(57)【要約】  本発明は、変異レオウイルスおよび遺伝子操作されたＩＳＶＰを提供する。具体的には、本発明は、シグマ３ポリペプチドを欠く、もしくはその発現減少を呈する、または機能性シグマ３ポリペプチドを欠く、変異レオウイルスを提供する。本明細書に記載される変異レオウイルスは、ＩＳＶＰを発生させ、安定して繁殖させるために使用することができる。該変異レオウイルスを含む組成物、ならびにこのような変異レオウイルスを使用する方法もまた提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の突然変異を含む変異レオウイルスであって、前記第１の突然変異は、シグマ３ポリペプチドの発現を減少させる、シグマ３ポリペプチドの発現を本質的に排除する、または機能性シグマ３ポリペプチドの不在をもたらす、変異レオウイルス。
【請求項２】
前記第１の突然変異は、前記シグマ３ポリペプチドをコードする核酸内、または前記シグマ３ポリペプチドの発現を調整する核酸内にある、請求項１に記載の変異レオウイルス。
【請求項３】
前記核酸は、Ｓ４遺伝子である、請求項２に記載の変異レオウイルス。
【請求項４】
前記第１の突然変異は、遺伝子操作された置換である、請求項１に記載の変異レオウイルス。
【請求項５】
前記第１の突然変異は、１つもしくは複数のヌクレオチドの遺伝子操作された挿入または欠失である、請求項１に記載の変異レオウイルス。
【請求項６】
１つもしくは複数のさらなる突然変異をさらに含む、請求項１に記載の変異レオウイルス。
【請求項７】
前記さらなる突然変異は、
ミュー１ポリペプチドの発現を減少させる、ミュー１ポリペプチドの発現を本質的に排除する、もしくは機能性ミュー１ポリペプチドの不在をもたらす突然変異、
ラムダ２ポリペプチドの発現を減少させる、ラムダ２ポリペプチドの発現を本質的に排除する、もしくは機能性ラムダ２ポリペプチドの不在をもたらす突然変異、および／または
シグマ１ポリペプチドの発現を減少させる、シグマ１ポリペプチドの発現を本質的に排除する、もしくは機能性シグマ１ポリペプチドの不在をもたらす突然変異、からなる群から選択される、請求項６に記載の変異レオウイルス。
【請求項８】
前記第１の突然変異は、前記シグマ３ポリペプチドの発現を少なくとも３０％減少させる、請求項１に記載の変異レオウイルス。
【請求項９】
感染性サブウイルス粒子（ＩＳＶＰ）である、遺伝子操作されたレオウイルス。
【請求項１０】
前記レオウイルスＩＳＶＰは、シグマ３ポリペプチドの発現減少を呈するように、シグマ３ポリペプチドの発現を欠くように、または非機能性シグマ３ポリペプチドを発現するように遺伝子操作される、請求項９に記載のレオウイルスＩＳＶＰ。
【請求項１１】
前記レオウイルスＩＳＶＰは、第１の突然変異を含むように遺伝子操作される、請求項１０に記載のレオウイルスＩＳＶＰ。
【請求項１２】
前記第１の突然変異は、前記シグマ３ポリペプチドをコードする核酸内、または前記シグマ３ポリペプチドの発現を調整する核酸内にある、請求項１１に記載のレオウイルスＩＳＶＰ。
【請求項１３】
前記核酸は、前記Ｓ４遺伝子である、請求項１２に記載のレオウイルスＩＳＶＰ。
【請求項１４】
前記第１の突然変異は、置換である、請求項１１に記載のレオウイルスＩＳＶＰ。
【請求項１５】
前記第１の突然変異は、１つもしくは複数のヌクレオチドの挿入または欠失である、請求項１１に記載のレオウイルスＩＳＶＰ。
【請求項１６】
１つもしくは複数のさらなる突然変異をさらに含む、請求項１１に記載のレオウイルスＩＳＶＰ。
【請求項１７】
前記さらなる突然変異は、
ミュー１ポリペプチドの発現を減少させる、ミュー１ポリペプチドの発現を本質的に排除する、もしくは機能性ミュー１ポリペプチドの不在をもたらす突然変異、
ラムダ２ポリペプチドの発現を減少させる、ラムダ２ポリペプチドの発現を本質的に排除する、もしくは機能性ラムダ２ポリペプチドの不在をもたらす突然変異、および／または
シグマ１ポリペプチドの発現を減少させる、シグマ１ポリペプチドの発現を本質的に排除する、もしくは機能性シグマ１ポリペプチドの不在をもたらす突然変異、からなる群から選択される、請求項１６に記載のレオウイルスＩＳＶＰ。
【請求項１８】
前記シグマ３ポリペプチドの発現を少なくとも３０％減少させる、請求項１０に記載のレオウイルスＩＳＶＰ。
【請求項１９】
増大した感染力を有するレオウイルスを作製する方法であって、
変異レオウイルスを生成するように第１のレオウイルスを突然変異させるステップであって、前記変異レオウイルスは、シグマ３ポリペプチドの発現減を呈する、シグマ３ポリペプチドの発現を欠く、または非機能性シグマ３ポリペプチドを発現する、ステップと、
前記変異レオウイルスを単離するステップであって、前記変異レオウイルスは、前記第１のレオウイルスと比較して増大した感染力を有する、ステップと、を含む、方法。
【請求項２０】
前記増大した感染力は、前記第１のレオウイルスと比較して、前記変異レオウイルスによって感染することができる腫瘍細胞の範囲の増加、または前記第１のレオウイルスと比較して、前記変異レオウイルスによって感染される細胞の数の増加によって証明される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
遺伝子操作されたレオウイルス感染性サブウイルス粒子（ＩＳＶＰ）を得る方法であって、
シグマ３ポリペプチドの発現減少を呈すように、シグマ３ポリペプチドの発現を欠くように、または非機能性シグマ３ポリペプチドを発現するように、第１のレオウイルスを遺伝子操作するステップと、
前記遺伝子操作されたレオウイルスを培養するステップと、
ＩＳＶＰを単離し、それによって遺伝子操作されたレオウイルスＩＳＶＰを得るステップと、を含む、方法。
【請求項２２】
被検体における増殖性疾患を治療する方法であって、請求項１に記載の前記変異レオウイルス、または請求項９に記載の前記遺伝子操作されたレオウイルスＩＳＶＰを前記被検体に投与するステップを含む、方法。
【請求項２３】
手術、化学療法、放射線治療、および免疫抑制療法からなる群から選択される手順のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１に記載の前記変異レオウイルス、または請求項９に記載の前記遺伝子操作されたレオウイルスＩＳＶＰを含む、医薬組成物。
【請求項２５】
１つもしくは複数の化学療法薬および／または１つもしくは複数の免疫抑制剤をさらに含む、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
