(57)【要約】白血球Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）および免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の相互作用を阻害できる可溶性多量体ポリペプチドまたはタンパク質が開示される。該タンパク質またはポリペプチドは、ヘッドトゥーテール配置で結合した２つ以上のＦｃ結合領域を含み、そのうち少なくとも１つは、ＦｃγＲ型受容体に由来し、かつ、前記Ｆｃ結合領域との結合を低減または阻害するためおよび／またはエフェクター機能を変化させるために修飾されている免疫グロブリンのＦｃドメインに含む。該ポリペプチドまたはタンパク質をコードするポリヌクレオチド分子、および免疫複合体（ＩＣ）媒介性炎症性疾患について被験体を治療する方法におけるその使用もまた記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
白血球Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）および免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の相互作用
を阻害できる可溶性多量体ポリペプチドであって、ヘッドトゥーテール配置で結合
した２つ以上のＦｃ結合領域を含み、そのうち少なくとも１つは、ＦｃγＲ型受容
体に由来し、かつ、前記Ｆｃ結合領域を結合する能力が実質的に無くおよび前記ポ
リペプチドの二量体化を可能にする修飾Ｆｃドメインを含む、前記ペプチド。  
【請求項２】
結合したＦｃ結合領域を２個だけ含み、そのうち少なくとも１つがＦｃγＲ型受
容体に由来する、請求項１のポリペプチド。
【請求項３】
前記ＦｃγＲ型受容体に由来する少なくとも１つのＦｃ結合領域がＦｃγＲＩＩ
型受容体に由来する、請求項１または２のポリペプチド。
【請求項４】
前記少なくとも１つのＦｃ結合領域がＦｃγＲＩＩａに由来する、請求項３のポ
リペプチド。
【請求項５】
前記結合したＦｃ結合領域のそれぞれがＦｃγＲ型受容体に由来する、請求項１
から４のいずれか１項のポリペプチド。
【請求項６】
前記結合したＦｃ結合領域のそれぞれが同一のＦｃγＲＩＩ型受容体に由来する
、請求項５のポリペプチド。
【請求項７】
前記Ｆｃ結合領域が１から２０個のアミノ酸を含むリンカーを介して結合する、
請求項１から６のいずれか１項のポリペプチド。
【請求項８】
前記修飾Ｆｃドメインが変化したエフェクター機能を示す、請求項１から７のい
ずれか１項のポリペプチド。
【請求項９】
前記ＦｃドメインがＩｇＧ1に由来しおよびＬｅｕ234および／またはＬｅｕ235
の置換によって修飾されている、請求項１から８のいずれか１項のポリペプチド。
【請求項１０】
前記ＦｃドメインがＩｇＧ２ａに由来しおよびＬｅｕ235、Ｇｌｕ318、Ｌｙｓ3
20およびＬｙｓ322のうちいずれか１つ以上の置換によって修飾されている、請求
項１から８のいずれか１項のポリペプチド。
【請求項１１】
前記ＦｃドメインがＩｇＧ４に由来しおよび２２８、２３３、２３４、２３５お
よび２３６位のアミノ酸のうちいずれか１つ以上のアミノ酸修飾によって修飾さ
れている、請求項１から８のいずれか１項のポリペプチド。
【請求項１２】
さらにキャリヤータンパク質を含む、請求項１から１１のいずれか１項のポリペ
プチド。
【請求項１３】
前記キャリヤータンパク質がヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である、請求項１２
のポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれか１項に記載のポリペプチドの二量体を含む可溶性多
量体タンパク質。
【請求項１５】
Ｆｃ融合二量体タンパク質の形の請求項１４のタンパク質であって、Ｆｃ融合二
量体タンパク質が第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖を含み、各ポ
リペプチド鎖が（ｉ）ヘッドトゥーテール配置で結合した、ＦｃγＲＩＩａに由来
する２つのＦｃ結合領域および（ｉｉ）実質的にＦｃγＲＩＩａ結合能が無くおよ
び第１および第２のポリペプチド鎖の二量体化を可能にする修飾Ｆｃドメインを含
む、前記タンパク質。
【請求項１６】
請求項１から１３のいずれか１項のポリペプチドまたは請求項１４もしくは１５
のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子。
【請求項１７】
発現カセットまたは発現ベクターに存在する、請求項１６のポリヌクレオチド分
子。
【請求項１８】
請求項１６または１７のポリヌクレオチド分子を含む組み換え宿主細胞。
【請求項１９】
下記の段階：
（ｉ） 請求項１６または１７の前記ポリヌクレオチド分子を含む組み換え宿主
細胞を提供すること、
（ｉｉ） 前記宿主細胞を適当な培地でおよび前記ポリペプチドまたはタンパク
質の発現に適した条件下で培養すること、および
（ｉｉｉ） 前記ポリペプチドまたはタンパク質を培養物から、および、任意に
培地から単離すること、を含むポリペプチドまたはタンパク質を作製する方法。
【請求項２０】
炎症性疾患について被験体を治療する方法であって、前記被験体に請求項１から
１２のいずれか１項のポリペプチドまたは請求項１４または１５のタンパク質を、
薬学的にまたは獣医学的に許容可能なキャリヤーまたは添加物と任意に組み合わせ
て投与することを含む、前記方法。
【請求項２１】
前記炎症性疾患が免疫複合体（ＩＣ）媒介性炎症性疾患である、請求項２０の
方法。
【請求項２２】
前記ＩＣ媒介性炎症性疾患が、関節リウマチ（ＲＡ）、免疫性血小板減少性紫斑
病（ＩＴＰ）、全身性エリテマトーサス（ＳＬＥ）、糸球体腎炎ヘパリン誘導性血
小板減少血栓症候群（ＨＩＴＴＳ）から成る群から選択される、請求項２１の方法
。
【請求項２３】
下記の段階：
（ｉ）適当な基材に結合した、請求項１から１３のいずれか１項に記載のポリペ
プチドまたは請求項１４または１５に記載のタンパク質を提供すること、
（ｉｉ）前記被験体から採取した血液を、ｅｘ ｖｉｖｏで前記基材に結合した
ポリペプチドまたはタンパク質と接触させることによって、前記血液中に存在する
ＩＣが前記ポリペプチドまたはタンパク質を介して基材に結合するように処理する
こと、
（ｉｉｉ）処理された血液を基材から分離すること、および
（ｉｖ）その後、処理された血液を被験体へ戻すこと、を含む、免疫複合体媒介
性炎症性疾患に罹患した被験体から循環性免疫複合体（ＩＣ）を除去する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、白血球Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）および免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）
相互作用を阻害できる、可溶性多量体Ｆｃ受容体ポリペプチドおよびタンパク質に
関する。そのようなポリペプチドおよびタンパク質は、炎症性疾患、特に関節リウ
マチ（ＲＡ）、免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）および全身性エリテマトーサ
ス（ＳＬＥ）といった免疫複合体媒介性炎症性疾患の治療に有用である。
【０００２】
参照による取り込み
本特許出願は：
−ＰＣＴ／ＡＵ２００６／００１８９０表題『多量体Ｆｃ受容体ポリペプ
チド』２００６年１２月１３日出願、および
−ＵＳ１１／７６２、６６４表題『多量体Ｆｃ受容体ポリペプチド』２０
０７年６月１３日出願
からの優先権を主張する。
これらの特許出願の全内容は参照により本開示に含まれる。
【背景技術】
【０００３】
自己免疫疾患およびＲＡおよびＳＬＥといった他の炎症性疾患の治療は、免疫系
に関与する分子の高まる理解が腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）およびインターロイ
キン１β（ＩＬ−１β）といった主要な炎症性分子の特異的阻害を可能にしている
、新たなおよび刺激的な局面に入っている。たとえば、近年の研究では、ＲＡの病
因に抗体が強力な役割を果たしうることが示されており、およびヒト臨床試験にお
いて、抗体産生Ｂ細胞を消去するための抗ＣＤ２０モノクローナル抗体（ＭＡｂ）
療法の使用に対する肯定的な応答は、ＲＡにおける抗体の重要な役割の強力な証拠
を生じている（エメリー（Ｅｍｅｒｙ）他、２００１）。Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）は
免疫グロブリンを基礎とするエフェクター系において中枢的な役割を果たすため、
ＦｃＲ機能の阻害はさまざまな疾患のための有効な治療法の基礎を提供しうる。さ
らに、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）はＩｇＧのためのエフェクター系に中枢的である
ため、白血球ＦｃγＲと抗体との間の相互作用を標的にすることは、ＲＡにおける
治療的介入のための新しい機会を提供する（ナッベ（Ｎａｂｂｅ）他、２００３）
。本出願者の目的であるそのような介入を達成する１つの方法は、抗体による白血
球活性化を防ぐ「おとり」として作用する、ＦｃγＲの可溶性形の使用である。
【０００４】
Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）は抗体のＦｃ部分を特異的に結合する白血球表面糖タンパ
ク質である。ＩｇＧに対する受容体は、ＦｃγＲであり、最も広範囲および多様で
あり、主な型はＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγ
ＲＩＩＩ（ＣＤ１６）である。正常免疫応答でｉｎ ｖｉｖｏで形成される免疫複
合体（ＩＣ）、およびＲＡといった自己免疫疾患の病理でみられるものは、多数の
ＦｃＲを同時に関与させうる。たとえば、ヒトでは、活性化マクロファージ、好中
球、好酸球および肥満細胞は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂおよ
びＦｃγＲＩＩＩを発現しうる（タカイ（Ｔａｋａｉ）、２００２）。しかし、こ
れらのうち、ＦｃγＲＩＩａがＩＣ媒介性炎症の主要な発動因子であり、および、
ＦｃγＲ型のすべてがＩｇＧＦｃドメインおよびＣＨ２ドメインの下側ヒンジ領域
に関与するため、任意の可溶性ＦｃγＲおとりポリペプチドはすべてのクラスのＦ
ｃγＲへのＩｇＧの結合を阻害しうるが、本出願者は、ＦｃγＲＩＩａが最も広い
結合特異性および最高の選択性を結合活性ＩｇＧ免疫複合体結合について示すため
、可溶性ＦｃγＲＩＩａの開発および研究は最大の潜在性を提供することを理解し
ている。
【０００５】
実際、以前の研究は、ＦｃγＲＩＩａ外部ドメイン（イエリノ（Ｉｅｒｉｎｏ）
他、１９９３ａ）から成る単純な組み換え可溶性ＦｃγＲＩＩａポリペプチド（ｒ
ｓＦｃγＲＩＩａ単量体）がＩＣ媒介性炎症を明らかに阻害できることを示してい
る。これらの研究では、ｒｓＦｃγＲＩＩａは抗体および抗原の受動投与によって
免疫複合体が真皮内に形成される（Ｐｆｌｕｍ他、１９７９）、アルサス（Ａｒｔ
ｈｕｓ）反応を用いて試験され、それは血管炎（関節炎における関節外合併症）の
モデルであり、およびまたＳＬＥでも起こる。ｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体が抗体お
よび抗原と同時投与された際に炎症および好中球浸潤を阻害した一方、免疫複合体
についての相対的に低レベルの選択性のため、多量のｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体が
必要であったことが見出された。この問題を克服するため、本出願者はｒｓＦｃγ
ＲＩＩａおとりの多量体形を用いることを提案し、および驚くべきことに、そのよ
うな多量体形の発現に成功できただけでなく、それらは免疫複合体についての選択
性の上昇を示したことを見出している。そのような多量体ｒｓＦｃγＲＩＩａポリ
ペプチドは、したがってＲＡおよびＳＬＥといったＩＣ媒介性炎症性疾患の治療に
顕著な有望性を示す。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題および課題を解決するための手段】
【０００６】
したがって、第１の態様では、本発明は白血球Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）および
免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の相互作用を阻害できる可溶性多量体ポリペプチドを
提供し、前記ポリペプチドはヘッドトゥーテール配置で結合した２つ以上のＦｃ結
合領域を含み、そのうち少なくとも１つは、ＦｃγＲ型受容体、および前記Ｆｃ結
合領域との結合を低減または阻害するためおよび／またはエフェクター機能を変化
させるために修飾されている免疫グロブリンのＦｃドメインに由来する。
【０００７】
好ましくは、該ポリペプチドは、ＦｃγＲＩＩ型受容体、特にＦｃγＲＩＩａに
由来するＦｃ結合領域の多量体である。そのような分子はホモ多量体であると考え
ることができ、およびこの種類の特に好ましい分子の１つは、ＦｃγＲＩＩ型受容
体に由来するＦｃ結合領域のホモ二量体である。しかし、本発明はまた、該分子は
ＦｃγＲ型受容体（たとえばＦｃγＲＩＩ型受容体）に由来するＦｃ結合領域およ
び別の起源由来のＦｃ結合領域（たとえば別のＦｃ受容体型に由来するＦｃ結合領
域または合成Ｆｃ結合ポリペプチド）の多量体でありうるとも考える。この種類の
分子はヘテロ多量体であると考えることができ、およびこの種類の特に好ましい分
子の１つはＦｃγＲＩＩ型受容体に由来するＦｃ結合領域およびＦｃγＲＩＩＩ型
受容体に由来するＦｃ結合領域のヘテロ二量体である。
【０００８】
Ｆｃ結合領域は、ペプチド結合を介してまたは短いリンカー配列（たとえば１ア
ミノ酸または、たとえば、長さ２から２０アミノ酸の短鎖ペプチド）を介して結合
されうる。
【０００９】
第２の態様では、本発明は、第１の態様に記載のポリペプチドを含む可溶性多量
体タンパク質を提供する。
【００１０】
第３の態様では、本発明は、第１の態様に記載のポリペプチドまたは第２の態様
に記載のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を
提供する。
【００１１】
該ポリヌクレオチド分子は、発現カセットまたは発現ベクター（たとえば細菌宿
主細胞への導入のためのプラスミド、または昆虫宿主細胞のトランスフェクション
のためのバキュロウイルスベクターといったウイルスベクター、または哺乳類宿主
細胞のトランスフェクションのためのプラスミドまたはレンチウイルスといったウ
イルスベクター）に存在しうる。
【００１２】
したがって、第４の態様では、本発明は、第３の態様に記載のポリヌクレオチド
分子を含む組み換え宿主細胞を提供する。
【００１３】
第５の態様では、本発明は；
（ｉ）第３の態様に記載のポリヌクレオチド分子を含む組み換え宿主細胞を提供
すること、
（ｉｉ）前記宿主細胞を適当な培地でおよび前記ポリペプチドまたはタンパク質
の発現に適した条件下で培養すること、および
（ｉｉｉ）前記ポリペプチドまたはタンパク質を培養物から、および、任意に培
養培地から単離することの段階を含む、ポリペプチドまたはタンパク質を製造する
ための方法を提供する。
【００１４】
第６の態様では、本発明は炎症性疾患について被験体を治療する方法であって、
第１の態様に記載のポリペプチドまたは第２の態様に記載のタンパク質を、薬学的
にまたは獣医学的に許容可能なキャリヤーまたは添加物と任意に組み合わせて前記
被験体へ投与することを含む、前記方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、両方のＦｃγＲＩＩａ外部ドメイン、すなわち外部ドメイン１および２をそれぞれ含む、２つのＦｃγＲＩＩａ細胞外領域のヘッドトゥーテールのホモ二量体コンストラクトのヌクレオチド配列（および翻訳されたアミノ酸配列）を提供する。ＦｃγＲＩＩａ外部ドメイン１および２は、ドメイン１を含むアミノ酸１から８８およびドメイン２を含むアミノ酸８９から１７４を含むＦｃγＲＩＩａポリペプチド配列のアミノ酸１から１７４から成る（ヒブズ（Ｈｉｂｂｓ）他，１９８８；ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ＩｇＧのＦｃ断片、低親和性ＩＩａ受容体（ＣＤ３２）（ＦＣＧＲ２Ａ）、ｍＲＮＡ、受入番号（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＮＭ）_０２１６４２； およびパウエル（Ｐｏｗｅｌｌ）他，１９９９）。図中で、アミノ酸１から１８２はＦｃγＲＩＩａの細胞外領域に由来し、そのうちアミノ酸１から１７４はＦｃγＲＩＩａ外部ドメイン１および２を含み、およびアミノ酸１７５から１８２は膜近傍柄部（ＦｃγＲＩＩａにおいて外部ドメイン１および２を膜貫通配列と結合する）を含む。二量体を含むＦｃγＲＩＩａ細胞外領域の第１はしたがってアミノ酸１から１８２から成り、およびＦｃγＲＩＩａ細胞外領域の第２はアミノ酸１８４から３６２（ＦｃγＲＩＩａのアミノ酸３から１８２に対応）から成る。下線のアミノ酸は非ＦｃγＲＩＩａリンカーアミノ酸残基を表す一方、太字のアミノ酸はＣ末端Ｈｉｓ6タグを示す。
