(57)【要約】安定化トロンビン組成物、その調製方法、およびそれらを具備するキットが開示される。組成物は、トロンビン、静菌的に効果的な量のベンジルアルコールまたはクロロブタノール、および０．１０％〜５．０％（ｗ／ｖ）のスクロースを水溶液中に含む。組成物は２℃〜８℃で保存されると４週間またはそれ以上の間安定している。本発明において使用するトロンビンは、ヒトトロンビン、組み換えヒトトロンビン、およびウシトロンビンを含むがこれらに限定されるものではない。【特許請求の範囲】
【請求項１】
トロンビンと、
ベンジルアルコールおよびクロロブタノールからなる群から選択された静菌的に効果的な量の防腐剤と、
０．１０％〜５．０％（ｗ／ｖ）のスクロースと
を水溶液中に含む医薬組成物。
【請求項２】
緩衝液、塩、ポリオール、界面活性剤、アミノ酸、または追加の炭水化物の１つまたはそれ以上をさらに含む請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記防腐剤がベンジルアルコールである請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ベンジルアルコールが０．８％〜１．５％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
マンニトールをさらに含む請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記マンニトールおよびスクロースが、マンニトール：スクロースの割合が１：１を超えるが２．５：１以下（ｗ／ｗ）で存在する請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記トロンビンがヒトトロンビンである請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記ヒトトロンビンが組み換えヒトトロンビンである請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記トロンビンがウシトロンビンである請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
トロンビンと、
薬学的に許容される緩衝液と、
０．１０％〜５％（ｗ／ｖ）のスクロースと、
濃度０．８％〜１．５％（ｖ／ｖ）のベンジルアルコールまたは濃度０．４％〜０．６％（ｗ／ｖ）のクロロブタノールからなる群から選択された防腐剤と、
をｐＨ５．７〜７．４の水溶液中に含む組成物。
【請求項１１】
前記防腐剤がベンジルアルコールである請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ベンジルアルコールの濃度が０．８％〜１．０％（ｖ／ｖ）である請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記スクロースの濃度が０．５％〜３．０％（ｗ／ｖ）である請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
前記スクロースの濃度が約１％（ｗ／ｖ）である請求項１０に記載の組成物。
【請求項１５】
前記緩衝液が、ヒスチジン緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、コハク酸緩衝液、および酢酸緩衝液からなる群から選択された請求項１０に記載の組成物。
【請求項１６】
マンニトールをさらに含む請求項１０に記載の組成物。
【請求項１７】
前記マンニトールおよびスクロースが、マンニトール：スクロースの割合が１：１を超えるが２．５：１以下（ｗ／ｗ）で存在する請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記希釈液が塩化ナトリウムを含む請求項１０に記載の組成物。
【請求項１９】
前記トロンビンがヒトトロンビンである請求項１０に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ヒトトロンビンが組み換えヒトトロンビンである請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記トロンビンがウシトロンビンである請求項１０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記トロンビンが０．１ｍｇ／ｍＬ〜５．０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する請求項１０に記載の組成物。
【請求項２３】
前記トロンビンが０．３ｍｇ／ｍＬ〜３．０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
ｐＨ５．７〜７．４の水溶液中で、
０．０３ｍｇ／ｍＬ〜１．６ｍｇ／ｍＬのトロンビンと、
０．１７％〜１．３％（ｗ／ｖ）のスクロースと、
１．１％〜１．６％（ｗ／ｖ）のマンニトールと、
０．８％〜２．０％（ｗ／ｖ）のＮａＣｌと、
０〜１．６ｍＭのＣａＣｌ２と、
