(57)【要約】ＢＭＰ−１０のアゴニストおよびアンタゴニストを用いて、心臓、腎臓および血管の細胞機能および恒常性を調整する方法および組成物が開示されている。特に、ＢＭＰ−１０関連の血管、腎臓、線維性および心臓の疾患および／または障害を治療、予防、および／または診断する方法が開示されている。ＢＭＰ−１０モジュレータ、例えば、アゴニストおよびアンタゴニストを評価するスクリーニング方法も開示されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＢＭＰ−１０応答性細胞または組織における骨形態形成タンパク質−１０（ＢＭＰ−１０）の一つ以上の生物活性を減少させる方法であって、ＢＭＰ−１０応答性細胞または組織であって、一つ以上のＢＭＰ−１０生物活性を増加させる前記細胞または組織を細胞または組織における一つ以上のＢＭＰ−１０生物活性を減少させるのに十分な量のＢＭＰ−１０アンタゴニストと接触させることを含み、ＢＭＰ−１０応答性細胞または組織が、血管または腎臓の細胞または組織、または線維性組織であって、ＢＭＰ−１０アンタゴニストが、抗ＢＭＰ−１０抗体分子、抗ＢＭＰ−１０レセプター抗体分子、可溶性ＢＭＰ−１０レセプター、ＢＭＰ−１０核酸抑制物質、ＢＭＰ−１０レセプター核酸抑制物質、ＢＭＰ−１０拮抗性プロペプチド、ＢＭＰ−１０結合領域融合変異体、およびＢＭＰ−１０レセプター結合領域融合変異体からなる群より選択されるところの、方法。
【請求項２】
ＢＭＰ−１０アンタゴニストが、
（ｉ）Ｓｍａｄタンパク質のリン酸エステル化；
（ｉｉ）ミオスタチン、エンドグリンまたは抑制性Ｓｍａｄの遺伝子発現の誘導；
（ｉｉｉ）プロ血管形成遺伝子の発現の増加；
（ｉｖ）Ｒａｓ関連タンパク質−１ａ（Ｒａｐ１ａ）の発現の減少；
（ｖ）図２２−２８において確認された、インビトロまたはインビボにおける内皮細胞のＢＭＰ−１０刺激に応答する一つ以上の遺伝子の発現の調整；
（ｖｉ）ストロマ由来分化因子（ＳＤＦ−１）またはマトリックスメタロペプチダーゼ９（ＭＭＰ−９）の血清濃度の増加；または
（ｖｉｉ）血管異常、例えば、血管異形成、大量出血、毛細管拡張症、および／または、動静脈奇形の増加から選択される一つ以上のＢＭＰ−１０生物活性を低下させる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＢＭＰ−１０アンタゴニストが、一つ以上の血管恒常性、腎機能、または線維組織の形成もしくは蓄積を変化させる、請求項１記載の方法。
【請求項４】
血管細胞または組織が、内皮または平滑筋の細胞または組織である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
接触ステップが細胞培養に存在するＢＭＰ−１０応答性細胞または組織に生じ、前記細胞培養があらかじめまたは同時にＢＭＰ−１０にさらされる、請求項１記載の方法。
【請求項６】
接触ステップが被験者に存在するＢＭＰ−１０応答性細胞または組織に生じる、請求項１記載の方法。
【請求項７】
被験者が、血管、腎臓、または、線維形成の疾患または障害を有するかまたは有する危険性があるヒト患者である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
哺乳類の被験者における、血管、腎臓または線維性疾患または障害を治療または予防する方法であって、被験者において血管または腎臓の細胞または組織または線維性組織における一つ以上のＢＭＰ−１０生物活性を阻害または低下させるのに十分な量で、ＢＭＰ−１０アンタゴニストを哺乳類の被験者に投与することを含み、ＢＭＰ−１０アンタゴニストが、抗ＢＭＰ−１０抗体分子、抗ＢＭＰ−１０レセプター抗体分子、可溶性ＢＭＰ−１０レセプター、ＢＭＰ−１０核酸抑制物質、ＢＭＰ−１０レセプター核酸抑制物質、ＢＭＰ−１０拮抗性プロペプチド、ＢＭＰ−１０結合領域融合変異体およびＢＭＰ−１０レセプター結合領域融合変異体からなる群より選択されるところの、方法。
【請求項９】
血管の疾患または障害が、内皮または平滑筋細胞の機能不全によって特徴づけられる、請求項７または８記載の方法。
【請求項１０】
被験者が、一つ以上の遺伝性出血性毛細管拡張（ＨＨＴ）、腎炎症候群、腎症、糖尿病ネフロパシ、網膜症、脳卒中、アテローム硬化、動脈硬化、末梢血管障害、高血圧、高脂血症、血栓症または再狭窄から選択される障害を有するかまたは有する危険性があるヒトである、請求項７または８記載の方法。
【請求項１１】
被験者が、結腸直腸癌、胃癌、乳癌、肺癌、食道癌、および肝臓癌腫からなる群から選択される腫瘍性障害を有するかまたは有する危険性があるヒトである、請求項７または８記載の方法。
【請求項１２】
線維性疾患または障害が、肝臓、肺、腎臓または心臓の線維組織の形成または蓄積によって特徴づけられる、請求項７または８記載の方法。
【請求項１３】
ＢＭＰ−１０が、成熟したまたはプロペプチドのヒトＢＭＰ−１０である、請求項１または８記載の方法。
【請求項１４】
ＢＭＰ−１０アンタゴニストが、ヒトＢＭＰ−１０またはヒトＢＭＰ−１０レセプターと結合する抗体分子である、請求項１または８記載の方法。
【請求項１５】
抗体分子が、ヒトＢＭＰ−１０またはヒトＢＭＰ−１０レセプター・ポリペプチドに対する、ヒト、ヒト化、キメラ、ラクダ科の動物、サメまたはインビトロで生成された抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
ＢＭＰ−１０アンタゴニストが、ＢＭＰ−１０レセプターまたはＢＭＰ−１０拮抗プロペプチドの可溶性断片である、請求項１または８記載の方法。
【請求項１７】
可溶性断片が、免疫グロブリンＦｃ領域に融合する、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
ＢＭＰ−１アンタゴニストが、エンドグリン、ＡＬＫレセプター、コーディン、ＵＳＡＧ−１、スクレロジンおよびアクチビン・レセプターＩＩＢからなる群より選択される、ＢＭＰ−１０レセプターまたはその断片である、請求項１または８記載の方法。
【請求項１９】
ＢＭＰ−１０核酸抑制物質またはＢＭＰ−１０レセプター核酸抑制物質が、アンチセンス分子、リボザイム、ＲＮＡｉおよび三重らせん分子からなる群より選択される、請求項１または８記載の方法。
【請求項２０】
不活発なまたは途絶えた血管または心臓の細胞増殖または活性によって特徴づけられる障害を治療する方法であって、血管または心臓の細胞または組織の一つ以上のＢＭＰ−１０生物活性を増加または刺激するのに十分な量で、ＢＭＰ−１０ポリペプチドまたはその機能的断片を被験者に投与することによって、障害を治療または予防することを含み、疾患が内皮細胞損傷に伴う障害または疾患であるところの、方法。
【請求項２１】
試験サンプルにおいて、ＢＭＰ−１０関連の血管、腎臓、または線維性障害または疾患を評価、診断、またはその進行をモニターする方法であって、対照標準サンプルに対する核酸またはポリペプチドのレベルの違いが、障害または疾患の存在または進行を示すように、ＢＭＰ−１０またはＢＭＰ−１０関連遺伝子から選択される核酸またはポリペプチドの発現または活性を評価することを含む、方法。
【請求項２２】
ＢＭＰ−１０関連遺伝子が、一つ以上のＧＤＦ−８、ＧＤＦ−１０、エンドグリン、抑制性Ｓｍａｄおよびプロ血管形成遺伝子を含む、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
血管または腎臓の機能を調整する試験化合物を同定する方法またはアッセイであって、
（ｉ）ＢＭＰ−１０またはＢＭＰ−１０レセプター・ポリペプチドまたは核酸と相互作用または結合する試験薬を提供するかまたは同定すること；および
（ｉｉ）参照サンプルに対する試験薬の存在下における血管または腎臓の細胞または組織の活性の変化を評価することを含み、試験化合物が、抗体分子、ＢＭＰ−１０ペプチド、可溶性ＢＭＰ−１０レセプター、可溶性ＢＭＰ−１０レセプターの融合体、低分子、自然に生じるＢＭＰ−１０アンタゴニスト、アンチセンス分子、リボザイム、ＲＮＡｉおよび三重らせん分子からなる群から選択されるところの、方法またはアッセイ。
【請求項２４】
評価ステップが、１つ以上のＢＭＰ−１０もしくはＢＭＰ−１０レセプター・ポリペプチド、またはＢＭＰ−１０もしくはＢＭＰ−１０レセプターをコード化する核酸を試験化合物と接触させること；および
試験化合物を含まないコントロールサンプルに対する、試験化合物の存在下における、ＢＭＰ−１０またはＢＭＰ−１０レセプター・ポリペプチドまたは核酸の一つ以上の活性の変化を検出することを含み、ここで、血管または腎臓の細胞または組織の活性の変化が、参照サンプルに対する、テスト化合物の存在下における、１つ以上の
（ｉ）Ｓｍａｄタンパク質のリン酸エステル化；
（ｉｉ）ミオスタチン、エンドグリン、または、抑制性Ｓｍａｄの遺伝子発現；
（ｉｉｉ）一つ以上のプロ血管形成遺伝子の発現；
（ｉｖ）Ｒａｓ関連タンパク質１ａ（Ｒａｐ１ａ）の発現；
（ｖ）図２２−２８において確認された、インビトロまたはインビボにおける内皮細胞のＢＭＰ−１０刺激に応答する一つ以上の遺伝子の発現；
（ｖｉ）ストロマ由来分化因子（ＳＤＦ−１）またはマトリックスメタロペプチダーゼ９（ＭＭＰ−９）の血清濃度；または
（ｖｉｉ）血管異常、例えば、血管異形成、大量出血、毛細管拡張症または動静脈奇形
の変化を測定することによって検出され、一つ以上の（ｉ）−（ｉｉｉ）および（ｖｉ）における減少、および（ｖｉ）における増加が、ＢＭＰ−１０機能のアンタゴニストを示し、そして、一つ以上の（ｉ）−（ｉｉｉ）および（ｖｉ）の増加、および（ｉｖ）の減少が、ＢＭＰ−１０機能のアゴニストを示すところの、請求項２６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００７年６月１日に出願された米国出願番号第60/932,815号の優先権を主張する。上述した出願の内容は、その全体を出典明示により本明細書の一部とする。
【０００２】
（配列表）
ｐｄｆおよびｔｘｔ形式の配列表の電子コピーは、これと共に提出されている。
【背景技術】
【０００３】
骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）は、異所性骨形成を誘発するそれらの初期の生物活性に由来し、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ）ファミリーに属する。ＴＧＦβファミリーの他のメンバーは、増殖分化因子（ＧＤＦ）、アクチビン、インヒビン、および、節およびミュラー管抑制物質（ＭＩＳ）を含む(Massague, J. (1998) Annu. Rev. Biochem. 67:753-791)。ＴＧＦβファミリーのメンバーは、プレ−プロペプチドとして発現され、それはタンパク分解処理されて、シスチン―結節サイトカインとして分泌される。大部分のＴＧＦファミリーのメンバーは、タイプＩおよびタイプＩＩのセリン／スレオニン・キナーゼレセプターの異種複合体と結合する。加えて、タイプＩＩＩ受容体（ベータグリカンおよびエンドグリン）は、シグナル伝達カスケードを強化することができるコレセプターとして作用する(Shi, Y. and Massague, J. (2003) Cell 113:685-700で再検証)。リガンド結合によって、タイプＩＩレセプターはタイプＩレセプター（アクチビン・レセプター様キナーゼ（ＡＬＫ）としても知られている）をリン酸化し、活性化し、そして、それは次にＳｍａｄタンパク質（Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ３、Ｓｍａｄ５またはＳｍａｄ８）をリン酸化する。リン酸化されたＳｍａｄは共通パートナー（Ｓｍａｄ４）と二量体化し、そして、この複合体は、標的遺伝子の転写を調整する核に転位される。抑制性Ｓｍａｄ（Ｓｍａｄ６およびＳｍａｄ７）は、このシグナリング・プロセスを中断することができる(Derynck, R. and Zhang, Y.E. (2003) Nature 425:577-584参照)。ＴＧＦファミリーのメンバーは発育上および形態形成上の作用の様々な変動範囲を媒介し、そして、細胞増殖、転位および分化プロセス（例えば、脂肪生成、筋生成、軟骨形成、心臓生成、血液生成および上皮細胞分化）を含む(概説については、Ducy, P. and Karsenty, G. (2000) Kidney International 57:2207-2214; Nakayama et al. (2000)) Cell Mol. Life Sci 57:943-956参照)。
【０００４】
骨形態形成タンパク質１０（ＢＭＰ−１０）は、ハーバート・ノイハウス（Herbert Neuhaus）によって１９９９年にクローン化され、心臓の発達におけるその生物学的作用について研究された(Neuhaus et al. (1999) Mechanism of Development 80:181-184)。典型的切断部位は、モノマー当たり４２１のアミノ酸タンパク質をプロ領域（３０９のアミノ酸）および約１０８のアミノ酸残基の成熟した領域に分ける。成熟したＢＭＰ−１０タンパク質は、ＴＧＦファミリーのメンバーに典型的に見られる６〜７つのシステインの立体的に保存されたパターンを有する。ＢＭＰ−１０シグナルは、心臓の誘導、未発達の心臓の肉柱形成、および心室筋細胞系統の明確化を含む、心臓の発達の複数のステップを媒介することが示された(Schneider (2003) Cytokine Growth Factor Rev. 14:1-4参照)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Massague, J. (1998) Annu. Rev. Biochem. 67:753-791
【非特許文献２】Shi, Y. and Massague, J. (2003) Cell 113:685-700
【非特許文献３】Derynck, R. and Zhang, Y.E. (2003) Nature 425:577-584
【非特許文献４】Ducy, P. and Karsenty, G. (2000) Kidney International 57:2207-2214
【非特許文献５】Nakayama et al. (2000)) Cell Mol. Life Sci 57:943-956
【非特許文献６】Neuhaus et al. (1999) Mechanism of Development 80:181-184
【非特許文献７】Schneider (2003) Cytokine Growth Factor Rev. 14:1-4
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＴＧＦファミリーのメンバー、特にＢＭＰ−１０に関連する広範囲の活性が得られるが、このファミリーのメンバー、例えば、ＢＭＰ−１０に関連する新規な活性およびモジュレータを同定することの必要性がまだ存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、少なくとも一つには、骨形態形成タンパク質−１０（ＢＭＰ−１０）のインビボ過剰発現が遺伝性出血性毛細管拡張症（ＨＨＴ）と同様の表現型を伴う動物モデルにおいて血管形成異常をもたらすという知見に基づく。該知見は、心臓および血管の恒常性の調節におけるＢＭＰ−１０の発現に関与する。血管機能を調整することにおけるＢＭＰ−１０の役割をさらに支持するために、ＢＭＰ−１０は、インビトロで内皮細胞における細胞シグナル現象および遺伝子発現を活性化することが示された。他の実施態様において、ＢＭＰ−１０は、インビトロで腎臓細胞の一つ以上のシグナル経路および遺伝子発現を活性化することが示された(例えば、ヒト初期腎臓近位尿細管上皮細胞)。本発明者らは、肝臓、肺、腎臓および心臓を含むさまざまな器官および組織の線維症とＢＭＰ−１０との関連性をさらに見出した。したがって、本発明は、一つには、ＢＭＰ−１０のアゴニストおよびアンタゴニストを使用して、ＢＭＰ−１０機能（例えば、心臓および血管の恒常性、腎機能、および／または、線維組織の形成および／または蓄積）を調整する方法および組成物を提供する。特に、ＢＭＰ−１０に関連する疾患および／または障害（例えば、ＢＭＰ−１０に関連する血管、心臓、腎臓および／または線維形成の疾患および障害）を治療、予防、および／または診断する方法が開示されている。ＢＭＰ−１０モジュレータ（例えば、ＢＭＰ−１０機能または発現のアゴニストおよびアンタゴニスト）を評価するスクリーニング方法も開示されている。
【０００８】
したがって、一の態様において、本発明は、ＢＭＰ−１０応答性細胞、組織および／または器官（例えば、血管（例えば、内皮の、平滑筋）、腎臓および／または心臓の細胞または組織、または線維症組織または器官）のＢＭＰ−１０の機能（例えば、一つ以上の生物活性）を調整する方法を特徴とする。該方法は、ＢＭＰ−１０応答性細胞、組織および／または器官の機能（または細胞、組織および／または器官のＢＭＰ−１０の生物活性）を調整するのに十分な量において、ＢＭＰ−１０モジュレータ、例えば、ＢＭＰ−１０のアゴニストまたはアンタゴニスト（例えば、ＢＭＰ−１０のヒトの成熟体またはプロペプチドの形状のアゴニストまたはアンタゴニスト）により、ＢＭＰ−１０応答性細胞、組織および／または器官を接触させることを含む。一の実施態様において、接触ステップを、例えば、細胞可溶化物、または、再構成されたシステムにおいて、インビボで達成することができる。あるいは、目的の方法を、培養細胞、例えば、インビトロまたはエクスビボにおいて、実施することができる。例えば、細胞（例えば、精製された、または、組換え細胞）をインビトロで培養することができ、そして、接触ステップをＢＭＰ−１０モジュレータを培養液に加えることによって達成することができる。実施態様において、細胞は、あらかじめまたは同時にＢＭＰ−１０にさらされる。典型的には、ＢＭＰ−１０応答性細胞は、哺乳類の細胞（例えば、ヒト細胞）である。いくつかの実施態様においては、ＢＭＰ−１０応答性細胞は、内皮細胞または細胞（例えば、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣＳ）、ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣＳ））の集団；血管平滑筋細胞またはその集団；心臓細胞（例えば、心筋細胞）またはその集団；あるいは腎臓細胞（例えば、ヒト腎臓近位尿細管細胞）またはその集団である。他の実施態様において、ＢＭＰ−１０組織は、内皮、血管、心臓、腎臓または線維形成の組織または器官（例えば、肝臓、肺、腹膜、腎臓または心臓の線維性または線維状の組織）である。他の実施態様において、その方法を、例えば、インビボ（例えば、治療または予防の）プロトコルの一部として、被験者、または、動物の被験者（例えば、心血管虚血性モデルまたは遺伝子変異モデルのようなインビボ動物モデル、例えば、ＢＭＰレセプター（ＢＭＰＲ２）に突然変異を有する動物モデルまたはＮＫＸ２−５欠損性の動物；または線維症動物モデル）に存在する細胞（例えば、ＢＭＰ−１０応答性細胞）において実施することができる。実施態様において、被験者は、ＢＭＰ−１０の発現または活性が上昇している。
【０００９】
インビボ方法について、ＢＭＰ−１０モジュレータは、単独でまたは他の薬剤と組み合わせて、ＢＭＰ−１０関連の血管、心臓、腎臓、または線維形成の疾患および／または障害に罹患している被験者（例えば、哺乳類）に、被験者のＢＭＰ−１０機能（例えば、一つ以上のＢＭＰ−１０活性）を変調するのに十分な量で投与されうる。
【００１０】
いくつかの実施態様において、例えば、被験者に対する投与の前に、ＢＭＰ−１０モジュレータ（例えば、アンタゴニスト）の総量または適用量は、一つ以上のＢＭＰ−１０生物活性（例えば、本明細書において記載されているＢＭＰ−１０活性の一つ以上）を調整、例えば、減少または阻害するのに必要とするＢＭＰ−１０アンタゴニストの総量を試験することによって決定されうる。インビボ方法は、所望により、障害または疾患に関連する一つ以上の症状を有する危険性のある、または、有している被験者を特定（例えば、評価、診断、スクリーニングおよび／または選択）するステップ（複数）を含みうる。
【００１１】
