理的な設計によって、同定され得る。これらの化合物の配列は、本発明の好ましい態様である。同様に、これらの好ましいオリゴマー化合物が相補的である標的内の配列モチーフ（「ホットスポット」と称する）は標的化に好ましい部位である。
【０１６９】
多くの場合において、インビボにおいて、又は臨床においてＦＡＢＰ４発現又は活性を調節するのに有効な、オリゴマー、例えばＬＮＡオリゴヌクレオチドの同定は、標的遺伝子の配列情報（例えば、配列番号１及び／又は３）に基づく。しかしながら、当業者であれば、かかるオリゴマー化合物は経験的な試験によっても同定できることを理解できるであろう。好ましい態様のものと比較して、例えば、より低い配列相同性、より多い又はより少ない修飾のヌクレオチド、又はより長い又はより短い長さを有するにもかかわらず臨床的治療に反応を示すオリゴマー化合物も、本発明の範囲内である。
【０１７０】
アミノ酸及びポリヌクレオチド相同性は、標準的設定を用いるＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムを用いて決定され得る：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｍｂｏｓｓ／ａｌｉｇｎ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌを参照のこと、方法：ＥＭＢＯＳＳ::ｗａｔｅｒ（ｌｏｃａｌ）：Ｇａｐ Ｏｐｅｎ＝１０．０、Ｇａｐ ｅｘｔｅｎｄ＝０．５、Ｂｌｏｓｕｍ ６２（タンパク質）、又はヌクレオチド配列にはＤＮＡｆｕｌｌを用いる。図３に示されるように、かかるアライメントは、ヒト及び異なる哺乳類種、例えばサル、マウス及び／又はラットからのＦＡＢＰ４をコードする核酸の領域を同定するためにも用いることができ、ここでその領域は、ヒトＦＡＢＰ４標的核酸と、異なる哺乳類種に存在する対応する核酸の両方を標的とするオリゴヌクレオチドの設計が可能な十分な長さの核酸相補性を有する、例えば、ヒトからのＦＡＢＰ４をコードする核酸と、異なる哺乳類種からのＦＡＢＰ４をコードする核酸の両方に１００％相補的な、少なくとも１０、例えば、少なくとも１２、例えば、少なくとも１４、例えば、少なくとも１６、例えば、少なくとも１８、例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７又は１８連続核酸塩基を有する。
【０１７１】
定義
本発明のオリゴマー（又はサブ配列又は結合した連続核酸塩基配列）と哺乳類ＦＡＢＰ４をコードする核酸、例えば本明細書に開示する核酸間の「相同性」を決定する際、相同性の決定は、本発明の化合物の対応する核酸塩基配列と哺乳類ＦＡＢＰ４（又は標的核酸）をコードする核酸の対応する領域との単純なアライメントによって行うことができ、相同性は、アライメントした塩基数をカウントし、本発明の化合物の連続塩基の合計数で割り、１００を掛けることによって決定する。かかる比較において、ギャップが存在する場合、かかるギャップは、ギャップ内の核酸塩基数が本発明の核酸塩基配列及び標的核酸間で異なる領域、というよりむしろ単なるミスマッチであるのが好ましい。
【０１７２】
用語「に位置する（ｌｏｃａｔｅｄ ｗｉｔｈ）」及び「に対応している（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ）」／「に対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｓ ｔｏ）」は、オリゴマーの核酸塩基配列又は連続核酸塩基配列と、ｉ）核酸標的の逆の相補体、例えばＦＡＢＰ４標的タンパク質をコードするｍＲＮＡ、例えば配列番号１、又は配列番号３及び／又は、ｉｉ）核酸配列は、配列番号：５、６、７、８、９、１０、及び１１の群において提供されるヌクレオチド配列、又は１つの態様においてそれらの逆の相補体、の等価体、との間の比較を意味する。ヌクレオチド類似体は、それらの同等又は対応するヌクレオチドと直接比較する。
【０１７３】
用語「対応するヌクレオチド類似体」及び「対応するヌクレオチド」は、ヌクレオチド類似体及びヌクレオチドの核酸塩基が同一であることを示すことを意図する。例えば、ヌクレオチドの２−デオキシリボースユニットがアデニンと連結している場合、「対応するヌクレオチド類似体」は、アデニンに連結するペントースユニット（２−デオキシリボースと異なる）を含有する。
【０１７４】
用語「核酸塩基」及び「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体の両方を包括する総称として用いられる。核酸塩基配列は、少なくとも２つのヌクレオチド又はヌクレオチド類似体を含む配列である。１つの態様としては、核酸塩基配列はヌクレオチドのみ、例えばＤＮＡユニットのみを含み得、別の態様において、核酸塩基配列はヌクレオチド類似体のみ、例えば、ＬＮＡユニットのみを含み得る。
【０１７５】
用語「核酸」は、２以上のヌクレオチドの共有結合によって形成された分子と定義する。
【０１７６】
用語「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は本明細書において互換的に用いられる。
【０１７７】
本明細書において用いる場合、用語「標的核酸」は、哺乳類ＦＡＢＰ４ポリペプチド、例えばヒトＦＡＢＰ４をコードするＤＮＡ、例えば配列番号１、マウス（配列番号３）、ラット（表１）、チンパンジー（表１）及び／又はサルＦＡＢＰ４をコードする核酸又はそれらの天然変異体、及びそれらに由来するＲＮＡ核酸、好ましくはｍＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ前駆体であるが好ましくは成熟ｍＲＮＡを意味する。１つの態様としては、例えば、研究又は診断において用いる場合、「標的核酸」は、上記ＤＮＡ又はＲＮＡ核酸標的に由来するｃＤＮＡ又は合成オリゴヌクレオチドであり得る。本発明によるオリゴマー化合物は、好ましくは標的核酸にハイブリダイズすることができる。
