(57)【要約】  本発明は、過剰増殖疾病、例えば癌、例えば化学療法抵抗性の癌の予防、緩和又は／及び治療のための、治療的手段又は／及び剤との共投与のための繊維芽細胞増殖因子受容体４（ＦＧＲＦ４）阻害剤に関する。更に、本発明は、診断的手段に関し、その際、ＦＧＦＲ４遺伝子の発現状態及び／又は多形が、過剰増殖疾病、例えば癌に苦しむ患者において決定される。この決定の結果に基づいて、そして治療すべき疾病の状態に基づいて、治療的なプロトコルが開発されてよい。本発明のまた別の主題は、スクリーニング方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
過剰増殖疾病の予防、緩和又は／及び治療のための医薬品の製造のための、ＦＧＦＲ４阻害剤の、更なる治療的手段又は／及び更なる治療剤と組み合わせた使用。
【請求項２】
更なる治療的手段又は／及び剤が、アポトーシス誘発性治療的手段又は／及び剤である、請求項１記載の使用。
【請求項３】
過剰増殖疾病が、ＦＧＦＲ４過剰発現と関連している、請求項１又は２記載の使用。
【請求項４】
過剰増殖疾病が、癌、例えば腎臓、膀胱、脳、食道、胃、膵臓、小腸、結腸、胸、肺、肝臓、脾臓、甲状腺、下垂体、副腎、卵巣、頸部、精巣の癌、前立腺癌、グリオーマ、メラノーマ、又は／及び白血病から選択される、請求項１から３までのいずれか１項記載の使用。
【請求項５】
過剰増殖疾病が、少なくとも部分的に治療抵抗性である、請求項１から４までのいずれか１項記載の使用。
【請求項６】
過剰増殖疾病が、少なくとも部分的に、アポトーシス誘発性治療的手段又は／及び剤に対して抵抗性である、請求項１から５までのいずれか１項記載の使用。
【請求項７】
更なる治療的手段が、放射線療法である、請求項１から６までのいずれか１項記載の使用。
【請求項８】
更なる治療剤が、細胞分裂抑制的、細胞毒性又は／及び化学療法的な剤から選択される、請求項１から７までのいずれか１項記載の使用。
【請求項９】
細胞分裂抑制的、細胞毒性又は／及び化学療法的な剤がドキソルビシン、タキサン、白金化合物、ヌクレオシド類似体、マイトマイシンＤ、エトポシド、シクロホスファミド、トポイソメラーゼ阻害剤及びタンパク質、例えば抗腫瘍抗体、から選択される、請求項８記載の使用。
【請求項１０】
過剰増殖疾病が、ＢｃｌＸL又は／及びＭＡＰキナーゼの過剰発現又は／及び過剰活動と関連している、請求項１から９までのいずれか１項記載の使用。
【請求項１１】
過剰増殖疾病に対する治療又は／及び剤の効力を増加させるための医薬品の製造のためのＦＧＦＲ４阻害剤の使用。
【請求項１２】
過剰増殖疾病の放射線又は／及び医薬品治療に対する感受性を増加させるための医薬品の製造のためのＦＧＦＲ４阻害剤の使用。
【請求項１３】
過剰増殖疾病が癌である、請求項１１又は１２記載の使用。
【請求項１４】
ＦＧＦＲ４阻害剤が、直接的なＦＧＦＲ４阻害剤である、請求項１から１３までのいずれか１項記載の使用。
【請求項１５】
ＦＧＦＲ４阻害剤が、非直接的なＦＧＦＲ４阻害剤である、請求項１から１３までのいずれか１項記載の使用。
【請求項１６】
ＦＧＦＲ４阻害剤が、アンチセンス分子、リボザイム、ｓｉＲＮＡ分子、抗体及び抗体断片、溶解性ＦＧＦＲ４分子、アンタゴニスト性のＦＧＦＲ４リガンドアナログ、ペプチド及び低分子量化合物から選択される、請求項１から１５までのいずれか１項記載の使用。
【請求項１７】
ＦＧＦＲ４阻害剤が、ＦＧＦＲ４抗体又はＦＧＦＲ４ｍＲＮＡに対して指向したｓｉＲＮＡ分子である、請求項１から１６までのいずれか１項記載の使用。
【請求項１８】
活性成分として、
（ａ）ＦＧＦＲ４阻害剤、及び
（ｂ）過剰増殖疾病の予防、緩和又は／及び治療のための剤であって、（ａ）とは異なる剤、
を、場合により、医薬的に許容可能なキャリアー、希釈剤又は／及び助剤と一緒に含有する、医薬組成物又はキット。
【請求項１９】
剤（ｂ）が、アポトーシス誘発剤である、請求項１８記載の医薬組成物又はキット。
【請求項２０】
（ａ）の阻害剤及び（ｂ）の剤を、単独の組成物の形態で又は少なくとも２つの別個の組成物の形態で提供する、請求項１８又は１９記載の組成物又はキット。
【請求項２１】
ＦＧＦＲ４阻害剤の有効量を、更なる治療的手段又は／及び更なる治療的な剤との共投与においてこれらを必要とする被験体に投与することを含む過剰増殖疾病の予防、緩和又は／及び治療のための方法。
【請求項２２】
更なる治療的手段又は／及び剤が、アポトーシス誘発性治療的手段又は／及び剤である、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
過剰増殖疾病が、少なくとも部分的に治療抵抗性である、請求項２１又は２２記載の方法。
【請求項２４】
過剰増殖疾病に罹患している可能性のある被験体からの試料を、ＦＧＦＲ４遺伝子の発現について分析する、過剰増殖疾病の診断方法。
【請求項２５】
過剰増殖疾病に罹患している可能性のある被験体からの試料を、ＦＧＦＲ４遺伝子中の多形の存在について分析する、過剰増殖疾病の診断方法。
【請求項２６】
過剰増殖疾病に罹患している可能性のある被験体からの試料を、ＦＧＦＲ４遺伝子の発現及びＦＧＦＲ４遺伝子中の多形の存在について分析する、過剰増殖疾病の診断方法。
【請求項２７】
多形が、ヒトのＦＧＦＲ４のアミノ酸３８８をコードする位置にある、請求項２５又は２６記載の方法。
【請求項２８】
過剰増殖疾病が、癌である、請求項２４から２７までのいずれか１項記載の方法。
【請求項２９】
癌が、非転移性癌である、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
癌が、転移性癌である、請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
過剰増殖疾病のアポトーシス抵抗性状態を決定することを更に含む、請求項２４から３０までのいずれか１項記載の方法。
【請求項３２】
診断の結果に基づき過剰増殖疾病の治療のための治療方式を設定することを更に含む、請求項２４から３１までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
過剰増殖疾病が、ＦＧＦＲ４過剰発現に関連した非転移性癌であり、その際、この治療方式は、更なる治療的手段又は／及び更なる治療剤と組み合わせた、ＦＧＦＲ４阻害剤の投与を含む、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
非転移性癌は、ＦＧＦＲ４−３８８Ｇｌｙ又は／及びＦＧＦＲ４−３８８Ａｒｇアレルに関連している、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
過剰増殖疾病が、ＦＧＦＲ４−３８８Ａｒｇアレル及び場合によりＦＧＦＲ４過剰発現に関連した転移性癌であり、その際、この治療方式は、更なる治療的手段又は／及び更なる治療剤と組み合わせた、ＦＧＦＲ４阻害剤の投与を含む、請求項３２記載の方法。
【請求項３６】
過剰増殖疾病が、ＦＧＦＲ４−３８８Ｇｌｙアレルに関連した転移性癌であり、その際、この治療方式は、更なる治療的手段又は／及び更なる治療剤と場合により組み合わせた、ＦＧＦＲ４アゴニストの投与を含む、請求項３２記載の方法。
【請求項３７】
化合物がＦＧＦＲ４阻害剤であるかどうかを決定することを含む、過剰増殖疾病のアポトーシス抵抗性を減少させるために適した化合物を同定又は／及びキャラクタリゼーションするためのスクリーニング方法。
【請求項３８】
過剰増殖疾病が、少なくとも部分的に療法に抵抗性のある過剰増殖疾病である、請求項３７記載のスクリーニング方法。
【請求項３９】
分子的又は／及び細胞的アッセイを含む、請求項３７又は３８記載のスクリーニング方法。
【請求項４０】
（ａ）少なくとも１の化合物をＦＧＦＲ４と接触させる工程、及び
（ｂ）この化合物の存在下でＦＧＦＲ４活性を決定する工程
