(57)【要約】  本発明は、多発性硬化症や、クローン病又は潰瘍性大腸炎のような炎症性大腸疾患などの自己免疫疾患の予防及び治療用の薬剤を調製するためのチモシンアルファ１の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己免疫疾患の予防及び治療用の薬剤を調製するためのチモシンアルファ１の使用。
【請求項２】
前記自己免疫疾患が多発性硬化症又は炎症性内臓疾患である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記炎症性内臓疾患が、具体的に炎症性腸管疾患である、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記炎症性腸管疾患が、潰瘍性大腸炎又はクローン病である、請求項３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己免疫疾患の予防及び治療用の薬剤を調製するためのチモシンアルファ１の使用に関する。具体的には、本発明は、多発性硬化症（ＭＳ）や、クローン病又は潰瘍性大腸炎のような炎症性腸管疾患などの自己免疫疾患の予防及び治療用の薬剤を調製するためのチモシンアルファ１の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症に基づいた神経疾患との闘いは、世界的な規模での科学的、社会的及び経済的な主要課題の一つである。ここ数年で、ＭＳ、感染性及び感染後の脳脊髄炎及び脳炎、自己免疫疾患の神経合併症、ラズムッセン脳炎、虚血並びに外傷性脳損傷などの中枢神経系（ＣＮＳ）の病態の相当数は、神経及び軸索の損傷に密接に関連した炎症プロセスによるものであることが明らかになってきている。神経変性は、永続性の神経不全の主要な原因である。神経炎症性の疾患は、感覚運動不全、認知機能の悪化、失禁及び行動異常などの重篤な障害に関連しているので、社会に対して多大の経済的なコストを強いることになる。多発性硬化症（ＭＳ）は、西欧において、若年成人の神経性疾患の主要な原因である。ＭＳは、遺伝的及び環境的な基礎因子を有する、病因が不明な、ＣＮＳの慢性炎症性疾患である。既に述べたように、ＭＳは、西欧において、若年成人の神経性疾患の主要な原因であり、中欧及び北欧において高頻度で見出されている（１００，０００人あたり３０例を超える）。多くの患者の場合、本疾患は、神経機能障害の事象で始まり、完全寛解又は部分寛解（再発寛解型ＭＳ）が続き、その後、進行性の障害を伴った進行性のトレンドを示す（二次進行性ＭＳ）。本疾患の急性なトレンドはより稀であるが、ある患者では、直ちに進行性のトレンド（一次進行性ＭＳ）を示す。病理学的には、ＭＳは、磁気共鳴映像で確認される損傷が白質内に存在することが特徴である。炎症性浸潤、ミエリン（アクソンを覆っている脂質に富んだ膜）及び稀突起膠細胞（ミエリンを生産する細胞）の喪失、アクソンの損傷並びに反応性のグリオーシスの全てが、病変又はプラークの中に認められている。最近では、さらに詳細な神経病理学的な研究及び高度の磁気共鳴映像技術の応用によって、白質内により広範に広がった炎症性の損傷が存在し、また大脳皮質の灰白質内に病変が存在し、これらが、神経変性プロセスと関連しており、また進行型の疾患において顕著であることが示されている。相当数の臨床研究及び実験研究にもかかわらず、ミエリン及び神経細胞の損傷の根底にある複雑な免疫病理学的な機序は、依然としてほとんど不明である。自己免疫疾患は、通常は、病気及び感染から身体を防御している免疫系が、自身を攻撃するときに発症する。自己免疫疾患は、神経及び筋肉などの身体の多くの部位を攻撃できると共に、重大かつ慢性の病的状態及び障害を引き起こす。本疾患に関する知見の大部分は、ヒトで生じていることを模倣した、動物の脱ミエリン化のモデルである、実験的自己免疫性脳炎（ＥＡＥ）の研究から得られている。実際には、動物をある種のミエリンタンパク質に対して感作させて、多発性硬化症の症状に類似した症状を発症させる。次いで、実験的療法をこれらの動物に施して、その有効性を評価する。細胞療法には、ある型の細胞、主に樹状細胞を用いるが、この細胞をこれらの障害を発症した動物に注入すると、免疫耐性の維持を担うＴ制御細胞（Ｔｒｅｇ）が生産される。