(57)【要約】基板上に置かれた蛍光サンプルを分析するための装置は、サンプルおよび基板から受ける個々の第１および第２光信号成分から導出される第１および第２電気信号を生成するための第１プロセッサを備える。該装置は、第１および第２電気信号の位相間に位相差が存在するように第１および第２電気信号を生成する。該装置は、第２電気信号を減衰させるための減衰信号を生成するための制御回路を備える。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板上に置かれた蛍光サンプルを分析するための装置であって、
サンプルからの第１光信号成分から由来する第１電気信号および、基板からの第２光信号成分から由来する第２電気信号を生成する第１プロセッサを備え、該装置は、第１および第２電気信号の位相間に位相差が存在するように第１および第２電気信号を生成するものであり、
第２電気信号を減衰させるための減衰信号を生成する制御回路を備える装置。
【請求項２】
制御回路は、第１位相発生器および可変利得モジュールを備え、
第１位相発生器は、減衰信号の位相を設定するように配置され、
可変利得モジュールは、減衰信号の振幅を設定するように配置され、
制御回路は、減衰信号が第２電気信号を打ち消し、あるいは実質的に打ち消すために配置される請求項１記載の装置。
【請求項３】
第１位相発生器は、第２電気信号の位相と等しいか、実質的に等しくなるように減衰信号の位相を設定するように配置される請求項２記載の装置。
【請求項４】
可変利得モジュールは、第２電気信号の振幅と等しいか、実質的に等しくなるように減衰信号の振幅を設定するように配置される請求項２または３記載の装置。
【請求項５】
制御回路は、加算モジュールを備え、加算モジュールは、第２電気信号から減衰信号を引き算することによって、第２電気信号を減衰させるように配置される請求項１〜４のいずれかに記載の装置。
【請求項６】
制御回路は、可変利得モジュールの制御のために、加算モジュールの出力をフィートバックするように配置される、請求項２〜４のいずれかに従属した場合の請求項５記載の装置。
【請求項７】
制御回路は、第２位相発生器を備え、第２位相発生器は、第１混合器によって加算モジュールの出力と混合され、可変利得モジュールの制御のための第１混合信号を生成するようにした出力信号を供給するように配置される請求項６記載の装置。
【請求項８】
第２位相発生器は、第１電気信号の位相と等しいか、実質的に等しい位相を持つように、その出力信号を設定するように配置される請求項１〜７のいずれかに記載の装置。
【請求項９】
装置は、第１位相発生器を較正するための第１較正回路を備え、
第１較正回路は、基板からの第２光信号成分から由来する第３電気信号を生成するための第２プロセッサを備え、
装置は、第１光信号成分から由来する成分を含む第３電気信号なしで第３電気信号を生成するように配置される請求項２〜８のいずれかに記載の装置。
【請求項１０】
第１較正回路は、第１位相発生器の出力信号の位相をシフトさせてシフト信号を生成し、シフト信号は、第２混合器によって第３電気信号と混合されて第２混合信号を生成するようにした直交位相シフタと、
第２混合信号のフィルタを行う第１較正フィルタとを備え、
第１較正フィルタの出力は、第１較正回路の制御入力としてフィードバックされるようにした請求項９記載の装置。
【請求項１１】
装置は、第２位相発生器を較正するための第２較正回路を備え、
第２較正回路は、基板からの第１光信号成分から由来する第４電気信号を生成する第３プロセッサを備え、
装置は、第３プロセッサが第２光信号成分から由来する成分を含む第４電気信号なしで第４電気信号を生成するように配置される請求項７〜１０のいずれかに記載の装置。
【請求項１２】
第２較正回路は、第４電気信号と第２位相発生器の出力を混合して、第３混合信号を生成するための第３混合器と、
第３混合信号のフィルタを行って、第２較正回路の制御入力としてフィードバックするようにした第２較正フィルタとを備える請求項１１記載の装置。
【請求項１３】
基板上に置かれた蛍光サンプルを分析するための装置であって、
蛍光サンプルを励起するための波長可変変調光源と、
蛍光サンプルおよび基板からの光信号成分を受けるための受光器と、
第１位相遅延発生器と、
可変利得モジュールと、
第２位相遅延発生器と、
可変利得モジュールのための制御回路とを備える装置。
【請求項１４】
基板上に置かれた蛍光サンプルを分析するための方法であって、
サンプルからの第１光信号成分から由来する第１電気信号および、基板からの第２光信号成分から由来する第２電気信号を生成することと、
第１および第２電気信号の位相間に位相差が存在するように第１および第２電気信号を生成することと、
第２電気信号を減衰させるための減衰信号を生成することとを含む方法。
【請求項１５】
基板上に置かれた蛍光サンプルを分析するための方法であって、
波長可変変調光源を調整して、蛍光サンプルを励起することと、
蛍光サンプルおよび基板からの光信号成分を受けて、個々の第１および第２電気信号を生成することと、
第１位相遅延発生器、可変利得モジュールおよび第２位相遅延発生器を制御して、第２電気信号を減衰させる減衰回路を生成することとを含む方法。
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれかに記載の装置を用いて、基板上に置かれた蛍光サンプルを分析する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への参照）
米国仮(provisional)特許出願番号第６０／８９９，６５７号（２００７年２月６日付出願、発明の名称「干渉打ち消し技術を用いたバックグラウンド蛍光の除去」）を参照する。この内容は、参照により全体がここで開示されたものとしてここに組み込まれ、この優先権が主張される。
【０００２】
本発明は、基板上に置かれた蛍光サンプルを分析するための装置および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
