(57)【要約】リボスイッチは、抗生物質および他の小分子治療のための標的である。リボスイッチおよびその一部を使用して、ＲＮＡ分子ならびに他のエレメントおよび分子の発現または機能を調節することができる。リボスイッチおよびその一部を、種々の他の方法で使用して、例えば、化合物を同定または検出することができる。化合物を使用して、リボスイッチを刺激、活性化、阻害、および／または非活性化することができる。リボスイッチおよびその一部を単独および他の核酸との組み合わせの両方にて種々の構築物およびＲＮＡ分子で使用することができ、核酸によってコードすることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
調節可能な遺伝子発現構築物であって、
コード領域に作動可能に連結されたリボスイッチを含むＲＮＡをコードする核酸分子を含み、該リボスイッチが該ＲＮＡの発現を調節し、該リボスイッチおよび該コード領域が非相同であり、該リボスイッチは、サイクリックジＧＭＰ応答性リボスイッチ、Ｓ−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチ、ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチ、Ｍｏｃｏ応答性リボスイッチ、またはＳＡＭ応答性リボスイッチである、構築物。
【請求項２】
前記リボスイッチがアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含み、該アプタマードメインおよび該発現プラットフォームドメインが非相同である、請求項１に記載の構築物。
【請求項３】
前記リボスイッチが２つ以上のアプタマードメインおよび１つの発現プラットフォームドメインを含み、該アプタマードメインの少なくとも１つおよび該発現プラットフォームドメインが非相同である、請求項１に記載の構築物。
【請求項４】
前記アプタマードメインの少なくとも２つが協同的結合を示す、請求項３に記載の構築物。
【請求項５】
リボスイッチであって、該リボスイッチが天然に存在するリボスイッチの非天然誘導体であり、該リボスイッチは、サイクリックジＧＭＰ応答性リボスイッチ、Ｓ−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチ、ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチ、Ｍｏｃｏ応答性リボスイッチ、またはＳＡＭ応答性リボスイッチである、リボスイッチ。
【請求項６】
前記リボスイッチがアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含み、該アプタマードメインおよび該発現プラットフォームドメインが非相同である、請求項５に記載のリボスイッチ。
【請求項７】
前記リボスイッチが、ＧＥＭＭモチーフ、ＳＡＨモチーフ、ｐｒｅＱ１−ＩＩモチーフ、Ｍｏｃｏモチーフ、またはＳＡＭ−ＩＶモチーフを含む、請求項６に記載のリボスイッチ。
【請求項８】
前記リボスイッチがトリガー分子によって活性化され、該リボスイッチが該トリガー分子によって活性化された場合にシグナルを産生する、請求項５に記載のリボスイッチ。
【請求項９】
前記リボスイッチが図１または図３のコンセンサス構造の１つを有する、請求項１に記載の構築物。
【請求項１０】
前記リボスイッチがアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含み、該アプタマードメインが天然に存在するサイクリックジＧＭＰ応答性リボスイッチ、Ｓ−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチ、ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチ、Ｍｏｃｏ応答性リボスイッチ、またはＳＡＭ応答性リボスイッチに由来する、請求項１に記載の構築物。
【請求項１１】
前記アプタマードメインが、天然に存在するサイクリックジＧＭＰ応答性リボスイッチ、Ｓ−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチ、ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチ、Ｍｏｃｏ応答性リボスイッチ、またはＳＡＭ応答性リボスイッチのアプタマードメインである、請求項１０に記載の構築物。
【請求項１２】
前記アプタマードメインが前記天然に存在するリボスイッチのアプタマードメインのコンセンサス構造を有する、請求項１０に記載の構築物。
【請求項１３】
前記アプタマードメインが、前記天然に存在するリボスイッチの塩基対の保存的変化のみからなる、請求項１０に記載の構築物。
【請求項１４】
目的の化合物を検出する方法であって、該方法が、
サンプルとリボスイッチとを接触させる工程を含み、該リボスイッチが該目的の化合物によって活性化され、該リボスイッチが該目的の化合物によって活性化された場合にシグナルを産生し、該サンプルが該目的の化合物を含む場合に該リボスイッチがシグナルを産生し、該リボスイッチが、サイクリックジＧＭＰ応答性リボスイッチまたはサイクリックジＧＭＰ応答性リボスイッチの誘導体、Ｓ−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチまたはＳ−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチの誘導体、ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチまたはｐｒｅＱ１応答性リボスイッチの誘導体、Ｍｏｃｏ応答性リボスイッチまたはＭｏｃｏ応答性リボスイッチの誘導体、またはＳＡＭ応答性リボスイッチまたはＳＡＭ応答性リボスイッチの誘導体である、方法。
【請求項１５】
前記目的の化合物によって活性化された場合に前記リボスイッチが構造を変化させ、該構造の変化が、構造依存性標識を介してシグナルを産生する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記目的の化合物によって活性化された場合に前記リボスイッチが構造を変化させ、該構造の変化によって該リボスイッチに連結されたＲＮＡの発現が変化し、該発現の変化によってシグナルが産生される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記シグナルが、前記リボスイッチに連結された前記ＲＮＡから発現したレポータータンパク質によって産生される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
（ａ）リボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子の遺伝子発現の変化について化合物を試験する工程であって、該変化が該リボスイッチを介し、該リボスイッチが、サイクリックジＧＭＰ応答性リボスイッチまたはサイクリックジＧＭＰ応答性リボスイッチの誘導体、Ｓ−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチまたはＳ−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチの誘導体、ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチまたはｐｒｅＱ１応答性リボスイッチの誘導体、Ｍｏｃｏ応答性リボスイッチまたはＭｏｃｏ応答性リボスイッチの誘導体、またはＳＡＭ応答性リボスイッチまたはＳＡＭ応答性リボスイッチの誘導体である、試験工程、
（ｂ）細胞と工程（ａ）で遺伝子発現を変化させた化合物との接触によって遺伝子発現を変化させる工程を含み、
該細胞がリボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子を含み、該化合物が該リボスイッチへの結合によって該遺伝子の発現を阻害する、方法。
【請求項１９】
リボスイッチを同定する方法であって、該方法が、
化合物の存在下および非存在下でＲＮＡ分子のインライン自発性切断を評価する工程であって、該ＲＮＡ分子が該化合物によって調節される遺伝子によってコードされる、評価工程を含み、
該ＲＮＡ分子の該インライン自発性切断パターンの変化がリボスイッチを示し、（ａ）該ＲＮＡがサイクリックジＧＭＰ応答性リボスイッチもしくはサイクリックジＧＭＰ応答性リボスイッチの誘導体を含み、該化合物がサイクリックジＧＭＰであり、（ｂ）該ＲＮＡがＳ−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチもしくはＳ−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチの誘導体を含み、該化合物がＳ−アデノシルホモシステインであり、（ｃ）該ＲＮＡがｐｒｅＱ１応答性リボスイッチもしくはｐｒｅＱ１応答性リボスイッチの誘導体を含み、該化合物がｐｒｅＱ１であり、または（ｄ）該ＲＮＡがＭｏｃｏ応答性リボスイッチもしくはＭｏｃｏ応答性リボスイッチの誘導体、またはＳＡＭ応答性リボスイッチもしくはＳＡＭ応答性リボスイッチの誘導体を含む、方法。
【請求項２０】
遺伝子発現を変化させる方法であって、該方法が、
化合物と細胞とを接触させる工程を含み、ここで、該細胞がサイクリックジＧＭＰ応答性リボスイッチ、Ｓ−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチ、ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチ、Ｍｏｃｏ応答性リボスイッチ、またはＳＡＭ応答性リボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子を含み、該化合物がサイクリックジＧＭＰ応答性リボスイッチ、Ｓ−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチ、ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチ、Ｍｏｃｏ応答性リボスイッチ、またはＳＡＭ応答性リボスイッチへの結合によって該遺伝子の発現を変化させる接触工程である、方法。
【請求項２１】
前記細胞が、遺伝子発現の変化を必要とすると同定されている、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞が細菌細胞である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記化合物が細菌細胞を死滅させるか増殖を阻害する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記化合物および前記細胞が、被験体への該化合物の投与によって接触する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞が前記被験体中の細菌細胞であり、該化合物が前記細菌細胞を死滅させるか、増殖を阻害する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記被験体が細菌に感染している、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記化合物を別の抗菌化合物と組み合わせて投与する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
前記化合物がバイオフィルム中の細菌増殖を阻害する、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連する出願への相互参照）
本願は、２００７年５月２９日に出願された米国仮特許出願第６０／９３２，１１２号の利益を主張する。２００７年５月２９日に出願された米国仮特許出願第６０／９３２，１１２号は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
（連邦政府の後援による研究に係る陳述）
本発明は、ＮＩＨによって授与された補助金番号ＧＭ０６８８１９、ＲＲ１９８９５−０２およびＲ３３ＤＫ０７０２７、ＮＨＬＢＩによって授与された補助金番号ＨＶ３８１８６、国立総合医学研究所によって授与された補助金番号Ｔ３２ＧＭ００７２２３、ならびに米国科学財団によって授与された補助金番号ＥＩＡ−０３２３５１０のもと、政府の援助を受けてなされた。政府は本発明における特定の権利を保有する。
（発明の分野）
本開示の発明は、一般に、遺伝子発現分野、具体的には、遺伝子発現の調節領域に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
細胞が種々の遺伝子発現パターンの変化による複数の生化学シグナルおよび環境信号に応答しなければならないので、正確な遺伝子調節は生物系の本質的特徴である。最も公知の遺伝子調節機構は、化学的または物理的な刺激を感知し、その後に関連するＤＮＡまたは伝令ＲＮＡ配列との選択的相互作用によって遺伝子発現を調整するタンパク質因子の使用を含む。タンパク質は、複合体形状を採用することができ、生物系がその化学的および物理的環境を正確に感知することができる種々の機能を実行する。代謝産物に応答するタンパク質因子は、典型的には、ＤＮＡに結合することによって転写開始を調整するか（例えば、ｌａｃリプレッサータンパク質；非特許文献１）、ＲＮＡに結合することによって転写終結（例えば、ＰｙｒＲタンパク質；非特許文献２）または翻訳（例えば、ＴＲＡＰタンパク質；非特許文献３）のいずれかを調節するように作用する。タンパク質因子は、アロステリック調整または翻訳後改変などの種々の機構によって環境刺激に応答し、高応答性遺伝子スイッチとしての機能を果たすためにこれらの機能を活用するのに長けている（例えば、非特許文献４を参照のこと）。
【０００３】
遺伝子調節におけるタンパク質因子の広範な関与に加えて、ＲＮＡが遺伝子調節で積極的な役割を果たし得ることも公知である。最近の研究により、小さな非コードＲＮＡが破壊のためのｍＲＮＡの選択的ターゲティングで役割を果たし、それにより、遺伝子発現が下方制御されるという実質的役割が明らかにされ始めている（例えば、非特許文献５およびそのリファレンスを参照のこと）。このＲＮＡ干渉過程は、短いＲＮＡがワトソン−クリック塩基相補性を介して意図するｍＲＮＡ標的を選択的に認識する能力を活用し、その後に結合したｍＲＮＡをタンパク質作用によって破壊する。新規であるが特異性の高いＲＮＡ結合部位を使用してタンパク質因子を生成するよりも進化過程によって新規の標的特異的ＲＮＡ因子を生成することの方がはるかに容易であるので、ＲＮＡはこの系における理想的な分子認識のための作用因子である。
【０００４】
タンパク質が、酵素、受容体、および構造機能についての、生物学が有するほとんどの要件を満たすにもかかわらず、ＲＮＡはこれらの能力でも役立ち得る。例えば、ＲＮＡは、相当な酵素力および正確な分子認識を示す多数のリボザイムドメイン（非特許文献６；非特許文献７）および受容体ドメイン（非特許文献８；非特許文献９）を形成するのに十分な構造可塑性を有する。さらに、これらの活性を組み合わせて、エフェクター分子によって選択的に調整されるアロステリックリボザイム（非特許文献１０；非特許文献１１）を作製することができる。
【０００５】
細菌リボスイッチＲＮＡは、主に、特定のｍＲＮＡの主なコード領域の５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）内に存在する遺伝子調節エレメントである。構造探索研究（以下でさらに考察している）により、リボスイッチエレメントが一般に以下の２つのドメインから構成されることが明らかとなっている：リガンド結合ドメインとしての機能を果たす天然のアプタマー（Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｎ，Ｄ．Ｊ．Ｐａｔｅｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０００，２８７，８２０；Ｌ．Ｇｏｌｄら、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９５，６４，７６３）および遺伝子発現に関与するＲＮＡエレメント（例えば、シャイン−ダルカルノ（ＳＤ）エレメント；転写ターミネーターステム）と適合する「発現プラットフォーム」。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ｋ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｊ．Ｃ．，１９９８，Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５８，１２７−１６４
【非特許文献２】Ｓｗｉｔｚｅｒ，Ｒ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６２，３２９−３６７
【非特許文献３】Ｂａｂｉｔｚｋｅ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｇｏｌｌｎｉｃｋ，Ｐ．，２００１，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８３，５７９５−５８０２
【非特許文献４】Ｐｔａｓｈｎｅ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｇａｎｎ，Ａ．（２００２）．Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｓｉｇｎａｌｓ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ
【非特許文献５】Ｈａｎｎｏｎ，Ｇ．Ｊ．２００２，Ｎａｔｕｒｅ  ４１８，２４４−２５１
【非特許文献６】Ｔｈｅ  ＲＮＡ  Ｗｏｒｌｄ  Ｒ．Ｆ．Ｇｅｓｔｅｌａｎｄ，Ｔ．Ｒ．Ｃｅｃｈ，Ｊ．Ｆ．Ａｔｋｉｎｓ，ｅｄｓ．，ｐｐ．３２１−３５０（１９９８）のＣｅｃｈ  ＆  Ｇｏｌｄｅｎ，Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ａ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ  ｕｓｉｎｇ  ｏｎｌｙ  ＲＮＡ．
【非特許文献７】Ｂｒｅａｋｅｒ，Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９７，３７１−３９０（１９９７）
【非特許文献８】Ｏｓｂｏｒｎｅ  ＆  Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｏｆ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９７，３４９−３７０（１９９７）
【非特許文献９】Ｈｅｒｍａｎｎ  ＆  Ｐａｔｅｌ，Ａｄａｐｔｉｖｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｐｔａｍｅｒｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７，８２０−８２５（２０００）
【非特許文献１０】Ｓｏｕｋｕｐ  ＆  Ｂｒｅａｋｅｒ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ＲＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｗｉｔｃｈｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６，３５８４−３５８９（１９９９）
【非特許文献１１】Ｓｅｅｔｈａｒａｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｒｉｂｏｓｗｉｔｃｈｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９，３３６−３４１（２００１）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の概要
調節可能な遺伝子発現構築物であって、コード領域に作動可能に連結されたリボスイッチを含むＲＮＡをコードする核酸分子を含み、リボスイッチがＲＮＡの発現を調節し、リボスイッチおよびコード領域が非相同である、構築物を本明細書中に開示する。リボスイッチは、サイクリックジＧＭＰ応答性リボスイッチ、Ｓ−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチ、ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチ、Ｍｏｃｏ応答性リボスイッチ、またはＳＡＭ応答性リボスイッチであり得る。リボスイッチはアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含むことができ、アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインは非相同である。リボスイッチは、２つ以上のアプタマードメインおよび１つの発現プラットフォームドメインも含むことができ、アプタマードメインの少なくとも１つおよび発現プラットフォームドメインは非相同である。アプタマードメインの少なくとも２つは協同的結合を示すことができる。
【０００８】
リボスイッチが天然に存在するリボスイッチの非天然誘導体であるリボスイッチも開示する。リボスイッチは、サイクリックジＧＭＰ応答性リボスイッチ、Ｓ−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチ、ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチ、Ｍｏｃｏ応答性リボスイッチ、またはＳＡＭ応答性リボスイッチであり得る。リボスイッチはアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含むことができ、アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインは非相同である。リボスイッチは、１つまたは複数のさらなるアプタマードメインをさらに含むことができる。アプタマードメインの少なくとも２つは協同的結合を示すことができる。リボスイッチをトリガー分子によって活性化することができ、リボスイッチは、トリガー分子によって活性化された場合にシグナルを産生する。
【０００９】
目的の化合物を検出する方法であって、該方法は、サンプルとリボスイッチとを接触させる工程を含み、リボスイッチが目的の化合物によって活性化され、リボスイッチが目的の化合物によって活性化された場合にシグナルを産生し、サンプルが目的の化合物を含む場合にリボスイッチがシグナルを産生し、リボスイッチがリボスイッチまたはリボスイッチの誘導体を含む、方法をさらに開示する。リボスイッチは、サイクリックジＧＭＰ応答性リボスイッチ、Ｓ−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチ、ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチ、Ｍｏｃｏ応答性リボスイッチ、またはＳＡＭ応答性リボスイッチであり得る。目的の化合物によって活性化された場合にリボスイッチが構造を変化させることができ、構造の変化が、構造依存性標識を介してシグナルを産生する。目的の化合物によって活性化された場合にリボスイッチは構造を変化させることもでき、構造の変化によってリボスイッチに連結されたＲＮＡの発現が変化し、発現の変化によってシグナルが産生される。シグナルを、リボスイッチに連結されたＲＮＡから発現したレポータータンパク質によって産生することができる。
【００１０】
（ａ）リボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子の遺伝子発現の阻害について化合物を試験する工程であって、阻害がリボスイッチを介し、リボスイッチがリボスイッチまたはリボスイッチの誘導体を含む、試験工程、（ｂ）細胞と工程（ａ）で遺伝子発現を阻害した化合物との接触によって遺伝子発現を阻害する工程であって、細胞がリボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子を含み、化合物がリボスイッチへの結合によって遺伝子発現を阻害する、阻害工程を含む方法も開示する。リボスイッチは、サイクリックジＧＭＰ応答性リボスイッチ、Ｓ−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチ、ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチ、Ｍｏｃｏ応答性リボスイッチ、またはＳＡＭ応答性リボスイッチであり得る。
【００１１】
（ａ）リボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子の遺伝子発現の抑制について化合物を試験する工程であって、抑制がリボスイッチを介し、リボスイッチがリボスイッチまたはリボスイッチの誘導体を含む、試験工程、（ｂ）細胞と工程（ａ）で遺伝子発現を抑制した化合物との接触によって遺伝子発現を抑制する工程であって、細胞がリボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子を含み、化合物がリボスイッチへの結合によって遺伝子発現を抑制する、抑制工程を含む方法も開示する。リボスイッチは、サイクリックジＧＭＰ応答性リボスイッチ、Ｓ−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチ、ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチ、Ｍｏｃｏ応答性リボスイッチ、またはＳＡＭ応答性リボスイッチであり得る。
【００１２】
リボスイッチを同定する方法であって、該方法は、トリガー分子の存在下および非存在下でＲＮＡ分子のインライン自発性切断（ｉｎ−ｌｉｎｅ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｃｌｅａｖａｇｅ）を評価する工程であって、ＲＮＡ分子がトリガー分子によって調節される遺伝子によってコードされる評価工程を含み、ＲＮＡ分子のインライン自発性切断パターンの変化がトリガー分子に応答性を示すリボスイッチを示す、方法を開示する。トリガー分子は、サイクリックジＧＭＰ、Ｓ−アデノシルホモシステイン、ｐｒｅＱ１、Ｍｏｃｏ、またはＳＡＭであり得る。
【００１３】
遺伝子発現を変化させる方法であって、該方法は、化合物と細胞とを接触させる工程を含み、該化合物が、サイクリックジＧＭＰ、ｐＧｐＧ、ＧｐＧ、またはＧｐＧｐＧである、方法も開示する。化合物はまた、サイクリックジＧＭＰ応答性リボスイッチを活性化することができるサイクリックジＧＭＰ、ｐＧｐＧ、ＧｐＧ、またはＧｐＧｐＧの誘導体であり得る。遺伝子発現を変化させる方法であって、該方法は、化合物と細胞とを接触させる工程を含み、該化合物がＳ−アデノシルホモシステインである、方法も開示する。化合物はまた、Ｓ−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチを活性化することができるＳ−アデノシルホモシステインの誘導体であり得る。例えば、化合物はＳ−アデノシル−Ｌ−システイン（ＳＡＣ）であり得る。遺伝子発現を変化させる方法であって、該方法は、化合物と細胞とを接触させる工程を含み、化合物がｐｒｅＱ１である、方法も開示する。化合物はまた、ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチを活性化することができるｐｒｅＱ１の誘導体であり得る。遺伝子発現を変化させる方法であって、該方法は、化合物と細胞とを接触させる工程を含み、化合物がＭｏｃｏである、方法も開示する。化合物はまた、Ｍｏｃｏ応答性リボスイッチを活性化することができるＭｏｃｏの誘導体であり得る。遺伝子発現を変化させる方法であって、該方法は、化合物と細胞とを接触させる工程を含み、化合物がＳＡＭである、方法も開示する。化合物はまた、ＳＡＭ応答性リボスイッチを活性化することができるＳＡＭの誘導体であり得る。ＳＡＭ−ＩＶリボスイッチを活性化するための化合物はまた、ＭｅＡｚａＡｄｏＭｅｔであり得る。
【００１４】
ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチ（およびｐｒｅＱ１応答性リボスイッチ由来のリボスイッチ）との使用に有用な化合物には、１位のＮをＣ、ＯまたはＳと置換することができ、２位のアミノ基を水素結合供与体と置換することができ、６位の酸素を水素結合受容体と置換することができ、７位のアミノ基を水素結合受容体と置換することができ、窒素を水素結合供与体と置換するかこれを使用して誘導体化することができるｐｒｅＱ１の誘導体が含まれる。
【００１５】
水素結合供与体および受容体の例には、ＮＨ、ＮＨ２＋、ＮＨ３＋、Ｏ、ＯＨ、Ｓ、ＳＨ、Ｃ−Ｒ５、ＣＨ−Ｒ５、Ｎ−Ｒ５、ＮＨ−Ｒ５、Ｏ−Ｒ５、またはＳ−Ｒ５が含まれ、式中、Ｒ５は、ＮＨ２＋、ＮＨ３＋、ＣＯ２Ｈ、Ｂ（ＯＨ）２、ＣＨ（ＮＨ２）２、Ｃ（ＮＨ２）２＋、ＣＮＨ２ＮＨ３＋、Ｃ（ＮＨ３＋）３、ヒドロキシメチル、１−ヒドロキシエチル、２−ヒドロキシエチル、１，２−ジヒドロキシエチル、２−ヒドロキシ−１−メチルエチル、１−ヒドロキシプロピル、２−ヒドロキシプロピル、３−ヒドロキシプロピル、１，３−ジヒドロキシプロピル、２，３−ジヒドロキシプロピル、１−ヒドロキシブチル、２−ヒドロキシブチル、３−ヒドロキシブチル、４−ヒドロキシブチル、１，４−ジヒドロキシブチル、２，４−ジヒドロキシブチル、１−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、３−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、１−ヒドロキシメチル−１−メチルエチル、トリスヒドロキシメチルメチル、チオールメチル、１−チオールエチル、２−チオールエチル、１，２−ジチオールエチル、２−チオール−１−メチルエチル、１−チオールプロピル、２−チオールプロピル、３−チオールプロピル、１，３−ジチオールプロピル、２，３−ジチオールプロピル、１−チオールブチル、２−チオールブチル、３−チオールブチル、４−チオールブチル、１，４−ジチオールブチル、２，４−ジチオールブチル、１−チオール−２−メチルプロピル、２−チオール−２−メチルプロピル、３−チオール−２−メチルプロピル、１−チオールメチル−１−メチルエチル、トリスチオールメチルメチル、アミノメチル、１−アミノエチル、２−アミノエチル、１，２−ジアミノエチル、２−アミノ−１−メチルエチル，１−アミノプロピル、２−アミノプロピル、３−アミノプロピル、１，３−ジアミノプロピル、２，３−ジアミノプロピル、１−アミノブチル、２−アミノブチル、３−アミノブチル、４−アミノブチル、１、４  ジアミノブチル、２，４−ジアミノブチル、１−アミノ−２−メチルプロピル、２−アミノ−２−メチルプロピル、３−アミノ−２−メチルプロピル、１−アミノメチル−１−メチルエチル、およびトリスアミノメチルメチルである。
【００１６】
細胞を、遺伝子発現の変化が必要であると同定することができる。細胞は細菌細胞であり得る。化合物は、細菌細胞を死滅させるか増殖を阻害することができる。被験体への化合物の投与によって化合物と細胞とを接触させることができる。細胞は被験体中の細菌細胞であり得、化合物は細菌細胞を死滅させるか増殖を阻害する。被験体は、細菌感染を有し得る。細胞は、サイクリックジＧＭＰ応答性リボスイッチ、Ｓ−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチ、ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチ、Ｍｏｃｏ応答性リボスイッチ、またはＳＡＭ応答性リボスイッチを含むことができる。化合物を、別の抗菌化合物と組み合わせて投与することができる。化合物は、バイオフィルム中の細菌増殖を阻害することができる。
【００１７】
細胞の生理学的状態を変化させる方法であって、該方法は、化合物と細胞とを接触させる工程を含み、該化合物が、サイクリックジＧＭＰ、ｐＧｐＧ、ＧｐＧ、またはＧｐＧｐＧである、方法も開示する。化合物はまた、サイクリックジＧＭＰ応答性リボスイッチを活性化することができるサイクリックジＧＭＰ、ｐＧｐＧ、ＧｐＧ、またはＧｐＧｐＧの誘導体であり得る。
【００１８】
トリガー分子を産生する方法であって、該方法は、トリガー分子を産生することができる変異細菌細胞を培養する工程であって、変異細菌細胞がトリガー分子に応答性を示すリボスイッチ中に変異を含み、変異を持たない細胞と比較して、変異が変異細菌細胞によってトリガー分子の産生を増加させる、培養工程、およびトリガー分子を細胞培養物から単離し、それにより、トリガー分子を産生する工程を含む、方法も開示する。トリガー分子は、例えば、サイクリックジＧＭＰ、Ｓ−アデノシルホモシステイン、ｐｒｅＱ１、Ｍｏｃｏ、またはＳＡＭであり得る。本方法により、リボスイッチ中に変異を含まない細菌細胞の培養と比較して、トリガー分子の産生を少なくとも１０％増加させることができる。本方法により、リボスイッチ中に変異を含まない細菌細胞の培養と比較して、トリガー分子の産生を少なくとも１５％増加させることができる。本方法により、リボスイッチ中に変異を含まない細菌細胞の培養と比較して、トリガー分子の産生を少なくとも２５％増加させることができる。リボスイッチは、ノックアウト変異を含むことができる。リボスイッチ中に変異を含む細菌細胞であって、変異を持たない細胞と比較して、変異が細胞によってリボスイッチのトリガー分子の産生を測定可能に増加させる、細菌細胞をさらに開示する。
【００１９】
細菌細胞増殖を阻害する方法であって、細胞とリボスイッチに結合する化合物とを接触させる工程を含み、細胞が化合物に対して応答性を示すリボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子を含み、化合物がリボスイッチへの結合によって細菌細胞増殖を阻害し、それにより、遺伝子発現が変化する、方法も開示する。リボスイッチは、サイクリックジＧＭＰ応答性リボスイッチ、Ｓ−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチ、ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチ、Ｍｏｃｏ応答性リボスイッチ、またはＳＡＭ応答性リボスイッチであり得る。本方法により、化合物と接触しない細胞と比較して細菌細胞増殖を少なくとも１０％減少させることができる。被験体への化合物の投与により、化合物と細胞とを接触させることができる。細胞は被験体中の細菌細胞であり得、化合物は細菌細胞を死滅させるか増殖を阻害する。被験体は、細菌感染を有し得る。化合物を、別の抗菌化合物と組み合わせて投与することができる。
【００２０】
サンプル中の化合物の検出方法であって、化合物に応答性を示すリボスイッチをサンプルと接触させる工程、および化合物とリボスイッチとの間の相互作用を検出する工程を含み、化合物とリボスイッチとの間の相互作用が化合物の存在を示す、方法を開示する。リボスイッチは、サイクリックジＧＭＰ応答性リボスイッチ、Ｓ−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチ、ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチ、Ｍｏｃｏ応答性リボスイッチ、またはＳＡＭ応答性リボスイッチであり得る。リボスイッチを標識することができる。
【００２１】
細胞と、遺伝子の遺伝子発現の阻害について化合物を試験することによって遺伝子の遺伝子発現を阻害する化合物と同定された化合物との接触によってリボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子の遺伝子発現を阻害する工程を含み、阻害がリボスイッチを介する、方法も開示する。リボスイッチは、サイクリックジＧＭＰ応答性リボスイッチ、Ｓ−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチ、ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチ、Ｍｏｃｏ応答性リボスイッチ、ＳＡＭ応答性リボスイッチ、またはかかるリボスイッチの誘導体であり得る。
【００２２】
細胞と、遺伝子の遺伝子発現の抑制について化合物を試験することによって遺伝子の遺伝子発現を抑制する化合物と同定された化合物との接触によってリボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子の遺伝子発現を抑制する工程を含み、抑制がリボスイッチを介する、方法も開示する。リボスイッチは、サイクリックジＧＭＰ応答性リボスイッチ、Ｓ−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチ、ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチ、Ｍｏｃｏ応答性リボスイッチ、ＳＡＭ応答性リボスイッチ、またはかかるリボスイッチの誘導体であり得る。
【００２３】
開示の方法および組成物のさらなる利点を以下の記載に一部示し、この記載から利点が一部理解される。あるいは、利点を、開示の方法および組成物の実施によって知ることができる。開示の方法および組成物の利点は、添付の特許請求の範囲で特に指摘した要素および組み合わせによって理解および達成される。上記の一般的記載および以下の詳細な記載の両方は例示および説明のみであり、特許請求の範囲に記載の本発明を制限するものではないと理解すべきである。
【００２４】
本明細書中に組み込まれ、且つ本明細書の一部を構成する添付の図面は、開示の方法および組成物のいくつかの実施形態を例示し、記載と共に、開示の方法および組成物の原理を説明するのに役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１Ａ】図１は、同定された２２のモチーフのうちの７つについて記載されたコンセンサス配列および構造を示す。ヌクレオチドの同一性／存在の保存の計算および共変動の証拠を実施例１に記載する。５％を超える非標準ヌクレオチドまたは喪失ヌクレオチドを有する提案された対を、共変動に分類しない。ヌクレオチド保存レベルは、モチーフ上の生化学的制約および系統発生上の多様性の両方によって影響を受けることに留意のこと。限られた範囲のモチーフ（例えば、ｐｒｅＱ１−ＩＩまたはＣＯＧ４７０８モチーフ）は、より保存されているようであり、可変長ステム中のいくつかの共変動位置は示さない。
【図１Ｂ】図１は、同定された２２のモチーフのうちの７つについて記載されたコンセンサス配列および構造を示す。ヌクレオチドの同一性／存在の保存の計算および共変動の証拠を実施例１に記載する。５％を超える非標準ヌクレオチドまたは喪失ヌクレオチドを有する提案された対を、共変動に分類しない。ヌクレオチド保存レベルは、モチーフ上の生化学的制約および系統発生上の多様性の両方によって影響を受けることに留意のこと。限られた範囲のモチーフ（例えば、ｐｒｅＱ１−ＩＩまたはＣＯＧ４７０８モチーフ）は、より保存されているようであり、可変長ステム中のいくつかの共変動位置は示さない。
【図１Ｃ】図１は、同定された２２のモチーフのうちの７つについて記載されたコンセンサス配列および構造を示す。ヌクレオチドの同一性／存在の保存の計算および共変動の証拠を実施例１に記載する。５％を超える非標準ヌクレオチドまたは喪失ヌクレオチドを有する提案された対を、共変動に分類しない。ヌクレオチド保存レベルは、モチーフ上の生化学的制約および系統発生上の多様性の両方によって影響を受けることに留意のこと。限られた範囲のモチーフ（例えば、ｐｒｅＱ１−ＩＩまたはＣＯＧ４７０８モチーフ）は、より保存されているようであり、可変長ステム中のいくつかの共変動位置は示さない。
【図１Ｄ】図１は、同定された２２のモチーフのうちの７つについて記載されたコンセンサス配列および構造を示す。ヌクレオチドの同一性／存在の保存の計算および共変動の証拠を実施例１に記載する。５％を超える非標準ヌクレオチドまたは喪失ヌクレオチドを有する提案された対を、共変動に分類しない。ヌクレオチド保存レベルは、モチーフ上の生化学的制約および系統発生上の多様性の両方によって影響を受けることに留意のこと。限られた範囲のモチーフ（例えば、ｐｒｅＱ１−ＩＩまたはＣＯＧ４７０８モチーフ）は、より保存されているようであり、可変長ステム中のいくつかの共変動位置は示さない。
【図２】図２は、ＧＥＭＭモチーフの共通の特徴を示す。２つのＧＥＭＭ例を共通の特徴を例示するために選択したが、これら２つの例は、完全な３２２ＧＥＭＭを示していない。（Ａ）この推定ＲＮＡは、標準的なＧＮＲＡテトラループおよび受容体を含む（灰色の領域）。ほぼ５０％のＧＥＭＭ例は、テトラループ受容体を含む可能性が高い。下流オペロン中の第１の遺伝子のみを示す。（Ｂ）いくつかのＧＥＭＭ  ＲＮＡはテトラループ受容体を欠くが、２つの余分に隆起したＡ残基（灰色の影）が存在し、これらの残基は受容体を欠く配列の約半分で見出される。灰色のオーバーラインのヌクレオチドを折り畳んで、ｒｈｏ非依存性転写ターミネーターのステムを形成することができる（その後に３’Ｕテールが続く）。このターミネーターは、Ｐ２ステムの３’部分（最も右のヘアピン）と競合するようである。３２２個のＧＥＭＭ例のうちの７８個は、転写ターミネーター重複Ｐ２と予想された。
【図３Ａ】図３は、サイクリックジＧＭＰアプタマーを示す。（Ａ）第２のメッセンジャーサイクリックジＧＭＰの化学構造。（Ｂ）１型および２型ＧＥＭＭ  ＲＮＡのコンセンサス配列および構造。（Ｃ）Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ第２染色体由来のＶｃ２  ＲＮＡの配列および構造ならびにＶＣ１７２２のＯＲＦとの近さ。示したヌクレオチドは、１１０  Ｖｃ２  ＲＮＡ構築物に対応する。太字の数字は、Ｄで認められたリガンド媒介構造調整領域を特定する。括弧は、１０ｎＭサイクリックジＧＭＰを使用して試験した場合に構造調整を示す最小の５’末端または３’末端（１１０  Ｖｃ２  ＲＮＡの対立する末端が保持される場合）を特定する。ヌクレオチド１３〜２０の配列はＣＧＣＡＣＡＧＧである。（Ｄ）５’３２Ｐ標識１１０  Ｖｃ２  ＲＮＡのインライン探索によって生成されたＲＮＡ産物のＰＡＧＥ分離。ＮＲ（反応なし）；Ｔ１（ＲＮアーゼＴ１での部分消化）；−ＯＨ（アルカリでの部分消化）。ＲＮＡを、１００μＭサイクリックジＧＭＰの非存在下（−）または存在下（＋）でインキュベートした。
【図３Ｂ】図３は、サイクリックジＧＭＰアプタマーを示す。（Ａ）第２のメッセンジャーサイクリックジＧＭＰの化学構造。（Ｂ）１型および２型ＧＥＭＭ  ＲＮＡのコンセンサス配列および構造。（Ｃ）Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ第２染色体由来のＶｃ２  ＲＮＡの配列および構造ならびにＶＣ１７２２のＯＲＦとの近さ。示したヌクレオチドは、１１０  Ｖｃ２  ＲＮＡ構築物に対応する。太字の数字は、Ｄで認められたリガンド媒介構造調整領域を特定する。括弧は、１０ｎＭサイクリックジＧＭＰを使用して試験した場合に構造調整を示す最小の５’末端または３’末端（１１０  Ｖｃ２  ＲＮＡの対立する末端が保持される場合）を特定する。ヌクレオチド１３〜２０の配列はＣＧＣＡＣＡＧＧである。（Ｄ）５’３２Ｐ標識１１０  Ｖｃ２  ＲＮＡのインライン探索によって生成されたＲＮＡ産物のＰＡＧＥ分離。ＮＲ（反応なし）；Ｔ１（ＲＮアーゼＴ１での部分消化）；−ＯＨ（アルカリでの部分消化）。ＲＮＡを、１００μＭサイクリックジＧＭＰの非存在下（−）または存在下（＋）でインキュベートした。
【図３Ｃ】図３は、サイクリックジＧＭＰアプタマーを示す。（Ａ）第２のメッセンジャーサイクリックジＧＭＰの化学構造。（Ｂ）１型および２型ＧＥＭＭ  ＲＮＡのコンセンサス配列および構造。（Ｃ）Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ第２染色体由来のＶｃ２  ＲＮＡの配列および構造ならびにＶＣ１７２２のＯＲＦとの近さ。示したヌクレオチドは、１１０  Ｖｃ２  ＲＮＡ構築物に対応する。太字の数字は、Ｄで認められたリガンド媒介構造調整領域を特定する。括弧は、１０ｎＭサイクリックジＧＭＰを使用して試験した場合に構造調整を示す最小の５’末端または３’末端（１１０  Ｖｃ２  ＲＮＡの対立する末端が保持される場合）を特定する。ヌクレオチド１３〜２０の配列はＣＧＣＡＣＡＧＧである。（Ｄ）５’３２Ｐ標識１１０  Ｖｃ２  ＲＮＡのインライン探索によって生成されたＲＮＡ産物のＰＡＧＥ分離。ＮＲ（反応なし）；Ｔ１（ＲＮアーゼＴ１での部分消化）；−ＯＨ（アルカリでの部分消化）。ＲＮＡを、１００μＭサイクリックジＧＭＰの非存在下（−）または存在下（＋）でインキュベートした。
【図３Ｄ】図３は、サイクリックジＧＭＰアプタマーを示す。（Ａ）第２のメッセンジャーサイクリックジＧＭＰの化学構造。（Ｂ）１型および２型ＧＥＭＭ  ＲＮＡのコンセンサス配列および構造。（Ｃ）Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ第２染色体由来のＶｃ２  ＲＮＡの配列および構造ならびにＶＣ１７２２のＯＲＦとの近さ。示したヌクレオチドは、１１０  Ｖｃ２  ＲＮＡ構築物に対応する。太字の数字は、Ｄで認められたリガンド媒介構造調整領域を特定する。括弧は、１０ｎＭサイクリックジＧＭＰを使用して試験した場合に構造調整を示す最小の５’末端または３’末端（１１０  Ｖｃ２  ＲＮＡの対立する末端が保持される場合）を特定する。ヌクレオチド１３〜２０の配列はＣＧＣＡＣＡＧＧである。（Ｄ）５’３２Ｐ標識１１０  Ｖｃ２  ＲＮＡのインライン探索によって生成されたＲＮＡ産物のＰＡＧＥ分離。ＮＲ（反応なし）；Ｔ１（ＲＮアーゼＴ１での部分消化）；−ＯＨ（アルカリでの部分消化）。ＲＮＡを、１００μＭサイクリックジＧＭＰの非存在下（−）または存在下（＋）でインキュベートした。
【図４】図４は、サイクリックジＧＭＰのＶｃ２アプタマーの親和性および特異性を示す。（Ａ）１１０  Ｖｃ２アプタマーの正規化切断の割合対サイクリックジＧＭＰ濃度のプロット。構造調整部位は、図３に示す通りである。（Ｂ）サイクリックジＧＭＰおよび種々のアナログの１１０  Ｖｃ２アプタマーによって示されたＫＤ値の比較。Ｇ（グアノシン）；ｐＧ、ｐＧｐＧ、ｐＧｐＡ（５’リン酸化モノおよびジヌクレオチド）；ＧｐＧｐＧ（トリヌクレオチド）、ＡＭＰおよびＧＭＰ（それぞれアデノシン一リン酸およびグアノシン一リン酸）。（Ｃ）インタクトなままのサイクリックジＧＭＰの割合の自然対数対インライン探索条件下でのインキュベーション時間のプロット。負の直線の勾配は、第２のメッセンジャー切断についての無触媒速度定数（ｋｕｎｃａｔ）を反映する。
【図５】図５は、代表的なサイクリックジＧＭＰアプタマーが遺伝子調節エレメントの成分であることを示す。（Ａ）レポーター融合構築物は、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ（Ｖｃ２）由来の野生型（ＷＴ）リボスイッチまたは変異（Ｍ１〜Ｍ３）リボスイッチを保有するか、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ（Ｂｃ１およびＢｃ２）またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（Ｃｄ１）由来の等価なＷＴおよびＭ３リボスイッチを保有する。（Ｂ）Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換した場合のＡに記載の構築物についてのβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子アッセイ。４つの代表について測定した最大ミラー（ＭＩｌｌｅｒ）単位は、それぞれ、４３６、４７、５、および５１であった。（Ｃ）ＷＴまたはＭ３  Ｃｄ１リボスイッチの下流に融合し、Ｘ−ｇａｌを含む寒天上で増殖させたβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子（ｌａｃＺ）を保有するＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞。
【図６】図６は、サイクリックジＧＭＰホスホジエステラーゼの発現がＣｄ１リボスイッチによって調節されたレポーター遺伝子の発現を変化させることを示す。（Ａ）野生型（ＷＴ）Ｃｄ１リボスイッチに融合し、ＥＡＬホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）をコードするＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ  ｖｉｅＡ遺伝子を欠く（−）か、正常な（＋）この遺伝子または変異した（Ｅ１７０Ａ）この遺伝子を保有するプラスミドで形質転換したβ−ガラクトシダーゼレポーター構築物を保有するＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞。（Ｂ）記載のようにＷＴまたはＭ３リボスイッチに融合し、Ａに記載のようにプラスミドで形質転換したレポーター遺伝子を保有するＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞のβ−ガラクトシダーゼレポーターアッセイ。Ｃｄ１についての正規化した遺伝子発現値１は、１０２ミラー単位を示す。
【図７】図７は、代表的生物のサイクリックジＧＭＰリボスイッチまたはアプタマーのゲノム上の位置を示す。代表物のすぐ下流に存在する遺伝子を示し、ここで、複数の遺伝子は推定オペロンを示す。遺伝子の非存在は、サイクリックジＧＭＰアプタマーがいかなるＯＲＦの５’近位に存在しないことを示す。ＣＯＧ３０７０は、ＴｆｏＸに類似するタンパク質配置であるｐｆａｍ０４９９４ドメインに連結する（９３、９４）。染色体を影を付けた線で示す；ｏｒｉ（複製起点）。
【図８】図８は、真正細菌における典型的なＳＡＭ代謝サイクルを示す。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｋ−１２株）またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ由来の遺伝子の名称を、各酵素の後の括弧内に示す。影を付けたボックスは、ＳＡＨエレメントのすぐ下流に存在するＯＲＦを特定する一方で、白抜きのボックスはＳＡＨエレメントが存在する場合にＳＡＨヒドロラーゼ遺伝子ａｈｃＹの下流（おそらく、同一のオペロン中）に時折存在するＯＲＦを特定する。ＴＨＦはテトラヒドロ葉酸塩である。
【図９】図９は、ＳＡＨエレメントが多数のグラム陽性細菌およびグラム陰性細菌で見出される高度に保存されたＲＮＡモチーフであることを示す。（Ａ）ＳＡＨリサイクリング遺伝子の５’ＵＴＲ中に存在する保存されたＲＮＡエレメントのコンセンサスヌクレオチド配列および二次構造モデル。コンセンサス配列および構造モデルを、ほぼ同一のゲノムＤＮＡから同定した重複物を除く代表的な６８モチーフの試験によって決定した。Ｐ１〜Ｐ４は、推定塩基対合領域を特定し、任意のＰ３ステムを保有するか排除する重複しない代表の数を示す。（Ｂ）バイオインフォマティクス検索によって同定し、ゲノムコンテクストによって検証されたＳＡＨエレメントの系統発生的分布（密接に関連した細菌株中の同一配列の重複ヒットが含まれる）。「他」カテゴリーは、環境配列（ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）中に見出されたヒットをいう。
【図１０Ａ】図１０は、Ｄｅｃｈｌｏｒｏｍｏｎａｓ  ａｒｏｍａｔｉｃａのｍｅｔＨ  ５’−ＵＴＲ由来のＳＡＨエレメントがＳＡＨに選択的に結合した場合に構造変化を受けることを示す。（Ａ）保存されたＳＡＨアプタマーを含む６８  ｍｅｔＨ  ＲＮＡの配列および二次構造モデル。５’３２Ｐ標識ＲＮＡのインライン探索中の自発的ＲＮＡ切断部位を、Ｂに示すデータから同定した。天然のＲＮＡ中に存在しない２つのグアノシル残基を構築物の５’末端に付加して、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を容易にした。１〜８および６３〜６８の領域中のヌクレオチドは、Ｂで示したゲル上で視覚化できず、したがって、これらの残基についての鎖切断を定量しなかった。（Ｂ）１００ｐＭ〜３００μＭの範囲の濃度でのＳＡＨの非存在下（−）および存在下での６８  ｍｅｔＨ  ＲＮＡのインライン検索に起因する自発的切断パターン。ＮＲ、Ｔ１、および−ＯＨレーンは、それぞれ、未処理、ＲＮアーゼＴ１での部分消化、または高ｐＨで部分消化の前駆体ＲＮＡを特定する。ＲＮアーゼＴ１消化（Ｇ残基後の切断）によって生成されたいくつかのバンドを同定し（矢頭）、Ｐｒｅは非切断前駆体ＲＮＡバンドを特定する。自発的ＲＮＡ切断の調整領域を縦棒で同定し、結合親和性を評価するために定量した部位を１〜３と表示する。アスタリスクは、Ｇ１１後の切断に対応する生成物バンドを特定するが、２’、３’−環状リン酸塩中間体が加水分解して２’−および３’−リン酸塩生成物の混合物が得られ、この生成物は、ＰＡＧＥ時にわずかにより速い移動度を示す。（Ｃ）プロットは、ＳＡＨおよび化合物３の濃度（ｃ）に及ぼすＢで指定した部位での６８  ｍｅｔＨ  ＲＮＡの自発的切断の依存性を示す。集合データについての最適曲線（ｂｅｓｔ  ｆｉｔ  ｃｕｒｖｅ）の使用および二状態結合モデルの推測によって各化合物の見かけ上のＫＤ値を評価する。最大半量（ｈａｌｆ−ｍａｘｉｍａｌ）構造調整を誘導するために必要なリガンドの濃度は、見かけ上のＫＤを反映する。
【図１０Ｂ】図１０は、Ｄｅｃｈｌｏｒｏｍｏｎａｓ  ａｒｏｍａｔｉｃａのｍｅｔＨ  ５’−ＵＴＲ由来のＳＡＨエレメントがＳＡＨに選択的に結合した場合に構造変化を受けることを示す。（Ａ）保存されたＳＡＨアプタマーを含む６８  ｍｅｔＨ  ＲＮＡの配列および二次構造モデル。５’３２Ｐ標識ＲＮＡのインライン探索中の自発的ＲＮＡ切断部位を、Ｂに示すデータから同定した。天然のＲＮＡ中に存在しない２つのグアノシル残基を構築物の５’末端に付加して、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を容易にした。１〜８および６３〜６８の領域中のヌクレオチドは、Ｂで示したゲル上で視覚化できず、したがって、これらの残基についての鎖切断を定量しなかった。（Ｂ）１００ｐＭ〜３００μＭの範囲の濃度でのＳＡＨの非存在下（−）および存在下での６８  ｍｅｔＨ  ＲＮＡのインライン検索に起因する自発的切断パターン。ＮＲ、Ｔ１、および−ＯＨレーンは、それぞれ、未処理、ＲＮアーゼＴ１での部分消化、または高ｐＨで部分消化の前駆体ＲＮＡを特定する。ＲＮアーゼＴ１消化（Ｇ残基後の切断）によって生成されたいくつかのバンドを同定し（矢頭）、Ｐｒｅは非切断前駆体ＲＮＡバンドを特定する。自発的ＲＮＡ切断の調整領域を縦棒で同定し、結合親和性を評価するために定量した部位を１〜３と表示する。アスタリスクは、Ｇ１１後の切断に対応する生成物バンドを特定するが、２’、３’−環状リン酸塩中間体が加水分解して２’−および３’−リン酸塩生成物の混合物が得られ、この生成物は、ＰＡＧＥ時にわずかにより速い移動度を示す。（Ｃ）プロットは、ＳＡＨおよび化合物３の濃度（ｃ）に及ぼすＢで指定した部位での６８  ｍｅｔＨ  ＲＮＡの自発的切断の依存性を示す。集合データについての最適曲線（ｂｅｓｔ  ｆｉｔ  ｃｕｒｖｅ）の使用および二状態結合モデルの推測によって各化合物の見かけ上のＫＤ値を評価する。最大半量（ｈａｌｆ−ｍａｘｉｍａｌ）構造調整を誘導するために必要なリガンドの濃度は、見かけ上のＫＤを反映する。
【図１０Ｃ】図１０は、Ｄｅｃｈｌｏｒｏｍｏｎａｓ  ａｒｏｍａｔｉｃａのｍｅｔＨ  ５’−ＵＴＲ由来のＳＡＨエレメントがＳＡＨに選択的に結合した場合に構造変化を受けることを示す。（Ａ）保存されたＳＡＨアプタマーを含む６８  ｍｅｔＨ  ＲＮＡの配列および二次構造モデル。５’３２Ｐ標識ＲＮＡのインライン探索中の自発的ＲＮＡ切断部位を、Ｂに示すデータから同定した。天然のＲＮＡ中に存在しない２つのグアノシル残基を構築物の５’末端に付加して、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を容易にした。１〜８および６３〜６８の領域中のヌクレオチドは、Ｂで示したゲル上で視覚化できず、したがって、これらの残基についての鎖切断を定量しなかった。（Ｂ）１００ｐＭ〜３００μＭの範囲の濃度でのＳＡＨの非存在下（−）および存在下での６８  ｍｅｔＨ  ＲＮＡのインライン検索に起因する自発的切断パターン。ＮＲ、Ｔ１、および−ＯＨレーンは、それぞれ、未処理、ＲＮアーゼＴ１での部分消化、または高ｐＨで部分消化の前駆体ＲＮＡを特定する。ＲＮアーゼＴ１消化（Ｇ残基後の切断）によって生成されたいくつかのバンドを同定し（矢頭）、Ｐｒｅは非切断前駆体ＲＮＡバンドを特定する。自発的ＲＮＡ切断の調整領域を縦棒で同定し、結合親和性を評価するために定量した部位を１〜３と表示する。アスタリスクは、Ｇ１１後の切断に対応する生成物バンドを特定するが、２’、３’−環状リン酸塩中間体が加水分解して２’−および３’−リン酸塩生成物の混合物が得られ、この生成物は、ＰＡＧＥ時にわずかにより速い移動度を示す。（Ｃ）プロットは、ＳＡＨおよび化合物３の濃度（ｃ）に及ぼすＢで指定した部位での６８  ｍｅｔＨ  ＲＮＡの自発的切断の依存性を示す。集合データについての最適曲線（ｂｅｓｔ  ｆｉｔ  ｃｕｒｖｅ）の使用および二状態結合モデルの推測によって各化合物の見かけ上のＫＤ値を評価する。最大半量（ｈａｌｆ−ｍａｘｉｍａｌ）構造調整を誘導するために必要なリガンドの濃度は、見かけ上のＫＤを反映する。
【図１１】図１１は、６８  ｍｅｔＨ  ＲＮＡが数桁の規模でＳＡＭを識別することを示す。（Ａ）脱メチル化による放射性同位元素［３Ｈ］ＳＡＭの崩壊により、非放射性ＳＡＨが得られる。（Ｂ）平衡透析法を使用して、公知のＳＡＭアプタマー（１５６ｍｅｔＡ）（Ｃｏｒｂｉｎｏら、２００５）のＳＡＭ結合親和性を６８  ｍｅｔＨ  ＲＮＡと比較した。各平衡透析システムのチャンバーａおよびｂを、分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）が５０００ダルトンの透過性膜によって分離する。示した［３Ｈ］ＳＡＭ（１００ｎＭ）またはＲＮＡを、チャンバーａおよびｂにそれぞれ添加する。ＳＡＭに対するＳＡＭ−ＩＩアプタマー１５６ｍｅｔＡの見かけ上のＫＤは約１μＭである（Ｃｏｒｂｉｎｏら、２００５）。したがって、チャンバーｂへのトリチウムのシフトは、使用条件下で最大なはずである。６８  ｍｅｔＨ  ＲＮＡが過剰に存在するので、チャンバー間のトリチウム分布に及ぼす非放射性ＳＡＨ（［３Ｈ］ＳＡＭの自発的脱メチル化由来）の影響は無視すべきである。示したデータは、数回の繰り返しの代表である。（Ｃ）ＳＡＨの６８  ｍｅｔＨ  ＲＮＡとの結合についての推定曲線と平衡透析法のために使用された６８  ｍｅｔＨ  ＲＮＡの濃度との比較。２５μＭでＲＮＡが存在する場合に６８  ｍｅｔＨ  ＲＮＡが［３Ｈ］ＳＡＭを最大限にシフトしないという所見により、ＳＡＭの見かけ上のＫＤが約１，０００倍劣っているか悪化することが示唆される。Ｍ６は２つの変異（Ｇ１２ＵおよびＡ１３Ｕ）を保有し、この変異は、図１３Ａに示す構築物Ｍ６と位置およびヌクレオチド同一性が等価である。
【図１２Ａ１】図１２は、６８  ｍｅｔＨ  ＳＡＨアプタマーの分子認識の特徴を示す。（Ａ）リガンド結合親和性を６８  ｍｅｔＨ  ＲＮＡを使用したインライン検索によって確立した化合物の化学構造および見かけ上のＫＤ値。見かけ上のＫＤ値を、図１０ＣのＳＡＨについて記載のように評価した。（Ｂ）ＳＡＨについての６８  ｍｅｔＨ  ＲＮＡの公知の分子認識の特徴のまとめ。
【図１２Ａ２】図１２は、６８  ｍｅｔＨ  ＳＡＨアプタマーの分子認識の特徴を示す。（Ａ）リガンド結合親和性を６８  ｍｅｔＨ  ＲＮＡを使用したインライン検索によって確立した化合物の化学構造および見かけ上のＫＤ値。見かけ上のＫＤ値を、図１０ＣのＳＡＨについて記載のように評価した。（Ｂ）ＳＡＨについての６８  ｍｅｔＨ  ＲＮＡの公知の分子認識の特徴のまとめ。
【図１２Ａ３】図１２は、６８  ｍｅｔＨ  ＳＡＨアプタマーの分子認識の特徴を示す。（Ａ）リガンド結合親和性を６８  ｍｅｔＨ  ＲＮＡを使用したインライン検索によって確立した化合物の化学構造および見かけ上のＫＤ値。見かけ上のＫＤ値を、図１０ＣのＳＡＨについて記載のように評価した。（Ｂ）ＳＡＨについての６８  ｍｅｔＨ  ＲＮＡの公知の分子認識の特徴のまとめ。
【図１２Ｂ】図１２は、６８  ｍｅｔＨ  ＳＡＨアプタマーの分子認識の特徴を示す。（Ａ）リガンド結合親和性を６８  ｍｅｔＨ  ＲＮＡを使用したインライン検索によって確立した化合物の化学構造および見かけ上のＫＤ値。見かけ上のＫＤ値を、図１０ＣのＳＡＨについて記載のように評価した。（Ｂ）ＳＡＨについての６８  ｍｅｔＨ  ＲＮＡの公知の分子認識の特徴のまとめ。
【図１３Ａ】図１３は、ＳＡＨリボスイッチがレポーター遺伝子発現を調節することを示す。（Ａ）遺伝子発現研究のために導入されたＰ．ｓｙｒｉｎｇａｅのａｈｃＹ  ５’−ＵＴＲおよび種々の変異の配列および二次構造モデル。
【図１３Ｂ】図１３は、ＳＡＨリボスイッチがレポーター遺伝子発現を調節することを示す。（Ｂ）Ａに定義の野生型（ＷＴ）および変異ａｈｃＹリーダー配列の下流に融合したβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子（ｌａｃＺ）の発現レベルを比較したプロット。ｐＲＡ３０１は、ｌａｃＺの前にいかなる挿入もない元のプラスミドｐＲＡ３０１によって形質転換されたレポーター株を示す。使用した異なる増殖培地を、実験手順中に定義する。値は、３つの独立した実験の平均であり、エラーバーは標準偏差を示す。
【図１４】図１４は、ＳＡＨレベルの上昇がリボスイッチ−レポーター融合物の発現を増加させることを示す。（Ａ）プロットは、２５μＭのＡｄｏ−２’，３’−ｄｉａｌまたは２５０μＭの列挙した他の化合物を補足しない（−）か、補足したＶｏｇｅｌ−Ｂｏｎｎｅｒ培地中で増殖させた野生型（ＷＴ）および変異（Ｍ６）レポーター株のβ−ガラクトシダーゼ発現レベル（図１３Ａ）である。化合物の略語：Ａｄｏ−２’，３’−ｄｉａｌ（アデノシン−２’，３’−ジアルデヒド）；Ａｄｏ（アデノシン）；Ｈｃｙ（ホモシステイン）；Ｌ−ｍｅｔ（Ｌ−メチオニン）。（Ｂ）表示濃度でＡｄｏ−２’，３’−ｄｉａｌを使用したＡに記載のレポーターアッセイに供したＷＴ、Ｍ１、およびＭ７構築物。値は３つの独立した実験の平均であり、エラーバーは標準偏差を示す。
【図１５】図１５は、ＣＯＧ４７０８  ＲＮＡモチーフ配列のアラインメントを示す。代表物の９７％および７５％を超えて存在するヌクレオチドを、それぞれ、大文字および小文字で示す（Ｒ＝Ａ、Ｇ；Ｙ＝Ｃ、Ｕ）。括弧によって記した色付きの領域は、二次構造エレメントＰ１（青色）、Ｐ２（緑色）、Ｐ３（橙色）、およびＰ４（紫色）を示した。示した全ての配列は固有の配列である。しかし、いくつかの配列は、ＮＸによって示したループ領域のみが異なり、したがって、ここでは同一のようである。生物の略語：（Ｓｍｕ）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｔｓ、（Ｓｐｎ−１）Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  Ｒ６、（Ｓｐｎ−２）Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＳＰ１８−ＢＳ７４、（Ｓｐｎ−３）Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＳＰ１９−ＢＳ７５、（Ｓｐｎ−４）Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＳＰ６−ＢＳ７３、（Ｓｐｙ）Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、（Ｓａｇ−１）Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ  ２６３０Ｖ／Ｒ、（Ｓａｇ−２）Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ  ＣＯＨ１、（Ｓｓａ）Ｓ．ｓａｎｇｕｉｎｉｓ、（Ｓｓｕ）Ｓ．ｓｕｉｓ、（Ｌｌａ−１）Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ、（Ｌｌａ−２）Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ  ＳＫ１１、（Ｌｃａ）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ。全ての異なるＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ株中に１２のさらなるＳｐｙ配列の例が存在する。全ての異なるＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株中にさらに７つのＳｐｎ−１の例が存在する。全ての異なるＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ株中にさらに６つのＳａｇ−１の例が存在する。異なるＳ．ｓｕｉｓ株で見出されたさらに１つのＳｓｕの例が存在し、異なるＬ．ｌａｃｔｉｓ株で見出されたさらなるＬｌａ−１の例が存在する。
【図１６Ａ】図１６は、ｐｒｅＱ１によるＣＯＧ４７０８  ＲＮＡの構造調整を示す。（Ａ）ＣＯＧ４７０８  ＲＮＡモチーフのコンセンサス配列および二次構造モデル。非保存ヌクレオチドを、黒色の実線または白抜きの円で示し、保存対合エレメントＰ１−Ｐ４を示す。矢印は、アプタマー機能を保持する短縮構築物中に存在するヌクレオチドを特定する（図１７を参照のこと）。影を付けたヌクレオチドは、保存されたシャイン−ダルカルノ（ＳＤ）配列を含む。
【図１６Ｂ】図１６は、ｐｒｅＱ１によるＣＯＧ４７０８  ＲＮＡの構造調整を示す。（Ｂ）変性ＰＡＧＥによって分離したＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  Ｒ６  ｐｒｅＱ１−ＩＩ  アプタマー代表（１−１０３  ＲＮＡ）の自発的切断産物。ＮＲ、Ｔ１、−ＯＨ、および（−）は、ぞれぞれ、反応なし、部分的ＲＮアーゼＴ１消化物、部分的アルカリ消化物、およびリガンドなしを示す。選択したＲＮアーゼＴ１切断産物（Ｇ残基の３’を切断）を、左側に同定する。右側の番号付けしたアスタリスクは、ｐｒｅＱ１に応答した構造調整の位置を示す。
【図１６Ｃ】図１６は、ｐｒｅＱ１によるＣＯＧ４７０８  ＲＮＡの構造調整を示す。（Ｃ）推定二次構造上にマッピングした１−１０３  ＲＮＡの自発的切断パターン。小文字ｇの表示は転写を改善するために付加されたグアノシン残基を特定し、番号付けしたアスタリスクはＢに示した番号付けした領域を特定する。
【図１７Ａ】図１７は、野生型および変異１７−９０  ＲＮＡのリガンド結合親和性を示す。（Ａ）１７−９０  ＲＮＡのいくつかのヌクレオチド間結合でのインライン検索中の自発的ＲＮＡ切断の調整対ｐｒｅＱ１のモル濃度の対数のプロット。
【図１７Ｂ】図１７は、野生型および変異１７−９０  ＲＮＡのリガンド結合親和性を示す。（Ｂ）左（０．５ｎＭ）から右（１０μＭ）のｐｒｅＱ１の濃度を使用してインキュベートした１７−９０  ＲＮＡのインライン探索ゲル。右側の矢印は、Ａで結合曲線を作成するために使用されたバンドを指す。他の表記は、図１６Ｂの凡例に記載の通りである。
【図１７Ｃ】図１７は、野生型および変異１７−９０  ＲＮＡのリガンド結合親和性を示す。（Ｃ）同定された分裂的および代償的変異Ｍ１〜Ｍ６を有する１７−９０  ＲＮＡの配列および構造。
【図１７Ｄ】図１７は、野生型および変異１７−９０  ＲＮＡのリガンド結合親和性を示す。（Ｄ）Ｃで指定した１７−９０  ＲＮＡ、３３−９０  ＲＮＡ、および変異１７−９０  ＲＮＡ  Ｍ１〜Ｍ６によって示されたｐｒｅＱ１のＫＤ値。白抜きの円は、実際のＫＤ値が１００μＭより高いことを示す。
【図１８】図１８は、平衡透析法を使用した１７−９０  ＲＮＡアプタマーによる代謝産物結合の分析を示す。（Ａ）３Ｈ−ｐｒｅＱ１およびＲＮＡを使用した平衡透析装置のローディング。チャンバーａおよびｂを、５，０００  ＭＯＣＯ膜によって分離する。（Ｂ）ＲＮＡ（−）なし、１７−９０  ＲＮＡ（１−８１）の短縮および不活性誘導体、ならびに１７−９０  ＲＮＡのチャンバーｂを使用した平衡透析法の結果。競合実験のために、過剰な非標識ｐｒｅＱ１およびグアニンを、１７−９０  ＲＮＡおよび３Ｈ−ｐｒｅＱ１を含む事前に平衡化した装置に添加した。エラーバーは、３つの独立した実験の標準偏差を示す。（Ｃ）シフトしない３Ｈ標識材料をＲＮＡに結合することができるかどうかを決定するための平衡透析法。第１の平衡化のために、Ｈ３−ｐｒｅＱ１を、１７−９０  ＲＮＡ（左）を使用して平衡化するか、ＲＮＡの非存在下（右）で平衡化する。各装置サイドからアリコートを取り出して、トリチウム分布を評価した。第２の平衡化のために、ＲＮＡを欠くチャンバー（シフトしないＨ３標識を含むチャンバー  ａ）由来の緩衝液を、新規の装置に移し、１７−９０  ＲＮＡを含むチャンバーｂを使用して再平衡化した。アリコートを再度取り出して、トリチウム分布を再評価する。（Ｄ）Ｃに記載の平衡透析実験の結果。エラーバーは、３つの独立した実験の標準偏差を示す。
【図１９Ａ１】図１９は、１７−９０  ｐｒｅＱ１−ＩＩアプタマーの分子認識分析を示す。（Ａ）ｐｒｅＱ１およびリガンドアナログについての１７−９０  ＲＮＡ（円）およびｐｒｅＱ１−Ｉリボスイッチ（四角）の分子認識の特徴の比較。ｐｒｅＱ１−ＩリボスイッチのＫＤ値は以前に公開されていた（Ｒｏｔｈら、２００７）。化学構造上の影は、アナログとｐｒｅＱ１との間の相違を特定する。白抜きの記号は、インライン探索アッセイで試験した最も高濃度のリガンドを指定し、ＫＤ値がこの濃度よりも高いことを示す。（Ｂ）Ａ中のデータから推測された分子認識接触のまとめ。