を含む、ＦＧＦＲ４阻害剤を同定する、請求項３７から３９までのいずれか１項記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の詳細な説明
本発明は、過剰増殖疾病、例えば癌、例えば化学療法抵抗性の癌の予防、緩和又は／及び治療のための、治療的手段又は／及び剤との共投与のための繊維芽細胞増殖因子受容体４（ＦＧＲＦ４）阻害剤に関する。更に、本発明は、診断的手段に関し、その際、ＦＧＦＲ４遺伝子の発現状態又は／及び多形が、過剰増殖疾病、例えば癌に苦しむ患者において決定される。この決定の結果に基づいて、そして治療すべき疾病の状態に基づいて、治療的なプロトコルが開発されてよい。本発明のまた別の主題は、スクリーニング方法である。
【０００２】
WO 99/37299は、ＦＧＦＲ突然変異体により引き起こされるＦＧＦＲ機能亢進に関連した疾病、特に癌の治療及び／又は予防のためのＦＧＦＲ４阻害剤の使用を開示する。ＦＧＦＲ４阻害の治療的な効果は、ＦＧＦＲ４−Ａｒｇ３８８変異体の増加した活性により引き起こされる腫瘍細胞の移入及び侵入の阻害に基づく。この文献の内容は、参照により本願に取り込まれる。
【０００３】
WO 03/063893は、過剰増殖疾病の診断、予防及び／又は治療のためのＦＧＦＲ４アゴニストの使用を開示する。ＦＧＦＲ４活性化の治療的な作用は、ＦＧＦＲ４−Ｇｌｙ３８８変異体の減少した活性により引き起こされる腫瘍細胞の移入及び侵入の阻害に基づく。この文献の内容は、参照により本願に取り込まれる。
【０００４】
現在の癌療法の深刻な問題は、癌細胞の１種以上の抗ガン剤に対する固有の又は獲得された抵抗性にある（多剤抵抗性、ＭＤＲ）。例えば、分裂する癌細胞は、抵抗性のあるクローンの選択により、特定の抗ガン治療の阻害性の作用に対して抵抗するための能力を獲得してよい。薬剤耐性、多剤耐性、又は／及び放射線に対する耐性の開発を抑制するための技術水準の戦略は、高用量での化学療法剤又は／及び放射線の初期投与である。しかしながら、このような高用量治療方式は、深刻な副作用により妨げられ、これはしばしば投与すべき用量を制限する。従って、外科手術によってはアクセスできない癌細胞、特に転移性細胞の完全な撲滅は、達成されることができない。
【０００５】
本発明の文脈において、ＦＧＦＲ４は意外にも、アポトーシスに対する癌細胞の抵抗性を増加させることにより化学療法剤での治療下で癌細胞の癌細胞生存を促進することが見出された。この作用は、移入／侵入の促進からは区別されることができる。アポトーシスシグナルの誘導は、ＭＡＰキナーゼカスケードを介して生じ、その一方で移入／侵入シグナルの誘導は、異なる経路を介して生じる。
【０００６】
この知見に基づき、ＦＧＦＲ４阻害剤が、癌細胞中でアポトーシス感受性を増加させることができることが実証されることができた。従って、ＦＧＦＲ４阻害剤が、抗ガン剤又は／及び放射線の治療的効力を促進することができることが結論付けられる。従って、抗ガン剤又は／及び放射線の用量は、単独で投与されるよりもむしろＦＧＦＲ４阻害剤と組み合わせて投与される場合に、特定の治療的効果を達成すべく減少されることができる。抗ガン剤と一緒でのＦＧＦＲ４阻害剤の共投与は、高用量の治療方式（例えば第１ライン治療）において特に有利であり、とりわけ、この抗ガン剤又は／及び放射線の用量が、不所望な副作用のために制限されるべきである場合である。
【０００７】
更に、ＦＧＦＲ４発現状態の決定又は／及びＦＧＦＲ４遺伝子の多形、特に３８８位での多形の決定は、癌及び他の過剰増殖疾病の治療のための改善された戦略を生じる可能性があることが結論付けられる。
【０００８】
本発明の第１の観点は、過剰増殖疾病の予防、緩和又は／及び治療のための医薬品の製造のための、ＦＧＦＲ４阻害剤の、更なる治療的手段又は／及び更なる治療剤と組み合わせた使用に関する。有利には、更なる治療的手段又は／及び剤が、アポトーシス誘発性治療的手段又は／及び剤である。
【０００９】
「過剰増殖疾病」又は「過剰増殖疾患」は、本願明細書で使用される場合には、任意の新形成、即ち、動物中の組織の任意の異常な新規の成長を含み、これは、成長制御の機能不全又は／及び損失に依存して良い。過剰増殖疾病は、腫瘍疾病及び／又は癌、例えば充実性腫瘍、例えば、癌腫、腺腫及び肉腫又は非充実性腫瘍、例えば白血病を含む。この過剰増殖疾患は、ＦＧＦＲ４過剰発現、即ち、通常組織と比較した増加したＦＧＦＲ４発現により有利には特徴付けられる。
【００１０】
本発明においては、過剰増殖疾病は、有利には、癌、より有利には腎臓、膀胱、脳、食道、胃、膵臓、小腸、結腸、胸、肺、肝臓、脾臓、甲状腺、下垂体、副腎、卵巣、頸部、精巣の癌、前立腺癌、グリオーマ、メラノーマ、又は／及び白血病から選択される過剰増殖疾病である。
【００１１】
有利な一実施態様において、癌は非転移性癌であり、特に、ＦＧＦＲ４−３８８Ｇｌｙアレル又は／及びＦＧＦＲ４−３８８Ａｒｇアレルを有する患者における非転移性癌である。更なる一実施態様において、癌は、転移性癌、特にＦＧＦＲ４−３８８Ａｒｇアレルを有する患者における転移性癌である。
【００１２】
非転移性癌の場合には、本発明は、充実性の又は非充実性の癌のアポトーシス感受性を増加させ、かつこのようにして、投与された抗ガン剤及び／又は放射線の効力を増加させることに適する。
【００１３】
転移性癌の場合には、本発明は、有利には上記で定義されたとおりの過剰増殖疾病における、転移、転移形成又は／及び転移進行、特にマイクロ転移の治療のために適する。転移、特にマイクロ転移は、しばしば外科手術によってはアクセスされることができず、かつ、薬理学的又は／及び放射線治療を必要とする。ＦＧＦＲ４阻害剤との共投与が、抗ガン剤又は／及び放射線の用量の効力を増加させるとの事実は、成功した撲滅又は転移の機会を増加させる。
【００１４】
本発明の有利な一実施態様において、過剰増殖疾患は、少なくとも部分的に治療抵抗性の過剰増殖疾患である。より有利には、過剰増殖疾患は、少なくとも部分的に、アポトーシス誘発性治療手段又は／及び薬剤に対して抵抗性である。
【００１５】
「治療抵抗性」とは、本発明の意味合いにおいて、過剰増殖性細胞／癌細胞中での、細胞増殖を抑制又は減少又は／及び細胞死を誘導するための、過剰増殖性細胞／癌細胞の治療に対する応答の不能性、即ち、療法的処理の不能性を含む。
【００１６】
治療抵抗性の深刻な形態は、本願明細書においては、多剤抵抗性においても含まれ、これは、上記したとおりである。「治療抵抗性」は、また、単独療法、特に、細胞分裂抑制性、細胞毒性又は／及び化学療法剤、例えば、アポトーシス誘導剤又は放射線療法を用いた単独療法に対する過剰増殖疾病の抵抗性をも含む。「治療抵抗性」とは、また、細胞分裂抑制性、細胞毒性及び化学療法剤及び放射線から選択された少なくとも２種の組み合わせ治療に対する抵抗性も含む。
【００１７】
「少なくとも部分的に治療抵抗性」とは、本願明細書において使用される場合には、特定の治療方式に対する過剰増殖細胞／癌細胞の減少されたか又は抑制された応答性を含み、その一方で、この細胞は、他の治療に対するこの完全な応答性を維持していて良い。このような特定の治療方式は、第１の抗ガン剤での治療であってよく、かつ、この過剰増殖性細胞／癌細胞は、「少なくとも部分的に治療抵抗性」であると考慮され、この特定の薬剤治療に対して減少したか又は抑制した応答性を有し、その一方で、過剰増殖性細胞／癌細胞は、まだなお、他の治療方式、例えば、第２の抗ガン剤を用いた治療での治療方式に対して応答する。治療抵抗性は、時間と共に増加して良い。従って、「少なくとも部分的に治療抵抗性」とは、本願明細書中で使用される場合には、抗ガン剤治療方式に対する完全な応答性からこの治療に対する完全な抵抗性への、治療抵抗性の一時的な発達をも含む。
【００１８】
