(57)【要約】  本発明は、Ｎ−アシルホスファチジルエタノールアミン−加水分解ホスホリパーゼＤ（ＮＡＰＥ−ＰＬＤ）酵素又はα／βヒドロラーゼ４（Ａｂｈ４）酵素の活性を修飾する薬剤の検出方法を提供する。開示の方法は、ハイスループットスクリーニング応用に適しているアッセイ形式で構成される。
2010528615.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４の活性を修飾する薬剤を同定する方法であって、
ａ）容器のアレイ中の少なくとも１つの容器にＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４を添加すること；
ｂ）容器のアレイ中の少なくとも１つの容器に薬剤を添加すること；
ｃ）容器のアレイ中の少なくとも１つの容器に基質を添加すること、ここで基質はドナー部分及びクエンチャー部分を含み、ここでドナー部分とクエンチャー部分との分子内近接が、クエンチされた検出可能なシグナルを生じさせる；
ｄ）所定の期間の間、容器のアレイ中、薬剤、ＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４及び基質をインキュベートすること；
ｅ）容器のアレイ中、ＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４によって基質からクエンチャー部分を除去した後の、ドナー部分からの検出可能なシグナルの量を測定すること；及び
ｆ）薬剤、基質及びＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４を含む第１の容器の検出可能なシグナルな量と、基質及びＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４を含む第２の容器の検出可能なシグナルな量とを比較すること
を含み、
それによって、差が所定の閾値を超える場合、上記薬剤を修飾剤として同定する、方法。
【請求項２】
ＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４の活性を修飾する薬剤を同定する方法であって、
ａ）容器のアレイ中の少なくとも１つの容器にＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４を添加すること；
ｂ）容器のアレイ中の少なくとも１つの容器に薬剤を添加すること；
ｃ）容器のアレイ中の少なくとも１つの容器に基質を添加すること、ここで基質はドナー部分及びクエンチャー部分を含み、ここでドナー部分とクエンチャー部分との分子内近接が、クエンチされた検出可能なシグナルを生じさせる；
ｄ）第１の時点で、容器のアレイ中ＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４によって基質からクエンチャー部分を除去した後の、ドナー部分からの検出可能なシグナルの量を測定すること；
ｅ）所定の期間の間、容器のアレイ中薬剤、ＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４及び基質をインキュベートすること；
ｆ）第２の時点で、容器のアレイ中ＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４によって基質からクエンチャー部分を除去した後の、ドナー部分からの検出可能なシグナルの量を測定すること；及び
ｇ）第１の時点での検出可能なシグナルの量と第２の時点での検出可能なシグナルの量とを比較すること
を含み、
それによって、差が所定の閾値を超える場合、上記薬剤を修飾剤として同定する、方法。
【請求項３】
ＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４の活性を修飾する薬剤を同定する方法であって、
ａ）容器のアレイ中の少なくとも１つの容器にＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４を添加すること；
ｂ）容器のアレイ中の少なくとも１つの容器に薬剤を添加すること；
ｃ）容器のアレイ中の少なくとも１つの容器に基質を添加すること、ここで基質はドナー部分及びアクセプター部分を含む；
ｄ）所定の期間の間、薬剤、ＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４及び基質をインキュベートすること；
ｅ）検出可能なシグナルの量を測定すること、ここで測定される検出可能なシグナルは、ドナー部分、アクセプター部分、ドナー部分のアクセプター部分に対する比率、及びドナー−アクセプター部分複合体からなる群より選択される；及び
ｆ）薬剤、基質及びＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４を含む第１の容器の検出可能なシグナルな量と、基質及びＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４を含む第２の容器の検出可能なシグナルな量とを比較すること
を含み、
それによって、差が所定の閾値を超える場合、上記薬剤を修飾剤として同定する、方法。
【請求項４】
ＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４の活性を修飾する薬剤を同定する方法であって、
ａ）容器のアレイ中の少なくとも１つの容器にＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４を添加すること；
ｂ）容器のアレイ中の少なくとも１つの容器に薬剤を添加すること；
ｃ）容器のアレイ中の少なくとも１つの容器に基質を添加すること、ここで基質はドナー部分及びアクセプター部分を含む；
ｄ）第１の時点で、検出可能なシグナルの量を測定すること、ここで測定される検出可能なシグナルは、ドナー部分、アクセプター部分、ドナー部分のアクセプター部分に対する比率、及びドナー−アクセプター部分複合体からなる群より選択される；
ｅ）所定の期間の間、薬剤、ＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４及び基質をインキュベートすること；
ｆ）第２の時点で、検出可能なシグナルの量を測定すること、ここで測定される検出可能なシグナルは、ドナー部分、アクセプター部分、ドナー部分のアクセプター部分に対する比率、及びドナー−アクセプター部分複合体からなる群より選択される；及び
ｇ）第１の時点での検出可能なシグナルの量と第２の時点での検出可能なシグナルの量とを比較すること
を含み、
それによって、差が所定の閾値を超える場合、上記薬剤を修飾剤として同定する、方法。
【請求項５】
検出可能なシグナルを蛍光共鳴エネルギー移動によって測定する、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
工程ｃの前に所定の期間の間、薬剤及びＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４のインキュベーションをさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
工程ａ、ｂ及びｃが任意の順序で行われ得るか又は一緒に行われ得る、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも１つのコントロールをさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１つのインヒビター、インデューサー又はモジュレーターをさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
基質がＰＥＤ６である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ＰＥＤ６を酢酸エチルに溶解する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
溶解されたＰＥＤ６を、トリトン  Ｘ−１００を約０．００５〜０．１％含む緩衝液に添加する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
緩衝液がトリトン  Ｘ−１００を約０．０５％含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
検出可能なシグナルが、蛍光色素、発色団、酵素、リンカー部分、ビオチン、電子供与体、電子受容体、色素、金属、及び放射性核種からなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ドナー部分及びクエンチャー部分が、ＢＯＤＩＰＹ／ＤＮＰ、ローダミン／ＤＮＰ及びＣｙ色素／ＤＮＰからなる群より選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１６】
ドナー部分及びアクセプター部分が、テキサスレッド及びフルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ及びフルオレセイン、ユーロピウム及びアロフィコシアニン（allophcocyamin）（ＡＰＣ）、シアン蛍光タンパク質／黄色蛍光タンパク質、並びに緑色蛍光タンパク質／青色蛍光タンパク質からなる群より選択される、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項１７】
工程ａにおけるＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４を、ＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４を発現するように一過的に又は安定的にトランスフェクションされた原核又は真核細胞を容器中培養することによって得る、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
ＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４を、生物学的サンプルからの、又はＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４を発現するように一過的に又は安定的にトランスフェクションされた細胞からの単離後に得る、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
生物学的サンプルが、ヒト、サル、ラット、マウス、ウサギ、及びモルモットからなる群より選択される哺乳動物由来である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
１つ又はそれ以上の工程をロボット又はワークステーションデバイスによって行う、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
ＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４の活性を修飾する薬剤を同定するためのアッセイシステムであって、
ａ）容器のアレイ；
ｂ）ＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４；
ｃ）ドナー部分及びクエンチャー部分を含む基質、ここでドナー部分が検出可能である；及び
ｄ）少なくとも１つの成分、ここで成分は、薬剤、インデューサー、インヒビター、モジュレーター、インデューサーのモジュレーター、インヒビターのモジュレーター、及びコントロールからなる群より選択される
を含む、アッセイシステム。
【請求項２２】
ＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４の活性を修飾する薬剤を同定するためのアッセイシステムであって、
ａ）容器のアレイ；
ｂ）ＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４；
ｃ）ドナー部分及びアクセプター部分を含む基質、ここでドナー部分又はアクセプター部分又は両方が検出可能である；及び
ｄ）少なくとも１つの成分、ここで成分は、薬剤、インデューサー、インヒビター、モジュレーター、インデューサーのモジュレーター、インヒビターのモジュレーター、及びコントロールからなる群より選択される
を含む、アッセイシステム。
【請求項２３】
請求項２１又は請求項２２に記載のアッセイシステムの少なくとも１つの要素と使用説明書とを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
Ｎ−アシルホスファチジルエタノールアミン−加水分解ホスホリパーゼＤ（ＮＡＰＥ−ＰＬＤ）酵素は、ホスファチジン酸及びアナンダミドへのＮ−アシルホスファチジルエタノールアミン（ＮＡＰＥ）の加水分解を触媒するホスホリパーゼである（図１）。α／βヒドロラーゼ４（Ａｂｈ４；Ａｂｈｄ４とも略される）は、代替の経路によってアナンダミドを生成する。アナンダミドは、公知の内在性カンナビノイドの１つである。従って、ＮＡＰＥ−ＰＬＤ及びＡｂｈ４は、アナンダミドの生合成の阻害はカンナビノイド−１（ＣＢ１）アンタゴニストといくつかの同様の効果又はさらなる効果を有する可能性があるため、生物学的に魅力的な標的である。従って、ＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４の活性を調節する治療法は、様々な障害、例えばしかしこれらに限定されないが、肥満、糖尿病、及びアテローム性動脈硬化症の治療において有用であり得る。
【０００２】
ＮＡＰＥ−ＰＬＤを調節する化合物を発見するという治療的可能性のために、製薬産業においてハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）アッセイを開発する必要性が存在した。しかし、ＮＡＰＥ−ＰＬＤは独特な酵素である。それは、他のホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）酵素を含む他のリパーゼから構造的に及び触媒的に識別可能である。類似の反応を触媒しヒスチジン依存性酵素である他のＰＬＤとは異なり、ＮＡＰＥ−ＰＬＤは、亜鉛依存性酵素であり、細菌の亜鉛−メタロ−β−ラクタマーゼと似ている。基質中のＮアシル部分がＮＡＰＥ−ＰＬＤ基質認識のために必要とされ、一方、他のＰＬＤは基質としてホスファチジルコリン又はホスファチジルイノシトールを使用する（非特許文献１〜５）。従って、文献において報告されたＰＬＤについてのアッセイ方法の多くは、ＮＡＰＥ−ＰＬＤを測定するために修正可能でない。ＰＬＤからのｐ−ニトロフェノールの遊離を測定する分光光度アッセイは、ＮＡＰＥ−ＰＬＤ酵素活性に必要なＮアシル部分を必要としない（非特許文献６、７）。ＮＡＰＥ−ＰＬＤはコリンを生成しないので、多くの通常のＰＬＤの生産物であるコリンの形成を検出するアッセイは有用ではない（非特許文献８）。遊離脂肪酸の形成を検出するＰＬＤについての連続蛍光置換アッセイは、ホスホリパーゼＡ酵素のさらなるカップリングを必要とし（即ち、ＰＬＤ活性の間接測定）、Ｎアシル部分を欠く基質を使用する（非特許文献９）。他の方法は、ＨＴＳ形式では容易に検出可能ではないクロマトグラフィー、ｐＨ変化、及び膜電荷などの技術を利用する（非特許文献１０〜１２）。最近開発されたリパーゼについてのいくつかのＨＴＳアッセイは、必要とされるＮアシル部分を有さない（非特許文献１３）。ＮＡＰＥ−ＰＬＤとは異なり、Ａｂｈ４は、亜鉛依存性酵素ではなく、セリンヒドロラーゼである（非特許文献１４）。
【０００３】
ＮＡＰＥ−ＰＬＤ活性をアッセイすることについて報告された方法は、放射標識されたＮＡＰＥを使用し、その後、遊離した放射標識生成物を薄層クロマトグラフィー（非特許文献２）、ジルコニウム沈殿（非特許文献１０）、又は液体クロマトグラフィー（非特許文献１５）によって定量する。
【０００４】
蛍光消光及び蛍光エネルギー移動法は、ＨＴＳ形式のアッセイにおいて一般的に使用されている。しかし、蛍光消光及び蛍光エネルギー移動法又は任意の他のＨＴＳを可能にする方法は、ＮＡＰＥ−ＰＬＤに適用されていなかった。本発明者らは、蛍光性ＢＯＤＩＰＹ基及び消光性２，４−ジニトロフェニル（ＤＮＰ）基（非特許文献１６）を利用して、ハイスループットスクリーニングを可能にするＮＡＰＥ−ＰＬＤの新規アッセイを開発した。ＨＴＳ適合性ＮＡＰＥ−ＰＬＤ蛍光アッセイは、基質としての、ＢＯＤＩＰＹ及びＤＮＰで二重標識されたＮ−アシルホスファチジルエタノールアミン分子（ＰＥＤ６）に基づく。インタクトな分子の場合、ＢＯＤＩＰＹ部分からの蛍光は、ＤＮＰ部分によってクエンチされ；ＰＥＤ６の酵素加水分解で、ＤＮＰ部分はＢＯＤＩＰＹ部分から遊離され、ＢＯＤＩＰＹからの発蛍光を可能にする（図２を参照のこと）。蛍光強度は、ＮＡＰＥ−ＰＬＤの活性に比例する。この新規なアッセイは、スクリーニングの処理量を増加させ、短時間でより多くの化合物の試験を可能にする。また、このＨＴＳ形式のアッセイは、放射標識材料の放射能及び薄層クロマトグラフィーの使用に伴う、取り扱い、廃棄物管理及び処理の問題を未然に防ぐ。
【０００５】
Ａｂｈ４は、特徴であるα／βタンパク質折り畳みを含有するヒドロラーゼのファミリーのメンバーである。Ａｂｈ４は、内在性カンナビノイド  アラキドニルエタノールアミド（arachidonlethanolamide）（ＡＥＡ；アナンダミド）の生合成の経路に関与すると提唱されている（非特許文献１４）。この経路は、酵素ＮＡＰＥ−ＰＬＤを使用する経路の代わるものとして提唱されている。Ａｂｈ４の酵素活性を測定するためのＳｉｍｏｎ及びＣｒａｖａｔｔによって記述されたアッセイは、放射性ＮＡＰＥ基質を使用し、続いて、生成物を薄層クロマトグラフィーによる分離を使用する。このようなアッセイは、扱いにくく、任意のかなりの処理量で化合物をスクリーニングすることに明らかに適さない。さらに、放射能の使用は、予防的な取り扱い及び処理方法に起因して、ルーチンなアッセイにとって望ましくない。Ｓｉｍｏｎ及びＣｒａｖａｔｔによって使用された放射性基質は、化学的タグ、又はそうでなければ蛍光性を有しないＮＡＰＥである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Schmid et al. J. Biol. Chem. 258:9302-9306, 1983
【非特許文献２】Okamoto et al., J. Biol. Chem. 279:5298-5305, 2004
【非特許文献３】Gottlin et al., Proc. Natl. Acad. USA 95:9202-9207, 1998
【非特許文献４】Petersen and Hansen, FEBS Lett. 455:41-44, 1999
【非特許文献５】Ueda et al., Curr. Med. Chem. 12:1413-1422, 2005
【非特許文献６】Hagishita et al., Anal. Biochem. 276:161-165, 1999
【非特許文献７】D'Arrigo et al., Analytica Chimica Acta 304:249-254, 1995
【非特許文献８】Hojjati and Jiang, J. Lipid Res. 47:673-676, 2006
【非特許文献９】Kinkaid and Wilton, Biochem. Soc. Trans. 25:S595, 1997
【非特許文献１０】Petersen et al., J. Lipid Res. 41:1532-1538, 2000
【非特許文献１１】Morris et al., Anal. Biochem. 252:1, 1997
【非特許文献１２】Aridor et al., Methods Enzymol. 404:108-115, 2005
【非特許文献１３】Schmidt and Bornscheuer, Biomol. Eng. 22:51-56, 2005
【非特許文献１４】Simon and Cravatt, J. Biol. Chem. 281:26465, 2006
【非特許文献１５】Fezza et al, Analytical Biochemistry 339:113-120, 2005