【図１９Ａ２】図１９は、１７−９０  ｐｒｅＱ１−ＩＩアプタマーの分子認識分析を示す。（Ａ）ｐｒｅＱ１およびリガンドアナログについての１７−９０  ＲＮＡ（円）およびｐｒｅＱ１−Ｉリボスイッチ（四角）の分子認識の特徴の比較。ｐｒｅＱ１−ＩリボスイッチのＫＤ値は以前に公開されていた（Ｒｏｔｈら、２００７）。化学構造上の影は、アナログとｐｒｅＱ１との間の相違を特定する。白抜きの記号は、インライン探索アッセイで試験した最も高濃度のリガンドを指定し、ＫＤ値がこの濃度よりも高いことを示す。（Ｂ）Ａ中のデータから推測された分子認識接触のまとめ。
【図１９Ｂ】図１９は、１７−９０  ｐｒｅＱ１−ＩＩアプタマーの分子認識分析を示す。（Ａ）ｐｒｅＱ１およびリガンドアナログについての１７−９０  ＲＮＡ（円）およびｐｒｅＱ１−Ｉリボスイッチ（四角）の分子認識の特徴の比較。ｐｒｅＱ１−ＩリボスイッチのＫＤ値は以前に公開されていた（Ｒｏｔｈら、２００７）。化学構造上の影は、アナログとｐｒｅＱ１との間の相違を特定する。白抜きの記号は、インライン探索アッセイで試験した最も高濃度のリガンドを指定し、ＫＤ値がこの濃度よりも高いことを示す。（Ｂ）Ａ中のデータから推測された分子認識接触のまとめ。
【図２０Ａ】図２０は、変異１７−９０アプタマーによるリガンド識別の変化を示す。種々の濃度の（Ａ）ｐｒｅＱ１および（Ｂ）ＤＡＰでの野生型（Ｃ４１）および変異（Ｕ４１）１７−９０  ＲＮＡのインライン探索によるＲＮＡ構造の調整を示すプロット。ポイントはいくつかの調整バンドについての平均正規化切断の割合を示し、エラーバーはこの平均の標準偏差を示す。（Ｃ）分子認識モデルおよびＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  Ｒ６由来のｐｒｅＱ１−ＩＩアプタマーの変異分析データと一致する可能なアプタマーとリガンドとの相互作用。
【図２０Ｂ】図２０は、変異１７−９０アプタマーによるリガンド識別の変化を示す。種々の濃度の（Ａ）ｐｒｅＱ１および（Ｂ）ＤＡＰでの野生型（Ｃ４１）および変異（Ｕ４１）１７−９０  ＲＮＡのインライン探索によるＲＮＡ構造の調整を示すプロット。ポイントはいくつかの調整バンドについての平均正規化切断の割合を示し、エラーバーはこの平均の標準偏差を示す。（Ｃ）分子認識モデルおよびＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  Ｒ６由来のｐｒｅＱ１−ＩＩアプタマーの変異分析データと一致する可能なアプタマーとリガンドとの相互作用。
【図２０Ｃ】図２０は、変異１７−９０アプタマーによるリガンド識別の変化を示す。種々の濃度の（Ａ）ｐｒｅＱ１および（Ｂ）ＤＡＰでの野生型（Ｃ４１）および変異（Ｕ４１）１７−９０  ＲＮＡのインライン探索によるＲＮＡ構造の調整を示すプロット。ポイントはいくつかの調整バンドについての平均正規化切断の割合を示し、エラーバーはこの平均の標準偏差を示す。（Ｃ）分子認識モデルおよびＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  Ｒ６由来のｐｒｅＱ１−ＩＩアプタマーの変異分析データと一致する可能なアプタマーとリガンドとの相互作用。
【図２１】図２１は、ＣＯＧ４７０８タンパク質の遺伝子を保有する種の系統樹を示す。２コピーの遺伝子を含む種をアスタリスクによってマークする。ＣＯＧ４７０８をコードする遺伝子がｐｒｅＱ１−Ｉリボスイッチに先行する種をＩで示し、この遺伝子がｐｒｅＱ１−ＩＩモチーフに先行する種をＩＩで示す。
【図２２】図２２は、１７６の代表物由来の最も一般的なＭｏｃｏ  ＲＮＡモチーフ形態のコンセンサス配列および二次構造モデルを示す。ＲはＡまたはＧを示し、ＹはＣまたはＵを示す。ＲＢＳと表示したボックスで囲ったヌクレオチドは、いくつかのＭｏｃｏ  ＲＮＡ代表物における隣接ＯＲＦのリボゾーム結合部位と予想される。
【図２３Ａ】図２３は、（ａ）Ｅ．ｃｏｌｉのｍｏａＡＢＣＤＥオペロンの略図を示す。ｍｏａＡ  ＯＲＦ上流のゲノム領域のヌクレオチド番号を、第１の転写開始部位（Ｓ１）を＋１と定義し、第２の転写開始部位（Ｓ２）を−８７と定義することによって確立する。ＦｎｒおよびＭｏｄＥ結合部位のおおよその位置を黒いボックスで示し、Ｍｏｃｏ  ＲＮＡモチーフとして指定した領域は、Ｐ１の末端ヌクレオチドから始まり、そして終結する（図２２）。種々の特徴の付番方式および位置は、以前に報告された通りである（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、２０００）。（ｂ）真正細菌におけるモリブデン補因子の生合成経路（Ｓｃｈｅａｒｚ，２００５）。略表記のタンパク質は、ＡＢＣ型モリブデン酸塩輸送体であるＭｏｄＡＢＣ以外の経路における酵素である。構造研究（Ｓａｎｉｈｖｉｌｉら、２００４；Ｂａｄｅｒら、２００４）は、これがＭｏｇＡに類似し、したがって、モリブドプテリン生合成に関与する可能性が高いことを示す。疑問符は、変換のための生合成酵素が知られていないことを示す。列挙した他のタンパク質は、補酵素としてＭｏｃｏ誘導体を使用する酵素である。コード領域が少なくとも１つの生物中のＭｏｃｏ  ＲＮＡモチーフの下流および付近に存在するタンパク質を、黒の影で強調する。
【図２３Ｂ１】図２３は、（ａ）Ｅ．ｃｏｌｉのｍｏａＡＢＣＤＥオペロンの略図を示す。ｍｏａＡ  ＯＲＦ上流のゲノム領域のヌクレオチド番号を、第１の転写開始部位（Ｓ１）を＋１と定義し、第２の転写開始部位（Ｓ２）を−８７と定義することによって確立する。ＦｎｒおよびＭｏｄＥ結合部位のおおよその位置を黒いボックスで示し、Ｍｏｃｏ  ＲＮＡモチーフとして指定した領域は、Ｐ１の末端ヌクレオチドから始まり、そして終結する（図２２）。種々の特徴の付番方式および位置は、以前に報告された通りである（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、２０００）。（ｂ）真正細菌におけるモリブデン補因子の生合成経路（Ｓｃｈｅａｒｚ，２００５）。略表記のタンパク質は、ＡＢＣ型モリブデン酸塩輸送体であるＭｏｄＡＢＣ以外の経路における酵素である。構造研究（Ｓａｎｉｈｖｉｌｉら、２００４；Ｂａｄｅｒら、２００４）は、これがＭｏｇＡに類似し、したがって、モリブドプテリン生合成に関与する可能性が高いことを示す。疑問符は、変換のための生合成酵素が知られていないことを示す。列挙した他のタンパク質は、補酵素としてＭｏｃｏ誘導体を使用する酵素である。コード領域が少なくとも１つの生物中のＭｏｃｏ  ＲＮＡモチーフの下流および付近に存在するタンパク質を、黒の影で強調する。
【図２３Ｂ２】図２３は、（ａ）Ｅ．ｃｏｌｉのｍｏａＡＢＣＤＥオペロンの略図を示す。ｍｏａＡ  ＯＲＦ上流のゲノム領域のヌクレオチド番号を、第１の転写開始部位（Ｓ１）を＋１と定義し、第２の転写開始部位（Ｓ２）を−８７と定義することによって確立する。ＦｎｒおよびＭｏｄＥ結合部位のおおよその位置を黒いボックスで示し、Ｍｏｃｏ  ＲＮＡモチーフとして指定した領域は、Ｐ１の末端ヌクレオチドから始まり、そして終結する（図２２）。種々の特徴の付番方式および位置は、以前に報告された通りである（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、２０００）。（ｂ）真正細菌におけるモリブデン補因子の生合成経路（Ｓｃｈｅａｒｚ，２００５）。略表記のタンパク質は、ＡＢＣ型モリブデン酸塩輸送体であるＭｏｄＡＢＣ以外の経路における酵素である。構造研究（Ｓａｎｉｈｖｉｌｉら、２００４；Ｂａｄｅｒら、２００４）は、これがＭｏｇＡに類似し、したがって、モリブドプテリン生合成に関与する可能性が高いことを示す。疑問符は、変換のための生合成酵素が知られていないことを示す。列挙した他のタンパク質は、補酵素としてＭｏｃｏ誘導体を使用する酵素である。コード領域が少なくとも１つの生物中のＭｏｃｏ  ＲＮＡモチーフの下流および付近に存在するタンパク質を、黒の影で強調する。
【図２４Ａ】図２４は、Ｍｏｃｏ  ＲＮＡのインライン探索アッセイを示す。（ａ）比較配列分析データから予想される二次構造モデルに適合するために示したＥ．ｃｏｌｉの１３８  ｍｏａＡ  ＲＮＡの配列（図２２ａ）。灰色の影を付けたヌクレオチドは、より高い比率で自発的３’ホスホジエステル切断され（ｂで示したデータ由来）、これは、典型的には、安定な二次構造または三次構造中に存在するヌクレオチド間結合と比較して高レベルの構造的柔軟性を示す。バーはリボゾーム結合部位としての機能を果たすと予想されるプリンヌクレオチドを特定し、ｍｏａＡの翻訳開始コドンをボックスで囲んでいる。（ｂ）Ｅ．ｃｏｌｉ由来の１３８  ｍｏａＡ  ＲＮＡのインライン探索アッセイ中に生成される産物のゲル画像。レーン１〜３は、インキュベーションなし（反応なし、ＮＲ）、Ｔ１  ＲＮアーゼでの部分消化（Ｔ１）、または部分的アルカリ消化に供した（−ＯＨ）のいずれかのゲル上に負荷した５’３２Ｐ標識前駆体ＲＮＡ（Ｐｒｅ）を含む。レーン４は、可能なリガンド化合物の非存在下（−）でのインライン探索条件下でのインキュベーション後に標識前駆体ＲＮＡと共に負荷した。塩基対合すると予想されるヌクレオチドの後で切断された放射性同位元素標識ＲＮＡフラグメントを含むゲルの領域を示す。
【図２４Ｂ】図２４は、Ｍｏｃｏ  ＲＮＡのインライン探索アッセイを示す。（ａ）比較配列分析データから予想される二次構造モデルに適合するために示したＥ．ｃｏｌｉの１３８  ｍｏａＡ  ＲＮＡの配列（図２２ａ）。灰色の影を付けたヌクレオチドは、より高い比率で自発的３’ホスホジエステル切断され（ｂで示したデータ由来）、これは、典型的には、安定な二次構造または三次構造中に存在するヌクレオチド間結合と比較して高レベルの構造的柔軟性を示す。バーはリボゾーム結合部位としての機能を果たすと予想されるプリンヌクレオチドを特定し、ｍｏａＡの翻訳開始コドンをボックスで囲んでいる。（ｂ）Ｅ．ｃｏｌｉ由来の１３８  ｍｏａＡ  ＲＮＡのインライン探索アッセイ中に生成される産物のゲル画像。レーン１〜３は、インキュベーションなし（反応なし、ＮＲ）、Ｔ１  ＲＮアーゼでの部分消化（Ｔ１）、または部分的アルカリ消化に供した（−ＯＨ）のいずれかのゲル上に負荷した５’３２Ｐ標識前駆体ＲＮＡ（Ｐｒｅ）を含む。レーン４は、可能なリガンド化合物の非存在下（−）でのインライン探索条件下でのインキュベーション後に標識前駆体ＲＮＡと共に負荷した。塩基対合すると予想されるヌクレオチドの後で切断された放射性同位元素標識ＲＮＡフラグメントを含むゲルの領域を示す。
【図２５】図２５は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＭｏｃｏ  ＲＮＡが遺伝子抑制にＭｏｃｏ生合成を必要とすることを示す。（ａ）対応するＤＮＡテンプレートをβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子に融合したＥ．ｃｏｌｉ  １４９  ｍｏａＡ  ＲＮＡのＰ３領域の描写。Ｍ１およびＭ２は、野生型（ＷＴ）ＲＮＡと比較して示したようにヌクレオチドの変化を保有する。（ｂ）異なるＭｏｃｏ濃度下でＷＴおよび変異Ｍｏｃｏ  ＲＮＡに融合したβ−ガラクトシダーゼレポーターｍＲＮＡの発現。アラビノース誘導性プロモーターによって調節されるトランスジェニックｍｏａオペロンの存在に起因して、Ｍｏｃｏ濃度は、それぞれ増殖培地中のアラビノースの有無によって増減する。（ｃ）細胞中のモリブデン酸塩またはタングステン酸塩の利用可能性に対する上記レポーター遺伝子発現の依存性。分析のために使用したＥ．ｃｏｌｉ株中の機能的モリブデン酸塩輸送体タンパク質の存在（ｍｏｄＣ）または非存在（ΔｍｏｄＣ）を示す。細胞を、０．２％アラビノースを含むＬＢ中で増殖させた。レポーター遺伝子発現アッセイを三連で行い、その平均値をプロットし、エラーバーは反復の標準偏差を示す。
【図２６】図２６は、ＷＴ  １４９  ｍｏａＡ  ＲＮＡのＤＮＡテンプレートに融合したβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子の発現に及ぼすＥ．ｃｏｌｉ  Ｍｏｃｏ生合成経路中の種々の遺伝子のノックアウトの影響を示す。各トランスジェニック株は、アラビノース誘導性プロモーターの調節下でＥ．ｃｏｌｉ  ｍｏａＡＢＣＤＥをコードするプラスミドを保有する。
【図２７】図２７は、Ｍｏｃｏ  ＲＮＡのサイズおよび構造がＥ．ｃｏｌｉ由来の他のリボスイッチアプタマーに類似することを示す。（ａ）Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｏａＡ  Ｍｏｃｏアプタマーの長さとタンパク質によって結合するかリボスイッチアプタマーとして機能することが公知のＥ．ｃｏｌｉ由来の調節ＲＮＡエレメントの長さとの比較。リボゾームタンパク質のＲＮＡ標的は、本分析に含まれない。（ｂ）ａに示すＲＮＡの二次構造モデル。示さなかったＲＮＡは、確立された二次構造を持たない。
【図２８Ａ】図２８は、ＳＡＭ−ＩモチーフとＳＡＭ−ＩＶモチーフとの比較を示す。ステムをＰ１〜Ｐ５と記した。ＳＡＭ−ＩＶ中のＰ５はしばしば喪失するが、シュードノットに関与するその５’部位は常に存在する。リガンドの５Å以内の公開されたＳＡＭ−Ｉ三次元構造（Ｍｏｎｔａｎｇｅ  ａｎｄ  Ｂａｔｅｙ  ２００６）中のヌクレオチドの位置、ＳＡＭ−ＩＶ中の対応する推定の位置、を太字で示す。ＳＡＭ−Ｉ番号付け（Ｍｏｎｔａｎｇｅ  ａｎｄ  Ｂａｔｅｙ  ２００６）にしたがって、両モチーフ中のリガンドに直接接触すると提案される６つの位置（例えば、Ａ４５）を記す。保存された特徴（ヌクレオチド同一性、バルジ、およびステム）に影を付けて、これらが両モチーフに共通であるか（黄色）、ＳＡＭ−Ｉに固有であるか（桃色）、ＳＡＭ−ＩＶに固有である（青色）ことを示す。
【図２８Ｂ】図２８は、ＳＡＭ−ＩモチーフとＳＡＭ−ＩＶモチーフとの比較を示す。ステムをＰ１〜Ｐ５と記した。ＳＡＭ−ＩＶ中のＰ５はしばしば喪失するが、シュードノットに関与するその５’部位は常に存在する。リガンドの５Å以内の公開されたＳＡＭ−Ｉ三次元構造（Ｍｏｎｔａｎｇｅ  ａｎｄ  Ｂａｔｅｙ  ２００６）中のヌクレオチドの位置、ＳＡＭ−ＩＶ中の対応する推定の位置、を太字で示す。ＳＡＭ−Ｉ番号付け（Ｍｏｎｔａｎｇｅ  ａｎｄ  Ｂａｔｅｙ  ２００６）にしたがって、両モチーフ中のリガンドに直接接触すると提案される６つの位置（例えば、Ａ４５）を記す。保存された特徴（ヌクレオチド同一性、バルジ、およびステム）に影を付けて、これらが両モチーフに共通であるか（黄色）、ＳＡＭ−Ｉに固有であるか（桃色）、ＳＡＭ−ＩＶに固有である（青色）ことを示す。
【図２９Ａ】図２９は、ＳＡＭ−ＩＶ  ＲＮＡがＳＡＭに選択的に結合することを示す。（Ａ）１３２  Ｓｃ  ＲＮＡの配列および推定される二次構造。（Ｂ）インライン探索ゲル。ＮＲ＝反応なし（ＲＮＡのみ）、Ｔ１＝部分的ＲＮアーゼＴ１消化物（グアノシル残基に対して３’を切断）、−ＯＨ＝部分的アルカリ消化物（全ヌクレオチド間結合を切断）、（−）＝反応物に化合物を添加しなかった。ＳＡＭ、ＳＡＨ、Ａｄｅ（アデノシン）、およびＭｅｔ（メチオニン）を、指定のように添加した。Ｇ２１〜Ｇ１１７：ａｇｔｅｒ  Ｇ残基切断に対応する選択されたバンドの同定。Ｒ１〜Ｒ５：リガンド媒介性調整をうけた領域。（Ｃ）調整領域（Ｒ１〜Ｒ５）を、複数のＳＡＭ濃度を使用してゲルから定量し（示さず）、０（ＳＡＭなし）〜１（飽和ＳＡＭ濃度）の範囲に正規化した。見かけ上のＫＤは、その理論上の二状態結合曲線が示したデータに最適に適合するということである。ＫＤ＝１５０ｎＭの理論上の曲線を示す。
【図２９Ｂ】図２９は、ＳＡＭ−ＩＶ  ＲＮＡがＳＡＭに選択的に結合することを示す。（Ａ）１３２  Ｓｃ  ＲＮＡの配列および推定される二次構造。（Ｂ）インライン探索ゲル。ＮＲ＝反応なし（ＲＮＡのみ）、Ｔ１＝部分的ＲＮアーゼＴ１消化物（グアノシル残基に対して３’を切断）、−ＯＨ＝部分的アルカリ消化物（全ヌクレオチド間結合を切断）、（−）＝反応物に化合物を添加しなかった。ＳＡＭ、ＳＡＨ、Ａｄｅ（アデノシン）、およびＭｅｔ（メチオニン）を、指定のように添加した。Ｇ２１〜Ｇ１１７：ａｇｔｅｒ  Ｇ残基切断に対応する選択されたバンドの同定。Ｒ１〜Ｒ５：リガンド媒介性調整をうけた領域。（Ｃ）調整領域（Ｒ１〜Ｒ５）を、複数のＳＡＭ濃度を使用してゲルから定量し（示さず）、０（ＳＡＭなし）〜１（飽和ＳＡＭ濃度）の範囲に正規化した。見かけ上のＫＤは、その理論上の二状態結合曲線が示したデータに最適に適合するということである。ＫＤ＝１５０ｎＭの理論上の曲線を示す。
【図２９Ｃ】図２９は、ＳＡＭ−ＩＶ  ＲＮＡがＳＡＭに選択的に結合することを示す。（Ａ）１３２  Ｓｃ  ＲＮＡの配列および推定される二次構造。（Ｂ）インライン探索ゲル。ＮＲ＝反応なし（ＲＮＡのみ）、Ｔ１＝部分的ＲＮアーゼＴ１消化物（グアノシル残基に対して３’を切断）、−ＯＨ＝部分的アルカリ消化物（全ヌクレオチド間結合を切断）、（−）＝反応物に化合物を添加しなかった。ＳＡＭ、ＳＡＨ、Ａｄｅ（アデノシン）、およびＭｅｔ（メチオニン）を、指定のように添加した。Ｇ２１〜Ｇ１１７：ａｇｔｅｒ  Ｇ残基切断に対応する選択されたバンドの同定。Ｒ１〜Ｒ５：リガンド媒介性調整をうけた領域。（Ｃ）調整領域（Ｒ１〜Ｒ５）を、複数のＳＡＭ濃度を使用してゲルから定量し（示さず）、０（ＳＡＭなし）〜１（飽和ＳＡＭ濃度）の範囲に正規化した。見かけ上のＫＤは、その理論上の二状態結合曲線が示したデータに最適に適合するということである。ＫＤ＝１５０ｎＭの理論上の曲線を示す。
【図３０Ａ】図３０は、ＳＡＭ−ＩＶが遺伝子調節エレメントであることを示す。（Ａ）試験した変異（Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３）をアプタマー二次構造中に示すが、全遺伝子間領域をレポーターアッセイで使用した（材料と方法を参照のこと）。
【図３０Ｂ】図３０は、ＳＡＭ−ＩＶが遺伝子調節エレメントであることを示す。（Ｂ）ＸｙｌＥレポーター活性を、Ａ３７５／分（２０分間にわたって測定）／ｇ総タンパク質の変化として定量した。細胞株は以下であった：「ＷＴ」＝野生型ＩＧＲ、「Ｍ１」〜「Ｍ３」＝変異ＩＧＲ、「ベクターなし」＝ｘｙｌＥレポーター遺伝子を含むベクターを欠く細胞。
【図３０Ｃ】図３０は、ＳＡＭ−ＩＶが遺伝子調節エレメントであることを示す。（Ｃ）Ｂから選択した３つの典型的な実験についての吸光度対時間のプロット。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
発明の詳細な説明
以下の特定の実施形態の詳細な記載およびそこに含まれる実施例、ならびに添付の図面および前および後の記載を参照して、開示の方法および組成物をより容易に理解することができる。
【００２７】
伝令ＲＮＡは、典型的には、タンパク質または小さなＲＮＡ調節因子によって、および翻訳過程の間のリボゾームによって作用する遺伝子情報の受動的キャリアと考えられている。一定のｍＲＮＡが天然のアプタマードメインを保有し、これらのＲＮＡドメインへの特異的代謝産物の直接結合によって遺伝子発現が調整されることが発見された。天然リボスイッチは、典型的には天然ＲＮＡと関連しない２つの驚くべき機能を示す。第１に、ｍＲＮＡエレメントは異なる構造状態を採用することができ、一方の構造は、その標的代謝産物の正確な結合ポケットとしての機能を果たす。第２に、構造状態間の代謝産物誘導性アロステリック相互交換により、いくつかの異なる機構のうちの１つによって遺伝子発現レベルが変化する。リボスイッチを、典型的には、以下の２つの個別のドメインに分けることができる：１つは標的に選択的に結合するドメイン（アプタマードメイン）および他方は遺伝子調節に影響を及ぼすドメイン（発現プラットフォーム）。これらの２ドメイン間の動的相互作用により遺伝子発現が代謝産物依存性にアロステリック調節される。
【００２８】
異なるクラスのリボスイッチが同定されており、活性化化合物（本明細書中でトリガー分子と呼ぶ）を選択的に認識することが示されている。例えば、補酵素Ｂ１２、グリシン、チアミンピロリン酸（ＴＰＰ）、およびフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）は、これらの化合物の代謝経路または輸送経路における重要な酵素をコードする遺伝子中に存在するリボスイッチを活性化する。各リボスイッチクラスのアプタマードメインは、高度に保存されたコンセンサス配列および構造に適合する。したがって、配列相同性検索を使用して、関連するリボスイッチドメインを同定することができる。リボスイッチドメインは、細菌、古細菌、および真核生物由来の種々の生物で発見されている。
【００２９】
Ａ．リボスイッチＲＮＡの一般的構成
細菌リボスイッチＲＮＡは、特定のｍＲＮＡの主なコード領域の５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）内に主に存在する遺伝子調節エレメントである。構造探索研究（以下でさらに考察）により、リボスイッチエレメントは一般に以下の２つのドメインから構成されることが明らかである：リガンド結合ドメインとしての機能を果たす天然のアプタマー（Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｎ，Ｄ．Ｊ．Ｐａｔｅｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０００，２８７，８２０；Ｌ．Ｇｏｌｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９５，６４，７６３）および遺伝子発現に関与するＲＮＡエレメント（例えば、シャイン−ダルガルノ（ＳＤ）エレメント；転写終結ステム）を妨害する「発現プラットフォーム」である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成したアプタマードメインが発現プラットフォームの非存在下で適切なリガンドに結合するという観察から、これらの結論を導いている（米国特許出願公開第２００５−００５３９５１号の実施例２、３、および６を参照のこと）。さらに、構造探索調査により、ほとんどのリボスイッチのアプタマードメインが個別に試験した場合に特定の二次構造および三次構造の折り畳みを採用し、全５’リーダーＲＮＡの関係において試験した場合にアプタマー構造と本質的に同一であることが示唆される。これは、多くの場合、アプタマードメインが発現プラットフォームと無関係に折り畳まれるモジュラー単位であることを示す（米国特許出願公開第２００５−００５３９５１号の実施例２、３、および６を参照のこと）。
【００３０】
最終的に、アプタマードメインのリガンド結合状態または非結合状態は発現プラットフォームを介して解釈され、それは遺伝子発現の際に影響を及ぼす。モジュラーエレメントとしてのリボスイッチの投影は、アプタマードメインが種々の生物の間（およびＴＰＰリボスイッチについて認められるように、界の間でさえも）で高度に保存されるのに対して（Ｎ．Ｓｕｄａｒｓａｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ  ２００３，９，６４４）、発現プラットフォームは、付加された読み取り枠（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｌａｍｅ）の発現が調節される配列、構造、および機構で変化するという事実によってさらに支持される。例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのｔｅｎＡ  ｍＲＮＡのＴＰＰリボスイッチへのリガンド結合によって転写が終結する（Ａ．Ｓ．Ｍｉｒｏｎｏｖ，ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ２００２，１１１，７４７）。この発現プラットフォームは、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のｔｈｉＭ  ｍＲＮＡ中のＴＰＰリボスイッチの発現プラットフォームと比較して配列および構造が異なり、ＴＰＰ結合はＳＤ遮断機構によって翻訳を阻害する（米国特許出願公開第２００５−００５３９５１号の実施例２を参照のこと）。ＴＰＰアプタマードメインは容易に認識可能であり、これらの２つの転写単位の間で機能的特徴がほぼ同一であるが、これらを実施する遺伝子調節機構および発現プラットフォームは非常に異なる。
【００３１】
リボスイッチＲＮＡのアプタマードメインは、典型的には、約７０〜１７０ｎｔ長の範囲である（米国特許出願公開第２００５−００５３９５１号の図１１）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化実験でかなりより短く構造が複雑である多種多様な小分子結合アプタマーが同定されたことを考慮すると、この観察はいくらか予想外であった（Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｎ，Ｄ．Ｊ．Ｐａｔｅｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０００，２８７，８２０；Ｌ．Ｇｏｌｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９５，６４，７６３；Ｍ．Ｆａｍｕｌｏｋ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９９９，９，３２４）。人工アプタマーと比較した天然アプタマー配列の複雑さおよび情報量の実質的増加についての理由が依然として証明されていないにもかかわらず、この複雑さは、高い親和性および選択性で機能するＲＮＡ受容体を形成するのに必要であるとみられる。リガンド−リボスイッチ複合体の見かけ上のＫＤ値は、低ナノモル（ｎａｎｏｍｏｌａｒ）から低マイクロモル（ｍｉｃｒｏｍｏｌａｒ）までの範囲である。いくつかのアプタマードメインは、追加発現プラットフォームから単離した場合、インタクトなリボスイッチよりも改良された標的リガンドに対する親和性を示す（約１０〜１００倍）ことも注目に値する（米国特許出願公開第２００５−００５３９５１号の実施例２を参照のこと）。おそらく、完全にインタクトなリボスイッチＲＮＡによって必要とされる複数の異なるＲＮＡ高次構造のサンプリングにはエネルギーコストがかかり、リガンド親和性の喪失が反映される。アプタマードメインは分子スイッチとしての機能を果たさなければならないので、これは、天然のアプタマーに対する機能的要求を付加することもでき、この付加は、そのより精巧な構造を合理化するのに役立ち得る。
【００３２】
Ｂ．サイクリックジＧＭＰリボスイッチ（ＧＥＭＭモチーフ）
ＧＥＭＭモチーフを含むサイクリックジＧＭＰ応答性リボスイッチ（サイクリックジＧＭＰリボスイッチまたはＧＥＭＭリボスイッチともいうことができる）は、Ｐ１およびＰ２と指定した２つの隣接するヘアピン（対合領域）を含む（図１および３）。Ｐ１は、配列および構造中で高度に保存されており、３−ヌクレオチド内部ループによって分離された２塩基対および６塩基対のステムからなり、末端ループによってキャッピングされている。内部ループは高度に保存されており、末端ループはほぼ必ずＧＮＲＡテトラループである（Ｈｅｎｄｒｉｘ  １９９７）。Ｐ１ステムは、いくつかの部位で共変動するという相当な証拠を提示し、広範な細菌にわたって構造中に高度に保存されている。この事実ならびにＰ２のより適度の共変動および可変長ステムにより、ＧＥＭＭが構造化ＲＮＡとして機能する強力な証拠が得られる。実施例２は、ＧＥＭＭモチーフがリボスイッチ中で機能することを証明している。Ｐ１およびＰ２に連結する配列は、事実上常にＡＡＡであり、３２２の例で例外はわずか２つである。
【００３３】
Ｐ２ヘアピンは、Ｐ１よりも適度に保存される。Ｐ１テトラループがＧＡＡＡである場合、ＧＮＲＡテトラループ受容体は、通常はＰ２中に出現する。この受容体は、しばしば、周知の１１−ｎｔモチーフであり、ＧＡＡＡループに支持され得るが、いくつかの配列は新規のテトラループ受容体であり得る。Ｐ１がＧＹＲＡテトラループを有する場合、Ｐ２塩基により近いバルジが時折見出されるにもかかわらず、受容体様配列はほとんど存在しない（図２）。
【００３４】
ＧＥＭＭ  ＲＮＡは、１型および２型と呼ばれる２つの類似の構造の１つに適合する（図３Ｂ）。両型は、同定した５０３の代表において広範な共変動を示す２つの塩基対合領域（Ｐ１およびＰ２）を保有する（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  ２００７）。１型ＲＮＡ（３０３例）は、第２の位置にプリン（Ｒ）と共にＰ１上にＧＮＲＡテトラループ（Ｈｅｕｓ  １９９１）を有する。ＧＲＲＡ配列の存在は、Ｐ２末端のテトラループ受容体の存在と相関し、この受容体はこのテトラループ型とドッキングすることが公知である（Ｃｏｓｔａ  １９９５）。対照的に、２型ＲＮＡ（１７１例）は、テトラループの第２の位置にピリミジン（Ｙ）を有し、いくつかの例では、ＧＹＲＡテトラループとのドッキングを好むＰ２上の構造を含む（Ｃｏｓｔａ  １９９５）。さらなる２９個の割り当てられていない代表が存在し、そのうちの２４個は非対合ヌクレオチドに隣接したＧＮＲＡテトラループを保有し、５個はテトラループ配列を欠く。
【００３５】
ＧＮＲＡテトラループおよびその受容体は、一般に構造化されたＲＮＡ中に見出され、以前にリボスイッチアプタマー中で認められている（Ｒｅｇｕｌｓｋｉ  ２００８）。しかし、Ｐ１およびＰ２ヘアピンの先端の配列および構造の可変性により、サイクリックジＧＭＰの任意の結合部位が最も保存された特徴を保有する中央または基部に存在する可能性が高いことが示唆される。
【００３６】
多数のＧＥＭＭ例には、ｒｈｏ非依存性転写ターミネーターヘアピンが含まれる。ターミネーターステムの５’側は、しばしば、Ｐ２ステムの３’側と重複する（そしておそらく競合する）（図２Ｂ）。ＧＥＭＭがリボスイッチである場合、リガンド結合は、提案されたＰ１およびＰ２構造を安定化し、それにより、競合する転写ターミネーターの形成を防止することができる。このモデルでは、より高いリガンド濃度によって遺伝子発現が増加する。δ−ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ中のＧＥＭＭ代表の１／３および他の分類群のいくつかは、「タンデム」配置にあり、ある例では、同一ＵＴＲ中の別の場所の３’および別の場所付近に見出される。調節ＲＮＡのかかる配置は、簡潔な調節ＲＮＡ立体配置によって許容されるよりも精巧な遺伝子発現調節に関与する（Ｓｕｄａｒｓａｎ  ２００６；Ｗｅｌｚ  ２００７；Ｍａｎｄａｌ  ２００６）。
【００３７】
ＧＥＭＭは細菌に広範に存在し、高度に保存された配列および構造を有するようであり、推定ＲＮＡに実質的な生化学的制約を強要する機能が示唆される。３２２のＧＥＭＭ配列がグラム陽性細菌およびグラム陰性細菌の両方で見出された。これはδ−ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、特にＧｅｏｂａｃｔｅｒおよび関連する属で共通である。γ−ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ内で、ＡｌｔｅｒｏｍｏｎａｄａｌｅｓおよびＶｉｂｒｉｏｎａｌｅｓに遍在する。ＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓおよびＰｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ（Ｐｌａｎｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）門の一定の目でも共通である。ＧＥＭＭを有する重要な病原体には、コレラおよび炭疽の原因病原体が含まれる。
【００３８】
配列データが遺伝子注釈づけを含む３０９のＧＥＭＭ例のうち、ＧＥＭＭは、２９７の例で遺伝子に対して５’調節立体配置にあり、これはシス調節の役割に関与する。おそらくＧＥＭＭによって調節される遺伝子は広範な機能を示すが、ほとんどの遺伝子は細胞外環境または膜に関連し、多数の遺伝子は運動性に関連する。
【００３９】
ＧＥＭＭの生物学的役割の理解により、広範な種々の微生物過程を明らかにすることができ、この過程は調節されるようである。実際、ＧＥＭＭは、既にいくつかの研究対象とされているＶｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅおよびＧｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓ種における２つの系に関与する。Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅはヒトでコレラを引き起こすが、その生活環の多くを水中で過ごし、多数の甲殻類のキチン含有外骨格に接着することができる。キチン（ＧｌｃＮＡｃ（Ｎ−アセチルグルコサミン）のポリマー）は、多数のＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅの遺伝子発現に影響を及ぼすことが示されている（Ｍｅｉｂｏｍ  ２００４）。ＧＥＭＭは、これらのキチン誘導性遺伝子の２つを調節するようである。第１のｇｂｐＡは、キチンビーズ（Ｍｅｉｂｏｍ  ２００４）およびヒト上皮細胞（Ｋｉｒｎ  ２００５）への接着ならびにマウス感染（Ｋｉｒｎ  ２００５）に重要である。
【００４０】
第２のキチン誘導性遺伝子はｔｆｏＸＶＣである。珍しいことに、キチンは、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅにおける天然のコンピテンスを誘導し（Ｍｅｉｂｏｍ  ２００５）、ｔｆｏＸＶＣ発現はこのコンピテンスに不可欠である。Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅは、個別のｔｆｏＸドメインに対応するＣＤＤモデルであるＣＯＧ３０７０およびｐｆａｍ０４９９４に適合する２つの遺伝子を有する。両ドメインから１０−２５より良好なＲＰＳＢＬＡＳＴ（Ｓｃｈａｆｆｅｒ  ２００１）Ｅ値が得られる。これらのうちの１つはｔｆｏＸＶＣ（ＶＣ１１５３遺伝子座）である。ＧＥＭＭは、ｔｆｏＸＧＥＭＭ（ＶＣ１７２２）と呼ばれる他の遺伝子を調節するようである。したがって、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅおよび関連細菌では、ＧＥＭＭは、キチン誘導性コンピテンスに関与し得るか、高濃度のキチンを含まない環境でコンピテンスでさえも調節することができる。
【００４１】
Ｇｅｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓおよび関連するδ−ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａは、電子受容体としてＦｅ（ＩＩＩ）などの金属イオンを使用して有機化合物を酸化することによってＡＴＰを生成することができる（Ｍｅｔｈｅ２００３）。ＧＥＭＭは、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ種におけるピリ線毛アセンブリ遺伝子に関連する。Ｇ．ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓにおけるピリ線毛は、導電性を示しており（Ｒｅｇｕｅｒａ  ２００５）、したがって、金属イオンの還元過程の一部である。
【００４２】
さらに、ＧＥＭＭは、Ｇ．ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓにおいて７つのチトクロームｃ遺伝子を調節するようである。この細菌が１１１の推定チトクロームｃ遺伝子を有するにもかかわらず、７つのＧＥＭＭ関連遺伝子のうちの５つが以前の研究で同定されており、特別な役割を有し得る。ＯｍｃＳ（外膜チトクロームＳ）は、Ｇ．ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓの外膜上に非常に豊富な２つのタンパク質のうちの１つであり、不溶性酸化鉄（ＩＩＩ）の還元に必要であるが、可溶性クエン酸鉄（ＩＩＩ）に必要ない（Ｍｅｈｔａ  ２００５）。ＯｍｃＧおよびＯｍｃＨは、ＯｍｃＢ（多くの条件下で不可欠なチトクロームｃ）の産生に必要である（Ｋｉｍｍ  ２００６）。ＯｍｃＡおよびＯｍｃＴは、ＯｍｃＧ、ＯｍｃＨ、またはＯｍｃＳと関連する。４つの他のＯｍｃ注釈づけのみがＧＥＭＭと直接関連しないＧ．ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓに残存する（ＯｍｃＢ、ＯｍｃＣ、ＯｍｃＥ、およびＯｍｃＦ）。
【００４３】
公知のリボスイッチと異なり、ＧＥＭＭは、非常に多様な遺伝子機能に関連する（実施例１中の表２）。この所見は、ＧＥＭＭリボスイッチが代謝経路の調節のための典型的なフィードバックセンサーとしての機能を果たさないことを示す。むしろ、ＧＥＭＭは、シグナル伝達、または潜在的に細胞間情報交換に関与する第２のメッセンジャー分子を感知する（Ｂａｓｓｌｅｒ  ２００６）。実施例２は、ＧＥＭＭモチーフの二次メッセンジャートリガー分子がサイクリックジＧＭＰであることを証明している。この方法では、異なる細菌は、異なる過程を調節するためにＧＥＭＭおよびそのシグナル伝達分子を使用する。多数のＧＥＭＭ関連遺伝子がシグナル伝達ドメインをコードするという事実は、多数のシグナル伝達タンパク質が調節される機構を示す。実施例２は、ＧＥＭＭ  ＲＮＡが実際に新規に見出されたリボスイッチクラスのアプタマー成分としての機能を果たすことを証明している。
【００４４】
Ｃ．Ｓ−アデノシルホモシステインリボスイッチ
ＳＡＨモチーフを含むＳ−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチ（ＳＡＨリボスイッチともいうことができる）は、分岐ステム構造を含む（図１および９Ａ）。ＳＡＨモチーフは、配列および構造中で高度に保存されており（図１および９Ａ）、予想されるステム領域内の共変動を示す（モジュラーステムおよび可変長ステムが含まれる）。ＳＡＨリボスイッチを、実施例１および３に記載する。ＳＡＨモチーフは、ＳＡＨ（Ｓ−アデノシルホモシステイン）代謝に関連する遺伝子に対して５’調節立体配置、主に、β−およびいくつかのγ−ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、具体的にはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属中で見出される。ＳＡＨは、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）代謝回路の一部であり、その主な成分には、アミノ酸のメチオニンおよびその誘導体ホモシステインが含まれる。ＳＡＨは、メチル化反応の補因子としてＳＡＭを使用する酵素の副生成物である。典型的には、ＳＡＨは、ホモシステインおよびアデノシンに加水分解される。次いで、ホモシステインを使用して、メチオニンを合成し、最終的にＳＡＭを合成する。
【００４５】
ＳＡＨが多数のＳＡＭ依存性メチルトランスフェラーゼを阻害するので、高レベルのＳＡＨは細胞に有毒である（Ｕｅｌａｎｄ  １９８２）。したがって、細胞は、ＳＡＨ濃度の上昇を感知し、有毒レベルに到達する前にこの化合物を破棄する必要がある可能性が高い。ＳＡＨモチーフが関連する遺伝子は、メチオニン合成で使用されるメチル供与体を合成するＳ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ（ａｈｃＹ）、コバラミン依存性メチオニンシンターゼ（ｍｅｔＨ）、およびメチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ（ｍｅｔＦ）である。ＳＡＨモチーフのこの遺伝子配置およびその高保存度は、ＳＡＨの感知およびその産物がＳＡＨ破壊に必要な遺伝子の発現の活性化での役割と一致する。実際、生化学的および遺伝的証拠は、このモチーフがＳＡＨ感知リボスイッチであることを示す。
【００４６】
Ｄ．ＰｒｅＱ１リボスイッチ（ｐｒｅＱ１−ＩＩまたはＣＯＧ４７０８モチーフ）
ｐｒｅＱ１−ＩＩを含むＰｒｅＱ１応答性リボスイッチ（ＣＯＧ４７０８モチーフともいうことができる）。ｐｒｅＱ１リボスイッチ、ｐｒｅＱ１−ＩＩリボスイッチ、またはＣＯＧ４７０８リボスイッチ）ともいうことができるかかるリボスイッチは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのいくつかの種およびＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ中のＣＯＧ４７０８遺伝子の上流に見出されるが、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓにおけるＣＯＧ４７０８遺伝子ファミリーのいくつかの例は推定ＲＮＡモチーフを欠く。ＣＯＧ４７０８遺伝子は、膜タンパク質をコードすると予想される。ｐｒｅＱ１−ＩＩリボスイッチを、実施例１および４に記載する。
【００４７】
ＣＯＧ４７０８モチーフは系統発生学的に高度に制約されており、６つの固有の配列しか持たないにもかかわらず、このモチーフは、共変動、モジュラーステム、および可変長ステムを示す（図１、１５、および１６Ａ）。モチーフは、ＣＯＧ４７０８遺伝子のシャイン−ダルカルノ配列と重複するシュードノットを有し、モチーフがこれらの遺伝子のシスレギュレーターをコードすることを示す。
【００４８】
改変核酸塩基ｐｒｅＱ１を感知するリボスイッチが最近特徴づけられた（Ｒｏｔｈ  ２００７）。このリボスイッチがＣＯＧ４７０８と関連するので、ＣＯＧ４７０８がｐｒｅＱ１に関連する代謝産物の輸送体であることが提案された。したがって、ＣＯＧ４７０８モチーフがｐｒｅＱ１感知リボスイッチでもあると見なされた。実験はこのことを支持している。ＣＯＧ４７０８モチーフは、以前に特徴づけられたｐｒｅＱ１感知リボスイッチ（Ｒｏｔｈ  ２００７）と配列や構造が類似しない。
【００４９】
Ｅ．細菌における転写終結のリボスイッチ調節
細菌は、主に、転写終結に２つの方法を使用する。転写伸長複合体を不安定化するために、一定の遺伝子はＲｈｏタンパク質に依存する終結シグナルを組み込む一方で（Ｊ．Ｐ．Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  ２００２，１５７７，２５１）、他の遺伝子はＲｈｏ非依存性ターミネーター（固有のターミネーター）を使用する（Ｉ．Ｇｕｓａｒｏｖ，Ｅ．Ｎｕｄｌｅｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  １９９９，３，４９５；Ｅ．Ｎｕｄｌｅｒ，Ｍ．Ｅ．Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｅｌｌｓ  ２００２，７，７５５）。後者のＲＮＡエレメントは、ＧＣリッチステム−ループおよびその後の一続きの６〜９個のウリジル残基から構成される。固有のターミネーターは、細菌ゲノム全体に広く存在し（Ｆ．Ｌｉｌｌｏら、２００２，１８，９７１）、典型的には、遺伝子またはオペロンの３’末端に存在する。興味深いことに、５’−ＵＴＲ内に存在する固有のターミネーターの例の数の増加が認められる。
【００５０】
細菌によって使用される広範な種々の遺伝子調節ストラテジーのうち、ＲＮＡポリメラーゼが調節様式で５’−ＵＴＲ内の終結シグナルに応答するクラスの例が増加している（Ｔ．Ｍ．Ｈｅｎｋｉｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２０００，３，１４９）。一定の条件中で、ＲＮＡポリメラーゼ複合体は、外部シグナルによって終結シグナルを認識または無視するように指示される。調節されずに転写開始が起こり得るにもかかわらず、ｍＲＮＡ合成（および遺伝子発現の）調節は、最終的に、固有のターミネーターの調節によって指示される。少なくとも２つの相互の排他的なｍＲＮＡ高次構造のうちの１つにより、転写終結をシグナル伝達するＲＮＡ構造が形成または破壊される。いくつかの例ではＲＮＡであり（Ｆ．Ｊ．Ｇｒｕｎｄｙら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ２００２，９９，１１１２１；Ｔ．Ｍ．Ｈｅｎｋｉｎ，Ｃ．Ｙａｎｏｆｓｋｙ，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  ２００２，２４，７００）、他の例ではタンパク質である（Ｊ．Ｓｔｕｌｋｅ，Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２００２，１７７，４３３）トランス作用因子は、一般に、特定の細胞内シグナルの受取りおよびその後のＲＮＡ高次構造の１つの安定化に必要である。リボスイッチにより、ＲＮＡ構造の調整と遺伝子調節機構によって解釈される代謝産物シグナルとの間の直接的な関連が得られる。
【００５１】
ほとんどの臨床抗菌化合物はたった４つの細胞過程のうちの１つを標的する（Ｗｏｌｆｓｏｎ  ２００６）。細菌がこれらの過程を保護するための十分に発達した耐性機構を有するので（Ｄ’Ｃｏｓｔａ  ２００６）、薬物介入に対して脆弱な新規の標的を開発するのに有用である。脆弱な過程の１つの型は、リボスイッチによる遺伝子発現の調節である（Ｗｉｎｋｌｅｒ  ２００５）。一定の細菌ｍＲＮＡの５’−ＵＴＲ中で典型的に見出される公知の各リボスイッチクラスのメンバーは、特定の基本的代謝産物に結合するように進化した構造化受容体（すなわち、「アプタマー」）（Ｍａｎｄａｌ  ２００４）を形成する。ほとんどの場合、リガンド結合は、結合した代謝産物の合成または輸送に関与する遺伝子または遺伝子群の発現を調節する。リボスイッチによって調節される生化学経路がしばしば細菌の生存に不可欠であるので、リボスイッチターゲティングによるこれらの経路の抑制は致死的であり得る。
【００５２】
いくつかの抗菌代謝産物アナログは、リボスイッチのターゲティングによって機能する（Ｓｕｄａｒｓａｎ  ２００３；Ｓｕｄａｒｓａｎ  ２００５；Ｗｏｏｌｌｅｙ  １９４３）。例えば、抗菌チアミンアナログであるピリチアミン（Ｗｏｏｌｌｅｙ  １９４３）は、チアミンピロリン酸塩結合リボスイッチのターゲティングによって機能する可能性が最も高い（Ｓｕｄａｒｓａｎ  ２００５）。同様に、抗菌リジンアナログであるＬ−アミノエチルシステイン（Ｓｈｉｏｔａ  １９５８）（ＡＥＣ、図１ｂ）は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のｌｙｓＣリボスイッチに結合し、ｌｙｓＣ調節レポーター遺伝子の発現を抑制する（Ｓｕｄａｒｓａｎ  ２００６）。さらに、ｌｙｓＣリボスイッチは、ＡＥＣに耐性を示すＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株（Ｌｕ  １９９１）およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株（Ｐａｔｔｅ  １９９８）で変異する。
【００５３】
他で特定しない限り、開示の方法および組成物は、特定の合成方法、特定の分析技術、または特定の試薬に制限されず、それ自体、変化することができると理解するべきである。本明細書中で使用した専門用語は特定の実施形態のみを記載することを目的とし、制限することを意図しないとも理解するべきである。
【００５４】
材料
開示の方法および組成物のために使用することができるか、これらと併せて使用することができるか、これらの調製で使用することができるか、または、これらの生成物である、材料、組成物、および成分を開示する。これらおよび他の材料を本明細書中に開示し、特にこれらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、群などを開示する場合、これらの化合物の種々の個々および集合的組み合わせおよび順列（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）のそれぞれに関する特別な言及は明確に開示できず、それぞれ、本明細書中で具体的に意図および記載されると理解される。例えば、リボスイッチまたはアプタマードメインを開示および考察し、多数の分子（リボスイッチまたはアプタマードメインが含まれる）に作製することができる多数の改変物を考察する場合、それとは反対であると具体的に示されない限り、リボスイッチまたはアプタマードメインおよび可能な改変物の各々および全ての組み合わせおよび順列を特に意図する。したがって、分子Ａ、Ｂ、およびＣのクラスを開示し、ならびに分子Ｄ、Ｅ、およびＦのクラス、および組み合わせ分子の例（Ａ−Ｄ）も開示する場合、各々を個別に引用しない場合でさえも、各々を個別または集合的に意図する。したがって、この例では、Ａ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−Ｅ、およびＣ−Ｆの各組み合わせを特に意図し、Ａ、Ｂ、およびＣ；Ｄ、Ｅ、およびＦ；ならびに組み合わせ例Ａ−Ｄの開示から開示されると見なすべきである。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせも特に意図および開示される。したがって、例えば、Ａ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、およびＣ−Ｅの下位集団（ｓｕｂ−ｇｒｏｕｐ）を特に意図し、Ａ、Ｂ、およびＣ；Ｄ、Ｅ、およびＦ；および組み合わせ例Ａ−Ｄの開示から開示されると見なすべきである。この概念を、本出願の全局面（開示の組成物を作製および使用する方法における工程が含まれるが、これらに限定されない）に適用する。したがって、実施することができる種々のさらなる工程が存在する場合、これらのさらなる工程の各々を開示の方法の任意の特定の実施形態または実施形態の組み合わせを使用して実施することができ、それぞれのかかる組み合わせが特に意図され、開示されると見なすべきであると理解される。
【００５５】
Ａ．リボスイッチ
リボスイッチは、発現するＲＮＡ分子の一部であり、トリガー分子によって結合した場合に状態が変化する発現調節エレメントである。リボスイッチを、典型的には、以下の２つの個別のドメインに分けることができる：１つは標的に選択的に結合するドメイン（アプタマードメイン）および他は遺伝子調節に影響を及ぼすドメイン（発現プラットフォームドメイン）である。遺伝子発現が代謝産物依存性にアロステリック調節されるこれらの２ドメイン間の動的相互作用がもたらされる。単離および組換えリボスイッチ、かかるリボスイッチを含む組換え構築物、かかるリボスイッチに作動可能に連結された非相同配列、かかるリボスイッチを保有する細胞およびトランスジェニック生物、リボスイッチ組換え構築物、ならびに非相同配列に作動可能に連結されたリボスイッチを開示する。非相同配列は、例えば、目的のタンパク質またはペプチド（レポータータンパク質またはペプチドが含まれる）をコードする配列であり得る。好ましいリボスイッチは、天然に存在するリボスイッチであるか、これに由来する（天然に存在するサイクリックジＧＭＰリボスイッチなど）。リボスイッチは、人工アプタマーを含むか、任意選択的に排除することができる。例えば、人工アプタマーには、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化および／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択によってデザインまたは選択されるアプタマーが含まれる。リボスイッチは、天然に存在するリボスイッチのコンセンサス配列（サイクリックジＧＭＰリボスイッチ、ＳＡＨリボスイッチ、ｐｒｅＱ１リボスイッチ、Ｍｏｃｏリボスイッチ、およびＳＡＭ−ＩＶリボスイッチのコンセンサス配列など）を含むことができる。サイクリックジＧＭＰリボスイッチのコンセンサス配列を、図１および図３Ｂに示す。サイクリックジＧＭＰリボスイッチの例を、図２および３Ｃに示す。ＳＡＨリボスイッチのコンセンサス配列を、図１および９Ａに示す。ｐｒｅＱ１-ＩＩ（ｐｒｅＱ１−ＩＩまたはＣＯＧ４７０８モチーフ）リボスイッチのコンセンサス配列を、図１、１５（配列）および１６Ａ（構造）に示す。
【００５６】
リボスイッチが天然に存在するリボスイッチの非天然誘導体であるリボスイッチを開示する。リボスイッチは、サイクリックジＧＭＰ応答性リボスイッチ、Ｓ−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチ、ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチ、Ｍｏｃｏ応答性リボスイッチ、またはＳＡＭ応答性リボスイッチであり得る。開示のリボスイッチ（その誘導体および組換え形態が含まれる）は、一般に、任意の供給源に由来し得る（天然に存在するリボスイッチおよびｄｅ  ｎｏｖｏでデザインしたリボスイッチが含まれる）。任意のかかるリボスイッチを、開示の方法中または開示の方法と共に使用することができる。しかし、異なるリボスイッチ型を定義することができ、いくつかのかかるサブタイプは、特定の方法においてまたは特定の方法を使用して有用であり得る（一般に、本明細書の他の場所に記載）。リボスイッチ型には、例えば、天然に存在するリボスイッチ、天然に存在するリボスイッチの誘導体および改変形態、コンセンサスリボスイッチ、キメラリボスイッチ、および組換えリボスイッチが含まれる。天然に存在するリボスイッチは、天然に見出されるリボスイッチの配列を有するリボスイッチである。かかる天然に存在するリボスイッチは、天然に存在するように天然に存在するリボスイッチの単離形態または組換え形態であり得る。すなわち、リボスイッチは、同一の一次構造を有するが、新規の遺伝子構成または核酸構成で単離または操作されている。コンセンサスリボスイッチは、天然に存在するリボスイッチのコンセンサス構造の配列および特徴を有する。キメラリボスイッチを、例えば、任意のリボスイッチのまたは特定のクラスもしくは型のリボスイッチのリボスイッチの一部および同一のリボスイッチのまたは任意の異なるクラスもしくは型のリボスイッチの異なるリボスイッチの一部；任意のリボスイッチのまたは特定のクラスもしくは型のリボスイッチのリボスイッチの一部および任意の非リボスイッチ配列または成分で構成することができる。組換えリボスイッチは、新規の遺伝子または核酸状況で単離または操作されているリボスイッチである。
【００５７】
リボスイッチは、１つまたは複数のアプタマードメインを有することができる。複数のアプタマードメインを有するリボスイッチ中のアプタマードメインは、トリガー分子の協同的結合を示すことができるか、トリガー分子の協同的結合を示すことができない（すなわち、アプタマーは協同的結合を示す必要がない）。後者の場合、アプタマードメインは、非依存性結合剤であるということができる。複数のアプタマーを有するリボスイッチは、１つまたは複数の発現プラットフォームドメインを有することができる。例えば、トリガー分子の協同的結合を示す２つのアプタマードメインを有するリボスイッチを、両方のアプタマードメインによって調節される１つの発現プラットフォームドメインに連結することができる。複数のアプタマーを有するリボスイッチは、リンカーを介して結合した１つまたは複数のアプタマーを有することができる。かかるアプタマーがトリガー分子の協同的結合を示す場合、リンカーは協同的リンカーであり得る。
【００５８】
ｘとｘ−１との間のヒル係数ｎを有する場合（ｘは、協同的結合について分析されるアプタマードメイン数（またはアプタマードメイン上の結合部位数）である）、アプタマードメインは協同的結合を示すということができる。したがって、例えば、リボスイッチが２と１との間のヒル係数を有する場合、２つのアプタマードメインを有するリボスイッチは協同的結合を示すということができる。使用した値ｘが協同的結合について分析したアプタマードメイン数（必ずしもリボスイッチ中のアプタマードメインの存在数ではない）に依存すると理解すべきである。一部のみしか協同的結合を示さない場合にリボスイッチが複数のアプタマードメインを有することができるので、これは理解される。
【００５９】
非相同アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含むキメラリボスイッチを開示する。すなわち、キメラリボスイッチは、ある供給源由来のアプタマードメインおよび別の供給源由来の発現プラットフォームドメインから構成される。非相同供給源は、例えば、異なる特異的リボスイッチ、異なるリボスイッチ型、または異なるリボスイッチクラスに由来し得る。非相同アプタマーは、非リボスイッチアプタマーにも由来し得る。非相同発現プラットフォームドメインは、非リボスイッチ供給源にも由来し得る。
【００６０】
改変リボスイッチまたは誘導体リボスイッチを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択および進化技術を使用して産生することができる。一般に、リボスイッチに適用されるｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化技術は、リボスイッチ配列の一部が変化している一方で、リボスイッチの他の部分が一定に保持されている改変（ｖａｒｉａｎｔ）リボスイッチ組の産生を含む。次いで、改変リボスイッチ組の活性化、非活性化、または遮断（または他の機能的もしくは構造的基準）を評価することができ、目的の基準を満たす改変リボスイッチを使用またはさらなる進化ラウンドのために選択する。改変体生成に有用な基盤リボスイッチは、本明細書中に開示の特異的およびコンセンサスリボスイッチである。コンセンサスリボスイッチを使用して、どのリボスイッチ部分がｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択および進化のために変化するかについての情報を提供することができる。
【００６１】
調節が変化した改変リボスイッチも開示する。リボスイッチの調節を、リボスイッチ（キメラリボスイッチである）の発現プラットフォームドメインへのアプタマードメインの作動可能な連結によって変化させることができる。次いで、アプタマードメインは、例えば、アプタマードメインのためのトリガー分子の作用によってリボスイッチの調節を媒介することができる。アプタマードメインを、任意の適切な様式で（例えば、リボスイッチの通常または天然のアプタマードメインの新規のアプタマードメインとの置換によるものが含まれる）、リボスイッチの発現プラットフォームドメインに作動可能に連結することができる。一般に、アプタマードメインが由来するリボスイッチを活性化、誘導体化、または遮断することができる任意の化合物または条件を使用して、キメラリボスイッチを活性化、誘導体化、または遮断することができる。
【００６２】
不活化リボスイッチも開示する。リボスイッチの共有結合の変化（例えば、リボスイッチの一部の架橋または化合物のリボスイッチへのカップリング）によってリボスイッチを不活化することができる。この様式でのリボスイッチの不活化は、例えば、リボスイッチに対しトリガー分子の結合を防止するか、トリガー分子の結合の際にリボスイッチの状態の変化を防止するか、リボスイッチの発現プラットフォームドメインがトリガー分子の結合の際に発現に影響を及ぼすのを防止する変化に起因し得る。
【００６３】
バイオセンサーリボスイッチも開示する。バイオセンサーリボスイッチは、その同系のトリガー分子の存在下で検出可能なシグナルを産生する操作リボスイッチである。有用なバイオセンサーリボスイッチを、閾値レベルまたは閾値レベルを超えるトリガー分子で誘発することができる。バイオセンサーリボスイッチを、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの使用のためにデザインすることができる。例えば、シグナルとしての機能を果たすかシグナル産生に関与するタンパク質をコードするレポーターＲＮＡに作動可能に連結されたバイオセンサーリボスイッチを、細胞または生物にリボスイッチ／レポーターＲＮＡをコードする核酸構築物を保有させるように操作することによってｉｎ  ｖｉｖｏで使用することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用するバイオセンサーリボスイッチの例は、高次構造依存性標識（リボスイッチの活性化状態に応じて変化するシグナル）を含むリボスイッチである。かかるバイオセンサーリボスイッチは、好ましくは、天然に存在するリボスイッチからの或いはそれに由来するアプタマードメインを使用する。バイオセンサーリボスイッチを、種々の状況およびプラットフォームで使用することができる。例えば、バイオセンサーリボスイッチを、固体支持体（プレート、チップ、ストリップ、およびウェルなど）と共に使用することができる。
【００６４】
新規のトリガー分子を認識する改変リボスイッチまたは誘導体リボスイッチも開示する。新規のトリガー分子を認識する新規のリボスイッチおよび／または新規のアプタマーを、公知のリボスイッチのために選択するか、公知のリボスイッチからデザインするか、公知のリボスイッチから誘導することができる。例えば、リボスイッチ中のアプタマー改変体組を産生する工程、目的の化合物の存在下での改変リボスイッチの活性化を評価する工程、活性化された改変リボスイッチ（または、例えば、最高にまたは最も選択的に活性化されたリボスイッチ）の選択、および所望の活性、特異性、活性と特異性との組み合わせ、または特性の他の組み合わせの改変リボスイッチが得られるまでこれらの工程を繰り返すことによってこれを行うことができる。
【００６５】
一般に、発現プラットフォームドメイン中の調節された鎖をアプタマードメインの調節鎖に相補的であるようにデザインまたは適合させることによって、任意のアプタマードメインを任意の発現プラットフォームドメインと共に使用するために適合させることができる。あるいは、調節鎖が発現プラットフォーム中の機能的に重要な配列に相補的であるように、アプタマーの配列およびアプタマードメインの調節鎖を適合させることができる。例えば、調節鎖を、調節鎖とＳＤ配列との間のステム構造の形成の際に、ＳＤ配列がリボゾームに接近不可能となり、それにより、翻訳開始が減少するか防止されるようにＲＮＡのシャイン−ダルカルノ配列に相補的であるように適応することができる。アプタマー鎖がアプタマードメイン中にＰ１ステムを形成させるための対応する変化を配列中に有することに留意のこと。協同的結合を示す複数のアプタマーを有するリボスイッチの場合、活性化アプタマー（発現プラットフォームドメインと相互作用するアプタマー）のＰ１ステムのみを、ＳＤ配列を有するステム構造を形成するようにデザインする必要がある。
【００６６】
別の例として、転写ターミネーターを、転写ターミネーター配列の一部がアプタマードメインの調節鎖（配列は調節された鎖である）と相補的であるＲＮＡ分子（ＲＮＡの非翻訳領域中が最も都合がよい）に付加することができる。これにより、アプタマードメインの調節配列がアプタマー鎖および調節された鎖を有するオルタナティブなステム構造を形成することが可能となり、それにより、リボスイッチの活性化または非活性化の際に転写ターミネーターステムが形成または破壊される。リボスイッチの調節下でオルタナティブなステム構造の類似のデザインによって任意の他の発現エレメントを得ることができる。
【００６７】
リボスイッチによって調節される転写ターミネーターのために、リボスイッチおよび発現プラットフォームエレメントの転写速度および間隔は、適切な調節に重要であり得る。転写速度を、例えば、転写を中止してリボスイッチを形成し、トリガー分子を感知することを可能にするためのポリメラーゼ中止エレメント（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｐａｕｓｉｎｇ  ｅｌｅｍｅｎｔ）（例えば、一連のウリジン残基）を含めることによって調整することができる。
【００６８】
コード領域に作動可能に連結されたリボスイッチを含むＲＮＡをコードする核酸分子を含み、リボスイッチがＲＮＡの発現を調節し、リボスイッチおよびコード領域が非相同である、調節可能な遺伝子発現構築物を開示する。リボスイッチは、サイクリックジＧＭＰ応答性リボスイッチ、Ｓ−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチ、ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチ、Ｍｏｃｏ応答性リボスイッチ、ＳＡＭ応答性リボスイッチ、またはかかるリボスイッチの誘導体であり得る。リボスイッチはアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含むことができ、アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインは非相同である。リボスイッチは、２つ以上のアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含むことができ、アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインの少なくとも１つが非相同である。アプタマードメインの少なくとも２つは協同的結合を示すことができる。
【００６９】
非相同リボスイッチおよびコード領域を含むＲＮＡ分子を開示する。すなわち、かかるＲＮＡ分子は、ある供給源由来のリボスイッチおよび別の供給源由来のコード領域から構成される。非相同供給源は、例えば、異なるＲＮＡ分子、異なる転写物、異なる遺伝子由来のＲＮＡまたは転写物、異なる細胞由来のＲＮＡまたは転写物、異なる生物由来のＲＮＡまたは転写物、異なる種由来のＲＮＡまたは転写物、天然の配列および人工または操作された配列、特異的リボスイッチ、異なるリボスイッチ型、または異なるリボスイッチクラスに由来し得る。
【００７０】
本明細書中に開示する場合、用語「コード領域」は、アミノ酸をコードする核酸の任意の領域をいう。これは、コドンまたはコドンのテンプレートを含む核酸鎖および二本鎖核酸分子の場合のかかる核酸鎖の相補物の両方を含むことができる。コード領域でない核酸領域を、非コード領域ということができる。転写される伝令ＲＮＡ分子は、典型的には、５’末端および３’末端の両方に非コード領域を含む。真核生物ｍＲＮＡ分子は、イントロンなどの内部非コード領域も含むことができる。いくつかのＲＮＡ分子型は、ｔＲＮＡ分子およびｒＲＮＡ分子などの機能的コード領域を含まない。機能的コード領域を含まないＲＮＡ分子（非コードＲＮＡ分子ともいうことができる）の発現も、開示のリボスイッチによって調節するか影響を及ぼすことができる。したがって、開示のリボスイッチを、コード領域へのリボスイッチの作動可能な連結のための本明細書中に開示の任意の様式で非コードＲＮＡ分子に作動可能に連結することができる。リボスイッチは、コード領域に作動可能に連結されたリボスイッチを含むＲＮＡの調節のために本明細書中に開示のようにかかるＲＮＡの発現を調節することができる。任意の核酸分子の機能を、開示のリボスイッチによって調節するか影響を及ぼすこともできる。例には、ＲＮＡ、ＤＮＡ、および人工核酸（ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノおよびロックド核酸（ＬＮＡ）、ならびにグリコール核酸（ＧＮＡ）およびトレオース核酸（ＴＮＡ）が含まれる）が含まれるが、これらに限定されない。開示の方法では、リボスイッチは、例えば、コード領域の発現、コードされたタンパク質の発現、非コードＲＮＡ分子の発現、ＲＮＡまたはコード領域の転写、またはコードされたタンパク質の翻訳を調節することができる。
【００７１】
１．アプタマードメイン
アプタマーは、特定の化合物および化合物クラスに選択的に結合することができる核酸セグメントおよび構造である。リボスイッチは、トリガー分子の結合の際にリボスイッチの状態または構造が変化するアプタマードメインを有する。機能的リボスイッチでは、アプタマードメインに連結した発現プラットフォームドメインの状態または構造は、トリガー分子がアプタマードメインに結合した場合に変化する。リボスイッチのアプタマードメインは、任意の供給源（例えば、天然リボスイッチのアプタマードメイン、人工アプタマー、操作された、選択された、進化した、または誘導されたアプタマーまたはアプタマードメインが含まれる）に由来し得る。リボスイッチ中のアプタマーは、一般に、ステム構造の形成などによって連結した発現プラットフォームドメイン部分と相互作用することができる少なくとも１つの部分を有する。このステム構造は、トリガー分子の結合の際に形成されるか破壊されるかのいずれかである。
【００７２】
種々の天然リボスイッチのコンセンサスアプタマードメインを、米国特許出願公開第２００５−００５３９５１号の図１１および本明細書中の他所に示す。サイクリックジＧＭＰリボスイッチのコンセンサス配列および構造を、図１および３に見出すことができる。ＳＡＨリボスイッチのコンセンサス配列を、図１および９Ａに示す。ｐｒｅＱ１-ＩＩ（ｐｒｅＱ１−ＩＩまたはＣＯＧ４７０８モチーフ）リボスイッチのコンセンサス配列を、図１、１５（配列）、および１６Ａ（構造）に示す。これらのアプタマードメイン（本明細書中に具体化された全てのダイレクト改変体（ｄｉｒｅｃｔ  ｖａｒｉａｎｔ）が含まれる）を、リボスイッチ中で使用することができる。コンセンサス配列および構造は、配列および構造の変形を示す。示した変形内のアプタマードメインを本明細書中でダイレクト改変体という。これらのアプタマードメインを、改変（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）または改変（ｖａｒｉａｎｔ）アプタマードメインが産生されるように改変することができる。保存的改変には、対の中のヌクレオチドが相補性を維持するような塩基対合ヌクレオチドの任意の変化が含まれる。中等度の改変には、示した長さ範囲の２０％以下のまたは等しい（長さまたは長さの範囲を示す）ステムまたはループの長さの変化が含まれる。コンセンサス構造が特定の長さのステムまたはループを示す場合、または、長さの範囲が列挙または表示される場合、ループおよびステムの長さを、「示す」と見なす。中等度の改変には、示した長さ範囲の４０％以下のまたは等しい（長さまたは長さの範囲を示さない）ステムまたはループの長さの変化が含まれる。中等度の改変には、アプタマードメインの非特定部分の機能的改変体も含まれる。
【００７３】
開示のリボスイッチのアプタマードメインを、任意の他の目的、および任意の他の状況のためにアプタマーとして使用することもできる。例えば、アプタマーを使用して、リボザイム、他の分子スイッチ、および構造の変化がＲＮＡの機能に影響を及ぼし得る任意のＲＮＡ分子を調節することができる。
【００７４】
２．発現プラットフォームドメイン
