(57)【要約】本発明は、式（Ｉ）の新規な化合物、及び癌の治療のための薬剤としてのその使用に関し、Ｘ，Ｙ，Ｚは、互いに独立してＣ又はＮを示し、ｎは、１，２，３を表し、ｍは、０又は１を表し、ｐは、０又は１〜６の整数を表し、Ｒ1、Ｒ2は、互いに独立して水素、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、Ｃ1〜Ｃ3アルキル基、及びＣ1〜Ｃ3アルコキシ基を示し、Ｒ3は、互いに独立して、ｐが０でない場合は水素、ハロゲン、Ｃ1〜Ｃ5直鎖又は分岐アルキル基、カルボキシ基、カルボメトキシ基、カルボエトキシ基、ベンジル基、アシル基、ヒドロキシ基、Ｃ1〜Ｃ4直鎖又は分岐アルコキシル基、トリフルオロメチル基、シアノ基、モルホリノ基、１，３−ジオキソリル基、Ｎ−アセチルアミジル基又はアミドイル基、飽和５〜８員環、Ｃ1〜Ｃ3アルキル基、ヒドロキシ基又はベンジル基で随意に置換された複素環、Ｃ1〜Ｃ6アルキルスルホニル基、１置換又は２置換のＣ1〜Ｃ5アルキル基、分岐又は環状アミンを示し、ｍが０であれば、ＣはＣＦ3又は分岐もしくは非分岐のＣ1〜Ｃ4アルキル基を示し、ｍ＝１であれば、Ｃは、−ＣＨ2−Ｏ−、−ＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−、−ＣＨ2（ＣＨ2）ＣＨ2−を示すか、又は、Ｎ−ＣもしくはＣ−Ｃ原子間の化学結合を意味し、ＣＯＮＲ6基は、その炭素原子もしくは窒素原子のいずれかを介してＣに結合し得るものであり、ＣＹＣは、Ｒ3で置換された、又は置換されていない、フェニル、ピリジニル、ナフチル、キノリニル、イソキノリニル、イソオキサゾリニル、チオフェニル、１，３，４−チアジアザゾリジニル、フラニル、テトラハイドロキノリニル、テトラハイドロイソキノリニル、モルホリニル、フラニル、シクロヘキセニル、及びクロメン−２−オン−イルを表す。【選択図】  なし
2010512357.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉの化合物。
2010512357.tif 000027
（Ｘ，Ｙ，Ｚは、互いに独立してＣ又はＮを示し、
ｎは、１，２，３を表し、ｍは、０又は１を表し、ｐは、０又は１〜６の整数を表し、
Ｒ1、Ｒ2は、互いに独立して水素、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、Ｃ1〜Ｃ3アルキル基、及びＣ1〜Ｃ3アルコキシ基を示し、
Ｒ3は、互いに独立して、ｐが０でない場合は水素、ハロゲン、Ｃ1〜Ｃ5直鎖又は分岐アルキル基、カルボキシ基、カルボメトキシ基、カルボエトキシ基、ベンジル基、アシル基、ヒドロキシ基、Ｃ1〜Ｃ4直鎖又は分岐アルコキシル基、トリフルオロメチル基、シアノ基、モルホリノ基、１，３−ジオキソリル基、Ｎ−アセチルアミジル基又はアミドイル基、飽和５〜８員環、Ｃ1〜Ｃ3アルキル基、ヒドロキシ基又はベンジル基で随意に置換された複素環、Ｃ1〜Ｃ6アルキルスルホニル基、１置換又は２置換のＣ1〜Ｃ5アルキル基、分岐又は環状アミンを示し、
Ｒ6は、以下の条件で、Ｈ、又は、脂環系もしくは複素脂環系の一部であり、
（ｍが０であれば、ＣはＣＦ3又は分岐もしくは非分岐のＣ1〜Ｃ4アルキル基を示し、ｍ＝１であれば、Ｃは、−ＣＨ2−Ｏ−、−ＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−、−ＣＨ2（ＣＨ2）ＣＨ2−を示すか、又は、Ｎ−ＣもしくはＣ−Ｃ原子間の化学結合を意味する）
ＣＯＮＲ6基は、その炭素原子もしくは窒素原子のいずれかを介してＣに結合し得るものであり、
ＣＹＣは、Ｒ3で置換された、又は置換されていない、フェニル、ピリジニル、ナフチル、キノリニル、イソキノリニル、イソオキサゾリニル、チオフェニル、１，３，４−チアジアザゾリジニル、フラニル、テトラハイドロキノリニル、テトラハイドロイソキノリニル、モルホリニル、フラニル、シクロヘキセニル、及びクロメン−２−オン−イルを表す。）
【請求項２】
ｎが１である請求項１記載の化合物。
【請求項３】
ｎが２である請求項１記載の化合物。
【請求項４】
ｎが３である請求項１記載の化合物。
【請求項５】
Ｘ、Ｙ、及びＺがＣである請求項１〜４のいずれかに記載の化合物。
【請求項６】
Ｘ及びＹがＣであり、ＺがＮである請求項１〜４のいずれかに記載の化合物。
【請求項７】
ＸがＣであり、Ｙ及びＺがＮである請求項１〜４のいずれかに記載の化合物。
【請求項８】
ｍが０である請求項１〜７のいずれかに記載の化合物。
【請求項９】
Ｃが、ＣＦ3又は分岐若しくは非分岐のＣ1〜Ｃ4アルキル基である請求項８記載の化合物。
【請求項１０】
Ｃがtert-ブチルである請求項９記載の化合物。
【請求項１１】
ｍが１である請求項１〜７のいずれかに記載の化合物。
【請求項１２】
Ｃが、−ＣＨ2−Ｏ−、−ＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−、−ＣＨ2（ＣＨ2）ＣＨ2−を示すか、又は、Ｎ−ＣもしくはＣ−Ｃ原子間の化学結合を意味する請求項１１記載の化合物。
