(57)【要約】  本発明は、個々の輸送システム（５０）の特性を光で測定するためのバイオチップ（１）に関する。輸送分子（５０）の特性を高い測定精度及び動作能力で測定するため、個々の輸送システム（５０）の特性を光で測定するためのバイオチップ（１）が、実質的に、１つの透明な担体（１０）及び上方へ開く複数の凹所（３０）を含み、バイオチップ（１）の開口（３１）が膜（４０）によって覆われ、こうして閉じた測定室（３０）が形成され、膜（４０）を経て凹所（３０）への基板分子（６０）の輸送が検出可能であるように、バイオチップ（１）が構成されている。
2010523987.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個々の輸送システム（５０）の特性を光で測定するためのバイオチップ（１）が、実質的に、１つの透明な担体（１０）及び上方へ開く複数の凹所（３０）を含み、バイオチップ（１）の開口（３１）が膜（４０）によって覆われ、こうして閉じた測定室（３０）が形成され、膜（４０）を経て凹所（３０）への基板分子（６０）の輸送が検出可能であるように、バイオチップ（１）が構成されている、バイオチップ。
【請求項２】
担体（１０）が大きい屈折率を持つ材料特にガラス、珪素又は酸化珪素から成り、この屈折率が使用される測定溶液の屈折率より大きいことを特徴とする、請求項１に記載のバイオチップ。
【請求項３】
担体（１０）が、その上側に結合される１つ又は複数の層（２０）を持っていることを特徴とする、請求項１又は２に記載のバイオチップ。
【請求項４】
上方へ開く凹所（３０）が１つの層又は複数の層（２０）に設けられていることを特徴とする、先行する請求項の１つに記載のバイオチップ。
【請求項５】
凹所（３０）の直径が励起光（８０）の波長より小さく、従って凹所（３０）がゼロモード導波路として構成されていることを特徴とする、先行する請求項の１つに記載のバイオチップ。
【請求項６】
膜（４０）及びその上にある基板分子（６０）から励起光（８０）を遮蔽するために、層（２０）の少なくとも１つが光を透過しない材料特に金属なるべく金又はチタンから成っていることを特徴とする、先行する請求項の１つに記載のバイオチップ。
【請求項７】
層（２０）の１つ又は複数が、結合材により担体（１０）に結合され、結合材がなるべくクロム又はチタンであることを特徴とする、先行する請求項の１つに記載のバイオチップ。
【請求項８】
励起光（８０）を反射して基板分子（６０）を繰り返し励起するため、層（２０）がその下側で反射するように構成されていることを特徴とする、先行する請求項の１つに記載のバイオチップ。
【請求項９】
バイオチップ（１）の表面が、特にアミノ反応するリンカ分子及び／又は膜（４０）をチップ（１）に結合する脂質誘導体を持っていることを特徴とする、先行する請求項の１つに記載のバイオチップ。
【請求項１０】
膜（４０）を電気的に測定するか又は電気的に制御又は開閉するため、層（２０）が導電性で電極として構成されていることを特徴とする、先行する請求項の１つに記載のバイオチップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は個々の輸送システムの特性を光で測定するためのバイオチップに関する。
【背景技術】
【０００２】  生物膜は細胞を外部の媒体から隔離し、細胞の個々の細胞区画を互いに隔離している。輸送プロテイン及び導管のような輸送システムは、膜の物質通過を選択的に制御する。これらの輸送体及び導管の機能障害は、多数の広がった病気に対して責任がある。２００４年に米国において最も多く販売された１００種類の薬品のうち、膜輸送体が最も頻繁に現れるターゲット群であった。世界中の３２６社の一覧表において、少なくとも１３０２種の輸送薬が、導入された薬及び開発中の薬である。全体として現在１００種以上の輸送ターゲットが製薬会社において研究され、そのことは、これがどんなに多くの経済的意味を持つかを示している。【０００３】  このような作用物質の開発のために、特別な基板の輸送速度のような特性を輸送ターゲット及び作用物質の影響により評価できるようにする測定方法が必要である。【０００４】  イオン及び帯電粒子の輸送速度を分析するために、電気測定を使用することができる。この方法は生物応用工学及び製薬の研究において多く使用されている。しかしこの方法は帯電した輸送基板に限られており、従って一般にイオン通路の群のために使用される。アミノ酸、ペプチド、サクレート及び脂肪酸のような帯電しない分子、及びＲＮＡ、ＤＮＡ及びプロテインのような生物巨大分子の輸送は、電気的方法により間接的にのみ測定可能である。【０００５】  これに反し蛍光分析は、これらの分子の輸送を見えるようにすることができる。そのための第１の準備作業は、生物分子の輸送のための大学グループによって、Ｘｅｎｏｐｕｓ  Ｌａｅｖｉｓから成る心ジャケット内の心穴群により行われた。それはα溶血素孔を通るカルシウムイオンの輸送の測定にも適用され、このα溶血素孔は、予め製造された人工脂質膜へ直接挿入され、変性構造から機能形式に戻る。【０００６】  そのため刊行物においてポリカーボネートフィルタ又はポリカーボネート構造が使用され、その凹所が共焦点レーザ走査顕微鏡検査により、輸送速度の蛍光測定のために使用された。これは、特にポリカーボネート及び測定バッファの屈折率の相違のため、悪い光学特性を生じる。基礎研究を越えて大きい動作能力で方法の生物応用工学又は薬学的応用に至るか又はこれに適したチップを使用する広範な実験は、発表されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】  従って本発明の課題は、輸送分子の特性を高い測定精度及び高い動作能力で測定できる装置を提案することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】  この課題は、個々の輸送システムの特性を光で測定するためのバイオチップが、実質的に、１つの透明な担体及び上方へ開く複数の凹所を含み、バイオチップの開口が膜によって覆われ、こうして閉じた測定室が形成され、膜を経て凹所への基板分子の輸送が検出可能であるように、バイオチップが構成されていることによって解決される。