０．００１％〜０．３２％（ｗ／ｖ）の界面活性剤または高分子量ポリエチレングリコールと、
薬学的に許容される緩衝液と、
ベンジルアルコールおよびクロロブタノールからなる群から選択された静菌的に効果的な量の防腐剤と、
から実質的になる水溶性の組成物であって、
前記緩衝液の濃度が外科手術の状況で前記組成物を利用するときにほぼ生理的ｐＨになるように選択され、前記マンニトール：スクロースの割合が１：１を超えるが２．５：１以下（ｗ／ｗ）である水溶性の組成物。
【請求項２５】
前記マンニトール対スクロースの割合が１．３３：１（ｗ／ｗ）である請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記スクロース：トロンビンのモル比が少なくとも７００：１である請求項２４に記載の組成物。
【請求項２７】
前記スクロース：トロンビンのモル比が少なくとも２０００：１である請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記防腐剤が濃度０．８％〜１．５％（ｖ／ｖ）のベンジルアルコールである請求項２４に記載の組成物。
【請求項２９】
トロンビンと、ベンジルアルコールおよびクロロブタノールからなる群から選択された静菌的に効果的な量の防腐剤の存在下で前記タンパク質を安定化させるのに十分な量のスクロースとを含む凍結乾燥した組成物を提供するステップと、
静菌的に効果的な量のベンジルアルコールまたはクロロブタノールを水中に含む希釈液を提供するステップと、
前記凍結乾燥した組成物と前記希釈液とを混合して溶液を作るステップであって、溶液中のスクロースの濃度が０．１０％〜５．０％（ｗ／ｖ）であるステップと、
を含む、安定化したトロンビン溶液を調製するための方法。
【請求項３０】
前記凍結乾燥した組成物が緩衝液、塩、またはポリオールをさらに含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
トロンビンと、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤とを含む凍結乾燥した組成物を提供するステップと、
前記凍結乾燥した組成物を希釈液の中で再構成して薬学的に許容されるトロンビン溶液を提供するステップであって、前記希釈液は前記溶液中でベンジルアルコールの濃度を０．８％〜１．５％（ｖ／ｖ）にし、スクロースの濃度を０．１０％〜５％（ｗ／ｖ）にするように選択されるステップと、
を含む、安定化したトロンビン溶液を調製するための方法。
【請求項３２】
前記溶液がマンニトールをさらに含む請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記マンニトールおよびスクロースが前記溶液中にマンニトール：スクロースの割合が１：１を超えるが２．５：１以下（ｗ／ｗ）で存在する請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
第１密閉容器に入った、静菌的に効果的な量のベンジルアルコールまたはクロロブタノールを水中に含む薬学的に許容される希釈液と、
第２密閉容器に入ったトロンビンおよびある量のスクロースを含む凍結乾燥した組成物であって、前記スクロースの量は、前記凍結乾燥した組成物を前記希釈液で再構成するときにスクロースの濃度が０．１０％〜５．０％（ｗ／ｖ）になるように選択される、凍結乾燥した組成物と
を具備するキット。
【請求項３５】
前記希釈液がＮａＣｌをさらに含む請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
前記希釈液が静菌性の食塩水である請求項３５に記載のキット。
【請求項３７】
前記希釈液を前記第１密閉容器から前記第２密閉容器に移動するための手段をさらに具備する請求項３４に記載のキット。
【請求項３８】
説明書をさらに具備する請求項３４に記載のキット。
【請求項３９】
塗布用デバイスをさらに具備する請求項３４に記載のキット。
【請求項４０】
前記塗布用デバイスがシリンジまたは噴霧器である請求項３９に記載のキット。
【請求項４１】
前記第１密閉容器および前記第２密閉容器が第３容器に梱包されている請求項３４に記載のキット。
【請求項４２】
トロンビンを、これを必要とするほ乳類に投与する方法であり、
ベンジルアルコールおよびクロロブタノールからなる群から選択された静菌的に効果的な量の防腐剤を含む薬学的に許容される希釈液を提供するステップと、
トロンビンおよびある量のスクロースを含む凍結乾燥した組成物を提供するステップと、
前記凍結乾燥した組成物を前記希釈液で再構成して溶液を作るステップと、
前記溶液を前記ほ乳類に適用するステップと、
を含む方法であって、
前記凍結乾燥した組成物を前記希釈液で再構成するときにスクロースの濃度が０．１０％〜５．０％（ｗ／ｖ）になるように前記スクロースの量が選択される方法。
【請求項４３】
前記希釈液が静菌性の食塩水である請求項４２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