医療診断ツールは、典型的には、大型で高価な設備、例えば、分光光度計、ガスクロマトグラフィ（ＧＣ）、質量分析計（ＭＳ）、高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、ペーパーおよび薄層クロマトグラフィ（ＰＣ，ＴＬＣ）、蛍光検出技術と組み合わせた電気泳動技術などを必要とする古典的な生化学的な技術を使用している。これらの標準的な分析ツールは、有効かつ効率的に作動する。
【０００４】
しかしながら、該ツールは、高価であり、消耗品、サンプル処理能力、熟練したオペレータを高コストで必要とする。これらの不具合は、迅速で安価なその場(in-situ)医療診断の妨げになる。こうした方法は、退屈で根気のいる処理をしばしば必要とする。従って、これらのツールの多くは、何らかの検査技術によって初期選別された推定陽性サンプルのための確認ツールとして使用される。
【０００５】
定量免疫測定技術は、同様な問題をもたらす。定量免疫測定分析の性能は、長い検査時間、比較的複雑で大型で高価な設備、熟練オペレータの必要性のため、集中した研究所に大きく制限される。こうして分析は、サンプル測定される患者から遠く離れたところで実施される。広範囲の免疫測定がより簡潔な方法で行えるのであれば、より安価で、看護の場所でまたは在宅看護で、数多くの患者の健康を毎年改善できるであろう。
【０００６】
光学バイオセンサは、改善された感度、簡潔性、電磁波干渉耐性などの利点により、免疫測定応用に活用されている主要タイプのバイオセンサである。光学技術の多くのタイプは、バイオセンシング応用として広く用いられる。蛍光ベースのセンサは、おそらく高感度、汎用性、精度、かなり良好な選択性により、最も高度に開発されたものである。
【０００７】
蛍光測定法はまた、小型化に極めて適している。この分野での現在の焦点は、励起光源をマイクロチャネル内のサンプルに集光して、複雑なレンズ、ミラー、光学フィルタのセットを用いてサンプルの蛍光放射を集光することによって、マイクロ流体チャネルの内側にある蛍光ラベル付き検体(analyte)を測定／検出することである。その結果、マイクロ流体基板からの蛍光信号が検出システムに入射して、強く不要な蛍光ノイズを生じさせることがある。測定対象の検体からの蛍光応答は、低い検体濃度に起因してしばしばかなり弱い。その結果、基板の蛍光に起因した蛍光ノイズが、測定対象の検体からの必要な蛍光信号を抑圧することがある。病気の早期検出では、バイオマーカー濃度は病気の早期段階では常に低い。現在のポイントオブケア(point-of-care)システムは、病気の早期検出にとって典型的な低検体濃度を検出するのに限界がある。
【０００８】
２つの手法が、この影響を緩和するために広く用いられる。
【０００９】
１）サンプルが存在する薄層から以外の信号を阻止できる共焦点蛍光顕微鏡の組み込み。この技術は、かなり良好に機能するが、大型で高価で複雑な光学系を必要とする。
【００１０】
２）無蛍光特性又は低い蛍光特性の材料を基板材料として選択する。この目的で光学等級のガラスやシリカが広く用いられている。これらの材料は、可視波長の光で励起された場合に低い自己蛍光を有するためである。しかしながら、これらの材料は、比較的高価であり、これらの材料を用いたマイクロ流体チャネルの製造は、時間を要するフォトマスク生成、フォトリソグラフ、エッチングのプロセスを必要とする。その結果、光学等級のガラスやシリカで製作したマイクロ流体チップは、比較的高価になる。
【００１１】
基板材料としての使用に適したと考えられる候補の安価な材料は、ポリマーベースの材料、例えば、ポリメチルメタクリレート(PMMA)、ポリカーボネート、マイラー(Mylar)などである。さらに、ポリマー材料を用いたマイクロ流体チャネルは、モールディング、エンボス加工、キャスティング、アブレーションのプロセスによって容易に製造できる。ポリカーシートにおける複雑なモデルのマイクロチャネルは、直接書込みレーザシステムを用いて１時間未満で製造されている。
【００１２】
しかしながら、これらの材料は、比較的高い自己蛍光信号を示すため、低検体濃度検出でのこれらの使用を妨げる。ポリマー基板からの蛍光バックグラウンド信号の強度は、マイクロ流体チャネル内のサンプルの蛍光信号よりも２桁大きいことがある。従って、マイクロ流体チップの利用は、ポリマー材料の自己蛍光バックグラウンドノイズを解消し排除できる技術を必要とする。
【００１３】
この技術の背景的議論は、蛍光材料が励起光源からの短いパルスによって励起された場合、材料は、強度が時間とともに指数関数的に減衰するように蛍光を発することを明らかにする。材料の蛍光強度がｔ＝０の初期強度の１／ｅに減衰する時間は、材料の蛍光寿命(lifetime)と称する。一般に、材料の化学組成に起因して、異なる材料は異なる寿命で蛍光を発するようになる。周波数領域では、材料が正弦波で変調された光源によって励起された場合、励起光源の周波数と同一の周波数で正弦波の蛍光信号が発生することになるが、その位相は励起光に対してシフトしている。よって、２つの蛍光材料が正弦波の光源によって励起された場合、２つの信号が検出され、その位相はこれらの個々の蛍光寿命に依存して変化するようになる。
【００１４】
周波数ｆｍｏｄに変調された光が、ポリマーからなるマイクロ流体チャネル内の蛍光ラベル付きサンプルの表面に入射した場合、励起信号が既にフィルタ除去されていると仮定すると、２セットの信号または信号成分が生成される。これらの信号／成分は、（１）測定対象のラベル付き検体が放射する蛍光信号成分と、（２）基板が放射する蛍光バックグラウンドノイズ信号／成分である。これらの２セットの信号は、入射光源と同じ変調周波数を有するが、入射する発振光源に対して異なる位相および振幅である。
【００１５】
これは、２つの信号の電圧−時間特性１００を示す図１に示しており、２つのポリマーの異なる蛍光寿命の差に起因する。マイクロ流体チャネル内に固定化された測定対象の検体は濃度が極めて低いため、２つの信号のうち弱い方を形成するようになる。この弱い信号１０２は、ω＝２πｆｍｏｄとして、ｙｓ（ｔ）＝Ａｓｓｉｎ（ωｔ＋φｓ）と表される。強い信号１０４は不要な信号であり、蛍光バックグラウンドノイズを表す。これは、ｙｎ（ｔ）＝Ａｎｓｉｎ（ωｔ＋φｎ）と表される。
