(57)【要約】【課題】生物の半数体状態におけるエピジェネティックな特性を調べるための方法を提供すること。【解決手段】倍数体の被験体のエピジェネティックな情報を得るための方法であって、該被験体から（ｉ）少なくとも一種の父系由来のＤＮＡ分子及び／又はそれと結合しているタンパク質及び／若しくは（ｉｉ）少なくとも一種の母系由来のＤＮＡ分子及び／若しくはそれと結合しているタンパク質を含む生体試料を得る段階と、父系由来又は母系由来のＤＮＡ分子又はそれと結合しているタンパク質のいずれか一種以上を修飾の有無について分析する段階とを含み、前記分析段階は任意の二ヶ所の修飾が１個の染色体上にｃｉｓで存在するのか又は２個の姉妹染色体に亘りｔｒａｎｓで存在するのかを決定する、倍数体の被験体のエピジェネティックな情報を得るための方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
倍数体の被験体のエピジェネティックな情報を得るための方法であって、
該被験体から
（ｉ）少なくとも一種の父系由来のＤＮＡ分子及び／又はそれと結合しているタンパク質、並びに／又は
（ｉｉ）少なくとも一種の母系由来のＤＮＡ分子及び／又はそれと結合しているタンパク質を含む生体試料を得る段階と、
父系由来若しくは母系由来のＤＮＡ分子又はそれと結合しているタンパク質のいずれか一種以上を修飾の有無について分析する段階と、を含み、
前記分析段階は任意の二ヶ所の修飾が１個の染色体上にｃｉｓで存在するのか、又は２個の姉妹染色体に亘りｔｒａｎｓで存在するのかを決定する、倍数体の被験体のエピジェネティックな情報を得るための方法。
【請求項２】
前記分析段階は、修飾が父系由来のＤＮＡ及び／若しくはそれと結合しているタンパク質に帰すのか、又は母系由来のＤＮＡ及び／若しくはそれと結合しているタンパク質に帰すのかを決定する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
修飾の有無は、インビボにおけるＤＮＡ分子の発現を調節し得ることである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記分析段階は、物理的方法を利用して、母系由来のＤＮＡ及び／又はそれと結合しているタンパク質から、父系由来のＤＮＡ及び／又はそれと結合しているタンパク質を実質的に単離することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記物理的方法は、母系由来のＤＮＡ分子及び／又はそれと結合しているタンパク質から父系由来のＤＮＡ分子及び／又はそれと結合しているタンパク質をレーザーダイセクションすることを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記分析段階は、父系由来のＤＮＡ及び／又はそれと結合しているタンパク質を、母系由来のＤＮＡ及び／又はそれと結合しているタンパク質と比較して選択的に分析可能なｉｎ  ｓｉｔｕ方法を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＤＮＡ分子又はそれと結合しているタンパク質は、二倍体細胞中に存在するか、又は二倍体細胞から得られる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記分析段階をＤＮＡに関して行う場合、前記修飾はメチル化である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記分析は、ジヌクレオチドＣｐＧのメチル化を決定することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記分析は、亜硫酸水素塩処理を利用するＤＮＡ配列決定、制限ランドマークゲノムスキャンニング、メチル化感受性任意プライム化ＰＣＲ、メチル化感受性制限酵素を用いるサザン分析、メチル化特異的ＰＣＲ、亜硫酸水素塩変換ＤＮＡから増幅されたＰＣＲ産物の制限酵素消化及びこれらの組み合わせからなる群から選択される方法を含む、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
前記分析が亜硫酸水素塩処理を利用するＤＮＡ配列決定を含む場合、前記分析は、（ａ）前記ＤＮＡ試料を亜硫酸水素ナトリウムと反応させて、５−メチルシトシン残基をいずれも変化させずに亜硫酸水素塩変換ＤＮＡ試料に特異的なプライマーの結合サイトを有する露出した亜硫酸水素塩変換ＤＮＡ試料を創出しつつ、未メチル化シトシン残基をウラシル残基に変換することと、（ｂ）トップ鎖及び／又ボトム鎖特異的プライマーを用いてＰＣＲ増幅手続きを行うことと、（ｃ）ＰＣＲ増幅生成物を単離することと、（ｄ）亜硫酸水素塩変換ＤＮＡ試料に相補的であり且つアッセイされる一以上のＣｐＧジヌクレオチド配列のシトシン残基の５’で直ちに停止する、約１５−ｍｅｒ長〜約２２−ｍｅｒ長のプライマー配列を含むＭｓ−ＳＮｕＰＥプライマー、ｄＮＴＰ及びＴａｑポリメラーゼを用いてプライマー伸長反応を行うことと、（ｆ）第一のプライマー伸長塩基の同一性を決定することにより一以上のＣｐＧジヌクレオチド配列のメチル化状態を決定することとを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ｄＮＴＰはラベルされ、且つ第一のプライマー伸長塩基の同一性の決定はラベル化ｄＮＴＰを組み込むことにより測定される、請求項１１の方法。
【請求項１３】
前記分析をタンパク質に関して行う場合、前記タンパク質はヒストンであり、前記修飾はアセチル化である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記エピジェネティックな情報は、被験体の表現型情報を提供し得るものである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記表現型情報は、疾患、病態又は障害の有無；疾患、病態又は障害の素因、潜在的治療分子に対する反応能力又は反応無能力；外部抗原又は自己抗原に対して免疫応答を開始する能力又は無能力；アレルギーの有無；及びアレルギーの素因からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は遺伝学の分野に関し、より具体的にはエピジェネティックスに関する。本発明は詳細には、生物の半数体状態におけるエピジェネティックな特性を調べるための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エピジェネティック遺伝は、単細胞生物又は多細胞生物から子孫に、遺伝子塩基配列へのコード化を伴うことなく情報を伝達することである。エピジェネティック遺伝の一形態はＤＮＡメチル化であり、これは多くのヒトの疾患に関与することが知られている。例えば、ＤＮＡメチル化プロファイルの変化は、癌やベックウイズ・ヴィーデマン（Beckwith-Wiedemann）症候群、プラダー・ウィリ（Prader-Willi）症候群、エンジェルマン（Angelman）症候群等の疾患によく見られる。ＤＮＡメチル化はヒトの発生過程における遺伝子発現の調節に関与することも知られている。プロモーター領域の高度のメチル化は転写のダウンレギュレーションにおいて重要であり、遺伝子発現の「スイッチ」を提供するとされている。
【０００３】
ＤＮＡメチル化は、通常ＣｐＧサイト（即ち、ＤＮＡ配列においてシトシンの後に直接グアニンが続く場所）において起きるエピジェネティックな修飾である。このメチル化によってシトシンが５−メチルシトシンに変化する。Ｍｅ−ＣｐＧの生成には酵素ＤＮＡメチルトランスフェラーゼが触媒となる。ＣｐＧサイトは脊椎動物のゲノムにはあまり見られないが、ＣｐＧアイランドと総称される脊椎動物の遺伝子プロモーター付近には高密度で存在することが多い。これらＣｐＧサイトのメチル化の状態は遺伝子の活性及び／又は発現に大きな影響を及ぼし得る。
【０００４】
メチル化のパターンは最近重要な研究トピックとなりつつある。例えば、ＤＮＡ低メチル化（メチル化の減少）とＤＮＡ高メチル化（メチル化の増加）の双方が、正常組織と癌組織の間で差別的にメチル化される遺伝子を調べる研究に関連付けられてきた。メチル化の変化と関連づけられている癌関連遺伝子には、細胞周期調節、ＤＮＡ修復、ＲＡＳシグナリング、侵襲に関連する遺伝子が含まれる。これまでの研究により、正常組織において遺伝子のメチル化は主としてＣｐＧの少ないコード化領域に局在することが分かっている。一方、遺伝子のプロモーター領域は、ＣｐＧアイランドが高密度なのにもかかわらずメチル化されていない。