発現プラットフォームドメインは、リボスイッチを含むＲＮＡ分子の発現に影響を及ぼすリボスイッチの一部である。発現プラットフォームドメインは、一般に、ステム構造の形成などによって連結したアプタマードメインの一部と相互作用することができる少なくとも１つの部分を有する。このステム構想は、トリガー分子の結合の際に形成されるか破壊されるかのいずれかである。ステム構造は、一般に、発現調節構造を形成するか、これの形成を防止するかのいずれかである。発現調節構造は、構造を含むＲＮＡ分子の発現を許容するか、防止するか、増強するか、阻害する構造である。例には、シャイン−ダルガルノ配列、開始コドン、転写ターミネーター、安定性シグナル、ならびにプロセシングシグナル（ＲＮＡスプライシングジャンクションおよび調節エレメントなど）が含まれる。
【００７５】
Ｂ．トリガー分子
トリガー分子は、リボスイッチを活性化することができる分子および化合物である。これには、リボスイッチの天然または通常のトリガー分子およびリボスイッチを活性化することができる他の化合物が含まれる。天然または通常のトリガー分子は、所与の天然のリボスイッチのためのトリガー分子であるかまたはいくつかの非天然リボスイッチの場合、リボスイッチがデザインされるためのトリガー分子か、それと共にリボスイッチが選択される（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択技術またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化技術など）トリガー分子である。
【００７６】
Ｃ．化合物
リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断することができる化合物およびかかる化合物を含む組成物も開示する。リボスイッチは、トリガー分子の結合または除去によって遺伝子発現を調節するように機能する。化合物を使用して、リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断することができる。リボスイッチのトリガー分子（ならびに他の活性化化合物）を使用して、リボスイッチを活性化することができる。トリガー分子以外の化合物を使用して、一般に、リボスイッチを非活性化または遮断することができる。リボスイッチを、例えば、リボスイッチの存在からのトリガー分子の除去によって非活性化することもできる。リボスイッチを、例えば、リボスイッチを活性化しないトリガー分子のアナログの結合によって遮断することができる。
【００７７】
ＲＮＡ分子がリボスイッチを含む、ＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子をコードする遺伝子の発現を変化させるための化合物も開示する。化合物のＲＮＡ分子との接触によってこれを行うことができる。リボスイッチは、トリガー分子の結合または除去によって遺伝子発現を調節するように機能する。したがって、リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断する条件に応じたリボスイッチを含む目的のＲＮＡ分子を供して、ＲＮＡの発現を変化させるために使用することができる。例えば、転写の終結またはＲＮＡへのリボゾーム結合遮断の結果として発現を変化させることができる。トリガー分子の結合は、リボスイッチの性質に応じて、ＲＮＡ分子の発現を減少または防止することができるか、ＲＮＡ分子の発現を促進または増加することができる。
【００７８】
ＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子をコードする遺伝子の発現を調節するための化合物も開示する。リボスイッチの活性化、非活性化、または遮断によってリボスイッチを含む天然に存在する遺伝子またはＲＮＡの発現を調節するための化合物も開示する。遺伝子がこの遺伝子を保有する細胞または生物の生存に不可欠である場合、リボスイッチの活性化、非活性化、または遮断により、細胞または生物が死滅、静止、または衰弱し得る。
【００７９】
リボスイッチの活性化、非活性化、または遮断によってリボスイッチを含む単離遺伝子、操作遺伝子、もしくは組換え遺伝子またはＲＮＡの発現を調節するための化合物も開示する。遺伝子が所望の発現産物をコードする場合、リボスイッチの活性化および非活性化を使用して、遺伝子発現を誘導し、それにより、発現産物を産生することができる。遺伝子が遺伝子発現または別の細胞過程のインデューサーまたはリプレッサーをコードする場合、リボスイッチの活性化、非活性化、または遮断により、他の調節された遺伝子または細胞過程を誘導、抑制、または脱抑制することができる。多数のかかる二次調節効果は公知であり、リボスイッチとの使用に適合することができる。かかる調節（ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）の一次調節（ｃｏｎｔｒｏｌ）としてのリボスイッチの利点は、リボスイッチトリガー分子が小さな非抗原性分子であり得ることである。
【００８０】
リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断する化合物を同定する方法も開示する。例えばリボスイッチを活性化する化合物を、試験化合物とリボスイッチとの接触させる工程およびリボスイッチの活性化を評価する工程によって同定することができる。リボスイッチが活性化される場合、試験化合物を、リボスイッチを活性化する化合物と同定する。リボスイッチの活性化を、任意の適切な様式で評価することができる。例えば、リボスイッチをレポーターＲＮＡに連結することができ、レポーターＲＮＡの発現、発現レベル、または発現レベルの変化を、試験化合物の存在下および非存在下で測定することができる。別の例として、リボスイッチは、高次構造依存性標識（リボスイッチの活性化状態に応じて変化するシグナル）を含むことができる。かかるリボスイッチは、好ましくは、天然に存在するリボスイッチに由来するか、これから誘導するアプタマードメインを使用する。認められるように、調節アッセイまたは測定を使用するか調節アッセイまたは測定を使用しないで、リボスイッチの活性化を評価することができる。
【００８１】
リボスイッチを非活性化する化合物の同定方法を、類似の方法で行うことができる。リボスイッチを遮断する化合物の同定を、任意の適切な様式で行うことができる。例えば、リボスイッチを活性化または非活性化することが公知の化合物の存在下および試験化合物の存在下でリボスイッチの活性化または非活性化を評価するためのアッセイを行うことができる。試験化合物の非存在下で観察されるように活性化または非活性化が認められない場合、試験化合物を、リボスイッチの活性化または非活性化を遮断する化合物と同定する。
【００８２】
サイクリックジＧＭＰ、ＳＡＨ、ｐｒｅＱ１、Ｍｏｃｏ、およびＳＡＭ−ＩＶリボスイッチと相互作用する化合物を本明細書中に開示する。これらの化合物のさらなる改変バージョンは、ＲＮＡ構造中の他の官能基への新規の接触によってリボスイッチへの結合を改善することができる。さらに、（他の特徴のうちで）生物学的利用能、毒性、および合成の容易さの調整を、これら２つの骨格（ｓｃａｆｆｏｌｄ）領域中の改変によって調節することができる。これは、リボスイッチの構造モデルがこれらの部位で多数の改変が可能であることを示すからである。
【００８３】
ハイスループットスクリーニングを使用して、標準的または非標準的な分子認識様式のいずれかを使用してリボスイッチＲＮＡにも結合する全く新しい化学的骨格を明らかにすることもできる。複数の異なるアプローチを使用して、代謝産物結合ＲＮＡを検出することができる（ゲルベースおよびチップベースの検出方法を使用したアロステリックリボザイムアッセイならびにインライン探索アッセイが含まれる）。リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断する化合物の同定および同定された化合物の製造によって作製された化合物も開示する。例えば、本明細書中の他所に開示の化合物同定方法と同定された化合物の製造方法との組み合わせにより、これを行うことができる。例えば、試験化合物とリボスイッチとの接触、リボスイッチの活性化の評価、および試験化合物によってリボスイッチが活性化された場合の化合物としてのリボスイッチを活性化する試験化合物の製造によって化合物を作製することができる。
【００８４】
化合物によるリボスイッチの活性化、非活性化、または遮断のチェックおよびチェックした化合物の製造によって作製された化合物も開示する。例えば、本明細書中の他所に開示の化合物の活性化、非活性化、または遮断評価方法とチェックした化合物の製造方法との組み合わせによってこれを行うことができる。例えば、試験化合物とリボスイッチとの接触、リボスイッチの活性化の評価、および試験化合物によってリボスイッチが活性化された場合の化合物としてのリボスイッチを活性化する試験化合物の製造によって化合物を作製することができる。化合物がリボスイッチを活性化、非活性化、または遮断する能力についての化合物のチェックは、リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断することを以前には知られていない化合物の同定および化合物がリボスイッチを活性化、非活性化、または遮断することが既に知られていた場合のリボスイッチを活性化、非活性化、または遮断する化合物の能力の評価の両方をいう。
【００８５】
本明細書中で使用される場合、用語「置換された」は、有機化合物の全ての許容される置換基が含まれることを意図する。広範な態様では、許容される置換基には、非環式および環式、分岐および非分岐、炭素環式および複素環式、ならびに芳香族および非芳香族の有機化合物の置換基が含まれる。例示的な置換基には、例えば、以下に記載の置換基が含まれる。許容される置換基は、適切な有機化合物について１つまたは複数および同一または異なり得る。本開示の目的のために、ヘテロ原子（窒素など）は、ヘテロ原子の原子価を満たす本明細書中に記載の有機化合物の水素置換基および／または任意の許容される置換基を有することができる。本開示は、いかなる様式においても有機化合物の許容される置換基に制限されることを意図しない。また、用語「置換」または「〜と置換された」には、かかる置換が置換される原子および置換基の許容される原子価に従い、置換によって安定な化合物（例えば、再配置、環状化、除去などによって自発的に変換を受けない化合物）が得られるという暗黙の条件が含まれる。
【００８６】
「Ａ１」、「Ａ２」、「Ａ３」、および「Ａ４」を、本明細書中で、種々の特定の置換基を示すための一般的な記号として使用する。これらの記号は、任意の置換基であり得、本明細書中に開示の置換基に制限されず、ある場合に置換基が一定の置換基であると定義される場合、別の場合に置換基をいくつかの他の置換基と定義することができる。
【００８７】
用語「アルキル」は、本明細書中で使用する場合、１〜２４個の炭素原子の分岐または非分岐の飽和炭化水素基（メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシル、およびテトラコシルなど）である。アルキル基は、置換または非置換でもあり得る。アルキル基を、１つまたは複数の基（下記のアルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシド、またはチオールが含まれるが、これらに限定されない）と置換することができる。用語「低級アルキル」は、６個以下の炭素原子のアルキル基（例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシルなど）である。
【００８８】
明細書を通して、「アルキル」を、一般に、非置換アルキル基および置換アルキル基の両方をいうために使用するが、置換アルキル基はまた、アルキル基上の特定の置換基の同定によって本明細書中で具体的に言及される。例えば、用語「ハロゲン化アルキル」は、具体的には、１つまたは複数のハライド（例えば、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素）と置換されたアルキル基をいう。用語「アルコキシアルキル」は、具体的には、１つまたは複数の下記のアルコキシ基と置換されたアルキル基をいう。用語「アルキルアミノ」は、具体的には、１つまたは複数の下記のアミノ基などと置換されたアルキル基をいう。「アルキル」をある例で使用する場合、「ハロゲン化アルキル」などの特定の用語を別の例で使用し、用語「アルキル」が「ハロゲン化アルキル」などの特定の用語もいわないことを意味しない。
【００８９】
このプラクティスを、本明細書中に記載の他の基にも使用する。すなわち、「シクロアルキル」などの用語は、非置換および置換のシクロアルキル部分の両方をいう一方で、置換部分を、さらに、本明細書中で具体的に特定することができる。例えば、特定の置換シクロアルキルは、例えば、「アルキルシクロアルキル」をいうことができる。同様に、置換アルコキシは、具体的には、例えば、「ハロゲン化アルコキシ」をいうことができ、特定の置換アルケニルは、例えば、「アルケニルアルコール」などであり得る。さらに、一般用語（「シクロアルキル」など）および特定の用語（「アルキルシクロアルキル」など）の使用プラクティスは、一般用語が特定の用語も含まないことを意味しない。
【００９０】
用語「アルコキシ」は、本明細書中で使用する場合、単一の末端エーテル結合によって結合したアルキル基である。すなわち、「アルコキシ」基を、−ＯＡ１（式中、Ａ２は上記定義のアルキルである）と定義することができる。
【００９１】
用語「アルケニル」は、本明細書中で使用する場合、構造式が少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む２〜２４個の炭素原子の炭化水素基である。（Ａ１Ａ２）Ｃ＝Ｃ（Ａ３Ａ４）などの非対称構造は、ＥおよびＺ異性体の両方を含むことを意図する。これは、非対称アルケンが存在する本明細書中の構造式から推測することができるか、結合記号Ｃ＝Ｃによって明確に示すことができる。アルケニル基を、１つまたは複数の基（下記のアルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシド、またはチオールが含まれるが、これらに限定されない）と置換することができる。
【００９２】
用語「アルキニル」は、本明細書中で使用する場合、構造式が少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む２〜２４個の炭素原子の炭化水素基である。アルキニル基を、１つまたは複数の基（下記のアルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシド、またはチオールが含まれるが、これらに限定されない）と置換することができる。
【００９３】
用語「アリール」は、本明細書中で使用する場合、任意の炭素ベースの芳香基を含む基（ベンゼン、ナフタレン、フェニル、ビフェニル、フェノキシベンゼンなどが含まれるが、これらに限定されない）である。用語「アリール」には、芳香基の環内に組み込まれた少なくとも１つのヘテロ原子を有する芳香基を含む基と定義される「ヘテロアリール」も含まれる。ヘテロ原子の例には、窒素、酸素、硫黄、およびリンが含まれるが、これらに限定されない。同様に、用語「アリール」にも含まれる用語「非ヘテロアリール」は、ヘテロ原子を含まない芳香基を含む基を定義する。アリール基は、置換または非置換であり得る。アリール基を、１つまたは複数の基（本明細書中に記載のアルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシド、またはチオールが含まれるが、これらに限定されない）と置換することができる。用語「ビアリール」は、アリール基の特定の型であり、アリールの定義内に含まれる。ビアリールは、ナフタレンのような融合環構造を介して共に結合するか、ビフェニルのような１つまたは複数の炭素−炭素結合を介して結合する２つのアリール基をいう。
【００９４】
用語「シクロアルキル」は、本明細書中で使用する場合、少なくとも３つの炭素原子から構成される非芳香族炭素ベースの環である。シクロアルキル基の例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどが含まれるが、これらに限定されない。用語「ヘテロシクロアルキル」は、環の少なくとも１つの炭素原子がヘテロ原子（窒素、酸素、硫黄、またはリンなどであるが、これらに限定されない）と置換された上記定義のシクロアルキル基である。シクロアルキル基およびヘテロシクロアルキル基は、置換または非置換であり得る。シクロアルキル基およびヘテロシクロアルキル基を、１つまたは複数の基（本明細書中に記載のアルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシド、またはチオールが含まれるが、これらに限定されない）と置換することができる。
【００９５】
用語「シクロアルケニル」は、本明細書中で使用する場合、少なくとも３つの炭素原子から構成され、且つ少なくとも１つの二重結合（すなわち、Ｃ＝Ｃ）を含む非芳香族炭素ベースの環である。シクロアルケニル基の例には、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロペンタジエニル、シクロヘキセニル、およびシクロヘキサジエニルなどが含まれるが、これらに限定されない。用語「ヘテロシクロアルケニル」は、上記定義のシクロアルケニル基の１つの型であり、用語「シクロアルケニル」の意味の範囲内に含まれ、環の少なくとも１つの炭素原子がヘテロ原子（窒素、酸素、硫黄、またはリンなどが含まれるが、これらに限定されない）と置換されている。シクロアルケニル基およびヘテロシクロアルケニル基は、置換または非置換であり得る。シクロアルケニル基およびヘテロシクロアルケニル基を、１つまたは複数の基（本明細書中に記載のアルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシド、またはチオールが含まれるが、これらに限定されない）と置換することができる。
【００９６】
用語「環状基（ｃｙｃｌｉｃ  ｇｒｏｕｐ）」を、アリール基、非アリール基（すなわち、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、およびヘテロシクロアルケニル基）、またはその両方のいずれかをいうために本明細書中で使用する。環状基は、置換または非置換であり得る１つまたは複数の環系を有する。環状基は、１つまたは複数のアリール基、１つまたは複数の非アリール基、または１つまたは複数のアリール基および１つまたは複数の非アリール基を含むことができる。
【００９７】
用語「アルデヒド」は、本明細書中で使用する場合、式−Ｃ（Ｏ）Ｈで示される。本明細書を通して、「Ｃ（Ｏ）」はＣ＝Ｏの略語である。
【００９８】
用語「アミン」または「アミノ」は、本明細書中で使用する場合、式ＮＡ１Ａ２Ａ３（式中、Ａ１、Ａ２、およびＡ３は、独立して、上記の水素、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基であり得る）によって示される。
【００９９】
用語「カルボン酸」は、本明細書中で使用する場合、式−Ｃ（Ｏ）ＯＨによって示される。「カルボキシラート」は、本明細書中で使用する場合、式−Ｃ（Ｏ）Ｏ−によって示される。
【０１００】
用語「エステル」は、本明細書中で使用する場合、式−ＯＣ（Ｏ）Ａ１または−Ｃ（Ｏ）ＯＡ１（式中、Ａ１は、上記のアルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基であり得る）によって示される。
【０１０１】
用語「エーテル」は、本明細書中で使用する場合、式Ａ１ＯＡ２（式中、Ａ１およびＡ２は、独立して、上記のアルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基であり得る）によって示される。
【０１０２】
用語「ケトン」は、本明細書中で使用する場合、式Ａ１Ｃ（Ｏ）Ａ２（式中、Ａ１およびＡ２は、独立して、上記のアルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基であり得る）によって示される。
【０１０３】
用語「ハライド」は、本明細書中で使用する場合、ハロゲンであるフッ素、塩素、臭素、およびヨウ素をいう。
【０１０４】
用語「ヒドロキシル」は、本明細書中で使用する場合、式−ＯＨによって示される。
【０１０５】
用語「スルホ−オキソ」は、本明細書中で使用する場合、式−Ｓ（Ｏ）Ａ１（すなわち、「スルホニル」）、Ａ１Ｓ（Ｏ）Ａ２（すなわち、「スルホキシド」）、−Ｓ（Ｏ）２Ａ１、Ａ１ＳＯ２Ａ２（すなわち、「スルホン」）、−ＯＳ（Ｏ）２Ａ１、または−ＯＳ（Ｏ）２ＯＡ１（式中、Ａ１およびＡ２は、上記の水素、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基であり得る）によって示される。本明細書を通して、「Ｓ（Ｏ）」は、Ｓ＝Ｏの略語である。
【０１０６】
用語「スルホニルアミノ」または「スルホンアミド」は、本明細書中で使用する場合、式−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ−によって示される。
【０１０７】
用語「チオール」は、本明細書中で使用する場合、式−ＳＨによって示される。
【０１０８】
本明細書中で使用する場合、「Ｒｎ」（式中、ｎはいくつかの整数である）は、上記列挙の１つまたは複数の基を独立して保有することができる。選択される基に応じて、第１の基を第２の基内に組み込むことができるか、あるいは、第１の基は、第２の基に対する懸垂基であり得る（すなわち、結合することができる）。例えば、句「アミノ基を含むアルキル基」を使用して、アミノ基を、アルキル基のバックボーン内に組み込むことができる。あるいは、アミノ基を、アルキル基のバックボーンに結合することができる。選択される基の性質は、第１の基が第２の基に埋め込まれるか第２の基に結合するかどうかによって決定される。
【０１０９】
逆に記載されない限り、実線のみでしめされ、ウェッジや破線で示されない化学結合を有する式は、可能な各異性体（例えば、各鏡像異性体およびジアステレオマーならびに異性体の混合物（ラセミ混合物またはスカレミック混合物（ｓｃａｌｅｍｉｃ  ｍｉｘｔｕｒｅ）など））を意図する。
【０１１０】
本明細書中に開示の一定の材料、化合物、組成物、および成分を、購入するか、当業者に一般的に公知の技術を使用して容易に合成することができる。例えば、開示の化合物および組成物の調製で使用される出発材料および試薬は、販売業者（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓ．）、Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ（Ｍｏｒｒｉｓ  Ｐｌａｉｎｓ，Ｎ．Ｊ．）、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，Ｐａ．）、またはＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）など）から入手可能であるか、リファレンス（Ｆｉｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｆｉｅｓｅｒ’ｓ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  １−１７（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９１）；Ｒｏｄｄ’ｓ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  １−５  ａｎｄ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌｓ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９８９）；Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  １−４０（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９１）；Ｍａｒｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）；およびＬａｒｏｃｋ’ｓ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ（ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ．，１９８９）など）に記載の手順に従った当業者に公知の方法によって調製する。
【０１１１】
開示のリボスイッチを活性化するための化合物には、サイクリックジＧＭＰ、ｐＧｐＧ、ＧｐＧ、またはＧｐＧｐＧ、サイクリックジＧＭＰ応答性リボスイッチを活性化することができるサイクリックジＧＭＰ、ｐＧｐＧ、ＧｐＧ、またはＧｐＧｐＧの誘導体、Ｓ−アデノシルホモシステイン、Ｓ−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチを活性化することができるＳ−アデノシルホモシステインの誘導体、ｐｒｅＱ１、ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチを活性化することができるｐｒｅＱ１の誘導体、Ｍｏｃｏ、Ｍｏｃｏ応答性リボスイッチを活性化することができるＭｏｃｏの誘導体、ＳＡＭ、およびＳＡＭ応答性リボスイッチを活性化することができるＳＡＭの誘導体が含まれる。ＳＡＭ−ＩＶリボスイッチを活性化するための化合物はまた、ＭｅＡｚａＡｄｏＭｅｔであり得る。
【０１１２】
Ｓ−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチの活性化のために、化合物はＳ−アデノシルホモシステインであり得る。化合物はまた、Ｓ−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチを活性化することができるＳ−アデノシルホモシステインの誘導体であり得る。例えば、化合物はＳ−アデノシル−Ｌ−システイン（ＳＡＣ）であり得る。図１２Ｂは、Ｓ−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチを活性化することができる化合物に重要な構造エレメントを示す。
【０１１３】
ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチ（およびｐｒｅＱ１応答性リボスイッチ由来のリボスイッチ）の活性化のために、化合物は、１位のＮをＣ、ＯまたはＳと置換することができ、２位のアミノ基を水素結合供与体と置換することができ、６位の酸素を水素結合受容体と置換することができ、７位のアミノ基を水素結合受容体と置換することができ、窒素を水素結合供与体と置換するかこれを使用して誘導することができる、ｐｒｅＱ１の誘導体であり得る。
【０１１４】
特定の部分または基を本明細書中で水素結合供与体または水素結合受容体ということができる一方で、参照を容易にするために種々の置換基を単に分類するためにこの専門用語が使用されると理解すべきである。かかる用語を、特定の部分がリボスイッチまたはいくつかの他の化合物との水素結合に実際に関与することを意味すると解釈すべきではない。例えば、本明細書中で水素結合受容体（または供与体）といわれる部分が、リボスイッチまたは他の化合物との疎水性相互作用、イオン性相互作用、ファンデルワールス相互作用、または他の型の相互作用に唯一または付加的に関与することができる可能性がある。
【０１１５】
本明細書中に開示の一定の基を本明細書中で水素結合受容体および水素結合供与体の両方をいうことができるとも理解される。例えば、−ＯＨは、水素原子の供与による水素結合供与体であり得る。−ＯＨは、酸素原子上の１つまたは複数の非結合電子対による水素結合受容体でもあり得る。したがって、本明細書を通して、種々の部分が水素結合供与体および受容体であり得、そのようなものとして言及することができる。
【０１１６】
上記定義内のあらゆる化合物は、本明細書中に具体的に開示されていることを意図するか、見なされるべきである。さらに、上記定義内で同定することができるあらゆる下位集団は、本明細書中に具体的に開示されていることを意図するか、見なされるべきである。結果として、任意の化合物または化合物の下位集団が特に使用のために含まれるか使用から排除されるか、化合物リスト中に含まれるか化合物リストから排除されることを特に意図する。例として、各化合物が上記定義の通りであり、且つサイクリックジＧＭＰ応答性リボスイッチを活性化することができる化合物群が意図される。
【０１１７】
リボスイッチと相互作用する化合物についての本明細書中に記載の特定の接触および相互作用（水素結合の供与または受容など）が好ましいが、化合物のリボスイッチとの相互作用に不可欠ではないと理解すべきである。例えば、化合物は、開示の接触および相互作用を有する化合物よりも低い親和性および／または特異性でリボスイッチと相互作用することができる。さらに、化合物上の異なるまたはさらなる官能基は、新規、異なる、および／または相殺するリボスイッチとの接触を導入することができる。かかる官能基は、他のリボスイッチ部分を有することができるか、これを有し、接触し、相互作用するようにデザインすることができる。かかる接触および相互作用は、トリガー分子およびコア構造の接触および相互作用を相殺することができる。
【０１１８】
Ｄ．構築物、ベクター、および発現系
開示のリボスイッチを、任意の適切な発現系と共に使用することができる。組換え発現を、通常、プラスミドなどのベクターを使用して行う。ベクターは、リボスイッチコード配列および発現するＲＮＡ（例えば、タンパク質をコードするＲＮＡ）に作動可能に連結されたプロモーターを含むことができる。ベクターはまた、転写および翻訳に必要な他のエレメントを含むことができる。本明細書中で使用する場合、ベクターは、外因性ＤＮＡを含む任意のキャリアをいう。したがって、ベクターは、分解することなく細胞に外因性核酸を輸送する作用物質（ａｇｅｎｔ）であり、送達された細胞中で核酸を発現させるプロモーターを含む。ベクターには、プラスミド、ウイルス核酸、ウイルス、ファージ核酸、ファージ、コスミド、および人工染色体が含まれるが、これらに限定されない。リボスイッチ調節構築物の輸送に適切な種々の原核生物および真核生物発現ベクターを産生することができる。かかる発現ベクターには、例えば、ｐＥＴ、ｐＥＴ３ｄ、ｐＣＲ２．１、ｐＢＡＤ、ｐＵＣ、および酵母ベクターが含まれる。ベクターを、例えば、種々のｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ状況で使用することができる。
【０１１９】
ウイルスベクターには、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、ＡＩＤＳウイルス、神経向性ウイルス（ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｔｒｏｐｈｉｃ  ｖｉｒｕｓ）、シンドビスウイルスおよび他のＲＮＡウイルス（ＨＩＶバックボーンを有するこれらのウイルスが含まれる）が含まれる。ベクターとしての使用が適切となるこれらのウイルスの性質を共有する任意のウイルスファミリーも有用である。Ｖｅｒｍａ（１９８５）に記載のレトロウイルスベクターには、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｕｒｉｎｅ  Ｍａｌｏｎｅｙ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ）（ＭＭＬＶ）、およびベクターとしてＭＭＬＶの所望の性質を発現するレトロウイルスが含まれる。典型的には、ウイルスベクターは、非構造初期遺伝子、構造後期遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写物、複製およびキャプシド形成に必要な逆末端反復、およびウイルスゲノムの転写および複製を調節するためのプロモーターを含む。ベクターとして操作する場合、ウイルスは、典型的には、１つまたは複数の初期遺伝子を除去し、除去したウイルスＤＮＡの代わりに遺伝子または遺伝子／プロモーターカセットをウイルスゲノム中に挿入する。
【０１２０】
「プロモーター」は、一般に、転写開始部位に対して比較的固定した位置に存在する場合に機能するＤＮＡ配列である。「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子の基本的相互作用に必要なコアエレメントを含み、上流エレメントおよび応答エレメントを含むことができる。
【０１２１】
「エンハンサー」は、一般に、転写開始部位から固定していない距離で機能し、転写単位に対して５’側（Ｌａｉｍｉｎｓ，１９８１）または３’側（Ｌｕｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３）であり得るＤＮＡ配列をいう。さらに、エンハンサーは、イントロン内に存在することができ（Ｂａｎｅｒｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３）、コード配列自体の内部にも存在することができる（Ｏｓｂｏｒｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４）。これらは、通常、１０ｂｐ長と３００ｂｐ長との間であり、シスで機能する。エンハンサーは、近接するプロモーターからの転写を増加させるように機能する。エンハンサーはまた、プロモーターと同様に、転写調節を媒介する応答エレメントをしばしば含む。エンハンサーは、しばしば、発現調節を決定する。
【０１２２】
真核生物宿主細胞（酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞、ヒト細胞、または有核細胞）で使用される発現ベクターはまた、ｍＲＮＡ発現に影響を及ぼし得る転写終結に必要な配列を含むことができる。これらの領域は、組織因子タンパク質をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分中でポリアデニル化セグメントとして転写される。３’非翻訳領域は、転写終結部位も含む。転写単位がポリアデニル化領域も含むことが好ましい。この領域の利点の１つは、転写単位がｍＲＮＡのようにプロセシングおよび輸送される可能性が増加することである。発現構築物中でのポリアデニル化シグナルの同定および使用は十分に確立されている。相同ポリアデニル化シグナルを導入遺伝子構築物中で使用することが好ましい。
【０１２３】
ベクターは、マーカー産物をコードする核酸配列を含む。このマーカー産物を使用して、遺伝子が細胞に送達されたかどうか、および一旦送達されると発現するかどうかを決定する。好ましいマーカー遺伝子は、β−ガラクトシダーゼおよび緑色蛍光タンパク質をコードするＥ．Ｃｏｌｉ  ｌａｃＺ遺伝子である。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、マーカーは選択可能なマーカーであり得る。かかる選択可能なマーカーが宿主細胞に首尾よく導入された場合、形質転換された宿主細胞は選択圧下においた場合に生存することができる。２つの広く使用されている異なるカテゴリーの選択レジメが存在する。第１のカテゴリーは、細胞の代謝および補充培地と無関係に増殖する能力を欠く変異細胞の使用に基づく。第２のカテゴリーは、任意の細胞型で使用される選択スキームをいい、変異細胞系統の使用を必要としない優性選択である。これらのスキームは、典型的には、宿主細胞の増殖を停止させるための薬物を使用する。新規の遺伝子を有するそれらの細胞は、薬物耐性を伝達するタンパク質を発現し、選択を生き抜く。かかる優性選択の例は、薬物であるネオマイシン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇ，１９８２）、ミコフェノール酸（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇ，１９８０）、またはハイグロマイシン（Ｓｕｇｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５）を使用する。
【０１２５】
遺伝子材料（プラスミド、ウイルスベクター、ウイルス核酸、ファージ核酸、ファージ、コスミド、および人工染色体であるが、これらに限定されない）の直接移入の使用またはカチオニックリポソームなどの細胞またはキャリア中の遺伝子材料の移入を介して、遺伝子を移入することができる。かかる方法は当該分野で周知であり、本明細書中に記載の方法での使用に容易に適応することができる。移入ベクターは、細胞に遺伝子を送達させるために使用される任意のヌクレオチド構築物（例えば、プラスミド）または一般的な遺伝子送達ストラテジーの一部（例えば、組換えレトロウイルスまたはアデノウイルスの一部）（Ｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：８３−８８，（１９９３））であり得る。適切なトランスフェクション手段（ウイルスベクター、化学的トランスフェクタント、または物理的機械的方法（エレクトロポレーションおよびＤＮＡの直接拡散など）が含まれる）は、例えば、Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１４６５−１４６８，（１９９０）；ａｎｄ  Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．Ｎａｔｕｒｅ，３５２，８１５−８１８，（１９９１）に記載されている。
【０１２６】
１．ウイルスベクター
好ましいウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、ＡＩＤＳウイルス、神経向性ウイルス、シンドビスウイルスおよび他のＲＮＡウイルス（ＨＩＶバックボーンを有するこれらのウイルスが含まれる）である。ベクターとしての使用が適切となるこれらのウイルスの性質を共有する任意のウイルスファミリーも好ましい。好ましいレトロウイルスには、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、およびベクターとしてＭＭＬＶの所望の性質を発現するレトロウイルスが含まれる。レトロウイルスベクターは、他のウイルスベクターより高い遺伝子負荷量（すなわち、導入遺伝子またはマーカー遺伝子）を輸送することができ、この理由のために、一般的に使用されるベクターである。しかし、これらは、非増殖細胞で有用ではない。アデノウイルスベクターは、比較的安定であり、作業が容易であり、高力価を有し、エアゾール処方物中で送達させることができ、非分裂細胞にトランスフェクトすることができる。ポックスウイルスベクターは、巨大であり、いくつかの遺伝子挿入部位を有し、熱安定性を示し、室温で保存することができる。好ましい実施形態は、ウイルス抗原によって誘発される宿主生物の免疫応答を抑制するように操作されたウイルスベクターである。この型の好ましいベクターは、インターロイキン８または１０のコード領域を保有する。
【０１２７】
ウイルスベクターは、細胞に遺伝子を導入するためのほとんどの化学的方法または物理的方法よりも高い処理能力（遺伝子導入能力）を有する。典型的には、ウイルスベクターは、非構造初期遺伝子、構造後期遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写物、複製およびキャプシド形成に必要な逆末端反復、およびウイルスゲノムの転写および複製を調節するためのプロモーターを含む。ベクターとして操作する場合、ウイルスは、典型的には、１つまたは複数の初期遺伝子を除去し、除去したウイルスＤＮＡの代わりに遺伝子または遺伝子／プロモーターカセットをウイルスゲノム中に挿入する。この構築物型は、約８ｋｂまでの外来遺伝子材料を保有することができる。除去された初期遺伝子の必要な機能を、典型的には、トランスで初期遺伝子の遺伝子産物を発現するように操作された細胞系統によって供給される。
【０１２８】
ｉ．レトロウイルスベクター
レトロウイルスは、レトロウイルス科のウイルスファミリー（任意の型、亜科、属、向性が含まれる）に属する動物ウイルスである。レトロウイルスベクターは、一般に、Ｖｅｒｍａ，Ｉ．Ｍ．，Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ−１９８５，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｐ．２２９−２３２，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，（１９８５）（本明細書中で参考として援用される）に記載されている。遺伝子治療のためのレトロウイルスベクターの使用方法の例は、米国特許第４，８６８，１１６号および同第４，９８０，２８６号；ＰＣＴ出願国際公開第９０／０２８０６号および国際公開第８９／０７１３６号；およびＭｕｌｌｉｇａｎ，（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２（１９９３））（その教示が本明細書中で参考として援用される）に記載されている。
【０１２９】
レトロウイルスは、本質的に、核酸カーゴ（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｃａｒｇｏ）に詰められたパッケージである。核酸カーゴは、パッケージングシグナルを保有し、これらのパッケージングシグナルは、複製された娘分子がパッケージコート内に効率的に詰められることを確実にする。パッケージシグナルに加えて、複製および複製されたウイルスのパッケージングのためにシスで必要な多数の分子が存在する。典型的には、レトロウイルスゲノムは、タンパク質コートの作製に関与するｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子を含む。これは、典型的には標的細胞に移入される外来ＤＮＡと置換されるｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子である。レトロウイルスベクターは、典型的には、パッケージコートへの組み込みのためのパッケージングシグナル、ｇａｇ転写単位の開始をシグナル伝達する配列、逆転写に必要なエレメント（逆転写のｔＲＮＡプライマーに結合するプライマー結合部位が含まれる）、ＤＮＡ合成中にＲＮＡ鎖のスイッチを導く末端反復配列、第２のＤＮＡ合成鎖の合成のためのプライミング部位としての機能を果たすプリンリッチ配列である５’→３’ＬＴＲ、および宿主ゲノムに挿入するためのレトロウイルスのＤＮＡ状態を挿入することができるＬＴＲの末端付近の特異的配列を含む。ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子の除去により、約８ｋｂの外来配列がウイルスゲノムに挿入され、逆転写するようになり、複製の際に新規のレトロウイルス粒子に詰められる。この核酸量は、各転写物のサイズに応じて、１つから多数の遺伝子の送達に十分である。挿入物中に他の遺伝子と共に正または負の選択マーカーのいずれかを含めることが好ましい。
【０１３０】
ほとんどのレトロウイルスベクター中の複製機構およびパッケージングタンパク質が除去されているので（ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ）、典型的には、パッケージング細胞系統へのこれらの配置によってベクターを生成する。パッケージング細胞系統は、複製およびパッケージング機構を含むが、いかなるパッケージングシグナルも欠くレトロウイルスを使用してトランスフェクションまたは形質転換した細胞系統である。選択のＤＮＡを保有するベクターをこれらの細胞系統にトランスフェクションする場合、目的の遺伝子を含むベクターを複製し、ヘルパー細胞によってシスで提供される機構によって新規のレトロウイルス粒子にパッケージングする。必要なシグナルを欠くので、この機構のゲノムはパッケージされない。
【０１３１】
ｉｉ．アデノウイルスベクター
複製欠損アデノウイルスの構築は記載されている（Ｂｅｒｋｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６１：１２１３−１２２０（１９８７）；Ｍａｓｓｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８７２−２８８３（１９８６）；Ｈａｊ−Ａｈｍａｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５７：２６７−２７４（１９８６）；Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６１：１２２６−１２３９（１９８７）；Ｚｈａｎｇ  ”Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｂｙ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＰＣＲ  ａｎａｌｙｓｉｓ”  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １５：８６８−８７２（１９９３））。ベクターとしてのこれらのウイルスの使用の利点は、これらのウイルスが最初の感染細胞内で複製することができるが新規の感染ウイルス粒子を形成できないので、他の細胞型に拡大することができる範囲が制限されていることである。組換えアデノウイルスは、気道上皮、肝細胞、血管内皮、ＣＮＳ実質、および多数の他の組織部位への直接的なｉｎ  ｖｉｖｏ送達後に高効率の遺伝子移入を達成することが示されている（Ｍｏｒｓｙ，  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：１５８０−１５８６（１９９３）；Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍ，  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：３８１−３８７（１９９３）；Ｒｏｅｓｓｌｅｒ，  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：１０８５−１０９２（１９９３）；Ｍｏｕｌｌｉｅｒ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４：１５４−１５９（１９９３）；Ｌａ  Ｓａｌｌｅ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：９８８−９９０（１９９３）；Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘ，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２５１２９−２５１３４（１９９２）；Ｒｉｃｈ，  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：４６１−４７６（１９９３）；Ｚａｂｎｅｒ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６：７５−８３（１９９４）；Ｇｕｚｍａｎ，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７３：１２０１−１２０７（１９９３）；Ｂｏｕｔ，  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：３−１０（１９９４）；Ｚａｂｎｅｒ，  Ｃｅｌｌ  ７５：２０７−２１６（１９９３）；Ｃａｉｌｌａｕｄ，  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ５：１２８７−１２９１（１９９３）；ａｎｄ  Ｒａｇｏｔ，  Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７４：５０１−５０７（１９９３））。組換えアデノウイルスは、特異的細胞表面受容体への結合によって遺伝子形質導入を達成し、その後、野生型または複製欠損アデノウイルスと同一の様式で、受容体媒介エンドサイトーシスによってウイルスを内在化する  （Ｃｈａｒｄｏｎｎｅｔ  ａｎｄ  Ｄａｌｅｓ，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４０：４６２−４７７（１９７０）；Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｂｕｒｌｉｎｇｈａｍ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １２：３８６−３９６（１９７３）；Ｓｖｅｎｓｓｏｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｓｓｏｎ，  Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５５：４４２−４４９（１９８５）；Ｓｅｔｈ，ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．  ５１：６５０−６５５（１９８４）；Ｓｅｔｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌ��．Ｂｉｏｌ．  ４：１５２８−１５３３（１９８４）；Ｖａｒｇａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６５：６０６１−６０７０（１９９１）；Ｗｉｃｋｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ７３：３０９−３１９（１９９３））。
【０１３２】
好ましいウイルスベクターは、Ｅ１遺伝子が除去されたアデノウイルスに基づいたウイルスベクターであり、これらのヴィロン（ｖｉｒｏｎ）をヒト２９３細胞系統などの細胞系統中で生成する。別の好ましい実施形態では、Ｅ１およびＥ３遺伝子の両方をアデノウイルスゲノムから除去する。
【０１３３】
別のウイルスベクター型は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づく。この欠損パルボウイルスは、多数の細胞型に感染することができ、ヒトに非病原性を示すので、好ましいベクターである。ＡＡＶ型ベクターは、約４〜５ｋｂを輸送することができ、野生型ＡＡＶは、第１９染色体に安定に挿入されることが公知である。この部位特異的組み込み特性を含むベクターが好ましい。このベクター型の特に好ましい実施形態は、Ａｖｉｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ製のＰ４．１  Ｃベクターである。これは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、ＨＳＶ−ｔｋ、および／またはマーカー遺伝子（緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子など）を含むことができる。
【０１３４】
ウイルスおよびレトロウイルス中の挿入遺伝子は、通常、所望の遺伝子産物の発現の調節を補助するためのプロモーターおよび／またはエンハンサーを含む。プロモーターは、一般に、転写開始部位に関して比較的固定した位置に存在する場合に機能する配列またはＤＮＡ配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子の基本的相互作用に必要なコアエレメントを含み、上流エレメントおよび応答エレメントを含むことができる。
【０１３５】
２．ウイルスプロモーターおよびエンハンサー
哺乳動物宿主細胞中のベクターからの転写を調節する好ましいプロモーターを、種々の供給源（例えば、ポリオーマ、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、および最も好ましくはサイトメガロウイルスなどのウイルスゲノム）、または非相同哺乳動物プロモーター（例えば、βアクチンプロモーター）から得ることができる。ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターを、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含むＳＶ４０制限フラグメントとして得ることが都合が良い（Ｆｉｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２７３：  １１３（１９７８））。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターを、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限フラグメントとして得ることが都合が良い（Ｇｒｅｅｎｗａｙ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １８：  ３５５−３６０（１９８２））。勿論、宿主細胞または関連種由来のプロモーターも本明細書中で有用である。
【０１３６】
エンハンサーは、一般に、転写開始部位から固定していない距離で機能し、転写単位に対して５’側（Ｌａｉｍｉｎｓ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：  ９９３（１９８１））または３’側（Ｌｕｓｋｙ，Ｍ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．３：  １１０８（１９８３））のいずれかであり得るＤＮＡ配列をいう。さらに、エンハンサーは、イントロン内に存在することができ（Ｂａｎｅｒｊｉ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ３３：  ７２９（１９８３））、ならびにコード配列自体の内部にも存在することができる（Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｔ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．４：  １２９３（１９８４））。これらは、通常、１０ｂｐ長と３００ｂｐ長との間であり、シスで機能する。エンハンサーは、近接するプロモーターからの転写を増加させるように機能する。エンハンサーはまた、転写調節を媒介する応答エレメントをしばしば含む。プロモーターはまた、転写調節を媒介する応答エレメントを含む。エンハンサーは、しばしば、遺伝子の発現調節を決定する。哺乳動物遺伝子由来の多数のエンハンサー配列が現在知られているが（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、およびインスリン）、典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用する。好ましい例は、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーである。
【０１３７】
プロモーターおよび／またはエンハンサーを、その機能を誘発する軽度または特異的な化学事象のいずれかによって特異的に活性化することができる。系を、テトラサイクリンおよびデキサメタゾンなどの試薬によって調節することができる。ガンマ線照射などの照射への曝露またはアルキル化化学療法薬によってウイルスベクター遺伝子発現を増強する方法も存在する。
【０１３８】
プロモーターおよび／またはエンハンサー領域が全ての真核細胞型で活性であることが好ましい。この型の好ましいプロモーターは、ＣＭＶプロモーター（６５０塩基）である。他の好ましいプロモーターは、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（全長プロモーター）、およびレトロウイルスベクターＬＴＦである。
【０１３９】
全ての特異的調節エレメントをクローン化し、これを使用して、黒色腫細胞などの特定の細胞型で選択的に発現する発現ベクターを構築することができることが示されている。グリア線維酸性タンパク質（ｇｌｉａｌ  ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ａｃｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＧＦＡＰ）プロモーターを使用して、神経膠起源の細胞中の遺伝子が選択的に発現されている。
【０１４０】
真核生物宿主細胞（酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞、ヒト細胞、または有核細胞）で使用される発現ベクターはまた、ｍＲＮＡ発現に影響を及ぼし得る転写終結に必要な配列を含むことができる。これらの領域は、組織因子タンパク質をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分中でポリアデニル化セグメントとして転写される。３’非翻訳領域は、転写終結部位も含む。転写単位がポリアデニル化領域も含むことが好ましい。この領域の利点の１つは、転写単位がｍＲＮＡのようにプロセシングおよび輸送される可能性が増加することである。発現構築物中でのポリアデニル化シグナルの同定および使用は十分に確立されている。相同ポリアデニル化シグナルを導入遺伝子構築物中で使用することが好ましい。転写単位の好ましい実施形態では、ポリアデニル化領域は、ＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナルに由来し、約４００塩基からなる。転写された単位は、他の標準的な配列のみを含むか、上記配列と組み合わせて構築物からの発現または構築物の安定性を改善することも好ましい。
【０１４１】
３．マーカー
ベクターは、マーカー産物をコードする核酸配列を含み得る。このマーカー産物を使用して、遺伝子が細胞に送達され、一旦送達されると発現するかどうかを決定する。好ましいマーカー遺伝子は、β−ガラクトシダーゼおよび緑色蛍光タンパク質をコードするＥ．Ｃｏｌｉ  ｌａｃＺ遺伝子である。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、マーカーは選択可能なマーカーであり得る。哺乳動物細胞に適切な選択可能なマーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシンアナログＧ４１８、ヒドロマイシン（ｈｙｄｒｏｍｙｃｉｎ）、およびピューロマイシンである。かかる選択可能なマーカーが哺乳動物宿主細胞に首尾よく移入された場合、形質転換された哺乳動物宿主細胞は選択圧下においた場合に生存することができる。２つの広く使用されている異なるカテゴリーの選択レジメが存在する。第１のカテゴリーは、細胞の代謝および補充培地と無関係に増殖する能力を欠く変異細胞系統の使用に基づく。２つの例は以下である：ＣＨＯ  ＤＨＦＲ−細胞およびマウスＬＴＫ−細胞である。これらの細胞は、チミジンまたはヒポキサンチンなどの栄養素を添加せずに増殖する能力を欠く。これらの細胞が完全なヌクレオチド合成経路に必要な一定の遺伝子を欠くので、これらの細胞は、補充培地中に欠けているヌクレオチドを供給しない限り生存できない。培地の補充の代替は、インタクトなＤＨＦＲ遺伝子またはＴＫ遺伝子を各遺伝子を欠く細胞に導入し、それによってその増殖要件を変化させることである。ＤＨＦＲ遺伝子またはＴＫ遺伝子で形質転換しなかった各細胞は、非補充培地で生存できない。
【０１４３】
第２のカテゴリーは、任意の細胞型で使用される選択スキームをいい、変異細胞系統の使用を必要としない優性選択である。これらのスキームは、典型的には、宿主細胞の増殖を停止させるための薬物を使用する。薬物耐性を伝達するタンパク質を発現する細胞は、選択を生き抜く。かかる優性選択の例は、薬物であるネオマイシン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｐ．ａｎｄ  Ｂｅｒｇ，Ｐ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：  ３２７（１９８２））、ミコフェノール酸（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．ａｎｄ  Ｂｅｒｇ，Ｐ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０９：  １４２２（１９８０））、またはハイグロマイシン（Ｓｕｇｄｅｎ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：  ４１０−４１３（１９８５））を使用する。３つの例は、真核生物調節下で細菌遺伝子を使用して、適切な薬物Ｇ４１８もしくはネオマイシン（ジェネテシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）、またはハイグロマイシンに対する耐性を伝達する。他には、ネオマイシンアナログＧ４１８およびピューラマイシン（ｐｕｒａｍｙｃｉｎ）が含まれる。
【０１４４】
Ｅ．バイオセンサーリボスイッチ
バイオセンサーリボスイッチも開示する。バイオセンサーリボスイッチは、その同系トリガー分子の存在下で検出可能なシグナルを生成する操作されたリボスイッチである。有用なバイオセンサーリボスイッチを、トリガー分子の閾値レベル以上で誘発することができる。バイオセンサーリボスイッチを、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用するためにデザインすることができる。例えば、シグナルとしての機能を果たすかその生成に関与するタンパク質をコードするレポーターＲＮＡに作動可能に連結されたサイクリックジＧＭＰバイオセンサーリボスイッチを、サイクリックジＧＭＰリボスイッチ／レポーターＲＮＡをコードする核酸構築物を保有するように細胞または生物を操作することによってｉｎ  ｖｉｖｏで使用することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用するためのバイオセンサーリボスイッチの例は、高次構造依存性標識を含むリボスイッチであり、この標識由来のシグナルは、リボスイッチの活性化状態に応じて変化する。かかるバイオセンサーリボスイッチは、好ましくは、天然に存在するリボスイッチに由来するかこれから誘導されるアプタマードメイン（サイクリックジＧＭＰなど）を使用する。
【０１４５】
Ｆ．レポータータンパク質およびペプチド
リボスイッチの活性化の評価またはバイオセンサーリボスイッチの評価のために、レポータータンパク質またはペプチドを使用することができる。レポータータンパク質またはペプチドをＲＮＡによってコードすることができ、その発現はリボスイッチによって調節される。実施例は、いくつかの特異的レポータータンパク質の使用を記載している。レポータータンパク質およびペプチドの使用は周知であり、リボスイッチとの使用のために容易に適応することができる。レポータータンパク質は、検出することができるか検出可能なシグナルを産生する任意のタンパク質またはペプチドであり得る。好ましくは、タンパク質またはペプチドの存在を、標準的な技術（例えば、放射免疫アッセイ、放射性標識、免疫アッセイ、酵素活性のためのアッセイ、吸光度、蛍光、発光、およびウェスタンブロット）を使用して検出することができる。より好ましくは、レポータータンパク質レベルを、低レベルでさえも、標準的な技術を使用して容易に定量可能である。有用なレポータータンパク質には、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、およびそれらの誘導体（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ由来のホタルルシフェラーゼ（ＦＬ）およびＲｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のウミシイタケルシフェラーゼ（ＲＬ）など）が含まれる。
【０１４６】
Ｇ．高次構造依存性標識
高次構造依存性標識は、標識が会合した分子または化合物（リボスイッチなど）の形態または高次構造の変化に基づいて蛍光強度または波長が変化する全ての標識をいう。プローブおよびプライマーとの関係において使用される高次構造依存性標識の例には、分子ビーコン、アンプリフォー（Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒ）、ＦＲＥＴプローブ、切断性ＦＲＥＴプローブ、ＴａｑＭａｎプローブ、スコーピオンプライマー、蛍光三重鎖オリゴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｔｒｉｐｌｅｘ  ｏｌｉｇｏ）（三重鎖分子ビーコンまたは三重鎖ＦＲＥＴプローブが含まれるが、これらに限定されない）、蛍光水溶性複合ポリマー、ＰＮＡプローブ、およびＱＰＮＡプローブが含まれる。かかる標識を、特に、その機能の原理を、リボスイッチと共に使用するために適応させることができる。いくつかの高次構造依存性標識型は、Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｎｇｓｍｏｒｅ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：２１−２７（２００１）中に概説されている。
【０１４７】
ステム消光標識（ｓｔｅｍ  ｑｕｅｎｃｈｅｄ  ｌａｂｅｌ）（高次構造依存性標識の一形態）は、ステム構造を形成する場合に標識からの蛍光が消光されるように消光部分が近接するような核酸上に配置された蛍光標識である。ステムが破壊される場合（標識を含むリボスイッチが活性化する場合など）、消光部分はもはや蛍光標識に近接せず、蛍光が増加する。この効果の例を、分子ビーコン、蛍光三重鎖オリゴ、三重鎖分子ビーコン、三重鎖ＦＲＥＴプローブ、およびＱＰＮＡプローブで見出すことができ、その操作原理をリボスイッチと共に使用するために適応させることができる。
【０１４８】
ステム活性化標識（高次構造依存性標識の一形態）は、ステム構造の形成によって蛍光が増加するか変化する標識または標識対である。ステム活性化標識には、受容体および供与体が近接する場合（標識を含む核酸鎖がステム構造を形成する場合）に供与体から受容体への蛍光共鳴エネルギー転移によって受容体が蛍光を発するような受容体蛍光標識および供与体部分が含まれ得る。ステム活性化標識は、典型的には、核酸分子中でステム構造を形成する場合に受容体および供与体が近接するような核酸分子（リボスイッチなど）上に配置された標識対である。ステム活性化標識の供与体部分自体が蛍光標識である場合、この標識は、受容体に近接しない場合（すなわち、ステム構造を形成しない場合）に蛍光（典型的には、受容体の蛍光よりも異なる波長で）としてエネルギーを放出することができる。ステム構造を形成する場合、全体的な効果としては、供与体蛍光が減少し、受容体蛍光が増加する。ＦＲＥＴプローブはステム活性化標識の使用例であり、その操作上の原理をリボスイッチと共に使用するために適応することができる。
【０１４９】
Ｈ．検出標識
リボスイッチの活性化、非活性化、もしくは遮断、またはリボスイッチの活性化、非活性化、もしくは遮断の際に産生された核酸またはタンパク質の発現の検出および定量を補助するために、検出標識を、検出プローブまたは検出分子に組み込むか、発現した核酸またはタンパク質に直接組み込むことができる。本明細書中で使用する場合、検出標識は、核酸またはタンパク質と直接または間接的に会合することができ、それにより、測定可能な検出シグナルが直接的または間接的のいずれかで得られる任意の分子である。多数のかかる標識は、当業者に公知である。開示の方法での使用に適切な検出標識の例は、放射性同位体、蛍光分子、リン光分子、酵素、抗体、およびリガンドである。
【０１５０】
適切な蛍光標識の例には、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、５，６−カルボキシメチルフルオレセイン、テキサスレッド、ニトロベンズ２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル（ＮＢＤ）、クマリン、塩化ダンシル、ローダミン、アミノ−メチルクマリン（ＡＭＣＡ）、エオシン、エリスロシン、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）、カスケードブルー（登録商標）、オレゴングリーン（登録商標）、ピレン、リサミン、キサンテン、アクリジン、オキサジン、フィコエリトリン、クォンタムダイＴＭ（ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｙｅＴＭ）などのランタニドイオンの大環状キレート、チアゾールオレンジ−エチジウムヘテロ二量体などの蛍光エネルギー転移染料、ならびにシアニン染料Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７が含まれる。他の特定の蛍光標識の例には、３−ヒドロキシピレン５，８，１０−トリスルホン酸、５−ヒドロキシトリプタミン（５−ＨＴ）、酸性フクシン、アリザリンコンプレクソン、アリザリンレッド、アロフィコシアニン、アミノクマリン、ステアリン酸アントロイル（ａｎｔｈｒｏｙｌ  ｓｔｅａｒａｔｅ）、アストラゾンブリリアントレッド４Ｇ、アストラゾンオレンジＲ、アストラゾンレッド６Ｂ、アストラゾンイエロー７ＧＬＬ、アタブリン、オーラミン、オーロホスフィン、オーロホスフィンＧ、ＢＡＯ９（ビスアミノフェニルオキサジアゾール）、ＢＣＥＣＦ、硫酸ベルベリン、ビスベンズアミド、ブランコホルＦＦＧ溶液、ブランコホルＳＶ、ボディピー  Ｆ１（Ｂｏｄｉｐｙ  Ｆ１）、ブリリアントスルホフラビンＦＦ、カルカインブルー（ｃａｌｃｉｅｎ  ｂｌｕｅ）、カルシウムグリーン、カルコフロールＲＷ溶液、カルコフロールホワイト、カルコホールホワイトＡＢＴ溶液、カルコホールスタンダード溶液、カルボスチリル、カスケードイエロー、カテコールアミン、キナクリン（ｃｈｉｎａｃｒｉｎｅ）、コリホスフィンＯ、クマリン−ファロイジン、ＣＹ３．１  ８、ＣＹ５．１  ８、ＣＹ７、ダンス（１−ジメチルアミノナファリン５スルホン酸）、ダンサ（ジアミノナフチルスルホン酸）、ダンシルＮＨ−ＣＨ３、ジアミノフェニルオキシジアゾール（ＤＡＯ）、ジメチルアミノ−５−スルホン酸、ジピロメテンホウ素二フッ化物（ｄｉｐｙｒｒｏｍｅｔｈｅｎｅｂｏｒｏｎ  ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ）、ジフェニルブリリアントフラビン７ＧＦＦ、ドーパミン、エリスロシンＩＴＣ、オイクリシン、ＦＩＦ（ホルムアルデヒド誘導蛍光）、フラゾオレンジ、フルオ３、フルオレスカミン、フラ−２、ゲナクリルブリリアントレッドＢ、ゲナクリルブリリアントイエロー１０ＧＦ、ゲナクリルピンク３Ｇ、ゲナクリルイエロー５ＧＦ、ｇｌｏｘａｌｉｃ  ａｃｉｄ、グラニュラーブルー、ヘマトポルフィリン、インド−１、イントラホワイトＣｆ液、リューコフォーＰＡＦ（Ｌｅｕｃｏｐｈｏｒ  ＰＡＦ）、リューコフォーＳＦ、リューコフォーＷＳ、リサミンローダミンＢ２００（ＲＤ２００）、ルシフェルイエローＣＨ、ルシフェルイエローＶＳ、マグダラレッド、マリーナブルー、マキシロンブリリアントフラビン１０ＧＦＦ、マキシロンブリリアントフラビン８ＧＦＦ、ＭＰＳ（メチルグリーンピロニンスチルベン）、ミトラマイシン、ＮＢＤ���ミン、ニトロベンゾキサジドール、ノルアドレナリン、ヌクレアーファストレッド、ヌクレアーイエロー、ナイロサンブリリアントフラビンＥ８Ｇ、オキサジアゾール、パシフィックブルー、パラローザニリン（ホイルゲン）、ホルウィットＡＲ溶液、ホルウィットＢＫＬ、ホルウィットＲｅｖ、ホルウィットＲＰＡ、ホスフィン３Ｒ、フタロシアニン、フィコエリトリンＲ、ポリアザインダセンポントクロームブルーブラック、ポルフィリン、プリムリン、プロシオンイエロー、ピロニン、ピロニンＢ、ピロザールブリリアントフラビン７ＧＦ、キナクリンマスタード、ローダミン１２３、ローダミン５ＧＬＤ、ローダミン６Ｇ、ローダミンＢ、ローダミンＢ２００、ローダミンＢエキストラ、ローダミンＢＢ、ローダミンＢＧ、ローダミンＷＴ、セロトニン、セブロンブリリアントレッド２Ｂ、セブロンブリリアントレッド４Ｇ、セブロンブリリアントレッドＢ、セブロンオレンジ、セブロンイエローＬ、ＳＩＴＳ（プリムリン）、ＳＩＴＳ（スチルベンイソチオスルホン酸）、スチルベン、スナーフ１、スルホローダミンＢ  Ｃａｎ  Ｃ、スルホローダミンＧエキストラ、テトラサイクリン、チアジンレッドＲ、チオフラビンＳ、チオフラビンＴＣＮ、チオフラビン５、チオライト、チオゾールオレンジ、チノポールＣＢＳ、トゥルーブルー、ウルトラライト、ウラニンＢ、ユビテックスＳＦＣ、キシレンオレンジ、およびＸＲＩＴＣが含まれる。