【図２】図２は、図１に示すヌクレオチド配列から発現されるＦｃγＲＩＩａの組み換え可溶性（ｒｓ）多量体形のウェスタンブロット分析を示す。ｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体は実質的に安定で、少量のｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体分解産物だけが認められた。一方、ｒｓＦｃγＲＩＩａ三量体および四量体形は不安定で、実質的にｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体形へ分解された。この分解は製造中のプロテアーゼインヒビターの使用によって、または別に切断部位を除去するように多量体形の配列を改変することによって回避されうる。
【図３】図３は、予想サイズが〜３０ｋＤａであるｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体（哺乳類細胞から発現された）（ａ）、および予想サイズが〜５０ｋＤａであるｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体（ｂ）の精製から回収された画分のクマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％アクリルアミドゲル、非還元条件下）を示す。
【図４】図４は、固定化（ａ）ＩｇＧ単量体（サンドグロブリン（Ｓａｎｄｏｇｌｏｂｕｌｉｎ））および（ｂ）モデル免疫複合体の熱凝集ＩｇＧ（ＨＡＧＧ）へのｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体の平衡結合反応を図式的に示す。
【図５】図５は、固定化（ａ）ＩｇＧ単量体（サンドグロブリン（Ｓａｎｄｏｇｌｏｂｕｌｉｎ））および（ｂ）モデル免疫複合体のＨＡＧＧへのｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体の平衡結合反応を図式的に示す。
【図６】図６は、標準ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ手順を用いて測定した、ヒトＩｇＧ単量体（サンドグロブリン（Ｓａｎｄｏｇｌｏｂｕｌｉｎ））および二量体−ＩｇＧ（ライト（Ｗｒｉｇｈｔ）他，１９８０）との溶液中の前の反応後に固定化ヒトＩｇＧ単量体（サンドグロブリン（Ｓａｎｄｏｇｌｏｂｕｌｉｎ））と結合した、ｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体（ａ）および図１のヌクレオチド配列から発現されたｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体（ｂ）のプロットを示す。
【図７ａ】図７は、（ａ）非阻害二量体−ＩｇＧ結合活性の百分率として計算した、精製ｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体およびｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体によるヒト好中球（ボランティアＶ５）との二量体−ＩｇＧ（ライト（Ｗｒｉｇｈｔ）他，１９８０）結合の阻害および（ｂ）二量体−ＩｇＧ結合二量体の百分率として計算した、精製ｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体（図１のヌクレオチド配列から発現された）によるヒト好中球（ボランティアＶ１）との二量体−ＩｇＧ結合の阻害のプロットを示す。
【図７ｂ】図７は、（ａ）非阻害二量体−ＩｇＧ結合活性の百分率として計算した、精製ｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体およびｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体によるヒト好中球（ボランティアＶ５）との二量体−ＩｇＧ（ライト（Ｗｒｉｇｈｔ）他，１９８０）結合の阻害および（ｂ）二量体−ＩｇＧ結合二量体の百分率として計算した、精製ｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体（図１のヌクレオチド配列から発現された）によるヒト好中球（ボランティアＶ１）との二量体−ＩｇＧ結合の阻害のプロットを示す。
【図８】図８は、（ａ）ではｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体（上清中に２．５μｇ／ｍｌにて）の非存在下および存在下の２４時間分化ヒトＭＤＭ（ボランティアＶ５）からの免疫複合体（二量体−ＩｇＧ）刺激ＴＮＦ分泌のプロットを示し；一方（ｂ）ではｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体（２．５μｇ／ｍｌ）の非存在下および存在下の２４時間分化ヒトＭＤＭ（ボランティアＶ１）からの免疫複合体（二量体−ＩｇＧ）刺激ＴＮＦ分泌のプロットを示す。
【図９】図９は、ｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体（３０μｇ／ｍｌ）の非存在下および存在下のＰ−セレクチン発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって測定したヒト血小板の免疫複合体（ＨＡＧＧ）刺激活性化のプロットを示す。
【図１０】図１０は、安定にトランスフェクションされたＣＨＯ−Ｓ細胞から単離されたｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体の（ａ）非還元および（ｂ）還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ、（ｃ）抗ＦｃγＲＩＩａ抗体を用いるウェスタンブロッティング、および（ｄ）ＨＰＬＣによる分析結果を示す。ｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体は予想分子量（〜５０ｋＤ）にて単一バンドとして泳動し、抗ＦｃγＲＩＩａ抗体と反応し、およびＨＰＬＣ分析による測定で純度＞９６％であった。
【図１１】図１１は、ｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体またはｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体のどちらかの存在下の細胞表面発現されたヒトＦｃγＲＩＩｂ（マウスＢリンパ腫細胞株ＩＩＡ１．６上）への免疫複合体（ＨＡＧＧ）結合のプロットを示す。
【図１２】図１２は、ＨＡＧＧ単独での処理後の活性化血小板の百分率として、ｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体またはｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体（図１のヌクレオチド配列から発現された）の存在下でＨＡＧＧでの処理後の、活性化血小板（ＣＤ４１およびＣＤ６２Ｐの両方について陽性）のプロットを示す。
【図１３】図１３は、ＯＶＡ免疫複合体単独の存在下で放出されたＴＮＦ−(の百分率として、ｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体またはｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体の存在下でＯＶＡ免疫複合体とのインキュベート後の、ＭＣ／９細胞からのＴＮＦ−(放出のプロットを示す。
【図１４】図１４は、ｒｓＦｃγＲＩＩａ融合タンパク質のウェスタンブロット分析を示す。（１）ｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体；（２）ｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体；（３）ＩｇＧ1−Ｆｃγ１（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）と融合したｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体；（４）ＩｇＧ1−Ｆｃγ１（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）と融合したｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体；（５）ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と融合したｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体；（６）ＨＳＡと融合したｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体；（７）精製ｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体標準；および（８）精製ｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体標準。
【図１５】図１５は、ｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体およびｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体融合物を用いたＨＡＧＧ捕捉ＥＬＩＳＡの結果を示す。（ａ）０．７５μｇ／ｍｌ（単量体標準）で始まるＦｃγＲＩＩａ単量体標準（パウエル（Ｐｏｗｅｌｌ）他、１９９９）；ｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体コンストラクト（トランスフェクション４２６（単量体））をトランスフェクションされた細胞に由来するタンパク質；ＩｇＧ−Ｆｃγ１（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）コンストラクトとのｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体融合物（単量体−Ｆｃ）をトランスフェクションされた細胞に由来するタンパク質；およびＨＳＡコンストラクトとのｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体融合物（ＨＳＡ−単量体）をトランスフェクションされた細胞に由来するタンパク質；（ｂ）０．５μｇ／ｍｌ（二量体標準）で始まるｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体標準；ｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体（トランスフェクション４２７（二量体））をトランスフェクションされた細胞に由来する上清；ＩｇＧ−Ｆｃγ１（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）とのｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体融合物（二量体−Ｆｃ）をトランスフェクションされた細胞に由来する上清；およびＨＳＡとのｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体融合物（ＨＳＡ−二量体）をトランスフェクションされた細胞に由来する上清。
【図１６】図１６は、受容体が適切に折りたたまれていることを確立するエピトープの存在を確認するための、ｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体およびｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体融合タンパク質に対する捕捉タグＥＬＩＳＡから得られた結果を示す。（Ａ）０．７５μｇ／ｍｌ（単量体標準）で始まるｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体標準；ｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体（トランスフェクション４２６（単量体））をトランスフェクションされた細胞に由来する上清；ＩｇＧ−Ｆｃγ１（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）とのｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体融合物（単量体−Ｆｃ）をトランスフェクションされた細胞に由来する上清；およびＨＳＡとのｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体融合物（ＨＳＡ−単量体）をトランスフェクションされた細胞に由来する上清；（Ｂ）０．５μｇ／ｍｌで始まるｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体標準（自製）；ＦｃγＲＩＩａ二量体（トランスフェクション４２７（二量体））をトランスフェクションされた細胞に由来する上清；ＩｇＧとのｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体融合ＩｇＧ−Ｆｃγ１（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）（二量体−Ｆｃ）をトランスフェクションされた細胞に由来する上清；およびＨＳＡとのｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体融合物（ＨＳＡ−二量体）をトランスフェクションされた細胞に由来する上清。
【図１７】図１７は、（ａ）ｒｓＦｃ(ＲＩＩａ単量体；（ｂ）ｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体；（ｃ）二量体化がｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体融合ポリペプチドのＦｃドメインを介して起こり、２つのＦｃ結合領域を有する分子（すなわちＦｃ結合領域について二量体である、または「二価」を有するタンパク質）を与える、ＩｇＧ−Ｆｃγ１（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）とのｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体融合物の二量体；（ｄ）二量体化がｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体融合ポリペプチドの２つのＦｃドメインを介して起こり、４つのＦｃ結合領域を有する分子（すなわちＦｃ結合領域について四量体である、または「四価」を有するタンパク質）を与える、ＩｇＧ−Ｆｃγ１（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）とのｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体融合物の二量体；（ｅ）ＨＳＡとのｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体融合物；および（ｆ）ＨＳＡとのｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体融合物の模式図を示す。図中で、Ｄ１およびＤ２はそれぞれ外部ドメイン１および２を指し、Ｄ２に隣接して示す棒はリンカー配列を表し、（ｃ）および（ｄ）で二量体化Ｆｃドメインの上の灰色ループはジスルフィド結合を表し、およびＨ6はＨｉｓタグを指す）。
【図１８】図１８は、関節炎のマウスモデルにおけるｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体（融合パートナー無し）の作用を示す。ＦｃγＲＩＩａ二量体の非存在下（黒四角）および存在下（白四角）で関節炎誘発性抗コラーゲン抗体で処理されたマウス。
【図１９】図１９は、本発明の一実施形態、すなわちＩｇＧ２ａに由来するＦｃドメインとのｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体融合物（この融合タンパク質を以後Ｄ２タンパク質と呼ぶ）のアミノ酸配列を示す。
【図２０】図２０は、図１９のＤ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列を示す。
【図２１】図２１は、図２０のヌクレオチド配列（Ｄ２タンパク質をコードする）を発現するために用いられたプラスミドを図示する。
【図２２】図２２は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図Ａ）による、およびウェスタンブロット（図Ｂ）による、図１９の精製Ｄ２タンパク質の分析を示す。
【図２３】図２３は、ＭＣ／９肥満細胞アッセイにおけるＴＮＦ−α放出に対する（図１９の）Ｄ２タンパク質の作用を示す。
【図２４】図２４は、ヒト好中球活性化に対する（図１９の）Ｄ２タンパク質の作用を示す。および
【図２５】図２５は、ヒト血小板活性化に対する（図１９の）Ｄ２タンパク質の作用を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、２つ以上のＦｃ結合領域を含みそのうち１つが本質的にＦｃγＲ型受
容体に由来する、白血球Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）および免疫グロブリンＧ（Ｉｇ
Ｇ）の相互作用を阻害できる可溶性多量体ポリペプチドおよびタンパク質を提供す