阻害、低下または一つ以上のＢＭＰ−１０生物活性の減衰が要求される実施態様において、ＢＭＰ−１０応答性細胞および／または組織は、例えば、被験者にＢＭＰ−１０アンタゴニストを投与することによって、ＢＭＰ−１０アンタゴニストに接触する。一の実施態様において、ＢＭＰ−１０アンタゴニストは、ＢＭＰ−１０またはＢＭＰ−１０レセプター（また、それぞれ、本明細書において、「ＢＭＰ−１０アンタゴニスト」および「ＢＭＰ−１０レセプターアンタゴニスト」と称される）に相互作用、例えば、結合し、そして、一つ以上のＢＭＰ−１０および／またはＢＭＰ−１０レセプター活性を低下または阻害する。典型的には、拮抗されるＢＭＰ−１０またはＢＭＰ−１０レセプターは、哺乳類、例えば、ヒトのＢＭＰ−１０またはＢＭＰ−１０レセプター（またはその機能的な変異体）である。実施態様において、拮抗されるＢＭＰ−１０は、成熟したＢＭＰ−１０配列（例えば、図２（配列番号２）に示されるヒトＢＭＰ−１０のアミノ酸配列またはそれに実質的に対応する配列、または図１（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列またはそれに実質的に対応する配列によってコード化されるアミノ酸配列の中で、アミノ酸約３１４〜４２４または一部のアミノ酸配列からなる成熟したＢＭＰ−１０配列）を含む。他の実施態様において、拮抗されるＢＭＰ−１０は、プロペプチドＢＭＰ−１０配列（例えば、図２（配列番号２）に示されるヒトＢＭＰ−１０アミノ酸配列またはそれに実質的に対応する配列、または図１（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列またはそれに実質的に対応する配列によってコード化されるアミノ酸配列の中で、アミノ酸約２２〜４２４または一部のアミノ酸配列からなるプロペプチドＢＭＰ−１０配列）を含む。実施態様において、拮抗されるＢＭＰ−１０レセプターは、エンドグリンまたはアクチビン・レセプター様キナーゼ（ＡＬＫ）−１、−３または−６（例えば、図３Ｄ（配列番号４）に示されるか、または、図３Ａ−３Ｃ（配列番号３）に示されるヌクレオチド配列からなる核酸によってコード化される、哺乳類の、例えば、ヒトのＡＬＫ−１のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列からなるＡＬＫ−１または−３；または図４Ｃ（配列番号６）に示されるか、または図４Ａ−４Ｂ（配列番号５）に示されるヌクレオチド配列からなる核酸によってコード化されるアミノ酸配列からなるヒトＡＬＫ−３；またはそれに実質的に対応する配列）である。
【００１２】
典型的なアンタゴニストは、ＢＭＰ−１０またはＢＭＰ−１０レセプターに、高い親和性（例えば、約１０７Ｍ−１、典型的には、約１０８Ｍ−１、さらに典型的には約１０９Ｍ−１〜１０１０Ｍ−１またはそれ以上の親和定数）で結合し、ＢＭＰ−１０応答性細胞、組織および／または器官（例えば、血管（例えば、内皮、平滑筋）および／または心臓、細胞または組織、または線維形成の組織または器官）において一つ以上のＢＭＰ−１０生物活性を低下および／または阻害する。本発明の方法および組成物を用いて阻害または低下されうる典型的なＢＭＰ−１０活性は、これに限定されるものではないが、１つ以上の以下：(i) Ｓｍａｄタンパク質のリン酸化（例えば、Ｓｍａｄ１、５および／または８のリン酸化）；(ii) ミオスタチン、エンドグリンおよび／または抑制性Ｓｍａｄの遺伝子発現の誘導（例えば、Ｓｍａｄ６および／または７の発現の誘導）；(iii) 一つ以上のプロ血管形成遺伝子（例えば、ＶＥＧＦ、ＩＤ１およびＩＤ２）の発現の増加；（iv）Ｒａｓ関連タンパク質１ａ（Ｒａｐ１ａ）の発現の減少；(v) 図２２−２８において同定された、インビトロまたはインビボ内皮または腎臓細胞のＢＭＰ−１０刺激に応答する一つ以上の遺伝子の発現の調整、例えば、増加または減少；（iv）ストロマ由来の分化要因（ＳＤＦ−１）および／またはマトリックスメタロペプチダーゼ９（ＭＭＰ−９）の血清濃度の増加；および／または（iv）血管異常（例えば、血管形成異常、大量出血、毛細管拡張症および／または動静脈奇形）の増加を含む。
【００１３】
一の実施態様において、ＢＭＰ−１０アンタゴニストは、ＢＭＰ−１０またはＢＭＰ−１０レセプターに対する抗体分子である。抗体分子は、モノクローナルまたは単一特異性抗体、または、ＢＭＰ−１０またはＢＭＰ−１０レセプター（例えば、哺乳類（例えば、ヒトＢＭＰ−１０またはＢＭＰ−１０レセプター（またはその機能的な変異体））に結合する、その抗原−結合断片（例えば、Fab、F(ab')2、Fv、単鎖Ｆｖ断片、単一領域の抗体、ジアボディー（diabody）（ｄＡｂ）、二価または二重特異性抗体、またはその断片、その単一領域の変異体、またはラクダ科の動物またはサメ抗体）でありうる。実施態様において、抗体分子は、成熟したＢＭＰ−１０（例えば、本明細書において記載されている成熟したヒトＢＭＰ−１０）と結合する。典型的には、抗体分子は、ヒトの、ヒト化された、キメラの、ラクダ科の動物の、サメの、または、インビボ生成された、ヒトＢＭＰ−１０またはヒトＢＭＰ−１０レセプター・ポリペプチドに対する抗体（またはその機能的な断片、例えば、本明細書において記載されている抗体断片）である。典型的には、抗体は、ＢＭＰ−１０またはＢＭＰ−１０レセプターの一つ以上の活性（例えば、本明細書において記載されているＢＭＰ−１０の一つ以上の生物活性）を阻害、低下または中和する。
【００１４】
一の態様において、抗体分子は、成熟したＢＭＰ−１０ポリペプチド（例えば、図２（配列番号２）の、アミノ酸約３１４〜４２４またはその断片からなるエピトープ、例えば、アミノ酸約３１４〜３２５、３２５〜３３５、３３５〜３４５、３４５〜３５５、３５５〜３６５、３６５〜３７５、３７５〜３８５、３８５〜３９５、３９５〜４０５、４０５〜４１５および４１５〜４２４）と結合して、ＢＭＰ−１０の一つ以上の活性を阻害、低下または中和する。別の実施態様において、抗体分子は、ＢＭＰ−１０プロペプチド（例えば、アミノ酸約２２〜４２４またはその断片からなるエピトープ（例えば、図２（配列番号２）の中で、アミノ酸約２２〜３１３、２２〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１００〜１１０、１１０〜１２０、１２０〜１３０、１３０〜１４０、１４０〜１５０、１５０〜１６０、１６０〜１７０、１７０〜１８０、１８０〜１９０、１９０〜２００、２００〜２１０、２１０〜２２０、２２０〜２３０、２３０〜２４０、２４０〜２５０、２５０〜２６０、２６０〜２７０、２７０〜２８０、２８０〜２９０、２９０〜３００、３００〜３１０）と結合し、ＢＭＰ−１０の一つ以上の活性を阻害、低下または中和する。さらに他の実施態様において、抗体分子は、ＢＭＰ−１０プロペプチドの切断部位に結合し、例えば、配列番号２のアミノ酸約２１−２２または３１３−３１４に位置するエピトープに結合し、ＢＭＰ−１０の一つ以上の活性を阻害、低下または中和する。実施態様において、抗体分子は、ＢＭＰ−１０レセプター、例えば、エンドグリン（例えば、ヒトエンドグリン）；またはアクチビン・レセプター様キナーゼ（ＡＬＫ）−１、−３または−６（例えば、図３Ｄ（配列番号４）および図４Ｃ（配列番号６）にそれぞれ示される、哺乳類の、例えば、ヒトのＡＬＫ−１および−３と同一のアミノ酸配列からなるＡＬＫ−１または−３）、またはそれに実質的に対応する配列に結合し、そして、ＢＭＰ−１０の一つ以上の活性を阻害、低下または中和する。
【００１５】
抗体分子は、完全長であり、（例えば、少なくとも１つ、典型的には２つの完全な重鎖、および、少なくとも１つ、典型的には２つの完全な軽鎖を含むことができ）あるいは、抗原−結合断片（例えば、Fab、F(ab')2、Fv、単鎖Ｆｖ断片または単一領域の抗体またはその断片）を含むことができる。さらに他の態様において、抗体分子は、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤおよびＩｇＥの重鎖定常領域から選択される、特に、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４の（例えば、ヒト）重鎖定常領域から選択される、重鎖定常領域を有する。他の態様において、抗体分子は、例えば、カッパまたはラムダの（例えば、ヒト）軽鎖定常領域から選択される軽鎖定常領域を有する。定常領域は、抗体の特性を修正するために（例えば、Ｆｃレセプター結合、抗体グリコシル化、システイン残基の数、エフェクター細胞機能および／または補足機能の一つ以上を増減するために）、変異、例えば、突然変異されうる。
【００１６】
他の実施態様において、ＢＭＰ−１０アンタゴニストは、ＢＭＰ−１０レセプター・ポリペプチド（例えば、ＢＭＰ−１０レセプター・ポリペプチドの抑制性ＢＭＰ−１０結合領域）の完全長または断片である。例えば、アンタゴニストは、ＢＭＰ−１０レセプターの可溶形態（例えば、ＢＭＰ−１０結合領域からなる哺乳類の（例えば、ヒトの）ＡＬＫ−１、−３または−６の可溶形態；例えば、哺乳類の（例えば、ヒトの）ＡＬＫ−１、−３または−６の細胞外領域の可溶形態）でありうる。例えば、ＢＭＰ−１０アンタゴニストは、ヒトＡＬＫ−１（図３Ｄ；配列番号４）のうちのアミノ酸約２２〜１１８、または、ヒトＡＬＫ３（図４Ｃ；配列番号６）のアミノ酸約２４〜１５２を含みうる。他の実施態様において、ＢＭＰ−１０アンタゴニストは、哺乳類の（例えば、ヒト）アクチビン・レセプター（例えば、図５Ｂ；配列番号１８のアミノ酸約１７〜１３３を含む、例えば、アクチビン・レセプターＩＩＢ（ＡｃｔＲＩＩＢ）の可溶形態である。
【００１７】
さらに他の実施態様において、ＢＭＰ−１０アンタゴニストは、ＢＭＰ−１０拮抗的なプロペプチド（例えば、抑制性複合体を成熟したＢＭＰ−１０により形成することができる、ＢＭＰ−１０の不完全なまたは変異体の形態（例えば、図２（配列番号２）のアミノ酸約２２〜３１３からなるヒトＢＭＰ−１０のプロペプチド領域の不完全なまたは変異体の形態）またはその部分または変異体）である。
【００１８】
ＢＭＰ−１０レセプターまたはＢＭＰ−１０拮抗的なプロペプチドの可溶形態は、単独で使用されうるかまたは機能的に第２の部分（例えば、免疫グロブリンＦｃ領域、血清アルブミン、ＰＥＧ化、ＧＳＴ、Ｌｅｘ−ＡまたはＭＢＰポリペプチド配列）に、結合（例えば、化学的結合、遺伝子またはポリペプチドの融合、非共有結合など）されうる。融合タンパク質は、さらに、第１の部分（例えば、可溶なＢＭＰ−１０レセプターまたはＢＭＰ−１０プロペプチド）を第２の部分に結合しているリンカー配列を含みうる。他の実施態様において、付加的なアミノ酸配列は、発現、立体的柔軟性、検出および／または単離または精製を容易にするために、融合タンパク質のＮ末端またはＣ末端に加えられうる。例えば、ＢＭＰ−１０レセプターまたはＢＭＰ−１０拮抗的なプロペプチドの可溶形態は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤおよびＩｇＥを含む、さまざまなアイソタイプの重鎖定常領域に融合することができる。典型的には、融合タンパク質は、例えば、ヒト免疫グロブリンＦｃ鎖、例えば、ヒトＩｇＧ（例えば、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ２またはその変異体の形態）に融合した、ヒトＢＭＰ−１０レセプターまたはＢＭＰ−１０プロペプチド（またはそれに対応する配列）の細胞外領域を含むことができる。Ｆｃ配列は、エフェクター細胞機能、Ｆｃレセプター結合および／または補足活性を低下させるために、一つ以上のアミノ酸で変異することができる。ヒトＩｇＧ１Ｆｃと融合するＡｃｔＲＩＩＢのアミノ酸約１７〜１３３からのアミノ酸配列を含む典型的な融合タンパク質は、図５Ｂ；配列番号１８に示される。
【００１９】
本明細書において記載されている抗体分子および可溶性または融合タンパク質は、その中に一つ以上の他の分子存在物、例えば、抗体（例えば、二重特異性であるかマルチ特異性の抗体）、毒素、放射性同位元素、細胞障害性であるか細胞増殖抑制薬剤に、機能的に（例えば、化学的結合、遺伝子の融合、非共有結合、その他によって）結合されることができることが理解されるであろう。
【００２０】
さらに別の実施態様では、ＢＭＰ−１０アンタゴニストは、結合領域融合変異体または低分子である。結合領域融合変異体は、ＣＨ１以外（例えば、ＩｇＧおよびＩｇＡのＣＨ２およびＣＨ３領域またはＩｇＥのＣＨ３およびＣＨ４領域）の重鎖からの一つ以上の天然または設計された定常領域からなる領域に次に融合するかまたは接続している、ヒンジまたはヒンジ作用領域のポリペプチドに融合するかまたは接続している結合領域ポリペプチドを典型的に含む変異体分子の実施例を提供する。典型的には、結合領域融合変異体または低分子は、哺乳類の、例えば、ヒトのＢＭＰ−１０またはＢＭＰ−１０レセプターに、少なくとも約107 M-1、典型的には、約108 M-1、より典型的には、約109 M-1 から 1010 M-1またはそれ以上の親和性で結合し、本明細書において記載されているように、一つ以上のＢＭＰ−１０生物活性を低下および／または阻害する。実施態様において、結合領域融合変異体または低分子は、成熟したＢＭＰ−１０配列（例えば、図２（配列番号２）の中で、アミノ酸約３１４〜４２４、または、その断片、例えば、アミノ酸約３１４〜３２５、３２５〜３３５、３３５〜３４５、３４５〜３５５、３５５〜３６５、３６５〜３７５、３７５〜３８５、３８５〜３９５、３９５〜４０５、４０５〜４１５および４１５〜４２４）と結合し、ＢＭＰ−１０の一つ以上の活性を阻害、低下または中和する。もう一つの実施態様において、結合領域融合変異体または低分子は、ＢＭＰ−１０プロペプチド（アミノ酸約２２〜４２４またはその断片、（例えば、図２（配列番号２）の中で、アミノ酸約２２〜３１３、２２〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１００〜１１０、１１０〜１２０、１２０〜１３０、１３０〜１４０、１４０〜１５０、１５０〜１６０、１６０〜１７０、１７０〜１８０、１８０〜１９０、１９０〜２００、２００〜２１０、２１０〜２２０、２２０〜２３０、２３０〜２４０、２４０〜２５０、２５０〜２６０、２６０〜２７０、２７０〜２８０、２８０〜２９０、２９０〜３００、３００〜３１４）と結合し、ＢＭＰ−１０の一つ以上の活性を阻害、低下または中和する。さらに他の実施態様において、結合領域融合変異体または低分子は、ＢＭＰ−１０プロペプチドの切断部位に結合し、例えば、配列番号２のアミノ酸約２１―２２または３１３―３１４に位置する領域に結合し、そして、ＢＭＰ−１０の一つ以上の活性を阻害、低下または中和する。実施態様において、結合領域融合変異体または低分子は、ＢＭＰ−１０レセプター、例えば、エンドグリン（例えば、ヒトエンンドグリン）；または、アクチビン・レセプター様キナーゼ（ＡＬＫ）−１、−３または−６（例えば、図３Ｄ（配列番号４）および図４Ｃ（配列番号６）でそれぞれ示される、哺乳類の、例えば、ヒトのＡＬＫ−１および−３と同一のアミノ酸配列からなるＡＬＫ−１または−３）またはそれに実質的に対応する配列に結合し、そして、ＢＭＰ−１０の一つ以上の活性を阻害、低下または中和する。
【００２１】
さらにもう一つの実施態様では、ＢＭＰ−１０アンタゴニストは、ＫＬ−４  表面活性物質（lucinactant）またはその変異体である。例えば、ＢＭＰ−１０アンタゴニストは、天然ヒト肺表面活性物質（例えば、ヒト表面活性物質タンパク質Ｂ（ＳＰＢ）の特性にきわめて類似するように設計されているＫＬ−４タンパク質様物質）の設計された変形であることができる。他の実施態様において、ＢＭＰ−１０アンタゴニストは、自然に生じるＢＭＰ−１０アンタゴニストのアミノ酸配列、またはそれに実質的に対応する配列を有する。例えば、ＢＭＰ−１０アンタゴニストは、子宮の感作関連gene１（ＵＳＡＧ−１）、スクレロジン（sclerosin）、ノジン、コーディン、グレムリンまたはねじれた原腸形成、またはその変異体または断片から選択される自然に生じるＢＭＰ−１０アンタゴニストのアミノ酸配列を有することができる。
【００２２】
もう一つの実施態様において、ＢＭＰ−１０アンタゴニストは、ＢＭＰ−１０またはＢＭＰ−１０レセプターをコード化している核酸の発現を阻害する。このようなＢＭＰ−１０アンタゴニストの例は、核酸分子、例えば、アンチセンス分子、リボザイム、ＲＮＡｉ、ＢＭＰ−１０またはＢＭＰ−１０レセプターをコード化している核酸にハイブリダイズする三重らせん体分子、または転写調節領域を含み、そして、ＢＭＰ−１０またはＢＭＰ−１０レセプターのｍＲＮＡ発現を阻害または低下させる。
【００２３】
インビボの実施態様において、ＢＭＰ−１０アンタゴニストは、ＢＭＰ−１０関連の障害および／または疾患を有する危険性がある、または、有している被験者に投与されることができる。被験者は、例えば、ＢＭＰ−１０関連の血管、腎臓、線維形成、または、心臓の障害または疾患を患っている、哺乳類（例えば、ヒト）であることができる。例えば、被験者は、血管障害または内皮細胞機能不全によって特徴づけられる障害、例えば、以下の一つ以上から選択される疾患または障害で苦しんでいる哺乳類（例えば、ヒト患者）である。：遺伝性出血性毛細管拡張症（ＨＨＴ）；腎臓症候群、腎症（例えば、糖尿病性腎症）、網膜症（例えば、糖尿病性網膜症）、新脈管の緑内障および他の糖尿病の脈管障害；脳卒中、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化、末梢血管疾患、高血圧（例えば、肺高血圧）、肺疾患、高脂血症、血栓症および／または再狭窄。ＢＭＰ−１０アンタゴニストは、望ましくないか過剰な内皮細胞増殖または新血管形成によって特徴づけられる腫瘍性および非腫瘍性血管障害を治療するかまたは防止するために用いることもできる。添付の実施例に示すように、ＢＭＰ−１０の投与は、培養の内皮細胞のプロ血管形成遺伝子（例えば、ＶＥＧＦ、ＩＤ１およびＩＤ２）の発現を増加させて、インビボでＳＤＦ−１ｂおよびＭＭＰ−９の発現を増加させた。従って、これらの遺伝子およびタンパク質のＢＭＰ−１０誘導の拮抗作用は、脈管形成および血管化を阻害または減少させるために用いることができ、このように、以下の一つ以上から選択される腫瘍性および非腫瘍性の疾患を治療または予防することに有用である：腫瘍（例えば、充実性の悪性腫瘍、例えば、結腸直腸、胃、胸部、肺、腎臓、食道および肝臓の癌腫）；および、他の癌障害（例えば、網膜芽腫、神経膠芽腫、星状細胞腫、神経芽細胞腫、その他）；同様に、非腫瘍性の障害（例えば、慢性関節リウマチ、乾癬および他の慢性の炎症性の障害、角膜および組織移植、その他）。
【００２４】
他の実施態様において、ＢＭＰ−１０アンタゴニストで処理される被験者は、ＢＭＰ−１０に関連する心臓の疾患または障害を患う。心臓病または心臓の疾患は、例えば、心臓への不十分な血液供給；心臓のリズムの不規則性；および／または心臓の心房から心室への刺激の不完全な伝導、を含む任意の種類の心臓機能不全によって特徴づけられることができる。心臓の疾患の例には、これらに制限されるわけではないが、先天性心臓病、心筋症（例えば、拡張性、肥大性、拘束性の心筋症）、鬱血性心不全および心筋梗塞が含まれる。
【００２５】
他の実施態様において、ＢＭＰ−１０アンタゴニストで処理される被験者は、線維症の疾患または障害を患う。出願人は、ＢＭＰ−１０のヒト腎臓近位尿細管上皮細胞への付加がプロ線維症遺伝子の発現を誘発することを本明細書において示した（図２４−２５）。培養の腎臓細胞へのＢＭＰ−１０の付加も、腎臓上皮細胞を刺激し、ＢＭＰ−１０レセプターアンタゴニストによって遮断される活性化をもたらす（図１９−２０）。これらの結果は、ＢＭＰ−１０の拮抗作用が線維症疾患または障害を処理または防止することに有用であることができることを示す。線維症疾患または障害は、線維様材料（例えば、細胞外マトリックス）または組織の異常なおよび／または過剰な形成または蓄積によって特徴づけられることができる。実施態様において、線維結合組織は、通常の組織（例えば、通常の平滑筋または他の通常の器官組織）に置き換えられる。線維組織の形成は、修復性または反応性の方法から生じ得る。線維形成の障害または疾患は、これに限定はされないが、心臓、皮膚、腎臓、肺、腹膜、腸および肝臓を含む組織および器官系と同様に、血管病（例えば心臓病、脳疾患および末梢血管疾患）を伴う線維増殖的な疾患を含む(例えば、Wynn, Nature Reviews 4:583-594 (2004), incorporated herein by referenceに開示されるように)。治療されることができる典型的な疾患は、これに限定されるものではないが、腎臓線維症を含み、そして、これに限定されるものではないが、損傷／線維症に関連する腎症、例えば、慢性腎症に関連する糖尿病（例えば、糖尿病性腎症）、ループス、硬皮症、糸球体腎炎、焦点性分節糸球体硬化症およびＩｇＡ腎症；肺または肺線維症、例えば、特発性肺線維症、放射線誘発性線維症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、硬皮症および慢性喘息；腸線維症、例えば、硬皮症および放射線誘発性腸線維症；肝臓線維症、例えば、肝硬変、アルコール誘発性肝臓線維症、胆汁導管損傷、原発性胆汁性肝硬変、感染またはウィルス誘発性肝臓線維症、先天性肝臓線維症および自己免疫肝炎；そして、他の線維症障害、例えば、嚢胞性線維症、心内膜心筋線維症、縦隔線維症、肋膜線維症、類肉腫症、硬皮症、脊髄損傷／線維症、骨髄線維症、脈管再狭窄およびアテローム性動脈硬化症を含む。
【００２６】
ＢＭＰ−１０アンタゴニストは、被験者に、単独で、または、一つ以上の薬剤または治療的な形態（例えば、治療薬）と組み合わせて投与されることができ、そして、ＢＭＰ−１０に関連する脈管、腎臓、線維形成または心臓の疾患および／または障害を治療することに有用である。一の実施態様において、第２の薬剤または治療的な形態は、以下の一つ以上から選択される：血管形成術、ベータレセプター遮断薬、高血圧治療薬、強心薬、抗血栓剤、血管拡張薬、ホルモン拮抗物質、エンドセリン・アンタゴニスト、カルシウムチャネル遮断薬、ホスホジエステラーゼ抑制剤、アンギオテンシン・タイプ２アンタゴニスト、サイトカイン遮断薬／抑制剤、スタチン、抗炎症剤。
