(57)【要約】本発明は、多成分核酸複合体(MNA複合体)カスケードを利用する方法に関する。MNA複合体は切断活性またはリガーゼ活性を持ちうる。さらに、本発明は、一つまたは複数のDNAzymeを含みうるカスケードを提供する。本発明はまた、標的の同定、検出、および定量化のためにこれらのカスケードを使用する方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a) 少なくとも第一のオリゴヌクレオチド成分および第二のオリゴヌクレオチド成分が標的の存在下で自己組織化して、リガーゼ活性を有する触媒的に活性な多成分核酸酵素(MNAzymeリガーゼ)を含む少なくとも第一の核酸酵素を形成できる、少なくとも第一の核酸複合体の少なくとも二つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド成分および少なくとも一つの基質を提供する工程、
(b) 少なくとも一つの標的を含有すると推定される試料と二つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド成分および少なくとも一つの基質とを、
(1) 該少なくとも一つの触媒的に活性なMNAzymeリガーゼの自己組織化、および
(2) 該少なくとも一つのMNAzymeリガーゼの触媒活性
を可能にする条件の下で接触させる工程、ならびに
(c) 該少なくとも一つのMNAzymeリガーゼの触媒活性の存在を判定する工程であって、該触媒活性の存在が該少なくとも一つの標的の存在を示す、工程
を含む、少なくとも一つの標的の存在を検出するための方法。
【請求項２】
(a) 第一の核酸酵素の形成を助長するのに標的との会合を必要とする成分を含み、少なくとも一つの基質をさらに含む第一の核酸複合体を提供する工程、ならびに
(b) 第一の核酸酵素により触媒される反応の産物と会合できる第二の核酸複合体の少なくとも一つの成分を提供する工程、および第二の核酸酵素として機能できる第二の核酸複合体を形成させる工程
を含む、標的の検出のための方法であって、
該核酸酵素の少なくとも一つがリガーゼ活性を有し、かつ該核酸酵素の少なくとも一つがMNAzymeであり、該方法が、
(i) 標的を含有すると推定される試料と第一の核酸複合体とを接触させる工程であって、該標的が第一の核酸複合体と会合して該第一の核酸酵素の形成を助長する、工程、および
(ii) 第一の核酸酵素により触媒される反応の産物と該第二の核酸複合体の少なくとも一つの成分とを接触させ、それにより該第二の核酸酵素として機能する第二の核酸複合体の形成を可能にする工程
を含み、
第一もしくは第二の核酸酵素の少なくとも一方またはその両方の活性が該標的の存在を示す、方法。
【請求項３】
第一もしくは第二の核酸酵素またはその両方により触媒される反応の産物と会合できる第三の核酸複合体の少なくとも一つの成分を提供する工程、および
第三の核酸酵素として機能できる第三の核酸複合体を形成させる工程
をさらに含む方法であって、該方法が、
第一もしくは第二の核酸酵素またはその両方により触媒される反応の産物と該第三の核酸複合体の少なくとも一つの成分とを接触させ、それにより該第三の核酸酵素として機能する第三の核酸複合体の形成を可能にする工程
を含み、
第一、第二、もしくは第三の核酸酵素またはそれらの任意の組み合わせの活性が該標的の存在を示す、請求項2記載の方法。
【請求項４】
第一、第二、または第三の核酸酵素のうちの少なくとも一つの産物と会合できる少なくとも一つのさらなる核酸複合体の少なくとも一つの成分を提供する工程、および
少なくとも一つのさらなる核酸酵素として機能できる少なくとも一つのさらなる核酸複合体を形成させる工程
をさらに含む方法であって、該方法が、
該第一、第二、または第三の核酸酵素のうちの少なくとも一つにより触媒される反応の産物と該少なくとも一つのさらなる核酸複合体の少なくとも一つの成分とを接触させ、それにより該少なくとも一つのさらなる核酸酵素として機能する少なくとも一つのさらなる核酸複合体の形成を可能にする工程
を含み、
第一、第二、第三の核酸酵素もしくは少なくとも一つのさらなる核酸酵素またはそれらの任意の組み合わせの活性が該標的の存在を示す、請求項3記載の方法。
【請求項５】
核酸酵素の少なくとも一つが切断活性を有する、請求項2〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
少なくとも第二の核酸酵素がリガーゼ活性を有する、請求項2〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
第一の核酸酵素がMNAzymeである、請求項2〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
核酸酵素の少なくとも一つがDNAzymeである、請求項2〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
前記核酸酵素のいずれか一つにより触媒される反応の産物が、組織化助長因子、パートザイム、基質、DNAzyme、スタビライザーアーム、またはそれらの成分からなる群より選択される、請求項2〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
標的が核酸である、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
前記成分の少なくとも一つが少なくとも一つのアプタマーをさらに含み、かつ方法が第一の核酸複合体の少なくとも一つの組織化助長因子および少なくとも一つの組織化阻害因子を提供する工程をさらに含み、標的が該アプタマーと会合し、該第一の核酸複合体が第一の核酸酵素として機能することを可能にする、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
標的が非核酸標的である、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
核酸酵素の少なくとも一つ、またはそれらの任意の組み合わせにより触媒される反応の産物が、前記の核酸複合体の少なくとも一つのうちの少なくとも一つの成分と会合し、それによってさらに前記の核酸酵素として機能する該前記の核酸複合体のうちのさらに少なくとも一つの形成を可能にする、請求項2〜12のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
(a) 第一のMNAzymeのための成分、少なくとも第一のMNAzyme基質、第一のDNAzymeリガーゼ、第一のDNAzymeリガーゼ基質、第二の組織化助長因子、少なくとも第二のMNAzyme基質、および第二のMNAzymeのための第一のパートザイムを提供する工程
を含む、カスケードを用いて第一の組織化助長因子を検出するための方法であって、該方法が、
(b) 該第一の組織化助長因子と該第一のMNAzymeのための成分とを、該第一のMNAzymeの触媒活性を可能にする条件の下で会合させ、このようにして該第一のMNAzymeの触媒活性を助長し、それによって該第一のMNAzyme基質の修飾を可能とする工程
を含み、
第一のMNAzyme基質の修飾が第二のDNAzymeリガーゼ基質の産生をもたらし、かつ
第一のDNAzymeリガーゼが第一および第二のDNAzymeリガーゼ基質と組織化し、かつ
DNAzymeリガーゼの触媒活性が第二のMNAzymeのための第二のパートザイムを産生し、かつ
第二のMNAzymeの触媒活性を可能にする条件の下での該第二のMNAzymeのための第二のパートザイムと該第二の組織化助長因子との会合、および第二のMNAzymeのための第一のパートザイムとの会合が、該第二のMNAzymeの触媒活性を助長し、それによって少なくとも第二のMNAzyme基質の修飾を可能とし、該基質のいずれかのまたはそれらの組み合わせの修飾が該第一の組織化助長因子の存在を示す、方法。
【請求項１５】
(a) 第一のMNAzymeのための成分、少なくとも第一のMNAzyme基質、DNAzymeリガーゼ、第一のDNAzymeリガーゼ基質、少なくとも第二のMNAzyme基質、ならびに第二のMNAzymeのための第一および第二のパートザイムを提供する工程
を含む、カスケードを用いて第一の組織化助長因子を検出するための方法であって、該方法が、
(b) 該第一の組織化助長因子と該第一のMNAzymeのための成分とを、該第一のMNAzymeの触媒活性を可能にする条件の下で会合させ、このようにして該第一のMNAzymeの触媒活性を助長し、それによって該第一のMNAzyme基質の修飾を可能とする工程
を含み、
第一のMNAzyme基質の修飾が第二のDNAzymeリガーゼ基質の産生をもたらし、かつ
第一のDNAzymeリガーゼが第一および第二のDNAzymeリガーゼ基質と組織化し、かつ
DNAzymeリガーゼの触媒活性が第二のMNAzymeのための第二の組織化助長因子を産生し、かつ
該第二のMNAzymeの触媒活性を可能にする条件の下での該第二の組織化助長因子と該第二のMNAzymeのための第一および第二のパートザイムとの会合が該第二のMNAzymeの触媒活性を助長し、それによって少なくとも第二のMNAzyme基質の修飾を可能とし、該基質のいずれかのまたはそれらの組み合わせの修飾が該第一の組織化助長因子の存在を示す、方法。
【請求項１６】
第二のMNAzymeにより触媒される反応の産物が、第三の核酸酵素の機能を可能にするために必要な成分である、請求項14または15記載の方法。
【請求項１７】
第三の核酸酵素により触媒される反応の産物が、第二のMNAzymeもしくはDNAzymeリガーゼ、またはその両方により触媒される反応に関与する成分である、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
(a) 第一のMNAzymeのための成分、少なくとも第一のMNAzyme基質、リガーゼ活性を有する第二のMNAzymeのための成分、第二のMNAzymeのための第二の組織化助長因子、第二のMNAzyme基質、第三のMNAzymeのための第三の組織化助長因子、少なくとも第三のMNAzyme基質、ならびに第三のMNAzymeのための第一のパートザイムを提供する工程
を含む、カスケードを用いて第一の組織化助長因子を検出するための方法であって、該方法が、
(b) 該第一の組織化助長因子と該第一のMNAzymeのための成分とを、該第一のMNAzymeの触媒活性を可能にする条件の下で会合させ、このようにして該第一のMNAzymeの触媒活性を助長し、それによって該第一のMNAzyme基質の修飾を可能とする工程
を含み、
第一のMNAzyme基質の修飾が、第四のMNAzyme基質の産生をもたらし、かつ
第二のMNAzyme組織化助長因子が、第二および第四のMNAzyme基質との第二のMNAzymeのための成分の組織化を助長し、かつ
第二のMNAzymeの触媒リガーゼ活性が、第三のMNAzymeのための第二のパートザイムを産生し、かつ
第三のMNAzymeの触媒活性を可能にする条件の下での、第三のMNAzymeのための該第一および第二のパートザイムと該第三の組織化助長因子との会合が、該第三のMNAzymeの触媒活性を助長し、それによって少なくとも第三のMNAzyme基質の修飾を可能とし、該基質のいずれかのまたはそれらの組み合わせの修飾が該第一の組織化助長因子の存在を示す、方法。
【請求項１９】
(a) 第一のMNAzymeのための成分、少なくとも第一のMNAzyme基質、リガーゼ活性を有する第二のMNAzymeのための成分、第二のMNAzymeのための第二の組織化助長因子、第二のMNAzyme基質、第三のMNAzymeのための第一および第二のパートザイム、ならびに少なくとも第三のMNAzyme基質を提供する工程
を含む、カスケードによる第一の組織化助長因子の検出のための方法であって、該方法が、
(b) 該第一の組織化助長因子と該第一のMNAzymeのための成分とを、該第一のMNAzymeの触媒活性を可能にする条件の下で会合させ、このようにして該第一のMNAzymeの触媒活性を助長し、それによって該第一のMNAzyme基質の修飾を可能とする工程
を含み、
該第一のMNAzyme基質の修飾が第四のMNAzyme基質の産生をもたらし、かつ
第二のMNAzyme組織化助長因子が第二および第四のMNAzyme基質との該第二のMNAzymeのための成分の組織化を助長し、かつ
第二のMNAzymeの触媒リガーゼ活性が第三のMNAzymeのための第三の組織化助長因子を産生し、ならびに
第三のMNAzymeの触媒活性を可能にする条件の下での、第三のMNAzymeのための該第一および第二のパートザイムと該第三の組織化助長因子との会合が、該第三のMNAzymeの触媒活性を助長し、それによって少なくとも第三のMNAzyme基質の修飾を可能とし、該基質のうちのいずれか一つのまたはそれらの組み合わせの修飾が該第一の組織化助長因子の存在を示す、方法。
【請求項２０】
第三のMNAzymeにより触媒される反応の産物が、第四の核酸酵素の機能を可能にするために必要な成分である、請求項18または19記載の方法。
【請求項２１】
第四の核酸酵素により触媒される反応の産物が、第二もしくは第三のMNAzymeまたはその両方により触媒される反応に関与する成分である、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
前記基質のうちのいずれか一つのまたはそれらの組み合わせの修飾が、検出可能な作用をもたらす、請求項14〜21のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
少なくとも一つの基質の修飾が、核酸の切断、核酸の連結、核酸のリン酸化、核酸のキャッピング、アミノ酸のアデニル化、補因子合成、RNA重合、鋳型依存性の重合、RNA-タンパク質の結合、アルドール反応、アルコール酸化、アルデヒド還元、プリンおよびピリミジンのヌクレオチド合成、アルキル化、アミド合成、尿素合成、ペプチド結合の形成、ペプチジル-RNA合成、アシル転移、アミノアシル化、炭酸加水分解、ホスホロチオエートアルキル化、ポルフィリンメタル化、炭素-炭素結合の形成、Pdナノ粒子の形成、ビフェニル異性化、エステル結合の形成、アミド結合の形成、DNA脱グリコシル化、チミン二量体光回復(photoreversion)、ならびにホスホロアミダイト切断からなる群より選択される、請求項14〜22のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
第一の組織化助長因子が、同定される、検出される、または定量化される標的である、請求項14〜23のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
DNAzymeリガーゼが、DNAzymeリガーゼ7Z81、7Z48、7Q10、および9DB1からなる群より選択される、請求項14〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６】
第二のMNAzymeの産物が第二のDNAzymeリガーゼ基質であり、DNAzymeリガーゼが第一および第二のDNAzymeリガーゼ基質の連結を助長し、それによって第二のMNAzymeのためのさらなる第二のパートザイムを産生する、請求項14記載の方法。
【請求項２７】
第二のMNAzymeの産物が第二のDNAzymeリガーゼ基質であり、DNAzymeリガーゼが第一および第二のDNAzymeリガーゼ基質の連結を助長し、それによって第二のMNAzymeのためのさらなる第二の組織化助長因子を産生する、請求項15記載の方法。
【請求項２８】
第三のMNAzymeの産物が第四のMNAzyme基質であり、第二のMNAzymeが第二および第四のMNAzyme基質の連結を助長し、それによって第三のMNAzymeのためのさらなる第二のパートザイムを産生する、請求項18記載の方法。
【請求項２９】
第三のMNAzymeの産物が第四のMNAzyme基質であり、第二のMNAzymeが第二および第四のMNAzyme基質の連結を助長し、それによって第三のMNAzymeのためのさらなる第三の組織化助長因子を産生する、請求項19記載の方法。
【請求項３０】
核酸の対が
2010523088.tif 000097
からなる群より選択される、MNAzymeリガーゼのためのパートザイム対に組み入れられる触媒コア配列としての単離された核酸の対の使用。
【請求項３１】
核酸の対が
2010523088.tif 000098
からなる群より選択される、パートザイム対に組み入れられる触媒コア配列としての単離された核酸の対を含むMNAzymeリガーゼ。
【請求項３２】
二つの基質を連結するためのMNAzymeリガーゼの使用であって、MNAzymeリガーゼの基質アームによる該基質の結合の後に、該基質がMNAzymeリガーゼにより連結されて産物を形成する、使用。
【請求項３３】
少なくとも一つの核酸複合体の成分と会合する、請求項32記載の産物。
【請求項３４】
組織化助長因子、パートザイム、基質、DNAzyme、スタビライザーアーム、活性阻害因子、組織化阻害因子、またはそれらの成分からなる群より選択される、請求項32または33記載の産物。
【請求項３５】
カスケードに関与しうる、請求項32〜34のいずれか一項記載の産物。
【請求項３６】
少なくとも一つの基質が、核酸酵素により触媒される反応の産物である、請求項32記載の使用。
【請求項３７】
(a) 複数の第一の核酸酵素の形成を助長するのに複数の標的のうちの一つとの会合を必要とする成分を各々が含み、少なくとも一つの基質を各々がさらに含む、複数の第一の核酸複合体を提供する工程、ならびに
(b) 複数の第一の核酸酵素により触媒される反応の複数の産物と会合できる複数の第二の核酸複合体の各々の少なくとも一つの成分を提供し、かつ複数の第二の核酸酵素として機能できる複数の第二の核酸複合体を形成させる工程であって、該核酸酵素の少なくとも一つがリガーゼ活性を有し、かつ該核酸酵素の少なくとも一つがMNAzymeである、工程
を含む、複数の標的の検出のための方法であって、該方法が、
(i) 該複数の標的が該複数の第一の核酸複合体と会合して該複数の第一の核酸酵素の形成を助長する、該複数の標的を含有すると推定される試料と複数の第一の核酸複合体とを接触させる工程、および
(ii) 複数の第一の核酸酵素により触媒される反応の複数の産物と複数の第二の核酸複合体の各々の少なくとも一つの成分とを接触させ、それにより該複数の第二の核酸酵素として機能する複数の該第二の核酸複合体の形成を可能にする工程
を含み、
第一もしくは第二のまたはその両方の核酸酵素の活性が該複数の標的の存在を示す、方法。
【請求項３７】
複数の第一または第二の核酸酵素のいずれか一つにより触媒される反応の産物の少なくとも一つが、少なくとも一つのさらなる核酸酵素の機能を可能とするのに必要な成分である、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
核酸酵素のいずれか一つにより触媒される反応の産物の少なくとも一つが、前記の核酸複合体のいずれか一つのうちの成分と会合し、それによって核酸複合体の少なくとも一つがさらなる核酸酵素として機能することを可能にする、請求項36または37記載の方法。
【請求項３９】
多成分核酸酵素リガーゼ(MNAzymeリガーゼ)基質としての少なくとも二つのオリゴヌクレオチドの使用であって、MNAzymeリガーゼの基質アームによる該基質の結合の後に、該基質がMNAzymeリガーゼにより修飾される、使用。
【請求項４０】
(a) 少なくとも二つの核酸酵素複合体の形成を助長するのに標的の少なくとも一つとの会合を必要とする成分を各々が含む、少なくとも二つの核酸複合体を提供する工程、および
(b) 該少なくとも二つの標的を含有すると推定される試料と該少なくとも二つの核酸複合体とを接触させる工程
を含む、少なくとも二つの標的の検出のための方法であって、該標的が該核酸複合体と会合して該核酸酵素複合体の形成を助長し、各核酸酵素複合体の活性により生成される少なくとも一つの産物がさらなる核酸酵素複合体の形成に必要であり、かつ
さらなる核酸酵素複合体の活性が該少なくとも二つの標的の存在を示す、方法。
【請求項４１】
核酸酵素複合体の少なくとも一つがリガーゼ活性を有する、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
核酸酵素複合体の少なくとも一つがMNAzyme複合体である、請求項40記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2007年4月5日付けで出願された米国特許仮出願第60/910,427号、2007年4月5日付けで出願されたオーストラリア特許仮出願第2007901833号、および2007年4月5日付けで出願された米国一部継続出願第11/697,021号の恩典を主張する。
【０００２】
技術分野
本発明は、多成分核酸(MNA)複合体を利用する方法に関する。MNA複合体は、リガーゼ活性または切断活性のような修飾活性を有する活性な酵素(例えばアプタ-MNAzymeを含むMNAzyme)でありうる。さらに、本発明は、MNAzymeを使用し、かつ一つまたは複数のDNAzymeも含みうるカスケードに関する。本発明は同様に、標的の同定、検出、および定量化のためにこれらのカスケードを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
特許、公開出願、技術論文、および学術論文を含みうる様々な刊行物は、本明細書の全体にわたって括弧内に引用されており、各々の書誌情報は本明細書の最後に見出すことができる。これらの各引用刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００４】
核酸の驚くべき物理的および機能的特性は、その進化的に最適化された機能のほかにも、たくさんの新たな生体分子デバイスおよび方法の可能性を提供する。デザイナー核酸（designer nucleic acid）は治療的実体、バイオセンサ、ナノスケールデバイス、および分子計算の手段のために企図された。これらの方法ではDNAの自己組織化、導電率、情報要素、増幅、スイッチ、分子検出、および触媒活性の特徴を活用する。さらに、DNAは頑丈、安定かつ熱安定であるので、機械デバイスまたは計算デバイスの分子工学には理想的な材料となる。
【０００５】
DNAおよびRNAのような、一本鎖核酸は、高度に特異的な受容体(例えばアプタマー)および触媒(例えばリボザイム、DNAzyme)として機能しうる複雑な三次元構造に折り重なる能力を有する。さらに、ハイブリダイゼーションのための核酸鎖間の相補性の要件は、標的の検出(例えばマイクロアレイ分析、ノザンブロッティング、もしくはサザンブロッティング)および/または標的の増幅(例えばポリメラーゼ連鎖反応)を可能にする広範な技術の基礎となる。さらに、ハイブリダイゼーションは核酸のナノスケール構築の基礎をもたらし、DNAに基づく計算戦略の基礎をもたらす。
【０００６】
酵素活性または触媒活性を有する多種多様の核酸分子はこの20年のうちに発見された。RNA酵素(「リボザイム」)は天然に存在するが、標的のRNA基質を特異的に認識かつ修飾するように遺伝子操作することができる(Haseloff and Gerlach, 1988)。インビトロ進化技術により「DNA酵素」または「DNAzyme」といわれることも多いデオキシリボ核酸を含む、多くのさらに触媒的な核酸の発見および開発が容易になった(掲載のEmillson and Breaker, 2002)。核酸の切断、核酸の連結、核酸のリン酸化、核酸のキャッピング、アミノ酸のアデニル化、補因子合成、RNA重合、鋳型依存性の重合、RNA-タンパク質の結合、アルドール反応、アルコール酸化、アルデヒド還元、プリンおよびピリミジンヌクレオチド合成、アルキル化、アミド合成、尿素合成、ペプチド結合の形成、ペプチジル-RNA合成、アシル転移、アミノアシル化、炭酸加水分解、ホスホロチオエートアルキル化、ポルフィリンメタル化、炭素-炭素結合の形成、Pdナノ粒子の形成、ビフェニル異性化、エステル結合の形成、アミド結合の形成、DNA脱グリコシル化、チミン二量体光回復(photoreversion)、またはホスホロアミダイト切断を含むがこれらに限定されない、広範囲の反応を触媒する能力を持つ、インビトロで進化されたDNAzymeおよび/またはリボザイムが発見されている(掲載のSilverman, 2007)。
【０００７】
具体的には、ワトソン・クリック塩基対合を介してハイブリダイズした後に異なる核酸配列を特異的に切断するDNAzymeおよびリボザイムが特徴付けられている。DNAzymeはRNA (Breaker and Joyce, 1994; Santoro and Joyce, 1997; Santoro and Joyce, 1998)またはDNA (Carmi et al., 1996)分子のどちらかを切断することができる。リボザイムもRNA (Haseloff and Gerlach, 1988)およびDNA (Raillard and Joyce, 1996)標的配列の両方を切断することができる。
【０００８】
「10:23」および「8:17」DNAzymeは、核酸基質を特定のRNAホスホジエステル結合の位置で切断することができる。これらのDNAzymeは天然の3'-5'ホスホジエステル結合を切断して、2',3'-環状リン酸および5'-ヒドロキシル基を有する反応産物を生成する(Santoro and Joyce, 1997; 掲載のEmilsson and Breaker, 2002)。
【０００９】
二つの独立した基質核酸にハイブリダイズした後に異なる核酸配列を特異的に連結するDNAzymeも特徴付けられている。特定のデオキシリボザイム(DNAzyme)は、2',3'-環状ホスフェートおよび5'-ヒドロキシル産物を連結し、非天然の2'-5'結合を生成しうる。そのようなDNAzymeの例としては「7Z81」および「7Z48」リガーゼ(Prior et al, 2004)ならびに「7Q10」DNAzymeリガーゼ(Flynn-Charlebois et al, 2003)が挙げられる。2',3'ジオールおよび5'-三リン酸産物を連結し、天然の3'-5'結合を生成しうるその他のDNAzymeも記載されている(Coppins and Silverman, 2004)。
【００１０】
いくつかの触媒核酸は、特異的に基質を認識し基質にハイブリダイズする二つの非保存基質結合ドメイン(「アーム」)が隣接する保存触媒ドメイン(「触媒コア」)を含んだ多数のドメインを有する類似の基本構造を持つ。この基本構造を有する核酸の例としては、ハンマーヘッド型リボザイム、10:23および8:17 DNAzyme、「7Z81」、「7Z48」、および「7Q10」DNAzymeリガーゼ、「UV1C」チミン二量体光回復DNAzyme、ならびに「DAB22」炭素-炭素結合形成DNAzymeが挙げられるが、これらに限定されることはない。これまで、広範囲の操作を必要とする、二つ以上の成分を有する触媒核酸の例は公知であるが、触媒核酸は、典型的には、単分子である(Tabor et al, 2006, Kurata et al, 2000)。
【００１１】
触媒核酸は、触媒コアを形成する領域内の特定の修飾だけを許容することが示されている(Perreault et al., 1990; Perreault et al., 1991; Zaborowska et al., 2002; Cruz et al., 2004; Silverman, 2004)。反応条件のストリンジェンシーに依り、ある程度のミスマッチが基質アームの範囲内で許容可能である。しかしながら、ワトソン・クリック塩基対合の要件は、触媒核酸を用いて、密接に関連する配列の識別を助長するプロトコルの開発を可能としたように、十分に厳格である(Cairns et al., 2000) (WO 99/50452)。
【００１２】
PCRのような、標的の増幅および検出技術は、研究においておよび/または臨床検査薬において広く使われている。しかしながら、その能力にもかかわらず、それぞれ固有の欠点がある。それらは全て、タンパク質酵素(例えばDNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、逆転写酵素、およびまたはリガーゼ)の使用を要する。タンパク質酵素が含まれることで、試薬製造の複雑さおよび費用が増加し、試薬を含有するキットの有効期間が短くなる。その他の関連した技術的課題には、偽陽性シグナルにつながる、前の反応からのレプリコン(標的アンプリコン)による混入、および/またはプライマー配列(プライマー-二量体)の複製によって引き起こされるバックグラウンドシグナルもしくは標的非依存性の連結によって引き起こされるバックグラウンドがある。
【００１３】
核酸酵素および核酸酵素カスケードはさまざまな範囲の、特に診断法での、生物工学的応用が考えられている。それらはシグナル増幅を助長することにより疾患の診断のためのタンパク質および核酸の検出を可能にすることができよう。
【００１４】
いくつかのグループが比色分析の読み出しによる核酸標的、および他の分析物の検出のために触媒核酸を用いることを報告している(Elghanian et al., 1997、Mirkin et al, 1996、およびLiu and Lu, 2004)。単分子触媒核酸を用いたシグナル増幅カスケードの例は当技術分野において公知である。例えばPaul and Joyce (2004)は、リガーゼ活性を有するリボザイムが媒介する複製カスケードについて記載している。別のアプローチでは、シグナル増幅カスケードに、交差切断（cross cleavage）によって互いを活性化し、直線化をもたらしえた二つの不活性な環状10:23 DNAzymeを用いている(Levy and Ellington, 2003)。
【００１５】
標的の検出、特にカスケードのような増幅系を用いた検出、例えば、複数の核酸酵素および特に少なくとも一つの多成分核酸酵素(MNAzyme)を含んだカスケードを伴う検出系が、当技術分野において必要とされ続けている。本発明は、リガーゼ活性を有する少なくとも一つの核酸酵素を組み入れた核酸酵素カスケードを伴う検出方法を提供する。さらに、リガーゼ活性を有する核酸酵素の使用によって、組織化助長因子、パートザイム、基質、DNAzyme、またはそれらの成分のような、核酸複合体のための成分の形成が可能になる。
【発明の概要】
【００１６】
本発明の一つの局面においては、
(a) 少なくとも第一のオリゴヌクレオチド成分および第二のオリゴヌクレオチド成分が標的の存在下で自己組織化して、リガーゼ活性を有する触媒的に活性な多成分核酸酵素(MNAzymeリガーゼ)を含む少なくとも第一の核酸酵素を形成できる、少なくとも第一の核酸複合体の少なくとも二つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド成分および少なくとも一つの基質を提供する工程、
(b) 少なくとも一つの標的を含有すると推定される試料と二つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド成分および少なくとも一つの基質とを
(1) 該少なくとも一つの触媒的に活性なMNAzymeリガーゼの自己組織化、および
(2) 該少なくとも一つのMNAzymeリガーゼの触媒活性
を可能にする条件の下で接触させる工程、ならびに
(c) 該少なくとも一つのMNAzymeリガーゼの触媒活性の存在を判定する工程
を含み、この触媒活性の存在が該少なくとも一つの標的の存在を示す、少なくとも一つの標的の存在を検出するための方法が提供される。
【００１７】
本発明の別の局面においては、
(a) 第一の核酸酵素の形成を助長するのに標的との会合を必要とする成分を含み、少なくとも一つの基質をさらに含む、第一の核酸複合体を提供する工程、ならびに、
(b) 第一の核酸酵素により触媒される反応の産物と会合できる第二の核酸複合体の少なくとも一つの成分を提供する工程、および第二の核酸酵素として機能できる第二の核酸複合体を形成させる工程
を含む、標的の検出のための方法が提供され、
該核酸酵素の少なくとも一つがリガーゼ活性を有し、該核酸酵素の少なくとも一つがMNAzymeであり、該方法は以下の工程:
(i) 標的を含有すると推定される試料と第一の核酸複合体とを接触させる工程であって、該標的が第一の核酸複合体と会合して該第一の核酸酵素の形成を助長する、工程、および
(ii) 第一の核酸酵素により触媒される反応の産物と該第二の核酸複合体の少なくとも一つの成分とを接触させ、それにより該第二の核酸酵素として機能する第二の核酸複合体の形成を可能にする工程
を含み、
第一もしくは第二の核酸酵素の少なくとも一方またはその両方の活性が該標的の存在を示す。
【００１８】
一つの態様においては、本方法は
第一もしくは第二の核酸酵素またはその両方により触媒される反応の産物と会合できる第三の核酸複合体の少なくとも一つの成分を提供する工程、および
第三の核酸酵素として機能できる第三の核酸複合体を形成させる工程
をさらに含むことができ、該方法が
第一もしくは第二の核酸酵素またはその両方により触媒される反応の産物と該第三の核酸複合体の少なくとも一つの成分とを接触させ、それにより該第三の核酸酵素として機能する第三の核酸複合体の形成を可能にする工程
を含み、
第一、第二、もしくは第三の核酸酵素またはそれらの任意の組み合わせの活性が該標的の存在を示す。
【００１９】
別の態様においては、本方法は
第一、第二、または第三の核酸酵素の少なくとも一つの産物と会合できる少なくとも一つのさらなる核酸複合体の少なくとも一つの成分を提供する工程、および
少なくとも一つのさらなる核酸酵素として機能できる少なくとも一つのさらなる核酸複合体を形成させる工程
をさらに含むことができ、該方法が
該第一、第二、または第三の核酸酵素の少なくとも一つにより触媒される反応の産物と該少なくとも一つのさらなる核酸複合体の少なくとも一つの成分とを接触させ、それにより該少なくとも一つのさらなる核酸酵素として機能する少なくとも一つのさらなる核酸複合体の形成を可能にする工程
を含み、
第一、第二、第三の核酸酵素もしくは少なくとも一つのさらなる核酸酵素またはそれらの任意の組み合わせの活性が該標的の存在を示す。
【００２０】
一つの態様においては、核酸酵素の少なくとも一つは切断活性またはリガーゼ活性を有することができる。さらに第一の核酸酵素はMNAzymeであることができる。さらに核酸酵素の少なくとも一つはDNAzymeであることができる。
【００２１】
別の態様においては、核酸酵素のいずれか一つにより触媒される反応の産物は、組織化助長因子、パートザイム、基質、DNAzyme、スタビライザーアーム（stabilizer arm）、またはそれらの成分を含む群より選択することができる。
【００２２】
一つの態様においては、標的は核酸であることができる。
【００２３】
一つの態様においては、該成分の少なくとも一つは少なくとも一つのアプタマーをさらに含むことができ、該方法は該第一の核酸複合体の少なくとも一つの組織化助長因子および少なくとも一つの組織化阻害因子を提供する工程をさらに含むことができ、該標的が該アプタマーと会合し、該第一の核酸複合体が第一の核酸酵素として機能することを可能にする。
【００２４】
一つの態様においては、標的は非核酸標的である。組織化助長因子は、検出されるさらなる標的であることができる。
【００２５】
さらなる態様においては、該核酸酵素の少なくとも一つ、またはそれらの任意の組み合わせにより触媒される反応の産物は、前記の核酸複合体の少なくとも一つのうちの少なくとも一つの成分と会合し、それによってさらに該前記の核酸酵素として機能する該前記の核酸複合体のさらに少なくとも一つの形成を可能にする。
【００２６】
本発明の別の局面においては、
(a) 第一のMNAzymeのための成分、少なくとも第一のMNAzyme基質、第一のDNAzymeリガーゼ、第一のDNAzymeリガーゼ基質、第二の組織化助長因子、少なくとも第二のMNAzyme基質、および第二のMNAzymeのための第一のパートザイムを提供する工程
を含む、カスケードによる第一の組織化助長因子の検出のための方法が提供され、該方法は以下の工程:
(b) 該第一の組織化助長因子を該第一のMNAzymeのための成分と、該第一のMNAzymeの触媒活性を可能にする条件の下で会合させ、このようにして該第一のMNAzymeの触媒活性を助長し、それによって該第一のMNAzyme基質の修飾を可能とする工程
を含み、
第一のMNAzyme基質の修飾が第二のDNAzymeリガーゼ基質の産生をもたらし、かつ
第一のDNAzymeリガーゼが第一および第二のDNAzymeリガーゼ基質と組織化し、かつ
DNAzymeリガーゼの触媒活性が第二のMNAzymeのための第二のパートザイムを産生し、ならびに
第二のMNAzymeの触媒活性を可能にする条件の下での該第二のMNAzymeのための第二のパートザイムと該第二の組織化助長因子、および第二のMNAzymeのための第一のパートザイムとの会合が該第二のMNAzymeの触媒活性を助長し、それによって少なくとも第二のMNAzyme基質の修飾を可能とし、該基質のいずれかのまたはそれらの組み合わせの修飾が該第一の組織化助長因子の存在を示す。
【００２７】
本発明の別の局面においては、
(a) 第一のMNAzymeのための成分、少なくとも第一のMNAzyme基質、DNAzymeリガーゼ、第一のDNAzymeリガーゼ基質、少なくとも第二のMNAzyme基質、ならびに第二のMNAzymeのための第一および第二のパートザイムを提供する工程
を含む、カスケードによる第一の組織化助長因子の検出のための方法が提供され、該方法は以下の工程:
(b) 該第一の組織化助長因子を該第一のMNAzymeのための成分と、該第一のMNAzymeの触媒活性を可能にする条件の下で会合させ、このようにして該第一のMNAzymeの触媒活性を助長し、それによって該第一のMNAzyme基質の修飾を可能とする工程
を含み、
第一のMNAzyme基質の修飾が第二のDNAzymeリガーゼ基質の産生をもたらし、かつ
第一のDNAzymeリガーゼが第一および第二のDNAzymeリガーゼ基質と組織化し、かつ
DNAzymeリガーゼの触媒活性が第二のMNAzymeのための第二の組織化助長因子を産生し、ならびに
該第二のMNAzymeの触媒活性を可能にする条件の下での該第二の組織化助長因子と該第二のMNAzymeのための第一および第二のパートザイムとの会合が該第二のMNAzymeの触媒活性を助長し、それによって少なくとも第二のMNAzyme基質の修飾を可能とし、該基質のいずれかのまたはそれらの組み合わせの修飾が該第一の組織化助長因子の存在を示す。
【００２８】
一つの態様においては、第二のMNAzymeにより触媒される反応の産物は、第三の核酸酵素の機能を可能にするために必要な成分であることができる。第三の核酸酵素により触媒される反応の産物は、第二のMNAzymeもしくはDNAzymeリガーゼ、またはその両方により触媒される反応に関与する成分であることができる。
【００２９】
本発明の別の局面においては、
(a) 第一のMNAzymeのための成分、少なくとも第一のMNAzyme基質、リガーゼ活性を有する第二のMNAzymeのための成分、第二のMNAzymeのための第二の組織化助長因子、第二のMNAzyme基質、第三のMNAzymeのための第三の組織化助長因子、少なくとも第三のMNAzyme基質、ならびに第三のMNAzymeのための第一のパートザイムを提供する工程
を含む、カスケードによる第一の組織化助長因子の検出のための方法が提供され、該方法は以下の工程:
(b) 該第一の組織化助長因子を該第一のMNAzymeのための成分と、該第一のMNAzymeの触媒活性を可能にする条件の下で会合させ、このようにして該第一のMNAzymeの触媒活性を助長し、それによって該第一のMNAzyme基質の修飾を可能とする工程
を含み、
第一のMNAzyme基質の修飾が第四のMNAzyme基質の産生をもたらし、かつ
第二のMNAzyme組織化助長因子が第二および第四のMNAzyme基質との第二のMNAzymeのための成分の組織化を助長し、かつ
第二のMNAzymeの触媒リガーゼ活性が第三のMNAzymeのための第二のパートザイムを産生し、ならびに
第三のMNAzymeの触媒活性を可能にする条件の下での、第三のMNAzymeのための該第一および第二のパートザイムと該第三の組織化助長因子との会合が該第三のMNAzymeの触媒活性を助長し、それによって少なくとも第三のMNAzyme基質の修飾を可能とし、該基質のいずれかのまたはそれらの組み合わせの修飾が該第一の組織化助長因子の存在を示す。
【００３０】
本発明の別の局面においては、
(a) 第一のMNAzymeのための成分、少なくとも第一のMNAzyme基質、リガーゼ活性を有する第二のMNAzymeのための成分、第二のMNAzymeのための第二の組織化助長因子、第二のMNAzyme基質、第三のMNAzymeのための第一および第二のパートザイム、ならびに少なくとも第三のMNAzyme基質を提供する工程
を含む、カスケードによる第一の組織化助長因子の検出のための方法が提供され、該方法は以下の工程:
(b) 該第一の組織化助長因子を該第一のMNAzymeのための成分と、該第一のMNAzymeの触媒活性を可能にする条件の下で会合させ、このようにして該第一のMNAzymeの触媒活性を助長し、それによって該第一のMNAzyme基質の修飾を可能とする工程
を含み、
該第一のMNAzyme基質の修飾が第四のMNAzyme基質の産生をもたらし、かつ
第二のMNAzyme組織化助長因子が第二および第四のMNAzyme基質との第二のMNAzymeのための成分の組織化を助長し、かつ
第二のMNAzymeの触媒リガーゼ活性が第三のMNAzymeのための第三の組織化助長因子を産生し、ならびに
第三のMNAzymeの触媒活性を可能にする条件の下での、第三のMNAzymeのための該第一および第二のパートザイムと該第三の組織化助長因子との会合が該第三のMNAzymeの触媒活性を助長し、それによって少なくとも第三のMNAzyme基質の修飾を可能とし、該基質のいずれか一つのまたはそれらの組み合わせの修飾が該第一の組織化助長因子の存在を示す。
【００３１】
一つの態様においては、第三のMNAzymeにより触媒される反応の産物は、第四の核酸酵素の機能を可能にするために必要な成分であることができる。第四の核酸酵素により触媒される反応の産物は、第二もしくは第三のMNAzymeまたはその両方により触媒される反応に関与する成分であることができる。
【００３２】
一つの態様においては、該基質のいずれか一つのまたはそれらの組み合わせの修飾は、検出可能な作用をもたらす。少なくとも一つの基質の修飾は、核酸の切断、核酸の連結、核酸のリン酸化、核酸のキャッピング、アミノ酸のアデニル化、補因子合成、RNA重合、鋳型依存性の重合、RNA-タンパク質の結合、アルドール反応、アルコール酸化、アルデヒド還元、プリンおよびピリミジンヌクレオチド合成、アルキル化、アミド合成、尿素合成、ペプチド結合の形成、ペプチジル-RNA合成、アシル転移、アミノアシル化、炭酸加水分解、ホスホロチオエートアルキル化、ポルフィリンメタル化、炭素-炭素結合の形成、Pdナノ粒子の形成、ビフェニル異性化、エステル結合の形成、アミド結合の形成、DNA脱グリコシル化、チミン二量体光回復、ならびにホスホロアミダイト切断を含む群より選択することができる。
【００３３】
第一の組織化助長因子は、同定される、検出される、または定量化される標的であることができる。
【００３４】
一つの態様においては、DNAzymeリガーゼは、DNAzymeリガーゼ7Z81、7Z48、7Q10、および9DB1を含む群より選択することができる。
【００３５】
別の態様においては、第二のMNAzymeの産物は第二のDNAzymeリガーゼ基質であることができ、DNAzymeリガーゼは第一および第二のDNAzymeリガーゼ基質の連結を助長し、それによって第二のMNAzymeのためのさらなる第二のパートザイムを産生する。第二のMNAzymeの産物は第二のDNAzymeリガーゼ基質であることができ、DNAzymeリガーゼは第一および第二のDNAzymeリガーゼ基質の連結を助長し、それによって第二のMNAzymeのためのさらなる第二の組織化助長因子を産生する。さらに、第三のMNAzymeの産物は第四のMNAzyme基質であることができ、第二のMNAzymeは第二および第四のMNAzyme基質の連結を助長し、それによって第三のMNAzymeのためのさらなる第二のパートザイムを産生する。
【００３６】
さらなる態様においては、第三のMNAzymeの産物は第四のMNAzyme基質であることができ、第二のMNAzymeは第二および第四のMNAzyme基質の連結を助長し、それによって第三のMNAzymeのためのさらなる第三の組織化助長因子を産生する。
【００３７】
本発明の別の局面においては、核酸の対が
2010523088.tif 000002
からなる群より選択される、MNAzymeリガーゼのためのパートザイム対に組み入れられる触媒コア配列としての単離された核酸の対の使用が提供される。
【００３８】
本発明の別の局面においては、核酸の対が
2010523088.tif 000003
からなる群より選択される、パートザイム対に組み入れられる触媒コア配列としての単離された核酸の対を含むMNAzymeリガーゼが提供される。
【００３９】
本発明の別の局面においては、MNAzymeリガーゼの基質アームによる基質の結合の後に該基質がMNAzymeリガーゼにより連結されて産物を形成させる、二つの基質を連結するためのMNAzymeリガーゼの使用が提供される。
【００４０】
一つの態様においては、産物は少なくとも一つの核酸複合体の成分と会合することができる。
【００４１】
別の態様においては、産物は、組織化助長因子、パートザイム、基質、DNAzyme、スタビライザーアーム、活性阻害因子、組織化阻害因子、またはそれらの成分を含む群より選択することができる。産物はカスケードに関与することができる。
【００４２】
別の態様においては、少なくとも一つの基質は、核酸酵素により触媒される反応の産物である。
【００４３】
本発明の別の局面においては、
(a) 複数の第一の核酸酵素の形成を助長するのに複数の標的のうちの一つとの会合を必要とする成分を各々が含み、少なくとも一つの基質を各々がさらに含む、複数の第一の核酸複合体を提供する工程、ならびに
(b) 複数の第一の核酸酵素により触媒される反応の複数の産物と会合できる複数の第二の核酸複合体の各々の少なくとも一つの成分を提供する工程および複数の第二の核酸酵素として機能できる複数の第二の核酸複合体を形成させる工程
を含み、該核酸酵素の少なくとも一つがリガーゼ活性を有し、かつ該核酸酵素の少なくとも一つがMNAzymeである、複数の標的の検出のための方法が提供され、該方法は以下の工程:
(i) 該複数の標的が該複数の第一の核酸複合体と会合して該複数の第一の核酸酵素の形成を助長する、該複数の標的を含有すると推定される試料と複数の第一の核酸複合体とを接触させる工程、および
(ii) 複数の第一の核酸酵素により触媒される反応の複数の産物と複数の第二の核酸複合体の各々の少なくとも一つの成分とを接触させ、それにより該複数の第二の核酸酵素として機能する複数の該第二の核酸複合体の形成を可能にする工程
を含み、
第一もしくは第二のまたはその両方の複数の核酸酵素が該複数の標的の存在を示す。
【００４４】
一つの態様においては、複数の第一または第二の核酸酵素のいずれか一つにより触媒される反応の産物の少なくとも一つは、少なくとも一つのさらなる核酸酵素の機能を可能とするのに必要な成分であることができる。
【００４５】
別の態様においては、核酸酵素のいずれか一つにより触媒される反応の産物の少なくとも一つは、前記の核酸複合体のいずれか一つのうちの成分と会合し、それによって核酸複合体の少なくとも一つがさらなる核酸酵素として機能することを可能にする。
【００４６】
本発明の別の局面においては、MNAzymeリガーゼの基質アームによる基質の結合の後に基質がMNAzymeリガーゼにより修飾される、多成分核酸酵素リガーゼ(MNAzymeリガーゼ)基質としての少なくとも二つのオリゴヌクレオチドの使用が提供される。
【００４７】
本発明の別の局面においては、少なくとも二つの標的の検出のための方法が提供され、該方法は以下の工程:
(a) 少なくとも二つの核酸酵素複合体の形成を助長するのに標的の少なくとも一つとの会合を必要とする成分を各々が含む、少なくとも二つの核酸複合体を提供する工程、および
(b) 該少なくとも二つの標的を含有すると推定される試料と該少なくとも二つの核酸複合体を接触させる工程
を含み、該標的が該核酸複合体と会合して該核酸酵素複合体の形成を助長し、各核酸酵素複合体の活性により生成される少なくとも一つの産物がさらなる核酸酵素複合体の形成に必要であり、
さらなる核酸酵素複合体の活性が該少なくとも二つの標的の存在を示す。
【００４８】
一つの態様においては、核酸酵素複合体の少なくとも一つはリガーゼ活性を有することができる。さらに、核酸酵素複合体の少なくとも一つはMNAzyme複合体であることができる。
【００４９】
本発明の別の局面によれば、
活性なMNAzymeが少なくとも第一の組織化助長因子成分および第二の組織化助長因子成分の存在下で形成され、
MNAzymeリガーゼが少なくとも第三の組織化助長因子の存在下で形成され、
該MNAzymeリガーゼが該第二の組織化助長因子成分と活性阻害因子成分との連結を助長して、活性阻害因子を形成させ、かつ
該活性阻害因子が該MNAzymeの一つまたは複数の成分と会合してMNAi複合体を形成する、
活性なMNAzymeをMNAi複合体にスイッチするためのリガーゼ活性を有するMNAzyme (MNAzymeリガーゼ)の使用が提供される。
【００５０】
一つの態様においては、組織化助長因子、活性阻害因子成分、または活性阻害因子の少なくとも一つが核酸分子であることができる。
【００５１】
一つの態様においては、組織化助長因子、活性阻害因子成分、または活性阻害因子の少なくとも一つがDNAまたはその類似体で構成されることができる。