医療用タンパク質製剤には大きな問題がある。タンパク質は三次元構造を持つことに加えて多様な官能基を有する。従って、分解は化学経路（結合生成または開裂を含む変形）および物理経路（変性、凝集、吸着、沈殿）の両方によって進行する。各タンパク質がアミノ酸配列、等電点および他の決定要素の独特な組み合わせを有しているので、溶液の条件の変化に対するタンパク質の反応は予測不可能であり、個別に確認しなければならない。分解の１つの形態の防止を試みると、多くの場合別の形態の分解の速度が増す。
【０００２】
タンパク質の分解は、凍結乾燥によって大幅に低減または回避することができる。しかし凍結乾燥は時間および費用がかかり、もし適切な賦形剤が加えられていなければ、タンパク質に変性および凝集を生じさせる可能性がある。溶液製剤の場合と同様に、凍結乾燥タンパク質の安定化は個別レベルで対処しなければならない。凝集および沈殿を低減することで、精製中および保存中の安定性を保持するために塩化ナトリウムが使用できる。しかし塩化ナトリウムは凍結乾燥製剤においては問題のある賦形剤である。なぜなら、塩化ナトリウムはガラス転移点を下げるので、初期温度を低く設定しサイクル期間を長く取らなければならないからである。Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ、特許文献１は、スクロースと、マンニトールと、塩化ナトリウムと、界面活性剤または高分子量ポリエチレングリコールとを用いてトロンビンを製剤することで、凍結乾燥トロンビン製剤を安定させる方法を開示している。しかし、凍結乾燥状態におけるタンパク質の安定化は、再構成したときの安定性を確保するものではなく、タンパク質溶液は、再構成後すみやかに使用されなければ、廃棄されなければならない場合が多い。加えて凍結乾燥製剤を使用するときの取り扱いは、無菌状態への配慮から多くの場合制限される。なぜなら再構成の間は容器および施栓系の完全性が損なわれるからである。このため、もし製剤が防腐剤の存在下において安定しているなら、使用中の取扱い時間を延ばすことができるかもしれない。
【０００３】
多くの場合タンパク質治療の費用が高いことを考慮すると、こういった溶液中のタンパク質の安定性を高める方法が必要である。トロンビンについて言えば、このタンパク質を安定化するためにさまざまな賦形剤が提案されてきた。たとえば、Ｓｉｌｂｅｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、特許文献２は、溶液中のトロンビンの変性を低減するための低濃度の食塩水およびグリセロールの使用を開示している。Ｎｉｓｈｉｍａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、特許文献３は、安定剤として糖類およびアミノ酸を含むトロンビン水溶液を開示している。
【０００４】
こうした改善があるにも関わらず、液体形態で長期間保存できるトロンビンの調製が当該技術において求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００６／０００２９１８号明細書
【特許文献２】米国特許第４，６９６，８１２号明細書
【特許文献３】米国特許第５，１３０，２４４号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、保存に安定性のあるトロンビンの組成物と関連製造方法と関連キットとを提供することを目的とする。本発明において使用するトロンビンは、ヒトトロンビン、組み換えヒトトロンビン、およびウシトロンビンを含むがこれらに限定されるものではない。
【０００７】
本発明の第１の態様において、水溶液中に、トロンビンと、ベンジルアルコールおよびクロロブタノールからなる群から選択された静菌的に効果的な量の防腐剤と、０．１０％〜５．０％（ｗ／ｖ）のスクロースとを含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、緩衝液、塩、ポリオール、界面活性剤、アミノ酸、または追加の炭水化物から１つまたはそれ以上をさらに含む。別の実施形態では、防腐剤はベンジルアルコールである。関連実施形態では、防腐剤は濃度０．８％〜１．５％、ｖ／ｖのベンジルアルコールである。別の実施形態では、組成物はマンニトールをさらに含む。関連実施形態では、マンニトールおよびスクロースは、マンニトール：スクロースの割合が１：１を超えるが２．５：１以下（ｗ／ｗ）で組成物の中に存在する。
【０００８】
本発明の第２の態様において、ｐＨ５．７〜７．４の水溶液の中に、トロンビンと、薬学的に許容される緩衝液と、０．１０％〜５％（ｗ／ｖ）のスクロースと、濃度０．８％〜１．５％（ｖ／ｖ）のベンジルアルコールまたは濃度０．４％〜０．６％（ｗ／ｖ）のクロロブタノールからなる群から選択された防腐剤とを含む組成物を提供する。１つの実施形態では、防腐剤はベンジルアルコールである。関連実施形態では、防腐剤は濃度０．８％〜１．０％、ｖ／ｖのベンジルアルコールである。他の実施形態では、スクロースの濃度は０．５％〜３．０％（ｗ／ｖ）または約１％（ｗ／ｖ）である。他の実施形態では、緩衝液は、ヒスチジン緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、コハク酸緩衝液および酢酸緩衝液からなる群から選択される。別の実施形態では、組成物はマンニトールをさらに含む。関連実施形態では、マンニトールおよびスクロースはマンニトール：スクロースの割合が１：１を超えるが２．５：１以下（ｗ／ｗ）で組成物の中に存在する。別の実施形態では、希釈液は塩化ナトリウムを含む。さらなる実施形態では、トロンビンは０．１ｍｇ／ｍＬ〜５．０ｍｇ／ｍＬまたは０．３ｍｇ／ｍＬ〜３．０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。