最近の研究によれば、樹状細胞は、処理された動物中で新しいＴｒｅｇ細胞の成長を引き起こし、これらのＴｒｅｇ細胞が、神経を被覆しているミエリンを攻撃する免疫細胞を、特異的に中和することが示されている。この処理は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成されたＴｒｅｇ細胞でも有効であった。最近の研究によれば、様々な病理に対して、臨床の分野で既に幅広く使用されているチモシンホルモンである、チモシンアルファ１（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ａ．Ｌ．Ｂａｄａｍｃｈｉａｎ，Ｍ．、チモシン：健康及び病気における化学及び生物学的特性（Ｔｈｙｍｏｓｉｎｓ：ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ．、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００４，４：５５９−７３））が、樹状細胞に対する選択的作用のためにｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴｒｅｇを誘導することができる（Ｒｏｍａｎｉ  Ｌ，Ｂｉｓｔｏｎｉ  Ｆ，Ｐｅｒｒｕｃｃｉｏ  Ｋ，Ｍｏｎｔａｇｎｏｌｉ  Ｃ，Ｇａｚｉａｎｏ  Ｒ，Ｂｏｚｚａ  Ｓ，Ｂｏｎｉｆａｚｉ  Ｐ，Ｂｉｓｔｏｎｉ  Ｇ，Ｒａｓｉ  Ｇ，Ｖｅｌａｒｄｉ  Ａ，Ｆａｌｌａｒｉｎｏ  Ｆ，Ｇａｒａｃｉ  Ｅ，Ｐｕｃｃｅｔｔｉ  Ｐ．、チモシンアルファ１は樹状細胞のトリプトファン異化作用を活性化し、炎症及び忍容性のバランスのための制御環境を整える（Ｔｈｙｍｏｓｉｎ  ａｌｐｈａ  １  ａｃｔｉｖａｔｅ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｓ  ａ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｂａｌａｎｃｅ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ．、Ｂｌｏｏｄ．２００６  Ｊｕｎ  １；［Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ］））ことが示されている。
【０００３】
炎症性腸管疾患（ＩＢＤ）には、小腸及び大腸の両方が関与し得る。クローン病及び潰瘍性大腸炎は、最も知られた型のＩＢＤであるが、これらの病因は不明なので、どちらも特発性の炎症性腸管疾患の範疇に属している。病理の検査では、ＩＢＤのある特定な型を示唆することもあるが、一般的には特異的ではない。「活性な」ＩＢＤは、急性の炎症が特徴である。「慢性の」ＩＢＤは、腸管陰窩の歪みや穴の構造上の変化が特徴である。陰窩の膿瘍（陰窩内腔で活性化された好中球から構成される）は、多くの型のＩＢＤの中に存在することができる。
【０００４】
潰瘍性大腸炎（ＵＣ）は、主として遠位粘膜の疾患である。事実上は、直腸が常に関与している。ＵＣの病理は不明である。ＵＣは、コーカサス人、女性及び若年成人（発症のピークは、約２０〜２５歳）の間で、より一般的である。臨床の結果には、しぶりを伴った、又はしぶりを伴わない下痢が含まれる。長期にわたってＵＣを患っている患者は、悪性腫瘍を発症する危険性が非常に高い。悪性腫瘍の発症確率が高いことを意味する、粘膜における新生物形成の変化である形成異常は、大腸生検を利用して確かめることができる。ＵＣの患者は、硬化性胆管炎及び胆汁管のがんを含む、肝障害を発症するリスクも高い。
【０００５】
クローン病は、腸管のどんな部位をも侵し得るが、腸管の細い部分及び遠位部が関与することが最も多い。炎症は一般に貫壁性であり、リンパ濾胞上部に小潰瘍のようなもの、又は貫壁性の溝及び慢性炎症の中に深い潰瘍のようなものを生成することがある。このようなケースの三分の一は、リンパ節及び肝臓などの、大腸を超えた領域に肉芽腫症を有する。貫壁性の炎症は、腸管と他の組織との間に、瘻孔を発達させる。本炎症は、一般的には部分的である。感染性及び免疫学的な機構が示唆されているが、病理は不明である。二峰性の発症率及び女性とコーカサス人における発症率の増加がある。臨床所見は多様であり、下痢、発熱及び疼痛、並びに関節炎、虹彩毛様体脈絡膜炎、結節性紅斑及び強直性脊椎炎による非腸管の所見が含まれることがある。