【００５２】
本発明の別の局面によれば、少なくとも第一のオリゴヌクレオチド成分および第二のオリゴヌクレオチド成分がMNAzymeリガーゼ組織化助長因子の存在下で自己組織化して、リガーゼ活性を有する触媒的に活性な多成分核酸酵素(MNAzymeリガーゼ)を形成させ、
該少なくとも第一および該第二のオリゴヌクレオチド成分の各々が基質アーム部分、触媒コア部分、およびセンサーアーム部分を含み、
自己組織化によって、該第一および第二のオリゴヌクレオチド成分のセンサーアーム部分がMNAzymeリガーゼのセンサーアームとして働き、第一および第二のオリゴヌクレオチド成分の基質アーム部分がMNAzymeリガーゼの基質アームとして働き、かつ第一および第二のオリゴヌクレオチド成分の触媒コア部分がMNAzymeリガーゼの触媒コアとして働き、
第一および第二のオリゴヌクレオチド成分をその各触媒コア部分の会合のために近接して維持し、少なくとも二つの基質を連結できるMNAzymeリガーゼの触媒コアを形成させるように、MNAzymeリガーゼのセンサーアームが該MNAzymeリガーゼ組織化助長因子と相互作用し、かつ
該MNAzymeの該触媒コアが該基質を連結できるように、該MNAzymeリガーゼの該基質アームが第一および第二の基質を結合する、少なくとも二つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド成分を含むリガーゼ活性を持った多成分核酸酵素が提供される。
【００５３】
一つの態様においては、リガーゼ活性を有する多成分核酸酵素のオリゴヌクレオチド成分、組織化助長因子、または基質の少なくとも一つがDNAまたはその類似体を含むことができる。
【００５４】
一つの態様においては、基質の連結は、検出可能な作用をもたらすことができる。
【００５５】
本発明の別の局面においては、少なくとも触媒コア部分、センサーアーム部分、およびレポーターアーム部分を各々が含む少なくとも二つのオリゴヌクレオチドパートザイム、ならびに組織化助長因子オリゴヌクレオチドおよび少なくとも二つの基質核酸を含む少なくとも三つのさらなるオリゴヌクレオチド成分を含んだ組成物であって、基質核酸を連結できる多成分核酸複合体を形成することができる該組成物が提供される。
【００５６】
一つの態様においては、組成物のオリゴヌクレオチド成分、組織化助長因子、または基質の少なくとも一つがDNAまたはその類似体を含むことができる。
【００５７】
本発明の別の局面においては、少なくとも第一のオリゴヌクレオチド成分および第二のオリゴヌクレオチド成分がMNAzyme組織化助長因子の存在下で自己組織化して、リガーゼ活性を有する触媒的に活性な多成分核酸酵素(MNAzymeリガーゼ)を形成させ、
該少なくとも第一および該第二のオリゴヌクレオチド成分の各々が基質アーム部分、触媒コア部分、およびセンサーアーム部分を含み、
自己組織化によって、該第一および第二のオリゴヌクレオチド成分のセンサーアーム部分がMNAzymeリガーゼのセンサーアームとして働き、第一および第二のオリゴヌクレオチド成分の基質アーム部分がMNAzymeリガーゼの基質アームとして働き、かつ第一および第二のオリゴヌクレオチド成分の触媒コア部分がMNAzymeリガーゼの触媒コアとして働き、
第一および第二のオリゴヌクレオチド成分をその各触媒コア部分の会合のために近接して維持し、少なくとも一つの基質を別のものに連結できるMNAzymeリガーゼの触媒コアを形成させるように、MNAzymeリガーゼのセンサーアームが該MNAzymeリガーゼ組織化助長因子と相互作用し、かつ
該MNAzymeリガーゼの該触媒コアが該基質を連結できるように、該MNAzymeリガーゼの該基質アームが第一および第二の基質を結合する、少なくとも二つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド成分を含む組成物が提供される。
【００５８】
一つの態様においては、基質の連結は、検出可能な作用をもたらすことができる。
【００５９】
一つの態様においては、組成物のオリゴヌクレオチド成分、組織化助長因子、または基質の少なくとも一つがDNAまたはその類似体を含むことができる。
【００６０】
本発明の別の局面においては、MNAzymeの少なくとも一つのオリゴヌクレオチド成分がアプタマーをさらに含む、リガーゼ活性を有する多成分核酸酵素が提供される。
【００６１】
別の局面においては、組織化助長因子または基質の少なくとも一つがアプタマーをさらに含む。
【００６２】
一つの態様においては、MNAzymeリガーゼの組織化は、アプタマーを結合できる一つまたは複数の分析物の有無によって指令されることができる。
【００６３】
本発明の別の局面においては、
(a) 少なくとも第一のオリゴヌクレオチド成分および第二のオリゴヌクレオチド成分が組織化助長因子の存在下で自己組織化して、リガーゼ活性を有する少なくとも一つの触媒的に活性な多成分核酸酵素(MNAzymeリガーゼ)を形成させる、少なくとも二つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド成分を提供する工程、
(b) 二つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド成分と、組織化助長因子を含有すると推定される試料とを、
(1) 該少なくとも一つの触媒的に活性なMNAzymeリガーゼの自己組織化、および
(2) 該少なくとも一つのMNAzymeリガーゼの触媒活性
を可能にする条件の下で接触させる工程、ならびに
(c) 該少なくとも一つのMNAzymeリガーゼの触媒活性の存在を判定する工程
を含み、触媒活性の存在が少なくとも一つの組織化助長因子の存在を示す、少なくとも一つの組織化助長因子の存在を検出するための方法が提供される。
【００６４】
一つの態様においては、オリゴヌクレオチド成分または組織化助長因子の少なくとも一つがDNAまたはその類似体で構成されることができる。
【００６５】
一つの態様においては、組織化助長因子は、同定される、検出される、または定量化される標的であることができる。
【００６６】
一つの態様においては、標的は核酸であることができる。
【００６７】
好ましい態様においては、核酸はDNA、メチル化DNA、アルキル化DNA、RNA、メチル化RNA、ミクロRNA、siRNA、shRNA、mRNA、tRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、プレ-およびプリ-ミクロRNA、他の非コーディングRNA、リボソームRNA、それらの誘導体、それらのアンプリコン、またはそれらの任意の組み合わせを含む群より選択することができる。
【００６８】
一つの態様においては、核酸の供給源は、合成供給源、哺乳類供給源、ヒト供給源、動物供給源、植物供給源、真菌供給源、細菌供給源、ウイルス供給源、古細菌供給源、またはそれらの任意の組み合わせを含む群より選択することができる。
【００６９】
一つの態様においては、本方法は、組織化助長因子を増幅する工程をさらに含むことができる。
【００７０】
一つの態様においては、増幅する工程は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、鎖置換増幅、ループ媒介等温増幅、ローリングサークル増幅、転写媒介増幅、自己持続配列複製、リガーゼ連鎖反応、核酸配列に基づく増幅、または逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)のうちの一つまたは複数を含むことができる。
【００７１】
一つの態様においては、反応のための組織化助長因子、オリゴヌクレオチド成分、もしくは基質の少なくとも一つまたはそれらの組み合わせは、二つ以上の分子で構成されることができる。
【００７２】
一つの態様においては、本方法は増幅の間または後の触媒活性の存在の判定をさらに含むことができる。
【００７３】
一つの態様においては、MNAzymeリガーゼの自己組織化は、組織化助長因子と第一および第二のオリゴヌクレオチド成分の一方または両方との接触を必要とすることができる。
【００７４】
一つの態様においては、本方法は、第一および第二のオリゴヌクレオチド成分の一方または両方の少なくとも一部分を接触させてMNAzymeリガーゼを自己組織化する少なくとも第三のオリゴヌクレオチド成分を提供する工程をさらに含むことができる。
【００７５】
一つの態様においては、本方法の第三のオリゴヌクレオチド成分は二つ以上の分子で構成されることができる。
【００７６】
本発明の一つの局面においては、
2010523088.tif 000004
を含む群より選択される配列を含んだMNAzymeリガーゼの触媒コアの部分を形成できる単離された核酸配列が提供される。
【００７７】
本発明の別の局面によれば、第一のMNAzymeのための成分、第一のMNAzyme基質、第二のMNAzymeのための成分、第二のMNAzymeのための第二の組織化助長因子、第二のMNAzyme基質、第三のMNAzymeのための第三の組織化助長因子、少なくとも第三のMNAzyme基質、および第三のMNAzymeのための第一のパートザイムを含むカスケードによる、第一の組織化助長因子の検出のための方法が提供され、
該第一のMNAzymeの触媒活性を可能にする条件の下での該第一のMNAzymeのための成分との該第一の組織化助長因子の会合が該第一のMNAzymeの触媒活性を助長し、それによって該第一のMNAzyme基質を切断し、
第一のMNAzyme基質の切断が第四のMNAzyme基質の産生をもたらし、かつ
第二のMNAzyme組織化助長因子が第二および第四のMNAzyme基質との第二のMNAzymeの組織化を助長し、かつ
第二のMNAzymeの触媒リガーゼ活性が第三のMNAzymeのための第二のパートザイムを産生し、ならびに
第三のMNAzymeの触媒活性を可能にする条件の下での、第三のMNAzymeのための該第一および第二のパートザイムと該第三の組織化助長因子との会合が該第三のMNAzymeの触媒活性を助長し、それによって少なくとも第三のMNAzyme基質の修飾をもたらす。
【００７８】
第一、第二、もしくは少なくとも第三のMNAzyme基質またはそれらの任意の組み合わせの修飾は、検出可能な作用をもたらすことができる。
【００７９】
少なくとも第三のMNAzyme基質の修飾は、核酸の切断、核酸の連結、核酸のリン酸化、核酸のキャッピング、アミノ酸のアデニル化、補因子合成、RNA重合、鋳型依存性の重合、RNA-タンパク質の結合、アルドール反応、アルコール酸化、アルデヒド還元、プリンおよびピリミジンヌクレオチド合成、アルキル化、アミド合成、尿素合成、ペプチド結合の形成、ペプチジル-RNA合成、アシル転移、アミノアシル化、炭酸加水分解、ホスホロチオエートアルキル化、ポルフィリンメタル化、炭素-炭素結合の形成、Pdナノ粒子の形成、ビフェニル異性化、エステル結合の形成、アミド結合の形成、DNA脱グリコシル化、チミン二量体光回復、ならびにホスホロアミダイト切断を含む群より選択することができる。
【００８０】
本発明の一つの態様においては、本方法は、第三のMNAzymeの産物が第四のMNAzyme基質であり、かつ第二のMNAzymeが第二および第四のMNAzyme基質の連結を助長し、それによって第三のMNAzymeのためのさらなる第二のパートザイムを産生する、増幅カスケードをさらに含む。
【００８１】
本発明の別の局面によれば、第一のMNAzymeのための成分、第一のMNAzyme基質、第二のMNAzymeのための成分、第二のMNAzyme組織化助長因子、第二のMNAzyme基質、第三のMNAzymeのための成分、および少なくとも第三のMNAzyme基質を含むカスケードによる、第一の組織化助長因子の検出のための方法が提供され、
該第一のMNAzymeの触媒活性を可能にする条件の下での該第一のMNAzymeのための成分との該第一の組織化助長因子の会合が該第一のMNAzymeの触媒活性を助長し、それによって該第一のMNAzyme基質を切断し、
第一のMNAzyme基質の切断が第四のMNAzyme基質の産生をもたらし、かつ
第二のMNAzyme組織化助長因子が第二および第四のMNAzyme基質との第二のMNAzymeの組織化を助長し、かつ
第二のMNAzymeの触媒活性が第三のMNAzymeのための第三のMNAzyme組織化助長因子を産生し、ならびに
第三のMNAzymeの触媒活性を可能にする条件の下での該第三のMNAzyme組織化助長因子と該第三のMNAzymeのための成分との会合が該第三のMNAzymeの触媒活性を助長し、それによって少なくとも第三のMNAzyme基質の修飾をもたらす。
【００８２】
第一、第二、もしくは少なくとも第三のMNAzyme基質またはそれらの任意の組み合わせの修飾は、検出可能な作用をもたらすことができる。
【００８３】
少なくとも第三のMNAzyme基質の修飾は、核酸の切断、核酸の連結、核酸のリン酸化、核酸のキャッピング、アミノ酸のアデニル化、補因子合成、RNA重合、鋳型依存性の重合、RNA-タンパク質の結合、アルドール反応、アルコール酸化、アルデヒド還元、プリンおよびピリミジンヌクレオチド合成、アルキル化、アミド合成、尿素合成、ペプチド結合の形成、ペプチジル-RNA合成、アシル転移、アミノアシル化、炭酸加水分解、ホスホロチオエートアルキル化、ポルフィリンメタル化、炭素-炭素結合の形成、Pdナノ粒子の形成、ビフェニル異性化、エステル結合の形成、アミド結合の形成、DNA脱グリコシル化、チミン二量体光回復、ならびにホスホロアミダイト切断を含む群より選択することができる。
【００８４】
本発明の一つの態様においては、本方法は、第三のMNAzymeの産物が第四のMNAzyme基質であり、かつ第二のMNAzymeが第二および第四のMNAzyme基質の連結を助長し、それによって第三のMNAzymeのためのさらなる第三の組織化助長因子を産生する、増幅カスケードをさらに含む。
【００８５】
本発明の別の局面によれば、切断活性を有する第一のMNAzymeのための成分、第一のMNAzyme基質、リガーゼ活性を有する第一のDNAzyme (DNAzymeリガーゼ)、第一のDNAzymeリガーゼ基質、第二の組織化助長因子、少なくとも第二のMNAzyme基質、および第二のMNAzymeのための第一のパートザイムを含むカスケードによる第一の組織化助長因子の検出のための方法が提供され、
該第一のMNAzymeの触媒活性を可能にする条件の下での該第一のMNAzymeのための成分との該第一の組織化助長因子の会合が該第一のMNAzymeの触媒活性を助長し、それによって該第一のMNAzyme基質の修飾をもたらし、
第一のMNAzyme基質の修飾が第二のDNAzymeリガーゼ基質の産生をもたらし、かつ
第一のDNAzymeリガーゼが第一および第二のDNAzymeリガーゼ基質と組織化し、かつ
DNAzymeリガーゼの触媒活性が第二のMNAzymeのための第二のパートザイムを産生し、ならびに
第二のMNAzymeの触媒活性を可能にする条件の下での第二のMNAzymeのための該第二のパートザイムと該第二の組織化助長因子および第二のMNAzymeのための第一のパートザイムとの会合が該第二のMNAzymeの触媒活性を助長し、それによって少なくとも第二のMNAzyme基質の修飾をもたらす。
【００８６】
オリゴヌクレオチド成分、組織化助長因子、または基質の少なくとも一つは、DNAまたはその類似体を含むことができる。
【００８７】
第一の組織化助長因子は、同定される、検出される、または定量化される標的であることができる。
【００８８】
第一もしくは第二のMNAzyme基質もしくはリガーゼ基質またはそれらの任意の組み合わせの修飾は、検出可能な作用をもたらすことができる。
【００８９】
第二のMNAzymeの触媒活性は、核酸の切断、核酸の連結、核酸のリン酸化、核酸のキャッピング、アミノ酸のアデニル化、補因子合成、RNA重合、鋳型依存性の重合、RNA-タンパク質の結合、アルドール反応、アルコール酸化、アルデヒド還元、プリンおよびピリミジンヌクレオチド合成、アルキル化、アミド合成、尿素合成、ペプチド結合の形成、ペプチジル-RNA合成、アシル転移、アミノアシル化、炭酸加水分解、ホスホロチオエートアルキル化、ポルフィリンメタル化、炭素-炭素結合の形成、Pdナノ粒子の形成、ビフェニル異性化、エステル結合の形成、アミド結合の形成、DNA脱グリコシル化、チミン二量体光回復、ならびにホスホロアミダイト切断を含む群より選択することができる。
【００９０】
第二のMNAzyme基質の修飾は切断であることができる。
【００９１】
基質の連結は検出可能な作用をもたらすことができる。
【００９２】
本発明の一つの態様においては、本方法は、第二のMNAzymeの産物が第二のDNAzymeリガーゼ基質であり、DNAzymeリガーゼが第一および第二のDNAzymeリガーゼ基質の連結を助長し、それによって第二のMNAzymeのためのさらなる第二のパートザイムを産生する、増幅カスケードをさらに含む。
【００９３】
DNAzymeリガーゼは、DNAzymeリガーゼ7Z81、7Z48、および7Q10を含む群より選択することができる。
【００９４】
本発明の別の局面によれば、切断活性を有する第一のMNAzymeのための成分、第一のMNAzyme基質、リガーゼ活性を有する第一のDNAzyme (DNAzymeリガーゼ)、第一のDNAzymeリガーゼ基質、第二のMNAzymeのための成分、および少なくとも第二のMNAzyme基質を含むカスケードによる第一の組織化助長因子の検出のための方法が提供され、
該第一のMNAzymeの触媒活性を可能にする条件の下での該第一のMNAzymeのための成分との該第一の組織化助長因子の会合が該第一のMNAzymeの触媒活性を助長し、それによって該第一のMNAzyme基質の修飾をもたらし、
第一のMNAzyme基質の修飾が第二のDNAzymeリガーゼ基質の産生をもたらし、かつ
第一のDNAzymeリガーゼが第一および第二のDNAzymeリガーゼ基質と組織化し、かつ
DNAzymeリガーゼの触媒活性が第二のMNAzymeのための第二の組織化助長因子を産生し、ならびに
第二のMNAzymeの触媒活性を可能にする条件の下での第二のMNAzymeのための該第二の組織化助長因子と該第二のMNAzymeのための成分との会合が該第二のMNAzymeの触媒活性を助長し、それによって少なくとも第二のMNAzyme基質の修飾をもたらす。
【００９５】
オリゴヌクレオチド成分、組織化助長因子、または基質の少なくとも一つは、DNAまたはその類似体を含むことができる。
【００９６】
第一もしくは第二のMNAzyme基質もしくはリガーゼ基質またはそれらの任意の組み合わせの修飾は、検出可能な作用をもたらすことができる。
【００９７】
第一の組織化助長因子は、同定される、検出される、または定量化される標的であることができる。
【００９８】
第二のMNAzymeの触媒活性は、核酸の切断、核酸の連結、核酸のリン酸化、核酸のキャッピング、アミノ酸のアデニル化、補因子合成、RNA重合、鋳型依存性の重合、RNA-タンパク質の結合、アルドール反応、アルコール酸化、アルデヒド還元、プリンおよびピリミジンヌクレオチド合成、アルキル化、アミド合成、尿素合成、ペプチド結合の形成、ペプチジル-RNA合成、アシル転移、アミノアシル化、炭酸加水分解、ホスホロチオエートアルキル化、ポルフィリンメタル化、炭素-炭素結合の形成、Pdナノ粒子の形成、ビフェニル異性化、エステル結合の形成、アミド結合の形成、DNA脱グリコシル化、チミン二量体光回復、ならびにホスホロアミダイト切断を含む群より選択することができる。
【００９９】
DNAzymeリガーゼは、DNAzymeリガーゼ7Z81、7Z48、および7Q10を含む群より選択することができる。
【０１００】
第二のMNAzyme基質の修飾は切断であることができる。
【０１０１】
基質の連結は検出可能な作用をもたらすことができる。
【０１０２】
本発明の一つの態様においては、本方法は、第二のMNAzymeの産物が第二のDNAzymeリガーゼ基質であり、DNAzymeリガーゼが第一および第二のDNAzymeリガーゼ基質の連結を助長し、それによって第二のMNAzymeのためのさらなる第二の組織化助長因子を産生する、増幅カスケードをさらに含む。
【０１０３】
本発明の別の局面によれば、切断活性を有する第一のMNAzyme (第一のMNAzyme切断因子)のための成分、第一の切断可能なMNAzyme基質、リガーゼ活性を有する第一のMNAzyme (第一のMNAzymeリガーゼ)のための成分、第一のMNAzymeリガーゼ組織化助長因子、第一のMNAzymeリガーゼ基質、第二のMNAzyme切断因子のための第二の組織化助長因子、第二の切断可能なMNAzyme基質、および第二のMNAzyme切断因子のための第一のパートザイムを含むカスケードによる第一の組織化助長因子の検出のための方法が提供され、
該第一のMNAzyme切断因子の触媒活性を可能にする条件の下での該第一のMNAzyme切断因子のための成分との該第一の組織化助長因子の会合が該第一のMNAzyme切断因子の触媒活性を助長し、それによって該第一の切断可能なMNAzyme基質の修飾をもたらし、
第一の切断可能なMNAzyme基質の修飾が第二のMNAzymeリガーゼ基質の産生をもたらし、かつ
MNAzymeリガーゼ組織化助長因子が第一のMNAzymeリガーゼと第一および第二のMNAzymeリガーゼ基質との組織化を助長し、かつ
MNAzymeリガーゼの触媒活性が第二のMNAzyme切断因子のための第二のパートザイムを産生し、ならびに
第二のMNAzyme切断因子の触媒活性を可能にする条件の下での、第二のMNAzyme切断因子のための該第一および第二のパートザイムと該第二の組織化助長因子との会合が該第二のMNAzyme切断因子の触媒活性を助長し、それによって第二の切断可能なMNAzyme基質の修飾をもたらす。
【０１０４】
オリゴヌクレオチド成分、組織化助長因子、または基質の少なくとも一つは、DNAまたはその類似体を含むことができる。
【０１０５】
第一の組織化助長因子は、同定される、検出される、または定量化される標的であることができる。
【０１０６】
第一もしくは第二の切断可能なMNAzyme基質またはその両方の修飾は、検出可能な作用をもたらすことができる。
【０１０７】
基質の連結は検出可能な作用をもたらすことができる。
【０１０８】
一つの態様においては、本方法は、第二のMNAzymeの産物が第二のMNAzymeリガーゼ基質であり、MNAzymeリガーゼが第一および第二のMNAzymeリガーゼ基質の連結を助長し、それによって第二のMNAzyme切断因子のためのさらなる第二のパートザイムを産生する、増幅カスケードをさらに含む。
【０１０９】
本発明の別の局面によれば、切断活性を有する第一のMNAzyme (第一のMNAzyme切断因子)のための成分、第一の切断可能なMNAzyme基質、リガーゼ活性を有する第一のMNAzyme (第一のMNAzymeリガーゼ)のための成分、第一のMNAzymeリガーゼ組織化助長因子、第一のMNAzymeリガーゼ基質、第二のMNAzyme切断因子のための成分、および第二の切断可能なMNAzyme基質を含むカスケードによる第一の組織化助長因子の検出のための方法が提供され、
該第一のMNAzyme切断因子の触媒活性を可能にする条件の下での該第一のMNAzyme切断因子のための成分との該第一の組織化助長因子の会合が該第一のMNAzyme切断因子の触媒活性を助長し、それによって該第一の切断可能なMNAzyme基質の修飾をもたらし、
第一の切断可能なMNAzyme基質の修飾が第二のMNAzymeリガーゼ基質の産生をもたらし、かつ
MNAzymeリガーゼ組織化助長因子が第一のMNAzymeリガーゼと第一および第二のMNAzymeリガーゼ基質との組織化を助長し、かつ
MNAzymeリガーゼの触媒活性が第二のMNAzyme切断因子のための第二のMNAzyme組織化助長因子を産生し、ならびに
第二のMNAzyme切断因子の触媒活性を可能にする条件の下での該第二のMNAzyme組織化助長因子と該第二のMNAzyme切断因子のための成分との会合が該第二のMNAzyme切断因子の触媒活性を助長し、それによって第二の切断可能なMNAzyme基質の修飾をもたらす。
【０１１０】
オリゴヌクレオチド成分、組織化助長因子、または基質の少なくとも一つは、DNAまたはその類似体を含むことができる。
【０１１１】
第一もしくは第二の切断可能なMNAzyme基質またはその両方の修飾は、検出可能な作用をもたらすことができる。
【０１１２】
基質の連結は検出可能な作用をもたらすことができる。
【０１１３】
第一の組織化助長因子は、同定される、検出される、または定量化される標的であることができる。
【０１１４】
一つの態様においては、本方法は、第二のMNAzymeの産物が第二のMNAzymeリガーゼ基質であり、MNAzymeリガーゼが第一および第二のMNAzymeリガーゼ基質の連結を助長し、それによって第二のMNAzyme切断因子のためのさらなる第二のMNAzyme組織化助長因子を産生する、増幅カスケードをさらに含む。
【０１１５】
本発明の別の局面においては、MNAzymeの基質アームによる基質の結合の後に基質がMNAzymeにより修飾される、多成分核酸酵素(MNAzyme)基質としての少なくとも一つのオリゴヌクレオチドの使用が提供される。
【０１１６】
本発明の別の局面においては、以下の工程:
(a) 部分的触媒コア配列に分けるためにDNAzyme配列内の位置を選択する工程
(b) 該部分的触媒コア配列をパートザイムに組み入れる工程
(c) パートザイム対の触媒活性を検出して、該パートザイムにおける該部分的触媒コア配列のどの組み合わせが活性なMNAzymeの形成に適合するかを判定する工程
を含む、DNAzyme由来の部分配列を組み入れたMNAzymeを生成するための方法が提供される。
【０１１７】
本発明の別の局面においては、
(a) DNAzymeの触媒コア配列を分ける工程
(b) 得られた部分的触媒コア配列をパートザイムに組み入れる工程
(c) MNAzyme活性を検出して、該パートザイムにおける該部分的触媒コア配列のどの組み合わせが活性なMNAzymeの形成に適合するかを判定する工程
を含む、パートザイムに組み入れることによって、機能的に活性なMNAzymeをもたらすDNAzyme触媒コア由来の部分的触媒コア配列を試験するための方法が提供される。
【０１１８】
本発明の別の局面においては、以下の工程:
(a) DNAzyme由来の触媒コア配列を分ける工程
(b) 得られた部分的触媒コア配列をパートザイムに組み入れる工程
(c) MNAzyme活性を検出して、該パートザイムにおける該部分的触媒コア配列のどの組み合わせが活性なMNAzymeの形成に適合するかを判定する工程
を含む、パートザイムに組み入れることによって、機能的に活性なMNAzymeをもたらす部分的触媒コア配列に分けるのにDNAzyme触媒コア配列内のどの位置が適しているかを同定するための方法が提供される。
【０１１９】
添付の図面を参照しながら、ほんの一例として、本発明の好ましい態様をこれから説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】多成分核酸(MNAzyme)の一つの例示的設計の描写: 例示的な開示として、MNAzymeは、組織化助長因子の存在下で自己組織化する二つのオリゴヌクレオチド成分(パートザイムAおよびパートザイムB)で構成される。二つのパートザイムが組織化助長因子の存在下で組織化する場合、基質を修飾できる、例えば切断できる触媒的に活性なMNAzymeが生じる。二つの成分パートザイムは、組織化助長因子に結合する(i) センサーアーム、基質に結合する(ii) 基質アーム、および(iii) 部分的触媒コア配列を有する。組織化助長因子分子の存在は「入力」シグナルを与え、これが、修飾を行いやすい高度に特異的な形でのパートザイム成分の組織化を指令する。いくつかの態様においては、組織化助長因子は、例えば、試験試料中に存在する標的核酸配列であることができる。他の態様においては、組織化助長因子は、例えば検出可能な実体または事象の存在下でのパートザイム成分の自己組織化を指令するために環境中に含まれる合成オリゴヌクレオチドであることができる。組織化されたMNAzymeによる基質の修飾は「出力」シグナルを与えることができ、これを、検出するおよび/または定量化することができる。例えば、基質がフルオロフォア(F)およびクエンチャー(Q)で二重標識される場合、活性なMNAzymeによる基質の切断はフルオロフォアとクエンチャーとを分離し、蛍光の同時増大をもたらす。
【図２】活性なMNAzymeのさらに例示的な設計。パネル(i): 複数の組織化助長因子成分がMNAzymeの形成に必要とされるMNAzymeの例示的な設計の描写。この設計では、一つの組織化助長因子成分(F1)はパートザイムAおよびBの両方のセンサーアームの領域に相補的であるが、もう一つの組織化助長因子成分(F2)はパートザイムBのみ(この図解のように)、またはパートザイムAのみのどちらかに相補的である。二つの組織化助長因子成分はともに、基質を修飾(例えば切断)できる活性なMNAzymeの組織化を指令する。パネル(ii): 一つのパートザイムA成分および二部構成のパートザイムB成分が組織化助長因子の存在下で組織化して、基質を修飾(例えば切断)できる活性なMNAzymeを産生する例示的な設計の描写。この略図では、パートザイムBは、スタビライザーアーム成分(S)といわれる第二の成分が存在しない場合、安定なMNAzymeの組織化を可能とするには不十分な、トランケートされたセンサーアーム(T)を有する。パートザイムのトランケートされたセンサーアームに隣接した位置での組織化助長因子とのスタビライザーアーム成分のハイブリダイゼーションによって、活性なMNAzymeの組織化が可能になる。  トランケートされるパートザイムアームは以下いずれかでありうることを当業者は理解するであろう: パートザイムAセンサーアーム、パートザイムBセンサーアーム(図に示されるように)、パートザイムA基質アーム、もしくはパートザイムB基質アーム、またはそれらの組み合わせ。
【図３】活性な多成分核酸複合体および不活性な多成分核酸複合体の存在下での出力シグナル(蛍光)の経時変化。この例では、第一のパートザイム(A)は単一成分オリゴヌクレオチドを含む。第二のパートザイム(B)は、基質アーム、部分的触媒コア、およびトランケートされたセンサーアーム(T)を含有する一つの成分、ならびにスタビライザーアーム(S)として働くもう一つの成分を有する。  蛍光の増大は、パートザイムAおよびBの成分の全てならびに組織化助長因子を含んだ反応(i)において認められた。これはこの反応における活性なMNAzymeの組織化および基質の切断と一致している。パートザイムBのスタビライザーアーム部分を省くこと(反応(ii))で、経時的なシグナルの増大は引き起こされず、この成分がこの系での活性なMNAzymeの組織化に不可欠であることが示唆された。組織化助長因子を欠いた対照反応(反応(iii))も経時的な蛍光の増大を示さなかった。  これらの反応はオリゴヌクレオチド複合体の二つの代替的状態を示す。活性なMNAzyme (反応(i))は活性な複合体(「オン」状態)を示す。パートザイムスタビライザーアーム成分(反応(ii))または組織化助長因子成分(反応(iii))のどちらかが除かれている反応は、不活性なMNA複合体(「オフ」状態)を表す。したがって、MNAzyme触媒活性は、各種のオリゴヌクレオチドの有無により、および/または機能的に活性である、例えば安定なMNAzymeもしくはMNAzyme複合体を形成するように他のオリゴヌクレオチド成分とハイブリダイズできる、そのようなオリゴヌクレオチド成分の能力により、調節することができる。トランケートされるアームは、スタビライザーアーム成分を伴わない限り、反応条件の下で安定なMNAzymeの組織化を可能とするには不十分であるように設計される。スタビライザーアームおよび組織化助長因子は、MNAzyme活性のための「オン」スイッチとして機能することができる。
【図４】不活性な多成分核酸阻害因子(MNAi)複合体(左手側)および活性なMNAzyme (右手側)の例示的な設計の描写: MNAi複合体は、パートザイムAおよびBが組織化助長因子成分および活性阻害因子と複合体を形成する場合に形成される(左手側)。不活性なMNAi複合体は基質と相互作用できるが、基質を触媒的に修飾できない。いくつかの態様においては、活性阻害因子は不安定なまたは切断可能なリンカー(点線矢印で示される)をさらに含むことができ、それらは活性阻害因子内の二つまたはそれ以上のドメインを分離することができる。そのようなドメインは、例えば、(i) パートザイム成分に実質的に非相補的であり、かつ触媒的に活性なMNAzymeの形成に必要な二次構造を破壊することによって阻害作用を及ぼす、活性阻害因子部分、および(ii) 活性阻害因子部分から分離されれば、組織化助長因子成分として機能し、活性なMNAzymeの組織化を指令しうる活性化因子の組織化助長因子部分を含むことができる。
【図５】種々の多成分核酸複合体の触媒活性の実証。全ての反応にパートザイムA、パートザイムB、およびフルオロフォアクエンチャー色素対で標識された基質が含まれた。さらに、反応には(i) 組織化助長因子F1/2、(ii) 部分F1およびF2を含む組織化助長因子(それらの配列は組織化助長因子F1/2の配列にともに対応する)、(iii) 組織化助長因子部分F1、ならびに活性阻害因子部分およびF2と同じ配列を有する部分に対応する二つの接合ドメインを含む活性阻害因子、または(iv) 組織化助長因子もしくは活性阻害因子なしのいずれかが含まれた。  蛍光の変化を活性なMNAzymeによる基質の触媒的切断の一つの指標として経時的にモニタリングした(図5)。蛍光は、組織化助長因子F1/2か、または組織化助長因子成分F1およびF2のどちらかを含む反応において急速に増大し、どちらもともに基質を切断できる、活性なMNAzyme 1および2それぞれの形成が示唆された。対照的に、F1と活性阻害因子とを含む反応では経時的な蛍光の増大を示さず、不活性なMNAi複合体の形成が示唆された。組織化助長因子が存在しない場合、蛍光の増大は見られなかった。
【図６】変種MNAzymeの設計のための例示的な構造。活性なMNAzyme複合体のいくつかの例をパネルA〜Dに示す。これらの構造は全て、基質(S)を修飾、例えば切断できる触媒的に活性な酵素を形成することができる。図示されているのは、一つの組織化助長因子F1 (パネルA)、二つの組織化助長因子成分F1およびF2 (パネルBおよびD)または三つの組織化助長因子成分F1、F2、およびF3 (パネルC)を含んだ、MNAzyme複合体のスキームである。パネルAは、パートザイムセンサーアーム内に自己相補的な領域を有するセンサーアームを含む。MNAzyme複合体はパネルDに示されるように一つまたは複数のスタビライジングアーム(sA)を含むこともできる。
【図７】MNAzymeの活性の調節のための例示的な戦略。この系における戦略は(i) リガンドを活性化因子分子として用いMNAzyme活性を制御する方法、ならびに/または(ii) アプタ-MNAzymeを用いた核酸および非核酸標的の検出の方法として用いることができる。  この例示的なアプタ-MNAzyme検出戦略に含まれる核酸オリゴヌクレオチドは、以下を含む：  (a) パートザイム；  (b) 末端の一方にアプタマーが組み入れられたパートザイムであるアプタ-パートザイム；  (c) アプタ-パートザイムとパートザイムの両方に結合して活性なMNAzymeの組織化を可能にするオリゴヌクレオチドである組織化助長因子；  (d) 基質、例えばレポーター基質；ならびに  (e) 少なくともアプタマー配列の一部分およびアプタ-パートザイム配列の基質結合アームの一部分に及ぶ領域において、アプタ-パートザイムにハイブリダイズする組織化阻害因子オリゴヌクレオチド。  活性化因子リガンドが存在しない場合には(左手側パネル)、組織化阻害因子オリゴヌクレオチドがアプタ-パートザイムに結合し、かくして、レポーター基質の結合と競合し、レポーター基質の結合を遮断する。活性化因子リガンドが存在する場合(右手側パネル)、これがアプタ-パートザイムのアプタマー配列に結合し、組織化阻害因子オリゴヌクレオチドの結合を遮断し、かくして活性なアプタ-MNAzyme複合体の組織化およびその後の基質の修飾、例えば基質の切断(図に示されるように)または例えば基質の連結を可能にする。したがって、活性なアプタ-MNAzymeは専ら、アプタ-パートザイムのアプタマー部分に結合できるリガンドの存在下で生じ、シグナル、例えば蛍光シグナルの増加または減少を引き起こすことができる。  アプタマー配列を、例えば、パートザイムの一方または両方の基質アームおよび/またはセンサーアームのどちらかの一つまたは複数に付着できることが理解されよう。アプタマーがセンサーアームに付着されたなら、組織化助長因子の結合は標的リガンドの存在しない場合に組織化阻害因子オリゴヌクレオチドによって遮断されうる。  この図に描かれるようにアプタ-MNAzymeが切断活性を有するなら、修飾は、例えば二重標識されたレポーター基質の切断、かくして、フルオロフォア/クエンチャー色素対の分離を引き起こすことにより蛍光の増大を引き起こすことができる。  アプタ-MNAzymeによって行われる修飾は、切断以外の修飾、例えば、二つの基質の連結であってよいことが理解されよう。この場合、シグナル変化は、例えば、フルオロフォア/クエンチャー色素対のフルオロフォアまたはクエンチャーのどちらかで各々が標識された、二つの連結可能な基質の連結後の蛍光の減少でありうる。  このアプタ-MNAzymeのアプローチを用いて、MNA複合体の触媒活性を切り替えできる分子スイッチを開発することもできよう。あるいは、それを核酸および非核酸標的リガンドの両方の検出に適用することもできる。
【図８】リガーゼ活性を有するDNAzymeおよび切断活性を有するMNAzymeにより媒介される切断/連結カスケードの一例: リガーゼ活性を有するDNAzymeは、例えば、図のように、オリゴ1およびオリゴ2が2',3'-環状リン酸および5'-ヒドロキシル末端を有するなら、第一のオリゴヌクレオチド(オリゴ1)を第二のオリゴヌクレオチド(オリゴ2)に連結して、オリゴ3の配列および連結接合部に2'-5' RNA結合を有する第三の連結産物(LP-オリゴ3)を生成することができる。そしてまた、LP-オリゴ3は、2'-5' RNA結合の位置で切断して切断産物(CP)のCP-オリゴ1およびCP-オリゴ2を生成し、かくしてさらなる連結ラウンドに関与できる2',3'-環状リン酸および5'-ヒドロキシル産物を再生しうるMNAzymeによって切断されることができる。  リガーゼ活性を有する他のDNAzymeは、例えば、オリゴ1およびオリゴ2が2',3'-ジオールおよび5'-三リン酸末端を有するなら、第一のオリゴヌクレオチド(オリゴ1)を第二のオリゴヌクレオチド(オリゴ2)に連結して、オリゴ3の配列および連結接合部に3'-5' RNA結合を有する第三の連結産物(LP-オリゴ3)を生成することができる。そしてまた、LP-オリゴ3は、3'-5' RNA結合の位置で切断して切断産物(CP)のCP-オリゴ1およびCP-オリゴ2を生成し、2',3'-環状リン酸および5'-ヒドロキシルを有する産物を産生できるMNAzymeによって切断されることができる。
【図９】二種の核酸酵素、すなわち、基質を切断できるMNAzyme、および基質を連結できるDNAzymeリガーゼを用いたカスケード反応の一例。工程(i)において、MNAzyme Aは組織化助長因子(例えば標的核酸)の存在下でのみ生じ、次いでMNAzyme基質Aを切断し、2',3'環状リン酸末端を有する5'産物Aを放出する。工程(ii)において、リガーゼ活性を有するDNAzyme Bは、工程(i)由来の5'産物Aを3'連結基質Bに連結し、かくして、別のMNAzyme Cのパートザイム成分として働きうる連結産物を生成する。工程(iii)において、工程(ii)のパートザイム/連結産物は第二のパートザイムおよび組織化助長因子Cと組織化して、基質Cを二つの産物、つまり5'産物Cおよび3'産物Cに切断できるMNAzyme Cを形成させる。  工程(i)において、組織化助長因子、例えば標的核酸は第一のMNAzyme Aの形成を指令することができる。MNAzyme Aは基質Aを切断し、かくして5'切断産物Aを生成することができ、この5'切断産物AをDNAzymeリガーゼBの基質として使用することができる。工程(ii)において、DNAzymeリガーゼBは工程(i)で生成された5'切断産物A (5'基質Bともいわれる)を別のオリゴヌクレオチド、つまり3'連結基質Bに連結し、かくしてMNAzyme Cのための新たなパートザイムを生成することができる。工程(iii)において、工程(ii)で生成された新しいパートザイム/連結産物は、別のパートザイムとともに、組織化助長因子Cの存在下で新たなMNAzyme Cを形成させることができ、このMNAzyme Cは基質Cを二つの産物、つまり5'産物Cおよび3'産物Cに切断することができる。検出可能なシグナルは基質Cの切断後に、この基質が、例えば、フルオロフォアおよびクエンチャー色素対で標識されていれば、発生されうる。  さらに、5'産物Cの配列が5'産物Aと同じであったなら、この産物は5'基質Bとして働くこともでき、フィードバック増幅カスケード反応が開始されうる。この反応において、MNAzyme Cは5'基質Bを絶えず生成することができ、この5'基質BがDNAzymeリガーゼBにより連結されて、さらに多くのMNAzyme Cの形成のためにさらに多くのパートザイムを生成することができる。この戦略は、MNAzyme Aの組織化を可能にする標的分析物による反応開始後のシグナル増幅のためのフィードバックカスケードまたは機構をもたらす。このカスケード戦略は、基質を連結できるDNAzymeおよび基質を切断できるMNAzymeによるシグナル増幅を伴う標的分析物の検出を可能にする。
【図１０】リガーゼ活性を有するMNAzyme (MNAzymeリガーゼ)の構造の例。例示的なMNAzymeリガーゼは、(i) 組織化助長因子(例えば標的核酸)にハイブリダイズするセンサーアーム、(ii) 触媒コアの部分を構成するドメイン、および(iii) 基質結合アームを含む三つのドメインを含有するパートザイム配列で構成される(図10A)。組織化助長因子、例えば標的核酸の存在下で、パートザイムが組織化し、活性なMNAzymeリガーゼを形成する。これらのMNAzymeは、2'3'環状リン酸を有する5'基質と5'ヒドロキシルを有する3'基質とを連結して(図10B)、非天然の2'-5'結合を含有する連結産物を生成することができる。  あるいは、MNAzymeは、二つの基質を5'基質上の2'3'ジオール末端と3'基質上の5'三リン酸末端とにより連結して、天然の3'-5'結合を含有する連結産物を生成することもできる。
【図１１】リガーゼ活性を有するMNAzymeおよび切断活性を有するMNAzymeを用いる反応のための例示的な戦略。リガーゼ活性を有するMNAzymeは第一のオリゴヌクレオチド(A)を第二のオリゴヌクレオチド(B)に連結して、連結接合部に2'-5' RNA結合を有する第三の連結産物(C)を生成することができる。但し、AおよびBが2',3'-環状リン酸および5'-ヒドロキシル末端を有することが条件となる。そしてまた、産物Cは、2'-5' RNA結合の位置で切断して切断産物AおよびBを生成し、かくしてさらなる連結ラウンドに関与できる2',3'-環状リン酸および5'-ヒドロキシル産物を再生しうるMNAzymeによって切断されることができる。  リガーゼ活性を有する他のMNAzymeは第一のオリゴヌクレオチド(A)を第二のオリゴヌクレオチド(B)に連結して、連結接合部に3'-5' RNA結合を有する第三の連結産物(C)を生成することができる。但し、AおよびBが2',3'-ジオールおよび5'-三リン酸末端を有することが条件となる。そしてまた、産物Cは、3'-5' RNA結合の位置で切断して切断産物AおよびBを生成し、2',3'-環状リン酸および5'-ヒドロキシル末端を有する産物を産生できるMNAzymeによって切断されることができる。
【図１２】切断を行うMNAzymeおよび連結を行うMNAzymeを用いるシグナル検出のための戦略。工程(i)において、組織化助長因子、例えば標的核酸は第一のMNAzyme Aの形成を指令することができる。MNAzyme Aは基質Aを切断し、かくして5'切断産物Aを生成することができ、この5'切断産物Aを、リガーゼ活性を有するMNAzyme Bの基質として使用することができる。工程(ii)において、MNAzymeリガーゼBは工程(i)で生成された5'切断産物A (5'基質Bとも呼ばれる)を別のオリゴヌクレオチド、つまり3'基質Bに連結し、かくしてMNAzyme Cのための新たなパートザイムを生成することができる。工程(iii)において、工程(ii)で生成された新しいパートザイム/連結産物は、別のパートザイムとともに、組織化助長因子Cの存在下で新たなMNAzyme Cを形成させることができ、このMNAzyme Cは基質Cを二つの産物、つまり5'産物Cおよび3'産物Cに切断することができる。検出可能なシグナルは基質Cの切断後に、この基質が、例えば、フルオロフォアおよびクエンチャー色素対で標識されていれば、発生されうる。この戦略は、二種のMNAzyme、すなわち基質を連結できるMNAzyme (MNAzymeリガーゼ)および基質を切断できるMNAzyme (MNAzyme切断因子)による標的分析物の検出を可能にする。  さらに、5'産物Cの配列が5'産物Aと同じであったなら、この産物は5'基質Bとして働くこともでき、フィードバックカスケード反応が開始されうる。この反応において、MNAzyme Cは5'基質Bを絶えず生成することができ、この5'基質BがMNAzymeリガーゼBにより連結されて、さらに多くのMNAzyme Cの形成のためにさらに多くのパートザイムを生成することができる。この戦略は、MNAzyme Aの組織化を可能にする標的分析物による反応開始後のフィードバックシグナル増幅のための機構を提供することができる。
【図１３】リガーゼ活性を有する第二のMNAzymeを用い活性なMNAzymeの「オン状態」とMNAi複合体の「オフ状態」間でMNA複合体をスイッチするための例示的な戦略の描写。基質Aを修飾(例えば切断または連結)できうる活性なMNAzyme Aは、組織化助長因子成分1 (AFC 1)および組織化助長因子成分2 (AFC 2)の存在下で形成されうる。リガーゼ活性を持つ第二のMNAzyme Bが、組織化助長因子3 (AF3)の存在下で形成され、次いでAFC 2を活性阻害因子成分(AIC)と連結し、活性阻害因子(AI)の形成を引き起こしうる。このAIはMNAzyme Aのためのパートザイム成分に結合し、不活性なMNAi複合体の形成をもたらしうる。したがって、この例でのMNAzymeリガーゼはMNAzyme Aを不活性化するオフスイッチとして作動しうる。不活性なMNAi複合体および触媒的に活性なMNAzymeは組織化成分の二つの代替的状態、すなわちそれぞれ「オフ」状態および「オン」状態を示す。
【図１４】単分子DNAzymeからMNAzymeを操作するための一般的方法の描写。多くのDNAzymeは、複数のドメインを有する類似の基本構造を持つ。これらのDNAzymeは、特異的に基質を認識して基質にハイブリダイズする二つの非保存基質結合ドメイン(「基質アーム」)が両側に位置した保存触媒ドメイン(触媒コア)を有する(左手上側の構造)。基質結合ドメインは、DNAzymeによって修飾されうる部位を基質が含んでいれば、どんな基質にも合わせることができる。  第一の工程においては、DNAzyme触媒コアのなかで、触媒コアの各部分を二つの部分配列に割り振って、この二つの部分コアがともに触媒コア全体を構成できるように、分割できる位置を同定する(右手上側の構造)。次いで二つのオリゴヌクレオチドAおよびB (候補パートザイム)を合成することができる(左手下側の構造)。オリゴヌクレオチドAは、(i) 基質に結合できる一つの基質結合アーム部分、(ii) 一つの部分的触媒コア部分、および(iii) 組織化助長因子分子に結合できる一つのセンサーアーム部分を含むように合成することができる。第二のオリゴヌクレオチドBは、(i) オリゴヌクレオチドAと同じ基質に結合でき、オリゴヌクレオチドBがオリゴヌクレオチドAの位置に隣接する位置で基質に結合する、一つの基質結合アーム、(ii) オリゴヌクレオチドAに組み入れられていない、DNAzyme触媒コア全体からの塩基を含む一つの部分的触媒コア部分、および(iii) オリゴヌクレオチドAと同じ組織化助長因子に結合でき、オリゴヌクレオチドBがオリゴヌクレオチドAの位置に隣接する位置で組織化助長因子に結合する、一つのセンサーアーム配列を含むように合成することができる(左手下側の構造)。  この過程を繰り返し、かくして、パートザイムの構造およびドメインを組み入れているが基質および組織化助長因子の存在下で触媒活性を持っても持たなくてもよい、一連のオリゴヌクレオチドAおよびBの対を生成することができる。類似の過程を、少なくとも二つの基質に作用できる核酸酵素に行えることを当業者は理解するであろう。候補パートザイム対(一連のオリゴヌクレオチドAおよびBの対)を、基質アームに適合する基質およびセンサーアームに適合する組織化助長因子と混合し(右手下側の構造)、次いでDNAzyme (左手上側)が示すのと同種の修飾活性の存在についてアッセイすることができる。DNAzymeの同種の修飾を触媒できるオリゴヌクレオチドAおよびBの対は、活性なMNAzymeの組織化に有用である。