【０１７８】
用語「それらの天然変異体」は、規定の分類学的グループ、例えば、哺乳類、例えば、マウス、ラット、サル、チンパンジー及び好ましくはヒトに天然に存在する、核酸配列のＦＡＢＰ４ポリペプチドの変異体を意味する。典型的には、ポリヌクレオチドの「天然変異体」を意味する場合、この用語は、例えば染色体転座又は複製により、クロモソーム８遺伝子座に見られるＦＡＢＰ４をコードするゲノムＤＮＡ、及びＲＮＡ、例えばそれらに由来するｍＲＮＡの変異体も包括し得る。特定のポリペプチド配列、例えば配列番号２又は４を言及する場合、この用語は、例えば翻訳と同時の、又は翻訳後の修飾、例えば、シグナルペプチド切断、タンパク質切断、グリコシル化などによって加工され得るタンパク質の天然形態も含む。
【０１７９】
本発明による化合物は、線状分子である、又は線状分子として合成されるのが好ましい。
【０１８０】
用語「結合基」は、２つのヌクレオチド、２つのヌクレオチド類似体、及び、ヌクレオチドとヌクレオチド類似体などを一緒に共有結合させることができる基を意味することを意図している。具体的かつ好ましい例には、リン酸塩基及びホスホロチオエート基が含まれる。
【０１８１】
本文脈において、用語「コンジュゲート」は、本明細書に記載の化合物（すなわちヌクレオチド類似体の配列を含む化合物）と、１以上の非ヌクレオチド／非ヌクレオチド類似体、又は非ポリヌクレオチド部分との共有結合によって形成されるヘテロ分子を示すことを意図する。非ヌクレオチド又は非ポリヌクレオチド部分の例には、高分子物質、例えばタンパク質、脂肪酸鎖、糖残基、糖タンパク質、ポリマー、又はそれらの組み合わせが含まれる。典型的には、タンパク質は標的タンパク質の抗体であり得る。典型的なポリマーはポリエチレングリコールであり得る。本発明の化合物が核酸塩基配列からなる場合、１つの態様としては、非核酸塩基部分、例えば上記のコンジュゲートをさらに含み得る。
【０１８２】
用語「少なくとも１つ」は、１より大きい、又は１と等しい整数を含む、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０などである。
【０１８３】
１つの態様としては、例えば、本発明の化合物の核酸又はタンパク質標的を言及する場合、用語「少なくとも１つ」は、「少なくとも２つ」及び「少なくとも３つ」及び「少なくとも４つ」なる語を含み、同様に用語「少なくとも２つ」は、「少なくとも３つ」及び「少なくとも４つ」なる語を含み得る。
【０１８４】
本明細書において用いる場合、用語「薬学的に許容される塩」は、本明細書において同定する化合物の所望の生物学的活性を保持し、最小の望ましくない毒性作用を示す塩を意味する。かかる塩の非限定的な例は、有機アミノ酸と形成され得、また塩基付加塩は、金属カチオン、例えば、亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウム、ナトリウム、カリウムなどと、又は、アンモニア、Ｎ、Ｎ−ジベンジルエチレン−ジアミン、Ｄ−グルコサミン、テトラエチルアンモニウム又はエチレンジアミンから形成されたカチオンと形成され得；又は（ｃ）（ａ）と（ｂ）の組み合わせ；例えば、亜鉛タンニン酸塩などがある。
【０１８５】
本文脈において、用語「Ｃ１−４−アルキル」は、直線の又は分枝の飽和炭化水素鎖を意味することを意図しており、ここでその鎖は、１−４の炭素原子、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル及びｔｅｒｔ−ブチルを有する。
【０１８６】
本明細書において用いる場合、用語「遺伝子」は、エクソン、イントロン、非コーディング５’及び３’領域、調節エレメント及び現在知られている全てのそれらの変異体、解明され得るさらなるあらゆる変異体を含む遺伝子を意味する。
【０１８７】
本明細書において用いる場合、用語「ＲＮＡアンタゴニスト」は、いずれかの形態のＲＮＡ（ｍＲＮＡ前駆体、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなどを含む）を標的とするオリゴヌクレオチドを意味する。
【０１８８】
用語「関連障害」は、高コレステロール血症を言及する場合、以下からなる群から選択される１以上の症状を意味する：アテローム性動脈硬化症、高脂血症、ＨＤＬ／ＬＤＬコレステロール平衡異常、脂質代謝異常、例えば、家族性複合型高脂血症（ＦＣＨＬ）、後天性高脂血症、スタチン耐性高コレステロール血症、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、及び冠動脈心疾患（ＣＨＤ）。
【０１８９】
１つの態様としては、用語「オリゴマー」又は「オリゴマー化合物」は、互換的に用いられ、例えば標的核酸への水素結合による結合によってヒトにおいて所望の治療効果を誘導することができるオリゴヌクレオチドを意味する。本明細書において開示するオリゴマー化合物は、非治療用途、例えば、診断用途を有し得るとも認識される。１つの態様として、用語「オリゴマー」は、一本鎖（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド）又は二本鎖オリゴヌクレオチドのいずれでもよい（任意に本明細書中に記載した非核酸塩基要素にコンジュゲートしていてもよい）。
【０１９０】
本明細書において用いる場合、用語「調節」は、遺伝子発現の増加（刺激）又は減少（阻害）のいずれかを意味する。本発明において、阻害は遺伝子発現の調節の好ましい形態であり、ｍＲＮＡは好ましい標的であり、すなわち遺伝子発現を減少させる。