る。そのようなポリペプチドおよびタンパク質は、ｒｓＦｃγＲＩＩ単量体といっ
た可溶性単量体ポリペプチドで以前に観察されたよりも免疫複合体に対する選択性
の増大を与え、およびそれによって、ＲＡおよびＳＬＥといったＩＣ媒介性炎症性
疾患の治療のための「おとり」分子としての顕著な有望性を提供する。
【００１７】
第１の態様では、本発明はしたがって白血球Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）および免
疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の相互作用を阻害できる可溶性多量体ポリペプチドを提
供し、前記ポリペプチドはヘッドトゥーテール配置で結合した２つ以上のＦｃ結合
領域を含み、そのうち少なくとも１つは、ＦｃγＲ型受容体、および前記Ｆｃ結合
領域との結合を低減または阻害するためにおよび／またはエフェクター機能を変化
させるために修飾されている免疫グロブリンのＦｃドメインに由来する。
【００１８】
ここでは、「可溶性」の語は、ポリペプチド（またはタンパク質）が細胞膜と結
合しておらず、およびしたがって膜貫通（すなわち親油性）ドメインのすべてまた
は相当な部分の不在または機能的破壊によって特徴づけられ、そのためポリペプチ
ド（またはタンパク質）が膜結合機能を全く持たないことを示す。細胞質ドメイン
もまた不在でありうる。
【００１９】
ここでは、「Ｆｃ結合領域」の語は、免疫グロブリンのＦｃドメイン（たとえば
免疫グロブリンのパパイン加水分解によって作製されたＦｃ断片）と結合できる、
遺伝子改変型および合成Ｆｃ結合ポリペプチドを含む、Ｆｃ受容体の任意の一また
は複数の部分をいう。
【００２０】
ＦｃγＲ型受容体に由来する少なくとも１つのＦｃ結合領域は、たとえば、Ｉｇ
Ｇに対して低親和性である，すなわちＩｇＧに対する親和性が５ｘ１０7Ｍ-1未満
であるＦｃγＲに由来しうる。そのような低親和性受容体は、ＦｃγＲＩＩ型受容
体（たとえば多型変異体ＦｃγＲＩＩａ−Ｈ１３１およびＦｃγＲＩＩａ−Ｒ１３
１を含むＦｃγＲＩＩａ（スチュアート（Ｓｔｕａｒｔ）他，１９８７；ブルック
ス（Ｂｒｏｏｋｓ）他，１９８９；セキ（Ｓｅｋｉ）他，１９８９）、ＦｃγＲＩ
ＩｂおよびＦｃγＲＩＩｃ）、ＦｃγＲＩＩＩ型受容体（たとえばＦｃγＲＩＩＩ
ａおよびＦｃγＲＩＩＩｂ）、ＦｃγＲＩ受容体の３つの外側ドメインの第１およ
び第２を含む切断ポリペプチド（ヒューレット（Ｈｕｌｅｔｔ）他，１９９１；ヒ
ューレット（Ｈｕｌｅｔｔ）他，１９９８）のようなＦｃγＲＩ型受容体の切断形
（たとえばＦｃγＲＩａおよびＦｃγＲＩｂ）、および通常はＩｇＧに対して高い
親和性を有するがしかし改変（たとえば１つ以上のアミノ酸置換、欠失および／ま
たは付加）のためにＩｇＧに対して５ｘ１０7Ｍ-1未満の低下した親和性を示すＦ
ｃγＲの遺伝子改変形）を含む。
【００２１】
好ましくは、該ポリペプチドは低親和性ＦｃγＲといったＦｃγＲ受容体に由来
するＦｃ結合領域のホモ多量体である。適当なＦｃ結合領域は、ＦｃγＲ受容体の
１つ以上の外部ドメインの、すべてのまたは１つのＦｃ結合部分から成る。当業者
はＦｃγＲ受容体のＦｃ結合外部ドメインを容易に同定できる。なぜならこれらの
ドメインはＩｇＧドメインスーパーファミリーに属し（ヒューレット（Ｈｕｌｅｔ
ｔ）他，１９９４，ヒューレット他，１９９５，ヒューレット他，１９９８，およ
びタム（Ｔａｍｍ）他，１９９６）および典型的には「トリプトファン・サンドイ
ッチ」（たとえばＦｃγＲＩＩａの残基Ｗ９０およびＷ１１３）および他の残基に
よって特徴づけられるためである（たとえばＦｃγＲＩＩａでは；外部ドメイン１
および外部ドメイン２リンカーの残基、および外部ドメイン２のＢＣ（Ｗ１１３−
Ｖ１１９）、Ｃ'Ｅ（Ｆ１３２−Ｐ１３７）およびＦＧ（Ｇ１５９−Ｙ１６０）ル
ープ（ヒューレット（Ｈｕｌｅｔｔ）他，１９９４））。
【００２２】
より好ましくは、該ポリペプチドはＦｃγＲＩＩａのＦｃ結合領域のホモ多量体
である。ＦｃγＲＩＩａ由来の適当なＦｃ結合領域は、ＦｃγＲＩＩａの外部ドメ
イン１および２の、すべてのまたは１つのＦｃ結合部分から成る。ＦｃγＲＩＩａ
外部ドメイン１および２は、ＦｃγＲＩＩａアミノ酸配列のアミノ酸１から１７２
の間に見られる（ヒブズ（Ｈｉｂｂｓ）他，１９８８，および受入番号（ＡＣＣＥ
ＳＳＩＯＮＮＭ）_０２１６４２）。ＦｃγＲＩＩａ外部ドメイン１および２のＦ
ｃ結合部分の例は、ＦｃγＲＩＩａアミノ酸配列のアミノ酸９０から１７４を含む
断片であり、外部ドメイン１および外部ドメイン２リンカーの残基および外部ドメ
イン２のＢＣ（Ｗ１１３−Ｖ１１９）、Ｃ'Ｅ（Ｆ１３２−Ｐ１３７）およびＦＧ
（Ｇ１５９−Ｙ１６０）ループを含む。Ｘ線結晶学試験は、この断片内で、アミノ
酸１１３−１１６、１２９、１３１、１３３、１３４、１５５、１５６および１５
８−１６０が、ＩｇＧのＦｃドメインと結合できる断片表面へ重要な寄与を行って
いることを明らかにしている（国際公開ＷＯ２００５／０７５５１２）。
【００２３】
該ポリペプチドはまた、ＦｃγＲＩＩ型受容体に由来するＦｃ結合領域および別
の起源に由来するＦｃ結合領域（たとえば別のＦｃγＲ型といった別のＦｃ受容体
型に由来するＦｃ結合領域、またはＩｇＡおよびＩｇＥに対する受容体といった他
の免疫グロブリン受容体に由来するＦｃ結合領域）のヘテロ多量体でありうる。こ
の種類の特に好ましい分子の１つは、ＦｃγＲＩＩ型受容体（特に、ＦｃγＲＩＩ
ａ）に由来するＦｃ結合領域およびＦｃγＲＩＩＩ型受容体に由来するＦｃ結合領
域のヘテロ二量体である。
【００２４】
特定のＦｃ受容体に「由来」していると考えられるＦｃ結合領域は、Ｆｃ受容体
のアミノ酸配列と同等であるアミノ酸配列を有するＦｃ結合領域、およびＦｃ受容
体に見られるＦｃ結合領域の配列の１つ以上のアミノ酸修飾を含むＦｃ結合領域を
含む。そのようなアミノ酸修飾は、アミノ酸置換、欠失、付加またはそれらの修飾
の任意の組み合わせを含んでよく、およびＦｃ受容体の生物活性と比較してＦｃ結
合領域の生物活性を変化させうる（たとえばアミノ酸修飾は免疫複合体に対する選
択性または親和性を向上させうる；アミノ酸１３３、１３４、１５８−１６１での
そのような修飾は国際公開第ＷＯ９６／０８５１２に記載されている）。一方、特
定のＦｃ受容体に由来するＦｃ結合領域は、Ｆｃ受容体の生物活性と比較してＦｃ
結合領域の生物活性を実質的に変化させない１つ以上のアミノ酸修飾を含みうる。
この種類のアミノ酸修飾は、典型的には保存的アミノ酸置換を含む。典型的な保存
的アミノ酸置換を下記の表１に示す。想定される具体的な保存的アミノ酸置換は、
Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ；Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｑ；Ｓ、Ｃ、Ｔ；Ｋ、Ｒ、Ｈ：およびＰ、
Ｎα−アルキルアミノ酸である。一般的に、保存的アミノ酸置換は、（ａ）置換の
部位でのＦｃ結合領域のポリペプチド骨格の構造、（ｂ）置換の部位でのポリペプ
チドの電荷または疎水性、および／または（ｃ）置換の部位でのアミノ酸側鎖のか
さに何ら実質的な作用を有しないことに基づいて選択される。１つ以上の保存的ア
ミノ酸置換を含むＦｃ結合領域が合成によって調製される場合は、Ｆｃ結合領域は
また、γ−カルボキシグルタミン酸およびヒドロキシプロリンおよびＤ−アミノ酸
といった、遺伝コードによってコードされない１または複数のアミノ酸を含みうる
。
【表１】
2010512154.tif 000002
＊は好ましい保存的置換を示す
【００２５】
Ｆｃ結合領域は好ましくは、ペプチド結合を介してまたは短いリンカー配列（た
とえば１アミノ酸または、たとえば、長さ２から２０アミノ酸の短鎖ペプチド）を
介して結合している。しかし、一部の環境では、Ｆｃ結合領域を他の適当な結合手
段を介して（たとえば化学的架橋によって）結合するのが好ましいかまたは望まし
い可能性がある。
【００２６】
本発明のポリペプチドのＦｃ結合領域は、「ヘッドトゥーテール」配置で結合し
ている。すなわち、第１のＦｃ結合領域のＣ末端（「テール」）が第２のＦｃ結合
領域のＮ末端（「ヘッド」）と直列に結合する。この方法で結合した少なくとも２
つのＦｃ結合領域、典型的には２つから４つのＦｃ結合領域があるが、しかしポリ
ペプチドはヘッドトゥーテール配置で結合した最大１０以上（たとえば２０）のＦ
ｃ結合領域を有しうる。Ｆｃ結合領域は典型的には、ペプチド結合を介してまたは
短いリンカー配列（たとえば１アミノ酸または、たとえば、長さ２から２０アミノ
酸、または、より好ましくは、長さ２から１５アミノ酸、長さ２から１０アミノ酸
、長さ２から８アミノ酸、または、非常に好ましくは、長さ２から５アミノ酸の短
鎖ペプチド）を介して結合されうる。適当な短いリンカー配列は、短いランダム配
列でありうるかまたは、ＦｃγＲの短い非Ｆｃ結合領域断片（たとえばＦｃγＲの
膜柄部の隣接領域に由来する２０アミノ酸以下の短い断片）を含みうる。リンカー
配列は、たとえば、タンパク質分解に対して低感受性である、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧ
Ｓ（配列番号：４）といった合成リンカー配列でありうる。そのようなリンカー配
列は、２から５個のタンデム「Ｇｌｙ４Ｓｅｒ」単位の形で提供されうる。Ｆｃ結
合領域を、ペプチド結合または短いリンカー配列を介して結合することは、組み換
え発現系を用いるポリペプチドの作成を可能にする。
【００２７】
このように、本発明に記載のポリペプチドの第１の特に好ましい一実施形態では
、ポリペプチドは、ヘッドトゥーテール配置で結合したＦｃγＲＩＩａ由来の２か
ら４個のＦｃ結合領域を含む。
【００２８】
本発明に記載のポリペプチドの第２の特に好ましい一実施形態では、ポリペプチ
ドは、ヘッドトゥーテール配置で結合したＦｃγＲＩＩａ由来の２個のＦｃ結合領
域を含む。
【００２９】
および本発明に記載のポリペプチドの第３の特に好ましい一実施形態では、ポリ
ペプチドは、それぞれ外部ドメイン１および２を含む２個のＦｃγＲＩＩａ細胞外
領域を含み、ここで前記細胞外領域は、１から２０アミノ酸を含むリンカーを介し
てヘッドトゥーテール配置で結合している。
【００３０】
本発明の一部の実施形態では、ポリペプチド内のＦｃ結合領域は、配列ＰＳＭＧ
ＳＳＳＰ（配列番号：７）で表される、ＦｃγＲＩＩａの膜隣接柄部領域を構成す
るペプチドリンカーを介して結合する。保存的アミノ酸置換を組み込む同等物を含
む、同様の二次構造を取る同等のリンカーもまた有用である。さらに、１または２
個少ないかまたは追加のアミノ酸を有する、このアミノ酸配列の切断および伸長も
また有用である。
【００３１】
適当なリンカーは一般的に、多量体ポリペプチドが、各Ｆｃ結合領域がＦｃドメ
インを持つ分子の結合に参加しうる構造を取ることを可能にするものである。この
方法で、リンカーは、たとえば、２つの結合したＦｃ結合領域を含むポリペプチド
が、対応する単量体によって結合されるよりも多量の、Ｆｃドメインを有する分子
を結合することを可能にする。この目的に適するリンカーの選択は、ここで例示さ
れる通り、簡単な結合実験に基づいて実施することができる。
【００３２】
本発明のポリペプチドは、キャリヤータンパク質をさらに含みうる（すなわちポ
リペプチドがキャリヤータンパク質および前記２つ以上の結合したＦｃ結合領域お
よび修飾Ｆｃドメインの「融合物」であるように）。キャリヤータンパク質は当業
者によく知られた任意の適当なキャリヤータンパク質でありうるが、しかし好まし
くは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはバイオアベイラビリティを改善するた
めに一般的に用いられる別のキャリヤータンパク質である（すなわち被験体へ投与
される際のポリペプチドの血清半減期を増加させることを介して）。都合良く、キ
ャリヤータンパク質は、当業者によく知られた任意の方法にしたがって、ポリペプ
チドを前記キャリヤータンパク質との融合タンパク質として発現することによって
、ポリペプチドと融合されうる。
【００３３】
本発明のポリペプチドはさらに、他の有用な結合分子、たとえば、バイオアベイ
ラビリティを改善するためのエチレングリコール（すなわちＰＥＧ化ポリペプチド
を生じるため）、ＣＤ４６、ＣＤ５５およびＣＤ５９といった補体調節分子、サイ
トカイン（たとえば炎症の部位へのサイトカインの配送を可能にするため）および
サイトカイン受容体を含みうる。
【００３４】
本発明のポリペプチドは、免疫グロブリンのＦｃドメインを含む。このＦｃドメ
インは、別のＦｃドメインと結合（すなわち二量体を形成）でき、およびそれによ
って、本発明に記載の２つ以上のポリペプチドを結合してタンパク質を形成する手
段を提供する。
【００３５】
このように、たとえば、同一でもまたは異なってもよくおよびそれ自身が２つ以
上の結合したＦｃ結合領域を含むもう１つのポリペプチドと融合しているもう１つ
のＦｃドメインと結合できるＦｃドメインと融合している、２つ以上の結合したＦ
ｃ結合領域を含むポリペプチドを用いることによって、少なくとも４つのＦｃ結合
領域を含むタンパク質（つまり、４つ以上のＦｃ結合領域を含む可溶性多量体タン
パク質）が作製されうる。
【００３６】
Ｆｃドメインは、任意の免疫グロブリン（たとえば、ＩｇＧ1、ＩｇＧ２ａまた
はＩｇＧ４といったＩｇＧ）から選択されうる。野生型ではＩｇＧ４Ｆｃドメイン
はＦｃγＲＩＩ受容体に対して相対的に低親和性であり、およびしたがってポリペ
プチドの結合したＦｃ結合領域（すなわちＦｃγＲＩＩ型受容体に由来する）との
自己アニーリングを回避するための修飾無しで本発明のポリペプチドに使用されう
る。より望ましくは、しかし、選択されたＦｃドメインは、結合したＦｃ結合領域
とのＦｃドメインの自己アニーリング（すなわち「自己結合」）を防ぐために、（
たとえばＦｃ受容体との結合に決定的な残基でのアミノ酸置換によって）修飾され
ており、および、好ましくは、ｉｎｖｉｖｏでＦｃ受容体との結合を防ぐために修
飾されている（すなわち修飾Ｆｃドメインは好ましくは、新生児Ｆｃ受容体（Ｆｃ
Ｒｎ）以外の、たとえば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを含む
内因性Ｆｃ受容体の結合について低下した親和性を示す）。その上、選択されたＦ
ｃドメインは、望ましくはエフェクター機能を変化させるように、たとえば補体結
合を低下させるように、および／または補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を低下また
は除去するように、修飾されている。そのような修飾は、たとえば、一連の変異Ｉ
ｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４ＦｃドメインおよびそれらのＦｃγＲ結合特性を
設計および記載しているクラーク（Ｃｌａｒｋ）および共同研究者らによって広範
に記載されている（参照により本開示に含まれる、アーマー（Ａｒｍｏｕｒ）他，
１９９９；アーマー（Ａｒｍｏｕｒ）他）。たとえば、２３４、２３５、２３６、
２３７、２９７、３１８、３２０および３２２位のアミノ酸のうち任意の１つ以上
は、（たとえばアミノ酸置換によって）Ｆｃ受容体または補体のＣ１成分といった
エフェクターリガンドに対する親和性を変化させるために、修飾されうる（ウィン
ター（Ｗｉｎｔｅｒ）他のＵＳ特許公報第５，６２４，８２１号および第５，６４
８，２６０号）。また、３２９、３３１および３２２位のアミノ酸のうち１つ以上
は、（たとえばアミノ酸置換によって）Ｃ１ｑ結合を変化および／またはＣＤＣを
低減または除去するように（たとえば、イドソジー（Ｉｄｕｓｏｇｉｅ）他によっ
てＵＳ特許公報第６，１９４，５５１号に記載された通り）、および／または抗体
依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を低減または除去するように修飾されうる
。
【００３７】
ある特に好ましい修飾Ｆｃドメインでは、ＦｃドメインはＩｇＧ1に由来し（ワ
インズ（Ｗｉｎｅｓ）他，２０００）、およびアミノ酸２３４および／または２３
５、すなわちＬｅｕ234および／またはＬｅｕ235にアミノ酸修飾を含む。これらの
ロイシン残基は、Ｆｃ受容体がＦｃドメインと噛み合う（ｅｎｇａｇｅ）ＩｇＧ1
の下部ヒンジ領域内にある。Ｆｃ受容体の噛み合い（すなわち結合）を防ぐために
、ロイシン残基の一方または両方が置換または欠失されうる；たとえば、Ｌｅｕ2
34およびＬｅｕ235の一方または両方がアラニン（すなわちＬ２３４Ａおよび／ま
たはＬ２３５Ａ）または別の適当なアミノ酸で置換されうる（ワインズ（Ｗｉｎｅ
ｓ）他，２０００）。
【００３８】
別の特に好ましい修飾Ｆｃドメインでは、ＦｃドメインはＩｇＧ２ａに由来し、
およびアミノ酸２３５、３１８、３２０および３２２、すなわちＬｅｕ235、Ｇｌ
ｕ318、Ｌｙｓ320およびＬｙｓ322のいずれか１つ以上にアミノ酸修飾を含む。好
ましくは、Ｌｅｕ235がグルタミン酸で置換され、およびＧｌｕ318、Ｌｙｓ320お
よびＬｙｓ322がアラニンで置換される。
【００３９】
別の特に好ましい修飾Ｆｃドメインでは、ＦｃドメインはヒトＩｇＧ４を含むＩ
ｇＧ４に由来し、およびアミノ酸２２８、２３３、２３４、２３５および２３６の
うちいずれかもう１つにアミノ酸修飾を含む。好ましくは、ＩｇＧ４Ｆｃドメイン
中のアミノ酸修飾は、Ｐｒｏ228、Ｐｒｏ233、Ｖａｌ234、Ａｌａ235、および２３
６の欠失（すなわちＤｅｌ236）を導入する。
【００４０】
第２の態様では、本発明は、第１の態様に記載のポリペプチドを含む可溶性多量
体タンパク質を提供する。