【図１５】基質を切断する核酸酵素、および基質を連結する酵素を用いて新たな組織化助長因子を形成させるカスケード反応。この図解において、オリゴヌクレオチドの5'末端を円で示す。工程(1)において、MNAzyme切断因子は組織化助長因子(例えば標的核酸)の存在下で組織化し、次いでMNAzyme基質1を切断し、2',3'環状リン酸末端を有する5'切断産物を放出する。工程(2)において、DNAzymeリガーゼ(またはMNAzymeリガーゼ)は工程(1)由来の5'切断産物を3'連結基質に連結し、かくして、別のMNAzyme切断因子2のための組織化助長因子として働きうる連結産物を生成する。工程(3)において、工程(2)における連結により形成された組織化助長因子は、基質2を二つの産物、つまり2',3'環状リン酸末端を有する5'切断産物と3'切断産物とに切断するMNAzyme切断因子2を形成するパートザイムの組織化を指令する。検出可能なシグナルは基質2の切断の後、この基質が、例えば、フルオロフォアおよびクエンチャー色素対で標識されている場合に発生されうる。この戦略は、複数種の核酸酵素、すなわち基質を連結できる酵素および基質を切断できる酵素による標的分析物の検出を可能にする。  さらに、MNAzyme切断因子2の5'産物の配列がMNAzyme切断因子1の5'産物と同じであったなら、この産物はリガーゼの基質として働くこともでき、フィードバックカスケード反応が開始されうる。この反応において、MNAzyme切断因子2はリガーゼの5'基質を絶えず生成することができ、この5'基質がリガーゼにより連結されて、さらに多くのMNAzyme切断因子2の形成のためにさらに多くの組織化助長因子を生成することができる。この戦略は、MNAzyme切断因子1の組織化を可能にする標的核酸のような組織化助長因子による反応開始後のフィードバックシグナル増幅のための機構をもたらすことができる。
【図１６】二種の核酸酵素、すなわち基質を切断できる酵素、および基質を連結できる酵素を用いるフィードバックカスケード反応のために考えられるスキーマ。この図解において、オリゴヌクレオチドの5'末端を円で示す。工程(1)において、MNAzyme切断因子1は組織化助長因子(例えば標的核酸)の存在下でのみ組織化し、次いでMNAzyme基質1を切断し、2',3'環状リン酸末端を有する5'切断産物と3'不用産物とを放出しうる。工程(2)において、DNAzymeリガーゼ(またはMNAzymeリガーゼ)は工程(1)由来の5'切断産物を3'連結基質に連結し、かくして、MNAzyme切断因子2のための組織化助長因子として働きうる連結産物を生成しうる。工程(3)において、工程(2)における連結により形成された組織化助長因子は、基質2を二つの産物、つまり2',3'環状リン酸末端を有する5'切断産物と3'切断産物とに切断しうるMNAzyme切断因子2を形成するパートザイムの組織化を指令しうる。検出可能なシグナルは基質2の切断後に、この基質が、例えば、フルオロフォアおよびクエンチャー色素対で標識されていれば、発生されうる。  さらに、MNAzyme切断因子2の切断産物のどちらかの配列がMNAzyme切断因子3の組織化助長因子成分として有用であったなら、これはフィードバックカスケードを開始することができる。この場合、MNAzyme切断因子3はMNAzyme切断因子1とは異なるセンサーアームを持ちうるが、MNAzyme切断因子1と同じ基質アームを持ちうる。したがって、MNAzyme切断因子3がMNAzyme切断因子2による切断によって生成された組織化助長因子成分の存在下で組織化されたなら、およびMNAzyme切断因子3が基質1を切断したなら、MNAzyme切断因子3の5'切断産物はDNAzymeリガーゼ(または組織化されたMNAzymeリガーゼ)の5'基質として働くこともでき、フィードバック増幅カスケード反応が開始されうる。  このフィードバックカスケード反応において、MNAzyme切断因子3は5'切断産物を絶えず生成することができ、この5'切断産物がDNAzymeリガーゼ(または組織化されたMNAzymeリガーゼ)による連結のための基質として働いて、さらに多くのMNAzyme切断因子2の組織化を指令しうるさらに多くの組織化助長因子を生成することができる。この戦略は、MNAzyme切断因子1の組織化を可能にする組織化助長因子(例えば標的分析物)による反応開始後のフィードバックシグナル増幅のための機構をもたらすことができる。この戦略は、基質を連結できるDNAzymeまたはMNAzymeおよび基質を切断できるMNAzymeによるシグナル増幅を伴う一つまたは複数の組織化助長因子(例えば標的分析物)の検出を可能にしうる。
【発明を実施するための形態】
【０１２１】
定義
特定の用語が本明細書において用いられ、それらは以下に記載の意味を有するものとする。
【０１２２】
「含む(comprising)」という用語は、「主に含むが、必ずしもそれのみを含むものではないこと」を意味する。さらに、「含む(comprise)」および「含む(comprises)」のような、「含む(comprising)」という語の変化形は、対応して変化した意味を有する。
【０１２３】
「ポリヌクレオチド」、「核酸」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は互換的に用いることができ、DNA、メチル化DNA、アルキル化DNA、RNA、メチル化RNA、ミクロRNA、siRNA、shRNA、mRNA、tRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、プレ-およびプリ-ミクロRNA、他の非コーディングRNA、リボソームRNA、それらの誘導体、それらのアンプリコン、またはそれらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド塩基の一本鎖もしくは二本鎖重合体、あるいはそれらの類似体、誘導体、変種、断片、または組み合わせをいう。非限定的な例として、核酸の供給源は、合成供給源、哺乳類供給源、ヒト供給源、動物供給源、植物供給源、真菌供給源、細菌供給源、ウイルス供給源、古細菌供給源、またはそれらの任意の組み合わせを含む群より選択することができる。
【０１２４】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、典型的には、DNAのセグメントもしくはDNA含有核酸分子、またはRNAもしくはRNA含有分子、あるいはそれらの組み合わせを示す。オリゴヌクレオチドの例としては、核酸標的；基質、例えば、切断活性、リガーゼ活性、または他の酵素活性を有するDNAzymeまたはMNAzymeによって修飾されうるもの；PCRのような方法によるインビトロでの標的増幅に使われるものなどのプライマー；ならびに、特定の態様においては、本明細書において定義のオリゴヌクレオチドを含みうる、組織化助長因子および組織化阻害因子、活性化因子、活性阻害因子および/または基質を含むがこれらに限定されない核酸複合体の成分が挙げられる。本明細書において用いられるパートザイムもオリゴヌクレオチドを含みうる。
【０１２５】
「置換因子(displacer)」または「置換因子オリゴヌクレオチド」は、少なくとも一つのさらなるオリゴヌクレオチドの相補性によって一本鎖である少なくとも一つの領域および二本鎖である少なくとも一つの領域を含んだ第一のオリゴヌクレオチド内の一本鎖領域に結合できるオリゴヌクレオチドであり、この置換因子オリゴヌクレオチドは分岐点移動の過程によって少なくとも一つの二本鎖領域内での第一のオリゴヌクレオチドからのさらなるオリゴヌクレオチドの解離を引き起こすことができる。分岐点移動の間に、さらなるオリゴヌクレオチドと第一のオリゴヌクレオチドとの間の相補性の領域が置換因子オリゴヌクレオチドと第一のオリゴヌクレオチドとの間の少なくとも一つの相補性の領域により分離かつ置き換えられ、このようにしてさらなるオリゴヌクレオチドの置換を引き起こす。置換因子オリゴヌクレオチドは二本鎖領域内にさらなるオリゴヌクレオチドの一つまたは複数の領域と同じ配列を有する少なくとも一つの領域を含む必要がある。分岐点移動の過程は、置換因子オリゴヌクレオチドと第一のオリゴヌクレオチドとの間で形成される新たな二本鎖領域をもたらし、さらなるオリゴヌクレオチドを一本鎖にするその同時放出を引き起こすことができる。
【０１２６】
「ポリヌクレオチド」、「核酸」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、特に指示されない限り、任意の特定の配列およびそれに相補的な配列の言及を含む。オリゴヌクレオチドは、LNAホスホロアミダイト、4-アセチルシチジン、5-(カルボキシヒドロキシルメチル)ウリジン、2'-O-メチルシチジン、5-カルボキシメチルアミノメチルチオウリジン、ジヒドロウリジン、2'-O-メチルプソイドウリジン、βD-ガラクトシルケオシン、2'-O-メチルグアノシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデノシン、1-メチルアデノシン、1-メチルプソイドウリジン、1-メチルグアノシン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアノシン、2-メチルアデノシン、2-メチルグアノシン、3-メチルシチジン、5-メチルシチジン、N6-メチルアデノシン、7-メチルグアノシン、5-メチルアミノメチルウリジン、5-メトキシアミノメチル-2-チオウリジン、βD-マンノシルメチルウリジン、5-メトキシカルボニルメチルウリジン、5-メトキシウリジン、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデノシン、N-((9-β-リボフラノシル-2-メチルチオプリン-6-イル)カルバモイル)トレオニン、N-((9-β-リボフラノシルプリン-6-イル)N-メチル-カルバモイル)トレオニン、ウリジン-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウリジン-5-オキシ酢酸(v)、ワイブトキソシン、プソイドウリジン、ケオシン、2-チオシチジン、5-メチル-2-チオウリジン、2-チオウリジン、4-チオウリジン、5-メチルウリジン、N-((9-β-D-リボフラノシルプリン-6-イル)カルバモイル)トレオニン、2'-O-メチル-5-メチルウリジン、2'-O-メチルウリジン、ワイブトシン、3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)ウリジン、βD-アラビノシルウリジン、およびβD-アラビノシルチミジンを含んだ群を含むがこれらに限定されない、少なくとも一つの付加または置換を含むことができる。
【０１２７】
「誘導体」という用語は、本発明の核酸またはヌクレオチドに関して用いられる場合、(例えば、組み換え手段により)一体的に産生されるまたは(例えば、化学的手段により)合成後に付加される任意の融合分子を含め、任意の機能的に等価の核酸またはヌクレオチドを含む。そのような融合体はRNAまたはDNAが付加された、あるいはポリペプチド(例えば、ピューロマイシンもしくは他のポリペプチド)、小分子(例えば、ソラレン)または抗体に結合された、本発明のオリゴヌクレオチドを含むことができる。
【０１２８】
「類似体」という用語は、核酸またはヌクレオチドに関して用いられる場合、DNAまたはRNA分子または残基に関連する物理的構造であって、DNAもしくはRNA残基またはそれらの類似体と水素結合を形成できる(すなわち、DNAもしくはRNA残基またはそれらの類似体とアニールして塩基対を形成できる)物理的構造を有する化合物を含むが、そのような結合は、「類似体」という用語のなかに包含される該化合物にはあまり必要とされない。このような類似体は、構造的に関連するリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド残基と異なる化学的および生物学的特性を保有しうる。メチル化、ヨウ素化、臭素化、またはビオチン化残基が類似体の例である。デオキシイノシン、C-5-イミダゾールデオキシウリジン、3-(アミノプロピニル)-7-デアザ-dATP、2'-O-メチルRNA、2'O-メチルキャップを含んだヌクレオチド類似体を含有する活性なDNAzymeが記載されている(Warashina et al., 1999; Cairns et al., 2003; Schubert et al., 2004; Sidorov et al., 2004)。他の類似体は、DNAzymeおよびMNAzymeの触媒活性と適合することもできよう。例えばある塩基での別の塩基の置換による、ある塩基の類似体での置換による、触媒活性を有する核酸の改変、または糖成分もしくはホスホジエステル骨格の改変は、当業者には容易でありうる。例えば、改変は、合成中に行うことができ、または合成後に特定の塩基の修飾によって行うことができる。塩基変化または塩基類似体のような改変を組み入れた触媒核酸の経験的試験により、触媒活性に及ぼす改変配列または特定の類似体の影響を評定することができる。塩基A、C、G、T、およびUの類似体は、当技術分野において公知であり、一部を表1に列挙する。
【０１２９】
（表１）本明細書において有用なヌクレオチド類似体の例
2010523088.tif 000005
2010523088.tif 000006
【０１３０】
「核酸酵素」、「触媒核酸」、「触媒活性を有する核酸」、および「触媒核酸酵素」という用語は、本明細書において互換的に用いられており、少なくとも一つの基質を認識し少なくとも一つの基質の修飾(連結または切断のような)を触媒しうる、DNAもしくはDNA含有分子もしくは複合体またはRNAもしくはRNA含有分子もしくは複合体、あるいはDNA-RNAハイブリッド分子または複合体であるそれらの組み合わせを意味するものとする。触媒核酸中のヌクレオチド残基は、塩基A、C、G、T、およびU、ならびにそれらの誘導体および類似体を含むことができる。上記の用語は、少なくとも一つの基質を認識し少なくとも一つの基質の修飾(連結または切断のような)を触媒しうる、単一のDNAもしくはDNA含有分子(当技術分野において「DNA酵素」、「デオキシリボザイム」、もしくは「DNAzyme」としても知られている)またはRNAもしくはRNA含有分子(当技術分野において「RNA酵素」もしくは「リボザイム」としても知られている)、あるいはDNA-RNAハイブリッド分子であるそれらの組み合わせを含みうる単分子核酸酵素を含む。上記の用語は、少なくとも一つの基質を認識し少なくとも一つの基質の修飾(連結または切断のような)を触媒しうる、DNAもしくはDNA含有複合体またはRNAもしくはRNA含有複合体、あるいはDNA-RNAハイブリッド複合体であるそれらの組み合わせを含んだ核酸酵素を含む。「核酸酵素」、「触媒核酸」、「触媒活性を有する核酸」、および「触媒核酸酵素」という用語は、それらの意味のなかにMNAzymeを含む。
【０１３１】
本明細書において用いられる「MNAzyme」または「多成分核酸酵素」という用語は、MNAzyme組織化助長因子(例えば、標的)の存在下でのみ、基質を触媒的に修飾できる活性な核酸酵素を形成する二つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド配列(例えばパートザイム)をいう。MNAzymeは基質の切断、基質の連結、および基質の他の酵素修飾を含め、さまざまな反応を触媒することができる。切断活性を持ったパートザイムAおよびパートザイムBを含む例示的なMNAzymeが図1に描かれている。エンドヌクレアーゼ活性または切断活性を有するMNAzymeは、「MNAzyme切断因子(cleaver)」としても公知である。図1を参照すると、パートザイムAおよびBは各々、組織化助長因子に(例えばワトソン・クリック塩基対合を通じて)結合する。MNAzymeは、単に、パートザイムAおよびBのセンサーアームが組織化助長因子上で相互に隣接してハイブリダイズする場合に生じる。MNAzymeの基質アームが基質を結合し、その修飾(例えば切断)は、パートザイムAおよびBの触媒ドメインの相互作用により形成されるMNAzymeの触媒コアによって触媒される。DNA/RNAキメラレポーター基質の切断が図中に例示されている。MNAzymeはフルオロフォアとクエンチャー色素の対の間で基質を切断し、かくしてシグナルを発する。「多成分核酸酵素」および「MNAzyme」という用語は、本明細書において互換的に用いられており、二つの分子で構成された二部構成の構造、または三つの核酸分子で構成された三部構成の構造、または他の多部構成の構造、例えば、四つもしくはそれ以上の核酸分子によって形成されたものを含む。「MNAzyme複合体」という用語は、その基質の少なくとも一つとともに組織化されたMNAzymeにより形成される複合体をいう。MNAzymeまたはMNAzyme複合体はアプタマーを含むことができ、それぞれ、アプタ-MNAzymeまたはアプタ-MNAzyme複合体ということができる。
【０１３２】
本明細書において用いられる「MNAzymeリガーゼ」という用語は、本明細書においてリガーゼ組織化助長因子または組織化助長因子(例えば、標的)といわれることもあるMNAzyme組織化助長因子の存在下でのみ、二つの基質を連結できる活性な核酸酵素を形成する二つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド配列(例えばパートザイム)を含んだリガーゼ活性を有するMNAzymeをいう。リガーゼ活性を有する例示的なMNAzymeが図10に図解されている。MNAzymeリガーゼは二つの基質を連結する。本明細書において用いられる「MNAzymeリガーゼ」という用語は、二つの分子で構成された二部構成の構造、または三つの核酸分子で構成された三部構成の構造、または他の多部構成の構造、例えば、四つもしくはそれ以上の核酸分子によって形成されたものを含む。
【０１３３】
本明細書において用いられる「連結する」という用語は、二つまたはそれ以上の分子を接合することを意味する。例えば「リガーゼ」は、二つまたはそれ以上の基質分子の間での結合の形成(連結)を触媒して、新たな分子を生成する酵素である。「連結」または「リガーゼ活性」という用語は、二つまたはそれ以上の基質分子の接合をいう。
【０１３４】
本明細書において用いられる場合、「パートザイム」、「成分パートザイム」、「パートザイム成分」、および「成分オリゴヌクレオチド」という用語は、本明細書において定義のMNAzyme組織化助長因子の存在下でのみ、それらの二つまたはそれ以上が「MNAzyme」をともに形成できるDNA含有オリゴヌクレオチド、RNA含有オリゴヌクレオチドまたはDNA-RNA含有オリゴヌクレオチドをいう。特定の好ましい態様においては、一つまたは複数の成分パートザイム、および好ましくは少なくとも二つの成分パートザイムが、次の三つの領域またはドメインを含むことができる: 修飾を触媒する触媒コアの一部を形成する「触媒」ドメイン；組織化助長因子と会合できるおよび/または組織化助長因子に結合できる「センサーアーム」ドメイン；ならびに基質と会合できるおよび/または基質に結合できる「基質アーム」ドメイン。これらの領域またはドメインの図解が図1および図10に示されている。パートザイムは、アプタマーを含むがこれに限定されない少なくとも一つのさらなる成分を含むことができ、本明細書においてこれを「アプタ-パートザイム」という。
【０１３５】
三つ以上の分子で構成されたMNAzymeの一例が図2 (ii)に図解されている。パートザイムは、トランケートされたセンサーアームを有するパートザイム成分および組織化助長因子と相互作用することにより(図2 (ii)に描かれるように)または基質と相互作用することによりMNAzyme構造を安定化するスタビライジングアーム成分を含むがこれらに限定されない、複数の成分を含むことができる。
【０１３６】
「核酸複合体」という用語は、DNAzyme、パートザイム、組織化助長因子、基質、およびスタビライザーアームを含む他のMNA成分、活性阻害因子、組織化阻害因子、ならびにそれらの成分または部分を含むがこれらに限定されない群より選択される二つまたはそれ以上の成分を含んだ触媒的に活性なまたは不活性な複合体をいう。
【０１３７】
本明細書において用いられる場合、「核酸複合体」という用語は、多成分核酸複合体(MNA複合体)を含む。さらに「核酸複合体」という用語は、少なくとも一つの基質と複合体化した単分子核酸酵素、例えば、基質に結合した切断活性を有するDNAzymeまたは必要とされる二つの基質のうちの少なくとも一つに結合したDNAzymeリガーゼを含む。「核酸酵素複合体」という用語は、DNAzyme複合体またはMNAzyme複合体をいう。「DNAzyme複合体」という用語は、少なくとも一つの基質を有するDNAzyme、例えば、基質に結合した切断活性を有するDNAzymeまたは必要とされる二つの基質のうちの少なくとも一つに結合したDNAzymeリガーゼを含む。
【０１３８】
「多成分核酸複合体」または「MNA複合体」という用語は、パートザイム、組織化助長因子、基質、およびスタビライザーアームを含む他の成分、活性阻害因子、組織化阻害因子、ならびにそれらの成分または部分を含むがこれらに限定されない群より選択される二つまたはそれ以上の成分を含んだ複合体をいう。いくつかの態様においては、MNA複合体は活性なMNAzymeを含む。他の態様においては、MNA複合体は、本明細書において多成分核酸阻害因子(MNAi)複合体またはMNAi複合体といわれることもあるMNAi複合体などの不活性な複合体である。他の態様においては、MNA複合体は、組織化助長因子、およびパートザイム、またはそれらの成分を含むがこれらに限定されない、MNAzymeによる組織化および/または触媒作用に必要な成分の一つまたは複数を欠きうる不活性なMNA複合体である。別の態様においては、MNA複合体は、組織化阻害因子の存在下または非存在下でアプタ-MNAzymeのための成分を含む。
【０１３９】
本明細書において用いられる「核酸酵素として機能できる核酸複合体を形成させる工程」の言及は、酵素が基質を修飾できるような、基質と複合体化した核酸酵素の形成に必要な成分を提供する工程をいう。本明細書において用いられる「核酸酵素として機能する核酸複合体の形成を可能にする工程」および「核酸複合体が核酸酵素として機能することを可能にする工程」とは、酵素が基質を修飾できるような、基質と複合体化した核酸酵素の形成を成分が可能にする場合に起こる過程をいう。
【０１４０】
本明細書において用いられる「調節因子(modulator)」という用語は、MNA複合体の触媒活性を増大または低減できる実体である。調節因子は、MNAzymeの活性を活性化するまたは作動する「活性化因子」であることができる。いくつかの態様においては、調節因子は、「組織化阻害因子」または「活性阻害因子」を含むがこれらに限定されない、MNAzymeまたはMNAzyme複合体の活性をスイッチオフできるまたは阻害できる「阻害因子」である。
【０１４１】
本明細書において用いられる「組織化助長因子分子」、「組織化助長因子」、「MNAzyme組織化助長因子分子」、「助長因子」、および「MNAzyme組織化助長因子」という用語は、MNAzymeのセンサーアームとの相互作用により成分パートザイムの自己組織化を促進して触媒的に活性なMNAzymeを形成できる実体をいう。本明細書において用いられる場合、組織化助長因子は、切断活性、リガーゼ活性、または他の酵素活性を有するMNAzymeの組織化を促進することができる。「リガーゼ組織化助長因子」という用語は、リガーゼ活性を有するMNAzymeの組織化を促進する組織化助長因子をいう。リガーゼ活性を有するMNAzymeのための組織化助長因子は、上記の他の用語のいずれかによっていわれることもある。好ましい態様においては、組織化助長因子は、MNAzymeの自己組織化のために必要とされる。組織化助長因子は、一つの分子で構成されてもよく、または一つもしくは複数のオリゴヌクレオチド「パートザイム」のセンサーアームと対合できるもしくはそれに結合できる二つもしくはそれ以上の「組織化助長因子成分」で構成されてもよい。組織化助長因子部分は他の成分のなかに、例えば活性阻害因子分子のなかに含まれることができ、この場合、それらは、例えば、切断によりそれらの成分から遊離されるまで活性なMNAzymeの組織化に寄与できない状態にある。組織化助長因子は一つの分子(例えば図1、図2(ii))または複数の分子(例えば図2(i)、図4〜6)で構成されることができる。
【０１４２】
組織化助長因子は標的であることができる。標的はDNA、メチル化DNA、アルキル化DNA、RNA、メチル化RNA、ミクロRNA、siRNA、shRNA、tRNA、mRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、プレ-およびプリ-ミクロRNA、他の非コーディングRNA、リボソームRNA、それらの誘導体、アンプリコン、またはそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される核酸であることができる。核酸は増幅されてもよい。増幅はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、鎖置換増幅、ループ媒介等温増幅、ローリングサークル増幅、転写媒介増幅、自己持続配列複製、リガーゼ連鎖反応、核酸配列に基づく増幅、または逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)のうちの一つまたは複数を含むことができる。
【０１４３】
本明細書において用いられる「活性化因子」とは、MNAzymeの活性化を引き起こす、任意のMNA構造のもしくはMNA調節因子のオリゴヌクレオチド成分、任意の「リガンド」、「標的」、または「事象」である。活性化因子オリゴヌクレオチドは、組織化助長因子または組織化助長因子成分；置換因子オリゴヌクレオチド；パートザイムまたはそれらの成分、例えばセンサーアームまたは基質アームのトランケーションの有るもの、およびパートザイムスタビライザーアーム成分を含むが、これらに限定されることはない。
【０１４４】
他の態様においては、活性化因子は、阻害作用を及ぼすオリゴヌクレオチドを除去することによりMNAzymeを活性化することができる。そのような機構を通じて活性化できるオリゴヌクレオチドの例としては、「活性阻害因子」または「組織化阻害因子」を含むがこれらに限定されない、阻害成分またはその部分を置換(除去)できる調節因子オリゴヌクレオチドが挙げられる。
【０１４５】
本明細書において用いられる「標的」という用語は、さらなる増幅工程および/またはカスケードの有無にかかわらず、MNAzymeのような特定の核酸酵素を用いる方法により検出、同定、または定量化しようとする任意の天然のまたは合成による実体、構成要素、または分析物を含む。標的はそれゆえ、高感度の検出、同定および/または定量化の方法が望ましい検出可能な実体、構成要素、または分析物の最も広い範囲を包含する。いくつかの例示的な標的としては核酸、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、生物全体、細胞、ウイルス、細菌、古細菌、酵母、真菌、抗体、代謝産物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、小分子、重合体、金属イオン、金属塩、プリオン、またはそれらの任意の誘導体、部分もしくは組み合わせが挙げられるが、これらに限定されることはない。他の標的も本明細書での使用が企図される。標的は組織化助長因子または活性化因子でもありうることが理解されよう。
【０１４６】
本明細書において用いられる場合、「検出可能な事象」という用語は、MNAzymeもしくはMNAzyme複合体および/または不活性なMNA複合体、例えば、MNAi複合体もしくは組織化阻害因子の存在下でアプタ-MNAzymeのための成分を含む複合体の微小環境の変化を含む。この変化は、例えば、物理的操作、温度の変化、pH、塩濃度、電荷、磁荷の変化、一つもしくは複数の分析物、陰イオン、陽イオン、キレート剤の濃度の変化、またはMNAもしくは調節因子成分の濃度の変化、あるいはそれらの任意の組み合わせであることができる。「の濃度の変化」の言及は、濃度の増加または減少を含み、MNAzymeおよびアプタ-MNAzyme、MNAzyme複合体およびアプタ-MNAzyme複合体、ならびに/または不活性なMNA複合体を含む一つまたは複数のMNA複合体のための一つまたは複数の成分を含め、MNA複合体の微小環境において前にはなかったまたは検出不能な濃度であった、一つまたは複数のMNA複合体のための任意の成分、例えば組織化助長因子または組織化助長因子成分を含む、実体の出現も含むことも理解されよう。
【０１４７】
微小環境の変化を用いてMNA複合体の触媒活性を操作できるので、検出可能な事象を示す実体を、MNAzymeの触媒活性の「活性化因子」または「阻害因子」として用いることもできる。したがって、これらの実体は、例えば不活性なMNA複合体からの活性なMNAzymeへの移行、またはその逆を促進することにより、MNAzymeの触媒活性がスイッチ「オン」または「オフ」されることを可能にする。いくつかの態様においては、事象または実体はMNAzymeの組織化および活性化を促進する。いくつかの態様においては、事象または実体はMNAzymeの分解および不活性化を促進する。他の態様においては、事象または実体は不活性なMNA複合体の組織化または分解を指令することができる。好ましい態様においては、MNAzyme触媒活性の活性化および不活性化の過程は可逆的である。
【０１４８】
あるいは、多成分核酸複合体は、MNA複合体成分の分解または触媒的に活性なMNAzymeの形成に必要なそれらの分子の一部だけの組織化を促進しうる微小環境の組成に起因して不活性であってもよい。いくつかの態様においては、活性化因子の組織化助長因子成分は、不活性なMNA複合体および/またはMNAzymeの微小環境において起こる反応の産物である。
【０１４９】
「検出可能な作用」または「出力」シグナルは、基質の修飾が起きたという徴候として検出できるまたは定量化できる作用である。作用の大きさは組織化助長因子(例えば標的)のような入力の量を示すことができる。検出可能な作用は、蛍光分光法、表面プラズモン共鳴、質量分光法、NMR、電子スピン共鳴、偏光蛍光分光法、円二色性、イムノアッセイ、クロマトグラフィー、放射分析、測光法、シンチグラフィー、電子的方法、UV、可視光もしくは赤外分光法、酵素的方法、またはそれらの任意の組み合わせを含む、さまざまな方法によって検出することができる。
【０１５０】
「活性化因子」の組織化助長因子または組織化助長因子部分は、活性なMNAzymeの組織化を制御するためにまたは不活性な多成分核酸複合体からの活性なMNAzymeへの移行を促進するために使用できる分子である。該多成分核酸複合体はMNAi複合体におけるような、活性阻害因子の存在により触媒的に不活性であってもよい。
【０１５１】
「活性阻害因子」という用語は、MNA複合体の一つまたは複数の成分に結合でき、かつ触媒的に不活性な「MNAi」複合体の組織化を指令できる、任意の実体をいう(例えば図4、図5(iii)、図13)。活性阻害因子による触媒活性の阻害は、パートザイムに実質的に非相補的である「活性阻害因子成分」または「活性阻害因子ドメイン」とも呼ばれる「活性阻害因子部分」によって媒介される。好ましい態様において、活性阻害因子は、例えば、活性阻害因子ドメイン、組織化助長因子ドメイン、基質ドメイン、および/またはレポータードメインより選択される任意の組み合わせでの機能ドメインを含むがこれらに限定されない、いくつかの異なる機能ドメインを含むことができる。そのような異なる機能ドメインは、活性阻害因子中のいくつかの異なる構造ドメインと一致してもまたは一致しなくてもよい。したがって、いくつかの態様においては、活性阻害因子は、パートザイム成分に実質的に非相補的であり、かつ触媒的に活性なMNAzymeの形成に必要な二次構造を破壊することにより阻害作用を及ぼす、活性阻害因子ドメインを含んでもよい。活性阻害因子の存在により、基質と相互作用できるが、基質を触媒的に修飾できない不活性なMNAi複合体の組織化が推進される。いくつかの態様においては、活性阻害因子は組織化助長因子ドメインを含むことができる。
【０１５２】
いくつかの態様においては、活性阻害因子は不安定なまたは切断可能なリンカーまたは基質をさらに含むことができ、それらは活性阻害因子内の二つまたはそれ以上のドメインの間、例えば活性阻害因子ドメインと活性化因子の組織化助長因子ドメインとの間に位置することができる。基質またはリンカー部位での切断は活性化因子の組織化助長因子部分からの活性阻害因子部分の分離を可能にすることができ、その活性化因子の組織化助長因子部分がひいては組織化助長因子成分として機能し、活性なMNAzymeの組織化を指令することができる。
【０１５３】
いくつかの態様においては、活性阻害因子のようなMNA成分は他の実体に結合されていてもよい。いくつかの態様においては、この成分(例えば活性阻害因子)を高周波磁界とカップリングされた金ナノ粒子に結合して、ハイブリダイゼーションの遠隔電子制御を可能にすることができよう。このアプローチでは、高周波磁界は、周囲の分子が比較的影響を受けないようにしながら、特異的オリゴヌクレオチドの可逆的な熱変性を可能にするアンテナとして機能する。いくつかの態様においては、この成分(例えば活性阻害因子)をビオチンで標識化して、成分の捕捉および物理的単離を助長することができよう。
【０１５４】
本明細書において用いられる場合、「組織化阻害因子」は、活性なMNAzymeまたはMNAzyme複合体の必須成分への相補的結合により、例えばパートザイム成分または組織化助長因子または基質への結合により、MNAzymeまたはMNAzyme複合体の組織化を阻害する成分である。少なくとも第一のMNAzymeまたはMNAzyme複合体成分への組織化阻害因子配列の結合は、第二のMNAzymeまたはMNAzyme複合体成分への結合をめぐる組織化阻害因子と該第一の成分との間の競合を引き起こす。例えば、組織化阻害因子はパートザイム基質アーム(基質に結合する)またはパートザイムセンサーアーム(組織化助長因子に結合する)のどちらかに結合することができる。組織化阻害因子が基質アームに相補的である(かつ結合される)場合、組織化阻害因子はパートザイムへの基質の結合を競合し(かつ遮断し) (図7)、ゆえにMNAzyme複合体の形成を遮断する。組織化阻害因子がセンサーアームに相補的である(かつ結合される)場合、組織化阻害因子はパートザイムへの組織化助長因子の結合を競合し(かつ遮断し)、ゆえに活性なMNAzymeの形成を遮断する。このように、組織化阻害因子はMNAzymeおよび/またはMNAzyme複合体の組織化を遮断する。組織化阻害因子分子を用いて、MNAzymeおよびMNAzyme複合体の組織化を制御することができ、非核酸分析物と核酸分析物の両方の検出のための戦略の開発をさらに可能にすることができる。
【０１５５】
本明細書において用いられる「基質」および「基質分子」という用語は、核酸酵素を含む酵素によって認識されうる、作用を受けうる、または修飾されうる任意の分子を含む。基質の修飾は、MNA系の活性をモニタリングするための「出力」シグナルをもたらす。特定の態様においては、一つまたは複数の基質が酵素によって認識され修飾されることができる。特定の態様においては、一つまたは複数の基質が、触媒活性を有する核酸によって認識され修飾されることができる。好ましい態様においては、基質はMNAzymeによって認識され修飾されることができる。基質の修飾は、修飾反応の産物の出現もしくは増加によって、または反応において修飾された基質の消失もしくは減少によって測定することができる。基質の言及は、連結反応のような二つまたはそれ以上の基質を要する反応との関連で用いられる場合、二つまたはそれ以上の基質のうちの少なくとも一つをいってもよいことが理解されよう。
【０１５６】
基質は、切断または連結を含むがこれらに限定されない、さまざまな酵素活性により修飾されることができる。本明細書において用いられる場合、基質は、酵素的切断を受けやすい「切断可能な基質」、または酵素的連結を受けやすい「連結可能な基質」、もしくは「リガーゼ基質」を含むことができる。
【０１５７】
本明細書において用いられる「レポーター基質」は、触媒反応に関連した基質の消失または産物の出現のどちらかの測定を助長することに特に適合されている1つまたは複数の基質である。レポーター基質は、溶液中で遊離している場合もあり、または例えば、表面にもしくは別の分子に、結合(もしくは「係留」)されている場合もある。レポーター基質は、例えば、フルオロフォア(クエンチャーのような、一つもしくは複数のさらなる成分を伴うもしくは伴わない)、放射性標識、ビオチン(例えばビオチン化)または化学発光標識を含む、任意の多種多様な手段によって、標識することができる。
【０１５８】
本明細書において用いられる場合、「ジェネリック基質（generic substrate）」は、各々が異なる組織化助長因子を認識できる多数のMNAzymeによって認識され触媒的に作用される基質、例えばレポーター基質である。このような基質を使用することで、いずれもがユニバーサルなジェネリック基質を認識する構造的に関連したMNAzymeによる多種多様な組織化助長因子の検出、同定、または定量化のための別個のアッセイ法の開発が助長される。これらのジェネリック基質は、各々、一つまたは複数の標識で独立的に標識することができる。好ましい態様においては、独立的に検出可能な標識を用い一つまたは複数のジェネリック基質を標識して、MNAzymeにより種々の組織化助長因子を独立的にまたは同時に検出するための簡便な系の生成を可能にする。いくつかの態様においては、MNAzymeにより切断された基質は、MNAzymeまたはDNAzymeリガーゼを用いて再構成され、それゆえ再利用されることができよう。いくつかの態様においては、MNAzymeにより切断または連結された基質を、さらなるMNAzymeまたはDNAzymeの成分または調節因子としてさらに使用することができる。
【０１５９】
「産物」という用語は、基質の酵素修飾の結果として産生される新たな分子をいう。本明細書において用いられる場合、「切断産物」という用語は、酵素による切断活性またはエンドヌクレアーゼ活性の結果として産生される新たな分子をいう。「連結産物」という用語は、酵素による基質の連結の結果として産生される新たな分子をいう。
【０１６０】
本明細書において用いられる「MNAi」複合体という用語は、触媒活性が本明細書において定義の「活性阻害因子」により阻害されている、触媒的に不活性な状態にあるMNA複合体をいう。好ましい態様においては、MNAi複合体は、例えば、MNAi複合体の例示的な設計を示した図4に描かれているように、活性阻害因子オリゴヌクレオチドの結合によって触媒的に不活性であってもよい。MNAi複合体は、パートザイムA、パートザイムB、組織化助長因子、および活性阻害因子が会合して、基質に結合できるが基質を修飾できない不活性な複合体を形成する場合に形成されることができる。
【０１６１】
本明細書において用いられる場合、「アプタマー」は、一つまたは複数のリガンドを認識する能力を有する構造を含むことができる。例えば、この認識は、アプタマーの高次構造、例えば、3次元結合ドメインまたはポケットによって高度の特異性を有することができる。アプタマーはそれゆえ、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドもしくは核酸、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、細胞、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、抗体、代謝産物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、生物全体、小分子、重合体、金属イオン、金属塩、プリオン、またはそれらの任意の誘導体、部分もしくは組み合わせ、あるいは他の任意の実体に結合することができる。本明細書において好ましいアプタマーは、吸着、回収、および再増幅の反復過程により合成核酸の複合ライブラリーから単離できる短い一本鎖DNAまたはRNAオリゴマーを含むことができる。本明細書において他の好ましいアプタマーは、一つまたは複数のリガンドを認識する能力を持ったタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、もしくはフィロマー(phylomer)、またはそれらの組み合わせを含むことができる。アプタマーはそれゆえ、アミノ酸または抗生物質などの小分子からタンパク質および核酸構造にわたるほぼあらゆる標的に対して生成されることができる。アプタマーを用いて、組織化阻害因子を含有するMNA複合体への分子スイッチを構築することができる。活性化因子リガンドの存在によってMNAzyme活性をスイッチオンすることができ、活性化因子リガンドの除去によってMNAzymeの活性をスイッチオフすることができる。さらに、アプタマーを用いて、核酸および非核酸リガンドの検出を助長することができる。リガンドの検出をさらに用いて、増幅カスケードを誘発することができる。
【０１６２】
本明細書において用いられる場合、「カスケード」という用語は、各段階の発生が典型的には、前の段階の発生に依存する、連続段階で起こる任意の連続の過程または動作をいう。本明細書において用いられる場合、カスケードは、段階(または反応工程)が一方向で起こり、かつ各段階(または工程)の発生が前の段階または工程の発生に依存する、「直線カスケード」であることができる。本明細書において用いられる場合、「フィードバックカスケード」または「フィードバック増幅カスケード」という用語は、各段階の発生が典型的には、前の段階の発生に依存し、かつ前の段階の発生が典型的には、その後の段階で起こる過程または動作に依る、連続段階で起こる任意の連続の過程または動作をいう。フィードバックカスケードでは、前の任意の段階の産物がその後の任意の段階のための成分または基質として働くことができ、その後の任意の段階の産物が前の任意の段階のための成分または基質として働くことができよう。カスケードは活性阻害因子またはその成分の影響の除去によるMNAi複合体の活性化を伴うことができる。
【０１６３】
カスケードはそれゆえ、酵素カスケードまたは他の任意のシグナル伝達カスケードを含むことができるが、これらに限定されることはない。いくつかの態様においては、カスケードは、MNAzymeの触媒活性から生じるシグナルの増幅を含むことができる。いくつかの態様においては、カスケードは、切断活性を有するMNAzymeの触媒活性から生じるシグナルの増幅を含むことができる。いくつかの態様においては、カスケードは、リガーゼ活性を有するMNAzymeの触媒活性から生じるシグナルの増幅を含むことができる。いくつかの態様においては、カスケードは、リガーゼ活性を有するDNAzymeまたはMNAzymeおよび切断活性を有するDNAzymeまたはMNAzymeの触媒活性から生じるシグナルの増幅を含むことができる。好ましい態様においては、そのような増幅カスケードは、第一の核酸酵素の触媒活性が第二の核酸酵素による基質の修飾に必要な分子を生成し、これが今度は、一つまたは複数のさらなる核酸酵素による基質の修飾に必要な分子を生成しうる、シグナルの反復増幅およびそれゆえ周期増幅を伴うことができる。いくつかの態様においては、生成される必要な分子は、パートザイム、核酸酵素、例えばDNAzyme、組織化助長因子、組織化助長因子成分、基質、スタビライザーアーム、それらの成分もしくは部分、またはそれらの組み合わせを含むことができるが、これらに限定されることはない。いくつかの態様においては、カスケードはそれゆえ、累積的作用の生成を伴うことができ、かくして、検出できるレベルまでシグナルを発生させることにより少量の標的を検出することができる。他の態様においては、三つ以上の触媒段階を利用することができる。カスケードは直線的であることができる。好ましい態様においては、カスケードは指数関数的であることができる。好ましい態様においては、カスケードはフィードバック増幅カスケードであることができる。
【０１６４】
以下の略記が本明細書においておよび本明細書全体を通して用いられる。
MNA：多成分核酸；
MNA複合体：多成分核酸複合体；
MNAzyme：多成分核酸酵素；
MNAi：多成分核酸阻害因子；
DNAzyme：デオキシリボ核酸酵素；
PCR：ポリメラーゼ連鎖反応；
RT-PCR：逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応；
LNA：ロックト核酸；
PNA：ペプチド核酸；
An：分析物または標的；
F：フルオロフォア；
Q：クエンチャー；
FAMまたは6-FAM：6-カルボキシフルオレセイン
BHQ1：BlackHole Quencher 1
BHQ2：BlackHole Quencher 2
shRNA：低分子ヘアピンRNA
siRNA：低分子干渉RNA
mRNA：伝令RNA
tRNA：転移RNA
snoRNA：核小体低分子RNA
stRNA：低分子一過性RNA
smRNA：低分子調節性RNA
プレ-マイクロRNA：前駆体マイクロRNA
プリ-マイクロRNA：一次マイクロRNA
GTP：グアノシン5'-三リン酸
CTP：シトシン5'-三リン酸
dATP：デオキシアデノシン5'-三リン酸
ATP：アデノシン5'-三リン酸
LP：連結産物
CP：切断産物
オリゴ：オリゴヌクレオチド
【０１６５】
例示的な態様の詳細な説明
本明細書において提供される図面および実施例は、本発明およびそのさまざまな態様を例示するためであり、限定するためではないことが最初に理解されるべきである。
【０１６６】
本発明によれば、多成分核酸(MNA)複合体を利用する方法が提供される。MNA複合体は、リガーゼ活性または切断活性のような修飾活性を有する活性な酵素(MNAzyme)であることができる。さらに、本発明は、一つまたは複数のDNAzymeも含みうるカスケードに関する。本発明は同様に、標的のような組織化助長因子の同定、検出、および定量化のためにこれらのカスケードを用いる方法に関する。
【０１６７】
1. MNAzymeを含むMNA複合体および不活性なMNA複合体
多成分核酸酵素(Multi-component Nucleic Acid enzyme) (本明細書において「MNAzyme」ともいわれる)およびその阻害因子は、同時係属中の2006年10月6日付で出願された米国特許出願第11/544,926号および2007年4月5日付で出願された同第11/697,021号にならびに同時係属中の国際出願PCT/AU2006/001473およびPCT/AU2007/001517に詳細に記載されており、これらの内容は参照により本明細書に全て組み入れられる。MNAzymeは、本明細書においてパートザイムともいわれる二つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド成分から自己組織化することができる。パートザイムオリゴヌクレオチドはMNAzyme組織化助長因子の存在下で自己組織化してMNAzymeを形成する。MNAzymeはそれゆえ、触媒的に活性な核酸酵素である。いくつかの態様においては、MNAzymeの存在を検出することができ、MNAzymeは組織化助長因子を含む標的の存在下でのみ生じることから、その存在は標的の存在を示す。上記の基本原理に基づく多種多様なアッセイ法が本明細書において提供される。MNAzymeを形成できるオリゴヌクレオチド、およびさまざまな配列のMNAzymeを含む組成物も、本明細書において提供される。いくつかの態様においては、オリゴヌクレオチド成分、組織化助長因子、活性阻害因子、または基質のうちの少なくとも一つは、活性化因子または標的に結合できるアプタマーを含むことができる。
【０１６８】
本発明は核酸酵素および複合体のための新規の方法および適用について記載する。本発明は、分析物の検出において、一工程の形式においてまたは核酸酵素カスケード反応において有用でありうるリガーゼ活性を持ったMNAzymeを形成するために使用できるオリゴヌクレオチド成分を提供する。
【０１６９】
さらに、リガーゼ活性または他の触媒修飾活性を有するMNAzymeを用いて、新しい活性なMNAzymeもしくはMNAzyme複合体の形成を指令するか、または触媒活性を欠いた代替構造の組織化を促進するかできる新たな成分を生成することにより他のMNAzymeの活性を操作することができる。
【０１７０】
リガーゼ活性または他の触媒活性を有するMNAzymeは、新しいMNAzymeもしくはMNAzyme複合体成分(例えば組織化助長因子、パートザイム、基質、スタビライザーアーム)またはDNAzyme複合体成分(例えば活性なDNAzymeもしくはDNAzyme基質)のような核酸酵素または核酸酵素複合体のための新たな成分を生成することができる。
【０１７１】
あるいは、MNAzymeを用いて、MNAi複合体を含む、不活性なMNA複合体の形成を指令することもできる。MNAi複合体は、適切な条件の下では活性なMNAzymeに組織化されうるが、「活性阻害因子」とともに組織化される場合には触媒的に不活性である複合体の形成をもたらす、オリゴヌクレオチド成分を含む。そのような不活性なMNA複合体は本明細書において「MNAi」複合体と定義され、そのような不活性は活性阻害因子による阻害的影響の発揮から生じることができる。MNAi複合体はパートザイム成分の基質アームを介して基質と相互作用できるが、基質を触媒的に修飾できない。活性阻害因子は、付着された核酸、ナノ粒子、ミクロ粒子、タンパク質、抗体、RNA、DNA、核酸類似体、ビオチン基、糖タンパク質、リポタンパク質、ペプチド核酸、ロックト核酸、ペプチド-核酸キメラ、高周波部分、またはそれらの任意の組み合わせのような実体を含むことができるが、これらに限定されない、さらなる実体を組み入れて物理的手段による除去を助長することができる。MNAi複合体は「オフ」状態を示すが、MNAzymeへの移行によって「オン」状態を示す。
【０１７２】
本発明はMNAzymeリガーゼおよび活性なMNAzymeから不活性なMNAi複合体にスイッチするための機構としてのその使用について記載する(図13)。MNAzymeリガーゼを用い、活性阻害因子成分を組織化助長因子成分に連結して、活性阻害因子を生成することができる。活性阻害因子が活性なMNAzyme中の組織化助長因子成分を結合および置換する場合に、複合体は不活性なMNAi複合体にスイッチされる。