【請求項１３】
ＣＯＮＲ6基が、その炭素原子によってＣに結合している請求項１〜１２のいずれかに記載の化合物。
【請求項１４】
ＣＯＮＲ6基が、その窒素原子によってＣに結合している請求項１〜１２のいずれかに記載の化合物。
【請求項１５】
式IIで示される請求項１記載の化合物。
2010512357.tif 000028
【請求項１６】
式IIIで示される請求項１記載の化合物。
2010512357.tif 000029
【請求項１７】
式IVで示される請求項１記載の化合物。
2010512357.tif 000030
【請求項１８】
式Ｖで示される請求項１記載の化合物。
2010512357.tif 000031
【請求項１９】
式VIで示される請求項１記載の化合物。
2010512357.tif 000032
【請求項２０】
式VIIで示される請求項１記載の化合物。
2010512357.tif 000033
【請求項２１】
式VIIIで示される請求項１記載の化合物。
2010512357.tif 000034
【請求項２２】
式IXで示される請求項１記載の化合物。
2010512357.tif 000035
【請求項２３】
式Ｘで示される請求項１記載の化合物。
2010512357.tif 000036
【請求項２４】
式XIで示される請求項１記載の化合物。
2010512357.tif 000037
【請求項２５】
請求項１〜２４のいずれかに記載の化合物の薬剤としての使用。
【請求項２６】
Ｗｎｔ経路依存性疾患の治療用医薬組成物の製造のための請求項１〜２４のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項２７】
癌治療用医薬組成物の製造のための請求項１〜２４のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項２８】
請求項１〜２４のいずれかに記載の化合物又は製薬学的に許容されるその塩を含む医薬組成物。
【請求項２９】
少なくとも１つの製薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤をさらに含む請求項２８に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、β−カテニンとＢＣＬ９及び／又はＢＣＬ９Ｌ蛋白質との間の相互作用を阻害する芳香族１，４−ジ−カルボキシルアミド、並びに、医薬組成物の調製のため及び特定疾患の治療のためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
概して、本発明は、Ｗｎｔ伝達経路の阻害物質に関する。そのような阻害物質は、幹細胞研究、又は、癌、骨および軟骨疾患のような異常なＷｎｔ活性化によって特徴付けられる疾患の治療のために用いられ得る。Ｗｎｔ経路の病的な活性化は、結腸直腸癌、肝細胞癌、乳癌、メラノーマ、中皮腫、リンパ腫、及び白血病において広く報告されてきた。そのうえ、Ｗｎｔ経路がＴ細胞の発達において必須の役割も担うことから（Staal，Meeldijk ら、2001；Staal and Clevers 2003）、ここで開示されるＷｎｔシグナル伝達回路阻害物質は、例えば臓器移植後の免疫抑制剤として、又は紅斑性狼瘡、多発性硬化症、及び関節リウマチといった特定の自己免疫疾患の治療のために用いられ得る。
【０００３】
Ｗｎｔ／Ｗｇ蛋白質は、応答細胞での特定標的遺伝子の発現を活性化することにより、脊椎動物の発達に多くの影響を及ぼす。これら標的遺伝子のいくつかは、特定されており、それら機能の一部は、細胞成長、細胞分化、及び細胞生存の制御と調和している（He, Sparks ら、1998；Crawford, Fingleton ら、 1999; Tetsu and McCormick 1999; Kolligs, Nieman ら、2002; Shtutman, Zhurinsky ら、 2002)。
【０００４】
リン酸化反応による分解を受けるβ−カテニンを通常はマークしている複雑な機構が確認されている。重要なことに、癌抑制遺伝子産物ＡＰＣ及びＡｘｉｎは、このβ−カテニン破壊複合物の必須成分である。Ｗｎｔ経路の活性化において、β−カテニンはこのリン酸化反応を逃れ、細胞質に蓄積し、核に侵入し、そこでＴＣＦ蛋白質及び最近確認されたＬｇｓ／ＢＣＬ９[Kramps, T.ら、 2002]蛋白質と共同作業し、標的遺伝子の転写コアクチベーターとして機能する。
【０００５】