【００２７】
ＢＭＰ−１０機能の増加が要求される実施態様において、ＢＭＰ−１０応答性細胞、組織または器官（例えば、脈管（例えば、内皮、平滑筋）、腎臓および／または心臓の細胞または組織）は、例えば、被験者にＢＭＰ−１０アゴニストを投与することによって、ＢＭＰ−１０アゴニストと接触する。ＢＭＰ−１０アゴニストの例は、ＢＭＰ−１０タンパク質または機能的に活性な断片、ペプチドまたはその変異体（例えば、哺乳類、例えば、ヒト、ＢＭＰ−１０（例えば、本明細書において記載されている成熟したＢＭＰ−１０またはそれに実質的に対応する配列）；またはＢＭＰ−１０タンパク質または機能的に活性な断片またはその変異体をコード化している核酸（例えば、図１（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列を含む核酸（または部分またはその変異体）を含む。本明細書において記載されているように、ＢＭＰ−１０アゴニストが単独で使われることができるかまたは機能的に第２の部分（例えば、免疫グロブリンＦｃ領域、血清アルブミン）に結合（例えば、化学的結合、遺伝子またはポリペプチド融合、非共有結合、またはそれ以外によって）することができる。他の実施態様において、ＢＭＰ−１０アゴニストは、ＢＭＰ−１０レセプター（例えば、本明細書において記載されているレセプター）と結合して、レセプター活性を増加させる。例えば、ＢＭＰ−１０アゴニストは、抗体分子、結合領域融合変異体またはＢＭＰ−１０レセプターと結合して、一つ以上の活性を刺激する任意の他の薬剤であることができる。
【００２８】
実施態様において、ＢＭＰ−１０アゴニストは、培養またはインビトロの細胞の成長および／または分化を拡大するために用いることができる。例えば、幹細胞は被験者（例えば、ＢＭＰ−１０関連の疾患にかかって、ＢＭＰ−１０アゴニストに接触される患者）から得られることができ、それによって、幹細胞集団を拡張する。拡張された幹細胞は、それから被験者に再導入されることができる。
【００２９】
実施態様において、ＢＭＰ−１０アゴニストは、被験者に投与される。被験者は、例えば、異常に不活性であるか損なわれたＢＭＰ−１０機能によって特徴づけられる疾患（例えば、異常に不活性であるか途絶された脈管であるか心臓細胞の増殖および／または活性によって特徴づけられる疾患）を患っている哺乳類（例えば、ヒト）であることができる。例えば、ＢＭＰ−１０アゴニストは、内皮細胞損傷の後（例えば、虚血発作または微小血管性脈管障害の後）、疾患または障害を処理するかまたは防止するために用いることができる。いくつかの実施態様において、投与されるＢＭＰ−１０アゴニストの総量または投与量は、例えば、被験者に対する投与の前に、上述したＢＭＰ−１０生物活性の一つ以上を増加または刺激するのに必要とされるＢＭＰ−１０アゴニストの総量をインビトロ または エクスビボでテストすることによって、測定されることができる。インビボ方法が、選択的に、疾患または障害と関連した一つ以上の症状を有する危険性のある、または、有している被験者を確認（例えば、評価、診断、スクリーニングおよび／または選択）するステップを含むことができる。
【００３０】
さらにもう一つ実施態様では、本発明は、被験者において、ＢＭＰ−１０関連の障害および／または疾患（例えば、ＢＭＰ−１０関連の脈管、腎臓、心臓または線維形成の障害および／または疾患）を治療または予防（例えば、治癒、抑制、改善、発病の遅延または防止、または、再発またはぶり返しの防止）する方法を特徴とする。その方法は、被験者にＢＭＰ−１０アンタゴニスト（例えば、本明細書において記載されているＢＭＰ−１０アンタゴニスト）を、ＢＭＰ−１０−応答性細胞および／または組織、例えば、脈管（例えば、内皮、平滑筋）、腎臓、および／または、心臓、細胞または組織または線維症組織の一つ以上のＢＭＰ−１０生物活性（例えば、本明細書において記載されている生物活性）を阻害するかまたは低下させるのに十分な量で、投与することを含み、このことにより、疾患または障害を治療または防止する。被験者は、例えば、本明細書において記載されているＢＭＰ−１０関連の障害および／または疾患を患っている哺乳類（例えば、ヒト）であることができる。いくつかの実施態様において、投与されるＢＭＰ−１０アンタゴニストの総量または投与量は、例えば、被験者に対する投与の前に、上述したＢＭＰ−１０生物活性の一つ以上を阻害するかまたは低下させることを必要とするＢＭＰ−１０アンタゴニストの量をインビトロまたはエクスビボで試験することによって、決定されることができる。その方法は、選択的に、ＢＭＰ−１０関連の障害および／または疾患（例えば、本明細書において記載されている脈管、腎臓、心臓であるか線維症障害および／または疾患）に関連する一つ以上の症状を有する危険性のある、または、有している被験者を確認（例えば、評価、診断、スクリーニングおよび／または選択）するステップ含むことができる。
【００３１】
ＢＭＰ−１０アンタゴニストは、被験者に、単独に、または、一つ以上の薬剤または治療的な形態（例えば、治療薬）と併用して投与されることができ、そして、それはＢＭＰ−１０関連の（例えば、血管、腎臓、心臓であるか線維症の）疾患または障害を治療することに有用である。一の実施態様において、第２の薬剤または治療的な形態は、以下の一つ以上から選択される：腫瘍壊死因子抑制剤；抗線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）抗体；肝細胞増殖因子（例えば、糖尿病性腎症および他の腎臓の徴候の処置において）；組織成長因子、プロテインＣまたはプロテインＳの凝固薬活性を阻害するかまたは中和することできる抗体；抗悪性腫瘍薬（例えば、特に、アルキル化薬、葉酸アンタゴニスト、代謝拮抗物質、５−フルオロウラシル、プリン・ヌクレオシド）；血管形成術；ベータレセプター遮断薬；高血圧治療薬；強心薬；抗血栓剤；血管拡張薬；ホルモン拮抗物質；エンドセリン・アンタゴニスト；カルシウムチャンネル遮断薬；ホスホジエステラーゼ抑制剤；アンギオテンシン・タイプ２アンタゴニスト、サイトカイン遮断薬／抑制剤、スタチンおよび／または抗炎症剤。
【００３２】
さらにもう一つの実施態様では、本発明は、異常に不活性であるか阻害されたＢＭＰ−１０反応性細胞の増殖および／または活性によって特徴づけられる疾患の治療または予防（例えば、治癒、抑制、改善、発病の遅延または防止、または、再発またはぶり返しの防止）の方法を特徴とする。例えば、ＢＭＰ−１０アゴニストは、内皮細胞損傷の後（例えば、虚血発作または微小血管性脈管障害の後）、疾患または障害を治療するかまたは防止するために用いることができる。内皮細胞および／または維管束組織の一つ以上のＢＭＰ−１０生物活性（例えば、本明細書において記載されている生物活性）を増加または刺激するのに十分な量において、その方法は、被験者に、ＢＭＰ−１０アゴニスト（例えば、本明細書において記載されているＢＭＰ−１０アゴニスト）を投与することを含み、それによって、疾患または障害を治療または防止する。被験者は、例えば、疾患または障害を患っている哺乳類（例えば、ヒト）であることができる。いくつかの実施態様において、投与されるＢＭＰ−１０アゴニストの総量または投与量は、例えば、被験者に対する投与の前に、上述したＢＭＰ−１０生物活性の一つ以上を増加または刺激するために必要とするＢＭＰ−１０アゴニストの量を試験することによって、決定されることができる。その方法は、任意に、障害または疾患に関連する一つ以上の症状を有する危険性のある、または、有している被験者を確認（例えば、評価、診断、スクリーニングおよび／または選択）するステップを含むことができる。
【００３３】
もう一つの実施態様において、本発明は、血管（例えば、内皮、平滑筋）、腎臓および／または心臓、細胞または組織または線維形成の組織における、ＢＭＰ−１０モジュレータ（例えば、ＢＭＰ−１０発現および／または活性のアゴニストまたはアンタゴニスト）を提供する。例えば、ＢＭＰ−１０アンタゴニスト（例えば、抗ＢＭＰ−１０または抗ＢＭＰ−１０レセプターの抗体、ＢＭＰ−１０プロペプチド、可溶性のＢＭＰ−１０レセプター（例えば、ＢＭＰ−１０レセプター））；または、ＢＭＰ−１０アゴニストは、本明細書において開示される方法を用いて、確認および／または生成されることができる。ＢＭＰ−１０モジュレータを含む組成物（例えば、医薬品組成物）もまた、開示される。組成物（例えば、医薬品組成物）がさらに、第２の治療薬（例えば、本明細書において記載されている第２の治療薬）を含むことができることを付記しておく。
【００３４】
血管および／または心臓の、本明細書において記載されている障害または疾患を治療するために用いるために、ＢＭＰ−１０モジュレータを含むパッケージされた医薬品組成物もまた、本発明によっても含まれる。任意に、パッケージされた医薬品組成物は、ラベルを付され、および／または、本明細書において記載されている血管、腎臓、線維症、および／または、心臓の疾患または障害を治療するために用いるための、いくつかの説明書を含む。
【００３５】
もう一つの実施態様においては、本発明は、ＢＭＰ−１０結合試薬（例えば、抗体分子）、結合領域融合変異体、ＢＭＰ−１０ポリペプチドまたはその断片またはＢＭＰ−１０をコード化している核酸に、相互作用するか、または、より好ましくは、特異的に結合するアンチセンス核酸分子を特徴とする。一の実施態様において、抗体分子または結合領域融合変異体は、哺乳類（例えば、ヒト）のＢＭＰ−１０ポリペプチドまたはその断片と結合する。一の実施態様において、抗体分子は、以下に位置するエピトープと結合する：プレ・プロＢＭＰ−１０ポリペプチド（例えば、図２（配列番号２）のアミノ酸約１〜４２４）；成熟したＢＭＰ−１０ポリペプチド（例えば、図２（配列番号２）の中で、アミノ酸約３１４〜４２４、３１４〜３２５、３２５〜３３５、３３５〜３４５、３４５〜３５５、３５５〜３６５、３６５〜３７５、３７５〜３８５、３８５〜３９５、３９５〜４０５、４０５〜４１５、４１５〜４２４；ＢＭＰ−１０シグナル配列（例えば、図２（配列番号２）のアミノ酸約１〜２１）；および／またはＢＭＰ−１０プロペプチド領域（例えば、図２（配列番号２）の中で、アミノ酸約２２〜４２４、２２〜３１３、２２〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１００〜１１０、１１０〜１２０、１２０〜１３０、１３０〜１４０、１４０〜１５０、１５０〜１６０、１６０〜１７０、１７０〜１８０、１８０〜１９０、１９０〜２００、２００〜２１０、２１０〜２２０、２２０〜２３０、２３０〜２４０、２４０〜２５０、２５０〜２６０、２６０〜２７０、２７０〜２８０、２８０〜２９０、２９０〜３００、３００〜３１０）。一の実施態様において、抗体分子または結合領域融合変異体は、一つ以上のＢＭＰ−１０に関連する活性（例えば、本明細書において記載されている活性）を変調、例えば、同調または拮抗する。
【００３６】
一の実施態様では、本発明は、ヒトＢＭＰ−１０タンパク質と特異的に結合する抗体分子または結合領域融合変異体を提供する方法を特徴とする。その方法は、：ヒトＢＭＰ−１０タンパク質またはその断片（例えば、本明細書において記載されている少なくとも一部のＢＭＰ−１０タンパク質からなる抗原）を提供すること；ヒトＢＭＰ−１０タンパク質またはその断片と特異的に結合する抗体分子または結合領域融合変異体を得ること；そして、抗体分子または結合領域融合変異体がヒトＢＭＰ−１０タンパク質に特異的に結合するかどうかを評価すること、または、ヒトＢＭＰ−１０タンパク質の活性を変調、例えば、抑制することにおける、抗体分子または結合領域融合変異体の有効性を評価すること；を含む。その方法は、被験者（例えば、ヒトまたはヒト以外の動物）に抗体分子を投与することを更に含むことができる。
【００３７】
もう一つの実施態様においては、本発明は、試験サンプルにおいて、ＢＭＰ−１０関連の疾患、例えば、血管および／または心臓の疾患（例えば、本明細書において記載されている疾患）を評価、診断および／または進行をモニターする方法を特徴とする。その方法はＢＭＰ−１０またはＢＭＰ−１０関連の遺伝子から選択される核酸またはポリペプチドの発現または活性を評価することを含み、対照サンプル（例えば、通常の被験者から、または、処理の前に得られたサンプル）に対する核酸の濃度の違いは、疾患の存在または進行を示す。実施態様において、ＢＭＰ−１０関連の核酸またはポリペプチドは、ＢＭＰ−１０に応答して変えられた発現によって特徴づけられる。典型的なＢＭＰ−１０関連の遺伝子は、これに限定されるものではないが、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−１０、エンドグリン、抑制性Ｓｍａｄ（例えば、Ｓｍａｄ６および／または７）；およびプロ血管形成遺伝子（例えば、ＶＥＧＦ、ＩＤ１およびＩＤ２）を含む。ある実施態様では、対照サンプルに対する試験サンプルのＢＭＰ−１０またはＢＭＰ−１０関連の遺伝子のレベルの増加は、ＢＭＰ−１０機能の拮抗作用が望ましいＢＭＰ−１０疾患（例えば、本明細書において記載されている、血管、腎臓、線維症および／または心臓の疾患）の診断と関係している。他の実施態様において、対照サンプルに対する試験サンプルのＢＭＰ−１０またはＢＭＰ−１０関連の遺伝子のレベルの減少は、ＢＭＰ−１０機能の同調性が望ましい、ＢＭＰ−１０の血管および／または心臓の疾患の診断と関係している。
【００３８】
一の実施態様において、評価ステップは、インビトロまたはエクスビボで行われる。例えば、サンプル（例えば、血清サンプル）は、被験者から得られる。
【００３９】
もう一つの実施態様において、評価ステップは、インビボで行われる。例えば、被験者にＢＭＰ−１０またはＢＭＰ−１０に関連する核酸またはポリペプチドと相互作用する検出可能にラベルをつけられた薬剤を投与することにより、そうすると、シグナルは、核酸またはポリペプチドの活性または発現のレベルと関連して発生する。
【００４０】
さらに他の実施態様では、本発明は、内皮細胞または血管機能を調整する化合物（例えば、テスト化合物）を確認する方法または分析法を提供する。その方法または分析法は、(i)（選択的に）ＢＭＰ−１０またはＢＭＰ−１０レセプターに相互作用、例えば、結合するテスト試薬を提供または確認すること、および／または、(ii)対照（例えば、対照サンプル）に対して、試験試薬の存在下、内皮細胞または維管束組織の活性の変化を評価することを含む。
【００４１】
テスト化合物は、抗体分子、ペプチド、可溶なＢＭＰ−１０レセプターまたはその融合体、結合領域融合変異体、低分子（例えば、コンビナトリアルまたは天産物ライブラリの一つ）、核酸、アンチセンス分子、リボザイム、ＲＮＡｉであることができる。一の実施態様において、テスト化合物は、ＢＭＰ−１０またはＢＭＰ−１０レセプター・ポリペプチドまたは核酸の活性または発現を調整（例えば、減少または増加）する。例えば、ＢＭＰ−１０またはＢＭＰ−１０レセプターの核酸の発現は、例えば、ｍＲＮＡ転写、ｍＲＮＡ安定性などを変えることによって、変調されることができる。
【００４２】
実施態様において、評価ステップは、テスト化合物を有し、ＢＭＰ−１０またはＢＭＰ−１０レセプター・ポリペプチド（例えば、本明細書において記載されているＢＭＰ−１０またはＢＭＰ−１０レセプター）またはＢＭＰ−１０またはＢＭＰ−１０レセプターをコード化している核酸の一つ以上と接触させること、および、所定レベル、例えば、テスト化合物の非存在下のコントロールサンプルと比較して、テスト化合物の存在下、ＢＭＰ−１０またはＢＭＰ−１０レセプター・ポリペプチドまたは核酸の一つ以上の活性の変化を評価することを含む。接触ステップは、インビトロ（培養細胞、例えば、ＨＵＶＥＣＳまたはＨＡＥＣＳまたは再構成されたシステムにおいて）またはインビボ（例えば、非ヒト被験者、例えば、ＢＭＰＲ２またはＮＫＸ２−５遺伝子の突然変異を有する動物モデルにテスト化合物を投与することによって）において有効である。テスト化合物の接触ステップおよび／または投与は、繰り返されることができる。
【００４３】
実施態様において、以下の一つ以上において、対照、例えば、対照サンプル（例えば、テスト化合物にさらされないコントロールサンプル）と対比して、テスト化合物の存在下の変化を測定することによって、内皮細胞または維管束組織の活性の変化は評価される：(i) Ｓｍａｄタンパク質のリン酸化（例えば、Ｓｍａｄ１、５および／または８のリン酸化）、(ii) ミオスタチン、エンドグリンおよび／または抑制性Ｓｍａｄの遺伝子発現（例えば、Ｓｍａｄ６および／または７の発現の誘導）、(iii) 一つ以上のプロ血管形成遺伝子（例えば、ＶＥＧＦ、ＩＤ１およびＩＤ２）の発現、(iv) Ｒａｓ関連タンパク質−１ａ（Ｒａｐ１ａ）の発現、(v) 図22-28において確認されるインビトロまたはインビボにおける内皮細胞のＢＭＰ−１０刺激に応答する一つ以上の遺伝子の発現、(vi) ストロマ由来分化因子（ＳＤＦ−１）および／またはマトリックスメタロペプチダーゼ９（ＭＭＰ−９）の血清レベル、および／または、(vii)血管の異常、例えば、血管形成異常、大量出血、毛細管拡張症および／または動静脈奇形。実施態様において、(i)から(iii)および(vi)の一つ以上の減少、おおよび、(iv)の増加は、ＢＭＰ−１０の機能のアンタゴニストを表し、そして、このようにして、ＢＭＰ−１０の拮抗作用が望ましい、血管および／または心臓の疾患の治療の候補を表す。
【００４４】
ある実施態様では、テスト化合物、ＢＭＰ−１０またはＢＭＰ−１０レセプターの間の相互作用は、評価される。実施態様において、このような相互作用は、テスト化合物とＢＭＰ−１０および／またはＢＭＰ−１０レセプターの間の複合体の形成および／または安定性の変化を検出することによって評価されることができ、以下の一つ以上を検出することによって決定されることができる。：例えば、生化学検出、親和性に基づく検出（例えば、ウエスタンブロット、親和性カラム）、免疫沈降法、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）に基づく分析法、分光測光的な手法（例えば、円偏光二色性、吸収度および溶液特性の他の測定値）による複合体自体の結合または物理的形成における変化；シグナル形質導入（例えば、Ｓｍａｄｓのリン酸化および／またはＢＭＰ−１０関連の遺伝子の転写活性）における変化、例えば、増加または減少；ストロマ由来の分化要因（ＳＤＦ−１）および／またはマトリックスメタロペプチダーゼ９（ＭＭＰ−９）の血清濃度の変化、例えば、増加または減少；および／または、(vii)血管の異常（例えば、血管形成異常、大量出血、毛細管拡張症および／または動静脈奇形）の変化、例えば、増加または減少。
【００４５】
一の実施態様において、テスト化合物は、同じまたは異なる分析法において確認されて、再テストされる。例えば、テスト化合物は、インビトロであるか無細胞系で確認され、動物モデルまたは細胞に基づく分析において再テストされる。分析の任意の順序または組合せが、使われることができる。例えば、高いスループット分析法が、動物モデルまたは組織培養との組合せで用いられることができる。
【００４６】
他の実施態様において、その方法または分析法は、ほぼ依存するシグナル生成、例えば、第１の融合タンパク質（例えば、ＢＭＰ−１０部からなる融合タンパク質）および第２の融合タンパク質（例えば、ＢＭＰ−１０レセプターからなる融合タンパク質）を含む２複合型分析に基づくステップを提供すること、前記２複合型分析法が複合体の形成または安定性の変化を検出する、例えば、複合体の形成がリポーター遺伝子の転写活性化を開始する条件下、２複合型分析法をテスト化合物に接触させることを含む。
【００４７】
さらに他の実施態様では、本発明は、本明細書において開示される複合体のＢＭＰ−１０またはＢＭＰ−１０レセプター・ポリペプチド成分の一つ以上をコード化している一つ以上の核酸からなる宿主細胞を提供する。
【００４８】
本明細書で用いられる、冠詞「ａ」および「ａｎ」は、冠詞の文法の対象のうちの１つ以上（例えば、少なくとも１つ）を指す。
【００４９】
用語「ｏｒ」は、明らかにそれ以外を意味しない限り、本明細書において、「ａｎｄ／ｏｒ」を意味するために用いられるか、それと交換可能に用いられる。
【００５０】
用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、本明細書において、交換可能に用いられる。
【００５１】
「およそ」および「約」は、通常、測定値の性質または精度を与えられて計量される数の誤差の許容できる程度を意味する。誤差の典型的な程度は、所与の値または値の範囲の２０パーセント（％）以内、典型的には、１０％以内、そして、より典型的には、５％以内である。
【００５２】
本明細書において記載のすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、それらの全部において引用したものとする。
【００５３】