そのために膜がバイオチップの凹所の上に張られるので、凹所が閉じられている。膜を経て供給されかつ蛍光法で検出可能な輸送基板は、従って膜に含まれる輸送プロテインまたはチャネルによってのみ、バイオチップの測定空間へ達する。蛍光測定によって、これらの基板を凹所において検出し、量定することができる。評価により輸送速度のようなパラメータが得られ、輸送プロテイン／チャネル又は例えば作用物質候補の影響の逆推論が可能になる。方法及び評価は自動的に高い動作能力で行うことができる。【０００９】  バイオチップ上になるべく金属から成る導電層が設けられると、この層を更になるべくインピーダンス分光学の測定又は電界の印加のための電極として使用することができる。膜上の溶液中の第２の電極により、例えばインピーダンス分光学により、被覆される脂質層又は細胞層の電気的密閉性についての情報が得られる。これは品質管理として脂質層の品質又は細胞の生存能力の評価に利用することができる。印加される電界は、例えばイオンチャネルを開かれた状態に切換え、それから上述したようにイオンに関係する蛍光指示薬の蛍光測定による輸送測定を行うために、電圧に関係するチャネルプロテインの制御に使用することができる。【００１０】  この方法を生物工学及び薬学に応用するため、標準方法により製造されるプロテオリポソーメン即ち膜へ挿入される輸送プロテインを含む人工の中空膜胞を使用することが必要である。これらの輸送プロテインは、バイオチップの活性化された表面に直接結合されるか、又は前もって形成された脂質膜による融合により設けられる。その際胞は輸送体を含む膜に変形され、この膜が凹所から形成されるバイオチップの測定室を閉鎖し、それにより輸送体を特徴づけかつ輸送速度を決定する蛍光測定を可能にする。【００１１】  担体は有利に大きい屈折率を持つ材料特にガラス、珪素又は酸化珪素から成っている。これにより光学的な人工的産物が減少され、ナノメータ範囲にある寸法を持つ凹所における蛍光検出が可能になる。この屈折率が使用される測定溶液の屈折率より大きいと、角をなす励起光の入射により、全反射従って材料と測定溶液の界面にエバネッセント界を生じて、蛍光検出に利用することができる。【００１２】  担体が、その上側に結合される１つ又は複数の層を持つことができる。上方へ開く凹所が１つの層又は複数の層に設けられている。これにより担体及び測定室に異なる材料を使用することができ、それが有利な特性を可能にする。【００１３】  好ましい実施形態では、凹所の直径が励起光の波長より小さく、従って凹所がゼロモード導波路として構成されている。その場合励起光の強さは、測定室内で指数関数的に減少し、それにより高度に選択的な励起が可能である。【００１４】  層の少なくとも１つが光を透過しない材料特に金属から成っていると���バイオチップは上側でほぼ光を透過する。これにより励起光が膜により遮蔽される。膜内又は膜の上従って測定室外にあって蛍光を発生する基板分子は、こうして励起されない。これにより有害な背景信号が減少されるか又は回避される。【００１５】  と二に適した材料は金である。なぜならば、これは化学的に不活性であり、担体材料に確実に結合可能であり、更に適当な光反射特性を持っているからである。チタンも同様に適している。【００１６】  金属層は結合材により担体に固定的に結合される。結合材として金属特にクロム又はチタンが非常によく適していることがわかった。【００１７】  励起光を反射して基板分子を繰り返し励起するため、金属層がその下側で反射するように構成されていることによって、測定精度の改善が行われる。【００１８】  金属層にある開口が凹所の開口より小さいように、金属層の開口が選ばれていることによって、凹所の開口を、その上に設けられる金属層によって一部覆うことができる。【００１９】  更に開口の上にある金属層が、膜の電気的測定のための電極として使用可能であるが、又は電界の発生のためにも使用可能である。【００２０】  層が酸化珪素から成っていると、層の凹所において輸送速度の蛍光検出が可能である。【００２１】  透明な担体の上にある層がテフロン又はサイトップのようなフルオロポリアから成っていると、これは、例えば共焦点レーザ走査顕微鏡検査により、測定室内で蛍光の検出を可能にする。【００２２】  凹所の直径が下から上側へ連続的に減少し、従って凹所がほぼ円錐形状を持つことによって、それ以外の改善が行われる。担体の上へ大きくなる室の直径は、こうして形成される測定空間における蛍光の検出を一層高い精度で可能にする。【００２３】  バイオチップの表面が、特にアミノ反応するリンカ分子及び／又は膜の適当な成分に共有結合又は非共有結合で結合する脂質誘導体を持っているように、結合すなわちバイオチップへの生物膜又は人工胞の固定を行うことができる。【００２４】  膜は輸送分子として１つ又は複数のプロテイン特に細孔プロテイン又はチャネルプロテイン又はキャリヤプロテインを持ち、これらのプロテインの輸送能力が胞膜を介して検出される。【００２５】  バイオチップのそれ以外の適用は、組換え形プロテイン及び抗体用の製造細胞線の特徴づけである。このため組換え形プロテイン又は抗体を製造するための細胞または細胞成分が測定される。その際細胞がバイオチップに結合されるので、その膜がチップの凹所を閉鎖する。バイオチップ上の細胞を成長させることも可能である。製造されるプロテインを測定空間へ分泌する際、レポーターシステムを介して蛍光信号が発生される。この蛍光信号は、製造される組換え形プロテインまたは抗体についての説明を与え、それによりこれらのプロテイン及び抗体の生物工学的製造のために使用可能で多量に製造される細胞を見つけ出すのを可能にする。【００２６】  測定の際使用される膜は、生物学的又は人工の脂質膜であってもよい。生物学的膜が使用される場合、特に自然の測定条件が生じる。