重要な変換体が継続的に抑制されているこの状況は、その抑制成分における変異の影響を非常に受けやすい。実際、Ｗｎｔシグナルの下流成分における変異は、様々なヒトの癌と関連していることが発見された（Kinzler and Vogelstein 1996; Miller, Hocking ら. 1999）。例えば、生殖細胞ＡＰＣ変異は、多くの良性大腸腫瘍を起こし得るものであり、そのうちのいくつかが癌へと発展する。ＡＰＣ遺伝子の体細胞変異は、８５％の散発性大腸腺腫及び癌に関連しており（Kinzler and Vogelstein 1996）、β−カテニンリン酸化反応部位における変異が、直腸結腸癌、肝細胞癌、及びメラノーマといったヒトの多くの癌で確認されており（Morin, Sparks ら、 1997; Rubinfeld, Robbins ら. 1997）（Caca, Kolligs ら、 1999）、Ａｘｉｎ変異が肝細胞癌で特定されている（Satoh, Daigo ら、 2000）。そのうえ、いくつかの変異、及び／又はＬＲＰ５、ｓｆｒｐｓ、ＷＩＦ−１、ＤＫＫもしくはＷｎｔリガンドのような上流成分の発現における変化は、癌と関連しているだけでなく、骨及び軟骨疾患とも関連している。これら全ての変異は、核のβ−カテニンの蓄積につながることから、この蛋白質及び相互作用パートナーは、Ｗｎｔ依存性の遺伝子発現を抑制する格好の標的として浮上してきた。
【０００６】
実際のところ、β−カテニン−Ｔｃｆ４相互作用を標的としたＷｎｔ経路の抑制物質、及びそのような抑制物質を見つけ出す方法は、様々な公開公報で開示されている。特許文献１は、精製された蛋白質及び抑制物質をスクリーニングするための従来公知の方法を開示している。特許文献２には、Ｔｃｆ−β−カテニン抑制物質をスクリーニングするための従来公知の方法が記載されている。特許文献３は、Ｔｃｆ−β−カテニン抑制物質に関連している。特許文献４は、低分子β−カテニン抑制物質としてセファロスポリンを開示している。特許文献５は、Ｔｃｆ４−β−カテニン相互作用の３Ｄモデルを用いてβ−カテニンにおける“目標設定可能な”ポケットを明らかにしている。この公報には、抑制物質を特定するための、前記相互作用に基づいたコンピュータでのスクリーニング方法だけでなく、この方法で特定された多くの抑制物質も記載されている。
【０００７】
上述のアプローチの主な欠点は、β−カテニン−Ｔｃｆ４相互作用の特性にある。特に、この蛋白質−蛋白質相互作用の表面は、非常に大きく、少なくともＥカドヘリンやＡＰＣの他のβ−カテニン相互作用パートナーと部分的に共有され（非特許文献１〜４）、これがその選択特異性について重大な問題を引き起こす。それゆえ、Ｗｎｔ経路でのこれに代わる標的が要望されている。
【０００８】
蛋白質のＬｅｇｌｅｓｓ（Ｌｇｓ）／ＢＣＬ９群は、キイロショウジョウバエのＡＰＣ癌抑制遺伝子のＷｎｔ経路下流の新規な正の調節因子として遺伝子検査で同定された。ヒトにおいて、２つの同族体、ＢＣＬ９及びＢＣＬ９類似（ＢＣＬ９、Ｂ９Ｌ又はＢＣＬ９−２として知られる）があり、これらは、キイロショウジョウバエ蛋白質のように、転写活性成分Ｐｙｇｏ及びβ−カテニンの間で不可欠なアダプター分子として活動する。β−カテニンへのＢＣＬ９蛋白質の結合は、癌細胞のＷｎｔシグナルの伝播に極めて重要である。
【０００９】
蛋白質−蛋白質相互作用を中断させることができる、又は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によるＢＣＬ９Ｌ発現を減少することができる競合ペプチドは、強力にＷｎｔ経路を抑制し、分化していない悪性の型から中程度へよく分化した組織へと癌細胞の分化を導く（US2002/0086986）。しかしながら、Ｗｎｔ経路における特異的で強力な抑制作用にもかかわらず、そのペプチド又はｓｉＲＮＡ分子は、低膜透過性及び低全身アベイラビリティー（低利用能）により、癌治療のための理想的な薬剤に相当するものとなっていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第９８／４２２９６号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０２／４４３７８号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０３／００６４４７号パンフレット
【特許文献４】国際公開第０２／０９６４３０号パンフレット
【特許文献５】国際公開第０１／１９３５３Ａ２号パンフレット
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Graham, T. A., C. Weaver ら. (2000). "Crystal structure of a beta-eaten in/Tcf com- plex." CeJ 103(6): 885-96.
【非特許文献２】Eklof Spink, K., S. G. Fridman ら. (2001). "Molecular mechanisms of beta-catenin recognition by adenomatous polyposis coli revealed by the structure of an APC-beta-catenin complex." Embo J 20(22): 6203-12.