本発明の他の特徴、目的および効果は、詳細な説明および図面から、そして、特許請求の範囲から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１は、ヒトＢＭＰ−１０プレプロ・タンパク質をコード化している核酸配列を示す（配列番号１、１５８４ｂｐ）。
【図２】図２は、ヒトＢＭＰ−１０プレプロ・タンパク質アミノ酸配列を示す（配列番号２、４２４アミノ酸）。
【図３】図３Ａ―３Ｃは、ヒト・アクチビンＡレセプターTypeII様前駆体タンパク質（また、本明細書において、「ＡＬＫ１」とも称される）をコード化している核酸配列を示す（配列番号３、４２６３ｂｐ）。図３Ｄは、ヒト・アクチビンＡレセプターTypeII様の１つの前駆体タンパク質（ＡＬＫ１）のアミノ酸配列を示す（配列番号４、５０３アミノ酸）。
【図４】図４Ａ−４Ｂは、ヒトＢＭＰ−１０レセプターType1A前駆体タンパク質（また、本明細書において、「ＡＬＫ３」とも称される）をコード化している核酸配列を示す（配列番号５、３６３１ｂｐ）。図４Ｃは、ヒトＢＭＰ−１０レセプターType 1A前駆体タンパク質（ＡＬＫ３）のアミノ酸配列を示す（配列番号６、５３２アミノ酸）。
【図５】図５Ａは、ヒトＡｃｔＲＩＩｂ−Ｆｃ融合タンパク質（配列番号１７）をコード化している核酸配列を示す。Ｇｐ１ｂシグナル配列をコード化している核酸配列は、下線を引かれる。ヒトＡｃｔＲＩＩｂ細胞外領域に対応するアミノ酸約１７〜１３３をコードする核酸配列は、ヒトＩｇＧ１Ｆｃをコード化している配列に融合する。ヒトＩｇＧ１  Ｆｃをコード化している核酸配列は、イタリックに示される。図５Ｂは、ヒトＡｃｔＲＩＩｂ−Ｆｃ融合タンパク質アミノ酸配列を示す（配列番号１８）。Ｇｐ１ｂシグナル・ペプチド配列は、下線を引かれる。ヒトＡｃｔＲＩＩｂ細胞外領域に対応する約アミノ酸１７〜１３３のアミノ酸配列は、ヒトＩｇＧ１Ｆｃに融合する。ＩｇＧ１  Ｆｃのアミノ酸配列は、イタリックに示される。
【図６】図６Ａ−６Ｂは、ヒトＳＭＡＤファミリーメンバー６（ＳＭＡＤ６）タンパク質をコード化している核酸配列を示す（配列番号１６、２９１２ｂｐ）。
【図７】図７Ａは、ヒト成人組織のヒトＢＭＰ−１０ｍＲＮＡの発現のノーザンブロット解析を示す。図７Ｂは、ヒトＢＭＰ−１０によって探索される複数のヒト組織ｍＲＮＡ発現ドットブロットのための解釈指針を示す。図７Ｃは、ヒトＢＭＰ−１０によって探索される複数のヒト組織発現ｍＲＮＡドットブロットの結果を示す。
【図８】図８は、マウスのＢＭＰ−１０過剰発現の後、全動物の全体の解剖を示す。
【図９】図９は、マウスのＢＭＰ−１０過剰発現の後、ＡｄＢＭＰ−１０マウスのマウス脳解剖を示す。
【図１０】図１０は、ＡｄＢＭＰ−１０およびコントロールマウスの脳のインビボ組織病理学的な研究を示す。
【図１１】図１１は、ＡｄＢＭＰ−１０およびコントロールマウスの肝臓のインビボ組織病理学的な研究を示す。
【図１２】図１２は、ＡｄＢＭＰ−１０およびコントロールマウスのための終末の体重を示す。
【図１３】図１３は、ＡｄＢＭＰ−１０およびコントロールマウスの脾臓、肝臓および胸腺のための終末の器官の重量を示す。
【図１４】図１４Ａ−１４Ｂは、ＡｄＢＭＰ−１０およびコントロールマウスのＡＳＴ、ＡＬＰおよびＡＬＴの血清化学の変化のデータを示す。
【図１５】図１５Ａ−１５Ｂは、ＡｄＢＭＰ−１０およびコントロールマウスの差分の血清化学研究を示す。
【図１６】図１６は、Ｒ−Ｓｍａｄ１、５、８リン酸化を経てインビトロで内皮細胞のＢＭＰ−１０活性化の時間過程を示している免疫ブロットを示す。
【図１７】図１７は、インビトロにおける内皮細胞において抑制性Ｓｍａｄｓ６および７のＢＭＰ−１０誘導を示している定量的なＰＣＲ結果を示す。
【図１８】図１８は、抗ＢＭＰ−１０プロ抗体によって探索される、調整された培養基のＢＭＰ−１０の存在を示している免疫ブロットを示す。
【図１９】図１９は、Ｒ−Ｓｍａｄ１、５、８リン酸化を経て、インビトロにおける腎臓上皮細胞のＢＭＰ−１０活性化を示している免疫ブロットを示す。
【図２０】図２０は、可溶なＡＬＫ１および可溶なＡｃｔＲＩＩＢによる腎臓上皮細胞のＢＭＰ−１０シグナリングの抑制を示している免疫ブロットを示す。
【図２１】図２１は、脂肪細胞分化のさまざまなステージで、Ｒ−Ｓｍａｄ １、５、８リン酸化を経て、インビトロにおけるマウス線維芽細胞のＢＭＰ−１０活性化を示している免疫ブロットを示す。
【図２２】図２２は、インビトロにおけるヒト臍静脈内皮細胞および大動脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣＳおよびＨＵＡＥＣＳ）の両方の３０分のＢＭＰ−１０処置に応答する差分の遺伝子発現の全体的な遺伝子発現分析を示す。
【図２３】図２３Ａ−２３Ｄは、インビトロにおけるヒト臍静脈内皮細胞および大動脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣＳおよびＨＵＡＥＣＳ）の両方の６０分のＢＭＰ−１０処置に応答する差分の遺伝子発現の全体的な遺伝子発現分析を示す。
【図２４】図２４Ａ−２４Ｄは、インビトロで５時間のヒト腎臓近位尿細管上皮細胞のＢＭＰ−１０処理に応答する差分の遺伝子発現の全体的な遺伝子発現分析を示す。
【図２５】図２５Ａ−２５Ｅは、インビトロで１７時間のヒト腎臓近位尿細管上皮細胞のＢＭＰ−１０処理に応答する差分の遺伝子発現の全体的な遺伝子発現分析を示す。
【図２６】図２６Ａ−２６Ｂは、注射後３日目のＡｄＢＭＰ−１０マウスの心臓組織の差分の遺伝子発現の全体的な遺伝子発現分析を示す。図２６Ｃ−２６Ｌは、注射後７日目のＡｄＢＭＰ−１０マウスの心臓組織の差分の遺伝子発現の全体的な遺伝子発現分析を示す。
【図２７】図２７Ａ−２７Ｄは、注射後３日目のＡｄＢＭＰ−１０マウスの筋組織の差分の遺伝子発現の全体的な遺伝子発現分析を示す。図２７Ｅ−２７Ｔは、注射後７日目のＡｄＢＭＰ−１０マウスの筋組織の差分の遺伝子発現の全体的な遺伝子発現分析を示す。
【図２８】図２８Ａ−２８Ｄは、注射後３日目のＡｄＢＭＰ−１０マウスの脂肪組織の差分の遺伝子発現の全体的な遺伝子発現分析を示す。
【図２９】図２９は、ＡｄＢＭＰ−１０マウスのＳＤＦ−１およびＭＭＰ９の血清変化を示しているＥＬＩＳＡ分析結果を示す。
【００５５】
さまざまな図面の参照符号の同類は、要素の同類を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
（詳細な説明）
本発明は、少なくとも一つには、骨形態形成タンパク質−１０（ＢＭＰ−１０）のインビボ過剰発現が、遺伝性出血性毛細管拡張症（ＨＨＴ）と類似の表現型をもつ動物モデルにおいて、脳と肝臓の根深い皮下血管形成異常という結果になったという発見に基づく。ＢＭＰ−１０を過剰発現させている動物は、また、広範囲にわたるうっ血および拡散した出血、および、脳、肝臓および肺の拡大した血管を含む、血管恒常性を調整する際のＢＭＰ−１０の機能と整合した多くの生理的異常を提示した。マウスのＢＭＰ−１０過剰発現に応答する転写プロファイリング研究は、筋肉の成長のレギュレーター（例えば、ミオスタチン、プロ血管形成タンパク質（例えば、ＶＥＧＦおよびＩＤ１）の上流制御および脂肪および心臓の抑制性Ｓｍａｄｓ）の遺伝子発現の広範囲にわたる変化を示した。これらの結果は、ＢＭＰ−１０シグナル形質導入カスケードの上流制御と整合している。
【００５７】
さらに、心臓および血管機能を調整する際のＢＭＰ−１０の役割を裏づけるために、ＢＭＰ−１０は、主要なヒト大動脈内皮細胞および主要なヒト臍静脈内皮細胞において、細胞のシグナル現象および遺伝子発現を活性化することが示された。例えば、これらの細胞におけるＢＭＰ−１０シグナリングの活性化は、Ｓｍａｄｓ（例えば、Ｓｍａｄ １、５および８）のリン酸化を増加させて、抑制性Ｓｍａｄ６および７の発現を誘発することが示された。
【００５８】
他の実施態様において、ＢＭＰ−１０は、インビトロの腎臓細胞（例えば、ヒトの主要な腎臓近位尿細管上皮細胞）において、一つ以上のシグナリング経路および遺伝子発現を活性化することが示された。出願人は、肝臓、肺、腎臓および心臓を含む、さまざまな器官および組織の線維症とＢＭＰ−１０の関連性を更に発見した。
【００５９】
従って、本発明は、ＢＭＰ−１０アゴニストおよびアンタゴニストを用いて、血管（例えば、内皮、平滑筋）、腎臓および／または心臓の細胞機能を調整する方法および組成物を提供する。特に、ＢＭＰ−１０関連の血管、腎臓、線維形成および／または心臓の障害および／または疾患を治療、予防および／または診断する方法が開示される。ＢＭＰ−１０モジュレータ（例えば、アゴニストおよびアンタゴニスト）を評価するスクリーニング方法も開示される。
【００６０】
本発明がより容易に理解されることができるために、特定の用語は最初に定められる。
追加的な定義は、詳細な説明の全体にわたって記載される。
【００６１】
ＴＧＦスーパーファミリー（例えば、ＢＭＰ−１０）のメンバーは、ここでは「プレ・プロペプチド」と記載され、そのＮ末端（例えば、ヒトＢＭＰ−１０のアミノ酸約１〜２１（図２；配列番号２））でシグナル配列を含み、通常、大きな前駆体としてコード化され、二塩基性アミノ酸切断部位およびプロペプチド（次に、他の二塩基性のアミノ酸切断部位および成熟した領域が続く）に続く。従って、プロペプチドまたはプロ領域は、成熟した領域へのＮ末端およびシグナル・ペプチドへのＣ末端の部分である。例えば、ヒトＢＭＰ−１０は、４２４のアミノ酸タンパク質を、プロペプチド領域（例えば、図２（配列番号２）のアミノ酸２２〜３１３からの約２９１のアミノ酸）およびモノマー（例えば、図２（配列番号２）のアミノ酸約３１４〜４２４からの）当たり、約１１０のアミノ酸残基の成熟した領域に分ける切断部位を有する。成熟したＢＭＰ−１０タンパク質は、通常、ＴＧＦファミリーメンバーの中に見つかる６〜７つのシステインの空間的に保存されたパターンを有する。成熟したＢＭＰ−１０領域は、通常、種の中で高度に保存される。
【００６２】
「骨形態形成タンパク質−１０」または「ＢＭＰ−１０」は、ＢＭＰ−１０活性（ＢＭＰ−１０レセプター（通常は、哺乳類、例えば、ネズミまたはヒトのＢＭＰ−１０レセプター）を保持するそれらの任意の変異体（変異体、断片および疑似ペプチドを含む）と同様に、任意の種（通常は、哺乳類、例えば、ネズミ、ヒト、非ヒトの霊長類起源）からのトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ）ファミリーのメンバーを指す。通常は、ＢＭＰ−１０は本明細書において記載されている生物活性を有し、そして、以下のうちの１つは以下を特徴とする：(i) 天然に存在する哺乳類のＢＭＰ−１０ポリペプチドまたはその断片のアミノ酸配列（例えば、ＢＭＰ−１０の熟成したまたはプロペプチドの形態）、例えば、図２（配列番号２）（ヒト）として示されるアミノ酸配列またはその断片（例えば、図２（配列番号２）（成熟した）のアミノ酸約３１４〜４２４）；(ii) 図２（配列番号２）（ヒト）として示されるアミノ酸配列またはその断片（例えば、図２（配列番号２）（成熟した）のアミノ酸約３１４〜４２４）に、実質的に同一な、例えば、８５％、９０％、９５％、９８％で同一なアミノ酸配列；(iii) 自然に生じる哺乳類のＢＭＰ−１０のヌクレオチド配列またはその断片（例えば、図１（配列番号１）（ヒト）またはその断片）によってコード化されたアミノ酸配列；(iv) 図１（配列番号１）（ヒト）として示されるヌクレオチド配列またはその断片に、実質的に同一な、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％で同一なヌクレオチド配列によってコード化されるアミノ酸配列；(v) 自然に生じるＢＭＰ−１０ヌクレオチド配列またはその断片、例えば、図１（配列番号１）（ヒト）またはその断片に変質するヌクレオチド配列によってコード化されたアミノ酸配列；または、(vi) ストリンンジェントな条件で、例えば、高度にストリンンジェントな条件で、前述のヌクレオチド配列のうちの１つにハイブリダイズするヌクレオチド配列。
【００６３】
用語「ＢＭＰ−１０プロペプチド」は、有用な活性を保持するその変異体（例えば、変異体、断片および疑似ペプチドの形態を含む）と同様に、ＢＭＰ−１０ファミリーメンバーの任意の天然に存在するプロペプチドからなるポリペプチドを指す。いくつかの実施態様において、本明細書において開示されるＢＭＰ−１０プロペプチドは、成熟したＢＭＰ−１０のアンタゴニストとして用いられる。その用語が本明細書において使われるとき、ＢＭＰ−１０プロペプチドは、ＢＭＰ−１０プロペプチドの断片、機能的な変異体および改変された形態を含む。一の実施態様において、ＢＭＰ−１０プロペプチドは、図２（配列番号２）のアミノ酸２２〜３１３のアミノ酸配列またはその部分を含むが、全長の成熟したＢＭＰ−１０配列を含まない。ＢＭＰ−１０プロペプチドは、その同族の成熟した領域の５０、４０、３０、２０、１０または５アミノ酸より少数を含むことができる。例えば、ＢＭＰ−１０プロペプチドの機能的な変異体は、成熟したＢＭＰ−１０タンパク質への結合および／またはＢＭＰ−１０レセプターへのＢＭＰ−１０の結合を競合的に阻害する能力によって特徴づけられることができる。
【００６４】
本明細書で用いられる場合、「骨形態形成タンパク質−１０レセプター」または「ＢＭＰ−１０レセプター」という用語は、ＢＭＰ−１０に結合し、細胞（例えば、内皮細胞）のシグナルを変換することができる任意の種からのレセプターを指す。ＢＭＰ−１０レセプターの例は、エンドグリン、アクチビンＡレセプターType-II様１前駆体タンパク質（また、本明細書において「ＡＬＫ１」として示される、図３；配列番号３および４として本明細書においてそれぞれ表されるヌクレオチドおよびアミノ酸配列）、および、ヒトＢＭＰ−１０レセプターType 1A前駆体タンパク質（また、本明細書において「ＡＬＫ３」として示され、図４Ａ−４Ｃ；配列番号５および配列番号６としてそれぞれ本明細書において表されるヌクレオチドおよびアミノ酸配列）を含む。ＢＭＰ−１０レセプターの活性化は、通常は、Ｓｍａｄタンパク質のリン酸化（例えば、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ３、Ｓｍａｄ５またはＳｍａｄ８の一つ以上のリン酸化）および遺伝子転写現象という結果になる。
【００６５】
通常は、ＢＭＰ−１０レセプターは本明細書において記載されている生物活性、および／または、以下の特徴のうちの１つを有する：(i) 天然に存在する哺乳類のＢＭＰ−１０レセプター・ポリペプチドまたはその断片のアミノ酸配列、例えば、図３Ｄ（配列番号４）（ヒトＡＬＫ―１）または図４Ｃ（配列番号６）（ヒトＡＬＫ３）として示されるアミノ酸配列またはその断片（例えば、図３Ｄ（配列番号４）のアミノ酸約２２―１１８、または、図４Ｃ（配列番号６）（細胞外領域）のアミノ酸約２４〜１５２）；(ii) 図３Ｄ（配列番号４）（ヒトＡＬＫ―１）または図４Ｃ（配列番号６）（ヒトＡＬＫ３）として示されるアミノ酸配列またはその断片（例えば、図３Ｄ（配列番号４）のアミノ酸約２２―１１８または図４Ｃ（配列番号６）（細胞外領域）のアミノ酸約２４〜１５２）に、実質的に同一、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％で同一なアミノ酸配列；(iii) 自然に生じる哺乳類のＢＭＰ−１０レセプターのヌクレオチド配列またはその断片によってコード化されたアミノ酸配列（例えば、図３Ａ−３Ｃ（配列番号３）（ヒトＡＬＫ１）または図４Ａ−４Ｂ（配列番号５）（ヒトＡＬＫ３）またはその断片）；(iv) 図３Ａ−３Ｃ（配列番号３）（ヒトＡＬＫ１）または図４Ａ−４Ｂ（配列番号５）（ヒトＡＬＫ３）として示されるヌクレオチド配列に、実質的に同一な、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％で同一なヌクレオチド配列によってコード化されるアミノ酸配列；(v) 自然に生じるＢＭＰ−１０ヌクレオチド配列またはその断片（例えば、図３Ａ−３Ｃ（配列番号３）（ヒトＡＬＫ１）または図４Ａ−４Ｂ（配列番号５）（ヒトＡＬＫ３））を変質するヌクレオチド配列によってコード化されたアミノ酸配列；または、(vi) ストリンジェントな条件、例えば、高度にストリンジェントな条件で、前述のヌクレオチド配列のうちの１つにハイブリダイズするヌクレオチド配列。
【００６６】
本明細書で用いられる場合、「可溶なＢＭＰ−１０レセプター・ポリペプチド」は、それ自体を膜に固定することができないＢＭＰ−１０レセプター・ポリペプチドである。このような可溶なポリペプチドは、例えば、そのポリペプチドを固定するために膜に及んでいる領域の中で充分な部分を欠如するか、または、膜に及んでいる領域が機能しないように修正された、本明細書において記載したＢＭＰ−１０レセプター・ポリペプチドを含む。通常、可溶なＢＭＰ−１０レセプター・ポリペプチドは、ＢＭＰ−１０と結合する能力を保持する。例えば、ＢＭＰ−１０レセプター・ポリペプチドの可溶性の断片（例えば、ヒトＡＬＫ−１の細胞外領域、または、図３Ｄ（配列番号４）のアミノ酸約２２−１１８からのＡＬＫ含んでいるアミノ酸配列からなるＢＭＰ−１０レセプターの断片）；図４Ｃ（配列番号６）のアミノ酸約２４〜１５２；または、アクチビン・レセプターＩＩＢ（ＡｃｔＲＩＩＢ）の可溶性の断片（例えば、図５Ｂ；配列番号１８のアミノ酸約１７〜１３３を含む）。さらに、可溶なＢＭＰ−１０レセプター・ポリペプチドは、第２の部分、例えば、ポリペプチド（例えば、免疫グロブリン鎖、ＧＳＴ、レックス−ＡまたはＭＢＰポリペプチド配列）を含む、例えば、融合することができる。例えば、融合タンパク質は、少なくともＢＭＰ−１０レセプター・ポリペプチドの断片を含むことができ、それはＢＭＰ−１０に結合することができ、第２の部分、例えば、ポリペプチド（例えば、免疫グロブリン鎖、Ｆｃ断片、以下を含むさまざまなアイソタイプの重鎖定常部：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤおよびＩｇＥ）に融合する。
【００６７】
ＢＭＰ−１０レセプター・ポリペプチドの用語「生物活性」は、成熟したＢＭＰ−１０タンパク質に対応する一つ以上の生物活性を指し、以下を含むが、これに限定されるものではない。；(1) ＢＭＰ−１０ポリペプチド（例えば、ヒトの成熟したＢＭＰ−１０ポリペプチド）との相互作用、例えば、結合；(2) Ｓｍａｄタンパク質のリン酸化および／または活性化（例えば、一つ以上のＳｍａｄ１、Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ３、Ｓｍａｄ５またはＳｍａｄ８のリン酸化）を刺激すること；(3) ＢＭＰ−１０関連遺伝子の増加または減少した転写；および／または、(4) 内皮および心臓の細胞の増殖、分化を調整すること、例えば、刺激すること、または、減少すること。
【００６８】
本発明の方法および組成物は、特定される配列を有しているか、または、その特定される配列と実質的に同一であるか類似する配列、例えば、特定される配列に、少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれ以上に同一である配列を有するＢＭＰ−１０およびＢＭＰ−１０レセプター・ポリペプチドおよび核酸を含む。アミノ酸配列の文脈において、「実質的に同一である」という用語は、i) それと同一の、または、ii) 第１および第２のアミノ酸配列が共通の構造領域および／または共通の機能的活性を有することができる第２のアミノ酸配列の整列配置されたアミノ酸残基の保守的な置換である、十分であるか最小限の数のアミノ酸残基を含む第一のアミノ酸を指すために本明細書において使われる。例えば、配列番号２、配列番号４または配列番号６に対して、少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する共通構造領域を含むアミノ酸配列は、実質的に同一であると称される。
【００６９】
核酸配列の文脈において、「実質的に同一である」という用語は、第１および第２の核酸配列が、共通の機能的活性を有するポリペプチドをコード化するか、あるいは、共通構造のポリペプチド領域または共通の機能を有するポリペプチドをコード化する第２の核酸配列の整列配置されたヌクレオチドと同一であるヌクレオチドの十分であるか最小限の数を含む第１の核酸配列を指すために、本明細書において使われる。例えば、配列番号１、３または５に対して、少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する核酸配列は、実質的に同一であると称される。
【００７０】
「機能的な変異体」という用語は、天然に存在する配列に実質的に同一のアミノ酸配列を有するか、または実質的に同一の核酸配列によってコード化され、そして、天然に存在する配列の一つ以上の活性を有することができるポリペプチドを指す。
【００７１】
配列の間の相同性の算出または配列の同一性（本明細書において、この用語は交換可能に用いられる）は、以下の通りに実行される。
【００７２】