【０００５】
メチル化の程度は遺伝子調節においても重要であろう。癌においては、エピジェネティックに媒介される遺伝子サイレンシングが徐々に起こる。このサイレンシングは転写のわずかな減少から始まり、隣接ヘテロクロマチンの広がりからＣｐＧアイランドの保護の低減が促進され、アイランドでのメチル化が促進される。このロスにより個々のＣｐＧサイトが徐々に増加するが、各細胞の同一遺伝子のコピー間で異なる。
【０００６】
エピジェネティック遺伝の他の形態は、ＤＮＡ結合タンパク質の影響によって生じる。例えば、ヒストンのアセチル化の状態は、それが結合する遺伝子の発現に影響を及ぼすことが知られている。ある種のヒストンのアセチル化は、クロマチン構造中のＤＮＡの高充填密度のため遺伝子サイレンシングを起こすと考えられている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来技術において、ＤＮＡ及びそれと結合しているタンパク質のエピジェネティックな修飾と表現型との間の関連が開示されているが、その相互作用は複雑であり、未だ完全には解明されていない。従来技術の問題を克服又は緩和するための本発明の一側面は、ＤＮＡ及びそれと結合しているタンパク質のエピジェネティックな修飾パターンを利用し、従来可能と思われていたよりも表現型を生物体に帰する方法を提供することにある。
【０００８】
文献、行為、材料、装置、物品等についての考察は、単に本発明の文脈を提供する目的のみで本明細書に記載されるものである。それらの内容のいずれか又は全てが先行技術の基礎の一部を構成するとか、本出願の各請求項の優先日より前に存在したがゆえに本発明に関連する分野における共通の一般的な知識であるとかいうことを示唆又は意味するものではない。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明はその第一の側面において、倍数体の被験体のエピジェネティックな情報を得るための方法であって、該被験体から（ｉ）少なくとも一種の父系由来のＤＮＡ分子及び／若しくはそれと結合しているタンパク質、並びに／又は（ｉｉ）少なくとも一種の母系由来のＤＮＡ分子及び／若しくはそれと結合しているタンパク質を含む生体試料を得る段階と、父系由来又は母系由来のＤＮＡ分子又はそれと結合しているタンパク質のいずれか一種以上を修飾の有無について分析する段階とを含み、前記分析段階は任意の二ヶ所の修飾が１個の染色体上にｃｉｓで存在するのか、又は２個の姉妹染色体に亘りｔｒａｎｓで存在するのかを決定する、倍数体の被験体のエピジェネティックな情報を得るための方法を提供する。
【００１０】
本出願人は、エピジェネティック分析で母系由来のＤＮＡ（及びそれと結合しているタンパク質）と父系由来のＤＮＡ（及びそれと結合しているタンパク質）を別々に考えることを提案する。この方法により、被験体の絶対的なエピジェネティック特性を決定することが可能であり、この特性化により例えば被験体の疾患とエピジェネティックな状態との間の新たな関連性を提供する。一方、従来技術の方法は母系由来及び父系由来のＤＮＡ及びそれと結合しているタンパク質のエピジェネティックな修飾を合算するものであり、「平均的」な結果を提供する。
【００１１】
本方法の一形態においては、分析段階は、修飾が、父系由来のＤＮＡ及び／又はそれと結合しているタンパク質に帰すのか、或いは母系由来のＤＮＡ及び／又はそれと結合しているタンパク質に帰すのかを決定する。他の実施形態においては、修飾の有無によってインビボにおけるＤＮＡ分子の発現を調節できる。
【００１２】
本方法の一形態においては、分析段階は、物理的方法を利用して、母系由来のＤＮＡ及び／又はそれと結合しているタンパク質から、父系由来のＤＮＡ及び／又はそれと結合しているタンパク質を実質的に単離することを含む。この物理的方法としては、母系由来のＤＮＡ及び／又はそれと結合しているタンパク質から、父系由来のＤＮＡ及び／又はそれと結合しているタンパク質をレーザーダイセクションすることがある。
【００１３】
分析段階は、父系由来のＤＮＡ及び／又はそれと結合しているタンパク質を、母系由来のＤＮＡ及び／又はそれと結合しているタンパク質と比較して、選択的に分析可能なｉｎ  ｓｉｔｕ方法を含むこともできる。このｉｎ  ｓｉｔｕ方法により、倍数体材料のプロービングによって絶対的な半数体エピジェネティック情報を提供することが可能となり、母系ＤＮＡ分子と父系ＤＮＡ分子とを物理的に分離する必要がなくなる。
【００１４】
本方法の他の形態においては、ＤＮＡ分子又はそれと結合しているタンパク質は二倍体細胞中に存在するか、或いは二倍体細胞から得られる。配偶子は半数体情報を含んでいるが、これら細胞は臨床的に得ることが難しく、及び／又は体細胞中に存在するエピジェネティックな修飾に関する不正確な情報を提供する。
【００１５】
分析段階をＤＮＡに関して行う本発明の他の形態においては、修飾はメチル化である。この分析は適切な方法のいずれによっても実施することができる。通常、一以上のサイトのメチル化の有無を分析する段階には、亜硫酸水素塩処理を利用するＤＮＡ配列決定、制限ランドマークゲノムスキャンニング、メチル化感受性任意プライム化ＰＣＲ、メチル化感受性制限酵素を用いるサザン分析、メチル化特異的ＰＣＲ、亜硫酸水素塩変換ＤＮＡから増幅されたＰＣＲ産物の制限酵素消化及びこれらの組み合わせからなる群から選択される方法が含まれる。分析をタンパク質に関して行う場合、そのタンパク質はヒストンとすることができ、修飾はアセチル化とすることができる。
【００１６】
本発明の方法により提供されるエピジェネティックな情報は、疾患、病態又は障害の有無；疾患、病態又は障害の素因；潜在的治療分子に対する反応能力又は反応無能力；外部抗原又は自己抗原に対して免疫応答を開始する能力又は無能力；アレルギーの有無；又はアレルギーの素因等の被験体の表現型情報を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明はその第一の側面において、倍数体の被験体のエピジェネティックな情報を得るための方法であって、該被験体から（ｉ）少なくとも一種の父系由来のＤＮＡ分子及び／又はそれと結合しているタンパク質、並びに／又は（ｉｉ）少なくとも一種の母系由来のＤＮＡ分子及び／又はそれと結合しているタンパク質を含む生体試料を得る段階と、父系由来又は母系由来のＤＮＡ分子又はそれと結合しているタンパク質のいずれか一種以上を修飾の有無について分析する段階とを含み、前記分析段階は任意の二ヶ所の修飾が１個の染色体上にｃｉｓで存在するのか或いは２個の姉妹染色体に亘りｔｒａｎｓで存在するのかを決定する方法を提供する。
【００１８】
本出願人の知る限りにおいて、本明細書に開示する発明は、エピジェネティック遺伝をＤＮＡ及びタンパク質の修飾によって研究する場合に、「フェーズ」の重要性が認識された最初のケースである。ＤＮＡのメチル化やＤＮＡと結合しているタンパク質のアセチル化等のエピジェネティック現象に関するフェーズ特異的な情報を得る初めてのケースである。従って本発明は、二ヶ所のエピジェネティック修飾が同一の染色体上に存在する（即ち、ｃｉｓの関係）か、或いは一ケ所が父系由来の染色体上に存在し且つもう一ケ所が母系由来の姉妹染色体に存在する（即ち、ｔｒａｎｓの関係）かを識別する能力を提供する。本出願人は、現在認められている、母系由来のＤＮＡと父系由来のＤＮＡの両者を用いるエピジェネティック分析方法は「平均的」な結果を提供するゆえ、情報不足を招くと考えている。この不足する情報はとりわけ個体及び集団におけるフェーズ特異的なエピジェネティック効果を特定するのに重要である。
【００１９】
エピジェネティックスの分野は遺伝学の分野においては比較的新しく、生物のＤＮＡ中の特定の塩基配列に依存しないゲノム機能の変化の研究を指す。エピジェネティックスは、ある細胞世代から次世代へ受け継がれる影響が胚形態形成、再生、細胞の正常ターンオーバー、腫瘍、細胞培養、又は単細胞生物の複製において起こるかという研究を含む。エピジェネティックプロセスの具体例としては、擬似突然変異、ブックマーキング、遺伝子サイレンシング、Ｘ染色体不活性化、位置効果、リプログラミング、トランスベクション、刷り込み、母系効果、癌発生の促進、種々の催奇形因子の効果及びヒストン修飾調節とヘテロクロマチンの調節が挙げられる。
【００２０】
本発明の一形態においては、分析段階は、修飾が父系由来のＤＮＡ及び／又はそれと結合しているタンパク質に帰すのか、或いは母系由来のＤＮＡ及び／又はそれと結合しているタンパク質に帰するのかを決定する。このような決定は、任意の二ヶ所の修飾の存在がｃｉｓであるかｔｒａｎｓであるかだけが必要な情報である場合には、必ずしも必要ではない。