【０１７３】
他のMNA複合体はMNAzymeの成分の一部または全部を含有するが、一部の必要な成分が活性なMNAzymeを形成するように会合されていないので、または微小環境がMNAzymeの触媒活性と不適合であるので、触媒的に活性ではない。触媒活性は、例えば、活性化因子成分、例えば組織化助長因子の存在を含むがこれに限定されない、特定の事象の発生、または温度、波長、圧力、塩、界面活性剤、陽イオンの濃度、もしくは他の任意のパラメータの変化を含むがこれらに限定されない、パラメータの変化によって活性化されることができる。いくつかの態様においては、微小環境に存在するMNAzymeのようなある核酸酵素の触媒活性は、組織化助長因子またはパートザイムを含むことができるが、これらに限定されない、新しい核酸酵素または核酸酵素複合体のための新たな活性化因子を生成することができる。
【０１７４】
好ましい態様においては、MNAzymeは一つまたは複数のDNAzymeおよび/またはリボザイムに基づく。修飾が核酸の切断、核酸の連結、核酸のリン酸化、核酸のキャッピング、アミノ酸のアデニル化、補因子合成、RNA重合、鋳型依存性の重合、RNA-タンパク質の結合、アルドール反応、アルコール酸化、アルデヒド還元、プリンおよびピリミジンヌクレオチド合成、アルキル化、アミド合成、尿素合成、ペプチド結合の形成、ペプチジル-RNA合成、アシル転移、アミノアシル化、炭酸加水分解、ホスホロチオエートアルキル化、ポルフィリンメタル化、炭素-炭素結合の形成、Pdナノ粒子の形成、ビフェニル異性化、エステル結合の形成、アミド結合の形成、DNA脱グリコシル化、チミン二量体光回復、ならびにホスホロアミダイト切断を含む群より選択されうる、少なくとも一つの基質の触媒修飾を行えるDNAzymeおよび/またはリボザイムが公知である。
【０１７５】
MNAzymeのためのより好ましいパートザイム成分は、特定のDNAzyme構造に基づく。切断活性を有するMNAzymeに現時点で好ましい構造は、10:23および8:17 DNAzymeを含め、切断を行うDNAzymeに基づく。リガーゼ活性を有するMNAzymeに現時点で好ましい構造は、「7Z81」および「7Z48」ならびに7Q10 DNAzymeのような、基質を連結して2'-5'結合を生成するDNAzymeリガーゼのほかに、9DB1リガーゼのような、基質を連結して3'-5'結合を生成するDNAzymeリガーゼに基づく。種々の態様においては、MNAzymeおよび不活性なMNA複合体は、リボヌクレオチド塩基およびデオキシリボヌクレオチド塩基の一方または両方を含む。より好ましい態様においては、MNAzymeおよび不活性なMNA複合体は、DNAzymeの構造に少なくとも部分的に基づく。他の好ましい態様においては、MNAzymeおよび不活性なMNA複合体は、少なくともいくつかのデオキシリボヌクレオチド塩基またはその類似体を含む。より好ましい態様においては、MNAzymeに組織化されるパートザイムの触媒コア部分は、一つまたは複数のデオキシリボヌクレオチド塩基またはその類似体を含む。より好ましい態様においては、一つまたは複数のデオキシリボヌクレオチド塩基またはその類似体は、MNAzymeによる基質の触媒作用に関与する。他の態様においては、触媒コア中の少なくとも一つのデオキシリボヌクレオチド塩基またはその類似体は、MNAzymeの触媒活性を改善する。他の態様においては、デオキシリボヌクレオチド塩基のない比較可能なMNAzymeのものに比べて、触媒作用が測定可能な速度で起こるにはMNAzymeの触媒コア中の少なくとも一つのデオキシリボヌクレオチド塩基またはその類似体に関して厳密な要件が存在する。
【０１７６】
本発明は、本明細書においてパートザイムともいわれる二つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド成分から自己組織化できるMNAzymeリガーゼを開示する。パートザイムオリゴヌクレオチドは少なくとも一つのMNAzymeリガーゼ組織化助長因子の存在下で自己組織化してMNAzymeリガーゼを形成する。MNAzymeリガーゼはそれゆえ、触媒的に活性な核酸リガーゼである。
【０１７７】
第一のパートザイムおよび第二のパートザイムを含むリガーゼ活性を持った例示的なMNAzymeが図10に描かれている。図10を参照して、第一のパートザイムおよび第二のパートザイムは、各々、組織化助長因子に(例えばワトソン・クリック塩基対合を通じて)結合する。MNAzymeリガーゼは、第一のパートザイムおよび第二のパートザイムのセンサーアーム(i)が組織化助長因子上で相互に隣接してハイブリダイズする場合に生じるのみである。MNAzymeの基質アーム(iii)が基質を結合し、その修飾(連結)は、第一のパートザイムおよび第二のパートザイムの触媒ドメイン(ii)の相互作用により形成されるMNAzymeリガーゼの触媒コアによって触媒される。二つの核酸基質の連結が図中に例示されている。
【０１７８】
いくつかの態様においては、リガーゼ活性を有するMNAzymeの存在を検出することができ、MNAzymeリガーゼは組織化助長因子を含む標的の存在下でのみ生じることから、その存在は標的の存在を示す。上記の基本原理に基づく多種多様なアッセイ法が本明細書において提供される。MNAzymeリガーゼを形成できるオリゴヌクレオチド、およびさまざまな配列のMNAzymeリガーゼを含む組成物も、本明細書において提供される。
【０１７９】
例えば、MNAzymeリガーゼ構造は、一つまたは複数のDNAzymeリガーゼに基づく。より好ましいのは、特定のDNAzymeリガーゼ構造に基づくMNAzymeリガーゼ構造である。現時点で好ましい構造は、7Q10、7Z81、7Z48、および9DB1 DNAzymeリガーゼを含むDNAzymeリガーゼに基づく。
【０１８０】
標的核酸のような組織化助長因子は、リガーゼ活性を有するMNAzymeを用いて検出することができる。一つのシナリオでは、標的核酸の提供は、リガーゼ活性を有するMNAzymeの形成をもたらす開始工程である。図12を参照して、開始標的核酸は組織化助長因子Bであり、組織化助長因子Aは、MNAzyme Aの組織化を推進するように含まれた合成分子でありうる。次にMNAzyme Aは、リガーゼ活性を有するMNAzyme Bにより標的の組織化助長因子Bを検出する反応に加えられうる、2'3'環状リン酸末端を持った5'連結可能な基質Bを反応のなかで生成するという唯一の目的を有する。このアプローチは、合成するのに費用のかかりうるおよび比較的不安定でありうる、2'3'環状リン酸のような特定の末端を持った基質を産生するための実用的な方法を提供することができよう。さらに図12を参照して、MNAzyme Aパートザイムおよび組織化助長因子Aは、連結可能な基質生成のための別々の予備反応のどちらでも切断活性の有るDNAzymeによって置換されるか、またはDNAzymeはリガーゼ活性を持ったMNAzymeと同じ反応混合物の中に存在するかできよう。実施例11では、MNAzymeおよびDNAzymeの組み合わせによる切断および連結を単一の反応混合物の中で行えることを実証する。
【０１８１】
本明細書において提供される場合、MNAzymeおよび不活性なMNA複合体は、当業者に周知の一つまたは複数の置換、例えば類似体、誘導体、修飾もしくは改変された塩基、リボヌクレオチド、糖もしくはリン酸骨格の改変、さまざまな欠失、挿入、置換、重複、もしくは他の修飾、またはこれらの任意の組み合わせを含有することができる。そのような修飾、置換、欠失、挿入などを、分子が触媒活性を保持するように、センサーアームおよび/もしくは基質アームにおいて、ならびに/または触媒コア部分において行うことができる。基質または組織化助長因子に結合するアームに対する置換および修飾は、十分に許容されうるものであり、実際、異なる基質/組織化助長因子に分子を合わせることを可能にする基礎となる。例えば、センサーアームの修飾によって異なる組織化助長因子に合わせることが可能になり、一方、基質アームの修飾によって異なる基質に合わせることが可能になるであろう。複数の基質(例えばジェネリック基質)の分析により、入力事象または実体(例えば組織化助長因子の提供)に応じて、複数の基質を修飾できる複数の活性なMNAzymeの組織化の存在を示すような複数の「検出可能な作用」または「出力」シグナルの同時モニタリングが可能になる。
【０１８２】
特定の好ましい態様においては、本発明は、デオキシリボヌクレオチドで構成される、または特定の修飾/置換などによりそのような分子から誘導される、触媒活性を持ったMNAzymeを想定する。一般に、分子全体を、例えば、リボヌクレオチドで置き換えることにより、その分子は不活性になる。何故ならその活性は特定の重要なデオキシリボヌクレオチドに依存しているからである。同じように、リボザイム中のいくつかのリボヌクレオチドをデオキシリボヌクレオチドで置換することもできるが、分子全体を、例えば、デオキシリボヌクレオチドで置き換えることにより、その分子は不活性になる。
【０１８３】
切断活性、連結活性、または他の酵素活性を有するMNAzyme、および不活性なMNA複合体が、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれか、あるいはその両方を含むことを当業者は理解するであろう。少なくとも一つのおよびより好ましくは全ての、デオキシリボヌクレオチド成分オリゴヌクレオチドを含むMNAzymeおよび不活性なMNA複合体が現時点で好ましい。同様に好ましいのはパートザイムの部分的触媒コアの少なくとも一つのなかに、少なくとも一つのデオキシリボヌクレオチド塩基またはその類似体を含むMNAzymeおよび不活性なMNA複合体である。さらにより好ましいのは、切断活性、連結活性、または他の酵素活性を有するMNAzymeの触媒活性にそのような塩基が必要とされる態様である。
【０１８４】
特定の態様においては、MNA複合体の少なくとも一つの成分は、ある条件の下でヘアピン構造を形成できる自己相補性の領域を含むことができる。一つの態様においては、自己相補性の領域はパートザイムセンサーアームの一方または両方に位置することができる。別の態様においては、自己相補性の領域はパートザイム基質アームの一方または両方に位置することができる。別の態様においては、自己相補性の領域は組織化助長因子、組織化阻害因子もしくは活性阻害因子成分、またはそれらの任意の組み合わせに存在することができる。他の態様においては、MNA複合体は、自己相補性の領域を含みうる基質に結合することができる。
【０１８５】
前記の局面のいずれかにおいて、少なくとも一つの基質の触媒修飾は、核酸の切断、核酸の連結、核酸のリン酸化、核酸のキャッピング、アミノ酸のアデニル化、補因子合成、RNA重合、鋳型依存性の重合、RNA-タンパク質の結合、アルドール反応、アルコール酸化、アルデヒド還元、プリンおよびピリミジンヌクレオチド合成、アルキル化、アミド合成、尿素合成、ペプチド結合の形成、ペプチジル-RNA合成、アシル転移、アミノアシル化、炭酸加水分解、ホスホロチオエートアルキル化、ポルフィリンメタル化、炭素-炭素結合の形成、Pdナノ粒子の形成、ビフェニル異性化、エステル結合の形成、アミド結合の形成、DNA脱グリコシル化、チミン二量体光回復、ならびにホスホロアミダイト切断からなる群より選択される。
【０１８６】
DNAで構成されるMNAzymeは、例えば安定性および使いやすさに関して、単分子または多部構成リボザイムよりも利点があることを当業者は同様に理解するであろう。いくつかの態様においては、MNAzymeは、標的としても基質としても機能する一つの分子を認識することしかできない単分子核酸酵素、例えばDNAzymeに比べて利点をもたらすことも理解されるべきである。さらに、触媒修飾、例えば切断はDNAzymeの標的/基質を破壊することもあり、したがって、標的はもう一ラウンドの認識に利用可能とされない。対照的に、単一のMNAzyme、例えば切断活性を有するMNAzymeは、少なくとも二つの分子、すなわち少なくとも一つの組織化助長因子および少なくとも一つの基質を認識することができる。したがって、組織化助長因子、例えば試料中に存在する標的核酸は、反応のなかで触媒的に修飾されず、MNAzymeによるさらなるラウンドの基質修飾に依然として利用可能である。さらに、二つの基質に作用できる単一のMNAzyme (例えばリガーゼ活性を有するMNAzyme)は、少なくとも三つの分子、すなわち少なくとも一つの組織化助長因子および少なくとも二つの基質を認識することができる。MNAzymeのこれらの特性によってそれらは、「入力」シグナルを「読み取り」できること、例えば組織化助長因子の存在を検出できること、および、例えば基質の酵素修飾を示す検出可能なシグナルの生成、または新たな入力シグナルとして有用でありうる新たな産物(例えば新たな組織化助長因子または成分)の生成により、「出力」シグナルを「書き込み」できることを成分に要求する系または過程に適応可能とされる。そのような過程はカスケード反応、論理ゲート、および他の過程を含む。MNAzymeはそれゆえ、例えば、入力シグナルを受け取り、適切な出力応答で応えるために、情報伝達の機構を提供することができよう。
【０１８７】
2. MNA複合体の組織化および分解を調節するための方法ならびにそれらの使用のための適用
MNAzymeの組織化および分解は、微小環境を変化させることにより制御することができる。そのような変化の例としては、温度、二価陽イオンのタイプおよび濃度、塩濃度、pH、添加物、ならびに活性なMNAzymeの組織化および/または活性に必須の重要な成分の有無を含むが、これらに限定されることはない。
【０１８８】
触媒的に活性なMNAzymeの組織化は温度依存的な形で調節することができる。一つの態様においては、触媒的に活性なMNAzymeの組織化はpH依存的な形で調節することができる。一つの態様においては、触媒的に活性なMNAzymeの組織化は二価陽イオンまたはキレート剤の有無に依存的な形で調節することができる。一つの態様においては、触媒的に活性なMNAzymeの組織化は塩依存的な形で調節することができる。一つの態様においては、触媒的に活性なMNAzymeの組織化はイオン濃度に依存的な形で調節することができる。
【０１８９】
組織化されたMNAzymeは「オン」状態を示すが、分解されたMNA複合体成分は「オフ」状態を示す。MNA複合体の組織化および分解は、温度によって制御することができる。「オン」状態は、MNAzymeまたはMNAzyme複合体の組織化にも触媒活性にも適合する範囲内の温度に温度をスイッチすることによって誘導することができる。逆に「オフ」状態は、MNAzymeまたはMNAzyme複合体の組織化および/または触媒活性のどちらかと適合する範囲外に温度をスイッチすることによって誘導することができる。MNA複合体の成分の融解温度は、限定された温度範囲内で組織化を可能とするだけであるように調整することができる。本発明のこの局面において特に有用であるオリゴヌクレオチドは、スタビライザーアーム成分、トランケートされたセンサーアームを有するパートザイム成分、ならびに組織化助長因子および/または調節因子オリゴヌクレオチドの成分を含むがこれらに制限されることはない。基本設計の成分(図1)がさらに小さな成分サブユニットまたは部分(図2)にさらに分けられたMNA複合体によって高い柔軟性が得られ、それらの配列を融解温度、配列組成、および他の成分オリゴヌクレオチドとの相補性、またはその欠如に関して調整することができる。図2を参照して、トランケートされるパートザイムアームは以下: パートザイムAセンサーアーム、パートザイムBセンサーアーム、パートザイムA基質アーム、パートザイムB基質アーム、またはそれらの任意の組み合わせのいずれかでありうることを当業者は理解するであろう。
【０１９０】
図6を参照して、活性なMNAzymeのさらに例示的な設計を示す。図6に例示の構造を有するMNAzyme複合体を用いて、切断以外の方法で基質を修飾することもでき、例えば、MNAzyme構造は基質を連結することもできる。
【０１９１】
温度に対するMNAzymeの感受性を利用して、温度センサーおよびレオスタットを構築することができる。温度が成分オリゴヌクレオチドの組織化(ハイブリダイゼーション)および/または触媒活性には高すぎるかまたは低すぎるかした場合、MNAzyme基質は修飾(例えば切断または連結)されないであろう。温度がMNAzyme活性に許容的であった場合、基質は修飾され、シグナルが発生されるであろう。MNAzyme活性に適合しない温度からMNAzyme活性に適合する温度への温度の上昇または低下は、MNAzymeによる基質修飾後に発生されるシグナルによって検出されるであろう。MNAzymeはかくして、温度変化を検出することができる装置を提供することができる。温度感知のためにMNAzymeを用いた簡単な装置の発明を、例えば、製薬産業、食品産業、および農産業を含め、多くの産業において適用できることを当業者は理解するであろう。
【０１９２】
他の態様においては、磁力は陽イオン濃度を調節することができ、それゆえMNAzyme活性をオンおよびオフに調節するためのスイッチとなることができる。正に帯電した陽イオンがいくつかのMNAzymeの触媒活性に必要とされる。あるいは磁力は、負に帯電したMNAオリゴヌクレオチド、例えばパートザイム、組織化助長因子、および基質またはそれらの成分を、正に帯電した陽イオン、例えばMg2+から物理的に分離することによりMNAzyme活性をオフにスイッチすることができよう。その後、MNAオリゴヌクレオチドおよび陽イオンを再び接触させることにより、MNAzymeを再びオンにスイッチすることができよう。
【０１９３】
いくつかの態様においては、活性な「オン」状態(MNAzyme)は、活性に適合する範囲内のpHを用いて誘導することができる。逆に「オフ」状態は、活性に適合する範囲外のpHを用いて誘導することができる。不安定な配列の加水分解を誘導し、かくしてMNAzymeおよび/または不活性なMNA複合体のための新たな成分を生成するか、または破壊するかのどちらかにより、MNA複合体の活性を制御するためにpHをさらに使用することもできる。
【０１９４】
MNA複合体のいずれかの成分の有無は、「オン」または「オフ」スイッチのどちらかとなることができる。例えば、オリゴヌクレオチド配列、融解温度、およびまたは濃度を変化させることで、さらに微調節を達成することができる。MNA複合体、例えば二部の組織化助長因子および/または二部のパートザイム成分(例えばトランケートされたセンサードメインおよびスタビライザーアームを有する)に組織化できる成分の設計範囲の広さから、ハイブリダイゼーション、ゆえにMNA複合体の組織化に適合する条件の調整(微調整)を可能とできる系に柔軟性が導入される。さらに、MNA複合体内の特定のオリゴヌクレオチドの結合のハイブリダイゼーション強度およびストリンジェンシーは、塩濃度、陽イオン濃度、温度、および添加物(例えばDMSO)の有無を含むがこれらに限定されない、多くの要因によって影響を受ける。したがって、ハイブリダイゼーションに影響を与える実体は、MNAzymeおよび/または不活性なMNA複合体の組織化および分解を制御するための手段を提供することができる。
【０１９５】
成分の物理的操作は、例えば、分子「フック」として付着された部分の物理的特性を利用することにより、および/またはオリゴヌクレオチドの固有の特性、例えば、負電荷もしくは配列相補性を利用することにより、達成することができる。別の態様においては、付着された部分は、例えばビオチン基を用いて、オリゴヌクレオチドが選択的に捕捉されることを可能にする。別の態様においては、その部分はハイブリダイゼーションの遠隔電子制御を助長するためにラジオ波磁場(radio-frequency magnetic field radio)を含有する。このアプローチは、MNA複合体内の特定のオリゴヌクレオチドの標的熱変性による成分分子の選択的除去を可能とし、かくして成分分子がそれ自体、活性化因子または阻害因子配列であるかどうかに応じて酵素活性の活性化または阻害を可能とするように設計されることができよう。例えば、活性阻害因子はMNAi複合体から選択的に変性され、活性なMNAzyme状態への移行を可能とすることができる。
【０１９６】
他の戦略を用いて、活性化因子または阻害因子分子の影響を除去し、したがって活性なMNAzymeおよびMNAi複合体などの不活性なMNA複合体の組織化または分解を促進することができよう。例えば、一本鎖末端での二つのオリゴヌクレオチド間のハイブリダイゼーションは、DNA分岐点移動および二本鎖核酸の領域の解きほぐしを引き起こすことができる。分岐点移動により核酸の二本鎖領域を解きほぐす過程は、核酸二重鎖の末端の位置にはない一本鎖領域の位置で開始されることもできる。例えば分岐点移動は、二つの二本鎖領域の間にある一本鎖領域の位置で開始されることができる。一つの態様においては、活性阻害因子は、分岐点移動により機能する置換因子オリゴヌクレオチドのような調節因子オリゴヌクレオチドによってMNAi複合体から除去されることができよう。別の態様においては、リガーゼ基質は、分岐点移動により機能する置換因子オリゴヌクレオチドのような調節因子オリゴヌクレオチドによってリガーゼ活性を有するMNAzyme複合体から除去されることができよう。
【０１９７】
他の態様においては、活性なMNAzymeもしくはMNAzyme複合体または不活性なMNA複合体のどちらかを本来構成しうるオリゴヌクレオチド成分よりも競合で勝るように、ゆえにオリゴヌクレオチド成分をスイッチ「オフ」またはシャットダウンするように、相補的オリゴヌクレオチドを用いることができる。このアプローチによって阻害される成分は、MNAzymeまたは不活性なMNA複合体のどちらかの活性化因子または阻害因子成分を含むことができる。
【０１９８】
リガーゼ活性を有する第二のMNAzyme (またはリガーゼ活性を有するDNAzyme)を用いて活性なMNAzymeの「オン状態」とMNAi複合体の「オフ状態」間でのMNA複合体のスイッチを助長するために別の例示的な戦略が設計される。図13を参照して、基質Aを修飾(例えば切断または連結)できうる活性なMNAzyme Aは、組織化助長因子成分1 (AFC 1)および組織化助長因子成分2 (AFC 2)の存在下で形成されうる。リガーゼ活性を持つ第二のMNAzyme Bが、組織化助長因子3 (AFC 3)の存在下で形成され、次いでAFC 2を活性阻害因子成分(AIC)と連結し、活性阻害因子(AI)の形成を引き起こしうる。このAIはMNAzyme Aのためのパートザイム成分に結合し、不活性であるMNAi A複合体の形成をもたらしうる。したがって、この例でのMNAzymeリガーゼはMNAzyme Aを不活性化するオフスイッチとして作動しうる。あるいは、DNAzymeリガーゼがMNAzyme B (MNAzymeリガーゼ)に置き換わり、MNAzyme Aを不活性化するオフスイッチとして作動しうる。不活性なMNAi複合体および触媒的に活性なMNAzymeは組織化成分の二つの代替的状態、すなわちそれぞれ「オフ」状態および「オン」状態を示しうる。単一の反応またはアッセイ法において単一のMNA複合体のまたは複数のMNA複合体の組織化または活性を調節するために、本明細書において提供される種々の方法を広く使用できることを当業者は認識するであろう。
【０１９９】
3. 分子スイッチとしての組成物の使用
本発明を生物学的「スイッチ」と同一視することができ、その適用が本明細書において企図されることを当業者は認識かつ理解するであろう。MNAzyme活性をスイッチオンおよびオフするための機構の例示的実例を、下記表2に記載する。
【０２００】
（表２）活性および不活性なMNA状態ならびに二つの状態間のスイッチのための機構
2010523088.tif 000007
【０２０１】
この関連で、多成分核酸複合体のいずれかの成分の有無は「活性化因子」または「オン」スイッチとなりえ、あるいはそれは阻害因子または「オフ」スイッチとなりえる。
【０２０２】
いくつかの態様においては、スタビライザーアームの存在または追加が「オン」スイッチとなりえる。一つの態様においては、例えば別のMNA複合体成分を含みうる例えば基質の切断による反応の間に、系のなかで新しいスタビライザーアームが生成されうる。他の態様においては、スタビライザーアームの非存在、修飾、または除去が「オフ」スイッチとなりえる。
【０２０３】
いくつかの態様においては、組織化助長因子またはその成分の存在が「オン」スイッチとなりえる。いくつかの態様においては、新しい組織化助長因子がMNA複合体成分のMNAzymeによる切断により、例えば、切断による修飾の前には活性阻害因子のような別のMNA複合体成分として働きうる基質を含むがこれに限定されない基質の切断により生成されうる。いくつかの態様においては、組織化助長因子が、配列内にコードされる特異的な「入力」シグナル系を与えうる。いくつかの態様においては、組織化助長因子が認識されまたは「読み取られ」うる。いくつかの態様においては、パートザイムセンサーアームは一つまたは複数の単一塩基だけが異なるものを含め組織化助長因子配列を「読み取る」ことができる。他の態様においては、組織化助長因子またはその成分の非存在または除去が「オフ」スイッチとなりえる。
【０２０４】
いくつかの態様においては、MNA複合体の成分が、反応環境に存在する成分の連結によって生成されうる。いくつかの態様においては、パートザイムがオリゴヌクレオチドの連結により生成され、それによって、例えば、活性なMNAzymeを形成するように会合できる新たなパートザイム成分をもたらす。いくつかの態様においては、組織化助長因子がオリゴヌクレオチドの連結により生成され、それによって、MNA複合体の組織化を助長できる新たな組織化助長因子成分をもたらす。いくつかの態様においては、基質または他の核酸酵素もしくはそれらの成分が、成分の連結により生成されうる。
【０２０５】
活性および不活性の状態間の移行は、分子スイッチを生成するための機構を与えることができ、これは活性および不活性な立体構造の間の交互入れ替えによって調節されうる。そのような分子スイッチは、例えば、核酸複製カスケードの制御に適用され、または自律的な治療用、診断用、および計算用の分子規模装置の調節に適用されうる。
【０２０６】
本発明は、一つまたは複数のMNAzyme組織化助長因子成分および一つまたは複数の組織化阻害因子分子の存在下で自己組織化して、触媒的に不活性なMNAi複合体を形成する自己組織性MNAi複合体のための成分を含む組成物を提供する。
【０２０７】
本発明の局面は図面を参照することによりさらによく理解されうる。図1は、組織化助長因子を用いてMNAzymeを組織化するための基本的方法の一例を描く。より具体的には、(i) センサーアーム部分、(ii) 基質アーム部分、および(iii) 触媒コア部分をそれぞれが含む、パートザイムAおよびパートザイムBを図1に示す。組織化助長因子の存在下で、パートザイムAおよびパートザイムBのセンサーアーム部分は組織化助長因子、例えばDNAまたはRNA標的配列の相補的部分にハイブリダイズし、その相補的部分と塩基対合しうる。このように組織化助長因子を接触させることによって、MNAzymeは自己組織化し、基質アームによって結合される基質を修飾できる触媒コアを形成する。好ましくは、MNAzymeの存在はその触媒活性の検出または測定を通じて検出される。組織化されたMNAzymeの基質アームは、基質アームおよび基質上の相補的配列の相互作用を通じて、基質、例えば図1に示されるレポーター基質を結合することができる。基質が基質アームにそのように結合されると、触媒コアは基質の修飾(例えば切断)を促進することができるようになり、その基質を直接的にまたは間接的に測定または検出することができる。MNAzymeはあるいは、種々の方法を用いて組織化(スイッチオン)され分解(スイッチオフ)されることもできる。
【０２０８】
パートザイムセンサーアーム、パートザイム基質アーム、組織化助長因子、および基質の一つまたは複数は、少なくとも二つの分子を含むことができる。一つの態様においては、例えばパートザイムセンサーアーム、パートザイム基質アーム、組織化助長因子、活性阻害因子、および基質を含むMNA複合体のための一つまたは複数の成分が少なくとも一つのアプタマーをさらに含むことができる。
【０２０９】
組織化助長因子は、MNA複合体の組織化を推進するために混合物に加えられる合成オリゴヌクレオチドを含むことができる。
【０２１０】
図2を参照して、活性なMNAzyme複合体のためのさらなる例示的な設計を示す。一つのMNAzyme複合体の例示的な構造がパネル(i)に描かれており、ここではMNAzymeの形成に複数の組織化助長因子成分が必要とされる。この設計では、組織化助長因子の一つの成分(F1)はパートザイムAおよびBの両方のセンサーアームの領域に相補的であるが、もう一つの組織化助長因子成分(F2)はパートザイムBのみ(図2(i)のように)、またはパートザイムAのみと相補性を有する。二つの組織化助長因子成分はともに、基質を修飾(例えば切断)できる活性なMNAzymeの組織化を指令する。パネル(ii)はMNAzyme複合体の例示的な設計を描いており、ここでは組織化助長因子の存在下での二部構成のパートザイムB成分とのパートザイムAの組織化によって、基質を修飾(例えば切断)できる活性なMNAzymeが生成される。この設計では、パートザイムBは、本明細書においてスタビライザーアーム成分(S)といわれる第二の成分が存在しない場合、安定なMNAzymeの組織化を可能とするには不十分な、トランケートされたセンサーアーム(T)を有する。しかしながら、パートザイムのトランケートされたセンサーアームが結合する箇所に隣接した位置においてスタビライザーアーム成分が組織化助長因子にハイブリダイズする場合、これによって活性なMNAzymeへの組織化が可能になる。
【０２１１】
組織化助長因子の存在下で、パートザイムAと、トランケートされたセンサーアームを有するパートザイムB成分と、スタビライザーアーム成分との組織化により形成される活性なMNAzymeは、「オン」状態を示す。パートザイム、パートザイムスタビライザーアーム成分、または組織化助長因子成分のいずれかの脱落、除去または修飾は、触媒的に活性な「オフ」状態をもたらすことができる。したがって、MNAzyme触媒活性は、各種のオリゴヌクレオチドの有無により、および/または触媒的に活性である、例えば安定なMNA複合体を形成するように他のオリゴヌクレオチド成分とハイブリダイズできるそのようなオリゴヌクレオチド成分の能力により、調節することができる。トランケートされるアームは、スタビライザーアーム成分を伴わなければ、反応条件下で安定なMNAzymeの組織化を可能とするには不十分であるように設計される。パートザイム、スタビライザーアーム成分、および組織化助長因子はかくして、MNAzyme活性のための「オン」スイッチとして機能することができる。
【０２１２】
図3に図示された反応はMNA複合体の二つの代替的状態を示す。活性なMNAzyme (反応(i))は「オン」状態を示す。パートザイムスタビライザーアーム成分(反応(ii))または組織化助長因子成分(反応(iii))のどちらかが除かれている反応は、「オフ」状態を示す不活性なMNA複合体である。したがって、MNAzyme触媒活性は各種のオリゴヌクレオチドの有無により、および/または機能的に活性である、例えば安定なMNAzymeを形成するように他のオリゴヌクレオチド成分とハイブリダイズできる、そのようなオリゴヌクレオチド成分の能力により、調節することができる。トランケートされるアームは、スタビライザーアーム成分を伴わなければ、反応条件下で安定なMNAzymeの組織化を可能とするには不十分であるように設計される。スタビライザーアームおよび組織化助長因子は、MNAzyme活性のための「オン」スイッチとして機能することができる。
【０２１３】
トランケートされるパートザイムアームは、以下: パートザイムAセンサーアーム、パートザイムBセンサーアーム(図2 (ii)および図3 (i)に図示されるように)、パートザイムA基質アームもしくはパートザイムB基質アームのいずれか、またはそれらの任意の組み合わせでありうることを当業者は理解するであろう。
【０２１４】
分子センサー、分子スイッチ、ならびに/または自己触媒的な自己複製カスケードおよび他の反復過程の調節因子もしくは伝播因子(propagators)の生成に向けた戦略においてMNAzymeを使用できることを当業者は認識するであろう。使用領域は医学的用途、獣医学的用途、農業用途、食品技術用途、撮像用途、および抗生物テロ用途を含むが、これらに限定されることはない。
【０２１５】
図4を参照して、MNAi複合体は、パートザイムAおよびBが組織化助長因子および活性阻害因子と複合体を形成する場合に形成される(左手側)。不活性なMNAi複合体は基質と相互作用できるが、基質を触媒的に修飾できない。いくつかの態様においては、活性阻害因子は不安定なまたは切断可能なリンカーをさらに含むことができ、それらは活性阻害因子内の二つまたはそれ以上のドメインを分離することができる。そのようなドメインは、例えば、(i) パートザイム成分に実質的に非相補的であり、かつ触媒的に活性なMNAzymeの形成に必要な二次構造を破壊することによって阻害作用を及ぼす阻害因子部分、および(ii) 阻害因子部分から分離されれば、さらなる組織化助長因子成分として機能し、活性なMNAzymeの組織化を指令しうる活性化因子部分を含むことができる。
【０２１６】
図4を参照して、活性なMNAzyme複合体(右手側)は、阻害因子分子を切断または二等分して、(i) 活性阻害因子部分と(ii) 活性化因子の組織化助長因子部分とを分離するなどの活性阻害因子の修飾の後に、MNAi複合体の成分から生じることができる。放出された活性化因子の組織化助長因子部分はその後、第二の組織化助長因子成分として機能することが可能であり、第二の組織化助長因子成分は第一の組織化助長因子成分と協調して、基質を触媒的に修飾できる活性なMNAzymeへのパートザイム成分AおよびBの組織化を指令することができる。
【０２１７】
逆に、活性なMNAzyme複合体(図4の右手側)は、活性阻害因子部分(i)を活性化因子の組織化助長因子部分(ii)に連結または接合し、従って活性阻害因子を生成することにより、不活性なMNAi複合体(図4の左手側)に変換することができる。
【０２１８】
不活性なMNAi複合体および触媒的に活性なMNAzymeは、組織化成分の二つの代替的状態、すなわちそれぞれ「オフ」状態および「オン」状態を示す。
【０２１９】
図13を参照して、リガーゼ活性を有する第二のMNAzymeを用い、活性なMNAzymeの「オン状態」からMNAi複合体の「オフ状態」にMNA複合体をスイッチするための例示的な戦略を記載する。基質Aを修飾(例えば切断または連結)できる活性なMNAzyme Aは、組織化助長因子成分1 (AFC 1)および組織化助長因子成分2 (AFC 2)の存在下で形成されうる。リガーゼ活性を持つ第二のMNAzyme Bが、組織化助長因子3 (AF 3)の存在下で生じ、次いでAFC 2を活性阻害因子成分(AIC)と連結し、活性阻害因子(AI)の形成を引き起こしうる。このAIはMNAzyme Aのためのパートザイム成分に結合し、不活性であるMNAi A複合体の形成をもたらしうる。したがって、この例でのMNAzymeリガーゼはMNAzyme Aを不活性化するオフスイッチとして作動しうる。不活性なMNAi複合体および触媒的に活性なMNAzymeは、組織化成分の二つの代替的状態、すなわちそれぞれ「オフ」状態および「オン」状態を示す。
【０２２０】
4. 不溶性および固体支持体を用いる方法
一般的に本方法は、多重化されるかされないかにかかわらず、溶液中で適用可能であり、または基質もしくはその部分を含めいずれかのMNA複合体成分の一つもしくは複数を付着できる不溶性支持体もしくは固体支持体と組み合わせられることも理解されるべきである。さらに、例えば切断活性および/またはリガーゼ活性のどちらかを有するDNAzymeを含め、MNAzymeカスケードに存在するさらなる酵素またはその成分を、不溶性支持体または固体支持体に付着することもできる。したがって、DNAzyme、パートザイム成分、基質、組織化阻害因子、組織化助長因子もしくは組織化助長因子成分、スタビライザー、および/または活性阻害因子もしくは組織化阻害因子のような阻害因子の少なくとも一つを、結合、付着、または係留することができる。さらに、パートザイム成分、基質、組織化阻害因子、組織化助長因子もしくは組織化助長因子成分、スタビライザーアーム、および/または活性阻害因子もしくは組織化阻害因子のような阻害因子のうち、少なくとも一つの部分を、結合、付着、または係留することもできる。
【０２２１】
本発明の態様は不溶性支持体を包含する。例として、不溶性支持体は別名アレイまたはマイクロアレイとして公知の「チップ」の形態であってよく、これは典型的には、チップにカップリングされた、係留された、または別の方法で付着された複数のオリゴヌクレオチドを含む。特定の態様においては、オリゴヌクレオチドは核酸を含む。
【０２２２】
特定の態様においては、複数のオリゴヌクレオチドは、基質、および/もしくはパートザイム、および/もしくは組織化助長因子、および/もしくは組織化阻害因子、および/もしくは活性阻害因子、ならびに/またはそれらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない、MNA複合体のための複数の成分またはそれらの部分を含むことができよう。特定の態様においては、複数のオリゴヌクレオチドは、MNA複合体のための複数の成分、またはそれらの部分を含む成分のいずれかのなかに含有されたおよび/またはそのいずれかに付着されたドメインに相補的である複数のオリゴヌクレオチドを含むことができよう。特定の態様においては、MNA複合体のための複数の成分またはそれらの部分は、基質、および/もしくはパートザイム、および/もしくは組織化助長因子、および/もしくは組織化阻害因子、および/もしくは活性阻害因子、ならびに/またはそれらの任意の組み合わせを含みうる二つ以上の機能ドメインを有するオリゴヌクレオチドを含むことができよう。
【０２２３】
複数のオリゴヌクレオチドを当技術分野において公知の任意の適当な方法により、例えば、ピペット、インクジェットプリント、コンタクトプリント、またはフォトリソグラフィーにより、固体支持体、例えばチップ、ビーズ、プレート、またはアレイ上に配置することができる。固体支持体は少なくとも一つの要素（element）で構成されることができ、各要素が少なくとも一つの核酸オリゴヌクレオチドを含む。この少なくとも一つの要素は、同じ配列の複数の核酸で構成されてもよい。固体支持体を構成する要素の数は任意数であってよく、複数の要素が一つの固体支持体上に配置される場合、それらの要素に、均一な距離もしくは可変的な距離、またはそれらの組み合わせで間隔をあけることができる。いくつかの態様においては、それらの要素をランダムに配置し、その後、各要素のそれぞれの位置を決めることができる。それらの要素のサイズおよび形状は、本発明の特定の用途に依存し、異なるサイズおよび形状の要素を組み合わせて一つの固体支持体にすることもできる。この固体支持体の表面は実質的に平面であってよく、または陥没部もしくは突起部などの特徴を有してもよく、それらの要素が、それらの陥没部または突起部に配置されてもよい。そのような陥没部は、要素を浸漬させる溶液の貯蔵器となることができ、またはそのような突起部は、要素の乾燥を助長することができる。例えば、要素を96ウェルプレートの各ウエルに配置することができる。いくつかの態様においては、固体支持体は、各々の要素を同定するために固有の識別子、例えば表示、無線周波タグ、集積装置、例えばマイクロプロセッサ、バーコード、または他のマーキングを含むことができる。これらの固有の識別子は、さらにはまたはあるいは、アレイ表面の陥没部または突起部を含むこともできる。さらに、これらの固有の識別子は、チップの正しい配向または同定のために提供することもできる。これらの固有の識別子は、データ取り込み装置により、または光学スキャナもしくは光学検出装置により直接読み取ることができる。
【０２２４】
5. 基質系
本発明によって同様に提供されるのは、異なる組織化助長因子を認識する新しいMNAzymeおよび不活性なMNA複合体を生成するために手軽な設計変更を可能とすることにより迅速な系の開発を可能とするジェネリックレポーター基質系である。本明細書において論じられるように、パートザイムの基質アーム部分および触媒コア部分は変わらないままであり、新しい組織化助長因子に必要な一つまたは複数のパートザイムのセンサーアーム部分のみが変わってよい。ジェネリックな基質配列が提供され、それゆえ同じ基質を種々の異なる用途のための系に組み入れることができる。さらに、基質が溶液中で遊離している、または支持体に係留もしくは付着されているようなアッセイ法を含め、本明細書の種々の態様における方法の中に同じ基質を組み入れることもできる。一連のジェネリック基質を多重反応のなかで使用し、複数の組織化助長因子の同時検出を可能にすることができる。
【０２２５】
場合によっては、エンドヌクレアーゼ活性または切断活性を有するMNAzymeまたはDNAzymeによって切断された基質は、DNAzymeリガーゼまたはMNAzymeリガーゼを用いて再構成され、ゆえに、再利用されてもよい。リガーゼ活性を有するDNAzymeまたはMNAzymeによって連結された基質は、切断活性を有するDNAzymeまたはMNAzymeの基質として再利用されることができる。但し、DNAzymeまたはMNAzyme切断因子がDNAzymeまたはMNAzymeリガーゼによる連結によって生成された結合を切断できることを条件とする。あるいは、切断活性を有するMNAzymeは、二つの連結可能な基質の接合部ではない連結産物内の位置で切断することもできる。但し、切断部位の要件がこの部位で満たされることを条件とする。
【０２２６】
以下でさらに詳細に記載するように、MNA複合体は、ユニバーサルまたはジェネリック基質を利用できる特定の態様において有利な特性を有する。そのような基質を、切断活性を有するMNAzymeの基質が、検出可能な部分もクエンチャー部分もともに含む、現時点で好ましい構成で図1に示す。このクエンチャー部分は、基質がMNAzymeによって切断されるまで、基質の検出可能な部分からの検出可能なシグナルを減らすまたは消すように適合される。例えば、このクエンチャー部分は「BlackHole Quencher 1」(BHQ1)または「BlackHole Quencher 2」(BHQ2)を含むことができる。
【０２２７】
したがって、MNAzymeは検出可能な部分とクエンチャー部分の間で基質を切断し、この二つの部分が溶液中で分離することを可能にし、それによってクエンチャー部分は検出可能な部分の局所環境から遠ざけられ、または効果的に除かれるので、検出可能なシグナルが出現または増大することができる。
【０２２８】
さらに、図10に示されるように、リガーゼ活性を有するMNAzymeの基質は、一つの基質が検出可能な部分を含み、一つの基質がクエンチャー部分を含むように設計することができる。クエンチャー部分は、基質が連結されて連結産物になり、かくして検出可能な部分およびクエンチャー部分が接近する場合に、検出可能な部分からの検出可能なシグナルを減らすまたは消すように適合される。例えば、このクエンチャー部分は「BlackHole Quencher 1」(BHQ1)または「BlackHole Quencher 2」(BHQ2)を含むことができる。さらに、リガーゼ活性を有するMNAzymeまたはリガーゼ活性を有するDNAzymeのどちらかが基質を連結し、一方の基質の検出可能な部分をもう一方の基質のクエンチャー部分と接近させ、それにより検出可能なシグナルを低減させることができる。
【０２２９】
別の例では、5'連結基質および3'連結基質がそれぞれフルオロフォアまたはクエンチャー色素(またはその逆)のどちらかで各々標識される場合、連結は蛍光の減少をもたらし、これが標識分析物の存在の指標となりうる。
【０２３０】
代替的な形式では、例えば、5'連結基質が検出可能な部分、例えばフルオロフォアで標識され、3'連結基質が、例えばチップまたはビーズのような固体支持体上の別個の位置に付着される場合、連結は標識分析物の存在下でその別個の位置でのシグナルの出現をもたらしうる。
【０２３１】
ジェネリックまたはユニバーサル基質の使用は、MNAzymeの成分パートザイムの設計によって可能とされる。パートザイムのセンサーアームのみを改変することにより、しかし基質アームは変えずに残すことにより、複数の組織化助長因子の各々に特異的な多種多様のMNAzymeまたは不活性なMNA複合体を設計することが可能であり、それらは全てユニバーサルなジェネリック基質を利用して出力シグナルを生成する。各入力事象または実体に応答するのにカスタマイズされたまたは特異な基質の必要がなくなるという点で、このことがもたらす利点を当業者は理解するであろう。各新たな組織化助長因子の検出には一つまたは複数のセンサーアーム部分の一つまたは複数の変化しか必要とされず、その上、基質アーム部分および触媒コア部分は一定のままとすることができる。したがって、MNAzyme切断因子のための単一の基質(例えばレポーター基質)、またはMNAzymeリガーゼのための検出可能な一対の基質を、MNAzymeによる単一の組織化助長因子もしくは他の入力事象の検出に、および/または改変されたMNAzymeによる一連の系での複数の組織化助長因子の検出に使用することができる。複数の切断可能なジェネリックレポーター基質、または連結可能なジェネリック基質の対によって、一つの系内での複数のMNAzymeの多重化モニタリングが可能とされる。
【０２３２】
場合によっては、異なるセンサーアームと共通の少なくとも一つの基質アームとを有する異なるMNAzymeを混合物の中に含むことが有用でありうる。例えば図16に図示されたフィードバックカスケードを参照して、MNAzyme切断因子3は、MNAzyme切断因子1とは異なるセンサーアームを持ちうるが、リガーゼによって後に連結される基質1上の配列の部分(ここでは、基質の5'部分)と相互作用するMNAzyme切断因子1のパートザイムの一つの基質アームの配列と同じである一つの基質アーム(パートザイムのうちの一つの)を有することができる。それゆえ、MNAzyme切断因子3は、基質1を切断する代わりに、切断可能な基質1に対して同じ配列を5'部分に有するが、異なる部分を3'末端に有する(またはその逆の)別の基質(基質3といわれる)を切断しうる。基質3の切断部位は、切断可能な基質1と3の間で共有される配列および異なる配列の接合部にありうる。この場合、MNAzyme切断因子3が、MNAzyme切断因子2による切断により生成された組織化助長因子成分の存在下で組織化される際、およびMNAzyme切断因子3が基質3を切断する場合、MNAzyme切断因子3の5'切断産物は、DNAzymeリガーゼ(または組織化されたMNAzymeリガーゼ)の5'基質ともなり、フィードバック増幅カスケード反応が開始されうる。
【０２３３】
さらに、基質は、標識された核酸、ナノ粒子、ミクロ粒子、タンパク質、抗体、RNA、DNA、核酸類似体、ビオチン基、糖タンパク質、リポタンパク質、ペプチド核酸、ロックト核酸、ペプチド-核酸キメラ、高周波磁界の部分、またはそれらの任意の組み合わせのようなさらなる実体を組み入れることもできる。
【０２３４】
基質はMNAzymeによって修飾され、それにより「検出可能な作用」または「出力」シグナルを与えることができる。検出過程において、MNAzymeによる基質修飾は、例えば、核酸の切断、核酸の連結、核酸のリン酸化、核酸のキャッピング、アミノ酸のアデニル化、補因子合成、RNA重合、鋳型依存性の重合、RNA-タンパク質の結合、アルドール反応、アルコール酸化、アルデヒド還元、プリンおよびピリミジンヌクレオチド合成、アルキル化、アミド合成、尿素合成、ペプチド結合の形成、ペプチジル-RNA合成、アシル転移、アミノアシル化、炭酸加水分解、ホスホロチオエートアルキル化、ポルフィリンメタル化、炭素-炭素結合の形成、Pdナノ粒子の形成、ビフェニル異性化、エステル結合の形成、アミド結合の形成、DNA脱グリコシル化、チミン二量体光回復、またはホスホロアミダイト切断を伴うことができる。
【０２３５】
MNAzymeによる基質修飾の結果として、検出可能な作用が生成されることができ、作用の大きさはそれゆえ入力シグナルの量を示すことができる。検出可能な作用は、蛍光分光法、表面プラズモン共鳴、質量分光法、NMR、電子スピン共鳴、偏光蛍光分光法、円二色性、イムノアッセイ、クロマトグラフィー、放射分析、測光法、シンチグラフィー、電子的方法、UV、可視光もしくは赤外分光法、酵素的方法、またはそれらの任意の組み合わせを含む、さまざまな方法によって検出することができる。
【０２３６】
本方法は、出力シグナルまたは検出可能な作用の大きさを定量化する工程をさらに含むことができる。一つの態様において、本方法は、定量化された出力シグナルから入力事象の大きさを決定する工程をさらに含むことができる。
【０２３７】
例えば検出可能な作用または出力シグナルの存在の決定による、触媒活性の決定は、触媒活性を定量化可能にする形で行うことができる。一つの態様において、検出可能な事象の大きさは定量化された触媒活性から決定することができる。
【０２３８】
いくつかのグループが、比色分析の読み出しによる核酸標的および他の分析物の検出を報告している(Elghanian et al., 1997, Mirkin et al, 1996、およびLiu and Lu, 2004)。この戦略では、金ナノ粒子の表面に付着された別個のDNAオリゴヌクレオチド配列を各々が有する、金ナノ粒子のバッチの調製を伴う。その後、金粒子に付着されている配列と相補性を有する「架橋オリゴヌクレオチド」の添加により、金粒子を凝集させることができる。粒子凝集は赤色から青色への色の同時変化をもたらす(Mirkin et al, 1996)。架橋オリゴヌクレオチドのなかにDNAzyme基質配列を含めることで、金粒子の凝集を逆転させる機構を与えることができる(Liu and Lu, 2004)。鉛の添加による鉛依存性のDNAzymeの活性化は、架橋オリゴヌクレオチドの切断、金粒子の解離、および青色から赤色への色の変化を引き起こした。