２つのアミノ酸配列の、または、２つの核酸配列のパーセント同一性を決定するために、配列は、最適な比較のために整列配置される。（例えば、最適な配置のため、ギャップは第一および第二のアミノ酸の一方または両方または核酸配列において導かれることができ、そして、非相同性の配列は比較のために無視されることができる。）好ましい実施態様において、比較のために整列配置される対照配列の長さは、対照配列の長さの、少なくとも３０％、好ましくは、少なくとも４０％、より好ましくは、少なくとも５０％、６０％、および、さらにより好ましくは、少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。対応するアミノ酸位またはヌクレオチド位のアミノ酸残基またはヌクレオチドは、それから比較される。第１の配列の位置が第２の配列の対応する位置として同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められるとき、その分子はその位置で同一である（本明細書において使用するとき、アミノ酸または核酸の「同一性」は、アミノ酸または核酸の「相同性」に等しい。）。
【００７３】
２つの配列間のパーセント同一性は、配列によって共有される同一の位置の数の関数であり、それは、２つの配列の最適配列のために導かれることを必要とするギャップの数および各ギャップの長さを考慮している。
【００７４】
配列の比較および２つの配列間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成されることができる。好ましい実施態様において、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェア・パッケージ（http://www.gcg.comで利用できる）のＧＡＰプログラムに組み込まれた、ニードルマンおよびブンシュ((1970) J. Mol. Biol. 48:444-453 )アルゴリズムを使用して、Blossum 62 matrix またはPAM250 matrixのいずれか、および、１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重量および１、２、３、４、５、または６の長さ重量を使用して決定される。さらにもう一つの好ましい実施態様において、２つの核酸配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェア・パッケージ（http://www.gcg.comで利用できる）のＧＡＰプログラムを使用すること、NWSgapdna.CMP matrixおよび４０、５０、６０、７０、または８０のギャップ重量および１、２、３、４、５、または６の長さ重量を使用することによって決定される。パラメータ（そして、特記しない限り、使われなければならないもの）の特に好適なセットは、１２のギャップペナルティ、４のギャップ延長ペナルティ、および、５のフレームシフトギャップペナルティを有するマトリックスを記録しているBlossum 62である。
【００７５】
２つのアミノ酸または核酸配列の間のパーセント同一性は、ALIGN program (version 2.0)に組み込まれたＥ．メイヤーズおよびＷ．ミラー((1989) CABIOS, 4:11-17)のアルゴリズムを使用すること、ＰＡＭ１２０重量残基テーブル、１２のギャップ長さペナルティ、４のギャップペナルティを使用することによって決定されることができる。
【００７６】
本明細書において記載されている核酸およびタンパク質配列は、例えば、他のファミリーメンバーまたは関連配列を確認するために、公共データベースに対して検索を実行する「質問配列」として用いられることができる。このような検索は、Altschul, et al. (1990) J. Mol.Biol. 215:403-10のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム(version 2.0)を使用することによって実行されることができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明のＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター核酸（配列番号１）分子に相同性の核酸配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラムscore = 100, wordlength = 12によって実行されることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明のＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター（配列番号１）タンパク質分子に相同性のアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラムscore = 50, wordlength = 3によって実行されることができる。比較のためにギャップされた配列を得るために、Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に開示される、Gapped BLASTが利用されることができる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用するときに、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルト・パラメータが使われることができる。http://www.ncbi.nlm.nih.gov.参照。
【００７７】
本明細書で用いられる場合、「低いストリンジェント、中位のストリンジェント、高いストリンジェント、または非常に高いストリンジェントな条件でハイブリダイズする」という用語は、ハイブリッド形成および洗浄の条件を説明する。ハイブリダイゼーション反応を実行するためのガイダンスは、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6に見られることができ、それは、引用したものとする。水性および非水系の方法が、その参考文献に記載されていて、いずれも用いられることもできる。本明細書において紹介される特定のハイブリッド形成条件は、以下の通りである：１）約４５℃の６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）の低いストリンジェントなハイブリッド形成条件（０．２Ｘ  ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、少なくとも５０℃の２回の洗浄が続く）（洗浄の温度は、低いストリンジェントな条件のために５５℃に増やされることができる）；２）６Ｘ  ＳＳＣ、約４５℃の中程度のストリンジェントなハイブリッド形成条件（０．２Ｘ  ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、６０℃の一回以上の洗浄が続く）；３）６Ｘ  ＳＳＣ、約４５℃の高いストリンジェントなハイブリッド形成条件（０．２Ｘ  ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、６５℃の一回以上の洗浄が続く）；そして、好ましくは、４）非常に高いストリンジェンントなハイブリッド形成条件は、０．５Ｍのリン酸ナトリウム、７％のＳＤＳ、６５℃（０．２Ｘ  ＳＳＣ、１％のＳＤＳ、６５℃の一回以上の洗浄が続く）である。非常に高いストリンジェントな条件４）は、特記しない限り、用いられるべき好適な条件である。
【００７８】
本発明のＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター・アゴニストとアンタゴニストがさらに保守的であるか必須ではないアミノ酸の置換を有することができ、そして、それはそれらの機能に実質的な影響を及ぼさないものと理解される。
【００７９】
「保守的なアミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基と置き換えられるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基の一系統は、従来技術において明らかにされた。これらの系統は、塩基性の側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、電荷を帯びていない極性の側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、無極性の側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β枝分れ側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。
【００８０】
さまざまな本発明の実施態様は、下記に詳述される。
【００８１】
Ｉ．ＢＭＰ−１０関連の細胞機能の調節
本発明は、ＢＭＰ−１０機能を調整する方法を提供する（例えば、心臓、腎臓および／または血管細胞および／または組織または線維症組織または器官のＢＭＰ−１０の一つ以上の生物活性を調整することによって）。その方法は、ＢＭＰ−１０応答性の細胞および／または組織の機能（または細胞または組織のＢＭＰ−１０の生物活性）調整する（例えば、増減する）のに十分な量において、ＢＭＰ−１０モジュレータ、例えば、ＢＭＰ−１０のアゴニストまたはアンタゴニスト（例えば、ヒト成熟したＢＭＰ−１０またはＢＭＰ−１０プロペプチドのアゴニストまたはアンタゴニスト）活性または発現を有する細胞および／または組織と接触することを含む。用語「ＢＭＰ−１０応答性の細胞および／または組織」は、ＢＭＰ−１０に応答して、シグナルを変換すること、例えば、リン酸エステル化、遺伝子発現することができる任意の細胞および／または組織を指す。実施態様において、ＢＭＰ−１０応答性の細胞は、血管の細胞および／または組織（例えば、内皮および／または平滑筋の細胞または組織）である。他の実施態様において、ＢＭＰ−１０応答性の細胞および／または組織は、心臓の細胞および／または組織（例えば、心筋細胞）を含む。他の実施態様において、ＢＭＰ−１０応答性の細胞および／または組織は、腎細胞または組織を含む。更に他の実施態様において、ＢＭＰ−１０応答性の細胞は、線維症組織または器官（例えば、線維症皮膜、腎臓、肺、腸、肝臓、腹膜または心臓）を含む。本発明の方法および組成物を使用して調整されることができる典型的なＢＭＰ−１０活性は、これに限定されるものではないが、以下の一つ以上を含む。：(i) Ｓｍａｄタンパク質のリン酸エステル化（例えば、Ｓｍａｄ１、５および／または８のリン酸エステル化）；(ii) ミオスタチン、エンドグリンおよび／または抑制性Ｓｍａｄの遺伝子発現の誘導（例えば、Ｓｍａｄ６および／または７の発現の誘導）；(iii) プロ血管形成遺伝子（例えば、ＶＥＧＦ、ＩＤ１およびＩＤ２）の発現の増加；Ｒａｓ関連のタンパク質−１ａ（Ｒａｐ１ａ）の発現の減少；(v) 調整、例えば、図22-28で確認されたインビボまたはインビトロにおける内皮細胞のＢＭＰ−１０刺激に対する一つ以上の遺伝子の発現の増加；(vi) ストロマ由来の分化因子（ＳＤＦ―１）および／またはマトリックスメタロペプチダーゼ９（ＭＭＰ−９）の血清レベルの増加；および／または、(vii) 血管異常、例えば、血管異形成、大量出血、毛細管拡張症および／または動静脈奇形の増加。
【００８２】
本発明の方法は、例えば、インビボでの（例えば、治療上または予防上の）プロトコルの一部としての被験者、または、動物の被験者（例えば、例えば、インビボ動物モデル（例えば、心血管虚血モデルまたは遺伝子組換えモデル）、例えば、ＢＭＰレセプター（ＢＭＰＲ２）の突然変異を有する動物モデルまたはＮＫＸ２−５が欠損する動物）に存在する細胞（例えば、心筋細胞、内皮および／または平滑筋細胞）において実行されることができる。インビボでの方法のために、ＢＭＰ−１０モジュレータは、単独で、または、他の薬剤と併用して、ＢＭＰ−１０関連の（例えば、血管であるか心臓の）障害または疾患を患っている被験者（例えば、哺乳類）に、ＢＭＰ−１０機能、および／または、被験者の一つ以上のＢＭＰ−１０活性を調節するのに十分な量で投与されることができる。
【００８３】
実施態様において、ＢＭＰ−１０モジュレータは、治療上有効量において投与される。本明細書で用いられる場合、用語「治療上有効量」は、意味のある患者の利益、例えば、このような障害の症状の改良、治癒、または治癒率の増加を示すのに十分な、医薬組成物または方法の各活性成分の総量を意味する。個々の有効成分に適用され、単独で投与されるとき、その用語は、その成分を単独で指す。組み合わせに適用されるときに、その用語は、組み合わせて、連続的に、または、同時に投与されるかどうかにかかわらず、治療効果をもたらす有効成分の組合わされた量を指す。
【００８４】
本発明の処理または使用の方法を実施することにおいて、ＢＭＰ−１０−アゴニストまたはアンタゴニストの治療上有効量は、単独で、または、他の療法（例えば、治療）と組み合わせて投与されることができる。一つ以上の薬剤によって共同投与されるときに、ＢＭＰ−１０および／またはＢＭＰ−１０レセプター−モジュレータは第２の薬剤と同時に、または、順次投与されることもできる。順次投与される場合、主治医は他の薬剤と併用してＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター−アゴニストまたはアンタゴニストを投与する適切な順序を決定する。この文脈において、「共に」という用語は、薬剤が、実質的に同時期に、同時または順次、与えられることを意味する。第２の化合物の投与の開始で、順次与えられる場合、２つの化合物の第１のものは、好ましくは、治療の部位の有効濃度で検出可能である。
【００８５】
多くのＢＭＰ−１０生物活性のうちの１つの抑制、減少、または、さもなければ減退が要求される実施態様において、ＢＭＰ−１０応答性の細胞、例えば、血管（例えば、内皮、平滑筋）および／または心臓の細胞および／または組織は、例えば、被験者にＢＭＰ−１０アンタゴニストを投与することによって、ＢＭＰ−１０アンタゴニストに接触される。一の実施態様において、ＢＭＰ−１０アンタゴニストは、ＢＭＰ−１０またはＢＭＰ−１０レセプター（また、個々に、それぞれ、本明細書において、「ＢＭＰ−１０アンタゴニスト」および「ＢＭＰ−１０レセプターアンタゴニスト」と称される）に相互作用、例えば、結合し、そして、一つ以上のＢＭＰ−１０および／またはＢＭＰ−１０レセプター活性を低下または阻害する。典型的アンタゴニストは、ＢＭＰ−１０またはＢＭＰ−１０レセプターに、高親和性（例えば、少なくとも約107 M1、典型的には約108 M-1、そしてされに典型的には、約109 M-1 から 1010 M-1またはそれ以上の親和定数）で結合し、そして、内皮細胞および／または維管束組織の一つ以上のＢＭＰ−１０生物活性を低下および／または阻害する。本明細書で用いられる場合、本発明の方法に役立つ「ＢＭＰ−１０アンタゴニスト」または「ＢＭＰ−１０レセプターアンタゴニスト」は、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター・ポリペプチドの一つまたは生物活性を低下、阻害、または、減弱させる薬剤を指す。典型的には、アンタゴニストは、ＢＭＰ−１０/ＢＭＰ−１０／レセプター・ポリペプチドに相互作用、例えば、結合する。ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプターアンタゴニストに用いている拮抗作用が、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター・ポリペプチドの生物活性の完全な除去を必ずしも示すというわけではない。
【００８６】
したがって、本発明は、被験者において、ＢＭＰ−１０関連の（例えば、血管または心臓の）障害および／または疾患を治療または予防（例えば、治癒、改善、発症の遅延または防止、再発またはぶり返しの抑制）する方法を提供する。その方法は、被験者にＢＭＰ−１０アンタゴニスト（例えば、本明細書において記載されているＢＭＰ−１０アンタゴニスト）を、血管および／または心臓の細胞および／または組織の一つ以上のＢＭＰ−１０生物活性（例えば、本明細書において記載されている生物活性）を阻害するかまたは低下させるのに十分な量において、投与することを含み、このことにより、疾患または障害を治療または予防する。
【００８７】
ＢＭＰ−１０アンタゴニストが投与される被験者は、例えば、異常な血管（例えば、内皮および／または平滑筋）の細胞活性（本明細書において「ＢＭＰ−１０関連の血管の障害および／または疾患」と記載される）によって特徴づけられる障害および／または疾患を患う哺乳類（例えば、ヒト）であることができる。例えば、被験者は、以下の一つ以上から選択される障害または疾患を患っている哺乳類（例えば、ヒト患者）であえる。：遺伝性出血性毛細管拡張（ＨＨＴ）；腎炎症候群および腎症（例えば、糖尿病ネフロパシ）、網膜症（例えば、糖尿病性網膜症）、血管新生緑内障および他の糖尿病性血管障害；脳卒中、アテローム硬化、動脈硬化、末梢血管疾患、高血圧（例えば、肺性高血圧）、高脂血症、血栓症、再狭窄、慢性関節リウマチ、乾癬、血管腫、甲状腺の過形成（グレーブス病を含む）、角膜および他の組織移植および慢性炎症および後水晶体線維増殖。そのアンタゴニストは、望ましくない過剰な血管透過性（例えば、脳腫瘍、悪性を伴う腹水、メイグスの症候群、肺炎症、ネフローゼ症候群、心膜液（例えば、心外膜炎に伴うもの）および胸水を伴う水腫）によって特徴づけられる疾患の治療にも役立つ。
【００８８】
例えば、出願人は、マウスのＢＭＰ−１０の過剰発現によって遺伝性出血性毛細管拡張（ＨＨＴ）と類似の表現型が生じるということを発見した。ＨＨＴ（別名ランデュ―オスラー病）は、１０，０００人の約１人に影響を及ぼす常染色体優性血管の異常形成である(Johnson, D.W. et al. (1996) Nat. Genet. 13:189。ＨＨＴの臨床異常は、通常、毛細管床の介在のない直接の動静脈接続によって生じる。結果として生じる毛細管拡張は、口腔（例えば、唇および舌）、鼻、および指先に生じる。より大きい動静脈奇形（ＡＶＭ）は、肺、脳および肝臓において見られることもできる(Marchuk, D.A. et al. (2003) Hum. Mol. Genet. 12:R97-R112)。大部分のＨＨＴ症例は、エンドグリン（ＥＮＧ）またはＡＬＫ１遺伝子の突然変異によって生じる。最近、ＳＭＡＤ４の突然変異は、併発性若年性ポリープ症およびＨＨＴ症候群を有する症例にも記載されていた(Gallione, C.J. et al. (2006) J. Med. Genet. 43:793-797)。ＨＨＴ（ＥＮＧ、ＡＣＶＲＬ１およびＳＭＡＤ４）に関係している３つの遺伝子の各々は、ＴＧＦ族からのレセプターまたはシグナル伝達分子をコード化する。従って、添付の実施例は、論文と組み合わせて、ＨＨＴを治療するためのＢＭＰ−１０活性のアンタゴニストの利用を支持する。
【００８９】
ＢＭＰ−１０アンタゴニストは、さまざまな腫瘍性疾患の治療にとっても、有用であることができる。治療に従う腫瘍および関連した障害は、乳癌、肺癌腫、胃癌腫、食道癌、結腸直腸癌腫、肝臓癌腫、卵巣癌、卵胞膜細胞腫、男性胚細胞腫、子宮頸癌、子宮内膜癌、子宮内膜増殖症、子宮内膜症、線維肉腫、絨毛癌、頭部および頸部癌、上咽頭癌、喉頭癌腫、肝芽細胞腫、カポジ肉腫、黒色腫、皮膚癌、血管腫、海綿状血管腫、血管芽細胞部、膵臓癌腫、網膜芽細胞腫、神経膠星状細胞腫、グリア芽細胞腫、シュワン細胞腫、希突起膠細胞腫、髄芽細胞腫、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨原性肉腫、平滑筋肉腫、尿路癌腫、甲状腺癌、ウィルム腫瘍、腎癌、前立腺癌、母斑症と関連した異常な血管増殖およびメイグス症候群）を含む。
【００９０】
ＢＭＰ−１０アンタゴニストは、線維症障害または疾患の治療においても有用であることができる。線維症障害は、組織の損傷の後、線維症物質（例えば、細胞外基質）の異常なおよび／または過剰な蓄積によって特徴づけられる病的状態である。線維症障害は、皮膚、腎臓、肺、腸および肝臓を含む多くの組織および器官系と同様に、血管疾患（例えば心疾患、脳疾患および末梢血管疾患）に関連する線維増殖疾患を含む(Wynn, Nature Reviews 4:583-594 (2004))。線維症障害が症状の多様な群であるにもかかわらず、大部分の線維症障害のために、線維症組織の蓄積を導く通常のメカニズムが共通して多くの要素を備えていると思われている。
【００９１】