【００２７】  測定は、再構成された輸送分子を収容する胞膜により行われるのがよい。これは、速やかで再現可能な測定を可能にする��胞膜へ埋込むことにより、輸送プロテインは更に再びその機能的な分子の幾何学的配置をとる。【００２８】  凹所の上に張られる膜ができるだけ少数なるべく１〜３個の輸送分子を含んでいると、正確な測定が可能である。【００２９】  輸送分子により輸送される基板の検出は、基板分子が蛍光を発することによって、特に基板分子が蛍光色素に結合されているけれども、例えばイオン流を測定するため基板に関係する蛍光指示薬への結合によっても結合されていることによって、可能にされる。【００３０】  蛍光を発する基板分子は、輸送分子により膜を経てバイオチップの凹所へ輸送される。そこで基板分子は、適当な蛍光検出装置によって検出される。【００３１】  検出装置が凹所内の共焦点面において蛍光を測定することによって、特に正確な測定が行われる。【００３２】  エバネッセント界が発生されて蛍光検出のために使用されるように、励起光の波長を考慮して凹所の直径が選ばれていることによって、精度が更に改善される。【００３３】  別の実施形態では、全反射角を励起光が入射され、こうして蛍光検出のために使用されることによって、エバネッセント界が発生される。【００３４】  別の好ましい実施形態では、層が導電性で電極として構成されて、膜を電気的に測定又は励起する。適当な層は、例えば担体上に設けられる金性の金属層とすることができる。【００３５】  驚くべきことに、それにより層が、更に膜又は細胞層又は膜にある輸送システムの電気的特性を特徴づける電極として使用可能である。【００３６】  バイオチップの上に張られる膜又は輸送システム例えば輸送プロテインを含む上皮細胞層のインピーダンスが測定されるように、バイオチップを使用することができる。これにより膜の密封性を検出することができる。【００３７】  特に電圧に感応する輸送システムを制御するため、電界を発生するためにも、電極によりバイオチップを使用することができる。これは例えば電圧に関係するイオンチャネル、即ち膜電圧の特定の限界値において開くか又は閉じるイオンチャネルである。印加される電界の変化により、膜を介する基板の輸送を変化することになる開閉過程を開始することができる。その場合凹所において蛍光指示薬により、輸送基板を検出することができる。【００３８】  例えばバイオチップの使用は、バイオチップの上の金属層をイオンチャネルを含む脂質膜で覆うことである。測定のため、導電層即ち電極へ電界が印加される。印加される電圧はイオンチャネルを活性化する。これにより膜を経て凹所へイオン流が生じて、蛍光により定量的に検出される。【００３９】  従って提案されたバイオチップは、驚くべきことに、それが生物学的輸送システムを電気的に機能的に開閉し、同時にそれにより膜を介して生じる輸送を蛍光により光学的に測定することができる。【００４０】  本発明の好ましい実施例が図面を参照して説明され、それ以外の有利な詳細が図からわかる。その際機能的の同じ部分は同じ符号を付けられている。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】  本発明によるバイオチップの垂直断面図を示す。
【図２】  胞を持つ図１と同様な垂直断面図を示す。
【図３】  上に載る生物学的細胞を持つ図２と同様な垂直断面図を示す。
【図４】  バイオチップのアレイの平面図を示す。
【図５ａ】  凹所を持つバイオチップの詳細を垂直断面図で示す。
【図５ｂ】  円錐状凹所を持つバイオチップの詳細を垂直断面図で示す。
【図６】  凹所を持つバイオチップの好ましい実施例の詳細を垂直断面図で示す。
【発明を実施するための形態】
【００４２】  図１は本発明によるバイオチップの垂直断面図を示す。バイオチップ１は、励起光又は蛍光に対して透明な担体１０を含んでいる。チップはその上側に凹所３０を持ち、これらの凹所が基板６０を検出する測定室として用いられる。図示した実施例では、バイオチップは異なる材料の複合体から成っている。カバーガラスから成り光を透過する担体１０が基礎を形成している。担体の上側には二酸化珪素から成る層２０が設けられている。二酸化珪素層２０上には、励起光８０に対する反射体としても金から成る別の層のための結合材としても役立つチタンから成る層が設けられている。金層は接触子及び電極として用いることができる。３つの層２０は貫通する凹所３０を持ち、これらの凹所により上方へ開くそれぞれ１つの測定室が形成される。
【００４３】  バイオチップ１の表面には、測定のため膜４０が設けられているので、測定室３０が閉鎖される。膜４０は、輸送システムとして輸送プロテイン又は細孔プロテインを含む人口のプロテオリポソーメン５から製造することができる。他方膜４０は、組換え形プロテインまたは抗体のための製造細胞線の細胞膜であってもよい。
【００４４】  膜４０は輸送プロテインまたは細孔プロテインのような輸送システム５０を含んでいる。この場合例示的に、例えば基板として、脂肪酸を含むアドレノロイコジストロフィーＡＢＣＤ１輸送体又は例えば精神疾患における新陳代謝を妨げられる基板としてのグルタミン酸塩を含むグルタミン酸塩輸送体のように多くの病気にとって重要なＡＢＣ輸送体群の輸送体を挙げることができる。
【００４５】  膜の上に、蛍光法で検出可能な１つ又は複数の輸送基板６０が付加される。これは、例えば基板が蛍光色素で共有結合で標識付けされていることによって可能である。膜４０に含まれる輸送システム５０によるバイオチップの凹所３０への輸送基板の輸送７０は、含まれる輸送システム５０に対して特有であり、測定空間３０における蛍光測定によって量定可能である。これは輸送システム５０にとって特有な輸送速度及び透過性のようなパラメータの逆推論、従って作用物質候補の評価又は製造細胞線の製造速度の評価を可能にする。
【００４６】  バイオチップは、測定空間３０を含みかつ光を透過する担体１０上に設けられるテフロン又はサイトップのような弗素ポリマ２０から成っていてもよい。これは、例えば共焦点レーザ走査顕微鏡検査により、測定空間内の蛍光の検出を可能にする。