【０２３９】
変化をモニタリングするための簡単な検出器を、この原理、およびエンドヌクレアーゼ活性またはリガーゼ活性を有するMNAzymeを用いて開発することができる。温度または他の実体もしくは事象の変化によってMNAzymeを活性化することができ、このMNAzymeは架橋オリゴヌクレオチドを修飾し、ナノ粒子の解離(切断因子の場合)または結合(リガーゼの場合)および色の変化を引き起こすことができた。
【０２４０】
6. 方法の最適化
本明細書において記載する方法が、さまざまな実験パラメータを用いて最適化されうることを、当業者は容易に理解するであろう。最適化される特定の実験パラメータおよびそのような最適化のレベルは、利用される特定の方法および/または検出される特定の事象に依るであろう。そのようなパラメータは、時間；温度；塩、界面活性剤、陽イオン、およびジメチルスルホキシド(DMSO)を含むがこれに限定されない他の試薬の濃度；ならびに核酸の長さ、相補性、GC含量、および融点(Tm)；を含むが、これらに限定されることはない。そのような方法を行うことができる温度は、約20℃から約96℃、約20℃から約75℃、20℃から約60℃、または約20℃から約55℃の範囲内でありうる。温度は一定であってよく、またはMNA複合体の組織化および/もしくはMNAzymeの触媒活性に適合するある温度と、MNA複合体の組織化および/もしくはMNAzymeの触媒活性に適合しないある温度との間で循環されてもよい。
【０２４１】
さらにはまたは代替として、パラメータの変化および/または微小環境を用いて、不活性状態から活性状態へのMNA複合体の活性化を誘発することができる。このように、微小環境のパラメータは、温度；波長；塩、界面活性剤、陽イオンの濃度；ならびに組織化助長因子または組織化助長因子成分、パートザイムまたはパートザイム成分、基質、組織化阻害因子、活性阻害因子、および活性化因子オリゴヌクレオチド成分を含むがこれらに限定されない構造成分および調節因子成分の濃度；の変化のような事象を含むがこれに限定されない、本明細書において定義の「活性化因子」を含むことができる。したがって、カスケード反応または分子スイッチの要素としてのMNA複合体の使用を達成するために、パラメータおよび/または微小環境のそのような最適化を試みることができる。
【０２４２】
一つの好ましい態様において、MNA複合体を使用する方法を実践するために最適化された反応を、本明細書において提供する。そのような最適化された反応において、場合によっては、カスケード中の一つまたは複数の核酸酵素によるものでありうる触媒活性の活性化は、最適化されていない反応の10、20、または30%を超えるまでに増大される。さらに好ましい反応条件は触媒活性を少なくとも35%または40%、および好ましくは50%またはそれ以上にまで向上させる。さらにいっそう好ましい態様において、最適化された反応は50%より多くの、および66%までの、75%までの、または100%までもの触媒活性の活性化の増大を有する。さらにいっそう好ましい態様において、完全に最適化された反応方法は、触媒活性の活性化の100%、200%、もしくはさらに300%、またはそれ以上の増大をもたらすであろう。他の好ましい反応条件は、最適化されていない反応条件で実践される方法よりも1000%またはそれ以上までに触媒活性の活性化を向上させることができる。本明細書において提供される方法を最適化するために非常に好ましい反応条件は、特定の二価陽イオンを含めることである。ほとんどの核酸酵素の触媒活性は、二価陽イオンの濃度によって濃度依存的に影響を受けうる。好ましい最適化反応は、Ba2+、Sr2+、Mg2+、Ca2+、Ni2+、Co2+、Mn2+、Zn2+、およびPb2+のうちの一つまたは複数について最適化される。
【０２４３】
7. アプタマーを用いる方法
図7を参照して、アプタ-MNAzymeの活性をスイッチ「オン」または「オフ」するために活性化因子リガンドを使用できる方法を図解する。この方法では図に示すように、活性化因子の非存在下でアプタ-MNAzymeの活性を遮断する組織化阻害因子を用いる。これらの方法では、一つまたは複数のリガンドを認識する能力を有する核酸、タンパク質、ポリペプチド、フィロマー(phylomer)、ペプチド、またはそれらの組み合わせを含みうるアプタマーを用いる。アプタマーは、例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドもしくは核酸、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、細胞、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、抗体、代謝産物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、生物全体、小分子、重合体、金属イオン、金属塩、プリオン、またはそれらの任意の誘導体、部分もしくは組み合わせ、あるいは他の任意の実体に結合することができる(Lee et al., 2004)。
【０２４４】
本明細書において好ましいアプタマーは、吸着、回収、および再増幅の反復過程により合成核酸の複合ライブラリーから単離できる短い一本鎖DNAまたはRNAオリゴマーを含むことができる。他の好ましいアプタマーは、一つまたは複数のリガンドを認識する能力を持ったタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、もしくはフィロマー(phylomer)、またはそれらの組み合わせを含むことができる。アミノ酸または抗生物質などの小分子からタンパク質および核酸構造にわたる、ほぼあらゆる標的を認識し結合しうるアプタマーを、生成することができる。好ましい態様においては、アプタマーは、例えば、好ましくは進化・選択技術により生成される核酸結合分子を含む。好ましくは、アプタマーは、例えば、上記表1のようにヌクレオチド類似体を含むがこれらに限定されない、DNAもしくはRNA分子、またはその両方の組み合わせを含むことができる。
【０２４５】
MNA複合体の少なくとも一つの成分は、核酸、ポリペプチド、ペプチド、生物全体、タンパク質、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、細胞、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、抗体、代謝産物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、小分子、重合体、金属イオン、金属塩、プリオン、またはそれらの任意の誘導体、部分もしくは組み合わせ、あるいは他の任意の実体を含む群より選択されるリガンドに結合する少なくとも一つのアプタマーまたはその部分を含むことができる。
【０２４６】
例えば、切断活性またはリガーゼ活性のどちらかを有するアプタ-MNAzymeは、一つまたは複数のアプタマーを組み入れることができる。アプタ-MNAzymeの組織化はそれゆえ、アプタマーに結合する一つまたは複数の分析物の有無により指令され、組織化阻害因子の解離を引き起こすことができる。
【０２４７】
一つまたは複数のアプタマーを、組織化助長因子分子およびまたは活性阻害因子のどちらかの末端に組み入れられることを、当業者は理解するであろう。さらに、複数のアプタマーをパートザイムオリゴヌクレオチド成分の一つまたは複数に組み入れられることも理解されよう。さらに、アプタマーをパートザイムオリゴヌクレオチド成分の少なくとも一つに組み入れられることも理解されよう。図7に図示されている戦略における組織化助長因子は、DNA、RNA、LNA、PNA、または一つもしくは複数のヌクレオチド塩基類似体を含有する配列を含むことができる。二つの分子、例えば、組織化助長因子として作用する一つの標的核酸と、アプタマーに結合する一つのリガンドとを認識することが可能でありうることを当業者は理解するであろう。
【０２４８】
図7に示される戦略において、アプタマー配列は、活性化因子の存在下でのみ活性なアプタ-MNAzymeが形成される配置で、パートザイム(アプタ-パートザイム)の末端に組み入れられる。
【０２４９】
パートザイム、組織化助長因子、活性阻害因子、または基質を含むオリゴヌクレオチド成分のいずれかに、一つまたは複数のアプタマーを組み入れられることも当業者は理解するであろう。さらに、アプタマーをこれらのオリゴヌクレオチドのいずれか一つのどちらかの末端に組み入れることもできる。
【０２５０】
図7に図示される戦略は、(i) リガンドを活性化因子分子として用いてアプタ-MNAzyme活性を制御する方法を提供するため、ならびに/または(ii) アプタ-MNAzymeを用いた非核酸および核酸標的の検出の方法を提供するために、使用することができる。さらに、アプタ-MNAzymeは、さまざまな範囲のリガンド標的を検出するために設計されたカスケード反応における第一の核酸酵素であることもできる。アプタ-MNAzyme検出戦略のための一つのスキーマに必要な核酸オリゴヌクレオチドは、以下を含む：
(a) パートザイム；
(b) 末端の一方にアプタマーが組み入れられたパートザイムであるアプタ-パートザイム；
(c) アプタ-パートザイムとパートザイムの両方に結合して活性なMNAzymeの組織化を可能にするオリゴヌクレオチドである組織化助長因子；
(d) 基質、例えばレポーター基質；ならびに
(e) 少なくともアプタマー配列の一部分とアプタ-パートザイム配列の基質結合アームの一部分とにわたる領域で、アプタ-パートザイムにハイブリダイズする組織化阻害因子オリゴヌクレオチド。
【０２５１】
活性化因子リガンドが存在しない場合には(図7；左手側パネル)、組織化阻害因子オリゴヌクレオチドがアプタ-パートザイムに結合し、かくして、レポーター基質の結合と競合し、レポーター基質の結合を遮断する。活性化因子リガンドが存在する場合(図7；右手側パネル)、これがアプタ-パートザイムのアプタマー配列に結合し、組織化阻害因子オリゴヌクレオチドの結合を遮断し、かくして活性なアプタ-MNAzyme複合体の組織化およびその後の基質の修飾、例えば基質の切断(図7に示されるように)または基質の連結を可能にする。したがって、活性なアプタ-MNAzyme複合体は、アプタ-パートザイムのアプタマー部分に結合できる活性化因子またはリガンドの存在下でのみ生じ、蛍光シグナルの発生を引き起こせる。
【０２５２】
図7に図解されるアプタ-MNAzymeのスキーマのさらなる態様においては、この系を用いて核酸および非核酸分子の組み合わせを同時に検出することができる。例として、アプタ-MNAzymeを用いて、(i) 組織化助長因子として機能し、アプタ-MNA複合体の形成を指令する核酸標的、ならびに(ii) 組織化阻害因子オリゴヌクレオチドに置き換わり、活性なアプタ-MNAzyme複合体の組織化およびその後の基質修飾を可能にしうる標的活性化因子リガンド(例えばタンパク質または小分子)の存在を検出することができる。
【０２５３】
リガーゼ活性を有するアプタ-MNAzymeを用いる別の戦略では、少なくとも二つの連結可能な基質が反応中に存在することができ、その一方をフルオロフォアで標識することができ、そのもう一方をクエンチャーで標識することができる。活性化因子リガンドが存在する場合、これはアプタ-パートザイムのアプタマー配列に結合し、組織化阻害因子オリゴヌクレオチドの結合を遮断し、かくして、基質の結合および連結を可能にしうる。したがって、アプタ-MNAzyme複合体は、アプタマーに結合できる活性化因子の存在下でのみ生じ、蛍光シグナルの減少を引き起こせる。
【０２５４】
いくつかの態様においては、MNAzyme活性の調節は、核酸または非核酸の標的活性化因子リガンドのどちらかをスイッチ機構として用いて達成することができる。他の態様において、活性を調節するために他の手段によって組織化阻害因子分子を操作する。例えば、組織化阻害因子を、選択的熱変性を含むいくつかの戦略または分岐点移動を用いてMNA複合体のオリゴヌクレオチド成分に置き換わる結合オリゴヌクレオチドおよび/もしくは置換因子オリゴヌクレオチドに競合するオリゴヌクレオチドを用いる方法によって除去することができる。
【０２５５】
修飾活性、例えば、切断活性または連結活性を有するアプタ-MNAzymeのためのアプタマー配列を、パートザイムAもしくはパートザイムBのどちらかまたはその両方に付加できることを当業者は理解するであろう。上記のスキーマにおいて、組織化阻害因子オリゴヌクレオチドは、パートザイムの少なくとも一つの基質アームおよびアプタマーの部分に結合した。
【０２５６】
アプタ-MNAzymeのためのアプタマー配列を、パートザイムAもしくはパートザイムBのどちらかの少なくとも一方またはその両方のセンサーアームに付加できることも当業者は理解するであろう。この態様においては、組織化阻害因子オリゴヌクレオチドは、アプタマーおよびセンサーアームの部分に結合しうる。活性化因子リガンドが存在しない場合、組織化阻害因子オリゴヌクレオチドは、アプタ-パートザイムに結合し、かくして、組織化助長因子または組織化助長因子成分の結合と競合し、それらの結合を遮断する。活性化因子リガンドが存在した場合、これはアプタ-パートザイムのアプタマー配列に結合し、組織化阻害因子オリゴヌクレオチドの結合を遮断し、かくして、組織化助長因子または組織化助長因子成分の結合を可能にし、基質を修飾、例えば切断または連結できる活性なアプタ-MNAzymeの組織化を指令しうる。したがって、アプタ-MNAzymeはアプタマーに結合できる活性化因子の存在下でのみ生じ、蛍光シグナルの変化、例えば蛍光の増加または減少を引き起こせる。
【０２５７】
図7に図解されるようにアプタ-MNAzymeが切断活性を有するなら、修飾は、例えば、フルオロフォア/クエンチャー色素対の分離を結果的にもたらす二重標識されたレポーター基質の切断によって、蛍光の増大を引き起こすことができる。
【０２５８】
アプタ-MNAzymeによって行われる修飾は、切断以外の修飾、例えば、二つの基質の連結であってよいことが理解されよう。この場合、シグナル変化は、例えば、フルオロフォア/クエンチャー色素対のフルオロフォアまたはクエンチャーのどちらかで各々が標識された二つの連結可能な基質の、連結後の蛍光の減少でありうる。
【０２５９】
このアプタ-MNAzymeのアプローチを用いて、標的検出方法またはMNA複合体の触媒活性を切り替えできる分子スイッチを開発することもできよう。さらに、アプタ-MNAzymeのアプローチは、直線的な核酸酵素カスケードまたはフィードバック核酸酵素増幅カスケードにおいて第一の工程を含むことができる。アプタ-MNAzymeを、組織化助長因子などの核酸標的と、アプタマーに結合できるものなどの非核酸標的リガンドの両方の同時検出に適用することもできよう。
【０２６０】
8. カスケード
カスケードは、各段階の発生が典型的には、前の段階の発生に依存する、連続段階で起こる任意の連続の過程または動作である。直線カスケードでは、段階(または反応工程)が一方向で起こり、かつ、各段階(または工程)の発生が前の段階または工程の発生に依存する。フィードバックカスケードまたはフィードバック増幅カスケードには、各段階の発生が典型的には前の段階の発生に依存し、かつ前の段階の発生がその後の段階で起こる過程または動作にさらに依存する、連続段階で起こる一連の過程または動作が含まれうる。フィードバックカスケードでは、前の任意の段階の産物がその後の任意の段階のための成分または基質として働くことができ、その後の任意の段階の産物が前の任意の段階のための成分または基質として働くことができよう。
【０２６１】
カスケードはそれゆえ、酵素カスケードまたは他の任意のシグナル伝達カスケードを含むことができるが、これらに限定されることはない。いくつかの態様においては、カスケードは、MNAzymeの触媒活性から生じるシグナルの増幅を含むことができる。いくつかの態様において、カスケードは、切断活性を有するMNAzymeの触媒活性から生じるシグナルの増幅を含むことができる。いくつかの態様において、カスケードは、リガーゼ活性を有するMNAzymeの触媒活性から生じるシグナルの増幅を含むことができる。いくつかの態様において、カスケードは、リガーゼ活性を有するDNAzymeまたはMNAzyme、および切断活性を有するDNAzymeまたはMNAzymeの触媒活性から生じるシグナルの増幅を含むことができる。好ましい態様において、そのような増幅カスケードは、第一の核酸酵素の触媒活性が第二の核酸酵素による基質の修飾に必要な分子を生成し、これがその後、一つまたは複数のさらなる核酸酵素による基質の修飾に必要な分子を生成しうる、シグナルの反復増幅およびそれゆえ周期増幅を伴うことができる。いくつかの態様において、必要な分子は、パートザイム、核酸酵素、例えばDNAzyme、組織化助長因子、組織化助長因子成分、基質、スタビライザーアーム、それらの部分もしくは成分、またはそれらの組み合わせを含むことができるが、これらに限定されることはない。いくつかの態様において、カスケードはそれゆえ、累積的作用の生成を伴うことができ、かくして、検出できるレベルまでシグナルを発生させることにより少量の標的を検出することができる。例えば、入力事象が低強度のものであるような、例えば標的が少量で存在し、検出できる出力シグナルを他の形では供与できないような用途において、シグナルを増幅するためにカスケードを利用することができる。他の態様においては、三つ以上の触媒段階を利用することができる。カスケードは直線的であることができる。好ましい態様においては、カスケードは指数関数的であることができる。
【０２６２】
直線カスケードにおいて(例えば図9、12、15に図解されているように)、カスケード中の各工程では、一部または全部が多重の代謝回転を起こしている可能性のある核酸酵素を利用し、それによって単一の核酸酵素(例えばDNAzymeまたはMNAzyme)がカスケード中の一つまたは複数の工程で多重の切断もしくは連結または他の修飾を行うことができる。多重の代謝回転はカスケード中の一つまたは複数の工程での増幅を助長し、検出工程の間に検出されるシグナルの増幅をもたらしうる。
【０２６３】
さらに、直線カスケードの拡張によってフィードバック増幅カスケードをもたらすこともできる。例えば、第三の核酸酵素の産物の配列が第一の核酸酵素の産物と同じであったなら、第三の核酸酵素の該産物は、第二の核酸複合体が第二の核酸酵素として機能することを可能にする分子として働くこともでき、フィードバック増幅カスケードを開始することができる。この反応において、第三の核酸酵素は、第二の核酸複合体が第二の核酸酵素として機能することを可能にし、かくして、第三の核酸複合体が第三の核酸酵素として機能することを可能にしうる第二の核酸酵素によるより多くの産物の生成を可能としうる産物を絶えず生成する。この戦略は、第一の核酸酵素の組織化を可能にしうる組織化助長因子(例えば標的分析物)による反応開始後のフィードバックシグナル増幅のための機構をもたらしうることが想定される。この戦略は、例えば、基質を連結しうるDNAzyme (またはMNAzyme)および基質を切断しうるMNAzymeによるシグナル増幅を伴う組織化助長因子(例えば標的分析物)の検出を可能にしうる。考えられるフィードバックカスケードの一つを図16に図解する。このスキーマの他の変化形は本明細書の全体にわたって記載されている。
【０２６４】
本明細書において記載する方法を用いて、本明細書において定義するカスケードを実行できることを当業者は理解するであろう。図9、12、15、および16に基づく他の戦略は、例えば切断または連結を含む種々の手段による少なくとも一つのMNAzymeによる少なくとも一つの基質の修飾を伴いうることも当業者は理解するであろう。直線およびフィードバック核酸酵素(DNAzymeおよびMNAzyme)カスケードは、ポリメラーゼ連鎖反応またはリガーゼ連鎖反応のような標的増幅技術とは異なり、過程を助長するのにタンパク質酵素を必要としない形式で増幅を可能にする。これは、よく使われるこれらの標的増幅プロトコルに比べて大きな利益をもたらす。さらに、スタビライザーアーム成分または組織化助長因子成分のような、いくつかのオリゴヌクレオチド成分を用いてMNAzymeの触媒活性を制御および調節できることで、MNAzymeの組織化を、微小環境における状態および成分によって強固に調節することが可能になる。本明細書において記載するカスケードは、本明細書において定義する活性なMNAzymeまたはアプタ-MNAzymeの形成によって開始されうることを当業者は理解するであろう。
【０２６５】
MNAzymeカスケード反応において有用なさらなる手段は、置換因子オリゴヌクレオチドの使用である。置換因子オリゴヌクレオチドは、一本鎖領域も二本鎖領域もともに有するDNA複合体内の一本鎖領域に結合することができる。置換因子がオリゴヌクレオチド(例えばオリゴ1)の一本鎖領域に結合すると、これは二本鎖領域内のオリゴ1に相補的な鎖(例えばcオリゴ1)に置き換わることができる。但し、置換因子がcオリゴ1と二本鎖領域内の同一配列を有することを条件とする。これによって、置換因子オリゴヌクレオチドとオリゴ1との間で形成される新たな二本鎖構造をもたらすことができ、一本鎖オリゴヌクレオチドとしてのcオリゴ1の放出を引き起こすことができる。
【０２６６】
この戦略はMNAzymeカスケード反応において有用でありうる。例えば、MNAzymeリガーゼに結合された連結産物は、パートザイムの基質アームと基質との間の相補性によって形成される二本鎖領域の間にいくつかの非対合塩基(一本鎖領域)を有する。基質に対して相補性のある置換因子オリゴヌクレオチド(例えばオリゴ1)が基質の一本鎖領域に結合すれば、これは分岐点移動によって相補的なパートザイムセンサーアーム(例えばcオリゴ1aおよびcオリゴ1b)に置き換わり、連結産物からパートザイムを分離しうる。したがって、これはリガーゼ酵素の代謝回転を増大しうる。この過程によって、置換因子と連結産物とを含む二本鎖が生じることになる。しかしながら、連結産物が反応におけるその後の工程に必要とされたなら、例えば、引き続くMNAzymeのための組織化助長因子として働くとしたなら、連結産物を置換因子から分離することが必要であろう。置換因子オリゴヌクレオチドが連結産物よりも短ければ、これは置換因子オリゴヌクレオチドと連結産物により形成される二重鎖の末端に一本鎖を生じるであろう。次の工程において、パートザイムセンサーアームがこれらの一本鎖領域に結合し、分岐点移動によって置換因子オリゴヌクレオチドを除去し、かくして、パートザイム(この場合にはそれら自体が置換因子オリゴヌクレオチドとして機能しえた)および連結産物(今度は組織化助長因子として機能する)とともに組織化された新しいMNAzymeをもたらしうる。
【０２６７】
この戦略に関する多くの変化形がカスケードにおいて有用である。例えば、図4 (左手側パネル)を参照し、置換因子を用いて、活性阻害因子の活性阻害因子ドメインに結合させることにより活性阻害因子を除去することができ、かつパートザイムセンサーアームが一本鎖とされ、かくして組織化助長因子成分の結合に利用可能とされるような分岐点移動によって活性阻害因子を置き換えることができる。
【０２６８】
MNAzymeカスケード反応はさまざまな範囲の生物工学的用途に、特に診断において、しかし医学的用途、獣医学的用途、農業用途、食品技術用途、撮像用途、および抗生物テロ用途などの他の領域においても適用されうる。それらは疾患診断のためのタンパク質および核酸の検出を可能にし、シグナル増幅を助長するならなおさらである。触媒核酸および/またはカスケード反応は、診断以外の用途、例えば、治療において使用できる分子スイッチおよびナノスケール装置の生物分子工学およびコンピュータ分析の分野において使用することができる。
【０２６９】
MNAzymeはさまざまなカスケードで用いるのに、DNAzymeに比べて利点がある。DNAzymeは、その標的でも基質でもある一つの分子を認識することしかできない。DNAzyme標的/基質は「入力」を与えると考えられ、酵素産物(修飾された標的/基質)は「出力」と考えられるが、入力も出力もともに同じ標的基質分子の代替(修飾および非修飾)形態であるにすぎないので、DNAzymeはカスケードにおけるより複雑な過程を伝達するその能力が限られている。さらに、触媒修飾、例えば切断は、DNAzymeの標的/基質を破壊することもあり、したがって、標的はもう一ラウンドの認識に利用可能とされない。対照的に、単一のMNAzyme、例えば切断活性を有するMNAzymeは、少なくとも二つの分子、すなわち少なくとも一つの組織化助長因子および少なくとも一つの基質を認識することができる。組織化助長因子、例えば試料中に存在する標的核酸は、反応のなかで触媒的に修飾されず、MNAzymeによるさらなるラウンドの基質修飾に依然として利用可能のままであろう。さらに、二つの基質に作用できる単一のMNAzyme (例えばリガーゼ活性を有するMNAzyme)は少なくとも三つの分子、すなわち少なくとも一つの組織化助長因子および少なくとも二つの基質を認識することができる。MNAzyme複合体のこれらの特性によって、それらは、入力(例えば核酸複合体が核酸酵素として機能することを可能にする分子)および出力(例えば産生されかつ後続の核酸複合体が核酸酵素として機能することを可能にする分子)を伴いうるカスケード反応におけるような過程で有用となる。さらに、MNAzyme複合体のこれらの特性によって、それらは、「入力」シグナル(例えば標的組織化助長因子またはMNA複合体成分でありうる分子)を「読み取り」(認識し)、「出力」シグナルを「書き込み」うる(例えば入力を認識し、分子に作用して出力を与えうる；例えば入力を認識し、基質を修飾して後続の工程で有用な新しい反応産物を生成しうる)ことを複数の成分に要求する過程で用いるのに極めて適当とされる。MNAzymeおよびMNAzyme複合体の特性は、一工程の過程(例えば標的の検出)において、ならびにまた、例えば、カスケード、論理ゲート、および他の過程を利用する系において有用である。MNAzyme複合体は、例えば、入力シグナルを受け取り、適切な出力応答で応えるために、複雑な情報伝達のための機構を提供する。本明細書の全体にわたって強調されているように、DNAzymeはカスケードにおいて依然有用でありうる。いくつかの例では、MNAzymeのような先行する核酸酵素によるDNAzyme複合体に対する基質またはDNAzymeの産生を含む。MNAzymeリガーゼは、例えば、新たなDNAzymeを生成するのに特に有用である。したがって、例えばMNAzymeによる連結または切断によって生成された一核酸酵素の「出力」情報は、例えば、後のおよび/または前の反応段階において有用なDNAzyme複合体の形成に関与しうる新たなDNAzymeまたは基質を生成することによって次の核酸酵素複合体のための「入力」を与えることができる。
【０２７０】
標的検出のために設計された形式でリガーゼ活性を有する核酸酵素およびMNAzymeを用いて直線カスケードを生成するための例示的な機構を図9に描く。この図は同様に、標的検出のための一般的方法について説明している。この方法では、リガーゼ活性を有するDNAzyme (DNAzymeリガーゼ)に依存して、一つのMNAzymeのためのパートザイムが、もう一つのMNAzymeの触媒活性による産物の少なくとも一つから組織化するのを制御する。
【０２７１】
図9の戦略では、切断活性を有するMNAzymeおよびリガーゼ活性を有するDNAzymeの組み合わせを用いる。工程(i)において、組織化助長因子、例えば標的核酸は第一のMNAzyme Aの形成を指令することができる。MNAzyme Aは基質Aを切断し、かくして5'切断産物Aを生成することができ、この5'切断産物AをDNAzymeリガーゼBの基質として使用することができる。工程(ii)において、DNAzymeリガーゼBは工程(i)で生成された5'切断産物A (5'基質Bともいわれる)を別のオリゴヌクレオチド、つまり3'連結基質Bに連結し、かくしてMNAzyme Cのための新たなパートザイムを生成することができる。工程(iii)において、工程(ii)で生成された新しいパートザイム/連結産物は、別のパートザイムとともに、組織化助長因子Cの存在下で新たなMNAzyme Cを形成させることができ、このMNAzyme Cは基質Cを二つの産物、つまり5'産物Cおよび3'産物Cに切断することができる。この基質が、例えば、フルオロフォアおよびクエンチャー色素対で標識されていれば、基質Cの切断後に、検出可能なシグナルが発生されうる。このカスケードは、MNAzyme Aの組織化を可能にする組織化助長因子(例えば標的分析物)による反応開始後のシグナル増幅のための機構をもたらす。この直線カスケード形式において、各工程では、一部または全部が多重の代謝回転を起こしている可能性のある核酸酵素を利用し、それによって単一の核酸酵素(例えばDNAzymeまたはMNAzyme)がカスケード中の一つまたは複数の工程で多重の切断、連結、または他の修飾を行うことができる。多重の代謝回転は、カスケード中の一つまたは複数の工程での増幅を助長し、一つまたは複数の工程の間に検出されるシグナルの増幅をもたらしうる。
【０２７２】
標的検出のために設計された形式でMNAzymeカスケードを生成するための別の機構を図12に描く。この図は同様に、標的検出のための一般的方法について説明している。この方法は、リガーゼ活性および切断活性を有するMNAzymeの組み合わせに依存する。MNAzymeリガーゼは、一つのMNAzyme切断因子のためのパートザイムが、もう一つのMNAzyme切断因子の触媒活性による産物の少なくとも一つから組織化するのを制御する。
【０２７３】
工程(i)において、組織化助長因子A、例えば標的核酸は、第一のMNAzyme Aの形成を指令することができる。MNAzyme Aは基質Aを切断し、かくして5'切断産物Aを生成することができ、この5'切断産物Aを、リガーゼ活性を有するMNAzyme Bの基質として使用することができる。工程(ii)において、MNAzymeリガーゼB (組織化助長因子Bの存在下でMNAzyme Bのパートザイム成分により形成された)は工程(i)で生成された5'切断産物A (5'基質Bともいわれる)を別のオリゴヌクレオチド、つまり3'基質Bに連結し、かくしてMNAzyme Cのための新たなパートザイムを生成することができる。工程(iii)において、工程(ii)で生成された新しいパートザイム/連結産物は、別のパートザイムとともに、組織化助長因子Cの存在下で新たなMNAzyme Cを形成させることができ、このMNAzyme Cは基質Cを二つの産物、つまり5'産物Cおよび3'産物Cに切断することができる。この基質が、例えば、フルオロフォアおよびクエンチャー色素対で標識されていれば、基質Cの切断後に、検出可能なシグナルが発生されうる。
【０２７４】
さらに、図9および12との関連で、5'産物Cの配列が5'産物Aと同じであったなら、この産物は5'基質Bとして働くこともでき、フィードバック増幅カスケードが開始されうる。この反応において、MNAzyme Cは5'基質Bを絶えず生成することができ、この5'基質Bが核酸酵素リガーゼ(図9中のDNAzyme Bまたは図12中のMNAzyme B)により連結されて、さらに多くのMNAzyme Cの形成のためにさらに多くのパートザイムを生成することができる。この戦略は、MNAzyme Aの組織化を可能にする組織化助長因子(例えば標的分析物)による反応開始後のフィードバックシグナル増幅のための機構をもたらすことができる。これらのフィードバックカスケード戦略は、複数種の核酸酵素、例えば、基質を切断できるMNAzyme (MNAzyme切断因子)と組み合わせたDNAzymeリガーゼまたはMNAzymeリガーゼによるシグナル増幅を伴った組織化助長因子の検出を可能にしうる。この種のフィードバックカスケードを本明細書の全体にわたって記載されている他の戦略と組み合わせて使用できることが認識されよう。図9および12に示されるものに類似の戦略に従うカスケードに適用可能とされる多くの変化形があることが理解されよう。例えば、リガーゼを用いて、例えば切断活性、リガーゼ活性、または他の酵素活性を有する別のMNAzymeのための組織化助長因子として働く連結産物を生成することができる。
【０２７５】
図9および12に類似の戦略に従う一つの可能なカスケードの一例は、二つまたはそれ以上のMNAzymeが異なる組織化助長因子(例えば標的)に応答し、かつ後の反応に関与するために使用されうる異なる修飾産物(例えば切断産物または連結産物)をもたらす各MNAzymeによって各修飾反応が触媒される反応において使用されうる場合であろう。例として、図9および12のカスケードを参照し、異なる組織化助長因子(例えば標的)に応答する二つまたはそれ以上の初期MNAzymeを用い、異なる修飾産物をもたらすことができ、異なる修飾産物は、反応の次の工程でリガーゼ活性を有する核酸酵素として機能できる対応する数のMNAリガーゼ複合体の形成に関与しうる。次いで核酸リガーゼが、組織化助長因子C、パートザイムA、B、またはそれらの成分などのMNAzyme C反応のための種々の要素を生成しうる。したがって、例えば、一つの初期MNAzymeの産物によって推進される一つのリガーゼ反応が、MNAzyme Cのための組織化助長因子を生成し、もう一つの初期MNAzymeの産物によって推進されるもう一つのリガーゼ反応がMNAzyme Cのためのパートザイムを生成しうる。そのような例では、両方の標的が存在してリガーゼ反応の両方を推進され、それゆえに組織化助長因子もパートザイムもともに生成する場合にだけ、MNAzyme Cが組織化され、触媒的に活性であるように、アッセイ法を整えることができよう。これは複数の標的の検出のための機構になろう。必要数の標的の存在下でのみ、MNAzyme Cの必要な要素の全てが基質Cを修飾するのに利用可能になろう。この例において、反応混合物の追加要素は、いくつのMNAzyme C要素がオリジナルの標的の認識によって生成されるかにしたがって調整されよう。したがって、例えば、二つの標的をモニターし、これが順にMNAzyme Cのための組織化助長因子CおよびパートザイムAの生成をもたらす反応を推進するなら、MNAzyme Cのための成分、パートザイムBおよび基質Cのみが、MNAzyme C複合体の形成および反応における第三の工程を進行可能とするために存在することが必要であろう。
【０２７６】
同様に、一つまたは複数の組織化助長因子(例えば標的)を検出し、いくつかの異なる要素を一つの後続の(例えば連結)工程に入れてもよい。例えば、図9を参照して、一つの初期反応が5'リガーゼ基質をもたらし、もう一つの初期反応が3'リガーゼ基質を生じうる。あるいは、図12に類似の別の例では、一つの初期MNAzyme切断因子がMNAzyme Bの5'リガーゼ基質を生じ、一つの初期MNAzymeリガーゼがMNAzymeリガーゼBのためのパートザイムを生成しうる。両方の産物がMNAzyme複合体の形成に関与するために利用可能である場合にだけ、リガーゼ基質は修飾されて、カスケード反応は進み続ける。そのような戦略において使用される異なる組織化助長因子(例えば標的)は、異なる分子もしくは一分子内の異なる配列、またはその組み合わせを含みうることが理解されよう。例えば、一分子内の三つの異なるSNPsを三つの異なるMNAzymeによって検出することができる。
【０２７７】
この戦略に対するその他多くの変化形があることが認識されよう。反応が進行するのに全てが必要とされるいくつかの異なる要素を反応にもたらすために複数の標的を用いるという一般概念は、多くの反応およびカスケードにおいて適用可能である。検出される標的の数はさまざまであり、例えば、二つまたはそれ以上の標的を検出することができる。それをカスケードの一つまたは多くの工程に適用することができる。カスケードの次工程のための成分を供与することによって「直接的に」もしくはカスケード後期に反応を生じさせることによって「間接的に」、またはそれらの種々の組み合わせで、それを適用することもできる。したがって、例えば、一つの標的によって指令された一つのMNAzymeが次の反応に必要な分子をもたらし、もう一つの標的によって指令されたもう一つのMNAzymeが次のまたは他の後の反応に必要な産物をもたらしうる。他の変化形も適用されうることが明らかであろう。この戦略を同じく、上記のように異なる修飾(例えば切断または連結)をもたらす酵素に適用できることが明らかであろう。さらに、さまざまな数の標的に応答するさまざまな数の核酸酵素によって生成される産物のさまざまな組み合わせが可能であり、これにはパートザイム、組織化助長因子、および他のMNA複合体成分が含まれるが、これらに限定されることはない。いくつかの標的に応答するいくつかの核酸酵素は、さらなる核酸酵素もしくは核酸酵素複合体の一つもしくは複数の成分を産生してもよく、またはさらなる核酸酵素もしくは核酸酵素複合体の成分の全てを産生してもよい。
【０２７８】
基質を切断できる核酸酵素を、基質を連結できる核酸酵素とともに用いるカスケード反応の別の例を図15に図解する。この例では、連結の過程が新しい組織化助長因子の生成をもたらす。工程(1)において、MNAzyme切断因子1は組織化助長因子(例えば標的核酸)の存在下でのみ組織化し、次いでMNAzyme基質1を切断し、2',3'環状リン酸末端を有する5'切断産物を放出する。工程(2)において、DNAzymeリガーゼ(またはMNAzymeリガーゼ)は、工程(1)由来の5'切断産物を3'連結基質に連結し、かくして、別のMNAzyme切断因子2のための組織化助長因子として働きうる連結産物を生成する。工程(3)において、工程(2)における連結により形成された組織化助長因子は、パートザイムの組織化を指令し、これは基質2を二つの産物、つまり2',3'環状リン酸末端を有する5'切断産物と3'切断産物とに切断できるMNAzyme切断因子2を形成する。この基質が、例えば、フルオロフォアおよびクエンチャー色素対で標識されている場合、基質2の切断の後、検出可能なシグナルが発生されうる。図9および12に図解した直線型のカスケードと同様に、図15中のカスケードにおける各工程では、一部または全部が多重の代謝回転を起こしている可能性のある核酸酵素を利用し、それによって単一の核酸酵素(例えばDNAzymeまたはMNAzyme)がカスケード中の一つまたは複数の工程で多重の切断もしくは連結または他の修飾を行うことができる。多重の代謝回転はカスケード中の一つまたは複数の工程での増幅を助長し、一つまたは複数の工程の間に検出されるシグナルの増幅をもたらしうる。
【０２７９】
さらに、図15に図解した直線カスケードの拡張によって、フィードバック増幅カスケードをもたらすこともできる。MNAzyme切断因子2の5'切断産物の配列がMNAzyme切断因子1の5'切断産物と同じであったなら、MNAzyme切断因子2の5'切断産物はDNAzymeリガーゼ(またはMNAzymeリガーゼ)の5'基質として働くこともでき、フィードバック増幅カスケード反応を開始することができる。この反応において、MNAzyme切断因子2は5'切断産物を絶えず生成し、この5'切断産物がDNAzymeリガーゼ(またはMNAzymeリガーゼ)による連結の基質として働き、かくしてさらに多くのMNAzyme切断因子2の組織化を指令しうるさらに多くの組織化助長因子の生成を可能にしうる。この戦略は、MNAzyme切断因子1の組織化を可能にしうる組織化助長因子(例えば標的分析物)による反応開始後のフィードバックシグナル増幅のための機構をもたらしうることが想定される。この戦略は、基質を連結しうるDNAzyme (またはMNAzyme)および基質を切断しうるMNAzymeによるシグナル増幅を伴う組織化助長因子(例えば標的分析物)の検出を可能にしうる。このスキーマの他の変化形は、本明細書の全体にわたって記載されている。
【０２８０】
二種の核酸酵素、すなわち、基質を切断できる核酸酵素と、基質を連結できる核酸酵素とを用いてフィードバックカスケード反応を生成するための別の例示的な方法を図16に提案する。図16はこの一般戦略のいくつかの変化形の一つにすぎない。工程(1)において、MNAzyme切断因子1は、組織化助長因子(例えば標的核酸)の存在下でのみ組織化し、次いでMNAzyme基質1を切断し、2',3'環状リン酸末端を有する5'切断産物および3'不用産物を放出する。工程(2)において、DNAzymeリガーゼ(またはMNAzymeリガーゼ)は、工程(1)由来の5'切断産物を3'連結基質に連結し、かくして、MNAzyme切断因子2のための組織化助長因子として働きうる連結産物を生成する。工程(3)において、工程(2)における連結により形成された組織化助長因子は、パートザイムの組織化を指令して、基質2を二つの産物、つまり2',3'環状リン酸末端を有する5'切断産物と3'切断産物とに切断しうるMNAzyme切断因子2を形成する。この基質が、例えば、フルオロフォアおよびクエンチャー色素対で標識されている場合、基質2の切断後に、検出可能なシグナルが発生されうる。さらに、MNAzyme切断因子2の切断産物のうちの一つの配列がMNAzyme切断因子3の組織化助長因子成分として有用であったなら、これはフィードバックカスケードを助長することができる。この場合、MNAzyme切断因子3はMNAzyme切断因子1とは異なるセンサーアームを持ちうるが、少なくとも同じ5'連結基質を与えて工程(ii)のリガーゼ反応に関与するために、MNAzyme切断因子1と共通の少なくとも一つの基質アームを要するであろう。(図16中で、MNAzyme切断因子1と同じ基質(基質1)であることを考えると、基質アームはMNAzyme切断因子1および3について同じものである)。工程4において、MNAzyme切断因子3はMNAzyme切断因子2による切断によって生成された組織化助長因子成分の存在下で組織化しうる。さらに、MNAzyme切断因子3は基質を切断し、MNAzyme切断因子1による基質1の切断によって生成された5'切断産物と同じものでありうる5'切断産物を生成しうる。そしてまた、この産物は、DNAzyme (またはMNAzyme)リガーゼの5'基質として働きもし、フィードバック増幅カスケード反応が開始されうる。この反応において、MNAzyme切断因子3は5'切断産物を絶えず生成し、この5'切断産物がDNAzyme (またはMNAzyme)リガーゼによる連結のための基質として働いて、さらに多くのMNAzyme切断因子2の組織化を指令しうるさらに多くの組織化助長因子を生成しうる。次いでMNAzyme切断因子2がさらに多くのMNAzyme切断因子3のためのさらに多くの組織化助長因子成分を生み出すことができ、フィードバックカスケードが生成されるであろう。この戦略は、MNAzyme切断因子1の組織化を指令する組織化助長因子(例えば標的分析物)による反応開始後のフィードバックシグナル増幅のための機構をもたらすことができる。この戦略は、基質を連結しうるDNAzyme (またはMNAzyme)および基質を切断しうるMNAzymeによるシグナル増幅を伴う組織化助長因子(例えば標的分析物)の検出を可能にするであろう。
【０２８１】
いくつかの上記例は、後続の反応における連結基質として5'切断産物の使用に言及しているが、後続の反応において連結基質として3'切断産物を使用することも、またはその両方とも可能でありうることが理解されよう。さらに、5'もしくは3'切断産物のどちらか、またはその両方を、後のまたは前の核酸酵素複合体の成分として使用することもできる。連結可能な基質は、使用されるリガーゼに応じて異なる末端を持ちうることも理解されよう。例えば、2'3'環状リン酸および5'ヒドロキシル末端に加えて、それらは、例えば、2'3'ジオール末端および5'三リン酸末端を持ちうる(表4参照)。切断活性を有するMNAzymeは、切断される結合に基づいて選択することができる。
【０２８２】
本明細書中のこのおよび他の例のさらなる変化形において、リガーゼ活性を有するDNAzyme (またはMNAzyme)は、断片を連結し、基質2を切断できるDNAzymeを形成して、別のMNAzyme (図16中のMNAzyme切断因子3と表示された)のための組織化助長因子または他の成分を生成しうる。したがって、この変化形において、MNAzyme切断因子2をDNAzyme切断因子と置き換えることができる。別の例示的な戦略において、DNAzyme (またはMNAzyme)リガーゼは、断片を連結し、反応中に存在する別のパートザイムおよび組織化助長因子と会合できる新たなパートザイムを生成し、かくして、基質2を切断してMNAzyme 3のための組織化助長因子成分を生成しうるMNAzyme切断因子2を形成させうる。このスキームに関する他の変化形が可能であり、本明細書中の他の箇所に記載されている。
【０２８３】
いくつかの代替的MNAzyme複合体が可能であり、カスケードにおいて使用できることを当業者は理解するであろう。これらの設計のいくつかを図6に図解しており、図中パネルA〜Dに活性なMNAzyme複合体の例をいくつか示している。これらの構造は全て、基質(S)を修飾(例えば切断)できる触媒的に活性な酵素を形成させることができる。この図解には、一つの組織化助長因子F1 (パネルA)、二つの組織化助長因子成分F1およびF2 (パネルBおよびD)、または三つの組織化助長因子成分F1、F2およびF3 (パネルC)を含んだ、MNAzymeのスキームが含まれる。パネルAに示される例には、パートザイムセンサーアーム内に自己相補的な領域を有するセンサーアームが挙げられている。MNAzymeはパネルDに示されるように一つまたは複数のスタビライジングアーム(sA)を含むこともできる。一つのパネルにおける変化形をもう一つのパネルにおける変化形と組み合わせて使用することができる。
【０２８４】
いくつかのカスケードが本明細書の全体にわたって示されていることを当業者は理解するであろう。それらのカスケードは本質的にモジュール式であり、かくして、それらのカスケードに対する多数の変化形が考えられることも理解されよう。下記の表3は可能な変化形の限定的なリストを示す。その他の変化形も可能であり、本発明の範囲内に含まれることを当業者は理解するであろう。
【０２８５】
（表３）MNAzymeまたはMNAzymeおよびDNAzymeの組み合わせを用いるいくつかの可能なカスケード
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＊工程を個々の反応容器のなかで連続的に行ってもよく、各種の工程を組み合わせてもよく、または一つもしくは複数のチャンバを有する単一の反応容器のなかで全ての工程を行うこともできる。各変化形は、カスケードの他の部分にフィードバックする工程を含め、さらなる工程を含むことができる。
【０２８６】
本明細書において記載および図示する例の反応において使われるカスケード反応の成分要素、工程または段階の選択のフローチャートをスキーム1に示す。この非限定的なフローチャートは、カスケード反応において有用な各種の成分要素のモジュール性を示す。
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【０２８７】
全ての反応で核酸酵素の組み合わせ、すなわち複数のMNAzymeまたはMNAzymeとびDNAzymeとの混合物を使用することができる。これらの酵素による修飾は、さまざまな数の切断および/または連結工程の組み合わせを伴う。いずれの場合にも、一つの工程の産物が、後続の工程のための基質、酵素、または酵素成分として働く。切断を行う核酸酵素を用いて、例えば、連結のための新たな基質、または新たなMNAzymeのための新たな組織化助長因子成分を生成することができる。連結を行う核酸酵素を用いて、例えば、DNAzymeまたはMNAzyme酵素のどちらかによる次工程での切断のための新たな基質を生成することができる。さらに、連結を行う核酸酵素を用いて、例えば、新たなDNAzymeまたはMNAzymeのための新たな成分、例えば組織化助長因子、新たなパートザイムもしくは新たなスタビライザーアームを生成することもできる。核酸酵素カスケードにおいて使用できる核酸酵素と得られる産物との組み合わせを使用するアッセイ法には、多数の変化形があることを当業者は理解するであろう。例えば、核酸酵素が切断因子として表示されている表3に掲載の変化形のいくつかにおいて、これをリガーゼと置き換えること(またはその逆)が可能であろう。いくつかのそのようなカスケード反応において有用な多数の個別の工程が、実施例で実証されており、スキーム1で要約されている。
【０２８８】
単一の核酸酵素により産生される複数の産物を用いて、一つまたは複数の核酸複合体が一つまたは複数の後続の工程において一つまたは複数の核酸酵素として機能することを可能にできることは、当業者には明らかであろう。
【０２８９】
一つの反応の産物が後続の反応における核酸酵素複合体の特定の成分として有用であると表示されている表3中の工程のいくつかにおいては、該成分を別の種類の成分と置き換えることが可能でありうる。例えば、表3の工程1において、MNAzymeは、核酸酵素複合体の組織化のため、基質としてではなく、組織化助長因子として有用である産物を生成しうる。
【０２９０】
シグナル、例えば蛍光シグナルは、触媒修飾が行われる工程で発生されうることが当業者には明らかであろう。例えば、蛍光シグナルは、一つにはフルオロフォアクエンチャー色素対を分離しうるDNAzymeまたはMNAzymeによる切断があるような任意の工程で発生し、蛍光の増加が引き起こされうる。さらに、蛍光シグナルは、例えば、一つにはフルオロフォアクエンチャー色素対を接近させうるDNAzymeまたはMNAzymeによる連結があるような任意の工程で発生し、蛍光の減少が引き起こされうる。さらに、蛍光シグナルは、カスケード反応内の複数の工程で発生しうる。
【０２９１】