突然変異を含むシグマ３ポリペプチドであって、前記突然変異は、ウイルスのカプシドに組み込まれない、または減少されたレベルで前記カプシドに組み込まれるシグマ３ポリペプチドをもたらす、シグマ３ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本出願は、２００７年５月２１日提出の米国暫定出願第６０／９３９，２５５号の利益を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
レオウイルスの増殖感染を確立する能力は、外側カプシドのタンパク質分解を必要とする。タンパク質分解は、細胞膜を貫通する能力を有し、それによってウイルスの遺伝子発現に必要な細胞質成分へのアクセスを得る、中間サブビリオン粒子（ＩＳＶＰ）と称される形状にビリオンを変換する。また、ＩＳＶＰを発生させるための無傷のレオウイルスビリオンの部分的なタンパク質分解は、キモトリプシンまたはトリプシン等のプロテアーゼを使用して、体内で行うことができる。例えば、Ｇｏｌｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００２，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ７６：７４３０−４３）およびＣｈａｎｄｒａｎ  ＆  Ｎｉｂｅｒｔ  （１９９８，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ７２：４６７−７５）を参照されたし。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｇｏｌｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００２，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ７６：７４３０−４３）
【非特許文献２】Ｃｈａｎｄｒａｎ  ＆  Ｎｉｂｅｒｔ  （１９９８，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ７２：４６７−７５）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本開示は、シグマ３ポリペプチドを欠く、またはその発現減少を呈する、あるいは機能性シグマ３ポリペプチドを欠く、変異レオウイルスについて記載する。本明細書に記載される変異レオウイルスは、ＩＳＶＰを発生させ、安定して繁殖させるために使用することができる。
【０００５】
シグマ３ポリペプチドの発現を減少させる、シグマ３ポリペプチドの発現を本質的に排除する、または機能性シグマ３ポリペプチドの不在をもたらす、第１の突然変異を含む変異レオウイルスを記載する。第１の突然変異は、シグマ３ポリペプチドをコードする核酸内、またはシグマ３ポリペプチドの発現を調整する核酸内にあってもよい。場合によっては、核酸は、Ｓ４遺伝子である。代表的な突然変異には、１つもしくは複数のヌクレオチドの遺伝子操作置換、遺伝子操作挿入または欠失を含む。通常、第１の突然変異は、シグマ３ポリペプチドの発現を少なくとも３０％減少させる。
【０００６】
本明細書に記載されるように、変異レオウイルスは、１つもしくは複数のさらなる突然変異を含むことができる。さらなる突然変異は、ミュー１ポリペプチドの発現を減少させる、ポリペプチドの発現を本質的に排除する、もしくは機能性ミュー１ポリペプチドの不在をもたらす突然変異、ラムダ２ポリペプチドの発現を減少させる、ラムダ２ポリペプチドの発現を本質的に排除する、もしくは機能性ラムダ２ポリペプチドの不在をもたらす突然変異、および／またはシグマ１ポリペプチドの発現を減少させる、シグマ１ポリペプチドの発現を本質的に排除する、もしくは機能性シグマ１ポリペプチドの不在をもたらす突然変異であってもよい。
【０００７】
また、遺伝子操作されたレオウイルス感染性サブウイルス粒子（ＩＳＶＰ）も提供する。そのようなレオウイルスＩＳＶＰは、シグマ３ポリペプチドの発現減少を呈するように、シグマ３ポリペプチドの発現を欠くように、または非機能性シグマ３ポリペプチドを発現するように、遺伝子操作することができる。本明細書に記載されるように、レオウイルスＩＳＶＰは、第１の突然変異を含むように遺伝子操作することができる。該第１の突然変異は、シグマ３ポリペプチドをコードする核酸内、またはシグマ３ポリペプチドの発現を調整する核酸内にあってもよい。場合によっては、核酸は、Ｓ４遺伝子である。代表的な突然変異には、１つもしくは複数のヌクレオチドの置換、および挿入または欠失を含む。通常、第１の突然変異は、シグマ３ポリペプチドの発現を少なくとも３０％減少させる。
【０００８】
本明細書に記載されるように、変異レオウイルスは、１つもしくは複数のさらなる突然変異を含むことができる。さらなる突然変異は、ミュー１ポリペプチドの発現を減少させる、ポリペプチドの発現を本質的に排除する、もしくは機能性ミュー１ポリペプチドの不在をもたらす突然変異、ラムダ２ポリペプチドの発現を減少させる、ラムダ２ポリペプチドの発現を本質的に排除する、もしくは機能性ラムダ２ポリペプチドの不在をもたらす突然変異、および／またはシグマ１ポリペプチドの発現を減少させる、シグマ１ポリペプチドの発現を本質的に排除する、もしくは機能性シグマ１ポリペプチドの不在をもたらす突然変異であってもよい。
【０００９】
増大した感染力を有するレオウイルスを作製するための方法を提供する。そのようなレオウイルスは、シグマ３ポリペプチドの発現減少を呈する、シグマ３ポリペプチドの発現を欠く、または非機能性シグマ３ポリペプチドを発現し、変異レオウイルスを単離する、変異レオウイルスであって、第１のレオウイルスと比較して増大した感染力を有する、変異レオウイルスを発生させるために、第１のレオウイルスを突然変異させることによって作製することができる。増大した感染力は、第１のレオウイルスと比較して、変異レオウイルスによって感染することができる腫瘍性細胞の範囲の増加、または第１のレオウイルスと比較して、変異レオウイルスによって感染される細胞数の増加によって、証明することができる。
【００１０】
また、遺伝子操作されたレオウイルス感染性サブウイルス粒子（ＩＳＶＰ）を得る方法も提供する。そのような方法は、シグマ３ポリペプチドの発現減少を呈するように、シグマ３ポリペプチドの発現を欠くように、または非機能性シグマ３ポリペプチドを発現するように、第１のレオウイルスを遺伝子操作するステップと、遺伝子操作されたレオウイルスを培養するステップと、ＩＳＶＰを単離し、それによって遺伝子操作されたレオウイルスＩＳＶＰを得るステップと、を含む。
【００１１】
