(57)【要約】  本発明は、ｈｕＣ２４２変異体などの、抗体変異体またはその断片を製造する工程を含み、ここで、変異体は、親抗体中の１以上のアミノ酸残基を置換することによって製造される。こうした置換（単数または複数）は、好ましくは、重鎖および軽鎖を含む親抗体の可変領域フレームワーク配列中で行われる。こうした置換（単数または複数）の結果、変異体抗体またはその断片は、宿主細胞中に導入した場合、親抗体と比較した際に、増進された抗体合成を示す。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列再操作によって、宿主細胞におけるヒト化ネズミ抗体またはその断片の産生を増加させるための方法であって：
ａ）ネズミ抗体可変領域フレームワーク配列のコレクションを並列させ、ここでこうした並列は、前記フレームワーク中の各位で最も頻繁に見られるアミノ酸残基（コンセンサス残基）を同定する；
ｂ）ヒト化抗体可変領域フレームワーク配列中の対応する残基と、前記コンセンサス残基を比較し；
ｃ）前記ヒト化抗体中で、可変領域フレームワーク配列中の１以上の非コンセンサスアミノ酸残基を同定し；そして
ｄ）前記ヒト化抗体またはその断片中で、１以上の非コンセンサスアミノ酸残基を同等の位のコンセンサス残基で置換して、変異体抗体を産生し、ここで前記変異体抗体は、前記ヒト化抗体に比較した際、より高い収量で、前記宿主細胞において産生される；そして
ｅ）場合によって、生物物理学的考慮のために、１以上のアミノ酸を非コンセンサス残基と置換する
工程を含む、前記方法。
【請求項２】
前記のより高い収量が、少なくとも２倍以上である、請求項１の方法。
【請求項３】
前記置換が前記重鎖中にある、請求項１の方法。
【請求項４】
前記置換が前記軽鎖中にある、請求項１の方法。
【請求項５】
前記置換が、重鎖中および軽鎖中の両方にある、請求項１の方法。
【請求項６】
置換が、可変領域フレームワーク配列のコア中にある、請求項３、４および５のいずれか一項の方法。
【請求項７】
非コンセンサスアミノ酸がまれなアミノ酸である、請求項３、４および５のいずれか一項の方法。
【請求項８】
ヒト化抗体がｈｕＣ２４２であり、そして置換が、Ｋａｂａｔ番号付けスキームによって決定される位の、配列番号１中の１６、２６、４６、もしくは８９より選択される１以上の重鎖可変領域位、または配列番号２中の軽鎖可変領域位４５もしくは７０、あるいは両方であり、そして軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２によって示され、そして重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１によって示される、請求項１の方法。
【請求項９】
ヒト化抗体がｈｕＣ２４２であり、そして置換が、Ｋａｂａｔ抗体残基番号付けスキームによって決定されるアミノ酸残基の、軽鎖中のＱ４５Ｋ／ＲおよびＡ７０Ｄからなる群より選択される１以上、ならびに重鎖中のアミノ酸残基Ｅ１Ａ、Ｄ２６Ｇ、Ｋ４６ＥおよびＴ８９Ｖからなる群より選択される１以上であり、そして軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２によって示され、そして重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１によって示される、請求項１の方法。
【請求項１０】
ヒト化抗体がｈｕＣ２４２であり、そして置換が、Ｋａｂａｔ抗体残基番号付けスキームによって決定されるアミノ酸残基の、軽鎖中のＱ４５Ｋ／ＲおよびＡ７０Ｄからなる群より選択される１以上であり、そして軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２によって示される、請求項１の方法。
【請求項１１】
ヒト化抗体がｈｕＣ２４２であり、そして置換が、Ｋａｂａｔ抗体残基番号付けスキームによって決定されるアミノ酸残基の、重鎖中のアミノ酸残基Ｅ１Ａ、Ｄ２６Ｇ、Ｋ４６ＥおよびＴ８９Ｖからなる群より選択される１つであり、そして重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１によって示される、請求項１の方法。
【請求項１２】
ヒト化抗体がｈｕＣ２４２であり、そして置換が、Ｋａｂａｔ抗体残基番号付けスキームによって決定されるアミノ酸残基の、重鎖中のアミノ酸残基Ｅ１Ａ、Ｄ２６Ｇ、Ｋ４６Ｅ、Ｔ８９Ｖ、Ｋ４６Ｅ／Ｄ２６Ｇ、Ｋ４６Ｅ／Ｋ８２Ｓ、Ｋ４６Ｅ／Ｔ８９Ｖ、Ｋ４６Ｅ／Ｅ１６Ａ／Ｄ２６Ｇ、Ｋ４６Ｅ／Ｋ８２Ｓ／Ｄ２６ＧおよびＫ４６Ｅ／Ｔ８９Ｖ／Ｄ２６Ｇからなる群より選択される１つであり、そして重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１によって示される、請求項１の方法。
【請求項１３】
ヒト化抗体がｈｕＣ２４２であり、そして置換が、Ｋａｂａｔ抗体残基番号付けスキームによって決定されるアミノ酸残基の、軽鎖中のＡ７０ＤまたはＱ４５Ｋ／Ｒの１つ、および重鎖中のＫ４６Ｅ、Ｄ２６Ｇ、Ｋ４６Ｅ／Ｄ２６ＧまたはＫ４６Ｅ／Ｔ８９Ｖの１つであり、そして軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２によって示され、そして重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１によって示される、請求項１の方法。
【請求項１４】
前記のより高い収量が、少なくとも２倍以上である、請求項８〜１３のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
請求項１および８〜１３のいずれか一項記載の方法によって産生される抗体。
【請求項１６】
重鎖可変領域または軽鎖可変領域をコードする前記配列の領域中に、少なくとも１つの変異を有する、完全長ヒトＣ２４２コード配列を含む、単離核酸であって、前記の少なくとも１つの変異が前記Ｃ２４２遺伝子によってコードされるタンパク質の収量を増加させ、そして前記タンパク質に前記の少なくとも１つの変異が含まれる、前記単離核酸。
【請求項１７】
前記の少なくとも１つの変異が、重鎖可変領域（図１２）アミノ酸モチーフまたは軽鎖可変領域（図１２）あるいは両方をコードする前記配列の領域中の変異を含む、請求項１６の核酸。
【請求項１８】
前記モチーフ中の前記の少なくとも１つの変異が、Ｇｌｎ（ＣＡＧ）をコードするコドンのＬｙｓ（ＡＡＡ）またはＡｒｇ（ＣＧＧ）への、Ａｌａ（ＧＣＴ）をコードするコドンのＡｓｐ（ＧＡＴ）への、Ｇｌｕ（ＧＡＧ）をコードするコドンのＡｌａ（ＧＣＣ）への、Ａｓｐ（ＧＡＣ）をコードするコドンのＧｌｙ（ＧＧＣ）への、Ｌｙｓ（ＡＡＡ）をコードするコドンのＧｌｕ（ＧＡＡ）への；またはＴｈｒ（ＡＣＣ）をコードするコドンのＶａｌ（ＧＴＣ）への置換より選択される、請求項１７の核酸。
【請求項１９】
前記コドンの前記置換が、軽鎖中または重鎖中で起こる、請求項１６の核酸。
【請求項２０】
前記軽鎖置換が：
Ｑ４５Ｋ／Ｒ    Ｇｌｎ（ＣＡＧ）からＬｙｓ（ＡＡＡ）またはＡｒｇ（ＣＧＧ）、あるいは
Ａ７０Ｄ    Ａｌａ（ＧＣＴ）からＡｓｐ（ＧＡＴ）
より選択される、請求項１６の核酸。
【請求項２１】
前記重鎖置換が：
Ｅ１６Ａ    Ｇｌｕ（ＧＡＧ）からＡｌａ（ＧＣＣ）；
Ｄ２６Ｇ    Ａｓｐ（ＧＡＣ）からＧｌｙ（ＧＧＣ）；
Ｋ４６Ｅ    Ｌｙｓ（ＡＡＡ）からＧｌｕ（ＧＡＡ）；または
Ｔ８９Ｖ    Ｔｈｒ（ＡＣＣ）からＶａｌ（ＧＴＣ）
より選択される、請求項１６の核酸。
【請求項２２】
前記配列が変異体Ｃ２４２遺伝子産物をコードする、請求項１６の核酸。
【請求項２３】
前記遺伝子産物が抗体である、請求項２２の核酸。
【請求項２４】
配列番号１［ｈｕＣ２４２］の重鎖および配列番号２［ｈｕＣ２４２］の軽鎖を含む可変領域を有する、親抗体中の１以上のアミノ酸置換を有し、そして単一宿主細胞中に導入した場合、前記親抗体に比較した際に、改善された合成を示す、変異体抗体またはそのエピトープ結合性断片。
【請求項２５】
前記置換が、Ｋａｂａｔ番号付けスキームによって決定される位の、前記配列番号２中の４５および７０、あるいは前記配列番号１中の１６、２６、４６、または８９より選択される１以上の位である、請求項２４の抗体。
【請求項２６】
前記置換が、Ｋａｂａｔ番号付けスキームによって決定される位の、重鎖中のＱ４５Ｋ／Ｒ、Ａ７０Ｄ、Ｅ１６Ａ、Ｄ２６Ｇ、Ｋ４６Ｅ、またはＴ８９Ｖからなる群より選択される、請求項２４の抗体。
【請求項２７】
配列再操作によって、宿主細胞におけるヒト化抗体またはそのエピトープ結合性断片の産生を増加させるための方法であって：
ａ）ヒト化抗体が由来したものが属するのと同じ属または他の近縁の分類学的分類由来の抗体由来の抗体可変領域フレームワーク配列のコレクションを並列させ、ここでこうした並列は、フレームワーク中の各位で最も頻繁に見られるアミノ酸残基（コンセンサス残基）を同定する；
ｂ）ヒト化抗体可変領域フレームワーク配列中の対応する残基と、コンセンサス残基を比較し；
ｃ）ヒト化抗体中で、可変領域フレームワーク配列中の１以上の非コンセンサス残基を同定し；そして
ｄ）ヒト化抗体またはその断片中で、前記の１以上の非コンセンサス残基を同等の位のコンセンサス残基で置換して、変異体抗体を産生し、ここで変異体抗体は、ヒト化抗体に比較した際、より高い収量で細胞において産生される
ｅ）場合によって、生物物理学的考慮のために、１以上のアミノ酸を非コンセンサス残基で置換してもよい
工程を含む、前記方法。
【請求項２８】
配列再操作によって、宿主細胞における親抗体またはその抗原結合性断片の産生を増加させるための方法であって：
ａ）親抗体が由来したものが属するのと同じ属または近縁の分類学的分類由来の抗体由来の抗体可変領域フレームワーク配列のコレクションを並列させ、ここでこうした並列は、フレームワーク中の各位で最も頻繁に見られるアミノ酸残基（コンセンサス残基）を同定する；
ｂ）親抗体可変領域フレームワーク配列中の対応する残基と、コンセンサス残基を比較し；
ｃ）親抗体中で、可変領域フレームワーク配列中の１以上の非コンセンサスアミノ酸残基を同定し；そして
ｄ）親抗体またはその断片中で、１以上の非コンセンサスアミノ酸残基を同等の位のコンセンサス残基で置換して、変異体抗体を産生し、ここで変異体抗体は、親抗体に比較した際、より高い収量で宿主細胞において産生される
ｅ）場合によって、生物物理学的考慮のために１以上のアミノ酸を非コンセンサス残基で置換してもよい
工程を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［０１］本出願は、２００６年１０月３１日出願の米国仮出願第６０／８５５，３６１号に優先権を請求し、該出願の全開示は、本明細書に援用される。
【０００２】
［０２］本発明は、抗体産生を改善する方法に関する。より詳細には、再操作された（reengineered）抗体が、再操作された抗体の親抗体に比較した際に、宿主細胞においてより高収量で産生されるように、抗体を再操作する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
［０３］モノクローナル抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断、実験室試薬、および療法剤を含む、広い範囲の使用を有する。現在、臨床試験を受けている、少なくとも２００の抗体または抗体断片がある（Morrow, K.J., Jr., Monoclonal antibody production techniques. Gen. Eng. News, 2002, 20(14):21）。
【０００４】
［０４］ＣＨＯ細胞における抗体の高レベル発現には、転写から翻訳および分泌までの最適な効率が必要である。哺乳動物発現プラスミドは、主に、ｈＣＭＶ極初期遺伝子エンハンサーおよびプロモーター配列のような強力なウイルスエンハンサーと一緒に、ＳＶ４０ポリＡ部位のような転写物安定化ポリアデニル化シグナルを用いることを通じて、高いｍＲＮＡレベルを達成するよう設計されている。抗体コード配列内の隠れたスプライス部位および他の潜在的な有害シス要素を除去することによって、ｍＲＮＡレベルがさらに増進するように合成ｃＤＮＡ構築物を設計してもよい。さらに、合成構築物は、最適コドン使用を通じて、そしてｍＲＮＡ二次構造エネルギーを最小限にすることによって、遺伝子翻訳機構を増進しうる（Trinh R, Gurbaxani B, Morrison SL, Seyfzadeh M. Optimization of codon pair use within the (GGGGS)3 linker sequence results in enhanced protein expression. Mol Immunol. 2004 Jan; 40(10):717-22）。しかし、こうした最適化発現系を用いた場合であっても、哺乳動物細胞における発現レベルは、異なる抗体間で有意に多様でありうる。発現プラスミドから抗体分子を合成するのに必要な、異なる細胞工程の分析によって、抗体の可変領域の特性が、所定の抗体の発現レベルに影響を及ぼしうるという概念が導かれた。しかし、転写または翻訳効率に関わりなく、遺伝子発現に影響を及ぼしうる可変領域の配列および構造の特性に関しては、ほとんどわかっていない。
【０００５】
［０５］可変領域遺伝子の特定のサブクラス由来の多くの抗体は、生物物理学的に、安定性が劣る素因があり、これが低い遺伝子発現につながりうる。ヒト軽鎖および重鎖可変領域は、ヒトｓｃＦｖファージライブラリーの分析に基づいて、多様な度合いの構造安定性を持つサブグループに分類可能である（Ewert S, Honegger A, Plueckthun A. Structure-based improvement of the biophysical properties of immunoglobulin VH domains with a generalizable approach. Biochemistry. 2003 Feb 18; 42(6):1517-28）。安定性が劣るメンバーを含むサブグループに属する抗体または断片は、凝集する傾向を有する可能性もあり、そしてフォールディングまたはアセンブリーが効率的でないため、発現が困難である可能性もある。
【０００６】
［０６］さらに、フォールディングおよび分泌のようなプロセスにおいて、重大な役割を果たす残基は、しばしば、生殖系列配列において非常に保存されているが、一次抗体レパートリーの生成および体細胞突然変異を通じたアフィニティー成熟の間に改変されうる。これは、安定性が劣り、そして発現が低い抗体につながりうる。単一残基変化は、シャペロン結合または軽鎖／重鎖アセンブリーを劇的に改変し、そして最終的には分解される、細胞内不対重鎖の増加を生じる可能性もある（Dul JL, Argon Y. A single amino acid substitution in the variable region of the light chain specifically blocks immunoglobulin secretion. Proc Natl Acad Sci U S A. 1990 Oct; 87(20):8135-9; Wiens GD, Lekkerkerker A, Veltman I, Rittenberg MB. Mutation of a single conserved residue in VH complementarity-determining region 2 results in a severe Ig secretion defect. J Immunol. 2001 Aug 15;167(4):2179-86）。他の不安定化させる突然変異には、埋没親水性残基または表面疎水性残基の導入が含まれる。重鎖Ｇｌｕ６／Ｇｌｎ６のような不変コアパッケージング残基はまた、Ｈ７およびＨ１０のような隣接位における残基変化に対しても感受性である（Honegger A, Plueckthun A. The influence of the buried glutamine or glutamate residue in position 6 on the structure of immunoglobulin variable domains. J Mol Biol. 2001 Jun 8; 309(3):687-99）。体細胞突然変異が、臨界構造閾値を超えない限り、多くの生物物理学的に望ましくない配列が、天然存在抗体中に見られうる。
【０００７】
［０７］合理的配列再操作アプローチを用いて、多くの抗体の安定性および発現潜在能力を増進させうる。抗体を再操作する最も単純なアプローチの１つは、何千もの抗体配列のデータベース中に存在する情報を利用することである（例えば、Johnson G, Wu TT. Kabat Database and its applications: future directions. Nucleic Acids Res. 2001 Jan 1; 29(1):205-6を参照されたい）。注意深く分析すると、問題が多い可能性がある残基を同定することも可能である。例えば、所定の位にまれにしか見られない個々の残基を改変して、この位のコンセンサス残基にマッチさせて、安定性（Steipe B, Schiller B, Plueckthun A, Steinbacher S. Sequence statistics reliably predict stabilizing mutations in a protein domain. J Mol Biol. 1994 Jul 15; 240(3): 188-92）および哺乳動物細胞株における発現さえ（Whitcomb EA, Martin TM, Rittenberg MB. Restoration of Ig secretion: mutation of germline-encoded residues in T15L chains leads to secretion of free light chains and assembled antibody complexes bearing secretion-impaired heavy chains. J Immunol. 2003 Feb 15;170(4): 1903-9）改善可能である。疎水性表面残基などの生物物理学的に攻撃的な残基の同定および逆転もまた、発現改善につながりうる（Nieba L, Honegger A, Krebber C, Plueckthun A. Disrupting the hydrophobic patches at the antibody variable/constant domain interface: improved in vivo folding and physical characterization of an engineered scFv fragment. Protein Eng. 1997 Apr; 10(4):435-44）。生物物理学的に安定な抗体の合理的再設計を補助するために現在利用可能なデータの大部分は、細菌で発現されるファージディスプレイ系において、抗体断片を用いて生成されてきている（Ewert S, Honegger A, Plueckthun A. Stability improvement of antibodies for extracellular and intracellular applications: CDR grafting to stable frameworks and structure-based framework engineering. Methods. 2004 Oct; 34(2): 184-99. Review）。
【０００８】
［０８］ＣＤＲ移植技術によるヒト化は、可能な場合はいつでも、より安定な生殖系列サブグループの１つから、ヒト・ドナー可変領域フレームワークを単に選択することによって、これらの安定性の問題を修正するかまたは回避するか、いずれかを行うことも可能である（Ｅｗｅｒｔら、２００４、上記）。ＷＯ  ２００４／０６５４１７は、抗体の可変ドメインの超可変領域１（ＨＶＲ１）および／または超可変領域２（ＨＶＲ２）アミノ酸配列を、ヒト可変ドメインサブグループコンセンサスアミノ酸配列各々の対応するＨＶＲ１および／またはＨＶＲ２アミノ酸配列に比較し、そして可変ドメインのＨＶＲ１および／またはＨＶＲ２アミノ酸配列と最大の配列同一性を有するサブグループコンセンサス配列を選択することによって、哺乳動物細胞培養において、より高い収量で、こうした抗体および／または抗原結合性断片を産生するためのさらなる改善法を提供する。ＷＯ  ２００４／０６５４１７において、コンセンサス配列は、最大の同一性のＨＶＲ１および／またはＨＶＲ２を持つ抗体に由来し、そしてすべてのフレームワーク配列が完全にヒト配列である、ＣＤＲ移植抗体に適用される。