カスケード反応のこれらの例の全てで、各段階の発生が典型的には、前の段階の発生に依存する、連続段階で起こる一連の過程または動作が存在する。さらにフィードバックカスケードが記載されている例では、各段階の発生が典型的には前の段階の発生に依存し、かつ少なくとも一つの前の段階の発生が典型的にはその後の段階で起こる過程または動作に依存する、連続段階で起こる一連の過程または動作が存在しうる。フィードバックカスケードでは、前の任意の段階の産物が、その後の任意の段階のための成分または基質として働くことができ、その後の任意の段階の産物が、前の任意の段階のための成分または基質として働くことができよう。
【０２９２】
カスケードは、一つもしくは複数のMNAzymeのための成分の存在下で、核酸標的(DNA/RNA)により開始されることができ、または、カスケードは、一つもしくは複数のアプタ-MNAzymeのための成分の存在下で、他の標的分析物(タンパク質、小分子など)により開始されることができる。その反応は、標的分析物の存在下で開始されうるのみであるため、標的分析物の検出および/または同定のための技術となりうる。その方法は、核酸複合体の不活性化および活性化の状態の間での移行に基づく。MNAzymeを用いた増幅を伴うカスケードは、PCRまたはリガーゼ連鎖反応のような標的増幅技術とは異なり、過程を助長するのにタンパク質酵素を必要としない。さらに、スタビライザーアーム成分または組織化助長因子成分のような、いくつかのオリゴヌクレオチド成分を用いてMNAzymeの触媒活性を制御および調節できることで、MNAzymeの組織化を、微小環境における状態および成分によって強固に調節することが可能になる。
【０２９３】
非核酸標的分析物により開始されるカスケードに関連して、アプタマーが有用である。アプタマーは、その高次構造、例えば、3-D結合ドメインまたはポケットに起因する高い親和性および特異性により、一つまたは複数のリガンドを認識する能力を有するDNA、RNA、またはペプチド配列である。多くのアプタマーは例えば、核酸、タンパク質、プリオン、小有機化合物、および/または生物全体を含め、リガンドに結合するその能力のために、インビトロにおいて徐々に発展してきた。「アプタザイム」は、アプタマーおよび核酸酵素の配列の両方、例えばDNAzymeまたはリボザイムに付加されたアプタマーで構成される配列を有する既報の配列である。アプタ-MNAzymeは、アプタ-MNA複合体における成分の一つに付加されたアプタマーを有するMNAzymeである。例えばアプタマーを、パートザイム、組織化助長因子、MNAzyme基質、またはMNA複合体のその他任意の成分に付加することができる。非核酸標的分析物とアプタマーとの会合は、核酸酵素の活性を助長することができる。このように、カスケードは、例えば、カスケードの第一工程として、アプタ-MNAzymeと会合する非核酸標的分析物によって開始されうる。さらに、カスケードにおいて、そのカスケードにおける核酸酵素により触媒される反応の産物は、開始MNAzymeまたはアプタ-MNAzyme以外の核酸酵素の成分に存在するアプタマーと会合し、それによってその核酸酵素の活性を助長することができる。
【０２９４】
MNAzymeおよび/またはアプタ-MNAzyme媒介性の増幅カスケードはさまざまな範囲の生物工学的用途に、特に診断において、しかし他の医学的用途、獣医学的用途、農業用途、食品技術用途、撮像用途、および抗生物テロ用途においても適用されうる。それらはシグナル増幅を助長することにより、疾患診断のためのタンパク質、核酸、または他の分子の検出を可能にしうる。触媒核酸および/またはカスケード反応は、診断以外の用途、例えば、治療において使用できるスイッチおよびナノスケール装置の生物分子工学およびコンピュータ分析の分野において使用することができる。
【０２９５】
9. 活性阻害因子または組織化助長因子のような成分の除去または生成によってMNA複合体の活性状態と不活性状態との間でスイッチを可能にする方法
活性なMNAzymeと不活性なMNA複合体との間の移行、またはその逆の移行は、一つもしくは複数の活性阻害因子、組織化助長因子、組織化阻害因子、パートザイムもしくはスタビライザーアーム、またはそれらの一部を含むがこれらに限定されない、MNA複合体成分の提供または除去によって達成することができる。いくつかの態様においては、活性阻害因子は不安定なまたは切断可能なリンカーまたは基質をさらに含むことができ、それらは活性阻害因子内の二つまたはそれ以上のドメイン、例えば活性阻害因子ドメインと活性化因子の組織化助長因子ドメインとの間に位置することができる。リンカー部位での切断は、活性化因子の組織化阻害因子ドメインから活性阻害因子ドメインを分離させることができ、その活性化因子の組織化阻害因子ドメインがひいては組織化助長因子成分として機能し、活性なMNAzymeの組織化を指令することができる。リンカーの切断は、MNAzyme切断、タンパク質酵素切断、またはpHおよびもしくは温度の変化によって誘導される加水分解を含むがこれらに限定されないいくつかの方法によって、達成することができる。
【０２９６】
あるいは、組織化阻害因子および/または組織化助長因子は、分岐点移動を伴う過程および/または成分オリゴヌクレオチドに対する相補性を用いて、選択的に除去することもできる。相補性を通じて機能する調節因子オリゴヌクレオチドは、それらが結合するオリゴヌクレオチドの二次構造を変化させることによってそのようにすることができる。いくつかの態様において、これは、活性化因子配列が次に他の成分と会合して活性なMNAzymeを形成させることができるような代替の高次構造をもたらすことができる。例として、そのような調節因子オリゴヌクレオチドは、活性化因子分子を非機能的な高次構造に制約するヘアピンのような分子内構造を破壊することができる。
【０２９７】
リガーゼ活性を有する第二のMNAzyme (またはリガーゼ活性を有するDNAzyme)を用いて、活性なMNAzymeの「オン状態」とMNAi複合体の「オフ状態」との間でのMNA複合体のスイッチを助長するために、代替の例示的な戦略を設計する。図13を参照して、基質Aを修飾(例えば切断または連結)しうる活性なMNAzyme Aは、組織化助長因子成分1 (AFC 1)および組織化助長因子成分2 (AFC 2)の存在下で形成されうる。リガーゼ活性を持つ第二のMNAzyme Bが、組織化助長因子3 (AF3)の存在下で形成され、次いでAFC 2を活性阻害因子成分(AIC)と連結し、活性阻害因子(AI)の形成を引き起こしうる。このAIはMNAzyme Aのためのパートザイム成分に結合し、不活性であるMNAi A複合体の形成をもたらしうる。したがって、この例でのMNAzymeリガーゼが、MNAzyme Aを不活性化するオフスイッチとして作動しうる。あるいは、DNAzymeリガーゼをMNAzymeリガーゼに置き換えて、MNAzyme Aを不活性化するオフスイッチとして作動するように使用してもよい。不活性なMNAi複合体および触媒的に活性なMNAzymeは、組織化成分の二つの代替的状態、すなわちそれぞれ「オフ」状態および「オン」状態を示しうる。
【０２９８】
10. キット
本発明は同様に、本明細書において開示される方法を実践するためのキットを提供する。典型的には、本発明の方法を実行するためのキットは、その方法を実行するのに必要な試薬の全てを含有する。典型的には、キットは第一の核酸複合体(例えばMNA複合体)を含有する少なくとも第一の容器を含むことができ、第一の核酸酵素の形成には、検出される、同定される、および/または定量化される標的を含有すると推定される試料の追加が必要である。酵素の形成は、後続の反応への関与に適した成分、例えば基質の産生をもたらすことができる。後続の反応において、該成分は、さらなる核酸複合体が核酸酵素として機能することを可能にする。前の反応の核酸酵素によって産生された成分との接触時に核酸酵素複合体を形成させるさらなる核酸複合体の形成を可能にする試薬も提供されうる。
【０２９９】
特定の態様において、活性な核酸酵素複合体の形成を可能にしうる核酸複合体の各々のための成分は、同じまたは別の容器の中に存在してもよい。他の態様において、活性な核酸酵素複合体の形成を可能にしうる核酸複合体の各々のための成分は、別の容器の中に存在してもよい。例えば、一つの態様において、キットは、核酸複合体の各々のための一つまたは複数の必要成分を、別の容器の中に含むことができる。
【０３００】
全ての核酸複合体のための全ての成分がキットの中にある必要のないことは、それらがカスケード反応の一部として生成されうることから理解されよう。多重反応を可能にする成分も想定される。
【０３０１】
他の態様において、例えば、切断活性またはリガーゼ活性のどちらかを有するさらなる核酸酵素複合体のための成分も、本発明のキットの一部をなすことができる。他の態様において、本発明のキットは、DNAzymeまたはその一部を含むことができる。
【０３０２】
典型的には、本発明のキットは、例えば洗浄用試薬および/または本発明の方法の実施に必要な他の試薬を含有する一つまたは複数の他の容器も含む。
【０３０３】
本発明との関連で、区画化されたキットには、試薬が別個の容器に含有されており、かつ小さなガラス容器、プラスチック容器、またはプラスチックもしくは紙のストリップを含みうる任意のキットが含まれる。そのような容器は、試料および試薬の相互汚染を回避しながらも一つの区画から別の区画への試薬の効率的な移動、ならびに定量的な形での一つの区画から別の区画への各容器の薬剤または溶液の添加を可能にすることができる。そのようなキットは、試験試料を受け入れる容器、アッセイにおいて使用される試薬を含有する容器、洗浄用試薬を含有する容器、および検出試薬を含有する容器も含むことができる。典型的には、本発明のキットは、キット成分を用いて適切な方法を行うための使用説明書も含む。本発明のキットおよび方法は、例えば、リアルタイムPCR機を含むがこれに限定されない、自動分析機器およびシステムと併せて用いることができる。
【０３０４】
異なる標的または事象の検出、同定、または定量化に適用するため、本発明の単一のキットが適用可能とされることもあり、またあるいは、例えば各標的に特異的な試薬を含有する異なるキットが必要とされることもある。本発明の方法およびキットは、任意の実体または事象を検出、同定、または定量化することが望ましい任意の状況において適用される。
【０３０５】
11. MNAzymeを生成する方法
本発明は同様に、単分子DNAzymeからMNAzymeを設計するための方法を提供する。
【０３０６】
修飾が、核酸の切断、核酸の連結、核酸のリン酸化、核酸のキャッピング、アミノ酸のアデニル化、補因子合成、RNA重合、鋳型依存性の重合、RNA-タンパク質の結合、アルドール反応、アルコール酸化、アルデヒド還元、プリンおよびピリミジンヌクレオチド合成、アルキル化、アミド合成、尿素合成、ペプチド結合の形成、ペプチジル-RNA合成、アシル転移、アミノアシル化、炭酸加水分解、ホスホロチオエートアルキル化、ポルフィリンメタル化、炭素-炭素結合の形成、Pdナノ粒子の形成、ビフェニル異性化、エステル結合の形成、アミド結合の形成、DNA脱グリコシル化、チミン二量体光回復、ならびにホスホロアミダイト切断を含む群より選択されうる、少なくとも一つの基質の触媒修飾の能力があるDNAzymeおよび/またはリボザイムが公知である。
【０３０７】
本明細書において記載するMNAzymeを生成する方法は、上記のものなど、ならびにHobartner and Silverman (2007)に記載のものおよび下記表に掲載のものを含むがこれらに限定されない、複数の核酸酵素に適用可能である。
【０３０８】
（表４）MNAzymeを形成させるために使用できるいくつかの単分子核酸酵素
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【０３０９】
多くのDNAzymeが、複数のドメインを有する類似の基本構造を持つことを当業者は認識するであろう。これらのDNAzymeは、特異的に基質を認識し基質にハイブリダイズする二つの非保存基質結合ドメイン(「基質アーム」)が隣接する保存触媒ドメイン(触媒コア)を持つ。基質がDNAzymeによって修飾されうる部位を含んでいれば、基質結合ドメインはどんな基質にも合わせることができる。ハンマーヘッド型リボザイム、10:23および8:17 DNAzyme、「7Z81」、「7Z48」、および「7Q10」リガーゼ、「UV1C」チミン二量体光回復DNAzyme、ならびに「DAB22」炭素-炭素結合形成DNAzymeを含むいくつかの触媒核酸は、複数のドメインを有する類似の基本構造を持つ。
【０３１０】
図14を参照して、単分子DNAzyme (左手上側の構造)からMNAzymeを設計するための方法を図解しており、それによれば、第一の工程において、触媒コアの各一部分を二つの部分配列へと割り振って、この二つの部分コアがともに触媒コア全体を構成できるように、DNAzyme触媒コア内で分割できる位置を特定する(右手上側の構造)。次いで二つのオリゴヌクレオチドAおよびB (候補パートザイム)を合成することができる(左手下側の構造)。オリゴヌクレオチドAは、(i) 基質に結合できる一つの基質結合アーム部分、(ii) 一つの部分的触媒コア部分、および(iii) 組織化助長因子分子に結合できる一つのセンサーアーム部分を含むように合成することができる。第二のオリゴヌクレオチドBは、(i) オリゴヌクレオチドAと同じ基質に結合でき、オリゴヌクレオチドBがオリゴヌクレオチドAの位置に隣接する位置で基質に結合する、一つの基質結合アーム、(ii) オリゴヌクレオチドAに組み入れられていない、DNAzyme触媒コア全体から由来の塩基を含む一つの部分的触媒コア部分、および(iii) オリゴヌクレオチドAと同じ組織化助長因子に結合でき、オリゴヌクレオチドBがオリゴヌクレオチドAの位置に隣接する位置で組織化助長因子に結合する一つのセンサーアーム配列を含むように合成することができる。この過程を繰り返し、かくして、パートザイムの構造およびドメインを組み入れたが、基質および組織化助長因子の存在下で触媒活性を持っても持たなくてもよい、一連のオリゴヌクレオチドAおよびBの対を生成することができる。
【０３１１】
次いで候補パートザイム対(一連のオリゴヌクレオチドAおよびBの対)の一部または全部を、パートザイムのセンサーアーム部分に相補的な組織化助長因子およびパートザイムの基質アーム部分に相補的である基質の存在下でインキュベートすることができる。インキュベーションは、部分的触媒コア配列が由来するDNAzymeによる基質の修飾に適合する条件の下で行われる。部分的配列が由来するDNAzymeと同種の修飾(例えば切断)を基質に対して行うことができるオリゴヌクレオチドAおよびBの対は、MNAzymeおよびMNAzyme複合体(右手下側の構造)に組織化できるパートザイムとして有用である。部分的触媒コアの配列は、新たなMNAzymeの他のパートザイムへの組み入れに適当である。新たな基質に(各パートザイムの基質結合ドメインを変化させることにより)および/または新たな組織化助長因子に(各パートザイムのセンサー結合ドメインを変化させることにより)合わせた、新たなパートザイムを合成することができる。
【０３１２】
第一および第二の基質に作用するMNAzyme、例えば単分子核酸酵素(例えばDNAzymeリガーゼ)から出発するMNAzymeリガーゼを設計するための方法で、類似の工程を必要とし、それによれば、第一の工程において、DNAzyme触媒コアのなかで、触媒コアの各一部分を二つの部分配列に割り振って、この二つの部分コアがともに触媒コア全体を構成できるように、分割できる位置を特定する。次いで二つのオリゴヌクレオチドAおよびB (候補パートザイム)を合成することができる。オリゴヌクレオチドAは、(i) 第一の基質に結合できる一つの基質結合アーム部分、(ii) 一つの部分的触媒コア部分、および(iii) 組織化助長因子分子に結合できる一つのセンサーアーム部分を含むように合成することができる。第二のオリゴヌクレオチドBは、(i) 第二の基質に結合できる一つの基質結合アーム、(ii) オリゴヌクレオチドAに組み入れられていない、DNAzyme触媒コア全体由来の塩基を含む一つの部分的触媒コア部分、および(iii) オリゴヌクレオチドAと同じ組織化助長因子に結合でき、オリゴヌクレオチドBがオリゴヌクレオチドAの位置に隣接する位置で組織化助長因子に結合する一つのセンサーアーム配列を含むように合成することができる。この過程を繰り返し、かくして、パートザイムの構造およびドメインを組み入れたが、基質および組織化助長因子の存在下で触媒活性を持っても持たなくてもよい、一連のオリゴヌクレオチドAおよびBの対を生成することができる。
【０３１３】
次いで候補パートザイム対(一連のオリゴヌクレオチドAおよびBの対)の一部または全部を、パートザイムのセンサーアーム部分に相補的な組織化助長因子およびパートザイムの基質アーム部分に相補的である二つの基質の存在下でインキュベートすることができる。インキュベーションは、部分的触媒コア配列が由来するDNAzymeによる基質の修飾(例えば連結)に適合する条件の下で行われる。部分的配列が由来するDNAzymeと同種の修飾(例えば連結)を基質に対して行うことができるオリゴヌクレオチドAおよびBの対は、MNAzymeおよびMNAzyme複合体に組織化できるパートザイムとして有用である。部分的触媒コアの配列は、他のMNAzymeのための他のパートザイムへの組み入れに適当である。新たな基質に(各パートザイムの基質結合ドメインを変化させることにより)および/または新たな組織化助長因子に(各パートザイムのセンサー結合ドメインを変化させることにより)合わせた、新たなパートザイムを合成することができる。
【０３１４】
さらに、類似の方法を用いて、成分パートザイムに組み入れることができる、DNAzyme触媒コアを割り振って得られた部分配列の変化に対する許容性を調べることもできる。例えば、例として挿入、欠失、代替のDNA塩基での置換、またはリボヌクレオチド、イノシン、もしくは他の類似体塩基などのDNA類似体での置換を含め、パートザイムに組み入れられる部分的触媒コアに対する修飾を行うことができる。次いで一つまたは複数の修飾を含む候補パートザイム対を上記のようにアッセイして、それらが、触媒的に活性なMNAzymeに組織化できるパートザイムへの組み入れに適当な部分的触媒コア配列の対を含むか否かを判定することができる。
【０３１５】
本発明の範囲を決して限定するものと解釈されるべきではない、以下の具体例を参照することによって、本発明をこれから、今まで以上に詳しくさらに記載する。
【０３１６】
実施例
実施例1:パートザイムBが二つの分子を含むMNAzymeの例
MNAzymeの基本設計に多くのバリエーションがあることが本発明において意図される。本実施例では、パートザイムAに由来する組織化助長因子と、二つの成分、すなわち、トランケートされたセンサーアームを有する一つのパートザイム成分とスタビライザーアームとして機能する一つのパートザイム成分とを含有するパートザイムBの存在下で、MNAzymeを組織化した。MNAzyme組織化は、パートザイムセンサーアームおよび組織化助長因子配列のワトソン・クリック塩基認識により起こる。以下の実施例では、トランケートされたアームおよびスタビライザーアームの使用を証明した。
【０３１７】
本実施例において使用したMNAzyme検出戦略を、図2(パネル(ii))および図3(i)に示した。
【０３１８】
この戦略に必要なオリゴヌクレオチドの一例を以下で説明する。
(a)パートザイムA；
(b)基質アーム、部分触媒コア、およびトランケートされたセンサーアームを含有する第一の成分；ならびに組織化助長因子にハイブリダイズし、パートザイムのトランケートされたセンサーアームに隣接する、第二のスタビライザーアーム成分を含む、パートザイムB。このスタビライザーアームは、パートザイムのトランケートされたセンサーアームが組織化助長因子にハイブリダイズするとMNAzyme組織化を助長するように設計されている；ならびに
(c)基質、例えば、レポーター基質。
【０３１９】
または、この戦略において有用なオリゴヌクレオチドは、パートザイムB；基質アーム、部分触媒コア、およびトランケートされたセンサーアームを含有する第一の成分；ならびに組織化助長因子にハイブリダイズすることができ、パートザイムのトランケートされたセンサーアームに隣接する、第二のスタビライザーアーム成分を含む、パートザイムAである。
【０３２０】
活性MNAzymeの組織化には、組織化助長因子が存在することも必要である。
【０３２１】
1.1.パートザイムオリゴヌクレオチドおよびスタビライザーアーム
本実施例において、パートザイムBのトランケートされたセンサーアームは、長さが5ヌクレオチドしかなかった。パートザイムAおよび二つのパートザイムB成分の配列(5'から3')を下に示した。以下の配列において、太字の塩基は、組織化助長因子とハイブリダイズし、下線の塩基は、組織化MNAzymeの触媒コアの一部を形成し、イタリック体の塩基は、基質にハイブリダイズする。「-P」は、そのオリゴヌクレオチドの3'リン酸化を示す。
2010523088.tif 000017
【０３２２】
1.2. レポーター基質
本実施例において使用したレポーター基質は、SubBi-2であった。SubBi-2は、その5'末端を6-FAM部分でおよびその3'末端をBHQ1部分で末端標識され、SubBi-2-FBと呼んだ。490nm(FAM励起波長)での励起と共に、520nm(FAM放射波長)でSubBi-2-FBの切断をモニターした。SubBi-2-FBの配列(5'から3')を下に示した。小文字の塩基はRNAを表し、大文字の塩基はDNAを表す。
SEQ ID NO:4 SubBi-2-FB:
2010523088.tif 000018
【０３２３】
1.3.組織化助長因子分子
組織化助長因子として使用した合成オリゴヌクレオチドの配列(5'から3')を下に示した。この組織化助長因子は、パートザイムBセンサーアームと完全にマッチした。標的の代わりに「無標的」対照としてヌクレアーゼ不含水を使用した。
SEQ ID NO:5組織化助長因子Xd-T:
2010523088.tif 000019
【０３２４】
1.4 反応条件
触媒活性MNAzymeによるレポーター基質の切断に起因する蛍光シグナルの増加により、組織化助長因子の検出を判断した。基質の添加により反応を開始し、全反応の総体積は50μLであった。反応は、FLUOstar OPTIMA(BMG Biotech)において55℃で行った。各反応の蛍光を、合計5分間、2秒ごとに読み取った。すべての反応は、200nM SubB1-2-FB、200nM XdA4/2-P、200nM XdB5/2-P、1xPCR Buffer II(Applied Biosystem)および25mM MgCl2を含有した。加えて、この反応は、表5に列挙するオリゴヌクレオチドを含有した。
【０３２５】
（表５）MNAzyme反応における追加の試薬
2010523088.tif 000020
【０３２６】
1.5 結果:パートザイムおよび組織化助長因子の存在下での活性MNAzyme組織化
組織化助長因子とパートザイムスタビライザーアーム成分を両方とも反応に含めたとき(反応(i):図3)、活性MNAzymeは組織化し、基質を切断して、経時的な蛍光の増加を示した。対照的に、組織化助長因子の非存在下では(反応(iii):図3)、蛍光は増加しなかった。さらに、スタビライザーアームの存在は、活性MNAzymeまたはMNAzyme複合体の形成に不可欠であることが明らかになった。組織化助長因子を含めてすべての反応成分を含有するが、スタビライザーアーム成分を欠く反応は、経時的な蛍光の増加をもたらさなかった(反応(ii):図3)。従って、安定なMNAzymeまたはMNAzyme複合体を形成するには5塩基のパートザイムBセンサーアームでは不十分であったが、スタビライザーアーム成分の存在が、パートザイムセンサーアームの短い長さ(トランケーション)を補い、ストリンジェントな温度条件(本実施例では55℃)のもとで安定なMNAzymeの形成を可能にすることが明らかになった。従って、このスタビライザーアーム成分は、トランケートされたセンサーアームを有するパートザイムを使用するこの系において、活性MNAzymeの組織化に不可欠なオリゴヌクレオチドである。
【０３２７】
さらに、パートザイムAおよび二つのパートザイムB成分を含有する反応において、パートザイムAセンサーアームに対して1ヌクレオチドミスマッチを有する代わりの組織化助長因子を含めたときには、蛍光シグナルは経時的に増加しなかった(データ示さず)。
【０３２８】
本実施例は、MNAzymeが、実験条件下で、完全にマッチする組織化助長因子の存在下でしか形成できないことを証明する。当業者であれば、活性MNAzymeと不活性な多成分核酸複合体との移行は、完全にマッチする組織化助長因子またはマッチしない組織化助長因子を設けることによって調節できることを理解するだろう。さらに、本実施例は、トランケートされたセンサーアームを含有する第一の分子および第二のスタビライザーアーム分子を含む、二成分パートザイムの使用を証明する。このような系ではスタビライザーアーム分子の存在が必要なことから、MNAzyme組織化を調節することができる別のツールが得られる。
【０３２９】
複数のオリゴヌクレオチド成分を含有するMNA複合体によって、大きな柔軟性が得られる。複数のオリゴヌクレオチド成分の配列は、融解温度、配列組成、および他の成分オリゴヌクレオチドとの相補性またはその欠如に関して調整することができる。トランケートされたアーム、スタビライザーアームを有するパートザイム成分、および組織化助長因子成分を含むが、これに限定されない、配列が短ければ短いほど、本発明のこの局面において特に有用である。本実施例は切断活性を有するMNAzymeを使用するが、MNAzymeまたはMNAzyme複合体に類似する構造設計が、切断以外の改変を引き起こすMNAzyme、例えば、連結可能なMNAzymeにおいて使用できると理解されるだろう。
【０３３０】
実施例2:リガーゼ活性を有するMNAzymeを用いた標的分析物の検出
少なくとも二つの基質を改変することができるMNAzymeの一例、例えば、リガーゼ活性を有するMNAzymeを、核酸標的の検出に使用することができる。リガーゼ活性を有するMNAzymeは、活性のある部分触媒コアのペア、例えば、実施例7に示す7Q10 DNAzymeまたは実施例9に示す7Z81 DNAzymeに由来する活性のある部分触媒コアのペアを含む二つのパートザイムから組織化することができる。パートザイムは、活性MNAzymeリガーゼの組織化助長因子として働くことができる標的核酸に相補的なセンサーアームを有してもよい。この基質アームは、適切な末端を有する連結可能な配列を含有する二つの基質分子に相補的なものでもよい(例えば、表4)。
【０３３１】
5'連結基質および3'連結基質がそれぞれフルオロフォア色素およびクエンチャー色素で標識されていれば(または逆もまた同じである)、連結が起こると、標的核酸が存在する指標として役立ち得る蛍光の減少が起こる。別の形式では、5'連結基質が検出可能な部分、例えば、フルオロフォアで標識され、3'連結基質が別個の位置、例えば、チップ上に取り付けられていれば、連結が起こると、標的核酸の存在下で別個の位置でシグナルが出現する。
【０３３２】
MNAzymeが、標的リガンドに特異的に結合することができるアプタマー配列を含有する、リガーゼ活性を有するアプタ-MNAzymeであれば、この戦略は他のリガンドの検出にも使用することができる。
【０３３３】
さらに、標的分析物の存在下でのMNAzymeによる二つの基質の連結は、カスケード反応における第一の段階を構成することができる。
【０３３４】
実施例3:活性MNAzymeまたはMNAi複合体の組織化を助長および阻害するための機構
MNAzymeは、1つまたは複数の組織化助長因子の存在下で組織化して、活性のある酵素を形成するパートザイムからなる(例えば、図1、2、4(右側パネル)、ならびに図5(iおよびii))。パートザイムセンサーアームに結合する組織化助長因子は標的分析物でもよく、MNAzymeが組織化するように反応混合物に添加される合成核酸分子でもよい。活性MNAzyme組織化に寄与する能力に加えて、パートザイムは「活性阻害因子」分子とハイブリダイズすると、不活性な非触媒MNAi複合体に組織化することができる(図4(左側パネル)および図5(iii)。様々な代わりのオリゴヌクレオチド配列を、活性MNAzymeまたは不活性MNAi複合体の組織化を調節する能力について試験した。
【０３３５】
(図4および図5に図示した) 本実施例では、(i)一つの分子(組織化助長因子F1/2)または(ii)二つの分子(組織化助長因子成分F1および組織化助長因子成分F2。これらの配列は共に助長因子F1/2に存在する配列を含む)の存在下でMNAzyme組織化を調べた。助長因子F2は、一方のパートザイムのセンサーアーム全体に結合し、他方のパートザイムのセンサーアームの4塩基対に結合するように、はみ出している。別の反応では、助長因子F2の配列を含む配列と、さらなる活性阻害因子ドメインを有する「活性阻害因子」分子を、不活性MNAi複合体が組織化するように反応を動かす能力について試験した。
【０３３６】
3.1 パートザイムオリゴヌクレオチド
パートザイムAおよびパートザイムBの配列(5'から3')を下に示した。以下の配列において、太字の塩基は、組織化助長因子とハイブリダイズし、下線の塩基は、組織化MNAzymeの触媒コアの一部を形成し、イタリック体の塩基は、基質にハイブリダイズする。「-P」は、そのオリゴヌクレオチドの3'リン酸化を示す。
2010523088.tif 000021
【０３３７】
3.2 レポーター基質
本実施例のレポーター基質は、以下の配列、5'から3'を有するSubBi-2-FBであった。SubBi-2-FBは、その5'末端を6-FAM部分でおよびその3'末端をBHQ1部分で末端標識した。485nm(FAM励起波長)での励起と共に、530nm(FAM放射波長)でSubBi-2-FBの切断をモニターした。小文字の塩基はRNAを表し、大文字の塩基はDNAを表す。
2010523088.tif 000022
【０３３８】
3.3 制御因子オリゴヌクレオチド
本実施例では、MNAzymeおよび/またはMNAi複合体の組織化を調節する能力について、いくつかの分子を試験した。組織化助長因子F2を構成する配列を助長因子F1/2および活性阻害因子の配列の中にも含めた。組織化助長因子F2を構成する配列は太字で下線を引いた配列である。
2010523088.tif 000023
【０３３９】
3.4 反応成分およびMNAzyme活性のモニタリング
MNAzyme活性のリアルタイムモニタリングは、BMG LabTech FluoStar蛍光光度計において総反応体積50μLで行った。反応は、55℃で4分間、等温的にモニターした。反応は、1xPCR Buffer II(Applied Biosystems)、25mM MgCl2、200nMのパートザイムA RO5A4/2-P、200nMのパートザイムB RO5B5/2-Pと、(i)400nMの組織化助長因子F1/2、もしくは(ii)400nMの組織化助長因子成分F1および400nMの組織化助長因子成分F2、もしくは(iii)400nMの活性阻害因子および400nMの組織化助長因子成分F1を含有するか、または(iv)組織化助長因子を含有しない反応混合物に、蛍光基質SubBi-2-FB(10μlの1μM溶液)を注入することによって開始した。
【０３４０】
3.5 結果:
様々な調節成分または構造成分オリゴヌクレオチドの組み合わせを用いた結果を図5に示す。組織化助長因子F1/2(図5(i))、または組織化助長因子成分F1およびF2(図5(ii))を含有する反応では、高レベルのMNAzyme切断活性を示す、迅速な蛍光シグナルの増加が見られた。助長因子の非存在下では、経時的な蛍光の増加は観察されなかった(図5(iv))。このことから、組織化助長因子は、常に、壊れていないオリゴヌクレオチドである必要はなく、パートザイムのセンサーアームの1つの上に互いに隣接して並ぶ複数のさらに短い助長因子成分に分割できることが証明される。
【０３４１】
活性阻害因子および助長因子F1を含有する反応では、蛍光シグナルの増加は経時的に観察されなかった(図5(iii))。活性阻害因子分子は助長因子F2の配列を含むので、助長因子F2に隣接する、付加した非相補的な阻害配列が、不活性MNAi複合体の組織化を動かす要素である。MNAi複合体は基質に結合することができるが、基質を触媒的に改変することができない。結果として、基質は切断されず、蛍光はMNAi複合体の存在下で経時的に増加しなかった(図5(iii))。組織化助長因子成分F1およびF2を含有する反応(図5(ii))と、組織化助長因子F1および(F2配列を組み込んでいる)活性阻害因子を含有する反応(図5(iii))とを比較すると、活性阻害因子内での阻害性ドメインの存在は、不活性MNAi複合体を組織化し、活性MNAzymeの形成を阻止することによって、酵素活性を調節するツールを提供できることが証明される。
【０３４２】
このように、組織化助長因子F1/2の存在下で形成するように設計されたMNAzymeは蛍光を発した。この実施例では、組織化助長因子F1/2は二つの部分(組織化助長因子成分F1およびF2)に分割することができ、触媒活性MNAzymeの組織化を誘導する能力を保持していることが証明された。二つの組織化助長因子成分はパートザイムセンサーアーム上に互いに隣接して結合すれば、活性MNAzymeの形成を安定化し、蛍光を引き起こすことができる。同一の反応条件下で行われた後の実験から、組織化助長因子成分F2のみの存在下では、経時的な蛍光の増加は観察されないことが証明された(データ示さず)。従って、本実施例では、パートザイムが活性MNAzymeに組織化するには、多成分の組織化助長因子が存在することが必要な場合があることが証明される。多成分組織化助長因子が必要な場合、これらの成分の1つまたは複数の有無を用いて、活性MNAzymeの組織化を制御し、従って、活性MNAzymeをスイッチオンおよびスイッチオフすることができる。
【０３４３】
さらに、活性阻害分子がパートザイムにハイブリダイズし、酵素活性に必要な、パートザイムセンサーアーム上の二つの組織化助長因子成分の接合部にある二次構造を破壊することによって、MNAzyme組織化を阻止できることが発見された(例として、図4および図5を参照されたい)。パートザイムAまたはBのいずれかにハイブリダイズするように、およびパートザイムのセンサーアームまたは基質アームのいずれかにハイブリダイズするように阻害分子を設計できることが、当業者により理解されるだろう。
【０３４４】
活性阻害因子、パートザイムスタビライザーアーム成分、および組織化助長因子、またはそれらの成分を含む分子は、活性MNAzymeおよび不活性MNAi複合体の組織化を調節するのに使用することができる。活性化状態(MNAzyme)と不活性化状態(MNAi複合体)とが移行できるので、活性コンホメーションと不活性コンホメーションを交替することによって調節可能な分子スイッチを作り出す機構が得られる。このような分子スイッチは、核酸複製カスケードの制御、または分子スケールの自律的な治療用装置、診断用装置、および計算用装置の調節に適用することができる。特定のオリゴヌクレオチド成分の解離を誘導するのに使用することができる様々なプロトコールが本文書全体を通じて議論される。
【０３４５】
実施例4:アデノシン5'-三リン酸などの低分子を含む非核酸分析物を検出するためのMNAzymeの適用
アプタマーは、高い親和性および特異性で標的分析物に結合する能力を獲得するように、大きなランダム配列オリゴヌクレオチドプールからインビトロで進化させた一本鎖のDNA分子またはRNA分子である。アプタマーは、タンパク質、炭水化物、脂質、ヌクレオチド、全細胞、およびウイルスを含む多くのタイプの分析物に特異的に結合する能力について選択されている。本実施例では、活性アプタ-MNAzymeが活性化因子リガンドの存在下でしか形成されない形にして、アプタマー配列をパートザイム(アプタ-パートザイム)の末端に組み込んだ。図7に示した以下の実施例に用いられる戦略を含めて、この目的を達成する方法がいくつかある。
【０３４６】
この例示的なアプタ-MNAzyme検出戦略に含まれる核酸オリゴヌクレオチドを図7に示した。これらの核酸オリゴヌクレオチドには、以下が含まれる:
(a)パートザイム；
(b)一端にアプタマーが組み込まれたパートザイムである、アプタ-パートザイム；
(c)活性MNAzymeの組織化を可能にする、アプタ-パートザイムおよびパートザイムの両方に結合する組織化助長因子；
(d)基質、例えば、レポーター基質；ならびに
(e)アプタマー配列の少なくとも一部およびパートザイム配列の基質結合アームの少なくとも一部に及ぶアプタ-パートザイム領域にハイブリダイズする、組織化阻害オリゴヌクレオチド。
【０３４７】
活性化因子リガンドの非存在下では(図7、パネル(i))、組織化阻害オリゴヌクレオチドはアプタ-パートザイムに結合し、従って、アプタ-パートザイムが基質に結合するのを阻止する。活性化因子リガンドの存在下では(図7、パネル(ii))、活性化因子リガンドはアプタ-パートザイムのアプタマー配列と相互作用することができ、従って、組織化阻害因子の結合を阻止し、活性アプタ-MNAzymeが組織化して、基質に結合し、切断するのを可能にする。従って、アプタ-MNAzymeは活性化因子リガンドの存在下のみ形成し、蛍光シグナルを発することができる。
【０３４８】
この戦略を、低分子であるATPの検出を用いて証明した。本実施例において使用した27ヌクレオチド長のアプタマー配列は、ATPおよびdATPの結合に対する特異性が高いと以前に報告されている(Achenbach, et al 2005, Huizenga and Szostak, 1995)。
【０３４９】
4.1 パートザイムオリゴヌクレオチド、組織化助長因子、および阻害オリゴヌクレオチド
本実施例では、アプタ-パートザイム分子を作製するために、ATPアプタマー配列をパートザイムの基質アームに隣接して配置した(図7)。アプタ-パートザイムおよび別のパートザイムのセンサーアームは、標的または調節分析物が存在するときにMNAzymeを組織化する反応に含まれる合成組織化助長因子に結合するように設計した。アプタ-パートザイムAtpA2/1およびパートザイムAtpB3/1の配列(5'から3')を下に示した。以下の配列において、太字の塩基は、組織化助長因子とハイブリダイズし、下線の塩基は、組織化MNAzymeの触媒コアの一部を形成し、イタリック体の塩基は、基質にハイブリダイズする。加えて、パートザイムAtpA2/1中の普通の活字の塩基は、ATPまたはdATPに結合することができるDNAアプタマー配列を示す。
2010523088.tif 000024
【０３５０】
組織化助長因子の配列(5'から3')を下に示した。
2010523088.tif 000025
【０３５１】
「組織化阻害因子」オリゴヌクレオチドの配列(5'から3')を下に示した。
2010523088.tif 000026
【０３５２】
4.2 レポーター基質
アプタ-MNAzyme活性は、二重標識核酸レポーター基質の切断によりモニターした。本実施例のレポーター基質は、下記の配列、5’から3’を有するSubBi-1-FBである。小文字の塩基はRNAを表し、大文字の塩基はDNAを表す。下線の塩基は、その5’末端の6-FAM部分およびその3’末端のBHQ1部分の位置を示す。490nm(FAM励起波長)での励起と共に、520nm(FAM放射波長)で、FAMとBHQ1の間のSubBi-1-FBリボヌクレオチドの切断に起因する蛍光の変化をモニターした。
2010523088.tif 000027
【０３５３】
4.3標的分析物または調節分析物および対照分子
本実施例のために使用した活性化因子リガンドは、アデノシン5'-三リン酸(ATP)およびデオキシアデノシン5'-三リン酸(dATP)であった。グアノシン5'-三リン酸(GTP)およびシトシン5'-三リン酸(CTP)を負の対照分子として使用した。すべての分子をBiolineから購入した。ヌクレアーゼ不含水を無分析物対照として使用した。
【０３５４】
4.4 反応条件
活性化因子リガンドの存在は、触媒活性アプタ-MNAzymeによるレポーター基質の切断によって引き起こされる蛍光シグナルの増加によって測定した。基質の添加により反応を開始させ、全反応の総体積は50μLであった。基質を注入する前に、(二次構造を減少させるために)すべての反応物を60℃で5分間プレインキュベートした。反応は、FLUOstar OPTIMA(BMG Biotech)において47℃で行った。各反応の蛍光を、合計10分間、3秒ごとに読み取った。各反応は、最終濃度200nM AtpA2/1、200nM AtpB3/1、200nM AtpC/1、200nM AtpR/1、200nM SubBi-1-FB、25mM MgCl2、50mM Tris HCl pH7.5、および2mMのATP、dATP、GTP、CTPのいずれかを含有したか、または分析物を含有しなかった(水対照)。
【０３５５】
4.5 結果:SubBi-1-FBレポーター基質の検出および切断
ATPまたはdATPの非存在下では、低レベルの蛍光が見られ、それは経時的に増加しなかった。これは、ATPの非存在下では、組織化阻害因子が活性アプタ-MNAzyme複合体の組織化を阻止したことを証明している。ATPまたはdATPの存在下では、蛍光シグナルは、より高く、それが経時的に増加した。これは、阻害オリゴヌクレオチドがdATPおよびATPによって置換され、活性アプタ-MNAzymeが形成されたことを示している。アプタ-MNAzymeの組織化は、リガンド依存的であった。GTPまたはCTPの存在下では、低レベルの蛍光が見られ、それは経時的に増加しなかった。GTPまたはCTPの存在下で観察された蛍光は、ATPまたはdATPの非存在下、すなわち無リガンドの水対照の場合で観察された蛍光と似ていた。本実施例は、標的分析物に非常に特異的なアプローチで分析物を検出するために、MNAzymeをアプタマーに連結できることを証明している。さらに、本実施例は、組織化阻害因子分子がアプタ-MNAzymeの組織化を制御するのに使用できることと、分子、例えば、ATPが、この系において活性化因子リガンドまたは分子制御因子として役立ち得ることを証明している。
【０３５６】
当業者であれば、この戦略の設計には柔軟性があると理解するだろう。例えば、アプタマーは、部分触媒コア配列を含有する二つのパートザイムの一端(5’または3’)に組み込むことができる。従って、組織化阻害因子は、アプタマー領域と(基質に結合する)基質アームに結合してもよく、アプタマー領域と(組織化助長因子に結合する)センサーアームに結合してもよい。前者の設計(図7および本実施例)では、阻害因子は基質の結合を遮断する。後者の設計では、阻害因子は組織化助長因子とアプタ-パートザイムの結合を阻止し、従って、活性MNAzymeの組織化を阻止する。
【０３５７】
本文献は、多くのタイプの分析物を検出することができる多数のアプタマーの配列を含む。これらには、タンパク質、炭水化物、脂質、プリオン、ヌクレオチド、全細胞、およびウイルスが含まれる。これらすべてのタイプの分析物に対するアプタマーをパートザイムに連結させて、非常に多岐にわたる範囲の分子を検出することができる。アプタマー(またはアプタ-パートザイム)への分析物の結合とMNAzymeによるレポーター基質の切断の両方に適合した反応条件(バッファー、温度、二価カチオン濃度など)は、経験的試験によって決定することができる。
【０３５８】
MNAzyme活性は、組織化阻害因子を除去または添加することによって調節することができる。オリゴヌクレオチド配列、融解温度、および/または濃度を変えると、さらに細かい調節が可能になる。MNA内での組織化阻害因子のハイブリダイゼーションは、塩濃度、カチオン濃度、温度、および添加物(例えば、DMSO)の有無を含むが、これに限定されない多くの要因の影響を受ける。従って、ハイブリダイゼーションに影響を及ぼす実体があると、MNAzymeの組織化および解体を制御するツールを得ることができる。
【０３５９】
組織化助長因子は、成分の物理的操作によって除去することができる。これは、例えば、分子「フック」として取り付けられた部分の物理的性質を利用することによって、および/またはオリゴヌクレオチドの固有の特性、例えば、負電荷もしくは配列相補性を利用することによって実現することができる。
【０３６０】
MNAzymeおよびアプタ-MNAzymeは、核酸標的および/または非核酸リガンドを含む標的分析物の分析に使用することができる。さらに、MNAzymeおよびアプタ-MNAzymeは、(本実施例において証明されたように)直接的な検出形式で分析物を検出するのに使用されてもよく、核酸酵素カスケード反応において使用されてもよい。1つの態様では、MNAzymeおよび/またはアプタ-MNAzymeは、カスケードの第一の工程を容易にすることができる。1つの態様では、核酸カスケードは、MNAzymeの組み合わせ、または、例えば、切断および/もしくは連結によって1つもしくは複数の基質を改変することができるMNAzyme およびDNAzymeの組み合わせを使用することができる。
【０３６１】
実施例5:リガーゼ活性を有する核酸酵素および切断活性を有する核酸酵素を用いたカスケード反応
二つの核酸酵素の触媒活性を利用したカスケード反応および/または分子スイッチに含めるのに有用な反応を図8において概説した。一方の反応は、2',3'環式リン酸基を有する5'基質と5'ヒドロキシルを有する3'基質を連結して、二つの基質の接合部に非天然2'-5'結合を有する連結産物を形成することができる、DNAzymeリガーゼによって媒介されてもよい。このようなDNAzymeリガーゼの例は当技術分野において公知である(表4の要約を参照されたい)。他方の反応は、連結産物を基質として使用することができ、連結によって作り出された非天然2'-5'結合を切断することができる、MNAzyme切断因子(cleaver)によって媒介されてもよい。切断によって、二つの切断産物、2',3'環式リン酸基末端を有する5'産物と5'-ヒドロキシル末端を有する3'産物を生成することができる。次に、切断産物の一方または両方は、DNAzymeリガーゼの基質として役立つことができる。
【０３６２】
または、反応は、2',3'-ジオールを有する5'基質と5'-三リン酸末端を有する3'基質を連結して、二つの基質の接合部に天然3'-5'結合を有する連結産物を形成することができる、DNAzymeリガーゼによって媒介されてもよい。このようなDNAzymeリガーゼの例は当技術分野において公知である(表4の要約を参照されたい)。他方の反応は、連結産物を基質として使用することができ、連結によって作り出された天然3'-5'結合を切断することができる、MNAzyme切断因子によって媒介されてもよい。切断によって、二つの切断産物、2',3'環式リン酸基末端を有する5'産物と5'-ヒドロキシル末端を有する3'産物を生成することができる。次に、切断産物の一方または両方は、このような末端を連結できるDNAzymeリガーゼの基質として役立つことができる。
【０３６３】
または、切断活性を有するMNAzymeは、二つの連結可能な基質の接合部にない連結産物内の部位が切断部位の必要条件を満たしていれば、二つの連結可能な基質の接合部にない連結産物内の部位を切断することができる。
【０３６４】
好ましい形式(図8)において、DNAzymeリガーゼは、第一のオリゴヌクレオチド(オリゴ1)が2',3'環式リン酸基を有し、第二のオリゴヌクレオチド(オリゴ2)が5'-ヒドロキシル末端を有するのであれば、オリゴ1をオリゴ2に連結して、第三の連結産物(LP)オリゴヌクレオチド(オリゴ3)を作り出すことができる。次に、LP-オリゴ3は、MNAzymeによって切断されて、切断産物(CP)、CP-オリゴ1およびCP-オリゴ2になることができる。従って、さらなるラウンドの連結に参加できる、2',3'環式リン酸基を有するオリゴヌクレオチドと、5'-ヒドロキシル末端を有するオリゴヌクレオチドが再生される。
【０３６５】
多重形式では、数種類のオリゴヌクレオチド、例えば、それぞれ、2',3'環式リン酸基および5'-ヒドロキシル末端を有する4種類のオリゴヌクレオチドを、DNAzymeリガーゼのシリーズによって連結して、16種類の独特の新しいLP配列(すなわち、それぞれ、オリゴヌクレオチド1、2、3、および4が組み合われたもの)にすることができる。次いで、MNAzymeのシリーズが、LP-オリゴ1からLP-オリゴ16を切断して、今からCP-オリゴ1、CP-オリゴ2、CP-オリゴ3、およびCP-オリゴ4と呼ぶ成分オリゴヌクレオチドにすることができる。または、切断活性を有するMNAzymeは、二つの連結可能な基質の接合部にないLP内の部位が切断部位の必要条件を満たしていれば、二つの連結可能な基質の接合部にないLP内の部位を切断することができる。このシナリオでは、オリゴヌクレオチド配列の複合混合物を作り出し、シャッフルし、および/または再配置することができる。
【０３６６】
図8に(示したように)一組のMNAzymeが一定の組織化助長因子を用いてもよく、および/またはMNAzymeは、前の連結ラウンドからのLP配列を組織化助長因子として用いてもよい。従って、オリゴヌクレオチドの連結によって生じた新たな情報(入力)データは、MNAzymeにより認識する「読み出す」ことができる。次いで、MNAzymeは、新たな出力産物および/または情報を生じるように切断する「書き込む」ことができる。MNAzymeが入力LPを読み出し、次いで、出発分子のプールに元々あるCP-オリゴ以外のCP-オリゴに切断することができるシステムは、新たな出力配列を書き直す、または再コード化するのに使用することができる。
【０３６７】
ある態様では、DNAzymeによる連結は、例えば、新たな組織化助長因子またはその成分を作ることによって、入力データを「書き込む」ことができる。MNAzymeは、組織化助長因子の中にコード化された情報を、パートザイムセンサーアームを用いて送ることによって、そのデータを「読み出す」ことができる。次いで、MNAzymeは、データ、例えば、新たな配列(例えば、切断産物)を「書き込ん」で、新たな出力データを作り出すことができる。次いで、この新たな出力データは、DNAzymeリガーゼが(例えば、DNAzymeリガーゼの連結基質として役立つように、MNAzyme切断産物の適性を確かめることによって)「読み出す」ことができる。