【０１９１】
本明細書において用いる場合、「ハイブリダイゼーション」は水素結合を意味し、相補的ヌクレオチド塩基間のワトソン−クリック、ホルスタイン（Ｈｏｌｓｔｅｉｎ）、逆ホルスタイン水素結合などであり得る。ワトソンとクリックはおよそ５０年前に、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）が２本の鎖の相対する相補的核酸塩基間に形成された水素結合によってらせん状の立体構造にまとまった２本の鎖からなることを示した。一般にＤＮＡに見られる４つの核酸塩基は、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）及びシトシン（Ｃ）であり、そのうちＧ核酸塩基はＣと対になり、Ａ核酸塩基はＴと対になる。ＲＮＡにおいては、核酸塩基チミンは核酸塩基ウラシル（Ｕ）に置き換えられ、Ｔ核酸塩基と同様にＡと対になる。標準的な二本鎖形成に関与する核酸塩基の化学基は、ワトソン−クリックの形態を構成する。フーグスティーン（Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ）は２−３年後に、プリン核酸塩基（Ｇ及びＡ）は、それらのワトソン−クリック形態に加えてフーグスティーン形態を有し、これは二本鎖の外側から認識でき、水素結合を介してピリミジンオリゴヌクレオチドと結合するのに利用され、これにより三重らせん構造が形成されることを示した。
【０１９２】
本発明の化合物は、標的核酸、例えばｍＲＮＡにハイブリダイズすることができるのが非常に好ましい。 
【０１９３】
Ｔｍの測定
１０ｍＭリン酸ナトリウム／１００ｍＭ ＮａＣｌ／０．１ｎＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）中、本化合物３μＭ溶液を、１０ｍＭリン酸ナトリウム／１００ｍＭ ＮａＣｌ／０．１ｎＭ ＥＤＴＡ中、３μＭ濃度のその相補体ＤＮＡ又はＲＮＡオリゴヌクレオチド（ｐＨ７．０）と、９０℃にて１分間混合し、室温まで冷ました。次いで、１℃／分の加熱速度において２５−９５℃の範囲にて２６０ｎＭの吸光度を測定し、二本鎖の融解曲線を決定した。Ｔｍは融解曲線の第一誘導体の最大値として測定する。
【０１９４】
コンジュゲート
本発明の１つの態様としては、本オリゴマー化合物はリガンド／コンジュゲートと連結し、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞内取り込みを増大させるのに用いられ得る。国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ２００６/０００５１２号明細書は適切なリガンド及びコンジュゲートを提供し、参照によりここに組み込まれる。
【０１９５】
本発明はまた、本明細書に記載の本発明による化合物、及び、その化合物に共有結合した少なくとも１つの非ヌクレオチド又は非ポリヌクレオチド部分を含むコンジュゲートを提供する。それ故に、本明細書に記載のような、本発明の化合物が特定の核酸からなる１つの態様としては、本化合物は、その化合物に共有結合した少なくとも１つの非ヌクレオチド又は非ポリヌクレオチド部分（例えば１以上のヌクレオチド又はヌクレオチド類似体を含まない）も含み得る。
【０１９６】
用途
本発明のオリゴマー化合物は、例えば、診断、治療及び予防のための研究試薬として利用することができる。
【０１９７】
研究において、かかるオリゴマーは、細胞及び実験動物における特定のＦＡＢＰ４タンパク質（典型的にはｍＲＮＡ分解又は阻害し、それによりタンパク質合成を阻害する）の合成を特異的に阻害するのに用いられ得、これにより、標的の機能解析又は治療介入における標的としての有用性の評価が促進される。
【０１９８】
診断において、オリゴマーは、ノーザン・ブロット、イン・サイチュハイブリダイゼーション又は同様の技術による、細胞及び組織におけるＦＡＢＰ４発現の検知及び定量化に用いられ得る。
【０１９９】
治療において、ＦＡＢＰ４の発現を調節することにより治療することができる疾患又は障害を有する疑いのある動物又はヒトは、本発明によるアンチセンス化合物を投与することにより治療する。ＦＡＢＰ４の発現に関係する疾患又は症状を有する疑いのある、又は罹患しやすい疑いのある、動物、特にマウス及びラット、ならびにヒトを、本発明の１以上のアンチセンス化合物又は組成物の治療的又は予防的有効量を投与することにより治療する方法をさらに提供する。
【０２００】
本発明による医薬組成物は、異常なレベルのＦＡＢＰ４に関係する症状、例えば、アテローム性動脈硬化症、糖尿病（特にＩＩ型糖尿病）、及びメタボリックシンドロームの治療に用いることができる。
【０２０１】
本発明による医薬組成物は、アルツハイマー病の治療に用いることができる。
【０２０２】
本発明による医薬組成物は、炎症性疾患、例えば、関節炎又は喘息の治療に用いることができる。
【０２０３】
適切な用量、処方、投与経路、組成、剤形、他の治療剤との組み合わせ、プロドラッグ形態も、国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ２００６／０００５１２号明細書に提供され、参照によりここに組み込まれるが、癌の治療のみに特に適用可能な国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ２００６／０００５１２号明細書の局面が本発明の治療／医薬組成物及び方法に適切でない場合もあることは認識すべきである。
【０２０４】