【０００９】
［０９］げっ歯類抗体の表面再構成（resurfacing）法（米国特許第５，６３９，６４１号； Roguska MA, Pedersen JT, Keddy CA, Henry AH, Searle SJ, Lambert JM, Goldmacher VS, Blaettler WA, Rees AR, Guild BC. Humanization of murine monoclonal antibodies through variable domain resurfacing. Proc Natl Acad Sci U S A. 1994 Feb 1 ; 91(3):969-73; Pedersen JT, Henry AH, Searle SJ, Guild BC, Roguska M, Rees AR. Comparison of surface accessible residues in human and murine immunoglobulin Fv domains. Implication for humanization of murine antibodies. J Mol Biol. 1994 Jan 21; 235(3):959-73）、抗体のベニヤリング（veneering）法（米国特許第６，７９７，４９２号； Padlan, E.A. 1991, Mol. Immunolgy 28:489-498）、および抗体の脱免疫化法（公報第ＷＯ９８／５２９７６）などの他のヒト化法は、ネズミ可変領域の疎水性コアを維持する。その結果、生物物理学的特性が劣った、ネズミ生殖系列由来のネズミコア構造を可変領域中に含む、こうしたヒト化抗体は、これらの特性を受け継ぐ可能性が高いであろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】ＷＯ  ２００４／０６５４１７
【特許文献２】米国特許第５，６３９，６４１号
【特許文献３】米国特許第６，７９７，４９２号
【特許文献４】ＷＯ９８／５２９７６
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Morrow, K.J., Jr., Monoclonal antibody production techniques. Gen. Eng. News, 2002, 20(14):21
【非特許文献２】Trinh R, Gurbaxani B, Morrison SL, Seyfzadeh M. Optimization of codon pair use within the (GGGGS)3 linker sequence results in enhanced protein expression. Mol Immunol. 2004 Jan; 40(10):717-22
【非特許文献３】Ewert S, Honegger A, Plueckthun A. Structure-based improvement of the biophysical properties of immunoglobulin VH domains with a generalizable approach. Biochemistry. 2003 Feb 18; 42(6):1517-28
【非特許文献４】Dul JL, Argon Y. A single amino acid substitution in the variable region of the light chain specifically blocks immunoglobulin secretion. Proc Natl Acad Sci U S A. 1990 Oct; 87(20):8135-9
【非特許文献５】Wiens GD, Lekkerkerker A, Veltman I, Rittenberg MB. Mutation of a single conserved residue in VH complementarity-determining region 2 results in a severe Ig secretion defect. J Immunol. 2001 Aug 15;167(4):2179-86
【非特許文献６】Honegger A, Plueckthun A. The influence of the buried glutamine or glutamate residue in position 6 on the structure of immunoglobulin variable domains. J Mol Biol. 2001 Jun 8; 309(3):687-99
【非特許文献７】Johnson G, Wu TT. Kabat Database and its applications: future directions. Nucleic Acids Res. 2001 Jan 1; 29(1):205-6
【非特許文献８】Steipe B, Schiller B, Plueckthun A, Steinbacher S. Sequence statistics reliably predict stabilizing mutations in a protein domain. J Mol Biol. 1994 Jul 15; 240(3): 188-92
【非特許文献９】Whitcomb EA, Martin TM, Rittenberg MB. Restoration of Ig secretion: mutation of germline-encoded residues in T15L chains leads to secretion of free light chains and assembled antibody complexes bearing secretion-impaired heavy chains. J Immunol. 2003 Feb 15;170(4): 1903-9
【非特許文献１０】Nieba L, Honegger A, Krebber C, Plueckthun A. Disrupting the hydrophobic patches at the antibody variable/constant domain interface: improved in vivo folding and physical characterization of an engineered scFv fragment. Protein Eng. 1997 Apr; 10(4):435-44
【非特許文献１１】Ewert S, Honegger A, Plueckthun A. Stability improvement of antibodies for extracellular and intracellular applications: CDR grafting to stable frameworks and structure-based framework engineering. Methods. 2004 Oct; 34(2): 184- 99. Review
【非特許文献１２】Roguska MA, Pedersen JT, Keddy CA, Henry AH, Searle SJ, Lambert JM, Goldmacher VS, Blaettler WA, Rees AR, Guild BC. Humanization of murine monoclonal antibodies through variable domain resurfacing. Proc Natl Acad Sci U S A. 1994 Feb 1 ; 91(3):969-73
【非特許文献１３】Pedersen JT, Henry AH, Searle SJ, Guild BC, Roguska M, Rees AR. Comparison of surface accessible residues in human and murine immunoglobulin Fv domains. Implication for humanization of murine antibodies. J Mol Biol. 1994 Jan 21; 235(3):959-73
【非特許文献１４】Padlan, E.A. 1991, Mol. Immunolgy 28:489-498
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、こうしたヒト化抗体の生物物理学的特性を改善しうる方法に対する必要性がある。これらの方法は、哺乳動物細胞からの表面再構成抗体のより高い発現を生じるはずである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
［１０］本発明は、一般的に、抗体産生増加を生じる、抗体（本明細書において、以後、「親抗体」）の生物物理学的特性を改善する方法を提供する。該方法は、親抗体の可変領域フレームワークにおいて、１以上の非コンセンサスアミノ酸残基を同定し、そして好ましくは、これらを１以上のコンセンサス残基で置換する。場合によって、生物物理学的考慮のために、１以上のアミノ酸を非コンセンサス残基で置換してもよい。
【００１４】
［１１］推測される天然の関係にしたがって、親抗体が由来した抗体が属するのと同じ種（例えばネズミ）由来、または同じ属（例えばハツカネズミ属（ｍｕｓ）およびクマネズミ属（ｒａｔｔｕｓ））由来の種に渡る、あるいは属または他の分類学的分類に渡って由来する抗体由来の、抗体可変領域フレームワーク配列のコレクションを並列させることによって、コンセンサス残基を同定する。
【００１５】
［１２］より詳細には、本発明は、配列再操作によって、宿主細胞における親抗体またはそのエピトープ結合性断片の産生を増加させるための方法を含む。配列再操作は：
ａ）推測される天然の関係にしたがって、親抗体が由来した抗体が属するのと同じ種（例えばネズミ）由来、または同じ属（例えばハツカネズミ属およびクマネズミ属）由来の種に渡る、あるいは属または他の分類学的分類に渡って由来する抗体由来の、抗体可変領域フレームワーク配列のコレクションを並列させ、ここでこうした並列は、フレームワーク中の各位で最も頻繁に見られるアミノ酸残基（コンセンサス残基）を同定する；
ｂ）親抗体可変領域フレームワーク配列中の対応する残基と、コンセンサス残基を比較し；
ｃ）親抗体中で、可変領域フレームワーク配列中の１以上の非コンセンサスアミノ酸残基を同定し；そして
ｄ）親抗体またはその断片中で、１以上の非コンセンサスアミノ酸残基を、同等の位のコンセンサス残基で置換して、変異体抗体を産生する、ここで変異体抗体は、親抗体に比較した際、より高い収量で、宿主細胞において産生される
工程を含む。
【００１６】
［１３］場合によって、生物物理学的考慮のために、１以上のアミノ酸を非コンセンサス残基で置換してもよい。
【００１７】
［１４］本発明はまた、一般的に、抗体産生増加を生じる、ヒト化抗体の生物物理学的特性を改善する方法も提供する。該方法は、ヒト化抗体の可変領域フレームワークコアにおいて、１以上の非コンセンサスアミノ酸残基を同定し、そしてこれらを１以上のコンセンサス残基で置換する。場合によって、生物物理学的考慮のために、１以上のアミノ酸を非コンセンサス残基で置換してもよい。推測される天然の関係にしたがって、親抗体が由来した抗体が属するのと同じ種由来、または同じ属（例えばハツカネズミ属およびクマネズミ属）由来の種（例えばネズミ）に渡る、あるいは属または他の分類学的分類に渡って由来する抗体由来の、抗体可変領域フレームワーク配列のコレクションを並列させることによって、コンセンサス残基を同定する。
【００１８】
［１５］したがって、本発明は、配列再操作によって、宿主細胞におけるヒト化抗体またはそのエピトープ結合性断片の産生を増加させるための方法を含む。配列再操作は：
ａ）推測される天然の関係にしたがって、ヒト化抗体が由来した抗体が属するのと同じ種（例えばネズミ）由来、または同じ属（例えばハツカネズミ属およびクマネズミ属）由来の種に渡る、あるいは属または他の分類学的分類に渡って由来する抗体由来の、抗体可変領域フレームワーク配列のコレクションを並列させ、ここでこうした並列は、フレームワーク中の各位で最も頻繁に見られるアミノ酸残基（コンセンサス残基）を同定する；
ｂ）ヒト化抗体可変領域フレームワーク配列中の対応する残基と、コンセンサス残基を比較し；
ｃ）ヒト化抗体中で、可変領域フレームワーク配列中の１以上の非コンセンサス残基を同定し；そして
ｄ）ヒト化抗体またはその断片中で、前記の１以上の非コンセンサス残基を、同等の位のコンセンサス残基で置換して、変異体抗体を産生し、ここで変異体抗体は、ヒト化抗体に比較した際、より高い収量で、細胞において産生される
工程を含む。
【００１９】
［１６］場合によって、生物物理学的考慮のために、１以上のアミノ酸を非コンセンサス残基で置換してもよい。
【００２０】
［１７］別の側面において、本発明は、抗体産生増加を生じる、ヒト化ネズミ抗体の生物物理学的特性を改善する方法を提供する。該方法は、ヒト化抗体の可変領域フレームワークにおいて、１以上の非コンセンサスアミノ酸残基を同定し、そしてこれらを１以上のコンセンサス残基で置換する。場合によって、生物物理学的考慮のために、１以上のアミノ酸を非コンセンサス残基で置換してもよい。ネズミ抗体由来の抗体可変領域フレームワーク配列のコレクションを並列させることによって、コンセンサス残基を同定する。
【００２１】
［１８］より詳細には、本発明は、配列再操作によって、宿主細胞におけるヒト化ネズミ抗体またはそのエピトープ結合性断片の産生を増加させるための方法を含む。配列再操作は：
ａ）ネズミ抗体可変領域フレームワーク配列のコレクションを並列させ、ここでこうした並列は、フレームワーク中の各位で最も頻繁に見られるアミノ酸残基（コンセンサス残基）を同定する；
ｂ）ヒト化抗体可変領域フレームワーク配列中の対応する残基と、コンセンサス残基を比較し；
ｃ）ヒト化抗体中で、可変領域フレームワーク配列中の１以上の非コンセンサスアミノ酸残基を同定し；そして
ｄ）ヒト化抗体またはその断片の可変領域フレームワーク配列中で、前記の１以上の非コンセンサス残基を、同等の位のコンセンサス残基で置換して、変異体抗体を産生し、ここで変異体抗体は、ヒト化抗体に比較した際、より高い収量で、細胞において産生される
工程を含む。
【００２２】
［１９］場合によって、生物物理学的考慮のために、１以上のアミノ酸を非コンセンサス残基で置換してもよい。
【００２３】
［２０］本発明はまた、変異体抗体をコードする単離核酸も含む。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】［２１］図１は、ＩｇＧ抗体、ならびに重鎖および軽鎖の可変領域の略図を示す。右側に、重鎖および軽鎖可変領域を漫画で表し、フレームワーク残基をグレーで、そしてＣＤＲ残基を黒で示す。可変領域終点ならびに各ＣＤＲの境界に関して、Ｋａｂａｔ抗体残基配列番号を示す。
【図２】［２２］図２は、ｈｕＣ２４２遺伝子を含有するプラスミドでの一過性トランスフェクション数時間後の、２９３Ｔ細胞によるｈｕＣ２４２産生が低いことを示す。ヒト化抗体Ａ、Ｂ、およびｈｕＣ２４２のプラスミドを濃度で標準化し、そして並行して２μｇ／ｍｌで２９３Ｔ細胞内に導入した。トランスフェクション１４時間、２２時間および４８時間後、分泌された抗体を培地から収集した。抗ｈｕＩｇＧ１  ＥＬＩＳＡを用いて、抗体濃度を決定した。
【図３】［２３］図３は、一過性トランスフェクションされた２９３Ｔ細胞におけるｈｕＣ２４２  ＨＣおよびＬＣ  ｍＲＮＡレベルを示す。ｈｕＣ２４２および他の表面再構成抗体Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆを、並行して２９３Ｔ細胞内に導入した。トランスフェクション７２時間後、各トランスフェクション細胞試料から、総ｍＲＮＡを単離し、そして続いて、試料を逆転写してｃＤＮＡにした。
【図４】［２４］図４は、ｈｕＣ２４２または表面再構成Ａｂ  Ａのいずれかを産生するＣＨＯ細胞由来の、Ｈ２Ｌ２と示される、アセンブリーされた損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）抗体、およびＨと示される重鎖に関するバンドを含むゲルを示す。Ａｂ  ＡおよびｈｕＣ２４２クローン１およびクローン２の発現およびアセンブリーを比較した。Ａｂ  Ａおよび２つのＣ２４２クローンに関するＣＨＯ細胞株を並行して培養し、そして細胞を溶解した。全細胞溶解物をプロテインＡ精製に供した。単離されたＩｇＧを非変性ゲル上で分離し、そしてクーマシーブルーで染色した。
【図５Ａ】［２５］図５Ａは、Ｋａｂａｔデータベース中のネズミ抗体のそれぞれのコンセンサス配列（配列番号３）と並列させた、ｈｕＣ２４２（配列番号１）抗体の重鎖可変領域配列を示す。ＣＤＲに下線を引き、そして太字で印を付ける。配列間で異なる残基をグレーの背景で強調し、そして本明細書に詳細に論じる好ましい残基を黒い背景で強調する。表面残基の下にアステリスク「＊」で印を付ける。
【図５Ｂ】［２６］図５Ｂは、Ｋａｂａｔデータベース中のネズミ抗体のそれぞれのコンセンサス配列（配列番号４）と並列させた、ｈｕＣ２４２（配列番号２）抗体の軽鎖可変領域配列を示す。ＣＤＲに下線を引き、そして太字で印を付ける。配列間で異なる残基をグレーの背景で強調し、そして本特許に詳細に論じる好ましい残基を黒い背景で強調する。表面残基の下にアステリスク「＊」で印を付ける。
【図５Ｃ】［２７］図５Ｃは、ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ由来の４つの表面再構成ヒト化ネズミ抗体のそれぞれのコンセンサス配列（ｈｕＭｙ９６  ＬＣ、配列番号６；  ｒＢ４  ＬＣ、配列番号７；  ｈｕＥＭ  １６４  ＬＣ、配列番号８；  ｈｕＮ９０１  ＬＣ、配列番号９；コンセンサス、配列番号１０）と並列させた、ｈｕＣ２４２（配列番号５）抗体の軽鎖可変領域配列の並列を示し、ｈｕＣ２４２で見られる非コンセンサスＱに対して、４つのヒト化抗体においては、アミノ酸Ｒが保存されたアミノ酸残基であることを示す。ネズミデータベースにおいては、Ｒは、最も保存されるアミノ酸残基であるＫで置換される。この場合、２つのアミノ酸が類似の特性を有するため、ＫはＲで置換可能である。にもかかわらず、ＱをＫで置換することが、本発明の範囲内であるよう含まれる。並列はＫａｂａｔに基づく。
【図６】［２８］図６は、ｈｕＣ２４２  ＨＣまたはＬＣフレームワークいずれかにおける、単一アミノ酸置換によって引き起こされるＩｇＧ産生の中程度の増加を示す。単一フレームワークアミノ酸置換を持つｈｕＣ２４２変異体の生産性を、親ｈｕＣ２４２および抗体Ｂのものと比較する。等量のプラスミドを２９３Ｔ細胞内にトランスフェクションした。７２時間後、分泌されたＩｇＧのレベルをＥＬＩＳＡで決定した。抗原発現性Ｃｏｌｏ２０５細胞への変異体ｈｕＣ２４２の結合をＦＡＣＳによって測定した。
【図７】［２９］図７は、２９３Ｔ一過性発現実験における２つまたは３つのｈｕＣ２４２  ＨＣおよびＬＣ変異体の組み合わせによるＩｇＧ産生の有意な増加を示す。元来のｈｕＣ２４２生産性を１．０と設定する。トランスフェクション７２時間後、分泌されたＩｇＧを培地から収集した。
【図８】［３０］図８は、ｈｕＣ２４２  ＨＣおよびＬＣ変異体のｍＲＮＡレベルが不変のままであることを示す。ｑＰＣＲによって、特定の変異体ｈｕＣ２４２  ｍＲＮＡレベルを決定し、そしてｎｅｏ  ｍＲＮＡに対して標準化した。
【図９】［３１］図９は、変性ゲル上の全細胞溶解物電気泳動による、ＨＣフレームワーク残基置換の結果としての細胞内ＬＣの集積増加を示す。トランスフェクション７２時間後、２９３Ｔ細胞を溶解した。それぞれ、抗ｈｕＩｇＧ１および抗ｈｕＫ抗体を用いて、ＨＣおよびＬＣを検出した。
【図１０Ａ】［３２］図１０（ａ）および１０（ｂ）は、ｈｕＣ２４２変異が、細胞における、ＨＣおよびＬＣ合成の増加、ならびに全抗体（Ｈ２Ｌ２）アセンブリーの増加を導くことを示す。
【００２５】
［３３］図１０（ａ）：トランスフェクション７２時間後、２９３Ｔ細胞を溶解した。ゲル上で溶解物を分離し、そして膜上にトランスファーし、これをアセンブリーしたおよびアセンブリーしていないＩｇＧ  ＨＣおよびＬＣに関して探査した（電気泳動は、非変性条件下であった）。ブロットをストリッピングし、そして抗チューブリン抗体で再探査して、試料装填レベルを示した。
【図１０Ｂ】図１０（ａ）および１０（ｂ）は、ｈｕＣ２４２変異が、細胞における、ＨＣおよびＬＣ合成の増加、ならびに全抗体（Ｈ２Ｌ２）アセンブリーの増加を導くことを示す。