【００１６】
一般に、測定対象の検体および基板から蛍光信号は異なる蛍光寿命を有するため、ｙｓとｙｎの間で位相差が存在する。入射信号に対する２つの信号の位相差は、それぞれφｓおよびφｎで表される。測定対象の弱い蛍光信号ｙｓ（ｔ）の検出を考えると、明らかに問題となる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
一緒に譲渡された国際特許公開第ＷＯ２００７／０４０４５９号は、この分野において幾つかのテクニックを開示している。これらのテクニックの少なくとも１つでは、必要なサンプル蛍光信号を示すシステムからの出力信号は、Ａｓ／２×ｓｉｎ（Δφ）で表される。ここで、Ａｓは、信号の振幅であり、Δφは、必要なサンプル蛍光信号の位相と不要なサンプル蛍光信号の位相との間の位相差である。このテクニックの一例は、添付した図２の回路２０に示している。回路２０の動作の詳細な説明は、ＷＯ２００７／０４０４５９に記載されている。
【００１８】
図２のフォトデテクタＩＩＩによって検出される信号は、ｙｔｏｔａｌ＝Ａｓｓｉｎ（ωｔ＋φｓ）＋Ａｎｓｉｎ（ωｔ＋φｎ）で与えられる。
【００１９】
ノイズ信号を除去するには、位相遅延回路を用いて、ノイズ信号成分Ａｎと直交する他の信号ｑ（ｔ）＝Ａｘｃｏｓ（ωｔ＋φｎ）を生成する。
【００２０】
これらの２つの信号を乗算すると、下記のようになる。
【００２１】
【数１】
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【００２２】
ＡｓＡｘ／２×ｓｉｎ（２ωｔ＋φｓ＋φｎ）と、ＡｎＡｘ／２×ｓｉｎ（２ωｔ＋２φｎ）は、ローパスフィルタによって除去されて、ＡｓＡｘ／２×ｓｉｎ（φｓ−φｎ）が残る。これは、位相差φｓ−φｎに依存したＤＣ信号である。ＡｓＡｘ／２×ｓｉｎ（φｓ−φｎ）は、φｓ−φｎが９０°のとき最大になる。
【００２３】
位相差は、信号ＡｓとノイズＡｎの間の蛍光寿命および、励起光源Ｉの変調周波数に依存する。一例として、フルオレセインとマイラーの場合、蛍光寿命の差は１ｎｓであり、９０°位相差を生成するには、光源Ｉに必要な変調周波数は２５０ＭＨｚである。こうした高い周波数は、ＬＥＤではなく、レーザダイオードを用いて達成できる。
【００２４】
変調周波数への位相差の依存性は正比例ではない。一般に、９０°位相シフトを得ることは可能でない。サンプルに応じて、位相差が最大になる一定の周波数が存在する。それは、そのシステムにとって最適な動作周波数になる。寿命の差が短いほど、この周波数は高くなる。
【００２５】
回路２０で得られるＤＣ出力は、ＡｓＡｘ／２である。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本発明は、独立請求項に定義される。本発明の幾つかの任意の特徴は、従属請求項に定義される。
【００２７】
基板上に置かれた蛍光サンプルを分析するための装置に、ノイズ信号成分を減衰させる減衰信号を生成する制御回路を設けることによって、幾つかの利点が得られる。
【００２８】
第１（必要）信号と第２（ノイズ）信号との間の位相差が、かなり９０°未満であっても、Ａｓで与えられるＤＣ出力が得られる。こうして蛍光サンプル分析装置は、サンプル信号とバックグラウンド信号との間の位相差が９０°でなくても、信号の全振幅Ａｓを復元することが可能である。このことは、光源を、現在必要とされる極めて高い周波数で変調する必要がないことを意味する。今のところＬＥＤについての最大変調周波数は、約１０ＭＨｚである。この周波数を用いて、一例として蛍光寿命の差を１ｎｓとすると、２つの蛍光信号の差は、Δφ＝３．６°と計算される。
【００２９】
ＷＯ２００７／０４０４５９において、回路からの出力信号は、ｓｉｎ（３．６°）／２＝０．０３１４で定義され、３０ｄＢ減衰と等価である（例えば、２５０ｍＶと比べて７．９ｍＶ出力）。
【００３０】
さらに、必要信号と不要信号との間の９０°位相差は、こうした位相差を必要としない請求項１に係る装置によって与えられる出力信号の半分であるＷＯ２００７／０４０４５９からの出力信号を最大化するのに必要である。１ｎｓの寿命の差を用いると、ＷＯ２００７／０４０４５９の光源は２５０ＭＨｚで変調する必要があり、変調周波数はレーザダイオードを用いて達成できるのだけである。
【００３１】
それは実行可能なテクニックではあるが、全体の実施コストは、位相差がかなり９０°未満であっても測定対象の信号を復元でき、高価でないＬＥＤの使用が可能である本テクニックよりも高くなる。
【００３２】
このように位相差１°または２°を提供する周波数で動作するために、最適な動作周波数を設定する必要がない。従って、極めて高い変調周波数を有する必要がない。
【００３３】
本発明について下記図面を参照して例として説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】典型的な必要信号成分および不要信号成分の電圧−時間カーブを示すグラフである。
【図２】基板上に置かれた蛍光サンプルを分析するための知られた回路アーキテクチャを示すブロック図である。
【図３】基板上に置かれた蛍光サンプルを分析するための装置の幾何構成の概略図である。
【図４】基板上に置かれた蛍光サンプルを分析するための装置のアーキテクチャを示すブロック図である。
【図５】基板上に置かれた蛍光サンプルを分析するための第２の装置の回路アーキテクチャを示すブロック図である。
【図６】図５の回路についての必要信号成分および不要信号成分の電圧−時間カーブを示すグラフである。
【図７】図５の回路での較正回路のためのアーキテクチャを示すブロック図である。
【図８】図７の較正回路の信号について電圧−時間カーブを示すグラフである。
【図９】追加の位相ロックループおよび直交(quadrature)位相シフタを用いた、蛍光ノイズキャンセルシステムについてのアーキテクチャを示すブロック図である。
