(57)【要約】  本発明は、少なくとも１つの追加の抗新生物性化合物及び4-キナゾリンアミン類を投与することによって哺乳動物の癌を治療する方法に関する。特に前記方法は、少なくとも１つの追加の抗新生物性化合物と共に、N-{3-クロロ-4-[(3-フルオロベンジル)オキシ]フェニル}-6-[5-({[2-(メタンスルホニル)エチル]アミノ}メチル)-2-フリル]-4-キナゾリンアミン並びにその塩及び溶媒和物を投与することによって癌を治療する方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物に治療上有効な量の(i)次式(I”)の化合物及び(ii)ペメトレキセドを投与することを含む、哺乳動物の感受性のある癌の治療方法。
【化１】
2010510990.tif 000012
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、他の抗新生物性化合物（anti-neoplastic compound）と共に、4-キナゾリンアミンを投与することによって、哺乳動物における癌を治療する方法に関する。特にこの方法は、追加の抗新生物性化合物と共に、N-{3-クロロ-4-[(3-フルオロベンジル)オキシ]フェニル}-6-[5-({[2-(メタンスルホニル)エチル]アミノ}メチル)-2-フリル]-4-キナゾリンアミン、又はその塩もしくは溶媒和物を投与することによる癌の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌治療に効果的な化学療法は、腫瘍学分野の継続する目標である。一般的に、癌は細胞の分裂、分化、及びアポトーシス細胞死を制御する正常なプロセスの脱調節に起因する。アポトーシス（プログラム細胞死）は、胚発生並びに変性神経疾患、心血管病及び癌等の様々な病因で重要な役割をしている。アポトーシスのキナーゼ調節を必要とする、最もよく研究されている経路の１つは、細胞表面の成長因子受容体から核への細胞シグナル伝達である ADDIN ENRef (Crews and Erikson, Cell, 74:215-17, 1993（非特許文献１）)。特に、erbBファミリーに属する成長因子受容体の細胞シグナル伝達は、よく研究されている。
【０００３】
これらの受容体によって媒介される細胞効果を制御するerbBファミリー間には重要な相互作用がある。EGFRに結合する６種のリガンドとして、EGF、形質転換増殖因子、アンフィレグリン、ヘパリン結合性EGF、ベータセルリン及びエピレグリンがある ADDIN ENRfu (Alroy & Yarden, FEBS Letters, 410:83-86, 1997（非特許文献２）; Burden & Yarden, Neuron, 18: 847-855, 1997（非特許文献３）; Klapper et al., ProcNatlAcadSci, 4994-5000, 1999（非特許文献４）)。別のクラスのリガンドであるヘルグリンは、HER3及び/又はHER4に直接結合する ADDIN ENRfu (Holmes et al., Science, 256:1205, 1992（非特許文献５）; Klapper et al., 1997, Oncogene, 14:2099-2109（非特許文献６）; Peles et al., Cell, 69:205, 1992（非特許文献７）)。特定のリガンドの結合は、erbBファミリーのメンバー内の受容体のホモ又はヘテロ二量化を誘導する ADDIN ENRfu (Carraway & Cantley, Cell, 78:5-8, 1994（非特許文献８）; Lemmon & Schlessinger, TrendsBiochemSci, 19:459-463, 1994（非特許文献９）)。他のerbB受容体メンバーとは対照的に、HER2の可溶性リガンドは未だ同定されておらず、ヘテロ二量化の後にトランス活性化されるようである。erbB-2受容体とEGFR、HER3及びHER4とのヘテロ二量化は、ホモ二量化よりも好ましい ADDIN ENRfu (Klapper et al., 1999（非特許文献４）; Klapper et al., 1997（非特許文献６）)。受容体の二量化によって、ATPが受容体の触媒部位へ結合し、その受容体のチロシンキナーゼが活性化され、Ｃ末端チロシン残基の自己リン酸化が起こる。そのリン酸化されたチロシン残基は、Grb2、Shc及びホスホリパーゼＣ等のタンパク質がドッキングする部位としての役割をもち、次にRas/MEK/Erk経路やPI3K/Akt経路等の下流シグナリング経路を活性化し、増殖、細胞運動、血管形成、細胞の生存及び分化等の生物反応に関与する転写因子その他のタンパク質を調節する ADDIN ENRfu (Alroy & Yarden, 1997（非特許文献２）; Burgering & Coffer, Nature, 376:599-602, 1995（非特許文献１０）; Chan et al., AnnRevBiochem, 68:965-1014,1999（非特許文献１１）; Lewis et al., AdvCanRes, 74:49-139,1998（非特許文献１２）; Liu et al., Genes and Dev, 13:786-791, 1999（非特許文献１３）; Muthuswamy et al., Mol&CellBio, 19,10:6845-6857,1999（非特許文献１４）; Riese & Stern, Bioessays, 20:41-48, 1998（非特許文献１５）)。
【０００４】
erbBファミリー受容体を標的にし、癌細胞内におけるそれらの活性化を阻害するために、モノクローナル抗体(Mab)、免疫抱合体、抗EGFワクチン、及びチロシンキナーゼ阻害剤等の幾つかの方法が開発されている ADDIN ENRfu (Sridhar et al., Lancet, 4,7:397-406,2003（非特許文献１６）に概説されている)。ErbB2を含むヘテロ二量体は最も安定で好ましいシグナル伝達開始事象であるので、erbB2及びEGFR双方を同時に阻害することは、魅力的な治療方法の一つである。癌の前臨床モデルにおいて有効性を有する、一連の6-チアゾリルキナゾリンerbB-2/EGFRチロシンキナーゼ二重阻害剤が合成されている ADDIN ENRfu (Cockerill et al., BiorgMedChemLett, 11:1401-1405,2001（非特許文献１７）; Rusnak et al., CanRes, 61:7196-7203, 2001a（非特許文献１８）; Rusnak et al., MolCanTher, 1:85-94,2001b（非特許文献１９）)。GW572016とは6-フラニルキナゾリンであり、EGFR及びerbB2キナーゼ双方に対する、経口で有効な可逆性二重キナーゼ阻害剤である ADDIN ENRfu (Rusnak et al., 2001b（非特許文献１９）)。ヒトにおける異種移植片についての研究では、GW572016は用量依存的にキナーゼ阻害を示し、EGFR又はerbB2を過剰発現している癌細胞を選択的に阻害する ADDIN ENRfu (Rusnak et al., 2001b（非特許文献１９）; Xia et al., Oncogene, 21:6255-6263, 2002（非特許文献２０））。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Crews and Erikson, Cell, 74:215-17, 1993
