(57)【要約】本発明は、一実施形態において、ビトロネクチンへのＰＡＩ−１の結合を調節する薬剤を含む有効量の組成物を患者に投与するステップを含む、患者の緑内障または高ＩＯＰを治療するための方法に関する。別の実施形態では、本発明は、ＰＡＩ−１の結合を調節すると考えられる候補物質を提供するステップと、候補物質が、緑内障または高ＰＡＩ−１に罹患している対象の小柱網における活性ＰＡＩ−１の量を低下させる能力を評価することによって、化合物を選択するステップと、選択された化合物を製造するステップとを含む、緑内障または高ＩＯＰのための治療として使用される化合物を製造する方法に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビトロネクチンへのＰＡＩ−１の結合を調節する薬剤を含む有効量の組成物を患者に投与するステップ
を含む、患者の緑内障または高ＩＯＰを治療するための方法。
【請求項２】
前記組成物が、眼科的に許容される保存剤、界面活性剤、粘度増強剤、浸透促進剤、ゲル化剤、疎水性塩基、ビヒクル、緩衝剤、塩化ナトリウム、水、およびこれらの組合せからなる群より選択される化合物をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組成物の一部または個別の投与のいずれかとして、β遮断薬、プロスタグランジン類似体、炭酸脱水酵素阻害剤、α２作動薬、縮瞳薬、神経保護剤、ｒｈｏキナーゼ阻害剤、およびこれらの組合せからなる群より選択される化合物を投与するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記組成物が、前記薬剤を約０．０１重量／体積パーセントから約５重量／体積パーセント含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記組成物が、前記薬剤を約０．２５重量／体積パーセントから約２重量／体積パーセント含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記薬剤が、ＺＫ４０４４、ＰＡＩ−０３９、ＷＡＹ−１４０３１２、ＨＰ−１２９、Ｔ−６８６、ＸＲ５９６７、ＸＲ３３４、ＸＲ３３０、ＸＲ５１１８、ＰＡＩ−１抗体、ＰＡＩ−１ペプチド模倣薬、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ビトロネクチンへのＰＡＩ−１の結合を調節する薬剤を含む有効量の組成物を患者に投与するステップ
を含む、治療を必要とする対象のＰＡＩ−１関連の眼障害を治療する方法。
【請求項８】
前記対象が、高眼圧症または緑内障を有するか、またはそれを発症する危険性がある、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記投与ステップが、前記対象における活性ＰＡＩ−１の量を低下させる、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記組成物が、眼科的に許容される保存剤、界面活性剤、粘度増強剤、浸透促進剤、ゲル化剤、疎水性塩基、ビヒクル、緩衝剤、塩化ナトリウム、水、およびこれらの組合せからなる群より選択される化合物をさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記組成物の一部または個別の投与のいずれかとして、β遮断薬、プロスタグランジン類似体、炭酸脱水酵素阻害剤、α２作動薬、縮瞳薬、神経保護剤、ｒｈｏキナーゼ阻害剤、およびこれらの組合せからなる群より選択される化合物を投与するステップをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記組成物が、前記薬剤を約０．０１重量／体積パーセントから約５重量／体積パーセント含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記組成物が、前記薬剤を約０．２５重量／体積パーセントから約２重量／体積パーセント含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
前記薬剤が、ＺＫ４０４４、ＰＡＩ−０３９、ＷＡＹ−１４０３１２、ＨＰ−１２９、Ｔ−６８６、ＸＲ５９６７、ＸＲ３３４、ＸＲ３３０、ＸＲ５１１８、ＰＡＩ−１抗体、ＰＡＩ−１ペプチド模倣薬、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
ＰＡＩ−１の結合を調節すると考えられる候補物質を提供するステップと、
該候補物質が、緑内障または高ＰＡＩ−１に罹患している対象の小柱網における活性ＰＡＩ−１の量を低下させる能力を評価することによって、化合物を選択するステップと、
選択された該化合物を製造するステップと
を含む、緑内障または高ＩＯＰのための治療として使用される化合物を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、米国特許法§１１９の下、200６年１０月３１日に出願された、米国仮特許出願第６0/８６３，７１５号（この全体の内容は、参考として本明細書に援用される）への優先権を主張する。