本発明はまた、本明細書に記載の化合物又はコンジュゲート、又はコンジュゲート、及び薬学的に許容される希釈剤、担体又はアジュバントを含む医薬組成物も提供する。国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ２００６／０００５１２号明細書は、適切な好ましい薬学的に許容される希釈剤、担体及びアジュバントを提供しており、参照によりここに組み込まれる。
【０２０５】
１つより多い活性成分を含む医薬組成物
本発明による医薬組成物は、高コレステロール血症及び／又は関連障害の治療に有用であることが示されているものを含む、他の活性成分をさらに含み得る。
そのような分類の化合物の１つはスタチンである。スタチンは、高コレステロール血症のために心血管疾患の危険性のある人々のコレステロールレベルを低下させる医薬として用いられる脂質低下薬の分類を形成するＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤である。それらはコレステロール合成の速度を決定する酵素である酵素ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素を阻害することによって作用する。肝臓におけるこの酵素の阻害はＬＤＬ−レセプターを刺激し、これにより血流からのＬＤＬの増大したクリアランスが起こり、血中コレステロールレベルが減少する。スタチンの例には、アトルバスタチン（商標）、セリバスタチン (商標)、フルバスタチン (商標)、ロバスタチン (商標)、メバスタチン (商標）、ピタバスタチン（商標）、プラバスタチン（商標）、ロスバスタチン（商標）及びシンバスタチン（商標）が含まれる。本発明の化合物とスタチンの併用により、スタチンの用量を減少させることが可能となり得、それ故に、常用量のスタチンに関連する副作用、例えば、筋肉痛、筋痙攣、胃腸症状、肝臓酵素の乱れ（ｄｅｒａｎｇｅｍｅｎｔ）、筋炎、ミオパシー、横紋筋融解症（骨格筋の病的破壊）（筋破壊産物が腎臓を損傷する場合に急性腎不全を引き起こし得る）などが克服され得る。
【０２０６】
両親媒性カルボン酸の分類であるフィブラートは、スタチンとフィブラートの併用において増加した頻度の横紋筋融解症が報告されているにもかかわらず、スタチンの使用としばしば組み合わせられる別の分類の化合物である。本発明による組成物はそれ故にフィブラート、及び必要に応じてスタチンをさらに含み得る。
本発明による組成物は、アポリポ蛋白Ｂ（Ａｐｏ−Ｂ）のモジュレーター、特にアポリポ蛋白Ｂの機能の発現を低下させることができる薬剤をさらに含み得る。適切には、アポリポ蛋白Ｂモジュレーターは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（例えばオリゴマー）、例えば、国際公開第００/９７６６２号、第０３/１１８８７号及び第２００４/４４１８１号パンフレットに開示されているものであり得る。好ましい組合せはＩＳＩＳ化合物３０１０１２（配列番号１３として示す）との組み合わせである。更に好ましいアポリポ蛋白Ｂモジュレーターは、米国特許仮出願第６０／８９６４１９号明細書に開示され、ここに参照として組み込まれる。
【０２０７】
本発明による組成物は、ＰＳＣＫ９発現のモジュレーター、例えば、ＰＳＣＫ９を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えばオリゴマー）をさらに含み得、その組成物はＦＡＢＰ４及びＰＳＣＫ９発現の両方の同時下方制御に用いられ得、血清コレステロールの観点において相乗効果が生じ、よって高コレステロール血症及び／又は関連障害を治療する際に有利である。本発明の化合物及びＰＳＣＫ９モジュレーター、例えば本明細書に言及するアンチセンスオリゴヌクレオチドの両方を含むかかる組成物も、スタチンをさらに含み得る。米国特許仮出願第６０／８２８７３５号明細書は適切なＰＳＣＫ９モジュレーターを開示し、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２０８】
本組成物は、ヌクレオチド類似体、例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ２００６／０００４８１号明細書（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されているものを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み得ることも認識されたい。国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ２００６／０００４８１号明細書において開示された、又は好ましいとして強調された特異的ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、本発明による医薬組成物における使用に特に適している。
【０２０９】
本発明のオリゴマーは、糖尿病の治療のために、フィブラート又はチアゾリジンジオン類（ＴＺＤ）と組み合わせ得る。ＴＺＤは、通常用いられる糖尿病薬である。フィブラート及びＴＺＤ類はＰＰＡＲ活性化を通じて作用し、ＦＡＢＰ４はその作用を阻害する。それゆえ、ＦＡＢＰ４を標的とするオリゴマーはフィブラート及び/又はＴＺＤ類の作用を促進することが期待され、２つの薬物の用量を低下させる必要を満たすことが推定される。
【０２１０】
本発明はまた、複数部分のキットを提供し、ここで、第一の部分は本発明による化合物、コンジュゲート及び／又は医薬組成物を含み、さらなる部分はアポリポ蛋白Ｂ又はＦＡＢＰ４の発現を低下させることができるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。それ故に、その複数部分のキットは本明細書において言及される治療方法に用いられ得、その方法は、第一の部分及びさらなる部分の両方を、同時に又は一方の後に他方を投与することを含むことを認識されたい。