【非特許文献１６】Hendrickson et al., Anal. Biochem. 276:27-35, 1999
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ＮＡＰＥ−ＰＬＤ活性を測定するために本発明者らによって初めて使用するのに成功した、ＮＡＰＥアナログであるＰＥＤ６が、同様にＡｂｈ４用にも有用となり得ると仮説を立てた。本発明者らは、Ａｂｈ４は、ＮＡＰＥ−ＰＬＤによって切断される結合とは異なる結合である２位のエステル結合を切断するが（図３を参照のこと）、クエンチングを除去した際の蛍光の増加という最終結果は同様であろうと予想した。１位のエステル結合も同様にＡｂｈ４によって切断され得るが、測定可能な蛍光変化を生じさせない。タグ付きの基質であるＰＥＤ６をＡｂｈ４酵素に対して使用することは新規であり、何故ならば、該酵素が該基質中のタグに耐性でかつＰＥＤ６を測定可能な程度まで加水分解することは全く明白ではないためである。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】酵素Ｎ−アシルホスファチジルエタノールアミン−加水分解ホスホリパーゼＤ（ＮＡＰＥ−ＰＬＤ）によるホスファチジン酸及びアナンダミドへのＮ−アシルホスファチジルエタノールアミン（ＮＡＰＥ）の加水分解を示す図である。
【図２】ＢＯＤＩＰＹ部分という蛍光基とＤＮＰ部分という消光基とを含むＰＥＤ６のインタクトな分子の略図を示す。ＮＡＰＥ−ＰＬＤによって酵素加水分解されると、ＤＮＰ部分がＢＯＤＩＰＹ部分から遊離され、ＢＯＤＩＰＹからの発蛍光が可能となる。
【図３】任意の２つの好適に置かれた蛍光分子、例えばＢＯＤＩＰＹ及びＤＮＰのドナー及びアクセプター（又はクエンチャー）部分の可能な位置を示す。ＮＡＰＥ−ＰＬＤ及びＡｂｈ４の切断部位を注記する。
【図４】ＮＡＰＥ−ＰＬＤ活性を測定するＢＯＤＩＰＹ蛍光のシグナル対バックグラウンド比に対する、ＰＥＤ６基質を調製するために使用したトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）  Ｘ−１００及び脂質の効果を示す図である。最終トリトン  Ｘ−１００濃度は０．０１２５％であった。基質を溶解するためにクロロホルムを使用した。
【図５】ＮＡＰＥ−ＰＬＤ活性を測定するＢＯＤＩＰＹ蛍光のシグナル対バックグラウンド比に対する、ＰＥＤ６基質を溶解するために酢酸エチルを使用した場合のトリトン  Ｘ−１００の効果を示す図である。
【図６】ＰＥＤ６基質滴定曲線（ＣＰＳ＝カウント／秒）を示す図である。
【図７】ＮＡＤＥ−ＰＬＤ酵素滴定曲線（ＣＰＳ＝カウント／秒）を示す図である。
【図８】ＮＡＤＥ−ＰＬＤについてのＫｍ測定を示す図である。
【図９】ＮＡＤＥ−ＰＬＤアッセイについてのＤＭＳＯ感度曲線を示す図である。
【図１０】典型的なＩＣ50曲線を示す図である。
【図１１】Ｃ末端６ｘＨｉｓタグの付いたＮＡＰＥ−ＰＬＤを発現させるために使用したヌクレオチド配列（配列番号１）を示す図である；発現され精製されたＣ末端Ｈｉｓタグを有するＮＡＰＥ−ＰＬＤタンパク質は、全長ＮＡＰＥ−ＰＬＤの配列（配列番号２）と比較して、Ｎ末端で切り詰められていることがわかった（配列番号３）。
【図１２】Ｃ末端Ｈｉｓタグを有するＡｂｈ４の発現されたアミノ酸配列（配列番号５）を示す図である。
【図１３】経時的なＡｂｈ４によるＰＥＤ６の加水分解から生じる発蛍光を追跡する典型的なトレースを示す（発光波長５２０ｎｍ）。時間は秒（ｓｅｃ）であり、ＲＦＵは、ミリ蛍光単位／分（ｍＲＦＵ／分）の相対蛍光単位（flourescent units）である。Ａ１（白丸）は、基質コントロール単独を表わし（傾き＝１７３３５ｍＲＦＵ／分）、Ａ２（白四角）は、Ａｂｈ４を含有するベクターでトランスフェクションされた細胞由来の溶解物を表わし（傾き＝８４９２７２ｍＲＦＵ／分）、Ａ３（白三角）は、非トランスフェクト細胞由来の溶解物を表わす（傾き＝４１６２２ｍＲＦＵ／分）。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本明細書において引用される全ての刊行物は、参照によって本明細書に組み入れられる。特に定義しない限り、本明細書において使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が属する技術の当業者に一般的に理解されるのと同一の意味を有する。
【００１０】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される専門用語は、特定の実施態様のみを説明する目的のためであり、本明細書における使用は、本発明を限定するようには意図されない。単語の単数形は、文脈がそうではないように明確に示さない限り、複数形を含むものとする。例えば、「ア（a）」、「アン（an）」及び「ザ（the）」という単数形は、複数形も同様に含むものとする。さらに、薬剤への言及は、２つ又はそれ以上の薬剤の混合物を含み得る。従って、用語「薬剤（an agent）」は、その混合物及び／又はエナンチオマーを含む、複数の薬剤を含む。用語「又は」は、文脈がそうではないように明確に指示しない限り、「及び／又は」を含む意味で一般的に使用されることにも留意すべきである。用語「含む（comprises）」及び／又は「含むこと（comprising）」は、本明細書において使用される場合、記載した特徴、工程、要素、及び／又は成分の存在を特定するが、１つ又はそれ以上の他の特徴、工程、要素、成分、及び／又はそれらの群の存在又は追加を排除しないことはさらに当然のことと理解されよう。
【００１１】
さらに、本発明によれば、当分野の技術内の従来の分子生物学、微生物学及び組換えＤＮＡ技術が使用され得る。このような技術は、文献に十分に記載されている。例えば、以下を参照のこと：Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (本明細書において“Sambrook et al., 1989”)；DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D. N. Glover ed. 1985)；Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984)；Nucleic Acid Hybridization [B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1985)]；Transcription And Translation [B. D. Hames & S. J. Higgins, eds. (1984)]；Animal Cell Culture [R. I. Freshney, ed. (1986)]；Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press, (1986)]；B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984)；F. M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)。
【００１２】
本発明のある実施態様は、ＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４の活性を修飾する薬剤を同定する方法であって、
（ａ）容器のアレイ中の少なくとも１つの容器にＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４を添加すること；
（ｂ）容器のアレイ中の少なくとも１つの容器に薬剤を添加すること；
（ｃ）容器のアレイ中の少なくとも１つの容器に基質を添加すること、ここで基質はドナー部分及びクエンチャー部分を含み、ここでドナー部分とクエンチャー部分との分子内近接が、クエンチされた検出可能なシグナルを生じさせる；
（ｄ）所定の期間の間、容器のアレイ中、薬剤、ＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４及び基質をインキュベートすること；
（ｅ）容器のアレイ中、ＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４によって基質からクエンチャー部分を除去した後の、ドナー部分からの検出可能なシグナルの量を測定すること；及び
（ｆ）薬剤、基質及びＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４を含む第１の容器の検出可能なシグナルな量と、基質及びＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４を含む第２の容器の検出可能なシグナルな量とを比較すること
を含み、
それによって、差が所定の閾値を超える場合、上記薬剤を修飾剤として同定する、方法である。
【００１３】
本発明のさらなる実施態様は、ＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４の活性を修飾する薬剤を同定する方法であって、
（ａ）容器のアレイ中の少なくとも１つの容器にＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４を添加すること；
（ｂ）容器のアレイ中の少なくとも１つの容器に薬剤を添加すること；
（ｃ）容器のアレイ中の少なくとも１つの容器に基質を添加すること、ここで基質はドナー部分及びクエンチャー部分を含み、ここでドナー部分とクエンチャー部分との分子内近接が、クエンチされた検出可能なシグナルを生じさせる；
（ｄ）第１の時点で、容器のアレイ中、ＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４によって基質からクエンチャー部分を除去した後の、ドナー部分からの検出可能なシグナルの量を測定すること；
（ｅ）所定の期間の間、容器のアレイ中、薬剤、ＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４及び基質をインキュベートすること；