【００２６】
［３４］図１０（ｂ）：プロテインＡアフィニティービーズを用いて、図１０（ａ）中に記載するように調製した細胞溶解物から、ＩｇＧを単離した。次いで、単離した試料を非変性ゲル上の電気泳動に供して、これを続いて、クーマシーブルーで染色した。
【図１１Ａ】［３５］図１１（ａ）は、Ｃｏｌｏ２０５細胞に対するｈｕＣ２４２およびｈｕＣ２４２変異体の結合の、ＦＡＣＳ分析を示す。Ａｂ  Ｂは、非結合性対照抗体である。
【図１１Ｂ】［３６］図１１（ｂ）は、Ｃｏｌｏ２０５細胞に対するｈｕＣ２４２およびｈｕＣ２４２変異体のＤＭ４コンジュゲートの結合の、ＦＡＣＳ分析を示す。Ａｂ  Ｂは、非結合性対照抗体である。
【図１１Ｃ】［３７］図１１（ｃ）は、ＦＡＣＳ分析を用いた、Ｃｏｌｏ２０５細胞上のＦＩＴＣ標識親ｈｕＣ２４２と、親ｈｕＣ２４２および変異体ｈｕＣ２４２抗体の競合的結合の結果を示す。抗体Ｂは、非結合性非競合性対照として働く。
【図１２−１】［３８］図１２は、重鎖（パネルＡ；配列番号１１および１２）および軽鎖（パネルＢ；配列番号１３および１４）のｈｕＣ２４２アミノ酸および核酸配列を示す。
【図１２−２】図１２は、重鎖（パネルＡ；配列番号１１および１２）および軽鎖（パネルＢ；配列番号１３および１４）のｈｕＣ２４２アミノ酸および核酸配列を示す。
【図１２−３】図１２は、重鎖（パネルＡ；配列番号１１および１２）および軽鎖（パネルＢ；配列番号１３および１４）のｈｕＣ２４２アミノ酸および核酸配列を示す。
【図１２−４】図１２は、重鎖（パネルＡ；配列番号１１および１２）および軽鎖（パネルＢ；配列番号１３および１４）のｈｕＣ２４２アミノ酸および核酸配列を示す。
【図１２−５】また、パネルＣにおいて、ｈｕＣ２４２中に同定されるアミノ酸変化をコードするコドン（単数または複数）を示す、ｈｕＣ２４２の重鎖可変ドメイン配列（配列番号１５）および軽鎖可変ドメイン配列（配列番号１６）も示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
［３９］本発明は、ヒト化ネズミ抗体に言及して記載されるが、当業者は、重鎖および／または軽鎖可変領域（単数または複数）のコンセンサス配列を得る、十分に大きいデータベースがある、任意の抗体に対して、再操作法を適用可能であることを理解するであろう。
【００２８】
［４０］ヒト抗原に対するモノクローナル抗体を生成する標準的な方法は、該抗原で別の動物種を免疫し、該動物の免疫Ｂ細胞を用いてハイブリドーマを生成し、そして該ヒト抗原に結合する抗体を分泌するハイブリドーマクローンを選択することである。最も一般的には、用いられる動物は、マウスまたはラットであり、したがって、生成される抗体は、ネズミ抗体である。ヒト抗原に対するモノクローナル抗体は、ヒトにおいて、診断目的のために、または癌、自己免疫疾患、炎症、および感染などの多様な疾患の治療のために、用いられる。しかし、ネズミモノクローナル抗体が異質の（foreign）タンパク質と認識され、そしてしばしば、ＨＡＭＡ応答（ヒト抗マウス抗体応答）と呼ばれる免疫応答を誘発するため、ヒトにおけるネズミモノクローナル抗体の使用は限定されている。ＨＡＭＡ応答を防止するため、ネズミ抗体をヒト化するための方法が開発されてきている。すべての方法は、ネズミ定常領域ドメイン（ＩｇＧのドメイン構造に関しては、図１を参照されたい）をヒト定常領域ドメインで置換するが、抗体の可変領域ドメインに関するヒト化戦略が異なる。ＣＤＲ移植法は、ヒトＣＤＲドメインを置換することによって、ネズミ可変領域由来の６つのＣＤＲドメインを相同ヒト可変領域に移し、したがって、ネズミ可変ドメインフレームワーク領域は、相同ヒトフレームワーク領域によって完全に置換される。げっ歯類抗体の表面再構成法（米国特許第５，６３９，６４１号；  Roguskaら  1994, Proc Natl Acad Sci U S A 91:969-73、上記；  Pedersenら  1994, J. Mol. Biol. 235:969-73、上記）、抗体のベニヤリング法（米国特許第６，７９７，４９２号；  Padlan, E.A. 1991, Mol. Immunolgy 28:489-498、上記）、および抗体の脱免疫化法（国際公報第ＷＯ９８／５２９７６）などの他のヒト化法は、ネズミ可変ドメインフレームワーク領域の疎水性コアを維持し、そしてフレームワーク領域中の表面曝露残基のみをヒト残基で変化させる。例えば、表面再構成技術を用いてヒト化された抗体は、すべての溶媒アクセス可能可変領域フレームワーク位でヒト残基を含有する一方、ＣＤＲおよび埋没可変領域フレームワーク位でネズミ残基を保持する。これらのヒト化抗体は、ＣＤＲ移植などの他のヒト化法において、疎水性コアが置換された場合にしばしば失われる、元来のネズミ抗体の結合アフィニティーを保持する。
【００２９】
［４１］ヒト化抗体は、典型的には、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞またはＴ２９３細胞（ヒト腎臓細胞株）などの哺乳動物宿主細胞において、その遺伝子を発現させることによって、産生される。本発明者らは、表面再構成技術によって調製された異なるヒト化抗体が、同じ哺乳動物宿主細胞において、異なる量で産生される（図２）が、抗体のｍＲＮＡは類似の量で産生される（図３）ことを観察した。本発明者らは、可変領域の一次アミノ酸配列が、抗体産生に影響を及ぼすと結論づけた。したがって、本発明者らは、可変ドメイン領域フレームワーク中に埋没ネズミアミノ酸コアを有するヒト化モノクローナル抗体の、哺乳動物宿主細胞における生産性の改善法を開発した。
【００３０】
略語および定義
ＭＡｂ  モノクローナル抗体
ＣＨ  重鎖定常領域（ドメイン）
ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３  重鎖定常領域１、２、および３
ＣＬ  軽鎖定常領域
ＶＨ  重鎖可変領域（ドメイン）
ＶＬ  軽鎖可変領域（ドメイン）
ＣＤＲ  相補性決定領域
ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３  軽鎖相補性決定領域１、２、および３
ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３  重鎖相補性決定領域１、２、および３
ＦＲ  可変ドメインのフレームワーク領域（ドメイン）
ＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３、ＦＲＬ４  軽鎖可変ドメインのフレームワーク領域１、２、３、および４
ＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３、ＦＲＨ４  重鎖可変ドメインのフレームワーク領域１、２、３、および４
ｑＰＣＲ  定量的ポリメラーゼ連鎖反応
抗体および定義の説明
［４２］図１に示すように、抗体は、典型的には、ジスルフィド結合によって一緒に連結された２つの重鎖、および２つの軽鎖を含む。各軽鎖は、ジスルフィド結合によってそれぞれの重鎖に連結される。各重鎖は、順番に、Ｎ末端から始まって、可変ドメイン（領域）、定常ドメイン（領域）１、ヒンジ領域、ならびに定常ドメイン（領域）２および３を含む。各軽鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（領域）およびＣ末端に定常ドメインを有する。軽鎖可変ドメインは、重鎖可変ドメインと並列する。軽鎖定常ドメインは、重鎖定常ドメイン１と並列する。軽鎖および重鎖中の定常ドメインは、抗原結合に直接は関与しない。
【００３１】
［４３］軽鎖および重鎖の各対の可変ドメインは、抗原結合部位を形成する。軽鎖および重鎖上のドメインは、同じ全体構造を有し、そして各ドメインは、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって連結され、配列が比較的保存された、４つの領域のフレームワークを含む。ＬＣおよびＨＣ各々の４つのフレームワーク領域は、主に、ベータシートコンホメーションを採用し、そしてＣＤＲは、ベータシート構造を連結し、そしていくつかの場合はその一部を形成する、ループを形成する。抗体の可変領域の６つのＣＤＲ（ＬＣおよびＨＣから各々３つ）は、互いに、そしてフレームワーク領域と近接して保持され、そして抗原結合部位を形成する。Ｋａｂａｔ（“Sequences of proteins of immunological interest”  米保健社会福祉省，  米政府印刷局，  １９８７）を参照することによって、抗体のＣＤＲおよびフレームワーク領域を決定してもよい。
【００３２】
［４４］免疫グロブリンの成熟重鎖および軽鎖の可変領域由来のアミノ酸を、それぞれ、ＨｘおよびＬｘと名付け、ここでｘは、Ｋａｂａｔのスキーム（上記）にしたがったアミノ酸位を示す。Ｋａｂａｔは、各サブグループ（例えばネズミ、ヒト、ラットなど）に関する抗体の多くのアミノ酸配列を列挙する。Ｋａｂａｔは、列挙された配列中の各アミノ酸に残基番号を割り当てる方法を用い、そして残基番号を割り当てるこの方法は、該分野における標準となってきている。保存されたアミノ酸を参照することにより、Ｋａｂａｔ中のコンセンサス配列の１つと、問題の抗体を並列させることによって、その概要中に含まれない他の抗体に、Ｋａｂａｔのスキームを拡張可能である。Ｋａｂａｔ番号付け系の使用は、異なる抗体中の同等の位のアミノ酸を容易に同定する。例えば、ヒト抗体のＬｎ（ｎは任意の整数であり、例えば５である）位のアミノ酸は、マウス抗体のアミノ酸位Ｌ５と同等の位を占める。Ｋａｂａｔ（上記）中の番号付けスキームを用いることによって、任意の２つの抗体配列を、一方向で並列させさえすればよい。したがって、抗体に関して、同一性パーセントは、ユニークでそしてよく定義された意味を有する。
【００３３】
［４５］本明細書において、用語「フレームワーク領域」は、Ｋａｂａｔら、上記によって定義されるような、１以上の種を含む属における、異なる免疫グロブリン間で比較的保存される領域（すなわちＣＤＲ以外）である、免疫グロブリン軽鎖および重鎖可変領域の位を指す。
【００３４】
［４６］本明細書において、「変異体抗体」または「変異体」は、親抗体のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有する抗体を指す。こうした変異体は、必然的に、親抗体と１００％未満の配列同一性または類似性を有する。好ましい態様において、変異体は、親抗体の重鎖または軽鎖可変ドメインのいずれかのアミノ酸配列と、約７５％〜１００％未満のアミノ酸配列同一性または類似性、より好ましくは、約８０％〜１００％未満、より好ましくは、約８５％〜１００％未満、より好ましくは、約９０％〜１００％未満、そして最も好ましくは、約９５％〜１００％未満のアミノ酸配列同一性または類似性を有する、アミノ酸配列を有するであろう。この配列に関する同一性または類似性は、本明細書において、配列を並列させ、そして必要であればギャップを導入して、最大の配列同一性パーセントを達成した後、親抗体残基と同一である（すなわち同じ残基である）候補配列中のアミノ酸残基の割合として定義される。Ｎ末端、Ｃ末端、あるいは可変ドメイン外部の抗体配列内の内部伸長、欠失、または挿入はいずれも、配列同一性または類似性に影響を及ぼすと見なされてはならない。抗体変異体は、一般的に、親抗体の対応する可変領域に比較した際の、可変領域中のアミノ酸置換（１以上のアミノ酸残基による；例えば少なくとも１〜約２５アミノ酸残基による、そして好ましくは、約１〜約１０アミノ酸残基による）を有するものである。
【００３５】
［４７］本明細書において、「親」抗体は、天然集団中で優位を占める遺伝子によって産生される抗体を含む。これにはまた、天然突然変異体型の抗体も含まれる。抗体のこうした天然集団から、またはその天然突然変異体から産生されたかまたは産生される可能性が高い抗体が、さらに含まれる。こうした抗体には、限定されるわけではないが、ヒト化または表面再構成、完全ヒト、またはキメラ化抗体、あるいは本発明の解説にしたがって生成または操作可能な任意の抗体が含まれる。こうした抗体は、一般的に、元来の抗体の結合特異性を所持するか、または元来の抗体の抗原結合性残基を所持するが、いくつかの場合、こうした抗体はまた、異なる結合特異性を有する可能性もある。例えば、抗体は、元来の抗原に部分的に関連するかまたは関連しない抗原に対する、改善された結合特異性を示しうる。
【００３６】
［４８］親抗体の限定されない例は、「親Ｃ２４２抗体」であり、これは、ネズミＣ２４２抗体（米国特許第５，５５２，２９３号）またはその誘導体の、あるいはこれらに由来する、抗原結合性残基を有する抗体を指す。例えば、モノクローナル抗体Ｃ２４２は、ネズミモノクローナル抗体、またはネズミモノクローナル抗体Ｃ２４２の抗原結合性残基を所持する、ヒト化、キメラ化、完全ヒトＣ２４２であってもよい。
【００３７】
［４９］抗体指向性療法などのターゲット指向性療法は、薬剤の経口または静脈内投与を通じた全身療法、あるいは外部放射線療法（ＸＲＴ）などの全身療法などの、非ターゲティング化療法に勝る利点を提供する。抗体指向性療法、および特にモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を用いた療法の利点は、正常組織への療法剤の影響をより抑えつつ、腫瘍に、療法剤の用量を送達する能力である。この指向性療法は、裸のＭＡｂ、あるいは薬剤、細菌または他の毒素、放射性核種、およびホウ素付加物（ｂｏｒｏｎ  ａｄｄｅｎｄｓ）などの中性子捕獲剤などの、細胞結合性剤にコンジュゲート化されたＭＡｂを用いる。
【００３８】
［５０］用語「エピトープ」には、免疫グロブリンに特異的に結合可能な任意のタンパク質決定基が含まれる。エピトープ決定基は、通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的活性表面群からなり、そして通常、特定の３次元構造特性とともに、特定の荷電特性を有する。
【００３９】
［５１］アミノ酸残基は、フレームワーク領域の配列中の所定の位で、ネズミ抗体の巨大なデータベース中のすべての抗体配列の１０％未満で見られる場合、この位で、まれな可変領域フレームワーク残基と呼ばれる。
【００４０】
［５２］巨大データベースの例は、Ｋａｂａｔ抗体データベースである（例えば、Johnson G, Wu TT. Kabat Database and its applications: future directions. Nucleic Acids Res. 2001 Jan l ;29(1):205-6を参照されたい）。巨大抗体データベースは、少なくとも１０００の個々の抗体可変領域配列を含有する。
【００４１】
［５３］上に示す定義を用いて、特定の態様に縛られることなく、本発明の理解を促進するために、以下の考察を提供する。
【００４２】
［５４］本発明は、１つの限定されない側面において、ネズミ可変領域コア構造を有するヒト化抗体の、哺乳動物細胞における産生を増進する方法を提供する。該方法は、可変領域フレームワークのネズミコアにおいて、非コンセンサスアミノ酸残基を同定し、そしてこれらをネズミコンセンサス配列のアミノ酸残基で置換する。
【００４３】
［５５］したがって、１つの態様において、本発明は、抗体変異体またはその断片を製造する工程を含み、ここで、変異体は、親抗体中の１以上のアミノ酸残基を、コンセンサス可変領域フレームワーク配列由来の対応する残基で置換することによって製造される。こうした置換（単数または複数）の結果、変異体抗体またはその断片は、宿主細胞中に導入した場合、親抗体と比較した際に、増進された抗体合成を示す。
【００４４】
［５６］親抗体において、置換は、好ましくは、親抗体の重鎖および軽鎖可変ドメインフレームワーク領域の各々の配列を、対応するコンセンサス配列アミノ酸残基を持つ、重鎖および軽鎖可変ドメインフレームワーク領域のコンセンサス配列と並列させることによって同定される、１以上の非コンセンサスアミノ酸で行われる。
【００４５】
［５７］好ましい態様において、親抗体中のアミノ酸残基の置換は、重鎖中で行われる。別の好ましい態様において、こうしたアミノ酸置換は、軽鎖中で行われる。親抗体の重鎖または軽鎖中のこうした置換を、独立にまたは同時に実行してもよい。コンセンサス配列は、推測される天然の関係にしたがって、親抗体が由来した抗体が属するのと同じ種（例えばネズミ）に属する、または同じ属（例えばハツカネズミ属およびクマネズミ属）由来の種に渡る、あるいは属または他の分類学的分類に渡って由来する、抗体サブグループの配列に由来する。
【００４６】
［５８］別の態様において、本発明は、親抗体に比較した際、宿主細胞における変異体抗体またはその断片の産生を増加させるための方法であって：ａ）親抗体の重鎖および軽鎖抗体可変ドメインフレームワーク領域各々の配列を、重鎖および軽鎖可変ドメインフレームワーク領域のコンセンサス配列と並列させ、ここでコンセンサス重鎖または軽鎖配列は、ネズミ抗体可変ドメインのデータベースに由来する；ｂ）親抗体可変ドメインフレームワーク領域中の１以上の重鎖残基をネズミ重鎖コンセンサス残基で置換するか、あるいは親抗体可変ドメインフレームワーク領域中の１以上の軽鎖残基をネズミコンセンサス軽鎖残基で置換し、ここで置換は、宿主細胞内に導入した場合、親抗体に比較した際に、より高い収量を生じる、変異体抗体またはその断片を生じる；ｃ）親抗体中で、Ｋａｂａｔ抗体残基番号付けスキームによって決定されるアミノ酸残基の、軽鎖中のＱ４５またはＡ７０より選択される１以上のアミノ酸残基、あるいは重鎖中のＥ１６、Ｄ２６、Ｋ４６またはＴ８９より選択される１以上のアミノ酸残基を同定し；そしてｄ）親抗体中の１以上のアミノ酸残基を、軽鎖中、それぞれ、Ｋ４５（場合によって、生物物理学的考慮のため、Ｋを非コンセンサス残基Ｒで置換してもよい）またはＤ７０より選択される１以上のアミノ酸残基、あるいは重鎖中、それぞれ、Ａ１６、Ｇ２６、Ｅ４６もしくはＳ４６またはＶ８９より選択される１以上のアミノ酸残基で置換する、ここで置換は、宿主細胞内に導入した場合、親抗体に比較した際に、より高い収量を生じる、変異体抗体またはその断片を生じる工程を含む、前記方法を提供する。
【００４７】
［５９］重鎖または軽鎖中の置換を、独立にまたは同時に実行してもよい。
【００４８】
［６０］好ましい態様において、変異体抗体軽鎖において、Ｑ４５はＫ４５によって置換され（場合によって、生物物理学的考慮のため、Ｋを非コンセンサス残基Ｒで置換してもよい）、そしてＡ７０はＤ７０によって置換され、そして変異体抗体重鎖において、Ｅ１６はＡ１６によって置換され；Ｄ２６はＧ２６によって置換され；Ｋ４６はＥ４６またはＳ４６によって置換され；そしてＴ８９はＶ８９によって置換される。こうした置換は、好ましくは、少なくとも約１００％または約２００％、変異体抗体収量を増加させる。好ましい態様において、収量は、少なくとも約３００％以上である。より好ましい態様において、収量は、約４００％以上である。最も好ましい態様において、収量は、約５００％以上である。変異体タンパク質収量の増加はまた、限定されるわけではないが、培養細胞に対する増殖因子の使用または血清不含培地の使用などの他の要因にも応じる可能性もある。
【００４９】
［６１］本発明はまた、重鎖可変領域または軽鎖可変領域をコードする配列の領域中のアミノ酸コドンにおいて、少なくとも１つの変異を有する、全長ネズミもしくはヒト、ヒト化またはキメラ化Ｃ２４２コード配列を含む単離核酸も含み、ここで、少なくとも１つの変異は、Ｃ２４２遺伝子によってコードされるタンパク質の収量を増加させ、そして該タンパク質には、該少なくとも１つのコドン変異によってコードされる少なくとも１つのアミノ酸変異が含まれる。
【００５０】
［６２］軽鎖において、置換はフレームワーク位から選択される（Ｋａｂａｔ番号付けスキーム）：
Ｑ４５をＫ４５に；場合によって、生物物理学的考慮のため、Ｋを非コンセンサス残基Ｒで置換してもよい。
【００５１】
Ａ７０をＤ７０に
［６３］重鎖において、置換はフレームワーク位から選択される（Ｋａｂａｔ番号付けスキーム）：
Ｅ１６をＡ１６に
Ｄ２６をＧ２６に
Ｋ４６をＥ４６に
Ｔ８９をＶ８９に
［６４］こうした配列置換は、変異体抗体である、変異体Ｃ２４２遺伝子産物をコードする。
【００５２】