【０２１１】
医学的方法及び使用
本発明のオリゴマー及び他の組成物は、肥満及びメタボリックシンドロームに関連する症状の治療に用いられ得る。当該分野の著名な科学者により、ＦＡＢＰ４による薬学的な治療介入は、肥満、インスリン耐性、ＩＩ型糖尿病、アテローム性動脈硬化症、及び、おそらく炎症性症状、例えば、関節炎、喘息、又は、アルツハイマー病の治療のオプションとなることが示唆されている(Ｍａｋｏｗｓｋｉ ａｎｄ Ｈｏｔａｍｉｓｌｉｇｉｌ ２００４)。
【０２１２】
さらに、異常なレベルのＦＡＢＰ４に関連し得、またそれ故に本発明による組成物、コンジュゲート及び化合物を用いて処置し得るさらなる症状には、以下からなる群から選択される障害が含まれる：脂質異常症及び高リポ蛋白血症：原発性リポ蛋白過剰血症、家族性高カイロミクロン血症、家族性リポ蛋白リパーゼ活性低下症；多遺伝子性高コレステロール血症、家族性低比重リポ蛋白受容体症、又は欠損症；家族性複合型脂質異常症、家族性低比重リポ蛋白受容体活性低下症；家族性異常βリポ蛋白(質)血症、家族性アポリポ蛋白Ｅ合成低下症；内因性脂質異常症、超低密度リポ蛋白質合成増加症、超低密度リポ蛋白質クリアランス低下症；家族性高トリグリセリド血症；メタボリックシンドローム、シンドロームＸ、糖尿病前症、インスリン耐性、ＩＩ型糖尿病；アテローム性動脈硬化症及び冠動脈疾患を含む心血管疾患；血栓症；末梢血管疾患、及び肥満。
【０２１３】
さらに、異常なレベルのＦＡＢＰ４に関係し得、またそれ故に本発明による組成物、コンジュゲート及び化合物を用いて処置され得るさらなる症状には、以下からなる群から選択される障害が含まれる：フォン・ギールケ病（Ｉ型糖原病）；リポジストロフィー（先天性及び後天性型）；クッシング症候群；成長ホルモン単独欠損症；真性糖尿病；甲状腺機能亢進症；高血圧；神経性食欲不振症；ウェルナー症候群；急性間欠性ポルフィリン症；原発性胆汁性肝硬変；肝外胆管５閉塞；急性肝炎；肝細胞腫；全身性エリトマトーデス；単クローン性ガンマグロブリン血症（骨髄腫、多発性骨髄腫、マクログロブリン血症及びリンパ腫などを含む）；内分泌疾患；肥満；ネフローゼ症候群；メタボリックシンドローム；炎症；関節リウマチ；甲状腺機能低下症；尿毒症（高尿酸血症）；不能；閉塞性肝疾患；突発性高カルシウム血症；異常グロブリン血症；上昇したインスリンレベル；デュプイトラン拘縮；ＡＩＤＳ；及びアルツハイマー病及び認知症。
【０２１４】
本発明は、ＦＡＢＰ４発現調節に十分な量の本発明の化合物を投与する工程を含む、血管内皮へのコレステロール粒子の結合を阻害する方法であって、結果として、以下の危険性を減じる方法を提供する：（ｉ）コレステロール粒子の酸化；（ｉｉ）血管内皮への単球結合；（ｉｉｉ）単球のマクロファージへの分化；（ｉｖ）マクロファージによる酸化された脂質３０粒子の取り込み及びサイトカインの放出（ＩＬ−１、ＴＮＦ−アルファ、ＴＧＦ−ベータを含むがこれらに限定されない）；（ｖ）線維状の線維脂肪の病変及び炎症の血小板形成；（ｖｉ）血餅を生じる内皮の病変；及び（ｖｉｉ）心筋梗塞又は卒中を生じる血餅。
【０２１５】
本発明の治療方法は、また、アテローム性動脈硬化症のプラーク形成を減少させ、及びインスリン感受性を増強（すなわち、インスリン耐性を低下）させる方法に用いることができる。
【０２１６】
本発明は、本明細書に開示のいずれかの及びあらゆる症状を処置するための医薬の製造における本発明の化合物の使用をさらに提供する。
【０２１７】
概説すると、本発明の一局面は、異常なレベルのＦＡＢＰ４に関係する症状に罹患している、又は罹患しやすい哺乳動物を処置する方法であって、ＦＡＢＰ４に標的化された、１以上のＬＮＡユニットを含む治療上有効量のオリゴマーを哺乳動物に投与することを含む方法を対象とする。
【０２１８】
本発明の興味深い局面は、上記に記載の症状の治療のための医薬の調製における、本明細書において規定されるオリゴマー（化合物）、又は本明細書に規定されるコンジュゲートの使用を対象とする。
【０２１９】
本発明の方法は、好ましくは異常なレベルのＦＡＢＰ４により引き起こされる疾患に対する治療又は予防のために用いられる。
【０２２０】
さらに、本明細書に記載の発明は、疾患を防ぐ又は治療する方法であって、かかる治療を必要とするヒトに治療上有効量のＦＡＢＰ４を調節するオリゴヌクレオチド化合物（高用量のオリゴマーを含むがこれに限定されない）を投与すること含む方法を包括する。本発明は、ＦＡＢＰ４を調節するオリゴヌクレオチド化合物の短期間の投与を行うことをさらに包括する。
【０２２１】
本発明の１つの態様としては、オリゴマー（化合物）はリガンド又はコンジュゲートに連結している。例えば、これはオリゴマーの細胞内取り込みを増大させるためである。１つの態様としては、コンジュゲートは、ステロール、例えばコレステロールである。
【０２２２】
本発明のオリゴマーはまた、活性原体、例えば、アスピリン、イブプロフェン、サルファ剤、糖尿病剤、抗菌又は抗生剤にコンジュゲートし得る。
【０２２３】
言い換えると、本発明はさらに、異常なレベルのＦＡＢＰ４を治療する方法であって、本明細書に規定されるオリゴマー、又は本明細書に規定されるコンジュゲート又は本明細書に規定される医薬組成物を必要とする患者に投与することを含み、さらなる化学療法剤を投与することをさらに含む方法を対象とする。そのさらなる投与は、さらなる化学療法剤が本発明の化合物とコンジュゲートするように、医薬組成物中に存在するように、又は分離した形態にて投与されるように行われ得る。
【０２２４】