【００２１】
本方法の他の実施形態においては、修飾の有無は、インビボにおけるＤＮＡ分子の発現を調節し得るものである。当業者によく知られているように、遺伝子の発現は、ＤＮＡメチル化等のエピジェネティックな修飾によって少なくともある程度制御されている。ＤＮＡメチル化は、真核生物において共通とされているＤＮＡのエピジェネティック修飾の一種である。ヒトにおいては、約１％のＤＮＡ塩基がＤＮＡメチル化を受ける。成人の体組織において、ＤＮＡメチル化は通常ＣｐＧジヌクレオチド環境で起こり、非ＣｐＧメチル化は一般に胚幹細胞で起こる。植物においては、シトシンが対称（ＣｐＧ又はＣｐＮｐＧ）及び非対称（ＣｐＮｐＮｐ）にメチル化される（Ｎは任意のヌクレオチドとなり得る）。
【００２２】
哺乳動物においては、全ＣｐＧの６０〜７０％がメチル化される。未メチル化ＣｐＧは、多くの遺伝子の５’制御領域に存在する「ＣｐＧアイランド」と呼ばれるクラスターに集合している。癌等種々の疾患の過程において、遺伝子プロモーターＣｐＧアイランドは異常な高メチル化を受けることにより、遺伝可能な転写サイレンシングとなる。転写サイレンシング状態は、メチル化ＣｐＧに結合可能なタンパク質を媒介として強化される。これらタンパク質はメチル−ＣｐＧ結合タンパク質と呼ばれ、ヒストンデアセチラーゼ及びヒストンを修飾可能な他のクロマチンリモデリングタンパク質を活性化し、ヘテロクロマチンと称されるコンパクトで、不活性なクロマチンを生成する。このクロマチンの構造変化を経由するＤＮＡメチル化とタンパク質との関係は、種々の表現型の出現に関連づけられる。例えば、メチル−ＣｐＧ−結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）の消失はレット（Ｒｅｔｔ）症候群と関連づけられ、メチル−ＣｐＧ結合ドメインタンパク質２（ＭＢＤ２）は癌における高メチル化遺伝子の転写サイレンシングを媒介する。ＤＮＡに結合しているタンパク質とメチル化の間には相互作用があり得るが、本発明はＤＮＡメチル化と関係ないＤＮＡと結合しているタンパク質の分析を含むと理解されよう。
【００２３】
前述のように、ＤＮＡに結合しているタンパク質は遺伝子発現の調節に関与することができる。例えば、ＤＮＡの物理的構造はクロマチンに詰め込まれて存在するが、転写調節タンパク質（転写因子とも言う）とＲＮＡポリメラーゼの能力に影響を及ぼすことができ、特定遺伝子へ接近し且つそれら遺伝子からの転写を活性化する。
【００２４】
クロマチン（染色質）とは、ＤＮＡが細胞内に存在している構造体を指す用語である。クロマチンの構造は、ＤＮＡとＤＮＡ結合タンパク質との相互作用によって決定され安定化される。ＤＮＡ結合タンパク質には２種のクラスがある。ヒストンはクロマチンのコンパクトな構造維持に関与するＤＮＡ結合タンパク質の主たるクラスである。５種の異なるヒストンタンパク質Ｈ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３及びＨ４が同定されている。
【００２５】
ＤＮＡ結合タンパク質の他のクラスは、単に非ヒストンタンパク質と称される広範な群のタンパク質である。このクラスのタンパク質には、種々の転写因子、ポリメラーゼ、ホルモン受容体、他の核酵素が含まれる。特定の細胞のいずれにも、１０００種を超える種々のＤＮＡ結合非ヒストンタンパク質が存在する。
【００２６】
ＤＮＡがヒストンと結合すると、ヌクレオソームと呼ばれる構造体が発生する。ヌクレオソームの核は、それぞれＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３及びＨ４からなるサブユニット２個からなるオクタマータンパク質構造体を含む。ヒストンＨ１はヌクレオソーム間のＤＮＡを占有し、リンカーヒストンとして同定されている。ヌクレオソーム核は約１５０ｂｐのＤＮＡを含む。各ヌクレオソーム間のリンカーＤＮＡは２０〜２００ｂｐ超とすることができる。これらのヌクレオソーム核構造体は、ＤＮＡを線状に引っ張り伸ばしたとすれば、紐上のビーズの様に見えよう。
ヌクレオソーム核自身はソレノイド状に丸くなり、これが更に丸くなりＤＮＡを圧縮する。これら最終的なコイルは圧縮されて更に核型分析にスプレッドに見られる特異的クロマチンとなる。クロマチンのタンパク質−ＤＮＡ構造は、核マトリックスと呼ばれる非ヒストンタンパク質の足場（scaffold）付着することにより安定化される。
【００２７】
本発明には、ＤＮＡと結合してタンパク質のいずれかへの修飾であって、そのタンパク質が結合している遺伝子の発現の調節を可能とする修飾が含まれる。例えば、ヒストン翻訳後修飾（ＰＴＭｓ）は正及び負の翻訳状態に関連する。これらＰＴＭｓの役割の典型的モデルは、転写因子への細胞質シグナリングに応じて、ＤＮＡ結合アクティベーターとＲＮＡポリメラーゼにより正のＰＴＭｓがプロモーター及びオープンリーディングフレームに亘って確立されることである。負のマークは、ゲノムのヘテロクロマチン領域に亘るＤＮＡ結合リプレッサー活性化による抑制の間に遺伝子に造られる。これら修飾の両セットは、続いて調節タンパク質コンプレックスを活性化するヌクレオソーム表面を改変する。
【００２８】
本明細書において、ヒストンのＰＴＭｓにはヒストン３（Ｈ３）、ヒストン４（Ｈ４）、ヒストン２Ａ（Ｈ２Ａ）、ヒストン２Ｂ（Ｈ２Ｂ）のアセチル化；Ｈ３、Ｈ２Ａ及びＨ２Ｂのリン酸化；Ｈ３及びＨ４のアルギニンメチル化；Ｈ３及びＨ４のリシンメチル化；Ｈ２Ａ及びＨ２Ｂのリシンユビキチル化；Ｈ２Ａ及びＨ２Ｂのリシンスモイル化；Ｈ３中のプロリン異性化；及びＡＤＰ−リボシル化脱イミノ化（アルギニンからシトルリンへの変換）が含まれるが、これらに限定されない。ヒストン変種のＨ２ＡＸ、Ｈ３．１、Ｈ３．３及びＨｚｔ１もＰＴＭｓを受ける。
【００２９】
このヒストンＰＴＭｓのレパートリーは「ヒストンコード」として知られ、特異的相互作用ドメインを含むエフェクタータンパク質の結合のための結合表面として役立つ。例えば、アセチル化はブロモドメインに認識され、メチル化はロイヤルファミリー（クロモ、テューダー、ＭＢＴ）のクロモ様ドメインと非関連ＰＨＤドメインに認識され、リン酸化は１４−３−３タンパク質中のドメインに認識される。
【００３０】
ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴs）には、ＧＮＡＴ［ＧＣＮ５（アミノ酸合成５の一般的コントロール）関連アセチルトランスフェラーゼ］ファミリー、ＣＢＰ／Ｐ３００（ＣＲＥＢ結合タンパク質）ファミリー及びＭＹＳＴ（ＭＯＺ、ＹＢＦ２／ＳＡＳ３、ＳＡＳ２、ＴＩＰ６０タンパク質）ファミリーが含まれる。これらのＨＡＴs、更には転写因子及び核−ホルモン関連ヒストンアセチルトランスフェラーゼには、ＧＣＮ５、ＰＣＡＦ（Ｐ３００／ＣＲＥＢ結合タンパク質−結合因子）、ＧＣＮ５Ｌ（アミノ酸合成５様２の一般コントロール）、ＥＬＰ３、Ｐ３００（ｅ１ａ結合タンパク質ｐ３００）、ＣＢＰ（ＣＲＥＢ結合タンパク質）、ＴＩＰ６０、ＭＯＦ／ＭＹＳＴ１、ＭＯＺ（単球白血病亜鉛フィンガータンパク質）／ＭＹＳＴ３、ＭＯＲＦ（ＭＯＺ関連因子）／ＭＹＳＴ４、ＨＢ０１（ＯＲＣに結合するヒストンアセチルトランスフェラーゼ）／ＭＹＳＴ２、ＡＴＦ２、ＴＡＦ１（ＴＡＴＡボックス結合因子１）、ＧＴＦ３Ｃ４（一般転写因子３ｃ、ポリペプチド４）、ＡＣＴＲ（アクチビン受容体、ＳＲＣ−１（ステロイド受容体コアクチベーター１）／ＮＣＯＡ１／２（核受容体コアクチベーター１）、ＡＣＴＲ（アクチビン受容体）、ＳＲＣ−１（ステロイド受容体コアクチベーター１）、ＣＤＹＬ及びＨＡＴ１（ヒストンアセチルトランスフェラーゼ１）が更に含まれる。
【００３１】
ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣs）には、クラスＩ及びクラスＩｌのＨＤＡＣｓ（ＨＤＡＣs１〜８及びＨＤＡＣs１０等）及びサーファミリーのクラスＩＩＩＮＡＤ依存酵素（ＳｉｒＴ２等）が含まれる。
【００３２】
ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴs）には、タイプＩ及びタイプＩｌのアルギニンＨＭＴs（ＰＲＭＴ１、ＰＲＭＴ４、ＰＲＭＴ５、ＰＲＭＴ７等）及びリシンＨＭＴsが含まれる。リシンＨＭＴには、ＭＬＬ（混合血統白血病）−１〜５、酵母Ｓｅｔ１タンパク質に相同性を有するセット１ファミリー（ＳＥＴ１Ａ及びＳＥＴ１Ｂを含む）、ＳＥＴ２、ＳＹＭＤ２、Ｐｒ−ＳＥＴ７／８、ＣＬＬ８、ＮＳＤ１、ＤＯＴ１、ＳＵＶ４２Ｈ１／２、ＥＺＨ２、ＲＩＺ１、ＳＵＶ３９Ｈ１／２、ＥｕＨＭＴアーゼ、ＧＬＰ、ＥＳＥＴ、ＳＥＴＤＢ１及びＧ９ａが含まれる。