【００４７】  しかしバイオチップは、穴３０を形成されかつ光を透過する担体１０上に設けられる金属層２０から成ることもできる。穴３０の直径がナノメータ範囲にある特定の大きさを下回ると、入射される。光はもはや完全に測定空間へ進入できず、その代わりに担体の移行部にエバネッセント界が形成される。その場合凹所は“ゾロモード導波路”を示し、こうして形成される測定空間内で蛍光の検出を可能にする。
【００４８】  バイオチップを製造する別の可能性は、二酸化珪素ダイオード２０に円錐状穴３０を異方性的にエッチングし、それからこの二酸化珪素を透明な担体１０上に設けることである。担体１０の方へ大きくなる穴の直径は、これらの凹所における蛍光の検出を可能にする。
【００４９】  更に例えばガラス１０＋２０、屈折率１．５３のような大きい屈折率を持つ材料に凹所３０を形成することによって、バイオチップを製造することができる。この屈折率は、測定空間３０内にあって１．３３の屈折率を持つ測定溶液の屈折率より著しく大きい。励起光が下から斜めに入射されると、担体から測定溶液への移行部において、特定の角から、光の全反射でエバネッセント界が生じて、測定空間３０における蛍光の検出に利用可能である。
【００５０】  図２は、胞５を持つ図１のような垂直断面図を示す。胞膜に細孔を形成するプロテイン５０が再構成されている。
【００５１】  図３は、上に載る生物学的細胞１５を持つ図２のような垂直断面図を示す。これは完全な細胞１５であるか、又はその一部だけであってもよい。細胞は複数の凹所３０にわたって延び、これらを覆っている。これにより、自然の生物学的条件での測定が可能である。
【００５２】  図４はバイオチップ１のアレイの平面図を示す。平面図で正方形のそれぞれ４つの凹所３０が密に隣接して配置されて１つの群３５を形成していることによって、このアレイが形成される。群３５はそれぞれ約１００μｍの長さｃ及び幅ｄを持っている。それぞれ１６個の凹所群３５又は６４個の凹所３０が、それぞれ約５００μｍの長さａ及び幅ｂを持つアレイ３６に設けられている。
【００５３】  図５ａは、凹所３０を持つバイオチップ１の実施例の詳細を垂直断面図で示している。この場合カバーガラスから成る担体１０上に、クロム又はチタン（図示せず）から成る結合材により、金から成る金属層が設けられている。この実施例では、測定室３０は金属にある開口３１によってのみ形成され、ガラス担体１０自体は凹所を持っていない。
【００５４】  ず５ｂは図５ａと類似な実施例を示しているが、金属層２０は円錐状の凹所３０を持っている。開口３１はその上側で同様に６０〜１２０ｎｍの直径を持っているが、下方へ広がっている。これにより測定精度が高まる。なぜならば、測定室３０はもっと多くの基板６０（図示ぜず）を含み、こうして信号／雑音比が改善される。
【００５５】  図６は、凹所を持つバイオチップ１の好ましい実施例の詳細を垂直断面図で示す。ここではカバーガラスから成る担体１０及びその上に結合される二酸化珪素の層２０上に、金から成る別の金属層が、クロム又はチタンから成る結合材（図示せず）により設けられている。両方の金属層は全部で約１００ｎｍの暑さをもっている。二酸化珪素層及び金属層は、層開口３１及び２００ｎｍの直径を持つ凹所３０を備えている。ピッチは５００ｎｍである。細胞膜の測定のために、ピッチは１〜２．５μｍである。
【００５６】  上述した実施例とは異なり、測定室は二酸化珪素２０及び両金属層から成る層内の凹所３０により形成される。凹所は約１μｍの長さｅ及び約２００ｎｍの開口直径３１を持っている。金属層の厚さｆはなるべく約１００ｎｍ、層開口２１の直径は約２００ｎｍである。
【００５７】  この実施例の利点は、一方では、凹所３０によりガラス担体１０に形成される測定空間が垂直方向に一層大きい寸法を持っていることである。これにより膜を経て輸送される基板分子５０（図示せず）が、平均して膜従って輸送されない基板分子５０から一層大きく離れている。理想的には、脂質膜（図示せず）の下にある基板分子５０のみが蛍光となるように励起されるようにし、これは一層大きい空間的距離により容易になる。それにより信号／雑音比が高まる。
【００５８】  上の凹所開口３１が金属層２０により一部覆われることによって、信号／雑音比を更に改善することができる。こうして励起光は、膜より上の輸送されない基板分子５０（図示ぜず）により効果的に遮蔽される。
【００５９】  別の驚くべき利点は、金属層２０が励起光を反射することである。このことを明らかにするため、図６は励起光の光線８０の概略図を示している。平行な光束８０は、斜角にガラス担体１０の下側へ入射される。光路は市販のＴＩＲＦ顕微鏡におけるように設けられている。光線８０は金属層２０により反射され、試料６０（図示せず）を持つ測定空間３０を繰り返し通過する。
【００６０】  これにより信号励起が倍数だけ強められ、それにより測定精度が更に著しく改善される。
【００６１】  励起光のほかに形成されるエバネッセント波は、図６に示されていない。傾斜入射及び金属層２０の厚さにより、直径は“ゼロモード励起”にとっては充分でないが、このことは信号抑制のために望ましい。
【符号の説明】
【００６２】  １    バイオチップ
２    胞
１０  担体
１５  生物学的細胞
２０  層
２１  層開口
３０  凹所
３１  凹所開口
３５  凹所群
３６  アレイ
４０  膜
５０  輸送分子
６０  基盤
８０  励起光
【図１】
2010523987.tif 000003
【図２】
2010523987.tif 000004
【図３】
2010523987.tif 000005
【図４】
2010523987.tif 000006
【図５ａ】
2010523987.tif 000007
【図５ｂ】
2010523987.tif 000008
【図６】