【非特許文献２】ADDIN ENRfu Alroy & Yarden, FEBS Letters, 410:83-86, 1997
【非特許文献３】Burden & Yarden, Neuron, 18: 847-855, 1997
【非特許文献４】Klapper et al., ProcNatlAcadSci, 4994-5000, 1999
【非特許文献５】Holmes et al., Science, 256:1205, 1992
【非特許文献６】Klapper et al., 1997, Oncogene, 14:2099-2109
【非特許文献７】Peles et al., Cell, 69:205, 1992
【非特許文献８】Carraway & Cantley, Cell, 78:5-8, 1994
【非特許文献９】Lemmon & Schlessinger, TrendsBiochemSci, 19:459-463, 1994
【非特許文献１０】Burgering & Coffer, Nature, 376:599-602, 1995
【非特許文献１１】Chan et al., AnnRevBiochem, 68:965-1014,1999
【非特許文献１２】Lewis et al., AdvCanRes, 74:49-139,1998
【非特許文献１３】Liu et al., Genes and Dev, 13:786-791, 1999
【非特許文献１４】Muthuswamy et al., Mol&CellBio, 19,10:6845-6857,1999
【非特許文献１５】Riese & Stern, Bioessays, 20:41-48, 1998
【非特許文献１６】Sridhar et al., Lancet, 4,7:397-406,2003
【非特許文献１７】Cockerill et al., BiorgMedChemLett, 11:1401-1405,2001
【非特許文献１８】Rusnak et al., CanRes, 61:7196-7203, 2001a
【非特許文献１９】Rusnak et al., MolCanTher, 1:85-94,2001b
【非特許文献２０】Xia et al., Oncogene, 21:6255-6263, 2002
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
併用治療は、癌治療において例外というよりむしろ、急速に標準となりつつある。腫瘍学者は、併用した場合により効果的な及び/又は増強された治療を、癌の影響で苦しむ個人に提供する抗新生物性化合物を、継続的に探索している。一般的に、優れた併用療法は単独療法よりも改善され、さらには相乗的効果を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、追加の抗新生物性化合物と共に、N-{3-クロロ-4-[(3-フルオロベンジル)オキシ]フェニル}-6-[5-({[2-(メタンスルホニル)エチル]アミノ}メチル)-2-フリル]-4-キナゾリンアミン(GW572016)並びにその塩及び/又は溶媒和物を投与することを含む、新規な癌の治療方法を確認した。
【０００８】
本発明の第一の態様では、治療上有効な量の(i)次式(I”)の化合物及び(ii)ペメトレキセドを哺乳動物に投与することを含む、前記哺乳動物の感受性のある癌の治療方法が提供される。
【化１】
2010510990.tif 000002
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本明細書で用いられる「新生物」とは、細胞又は組織の異常増殖を意味し、非癌性増殖である良性腫瘍、及び癌性増殖である悪性腫瘍を含むものと理解される。「新生物の」とは、新生物又は新生物と関連のある言葉を意味する。
【００１０】
本明細書で用いられる「有効な量」とは、例えば研究者又は臨床医が求める、組織、系、動物又はヒトの生物学的又は医学的応答を引き出す薬剤又は医薬の量を意味する。さらに「治療上有効な量」とは、そのような量を投与されていない対応する被験体と比較して、治療の改善、回復、予防又は病気、疾患もしくは副作用の改善、又は病気もしくは疾患の進行速度の減退をもたらす量を意味する。この用語はまた、正常な生理的機能を増進するのに有効な量も包含する。
【００１１】
当業者によく知られるように、癌又は腫瘍は、癌性腫瘍が増殖する初めの（原発性の）場所から、解剖学的に離れた１以上の部位へ広がるという意味で転移性を有することが多い。本明細書で用いられるように、患者における「腫瘍」とは、原発性腫瘍だけでなく、転移性腫瘍増殖も含む。同様に、癌又は癌治療への言及は、原発性及び転移性の癌、並びに原発性癌及び転移性癌の部位の治療だけでなく、原発性又は転移性の癌増殖の予防又は再発も含む。
【００１２】
「erbB-1」としても知られる「EGFR」及び「erbB-2」は、erbBファミリーのタンパク質チロシンキナーゼ膜貫通成長因子受容体である。タンパク質チロシンキナーゼは細胞の増殖、分化の制御に関与する様々なタンパク質中の、特定のチロシン残基のリン酸化を触媒する (A.F. Wilks, Progress in Growth Factor Research, 1990, 2, 97-111; S.A. Courtneidge, Dev. Supp.l, 1993, 57-64; J.A. Cooper, Semin. Cell Biol., 1994, 5(6), 377-387; R.F. Paulson, Semin. Immunol., 1995, 7(4), 267-277; A.C. Chan, Curr. Opin. Immunol., 1996, 8(3), 394-401)。I型受容体チロシンキナーゼのErbBファミリーは、ErbB1（上皮成長因子受容体（EGFR又はHER1）としても知られる）、erbB2（Her2としても知られる）、erbB3及びerbB4を含む。これらの受容体チロシンキナーゼは、上皮組織、間葉組織及び神経組織で広く発現しており、細胞の増殖、生存及び分化を制御する役割をもつ(Sibilia and Wagner, Science, 269: 234 (1995); Threadgill et al., Science, 269: 230 (1995))。