【０００９】
本発明の第３の態様において、ｐＨ５．７〜７．４の水溶液の中に、０．０３ｍｇ／ｍＬ〜１．６ｍｇ／ｍＬのトロンビンと、０．１７％〜１．３％（ｗ／ｖ）のスクロースと、１．１％〜１．６％（ｗ／ｖ）のマンニトールと、０．８％〜２．０％（ｗ／ｖ）のＮａＣｌと、０〜１．６ｍＭのＣａＣｌ２と、０．００１％〜０．３２％（ｗ／ｖ）の界面活性剤または高分子量ポリエチレングリコールと、薬学的に許容される緩衝液と、ベンジルアルコールおよびクロロブタノールからなる群から選択された静菌的に効果的な量の防腐剤とから実質的になる水溶性の組成物を提供する。緩衝液の濃度は外科手術の状況で組成物を利用するときにほぼ生理的ｐＨになるように選択され、マンニトール：スクロースの割合は１：１を超えるが２．５：１以下（ｗ／ｗ）である。１つの実施形態では、マンニトール対スクロースの割合は１．３３：１（ｗ／ｗ）である。他の実施形態では、スクロース対トロンビンのモル比は少なくとも７００：１または少なくとも２０００：１である。別の実施形態では、防腐剤は濃度０．８％〜１．５％（ｖ／ｖ）のベンジルアルコールである。
【００１０】
本発明の第４の態様において、（ａ）トロンビンと、ベンジルアルコールおよびクロロブタノールからなる群から選択された静菌的に効果的な量の防腐剤の存在下でこのタンパク質を安定化させるのに十分な量のスクロースとを含む凍結乾燥した組成物を提供するステップと、（ｂ）水中に静菌的に効果的な量のベンジルアルコールまたはクロロブタノールを含む希釈液を提供するステップと、（ｃ）凍結乾燥した組成物と希釈液とを混合して溶液を作るステップであって、溶液中のスクロースの濃度が０．１０％〜５．０％（ｗ／ｖ）であるステップと、を含む、安定化したトロンビン溶液を調製するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、凍結乾燥した組成物は、緩衝液、塩、またはポリオールをさらに含む。
【００１１】
本発明の第５の態様において、（ａ）トロンビンと、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤とを含む凍結乾燥した組成物を提供するステップと、（ｂ）薬学的に許容されるトロンビン溶液を提供するために凍結乾燥した組成物を希釈液の中で再構成するステップで、希釈液は溶液中でベンジルアルコールの濃度を０．８％〜１．５％（ｖ／ｖ）にし、スクロースの濃度を０．１０％〜５％（ｗ／ｖ）にするように選択されるステップと、を含む、安定化したトロンビン溶液を調製するための方法を提供する。１つの実施形態では、溶液はマンニトールをさらに含む。関連実施形態では、溶液はマンニトールを含み、マンニトールおよびスクロースはマンニトール：スクロースの割合が１：１を超えるが２．５：１以下（ｗ／ｗ）で溶液中に存在する。
【００１２】
本発明の第６の態様において、（ａ）第１密閉容器に入った、静菌的に効果的な量のベンジルアルコールまたはクロロブタノールを水中に含む薬学的に許容される希釈液と、（ｂ）第２密閉容器に入ったトロンビンおよびある量のスクロースを含む凍結乾燥した組成物であって、スクロースの量は、凍結乾燥した組成物を希釈液で再構成するときにスクロースの濃度が０．１０％〜５．０％（ｗ／ｖ）になるように選択される、凍結乾燥した組成物とを具備するキットを提供する。１つの実施形態では、希釈液はＮａＣｌをさらに含む。関連実施形態では、希釈液は静菌性の食塩水である。別の実施形態では、キットは希釈液を第１密閉容器から第２密閉容器に移動するための手段をさらに具備する。さらなる実施形態では、キットは説明書および／または、たとえばシリンジまたは噴霧器のような塗布用デバイスを具備する。さらに追加する実施形態では、第１密閉容器および第２密閉容器は第３容器に梱包される。
【００１３】
本発明の第７の態様において、（ａ）ベンジルアルコールおよびクロロブタノールからなる群から選択された静菌的に効果的な量の防腐剤を含む薬学的に許容される希釈液を提供するステップと、（ｂ）トロンビンおよびある量のスクロースを含む凍結乾燥した組成物を提供するステップと、（ｃ）凍結乾燥した組成物を希釈液で再構成して溶液を作るステップと、（ｄ）溶液をほ乳類に適用するステップと、を有し、凍結乾燥した組成物を希釈液で再構成するときにスクロースの濃度が０．１０％〜５．０％（ｗ／ｖ）になるようにスクロースの量が選択される、トロンビンを必要とするほ乳類にこれを投与する方法を提供する。１つの実施形態において、希釈液は静菌性の食塩水である。
【００１４】