（ｆ）第２の時点で、容器のアレイ中ＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４によって基質からクエンチャー部分を除去した後の、ドナー部分からの検出可能なシグナルの量を測定すること；及び
（ｇ）第１の時点での検出可能なシグナルの量と第２の時点での検出可能なシグナルの量とを比較することを含み、
それによって、差が所定の閾値を超える場合、上記薬剤を修飾剤として同定する方法である。
【００１４】
「所定の」は、期間又は閾値が、本発明の方法を使用する前に確立されることを示す。期間又は閾値は、任意に又は実験的に選択され得る。非限定的な例は、時間的経過を行い、次いで、時間的経過の結果に基づいて検出可能なシグナルを測定するための時間を選択することである。「期間」は、時間の任意の単位であり得；非限定的な例としては、秒、分又は時間が挙げられる。「閾値」は、応答を示すために必要とされる検出可能なシグナルの量を指す。
【００１５】
本発明のある実施態様は、検出可能なシグナルを利用する。当業者は、本発明によって使用され得る膨大な数の検出可能なシグナルを容易に認識し得る。非限定的な例としては、蛍光色素、発色団、酵素、リンカー部分、ビオチン、電子供与体、電子受容体、色素、金属、及び放射性核種が挙げられる。
【００１６】
本発明のある実施態様は、ドナー部分及びクエンチャー部分を使用する。非限定的な例としては、ＢＯＤＩＰＹ及びＤＮＰ、ローダミン及びＤＮＰ、Ｃｙ色素及びＤＮＰ、Ａｌｅｘａ及びＱＳＹ色素、ＢＯＤＩＰＹ及びＤＮＰが挙げられる。当業者は、それらが本発明によって利用され得るような好適な特性を有する異なるドナー及びクエンチャー部分を使用する他の好適な組み合わせを容易に同定し得る。
【００１７】
本発明は、検出可能なシグナルを発生させるための多くの技術の利用へ修正可能である。非限定的な例は、蛍光共鳴エネルギー移動（より一般的にはＦＲＥＴと呼ばれる）の使用である。蛍光共鳴エネルギー移動は、励起状態のフルオロフォアから、非常に近接している第２の発色団へ、エネルギーの移動が生じるプロセスである。例えば、蛍光共鳴エネルギー移動は、励起電子状態のドナーフルオロフォアを必要とし、これは、その励起エネルギーを長距離双極子−双極子相互作用によって近くのアクセプター発色団へ移動させ得る。共鳴エネルギー移動は、連成振動子、例えば、同一の周波数で振動する音叉の対と考えられ得る。従って、使用されるドナー及びアクセプター部分に応じて、当業者は、ドナー−アクセプター対の分子内相互作用から生じる検出可能なシグナル、並びに分子内相互作用の分離又は崩壊に続いてのドナー部分及びアクセプター部分又は両方からの検出可能なシグナルを測定し得る。ドナー−アクセプター対の非限定的な例としては、以下が挙げられる：シアン蛍光タンパク質−黄色蛍光タンパク質対、緑色蛍光タンパク質−青色蛍光タンパク質対、ユーロピウム及びアロフィコシアニン（allophcocyamin）、シアン蛍光タンパク質／黄色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質／青色蛍光タンパク質、並びに好適な励起及び放射波長を有する種々のＣｙ色素、種々のＢＯＤＩＰＹ色素又は種々のＡｌｅｘａ色素の組み合わせ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ及びフルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ及びフルオレセイン、ローダミン及びフルオレセイン、好適な蛍光特性を有する種々のＢＯＤＩＰＹ色素の組み合わせ、好適な蛍光特性を有する種々のＣｙ色素の組み合わせ、並びにユーロピウムキレート若しくは他のランタニドキレート及びＡＰＣ、ＸＬ６６５若しくは他の修飾ＡＰＣ。当業者は、Ｃｙ色素は、類似の構造を有するが異なる蛍光特性を有する多くの色素についての一般名であることを容易に認識し得る。同様に、ＢＯＤＩＰＹ及びＡｌｅｘａ色素は、類似の構造及び異なる蛍光特性を有するあるクラスの色素を示す。従って、理論上は、多数の組み合わせが、ＦＲＥＴについて好適である。非限定的な例は、ＢＯＤＩＰＹ４８０とＣｙ色素５２０である。
【００１８】
従って、本発明のある実施態様は、ＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４の活性を修飾する薬剤を同定する方法であって、
（ａ）容器のアレイ中の少なくとも１つの容器にＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４を添加すること；
（ｂ）容器のアレイ中の少なくとも１つの容器に薬剤を添加すること；
（ｃ）容器のアレイ中の少なくとも１つの容器に基質を添加すること、ここで基質はドナー部分及びアクセプター部分を含む；
（ｄ）所定の期間の間、薬剤、ＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４及び基質をインキュベートすること；
（ｅ）検出可能なシグナルの量を測定すること、ここで測定される検出可能なシグナルは、ドナー部分、アクセプター部分、ドナー部分のアクセプター部分に対する比率、及びドナー−アクセプター部分複合体からなる群より選択される；及び
（ｆ）薬剤、基質及びＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４を含む第１の容器の検出可能なシグナルな量と、基質及びＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４を含む第２の容器の検出可能なシグナルな量とを比較することを含み、
それによって、差が所定の閾値を超える場合、上記薬剤を修飾剤として同定する方法である。
【００１９】
本発明のさらなる実施態様は、ＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４の活性を修飾する薬剤を同定する方法であって、
（ａ）容器のアレイ中の少なくとも１つの容器にＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４を添加すること；
（ｂ）容器のアレイ中の少なくとも１つの容器に薬剤を添加すること；
（ｃ）容器のアレイ中の少なくとも１つの容器に基質を添加すること、ここで基質はドナー部分及びアクセプター部分を含む；
（ｄ）第１の時点で、検出可能なシグナルの量を測定すること、ここで測定される検出可能なシグナルは、ドナー部分、アクセプター部分、ドナー部分のアクセプター部分に対する比率、及びドナー−アクセプター部分複合体からなる群より選択される；
（ｅ）所定の期間の間、薬剤、ＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４及び基質をインキュベートすること；
（ｆ）第２の時点で、検出可能なシグナルの量を測定すること、ここで測定される検出可能なシグナルは、ドナー部分、アクセプター部分、ドナー部分のアクセプター部分に対する比率、及びドナー−アクセプター部分複合体からなる群より選択される；及び
（ｇ）第１の時点での検出可能なシグナルの量と第２の時点での検出可能なシグナルの量とを比較することを含み、
それによって、差が所定の閾値を超える場合、上記薬剤を修飾剤として同定する方法である。
【００２０】
本発明の原理は、エネルギードナー部分からエネルギーアクセプター部分への基質分子内でのエネルギーの移動に基づく。最も広い範囲で、前記アッセイは、任意の２つの好適に置かれた部分、ドナー及びアクセプター（又はクエンチャー）が基質分子によって連結されている場合、機能的である。非限定的な例として、ドナーは、ＮＡＰＥ基質の３つの脂肪酸鎖のうちの１つに配置され（例えば、鎖１又は２）、エネルギーアクセプター（又はクエンチャー）は、エネルギー移動が生じるに十分に依然として近い、別の部位に配置される（例えば、鎖３、図３を参照のこと）。基質が加水分解される前は、ドナー及びアクセプター（又はクエンチャー）は、非常に近接しており、ドナーからの検出可能なシグナルは、アクセプター（又はクエンチャー）によってクエンチされている。基質が加水分解されると、ドナー及びアクセプター（又はクエンチャー）は分離され、検出可能なシグナル、例えばドナーからの蛍光が遊離され、これは、酵素活性を検出するための読出しとして役立つ。代替の例としては、基質が加水分解され、ドナー及びアクセプターが分離されると、ドナーからの蛍光が検出され得、アクセプターからの蛍光が検出され得、ここで、ドナー及びアクセプターシグナルの一方又は両方が測定され得るか、又はドナーとアクセプターとの比率が測定され得る。
【００２１】
以下は、ドナー−アクセプター配置の組み合わせの非限定的な例である：鎖１及び３、鎖２及び３、鎖３及び１、又は鎖３及び２（図３）。当業者は、鎖１及び２の炭化水素鎖が変更し得ることを正しく理解する。鎖３も変更し得るが、Ｎアシル部分は維持すべきである。蛍光プローブは、修飾がＮＡＰＥ−ＰＬＤ酵素の活性に干渉しない限り、鎖の任意の位置に配置され得る。一つの波長によって励起されると、反対のフルオロフォア（fluorphore）によってアクセプト又はクエンチされるに適切な波長の光をドナーが放射するという点で、蛍光性ドナー及びアクセプター対は適合性でなければならない。蛍光性ドナー−アクセプター対のいくつかの組み合わせが存在する。例えば、使用に適した組み合わせの非限定的な例として以下が挙げられる：シアン蛍光タンパク質−黄色蛍光タンパク質対、緑色蛍光タンパク質−青色蛍光タンパク質対、ユーロピウム及びアロフィコシアミン、シアン蛍光タンパク質／黄色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質／青色蛍光タンパク質、並びに好適な励起及び発光波長を有する種々のＣｙ色素、種々のＢＯＤＩＰＹ色素又は種々のＡｌｅｘａ色素の組み合わせ、ＢＯＤＩＰＹ及びＤＮＰ、ローダミン及びＤＮＰ、Ｃｙ色素及びＤＮＰ、Ａｌｅｘａ及びＱＳＹ色素、ＢＯＤＩＰＹ及びＤＮＰ、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）及びフルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ及びフルオレセイン、ローダミン及びフルオレセイン、好適な蛍光特性を有する種々のＢＯＤＩＰＹ色素の組み合わせ、好適な蛍光特性を有する種々のＣｙ色素の組み合わせ、並びにユーロピウムキレート若しくは他のランタニドキレート及びＡＰＣ、ＸＬ６６５若しくは他の修飾ＡＰＣ。