野生型のerbB2もしくはEGFRの発現の増加、又は構成的活性化受容体の変異型の発現は、インビトロにおいて細胞を形質転換させる(Di Fiore et al., 1987; DiMarco et al, Oncogene, 4: 831 (1989); Hudziak et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 84:7159 (1987); Qian et al., Oncogene, 10:211 (1995))。erbB2又はEGFRの発現の増加は、幾つかの乳癌や他の様々な悪性腫瘍における、不良な臨床転帰と相関している(Slamon et al., Science, 235: 177 (1987); Slamon et al., Science, 244:707 (1989); Bacus et al, Am. J. Clin. Path, 102:S13 (1994))。
【００１３】
本明細書で用いられる、「溶媒和物」は、溶質（本発明では式(I)の化合物又はその塩）及び溶媒によって形成される可変の化学量論の複合体に関する。本発明の目的に合う溶媒は、溶質の生物活性を妨げないものである。そのような好適な溶媒の例として、限定するものではないが、水、メタノール、エタノール及び酢酸がある。好ましくは製薬上許容される溶媒を用いる。好適な製薬上許容される溶媒の例として、水、エタノール及び酢酸が挙げられるが、これらに限らない。最も好ましい溶媒は、水である。
【００１４】
上記のように、本発明は他の抗新生物性化合物と共に、N-{3-クロロ-4-[(3-フルオロベンジル)オキシ]フェニル}-6-[5-({[2-(メタンスルホニル)エチル]アミノ}メチル)-2-フリル]-4-キナゾリンアミン(GW572016)並びにその塩及び/又は溶媒和物を投与することを含む、癌の治療方法に関する。
【００１５】
本明細書で開示されている癌の治療方法は、式(I)の化合物又はその塩もしくは溶媒和物の投与を含む。
【化２】
2010510990.tif 000003
【００１６】
別の実施形態では、この化合物は、式(I)の化合物の二トシル酸塩である式(I')の化合物又はその無水型もしくは水和型である。式(I)の化合物の二トシル酸塩は、N-{3-クロロ-4-[(3-フルオロベンジル)オキシ]フェニル}-6-[5-({[2-(メタンスルホニル)エチル]アミノ}メチル)-2-フリル]-4-キナゾリンアミン(GW572016)二トシル酸塩の化学名を有し、ラパチニブ(lapatinib)としても知られている。
【化３】
2010510990.tif 000004
【００１７】
一実施形態では、この化合物は式(I’)の化合物の無水二トシル酸塩である。別の実施形態では、この化合物は式(I’)の化合物の二トシル酸塩一水和物である式(I”)の化合物である。
【化４】
2010510990.tif 000005
【００１８】
式(I)の化合物の遊離塩基、塩酸塩及び二トシル酸塩は、上記の国際特許出願番号PCT/EP99/00048（１９９９年１月８日に出願、１９９９年７月１５日にWO99/35146として公開）、及び国際特許出願番号PCT/US01/20706（２００１年６月２８日に出願、２００２年１月１０日にWO02/02552として公開）の方法に従って調製することができ、また以下に示す適当な例に従って調製することもできる。
【００１９】
式(I)の化合物の二トシル酸塩のかかる調製方法の一つを次のスキーム１に示す。
【００２０】
スキーム１
【化５】
2010510990.tif 000006
【００２１】
スキーム１において、式(III)の化合物の二トシル酸塩の調製は４つの段階で行われる。段階(Stage)１では、スキーム１中に示される二環式化合物とアミンを反応させ、ヨードキナゾリン誘導体を得る。段階２では、それに対応するアルデヒド塩を調製する。段階３では、キナゾリン二トシル酸塩を調製する。段階４では、二トシル酸塩一水和物を調製する。
【００２２】
一般的には、本発明の塩は製薬上許容される塩である。「製薬上許容される塩」に含まれる塩は、本発明の化合物の無毒性の塩を意味する。本発明の化合物の塩は、本発明の化合物中の置換基にある窒素に由来する酸付加塩からなっていてもよい。代表的な塩として次のものがある：酢酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、重硫酸塩、酒石酸水素塩、ホウ酸塩、臭化物、エデト酸カルシウム塩、カンシル酸塩、炭酸塩、塩化物、クラブラン酸塩、クエン酸塩、二塩酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩、エストレート、エシレート、フマル酸塩、グルセプテート、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリコリルアルサニレート（glycollylarsanilate）、ヘキシルレゾルシン酸塩、ヒドラバミン（hydrabamine）、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩(hydroxynaphthoate)、ヨウ化物、イセチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、メチル臭化物、メチル硝酸塩、メチル硫酸塩、マレイン酸一カリウム塩、ムケート（mucate）、ナプシル酸塩、硝酸塩、N-メチルグルカミン、シュウ酸塩、パモ酸塩（エンボネート(embonate)）、パルミチン酸塩、パントテン酸塩、リン酸塩/二リン酸塩、ポリガラクツロン酸塩、カリウム塩、サリチル酸塩、ナトリウム塩、ステアリン酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩、トシル酸塩、トリエチオダイド（triethiodide）、トリメチルアンモニウム塩、及び吉草酸塩。製薬上許容されない他の塩は、本発明の化合物を調製する際有用であり得、これらは本発明のさらなる態様を構成する。
【００２３】
一実施形態では、この癌の治療方法は式(I”)の化合物をペメトレキセドと共に投与する、感受性のある癌を治療する方法である。一実施形態では、その感受性のある癌は肺癌である。一実施形態では、その肺癌はEGFR及び/又はerbB-2を過剰発現している。他の実施形態では、その感受性のある癌は非小細胞肺癌である。一実施形態では、その非小細胞肺癌はEGFR及び/又はerbB-2を過剰発現している。
【００２４】
ペメトレキセド(Pemetrexed)、（N-[4-[2-(2-アミノ-4,7-ジヒドロ-4-オキソ-1H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-5-イル)エチル]ベンゾイル-L-グルタミン酸二ナトリウム塩７水和物）は、ALIMTA（登録商標）として注射剤で市販されている。ペメトレキセドは、事前に化学療法をした後の、局所進行性又は転移性の非小細胞肺癌の患者の治療に用いられる。ペメトレキセドは、細胞複製に必須の葉酸依存性の代謝過程を妨げることによって、抗新生物活性を奏す抗葉酸剤である。