本発明の上記および他の態様は、以下の本発明の説明を参照することで明らかになるであろう。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
「静菌性の食塩水」とは、防腐剤として０．９％のベンジルアルコールを含み、水に溶けた０．９％塩化ナトリウム（生理食塩水）のことである。
【００１６】
「静菌的に効果的な防腐剤の量」とは、米国薬局方（ＵＳＰ）５１の基準による静菌的効果を提供する量であり、治療薬の剤形を、細菌の増殖から、または製造中もしくは製造後に不注意に取り込まれた微生物から保護するのに十分な量である。ベンジルアルコールが静菌効果を提供する標準的な量の範囲は０．９％〜２．０％（ｖ／ｖ）であるが、いくつかの用例では５％までの量が使用されてもよい。クロロブタノールが静菌効果を提供する標準的な量の範囲は０．４％〜０．６％（ｗ／ｖ）である。当業者は、防腐剤の必要な濃度は溶液の構成物によって幾分変わるであろうし、通常の医薬品の賦形剤は静菌作用を増加あるいは減退させる可能性があることを認識しているであろう。いかなる溶液に対しても必要とされる実際の濃度は標準的な試験手順によって決定することができる。
【００１７】
本明細書で用いられている「希釈液」は、治療薬を希釈する、またはより効力のない状態にする溶液を意味する。この用語は、乾燥した（たとえば凍結乾燥した）治療薬を再構成するために使用されるような溶液を含めて用いられる。「薬学的に許容される希釈液」は、薬事規制機関によって認められているＧＲＡＳ（一般的に安全であると認められる：ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ａｓ  ｓａｆｅ）リストに記載されている希釈液を意味する。通常使用される薬学的に許容される希釈液は、米国薬局方滅菌水、米国薬局方生理食塩水、および米国薬局方５％デキストロースを含む。
【００１８】
本明細書で用いられている「トロンビン」は活性型酵素を意味し、□‐トロンビンとしても知られ、プロトロンビン（第ＩＩ因子）のタンパク質分解による切断に由来する。以下に開示するように、トロンビンは、当技術分野で周知のさまざまな方法で調製することができ、「トロンビン」という用語は特定の製造方法を含意するものではない。ヒトトロンビンはジスルフィド結合によって結合した２つのポリペプチド鎖で構成される２９５のアミノ酸からなるタンパク質である。本発明においてはヒトトロンビンおよび非ヒト（たとえばウシ）トロンビンの両方が使用できる。トロンビンは止血剤として、および組織接着剤の成分として医学的に使用される。
【００１９】
ヒトトロンビンおよび非ヒトトロンビンは当技術分野で周知の方法によって調製される。たとえば血漿からのトロンビンの精製は、Ｂｕｉ‐Ｋｈａｃ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，９８１，２５４号明細書で開示されている。コーンフラクションＩＩＩのような血漿分画からのトロンビンの精製は、Ｆｅｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：３５８７‐３５９８，１９７７で開示されている。米国特許第５，４７６，７７７号明細書で開示されているように、組み換えトロンビンは、ヘビの毒活性化因子を用いた活性化によってプレトロンビン前駆体から調製することができる。適切な毒活性化因子は、エカリンおよびＯｘｙｕｒａｎｕｓ  ｓｃｕｔｅｌｌａｔｕｓ 由来のプロトロンビン活性化因子を含む。活性化第Ｘ因子のような他の活性化因子も利用できる。
【００２０】
高度に純化されたトロンビンは、ｍｇあたりほぼ３２００ＮＩＨ単位、つまりｍｇあたり３８００国際単位の比活性度を有する。１ＮＩＨ単位は、１．１９国際単位に相当する。本明細書で用いられている省略語の「Ｕ」は「単位（Ｕｎｉｔｓ）」を表し、特に規定しない限り、ＮＩＨ単位を意味する。省略語の「ＩＵ」は国際単位（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｔｓ）を意味する。
【００２１】
数値域（たとえば「Ｘ〜Ｙ」）は、特に規定しない限り両端点を含む。
【００２２】
「約」および「ほぼ」という用語は表示した値の±１０％の誤差範囲を意味する。たとえば「約１％」は０．９％から１．１％までの範囲を意味するために使われ、この全てを含む。
【００２３】
本明細書で引用する全ての参考文献は、その内容全体を本明細書に援用する。
【００２４】