【０１５１】
有用な蛍光標識は、フルオレセイン（５−カルボキシフルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、ローダミン（５，６−テトラメチルローダミン）、ならびにシアニン染料Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７である。これらの蛍光体の吸収および発光の極大は、ＦＩＴＣ（４９０ｎｍ；５２０ｎｍ）、Ｃｙ３（５５４ｎｍ；５６８ｎｍ）、Ｃｙ３．５（５８１ｎｍ；５８８ｎｍ）、Ｃｙ５（６５２ｎｍ：６７２ｎｍ）、Ｃｙ５．５（６８２ｎｍ；７０３ｎｍ）およびＣｙ７（７５５ｎｍ；７７８ｎｍ）であり、したがって、同時検出が可能である。フルオレセイン染料の他の例には、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、２’，４’，１，４，−テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、２’，４’，５’，７’，１，４−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシローダミン（ＪＯＥ）、２’−クロロ−５’−フルオロ−７’，８’−融合フェニル−１，４−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＮＥＤ）および２’−クロロ−７’−フェニル−１，４−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＶＩＣ）が含まれる。蛍光標識は、種々の商業供給者（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ；およびＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏが含まれる）から得ることができる。
【０１５２】
目的とするさらなる標識には、それらが関連するプローブが標的分子に特異的に結合する場合にのみシグナルを提供するものが含まれ、かかる標識には、Ｔｙａｇｉ  ＆  Ｋｒａｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９６）１４：３０３および欧州特許第００７０６８５  Ｂ１号に記載の「分子ビーコン」が含まれる。目的とする他の標識には、米国特許第５，５６３，０３７号、国際公開第９７／１７４７１号、および国際公開第９７／１７０７６号に記載されているものが含まれる。
【０１５３】
標識ヌクレオチドは、合成の間に発現核酸へ直接組み込むための検出標識の有用な形態である。核酸に組み込むことができる検出標識の例には、ＢｒｄＵｒｄ（５−ブロモデオキシウリジン、Ｈｏｙ  ａｎｄ  Ｓｃｈｉｍｋｅ，Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２９０：２１７−２３０（１９９３））、アミノアリルデオキシウリジン（Ｈｅｎｅｇａｒｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：３４５−３４８（２０００））、５−メチルシトシン（Ｓａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ９５１：１５７−１６５（１９８８））、ブロモウリジン（Ｗａｎｓｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １２２：２８３−２９３（１９９３））などのヌクレオチドアナログ、およびビオチン（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：６６３３（１９８１））またはジゴキシゲニン（ｄｉｇｏｘｙｇｅｎｉｎ）（Ｋｅｒｋｈｏｆ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０５：３５９−３６４（１９９２））などの適切なハプテンで改変したヌクレオチドが含まれる。適切な蛍光標識ヌクレオチドは、フルオレセイン−イソチオシアネートｄＵＴＰ、シアニン−３−ｄＵＴＰおよびシアニン−５−ｄＵＴＰである（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２２：３２２６−３２３２（１９９４））。ＤＮＡに好ましいヌクレオチドアナログ検出標識は、ＢｒｄＵｒｄ（ブロモデオキシウリジン、ＢｒｄＵｒｄ、ＢｒｄＵ、ＢＵｄＲ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ）である。検出標識のＤＮＡへの組み込みに有用な他のヌクレオチドアナログは、ＡＡ−ｄＵＴＰ（アミノアリル−デオキシウリジントリホスフェート、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）および５−メチル−ｄＣＴＰ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）である。検出標識のＲＮＡへの組み込みに有用なヌクレオチドアナログは、ビオチン−１６−ＵＴＰ（ビオチン−１６−ウリジン−５’−トリホスフェート、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）である。フルオレセイン、Ｃｙ３およびＣｙ５は、直接標識のためにｄＵＴＰに結合することができる。Ｃｙ３．５およびＣｙ７は、ビオチン−またはジゴキシゲニン標識プローブの二次検出用のアビジンまたは抗ジゴキシゲニン結合体として利用可能である。
【０１５４】
ビオチンなどの核酸に組み込まれる検出標識を、その後に当該技術で周知の感度のよい方法を使用して検出することができる。例えば、ビオチンは、ビオチンに結合しているストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ結合体（Ｔｒｏｐｉｘ，Ｉｎｃ．）を使用して検出することができ、その後に適切な基質（例えば、化学発光基質ＣＳＰＤ：３−（４−メトキシスピロ−〔１，２，−ジオキセタン−３−２’−（５’−クロロ）トリシクロ〔３．３．１．１３，７〕デカン〕−４−イル）フェニルリン酸二ナトリウム；Ｔｒｏｐｉｘ，Ｉｎｃ．）の化学発光により検出することができる。標識はまたは、例えば、化学シグナル増幅により、または発光シグナルを生じる酵素（例えば、化学発光１，２−ジオキセタン基質）もしくは蛍光シグナルを生じる酵素への基質を使用することにより検出することができる、アルカリホスファターゼ、ダイズペルオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびポリメラーゼなどの酵素であり得る。
【０１５５】
２個以上のこれらの検出標識を組み合わせる分子も検出標識と見なされる。既知の検出標識のいずれかを、開示されているプローブ、タグ、分子、および方法と共に使用して、開示の方法で産生された活性化または非活性化リボスイッチ、または核酸、またはタンパク質を標識および検出することができる。検出標識により生成されたシグナルを検出および測定する方法も、当業者に公知である。例えば、放射性同位体を、シンチレーションカウンティングまたは直接可視化により検出することができ、蛍光分子を、蛍光分光光度計を使用して検出することができ、リン光分子を、分光光度計またはカメラによる直接可視化により検出することができ、酵素を、酵素により触媒された反応の産物の検出または可視化により検出することができ、抗体を、抗体に結合した二次検出標識を検出することによって検出することができる。本明細書で使用する場合、検出分子は、検出する化合物または組成物と相互作用し、１つまたは複数の検出標識をカップリングする分子である。
【０１５６】
Ｉ．配列類似性
本明細書中で考察するように、用語相同性および同一性の使用は類似性と同一であることを意味すると理解される。したがって、例えば、用語相同性を２配列間（例えば、非天然配列）で使用する場合、これは必ずしもこれら２配列間の進化的関係を示しているわけではなく、むしろ、それらの核酸配列間の類似性または関連性に注目していると理解される。２つの進化的に関連した分子間の相同性の多数の決定方法を、これらが進化的に関連するかどうかと無関係に、配列類似性を測定するために任意の２つ以上の核酸またはタンパク質に日常的に適用する。
【０１５７】
一般に、本明細書中に開示のリボスイッチ、アプタマー、発現プラットフォーム、遺伝子、およびタンパク質の任意の公知の改変体および誘導体または生じ得るものを定義する１つの方法は、公知の特異的配列に対する相同性に関する改変体および誘導体の定義によると理解される。本明細書中に開示の特定の配列のこの同一性も、本明細書中の他所で考察する。一般に、本明細書中に開示のリボスイッチ、アプタマー、発現プラットフォーム、遺伝子、およびタンパク質の改変体は、典型的には、定められた配列または天然配列に対して少なくとも約７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の相同性を有する。当業者は、２つのタンパク質または核酸（遺伝子など）の相同性の決定方法を容易に理解する。例えば、相同性がその最高レベルとなるような２つの配列のアラインメント後に相同性を計算することができる。
【０１５８】
相同性の別の計算方法を、公開されたアルゴリズムによって行うことができる。比較のための最適な配列アラインメントを、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ  Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．ＭｏＬ  Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４（１９８８）の類似性検索方法、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、または調査によって行うことができる。
【０１５９】
例えば、Ｚｕｋｅｒ，Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：４８−５２，１９８９，Ｊａｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：７７０６−７７１０，１９８９，Ｊａｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：２８１−３０６，１９８９（少なくとも核酸アラインメントに関する材料について本明細書中で参考として援用される）に開示のアルゴリズムによって、核酸についての同型の相同性を得ることができる。典型的には任意の方法を使用することができると理解され、場合によってはこれらの種々の方法の結果が異なり得ると理解されるが、当業者は、これらの方法の少なくとも１つを使用して同一性を見出す場合、配列は定められた同一性を有するといわれると理解する。
【０１６０】
例えば、本明細書中で使用する場合、別の配列に対して特定の相同率を有するものとして列挙される配列は、１つまたは複数の上記の計算方法のいずれかによって計算した列挙した相同性を有する配列をいう。例えば、本明細書中で定義するように、Ｚｕｋｅｒ計算法を使用して第１の配列が第２の配列に対して８０％相同性を有すると計算される場合、任意の他の計算法によって計算した場合に第１の配列が第２の配列に対して８０％相同性を持たない場合でさえ、第１の配列は第２の配列に対して８０％相同性を有する。別の例として、本明細書中で定義するように、Ｚｕｋｅｒ計算法およびＰｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ計算法の両方を使用して第１の配列が第２の配列に対して８０％相同性を有すると計算される場合、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎの計算法、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈの計算法、Ｊａｅｇｅｒの計算法、または任意の他の計算法によって計算した場合に第１の配列が第２の配列に対して８０％相同性を持たない場合でさえ、第１の配列は第２の配列に対して８０％相同性を有する。さらに別の例として、本明細書中で定義するように、各計算法を使用して第１の配列が第２の配列に対して８０％相同性を有すると計算される場合、第１の配列は第２の配列に対して８０％相同性を有する（しかし、実際には、異なる計算法により、しばしば、異なる相同率の計算値が得られる）。
【０１６１】
Ｊ．ハイブリッド形成および選択的ハイブリッド形成
用語「ハイブリッド形成」は、典型的には、少なくとも２つの核酸分子（プライマーまたはプローブとリボスイッチまたは遺伝子など）の間の配列駆動相互作用を意味する。配列駆動相互作用は、２つのヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド誘導体の間でヌクレオチド特異的様式にて起こる相互作用を意味する。例えば、Ｃと相互作用するＧまたはＴと相互作用するＡは、配列駆動相互作用である。典型的には、配列駆動相互作用は、ヌクレオチドのワトソン−クリック面またはフーグスティーン面上で起こる。２つの核酸のハイブリッド形成は、当業者に公知の多数の条件およびパラメータに影響を受ける。例えば、塩濃度、ｐＨ、および反応温度の全てが２つの核酸分子がハイブリッド形成するかどうかに影響を及ぼす。
【０１６２】
２つの核酸分子間の選択的ハイブリッド形成のパラメータは、当業者に周知である。例えば、いくつかの実施形態では、選択的ハイブリッド形成条件を、ストリンジェントなハイブリッド形成条件と定義することができる。例えば、ハイブリッド形成のストリンジェンシーを、ハイブリッド形成工程および洗浄工程のいずれかまたは両方の温度および塩濃度の両方によって調節する。例えば、選択的ハイブリッド形成を達成するためのハイブリッド形成条件は、高イオン強度溶液（６×ＳＳＣまたは６×ＳＳＰＥ）中でＴｍ（分子の半分がそのハイブリッド形成パートナーから解離する融点）より約１２〜２５℃低い温度でのハイブリッド形成およびそれに続く洗浄温度がＴｍより約５℃〜２０℃低いように選択された温度と塩濃度との組み合わせによる洗浄を含むことができる。温度および塩条件は、フィルター上に固定した参照ＤＮＡサンプルを目的の標識核酸とハイブリッド形成させ、次いで、異なるストリンジェンシー条件下で洗浄する予備実験において実験的に容易に決定される。ハイブリッド形成温度は、典型的には、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッド形成についてはより高い。上記の条件または当該分野で公知の条件を使用して、ストリンジェンシーを達成することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９；Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８７：１５４：３６７，１９８７（少なくとも核酸のハイブリッド形成に関連する材料について本明細書中で参考として援用される））。ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッド形成のための好ましいストリンジェントなハイブリッド形成条件は、約６８°Ｃ（水溶液中）の６×ＳＳＣまたは６×ＳＳＰＥおよびそれに続く６８℃での洗浄であり得る。ハイブリッド形成および洗浄のストリンジェンシーを、必要に応じて、所望の相補度が減少するのに合わせて、さらに、変動性が検索される任意の領域のＧ−ＣまたはＡ−Ｔの豊富さに応じて減少させることができる。同様に、ハイブリッド形成および洗浄のストリンジェンシーを、必要に応じて、所望の相同性が増加するのに合わせて、さらに、高相同性が望まれる任意の領域のＧ−ＣまたはＡ−Ｔの豊富さに応じて増加させることができ、これらは全て当該分野で公知である。
【０１６３】
別の選択的ハイブリッド形成を定義する方法は、他の核酸に結合した核酸の１つの量（比率）の検索による。例えば、いくつかの実施形態では、選択的ハイブリッド形成条件は、少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％の制限核酸が非制限核酸に結合する場合である。典型的には、非制限核酸は、例えば、１０、または１００、または１０００倍過剰である。このアッセイ型を、制限核酸および非制限核酸の両方が、例えば、それらのｋｄよりも１０倍、または１００倍、または１０００倍を下回る条件下、または核酸分子の一方のみが１０倍、または１００倍、または１０００倍である条件下、または核酸分子の一方または両方がそれらのｋｄを超える条件下で行うことができる。
【０１６４】
別の選択的ハイブリッド形成を定義する方法は、所望の酵素操作を促進するためにハイブリッド形成が必要な条件下で酵素的に操作される核酸の比率の検索による。例えば、いくつかの実施形態では、選択的ハイブリッド形成条件は、少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％の核酸が、酵素操作を促進する条件下で酵素的に操作される場合である。例えば、酵素操作がＤＮＡ伸長である場合、選択的ハイブリッド形成条件は、少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％の核酸分子が伸長される場合である。好ましい条件には、製造者によって示唆される条件または当該分野で操作を実行する酵素に適切であることが示された条件も含まれる。
【０１６５】
相同性と同様に、２つの核酸分子の間のハイブリッド形成レベルを決定するための本明細書中に開示の種々の方法が多数存在すると理解される。これらの方法および条件により、２つの核酸分子間で異なる比率でハイブリッド形成を提供し得るが、他で示さない限り、任意の方法のパラメータを満たすことで十分であると理解される。例えば、８０％ハイブリッド形成が必要である場合、およびこれらの方法のいずれか１つにおける必要なパラメータ内でハイブリッド形成が起こる限り、本明細書中に開示されると見なされる。
【０１６６】
当業者は、組成物または方法が集合的または単独にハイブリッド形成の決定のためのこれらの基準のうちのいずれか１つを満たす場合、この組成物または方法は本明細書中に開示される組成物または方法であると理解すると理解される。
【０１６７】
Ｋ．核酸
核酸ベースである種々の分子（例えば、リボスイッチ、アプタマー、ならびにリボスイッチおよびアプタマーをコードする核酸が含まれる）を本明細書中に開示する。開示の核酸は、例えば、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、またはヌクレオチド置換物から構成され得る。これらの分子および他の分子の制限されない例は、本明細書中に述べられている。例えば、ベクターを細胞中で発現する場合、発現したｍＲＮＡは、典型的には、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＵから構成されると理解される。同様に、例えば、外因性送達によって核酸分子を細胞または細胞環境に導入する場合、細胞環境下で核酸分子の分解を減少させるヌクレオチドアナログから核酸分子が構成されることが有利であると理解される。
【０１６８】
それらの関連する機能が維持される限り、リボスイッチ、アプタマー、発現プラットフォーム、および任意の他のオリゴヌクレオチドおよび核酸は、改変ヌクレオチド（ヌクレオチドアナログ）から構成され得るかまたはそれを含むことができる。多くの改変ヌクレオチドが知られており、オリゴヌクレオチドおよび核酸で使用することができる。ヌクレオチドアナログは、いくつかの改変型（塩基部分、糖部分またはリン酸部分のいずれかに対応する）を含むヌクレオチドである。塩基部分に対する改変には、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ／Ｕ、ならびに異なるプリンまたはピリミジン塩基の天然および合成改変が含まれる（ウラシル−５−イル、ヒポキサンチン−９−イル（Ｉ）および２−アミノアデニン−９−イルなど）。改変塩基には、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニジンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニジンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換のアデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換のウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンが含まれるが、これらに限定されない。さらなる塩基改変を、例えば、米国特許第３，６８７，８０８号、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３およびＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ  ２８９−３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．ｅｄ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３で見出すことができる。特定のヌクレオチドアナログ（５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびにＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリンなど）には、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンが含まれる。５−メチルシトシンは、二重鎖形成の安定性を増加することができる。他の改変塩基は、ユニバーサル塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅ）として機能するものである。ユニバーサル塩基には、３−ニトロピロールおよび５−ニトロインドールが含まれる。ユニバーサル塩基は、通常の塩基の代わりになるが、塩基対合に対して偏りがない。すなわち、ユニバーサル塩基は、任意の他の塩基と塩基対合することができる。塩基改変は、しばしば、例えば２’−Ｏ−メトキシエチルなどの糖改変と組み合わせて、二重鎖の安定性の増加などの特有の特性を得ることができる。塩基改変の範囲を詳述し、記載する、多数の米国特許（第４，８４５，２０５号、第５，１３０，３０２号、第５，１３４，０６６号、第５，１７５，２７３号、第５，３６７，０６６号、第５，４３２，２７２号、第５，４５７，１８７号、第５，４５９，２５５号、第５，４８４，９０８号、第５，５０２，１７７号、第５，５２５，７１１号、第５，５５２，５４０号、第５，５８７，４６９号、第５，５９４，１２１号、第５，５９６，０９１号、第５，６１４，６１７号および第５，６８１，９４１号など）が存在する。これらの特許は、それぞれその全体が、特に、塩基改変、それらの合成、それらの使用、ならびにそれらのオリゴヌクレオチドおよび核酸への組み込みについて本明細書中で参照として援用される。
【０１６９】
ヌクレオチドアナログは、糖部分の改変を含むこともできる。糖部分の改変には、リボースおよびデオキシリボースの天然改変、ならびに合成改変が含まれる。糖改変には、２’位での以下の改変が含まれるが、これらに限定されない：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキル（ここで、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、Ｃ１〜Ｃ１０置換または非置換のアルキルまたはＣ２〜Ｃ１０置換または非置換のアルケニルおよびアルキニルであり得る）。２’糖改変には、−Ｏ〔（ＣＨ２）ｎＯ〕ｍＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−ＯＮＨ２および−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２（ここで、ｎおよびｍは、１〜約１０である）も含まれるが、これらに限定されない。
【０１７０】
２’位での他の改変には、Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルもしくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、介入物質、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善する基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善する基、および同様な特性を有する他の置換基が含まれるが、これらに限定されない。類似の改変を、糖の他の位置、特に３’末端ヌクレオチド上または２’−５’結合オリゴヌクレオチド内の糖の３’位、および５’末端ヌクレオチドの５’位で行うこともできる。改変糖には、架橋環酸素での改変（ＣＨ２およびＳなど）を含むものも含まれる。ヌクレオチド糖アナログは、ペントフラノシル糖の代わりに、シクロブチル部分などの糖模倣物を有することもできる。かかる改変糖構造の調製を教示する多数の米国特許（第４，９８１，９５７号、第５，１１８，８００号、第５，３１９，０８０号、第５，３５９，０４４号、第５，３９３，８７８号、第５，４４６，１３７号、第５，４６６，７８６号、第５，５１４，７８５号、第５，５１９，１３４号、第５，５６７，８１１号、第５，５７６，４２７号、第５，５９１，７２２号、第５，５９７，９０９号、第５，６１０，３００号、第５，６２７，０５３号、第５，６３９，８７３号、第５，６４６，２６５号、第５，６５８，８７３号、第５，６７０，６３３号および第５，７００，９２０号など）が存在し、それぞれその全体が、特に、改変糖構造、それらの合成、それらの使用、ならびにそれらのヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよび核酸への組み込みについての記載が、本明細書中で参考として援用される。
【０１７１】
ヌクレオチドアナログは、リン酸部分を改変することもできる。改変リン酸部分には、２つのヌクレオチド間の架橋が、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび他のアルキルホスホネート（３’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートが含まれる）、ホスフィネート、ホスホルアミデート（３’−アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートが含まれる）、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、およびボラノホスフェートを含むように改変できるものが含まれるが、これらに限定されない。２つのヌクレオチド間のこれらのリン酸または改変リン酸架橋は、３’−５’架橋または２’−５’架橋を介することができ、および架橋は、３’−５’から５’−３’までまたは２’−５’から５’−２’までなどの逆の極性を含むことができることが理解される。種々の塩、混合塩および遊離酸形態も含まれる。多数の米国特許が改変リン酸を含むヌクレオチドをどのように作製し、使用するかを教示しており、第３，６８７，８０８号、第４，４６９，８６３号、第４，４７６，３０１号、第５，０２３，２４３号、第５，１７７，１９６号、第５，１８８，８９７号、第５，２６４，４２３号、第５，２７６，０１９号、第５，２７８，３０２号、第５，２８６，７１７号、第５，３２１，１３１号、第５，３９９，６７６号、第５，４０５，９３９号、第５，４５３，４９６号、第５，４５５，２３３号、第５，４６６，６７７号、第５，４７６，９２５号、第５，５１９，１２６号、第５，５３６，８２１号、第５，５４１，３０６号、第５，５５０，１１１号、第５，５６３，２５３号、第５，５７１，７９９号、第５，５８７，３６１号および第５，６２５，０５０号が含まれるが、これらに限定されない（それぞれその全体が、特に、改変リン酸、それらの合成、それらの使用、ならびにそれらのヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよび核酸への組み込みについての記載が、本明細書中で参考として援用される）。
【０１７２】
ヌクレオチドアナログは単一の改変しか含む必要がないが、１つの部分の中にまたは異なる部分の間に、複数の改変を含むこともできることが理解される。
【０１７３】
ヌクレオチド置換物は、ヌクレオチドと同様の機能的性質を有するが、リン酸部分を含まない分子である（ペプチド核酸（ＰＮＡ）など）。ヌクレオチド置換物は、ワトソン・クリックまたはフーグスティーン様式で相補核酸を認識し、それにハイブリダイズする（塩基対合する）分子であるが、リン酸部分以外の部分を介して一緒に結合する分子である。ヌクレオチド置換物は、適切な標的核酸と相互作用する場合、二重らせん型構造に調和することもできる。
【０１７４】
ヌクレオチド置換物は、リン酸部分および／または糖部分が置換されたヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログである。ヌクレオチド置換物は、標準的なリン原子を含まない。リン酸の置換物は、例えば、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間架橋、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間架橋、または１つまたは複数の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環ヌクレオシド間架橋であり得る。これらには、モルホリノ架橋（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成されている）；シロキサン骨格；硫化物、スルホキシドおよびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファミン酸骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホン酸およびスルホンアミド骨格；アミド骨格を有するもの、ならびに混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２成分部分を有する他のものが含まれる。多数の米国特許がこれらの種類のリン酸置換体をどのように作製し、使用するかを開示しており、第５，０３４，５０６号、第５，１６６，３１５号、第５，１８５，４４４号、第５，２１４，１３４号、第５，２１６，１４１号、第５，２３５，０３３号、第５，２６４，５６２号、第５，２６４，５６４号、第５，４０５，９３８号、第５，４３４，２５７号、第５，４６６，６７７号、第５，４７０，９６７号、第５，４８９，６７７号、第５，５４１，３０７号、第５，５６１，２２５号、第５，５９６，０８６号、第５，６０２，２４０号、第５，６１０，２８９号、第５，６０２，２４０号、第５，６０８，０４６号、第５，６１０，２８９号、第５，６１８，７０４号、第５，６２３，０７０号、第５，６６３，３１２号、第５，６３３，３６０号、第５，６７７，４３７号、および第５，６７７，４３９号が含まれるが、これらに限定されない（それぞれその全体が、特に、リン酸置換体、それらの合成、それらの使用、ならびにそれらのヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよび核酸への組み込みについての記載が、本明細書中で参考として援用される）。
【０１７５】
また、ヌクレオチドの糖とリン酸の両方の部分を、例えばアミド型架橋（アミノエチルグリシン）（ＰＮＡ）で置換することができることが、核酸置換物において理解される。米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，７１４，３３１号および同第５，７１９，２６２号は、ＰＮＡ分子をどのように作製し、使用するかを教示しており、それぞれ本明細書中で参考として援用される。（Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１４９７−１５００（１９９１）も参照すること）。
【０１７６】
オリゴヌクレオチドおよび核酸をヌクレオチドから構成することができ、異なるヌクレオチド型または同一のヌクレオチド型から構成することができる。例えば、オリゴヌクレオチドにおける１つまたは複数のヌクレオチドが、リボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、またはリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドの混合物であり得るか、ヌクレオチドの約１０％〜約５０％が、リボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、またはリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドの混合物であり得るか、ヌクレオチドの約５０％以上が、リボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、またはリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドの混合物であり得るか、あるいは全てのヌクレオチドが、リボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、またはリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドの混合物であり得る。かかるオリゴヌクレオチドおよび核酸を、キメラオリゴヌクレオチドおよびキメラ核酸と呼ぶことができる。
【０１７７】
Ｌ．固体支持体
固体支持体は、分子（トリガー分子など）およびリボスイッチ（または開示の方法で使用されるか開示の方法によって産生された他の成分）を会合することができる固体状態の基質または支持体である。リボスイッチおよび他の分子を、固体支持体と直接または間接的に会合することができる。例えば、分析物（例えば、トリガー分子、試験化合物）を、固体支持体表面に結合することができるか、固体支持体上に固定した捕捉剤（例えば、分析物に結合する化合物または分子）と会合することができる。別の例として、リボスイッチを、固体支持体表面に結合することができるか、固体支持体上に固定したプローブと会合することができる。アレイは、複数のリボスイッチ、プローブ、または他の分子がアレイ、グリッド、または他の組織化されたパターンに会合された固体支持体である。
【０１７８】
固体支持体で使用する固体状態の基質には、成分を直接または間接的に会合することができる任意の固体材料が含まれ得る。これには、アクリルアミド、アガロース、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、金、ポリスチレン、ポリエチレンビニルアセテート、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリエチレンオキシド、ポリシリケート、ポリカーボネート、テフロン（登録商標）、フルオロカーボン、ナイロン、シリコンラバー、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルソエステル、官能性シラン、ポリプロピルフメレート、コラーゲン、グリコサミノグリカン、およびポリアミノ酸などの材料が含まれる。固体状態の基質は、任意の有用な形態（薄膜、膜、ボトル、皿、ファイバー、織り繊維、成形ポリマー、粒子、ビーズ、微粒子、またはこれらの組み合わせが含まれる）を有することができる。固体状態の基質および固体支持体は、多孔質または非多孔質であり得る。チップは、矩形または四角の材料小片である。固体状態の基質の好ましい形態は、薄膜、ビーズ、またはチップである。有用な固体状態の基質の形態はマイクロタイターディッシュである。いくつかの実施形態では、マルチウェルガラススライドを使用することができる。
【０１７９】
アレイは、固体支持体上の規定または所定の位置に固定した複数のリボスイッチ、トリガー分子、他の分子、化合物、またはプローブを含むことができる。固体支持体上のそれぞれの所定の位置は、一般に、１種の成分型を有する（すなわち、その位置の全成分は同一である）を有する。あるいは、固体支持体上の同一の所定の位置に複数の成分型を固定することができる。各位置は、所与の成分の複数のコピーを有する。固体支持体上の異なる成分の空間的分離により、個別に検出および同定が可能である。
【０１８０】
有用であるにもかかわらず、固体支持体は単一の単位または構造である必要はない。リボスイッチ、トリガー分子、他の分子、化合物、および／またはプローブの組を、多数の固体支持体の一面に分布させることができる。例えば、ある極端な場合では、各成分を個別の反応管または反応容器中、または個別のビーズまたは微粒子上に固定することができる。
【０１８１】
オリゴヌクレオチドの固体状態の基質への固定方法は十分に確立されている。オリゴヌクレオチド（アドレスプローブおよび検出プローブが含まれる）を、確立されたカップリング法を使用して基質にカップリングすることができる。例えば、適切な付着方法は、Ｐｅａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１（１１）：５０２２−５０２６（１９９４）およびＫｈｒａｐｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（Ｍｏｓｋ）（ＵＳＳＲ）２５：７１８−７３０（１９９１）に記載されている。カゼイン被覆スライド上の３’−アミンオリゴヌクレオチドの固定方法は、Ｓｔｉｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：６３７９−６３８３（１９９５）に記載されている。オリゴヌクレオチドの固体状態の基質への有用な付着方法は、Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：５４５６−５４６５（１９９４）に記載されている。
【０１８２】
固体支持体上に固定した各成分（例えば、リボスイッチ、トリガー分子、または他の分子）を、固体支持体の異なる所定の領域に配置することができる。異なる位置は、異なる反応チャンバーであり得る。異なる所定の領域それぞれを、相互の異なる領域から物理的に分離することができる。固体支持体の異なる所定の領域の間の距離は、固定されていても変化しても良い。例えば、アレイでは、各成分を、相互に固定した距離に配置することができる一方で、ビーズに会合した成分は固定した空間的関係にない。特に、複数の固体支持体単位（例えば、複数のビーズ）の使用により、距離が変化する。
【０１８３】
成分を、任意の密度で固体支持体上に会合または固定することができる。成分を、立方センチメートルあたり４００種を超える異なる成分を含む密度で固体支持体に固定することができる。成分アレイは、多数の成分を有することができる。例えば、アレイは、固体支持体上に固定した少なくとも１，０００種の異なる成分、固体支持体上に固定した少なくとも１０，０００種の異なる成分、固体支持体上に固定した少なくとも１００，０００種の異なる成分、または固体支持体上に固定した少なくとも１，０００，０００種の異なる成分を有することができる。
【０１８４】
Ｍ．キット
上記の材料および他の材料を、開示の方法の実施または実施の補助に有用なキットとして任意の適切な組み合わせで一緒に包装することができる。所与のキット中のキット構成成分を、開示の方法で一緒に使用するためにデザインおよび適合することが有用である。例えば、化合物検出のためのキット、１つまたは複数のバイオセンサーリボスイッチを含むキットを開示する。キットはまた、リボスイッチの活性化の検出のための試薬および標識を含むことができる。
【０１８５】
Ｎ．混合物
開示の方法の実施または実施のための調製によって形成された混合物を開示する。例えば、リボスイッチおよびトリガー分子を含む混合物を開示する。
【０１８６】
方法が組成物、または成分、または試薬の混合または接触を含むときはいつでも、方法の実施により、多数の異なる混合物が作製される。例えば、方法が３つの混合工程を含む場合、工程を個別に実施する場合にこれらの各工程後に固有の混合物が形成される。さらに、工程の実施方法と無関係に、全工程の完了時点に混合物が形成される。本開示は、開示の方法の実施によって得られたこれらの混合物および任意の開示の試薬、組成物、または成分（例えば、本明細書中に開示）を含む混合物を意図する。
【０１８７】
Ｏ．系
開示の方法の実施または実施における補助に有用な系を開示する。系は、一般に、構造、機械、およびデバイスなどならびに組成物、化合物、材料などの製品の組み合わせを含む。開示または開示から明らかなかかる組み合わせを意図する。例えば、バイオセンサーリボスイッチ、固体支持体、および信号読み取りデバイスを含む系を開示および意図する。
【０１８８】
Ｐ．データ構造およびコンピュータ制御
開示の方法で使用されるか、開示の方法によって生成されるか、開示の方法から生成されるデータ構造を開示する。データ構造は、一般に、組成物または媒体中に回収され、組織化され、保存され、そして／または統合された任意の形態のデータ、情報、および／またはオブジェクトである。電子的形態（ＲＡＭ中または保存ディスク上など）で保存されたリボスイッチ構造および活性化の測定値は、１つのデータ構造型である。
【０１８９】
開示の方法、その任意の一部、またはその調製を、コンピュータ制御によって調節、管理、または支援することができる。かかるコンピュータ制御を、コンピュータ制御されたプロセスまたは方法によって実施することができ、データ構造を使用および／または生成することができ、コンピュータプログラムを使用することができる。かかるコンピュータ制御、コンピュータ制御されたプロセス、データ構造、およびコンピュータプログラムが意図され、本明細書中に開示されると理解すべきである。
【０１９０】
方法
リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断する方法を開示する。かかる方法は、例えば、リボスイッチとリボスイッチを活性化、非活性化、または遮断することができる化合物またはトリガー分子とを接触する工程を含むことができる。リボスイッチは、トリガー分子の結合または除去によって遺伝子発現を調節するように機能する。化合物を使用して、リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断することができる。リボスイッチのためのトリガー分子（および他の活性化化合物）を使用して、リボスイッチを活性化することができる。一般に、トリガー分子以外の化合物を使用して、リボスイッチを非活性化または遮断することができる。リボスイッチを、例えば、リボスイッチの有するその存在からのトリガー分子の除去によって非活性化することもできる。したがって、開示のリボスイッチの非活性化方法は、例えば、リボスイッチの有するその存在からまたはリボスイッチとの接触からのトリガー分子（または他の活性化化合物）の除去工程を含むことができる。リボスイッチを、例えば、リボスイッチを活性化しないトリガー分子アナログの結合によって遮断することができる。
【０１９１】
化合物をＲＮＡ分子と接触させることによってＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子をコードする遺伝子の発現を変化させる方法も開示し、このＲＮＡ分子はリボスイッチを含む。リボスイッチは、トリガー分子の結合または除去によって遺伝子発現を調節するように機能する。したがって、リボスイッチを含む目的のＲＮＡ分子を、リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断する条件に供することによって、ＲＮＡ発現を変化させることができる。例えば、転写の終結またはＲＮＡへのリボゾーム結合の遮断の結果として発現を変化させることができる。トリガー分子の結合は、リボスイッチの性質に応じて、ＲＮＡ分子の発現を減少または防止することができるか、ＲＮＡ分子の発現を促進または増加させることができる。
【０１９２】
リボスイッチの活性化、非活性化、または遮断によってリボスイッチを含む天然に存在する遺伝子またはＲＮＡの発現を調節する方法も開示する。遺伝子が遺伝子を保有する細胞または生物の生存に不可欠である場合、リボスイッチの活性化、非活性化、または遮断により、細胞または生物が死滅させるか、休止させるか、衰弱させることができる。例えば、微生物の生存に不可欠な天然に存在する遺伝子中での天然に存在するリボスイッチの活性化により、微生物を死滅させることができる（リボスイッチの活性化によって発現がオフになるか抑制される場合）。これは、抗菌効果および抗生効果のための開示の化合物および方法の使用の１つの根拠である。これらの抗菌効果を有する化合物は、静菌性または殺菌性を示すと見なされる。
【０１９３】
リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断することができる化合物を選択および同定する方法も開示する。リボスイッチの活性化は、トリガー分子の結合の際のリボスイッチの状態の変化をいう。リボスイッチを、トリガー分子以外の化合物およびトリガー分子の結合以外の方法で活性化することができる。用語トリガー分子を、本明細書中で、リボスイッチを活性化することができる分子および化合物をいうために使用する。これには、リボスイッチおよびリボスイッチを活性化することができる他の化合物のための天然または通常のトリガー分子が含まれる。天然または通常のトリガー分子は、所与の天然のリボスイッチのトリガー分子またはいくつかの非天然リボスイッチの場合、リボスイッチがデザインされるか、リボスイッチが選択される（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択技術またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化技術など）トリガー分子である。非天然トリガー分子を、非天然トリガー分子ということができる。
【０１９４】
細菌と本明細書中に開示されているか本明細書中に開示の方法によって同定された化合物とを接触させる工程を含む、細菌を死滅または阻害する方法も開示する。
【０１９５】
リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断する化合物を同定する方法も開示する。例えば、リボスイッチを活性化する化合物を、試験化合物とリボスイッチとの接触およびリボスイッチの活性化の評価によって同定することができる。リボスイッチが活性化される場合、試験化合物を、リボスイッチを活性化する化合物と同定する。リボスイッチの活性化を、任意の適切な様式で評価することができる。例えば、リボスイッチをレポーターＲＮＡに連結することができ、レポーターＲＮＡの発現、発現レベル、または発現レベルの変化を、試験化合物の存在下および非存在下で測定することができる。別の例として、リボスイッチは、高次構造依存性標識（リボスイッチの活性化状態に応じて変化するシグナル）を含むことができる。かかるリボスイッチは、好ましくは、天然に存在するリボスイッチに由来するか、これから誘導したアプタマードメインを使用する。認められるように、調節アッセイまたは測定を使用するかあるいは調節アッセイまたは測定を使用しないで、リボスイッチ活性化の評価を実施することができる。リボスイッチを非活性化する化合物の同定方法を、類似の方法で行うことができる。
【０１９６】
本明細書中の他所に開示の方法に加えて、リボスイッチを遮断する化合物の同定を、任意の適切な様式で行うことができる。例えば、リボスイッチを活性化または非活性化することが公知の化合物の存在下および試験化合物の存在下でリボスイッチの活性化または非活性化を評価するためのアッセイを行うことができる。試験化合物の非存在下において認められないのと同様に活性化または非活性化が認められない場合、試験化合物を、リボスイッチの活性化または非活性化を遮断する化合物と同定する。
【０１９７】
バイオセンサーリボスイッチを使用した化合物の検出方法も開示する。本方法は、試験サンプルとバイオセンサーリボスイッチとを接触させる工程およびバイオセンサーリボスイッチの活性化を評価する工程を含むことができる。バイオセンサーリボスイッチの活性化は、試験サンプル中のバイオセンサーリボスイッチのためのトリガー分子の存在を示す。バイオセンサーリボスイッチは、その同系トリガー分子の存在下で検出可能なシグナルを産生する操作されたリボスイッチである。有用なバイオセンサーリボスイッチを、トリガー分子の閾値レベルまたは閾値レベルを超えて誘発することができる。バイオセンサーリボスイッチを、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの使用のためにデザインすることができる。例えば、シグナルとしての機能を果たすかその生成に関与するタンパク質をコードするレポーターＲＮＡに作動可能に連結されたサイクリックジＧＭＰバイオセンサーリボスイッチを、リボスイッチ／レポーターＲＮＡをコードする核酸構築物を保有するように細胞または生物を操作することによってｉｎ  ｖｉｖｏで使用することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用するためのバイオセンサーリボスイッチの例は、高次構造依存性標識を含むサイクリックジＧＭＰリボスイッチであり、この標識由来のシグナルは、リボスイッチの活性化状態に応じて変化する。かかるバイオセンサーリボスイッチは、好ましくは、天然に存在するサイクリックジＧＭＰリボスイッチに由来するかこれから誘導されるアプタマードメインを使用する。
【０１９８】
リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断する化合物の同定および同定された化合物の製造によって作製された化合物も開示する。例えば、本明細書中の他所に開示の化合物同定方法と同定された化合物の製造方法との組み合わせにより、これを行うことができる。例えば、試験化合物とリボスイッチとの接触工程、リボスイッチの活性化の評価工程、および試験化合物によってリボスイッチが活性化された場合の化合物としてのリボスイッチを活性化する試験化合物の製造工程によって化合物を作製することができる。
【０１９９】
化合物によるリボスイッチの活性化、非活性化、または遮断のチェック工程およびチェックした化合物の製造工程によって作製された化合物も開示する。例えば、本明細書中の他所に開示したように化合物の活性化、非活性化、または遮断の評価方法とチェックした化合物の製造方法との組み合わせによってこれを行うことができる。例えば、試験化合物とリボスイッチとの接触工程、リボスイッチ活性化の評価工程、および試験化合物によってリボスイッチが活性化された場合の化合物としてのリボスイッチを活性化する試験化合物の製造工程によって化合物を作製することができる。化合物がリボスイッチを活性化、非活性化、または遮断する能力についての化合物のチェックは、リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断することを以前に知られていない化合物の同定および化合物がリボスイッチを活性化、非活性化、または遮断することが既に知られていた場合のリボスイッチを活性化、非活性化、または遮断する化合物の能力の評価の両方をいう。目的の化合物を検出する方法であって、サンプルとリボスイッチとを接触させる工程を含み、リボスイッチが目的の化合物によって活性化され、リボスイッチが目的の化合物によって活性化された場合にシグナルを産生し、サンプルが目的の化合物を含む場合にリボスイッチがシグナルを産生し、リボスイッチがリボスイッチまたはリボスイッチの誘導体を含む方法をさらに開示する。リボスイッチは、サイクリックジＧＭＰ応答性リボスイッチ、Ｓ−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチ、ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチ、Ｍｏｃｏ応答性リボスイッチ、またはＳＡＭ応答性リボスイッチであり得る。目的の化合物によって活性化された場合にリボスイッチが高次構造を変化させることができ、高次構造の変化が、高次構造依存性標識を介してシグナルを産生する。目的の化合物によって活性化された場合にリボスイッチは高次構造を変化させることもでき、高次構造の変化によってリボスイッチに連結されたＲＮＡの発現が変化し、発現の変化によってシグナルが産生される。シグナルを、リボスイッチに連結されたＲＮＡから発現したレポータータンパク質によって産生することができる。
【０２００】
目的の化合物を検出する方法であって、サンプルとリボスイッチとを接触させる工程を含み、リボスイッチが目的の化合物によって活性化され、リボスイッチが目的の化合物によって活性化された場合にシグナルを産生し、サンプルが目的の化合物を含む場合にリボスイッチがシグナルを産生し、リボスイッチがリボスイッチまたはリボスイッチの誘導体を含む方法をさらに開示する。リボスイッチは、サイクリックジＧＭＰ応答性リボスイッチ、Ｓ−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチ、ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチ、Ｍｏｃｏ応答性リボスイッチ、またはＳＡＭ応答性リボスイッチであり得る。目的の化合物によって活性化された場合にリボスイッチが高次構造を変化させることができ、高次構造の変化が、高次構造依存性標識を介してシグナルを産生する。目的の化合物によって活性化された場合にリボスイッチは高次構造を変化させることもでき、高次構造の変化によってリボスイッチに連結されたＲＮＡの発現が変化し、発現の変化によってシグナルが産生される。シグナルを、リボスイッチに連結されたＲＮＡから発現したレポータータンパク質によって産生することができる。
【０２０１】
具体的には、サイクリックジＧＭＰ応答性リボスイッチをサンプルと接触させる工程、サイクリックジＧＭＰとサイクリックジＧＭＰ応答性リボスイッチとの間の相互作用を検出する工程を含み、サイクリックジＧＭＰとサイクリックジＧＭＰ応答性リボスイッチとの間の相互作用がサイクリックジＧＭＰの存在を示す、サンプル中のサイクリックジＧＭＰを検出する方法を開示する。サイクリックジＧＭＰ応答性リボスイッチを標識することができる。
【０２０２】
（ａ）リボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子の遺伝子発現の阻害について化合物を試験する工程であって、阻害がリボスイッチを介し、リボスイッチがリボスイッチまたはリボスイッチの誘導体を含む、試験工程、（ｂ）細胞と工程（ａ）で遺伝子発現を阻害した化合物との接触によって遺伝子発現を阻害する工程を含み、細胞がリボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子を含み、化合物がリボスイッチへの結合によって遺伝子発現を阻害する、方法も開示する。リボスイッチは、サイクリックジＧＭＰ応答性リボスイッチ、Ｓ−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチ、ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチ、Ｍｏｃｏ応答性リボスイッチ、またはＳＡＭ応答性リボスイッチであり得る。
【０２０３】
（ａ）リボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子の遺伝子発現の抑制について化合物を試験する工程であって、抑制がリボスイッチを介し、リボスイッチがリボスイッチまたはリボスイッチの誘導体を含む、試験工程、（ｂ）細胞と工程（ａ）で遺伝子発現を抑制した化合物との接触によって遺伝子発現を抑制する工程を含み、細胞がリボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子を含み、化合物がリボスイッチへの結合によって遺伝子発現を抑制する、方法も開示する。リボスイッチは、サイクリックジＧＭＰ応答性リボスイッチ、Ｓ−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチ、ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチ、Ｍｏｃｏ応答性リボスイッチ、またはＳＡＭ応答性リボスイッチであり得る。
【０２０４】
化合物と細胞とを接触させる工程を含み、化合物が、サイクリックジＧＭＰ、ｐＧｐＧ、ＧｐＧ、またはＧｐＧｐＧである、遺伝子発現を変化させる方法も開示する。化合物はまた、サイクリックジＧＭＰ応答性リボスイッチを活性化することができるサイクリックジＧＭＰ、ｐＧｐＧ、ＧｐＧ、またはＧｐＧｐＧの誘導体であり得る。化合物と細胞とを接触させる工程を含み、化合物がＳ−アデノシルホモシステインである、遺伝子発現を変化させる方法も開示する。化合物はまた、Ｓ−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチを活性化することができるＳ−アデノシルホモシステインの誘導体であり得る。化合物と細胞とを接触させる工程を含み、化合物がｐｒｅＱ１である、遺伝子発現を変化させる方法も開示する。化合物はまた、ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチを活性化することができるｐｒｅＱ１の誘導体であり得る。化合物と細胞とを接触させる工程を含み、化合物がＭｏｃｏである、遺伝子発現を変化させる方法も開示する。化合物はまた、Ｍｏｃｏ応答性リボスイッチを活性化することができるＭｏｃｏの誘導体であり得る。化合物と細胞とを接触させる工程を含み、化合物がＳＡＭである、遺伝子発現を変化させる方法も開示する。化合物はまた、ＳＡＭ応答性リボスイッチを活性化することができるＳＡＭの誘導体であり得る。ＳＡＭ−ＩＶリボスイッチを活性化するための化合物はまた、ＭｅＡｚａＡｄｏＭｅｔであり得る。
【０２０５】
Ｓ−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチの活性化のために、化合物は、Ｓ−アデノシルホモシステインであり得る。化合物はまた、Ｓ−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチを活性化することができるＳ−アデノシルホモシステインの誘導体であり得る。例えば、化合物はＳ−アデノシル−Ｌ−システイン（ＳＡＣ）であり得る。図１２Ｂは、Ｓ−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチを活性化することができる化合物に重要な構造エレメントを示す。
【０２０６】
ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチ（およびｐｒｅＱ１応答性リボスイッチ由来のリボスイッチ）の活性化のために、化合物は、１位のＮをＣ、Ｏ  またはＳと置換することができ、２位のアミノ基を水素結合供与体と置換することができ、６位の酸素を水素結合受容体と置換することができ、７位のアミノ基を水素結合受容体と置換することができ、窒素を水素結合供与体と置換するかこれを使用して誘導することができる、ｐｒｅＱ１の誘導体であり得る。
【０２０７】
細胞を、遺伝子発現の変化が必要であると同定することができる。細胞は細菌細胞であり得る。化合物は、細菌細胞を死滅させるか増殖を阻害することができる。被験体への化合物の投与によって化合物と細胞とを接触させることができる。細胞は被験体中の細菌細胞であり得、化合物は細菌細胞を死滅させるか増殖を阻害する。被験体は、細菌感染を有し得る。細胞は、サイクリックジＧＭＰ応答性リボスイッチ、Ｓ−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチ、ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチ、Ｍｏｃｏ応答性リボスイッチ、またはＳＡＭ応答性リボスイッチを含むことができる。化合物を、別の抗菌化合物と組み合わせて投与することができる。化合物は、バイオフィルム中の細菌増殖を阻害することができる。化合物と細胞とを接触させる工程を含み、化合物が、サイクリックジＧＭＰ、ｐＧｐＧ、ＧｐＧ、またはＧｐＧｐＧである、細胞の生理学的状態を変化させる方法も開示する。化合物はまた、サイクリックジＧＭＰ応答性リボスイッチを活性化することができるサイクリックジＧＭＰ、ｐＧｐＧ、ＧｐＧ、またはＧｐＧｐＧの誘導体であり得る。
【０２０８】
トリガー分子の存在下および非存在下でＲＮＡ分子のインライン自発性切断を評価する工程を含み、ＲＮＡ分子がトリガー分子によって調節される遺伝子によってコードされ、ＲＮＡ分子のインライン自発性切断パターンの変化がトリガー分子に応答するリボスイッチを示す、リボスイッチを同定する方法を開示する。トリガー分子は、サイクリックジＧＭＰ、Ｓ−アデノシルホモシステイン、ｐｒｅＱ１、Ｍｏｃｏ、またはＳＡＭであり得る。
【０２０９】
（ａ）リボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子の遺伝子発現の阻害について化合物を試験する工程であって、阻害がリボスイッチを介し、リボスイッチがサイクリックジＧＭＰ応答性リボスイッチまたはサイクリックジＧＭＰ応答性リボスイッチの誘導体を含む、試験工程、（ｂ）細胞と工程（ａ）で遺伝子発現を阻害した化合物との接触によって遺伝子発現を阻害する工程を含み、細胞がリボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子を含み、化合物がリボスイッチへの結合によって遺伝子発現を阻害する、方法を開示する。
【０２１０】
細胞と遺伝子の遺伝子発現の阻害について化合物を試験することによって遺伝子の遺伝子発現を阻害する化合物と同定された化合物との接触によってリボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子の遺伝子発現を阻害する工程を含み、阻害がリボスイッチを介し、リボスイッチがサイクリックジＧＭＰ応答性リボスイッチまたはサイクリックジＧＭＰ応答性リボスイッチの誘導体を含む、方法も開示する。
【０２１１】
Ａ．抗菌化合物の同定
リボスイッチは、有機小分子の結合のために進化した構造化ＲＮＡの新規のクラスである。リボスイッチの天然の結合ポケットを、代謝産物アナログを使用するか、天然代謝産物の形状−空間を模倣する化合物によってターゲティングすることができる。リボスイッチの小分子リガンドにより、薬物候補を生成するための誘導体化に有用な部位が得られる。いくつかのリボスイッチの分布は、米国特許出願公開第２００５−００５３９５１号の表１に示されている。一旦リボスイッチクラスが同定され、薬物標的としてのその潜在力が評価されると（サイクリックジＧＭＰリボスイッチなど）、候補分子を同定することができる。
【０２１２】
細菌の薬物耐性株の出現により、新規クラスの抗生物質同定の必要性が強調される。抗リボスイッチ薬は、以下の理由のために非常に興味深い抗菌作用様式を示す。リボスイッチは、基本的代謝過程に重要な遺伝子発現を調節する。したがって、薬物を使用したこれらの遺伝子調節エレメントの操作により、新規の抗生物質が得られる。これらの抗菌薬を、静菌性または殺菌性を示すと見なすことができる。リボスイッチはまた、代謝産物に選択的に結合するように進化したＲＮＡ構造を保有し、したがって、これらのＲＮＡ受容体は、タンパク質酵素および受容体のように良好な薬物標的物を作製する。
【０２１３】
化合物の非存在下での同一のリボスイッチアッセイと比較して（すなわち、コントロールアッセイと比較して）、化合物の存在下のリボスイッチアッセイにおけるシグナルが少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、５０％、７５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、４００％、または５００％増加する場合に、化合物がリボスイッチを活性化すると同定することができるか、リボスイッチ活性化活性を有すると決定することができる。リボスイッチアッセイを、任意の適切なリボスイッチ構築物を使用して行うことができる。リボスイッチ活性化アッセイに特に有用なリボスイッチ構築物を、本明細書中の他所に記載している。１つまたは複数の特定のリボスイッチ、リボスイッチ構築物、またはリボスイッチクラスに関して、化合物を、リボスイッチを活性化するかリボスイッチ活性化活性を有すると同定することができる。便宜上、あるリボスイッチクラスを活性化するかあるリボスイッチクラスのリボスイッチ活性化活性を有すると同定された化合物を、特定のリボスイッチ（特定の種で見出されたそのクラスのリボスイッチなど）についてもそのように同定することができる。例えば、サイクリックジＧＭＰリボスイッチを活性化するかサイクリックジＧＭＰリボスイッチに対するリボスイッチ活性化活性を有すると同定された化合物を、特定のサイクリックジＧＭＰリボスイッチ（例えば、  Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅまたはＧｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓで見出されたサイクリックジＧＭＰリボスイッチなど）についてそのように同定することができる。
【０２１４】
Ｂ．抗菌化合物の使用方法
ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗菌方法を本明細書中に開示する。「抗菌の」は、細菌増殖の阻害もしくは防止、細菌の死滅、または細菌数の減少を意味する。したがって、細菌を有効量の本明細書中に開示の１つまたは複数の化合物と接触させる工程を含む、細菌増殖を阻害または防止する方法を開示する。開示の化合物のさらなる構造を本明細書中に提供する。
【０２１５】
細胞とリボスイッチに結合する化合物とを接触させる工程を含み、細胞が化合物に応答性を示すリボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子を含み、化合物がリボスイッチへの結合によって細菌細胞増殖を阻害し、それにより、遺伝子発現が変化する、細菌細胞増殖を阻害する方法を開示する。リボスイッチは、サイクリックジＧＭＰ応答性リボスイッチ、Ｓ−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチ、ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチ、Ｍｏｃｏ応答性リボスイッチ、またはＳＡＭ応答性リボスイッチであり得る。本方法により、化合物と接触しない細胞と比較して細菌細胞増殖を少なくとも１０％減少させることができる。被験体への化合物の投与により、化合物と細胞とを接触させることができる。細胞は被験体中の細菌細胞であり得、化合物は細菌細胞を死滅させるか増殖を阻害する。被験体は、細菌感染を有し得る。化合物を、別の抗菌化合物と組み合わせて投与することができる。
【０２１６】
細菌は、以下の属由来の細菌などの任意の細菌であり得る：例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｉｄｉｏｍａｒｉｎａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｓｏｌｉｂａｃｔｅｒ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ、およびＶｉｂｒｉｏ。細菌は、例えば、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｉｃｉｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｆｎｉｅｎｓｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｏｍｎｕｓ、Ｉｄｉｏｍａｒｉｎａ  ｌｏｉｈｉｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｉｈｅｙｅｎｓｉｓ、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｅｎｉ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｓｏｌｉｂａｃｔｅｒ  ｕｓｉｔａｔｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、またはＶｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓであり得る。細菌増殖を、細菌が見出される任意の状況で阻害することもできる。例えば、流動物、バイオフィルム、および表面上での細菌増殖を阻害することができる。本明細書中に開示の化合物を、任意の他の化合物または組成物と組み合わせて投与または使用することができる。例えば、開示の化合物を、別の抗菌化合物と組み合わせて投与または使用することができる。