ＦＧＦＲ４阻害剤と組み合わせるべき本発明の治療的手段は、任意の適した治療的手段を含み、これは、過剰増殖性疾病の予防、緩和又は／及び治療に適していて、特に、過剰増殖性細胞／癌細胞におけるアポトーシスの誘導に適している。従って、この治療的手段は、過剰増殖性疾病の予防、緩和又は／及び治療のための剤（抗ガン剤、特に、アポトーシス誘導剤）又は／及び放射線を用いた治療を含む。有利な一実施態様において、過剰増殖性疾病の予防、緩和又は／及び治療のための治療的手段は、放射線療法、より有利には、ガンマ線照射療法である。放射線治療方式は、当業者に知られている。この癌治療の技術水準の用量は、ＦＧＦＲ４阻害剤の投与と組み合わせられた場合には、減少されてよい。
【００１９】
本発明のＦＧＦＲ４阻害剤と組み合わせられるべき過剰増殖性疾病の予防、緩和又は／及び治療のための剤は、細胞増殖抑制性、細胞毒性又は／及び化学療法剤、医薬的許容な塩及びその誘導体、及びその組み合わせから選択される。有利には、この剤は、ドキソルビンシン、タキサン、例えばパクリタキセル又はドセラキセル、白金化合物、例えばシスプラチン、トランスプラチン又はオキサリプラチン、ヌクレオシド類似体、例えば５−フルオロウラシル、又はフルオダラ、マイトマイシンＤ１、エトポシド、シクロホスファミド、トポイソメラーゼ阻害剤、例えばカンプトテシン、トポテカン又はイリノテカン、タンパク質、例えば抗腫瘍抗体、医薬的に許容可能な塩、及びその誘導体、及びその組み合わせから選択される。この組み合わせは、過剰増殖性疾病の予防、緩和又は／及び治療のための上記で定義された剤から選択された２種以上の活性成分を含む。
【００２０】
本願明細書において使用される場合の共投与（組み合わせ治療又は組み合わせ療法とも呼ばれる）は、本発明のＦＧＦＲ４阻害剤及び過剰増殖疾病の予防、緩和又は／及び治療のための治療的手段又は／及び剤、有利にはアポトーシス誘発性治療的手段又は／及びアポトーシス誘発性剤の投与を含み、この結果、これらは同じ時間に活性がある。
【００２１】
共投与は、ＦＧＦＲ４阻害剤及び過剰増殖疾病の予防、緩和又は／及び治療のための剤の、単独組成物の形態での又は別個の組成物の形態での投与を含み、その際、有利には少なくとも２種の別個の組成物、より有利には２種の別個の組成物である。共投与は、治療的手段又は／及び過剰増殖疾病の予防、緩和又は／及び治療のための剤及びＦＧＦＲ４阻害剤の同時（即ち、同じ時間での）又は逐次的な、即ち、間隔をおいた投与を含む。
【００２２】
「間隔をおいた」共投与は、治療的手段及び／又は過剰増殖疾病の予防、緩和又は／及び治療のための剤と、ＦＧＦＲ４阻害剤との、最大で１時間、最大で６時間、最大で１２時間、最大で１日間又は最大で１ヶ月間の間隔内での投与を含む。間隔をおいての共投与はまた、１日毎の、週毎の又は月毎のベースでの同じ又は異なるスケジュールを用いた治療的手段又は／及び剤とＦＧＦＲ４阻害剤の投与を含み、これはまた、剤及びＦＧＦＲ４阻害剤の投与形態にも依存し、これは同じか又は異なっていてよく、例えば、迅速放出投与形態、制御された放出投与形態及び／又はデポー形態であってよい。例えば、共投与は、上記で定義したとおりのアポトーシス誘発剤又は／及び放射線治療及びＦＧＦＲ４阻害剤の投与のための異なるスケジュールを含む。
【００２３】
本発明は、癌細胞中でＦＧＦＲ４過剰発現が、通常のＦＧＦＲ４発現を示す細胞と比較して、アポトーシス誘発に対する、例えば化学治療剤、例えばドキソルビシンに対する又は放射線による増加した抵抗性を媒介できることを実証する。この知見に基づき、ＦＧＦＲ４阻害が、癌細胞のアポトーシス誘発に対する感受性を増加させることが実証される。更なる知見は、ＦＧＦＲ４が、有利に、ＢｃｌＸLの発現及び／又は活性及びＭＡＰキナーゼ、特にＥｒｋ１及びＥｒｋ２の発現を制御することである。
【００２４】
理論に拘束されることを望むこと無しに、本発明のデータは、癌細胞中での薬剤／多剤抵抗性の１つの可能性のある機構は、ＦＧＦＲ４過剰発現であり、これによりシグナルカスケードが生じ、ＢｃｌＸL及びＭＡＰキナーゼ、例えばＥｒｋ１及びＥｒｋ２の過剰発現及び／又は増加した活性を生じる。従って、本発明の別の実施態様において、本発明のこの過剰増殖性疾患は、ＦＧＦＲ４過剰発現及びこれにより生じるシグナルカスケードに関連している。
【００２５】
本発明の更なる観点は、ＦＧＦＲ４阻害剤の、過剰増殖疾病に対する治療又は／及び剤、特にアポトーシス誘導療法又は／及び剤の効力を増加させるための医薬品の製造のための使用に関する。
【００２６】
また更なる一観点は、過剰増殖疾病の放射又は／及び医薬品治療に対する感受性を増加させるための医薬品の製造のためのＦＧＦＲ４阻害剤の使用に関する。
【００２７】
本発明のまた別の実施態様においては、ＦＧＦＲ４阻害は特異的な阻害である。「特異的阻害」は、ＦＧＦＲ４活性の選択的阻害である。ＦＧＦＲ４の特異的な阻害において、他の細胞構成成分の活性、特にレセプター（例えばＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２又は／及びＦＧＦＲ３）の活性は、顕著に阻害されず、即ち、ＦＧＦＲ４の特異的な阻害剤の他の細胞構成成分に対するＩＣ５０値は、ＦＧＦＲ４に対するＩＣ５０に比較して少なくとも１０倍、有利には１００倍、より有利には１０００倍以上より大きい。本発明はまた、ＦＧＦＲ４の非特異的阻害をも参照する。
【００２８】
本発明のＦＧＦＲ４阻害は、有利には、ＦＧＦＲ４の細胞外ドメインに対する分子結合である。
【００２９】
本発明のＦＧＦＲ４阻害剤は、直接的な阻害剤又は非直接的な阻害剤であってよい。ＦＧＦＲ４の直接的な阻害剤は、直接的にＦＧＦＲ４、ＦＧＦＲ４転写産物又は／及びＦＧＦＲ４遺伝子を阻害し、これにより、ＦＧＦＲ４活性を減少させる。
【００３０】
ＦＧＦＲ４の非直接的な阻害剤は、上記のように直接的にＦＧＦＲ４を阻害せず、しかしながら、ＦＧＦＲ４と相互作用するターゲット、例えばＦＧＦＲ４リガンド、例えばＦＧＦ１、−２、−４、−６、−８、−１６、−１７、−１８又は−１９上で、下流のターゲット、例えばＢｃｌＸL、又は、ＭＡＰキナーゼカスケード中のタンパク質、例えばＥｒｋ１又は／及びＥｒｋ２上で阻害する。更に、ＦＧＦＲ４の非直接的な阻害は、転写又は翻訳上の阻害剤又は輸送経路又は脂質ラフトの阻害剤により実施されてよい。
【００３１】
本願明細書において使用する場合の「ＦＧＦＲ４活性」は、生理学的な又は病理学的な作用、特にアポトーシスに対する細胞の抵抗性を生じるためのＦＧＦＲ４ポリペプチドの能力を含む。
【００３２】
本発明において、ＦＧＦＲ４の活性は、核酸レベル、例えば、遺伝子レベル又は転写レベルで阻害されてよい。遺伝子レベルでの阻害は、部分的な又は完全な遺伝子不活性化、例えば遺伝子破断による遺伝子不活性化を含んでよい。阻害はまた、転写レベルで生じてよく、例えば、ＦＧＦＲ４ｍＲＮＡ、ＦＧＦＲ４リガンドｍＲＮＡ又は／及び下流のターゲットのｍＲＮＡに対して指向されていてよいアンチセンス分子、リボザイム、ｓｉＲＮＡ分子の投与により生じてよい。適したアンチセンス分子は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子及び核酸アナログから選択されてよい。リボザイムは、ＲＮＡ分子及び核酸アナログから選択されてよい。ＲＮＡ干渉できる二重鎖ＲＮＡ小分子（ｓｉＲＮＡ）は、ＲＮＡ分子及び核酸アナログから選択されてよい。有利な二重鎖ｓｉＲＮＡ分子は、１９〜２５ヌクレオチド及び場合により少なくとも１つの３′オーバーハングの長さの鎖を有する。適したｓｉＲＮＡ分子は、例えば、Elbashir et al. (Nature 411 (2001 ), 494-498), Elbashir et al. (Genes & Dev. 15 (2001), 188-200) 又は Elbashir et al. (EMBO J.20 (2001), 6877-6898)により得られてよい。この文献の内容は、参照により本願に取り込まれる。
【００３３】