【０００６】
潰瘍性大腸炎とクローン病の比較
【表１】
2010507650.tif 000002
【０００７】
感染が原因のＩＢＤは、一般的に発症がより急性であり、発症期間が短い。ＩＢＤを発症させる細菌には、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）及びいくつかの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が含まれる。細菌は、慢性的な変化のない、自己限定性大腸炎の一般的な原因である。ウイルス性の発病因子には、ノーウォークウイルス（Ｎｏｒｗａｌｋ  Ｖｉｒｕｓ）、ロタウイルス（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）、及びサイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）が含まれる。その他の原因としては、クラミジア感染及びアメーバ症がある。抗生物質の使用に関連したＩＢＤは、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）又はカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）などの他の微生物の過剰な増殖を引き起こすことにつながる、広範囲抗生物質を使用する療法に起因し得る。ＩＢＤは、また、虚血に起因することもある。
【０００８】
薬物治療は、潰瘍性大腸炎及びクローン病の両方の症状を緩和するための主要な方法である。ＩＢＤの治療のための薬剤の開発には、大きな進歩がある。これらには次の薬剤が含まれる：
・本疾患によって引き起こされる炎症を減少させるために用いられる、抗炎症剤。
・免疫システムが、自分自身の身体を攻撃することによって、炎症の悪循環を引き起こすことを阻害するための、免疫抑制剤。
【０００９】
ＩＢＤ患者が、これらの薬剤に反応しない場合には、外科手術が必要になる。しかし、ＵＣ及びクローン病に対する外科手術の手法は大きく異なっている。クローン病においては、本疾患に再発性があるため、医師はできるだけ手術を避ける努力をしなければならない。さらに、クローン病に対して積極的な外科的アプローチを行うと、短小腸症候群などのさらなる合併症の原因になると考えられており、この短小腸症候群は、成長障害及び栄養素の摂取能力の減退の問題を引き起こす。ＵＣに関しては、医師は骨盤に糞便を収集するためのポケットを小腸に形成する、回腸肛門吻合（回腸貫通とも呼ばれる）と呼ばれる外科的な操作と一緒に、結腸（大腸）を削除することが必要になる場合がある。この回腸肛門吻合は、糞便が肛門を通過することを可能にする。
【００１０】
最近の知見によれば、ＩＢＤが、炎症エフェクター及び制御細胞（Ｔｒｅｇ）が関与する、免疫の調節障害である可能性のあることが示唆されている。この点に関して、ＩＢＤの実験モデルにおいて、ＩＢＤの転帰に関連付けできる可能性のある、３つのシナリオが確認できる：
ａ．バランスのとれたエフェクター及び制御応答＝炎症反応の制御及びＩＢＤの兆候はない。
ｂ．制御応答に対する過剰なエフェクター応答＝炎症及びＩＢＤ。
ｃ．制御の欠落＝無制御の炎症及び重篤なＩＢＤ。
【００１１】
ＩＢＤの治療のために研究されている製品数は、１９９３年の３製品、１標的から、２００５年の３０超の製品、１０超の標的へと増加した。ＴＮＢＳ（下記参照）で誘導した大腸炎は、クローン病に対する革新的な療法を試験するための、有効な前臨床モデルとして役立つ。これには、大腸における５−アミノサリチル酸及びロイコトリエン拮抗剤の適用、一酸化窒素を放出するプレドニソロン誘導体を用いた全身処理、ケモカインの拮抗剤並びに抗接着分子が含まれる。臨床的観点からは、クローン病に罹患した患者のサブグループにおいて有望である、抗ＴＮＦのアプローチが、慢性のＴＮＢＳ大腸炎においても有益な治療効果を示している。ＩＢＤの発症機序解明の過程おいて開発され、研究されている多くの製品が、ＩＢＤに関する臨床研究を増加させる努力が必要であることを強調している。最近の研究によれば、様々な病状に対して臨床分野で既に幅広く使用されている、チモシンホルモンの一つであるチモシンアルファ１が、樹状細胞に対する選択的な作用のために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴｒｅｇを誘導することができることを示している。