【図１０】図９の回路での較正回路のためのアーキテクチャを示すブロック図である。
【図１１】追加の２つの代替の位相ロックループおよび直交位相シフタを用いた、蛍光ノイズキャンセルシステムのためのアーキテクチャを示すブロック図である。
【図１２】図１１の回路での較正回路のためのアーキテクチャを示すブロック図である。
【図１３】蛍光サンプルを分析するためのさらに代替の回路である。
【図１４】図１３の回路での較正回路のためのアーキテクチャを示すブロック図である。
【図１５】追加の２つの位相ロックループおよび直交位相シフタを用いた、変更した蛍光ノイズキャンセルシステムのレイアウトを示すブロック図である。
【図１６】追加の位相ロックループを備えた、変更した蛍光ノイズキャンセルシステムの較正回路のレイアウトを示すブロック図である。
【図１７】追加の２つの代替の位相ロックループおよび直交位相シフタを用いた、変更した蛍光ノイズキャンセルシステムを提供する他の代替回路１７００を示す。
【図１８】追加の代替の位相ロックループを用いた、他の較正回路１８００のレイアウトを示す。
【図１９】直交位相シフタを用いたノイズキャンセルシステムのための他の回路を示す。
【図２０】変更した蛍光ノイズキャンセルシステムを規定する較正回路２０００を示す。
【図２１】他の変更した蛍光ノイズキャンセルシステムを規定する代替回路２１００を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
図３を参照して、基板上に置かれた蛍光サンプルを分析するための装置の幾何構成を示している。装置３００は、マイクロ流体カード３０２を備え、蛍光サンプル３０４がマイクロ流体カード基板３０２上にあるマイクロ流体チャネル内に置かれている。読み取りノイズ除去ユニット３０６が配置され、蛍光サンプル３０４を励起する光源システム３０８によって光を供給する。
【００３６】
検出システム３０１は、蛍光サンプル３０４からの光およびマイクロ流体カード基板３０２からの反射／ノイズを受光し、読み取りノイズ除去ユニット３０６に伝送されて処理される。ポリカーボネート材料、例えば、ＰＭＭＡ、マイラー(Mylar)などをベースとしたマイクロ流体チャネルは、比較的安価で、容易に製造できるため、ポリカーボネート材料はマイクロ流体応用にとって重要な材料になり、これはしばしば消耗品として考えられる。
【００３７】
しかしながら、ポリカーボネート材料の蛍光バックグラウンドは、特にマイクロ流体チャネル内に固定された測定対象の検体の蛍光強度と比べると、かなり高い。図３のコンパクトで簡単な蛍光検出システム３００は、測定対象の検体３０４の蛍光放射だけでなく、マイクロ流体基板３０２からの蛍光など、照射スポットで発生する他の光放射も拾い上げてしまう。
【００３８】
異なるタイプの光源が、励起光源３０８として使用できる。各種例として、レーザダイオード、ＬＥＤ、広帯域光源など、適切な波長のレーザがある。光源３０８の波長は、検体に付着した蛍光ラベルを励起できるものである必要がある。例えば、蛍光ラベルがフルオレセインである場合、４５０ｎｍ〜５００ｎｍの波長を持つ光源が必要である。光源３０８の波長は、単一波長、即ち、レーザまたはレーザダイオードによって放射される光を有するだけでもよい。しかしながら、レーザ光源は、通常は比較的大きく高価である。さらに、レーザおよびレーザダイオードは、一定の波長で利用可能なだけであり、これは広範囲の異なるタイプの蛍光物質に適していないかもしれない。
【００３９】
使用する光源３０８が、励起波長領域だけでなく蛍光波長領域を網羅するＬＥＤである場合、適切なローパス光学フィルタまたはバンドパス光学フィルタ（不図示）がＬＥＤ３０８とマイクロ流体カード３０２との間に設置できる。光ビーム、特にＬＥＤ３０８からの光ビームは発散して、集光レンズ系がマイクロチャネル内のサンプル３０４に光を集光するように設けられる。
【００４０】
ラベル付き検体３０２および基板３０４からの蛍光放射強度は、励起光源３０８からの光強度に比例する。しかしながら、光源３０８の強度が高すぎる場合、蛍光物質の急速な光破壊または光退色を引き起こすことがある。発明者は、３４６０ｍｃｄを持つ４７０ｎｍの青色ＬＥＤがフルオレセインを励起するのに適した光源であることを見出した。
【００４１】
光源３０８は、測定対象の蛍光信号と不要なノイズ信号との間の位相差が存在するような周波数で変調される。この条件を達成する変調周波数は、蛍光ラベル付き検体３０４の蛍光寿命とマイクロ流体基板３０２の蛍光寿命との間の差に依存する。変調周波数は、式（１）を用いて下記のように計算できる。
【００４２】
【数２】
2010518394.tif 000004
【００４３】
ここで、Δｔは、ラベル付き検体３０４と基板３０２との間の蛍光寿命の差である。
【００４４】
例えば、Δｔ＝１ｎｓであれば、ｆｍｏｄ＝２５０ＭＨｚである。一般に、ＬＥＤが１０ＭＨｚまでしか変調できないことが判っている。従って、高周波の変調が必要である場合、レーザ光源またはレーザダイオードを使用する必要があろう。
【００４５】
上述のように、光源３０８は、必要信号と不要信号との間の位相差が存在するのを確保するように変調された励起周波数を有してもよい。代替として、位相差は、読み取りノイズ除去ユニット３０６において、受光検出システム３１０またはユニット３０６中の処理電子回路のいずれかで発生できる。ここで開示したテクニックの重要な態様は、サンプルおよび基板からの個々の光信号を表す電気信号または信号成分は、両者間で位相差を有することである。
【００４６】
光検出器３１０の動作領域は、測定対象の検体３０４の蛍光波長をカバーする必要がある。例えば、使用する蛍光物質が５００ｎｍ〜６００ｎｍの蛍光波長範囲を有するフルオレセインである場合、光検出器３１０はこの波長範囲に感度を有する必要がある。測定対象の範囲外にある波長を持つ信号フィルタ除去するために、光学フィルタ３１０、ロングパスフィルタまたはバンドパスフィルタを受光器／検出器３１０の前方に設置する必要があるであろう。システム３００での光源３０８は、一定の変調周波数で変調しており、受光器３１０は、その周波数での変調信号に応答できる必要がある。