更に、ＦＧＦＲ４活性は、タンパク質レベルで阻害されてよく、例えば、特異的なＦＧＦＲ４阻害を生じる化合物の投与により阻害されてよい。タンパク質レベルでのこの阻害は、例えば抗体又は抗体断片の適用を含んでよい。特に、これらの抗体又は抗体断片は、ＦＧＦＲ４に対して指向されていて、有利には、ＦＧＦＲ４の細胞外ドメイン又はＦＧＦＲ４リガンド又は／及び下流のターゲットに対して指向されている。この抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体、組み換え抗体、例えば一重鎖抗体又はこのような抗体の断片であって、少なくとも１つの抗原結合部位を含有するもの、例えば、タンパク質加水分解抗体断片、例えばＦａｂ、Ｆａｂ′又はＦ（ａｂ′）2断片又は組み換え抗体断片、例えばｓｃＦｖ断片であってよい。治療上の目的のために、特に、ヒトの治療のために、キメラ抗体、ヒト化した抗体又はヒトの抗体の投与が特に有利である。
【００３４】
更に、溶解性ＦＧＦＲ４レセプター、例えばレセプター断片であって膜アンカードメインのないもの、アンタゴニスト性ＦＧＦＲ４リガンド突然変異タンパク質、例えば、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ６、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８又はＦＧＦ１９の突然変異タンパク質、ペプチド又は低分子量ＦＧＦＲ４阻害剤は本発明において使用されてよい。ＦＧＦＲ４の低分子量阻害剤の例は、インドリノン（Mohammadi et al. (1997), Science 276:955-960), SU5402, SU4984, 及び PD17304 (Koziczak et al. (2004), Biol. Chem.279, 50004-50011）である。
【００３５】
ＦＧＦＲ４ｍＲＮＡと相互作用し、これによりＦＧＦＲ４活性をノックダウンできる適したｓｉＲＮＡ分子の例は、第１表に示されている。この表中には、ｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖及びＦＧＦＲ４ｍＲＮＡ上のこのそれぞれの開始ヌクレオチドの位置（(NCBI L03840）が、示されていることに留意すべきである。
第１表：
【表１】
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【００３６】
本発明はまた、上記した少なくとも２種のＦＧＦＲ４阻害剤の投与を含み、特に２種、３種、４種又は５種のＦＧＦＲ４阻害剤である。
【００３７】
更なるＦＧＦＲ４阻害剤は、詳細に以下に概要が示されるとおりスクリーニング手順により同定されてよい。
【００３８】
本発明のまた別の観点は、
（ａ）上記したとおりのＦＧＦＲ４阻害剤、及び
（ｂ）過剰増殖疾病の予防、緩和又は／及び治療のための剤であって、（ａ）とは異なる剤、
を、場合により、医薬的に許容可能なキャリアー、希釈剤又は／及び助剤と一緒に含有する、医薬組成物又はキットである。
【００３９】
有利には、本発明のキットの医薬組成物中においては、過剰増殖疾病の予防、緩和又は／及び治療のための剤は、アポトーシス誘発剤、例えば上記したとおりの化学療法剤である。
【００４０】
本発明における使用のために適した医薬組成物又はキットは、活性成分が、意図される目的の達成のために有効な量で含有されている組成物又はキットを含む。治療的に有効な量は、上記したとおりの過剰増殖疾病に苦しむ患者において症状の改善又は生存率の延長化を生じる、特に、ＦＧＦＲ４阻害剤と上記したとおりの過剰増殖疾病の予防、緩和又は／及び治療のための剤又は／及び治療的手段の相互作用を生じる化合物の量を指す。特に、相乗作用は、上記したとおりの共投与において過剰増殖疾病の予防、緩和又は／及び治療のための剤又は／及び治療的手段の用量の減少又は／及び増加した効力である。
【００４１】
ＦＧＦＲ４阻害剤及び過剰増殖疾病の予防、緩和又は／及び治療のための剤の毒性及び治療的効力は、細胞培養又は実験動物中での標準的な製薬的手段により決定されることができ、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％にとって致命的な用量）及びＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）の決定のためである。本発明において使用される任意の化合物のためには、この治療的な有効用量は、細胞培養アッセイから最初に見積もられることができる。例えば、用量は、動物モデル中で細胞培養中で決定されるとおりＩＣ５０を含む循環する濃度範囲を達成するために処方されることができる（即ち、この成長因子レセプター活性の半分の最大の阻害を達成する試験化合物の濃度）。このような情報は、ヒト中で使用される用量をより正確に決定するために使用されることができる。
【００４２】
毒性と治療的作用との間での用量比は、治療的指数であり、かつ、これはＬＤ５０とＥＤ５０との間の比として表現されることができる。高い治療指数を示す化合物が有利である。投与及び用量の正確な処方、経路は、個々の医者により患者の症状の観点から選択されることができる（例えば、Fingl et al., 1975,  ,,The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 , p. 1 参照のこと）。用量及び間隔は、レセプター調節作用を維持するために十分な活性残基の血漿レベル又は最小有効濃度（ＭＥＣ）を提供すべく個々に調節されてよい。このＭＥＣは、それぞれの化合物について変更されるが、しかしながら、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのデータから、例えば、本願明細書において説明されたアッセイを用いるレセプターの５０−９０％阻害を達成するために必要な濃度を見積もることができる。化合物は、時間の１０〜９０％、有利には３０〜９０％、最も有利には５０〜９０％にわたるＭＥＣを超える血漿レベルを維持する方式を用いて投与されるべきである。ＭＥＣを達成するために必要な用量は個々の特性及び投与経路に依存するものである。局所投与又は選択的取り込みの場合に、この薬剤の有効な局所濃度は、血漿濃度に関連しなくてよい。
【００４３】
投与される医薬組成物又はキットの実際の量は、治療される被験体、被験体の体重、この病気の深刻度、投与経路及び処方する医師の判断に依存する。抗体及び治療的に活性のある核酸分子又は他の化合物のためには、例えば、一日あたり０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、特に０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇの一日量が適している。
【００４４】
投与の適した経路は、例えば、経口、直腸、経粘膜又は直腸投与；非経口配送、筋肉内、皮下、髄内注射、また同様に鞘的な、直接的な心室内、静脈内、腹腔内、経鼻又は経眼注射を含む。
【００４５】
又は、本発明の医薬組成物又はキットを全身的にでなくむしろ局所的に投与してよく、例えば、前記化合物を直接的に充実性腫瘍中に、しばしばデポー又は維持された放出処方において、注射することを介して投与されてよい。
【００４６】
更に、本発明の医薬組成物又はキットを、標的化した薬剤配送系において、例えば腫瘍特異的抗体で被覆したリポソームにおいて投与してよい。このリポソームは、腫瘍に標的化され、腫瘍により選択的に取り込まれる。
【００４７】
本発明の医薬組成物又はキットにおいて、（ａ）のＦＧＦＲ４阻害剤及び過剰増殖疾病の予防、緩和及び／又は治療のための（ｂ）の剤は、１つの医薬組成物（単独投与形態）において提供されてよく、又は、異なる組成物（別個の投与形態）において提供されてよく、有利には少なくとも２種の別個の組成物、より有利には、２種の別個の組成物において提供されてよい。特に、本発明の医薬組成物の別個の組成物が、同じ経路により又は異なる経路により投与されてよい。前記医薬組成物又はキットの、治療的手段、例えばアポトーシス誘発性の治療的手段、例えば放射線治療と一緒での共投与は、上記したとおりである。
【００４８】