【００１２】
今日まで、自己免疫疾患は、コルチコステロイドなどの免疫抑制剤又は抗炎症剤で治療されている。しかし、これらの薬剤は、免疫の抑制及び高血糖症などの、ときには重篤な、副作用を有することがある。
【００１３】
上記の観点から、既知の療法が有する不都合な点を提起しないような、自己免疫疾患の治療及び予防のための新規な薬剤に対する明確なニーズがある。
【００１４】
本発明者等は、チモシンアルファ１が、身体に対して何らの有害作用を引き起こすことなく、自己免疫疾患を予防し、かつ効果的に治療することができることを発見した。
【００１５】
チモシンアルファ１（Ｔα１）は、天然に見出されるチミンペプチドであり、単独療法及びＩＦＮ−αとの組み合わせ療法で、並びに免疫アジュバントとして、ある種のウイルス性感染症に対する治療薬としてよく知られている（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ  Ａ．等、２００４  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．４：５５９−５７３）。
【００１６】
チモシンアルファ１については、免疫不全症、腫瘍及びＡＩＤＳの治療など、他の治療適応症も知られている。Ｔα１が、ＴＬＲ９を通して樹状細胞（ＤＣ）の機能を調整することによって、先天性免疫系や適応免疫系の内因性の制御因子として作用することが、最近示されている（Ｒｏｍａｎｉ  Ｌ．等、２００４，Ｂｌｏｏｄ  １０３：４２３２−４２３９）。
【００１７】
チモシンアルファ１は、また、ＩＦＮ−αとの組み合わせ、及び免疫アジュバントとして、ある種のウイルス性感染症の治療に対する生物学的応答の調節因子としても知られている（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ  Ａ．等、２００４  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．４：５５９−５７３）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明の具体的な目的は、自己免疫疾患、好ましくは、多発性硬化症や、炎症性腸管疾患（例えば潰瘍性大腸炎及びクローン病）のような炎症性内臓疾患の予防及び治療用の薬剤を調製するためのチモシンアルファ１の使用にある。
【００１９】
本発明を、その好ましい実施形態に従い、添付図面にある図を特に参照して、例示の目的で記載するが、これらの実施例に限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＭＯＧペプチドによる免疫化に関する、時間（日）に対するマウス（ｎ＝５）の平均臨床スコアを示す図である。
【図２】オスミウムテトロキシドで染色した、脊髄のセミファイン切片の組織学的分析を示し、ＭＧＯで処理したマウスにおける、脱ミエリン化した領域を強調する図である。チモシンアルファ１で処理したマウスにおける、脱ミエリン化の顕著な兆候は認められない。背景の矢印は、完全な状態のミエリン鞘を示している。
【図３】ＤＡＳ、ＭＡＳ及びＭＰＯの尺度で測定した、誘導された大腸炎の重篤度に対する、チモシンアルファ１の影響を示す図である。チモシンアルファ１によって、真性大腸炎の存在に関連した及び関連が想定されるパラメータの全てが、劇的に減少することを示している。
【図４】対照の動物、大腸炎（ＴＮＢＳ）の動物、又はチモシンアルファ１（ＴＮＢＳ＋Ｔα１）処理の動物の粘膜固有層から単離した、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋のサイトカイン生産を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