［６５］本発明はまた、親抗体において、配列番号１（重鎖）または配列番号２（軽鎖）の１以上のアミノ酸残基を置換することによって、宿主細胞培養からの、親抗体の変異体である抗体の収量を増加させるための方法であって、ａ）Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ（Invitrogen）などのアミノ酸配列分析ソフトウェアを用いて、重鎖および軽鎖免疫グロブリン可変領域フレームワークを並列させることによって、配列番号１（重鎖）をコンセンサス重鎖配列と、または配列番号２（軽鎖）をコンセンサス軽鎖配列と並列させ、ここで、コンセンサス重鎖または軽鎖配列は、ネズミ抗体配列のデータベースに由来する（例えば、Kabat database−JohnsonおよびWu，２００１）；ｂ）ｂ）親抗体において、Ｋａｂａｔスキームによって決定されるアミノ酸残基の、配列番号１中のＥ１６、Ｄ２６、Ｋ４６またはＴ８９および配列番号２中のＱ４５またはＡ７０より選択される１以上のアミノ酸残基を同定し、そしてｃ）１以上のアミノ酸残基；配列番号１中のＥ１６、Ｄ２６、Ｋ４６またはＴ８９および配列番号２中のＱ４５またはＡ７０を、コンセンサス配列由来の、それぞれ、配列番号１中のＡ１６、Ｇ２６、Ｅ４６、Ｓ４６またはＶ８９、およびそれぞれ、配列番号２中のＫ４５（場合によって、生物物理学的考慮のため、Ｋを非コンセンサス残基Ｒで置換してもよい）またはＤ７０より選択されるアミノ酸残基で置換する、ここで置換は、変異体抗体の産生を生じ、そして変異体抗体を宿主細胞内に導入した際、変異体収量が親抗体より多い工程を含む、前記方法もまた含む。
【００５３】
［６６］別の態様において、本発明は、ｈｕＣ２４２の変異体などの変異体抗体またはそのエピトープ結合性断片を含み、ここで変異体は、配列番号１の重鎖［ｈｕＣ２４２重鎖］および配列番号２の軽鎖［ｈｕＣ２４２軽鎖］を含む可変領域を有する、親抗体中の１以上のアミノ酸置換を有し、そして変異体は、単一宿主細胞中に導入した場合、親抗体に比較した際に、重鎖および／または軽鎖の改善された合成、および改善された重鎖／軽鎖アセンブリーを示し、置換は、Ｋａｂａｔ番号付けスキームによって決定される位の、配列番号１中の１６、２６、４６、もしくは８９より選択される１以上の重鎖可変領域位、または配列番号２中の軽鎖可変領域位４５もしくは７０、あるいはその両方で実行される。より好ましくは、変異体抗体は、軽鎖残基Ｑ４５からＫ４５（場合によって、生物物理学的考慮のため、Ｋを非コンセンサス残基Ｒで置換してもよい）またはＡ７０からＤ７０、あるいは重鎖残基Ｅ１６からＡ１６、Ｄ２６からＧ２６、Ｋ４６からＥ４６、またはＴ８９からＶ８９からなる群より選択され、そして重鎖または軽鎖のフレームワーク領域中に位置する、アミノ酸置換を有する。
【００５４】
［６７］別の態様において、本発明の細胞結合性剤はまた、Ｃ２４２抗原（ＣＤ４４／ＣａｎＡｇ）などのリガンドを特異的に認識し、したがってコンジュゲートが十分な期間、ターゲット細胞と接触して、コンジュゲートの細胞毒性剤部分が、細胞に対して作用するのを可能にし、そして／またはコンジュゲートが細胞によって内在化されるのに十分な期間を可能にするであろう。
【００５５】
［６８］好ましい態様において、細胞毒性コンジュゲートは、細胞結合性剤として、抗Ｃ２４２抗体の変異体を含み、より好ましくは、細胞毒性コンジュゲートは、Ａ７０Ｄ；Ｑ４５Ｋ／Ｒ；Ｄ２６Ｇ；Ｋ４６Ｅ；Ｋ４６Ｅ／Ｔ８９Ｖ；Ｋ４６Ｅ／Ｋ８２Ｓ；Ｋ４６Ｅ／Ｅ１６Ａ／Ｄ２６Ｇ；Ａ７０Ｄ／Ｋ４６Ｅ／Ｔ８９Ｖ；Ｋ４６Ｅ／Ｄ２６Ｇ；Ｋ４６Ｅ／Ｋ８２Ｓ／Ｄ２６Ｇ；Ｋ４６Ｅ／Ｔ８９Ｖ／Ｄ２６Ｇ；Ａ７０Ｄ／Ｋ４６Ｅ；Ｑ４５Ｋ（Ｒ）／Ｋ４６Ｅ／Ｔ８９Ｖ；Ａ７０Ｄ／Ｄ２６Ｇ；Ｑ４５Ｋ（Ｒ）／Ｋ４６Ｅ；Ａ７０Ｄ／Ｋ４６Ｅ／Ｄ２６Ｇ；Ｑ４５Ｋ（Ｒ）／Ｄ２６Ｇ；Ｑ４５Ｋ（Ｒ）／Ｋ４６Ｅ／Ｄ２６Ｇ抗体またはそのエピトープ結合性断片より選択される変異体を含む。これらの抗体は、Ｃ２４２抗原（ＣＤ４４／ＣａｎＡｇ）を特異的に認識し、そしてターゲティング化様式で、癌細胞などの異常な細胞または組織に、細胞毒性剤を導くことが可能である。
【００５６】
［６９］本発明の細胞毒性コンジュゲートの第二の構成要素は、細胞毒性剤である。用語「細胞毒性剤」は、本明細書において、細胞の機能または増殖を減少させるかまたは遮断し、そして／または細胞の破壊を引き起こす、物質を指す。
【００５７】
［７０］好ましい態様において、細胞毒性剤は、タキソール、ＤＭ１またはＤＭ４などのメイタンシノイド、ＣＣ−１０６５またはＣＣ−１０６５類似体である。好ましい態様において、本発明の細胞結合性剤は、直接、あるいは切断可能または切断不能リンカーを介して、細胞毒性剤に共有結合している。
【００５８】
［７１］別の態様において、ヒト化抗体またはそのエピトープ結合性断片をメイタンシノイドなどの薬剤にコンジュゲート化して、薬剤をＣ２４２抗原（ＣＤ４４／ＣａｎＡｇ）などのリガンドにターゲティングすることによって、抗原を発現している細胞に向かう特異的細胞毒性を有するプロドラッグを形成してもよい。こうした抗体および小さい非常に毒性である薬剤（例えばメイタンシノイド、タキサン、およびＣＣ−１０６５類似体）を含む細胞毒性コンジュゲートを、乳房腫瘍および卵巣腫瘍などの腫瘍治療のための療法剤として用いてもよい。
【００５９】
［７２］したがって、本発明の解説にしたがって産生される親抗体の抗体変異体を、裸の抗体として、または細胞結合性剤として作用する抗体として、ターゲティング化療法のために用いてもよい。
【００６０】
細胞毒性剤
［７３］本発明の細胞毒性コンジュゲートで用いる細胞毒性剤は、細胞死を生じるか、または細胞死を誘導するか、または何らかの方式で細胞生存度を減少させる、いかなる化合物であってもよい。好ましい細胞毒性剤には、例えば、以下に定義する、メイタンシノイドおよびメイタンシノイド類似体、タキソイド、ＣＣ−１０６５およびＣＣ−１０６５類似体、ドラスタチンおよびドラスタチン類似体が含まれる。これらの細胞毒性剤を、本明細書に開示するような抗体、抗体断片、機能的同等物、改善された抗体およびその類似体にコンジュゲート化する。
【００６１】
［７４］ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法によって、細胞毒性コンジュゲートを調製してもよい。抗体に薬剤またはプロドラッグを連結するため、連結基を用いる。適切な連結基が当該技術分野に周知であり、そしてこうした連結基には、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光解離基、ペプチダーゼ不安定性基およびエステラーゼ不安定性基が含まれる。好ましい連結基はジスルフィド基およびチオエーテル基である。例えば、ジスルフィド交換反応を用いて、あるいは抗体および薬剤またはプロドラッグ間にチオエーテル結合を形成することによって、コンジュゲートを構築してもよい。
【００６２】
メイタンシノイド
［７５］細胞毒性コンジュゲートを形成するため、本発明で使用可能な細胞毒性剤の中に、メイタンシノイドおよびメイタンシノイド類似体がある。適切なメイタンシノイドの例には、メイタンシノールおよびメイタンシノール類似体が含まれる。メイタンシノイドは、微小管形成を阻害し、そして哺乳動物細胞に対して非常に毒性である薬剤である。
【００６３】
［７６］適切なメイタンシノール類似体の例には、修飾芳香族環を有するものおよび他の位で修飾を有するものが含まれる。こうした適切なメイタンシノイドの例が、米国特許第４，４２４，２１９号；第４，２５６，７４６号；第４，２９４，７５７号；第４，３０７，０１６号；第４，３１３，９４６号；第４，３１５，９２９号；第４，３３１，５９８号；第４，３６１，６５０号；第４，３６２，６６３号；第４，３６４，８６６号；第４，４５０，２５４号；第４，３２２，３４８号；第４，３７１，５３３号；第６，３３３，４１０号；第５，４７５，０９２号；第５，５８５，４９９号；および第５，８４６，５４５号に開示される。
【００６４】
［７７］修飾芳香族環を有するメイタンシノールの適切な類似体の具体的な例には：
（１）Ｃ−１９−デクロロ（米国特許第４，２５６，７４６号）（アンサマイトシンＰ２のＬＡＨ還元によって調製）；
（２）Ｃ−２０−ヒドロキシ（またはＣ−２０−デメチル）＋／−Ｃ−１９−デクロロ（米国特許第４，３６１，６５０号および第４，３０７，０１６号）（ストレプトミセス属（Streptomyces）またはアクチノミセス属（Actinomyces）を用いた脱メチル化、あるいはＬＡＨを用いた脱クロロ化によって調製）；および
（３）Ｃ−２０−デメトキシ、Ｃ−２０−アシルオキシ（−ＯＣＯＲ）、＋／−デクロロ（米国特許第４，２９４，７５７号）（塩化アシルを用いたアシル化によって調製）
が含まれる。
【００６５】
［７８］他の位の修飾を有するメイタンシノールの適切な類似体の具体的な例には：
Ｃ−９−ＳＨ（米国特許第４，４２４，２１９号）（Ｈ２ＳまたはＰ２Ｓ５とメイタンシノールの反応によって調製）；
Ｃ−１４−アルコキシメチル（デメトキシ／ＣＨ２ＯＲ）（米国特許第４，３３１，５９８号）；
Ｃ−１４−ヒドロキシメチルまたはアシルオキシメチル（ＣＨ２ＯＨまたはＣＨ２ＯＡｃ）（米国特許第４，４５０，２５４号）（ノカルジア属（Nocardia）から調製）；
Ｃ−１５−ヒドロキシ／アシルオキシ（米国特許第４，３６４，８６６号）（ストレプトミセス属によるメイタンシノールの変換によって調製）；
Ｃ−１５−メトキシ（米国特許第４，３１３，９４６号および第４，３１５，９２９号）（トレウィア・ヌディフロラ（Trewia nudiflora）から単離）；
Ｃ−１８−Ｎ−デメチル（米国特許第４，３６２，６６３号および第４，３２２，３４８号）（ストレプトミセス属によるメイタンシノールの脱メチル化によって調製）；および
４，５−デオキシ（米国特許第４，３７１，５３３号）（メイタンシノールの三塩化チタン／ＬＡＨ還元によって調製）
が含まれる。
【００６６】
［７９］好ましい態様において、本発明の細胞毒性コンジュゲートは、細胞毒性剤として、以前はＮ２’−デアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシンと称された、チオール含有メイタンシノイドＤＭ１を利用する。ＤＭ１は、以下の構造式（Ｉ）：Ｌ（Ｉ）によって示される。
【００６７】
［８０］別の好ましい態様において、本発明の細胞毒性コンジュゲートは、細胞毒性剤として、以前はＮ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−メチル−４−メルカプト−１−オキソペンチル）−メイタンシンと称された、チオール含有メイタンシノイドＤＭ４を利用する。ＤＭ４は、以下の構造式（ＩＩ）：
【００６８】
【化１】
2010508043.tif 000002
【００６９】
によって示される。本発明のさらなる態様において、イオウ原子を所持する炭素原子上に、モノまたはジアルキル置換を所持する、チオールおよびジスルフィド含有メイタンシノイドを含む、他のメイタンシンを用いてもよい。これらには、Ｃ−３、Ｃ−１４ヒドロキシメチル、Ｃ−１５ヒドロキシ、またはＣ−２０デスメチルに、立体障害を受けた（ｈｉｎｄｅｒｅｄ）スルフヒドリル基を所持するアシル基を含むアシル化アミノ酸側鎖を有するメイタンシノイドが含まれ、ここで、チオール官能性を所持するアシル基の炭素原子は１つまたは２つの置換基を有し、前記置換基は、１〜１０の炭素原子を有する直鎖アルキルまたはアルケニル、３〜１０の炭素原子を有する分枝鎖または環状アルキルまたはアルケニル、フェニル、置換フェニル、あるいは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり、そしてさらに、置換基の１つはＨであってもよく、そしてアシル基は、カルボニル官能性およびイオウ原子間に少なくとも３つの炭素原子の長さの直鎖を有する。
【００７０】
［８１］こうしたさらなるメイタンシンには、式（ＩＩＩ）によって示される化合物：
【００７１】
【化２】
2010508043.tif 000003
【００７２】
式中：
Ｙ’は
（ＣＲ７Ｒ８）ｌ（ＣＲ９＝ＣＲ１０）ｐ（Ｃ≡Ｃ）ｑＡｏ（ＣＲ５Ｒ６）ｍＤｕ（ＣＲ１１＝ＣＲ１２）ｒ（Ｃ≡Ｃ）ｓＢｔ（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＲ１Ｒ２ＳＺ
を示し、
式中：
Ｒ１およびＲ２は、各々独立に、１〜１０の炭素原子を有する直鎖アルキルまたはアルケニル、３〜１０の炭素原子を有する分枝鎖または環状アルキルまたはアルケニル、フェニル、置換フェニル、あるいは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり、そしてさらに、Ｒ２はＨであってもよく；
Ａ、Ｂ、Ｄは、３〜１０の炭素原子を有するシクロアルキルまたはシクロアルケニル、単純または置換アリール、あるいは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、およびＲ１２は、各々独立に、Ｈ、１〜１０の炭素原子を有する直鎖アルキルまたはアルケニル、３〜１０の炭素原子を有する分枝鎖または環状アルキルまたはアルケニル、フェニル、置換フェニル、あるいは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり；
ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、ｔおよびｕは、各々独立に、０または１〜５の整数であり、但し、どの時点においても、ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、ｔおよびｕの少なくとも２つはゼロではなく；そして
Ｚは、Ｈ、ＳＲまたは−ＣＯＲであり、式中、Ｒは、１〜１０の炭素原子を有する直鎖アルキルまたはアルケニル、３〜１０の炭素原子を有する分枝鎖または環状アルキルまたはアルケニル、あるいは単純または置換アリール、あるいは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルである
が含まれる。
【００７３】
［８２］式（ＩＩＩ）の好ましい態様には：
Ｒ１がメチルであり、Ｒ２がＨであり、そしてＺがＨである
Ｒ１およびＲ２がメチルであり、そしてＺがＨである
Ｒ１がメチルであり、Ｒ２がＨであり、そしてＺが−ＳＣＨ３である
Ｒ１およびＲ２がメチルであり、そしてＺが−ＳＣＨ３である
式（ＩＩＩ）の化合物が含まれる。
【００７４】
［８３］こうしたさらなるメイタンシンにはまた、式（ＩＶ−Ｌ）、（ＩＶ−Ｄ）、または（ＩＶ−Ｄ，Ｌ）：
【００７５】
【化３】
2010508043.tif 000004
【００７６】
式中：
Ｙ１は、（ＣＲ７Ｒ８）ｌ（ＣＲ５Ｒ６）ｍ（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＲ１Ｒ２ＳＺを示し、
式中：
Ｒ１およびＲ２は、各々独立に、１〜１０の炭素原子を有する直鎖アルキルまたはアルケニル、３〜１０の炭素原子を有する分枝鎖または環状アルキルまたはアルケニル、フェニル、置換フェニル、あるいは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり、そしてさらに、Ｒ２はＨであってもよく；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、各々独立に、Ｈ、１〜１０の炭素原子を有する直鎖アルキルまたはアルケニル、３〜１０の炭素原子を有する分枝鎖または環状アルキルまたはアルケニル、フェニル、置換フェニル、あるいは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり；
ｌ、ｍおよびｎは、各々独立に、１〜５の整数であり、そしてさらに、ｎは０であってもよく；
Ｚは、Ｈ、ＳＲまたは−ＣＯＲであり、式中、Ｒは、１〜１０の炭素原子を有する直鎖アルキルまたはアルケニル、３〜１０の炭素原子を有する分枝鎖または環状アルキルまたはアルケニル、あるいは単純または置換アリール、あるいは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり；そして
Ｍａｙは、Ｃ−３、Ｃ−１４ヒドロキシメチル、Ｃ−１５ヒドロキシまたはＣ−２０デスメチルに側鎖を所持するメイタンシノイドを示す
によって示される化合物も含まれる。
【００７７】
［８４］式（ＩＶ−Ｌ）、（ＩＶ−Ｄ）および（ＩＶ−Ｄ，Ｌ）の好ましい態様には：
Ｒ１がメチルであり、Ｒ２がＨであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８が、各々、Ｈであり、ｌおよびｍが各々１であり、ｎがゼロであり、そしてＺがＨである
Ｒ１およびＲ２がメチルであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８が、各々、Ｈであり、ｌおよびｍが１であり、ｎが０であり、そしてＺがＨである
Ｒ１がＨであり、Ｒ２がメチルであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８が、各々、Ｈであり、ｌおよびｍが各々１であり、ｎが０であり、そしてＺが−ＳＣＨ３である
Ｒ１およびＲ２がメチルであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８が、各々、Ｈであり、ｌおよびｍが１であり、ｎが０であり、そしてＺが−ＳＣＨ３である
式（ＩＶ−Ｌ）、（ＩＶ−Ｄ）および（ＩＶ−Ｄ，Ｌ）の化合物が含まれる。
【００７８】
［８５］好ましくは、細胞毒性剤は、式（ＩＶ−Ｌ）によって示される。
【００７９】
［８６］こうしたさらなるメイタンシンにはまた、式（Ｖ）：
【００８０】
【化４】
2010508043.tif 000005
【００８１】
式中：
Ｙは、（ＣＲ７Ｒ８）ｌ（ＣＲ５Ｒ６）ｍ（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＲ１Ｒ２ＳＺを示し、
式中：
Ｒ１およびＲ２は、各々独立に、１〜１０の炭素原子を有する直鎖アルキルまたはアルケニル、３〜１０の炭素原子を有する分枝鎖または環状アルキルまたはアルケニル、フェニル、置換フェニル、あるいは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり、そしてさらに、Ｒ２はＨであってもよく；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、各々独立に、Ｈ、１〜１０の炭素原子を有する直鎖アルキルまたはアルケニル、３〜１０の炭素原子を有する分枝鎖または環状アルキルまたはアルケニル、フェニル、置換フェニル、あるいは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり；
ｌ、ｍおよびｎは、各々独立に、１〜５の整数であり、そしてさらに、ｎは０であってもよく；そして
Ｚは、Ｈ、ＳＲまたは−ＣＯＲであり、式中、Ｒは、１〜１０の炭素原子を有する直鎖アルキルまたはアルケニル、３〜１０の炭素原子を有する分枝鎖または環状アルキルまたはアルケニル、あるいは単純または置換アリール、あるいは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルである
によって示される化合物も含まれる。
【００８２】
［８７］式（Ｖ）の好ましい態様には：
Ｒ１がメチルであり、Ｒ２がＨであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８が、各々、Ｈであり；ｌおよびｍが各々１であり、ｎが０であり；そしてＺがＨである
Ｒ１およびＲ２がメチルであり；Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８が、各々、Ｈであり、ｌおよびｍが１であり；ｎが０であり；そしてＺがＨである
Ｒ１がメチルであり、Ｒ２がＨであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８が、各々、Ｈであり、ｌおよびｍが各々１であり、ｎが０であり、そしてＺが−ＳＣＨ３である
Ｒ１およびＲ２がメチルであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８が、各々、Ｈであり、ｌおよびｍが１であり、ｎが０であり、そしてＺが−ＳＣＨ３である
式（Ｖ）の化合物が含まれる。
【００８３】
［８８］こうしたさらなるメイタンシンにはさらに、式（ＶＩ−Ｌ）、（ＶＩ−Ｄ）、または（ＶＩ−Ｄ，Ｌ）：
【００８４】
【化５】
2010508043.tif 000006
【００８５】
式中：
Ｙ’は
（ＣＲ７Ｒ８）ｌ（ＣＲ９＝ＣＲ１０）ｐ（Ｃ≡Ｃ）ｑＡｏ（ＣＲ５Ｒ６）ｍＤｕ（ＣＲ１１＝ＣＲ１２）ｒ（Ｃ≡Ｃ）ｓＢｔ（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＲ１Ｒ２ＳＺ
を示し、
式中：
Ｒ１およびＲ２は、各々独立に、１〜１０の炭素原子を有する直鎖アルキルまたはアルケニル、３〜１０の炭素原子を有する分枝鎖または環状アルキルまたはアルケニル、フェニル、置換フェニル、あるいは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり、そしてさらに、Ｒ２はＨであってもよく；