典型的な線維症障害は、以下を含むが、これに限定されるものではない。：(i) 肺または肺線維症、例えば、特発性肺線維症、放射線によって誘発された線維症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、強皮症、肺線維症、慢性喘息、ケイ肺症、アスベストによって誘発された肺線維症、急性肺損傷および急性呼吸窮迫（細菌性肺炎に誘発されるもの、外傷に誘発されるもの、ウイルス性肺炎に誘発されるもの、ベンチレータに誘発されるもの、非肺敗血症に誘発されるもの、および、吸引に誘発されるものを含む）；(ii) 腎臓線維症（これに限定されないが、損傷／線維症を伴う腎症、例えば、糖尿病（例えば、糖尿病ネフロパシ）、ループス、強皮症、糸球体腎炎、焦点性分節糸球体硬化症およびＩｇＡ腎症を伴う慢性腎症を含む）；(iii) 腸線維症、例えば、強皮症および放射線で誘発される腸線維症；(iv) 肝臓線維症、例えば、肝硬変、アルコールによって誘発された肝臓線維症、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、胆管導管損傷、原発性胆汁性肝硬変、感染またはウイルスに誘発された肝臓線維症（例えば、慢性ＨＣＶ感染）および自己免疫肝炎；(v) 頭頸部線維症、例えば、放射線で誘発されるもの；(vi) 角膜瘢痕、例えば、レーザー手術、角膜移植片および柵状織切除；(vii) 肥大性の瘢痕およびケロイド、例えば、熱傷に誘導されるもの、および、外科的なもの；そして、(viii) 他の線維症疾患、例えば、類肉腫症、強皮症、脊髄損傷／線維症、骨髄線維症、血管再狭窄、アテローム硬化、ウェゲナー肉芽腫症、混合型結合組織病およびパイロニー病。
【００９２】
いくつかの分析系および動物モデルは、ＢＭＰ−１０モジュレータの作用を評価するために公知技術である(例えば、Wynn, Nature Reviews 4:583-594 (2004); Phan and Kunkel (1992) Exp. Lung Res., 18: 29-43; WO2000/064944参照。その内容をここに参考文献として組み入れる。)。肺線維症の１つの典型的なモデルは、ブレオマイシン（ＢＬ）−齧歯動物モデルである。このモデルは、それがヒトの疾病の構成要素の多数を有する線維症の症状をもたらすので、また、ＢＬによって誘発された肺線維症がヒト化学療法においてよく認識される副作用であるので、魅力的である。齧歯動物のＢＬの気管内（ＩＴ）滴下注入は、線維形成のメカニズムを研究するために、そして、潜在的に望ましい抗線維化化合物を選別するために、広く使われてきた。一旦それが鉄およびＤＮＡと結合するならば、ＢＬによって誘発された肺毒性の最初の原因が、反応性の酸素種（ＲＯＳ）の生成に起因しているにもかかわらず、肺線維症の最終的な徴候につながっているプロセスは、さまざまな炎症性の媒介物質の放出を伴う(Giri and Wang., Comments Toxicol., 3: 145-176 (1989))。
【００９３】
ＢＬによって誘発された肺損傷の原因は、水腫、出血、そして、好中球およびマクロファージが優位を占める細胞浸潤物によって最初に特徴づけられる。肺の血管、間質および肺胞空間の炎症性白血球の過剰な蓄積は、ＲＯＳおよび蛋白質分解酵素の生成によって、血管−および実質の損傷を負わせることができる。
【００９４】
本発明の他の実施態様によれば、疾患を予防または治療する際のアンタゴニストの効果は、連続的に、または、それらの目的のために効果的である他の薬剤（例えば、以下に示される）と組み合わせて、アンタゴニストを投与することによって改良されることができる。；例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）抑制物質；酸性であるか塩基性の線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）の血管形成活性を阻害または中和することができる抗体；肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）（ＴＧＦＢ）（例えば、糖尿病ネフロパシおよび他の腎臓適応症の治療において）；組織因子、プロテインＣまたはタンパク質Ｓの血液凝固性活性を阻害または中和することができる抗体（１９９１年２月２１日に公表された、Esmon, et al., PCT Patent Publication No. WO 91/01753参照。）、または、一つ以上の従来の治療薬（例えば、アルキル化剤、葉酸拮抗薬、核酸代謝の代謝対抗物質、抗生物質、ピリミジン類似体、５−フルオロウラシル、プリンヌクレオシド、アミン、アミノ酸、トリアゾル・ヌクレオシドまたはコルチコステロイド）。このような他の薬剤は、投与されている組成物に存在してもよいかまたは別に投与されることができる。また、放射性物質の照射または投与を含むかどうかにかかわらず、アンタゴニストは、連続的に、または、放射線治療と組み合わせて最適に投与される。
【００９５】
他の実施態様において、ＢＭＰ−１０アンタゴニストは、ＢＭＰ−１０関連の心臓の疾患または障害を患う被験者を治療するために用いられることができる。心臓性または心臓の疾患は、例えば、心臓への不十分な血液供給、心臓のリズムの不規則性、および／または心臓の心房から心室へのインパルスの不完全な伝導を含む任意の種類の心臓機能不全によって特徴づけられることができる。心臓性の疾患の例は、これに限定されないが、先天性心疾患、心筋症（例えば、拡張型、肥大性の、拘束性の心筋症）、うっ血心不全および心筋梗塞を含む。ＢＭＰ−１０アンタゴニストは、単独で、または、一つ以上の薬剤または治療法（例えば、治療薬）と組み合わせて、被験者に投与されることができ、それは、ＢＭＰ−１０に関連する血管または心臓性の疾患および／または障害を治療するために有用である。一の実施態様において、第２の薬剤または治療法は、以下の一つ以上から選ばれる。：血管形成術、ベータレセプター遮断薬、抗高血圧薬、強心薬、抗血栓剤、血管拡張神経、抗ホルモン剤、エンドセリン・アンタゴニスト、カルシウムチャネル遮断薬、ホスホジエステラーゼ抑制物質、アンギオテンシン２型アンタゴニストおよび／またはサイトカイン遮断薬／抑制物質。
【００９６】
内皮細胞または血管機能の増加が要求される実施態様において、内皮細胞または維管束組織は、例えば、被験者にＢＭＰ−１０アゴニストを投与することによって、ＢＭＰ−１０アゴニストに接触される。本明細書で用いられる場合、本発明の方法に有用な「ＢＭＰ−１０アゴニスト」または「ＢＭＰ−１０レセプター・アゴニスト」は、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター・ポリペプチドの生物活性の一つを強化、誘発、または、増強する薬剤を指す。典型的に、そのアゴニストは、ＢＭＰ−１０レセプター・ポリペプチド相互作用、例えば、結合し、そして、一つ以上のＢＭＰ−１０レセプター活性を活性化する。ＢＭＰ−１０アゴニストの例は、ＢＭＰ−１０タンパク質または機能的に活性な断片、ペプチド、またはその変異体（例えば、哺乳動物、例えば、ヒトのＢＭＰ−１０（例えば、本明細書において記載されている成熟したＢＭＰ−１０またはそれに実質的に相同性の配列））；または、ＢＭＰ−１０タンパク質または機能的に活性な断片またはその変異体をコード化している核酸（例えば、図１（配列番号１）に示される核酸配列または部分またはその変異体を含む核酸）を含む。ＢＭＰ−１０アゴニストは、単独で用いられるか、または、第２の部分、例えば、本明細書において記載されているように、免疫グロブリンＦｃ領域、血清アルブミンに機能的に結合（例えば、化学的結合、遺伝子のまたはポリペプチド融合、非共有結合、その他によって）されることができる。他の実施態様において、ＢＭＰ−１０アゴニストは、ＢＭＰ−１０レセプター（例えば、本明細書において記載されているレセプター）と結合して、レセプター活性を増加させる。例えば、ＢＭＰ−１０アゴニストは、抗体分子、結合領域融合変異体またはＢＭＰ−１０レセプターと結合して、一つ以上の活性を刺激する任意の他の薬剤であることができる。
【００９７】
ＢＭＰ−１０アゴニストで治療される被験者は、例えば、異常に不活性であるか破壊されたＢＭＰ−１０細胞増殖および／または活性によって特徴づけられる疾患を患う哺乳類、例えば、ヒトであることができる。例えば、ＢＭＰ−１０アゴニストは、内皮細胞損傷の後（例えば、虚血発作または微小血管性脈管症の後）、疾患または障害を治療または防止するために用いられることができる。従って、異常に不活性であるか損なわれたＢＭＰ−１０−応答性細胞の増殖および／または活性によって特徴づけられる疾患を治療するかまたは予防する（例えば、治癒、改善、発症の遅延または防止、再発またはぶり返しを防止する）方法が開示される。例えば、ＢＭＰ−１０アゴニストは、内皮細胞損傷の後（例えば、虚血発作または微小血管性脈管症の後）、疾患または障害を治療または防止するために用いられることができる。その方法は、被験者にＢＭＰ−１０アゴニスト（例えば、本明細書において記載されているＢＭＰ−１０アゴニスト）を、内皮細胞および／または維管束組織の一つ以上のＢＭＰ−１０生物活性（例えば、本明細書において記載されている生物活性）を増加または刺激するのに十分な量において投与することを含み、このことにより、疾患または障害を治療または防止する。被験者は、例えば、疾患または障害を患う哺乳類、例えば、ヒトであることができる。
【００９８】
本発明のＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター・アゴニストおよびアンタゴニスト（また、本明細書において、「活性体」と称される）は、医薬組成物に組み込まれることができる。このような組成物は、通常、核酸分子、タンパク質、抗体および薬学的に受け入れられるキャリアを含む。本明細書で用いられる場合、用語「薬学的に受け入れられるキャリア」は、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌性薬剤、等張性および吸収を遅らせる薬剤、および、薬学的な投与と両立する同類を含む。補助活性体も、組成物に組み込まれることがある。
【００９９】
医薬組成物は、投与の目的とするルートと両立するために調製される。投与ルートの例は、非経口投与薬（例えば、静脈、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（局所的の）、経粘膜および直腸投与を含む。腸管外、皮内または皮下の適用のために使用する溶液またはサスペンションは、以下の成分を含むことができる。：無菌の希釈液（例えば、注射用蒸留水、食塩溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒）；抗菌物質（例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム）；キレート薬（例えば、エチレンジアミン四酢酸）；緩衝液（例えば、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩および張性の調整のための薬剤（例えば、塩化ナトリウムまたはブドウ糖））。ｐＨは、酸または塩基（例えば、塩化水素または水酸化ナトリウム）によって調整されることができる。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは多回投与バイアルに封入することができる。
【０１００】
ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター・アゴニストまたはアンタゴニストの治療上有効量が経口的に投与されるときに、結合剤は錠剤、カプセル、散剤、溶液またはエリキシルの形である。錠剤の形で投与されるときに、本発明の医薬組成物は、さらに、固体担体（例えばゼラチンまたはアジュバント）も含むことができる。錠剤、カプセルおよび散剤は、約５〜９５％の結合剤、および、好ましくは約２５〜９０％の結合剤を含む。液体状態で投与されるときに、液体担体、例えば、水、石油、動物または植物起源の油（例えば、落花生油、鉱油、ダイズ油または胡麻油）または合成油脂は、加えられることができる。医薬組成物の液体状態は、更に、生理的食塩水、ブドウ糖または他のサッカリド溶液、またはグリコール（例えば、エチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール）を含むことができる。液体状態において投与されるときに、医薬組成物は、約０．５〜９０重量％、そして、好ましくは約１〜５０％の結合剤を含む。
【０１０１】
ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター・アゴニストまたはアンタゴニストの治療上有効量が静脈内、皮膚または皮下注射によって投与されるときに、結合剤は、発熱原のない、非経口的に受け入れられる水溶液の形である。ｐＨ、等張性、安定性などを十分に考慮した、このような非経口的に受け入れられるタンパク質溶液の製剤は、従来技術の範囲内である。静脈内、皮膚または皮下注射のための好適な医薬組成物は、結合剤に加えて、等張性溶媒、例えば、塩化ナトリウム注射剤、リンゲル注射剤、ブドウ糖注射剤、ブドウ糖および塩化ナトリウム注射剤、泌乳されたリンゲル注射剤または他の公知の溶媒を含まなければならない。本発明の医薬組成物は、安定剤、防腐剤、緩衝液、抗酸化剤または当業者に知られている他の添加物を含むこともできる。
【０１０２】
吸入による投与のために、その化合物は、適切な噴霧剤、例えば、ガス（例えば、二酸化炭素）を含む加圧された容器またはディスペンサまたは噴霧器からエアゾールスプレーの形で供給される。
【０１０３】
全身投与は、経粘膜または経皮の手段によることも可能である。経粘膜または経皮の投与のために、浸透されるバリアに適切な浸透剤が、製剤において使われる。このような浸透剤は、通常、公知技術であり、そして、例えば、経粘膜投与のために、界面活性剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、鼻内噴霧または坐薬を用いることにより達成されることができる。経皮投与のために、活性な化合物は、一般に公知技術の軟膏、塗剤、ゲル類またはクリームに調製される。
【０１０４】
化合物は、（例えば、従来の座薬基剤例えば、カカオ脂および他のグリセリドによって）坐薬または直腸到達のための貯留浣腸剤の形で調合されることもできる。
【０１０５】
一の実施態様において、活性化合物は、化合物を身体からの迅速な除去から保護するキャリア（例えば、インプラントおよびマイクロカプセルに入れられたデリバリー・システムを含む徐放製剤）で調合される。生物分解可能な、生物学的適合性のポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水塩、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸が用いられることができる。このような製剤の調製の方法は、当業者にとって明らかである。その物質は、商業的にAlza Corporation および Nova Pharmaceuticals, Inc.から得られることもできる。リポソーム型サスペンション（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を有する感染細胞を目標とされるリポソームを含む）が、薬学的に受け入れられるキャリアとして用いられることもできる。例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されているように、これらは周知の方法に従って調合されることができる。
【０１０６】
アンタゴニストが、生物学的な、例えば、抗体分子、可溶性のレセプター融合である実施態様において、約１ｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇのアンタゴニストは、例えば、一つ以上の独立した投与か、または、持続性点滴によるかにかかわらず、疾患の種類および重症度に基づく患者への投与のための最初の投与量の候補である。典型的１日の投与量は、前述の要因に応じて、約１ｇ／ｋｇから、１００ｍｇ／ｋｇ以上にわたるかもしれない。障害に応じて、少なくとも数日にわたる繰り返し投与のために、病徴の所望の抑制が発生するまで、治療は繰り返される。しかしながら、他の投与計画が有用かもしれない。この療法の経過は、例えば、Ｘ線撮影腫瘍イメージングを含めて、従来の技術および分析によって容易にモニターされる。
【０１０７】
本発明の医薬組成物を用いた療法の継続時間は、治療されている疾患および障害の重症度および個々の患者の潜在的特異体質の反応に依存して変化する。ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター―アゴニストまたはアンタゴニストの各使用の継続時間は、連続静脈内投与の１２〜２４時間の範囲であることが考えられる。最後に、主治医は、本発明の医薬組成物を使用している静注療法の適切な継続時間を決定する。
【０１０８】
細胞培養分析および動物試験から得られるデータが、ヒト用の投与量の範囲を作成する際に使われることができる。このような化合物の投与量は、好ましくは、ほとんど毒性を有しないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲の中にある。投与量は、使用される剤形および利用される投与ルートによって、この範囲の中で変化するかもしれない。本発明の方法で使用する任意の化合物のために、治療的に有効な投与量は、細胞培養分析から最初に測定されることができる。投与量は、細胞培養において決定されるように、ＩＣ５０（すなわち、症状の最大の半減抑制を達成するテスト化合物の濃度）を含む循環血漿の濃度範囲を達成するために、動物モデルにおいて作成されるかもしれない。このような情報は、より正確にヒトの有用な投与量を決定するために用いることができる。血漿のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィによって、測定されるかもしれない。
【０１０９】
本明細書で定義されるとき、タンパク質またはポリペプチドの治療上有効量（すなわち、有効薬量）は、約０．００１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは、約０．０１〜２５ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは、約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重、そして、さらにより好ましくは、約１〜１０ｍｇ／ｋｇ、２〜９ｍｇ／ｋｇ、３〜８ｍｇ／ｋｇ、４〜７ｍｇ／ｋｇまたは５〜６ｍｇ／ｋｇ体重の範囲で変動する。タンパク質またはポリペプチドは、約１〜１０週の間、好ましくは、２〜８週の間、より好ましくは、約３〜７週の間に、そして、さらにより好ましくは、約４、５または６週間につき１回投与されることができる。特定の要因は、これに限定されるものではないが、疾病または疾患の重症度、被験者のそれ以前の治療、総合的な健康状態および／または年齢、および現在の他の疾患を含み、効果的に被験者を治療することを必要とする投与量およびタイミングに影響するかもしれないことを、当業者は理解する。さらに、タンパク質、ポリペプチドまたは抗体の治療上有効量による被験者の治療は、単一の治療、または、好ましくは、一連の治療を含むことができる。
【０１１０】
抗体のために、好適な投与量は、０．１ｍｇ／ｋｇ体重（通常、１０ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ）である。抗体が脳に作用する場合、５０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの投与量は、通常、適切である。通常、部分的なヒト抗体および完全にヒト抗体は、ヒト身体の範囲内で、他の抗体より長い半減期を有する。したがって、より低い投与量、および、より頻繁でない投与は、しばしば可能である。脂質化のような変性は、抗体を安定させて、取り込みおよび組織浸透（例えば、脳に）を強化するために用いることができる。抗体の脂質化のための方法は、Cruikshank et al. ((1997) J. Acquired Immune Deficiency Syndromes and Human Retrovirology 14:193)により開示されている。
【０１１１】
典型的な投与量は、被験者またはサンプル重量のキログラム当たり、低分子のミリグラムまたはマイクログラム量を含む（例えば、1キログラムにつき約１マイクログラムから約５００ミリグラムまで、1キログラムにつき約１００マイクログラムから約５ミリグラムまで、1キログラムにつき、約１マイクログラムから約５０マイクログラムまで）。低分子の適切な投与量は、調整される発現または活性に関して低分子の効能に依存することがさらに理解される。これらの低分子の一つ以上が動物（例えば、ヒト）に投与されるときに、本発明のポリペプチドまたは核酸の発現または活性を調整するために、医師、獣医師または研究者は、例えば、最初は比較的低い投与量を定めるかもしれないが、その後で、適切な反応が得られるまで、投与量を増加させる。さらに、任意の特定の動物の被験者のための特定の投与量レベルは、用いられる特定の化合物、被験者の年齢、体重、総合的な健康状態、性および食事制限、投与時間、投与ルート、排出率、任意の複合製剤および調整される発現または活性の程度を含む様々な要因に依存することが理解される。
【０１１２】