2010523987.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】平成21年8月26日(2009.8.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜に結合される能動又は受動輸送システム（５０）の特性を測定するためのバイオチップ（１）が、測定室として形成される複数の凹所（３０）を有する層（２０）を持っているものにおいて、この層（２０）上に、測定室（３０）用の開口（２１）を持ちかつ実質的に光を透過しない層（２２）が設けられて、脂質膜（４０）を経て閉じた測定室（３０）への基板分子（６０）の輸送（３０）を測定する際、膜及び測定室（３０）外の基板分子（６０）から励起光（８０）を遮蔽することを特徴とする、バイオチップ。
【請求項２】
測定室（３０）を持つ層（２０）が透明であり、なるべく１．３３より大きい屈折率を持つ材料から成っていることを特徴とする、請求項１に記載のバイオチップ。
【請求項３】
測定室（３０）を持つ層（２０）がガラス、珪素、二酸化珪素、又はフルオロポリマかた成っていることを特徴とする、請求項１又は２に記載のバイオチップ。
【請求項４】
測定室（３０）を持つ層（２０）のために、なるべくガラス又は珪素又は二酸化珪素から成る透明な担体（１０）が設けられていることを特徴とする、先行する請求項の１つに記載のバイオチップ。
【請求項５】
実質的に光を通さない層（２２）が、金属なるべく金、チタン又はクロムから成り、励起光（８０）を測定室（３０）内へ反射するように構成されていることを特徴とする、先行する請求項の１つに記載のバイオチップ。
【請求項６】
測定室（３０）外にある基板分子（６０）から励起光（８０）を遮断するため、実質的に光を透過しない層（２２）にある開口（２１）が、測定室（３０）の開口（３１）より小さいことを特徴とする、先行する請求項の１つに記載のバイオチップ。
【請求項７】
光を透過しない層（２２）上に、測定室（３０）の１つ又は複数の開口（２１）を上から覆って閉鎖する人工的又は天然の脂質膜（４０）が設けられていることを特徴とする、先行する請求項の１つに記載のバイオチップ。
【請求項８】
特にアミノ反応するリンカ分子及び／又は脂質誘導体が設けられて、脂質膜（４０）をチップ（１）に結合することを特徴とする、先行する請求項の１つに記載のバイオチップ。
【請求項９】
金属層（２２）が電極として構成され、脂質膜（４０）の上に別の電極が設けられて、脂質膜（４０）及び／又は輸送システム（５０）を通る電流又はインピーダンスを測定するか、又は電位の印加により輸送システム（５０）を開閉することを特徴とする、先行する請求項の１つに記載のバイオチップ。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は個々の輸送システムの特性を光で測定するためのバイオチップに関する。
【背景技術】
【０００２】  生物膜は細胞を外部の媒体から隔離し、細胞の個々の細胞区画を互いに隔離している。輸送プロテイン及びチャネルのような輸送システムは、膜の物質通過を選択的に制御する。これらの輸送体及びチャネルの機能障害は、多数の広がった病気に対して責任がある。２００４年に米国において最も多く販売された１００種類の薬品のうち、膜輸送体が最も頻繁に現れるターゲット群であった。世界中の３２６社の一覧表において、少なくとも１３０２種の輸送薬が、導入された薬及び開発中の薬である。全体として現在１００種以上の輸送ターゲットが製薬会社において研究され、そのことは、これがどんなに多くの経済的意味を持つかを示している。【０００３】  このような作用物質の開発のために、特別な基板の輸送速度のような特性を輸送ターゲット及び作用物質の影響により評価できるようにする測定方法が必要である。この場合特に個々のターゲット分子を自動化して高い動作能力で特徴づける方法が必要とされる。【０００４】  イオン及び帯電粒子の輸送速度を分析するために、電気測定を使用することができる。この方法は生物応用工学及び製薬の研究において多く使用されている。しかしこの方法は帯電した輸送基板に限られており、従って一般にイオンチャネルの群のために使用される。アミノ酸、ペプチド、サクレート及び脂肪酸のような帯電しない分子、及びＲＮＡ、ＤＮＡ及びプロテインのような生物巨大分子の輸送は、電気的方法により間接的にのみ測定可能である。【０００５】  これに反し蛍光分析は、これらの分子の輸送を見えるようにすることができる。そのための第１の準備作業は、生物分子の輸送のための大学グループによって、Ｘｅｎｏｐｕｓ  Ｌａｅｖｉｓから成る心ジャケット内の心穴群により行われた。それはα溶血素孔を通るカルシウムイオンの輸送の測定にも適用され、このα溶血素孔は、予め製造された人工脂質膜へ直接挿入され、変性構造から機能形式に戻る。【０００６】  そのため刊行物においてポリカーボネートフィルタ又はポリカーボネート構造が使用され、その凹所が共焦点レーザ走査顕微鏡検査により、輸送速度の蛍光測定のために使用された。これは、特にポリカーボネート及び測定バッファの屈折率の相違のため、悪い光学特性を生じる。基礎研究を越えて高い動作能力で方法の生物応用工学又は薬学的応用に至るか又はこれに適したチップを使用する広範な実験は、発表されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】  従って本発明の課題は、輸送分子の特性を高い測定精度及び高い動作能力で測定できる装置を提案することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】  この課題は、個々の輸送システムの特性を光で測定するためのバイオチップが、実質的に、１つの透明な担体及び上方へ開く複数の凹所を含み、バイオチップの開口が膜によって覆われ、こうして閉じた測定室が形成され、膜を経て凹所への基板分子の輸送が検出可能であるように、バイオチップが構成されていることによって解決される。そのために膜がバイオチップの凹所の上に張られるので、凹所が閉じられている。