Ａ、Ｂ、Ｄは、３〜１０の炭素原子を有するシクロアルキルまたはシクロアルケニル、単純または置換アリール、あるいは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、およびＲ１２は、各々独立に、Ｈ、１〜１０の炭素原子を有する直鎖アルキルまたはアルケニル、３〜１０の炭素原子を有する分枝鎖または環状アルキルまたはアルケニル、フェニル、置換フェニル、あるいは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり；
ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、ｔおよびｕは、各々独立に、０または１〜５の整数であり、但し、どの時点においても、ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、ｔおよびｕの少なくとも２つはゼロではなく； 
Ｚは、Ｈ、ＳＲまたは−ＣＯＲであり、式中、Ｒは、１〜１０の炭素原子を有する直鎖アルキルまたはアルケニル、３〜１０の炭素原子を有する分枝鎖または環状アルキルまたはアルケニル、あるいは単純または置換アリール、あるいは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルである；そして
Ｍａｙはメイタンシノイドである
によって示される化合物が含まれる。
【００８６】
［８９］式（ＶＩ）の好ましい態様には：
Ｒ１がメチルであり、Ｒ２がＨであり、そしてＺがＨである
Ｒ１およびＲ２がメチルであり、そしてＺがＨである
Ｒ１がメチルであり、Ｒ２がＨであり、そしてＺが−ＳＣＨ３である
Ｒ１およびＲ２がメチルであり、そしてＺが−ＳＣＨ３である
式（ＶＩ）の化合物が含まれる。
【００８７】
［９０］上述のメイタンシノイドを、変異体抗Ｃ２４２抗体Ａ７０Ｄ；Ｑ４５Ｋ／Ｒ；Ｄ２６Ｇ；Ｋ４６Ｅ；Ｋ４６Ｅ／Ｔ８９Ｖ；Ｋ４６Ｅ／Ｋ８２Ｓ；Ｋ４６Ｅ／Ｅ１６Ａ／Ｄ２６Ｇ；Ａ７０Ｄ／Ｋ４６Ｅ／Ｔ８９Ｖ；Ｋ４６Ｅ／Ｄ２６Ｇ；Ｋ４６Ｅ／Ｋ８２Ｓ／Ｄ２６Ｇ；Ｋ４６Ｅ／Ｔ８９Ｖ／Ｄ２６Ｇ；Ａ７０Ｄ／Ｋ４６Ｅ；Ｑ４５Ｋ（Ｒ）／Ｋ４６Ｅ／Ｔ８９Ｖ；Ａ７０Ｄ／Ｄ２６Ｇ；Ｑ４５Ｋ（Ｒ）／Ｋ４６Ｅ；Ａ７０Ｄ／Ｋ４６Ｅ／Ｄ２６Ｇ；Ｑ４５Ｋ（Ｒ）／Ｄ２６Ｇ；Ｑ４５Ｋ（Ｒ）／Ｋ４６Ｅ／Ｄ２６Ｇ、あるいはその相同体または断片にコンジュゲート化してもよく、ここで、抗体は、メイタンシノイドのＣ−３、Ｃ−１４ヒドロキシメチル、Ｃ−１５ヒドロキシまたはＣ−２０デスメチルに見られるアシル化アミノ酸側鎖のアシル基上に存在するチオールまたはジスルフィド官能性を用いて、メイタンシノイドに連結され、そしてアシル化アミノ酸側鎖のアシル基が、１つまたは２つの置換基を有する炭素原子に位置する、チオールまたはジスルフィド官能性を有し、前記置換基は、１〜１０の炭素原子を有する直鎖アルキルまたはアルケニル、３〜１０の炭素原子を有する分枝鎖または環状アルキルまたはアルケニル、フェニル、置換フェニル、あるいは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり、そしてさらに、置換基の１つはＨであってもよく、そしてアシル基は、カルボニル官能性およびイオウ原子間に少なくとも３つの炭素原子の長さの直鎖を有する。
【００８８】
［９１］本発明の好ましいコンジュゲートは、式（ＶＩＩＩ）：
【００８９】
【化６】
2010508043.tif 000007
【００９０】
式中：
Ｙ１’は
（ＣＲ７Ｒ８）ｌ（ＣＲ９＝ＣＲ１０）ｐ（Ｃ≡Ｃ）ｑＡｏ（ＣＲ５Ｒ６）ｍＤｕ（ＣＲ１１＝ＣＲ１２）ｒ（Ｃ≡Ｃ）ｓＢｔ（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＲ１Ｒ２Ｓ−
を示し、
式中：
Ｒ１およびＲ２は、各々独立に、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０の炭素原子を有する直鎖アルキルまたはアルケニル、３〜１０の炭素原子を有する分枝鎖または環状アルキルまたはアルケニル、フェニル、置換フェニル、あるいは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり、そしてさらに、Ｒ２はＨであってもよく；
Ａ、Ｂ、およびＤは、各々独立に、３〜１０の炭素原子を有するシクロアルキルまたはシクロアルケニル、単純または置換アリール、あるいは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、およびＲ１２は、各々独立に、Ｈ、１〜１０の炭素原子を有する直鎖アルキルまたはアルケニル、３〜１０の炭素原子を有する分枝鎖または環状アルキルまたはアルケニル、フェニル、置換フェニル、あるいは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり；そして
ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、ｔおよびｕは、各々独立に、０または１〜５の整数であり、但し、どの時点においても、ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、ｔおよびｕの少なくとも２つはゼロではない
のメイタンシノイドにコンジュゲート化された、変異体Ａ７０Ｄ；Ｑ４５Ｋ／Ｒ；Ｄ２６Ｇ；Ｋ４６Ｅ；Ｋ４６Ｅ／Ｔ８９Ｖ；Ｋ４６Ｅ／Ｋ８２Ｓ；Ｋ４６Ｅ／Ｅ１６Ａ／Ｄ２６Ｇ；Ａ７０Ｄ／Ｋ４６Ｅ／Ｔ８９Ｖ；Ｋ４６Ｅ／Ｄ２６Ｇ；Ｋ４６Ｅ／Ｋ８２Ｓ／Ｄ２６Ｇ；Ｋ４６Ｅ／Ｔ８９Ｖ／Ｄ２６Ｇ；Ａ７０Ｄ／Ｋ４６Ｅ；Ｑ４５Ｋ（Ｒ）／Ｋ４６Ｅ／Ｔ８９Ｖ；Ａ７０Ｄ／Ｄ２６Ｇ；Ｑ４５Ｋ（Ｒ）／Ｋ４６Ｅ；Ａ７０Ｄ／Ｋ４６Ｅ／Ｄ２６Ｇ；Ｑ４５Ｋ（Ｒ）／Ｄ２６Ｇ；Ｑ４５Ｋ（Ｒ）／Ｋ４６Ｅ／Ｄ２６Ｇ、あるいはその相同体または断片を含むものである。
【００９１】
［９２］好ましくは、Ｒ１はメチルであり、Ｒ２はＨであるか、またはＲ１およびＲ２はメチルである。
【００９２】
［９３］本発明のさらにより好ましいコンジュゲートは、式（ＩＸ−Ｌ）、（ＩＸ−Ｄ）、または（ＩＸ−Ｄ，Ｌ）：
【００９３】
【化７】
2010508043.tif 000008
【００９４】
式中：
Ｙ１は、（ＣＲ７Ｒ８）ｌ（ＣＲ５Ｒ６）ｍ（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＲ１Ｒ２Ｓ−を示し、
式中：
Ｒ１およびＲ２は、各々独立に、１〜１０の炭素原子を有する直鎖アルキルまたはアルケニル、３〜１０の炭素原子を有する分枝鎖または環状アルキルまたはアルケニル、フェニル、置換フェニル、複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり、そしてさらに、Ｒ２はＨであってもよく；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、各々独立に、Ｈ、１〜１０の炭素原子を有する直鎖アルキルまたはアルケニル、３〜１０の炭素原子を有する分枝鎖または環状アルキルまたはアルケニル、フェニル、置換フェニル、あるいは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり；
ｌ、ｍおよびｎは、各々独立に、１〜５の整数であり、そしてさらに、ｎは０であってもよく；そして
Ｍａｙは、Ｃ−３、Ｃ−１４ヒドロキシメチル、Ｃ−１５ヒドロキシまたはＣ−２０デスメチルで側鎖を所持するメイタンシノールを示す
のメイタンシノイドにコンジュゲート化された、変異体抗Ｃ２４２抗体Ａ７０Ｄ；Ｑ４５Ｋ／Ｒ；Ｄ２６Ｇ；Ｋ４６Ｅ；Ｋ４６Ｅ／Ｔ８９Ｖ；Ｋ４６Ｅ／Ｋ８２Ｓ；Ｋ４６Ｅ／Ｅ１６Ａ／Ｄ２６Ｇ；Ａ７０Ｄ／Ｋ４６Ｅ／Ｔ８９Ｖ；Ｋ４６Ｅ／Ｄ２６Ｇ；Ｋ４６Ｅ／Ｋ８２Ｓ／Ｄ２６Ｇ；Ｋ４６Ｅ／Ｔ８９Ｖ／Ｄ２６Ｇ；Ａ７０Ｄ／Ｋ４６Ｅ；Ｑ４５Ｋ（Ｒ）／Ｋ４６Ｅ／Ｔ８９Ｖ；Ａ７０Ｄ／Ｄ２６Ｇ；Ｑ４５Ｋ（Ｒ）／Ｋ４６Ｅ；Ａ７０Ｄ／Ｋ４６Ｅ／Ｄ２６Ｇ；Ｑ４５Ｋ（Ｒ）／Ｄ２６Ｇ；Ｑ４５Ｋ（Ｒ）／Ｋ４６Ｅ／Ｄ２６Ｇ、あるいはその相同体または断片を含むものである。
【００９５】
［９４］式（ＩＸ−Ｌ）、（ＩＸ−Ｄ）および（ＩＸ−Ｄ，Ｌ）の好ましい態様には：
Ｒ１がメチルであり、Ｒ２がＨであるか、またはＲ１およびＲ２がメチルである、
Ｒ１がメチルであり、Ｒ２がＨであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８が、各々、Ｈであり；ｌおよびｍが各々１であり；ｎが０である
Ｒ１およびＲ２がメチルであり；Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８が、各々、Ｈであり；ｌおよびｍが１であり；ｎが０である
式（ＩＸ−Ｌ）、（ＩＸ−Ｄ）および（ＩＸ−Ｄ，Ｌ）の化合物が含まれる。
【００９６】
［９５］好ましくは、細胞毒性剤は、式（ＩＸ−Ｌ）によって示される。
【００９７】
［９６］本発明のさらに好ましいコンジュゲートは、式（Ｘ）：
【００９８】
【化８】
2010508043.tif 000009
【００９９】
式中、置換基は、上記式（ＩＸ）に関して定義されるとおりである
のメイタンシノイドにコンジュゲート化された、変異体抗Ｃ２４２抗体Ａ７０Ｄ；Ｑ４５Ｋ／Ｒ；Ｄ２６Ｇ；Ｋ４６Ｅ；Ｋ４６Ｅ／Ｔ８９Ｖ；Ｋ４６Ｅ／Ｋ８２Ｓ；Ｋ４６Ｅ／Ｅ１６Ａ／Ｄ２６Ｇ；Ａ７０Ｄ／Ｋ４６Ｅ／Ｔ８９Ｖ；Ｋ４６Ｅ／Ｄ２６Ｇ；Ｋ４６Ｅ／Ｋ８２Ｓ／Ｄ２６Ｇ；Ｋ４６Ｅ／Ｔ８９Ｖ／Ｄ２６Ｇ；Ａ７０Ｄ／Ｋ４６Ｅ；Ｑ４５Ｋ（Ｒ）／Ｋ４６Ｅ／Ｔ８９Ｖ；Ａ７０Ｄ／Ｄ２６Ｇ；Ｑ４５Ｋ（Ｒ）／Ｋ４６Ｅ；Ａ７０Ｄ／Ｋ４６Ｅ／Ｄ２６Ｇ；Ｑ４５Ｋ（Ｒ）／Ｄ２６Ｇ；Ｑ４５Ｋ（Ｒ）／Ｋ４６Ｅ／Ｄ２６Ｇ、あるいはその相同体または断片を含むものである。
【０１００】
［９７］本発明のさらに好ましいコンジュゲートは、式（ＸＩ）：
【０１０１】
【化９】
2010508043.tif 000010
【０１０２】
式中、置換基は、上記式（ＶＩＩＩ）に関して定義されるとおりである
のメイタンシノイドにコンジュゲート化された、変異体抗Ｃ２４２抗体Ａ７０Ｄ；Ｑ４５Ｋ／Ｒ；Ｄ２６Ｇ；Ｋ４６Ｅ；Ｋ４６Ｅ／Ｔ８９Ｖ；Ｋ４６Ｅ／Ｋ８２Ｓ；Ｋ４６Ｅ／Ｅ１６Ａ／Ｄ２６Ｇ；Ａ７０Ｄ／Ｋ４６Ｅ／Ｔ８９Ｖ；Ｋ４６Ｅ／Ｄ２６Ｇ；Ｋ４６Ｅ／Ｋ８２Ｓ／Ｄ２６Ｇ；Ｋ４６Ｅ／Ｔ８９Ｖ／Ｄ２６Ｇ；Ａ７０Ｄ／Ｋ４６Ｅ；Ｑ４５Ｋ（Ｒ）／Ｋ４６Ｅ／Ｔ８９Ｖ；Ａ７０Ｄ／Ｄ２６Ｇ；Ｑ４５Ｋ（Ｒ）／Ｋ４６Ｅ；Ａ７０Ｄ／Ｋ４６Ｅ／Ｄ２６Ｇ；Ｑ４５Ｋ（Ｒ）／Ｄ２６Ｇ；Ｑ４５Ｋ（Ｒ）／Ｋ４６Ｅ／Ｄ２６Ｇ、あるいはその相同体または断片を含むものである。
【０１０３】
［９８］特に好ましいのは、Ｒ１がＨであり、Ｒ２がメチルであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８が、各々、Ｈであり、ｌおよびｍが、各々、１であり、そしてｎが０である、上記化合物のいずれかである。
【０１０４】
［９９］さらに特に好ましいのは、Ｒ１およびＲ２がメチルであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８が、各々、Ｈであり、ｌおよびｍが１であり、そしてｎが０である、上記化合物のいずれかである。
【０１０５】
［１００］さらに、Ｌ−アミノアシル立体異性体が好ましい。
【０１０６】
［１０１］１〜１０の炭素原子を有する直鎖アルキルまたはアルケニルの例には、限定されるわけではないが、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、プロペニル、ブテニルおよびヘキセニルが含まれる。
【０１０７】
［１０２］３〜１０の炭素原子を有する分枝アルキルまたはアルケニルの例には、限定されるわけではないが、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソペンチル、１−エチル−プロピル、イソブテニルおよびイソペンテニルが含まれる。
【０１０８】
［１０３］３〜１０の炭素原子を有する環状アルキルまたはアルケニルの例には、限定されるわけではないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロペンテニル、およびシクロヘキセニルが含まれる。
【０１０９】
［１０４］単純アリールには、６〜１０の炭素原子を有するアリールが含まれ、そして置換アリールには、１〜４の炭素原子を含有する少なくとも１つのアルキル置換基、またはメトキシ、エトキシなどのアルコキシ置換基、あるいはハロゲン置換基またはニトロ置換基を所持する、６〜１０の炭素原子を有するアリールが含まれる。
【０１１０】
［１０５］６〜１０の炭素原子を含有する単純アリールの例には、フェニルおよびナフチルが含まれる。
【０１１１】
［１０６］置換アリールの例には、ニトロフェニル、ジニトロフェニルが含まれる。
【０１１２】
［１０７］複素環芳香族ラジカルには、Ｎ、ＯまたはＳより選択される１つまたは２つのヘテロ原子を含有する３〜１０員環を有する基が含まれる。
【０１１３】
［１０８］ヘテロシクロアルキルラジカルには、Ｎ、ＯまたはＳより選択される１つまたは２つのヘテロ原子を含有する３〜１０員環系を含む、環状化合物が含まれる。
【０１１４】
［１０９］複素環芳香族ラジカルの例には、ピリジル、ニトロピリジル、ピロリル、オキサゾリル、チエニル、チアゾリル、およびフリルが含まれる。
【０１１５】
［１１０］ヘテロアルキルラジカルの例には、ジヒドロフリル、テトラヒドロフリル、テトラヒドロピロリル、ピペリジニル、ピペラジニル、およびモルホリノが含まれる。
【０１１６】
［１１１］米国特許第７，２７６，４９７号に解説される各メイタンシノイドもまた、本発明の細胞毒性コンジュゲートに使用可能である。米国特許第７，２７６，４９７号の全開示が、本明細書に援用される。
【０１１７】
ジスルフィド含有連結基
［１１２］変異体抗Ｃ２４２抗体Ａ７０Ｄ；Ｑ４５Ｋ／Ｒ；Ｄ２６Ｇ；Ｋ４６Ｅ；Ｋ４６Ｅ／Ｔ８９Ｖ；Ｋ４６Ｅ／Ｋ８２Ｓ；Ｋ４６Ｅ／Ｅ１６Ａ／Ｄ２６Ｇ；Ａ７０Ｄ／Ｋ４６Ｅ／Ｔ８９Ｖ；Ｋ４６Ｅ／Ｄ２６Ｇ；Ｋ４６Ｅ／Ｋ８２Ｓ／Ｄ２６Ｇ；Ｋ４６Ｅ／Ｔ８９Ｖ／Ｄ２６Ｇ；Ａ７０Ｄ／Ｋ４６Ｅ；Ｑ４５Ｋ（Ｒ）／Ｋ４６Ｅ／Ｔ８９Ｖ；Ａ７０Ｄ／Ｄ２６Ｇ；Ｑ４５Ｋ（Ｒ）／Ｋ４６Ｅ；Ａ７０Ｄ／Ｋ４６Ｅ／Ｄ２６Ｇ；Ｑ４５Ｋ（Ｒ）／Ｄ２６Ｇ；Ｑ４５Ｋ（Ｒ）／Ｋ４６Ｅ／Ｄ２６Ｇなどの抗体にメイタンシノイドを連結するため、メイタンシノイドは連結部分を含む。連結部分は、完全活性メイタンシノイドの放出を可能にする化学結合を特定の部位に含有する。適切な化学結合は、当該技術分野に周知であり、そしてこれには、ジスルフィド結合、酸不安定性結合、光解離結合、ペプチダーゼ不安定性結合およびエステラーゼ不安定性結合が含まれる。好ましいのはジスルフィド結合である。
【０１１８】
［１１３］連結部分はまた、反応性化学基も含む。好ましい態様において、ジスルフィド結合連結部分を介して、反応性化学基を、メイタンシノイドに共有結合させてもよい。
【０１１９】
［１１４］特に好ましい反応性化学基は、Ｎ−スクシンイミジルエステルおよびＮ−スルホスクシンイミジルエステルである。
【０１２０】
［１１５］反応性化学基を含有する連結部分を含む、特に好ましいメイタンシノイドは、連結部分がジスルフィド結合を含有し、そして化学反応基がＮ−スクシンイミジルまたはＮ−スルホスクシンイミジルエステルを含む、メイタンシノールのＣ−３エステルおよびその類似体である。
【０１２１】
［１１６］メイタンシノイド上の多くの位が、連結部分を化学的に連結する位として働きうる。例えば、ヒドロキシル基を有するＣ−３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ−１４位、ヒドロキシで修飾されたＣ−１５位、およびヒドロキシ基を有するＣ−２０位がすべて、有用であると期待される。しかし、Ｃ−３位が好ましく、そしてメイタンシノールのＣ−３位が特に好ましい。
【０１２２】
［１１７］連結部分を有するメイタンシノールのエステルの合成を、ジスルフィド結合を含有する連結部分の観点で記載する一方、当業者は、他の化学結合（上述のようなもの）を持つ連結部分もまた、本発明で使用可能であり、他のメイタンシノイドも使用可能であることを理解するであろう。他の化学結合の具体的な例には、酸不安定性結合、光解離結合、ペプチダーゼ不安定性結合およびエステラーゼ不安定性結合が含まれる。本明細書に援用される、米国特許第５，２０８，０２０号の開示は、こうした結合を所持するメイタンシノイドの産生を解説する。
【０１２３】
［１１８］反応性基を所持するジスルフィド部分を有するメイタンシノイドおよびメイタンシノイド誘導体の合成が、各々、本明細書に援用される、米国特許第６，４４１，１６３号および第６，３３３，４１０号、ならびに米国公報第２００３−００５５２２６  Ａ１号に記載される。
【０１２４】
［１１９］ＤＭ１などの反応性基含有メイタンシノイドを、変異体抗Ｃ２４２抗体Ａ７０Ｄ；Ｑ４５Ｋ／Ｒ；Ｄ２６Ｇ；Ｋ４６Ｅ；Ｋ４６Ｅ／Ｔ８９Ｖ；Ｋ４６Ｅ／Ｋ８２Ｓ；Ｋ４６Ｅ／Ｅ１６Ａ／Ｄ２６Ｇ；Ａ７０Ｄ／Ｋ４６Ｅ／Ｔ８９Ｖ；Ｋ４６Ｅ／Ｄ２６Ｇ；Ｋ４６Ｅ／Ｋ８２Ｓ／Ｄ２６Ｇ；Ｋ４６Ｅ／Ｔ８９Ｖ／Ｄ２６Ｇ；Ａ７０Ｄ／Ｋ４６Ｅ；Ｑ４５Ｋ（Ｒ）／Ｋ４６Ｅ／Ｔ８９Ｖ；Ａ７０Ｄ／Ｄ２６Ｇ；Ｑ４５Ｋ（Ｒ）／Ｋ４６Ｅ；Ａ７０Ｄ／Ｋ４６Ｅ／Ｄ２６Ｇ；Ｑ４５Ｋ（Ｒ）／Ｄ２６Ｇ；Ｑ４５Ｋ（Ｒ）／Ｋ４６Ｅ／Ｄ２６Ｇと反応させて、細胞毒性コンジュゲートを産生する。ＨＰＬＣによって、またはゲルろ過によって、これらのコンジュゲートを精製してもよい。
【０１２５】
［１２０］こうした抗体−メイタンシノイド・コンジュゲートを産生するためのいくつかの優れたスキームが、各々、その全体が本明細書に援用される、米国特許第６，３３３，４１０号、第６，４１１，１６３号および第６，７１６，８２１号、ならびに米国特許公報第２００３−００５５２２６  Ａ１号に提供される。
【０１２６】
［１２１］一般的に、水性緩衝液中の抗体溶液を、反応性基を所持するジスルフィド部分を有する、モル過剰のメイタンシノイドとインキュベーションしてもよい。過剰なアミン（エタノールアミン、タウリンなど）の添加によって、反応混合物の反応を停止してもよい。次いで、ゲルろ過によって、メイタンシノイド−抗体コンジュゲートを精製してもよい。
【０１２７】
［１２２］２５２ｎｍおよび２８０ｎｍの吸光度の比を、分光光度的に測定することによって、抗体分子あたりに結合するメイタンシノイド分子の数を決定してもよい。平均１〜１０のメイタンシノイド分子／抗体分子が好ましい。
【０１２８】
［１２３］メイタンシノイド薬剤と抗体のコンジュゲートを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、多様な望ましくない細胞株の増殖を抑制する能力に関して、評価してもよい。例えば、ヒト類表皮癌細胞株Ａ−４３１、ヒト小細胞肺癌細胞株ＳＷ２、ヒト乳房腫瘍細胞株ＳＫＢＲ３およびバーキットリンパ腫細胞株Ｎａｍａｌｗａなどの細胞株は、これらの化合物の細胞毒性の評価のため、容易に使用可能である。評価しようとする細胞を化合物に２４時間曝露して、そして既知の方法による直接アッセイにおいて、細胞の生存率を測定してもよい。次いで、アッセイ結果からＩＣ５０値を計算してもよい。
【０１２９】
ＰＥＧ含有連結基
［１２４］メイタンシノイドをまた、米国特許第６，７１６，８２１号に示されるように、ＰＥＧ連結基を用いて、抗体に連結してもよい。これらのＰＥＧ連結基は、水中および非水性溶媒中の両方で、可溶性であり、そしてこれを用いて、１以上の細胞毒性剤を、細胞結合性剤に連結してもよい。典型的なＰＥＧ連結基には、一端の官能性スルフヒドリル基またはジスルフィド基、およびもう一端の活性エステルを通じて、リンカーの反対の端で、細胞毒性剤および細胞結合性剤に結合する、ヘテロ二官能性ＰＥＧリンカーが含まれる。
【０１３０】
［１２５］ＰＥＧ連結基を用いた、細胞毒性コンジュゲートの合成の一般的な例として、具体的な詳細に関して、米国特許第６，７１６，８２１号に再び言及する。合成は、反応性ＰＥＧ部分を所持する１以上の細胞毒性剤と抗体の反応で始まり、この反応が、抗体のアミノ酸残基による、各反応性ＰＥＧ部分の末端活性エステルの置換を生じ、ＰＥＧ連結基を通じて抗体に共有結合した１以上の細胞毒性剤を含む、細胞毒性コンジュゲートを生じる。
【０１３１】
他の連結基
［１２６］切断不能リンカーを含むメイタンシノイド・コンジュゲートは、その全開示が本明細書に援用される、米国特許公報第２００５−０１６９９３３  Ａ１に記載される。
【０１３２】
タキサン
［１２７］本発明記載の細胞毒性コンジュゲートで用いる毒性剤はまた、タキサンまたはその誘導体であってもよい。
【０１３３】