本発明のまた別の観点は、ＦＧＦＲ４阻害剤を有効量で、過剰増殖疾病の予防、緩和及び／又は治療のための治療的手段又は／及び剤と共投与においてこれを必要とする被験体に投与することを含む過剰増殖疾病の予防、緩和及び／又は治療のための方法である。有利には、この方法において過剰増殖疾病の予防、緩和及び／又は治療のためのこの治療的手段又は／及び剤は、アポトーシス誘発性治療手段又は／及び剤である。この方法の特定の実施態様は、過剰増殖疾病、ＦＧＦＲ４阻害剤、アポトーシス誘発性治療的手段、アポトーシス誘発性剤又は／及び治療的手段又は／及び剤と上記したとおりのＦＧＦＲ４粗顔剤との共投与のモードに関する。予防、緩和又は／及び治療の方法の有利な一実施態様において、過剰増殖疾患は、少なくとも部分的に治療抵抗性の過剰増殖疾患である。
【００４９】
予防、緩和又は／及び治療の必要のある被験体は、過剰増殖疾病に苦しんでいてよい任意の動物であってよく、特には哺乳類、特にはヒトである。
【００５０】
本発明の更なる観点は、過剰増殖疾病に罹患している可能性のある被験体からの試料を、ＦＧＦＲ４遺伝子の発現について分析する、過剰増殖疾病の診断方法に関する。この試料は、例えば体液試料又は組織試料であってよく、例えばバイオプサイであってよい。ＦＧＦＲ４発現は、標準的な方法に応じて、例えば遺伝子アレイ又は免疫化学的、即ち、免疫組織化学的方法を用いて核酸レベル又はタンパク質レベルで決定されてよい。ＦＧＦＲ４の過剰発現は、分析すべき試料中でのＦＧＦＲ４発現と、対照試料、例えば健康な被験体から試料におけるＦＧＦＲ４発現又は標準的な値とを比較することにより、決定される。
【００５１】
本発明の更なる一観点は、被験体からの試料中のＦＧＦＲ４多形の決定を含む過剰増殖疾病の診断に関する。この決定は、例えば、標準的な方法により、例えば、制限断片長さ多形（ＲＦＰＬ）決定により核酸レベルで実施されてよい。特に有利な一実施態様において、ＦＧＦＲ４−３８８Ｇｌｙ及びＦＧＦＲ４−３８８Ａｒｇアレルの多形分析が実施される。
【００５２】
本発明の更なる観点は、ＦＧＦＲ４発現の分析及びＦＧＦＲ４多形の決定を含む、過剰増殖疾病の診断に関する。
【００５３】
ＦＧＦＲ４発現の分析又は／及びＦＧＦＲ４多形の決定の結果に基づき、過剰増殖疾病の治療のための治療方式が設計されてよい。ＦＧＦＲ４過剰発現により特徴付けられる非転移性腫瘍の治療のためには、この治療方式は、ＦＧＦＲ４阻害剤と、上記したとおりの放射線又は／及び化学療法と組み合わせた共投与を含んでよい。また、ＦＧＦＲ４−３８８Ａｒｇアレルの過剰発現により特徴付けられる転移性腫瘍は、ＦＧＦＲ４阻害剤と、例えば放射線又は／及び化学療法と組み合わせた投与により治療されてよい。他方では、ＦＧＦＲ４−３８８Ｇｌｙアレルを有する被験体における腫瘍転移は、WO 03/063893中に説明されたとおりのＦＧＦＲ４の活性化により治療されてよい。
【００５４】
本発明の別の観点は、過剰増殖細胞のアポトーシス抵抗性を減少させるために適した化合物を同定又は／及びキャラクリゼーションするためのスクリーニング方法であり、その際、このスクリーニング方法は、この化合物がＦＧＦＲ４阻害剤であるかどうかを決定することを含む。
【００５５】
特定の一実施態様において、ＦＧＦＲ４阻害剤を同定する本発明のスクリーニング方法は、
（ａ）ＦＧＦＲ４と少なくとも１つの化合物を接触させる工程、及び
（ｂ）ＦＧＦＲ４活性をこの化合物の存在下で決定する工程
を含む。
【００５６】
本発明のスクリーニング方法は、単離されたタンパク質、細胞抽出物、組み換え細胞又は／及びトランスジェニック非ヒト動物の使用を含んでよい。特に、このＦＧＦＲ４阻害剤は、分子又は／及び細胞アッセイにおいて同定されてよい。
【００５７】
この組み換え細胞又は／及びトランスジェニック非ヒト動物は有利には、野生型の相応する細胞又は動物と比較して改変されたＦＧＦＲ４発現、特に、ＦＧＦＲ４過剰発現を示す。
【００５８】
本発明のスクリーニング方法において、ＦＧＦＲ４阻害剤は、有利には、ＦＧＦＲ４によるポジティブなＢｃｌＸL及び／又はＭＡＰキナーゼ制御の阻害剤、又は／及びＦＧＦＲ４誘発されたアポトーシスに対する抵抗性の阻害剤である。従って、上述したとおり、工程（ｂ）は、ＦＧＦＲ４の量の決定、ＦＧＦＲ４によるＢｃｌＸL又は／及びＭＡＰキナーゼ上方調節又は／及びアポトーシス誘発に対するＦＧＦＲ４誘発された抵抗性の決定を含んでよい。
【００５９】
本発明のスクリーニング方法は、新規の化合物又は化合物のクラスを同定するためのハイスループット形式において実施されることができる。更に、本発明のスクリーニング方法は、既知の化合物の薬理的有効性又は／及び副作用のキャラクリぜーションのためのバリデーション手段として適している。
【００６０】
更に、本発明は、以下の図及び実施例により説明されるものである。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】図１は、ＦＧＦＲ４は、ドキソルビシン（ＤＸＲ）処理されたＭＤＡ−ＭＢ−４５３クローンにおいて上方制御されることを示す図である。
【図２Ａ】図２Ａは、ＭＣＦ７−ＦＧＦＲ４−及びＭＣＦ７−Ｍｏｃｋ細胞溶解物の、モノクローナルＦＧＦＲ４抗体を用いた免疫沈降、及び、ポリクローナルＦＧＦＲ４抗体を用いたブロットの探査を示す図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、４５３Ｒ１ノックダウン細胞中でのＦＧＦＲ４の免疫沈降を示す図である。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ＤＸＲの異なる濃度を用いて２４時間の用量／応答アッセイ及びヨウ化プロピジウム染色及びその後のＦＡＣＳを用いたアポトーシス細胞の測定を示す図である。
【図２Ｄ】図２Ｄは、化学治療剤シクロホスファミド（ＣＰＡ）、タキソテレ（Taxotere）（ＴＸＴ）及びシスプラチン（ＣＰ）を用いた４８時間のアポトーシスの誘導を示す図である。
【図３】図３は、大腸癌細胞系列７６９−Ｐ中でのＦＧＦＲ４のノックダウンは、アポトーシス感受性を増加させることを示す図である。
【図４】図４は、一過的なＦＧＦＲ４ノックダウン細胞中での下流のシグナル経路の分析を示す図である。
【図５】図５は、ＦＧＦＲ４は、様々な細胞系列においてＢｃｌ−ｘｌの発現に影響を及ぼすことを示す図である。
【図６】図６は、ＦＧＦＲ４ブロックｊ化抗体の使用はＦＧＦ１９誘導したＭＡＰＫ活性化の阻害を媒介することを示す図である。
【図７】図７は、ＦＧＦＲ４ブロック化抗体（１０Ｆ１０）は、ＤＸＲ処理した癌細胞の化学療法抵抗性を減少させることを示す図である。
【００６２】
図の説明
図１：ＦＧＦＲ４は、ドキソルビシン（ＤＸＲ）処理されたＭＤＡ−ＭＢ−４５３クローンにおいて上方制御される。
【００６３】
Ａ  アレイ分析によるＦＧＦＲ４の発現。細胞系列ＭＤＡ−ＭＢ−４５３及びこの抵抗性のクローン（４５３Ｒ）を用いた１０個の独立した実験におけるＦＧＦＲ４の平均遺伝子発現。Ｂ  それぞれの抵抗性のクローン（４５３Ｒ１−Ｒ２９）の発現を、３つの独立した実験によりアセンブリーした。
【００６４】
図２：ＦＧＦＲ４発現は、乳癌細胞の化学療法抵抗性に作用する。
【００６５】
Ａ  ＭＣＦ７−ＦＧＦＲ４−及びＭＣＦ７−Ｍｏｃｋ細胞溶解物の、モノクローナルＦＧＦＲ４抗体を用いた免疫沈降、及び、ポリクローナルＦＧＦＲ４抗体を用いたブロットの探査。ＭＣＦ７−ＦＧＦＲ４及びＭＣＦ７−Ｍｏｃｋ細胞を２μＭ  ＤＸＲで、４８時間処理し、アポトーシスを誘導した。ヨウ化プロピジウム染色した細胞をＦＡＣＳにより定量化した。Ｂ  ４５３Ｒ１ノックダウン細胞中でのＦＧＦＲ４の免疫沈降。ノックダウンを４５３Ｒ１で実施した。Ｃ  ＤＸＲの異なる濃度を用いて２４時間の用量／応答アッセイ及びヨウ化プロピジウム染色及びその後のＦＡＣＳを用いたアポトーシス細胞の測定。Ｄ  化学治療剤シクロホスファミド（ＣＰＡ）、タキソテレ（Taxotere）（ＴＸＴ）及びシスプラチン（ＣＰ）を用いた４８時間のアポトーシスの誘導。アポトーシスの割合を、ヨウ化プロピジウム染色及びその後のＦＡＣＳにより測定した。