【００４１】
第３の態様では、本発明は、第１の態様に記載のポリペプチドまたは第２の態様
に記載のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を
提供する。
【００４２】
該ポリヌクレオチド分子は、発現カセットまたは発現ベクター（たとえば細菌宿
主細胞への導入のためのプラスミド、または昆虫宿主細胞のトランスフェクション
のためのバキュロウイルスベクターといったウイルスベクター、または哺乳類宿主
細胞のトランスフェクションのためのプラスミドまたはレンチウイルスといったウ
イルスベクター）に存在しうる。
【００４３】
本発明に記載のポリペプチドの二量体を含む可溶性多量体タンパク質については
、当業者は、該コードポリヌクレオチド分子が、宿主細胞における発現に際して、
融合ポリペプチドの１本鎖を与え、それが次いで、宿主細胞分泌の産物として目的
の多量体タンパク質を与えることを理解する。
【００４４】
第４の態様では、本発明は、第３の態様に記載のポリヌクレオチド分子を含む組
み換え宿主細胞を提供する。
【００４５】
組み換え宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）といった細菌細胞、メタノール資
化酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）といった酵母細胞、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅ
ｒａ）Ｓｆ９細胞といった昆虫細胞、チャイニーズハムスタ−卵巣（ＣＨＯ）、サ
ル腎臓（ＣＯＳ）細胞およびヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞といった哺
乳類細胞、および植物細胞から選択されうる。
【００４６】
第５の態様では、本発明は；
（ｉ）第４の態様に記載のポリヌクレオチド分子を含む組み換え宿主細胞を提供
すること、
（ｉｉ）前記宿主細胞を適当な培養培地でおよび前記ポリペプチドまたはタンパ
ク質の発現に適した条件下で培養すること、および
（ｉｉｉ）前記ポリペプチドまたはタンパク質を培養物から、および、任意に培
養培地から単離すること
の段階を含む、ポリペプチドまたはタンパク質を製造するための方法を提供する。
【００４７】
該ポリペプチドまたはタンパク質は、当業者によく知られた任意の方法を用いて
単離されうる。たとえば、ポリペプチドまたはタンパク質は、金属アフィニティク
ロマトグラフィー法を用いて、または固定化ＩｇＧまたは熱凝集ＩｇＧ（ＨＡＧＧ
）クロマトグラフィー法を用いて、容易に単離されうる。
【００４８】
第６の態様では、本発明は炎症性疾患について被験体を治療する方法であって、
第１の態様に記載のポリペプチドまたは第２の態様に記載のタンパク質を、薬学的
にまたは獣医学的に許容可能なキャリヤーまたは添加物と任意に組み合わせて前記
被験体へ投与することを含む、前記方法を提供する。
【００４９】
該方法は、ＲＡ、ＩＴＰ、ＳＬＥ、糸球体腎炎およびヘパリン誘導性血小板減少
血栓症候群（ＨＩＴＴＳ）を含むＩＣ媒介性炎症性疾患といった炎症性疾患の治療
に適する。
【００５０】
被験体は、典型的にはヒトであるが、しかし第６の態様の方法はまた、家畜（た
とえば競走馬）およびコンパニオンアニマルといった他の動物被験体での使用にも
適しうる。
【００５１】
「薬学的にまたは獣医学的に許容可能なキャリヤーまたは添加物」の語は、本発
明のポリペプチドまたはタンパク質を被験体へ送るための、任意の薬学的にまたは
獣医学的に許容可能な溶媒、懸濁剤または媒体をいうことが意図される。
【００５２】
該ポリペプチドまたはタンパク質は、当業者によく知られた任意の経路、特に静
脈内（ｉｖ）投与、皮内（ｉｄ）投与および皮下（ｓｃ）投与ならびに経口および
経鼻投与を介して被験体へ投与されうる。皮下投与については、投与は注射を介し
てまたは皮下に挿入されたカテーテルによって達成されうる。代替的に、皮下投与
は、徐放インプラント組成物または注射用デポ形成組成物を介して達成されうる。
【００５３】
典型的には、該ポリペプチドまたはタンパク質は、１日当たり０．５から１５ｍ
ｇ／ｋｇ被験体体重の範囲の用量で投与される。当業者は、しかし、「有効量」（
すなわち炎症性疾患を治療する際に有効となる用量）の量は被験体の年齢および一
般的健康および治療すべき炎症性疾患の重症度を含むいくつかの因子にしたがって
変化することを理解する。具体的な各被験体について適当な有効量を特定または最
適化することは十分に当業者の能力内である。
【００５４】
本発明の別の態様では、第１の態様に記載のポリペプチドまたは第２の態様に記
載のタンパク質を、薬学的にまたは獣医学的に許容可能なキャリヤーまたは添加物
と任意に組み合わせて含む組成物、および第１の態様に記載のポリペプチドまたは
第２の態様に記載のタンパク質の、炎症性疾患の治療用の医薬の製造における使用
が提供される。
【００５５】
さらに、本発明のポリペプチドおよびタンパク質はまた、炎症性疾患についての
被験体の治療以外の用途にも有用である。すなわち、それらはＲＡおよびＳＬＥと
いった自己免疫疾患の病理に関連する循環性免疫複合体（ＩＣ）を検出する診断ア
ッセイに使用でき、ここで該ポリペプチドまたはタンパク質は、そのようなアッセ
イで使用される典型的な沈降段階（ポリエチレングリコールを用いる）の代わりに
、ＩＣ「捕捉」（たとえばＥＬＩＳＡプレートといった適当な基材へのポリペプチ
ドまたはタンパク質の結合による）の段階に使用されうる。分析すべき試料（たと
えば被験体に由来する血清または滑液試料）からのＩＣを捕捉後、捕捉されたＩＣ
は、本発明のポリペプチドまたはタンパク質を、マーカーまたはレポーター（検出
可能なシグナルを生じることができる、たとえば放射性標識分子、化学発光分子、
生物発光分子、蛍光分子またはホースラディッシュペルオキシダーゼといった酵素
）として作用しうる分子と結合した形で用いることによって検出されうる。代替的
に、捕捉されたＩＣは、循環性ＩＣ中の特定の自己抗原のレベルの測定を可能にす
るための、特定の自己抗原（たとえばＲＡにおけるシトルリン、ＳＬＥにおけるＤ
ＮＡ、シェーグレン症候群におけるＬａ／ＳＳ−Ｂ、および強皮症におけるＤＮＡ
トポイソメラーゼＩ）に特異的な抗体を用いて、検出または「プローブ」すること
ができ、それは改善された診断または予後判定結果を有する自己免疫疾患のための
アッセイの開発を可能にしうる。さらに、同様の方法で、適当な基材に結合した本
発明のポリペプチドまたはタンパク質によって捕捉されたＩＣは、感染性病原体（
たとえばブドウ状球菌および連鎖球菌といった細菌、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆ
ａｌｃｉｐａｒｕｍ）（マラリア）といった寄生虫、およびＣ型肝炎ウイルス（Ｈ
ＣＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ
）およびデング熱の原因アルボウイルスといったウイルス）の特定抗原に特異的な
抗体を用いて、検出または「プローブ」することができ、感染症の病原体の同定、
疾患予後および／または感染症の管理に有用な情報を提供する。
【００５６】
さらに、本発明のポリペプチドおよびタンパク質はまた、さまざまなバイオアッ
セイに有用であり、そこでマクロファージ、樹状細胞（ＤＣ）および好中球を含む
細胞からの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の放出を有用に阻害できる。さらに、上述のも
ののようなマーカーまたはレポーターとして作用しうる分子と結合される場合、該
ポリペプチドまたはタンパク質は、炎症部位のｉｎ ｖｉｖｏ造影に使用されうる
。
【００５７】
さらに、本発明のポリペプチドおよびタンパク質は、ＩＣ媒介性炎症性疾患に伴
う循環性ＩＣの除去に有用であり、そこで該ポリペプチドまたはタンパク質は不活
性ビーズ、繊維または他の表面といった適当な基材と結合しており、およびＩＣ複
合体を含む被験体由来の体液（特に血液）に曝露され、そのためＩＣが捕捉されお
よび続いて体液から除去される。処理された体液は、実質的にＩＣが枯渇しており
、次いでその体液が得られた被験体へ戻すことができる。
【００５８】
本発明の性質がより明瞭に理解されうるように、その好ましい形態がここで下記
の非限定的な実施例を参照して記載される。
【実施例１】
【００５９】
ＦｃＲ多量体ポリペプチドの作製、精製および特徴づけ
材料および方法
ＦｃγＲＩＩａ多量体発現ベクターの構築
ヒトＦｃγＲＩＩａの外部ドメイン１および２を含むＦｃ結合領域を、熱安定性
ポリメラーゼＰｗｏ（ロシュ社（Ｒｏｃｈｅ））、クローンＨｕ３．０（ヒブズ（
Ｈｉｂｂｓ）他、１９８８、受入番号（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＮＭ）_０２１６４２
）をｃＤＮＡテンプレートとして、およびプライマーｏＢＷ１０ GTAGCTCCCCCAAA
GGCTG （配列番号：１）およびｏＢＷ１１ CTACCCGGGTGAAGAGCTGCCCATG （配列番
号：２）を用いることによって増幅した。半分のＳｎａＢＩ部位（すべてのＤＮＡ
修飾酵素はニュー・イングランド・バイオラブズ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉ
ｏｌａｂｓ）由来であった）およびＳｍａＩ部位を下線で示す。平滑末端ＰＣＲ産
物を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、ベクターｐＰＩＣ９（インビトロジェン・ラ
イフテクノロジーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ
ｓ））へ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー（Ｋｌｅｎｏｗ）断片で埋めたＥｃｏ
ＲＩ部位にてライゲーションし、ベクターｐＢＡＲ１４を作製した。ＦｃγＲＩＩ
ａのタンデム外部ドメインをコードするベクターｐＢＡＲ２８を作製するために、
ｐＢＡＲ１４をＳｎａＢＩで消化し、その部位へｐＢＡＲ１４のＳｎａＢＩ／Ｓｍ
ａＩ断片をライゲーションした。
【００６０】
ＦｃγＲＩＩａ多量体化外部ドメインを発現するためのバキュロウイルスベクタ
ーは下記の通り構築された：ＦｃγＲＩＩａリーダー配列および外部ドメイン１お
よび２をコードする断片は、ｐＶＬ−１３９２（パウエル（Ｐｏｗｅｌｌ）他，１
９９９，およびマクスウェル（Ｍａｘｗｅｌｌ）他，１９９９）からＥｃｏＲＩお
よびＸｂａＩでの消化によって得られ、および次いで複数クローニング部位のＢａ
ｍＨＩ部位がまずＢａｍＨＩでの消化によって除去されＤＮＡポリメラーゼのクレ
ノー（Ｋｌｅｎｏｗ）断片および再ライゲーションを用いて埋めた修飾ｐＢＡＣＰ
ＡＫ９（インビトロジェン・ライフテク（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃ
ｈ））のＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ部位へライゲーションした。このコンストラクトの
ベクターｐＢＡＲ６９をＢａｍＨＩで消化し、ｐＢＡＲ２８のＢａｍＨＩ断片をラ
イゲーションして、それぞれｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体、三量体および四量体をコ
ードするベクターｐＢＡＲ７１、ｐＢＡＲ７２およびｐＢＡＲ７３を生じた。挿入
サイズはＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ消化によって定められ、および多量体化ＢａｍＨＩ
断片の正しい方向はＰｖｕＩＩ消化によって標準手順を用いてスクリーニングした
。
【００６１】
ＦｃγＲＩＩａ単量体および二量体をコードする哺乳類発現ベクターを下記の通
り作製した：ＦｃγＲＩＩａｃＤＮＡクローンＨｕ３．０（ヒブズ（Ｈｉｂｂｓ）
他，１９８８，および定義（ＤＥＦＩＮＩＴＩＯＮ）：ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉ
ｅｎｓ）ＩｇＧのＦｃ断片，低親和性ＩＩａ，受容体（ＣＤ３２）（ＦＣＧＲ２Ａ
），ｍＲＮＡ，受入番号（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＮＭ）_０２１６４２）を、アキュ
プライム（ａｃｃｕｐｒｉｍｅ）Ｐｆｘ ＰＣＲ （インビトロジェン・ライフテク
ノロジーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を
用いて増幅し、およびゲートウェイ（Ｇａｔｅｗａｙ）（商標）ベクター ｐＤＯ
ＮＲ（商標）２２１（インビトロジェン・ライフテクノロジーズ）へ、取扱説明書
にしたがってＢＰクロナーゼ（商標）反応（インビトロジェン・ライフテク）を用
いてクローニングし、ｐＮＢ６を生じた。ｐＮＢ６のポリメラーゼのアキュプライ
ムＰｆｘを用いたプライマーｏＢＷ１１およびｏＢＷ３０２ TCTCATCACCACCATCAC
CACGTCTAGACCCAGCTTTCTTGTACAAAG （配列番号： ３）とのＰＣＲ、ＳｍａＩでの消
化およびＴ４リガーゼでのライゲーションは、Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグを有す
るｒｓＦｃγＲＩＩａをコードするｐＢＡＲ３９０を生じた。ｐＢＡＲ３９０のＢ
ａｍＨＩでの消化およびｐＢＡＲ２８のＢａｍＨＩ断片のライゲーションは、ｒｓ
ＦｃγＲＩＩａ二量体をコードするベクターｐＢＡＲ３９７を生じた。ＰｖｕＩＩ
消化を次いで用いて、二量体化ＢａｍＨＩ断片の方向をスクリーニングし、および
ＡＢＩＢｉｇＤｙｅ３．１（アプライド・バイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ））でシークエンシングし、標的配列を確認した。ゲートウェ
イＬＲクロナーゼ反応（インビトロジェン・ライフテクノロジーズ）を次いで用い
、ＦｃγＲＩＩａ単量体（ｐＢＡＲ３９０）または二量体（ｐＢＡＲ３９７）をゲ
ートウェイ（Ｇａｔｅｗａｙ）リーディングフレームＡカセット（インビトロジェ
ン・ライフテクノロジーズ）を適用した発現ベクターｐＡＰＥＸ３Ｐ（エバンズ（
Ｅｖａｎｓ）他，１９９５，およびクリスチャンセン（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ
）他，１９９６）へ導入し、発現ベクターｐＢＡＲ４２６およびｐＢＡＲ４２７を
生じた。同様に、ゲートウェイＬＲクロナーゼ反応を用いて、ＦｃγＲＩＩａ単量
体（ｐＢＡＲ３９０）または二量体（ｐＢＡＲ３９７）を、ゲートウェイ（Ｇａｔ
ｅｗａｙ）リーディングフレームＡカセット（インビトロジェン・ライフテクノロ
ジーズ）を適用した発現ベクターｐＩＲＥＳｎｅｏ（クローンテック社（Ｃｌｏｎ
ｔｅｃｈ））へ導入した。図１は、発現ベクターｐＢＡＲ４２７を構築するのに用
いたｐＢＡＲ３９７内のＦｃγＲＩＩａ「ヘッドトゥーテール」二量体コンストラ
クトについてポリヌクレオチド配列（および翻訳されたアミノ酸配列）を示す。２
つの反復はアミノ酸１から１７４（すなわち第１のＦｃ結合領域）および１８４か
ら３６２（すなわち第２のＦｃ結合領域）として示され、およびＦｃγＲＩＩａ膜
隣接柄部の短い（８アミノ酸配列；残基１７５から１８２）断片に加えて追加のバ
リン残基（図１で下線で示す残基１８３）を介して結合している。図１に示す配列
のアミノ酸−３１から−１はＦｃγＲＩＩａの天然のリーダー配列を表す。
【００６２】
ｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体および二量体ポリペプチドの作製
組み換え可溶性ＦｃγＲＩＩａ（ｒｓＦｃγＲＩＩａ）単量体および二量体ポリ
ペプチドのＨＥＫ２９３Ｅ細胞における発現は、５μｇのプラスミドＤＮＡ（ｐＢ
ＡＲ４２６，ｐＢＡＲ４２７）を１０ｃｍ2ウェルに入れ、およびリポフェクタミ
ン２０００試薬（インビトロジェン・ライフテクノロジーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））またはトランジット（Ｔｒａｎｓｉ
ｔ）試薬（バイオラッド・ラボラトリーズ社（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ））を用いるトランスフェクションによって取扱説明書にしたがって実施さ
れた。４８時間後、トランスフェクションされた細胞を次いで４μｇ／ｍｌピュー
ロマイシン中でのインキュベートによって選択した。ピューロマイシン選択細胞を
、次いで１％ＦＣＳ添加ＣＤ２９３培地（インビトロジェン・ライフテクノロジー
ズ）中で定常期まで増殖させた。組み換え産物を次いで固定化ニッケル（キアゲン
社（Ｑｉａｇｅｎ））またはコバルト（クローンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））
カラムを用いたクロマトグラフィーによって精製し、およびスーパーデックス（Ｓ
ｕｐｅｒｄｅｘ）２００またはスーパーデックスＧ７５（アマシャム／ファルマシ
ア社（Ａｍｅｒｓｈａｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ））サイズ排除クロマトグラフィー
を用いてさらに精製した。
【００６３】
ｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体および二量体ポリペプチドのアフィニティ測定の比較