【００３３】
アルギニンデメチラーゼ及びリシンデメチラーゼには、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ（ＰＭＲＴ４、ＰＲＭＴ５及びＣＡＲＭ１）、ＬＳＤ１、ＪＨＤＭＩａ、ＪＨＤＭＩｂ、ＪＨＤＭ２ａ、ＪＨＤＭ２ｂ、ＪＭＪＤ２Ａ／ＪＨＤＭ３Ａ、ＪＭＪＤ２Ｂ、ＪＭＪＤ２Ｃ及びＪＭＪＤ２Ｄが含まれる。
【００３４】
脱イミノ化、リン酸化、スモイル化、ユビキチル化等、他のヒストンＰＴＭsを媒介する酵素は、ＰＡＤＩ４、Ｂｍｉ／Ｒｉｎｇ１Ａ、ＲＮＦ２０／ＲＮＦ４０及びＵｂｃＨ６；モノＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ及びポリＡＤＰ−リボースポリメラーゼ；プロリンイソメラーゼ；及びハプシン、ＭＳＫ１／２、ＣＫＩＩ及びＭｓｔ１等のキナーゼである。更に、メチル−ＣｐＧ結合ドメイン（ＭＢＤ）タンパク質等のメチル化ＤＮＡに結合するタンパク質には、ＭｅＣＰ２、ＭＢＤ１−４、ＭＢＤ３Ｌ−１及びＭＢＤ３Ｌ−２が含まれる。
【００３５】
更に、昆虫、植物及び菌類においてＲＮＡｉがヘテロクロマチン生成に関与することや、最近の研究により脊椎動物にこのメカニズムが存在することが示唆されたことにより、本発明はＲＮＡｉによるクロマチンの修飾を含む。
【００３６】
当業者はＤＮＡと結合しているタンパク質を単離する方法については習熟している。ＤＮＡの５−メチルシトシン全含有量又はヒストンＰＴＭsは、高速キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー又はマススペクトロメトリーにより調べることができる。制限ランドマークゲノムスキャンニング等のエピジェネティックな分析を利用して半数体遺伝子材料を調べることができる。しかしながら、目的配列の増幅（通常ポリメラーゼ連鎖反応）を利用する方法、例えばインターメチル化サイトの増幅（ＡＩＭＳ）又はディファレンシャルメチル化ハイブリダイゼーション（ＤＭＨ）は特に興味深い。ハイブリダイゼーションターゲットのローリングサークル増幅を容易とするＰ−ＬＩＳＡ（後に触れる）を検出すること等、検出用シグナルの増幅を利用する方法は更に興味深い。
【００３７】
単一染色体のメチル化の分析を小型化するために、ゼプトモル量（４０ｘ１０-21ｍｏｌ）のタンパク質を検出できるプロキシミティリゲーションｉｎ  ｓｉｔｕアッセイ（Ｐ−ＬＩＳＡ）等の技法を利用することが可能である（フレドリクソンＳ．ら、（２００２）、「プロキシミティ依存ＤＮＡリゲーションアッセイを利用するタンパク質検出」．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０（５）：４７３〜７）。この方法は目標タンパク質に対する抗体(一例として、メチル化タンパク質に対する抗体)を利用するものであり、この方法により、抗体を標的タンパク質に結合させて接近させた場合、酵素的リゲーションに際してローリングサークル増幅のテンプレートとなる共役オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが可能になる。標的タンパク質の検出には独立した２回の認識が必要であるから、検出は非常に特異的であり、且つ個々のタンパク質コンプレックスを検出することができる（ソルダーベルクＯ．、（２００６）、「プロキシミティリゲーションによる個々の内因性タンパク質コンプレックスのｉｎ  ｓｉｔｕ直接観察」、Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ２００６  ３（１２）：９９５〜１０００）。この方法はタンパク質−ＤＮＡ相互作用の研究に利用され、局所検出のためのＤＮＡ−タンパク質相互作用のｉｎ  ｓｉｔｕ分析を可能ならしめている（グスタフスドッティヤーＳ．Ｍ．ら、（２００７）、「プロキシミティリゲーションによるＤＮＡ−タンパク質相互作用のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析」、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．  １０４（９）：３０６７〜７２）．
【００３８】
クロマチン免疫沈澱をジーンアレイ技術と組み合わせる（チップオンチップ（ChIP on chip））。この方法においては、翻訳後修飾ＤＮＡ結合タンパク質に対する抗体を用いて、修飾タンパク質と標的ＤＮＡの両者を免疫沈澱させる。即ち、クロスリンキングを利用してＤＮＡ結合タンパク質をＤＮＡに固定し、ＤＮＡフラグメンテ−ションの後、免疫沈澱を利用し、用いた抗体により決定された特異性を有するタンパク質−ＤＮＡフラグメントを精製する。加水分解してクロスリンキングを戻した後、ＤＮＡの増幅とラベルを行う。このＤＮＡを更にマイクロアレイにハイブリダイズし、ＤＮＡ結合タンパク質が結合している領域を分析して特定する。或いは、遺伝子を遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲで調べることができる（単一遺伝子ＣｈＩＰとして知られている）。
【００３９】
ディファレンシャルメチル化ハイブリダイゼーションを利用してメチル化ＤＮＡを同定することもできる。この方法においては、クローン化したＣｐＧアイランドを含む特殊なＤＮＡマイクロアレイを用いる。本発明においては、比較されるＤＮＡサンプル（２個の半数体ＤＮＡサンプル（染色体、クロマチド等））はそれぞれメチル化感受性制限酵素で消化され、各サンプルから誘導されたポリメラーゼ連鎖反応アンプリコンをＣｐＧアイランドアレイにハイブリダイズする。いずれかのサンプルにおいて強いハイブリダイゼーションシグナルを有するアレイ要素は、メチル化感受性制限酵素による切断から保護され、従って、サンプル中でＰＣＲによって増幅されたディファレンシャル高メチル化ＣｐＧアイランドを示す。
【００４０】
エピジェネティックな分析の更なる利点は、ＤＮＡメチル化等のエピジェネティックマークを少量のＤＮＡを用いて調べることができることである。ＤＮＡメチル化の分析に関し、ＭＢＤ２／ＭＢＤ３Ｌ１コンプレックスのメチル化ＤＮＡに対する高いアフィニティに基づくメチル化ＣｐＧアイランドリカバリーアッセイ（ＭＩＲＡ）を利用してメチル化ＤＮＡを精製することができる。即ち、超音波処理したＤＮＡを、ＭＢＤ３Ｌ−１（メチル化ＤＮＡに対するＭＢＤ２のアフィニティを向上させるＭＢＤ２の結合パートナー）の存在下、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−ＭＢＤ２ｂを含むマトリックス中でインキュベートする。特異的に結合したＤＮＡはマトリックスから溶離され、遺伝子特異的ＰＣＲ反応を行いＣｐＧアイランドのメチル化を検出する。或いは、結合ＤＮＡはマイクロアレイを利用して調べることができる。この方法によれば１ｎｇのＤＮＡを用いてメチル化を検出できる。エピジェネシスに伴う他のタンパク質のＧＳＴフュージョンはこのような「プルダウン」方法により利用することができ、ビオチンを伴うフュージョンはプルダウンマトリックスに対するアフィニティを向上させるために利用することができる。ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ、Ｐｒｙｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ等の定量的なメチル化分析の利点は、亜硫酸水素塩配列決定と組み合わせた場合、非常に少量のメチル化ＤＮＡの検出が可能なことである。一例として、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌの場合、３０ｐｇのメチル化ＤＮＡの検出が可能である。
【００４１】
更に、トッププダウンプロテオミクス（前もってペプチドに消化せずに未処理のタンパク質を分析）における最近の進歩により、ヌクレオソーム中の種々のヒストンの未処理修飾パターンを調べることが可能である。
【００４２】
エピジェネシスのメカニズムについて多くの研究がなされているが、従来技術において、母系由来のＤＮＡ分子又はタンパク質のエピジェネティックな修飾と同時に父系由来のＤＮＡ分子又はタンパク質のエピジェネティックな修飾を考慮する複雑な影響については十分に解明されていない。これは、従来技術の方法が二倍体材料を用いてエピジェネティックな修飾を分析しているためである。
【００４３】