【００６６】
図３：大腸癌細胞系列７６９−Ｐ中でのＦＧＦＲ４のノックダウンは、アポトーシス感受性を増加させる。
【００６７】
７６９−ノックダウン細胞中でのＦＧＦＲ４の免疫沈降。ノックダウンを、ｓｉＲＮＡ分子６６、７４及び７０それぞれを用いて実施した（参照、第１表）。ＤＸＲ処理した（２μＭ、４８時間）７６９−Ｐ細胞のヨウ化プロピジウム染色及びフローサイトメトリー分析を、アポトーシス定量化のために実施した。
【００６８】
図４：一過的なＦＧＦＲ４ノックダウン細胞中での下流のシグナル経路の分析。
【００６９】
Ａ  ルシフェラーゼ（対照）又はＦＧＦＲ４  ｓｉＲＮＡ（ｓｉＦＧＦＲ４）で一過的にトランスフェクションしたＢＴ４７４及びＺＲ７５−１細胞におけるＦＧＦＲ４の免疫沈降。ＴＬ免疫ブロットを、Ｅｒｋリン酸化をモニターするために実施した。Ｂ  示した時間点にわたるＤＸＲで処理した一過的なＦＧＦＲノックダウンのアポトーシスアッセイ。
【００７０】
図５：ＦＧＦＲ４は、様々な細胞系列においてＢｃｌ−ｘｌの発現に影響を及ぼす。
【００７１】
Ａ  ＭＣＦ７Ｍｏｃｋ及び異所的にＦＧＦＲ４を発現する細胞中のＢｃｌ−ｘｌ発現のアレイ分析。Ｂ  ＭＣＦ７細胞中でのＢｃｌ−ｘｌ発現のＴＬ免疫ブロット。Ｃ  ＢＴ４７４及びＺＲ７５−１細胞中でのＦＧＦＲ４ノックダウン及びＢｃｌ−ｘｌのＴＬ免疫ブロット。Ｄ  ＭＧＦ７−ＦＧＦＲ４細胞を１０μＭのＵ0126で６時間及び１２時間処理した。Ｕ0126処理した細胞のｃＤＮＡを、Ｂｃｌ−ｘｌプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲを実施するために利用した。それぞれのＲＴ−ＰＣＲにおいて利用されたｃＤＮＡの統合性及び量は、ＧＡＰＤＨ増幅により測定された。
【００７２】
図６：ＦＧＦＲ４ブロックｊ化抗体の使用はＦＧＦ１９誘導したＭＡＰＫ活性化の阻害を媒介する。
【００７３】
Ａ  異なる乳癌細胞系列（ＢＴ−４７４、ＭＤＡ−ＭＢ−３６−１及びＺＲ７５−１）を、４８時間０％のＦＣＳ／培地で培養した。細胞をＦＧＦ１９単独で又は１０Ｆ１０＋ＦＧＦ１９で処理し、かつ、この未処理の対照細胞と比較した。この細胞の刺激及び再度の阻害は、Ｐ−ＥＲＫ−ＡＢを用いたＴＬ免疫ブロットにより示される。Ｂ  ＤＸＲ及び様々な刺激で処理されたＭＤＡ−ＭＢ３６１及びＢＴ４７４乳癌細胞系列のアポトーシス割合。
【００７４】
図７：ＦＧＦＲ４ブロック化抗体（１０Ｆ１０）は、ＤＸＲ処理した癌細胞の化学療法抵抗性を減少させる。
【００７５】
Ａ  ｃＤＮＡマイクロアレイ分析は、様々な乳癌細胞系列における相対的なＦＧＦＲ４発現を示す。Ｂ  ＤＸＲを用いたアポトーシスの、ＦＧＦ１９又はＦＧＦ１９／１０Ｆ１０処理した、最も高いＦＧＦＲ４発現を示す乳癌細胞系列中での誘導。ＰＪ染色及び引き続くＦＡＣＳ分析によるアポトーシス割合の定量化。Ｃ  上記したとおりに評価した、乳腺以外の起源を有する２種の癌細胞系列のアポトーシス割合。
【００７６】
実施例
材料及び方法
試薬及び抗体
ＦＧＦリガンドを、ＴＥＢＵ (Offenbach, Germany)から購入した。この使用した抗体は、ポリクローナル抗ＦＧＦＲ４、抗Ｅｒｋ２及び抗Ａｋｔ１／２（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）、ウサギポリクローナル抗ホスホＡｋｔ（Ｓｅｒ４７３）（New England BioLabs, Beverly, MA）、マウスモノクローナル抗ホホスホチロシン抗体４Ｇ１０（Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY）、マウスモノクローナル抗チューブリン（Sigma, St Louis, MO）、ウサギポリクローナル抗ホスホＥｒｋ（Cell signalling, USA）及びマウスモノクローナル抗Ｂｃｌ−ｘｌ（BD Biosciences, Heidelberg, Germany）、マウスモノクローナル抗ＶＳＶ抗体、マウスモノクローナル抗ＦＧＦＲ４抗体  １０Ｆ１０（U3pharma, Martinsried）であった。
【００７７】
ＨＲＰコンジュゲートした二次抗体は、ヤギ抗マウス（Sigma, Taufkirchen, Germany）及びヤギ抗ウサギ（Biorad, Munich, Germany）であった。要求される場合には、細胞を完全な血清除去により４８時間飢餓させ、そして図の説明において示したとおりに成長因子で処理した。
【００７８】
細胞培養、プラスミド及びレトロウィルス感染
細胞系列７６９−Ｐ、ＴＥ６７１、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＢＴ４７４、ＭＤＡ−ＭＢ３６１、ＭＤＡ−ＭＢ２３１、ＺＲ７５−１及びＭＣＦ７を、ＡＴＣＣ（American type culture collection, Manassas, VA）から獲得し、そして、この供給者の指示に従って、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞以外は培養させ、これは、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）及びグルタミン（Gibco/lnvitrogen, Karlsruhe, Germany）で補給されたＲＰＭＩ培地中で維持した。
【００７９】
ヒトｆｇｆｒ４をコードするｃＤＮＡを含有するｐＬＸＳＮベクターは、以前説明されてる（Bange 2002）。ＦＧＦＲ４を発現するこのポリクローナルＭＣＦ７細胞系列は、レトロウィルス遺伝子移入により産出された。アンホトロピックレトロウィルス上清を、 Pear et al. 1993, Kinsella and Nolan 1996により以前説明されているとおりの、リン酸カルシウム／クロロキン方法による適したベクターコンストラクトを用いたフェニックスパッキング細胞のトランスフェクションにより産出した。トランスフェクションの４８時間後に、この組織培養媒体を、０．４５μｍのフィルターを介して濾過し、ポリブレン（polybrene）（終濃度4 μg/ml）と混合し、そしてこの細胞の感染のために使用した。細胞を３回少なくとも４時間にわたり感染させ、かつ、新規の媒体を用いて２４時間にわたり回収した。ＦＧＦＲ４を安定に発現するポリクローナル細胞を、Ｇ４１８（２ｍｇ／ｍｌ）を用いて２週間選択した。
【００８０】
ｓｉＲＮＡによる下方制御のためにＦＧＦＲ４タンパク質を標的化するために、ｐRetroSuper-ＦＧＦＲ４コンストラクトを供給者（OligoEngine）の指示に従って産出した。使用したｓｉＲＮＡの標的配列はこの明細書中では次のものである：ＧＡＧＣＡＧＧＡＧＣＴＧＡＣＡＧＡＧＴ  （ｓｉ  ６６），  ＣＴＡＣＣＴＧＣＴＡＧＡＴＧＴＧＣＴＧ  （ｓｉＣｔｒｌ）  及びＧＴＧＣＴＣＧＡＣＣＴＴＧＡＴＡＧＣＡ  （ｓｉ  ７４）。ｐＲｅｔｒｏＳｕｐｅｒ−ＦＧＦＲ４を有するポリクローナル細胞を、プロマイシン（puromycin）（２ μｇ／ｍｌ）を用いて２日間選択した。
【００８１】
逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）及び半定量的ＰＣＲ  
ＲＮＡを、ＲＮeasy Mini Kit（Qiagen, Hilden, Germany）を用いて単離し、かつ、ＡＭＶ逆転写酵素（Roche, Mannheim, Germany）及びOligodT-プライマー（Gibco, Germany）を用いてｃＤＮＡ中に逆転写した。このＲＮＡ及びｃＤＮＡ濃度を、NanoDrop ND1000（PeqLab, Erlangen, Germany）系を用いて測定した。半定量的ＰＣＲ増幅のためには、以下のプライマー（MWG, Ebersberg, Germany）を使用した：