【００２２】
当業者は、ＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４、薬剤、及び基質を添加する順序は任意に行われ得るか又は一緒に行われ得ることを容易に正しく理解し得る。非限定的な例は、ＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４、基質、及び薬剤を１つの混合物に作製し、該混合物を一度に添加することである。別の非限定的な例は、最初に基質、次いで薬剤、次いでＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４を添加することである。いかなる添加順序もフォローされ（followed）得る。さらなる実施態様は、ＮＡＰＥ−ＰＬＤ若しくはＡｂｈ４、薬剤、又は基質のいずれか１つ又はそれ以上の所定の期間の間のインキュベーションを、工程ａ、ｂ又はｃの間に追加することであり得る。基質、薬剤、又はＮＡＰＥ−ＰＬＤ若しくはＡｂｈ４を一度に又は異なる順序で添加することなどの改良は、十分に当業者の知識及び能力の範囲内にあり、本発明の考慮される実施態様である。
【００２３】
本発明の実施態様は基質を利用する。基質は、ＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４が作用し得る任意の材料又は物質であり得る。非限定的な例はＰＥＤ６である。
【００２４】
本発明の実施態様は、全長ヒトＮＡＰＥ−ＰＬＤを含む酵素ＮＡＰＥ−ＰＬＤを利用する。他の種由来のＮＡＰＥ−ＰＬＤもまた使用され得る。ＮＡＰＥ−ＰＬＤは、他のタンパク質、例えばタンパク質単離に有用であるＨＩＳタグも同様に含むように発現され得る。さらに、ＮＡＰＥ−ＰＬＤ酵素の切り詰め型が使用され得る。非限定的な例は配列番号３である。切り詰められる場合、切り詰めは活性部位に干渉しない場合がある。切り詰められたタンパク質内に活性部位が依然として含まれかつインタクトであるならば、いかなる切り詰めも使用され得る。
【００２５】
本発明の実施態様は、全長ヒトＡｂｈ４を含む酵素Ａｂｈ４を利用する。非限定的な例は配列番号５である。他の種由来のＡｂｈ４も使用され得る。Ａｂｈ４は、他のタンパク質、例えばタンパク質単離に有用であるＨＩＳタグも同様に含むように発現され得る。さらに、Ａｂｈ４酵素の切り詰め型が使用され得る。切り詰められる場合、切り詰めは活性部位に干渉しない場合がある。切り詰められたタンパク質内に活性部位が依然として含まれかつインタクトであるならば、いかなる切り詰めも使用され得る。
【００２６】
本発明は、ＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４の活性を修飾する薬剤を同定（例えば、スクリーニング、検出、キャラクタライズ、分析、及び定量）するための方法を提供する。用語「薬剤」、「テスト薬剤」、「テスト化合物」、「薬物候補物」若しくは「モジュレーター」又は文法的均等物は、本明細書において使用される場合、本発明のアッセイにおいて使用され、ＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４の活性を調節するその能力についてアッセイされる、天然又は合成の、任意の分子、例えばタンパク質、オリゴペプチド（例えば、約５〜約２５アミノ酸長、好ましくは約１０〜２０又は１２〜１８アミノ酸長、好ましくは１２、１５、又は１８アミノ酸長）、小有機分子、多糖、脂質（例えば、スフィンゴリピド）、脂肪酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドなどを示す。アッセイされ得る化合物について特別の制限はない。例としては、低、中若しくは高分子量の化学分子の単一の薬剤又はライブラリー、精製タンパク質、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成ペプチドライブラリー、細胞抽出物、及び培養上清が挙げられる。薬剤は、種々の薬剤の任意の組み合わせを包含する。
【００２７】
薬剤は、少なくとも１つ又はそれ以上の可溶性若しくは不溶性因子、細胞マトリックス成分、調整培地、細胞抽出物、組織抽出物、外植片、ｐＨ調整剤、ガス、浸透圧調整剤、イオン強度調整剤、ウイルス、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は遺伝子フラグメントを含み得る。薬剤は、十分な範囲の多様性を提供するか、又は逆に類似の構造若しくは特徴に限定されるコンビナトリアル又はランダム化ライブラリーなどの、テスト薬剤のライブラリーの形態であり得る。薬剤は、場合により、融合パートナー、例えば標的化合物、レスキュー化合物（rescue compound）、二量体化化合物、安定化化合物、アドレサブル化合物（addressable compound）、及び他の機能性部分へ連結され得る。従来的に、有用な特性を有する新規化合物は、ある所望の特性又は活性、例えば阻害活性若しくは調節活性、を有するテスト薬剤（「リード化合物」又は「リード」と呼ばれる）を同定することによって、作り出される。次いで、リード化合物はスカフォールドとして使用され、リード化合物の変異体が作出され、さらにそれらの変異体化合物の特性及び活性が評価される。
【００２８】
薬剤は、処理条件、並びに外部及び内部条件又は環境の操作を含み得る。このような薬剤の非限定的な例としては、紫外線が挙げられる。
【００２９】
本発明のある実施態様は、ＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４の活性を修飾する薬剤を同定するための方法である。用語「修飾する」は、ＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４の活性又は特異性のいかなる変化をも包含する。従って、用語「修飾する」は、ＮＡＰＥ−ＰＬＤ活性又はＡｂｈ４活性のインヒビター、インデューサー又はモジュレーターである薬剤を挙げ得る。
【００３０】
用語「インヒビター」は、ＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４の活性又は特異性を遮断、中断又は防止することができるいかなる薬物、化学物質、タンパク質又はタンパク質フラグメントをも包含する。さらに、インヒビターは、細胞性タンパク質の発現を遮断しそれによってＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４に直接的に又は間接的に影響を与える経路を阻害する、例えば分子シャペロン、抗体又は阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）であり得る。「遮断」、「遮断する」又は「遮断すること」は、絶対的である必要はなく、しかし任意の測定可能な阻害が、遮断が生じているという指示である。「インヒビター」は、細胞応答を遮断、中断又は防止し、それによってＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４の活性又は特異性を防止又は中断又は遮断するような様式での、培地成分の変更又は酸素増加若しくは欠乏などの培養条件の操作であってもよい。
【００３１】
用語「インデューサー」は、ＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４の活性又は特異性を開始、刺激又は増強することができるいかなる薬物、化学物質、タンパク質又はタンパク質フラグメントをも包含する。さらに、インデューサーは、細胞性タンパク質の発現を遮断しそれによって阻害を除去するか又は細胞応答、活性若しくは経路を直接的に開始若しくは刺激する、分子シャペロン、抗体又は阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）であり得る。「インデューサー」は、細胞応答を遮断、中断又は防止し、最終的にＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４の活性又は特異性を開始、刺激又は増強するような様式での、培地成分の変更又は酸素増加若しくは欠乏などの培養条件の操作であってもよい。
【００３２】
用語「モジュレーター」は、ＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４の活性又は特異性の、又はＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４の活性又は特異性に関与する細胞応答、活性又は経路の、強度、割合又は特徴を調節することができるいかなる薬物、化学物質、タンパク質又はタンパク質フラグメントをも包含する。さらに、モジュレーターは、細胞性タンパク質の発現を遮断しそれによって阻害を除去するか又はＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４の活性又は特異性に最終的に影響を与える細胞応答、活性又は経路を誘導する、分子シャペロン、抗体又は阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）であり得る。「モジュレーター」は、ＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４の活性又は特異性に影響を与え得る細胞応答の強度、割合又は特徴を調節するような様式での、培地成分の変更又は酸素増加若しくは欠乏などの培養条件の操作であってもよい。
【００３３】