本発明は溶液中のトロンビンを安定化させるための方法を提供する。本発明者らは、以前開示された（Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ.、米国特許出願公開第２００６０００２９１８号明細書）組み換えヒトトロンビンの凍結乾燥製剤が、静菌性の食塩水で再構成されたとき、冷蔵庫内温度で１３週間までの間安定性を保持していることを発見した。この結果は、ベンジルアルコールのような防腐剤がタンパク質を変性させ凝集の速度を増すという周知の傾向（たとえば、Ｇｕｐｔａ  ａｎｄ  Ｋａｉｓｈｅｖａ，ＡＡＰＳ  ＰｈａｒｍＳｃｉ  ５（２）：Ｅ８，２００３；Ｍａａ  ａｎｄ  Ｈｓｕ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．１４０：１５５−１６８，１９９６； Ｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１４：７２５−７２９，１９９７）を考慮すると予想外であった。ウシトロンビン製剤（ＴＨＲＯＭＢＩＮ−ＪＭＩ，Ｋｉｎｇ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）が静菌性の食塩水で再構成されたとき、溶液に濁りが生じた。後者の製剤の濁りは、それを再構成するときに用いる希釈液にスクロースを加えることで回避出来る可能性があることが判明した。
【００２５】
本発明の組成物は、水溶液中に、トロンビンと、ベンジルアルコールおよびクロロブタノールからなる群から選択された静菌的に効果的な量の防腐剤と、防腐剤によって誘発される分解に対してトロンビンを安定化させるためのスクロースとを含む。組成物の中のスクロースの濃度は、０．１０％〜５．０％（ｗ／ｖ）、時々０．１７％〜５．０％、たいていは０．１７％〜３．０％、より通常には０．５％〜２．０％である。本発明のいくつかの実施形態ではスクロースの濃度は１％（ｗ／ｖ）である。トロンビン組成物は冷蔵庫内温度で最低４週間安定している。このタイプの組み換えヒトトロンビン溶液は、２℃〜８℃で保存してから６週間後および１３週間後に試験すると、安定性を保持していることが発見された。
【００２６】
当業者には明白であるように、組成物は、緩衝液、増量剤、リオプロテクタント、溶解剤、界面活性剤、炭水化物、ポリオール、アミノ酸、追加の炭水化物（たとえばトレハロース）、および／または張性調整剤（たとえば塩、マンニトール）のような追加成分を含んでもよい。実成分の選択は所定の設計上の選択の問題であり、当業者レベルの範囲内である。例としては、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，２００５を参照されたい。
【００２７】
トロンビンは通常、薬学的に許容される希釈液を加え、混合することで再構成することができる凍結乾燥粉体または凍結乾燥ケークとして提供される。希釈液は通常、防腐剤（たとえばベンジルアルコールまたはクロロブタノール）を含んでいる。希釈液の分量は、溶液中のスクロースの最終濃度が０．１０％〜５．０％（ｗ／ｖ）になるように選択される。スクロースは凍結乾燥トロンビン製剤、希釈液、または両方に存在していてもよいが、少なくとも、再構成された溶液中のスクロースの総濃度は０．１０％〜５．０％、０．１７％〜５．０％、０．１７％〜３．０％、または０．５％〜２．０％（ｗ/ｖ）の範囲内である。以下に、より詳細に開示するように、凍結乾燥製剤は緩衝液も含んでよい。１つの実施形態では、製剤は増量剤としてマンニトールを含む。好ましい製剤では、マンニトールはマンニトール：スクロースの割合が１：１を超えるが２．５：１以下（ｗ／ｗ）で含まれる。希釈液の実際の選択は、凍結乾燥製剤の組成物と製品の使用目的とを考慮に入れて実施することになる。しかし本発明は組成物が作られる方法またはその成分が混合される順序によって制限されるものではない。たとえば、１つかそれ以上のリオプロテクタントを含むトロンビンの凍結乾燥製剤は、防腐剤およびスクロースを含む薬学的に許容される希釈液で再構成することができ、上記で開示したように、任意に追加成分を含む。もし長期間の保存が必要でないなら、または凍結を下回る温度（＜０℃）での保存によって安定性が増大するなら、精製されたトロンビンは、凍結乾燥製剤を調製せずに、防腐剤とスクロースと任意に他の成分とで製剤することができる。
【００２８】
本発明においては、薬学的に許容される緩衝液はどれでも使用してよい。ｐＨ６．０を超えると増大する自己分解（β‐トロンビンおよびγ‐トロンビンを含む不活性な自己分解生成物の生成）を原因とするトロンビンの活性の喪失、およびｐＨ６．０を下回ると増大する沈殿を制限するために、弱酸性からほぼ中性ｐＨである緩衝液を選択することが好ましい。したがって、弱酸性からほぼ中性ｐＨ（すなわちｐＨ５．７〜７．４）で効果的な薄い緩衝液を使用すると都合がよい。しかし出血している組織にトロンビンが適用されるときは、ｐＨを生理的ｐＨ（すなわちｐＨ７．３５〜７．４５）まで上げてもよい。それによってトロンビンは最適な生物学的活性を提供する。ｐＨ６．０〜６．５に緩衝液で処理されたトロンビン組成物が好ましい。適切な緩衝液の例は、ヒスチジン緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス（２‐アミノ‐２‐（ヒドロキシメチル）‐１，３‐プロパンジオール）緩衝液、およびコハク酸緩衝液を含む。たとえば、ヒスチジン緩衝液は１〜２０ｍＭ、たいていは２〜１０ｍＭ、より多くの場合約５ｍＭの濃度で含めることができる。
【００２９】