【０３６８】
他の態様では、MNAzymeによる切断は、入力データを、例えば、新たな連結可能な基質を作り出すことによって「書き込む」ことができる。DNAzymeリガーゼは、基質結合アームを用いて、基質内にコード化された情報を送ることによって、そのデータを「読み出す」ことができる。次いで、DNAzymeリガーゼは、例えば、新たな連結産物配列を作ることによって、データを「書き込む」ことができる。新たな連結産物は、活性MNAzyme切断因子の形成に必要な成分として役立ってもよい。例えば、新たな連結産物は、新たな組織化助長因子またはその成分として役立ってもよい。このように、連結産物は新たな出力データを提供することができ、次いで、新たな出力データは、MNAzyme切断因子が(MNAzyme切断因子の組織化助長因子または組織化助長因子成分として役立つように、DNAzyme連結産物の適性を確かめることによって)「読み出す」ことができる。
【０３６９】
従って、このMNAzyme/DNAzymeリガーゼカスケードは自動機械を形成することができる。このような装置は、規定された手順に従って、情報をある形から別の形に変換することができる。この場合、手順は、MNAzymeおよびDNAzymeリガーゼの基質アームおよび/またはセンサーアームによってコード化および指示される。
【０３７０】
DNAおよびタンパク質酵素(制限エンドヌクレアーゼおよびリガーゼ)用いて、計算問題を解くことができる自動機械が、Benenson et al, 2001によって開発された。カスケード反応において、制限エンドヌクレアーゼは二本鎖DNAを切断し、タンパク質リガーゼは切断産物を連結した。タンパク質酵素は「ハードウェア」として役立ち、DNAは「ソフトウェア」をコード化した。この入力および自動機械は、適切なDNAソフトウェア配列を選択することによってプログラムされた。自動機械は、制限エンドヌクレアーゼによる切断、ハイブリダイゼーション、および連結のサイクルからなるカスケードによって進行して、自動機械の最終状態をコード化した検出可能な出力分子、従って、計算結果を生じた(Benenson et al, 2001)。
【０３７１】
DNAzymeリガーゼ/MNAzymeカスケードは、Benenson et al (2001)が用いたカスケードと同じように使用することができ、従って、計算問題を解くことができる装置を提供することができる。Benensonの装置とは異なり、DNAzymeリガーゼ/MNAzymeカスケードは、同じ結果を得るためにタンパク質酵素を必要としない。Benensonの装置は二本鎖DNAによってプログラムされたが、DNAzymeリガーゼ/MNAzymeカスケードは、例えば、初期入力オリゴヌクレオチド、MNAzymeの基質アームおよび/またはセンサーアーム、ならびにDNAzymeリガーゼの基質アームを含む様々な配列によってコード化されるだろう。
【０３７２】
別の態様では、DNAzymeリガーゼ/MNAzymeカスケードはまた、分子ライブラリーを構築する、および/または分子ライブラリーの多様性を増加させる方法としてオリゴヌクレオチド配列を「シャッフル」するのに使用することもできる。
【０３７３】
ある態様では、DNAzymeリガーゼは、MNAzymeおよび/または不活性MNAの成分を作り出すか、または破壊するのに使用することができる。例として、DNAリガーゼは、「組織化助長因子成分」に「活性阻害因子」を取り付けて、MNAi複合体を組織化することができる(「オフ」状態)。または、DNAzymeリガーゼは、センサーアームまたは基質アームをパートザイム成分に取り付けて、組織化を促進することによってMNAzymeの「オン」スイッチを作り出すことができる。別の態様では、DNAzymeリガーゼは、オリゴヌクレオチドを選択的に捕捉することができる部分、例えば、ビオチン基で標識された配列に取り付けられてもよく、この部分は、ハイブリダイゼーションの電子遠隔制御を容易にするために、高周波磁場ラジオ(radio-frequency magnetic field radio)を含有してもよい。このアプローチを用いると、酵素活性の活性化または阻害を可能にする成分分子を選択的に取り出すことができるだろう。例えば、MNAi複合体から活性阻害因子を選択的に変性して、活性MNAzyme状態に移行させることができる。
【０３７４】
本実施例において使用したDNAzymeリガーゼ(図8に示した)は、MNAzymeリガーゼ(図11に示した)と交換できることが理解されるだろう。
【０３７５】
実施例6:複数の核酸酵素の活性、本実施例では具体的には、核酸基質を切断するMNAzymeおよび核酸基質を連結するDNAzymeの活性を利用した反応の証明。あるタイプの核酸酵素により作り出された切断産物または連結産物は、次の核酸酵素反応に関与する新たな基質または酵素成分を形成する。
本実施例において使用した戦略を図9に示した。本実施例は、(i)標的核酸を用いて、基質(MNAzyme基質A)を切断できるMNAzyme(MNAzyme A)の形成を誘導して、リガーゼ活性を有するDNAzymeBの基質として使用可能な5'切断産物Aを作製すること；(ii)DNAzymeリガーゼBを用いて、工程(i)において作製された5'切断産物Aを別のオリゴヌクレオチド連結基質と連結して、新たなパートザイムを作り出すこと；および(iii)工程(ii)において作製された新たなパートザイム/連結産物を用いて、基質(MNAzyme基質C)を切断できる新たなMNAzyme(MNAzyme C)を形成することを証明する。本実施例では、MNAzyme基質Cをフルオロフォア色素およびクエンチャー色素ペアで標識することによって、反応を蛍光モニタリングした。
【０３７６】
本実施例において使用したDNAzymeリガーゼBは、2',3'環式リン酸基および5'-ヒドロキシル基からの2'-5'ホスホジエステル結合の形成によりRNAを連結することが以前に報告されている(Prior et al, 2004)。5'基質と2',3'環式リン酸基末端が必要なことに加えて、本実施例において使用したDNAzymeリガーゼは、連結接合部に、ある特定の配列モチーフ、ua＊g(AまたはG)(小文字はRNA塩基を表し、大文字はRNAまたはDNA塩基を表し、＊は連結部位を表す)も必要とする。
【０３７７】
第一の工程において、MNAzyme Aは標的核酸の存在下で形成され、MNAzyme基質A(preSub5)を切断して、2',3'環式リン酸基末端を有する切断断片を作製するのに用いられる。次いで、第二の工程において、DNAzymeリガーゼは、5'産物A(preSub5切断断片)と別のオリゴヌクレオチド連結基質(preSub3)を連結するのに用いられる。第三の工程において、連結産物は新たなパートザイムとして機能する。新たなパートザイムは第二のパートザイムおよび組織化助長因子と一緒になってMNAzyme Cを形成し、蛍光標識された基質C(SubBi-2-FB)を切断することができる。
【０３７８】
6.1 DNAzymeリガーゼB
DNAzymeリガーゼとして働くDNAオリゴヌクレオチド配列を以下に示した。
2010523088.tif 000028
【０３７９】
6.2 パートザイムオリゴヌクレオチド
以下の配列において、太字の塩基は、標的核酸配列とハイブリダイズし、下線の塩基は、組織化MNAzymeの触媒コアの一部を形成し、イタリック体の塩基は、基質にハイブリダイズする。
【０３８０】
以下は、MNAzyme Aの成分を形成するパートザイムの配列である。
2010523088.tif 000029
【０３８１】
以下の配列は、連結産物/パートザイムと会合してMNAzyme Cの成分を形成するパートザイムに対応する。
2010523088.tif 000030
【０３８２】
6.3 MNAzyme基質A(MNAzyme Aの基質)
以下の配列において、小文字の塩基はRNAを表し、大文字の塩基はDNAを表す。
2010523088.tif 000031
【０３８３】
6.4 DNAzymeリガーゼ基質
以下の配列において、小文字の塩基はRNAを表し、大文字の塩基はDNAを表す。3'DNAzymeリガーゼ基質は、以下の配列および5'ヒドロキシル基を有するように合成した。
2010523088.tif 000032
【０３８４】
6.5 MNAzyme基質C(MNAzyme Cの蛍光レポーター基質)
本実施例において使用したレポーター基質は、SubBi-2であった。本実施例において、SubBi-2は、その5'末端を6-FAM部分でおよびその3'末端をBHQ1部分で末端標識し、SubBi-2-FBと呼んだ。490nm(FAM励起波長)での励起と共に、520nm(FAM放射波長)でSubBi-2-FBの切断をモニターした。SubBi-2-FBの配列(5'から3')を下に示した。小文字の塩基はRNAを表し、大文字の塩基はDNAを表す。
2010523088.tif 000033
【０３８５】
6.6 MNAzyme Aの標的配列
MNAzyme Aにより認識される標的配列は、ヒトミクロRNAであるmiR-20 RNA配列と相同な合成DNAオリゴヌクレオチドであった。標的配列は、以下の配列を有した。
2010523088.tif 000034
【０３８６】
6.7 MNAzyme Cの組織化助長因子
MNAzyme C形成に必要な組織化助長因子は、以下の配列を有する合成DNAオリゴヌクレオチドであった。
2010523088.tif 000035
【０３８７】
6.8 反応条件
反応は、下記のように、3個の別々のチューブにおいて、3つの連続した工程(i)、(ii)、および(iii)で行った。
(i)必要とされる2',3'環式リン酸基末端を有する5'切断産物/リガーゼ基質を作製するために、総反応体積100μlで、preSub5をMNAzyme Aによって40℃で1時間切断した。反応は、500nM preSub5、50mM Tris HCl(25℃でpH9.0)、25mM MgCl2と、
(a)MNAzymeのパートザイムA(100nM miR20A2/1および100nM miR20B3/1)および100nMのD-20標的を含有するか、または
(b)追加のオリゴヌクレオチドを含有しなかった(非切断対照)。
(ii)総反応体積25μlで、連結を40℃で2時間行った。反応は、前の切断反応混合物(i-a)または(i-b)10μl、200nM preSub3、150mM NaCl、2mM KCl、50mM Tris HCl(25℃でpH9.0)および40mM MgCl2と、
(a)200nMのDNAzymeリガーゼ7Z81-10/10を含有したか、または
(b)追加のオリゴヌクレオチドを含有しなかった(非連結対照)。
(iii)連結によって形成されたパートザイムが媒介するMNAzyme切断による終点蛍光検出を、Cepheid Smartcyclerによって55℃で45分間、等温的に行った。蛍光標識された基質SubBi-2-FBの添加により反応を開始した。反応は、総反応体積25μlで、前の連結反応混合物10μl、200nMのパートザイムSTB5/2(21)、200nMのMNAzyme C組織化助長因子、50mM Tris HCl(25℃でpH9.0)、25mM MgCl2、および200nMの基質SubBi-2-FBを含有した。
【０３８８】
以下のオリゴヌクレオチド試薬を含有した反応(表6)について、MNAzyme基質C(SubBi-2-FB)の切断による蛍光の増加を経時的にモニターした。
【０３８９】
（表６）MNAzyme基質C(SubBi-2-FB)の切断による蛍光の増加を経時的にモニターした
2010523088.tif 000036
【０３９０】
反応1、2、および3の工程(iii)について、経時的な蛍光の増加を測定した(表6)。反応1は、工程(i)、(ii)、および(iii)のすべてのオリゴヌクレオチド反応成分を含有し、経時的な蛍光の増加を示した。対照的に、反応2は、工程(i)について、MNAzyme Aオリゴヌクレオチドパートザイム成分とMNAzyme Aの標的配列が両方とも無く、経時的な蛍光の増加を示さなかった。同様に、反応3は、工程(ii)に必要なDNAzymeリガーゼオリゴヌクレオチドが無く、経時的な蛍光の増加を示さなかった。これらの反応は共に、以下の事象が反応1において起こったことを示している。
【０３９１】
第一に、MNAzyme Aは、特定の標的(D-20)の存在下でMNAzyme基質Aを切断して、二つの断片を生成した。二つの断片は、一方は、2',3'環式リン酸基末端のある配列CTGTAGCACTCACTAua(SEQ ID NO: 40)を有する5'断片である。第二に、この5'断片は、工程(ii)の反応混合物中に存在する第二のオリゴヌクレオチドリガーゼ基質と連結され、この結果、
2010523088.tif 000037
の配列を有する新たなオリゴヌクレオチド(連結産物)が形成された(大文字はDNA塩基を表し、小文字はRNA塩基を表す)。次に、この連結産物は、MNAzyme Cのパートザイム成分として機能した。この新たに作り出されたパートザイムは、組織化助長因子の存在下で第二のパートザイムと会合し、MNAzyme Cを作り出した。MNAzyme CはMNAzyme基質C(SubBi-2-FB)を切断して、フルオロフォア/クエンチャー色素ペアを分離して、蛍光を増加させた。
【０３９２】
「非MNAzyme A切断」対照(反応2)から、2',3'環式リン酸基末端を有する5'断片の切断および作製が、MNAzyme Cに必要な一方のパートザイムの後の連結および形成に不可欠であることが証明された。「非連結」対照(反応3)から、2',3'環式リン酸基末端を有する5'切断産物Aと第二の3'リガーゼ基質の連結が、MNAzyme Cの一方の成分の形成に不可欠であることが証明された。
【０３９３】
本実施例において証明された戦略は、二つのタイプの核酸酵素、すなわち、基質を連結することができるDNAzyme(DNAzymeリガーゼ)および基質を切断することができるMNAzyme(MNAzyme切断因子)を用いたカスケード反応における標的分析物の検出を可能にする。カスケードのそれぞれの酵素工程に複数の代謝回転があることで、シグナル増幅が可能になる。
【０３９４】
本実施例において証明され、図9に示したカスケード戦略は、フィードバック増幅カスケードを作り出すように展開および使用することができる。5'切断産物Cの配列が5'切断産物Aと同じであれば、この産物は5'基質Bとしても役立つことができ、フィードバックカスケード反応を開始することができる。この反応において、MNAzyme切断因子Cは絶えず5'基質Bを作製し、次に、5'基質Bは、DNAzymeリガーゼBによって連結されて、さらに多くのMNAzyme切断因子Cを形成するように、さらに多くのパートザイムを作り出す。この戦略は、組織化助長因子、例えば、MNAzyme切断因子 Aの組織化を誘導することができる標的分析物による反応開始後にフィードバック増幅する機構を提供することができる。この戦略を用いると、二つのタイプの核酸酵素、すなわち、基質を連結することができるDNAzyme(DNAzymeリガーゼ)および基質を切断することができるMNAzyme(MNAzyme切断因子)を用いて、標的分析物を検出した後に、フィードバックカスケードによりシグナル増幅することが可能になる。
【０３９５】
当業者であれば、この基本カスケード戦略に多くの変形があることを理解するだろう。例として、DNAzymeBは、例えば、切断活性、リガーゼ活性、または他の酵素活性を有し得る別のMNAzymeの組織化助長因子として役立つ連結産物を作り出すのに使用することができる。本明細書全体を通じて、さらなるバリエーションが含まれる。
【０３９６】
実施例7.リガーゼ活性を有するMNAzymeの形成を可能にする配列および条件、ならびにカスケード反応において有用な形式における、これらのリガーゼ活性を有するMNAzymeの試験
本実施例において候補MNAzymeリガーゼパートザイム配列を作製する基礎として、DNAzymeリガーゼ7Q10を使用した。図10に示したように、それぞれのリガーゼパートザイムは、(i)組織化助長因子(例えば、標的核酸)にハイブリダイズするセンサーアーム、(ii)触媒コアの一部を構成するドメイン、および(iii)基質結合アームを含む、3つの配列ドメインからなった。、2',3'環式リン酸基および5'-ヒドロキシル基からの2'-5'ホスホジエステル結合の形成によりRNAを連結することが以前に報告されている7Q10 DNAzymeリガーゼ(Flynn-Charlebois et al, 2003)の触媒領域の一部を組み込むように、部分コア配列を設計した。
【０３９７】
候補パートザイム配列の組み合わせの酵素活性を評価するために、多工程アッセイを使用した。一般的な戦略を図12において概説する。これもシグナル増幅法の基礎となり得る。第一の工程では、MNAzyme Aが組織化助長因子Aの存在下で形成され、MNAzyme基質Aを切断して、2',3'環式リン酸基末端を有する5'切断産物Aを作製するのに用いられる。第二の工程では、リガーゼ活性を有する活性MNAzymeBが組織化助長因子Bの存在下で組織化し、次いで、5'産物A(5'基質B)を3'基質Bに連結する。第三の工程では、連結産物Bは新たなパートザイムとして機能する。新たなパートザイムは別のパートザイムおよび組織化助長因子Cと一緒になってMNAzyme Cを形成し、次いで、基質Cを切断することができる。基質Cは、例えば、蛍光標識されてもよい。いくつかのリガーゼパートザイムペアの触媒活性をアッセイした。
【０３９８】
7.1 リガーゼ活性を有するDNAzyme(7Q10)の不完全触媒コア配列に対応するドメインを組み込んだ、パートザイムオリゴヌクレオチド
本実験では、第二の工程のためのパートザイムペアのシリーズはすべて、組織化助長因子(AFMzLB)にハイブリダイズするように設計されたセンサーアーム、ならびに二つの基質配列5LSubBおよび3LSubBにハイブリダイズするように設計された基質アームを用いて合成した。本実験において使用したパートザイムペアの配列(5'から3')を下に示した。下線の塩基は、組織化された候補MNAzymeの触媒コアの一部を形成し、太字の塩基(センサードメイン)は、組織化助長因子とハイブリダイズし、イタリック体の塩基(基質ドメイン)は、基質にハイブリダイズする。
2010523088.tif 000038
【０３９９】
7.2 リガーゼ活性を有する対照DNAzyme
基質配列5LSubBおよび3LSubBにハイブリダイズするように設計された基質アームを有するDNAzymeリガーゼ7Q10を本実験において使用し、配列(5'から3')を下に示した。下線の塩基は触媒コアを形成し、イタリック体の塩基は、基質にハイブリダイズする。
2010523088.tif 000039
【０４００】
7.3 MNAzyme 基質A(MNAzyme Aの基質)
以下の配列において、小文字の塩基はRNAを表し、大文字の塩基はDNAを表す。
2010523088.tif 000040
【０４０１】
7.4 連結用の3'基質B
本実験において使用した連結用の3'基質の配列(5'から3')を下に示した。このオリゴヌクレオチドは5'ヒドロキシル基を有する。小文字の塩基はRNAを表し、大文字の塩基はDNAを表す。
2010523088.tif 000041
【０４０２】
7.5 MNAzyme Cの基質(検出用の蛍光レポーター基質C)
本実施例において使用したレポーター基質は、SubBi-2であった。本実施例において、SubBi-2は、その5'末端を6-FAM部分でおよびその3'末端をBHQ1部分で末端標識し、SubBi-2-FBと呼んだ。490nm(FAM励起波長)での励起と共に、520nm(FAM放射波長)でSubBi-2-FBの切断をモニターした。SubBi-2-FBの配列(5'から3')を下に示した。小文字の塩基はRNAを表し、大文字の塩基はDNAを表す。
2010523088.tif 000042
【０４０３】
7.6 組織化助長因子
MNAzyme Aセンサードメインによって認識される組織化助長因子Aは、以下の配列を有する合成DNAオリゴヌクレオチドであった。
2010523088.tif 000043
【０４０４】
MNAzyme Bセンサードメインによって認識される組織化助長因子Bは、以下の配列を有する合成DNAオリゴヌクレオチドであった。
2010523088.tif 000044
【０４０５】
MNAzyme Cセンサードメインによって認識される組織化助長因子Cは、以下の配列を有する合成DNAオリゴヌクレオチドであった。
2010523088.tif 000045
【０４０６】
7.7 切断活性を有するMNAzymeのパートザイム
以下の配列を有する、MNAzyme Aのパートザイムを合成した。
2010523088.tif 000046
【０４０７】
以下の配列を有する、MNAzyme Cのパートザイムを合成した。
2010523088.tif 000047
【０４０８】
7.8 リガーゼ活性の検出
7.8.1反応条件
反応は、下記のように、3個の別々のチューブにおいて、3つの連続した工程(i)、(ii)、および(iii)で行った。
(i)必要とされる2',3'環式リン酸基末端を有する5'リガーゼ基質(5LSubB)を作製するために、SubA/pre5LSubBをMNAzyme Aによって40℃で1時間切断した。反応は、100nMパートザイム4SyntA2/1(16)、100nMのパートザイム4SyntB3/1(16)、100nM組織化助長因子AF-MzCA、500nM SubA/Pre5LSubB、50mM Tris HCl(25℃でpH9.0)および50mM MgCl2を含有した。
(ii)総反応体積25μlで、連結を40℃で2時間行った。反応は、工程(i)からの切断反応混合物10μl、200nM 3LSubB、200nM AF-MzLB、150mM NaCl、2mM KCl、50mM Tris HCl(25℃でpH9.0)、および40mM MgCl2と、
(a)200nMの対照DNAzymeリガーゼ7Q10-10/10、または
(b)それぞれ200nMのSplit1パートザイムAおよびB(RO5LS1AおよびRO5LS1B)、または
(c)それぞれ200nMのSplit2パートザイムAおよびB(RO5LS2AおよびRO5LS2B)、または
(d)それぞれ200nMのSplit3パートザイムAおよびB(RO5LS3AおよびRO5LS3B)、または
(e)それぞれ200nMのSplit4パートザイムAおよびB(RO5LS4AおよびRO5LS4B)、または
(f)それぞれ200nMのSplit5パートザイムAおよびB(RO5LS5AおよびRO5LS5B)、または
(g)それぞれ200nMのSplit6パートザイムAおよびB(RO5LS6AおよびRO5LS6B)、または
(h)それぞれ200nMのSplit7パートザイムAおよびB(RO5LS7AおよびRO5LS7B)、または
(i)それぞれ200nMのSplit2パートザイムA(RO5LS2A)およびSplit4パートザイムB(RO5LS4B)
を含有した。
【０４０９】
さらなる「無5'連結基質」対照反応には、工程(i)からの切断反応混合物10μlが無かった。この反応混合物は、200nM 3LSubB、それぞれ200nMのSplit 4パートザイムAおよびB(RO5LS4AおよびRO5LS4B)、150mM NaCl、2mM KCl、50mM Tris HCl(25℃でpH9.0)、40mM MgCl2、200nM AF-MzLB、および200nMのSubA/Pre5LsubBを含有した。
(iii)工程(ii)の連結によって形成されたパートザイムが媒介したMNAzyme C切断による蛍光検出を、Cepheid Smartcyclerによって55℃で3.5時間まで、等温的に行った。データ収集点は5分間隔であった。蛍光標識された基質SubBi-2-FBの添加により反応を開始した。反応は、総反応体積25μlで、10μlの前の連結反応混合物(ii-aまたはii-bまたはii-cまたはii-dまたはii-eまたはii-fまたはii-gまたはii-hまたはii-iあるいは「無連結基質」対照)、200nMのMNAzyme CパートザイムB(STB5/2(21))、200nM MNAzyme C組織化助長因子(AF-MzCC)、50mM Tris HCl(25℃でpH9.0)、25mM MgCl2、および200nMの基質SubBi-2-FBを含有した。反応について、MNAzyme基質C(SubBi-2-FB)の切断による蛍光の増加を経時的にモニターした。
【０４１０】
7.8.2 結果
(a)対照反応
正の対照DNAzymeリガーゼ反応(工程i、ii-a、およびiii)は経時的な蛍光の増加を示した。この反応により、MNAzyme Aは、SubA/Pre5LSubBを形成および切断して、DNAzymeリガーゼが基質として使用するのに適した2',3'環式リン酸基を有する産物(5LSubB)を作製できることが確かめられる。5LSubBの配列は、
2010523088.tif 000048
であり、大文字はDNA塩基を表し、小文字はRNA塩基を表す。この対照反応によって、単分子DNAzymeリガーゼ7Q10-10/10が5LSubBおよび3LSubBを連結し、
2010523088.tif 000049
の配列(大文字はDNA塩基を表し、小文字はRNA塩基を表す)を有する、新たなオリゴヌクレオチド(連結産物)を形成したことが証明された。次に、この連結産物は、MNAzyme Cのパートザイム成分として機能し、MNAzyme Cは基質C(SubBi-2-FB)を切断して、蛍光を増加させた。この蛍光の増加は、リガーゼ活性の代用マーカーとして働いた。
【０４１１】
「無5'連結基質」対照反応(工程iiおよびiiiのみ)は、経時的な蛍光の増加を示さなかった。このことは、SubA/Pre5LSubBがMNAzyme Aによって切断されて5LSubBを生じなければ、適切な5'連結基質が3LSubBとの連結に利用されないことを証明している。結果として、MNAzyme Cのパートザイムは作製されず、蛍光の増加が観察されない。
【０４１２】
(b)機能的MNAzymeリガーゼを形成する能力を有する、または有しない可能性のある候補パートザイムペアを用いたときに、リガーゼ活性が存在するかどうか試験するように設計された反応
工程iおよびiiiと、工程ii-e(Split4)またはii-f(Split5)のいずれかを組み込んだ反応は、経時的な蛍光の増加を示した。DNAzymeリガーゼ7Q10の触媒コアを、これらの位置で分割し、次いで、組織化助長因子の存在下でパートザイムの部分コアを再組織化すると、これらの反応条件下で活性MNAzymeリガーゼが生じた。
【０４１３】
工程iおよびiiiと、工程ii-b(Split1)またはii-c(Split2)またはii-d(Split3)またはii-g(Split6)またはii-h(Split7)またはii-i(Split2/4)のいずれかを組み込んだ反応は、MNAzyme C切断による35分間のモニタリング後に蛍光の増加を示さなかった。このことは、DNAzymeリガーゼ7Q10の触媒コアを、これらの位置で分割し、次いで、組織化助長因子と共に部分コアを再組織化しても、これらの反応条件下では、検出可能なMNAzymeリガーゼ活性は生じないことを証明している。
【０４１４】
本実施例は、特定の配列およびその組み合わせに応じて不活性なMNA複合体または様々なレベルの酵素活性を有するMNA複合体を組織化するのに使用することができる、多数のパートザイム配列を作製した。試験した候補パートザイム配列の一般的な設計を表7にまとめた。
【０４１５】
（表７）試験したパートザイム配列の一般的な設計
2010523088.tif 000050
【０４１６】
活性MNAzymeには、Split4またはSplit5と同じ分割を有する前記の実施例を含めて、多種多様な用途があるだろう。例として、MNAzymeリガーゼは標的分析物を検出するのに使用することができる。MNAzymeリガーゼは、RNAまたはDNA標的配列などの分析物(組織化助長因子)の存在下でしか組織化できないように設計することができる。5'連結基質がフルオロフォア色素で標識され、3'連結基質がクエンチャー色素で標識されれば(または逆もまた同じ)、連結によって蛍光が減少し、標的分析物が存在する指標として役立つだろう。代わりの形式では、5'連結基質が検出可能な部分、例えば、フルオロフォアで標識され、3'連結基質が別個の位置、例えば、チップ上またはビーズ上に取り付けられば、標的分析物が存在すると、連結によって別個の位置にシグナルが現れるだろう。
【０４１７】
本実施例においてリガーゼ活性をアッセイするのに使用した戦略を、図12に示した。活性パートザイムが特定されていれば、同じカスケード反応を用いて、組織化助長因子、例えば、標的分析物の存在を検出することができる。検出を可能にするカスケード反応では、二つのタイプの核酸酵素、すなわち、基質を連結することができるMNAzymeおよび基質を切断することができるMNAzymeが用いられる。カスケードのそれぞれの酵素工程に複数の代謝回転があることで、シグナル増幅が可能になる。
【０４１８】
本実施例において証明され、図12に示したカスケードは、フィードバック増幅カスケードを作り出すように展開および使用することができる。5'切断産物Cの配列が5'切断産物Aと同じであれば、この産物は5'基質Bとしても役立つことができ、フィードバックカスケード反応を開始することができる。この反応において、MNAzyme切断因子Cは絶えず5'基質Bを作製し、次に、5'基質Bは、MNAzymeリガーゼBによって連結されて、さらに多くのMNAzyme切断因子Cを形成するように、さらに多くのパートザイムを作り出すことができる。この戦略は、MNAzyme切断因子Aの組織化を誘導することができる標的分析物による反応開始後にフィードバック増幅する機構を提供することができる。この戦略を用いると、二つのタイプのMNAzyme、すなわち、MNAzymeリガーゼおよびMNAzyme切断因子を用いて、標的分析物を検出した後に、フィードバックカスケードによりシグナル増幅することが可能になる。
【０４１９】
さらに、本実施例はまた、開始工程によってリガーゼ活性を有するMNAzymeが形成される反応の一例とみなすこともできる。このシナリオでは、図12を見ると、開始標的核酸は組織化助長因子B(AF-MzLB)であり、組織化助長因子A(AF-MzCA)は、MNAzyme Aの組織化を動かすように含めた合成分子である。次いで、MNAzyme Aの目的は、反応において、2',3'環式リン酸基末端を有する連結可能な5'基質Bを作製することしかなく、次いで、2',3'環式リン酸基末端を有する連結可能な5'基質Bは、リガーゼ活性を有するMNAzyme Bを用いて、標的組織化助長因子Bを検出する反応に加えることができる。これにより、合成に費用がかかり、比較的不安定な2'3'環式リン酸基末端を有する基質を作製する現実的な方法を得ることができる。さらに、MNAzyme Aパートザイムおよび組織化助長因子Aは、連結可能な基質を作製するための別の予備反応に存在する、切断活性を有するDNAzymeと交換されてもよく、このDNAzymeは、リガーゼ活性を有するMNAzymeと同じ反応混合物中に存在してもよい。実施例11は、MNAzymeおよびDNAzymeの組み合わせを用いた切断および連結が1つの反応混合物中で実施可能なことを証明している。
【０４２０】
当業者であれば、この基本カスケード戦略に多くの変形があることを理解するだろう。例として、MNAzyme Bは、切断活性、リガーゼ活性、または他の酵素活性を有する別のMNAzymeの組織化助長因子として役立つ連結産物を作り出すのに使用することができる。別の例では、MNAzyme Cは、切断以外の手段によって基質を改変することができる。本明細書全体を通じて、さらなる態様が含まれる。
【０４２１】
実施例8:リガーゼ活性を有する第2のMNAzymeを用いて、「オン状態」の活性MNAzymeと「オフ状態」のMNAi複合体の間でMNA複合体を切り替える例示的な戦略
図13は、リガーゼ活性を有する第2のMNAzymeを用いて、「オン状態」の活性MNAzymeと「オフ状態」のMNAi複合体の間でMNA複合体を切り替える例示的な戦略を図示する。この戦略では、基質Aを改変(例えば、切断または連結)することができる活性MNAzyme Aは、組織化助長因子成分1(AFC1)および組織化助長因子成分2(AFC2)の存在下で形成することができる。リガーゼ活性を有する第二のMNAzyme Bは、例えば、1つまたは複数の成分を含むことができる組織化助長因子3(AF3)の存在下で形成することができ、次いで、AFC2と活性阻害因子成分(AIC)を連結して、活性阻害因子(AI)を形成することができる。このAIは、MNAzyme Aのパートザイム成分に結合し、不活性なMNAiA複合体を形成することができる。従って、本実施例のMNAzymeリガーゼは、MNAzyme Aを不活性化するオフスイッチとして働くことができる。不活性MNAi複合体および触媒活性MNAzymeは、それぞれ、組織化された成分の二つの交替する状態、すなわち、「オフ」状態および「オン」状態に相当する。
【０４２２】
実施例9.リガーゼ活性を有するMNAzymeの形成を可能にする配列および条件、ならびにシグナル増幅カスケードにおいて有用な形式における、これらのリガーゼ活性を有するMNAzymeの試験
本実施例における候補MNAzymeリガーゼパートザイム配列を作製する基礎として、DNAzymeリガーゼ7Z81を使用した。図10に示したように、それぞれのリガーゼパートザイムは、(i)組織化助長因子(例えば、標的核酸)にハイブリダイズするセンサーアーム、(ii)触媒コアの一部を構成するドメイン、および(iii)基質結合アームを含む、3つの配列ドメインからなった。2',3'環式リン酸基および5'-ヒドロキシル基からの2'-5'ホスホジエステル結合の形成によりRNAを連結することが以前に報告されている7Z81 DNAzymeリガーゼ(Prior et al, 2004)の触媒領域の一部を組み込むように、部分コア配列を設計した。
【０４２３】
候補パートザイム配列の組み合わせの酵素活性を評価するために、多工程アッセイを使用した。一般的な戦略を図12において概説する。これもシグナル増幅法の基礎となり得る。第一の工程では、MNAzyme Aが組織化助長因子Aの存在下で形成され、MNAzyme基質Aを切断して、2',3'環式リン酸基末端を有する5'切断産物Aを作製するのに用いられる。第二の工程では、リガーゼ活性を有する活性MNAzyme Bが組織化助長因子Bの存在下で組織化し、次いで、5'産物A(5'基質B)を3'基質Bに連結する。第三の工程では、連結産物Bは新たなパートザイムとして機能する。新たなパートザイムは別のパートザイムおよび組織化助長因子Cと一緒になってMNAzyme Cを形成し、次いで、基質Cを切断することができる。基質Cは、例えば、蛍光標識されてもよい。いくつかのリガーゼパートザイムペアの触媒活性をアッセイした。
【０４２４】
9.1 リガーゼ活性を有するDNAzyme(7Z81)の不完全触媒コア配列に対応するドメインを組み込んだ、パートザイムオリゴヌクレオチド
本実験において、第二の工程のためのパートザイムペアのシリーズはすべて、組織化助長因子(AFMzLB)にハイブリダイズするように設計されたセンサーアーム、ならびに二つの基質配列5LSubBおよび3LSubBにハイブリダイズするように設計された基質アームを用いて合成した。本実験において使用したパートザイムペアの配列(5'から3')を下に示した。下線の塩基は、組織化された候補MNAzymeの触媒コアの一部を形成し、太字の塩基(センサードメイン)は、組織化助長因子とハイブリダイズし、イタリック体の塩基(基質ドメイン)は、基質にハイブリダイズする。
2010523088.tif 000051
【０４２５】
9.2リガーゼ活性を有する対照DNAzyme
本実施例において使用したDNAzymeリガーゼは、2',3'環式リン酸基を有する5'連結基質および5'-ヒドロキシル基を有する3'連結基質を用いて、RNAを連結し、2'-5'ホスホジエステル結合を形成することが以前に報告されている(Prior et al, 2004)。基質に特定の末端が必要なことに加えて、本実施例において使用したDNAzymeリガーゼは、連結接合部に、ある特定の配列モチーフも必要とする。
【０４２６】
基質配列5LSubBおよび3LSubBにハイブリダイズするように設計された基質アームを有するDNAzymeリガーゼ7Z81を本実験において使用し、配列(5'から3')を下に示した。下線の塩基は触媒コアを形成し、イタリック体の塩基は、基質にハイブリダイズする。
2010523088.tif 000052
【０４２７】
9.3 MNAzyme 基質A(MNAzymeAの基質)
基質A(Pre5LSubB2-FB)の配列は以下である。リボ塩基の5'側を6-FAM部分で内部標識し、リボ塩基の3'側をBHQ1部分で標識した(下線の塩基)。小文字の塩基はRNAを表し、大文字の塩基はDNAを表す。
2010523088.tif 000053
【０４２８】
9.4 連結用の3'基質B
本実験において使用した連結用の3'基質の配列(5'から3')を下に示した。このオリゴヌクレオチドは5'ヒドロキシル基を有する。小文字の塩基はRNAを表し、大文字の塩基はDNAを表す。
2010523088.tif 000054
【０４２９】
9.5 MNAzyme Cの基質(検出用の蛍光レポーター基質C)
本実施例において使用したレポーター基質は、SubBi-2であった。本実施例において、SubBi-2は、その5'末端をQuasar670部分でおよびその3'末端をBHQ2部分で末端標識し、SubBi-2-Q6B2と呼んだ。635nmでの励起と共に、665nmでSubBi-2-Q6B2の切断をモニターした。SubBi-2-Q6B2の配列(5'から3')を下に示した。小文字の塩基はRNAを表し、大文字の塩基はDNAを表す。
2010523088.tif 000055
【０４３０】
9.6 組織化助長因子
MNAzyme Aセンサードメインによって認識される組織化助長因子Aは、以下の配列を有する合成DNAオリゴヌクレオチドであった。
2010523088.tif 000056
【０４３１】
MNAzyme Bセンサードメインによって認識される組織化助長因子Bは、以下の配列を有する合成DNAオリゴヌクレオチドであった。
2010523088.tif 000057
【０４３２】
MNAzyme Cセンサードメインによって認識される組織化助長因子Cは、以下の配列を有する合成DNAオリゴヌクレオチドであった。
2010523088.tif 000058
【０４３３】
9.7 切断活性を有するMNAzymeのパートザイム
以下の配列を有する、MNAzyme Aパートザイムを合成した。
2010523088.tif 000059
【０４３４】
以下の配列を有する、MNAzyme Cパートザイムを合成した。
2010523088.tif 000060
【０４３５】
9.8 リガーゼ活性の検出
9.8.1 反応条件
反応は、下記のように、3個の別々のチューブにおいて、3つの連続した工程(i)、(ii)、および(iii)で行った。
(i)必要とされる2',3'環式リン酸基末端を有する5'リガーゼ基質(5LSubB)を作製するために、Pre5LSubB2-FBをMNAzyme Aによって40℃で1時間切断した。反応は、50nMのパートザイムRO4A2/1(11)、50nMのパートザイムRO4B3/1(12)、100nMの組織化助長因子AF-MzCA2、1000nM Pre5LSubB2-FB、50mM Tris HCl(25℃でpH9.0)、および40mM MgCl2を含有した。
(ii)総反応体積25μlで、連結を40℃で2時間行った。反応は、工程(i)からの切断反応混合物10μl、1000nM 3LSubB、500nM AF-MzLB、150mM NaCl、2mM KCl、50mM Tris HCl(25℃でpH9.0)、および40mM MgCl2と、
(a)500nMの対照DNAzymeリガーゼ7Z81-10/10、または
(b)それぞれ500nMのSplit1パートザイムAおよびB(RO5S1AおよびRO5S1B)、または
(c)それぞれ500nMのSplit2パートザイムAおよびB(RO5S2AおよびRO5S2B)、または
(d)それぞれ500nMのSplit3パートザイムAおよびB(RO5S3AおよびRO5S3B)、または
(e)それぞれ500nMのSplit4パートザイムAおよびB(RO5S4AおよびRO5S4B)、または
(f)それぞれ500nMのSplit5パートザイムAおよびB(RO5S5AおよびRO5S5B)、または
(g)それぞれ500nMのSplit6パートザイムAおよびB(RO5S6AおよびRO5S6B)、
を含有したか、
(h)DNAzymeまたはパートザイムを含有しなかった(無リガーゼ対照)。
(iii)工程(ii)の連結によって形成されたパートザイムが媒介したMNAzyme C切断による蛍光検出を、Cepheid Smartcyclerによって55℃で2時間、等温的に行った。データ収集点は72秒間隔であった。蛍光標識された基質SubBi-2-Q6B2の添加により反応を開始した。反応は、総反応体積25μlで、10μlの前の連結反応混合物(ii-aまたはii-bまたはii-cまたはii-dまたはii-eまたはii-fまたはii-gまたはii-h)、500nMのMNAzyme CパートザイムB(STB5/2(21))、100nMのMNAzyme C組織化助長因子(AF-MzCC)、PCRIIバッファー(Applied Biosystems)、50mM MgCl2、および1000nMの基質SubBi-2-Q6B2を含有した。各反応について、MNAzyme基質C(SubBi-2-Q6B2)の切断による蛍光の増加を経時的にモニターした。
【０４３６】
9.8.2 結果
(a)対照反応
正の対照DNAzymeリガーゼ反応(工程i、ii-a、およびiii)は、経時的な蛍光の増加を示した。MNAzyme C形成依存性のリガーゼにより生じたシグナルを、任意の蛍光単位で測定した。全体の蛍光変化(最後の蛍光-最初の蛍光)および反応が完了した(蛍光シグナルがプラトーに達した)時間を表8に示した。対照DNAzyme反応において観察された、この蛍光変化から、カスケード反応の工程は首尾よく達成されたことが確かめられた。この反応において、MNAzyme Aが形成し、Pre5LSubB2-FBを切断して、DNAzymeリガーゼが基質として使用するのに適した2',3'環式リン酸基を有する産物(5LSubB)を作製した。切断産物5LSubBの配列は
2010523088.tif 000061
であり、大文字はDNA塩基を表し、小文字はRNA塩基を表す。この対照反応によって、単分子DNAzymeリガーゼ7Z81-10/10が5LSubBおよび3LSubBを連結し、
2010523088.tif 000062
の配列(大文字はDNA塩基を表し、小文字はRNA塩基を表す)を有する、新たなオリゴヌクレオチド(連結産物)を形成したことが証明された。次に、この連結産物は、MNAzyme Cのパートザイム成分として機能し、MNAzyme Cは基質C(SubBi-2-Q6B2)を切断して、蛍光を増加させた。この蛍光の増加は、リガーゼ活性の代用マーカーとして働いた。
【０４３７】
無リガーゼ対照反応(工程i、ii-h、およびiii)は、有意な経時的な蛍光の増加を示さなかった(表8)。これは、リガーゼが存在しなければ、5LSubBは3LSubBに連結できないことを証明している。結果として、MNAzyme Cのパートザイムは作製されず、蛍光の増加は観察されない。
【０４３８】
(b)機能的MNAzymeリガーゼを形成する能力を有する、または有しない可能性のある候補パートザイムペアを用いたときに、リガーゼ活性が存在するかどうか試験するように設計された反応
工程iおよびiiiと、工程ii-b(Split1)、ii-c(Split2)、ii-d(Split3)、ii-e(Split4)、ii-f(Split5)、およびii-g(Split6)を組み込んだ反応は、経時的な蛍光の増加を示した。それぞれの候補パートザイムペアが基質を連結する能力を、任意の蛍光単位の変化によって測定した。全体の蛍光変化(最後の蛍光-最初の蛍光)および反応が完了した(蛍光シグナルがプラトーに達した)時間を表8に示した。DNAzymeリガーゼ7Z81の触媒コアを、これらの位置で分割し(表9)、次いで、組織化助長因子の存在下でパートザイムの部分コアを再組織化すると、これらの反応条件下で活性MNAzymeリガーゼが生じた。
【０４３９】
（表８）様々なパートザイムの経時的な蛍光変化
2010523088.tif 000063
本実施例は、特定の配列およびその組み合わせに応じて様々なレベルの活性を有するMNAzymeを組織化するのに使用することができる、多数のパートザイム配列を作製した。試験した候補パートザイム配列の一般的な設計を表9にまとめた。
【０４４０】
（表９）試験したパートザイム配列の一般的な設計
2010523088.tif 000064
【０４４１】
活性MNAzymeには、前記の実施例、特に、Split5と同じ分割を有するMNAzymeを含めて多種多様な用途があるだろう。例として、MNAzymeリガーゼは標的分析物を検出するのに使用することができる。MNAzymeリガーゼは、RNAまたはDNA標的配列などの分析物(組織化助長因子)の存在下でしか組織化できないように設計することができる。例として、5'連結基質がフルオロフォア色素で標識され、3'連結基質がクエンチャー色素で標識されれば(または逆もまた同じ)、連結によって蛍光が減少し、標的分析物が存在する指標として役立つだろう。代わりの形式では、5'連結基質が検出可能な部分、例えば、フルオロフォアで標識され、3'連結基質が別個の位置、例えば、チップ上またはビーズ上に取り付けられれば、標的分析物が存在すると、連結によって別個の位置にシグナルが現れるだろう。
【０４４２】
図12に図示したような、本実施例においてリガーゼ活性をアッセイするのに使用した戦略は、フィードバックシグナル増幅カスケードを作り出すのに使用することができる直線カスケードを構成する。5'産物Cの配列が5'産物Aの配列と同じであれば、この産物は5'基質Bとしても役立ち、フィードバックカスケード反応を開始することができる。この反応において、MNAzyme Cは、5'基質Bを絶えず作製することができ、次に、5'基質Bは、MNAzymeリガーゼBによって連結されて、さらに多くのMNAzyme Cが形成するように、さらに多くのパートザイムを作り出すことができる。この戦略は、MNAzyme Aの組織化を誘導することができる組織化助長因子(例えば、標的分析物)による反応開始後にフィードバック増幅する機構を提供することができる。この戦略を用いると、二つのタイプのMNAzyme、すなわち、基質を連結することができるMNAzyme(MNAzymeリガーゼ)および基質を切断することができるMNAzyme(MNAzyme切断因子)を用いて、組織化助長因子(例えば、標的分析物)を検出した後に、シグナル増幅することが可能になる。
【０４４３】
当業者であれば、この基本戦略に多くの変形があることを理解するだろう。例として、MNAzyme Bは、切断活性、リガーゼ活性、または他の酵素活性を有する別のMNAzymeの組織化助長因子として役立つ連結産物を作り出すのに使用することができる。別の例では、MNAzyme Cは、切断以外の手段によって基質を改変することができる。本明細書全体を通じて、さらなる態様が含まれる。
【０４４４】
実施例10.DNAzymeからMNAzymeに作り変える一般的方法
インビトロ進化法によって、多くのDNAzymeの発見および開発が容易になった(Emillson and Breaker, 2002に概説)。核酸の切断、核酸の連結、ポルフィリンメタレーション、炭素-炭素結合の形成、DNAリン酸化、エステル結合、アミド結合、DNA脱グリコシル、チミン二量体の光変換、およびホスホロアミダート切断を含む広範囲の反応を触媒する能力を有する、インビトロで進化させたDNAzymeが発見されている(Silverman, 2007に概説)。
【０４４５】
多くのDNAzymeには、複数のドメインを有する類似した基本構造がある。これらのDNAzymeは、保存されていない二つの基質結合ドメイン(「アーム」)に隣接した、保存された触媒ドメイン(触媒コア)を含む。基質結合ドメイン(「アーム」)は、基質(例えば、DNAzyme切断因子もしくは1つの基質に作用するDNAzymeの場合)または少なくとも二つの基質(例えば、DNAzymeリガーゼもしくは少なくとも二つの基質に作用するDNAzymeの場合)を特異的に認識し、これにハイブリダイズする。DNAzymeにより改変できる部位が基質に含まれるのであれば、基質結合ドメインは任意の基質に合わせることができる。本実施例は、公知のDNAzymeに基づいて新たなMNAzymeに作り変えるための一般的な戦略について述べる。この一般的な戦略を図14において図示した。
【０４４６】