［１２８］タキサンは、細胞毒性天然産物であるパクリタキセル（タキソール）、および半合成誘導体であるドセタキセル（タキソテール）を含む化合物ファミリーであり、これらの２つの化合物は、癌の治療に広く用いられている。タキサンは、チューブリンの脱分極を阻害し、細胞死を生じる、紡錘体毒物である。ドセタキセルおよびパクリタキセルは、癌治療に有用な剤であるが、正常細胞に対して非特異的に毒性であるため、その抗腫瘍活性は限定される。さらに、パクリタキセルおよびドセタキセルのような化合物は、それ自体、細胞結合性剤のコンジュゲートにおいて使用するには、十分に強力ではない。
【０１３４】
［１２９］細胞毒性コンジュゲートの調製に使用するのに好ましいタキサンは、式（ＸＩ）のタキサン：
【０１３５】
【化１０】
2010508043.tif 000011
【０１３６】
である。
【０１３７】
［１３０］抗体などの細胞結合性剤にタキサンをコンジュゲート化するための方法とともに、本発明の細胞毒性コンジュゲートにおいて使用可能な典型的なタキサンを合成するための方法が、米国特許第５，４１６，０６４号、第５，４７５，０９２号、第６，３４０，７０１号、第６，３７２，７３８号、第６，４３６，９３１号、第６，５９６，７５７号、第６，７０６，７０８号および第６，７１６，８２１号、ならびに米国特許公報第２００４−００２４０４９  Ａ１号に詳細に記載される。
【０１３８】
ＣＣ−１０６５類似体
［１３１］本発明記載の細胞毒性コンジュゲートで使用する毒性剤はまた、ＣＣ−１０６５またはその誘導体であってもよい。
【０１３９】
［１３２］ＣＣ−１０６５は、ストレプトミセス・ゼレンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｚｅｌｅｎｓｉｓ）の培養ブロスから単離される、強力な抗腫瘍抗生物質である。ＣＣ−１０６５は、ドキソルビシン、メトトレキセートおよびビンクリスチンなどの、一般的に用いられる抗癌薬剤よりも、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、約１０００倍強力である（Ｂ．Ｋ．  Ｂｈｕｙａｎら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ４２，  ３５３２−３５３７（１９８２））。本発明で使用するのに適したＣＣ−１０６５およびその類似体の限定されない例は、米国特許第６，３７２，７３８号、第６，３４０，７０１号、第５，８４６，５４５号および第５，５８５，４９９号に開示される。
【０１４０】
［１３３］ＣＣ−１０６５の細胞毒性能は、そのアルキル化活性、およびそのＤＮＡ結合活性またはＤＮＡ挿入（intercalating）活性と相関付けられてきている。これらの２つの活性は、分子の別個の部分に属する。したがって、アルキル化活性は、シクロプロパピロロインドール（ＣＰＩ）・サブユニット中に含有され、そしてＤＮＡ結合活性は、２つのピロロインドール・サブユニット中に属する。
【０１４１】
［１３４］ＣＣ−１０６５は、細胞毒性剤として特定の魅力的な特徴を有するが、療法的使用においては限界を有する。マウスにＣＣ−１０６５を投与すると、遅延型肝毒性が引き起こされ、１２．５μｇ／ｋｇの単回静脈内用量後、第５０日での死亡を導く｛Ｖ．  Ｌ．  Ｒｅｙｎｏｌｄｓら，  Ｊ．  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，  ＸＸＩＸ，  ３１９−３３４（１９８６）｝。このことから、遅延型毒性を引き起こさない類似体を開発する努力に拍車がかかり、そしてＣＣ−１０６５をモデルとするより単純な類似体の合成が記載されてきている｛Ｍ．Ａ．  Ｗａｒｐｅｈｏｓｋｉら，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．，  ３１，  ５９０−６０３（１９８８）｝。
【０１４２】
［１３５］本発明で有用な別の一連の類似体において、ＣＰＩ部分がシクロプロパベンズインドール（ＣＢＩ）部分によって置換された｛Ｄ．Ｌ．  Ｂｏｇｅｒら，  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．，  ５５，  ５８２３−５８３３，  （１９９０），  Ｄ．Ｌ．  Ｂｏｇｅｒら，  ＢｉｏＯｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．，  １，  １１５−１２０（１９９１）｝。これらの化合物は、マウスにおいて、遅延型毒性を引き起こすことなく、親薬剤の高いｉｎ  ｖｉｔｒｏ強度を維持する。ＣＣ−１０６５同様、これらの化合物は、共有方式でＤＮＡの副溝に結合して、細胞死を生じる、アルキル化剤である。しかし、最も有望な類似体、アドゼレシンおよびカルゼレシンの臨床的評価は、期待はずれの結果を導いた｛Ｂ．Ｆ．  Ｆｏｓｔｅｒら，  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇｓ，  １３，  ３２１−３２６（１９９６）；  Ｉ．  Ｗｏｌｆｆら，  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ２，  １７１７−１７２３（１９９６）｝。これらの薬剤は、全身毒性が高いため、劣った療法効果を示す。
【０１４３】
［１３６］腫瘍部位へのターゲティング化送達を通じて、ｉｎ  ｖｉｖｏ分布を変化させ、ターゲティングされない組織に対する、より低い毒性、そしてしたがって、より低い全身毒性を生じることによって、ＣＣ−１０６５類似体の療法的有効性を非常に改善することも可能である。この目的を達成するため、腫瘍細胞を特異的にターゲティングする、細胞結合性剤とＣＣ−１０６５の類似体および誘導体のコンジュゲートが記載されてきている｛米国特許第５，４７５，０９２号；第５，５８５，４９９号；第５，８４６，５４５号｝。これらのコンジュゲートは、典型的には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで高いターゲット特異的細胞毒性を示し、そしてマウスにおけるヒト腫瘍異種移植片モデルにおいて、ひときわ優れた抗腫瘍活性を示す｛Ｒ．Ｖ．Ｊ．  Ｃｈａｒｉら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ５５，  ４０７９−４０８４（１９９５）｝。
【０１４４】
［１３７］抗体などの細胞結合性剤に類似体をコンジュゲート化するための方法とともに、本発明の細胞毒性コンジュゲートで使用可能なＣＣ−１０６５類似体を合成するための方法が、米国特許第５，４７５，０９２号、第５，８４６，５４５号、第５，５８５，４９９号、第６，５３４，６６０号、第６，５８６，６１８号、および第６，７５６，３９７号に、そして米国特許公報第２００３−０１９５３６５  Ａ１号に、詳細に記載される。
【０１４５】
他の薬剤
［１３８］メトトレキセート、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、カリケアマイシン、チューブリシン（ｔｕｂｕｌｙｓｉｎ）およびチューブリシン類似体、デュオカルマイシンおよびデュオカルマイシン類似体、ドラスタチンおよびドラスタチン類似体、例えばオーリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）および類似体などの薬剤もまた、本発明のコンジュゲートの調製に適している。また、血清アルブミンなどの仲介キャリアー分子を通じて、抗体分子に薬剤分子を連結させてもよい。例えば、米国第０９／７４０９９１号に記載されるように、ドキサルビシン（Ｄｏｘａｒｕｂｉｃｉｎ）およびダノルビシン（Ｄａｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）化合物もまた、有用な細胞毒性剤でありうる。これらの薬剤はまた、以下に論じるような共療法に用いてもよい。
【０１４６】
共療法
［１３９］句「併用療法」（または「共療法」）は、ｈｕＣ２４２抗体の変異体などの変異体抗体、化学療法剤または免疫毒素の使用を意味し、そして薬剤併用の有益な効果を提供するレジメンで、連続した方式での各剤の投与を含むよう意図される。共療法はまた、例えば、これらの活性剤を固定した比で有する単一投薬量を摂取することによって、または各剤に関して多数の別個の薬剤を摂取することによって、実質的に同時の方式で、これらの剤を共投与することを含むよう意図される。「併用療法」にはまた、静脈内、筋内または他の非経口経路による、体内への同時または連続投与も含まれ、副鼻腔経路で見られるような粘膜組織を通じた直接吸収が含まれる。連続投与にはまた、個々の要素を異なる時点で、そして／または異なる経路によって投与してもよいが、組み合わせで作用して、有益な効果を提供する、薬剤併用も含まれる。
【０１４７】
［１４０］句「療法的に有効」は、腫瘍、例えば腫瘍の進行を、減少させるかまたは防止する際の改善の目的を達成しつつ、各剤に典型的には関連する副作用を回避するであろう、併用療法において使用するための各剤の量を適格とすることが意図される。
【０１４８】
［１４１］好ましい併用療法は、本質的に２以上の活性剤、すなわち、変異体ｈｕＣ２４２の裸の抗体またはそのコンジュゲート、および免疫毒素、化学療法剤、免疫調節剤または変異体抗体とは異なる抗体から選択される他の剤からなる。剤は、任意の１つの他の剤に対する裸の抗体またはそのコンジュゲートの約０．５対１〜約２０対１の重量比範囲の組み合わせで用いられる。最終的には抗体またはコンジュゲートおよび任意の１つの他の剤の選択に応じて、これらの２つの剤の好ましい範囲は、約１対１〜約１５対１であり、一方、より好ましい範囲は、約１対１〜約５対１であろう。また、患者の必要性に応じて、抗体またはそのコンジュゲート、および他の剤の比を逆転させてもよい。例えば、最初の治療後、変異体の裸の抗体またはそのコンジュゲートに比較した際、他の剤の１つのより高い用量に、患者がより反応性であることが見出されたならば、こうした薬剤の提供者は、治療がより有効であるように比を切り替えてもよい。免疫毒素の調製は、一般的に、当該技術分野に周知である（例えば、本明細書に援用される、米国特許第４，３４０，５３５号を参照されたい）。以下の特許および特許出願は各々、免疫毒素生成、精製および使用に関する本発明の解説をさらに補充する目的のため、本明細書にさらに援用される：米国特許第５，８５５，８６６号；第５，７７６，４２７号；第５，８６３，５３８号；第６，００４，５５４号；第５，９６５，１３２号；第６，０５１，２３０号；および第５，６６０，８２７号；ならびに米国出願第０７／８４６，３４９号。
【０１４９】
［１４２］また、ｈｕＣ２４２変異体などの変異体抗体を、免疫調節剤に直接または間接的に結合させてもよい。何らかの方式で、本発明の抗体による腫瘍の破壊を増加させうる生物学的反応修飾剤（免疫調節剤など）の中には：腫瘍壊死因子、マクロファージ活性化因子、コロニー刺激因子、インターフェロンなどのリンホカインが含まれる。
【０１５０】
［１４３］共療法が注射可能複合体を含む場合、ホルモン、免疫抑制剤、抗生物質、細胞分裂阻害剤、利尿剤、胃腸剤、心臓血管剤、抗炎症剤、鎮痛剤、局所麻酔剤、および神経薬理学的剤からなる群より選択される療法剤をさらに含んでもよく、これらの剤は、いかなる副作用のリスクも低下させるように投与される。
【０１５１】
療法組成物
［１４４］本発明はまた、療法的有効量の本発明の変異体抗体および薬学的に許容されうるキャリアーを含む、哺乳動物における、過剰増殖障害の治療のための療法組成物にも関する。１つの態様において、薬学的組成物は、肺、乳房、結腸、前立腺、腎臓、膵臓、卵巣、子宮頸部およびリンパ器官の癌、骨肉腫、滑膜癌、ＣａｎＡｇが発現されている肉腫または癌腫、およびＣａｎＡｇが主に発現されるとこれから決定されるはずの他の癌の治療用である。別の態様において、薬学的組成物は、例えば、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、および多発性硬化症などの自己免疫疾患；腎移植拒絶、肝移植拒絶、肺移植拒絶、心臓移植拒絶、および骨髄移植拒絶などの移植片拒絶；移植片対宿主病；ｍＶ感染、ＨＩＶ感染、ＡＩＤＳ等のウイルス感染；ならびにランブルべん毛虫症、アメーバ症、住血吸虫症などの寄生虫感染および一般の当業者によって決定されるような他のものなどの他の障害の治療に関する。
【０１５２】
［１４５］本発明は：
本発明の変異体抗体またはそのエピトープ結合性断片、あるいは細胞毒性剤および変異体抗体またはそのエピトープ結合性断片のコンジュゲートの有効量、ならびに
不活性または生理学的に活性であってもよい、薬学的に許容されうるキャリアー
を含む薬学的組成物を提供する。
【０１５３】
［１４６］本明細書において、「薬学的に許容されうるキャリアー」には、生理学的に適合する、あらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌および抗真菌剤等が含まれる。適切なキャリアー、希釈剤および／または賦形剤の例には、１以上の水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等、ならびにその組み合わせが含まれる。多くの場合で、組成物中に、糖、多価アルコール、または塩化ナトリウムなどの等張剤を含むことが好ましいであろう。特に、適切なキャリアーの適切な例には：（１）約１ｍｇ／ｍｌ〜２５ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミンを含有するかまたは含有しない、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ〜７．４、（２）０．９％生理食塩水（０．９％ｗ／ｖ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ））、および（３）５％（ｗ／ｖ）デキストロースが含まれ；そしてまた、こうしたキャリアーは、トリプタミンなどの酸化防止剤、およびＴｗｅｅｎ２０などの安定化剤もまた含有してもよい。
【０１５４】
［１４７］本明細書記載の組成物はまた、治療中の特定の障害に対して必要とされるように、さらなる療法剤も含有してもよい。好ましくは、本発明の変異体抗体またはそのエピトープ結合性断片、あるいは細胞毒性剤および変異体抗体またはそのエピトープ結合性断片のコンジュゲート、ならびに補助活性化合物は、互いに不都合に影響を及ぼさない、相補的活性を有するであろう。好ましい態様において、さらなる療法剤は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、組織因子（ＴＦ）、プロテインＣ、プロテインＳ、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、またはＨＥＲ２受容体のアンタゴニストである。
【０１５５】
［１４８］本発明の組成物は、多様な型であってもよい。これらには、例えば、液体、半固体、および固体投薬型が含まれるが、好ましい型は、意図される投与様式および療法適用に応じる。典型的な好ましい組成物は、注射可能または注入可能溶液の型であってもよい。好ましい投与様式は、非経口（例えば静脈内、筋内、腹腔内、皮下）である。好ましい態様において、本発明の組成物をボーラスとして、または一定の期間に渡る連続注入によって、静脈内投与する。別の好ましい態様において、局所ならびに全身性療法効果を発揮するように、筋内、皮下、関節内、滑膜内、腫瘍内、腫瘍周辺、病巣内、または病巣周辺経路によって、これらを注射する。
【０１５６】
［１４９］本発明の変異体抗体またはそのエピトープ結合性断片、あるいは細胞毒性剤および変異体抗体またはそのエピトープ結合性断片のコンジュゲートを、必要な量で、適切な溶媒中に取り込み、その後、精密ろ過によって滅菌することによって、非経口投与のための無菌組成物を調製してもよい。溶媒またはビヒクルとして、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等、ならびにその組み合わせが使用可能である。多くの場合で、組成物中に、糖、多価アルコール、または塩化ナトリウムなどの等張剤を含むことが好ましいであろう。これらの組成物はまた、佐剤、特に、湿潤剤、等張化剤、乳化剤、分散剤および安定化剤も含有してもよい。非経口投与のための無菌組成物はまた、使用時に滅菌水または任意の他の注射可能無菌媒体中に溶解してもよい、無菌固形組成物の形でも調製可能である。
【０１５７】
［１５０］本発明の変異体抗体またはそのエピトープ結合性断片、あるいは細胞毒性剤および変異体抗体またはそのエピトープ結合性断片のコンジュゲートはまた、経口投与可能である。経口投与用の固形組成物として、錠剤、丸剤、粉末（ゼラチンカプセル、サシェー剤）または顆粒が使用可能である。これらの組成物において、本発明記載の活性成分を、アルゴン流下で、デンプン、セルロース、スクロース、ラクトースまたはシリカなどの１以上の不活性希釈剤と混合する。これらの組成物はまた、希釈剤以外の物質、例えばステアリン酸マグネシウムもしくはタルク、着色剤、コーティング剤（糖衣錠剤）またはグレーズなどの１以上の潤滑剤も含んでもよい。
【０１５８】
［１５１］経口投与用の液体組成物として、水、エタノール、グリセロール、植物油またはパラフィンオイルなどの不活性希釈剤を含有する、薬学的に許容されうる溶液、懸濁物、エマルジョン、シロップおよびエリキシルを用いてもよい。これらの組成物は、希釈剤以外の物質、例えば、湿潤剤、甘味料、増粘剤、フレーバー剤または安定化製品を含んでもよい。
【０１５９】
［１５２］用量は、所望の効果、治療期間、および用いる投与経路に応じ；一般的には、成人に関して、１日あたり、経口で５ｍｇ〜１０００ｍｇであり、単位用量は活性物質１ｍｇ〜２５０ｍｇの範囲である。一般的に、年齢、体重および治療しようとする被験体に特異的な他の任意の要因に応じて、医師が適切な投薬量を決定するであろう。
【０１６０】
［１５３］所望の度合いの純度を有する変異体またはそのコンジュゲートを、場合によって生理学的に許容されうるキャリアー、賦形剤または安定化剤と混合することによって、保存用に調製されるアゴニストまたはアンタゴニストとして、水性溶液または凍結乾燥配合物の型で、療法配合物中で、本発明の改善されたまたは変異体抗体またはそのコンジュゲートを用いてもよい［Remington's Pharmaceutical Sciences  第１６版，  Osol, A.監修（１９８０）；米国特許出願第１０／８４６，１２９号］。許容されうるキャリアー、賦形剤、または安定化剤は、使用する投薬量および濃度でレシピエントに非毒性であり、そしてリン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンを含む酸化防止剤；保存剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリン類を含む、単糖、二糖、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質錯体）；および／またはＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。
【０１６１】
［１５４］変異体はまた、リポソーム中に配合されてもよい。Epsteinら，  Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688(1985)；  Hwangら，  Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030(1980)；ならびに米国特許第４，４８５，０４５号および第４，５４４，５４５号に記載されるものなど、当該技術分野に知られる方法によって、関心対象の分子を含有するリポソームを調製する。循環時間が増進したリポソームが、米国特許第５，０１３，５５６号に開示される。
【０１６２】
［１５５］ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発法によって、特に有用なイムノリポソームを生成することも可能である。定義される孔サイズのフィルターを通じてリポソームを押し出して、望ましい直径のリポソームを生じる。Ｍａｒｔｉｎら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５７：２８６−２８８（１９８２）に記載されるように、ジスルフィド交換反応を介して、本発明の抗体のＦａｂ’断片をリポソームにコンジュゲート化してもよい。化学療法剤（ドキソルビシンなど）が、場合によってリポソーム内に含有される。Ｇａｂｉｚｏｎら，  Ｊ．  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．  ８１（１９）：１４８４（１９８９）を参照されたい。
【０１６３】