【０２１７】
「細菌増殖の阻害」を、１つの細菌が娘細胞に分裂する能力の減少または細菌集団が娘細胞を形成する能力の減少と定義する。細菌が再生する能力を、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または１００％またはそれを超えて減少させることができる。
【０２１８】
細菌を１つまたは複数の本明細書中に開示および記載の化合物と接触させる工程を含む、細菌または細菌集団の増殖の阻害および／または死滅方法も提供する。
【０２１９】
「細菌の死滅」を、１つの細菌の死滅または複数の細菌（コロニー中の細菌など）の数の減少と定義する。複数の形態の細菌について言及する場合、「細菌の死滅」を、１０％の集団、２０％の集団、３０％の集団、４０％の集団、５０％の集団、６０％の集団、７０％の集団、８０％の集団、９０％の集団、または１００％以下の集団の比率での所与の細菌集団の細胞死と定義する。
【０２２０】
本明細書中に開示の化合物および組成物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで抗菌活性を有し、同様に殺菌性を示し得る他の化合物または組成物と併せて使用することができる。
【０２２１】
本明細書中に提供される化合物の、用語「治療有効量」は、非毒性であるが、１つまたは複数の症状を望ましく減少させるのに十分な化合物の量を意味する。以下に指摘するように、化合物の正確な必要量は、被験体の種、年齢、および一般的な健康状態、処置を受ける疾患の重症度、使用された特定の化合物、ならびにその投与様式などに応じて被験体によって変化する。したがって、正確な「有効量」を特定することは可能でない。しかし、当業者は、適切な有効量を、日常的な実験のみを使用して決定することができる。
【０２２２】
本明細書中に開示の組成物および化合物を、薬学的に許容可能なキャリア中にてｉｎ  ｖｉｖｏで投与することができる。「薬学的に許容可能な」は、生物学的でないか、そうでなければ望ましくないことはない材料を意味する。すなわち、材料を、いかなる望ましくない生物学的影響を引き起こすことなくまたは含有するいかなる薬学的組成物の他の成分との有害様式での相互作用も引き起こすことなく被験体に投与することができる。当業者に周知のように、キャリアを、当然のことながら、有効成分の任意の分解を最小にし、被験体における任意の有害な副作用を最小にするように選択する。
【０２２３】
本明細書中に開示の組成物または化合物を、経口、非経口（例えば、静脈内）、筋肉内注射、腹腔内注射、経皮、体外、局所など（局所的鼻腔内投与または吸入剤による投与が含まれる）で投与することができる。本明細書中で使用する場合、「局所鼻腔内投与」は、外鼻孔の一方または両方を介した鼻および鼻道への組成物の送達を意味し、噴霧機構もしくは液滴機構、または核酸もしくはベクターのエアゾール化による送達を含むことができる。吸入剤による組成物の投与は、噴霧または液滴機構による送達によって鼻または口を介して行うことができる。挿管によって呼吸器系の任意の領域（例えば、肺）に直接送達させることもできる。組成物の正確な必要量は、被験体の種、年齢、体重、および一般的な健康状態、処置を受けるアレルギー障害の重症度、使用された特定の核酸またはベクター、ならびにその投与様式などに応じて被験体によって変化する。したがって、全ての組成物について正確な量を特定することは可能でない。しかし、当業者は、適切な量を、本明細書中に教示された日常的な実験のみを使用して決定することができる。
【０２２４】
組成物または化合物の非経口投与は、使用する場合、一般に、注射によって特徴づけられる。注射剤を、従来の形成で、液体溶液または懸濁液、注射前に液体中に懸濁する溶液に適切な固体形態、または乳濁液として調製することができる。より最近に修正された非経口投与アプローチは、一定の投薬量を維持するような遅延放出系または徐放系の使用を含む。例えば、米国特許第３，６１０，７９５号（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【０２２５】
本明細書中に開示の組成物および化合物を、薬学的に許容可能なキャリアと組み合わせて治療的に使用することができる。適切なキャリアおよびその処方物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（１９ｔｈ  ｅｄ．）ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ  １９９５に記載されている。典型的には、処方物を等張にするのに適切な量の薬学的に許容可能な塩を処方物中で使用する。薬学的に許容可能なキャリアの例には、生理食塩水、リンゲル液、およびデキストロース溶液が含まれるが、これらに限定されない。溶液のｐＨは、好ましくは、約５〜約８、より好ましくは約７〜約７．５である。さらなるキャリアには、マトリックスが成形製品の形態である（例えば、フィルム、リポソーム、または微粒子）抗体を含む固体の疎水性ポリマーの半透性マトリックスなどの徐放性調製物が含まれる。例えば、投与経路および投与される組成物の濃度に応じて、一定のキャリアがより好ましいことが当業者に明らかである。
【０２２６】
薬学的キャリアは、当業者に公知である。これらは、最も典型的には、ヒトへの薬物投与のための標準的なキャリアである（滅菌水、生理食塩水、生理学的ｐＨの緩衝化溶液などの溶液が含まれる）。組成物を、筋肉内または皮下に投与することができる。他の化合物を、当業者によって使用される標準的な手順にしたがって投与する。
【０２２７】
薬学的組成物は、選択の分子に加えて、キャリア、増粘剤、希釈剤、緩衝液、防腐剤、および界面活性剤などを含むことができる。薬学的組成物はまた、１つまたは複数の有効成分（抗菌薬、抗炎症薬、および麻酔薬など）を含むことができる。
【０２２８】
薬学的組成物を、局所処置または全身処置のいずれが望ましいかおよび処置する領域に応じて多数の方法で投与することができる。投与は、局所（眼科、膣、直腸、鼻腔内が含まれる）、経口、吸入、または非経口（例えば、点滴、皮下、腹腔内、または筋肉内注射）であり得る。開示の抗体を、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内、または経皮に投与することができる。
【０２２９】
非経口投与のための調製物には、滅菌の水溶液または非水溶液、懸濁液、および乳濁液が含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（オリーブ油など）、および注射可能な有機エステル（オレイン酸エチルなど）である。水性キャリアには、水、アルコール溶液／水溶液、乳濁液または懸濁液（生理食塩水および緩衝化溶媒が含まれる）が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸化リンゲル液、または不揮発性油が含まれる。静脈内ビヒクルには、流体および栄養補給液（ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒ）、および電解質補給液（リンゲルデキストロースにもとづくものなど）などが含まれる。防腐剤および他の添加物も存在し得る（例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなど）。
【０２３０】
局所投与のための処方物には、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、座剤、スプレー、液体、および粉末が含まれ得る。従来の薬学的キャリア、水性、粉末、または油性ベース、および増粘剤などが必要であるか望ましくあり得る。
【０２３１】
経口投与のための組成物には、粉末または顆粒、水性媒体または非水性媒体での懸濁液または溶液、カプセル、サシェ、または錠剤が含まれる。増粘剤、香味物質、希釈剤、乳化剤、分散助剤、または結合剤が望ましくあり得る。
【０２３２】
いくつかの組成物を、無機酸（塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、およびリン酸など）および有機酸（ギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、およびフマル酸など）との反応によりまたは無機塩基（水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムなど）および有機塩基（モノ、ジ、トリアルキルおよびアリールアミンおよび置換エタノールアミンなど）との反応によって形成された薬学的に許容可能な酸付加塩または塩基付加塩として潜在的に投与することができる。
【０２３３】
本明細書中に開示の治療組成物を、化合物分子をカップリングする個別のキャリアとしてのモノクローナル抗体の使用によって送達させることもできる。本開示の治療組成物を、標的化が可能な（ｔａｒｇｅｔａｂｌｅ）薬物キャリアとしての可溶性ポリマーとカップリングすることもできる。かかるポリマーには、ポリビニル−ピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピルメタクリル−アミドフェノール（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｌ−ａｍｉｄｅｐｈｅｎｏｌ）、ポリヒドロキシエチルアスパルトアミドフェノール、またはパルミトイル残基と置換されたポリエチレンオキシドポリリジンが含まれ得るが、これらに限定されない。さらに、本開示の治療組成物を、薬物の制御放出の実施に有用な生分解性ポリマークラス（例えば、ポリ乳酸、ポリイプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルソエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロ−ピラン、ポリシアノアクリレート、およびヒドロゲルの架橋または両親媒性ブロックコポリマー）とカップリングすることができる。
【０２３４】
細菌感染の、好ましくは少なくとも約３％、より好ましくは約１０％、より好ましくは約２０％、より好ましくは約３０％、より好ましくは約５０％、より好ましくは７５％、さらにより好ましくは約１００％が化合物の投与によって減少する。感染の減少を、白血球数の減少、解熱、炎症の減少、細菌数の減少、または細菌感染の他の指標の減少などのパラメーターによって決定する。細菌感染減少率を増加させるために、被験体に無毒のままで最も有効なレベルに投薬量を増加させることができる。
【０２３５】
全体を通して使用する場合、「被験体」は、個体をいう。好ましくは、被験体は、哺乳動物（非ヒト哺乳動物または霊長類、およびより好ましくはヒトなど）である。「被験体」には、飼い慣らされた動物（ｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｅｄ  ａｎｉｍａｌ）（ネコ、イヌなど）、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）、実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモットなど）、および魚類が含まれ得る。
【０２３６】
「細菌感染」を、被験体またはサンプル中の細菌の存在と定義する。かかる細菌は、被験体またはサンプルの内部または表面に天然に存在する細菌の増殖であり得るか、外来生物の侵入に起因し得る。
【０２３７】
本明細書中に開示の化合物を、抗生物質と同一の様式で使用することができる。抗生物質の使用は、当該分野で十分に確立されている。その使用の一例には、動物の処置が含まれる。必要に応じて、開示の化合物を、通常、獣医または栄養士の専門的指導の下で注射または飼料もしくは水を介して動物に投与することができる。化合物を、疾患の重症度および動物種などの環境に応じて、個別または群のいずれかで動物に送達させる。全動物が類似の免疫状態にあり、且つ全動物が同一の病原微生物に曝露されている場合、群れ全体を治療およびケアする必要があり得る。
【０２３８】
化合物の別の使用例には、細菌感染した水生動物を選択する工程、開示の化合物、キレート剤（ＥＤＴＡなど）、ＴＲＩＥＮＥを含む抗菌溶液を準備する工程、溶液にｐＨ緩衝剤を添加し、そのｐＨを約７．０と約９．０との間の値に調整する工程、水生動物をその溶液中に浸漬し、動物の微生物負荷の減少に有効な期間水生動物を溶液中に静置する工程、水生動物を溶液から出して、動物をその溶液を含んでいない水に戻す工程を含む、水生動物の微生物完成の減少が含まれる。ＥＤＴＡ、開示の化合物、ＴＲＩＥＮＥ、およびｐＨ緩衝剤を含む溶液中の水生動物の浸漬を、動物の微生物負荷が消失するまで繰り返すことができる（米国特許第６，５１８，２５２号）。
【０２３９】
本明細書中に開示の化合物の他の使用には、歯科治療および水の精製（これには、例えば、都市用水、汚物処理システム、飲料水および非飲料水の供給、および孵化場が含まれ得る）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２４０】
Ｃ．トリガー分子の生産方法
トリガー分子を産生することができる変異細菌細胞を培養する工程であって、変異細菌細胞がトリガー分子に応答性を示すリボスイッチ中に変異を含み、変異を持たない細胞と比較して、変異が変異細菌細胞によるトリガー分子の産生を増加させる、培養工程、およびトリガー分子を細胞培養物から単離し、それにより、トリガー分子を生産する工程を含む、トリガー分子を生産する方法を本明細書中に開示する。トリガー分子は、サイクリックジＧＭＰ、Ｓ−アデノシルホモシステイン、ｐｒｅＱ１、Ｍｏｃｏ、またはＳＡＭであり得る。
【０２４１】
変異細菌細胞はノックアウト変異体であり得、この細胞は、トリガー分子に応答性を示すリボスイッチを産生することができない。この細胞は、完全に除去されたリボスイッチをコードする領域を有し得る。トリガー分子の産生を、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０％、またはそれを超えて増加させることができる。これを、インタクトなリボスイッチを有する細胞によって産生される全トリガー分子の量と比較した全トリガー分子の量によって測定することができる。
【０２４２】
変異を持たない細胞と比較して変異が細胞によるトリガー分子の産生を測定可能に増加させる、トリガー分子に応答性を示すリボスイッチに変異を含む細菌細胞をさらに開示する。「測定可能に増加する」は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０％またはそれを超えるトリガー分子産生の増加を意味する。
【実施例】
【０２４３】
（実施例１）
Ａ．実施例１：ＣＭｆｉｎｄｅｒ比較ゲノミクスパイプラインを使用した細菌における２２の候補構造化ＲＮＡの同定
比較ゲノミクスに基づいたコンピュータパイプラインを細菌に適用し、２２の候補ＲＮＡモチーフを同定した。６つは、特異的代謝産物の結合に関する遺伝子発現を調節するｍＲＮＡエレメントであるリボスイッチであると考えられた。個別の研究では、これらのうちの２つが新規のリボスイッチであることが確認された。３つの他のリボスイッチ候補は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ目における推定輸送体遺伝子、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓにおけるクエン酸回路遺伝子、またはいくつかの門におけるモリブデン補因子生合成遺伝子のいずれかの上流である。残りのリボスイッチ候補である広範なＧＥＭＭ（環境、膜、および運動性の遺伝子）モチーフは、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅにおける天然のコンピテンスおよびＧｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓにおける電子受容体としての金属イオンの使用に重要な遺伝子に関連する。他のモチーフのうちの１つは、以前に公開された候補リボスイッチｙｋｋＣ／ｙｘｋＤに類似の遺伝子分布を有するが、異なる構造を有する。可能な非コードＲＮＡを、５つの門、いくつかのさらなるシス調節ＲＮＡ（ε−ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ中の１つ（プリン生合成に関与するｐｕｒＤの上流）が含まれる）、およびＣｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ中の１つ（ＡＴＰシンターゼオペロン内）で同定した。これらの候補ＲＮＡを、複数の細胞過程に関与するＲＮＡモチーフの増加しているリストに加え、多数のさらなるＲＮＡが依然として発見されていないことを示す。
【０２４４】
新規の構造化ＲＮＡの最近の発見（Ｈｅ  ２００６；Ｓｔｏｒｚ  ２００５；Ｋｉｍａ  ２００６；Ｃｌａｖｅｒｉｅ  ２００５）は、かかるＲＮＡが細胞で共通であることを示す。さらなる構造化ＲＮＡの発見を補助するために、細菌内の保存ＲＮＡを同定することができる自動化パイプラインが開発されている（Ｙａｏ  ２００７）。このパイプラインは、相同遺伝子のｍＲＮＡの潜在的な５’ＵＴＲ（非翻訳領域）を構築し、ＣＭｆｉｎｄｅｒ（Ｙａｏ  ２００６）プログラムを使用して各ＵＴＲ組内の保存ＲＮＡ構造（すなわち、「モチーフ」）を推定する。次いで、自動化相同検索を使用して、これらのモチーフのさらなる例を見出し、ＣＭｆｉｎｄｅｒを使用して各モチーフの二次構造モデルおよび配列アラインメントを改良する。推定されるＲＮＡ二次構造を有するアラインメント組を出力し、これらのアラインメントをその後に手作業で分析してモデルを改善し、どのモチーフがさらなる研究に有利であるかを評価する。
【０２４５】
ＲＮＡに対する他の自動化検索が実施されているにもかかわらず（Ｂａｒｒｉｃｋ  ２００４；Ｃｏｒｂｉｎｏ  ２００５；Ａｘｍａｎｎ  ２００５；Ｓｅｌｉｖｅｒｓｔｏｖ  ２００５；ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ  ２００３；Ｃｏｖｅｎｔｒｙ  ２００４；Ｗａｓｈｉｅｔｌ  ２００５；Ｐｅｄｅｒｓｅｎ  ２００６；Ｔｏｒａｒｉｎｓｓｏｎ  ２００６）、このパイプライン（Ｙａｏ  ２００７）を、３つの特徴によってこれらの検索から識別する。第１に、このパイプラインはＣＭｆｉｎｄｅｒを使用し、このＣＭｆｉｎｄｅｒは、いくつかの入力配列がモチーフを含まないか、非関連配列ドメインを保有するモチーフの代表を含むかのいずれかである場合でさえ、モチーフを発見することができる。ＣＭｆｉｎｄｅｒはまた、配列保存が低い場合でさえも有用なアラインメントを生成することができるが、このアルゴリズムは配列が類似するのもは何でも活用する。第２に、このパイプラインは、相同性検索を統合して各モチーフのアラインメントおよび構造モデルを自動的に洗練させる。第３に、このパイプラインは相同遺伝子のＵＴＲをアラインメントするので、シス調節ＲＮＡを見い出すのに適しており、配列保存に対するその依存性がさらに減少する。
【０２４６】
実際、テストケースとして細菌門Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓを使用して、このパイプラインが事実上全ての公知のシス調節ＲＮＡを有用に予想することが以前に証明された（Ｙａｏ  ２００７）。パイプラインはまた、これらが偶然に相同遺伝子の上流である場合にトランスにコードされたＲＮＡ（すなわち「非コードＲＮＡ」（ｎｃＲＮＡ））である可能性が高いモチーフを見い出す。
【０２４７】
このパイプラインを使用して、そのゲノムが配列決定された全細菌の間の構造化ＲＮＡを見い出すことができる。保存された構造化ＲＮＡである可能性が高い２２モチーフを記載する。リボスイッチ（特定の小分子を直接感知して遺伝子発現を調節するｍＲＮＡ中に通常見出される構造化ＲＮＡ型）が主な研究対象であった（Ｗｉｎｋｌｅｒ  ２００５；Ｂａｔｅｙ  ２００６）。その後の実験により、これらのモチーフのうちの２つが新規のリボスイッチであることが確認された。第１のモチーフはＳＡＨ（Ｓ−アデノシルホモシステイン）に結合し（図１）、第２のモチーフはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒおよび関連種におけるＳＡＭ（Ｓ−アデノシルメチオニン）結合リボスイッチである。別のリボスイッチ候補を使用した実験の証拠は、これがモリブデン補因子（すなわち、「Ｍｏｃｏ」）を感知することを示す。
【０２４８】
特に興味深い候補は、リボスイッチに典型的な性質を有するＧＥＭＭ（環境、膜、および運動性の遺伝子）モチーフである。例えば、ＧＥＭＭは、広範且つ高度に保存された遺伝子エレメントであり、３０９例のうち２９７例で、隣接する読み取り枠（ＯＲＦ）の５’ＵＴＲ中に存在する可能性が高くなるように配置されている。ＧＥＭＭによって調節されると予想される遺伝子は、典型的に、細胞外条件に対する感知および反応に関連し、ＧＥＭＭがシグナル伝達または細胞間情報交換のために産生された代謝産物を感知することができると示唆される。
【０２４９】
１．材料と方法
ｉ．候補ＲＮＡモチーフの同定
保存ドメインデータベース（Ｍａｒｃｈｌｅｒ−Ｂａｕｅｒ  ２００５）バージョン２．０８で分類された遺伝子の潜在的な５’ＵＴＲを、コンピュータパイプラインの入力として使用した（Ｙａｏ  ２００７）。完成したゲノム配列および遺伝子の位置を、ＲｅｆＳｅｑ（Ｐｒｕｉｔｔ  ２００５）バージョン１４から取り出したが、その遺伝子含量が他のゲノムと高度に類似するゲノムを排除した。ＵＴＲ抽出アルゴリズム（Ｎｅｐｈ  ２００６）により、オペロン構造のためにＵＴＲが常に遺伝子のすぐ上流に存在し得ないという事実が説明された。
【０２５０】
各保存ドメインについて、収集された潜在的ＵＴＲ配列をＣＭｆｉｎｄｅｒバージョン０．２へのインプットとして供し、ＵＴＲ組内の構造的に保存されたモチーフの複数の局所配列アラインメントを生成した。次いで、誤注釈づけされたＯＲＦの理由を明らかにするために遺伝子間領域が両末端上の５０ヌクレオチドまで伸長したことを除き、これらのアラインメントを使用して、注釈づけされた遺伝子間領域内のさらなるホモログを検索した。この相同性検索を、ＭＬ−ヒューリスティックフィルタ（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  ２００６）を備えたＲＡＶＥＮＮＡプログラムバージョン０．２ｆ（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  ２００４；Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  ２００４ｉｉ；Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  ２００６）、Ｉｎｆｅｒｎａｌ（Ｅｄｄｙ  ２００５）バージョン０．７によって実行した大域モードにおける共分散モデル（Ｅｄｄｙ  １９９４）、およびＥ値（Ｋｌｅｉｎ  ２００３）カットオフ１０を使用して行った。次いで、ＣＭｆｉｎｄｅｒを、これらの新規のホモログを使用して、その最初のアラインメントを洗練させた。公知のＲＮＡを、Ｒｆａｍデータベース（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ  ２００５）バージョン７．０に基づいて検出した。短い配列の系統発生的保存、種の多様性、および構造基準に基づいて予想をスコアリングした。パイプラインアルゴリズムは、他の場所により詳細に記載されている（Ｙａｏ  ２００７）。
【０２５１】
細菌ゲノム配列データをグループ分けし、ＵＴＲ抽出を行い、各群について個別にモチーフ予想および相同性検索を行った。これは、異なる門におけるＵＴＲがしばしば同一モチーフを含まないという事実によって動機付けされた。しかし、わずかな配列決定したメンバーを有する門を分類学に基づいて融合して、モチーフを予測するのに十分な配列データをアセンブリすることを試みた。１つまたは２つの配列決定したメンバーしか持たない門（例えば、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｉ）を無視した。以下の８群を使用した：（１）Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ、（２）Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、（３）α−ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、（４）β−ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、（５）γ−ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、（６）δ−およびε−ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、（７）Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、および（８）Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、Ｃｈｌｏｒｏｂｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｅ、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ、およびＳｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ。
【０２５２】
ｉｉ．候補モチーフの分析および相同性検索ストラテジー
次いで、有望なモチーフを選択し、さらなる相同性検索の実施によってこれらをさらに分析し、そのアラインメントをＲＡＬＥＥで編集した（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ  ２００５）。ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  １９９７）、Ｍｆｏｌｄ（Ｚｕｋｅｒ  ２００３）、Ｒｎａｌｌ（Ｗａｎ  ２００４）を使用し（ｒｈｏ非依存性転写ターミネーターを同定するため）、ＣＭｆｉｎｄｅｒおよびＲＡＶＥＮＮＡを使用してこれらの分析を補助した。モチーフに関連する代謝経路に関する情報を、ＫＥＧＧ（Ｋａｎｅｈｉｓａ  ２００６）から検索した。さらなる構造エレメントの同定によってアラインメントを拡大するために、アラインメントのその５’末端および３’末端を５０〜１００ヌクレオチド伸長し、必要に応じて、ＣＭｆｉｎｄｅｒを使用するか手作業の検査のいずれかによって再アラインメントした。
【０２５３】
ホモログのさらなる検索に、いくつかの方法でＲＡＶＥＮＮＡを使用した。大域モードおよび局所モード（Ｅｄｄｙ  ２００５）の共分散モデル検索の両方により、相補性の結果が得られた。手作業で指示する検索で使用した配列データベースは、ＲｅｆＳｅｑバージョン１９（Ｐｒｕｉｔｔ  ２００５）の「微生物」サブセット、ならびに酸性鉱山廃液（Ｔｙｓｏｎ  ２００４）（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション  ＡＡＤＬ０１００００００）およびサルガッソー海（Ｖｅｎｔｅｒ、２００４）（ＡＡＣＹ０１００００００）由来の環境ショットガン配列であった。
【０２５４】
適切な場合、これらの配列の４種のサブセットを検索した。第１に、環境配列データを必ずしも使用したわけではなかった。第２に、モチーフが本来由来する細菌群中のゲノムのみを検索した（例えば、β−ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）。第３に、遺伝子間領域（前述のように５０ヌクレオチド伸長した）のみを検索した。第４に、ＢＬＡＳＴプログラムであるｔｂｌａｓｔｎを使用して、モチーフに関連する遺伝子と相同な遺伝子を検索した。次いで、ＲＡＶＥＮＮＡ検索を、これらのマッチの２Ｋｂ上流（５’ＵＴＲを含むと予想される）および２００ヌクレオチド下流に対して行った（見かけ上のコード相同性が真のＯＲＦの上流を伸長し、それにより、ＢＬＡＳＴが開始コドンを誤同定し得るので）。ＢＬＡＳＴデータベースとしてモチーフの細菌群を使用することにより、高度に多様なホモログの発見が容易になった。例えば、ε−ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａにおけるｐｕｒＤ遺伝子上流の検索により、短縮ステムを有するｐｕｒＤモチーフのホモログ（以下を参照のこと）が明らかとなった。さらに、かかる小さなデータベースを使用して、ＭＬ−発見的フィルタをＲＡＶＥＮＮＡで先に行った。ＢＬＡＳＴデータベースとして全配列組を使用する場合、この配列組は他の門のホモログを見い出すのに役立ち得る。
【０２５５】
ｉｉｉ．モチーフの排除
モチーフが構造化ＲＮＡに特徴的な特徴を示すことができなかった場合、モチーフをさらなる研究から排除した。構造予測を誤ったモチーフの排除を補助するために、配列情報のみを使用して予想された構造中の全ての塩基対を除去することによって相同性検索を行った。構造が保存されない配列ベースのマッチは、予想した構造が不正確であることを示す。しかし、かかるホモログを、構造が保存されると仮定する共分散モデルによって除外することができる。配列ホモログによって提案された構造が実際は不十分に保存されていたことが明らかになった場合、いくつかのモチーフをこのストラテジーを使用して排除した。
【０２５６】
ｉｖ．コンセンサス図についての保存および共変動の範囲の確立
コンセンサス図中で反映された保存範囲を確立するために（例えば、図１中）、配列に加重して高度に類似するホモログの重要性を減じた。加重にはＩｎｆｅｒａｌ（Ｅｄｄｙ  ２００５）によって実行されるＧＳＣアルゴリズム（Ｇｅｒｓｔｅｉｎ  １９９４）を使用し、次いで、加重ヌクレオチド頻度を複数の配列アラインメント中の各位置で計算した。塩基対を共変動として分類するために、ワトソン−クリックまたはＧ−Ｕ対の加重頻度を計算した。しかし、両ヌクレオチドが除外されていたか、いずれかのヌクレオチドの同一性が不明であった（例えば、４つのいずれかの塩基を示す「Ｎ」であった）アラインメント配列を破棄した。２つの配列がモチーフを保有する配列のうちの両方の位置が異なるワトソン−クリックまたはＧ−Ｕ対を有していた場合、共変動位置として分類した。１つの位置のみが異なっていた場合、オカレンスを適合性変異として分類した。しかし、非ワトソン−クリックまたはＧ−Ｕ対の頻度が５％を超えた場合、これらの位置を、共変動または適合性変異と注釈付けしなかった。
【０２５７】
２．結果
ｉ．新規のＲＮＡモチーフの評価および分析
ＣＭｆｉｎｄｅｒパイプラインによって予測された有望な構造化ＲＮＡモチーフを手作業で試験して、コンセンサス配列および構造モデルを洗練させ（材料と方法を参照のこと）、可能な機能に関する情報を得た。各候補についての重要な所見を表１にまとめている。同定された２２のモチーフのうちの７つを図１に示す。
【０２５８】
表１．推定構造化ＲＮＡモチーフのまとめ。「ＲＮＡ」＝ＲＮＡとして機能する（ｄｓＤＮＡと対照的）、「Ｃｉｓ」＝シス調節性、「スイッチ」＝リボスイッチ。評価：「Ｙ」＝確実に真、「ｙ」＝おそらく真、「？」＝可能性あり、「ｎ」＝おそらく真でない、「Ｎ」＝確実に真でない。これらの評価を、実験的試験前に行った。残りの列は、以下である：「門／綱」（モチーフを含む門またはｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａについては綱）、「Ｍ，Ｖ」（「Ｍ」＝モジュラーステム（時々しか存在しないステムである）を有する、「Ｖ」＝可変長ステム）、「Ｃｏｖ．」＝共変動対合の位置の数（方法を参照のこと；この数字のみによってモチーフを分類することは望ましくなく、むしろ、全体としてアラインメントを評価すべきであることに留意のこと）、「＃」＝代表数、「Ｎｏｎ  ｃｉｓ」＝Ｘ／Ｙ（ここで、Ｘは遺伝子に対して５’調節性立体配置にない代表数であり、Ｙは注釈づけされた遺伝子を有する配列内の代表数である（いくつかのＲｅｆＳｅｑ配列は注釈づけを欠く））。ＭｏｃｏおよびＳＡＭ−ＩＶリボスイッチデータを、将来の報告で示す。ガンマ−１５０および球菌−１は、付録のみに示す。
【０２５９】
【表１】
2010528617.tif 000002
さらなる研究のための候補ＲＮＡモチーフを選択するための決定は、配列および構造の両方、共変動、および遺伝子コンテクスト（例えば、モチーフが特定の遺伝子ファミリーの上流に常に存在するかどうか）の保存の定量的評価に基づいた。構造化ＲＮＡは、通常、領域中に複雑な三次元構造を形成するか、他の制約下にある多数の保存ヌクレオチドを有するので、保存配列は重要である。構造化ＲＮＡは、時折、可変長ステムまたは「モジュラーステム」（いくつかであるが全てではない代表の中に存在するステム）を有する。ステムの両側が共に出現するかいずれも出現しないという事実は、共変動に類似し、構造が保存されるという証拠である。
【０２６０】
リボスイッチなどのシス調節ＲＮＡは、ｍＲＮＡ遺伝子を調節するｍＲＮＡ領域である。細菌では、ほとんどのシス調節ＲＮＡは、調節下でｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中に見出される。転写開始部位を確実に予想することが可能ではないにもかかわらず、エレメントがｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中に存在し得る場合（転写開始部位がエレメントに対して５’にある場合）、モチーフの代表は遺伝子に対して「５’調節立体配置」に存在すると宣言される。ほとんどまたは全てのモチーフの代表が遺伝子に対して５’調節立体配置にある場合、これは、モチーフがシス調節機能を有することができるという証拠である。
【０２６１】
シス調節ＲＮＡは、しばしば、以下の２つの注目すべき構造の特徴のうちの１つを有する：ｒｈｏ非依存性転写ターミネーターまたはシャイン−ダルガルノ配列（細菌リボゾーム結合部位）と重複するステム（Ｗｉｎｋｌｅｒ  ２００５）。ｒｈｏ非依存性転写ターミネーターは、強力なヘアピンおよびその後の４つ以上のＵ残基からなる（Ｈｅｎｋｉｎ  ２００２）。調節ＲＮＡドメインは、ターミネーターステムの条件付き形成によって遺伝子発現を調節することができる。同様に、条件付きで形成されたステムは、シャイン−ダルガルノ配列と重複し、それにより、翻訳レベルで遺伝子を調節することができる（Ｗｉｎｋｌｅｒ  ２００５）。
【０２６２】
本研究で同定された、いくつかのモチーフは、１つまたはタンデムなヘアピンからなる。これらのうちのいくつかは、ホモ二量体タンパク質が逆鎖（ｏｐｐｏｓｉｔｅ  ｓｔｒａｎｄ）中の所与のＤＮＡベースのエレメントに結合するタンパク質結合モチーフである可能性がある。便宜上、モチーフが構造化ＲＮＡを形成できないか、ｍＲＮＡレベルで機能できないにもかかわらず、かかるモチーフは５’調節立体配置を有するとも説明される。
【０２６３】
ｉｉ．ＧＥＭＭモチーフ
ＧＥＭＭは細菌に広範に存在し、高度に保存された配列および構造を有するようであり、推定ＲＮＡに実質的な生化学的制約を課する機能が示唆される。３２２のＧＥＭＭ配列がグラム陽性細菌およびグラム陰性細菌の両方で見出された。これはδ−ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、特にＧｅｏｂａｃｔｅｒおよび関連する属で共通である。γ−ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ内で、ＡｌｔｅｒｏｍｏｎａｄａｌｅｓおよびＶｉｂｒｉｏｎａｌｅｓに遍在する。ＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓおよびＰｌａｎｔｏｍｙｃｅｔｅｓ門の一定の目でも共通である。ＧＥＭＭを有する重要な病原体には、コレラおよび炭疽の原因病原体が含まれる。
【０２６４】
配列データが遺伝子注釈づけを含む３０９のＧＥＭＭ例のうち、ＧＥＭＭは、２９７の例で遺伝子に対して５’調節立体配置にあり、これはシス調節の役割を意味する。おそらくＧＥＭＭによって調節される遺伝子は広範な機能を示すが、ほとんどの遺伝子は細胞外環境または膜に関連し、多数の遺伝子は運動性に関連する。
【０２６５】
ＧＥＭＭは、Ｐ１およびＰ２と指定した２つの隣接するヘアピン（対合領域）からなる（図１および３）。Ｐ１は、配列および構造中で高度に保存されており、３−ヌクレオチド内部ループによって分離された２塩基対および６塩基対のステムからなり、末端ループによってキャッピングされている。内部ループは高度に保存されており、末端ループはほぼ必ずＧＮＲＡテトラループである（Ｈｅｎｄｒｉｘ  １９９７）。Ｐ１ステムは、いくつかの位置で共変動するという相当な証拠があり、広範な細菌にわたって構造において高度に保存されている。この事実ならびにＰ２のより適度な共変動および可変長ステムにより、ＧＥＭＭが構造化ＲＮＡとして機能する強力な証拠が得られる。実施例２は、ＧＥＭＭモチーフがリボスイッチ中で機能することを証明している。Ｐ１およびＰ２に連結する配列は、事実上常にＡＡＡであり、３２２の例で例外はわずか２つである。
【０２６６】
Ｐ２ヘアピンは、Ｐ１よりも適度に保存される。Ｐ１テトラループがＧＡＡＡである場合、ＧＮＲＡテトラループ受容体は、通常はＰ２中に出現する。この受容体は、しばしば、周知の１１−ｎｔモチーフであり、ＧＡＡＡループに支持され得るが、いくつかの配列は新規のテトラループ受容体であり得る。Ｐ１がＧＹＲＡテトラループを有する場合、Ｐ２塩基により近いバルジが時折見出されるにもかかわらず、受容体様配列はほとんど存在しない（図２）。
【０２６７】
多数のＧＥＭＭ例には、ｒｈｏ非依存性転写ターミネーターヘアピンが含まれる。ターミネーターステムの５’側は、しばしば、Ｐ２ステムの３’側と重複する（そしておそらく競合する）（図２Ｂ）。ＧＥＭＭがリボスイッチである場合、リガンド結合は、提案されたＰ１およびＰ２構造を安定化し、それにより、競合する転写ターミネーターの形成を防止することができる。このモデルでは、より高いリガンド濃度によって遺伝子発現が増加する。δ−ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ中のＧＥＭＭ代表の１／３および他の分類群のいくつかは、「タンデム」配置にあり、ある例では、同一ＵＴＲ中の別の場所の３’および別の場所付近に見出される。調節ＲＮＡのかかる配置は、簡潔な調節ＲＮＡ立体配置によって許容されるよりも精巧な遺伝子発現調節に関与する（Ｓｕｄａｒｓａｎ  ２００６；Ｗｅｌｚ  ２００７；Ｍａｎｄａｌ  ２００６）。
【０２６８】
ＧＥＭＭの生化学的役割の理解により、広範な種々の微生物過程を明らかにすることができ、ＧＥＭＭは微生物過程を調節するようである。実際、ＧＥＭＭは、既にいくつかの研究対象とされているＶｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅおよびＧｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓ種における２つの系に関与する。Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅはヒトでコレラを引き起こすが、その生活環の多くを水中で過し、多数の甲殻類のキチン含有外骨格に接着することができる。キチン（ＧｌｃＮＡｃ（Ｎ−アセチルグルコサミン）のポリマー）は、多数のＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅの遺伝子発現に影響を及ぼすことが示されている（Ｍｅｉｂｏｍ  ２００４）。ＧＥＭＭは、これらのキチン誘導性遺伝子の２つを調節するようである。第１のｇｂｐＡは、キチンビーズ（Ｍｅｉｂｏｍ  ２００４）およびヒト上皮細胞（Ｋｉｒｎ  ２００５）への接着ならびにマウス感染（Ｋｉｒｎ  ２００５）に重要である。
【０２６９】
第２のキチン誘導性遺伝子はｔｆｏＸＶＣである。注目すべきことに、キチンは、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅにおける天然のコンピテンスを誘導し（Ｍｅｉｂｏｍ  ２００５）、ｔｆｏＸＶＣ発現はこのコンピテンスに不可欠である。Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅは、個別のｔｆｏＸドメインに対応するＣＤＤモデルであるＣＯＧ３０７０およびｐｆａｍ０４９９４に適合する２つの遺伝子を有する。両ドメインから１０−２５より良好なＲＰＳＢＬＡＳＴ（Ｓｃｈａｆｆｅｒ  ２００１）Ｅ値が得られる。これらのうちの１つはｔｆｏＸＶＣ（ＶＣ１１５３遺伝子座）である。ＧＥＭＭは、ｔｆｏＸＧＥＭＭ（ＶＣ１７２２）と呼ばれる他の遺伝子を調節するようである。したがって、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅおよび関連細菌では、ＧＥＭＭは、キチン誘導性コンピテンスに関与し得るか、高濃度のキチンを含まない環境下でコンピテンスでさえも調節することができる。
【０２７０】
Ｇｅｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓおよび関連するδ−ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａは、電子受容体としてＦｅ（ＩＩＩ）などの金属イオンを使用して有機化合物を酸化することによってＡＴＰを生成することができる（Ｍｅｔｈｅ  ２００３）。ＧＥＭＭは、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ種におけるピリ線毛アセンブリ遺伝子に関連する。Ｇ．ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓにおけるピリ線毛は、導電性を示しており（Ｒｅｇｕｅｒａ  ２００５）、したがって、金属イオンの還元過程の一部である。
【０２７１】
さらに、ＧＥＭＭは、Ｇ．ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓにおいて７つのチトクロームｃ遺伝子を調節するようである。この細菌が１１１の推定チトクロームｃ遺伝子を有するにもかかわらず、７つのＧＥＭＭ関連遺伝子のうちの５つが以前の研究で同定されており、特別な役割を有し得る。ＯｍｃＳ（外膜チトクロームＳ）は、Ｇ．ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓの外膜上に非常に豊富な２つのタンパク質のうちの１つであり、不溶性酸化鉄（ＩＩＩ）の還元に必要であるが、可溶性クエン酸鉄（ＩＩＩ）には必要でない（Ｍｅｈｔａ  ２００５）。ＯｍｃＧおよびＯｍｃＨは、ＯｍｃＢ（多くの条件下で不可欠なチトクロームｃ）の産生に必要である（Ｋｉｍｍ  ２００６）。ＯｍｃＡおよびＯｍｃＴは、ＯｍｃＧ、ＯｍｃＨ、またはＯｍｃＳと関連する。４つの他のＯｍｃ注釈づけのみがＧＥＭＭと直接関連しないＧ．ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓに残存する（ＯｍｃＢ、ＯｍｃＣ、ＯｍｃＥ、およびＯｍｃＦ）。
【０２７２】
公知のリボスイッチと異なり、ＧＥＭＭは、非常に多様な遺伝子機能に関連する（表２）。この所見は、ＧＥＭＭリボスイッチが代謝経路の調節のための典型的なフィードバックセンサーとしての機能を果たさないことを示す。むしろ、ＧＥＭＭは、シグナル伝達、またはおそらく細胞間情報交換に関与する第２のメッセンジャー分子を感知する（Ｂａｓｓｌｅｒ  ２００６）。実施例２は、ＧＥＭＭモチーフの二次メッセンジャートリガー分子がサイクリックジＧＭＰであることを証明している。この方法では、異なる細菌は、異なる過程を調節するためにＧＥＭＭおよびそのシグナル伝達分子を使用する。多数のＧＥＭＭ関連遺伝子がシグナル伝達ドメインをコードするという事実は、多数のシグナル伝達タンパク質が調節される機構を示す。実施例２は、ＧＥＭＭ  ＲＮＡが実際に新規に見出されたリボスイッチクラスのアプタマー成分としての機能を果たすことを証明している。
【０２７３】
【表２】
2010528617.tif 000003
ｉｉｉ．ＳＡＨモチーフ
ＳＡＨモチーフは、配列および構造中で高度に保存されており（図１）、予想されるステム領域内の共変動を示す（モジュラーステムおよび可変長ステムが含まれる）。ＳＡＨモチーフは、ＳＡＨ（Ｓ−アデノシルホモシステイン）代謝に関連する遺伝子に対して５’調節立体配置、主に、β−およびいくつかのγ−ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、特にシュードモナス属中で見出される。ＳＡＨは、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）代謝回路の一部であり、その主な成分には、アミノ酸メチオニンおよびその誘導体ホモシステインが含まれる。ＳＡＨは、メチル化反応の補因子としてＳＡＭを使用する酵素の副生成物である。典型的には、ＳＡＨは、ホモシステインおよびアデノシンに加水分解される。次いで、ホモシステインを使用して、メチオニンを合成し、最終的にＳＡＭを合成する。
【０２７４】
ＳＡＨが多数のＳＡＭ依存性メチルトランスフェラーゼを阻害するので、高レベルのＳＡＨは細胞に有毒である（Ｕｅｌａｎｄ  １９８２）。したがって、細胞は、ＳＡＨ濃度の上昇を感知し、有毒レベルに到達する前にこの化合物を破棄する必要がある可能性が高い。ＳＡＨモチーフが関連する遺伝子は、メチオニン合成で使用されるメチル供与体を合成するＳ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ（ａｈｃＹ）、コバラミン依存性メチオニンシンターゼ（ｍｅｔＨ）、およびメチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ（ｍｅｔＦ）である。ＳＡＨモチーフのこの遺伝子配置およびその高保存度は、ＳＡＨの感知およびその産物がＳＡＨ破壊に必要な遺伝子の発現の活性化での役割と一致する。実際、生化学的および遺伝的証拠は、このモチーフがＳＡＨ感知リボスイッチであるという仮説を支持する。
【０２７５】
ｉｖ．ＣＯＧ４７０８モチーフ
このモチーフは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのいくつかの種およびＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓのＣＯＧ４７０８遺伝子の上流に見出されるが、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのＣＯＧ４７０８遺伝子ファミリーのいくつかの例では推定ＲＮＡモチーフを欠く。ＣＯＧ４７０８遺伝子は、膜タンパク質をコードすると予想される。
【０２７６】
ＣＯＧ４７０８モチーフ（ｐｒｅＱ１−ＩＩモチーフともいうことができる）は系統発生学的に高度に制約されており、６つの固有の配列しか持たないにもかかわらず、このモチーフは、共変動、モジュラーステム、および可変長ステムを示す（図１）。モチーフは、ＣＯＧ４７０８遺伝子のシャイン−ダルガルノ配列と重複するシュードノットを有し、モチーフがこれらの遺伝子のシスレギュレーターをコードすることを示す。
【０２７７】
改変核酸塩基ｐｒｅＱ１を感知するリボスイッチが最近特徴づけられた（Ｒｏｔｈ  ２００７）。このリボスイッチがＣＯＧ４７０８と関連するので、ＣＯＧ４７０８がｐｒｅＱ１に関連する代謝産物の輸送体であることが提案された。したがって、ＣＯＧ４７０８モチーフがｐｒｅＱ１感知リボスイッチでもあると考えられた。実験はこのことを支持している。ＣＯＧ４７０８モチーフは、以前に特徴づけられたｐｒｅＱ１感知リボスイッチ（Ｒｏｔｈ  ２００７）と配列や構造が類似しない。
【０２７８】
ｖ．ｓｕｃＡモチーフ
ＳｕｃＡモチーフは、関連下流遺伝子であるｓｕｃＢ／ａｃｅＦおよびｌｐｄと同時転写される可能性が高いｓｕｃＡ遺伝子に対して５’調節立体配置中のみで見出される。これらの３つの遺伝子産物は、クエン酸回路中で２−オキソグルタル酸塩からスクシニル−ＣｏＡを合成する。ｓｕｃＡモチーフの全ての検出例は、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ目の中のβ−ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａにある。ｓｕｃＡモチーフ中の多数のヌクレオチドが厳格に保存されているが、そうでないヌクレオチドは、共変動を示し、非標準的塩基対をほとんど含まない（図１）。モチーフは推定シャイン−ダルガルノ配列と重複するステムを有し、それにより、ｓｕｃＡモチーフはシス調節ＲＮＡに対応することができる。ｓｕｃＡモチーフの比較的複雑な構造は、これがリボスイッチであり得ることを示す。
【０２７９】
ｖｉ．２３Ｓ−メチルモチーフ
本モチーフは、２３ＳｒＲＮＡに作用することができるｒＲＮＡメチルトランスフェラーゼと注釈づけされた遺伝子の上流に一貫して存在する。２３Ｓ−メチルＲＮＡが、逆鎖上の介在配列中の他の遺伝子と共に２３ＳｒＲＮＡメチルトランスフェラーゼＯＲＦからおよそ３Ｋｂに存在する場合、１つの例外が見出される。２３Ｓ−メチルモチーフは、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓの目であるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓに限定される。
【０２８０】
２３Ｓ−メチルモチーフは、２つの大きなヘアピンからなる。第２のヘアピンは一続きのＵで終結し、ｒｈｏ非依存性転写ターミネーターであり得る。両ステムは相当な共変動を有し、これらが機能的ＲＮＡの一部であるという強力な証拠が得られる。構造モデルは多数の対合位置が時折非標準的塩基対を有することを示すにもかかわらず、モチーフの各例は主にエネルギー的に好ましい対からなる。推定転写ターミネーターの存在は、これがシス調節ＲＮＡであることを示す。２３ＳｒＲＮＡメチルトランスフェラーゼがＲＮＡ基質と相互作用するので、リボゾームタンパク質遺伝子の自己調節と類似の様式で２３Ｓ−メチルモチーフを使用してその発現を自己調節することができる（Ｚｅｎｇｅｌ  １９９４）。
【０２８１】
ｖｉｉ．ｈｅｍＢ／抗ｈｅｍＢモチーフ
本モチーフは、種々のβ−ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、特にＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａで見出される。転写され得るＤＮＡ鎖に関していくつかの多義性が存在し、これは、その構造が類似する共変動および両方向での保存を示すからである。ある方向では、これはしばしばｈｅｍＢ遺伝子の上流にある。これはこの方向でシス調節ＲＮＡであり得るが、ｈｅｍＢモチーフ代表のすぐ下流に存在する相互に相同でない２つの遺伝子が存在し、これらはシス調節ＲＮＡの通常の様式で調節されるべき誤った鎖上に存在する。他の方向では（アンチｈｅｍＢ）、モチーフは、典型的には、遺伝子の５’ＵＴＲに存在しない。アンチｈｅｍＢモチーフは、転写ターミネーターヘアピンで終結する。アンチｈｅｍＢ例下流の多数の遺伝子は、逆鎖上にあり、したがって、アンチｈｅｍＢが非コードＲＮＡをコードすることができることを示す。
【０２８２】
ｖｉｉｉ．ＭＡＥＢ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａにおける代謝関連エレメント）
本モチーフは、いくつかの保存された位置を有する１つのヘアピンからなる（図１）。これはＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ（β−ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ属）に広範に存在する。これは、典型的には保存されたリンカー配列と共に連続して複数回見出されるが（２〜６コピー）、２つの例中で１２コピーにも及ぶ。単一または反復ＭＡＥＢモチーフの１４１個のオカレンスのうちの１３２個は遺伝子に対して５’調節立体配置内に存在する。実際、これらの多数の遺伝子は、一次代謝に直接関与し（例えば、小分子の生合成、異化、または輸送に関与する遺伝子）、ＤＮＡ修復、複製、シグナル伝達、または運動性などの遺伝子ではない。１つを超える例中のＭＡＥＢ下流の４６個の保存ドメイン（仮説上の遺伝子を除く）のうち、少なくとも４２個を、一次代謝に関与すると注釈づけする。一次代謝に関与しない多数の細菌遺伝子が存在するので、これらのデータは代謝遺伝子調節との機能的関連を示す。
【０２８３】
ＭＡＥＢと豊富なグリシンに対する細胞応答との間の関係が存在し得る。ＭＡＥＢはｇｃｖＰおよびｇｃｖＴ（グリシン切断系の一部である）と頻繁に関連し、過剰なグリシンがクエン酸回路に流れ込む。ＭＡＥＢはまた、いくつかのクエン酸回路遺伝子に関連する。しかし、ＭＡＥＢは、グリシンまたはクエン酸回路とより希薄な関係を有するいくつかの他の遺伝子と関連する。最も多数のＭＡＥＢ反復がこの系中のｇｃｖ遺伝子と関連するので、グリシン切断系との関係が存在し得る。さらに、グリシンに結合する少なくとも１つのリボスイッチクラスが存在するが、このクラスは、ＭＡＥＢを有する生物中のゲノムあたりたった１コピーでしか存在せず、ＭＡＥＢのためのグリシン調節での役割に留まり得る。
【０２８４】
ＭＡＥＢモチーフの代表は、塩基対合を保存する共変動を示すが、他は対合を破壊する変異を保有する。この事実は、実際に、これが、各タンパク質単位が逆鎖に結合するようにタンパク質二量体に結合するＤＮＡ配列であり得る。対称的な位置の１つの対でのヌクレオチドは、ステムの両側でプリン（ＡまたはＧ）として保存される。プリンがワトソン−クリック対では決してないので、プリンは逆鎖上に同じ同一性を持つことができない。ＤＮＡ結合モチーフの例が異なり得ることが予想されるにもかかわらず、対称プリンは、モチーフ自体（単に例ではない）が逆鎖上に異なるパターンを有することを意味する。
【０２８５】
ｉｘ．ミニ−ｙｋｋＣモチーフ
ミニ−ｙｋｋＣモチーフは、そのステムが相当な共変動を示し、そのループが特徴的なＡＣＧＲモチーフを有する２つのタンデムヘアピンからなる（図１）。ミニ−ｙｋｋＣは、α−、β−、およびγ−ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａに広範に存在し、他の分類群にさらなる例が存在する。前記ｙｋｋＣ／ｙｘｋＤモチーフと類似の遺伝子組のシス−レギュレーターのようであるので、本モチーフをミニ−ｙｋｋＣと命名した（Ｂａｒｒｉｃｋ  ２００４）（以後「ｙｋｋＣ」と呼ぶ）。ｙｋｋＣおよびミニ−ｙｋｋＣに共通の８つ全ての保存ドメインを以下に列挙する。ｙｋｋＣおよびミニ−ｙｋｋＣの構造は無関係のようである。
【０２８６】
ｙｋｋＣモチーフは、高度に構造化され、広範に保存されたモチーフである。しかし、ミニ−ｙｋｋＣの簡潔な構造は、その広範な系統発生によって広範な保存を指示する機能が示唆されるにもかかわらず、ほとんどの他のリボスイッチに特徴的ではない。比較的狭い一連の遺伝子機能に関連し、そのコード領域に近い（９０％がシャイン−ダルガルノ配列の３３ヌクレオチド内に存在する）ので、ミニ−ｙｋｋＣは、シス調節エレメントのようである。遺伝子発現を調節するために使用される機構が異なり得るにもかかわらず、ミニ−ｙｋｋＣはｙｋｋＣモチーフと同一の役割を果たすことができる。たった１つのヘアピンを有するミニ−ｙｋｋＣの例が存在し得ることに留意のこと。
【０２８７】
ｘ．ＰｕｒＤモチーフ
ＰｕｒＤモチーフは、完全に配列決定されたε−ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ（例えば、ＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒおよびＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）中の全ｐｕｒＤ遺伝子の上流に見出される。ｐｕｒＤ遺伝子は、プリン生合成に関与するＧＡＲ（ホスホリボシルグリシンアミド）シンセターゼをコードする。ｐｕｒＤモチーフは、塩基対合を破壊するいくつかの変異も示すが、共変動およびモジュラーステムを示す（図１）。
【０２８８】
ｘｉ．６Ｃモチーフ
本モチーフはＡｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａに広範に存在し、２つのヘアピンからなり、各ヘアピンのループは、少なくとも一続きの６Ｃを含む。６Ｃモチーフは、そのステム中に顕著な共変動を示す。６Ｃモチーフ例は、通常、染色体分配およびピリ線毛アセンブリに関連すると予想される遺伝子に適度に近い（２００〜３００ヌクレオチド）。
【０２８９】
ｘｉｉ．トランスポゾンおよび切出し酵素関連モチーフ  
α−ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａにおける１つのトランスポザーゼ関連モチーフおよびＡｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａにおけるＸｉｓ切出し酵素に関連する別のモチーフも見出された。両モチーフは、主に、１０〜１５塩基対ステムを有する１つのヘアピンからなる。両モチーフはまた、多数の共変動も示し、これにより、これらのモチーフが機能的構造化ＲＮＡを形成することが示唆される。切出し酵素モチーフは、切出し酵素遺伝子に対して５’調節立体配置内に存在する。
【０２９０】
ｘｉｉｉ．ＡＴＰＣモチーフ
ＡＴＰＣモチーフはいくつかのＣｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａにおいてＡＴＰシンターゼオペロン中のＡサブユニットとＣサブユニットをコードする遺伝子間で見出される。ＡＴＰＣモチーフ例は、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓの全ての配列決定された株および一定のＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ種で見出される。本モチーフは、主に、３ステムジャンクションからなる。以前の研究により、Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＡＴＰシンターゼオペロン中のヘアピン様構造が提案されたが、この構造はより複雑な形状ではなく、ＡＴＰＣモチーフと異なる位置に存在するＣｕｒｔｉｓ  １９８８）。
【０２９１】
ｘｉｖ．Ｔｈｅ  シアノ−３０Ｓモチーフ
本モチーフは、いくつかのＣｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ中に見出され、３０Ｓリボゾームタンパク質Ｓ１をコードする遺伝子に対して５’調節立体配置内にある。これは、相互に異なる２つのヘアピン、Ｐ１ループ中の５つのヌクレオチドがＰ２の３’末端をちょうど超えたヌクレオチドと塩基対合するシュードノットからなる。Ｐ１およびＰ２中の対合を破壊するいくつかの変異が存在するにもかかわらず、これらのステム中に多数の代償的変異も存在する。さらに、シュードノット中の対合は共変動し、全ての代表中に存在する。
【０２９２】
遺伝子コンテクストを考慮すると、このモチーフは、下流リボゾームタンパク質遺伝子のリガンドを模倣することができ（Ｚｅｎｇｅｌ  １９９４）、それにより、この遺伝子産物はその自己の発現を調節する。シアノ−３０Ｓモチーフの同定により、かかるＲＮＡが広範な種々の門で見出されるという見解が支持される。
【０２９３】
ｘｖ．Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓモチーフ
ｌａｃｔｏ−１およびｌａｃｔｏ−２モチーフは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ目に制限される。ｌａｃｔｏ−１モチーフはいくつかの共変動を有するが、いくつかの変異が塩基対合を破壊する。いくつかの例は、主なヘアピンとシャイン−ダルガルノ配列との間のＳ（ＭＫ）（またはＳＡＭ−ＩＩＩ）（Ｆｕｃｈｓ  ２００６）リボスイッチの可変領域を交差する。ｌａｃｔｏ−２モチーフは、多数の内部ループを有する大きなヘアピンからなり、このループのいくつかは、高度に保存された配列を有する。いくつかの変異が対合を破壊するにもかかわらず、相当な量の共変動が存在し、ｌａｃｔｏ−２モチーフ例が構造化ＲＮＡであることが示唆される。
【０２９４】
ｘｖｉ．ＴＤ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）モチーフ
２つの予想されるモチーフは、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａにおいていくつかの例を有するが、任意の他の配列決定された細菌において見出されない。ＴＤ−１およびＴＤ−２モチーフは、それぞれ、２８および３６の代表を有する。７つのＴＤ−１モチーフ代表は、ＴＤ−２の例の逆相補物と重複し、２つのほとんどの５’ヘアピンを共有する。
【０２９５】
両モチーフは、共変動および可変長またはモジュラーステムのいずれかを示す。ＴＤ−１モチーフは、通常、遺伝子に対して５’調節立体配置内にある。ＴＤ−２モチーフは５’調節立体配置を共有しないので、非コードＲＮＡに対応することができる。
【０２９６】
３．考察
ＣＭｆｉｎｄｅｒベースの比較ゲノミクスパイプラインを使用して、２２の新規の推定ＲＮＡモチーフが見出された。２つは、リボスイッチと既に実験で確認されている。いくつかの他のモチーフについて、共変動および他の特徴は、モチーフが機能的構造化ＲＮＡであり、多数のモチーフについての可能な機能が提案されていることを示す。したがって、パイプラインは、新規ＲＮＡの発見に有用なようである。
【０２９７】
その知見は、ＣＭｆｉｎｄｅｒベースのパイプラインが広く存在し且つ高度に保存された広範な二次構造を保有するＲＮＡを回収することができること、およそ６０ヌクレオチド長以上であること、および相同遺伝子と関連することを示している。３つの候補リボスイッチは、これらの特徴を有する（ＧＥＭＭ、Ｍｏｃｏ、およびＳＡＨ）。残り３つの候補であるＳＡＭ−ＩＶ、ＣＯＧ４７０８モチーフ、およびｓｕｃＡモチーフは、これらのモチーフが分類法レベルで１つの目以外では見出されないという点で、最も知られているリボスイッチよりも分布が狭い。
【０２９８】
（実施例２）
Ｂ．実施例２：真正細菌におけるリボスイッチクラスは二次メッセンジャーサイクリックジＧＭＰを感知する
サイクリックジＧＭＰは、多様な細菌種において広範な生理学的変化を誘発するための二次メッセンジャーとして機能する環状ＲＮＡジヌクレオチドである。過程の調節には、細胞分化、運動型とバイオフィルム生活様式との間の変換、および毒性遺伝子発現が含まれる。しかし、遺伝子発現を調節するためにサイクリックジＧＭＰによって使用される機構は、２０年前よりも前の化合物の発見以来依然として未解明のままである。データは、多数の細菌種におけるサイクリックジＧＭＰが多数の基本的細胞過程に関与する遺伝子発現を調節するリボスイッチによって感知されることを示す。種々のサイクリックジＧＭＰレギュロン（毒性遺伝子発現、ピリ線毛形成、および鞭毛オルガネラ生合成に関連するいくつかのリボスイッチが含まれる）が明らかにされている。さらに、サイクリックジＧＭＰリボスイッチのコンセンサスに適合する配列は、バクテリオファージのゲノム中に存在する。
【０２９９】
二次メッセンジャーサイクリックジＧＭＰ（図３Ａ）は、細菌Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ由来のセルロースシンターゼのアクチベーターとして発見された（Ｒｏｓｓ  １９８５；Ｒｏｓｓ  １９８７）。その後の研究により、サイクリックジＧＭＰが細菌にほぼ遍在し、広範囲にわたって細胞生理学に影響を及ぼすことが明らかとなった（Ｊｅｎａｌ  ２００６；Ｒｙａｎ  ２００６；Ｔａｍａｙｏ  ２００７）。サイクリックジＧＭＰは、ＧＧＤＥＦアミノ酸ドメインによって特徴づけられるジグアニル酸シクラーゼ（ＤＧＣ）酵素によって２つのグアノシン−５’−三リン酸塩分子から形成された環状ＲＮＡジヌクレオチドである。一旦形成されると、化合物は、ＥＡＬまたはＨＤ−ＧＹＰアミノ酸ドメインのいずれかを含むホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）酵素によって選択的に分解される（Ｊｅｎａｌ  ２００６；Ｒｙａｎ  ２００６；Ｔａｍａｙｏ  ２００７；Ｓｉｍｍ  ２００４およびその参考文献）。多数の細菌種（病原体Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅが含まれる）は、多数の異なるＤＧＣおよびＰＤＥタンパク質を有する（Ｇａｌｐｅｒｉｎ  ２００１；Ｕｌｒｉｃｈ  ２００５；Ｒｏｅｍｌｉｎｇ  ２００５）。これらのタンパク質の活性は、細胞サイクリックジＧＭＰ濃度を調整するための特異的刺激によって誘発され（Ｒｏｅｍｌｉｎｇ  ２００５）、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅにおけるこの二次メッセンジャー濃度の変化は、皺、バイオフィルム形成、および毒性を調節することが公知である（Ｌｉｍ  ２００６ｃ；Ｂｅｙｈａｎ  ２００７；Ｔｉｓｃｈｌｅｒ  ２００５；Ｗａｔｅｒｓ  ２００８）。
【０３００】
細菌で多様な生理学的変化を引き起こすためにサイクリックジＧＭＰによって使用される機構は、長い間不明であった。サイクリックジＧＭＰ切断ＰＤＥによるターゲティングに加えて、この二次メッセンジャーはいくつかのＤＧＣタンパク質に結合して、それ自体の合成をアロステリックに抑制することができる（Ｃｈａｎ  ２００４；Ｗａｓｓｍａｎ  ２００７）。公知の唯一の他のタンパク質標的は、Ｇ．ｘｙｌｉｎｕｓ  セルロースシンターゼ（Ｒｏｓｓ  １９８５；Ｒｏｓｓ  １９８７）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰｅｌＤタンパク質（Ｌｅｅ  ２００７）、およびＰｉｌＺドメインタンパク質（Ｒｙｊｅｎｋｏｖ  ２００６）である。しかし、これらのタンパク質に結合するサイクリックジＧＭＰは、その大域的細胞効果を完全に説明していない（Ｔａｍａｙｏ  ２００７；Ｗｏｌｆｅ  ２００８）。したがって、依然として発見されていないサイクリックジＧＭＰの重要な調節標的が存在する。
【０３０１】
サイクリックジＧＭＰのリボスイッチ。サイクリックジＧＭＰリボスイッチの存在によってどのようにしてこの二次メッセンジャーが多数の遺伝子の転写および翻訳を調節するのかを説明することができるとの仮説が立てられている（Ｔａｍａｙｏ  ２００７）。いくつかの生物中でＤＧＣおよびＰＤＥタンパク質の読み取り枠（ＯＲＦ）のすぐ上流に存在するＧＥＭＭと呼ばれる高保存ＲＮＡドメインの同定が最近報告された（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ、２００７）。このＲＮＡドメインはまた、サイクリックジＧＭＰによって調節される可能性が高い遺伝子に頻繁に関連する。ＧＥＭＭ  ＲＮＡの高保存およびゲノム分布は、その標的リガンド濃度の変化に応答して遺伝子発現を調節する代謝産物感知リボスイッチ（Ｗｉｎｋｌｅｒ  ２００５；Ｂｒｅａｋｅｒ  ２００８（Ｓｃｉｅｎｃｅ））の特徴である。
【０３０２】
ＧＥＭＭ  ＲＮＡは、１型および２型と呼ばれる２つの類似の構造の１つに適合する（図３Ｂ）。両型は、同定した５０３の代表において広範な共変動を示す２つの塩基対合領域（Ｐ１およびＰ２）を保有する（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，２００７）。１型ＲＮＡ（３０３例）は、第２の位置にプリン（Ｒ）と共にＰ１上にＧＮＲＡテトラループ（Ｈｅｕｓ  １９９１）を有する。ＧＲＲＡ配列の存在は、Ｐ２の端のテトラループ受容体の存在と相関し、それはこのテトラループ型とドッキングすることが公知である（Ｃｏｓｔａ  １９９５）。対照的に、２型ＲＮＡ（１７１例）は、テトラループの第２の位置にピリミジン（Ｙ）を有し、いくつかの例では、ＧＹＲＡテトラループとのドッキングを好むＰ２上の構造を含む（Ｃｏｓｔａ  １９９５）。さらなる２９個の割り当てられていない代表が存在し、そのうちの２４個は非対合ヌクレオチドに隣接したＧＮＲＡテトラループを保有し、５個はテトラループ配列を欠く。
【０３０３】
ＧＮＲＡテトラループおよびその受容体は、一般に構造化されたＲＮＡ中に見出され、以前にリボスイッチアプタマー中で認められている（Ｒｅｇｕｌｓｋｉ  ２００８）。しかし、Ｐ１およびＰ２ヘアピンの先端の配列および構造の可変性により、サイクリックジＧＭＰの任意の結合部位が最も保存された特徴を保有する中央または基底の部分に位置する可能性が高いことが示唆される。
【０３０４】
ＧＥＭＭ  ＲＮＡはサイクリックジＧＭＰに選択的に結合する。病原性細菌Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅのゲノムは、個別の染色体上に２つのＧＥＭＭ  ＲＮＡ配列を保有する。染色体Ｉ上で、１型ＧＥＭＭ  ＲＮＡ（Ｖｃ１と呼ばれる）はＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ  ｇｂｐＡ遺伝子の上流に存在し、キチンまたはその主な単量体単位Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンに結合するタンパク質因子をコードする。ＧｂｐＡは、ヒトにおけるコレラ感染に関与している（Ｋｉｒｎ、２００５）。染色体ＩＩ上で、別の１型ＲＮＡ（Ｖｃ２と呼ばれる）は、ｔｆｏＸに相同な遺伝子（ＶＣ１７２２）の上流に存在する（Ｍａｎｄａｌ  ２００３；Ｍｅｉｂｏｍ  ２００５）。ｔｆｏＸ遺伝子（いくつかの生物ではｓｘｙと呼ばれる；Ｃａｍｅｒｏｎ  ２００８）は、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅがキチンに曝露された場合にコンピテンスが増加する遺伝子の調節を担う因子をコードする。この配列類似性を考慮すると、ＶＣ１７２２タンパク質はまた、転写因子として機能することができる。