５′−ＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴ−ＣＡＣ−３′  （ＧＡＰＤＨ  フォーワード）
及び５′−ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧ−ＴＴＧＣＴＧＴＡ−３′  （ＧＡＰＤＨリバース），
５′−ＡＧＡＡＴＴＣＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＣＴＣＡＧＡＧＣＡＡＣＣ−３′  （Ｂｃｌ−ｘｌ  フォーワード）  及び
５′−ＧＧＧ−ＴＧＡＴＧＴＧＧＡＧＣＴＧＧＧＡＴＧＴＣ−３′  （Ｂｃｌ−ｘｌ  リバース）。ＰＣＲ産物を、２％のアガロースゲルに対して電気泳動し、かつ、ＤＮＡをエチジウムブロミド染色を用いて視覚化した。
【００８２】
細胞溶解、免疫沈降及び免疫ブロッティング
細胞培養体を、ＰＢＳで洗浄し、４℃で、ホスファターゼ及びプロテアーゼ阻害剤（１０ｍＭ  ピロリン酸ナトリウム、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、２ｍＭ  オルトバナジン酸ナトリウム、１０μｇ／ｍｌアプロチニン）で補給した、溶解緩衝液（５０ｍＭ、ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、１０％グリセロール及び１％Triton X-100）を用いてインキュベーションした。細胞デブリを、遠心分離により除去した。タンパク質濃度測定を、Pierce (Bonn, Germany)からのMicro-BCA-タンパク質アッセイを用いて実施した。免疫沈降のために、全細胞溶解物を、抗体及び３０μｌのタンパク質Ａ−又はＧ−セファローススラリー（GE Healthcare）と組み合わせた。この試料を、３時間回転輪上で４℃でインキュベーションした。この沈殿物を、３×ＳＤＳ試料緩衝液中に懸濁した、ＨＮＴＧ緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、０．１％  Triton X-100及び１０ｍＭ  ピロリン酸ナトリウム）で３回洗浄し、３分間沸騰させ、かつ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。ウェスタンブロット分析のために、タンパク質をニトロセルロース膜に移し、かつ、適した抗体を用いてインキュベーションした。シグナルを、促進された化学発光検出系（ECL, Perkin Elmer, Wellesley, MA）を介して展開した。再度探査する前に、膜を、２％ＳＤＳを含有する６５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ６．８緩衝液を用いて、５０℃で１時間にわたりストリップした。
【００８３】
ＲＮＡ干渉
内因性の遺伝子を標的化するために２１ヌクレオチドｓｉＲＮＡデュプレックス（Ambion, Huntington, Cambridge, UK）のトランスフェクションを、Elbashir et al. 2001により説明されたとおり、６ウェルプレートにつきLipofectamine 2000（Invitrogen）及びｓｉＲＮＡデュプレックス０．８４μｇを使用して実施した。トランスフェクションした細胞を、示された時間点で評価した。使用したｓｉＲＮＡの配列は次のとおりである：
ＦＧＦＲ４ ５'−ＧＧＣＵＣＵＵＣＣＧＧＣＡＡＧＵＣＡＡｔｔ−３' 及び ＧＬ２−ルシフェラーゼ ５'−ＣＧＵＡＣＧＣＧＧＡＡＵＡＣＵＵ−ＣＧＡｔｔ−３'。ＦＧＦＲ４の特異的なサイレンシングを、イムノブロット分析により確認し、これは、以前説明されたとおりである。
【００８４】
細胞死アッセイ
細胞死を、以前に説明されたとおりにフローサイトメトリーを用いて低二媒体細胞のパーセンテージをカウントすることにより測定した（Nicoletti, I., Migliorati, G., Pagliacci, M. C1 Grignani, F., and Riccardi, C. (1991) J. Immunol. Methods 139, 271-279)）。ヨウ化プロピジウム蛍光を、FACSCalibur (BD Biosciences)でＦＬ２チャンネル中で測定した。細胞培養上清及びトリプシン化した細胞をプールした。
【００８５】
ｃＤＮＡアレイハイブリダイゼーション
ｃＤＮＡｓの放射線ラベル化を、Megaprime-ラベル化キット（Amersham Biosciences）及び５０μＣｉの［α−33Ｐ］ＡＴＰを反応につき使用して達成した。このラベル化したｃＤＮＡをQiagen からのNucleotide Removalキットを介して精製し、かつ、ハイブリダイゼーション緩衝液（５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）中の０．５ｍｇ／ｍｌのＣＯＴ−ＤＮＡ（Invitrogen）を用いて、５分間９５℃及び３０分間６８℃でインキュベーションして、ｃＤＮＡ中の繰り返し配列をブロックした。このｃＤＮＡを予備加熱（６８℃）した、１００μｇ／ｍｌのｔＲＮＡ（baker's yeast, Roche Applied Science）を含有するハイブリダイゼーション緩衝液に添加した。ｃＤＮＡアレイを、予備ハイブリダイゼーション緩衝液（５×デーンハルト（Denhardfs）、５×ＳＳＣ、１００ｍＭ  ＮａＰＯ4、２ｍＭ  Ｎａ2Ｐ2Ｏ7、１００μｇ／ｍｌ  ｔＲＮＡ）中で４時間インキュベーションし、引き続きこのラベル化したｃＤＮＡをハイブリダイゼーション緩衝液中に１６時間インキュベーションした。このｃＤＮＡを取り除き、かつこのｃＤＮＡアレイを、増加するストリンジェンシーで洗浄し、乾燥し、そしてリンイメージ化プレート（Fuji）上に曝した。このプレートをFujiBas2500リンイメージ化装置（phosphorimaging device）上で読み取り、かつ、この粗のスポット値（ボリューム）を、ArrayVision (RayTest, Canada)を用いて決定した。
【００８６】
結果
ＤＸＲ処理したＭＤＡ−ＭＢ４５３クローン中のＦＧＦＲ４の増加した発現
乳癌細胞系列ＭＤＡ−ＭＢ−４５３中での抗アポトーシス機構を同定するためのアッセイを実施した。従って、細胞をＤＸＲで処理し、生存したクローンを単離した。平均してＦＧＦＲ４ｍＲＮＡの２倍の上方調節が、アレイ分析により産出された遺伝子発現プロファイルが比較された場合に、ＤＸＲ処理を生存したクローン中で見出された（図１Ａ）。このクローンの約半分がＦＧＦＲ４ｍＲＮＡレベルにおいて４倍までの増加を示し、その一方で、他のものは、弱い増加を示すか又は増加を示さなかった（図１Ｂ）。ＦＧＦＲ４発現レベルを、半定量的ＰＣＲにより評価し、かつ、定量化した。
【００８７】
Ｆｇｆｒ４発現は、癌細胞の化学療法抵抗性に作用を及ぼす
更にＦＧＦＲ４の抗アポトーシス機構における関連を分析するために、Ｆｇｆｒ４遺伝子を乳癌細胞系列ＭＣＦ７において発現した（図２Ａ）。これらの細胞の増殖は、通常の培養条件では影響を及ぼされなかった。しかしながら、ＤＸＲ処理すると、ＭＣＦ７−Ｆｇｆｒ４細胞は、ＭＣＦ７に比較してより迅速な増殖を示した。異所的にＦｇｆｒ４を発現する細胞中でのＤＸＲに対するこの減少した感受性のために、我々は、フローサイトメトリーによりアポトーシス性細胞のパーセンテージを分析した。親のＭＣＦ７細胞に比較して、ＭＣＦ７−Ｆｇｆｒ４発現細胞は、アポトーシスの減少した割合を示した（図２Ａ）。
【００８８】
化学療法抵抗性におけるＦｇｆｒ４の役割を更に研究するために、抵抗性のＭＤＡ−ＭＢ４５３クローンの２種（４５３Ｒ１及び４５３Ｒ９）を利用し、かつ、腎臓癌腫細胞系列７６９−Ｐを、２種の異なるＦＧＦＲ４−ｓｉＲＮＡｓ（ｓｉ６６及びｓｉ７４）によるＦｇｆｒ４安定なノックダウンについて、利用した。ここでは、ｓｉＲＮＡｓ  ｓｉ６６及びｓｉ７４は、このレセプター発現を、４５３Ｒ１、７６９−Ｐ（図２Ｂ）及び４５３Ｒ９細胞系列において効率的にノックダウンできた。これらの細胞は、Ｍｏｃｋ又はｃｔｒｌ−ｓｉＲＮＡ感染させた細胞に比較して、ＤＸＲ処理に対してアポトーシス割合の増加を示した（図２Ｂ）。