【００２５】
一実施形態では、この癌の治療方法は式(I”)の化合物をテモゾールアミドと共に投与する、感受性のある癌を治療する方法である。一実施形態では、その感受性のある癌は脳癌である。一実施形態では、その脳癌はEGFR及び/又はerbB-2を過剰発現している。他の実施形態では、その感受性のある癌はグリア芽腫である。一実施形態では、そのグリア芽腫はEGFR及び/又はerbB-2を過剰発現している。他の実施形態では、その感受性のある癌は星状細胞腫である。一実施形態では、その星状細胞腫はEGFR及び/又はerbB-2を過剰発現している。
【００２６】
テモゾールアミド（temozolamide）（3,4-ジヒドロ-3-メチル-4-オキシイミダゾ[5,1-d]-as-テトラジン-8-カルボキサミド）は、TEMODAR（登録商標）カプセル剤として市販されている。テモゾールアミドは、不応性未分化星状細胞腫の成人患者の治療に用いられる。テモゾールアミドは生理的pH下で、活性化合物である3-メチル-(トリアゼニル-1-イル)-イミダゾール-4-カルボキサミド(MTIC)に変換し、DNAのアルキル化を介して細胞毒性を奏すると考えられている。
【００２７】
一実施形態では、この癌の治療方法は式(I”)の化合物をラロタキセル（larotaxel）と共に投与する、感受性のある癌の治療方法である。一実施形態では、その感受性のある癌は乳癌である。一実施形態では、その乳癌はEGFR及び/又はerbB-2を過剰発現している。他の実施形態では、その感受性のある癌は膵臓癌である。一実施形態では、その膵臓癌はEGFR及び/又はerbB-2を過剰発現している。
【００２８】
ラロタキセルは、XRP9881としても知られており、Sanofi-Aventisによって開発されているタキサン（taxane）（10-デアセチルバッカチンIII）の半合成誘導体である。ラロタキセルはチューブリンに結合し、微小管の組立及び安定化を促進し、微小管脱重合を妨げ、それにより細胞増殖を阻害する。
【００２９】
一実施形態では、この癌の治療方法は式(I”)の化合物をパーツズマブ（pertuzumab）と共に投与する、感受性のある癌の治療方法である。一実施形態では、その感受性のある癌は乳癌である。一実施形態では、その乳癌はEGFR及び/又はerbB-2を過剰発現している。他の実施形態では、その感受性のある癌は卵巣癌である。一実施形態では、その卵巣癌はEGFR及び/又はerbB-2を過剰発現している。
【００３０】
パーツズマブは、オムニターグ（Omnitarg (2C4)）としても知られ、Genentechによって開発されているヒト化モノクローナル抗体である。パーツズマブはHER二量化阻害剤であり、HER2との二量体対（HER2-HER1、HER2-HER3、HER2-HER4）の二量化を阻害する。HER2の二量化の阻害は、MAPK及びPI3K経路等の細胞内シグナルカスケードの活性化を妨げ、それにより癌細胞の成長及び増殖を阻害するものと考えられている。
【００３１】
一実施形態では、この癌の治療方法は式I”の化合物をイクサベピロン（ixabepilone）と共に投与する、感受性のある癌の治療方法である。一実施形態では、その感受性のある癌は乳癌である。一実施形態では、その乳癌はEGFR及び/又はerbB-2を過剰発現している。他の実施形態では、その感受性のある癌は膵臓癌である。一実施形態では、その膵臓癌はEGFR及び/又はerbB-2を過剰発現している。別の実施形態では、その感受性のある癌は前立腺癌である。一実施形態では、その前立腺癌はEGFR及び/又はerbB-2を過剰発現している。
【００３２】
イクサベピロン(BMS 247550)は、Bristol Myers Squibbによって現在開発されている、エポシロンＢの半合成アナログである。イクサベピロンは微小管安定剤であり、微小管重合の促進剤である。このような微小管の安定化、重合化は癌細胞の成長及び増殖を阻害するものと考えられている。
【００３３】
一実施形態では、この癌の治療方法は式I”の化合物をヒートショックプロテイン90(HSP90)阻害剤と共に投与する、感受性のある癌の治療方法である。HSP90はタンパク質のフォールディングや安定化、即ちコンフォメーションの成熟化を調節するシャペロンタンパク質であり、それにより癌と関連のある幾つかのシグナルタンパク質の機能を調節する。このようなシグナルタンパク質とHSP90との相互作用によって、癌細胞の増殖が起こると考えられている。一実施形態では、HSP90阻害剤は17-アリルアミノ-17-デメトキシゲルダナマイシン(17AAG)である。一実施形態では、その感受性のある癌は乳癌である。一実施形態では、その乳癌はEGFR及び/又はerbB-2を過剰発現している。
【００３４】
一実施形態では、この癌の治療方法は式(I”)の化合物をオキサリプラチン（oxaliplatin）と共に投与する、感受性のある癌の治療方法である。一実施形態では、その感受性のある癌は結腸直腸癌である。他の実施形態では、その感受性のある癌は胃癌又は食道癌である。他の実施形態では、その感受性のある癌は胃癌である。一実施形態では、その胃癌はEGFR及び/又はerbB-2を過剰発現している。別の実施形態では、その感受性のある癌は食道癌である。一実施形態では、その食道癌はEGFR及び/又はerbB-2を過剰発現している。
【００３５】
オキサリプラチン（シス-[(1R,2R)-1,2-シクロヘキサンジアミン-N,N’][オキサレート(2-)-O,O’]白金）は、Sanofi-AventisからEloxatin（登録商標）として注射剤型で市販されている。オキサリプラチンは有機白金錯体であり、白金原子が1,2-ジアミノシクロヘキサン(DACH)及び脱離基としてのシュウ酸リガンドと複合体を形成している。生理的条件下では、オキサリプラチンはシュウ酸リガンドを失い、高分子と共有結合可能な活性誘導体を形成する。一般的には、鎖間及び鎖内の白金とDNAとの架橋が形成され、DNA複製及び転写を阻害する。オキサリプラチンは、癌の完全切除又は結腸もしくは直腸の進行癌の治療が行われる、ステージ３の結腸癌患者のアジュバント療法のために、5-フルオロウラシル及びロイコボリン（leucovorin）との併用が承認されている。
【００３６】
一実施形態では、この癌の治療方法は、式(I”)の化合物をオキサリプラチン及び5-フルオロウラシルと共に投与する、感受性のある癌の治療方法である。他の実施形態では、その感受性のある癌は胃癌又は食道癌である。他の実施形態では、その感受性のある癌は胃癌である。一実施形態では、その胃癌はEGFR及び/又はerbB-2を過剰発現している。他の実施形態では、その感受性のある癌は食道癌である。一実施形態では、その食道癌はEGFR及び/又はerbB-2を過剰発現している。