被検体における増殖性疾患を治療する方法を、さらに提供する。そのような治療の方法は、本明細書に開示される変異レオウイルス、または本明細書に開示される遺伝子操作されたレオウイルスＩＳＶＰを被検体に投与するステップを含む。また、そのような方法は、手術、化学療法、放射線治療、および免疫抑制療法から選択される、少なくとも１つの手順を含む。
【００１２】
本明細書に記載される変異レオウイルスまたは本明細書に記載される遺伝子操作されたレオウイルスＩＳＶＰを含む、医薬組成物が提供される。そのような医薬組成物は、１つもしくは複数の化学療法薬および／または１つもしくは複数の免疫抑制剤をさらに含むことができる。
【００１３】
また、ウイルスのカプシドに組み込まれない、または減少したレベルでカプシドに組み込まれる、シグマ３ポリペプチドをもたらす突然変異を含む、シグマ３ポリペプチドを提供する。
【００１４】
別段の定義がない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学的用語は、本発明の方法および組成物が属する当該技術分野において通常の技術を有する者に一般に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または同等の方法および材料は、本発明の方法および組成物の実施または試験において使用できるが、適切な方法および材料は、以下に説明する。加えて、材料、方法、および実施例は、単なる例証であり、限定することを意図しない。本明細書において言及されるすべての発行物、特許出願、特許、および別の参考文献は、それら全体を参照することによって本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】レオウイルスビリオンおよびレオウイルスＩＳＶＰの構造要素を示す、概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
シグマ３ポリペプチドを欠く、またはその発現減少を呈する、あるいは機能性シグマ３ポリペプチドを欠く、変異レオウイルスを本明細書において説明する。シグマ３ポリペプチドをコードする、または調整する核酸内の突然変異を含むことに加えて、また、本明細書に記載される変異レオウイルスは、他の外側カプシドタンパク質の１つもしくは複数の中に、さらなる突然変異を含むことができる。本明細書に提供される変異レオウイルスは、多代継代のためのＩＳＶＰとして安定して繁殖させることができる、中間サブビリオン粒子（ＩＳＶＰ）を発生させるために、使用することができる。ＩＳＶＰは、通常、レオウイルス自体と比較して、増大した感染力および／または免疫原性の低下を呈するが、ＩＳＶＰは、通常、安定した方法で繁殖する能力に欠けている。対照的に、変異レオウイルスによって形成される該ＩＳＶＰは、酵素処理等によって作られたＩＳＶＰとは異なり、複数回の複製で安定した繁殖を示す。
【００１７】
変異レオウイルスおよびその作製方法
本明細書に記載されるように、変異レオウイルスは、シグマ３ポリペプチドの発現を減少させる、または本質的に排除する、あるいは機能性シグマ３ポリペプチドの不在をもたらす、第１の突然変異を含むことができる。シグマ３ポリペプチドの発現を排除する、または機能性シグマ３ポリペプチドの不在をもたらす突然変異は、該シグマ３ポリペプチドをコードする核酸（すなわち、Ｓ４遺伝子）内、または該シグマ３ポリペプチドの発現もしくは機能を調整するポリペプチドをコードする核酸内にあってもよい。
【００１８】
該シグマ３ポリペプチドは、長さが３６５のアミノ酸であり、４１ｋＤａの分子量を有する。無傷ビリオンは、６００の該シグマ３ポリペプチドの複製物を含む。該シグマ３ポリペプチドは、例えば、ミュー１、ラムダ２、およびシグマ１を含む他の外側カプシドタンパク質と相互作用する可能性が高く、また、ＲＮＡの選択またはＲＮＡのパッケージングに関係し得る。レオウイルスビリオンの像は、該シグマ３ポリペプチドが、ビリオンの表面上に指のように突起し、ビリオンの密度に大きく関係することを示す。図１を参照されたし。
【００１９】
本明細書で使用される場合、シグマ３ポリペプチドの発現を減少させる突然変異とは、シグマ３ポリペプチドの野生型レベルを発現するレオウイルスと比較して、少なくとも３０％（例えば、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％）のシグマ３ポリペプチドの量の減少をもたらす突然変異を指す。本明細書で使用される場合、シグマ３ポリペプチドの発現を本質的に排除する突然変異とは、野生型レオウイルスによって生成されるシグマ３ポリペプチドの量と比較して、少なくとも９５％（例えば、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）のシグマ３ポリペプチドの量の減少をもたらす、突然変異を指す。本明細書で使用される場合、機能性シグマ３ポリペプチドの減少または不在をもたらす突然変異とは、シグマ３ポリペプチドを発現するが、ウイルスのカプシドをアセンブルすることができない、またはカプシドに組み込むことができない、シグマ３ポリペプチドをもたらす、突然変異を指す。変異レオウイルスが繁殖する能力を保持できるように、シグマ３ポリペプチドが他の機能性（例えば、ＲＮＡを結合する能力）を保持することが望ましい、またはその必要がある場合があることが理解されるであろう。
【００２０】
本明細書に記載されるように、シグマ３ポリペプチド内の突然変異は、突然変異（例えば、野生型シグマ３ポリペプチド）を含まないシグマ３ポリペプチドと比較して、減少したレベルでカプシドに組み込まれる、シグマ３ポリペプチドをもたらすことができる。本明細書に記載されるように、また、シグマ３ポリペプチド内の突然変異は、ウイルスのカプシドに組み込むことができないシグマ３ポリペプチドをもたらすことができる。いずれかの特定の機構に束縛されるものではないが、シグマ３ポリペプチドは、シグマ３ポリペプチドおよびミュー１ポリペプチドの適切に結合する能力の無さ、またはシグマ３ポリペプチドのカプシドへの組み込みを減少させるまたは妨げる構造変化のため、低減した機能、または機能の欠失を有し得る。
【００２１】