標準ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ手順（ワインズ（Ｗｉｎｅｓ）他，２００１；ワイ
ンズ（Ｗｉｎｅｓ）他，２００３）を用いて、精製ｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体およ
び二量体についてアフィニティ測定を実施した；ｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体または
二量体をさまざまな濃度で、固定化ヒトＩｇＧ単量体（サンドグロブリン（Ｓａｎ
ｄｏｇｌｏｂｕｌｉｎ），ノバルティス社（Ｎｏｖａｒｔｉｓ））または熱凝集Ｉ
ｇＧ（ＨＡＧＧ，ワインズ（Ｗｉｎｅｓ）他，１９８８；ワインズ（Ｗｉｎｅｓ）
他，２００３）へ６０分間注入し、その時間後、表面を再生した（ワインズ（Ｗｉ
ｎｅｓ）他、２００３）。バイオセンサー表面上にヒトＩｇＧ単量体を固定化する
ことで、それは免疫複合体を模倣する多価アレイになる。
【００６４】
ｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体および二量体ポリペプチドの阻害活性の比較
精製ｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体および二量体を、ヒトＩｇＧ単量体（サンドグロ
ブリン（Ｓａｎｄｏｇｌｏｂｕｌｉｎ））および二量体−ＩｇＧ（ライト（Ｗｒｉ
ｇｈｔ）他，１９８５）の漸増濃度の溶液とインキュベートした。遊離受容体ポリ
ペプチドの量を次いで、標準ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ手順にしたがって固定化ヒト
ＩｇＧ単量体へ注入することによって測定した。
【００６５】
ｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体および二量体ポリペプチドによるヒト細胞への免疫複
合体結合の阻害
小さい免疫複合体（二量体−ＩｇＧに代表される）のヒト好中球（ボランティア
Ｖ１およびＶ５）への結合を、精製ｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体および二量体ポリペ
プチドの非存在下および存在下で、フローサイトメトリー分析によって測定した（
『免疫学カレント・プロトコル』（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ），ワイリー・インターサイエンス社（Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅ
ｒｓｃｉｅｎｃｅ））。
【００６６】
免疫複合体刺激ＭＤＭ（単球由来マクロファージ）からのＴＮＦ分泌のｒｓＦｃ
γＲＩＩａ単量体および二量体ポリペプチドによる阻害
第１の実験で、末梢単核細胞をヒト血液（ボランティアＶ５）から抽出し、ＣＤ
１４発現についてオートマックス（ａｕｔｏｍａｃｓ）ソーター（ミルテニー・バ
イオテク社（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ））を用いて陽性選択し、および２
４時間Ｍ−ＣＳＦの存在下でＭＤＭ（単球由来マクロファージ）へ分化させ、その
後、さまざまな濃度の小さい免疫複合体（二量体−ＩｇＧに代表される）で、ｒｓ
ＦｃγＲＩＩａ二量体（上清中に２．５μｇ／ｍｌ）の非存在下および存在下で刺
激した。ＭＤＭからのＴＮＦ分泌を次いでヒトＴＮＦＥＬＩＳＡによって取扱説明
書にしたがって測定した（ＢＤファーミンジェン社（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ
））。第２の実験で、ＭＤＭを同様にｅｘ ｖｉｖｏでヒト血液（今回はボランテ
ィアＶ１由来）から作製しおよび２４時間分化させ、その後、さまざまな濃度の小
さい免疫複合体（すなわち二量体−ＩｇＧ）で、ｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体（上清
中に２．５μｇ／ｍｌ）の非存在下および存在下で刺激した。
【００６７】
ｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体ポリペプチドによる血小板の免疫複合体活性化の阻害
洗浄した血小板を全血の低速遠心分離によって調製し（タイ（Ｔｈａｉ）他，２
００３）および熱凝集ＩｇＧ（ＨＡＧＧ）で刺激した。血小板の活性化は、Ｐ−セ
レクチン（ＣＤ６２Ｐ）の表面発現の増加によってフローサイトメトリーで測定し
た（ラウ（Ｌａｕ）他，２００４）。
【００６８】
結果
ｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体および多量体ポリペプチドの昆虫細胞からの発現
感染細胞上清のウェスタンブロット分析は、組み換え可溶性ＦｃγＲＩＩａの二
量体および三量体形の産生の成功を実証した（図２）。いくらかの三量体ポリペプ
チドが検出されたが、これは概ね切断されて二量体形となり、および四量体は検出
されず、概ね切断されて二量体形を生じた。ＦｃγＲＩＩａ二量体は本質的に最も
安定であったため、これはさらに特徴づけられおよび哺乳類発現系で開発された（
すなわちＨＥＫ２９３Ｅ細胞）。
【００６９】
しかし、天然ＦｃγＲＩＩａはタンパク質分解によって白血球細胞表面から脱落
しうるため（アスティア（Ａｓｔｉｅｒ）他，１９９４）、三量体、四量体および
より大きい多量体のタンパク質分解を最小化するための１つの戦略は、ＦｃγＲＩ
Ｉａ細胞外領域を結合する膜隣接柄部リンカー配列を消去するかまたはより好まし
くは置換することになる。たとえば、膜隣接柄部リンカー配列のタンパク質分解感
受性は、１つ以上のアミノ酸修飾（たとえば１つ以上のアミノ酸置換、欠失および
／または付加）によって、またはリンカー配列を、たとえば、タンパク質分解に対
して低感受性であるＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号：４）といった合成リンカー
配列で置換することによって、低減されうる。
【００７０】
三量体、四量体およびより大きい多量体の作製に成功するための別の戦略は、発
現された二量体ポリペプチドを、１つ以上の単量体または別の二量体ポリペプチド
と、化学的架橋によって結合することである。ＦｃγＲＩＩａ二量体の多量体もま
た、二量体ポリペプチドを、自身が二量体でありおよび任意の融合パートナーを二
量体化するＦｃドメイン（たとえばＩｇＧ Ｆｃドメイン）との融合タンパク質と
して発現することによって作製されうる。
【００７１】
ｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体および二量体ポリペプチドの哺乳類細胞からの発現
タンパク質収量は、ｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体について３ｍｇ／ｌ（コンストラ
クトｐＢＡＲ４２６）、およびｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体について、〜０．５ｍｇ
／ｌまで（コンストラクトｐＢＡＲ４２７）であった。図３は、ｒｓＦｃγＲＩＩ
ａ単量体および二量体の精製から回収された画分のクマシー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ
）染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％アクリルアミドゲル、非還元条件下）を示す。ｒ
ｓＦｃγＲＩＩａ単量体は予想サイズが〜３０ｋＤａであり（ａ）、一方、ｒｓＦ
ｃγＲＩＩａ二量体は予想サイズが〜６０ｋＤａであった（ｂ）。
【００７２】
ｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体および二量体ポリペプチドのアフィニティ測定の比較
アッセイの結果を図４および５に示す。アッセイは、ｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体
が、ヒトＩｇＧ単量体について１．７μＭおよびＨＡＧＧについて１．０５μＭの
アフィニティ解離定数（ＫD）を有する１結合部位を有することを示した。ｒｓＦ
ｃγＲＩＩａ二量体の場合、結合データは、固定化ヒトＩｇＧ単量体について３．
２ｎＭ（ＫD1）および１００ｎＭ（ＫD2）、およびＨＡＧＧについて２．７３ｎＭ
（ＫD1；単量体ｒｓＦｃγＲＩＩａのＫDより約３００倍小さい）および９９ｎＭ
（ＫD2）のアフィニティ解離定数（ＫD）を有する２結合部位モデルに最も良く合
致した。
【００７３】
ｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体および二量体ポリペプチドの阻害活性の比較
ｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体および二量体ポリペプチドの阻害活性を比較するため
に実施した実験は、溶液中で、ｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体（図６ａ）はヒトＩｇＧ
単量体および小さい免疫複合体（すなわち二量体−ＩｇＧに代表される）を識別し
ないことを示した。対照的に、溶液中のｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体（図６ｂ）は、
ヒトＩｇＧ単量体よりも小さい免疫複合体（すなわち二量体−ＩｇＧ）を選択的に
結合する。
【００７４】
ヒト細胞への免疫複合体結合のｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体および二量体ポリペプ
チドによる阻害
阻害アッセイの結果を図７ａおよび７ｂに示し、およびこれらは、小さい免疫複
合体（すなわち二量体−ＩｇＧ）をヒト好中球との結合から阻害することについて
、ｒｓＦｃ(ＲＩＩａ二量体（ＩＣ50＝１．１μｇ／ｍｌ）が、ｒｓＦｃ(ＲＩＩａ
単量体（ＩＣ50＝１０．５μｇ／ｍｌ）よりも〜１０倍活性が高いことを示す。さ
らに、結果は、小さい免疫複合体（二量体−ＩｇＧ）のヒト好中球との結合からの
ｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体による阻害は、別々の２人に由来する好中球で再現可能
でありＩＣ50が０．９〜１．１μｇ／ｍｌであったことを示した。
【００７５】
免疫複合体刺激ＭＤＭ（単球由来マクロファージ）からのＴＮＦ分泌のｒｓＦｃ
γＲＩＩａ単量体および二量体ポリペプチドによる阻害
結果を図８ａおよび８ｂに示す。ｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体は、２４時間分化ヒ
トＭＤＭからの免疫複合体（すなわち二量体−ＩｇＧ）刺激されたＴＮＦ分泌を阻
害するように見えた。
【００７６】
ｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体ポリペプチドによる血小板の免疫複合体活性化の阻害
洗浄したヒト血小板をＨＡＧＧ（１０μｇ／ｍｌ）と共に、ｒｓＦｃγＲＩＩａ
二量体３０μｇ／ｍｌの存在下および非存在下で３０分間インキュベートした。図
９に示す通り、Ｐ−セレクチン（ＣＤ６２Ｐ）のより少ない発現が証拠となり、血
小板の活性化はｒｓＦｃ(ＲＩＩａ二量体の存在下で阻害されたことが見出された
。
【００７７】
考察
単量体（ｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体）および二量体（ｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体
）形の組み換え可溶性ＦｃγＲＩＩａのＨＥＫ２９３Ｅ細胞における発現に成功し
た。ＢＩＡｃｏｒｅ平衡結合アッセイは、ｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体が固定化Ｉｇ
Ｇ（サンドグロブリン（Ｓａｎｄｏｇｌｏｂｕｌｉｎ））に対して単量体受容体よ
りも〜３００倍大きい結合活性を有する（すなわち固定化ＩｇＧとの相互作用にお
いてｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体はＫD〜１μＭである一方ｒｓＦｃγＲＩＩａ二量
体はＫD〜３ｎＭである）ことを実証した。ＢＩＡｃｏｒｅを用いる競合実験はま
た、ｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体が小さい免疫複合体を選択的に結合することを実証
し、および２名のドナー由来の好中球を用いる細胞系アッセイで選択的阻害活性が
確認された。ｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体はまた、ｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体よりも
小さいＩｇＧ免疫複合体結合の約１０倍強力なインヒビターであることが証明され
、および標準血小板アッセイでは、ｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体は血小板の免疫複合
体活性化を完全に阻害することが観察された（すなわちｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体
は細胞活性化の強力なインヒビターである）。したがって、本発明に記載のｒｓＦ
ｃγＲＩＩａ二量体および他の可溶性多量体タンパク質およびポリペプチドは、Ｒ
ＡおよびＳＬＥといったＩＣ媒介性炎症性疾患の治療に顕著な有望性を示すと考え
られる。
【実施例２】
【００７８】
ｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体ポリペプチドの作製、精製および特徴づけ
材料および方法
ｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体ポリペプチドの産生
実施例１に記載のＦｃ(ＲＩＩａ二量体コンストラクトを修飾ＣＭＶプロモータ
ーの調節下の哺乳類発現ベクターへクローニングした。安定ＣＨＯ−Ｓ形質転換体
を次いで下記の通りに樹立した：９０％集密のＣＨＯ−Ｓ細胞を採取し、３回洗浄
し、および２ｘ１０7細胞を含む１５ｍｌ培地を１０ｃｍシャーレに分注した。直
鎖化ＤＮＡ−リポフェクタミン２０００複合体（比１：２．５）を次いで５分間室
温にてインキュベートし、および細胞へ滴下して加えた。続いて、細胞を３７℃に
て４８時間インキュベートし、および次いで限界希釈で９６ウェルプレートに、６
００μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢ、８ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｘＨＴサプリメ
ントおよび５０μｇ／ｍｌ硫酸デキストランを添加したＣＤ−ＣＨＯ培地に播種し
た。細胞を標準ＥＬＩＳＡによってスクリーニングして可溶性ＦｃγＲＩＩａタン
パク質を検出し、および最高の発現株を限界希釈によって再びサブクローニングし
た。１つのクローン（＃６）がＦｃγＲＩＩａ二量体を約４０ｍｇ／Ｌにて分泌し
、および振とうフラスコ内で３０℃にて最適タンパク質発現のために培養された。
【００７９】
ｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体を含む上清をタンジェンシャルフローろ過によって濃
縮し、および２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．４緩衝液へ交換した。試料を次い
で２０ｍＭリン酸ナトリウムおよび０．５Ｍ塩化ナトリウムで４倍に希釈し、およ
びＨｉｓＴｒａｐＦＦ２ｘ５ｍｌカラム（ＧＥヘルスケア社（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ
ｃａｒｅ））で精製し，２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウムｐＨ
７．４および１００ｍＭイミダゾールで溶出した。溶出した材料を透析し、および
イオン交換クロマトグラフィーによって２５ｍｌＱＦＦカラム（ＧＥヘルスケア社
）を用いて精製し、および１５０ｍＭ塩化ナトリウムで溶出した。精製した材料を
次いでリン酸緩衝生理食塩水へ透析した。
【００８０】
ＦｃγＲＩＩｂへのＨＡＧＧ結合のｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体ポリペプチドでの
ブロッキング
精製ｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体が細胞表面ＦｃγＲＩＩｂへの免疫複合体結合を
ブロックする能力を、フローサイトメトリーアッセイによって評価した。熱凝集Ｉ
ｇＧ（ＨＡＧＧ）をさまざまな濃度のｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体またはｒｓＦｃγ
ＲＩＩａ単量体（Ｒ＆Ｄシステムズ社（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ），品番１３３０
−ＣＤ／ＣＦ）と１時間４℃にてインキュベートした。これらの混合物を次いで、
ヒトＦｃγＲＩＩｂでトランスフェクションしたＩＩＡ１．６細胞１０5個の入っ
た９６ウェルプレートへ加えた（ＩＩＡ１．６は内因性ＦｃγＲ発現を欠くマウス
Ｂリンパ腫株である）。プレートを１時間４℃にてインキュベートし、洗浄し、お