【００３７】
5-フルオロウラシル（5-フルオロ-2,4-(1H,3H)ピリミジンジオン）はフルオロウラシルとして市販されている。5-フルオロウラシルの投与によって、チミジル酸合成が阻害され、またRNA及びDNA双方に組み込まれる。その結果、一般的には細胞死が起こる。5-フルオロウラシルは、胸、結腸、直腸、胃及び膵臓の腫瘍を治療する際、単剤として又は他の化学療法剤と共に用いられる。骨髄抑制及び粘膜炎は、5-フルオロウラシルの用量を制限する副作用である。
【００３８】
一実施形態では、この癌の治療方法は式(I”)の化合物をオキサリプラチン及びカペシタビン（capecitabine）と共に投与する、感受性のある癌の治療方法である。他の実施形態では、その感受性のある癌は胃癌又は食道癌である。他の実施形態では、その感受性のある癌は胃癌である。一実施形態では、その胃癌はEGFR及び/又はerbB-2を過剰発現している。他の実施形態では、その感受性のある癌は食道癌である。一実施形態では、その食道癌はEGFR及び/又はerbB-2を過剰発現している。
【００３９】
カペシタビン（5’-デオキシ-5-フルオロ-N-[(ペンチルオキシ)カルボニル]-シチジン）は、XELODA（登録商標）として150又は500mgの錠剤として市販されている。カペシタビンは、生体内で5-フルオロウラシルへ変換する5’-デオキシ-5-フルオロウリジン(5’-DFUR)の経口投与用プロドラッグである。カペシタビンは、パクリタキセル及びアントラサイクリンを含む治療計画に対して耐性をもつ転移性乳癌の治療に用いられる。
【００４０】
一実施形態では、この癌の治療方法は式(I”)の化合物をヘッジホッグ経路阻害剤と共に投与する、感受性のある癌の治療方法である。ヘッジホッグ経路の活性化は、様々な癌と関連している。パッチト(PTCH)はソニックヘッジホッグ(SHh)を含むヘッジホッグリガンドの受容体である。ヘッジホッグリガンドがないとPTCH受容体は、Ｇ共役様受容体であるスムーズンド（Smoothened (SMO)）を抑制する。ヘッジホッグリガンドがPTCHに結合すると、SMOは抑制されなくなり、ヘッジホッグ経路は経路の転写因子活性化の増強と共に活性化され、シグナルカスケードの開始によって癌細胞増殖及び転移の増大が誘導される。例えばSMO阻害によるヘッジホッグ経路の抑制は、癌細胞のアポトーシスを増加させ、侵襲性を減少させる可能性がある。一実施形態では、ヘッジホッグ経路阻害剤は、SMO阻害剤であるシクロパミン（cyclopamine）である。一実施形態では、感受性のある癌は前立腺癌である。一実施形態では、その前立腺癌はアンドロゲン非依存性の前立腺癌である。他の実施形態では、その癌は胸、肺、脳又は皮膚の癌である。他の実施形態では、その癌は基底細胞癌である。
【００４１】
このように本発明による併用治療は、少なくとも１つの他の抗新生物性剤の使用及び式(I”)の化合物の投与を含む。このような薬剤の組合せは、一緒に又は別々に投与することができ、別々に投与する場合、あらゆる順序で、時間的に近接し及び離れている場合双方において、同時に又は逐次的に起こりうる。式(I”)の化合物及びその他の医薬活性剤の量、並びに投与の相対的なタイミングは、所望の併用治療の効果を達成するように選択される。
【００４２】
本発明では、式(I”)の化合物及び少なくとも１つの抗新生物性剤を含む薬剤の併用も考えられる。このような式(I”)の化合物及び少なくとも１つの抗新生物性剤は上記の通りであり、本発明の癌の治療方法においては、上述したどの併用法で使用してもよい。
【００４３】
本発明の癌の治療方法で用いるため、治療効果のある量の式(I”)の化合物及びその塩又は溶媒和物を、未加工の化学物質として投与することもできるが、医薬組成物として活性成分を提供することもできる。従って、本発明はさらに医薬組成物を提供し、本発明の癌の治療方法においてその医薬組成物を投与することができる。医薬組成物は治療効果のある量の式(I”)の化合物又はその塩もしくは溶媒和物、及び１以上の製薬上許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む。担体、希釈剤又は賦形剤は、製剤の他の成分と適合し、またレシピエントにとって有害ではないという点で、許容可能でなければならない。
【００４４】
医薬製剤は、単位用量あたり既定量の活性成分を含む単位用量形態で提供することができる。このような単位は、例えば治療すべき状態、投与経路、患者の年齢、体重及び状態に依存する。単位用量製剤は、本明細書中上記の通り、日用量もしくはそれ未満の用量（sub-dose）の、又はその適切な一部分の活性成分を含むものが好ましい。さらに、このような医薬製剤は当業者に公知であるいずれの方法でも調製することができる。
【００４５】
式(I”)の化合物は任意の適切な経路によって投与することができる。好適な経路は、経口、直腸、経鼻、局所(口腔及び舌下を含む)、膣内及び非経口(皮下、筋内、静脈内、皮内、髄腔内及び硬膜外を含む)を含む。例えば併用治療されるレシピエントの状態によって、好適な経路を変更することができることは理解されうる。
【００４６】
経口投与に適した医薬製剤を、個々の単位、例えばカプセル剤もしくは錠剤、粉剤もしくは顆粒剤、水性液体もしくは非水性液体中の溶液剤もしくは懸濁液剤、食用のフォーム剤もしくはホイップ剤、又は水中油型乳剤もしくは油中水型乳剤として提供することができる。
【００４７】
例えば錠剤又はカプセル剤の形態で経口投与する場合、活性薬剤成分を、経口用で無毒の製薬上許容される不活性担体、例えばエタノール、グリセロール、水等と混合することができる。粉剤を調製するには、化合物を好適な微粒径に細かく砕き、同様に細かく砕いた医薬担体、例えばでんぷん又はマンニトールのような食用炭水化物と共に混合する。香味料、保存料、分散剤及び着色剤を配合してもよい。
【００４８】
カプセル剤を製造するには、上記のように粉末混合物を調製し、成形したゼラチンシース（gelatin sheath）に充填する。充填作業に先だって、コロイド状シリカ、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、又は固体のポリエチレングリコール等の潤滑剤及び滑沢剤を粉末混合物に添加してもよい。カプセル剤を摂取する際の医薬品の有効性を改善するために、寒天、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム等の崩壊剤又は可溶化剤を添加することもできる。
【００４９】