【０００２】
発明の技術分野
本発明は、一般に眼障害の治療に関し、より詳細には、ＩＯＰを低下させ、かつ／または緑内障を治療しもしくは予防する薬剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
原発性開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ）は、慢性または単性緑内障としても知られ、米国におけるすべての緑内障の大部分を占める。緑内障のほとんどの形態は、解剖学的、生化学的または生理学的根拠を有する、房水の流れの妨害によって生じる。
【０００４】
高レベルのプラスミノーゲン活性化因子阻害剤−１（ＰＡＩ−１）が、緑内障患者の房水中に検出されている（Danら、Arch Opthalmol、２００５年）。ＰＡＩ−１レベルは、数ある内因性の刺激の中でも、サイトカインＴＧＦβによって増大する（Binderら、NewsPhysiol Sci、２００２年）。ＰＡＩ−１は、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）およびウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）の両方の活性を阻害する。ｔＰＡおよびｕＰＡは共に、線維素溶解カスケードでの重要な中間体である、プラスミノーゲンからプラスミンへの転換を触媒する（Wuら、CurrDrug Targets、２００２年）。プラスミンは、あるプロマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）からその活性な細胞外マトリックス（ＥＣＭ）劣化形態への転換を促進させることが知られている（Heら、PNAS、１９８９年）。ＰＡＩ−１は、ビトロネクチン、即ちＥＣＭ成分と、接着受容体として働く細胞表面インテグリンとの関係も調節する（Zhouら、NatureStructural Biology、２００３年）。このように、ＰＡＩ−１は、非眼組織の細胞の接着の低下および剥離の増大の両方に関係している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＩＯＰ（ＩＯＰ）の低下および／またはＰＯＡＧの治療に有効であることが証明されている薬物療法には、房水の生成を低下させる薬剤と、房水流出率を上昇させる薬剤との両方が含まれる。そのような治療薬は、一般に、２つの可能性ある経路、即ち局所（眼に直接施用）または経口経路の一方によって投与される。しかし、医薬品による抗高眼圧症の手法は、様々な望ましくない副作用を示している。例えば、ピロカルピンなどの縮瞳薬は、かすみ目、頭痛、およびその他の視覚に対する負の副作用を引き起こす可能性がある。全身投与される炭酸脱水酵素阻害剤も、吐き気、消化不良、疲労、および代謝性アシドーシスを引き起こす可能性がある。あるプロスタグランジンは、充血、目の痒み、睫毛および眼窩周囲皮膚の黒ずみを引き起こす。そのような負の副作用は、患者の服薬遵守の低下または治療の停止に繋がり、視覚が低下するようになる可能性がある。さらに、ある既存の緑内障治療薬で治療した場合、単に十分に応答しない個人がいる。したがって、緑内障や高眼圧症などの眼障害を治療するための、その他の治療薬が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
要旨
本発明の実施形態は、ビトロネクチンへのＰＡＩ−１の結合の調節を使用して、眼疾患を治療しかつ／またはＩＯＰを低下させることができることを認める。一実施形態は、ビトロネクチンへのＰＡＩ−１の結合を調節する薬剤を含む有効量の組成物を、患者に投与するステップを含む、患者の緑内障または高ＩＯＰを治療するための方法を提供する。
【０００７】
本発明の別の実施形態は、ビトロネクチンへのＰＡＩ−１の結合を調節する薬剤を含む有効量の組成物を投与するステップを含む、ＰＡＩ−１関連の眼障害を治療する方法である。
【０００８】
これらの実施形態の一部において、薬剤は、ＺＫ４０４４、ＰＡＩ−０３９、ＷＡＹ−１４０３１２、ＨＰ−１２９、Ｔ−６８６、ＸＲ５９６７、ＸＲ３３４、ＸＲ３３０、ＸＲ５１１８、ＰＡＩ−１抗体、ＰＡＩ−１ペプチド模倣薬（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）、およびこれらの組合せである。
【０００９】
さらに別の実施形態は、ＰＡＩ−１の結合を調節すると考えられる候補物質を提供するステップと、候補物質が、緑内障または高ＰＡＩ−１に罹患している対象の小柱網における活性ＰＡＩ−１の量を低下させる能力を評価することによって、化合物を選択するステップと、選択された化合物を製造するステップとを含む、緑内障または高ＩＯＰの治療薬として使用される化合物を製造する方法である。
【００１０】
ある実施形態では、本発明の組成物はさらに、眼科的に許容される保存剤、界面活性剤、粘度増強剤、浸透促進剤、ゲル化剤、疎水性塩基、ビヒクル、緩衝剤、塩化ナトリウム、水、およびこれらの組合せからなる群より選択される化合物を含む。