膜を経て供給されかつ蛍光法で検出可能な輸送基板は、従って膜に含まれる輸送プロテインまたはチャネルによってのみ、バイオチップの測定空間へ達する。蛍光測定によって、これらの基板を凹所において検出し、量定することができる。評価により輸送速度のようなパラメータが得られ、輸送プロテイン／チャネル又は例えば作用物質候補の影響の逆推論が可能になる。方法及び評価は自動的に高い動作能力で行うことができる。【０００９】  バイオチップ上になるべく金属から成る導電層が設けられると、この層を更になるべくインピーダンス分光学の測定又は電界の印加のための電極として使用することができる。膜上の溶液中の第２の電極により、例えばインピーダンス分光学により、被覆される脂質層又は細胞層の電気的密閉性についての情報が得られる。これは品質管理として脂質層の品質又は細胞の生存能力の評価に利用することができる。印加される電界は、例えばイオンチャネルを開かれた状態に切換え、それから上述したようにイオンに関係する蛍光指示薬の蛍光測定による輸送測定を行うために、電圧に関係するチャネルプロテインの制御に使用することができる。【００１０】  この方法を生物応用工学及び薬学に応用するため、標準方法により製造されるプロテオリポソーメン即ち膜へ挿入される輸送プロテインを含む人工の中空膜胞を使用することが必要である。これらの輸送プロテインは、バイオチップの活性化された表面に直接結合されるか、又は前もって形成された脂質膜による融合により設けられる。その際胞は輸送体を含む膜に変形され、この膜が凹所から形成されるバイオチップの測定室を閉鎖し、それにより輸送体を特徴づけかつ輸送速度を決定する蛍光測定を可能にする。【００１１】  担体は有利に大きい屈折率を持つ材料特にガラス、珪素又は酸化珪素から成っている。これにより光学的な人工的産物が減少され、ナノメータ範囲にある寸法を持つ凹所における蛍光検出が可能になる。この屈折率が使用される測定溶液の屈折率より大きいと、角をなす励起光の入射により、全反射従って材料と測定溶液の界面にエバネッセント界を生じて、蛍光検出に利用することができる。【００１２】  担体が、その上側に結合される１つ又は複数の層を持つことができる。上方へ開く凹所が１つの層又は複数の層に設けられている。これにより担体及び測定室に異なる材料を使用することができ、それが有利な特性を可能にする。【００１３】  好ましい実施形態では、凹所の直径が励起光の波長より小さく、従って凹所がゼロモード導波路として構成されている。その場合励起光の強さは、測定室内で指数関数的に減少し、それにより高度に選択的な励起が可能である。【００１４】  層の少なくとも１つが光を透過しない材料特に金属から成ってい���と、バイオチップは上側でほぼ光を透過しない。これにより励起光が膜により遮蔽される。膜内又は膜の上従って測定室外にあって蛍光を発生する基板分子は、こうして励起されない。これにより有害な背景信号が減少されるか又は回避される。【００１５】  特に適した材料は金である。なぜならば、これは化学的に不活性であり、担体材料に確実に結合可能であり、更に適当な光反射特性を持っているからである。チタンも同様に適している。【００１６】  金属層は結合材により担体に固定的に結合される。結合材として金属特にクロム又はチタンが非常によく適していることがわかった。【００１７】  励起光を反射して基板分子を繰り返し励起するため、金属層がその下側で反射するように構成されていることによって、測定精度の改善が行われる。【００１８】  金属層にある開口が凹所の開口より小さいように、金属層の開口が選ばれていることによって、凹所の開口を、その上に設けられる金属層によって一部覆うことができる。【００１９】  更に開口の上にある金属層が、膜の電気的測定のための電極として使用可能であるか、又は電界の発生のためにも使用可能である。【００２０】  層が酸化珪素から成っていると、層の凹所において輸送速度の蛍光検出が可能である。【００２１】  透明な担体の上にある層がテフロン又はサイトップのようなフルオロポリマから成っていると、これは、例えば共焦点レーザ走査顕微鏡検査により、測定室内で蛍光の検出を可能にする。【００２２】  凹所の直径が下側から上側へ連続的に減少し、従って凹所がほぼ円錐形状を持つことによって、それ以外の改善が行われる。担体の上へ大きくなる室の直径は、こうして形成される測定空間における蛍光の検出を一層高い精度で可能にする。【００２３】  バイオチップの表面が、特にアミノ反応するリンカ分子及び／又は膜の適当な成分に共有結合又は非共有結合で結合する脂質誘導体を持っているように、結合すなわちバイオチップへの生物膜又は人工胞の固定を行うことができる。【００２４】  膜は輸送分子として１つ又は複数のプロテイン特に細孔プロテイン又はチャネルプロテイン又はキャリヤプロテインを持ち、これらのプロテインの輸送能力が胞膜を介して検出される。【００２５】  バイオチップのそれ以外の適用は、組換え形プロテイン及び抗体用の製造細胞線の特徴づけである。このため組換え形プロテイン又は抗体を製造するための細胞または細胞成分が測定される。その際細胞がバイオチップに結合されるので、その膜がチップの凹所を閉鎖する。バイオチップ上の細胞を成長させることも可能である。製造されるプロテインを測定空間へ分泌する際、レポーターシステムを介して蛍光信号が発生される。この蛍光信号は、製造される組換え形プロテインまたは抗体についての説明を与え、それによりこれらのプロテイン及び抗体の生物工学的製造のために使用可能で多量に製造される細胞を見つけ出すのを可能にする。【００２６】  測定の際使用される膜は、生物学的又は人工の脂質膜であってもよい。生物学的膜が使用される場合、特に自然の測定条件が生じる。【００２７】  測定は、再構成された輸送分子を収容する胞膜により行われるのがよい。これは、速やかで再現可能な測定を可能��する。胞膜へ埋込むことにより、輸送プロテインは更に再びその機能的な分子の幾何学的配列をとる。