さらに、所望により又は必要であれば、好適な結合剤、滑沢剤、崩壊剤及び着色剤を混合物に配合することもできる。好適な結合剤として、デンプン、ゼラチン、天然の糖類（グルコース、β-ラクトース等）、コーン甘味剤、天然及び合成のガム（アラビアガム、トラガカント、アルギン酸ナトリウム等）、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ワックス等が挙げられる。これらの剤形中で用いられる滑沢剤としては、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム等がある。崩壊剤としては、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガム等があるが、これらに限らない。錠剤を製造するには、例えば粉末混合物を調製し、顆粒化又はスラグ化し、滑沢剤及び崩壊剤を加えて打錠する。粉末混合物を調製するには、好適に粉砕した化合物を、上記のような希釈剤又は基剤と、場合により結合剤（カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン等）、溶解抑制剤（パラフィン等）、吸収促進剤（第四級塩等）及び/又は吸収剤（ベントナイト、カオリン、リン酸二カルシウム等）と混合する。粉末混合物を顆粒化するには、シロップ、デンプンペースト、アカディア粘液、又はセルロースもしくはポリマー材料の溶液等の結合剤を用いて湿らせてから、スクリーンを通過させることができる。顆粒化の別法として、粉末混合物を打錠機にかけて、不完全に成形されたスラグにし、そのスラグを破壊して顆粒にすることができる。ステアリン酸、ステアリン酸塩、タルク、又は鉱油を添加することにより、顆粒を滑らかにして、形成する色素が錠剤に付着するのを防止することができる。続いて、その滑沢剤を添加した混合物を錠剤に圧縮する。本発明の化合物を自由流動性の不活性担体と混合し、顆粒化又はスラグ化工程を経ずに直接圧縮して錠剤とすることもできる。シェラックのシールコーティング、糖もしくはポリマー材料のコーティング、及びワックスの光沢コーティングからなる透明又は不透明な保護コーティングを施すことができる。異なる単位投薬量を区別できるよう、これらのコーティングに色素を添加することもできる。
【００５０】
溶液剤、シロップ剤、及びエリキシル剤等の経口液剤は、一定量が既定量の化合物を含むように単位剤形として調製することができる。シロップ剤を調製するには、化合物を好適に香味付けした水溶液に溶解させることができる。一方、エリキシル剤を調製するには、無毒性のアルコール性媒体を用いる。懸濁液剤を製剤化するには、化合物を無毒性の媒体に分散させることによりできる。可溶化剤及び乳化剤（エトキシル化イソステアリルアルコール及びポリオキシエチレンソルビトールエーテル等）、防腐剤、香味添加剤（ペパーミント油、天然甘味料、サッカリン又は他の人工甘味料等）等を添加することもできる。
【００５１】
必要に応じて、経口投与用の単位用量製剤をマイクロカプセル化することができる。例えば粒状物質をポリマー、ワックス等でコーティングするか、又はその中に埋め込むことによって、この製剤の放出を長期化又は持続するように調製することもできる。
【００５２】
本発明で用いる薬剤は、リポソームデリバリーシステム、例えば小さい単層小胞、大きな単層小胞、及び多重層小胞等の形で投与することもできる。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミン又はホスファチジルコリン等の種々のリン脂質から形成することができる。
【００５３】
本発明で用いられる薬剤を、化合物分子と結合する個々の担体として、モノクローナル抗体を用いることによって、送達することもできる。この化合物を、標的化可能な薬物担体としての可溶性ポリマーと結合させてもよい。そのようなポリマーとして、パルミトイル残基で置換された、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド-フェノール、ポリヒドロキシエチルアスパルトアミドフェノール又はポリエチレンオキシドポリリジンがある。さらにこの化合物を、薬物の制御放出に有用なクラスの生分解性ポリマーと結合させることもでき、例えばポリ乳酸、ポリεカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレート、及びヒドロゲルの架橋型又は両親媒性のブロックコポリマーがある。
【００５４】
経皮投与に適した医薬製剤は、レシピエントの表皮に長期間接触した状態にできる個別のパッチ剤として提供することができる。例えば、活性成分をイオントフォレシスによりパッチ剤から送達することができ、イオントフォレシスについてはPharmaceutical Research, 3(6), 318 (1986)に概説されている。
【００５５】
局所投与に適した医薬製剤は、軟膏剤、クリーム剤、懸濁液剤、ローション剤、粉剤、溶液剤、ペースト剤、ゲル剤、スプレー剤、エーロゾル剤、又はオイル剤として製剤化することができる。
【００５６】
眼又は他の外部組織（例えば口や皮膚）を治療する場合には、製剤を局所軟膏剤又はクリーム剤として適用することが好ましい。軟膏剤として製剤化する場合は、活性成分をパラフィン系又は水混和性の軟膏基剤と共に用いることができる。あるいは、活性成分を、水中油型クリーム基剤又は油中水型基剤を用いて、クリーム剤として製剤化することもできる。
【００５７】
眼への局所投与に適した医薬製剤としては点眼薬があり、この場合活性成分を好適な担体（特に水性溶媒）中に溶解又は懸濁させる。
【００５８】
口内への局所投与に適した医薬製剤としては、ロゼンジ剤、トローチ剤、及び口内洗浄剤がある。
【００５９】
直腸投与に適した医薬製剤を、座薬又は浣腸として提供することができる。
【００６０】
担体が固体である鼻腔内投与に適した医薬製剤として、例えば20〜500ミクロンの範囲にある粒子サイズの粗い粉末があり、これは鼻から吸引する方法で、即ち鼻の近くに保持した粉末の容器から、鼻孔へ急速に吸入することにより、投与される。経鼻スプレー剤又は点鼻薬として投与するための、担体が液体である好適な製剤としては、活性成分を含む水溶液又は油性溶液がある。
【００６１】
吸入投与に適した医薬製剤には、各種の定量式加圧エアゾール、ネブライザー又はインサフレーターによって発生させることができる、微粒子状のダスト又はミストがある。
【００６２】
膣内投与に適した医薬製剤を、ペッサリー、タンポン、クリーム、ジェル、ペースト、フォーム、又はスプレー製剤として提供することができる。
【００６３】
非経口投与に適した医薬製剤には、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、及び対象となるレシピエントの血液と製剤とを等張にする溶質を含みうる水性及び非水性の無菌注射溶液、並びに懸濁化剤と増粘剤を含みうる水性及び非水性の無菌懸濁液が含まれる。これらの製剤は、単位用量又は複数回用量の容器（例えば、密閉アンプル及びバイアル）に入れて提供することができ、また、使用直前に無菌の液状担体（例えば、注射用の水）を添加するだけでよい凍結乾燥状態で保存することができる。即時注射用の溶液及び懸濁液は、無菌の粉剤、顆粒剤及び錠剤から調製することができる。