【００１１】
さらにその他の実施形態では、β遮断薬、プロスタグランジン類似体、炭酸脱水酵素阻害剤、α２作動薬、縮瞳薬、神経保護剤、ｒｈｏキナーゼ阻害剤、およびこれらの組合せからなる群より選択される化合物を、組成物の一部として投与してもよく、または個別に投与してもよい。
【００１２】
前述の簡単な概要は、本発明のある実施形態の特徴および技術的利点について広く述べている。追加の特徴および技術的利点は、以下の本発明の詳細な説明に記述する。本発明の特徴と考えられる新規な特徴は、任意の添付の図を併せて考慮することにより、本発明の詳細な説明からより良く理解されよう。しかし、本明細書で提供される図は、本発明を例示するのを助け、または本発明の理解を発展させるのを助けることを目的とし、本発明の範囲を限定しようとするものではない。
【００１３】
本発明およびその利点のより完全な理解は、添付図面と併せて読まれる以下の記述を参照することによって、得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ヒト小柱網（ＧＴＭ−３）細胞上澄みにおけるＰＡＩ−１のレベルに対する、ＴＧＦβ２の濃度依存性の影響（２４時間）を示す、実験結果のグラフである。データは、平均およびＳＥＭで表し、ｎ＝３である。＊対応するビヒクル群に対してｐ＜０．０５であり、一元配置分散分析を行い、その後、ダネット検定を行う。
【図２】様々な時間にわたりＴＧＦβ２（５ｎｇ／ｍＬ）で治療しまたは治療しない場合の、ＧＴＭ−３細胞上澄みにおけるＰＡＩ−１レベルを示す、実験結果のグラフである。データは、平均およびＳＥＭで表し、ｎ＝３である。＊対応するビヒクル時点群に対してｐ＜０．０５であり、スチューデントｔ検定を行う。
【図３】ビトロネクチン基質への形質転換（ＧＴＭ−３）および非形質転換（ＧＴＭ７３０）細胞の接着に対する、野生型ＰＡＩ−１（１μｇ／ｍＬ、２時間）およびＴＧＦβ２（５ｎｇ／ｍＬ、２時間）の影響を示す棒グラフである。データは、平均およびＳＥＭで表し、ｎ＝１２〜４４である。＊対応する未治療群に対してｐ＜０．０５であり、一元配置分散分析を行い、その後、ダネット検定を行う。
【図４】ビトロネクチン基質へのＧＴＭ−３細胞の接着に対する、野生型ＰＡＩ−１（２時間）の、濃度依存性の影響を示す実験結果のグラフである。データは、平均およびＳＥＭで表し、ｎ＝４である。＊ビヒクル群に対してｐ＜０．０５であり、一元配置分散分析を行い、その後、ダネット検定を行う。
【図５】ビトロネクチン基質へのＧＴＭ−３細胞の接着に対する、野生型ＰＡＩ−１（１μｇ／ｍＬ）の、時間依存性の影響を示す実験結果のグラフである。データは、平均およびＳＥＭで表し、ｎ＝１２〜４４である。
【図６】ビトロネクチン基質へのＧＴＭ−３およびＧＴＭ７３０細胞の接着に対する、野生型ＰＡＩ−１（１μｇ／ｍＬ、１時間）対安定な耐分解性ＰＡＩ−１変異体（１μｇ／ｍＬ、１時間）の影響を示す、実験結果の棒グラフである。データは、平均およびＳＥＭで表し、ｎ＝４である。＊対応する未治療群に対してｐ＜０．０５であり、スチューデントｔ検定を行う。＊＊対応するＰＡＩ−１（野生型）治療群に対してｐ＜０．０５であり、スチューデントｔ検定を行う。
【図７】ビトロネクチン基質へのＧＴＭ−３細胞の接着に対する、野生型ＰＡＩ−１（１μｇ／ｍＬ、２時間）対非ビトロネクチン結合ＰＡＩ−１変異体（１μｇ／ｍＬ、２時間）の影響を示す、実験結果の棒グラフである。データは、平均およびＳＥＭで表し、ｎ＝４〜２４である。＊未治療群に対してｐ＜０．０５であり、一元配置分散分析を行い、その後、ダネット検定を行う。
【図８】ＧＴＭ−３細胞の移動に対する野生型ＰＡＩ−１の濃度依存性の影響（４時間）を示す、実験結果のグラフである。データは、平均およびＳＥＭで表し、ｎ＝４〜３２である。＊ビヒクル群に対してｐ＜０．０５であり、一元配置分散分析を行い、その後、ダネット検定を行う。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
ＰＡＩ−１は、非眼組織では、細胞の接着の低下および剥離の増大の両方に関連している。本明細書に開示されるデータを検討すると、緑内障性房水でのＰＡＩ−１レベルの上昇は、小柱網細胞に対するＴＧＦβ２の作用に起因する可能性があるという結論に至る。ＴＭ細胞接着の、ＰＡＩ−１誘導による低下は、細胞外マトリックス成分ビトロネクチンへの細胞接着の、ＰＡＩ−１干渉による可能性が高い。さらに、ＴＭ細胞接着の、ＰＡＩ−１誘導による低下は、小柱網環境からのＴＭ細胞の移動を促進させる可能性がある。このように、ＰＡＩ−１誘導によるＴＭ細胞接着の低下およびＴＭ細胞移動の増大は、緑内障の眼で見られるＴＭ細胞充実性の低下において重要な因子となり得る。本発明の、ある実施形態は、ＰＡＩ−１がそのような影響を小柱網（ＴＭ）組織で引き起こし得ることを認めている。
【００１６】