よび次いで抗ｈＩｇＧ−ＦＩＴＣ複合体で染色して結合ＨＡＧＧを検出した。洗浄
後、細胞をＦＡＣＳスキャンフローサイトメーターで標準手順を用いて分析した。
【００８１】
ｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体ポリペプチドを用いたＨＡＧＧ誘導血小板活性化のブ
ロッキング
ＨＡＧＧへの血小板の曝露は、Ｆｃ(ＲＩＩａを介する活性化を結果として生じ
、Ｐ−セレクチン（ＣＤ６２Ｐ）のアップレギュレーションに繋がる。ｒｓＦｃγ
ＲＩＩａ二量体またはｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体がこの活性化をブロックする能力
を、フローサイトメトリーアッセイによって評価した。熱凝集ＩｇＧ（ＨＡＧＧ）
をさまざまな濃度のｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体またはｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体（
Ｒ＆Ｄシステムズ社（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ），品番１３３０−ＣＤ／ＣＦ）と
１時間４℃にてインキュベートした。混合物を次いで、予め洗浄しおよび１ｍＭ
ＥＤＴＡ添加タイロード／ヘペス（Ｔｙｒｏｄｅｓ／Ｈｅｐｅｓ）緩衝液に再懸濁
したヒト血小板３ｘ１０7個の入った９６ウェルプレートへ加えた。３０分間室温
にてインキュベート後、細胞を洗浄し、固定し、およびＣＤ６２ＰおよびＧＰＩＩ
ｂ（ＣＤ４１）発現について標準法によって染色し、およびＦＡＣＳスキャンフロ
ーサイトメーターで分析した。
【００８２】
ｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体ポリペプチドは免疫複合体誘導ＭＣ／９活性化をブロ
ックする
ＭＣ／９は免疫複合体への曝露後に活性化されおよびＴＮＦ−αを放出するＦｃ
γＲ陽性マウス肥満細胞株である。ｒｓＦｃ(ＲＩＩａ二量体またはｒｓＦｃγＲ
ＩＩａ単量体がこの活性化をブロックする能力を、オボアルブミンおよび抗オボア
ルブミン抗体から成る免疫複合体（ＯＶＡ ＩＣ）を刺激剤として用いて評価した
。ＯＶＡ ＩＣ（１０μｇ）をさまざまな濃度のｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体または
ｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体（Ｒ＆Ｄシステムズ社（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、品
番１３３０−ＣＤ／ＣＦ）と１時間室温にてインキュベートした。混合物を次いで
、２ｘ１０5ＭＣ／９細胞の入った９６ウェルプレートへ加え、および一夜３７℃
にてインキュベートした。上清を回収し、およびＴＮＦ−αの量を市販のＥＬＩＳ
Ａキット（ＢＤバイオサイエンス社（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を用いて
測定した。
【００８３】
ｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体はヒトＦｃγＲＩＩａトランスジェニックマウスモデ
ルにおいて誘導性関節炎を阻害する
ｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体の活性を、参照により本開示に含まれる公開されたＰ
ＣＴ出願ＷＯ０３／１０４４５９に記載されるトランスジェニックヒトＦｃγＲＩ
Ｉａマウスを用いて関節炎モデルで評価した。これらのマウスは、ヒトＦｃγＲＩ
Ｉａをコードする導入遺伝子を発現する。
【００８４】
臨床的に明らかな関節炎（標準関節炎指標を用いて判定）がこれらのマウスにお
いて単回２ｍｇ用量のモノクローナル抗体Ｍ２１３９含有ＰＢＳの投与後少なくと
も４日目までに誘発され、それはコラーゲンＩＩのアミノ酸５５１−５６４のＪ１
エピトープに特異的に結合するＩｇＧ２ａである。該モノクローナル抗体は、関節
炎誘発性であると証明されているハイブリドーマによって産生される（アミルアフ
マディ（Ａｍｉｒａｈｍａｄｉ）他，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔ
ｉｓｍ，Ｊｕｎｅ ２００５； ナンダクマール（Ｎａｎｄａｋｕｍａｒ） 他，Ａ
ｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｍａｙ ２００４）
。
【００８５】
マウスを図１に示す可溶性ＦｃγＲＩＩａ二量体を用いて下記の通り処理した：
４匹のＦｃγＲＩＩａ Ｔｇマウスに０．５ｍｇ可溶性ＦｃγＲＩＩａ二量体を注
射し、およびマウス４匹の対照群にＰＢＳをｉ．ｐ．投与した。２時間後、両方の
群に２ｍｇのＭ２１３９（ｉｐ）を注射し、および１ｍｇの二量体またはＰＢＳを
ボーラス投与した。二量体（０．５ｍｇ／用量）をＭ２１３９の注射後２４および
４８時間の両方に再び投与した。関節炎を通常通り採点し、可能な最高スコアは１
２点であった。４足各０〜３点（０＝正常；１＝発症関節１、紅斑、軽度腫脹；２
＝２つ以上の発症関節、足首／手首腫脹；３＝全関節発症、可動性消失／強直、著
明な紅斑および浮腫）。
【００８６】
結果
ｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体ポリペプチドの産生
図１０は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元および非還元条件下）；抗ＦｃγＲＩＩａ抗
体（（Ｒ＆Ｄシステムズ社（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ），品番ＡＦ１８７５）およ
びウサギ抗ヤギＩｇＧ−ペルオキシダーゼを検出抗体として用いるウェスタンブロ
ッティング；およびＨＰＬＣを含む、精製ｒｓＦｃγＲＩＩａ材料の分析を示す。
ポリペプチドは予想分子量（〜５０ｋＤ）で単一バンドとして泳動し、抗ＦｃγＲ
ＩＩａ抗体と反応し、およびＨＰＬＣ分析によって測定された通り純度＞９６％で
ある。
【００８７】
ｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体ポリペプチドはＦｃ(ＲＩＩｂへのＨＡＧＧ結合をブ
ロックする
ＨＡＧＧ結合アッセイの結果を図１１に示す。ｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体および
ｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体の両方が、細胞表面ＦｃγＲＩＩｂへのＨＡＧＧの結合
を完全にブロックできた。しかし、ｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体（ＩＣ５０＝３．９
ｎｇ／ｍｌ）は単量体タンパク質（ＩＣ５０＝２０８２ｎｇ／ｍｌ）よりも５００
倍よりもっと強力であった。
【００８８】
ｒｓＦｃ(ＲＩＩａ二量体ポリペプチドはＨＡＧＧに誘導される血小板活性化を
ブロックする
血小板活性化アッセイの結果を図１２に示す。ＨＡＧＧ単独での処理後の活性化
血小板（ＣＤ４１およびＣＤ６２Ｐの両方について陽性）の割合を１００％と定め
た。ｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体およびｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体の両方が、ＨＡＧ
Ｇに誘導されるＣＤ６２Ｐアップレギュレーションを顕著に低減できた。滴定によ
って、ｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体（ＩＣ５０＝３．９μｇ／ｍｌ）はｒｓＦｃ(Ｒ
ＩＩａ単量体（ＩＣ５０＝２０．９μｇ／ｍｌ）よりも５倍強力であったことが明
らかになった。
【００８９】
ｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体ポリペプチドは免疫複合体誘導ＭＣ／９活性化をブロ
ックする
ＭＣ／９活性化アッセイの結果を図１３に示す。ＯＶＡＩＣ単独とのインキュベ
ート後に放出されるＴＮＦ−αの量を１００％と定めた。ｒｓＦｃγＲＩＩａ二量
体およびｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体の両方が、免疫複合体によって誘導されるＴＮ
Ｆ−α放出を完全に抑制できた。滴定によって、ｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体（ＩＣ
５０＝２．１μｇ／ｍｌ）はｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体（ＩＣ５０＝１７．７μｇ
／ｍｌ）よりも８倍強力であったことが明らかになった。
【００９０】
ｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体はヒトＦｃγＲＩＩａトランスジェニックマウスモデ
ルにおいて誘導性関節炎を阻害する
図１８に示す通り、ｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体の投与は関節炎スコアの劇的な低
下を与えた。第２の試験は、二量体によって媒介される関節炎スコアの低下を、そ
れほど劇的にではないが確認した。
【００９１】
考察
ｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体のＣＨＯ−Ｓ細胞における発現に成功した。還元およ
び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、精製ｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体はサイズが約５０ｋ
Ｄａであったことを示し、およびウェスタンブロッティングは、二量体が抗Ｆｃ(
ＲＩＩａ抗体によって特異的に結合したことを示した。ｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体
はＨＰＬＣによって純度９６％と測定された。
【００９２】
ｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体およびｒｓＦｃ(ＲＩＩａ単量体の両方が、細胞表面
ＦｃγＲＩＩｂへのＨＡＧＧの結合を完全にブロックし、ｒｓＦｃγＲＩＩａ二量
体がｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体よりも約５００倍高いブロッキング効率を有した。
同様に、ｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体およびｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体の両方が、Ｈ
ＡＧＧに誘導される血小板活性化を顕著に低減でき、二量体がｒｓＦｃγＲＩＩａ
単量体よりも約５倍高い効力を有した。さらに、ｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体および
ｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体の両方が、ＴＮＦ−α放出によって測定されるマウス肥
満細胞株（ＭＣ／９）活性化を抑制し、二量体が単量体よりも８倍高い効力を示し
た。
【００９３】
重要なことに、ｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体は誘導性関節炎のマウスモデルにおい
て関節炎を回復させ、ｉｎ ｖｉｖｏ有効性を実証した。
【実施例３】
【００９４】
ＩｇＧ1由来Ｆｃドメインを含むｒｓＦｃγＲＩＩａ融合ポリペプチドの設計お
よび発現
材料および方法
ｒｓＦｃγＲＩＩａ融合発現ベクターの構築
可溶性単量体ＦｃγＲＩＩａまたは可溶性二量体ＦｃγＲＩＩａをコードするポ
リヌクレオチドを独立して、ＩｇＧ1−Ｆｃγ１をコードするポリヌクレオチドと
融合した（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）。
【００９５】
可溶性単量体ＦｃγＲＩＩａポリペプチドのＣ末端を、２個のＦｃ部分を共有結
合する下部ヒンジの鎖間ジスルフィド結合のＮ末端側の位置で、ヒトＩｇＧ1ポリ
ペプチドと動作可能に融合した。この位置での融合は、共有結合したＦｃドメイン
間の相互作用のために第２のＦｃドメインと二量体化する、単量体ＦｃγＲＩＩａ
−ＩｇＧ1−Ｆｃγ１（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）融合タンパク質を生じる。Ｉｇ
Ｇヒンジ領域はその柔軟性が知られており、および下部ヒンジの鎖間ジスルフィド
結合のＮ末端側にＦｃ結合領域を含むポリペプチドの融合は、Ｆｃ結合領域の動き
の相当な自由を可能にする。
【００９６】
同様に、可溶性二量体ＦｃγＲＩＩａポリペプチドのＣ末端を、２個のＦｃ部分
を共有結合する下部ヒンジの鎖間ジスルフィド結合のＮ末端側の位置で、ヒトＩｇ
Ｇ1ポリペプチドと動作可能に融合した。
【００９７】
可溶性単量体ＦｃγＲＩＩａまたは可溶性二量体ＦｃγＲＩＩａをコードするポ
リヌクレオチドを独立して、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）をコードするポリヌク
レオチドと、従前の国際特許明細書第ＷＯ９６／０８５１２号に記載されるのと同
等の方法で融合した。その明細書に開示される通り、ＨＳＡをｒｓＦｃγＲＩＩａ
単量体のＮ末端に融合した。同様の方法で、ＨＳＡをｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体の
Ｎ末端に融合した。
【００９８】
さまざまな融合ポリペプチドまたはタンパク質をコードするポリヌクレオチドを
、ｐＡＰＥＸ３Ｐ−ｘＤＥＳＴへ、標準クローニング法を用いて、動作可能に挿入
した。
【００９９】
ｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体およびｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体融合物の精製
ｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体および二量体融合発現ベクターを、標準的方法を用い
て、ＣＨＯＰ細胞に一過性トランスフェクションし、および２９３Ｅ細胞に安定ト
ランスフェクションした。一過性トランスフェクションされたＣＨＯＰ細胞上清を
、抗ＦｃγＲＩＩａ抗体８．２を用いて免疫沈降し（パウエル（Ｐｏｗｅｌｌ）他
，１９９９）、および免疫沈降物を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％）に供した。
ウェスタンブロット分析を次いで標準的方法を用いて、およびウサギ抗ＦｃγＲＩ
Ｉａ抗体（マクスウェル（Ｍａｘｗｅｌｌ）他，１９９９）を一次抗体としておよ
び抗ウサギＩｇ−ＨＲＰを二次抗体として用いて実施した。
【０１００】
トランスフェクションされたＣＨＯＰ細胞上清中のｒｓＦｃγＲＩＩａ融合物の
検出のためのＨＡＧＧ捕捉ＥＬＩＳＡ
ＨＡＧＧ捕捉ＥＬＩＳＡを、ｒｓＦｃγＲＩＩａ融合物のＦｃ結合活性を測定す
るために実施した。ｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体融合物の結合活性を測定するために
、既知のＦｃγＲＩＩａ単量体標準（パウエル（Ｐｏｗｅｌｌ）他，１９９９）（
０．７５μｇにて開始）およびｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体トランスフェクション細
胞に由来するタンパク質（トランスフェクション４２６）を、滴定し、および、Ｉ
ｇＧ−Ｆｃγ１とのｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体融合物（Ｌ２３４Ａ，Ｌ２３５Ａ）
（単量体−Ｆｃ）をトランスフェクションした細胞由来のタンパク質の結合と比較
し、およびＨＳＡとのｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体融合物（ＨＳＡ−単量体）をトラ
ンスフェクションした細胞由来のタンパク質の結合と比較した。
【０１０１】
ｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体融合物の結合活性を測定するために、既知のＦｃγＲ
ＩＩａ二量体標準（０．５μｇ／ｍｌにて開始）およびｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体
をトランスフェクションした細胞由来のタンパク質（トランスフェクション４２７
）を、滴定し、および、ＩｇＧ−Ｆｃγ１とのｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体融合物（
Ｌ２３４Ａ，Ｌ２３５Ａ）（二量体−Ｆｃ）をトランスフェクションした細胞由来
のタンパク質の結合と比較し、およびＨＳＡとのｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体融合物
（ＨＳＡ−二量体）をトランスフェクションした細胞由来のタンパク質の結合と比
較した。
【０１０２】
トランスフェクションされたＣＨＯＰ細胞上清中のｒｓＦｃγＲＩＩａ融合物の