本開示に係る変異レオウイルスは、哺乳類オルトレオウイルス３型であってもよい。哺乳類オルトレオウイルス３型には、ＤｅａｒｉｎｇおよびＡｂｎｅｙ株（それぞれ、Ｔ３ＤまたはＴ３Ａ）を含むが、これらに限定されない。例えば、ＡＴＣＣ受入番号ＶＲ−２３２およびＶＲ−８２４を参照されたし。本明細書に記載されるように、変異レオウイルスは、自然に発生した突然変異または遺伝子操作された突然変異を含むことができる。例えば、自然発生レオウイルス（例えば、患者から等、自然のソースから単離された）は、突然変異させることができる、または該シグマ３ポリペプチドを発現しない、もしくは機能性シグマ３ポリペプチドを欠く、組み換えレオウイルス（例えば、米国特許第７，１６３，６７８号を参照）を発生させることができる。Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００６，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ８０：６７１−８１）、Ｅｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，    （２００１，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ７５：３１９７−２０６）、およびＷｅｔｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ７１：１３６２−９）によって記載されるもの等のＳ４遺伝子内に突然変異を担持するレオウイルスは、そのような突然変異が機能性シグマ３ポリペプチドを発現すると考えられるため、本突然変異の一員ではなく、それから除外されることに留意されたい。
【００２２】
本明細書で言及する突然変異は、１つもしくは複数のヌクレオチドの置換または挿入または欠失であり得る。点突然変異としては、例えば、単発性ヌクレオチド転位（プリンからプリンまたはピリミジンからピリミジン）、または塩基転換（プリンからピリミジンまたはその逆）、および単発性または多発性ヌクレオチド欠失または挿入が挙げられるが、これらに限定されない。核酸における突然変異は、構造変化、または機能の喪失もしくは部分的喪失をもたらし得る、コード化したポリペプチドにおける１つもしくは複数の保守的または非保守的アミノ酸置換、その地点からコード化される全く異なるポリペプチドをもたらす翻訳の読み枠におけるシフト（「フレームシフト」）、切断されたポリペプチドをもたらす早期終止コドン（「切断」）を生じ得るか、またはレオウイルス核酸における突然変異は、コード化したポリペプチドを全く変化させない場合がある（「サイレント」または「ナンセンス」）。保守的および非保守的アミノ酸置換に関する開示は、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｏｖｅｒｉｎｇｔｏｎ，１９９３，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２３３：７１６−３８、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１０９１５−１９、および米国特許第４，５５４，１０１号を参照されたし。
【００２３】
突然変異は、当該技術分野において既知の任意の数の方法を使用して、レオウイルスの核酸に生成することができる。例えば、部位特異的突然変異誘発法を使用して、レオウイルスの核酸配列を修飾することができる。部位特異的突然変異誘発の最も一般的な方法の１つは、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発である。配列において所望の変更をコード化するオリゴヌクレオチドは、対象となるＤＮＡの１つの鎖にアニールさせ、ＤＮＡ合成を開始するためのプライマとして作用する。このように、該配列変更を含む該オリゴヌクレオチドは、新しく合成された鎖に組み込まれる。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ，  １９８５，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８２：４８８；  Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７，  Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  １５４：３６７；  Ｌｅｗｉｓ  ＆  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，  １９９０，  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １８：３４３９；  Ｂｏｈｎｓａｃｋ，  １９９６，  Ｍｅｔｈ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ５７：１；  Ｄｅｎｇ  ＆  Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ，  １９９２，  Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ２００：８１、およびＳｈｉｍａｄａ，  １９９６，  Ｍｅｔｈ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ５７：１５７を参照されたし。他の方法も、タンパク質またはポリペプチドの配列を修飾するために、当技術分野で日常的に使用される。例えば、突然変異を含有する核酸は、ＰＣＲまたは化学合成を使用して生成するか、またはアミノ酸配列に所望の変更を有するポリペプチドは、化学的に合成することができる。例えば、Ｂａｎｇ  ＆  Ｋｅｎｔ，２００５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０２：５０１４−９、およびその中の参考文献を参照されたし。
【００２４】
該シグマ３ポリペプチドの発現を消失もしくは減少させる、または非機能性もしくは低減機能性シグマ３ポリペプチドをもたらす突然変異に加えて、本明細書に記載されるように、また、変異レオウイルスは、他のレオウイルスカプシドポリペプチド（例えば、ミュー１、ラムダ２、および／またはシグマ１）のうちの１つの中に、１つもしくは複数のさらなる突然変異（例えば、第２の、第３の、または第４の突然変異）を含むことができる。該シグマ３ポリペプチドに影響を与える突然変異を含むレオウイルス、および任意に、他の外側カプシドタンパク質のいずれかまたはすべての中のさらなる突然変異は、そのような変異レオウイルスの感染する、または細胞溶解を引き起こす能力のために、選別することができる。例えば、本明細書に記載される変異レオウイルスを選別するために、野生型レオウイルスによる溶解に耐性を示す腫瘍細胞を使用することができる。
【００２５】