【００２８】  凹所の上に張られる膜ができるだけ少数なるべく１〜３個の輸送分子を含んでいると、正確な測定が可能である。【００２９】  輸送分子により輸送される基板の検出は、基板分子が蛍光を発することによって、特に基板分子が蛍光色素に結合されているけれども、例えばイオン流を測定するため基板に関係する蛍光指示薬への結合によっても結合されていることによって、可能にされる。【００３０】  蛍光を発する基板分子は、輸送分子により膜を経てバイオチップの凹所へ輸送される。そこで基板分子は、適当な蛍光検出装置によって検出される。【００３１】  検出装置が凹所内の共焦点面において蛍光を測定することによって、特に正確な測定が行われる。【００３２】  エバネッセント界が発生されて蛍光検出のために使用されるように、励起光の波長を考慮して凹所の直径が選ばれていることによって、精度が更に改善される。【００３３】  別の実施形態では、全反射角で励起光が入射され、こうして蛍光検出のために使用されることによって、エバネッセント界が発生される。【００３４】  別の好ましい実施形態では、層が導電性で電極として構成されて、膜を電気的に測定又は励起する。適当な層は、例えば担体上に設けられる金製の金属層とすることができる。【００３５】  驚くべきことに、それにより層が、更に膜又は細胞層又は膜にある輸送システムの電気的特性を特徴づける電極として使用可能である。【００３６】  バイオチップの上に張られる膜又は輸送システム例えば輸送プロテインを含む上皮細胞層のインピーダンスが測定されるように、バイオチップを使用することができる。これにより膜の密封性を検出することができる。【００３７】  特に電圧に感応する輸送システムを制御するため、電界を発生するためにも、電極によりバイオチップを使用することができる。これは例えば電圧に関係するイオンチャネル、即ち膜電圧の特定の限界値において開くか又は閉じるイオンチャネルである。印加される電界の変化により、膜を介する基板の輸送を変化することになる開閉過程を開始することができる。その場合凹所において蛍光指示薬により、輸送基板を検出することができる。【００３８】  例えばバイオチップの使用は、バイオチップの上の金属層をイオンチャネルを含む脂質膜で覆うことである。測定のため、導電層即ち電極へ電界が印加される。印加される電圧はイオンチャネルを活性化する。これにより膜を経て凹所へイオン流が生じて、蛍光により定量的に検出される。【００３９】  従って提案されたバイオチップは、驚くべきことに、それが生物学的輸送システムを電気的に機能的に開閉し、同時にそれにより膜を介して生じる輸送を蛍光により光学的に測定することができる。【００４０】  本発明の好ましい実施例が図面を参照して説明され、それ以外の有利な詳細が図からわかる。その際機能的の同じ部分は同じ符号を付けられている。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】  本発明によるバイオチップの垂直断面図を示す。
【図２】  胞を持つ図１と同様な垂直断面図を示す。
【図３】  上に載る生物学的細胞を持つ図２と同様な垂直断面図を示す。
【図４】  バイオチップのアレイの平面図を示す。
【図５ａ】  凹所を持つバイオチップの詳細を垂直断面図で示す。
【図５ｂ】  円錐状凹所を持つバイオチップの詳細を垂直断面図で示す。
【図６】  凹所を持つバイオチップの好ましい実施例の詳細を垂直断面図で示す。
【発明を実施するための形態】
【００４２】  図１は本発明によるバイオチップの垂直断面図を示す。バイオチップ１は、励起光又は蛍光に対して透明な担体１０を含んでいる。チップはその上側に凹所３０を持ち、これらの凹所が基板６０を検出する測定室として用いられる。図示した実施例では、バイオチップは異なる材料の複合体から成っている。カバーガラスから成り光を透過する担体１０が基礎を形成している。担体の上側には二酸化珪素から成る層２０が設けられている。二酸化珪素層２０上には、励起光８０に対する反射体としても金から成る別の層のための結合材としても役立つチタンから成る層が設けられている。金層は接触子及び電極として用いることができる。３つの層２０は貫通する凹所３０を持ち、これらの凹所により上方へ開くそれぞれ１つの測定室が形成される。
【００４３】  バイオチップ１の表面には、測定のため膜４０が設けられているので、測定室３０が閉鎖される。膜４０は、輸送システムとして輸送プロテイン又は細孔プロテインを含む人口のプロテオリポソーメン５から製造することができる。他方膜４０は、組換え形プロテインまたは抗体のための製造細胞線の細胞膜であってもよい。
【００４４】  膜４０は輸送プロテインまたは細孔プロテインのような輸送システム５０を含んでいる。この場合例示的に、例えば基板として、脂肪酸を含むアドレノロイコジストロフィーＡＢＣＤ１輸送体又は例えば精神疾患における新陳代謝を妨げられる基板としてのグルタミン酸塩を含むグルタミン酸塩輸送体のように多くの病気にとって重要なＡＢＣ輸送体群の輸送体を挙げることができる。
【００４５】  膜の上に、蛍光法で検出可能な１つ又は複数の輸送基板６０が付加される。これは、例えば基板が蛍光色素で共有結合で標識付けされていることによって可能である。膜４０に含まれる輸送システム５０によるバイオチップの凹所３０への輸送基板の輸送７０は、含まれる輸送システム５０に対して特有であり、測定空間３０における蛍光測定によって量定可能である。これは輸送システム５０にとって特有な輸送速度及び透過性のようなパラメータの逆推論、従って作用物質候補の評価又は製造細胞線の製造速度の評価を可能にする。
【００４６】  バイオチップは、測定空間３０を含みかつ光を透過する担体１０上に設けられるテフロン又はサイトップのようなフルオロポリマ２０から成っていてもよい。これは、例えば共焦点レーザ走査顕微鏡検査により、測定空間内の蛍光の検出を可能にする。