【非特許文献３】Huber, A. H. and W. I. Weis (2001). "The structure of the beta-catenin/E-cadherin complex and the molecular basis of diverse ligand recognition by beta- catenin." Cell 105(3): 391-402.
【非特許文献４】Poy, F., M. Lepourcelet ら. (2001). "Structure of a human Tcf4-beta-catenin com- plex." Nat Struct Biol 8(12): 1053-7.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
β−カテニン／ＢＣＬ９−ＢＣＬ９Ｌ相互作用の新規な阻害物質、特に、より低分子量で良好な細胞透過性といった改良された薬剤特性を備えた化合物を提供することが本発明の課題の１つである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
一般式（Ｉ）の化合物がこれらの要望を満たしβ−カテニン／ＢＣＬ９−ＢＣＬ９Ｌ相互作用を効果的に阻害することが見出された。
【００１４】
【化１】
2010512357.tif 000003
【００１５】
Ｘ，Ｙ，Ｚは、互いに独立してＣ又はＮを示し、
ｎは、１，２，３を表し、ｍは、０又は１を表し、ｐは、０又は１〜６の整数を表し、
Ｒ1、Ｒ2は、互いに独立して水素、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、Ｃ1〜Ｃ3アルキル基、及びＣ1〜Ｃ3アルコキシ基を示し、
Ｒ3は、互いに独立して、ｐが０でない場合は水素、ハロゲン、Ｃ1〜Ｃ5直鎖又は分岐アルキル基、カルボキシ基、カルボメトキシ基、カルボエトキシ基、ベンジル基、アシル基、ヒドロキシ基、Ｃ1〜Ｃ4直鎖又は分岐アルコキシル基、トリフルオロメチル基、シアノ基、モルホリノ基、１，３−ジオキソリル基、Ｎ−アセチルアミジル基又はアミドイル基、Ｃ1〜Ｃ3アルキル基、ヒドロキシ基、ベンジル基で随意に置換された飽和５〜８員環、複素環、Ｃ1〜Ｃ6アルキルスルホニル基、１置換又は２置換のＣ1〜Ｃ5アルキル基、分岐又は環状アミンを示し、
Ｒ6は、以下の条件で、Ｈ、又は、脂環系もしくは複素脂環系の一部であり、
（ｍが０であれば、ＣはＣＦ3又は分岐もしくは非分岐のＣ1〜Ｃ4アルキル基を示し、ｍ＝１であれば、Ｃは、−ＣＨ2−Ｏ−、−ＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−、−ＣＨ2（ＣＨ2）ＣＨ2−を示すか、又は、Ｎ−ＣもしくはＣ−Ｃ原子間の化学結合を意味する。）
ＣＯＮＲ6基は、その炭素原子もしくは窒素原子のいずれかを介してＣに結合し得るものであり、
ＣＹＣは、Ｒ3で置換された、又は置換されていない、フェニル、ピリジニル、ナフチル、キノリニル、イソキノリニル、イソオキサゾリニル、チオフェニル、１，３，４−チアジアザゾリジニル、フラニル、テトラハイドロキノリニル、テトラハイドロイソキノリニル、モルホリニル、フラニル、シクロヘキセニル、及びクロメン−２−オン−イルを表す。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】試験例１（ＥＬＩＳＡ法）に記載されたようにＢＣＬ９／ＢＣＬ９Ｌ−β−カテニン、Ｔｃｆ−４−β−カテニン及びＥ−カドヘリン−β−カテニン相互作用の阻害を試験したときの本発明に係る化合物（TGC0012296）の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の好ましい実施形態では、ｎが１である。それゆえ、基本的な１，４置換環状構造は、フェニル、ピリジニル、ピリダジニル、ピラジニル、又はピリミジニル環である。
【００１８】
本発明のより好ましい実施形態では、ｎが２であり、対応する１，８二置換環状基本構造モチーフは、ビフェニル、ビピリジニル、ビピリダジニル、ビピラジニル、又はビピリミジニルである。
【００１９】
さらに好ましい実施形態では、ｎが３である。対応する最も好ましい３環基本構造からなる１，１２二置換基本構造モチーフは、パラテルフェニル、２，５ジフェニルピリジニル、３，４ジフェニルピリダジニル、２，５ジフェニルピラジニルである。
【００２０】
特に好ましい実施形態では、Ｘ、Ｙ及びＺがＣであり、このように、フェニル、ビフェニル、及びテルフェニル構造モチーフが基本環状構造を形成する。
【００２１】
他の好ましい実施形態では、Ｘ及びＹがＣであり、ＺがＮである。これら好ましい構造モチーフは、例えば、ピリジニル、ジピリジニル、テルピリジニルである。
【００２２】
別の実施形態では、ＸがＣであり、Ｙ及びＺがＮである。対応する好ましい構造モチーフは、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、及びビピリダジニル、ビピラジニル又はビピリミジニルである。
【００２３】