本発明の核酸分子は、ベクトルに挿入され、遺伝子治療ベクトルとして用いられることができる。遺伝子治療ベクトルは、例えば、静脈注射、局所投与（米国特許５，３２８，４７０号を参照）または定位的注入（例えば、Chen et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054-3057）によって、被験者に提供されることができる。遺伝子治療ベクターの製剤は、遺伝子治療ベクターを受け入れられる希釈液に含み、または、遺伝子伝達ビヒクルに埋め込まれる緩徐溶出マトリックスからなることができる。別法として、完全な遺伝子伝達ベクターが、組換え型細胞から完全に生産されることができる場合（例えば、レトロウイルスベクター）には、製剤は、遺伝子デリバリー・システムを生じる一つ以上の細胞を含むことができる。
【０１１３】
医薬組成物は、投与のための説明書と共に、容器、パックまたはディスペンサに含まれることができる。
【０１１４】
II.ＢＭＰ−１０アゴニストおよびアンタゴニスト
抗体分子
ある実施態様では、ＢＭＰ−１０アゴニスト／アンタゴニストは、ＢＭＰ−１０またはＢＭＰ−１０レセプターに対する抗体分子である。実施態様において、抗体分子は、モノクローナルであるか単一特異性抗体またはその抗原結合断片（例えば、Fab、F(ab')2、Fv、単鎖Ｆｖ断片、またはラクダ科の動物の変異体）であり、それは、ＢＭＰ−１０またはＢＭＰ−１０レセプター、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）ＢＭＰ−１０またはＢＭＰ−１０レセプター（またはその機能的な変異体）と結合する。実施態様において、抗体分子は、成熟したＢＭＰ−１０（例えば、本明細書において記載されている成熟したヒトＢＭＰ−１０）と結合する。
【０１１５】
典型的には、抗体分子は、ヒトＢＭＰ−１０またはヒトＢＭＰ−１０レセプター・ポリペプチド（または機能的なその断片）に対するヒトの、ヒト化された、キメラの、ラクダ科の動物の、または、インビトロで生成された抗体である。典型的には、抗体は、ＢＭＰ−１０またはＢＭＰ−１０レセプターの一つ以上の活性（例えば、本明細書において記載されているＢＭＰ−１０の一つ以上の生物活性）を阻害、低下または中和する。一の実施態様において、抗体分子は、成熟したＢＭＰ−１０ポリペプチド（例えば、約アミノ酸３１４〜４２４）、または、その断片からなる抗原決定基、例えば、図２（配列番号２）のアミノ酸約３１４〜３２５、３２５〜３３５、３３５〜３４５、３４５〜３５５、３５５〜３６５、３６５〜３７５、３７５〜３８５、３８５〜３９５、３９５〜４０５、４０５〜４１５および４１５〜４２４と結合する。他の実施態様において、抗体分子は、ＢＭＰ−１０プロペプチド（例えば、アミノ酸約２２〜４２４）、または、その断片からなる抗原決定基、例えば、図２（配列番号２）のアミノ酸約２２〜３１３、２２〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１００〜１１０、１１０〜１２０、１２０〜１３０、１３０〜１４０、１４０〜１５０、１５０〜１６０、１６０〜１７０、１７０〜１８０、１８０〜１９０、１９０〜２００、２００〜２１０、２１０〜２２０、２２０〜２３０、２３０〜２４０、２４０〜２５０、２５０〜２６０、２６０〜２７０、２７０〜２８０、２８０〜２９０、２９０〜３００、３００〜３１０と結合する。更に他の実施態様において、抗体分子は、ＢＭＰ−１０プロペプチドの切断部位と結合する（例えば、配列番号２のアミノ酸約２１〜２２または３１３〜３１４に位置する抗原決定基に結合する）。実施態様において、抗体分子は、ＢＭＰ−１０レセプター、例えば、エンドグリン（例えば、ヒト・エンドグリン）；または、アクチビン・レセプター様キナーゼ（ＡＬＫ）−１、−３または−６（例えば、図３Ｄ（配列番号４）および図４Ｃ（配列番号６）にそれぞれ示される哺乳動物、例えば、ヒトＡＬＫ−１および−３と同一のアミノ酸配列からなるＡＬＫ−１または−３）、または、それに実質的に相同的な配列に結合する。
【０１１６】
本明細書で用いられる場合、「抗体分子」という用語は、少なくとも一つの免疫グロブリン可変ドメイン配列からなるタンパク質をいう。抗体分子という用語は、例えば、完全長の、成熟した抗体および抗原結合断片を含む。例えば、抗体分子は、重（Ｈ）鎖可変ドメイン配列（ＶＨとして本明細書において略記される）、および、軽（Ｌ）鎖可変ドメイン配列（ＶＬとして本明細書において略記される）を含むことができる。他の実施態様において、抗体分子は、２つの重（Ｈ）鎖可変ドメイン配列および２つの軽（Ｌ）鎖可変ドメイン配列を含み、それによって、２つの抗原結合部位（例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fc、Fd、Fd'、Fv,、単鎖抗体（例えば、scFv）、単一可変ドメイン抗体、二重特異性抗体（Dab）（二価および二重特異性）およびキメラ（例えば、ヒト化された）抗体）を形成し、それは、抗体全体または組換えＤＮＡ技術を使用して新規に合成されるものの変性によって生成されるかもしれない。これらの機能的な抗体断片は、選択的にそれらのそれぞれの抗原またはレセプターと結合する能力を保持する。抗体および抗体断片は、抗体の任意のクラスに由来するものであることができ、これに限定されるものではないが、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥ、および、抗体の任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）に由来するものを含む。本発明の抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであることができる。抗体は、ヒトの、ヒト化された、ＣＤＲ融合された、または、インビトロで生成された抗体であることもでる。抗体は、例えば、ＩｇＧ１（ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）から選択される重鎖定常領域を有することができる。抗体は、例えば、kappa またはλから選択される軽鎖を有することもできる。
【０１１７】
抗原結合フラグメントの例は、以下からなる。：(i) Ｆａｂフラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１領域からなる一価の断片；(ii) F(ab')2断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって結合される２つのＦａｂフラグメントからなる二価断片；(iii) ＶＨおよびＣＨ１領域からなるＦｄ断片；(iv) 抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨ領域からなるＦｖ断片、(v) ＶＨ領域からなる二重特異性抗体；(vi) ラクダ科の動物またはラクダ科の動物化された可変ドメイン；(vii) 単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426、および、Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883、参照；(viii) 単一領域の抗体。これらの抗体断片は、当業者に知られている従来技術を使用して得られ、そして、その断片は、完全な抗体と同様に、有用性についてスクリーニングされる。
【０１１８】
「抗体」という用語には、その機能的な断片と同様に完全な分子を含み、抗体の定常領域は、抗体の特性を修正するために（例えば、Ｆｃレセプター結合、抗体糖鎖形成、システイン残基の数、エフェクター細胞機能または補足的機能の一つ以上を増減するために）、変更、例えば、突然変異されることができる。
【０１１９】
本発明の抗体は、単一領域の抗体でもあることもできる。単一領域の抗体は、補完的な決定領域が単一領域のポリペプチドの部分である抗体を含むことができる。実施例は、これに限定されないが、Ｈ鎖抗体、軽鎖が自然に欠けている抗体、通常の４鎖の抗体から誘導される単一領域の抗体、抗体に由来するもの以外の、改変抗体および単一領域の足場（scaffolds）を含む。単一領域の抗体は、人工または将来の単一領域の抗体のいずれかでもよい。単一領域の抗体は、これに限定されないが、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、魚、サメ、ヤギ、ウサギおよびウシを含むいくつかの種に由来してもよい。本発明の一の実施態様において、単一領域の抗体は、魚において見られる免疫グロブリンの可変領域から誘導されることができる（例えば、サメの血清において見られる新規な抗原レセプター（ＮＡＲ）として知られている免疫グロブリン・アイソタイプから誘導されるもの）。ＮＡＲ（「ＩｇＮＡＲｓ」）の可変領域から誘導される単一領域の抗体を製造する方法は、WO 03/014161 および Streltsov (2005) Protein Sci. 14:2901-2909に記載されている。本発明の別の実施態様では、単一領域の抗体は、軽鎖が欠けているＨ鎖抗体として公知の天然に生じる単一領域の抗体である。このような単一領域の抗体は、例えば、WO 9404678において開示される。明らかな理由で、軽鎖が自然に欠けているＨ鎖抗体に由来するこの可変領域は、それと４鎖の免疫グロブリンの通常のＶＨを区別するＶＨＨまたはナノボディとして本明細書において知られる。このようなＶＨＨ分子は、ラクダ科種、例えば、ラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカおよびグアナコにおいて、増やされる抗体から誘導されることができる。ラクダ科以外の他の種は、軽鎖が自然に欠けている重鎖抗体を生産してもよく、このようなＶＨＨｓは、本発明の範囲内である。
【０１２０】
ＶＨおよびＶＬ領域は、「フレームワーク領域」（ＦＲ）と称される、より保存される領域に点在する、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域に再分割されることができる。フレームワーク領域およびＣＤＲの範囲は、多くの方法（例えば、Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917参照）、および、Oxford Molecular's AbM antibody modelling softwareにより用いられるＡｂＭ定義（例えば、Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. In: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. and Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg)、参照）によって明確に定義された。通常、特に示されない限り、以下の定義は使われる。重鎖可変領域のＣＤＲ１のＡｂＭ定義および他のＣＤＲのカバット定義。さらに、カバットまたはＡｂＭ  ＣＤＲに関して記載されている本発明の実施態様は、コチアの超可変性ループを使用して実施されてもよい。各ＶＨおよびＶＬは、通常は３つのＣＤＲおよび４つのＦＲｓを含み、以下の順序で、アミノ末端からカルボキシ末端まで配列される。：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。
【０１２１】
本明細書で用いられる場合、「免疫グロブリン可変領域の配列」とは、免疫グロブリン可変領域の構造を形成することができるアミノ酸配列をいう。例えば、その配列は、自然に生じる可変領域のアミノ酸配列の全部または一部を含んでもよい。例えば、その配列は、１つ、２つまたはそれ以上のＮ末端またはＣ末端アミノ酸を含んでもよいし含まなくてもよく、または、タンパク質構造の形態と互換性を持つ他の改変を含んでもよい。
【０１２２】
用語「抗原結合部位」は、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプターまたはその抗原決定基と結合する界面を形成する決定因子からなる抗体分子の部分を指す。タンパク質（または疑似タンパク質）に関して、抗原結合部位は、通常は、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプターと結合する界面を形成する一つ以上のループ（少なくとも４つのアミノ酸または疑似アミノ酸疑の）を含む。通常は、抗体分子の抗原結合部位は、少なくとも１つ、または、２つのＣＤＲ、または、より通常は、少なくとも３つ、４つ、５つまたは、６つのＣＤＲを含む。
【０１２３】
本明細書で用いられる、用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、単一の分子組成物の抗体分子の製剤を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定の抗原決定基に対する単一の結合特異性および親和性を示す。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術によって、または、ハイブリドーマ技術（例えば、組換え法）を利用しない方法によって製造されることができる。
【０１２４】
「有効なヒト」タンパク質は、中和抗体反応、例えば、ヒト抗ネズミ抗体（ＨＡＭＡ）反応を引き起こさないタンパク質である。ＨＡＭＡは、例えば、抗体分子が繰り返し投与される場合、例えば、慢性であるか再発性の疾病症状の治療において、多くの状況における問題を含む可能性がある。ＨＡＭＡ反応は、血清からさらなる抗体の除去のため(例えば、 Saleh et al., Cancer Immunol. Immunother., 32:180-190 (1990)、参照)、更に、潜在的アレルギー性反応のため(例えば、LoBuglio et al., Hybridoma, 5:5117-5123 (1986)、参照)、反復抗体投与を潜在的に無効にすることができる。
【０１２５】
抗−ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であることができる。他の実施態様において、抗体は、リコンビナント的に生じることができ、例えば、ファージ・ディスプレイによって、または、コンビナトリアルな方法によって生じることができる。
【０１２６】
抗ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター抗体を生成するファージ・ディスプレイおよびコンビナトリアルな方法は、公知技術である。(例えば、Ladner et al. U.S. Patent No. 5,223,409; Kang et al. 国際公開番号 WO 92/18619; Dower et al. 国際公開番号WO 91/17271; Winter et al. 国際公開WO 92/20791; Markland et al. 国際公開番号WO 92/15679; Breitling et al. 国際公開WO 93/01288; McCafferty et al. 国際公開番号WO 92/01047; Garrard et al. 国際公開番号WO 92/09690; Ladner et al. 国際公開番号WO 90/02809; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Griffths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226:889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; and Barbas et al. (1991) PNAS 88:7978-7982に記載されており、それらのすべては本明細書において引用される。)
【０１２７】
抗ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター抗体は、完全にヒト抗体（例えば、抗体をヒト免疫グロブリン配列から作り出すように遺伝子操作されたマウスにおいて製造される抗体）、または、非ヒトの抗体、例えば、齧歯動物（マウスまたはネズミ）、ヤギ、霊長類（例えば、サル）、ラクダの抗体である。好ましくは、非ヒトの抗体は、齧歯動物（マウスまたはネズミ抗体）である。齧歯目の抗体を製造する方法は、公知技術である。
【０１２８】
ヒト・モノクローナル抗体は、マウス系よりもむしろヒト免疫グロブリン遺伝子を担持しているトランスジェニック・マウスを使用して発生することができる。興味ある抗原によって免疫化されるこれらのトランスジェニック・マウスからの脾細胞は、ヒト・タンパク質からの抗原決定基に対する特異的親和性を有するヒトｍＡｂｓを分泌するハイブリドーマを生じるために用いられる(例えば、Wood et al. 国際出願WO 91/00906, Kucherlapati et al. PCT publication WO 91/10741; Lonberg et al. 国際出願WO 92/03918; Kay et al. 国際出願92/03917; Lonberg, N. et al. 1994 Nature 368:856-859; Green, L.L. et al. 1994 Nature Genet. 7:13-21; Morrison, S.L. et al. 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855; Bruggeman et al. 1993 Year Immunol 7:33-40; Tuaillon et al. 1993 PNAS 90:3720-3724; Bruggeman et al. 1991 Eur J Immunol 21:1323-1326、参照)。
【０１２９】
抗ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター抗体は、その可変領域またはその部分（例えば、ＣＤＲ）が非ヒトの生物（例えば、ネズミまたはマウス）において生成されるものであることができる。キメラ、ＣＤＲ融合およびヒト化の抗体は、本発明の範囲内である。非ヒトの生物（例えば、ネズミまたはマウス）において発生して、それから、例えば、可変フレームワークまたは定常領域において、ヒトの抗原性を減少させるために変更される抗体は、本発明の範囲内である。
【０１３０】
キメラ抗体は、公知技術の組み換えＤＮＡ技術によって製造されることができる。例えば、ネズミ（または他の種）モノクローナル抗体分子のＦｃ定常領域をコード化している遺伝子は、ネズミＦｃをコード化している領域を取り除くために、制限酵素によって分解され、そして、ヒトＦｃ定常領域をコード化している遺伝子の均等物は、置換される(Robinson et al., 国際特許公開PCT/US86/02269; Akira, et al., 欧州特許出願184,187; Taniguchi, M., 欧州特許出願171,496; Morrison et al., 欧州特許出願173,494; Neuberger et al., 国際出願 WO 86/01533; Cabilly et al. 米国特許番号4,816,567; Cabilly et al., 欧州特許出願 125,023; Better et al. (1988 Science 240:1041-1043); Liu et al. (1987) PNAS 84:3439-3443; Liu et al., 1987, J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al. (1987) PNAS 84:214-218; Nishimura et al., 1987, Canc. Res. 47:999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446-449; and Shaw et al., 1988, J. Natl Cancer Inst. 80:1553-1559)。
【０１３１】
ヒト化であるかＣＤＲ融合された抗体は、ドナーＣＤＲと置き換わる、少なくとも１つまたは２つ、しかし、通常、全３つのレセプターＣＤＲ（重いまたは軽い免疫グロブリン鎖）を有する。抗体は、少なくとも一部の非ヒトのＣＤＲと置き換えられてもよく、または、ＣＤＲのいくつかだけは、非ヒトのＣＤＲと置き換えられてもよい。ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプターまたはその断片にヒト化抗体の結合のために必要とされるＣＤＲの数を置き換えることだけが必要である。好ましくは、ドナーは、齧歯目の抗体（例えば、ネズミまたはマウス抗体）であり、そして、レセプターは、ヒト・フレームワークまたはヒト・コンセンサス・フレームワークである。通常は、ＣＤＲを提供している免疫グロブリンは「ドナー」と呼ばれて、そして、フレームワークを提供している免疫グロブリンは「レセプター」と呼ばれている。一の実施態様において、ドナー免疫グロブリンは、非ヒトの（例えば、齧歯目の）である。レセプターフレームワークは、自然に生じる（例えば、ヒト）フレームワークまたはコンセンサス・フレームワーク、または、それに対して、８５％またはそれ以上、同一な、好ましくは、９０％、９５％、９９％またはそれ以上、同一な配列である。
【０１３２】