本発明において使用するための他の緩衝液の適切な濃度は、当業者によって容易に決定できる。調合緩衝液については、血液を加え、それによって得られた溶液のｐＨを測定することによって試験することができる。適例となるアッセイでは、ウサギの血液のアリコートがいくつかの緩衝液に段階的に添加され、毎添加後にｐＨが測定される。このような試験法でヒスチジン緩衝液が試験されると、３．２ｍＭ、５ｍＭ、１２．８ｍＭ、および２０ｍＭのヒスチジンが、血液量１．０以下の添加で中性になる。対照的に、１６０ｍＭのコハク酸緩衝液および９０ｍＭのリン酸／１２．８ｍＭのヒスチジン緩衝液は血液量２〜３を添加した後でも、７．０を超すｐＨで混合物を形成しなかった。従って、コハク酸またはリン酸／ヒスチジンのような緩衝液を使用するときはより低い濃度が好ましい。
【００３０】
本発明における標準的なトロンビン組成物は、０．０３ｍｇ／ｍＬ〜１．６ｍｇ／ｍＬのトロンビンと、０．１７％〜１．３％（ｗ／ｖ）のスクロースと、静菌的に効果的な量のベンジルアルコールまたはクロロブタノールと、１．１％〜１．６％（ｗ／ｖ）のマンニトールと、０．８％〜２．０％（ｗ／ｖ）のＮａＣｌと、０〜１．６ｍＭのＣａＣｌ２と、０．００１％〜０．３２％（ｗ／ｖ）の界面活性剤（たとえばポリエチレンオキシド、ソルビタンエステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、脂肪酸グリセリド、またはポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）または高分子量ポリエチレングリコール（たとえばＰＥＧ４００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ５０００、またはＰＥＧ８０００）と、ｐＨ５．７〜７．４の薬学的に許容される緩衝液とから実質的になる。いくつかの好ましい組成物においてはマンニトール：スクロースの割合は、１：１を超えるが２．５：１以下（ｗ／ｗ）である。
【００３１】
本発明の組成物におけるトロンビンの濃度は、使用目的により、希釈液の量を調整することでさまざまにすることができる。出血を抑制するための局所使用としては、トロンビンの濃度は通常約１００Ｕ／ｍＬ〜約２０，０００Ｕ／ｍＬ（ほぼ１ｍＬあたり０．０２６ｍｇの□‐トロンビンから１ｍＬあたり５．２６ｍｇの□‐トロンビン）、より一般的には約３００Ｕ／ｍＬ〜約５，０００Ｕ／ｍＬ、標準的には約１，０００Ｕ／ｍＬであるが、実際の濃度は個々の患者の必要性に応じて医師によって決定される。トロンビン溶液は直ちに使用すること、室温で４８時間まで維持すること、または冷蔵庫で４週間もしくはそれ以上まで保存することができる。トロンビンは、多くの場合慣習的な外科手術の実務に従って、吸収性のあるゼラチンスポンジまたは他の投薬媒体物と組み合わせて、出血している組織に止血のために適用することができる。トロンビンは組織接着剤またはフィブリン接着剤の成分として使用することもできる。これらまたは他のトロンビンの使用は当技術分野で周知である。
【００３２】
本発明は第１密閉容器に入った希釈液および第２密閉容器に入った凍結乾燥したトロンビンを含むキットに入ったトロンビンをさらに提供する。希釈液は静菌的に効果的な量のベンジルアルコールまたはクロロブタノールを含む。標準的な実施形態では、希釈液はベンジルアルコールまたはクロロブタノールを含む生理食塩水（０．９ｗ／ｖ％の塩化ナトリウム溶液）である。キットは、噴霧器、シリンジ、またはその他同種の塗布用デバイスと、容器の中および外への液体の移動を容易にする１本もしくはそれ以上の針または他の移動用デバイスとをさらに具備してもよい。針を用いない移動用デバイスを含むこういったさまざまなデバイスは当技術分野で周知である。例については米国特許第６，５５８，３６５号明細書を参照されたい。説明書もキットに梱包されてよい。通常、第１密閉容器および第２密閉容器は第３容器に梱包される。キットの内容物は通常無菌である。第３容器も無菌にできる。
【００３３】
本発明は以下の非制限的な実施例によってさらに説明される。
【実施例】
【００３４】
（実施例１）
５ｍＭのヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＣａＣｌ２、０．１％のＰＥＧ３３５０、ｐＨ６．０に、表１に示すさまざまな濃度のマンニトールおよびスクロースを加えた中に、組み換えヒトトロンビン（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ：ｒｈＴｈｒｏｍｂｉｎ）を、１ｍｇ／ｍＬ（３２００Ｕ／ｍＬ）製剤した。
【００３５】
【表１】
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溶液のアリコート１．６ｍＬずつをバイアルに入れ、表２に示す条件下で凍結乾燥した。その後の分析のために、凍結乾燥したサンプルを必要に応じて水中で再構成した。凍結乾燥したサンプルおよび再構成したサンプルの目視観測を表３に示す。
【００３６】
【表２】
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【００３７】
【表３】
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（実施例２）