本発明はまた、医薬として使用するための、本明細書に規定される化合物、組成物又はコンジュゲートに関する。
【０２２５】
本発明はさらに、異常なレベルのＦＡＢＰ４を治療するための医薬の製造における、本明細書に規定される化合物、組成物又はコンジュゲートの使用に関する。典型的には、異常なレベルのＦＡＢＰ４は、高コレステロール血症及び関連障害、例えば、アテローム性動脈硬化症又は高脂血症の形態である、又はそれらを引き起こす、又はそれらによって特徴付けられる。
【０２２６】
さらに、本発明は、高コレステロール血症及び関連障害、例えば、アテローム性動脈硬化症、２型糖尿病及び高脂血症から選択される疾患又は症状に罹患した対象を治療する方法であって、本明細書に規定される医薬組成物を必要とする対象に投与する工程を含む方法に関する。好ましくは、医薬組成物は経口投与される。
【０２２７】
関連疾患の例にはまた、種々のタイプのＨＤＬ／ＬＤＬコレステロール平衡異常；脂質代謝異常、例えば、家族性複合型高脂血症（ＦＣＨＬ）、後天性高脂血症、スタチン耐性高コレステロール血症；冠動脈疾患（ＣＡＤ）、冠動脈心疾患（ＣＨＤ）、アテローム性動脈硬化症が含まれる。
【０２２８】
本発明による組成物がアポリポ蛋白Ｂ１００発現のモジュレーター、例えばアポリポ蛋白Ｂ１００を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドも含む場合、その組成物はＦＡＢＰ４及びアポリポ蛋白Ｂ１００の両方の発現の同時下方制御において用いられ得、血清コレステロールの観点において相乗効果が起こり、それ故高コレステロール血症及び／又は関連障害を治療する場合に有利となることが認識される。本発明の化合物及びアポリポ蛋白Ｂモジュレーター、例えば本明細書にて言及されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの両方を含むかかる組成物はまた、スタチンをさらに含み得る。
【０２２９】
本発明による組成物がＰＳＣＫ９発現のモジュレーター、例えば、ＰＳＣＫ９を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドも含む場合、その組成物はＦＡＢＰ４及びＰＳＣＫ９の両方の発現の同時下方制御において用いられ得、血清コレステロールの観点において相乗効果が起こり、それ故高コレステロール血症及び／又は関連障害を治療する場合に有利となることが認識される。本発明の化合物及びＰＳＣＫ９モジュレーター、例えば本明細書にて言及されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの両方を含むかかる組成物はまた、スタチンをさらに含み得る。米国仮出願第６０／８２８７３５号は、適切なＰＳＣＫ９モジュレーターを開示する参照として本明細書に組み込まれる。
【０２３０】
参考文献
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【実施例１】
【０２３１】
標的:
マウス:
遺伝子略名：Ｆａｂｐ４及び名前：脂肪酸結合タンパク質４、脂肪細胞［ハツカネ
ズミ］
遺伝子別名：ＡＬＢＰ／Ａｐ２、Ａｐ２、Ｌｂｐｌ
配列番号３
ヒト:
遺伝子略名：ＦＡＢＰ４及び名前：脂肪酸結合タンパク質４、脂肪細胞［ホモサピ
エンス］
遺伝子別名：Ａ−ＦＡＢＰ
配列番号１
【０２３２】
脂肪酸結合タンパク質４（ＦＡＢＰ４）は、ａＰ２（脂肪細胞脂肪酸結合タンパク質）とも呼ばれ、大部分は脂肪細胞及びマクロファージに発現し、食事誘導性の肥満症、アテローム性動脈硬化症、及びインスリン耐性において重要な役割を果たす。ＦＡＢＰ４は、脂肪酸による転写制御を受ける細胞質タンパク質である。これは、脂肪酸取り込み、輸送及び代謝に関わりがあると考えられている。
【０２３３】
標的核酸の発現に対するアンチセンス化合物の効果は、様々な細胞型のいずれかにおいて試験することができ、ただしその標的核酸が測定可能なレベルにあることを条件とする。標的は、内因的に、又は前記核酸をコードする核酸の一時的なもしくは安定なトランスフェクションにより発現させることができる。
【０２３４】
標的核酸の発現レベルは、例えば、ノーザン・ブロット分析、定量的ＰＣＲ、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイを用いて、ルーチン的に測定することができる。以下の細胞型は例証を目的として提供しているが、他の細胞型もルーチン的に用いられており、ただし選択された細胞型において標的が発現されることを条件とする。
【０２３５】
細胞は以下に記載する適切な培地において培養し、３７℃、湿度９５−９８％、５％ＣＯ2において維持した。細胞を毎週２−３回ルーチン的に継代した。
【０２３６】
肝１−６細胞：ネズミ肝細胞株肝１−６細胞はＡＴＣＣから購入し、１０％ＦＢＳ＋Ｇｌｕｔａｍａｘ Ｉ＋ゲンタマイシンを含むＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）において培養した。
【０２３７】
ＰＣ３：ヒト前立腺癌細胞株ＰＣ３はＡＴＣＣから購入し、１０％ＦＢＳ＋Ｇｌｕｔａｍａｘ Ｉ＋ゲンタマイシンを含むＥａｇｌｅ ＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）において培養した。
【０２３８】
ＲＡＷ２６４．７：ネズミ単球／マクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７はＡＴＣＣから購入し、１０％ＦＢＳ＋Ｇｌｕｔａｍａｘ Ｉ＋ゲンタマイシンを含むＥａｇｌｅ ＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）において培養した。
【０２３９】