【００６４】
上で特に挙げた成分に加えて、製剤には、その製剤の種類を考慮して、当技術分野で慣用の他の物質が含まれ得ることは理解されるべきであり、例えば、経口投与に適する製剤は香味剤を含むことができる。
【００６５】
式(I)の化合物の二トシル酸塩の経口製剤については、国際特許出願番号PCT/US2006/014447（出願日が２００６年４月１８日、WO 2006/113649として２００６年１０月２６日に公開）に記載されている。
【００６６】
上記のように、治療上有効な量の式(I”)の特定の化合物を、哺乳動物に投与する。一般的に、本発明の投与剤の１つの治療上有効な量は、多くの要因に依存しており、例えば哺乳動物の年齢及び体重、治療を要する正確な状態、その状態の重篤度、製剤の種類並びに投与経路が挙げられる。最終的には、治療上有効な量は、治療にあたる医師又は獣医によって決められることになる。
【００６７】
以下の実施例は例示にすぎなく、いかなる場合も本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【００６８】
本明細書では、これらの方法、スキーム及び実施例で用いる記号及び慣用語は、最新の科学文献、例えばJournal of the American Chemical Society又はJournal of Biological Chemistryで用いられるものに一致する。アミノ酸残基を表すために、標準的な一文字又は三文字表記が一般に用いられるが、アミノ酸は、特に指定しない限り、L体であるものとする。特に断らない限り、出発物質はすべて市販品の供給元から入手し、それ以上精製をせずに使用した。特に、実施例及び本明細書全体を通して以下の略号が用いられる：
g(グラム);                          mg(ミリグラム);
L(リットル);                        mL(ミリリットル);
μL(マイクロリットル);              psi(ポンド/平方インチ);
M(モル);                            mM(ミリモル);
N(ノーマル);                        Kg(キログラム);
i.v.(静脈内)                        Hz(ヘルツ);
MHz(メガヘルツ);                    mol(モル);
mmol(ミリモル)                      RT(室温)
min(分);                            h(時);
mp(融点);                           TLC(薄層クロマトグラフィー);
Tr(保持時間);                       RP(逆相);
DCM(ジクロロメタン);                DCE(ジクロロエタン);
DMF(N,N-ジメチルホルムアミド);      HOAc(酢酸);
TMSE(2-(トリメチルシリル)エチル);   TMS(トリメチルシリル);
TIPS(トリイソプロピルシリル);       TBS(t-ブチルジメチルシリル);
HPLC(高圧液体クロマトグラフィー);
THF(テトラヒドロフラン);            DMSO(ジメチルスルホキシド);
EtOAc(酢酸エチル);                  DME(1,2-ジメトキシエタン);
EDTA                                エチレンジアミン四酢酸
FBS                                 ウシ胎仔血清
IMDM                                イスコフ改変ダルベッコ培地
IMS                                 工業用メタノール変性アルコール
PBS                                 リン酸緩衝食塩水
RPMI                                ロズウェルパーク記念研究所
RIPA緩衝液                          *
RT                                  室温
*150mM NaCl、50mM Tris-HCl、pH7.5、0.25%(w/v)-デオキシコール酸塩、1%NP-40、5mMオルトバナジウム酸ナトリウム、2mMフッ化ナトリウム、及びプロテアーゼインヒビターカクテル。
【００６９】
別段の指示が無い限り、全ての温度は℃（摂氏）で表される。特に指定しない限り、全ての反応は、室温にて不活性雰囲気のもとで行われる。
【００７０】
GW572016Fとはラパチニブであり、化学名は、N-{3-クロロ-4-[(3-フルオロベンジル)オキシ]フェニル}-6-[5-({[2-(メタンスルホニル)エチル]アミノ}メチル)-2-フリル]-4-キナゾリンアミン二トシル酸塩一水和物である。
【実施例１】
【００７１】
GW572016Fの調製
段階１
【化６】
2010510990.tif 000007
【００７２】
撹拌した3H-6-ヨードキナゾリン-4-オン(化合物A) のトルエン(5容量)懸濁液を、20〜25℃にてトリ-n-ブチルアミン(1.2当量)で処理し、90℃に加熱した。続いて、オキシ塩化リン(1.1当量)を加え、反応混合物を加熱還流した。反応混合物を50℃に冷却し、トルエン(5容量)を加えた。化合物C(1.03当量)を固体で加え、そのスラリーを90℃に再加熱し、1時間撹拌した。スラリーを第二容器に移し替え、第一容器をトルエン(2容量)で洗浄し、反応混合物と混合した。反応混合物を70℃に冷却し、内容物の温度を68〜72℃に保持しながら、撹拌したスラリーに1.0M水酸化ナトリウム水溶液(16容量)を、1時間かけて滴下した。混合物を65〜70℃で1時間撹拌し、1時間かけて20℃に冷却した。懸濁液を20℃で2時間撹拌し、生成物をろ過にて回収後、水(3x5容量)及びエタノール(IMS、2x5容量)で順次洗浄し、50〜60℃で真空乾燥した。
【００７３】
容量は用いた化合物Ａの量をもとに見積もった。
【００７４】
観察されたパーセント収率範囲：白色又は黄色結晶として90〜95％。
【００７５】
段階２
【化７】
2010510990.tif 000008
【００７６】
N-{3-クロロ-4-[(3-フルオロベンジル)オキシ]フェニル}-6-ヨード-4-キナゾリンアミン（化合物Ｄ）(1重量)、ボロン酸（化合物Ｅ）(0.37重量、1.35当量)、及び10％パラジウム木炭（palladium on charcoal）(0.028重量、50%の水湿潤)の混合物を、IMS(15容量)中にてスラリー化した。得られた懸濁液を5分間撹拌し、ジイソプロピルエチルアミン(0.39容量、1.15当量)で処理し、約70℃で約3時間加熱したところ、反応は終了した（HPLC分析により決定）。その反応混合物をテトラヒドロフラン(THF、15容量)で希釈し、加熱濾過（hot-filter）し、触媒を除去した。容器をIMS(2容量)で洗浄した。