５ｍＭのヒスチジン、３％（ｗ／ｖ）のスクロース、４％（ｗ／ｖ）のマンニトール、１５０ｍＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＣａＣｌ２、０．１％のＰＥＧ３３５０、ｐＨ６．０に、組み換えヒトトロンビンを１ｍｇ／ｍＬ製剤した。溶液のアリコート１．６ｍＬずつをバイアルに入れ、表４に示す条件下で凍結乾燥した。
【００３８】
【表４】
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（実施例３）
組み換えヒトトロンビン（「ｒｈＴｈｒｏｍｂｉｎ  ＤＰ」、実施例２で開示した方法で調製されたもの）およびウシトロンビン（ＴＨＲＯＭＢＩＮ−ＪＭＩ、Ｊｏｎｅｓ  Ｐｈａｒｍａ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，  Ｂｒｉｓｔｏｌ，  ＶＡ；  マンニトールおよび塩化ナトリウムを含む凍結乾燥粉体）各１バイアル（５，０００ＩＵ）ずつを５ｍＬの米国薬局方静菌性の食塩水で再構成した。ウシトロンビンは再構成したとき、外見上無色で濁りがあり泡が多かったが、一方組み換えトロンビンは無色で透明であった。続いて２５℃で４８時間保管した後、ウシトロンビンは無色で目視可能な沈殿物があり、組み換えトロンビンは依然として無色で透明であった。
【００３９】
（実施例４）
ｒｈＴｈｒｏｍｂｉｎ  ＤＰ、組み換えヒトトロンビン試験的製剤（実施例１、製剤Ｔ）、およびウシトロンビン（ＴＨＲＯＭＢＩＮ−ＪＭＩ）各１バイアル（５，０００ＩＵ）ずつを５．０ｍＬの米国薬局方静菌性の食塩水で再構成した。再構成した溶液中のスクロースの濃度は、ウシトロンビンで０％、試験的トロンビンで０．１７％、およびｒｈＴｈｒｏｍｂｉｎ  ＤＰで１．０％であった。ｒｈＴｈｒｏｍｂｉｎの溶液は両方とも透明であったが、一方ウシトロンビンの溶液は外見上濁りがあった。
【００４０】
（実施例５）
ｒｈＴｈｒｏｍｂｉｎ  ＤＰのバイアル（５，０００ＩＵ）を米国薬局方静菌性の食塩注射で再構成した（ｎ＝３）。再構成したサンプルを上下逆にして２〜８℃で１週間、２週間、４週間、６週間、９週間および１３週間、ならびに２５℃で８時間、２４時間、および４８時間保存した。保存後、サンプルを，外見、含有量（ＲＰ‐ＨＰＬＣによる）、純度（ＲＰ‐ＨＰＬＣ）、有効性（凝血活性）、および高分子量（ｈｉｇｈ−ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−ｗｅｉｇｈｔ：ＨＭＷ）の不純物（ＳＥ‐ＨＰＬＣ）について分析した。表５に示す通り、評価した期間と条件では著しい不安定性は観察されなかった。
【００４１】
【表５】
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（実施例６）
ｒｈＴｈｒｏｍｂｉｎ  ＤＰおよび試験的製剤のバイアル（各５，０００ＩＵ）を１．６ｍＬの静菌性の食塩水で再構成した。スクロースの濃度はｒｈＴｈｒｏｍｂｉｎ  ＤＰの溶液で３．０％、および試験的製剤の溶液で０．５％であった。２５℃では、再構成直後にも、２４時間後にも、４８時間後にも沈殿物は全く観測されなかった。
【００４２】
（実施例７）
組み換えヒトトロンビンＤＰのバイアル（５，０００ＩＵ）３本を、それぞれ５ｍＬの静菌性の食塩水で再構成した。２〜８℃で１３週間保存した後、沈殿物は全く観測されなかった。
【００４３】
（実施例８）
組み換えヒトトロンビンＤＰを、生理食塩水中に０．９％または２．０％のベンジルアルコールを加えて再構成した。サンプルは２５℃で保存した。０．９％のサンプルでは、再構成直後にも４８時間後にも沈殿物は全く観測されなかった。２．０％のベンジルアルコールを含むサンプルは、再構成直後には沈殿物は見られなかったが、２４時間後に沈殿物が見られた。
【００４４】
（実施例９）
ウシトロンビンを１％のスクロースを含む静菌性の食塩水で再構成した。サンプルは２５℃で保存した。再構成直後にも２４時間後にも４８時間後にも沈殿物は全く観測されなかった。
【００４５】
（実施例１０）
以下の防腐剤を、生理食塩水で再構成した組み換えヒトトロンビンＤＰのサンプルに個々に加えた。フェノール（１％、ｗ／ｖ）、ｍ‐クレゾール（０．２％、ｖ／ｖ）、メチルパラベン（０．５％、ｗ／ｖ）、プロピルパラベン（１％、ｗ／ｖ）、またはクロロブタノール（０．５％、ｗ／ｖ）。サンプルは２５℃で保存した。フェノールおよびｍ‐クレゾールのサンプルには２４時間後に沈殿物が観測された。０．５％のクロロブタノールを含むサンプルは２４時間後および４８時間後に透明のままであった。メチルパラベンおよびプロピルパラベンは試験された濃度の溶液中では溶解できなかった。
【００４６】
前述のことから、本発明の具体的な実施形態が説明の目的で本明細書に記載されてきたが、さまざまな改良が本発明の精神と範囲から逸脱することなくなされてもよいことは明らかである。したがって、本発明は添付の特許請求の範囲を除き、制限されるものではない。
【国際調査報告】
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