（実施例１）
ＥＡＥにおけるチモシンアルファ１の有効性の評価
この目的を達成するために、ＥＡＥのモデルを用いて、感受性動物のミエリンに由来するペプチドを投与することによる疾患の誘導を考察した。この動物をチモシンアルファ１で処理し、臨床的及び組織学的なパラメータに従って、チモシンアルファ１の有効性を評価した。
【００２２】
方法
ＥＡＥの誘導
完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ、４マイクログラム／ｍｌ）中１００マイクログラムのＭＯＧ３５−５５（ミエリン糖タンパク質のペプチド断片）からなる乳濁液１００マイクロリットルを、Ｃ５７ＢＬ６マウスの尾の付け根の部分に注射して、ＥＡＥを誘導する。ＥＡＥの誘導は、免疫処置の当日及び３日後に、２００ｎｇ／マウスの用量のパートキシック毒素を腹腔内に注射することによるのが好ましい。チモシンアルファ１（２００ｎｇ／ｋｇ）での処理は、２種類の実験設計に従って、腹腔内注射で行う。１種類目は、ＭＯＧを投与した最初の日からチモシンの投与を開始し、その後３日間継続して投与した（Ｔα１＋ＭＯＧ）。２種類目は、ＭＯＧを投与して１０日後からチモシンの投与を開始し、その後３日間継続して投与した（ＭＯＧ＋Ｔα１）。
【００２３】
ＥＡＥの評価
以下のパラメータに従って、マウスを毎日臨床評価した：０、正常；１、尾の弛緩又は後肢の弱り；２、後肢の弱りを伴う尾の弛緩；３、後肢の不全麻痺；４、後肢の完全麻痺；５、瀕死状態。脊髄のセミファイン切片の組織学的分析は、オスミウムテトロキシドで染色して行った。
【００２４】
結果
結果（図１）は、チモシンアルファ１が、ＭＯＧで処理したマウスにおけるＥＡＥの発症率及びその症状の重大さ（スコア）の両方を、有意に減少させることができることを示している。この効果は、ＭＯＧの感作と同時及びその後にチモシンを投与した場合に、特に顕著である。
【００２５】
図２は、オスミウムテトロキシドで染色した、脊髄のセミファイン切片の組織学的分析を示し、ＭＧＯで処理したマウスにおける、脱ミエリン化した領域を強調しているが、チモシンアルファ１で処理したマウス内には、脱ミエリン化の顕著な兆候は認められない。黒い矢印は、完全な状態のミエリン鞘を示す。これらの結果は、チモシンアルファ１が、ＥＡＥの発症及びその神経病理学的な重篤度に対して、保護的な作用を有することを示している。
【００２６】
（実施例２）
ＩＢＤの実験モデルにおけるチモシンアルファ１の有効性の評価（Ｆｉｏｒｕｃｃｉ  Ｓ，Ａｎｔｏｎｅｌｌｉ  Ｅ，Ｄｉｓｔｒｕｔｔｉ  Ｅ，Ｄｅｌ  Ｓｏｌｄａｔｏ  Ｐ，Ｆｌｏｗｅｒ  ＲＪ，Ｃｌａｒｋ  ＭＪ，Ｍｏｒｅｌｌｉ  Ａ，Ｐｅｒｒｅｔｔｉ  Ｍ，Ｉｇｎａｒｒｏ  ＬＪ．ＮＣＸ−１０１５、プレドニソロンの一酸化窒素誘導体は粘膜固有層における調節性Ｔ細胞を促進し、マウスにおける２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸誘導の大腸炎に対して保護する（ａ  ｎｉｔｒｉｃ−ｏｘｉｄｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｏｆ  ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ、ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌａｍｉｎａ  ｐｒｏｐｒｉａ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ２，４，６−ｔｒｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅ  ｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｏｌｉｔｉｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００２，９９：１５７７０−５）。