【００４７】
この方法に適した多くのタイプの受光器／検出器が存在しており、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、光電子増倍管などである。光電子増倍管は、極めて高感度の光検出器であるが、サイズが比較的大きく、高いバイアス電圧（１０００Ｖ）を必要とする。一方、フォトダイオードは安価、コンパクト、簡素であるが、その感度は光電子増倍管ほど良好ではなく、極めて弱い蛍光信号に適していないかもしれない。妥協として、アバランシェフォトダイオードは、比較的安価でコンパクトであり、良好な感度を有する。マルチチャネル検出システムでは、アレイＣＣＤ検出器が良好な選択を提供する。
【００４８】
図４を参照して、基板上に置かれた蛍光サンプルを分析するための第２の装置を説明する。装置４００は、基板４０２上に置かれたサンプル４０４を分析するように配置される。光４０５が検体４０４および基板４０２から放射され、装置４００によって処理される。
【００４９】
装置４００は、第１プロセッサ４０６を備える。第１プロセッサ４０６は、光信号を受光する光学読み取り器（不図示）からの電気信号を受けるように構成してもよく、あるいは、光学読み取り器は第１プロセッサ４０６と一体化してもよい。
【００５０】
第１プロセッサ４０６は、サンプル４０４からの第１光信号成分および基板４０２からの第２光信号成分の両方を含む光信号４０６を受ける。基板４０２およびサンプル４０４から伝送される光は、励起された蛍光サンプル４０４から放射された蛍光、及び／又はサンプルおよび基板を励起する光源（不図示）から直接に反射した光を含んでもよい。
【００５１】
第１プロセッサ４０６は、サンプル４０４からの第１光信号成分から由来する第１電気信号４０８および、基板４０２からの第２光信号成分から由来する第２電気信号４１０を生成する。第１信号４０８および第２信号４１０は、第２電気信号４１０を減衰させるための減衰信号を生成する制御回路４１２に供給される。制御回路４１２の出力信号４１４。制御回路４１２は、第２電気信号４１０を充分または完全に減衰させた場合、出力信号４１２は、事実上、第１電気信号４０８を含む。こうして制御回路４１２は、基板４０２からのバックグラウンド光ノイズを表す第２電気信号４１０を打ち消し、あるいは少なくとも実質的に打ち消す。
【００５２】
図５に移って、基板上に置かれた蛍光サンプルを分析するための他の装置５００について説明する。回路５００は、本例では受光器１である第１プロセッサ５０２を備える。上述のように、受光器は、実際上、サンプル５０９およびマイクロ流体カード５１０からの光信号を処理するための処理電子回路とは分離し、または一体化して設けてもよい。図５の例では、第１プロセッサ５０２は、一体化した受光器および信号処理ユニットであって、光信号を受光し処理して、サンプル５０９からの第１光信号成分から由来する第１電気信号５２８および、マイクロ流体カード基板５１０からの第２光信号成分から由来する第２電気信号５３０を生成する。
【００５３】
さらに、装置は、第２電気信号５３０を減衰させるための減衰信号５３２を生成するための制御回路５０４を備える。
【００５４】
回路アーキテクチャ５００および動作について説明する。上述のように、第１プロセッサ５０２（受光器１）は、サンプル５０９およびマイクロ流体カード５１０からの光信号を受ける。第１プロセッサ５０２で導出された信号５２８，５３０は、加算モジュール５１５に供給される。光源５０６は、正弦波発生器５０８によって起動される。続いて、正弦波発生器５０８は、第１位相発生器５１２（位相遅延１）も起動して、その出力は可変利得モジュール５１４に供給される。可変利得モジュール５１４の出力は、減衰信号を含む信号５３２である。正弦波発生器５０８は、第２位相発生器５１８（位相遅延２）も起動して、その出力は第１混合器５２０に接続される。加算モジュール５１５の出力５３４は、第１混合器５２０にも供給される。混合器５２０の出力は、回路５２２への入力として供給される。回路５２２は、フィルタ５２４（ＬＰＦ３）と、可変利得モジュール５１４を制御するための制御回路５２６とを備える。
【００５５】
以下、回路５００の動作の詳細な数学的解析について説明する。その前に、動作について次のように要約する。第１位相発生器５１２は、減衰信号５３２の位相を設定するように配置され、可変利得モジュール５１４は、減衰信号５３２の振幅を設定するように配置される。制御回路５０４は、減衰信号が第２電気信号成分５３０を打ち消し、あるいは少なくとも実質的に打ち消すために配置される。こうして第１位相発生器５１２は、第２電気信号５３０の位相と等しいか、実質的に等しくなるように減衰信号の位相を設定する。これは、図５に示しており、第１位相発生器５１２の出力は、ｓｉｎ（ωｔ＋φｎ）の形式である。
【００５６】
減衰信号５３２の振幅を設定（調整）するには、可変利得モジュール５１４は、振幅を第２電気信号５３０と等しいか、実質的に等しくなるように設定する。
【００５７】
第２電気信号５３０の減衰は、第１プロセッサ５０２の出力５２８，５３０を加算モジュール５１５に供給することによって行われ、減衰信号５３２は出力５２８，５３０から引き算される。減衰信号５３２が不要信号５３０と同じか、実質的に同じである場合、不要信号５３０は、加算モジュール５１５の出力からキャンセルされる。
【００５８】
制御回路５０４は、可変利得モジュール５１４の制御のために、加算モジュール５１５の出力５３４を混合器５２０にフィートバックする。第２位相発生器５１８（位相遅延２）の出力も混合器５２０にフィートバックされる。混合器５２０の出力は、可変利得モジュール５１４を制御する第１混合信号である。これは、フィルタ５２４および制御回路５２６に供給される。
【００５９】
第２位相発生器５１８は、第１電気信号５２８の位相と等しいか、実質的に等しい位相を持つように、その出力信号５３８を設定する。即ち、位相は、サンプル５０９から第１プロセッサ５０２で受けた必要信号の位相に対して実質的に設定される。