【０３０５】
両ＧＥＭＭ  ＲＮＡを使用して生化学分析および遺伝子分析を行って、これらがサイクリックジＧＭＰのアプタマーとして機能するかどうかを決定した。１１０ヌクレオチドＶｃ２  ＲＮＡ構築物（１１０Ｖｃ２；図３Ｃ）を、１００μＭサイクリックジＧＭＰの非存在下または存在下でのインライン探索（Ｓｏｕｋｕｐ  １９９９）に供した（図３Ｄ）。Ｐ１ステムおよびＰ２ステムの塩基の自発的切断パターンの変化により、構造調整を受けた領域付近の保存ヌクレオチド（１〜３と記す）が二次メッセンジャー結合に重要であることが示唆される。Ｖｃ１  ＲＮＡ  を含む構築物およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓおよびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の代表的なサイクリックジＧＭＰアプタマーについて類似の結果を得た。
【０３０６】
種々のサイクリックジＧＭＰ濃度を使用したインライン探索に１１０Ｖｃ２  ＲＮＡを供することにより、約１ｎＭの見かけ上の解離定数（ＫＤ）を確立した。得られたプロット（図４Ａ）は、ＲＮＡアプタマーとそのリガンドとの間の１：１飽和相互作用と一致する（Ｗｅｌｚ  ２００７）。アプタマーが報告された種々の多量体サイクリックジＧＭＰ複合体の１つと結合することができるにもかかわらず（Ｅｇｌｉ  １９９０；Ｚｈａｎｇ  ２００６）、測定したＫＤ値をはるかに超える濃度でこれらの分子間サイクリックジＧＭＰ複合体の形成が起こる。さらに、ＫＤの変化は、インライン探索反応でＫ＋がＮａ＋に置換された場合、これらの１価の金属が形成されたサイクリックジＧＭＰ複合体型に影響を及ぼすにもかかわらず、認められない。
【０３０７】
１１０Ｖｃ２アプタマーとサイクリックジＧＭＰとの間に形成された複合体は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのＰｉｌＺタンパク質ドメインによるサイクリックジＧＭＰ結合について測定された親和性（ＫＤ＝８４０  ｎＭ；Ｒｙｊｅｎｋｏｖ  ２００６）よりほぼ３桁強い。さらに、二次メッセンジャーの種々のアナログは、Ｖｃ２アプタマーによって強く識別される（図４Ｂ）。試験したアナログから、二次メッセンジャーの環状構造およびそのグアニン核酸塩基の両方が実質的にリガンド認識に寄与することは明らかである。例えば、ＥＡＬ  ＰＤＥによるサイクリックジＧＭＰの線状分解産物（ｐＧｐＧと呼ばれる）は、ほぼ３桁弱くアプタマーに結合する。同様に、ＨＤ−ＧＹＰ  ＰＤＥのｐＧ（５’ＧＭＰ）産物は、サイクリックジＧＭＰのＫＤより５桁高い濃度であってもアプタマーに結合しない。したがって、このアプタマークラスの生物学的に関連するリガンドは、サイクリックジＧＭＰのようであり、この二次メッセンジャーの分解産物ではないようである。
【０３０８】
サイクリックジＧＭＰは、２つの構造的に制限された３’，５’リン酸ジエステル結合を含むＲＮＡジヌクレオチドである（図３Ａ）。いくつかの場合、幾何学的に制限されたヌクレオチド間結合により、ＲＮＡ鎖切断が加速される（Ｓｏｕｋｕｐ  １９９９）。サイクリックジＧＭＰがインライン探索条件下で安定的であるかどうかを評価するために、自発的分解についての速度定数を決定した。インライン探索条件下で、サイクリックジＧＭＰは、３．２×１０−６／分の速度定数で切断され（図４Ｃ）、これは約１５０日の半減期に対応する。この速度定数は、類似の条件下でインキュベートした場合に制限されない線状ポリヌクレオチド中に存在するＲＮＡ結合について予想される速度定数に類似する（Ｌｉ  １９９９）。したがって、二次メッセンジャーは、インライン探索アッセイ中で安定的であり、ＰＤＥ酵素作用に供されない場合に細胞中でなおさらに安定的である可能性が高い。
【０３０９】
サイクリックジＧＭＰリボスイッチによる遺伝子調節。細菌リボスイッチは、典型的には、あまり保存されていない発現プラットフォームのすぐ上流に存在する保存アプタマーを保有する。細菌中のほとんどの発現プラットフォームは、転写終結または翻訳開始を調節する構造を形成する（Ｂａｒｒｉｃｋ  ２００７）。類似の構造は多数のＧＥＭＭ  ＲＮＡ代表に関連し、サイクリックジＧＭＰアプタマーがリボスイッチ成分である可能性が高いことを示す。
【０３１０】
サイクリックジＧＭＰアプタマーがリボスイッチの感知ドメインとして生体内で機能するかどうかを評価するために、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、およびＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の４つの５’ＵＴＲを選択した。Ｖｃ２について、予想された天然プロモーターを含むＤＮＡ、アプタマーまたはそのバリアント（図５Ａ）、および隣接発現プラットフォームを使用して、Ｅ．ｃｏｌｉのｌａｃＺレポーター遺伝子との翻訳融合物を調製した。アプタマー−レポーター融合構築物を保有するトランスジェニックＥ．ｃｏｌｉ細胞を液体培地中で増殖させ、β−ガラクトシダーゼ活性についてアッセイした。
【０３１１】
野生型（ＷＴ）Ｖｃ２アプタマーを保有するレポーター構築物は、高レベルの遺伝子発現を示す（図５Ｂ）。対照的に、Ｐ１を破壊する変異またはさもなければＰ２バルジ中の厳格に保存されたヌクレオチドの変化を保有する構築物Ｍ１およびＭ３は、ＷＴの１０％未満のレポーター遺伝子を発現する。さらに、Ｐ１の構造を修復する４つの変異（Ｍ２）を有するアプタマーは、ほぼＷＴの遺伝子発現を示す。これらの結果は、Ｖｃ２アプタマーを組み込むリボスイッチが隣接ＯＲＦの翻訳の活性化によって「オン」スイッチとして機能することを示す。同様に、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ（Ｂｃ１およびＢｃ２）およびＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（Ｃｄ１）由来のサイクリックジＧＭＰリボスイッチのための転写融合物を調製した。ＷＴおよびＭ３変異体の発現パターンは、Ｂｃ１の「オン」スイッチ機能およびＢｃ２およびＣｄ１の「オフ」スイッチ機能と一致する（図５Ｂ）。
【０３１２】
サイクリックジＧＭＰ濃度の変化は、リボスイッチ媒介遺伝子発現を調整する。サイクリックジＧＭＰリボスイッチによる遺伝子発現の調整を、二次メッセンジャーの細胞濃度を操作しながらＣｄ１  ＲＮＡの「オフ」スイッチ作用を試験することによって確立した。サイクリックジＧＭＰ濃度を、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅのｖｉｅＡ遺伝子産物の発現によって調整した。ＶｉｅＡは、二次メッセンジャーのその線状ｐＧｐＧ形態への加水分解の促進によってサイクリックジＧＭＰの細胞濃度を低下させると予想されるＥＡＬホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）である（Ｌｉ  １９９９）。空のベクターを保有するか、ＰＤＥ活性を排除するＥ１７０Ａ変異を有するＶｉｅＡタンパク質を発現する細胞（Ｔａｍａｙｏ  ２００５）は、増殖条件下で細胞に通常のサイクリックジＧＭＰ濃度を維持すると予想される。
【０３１３】
ｌａｃＺを有するＷＴ  Ｃｄ１リボスイッチの転写融合物を保有し、Ｘ−ｇａｌを有する寒天プレート上で増殖させたトランスジェニックＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞は、空のプラスミドベクターまたは不活性なＥ１７０Ａ  ＶｉｅＡ変異体をコードするベクターのいずれかで同時形質転換した場合、低いβ−ガラクトシダーゼ活性を示す（図６Ａ）。対照的に、頑強なβ−ガラクトシダーゼ活性は、レポーター構築物およびＶｉｅＡ  ＰＤＥをコードするベクターで同時形質転換する細胞において明らかである。液体培養由来のこれらのトランスジェニック細胞をアッセイした場合に類似の傾向が認められるのに対して、Ｃｄ１アプタマー中にＭ３変異を保有するレポーター構築物は依然としてｖｉｅＡ発現の影響をあまり受けない（図６Ｂ）。これらの所見は、Ｃｄ１リボスイッチによる「オフ」スイッチ機能とも一致し、この機能は、細胞中のサイクリックジＧＭＰ濃度の低下によってＰＤＥ作用を軽減する。
【０３１４】
多様な細菌におけるサイクリックジＧＭＰリボスイッチの役割。Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅがたった２つのサイクリックジＧＭＰリボスイッチ代表しか持たないにもかかわらず（図７）、これらのＲＮＡの生理学的役割は重大である。Ｖｃ１リボスイッチに関連するｇｂｐＡ遺伝子産物は、細菌が哺乳動物の腸にコロニー形成してコレラ病を発症させる重要な決定因子であることが報告された糖結合タンパク質である（Ｋｉｒｎ、２００５）。Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅは哺乳動物宿主の腸にコロニー形成する場合にそのサイクリックジＧＭＰレベルを低下させることも示されている（Ｔａｍａｙｏ  ２００５）。サイクリックジＧＭＰレベルの変化に対するＣｄ１リボスイッチの応答を証明するために本研究で使用したＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅのｖｉｅＡ遺伝子（図６Ａ）は、細菌感染に不可欠であることが公知である。したがって、ＶｉｅＡ作用によって起こるサイクリックジＧＭＰレベルの低下をＶｃ１リボスイッチによって感知して、ＧｂｐＡの発現およびＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ感染を容易にすることが可能である。
【０３１５】
Ｖｃ２リボスイッチに関連するＶＣ１７２２遺伝子は、コンピテンスに重要な公知の転写因子に類似のタンパク質をコードする（Ｍｅｉｂｏｍ  ２００５）。皺表現型を産生するＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ変異体が高レベルのサイクリックジＧＭＰを有し、より高いＶＣ１７２２  ｍＲＮＡ発現を示すことが以前に示されている（Ｌｉｍ  ２００６ｃ；Ｂｅｙｈａｎ  ２００７）。これは、ＶＣ１７２２  ｍＲＮＡに関連するＶｃ２リボスイッチが、サイクリックジＧＭＰ濃度が上昇した場合により高い遺伝子発現が得られる遺伝子「オン」スイッチであることを示すデータと一致する（図５Ｂ）。
【０３１６】
いくつかの生物は、非常に多数のサイクリックジＧＭＰリボスイッチ代表を有する（図７）。３０の代表が同定されているＧｅｏｂａｃｔｅｒ  ｕｒａｎｉｕｍｒｅｄｕｃｅｎｓは、そのゲノムが配列決定された細菌種のうちで最も多数のサイクリックジＧＭＰアプタマーＲＮＡを有する。これらは、タンデムサイクリックジＧＭＰアプタマーを保有する５つのＲＮＡと共に２５個の異なる転写単位の上流に分布する。２つのアミノ酸と協同的に結合するいくつかのグリシンアプタマーについて類似のタンデム配置が認められている（Ｍａｎｄａｌ  ２００４ｃ）。しかし、より一般的なタンデム配置が同一リガンドに応答する完全なリボスイッチに関与する（Ｗｅｌｚ  ２００７；Ｓｕｄａｒｓａｎ  ２００６）。両方のタンデム構造の配置により、リボスイッチがリガンド濃度のより小さな変化により繊細に応答し（Ｗｅｌｚ  ２００７）、より計数的な遺伝子スイッチとして機能することが可能となる。
【０３１７】
多数のサイクリックジＧＭＰリボスイッチに関連する遺伝子機能が未知であるにもかかわらず、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅにおけるいくつかの代表のそれらの位置に注目すべきである（図７）。Ｃｄ１リボスイッチは、この種の全鞭毛装置を構築するのに必要なタンパク質をコードする大きなオペロンの５’ＵＴＲ中に存在する遺伝子「オフ」スイッチである（図５および６）。この配置により、いくつかの細菌がリボスイッチを使用してサイクリックジＧＭＰ濃度の変化を感知してオルガネラの生合成を調節し、運動型対固着の生活様式の変換を調節することが明らかとなる。
【０３１８】
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅゲノム内に組み込まれたＰｈｉＣＤ１１９バクテリオファージＤＮＡ内に存在するサイクリックジＧＭＰリボスイッチ代表の同定も興味深い。バクテリオファージゲノムの溶解モジュール内に存在するリボスイッチ配列はまた、バクテリオファージ粒子中にパッケージングされたＤＮＡで明らかである（Ｇｏｖｉｎｄ  ２００６）。２０を超える代謝産物感知リボスイッチクラスが報告されており、且つこれらのクラスの何千もの代表が同定されているにもかかわらず、サイクリックジＧＭＰ  ＲＮＡ  Ｃｄ２、Ｃｄ１２、およびファージ由来の関連ＲＮＡは、バクテリオファージ関連リボスイッチの唯一の公知の例である。おそらくウイルスは基本的代謝産物を感知する必要がほとんどないが、二次メッセンジャーサイクリックジＧＭＰ濃度の変化によって起こる細菌細胞の生理学的形質転換のモニタリングによって進化上の利点を得ることができる。
【０３１９】
１．材料と方法
ｉ．バイオインフォマティクス
公知のサイクリックジＧＭＰリボスイッチ組を、以前に確立された複数の配列アラインメント（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  ２００７）の使用によって拡大して、さらなる相同性検索を行った。これらの検索を、ＲＡＶＥＮＮＡ（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  ２００６）を使用して、ＲｅｆＳｅｑバージョン２５（Ｐｒｕｉｔｔ  ２００５）微生物配列ならびに酸性鉱山廃液（Ｔｙｓｏｎ  ２００４）、土壌およびホエールフォール（Ｔｒｉｎｇｅ  ２００５）、ヒト消化管（Ｇｉｌｌ  ２００６）、マウス消化管（Ｔｕｒｎｂａｕｇｈ  ２００６）、無腸の海ミミズ（Ｗｏｙｋｅ  ２００６）、スラッジコミュニティ（Ｇａｒｃｉａ  Ｍａｒｔｉｎ  ２００６）、および世界的海洋調査（Ｖｅｎｔｅｒ  ２００４；Ｒｕｓｃｈ  ２００７）由来の環境配列に対して行った。コンセンサス図中で反映された保存統計学（図３）を、以前に確立されたプロトコールを使用して計算した（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  ２００７）。ＲｅｆＳｅｑおよびＤＯＥ  Ｊｏｉｎｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅまたは世界的海洋調査由来の遺伝子注釈づけを使用して図７を作製した。遺伝子を、保存ドメインデータベース（Ｍａｒｃｈｌｅｒ−Ｂａｕｅｒ  ２００５）バージョン２．０８に基づいて分類した。
【０３２０】
ｉｉ．オリゴヌクレオチド、化学物質、プラスミド、および細菌株
ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓまたはイェール大学Ｗ．Ｍ．Ｋｅｃｋ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。サイクリックジＧＭＰ、ｐＧｐＧ、および３’、５’−サイクリックＧＭＰをＢｉｏＬｏｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入し、３’−グアノシン一リン酸塩をＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓから購入した。ＡｐＧ、ＧｐＧ、ＧｐＡ、ｐＧｐＡ、およびＧｐＧｐＧを、Ｏｌｉｇｏｓ  Ｅｔｃから購入した。他の全ての化学物質を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。
【０３２１】
ｐＤＧ１６６１およびｐＤＧ１４８を、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＢＧＳＣ；オハイオ州立大学）から入手した。ｐＲＳ４１４は、Ｄｒ．Ｒ．Ｓｉｍｏｎｓ（ＵＣＬＡ）から贈与された。Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ  Ｏ１  ｂｉｏｖａｒ  ｅｌｔｏｒ  Ｎ１６９６１株のゲノムＤＮＡは、Ｄｒ．Ｂ．Ｂａｓｓｌｅｒ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｕ．）から提供された。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １Ａ１株、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ  ６Ａ５株（ＡＴＣＣ  １４５７９）、およびＢ．ｃｅｒｅｕｓ  ６Ａ１５株（ＡＴＣＣ  １０９８７）もＢＧＳＣから入手した。ＡＴＣＣ  ９６８９株由来のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅゲノムＤＮＡを、ＡＴＣＣから入手した。コンピテントＤＨ５−α  Ｅ．ｃｏｌｉを、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから購入した。
【０３２２】
ｉｉｉ．サイクリックジＧＭＰの分解動力学
５００μＭのサイクリックジＧＭＰ溶液を、インライン探索緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３、２３℃）、１００ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）の存在下で種々の時間インキュベートした。サイクリックジＧＭＰの添加によって反応を開始し、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ  Ｏｌｉｇｏカラム（５μＭ、６．２ｍｍ×８０ｍｍ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  １２００シリーズＨＰＬＣに１０μＬアリコートを注入する時に反応をクエンチした。化合物を、９５％  ０．１Ｍ  ＮａＨＰＯ４（ｐＨ６．０、２３℃）および５％アセトニトリルから１００％  １Ｍ  ＮａＣｌまでから構成される勾配の移動相を使用して溶離した。２５４ｎｍの吸光度をモニタリングした。サイクリックジＧＭＰに対する速度定数を、未分解で残存するサイクリックジＧＭＰの割合の自然対数対時間をプロットすることによって確立した。得られた直線の負の勾配は速度定数を反映する。
【０３２３】
ｉｖ．サイクリックジＧＭＰアナログの純度分析および完全性
サイクリックジＧＭＰのジ−およびトリ−ヌクレオチドアナログの純度を、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  １２００シリーズＨＰＬＣを使用して、溶離化合物の２５４ｎｍの吸光度のモニタリングによって試験した。化合物を、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｅｘｔｅｎｄ  Ｃ１８カラム（３．５μＭ、４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）を使用し、９５％水、５％アセトニトリル、および０．１％トリフルオロ酢酸（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ）から１００％アセトニトリルおよび０．１％トリフルオロ酢酸までの勾配移動相を使用して分離した。ＨＰＬＣ軌跡により、５０％から９５％のＵＶ吸収物質が所望のアナログに対応することが明らかとなった。
【０３２４】
各アナログに対して高分解能質量分析を行って、それらの正確な質量を確認した。Ｃ２０Ｈ２５Ｎ１０Ｏ１１Ｐ（ＧｐＡ）についてのＨＲＭＳ（ＥＳ）の計算値および（Ｍ−Ｈ）−実測値は以下であった：６１２．１４４２、６１１．１３７５；Ｃ２０Ｈ２５Ｎ１０Ｏ１１Ｐ（ＡｐＧ）：６１２．１４４２、６１１．１３７２３；Ｃ２０Ｈ２５Ｎ１０Ｏ１２Ｐ（ＧｐＧ）：６２８．１３９１、６２７．１３２０７；Ｃ２０Ｈ２６Ｎ１０Ｏ１４Ｐ２（ｐＧｐＡ）：６９２．１１０５、６９１．１０４１０；Ｃ３０Ｈ３７Ｎ１５Ｏ１９Ｐ２（ＧｐＧｐＧ）：９７３．１８６５、９７２．１８２５、および（Ｍ−２Ｈ）−２  ４８５．５８５９７。
【０３２５】
ｖ．ＲＮＡの調製
ＤＮＡテンプレートを、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７  ＲＮＡＰ）のプロモーター配列＋ＲＮＡの収率を増加させるための転写開始部位の２つのグアニン残基を付加したプライマーと共に野生型または変異ｐＲＳ４１４プラスミドＤＮＡを使用したＰＣＲ増幅によって調製した。ＲＮＡ分子を、適切なＤＮＡテンプレートおよびＴ７  ＲＮＡＰを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０、２３℃）、２０ｍＭ  ＮａＣｌ、１４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および１００μＭ  ＥＤＴＡを使用した試験管内転写によって調製した。ＲＮＡを、変性（８Ｍ尿素）１０％ポリアクリルアミドゲルにて精製し、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５、２３℃）、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、および１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）中にてゲルから溶離させた。製造者のプロトコールに従って、ＲＮＡをエタノールを使用して沈殿させ、アルカリホスファターゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して脱リン酸化し、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して５’放射性同位元素標識した。放射性同位元素標識したＲＮＡを、上記のようにゲル精製した。
【０３２６】
ｖｉ．インライン探索
インライン探索アッセイを、以前に記載の方法（Ｓｏｕｋｕｐ  １９９９）に類似の方法を使用して行った。簡潔に述べれば、５’３２Ｐ標識したＲＮＡ（サイクリックジＧＭＰのＫＤ分析については約５０ｐＭ、他の全ての分析については約５ｎＭ）を、表示の化合物と共に、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＫＣｌ、および５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．３、２３℃）中にて２３℃で約４０時間インキュベートした。ＲＮＡ切断産物を、変性１０％ＰＡＧＥによって分離し、Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を使用して視覚化し、ＳＡＦＡ  ｖ１．１ソフトウェア（Ｄａｓ  ２００５）またはＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を使用して分析した。ＳＡＦＡソフトウェアを使用して、各レーンにロードしたＲＮＡ量の相違を補正し、各バンド強度を決定した。強度の顕著な変化を示したバンドを、構造調整を受けたと同定した。
【０３２７】
サイクリックジＧＭＰに対する１１０Ｖｃ２のＫＤを決定するために、種々の濃度のサイクリックジＧＭＰを使用して、上記のようにインライン探索を行った。例外的に低濃度の放射性同位元素標識された１１０Ｖｃ２  ＲＮＡの使用により、ロードしたサンプルにさらなる非標識ＲＮＡを補足し、インライン探索に個別に供した。これにより、ゲルマトリックスに非特異的に結合した放射性同位元素標識ＲＮＡ量が減少し、画像化中のバンドの解像度が増大した。ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を使用して解離定数（ＫＤ）を決定し、構造調整部位の各バンド強度を比較した。それにより、リガンドの非存在下で調整が起こらず、最も高い試験濃度のリガンドの存在下で完全に調整されると推測された。表示の調整部位での調整の割合（Ｆ）対リガンド濃度の対数［Ｌ］のプロッティングおよびＳｉｇｍａＰｌｏｔ  ９（Ｓｙｓｔａｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用した式Ｆ＝［Ｌ］／（［Ｌ］＋ＫＤ）へのデータのフィッティングによって解離定数を決定した。
【０３２８】
ｖｉｉ．プラスミドおよび細菌株の調製
Ｖｃ２（ＣＯＧ３０７０（Ｔｆｏｘ様遺伝子）の５’ＵＴＲ）を、ＥｃｏＲＩ-ＢａｍＨＩフラグメントとしてＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅゲノムＤＮＡから増幅し、翻訳レポーターベクターｐＲＳ４１４にクローン化し、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるその遺伝子調節機能を、以前に記載の方法に類似の方法を使用して確立した（Ｎａｈｖｉ  ２００２）。具体的には、ＯＲＦの開始に関する−３４８ｎｔから＋２１ｎｔまでの領域を、ＣＯＧ３０７０  ＯＲＦの第７コドンをｌａｃＺレポーター遺伝子の第９コドンにインフレームで融合したｌａｃＺレポーターベクター中で翻訳融合物としてクローン化した。調節領域中の変異を、製造者の説明書にしたがってＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して、このプラスミドから生成した。
【０３２９】
Ｂ．ｃｅｒｅｕｓおよびＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅにおける推定ＯＲＦ上流の５’ＵＴＲ領域を、ＥｃｏＲＩ-ＢａｍＨＩフラグメントとしてＰＣＲによって増幅し、ベクターｐＤＧ１６６１にクローン化してプロモーターレスｌａｃＺ遺伝子との転写融合物を得た。増幅フラグメントは、ＵＴＲ上流の推定プロモーターエレメントおよび対応する遺伝子の上流のリボスイッチに関連する転写ターミネーターを含んでいた。得られた構築物を、以前に記載のように、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのａｍｙＥ遺伝子座に組み込んだ（Ｓｕｄａｒｓａｎ  ２００３）。変異構築物を、上記の部位特異的変異誘発を使用して生成した。
【０３３０】
Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ由来のサイクリックジＧＭＰ特異的ホスホジエステラーゼ遺伝子（ｖｉｅＡ）を、ＰＣＲによってゲノムＤＮＡから増幅した。ｖｉｅＡ遺伝子を、以前に記載のライゲーション非依存性クローニングを使用して、改変ｐＤＧ１４８ベクター中のＰｓｐａｃプロモーターの下流に存在するｓｔｕＩ部位にクローン化した（Ｊｏｓｅｐｈ  ２００１）。ｖｉｅＡ遺伝子が構成性発現すると予想されるように本ベクター中のｌａｃＩ遺伝子を変異した。ｖｉｅＡノックアウト変異体Ｅ１７０Ａを、上記の部位特異的変異誘発を使用して作製した。
【０３３１】
ｖｉｉｉ．β−ガラクトシダーゼアッセイ
野生型および変異Ｖｃ２−ｐＲＳ４１４構築物を、コンピテントＮＥＢ  ５−α（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換した。各コロニーを、５０μｇ／ｍＬカルベニシリンを含むＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉブロス中にて振とうしながら３７℃で一晩増殖させた。培養物を、約０．１のＯＤ６００まで希釈し、約０．６のＯＤ６００まで増殖させた後、標準的プロトコールに従ってβ−ガラクトシダーゼアッセイを行った（Ｍｉｌｌｅｒ  １９９２）。Ｂｃ１、Ｂｃ２、およびＣｄ１を含むｐＤＧ１６６１で形質転換したＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株の一晩培養物を約０．２のＯＤ６００まで継代し、その後に約１のＯＤ６００まで約３時間増殖させ、上記のようにβ−ガラクトシダーゼアッセイを行った。
【０３３２】
上記のトランスジェニックＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞を使用した固体寒天プレート上で行った遺伝子発現アッセイを、３７℃で少なくとも１６時間の画線細胞の増殖によって行った。寒天（ＴＢＡＢ）は、必要に応じて、４００μｇ／ｍＬ  Ｘ−ｇａｌおよび５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールおよび／またはカナマイシンを含んでいた。
【０３３３】
（実施例３）
Ｃ．実施例３：Ｓ−アデノシルホモシステインを感知し、補酵素再利用に関与する遺伝子を活性化するリボスイッチ
多数のグラム陽性およびグラム陰性の細菌種におけるＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＳＡＭ）再利用に関与する遺伝子の上流に見出される高度に保存されたＲＮＡモチーフを同定した。このモチーフの代表の系統発生分布および保存された構造の特徴は、リボスイッチ機能を示す。リボスイッチは、細菌ｍＲＮＡの５’非翻訳領域（ＵＴＲ）中に典型的に見出される、広範に存在する代謝産物感知遺伝子調節エレメントである。無タンパク質試験管内アッセイでＳ−アデノシルホモシステイン（ＳＡＨ）を特異的に認識するこのＲＮＡモチーフの例を同定し、これらのＲＮＡがＳＡＭおよび他の密接に関連するアナログを強く識別することを確認した。代表的なＳＡＨモチーフは、代謝産物が結合した場合に生体内で下流遺伝子の発現を活性化することが見出された。これらの所見により、ＳＡＨモチーフＲＮＡが、ＳＡＨに選択的に結合して消費されたＳＡＭ補酵素の再利用に不可欠な遺伝子を調節するリボスイッチクラスの異なるリガンド結合アプタマーであることが確認される。
【０３３４】
ＲＮＡアプタマーは、特異的リガンドに対して選択的結合ポケットを形成する高度に構造化されたポリヌクレオチドである（Ｇｏｌｄら、１９９５；ＯｓｂｏｒｎｅおよびＥｌｌｉｎｇｔｏｎ、１９９７）。その標的に対して高い親和性および選択性を示すように操作されたアプタマーを作製し、このアプタマーは基礎研究、バイオテクノロジー、および治療薬に適用される高い潜在性を有し得る（Ｂｒｅａｋｅｒ，２００４；ＢｕｎｋａおよびＳｔｏｃｋｌｅｙ、２００６）。ＲＮＡアプタマーはまた、多数の細菌伝令ＲＮＡの５’ＵＴＲ中に天然に存在することができ、これらはリボスイッチと呼ばれる遺伝子調節エレメントのセンサードメインとしての機能を果たす（ＭａｎｄａｌおよびＢｒｅａｋｅｒ、２００４ａ；ＳｏｕｋｕｐおよびＳｏｕｋｕｐ、２００４；ＷｉｎｋｌｅｒおよびＢｒｅａｋｅｒ、２００５）。その操作された対応物と同様に、天然アプタマーは、重要な代謝遺伝子の発現を正確に調節するために細胞によって使用されるＲＮＡアプタマーに必要な高い親和性および特異性でその標的に結合することができる。しかし、天然アプタマーは、典型的には、操作されたアプタマーよりはるかに長く（３４ヌクレオチドと２００ヌクレオチドとの間の範囲）（Ｂｒｅａｋｅｒ、２００６）、おそらく、天然アプタマーは、タンパク質から作製された遺伝子調節因子と競合するために必要な高レベルの性能を示すことが可能である。
【０３３５】
各リボスイッチは、通常、そのアプタマードメインによる代謝産物結合を活用して、隣接する発現プラットフォームの構造変化を引き起こす。これらの構造の変化により、読み取り枠（ＯＲＦ）または下流に存在する複数のＯＲＦからのタンパク質産生レベルが確立される。しかし、代謝物結合によって常に折り畳みの変化が起こるわけではない。例えば、あるリボスイッチクラスは、その作用が下流ＯＲＦの発現を抑制する自己切断リボザイムの補酵素として標的代謝産物を使用する（Ｗｉｎｋｌｅｒら、２００４；Ｃｏｃｈｒａｎｅら、２００７）。使用した機構と無関係に、リボスイッチはしばしば遺伝子を調節し、この遺伝子のタンパク質産物が代謝産物または代謝産物の前駆体の合成、分解、または輸送に関与し、代謝産物または代謝産物の前駆体の細胞濃度がアプタマードメインによって感知される。
【０３３６】
リボスイッチアプタマーは、改変塩基または支持タンパク質因子が関与しない限り、４つの共通ヌクレオチドのみを使用してその標的代謝産物の正確な結合ポケットを形成しなければならない。ＳＡＭ（Ｃｏｒｂｉｎｏら、２００５；Ｆｕｃｈｓら、２００６）およびｐｒｅＱ１（Ｗｅｉｎｂｅｒｇら、２００７）などのいくつかのリガンドが全く異なるアプタマー構造を有する複数のリボスイッチクラスによって検出されるにもかかわらず、これによって各アプタマーに強い選択圧が与えられ、進化を通して一定の構造の特徴が維持される。遠縁の生物から同定されたリボスイッチアプタマークラスの代表でさえ、配列および二次構造の相当な保存を示す。本保存は、アプタマーによって結合されるリガンドの同一性と相まって、リボスイッチの異なるクラスへの組織化の基礎を形成する。
【０３３７】
リボスイッチアプタマーの保存された特徴は、公知のリボスイッチクラスの代表数を拡大し（例えば、Ｒｏｄｉｏｎｏｖら、２００２；Ｒｏｄｉｏｎｏｖら、２００３ａ；Ｎａｈｖｉら、２００４；Ｒｏｄｉｏｎｏｖら、２００４；）、以前に知られていなかったリボスイッチクラスを発見する（例えば、Ｒｏｄｉｏｎｏｖら、２００３ｂ；Ｂａｒｒｉｃｋら、２００４；Ｃｏｒｂｉｎｏら、２００５；Ｗｅｉｎｂｅｒｇら、２００７）ためにコンピュータ支援検索アルゴリズムによって活用されている。対照的に、発現プラットフォームは、同一のリボスイッチクラス内でさえも配列および構造が広範に変化する。例えば、ＴＰＰリボスイッチは、種々の発現プラットフォーム構造を有するコンセンサスアプタマーを組み込んで、細菌における転写終結および翻訳開始（Ｗｉｎｋｌｅｒら、２００２；Ｍｉｒｏｎｏｖら、２００２；Ｒｅｎｔｍｅｉｓｔｅｒら、２００７）および真核生物におけるＲＮＡスプライシング（Ｓｕｄａｒｓａｎら、２００３ａ；Ｋｕｂｏｄｅｒａら、２００３；Ｂｏｃｏｂｚａら、２００７；Ｃｈｅａｈら、２００７；Ｗａｃｈｔｅｒら、２００７）を調節する。
【０３３８】
上で述べたように、異なる構造クラス由来のアプタマーを有するリボスイッチは、同一の標的代謝産物を認識することができる。補酵素ＳＡＭ（またはＡｄｏＭｅｔ）を特異的に認識する４つのリボスイッチクラスが発見されており、これらは、ＳＡＭ−Ｉ（Ｅｐｓｈｔｅｉｎら、２００３；ＭｃＤａｎｉｅｌら、２００３；Ｗｉｎｋｌｅｒら、２００３）、ＳＡＭ−ＩＩ（Ｃｏｒｂｉｎｏら、２００５，Ｌｉｍら、２００６ｂ）、ＳＡＭ−ＩＩＩまたはＳＭＫ（Ｆｕｃｈｓら、２００６）、およびＳＡＭ−ＩＶ（Ｗｅｉｎｂｅｒｇら、２００７；未発表データ）と呼ばれている。これらのクラスのうち、ＳＡＭ−Ｉリボスイッチは最も広範な公知の系統発生分布を有し、多数の細菌群で例が見出されている（Ｒｏｄｉｏｎｏｖら、２００４）。ＳＡＭ−ＩＩリボスイッチは、グラム陰性ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａおよびｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓで広く見出される一方で（Ｃｏｒｂｉｎｏら、２００５）、ＳＡＭ−ＩＩＩリボスイッチはグラム陽性乳酸細菌のみで報告されている（Ｆｕｃｈｓら、２００６）。４つの全クラスのアプタマーは、ＳＡＭ依存性メチル基転移の副生成物であるＳＡＨ（またはＡｄｏＨｃｙ）よりもＳＡＭに優先的に結合する（Ｔａｋｕｓａｇａｗａら、１９９８）。例えば、ＳＡＭ−ＩおよびＳＡＭ−ＩＩアプタマーの代表は、それぞれ、約８０倍および１０００倍を超えてＳＡＨを識別する（Ｌｉｍら、２００６ｂ）。化合物がたった１つのメチル基が異なることを考慮すれば、この識別レベルは特筆すべきである。
【０３３９】
ＳＡＨからＬ−メチオニンへの変換を担う遺伝子の上流に常に見出される高度に保存された一次配列および二次構造を有する細菌ＲＮＡエレメントの発見を本明細書中に記載する。ＲＮＡエレメントは、ＳＡＨに選択的に結合してＳＡＭを少なくとも１０００倍識別する異なるアプタマークラスを示し、このクラスは、４つの公知のＳＡＭアプタマーの分子認識の特徴と全く対照的である。細菌Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅのａｈｃＹ  ｍＲＮＡでは、ＳＡＨアプタマーへの代謝産物の結合による構造変化によって生体内での下流遺伝子の発現が活性化し、したがって、ＳＡＨアプタマーが異なるＳＡＨ応答性リボスイッチクラスのセンサー成分を形成する。
【０３４０】
１．結果
ｉ．ＳＡＨ再利用に関連する保存されたＲＮＡモチーフの同定
さらなるリボスイッチクラスおよび他の構造化調節ＲＮＡモチーフを同定する目的で、多数の細菌クラス中の遺伝子ファミリーの遺伝子間領域（ＩＧＲ）の体系的検索を、ＣＭｆｉｎｄｅｒ比較ゲノミクスパイプライン（Ｙａｏら、２００７）を使用して行った（Ｗｅｉｎｂｅｒｇら、２００７）。この検索ストラテジーを使用して細菌中に多数のＲＮＡモチーフが同定され、いくつかのモチーフが代謝産物感知リボスイッチとして機能するＲＮＡに予想される特徴を有する。
【０３４１】
１つの候補リボスイッチクラスはＳＡＨモチーフと呼ばれた。これはこのＲＮＡの代表に最も一般に関連する遺伝子がＳ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ（ａｈｃＹ、ＣＯＧ０４９９）、コバラミン依存性メチオニンシンターゼ（ｍｅｔＨ、ＣＯＧ１４１０）、およびメチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ（ｍｅｔＦ、ＣＯＧ０６８５）であるからである（図８）。ＳＡＨモチーフ代表のゲノムコンテクストおよびその高い保存度は、ＳＡＨの感知およびその産物がＳＡＭを再合成するためのＳＡＨ再利用に必要な遺伝子発現の活性化での役割と一致する。ＳＡＭ依存性メチル化反応のＳＡＨ副生成物（Ｔａｋｕｓａｇａｗａら、１９９８）は、ＳＡＭと比較して類似またはさらに良好な親和性で多数のＳＡＭ依存性メチルトランスフェラーゼに結合し、したがって、これらの酵素の強力なインヒビターとして機能する（Ｕｅｌａｎｄ、１９８２）。メチルトランスフェラーゼ活性が高い間に、化合物が低毒性生成物に変換されない限り、細胞は有毒レベルのＳＡＨを蓄積し得る。したがって、ＳＡＨの迅速な感知およびＳＡＭを再編成するためのＳＡＨの再利用の遺伝子の活性化が重要である。
【０３４２】
真正細菌には、共にＳＡＨからホモシステインに変換するＳＡＨ異化のための２つの主な経路が存在する（図８）。多数の細菌種では、ＳＡＨヌクレオシダーゼ（ＥＣ  ３．２．２．９）は、ＳＡＨのＮ−グリコシド結合の切断を触媒してアデニンおよびＳ−リボシルホモシステインを生成する（Ｄｅｌｌａ  Ｒａｇｉｏｎｅら、１９８５）。次いで、後者の化合物をｌｕｘＳの遺伝子産物によって加水分解して、ホモシステインを形成することができる（Ｓｃｈａｕｄｅｒら、２００１）。別の経路は、ＳＡＨモチーフ代表に一般に関連するａｈｃＹを含む。ＳＡＨヒドロラーゼ（ａｈｃＹの遺伝子産物）は、ＳＡＨのチオエーテル結合の分解を触媒して、アデノシンおよびホモシステインを生成する（Ｓｈｉｍｉｚｕら、１９８４）。ｍｅｔＨの遺伝子産物は、次いで、ｍｅｔＦの遺伝子産物によって５，１０−メチルＴＨＦから生成される（Ｓｈｅｐｐａｒｄ、１９９９）５−メチルテトラヒドロ葉酸（５−メチルＴＨＦ）をメチル供与体として使用してホモシステインをＬ−メチオニンにメチル化する（Ｏｌｄら、１９８８）。ｍｅｔＫ遺伝子によってコードされるＳＡＭシンターゼは、メチオニンおよびＡＴＰからＳＡＭを再生してサイクルを完成する（ＴａｂｏｒおよびＴａｂｏｒ、１９８４）。β−ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａおよびγ−ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａのいくつかの種においてｍｅｔＫ遺伝子がＳＡＨ  ＲＮＡモチーフの上流に極めて近接して存在し、これが同一オペロン中に存在し得ることに留意することが興味深い。ｌｕｘＳ遺伝子産物のホモログ（ＣＯＧ１８５４）は保存されたＲＮＡエレメントが見出されたゲノム中で同定されなかったので、これらの生物において、ＳＡＨの異化はＳＡＨヒドロラーゼを含む経路によって排他的に進行することができる。
【０３４３】
修正構造モデルに適合するＳＡＨ  ＲＮＡモチーフの全部で９５個のオカレンスが見出され、これらの適合物のうちの６８個が重複していない。同定された全てのＳＡＨ  ＲＮＡモチーフの例は、環境配列からまたはＲＮＡモチーフに隣接する遺伝子同一性が利用できない不完全に配列決定されたゲノムから同定されたモチーフを除いて、ＳＡＨ再利用遺伝子に隣接して見出される。ほとんどの場合、ＳＡＨ  ＲＮＡの代表は、ほとんど例外なく、ＳＡＨヒドロラーゼ（ａｈｃＹ）、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ（ｍｅｔＦ）、および時折メチオニンシンターゼ（ｍｅｔＨ）をコードするオペロンのようなものの上流に存在する。Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｄｅｃｈｌｏｒｏｍｏｎａｓ、およびＲａｌｓｔｏｎｉａのいくつかの種では、オペロンは、未知の機能の予想される膜タンパク質（ＣＯＧ１９５０）を含む。ＳＡＨ  ＲＮＡ関連オペロンで稀にしか出現しない他の遺伝子には、ｒＲＮＡメチラーゼ（ＣＯＧ１１８９）（コンピテンス特異的遺伝子（ｔｆｏＸ、ＣＯＧ３０７０）のレギュレーター）およびグアノシンポリリン酸塩代謝に関与する酵素（ｓｐｏＴ、ＣＯＧ０３１７）をコードする遺伝子が含まれる。
【０３４４】
ＲＮＡモチーフのコンセンサス配列および構造モデル（図９Ａ）を、アラインメント中の６８個の非重複配列に基づいて構築した。コンセンサスＲＮＡモチーフは、Ｐ１およびＰ２と指定された塩基対合領域に隣接した高度に保存されたヌクレオチドの中核から構成され、ここで、Ｐ２は可変配列ループ（Ｌ２）によってキャッピングされている。ＲＮＡはまた、中核とＲＮＡの３’末端の高度に保存されたヌクレオチドとの間にシュードノット（Ｐ４）を形成する。ヘアピン（Ｐ３およびＬ３）は、いくつかの代表においてＰ１ステムとＰ４ステムとの間に生じる。二次構造エレメントは、全て共変動によって支持される。
【０３４５】
β−ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａおよびγ−ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａに加えて、このコンセンサス配列および構造に適合するＲＮＡの例は、□−ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａの種およびいくつかのグラム陽性Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ（図９Ｂ）でも見出された。異なるゲノム領域中に存在する、予想されるａｈｃＹおよびｍｅｔＨコード配列の両方の前に２つのインシデントが同定されたＡｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｓｐ．、Ｄｅｃｈｌｏｒｏｍｏｎａｓ  ａｒｏｍａｔｉｃａ、Ａｚｏａｒｃｕｓ  ｓｐ．、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ  ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．、Ｒｈｏｄｏｆｅｒａｘ  ｆｅｒｒｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、およびＲｕｂｒｉｖｉｖａｘ  ｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓを除き、ほとんどの生物は、１つのＲＮＡエレメントのオカレンスを有する。
【０３４６】
ｉｉ．６８  ｍｅｔＨ  ＲＮＡによるＳＡＨの選択的結合
ＳＡＨ  ＲＮＡの構造の特徴およびゲノム配置は、これらがＳＡＨを感知するリボスイッチのアプタマーとしての機能を果たすことを示す。無タンパク質試験管内系において代謝産物を特異的に認識して遺伝子調節エレメントとして機能することができる（リボスイッチの２つの決定的な特徴）ＲＮＡモチーフの例を探求した。Ｄｅｃｈｌｏｒｏｍｏｎａｓ  ａｒｏｍａｔｉｃａ中のｍｅｔＨ遺伝子の上流に同定されたＳＡＨ  ＲＮＡを含む６８−ヌクレオチドＲＮＡ（６８  ｍｅｔＨと指定、図１０Ａ）を選択した。Ｄ．ａｒｏｍａｔｉｃａ  ６８  ｍｅｔＨ  ＲＮＡは、このモチーフのコンセンサス配列および構造に密接に対応するほぼ最短の配列である。その長さの減少は、任意選択的Ｐ３ステムの非存在に一部起因する（図９Ａ）。
【０３４７】
インライン探索アッセイ（ＳｏｕｋｕｐおよびＢｒｅａｋｅｒ、１９９９）を使用して、予想される二次構造を確証し（図１０Ａ）、６８  ｍｅｔＨ  ＲＮＡがＳＡＨに直接結合することを立証した。このアッセイは、ＲＮＡの自発的切断が構築されないヌクレオチド間結合でより迅速に生じ、それにより、ＲＮＡ構造の特徴およびリガンドに結合した場合にこれらが受ける変化を明らかにすることができるという事実を活用する。５’  ３２Ｐ標識された６８  ｍｅｔＨ  ＲＮＡを、漸増濃度のＳＡＨを含む反応物中でインキュベートし、得られた自発的切断産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離した（図１０Ｂ）。任意のリガンドの非存在下で、Ｌ２を形成すると予想されるＲＮＡ領域、Ｐ１とＰ２とを分離する内部ループ、およびＲＮＡの３’末端部分でより高いバンド強度が認められた。これらの所見により、Ｐ１およびＰ２が形成されるが、ＲＮＡのコアおよび３’テール（Ｐ４シュードノットのヌクレオチドを含む）中の高度に保存されたヌクレオチドの大部分がリガンドの非存在下であまり構造化しないことが示唆される。
【０３４８】
漸増濃度のＳＡＨの存在下で、ＲＮＡ全体のいくつかの位置でバンド強度の漸進的変化が認められた。これは、ＲＮＡがこの代謝産物のアプタマーとしての機能を果たす場合に予想されるように、ＳＡＨによってＲＮＡ折り畳みが変化することが確認された。さらに、多数の他のリボスイッチアプタマーについて典型的に認められるように、構造変化は系統発生学的に保存された領域で主に見出される（図９Ａ、図１０Ａ）。ＳＡＨ結合に応答した最も注目すべき変化は、シュードノットＰ４の安定化およびコアの他の保存されたヌクレオチド中の柔軟性の低下である。これは、高度に保存されたヌクレオチドがＳＡＨの結合ポケット形成に関与することを示す。
【０３４９】
ＳＡＨに対する６８  ｍｅｔＨ  ＲＮＡの見かけ上の解離定数ＫＤは、ＳＡＨ濃度範囲にわたるいくつかのヌクレオチド位置での自発的切断範囲の定量によって約２０ｎＭと評価された（図１０Ｂおよび１０Ｃ）。この見かけ上のＫＤ値はリボスイッチアプタマーに典型的であり、約２００μＭ（Ｗｉｎｋｌｅｒら、２００４）から約２００ｐＭ（ＷｅｌｚおよびＢｒｅａｋｅｒ、２００７；Ｓｕｄａｒｓａｎら、２００６）までの範囲であることが見出された。インライン探索アッセイによって明らかになった類似のＳＡＨ媒介性の形状変化を、Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅのａｈｃＹ遺伝子由来の１２２−ヌクレオチドのＳＡＨアプタマー構築物を使用して得た。１２２  ａｈｃＹ  ＲＮＡが任意選択的なＰ３ステムを保有するにもかかわらず、ＲＮＡはリガンド結合に関してアプタマーコア中に重要な構造変化を受け、見かけ上のＫＤ値は６８  ｍｅｔＨ  ＲＮＡについて測定したＫＤ値に類似する。
【０３５０】
ＳＡＨ応答性リボスイッチのセンサーとして機能するためのＳＡＨアプタマーについて、それがＳＡＨと類似の構造の生物学的に関連する化合物を区別できなければならない。おそらく最も重要には、アプタマーは、１つのメチル基および硫黄中心の関連する正電荷のみがＳＡＨと異なるＳＡＭを識別しなければならない。インライン探索およびＳＡＭの商業的供給源を使用して、６８  ｍｅｔＨ  ＲＮＡは、他のＳＡＨアプタマーと同様に、ＳＡＨについて確立された見かけ上のＫＤ値よりも１０倍しか高くない見かけ上のＫＤ値を示すことが見出された。しかし、ＳＡＭは自発的に分解してかなりのレベルでＳＡＨ汚染し、新たに調製した市販のＳＡＭサンプルでさえも約１０％のＳＡＨを含む（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｓｅｒｖｉｃｅ）。したがって、６８  ｍｅｔＨ  ＲＮＡによるＳＡＭのより高いレベルの識別は、ＳＡＭサンプル中のＳＡＨの存在によって不明確であり得る。
【０３５１】
ＳＡＨアプタマーがＳＡＭを識別する能力をより正確に評価するために、ＳＡＭのＳＡＭ−Ｉクラスリボスイッチアプタマーへの結合特性を密接に模倣することが以前に示されたＳＡＨのスルホンアナログを使用したインライン探索（Ｌｉｍら、２００６ｂ）を行った。具体的には、ＳＡＨのスルホンアナログは、ＳＡＭ中に存在する硫黄上にメチル基を欠くが、硫黄から電子密度を引いて天然補酵素のそれに類似のこの原子の相対的正電荷を増加させる２つの電気陰性酸素原子を保有する。インライン探索の結果（図１０Ｃ）により、スルホンアナログがＳＡＨより約３桁低い見かけ上のＫＤで６８  ｍｅｔＨ  ＲＮＡに結合することが明らかとなる。
【０３５２】
また、ＳＡＭに対する６８  ｍｅｔＨ  アプタマーのＫＤ値を平衡透析法の使用によって評価して、ＳＡＨ  アプタマーの機能を１５６  ｍｅｔＡと呼ばれる以前に報告されたＳＡＭ−ＩＩアプタマー（Ｃｏｒｂｉｎｏら、２００５）の機能と比較した。６８  ｍｅｔＨ  ＲＮＡまたは１５６  ｍｅｔＡ  ＲＮＡ（１０□Ｍ）のいずれかを、平衡透析法装置の一方のチャンバーに添加し、１００ｎＭの［３Ｈ］ＳＡＭ（図１１Ａ）を他方のチャンバーに添加した。チャンバーを、分子量カットオフ５０００ダルトンの透過性膜によって分離した。［３Ｈ］ＳＡＭの硫黄中心のメチル基が放射性同位元素標識されるので、夾雑ＳＡＨは放射性を示さず、したがって、２チャンバー間の放射能の平衡分布に影響を及ぼさない。
【０３５３】
同一アッセイ条件下で６８  ｍｅｔＨ  ＲＮＡが存在する場合にシフトしないのと比較して、１５６  ｍｅｔＡ  ＲＮＡは、ＳＡＭ−ＩＩアプタマーを含むチャンバーに有利なように［３Ｈ］ＳＡＭの分布が約１．５倍シフトする（図１１Ｂ）。インライン探索によって決定したところ、１５６  ｍｅｔＡ  ＲＮＡのＳＡＭに対する見かけ上のＫＤは約１□Ｍである（Ｃｏｒｂｉｎｏら、２００５）。したがって、ＳＡＭに対する６８  ｍｅｔＨのＫＤ値は、１□Ｍより高い。さらに、２５μＭの６８  ｍｅｔＨ  ＲＮＡを使用した場合にＳＡＭ−ＩＩリボスイッチについて認められた放射能シフトに等価な放射能シフトが存在しないことは、ＳＡＭに対するそのＫＤは２５μＭに過ぎない可能性が高いことを示す。これは、６８  ｍｅｔＨ  ＲＮＡがＳＡＭよりもよりよく１０００倍高い可能性がある親和性でＳＡＨを認識することを示す（図１１Ｃ）。ＳＡＨとＳＡＭとの間のこの識別は、リボスイッチがＳＡＨと等価であるか少し過剰なＳＡＭ濃度に曝露した場合でさえもＳＡＨレベルの変化に応答したＳＡＨ再利用遺伝子の発現を正確に調節するのに十分なはずである。
【０３５４】
ＳＡＨアプタマーの分子認識特性を、ＳＡＨの１５アナログに対する６８  ｍｅｔＨ  ＲＮＡの見かけ上のＫＤ値を確立することによってより詳細に評価した（図１２Ａ）。アミノ酸のカルボキシル基およびアミノ基、糖環および核酸塩基上の種々の位置、ならびにチオエステル結合を改変した。Ｓ−アデノシルシステイン（ＳＡＣ）以外の全てのアナログは、親和性が少なくとも３桁減少する。興味深いことに、ＳＡＭ感知リボスイッチに観察されるものと異なり、ＳＡＣのより短いアミノ酸側鎖による親和性の喪失は小さなものでしかなかった（Ｌｉｍら、２００６ｂ）。
【０３５５】
ＳＡＨのスルホン（化合物３）およびアザ（化合物４）誘導体中の硫黄原子の変化はまた親和性を３桁減少させ、このリガンド認識位置の重要性を示す。化合物４は、インライン探索のために使用した条件下であまり変化しない（Ｌｉｍら、２００６ｂ）。したがって、ＲＮＡとのそのより弱い相互作用がメチル基の存在によって立体干渉を引き起こし得る。硫黄原子での化合物３のより高い正の電荷密度（Ｌｉｍら、２００６ｂ）は、化合物４と比較して本化合物のわずかにより弱い結合に寄与し得る。さらに、ＳＡＨ中の硫黄中心の２組の孤立電子対は、ＲＮＡのリガンド認識で重要な役割を果たし得る。ＳＡＨ（およびＳＡＣ）の硫黄原子は、考えられる限り、電荷移動またはファンデルワールス相互作用によってアプタマーと生産的に相互作用することができる。最後に、アデノシンはＳＡＨアプタマーと弱く相互作用するが（Ｋｄ約１００□Ｍ）、ホモシステインやメチオニンは１ｍＭもの濃度でもＲＮＡ構造のいかなる調整も引き起こさない。
【０３５６】
これらの結果を使用して、６８  ｍｅｔＨ  ＲＮＡによるＳＡＨの分子認識モデルを作製した（図１２Ｂ）。いくつかの他のリボスイッチアプタマークラスについて認められるように、このモデルは、本質的にリガンド上のあらゆる官能基が重要な分子認識決定要因としての機能を果たすことを示す（例えば、  Ｍａｎｄａｌら、２００３；Ｓｕｄａｒｓａｎら、２００３ｂ；Ｍａｎｄａｌら、２００４ｃ；Ｌｉｍら、２００６ａ；Ｌｉｍら、２００６ｂ）。
【０３５７】
ｉｉｉ．ＳＡＨ結合はレポーター遺伝子の発現を活性化する
ＳＡＨエレメントとＰ．ｓｙｒｉｎｇａｅ由来のａｈｃＹ  ｍＲＮＡの開始コドンとの間の配列は、Ｐ４ステムの３’末端の２つのヌクレオチドが二者択一的にリボゾーム結合部位またはシャイン−ダルガルノ（ＳＤ）配列と塩基対合することができる追加のステム−ループ構造を形成すると予想される（図１３Ａ）。この後者の相互作用は、２つの塩基対によって追加のステム−ループ構造を伸長し、したがって、ＳＤ隔離ステムとして機能することができる。したがって、このＲＮＡは、おそらくＳＤ配列の曝露によってリガンド結合するときに遺伝子発現を活性化してｍＲＮＡとのリボゾーム相互作用を容易にするＳＡＨ応答性リボスイッチとして機能する。Ｄ．ａｒｏｍａｔｉｃａ  ｍｅｔＨ遺伝子由来のＳＡＨアプタマーについて類似のＳＡＨ媒介性再配置が予想されるにもかかわらず、このＲＮＡとのリガンド結合が転写ターミネーターステムの形成を調節するようである。
【０３５８】
Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅにおけるａｈｃＹ遺伝子の５’ＵＴＲを含むＩＧＲをｌａｃＺコード配列のすぐ上流に融合した生体内遺伝子調節アッセイを行った。この構築物は、レポーター遺伝子ＯＲＦとインフレームで融合したａｈｃＹ遺伝子の開始コドンを保持していた。得られた翻訳融合ベクターをＰ．ｓｙｒｉｎｇａｅに形質転換して、野生型（ＷＴ）レポーター株を産生した。同様に、アプタマー機能を破壊または修復すると予想される一連の変異レポーター株を構築した（図１３Ａ）。形質転換したＰ．ｓｙｒｉｎｇａｅ株を、次いで、Ｋｉｎｇ培地Ｂ（リッチ）またはＶｏｇｅｌ−Ｂｏｎｎｅｒ培地（最小）のいずれかで増殖させ、変異構築物のレポーター発現レベルをＷＴレポーター構築物由来の結果と比較した（図１３Ｂ）。
【０３５９】
リッチ培地では、ＳＡＨ濃度は高いと予想される。これは細胞が補因子としてＳＡＭの使用が必要な代謝経路を利用するはずであるからである。予想通り、ＷＴ構築物の□−ガラクトシダーゼレポーター活性は、ステムＰ１とＰ２またはＪ１−２との間のジャンクション（図１３Ａ）中の２つの保存ヌクレオチドを破壊する変異を保有する構築物Ｍ１と比較して上昇する（図１３Ｂ、上）。この所見は、ＳＡＨ結合が遺伝子発現を活性化し、リガンド結合を破壊する変異によってリボスイッチがオフ状態に戻るという考えと一致する。残念なことに、Ｍ２によって保有される変異によるＰ２ステムの不安定化がリボスイッチ機能を破壊すると予想されたという事実にもかかわらず、Ｍ２およびＭ３の両方はＷＴ様発現を示す。しかし、インライン探索（ＳＡＨの存在下および非存在下）により、Ｍ２構築物が著しく誤折り畳みされ、それにより、レポーター構築物が高遺伝子発現に戻り得ることが明らかとなった。過剰に誤折り畳みしなかった構築物を得たＰ２のさらなる変異を試験した。予想通り、変異体Ｍ４（Ｐ２破壊）およびＭ５（Ｐ２修復）は、それぞれ、遺伝子発現の喪失およびその後の遺伝子発現の修復を示す。これらの所見は、アプタマーの破壊によってリボスイッチが遺伝子発現のオフ状態に戻ることを再度示し、Ｍ２変異が実際にその誤折り畳みおよび遺伝子発現の結果で異常であることを示す。
【０３６０】
同様に、構築物Ｍ６、Ｍ７、およびＭ８によって保有される変異の影響は、ＳＤ隔離を含む遺伝子調節機構と一致する。これらの構築物は、それぞれ、Ｐ４の安定性を低下させる２つの変異を保有し、かかる構築物に対するＳＡＨ結合親和性の喪失がインライン探索の使用によって認められた。さらに、ＳＡＨ結合が破壊された構築物はまた、低い□−ガラクトシダーゼレポーター活性を得ることができる。この結果は、実際、Ｍ６およびＭ８について認められるが、Ｍ７はＷＴ発現に近い（図１３Ａ）。Ｍ７変異はＰ４形成を破壊するにもかかわらず、この変異はＳＤ配列に重複する隔離ステムも破壊することができる。したがって、Ｍ７リボスイッチは、もはやＯＦＦ状態に戻す能力がないはずであり、認められるように、リボスイッチ−レポーター融合構築物の遺伝子発現は高くなり得る。最少培地（Ｖｏｇｅｌ−Ｂｏｎｎｅｒ培地）で増殖した細胞を使用して類似の一連のレポーター遺伝子アッセイを行った。最少培地で増殖した種々の構築物を使用して同一の傾向が認められたが（図１３Ｂ、下）、レポーター発現についての絶対値はリッチ培地においてより高かった。最小培地における全レポーター発現のこの減少は、一般的な代謝活性およびタンパク質合成の減少に起因し得る。
【０３６１】
インライン探索を使用して、Ｐ４ステム形成とＳＤ隔離ステム形成との間の競合を観察することができるかどうかを判定した。図１３Ａに示したものと類似の１５１  ａｈｃＹ  ＲＮＡに基づいたより長い構築物を使用したインライン探索により、ＳＡＨが存在する場合にＳＤ隔離ステムが実際にＷＴ構築物中で破壊されることが明らかとなる。対照的に、本構築物のＭ６バージョンはＳＡＨの有無と無関係にＳＤ隔離ステムを形成するのに対して、Ｍ７バリアントはこのステムを形成できない。したがって、完全なＰ４ステムおよび完全なＳＤ隔離ステムの相互排他的形成は、Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ  ａｈｃＹ遺伝子由来のＳＡＨリボスイッチの発現プラットフォームの重要な成分であり得る。
【０３６２】
生体内での代謝産物エフェクターとしてＳＡＨをさらに確立するために、細胞ＳＡＨレベルを増加させることが公知のエフェクターを補充した最小培地中で増殖させたＷＴ株のレポーター発現を測定した（図１４）。アデノシン−２’，３’−ジアルデヒド（ＳＡＨヒドロラーゼのインヒビター）およびアデノシン＋ホモシステインは共に、細胞ＳＡＨレベルを実質的に増加させることが以前に報告されている（Ｈｅｒｍｅｓら、２００４）。ＳＡＨヒドロラーゼインヒビターまたはアデノシン／ホモシステイン混合物のいずれかを補充した培地は、ＷＴリボスイッチ−レポーター融合構築物の発現を約１０〜２０倍増加させ（図１４Ａ）、アデノシン−２’，３’−ジアルデヒド濃度の増加により、ＷＴを使用した遺伝子発現は増加するが、欠損変異体Ｍ１およびＭ７では増加しなかった（図１４Ｂ）。培地へのメチオニンの添加により、リボスイッチ媒介性発現が同様に増加する。増殖培地中の過剰なメチオニンにより、細胞ＳＡＭ濃度がより高くなり（Ｗｉｎｋｌｅｒら、２００３）、細胞ＳＡＨ濃度も増加し得る。
【０３６３】
対照的に、培地への２５０□Ｍ  ＳＡＨの添加によってレポーター発現はわずかしか増加しない。ＳＡＨはインタクトな分子として細胞膜を横切らず（Ｕｅｌａｎｄ、１９８２）、このことは、何故この化合物の添加がレポーター発現レベルにほとんど影響を及ぼさないかを説明している。Ｐ４の形成を破壊し、且つアプタマーのコアコンセンサス配列を変化させる変異を保有するＭ６リボスイッチ−レポーター融合構築物を用いて、遺伝子発現がほぼ認められないので、レポーター発現の上方制御はリボスイッチ依存性のようである（図１３Ａ）。
【０３６４】
２．考察
ＳＡＨはＳＡＭ依存性メチル転移反応の生成物として生物系に遍在しているが、高濃度で存在する場合にこれらの反応のインヒビターとしても機能する（Ｕｅｌａｎｄ、１９８２）。したがって、多数の細胞は、ＳＡＨを選択的に感知して過剰なＳＡＨを破棄する必要がある。いくつかの生物では、ＳＡＨは、硫黄代謝に関与する遺伝子を調節するタンパク質遺伝因子（Ｒｅｙら、２００５）によって感知される。これらの所見により、ＲＮＡ分子が類似の能力でＳＡＨを感知してその異化に必要な重要遺伝子を調節するのに役立ち得ることが明らかとなる。
【０３６５】
ＳＡＨエレメントの同定により、ＳＡＨに選択的に結合する、高度に保存され且つ広範に分布する細菌ＲＮＡの第１の例が得られる。このＲＮＡは、常にＯＲＦのすぐ上流に存在するリボスイッチクラスのアプタマードメインとしての役割を果たし、その予想されるタンパク質産物がＳＡＨ異化に関与する。これは、ＳＡＨリボスイッチの大部分がリガンド結合に応答して遺伝子発現をオンにする可能性が高いことを示す。実際、ＲＮＡエレメントの直接リガンド結合が一定の二次構造および三次構造を安定化して隣接ＯＲＦのＳＤ配列に接近可能にし、リボゾーム結合およびその後の翻訳を可能にする。
【０３６６】
ＳＡＨ結合に対して強く識別するいくつかの異なるクラスの公知のＳＡＭ感知リボスイッチが存在するにもかかわらず（Ｌｉｍら、２００６ｂ；Ｆｕｃｈｓ、２００６）、ＳＡＨリボスイッチは、ＳＡＨ結合を好み、且つＳＡＭを拒絶するようにこの識別を逆にする同定された第１のＲＮＡクラスである。他のリボスイッチクラスと同様に、他の密接に関連する化合物による遺伝子発現の調節を防止するために、リガンド結合の高い選択性が必要であり得る。ＳＡＨアプタマーによる強い分子識別により、不必要に活性化したＳＡＨ異化遺伝子発現からＳＡＭなどの他の化合物が排除される可能性が高く、これはＳＡＨが高レベルに蓄積する場合のみに必要である。ＳＡＭ（ＳＡＨの代謝前駆体）は通常の条件下でＳＡＨよりも巨大な細胞プールを有するので、ＳＡＨアプタマーのこの識別力は特に重要である（Ｕｅｌａｎｄ、１９８２）。ＳＡＨリボスイッチの遺伝子コンテクストおよびＳＡＭを約３桁の規模で識別するその能力は、ＳＡＨが生体内でＲＮＡエレメントによって感知される代謝産物であることを示す。したがって、ＳＡＨリボスイッチにより、ＳＡＨ濃度が適切な遺伝子発現に値する場合のみに細胞がＳＡＨ分解のための資源を拡大することが可能であるセンサーおよび遺伝子調節エレメントのクラスを有する遺伝子が得られる。
【０３６７】
天然ＳＡＭアプタマーと同様に、本研究で最も詳細に試験したＳＡＨアプタマーは、分子認識のためのリガンド上の本質的にあらゆる官能基を使用する。１つの留意すべき例外は、ＳＡＨアプタマーが、親和性を実質的に喪失することなく、リガンドのアミノ酸部分からのメチレン基の除去を許容するという所見である。Ｓ−アデノシルシステイン（ＳＡＣ；図１２Ａ、化合物２）はＳＡＨ中に存在する同一の一連の官能基を保有するが、これらの基のいくつかはアプタマーの結合ポケット中の１Å以上が置換されなければならない。より短いＳＡＣアナログの許容について、ＲＮＡアプタマーがそれぞれがリガンドの片側と相互作用する２つの個別の結合ポケットを形成することができると説明することが可能である。これにより、結合部位が異なる長さのリガンドを認識可能な一定レベルの適応性が得られる。見かけ上のＫＤ値は次第に低くなっていくが、次第に短くなって行くチアミン一リン酸塩およびチアミン化合物に結合することができるＴＰＰ結合リボスイッチについてのこのリボスイッチアプタマー機能型の優先性が報告されている（Ｗｉｎｋｌｅｒら、２００２）。ＴＰＰリボスイッチアプタマーの原子分解モデル（ＥｄｗａｒｄｓおよびＦｅｒｒｅ−Ｄ’Ａｍａｒｅ，２００６；Ｓｅｒｇａｎｏｖら、２００６；Ｔｈｏｒｅら、２００６）により、比較的高い親和性でより短いチアミン一リン酸塩リガンドに結合するようにその位置を調整することができる二分リガンド結合ポケットが明らかとなる。
【０３６８】
ＳＡＨアプタマー中で最も高度に保存されたヌクレオチドは、主に、Ｐ４中およびＰ１、Ｐ２、およびＰ４に架橋するジャンクション中に存在する（図９Ａ）。インライン探索によって認められたこれらの残基の構造の実質的な調整によって明らかなように、これらのヌクレオチドは、ＳＡＨの結合ポケットの形成に関与し得る（図１０Ａおよび１０Ｂ）。これらのヌクレオチドは、硫黄中心で電荷を欠くリガンドに結合するポケットを形成し、したがって、ＳＡＭ−Ｉアプタマーのそれと異なる方法でこの原子中心と相互作用する構造を形成する。ＳＡＨアプタマーは、本研究で試験した硫黄中心が改変されている両化合物を拒絶する（図１２Ａ、化合物３および４）。ＳＡＨの硫黄を置換した窒素中心が同様に不荷電であるので、化合物４に対する識別は特に注目に値する。したがって、ＳＡＨリボスイッチは、ＳＡＨ中の硫黄に等価な原子上のさらなる化学部分を保有するＳＡＭ、３、および４のような化合物の立体排除によって識別することは明白である。
【０３６９】
リボスイッチクラスのリストの拡大に加えて、ＳＡＨアプタマーの同定は、高選択性ＳＡＨセンサーとして適用される。例えば、ＳＡＨはホモシステインの供給源であり、これを心血管疾患のマーカーとして使用することができる（Ｎｙｇａｒｄら、１９９９）。ＳＡＨエレメントのコンセンサスに適合する配列決定した細菌ゲノム中で同定された最も短い例は、５０ヌクレオチドをわずかに超えるサイズである（Ｄｅｃｈｌｏｒｏｍｏｎａｓ  ａｒｏｍａｔｉｃａにおけるＯＲＦ  Ｄａｒｏ＿０１８６の上流に存在する）。ＳＡＨに対するナノモルの親和性およびＳＡＭなどの密接に関連するアナログに対する数桁規模の識別ならびに容易に利用可能な発現プラットフォームを結びつけて考えて、ＳＡＨエレメントは試験管内および生体内適用のための所望の性質を有する。
【０３７０】
３．実験手順
ｉ．オリゴヌクレオチド、化学物質、および細菌
合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、イェール大学  Ｗ．Ｍ．Ｋｅｃｋ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙまたはＳｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓから購入し、他で記載しない限りさらに処理することなく使用した。［３Ｈ］ＳＡＭまたはＳ−（５’−アデノシル）−Ｌ−メチオニン−（メチル−３Ｈ）をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰをＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。化合物４は、シェフィールド大学  Ｇ．Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ教授から譲渡された。ＳＡＨアナログ３、５、６、および９〜１６（それらの調製を他の場所に記載した）を除いた他の全ての化学物質をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した（Ｌｉｍら、２００６ｂ）。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．ｔｏｍａｔｏ  ｓｔｒ．ＤＣ３０００は、コーネル大学  Ｇｒｅｇｏｒｙ  Ｂ．Ｍａｒｔｉｎ教授から譲渡された。
【０３７１】
ｉｉ．ＲＮＡの調製
６８  ｍｅｔＨおよび１２２  ａｈｃＹ  ＲＮＡを、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼおよび対応するＤＮＡテンプレートを使用した試験管内での転写によって調製した。６８  ｍｅｔＨのＤＮＡテンプレートを、製造者の説明書にしたがってＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して合成テンプレートＤＮＡとハイブリッド形成したＴ７プロモーター配列を保有するプライマーの伸長によって生成した。合成テンプレートＤＮＡを、変性（８Ｍ尿素）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）の使用によって伸長前に精製した。野生型および変異１２２  ａｈｃＹ  ＲＮＡのＤＮＡテンプレートを、下記の適切なプラスミドを使用したＰＣＲ増幅から生成した。ＲＮＡ転写物を変性ＰＡＧＥによって精製し、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５、２３℃）、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、および１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む溶液を使用してゲルフラグメントから溶離させた。製造者の説明書にしたがって、ＲＮＡをエタノールでの沈殿によって濃縮し、アルカリホスファターゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して脱リン酸化し、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して５’放射性同位元素標識した。放射性同位元素標識したＲＮＡを、上記のように変性ＰＡＧＥによって精製し、単離した。
【０３７２】
平衡透析法のために使用される野生型および変異６８  ｍｅｔＨ  ＲＮＡを上記のように調製および精製するが、脱リン酸化および放射性同位元素標識を使用しなかった。平衡透析法のために使用される１５６  ｍｅｔＡ  ＲＮＡ（Ｃｏｒｂｉｎｏら、２００５）を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＧＶ２２６０株のホールセルＰＣＲによって生成したＤＮＡテンプレートを使用して、上記のように調製した。