さらなる実施形態では、２，５ジフェニルピリジニル、３，４ジフェニルピリダジニル、及び２，５ジフェニルピラジニルのように異なるＮ原子の数を含んだ異なる構造モチーフの混合物も好ましい。
【００２４】
別の好ましい実施形態では、ｍが０であり、ＣがＣＦ3基、又は分岐もしくは非分岐Ｃ〜Ｃアルキル基、特にメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、tert−ブチル及びイソプロピルである。特に好ましい実施形態では、Ｃがtert−ブチル又はイソプロピルである。
【００２５】
本発明のさらに好ましい実施形態では、ｍが１である。この場合、Ｃは、−ＣＨ2−Ｏ−、−ＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−、−ＣＨ2（ＣＨ2）ＣＨ2−からなる群より選ばれたもの、又は、Ｎ−Ｃ又はＣ−Ｃ原子間の化学結合を意味する。最も好ましい実施形態では、ＣがＮ−Ｃ又はＣ−Ｃ原子間の化学結合を意味する。
【００２６】
特に好ましい実施形態では、式ＩにおけるＣＯＮＲ6基が、その炭素原子によってＣに結合している。同様に好ましい代わりの実施形態では、ＣＯＮＲ6基が、その窒素原子によってＣに結合している。従って、立体因子、酸度、さらなる置換に関するＣの好ましい実施形態の微調整が提供される。
【００２７】
本発明との関連で、“ハロゲン”は、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ及びＦを意味する。特に好ましくは、Ｃｌ、Ｂｒ及びＦであり、より好ましくは、Ｃｌ及びＢｒである。
【００２８】
本発明に係る特に好ましい化合物は、下記の化学式を有する。
【００２９】
【化２】
2010512357.tif 000004
【００３０】
本発明に係るさらに好ましい化合物は、下記の化学式を有する。
【００３１】
【化３】
2010512357.tif 000005
【００３２】
本発明に係るさらに特に好ましい化合物は、下記の化学式を有する
【００３３】
【化４】
2010512357.tif 000006
【００３４】
好ましい化合物は、下記の化学式を有する。
【００３５】
【化５】
2010512357.tif 000007
【００３６】
【化６】
2010512357.tif 000008
【００３７】
【化７】
2010512357.tif 000009
【００３８】
【化８】
2010512357.tif 000010
【００３９】
【化９】
2010512357.tif 000011
【００４０】
【化１０】
2010512357.tif 000012
【００４１】
【化１１】
2010512357.tif 000013
【００４２】
好ましい例に示されているように、最も特徴的な特性の１つは、“中央の”芳香族中核における“直鎖の”１，４、１，８、又は１，１２の置換パターンである。これは、ペプチドとの相互作用のための結合ポケットであるエピトープ（抗原決定基）がまっすぐで管状様（“直線”）構造であるから特に利点になり、その結果、本発明に係る化合物はそのポケットに立体的に特によく適合し、そのエピトープの主要残基との結合における特異性を可能にする。
【００４３】
本発明のさらなる目的は、本発明に係る化合物の薬剤としての使用、及び、限定されるものではないが結腸癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、肝細胞癌、卵巣癌、メラノーマ、及び、骨関節炎もしくはリウマチ性関節炎という骨及び関節疾患のような、Ｗｎｔ経路の過剰活性化に特徴付けられる疾患の治療のための医薬組成物の製造のための使用である。
【００４４】
本発明は、さらには、本発明に係る化合物又は製薬学的に許容されるその塩、そしてさらなる実施形態では、少なくとも１つの製薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤を含む医薬組成物に関する。
【００４５】
本発明の化合物は、単独で、又は、製薬学的に許容されるその塩のかたちで投与され得る。本発明の化合物を含む医薬組成物、又は製薬学的に活性なその塩は、さらに少なくとも１つの製薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含み得る。特定の実施形態では、活性化合物もさらに組成物中に含まれ得る。
【００４６】
本発明における化合物は、局所、経口、経皮、注射、舌下、経鼻、髄腔内、経直腸、吸入、静脈の投与のために、例えば、錠剤、ゲル、カプセル、布片、軟膏、クリームのかたちで剤型化され得る。非経口の伝達は、持続性薬剤、注射器、アンプル、又はバイアルによってなされ得る。
【００４７】