例えば、さらなる突然変異は、ミュー１ポリペプチドの発現を減少させる、もしくは本質的に排除する、または機能性ミュー１ポリペプチドの不在をもたらすことができる。Ｍ２遺伝子によってコードされるミュー１ポリペプチドは、細胞透過に関与する可能性が高く、転写酵素の活性化に関係し得る。それぞれのビリオンは、シグマ３ポリペプチドとの１：１錯体の形状で提供される、約６００のミュー１ポリペプチドの複製物を含む。該ミュー１ポリペプチドは、Ｎ末端上でミリストレート化され、次いでミリストレート化されたＮ末端４２残基が切断され、Ｃ末端フラグメント（ミュー１Ｃ）をもたらす。さらに、または代替として、さらなる突然変異は、ラムダ２ポリペプチドの発現を減少させる、もしくは本質的に排除する、または機能性ラムダ２ポリペプチドの不在をもたらすことができ、および／あるいはさらなる突然変異は、シグマ１ポリペプチドの発現を減少させる、もしくは本質的に排除する、または機能性シグマ１ポリペプチドの不在をもたらすことができる。該ラムダ２ポリペプチドは、Ｌ２遺伝子によってコードされ、粒子集合に関与し、グアニリルトランスフェラーゼおよびメチルトランスフェラーゼ活性を呈する。シグマ１ポリペプチドは、Ｓ１遺伝子によってコードされ、細胞付着性に関与し、ウイルス血球凝集素としての役割を果たす。
【００２６】
レオウイルス粒子からの核酸は、市販の標準核酸手法を使用して単離することができる。また、例えばＳｃｈｉｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｏｒｔｈｏｒｅｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，”  Ｃｈ  ５２，  ｉｎ  Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  Ｋｎｉｐｅ  ＆  Ｈｏｗｌｅｙ，  ｅｄｓ．，  ２００６，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓも参照されたし。本明細書で使用される場合、単離した核酸とは、通常それらが結合している他の核酸から分離された核酸を指す。したがって、単離した核酸は、非レオウイルス性（例えば、宿主細胞）核酸を本質的に含まないレオウイルス性核酸、または他のゲノム分節に対応する核酸を本質的に含まないレオウイルス性ゲノム分節を含むが、これらに限定されない。加えて、単離した核酸には、組み換えまたは合成核酸等の操作された核酸を含むことができる。
【００２７】
本明細書に記載されるように、変異レオウイルスは、当該技術分野において既知の方法を使用して、感染性サブウイルス粒子（ＩＳＶＰ、例えば遺伝子操作されたＩＳＶＰ）を生成する、シグマ３ポリペプチドに影響を与える第１の突然変異を少なくとも含むゲノム分節を再構成することによって、発生させることができる。例えば、Ｓｃｈｉｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｏｒｔｈｏｒｅｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，”  Ｃｈ  ５２，  ｉｎ  Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  Ｋｎｉｐｅ  ＆  Ｈｏｗｌｅｙ，  ｅｄｓ．，  ２００６，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  １９６９，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ３９（４）：７９１−８１０、および米国特許第７，１８６，５４２号、同第７，０４９，１２７号、同第６，８０８，９１６号、および同第６，５２８，３０５号を参照されたし。また、変異レオウイルスは、プラスミド系逆遺伝学系を使用して、レオウイルスゲノム分節を発現させ、ＩＳＶＰを生成することによって、発生させることができる。例えば、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７，  Ｃｅｌｌ  Ｈｏｓｔ  ＆  Ｍｉｃｒｏｂｅ，  １：１４７−５７を参照されたし。本明細書で使用される場合、遺伝子操作された、または変異ＩＳＶＰは、変異レオウイルスであり、少なくとも該シグマ３ポリペプチドに影響を与える、遺伝子操作された、または自然に発生した突然変異を担持するレオウイルスから発生したＩＳＶＰを指す。本明細書に記載されるＩＳＶＰは、安定しており、多（例えば、１を超える、例えば、２、３、４、５、１０、２０、５０、またはそれ以上）代継代のためのＩＳＶＰとして繁殖させることができる。
【００２８】
本明細書に記載される、遺伝子操作されたＩＳＶＰを介して、またはプラスミドによる逆遺伝学系によって生成される変異レオウイルスは、例えば、ヒト腫瘍細胞またはＬ９２９マウス線維芽細胞内で培養することができる。本明細書に開示される変異レオウイルスは、該シグマ３ポリペプチドを欠くレオウイルス株に対してのみ許容状態である細胞内で培養することができる。本明細書に記載される変異レオウイルスを継代するために、そのような細胞株を使用することは、突然変異の選択を可能にし、また、突然変異の復帰を低減または予防するために使用することができる。
【００２９】
変異レオウイルスは、標準手法を使用して、精製することができる。例えば、Ｓｃｈｉｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｏｒｔｈｏｒｅｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，”  Ｃｈ  ５２，  ｉｎ  Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  Ｋｎｉｐｅ  ＆  Ｈｏｗｌｅｙ，  ｅｄｓ．，  ２００６，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  １９６９，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ３９（４）：７９１−８１０、ならびに米国特許第７，１８６，５４２号、同第７，０４９，１２７号、同第６，８０８，９１６号、および同第６，５２８，３０５号を参照されたし。該シグマ３ポリペプチドを含むレオウイルスを除去し、該シグマ３ポリペプチドを欠く突然変異が流入できるようにするために、例えば、該シグマ３ポリペプチドに特異的な抗体を用いて、親和性クロマトグラフィを使用することができる。本明細書で使用される場合、精製された変異レオウイルスとは、それらに自然に付随する細胞構成要素から分離されたレオウイルスを指す。通常、レオウイルスは、それらが乾燥重量で少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％）であり、それらが自然に結合するタンパク質および他の細胞構成要素を含まない場合に、「精製された」と見なされる。