活性ＰＡＩ−１は、その不活性な配置構成に素早くかつ自発的に変換する能力があるので、循環ＰＡＩ−１は、通常は潜在した形で存在する。しかし、ビトロネクチンに結合したＰＡＩ−１は、その活性形態で安定化するようになり、その結果、非常に長い半減期になる。このように、活性ＰＡＩ−１の悪影響を低減させる一手段は、ＰＡＩ−１とビトロネクチンとの相互作用を調節する薬剤を利用することである。したがってそのような薬剤は、ＥＣＭに結合していないビトロネクチンを、その細胞表面（インテグリン）受容体に結合させ、したがって、細胞接着を増大させ、ＴＭ組織からの細胞損失を低減させる。ビトロネクチンに結合するＰＡＩ−１の能力を調節することにより、緑内障の管理に対して実現可能な治療アプローチを提供することができる。
【００１７】
本発明の、ある実施形態は、下記のスキームに示されるような、ビトロネクチンへのＰＡＩ−１の結合を妨げることによる、緑内障などの眼障害でのＰＡＩ−１の下流の効果を目標とする方法であり、
【００１８】
【化１】
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ただしＰＡＩ−１は、小柱網（ＴＭ）細胞表面接着受容体（インテグリン）と細胞外マトリックス成分ビトロネクチンとの結合を低減させるものである。その結果、細胞はＴＭから切り離され、ＴＭの近傍小管への水溶液流を介して一掃される。この切り離されたＴＭ細胞およびその砕片の蓄積は、耐流出性を増大させかつＩＯＰを高めるのに寄与する。したがって、ビトロネクチンへのＰＡＩ−１の結合の調節は、ＴＭ細胞の剥離を低下させ、高い耐流出性および高いＩＯＰを低下させることができる。さらにＴＭ組織細胞充実性は、それによって増大し、そのような生体機能を食作用として保存することができる。
【００１９】
ＰＡＩ−１結合調節因子
様々なＰＡＩ−１結合調節因子が、当技術分野では知られている。例えば、Jensenらは、野生型ＰＡＩ−１に対して強力な親和性を有する小ペプチドの発見について述べているが、この小ペプチドは、ｕＰＡ−ＰＡＩ−１複合体と低密度リポタンパク質受容体ファミリーメンバーとの結合を阻害する（Jensenら、Inhibitionof plasminogen activator inhibitor-1 binding to endocytosis receptors of thelow-density-lipoprotein receptor family by a peptide isolated from a phagedisplay library、Biochem J.、２００６年、３９９巻（３）号：３８７〜３９６頁）。組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）および／またはウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）を阻害するＰＡＩ−１の能力を変化させる薬剤は、ＰＡＩ−１結合も同様に調節することができる。そのような薬剤には、下記のものが含まれるが、これらに限定するものではない：ＺＫ４０４４（Liangら、Characterizationof a small molecule PAI-1 inhibitor, ZK4044、Thromb Res.、２００５年、１１５巻（４）号：３４１〜５０頁））、ＰＡＩ−０３９（チプラキスチニン）（Weisbergら、Pharmacologicalinhibition and genetic deficiency of plasminogen activator inhibitor-1attenuates angiotensin II/salt-induced aortic remodeling、Arterioscler Thromb VaseBiol.、２００５年２月、２５巻（２）号：３６５〜７１頁；Hennanら、Evaluation of PAI-039[{1-benzyl-5-[4-(trifluoromethoxy)phenyl]-1H-indol-3-yl}(oxo)acetic acid], anovel plasminogen activator inhibitor-1 inhibitor, in a canine model ofcoronary artery thrombosis、J Pharmacol Exp Ther.、２００５年８月、３１４巻（２）号：７１０〜６頁、Epub、２００５年４月２８日；Elokdahら、Anovel, orally efficacious inhibitor of plasminogen activator inhibitor-1:design, synthesis, and preclinical characterization、J Med Chem.、２００４年７月１日、４７巻（１４）号：３４９１〜４頁）、ＷＡＹ１４０３１２（Crandallら、Characterizationand comparative evaluation of a structurally unique PAI-1 inhibitor exhibitingoral in-vivo efficacy、J Thromb Haemost.、２００４年８月、２巻（８）号：１４２２〜８頁；Crandallら、WAY-140312reduces plasma PAI-1 while maintaining normal platelet aggregation、BiochemBiophys Res Commun.