本出願人は、被験体のエピジェネティックな状態の絶対的な特性化は、ＤＮＡ及びそれと結合しているタンパク質のエピジェネティック修飾を、半数体の状態で別々に分析することによってのみ可能であると考えている。例えば、エピジェネティックな修飾がメチル化である場合、半数体材料を用いると、ヘテロ接合性の現象の認識のためのフェーズ特異的な効果が解明され、且つ単一のＣｐＧサイトにおける変異であっても（単位的機能の）「アイランド」を含む多数のＣｐＧサイトに亘って定量的な変異分析が提供される。この絶対的特性化によって、個体におけるある種の疾患の存在及び／又は素因、個体におけるある種の治療分子に対する反応能力等、表現型の情報をより正確に得ることができる。
【００４４】
より具体的な例を考えてみると、ＤＮＡメチル化は発癌に関与すると考えられているエピジェネティックな特徴である。次の表にメチル化感受性の癌関連遺伝子を記載する。
【００４５】
【表１−１】
2010528628.tif 000002
【００４６】
【表１−２】
2010528628.tif 000003
【００４７】
【表１−３】
2010528628.tif 000004
【００４８】
【表１−４】
2010528628.tif 000005
【００４９】
表からわかるように、従来技術においてはメチル化が発癌において重要であることは考慮されているものの、これまで二倍体材料しか使用されていない。本出願人は、従来技術の方法が正確さに欠ける情報を提供しやすいと考えている。例えば、腫瘍試料のあるプロモーターのプロファイリングに際し中程度のメチル化度が認められるかもしれない。実際には腫瘍は当然二倍体であるので、測定されたメチル化度は母系由来のプロモーター配列のメチル化と父系由来のプロモーター配列のメチル化の平均である。この平均的な結果は場合によっては（母系父系両者由来のプロモーターがある程度メチル化されているため）正しいが、普遍的に正しいとは言えないであろう。例えば、母系のプロモーター配列は完全に非メチル化状態であってもよく、父系のプロモーター配列は高度にメチル化されていてもよい。仮に母系由来の配列が父系の配列にプロモーター活性の点で優勢であるなら、母系の配列及び父系の配列を別々に分析することの重要さは明白となる。
【００５０】
前述のように、細胞の半数体状態に関して、エピジェネティック修飾の有無を分析していることがわかるであろう。従って、検討中のあるＤＮＡサイトにおけるメチル化の有無は、どこで母系由来のエピジェネティックな特徴が、相手方の父系由来のエピジェネティックな特徴から実質的に分離されているかを決定することができる。このように、母系由来のエピジェネティックな特徴の影響は、父系由来のエピジェネティックな特徴の非存在下で確認することができる（その逆も可能）。本出願人は、二倍体材料を分析する場合に提供される潜在的に不正確な（又は少なくとも完全に正確ではないこと）結果を排除することにより、より正確なメチル化マップが得られると考えている。
【００５１】
当業界の技術者は、本発明がゲノム刷り込みの自然プロセスと区別され、ある種の遺伝子の発現レベルが母系ゲノム又は父系ゲノムから受け継がれたか否かに依存することを認識するであろう。例えば、インスリン様成長因子−２（ＩＧＦ２）は、その発現が胎児の正常な発生及び成長に必要な遺伝子である。ＩＧＦ２の発現は遺伝子の父系のコピーからのみ起こる。刷り込み遺伝子はメチル化の状態によって「マーク」される。ＩＧＦ２の場合、インシュレーター要素と呼ばれる父系の遺伝子座の要素がメチル化されて、その機能がブロックされる。メチル化されないインシュレーターの機能は、結合時にＩＧＦ２の発現活性化をブロックするタンパク質を結合することである。メチル化された場合、このタンパク質はインシュレーターに結合できず、離れたエンハンサー要素がＩＧＦ２遺伝子の発現を起こすことを可能にする。母系ゲノムにおいてはインシュレーターはメチル化されないのでタンパク質が結合して、離れたエンハンサー要素の作用をブロックする。一方、本発明は、メチル化についてのフェーズ特異的な情報を提供することにより、母系ＤＮＡ、父系ＤＮＡ又はその両者の絶対的な半数体メチル化の帰属を提供することに関する。
【００５２】
「絶対的」とは、あるエピジェネティック修飾パターンをある表現型に帰属する際に、推定、推測、或いは類似性又は見込みの決定を伴わないことを意味する。従来技術に記載されるエピジェネティック修飾を分析する方法は、父系修飾と母系修飾が組み合わされて存在することによって混乱を伴っている。従って、例えば非半数体材料を分析する場合、あるアルゴリズムを用いてメチル化パターンの表現型へのもっともらしい帰属を推定又は推測できるが、その帰属は必然的に無効となるであろう。メチル化パターンを表現型に帰属する際にしばしば認められる混乱は、少なくとも部分的には二倍体材料が与える混乱の影響から生じると考えられる。
【００５３】
本発明の方法によれば、ＤＮＡ及び／又はそれと結合しているタンパク質は被験体の生体試料から得る。生体試料はＤＮＡ及び／又はそれと結合しているタンパク質を含む限りいかなるものでもよく、全血、血清、血液細胞、皮膚細胞、唾液、尿、毛髪、爪、涙、爪等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５４】
分析段階は母系由来のＤＮＡから父系由来のＤＮＡの実質的な単離を含むが、当業の技術者は知られている適切な方法のいずれかを利用することができる。実質的な単離を達成するための手段は本発明の範囲において制約を受けず、父系由来又は母系由来のＤＮＡ及び／又はそれと結合しているタンパク質を実質的に単離する段階の一形態は物理的手段によるものと理解されたい。物理的手段によってもたらされる利点は、非物理的手段（二倍体材料の選択的プロービング等）に比べて、父系由来の材料と母系由来の材料とを識別することに関連する問題を回避できることである。例えば、選択的プローブを使用する場合、クロスハイブリダイゼ−ションが問題となり、曖昧な結果を導くことがあり得る。クロスハイブリダイゼ−ションを制限するためにハイブリダイゼ−ションの条件を変更することができるが、このためには更なる実験を行う必要がある。
【００５５】
本発明の一形態において、父系由来のＤＮＡ又は母系由来のＤＮＡを専ら含む半数体ＤＮＡを提供するための物理的方法は、染色体マイクロダイセクションである。半数体ＤＮＡは、完全材料、父系染色体、クロマチド又はクロマチドのフラグメントであることができる。簡便に、染色体中のカットは、動原体より遠位で、ｐ（短）腕及びｑ（長）腕に分離することができる。それぞれは半数体ＤＮＡ分子に存在している。当業者は、染色体中の物理的領域を特定することができ、二倍体、三倍体、四倍体又はより高い倍数性を有する他の試料のいずれかから半数体ＤＮＡを単離する適切な方法を採用することができる。
【００５６】
マイクロマニピュレーションに使用するプラットフォーム及び道具は当業者にはよく知られている。マイクロダイセクションは技術的には正確さを要するが、日常的に行うことができる。装置としては、マイクロマニピュレーター及び回転ステージを供える顕微鏡（直立又は倒立）及びピペットプルラー（マイクロニードル用）が要求される。顕微鏡には振動単離が推奨される。特段のクリーンルームは必要とされないが、マイクロダイセクトされた染色体フラグメントはわずかフェムトグラム量のＤＮＡを含むので、外部ＤＮＡによる汚染は制御しなければならない。
【００５７】
本発明の一形態においては、半数体ＤＮＡ分子を単離するための非接触方法を利用することができる。この方法の一例はレーザーマイクロビームである。レーザーマイクロビームマイクロダイセクションは、顕微鏡をインターフェースとする高ビーム品質パルスＵＶレーザーを用いることができる。レーザービームマイクロダイセクションは、例えばロボットマイクロビーム（Ｐ．Ａ．Ｌ．Ｍ．〔商標〕（商品名）、Ｐ．Ａ．Ｌ．Ｍ．ゲーエムベーハー、ベルンリ−ト、ドイツ）を用いて行うことができる。レーザー光はゲノムセグメントにダメージを与えない又はゲノムセグメントを破壊しない波長を有することが好ましく、例えばＤＮＡ等の核酸の最大吸収波長から離れた３３７ｎｍが好ましい。
【００５８】
染色体のレーザーマイクロダイセクションに便利な他のシステムは、レイカ（Leica）レーザーマイクロダイセクション顕微鏡である。このシステムが用いるのはＤＭＬＡ直立顕微鏡であり、モーター付きノーズピース、モーター付きステージ、ｘｙｚ−コントロール要素の他に、新型ＤＭＬＡ顕微鏡の長所を有する。用いられるレーザーは波長３３７ｎｍのＵＶレーザーである。カット中は光学的に動くが、ステージは固定されている。対象領域はモニター上でマークすることができ、ＰＣ制御でカットする。試料は外力を加えることなくＰＣＲ管に落下する。カットの結果は自動検査モードで容易にチェックできる。