本発明のさらなる実施態様において、モジュレーターは、インデューサーと併用して使用され得、その結果、インデューサーのモジュレーターは、インデューサーの効力をより高め（例えば、ＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４活性を増強させる）、又は、インデューサーの効力をより低める（例えば、ＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４活性を低下させる）。インヒビターのモジュレーターは、インヒビターの効力をより低め（例えば、ＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４活性を増強させる）、又は、インヒビターの効力をより高める（例えば、ＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４活性を低下させる）。
【００３４】
インヒビター、インデューサー又はモジュレーターはまた、疾患状態の経路又は側面を模倣するために利用され得る。非限定的な例示的な例として、本発明の実施態様は、精神障害、糖尿病又は肥満の側面を模倣するＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４インヒビター、インデューサー又はモジュレーターの存在下でＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４の活性を修飾する薬剤を同定することである。従って、本発明の実施態様は、ＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４活性又は特異性が影響されると考えられる疾患状態を改善し得るテスト薬剤を同定するためのスクリーニング方法を包含する。
【００３５】
本発明の別の実施態様は、２つ以上のインデューサー、インヒビター又はモジュレーターの使用である。２つ以上のインデューサー、インヒビター又はモジュレーターを使用することは、相加効果、カウンター効果、相乗効果を有し得、又は複数の経路に影響を与え得るが、これらに限定されない。
【００３６】
本発明の実施態様は、ＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４の活性を修飾する薬剤を同定する方法であって、さらにコントロールを含む方法である。コントロールは、当業者によって十分に理解される技術用語である。適切なコントロールは、研究下の実験課題又は使用されるアッセイパラメータに依存し得る。コントロールは、アッセイ条件の特定のセット又は培養培地への特定の化合物の添加若しくは排除であり得る。コントロールは、添加されるコントロール化合物又はアッセイ条件が、期待される反応をもたらす場合、ポジティブコントロールと考えられ得る。例えば、研究下の薬剤がＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４を阻害すると予想される場合、ポジティブコントロールは、ＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４を阻害することが公知である化合物又は薬剤である。コントロールはまた、ネガティブコントロールであり得る。ネガティブコントロールは、期待される反応をもたらす、アッセイ条件の特定のセット又は培養培地への特定の化合物若しくは薬剤の、添加若しくは排除であり得る。例えば、研究下の薬剤がＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４を阻害すると期待される場合、ネガティブコントロールはＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４を阻害しないことが期待されることになる。コントロールは、「ビヒクル」コントロールであり得る。例えば、テスト薬剤がＤＭＳＯに溶解される場合、ビヒクルコントロールは、テスト薬剤を含まないＤＭＳＯである。コントロールは、単に、過去のデータの使用であってもよい。
【００３７】
本発明の実施態様は、ＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４が、ＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４を発現するように一過的に又は安定的にトランスフェクションされている原核又は真核細胞を容器中培養することによって提供される方法である。従って、本発明のさらなる実施態様は、ＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４を発現又は過剰発現するように一過的に又は安定的に形質転換された細胞を使用することである。発現は、誘導性又は構成的であり得る。薬剤は、ＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４を発現又は過剰発現するように一過的に又は安定的に形質転換された培養細胞を含む容器へ薬剤を添加することによって、ＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４活性を調節するそれらの能力について試験され得る。
【００３８】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に好適な形態で核酸分子を含む。従って、本発明の組換え発現ベクターは、発現について使用される宿主細胞に基づいて選択された、１つ又はそれ以上の調節配列を含み得、これは、発現される核酸へ機能可能に連結されている。組換え発現ベクター内で、「機能可能に連結された」は、問題のヌクレオチド配列が、（例えば、インビトロ転写／翻訳系における、又はベクターが宿主細胞中へ導入される場合は宿主細胞における）該ヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で調節配列へ連結されていることを意味するものとする。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサー及び他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むものとする。このような調節配列は、例えば、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology Vol. 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) に記載されている。調節配列としては、多くのタイプの宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指令するもの（例えば、組織特異的調節配列）が挙げられる。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの因子に依存し得ることは、当業者によって正しく理解されよう。本発明の発現ベクターは、本明細書に記載される核酸によってコードされるタンパク質又はペプチドを産生するように宿主細胞中へ導入され得る。
【００３９】
用語「過剰発現」は、本明細書において使用される場合、ポリペプチドを通常発現しない細胞における、又はポリペプチドを通常発現する細胞における、ポリペプチドの発現の通常レベルよりも大きいレベルでの、細胞による、ポリペプチド、例えばアポトーシス又は細胞生存機構に関与し得る分子の発現を指す。例えば、ポリペプチドの発現は、ポリペプチドを通常発現する野生型、基底状態又は非誘導性細胞におけるポリペプチドの発現と比較した場合、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０、８０％、９０％、１００％、又はそれ以上の差であり得る。問題のポリペプチドの突然変異体、変異体、又はアナログは、過剰発現され得る。
【００４０】
本明細書において使用される場合、用語「一過性」発現は、細胞の染色体から分離している外因性核酸分子の発現を指す。一過性発現は、一般的に、外因性核酸の導入の２〜３日後にその最大値に達し、続いて減少する。
【００４１】
本明細書において使用される場合、用語「安定」発現は、細胞の染色体の一部である外因性核酸分子の発現を指す。一般的に、遺伝子の安定発現のためのベクターは、１つ又はそれ以上の選択マーカーを含む。
【００４２】
形質転換された、形質転換されていない、初代培養及び生物学的サンプルについての細胞培養技術は、当技術分野においてよく知られている。生物学的サンプル又は培養細胞は、使用のために必要とされるまで保存され得る。培養のために使用される培地は、特別に設計されるか又は商業的供給源から購入され得る。
【００４３】
本発明の実施態様は、市販されている細胞株を使用する。例えば、使用され得る細胞は、American Tissue Culture Company又は他の供給源から入手可能である。細胞は、原核細胞又は真核細胞であり得る。本発明の範囲は、使用される細胞のタイプによって限定されない。初代培養物も利用され得る。未分化細胞は、細胞を特定の表現型へ分化させるために種々の薬剤へ供され得る。例えば、乏突起膠細胞に分化するように誘導される前駆細胞は、本発明の実施態様である。使用される特定の細胞型は、所望の細胞型によって特異的に発現されるマーカーによって、又は代わりに、特定のマーカーの消失によって、選択され得る。細胞は、当業者によって一般的に使用されているフローサイトメトリーなどの方法によって分離又はソートされ得る。
【００４４】
本発明の実施態様は、均一な細胞集団を使用する。本発明の代替の実施態様は、不均一な細胞集団を使用する。細胞は、本発明のアッセイを完成するための任意のタイプ及び任意の割合のものであり得る。
【００４５】
細胞は生物学的サンプルから得られ得る。生物学的サンプルとしては、組織又は流体、組織の切片、例えば、生検及び剖検サンプル、並びに組織学的目的で採取された凍結切片が挙げられ得るが、これらに限定されない。このようなサンプルとしては、血液、痰、組織、培養細胞、例えば初代培養物、外植片、及び形質転換細胞、糞便、尿などが挙げられる。生物学的サンプルは、哺乳動物、例えば霊長類、例えばチンパンジー、マカク若しくはヒト、ウシ、イヌ、ネコ、齧歯動物、例えばモルモット、ラット、マウス、ウサギ、又は鳥類、爬虫類、若しくは魚類を含む、真核生物から得られ得る。
【００４６】