【０３７３】
ｉｉｉ．インライン探索分析
インライン探索アッセイを、本質的に以前に記載のように行った（ＳｏｕｋｕｐおよびＢｒｅａｋｅｒ、１９９９）。５’３２Ｐ標識ＲＮＡを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３、２５℃）、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＫＣｌ、および表示濃度の試験化合物を含む１０μｌの体積にて室温で約４０時間インキュベートした。自発的切断産物を変性１０％ＰＡＧＥによって分離し、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を使用して視覚化し、ＳＡＦＡ  ｖ１．１ソフトウェア（Ｄａｓら、２００５）を使用して定量した。各ヌクレオチド位置でのＲＮＡの切断量を、ＳＡＦＡ分析から得た。この分析は、不変レベルで自発的に切断する基準ヌクレオチド位置を自動的に決定して、各レーンの異なるロード量を修正する。各調整部位での各バンド強度を合計および正規化して、構造的に調整されたＲＮＡの割合についての値を得た。これにより、リガンドの非存在下では調整されず、最高濃度のリガンドの存在下で最大に調整されると見なされた。見かけ上の解離定数（ＫＤ）の値を、ＳｉｇｍａＰｌｏｔ９ソフトウェア（Ｓｙｓｔａｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）を使用した調整の割合（Ｆ）対３つ全ての示した調整部位でのリガンド濃度（［Ｌ］）のプロットの式Ｆ＝［Ｌ］／（［Ｌ］＋ＫＤ）へのフィッティングによって決定した。
【０３７４】
ｉｖ．平衡透析法
チャンバー間の分離を５０００ダルトン分子量カットオフの透析膜によって維持するＤｉｓｐｏ−Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  Ｂｉｏｄｉａｌｙｚｅｒ（Ｔｈｅ  Ｎｅｓｔ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈｂｏｒｏ，ＭＡ，ＵＳＡ）の各サイドへの２０μｌサンプルの送達によって、平衡透析法を行った。一方のチャンバーは、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３、２４℃）、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＫＣｌ、および１００ｎＭ  ［３Ｈ］ＳＡＭから構成される緩衝液を含んでいた。反対側のチャンバーは、同一の緩衝液および表示濃度の１５６  ｍｅｔＡまたは６８  ｍｅｔＨ  ＲＮＡのいずれかを含んでいた。２５℃で１１．５時間のインキュベーション後、５μｌアリコートを両チャンバーから取り出し、液体シンチレーションカウンターによって放射能を測定した。
【０３７５】
ｖ．生体内レポーター遺伝子発現アッセイ
予想されるａｈｃＹ翻訳開始部位（ＧｅｎＢａｎｋ受入れ番号：ＮＣ＿００４５７８．１；ヌクレオチド５，７７１，０７２〜５，７７１，４４４）と比較したヌクレオチド−３６７〜＋６を、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．ｔｏｍａｔｏ  ｓｔｒ．ＤＣ３０００のホールセルＰＣＲによってＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとして増幅した。ＰＣＲ産物を、ｌａｃＺレポーター遺伝子のすぐ上流の翻訳融合ベクターｐＲＡ３０１にクローン化した（ＡｋａｋｕｒａおよびＷｉｎａｎｓ、２００２）。このレポーターベクターは、ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａベクターｐＶＳ１（Ｉｔｏｈら、１９８４）由来の複製起点ｒｅｐおよび安定領域ｓｔａを保有するので、シュードモナスで安定に維持される。変異体Ｍ１〜Ｍ８を、テンプレートして得られたプラスミド、適切な変異誘発プライマー、およびＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を製造者の説明書にしたがって使用して生成した。全組換えプラスミドの完全性を、配列決定によって確認した。ｐＲＡ３０１バリアントのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅへの形質転換を、標準的なプロトコールにしたがったエレクトロポレーションによって行った（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９２）。正確な形質転換体を、スペクチノマイシン（７５μｇ／ｍｌ）に対する選択性および  リファンピシン（５０μｇ／ｍｌ）耐性によって同定した。
【０３７６】
野生型（ＷＴ）および変異Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅレポーター株におけるｌａｃＺ遺伝子の発現レベルを測定するために、細胞を、Ｋｉｎｇ培地Ｂ（Ｋｉｎｇら、１９５４）（２０ｇ／ｌ  Ｐｒｏｔｅｏｓｅ  Ｐｅｐｔｏｎｅ  ｎｏ．３、１０ｇ／ｌ  グリセロール、１．５ｇ／ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４、１．５ｇ／ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ｐＨ７．２）、５０μｇ／ｍｌリファンピシン、および７５μｇ／ｍｌスペクチノマイシンまたはＶｏｇｅｌ−Ｂｏｎｎｅｒ最小培地（０．２ｇ／ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２ｇ／ｌクエン酸一水和物、１０ｇ／ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４、３．５ｇ／ｌ  ＮＨ４ＮａＨＰＯ４・４Ｈ２Ｏ、ｐＨ  ７．０）、０．５％  ｗ／ｖグルコース、５０μｇ／ｍｌリファンピシン、および７５μｇ／ｍｌスペクチノマイシンのいずれかにて振とうしながら２８℃で一晩増殖させた。一晩培養物を、同一培地でＡ６００＝０．１〜０．２に希釈し、表示のさらなる化合物を補充した。培養物をさらに４．５時間（Ｋｉｎｇ培地Ｂ）または６時間（Ｖｏｇｅｌ−Ｂｏｎｎｅｒ培地）インキュベートし、その後に標準的なプロトコールにしたがってβ−ガラクトシダーゼアッセイを行った（Ｍｉｌｌｅｒ、１９９２）。報告したミラー単位は、３つの反復実験の平均であった。
【０３７７】
（実施例４）
Ｄ．実施例４：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉａにおける第２の天然ｐｒｅＱ１  アプタマークラスの確認
真正細菌ゲノムのバイオインフォマティクス検索により、関連遺伝子の試験でリガンドの同一性が直ちに明らかにならない多数のリボスイッチ候補が得られた。これらのモチーフの１つは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ科においてＣＯＧ４７０８またはＤＵＦ９８８に分類された仮説上の膜タンパク質をコードする遺伝子の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）内にもっぱら見出される。キューオシン生合成中間体であるｐｒｅ−キューオシン１（ｐｒｅＱ１）に結合するリボスイッチは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ外の細菌の多数のＦｉｒｍｉｃｕｔｅ種における相同遺伝子の５’ＵＴＲ中に同定された。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  Ｒ６由来のＣＯＧ４７０８  ＲＮＡモチーフの代表もｐｒｅＱ１に結合することを本明細書中に示す。さらに、このＲＮＡの代表は、前に記載したｐｒｅＱ１リボスイッチクラスのそれと異なる構造および分子認識特性を有する。ｐｒｅＱ１は２つ以上の異なる天然アプタマークラスが存在する第２の代謝産物であり、同一の代謝産物に結合するために異なる構造を利用する天然アプタマーが共通であり得ることを示す。さらに、ｐｒｅＱ１結合ＲＮＡとＣＯＧ４７０８に分類されるタンパク質をコードするほとんどの遺伝子との関連は、これらのタンパク質がｐｒｅＱ１または別のキューオシン生合成中間体の輸送体として機能することを示す。
【０３７８】
リボスイッチは、遺伝子発現を調節するための小分子代謝産物に結合する構造化ＲＮＡである（ＭａｎｄａｌおよびＢｒｅａｋｅｒ  ２００４ａ；ＳｏｕｋｕｐおよびＳｏｕｋｕｐ  ２００４；ＴｕｃｋｅｒおよびＢｒｅａｋｅｒ  ２００５；ＷｉｎｋｌｅｒおよびＢｒｅａｋｅｒ  ２００５）。リボスイッチは、典型的には、リガンド結合アプタマーおよびリガンド結合を遺伝子調節に変える発現プラットフォームからなる。各リボスイッチクラスのアプタマーは、通常、リガンド結合部位によって強いられる制限によって十分に保存される。アプタマー配列のこの保存およびアプタマーの構造により、ゲノム配列のバイオインフォマティクス分析が新規のリボスイッチ候補の同定のための有効なツールとなる（例えば、Ｒｏｄｉｏｎｏｖら２００２；Ｒｏｄｉｏｎｏｖら２００３；Ｂａｒｒｉｃｋら２００４；Ａｂｒｅｕ−ＧｏｏｄｇｅｒおよびＭｅｒｉｎｏ  ２００５；Ｃｏｒｂｉｎｏら２００５；Ｗｅｉｎｂｅｒｇら２００７）。対照的に、発現プラットフォームは非常に変化し、転写終結および翻訳阻害などの多様な遺伝子調節機構を利用することができる（ＭａｎｄａｌおよびＢｒｅａｋｅｒ  ２００４ａ）。発現プラットフォームを、通常、各リボスイッチ配列の試験によって識別することができるが、配列および構造保存のその相対的欠如により、新規のリボスイッチクラスのバイオインフォマティクスによる発見のための標的としてのその有用性が妨げられる。
【０３７９】
バイオインフォマティクス検索を使用して、多数のリボスイッチおよびリボスイッチの候補が発見されている（例えば、Ｂａｒｒｉｃｋら２００４；Ｃｏｒｂｉｎｏら２００５）。ごく最近、数百個の細菌ゲノムの検索に適用したＣＭｆｉｎｄｅｒパイプライン（Ｙａｏら２００６）を使用した２２のＲＮＡモチーフの発見を使用した（Ｗｅｉｎｂｅｒｇら２００７）。２２モチーフのうちの６個は、リボスイッチなどのシス調節ＲＮＡに共通の特徴を示す。例えば、これらのモチーフは、遺伝子または異なる遺伝子組のすぐ上流に一貫して存在する。さらに、これらのモチーフの代表は、以下の２つの特徴のうちの１つを有する：ｒｈｏ非依存性転写ターミネーターまたはすぐ下流に存在する遺伝子のリボゾーム結合部位またはシャイン−ダルガルノ配列（ＳＤ）に重複するステム。いくつかの記載のモチーフについて、リガンド同一性を、ＲＮＡのゲノムコンテクストから推測した（Ｗｅｉｎｂｅｒｇら２００７；Ｗａｎｇら２００８；Ｒｅｇｕｌｓｋｉらが提出）。他のモチーフについて、以前にゲノムコンテクストからリガンド同一性に関する情報はほとんど得られなかったか全く得られなかった。１つのかかるＲＮＡモチーフは、ＣＯＧ４７０８またはＤＵＦ９８８に分類されるＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓで見出された保存された仮説上の膜タンパク質の遺伝子のみと関連することが見出された。
【０３８０】
キューオシン（Ｑ）生合成前駆体ｐｒｅＱ１に応答するリボスイッチ（Ｒｏｔｈら２００７）が記載されている。Ｑは、ほとんどの細菌においてＴｙｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、およびＨｉｓのｔＲＮＡ中のＧＵＮアンチコドンのゆらぎ位置で見出される高改変塩基である（ＨａｒａｄａおよびＮｉｓｈｉｍｕｒａ  １９７２）。Ｑ改変は、翻訳忠実度に重要であることが公知である（Ｍｅｉｅｒら１９８５；ＢｉｅｎｚおよびＫｕｂｌｉ  １９８１；Ｕｒｂｏｎａｖｉｃｉｕｓら２００１）。Ｑ生合成は、ＧＴＰから開始され、一連の酵素工程において中間体ｐｒｅＱ０（７−シアノ−７−デアザグアニン）およびｐｒｅＱ１（７−アミノメチル−７−デアザグアニン）を介して進行する（Ｋｕｃｈｉｎｏら１９７６；Ｏｋａｄａら１９７８；Ｉｗａｔａ−Ｒｅｕｙｌ  ２００３；ＧａｕｒおよびＶａｒｓｈｎｅｙ  ２００５；Ｖａｎ  Ｌａｎｅｎら２００５）。ｐｒｅＱ１は特異的グアニンｔＲＮＡと優先的に置換され、残りの生合成工程がｉｎ  ｓｉｔｕで起こる（Ｏｋａｄａら１９７９；Ｓｌａｎｙら１９９３）。したがって、ｐｒｅＱ１は、ｔＲＮＡへの挿入前に遊離形態で存在する最後のＱ前駆体である。
【０３８１】
公知のｐｒｅＱ１リボスイッチクラスの代表（Ｒｏｔｈら２００７）は、しばしばＱ生合成オペロンの上流に存在するが（Ｒｅａｄｅｒら２００４）、いくつかはまたそうでなければＱに関連しないタンパク質をコードする他の遺伝子の上流で同定されており、これらの遺伝子型の１つはＣＯＧ４７０８に分類される。したがって、ＣＯＧ４７０８タンパク質がＱ生合成前駆体の輸送に関連し得ると推測された。
【０３８２】
本研究では、ＣＯＧ４７０８タンパク質をコードする遺伝子に関連するＲＮＡがｐｒｅＱ１に強固且つ選択的に結合し、遺伝子の「オフ」スイッチと一致する特徴も示すと判定した。したがって、このＲＮＡモチーフの代表が実際にｐｒｅＱ１リボスイッチの第２のクラス（以後、ｐｒｅＱ１−ＩＩと呼ぶ）としての機能を果たすと提案された。ｐｒｅＱ１−ＩＩリボスイッチアプタマーは、以前に記載されたｐｒｅＱ１リボスイッチ（Ｒｏｔｈら２００７）（現在、ｐｒｅＱ１−Ｉに改名）のそれよりも実質的に異なる構造および分子認識プロフィールを有する。したがって、ｐｒｅＱ１は、天然ＲＮＡアプタマーの少なくとも２つのクラスによって認識される代謝産物の第２の例としてのＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）（Ｃｏｒｂｉｎｏら２００５）に連結する。さらに、新規のリボスイッチクラスの発見を、そのホモログが公知のリボスイッチによって調節されるｍＲＮＡの非コード領域中で検索することによって補助することができる。
【０３８３】
１．結果と考察
ｉ．ＣＯＧ４７０８  ＲＮＡモチーフのバイオインフォマティクス
ＣＯＧ４７０８  ＲＮＡモチーフの元の記載には、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ科由来の２２個の配列を含み、そのうちの６つは固有であった（Ｗｅｉｎｂｅｒｇら２００７）。ＣＯＧ４７０８  ＲＮＡモチーフのさらなる例を同定するために、アップデートされた配列データベースリリース（ＲｅｆＳｅｑ２５）を使用して相同性検索を行った。モチーフと適合するさらなる１８個の配列を同定し、それにより、配列の総数は４０個になり、固有の配列数は１３個になった（図１５）。
【０３８４】
ほとんどの新規の代表を、代表的な株が以前に配列決定されているＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、またはＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓなどの生物において同定した。したがって、いくつかのさらなるＣＯＧ４７０８  ＲＮＡは、既に記載のものと非常に類似しているか同一である。Ｓ．ｓｕｉｓ、Ｓ．ｓａｎｇｕｉｎｉｓ、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉにおけるモチーフの配列適合も同定した。モチーフの全ての代表は、ＣＯＧ４７０８またはＤＵＦ９８８と注釈付けしたタンパク質をコードする遺伝子の５’−ＵＴＲ中で見出された。アプタマー内にシュードノット、ループ配列、およびＳＤ配列を含む以前に記載のモチーフ（Ｗｅｉｎｂｅｒｇら２００７）の保存された特徴は、全ての新規の代表中に存在する（図１６Ａ）。この構造化ＲＮＡクラスは、以前に決定されたよりも広範な細菌種にわたって保存されている。さらに、ＲＮＡのコンセンサス配列パターンおよび二次構造モデルの両方は、ｐｒｅＱ１−Ｉアプタマークラスについて認められたものよりも実質的により複雑である（Ｒｏｔｈら２００７）。
【０３８５】
ｉｉ．ＣＯＧ４７０８  ＲＮＡモチーフの代表は、ｐｒｅＱ１感知リボスイッチとして機能する可能性が高い。
【０３８６】
前記のｐｒｅＱ１−Ｉリボスイッチ（Ｒｏｔｈら２００７）とのＣＯＧ４７０８タンパク質をコードする遺伝子の関連に基づいて、ＣＯＧ４７０８の遺伝子に関連する第２の保存されたＲＮＡモチーフもｐｒｅＱ１を感知すると仮定される。ＣＯＧ４７０８  ＲＮＡがｐｒｅＱ１結合に応答した構造変化を受けるかどうかを決定するために、インライン探索アッセイ（ＳｏｕｋｕｐおよびＢｒｅａｋｅｒ  １９９９；Ｗｉｎｋｌｅｒら２００２）を、ｐｒｅＱ１の存在下および非存在下でこのモチーフの代表に対して行った。インライン探索アッセイは、内部リン酸エステル転送に起因する自発的ＲＮＡ切断速度の相違を活用する。代謝産物結合の際のＲＮＡ構造の変化によって一般にＲＮＡフラグメンテーションパターンが変わるように、ＲＮＡ鎖の非制限領域は、典型的には、制限領域よりも切断速度が速い（ＳｏｕｋｕｐおよびＢｒｅａｋｅｒ  １９９９；ＬｉおよびＢｒｅａｋｅｒ  １９９９）。
【０３８７】
Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  Ｒ６由来のＣＯＧ４７０８  ＲＮＡモチーフを含む１０３−ヌクレオチド構築物（以後、１−１０３  ＲＮＡと呼ぶ）に対応する５’３２Ｐ標識ＲＮＡを種々の濃度のｐｒｅＱ１とインキュベートし、自発的切断産物を変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって分離した。１−１０３  ＲＮＡの断片化パターンは濃度依存性の変化を示し、したがって、ｐｒｅＱ１依存性ＲＮＡ構造変化が起こることが明らかとなる（図１６Ｂ）。これらの所見により、ＣＯＧ４７０８  ＲＮＡが異なるクラスのｐｒｅＱ１アプタマー（本発明者らによってｐｒｅＱ１−ＩＩと命名した）であることも確認される。全長１−１０３  ＲＮＡ構築物の切断パターンは、系統発生分析に基づいて予想される二次構造と一致する（Ｗｅｉｎｂｅｒｇら２００７）。ループおよび連結領域は切断の証拠を示す一方で、予想される塩基対合領域が依然として主に切断から保護される（図１６Ｃ）。切断速度の減少を示すほとんどのヌクレオチドは、最も高度に保存されたヌクレオチドに対応する（図１６Ｃ）。ＳＤ配列およびＰ３を含む抗ＳＤは、ｐｒｅＱ１の非存在下でいくつかの切断を示す。この切断はリガンド結合の際に減少し、このことはＳＤと抗ＳＤとの相互作用がｐｒｅＱ１の存在下で安定化することを示し、ＳＤを隔離して翻訳開始を防止すると予想される。対照的に、１６以下の番号を付けたヌクレオチドで生じる高レベルの自発的切断は、１−１０３  ＲＮＡ構築物の５’領域が依然として大部分が構築されていないことを示す。この所見は、ｐｒｅＱ１−ＩＩアプタマー代表のうちの保存されたヌクレオチドの比較的まばらな分布を加味して、この領域がアプタマー構造の重要な部分の形成に関与しないことを示す。
【０３８８】
バイオインフォマティクスおよび構造探索データに基づいて、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のｐｒｅＱ１−ＩＩ  ＲＮＡモチーフが遺伝子オフスイッチとして機能し、リガンド結合がＰ３二次構造を安定化させてＳＤ配列を隔離し、遺伝子発現を防止することが示されている。この遺伝子調節機構は、いくつかの他のリボスイッチについて以前に認められている（Ｒｏｄｉｏｎｏｖら２００２；ＭａｎｄａｌおよびＢｒｅａｋｅｒ  ２００４ａ；Ｆｕｃｈｓら２００６；Ｗａｎｇら２００８）。同様に、ｐｒｅＱ１−Ｉリボスイッチの代表は、ｐｒｅＱ１に応答して相同ＣＯＧ４７０８遺伝子の発現を下方制御すると予想される（Ｒｏｔｈら２００７）。
【０３８９】
ｉｉｉ．最小ｐｒｅＱ１−ＩＩ二次構造をバイオインフォマティクスによって正確に予想する。
【０３９０】
短縮構築物がｐｒｅＱ１結合活性を保持するかどうかを決定するために、一連の５’および３’短縮ＲＮＡおよび使用されるインライン探索を構築した。対合エレメントＰ１〜Ｐ４（ヌクレオチド１７〜９０）を含むＲＮＡのｐｒｅＱ１に対する見かけ上のＫＤは約１００ｎＭである（図１７Ａ、Ｂ）。この親和性は他のリボスイッチアプタマーについて認められた範囲内であり、したがって、インライン探索中に比較的構築されてないままであるほとんどの５’−ヌクレオチド（図１６Ｃ）が高親和性代謝産物結合に必要ないことを証明する。Ｐ１を欠くさらにより短いＲＮＡ構築物（ヌクレオチド３３〜９０）は１７−９０  ＲＮＡ構築物とほぼ同一のＫＤを有し、いくつかの位置で共変動が認められたにもかかわらず、保存されたＰ１エレメントもｐｒｅＱ１リガンドの分子認識に関与する可能性が低いことが明らかとなる（Ｗｅｉｎｂｅｒｇら２００７）。おそらくＰ１は、本発明者らの試験管内インライン探索アッセイによって捕捉されない生体内でのＲＮＡ折り畳みまたは機能中で役割を果たす。
【０３９１】
提案された構造モデルをさらに試験するために、１７−９０  ＲＮＡの各対合エレメント中に破壊変異および代償的変異を保有する構築物を作製し（図１７Ｃ）、これらの構築物のリガンド結合活性をインライン探索の使用によって評価した（図１７Ｄ）。予想通り、Ｐ２の破壊変異（Ｍ１）により、リガンド結合親和性が約１／１００に減少し（ＫＤは約１０μＭ）、代償的変異（Ｍ２）によってリガンド結合親和性を部分的に救済する（ＫＤ約２５０ｎＭ）。自発的切断産物のパターンは、Ｐ２がＭ１中で対合せず、Ｍ２中で対合する構造と一致する。
【０３９２】
それぞれＰ３およびＰ４に存在する破壊変異Ｍ３およびＭ５は共にｐｒｅＱ１結合を無効にする（図１７Ｄ）。代償的変異Ｍ６（Ｐ４中）が予想通りにリガンド結合を完全に修復するのに対して、Ｐ３塩基対合を修復するために代償的変化を保有するＭ４変異体はｐｒｅＱ１結合を修復しない。この代償的変異の欠損は、いくつかの理由に起因し得る。Ｍ３およびＭ４は共に、インライン探索中にリガンドの非存在下で野生型ＲＮＡのものとは異なる自発的切断パターンを示し、これらの変異によって相当な誤折り畳みを生じることを示す。さらに、変異したＰ３ヌクレオチドはＳＤ配列および抗ＳＤ配列の存在によって厳格に保存され、この領域はリガンド結合を調整する（図１６Ｂ、Ｃ）。これらの特徴により、Ｐ３における塩基同一性の変化が広範な誤折り畳みを生じ、Ｍ４構築物においてｐｒｅＱ１結合に重要な分子接触（直接または間接的のいずれか）を欠き得ることが示唆される。
【０３９３】
ｉｖ．平衡透析法によってｐｒｅＱ１結合を確認する
異なる方法論を使用して３Ｈ−ｐｒｅＱ１および１７−９０  ＲＮＡ構築物を使用して平衡透析実験を行い、リガンド結合および分子認識の特異性を確認した。平衡透析法のために、３Ｈ−ｐｒｅＱ１を平衡透析装置のチャンバーａに添加し、過剰なＲＮＡをチャンバーｂに添加する。２つのチャンバーを、５，０００ダルトン分子量カットオフの透析膜によって分離する（図１８Ａ）。溶液を平衡化し、続いて各チャンバー中のトリチウム画分を液体シンチレーションカウンティングによって測定した。３Ｈ−ｐｒｅＱ１が１７−９０  ＲＮＡで平衡化された場合にＲＮＡにトリチウムがシフトして２つのチャンバーの放射性シグナル比（ｂ／ａ）が約１．７５になるのが認められ（図１８Ｂ）、これはＲＮＡが３Ｈ−ｐｒｅＱ１に結合してチャンバーｂに隔離されたことを示す。ＲＮＡを用いないか、Ｐ３ステムを形成する能力を欠くＲＮＡ（１−８１  ＲＮＡ）を用いて３Ｈ−ｐｒｅＱ１（１μＭ）を平衡化する場合、３Ｈ標識は均一に分布する（ｂ／ａ  約１）。３Ｈ−ｐｒｅＱ１を用いて１７−９０  ＲＮＡを平衡化して放射能の非対称分布を確立する場合、過剰な非標識ｐｒｅＱ１をチャンバーａに再度添加して３Ｈ標識を再分布させる。しかし、過剰な非標識グアニンの添加では３Ｈの分布に影響を及ぼさず、試験濃度のグアニンでは１７−９０  ＲＮＡ中のリガンド結合部位を３Ｈ−ｐｒｅＱ１と競合できないことを示す。
【０３９４】
平衡透析中に認められた傾向がインライン探索によって認められたｐｒｅＱ１−ＩＩアプタマーの結合機能と一致するにもかかわらず、３Ｈ標識のシフト範囲は予想するほど大きくない。使用濃度のＲＮＡによって３Ｈ−ｐｒｅＱ１の結合部位を過剰に供給したはずであり、そのリガンドに対するアプタマーのＫＤの測定値を考慮すると、全ｐｒｅＱ１分子をＲＮＡで飽和するのに十分なはずであった。したがって、非標識ｐｒｅＱ１競合物の非存在下で平衡が起こった場合、ｂ／ａ比はより大きいはずであった。
【０３９５】
この矛盾をさらに試験するために、１７−９０  ＲＮＡでの平衡化後に残存する非シフト３Ｈ標識物質を含むチャンバーａの内容物を新規に調製した１７−９０  ＲＮＡのサンプルの反対側の新規の装置のチャンバーａに移し、２つのチャンバーを再平衡化させる実験を行った（図１８Ｃ）。予想通り、３Ｈ標識物質は両チャンバー間で均一に分布し（図１８Ｄ）、３Ｈの非シフト部分の分子供給源がＲＮＡに結合せず、ｐｒｅＱ１である可能性が低いことを示した。この分析から、たった約２５％の３Ｈ標識物質がｐｒｅＱ１であると評価された。この結論との一致は、平衡透析法のために使用した３Ｈ標識ｐｒｅＱ１サンプルの純度分析の結果である。約８２％の３Ｈ標識が溶媒に由来し、混合物中に存在するＵＶ吸収化合物は他にない。まとめると、平衡透析実験は、ＣＯＧ４７０８  ＲＮＡモチーフのコアを保有するＲＮＡ構築物がｐｒｅＱ１の選択的アプタマーとして機能することも示す。
【０３９６】
ｖ．１７−９０  ＲＮＡによるｐｒｅＱ１の選択的認識
Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のｐｒｅＱ１−ＩＩアプタマーの分子認識決定要因を、一連のｐｒｅＱ１アナログに対する１７−９０  ＲＮＡの結合親和性の測定によって確立した。アミノメチル基の認識を評価するために、本発明者らは、ｐｒｅＱ０（７−シアノ−７−デアザグアニン）、７−（Ｎ，Ｎ’−ジメチルアミノメチル）−７−デアザグアニン、および７−カルボキシアミド−７−デアザグアニンを試験した。ジメチルアミノメチルアナログおよびｐｒｅＱ０の両方が約５００ｎＭのＫＤ値を示し、アルキルアミン基の末端で生じる実質的な立体的閉塞が存在せず、この基が水素結合供与体として機能する可能性が低いことを示す（図１９Ａ）。むしろ、アミノエチル基に対する生産的相互作用は、水素結合受容体としてのアミノ基を含み得る。稀であるが、アミノ基の窒素原子（Ｌｕｉｓｉら１９９８）は、いくつかの他の核酸構造中で水素結合受容体としての機能を果たすことができる。
【０３９７】
平衡透析法の使用によって認められたように（図１８Ｂ）、１７−９０  ＲＮＡはグアニンに対し強く識別する（ＫＤ約１０μＭ）。グアニンアナログである７−デアザグアニンは、ほんのわずかにより良好な親和性で結合し、ｐｒｅＱ１の選択性がほとんどないのは７位の窒素原子の非存在に由来することを示す。１ｍＭもの高濃度での７−メチルグアニン結合の欠如は、７位の分子認識接触のいかなる破壊よりもむしろ９位での水素結合供与体の非存在に起因する可能性が高い。
【０３９８】
試験した残りのプリン化合物から、２位のアミンがリガンド結合に重要であることあ明らかである（図１９Ａ）。２，６−ジアミノプリン（ＤＡＰ）は、グアニン様ワトソン−クリック塩基対合縁部を欠くが、試験濃度でのＲＮＡによって測定可能に結合する能力を保持する唯一の化合物である。興味深いことに、プリン環の６位にケト酸素（グアニン）またはアミン（ＤＡＰ）のいずれかを保有する化合物により、ほぼ同一のＫＤ値が得られる。しかし、６位に環外官能基を欠くことによってグアニンおよびＤＡＰと異なる２−アミノプリンについて結合は検出されない。したがって、６位のグアニンのケト基およびＤＡＰのアミノ基は、分子認識に等しく寄与するようである。より複雑な可能性が存在するにもかかわらず、この所見についての最も簡潔な説明は、６位のｐｒｅＱ１のケト基およびＤＡＰアミンの窒素原子の両方が水素結合受容体としての機能を果たすことである。
【０３９９】
１７−９０  ＲＮＡおよびそのｐｒｅＱ１リガンドによって作製された推定分子認識接触のまとめにより（図１９Ｂ）、ｐｒｅＱ１−Ｉアプタマーについて同定された分子認識接触と比較した相違が明らかとなる（Ｒｏｔｈら２００７）。７−ジメチルアミノメチルおよび７−カルボキシメチルアナログの相対的特異性が２つのアプタマークラスについて逆になるので、７位のアミノメチル部分の認識が実質的に異なる。さらに、ｐｒｅＱ１−Ｉリボスイッチがグアニンとさらに強い相互作用を形成し、グアニンに対するｐｒｅＱ１の顕著に低い特異性が得られる。ｐｒｅＱ１−Ｉリボスイッチと同様に、２位のアミンは１７−９０  ＲＮＡのリガンド結合に重要なようである。しかし、アナログ結合データは、ｐｒｅＱ１−ＩＩアプタマーがプリン環のＮ１位と接触しないことを示す。これは、リガンドとｐｒｅＱ１−Ｉアプタマーとの間に形成されると提案されたワトソン−クリック塩基対と異なる（Ｒｏｔｈら２００７）。これは、ｐｒｅＱ１−ＩＩアプタマーの異なる配列および構造エレメントが折り畳まれてｐｒｅＱ１−Ｉアプタマーによって作製されたものと異なる結合ポケットを形成するという既存のデータから明らかである。
【０４００】
ｖｉ．ワトソン−クリック塩基対合でリガンド認識が説明される可能性は低い
グアニンおよびアデニンに結合するリボスイッチは、選択的リガンド結合のために標準的なワトソン−クリック塩基対を使用することが見出されている（Ｇｉｌｂｅｒｔら２００６；ＭａｎｄａｌおよびＢｒｅａｋｅｒ  ２００４ｂ；Ｂａｔｅｙら２００４；Ｓｅｒｇａｎｏｖら２００４；Ｎｏｅｓｋｅら２００５）。プリンリボスイッチアプタマーの１つの点変異は、グアニンとアデニンとの間のアプタマー特異性を切り替えるのに十分である（ＭａｎｄａｌおよびＢｒｅａｋｅｒ  ２００４ｂ）。同様に、２’−デオキシグアノシンに結合するリボスイッチの特異性を、類似の変異によって変化させることができる（Ｋｉｍら２００７）。類似の機構をｐｒｅＱ１−Ｉリボスイッチアプタマーで使用することができ、この機構により、保存されたシチジンのウリジンへの変異によってリガンド特異性がｐｒｅＱ１からＤＡＰへ変化する（Ｒｏｔｈら２００７）。
【０４０１】
１７−９０  ＲＮＡがリガンド特異性を促進するために類似の機構を使用するかどうかを評価するために、唯一の普遍的に保存された非対合シチジン（Ｃ３３）（図１５、図１６Ａ）をウリジンに変異した。ｐｒｅＱ１−ＩＩアプタマー中に存在するさらなる厳格に保存されたシチジン残基（Ｃ３２およびＣ５１）が存在するにもかかわらず、これらの残基は予想される塩基対合したエレメント内に存在し、したがって、リガンドと標準的な塩基対合を形成する可能性が低い。しかし、３３位にＵを保有する変異ＲＮＡが野生型ＲＮＡと非常に類似して挙動し、ｐｒｅＱ１に対するＫＤが約２５０ｎＭであることが認められた。したがって、この残基は、リガンドと標準的な塩基対合を形成する可能性が低い。このＲＮＡ領域がリガンド結合を調整せず（図１６Ｂ、Ｃ）、Ｐ１がリガンド結合に必要ないことを考慮すると、この所見は驚くべきものではない。
【０４０２】
ヌクレオチドＣ４１はまた、ｐｒｅＱ１との塩基対形成の候補として認められた。このヌクレオチドは保存されたアプタマーのコアの近位にあり、リガンド結合を調整する（図１６）。４０個の公知のＣＯＧ４７０８  ＲＮＡのたった１つの代表でＣ４１がＵ残基に変異することが見出された（図１５）。ある位置にこのＣからＵへの変化を保有する１７−９０  ＲＮＡ構築物はｐｒｅＱ１に対する親和性が２桁の規模で喪失し（図２０Ａ）、この残基が実際にリガンド結合に重要であることを示す。しかし、変異構築物は、アデニン塩基対合表面を有するアナログを好むための特異性の変化を受けない。これらの結果は、Ｃ４１もリガンドと標準的な塩基対を形成し得ないことを示す。
【０４０３】
Ｕ４１変異体は野生型１７−９０  ＲＮＡよりも不十分にｐｒｅＱ１に結合するにもかかわらず、この変異体は野生型と本質的に同一の親和性でＤＡＰに結合する（図２０Ｂ）。対照的に、グアニン結合はもはやＵ４１変異体を使用して検出できない。これらの所見は、４１位のヌクレオチドがｐｒｅＱ１−ＩＩアプタマーの分子認識モデルと一致する様式でリガンドと接触することを示す（図１９Ｂ）。Ｃ４１の環外アミノ基はｐｒｅＱ１のケト基に水素を供与することができるが、Ｕ４１中のこのアミンの代わりのケト基は等価な水素結合を形成できない（図２０Ｃ）。したがって、認められるように、変異ＲＮＡは、野生型ＲＮＡより不十分にｐｒｅＱ１に結合するはずである（図２０Ａ）。対照的に、Ｃ４１の環外アミノ基は、ＤＡＰの６位の環外アミンの窒素原子に水素を供与して水素結合を形成することができる。同様に、Ｕ４１の対応するケト基は水素結合受容体としての機能を果たすことができ、ＤＡＰの６位の同一の環外アミンと等価な水素結合を形成可能である（図２０Ｃ）。この配置は、Ｃ４１およびＵ４１  ＲＮＡによるＤＡＰ結合に対してほぼ同一のＫＤ値（図２０Ｂ）が何故認められるのかを説明することができる。
【０４０４】
２．結論
ｐｒｅＱ１は、１つを超える天然アプタマークラスによって認識される代謝産物の第２の例である。今までにＳ−アデノシルメチオニン（ＡｄｏＭｅｔまたはＳＡＭ）を認識する４つの異なるアプタマークラスが同定されている。ＳＡＭ−ＩまたはＳ−ｂｏｘ（Ｅｐｓｈｔｅｉｎら２００３；ＭｃＤａｎｉｅｌら２００３；Ｗｉｎｋｌｅｒら２００３）、ＳＡＭ−ＩＩ（Ｃｏｒｂｉｎｏら２００６）、ＳＡＭ−ＩＩＩまたはＳＭＫ−ボックス（Ｆｕｃｈｓら２００６）、およびＳＡＭ−ＩＶ（Ｗｅｉｎｂｅｒｇら２００７）は、しばしば、異なる生物中の同一の遺伝子を調節する（例えば、ＳＡＭシンターゼ、ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼ）。第２の天然ｐｒｅＱ１アプタマークラスの発見は、ＳＡＭが特別なケースではなく、さらなる代謝産物を複数の異なるＲＮＡ構造によって結合して異なる生物中の類似の遺伝子組を調節することができることを示す。
【０４０５】
２つのｐｒｅＱ１結合ＲＮＡのＣＯＧ４７０８またはＤＵＦ９８８に分類される膜タンパク質との関連は、このタンパク質がキューオシン生合成中間体の輸送体であることを示す。その遺伝子がＴＰＰリボスイッチに関連する未知の機能の膜タンパク質は、その後に、ＴＰＰおよびチアミン輸送に関与することが示され（Ｒｏｄｉｏｎｏｖら２００２；Ｗｉｎｋｌｅｒら２００２；Ｓｃｈｙｎｓら２００５）、これは、どのようにしてＲＮＡ遺伝子調節エレメントの特徴をタンパク質機能の説明に導くことができるのかを説明している。同様に、ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質機能の知識は、関連リボスイッチのリガンド同一性の確立に役立ち得る。
【０４０６】
興味深いことに、多数の細菌において、ｐｒｅＱ１の生合成または輸送に関連する遺伝子に相同な多数の遺伝子が存在するにもかかわらず、これらの遺伝子は確立された調節機構を持たない。したがって、かかる遺伝子のｍＲＮＡが他のｐｒｅＱ１リボスイッチクラスを保有することができると推測した。新規のｐｒｅＱ１アプタマーが発見される可能性を評価するために、ｐｒｅＱ１−ＩおよびｐｒｅＱ１−ＩＩアプタマーを欠き、そのゲノムが配列決定されている生物におけるいくつかのＣＯＧ４７０８遺伝子の上流の遺伝子間領域を観察した。
【０４０７】
ＣＯＧ４７０８遺伝子は細菌中での分布範囲が狭く、３つの例以外の全ての例がＢａｃｉｌｌｉおよびＣｌｏｓｔｒｉｄｉａ綱にある（図２１）。γ−ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ（Ｒｕｂｒｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌａｎｏｐｈｉｌｕｓ）でＣＯＧ４７０８の１つの例が存在し、古細菌（Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ  ｐｅｎｄｅｎｓおよびＳｔａｐｈｙｌｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ）で見出された２つの例が存在する。ＣＯＧ４７０８タンパク質に対応する遺伝子は、４６例のうちの３０例でｐｒｅＱ１アプタマーと関連する（図２１）。いくつかの生物は、２コピーの遺伝子を含み、リボスイッチは、典型的にはこれらのコピーのうちのたった１つに関連するが、Ａｌｋａｌｉｐｈｉｌｕｓ  ｍｅｔａｌｌｉｒｅｄｉｇｅｎｓでは、この遺伝子の両方のコピーよりｐｒｅＱ１−Ｉリボスイッチが先行する。ＣＯＧ４７０８の遺伝子が公知のｐｒｅＱ１感知ＲＮＡに関連しない多数の生物では、ＯＲＦのすぐ上流の遺伝子間領域は、５０塩基対を超える。これは、ＲＮＡアプタマーがｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中に存在するのに十分な空間である。しかし、かかる領域は、典型的には、任意の他の配列に対する検出可能な相同性をほとんど示さないか全く示さない。これは、かかる領域が構造化ＲＮＡを欠くか、かかる領域が多数の他の細菌でホモログを有するアプタマーを保有しないことを示す。
【０４０８】
インライン探索アッセイを使用して、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｅｎｉ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓにおけるＣＯＧ４７０８タンパク質をコードするＯＲＦの上流およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓにおける両ＣＯＧ４７０８コピーの上流の遺伝子間領域を試験した。試験したＲＮＡはどれもｐｒｅＱ１の存在下で構造調整を示さず、これらのＲＮＡがｐｒｅＱ１結合リボスイッチを含まないことを示す。しかし、外来性５’または３’配列由来の干渉に起因するＲＮＡ誤折り畳みを含むいくつかの異なる因子ならびに生体内条件と試験管内条件との間の相違がインライン探索アッセイを複雑にし得る。
【０４０９】
ほとんどの他の同定されたリボスイッチと対照的に、ｐｒｅＱ１−ＩＩアプタマーは非常に分布が狭く、主にＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ科由来の細菌に存在する。ＳＡＭ−ＩＩＩも同一の細菌群に制限されるようであるので（Ｆｕｃｈｓら２００６）、この狭い分布には前例がある。
【０４１０】
３．材料と方法
ｉ．化学物質およびＤＮＡオリゴヌクレオチド
ｐｒｅＱ１、ｐｒｅＱ０、７−（Ｎ，Ｎ’−ジメチルアミノメチル）−７−デアザグアニン、７−カルボキシアミド−７−デアザグアニン、および７−アミノメチル−７−デアザアデニンの化学合成は以前に記載した（Ｒｏｔｈら２００７）。残りのプリン化合物および他の化学物質を、他で記載しない限り、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。３Ｈ−ｐｒｅＱ１を、以前に記載のように得た（Ｈｕｒｔら２００７）。合成ＤＮＡは、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓによって調製された。
【０４１１】
ｉｉ．ＲＮＡの調製
ｐｒｅＱ１−ＩＩ（Ｃｏｇ４７０８  ＲＮＡ）モチーフに対応するＣＯＧ４７０８をコードする遺伝子の５’ＵＴＲの一部を、以下のプライマーを使用してＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  Ｒ６からＰＣＲ増幅した：５’−ＧＧＡＡＴＴＣＡＡＣＡＡＧＴＣＴＡＡＣＡＧＡＡＡＡＧＴＡＧ  ＡＡＡＧＧＣＧＧＧＣ−３’（配列番号１）、５’−ＴＴＴＴＧＴＣＡＴＴＴＴＴＴＣＴＣＣＴＴＴＡＡＣＧＴ  ＣＴＧＧＡＴＡＡＣＴＣＴＣＡＡＡＡＧＣ−３’（配列番号２）。次いで、得られた二本鎖ＤＮＡを、ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してｐＣＲ２．１にクローン化した。プラスミドインサートを配列決定し（イェール大学  Ｔｈｅ  Ｗ．Ｍ．Ｋｅｃｋ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ）、Ｔ７プロモーター配列が前に存在し、且つ転写効率を改善するための２つのグアノシン残基を含む所望のＲＮＡをコードするＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅用テンプレートとして使用した。破壊変異および代償的変異を、ＰＣＲの変異プライマーを使用してＰＣＲ産物に導入した。ＰＣＲ産物をＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用して試験管内で転写し、得られたＲＮＡを、他の場所に記載の方法に類似の方法を使用した変性６％ＰＡＧＥによって精製した（Ｓｅｅｔｈａｒａｍａｎら２００１）。
【０４１２】
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の記載の構築物に対応するＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲ（ＤｉｌｌｏｎおよびＲｏｓｅｎ  １９９０）によってゲノム配列に基づいた合成オリゴヌクレオチド組から構築した。Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｏ．ｏｅｎｉ（ＰＳＵ−１）、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、およびＧ．ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣＯＧ４７０８タンパク質をコードする遺伝子の上流の遺伝子間領域に対応するＤＮＡフラグメントを、各ゲノムＤＮＡおよび適切な位置にＴ７プロモーター配列を含むプライマーを使用したＰＣＲによって増幅した。Ｏ．ｏｅｎｉおよびＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのゲノムＤＮＡサンプルを、ＡＴＣＣから入手した。ＲＮＡ分子を、上記の試験管内転写によって調製した。
【０４１３】
ｉｉｉ．インライン探索アッセイ
試験管内転写によって調製したＲＮＡ分子を、製造者の説明書にしたがって、アルカリホスファターゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して脱リン酸化し、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（ＧＥ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で放射性同位元素標識した。５’３２Ｐ標識ＲＮＡを、上記のようにＰＡＧＥによって精製した。約１ｎＭの５’３２Ｐ標識したＲＮＡを含むインライン探索反応を、上記のようにリガンドを使用するか使用しないでアセンブリした（ＳｏｕｋｕｐおよびＢｒｅａｋｅｒ、１９９９）。５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３、２３℃）、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および１００ｍＭ  ＫＣｌを含む反応混合物を、２５℃で約４０時間インキュベートした。Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａおよびＧ．ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓ起源のＲＮＡについて、５８℃で３０分間および６０℃で１５分間でもそれぞれインキュベートした。サンプルを変性１０％ＰＡＧＥで分離し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒおよびＩｍａｇｅＱｕａＮＴソフトウェアを使用して、画像化および定量を行った。
【０４１４】
一連のリガンド濃度を使用してインライン探索アッセイを行うことによってＫＤ値を決定した。各分析について示した部位での正規化したＲＮＡの切断の割合を各リガンド濃度で計算し、それらのポイントに標準結合曲線をフィッティングした。最も高い試験濃度がそれぞれ１００μＭ、１００μＭ、１０μＭ、および３０μＭであるｐｒｅＱ１、グアニン、７−カルボキシアミド−７−デアザグアニン、７−アミノメチル−７−デアザアデニンを除き、ほとんどの試験化合物の濃度は１ｎＭと１ｍＭとの間で様々であった。
【０４１５】
ｉｖ．平衡透析法
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３、２３℃）、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＫＣｌ、および１μＭの３Ｈ標識ｐｒｅＱ１を含む３０μｌ混合物を、ＤｉｓｐｏＥｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  Ｄｉａｌｙｚｅｒ（ＥＤ−１、Ｈａｒｖａｒｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の一方のチャンバーに配置し、３Ｈ標識ｐｒｅＱ１を差し引いた同一成分を含む同体積を反対側に添加した。言及する場合、後者の溶液は５μＭ  １７−９０  ＲＮＡまたは５μＭ  １−８１  ＲＮＡのいずれかも含んでいた。１４時間の平衡化後、５μｌアリコートを装置の各サイドから取り出して液体シンチレーションカウンティングによって２つのチャンバー中の３Ｈ標識の分布を決定した。競合的結合試験のために、１ｍＭ非標識化合物を含む３μＬの上記の緩衝液混合物をＲＮＡを欠くチャンバーに添加し、同体積の緩衝液をＲＮＡ含有チャンバーに添加した。チャンバーをさらに８時間平衡化後、３Ｈ−標識の分布を上記のように再評価した。
【０４１６】
３Ｈ標識ｐｒｅＱ１のＨＰＬＣは、ｐｒｅＱ１と一致する１つのＵＶ活性ピークを示した。３Ｈ−標識がｐｒｅＱ１に組み込まれなかったものに由来するかどうかを評価するために、４０μＬアリコートの３Ｈ−ｐｒｅＱ１溶液（約２ｍＭ）を８ｍｇの脱色炭および２００μＬ水と混合した。次いで、スラリーを、遠心分離によって分離し、上清を取り出し、濾過した（０．２２ミクロン）。上清のＨＰＬＣ分析により、水性部分にｐｒｅＱ１が存在しないことが明らかとなり、炭素がその複素環を完全に吸収したことを示した。上清部分に存在するトリチウムおよび炭素残渣を、液体シンチレーションカウンティングによって測定した。
【０４１７】
ｖ．バイオインフォマティクス
ＲｅｆＳｅｑ２５に対して相同性検索を行い（Ｐｒｕｉｔｔら２００７）、ＣＯＧ４７０８  ＲＮＡモチーフコンセンサス配列を以前に記載のように決定した（Ｗｅｉｎｂｅｒｇら２００７）。ＣＯＧ４７０８（ＤＵＦ９８８）遺伝子の例を、ＰＦＡＭデータベース（リリース２２．０）（Ｆｉｎｎら２００６）によって同定した。いくつかの生物由来のＣＯＧ４７０８タンパク質配列のＮＣＢＩゲノムデータベースに対するＢＬＡＳＴ検索では、いかなるさらなる配列も得られなかった。例を、完全に配列決定されたゲノムに制限し、ｐｒｅＱ１−ＩまたはｐｒｅＱ１−ＩＩリボスイッチがＣＯＧ４７０８タンパク質をコードするＯＲＦの上流の遺伝子間領域に存在するかどうか決定した。同種の高度に類似の株または分離株をリストから除去して重複性を減少させた。
【０４１８】
（実施例５）
Ｅ．実施例５：モリブデン補因子およびタングステン補因子代謝に関与する細菌遺伝子を調節する広範に存在するリボスイッチ候補
モリブデン酸塩輸送体、モリブデン補因子（Ｍｏｃｏ）生合成酵素、および補酵素としてＭｏｃｏを使用するタンパク質をコードする遺伝子の上流に存在する高度に保存されたＲＮＡモチーフを同定した。バイオインフォマティクス検索により、γ−ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、δ−ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ−Ｔｈｅｒｍｕｓ種、および環境サンプル由来のＤＮＡにおける１７６の代表を同定した。遺伝子アッセイを使用して、Ｍｏｃｏ生合成オペロンに関連するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ中のＭｏｃｏ  ＲＮＡがＭｏｃｏ産生に応答して遺伝子発現を調節することが証明された。さらに、この保存されたＲＮＡがＭｏｃｏの密接に関連するアナログを識別することを示す証拠を得た。これらの結果は、広範な系統発生的保存およびいくつかの例に近い典型的な遺伝子調節構造と併せて、この構造化ＲＮＡの代表がＭｏｃｏを感知する新規のリボスイッチクラスに該当することを示す。さらに、関連するタングステン補因子（Ｔｕｃｏ）によって誘発される可能性が高いこのＲＮＡのバリアントが同定された。このバリアントは、金属成分としてモリブデンのかわりにタングステンを保有する。
【０４１９】
リボスイッチは、代謝産物または金属イオンに選択的に結合し、遺伝子調節エレメントとして機能する構造化ＲＮＡドメインである（ＭａｎｄａｌおよびＢｒｅａｋｅｒ、２００４；ＳｏｕｋｕｐおよびＳｏｕｋｕｐ、２００４；ＷｉｎｋｌｅｒおよびＢｒｅａｋｅｒ、２００５；Ｗｉｎｋｌｅｒ、２００５）。リボスイッチは、一般に、真正細菌ｍＲＮＡの非翻訳領域中に見出され、通常、転写伸長または翻訳開始の調節によって遺伝子発現を調節する（ＢｒｅａｋｅｒおよびＢａｒｒｉｃｋ，２００７）。まれに例外はあるが（Ｗｉｎｋｌｅｒら、２００４；Ｂａｒｉｃｋら、２００４）、リボスイッチは２つのモジュラー領域（アプタマードメインおよび発現プラットフォーム）から構成される。アプタマーは標的代謝産物のための選択的結合ポケットを形成し、この結合事象は隣接発現プラットフォームの折り畳みをアロステリックに調節して、遺伝子発現を調節する。各リボスイッチクラスの代謝産物結合ポケットは、遠縁の生物から同定された代表の間でさえも配列および構造中で高度に保存される（ＢｒｅａｋｅｒおよびＢａｒｒｉｃｋ、２００７）。
【０４２０】
リボスイッチにより、バイオインフォマティクス検索を使用した発見のための優れた標的が作製される。例えば、ＣＭｆｉｎｄｅｒ比較ゲノミクスパイプライン（Ｙａｏら、２００７；Ｗｅｉｎｂｅｒｇら、２００７）は、新規の機能ＲＮＡエレメントを同定するために使用した１つのバイオインフォマティクスアプローチを示す。これは、相同遺伝子の推定５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）を同定し、次いで、種々の生物由来のＵＴＲの間の配列および二次構造の保存の証拠についてこれらの領域を試験する。配列および構造の保存パターンを使用して、最初に予想したモチーフの洗練のためにさらなるホモログを同定する。ＣＭｆｉｎｄｅｒパイプラインにより、最近検証されたか（Ｗａｎｇら、２００８）、検証を待っている多数の有望なリボスイッチ候補を同定した。報告された１つの新規のモチーフは、モリブデン補因子（Ｍｏｃｏ）代謝に関与するタンパク質をコードする読み取り枠（ＯＲＦ）の上流で一般に見出される大きく且つ複雑なＲＮＡドメインである（Ｗｅｉｎｂｅｒｇら、２００７）。
【０４２１】
Ｍｏｃｏは、モリブデン原子（Ｍｏ）が配位している三環式ピラノプテリン（Ｓｃｈｗａｒｔｚ、２００５；Ｂａｕｇｈら、１９９８）である。モリブデンは、元素周期表でクロムおよびタングステンと同列にある遷移金属である。生合成後、Ｍｏｃｏを、Ｍｏ依存性酵素の活性部位に挿入する。この酵素は炭素、窒素、および硫黄代謝回路における重要な反応を触媒するためにＭｏの酸化還元活性を利用する（Ｂａｕｇｈら、１９９８）。このモチーフの１７６例を、広範な種々の真正細菌（γ−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、δ−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、およびＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ−Ｔｈｅｒｍｕｓが含まれる）および環境配列において同定した（Ｗｅｉｎｂｅｒｇら、２００７）。このモチーフは、代謝産物感知リボスイッチに典型的な特徴（広範な配列保存、予想される塩基対合エレメント内のヌクレオチド共変動の証拠、および保存された非対合ヌクレオチドと混合した塩基対合エレメントの精巧なアセンブリが含まれる）を示す。
【０４２２】
Ｅ．ｃｏｌｉ由来の代表的なＭｏｃｏ  ＲＮＡがＭｏｃｏを選択的に感知し、この補酵素レベルの変化に応答して隣接遺伝子の発現を調節するという証拠を本明細書中に提供する。さらに、Ｍｏｃｏ  ＲＮＡがＭｏｃｏと密接に関連するアナログであるＴｕｃｏとの間の識別の調節に関与することを示し、したがって、ＭｏｃｏがＭｏｃｏ  ＲＮＡによって形成されたアプタマーによって特異的に認識されるという、さらなる証拠が得られる。これらの実験による所見は、一定のＲＮＡバリアントと補酵素代謝の特徴との間の相関と併せて、この構造化ＲＮＡクラスが異なるＭｏｃｏおよびＴｕｃｏを感知するリボスイッチを含むことを示す。
【０４２３】
１．結果と考察
ｉ．Ｍｏｃｏモチーフは、広範に存在し、高度に保存されている
比較ゲノミクスパイプライン（Ｙａｏら、２００７）を使用してγ−ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａにおけるモリブデン補因子生合成プロテインＡをコードする遺伝子のＵＴＲを試験した場合、共変動および構造化ＲＮＡが示唆される他の特徴（Ｗｅｉｎｂｅｒｇら、２００７）を示すモチーフを同定した。これらの検索により、γ−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、δ−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ−Ｔｈｅｒｍｕｓ種、および環境ＤＮＡ配列中のこのモチーフ（「Ｍｏｃｏ  ＲＮＡ」と呼ぶ）の１７６個の例を同定した。これらの配列を、推定コンセンサス構造によってガイドされたＲＡＬＥＥ（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ、２００５）を使用した手作業のアラインメントによって比較した。このアラインメントにより、モチーフの中心の多ステムジャンクション付近の配列保存が最も高く（図２２）、ほとんどのヌクレオチドが７５〜１００％の配列保存を示すことが明らかとなる。
【０４２４】
５つもの塩基対合エレメント（Ｐ１〜Ｐ５と記す）がＭｏｃｏ  ＲＮＡの二次構造の構造を形成する。このうち、保存された二次構造は、それぞれ、Ｐ４の遠位末端およびＰ２バルジの中央に見出されるＧＮＲＡテトラループ（ＨｅｕｓおよびＰａｒｄｉ、１９９１）およびテトラループ受容体（ＣｏｓｔａおよびＭｉｃｈｅｌ、１９９５）である。５つのＭｏｃｏ  ＲＮＡ以外の全てにおけるテトラループ配列はＧＡＡＡである。しかし、ＧＣＡＡテトラループを保有する４つ全てのＭｏｃｏ  ＲＮＡは受容体を欠く一方で、ＧＡＡＡテトラループを有するたった２つのＭｏｃｏ  ＲＮＡが受容体を欠く。類似の相関は、ＧＥＭＭモチーフと呼ばれる別の新規に見出されたＲＮＡモチーフの代表について以前に認められている（Ｗｅｉｎｂｅｒｇら、２００７）。
【０４２５】
Ｍｏｃｏモチーフの代表を、Ｐ３ステムの有無に基づいて２つの群に分類することができる。全ての公知の代表のアラインメントにより、高度に保存された見かけ上のアプタマー領域およびその後に続く公知の代謝産物感知リボスイッチに典型的な異なる発現プラットフォーム型を形成すると見られる配列が明らかになる。例えば、ｍｏａＡＢＣＤＥオペロン上流のＥ．ｃｏｌｉ  Ｍｏｃｏ  ＲＮＡの可能な発現プラットフォーム（図２３ａ）は、Ｐ１ステムを形成するヌクレオチド内の下流読み取り枠（ＯＲＦ）のリボゾーム結合部位を含むようである。このアラインメントは、アプタマードメインによるリガンド結合が遺伝子発現を抑制することを示すことができる。細菌の内因性転写ターミネーターの予想される配列および構造に適合するステム−ループ構造の上流に推定アプタマードメインが見出される例も存在する（ＧｕｓａｒｏｖおよびＮｕｄｌｅｒ、１９９９；ＹａｒｎｅｌｌおよびＲｏｂｅｒｔｓ、１９９９）。さらに、いくつかの生物は、１つを超えるＭｏｃｏ  ＲＮＡ代表を保有し、同一生物中に両方の発現プラットフォーム型が出現する。
【０４２６】
ほとんどの生物がゲノムあたり１つのＭｏｃｏ  ＲＮＡ代表を保有するが、そのゲノムが完全に配列決定された、いくつかの生物においては４つまたは５つものモチーフの例を有する。最多数のＭｏｃｏ  ＲＮＡの代表を、Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｆｎｉｅｎｓｅ（８個有する）およびＳｙｎｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｗｏｌｆｅｉ（少なくとも１５バージョン有する）が保有する。興味深いことに、Ｍｏｃｏ  ＲＮＡモチーフのタンデム配置はＳ．ｗｏｌｆｅｉおよびＧｅｏｂａｃｔｅｒ  ｍｅｔａｌｌｉｒｅｄｕｃｅｎｓ中に存在する。稀であるが、他の代謝産物感知リボスイッチクラスを有するタンデム配置のリボスイッチまたはそのサブドメインが同定されている（ＭａｎｄａｌおよびＢｒｅａｋｅｒ、２００４；Ｆａｍｕｌｏｋ、２００４；Ｓｕｄａｒｓａｎら、２００６；ＳｔｏｄｄａｒｄおよびＢａｔｅｙ、２００６）。これらのより複雑な構造がリボスイッチによって使用されて、複数のシグナル伝達インプットに応答する能力（Ｓｕｄａｒｓａｎら、２００６）などの精巧な機能を達成するか、より小さなリガンド濃度の変化により応答する（ＭａｎｄａｌおよびＢｒｅａｋｅｒ、２００４；ＷｅｌｚおよびＢｒｅａｋｅｒ、２００７）。Ｓ．ｗｏｌｆｅｉ中の１つのオペロンは、連続した３つのＭｏｃｏ  ＲＮＡを保有する。
【０４２７】
ｉｉ．Ｍｏｃｏモチーフは、Ｍｏｃｏ生合成遺伝子に関連する
最も知られているリボスイッチは、シスで機能してそれらの同族リガンドの結合に応答して近位遺伝子の発現を調節する。リボスイッチアプタマーによって感知されるリガンドは、典型的には、酵素によって触媒される経路の最終産物または調節下でｍＲＮＡによってコードされる酵素である。あるいは、その発現がリボスイッチによって調節される遺伝子産物の補因子または基質として小分子リガンドが時折必要である。リボスイッチが通常シス調節機構を使用するので、リボスイッチの下流に存在する遺伝子によってコードされるタンパク質の機能により、リガンドの同一性に関する大量の情報を得ることができる。
【０４２８】
Ｍｏｃｏ  ＲＮＡの機能を確立する目的で、この保存されたＲＮＡの代表を保有する隣接ゲノム位置中の遺伝子の機能を考慮した。γ−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ（Ｅ．ｃｏｌｉが含まれる）では、モチーフはｍｏａＡＢＣＤＥオペロンの上流に見出され（図２３ａ）、このオペロンはモリブドプテリン（ＭＰＴ）生合成を担うタンパク質をコードする（Ｓｃｈｗａｒｚ、２００５）。いくつかの細菌では、代表はｍｏｄＡＢＣの上流にも存在し、このｍｏｄＡＢＣは高親和性モリブデン酸塩輸送体複合体をコードする（ＧｒｕｎｄｅｎおよびＳｈａｎｍｕｇａｍ、１９９７）。Ｍｏｃｏモチーフがモリブドプテリン生合成オペロンおよびモリブドプテリンオキシドレダクターゼをコードすると予想される遺伝子の両方の上流に存在する３つのγ−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ種（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｏｍｎｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ、およびＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型亜型１）も存在する。Ｍｏｃｏモチーフは、Ｍｏｃｏ生合成酵素、高親和性モリブデン酸塩輸送体、および反応を触媒するためにＭｏｃｏを使用する酵素の遺伝子の異なる配置の上流にも見出される。一般に、これらのゲノムコンテクストは、このリボスイッチ候補の潜在的リガンドとしてＭｏｃｏまたはその補因子の生合成中間体を示す。いくつかの公知のリボスイッチクラスは他の共通の補酵素を感知してそれに応答し、したがって、Ｍｏｃｏはこのリボスイッチ候補の最も可能性の高いリガンドと見なされた。
【０４２９】
モリブデン補因子生合成は、真正細菌からヒトまで保存されている複雑且つ古い経路である。モリブデンまたはＭｏｃｏを必要としない唯一の生物は、その代わりにタングステンおよび類似の補酵素Ｔｕｃｏを使用する（Ｓｃｈｗａｒｚ、２００５）。Ｅ．ｃｏｌｉでは、全部で１５のタンパク質をコードするＭｏｃｏ代謝に関与する以下の５つの公知のオペロンが存在する：ｍｏａ、ｍｏｂ、ｍｏｄ、ｍｏｅ、およびｍｏｇ（Ｓｈａｎｍｕｇａｍら、１９９９）。Ｍｏｃｏ生合成の最初の２つのステップは、ｍｏａオペロンによってコードされる遺伝子によって触媒される（図２３ｂ）。具体的には、Ｓ−アデノシルメチオニン依存性酵素、ＭｏａＡおよび特徴づけられていないホモ六量体ＭｏａＣによって触媒される反応においてグアノシン−５’−三リン酸（ＧＴＰ）がサイクリックピラノプテリン一リン酸（ｃＰＭＰ）に変換される（ＷｕｅｂｂｅｎｓおよびＲａｊａｇｏｐａｌａｎ、１９９５）。１時間未満の半減期を有するので、ｃＰＭＰは最も安定なＭｏｃｏ生合成中間体である（Ｓａｎｔａｍａｒｉａ−Ａｒａｕｇｏら、２００４）。次いで、ＭｏａＤおよびＭｏａＥによって形成されたヘテロ四量体ＭＰＴシンターゼ複合体は、２つの硫黄原子のｃＰＭＰへの転移を触媒し、それにより、ＭＰＴジチオラートが得られる（Ｐｉｔｔｅｒｌｅら、１９９３）。
【０４３０】
次いで、Ｍｏｃｏは、ＭＰＴのアデニル化およびモリブデン補因子を形成するためのＭｏの挿入を含む独立した一連のステップを介してｍｏｇＡおよびｍｏｅＡの生成物によってＭＰＴから合成される（ＮｉｃｈｏｌｓおよびＲａｊａｇｏｐａｌａｎ、２００２）。Ｅ．ｃｏｌｉでは、Ｍｏｃｏを、ＭｏｂＡによってビス−モリブドプテリングアニンジヌクレオチド補因子（ビス−ＭＧＤ）にさらに改変する（Ｌａｋｅら、２０００）。次いで、このビス−ＭＧＤを、モリブデン含有酵素に挿入する。他の真正細菌では、Ｍｏｃｏを、補酵素としても使用する他の誘導体が得られるように改変することができる（Ｓｃｈｗａｒｚ、２００５）。上述の全てのＭｏｃｏ生合成遺伝子およびＭｏｃｏまたはその誘導体を補酵素として使用する酵素をコードするいくつかの遺伝子は、少なくともいくつかの細菌においてＭｏｃｏＲＮＡモチーフに関連する（図２３ｂ）。
【０４３１】
ｉｉｉ．Ｍｏｃｏ  ＲＮＡの構造特徴の生化学分析
Ｍｏｃｏおよびその生合成中間体の化学的不安定性を考慮すると、試験管内での直接結合相互作用についてこれらの化合物を試験することは実用的でなかった。したがって、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＭｏｃｏ  ＲＮＡがリボスイッチ機能と一致する特徴を有するかどうかを決定するための一連の生化学実験および遺伝子実験を行った。このＭｏｃｏ  ＲＮＡ代表についての提案された構造モデルを評価するための、塩基対合Ｐ１エレメントの始まりの５’の９ヌクレオチド上流からＰ１の３’末端を超える１０ヌクレオチドまでにわたるＭｏｃｏモチーフを含む１３８−ヌクレオチドＲＮＡ構築物（１３８ｍｏａＡと呼ぶ、図２４ａ）。１３８  ｍｏａＡは、Ｐ３ステム（いくつかの代表では存在しない）、予想されるリボゾーム結合部位、およびｍｏａＡ  ＯＲＦのＡＵＧ翻訳開始コドンを含む。ＲＮＡはまた、５’末端に試験管内転写による産生を容易にするための２つのさらなるＧ残基を保有する。微量の５’３２Ｐ標識１３８ｍｏａＡ  ＲＮＡを、インライン探索分析（ＳｏｕｋｕｐおよびＢｒｅａｋｅｒ、１９９９）に供した。この分析は、ＲＮＡ構造中の相違によって引き起こされる種々のヌクレオチド間結合の自発的切断の頻度の相違を活用して硬直した構造および柔軟な構造の領域を同定する。
【０４３２】
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって分離した場合、インライン探索の間に生成されたＲＮＡ切断産物の得られたパターン（図２４ｂ）は、比較配列分析を基に推定した主な二次構造の特徴のほとんどと一致した（図２２）。具体的には、高レベルの自発的ホスホエステル転移を示すほとんどの部位がステムＰ３およびＰ５のループに局在し、予想される塩基対合ステム間を架橋するジャンクション中にクラスターを形成する。しかし、自発的切断パターンは、大部分のＰ２ステムのために提案された二次構造と一致しない。このステムは構造的柔軟性を潜在的に示すことができる２つの内部バルジを有することができるにもかかわらず、認められたいくつかのＲＮＡフラグメントは、塩基対合することができるヌクレオチドでの切断の結果である。
【０４３３】
インライン探索の結果により、いくつかの高度に保存されたヌクレオチドを保有するＰ２ステムおよびジャンクションの高次構造が変化して、リガンド結合ポケットを形成することができると示唆される。これは、他の公知のリボスイッチアプタマーの挙動と一致し、このアプタマーのうちのいくつかは、インライン探索アッセイによって、標的代謝産物の添加の際に構造の実質的な変化を受けることが認められる（Ｎａｈｖｉら、２００２；Ｗｉｎｋｌｅｒら、２００２；Ｍａｎｄａｌら、２００３）。
【０４３４】
ｉｖ．Ｍｏｃｏ  ＲＮＡは遺伝子調節エレメントとして機能する
Ｅ．ｃｏｌｉでは、ｍｏａオペロンの転写を調節することが公知の２つのプロモーター部位および付随するタンパク質因子結合部位が存在する（図２３ａ）。Ｓ２プロモーター部位は、嫌気性タンパク質転写因子Ｆｎｒに依存する（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、２０００；ＳｐｉｒｏおよびＧｕｅｓｔ、１９９０）。嫌気性条件に応答するオペロンのこの転写上方制御によってＭｏｃｏ（嫌気性呼吸に関与する一定のタンパク質が補酵素として必要とする）の生合成の増加が可能となる。ｍｏａオペロンのＳ１プロモーター部位をモリブデン酸塩結合ＭｏｄＥ（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、２０００）によって活性化し、このモリブデン酸塩結合ＭｏｄＥは、細胞中のモリブデン酸塩に結合してｍｏｄＡＢＣＤオペロンの転写を上方制御する転写因子である（Ｇｒｕｄｅｎら、１９９９）。これにより、細胞中で利用可能なＭｏｃｏを合成するのに十分なモリブデン酸塩が確実に存在する。さらに、ＣｕｅＲの予想される結合部位がＭｏｃｏエレメントの下流に存在するにもかかわらず、銅応答因子ＣｕｅＲによってｍｏａオペロン中のいくつかの遺伝子を調節する証拠が存在する（ＹａｍａｍｏｔｏおよびＩｓｈｉｈａｍａ、２００５）。
【０４３５】
この多層転写調節ネットワークに加えて、Ｓ１プロモーターとｍｏａＡ開始コドンとの間の１３１−ｎｔストレッチが第３の調節系に寄与することが知られていた（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、２０００）。具体的には、この領域の存在により、Ｍｏｃｏが細胞中に存在する場合にｍｏａオペロンの抑制が可能となる（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、２０００；ＢａｋｅｒおよびＢｏｘｅｒ、１９９１）。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｍｏａオペロン発現に及ぼすＦｎｒおよびＭｏｄＥ転写因子の影響は、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）のこの部分が欠失される場合にのみ認め得る。興味深いことに、この１３１−ｎｔ領域は、Ｍｏｃｏ  ＲＮＡモチーフを正確に含む。さらに、ＤＮＡのこの部分または対応するＲＮＡ転写物に対して作用するタンパク質調節因子は同定されておらず、このｍＲＮＡ部分がＭｏｃｏの直接的センサーとしての機能を果たすことができるという可能性については未解決のままである。
【０４３６】
Ｍｏｃｏ  ＲＮＡの構造上の特徴は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｏａオペロンの公知の遺伝子調節の特徴を加味して、Ｍｏｃｏ  ＲＮＡ代表が代謝産物感知リボスイッチであることを示す。Ｍｏｃｏ  ＲＮＡが遺伝子調節エレメントとして機能することを確認するために、ＰＣＲを使用して、野生型ｍｏａＡ  ５’ＵＴＲに対応するＥ．ｃｏｌｉゲノムの一部を増幅した。このゲノムセグメントは、Ｐ１の５’の始まりの９ｎｔ上流から始まり、Ｐ１の３’末端を超えてｍｏａＡコード領域に２１ｎｔ伸長する１４９−ヌクレオチドＲＮＡ（１４９  ｍｏａＡと呼ぶ）をコードする。また、Ｐ３ステム中の塩基対合を破壊し（Ｍ１）、その後に修復する（Ｍ２）変異を有する１４９  ｍｏａＡ  ＲＮＡを発現する２つのバリアントＤＮＡを生成する（図２５ａ）。
【０４３７】
これらの配列を、β−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子の上流且つインフレームで翻訳融合プラスミドにクローン化した。融合物を、本質的に活性なｌａｃＵＶ５プロモーターの調節下において、ｍｏａＡオペロンの発現を自然に制限する上流の嫌気性且つモリブデン酸塩依存性のプロモーター調節の影響を排除した。この一連のプラスミドを、ｍｏａＡ遺伝子が欠失したＥ．ｃｏｌｉ株中に配置した。得られた形質転換体を、アラビノース誘導性且つグルコース抑制性プロモーターの調節下にてｍｏａＡＢＣＤＥオペロンを含むプラスミドで形質転換した（Ｇｕｚｍａｎら、１９９５）。これらの二重形質転換株は、Ｍｏｃｏ濃度が高いか低い場合のレポーター遺伝子発現に関する１４９  ｍｏａＡ  ＲＮＡの役割を決定することができた。
【０４３８】
野生型１４９  ｍｏａＡ構築物（ＷＴ）を保有する細胞は、アラビノースの存在下で増殖させた場合に低いβ−ガラクトシダーゼ遺伝子発現を示した（高濃度のＭｏｃｏが予想される）（図２５ｂ）。対照的に、ＷＴ構築物を有する細胞は、グルコースの存在下で増殖させた場合にレポーター遺伝子発現が３倍を超える増加を示す（低濃度のＭｏｃｏが予想される）。この結果は、Ｍｏｃｏ  ＲＮＡエレメントが遺伝子発現を抑制し、これは、Ｍｏｃｏ生合成経路における小分子産物に対する応答による可能性がもっとも高いことを示す。遺伝子「オフ」スイッチとしてのこのＭｏｃｏ  ＲＮＡの機能は、バイオインフォマティクスによって予想される機構と一致する。
【０４３９】
Ｐ３ステム中の変異（Ｍ１）の導入によるＭｏｃｏ  ＲＮＡの保存された二次構造の破壊により、遺伝子発現の抑制解除がもたらされる。対照的に、塩基対合を修復するさらなる変異（Ｍ２）を使用したＰ３配列の変化はまた、Ｍｏｃｏ生合成のアラビノース誘導の際の遺伝子抑制が修復される。これらのバリアントによって示された遺伝子調節の破壊および野生型レポーター遺伝子発現レベルへの回帰は、Ｍｏｃｏ  ＲＮＡが活性にその保存された二次構造が必要な遺伝子調節エレメントであることを示す。