【００３０】
本明細書に記載される変異レオウイルスは、非変異レオウイルス（例えば、制御レオウイルス）と比較して、増大した感染力および／または免疫原性の低下を呈し、そのような形質に基づいて選択することができる。増大した感染力は、機能性シグマ３ポリペプチドを発現するレオウイルス（例えば、無傷ビリオン、例えば、野生型レオウイルス）と比較して、変異レオウイルスによって感染される腫瘍細胞の範囲および／または細胞の数の増加によって証明することができる。変異レオウイルスの免疫原性の低下は、そのような変異レオウイルスの、被検体において有意な免疫学的応答を誘発する能力の無さによって証明することができる。また、本明細書に記載される変異レオウイルスは、より早い複製の速度、より速いパッケージングの速度、アポトーシスを誘発する能力、ヒト腫瘍細胞株への溶解に影響を与え、それを効率的に死亡させる能力、有効な腫瘍エピトープを放出する能力、標準的化学療法との相互作用、およびウイルス増殖数の増加を含むが、これらに限定されない、他の望ましい形質のために、選別および選択することができる。さらに、変異レオウイルスは、腫瘍細胞（例えば、活性Ｒａｓ経路を有する哺乳類細胞）を溶解性感染させる能力のために、選択することができる。例えば、米国特許第７，０５２，８３２号を参照されたし。
【００３１】
修飾配列を有するレオウイルスを使用する方法
これまでに説明されているとおり（例えば、米国特許第６，１１０，４６１号、第６，１３６，３０７号、第６，２６１，５５５号、第６，３４４，１９５号、第６，５７６，２３４号、および第６，８１１，７７５号を参照されたし）、レオウイルスは、宿主細胞のＲａｓ経路機構を使用して、二本鎖ＲＮＡ活性タンパク質キナーゼ（ＰＫＲ）、ひいては細胞内複製を下方制御する。これらの発見に基づき、レオウイルスを使用して、マウス、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ブタ、非ヒト霊長類、およびヒト等の哺乳類における増殖性疾患を治療するための方法が開発されている。本明細書に記載の変異レオウイルスを使用して、被検体における増殖性疾患を治療することができる。
【００３２】
「増殖性疾患」は、細胞が正常な組織の増殖よりも速く増殖する、任意の細胞障害である。したがって、「増殖細胞」は、正常細胞よりも速く増殖している細胞である。増殖性疾患としては、腫瘍とも称される新生物が挙げられるが、これに限定されない。新生物としては、膵癌、乳癌、脳腫瘍（例えば、膠芽細胞腫）、肺癌、前立腺癌、結腸直腸癌、甲状腺癌、腎癌、副腎癌、肝臓癌、１型神経線維腫症、および白血病を含むが、これらに限定されない。新生物は、充実性新生物（例えば、非上皮性悪性腫瘍または癌腫）または造血系に影響を及ぼす癌性増殖（例えば、リンパ腫または白血病）であり得る。他の増殖性疾患としては、神経線維腫症が挙げられるが、これに限定されない。
【００３３】
一般に、レオウイルスを治療として使用する増殖性疾患において、増殖細胞の少なくとも一部は、Ｒａｓ遺伝子（またはＲａｓシグナル伝達経路の因子）が、直接（例えば、Ｒａｓにおける活性突然変異による）または間接的に（例えば、Ｒａｓ経路における上流または下流要素の活性化による）活性化される突然変異を有し得る。Ｒａｓ経路における上流因子の活性化は、例えば、表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）またはＳｏｓを用いる形質転換を含む。例えば、Ｗｉｅｓｓｍｕｌｌｅｒ  ＆  Ｗｉｔｔｉｎｇｈｏｆｅｒ，  １９９４，  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，  ６（３）：２４７−２６７；  ａｎｄ  Ｂａｒｂａｃｉｄ，  １９８７，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ５６，  ７７９−８２７を参照されたし。Ｒａｓ経路における下流要素の活性化は、例えば、Ｂ−ｒａｆ内の突然変異を含む。例えば、Ｂｒｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００２，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ６２：６９９７−７０００）を参照されたし。加えて、レオウイルスは、ＰＫＲの突然変異または調節障害によって引き起こされる増殖性疾患を治療するために有用である。（１９９８，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  １７：３３５１−６２）を参照されたし。
【００３４】
本明細書に記載の変異レオウイルスは、増殖性疾患を有する哺乳類に投与することができる。本明細書で使用される場合、投与とは、変異レオウイルス（例えば、ＩＳＶＰ）が増殖細胞に接触するようなレオウイルスのデリバリーを指す。変異レオウイルスを投与する経路は、疾患の種類および増殖細胞の位置に依存する。種々の投与経路を採用することができ、以下の例を一例として提供し、いかようにも制限することを意味しない。
【００３５】
充実性新生物の場合、例えば、変異レオウイルスは、腫瘍への直接注射、または注射、注入等による全身投与（例えば、静脈内投与）を含む方法によって投与することができる。造血新生物の場合、例えば、変異レオウイルスは、静脈内投与または経脈管投与することができる。転移性新生物、または脳腫瘍等の新生物の場合、例えば、変異レオウイルスは、体内で全身に輸送されるように投与することができる（例えば、骨髄内、静脈内、または筋肉内）。変異レオウイルスは、例えば、皮下的投与法、腹腔内投与法（例えば、卵巣新生物の場合）、局部的投与法（例えば、黒色腫の場合）、経口的投与法（例えば、口腔または食道新生物の場合）、直腸的投与法（例えば、結腸直腸新生物の場合）、経膣的投与法（例えば、子宮頚部または膣新生物の場合）、経鼻的投与法、または吸引スプレーによって（例えば、肺新生物の場合）、投与することができる。変異レオウイルスは、複数の経路によって、および／または被検体における複数の位置に投与することができる。
【００３６】