【００６０】
代替として、説明したコンポーネントの全ては、蛍光サンプル５０９を励起するための波長可変(tuneable)変調光源５０６と、蛍光サンプル５０９および基板５１０からの光信号成分を受光するための受光器５０２と、第１位相遅延発生器５１２と、可変利得モジュール５１４と、第２位相遅延発生器５１８と、可変利得モジュール５１４のための制御回路５２２とを備えた単一の装置５００に設けてもよい。
【００６１】
回路５００の動作の数学的解析を説明する。最初に、光源５０６起動５０８の周波数ωｔは、サンプル５０９によって発生する測定対象の信号５２８ｙｓとマイクロ流体カード５１０によって発生する不要信号ｙｎとの間の位相差が存在するように調整される。
【００６２】
加算器５１５の後の信号５３４ｙｓｕｍは、下記のように、サンプル５０９によって発生する信号５２８ｙｓ、マイクロ流体システム５１０によって発生する不要信号ｙｎ、および生成された減衰信号５３２−Ａｖｓｉｎ（ωｔ＋φｎ）で構成される。
【００６３】
【数３】
2010518394.tif 000005
【００６４】
第２位相発生器５１８の出力ｑ２（ｔ）５３８は次のようになる。
【００６５】
【数４】
2010518394.tif 000006
【００６６】
第１混合器５２０において、式（２）で定義される信号５３４と式（３）で定義される信号５３８とを混合すると、下記の式で定義される第１混合信号５４０が得られる。
【００６７】
【数５】
2010518394.tif 000007
【００６８】
こうして第１混合信号５４０は、式（４）においてＤＣ成分とＡＣ成分を含むことが判る。ＡＣ成分がローパスフィルタ５２４（ＬＰＦ３）を用いてフィルタ除去されると仮定すると、下記のように誤差信号ＶｅであるＤＣ成分だけが残る。
【００６９】
【数６】
2010518394.tif 000008
【００７０】
誤差信号Ｖｅは、制御回路５２６に供給されて、利得モジュール５１４の利得Ａｖを調整し、生成された信号５１２の振幅を制御し、不要な基板蛍光信号５３０ｙｎを打ち消す。制御回路５２６は、誤差信号を可変利得増幅器５１４に割り当てる標準の制御回路である。これは、下記の場合に達成される。
【００７１】
【数７】
2010518394.tif 000009
【００７２】
式（２）を用いて、加算モジュール５１５の出力５３４ｙｓｕｍ＝ｙｓとなる。
【００７３】
必要なサンプル蛍光信号５２８の振幅５３６Ａｓは、振幅検出器５３６による出力である。
【００７４】
このテクニックは、不要な基板蛍光信号５３０ｙｎから第１プロセッサ５０２（受光器１）の出力が下記で与えられる場合にも適用可能である。
【００７５】
【数８】
2010518394.tif 000010
【００７６】
信号５３０ｙｎの係数αｋおよび位相φｋ（ｋ＝２．．．∞）は、未知とすることができる。それは、式（６）での信号５３０ｙｎの成分との混合（３）が、下記のようになるからである。
【００７７】
【数９】
2010518394.tif 000011
【００７８】
式（７）で得られた信号およびＡ０ｃｏｓ（ωｔ＋φｓ）は、同じローパスフィルタ５２４（ＬＰＦ３）を用いてフィルタ除去できる。従って、制御回路５３６への誤差信号は、式（５）のＶｅで与えられるものと同じである。よって、加算器５１５の出力は、バンドパスフィルタがＤＣ成分Ａ０およびＶｅ＝０の高次の高調波（ｋ≧２）を除去した後、必要なサンプル蛍光信号５２８ｙｓになる。必要なサンプル蛍光信号５２８ｙｓの振幅Ａｓは、バンドパスフィルタ（図５では不図示）の後、振幅検出器５１６を用いて測定できる。
【００７９】
回路５００の性能評価は、実施した干渉打ち消しテクニックは、変調周波数３ＭＨｚに対応した位相差１．０８度について、必要なサンプル蛍光信号を復元できることを示す。こうしてＬＥＤを用いた低コストの実用化が可能になる。これは、約１０ＭＨｚの最大変調周波数を有する変調範囲内にある所望の変調周波数であるからである。
【００８０】
変調周波数を３ＭＨｚに設定すると、これは位相差１．０８度を与える。必要なサンプル蛍光信号５２８の振幅は、Ａｓ＝０．４Ｖであり、不要な基板蛍光信号５３０は、Ａｎ＝０．８Ｖである。図６は、必要なサンプル蛍光信号５２８が、全体として損失なしで復元できることを示しており、これにより知られたテクニックより著しい改善を提供している。
【００８１】
こうしてこのテクニックの重要な利点は、マイクロ流体チップ内にある測定対象の検体からの極めて弱い蛍光信号を、マイクロ流体基板の蛍光バックグラウンドに起因した、かなり大きな不要な蛍光信号と区別できる点である。これは、基板信号と検体信号との間の位相差が９０°よりかなり小さい低い変調周波数であっても達成可能である。従って、このテクニックにより、高い蛍光特性を持つ材料からなるマイクロ流体チップ内での極めて低い検体濃度の検出が可能になる。
【００８２】
このこのテクニックにより、マイクロ流体基板の蛍光バックグラウンドに起因したノイズ信号の除去が可能であるため、高いバックグラウンド蛍光のポリマー材料がマイクロ流体基板として使用できる。ポリマーシートをマイクロ流体材料として利用することは、低コスト、製造の容易さ、堅牢性など多くの利益を提供する。ポリマーシートは、マイクロ流体基板として広く用いられているような光学等級ガラスやシリカウエハより安価になる傾向がある。従って、マイクロ流体チップのコストは著しく低減できるため、ポイントオブケア(point-of-care)免疫測定システムにおいて消費可能かつ廃棄可能なカートリッジとして取り扱うことが可能になる。ポリマーマイクロ流体チップは頑丈であるため、未熟な研究所アシスタントにも適している。
【００８３】
使用の前に、図５の回路は最初に較正してもよい。図７を参照して、較正テクニックを回路７００を参照して説明する。
【００８４】