【０４４０】
ｖ．モリブデン輸送はＭｏｃｏ  ＲＮＡ遺伝子調節機能に影響を及ぼす
モリブデン酸塩を、ｍｏｄオペロンによってコードされる高親和性タンパク質依存性ＡＢＣ輸送体を介してＥ．ｃｏｌｉ細胞に輸送する（ＧｒｕｎｄｅｎおよびＳｈａｎｍｕｇａｍ、１９９７；Ｍａｕｐｉｎ−Ｆｕｒｌｏｗら、１９９５）。モリブデン酸塩を補足しない培地では、野生型Ｅ．ｃｏｌｉの細胞内モリブデン酸塩濃度は１．０μＭであるのに対して、モリブデン酸塩輸送体欠損株における細胞内モリブデン酸塩濃度は０．２μＭと評価される（ＳｃｏｔｔおよびＡｍｙ、１９８９）。しかし、このモリブデン酸塩欠損およびこれに起因する有害反応を、増殖培地へのモリブデン酸ナトリウムの添加によって克服することができる。高細胞外モリブデン酸ナトリウム濃度下で、硫酸塩輸送系は、モリブデン酸塩を移入することができ、それにより、野生型およびモリブデン酸塩輸送体欠損株の細胞内モリブデン酸塩濃度を約５μＭにすることができる（ＳｃｏｔｔおよびＡｍｙ、１９８９；Ｒｏｓｅｎｔｅｌら、１９９５）。
【０４４１】
モリブデン酸塩が１４９  ｍｏａＡ  ＲＮＡによる遺伝子調節に重要であるかどうかを決定するために、Ｅ．ｃｏｌｉのｍｏｄＣノックアウト株を、高親和性モリブデン酸塩輸送体機能を排除するように導いた。次いで、この株を、ｍｏａＡＢＣＤＥ誘導性発現プラスミドならびに野生型および変異１４９  ｍｏａＡレポーター融合プラスミドで形質転換した。微量のモリブデン酸塩を含むＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２００１）中で増殖させた場合、ｍｏｄＣ欠失により、ＷＴ  １４９  ｍｏａＡレポーター融合物が高レベルの遺伝子発現をもたらす（図２５ｃ）。対照的に、同一の株を１０ｍＭモリブデン酸ナトリウムを補足したＬＢ中で増殖させた場合、機能的ＭｏｄＣを保有する形質転換体のそれと類似のレベルに発現が抑制される。これは、適量のモリブデン酸塩が細胞中で利用可能でない限り、Ｍｏｃｏ  ＲＮＡを介した遺伝子発現を誘発するために必要とされる分子は十分な濃度で存在しないことを示す。
【０４４２】
興味深いことに、細胞を１０ｍＭタングステン酸ナトリウムを補足したＬＢ中で増殖させる場合、ｍｏｄＣ欠失を保有する形質転換体中の野生型１４９  ｍｏａＡレポーター融合構築物は抑制解除されるようになる。上で述べたように、タングステンは、細胞に侵入して、補因子の金属イオン成分としてモリブデンと置き換わり得る。しかし、１４９  ｍｏａＡ  ＲＮＡが代謝産物感知リボスイッチ（例えば、Ｍｏｃｏ）として機能する場合、これは、モリブデンに配位した化合物とタングステンに配位した類似化合物との間を識別する能力を有する。全ての場合、破壊変異（Ｍ１）および代償的変異（Ｍ２）を保有するレポーター融合構築物により、期待される遺伝子発現プロフィールが得られる。
【０４４３】
ｖｉ．生合成遺伝子の変異により、Ｍｏｃｏが調節リガンドであることが示唆される  
上記結果を考慮すると、ＭｏｃｏがＭｏｃｏ  ＲＮＡによって直接感知することができる調節因子であると推測された。Ｍｏｃｏ生合成経路中の特定の化合物が遺伝子発現の調節を担うというさらなる証拠を得るために、経路に沿った種々の遺伝子に合わせたノックアウト変異を作製した。前に試験したｍｏａＡノックアウトに加えて（図２５ｂ）、ｍｏｇＡ、ｍｏｄＣ、またはｍｏｅＡのノックアウト（Δ）を有する株を作製し、ｍｏａＡＢＣＤＥ誘導性発現プラスミドおよび野生型１４９  ｍｏａＡレポーター融合プラスミドで形質転換した。ΔｍｏｇＡ、ΔｍｏｄＣ、およびΔｍｏｅＡノックアウト株は、ｍｏａＡＢＣＤＥ発現プラスミドの誘導と無関係に、抑制解除を示す（図２６）。結果は、これら３つのタンパク質が小分子シグナルの産生に不可欠であり、ｍｏａオペロンの誘導がこれらのタンパク質の喪失を代償できないことを示す。
【０４４４】
ΔｍｏｄＣ株の遺伝子発現の特徴は、前に認められた特徴に類似し（図２５ｃ）、モリブデン酸塩輸送がシグナル伝達化合物の形成に必要であることが証明される。しかし、ΔｍｏｅＡ株の特徴により、モリブデン酸塩のみがシグナル伝達化合物である可能性が低いことが明らかになる。ＭｏｅＡは、モリブデンのモリブドプテリン（Ｍｏｃｏ生合成経路の最終ステップ）への挿入を触媒し、この活性は１４９  ｍｏａＡ  ＲＮＡによる遺伝子発現の調節に必要である。
【０４４５】
多数のリボスイッチクラスについて、リボスイッチアプタマーによって感知されるリガンドは、調節される生合成経路中の最終補酵素または代謝産物である（ＷｉｎｋｌｅｒおよびＢｒｅａｋｅｒ、２００５）。Ｍｏｃｏは全ドメインに広く存在する化合物である一方で、いくつかの細菌はＭｏ依存性酵素の活性部位に挿入されるＭｏｃｏの誘導体を生成する。Ｍｏｃｏは、このリボスイッチクラスの最も論理的なリガンドである。
【０４４６】
Ｅ．ｃｏｌｉでは、Ｍｏｃｏをタンパク質に挿入することができる前に、ＭｏｃｏをＭｏｂＡによってさらに改変しなければならない（Ｉｏｂｂｉ−Ｎｉｖｏｌら、１９９５；Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９１）。次いで、得られたＭｏｃｏのビス−ＭＧＤ形態（図２３ｂ）を、モリブドプロテイン（ｍｏｌｙｂｄｏｐｒｏｔｅｉｎ）に挿入することができる。Ｍｏｃｏの誘導体がリボスイッチリガンドであり得るかどうかを決定するために、ΔｍｏｂＡ株を構築し、その影響を上記のレポーター遺伝子発現に関して評価した。グルコースを含むＬＢ中で増殖させた場合、他の全ての形質転換体と同一の抑制解除が認められる（図２６）。しかし、細胞をアラビノースを補足したＬＢ中で増殖させる場合、レポーター融合構築物の抑制は修復される。ＭｏｂＡを使用しなかっとしても、細胞は、ｍｏａＡ  １４９  ＲＮＡによって調節された遺伝子発現を抑制することが必要な小分子を産生することができる。これらの結果は、ＭｏｃｏがＭｏｃｏ  ＲＮＡ依存性遺伝子調節を担う小分子であることと一致する。
【０４４７】
ｖｉｉ．Ｍｏｃｏ  ＲＮＡがＭｏｃｏとＴｕｃｏとを識別することができる証拠
リボスイッチは、生合成経路内の密接に関連する中間体の間で分化する能力で知られている。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ種およびいくつかの好熱性古細菌種は、モリブデンよりもむしろタングステンをモリブドプテリンに組み込み、それにより、密接に関連した化合物Ｔｕｃｏが形成される（Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９３）。ＭｏおよびＷの原子半径およびイオン半径は実質的に同一であり、その電子親和力も同様である（ＫｌｅｔｚｉｎおよびＡｄａｍｓ、１９９６）。今回の研究に重要なのは、Ｅ．ｃｏｌｉがＷを最終Ｗ−ビス−ＭＧＤ補因子に組み込み、次いで、補因子を機能的トリメチルアミンＮ−オキシドレダクターゼに挿入することができることを示したことである（Ｂｕｃら、１９９９）。
【０４４８】
以前の研究（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、２０００）では、１３１−ｎｔ上流領域によるｍｏａＡＢＣＤＥオペロンの見かけ上の抑制がＭｏｃｏの存在下で起こるが、Ｔｕｃｏの存在下で抑制解除される。この以前の所見は本データと一致し（図２５ｃ）、Ｍｏｃｏ  ＲＮＡ−レポーター融合構築物を保有する細胞が培地へのタングステン酸塩の添加に影響を受けないことを証明する。したがって、Ｍｏｃｏ  ＲＮＡは、これら２つのほぼ同一の補因子を識別することができる。
【０４４９】
Ｍｏｃｏ  ＲＮＡ代表の系統発生的分布および配列アラインメントの調査により、モチーフに２つの主なクラスが存在することが明らかになった。Ｍｏｃｏ  ＲＮＡモチーフの１７６例のうち、５８例はＰ３ステムを欠く。しかし、この群は系統発生的区分に沿って厳格に分類されず、同一リガンドを認識するリボスイッチアプタマーの構造バリアントの伝播と一致する。
【０４５０】
興味深いことに、Ｍｏｃｏ  ＲＮＡの２つの構造型は、細菌の間でのＭｏｃｏおよびＴｕｃｏの利用とほぼ完全な一致を示し（表３）、これは、２つのＲＮＡ型によってＭｏｃｏまたはＴｕｃｏのいずれかを選択的に認識することが可能であることを示す。ＭｏｃｏまたはＴｕｃｏを使用する生物を、これらの補因子に関連する化合物を使用または輸送すると予想されるタンパク質をコードする遺伝子の存在によって暫定的に同定することができる。Ｐ３ステムを含むＭｏｃｏ  ＲＮＡは、モリブドプテリンまたはＭｏｃｏを合成するタンパク質をコードする遺伝子と排他的に関連し、補酵素としてＭｏｃｏを使用することが公知であるか予想される酵素をコードする遺伝子のみとも関連する。対照的に、Ｐ３ステムを欠くＭｏｃｏ  ＲＮＡ代表を保有する１９生物のうちの１７生物はまた、Ｔｕｃｏ代謝を示す遺伝子を保有する。さらに、Ｐ３欠如ＲＮＡは、モリブドプテリン生合成（モリブドプテリンはＴｕｃｏおよびＭｏｃｏ生合成の両方の前駆体である）に関連する酵素をコードする遺伝子または補酵素としてＴｕｃｏを使用することが公知であるか予想される酵素をコードする遺伝子とほぼ排他的に関連する。
【０４５１】
ＭｏｃｏおよびＴｕｃｏ代謝を用いたＭｏｃｏ  ＲＮＡ型の分離の見かけ上の例外は、予測されるモリブデン酸塩輸送体に関連するＰ３欠如ＲＮＡを有するＰｅｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｒｂｉｎｏｌｉｃｕｓについて明らかである（表３、注釈づけａ）。しかし、この輸送体クラスのメンバーは、タングステン酸塩を識別できず、したがって、この生物中の輸送体は、Ｔｕｃｏ生合成に実際に重要であり得る。Ｍｏｃｏ  ＲＮＡの両構造変動を保有する生物においてさえ、Ｐ３含有ＲＮＡおよびＰ３欠如ＲＮＡのＭｏｃｏおよびＴｕｃｏ代謝過程へのそれぞれの分離は主に維持される。
【０４５２】
２つのＭｏｃｏ  ＲＮＡ型の特筆すべき分離を、Ｐ３ステムの有無によって異なり、ＭｏｃｏまたはＴｕｃｏをそれぞれ選択的に感知する２つのＭｏｃｏ  ＲＮＡ型の存在によって説明することができる。しかし、Ｐ３ステムをＥ．ｃｏｌｉ  Ｍｏｃｏ  ＲＮＡから欠失しているが、この変化は試験した全増殖条件下で遺伝子調節を完全に破壊した。おそらく、この欠如のみではＭｏｃｏからＴｕｃｏへのＭｏｃｏ  ＲＮＡの特異性の交換に不十分である。
【０４５３】
上で述べたように、ＲＮＡエレメントの三重配置は、Ｓ．ｗｏｌｆｅｉ中の見かけ上の７遺伝子オペロン中に存在する。このオペロン中の遺伝子は、モリブドプテリン合成、モリブデン酸塩またはタングステン酸塩の輸送、および未知の機能の他の遺伝子に関与するタンパク質をコードすることが予想される。このシリーズ中の３つの全ＲＮＡはＰ３ステムを欠く。さらに、推定内因性転写ターミネーターを、最初の２つのＲＮＡモチーフならびに、オペロン中の第３のモチーフと第１のＯＲＦとの間の長いギャップにしたがって観察した。各リボスイッチが実際に個別の発現プラットフォームを介して機能する場合、および、Ｐ３ステムの非存在がＴｕｃｏ結合を示す場合、以前に記載のタンデムリボスイッチ（ＷｅｌｚおよびＢｒｅａｋｅｒ、２００７）と比較して、より高い「デジタル」遺伝子調節特性を有する三重配置によって細胞がＴｕｃｏ濃度の小さな変化に例外的に応答することが可能である。
【０４５４】
２．結論
Ｅ．ｃｏｌｉでは、ｍｏａＡＢＣＤＥオペロンの転写は、ＭｏｄＥおよびＦＮＲの両方によって上方制御される。しかし、Ｍｏｃｏ  ＲＮＡおよびＭｏｃｏが存在する場合にこのオペロンの翻訳が防止される。ＭｏｄＥおよびＦＮＲの調節は、Ｍｏｃｏ産生の必要条件（ＦＮＲによって感知される嫌気性増殖条件）および可能条件（ＭｏｄＥによって感知される十分なモリブデン酸塩レベル）が細胞中に存在する場合ｍｏａＡＢＣＤＥ転写物のみが確実に作製される。Ｍｏｃｏ  ＲＮＡが実際にリボスイッチである場合、さらなる調節層を添加する。Ｍｏｃｏ感知リボスイッチは、ｍｏａＡＢＣＤＥ転写物への遊離Ｍｏｃｏ結合によって示されるように、十分なレベルのＭｏｃｏが既に存在する場合、Ｍｏｃｏ生合成タンパク質は作製されないことを確実にする。この系により、細胞内のＭｏｃｏに対する要求の変化に迅速であるが有効に応答することが可能である。
【０４５５】
本明細書中に示した実験データおよびバイオインフォマティクスデータは、Ｍｏｃｏ  ＲＮＡモチーフに適合するＲＮＡがＭｏｃｏまたはＴｕｃｏ感知リボスイッチアプタマーとしての機能を果たし得ることを示す。ＲＮＡは、リボスイッチ機能と一致するゲノム分布を有し、１４９  ｍｏａＡ  ＲＮＡは、その二次構造に依存する遺伝子調節機能を示す。しかし、Ｍｏｃｏおよびその代謝中間体の不安定性により、インライン探索、平衡透析法、または蛍光ベースのアッセイなどの一般的に使用される技術を使用したこれらの補酵素のＲＮＡへの直接結合の証明が妨げられる。これらの後者の実験を典型的に使用して、タンパク質因子の完全な非存在下でリガンド結合が起こることを証明する。
【０４５６】
いくつかの一連の証拠は、タンパク質因子が代謝産物感知に関与せず、ＲＮＡが直接的センサーとしての機能を果たすことを示す。以前の研究により、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＭｏｃｏ生合成遺伝子を調節する酸素およびモリブデン酸塩に応答するタンパク質因子を同定した（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、２０００；ＳｐｉｒｏおよびＧｕｅｓｔ、１９９０；Ｇｒｕｄｅｎら、１９９９）。しかし、この生物におけるｍｏａＡ遺伝子のすぐ上流に存在する調節領域のための因子は同定されていない。さらに、Ｍｏｃｏ  ＲＮＡ代表を、２つの異なる構造（Ｐ３を含むものおよび含まないもの）に分類することができ、これらのモチーフ型の分布は、生物によるＭｏｃｏ、Ｔｕｃｏ、またはその両方の使用と相関する（表３）。ＭｏｃｏおよびＴｕｃｏの直接的センサーとしての機能を果たすのがＲＮＡである場合、これらの構造的に異なるＲＮＡのかかる組合せ（ａｓｓｏｒｔｍｅｎｔ）が予想される。
【０４５７】
Ｍｏｃｏ  ＲＮＡはまた、他のリボスイッチ代表といくつかの重要な特徴を共有する。例えば、補酵素Ｂ１２（Ｎａｈｖｉら、２００４）、チアミンピロリン酸（Ｗｉｎｋｌｅｒら、２００２ａ）、フラビンモノヌクレオチド（Ｗｉｎｋｌｅｒら、２００２ｂ）、およびリジン（Ｓｕｄａｒｓａｎら、２００３）に応答するＥ．ｃｏｌｉ中に存在することが公知のリボスイッチアプタマーの４つの他のクラスが存在する。Ｍｏｃｏ  ＲＮＡ（Ｗｅｉｎｂｅｒｇら、２００７）と同様に、これらのリボスイッチは全てＲＮＡから構成される非リボスイッチ遺伝子調節エレメントと比較して大きく（図２７）、これらは全て高レベルのヌクレオチド配列および配列保存を有している（ＢａｒｒｉｃｋおよびＢｒｅａｋｅｒ、２００７）。Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＭｏｃｏ  ＲＮＡおよび公知のリボスイッチアプタマーは、１００ヌクレオチドより大きく、且つ４〜６つのステムを保有する。このステムは、遠縁の生物由来の代表においてさえ塩基対合を維持するヌクレオチド共変動の証拠を示す。
【０４５８】
Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＲＮＡに結合する公知の代謝調節タンパク質（ＣｓｐＡ（ＰｈａｄｔａｒｅおよびＩｎｏｕｙｅ、１９９９）、ＢｇｌＧ（Ｈｏｕｍａｎら、１９９０）、およびその他（Ｌｉｕら、１９９７；Ｔｏｒｒｅｓ−Ｌａｒｉｏｓら、２００２；Ｖｅｃｅｒｅｋら、２００５；ＲｉｃｈａｒｄｓｏｎおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ、１９９６；ＴａｎｇおよびＧｕｅｓｔ、１９９９）など）は、非常により小さなＲＮＡストレッチを認識する。これらのタンパク質結合配列中に任意の二次構造が存在する場合、二次構造は、一般に、１つのヘアピンからなる。この傾向に対する１つの例外はＴｈｒＲＳ  ＲＮＡエレメント（Ｔｏｒｒｅｓ−Ｌａｒｉｏｓら、２００２）であり、このエレメントは、通常は大きな構造化ｔＲＮＡに結合するアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼによる結合を好むように構造が進化している。ほとんどのタンパク質結合ＲＮＡモチーフと対照的に、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｏａＡ  ＲＮＡ由来のＭｏｃｏ  ＲＮＡは、１３８ヌクレオチドに及び、少なくとも５つの保存ステム−ループエレメントを形成する。したがって、Ｍｏｃｏ  ＲＮＡの大きく且つ広範に保存された構造は、タンパク質因子によって結合するほとんどのＲＮＡ遺伝子調節エレメントよりもＥ．ｃｏｌｉ由来の公知のリボスイッチＲＮＡでより特徴的である。これらの特徴は、Ｍｏｃｏ  ＲＮＡが新規に見出された代謝産物感知リボスイッチクラスのメンバーであることを示す。
【０４５９】
３．実験手順
ｉ．オリゴヌクレオチドおよび化学物質
合成ＤＮＡは、イェール大学  Ｈｏｗａｒｄ  Ｈｕｇｈｅｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｋｅｃｋ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒによって合成された。以下の化学物質をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した：カルベニシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、Ｌ−アラビノース、Ｄ−グルコース、グリセロール、モリブデン酸ナトリウム、およびタングステン酸ナトリウム。
【０４６０】
ｉｉ．細菌株および培地
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＪ４８０株（ＭＧ１６５５  ΔｌａｃＸ７４）（ＣａｂｒｅｒａおよびＪｉｎ、２００１）をＤ．Ｊ．Ｊｉｎ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）から入手し、ＮＥＢ５α細胞をＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから入手した。Ｗａｎｎｅｒ遺伝子破壊セット（ｐＫＤ４６、ｐＫＤ１３、およびｐＣＰ２０）（ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ、２０００）に対応するプラスミドを、イェール大学  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒから得た。培地補助剤を各実験について記載のように添加した：カルベニシリン、５０μｇ／ｍＬ；クロラムフェニコール、５μｇ／ｍＬ；カナマイシン５０μｇ／ｍＬ；Ｌ−アラビノース、０．２％（ｗ／ｖ）；Ｄ−グルコース、０．２％（ｗ／ｖ）。アラビノース補足を適用する場合、グリセロール０．２％（ｗ／ｖ）を、培地に添加する（Ｇｕｚｍａｎら、１９９５）。
【０４６１】
ｉｉｉ．Ｍｏｃｏ  ＲＮＡの調製
インライン探索のために使用した１３８  ｍｏａＡ  ＲＮＡ構築物を、連続的ＰＣＲ増幅反応によって生成されたテンプレートを使用した試験管内転写によって調製した。ｍｏａＡ上流の遺伝子間領域を、プライマー５’−ＧＡＡＴＴＣＣＣＴＧＧＡＧＴＣＡＧＡＴＴＡＴＣＣＧＣ（配列番号４）および５’−ＣＴＧＧＡＴＣＣＡＧＴＴＧＴＧＡＡＧＣＣＡＴＧＴＡＣＡＣ（配列番号５）を使用して、ＰＣＲによってＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２  ゲノムＤＮＡから増幅した。ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩによる消化後、ＰＣＲ産物をｐＲＳ４１４にクローン化し、得られたプラスミドの完全性を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。このプラスミドを、１３８  ｍｏａＡ構築物をコードするＤＮＡ構築物のＰＣＲ増幅のためのテンプレートとして使用し（ＲＮＡ転写物の５’末端に対応するＧＧ付加を含む）、非テンプレート鎖のプライマーはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含んでいた。以前に記載のように、ＲＮＡ分子を、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用した試験管内での転写によって調製し、変性ＰＡＧＥを使用して精製した（Ｒｏｔｈら、２００６）。
【０４６２】
ｉｖ．１３８  ｍｏａＡ  ＲＮＡのインライン探索分析
製造者によって供給されたプロトコールにしたがって、試験管内転写によって調製したＲＮＡの４０ピコモル（ｐｍｏｌｅ）を、アルカリホスファターゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して脱リン酸化し、２０ピコモルをＴ４  ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用してγ−３２Ｐ［ＡＴＰ］で放射性同位元素標識した。ＰＡＧＥによって精製された放射性同位元素標識ＲＮＡを使用したインライン探索反応物を、以前に記載のようにアセンブリし（Ｍａｎｄａｌら、２００３）、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３、２３℃）、１００ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および約５ｎＭ前駆体ＲＮＡを含む１０μＬの体積中にて２５℃で４０時間インキュベートした。得られたＲＮＡフラグメントを、１０％変性ＰＡＧＥの使用によって分離し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒを使用して画像化し、ＩｍａｇｅＱｕａＮＴソフトウェアを使用して定量した。
ｖ．ｍｏａＡ、ｍｏｇＡ、ｍｏｄＣ、ｍｏｅＡ、およびｍｏｂＡノックアウトの生成
特定の遺伝子が欠失したＥ．ｃｏｌｉ  ＤＪ４８０株を、他の場所に記載のように（ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ、２０００）、λ−ｒｅｄ組換え法および適切なＰＣＲ産物を使用して生成した。簡潔に述べれば、プラスミドｐＫＤ１３および以下のプライマーを使用したＰＣＲ増幅によって変異体を作製した：
ｍｏａＡ、５’−ＡＧＧＡＡＧＡＡＡＴＧＡＣＴＴＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＡＴＣＴＧＧＡＡＡＧＧＴＧ  ＴＡＣＡＴＧＧＣＴＡＴＴＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＣ（配列番号６）および
５’−ＡＣＣＴＧＡＣＴＣＡＴＣＴＧＡＴＣＴＣＴＣＣＴＴＴＴＧＡＣＧＴＴＴＴＡ  ＧＣＣＧＣＣＡＡＴＧＴＡＣＧＡＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣＧ；ｍｏｇＡ（配列番号７）、
５’−ＴＧＴＡＴＣＡＴＴＣＴＧＴＴＴＡＡＣＧＡＧＡＣＴＧＴＴＴＡＡＡＣＧＧＡＡＡ  ＡＡＴＣＴＴＧＡＴＧＡＡＴＡＴＴＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＣ（配列番号８）および
５’−  ＴＴＧＡＧＡＴＣＣＣＣＣＣＧＣＴＣＧＧＧＧＧＧＡＴＴＴＴＴＴＴＡＴＴＣＧＣ  ＴＡＡＣＧＴＣＧＣＧＴＣＴＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣＧ；ｍｏｅＡ（配列番号９），
５’−ＧＡＣＡＴＡＡＴＡＧＧＣＡＡＡＴＴＣＧＡＴＴＴＴＧＣＣＴＣＣＧＣＡＧＧＡ  ＧＴＧＴＴＴＴＣＡＴＧＧＡＡＡＴＴＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＣ（配列番号１０）および
５’−ＣＡＧＣＡＴＣＴＣＣＴＧＡＴＣＧＣＴＧＡＧＴＴＣＣＧＣＣＡＴＴＡＣＡＧＧ  ＣＣＴＣＣＧＡＡＣＡＡＣＧＣＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣＧ（配列番号１１）；
ｍｏｄＣ、５’−ＧＡＡＴＧＧＣＴＧＧＣＣＡＧＡＡＴＣＡＧＣＣＧＴＧＡＡＣＧＧＧＣＧＧＧ  ＧＣＧＣＴＡＡＴＣＡＴＧＣＴＧＡＴＴＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＣ（配列番号１２）および
５’−ＴＴＧＣＣＣＡＧＴＴＣＡＴＴＴＡＴＡＧＣＣＡＣＣＴＧＡＴＴＡＡＴＣＡＧ  ＧＣＧＧＴＴＡＴＣＧＡＣＡＣＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣＧ（配列番号１３）；
ｍｏｂＡ、５’−ＧＡＣＡＣＧＴＴＡＧＣＡＧＧＧＴＣＡＡＴＣＣＣＡＣＡＡＴＡＡＡＡＧＡＧ  ＧＣＧＡＴＡＴＣＧＧＴＧＡＡＴＡＴＴＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＣ（配列番号１４）および
５’−  ＡＣＴＣＣＡＣＧＣＧＧＣＡＡＡＧＧＣＧＡＧＴＡＡＣＧＧＴＡＴＣＡＴＣ  ＧＴＴＴＴＴＣＣＴＧＣＣＡＴＣＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣＧ（配列番号１５）。
【０４６３】
ＦＬＰ認識標的部位に隣接したカナマイシン耐性カセットおよび隣接染色体配列に対して同一の５０ヌクレオチド配列同一性を含む得られた約１．４ｋｂ長のＰＣＲ産物を精製し、ＤｐｎＩ消化に供した。ＤＪ４８０細胞を、相同組換えを促進するλファージ由来のＲｅｄリコンビナーゼをコードするＲｅｄヘルパープラスミドｐＫＤ４６で形質転換した。形質転換体を、アンピシリン耐性について選択した。Ｌ−アラビノースを使用して増殖させたＤＪ４８０／ｐＫＤ４６細胞を、遺伝子特異的／ｐＫＤ１３  ＰＣＲ産物で形質転換した。ＤＪ４８０の染色体へのＰＣＲ産物の組換えを、カナマイシン耐性形質転換体の選択によって決定した。全ての得られた欠失変異体を、カナマイシンカセットに特異的な内部プライマー
（ｋ１  ５’−ＣＡＧＴＣＡＴＡＧＣＣＧＡＡＴＡＧＣＣＴ（配列番号１６）およびｋ２  ５’−ＣＧＧＴＧＣＣＣＴＧＡＡＴＧＡＡＣＴＧＣ（配列番号１７））および隣接遺伝子特異的プライマー（ｍｏａＡ  ５’−ＣＧＣＴＡＧＴＡＴＣＧＧＣＡＴＡＡＣＣＡＣ（配列番号１８）および５’−ＧＡＡＴＣＧＣＧＣＡＧＡＴＡＧＴＧＡＣＣＧ（配列番号１９）、ｍｏｇＡ  ５’−ＧＣＴＡＣＣＴＣＴＴＣＴＧＡＡＧＣＣＴＧＴＣＴＧＴ（配列番号２０）および５’−  ＡＴＧＧＧＴＧＡＡＧＴＡＣＴＧＡＡＣＧＡＧＣＡＧＴ（配列番号２１）、ｍｏｅＡ  ５’−ＧＡＴＧＧＡＴＡＴＧＧＣＡＴＧＴＡＡＡＧＧＣＡＧＧ（配列番号２２）および５’−ＡＧＣＡＣＧＣＧＡＧＡＡＴＣＴＴＴＣＡＧＣＧＣＣＴ（配列番号２３）、ｍｏｄＣ  ５’−ＧＡＧＣＧＧＣＧＡＧＡＣＴＧＴＧＣＡＴＴＡ（配列番号２４）および５’−ＧＣＡＡＣＧＣＣＧＡＴＧＡＣＧＣＧＧＴＡ（配列番号２５）、ならびにｍｏｂＡ  ５’−ＣＴＴＣＡＴＴＣＡＧＡＣＧＴＴＴＡＣＡＴＴＴＣＡＴＡＧ（配列番号２６）および５’−ＣＡＴＣＣＡＴＡＴＣＡＴＧＧＴＧＣＧＴＡＴＧＣＴＴＡ（配列番号２７））の両方を使用したＰＣＲによって検証した。
【０４６４】
次いで、カナマイシンカセットを、ＦＬＰプラスミドｐＣＰ２０の使用による部位特異的組換えによって排除した。得られたカナマイシン感受性形質転換体を、ｐｒｅ−ＦＬＰ検証のために使用した同一のプライマーを使用したＰＣＲによって検証した。
【０４６５】
ｖｉ．β−ガラクトシダーゼ翻訳融合物および変異体の構築
オペレーター結合部位を欠く構造的に活性なｌａｃＵＶ５プロモーターによって駆動するＭｏｃｏ  ＲＮＡ−レポーター融合構築物の調製を、以下のように行った。Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｏａＡＢＣＤＥオペロンのＳ１転写開始部位と比較して１〜１４５のヌクレオチド配列（図２３ａ）を、５６  ｎｔ  ｌａｃＵＶ５プロモーター配列（下線）（Ｄｉｃｋｓｏｎら、１９７５）を含むプライマー５’−ＧＡＡＴＴＣＣＴＣＡＴＴＡＧＧＣＡＣＣＣＣＡＧＧＣＴＴＴＡＣＡＣＴＴＴＡＴＧＣＴ  ＴＣＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＣＣＡＣＴＡＡＡＣＡＣＴＣＴＡＧＣＣＴＣ（配列番号２８）およびプライマー５’−ＣＴＧＧＡＴＣＣＡＧＴＴＧＴＧＡＡＧＣＣＡＴＧＴＡＣＡＣ（配列番号２９）を使用したＰＣＲによってＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２株から増幅した。ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩでの消化後、増幅産物をｌａｃＺのプロモーターレスコピーを含むｐＲＳ４１４プラスミド（Ｓｉｍｏｎｓら、１９８７）にクローン化して、ｌａｃＺの９番目のコドンとｍｏａＡの５番目のコドンとの間のインフレーム融合物を得た。ＮＥＢ−５α細胞を、得られたプラスミドで形質転換した。形質転換体をアンピシリン耐性について選択し、ｌａｃＵＶ５−Ｍｏｃｏモチーフ−ｌａｃＺ翻訳融合物の完全性をＤＮＡ配列決定によって確認した。全ての部位特異的変異を、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）および適切な変異誘発ＤＮＡプライマーを使用してＭｏｃｏリボスイッチに導入した。全ての変異を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０４６６】
ｖｉｉ．ＭｏａＡＢＣＤＥ  ｐＢＡＤ３３過剰発現プラスミドの構築
ｍｏａＡＢＣＤＥオペロンをｐＢＡＤ３３プラスミド（Ｇｕｚｍａｎら、１９９５）にクローン化して、細胞内のＭｏｃｏレベルのアラビノース誘導性調節を可能にした。２．７ｋｂ  ＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ  ｍｏａＡＢＣＤＥフラグメントを、プライマー５’−ＣＴＡＧＧＴＡＣＣＴＣＴＧＧＡＡＡＧＧＴＧＴＡＣＡＴＧＧＣＴＴＣＡＣＡＡＣ（配列番号３０）および５’−ＴＡＧＡＡＧＣＴＴＡＡＣＴＡＣＣＡＧＣＧＴＴＴＴＧＣＣＧＣＣＴＧＣＴＧ（配列番号３１）を使用したＰＣＲによってＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２から増幅した。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって精製し、ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ消化に供し、ｐＢＡＤ３３も同様に行った。次いで、消化したフラグメントをアラビノース誘導性プロモーター下流のｐＢＡＤ３３にライゲーションし、ＮＥＢ−５α細胞に形質転換した。形質転換体を、クロラムフェニコール耐性について選択し、融合物をＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０４６７】
ｖｉｉｉ．変異株の生成
ｍｏａＡ、ｍｏｇＡ、ｍｏｄＣ、ｍｏｅＡ、およびｍｏｂＡノックアウトＤＪ４８０株を、野生型または変異１４９  ｍｏａＡ−レポーター融合物を含むｌａｃＵＶ５−Ｍｏｃｏモチーフ−ｌａｃＺ融合物ｐＲＳ４１４プラスミドおよびｍｏａＡＢＣＤＥ  ｐＢＡＤ３３過剰発現プラスミドの両方で同時に形質転換した。形質転換体を、アンピシリン耐性およびクロラムフェニコール耐性の両方について選択した。
【０４６８】
ｉｘ．Ｅ．ｃｏｌｉ由来の１４９  ｍｏａＡ  ＲＮＡによる遺伝子調節の生体内分析
Ｅ．ｃｏｌｉの野生型および変異レポーター株中のｌａｃＺ由来の遺伝子発現を測定するために、細胞を、表示のように補足した３ｍＬのＬＢを含む１４ｍＬ培養バイアル中にて３７℃で一晩振とうしながら増殖させた。次いで、細胞を、９６ウェルプレート中のＬＢ１５０μＬ中においてＯＤ６００  ０．０５まで希釈し、０．５と０．７との間のＡ６００までに３７℃で振とうしながら増殖させ、次いで、遺伝子発現実験のために回収した。β−ガラクトシダーゼ活性を、他の場所に記載の９６ウェルマイクロプレートプロトコールを使用してアッセイした（Ｂｌｏｕｎｔら、２００７）。
【０４６９】
ｘ．ＭｏｃｏおよびＴｕｃｏ代謝のバイオインフォマティクス分析
ＭｏｃｏおよびＴｕｃｏ代謝の種々の生物への割り当てならびにＭｏｃｏ  ＲＮＡモチーフ型の３つの過程（モリブドプテリン生合成、Ｍｏｃｏ生合成または使用、およびＴｕｃｏ生合成または使用；表３）に関与する遺伝子への割り当てを配列相同性分析によって行った。Ｔｕｃｏを使用するが、実験的にそのように証明されなかった生物を同定するために、ＢＬＡＳＴを使用してｔｕｐＡおよびｔｕｐＢに相同な遺伝子を検索した。これらの遺伝子は、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｉｄａｍｉｎｏｐｈｉｌｕｍにおいてタングステン酸塩に特異的な輸送体をコードすることが示されている（Ｍａｋｄｅｓｓｉら、２００１）。Ｐｅｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｒｂｉｎｏｌｉｃｕｓおよびＤｅｓｕｌｆｏｔａｌｅａ  ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｉａにおけるＴｕｃｏ代謝をｗｔｐＡホモログの存在に基づいて割り当て、このホモログは、異なるが選択的なタングステン酸塩の輸送体であることが示されている（Ｂｅｖｅｒｓら、２００６）。隣接遺伝子のタンパク質産物の注釈付けした機能の試験または注釈付けが利用可能でない場合の配列相同性を使用した機能の割り当てによってＭｏｃｏ  ＲＮＡモチーフの上記列挙の３つの過程への割り当てを行った。
【０４７０】
表３  Ｐ３の存在または非存在とＭｏｃｏまたはＴｕｃｏ関連遺伝子の存在との間の相関。Ｍｏｃｏ関連遺伝子を保有する生物を、公知のＭｏｃｏ依存性タンパク質およびモリブデン酸塩輸送に関与するタンパク質に相同な遺伝子について各生物のゲノム検索によって同定した。Ｔｕｃｏ関連遺伝子を保有する生物を、Ｍｏｃｏについて記載され、且つ他の場所に公開されたように同定した（Ｂｅｖｅｒｓら、２００６；Ｉｙｅｒら、２００６）。モリブドプテリン（ｍｏｌｙ）の生合成に重要な遺伝子がＭｏｃｏまたはＴｕｃｏのいずれかの産生に関与し得るので、これらの遺伝子の存在を、個別の列に示した。アスタリスクが存在しないのは、生物が指定の化合物に関連する遺伝子を欠くことを意味するのではなく、むしろ、文献またはゲノムデータベース検索のいずれかでこれらの遺伝子の存在についての証拠を見出せなかったことを示す。遺伝子のゲノム検索は、ＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ｌｐｒｏｋｓ．ｃｇｉ）由来の注釈付けしたゲノムに依存した。
注釈：影を付けたボックスａ〜ｃは、ＲＮＡ型とＭｏｃｏまたはＴｕｃｏ遺伝子調節との間の相関が破られているように現れる例のみを特定する。しかし、ａは、Ｐ３欠如ＲＮＡがｍｏｄＡに関連し、そのタンパク質産物がモリブデン酸塩とタングステン酸塩とを識別できない輸送体である場合を指定する（Ｃｈａｎら、１９９５）。ｂについて、Ｐ３欠如ＲＮＡは、Ｔｕｃｏ関連遺伝子ＣＯＧ２４１４（タングステン依存性アルデヒドフェレドキシンレダクターゼをコードする）（Ｈａｒｂｏｒｎｅら、１９９２）およびｎｉｒＢ（硝酸レダクターゼをコードし、通常はＭｏｃｏを必要とする）（Ｃｌａｒｋｅら、２０００）を保有する２遺伝子オペロンに関連する。ｃでは、Ｐ３欠如ＲＮＡは、推定Ｍｏｃｏ使用亜硫酸オキシダーゼ酵素をコードする２つの遺伝子に関連する。したがって、ａおよびｂは相関を破らない一方で、他の可能性には、ｃにおける所見を説明するために呼び出される必要がある（テキストを参照のこと）。また、Ｓ．ｗｏｌｆｅｉでは、１つのＰ３含有ＲＮＡはｔｒｏＡに関連し、このｔｒｏＡは金属輸送複合体の成分をコードすると予想される。類似のアレンジメントがＤｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｆｎｉｅｎｓｅ  ＤＣＢ−２において存在する。しかし、ＴｒｏＡおよびニトロゲナーゼＭｏＦｅタンパク質（Ｍｏｃｏ含有タンパク質である）の構造的な構成は類似する（Ｃｈａｎら、１９９５）。したがって、Ｐ３含有ＲＮＡはＭｏＦｅニトロゲナーゼの遺伝子に関連するのは明らかである。
【０４７１】
【表３】
2010528617.tif 000004
（実施例６）
Ｆ．実施例６：ＳＡＭ−ＩＶリボスイッチのアプタマーコアはＳＡＭ−Ｉリボスイッチのリガンド結合部位を模倣する
「ＳＡＭ−ＩＶ」と呼ばれる新規のリボスイッチファミリーは、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭまたはＡｄｏＭｅｔ）の直接的感知によって遺伝子発現を調節すると報告されている第４の異なるｍＲＮＡエレメント組である。ファミリー特異的ヌクレオチド同一性を有する再配置された構造およびヌクレオチド位置にもかかわらず、ＳＡＭ−ＩＶリボスイッチは、前述のＳＡＭ−Ｉリボスイッチと共に保存されたヌクレオチド位置を共有する。配列分析および分子認識試験により、ＳＡＭ−ＩおよびＳＡＭ−ＩＶリボスイッチが類似のリガンド結合部位を共有するが、異なる骨格を有することが示唆される。これらの所見は、ＲＮＡが相当な構造多用途性を有することを示し、リボスイッチがこの潜在力を活用して遺伝子調節におけるＲＮＡ範囲を拡大することが明らかとなる。
【０４７２】
リボスイッチは、特定の代謝産物に特異的に結合し、代謝産物濃度の変化に応答して遺伝子発現を調節するｍＲＮＡエレメントである（ＭａｎｄａｌおよびＢｒｅａｋｅｒ  ２００４；ＷｉｎｋｌｅｒおよびＢｒｅａｋｅｒ  ２００５；Ｂａｔｅｙ  ２００６；Ｃｏｐｐｉｎｓら２００７）。Ｓ−アデノシルメチオニン（多数のメチラーゼ酵素の補因子）は、以下の３つの以前に公開されたリボスイッチクラスによって認識される：ＳＡＭ−Ｉ（Ｗｉｎｋｌｅｒら２００３；ＭｃＤａｎｉｅｌら２００３；Ｅｐｓｈｔｅｉｎら２００３）、ＳＡＭ−ＩＩ（Ｃｏｒｂｉｎｏら２００５）、およびＳＡＭ−ＩＩＩ（またはＳＭＫ）（Ｆｕｃｈｓら２００６）リボスイッチ。３つ全てのリボスイッチファミリーがＳＡＭを特異的に認識する一方で、これらは配列または構造が見かけ上類似していない。
【０４７３】
複数の異なるＳＡＭ結合リボスイッチの発見は、例えば複数の自己切断リボザイムの発見のように、ＲＮＡが多様な方法で同一の生化学的課題を解決するのに十分な構造の精巧さを有することを支持する。さらに、２つの大リボザイムクラス（群ＩイントロンおよびＲＮアーゼＰ  ＲＮＡ）の構造研究および配列分析は、これらのＲＮＡ中の異なる骨格が触媒コア中のヌクレオチドの同一の位置を支持することを示す（ＭｉｃｈｅｌおよびＷｅｓｔｈｏｆ  １９９０；Ｋｒａｓｉｌｎｉｋｏｖら２００４；Ｔｏｒｒｅｓ−Ｌａｒｉｏｓら２００６；ＶｉｃｅｎｓおよびＣｅｃｈ  ２００６）。
【０４７４】
バイオインフォマティクスを使用した細菌における新規のリボスイッチの検索の間に（Ｙａｏら２００７；Ｗｅｉｎｂｅｒｇら２００７）、新規のＳＡＭ結合リボスイッチ組に分類された保存された構造化ＲＮＡモチーフを同定した。これらの「ＳＡＭ−ＩＶ」リボスイッチは、Ａｃｔｉｍｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（結核の原因病原体））で主に見出される。ＳＡＭ−ＩＶリボスイッチは、ＳＡＭ−Ｉリボスイッチのリガンド結合コアと類似するが、構造およびヌクレオチド同一性において他の場所に多数の相違を有する。したがって、ＳＡＭ−ＩおよびＳＡＭ−ＩＶリボスイッチは、異なる骨格であるが、高度に類似のリガンド結合コアを有し得る。ＳＡＭ−ＩＶリボスイッチを使用した所見は、構造模倣が大リボザイムに制限されないことを示し、それにより、多様な構造化ＲＮＡ種の間で広範に存在すると示唆される。
【０４７５】
１．結果と考察
ｉ．ＳＡＭ−ＩＶモチーフの同定
ＳＡＭ−ＩＶモチーフを、ＣＭｆｉｎｄｅｒ比較ゲノミクスパイプライン（Ｗｅｉｎｂｅｒｇら２００７；Ｙａｏら２００７）を使用して見い出した。ほとんどのＳＡＭ−ＩＶ例は、硫黄代謝に関与する遺伝子の上流（おそらく、５’ＵＴＲ中）に存在し、ＳＡＭ−ＩＶがＳＡＭ結合リボスイッチに対応することを示す。ＳＡＭ−ＩＶ  ＲＮＡのほとんど全ての公知のオカレンスは、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ目に存在する。
【０４７６】
ｉｉ．ＳＡＭ−ＩＶモチーフコアは、ＳＡＭ−Ｉのコアに類似する
ＳＡＭ−ＩＶの高度に保存された領域と、ＳＡＭ−Ｉ、ＳＡＭ−ＩＩ、およびＳＡＭ−ＩＩＩリボスイッチの高度に保存された領域とを比較した。ＳＡＭ−ＩＶは、ＳＡＭ−Ｉ結合コアの重要な配列および構造の特徴を共有するが、ヌクレオチド同一性の顕著な相違が他の場所に見出され、構造全体で非常に偏りがある（図２８）。リガンド原子の５Å以内に原子を有するＳＡＭ−Ｉの三次元構造（ＭｏｎｔａｎｇｅおよびＢａｔｅｙ  ２００６）中の全ヌクレオチドとしてのコア（図２８、太字）を同定し、保存された構造の特徴の見かけ上の類似性に基づいて類似のＳＡＭ−ＩＶの位置にＳＡＭ−Ｉをマッピングした。周囲の保存されたヌクレオチド同一性または他の特徴が共通の同一性が偶然起こる可能性が低いことを示す場合、ヌクレオチド同一性を、両モチーフに共通に分類した（図２８、影付き）。
【０４７７】
両モチーフは多ステムジャンクションを有し、Ｐ３ステム中のヌクレオチド同一性が広範に類似する（図２８）。Ｐ１とＰ２との間のジャンクションも類似性を共有し、両モチーフは、Ｐ２の末端ループとＰ３の３’側のジャンクションとの間にシュードノットを形成するようである。このシュードノットを適応させるために、ＳＡＭ−Ｉ中のＰ２は標準的なｋｉｎｋターンを有する（Ｌｅｓｃｏｕｔｅら２００５；ＭｏｎｔａｎｇｅおよびＢａｔｅｙ  ２００６）。興味深いことに、ＳＡＭ−ＩＶ中のＰ２中の内部ループはｋｉｎｋターンと同様に機能することができ、これらのＲＮＡがシュードノット構造を採用することが可能である。
【０４７８】
しかし、２つのモチーフは、多数の場所で異なる構造エレメントおよび異なるヌクレオチド保存パターンを有する（図２８、淡色の影）。ＳＡＭ−Ｉコア中のＰ４ヘアピンはＳＡＭ−ＩＶ中に存在しないが、異なるＰ４ヘアピンがＳＡＭ−ＩＶ中のＰ１の外側に見出される。これらのＰ４ヘアピンは、異なる保存ヌクレオチド同一性を有する。コアの外側に付加したＰ４に加えて、ＳＡＭ−ＩＶはさらなるシュードノットを形成することができ、これはＳＡＭ−Ｉでは欠く。また、ＳＡＭ−ＩＶは、そのループおよびステムの長さがＳＡＭ−Ｉのそれと異なり、配列がほとんど類似しないようであるという点で、ＳＡＭ−Ｉとは非常に異なるＰ２を有す。実際、Ｐ２中のｋｉｎｋターンはＳＡＭ−Ｉリボスイッチ中で高度に保存されているが（ＢａｒｒｉｃｋおよびＢｒｅａｋｅｒ  ２００７）、ＳＡＭ−ＩＶリボスイッチ配列はこの構造モチーフを持たない。ＳＡＭ−ＩとＳＡＭ−ＩＶとの間の保存ヌクレオチド同一性の他の相違は、Ｐ３の先端、Ｐ１のベース、およびＰ３の３’側のジャンクションに存在する。
【０４７９】
これらの相違のために、ＳＡＭ−ＩＶリボスイッチは、少なくとも３つの以前の研究におけるＳＡＭ−Ｉに基づいた相同性検索による検出から逃れていた。第１の研究では、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａのゲノムを、ＰＡＴプログラムを用いて調節ＲＮＡ（ＳＡＭ−Ｉアプタマーが含まれる）について検索した（Ｓｅｌｉｖｅｒｓｔｏｖら２００５）。第２に、グラム陽性細菌を、ＲＮＡ−ＰＡＴＴＥＲＮプログラムを使用して、ＳＡＭ−Ｉアプタマーおよび硫黄代謝における他の遺伝子調節エレメントについて検索した（Ｒｏｄｉｏｎｏｖら２００４）。第３に、全細菌における公知のリボスイッチのホモログの検索にＳｅｑｕｅｎｃｅＳｎｉｆｆｅｒおよびＲＡＶＥＮＮＡ（ＷｅｉｎｂｅｒｇおよびＲｕｚｚｏ  ２００６）（保存された配列および二次構造を確率的にモデリングするために統計プロフィール技術を活用する）を使用した。多数のａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓが異なるゲノム座標でＳＡＭ−ＩおよびＳＡＭ−ＩＶリボスイッチの両方を保有しているのにもかかわらず、ＳＡＭ−ＩＶリボスイッチを検出するための全ての試みは失敗した。
【０４８０】
ＳＡＭ−ＩおよびＳＡＭ−ＩＶの類似性は、主にそのコアに制限されるので、ＳＡＭ−ＩおよびＳＡＭ−ＩＶリボスイッチは、類似の結合部位および分子認識特性を共有することができる。これは、ＳＡＭ−Ｉ原子分解モデル（ＭｏｎｔａｎｇｅおよびＢａｔｅｙ  ２００６）によって支持され、このモデルにより、６つのヌクレオチドがリガンドと直接相互作用すると提案された（図２８）。これら６つの位置でのヌクレオチド同一性は、１つを除いて全てのＳＡＭ−Ｉ代表で厳格に保存されている。これらのリガンド接触位置に対応すると提案されたＳＡＭ−ＩＶ中の６つの位置のうちの５つが、ＳＡＭ−Ｉリボスイッチと同一のヌクレオチド同一性で全ての公知のＳＡＭ−ＩＶ代表中で保存されている。第６のＵ８８は、典型的には、ＳＡＭ−ＩＶ中でシトシンであるが、４つ全ての核酸塩基がこの位置で認められる。
【０４８１】
ｉｉｉ．ＳＡＭ−ＩＶ  ＲＮＡの分子認識の特徴
ＳＡＭ−ＩＶ  ＲＮＡの分子認識を評価するために、インライン探索アッセイ（ＳｏｕｋｕｐおよびＢｒｅａｋｅｒ  １９９９）を、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒで見出されるＳＡＭ−ＩＶを含む１３２−ヌクレオチドＲＮＡ（１３２  Ｓｃ  ＲＮＡと呼ばれる）に適用した。これらのアッセイでは、１３２  Ｓｃ  ＲＮＡは、約１５０ｎＭの見かけ上の解離定数（ＫＤ）でＳＡＭに結合するのに対して、Ｓ−アデノシルホモシステイン（ＳＡＨ）については２０μＭであった。アデノシンおよびメチオニンのＫＤ値は１ｍＭより低かった（図２９）。これらの値は、１３２  Ｓｃ  ＲＮＡアプタマーが、他のＳＡＭリボスイッチアプタマークラスと類似の親和性および特異性でＳＡＭに結合することを証明する。
【０４８２】
ＳＡＭ−ＩＶリボスイッチは、ＳＡＭ−Ｉ中のＵ８８に対応するヌクレオチドを保存しない（図２８）。ＳＡＭ−Ｉリボスイッチ中のこの位置のＯ２カルボニル酸素がＳＡＭリガンド中の硫黄の正電荷を感知すると予想されるので（ＭｏｎｔａｎｇｅおよびＢａｔｅｙ  ２００６）、硫黄の位置が異なる以下の化合物に対するＳＡＭ−ＩおよびＳＡＭ−ＩＶリボスイッチの親和性を比較した：ＳＡＭ、ＳＡＨ、ＳＡＨスルホン（ＢｏｒｃｈａｒｄｔおよびＷｕ  １９７４）、ならびに２つのアザ誘導体であるＡｚａＡｄｏＭｅｔおよびＭｅＡｚａＡｄｏＭｅｔ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら１９９９）。１３２  Ｓｃ  ＲＮＡは、Ｕ８８に類似の位置に核酸塩基としてウラシルの代わりにシトシンを有する。シトシンがＯ２カルボニルを保存するにもかかわらず、ワトソン−クリックＧ−Ｃ対によって形成されたさらなる水素結合は、リガンドの正電荷との相互作用を破壊することができ、それにより、ＳＡＭ−Ｉリボスイッチ中のＵ８８の完全な保存を説明することができる。
【０４８３】
１３２  Ｓｃ  ＲＮＡの分子認識を、１２４ｙｉｔＪと呼ばれる以前に研究されたＳＡＭ−Ｉリボスイッチの分子認識と比較した（Ｗｉｎｋｌｅｒら２００３）。リボスイッチによるリガンド中の改変に対する識別を測定するために、改変リガンドのＫＤの比をＳＡＭのＫＤで割った。ＳＡＭ−ＩおよびＳＡＭ−ＩＶリボスイッチは、ＳＡＭおよびＳＡＭ誘導体と結合して類似の測定されたＫＤ比が得られる（表４）。これらのデータは、ＳＡＭ−ＩＶ中のＵ８８があまり保存されていないが、ＳＡＭ−ＩＶ分子認識がＳＡＭ−Ｉと類似していることを示す。
【０４８４】
ｉｖ．ＳＡＭ−ＩＶは遺伝子調節エレメントである
ＳＡＭ−ＩＶが生体内で遺伝子発現を調節するかどうかを決定するために、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ遺伝子座ＳＣＯ２１４６の上流のＳＡＭ−ＩＶ含有遺伝子間領域を、ｘｙｌＥレポーター遺伝子との翻訳融合物としてクローン化した。プロモーターをＳＡＭ−ＩＶ遺伝子間領域中に容易に同定することができないので、この領域をグリセロール−誘導性プロモーターの調節下においた（Ｋｉｅｓｅｒら２０００）。
【０４８５】
最も知られているＳＡＭリボスイッチは、ＳＡＭへの結合の際に遺伝子発現を低下させ、それにより、ＳＡＭレベルが高い場合にそのタンパク質産物が必要とされない遺伝子の発現を減少させる。ＳＡＭ−ＩＶが遺伝子調節エレメントであるかどうかを試験するために、ＳＡＭ−ＩＶリボスイッチの機能を破壊するか修復すると予想される変異を導入した。第１の変異（Ｍ１）は、これらのヌクレオチドがＳＡＭ−Ｉアプタマー中のヌクレオチドに類似すると仮定することによってＳＡＭに直接接触すると予想される位置を改変した。第２の変異（Ｍ２）は、保存された二次構造中の塩基対合を破壊する。第３の変異（Ｍ３）は、代償的変異によってＭ２で喪失された塩基対合を回復し、野生型活性を回復することができる。
【０４８６】
複合培地での増殖後に４つの各リボスイッチ−レポーター融合物を保有するＳ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ細胞中のＸｙｌＥ活性を測定した。ここで、ＳＡＭの細胞濃度は豊富であると予想される。予想どおり、Ｍ１およびＭ２リボスイッチを有する株は野生型またはＭ３リボスイッチを有する株よりも高いレポーター遺伝子発現を示した（図３０）。これらの結果は、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ由来のＳＡＭ−ＩＶ  ＲＮＡが遺伝子調節エレメントであることを示しており、分子認識実験はＳＡＭに応答することを示している。細胞ＳＡＭ濃度を枯渇させた条件下でレポーター遺伝子発現を測定したが、これらの結果は、構築物を使用した非常に低レベルのレポーター遺伝子発現のために決定的ではなかった。
【０４８７】
ＳＡＭレベルがこれらの種において抗生物質産生および胞子形成に影響を及ぼすので、硫黄代謝の遺伝子調節はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓで特に興味深い（Ｋｉｍら２００３；Ｏｋａｍｏｔｏら２００３）。ＳＡＭ−ＩＶによって明らかに調節されるいくつかの遺伝子（例えば、ＳＣＯ２１４６）は、セレノシステインリアーゼと予想される。これらは、例えば、硫黄代謝で役割を果たすことができる。
【０４８８】
ｖ．ＳＡＭ−ＩＶの進化史
多岐にわたる進化を説明することができるモデルを本明細書中に示す。本モデルでは、ＳＡＭ−Ｉ様祖先は、そのＰ４ステムを喪失し、Ｐ４の喪失に起因するその後の任意の負の影響をＰ１ステムの３’側の異なるＰ４ステムの獲得によって代償し、最終的にＳＡＭ−ＩＶ様ＲＮＡを得た。３つの事実がこのモデルと一致する。第１に、ＳＡＭ−ＩＶはＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓにほとんど制限される一方で、ＳＡＭ−Ｉはこの分類群および多数の他の分類群で見出され、これらが先祖を共有する場合、おそらくＳＡＭ−Ｉに類似すると示唆される。第２に、Ｐ４は、骨格にのみ関与することが見出され（ＭｏｎｔａｎｇｅおよびＢａｔｅｙ  ２００６）、それにより、置換がより容易であり得る。第３に、少数のＳＡＭ−Ｉリボスイッチは完全にＰ４ステムおよびループを欠き、Ｐ４喪失を許容することができる。
【０４８９】
ｖｉ．ＳＡＭ−ＩＶリボスイッチの分類および重要性
タンパク質を、種々の基準によってファミリーおよびスーパーファミリーに分類する（ＯｒｅｎｇｏおよびＴｈｏｒｎｔｏｎ  ２００５）。独自の基準は、配列相同性のみに基づいた（Ｄａｙｈｏｆｆら１９７６）。他のグループはこの前例を継続するが（例えば、Ｂａｒｋｅｒら１９９６）、あるところでは構造的または機能的な類似性も考慮している（Ｍｕｒｚｉｎら１９９５）。一般に、ファミリーに分類されたタンパク質は明確な相同性を有する一方で、スーパーファミリーに分類されたタンパク質は、より遠縁なようであり、相同性は「可能性あり」としか見なされない（Ｍｕｒｚｉｎら１９９５；Ｄａｙｈｏｆｆら１９７６）。ＳＡＭ−ＩとＳＡＭ−ＩＶリボスイッチとの間の保存および再配置構造の不適合なパターンを考慮して、およびその類似性が最新の配列分析方法を回避するため、本発明者らは、それらが異なるファミリーを含むと提案する。しかし、それらのコアの類似性は、それらを１つのスーパーファミリーに分類するのに十分示唆的である。ＳＡＭ−ＩＶリボスイッチに対する三次元構造研究がそれらの分類を精巧にするのに役立ち得る。リボスイッチは、「クラス」および「型」に形成される。クラスは、構造および機能の性質を共有する一連のリボスイッチと定義する一方で、型を使用して、同一クラスに属するが異なる下部構造を保有するＲＮＡを分類する。この専門用語を相同タンパク質の分類に使用した専門用語と関連づけるために、「クラス」は「ファミリー」に対応し、「型」は「サブファミリー」に対応する。
【０４９０】
ＳＡＭ−ＩとＳＡＭ−ＩＶリボスイッチとの間の関係と性質が異なる可能性があるが、さらなるリボスイッチファミリーは構造多様性を示す。例えば、ｐｒｅＱ１−Ｉリボスイッチを、ループ配列に基づいてサブファミリーに分配することができる（Ｒｏｔｈら２００７）。また、以前に報告されたアデノシルコバラミン結合リボスイッチ（Ｎａｈｖｉら２００４）は通常保存されているドメインを欠く一方で、その３’隣接配列はリガンド認識に不可欠である。このバリアントは、典型的なアデノシルコバラミンリボスイッチよりもプリニルコバラミンに高い親和性を示したので、バリアントの結合コアを変化させることができる。
【０４９１】
結果は、リボスイッチＲＮＡが多様な構造を使用して重要なヌクレオチドを同一の結合部位に配置することができることを証明する。Ｉ群イントロンおよびＲＮアーゼ  Ｐ  ＲＮＡについての類似の所見を考慮して、この現象が広範なＲＮＡによって示されるとここに結論づける。ＲＮＡの構造レパートリーのこの頑強な天然の用途は、ＲＮＡが分子感知および遺伝子調節のための強力且つ多用途のポリマーであるという結論を支持する。
【０４９２】
２．材料と方法
ｉ．バイオインフォマティクス
ＳＡＭ−ＩＶモチーフをＣＭｆｉｎｄｅｒ比較ゲノミクスパイプラインを使用して同定し、そのアラインメントを以前に確立されたストラテジーを使用して推測したが（Ｗｅｉｎｂｅｒｇら２００７；Ｙａｏら２００７）、ＲｅｆＳｅｑのバージョン２１（Ｐｒｕｉｔｔら２００５）を使用した。ＳＡＭ−Ｉアラインメントデータは他の場所に公開されていた（ＢａｒｒｉｃｋおよびＢｒｅａｋｅｒ  ２００７）。図２８に示した保存統計学（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ）を、以前に報告されているように計算した（Ｗｅｉｎｂｅｒｇら２００７）。
【０４９３】
ｉｉ．微生物遺伝学およびプラスミド
遺伝子発現のリボスイッチ調節を試験するために、本発明者らは、カテコール２，３−ジオキシゲナーゼをコードするｘｙｌＥレポーター遺伝子（Ｋｉｅｓｅｒら２０００）の上流のＳ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ中のＳＡＭ−ＩＶ含有遺伝子間領域をクローン化した。この酵素はカテコールを２−ヒドロキシムコナートセミアルデヒドに変換し、３７５ｎｍでのその吸光度によって比色アッセイが可能である。本発明者らはｐＭＴ３２２６（Ｋｉｅｓｅｒら２０００）（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ中で複製され、アプラマイシン耐性遺伝子およびｘｙｌＥレポーター遺伝子をグリセロール−誘導性プロモーターの下流に含む組み込みＳｔｒｅｐｔｏｙｍｃｅｓプラスミド）を使用した。ｘｙｌＥ遺伝子との翻訳融合物を構築するために、第２のＢａｍＨＩ部位を、プライマー５’−  ＧＡＡＧＡＧＧＴＧＡＣＧＴＣＡＴＧＧＡＴＣＣＧＡＡＣＡＡＡＧＧＴＧＴＡ  ＡＴＧＣ（配列番号３２）およびその逆方向相補物を使用してＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によってｐＭＴ３２２６に付加した。ＳＡＭ−ＩＶを含むＳ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ遺伝子間領域を、プライマー５’−ＣＴＡＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＧＣＧＴＡＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＴＧＴＧＴ（配列番号３３）および５’−  ＧＴＡＧＧＡＴＣＣＡＣＡＧＣＧＧＴＧＧＧＴＡＣＧＧＡＣＡＴＧＧＣＧ（ＢａｍＨＩ部位に下線、配列番号３４）を使用したＰＣＲによってゲノムＤＮＡから増幅した。高Ｇ＋Ｃ  ＤＮＡ産物の増幅を補助するために、ＰＣＲ反応物は、１．３Ｍベタイン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および５％ＤＭＳＯ（Ｆｒａｃｋｍａｎら１９９８）を含んでいた。「ｐＥＺ３５」をアセンブリするために、ｐＭＴ３２２６およびＰＣＲ産物をＢａｍＨＩで切断し、ｐＭＴ３２２６由来の小フラグメントをアガロースゲル精製によって取り出し、ＤＮＡ分子をライゲーションし、正確な配列および配向を配列決定によって検証した。変異リボスイッチ（Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３）を含むベクターを、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅによって作製した。抱合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）によって、プラスミドをＳ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ｍ１４５に導入した（Ｋｉｅｓｅｒら２０００）。接合完了体（ｅｘｃｏｎｊｕｇａｎｔ）の胞子ストックを、ＭＳ寒天上にて２８℃で増殖させた細胞から回収し（Ｋｉｅｓｅｒら２０００）、−２０℃の１５％グリセロール中で保存した。硫酸アプラマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、Ｅ．ｃｏｌｉについては１００μｇ／ｍＬ使用し、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒについては５０μｇ／ｍＬ使用した。
【０４９４】
遺伝学実験を開始するために、胞子ストックを氷上で解凍し、１ｍＬのｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００緩衝液（Ｈｏｄｇｓｏｎ  １９８２）で洗浄し、１ｍＬ  ｄＨ２Ｏに再懸濁した。この混合物を、２５ｍＬ培養物中に、Ｈ２Ｏと比較して測定してＡ４５０約０．０３となるよう接種した（Ｈｏｄｇｓｏｎ  １９８２）。培地は、夾雑リスクを低下させるためにデキストロース（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を含まない２４ｇ／Ｌダイズトリプシンブロス（ＴＳＢ）、４％グリセロール、２０μｇ／ｍＬ硫酸アプラマイシン（ベクターを欠く細胞以外）、および１２．５μｇ／ｍＬナリジクス酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）であった。培養物を、２５０ｍＬフラスコ中にて振とうしながら２８℃で５０．５時間増殖させた。次いで、無細胞抽出物中のＸｙｌＥ活性を測定した（Ｋｉｅｓｅｒら２０００）。粗抽出物中に残存する細胞デブリスがＸｙｌＥ酵素曲線にノイズを加えるので、２回の遠心分離後に上清を抽出し、次いで、孔径０．２μｍの膜（Ｗｈａｔｍａｎ）によって濾過し、その後に２０分間遠心分離した。反応物は、１ｍＬ無カテコールアッセイ緩衝液、１００μＬ無細胞抽出物、１０μＬ  ２０ｍＭカテコールを含んでおり、Ｖａｒｉａｎ  ５０  Ｂｉｏ分光光度計にて３７５ｎｍの吸光度を６秒毎に２０分間測定した。濾過にもかかわらず、時折デブリスが残存し、このデブリスが全ての可視波長（３７５ｎｍが含まれる）で吸収があった。４８０ｎｍ（ＸｙｌＥ反応生成物によって著しく吸収されるわけではない波長）での変化が２０分間にわたって０．０００４を超え、且つ３７５ｎｍに匹敵する規模になった場合、本発明者らは結果を破棄し、新たな反応を準備した。全２０分間にわたるＡ３７５の変化を使用してＸｙｌＥ活性を評価した。これは、以前に報告されているように（Ｋｉｅｓｅｒら２０００）、線形範囲のみの使用よりも再現性があり得る。
【０４９５】
ｉｉｉ．インライン探索アッセイ
ｐＥＺ３５プラスミド（上記）中のアプタマーに対応するＤＮＡを、プライマー５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＴＴＴＴＴＣＧＡＣＡＧＧＴＣＡＴＧＡＧＴＧＡＣＡＧＴＣ（Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列に下線、配列番号３５）および５’−ＡＧＧＧＧＴＣＣＧＣＧＣＴＴＧＣＣＧＴＧＧＡＣＣＴＴＧＣＴＧ（配列番号３６）を使用したＰＣＲによって増幅した。以前に記載されたプロトコール（Ｒｏｔｈら２００７）を使用して、５’３２Ｐ標識ＲＮＡ分子を、試験管内転写によってＰＣＲ産物から調製し、脱リン酸化し、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰで放射性同位元素標識した。以前に記載のように（Ｒｏｔｈら２００７）、インライン探索反応を準備し、５’３２Ｐ標識フラグメントを変性ＰＡＧＥによって分離し、画像化した。
【０４９６】
表４．ＳＡＭ−ＩおよびＳＡＭ−ＩＶによる分子認識。ＳＡＭ誘導体についてのＫＤ値を列挙し、所与の化合物のＫＤのＳＡＭのＫＤに対する比も同様に列挙する。ＳＡＭ−ＩのＫＤ値は以前に計算されている（Ｌｉｍら２００６）。化合物の構造は、以下のナンバリングスキームを使用して以前に示されていた（Ｌｉｍら２００６）：ＳＡＭ（化合物１）、ＳＡＨ（２）、ＳＡＨ  スルホン（４）、ＡｚａＡｄｏＭｅｔ（５）、ＭｅＡｚａＡｄｏＭｅｔ（６）。
【０４９７】
【表４】
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開示の方法および組成物が記載の特定の方法、プロトコール、および試薬に制限されず、これらは変化し得ると理解される。本明細書中で使用した専門用語が特定の実施形態の記載のみを目的とし、本発明の範囲を制限することを意図せず、本発明は添付の特許請求の範囲のみに制限されるとも理解すべきである。
【０４９８】
本明細書中および添付の特許請求の範囲で使用する場合、他で明確に示さない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には複数形が含まれることに留意しなければならない。したがって、例えば、「ａ  ｒｉｂｏｓｗｉｔｃｈ」は複数のかかるリボスイッチが含まれ、「ｔｈｅ  ｒｉｂｏｓｗｉｔｃｈ」は１つまたは複数のリボスイッチおよび当業者に公知のその等価物などをいう。
【０４９９】
「任意選択的な」または「任意選択的に」は、その後に記載する事象、環境、または材料が出現または存在してもしなくてもよいことを意味し、ならびに記載には、事象、環境、または材料が出現または存在する例およびそれが出現しないかまたは存在しない例が含まれることを意味する。
【０５００】
範囲を、本明細書中で、「約」１つの特定の値から、および／または「約」別の特定の値までと示すことができる。かかる範囲を示す場合、他で具体的に示さない限り、一方の特定の値からおよび／または他方の特定の値までの範囲も具体的に意図され、開示されると見なされる。同様に、値を先行詞「約」の使用によって近似値で示す場合、特定の値が別の具体的に意図される実施形態を形成し、他で具体的に示されない限り、開示されたと見なすべきであると理解される。他で具体的に示されない限り、各範囲の終点（ｅｎｄｐｏｉｎｔ）が他の終点に関して有意であり、且つ他の終点に依存しないとさらに理解される。最終的に、例示的に開示された範囲内の全ての各値および値の部分的範囲も具体的に意図され、他で具体的に示さない限り、開示されると見なすべきであると理解すべきである。特定の場合にこれらの実施形態のいくつかまたは全てが例示的に開示されるかどうかと無関係に、上記を適用する。
【０５０１】
他で定義しない限り、本明細書中で使用した全ての技術用語および科学用語は、開示の方法および組成物が属する分野の当業者に一般的に理解される意味を有する。本明細書中に記載のものに類似するか等価な任意の方法および材料を本発明の方法および組成物の実施または試験で使用することができるにもかかわらず、特に有用な方法、デバイス、および材料は記載の通りである。本明細書中で引用した刊行物および刊行物が引用した材料は、特に本明細書中で参考として援用される。本発明は、先行発明によるかかる開示に先行する権利がないと承認していると解釈されない。いかなるリファレンスも先行技術を構成していると承認していない。リファレンスの考察はその著者の主張を記載し、出願人が引用した書類の正確性および適切性に挑む権利を留保する。多数の刊行物が本明細書で参照されているにもかかわらず、かかるリファレンスは任意のこれらの書類が当該分野の一般的知識の一部を形成することを承認しないことが明確に理解される。
【０５０２】
本明細書の記載および特許請求の範囲を通して、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」およびこの用語の変形形態（「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」など）は、「含むが、これらに限定されない」を意味し、例えば、他の添加物、成分、整数、または工程を排除することを意図しない。
【０５０３】
当業者は、日常的な実験しか使用せずに、本明細書中に記載の方法および組成物の特定の実施形態に対する多数の等価物を認識するか、確認することができる。かかる等価物は、以下の特許請求の範囲に含まれることが意図される。
【０５０４】
参考文献
【０５０５】
【数１】
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【０５０６】
【数２】
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【０５０７】
【数３】
2010528617.tif 000008
【０５０８】
【数４】
2010528617.tif 000009
【０５０９】
【数５】
2010528617.tif 000010
【０５１０】
【数６】
2010528617.tif 000011
【０５１１】
【数７】
2010528617.tif 000012
【０５１２】
【数８】
2010528617.tif 000013
【０５１３】
【数９】
2010528617.tif 000014
【０５１４】
【数１０】
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【０５１５】
【数１１】
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【０５１６】
【数１２】
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【０５１７】
【数１３】
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【０５１８】
【数１４】
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【０５１９】
【数１５】
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【０５２０】
【数１６】
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【０５２１】
【数１７】
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【０５２２】
【数１８】
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【０５２３】
【数１９】
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【０５２４】
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【０５２５】
【数２１】
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【０５２６】
【数２２】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２Ａ１】
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【図１２Ａ２】
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【図１２Ａ３】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１８】
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【図１９Ａ１】
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【図１９Ａ２】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ１】
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【図２３Ｂ２】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３０Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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