【００７７】
p-トルエンスルホン酸一水和物(1.5重量、4当量)の水(1.5容量)溶液を、65℃に保温したろ液に、5〜10分間かけて加えた。結晶化後、その懸濁液を60〜65℃で1時間撹拌し、1時間かけて約25℃に冷却し、さらにこの温度で2時間撹拌した。固形物をろ過にて回収し、IMS(3容量)で洗浄後、約50℃で真空乾燥し、黄色〜橙色の結晶性固体として化合物Ｆを得た（約5%w/wエタノールを含んだエタノール溶媒和物として単離した）。
【００７８】
段階３
【化８】
2010510990.tif 000009
【００７９】
化合物Ｆ(1重量)及び2-(メチルスルホニル)エチルアミン塩酸塩(0.4重量、1.62当量)をTHF(10容量)中で懸濁させた。続いて、酢酸(0.354容量、4当量)及びジイソプロピルエチルアミン(DIPEA、1.08容量、4.01当量)を加えた。得られた溶液を30〜35℃で約１時間撹拌後、22℃に冷却した。続いて、ナトリウムトリアセトキシボロハイドライド(0.66重量、2.01当量)を連続チャージ（continual charge）で約15分間かけて加えた（この時点で多少の発泡が観察される）。得られた混合物を約22℃で約2時間撹拌し、HPLC分析用にサンプルを採取した。反応物に水酸化ナトリウム水溶液(25%w/w、3容量)、続いて水(2容量)を加えて反応を停止させ、約30分間撹拌した（苛性アルカリ添加の開始時に多少の発泡が観察された）。
【００８０】
続いて、その水相を分離し、THF(2容量)にて抽出し、合わせたTHF抽出物を25%w/v塩化アンモニウム水溶液(2x5容量)2で２回洗浄した。p-トルエンスルホン酸一水和物(p-TSA、0.74重量、2.5当量)の水(1容量)1溶液を調製し、約60℃に加熱し、GW572016F(化合物G)(0.002重量)を播種した。
【００８１】
浴槽温度を60±3℃に保ちながら、GW572016の遊離塩基を含むTHF溶液をp-TSA溶液に少なくとも30分間かけて加えた。得られた懸濁液を約60℃で1〜2時間撹拌し、1時間かけて20〜25℃に冷却し、この温度で約1時間静置した。固体をろ過にて回収し、95:5のTHF:水(3x2容量)で洗浄し、約35℃で真空乾燥したところ、明黄色結晶性固体であるGW572016F（化合物Ｇ）を得た。予想収率は理論の80%であり、117%w/wであった。
【００８２】
1  最小反応容量は約1容量
2  最大反応容量は約17容量
#  分析のために補正。
【００８３】
段階4 
【化９】
2010510990.tif 000010
【００８４】
N-{3-クロロ-4-[(3-フルオロベンジル)オキシ]フェニル}-6-[5-({[2-(メタンスルホニル)エチル]アミノ}メチル)-2-フリル]-4-キナゾリンアミン(1重量)の二トシル酸塩一水和物（化合物Ｇ）を含むテトラヒドロフラン(THF、14容量)及び水(6容量)の懸濁液を、約55〜60℃で30分間加熱すると溶液が得られ、その溶液をろ過によって透明にし、ライン（line）をTHF/水(7:3比、2容量)で洗浄し、結晶化容器中に入れた。得られた溶液を加熱還流し、テトラヒドロフラン(9容量、95%w/w、水との共沸混合物)を大気圧で留去した。
【００８５】
その溶液にN-{3-クロロ-4-[(3-フルオロベンジル)オキシ]フェニル}-6-[5-({[2-(メタンスルホニル)エチル]アミノ}メチル)-2-フリル]-4-キナゾリンアミン二トシル酸塩一水和物(0.002重量)を播種した。いったん結晶が確立した後、反応温度を55℃より高く保ちながら、水(6容量)を加えた。続いて、その混合物を約2時間かけながら5〜15℃に冷却した。固体をろ過にて回収し、テトラヒドロフラン/水(3:7比、2容量)に続いてテトラヒドロフラン/水(19:1比、2容量)で洗浄し、45℃で真空乾燥し、明黄色結晶性固体としてN-{3-クロロ-4-[(3-フルオロベンジル)オキシ]フェニル}-6-[5-({[2-(メタンスルホニル)エチル]アミノ}メチル)-2-フリル]-4-キナゾリンアミン二トシル酸塩一水和物（化合物Ｇ）を得た。
【実施例２】
【００８６】
ラパチニブ及びペメトレキセドの投薬
最も効能のある単一薬剤より強く腫瘍の細胞増殖を阻害する２つの薬剤による併用治療の効能を定量化するよう設計した統計解析法を用いて、ラパチニブ及びペメトレキセドによる併用治療と、各々による単一治療とを比較した。ヒト肺腫瘍細胞(Calu3、NCI-H322、NCI-H1650及びNCI-H1975：アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより得られる非小細胞肺癌株)を、10%ウシ胎仔血清を含むRPMI1640で、37℃、95％空気、5%CO2にて加湿培養器中で培養した。続いて、細胞を96ウェル組織培養プレート(Falcon、3075)中で、所定の播種密度（Calu-3、10000細胞/ウェル、NCI-H322、 5000細胞/ウェル、NCI-H1650、10000細胞/ウェル、NCI H1975、5000細胞/ウェル）で解析した。播種してから約24時間後、順次10回2倍希釈したペメトレキセド、ラパチニブ(双方の薬剤で、10〜0.020マイクロモル)又は併用した２つの薬剤を、細胞に作用させた。DMSOの最終濃度は、全てのウェルで0.6%であった。細胞を化合物の存在下で3日間培養した。その後、培地をアスピレーションで除去した。1ウェルあたり90マイクロリットルのメチレンブルー(Sigma、M9140、1:1エタノール:水中0.5%)で細胞染色し、少なくとも30分間室温でインキュベートし、細胞バイオマスを測定した。染色剤を除去し、脱イオン水への浸漬によってプレートを洗浄し、空気乾燥した。細胞から染色剤を脱離させるため、100マイクロリットルの可溶化溶液(PBS中、1%N-ラウロイルサルコシン、ナトリウム塩、シグマL5125)を加え、プレートを約30分間穏やかに振とうした。その後、マイクロプレートリーダーで620nMの光学密度を測定した。細胞増殖の阻害率を、媒体を処理した対照ウェルと比較して計算した。各単一治療投薬のペアーについて、併用治療の阻害率を二つの単一治療のうちより効能のあるものと比較し、併用治療が単一治療の各々より効能のある確率を決定した(p値)。Ｔ統計を行うため、全ての投薬対についてのp値を用いた。-3未満のＴ統計値の場合、併用治療の方が最も良い単一の薬剤を用いた場合よりも良いことを示す。3より大きいＴ統計値の場合は、併用治療の方が最も良い単一の薬剤を用いる場合よ
りも悪いことを示す。Ｔ統計値が-3より大きく、3より小さい場合は、併用治療が最も良い単一の薬剤を用いる場合と同じであることを示す。
【００８７】
結果
【表１】
2010510990.tif 000011
【国際調査報告】
2010510990.tif 000013