オリゴヌクレオチドのリスト：
【表２】
2010537958.tif 000007
【実施例２】
【０２４０】
イン・ビトロモデル：アンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置
細胞培養及びトランスフェクション：６ウェルプレート中の１０％ＦＢＳ、Ｇｌｕｔａｍａｘ Ｉ及びゲンタマイシンを補足した成長培地に３７℃（５％ＣＯ２）において肝１−６細胞、ＰＣ３及びＲＡＷ２６４．７を播種した。細胞が６０−７０％コンフルエントになった時点に、リポフェクタミン２０００(５μｇ／ｍＬ)を用いて種々の濃度のオリゴヌクレオチド（０．０４−２５ｎＭ）により２複製ずつ細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションは基本的にＤｅａｎら（１９９４, ＪＢＣ ２６９：１６４１６−１６４２４）により報告された通りに行った。簡単に説明すると、細胞をＯｐｔｉＭＥＭ中のリポフェクタミンとともに１０分間インキュベートし、次いでオリゴヌクレオチドを１ウェルにつき合計量０．５ｍＬのトランスフェクションミックスに加えた。４時間後、そのトランスフェクションミックスを除去し、細胞を洗浄し、３７℃にておおよそ２０時間成長させた（適切な成長培地におけるｍＲＮＡ分析及びタンパク質分析）。次いで細胞をタンパク質及びＲＮＡ分析のために収穫した。
【実施例３】
【０２４１】
イン・ビトロモデル：ＲＮＡの抽出及びｃＤＮＡ合成
トータルＲＮＡの単離
トータルＲＮＡをＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離した。細胞をＰＢＳにより洗浄し、１％メルカプトエタノールを捕捉した細胞溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ）（ＲＴＬ、 Ｑｉａｇｅｎ）を直接ウェルに加えた。数分後、サンプルを製造者の説明書に従って処理した。
【０２４２】
ファーストストランドの合成
ファーストストランドの合成は、ＯｍｎｉＳｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ｋｉｔ又はＭ−ＭＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（基本的に製造者（Ａｍｂｉｏｎ）による記載の通り）のいずれかを用いて製造者（Ｑｉａｇｅｎ）の説明書に従って行った。ＯｍｎｉＳｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを用いる場合、各サンプルの０．５μｇのトータルＲＮＡを１２μｌに調整し、０．２μｌポリ(ｄＴ)１２−１８（０．５μｇ／μｌ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２μｌ ｄＮＴＰミックス（各５ｍＭ）、２μｌ １０×ＲＴ緩衝液、０．５μｌ ＲＮＡｇｕａｒｄ（商標）ＲＮＡｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（３３ユニット／ｍＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）及び１μｌ ＯｍｎｉＳｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅと混合し、次いで３７℃にて６０分間インキュベーションし、９３℃にて５分間加熱して失活させた。
【０２４３】
ファーストストランド合成を無作為のデカマー及びＭ−ＭＬＶ−Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（基本的に製造者（Ａｍｂｉｏｎ）による記載の通り）を用いて行う場合、各サンプルの０．２５μgのトータルＲＮＡをＨ２Ｏ中１０．８μｌに調整した。デカマー２μｌ及びｄＮＴＰミックス２μl（それぞれ２．５ｍＭ）を加えた。サンプルを７０℃に３分間加熱し、氷水において直ちに冷却し、（１０×ＲＴ緩衝液２μｌ；Ｍ−ＭＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ １μl；ＲＮＡａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ０．２５μl）を含有するミックス３．２５μlを加えた。ｃＤＮＡを４２℃にて６０分間合成し、次いで９５℃にて１０分間熱失活工程を行い、最後に４℃に冷却した。
【実施例４】
【０２４４】
インビトロ及びイン・ビボモデル：リアルタイムＰＣＲによるＦＡＢＰ４発現のオリゴヌクレオチド阻害の分析
ＦＡＢＰ４発現のアンチセンス調節は当分野において既知の様々な方法においてアッセイすることができる。例えばＦＡＢＰ４ ｍＲＮＡレベルは、例えばノーザン・ブロット分析、競合的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、又はリアルタイムＰＣＲによって定量化することができる。リアルタイム定量ＰＣＲが現在好ましい。ＲＮＡ分析はトータル細胞ＲＮＡ又はｍＲＮＡ上において行うことができる。
【０２４５】
ＲＮＡ単離及びＲＮＡ分析、例えばノーザン・ブロット分析の方法は当分野において日常的であり、例えばＪｏｈｎ ＷｉｌｅｙとＳｏｎｓの「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」に記載されている。
【０２４６】