、２００３年１１月２８日、３１１巻（４）号：９０４〜８頁）、ＨＰ１２９（フェンドサル）（Yeら、Synthesisand biological evaluation of menthol-based derivatives as inhibitors ofplasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1)、Bioorg Med Chem Lett.、２００３年１０月６日、１３巻（１９）号：３３６１〜５頁）、およびＴ−６８６（Murakamiら、Protectiveeffect of T-686, an inhibitor of plasminogen activator inhibitor-1 production,against the lethal effect of lipopolysaccharide in mice、Jpn J Pharmacol.、１９９７年１１月７５巻（３）号：２９１〜４頁）；Ohtaniら、T-686,a novel inhibitor of plasminogen activator inhibitor-1, inhibits thrombosiswithout impairment of hemostasis in rats、Eur J Pharmacol.、１９９７年７月９日、３３０巻（２〜３）号：１５１〜６頁；Vinogradskyら、Anew butadiene derivative, T-686, inhibits plasminogen activator inhibitortype-1 production in vitro by cultured human vascular endothelial cells anddevelopment of atherosclerotic lesions in vivo in rabbits、Thromb Res.、１９９７年２月１５日、８５巻（４）号：３０５〜１４頁；Ohtaniら、Inhibitoryeffect of a new butadiene derivative on the production of plasminogen activatorinhibitor-1 in cultured bovine endothelial cells、J Biochem (Tokyo)、１９９６年１２月、１２０巻（６）号：１２０３〜８頁）、Bryansら、Inhibitionof plasminogen activator inhibitor-1 activity by two diketopiperazines, XR330and XR334、The Journal of Antibiotics、１９９６年１０月４９巻（１０）号：１０１４〜１０２１頁、XR5118.Einholmら、Biochemical mechanism of action of a diketopiperazine inactivator ofplasminogen activator inhibitor-1, XR5118、Biochem J、２００３年、３７３巻：７２３〜７３２頁）。
【００２０】
さらに、Yeによって教示されるようなＰＡＩ−１阻害剤（Yeら、Synthesisand biological evaluation of piperazine-based derivatives as inhibitors ofplasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1)、Bioorg Med Chem Lett.、２００４年２月９日、１４巻（３）号：７６１〜５頁；Yeら、Synthesisand biological evaluation of menthol-based derivatives as inhibitors ofplasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1)、Bioorg Med Chem Lett.、２００３年１０月６日、１３巻（１９）号：３３６１〜５頁）、Verbeke（Verbekeら、Cloningand paratope analysis of an antibody fragment, a rational approach for thedesign of a PAI-1 inhibitor、J Thromb Haemost.、２００４年２月、２巻（２）号：２８９〜９７頁）およびvanGiezen（van Giezenら、The Fab-fragment of a PAT-1 inhibiting antibody reducesthrombus size and restores blood flow in a rat model of arterial thrombosis、ThrombHaemost.、１９９７年５月、７７巻（５）号：９６４〜９頁）によって教示されるような抗体ベースの阻害剤も、ＰＡＩ−１の結合を調節することができる。その他のＰＡＩ−１結合調節因子は、ＰＡＩ−１ペプチド模倣薬を含んでよい。「ＰＡＩ−１結合調節因子」という見出しのこのセクションで引用されているすべての参考文献の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００２１】