［１５６］本明細書記載の配合物はまた、治療される特定の徴候のために、必要であるように、１より多い活性化合物、好ましくは、互いに不都合に影響を及ぼさない、相補的活性を持つものも含有してもよい。こうした分子は、適切に、意図される目的に有効な量で、組み合わせて存在する。例えば、Ｃ２４２変異体またはそのコンジュゲートを、化学療法剤などの共療法剤と組み合わせてもよい。
【０１６４】
［１５７］例えばコアセルベーション技術によって、または界面重合によって、調製されたマイクロカプセル、それぞれ例えばヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセルに、コロイド薬剤送達系に（例えば、リポソーム、アルブミン微小球体、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）、またはマクロエマルジョンに、活性成分を被包することもまた可能である。こうした技術が、Remington's, Pharmaceutical Sciences  第１６版  Osol, A.監修（１９８０）に開示される。
【０１６５】
［１５８］ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に用いようとする配合物は、無菌でなければならない。これは、上に論じるように、滅菌ろ過膜を通じたろ過によって容易に達成される。
【０１６６】
［１５９］持続性放出調製物を調製することも可能である。持続性放出調製物の適切な例には、アンタゴニストを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、このマトリックスは、成型された物品の形、例えばフィルム、またはマイクロカプセルである。持続性放出マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル［例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール）］、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸およびエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、分解不能エチレン−酢酸ビニル、分解可能乳酸−グリコール酸コポリマー、例えばＬｕｐｒｏｎ  ＤｅｐｏｔＴＭ（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドで構成される注射可能微小球体）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸などのポリマーは、１００日以上に渡って分子を放出することが可能であるが、特定のヒドロゲルは、より短い期間でタンパク質を放出する。被包抗体は、長期間体内に留まると、３７℃で水分に曝露された結果、変性するかまたは凝集し、生物学的活性の損失を生じ、そして免疫原性の変化を生じうる。関与する機構に応じて、安定化のため、合理的戦略を考案することが可能である。例えば、凝集機構が、チオジスルフィド交換を通じた、分子間Ｓ−Ｓ結合形成であることが発見されたならば、安定化は、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥し、水分含量を調節し、適切な添加剤を用い、そして特定のポリマーマトリックス組成を発展させることによって、達成可能である。
【０１６７】
療法的使用法
［１６０］別の態様において、本発明は、抗ＣＤ４４／ＣａｎＡｇ（抗原）の機能をアンタゴナイズする抗体を、必要な患者に投与することによって、Ｃ２４２抗原活性を阻害するための方法を提供する。本発明の変異体抗体またはそのエピトープ結合性断片、あるいは細胞毒性剤および変異体抗体またはそのエピトープ結合性断片のコンジュゲートのいずれかを療法的に用いてもよい。
【０１６８】
［１６１］好ましい態様において、本発明の変異体抗体またはそのエピトープ結合性断片、あるいは細胞毒性剤および変異体抗体またはそのエピトープ結合性断片のコンジュゲートを、哺乳動物における過剰増殖障害の治療に用いる。より好ましい態様において、上に開示し、そして本発明の変異体抗体またはそのエピトープ結合性断片、あるいは細胞毒性剤および変異体抗体またはそのエピトープ結合性断片のコンジュゲートを含有する、薬学的組成物の１つを、哺乳動物における過剰増殖障害の治療に用いる。好ましくは、障害は、肺、乳房、結腸、前立腺、腎臓、膵臓、卵巣、子宮頸部およびリンパ器官の癌、骨肉腫、滑膜癌、ＣａｎＡｇが発現されている肉腫または癌腫、およびＣａｎＡｇが主に発現されるとこれから決定されるはずの他の癌である。別の態様において、前記薬学的組成物は、例えば、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、および多発性硬化症などの自己免疫疾患；腎移植拒絶、肝移植拒絶、肺移植拒絶、心臓移植拒絶、および骨髄移植拒絶などの移植片拒絶；移植片対宿主病；ｍＶ感染、ＨＩＶ感染、ＡＩＤＳ等のウイルス感染；ならびにランブルべん毛虫症、アメーバ症、住血吸虫症などの寄生虫感染および一般の当業者によって決定されるような他のものなどの他の障害に関する。
【０１６９】
［１６２］同様に、本発明は、選択された細胞集団の増殖を阻害するための方法であって、ＣａｎＡｇを発現する、ターゲット細胞、またはターゲット細胞を含有する組織を、本発明の変異体抗体もしくはそのエピトープ結合性断片、または細胞毒性剤および変異体抗体もしくはそのエピトープ結合性断片のコンジュゲート、あるいは変異体抗体もしくはそのエピトープ結合性断片、または細胞毒性剤および変異体抗体もしくはそのエピトープ結合性断片のコンジュゲートを含む療法剤の有効量と、単独で、あるいは他の細胞毒性剤または療法剤と組み合わせて接触させる工程を含む、前記方法を提供する。
【０１７０】
［１６３］選択した細胞集団の増殖を阻害するための方法を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、またはｅｘ  ｖｉｖｏで実施してもよい。本明細書において、「増殖の阻害」は、短期間であれ、または長期間であれ、細胞増殖の遅延、細胞生存度の減少、細胞死の誘発、細胞溶解、および細胞死の誘導を意味する。
【０１７１】
［１６４］ｉｎ  ｖｉｔｒｏ使用の例には、同じ患者への移植前の、疾患細胞または悪性細胞を殺すための自己骨髄の治療；適格性Ｔ細胞を殺し、そして移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を防止するための、移植前の骨髄の治療；ターゲット抗原を発現していない望ましい変異体以外のすべての細胞を殺すか；または望ましくない抗原を発現する変異体を殺すための、細胞培養の治療が含まれる。
【０１７２】
［１６５］非臨床的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ使用の条件は、一般の当業者によって容易に決定される。
【０１７３】
［１６６］臨床的ｅｘ  ｖｉｖｏ使用の例は、癌治療において、または自己免疫疾患治療において、自己移植前に、骨髄から腫瘍細胞またはリンパ球を取り除くこと、あるいは移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を防止するため、移植前に、自己または同種骨髄または組織からＴ細胞および他のリンパ球を取り除くことである。治療を以下のように行ってもよい。骨髄を患者または他の個体から採取し、そして次いで、本発明の変異体抗体またはそのエピトープ結合性断片、あるいは細胞毒性剤および変異体抗体またはそのエピトープ結合性断片のコンジュゲートを添加した、血清を含有する培地中でインキュベーションする。濃度は、約１０μＭ〜１ｐＭの範囲であり、約３７℃で約３０分間〜約４８時間、インキュベーションする。濃度およびインキュベーション時間、すなわち用量の正確な条件は、一般の当業者によって容易に決定される。インキュベーション後、血清を含有する培地で、骨髄細胞を洗浄し、そして既知の方法にしたがって、ｉ．ｖ．注入によって、患者に戻す。患者が骨髄採取時および処置細胞の再注入の間に切除化学療法または全身照射過程などの他の治療を受ける状況下では、標準的医学装置を用いて、液体窒素中で処置骨髄細胞を凍結保存する。
【０１７４】
［１６７］臨床的ｉｎ  ｖｉｖｏ使用のため、本発明の変異体抗体またはそのエピトープ結合性断片、あるいは細胞毒性剤および変異体抗体またはそのエピトープ結合性断片のコンジュゲートを溶液として供給して、無菌性および内毒素レベルに関して試験する。細胞毒性コンジュゲート投与の適切なプロトコルの例は、以下のとおりである。コンジュゲートを毎週、４週間、ｉ．ｖ．ボーラスとして投与する。ボーラス用量は、生理食塩水５０〜１００ｍｌ中で投与され、これに５〜１０ｍｌのヒト血清アルブミンを添加してもよい。投薬量は、ｉ．ｖ．投与あたり１０μｇ〜１ｇである（１日あたり、１００ｎｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲）。より好ましくは、投薬量は、５０μｇ〜３０ｍｇの範囲であろう。最も好ましくは、投薬量は、１ｍｇ〜２０ｍｇの範囲であろう。治療４週後、患者に、毎週、治療を投与し続けてもよい。臨床状況が保証するように、投与経路、賦形剤、希釈剤、投薬量、時間等に関して、具体的な臨床プロトコルを、一般の当業者が決定してもよい。
【０１７５】
診断
［１６８］また、本発明の抗体または抗体断片を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで、生物学的試料中のＣ２４２抗原（抗ＣＤ４４／ＣａｎＡｇ）を検出してもよい。１つの態様において、本発明の変異体Ｃ２４２抗体を用いて、組織中または組織由来の細胞中の抗ＣＤ４４／ＣａｎＡｇレベルを決定する。好ましい態様において、組織は疾患組織である。該方法の好ましい態様において、組織は腫瘍またはその生検である。該方法の好ましい態様において、組織またはその生検をまず、患者から切り出して、そして次いで、本発明の抗体または抗体断片を用いたイムノアッセイにおいて、組織または生検中の抗ＣＤ４４／ＣａｎＡｇのレベルを決定してもよい。組織またはその生検を凍結するかまたは固定してもよい。同じ方法を用いて、翻訳後修飾（例えばグリコール化）、細胞表面レベル、または細胞局在など、抗ＣＤ４４／ＣａｎＡｇの他の特性を決定してもよい。
【０１７６】
［１６９］上述の方法を用いて、癌を有することが知られるか、または推測される被験体において、癌を診断することも可能であり、ここで、前記患者において測定されたＣａｎＡｇのレベルを、正常参照被験体または標準のものと比較する。次いで、前記方法を用いて、腫瘍がＣａｎＡｇを発現しているかどうかを決定してもよく、これは、腫瘍が、本発明の抗体、抗体断片または抗体コンジュゲートでの治療によく反応するであろうことを示唆しうる。好ましくは、腫瘍は、肺、乳房、結腸、前立腺、腎臓、膵臓、卵巣、子宮頸部およびリンパ器官の癌、骨肉腫、滑膜癌、ＣａｎＡｇが発現されている肉腫または癌腫、およびＣａｎＡｇが主に発現されるとこれから決定されるはずの他の癌である。
【０１７７】
［１７０］本発明は、研究または診断適用で使用するためにさらに標識されている、変異体モノクローナル抗体、変異体ヒト化抗体およびそのエピトープ結合性断片をさらに提供する。好ましい態様において、標識は、放射標識、蛍光体、発色団、画像化剤または金属イオンである。
【０１７８】
［１７１］前記の標識抗体またはそのエピトープ結合性断片を、癌を有すると推測される被験体に投与し、そして被験体体内の標識分布を測定するかまたは監視する、診断法もまた、提供する。
【０１７９】
キット
［１７２］本発明にはまた、例えば記載する細胞毒性コンジュゲート、および特定の細胞種を殺すための細胞毒性コンジュゲートの使用のための説明書を含むキットも含まれる。使用説明書には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで細胞毒性コンジュゲートを使用するための指示が含まれてもよい。
【０１８０】
［１７３］典型的には、キットは、細胞毒性コンジュゲートを含有する区画を有するであろう。細胞毒性コンジュゲートは、凍結乾燥型、液体型、またはキットに含まれるよう受け入れ可能な他の型であってもよい。キットはまた、キット中の使用説明書に記載される方法を実施するのに必要なさらなる要素、例えば凍結乾燥粉末を再構成するための滅菌溶液、患者に投与する前に、細胞毒性コンジュゲートと組み合わせるためのさらなる剤、および患者にコンジュゲートを投与するのに役立つツールも含有してもよい。
【０１８１】
コンセンサス配列の設計
［１７４］Ｋａｂａｔネズミ抗体配列データベース中の各位に存在する残基を数え上げることによって、コンセンサス配列を生成した。配列分析およびデータ管理ソフトウェア「Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ」（Invitrogen Corp.製品）中のＣｌｕｓｔａｌＷモジュールを用いて、数千の軽鎖および重鎖可変領域配列を並列させた。Lu G, Moriyama EN Vector NTI, a balanced all-in-one sequence analysis suite. Brief Bioinform. 2004 Dec;5(4):378-88もまた参照されたい。並列を、Microsoft Excelスプレッドシートに取り込んで、どの残基が、ネズミ軽鎖および重鎖可変領域データベース中の各位で最も頻繁に見られるかを計算し、そして次いで、「コンセンサス」配列として、結果を出力する。ときどき、２つのアミノ酸残基間でコンセンサスが分かれうるが、その場合、２つの保存されたアミノ酸のうち少ない方を選択して、抗体の生物物理学的特性またはヒト化考慮を増進させる。例えば、本発明の場合、軽鎖中のＱ４５をＲで置換し、これは、非コンセンサス残基を、Ｋであるネズミコンセンサス残基で置換していない。こうした観察は、過度の実験またはこれらの具体的な詳細を必要とせずに、当業者には、明らかであろう。
【０１８２】
［１７５］Ｋａｂａｔ配列データベースは、ライセンスを購入することによって、商業的に入手可能である。さらに、ＮＣＢＩウェブサイト上で、数千のネズミ抗体配列が、ダウンロードのために公的に入手可能であり、そしてこれらの配列を用いて、類似のデータを生成可能である。
【０１８３】
［１７６］本明細書、および続く実施例に引用されるすべての参考文献は、その全体が本明細書に完全に援用される。
【０１８４】
［１７７］本発明の広い範囲は、以下の実施例を参照して最適に理解され、実施例は、本発明を具体的な態様に限定することを意図されない。
【実施例】
【０１８５】
材料
［１７８］標準的ＣｓＣｌ２精製技術によって、ｐＳｙｎＣ２４２および対照プラスミドプレップを調製した。QuikChange部位特異的突然変異誘発系をStratageneから得た（＃２００５１８）。RNeasyミニキットをQiagenから注文した（＃７４１０４）。逆転写酵素反応用のSuperscript第一鎖合成系をGibcoBRLから得た（＃１１９０４−４１８）。Cyber GreenリアルタイムＰＣＲマスターミックスをApplied Biosystemsから得た（＃４３０９１５５）。フルオレセイン・コンジュゲート化ストレプトアビジンをJackson Immuno Researchから得た（＃０１６−０１０−０８４  １ｍｇ／ｍｌ）。９６ウェルＵ底プレートをFALCONから得た（＃３０７７）。ＥＺ−Ｌｉｎｋスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンをPierceから得た（＃２１３３５）。
【０１８６】
方法
部位特異的突然変異誘発による、ｈｕＣ２４２  ＨＣおよびＬＣフレームワークに対するアミノ酸置換
プライマー設計
［１７９］突然変異誘発反応のための相補的ＰＣＲプライマー対は、長さ３０塩基であり、そしてプライマー中央に所望のヌクレオチド（単数または複数）置換を含有した。プライマーをＰＡＧＥ精製し、そして１５０ｎｇ／μｌで再構成した。
【０１８７】
ＰＣＲ突然変異誘発反応
［１８０］ＰＣＲ反応を以下のように調製した：薄壁エッペンドルフ（epidorf）試験管中、５μｌの１０ｘ反応緩衝液（Stratagene）、２０ｎｇのｄｓＤＮＡテンプレート、０．８５μｌ（１２５ｎｇ）の順方向プライマー、０．８５μｌ（１２５ｎｇ）の逆方向プライマー、１μｌの４００ｍＭ  ｄＮＴＰ（Stratagene）、およびｄｄＨ２Ｏを最終体積５０μｌまで添加した。最後に、１μｌのＰｆｕＴｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ／μｌ、Stratagene）を反応混合物に添加し、そして試験管をMJ Researchサーマルサイクラーに入れた。反応条件は以下の通りであった：
９５℃３０秒間を１サイクル
９５℃３０秒間、その後の５５℃１分間、および６８℃１１分間（１１ｋｂテンプレートで１分間／ｋｂ）を１２サイクル。２塩基を変化させた場合は、サイクル数を１４に増加させた。
６８℃８分間を１サイクル
４℃で維持
コンピテント細胞の形質転換を以下のように行った：
［１８１］ＰＣＲテンプレートＤＮＡを、メチル化依存性制限酵素、Ｄｐｎ１（Stratagene）での消化によって中和した。１μｌのＤｐｎ１をＰＣＲ反応に直接添加し、そして２７℃で１時間インキュベーションして制限消化を行った。次いで反応は、３μｌのＤｐｎ１消化ＰＣＲ産物を５０μｌのＸＬ−１コンピテント細胞（Stratagene）に添加し、氷上で３０分間インキュベーションし、その後、４２℃で４５秒間、熱パルス処理し、氷上に２分間戻し、そして次いで、０．５ｍｌのＳＯＣ緩衝液を添加して、２２５ｒｐｍで振盪しながら３７℃で１時間、最終インキュベーションすることによって、形質転換した。形質転換細胞をＬＢ／Ａｍｐプレート上にプレーティングし（プレートあたり３００μｌ）、そして３７℃で一晩インキュベーションした。
【０１８８】
突然変異誘発の確認
［１８２］Qiagenミニプレップカラムを用いて、形質転換コロニーからプラスミドＤＮＡを単離し、そしてアガロースゲル電気泳動によってスクリーニングした。予期される突然変異誘発産物を確認するため、ＶＨおよびＶＬ領域を配列決定することによって、テンプレートＤＮＡと同じ電気泳動移動度を維持したプラスミドをさらに解析した。標準的自動化配列決定技術によって、配列決定反応を行った（Sterky F, Lundeberg J Sequence analysis of genes and genomes. J Biotechnol. 2000 Jan 7;76(1): 1-31）。
【０１８９】
一過性トランスフェクション
［１８３］QiagenのSuperfection試薬キットを用いて、抗体発現プラスミドでの一過性トランスフェクションを行った。試験プラスミド間のトランスフェクション同等性を確実にするため、ＯＤ２６０によってＤＮＡ濃度を測定し、そしてアガロースゲル上での視覚化によって確認した。トランスフェクション前に、６ウェルプレート中、ウェルあたり３ｘ１０５の２９３Ｔ細胞をプレーティングした。２μｇのプラスミドＤＮＡ（またはブランク対照のため、ＴＥ）を含む、ウェルあたり０．６ｍｌのトランスフェクション混合物を作製し、１５μｌのSuperfect（Qiagen）と混合し、そしてＲＴで１０分間インキュベーションした。混合物を２９３Ｔ細胞に添加し、次いでこれを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中に２時間入れた。次に、細胞を細胞培地で洗浄し、そして最終的に１ｍｌの培地中、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で、０時間、１４時間、２２時間および４８時間インキュベーションして、抗体産生を可能にした。トランスフェクション０時間、１４時間、２２時間および４８時間後に、分泌された抗体を培地から収集した。抗ｈｕＩｇＧ１定量的ＥＬＩＳＡ（ＱＥ）によって、抗体濃度を測定した。
【０１９０】
定量的ＥＬＩＳＡ
［１８４］ヒツジ抗ヒトＩｇＧ抗体（The Biding Site Limited、英国、製品コードＡＵ０００６）を用いて室温で１時間コーティングした９６ウェルプレート中、定量的ＥＬＩＳＡを行った。次いで、ＰＢＳ中の１％新生ヤギ血清を用いて室温で１時間、プレートをブロッキングした。トランスフェクション上清を連続希釈し、そしてブロッキングしたプレートに適用した後、さらに室温で１時間インキュベーションした。次いで、ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ／０．０５％Ｔｅｅｎ−２０で４回洗浄し、二次抗体を添加し（ペルオキシダーゼ・コンジュゲート化抗ヒト・カッパ抗体（The Biding Site Limited、英国、製品コードＡＰ０１５））、そしてプレートを再び室温で１時間インキュベーションした。最後に、プレートをＰＢＳ／０．０５％Ｔｅｅｎ−２０で４回洗浄し、そしてＡＢＴＳを添加した（０．１Ｍクエン酸緩衝液中、０．５ｍｇ／ｍｌ  ＡＢＴＳ、０．０３％Ｈ２Ｏ２）。ＥＬＩＳＡプレート吸光度をＯＤ４０５で読み取って、そして内部標準の吸光度に比較して、ヒトＩｇＧ１濃度を計算した。