検出のための捕捉タグＥＬＩＳＡ
標準ＥＬＩＳＡ法を用いて、プレートを抗ＦｃγＲＩＩａ抗体８．２でコーティ
ングした。ｒｓＦｃγＲＩＩａ融合物をウェルに加え、および８．２抗体と接触さ
せた。二次抗体は抗ＦｃγＲＩＩａ抗体８．７−ＨＲＰ（パウエル（Ｐｏｗｅｌｌ
）他，１９９９；イエリノ（Ｉｅｒｉｎｏ）他，１９９３ａ）であり、これは、抗
体８．２とは異なるＦｃγＲＩＩａエピトープに特異的である。
【０１０３】
試験した単量体ｒｓＦｃγＲＩＩａ試料は、既知ｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体（単
量体標準０．７５μｇ／ｍｌにて開始）、ｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体をトランスフ
ェクションした細胞（トランスフェクション４２６）由来の上清、ＩｇＧ−Ｆｃγ
１とのｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体融合物（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）（単量体−Ｆ
ｃ）をトランスフェクションした細胞由来の上清、およびＨＳＡとのｒｓＦｃγＲ
ＩＩａ単量体融合物（ＨＳＡ−単量体）をトランスフェクションした細胞由来の上
清を含んだ。
【０１０４】
試験した二量体ｒｓＦｃγＲＩＩａ試料は、既知ＦｃγＲＩＩａ二量体（二量体
標準０．５μｇ／ｍｌにて開始）、ｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体をトランスフェクシ
ョンした細胞（トランスフェクション４２７）由来の上清、ＩｇＧ−Ｆｃγ１との
ｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体融合物（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）（単量体−Ｆｃ）を
トランスフェクションした細胞由来の上清、およびＨＳＡとのｒｓＦｃγＲＩＩａ
二量体融合物（ＨＳＡ−単量体）をトランスフェクションした細胞由来の上清を含
んだ。
【０１０５】
結果
ｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体および二量体融合物の発現
精製ｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体およびｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体の活性に基づき
、ｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体−ＩｇＧ−Ｆｃγ１（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）融合
物は、ｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体−ＩｇＧ−Ｆｃγ１（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）
融合物（２９３Ｅ細胞中で約４μｇ／ｍｌ）よりも高いレベル（２９３Ｅ細胞中で
約１２μｇ／ｍｌ）で分泌された。
【０１０６】
図１４に示す通り、ウェスタンブロット分析は、融合タンパク質が上清中に予想
分子量サイズに存在したこと、およびそれらは識別可能なタンパク質として産生に
成功し、分解産物の証拠が無かったことを示した。
【０１０７】
トランスフェクションされたＣＨＯＰ細胞上清中のｒｓＦｃγＲＩＩａ融合物の
検出のためのＨＡＧＧ捕捉ＥＬＩＳＡ
図１５（ａ）に示す通り、ＩｇＧ−Ｆｃγ１とのｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体融合
物（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）（単量体−Ｆｃ）はアッセイで検出可能に結合し、
一方ＨＳＡとのｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体融合物（ＨＳＡ−単量体）は結合が不十
分であったことが観察された。この結果は、ＩｇＧ−Ｆｃγ１とのｒｓＦｃγＲＩ
Ｉａ単量体融合物（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）は融合Ｆｃドメインの重鎖間の二量
体化の結果として（Ｆｃ結合領域の）二量体になり、一方ＨＳＡとのｒｓＦｃγＲ
ＩＩａ単量体融合物はＦｃ結合領域について単量体のままである事実によって説明
されうる。
【０１０８】
図１５（ｂ）に示す通り、精製されたＩｇＧ−Ｆｃγ１とのｒｓＦｃγＲＩＩａ
二量体融合物（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）（二量体−Ｆｃ）は二量体標準と同様の
結合活性を示し、およびＨＳＡとのｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体融合物（ＨＳＡ−単
量体）は、検出可能な、しかしより低い、結合活性を有した。この場合、ＩｇＧ−
Ｆｃγ１とのｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体融合物（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）は、融
合Ｆｃドメインの重鎖間の二量体化のため、Ｆｃ結合領域について四量体（または
「四価」）であった一方、ＨＳＡとのｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体融合物はＦｃ結合
領域について二量体のままである。
【０１０９】
トランスフェクションされたＣＨＯＰ細胞上清中のｒｓＦｃγＲＩＩａ融合物の
検出のための捕捉タグＥＬＩＳＡ
図１６（ａ）に示す通り、ＩｇＧ−Ｆｃγ１とのｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体融合
物（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）およびＨＳＡとのｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体融合物
は両方とも、このアッセイで捕捉されおよび検出可能である。図１６（ｂ）に示す
通り、ＩｇＧ−Ｆｃγ１とのｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体融合物（Ｌ２３４Ａ，Ｌ２
３５Ａ）およびＨＳＡとのｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体融合物もまた両方とも、この
アッセイで捕捉されおよび検出可能である。明らかに、これらの受容体を捕捉する
のに用いられた８．２エピトープおよび捕捉された受容体を検出するのに用いられ
た８．７エピトープの両方が未変化であり、融合物の正しい折りたたみを示す。
【０１１０】
考察
ｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体およびｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体融合コンストラクト
をベクターｐ−ＡＰＥＸ３Ｐ−ｘＤＳＴから発現し、およびＣＨＯＰ細胞で一過性
に、および２９３Ｅ細胞で安定に発現した。発現された融合物は、ウェスタンブロ
ット上で明瞭なタンパク質として現れ、分解産物の証拠は無かった。
【０１１１】
ＩｇＧ−Ｆｃγ１とのｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体融合物（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５
Ａ）は、対応する単量体よりも低い発現レベルを示しうる。しかし、ＨＳＡとのｒ
ｓＦｃγＲＩＩａ二量体融合物の発現レベルは、ウェスタンブロットによって測定
された通りＨＳＡとのｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体融合物の発現レベルとほぼ同等で
あり（図１４）、およびしたがってｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体の大スケール生産の
手段として相当な有望性を示す。興味あることに、ｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体融合
物は、対応する単量体よりも高いＨＡＧＧおよび抗ＦｃγＲＩＩａ抗体８．２結合
活性を示した。上述の通り、これはｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体融合物がＦｃ結合領
域について二量体または四量体（ＩｇＧ−Ｆｃγ１とのｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体
融合物（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）の場合）であって、および結果として、この多
価性のためにより高い見かけの結合親和性（結合活性）を有した事実によって説明
されうる。四量体分子は免疫複合体と、結合が実質的に不可逆的となる高い親和性
で結合し得ると予想される。
【実施例４】
【０１１２】
ＩｇＧ２ａに由来するＦｃドメインを含むｒｓＦｃγＲＩＩａ融合ポリペプチド
の設計および発現
この実施例では、ｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体融合タンパク質を、修飾マウスＩｇ
Ｇ２ａＦｃドメインを融合パートナーとして用いて調製した。該二量体融合タンパ
ク質をＤ２と表した。このタンパク質の活性を、融合パートナーを欠くｒｓＦｃγ
ＲＩＩａ二量体（実施例１および２に記載される通り）と比較し、および融合パー
トナーが該修飾マウスＩｇＧ２ａＦｃドメインであるｒｓＦｃγＲＩＩａ単量体融
合タンパク質と比較した。
【０１１３】
組み換え可溶性Ｄ２ＦｃγＲＩＩａＦｃ（Ｄ２）タンパク質の設計
Ｄ２タンパク質の翻訳されたアミノ酸配列（配列番号：８）およびヌクレオチド
配列（配列番号：９）をそれぞれ図１９および２０に示す。Ｄ２タンパク質は、天
然ＦｃγＲＩＩａシグナル配列（アミノ酸１−３１）、ＦｃγＲＩＩａタンパク質
の細胞外ドメイン（アミノ酸３２−２０５）、ＦｃγＲＩＩａ膜隣接柄部に相当す
る短いリンカーに加えて追加のバリン残基（残基２０６−２１４）、第２のＦｃγ
ＲＩＩａタンパク質（残基２１５−３８５）、膜隣接柄部リンカーの１反復（残基
３８６−３９３）およびマウスＩｇＧ２ａＦｃドメイン（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３
）領域（残基３９４−６２５）から成るポリペプチドの二量体を含む。ＩｇＧ２ａ
Ｆｃドメインは下記の４つの変異を含み、それらはＦｃ受容体結合および補体結合
を低減するために導入された：Ｌｅｕ−４１３からＧｌｕへ（ＥＵナンバリング系
で２３５位に相当），Ｇｌｕ−４９６からＡｌａへ（ＥＵ３１８位に相当），Ｌｙ
ｓ−４９８からＡｌａへ（ＥＵ３２０位に相当）およびＬｙｓ−５００からＡｌａ
へ（ＥＵ３２２位に相当）。
【０１１４】
Ｄ２発現ベクターの構築
ヒトＦｃγＲＩＩａのシグナルペプチドおよび細胞外ドメインをコードするｃＤ
ＮＡを、以前に構築されたプラスミド（ＦｃγＲＩＩａ−ｄ／ｐＡＰＥＸ−ｄｅｓ
ｔ）をテンプレートとしておよび表１に示すプライマー１および４を用いてＰＣＲ
によって増幅した。変異マウスＩｇＧ２ａＦｃ領域を、以前に構築されたプラスミ
ド（ＣＤ２００ＩｇＧ２ａＦｃ−ｄ）をテンプレートとしておよび表２に示すプラ
イマー２および３を用いてＰＣＲによって増幅した。
【表２】
2010512154.tif 000003
【０１１５】
ＦｃγＲＩＩａおよび修飾マウスＩｇＧ２ａＦｃＰＣＲ産物を次いでオーバーラッピングＰＣＲによって、プライマー１および２を用いて増幅した。増幅は、プラチナＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、０．４ｍＭの各ｄＮＴＰ、２０ｐｍｏｌの各プライマーおよび１００ｎｇのテンプレートＤＮＡを用いることによって下記の条件下で実施した：最初の融解を９４℃にて５分間、その後、９４℃１．５分間、次いで６５℃２分間、次いで７２℃３分間から成る３０サイクル。反応物を次いで７２℃にて１０分間保ち、および４℃へ冷却した。反応産物を０．７％アガロースゲルで電気泳動し、およびエチジウムブロマイドで可視化した。目的のＤＮＡバンドを切り出し、およびキアクイック（ＱＩＡｑｕｉｃｋ）ゲル抽出キット（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ））を用いることによってアガロースゲルから精製した。この精製ＰＣＲ産物をＮｈｅＩおよびＡｇｅＩ制限酵素で消化し、およびキアクイックＰＣＲ精製キット（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ））を用いて精製した。断片を次いでＴ４ＤＮＡリガーゼによって、ＮｈｅＩおよびＡｇｅＩで同様に消化したｐＭＰＧ発現プラスミドへライゲーションした。ライゲーション反応物（５μｌ）を次いで５０μｌのコンピテント大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ５α細胞（インビトロジェン社）へ取扱説明書にしたがって形質転換した。形質転換体を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ寒天プレートに平板播種し、次いで３７℃にて１６時間インキュベートした。プラスミドＤＮＡを小スケール大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物からミニプレップ（ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐ）によって精製し，およびＤＮＡ配列を確認した。結果として生じる発現プラスミドｐＭＰＧ−Ｄ２ＦｃγＲＩＩＡ−ＩｇＧ２ａＦｃの図を図２１に示す。
【０１１６】
Ｄ２を発現するＣＨＯクローンの作製
ｐＭＰＧ−Ｄ２ ＦｃγＲＩＩａ−ＩｇＧ２ａＦｃプラスミドＤＮＡを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の大量培養からプラスミドマキシ（ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ）キット（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ））を用いて単離し、ＸｂａＩによって直鎖化し、およびキアゲンチップを用いて精製した。無血清の化学的に定められた培地で増殖したＣＨＯ−Ｓ細胞を、該直鎖化プラスミドで、リポフェクタミン２０００試薬を用いてトランスフェクションした。４８時間後、細胞を９６ウェルプレートへ異なる濃度で（１００００、５０００、または２０００細胞／ウェル）、６００μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢ含有培地へ移した。薬剤耐性オリゴクローンを、ＥＬＩＳＡによって下記の通りスクリーニングした：９６ウェルプレートを１００μｌのヤギ抗マウスＩｇＧＦｃ（シグマ社（Ｓｉｇｍａ））でコーティングし、および一夜４℃にてインキュベートした。ウェルを洗浄し、および２００μｌの２％ＢＳＡを含むＰＢＳＴで室温にて１時間ブロッキングした。洗浄後、試料１００μｌを１％ＢＳＡ含有ＰＢＳＴで希釈し、ウェルに加え、１時間インキュベートし、洗浄しおよび次いでＨＲＰ複合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ特異的）（シグマ社）と１時間室温にてインキュベートした。ウェルを洗浄し、およびＴＭＢ基質を添加しおよび３から５分間室温にてインキュベートした。吸光度を４５０ｎｍにて測定し、および既知量の精製マウスＩｇＧまたはＤ２ＦｃγＲＩＩａ−ＩｇＧ２ａＦｃを用いて標準曲線を作成した。上清試料もまたＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングによって分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥについて、試料を、２−ＭＥを含むかまたは含まない試料緩衝液に再懸濁し、および９５℃にて１０分間加熱し、および氷上で冷却した。試料を次いで８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離した。ゲルを次いでクマシーブルー（ＣｏｏｍａｓｓｉｅＢｌｕｅ）で取扱説明書にしたがって染色した。ウェスタンブロッティングについては、上記の通り試料を調製しおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、および次いでイムノブロット（ＩｍｍｕｎｏＢｌｏｔ）ＰＶＤＦ膜（バイオラッド社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））に１時間１００Ｖにて移した。膜を１時間５％スキムミルクを含むＰＢＳ／０．１％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０でブロックし、および０．２(ｇ／ｍｌヤギ抗ヒトＦｃγＲＩＩａ抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ社（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ））と共に１時間、およびＨＲＰ複合体化ウサギ抗ヤギＩｇＧ（シグマ社の完全分子）と共に１時間インキュベートし，次いでＴＭＢ基質（ベクター・ラボラトリーズ社（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ）を用いて発色した。２回目の限界希釈をより低い別の濃度（０．２５，および０．５細胞／ウェル）にて６００μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢを含む培地で実施した。２から３週間後、薬剤耐性クローンを再び組み換えタンパク質産生についてＥＬＩＳＡによって評価し、およびウェスタンブロットによって試験した。