この目的を達成するために、ＩＢＤのモデルを用いて、トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）のハプテン化された誘導体を大腸内に投与することによる疾患の誘導を考察した。この動物をチモシンアルファ１で処理し、臨床的及び組織学的なパラメータに従って、その有効性を評価した。
【００２７】
方法
大腸炎のモデル
ハプテン化されたＴＮＢＳを大腸に適用すると、げっ歯類に急性及び慢性の大腸炎を引き起こす（Ｆｉｏｒｕｃｃｉ  Ｓ，Ａｎｔｏｎｅｌｌｉ  Ｅ，Ｄｉｓｔｒｕｔｔｉ  Ｅ，Ｄｅｌ  Ｓｏｌｄａｔｏ  Ｐ，Ｆｌｏｗｅｒ  ＲＪ，Ｃｌａｒｋ  ＭＪ，Ｍｏｒｅｌｌｉ  Ａ，Ｐｅｒｒｅｔｔｉ  Ｍ，Ｉｇｎａｒｒｏ  ＬＪ．ＮＣＸ−１０１５、プレドニソロンの一酸化窒素誘導体は粘膜固有層における調節性Ｔ細胞を促進し、マウスにおける２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸誘導の大腸炎に対して保護する（ａ  ｎｉｔｒｉｃ−ｏｘｉｄｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｏｆ  ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ、ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌａｍｉｎａ  ｐｒｏｐｒｉａ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ２，４，６−ｔｒｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅ  ｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｏｌｉｔｉｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００２，９９：１５７７０−５）。
【００２８】
ＴＮＢＳによる大腸炎における粘膜の炎症は、好中球性の浸潤物を有するが、炎症はまた、Ｔリンパ球の活性化（Ｔｈ１）並びに多量のマクロファージ及び単球類を含んでいる。組織学的特徴は、ヒトにおけるクローン病、貫壁性の炎症、肉芽腫、潰瘍及び不連続病変（正常な粘膜に挟まれた潰瘍の斑点）に類似している（Ｍｏｒｒｉｓ  ＧＰ，Ｂｅｃｋ  ＰＬ，Ｈｅｒｒｉｄｇｅ  ＭＳ，Ｄｅｐｅｗ  ＷＴ，Ｓｚｅｗｃｚｕｋ  ＭＲ，Ｗａｌｌａｃｅ  ＪＬ．、ラットの大腸における慢性的炎症及び潰瘍のハプテン誘導モデル（Ｈａｐｔｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｕｌｃｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ  ｃｏｌｏｎ、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．１９８９，９６：７９５−８０３））。
【００２９】
何らかの下痢の開始、体重の減少、糞便中の血液について、動物を毎日監視し、また、その生存率（疾患の活性の程度、ＤＡＳと相関する）を調べた。実験の終了時に、生存しているマウスを屠殺して大腸を解剖し、微視的な病変を評価した（粘膜活性スコア、ＭＡＳと呼ばれる）。次に、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性（炎症のインデックスの一つ）を測定するために、組織の切片を用いた。
【００３０】
大腸炎の微視的な度合
切片化した大腸を顕微鏡下（倍率５）で調べ、充血、腸管肥厚、及び潰瘍の拡大などの、炎症を反映した基準に基づいた、０〜１０の尺度に従って、その微視的な病変を分類した。
【００３１】
ＭＰＯの分析