送達形態
本発明のＰＡＩ−１結合調節因子は、送達のため様々なタイプの眼科製剤に組み込むことができる。化合物は、当業者に周知の技法を使用して、眼に直接（例えば：局所点眼薬または軟膏；盲管に埋め込まれ、または強膜に隣接しもしくは眼内に埋め込まれた、医薬品送達スポンジなどの遅延放出デバイス；眼窩周囲、結膜、サブテノン、前房内、硝子体内、または小管内注射）または全身に（例えば：経口、静脈内、皮下、または筋肉内注射；非経口、経皮、または経鼻送達）送達してよい。さらに、本発明のＰＡＩ−１結合調節因子は、眼内挿入物または埋め込み可能なデバイスに配合してよいことが考えられる。
【００２２】
本明細書に開示されるＰＡＩ−１結合調節因子は、眼に送達するために、局所眼科製剤に組み込まれることが好ましい。化合物は、水性の滅菌眼科用懸濁液または溶液を形成するために、眼科的に許容される保存剤、界面活性剤、粘度増強剤、浸透促進剤、緩衝剤、塩化ナトリウム、および水と組み合わせてもよい。眼科用溶液製剤は、生理学的に許容される等張性水性緩衝液に化合物を溶解することによって、調製してもよい。さらに、眼科用溶液は、化合物の溶解を助けるために、眼科的に許容される界面活性剤を含んでよい。さらに眼科溶液は、結膜嚢での製剤の保持を改善するために、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、またはポリビニルピロリドンなどの粘度を増大させる薬剤を含有してよい。限定するものではないがゲランおよびキサンタンガムを含めたゲル化剤を、使用することもできる。滅菌眼科用軟膏製剤を調製するために、活性成分を、鉱油や液体ラノリン、白色ワセリンなどの適切なビヒクル中で保存剤と組み合わせる。滅菌眼科用ゲル製剤は、類似の眼科調製物用に公開された処方により、例えばカルボポル−９７４などの組合せから調製された親水性塩基中に、化合物を懸濁させることによって調製してもよく；保存剤および等張化剤を組み込むことができる。
【００２３】
ＰＡＩ−１結合調節因子は、ｐＨが約４から８の、局所眼科用懸濁液または溶液として処方されることが好ましい。化合物は、高いＩＯＰを経験している患者のＩＯＰを低下させ、かつ／または緑内障患者において正常なＩＯＰレベルを維持するのに十分な量で、局所懸濁液または溶液中に含有される。そのような量を、本明細書では、「ＩＯＰを制御するのに有効な量」またはより単純に「有効量」と呼ぶ。化合物は通常、これらの製剤に、０．０１から５重量／体積％（「ｗ／ｖ％」）の量で含有されることになるが、好ましくは０．２５から２ｗ／ｖ％の量である。このように、局所調製物の場合、熟練した臨床医の判断に応じて、これら製剤の１から２滴を１日１から４回、眼の表面に送達する。
【００２４】
ＰＡＩ−１結合調節因子は、その他の高ＩＯＰまたは緑内障治療薬、例えば、限定するものではないがｒｈｏキナーゼ阻害剤、β遮断薬、プロスタグランジン類似体、炭酸脱水酵素阻害剤、α２作動薬、縮瞳薬、セロトニン作動薬、および神経保護剤などと組み合わせて使用してもよい。
【００２５】
本明細書で使用される「ＰＡＩ−１結合調節因子」は、そのような調節因子ならびに医薬品として許容されるその塩を包含する。ＰＡＩ−１結合調節因子の、医薬品として許容される塩は、ＰＡＩ−１結合調節活性を保持する塩であり、人体に許容される。塩は、本明細書の薬剤がアミノまたはカルボキシ置換基を有することができるので、酸または塩基の塩でよい。塩は、酢酸、安息香酸、桂皮酸、クエン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グリコール酸、臭化水素酸、塩酸、マレイン酸、マロン酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、硝酸、シュウ酸、リン酸、プロピオン酸、ピルビン酸、サリチル酸、コハク酸、硫酸、酒石酸、ｐ−トルエンスルホン酸、およびトリフルオロ酢酸などの酸を用いて形成することができる。塩は、第１、２、または３級アミンなどの塩基、アルミニウム、アンモニウム、カルシウム、銅、鉄、リチウム、マグネシウム、マンガン、カリウム、ナトリウム、および亜鉛などを用いて形成することができる。
【００２６】
生物活性の決定
ＰＡＩ−１結合調節因子は、その生物活性を決定するのに使用することもできる結合アッセイまたは機能アッセイを使用して、選択することができる。そのようなアッセイは、前述の方法を使用して、当業者により開発することができる。その他のアッセイは、以下に示される実施例のデータから得られ、または得ることができる。例えば、後で記述されるＴＭ細胞移動アッセイは、推定上のＰＡＩ−１結合調節因子が検査薬として添加される場合に使用することができる。
【００２７】
生体内生物活性試験