本発明の化合物は、このように、標準的な補助剤、担体又は希釈剤といっしょになって、医薬組成物及びその投薬単位のかたちへとなり、そのようなかたちで固体、液体、又は殺菌された注射用溶液のかたちで採用され得る。固体の担体が用いられた場合、調剤は錠剤、粉状またはペレット状でハードゼラチンカプセルに入った状態、又はトローチやドロップのかたちになり得る。固体の担体は、結合剤、錠剤滑剤、フィラー、崩壊剤、湿潤剤などの標準的な賦形剤を含み得る。錠剤は、標準的な技術でフィルムコートされ得る。液体の担体が採用された場合、調剤は、シロップ、エマルジョン、ソフトゼラチンカプセル、注入用賦形剤、水性又は非水性液体分散液のかたちになり得るものであり、又は、使用前に水又は他の適当な媒体で再構成されるための乾燥物になり得る。液体調剤は、分散剤、乳化剤、湿潤剤、非水媒体（食用油を含む）、防腐剤、香料及び／又は着色剤といった標準的な添加物を含み得る。非経口投与のためには、媒体は、塩水溶液、グルコース溶液などが用いられ得るが、通常、少なくとも大部分において滅菌水を含む。注射用分散液も用いられ、この場合、標準的な分散剤が採用され得る。標準的な防腐剤、緩衝剤なども非経口剤形に加えられ得る。しかしながら、投与は、例えば坐薬のかたちで直腸内に、例えばペッサリー、タンポン、クリームのかたちで経膣的に、例えば、軟膏、クリーム、チンキ剤のかたちで経皮的におこなわれることもあり得る。
【００４８】
ここで記載している疾患を患っている又は患いそうである哺乳類、特にヒトに対する本発明の化合物又は医薬組成物の適当な投与量は、活性成分で体重に対し約０．１μｇ／ｋｇから５００ｍｇ／ｋｇの量である。非経口投与のためには、静脈投与において投与量が体重あたり０．１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇになり得る。活性成分は、好ましくは、日々１回から４回等量で投与される。式（Ｉ）の化合物は、前駆体（プロドラッグ）のかたち、又は生体内で活性化合物を放出するような適切に変性されたかたちでも用いられ得る。通常、投与量は、治療されている宿主とって最適な効果量が決定されるまで徐々に増やされる。最適な投与量は、治療されている状況、投与される化合物の選択、投与経路、性、年齢、体重、及び各人の症状の重症度に関わる治療中の各人の特有の反応を含む関連事情により、医師又は他の当業者によって決定され得る。
【００４９】
医薬組成物は、活性成分、即ち本発明の化合物の適当量を含む所望の剤形に適した標準的な技術によって調製される。そのような医薬組成物及びその投与単位形態は、標準的な成分を標準的な割合で含み、さらなる活性化合物又は本質があってもなくてもよく、そのような単位投与形態は、採用される日々の目的とする投与量範囲と釣り合った活性成分の効果的な適当量を含み得る。
【００５０】
下記の試験例及び具体的に示された化合物は、さらに、それら発明を実施するために発明者らによって考察された最良の形態を示している。これらの例は、好ましい実施形態に関しており、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるものではない。
【実施例】
【００５１】
（試験例１）
ＥＬＩＳＡに基づく蛋白質−蛋白質相互作用インビトロ試験
【００５２】
細菌における蛋白質の生成
Ｌｇｓ及びβ−カテニンの結合領域を含むｃＤＮＡをｐＧＥＸ−４Ｔ誘導性細菌発現ベクター（Pharmacia）中にグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）ｃＤＮＡの下流で融合した。同様の組み換えＤＮＡ構築をｐＥＴ−３２ａ（＋）ベクター中においてチオレドキシン−６ＨｉｓタグをＮ末端に含む融合蛋白質の発現のためにおこなった。製造者の推奨方法に従って融合蛋白質をＢＬ２１細菌（例えばStratagene社）中で作製した。
【００５３】
作製された融合蛋白質を単離すべく、細菌を酸化アルミニウム（Sigma, A2039）中で破砕し、得られた粉体をライシス緩衝液（14OmM NaCl、1OmM Na2HPO4、1.8mM KH2PO4、2.7mM KCl、1mM  EDTA、1% Triton-X-100、1mM  DTT、及びプロテアーゼ阻害剤）で回転させながら３０分間抽出した。上澄みを遠心分離によって取り除き、蛋白質精製の前に０．４５μｍの膜でろ過した。ＧＳＴで標識された蛋白質を得るべく、製造者の推奨方法（Amersham Pharmacia）に従って溶解物をグルタチオンアガロースビーズで処理し、精製された蛋白質を５０ｍＭ Tris−Ｃｌ、１０mM還元グルタチオンｐＨ８．０中に溶出させた。チオレドキシン−６Ｈｉｓ融合物を得るため、ＨＰＬＣ装置（例えばAkta Prime, G. E. Healthcare）を用いてニッケルキレートカラム（例えばHitrap chelating, G. E. Healthcare）により、タグされた蛋白質を溶解物から精製し、濃度増加イミダゾールにおいて溶出させた。精製された蛋白質溶液を使用前にＰＢＳにより透析した。生成物の性質を当業者に周知の標準方法によりＳＤＳ−ゲル電気泳動で確認した。
【００５４】
化合物調製：化合物はＤＭＳＯ中で２５ｍＭの貯蔵物として準備され、最終試験濃度にするため１００μＭまで希釈され得る。試験における最終的なＤＭＳＯ濃度は５％である。
【００５５】
ＥＬＩＳＡ法