本発明の実施態様は、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）法における使用である。ＨＴＳは、疾患病理の生物学的機構又は側面をモデル化するように設計されたアッセイにおける何千もの異なる化合物の自動同時試験である。２つ以上の化合物、例えば、複数の化合物が、同時に、例えば１つのバッチにおいて、試験され得る。１実施態様において、用語ＨＴＳスクリーニング法は、選択の読出しに影響を及ぼす１つの化合物又は複数の化合物の能力を試験するアッセイを指す。
【００４７】
本発明の実施態様は、ロボット又はワークステーションデバイスを利用する。液体処理システム、分析装置、例えば蛍光リーダー又はシンチレーションカウンター、並びに細胞培養及びサンプル操作のためのロボット工学は、当技術分野において周知である。機械システム、例えばロボットアーム又は「チェリーピッキング」装置が、当業者に利用可能である。市販のプレートリーダーが、例えば、従来の９６ウエル又は３８４ウエルプレートを分析するために利用可能である。所定のウエルを分析し生データレポートを作製する、単一サンプル、複数サンプル又はプレートサンプルリーダーが、利用可能である。生データは、種々の様式で変換され、提示され得る。
【００４８】
本発明の実施態様は、細胞及び他の材料、例えば培養培地を受容し得る、容器のアレイを含む。容器のアレイは、本発明の範囲内の細胞を保持するに好適な少なくとも１つ又は２つ以上の容器からの任意の数の容器であり得る。例としては、フラスコ、培養皿、チューブ、例えば１．５ｍｌチューブ、１２ウエルプレート、９６ウエルプレート、３８４ウエルプレート、１５３６ウエルプレート、及び恐らく４０００個の容器を有する小型マイクロタイタープレート（米国特許出願第20050255580号）が挙げられるが、これらに限定されない。容器のアレイは、保護カバーの追加に修正可能であり得、この場合、汚染物質の侵入又は内容物の蒸発を防止する。
【００４９】
容器のさらなる特徴は、容器が分析を可能にし得ることであり、非限定的な例としては、分光光度分析、シンチレーション計数及び蛍光測定が挙げられる。しかし、サンプルはさらなる分析へ修正可能な好適な容器に移され得ることを考えると、これは、本発明の範囲内で使用され得る容器に対する限定ではない。非限定的な例は、方法が容器の第２のアレイを提供することさらに含むように方法を変更することであり、ここで、容器の第１のアレイ由来のサンプルが容器の第２のアレイへ移される。
【００５０】
本発明のある実施態様は、ＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４の活性を修飾する薬剤を同定するためのアッセイシステムであって、（ａ）容器のアレイ；（ｂ）ＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４；（ｃ）ドナー部分及びクエンチャー部分を含む基質、ここで、ドナー部分が検出可能である；及び（ｄ）少なくとも１つの成分、ここで、成分は、薬剤、インデューサー、インヒビター、モジュレーター、インデューサーのモジュレーター、インヒビターのモジュレーター、及びコントロールからなる群より選択される；を含むアッセイシステムである。
【００５１】
本発明の別の実施態様は、ＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４の活性を修飾する薬剤を同定するためのアッセイシステムであって、（ａ）容器のアレイ；（ｂ）ＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４；（ｃ）ドナー部分及びアクセプター部分を含む基質、ここで、ドナー部分又はアクセプターアクセプター部分又は両方が検出可能である；及び（ｄ）少なくとも１つの成分、ここで、成分は、薬剤、インデューサー、インヒビター、モジュレーター、インデューサーのモジュレーター、インヒビターのモジュレーター、及びコントロールからなる群より選択される；を含むアッセイシステムである。
【００５２】
本発明の実施態様は、ＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４の活性又は特異性を修飾する成分である。成分は、コントロール、薬剤、インデューサー、インヒビター、モジュレーター、インデューサーのモジュレーター、及びインヒビターのモジュレーターからなる群より選択される。アッセイシステムは、２つ以上の成分を有し得る。
【００５３】
本発明のさらなる実施態様は、アッセイシステムの少なくとも１つの要素と使用説明書とを含むキットである。従って、アッセイシステムの成分は、別々に提供され得、又は一緒に、例えばキット中に、提供され得る。アッセイシステムの成分は、個々の成分の安定性を最大化する方法に従って、作製され、キット中に含まれ得る。このような方法は、当業者によく知られている。例えばアッセイシステムの細胞は、懸濁液として提供され得るか、又は凍結乾燥され得る。アッセイシステムのさらなる成分、例えば緩衝液、アッセイ成分を混合するための容器、例えばマイクロタイタープレート又は試験管も含まれ得る。アッセイシステムは、アッセイを行うための説明書並びにデータ処理及び解釈についての説明書を含むキットの形態で提供され得る。
【００５４】
本発明の実施態様は、治療有効量の本発明の方法によって同定された薬剤と薬学的に許容される担体とを含む、ＮＡＰＥ−ＰＬＤ又はＡｂｈ４の調節のための薬剤組成物である。用語「治療有効量」は、患者（subject）又は哺乳動物における疾患又は障害を治療するに有効な薬剤の量を指す。非限定的な例として、肥満の症例では、治療有効量の薬物は、体重を減少させ得る。本発明の薬剤組成物は、他の治療剤と組み合わせて使用され得る。例えば、肥満の治療において、薬剤組成物は、他の食欲抑制剤と組み合わせて投与され得る。
【００５５】
下記の実施例において本発明をさらに説明するが、これらは、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。当業者が製造し及び使用するのに十分詳細に本発明を説明し及び例証しているが、一方種々の代替、修飾、及び改良が本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく理解できる。当業者は、目標を達成し、言及した目的及び利点、さらにそれに内在する目的及び利点を得るために、本発明をうまく適合させることを容易に正しく理解する。下記の実施例は、実施態様の説明であり、本発明の範囲に関する限定として意図されていない。それらに関する修飾及び他の使用は、当業者に思い浮かび得る。これらの修飾は、本発明の趣旨内に包含され、特許請求の範囲によって画定される。本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく、種々の置換及び修飾を、本明細書に開示した本発明に対して為すことが可能である。
【００５６】
本明細書において例示的に記載した本発明を、本明細書に具体的に開示していない任意の一つ又は複数の要素、一つ又は複数の限定の非存在下において実施することができる。用いられている用語及び表現は説明の用語として使用されており、かつ限定するものではなく、このような用語及び表現の使用において、明らかにし、開示した本特徴又はその部分のいかなる均等物をも排除する意図はなく、しかし、種々の修飾が特許請求される本発明の範囲内で可能なはずである。従って、本発明は実施態様及び場合による特徴によって具体的に開示されているが、本明細書に開示された概念の修飾及び変更が当業者によってなされ得ること、並びにこのような修飾及び変更は添付の特許請求の範囲によって画定される本発明の範囲内にあると考えられることが当然のことと理解すべきである。
【実施例】
【００５７】
実施例１
ＮＡＰＥ−ＰＬＤ酵素の作製：
ＮＡＰＥ−ＰＬＤを大腸菌及び哺乳動物細胞中で発現させた。ＮＡＰＥ−ＰＬＤの活性が比較的低いこと及び大量のタンパク質がハイスループットスクリーニングに必要とされることのために、哺乳動物発現系は良い選択ではなかった。ＨＴＳをサポートするための大量のタンパク質を得るために、本発明者は、大腸菌及びバキュロウィルス／昆虫細胞系中においてＮＡＰＥ−ＰＬＤの発現を試験した。大腸菌中において発現されたＮＡＰＥ−ＰＬＤは、バキュロウィルス／昆虫細胞中において発現されたタンパク質と比べて、より低い溶解性、より低い特異的活性、及びより低い発現レベルしか有していなかった。従って、本発明者は、ＨＴＳをサポートする発現系としてバキュロウィルス／昆虫細胞を選択した。ｐＤＥＳＴ８．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、昆虫細胞中においてＣ末端６ｘＨｉｓタグを有するＮＡＰＥ−ＰＬＤを発現させた（配列番号１）。この発現系は、金属キレートクロマトグラフィーを通して高純度で大量のＮＡＰＥ−ＰＬＤを生成することを可能にした。
【００５８】
ＮＡＰＥ−ＰＬＤの配列は前述した（配列番号２）。Ｃ末端Ｈｉｓタグを有するタンパク質（ＭＷ  ４９ｋＤａ）を発現させ、これをトリトン  Ｘ−１００の存在下で昆虫細胞から可溶性活性形態で精製した。発現した酵素は、４６個のアミノ酸だけＮ末端で切り詰められているとわかった（配列番号３）。
【００５９】
実施例２
一般アッセイパラメータ：
一般アッセイ条件は、以下の材料の以下の最終濃度を使用した：ＮＡＰＥ−ＰＬＤ  １４ｎＭ、ＰＥＤ６（基質）１０μＭ、テスト化合物１０μＭ、ＤＭＳＯ  １％。ＰＥＤ６を凍結乾燥粉末として購入し（表１参照）、−２０℃で保存した。新鮮な基質溶液を毎日調製した。ＰＥＤ６  １ｍｇを酢酸エチル０．８８ｍｌに溶解し、アッセイ緩衝液４３．１２ｍｌ中に希釈し、２０μＭ  ワーキング溶液を作製した。光感受性であるので、ＰＥＤ６は直射日光を避けなければならなかった。
【００６０】
【表１】
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【００６１】