【００５９】
半数体ＤＮＡ分子の単離は例えば、ＰＡＬＭレーザーを用いる染色体セグメントのレーザーカタパルティング（射出）を利用するマイクロダイセクションによって行うことができる。この場合非接触プロセスは、標的染色体要素の周りをレーザーアブレーションすることと、次の一本腕ＤＮＡの分析のために、定義された要素をマイクロ遠心管キャップ等のチューブキャップにレーザー力によりカタパルティングすることを含む。
【００６０】
単離された半数体ＤＮＡ分子はレーザー圧カタパルティングを利用して回収することができる。レーザー圧カタパルティングは、レーザーマイクロビームを例えば目的の半数体ゲノムセグメントに集光させ、必要な半数体材料を不要なゲノムセグメントからカタパルトさせる力を高フォトン密度により発生させることにより達成することができる。試料はフォトン波の頂上を移動し、回収管にカタパルトされる。好ましい回収管は当業者には知られおり、通常のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）反応管やマイクロ遠心管等のチューブが挙げられる。
【００６１】
父系由来又は母系由来のＤＮＡは、父系ＤＮＡと母系ＤＮＡを区別可能なプローブを用いるプレパラティブフローサイトメトリーによって実質的に単離することができる。他の方法は放射線ハイブリッドを用いる方法であって、二倍体材料の調製に各染色体対の一方のみにヒト染色体を用いる方法である。他の方策はＧＭＰテクノロジー社（GMP Technologies Inc.）によって開発された「コンバージョンテクノロジー」の利用である。ＧＭＰコンバージョンテクノロジー（ＧＭＰ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ〔商標〕）は染色体対を単一の染色体に分離するプロセスを利用する。分離された場合、遺伝子配列を特定する遺伝子プローブを用いて対立遺伝子を個々に分析することができる。この技法は遺伝子、染色体又はヒト全ゲノムに応用できる。
【００６２】
本発明の他の形態においては、汚染性遺伝子材料を、汚染性遺伝子材料としての機能をもはや発揮させないように不活性化又は焼灼する。例えば、母系由来のＤＮＡを単離したい場合、父系の寄与を不活性化又は焼灼することができる。これは、例えば注意深く向けられたレーザービームを用いて相同染色体を破壊することにより達成することができる。
【００６３】
父系由来又は母系由来のＤＮＡ分子を選択的分析する他の方法は、半数体ＤＮＡのコピー数が汚染性のＤＮＡコピー数を大幅に上回るように、ＰＣＲにより半数体配列を選択的に増幅することである。ＤＮＡ分子混合物は、実質的に全部の汚染性ＤＮＡが消化され、且つ少量の半数体ＤＮＡが残存するように、ヌクレアーゼを用いて部分的に消化することもできる。
【００６４】
半数体ＤＮＡを選択的に増幅する他の可能性としては、タグを含むプライマーを用いるロングＰＣＲと、そのタグを用いてコピーを分離することである。
【００６５】
一旦父系由来又は母系由来のＤＮＡが実質的に単離されると、分析によってエピジェネティック修飾の有無を決定する。
【００６６】
エピジェネティック修飾がＤＮＡメチル化である場合、シトシンピリミジン環の５位の炭素にメチル基が有るか否かを分析することによってメチル化を検出することができる。
【００６７】
この方法は適切な方法論のいずれを利用しても実施することができる。通常、一以上のサイトのメチル化の有無を分析する方法には、亜硫酸水素塩処理を利用するＤＮＡ配列決定、制限ランドマークゲノムスキャンニング、メチル化感受性任意プライム化ＰＣＲ、メチル化感受性制限酵素を用いるサザン分析、メチル化特異的ＰＣＲ、亜硫酸水素塩変換ＤＮＡから増幅されたＰＣＲ産物の制限酵素消化及びこれらの組み合わせからなる群から選択される方法が含まれる。
【００６８】
亜硫酸水素塩配列決定は、一本鎖ＤＮＡと亜硫酸水素ナトリウムとの反応を含む。亜硫酸ナトリウムは選択的にシトシンを脱アミノ化してウラシルとするが、メチルシトシンとは反応しない。亜硫酸水素塩反応で製造された修飾ＤＮＡ配列はＰＣＲによって増幅し、その後増幅ＤＮＡをクローンニングと配列決定のためにプラスミドベクターにリゲートする。ＤＮＡの配列が決定されると、変化していないメチル化シトシン残基のみがシトシンとして増幅される。
【００６９】
亜硫酸水素塩配列決定は１００未満の細胞から単離されたＤＮＡを用いて行うことができる。通常腫瘍検体は非常に小さいので、このことはツールの主たる一利点である。亜硫酸水素塩配列決定の他の利点は、ゲノムの長いストレッチを分析してＤＮＡ中のメチル化パターンを非常に明確に決定する能力である。この能力により５−メチルシトシン残基が定量的でポジティブに表示される。
【００７０】
ＭＳＰはメチル化スクリ−ニングのための迅速且つ高感度の技法である。ＭＳＰは、亜硫酸水素ナトリウムを用いて実施され、ＤＮＡを修飾し且つ未メチル化シトシンをウラシルに変換する。未メチル化ＤＮＡに対しメチル化ＤＮＡに特異的なプライマーを用いて後続の増幅を行い、単純ゲル電気泳動により分析する。メチルライト（MethyLight）は次世代のＭＳＰアッセイである。試料の処理及びアッセイの前提は同一である。メチルライトは進歩した方法である。即ち、標準的ＭＳＰによって提供される非常に高い感度は維持されつつ、アッセイはより定量的に行われ、リアルタイム「ＴａｑＭａｎ」ＰＣＲフォーマットと組み合わせればより労力低減となる。
【００７１】
メチル化特異的ＰＣＲの特異性に影響を及ぼす最重要パラメータはプライマーのデザインによって決定される。実際に、単に一本鎖、最も普通にはセンス鎖を処理することが好ましいことが多い。この方法の一形態において、プライマーは２０〜３０ｂｐ長の領域を増幅するようにデザインされ、且つ未修飾ＤＮＡが該プライマーのテンプレートとならないことを確実にするために元の配列中に十分な量のシトシンを含むべきである。更に、ＣｐＧジヌクレオチド内のシトシンの数と位置によって、メチル化テンプレート又は未メチル化テンプレートに対するプライマーの特異性が決定される。通常、各プライマーに１〜３のＣｐＧサイトが含まれ、各プライマーの３’領域に集中される。これにより最適な特異性が提供され、ミスプリンティングによる偽ポジティブが低減される。同一サーモサイクラー中の遺伝子のＵとＭとの反応の同時分析を容易とするため、本発明者らはプライマーの長さを調節して、ほぼ等しい溶融／アニール温度を得る。通常これにより、Ｍ生成物よりも少数塩基対分長いＵ生成物が得られ、電気泳動後の各レーンを認識する簡便な方法が提供される。
【００７２】
メチル化特異的ＰＣＲは、メチル化サイトと未メチル化サイトとを差別化するために特異的なプライマー認識を利用するため、増幅のためにストリンジェントな条件を維持することが好ましい。このことは、アニール温度をアニーリングと後続の増幅を可能ならしめる最高温度に近づけるべきであることを意味する。実際、新しいプライマーは通常、計算された溶融温度より５〜８度低い初期アニール温度でテストされる。非特異性はアニール温度を若干上昇させることにより改善でき、ＰＣＲ産物が無いことや少ないことは１〜３℃下げることにより改善することができる。全てのＰＣＲプロトコールについて、テンプレートＤＮＡ及び試薬類が外因性のＤＮＡ又はＰＣＲ産物によって汚染されないことを確実とする注意が必要である。
【００７３】
ＭＳＰは、亜硫酸水素ナトリウム処理の後でメチル化対立遺伝子と未メチル化対立遺伝子の間に起こる配列の違いを利用する。ＣｐＧ中のＣｐＧサイトの数（frequency）はこの配列の違いを亢進する。亜硫酸水素塩修飾ＤＮＡにおける未メチル化ＤＮＡとメチル化ＤＮＡを区別する、ある遺伝子座に対するプライマーをデザインする。この区別はＰＣＲ増幅の一部であるため、特異性を維持しつつ、非常に高い感度（通常０．１％の対立遺伝子の検出）を達成することができる。ＰＣＲ増幅及びゲル電気泳動後、更なる制限又は配列決定をする必要なしに直ちに結果が得られる。また、ＭＳＰはパラフィン包埋、マイクロディセクション試料を含む非常に少量の試料の分析を可能とする。
【００７４】
本発明の他の形態において、一以上のサイトのメチル化分析の有無を分析する段階は、  （ａ）半数体ＤＮＡ試料を亜硫酸水素ナトリウムと反応させて、５−メチルシトシン残基をいずれも変化させずに亜硫酸水素塩変換ＤＮＡ試料に特異的なプライマーの結合サイトを有する露出した亜硫酸水素塩変換ＤＮＡ試料を創出しつつ、未メチル化シトシン残基をウラシル残基に変換することと、