回路７００は、第１位相発生器５１２を較正するための第１較正回路７０２と、第２位相発生器５１８を較正するための第２較正回路７０４とを備える。第１較正回路７０２は、基板５１０からの第２光信号成分から由来する第３電気信号７２４を生成するための第２プロセッサ７０６（受光器２）を備える。装置７００は、第１光信号成分から由来する成分を含む第３電気信号なしで第３電気信号７２４を生成するように配置される。後述するように、これは、マイクロ流体カードからサンプルを除去し、マイクロ流体カードを光源５０６からの光に曝すことによって行われる。
【００８５】
第１較正回路７０２は、第１位相発生器５１２からの出力信号７２６の位相をシフトさせる直交(quadrature)位相シフタ７０８をさらに備える。直交位相シフタ７０８の出力は、第３電気信号７２４と混合して、第２混合信号７３０を生成するための第２混合器７１０に供給されるシフトした信号７２８である。
【００８６】
第２混合信号７３０は、第１較正フィルタ７１２（ＬＰＦ４）への入力として供給される。この動作の数学的解析は後述する。第１較正フィルタ７１２の出力信号７３２は、第１較正回路の制御入力を提供する制御モジュール７１４に制御入力としてフィードバックされる。
【００８７】
装置７００の第２較正回路７０４は、第２位相発生器５１８を較正するためのものである。第２較正回路７０４は、基板５１０からの第１光信号成分から由来する第４電気信号７３４を生成する第３プロセッサ７１６（受光器３）を備える。第１プロセッサ７１６は、第２光信号成分から由来する成分を含む第４電気信号７３４なしで第４電気信号を生成する。これは、基板５１０からのバックグラウンド／ノイズ光の無い、サンプル５０９からの光を第３プロセッサ７１６で受けることによって行われる。
【００８８】
第４電気信号７３４は、第２位相遅延発生器５１８の出力７３６と混合するための第３混合器７１８に供給される。第３混合器７１８の出力７３８は、第２較正フィルタ７２０（ＬＰＦ５）に供給される第３混合信号であり、その出力７４０は、第２較正回路７０４の制御入力として、ステージ７２２にフィードバックされる。この数学的解析は後述する。
【００８９】
主回路５００は、較正ステージが位相発生器５１２，５１８を調整するために、全体システムから最初は分離している。これは、第１位相発生器５１２をφｎに調整することを要し、ここで、φｎは不要な基板蛍光信号５３０の位相であり、サンプル５０９無しのマイクロ流体カード５１０が較正システム７００に挿入され、第１位相発生器５１２をφｎに調整する。
【００９０】
同時に、第２位相発生器５１８は、必要な零化群(annihilator)信号ｃｏｓ（ωｔ＋φｓ）５３８を発生するように調整される。ここで、φｓは、必要なサンプル蛍光信号５２８であり、マイクロ流体カード５１０無しのサンプルが較正システム７００に挿入され、第２位相発生器５１８を調整して、ｃｏｓ（ωｔ＋φｓ）を発生する。
【００９１】
不要な第２信号５３０の位相と等しい（またはほぼ等しい）減衰信号の位相を設定する第１位相発生器５１２の調整について説明する。
第２プロセッサ７０６（受光器２）後の信号７２４ｙｎｃ（ｔ）は次のようになる。
【００９２】
【数１０】
2010518394.tif 000012
【００９３】
第１位相発生器５１２の発生信号７２６ｙ１ｇ（ｔ）は次のようになる。
【００９４】
【数１１】
2010518394.tif 000013
【００９５】
直交位相シフタ７０８後のシフトした信号ｑ１ｃ（ｔ）は、下記の式（１０）で与えられることになる。
【００９６】
【数１２】
2010518394.tif 000014
【００９７】
第２混合器７１０での信号７２４（式（８））と信号７２８（式（１０））の混合は、下記の式（１１）で与えられる第２混合信号７３０をもたらす。
【００９８】
【数１３】
2010518394.tif 000015
【００９９】
式（１１）においてＤＣ成分およびＡＣ成分が存在することが判る。ＡＣ成分が第１較正フィルタ７１２（例えば、ローパスフィルタＬＰＦ４）を用いてフィルタ除去されるとすると、誤差信号ＶｅｎであるＤＣ成分だけが残り、信号７３２が下記の式（１２）で与えられる。
【０１００】
【数１４】
2010518394.tif 000016
【０１０１】
誤差信号７３２Ｖｅｎは、制御回路７１４に供給されて、Ｖｅｎ＝０かつ第１位相発生器５１２がφｎに調整されるまで、第１位相発生器５１２を調整する。ここで、φｎは不要な基板蛍光信号５３０の位相である。
【０１０２】
必要なサンプル蛍光信号５２８の位相と等しい（またはほぼ等しい）ように設定するための第２位相発生器５１８の調整について説明する。
【０１０３】
第３プロセッサ７１６（受光器３）後の信号７３４ｙｓｃ（ｔ）は次のようになる。
【０１０４】
【数１５】
2010518394.tif 000017
【０１０５】
第２位相発生器５１８の発生信号７３６ｙ２ｇ（ｔ）は次のようになる。
【０１０６】
【数１６】
2010518394.tif 000018
【０１０７】
第３混合器７１８での信号７３４（式（１３））と信号７３６（式（１４））の混合は、下記の式（１１）で与えられる第３混合信号７３８をもたらす。
【０１０８】
【数１７】
2010518394.tif 000019
【０１０９】
式（１５）においてＤＣ成分およびＡＣ成分が存在することが判る。ＡＣ成分が第２較正フィルタ７２０（例えば、ローパスフィルタＬＰＦ５）を用いてフィルタ除去されるとすると、誤差信号ＶｅｓであるＤＣ成分だけが残り、信号７４０が下記の式（１６）で与えられる。
【０１１０】
【数１８】
2010518394.tif 000020
【０１１１】
誤差信号Ｖｅｓは、制御回路７２２に供給されて、Ｖｅｓ＝０かつ第２位相発生器５２２が必要な零化群(annihilator)信号５３８ｃｏｓ（ωｔ＋φｓ）５３８を発生するように調整されるまで、第２位相発生器５２２を調整する。ここで、φｓは必要なサンプル蛍光信号５２８の位相である。
【０１１２】
このテクニックは、第１位相発生器５１２を基本位相φｎに調整するためにも使用できる。ただし、第２プロセッサ７０６（受光器２）の出力７２４ｙｇｎ（ｔ）は、下記の式（１７）で与えられる。
【０１１３】
【数１９】