あるＰＡＩ−１結合調節因子が、ＩＯＰを安全に低下させる能力は、ニュージーランド白ウサギおよび／またはカニクイザルを使用した、生体内アッセイを用いたある実施形態で評価することができる。
【００２８】
ニュージーランド白ウサギにおける眼の安全性評価
ニュージーランド白ウサギの両眼に、試験化合物をビヒクルに溶かした３０μＬの一定分量１滴を、局所投与する。動物を、投与後に０．５時間連続してモニタし、次いでその後の２時間は０．５時間ごとにモニタし、または作用がもはや明白ではなくなるまでモニタする。
【００２９】
ニュージーランド白ウサギでの急性ＩＯＰ応答
眼内圧力（ＩＯＰ）は、０．１％プロパラカインで軽く角膜麻酔した後に、Ｍｅｎｔｏｒ  Ｃｌａｓｓｉｃ  ３０呼吸圧計で決定する。各測定の後に、１または２滴の生理食塩水で眼を濯ぐ。基準ＩＯＰを測定した後、試験化合物を、３０μＬの一定分量１滴、各動物の片眼または両眼に点眼し、あるいは一方の眼に化合物を点眼し、反対側の眼にビヒクルを点眼する。その後、ＩＯＰ測定を、０．５、１、２、３、４、および５時間後に行う。
【００３０】
カニクイザルでの急性ＩＯＰ応答
眼内圧力（ＩＯＰ）を、前述のように０．１％プロパラカインで軽く角膜麻酔した後に、Ａｌｃｏｎ呼吸圧計で決定する（Sharifら、J. Ocular Pharmacol. Ther.、２００１年、１７巻：３０５〜３１７頁；Mayら、J. Pharmacol.Exp. Ther.、２００３年、３０６巻：３０１〜３０９頁）。眼を、各測定後に１または２滴の生理食塩水で濯ぐ。基準ＩＯＰ測定の後、試験化合物を、３０μＬの一定分量を１滴または２滴、カニクイザルの選択された眼に点眼する。その後、ＩＯＰ測定を、１、３、および６時間後に行う。すべての動物の右眼にレーザ線維柱帯形成術を施して、高眼圧症を誘発した。すべての左眼は正常であり、したがって正常ＩＯＰを有する。
【実施例】
【００３１】
下記の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すために含める。当業者なら、下記の実施例に開示される技法は、本発明の実施に際して十分に機能する、本発明者によって発見された技法であり、したがってその実施のために好ましい形態を構成すると見なすことができることを理解すべきである。しかし当業者なら、本発明の開示に照らして、開示されている具体的な実施形態に多くの変更を行うことができ、本発明の精神および範囲から逸脱することなくなお同様のまたは類似した結果を得ることができることを理解すべきである。
【００３２】
（実施例１）
ＴＧＦβ２はＴＭ細胞中のＰＡＩ−１含量を増加させる
図１は、ＴＧＦβ２が、小柱網細胞培養物（ＧＴＭ−３）中のＰＡＩ−１含量を増加させることを示す、実験結果を表す。ＰＡＩ−１媒介性の作用は、先に観察された、ＴＭ組織も含めた様々な組織での細胞外マトリックス材料の、ＴＧＦβ２媒介性蓄積に寄与する可能性がある。図２は、そのようなＴＧＦβ２媒介性のＰＡＩ−１増加が、ＴＧＦβ２で治療した細胞培養物において永続的であることを実証する。ＴＧＦβ２の治療は、ＴＭ細胞上澄みにおいて、ＰＡＩ−１の濃度依存性および時間依存性の両方の蓄積をもたらす（図１および２）。ＰＡＩ−１レベルは、ＴＧＦβ２に応答して徐々に増加し、治療後約２４時間で一定レベルに到達する。
【００３３】
（実施例２）
野生型ＰＡＩ−１はＴＭ細胞の接着を減少させる
図３は、組換えヒトＰＡＩ−１（２時間治療）が、ビトロネクチン基質に対する培養ヒトＴＭ細胞の接着を減少させる能力を実証する実験データを示し；同じモデルでは、接着は、ビトロネクチンに結合しない変異ＰＡＩ−１（図７）によって影響を受けなかった。図４は、ＰＡＩ−１の濃度の増加がＴＭ細胞の接着に及ぼす影響を示す。接着に対するＰＡＩ−１の作用は用量依存性であり、推定されるＥＣ５０は約０．６μＭであった。それによって、ＴＭ細胞接着に対するそのような妨害は、緑内障、特にＰＯＡＧに見られるような、加速されたＴＭ細胞損失を引き起こす可能性がある。剥離されたＴＭ細胞は、房水流出の閉塞に寄与する可能性があり、プロセスは、高い耐流出性および高ＩＯＰをもたらすと考えられる。小柱網組織からのＴＭ細胞の損失は、貧食能が低下する結果、不十分な砕片清浄化率ももたらす可能性がある。
【００３４】
再び図３を参照すると、ＴＧＦβ２で２時間治療した細胞は、対照と比較した場合、接着の測定可能な損失を生じなかった。ＴＧＦβ２による短期間の治療の効果がないことは、２時間という治療期間中の、ＴＧＦβ２媒介性のＰＡＩ−１誘導が不十分であることに起因すると考えられる（図２参照）。ＳＶ４０形質転換（ＧＴＭ−３）細胞の応答は、非形質転換（ＧＴＭ７３０）細胞の場合と非常に類似していた。
【００３５】
（実施例３）
野生型ＰＡＩ−１は経時的に分解する
図５は、野生型ＰＡＩ−１媒介性の接着の損失が一時的であり、接着レベルは２４時間後に対照レベル付近に戻ることを示す、実験データを示している。図６は、ビトロネクチン基質へのＧＴＭ−３細胞およびＧＴＭ７３０細胞の接着に対する、野生型ＰＡＩ−１（１μｇ／ｍＬ、１時間）対安定な耐分解性ＰＡＩ−１変異体（１μｇ／ｍＬ、１時間）の影響を示す、実験結果の棒グラフである。図５と共に解釈すると、データは、野生型ＰＡＩ−１が経時的に分解することを実証している。したがって、ＰＡＩ−１の影響は、野生型タンパク質よりも耐分解性のある安定なＰＡＩ−１変異体（Ｋ１５４Ｔ、Ｑ１３９Ｌ、Ｍ３５４Ｉ、およびＨ１５０Ｈ変異体の混合物）を使用することによって高められた。