（ｂ）トップ鎖及び／又ボトム鎖特異的プライマーを用いてＰＣＲ増幅手続きを行うことと、
（ｃ）ＰＣＲ増幅生成物を単離することと、
（ｄ）Ｍｓ−ＳＮｕＰＥプライマー、当該Ｍｓ−ＳＮｕＰＥプライマーは、亜硫酸水素塩変換ＤＮＡ試料に相補的であり、且つアッセイされる一以上のＣｐＧジヌクレオチド配列のシトシン残基の５’で直ちに停止するような、約１５−ｍｅｒ長〜約２２−ｍｅｒ長のプライマー配列を含むものである；ｄＮＴＰ；及びＴａｑポリメラーゼを用いて、プライマー伸長反応を行うことと、
（ｆ）第一のプライマー伸長塩基の同一性を決定することにより一以上のＣｐＧジヌクレオチド配列のメチル化状態を決定することと、を含む。
【００７５】
メチル化分析は、潜在的メチル化サイトを特定するための高スループット方法を利用することによって容易とすることができる。スクリーニングに利用可能な手法としては、制限ランドマークゲノムスキャンニング（ＲＬＧＳ）、及びアザシチジンのようなＤＮＡメチルトランスフェラーゼインヒビターに曝露した後どの遺伝子が発現されたかをみるための代用物として利用できる遺伝子発現アレイが挙げられる。
【００７６】
当業界において高パラレルゲノム−ワイドアッセイが多数知られており、ファンらが開示している（Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  ２００６、７（８）、６３２〜４４；この記載内容全体を本明細書の一部を構成するとしてここに援用する）。当業者はこのような方法の多くを契約サービスとして利用可能であり、一例としては例えばイルミナ社（サンディエゴ、ＣＡ）が提供する「ゴールデンゲートメチル化溶液」が挙げられる。このイルミナのシステムは、９６試料に亘る数百を超える遺伝子に亘るシングルサイト分解において１，５３６個までのＣｐＧサイトを分析することができる。従って、このシステムは一回のアッセイ当たり１４７，４５６の定量的なＤＮＡメチル化測定結果を提供することができる。
【００７７】
本発明には、ヒトＣｐＧアイランドライブラリーを得て、配列させることも含まれる。データベースの構築は得られたままのクロマトグラムから開始する。重複を除去した後、６，８００のエレメント全てを高スループットゲノム及びｎｒＤＮＡ配列データベース（カリフォルニア大学、サンタクルス）に対してベーシックローカルアラインメントサーチツール（ＢＬＡＳＴ）分析し、配列決定する。このＣｐＧアイランドデータベースにおいて、それぞれのクローンにＩＤナンバーが付けられ、染色体の位置、プロモーターであるか５′隣接領域に存在するかどうか、ＧＣ含有量、及びクローン中にどのような制限サイトが存在するか等の特性がリストに記載される。最後の情報は、実際の配列同様、制限酵素分析の有用性を決定するのに役立つ。
【００７８】
ＣＧＩマイクロアレイ技術も本発明の方法において有用なものとして含まれる。この技術は一チップ上の何千もの潜在的標的ＤＮＡメチル化の同時帰属を可能にする。この技術は、ＣｐＧアイランドクローンをスライドガラス上に配列させることと、標的試料のアンプリコンを調製することと、得られたアンプリコンをＣＧＩマイクロアレイにハイブリダイズすることを含む。一例として、ＣｐＧアイランドの外を直ちに切断する制限酵素（Ｍｓｅ１）を用いて得られた腫瘍由来ゲノムＤＮＡ試料を用いてこの技術を行うことができる。次に、ＰＣＲプライマー配列を有するキャッチリンカーをＭｓｅ１フラグメントに添加する。この試料を、ゲノム増幅がいかに上手くいったかを決定するためのデノミネーターとして働くレファレンス分と、ＭｃｒＢＣ及び領域がメチル化されていた場合ＤＮＡのみ消化するメチル化感受性制限酵素によって消化されるテスト分とに分割する。これら二部分をＰＣＲで増幅し、ＤＮＡをＣｙ５レッド（テスト）又はＣｙ３グリーン（レファレンス）蛍光染料で直接ラベルする。試験試料中でＭｃｒＢＣで消化されなかったＤＮＡフラグメントは、Ｃｙ５−ラベルＰＣＲ産物を与えるが、ＭｃｒＢＣによって消化されたメチル化フラグメントがあれば非ラベルＰＣＲ産物は得られない。ラベルされたテストＰＣＲ産物とレファレンスのＰＣＲ産物を混合し、スライドガラスにスポットする。ハイブリダイズが起こったスライドガラスをスキャンして、得られたイメージを分析し、メチル化シグナルを特定する。
【００７９】
当業者に認識されるように、本発明は生物学、特に医学の分野において多くの用途がある。前述のように、癌はエピジェネティックであると考えらえる。実際、エピジェネティックな変化、特にＤＮＡメチル化は容易に変化を受けるので、ある環境因子がいかに癌のリスクを増加させ得るかを説明するための良い候補である。メチル化の精密な構成及びクロマチンは、遺伝子発現パターンの正常の細胞ホメオスタシスを制御するが、これは癌細胞において認識不可能となる。形質転換細胞のゲノムは、全体的なゲノム低メチル化と、遺伝子制御領域に結合するＣｐＧアイランドの高密度の高メチル化を同時に受けることがあり得る。この劇的な変化は、染色体不安定、内在性寄生配列の活性化、刷り込みの消失、不規則な発現、異数性及び突然変異を引き起こすことができ、腫瘍抑制遺伝子の転写サイレンシングの一因となり得る。高メチル化に関連する不活性化は、ＤＮＡ修復（ｈＭＬＨ１、ＢＲＣＡ１、ＭＧＭＴ、ｅｍリーダー）、細胞周期（ｐ１６（ＩＮＫ４ａ）、ｐ１４（ＡＲＦ）、ｐ１５（ＩＮＫ４ｂ））及びアポトーシス（ＤＡＰＫ、ＡＰＡＦ−１）等の細胞ネットワークにおける経路の多くに影響を及ぼし得る。変則的なＣｐＧアイランドメチル化は、悪性細胞のバイオマーカー及びそれらの挙動のプレディクターとしても利用することができる。
【００８０】
本発明の一形態において、半数体ＤＮＡは二倍体細胞に存在するか、或いは二倍体細胞から得られる。この方法においては、体細胞の常染色体を用いることができる。「常染色体」とは、性染色体を除く正常な体細胞又は生殖細胞の存在するいずれかの細胞を意味する。例えば，ヒト染色体においては１〜２２が常染色体である。本出願人は、メチル化等のエピジェネティック修飾は少なくとも部分的に消去され、完全に消去されることも多いという理由で、自然半数体材料（精子や卵子に含まれる）を避けることが有利であると考えている。これは、メチル化のパターンは通常減数分裂の際にリセットされるからである。従って、精細胞又は卵細胞の分析は、被験体の表現型の定義を可能とする有用な情報を提供しないであろう。
【００８１】
精細胞又は卵等の自然半数体材料の使用は、臨床において性細胞を取得のあたっての問題からも避けられるべきである。卵の取得はどの年代の女性にとっても侵襲的であり、また、小児男性からの精細胞の採取も医学的介入を必要とする。
【００８２】
減数分裂−再結合のプロセスの際に、ｃｉｓに結合していた遺伝子座がｔｒａｎｓ結合になる現象が起こり得ると考えられる場合、エピジェネティックなハプロタイピングにおいて性細胞を避けることは更に有利である。従って、配偶子のエピジェネティックなハプロタイプを分析すると、二倍体細胞から得られる半数体ＤＮＡのハプロタイプ情報と異なった（即ち、間違った）ハプロタイプ情報が得られるであろう。
【００８３】
本方法の一形態においては、父系由来及び母系由来両者のＤＮＡ及び／又はそれと結合しているタンパク質のエピジェネティックな修飾を分析する。（例えば）母系ＤＮＡか父系ＤＮＡのいずれかのメチル化パターンを調査すれば情報が得られるが、両ソースからのＤＮＡ分子のメチル化を分析すれば更なる情報が得られるであろう。
【００８４】
本発明の一実施形態においては、同一のＤＮＡ分子の二以上のサイトのメチル化を分析する。本方法のこの形態は、二ヶ所のメチル化サイトが細胞中のＤＮＡ分子上にｃｉｓ或いはｔｒａｎｓとして自然に存在するのか決定する際に有用である。これは、単一の染色体（母系又は父系由来のいずれか）上のメチル化サイトのみ考慮することにより、例えば、二ヶ所のメチル化サイトが同一の染色体上に現れることからｃｉｓとして存在することを示すことにより達成することができる。二ヶ所のメチル化サイトがｔｒａｎｓとして存在することを示すためには、母系染色体及び父系染色体を分析することも必要であろう。
【００８５】