まず最初に、改変活性、例えば、切断活性を有するDNAzymeからMNAzymeを得る方法について述べる。第一の工程では、二つの部分コアが一緒になって触媒コア全体を構成するように、触媒コアのそれぞれの部分を二つの配列の間で分配できるようにするために、分割可能な、DNAzyme触媒コア内の位置を特定する。次いで、(i)基質に結合することができる基質結合アーム部分を一つ、(ii)部分触媒コア部分を一つ、および(iii)組織化助長因子分子に結合することができるセンサーアーム部分を一つ含有するように、オリゴヌクレオチドAを合成することができる。第二のオリゴヌクレオチドBは、(i)オリゴヌクレオチドAと同じ基質に結合することができ、それにより、オリゴヌクレオチドBがオリゴヌクレオチドAの位置に隣接する位置で基質に結合する、基質結合アーム部分を一つ、(ii)オリゴヌクレオチドAに組み込まれなかった、DNAzyme触媒コア全体に由来する塩基を含有する部分触媒コア部分を一つ、および(iii)オリゴヌクレオチドAと同じ組織化助長因子に結合することができ、それにより、オリゴヌクレオチドBがオリゴヌクレオチドAの位置に隣接する位置で基質に組織化助長因子する、センサーアーム部分を一つ含有するように合成される。このプロセスを繰り返すと、パートザイムの構造およびドメインを組み込んでいるが、基質および組織化助長因子の存在下で触媒活性を有する、または有さない可能性のある、オリゴヌクレオチドAおよびBのペアのシリーズを作ることができる。
【０４４７】
次いで、候補パートザイムペア(このシリーズからのオリゴヌクレオチドAおよびBのペア)の一部または全てを、パートザイムのセンサーアーム部分に相補的な組織化助長因子およびパートザイムの基質アーム部分に相補的な基質の存在下でインキュベートすることができる。インキュベーションは、部分触媒コア配列が得られたDNAzymeによる基質の改変と適合する条件下で行われる。部分配列が得られたDNAzymeと同じタイプの改変を基質に行うことができる、オリゴヌクレオチドAおよびBのペアは、MNAzymeに組織化することができるパートザイムとして有用である。部分触媒コアの配列は他のパートザイムに組み込むのに適している。(各パートザイムの基質結合ドメインを変えることによって)新たな基質に合わせた、および/または(各パートザイムのセンサー結合ドメインを変えることによって)新たな組織化助長因子に合わせた、新たなパートザイムを合成することができる。
【０４４８】
単分子核酸酵素(例えば、DNAzymeリガーゼ)から二つの基質に働くMNAzyme(例えば、MNAzymeリガーゼ)に作り変える方法は、類似の工程を必要とする。第一の工程では、二つの部分コアが一緒になって触媒コア全体を構成するように、触媒コアのそれぞれの部分を二つの部分配列の間で分配できるように、分割可能な、DNAzyme触媒コア内の位置を特定する。次いで、二つのオリゴヌクレオチドAおよびB(候補パートザイム)を合成することができる。次いで、オリゴヌクレオチドAは、(i)第一の基質(例えば、連結可能な基質)に結合することができる基質結合アーム部分を一つ、(ii)部分触媒コア部分を一つ、および(iii)組織化助長因子分子に結合することができるセンサーアーム部分を一つ含有するように合成することができる。第二のオリゴヌクレオチドBは、(i)第二の基質(例えば、連結可能な基質)に結合することができる基質結合アーム部分を一つ、(ii)オリゴヌクレオチドAに組み込まれなかった、DNAzyme触媒コア全体に由来する塩基を含有する部分触媒コア部分を一つ、および(iii)オリゴヌクレオチドAと同じ組織化助長因子に結合することができ、それにより、オリゴヌクレオチドBがオリゴヌクレオチドAの位置に隣接する位置で組織化助長因子に結合する、センサーアーム配列を一つ含有するように合成することができる。このプロセスを繰り返すと、パートザイムの構造およびドメインを組み込んでいるが、基質および組織化助長因子の存在下で触媒活性を有する、または有さない可能性のある、オリゴヌクレオチドAおよびBのペアのシリーズを作ることができる。
【０４４９】
次いで、候補パートザイムペア(このシリーズからのオリゴヌクレオチドAおよびBのペア)の一部または全てを、パートザイムのセンサーアーム部分に相補的な組織化助長因子およびパートザイムの基質アーム部分に相補的な基質(例えば、連結可能な基質)の存在下でインキュベートすることができる。インキュベーションは、部分触媒コア配列が得られたDNAzymeによる基質の改変(例えば、連結)と適合する条件下で行われる。部分配列が得られたDNAzymeと同じ改変(例えば、連結)を基質に行うことができる、オリゴヌクレオチドAおよびBのペアは、MNAzymeに組織化することができるパートザイムとして有用である。部分触媒コアの配列は他のパートザイムに組み込むのに適している。(各パートザイムの基質結合ドメインを変えることによって)新たな基質に合わせた、および/または(各パートザイムのセンサー結合ドメインを変えることによって)新たな組織化助長因子に合わせた、新たなパートザイムを合成することができる。
【０４５０】
このアプローチを用いて、活性MNAzymeを形成することができるパートザイムに組み込むのに適した部分触媒コアを特定した具体例が、リガーゼ活性を有する二つのDNAzyme(実施例7および実施例9)ならびに切断活性を有する一つのDNAzyme(実施例14)について証明されている。
【０４５１】
さらに、成分パートザイムに組み込むことができる、DNAzyme触媒コアの分割から得られた部分配列の変化に対する耐性を調べるために、類似の方法を使用することができる。例えば、パートザイムに組み込まれる部分触媒コアに対して改変を加えることができる。改変には、例として、挿入、欠失、別のDNA塩基による置換、またはリボヌクレオチド、イノシン塩基、もしくは他の類似体などのDNA塩基類似体による置換が含まれる。次いで、1つまたは複数の改変を含有する候補パートザイムペアが、触媒活性MNAzymeに組織化することができるパートザイムとして適しているかどうか確かめるために、前記のようにアッセイすることができる。
【０４５２】
実施例11.複数の核酸酵素の活性を利用したカスケード反応
本実施例において使用した一般的な戦略を図9において概説する。この戦略もシグナル増幅法の基礎となり得る。この具体例では、反応を二つの工程で行った。第一の工程(図9(i)および(ii))では、MNAzyme Aが組織化助長因子(例えば、標的核酸)の存在下で形成され、基質(MNAzyme基質A)を切断して、2',3'環式リン酸基末端を有する5'切断産物を作製するのに用いられた。同時に、DNAzymeリガーゼを用いて、5'切断産物と別のオリゴヌクレオチド連結基質Bを連結して、新たなMNAzyme成分(例えば、パートザイム)として機能する連結産物を作り出した。第二の工程(図9(iii))では、第一の工程において作製されたパートザイム連結産物は、基質(MNAzyme基質C)を切断することができる新たなMNAzyme(MNAzyme C)の形成に関与する。本実施例では、MNAzyme基質Cをフルオロフォア色素およびクエンチャー色素ペアで標識することによって、反応を蛍光モニタリングした。
【０４５３】
11.1 MNAzyme Aのパートザイム
第一の工程では、MNAzyme Aが組織化助長因子(AF-MzCA2)の存在下で形成され、MNAzyme基質A(Pre5LSubB2-FB)を切断するのに用いられた。MNAzyme Aパートザイム(RO4A2/1(11)およびRO4B3/1(12))の配列を以下に示した。下線の塩基は触媒コアの一部を形成し、太字の塩基は、組織化助長因子とハイブリダイズし、イタリック体の塩基は、基質にハイブリダイズする。
2010523088.tif 000065
【０４５４】
11.2 リガーゼ活性を有するDNAzyme
本実施例において使用したDNAzymeリガーゼは、2',3'環式リン酸基および5'-ヒドロキシル基からの2'-5'ホスホジエステル結合の形成によりRNAを連結することが以前に報告されている(Prior et al, 2004)。5'基質と2',3'環式リン酸基末端が必要なことに加えて、本実施例において使用したDNAzymeリガーゼは、連結接合部に、ある特定の配列モチーフも必要とする。
【０４５５】
本実験では、第一の工程において、基質配列5LSubBおよび3LSubBにハイブリダイズするように設計された基質アームを有するDNAzymeリガーゼ7Z81(7Z81-10/10)を使用した。配列(5'から3')を下に示した。下線の塩基は触媒コアを形成し、イタリック体の塩基は、基質にハイブリダイズする。
2010523088.tif 000066
【０４５６】
11.3 MNAzyme Cのパートザイム
第二の工程では、連結産物は新たなパートザイムとして機能し、パートザイムB(STB5/2(21))および組織化助長因子(AF-MzCC)と一緒になってMNAzyme Cを形成し、蛍光標識された基質C(SubBi-2-Q6B2)を切断した。対照パートザイムA(LS817A4/2)は連結産物と同じ配列であり、これもパートザイムB(STB5/2(21))と一緒になってMNAzyme Cを形成した。以下の配列は、MNAzyme Cの一部を形成するパートザイムに対応する。下線の塩基は触媒コアの一部を形成し、太字の塩基は、組織化助長因子とハイブリダイズし、イタリック体の塩基は、基質にハイブリダイズする。
2010523088.tif 000067
【０４５７】
11.4 MNAzyme基質A(MNAzyme切断因子Aの基質)
MNAzyme基質AをMNAzyme切断因子Aによって切断した。次いで、5LSubBと名付けた、結果として得られた5'断片を、DNAzymeリガーゼによって3LSubBに連結した。基質A(Pre5LSubB2-FB)の配列は以下である。リボ塩基の5'側を6-FAM部分で内部標識し、リボ塩基の3'側をBHQ1部分で標識した(下線の塩基)。小文字の塩基はRNAを表し、大文字の塩基はDNAを表す。
2010523088.tif 000068
【０４５８】
11.5 DNAzymeリガーゼ基質 B
本実験において使用した連結用3'基質の配列を(5'から3')を下に示した。このオリゴヌクレオチドは5'ヒドロキシル基を有する。小文字の塩基はRNAを表し、大文字の塩基はDNAを表す。
2010523088.tif 000069
【０４５９】
11.6 MNAzyme Cの基質(検出用の蛍光レポーター基質C)
本実施例において使用したレポーター基質は、SubBi-2であった。本実施例において、SubBi-2は、その5'末端をQuasar670部分でおよびその3'末端をBHQ2部分で末端標識し、SubBi-2-Q6B2と呼んだ。635nmでの励起と共に、665nmでSubBi-2-Q6B2の切断をモニターした。SubBi-2-Q6B2の配列(5'から3')を下に示した。小文字の塩基はRNAを表し、大文字の塩基はDNAを表す。
2010523088.tif 000070
【０４６０】
11.7 組織化助長因子
MNAzyme Aセンサードメインによって認識される組織化助長因子Aは、以下の配列を有する合成DNAオリゴヌクレオチドであった。
2010523088.tif 000071
【０４６１】
MNAzyme Cセンサードメインによって認識される組織化助長因子Cは、以下の配列を有する合成DNAオリゴヌクレオチドであった。
2010523088.tif 000072
【０４６２】
11.8 反応条件
反応は、下記のように、2個の別々のチューブにおいて、2つの連続した工程1および2で行った。
(1)必要とされる2',3'環式リン酸基末端を有する5'切断産物/リガーゼ基質(5LSubB)を作製するためのMNAzyme AによるPre5LSubB2-FBの切断、およびDNAzymeリガーゼによる、この断片と3LSubBの連結を、総反応体積50μlで、45℃で2時間行った。反応は、70mM Tris HCl(25℃でpH9.0)、50mM MgCl2、150mM NaCl、2mM KCl、40nM RO4B3/1(12)、40nM RO4A2/1(11)、200nM Pre5LSubB2-FBと、
(a)40nM AF-MzCA2、200nM DNAリガーゼ7Z81-10/10、および100nM 3LSubB；または
(b)40nM AF-MzCA2および100nM 3LSubB；または
(c)40nM AF-MzCA2および200nM DNAリガーゼ7Z81-10/10；または
(d)200nM DNAリガーゼ7Z81-10/10および100nM 3LSubB；または
(e)100nM 3LSubBのみ；または
(f)200nM DNAリガーゼ7Z81-10/10のみ
を含有した。
(2)MNAzyme Cによる切断から生じた蛍光の検出を、Cepheid Smartcyclerによって55℃で1時間、等温的に行った。蛍光標識された基質SubBi-2-Q6B2の添加により反応を開始した。反応は、総反応体積25μlで、前の連結反応混合物の1つ(1-aまたは1-bまたは1-cまたは1-dまたは1-eまたは1-f)10μl、および200nMのパートザイムB(STB5/2(21))、および200nM MNAzyme C組織化助長因子(AF-MzCC)、および200nMの基質SubBi-2-Q6B2を含有した。反応(1-f)10μlに200nM対照MNAzyme CパートザイムA(LS817A4/2)も添加した、正の対照反応(1-g)も含めた。
【０４６３】
11.9 結果
以下のオリゴヌクレオチド試薬を含めた反応(表10)について、MNAzyme基質C(SubBi-2-Q6B2)の切断による蛍光の増加を経時的にモニターした。
【０４６４】
（表１０）MNAzyme基質C(SubBi-2-Q6B2)の切断による蛍光の増加を経時的にモニターした
2010523088.tif 000073
2010523088.tif 000074
【０４６５】
蛍光レベルを、反応1〜7(表10)の工程(2)について経時的に測定した。反応1(1-a)は、工程(1)および(2)のすべてのオリゴヌクレオチド反応成分を含有しており、経時的な蛍光の増加を示した。観察された蛍光変化は、この反応において、484任意単位より大きく、1時間の蛍光モニタリング後に、時間0の約46から530以上に増加した。
【０４６６】
対照的に、反応2(1-b)は、工程(1)のDNAzymeリガーゼ(7Z81-10/10)オリゴヌクレオチドが無く、経時的な蛍光の増加を示さなかった。反応3(1-c)は、リガーゼ基質B(3LSubB)が無いが、工程(1)からのDNAzymeリガーゼを含有し、経時的な蛍光の増加を示さなかった。反応4(1-d)は、工程(1)からの組織化助長因子A(AF-MzCA2)が無く、1時間の蛍光モニタリングにわたって観察された約40任意単位のバックグラウンドドリフトを上回る、わずかな蛍光の経時的増加しかなかった。反応5(1-e)は、工程(1)からの組織化助長因子AおよびDNAzymeリガーゼが両方とも無く、経時的な蛍光の増加を示さなかった。反応6(1-f)は、リガーゼ基質Bおよび組織化助長因子Aが両方とも無く、経時的な蛍光の増加を示さなかった。反応7(1-g)は、対照MNAzyme CパートザイムA(LS817A4/2)を含有する正の対照であり、反応が1分未満で完了する経時的な蛍光の増加を示した。これらの反応は共に、以下の事象が反応1(1-a)で起こったことを示している。
【０４６７】
第一に、MNAzyme Aは、特定の標的組織化助長因子A(AF-MzCA2)の存在下で基質A(Pre5LSubB2-FB)を切断して、二つの断片を作製する。断片の一つは、2',3'環式リン酸基末端を有する5'断片5LSubB
2010523088.tif 000075
であった。第二に、5LSubBを、工程(1)の反応混合物中に存在する第二のDNAzymeオリゴヌクレオチドリガーゼ基質B(3LSubB)に連結させた。これにより、
2010523088.tif 000076
の配列を有する(大文字はDNA塩基を表し、小文字はRNA塩基を表す)、新たなオリゴヌクレオチド(連結産物)が形成した。次に、この連結産物は、MNAzyme Cのパートザイムとして機能した。この新たに連結されたパートザイムAはMNAzyme CパートザイムBおよび組織化助長因子Cと会合して、MNAzyme Cを作り出した。MNAzyme CはMNAzyme基質C(SubBi-2-Q6B2)を切断して、フルオロフォア/クエンチャー色素ペアを分離し、従って、蛍光を増加させた。
【０４６８】
「非連結」対照(反応2(1-b)および3(1-c))から、2',3'環式リン酸基末端を有する5'切断(5LSubB)産物と第二のリガーゼ基質B(3LSubB)の連結は、MNAzyme Cのパートザイム成分の形成に不可欠であることが証明された。
【０４６９】
「無組織化助長因子A(AF-MzCA2)」対照(反応4(1-d)、5(1-e)、および6(1-f))から、MNAzyme AによるMNAzyme基質A(Pre5LSubB2-FB)の切断および2',3'環式リン酸基末端を有する5'断片の作製は、MNAzyme Cの組織化および活性に必要なパートザイムの後の連結および形成に不可欠であることが証明された。
【０４７０】
本実施例のカスケード反応によって、組織化助長因子、本実施例では標的核酸配列の存在を検出することができた。検出を可能にしたカスケード反応では、二つのタイプの核酸酵素、すなわち、基質を連結することができるDNAzymeおよび基質を切断することができるMNAzymeが用いられる。カスケードのそれぞれの酵素工程に複数の代謝回転があることで、シグナル増幅が可能になる。
【０４７１】
本実施例において証明され、図9に図示したカスケードは、フィードバック増幅カスケードを作り出すように展開および使用することができる。5'切断産物Cの配列が5'切断産物Aと同じであれば、この産物は5'基質Bとしても役立つことができ、フィードバックカスケード反応を開始することができる。この反応において、MNAzyme切断因子Cは絶えず5'基質Bを作製し、次に、5'基質Bは、DNAzymeリガーゼBによって連結されて、さらに多くのMNAzyme切断因子Cを形成するように、さらに多くのパートザイムを作り出す。この戦略は、MNAzyme切断因子Aの組織化を誘導することができる標的分析物による反応開始後にフィードバック増幅する機構を提供することができる。この戦略を用いると、二つのタイプの核酸酵素、すなわち、DNAzymeリガーゼおよびMNAzyme切断因子を用いて、標的分析物を検出した後に、フィードバックカスケードによりシグナル増幅することが可能になる。
【０４７２】
さらに、DNAzymeリガーゼが二つの断片を連結し、このカスケードにおいて有用な、いくつかの可能性のある酵素、酵素成分、または基質を作り出すことができることは当業者に明らかであろう。前記の酵素、酵素成分、または基質には、(a)第二のMNAzyme(例えば、本実施例に示し、図9においてMNAzyme Cと表示した、MNAzyme切断因子)のパートザイム；あるいは(b)実施例12に記載し、図15においてMNAzyme切断因子2と表示した、第二のMNAzymeの新たな組織化助長因子；あるいは(c)(例えば、切断、連結などによって)基質を改変することができる新たなDNAzyme、またはMNAzymeもしくはDNAzymeによる改変に適した基質を含むが、これに限定されない。さらに、実施例7および9において証明したように、リガーゼ活性を有するDNAzymeを、リガーゼ活性を有するMNAzymeで置換できることは当業者に明らかであろう。この戦略は用途が広く、第一の工程および第二の工程の連続カスケードとして、または工程2(図9(iii))が工程1(図9(i)および(ii))の成分を作り出すフィードバックカスケード反応として行うことができる。さらに、工程2(図9(iii))は、後のさらなる反応の成分を作り出すことができる。
【０４７３】
実施例12:複数の核酸酵素の活性を利用したカスケード反応の一例
本実施例において使用した一般的な戦略を図15において概説する。この戦略もシグナル増幅法の基礎となり得る。第一の工程では、MNAzyme(MNAzyme切断因子1)が組織化助長因子(例えば、標的核酸)の存在下で形成され、基質(MNAzyme基質1)を切断して、2',3'環式リン酸基末端を有する5'切断産物を作製するのに用いられる。第二の工程では、DNAzymeリガーゼを用いて、工程1において作製された切断産物を別のオリゴヌクレオチド連結基質に連結して、組織化助長因子として機能する連結産物を作り出す。第三の工程では、工程2において作製された組織化助長因子連結産物は、基質(MNAzyme基質2)を切断することができる新たなMNAzyme(MNAzyme切断因子2)の形成に関与する。本実施例では、MNAzyme基質2をフルオロフォア色素およびクエンチャー色素ペアで標識することによって、反応を蛍光モニタリングした。
【０４７４】
12.1 MNAzyme切断因子1のパートザイム
第一の工程では、MNAzyme切断因子1が組織化助長因子(AF-MzCA2)の存在下で形成され、MNAzyme基質1(Pre5LSubB2-FB)を切断するのに用いられた。MNAzyme切断因子1パートザイム(RO4A2/1(11)およびRO4B3/1(12))の配列を以下に示した。下線の塩基は触媒コアの一部を形成し、太字の塩基は、組織化助長因子とハイブリダイズし、イタリック体の塩基は、基質にハイブリダイズする。
2010523088.tif 000077
【０４７５】
12.2 リガーゼ活性を有するDNAzyme
本実施例において使用したDNAzymeリガーゼは、2',3'環式リン酸基および5'-ヒドロキシル基からの2'-5'ホスホジエステル結合の形成によりRNAを連結することが以前に報告されている(Prior et al, 2004)。5'基質と2',3'環式リン酸基末端が必要なことに加えて、本実施例において使用したDNAzymeリガーゼは、連結接合部に、ある特定の配列モチーフも必要とする。
【０４７６】
第二の工程では、基質配列5LSubBおよび3LSubBにハイブリダイズするように設計された基質アームを有するDNAzymeリガーゼ7Z81(7Z81-10/10)を本実験において使用した。配列(5'から3')を下に示した。下線の塩基は触媒コアを形成し、イタリック体の塩基は、基質にハイブリダイズする。
2010523088.tif 000078
【０４７７】
12.3 MNAzyme切断因子2のパートザイム
第三の工程では、連結産物は新たな組織化助長因子として機能し、パートザイムペアと一緒になってMNAzyme切断因子3を形成し、蛍光標識された基質3(SubBi-3-TxB2)を切断することができる。以下の配列は、MNAzyme切断因子2の成分を形成するパートザイムに対応する。下線の塩基は触媒コアの一部を形成し、太字の塩基は、組織化助長因子とハイブリダイズし、イタリック体の塩基は、基質にハイブリダイズする。
2010523088.tif 000079
【０４７８】
12.4 MNAzyme基質1(MNAzyme切断因子1の基質)
MNAzyme基質1をMNAzyme切断因子1によって切断した。次いで、5LSubBと名付けた、結果として得られた5'断片を、DNAzymeリガーゼによって3LSubBに連結させた。基質1(Pre5LSubB2-FB)の配列は以下である。リボ塩基の5'側を6-FAM部分で内部標識し、リボ塩基の3'側をBHQ1部分で標識した(下線の塩基)。小文字の塩基はRNAを表し、大文字の塩基はDNAを表す。
2010523088.tif 000080
【０４７９】
12.5 DNAzymeリガーゼ基質
本実験において使用した連結用3'基質の配列(5'から3')を下に示した。このオリゴヌクレオチドは5'ヒドロキシル基を有する。小文字の塩基はRNAを表し、大文字の塩基はDNAを表す。
2010523088.tif 000081
【０４８０】
12.6 MNAzyme 基質2(MNAzyme切断因子2の蛍光レポーター基質)
本実施例において使用したレポーター基質は、SubBi-3であった。本実施例においてSubBi-3は、その5'末端をテキサスレッド部分でおよびその3'末端をBHQ2部分で末端標識し、SubBi-3-TxB2と呼んだ。585nm(TxB2励起波長)での励起と共に、610nm(TxB2放射波長)でSubBi-3-TxB2の切断をモニターした。SubBi-3-TxB2の配列(5'から3')を下に示した。小文字の塩基はRNAを表し、大文字の塩基はDNAを表す。
2010523088.tif 000082
【０４８１】
12.7 MNAzyme切断因子1の組織化助長因子配列
MNAzyme切断因子1センサードメインによって認識される組織化助長因子は、以下の配列を有する合成DNAオリゴヌクレオチドであった。
2010523088.tif 000083
【０４８２】
12.8 反応条件
反応は、下記のように、3個の別々のチューブにおいて、3つの連続した工程(i)、(ii)、および(iii)で行った。
(i)必要とされる2',3'環式リン酸基末端を有する5'切断産物/リガーゼ基質(5LSubB)を作製するために、Pre5LSubB2-FBを、MNAzyme切断因子1によって、総反応体積100μlで40℃で66分間切断した。反応は、50mM Tris HCl(25℃でpH9.0)、50mM MgCl2、150mM NaCl、2mM KCl、50nM RO4B3/1(12)、50nM RO4A2/1(11)と、
(a)1000nM Pre5LSubB2-FB、50nM AF-MzCA2；または
(b)1000nM Pre5LSubB2-FB；または
(c)50nM AF-MzCA2
を含有した。
(ii)総反応体積50μlで、40℃で2時間、連結を行った。反応は、最終濃度150mM NaCl、2mM KCl、50mM Tris HCl(25℃でpH9.0)および50mM MgCl2を含む反応物に、前の切断反応混合物(i-a)または(i-b)または(i-c)25μl、500nM 3LSubBと、
(a)500nMのDNAzymeリガーゼ7Z81-10/10
を含有したか、
(b)DNAzymeリガーゼを含有しなかった(非連結対照)。
(iii)Pre5LSubB2-FBの切断産物(5LSubB)および連結基質(3LSubB)の連結によって形成された組織化助長因子の存在下で、MNAzyme切断因子2パートザイムが組織化したことに起因する、MNAzymeによる切断から生じた蛍光の検出を、Cepheid Smartcyclerによって50℃で2時間、等温的に行った。蛍光標識された基質SubBi-3-TxB2の添加により反応を開始した。二重反応は、総反応体積25μlで、前の連結反応混合物((i-a/ii-a)または(i-a/ii-b)または(i-b/ii-a)または(i-b/ii-b)または(i-c/ii-a)または(i-c/ii-b))の1つを10μlと、MNAzyme切断因子2の200nMパートザイムA(LIGFACA5/3)および200nMパートザイムB(LIGFACB6/3)、ならびに400nMの基質SubBi-3-TxB2を含有した。
【０４８３】
12.9 結果
以下のオリゴヌクレオチド試薬を含有する反応(表11)について、MNAzyme基質2(SubBi-3-TxB2)の切断による蛍光の増加を経時的にモニターした。
【０４８４】
（表１１）経時的にモニターし、MNAzyme基質2(SubBi-3-TxB2)の切断による蛍光の増加
2010523088.tif 000084
【０４８５】
反応1、2、3、4、5、および6の工程(iii)について、蛍光レベルを経時的に測定した(二重反復で行った)(表10)。反応1(i-a/ii-a)は、工程(i)、(ii)、および(iii)のすべてのオリゴヌクレオチド反応成分を含有し、経時的な蛍光の増加を示した。観察された蛍光変化は、この反応において、900任意単位より大きく、2時間後に、時間0の約180から1100以上に増加した。
【０４８６】
対照的に、反応2、3、4、5、および6は、2時間の蛍光モニタリングにわたって観察された約50任意単位のバックグラウンドドリフトを上回る、経時的な蛍光の増加を示さなかった。従って、反応2(i-a/ii-b)は、工程(ii)のリガーゼDNAzymeオリゴヌクレオチドが無く、経時的な蛍光の増加を示さなかった。反応3(i-b/ii-a)は、組織化助長因子1(AF-MzCA2)が無いが、工程(ii)からのDNAzymeリガーゼを含有し、経時的な蛍光の増加を示さなかった。反応4(i-b/ii-b)は、工程(ii)からの組織化助長因子1(AF-MzCA2)およびDNAzymeリガーゼが両方とも無く、経時的な蛍光の増加を示さなかった。反応5(i-c/ii-a)は、基質1(Pre5LSubB2-FB)が無いが、工程(ii)からのDNAzymeリガーゼを含有し、経時的な蛍光の増加を示さなかった。反応6(i-c/ii-b)は、基質1(Pre5LSubB2-FB)およびDNAzymeリガーゼが両方とも無く、経時的な蛍光の増加を示さなかった。これらの反応は共に、以下の事象が反応1で起こったことを示している。
【０４８７】
第一に、MNAzyme切断因子1は、特定の組織化助長因子1(AF-MzCA2)の存在下で基質1(Pre5LSubB2-FB)を切断して、二つの断片を作製する。断片の一つは、2',3'環式リン酸基末端を有する5'断片
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であった。第二に、5LSubBを、工程(ii)の反応混合物中に存在する第二のDNAzymeオリゴヌクレオチドリガーゼ基質(3LSubB)に連結させた。この結果、
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の配列を有する(大文字はDNA塩基を表し、小文字はRNA塩基を表す)、新たなオリゴヌクレオチド(連結産物)が形成した。次に、この連結産物は、MNAzyme切断因子2の組織化助長因子として機能した。この新たに連結された組織化助長因子はパートザイムと会合して、MNAzyme切断因子2を作り出した。MNAzyme切断因子2はMNAzyme基質2(SubBi-3-TxB2)を切断して、フルオロフォア/クエンチャー色素ペアを分離し、従って、蛍光を増加させた。
【０４８８】
「非連結」対照(反応2、4、および6)から、2',3'環式リン酸基末端を有する5'切断断片(5LSubB)と第二のリガーゼ基質(3LSubB)の連結は、MNAzyme切断因子2の組織化助長因子成分の形成に不可欠であることが証明された。
【０４８９】
「無組織化助長因子(AF-MzCA2)」対照(反応3および4)から、MNAzyme切断因子1による基質1(Pre5LSubB2-FB)の切断および2',3'環式リン酸基末端を有する5'断片(5LSubB)の作製は、MNAzyme切断因子2の組織化に必要な組織化助長因子の後の連結および形成に不可欠であることが証明された。
【０４９０】
本実施例において証明された戦略は、フィードバックシグナル増幅カスケードを作り出すのに使用することができる。MNAzyme切断因子2による切断によって、MNAzyme切断因子1により作製されたものと同じ5'切断産物が生じるのであれば、この切断産物も連結して、連結産物を形成することができる。次いで、この連結産物は、さらなるMNAzyme切断因子2複合体が組織化するための別の新たなMNAzyme成分(例えば、パートザイム、組織化助長因子、または基質)として機能することができる。
【０４９１】
さらに、DNAzymeリガーゼが二つの断片を連結し、このカスケードにおいて有用な、いくつかの可能性のある酵素または酵素成分を作り出すことができることは当業者に明らかであろう。前記の酵素または酵素成分には、(a)(本実施例に示した)第二のMNAzyme切断因子の新たな組織化助長因子、または(b)実施例6、7、9、および11に示したような、第二のMNAzymeの新たなパートザイム、または(c)(例えば、切断、連結などによって)基質を改変することができる新たなDNAzymeを含むが、これに限定されない。さらに、実施例7および9において証明したように、リガーゼ活性を有するDNAzymeを、リガーゼ活性を有するMNAzymeで置換できることは当業者に明らかであろう。この戦略は用途が広く、第一の工程、第二の工程、および第三の工程の連続カスケードとして、または工程3が工程2の成分を作り出し、工程2が工程3の成分を作り出すフィードバックカスケード反応として行うことができる。さらに、工程3は、後のさらなる反応の成分を作り出すことができる。
【０４９２】
実施例13:可能性のあるフィードバックを有するカスケード反応
フィードバック増幅カスケードの一バリエーションの模式図を図16に示す。MNAzyme切断、DNAzyme連結、およびMNAzyme切断を伴うカスケードの最初の工程を図15に示し、実施例6、7、9、11、および12において証明した。本実施例に記載し、図16に示した図式は、実施例6、7、9、11、および12のカスケードの戦略を展開し、フィードバック増幅カスケードの戦略について述べている。
【０４９３】
図16に示したように、第一の工程では、MNAzyme切断因子1は、組織化助長因子(例えば、標的核酸)の存在下でしか組織化せず、次いで、MNAzyme基質1を切断して、2',3'環式リン酸基末端を有する5'切断産物を放出することができる。第二の工程では、DNAzymeリガーゼ(または組織化MNAzymeリガーゼ)は、第一の工程からの5'切断産物を3'連結基質に連結して、別のMNAzyme切断因子2の組織化助長因子として役立つことができる連結産物を作り出すことができる。第三の工程では、第二の工程における連結によって形成された組織化助長因子は、MNAzyme切断因子2を形成できるパートザイムの組織化を誘導することができる。MNAzyme切断因子2は、基質2を、二つの産物、2',3'環式リン酸基末端を有する5'産物切断および3'切断産物に切断することができる。この基質が、例えば、フルオロフォア色素およびクエンチャー色素ペアで標識されていれば、基質2が切断された後に、検出可能なシグナルを発することができる。
【０４９４】
さらに、MNAzyme切断因子2の切断産物のいずれかの配列が、MNAzyme切断因子3の組織化助長因子成分として有用であれば、これはフィードバックカスケードを開始することができる。この場合、MNAzyme切断因子3は、MNAzyme切断因子1とは異なるセンサーアームを有するが、MNAzyme切断因子1と同じ基質アームを有してもよい。従って、MNAzyme切断因子2による切断によって作製された組織化助長因子成分の存在下で、MNAzyme切断因子3が組織化し、MNAzyme切断因子3が基質1を切断すれば、MNAzyme切断因子3の5'切断産物はDNAzymeリガーゼ(または組織化MNAzymeリガーゼ)の5'基質としても役立つことができ、フィードバック増幅カスケード反応を開始することができる。この反応において、MNAzyme切断因子3は絶えず5'切断産物を作製し、次に、5'切断産物は、DNAzymeリガーゼ(または組織化MNAzymeリガーゼ)による連結の基質として役立って、さらに多くの組織化助長因子を作り出し、組織化助長因子はさらに多くのMNAzyme切断因子2の組織化を誘導することができる。この戦略は、MNAzyme切断因子1の組織化を可能にする組織化助長因子(例えば、標的分析物)による反応開始後に、フィードバックシグナルを増幅する機構を提供することができる。この戦略を用いると、基質を連結することができるDNAzymeまたはMNAzymeおよび基質を切断することができるMNAzymeを用いて、1つまたは複数の組織化助長因子(標的分析物)を検出した後に、シグナル増幅することが可能になる。
【０４９５】
さらなるバリエーションでは、リガーゼ活性を有するDNAzyme(またはMNAzyme)は、MNAzyme3の組織化助長因子成分を作り出す基質2を切断することができるDNAzymeを形成するように、断片を連結することができる。従って、このバリエーションでは、MNAzyme切断因子2を、第二の工程からの連結によって作り出されたDNAzyme切断因子で置換することができる。
【０４９６】
基質が、例えば、フルオロフォアクエンチャー色素ペアで標識されていれば、基質1および/または基質2が切断されることによってシグナルが発生することも当業者に明らかであろう。この場合、切断によって蛍光が増加するだろう。さらに、連結基質と、MNAzyme切断因子1および/またはMNAzyme切断因子3の5'産物がそれぞれフルオロフォアまたはクエンチャーで標識されていれば、断片が連結した後に、蛍光変化を測定することが可能になるであろう。このシナリオでは、連結によって、溶液中で、または一方の連結可能な基質が固体支持体に取り付けられているアッセイでは特定の位置で、蛍光が変化するだろう。
【０４９７】
MNAzymeまたはDNAzymeによる工程2または工程3の切断(または連結)によって作製される組織化助長因子成分は、非常に多くの設計のいずれか一つでよい。例として、図6に図示したような、組織化助長因子および/またはパートザイムセンサーアームの構成をいずれも組織化することができる。
【０４９８】
MNAzyme切断因子2の産物がMNAzyme切断因子3の組織化助長因子成分として使用することができるフィードバックカスケード戦略の別のバリエーションでは、MNAzyme切断因子3は、改変された構造を有してもよい。この変形では、MNAzyme切断因子3は、MNAzyme切断因子1とは異なるセンサーアームを有することができるが、基質1上の配列の一部(基質の5'部分)と相互作用するMNAzyme切断因子1パートザイム配列と同じMNAzyme 3基質アームを(一方のパートザイム上に)一つ有してもよい。基質1上の配列の一部(基質の5'部分)は、後で、リガーゼによって連結される。従って、MNAzyme切断因子3は、5'部分では同じ配列を有するが、3'末端では異なる部分を有する、基質(切断可能な基質3)を切断することができ、切断可能な基質1について逆もまた同じである。基質3の切断部位は、切断可能な基質1と切断可能な基質3の間で共通する配列と、異なる配列の接合部にある。この場合、MNAzyme切断因子3が、MNAzyme切断因子2による切断によって作製された組織化助長因子成分の存在下で組織化されたとき、MNAzyme切断因子3が基質3を切断すれば、MNAzyme切断因子3の5'切断産物は、DNAzymeリガーゼ(または組織化MNAzymeリガーゼ)の5'基質としても役立つことができ、フィードバック増幅カスケード反応を開始することができる。この反応において、MNAzyme切断因子3は絶えず5'切断産物を作製し、次に、5'切断産物は、DNAzymeリガーゼ(または組織化MNAzymeリガーゼ)による連結の基質として役立って、さらに多くの成分、例えば、組織化助長因子を作り出し、組織化助長因子はさらに多くのMNAzyme切断因子2の組織化を誘導することができる。この戦略は、MNAzyme切断因子1の組織化を可能にする組織化助長因子(例えば、標的分析物)による反応開始後に、フィードバックシグナルを増幅する機構を提供することができる。この戦略を用いると、基質を連結することができるDNAzymeまたはMNAzymeおよび基質を切断することができるMNAzymeを用いて、組織化助長因子(例えば、標的分析物)を検出した後に、シグナル増幅することが可能になる。
【０４９９】
このカスケードにおいて用いられる核酸酵素は、後の反応、例えば、フィードバック状況において使用することができる異なる成分を作り出すことができることも当業者に理解されるだろう。例として、図16を見ると、MNAzyme切断因子2は、図示した組織化助長因子成分の代わりにMNAzyme切断因子3のスタビライザーアームを作り出すことができる。別のバリエーションでは、MNAzyme切断因子2は、例えば、図16とは反対に、MNAzyme切断因子3のパートザイムもしくは組織化助長因子またはDNAzyme切断因子を作り出すことができるMNAzymeリガーゼと交換することができる。これにより、MNAzyme切断因子2は組織化助長因子成分を作り出す。
【０５００】
戦略の別の変形では、DNAzyme(またはMNAzyme)リガーゼは断片を連結し、反応物に存在する別のパートザイムおよび組織化助長因子と会合することができる新たなパートザイムを作り出して、MNAzyme切断因子2を形成することができる。MNAzyme切断因子2は基質2を切断して、MNAzyme3の組織化助長因子成分を作り出すことができる。
【０５０１】
説明したバリエーションはまた、本明細書全体を通じて、他のカスケードにおいても適宜使用することができる。本明細書の他の場所に記載の、さらなるバリエーションもここで適用することができる。
【０５０２】
フィードバックカスケードを含む核酸酵素カスケードを用いると、標的分析物が検出された後に、シグナルが発生する。このカスケードの第一のMNAzymeはMNAzymeでもアプタ-MNAzymeでもよく、従って、MNAzyme系は、核酸標的および非核酸分析物、例えば、タンパク質または脂質を検出するように設計することができる。
【０５０３】
さらに、フィードバックカスケードは、出力または検出可能なシグナルをさらに増幅することができる。核酸酵素を用いたシグナル増幅カスケードには、標的増幅検出技術、例えば、リアルタイムPCRを上回る利点がある。標的増幅技術は、研究および/または臨床診断において広く用いられている強力なツールであるが、それぞれ固有の欠点がある。これらは全て、タンパク質酵素(例えば、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、逆転写酵素、および/またはリガーゼ)の使用を必要とする。タンパク質酵素を含めると、試薬製造の複雑さおよびコストが上昇し、試薬を備えるキットの貯蔵寿命が短くなる。他の関連する技術的な問題には、偽陽性シグナルにつながる、前の反応からのレプリコン(標的アンプリコン)による汚染、および/またはプライマー配列(プライマー-二量体)の複製により引き起こされるバックグラウンドシグナル、もしくは標的非依存性の連結により引き起こされるバックグラウンドが含まれる。
【０５０４】
実施例14:10:23触媒コアに由来する変異部分触媒コア配列を含有するパートザイムペアシリーズからのMNAzyme活性の試験
様々なインビトロで進化させたDNAzymeからの部分配列を組み込んだ多成分核酸酵素(MNAzyme)を作ることができる。8:17DNAzymeおよび10:23DNAzymeからの部分配列に基づく活性MNAzymeが証明されている。さらに、8:17DNAzymeおよび10:23DNAzymeに基づく、いくつかの代わりのパートザイム設計が切断活性を有するか、または切断活性を欠くことが示されている(PCT/AU2006/001473、Johnson & Johnson Research Pty Limited)。本実施例では、基質を切断することができる10:23DNAzymeからの部分触媒コア配列に基づいて、活性なパートザイム配列および不活性なパートザイム配列が両方とも特定される。さらに、本実施例は、部分触媒コア配列がパートザイムに組み込まれたときに、機能的な活性MNAzymeが作製されるように、触媒コア配列の分割に最適な場所を特定するのに必要な工程のための一般的なプロトコールを提供する。
【０５０５】
公知の、またはインビトロで進化させた他のDNAzymeを、本実施例ならびに実施例7および9に記載の分析と類似の分析に供することができる。従って、これらの実施例は、切断(本実施例)もしくは連結(実施例7および9)を含む多くの機能、または核酸のリン酸化、核酸キャッピング、アミノ酸アデニル化、補因子合成、RNA重合、テンプレート指向性重合、RNA-タンパク質の結合、アルドール反応、アルコール酸化、アルデヒド還元、プリンおよびピリミジンヌクレオチド合成、アルキル化、アミド合成、尿素合成、ペプチド結合の形成、ペプチジル-RNA合成、アシル転移、アミノアシル化、炭酸塩加水分解、ホスホロチオエートアルキル化、ポルフィリンメタレーション、炭素-炭素結合の形成、Pdナノ粒子形成、ビフェニル異性化、エステル結合の形成、アミド結合の形成、DNA脱グリコシル、チミン二量体の光変換、およびホスホロアミダート切断を含むが、これに限定されない、インビトロで進化させた他の機能が可能な活性MNAzymeの部分触媒コア配列を特定するのに、当業者が使用することができる方法を提供する。
【０５０６】
14.1.パートザイムオリゴヌクレオチド
本実施例における方法は、パートザイムに組み込まれると機能的活性MNAzymeを生じさせる部分触媒コア配列に分割するために、10:23触媒コア配列の中のどの位置が適するかを調査するために使用した。10:23配列を様々なポイントで分割し、その後、それらの二つの部分配列を、標的(ヒトRPLPO遺伝子)の存在下で基質を切断するように設計されたパートザイムペアのシリーズに組み込んだ。試験した各パートザイムペアについての部分触媒コアを、その10:23DNAzymeの完全触媒コア配列(Santoro and Joyce, 1997)への参照と共に、表12に示す。
【０５０７】
（表１２）10:23DNAzymeにおける、ならびにコア内の位置1〜15の塩基を二つのパートザイムAおよびBの間で異なるように配置した変異体パートザイムペアのシリーズにおける、塩基および位置
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すべての配列は、5'から3'へと記載されている。MNAzyme設計およびパートザイムの命名により、DNAzymeおよびコア内の分割位置が特定される。例えば、設計6は、位置8のTと位置9のAの間(T8-T9)でコアを分割した、パートザイムA4およびパートザイムB5設計(A4:B5)を有する10:23由来のMNAzymeである。
【０５０８】
この実験では、パートザイムペアのシリーズはすべて、ヒトRPLPO遺伝子のエキソン5にハイブリダイズするように設計したセンサーアーム、および基質、SubBi-2に向けた基質アームと共に合成された。この実験において使用したパートザイムペアは、Sigma-Proligoによって合成されたものであり、それらの配列を下に示した(5'から3')。下線の塩基は、組織化MNAzymeの触媒コアの一部を形成し、太字の塩基は、核酸標的とハイブリダイズし、イタリック体の塩基は、基質にハイブリダイズする。「-P」は、そのオリゴヌクレオチドの3'リン酸化を示す。
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【０５０９】
14.2.レポーター基質
本実施例のためのレポーター基質は、下のとおりの配列、5'から3'を有するSubBi-2である。本実施例において、SubBi-2は、その5'末端を6-FAM部分でおよびその3'末端をBHQ1部分で末端標識し、SubBi-2-FBと呼んだ。485nm(FAM励起波長)での励起と共に、530nm(FAM放射波長)でSubBi-2-FBの切断をモニターした。小文字の塩基はRNAを表し、大文字の塩基はDNAを表す。
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【０５１０】
14.3.ヒトRPLPO遺伝子のエキソン5の増幅のためのPCRプライマー
これらのプライマーの配列を下に5'から3'へと示す。
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【０５１１】
14.4.標的テンプレート
K562細胞から抽出したヒトゲノムDNAをPCR反応のテンプレートとして使用した。
【０５１２】
14.5.反応条件
標的配列のリアルタイム増幅およびパートザイムペアの触媒活性の検出を、ABI 7700サーモサイクラー(Applied Biosystems)を用いてサイクリングさせる25μLの反応で行った。サイクリングパラメータは、95℃で7分間、10サイクルの95℃で15秒間および65℃で30秒間(1サイクルにつき温度が1℃低下する)、ならびに最後に、50サイクルの95℃で15秒間および50℃で30秒間であった。各反応は、0.04μMの5RO5/2、0.2μMの3RO5/2、10mMのMgCl2、50μMの各dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、1xImmobuffer(Bioline)、0.2μMのSubBi-2-FB、1xROXリファレンス色素(Invitrogen)、10単位のRnasin(Promega)、1単位のImmolase Polymerase(Bioline)、および100ngのゲノムDNAを含有した。加えて、各反応は、パートザイムのペア:0.2μMのパートザイムAおよび0.2μMのパートザイムB(RPLPOパートザイムペアA4:B5またはA5:B6またはA6:B7またはA7:B8またはA8:B9またはA9:B10)を含有した。
【０５１３】
14.6.結果
リアルタイムMNAzyme-PCR法を使用して、六つのRPLPOパートザイムペアのうちの三つから触媒活性を検出した。パートザイムペアA4:B5およびA5:B6は、高い触媒活性レベルを示し、その結果、22サイクル後に標的を検出することができた(表13)。A7:B8パートザイムペアも活性を有したが、A4:B5およびA5:B6より低い活性であった。この実験の条件下でパートザイムペアA6:B7、A8:B9またはA9:B10から触媒活性は検出されなかった。
【０５１４】
（表１３）様々なパートザイムペアを使用して得たサイクル閾値(Ct)
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Ct値は、三重反復の反応からの平均であり、このとき、蛍光レベル閾値を0.2に設定し、サイクル1〜14の間、ベースラインバックグラウンド蛍光を引いた。
【０５１５】
本実施例は、部分コア配列がパートザイムに組み込まれたときに、触媒活性MNAzymeを形成できるように、10:23DNAzymeの触媒コアを分割する方法がいくつかあることを証明する。本実施例はまた、部分コア配列がパートザイムに組み込まれたときに、全ての部分コア配列が活性MNAzymeを形成するとは限らないことを証明する。本実施例で証明された方法は、活性MNAzymeに組織化することができるパートザイムへの組込みに適した部分コア配列を特定するのに使用することができる。
【０５１６】
特許および特許刊行物：
PCT国際公開公報第99/50452号
他の参考文献:
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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