【００８９】
化学治療的薬剤に対する増加した感受性は、我々が分析したＤＸＲの特定の濃度で存在するだけでなく、異所的にＦＧＦＲ４を発現するＭＣＦ７細胞及び様々なＤＸＲ濃度でのＦＧＦＲ４ノックダウンを有する４５３Ｒ１細胞のアポトーシス割合でも存在した。ＭＣＦ７−Ｆｇｆｒ４細胞においてはアポトーシスは、様々なＤＸＲ濃度で減少した。結果として、ＦＧＦＲ４ノックダウン細胞は、感染していない細胞に比較してより高いアポトーシス割合を示した（図２Ｃ）。同様の結果は、ＦＧＦＲ４ノックダウンした場合の、内因性にＦＧＦＲ４を発現する腎臓癌腫細胞系列７６９−ＰのＤＸＲ処理で得られた（図３）。
【００９０】
最後に、我々は、ＭＣＦ７中のＦｇｆｒ４の異所性発現又は４５３Ｒ１細胞中でのＦＧＦＲ４ノックダウンが、他の化学薬品治療剤に対する感受性に影響を及ぼすかどうかを分析した。興味深いことに、サイトホスファミド（ＣＰＡ）の場合にのみ、減少したアポトーシス感受性が、様々な化学的治療剤で処理された、ＦＧＦＲ４過剰発現細胞中で観察されることができた。期待どおり、４５３Ｒ１  ｓｉＲＮＡ６６及び７４細胞は、ＣＰＡで処理した場合に対照細胞に比較してより高いアポトーシス割合を示した（図２Ｄ）。細胞がタキソテレ（ＴＸＴ）及びシスプラチン（ＣＰ）で処理された場合には影響は観察されることができなかった。まとめると、これらの実験は、ＦＧＦＲ４の過剰発現がアポトーシス抵抗性を増加させ、その一方で、ＦＧＦＲ４の安定なノックダウンが、化学治療的薬剤治療に対する癌細胞を敏感化させることを示す。
【００９１】
ＦＧＦＲ４のノックダウンは、ＭＡＰＫシグナル経路に影響を及ぼす
このＦＧＦＲ４により支配されているシグナル経路を調べるために、我々は様々な乳癌細胞系列ＺＲ７５−１及びＢＴ４７４を利用し、これはＦＧＦＲ４の高い量を内因的に発現している。Ｆｇｆｒ４に対して指向した合成のｓｉＲＮＡ（ｓｉＦＧＦＲ４）を用いた一過的なノックダウンは、９６時間でのホスホＥｒｋレベルにおける減少を示した（図４）。このＡｋｔリン酸化は、ノックダウンにより影響を及ぼされず、かつ、全ての時間点で活性化されたままであった（データ示さず）。従って、ＦＧＦＲ４が、ＡｋｔよりもむしろＭＡＰＫ活性化を制御することを我々は結論付ける。アポトーシス割合もまた、様々な時間点でのＦＧＦＲ４の一過的なノックダウンにより影響を及ぼされた（図４Ｂ）。
【００９２】
異所性ＦＧＦＲ４発現細胞の遺伝子発現分析は、Ｂｃｌ−ｘｌの増加したレベルを明らかにする
ＦＧＦＲ４過剰発現細胞系列の化学療法抵抗性を媒介する分子機構に関する更なる知見を得るために、ＦＧＦＲ４細胞を異所的に発現するＭＣＦ７細胞の遺伝子発現アレイ分析を実施した。ここで、我々は、Ｂｃｌ−ｘｌ発現が未制御状態に比較して、ＦＧＦＲ４過剰発現のために２倍となることを検出できた（図５Ａ）。我々は、半定量的ＰＣＲによりＢｃｌ−ｘｌの発現レベルにおける相違を評価した。Ｂｃｌ−ｘｌタンパク質は、ＦＧＦＲ４を発現するＭＣＦ７細胞系列にのみ見出された（図５Ｂ）。Ｂｃｌ−ｘｌ発現がＦＧＦＲ４に依存していることを確認するために、我々は様々な細胞系列において一過的にＦｇｆｒ４をノックダウンし、両者のタンパク質の発現の変化を分析した。ここで、我々はＢｃｌ−ｘｌ発現がＦＧＦＲ４ノックダウンで抑制されていることを示すことができた。これらの結果は、Ｂｃｌ−ｘｌ発現はＦＧＦＲ４発現に依存性であり、かつ、ＦＧＦＲ４ノックダウンにより抑制されることができることを示した。ＭＡＰＫはＢｃｌ−ｘｌ発現の極めて重要なレギュレーターであるので、ＭＣＦ７−ＦＧＦＲ４細胞をＵ0126、特異的なＭＥＫ阻害剤で処理した。この半定量的なＰＣＲは、Ｕ0126処理が、Ｂｃｌ−ｘｌ発現を破壊することを示した（図５Ｄ）。従って、我々は、Ｂｃｌ−ｘｌ発現が、ＦＧＦＲ４発現及びＭＡＰＫ活性に依存することを結論付ける。
【００９３】
Ｆｇｆｒ４ブロック化抗体は、ＦＧＦ１９誘発されたＭＡＰＫ活性化を阻害する
次に、我々は、この促進された化学療法抵抗性が、様々な癌細胞系列においてＦｇｆｒ４活性と連結しているかどうかとの問いに言及したかった。この目的のために、Ｆｇｆｒ４ブロック化抗体（１０Ｆ１０）を使用した。我々は、様々な乳癌細胞系列を特異的なリガンドＦＧＦ１９で刺激し、この系列は内因的にＦｇｆｒ４を発現する。ＦＧＦ１９処理されると、ｐ−Ｅｒｋ−レベルは、刺激されていない対照細胞に比較して増加した。Ｆｇｆｒ４ブロック化抗体でのこの細胞系列の予備インキュベーション及び引き続くＦＧＦ１９刺激後に、単独でＦＧＦ１９で処理された癌細胞系列に比較して減少したｐ−Ｅｒｋレベルが検出されることができた（図６Ａ）。この実験において、我々は、Ｆｇｆｒ４ブロック化抗体（１０Ｆ１０）が、Ｆｇｆｒ４媒介した下流のシグナリングを阻害することを明らかに示すことができた。
【００９４】
このＦｇｆｒ４レセプター活性のブロック化が、化学的治療薬剤に対する増加した感受性を生じるかどうかを確認するために、乳癌細胞系列ＭＤＡ−ＭＢ−３６１及びＢＴ４７４を、ＤＸＲ、ＶＳＶ／１０Ｆ１０抗体で又は様々な組み合わせにおいてインキュベーションし、かつ、ＤＸＲ−処理４８時間後のアポトーシス割合を測定した。ここで、我々は、ＦＧＦＲ４の１０Ｆ１０−抗体によるブロック化が、ＤＸＲ誘発のためにアポトーシス割合の増加を生じ、その一方でこのＶＳＶ抗体インキュベーションがアポトーシスに対して作用がないことを実証することができた（図６Ｂ）。
【００９５】
ＦＧＦＲ４ブロック化抗体（１０Ｆ１０）は、ＤＸＲ処理した癌細胞の化学療法抵抗性を減少した
ｃＤＮＡマイクロアレイ実験において、Ｆｇｆｒ４が、入手可能な乳癌細胞系列の約３０％において高度に発現していることを観察できた（図７Ａ）。このレセプターの高度の発現は、細胞系列ＢＴ−４７４、ＺＲ７５−１、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１及びＭＤＡ−ＭＢ−４５３において観察された。従って、これらの細胞系列を使用して、ＦＧＦＲ４シグナリングを阻害し、かつ、この癌細胞を化学療法のために敏感化した。ＦＧＦ１９／ＤＸＲ処理した癌細胞系列のアポトーシス割合を、ＦＧＦＲ４ブロック化抗体で更に処理した細胞系列と比較した。様々な細胞系列のＤＸＲ／ＦＧＦ１９処理は、アポトーシスを低度から中間の低度において誘発し、その一方でＦＧＦＲ４ブロック化抗体での更なる処理は、更にこのアポトーシス割合を顕著に増加させた（図７Ｂ）：ＭＤＡ−ＭＢ−３６１中約４０％、ＺＲ７５−１中約２９％、そして、ＢＴ−４７４中約１０％。ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞中で、１０Ｆ１０−ＡＢ処理を用いて増加したアポトーシスを検出できなかった。これは、この細胞系列中でのＦＧＦＲ４の構成的な活性化のためである可能性があり、これは、１０Ｆ１０抗体によりブロック化されることができなかった（データ示さず）。しかしながら、これらの実験において、ＦＧＦＲ４活性が、ＤＸＲに対する癌細胞の抵抗性を支持し、その一方でＦＧＦＲ４活性化のＦＧＦＲ４ブロック化抗体（１０Ｆ１０）による阻害は、癌細胞の増加した化学療法感受性を生じることが実証できた。
【００９６】
最後に、乳組織以外の起源の癌細胞系列中でのブロック化Ａｂ１０Ｆ１０の有効性を分析した。一例として、７６９−Ｐ腎臓癌腫及びＴＥ６７１グリオブラストーマ細胞系列を使用した。ブロック化抗体での処理は、これらの細胞中でのアポトーシス割合を増加させた。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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