【００４７】  しかしバイオチップは、穴３０を形成されかつ光を透過する担体１０上に設けられる金属層２２から成ることもできる。穴３０の直径がナノメータ範囲にある特定の大きさを下回ると、入射される光はもはや完全に測定空間へ進入できず、その代わりに担体の移行部にエバネッセント界が形成される。その場合凹所は“ゼロモード導波路”を示し、こうして形成される測定空間内で蛍光の検出を可能にする。
【００４８】  バイオチップを製造する別の可能性は、二酸化珪素ダイオード２０に円錐状穴３０を異方性的にエッチングし、それからこの二酸化珪素を透明な担体１０上に設けることである。担体１０の方へ大きくなる穴の直径は、これらの凹所における蛍光の検出を可能にする。
【００４９】  更に例えばガラス１０＋２０、屈折率１．５３のような大きい屈折率を持つ材料に凹所３０を形成することによって、バイオチップを製造することができる。この屈折率は、測定空間３０内にあって１．３３の屈折率を持つ測定溶液の屈折率より著しく大きい。励起光が下から斜めに入射されると、担体から測定溶液への移行部において、特定の角から、光の全反射でエバネッセント界が生じて、測定空間３０における蛍光の検出に利用可能である。
【００５０】  図２は、胞５を持つ図１のような垂直断面図を示す。胞膜に細孔を形成するプロテイン５０が再構成されている。
【００５１】  図３は、上に載る生物学的細胞１５を持つ図２のような垂直断面図を示す。これは完全な細胞１５であるか、又はその一部だけであってもよい。細胞は複数の凹所３０にわたって延び、これらを覆っている。これにより、自然の生物学的条件での測定が可能である。
【００５２】  図４はバイオチップ１のアレイの平面図を示す。平面図で正方形のそれぞれ４つの凹所３０が密に隣接して配置されて１つの群３５を形成していることによって、このアレイが形成される。群３５はそれぞれ約１００μｍの長さｃ及び幅ｄを持っている。それぞれ１６個の凹所群３５又は６４個の凹所３０が、それぞれ約５００μｍの長さａ及び幅ｂを持つアレイ３６に設けられている。
【００５３】  図５ａは、凹所３０を持つバイオチップ１の実施例の詳細を垂直断面図で示している。この場合カバーガラスから成る担体１０上に、クロム又はチタン（図示せず）から成る結合材により、金から成る金属層２２が設けられている。この実施例では、測定室３０は金属２２にある開口３１によってのみ形成され、ガラス担体１０自体は凹所を持っていない。
【００５４】  ず５ｂは図５ａと類似な実施例を示しているが、金属層２２は円錐状の凹所３０を持っている。開口３１はその上側で同様に６０〜１２０ｎｍの直径を持っているが、下方へ広がっている。これにより測定精度が高まる。なぜならば、測定室３０はもっと多くの基板６０（図示ぜず）を含み、こうして信号／雑音比が改善される。
【００５５】  図６は、凹所を持つバイオチップ１の好ましい実施例の詳細を垂直断面図で示す。ここではカバーガラスから成る担体１０及びその上に結合される二酸化珪素の層２０上に、金から成る別の金属層２２が、クロム又はチタンから成る結合材（図示せず）により設けられている。両方の金属層は全部で約１００ｎｍの厚さをもっている。二酸化珪素層及び金属層２０，２２は、層開口２１，３１及び２００ｎｍの直径を持つ凹所３０を備えている。ピッチは５００ｎｍである。細胞膜の測定のために、ピッチは１〜２．５μｍである。
【００５６】  上述した実施例とは異なり、測定室は二酸化珪素２０及び両金属層２２から成る層内の凹所３０により形成される。凹所は約１μｍの長さｅ及び約２００ｎｍの開口直径３１を持っている。金属層２２の厚さｆはなるべく約１００ｎｍ、層開口２１の直径は約２００ｎｍである。
【００５７】  この実施例の利点は、一方では、凹所３０によりガラス担体１０に形成される測定空間が垂直方向に一層大きい寸法を持っていることである。これにより膜を経て輸送される基板分子５０（図示せず）が、平均して膜従って輸送されない基板分子５０から一層大きく離れている。理想的には、脂質膜（図示せず）の下にある基板分子５０のみが蛍光となるように励起されるようにし、これは一層大きい空間的距離により容易になる。それにより信号／雑音比が高まる。
【００５８】  上の凹所開口３１が金属層２２により一部覆われることによって、信号／雑音比を更に改善することができる。こうして励起光は、膜より上の輸送されない基板分子５０（図示ぜず）により効果的に遮蔽される。
【００５９】  別の驚くべき利点は、金属層２２が励起光を反射することである。このことを明らかにするため、図６は励起光の光線８０の概略図を示している。平行な光束８０は、斜角にガラス担体１０の下側へ入射される。光路は市販のＴＩＲＦ顕微鏡におけるように設けられている。光線８０は金属層２２により反射され、試料６０（図示せず）を持つ測定空間３０を繰り返し通過する。
【００６０】  これにより信号励起が倍数だけ強められ、それにより測定精度が更に著しく改善される。
【００６１】  励起光のほかに形成されるエバネッセント波は、図６に示されていない。傾斜入射及び金属層２２の厚さにより、直径は“ゼロモード励起”にとっては充分でないが、このことは信号抑制のために望ましい。
【符号の説明】
【００６２】  １    バイオチップ
２    胞
１０  担体
１５  生物学的細胞
２０  層
２１  層開口
２２  金属層
３０  凹所
３１  凹所開口
３５  凹所群
３６  アレイ
４０  膜
５０  輸送分子
６０  基盤
７０  輸送
８０  励起光
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図５ａ】
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【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図６】
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【国際調査報告】
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