【００３６】
（実施例４）
接着に対する野生型ＰＡＩ−１の影響はビトロネクチン媒介性である
図７は、ビトロネクチン基質へのＧＴＭ−３細胞の接着に対する、野生型ＰＡＩ−１（１μｇ／ｍＬ、２時間）対非ビトロネクチン結合ＰＡＩ−１変異体（１μｇ／ｍＬ、２時間）の影響を示す、実験結果の棒グラフである。通常なら機能的であることが知られている、まだビトロネクチンと結合していない変異体ＰＡＩ−１は、ビトロネクチン基質とのＴＭ細胞接着に対して影響がなく、一方、野生型ビトロネクチン結合ＰＡＩ−１は、対照レベルの約５０％まで接着を低減させた。
【００３７】
図８は、ＧＴＭ−３細胞の移動に対する野生型ＰＡＩ−１の濃度依存性の作用（４時間）を示す、実験結果のグラフである。野生型ＰＡＩ−１は、ＴＭ細胞接着を低減させる濃度の同様の濃度で、ＴＭ細胞の移動を誘発させた。
【００３８】
実施例１〜４のための方法
ヒトＴＭ細胞培養：ヒトＴＭ細胞を、死後ヒトドナー組織から単離し、特徴付け、前述のように培養した。形質転換（ＧＴＭ−３）細胞系の生成および特徴付けも、前述の通りであった（Pangら、Preliminary characterization of a transformed cell strainderived from human trabecular meshwork、Curr. Eye Res.、１９９４年、１３巻：５１〜６３頁）。
【００３９】
ＰＡＩ−１  ＥＬＩＳＡ：ＴＭ細胞培養物の２４ウェルプレートを、２４時間血清除去し、その後さらに２４時間（または指示通りに）、無血清培地中でＴＧＦβ２と共にインキュベートした。治療した培養物からの一定分量の上澄みを、ヒトＰＡＩ−１  ＥＬＩＳＡキット（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）を用いて、分泌されたＰＡＩ−１の含量に関して定量した。
【００４０】
ＴＭ細胞接着：ＴＭ細胞接着は、ＩｎｎｏＣｙｔｅ  ＥＣＭ  Ｃｅｌｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を用いて決定した。ＴＭ細胞（２００００／ウェル；無血清培地）を、ビトロネクチンでコーティングした９６ウェルプレート上に播いた。次いで検査薬を添加し、その後、細胞培養インキュベータ内で、支持された時間にわたってインキュベートした。次いで非接着細胞を、デカンテーションによって除去し、ＰＢＳでウェルを穏やかに洗浄した。相対的な細胞付着を、蛍光色素（カルセイン−ＡＭ）の取込みを用いて決定した。
【００４１】
ＴＭ細胞移動：ＴＭ細胞の移動を、ＩｎｎｏＣｙｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を使用して評価した。ＴＭ細胞（５００００／ウェル；無血清培地）を、キットを備えた移動チャンバの上部ウェルアセンブリ内に播いた。下部ウェルには、検査薬の溶液を満たし、次いでチャンバを、細胞培養インキュベータ内でインキュベートした。４時間後、上部ウェルアセンブリを取り出し、上澄みを穏やかにデカントして、付着していない細胞を除去した。次いで上部ウェルアセンブリを、剥離緩衝液およびカルセイン−ＡＭの混合物が入っている新たな下部プレートに置いた。６０分後、それぞれの下部ウェルからの一定分量を、新たな黒色９６ウェルプレートに移し、相対的な蛍光を決定した。
【００４２】
配合実施例５〜８
【００４３】
【化２】
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【００４４】
【化３】
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本発明およびその実施形態について、詳細に述べてきた。しかし、本発明の範囲は、明細書に記述される任意のプロセス、製造、組成物、化合物、手段、方法、および／またはステップの特定の実施形態に限定するものではない。本発明の精神および／または本質的な特徴から逸脱することなく、様々な修正、置換、および変更を、開示された材料に対して行うことができる。したがって当業者なら、この開示から、本明細書に記述される実施形態と実質的に同じ機能を発揮しまたは実質的に同じ結果をもたらす後の修正、置換、および／または変更を、本発明のそのような関連ある実施形態に従って利用してもよいことを、容易に理解するであろう。このように、下記の特許請求の範囲は、その範囲内に、本明細書に開示されたプロセス、製造、組成物、化合物、手段、方法、および／またはステップに対する修正、置換、および変更を包含するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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