2010518394.tif 000021
【０１１４】
信号７２４ｙｇｎ（ｔ）の係数αｋおよび位相φｋ（ｋ＝２，…，∞）は、未知にできる。その理由は、式（１７）のｙｇｎ（ｔ）成分との混合によって下記の式（１８）となるからである。
【０１１５】
【数２０】
2010518394.tif 000022
【０１１６】
式（１８）で得られた信号およびＡ０ｃｏｓ（ωｔ＋φｎ−Δφｎ）は、同じ較正フィルタ７１２（ＬＰＦ４）を用いてフィルタ除去できる。従って、第１位相発生器５１２は、回路７１４を用いて信号ｙｇｎ（ｔ）の基本位相φｎに調整できる。
【０１１７】
同様に、第３プロセッサ７１６（受光器３）の出力７３４  ｙｇｓ（ｔ）は、下記の式（１９）で与えられる。
【０１１８】
【数２１】
2010518394.tif 000023
【０１１９】
信号７３４ｙｇｓ（ｔ）の係数αｋおよび位相φｋ（ｋ＝２，…，∞）は、未知にできる。第２位相発生器５２２が必要な零化群(annihilator)信号７３６  ｃｏｓ（ωｔ＋φｓ）を発生するように調整できることになる。ここで、φｓは、制御回路７２２を用いた信号ｙｇｓ（ｔ）の基本位相である。
【０１２０】
Ａｎｃ＝０．８ＶおよびＡｓｃ＝０．４Ｖの場合、図８は電気信号７２４，７２６，７３４，７３６について電圧−時間特性を示し、較正回路が第１位相発生器５１２をφｎに調整でき、第２位相発生器５２２が必要な零化群(annihilator)信号５３８  ｃｏｓ（ωｔ＋φｓ）を発生するように調整できることを示す。両方の較正ループについて安定な状態での誤差信号はゼロだからである。
【０１２１】
前述の例についての網羅的でない幾つかの変形について説明する。
【０１２２】
図９は、追加の２つの位相ロックループおよび直交(quadrature)位相シフタを用いた、蛍光ノイズキャンセルシステムのアーキテクチャを示す。このシステムアーキテクチャ９００は、次のような１０個の主要なブロックを備える。波長可変(tuneable)変調光源システム［Ｉ］、位相遅延発生器１［ＩＩ］、位相ロックループ回路１［ＩＩＩ］、可変利得Ａｖ［ＩＶ］、サンプル（検体およびマイクロ流体カード）［Ｖ］、受光器１［ＶＩ］、制御回路［ＶＩＩ］、位相遅延発生器２［ＶＩＩＩ］、位相ロックループ回路２［ＩＸ］、および直交位相シフタ［Ｘ］。
【０１２３】
図９の回路の較正は、図１０のアーキテクチャ１０００を参照して説明する。位相遅延発生器の較正は、追加の７個のブロック、即ち、マイクロ流体カード［ＸＩ］、受光器２［ＸＩＩ］、直交位相シフタ［ＸＩＩＩ］、較正回路１［ＸＩＶ］、サンプル［ＸＶ］、受光器３［ＸＶＩ］、および較正回路２［ＸＶＩＩ］を必要とする。
【０１２４】
図１１は、追加の２つの代替の位相ロックループおよび直交位相シフタを用いた、蛍光ノイズキャンセルシステムのための他の代替アーキテクチャを示す。これは、アーキテクチャ１１００として示している。図１１の回路１１００は、図１２の較正回路１２００に従って較正される。
【０１２５】
蛍光サンプルを分析するためのさらに代替の回路１３００を図１３に示す。回路１３００は、追加の直交位相シフタを使用する。図１４は、図１３の回路１３００を較正するための回路アーキテクチャ１４００を示す。
【０１２６】
追加の２つの位相ロックループおよび直交位相シフタを用いた、変更した蛍光ノイズキャンセルシステムのレイアウトを図１５に示す。この図と次の図において、誤差変数は、図５と図７で与えられた制御回路および較正回路２の誤差信号の合計である。誤差変数は、制御回路および較正回路２に供給される。較正回路２および制御回路は、制御ループと較正ループとの間の相互作用に起因して、設計がより難しくなるであろう。
【０１２７】
代替の較正回路１６００を図１６に示す。回路は、追加の位相ロックループを備えた、変更した蛍光ノイズキャンセルシステムである。
【０１２８】
図１７は、追加の２つの代替の位相ロックループおよび直交位相シフタを用いた、変更した蛍光ノイズキャンセルシステムを提供する他の代替回路１７００を示す。
【０１２９】
図１８は、追加の代替の位相ロックループを用いた、他の較正回路１８００のレイアウトを示す。
【０１３０】
図１９は、直交位相シフタを用いたノイズキャンセルシステムのための他の回路１９００を示す。
【０１３１】
図２０は、変更した蛍光ノイズキャンセルシステムを規定する較正回路２０００を示す。図２１は、他の変更した蛍光ノイズキャンセルシステムを規定する代替回路２１００を示す。
【０１３２】
本発明を例を用いて説明したが、添付の請求項の精神および範囲から逸脱することなく、実施例の詳細について種々の変更が可能であることは理解されよう。
【図１】
2010518394.tif 000024
【図２】
2010518394.tif 000025
【図３】
2010518394.tif 000026
【図４】
2010518394.tif 000027
【図５】
2010518394.tif 000028
【図６】
2010518394.tif 000029
【図７】
2010518394.tif 000030
【図８】
2010518394.tif 000031
【図９】
2010518394.tif 000032
【図１０】
2010518394.tif 000033
【図１１】
2010518394.tif 000034
【図１２】
2010518394.tif 000035
【図１３】
2010518394.tif 000036
【図１４】
2010518394.tif 000037
【図１５】
2010518394.tif 000038
【図１６】
2010518394.tif 000039
【図１７】
2010518394.tif 000040
【図１８】
2010518394.tif 000041
【図１９】
2010518394.tif 000042
【図２０】
2010518394.tif 000043
【図２１】
2010518394.tif 000044
【国際調査報告】
2010518394.tif 000045
2010518394.tif 000046