【０１１７】
Ｄ２タンパク質の精製
ＣＨＯ形質転換体を振とうフラスコで３７℃にて増殖させた。細胞が密度１．５から２ｘ１０6細胞／ｍｌに達した際、３０℃にて７から１０日間連続かくはんしながらインキュベートした。上清を回収し、３０００ｘｇで３０分間４℃にて遠心分離し、および一連の異なるオートクレーブ処理メンブレンフィルター孔径（５．０から０．２μｍ）を通してろ過した。バイオマックス（ＢｉｏＭａｘ）１０メンブレンを用いたタンジェンシャルフローろ過（ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））を用いて上清を濃縮しおよび２０ｍＭ Ｎａ−Ｐ／１４８ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．８への緩衝液交換を実施した。材料を次いで結合緩衝液（２０ｍＭ Ｎａ−Ｐ＆３Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．８）で９倍希釈し、およびプロテインＡカラム（ＧＥヘルスケア社（ＧＥ Ｈｅａｔｈｃａｒｅ））に４ｍｌ／分間一夜４℃にて負荷した。カラムを結合緩衝液（２０容５ｍｌ／分にて）で洗浄し、およびタンパク質を０．１Ｍクエン酸ｐＨ４．０で２ｍｌ／分にて溶出した。溶出した材料を中性へｐＨ調整し、および４Ｌの１０ｍＭ Ｎａ−Ｐ、ｐＨ６．０に対して４℃にて一夜透析した。それを次いでマクロプレップ４０μｍセラミックヒドロキシアパタイトＩＩ型（ＣＨＴＩＩ）カラム（バイオラッド社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））に負荷した。カラムを結合緩衝液で洗浄後、タンパク質を１０ｍＭ Ｎａ−Ｐ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０で溶出した（全操作を流速５ｍｌ／分にて。溶出した材料を次いで３Ｘ４ＬのＰＢＳ、ｐＨ７．４に対して４℃にて透析した。タンパク質濃度を２８０ｎＭでの吸収によって測定した（吸光係数１．３４）。図２２Ａは最終精製材料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ウェスタンブロット分析を図２２Ｂに示す。
【０１１８】
Ｄ２タンパク質は免疫複合体誘導ＭＣ／９肥満細胞活性化をブロックする
Ｄ２タンパク質をＦｃγ受容体の免疫複合体媒介性活性化をブロックする能力についてＭＣ／９肥満細胞アッセイで試験した。ＭＣ／９は、免疫複合体への曝露後に活性化されおよびＴＮＦ−αを放出するＦｃγＲ陽性マウス肥満細胞株である。オボアルブミン−抗オボアルブミン抗体の免疫複合体（ＯＶＡ ＩＣ）１０(ｇを精製Ｄ２と１時間室温にてインキュベートした。ＯＶＡ ＩＣをまた精製ＢＩＦ（実施例１および２に記載の通りＦｃタグを欠くＤ２の変異体）および精製Ｍ２タンパク質（修飾ＩｇＧ２ａＦｃドメインと融合したＦｃγＲＩＩａサブユニットを１個だけ含むＤ２の変異体）とインキュベートした。混合物を次いで、２ｘ１０5ＭＣ／９細胞の入った９６ウェルプレートへ加え、および一夜３７℃にてインキュベートした。上清を回収し、およびＴＮＦ−αの量を市販のＥＬＩＳＡキットによって測定した。結果を図２３に示し、ここで処理の非存在下で放出されたＴＮＦ−αの量を１００％と定めている。Ｄ２およびＭ２タンパク質およびｒｓＦｃγＲＩＩａ二量体ポリペプチドはＯＶＡ ＩＣ媒介性活性化を完全に抑制する。Ｄ２タンパク質は、しかし、非Ｆｃタグ化二量体よりも３倍強力であり、およびＦｃタグ化単量体（Ｍ２）よりも１２倍強力である。
【０１１９】
Ｄ２タンパク質はＦｃγＲの免疫複合体媒介活性化を好中球活性化アッセイにおいてブロックする
Ｄ２タンパク質をまた、Ｆｃγ受容体の免疫複合体媒介性活性化をブロックする能力について好中球活性化アッセイで試験した。休止ヒト好中球はＦｃγＲＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩｂの両方を発現し、および免疫複合体による活性化に際してＬ−セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）の細胞表面発現を速やかに失う。ＯＶＡ ＩＣ（１００μｇ／ｍｌ）を単独で、または精製Ｄ２、Ｍ２またはＢＩＦの滴定された量と１時間氷上でインキュベートした。混合物を次いで、デキストラン沈降およびフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）密度勾配遠心分離によって末梢血から精製されたヒト好中球２ｘ１０5／ウェルの入った９６ウェルプレートへ加えた。プレートを３７℃にて１５分間インキュベートし、および反応を等容の氷冷緩衝液の添加によって停止し、続いて氷上で５分間インキュベートした。好中球細胞表面上のＣＤ６２Ｌのレベルをフローサイトメトリーによって測定した。結果を図２４に示し、ここでＯＶＡ ＩＣ単独の存在下でＣＤ６２Ｌを発現している細胞の割合を１００％パーセント活性化と定め、およびＣＤ６２Ｌを発現している未処理細胞のパーセントを０％活性化と定めている。ＢＩＦおよびＭ２タンパク質は同様の抑制活性を示した。Ｄ２タンパク質は、しかし、約６倍強力である。
【０１２０】
Ｄ２タンパク質はＦｃγＲの免疫複合体媒性活性化を血小板活性化アッセイにおいてブロックする
さらに、Ｄ２タンパク質を、Ｆｃγ受容体の免疫複合体媒介性活性化をブロックする能力について血小板活性化アッセイで試験した。典型的な免疫複合体の熱凝集ＩｇＧ（ＨＡＧＧ）への血小板の曝露は、ＦｃγＲＩＩａを介する活性化を結果として生じ、Ｐ−セレクチン（ＣＤ６２Ｐ）のアップレギュレーションに繋がる。熱凝集ＩｇＧ（ＨＡＧＧ）をさまざまな濃度のＤ２タンパク質（またはＭ２またはＢＩＦ）と１時間４℃にてインキュベートした。混合物を次いで、予め洗浄しおよび１ｍＭ ＥＤＴＡ添加タイロード／ヘペス（Ｔｙｒｏｄｅｓ／Ｈｅｐｅｓ）緩衝液に再懸濁したヒト血小板３ｘ１０7個の入った９６ウェルプレートへ加えた。３０分間室温にてインキュベート後、細胞を洗浄し、固定し、およびＣＤ６２ＰおよびＧＰＩＩｂ（ＣＤ４１）発現について標準法によって染色し、およびＦＡＣＳスキャンフローサイトメーターで分析した。活性化アッセイの結果を図２５に示す。ＨＡＧＧ単独での処理後の活性化血小板（ＣＤ４１およびＣＤ６２Ｐの両方について陽性）の割合を１００％と定めた。ＢＩＦおよびＭ２タンパク質は同様の抑制活性を示した。Ｄ２タンパク質は、しかし、約３倍強力である。
【０１２１】
考察
Ｄ２タンパク質は、Ｆｃ受容体結合および補体固定を低減するためにアミノ酸４個で変異しているマウスＩｇＧ２ａＦｃドメインと融合したＦｃγＲＩＩａタンパク質の２個のヘッドトゥーテールの細胞外ドメインを含む。Ｄ２タンパク質はＭＣ／９肥満細胞の免疫複合体媒介活性化を効果的にブロックし、および好中球活性化アッセイおよび血小板活性化アッセイの両方においてＦｃγＲの免疫複合体媒介活性化を効果的にブロックした。そのようなＦｃ結合二量体融合タンパク質はしたがって、ｉｎ ｖｉｖｏで免疫複合体媒介性疾患の有効なインヒビターでありうる。
【実施例５】
【０１２２】
ヘテロ二量体Ｆｃ受容体ポリペプチドの設計および発現
材料および方法
ＦｃγＲＩＩａ−ＦｃγＲＩＩＩヘテロ二量体発現ベクターの構築
ＦｃγＲＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩのＦｃ結合領域は、ｃＤＮＡテンプレートから、実施例１に記載される適当なプライマーを用いて、独立してＰＣＲ増幅されうる。増幅される領域は、外部ドメイン１および外部ドメイン２リンカー（すなわちＤ１／Ｄ２結合部）の残基、およびＢＣ、Ｃ'ＥおよびＦＧループといった、Ｆｃ結合領域の既知の特徴的残基およびモチーフを包含する。これらのＦｃ結合領域についてポリヌクレオチド配列は当業者によく知られている。
【０１２３】
平滑末端ＰＣＲ産物は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、ベクターｐＰＩＣ９（インビトロジェン・ライフテクノロジーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））へ、ＤＮＡポリメラーゼのクレノー（Ｋｌｅｎｏｗ）断片で埋めたＥｃｏＲＩ部位にてライゲーションされうる。動作可能に融合されたＦｃγＲＩＩａ−ＦｃγＲＩＩＩヘテロ二量体ポリヌクレオチドは、実施例１に記載されたのと同様のＰＣＲおよびクローニング法を用いて、これらの増幅産物から作製されうる。挿入サイズおよび方向は、分析的制限酵素消化またはＤＮＡ配列決定によって確認されうる。
【０１２４】
動作可能に融合されたＦｃγＲＩＩａ−ＦｃγＲＩＩＩヘテロ二量体ポリヌクレオチドは、さまざまな発現ベクターへクローニングされうる。たとえば、ＦｃγＲＩＩａ−ＦｃγＲＩＩＩヘテロ二量体ポリヌクレオチドは、複数クローニング部位のＢａｍＨＩ部位がまずＢａｍＨＩでの消化によって除去されＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー（Ｋｌｅｎｏｗ）断片および再ライゲーションを用いて埋めた修飾ｐＢＡＣＰＡＫ９（インビトロジェン・ライフテク（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ））のＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ部位へライゲーションされうる。挿入サイズはＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ消化によって定められ、および多量体化ＢａｍＨＩ断片の正しい方向はＰｖｕＩＩ消化によって標準手順を用いてスクリーニングされうる。
【０１２５】
代替的に、ＦｃγＲＩＩａ−ＦｃγＲＩＩＩヘテロ二量体ポリヌクレオチドは、哺乳類発現ベクターへクローニングされうる。たとえば、ゲートウェイ（Ｇａｔｅｗａｙ）ＬＲクロナーゼ反応（インビトロジェン・ライフテクノロジーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を用いて、任意に融合された多量体Ｆｃ受容体ポリヌクレオチド断片を、ゲートウェイ（商標）・リーディングフレームＡカセット（インビトロジェン・ライフテクノロジーズ）を適用した発現ベクターｐＡＰＥＸ３Ｐ（エバンズ（Ｅｖａｎｓ）他，１９９５，およびクリスチャンセン（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ）他，１９９６）へ導入して、融合Ｆｃ受容体多量体を発現する哺乳類発現ベクターを与えることができる。同様に、ゲートウェイＬＲクロナーゼ反応を、任意に融合された多量体Ｆｃ受容体ポリヌクレオチド断片を、ゲートウェイ・リーディングフレームＡカセット（インビトロジェン・ライフテクノロジーズ）を適用した発現ベクターｐＩＲＥＳｎｅｏ（クローンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））へ導入するのに用いることができる。
【０１２６】
考察
Ｆｃ結合領域の多量体化は、Ｆｃドメインとのより高い結合活性相互作用を有する分子を生じる。多量体中の各単量体は、免疫グロブリンのＦｃドメインと別々に相互作用でき、より高い結合活性を生じる。異なるＦｃ受容体に由来するＦｃ結合ドメインを含む多量体が作製されうる。たとえば、ＦｃγＲＩ、ＦｇγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂ、Ｆｃ(ＲＩおよびＦｃ(ＲＩのＦｃ結合領域の組み合わせから多量体が形成されうる。ヘテロ二量体もまた、これらのＦｃ結合領域の組み合わせから形成されうる。たとえば、ＦｃγＲＩＩａ−ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃγＲＩＩａ−ＦｃγＲＩ、およびＦｃγＲＩ−ＦｃγＲＩＩＩヘテロ二量体、およびＦｃ結合領域の他の組み合わせから成るヘテロ二量体が形成されうる。
【０１２７】
いくつかのＦｃ受容体のＦｃ結合ドメインが突然変異誘発または結晶学によって定められている（ＩｇＧおよびＦｃγＲ：マクスウェル（Ｍａｘｗｅｌｌ）他１９９９，ラダエフ（Ｒａｄａｅｖ）他，２００１，ゾンダーマン（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ）他，２０００，ヒューレット（Ｈｕｌｅｔｔ）他，１９８８，ヒューレット他，１９９１，ヒューレット他，１９９４，ヒューレット他，１９９５；ＩｇＥおよびＦｃ(ＲＩ：ガーマン（Ｇａｒｍａｎ）他，２０００；ＩｇＡおよびＦｃαＲＩ相互作用：ワインズ（Ｗｉｎｅｓ）他，２００１，ハー（Ｈｅｒｒ）他，２００３）。さらに、類似ＦｃＲ配列の比較およびＦｃ受容体構造の比較分析が実施されている（ゾンダーマン（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ）他，２００１）。これらの分析は、異なるＦｃ受容体の、関連する明瞭に定められたセグメントは、それらのリガンドと相互作用できることを示す。さらに、結晶分析は、これをＦｃγＲＩＩａおよびＩｇＧ相互作用について国際特許明細書第ＷＯ２００６／１３３４８６号において、ＦｃγＲＩＩＩおよびＩｇＧの結晶分析と比較して実証している（ラダエフ（Ｒａｄａｅｖ）他２００１、ゾンダーマン（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎ）他、２００１）。
【０１２８】
明らかに、これらのデータは、他のＦｃ受容体の突然変異誘発実験と合わせて、これらの関連するＦｃ受容体の外部ドメイン１および外部ドメイン２の間の連結領域に由来するセグメント、および別の受容体の第２のドメインのＢＣ、Ｃ'ＥおよびＦＧループに由来するセグメントは、それらのそれぞれのリガンドと相互作用することを示す。他のポリペプチドへのそのようなＦｃ結合領域の組み込みは、新しいポリペプチドにその免疫グロブリン型に対する特異性を与えることができる。この目的のために、ヒューレット（Ｈｕｌｅｔｔ）他，１９９１，ヒューレット他，１９９５，およびマクスウェル（Ｍａｘｗｅｌｌ）他，１９９９は、そうでなければＩｇＧを結合できないタンパク質へのＩｇＧ結合領域の付加は、ＩｇＧに対する特異性を獲得したことを実証している。同様に、国際特許明細書第ＷＯ９６／０８５１２号に以前に記載された通り、ＩｇＥを結合できないタンパク質への一連のＩｇＥ結合配列の挿入は、ＩｇＥ特異性を有するタンパク質キメラを結果として生じたことが観察されている。したがって、同様の方法で、ＦｃγＲＩまたはＦｃγＲＩＩＩ由来の、ＩｇＧと相互作用するＦｃ結合領域の、ポリペプチドまたはタンパク質への包含は、ＩｇＧ結合機能をそのポリペプチドまたはタンパク質に与えることができ、または同様に、ＣＤ８９またはＦｃαＲＩ由来の、ＩｇＡと相互作用するＦｃ結合領域の、ポリペプチドまたはタンパク質への包含は、ＩｇＡ結合機能をそのポリペプチドまたはタンパク質に与えることができることが予測される。そのような配列は、ＩｇＡと相互作用することが知られているＣＤ８９のＦｃαＲＩの第１の細胞外ドメインのループを含むことができ、そのようなループはドメイン１のＢＣ、Ｃ'ＥおよびＦＧループを含む。重要な残基は、アミノ酸３５、５２および８１−８６を含む（ワインズ（Ｗｉｎｅｓ）他，２００１，ハー（Ｈｅｒｒ）他，２００３）。この方法で、免疫グロブリンの異なるクラスと相互作用する能力のあるセグメントを含む受容体ポリペプチドおよびタンパク質が可能である。
【０１２９】
本明細書を介して、「含む」の語、または三人称または現在分詞といった変形は表示された１つの要素、整数または段階、または要素、整数または段階の群の包含を意味するが、しかし任意の他の１つの要素、整数または段階、または要素、整数または段階の群の除外を意味しないと理解される。
【０１３０】
本明細書で言及されるすべての文献は参照により本開示に含まれる。本明細書に含まれている文書、法令、材料、器具、品目などの任意の考察は本発明のコンテクストを提供する目的のためだけである。これらの事柄のいずれかまたはすべてが先行技術基礎の一部をなすかまたは、オーストラリアまたは別の場所で本出願の各請求項の優先日以前に存在した本発明に関連する分野の一般常識であったことの承認とは取られない。
【０１３１】
具体的な実施形態に示される通り、幅広く記載された本発明の概念または範囲を離れることなく多数の変形および／または修飾が本発明に実施されうることを当業者は理解する。本実施形態は、したがって、すべての面で例証と考えられおよび限定的でないと考えられる。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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