リアルタイム定量（ＰＣＲ）は、ＢｉｏＲＡＤから入手可能な市販のｉＱ Ｍｕｌｔｉ−Ｃｏｌｏｒ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いて簡便に行うことができる。リアルタイム定量ＰＣＲは当業者によく知られている技術であり、例えばＨｅｉｄ ｅｔ ａｌ． Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （１９９６）， ６: ９８６−９９４に教示されている。
【０２４７】
ＦＡＢＰ４ ｍＲＮＡレベルのリアルタイム定量ＰＣＲ分析
処置及び非処置サンプルにおいて相対的なヒトＦＡＢＰ４ ｍＲＮＡレベルを決定するために、作製されたｃＤＮＡを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを用いる定量的ＰＣＲ分析に用いた。ＦＡＢＰ４ ｍＲＮＡ発現は、全般に製造者の記載の通り定量した。簡単に示すと、４μｌのｃＤＮＡを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入したＴａｑｍａｎ Ｆａｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ及びｐｒｉｍｅｒ−ｐｒｏｂｅ ｍｉｘを含む６μlのｍａｓｔｅｒｍｉｘに加えた。
【０２４８】
全てのサンプルは、２回ずつ行い、それぞれの細胞株から合成された２倍希釈のｃＤＮＡを用いて関連づけた。ＦＡＢＰ４ ｍＲＮＡの相対的な量は、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＳｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎソフトウエアを用いて計算した閾値サイクルから決定し、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡによって標準化した。
【実施例５】
【０２４９】
実施例４：インビトロ分析：（ネズミ肝細胞株１−６、ヒト前立腺癌細胞株ＰＣ３及びネズミ単球／マクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７）用量反応／ＦＡＢＰ４発現のアンチセンス阻害
本発明に従い、ヒト及びネズミＦＡＢＰ４ ｍＲＮＡの種々の領域を標的とするように一連のオリゴヌクレオチドを設計した。表１を参照のこと。ネズミ肝細胞（肝細胞１−６）において、オリゴヌクレオチド化合物（太字で示す）：配列番号：１２（３８９６）、１５（３９００）、１８（３８９７）、１９（３８９８）、２３（３９０１）、２４（３８９５）、及び２７（３８９９）（図１、図２、図３）について、脂質支援型の取り込みの後に、ＦＡＢＰ４ ｍＲＮＡをノックダウンする能力についてオリゴヌクレオチド化合物を評価した。実施例１−３に記載のように実験を行った。結果は、全ての化合物について２５ｎＭにおいて非常に強力な下方制御（肝１−６細胞、ＰＣ３、及びＲＡＷ２６４．７において、それぞれ３０−５０％、９５−６０％、＞６０％）を示した。しかし、１ｎＭにおいては、１化合物のみＰＣ３細胞（配列番号：１２）において５０％という強力なＦＡＢＰ４ ｍＲＮＡによる下方制御を受けた（図２）。
【０２５０】
ＦＡＢＰ−４の発現は、リポフェクタミンのトランスフェクション後、０．０４、０．２、１、５、１０及び２５ｎＭのオリゴヌクレオチド溶液で決定した。ＲＮＡを細胞から単離し、ＦＡＢＰ４ ｍＲＮＡを、実施例１−３に記載のようにｑＰＣＲで決定した。
【０２５１】
肝１−６細胞（マウス肝癌細胞株）において、最も強力なオリゴヌクレオチドは、配列番号：１２、配列番号：１５、及び配列番号：２３であり、ＩＣ５０がそれぞれ５、５、及び１ないし５ｎＭであった。肝１−６細胞は、ＰＣ３細胞に比べ低いトランスフェクション効果のため、ＩＣ５０が全般に高くなった（図１）。
【０２５２】
ＰＣ３細胞（ヒト前立腺癌細胞株）では、最も強力にＦＡＢＰ−４ ｍＲＮＡを下方制御したオリゴヌクレオチドは、配列番号：２４、配列番号：１２、及び配列番号：２３であり、ＩＣ５０がそれぞれ１、０．２、及び１ｎＭであった（図２）。
【０２５３】
ＲＡＷ２６４．７のオリゴヌクレオチドのスクリーニングは、ＦＡＢＰ４ ｍＲＮＡ発現への効果を評価するために行った（図３）。ＲＡＷ２６４．７は、ＦＡＢＰ４を発現するネズミ単球／マクロファージ細胞株である。これらの細胞中において、オリゴヌクレオチドの配列番号：１８、１９、及び１５のＩＣ５０は５ｎＭ前後だったのに対し、配列番号、１２、及び２３のＩＣ５０は５−１０ｎＭ、配列番号：２７のＩＣ５０は１０ないし２５ｎＭの間、配列番号：２４のＩＣ５０は＞２５ｎＭであった。
【実施例６】
【０２５４】
ＦＡＢＰ４の下方制御におけるオリゴヌクレオチド配列：
【表３−１】
2010537958.tif 000008
【表３−２】
2010537958.tif 000009
【表３−３】
2010537958.tif 000010
【図１】
2010537958.tif 000011
【図２】
2010537958.tif 000012
【図３】
2010537958.tif 000013
【図４−１】
2010537958.tif 000014
【図４−２】
2010537958.tif 000015
【図５】
2010537958.tif 000016
【配列表】
2010537958000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成22年4月30日(2010.4.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2010537958000001.app
【国際調査報告】
2010537958.tif 000045
2010537958.tif 000046
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