既報の方法（Ｆｉｏｒｕｃｃｉ  Ｓ，Ａｎｔｏｎｅｌｌｉ  Ｅ，Ｄｉｓｔｒｕｔｔｉ  Ｅ，Ｄｅｌ  Ｓｏｌｄａｔｏ  Ｐ，Ｆｌｏｗｅｒ  ＲＪ，Ｃｌａｒｋ  ＭＪ，Ｍｏｒｅｌｌｉ  Ａ，Ｐｅｒｒｅｔｔｉ  Ｍ，Ｉｇｎａｒｒｏ  ＬＪ．ＮＣＸ−１０１５、プレドニソロンの一酸化窒素誘導体は粘膜固有層における調節性Ｔ細胞を促進し、マウスにおける２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸誘導の大腸炎に対して保護する（ａ  ｎｉｔｒｉｃ−ｏｘｉｄｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｏｆ  ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ、ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌａｍｉｎａ  ｐｒｏｐｒｉａ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ２，４，６−ｔｒｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅ  ｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｏｌｉｔｉｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００２，９９：１５７７０−５）に従って、基質としてトリメチルベンジジン（ＴＭＢ）を用いた分光学的な分析手法よって、ＭＰＯの活性を測定し、大腸における好中球の浸潤を監視した。本活性は、タンパク質１ｍｇあたりのＵで表される。
【００３２】
チモシンアルファ１による処理
Ｔα１（Ｓｉｇｍａから購入、セントルイス、ミズーリ州、米国；製品番号Ｔ３４１０；分子式Ｃ１２９Ｈ２１５Ｎ３３Ｏ５５）及びスクランブルペプチドは、滅菌した乾燥粉末の形で供給された。この粉末を滅菌水に再溶解した（標準リムルス細胞分解産物試験によるエンドトキシン濃度は、＜０．０３ｐｇ／ｍｌ）。２００マイクログラム／ｋｇ用量のチモシンアルファ１を、ＴＮＢＳによる大腸炎誘導の日から開始して連続６日間、腹腔内注射で投与した。
【００３３】
サイトカインの測定
粘膜固有層から単離し、リンパ球（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，ＢＤ、パロアルト、カリフォルニア州）上で発現される、ＣＤ３及びＣＤ２８の分子に対する抗体でｉｎ  ｖｉｔｒｏで４８時間賦活化した、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋表現型のリンパ球細胞の培養物の上澄について、特定のＥＬＩＳＡテスト（ＥＬＩＳＡキット、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、ミネアポリス、ミネソタ州）を利用して、サイトカインの測定を行った。
【００３４】
炎症及びサイトカインに関する全ての評価は、チモシンアルファ１による処理が終了した翌日に行った。
【００３５】
図３は、ＤＡＳ、ＭＡＳ及びＭＰＯの尺度で測定した、誘導した大腸炎の重篤度に対する、チモシンアルファ１の影響を示している。この結果は、チモシンアルファ１によって、真性大腸炎に関連した及び関連が想定されるパラメータの全てが、劇的に減少することを示している。
【００３６】
図４は、対照の動物、大腸炎（ＴＮＢＳ）の動物又はチモシンアルファ１（ＴＮＢＳ＋Ｔα１）処理の動物の粘膜固有層から単離したＣＤ４＋ＣＤ２５＋の、サイトカインの生産を示している。この結果は、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−１７などの炎症促進性のサイトカインの明確な増加、及び大腸炎の動物における抗炎症性のＩＬ−１０の非有意な生産を示している。炎症性／抗炎症性のサイトカインの生産パターンは、チモシン処理によって有意に乱され、ＩＬ−１０の生産が明らかに増加した。
【００３７】
これらの結果は、チモシンアルファ１が、大腸炎の実験モデルにおけるＩＢＤの重篤度に対して保護作用を有することを示すものである。
【図１】
2010507650.tif 000003
【図３】
2010507650.tif 000004
【図４】
2010507650.tif 000005
【図２】
2010507650.tif 000006
【国際調査報告】
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