本明細書で開示される変異レオウイルスは、増殖性疾患を治療するために十分な量（例えば、「有効量」）で投与する。増殖性疾患は、変異レオウイルスの増殖細胞への投与が、細胞の溶解（例えば、腫瘍崩壊）に影響を及ぼし、増殖細胞の数の減少、新生物の大きさの減少、および／または増殖性疾患に関連する症状（例えば、疼痛）の減少または排除をもたらす場合に、治療する。腫瘍崩壊という用語が、本明細書で使用される場合、増殖細胞の少なくとも１０％が溶解される（例えば、細胞の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、または７５％が溶解される）ことを意味する。溶解のパーセンテージは、例えば、哺乳動物の新生物の大きさまたは増殖細胞数の減少を測定する、または（例えば、増殖細胞のバイオプシーから）生体外の細胞溶解量を測定することによって決定することができる。
【００３７】
変異レオウイルスの有効量は、個別の基準で決定され、少なくとも一部は、使用された特定の変異レオウイルス、個体の体格、年齢、性別、および増殖細胞の大きさおよび他の性質に基づき得る。例えば、ヒトの治療の場合、存在する増殖細胞または新生物の種類、大きさ、および数に応じて、変異レオウイルスの約１０３〜１０１２プラーク作製単位（ＰＦＵ）を使用することができる。該有効量は、体重１ｋｇ当たり約１．０ＰＦＵ〜体重１ｋｇ当たり約１０１５ＰＦＵであり得る（例えば、体重１ｋｇ当たり約１０２ＰＦＵ〜体重１ｋｇ当たり約１０１３ＰＦＵ）。変異レオウイルスは、１回量または多回量（例えば、２回、３回、４回、６回、またはそれ以上）で投与することができる。多回量は、同時にまたは（例えば、数日または数週間の期間をかけて）連続して投与することができる。変異レオウイルスを用いる治療は、数日から数ヶ月、または疾患の減退が達成されるまで継続してもよい。
【００３８】
本明細書で開示される変異レオウイルスは、手術または増殖細胞（例えば、新生物）の除去と併せて、投与できることが想定される。変異レオウイルスは、放射線治療と併せて、または放射線治療に加えて、投与できることも想定される。さらに、変異レオウイルスは、抗癌性化合物、化学療法薬、および／または免疫抑制剤と併せて、またはそれらに加えて、投与できることが想定される。このような薬剤としては、５−フルオロウラシル、マイトマイシンＣ、メトトレキサート、ヒドロキシウレア、ゲムシタビン、シクロホスファミド、ダカルバジン、ミトキサントロン、アントラサイクリン（例えば、エピルビシンおよびドキソルビシン）、チューブリン安定化剤（例えば、ビンカアルカロイド）、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，  Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，  ＣＡ）等の受容体に対する抗体、エトポシドおよびプレグナソーム、カルボプラチンおよびシスプラチン等の白金化合物、ＴＡＸＯＬ（登録商標）（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ）およびＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ  ＳＡ，  Ａｎｔｏｎｙ，  Ｆｒａｎｃｅ）等のタキサン、タモキシフェンおよび抗エストロゲン等のホルモン療法、インターフェロン、アロマターゼ阻害剤、プロゲステロン剤、ＬＨＲＨ類似体が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に開示される変異レオウイルスは、ＩＬ−２、ＴＮＦアルファ、ＶＥＧＦ、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、およびレラキシン（必ずしもこれらに限定されない）等の血管透過剤と併せて、またはこれらに加えて投与できることも想定される。
【００３９】
医薬組成物
本明細書に開示される変異レオウイルスを含む医薬組成物を提供する。例えば、米国特許第６，５７６，２３４号を参照されたし。１つもしくは複数の変異レオウイルスに加えて、医薬組成物は典型的に、医薬的に容認可能な担体を含む。医薬的に容認可能な担体は、変異レオウイルスに対する媒体、担体、または培地として作用する固体、半固体、または液体材料を含む。したがって、例えば、変異レオウイルスを含む組成物は、錠剤、ピル、粉末、トローチ剤、小袋、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、乳液、溶液、シロップ、エアロゾル（固体としてまたは液体培地中）、例えば、重量で最大１０％の活性成分を含有する軟膏、軟質および硬質ゼラチンカプセル、座薬、無菌注射液、および無菌のパッケージ化された粉末の形態である。
【００４０】
適切な担体の一部の実施例は、リン酸緩衝化生理食塩水または別の生理的に容認可能な緩衝液、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、スターチ、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、滅菌水、シロップ剤、およびメチルセルロースを含む。医薬組成物は、追加として、タルク、ステアリン酸マグネシウム、および鉱油などの平滑剤、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、安息香酸メチルおよび安息香酸プロピルヘキセドリンなどの保存剤、甘味剤、および香料添加剤を含み得るが、これらに限定されない。医薬組成物は、当技術分野において既知の処置を採用することによって、変異レオウイルスを迅速に、持続的に、または遅延的に放出するように、製剤化することができる。以下に説明する製剤に加えて、医薬組成物に使用するための他の適切な製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  （２００３，  Ｇｅｎｎａｒｏ  ＆  Ｇｅｎｎａｒｏ，  ｅｄｓ．，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｅｎｓ）に見出される。
【００４１】
錠剤等の固体組成物を調製する場合、変異レオウイルスを、医薬担体と混合して固体組成物を作製することができる。任意に、錠剤またはピルをコーティングするか、または別の方法で化合して、持続性作用の利益を提供する剤形を提供することができる。例えば、錠剤またはピルは、内部投与および外部投与成分を含み、後者は、前者を覆うエンベロープ形体である。２つの成分は、胃内の分解に抵抗するように機能する腸溶層によって分離され、内部成分が無傷で十二指腸を通過し、または遅延放出することを可能にする。かかる腸溶層またはコーティングには種々の材料を使用することができ、かかる材料としては、多くのポリマー酸、およびポリマー酸とセラック、セチルアルコール、および酢酸セルロース等の材料との混合物が挙げられる。