テスト化合物を適切な緩衝液に希釈した。非限定的な例は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０であり、該緩衝液は、ＤＭＳＯ、例えば１０％ＤＭＳＯを含有する場合があった。アッセイ緩衝液は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０、０．０５％トリトン  Ｘ−１００であり、停止液は、０．４Ｍ  ＨＣｌ、０．０５％トリトン  Ｘ−１００であった。
【００６２】
試薬の添加順序、及び使用した装置：
１）酵素（ＮＡＰＥ−ＰＬＤ、２２μＭ）をアッセイ緩衝液で２８ｎＭに希釈した。
２）基質を調製した（アッセイ緩衝液中２０μＭ）。
３）ＮＡＰＥ−ＰＬＤ  １０μｌを、ＦＬＥＸＤＲＯＰを使用して、アッセイプレートに添加した。
４）化合物（化合物プレートからの）２μｌを、Ｃｙ−Ｂｉｏを使用して、アッセイプレートの適切なウエルに添加した。
５）室温で３０分間、カバーした状態で、プレートをインキュベートした（化合物プレインキュベート）。
６）ＰＥＤ６  １０μｌを、ＦＬＥＸＤＲＯＰを使用して、アッセイプレートに添加した。
７）室温で３０分間、カバーした状態で、プレートをインキュベートした（酵素反応）。
８）ＦＬＥＸＤＲＯＰを使用して停止液２０μｌを添加することによって、反応を停止させた。
９）ＬＪＬ  Ａｃｑｕｅｓｔで読み取った。励起フィルター、４８５ｎＭ；発光フィルター、５３０ｎＭ。
【００６３】
実施例３
基質（ＰＥＤ６）溶媒の最適化：
ＰＥＤ６及びＮＡＰＥ−ＰＬＤの他の可能性ある基質は脂質であるので、それらは非常に疎水性である。従って、水性アッセイ緩衝液を添加する前に、クロロホルムに基質を溶解することは合理的であった。本発明者は、水溶液中のＰＥＤ６の溶解性をさらに高めるために、トリトン  Ｘ−１００を０〜０．０５％添加した。さらに、高濃度のトリトン  Ｘ−１００も、ＮＡＰＥ−ＰＬＤの活性を高めると報告されていた（０．２％まで）（Petersen and Hansen, FEBS Lett. 455:41-44, 1999）。これらの基質溶媒条件下では、アッセイは機能しなかった（表２参照）。
【００６４】
【表２】
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【００６５】
どのようにして基質を適切に調製するかという問題のさらなる研究のために、本発明者は、他のＰＬＤについてのアッセイ条件を調べた。１つの論文では、ＰＬＤの疎水性脂質基質が使用され、これらは、クロロホルムに溶解し、次いでクロロホルムに溶解したホスファチジルイノシトール／ホスファチジルコリン（ＰＩ／ＰＣ）ブレンドと混合された（Petry et al., J. Lipid Res. 46:603-614, 2005）。次いで、最終混合物を乾燥した。混合物を水性緩衝液に再懸濁するために、超音波処理を必要とした。この手順に続いて、アッセイは検出可能なシグナルを与え始めたが、シグナル対バックグラウンド比は低かった。水性アッセイ緩衝液にトリトン  Ｘ−１００を添加することによって、シグナル対バックグラウンド比が増加したが、アッセイノイズも増加した（図４）。このようなノイズの多いアッセイは、ハイスループットスクリーニングに適さなかった。
【００６６】
水性緩衝液中における疎水性脂質基質の溶解性を高めるために３つの方法があった：有機溶媒（例えば、クロロホルム）、脂質（例えば、ＰＩ及びＰＣ）、又は洗浄剤（例えば、トリトン  Ｘ−１００）。最初の溶解において使用した有機溶媒クロロホルムは最終的にタンパク質を損傷するので、本発明者は、水性緩衝液を添加する前にクロロホルムを乾燥除去なければならなかった。本発明者は、より「タンパク質親和性」の有機溶媒、例えば酢酸エチルを使用すれば、それは、タンパク質を損傷することなく水性アッセイ緩衝液中に残り得、疎水性脂質基質の溶解性を高めるのに役立ち得ると仮説を立てた。この理論に基づいて、本発明者は、疎水性脂質基質を溶解するために酢酸エチルを使用し、次いで、酢酸エチルを乾燥除去することなく、トリトン  Ｘ−１００を０〜０．１％含有する水性緩衝液を添加した。このアッセイ戦略は良好に機能した（表２を参照のこと）。しかし、トリトン  Ｘ−１００ワーキング濃度についてのシグナル対バックグラウンド検出ウィンドウは制限された。低いトリトン  Ｘ−１００濃度下において、疎水性脂質基質は完全には可溶性でなく、ＮＡＰＥ−ＰＬＤ酵素に利用可能でなく、従ってシグナル対バックグラウンド比は小さかった。トリトン  Ｘ−１００の濃度を増加させることによって、酵素に対する基質の利用可能性を高め、より高いシグナル対バックグラウンド比が得られた。しかし、トリトン  Ｘ−１００濃度をさらに高めると、非常に高いバックグラウンド蛍光が生じ、従ってシグナル対バックグラウンド比が低下した（図５）。従って、最適な基質調製条件について、本発明者は条件５を選択した（表２）。
【００６７】
実施例４
基質及び酵素滴定：
基質滴定について、基質濃度を５μＭから１０μＭに増加させるにつれて、検出ウィンドウはほぼ二倍になり、一方、バックグラウンドシグナルは一定のままであった（図６）。最新の緩衝液条件（トリトン  Ｘ−１００  ０．０５％）下での最大蛍光シグナルを見出すために、高濃度の酵素（１：１００）を使用した。
酵素滴定について、ＮＡＰＥ−ＰＬＤを、１：１００から１：６４００へ連続希釈した（図７）。反応を、ＰＥＤ６を１０μＭの最終濃度まで添加することによって開始させた。反応体積は２０μｌであった。蛍光強度を２分毎に測定した。これらの結果に基づいて、１４ｎＭ酵素（１：１６００）及び３０分の反応時間を、さらなる実験用に選択した。
【００６８】
実施例５
ＮＡＰＥ−ＰＬＤについてのＫｍ測定：
３．９μＭのＫm及び４．４６×１０4ＦＵ／分／μｇタンパク質のＶｍａｘについての値（図８）を測定した。使用するタンパク質の量についてＶｍａｘ値を正規化した。競合的インヒビターを含む、種々の作用様式を有するインヒビターを同定することができるように、本発明者は、測定されたＫｍ値に近い濃度である５μＭの濃度から基質滴定を開始することを選択し、１０μＭ基質濃度が、シグナル対バックグラウンド比とインヒビターに対する感度との最良の組み合わせを提供することがわかった。さらに、ＮＡＰＥ−ＰＬＤアッセイ条件についての以下のパラメータは：１４ｎＭ酵素、１０μＭ基質、反応時間２０μｌ体積中３０分である。
【００６９】
実施例６
ＤＭＳＯ感度：
多くのケミカルライブラリーはＤＭＳＯ中のストック溶液として維持されているので、本発明者は、ＤＭＳＯに対するアッセイの感度を試験した（図９）。アッセイは、ＤＭＳＯにいくぶん感受性であったが、ＤＭＳＯは十分に許容された。
【００７０】
実施例７
典型的なＩＣ50曲線：
ＮＡＰＥ−ＰＬＤの公知のインヒビターはない。従って、アッセイのバリデーションの間、ＮＡＰＥ−ＰＬＤを阻害するとわかった化合物を、アッセイにおける用量反応活性を実証するために使用した（図１０）。一次アッセイにおける一般的な「偽陽性」効果は、ミセル崩壊性化合物に起因することが予想され、何故ならば、疎水性基質は、溶解性について、緩衝液中の洗浄剤に非常に依存性であるためである。トリトン  Ｘ−１００がアッセイ緩衝液中に存在しない場合、基質蛍光は非常に低く、この効果により陽性化合物とよく似ることがあった。このような「偽陽性」を確認するために、化合物及び基質の存在下でしかし酵素の非存在下で蛍光を測定し、化合物がトリトン  Ｘ−１００の存在下で基質の蛍光強度に干渉するかどうかを測定することができる。
【００７１】
実施例８
Ａｂｈ４の調製及び基質としてのＰＥＤ６の試験
ｐｃＤＮＡ３．１ｚｅｏ＿ＤＥＳＴベクターを使用して、一過性発現のための懸濁細胞株であるＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、ヒトＡｂｈ４をクローニングし及び発現させた。ｐｃＤＮＡ３．１ｚｅｏ＿ＤＥＳＴは、ｐｃＤＮＡ３．２ｚｅｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の修飾ベクターである。Ａｂｈ４コード配列を含有するｐｃＤＮＡ３．１ｚｅｏ＿ＤＥＳＴベクターを、配列番号４に開示する。Ａｂｈ４を、Ｃ末端Ｈｉｓタグと共に発現した（配列番号５）。粗溶解物の一部をＰＥＤ６の加水分解について試験し、これは蛍光を生じた。トランスフェクト細胞からの溶解物（７５μｇタンパク質）を、最終体積１００μＬ中にトリトン  Ｘ−１００（基質を可溶化させるため）を０．０５％含有するＴｒｉｓ  ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）中のＰＥＤ６（最終アッセイ濃度５μＭ）の溶液に添加した。９６ウエルブラックプレート中の反応を、励起及びトップからの読み取り（励起波長４８８ｎｍ、発光波長５２０ｎｍ）で、蛍光プレートリーダーＧｅｍｉｎｉ（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ）で連続的にモニタリングした。トランスフェクションされていないＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３Ｆ細胞の溶解物（７５μｇタンパク質）を、コントロールとして使用した。これらの条件下で、１９倍より高い割合が、コントロール溶解物と比べてトランスフェクト細胞由来の溶解物で観察され、このことは、存在するＡｂｈ４が基質ＰＥＤ６を効率的に加水分解していることを示唆している（図１２）。この知見をさらに検証するために、インヒビターＭＡＦＰ（メチルアラキドニルフルオロホスホネート）を使用した。５．３４μＭの濃度で、このインヒビターは、観察された活性の＞９５％阻害を示し、Ｓｉｍｏｎ及びＣｒａｖａｔｔ（２００６）の知見と一致した。
【００７２】
Ａｂｈ４による及びＮＡＰＥ−ＰＬＤによるＰＥＤ６の加水分解の生産物が異なることを確認するために、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を行った。酢酸エチルで抽出した酵素反応混合物のクロロホルム：メタノール：アンモニア系を使用してのシリカゲルでのＴＬＣによって、反応生成物が異なることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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