或いは、本方法は、ＤＮＡ及び／又はそれと結合しているタンパク質が、父系由来及び母系由来の要素に物理的に分離されていない状態で実施することもできる。Ｉｎ  ｓｉｔｕ方法によれば、父系ＤＮＡ又は母系ＤＮＡを物理的に二分子に分離する必要なしに選択的にプローブすることが可能となろう。このように、二倍体材料を用いて細胞の半数体状態における情報を提供することができる。母系又は父系のＤＮＡを選択的に特定することにより母系又は父系の染色体に対するエピジェネティック修飾のローカリゼーションを可能にする点から、プライムドｉｎ  ｓｉｔｕラベリング（ＰＲＩＮＳ）等の方法は有用である。この方法では、染色体に特異的なプライマーと中期及び間期の核両者を用いることができた（ヒンドゥクジャーら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．、１９９４；３３：９５〜１０７）。
【００８６】
ＰＮＡプローブを染色体のｉｎ  ｓｉｔｕ特定化に用いることができることも、本発明に含まれる。ＰＮＡ化学は、小分子オリゴマーの作成に利用することができる。これらオリゴマーは染料でラベルされた際、良好なプローブとなり、従来の核酸類と異なる利点を提供する。通常、ＰＮＡプローブは非常に小さく（１２〜２０ｍｅｒ）、強いシグナルと非常に低いバックグラウンドを示す。ＰＮＡプローブは、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＰＮＡ−ＦＩＳＨ）の環境において、中期及び間期の染色体に基づいて染色体構造を調べるための強力な技術として用いることができる。ＰＮＡ−ＦＩＳＨは、小さいＰＮＡオリゴマープローブを用いて配列特異的に染色体をラベルすることにより、特定の染色体における基本的な配列を特定化する方法である。ＰＮＡ−ＦＩＳＨの方法は、シュトラウス２００２（ＦＩＳＨ技術における「ＰＮＡ−ＦＩＳＨ」、ラウテンシュトラウス／リーアー編、シュプリンガー・フェアラーク、ハイデルベルク）に開示されている。
【００８７】
本明細書に開示される方法は、メチル化の影響及びタンパク質の修飾を遺伝子発現と関連して考慮しなければならない生物学のどんな領域にも利用することができる。これらの用途は動物（ヒト又は他の動物）に限られず、植物にも応用できる。
【００８８】
本発明の方法により得られる表現型情報は、疾患、病態又は障害の有無、疾患、病態又は障害の素因、治療分子に対する反応能力又は反応無能力、外部抗原又は自己抗原に対して免疫応答を開始する能力又は無能力、アレルギーの有無、及びアレルギーの素因を含む。
【００８９】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものとは解釈されない。
【実施例１】
【００９０】
半数体ＤＮＡのメチル化特異的ＰＣＲ
組織の調製
ヒト被験体から得られた末梢血細胞の中期スプレッドを、標準核型決定法によりＰＥＮスライド膜上に調製する。標準ギムザ染色液を調製し、これを用いて調製物中の染色体を特定化する。
【００９１】
染色の手続き
段階              プロセス                                        時間
１．  リン酸バッファー（ｐＨ：６．８）                            １分
２．  ０．０２５％トリプシン／リン酸バッファー（ｐＨ：６．８）    ２分
３．  リン酸バッファー（ｐＨ：６．８）                            １分
４．  ギムザ染色、作用液                                        １５分
５．  蒸留水                                            ２〜３ディップ
【００９２】
余剰の水はスライドから振り切り、裏側をキムワイプで乾かし、空気中で乾燥する。
【００９３】
レーザーマイクロダイセクション
ＰＡＬＭTMマイクロダイセクションシステム（Ｐ．Ａ．Ｌ．Ｍ．マイクロレーザーテクノロジーズ・ゲーエムベーハー、ドイツ）を用いる。中期スプレッド（前述のように調製）を用いてＰ．Ａ．Ｌ．Ｍ顕微鏡（ｘ１００対物レンズ）下でレーザー捕捉する。標準Ｐ．Ａ．Ｌ．Ｍ顕微鏡プロトコールに従って、単一染色体を含む姉妹染色体から空間的に分離された単一中期染色体を、６μＬの０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を含むカップ（２００μＬ、ウルトラフラックスフラットカップＰＣＲチューブ）中にカタパルトする。メチル化分析のため、カタパルトされた材料を遠心分離にてチューブの底に移送した。母系由来及び父系由来両者のＤＮＡ試料が得られる。
【００９４】
ＤＮＡ抽出
カップシュアマクロＬＣＭカップ上でマイクロダイセクトされた染色体フラグメントから得られたＤＮＡを、ピコピュアＤＮＡ抽出キット（アークトゥスラス社、ＣＡ）を用い、キットのプロトコールに従って抽出する。
【００９５】
メチル化の検出
ＤＮＡを亜硫酸水素ナトリウム処理にて修飾し、未メチル化（メチル化ではなく）シトシンをウラシルに変換する。亜硫酸水素塩を除去し、化学的変換が終了した後、この修飾ＤＮＡをＰＣＲのテンプレートとして用いる。それぞれのＤＮＡ試料についてＰＣＲ反応を二回行う。一方は目的遺伝子のためにメチル化してあるＤＮＡに対してであり、他方は未メチル化のままのＤＮＡに対してである。ＰＣＲ産物は６〜８％非変性ポリアクリルアミドゲル上で分離し、各バンドを臭化エチジウムで染色して視覚化する。適切な分子量のバンドの存在は、原試料に未メチル化及び／又はメチル化対立遺伝子が存在することを示す。
【００９６】
混合物調製のため、１０ｘＰＣＲバッファー、ＮＴＰ及びプライマーを解凍する。分析すべき試料の数を決定する。試料には、未メチル化反応及びメチル化反応に対する陽性コントロールと水コントロールが含まれる。各ＰＣＲ反応（メチル化及び未メチル化）用に混合物のマスターを作る。各５０μＬの反応混合物に次に示す量を使用する。
【００９７】
１０ｘＰＣＲバッファー：５μＬ
２５ｍＭ４ＮＴＰミックス：２．５μＬ
センスプライマー（３００ｎｇ／μＬ）：１μＬ
アンチセンスプライマー（３００ｎｇ／μＬ）：１μＬ
蒸留無菌水：２８．５μＬ
【００９８】
３８μＬのＰＣＲミックスを、各試料用にラベルされた個々のＰＣＲチューブに分注する（０．５  ｍＬチューブ又はストリップ）。分注に先立ち、内容物をよく混合する。
【００９９】
２μＬの亜硫酸水素塩修飾ＤＮＡテンプレートを各チューブに添加する。未メチル化反応物及びメチル化反応物を、陽性コントロール及びＤＮＡフリーコントロールとして各試料に含ませる。
【０１００】
サーモサイクラーに入れる前に１、２滴の鉱物油（約２５〜５０μＬ）を各チューブに添加する。この鉱物油は反応液の表面を完全に覆うことによって蒸発を防ぐ。
【０１０１】
続いてサーマルサイクラーにてＰＣＲ産物を増幅する。ＰＣＲは９５℃、５分間の変性で開始する。最初の変性の後、Ｔａｑポリメラーゼを加える（１．２５ユニットのＴａｑポリメラーゼ、無菌蒸留水で１０μＬに希釈）。この１０μＬを４０μＬの先の油と、ピペットを上下しながら穏やかに混合する。増幅は次にしめすパラメータに従って３５サイクル継続する。
【０１０２】
３０秒、９５℃（変性）
３０秒、プライマー特異的（アニーリング）
３０秒、７２℃（伸長）
最終ステップ：４分、７２℃（伸長）
保存４０℃、分析まで
【０１０３】
ＰＣＲ産物を次のようにゲル電気泳動にて分析する。
【０１０４】
６〜８％の非変性ポリアクリルアミドゲルを調製する。１ｘＴＢＥはより良い緩衝能と、産物分割のためのよりシャープバンドを提供する。通常ＭＳＰ分析で得られる産物の大きさは８０〜２００ｂｐの範囲であり、アクリルアミドゲルはサイズ分割にもっとも適している。高パーセンテ−ジ水平アガロースゲルも代替的に使用できる。
【０１０５】
各試料から得られた反応物を一緒に泳動させると、未メチル化対立遺伝子及びメチル化対立遺伝子間の直接比較が可能となる。陽性及び陰性コントロールも含まれる。垂直ゲルは１０Ｖ／ｃｍにおいて１〜２時間泳動する。ゲルを臭化エチジウムで染色し、ＵＶ光下で視覚化する。特定のＤＮＡ領域における、母系由来のＤＮＡ及び父系由来のＤＮＡのメチル化状態の比較がなされる。
【０１０６】
最後に、種々の他の変更及び／又は改変は明細書に概述した本発明の精神を逸脱しないで可能であると理解されたい。
【０１０７】
本願に基づき優先権を主張してのオーストラリア又は他の国に更なる特許出願がなされる可能性があるが、ここに掲げる暫定的クレームは例としてのみ提供され、更なる出願のいずれかにおいてクレームされる範囲を限定することは意図されないことが理解されよう。後の日付において発明を更に定義又は再定義するため、これら暫定的クレームに特徴を追加したり、仮のクレームから特徴を除くこともありうる。
【国際調査報告】
2010528628.tif 000006
2010528628.tif 000007
2010528628.tif 000008