【００４２】
経口投与または注入用の変異レオウイルスを含む液体製剤としては、水溶液、適切に味を付けたシロップ、水性または油性懸濁液、およびコーン油、綿実油、ごま油、ココナッツ油、またはピーナッツ油等の食用油を含む味を付けた乳化剤、ならびにエリキシル剤および同様の医薬賦形剤が挙げられる。
【００４３】
吸入用または吹き入れ用の組成物は、医薬的に容認可能な水性または有機溶媒中の溶液および懸濁液、またはそれらの混合物、および粉末を含む。これらの液体または固体組成物は、本明細書で説明される適切な医薬的に容認可能な賦形剤を含み得る。かかる組成物は、局所または全身的作用のために、経口または経鼻呼吸経路によって投与することができる。医薬的に容認可能な溶媒中の組成物は、不活性ガスの使用によって噴霧してもよい。噴霧された溶液は、噴霧装置から直接吸入することができるか、または噴霧装置は、フェイスマスクテントまたは間欠型陽圧人工呼吸器に取り付けることができる。溶液、懸濁液、または粉末組成物は、適切な方法で製剤をデリバリーする装置から、経口的または経鼻的に投与することができる。
【００４４】
本開示の方法で採用することができる別の製剤は、経皮的デリバリー装置（例えば、パッチ）を採用する。かかる経皮的パッチを使用して、本明細書に記載の変異レオウイルスを連続的または断続的に注入することができる。医薬剤をデリバリーするための経皮パッチの構成および使用は、当技術分野において既知である。例えば、米国特許第５，０２３，２５２号を参照されたし。かかるパッチは、変異レオウイルスの連続的、パルス型、またはオンデマンドのデリバリー用に構成することができる。
【００４５】
必要に応じて、変異レオウイルスは、リポソームまたはミセルでコーティングし、レオウイルスに対する免疫を発達させた哺乳動物における免疫反応を低減または回避することができる。かかる組成物は、免疫保護レオウイルスと称される。例えば、米国特許第６，５６５，８３１号および７，０１４，８４７号を参照されたし。加えて、本明細書に開示する変異レオウイルス（例えば、シグマ３ポリペプチドまたは機能に欠ける、または不足するもの）は、酵素でタンパク質分解的に処理し、いかなる存在する他のカプシドタンパク質を除去、または部分的に除去することができる。
【００４６】
変異レオウイルス、またはかかる変異レオウイルスを含む医薬組成物は、キットにパッケージ化することができる。キットは、１つもしくは複数の化学療法剤、１つもしくは複数の免疫抑制剤、および／または１つもしくは複数の抗抗レオウイルス抗体）も含むことが想定される。医薬組成物は、単位用量形態で製剤化することができる。「単位用量形態」という用語は、ヒト被験体および他の哺乳動物に対する単位用量として適切な物理的に不連続な単位を指し、各単位は、適切な医薬的に容認可能な担体に関連して、所望の治療効果を生成するように計算された既定量の変異レオウイルスを含有する。
【００４７】
本発明に従って、従来の分子生物学、微小生物学、生化学および組み換えＤＮＡ技術は、当該技術の範囲内で採用し得る。このような技術は、文献内で十分に説明されている。該方法および組成物は、以下の実施例においてさらに説明し、これらは、請求項において説明する発明の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【００４８】
実施例１  変異レオウイルスの発生
プラス鎖ＲＮＡが転写されるように、構成的プロモータまたは誘導プロモータの制御下でＳ４遺伝子の突然変異型を発現するコンストラクトを作製する。一実施例においては、Ｓ４遺伝子の翻訳のための開始コドンを、欠失、挿入、または置換によって、突然変異させる。次いで該コンストラクトを用いて、レオウイルス感受性細胞株を形質転換する。
【００４９】
レオウイルスで形質転換した細胞株を感染させ、必要に応じて、Ｓ４遺伝子の発現を誘発する。該突然変異を含むプラス鎖Ｓ４  ＲＮＡは、パッケージされているが、少なくともコードされた該シグマ３ポリペプチドのカプシドへの組み込みに対して、非機能性である二本鎖変異Ｓ４  ＲＮＡを生成させる、ウイルスＲＮＡ依存型ＲＮＡポリメラーゼの基質である。
【００５０】
形質転換細胞からの子孫ウイルスは、該シグマ３ポリペプチドを発現する野生型レオウイルス、ならびに該シグマ３ポリペプチドを発現しない変異レオウイルスの両方を含む。該シグマ３ポリペプチドを発現しない変異レオウイルスは、裸レオウイルスと称される場合がある。
【００５１】
該裸ウイルスは、例えば、脱殻ステップにおいて妨害を示した細胞株を用いて、プラーク滴定アッセイを使用して選択する。そのような細胞株においては、野生型ウイルスは、効率的に複製することができない。最大のプラークを選択し、拡大する。代替として、該シグマ３ポリペプチドに特異的な抗体を用いて、親和性クロマトグラフィを使用して、該野生型レオウイルスを精製する。該シグマ３ポリペプチドの存在または不在は、ウエスタンブロット法および／または免疫沈降法によって判断する。
【００５２】
材料および方法を、その詳細な説明と併せて説明しているが、前述の説明は、例証を目的とするものであって、添付の請求項の範囲によって定義される、材料および方法の範囲を制限するものではないことを理解されたい。他の態様、利点、および本発明の変形は、以下の請求項の範囲内である。
【００５３】
開示した方法および組成物に使用できる、併用できる、その調製に使用できる、またはその産物を開示する。これらの材料または他の材料を本明細書に開示するが、これらの方法および組成物の組み合わせ、サブセット、グループ等を開示することを理解されたい。すなわち、これらの組成物および方法のそれぞれの種々の個々および集合的な組み合わせおよび入れ替えへの具体的な言及は明確に開示し得ないが、それぞれを、本明細書において具体的に想定および説明する。例えば、レオウイルスの特定の突然変異または特定の方法を開示および議論し、レオウイルスに対して作製できる突然変異の数または方法に対して行うことができる修正について論じる場合、レオウイルスおよび方法の組み合わせおよび入れ替えのそれぞれおよびすべては、矛盾することが明記されない限り、具体的に想定する。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせも具体的に想定および開示する。
【図１】
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【国際調査報告】
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