【０１９１】
元来のおよび突然変異ｈｕＣ２４２のｍＲＮＡおよび細胞内ＨＣ／ＬＣレベルの定量的比較
総ＲＮＡ単離
［１８５］キットプロトコルにしたがって、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙスピンカラムを用いて、６ｘ１０６一過性トランスフェクション２９３Ｔ細胞から総ＲＮＡを単離した。細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで洗浄し、ペレットにし、上清を取り除き、そしてペレットを−８０℃で一晩凍結させた。１％（ｖ／ｖ）β−メルカプトエタノールを含有する５００μｌの緩衝液ＲＬＴ中で細胞ペレットを破壊し、完全に混合し、そして次いで、２０ゲージ針を５回通過させることによってホモジナイズした。各ホモジネートに、５００μｌの７０％エタノールを添加し、試験管を混合し、次いで７００μｌの試料をＲＮｅａｓｙミニカラムに適用し、そして試験管を１０，０００ｒｐｍで１５秒間回転させた。フロースルーを廃棄し、そしてカラムを３５０μｌの緩衝液ＲＷ１で洗浄し、その後、１０，０００ｒｐｍで１５秒間、もう一度回転させた。８０μｌのＤＮａｓｅ  Ｉ溶液（７０μｌの緩衝液ＲＤＤ中の１０μｌ  ＤＮａｓｅ  Ｉ）をカラム膜中央に添加し、ＲＴ（２０〜３０℃）で１５分間インキュベーションし、次いで、３５０μｌの緩衝液ＲＷ１をカラムに添加し、そして試験管を１０，０００ｒｐｍで１５秒間回転させて、細胞ＤＮＡを取り除いた。フロースルーを廃棄し、そしてカラムを新しい２ｍｌ収集試験管に移し、各５００μｌの緩衝液ＲＰＥでさらに２回洗浄し、そして最初の洗浄の際には、１０，０００ｒｐｍで１５秒間回転させ、そして２回目の洗浄の際には、２分間回転させた。カラムを新しい２ｍｌ収集試験管に入れ、そして１分間、最高速度で回転させて、カラムを完全に乾燥させた。最後に、カラムを新しい１．５ｍｌ収集試験管に移し、そして３０μｌのＲＮａｓｅ不含水でＲＮＡを溶出させ、そして１０，０００ｒｐｍで１分間回転させた。ＯＤ２６０によってＲＮＡ濃度を測定し、そして次いで、試料を−８０℃で保存した。
【０１９２】
ｃＤＮＡ合成
［１８６］キットプロトコルにしたがって、Superscript II逆転写酵素（Invitrogen）を用いて、第一鎖ｃＤＮＡ合成反応を行った。３μｌ総ＲＮＡ、３μｌランダムヘキサマー、１μｌ  １０ｍＭ  ｄＮＴＰ、そしてＤＥＰＣ処理水で１０μｌにして、反応混合物を作製した。混合物を６５℃で５分間インキュベーションし、そして次いで、氷上に少なくとも１分間置いた。各反応に、２μｌ  １０ｘＲＴ緩衝液、４μｌ  ２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２μｌ  ０．１Ｍ  ＤＴＴ、および１μｌ  ＲＮアーゼＯＵＴリボヌクレアーゼ阻害剤を添加し、混合し、そして２５℃で２分間インキュベーションした。次に、１μｌ（５０Ｕ）Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素を各試験管に添加し、混合し、そして２５℃で１０分間、４２℃で５０分間、７０℃で１５分間インキュベーションし、そして次いで氷上で冷却した。簡単に回転させて反応を収集し、そして定量的ＰＣＲに進む前に、ＲＮアーゼＨ（各試験管に１μｌ添加し、そして３７℃で２０分間インキュベーションする）でＲＮＡを除去した。
【０１９３】
定量的ＰＣＲセットアップ
［１８７］Cyber GreenリアルタイムＰＣＲマスターミックスキット（Applied Biosystems）を用いて、９６ウェルプレート中、定量的ＰＣＲ反応を行った。逆転写酵素反応を１：５００に希釈して、そして１０μｌの各試料を３つ組ウェル中にプレーティングした。各プライマー対に関して、１つのＲＮＡ試料の１：１００、１：２００、１：４００、１：８００および１：１６００希釈の１０μｌを用いて、標準曲線（４〜５点）を生成した。各プラスミド上に存在するネオマイシン耐性遺伝子に特異的なプライマーを用いて、内部トランスフェクション対照もまた、各試料に関して３つ組で行った。アクチン特異的プライマーを用いて、各試料に関して、別個の細胞数対照もまた行った。各実験および対照ウェルに、１５μｌの反応混合物（０．０５μｌの各１００μＭプライマー、１２．５μｌの２ｘCyber Green  ＰＣＲマスターミックス、および２．４μｌのｄｄＨ２Ｏ）を添加した。プレートを封印し、そして回転させて、内容物を収集した後、ＡＢＩプリズム７０００リアルタイム・サーマルサイクラー中に入れた。９５℃で１０分間、その後、９５℃１５秒間および６０℃１分間の４０サイクルで、反応を行った。ＡＢＩプリズム７０００ソフトウェアを用いて、反応データを分析した。
【０１９４】
細胞内重鎖および軽鎖レベルの分析
［１８８］安定してまたは一過性にＩｇＧを発現している細胞を、ＲＩＰＡ緩衝液中で溶解し、そしてタンパク質濃度を標準化した。細胞溶解物を、変性または非変性条件下のいずれかで電気泳動に供した。必要に応じて、電気泳動前に、プロテインＡ沈降技術によって、溶解物中のＩｇＧを精製するかまたは濃縮した。それぞれ、重鎖および軽鎖バンドを視覚化するために、抗ヒトＩｇＧおよび抗ヒトＬＣκ抗体を用いたウェスタンブロッティング技術によって、アクリルアミドゲルを分析した。
【０１９５】
抗原陽性細胞へのｈｕＣ２４２の結合アフィニティーの測定
非競合的結合
［１８９］ｈｕＣ２４２および変異体抗体をＦＡＣＳ緩衝液（ＲＰＭＩ培地中、２．５％ＮＧＳ）で１〜２μｇ／ｍｌに標準化した。２つ組５０μｌ試料を９６ウェルプレートに適用し、そしてＦＡＣＳ緩衝液中、１：１で連続希釈した。Ｃｏｌｏ２０５細胞をＦＡＣＳ緩衝液中、４ｘ１０６細胞／ｍｌに再懸濁し、そして５０μｌを各ウェルに添加した。プレートを２時間インキュベーションし、そして次いでウェルあたり２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、１２００ｒｐｍ、４℃で５分間回転させた。上清を取り除き、そして５０μｌのＦＩＴＣ標識二次抗体（ＦＡＣＳ緩衝液中１：１００希釈）を各ウェルに添加して、そしてプレートを４℃で３０分間インキュベーションした。最後に、上述のようにプレートを洗浄し、そして２００μｌ／ウェルの、ＰＢＳ中の１％ホルムアルデヒドで細胞を固定した。BD FACScalliberフローサイトメーター上での蛍光によって、ターゲット細胞への相対的抗体結合を分析した。
【０１９６】
競合的結合
［１９０］ｈｕＣ２４２を１ｍｇ／ｍｌのＥＺ−Ｌｉｎｋスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Pierce  ＃２１３３５）でビオチン化し、室温で１時間インキュベーションした。反応をタウリンで停止し、そして次いで、１ｘＰＢＳに対して、４℃で一晩透析した。４ｘ１０−１０Ｍの最終反応濃度のため、ビオチン化ｈｕＣ２４２を１．６ｘ１０−９Ｍに希釈した。
【０１９７】
［１９１］非標識ｈｕＣ２４２および変異体抗体を、４ｘ１０−８Ｍから１ｘ１０−１１Ｍまで、１：２で連続希釈し、そして各試料５０μｌをプレートに添加した。次に、３回上下させてピペッティングすることによって、ウェルあたり５０μｌのビオチン化ｈｕＣ２４２を混合した。Ｃｏｌｏ２０５細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、２ｘ１０５細胞／ｍｌに再懸濁し、そして抗体混合物を含有する各ウェル中に、１００μｌを混合した。プレートを氷上で２時間インキュベーションし、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、そして次いで、５０μｌの１：１００希釈フルオレセイン・コンジュゲート化ストレプトアビジンを添加した。次に、プレートを氷上で１時間インキュベーションし、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、そしてウェルあたり２００μｌの、ＰＢＳ中の１％ホルムアルデヒドで細胞を固定した。BD FACScalliberフローサイトメーター上で競合的結合を分析した。
【０１９８】
２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクション後、数時間以内に低いｈｕＣ２４２産生が観察される
［１９２］２９３Ｔ細胞において一過性トランスフェクションを行って、中程度から高い発現潜在能力を有することが知られる対照抗体と、ｈｕＣ２４２の発現を比較した。２つの対照ヒト化抗体ならびにｈｕＣ２４２をコードするプラスミドを、並行して２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、そしてトランスフェクション０時間、１４時間、２２時間および４８時間後、分泌された抗体を培地から収集した。早くもトランスフェクション１４時間後に、分泌されたｈｕＣ２４２は、両対照抗体よりもはるかに少なく（図２）、そして相違は経時的に増加した。４８時間後、集積したｈｕＣ２４２収量は、対照Ａのわずか約７％であり、そして対照Ｂの１２％であった。
【０１９９】
２９３Ｔ一過性トランスフェクション中のｈｕＣ２４２重鎖および軽鎖ｍＲＮＡレベルは正常なようである
［１９３］低いｈｕＣ２４２産生が、低いＩｇＧメッセンジャーＲＮＡレベルによるのかどうかを調べるため、ｈｕＣ２４２の重鎖および軽鎖ｍＲＮＡを、ImmunoGenのレパートリー中の他のヒト化抗体に比較した。ｈｕＣ２４２および対照抗体を並行して２９３Ｔ細胞にトランスフェクションして、そして７２時間後、細胞からｍＲＮＡを単離した。定量的ＲＴ−ＰＣＲ技術によって試料を分析し、そして結果（図３）は、ｈｕＣ２４２  ｍＲＮＡレベルが、対照抗体に匹敵することを示す。標準化ｈｕＣ２４２重鎖ｍＲＮＡは、大部分の抗体より幾分高かったが、対照Ｃと類似であった。ｈｕＣ２４２軽鎖ｍＲＮＡは、対照Ａのものより低かったが、対照ＡおよびＣと類似であった。総合すると、ｈｕＣ２４２重鎖および軽鎖両方の細胞ｍＲＮＡレベルは、高生産性が可能ないくつかの他の抗体に匹敵することが見出された。
【０２００】
安定ＣＨＯ細胞株において、ＨＣ（Ｈ）に対する、アセンブリーしたｈｕＣ２４２（Ｈ２Ｌ２）の相対比は、ｈｕＢ４比より有意に低い
［１９４］ｑＰＣＲ結果に基づいて、ｈｕＣ２４２の低い生産性は、転写後のものである可能性が高い。転写後事象を分析するため、細胞内発現、ならびに重鎖および軽鎖ペプチドのアセンブリーを、対照ＡおよびｈｕＣ２４２間で比較した。対照Ａを発現している安定ＣＨＯ細胞株を、ｈｕＣ２４２を発現している２つの安定ＣＨＯ細胞株と比較した。全細胞溶解物をプロテインＡ精製に供し、そして単離ＩｇＧを非変性ゲル上で分離し、そしてクーマシーブルーで染色した（図４）。対照抗体に比較して、ｈｕＣ２４２では多数の不完全アセンブリー種が存在したことから、おそらくペプチド間の適合性が劣っているか、または軽鎖供給が不十分であるため、重鎖および軽鎖アセンブリーが非効率的であることが、ｈｕＣ２４２抗体の低い発現の根源である可能性があると示唆される。
【０２０１】
多数のｈｕＣ２４２重鎖および軽鎖フレームワーク残基が、コンセンサス配列と一致しない
［１９５］ｈｕＣ２４２重鎖および軽鎖フレームワーク中の非コンセンサス残基の存在は、最初に、安定ＣＨＯ株において高レベル発現が可能であることが知られる対照表面再構成抗体と、ｈｕＣ２４２可変領域アミノ酸配列を並列させることによって、認識された。低発現につながる残基は、天然に広く行き渡っている可能性は低いため、それぞれ、全ＫａｂａｔネズミＩｇＧ１およびカッパ軽鎖データベースから生成したコンセンサス配列と、ｈｕＣ２４２重鎖および軽鎖可変領域フレームワークを並列させた（図５）。ｈｕＣ２４２などの表面再構成抗体中の埋没残基は、元来のネズミ親抗体のネズミ残基すべてを保持し、そしてヒト表面残基は、一般的に、置換に関して考慮されないため、ネズミコンセンサス配列を利用した。図５に示す残基２６（Ｄ）は、表面上に曝露されているため、例外的に埋没残基でない。この残基（Ｄ）からネズミ残基が始まり、そして一般的な規則として、埋没残基の外側に見られるとしても、ネズミ残基は置換可能であるため、この残基をＧで置換した。この場合、ネズミコンセンサス由来のＧ残基は、たまたま、Ｃ２４２ヒト化に用いたヒト配列と一致する。
【０２０２】
［１９６］組換え抗体の小規模セットとマッチしない、同じｈｕＣ２４２フレームワーク位は、広いデータベース由来のコンセンサス配列ともまたマッチしなかった。さらに、これらのｈｕＣ２４２残基の多くは、Ｋａｂａｔデータベース中の同じ位で非常にまれであることが見出され、１６％のネズミ抗体から、低い場合は０．８％の範囲でしか存在しなかった（以下の表を参照されたい）。これらのまれな埋没フレームワーク残基を、いずれかが、ｈｕＣ２４２抗体の低発現能に寄与しているかどうかに関するさらなる研究のために選択した。
【０２０３】
【表１】
2010508043.tif 000012
【０２０４】
ｈｕＣ２４２または軽鎖フレームワークいずれかにおける単一アミノ酸置換によるＩｇＧ産生の中程度の増加
［１９７］ｈｕＣ２４２重鎖および軽鎖フレームワーク中で同定された一般的でない残基が、抗体産生に負に影響を及ぼしうるかどうかを調べるため、部位特異的突然変異誘発を用いて、対応するコンセンサス残基によってこれらの残基を置換した。一過性トランスフェクションによって、ｈｕＣ２４２の単一アミノ酸変異体に関する抗体発現を、ｈｕＣ２４２および対照抗体に比較した。それぞれの発現プラスミドを２９３Ｔ細胞にトランスフェクションして、そして７２時間後、定量的ＥＬＩＳＡによって、分泌されたＩｇＧレベルを決定した。ｈｕＣ２４２重鎖または軽鎖フレームワーク領域いずれかにおける単一アミノ酸置換によって、ＩｇＧ産生の中程度の増加が達成された（図６）。
【０２０５】
［１９８］残基置換が、抗体結合活性を改変しないことを確実にするため、抗原陽性Ｃｏｌｏ  ２０５細胞に対するＦＡＣＳによって、ｈｕＣ２４２変異体を評価した。結果は、アミノ酸置換が結合プロフィールを変化させないことを示した（図６）。
【０２０６】
ｈｕＣ２４２重鎖および軽鎖フレームワークにおける２〜３残基の変化の組み合わせによって、抗体生産性の有意な増加が達成される
［１９９］多数のフレームワーク残基変化を含むように、ｈｕＣ２４２アミノ酸置換を拡大した。また、変異体重鎖および軽鎖構築物を組み合わせて、各々、２以上の残基置換を含有する、一連のｈｕＣ２４２変異体対を構築した。ｈｕＣ２４２変異体の相対的生産性を、上述のように２９３Ｔ一過性トランスフェクションにおいて比較した。多様な残基置換組み合わせは、異なるレベルの生産性を生じ、ｈｕＣ２４２重鎖および軽鎖可変領域フレームワーク両方の間で組み合わせた２つまたは３つの変化を含有するもので、最大の増加が見られた（図７）。
【０２０７】
［２００］ｈｕＣ２４２変異体重鎖および軽鎖のｍＲＮＡレベルは、不変のままである。
【０２０８】
［２０１］変異体配列で見られるｈｕＣ２４２生産性の増加は、抗体の転写、翻訳または翻訳後特性の改善のためでありうる。ｈｕＣ２４２発現増加の原因を調べるため、ｑＰＣＲ実験を行って、一過性トランスフェクション２９３Ｔ細胞において発現されたｈｕＣ２４２およびｈｕＣ２４２配列変異体のｍＲＮＡレベルを評価した。結果は、ｈｕＣ２４２と比較した際、ｈｕＣ２４２変異体が、重鎖および軽鎖両方に関して、類似のレベルのｍＲＮＡを産生したことを示す（図８）。これは、ｈｕＣ２４２変異体の抗体産生増加が、転写またはｍＲＮＡ安定性の増加によるものではなく、おそらく、転写後特性の改善によることを示唆する。
【０２０９】
重鎖変異の結果として、細胞内軽鎖ペプチドの増加が観察される
［２０２］可変領域フレームワーク残基置換によるｈｕＣ２４２生産性の増加に関連する、ありうる機構をさらに研究するため、細胞内重鎖および軽鎖ペプチドレベルを比較した。ｈｕＣ２４２および配列変異体を２９３Ｔ細胞に一過性にトランスフェクションして、７２時間後にこれを溶解し、そして変性条件下のウェスタンブロッティング技術によって、全細胞溶解物を評価した。抗ｈｕＩｇＧ１および抗ｈｕＫ二次抗体両方を利用して、同じゲル上の重鎖および軽鎖バンド両方を視覚化した。興味深いことに、重鎖可変領域フレームワーク中の残基置換は、重鎖発現に影響を与えず、むしろ残基置換をまったく含有しないｈｕＣ２４２軽鎖の細胞内集積を増加させた（図９）。これらの結果は、おそらく、重鎖軽鎖適合性の増進を通じて、ｈｕＣ２４２重鎖変異体が、ｈｕＣ２４２軽鎖の分解を防御し、これが抗体アセンブリー増加および最終的に抗体産生増加につながることを示唆する。これらの結果はまた、ｈｕＣ２４２変異体の生産性が、細胞内軽鎖に大まかに比例するが、重鎖レベルには比例しないこともまた示した。
【０２１０】
ｈｕＣ２４２残基置換が、重鎖および軽鎖アセンブリーの改善につながる
［２０３］非変性条件下で行うウェスタンブロットは、ｈｕＣ２４２変異体における翻訳後特性の改善のさらなる証拠を提供する。非変性ウェスタンブロッティング技術によって、ｈｕＣ２４２および変異体構築物で一過性トランスフェクションした２９３Ｔ細胞由来の全細胞溶解物を評価した（図１０）。これらの実験において、変性されていない完全にアセンブリーされた抗体を、アセンブリーされていない重鎖および軽鎖、ならびに中間アセンブリー産物と一緒に視覚化可能であった。中間アセンブリー産物（Ｈ２、Ｈ２Ｌ１など）に対する、完全にアセンブリーされたＩｇＧ（Ｈ２Ｌ２）の細胞内比率は、アミノ酸置換の結果、有意に改善された（図１０（ａ））。さらに、これらの結果は、重鎖および軽鎖変異体を組み合わせて用いた場合、どちらの鎖の細胞内レベルも増加することを示した。これは、重鎖および軽鎖変異体配列の間の相互作用の改善が、分解からの相互鎖内防御を生じることを示唆する。
【０２１１】
［２０４］ｈｕＣ２４２および変異体構築物をクーマシーブルー染色ゲル上で評価して、ウェスタンブロッティング技術と関連する潜在的なアーチファクトを回避した（図１０（ｂ））。一過性トランスフェクション２９３Ｔ細胞由来の全細胞溶解物を、プロテインＡ精製技術に供し、次いで、単離されたＩｇＧを非変性ＰＡＧＥに適用し、そして続いて、クーマシーブルーで染色した。結果は、ウェスタンブロットによって観察されるものと一致し、ｈｕＣ２４２レーンにおいて、有意なレベルの部分的アセンブリー抗体が示され、そしてｈｕＣ２４２変異体レーンにおいて、完全にアセンブリーした抗体（Ｈ２Ｌ２）の比率増加が示される。
【０２１２】
ｈｕＣ２４２変異体における残基置換は、抗原結合活性に影響を及ぼさない
［２０５］ＦＡＣＳによって、抗原陽性Ｃｏｌｏ２０５細胞に対する、ｈｕＣ２４２および変異体構築物の相対的結合活性を評価した。抗体生産性増進が可能なｈｕＣ２４２変異体は、抗原結合活性に有意な変化を示さなかった（図１１（ａ））。これらの結果をさらに確認するため、Ｃｏｌｏ２０５細胞に結合したビオチン化ｈｕＣ２４２を、連続希釈した非標識ｈｕＣ２４２変異体に曝露することによって、競合的結合アッセイを行った（図１１（ｂ））。この実験は、ｈｕＣ２４２変異体が、濃度依存様式で、抗原陽性Ｃｏｌｏ２０５細胞への結合に関して、ｈｕＣ２４２と競合可能であることを立証した。直接および競合的結合アッセイの結果を合わせると、ｈｕＣ２４２および変異体構築物が、類似の結合活性を有することを示す。
【０２１３】
［２０６］一般の当業者は、過度の実験に訴えることなく、請求されるような本発明を実施する際に、本明細書に具体的に例示されるもの以外の、プロセスを含む再操作条件および技術を使用してもよいことを認識するであろう。一般の当業者は、本明細書に例示する方法、プロセシング条件、および技術の機能的同等物が、当該技術分野に存在することを認識し、そして理解するであろう。すべてのこうした既知の同等物が、本発明に含まれると意図される。
【図１】
2010508043.tif 000013
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１２−５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年7月2日(2009.7.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】
【化１】
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【国際調査報告】
2010508043.tif 000043