リン酸緩衝食塩水で適度な濃度に希釈された１００μｌのＧＳＴ蛋白質（例えばＧＳＴ−βカテニン）を、高吸着能を有する（例えばNunc Maxisorp）９６ｗｅｌｌプレートの各ｗｅｌｌに加え、４℃で終夜静置した。次の日、ｗｅｌｌ中の液体を捨て、ＰＢＳ中の３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）１５０μｌを各ｗｅｌｌに加え、緩やかに揺らしながら室温で２時間インキュベートした。続いてこの溶液を捨て、各ｗｅｌｌを２００μｌのＰＢＳで２回洗浄した。２回目の洗浄液を注意深く捨てた後、５μｌの化合物希釈液と、ＰＢＳで適度な濃度に希釈された９５μｌの６Ｈｉｓ融合蛋白質（例えば６Ｈｉｓ−Ｂｃｌ９）との混合物を各ｗｅｌｌに加えた。さらにプレートを緩やかに揺らしながら室温で１時間インキュベートした。次に、この蛋白質溶液を捨て、２００μｌの０．１％Tween-20  ＰＢＳ溶液でｗｅｌｌを３回洗浄した。最後の洗浄液を注意深く捨てた後、ＰＢＳの１％ＢＳＡで適度な濃度に希釈され西洋ワサビペルオキシダーゼ（例えばRoche antibody 11965085001）に接合した抗６Ｈｉｓ抗体の１００μｌをｗｅｌｌに加え、緩やかに揺らしながら１時間室温でプレートをインキュベートした。次にこの溶液を捨て、２００μｌの０．１％Tween-20ＰＢＳ溶液で３回洗浄した。最後の洗浄液を注意深く捨てた後、溶液中の１００μｌのＨＲＰ基質テトラメチルベンズアミジン（ＴＭＢ）をｗｅｌｌに加え、プレートを暗室中で３０分間まで室温でインキュベートした。反応は、各ｗｅｌｌに１００μｌの２Ｎ  ＨＣｌを加えることにより停止させ、光学濃度を４５０ｎｍ及び６３０ｎｍで測定した。
【００５６】
（試験例２）
癌細胞におけるＷｎｔ活性の抑制
【００５７】
ＥＬＩＳＡに基づく蛋白質−蛋白質相互作用法で確認されたＷｎｔ経路におけるβ−カテニン／ＢＣＬ９抑制物質の効果は、転写因子のＴｃｆ／Ｌｅｆ群に応答するレポーター遺伝子を用いて、又は、適当な細胞株におけるＷｎｔ標的遺伝子の量的分析によって、細胞培養系において評価され得る。
【００５８】
レポーター遺伝子は、転写因子応答要素及び最小プロモーターにシスで結合し、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光蛋白質、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ又はルシフェラーゼのように容易に検出でき若しくは分析できる遺伝子を含む構築物である。用いた発現ベクターに応じて、この手順は例えば、哺乳類の細胞株にもショウジョウバエの細胞株にも適用され得る。例えば、ＳＷ６２０（ＡＴＣＣ）のような構造的に活性化しているＷｎｔ経路を備えた結腸癌細胞は、適した系である。これにより、Ｔｃｆ−４誘導ルシフェラーゼレポータープラスミド（即ちTOPFLASH Upstate biotechnology, New York, USA）は、一時的に又は安定的に公知のごとく細胞に核酸を導入する。細胞中に遺伝子材料を導入するための、感染、電気穿孔法、トランスフェクションを含むいかなる手段も用いることができ、これらに限られない。例えば、ＤＮＡをＳＷ６２０細胞に導入すべく、Lipofectamineトランスフェクション試薬（Life Technologies, Inc.）のようなリポフェクション試薬が用いられ得る。一過性トランスフェクション手順によって、２番目のレポーター遺伝子、例えばウミシイタケルシフェラーゼレポータープラスミドｐＲＬ−ＳＶ４０（Promega Corporation, Madison USA）は、トランスフェクション性能の標準化のためにコトランスフェクトされる必要がある。薬剤は、トランスフェクション（一過性トランスフェクション）の後２４時間、又は、細胞（安定にトランスフェクトされた細胞）の播種後２４時間で培地に加えられる。細胞抽出物は、２４〜４８時間後に用意され、製造者（例えば、ルシフェラーゼ活性： Promega Corporation）によって説明されているようにレポーター遺伝子活性のために試験される。溶媒のみで処理された細胞と比べて５０％以上レポーター遺伝子の活性が減少した化合物は、該当したものとして考えられる。平行して、例えば、黄色テトラゾリウム塩細胞増殖分析（ＭＴＴ）法によって毒性が評価され得る。
【００５９】
表１は、本発明に係る特定の化合物のインビトロ活性を示す。ＴＧＣ  ＩＤは、被験物内部識別番号のことであり；特異性値は、β−カテニン−ＢＣＬ９−ＢＣＬ９Ｌの阻害に対する化合物の特異性を表現しており（特異性はＥ−カドヘリン−β−カテニン、Ｔｃｆ−４−βカテニン又はＢＣＬ９−Ｐｙｇｏ相互作用を著しく阻害しないことを意味する）；ＭＷは分子量を意味する。
【００６０】
【表１】
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【００６１】
表から明らかなように、式IIからXIに係る化合物は、β−カテニン／ＢＣＬ９−ＢＣＬ９Ｌ相互作用に対する反応性及び特異性に関して特に有利な結果を示している。
【００６２】
本発明に係る成分は、一般的な合成経路を採用して次のように調製できる。
【００６３】
【化１２】
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【００６４】
ジカルボン酸（１当量）をジクロロメタン（5 mL/mmol対酸）に分散させ、０℃に冷却した。
次に、反応を開始すべく、塩化オキサリル（２．２当量）を注入し続いてＤＭＦを４滴入れた。反応混合物は０℃で反応させ夜通し強く撹拌しながら室温まで上げた。
【００６５】
次に過剰の塩化オキサリルを取り除き、反応混合残渣を０℃に冷却した。ジクロロメタン中のトリエチルアミン（３当量）（5 mL/mmol対トリエチルアミン）を注入し、続いて、ジクロロメタン中の相当量のアニリン（３当量）（5 mL/mmol対アニリン）を徐々に加えた。生じた反応混合物は、温度を０℃から室温にしながら終夜撹拌した。反応混合物をろ過し続いて水で洗浄した。溶剤の揮発において、粗生成物はメタノールによって結晶化されるか、あるいは、カラムクロマトグラフィーにより白色粉体となった。
【００６６】
本発明に係る化合物を合成するためのさらなる一般的に適用可能な調製アプローチ、特に非対称の化合物のためのものが、TGC0012409（CR-5516/IIIともいう）の合成で例示される。
【００６７】
【化１３】
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【００６８】
CR-5514/II（1.5gm, 8.280mmol）を無水条件で４時間、透明溶液を得るまで塩化チオニル（15.0mL）で還流した。過剰の塩化チオニルを蒸留によって取り除いた。残渣を０℃にまで冷却し、ピリジン（10.0mL）を入れ、4-アセトアミドアニリン（1.36gm, 9.100mmol）を入れ、ＨＣｌの発生がなくなるまで時々振った。得られた固体を氷冷水（200mL）に入れ、DCM（３×１５０ｍＬ）で抽出し、５％NaHCO3水溶液、水、塩水で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥した。減圧下での溶媒の除去は、粗生成物を生じさせ、この生成物を２％メタノール等級のＤＣＭを用いてＤＣＭ中でカラムクロマトグラフィーによって精製し、CR-5516/I（0.600gm）を得た。
【００６９】
撹拌されているCR-5516/I（0.230gm, 0.7341 mmol）のＴＨＦ（10.0mL）溶液に、０℃で水酸化リチウム一水和物水溶液（0.092gm, 2.202mmol、2.3mL水中）を滴下した。反応混合物を室温で夜通し撹拌した（出発材料のいくつかはＴＬＣで観察された）。ＴＨＦを減圧下で蒸留により取り除き、酢酸エチルと水との間で分液した。水相を酢酸エチル（３×１００ｍＬ）で洗浄した。水相のｐＨを１ＮのＨＣｌ溶液を加えることにより５〜６に調整し、続いてＤＣＭ（５×７５ｍＬ）で抽出した。複合したＤＣＭ層を水、塩水で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、溶媒を減圧下で取り除き、粗生成物を得た。５％ジクロロメタン等級のメタノール中のＤＣＭを用いてカラムクロマトグラフィーによって精製をおこない、CR-5516/II（80mg）を得た。
【００７０】
撹拌されているCR-5516/II（0.070gm、0.2338mmol）のＤＭＦ（7.0mL）溶液に、炭酸カリウム（0.068gm, 4.909mmol）を加え、室温で１５分間撹拌した。上記反応混合物に4-メトキシアニリン（0.032gm, 2.572mmol）を加え、ＨＡＴＵ（２−（７−アザ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル)−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロフォスフェート、0.133gm、0.3507mmol）を加えた。得られた反応混合物は夜通し室温で撹拌した。溶媒を減圧下で取り除き、粗生成物をＤＣＭ２０％メタノール等級のＤＣＭを用いてカラムクロマトグラフィーによって精製し、灰色がかった固体として（10mg）純CR-5516/IIIを生成させた。
【００７１】
この合成アプローチは上記特定の化合物に限定されず、本発明における他の化合物も単にそれぞれ開始物質を変えることで使用できると理解される。
【００７２】
本発明における典型的な化合物の質量分析（ＭＳ）及び１Ｈ−ＮＭＲの抜粋データを続く表２に示す（ｐｐｍで与えられた重水素含有ジメチルスルホキシドにおけるシグナル  ｓ：一重線、ｄ：二重線、ｔ：三重線、ｑ：四重線、ｄｄ：二重線の二重線、ｄｔ：三重線の二重線、ｍ：多重線、ｂ：広幅）。
【００７３】
【表２】
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【００７４】
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【図１】
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【国際調査報告】
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