本明細書で用いられる場合、「共通配列」という用語は、関連配列の一系統の最もしばしば発生しているアミノ酸（またはヌクレオチド）から形成される配列をいう(例えば、Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany 1987参照)。タンパク質の一系統において、共通配列の各位置は、系統のその位置で最もしばしば発生しているアミノ酸によって占められる。２つのアミノ酸が等しくしばしば発生する場合、いずれも共通配列に含まれることができる。「コンセンサス・フレームワーク」とは、コンセンサス免疫グロブリン配列のフレームワーク領域をいう。
【０１３３】
抗体は、公知技術の方法によってヒト化されることができる。ヒト化抗体は、ヒトＦｖ可変領域から均等な配列を有する抗原結合に直接関係していないＦｖ可変領域の配列を置き換えることによって生成されることができる。ヒト化抗体を生成する一般の方法は、Morrison, S. L., 1985, Science 229:1202-1207, Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214, およびQueen et al. US 5,585,089, US 5,693,761 and US 5,693,762により提供され、その全ての内容は、本明細書に引用したものとする。それらの方法は、重鎖または軽鎖のうちの少なくとも１つから免疫グロブリンＦｖ可変領域の全部または一部をコード化する核酸配列を分離、操作、発現することを含む。このような核酸の供給源は、当業者に公知であり、そして、例えば、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター・ポリペプチドまたはその断片に対する抗体を生産しているハイブリドーマから得られるかもしれない。ヒト化抗体またはその断片をコード化している組み換えＤＮＡは、それから適切な発現ベクターにクローンされることができる。
【０１３４】
ヒト化であるかＣＤＲ融合される抗体は、ＣＤＲ−融合またはＣＤＲ置換によって製造されることができ、そこにおいて、免疫グロブリン鎖の１、２またはすべてのＣＤＲは、置き換えられることができる。例えば、U.S. Patent 5,225,539; Jones et al. 1986 Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. 1988 Science 239:1534; Beidler et al. 1988 J. Immunol. 141:4053-4060; Winter US 5,225,539、参照。その全ての内容は、ここに明白に引用したものとする。Winterは、本発明のヒト化抗体を調製するために用いられるかもしれないＣＤＲ−グラフト法を記載し(UK Patent Application GB 2188638A, filed on March 26, 1987; Winter US 5,225,539)、その内容は、明白に引用したものとする。
【０１３５】
特定のアミノ酸が置換、削除、または、付加されたヒト化抗体もまた、本発明の範囲内である。例えば、抗原への結合を改良するために、好適なヒト化抗体は、フレームワーク領域のアミノ酸置換を有する。例えば、ヒト化抗体は、ドナー・フレームワーク残基に、または、レセプターフレームワーク残基以外の他のアミノ酸に同一のフレームワーク残基を有する。このような抗体を生成するために、ヒト化免疫グロブリン鎖のレセプターフレームワーク残基の選択された、少ない数は、対応するドナー・アミノ酸によって置き換えられることができる。置換の好適な位置は、ＣＤＲに隣接するアミノ酸残基を含むか、または、それは、ＣＤＲと相互作用することができる(例えば、US 5,585,089、参照)。アミノ酸をドナーから選択するための基準は、US 5,585,089, 例えば、US 5,585,089のcolumns 12-16, 例えば、US 5,585,089 のcolumns 12-16中に記載され、その内容をここに参考文献として組み入れる。抗体をヒト化するための他の技術は、Padlan et al. EP 519596 A1, published on December 23, 1992中に記載されている。
【０１３６】
一の実施態様において、抗体は、精製されたＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター抗原またはその断片（例えば、本明細書において記載されている断片）、膜関連の抗原、組織（例えば、天然組織）調製物、細胞全体、好ましくは、生きている細胞、溶解する細胞または細胞分画（例えば、膜画分）を免疫化することによって製造されることができる。
【０１３７】
抗ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター抗体は、単一の鎖抗体であることができる。単鎖抗体（ｓｃＦＶ）は、設計されてもよい(例えば、Colcher, D. et al. (1999) Ann N Y Acad Sci 880:263-80; and Reiter, Y. (1996) Clin Cancer Res 2:245-52、参照)。単一の鎖抗体は、同じ目標ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプタータンパク質の異なる抗原決定基のための特異性を有する多価抗体を生成するために、二量体化または多量体化されることができる。
【０１３８】
更に他の実施態様において、抗体分子は、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤおよびＩｇＥの重鎖定常領域から選択される；特に、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４の（例えば、ヒト）重鎖定常領域から選択される重鎖定常領域を有する。他の実施態様において、抗体分子は、例えば、κまたはλの（例えば、ヒト）軽鎖定常領域から選択される軽鎖定常領域を有する。定常領域は、抗体の特性を修正するために（例えば、以下の一つ以上を増減するために：Ｆｃレセプター結合、抗体糖鎖形成、システイン残基の数、エフェクター細胞機能、および／または、補足的な機能）、変更、例えば、突然変異されることができる。一の実施態様において、抗体は、エフェクター機能を有し、そして、補体を固定することができる。他の実施態様において、抗体は、エフェクター細胞を補充せず、または、補体を固定しない。他の実施態様において、抗体は、Ｆｃレセプターを結合するための低下された能力を有するか、または、その能力を有しない。例えば、それは、アイソタイプまたはサブタイプ、断片または他の変異体であり、それはＦｃレセプターへの結合を裏づけない。（例えば、それは、突然変異を起こすか削除されたＦｃレセプター結合領域を有する。）
【０１３９】
抗ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター抗体（例えば、モノクローナル抗体）は、標準技術（例えば、アフィニティークロマトグラフィまたは免疫沈降法）によって、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプターを分離するために用いることができる。そのうえ、抗ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター抗体は、タンパク質の発現の発生量およびパターンを評価するために、（例えば、細胞可溶化液または細胞上澄みにおいて）ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプタータンパク質を検出するために用いられることができる。抗ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター抗体は、診断によって、臨床試験ステップの一部として、組織のタンパク質レベルをモニターするために、例えば、与えられた治療法の有効性を決定するために、用いられることができる。検出は、抗体を検出可能な物質（すなわち、抗体標識）に連結する（すなわち、物質的に結合する）ことによって容易になることができる。検出可能な物質の例は、さまざまな酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光材料、生物発光物質および放射性物質を含む。適切な酵素の例は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼを含み、；好適な補欠分子族錯体の例は、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを含み、；好適な蛍光物質の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレッセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトラニジラミン・フルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンを含み、；発光材料の例は、ルミノールを含み、；生物発光物質の例は、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンを含む、そして、適切な放射性物質の例は、125I, 131I, 35S または 3Hを含む。
【０１４０】
本発明は、また、抗ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター抗体（例えば、本明細書において記載されている抗ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター抗体）をコード化する核酸も含む。また、核酸を含むベクター、および、核酸によって形質転換される細胞（特に、抗体を生産するために有用である細胞、例えば、哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯまたはリンパ細胞）も含まれる。
【０１４１】
本発明は、また、抗ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター抗体、例えば、および、本明細書において記載されている抗体を製造するセル・ライン（例えば、ハイブリドーマ）、および、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター抗体を製造するために前記細胞を使用する方法も含む。
【０１４２】
また、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター配列およびその変異体をコード化する核酸にも特徴がある。ポリペプチドは、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター、および、選択的に、他の種からのＢＭＰ−１０も結合するＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター結合剤を提供するために用いることができる。
【０１４３】
一の実施態様では、本発明は、特異的にＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプターと結合する標的結合分子を提供する方法を特徴とする。例えば、標的結合分子は、抗体分子である。この方法は、以下からなる：少なくとも非ヒトのタンパク質の一部からなる標的タンパク質を提供すること；ヒト標的タンパク質の対応する部分に相同的（少なくとも、７０、７５、８０、８５、８７、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８％同一）であるが、少なくとも一つのアミノ酸（例えば、少なくとも１つの、２つの、３つの、４つの、５つの、６つの、７つの、８つのまたは、９つのアミノ酸）によって異なる部分；特異的に抗原と結合する結合剤を得ること；そして、標的タンパク質の活性を調整する際の結合剤の有効性を評価すること。方法は、ヒト被検者に結合剤（例えば、抗体分子）または誘導体（例えば、ヒト化された抗体分子）を投与することを更に含むことができる。一の実施態様において、標的タンパク質は、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプターである。
【０１４４】
一の実施態様において、採取のステップは、上記の通りのタンパク質発現ライブラリを使用することからなる。例えば、ライブラリは、抗体分子、例えば、scFv’sのFab’sを表示する。一の実施態様において、採取のステップは、免疫原として抗原を使用している動物を免疫化することからなる。例えば、動物は、齧歯動物、例えば、マウスまたはネズミであることができる。動物は、トランスジェニック動物であることができる。
【０１４５】
ＢＭＰ−１０プロペプチド
更に他の実施態様において、ＢＭＰ−１０アンタゴニストは、ＢＭＰ−１０に拮抗的なプロペプチド（例えば、成熟したＢＭＰ−１０とともに抑制性複合体を形成することができるＢＭＰ−１０のトランケートされた、または、変異体の形態、（例えば、図２（配列番号２）のアミノ酸約２２〜３１３からなるヒトＢＭＰ−１０のプロペプチド領域のトランケートされた、または、変異体の形態）である。ＢＭＰ−１０プロペプチドおよびその変異体を生成する方法は、公知技術であり、そして、US 2006/0024783において開示され、その内容は、ここに参考文献として組み入れる。
【０１４６】
可溶性ＢＭＰ−１０レセプター
ＢＭＰ−１０レセプターまたはＢＭＰ−１０に拮抗的なプロペプチドの可溶形態は、単独で使われるか、または、第２の部分（例えば、免疫グロブリンＦｃ領域、血清アルブミン、PEG化、ＧＳＴ、レックス−ＡまたはＭＢＰポリペプチド配列）に、機能的に結合（例えば、化学的結合、遺伝子のまたはポリペプチド融合、非共有結合またはその他によって）されることができる。本明細書で用いられる場合、「融合タンパク質」は、使用可能な状態で結合された、例えば、結合された部分（例えば、タンパク質部分）を２つ以上含んでいるタンパク質を指す。通常は、その部分は、共有結合性に結合される。その部分は、直接、結合されるか、または、スペーサまたはリンカーを介して連結されることができる。
【０１４７】
融合タンパク質は、さらに、第２の部分に第１の部分（例えば、可溶性ＢＭＰ−１０レセプターまたはＢＭＰ−１０プロペプチド）を接続しているリンカー配列を含むかもしれない。例えば、融合タンパク質は、ペプチド・リンカー（例えば、約４〜２０の、より好ましくは、５〜１０の長さのアミノ酸のペプチド・リンカー）を含むことができ、ペプチド・リンカーは、８のアミノ酸の長さである。ペプチド・リンカーのアミノ酸の各々は、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、ＴｈｒおよびＡｌａからなる群から選択され、ペプチド・リンカーは、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ要素を含む。他の実施態様において、融合タンパク質はペプチド・リンカーを含み、そして、ペプチド・リンカーは式(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)yを有する配列を含み、ここで、ｙは、１、２、３、４、５、６、７、または８である（配列番号１９）。
【０１４８】
他の実施態様において、追加的なアミノ酸配列は、発現、検出および／または単離または精製を容易にするために、融合タンパク質のＮ末端またはＣ末端に加えられることができる。例えば、ＢＭＰ−１０レセプター融合タンパク質は、一つ以上の追加的な部分（例えば、ＧＳＴ、Ｈｉｓ６タグ（配列番号２０）、ＦＬＡＧタグ）に結合されてもよい。例えば、融合タンパク質は、さらに、融合タンパク質配列がＧＳＴ（すなわち、グルタチオンＳ―トランスフェラーゼ）配列のＣ末端に融合するＧＳＴ融合タンパク質に結合されてもよい。このような融合タンパク質は、ＢＭＰ−１０レセプター融合タンパク質の精製を容易にすることができる。
【０１４９】
他の実施態様において、融合タンパク質は、非相同のシグナル配列（すなわち、ＢＭＰ−１０レセプター核酸によってコード化されるポリペプチドに存在しないポリペプチド配列）をそのＮ末端で含む。例えば、自然のＢＭＰ−１０レセプター・シグナル配列は、取り除かれ、そして、他のタンパク質からシグナル配列で置き換えられることができる。特定の宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）において、ＢＭＰ−１０レセプターの発現および／または分泌は、非相同のシグナル配列を用いることにより増加することができる。
【０１５０】
本発明のキメラまたは融合タンパク質は、標準的な組み換えＤＮＡ技術によって生じることができる。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡ断片は、従来の技術、例えば、ライゲーションのための平滑末端化または付着末端化された末端を使用すること、適切な末端を提供する制限酵素消化、適切なものとしての粘着末端のフィルイン、望ましくない合併を回避するアルカリ性ホスファターゼ治療、そして、酵素的な結合によって、フレームで一緒に結合される。他の実施態様において、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成装置を含む従来技術によって合成されることができる。別法として、遺伝子断片のＰＣＲ増幅は、その後、キメラ遺伝子配列を生成するために、アニールまたは再増幅されることされることができる２つの連続的な遺伝子断片の間に補完的なオーバーハングを引き起こすアンカー・プライマーを使用して行われることができる(例えば、Ausubel et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1992、参照)。そのうえ、融合部分（例えば、免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域）をコード化する、多くの発現ベクターは市販されている。融合部分が免疫グロブリン・タンパク質にフレームで結合されるように、核酸をコード化しているＢＭＰ−１０レセプターは、このような発現ベクターにクローンされることができる。
【０１５１】
いくつかの実施態様において、ＢＭＰ−１０レセプター融合ポリペプチドは、オリゴマ（例えば二量体または三量体）として存在する。
【０１５２】
他の実施態様において、ＢＭＰ−１０レセプター・ポリペプチド部分は、自然に生じるＢＭＰ−１０レセプター配列（野生型）の突然変異を有する変異体ＢＭＰ−１０レセプター・ポリペプチドとして提供され、それは、ＢＭＰ−１０にＢＭＰ−１０レセプター・ポリペプチドのより高い親和性（非変異の配列と比較して）の結合という結果になる。
【０１５３】
他の実施態様において、ＢＭＰ−１０レセプター・ポリペプチド部分は、自然に生じるＢＭＰ−１０レセプター・ポリペプチド配列（野生型）の突然変異を有する変異体ＢＭＰ−１０レセプター・ポリペプチドとして提供され、それは、（非変異の配列と比較して）蛋白質分解に対してより高い耐性のあるＢＭＰ−１０レセプター配列という結果になる。
【０１５４】
いくつかの実施態様において、第１のポリペプチドは、全長ＢＭＰ−１０レセプター・ポリペプチドを含む。別の実施態様では、第１のポリペプチドは、全長ＢＭＰ−１０レセプター・ポリペプチドより少ないものからなる。例えば、アンタゴニストは、ＢＭＰ−１０レセプターの可溶形態（例えば、ＢＭＰ−１０結合領域からなる哺乳類の（例えば、ヒト）エンドグリン、ＡＬＫ−１、−３または−６の可溶形態；例えば、哺乳類の（例えば、ヒト）ＡＬＫ−１、−３または−６の細胞外領域の可溶形態）であることができる。）例えば、ＢＭＰ−１０アンタゴニストは、ヒトＡＬＫ−１（図３Ｄ；配列番号４）のアミノ酸約２２〜１１８；ヒトＡＬＫ３（図４Ｃ；配列番号６）のアミノ酸約２４〜１５２；または、アクチビン・レセプターＩＩＢ（ＡｃｔＲＩＩＢ）の可溶性の断片（例えば、図５Ｂ；配列番号１８のアミノ酸約１７〜１３３を含む）；を含むことができる。
【０１５５】
他の実施態様において、追加的なアミノ酸配列は、発現、立体化学的柔軟性、検出および／または単離または精製を容易にするために、融合タンパク質のＮ末端またはＣ末端に加えられることができる。第２のポリペプチドは、好ましくは、可溶性である。いくつかの実施態様において、第２のポリペプチドは、結合されたポリペプチドの半減期（例えば、血清半減期）を高める。いくつかの実施態様において、第２のポリペプチドは、第２のＢＭＰ−１０レセプター・ポリペプチドを有する融合ポリペプチドの結合を促進する配列を含む。実施態様において、第２のポリペプチドは、少なくとも免疫グロブリン・ポリペプチドの領域を含む。免疫グロブリン融合ポリペプチドは、公知技術で、例えば米国特許5,516,964；5,225,538;5,428,130;5,514,582;5,714,147;および、5,455,165に記載されている。例えば、ＢＭＰ−１０レセプターまたはＢＭＰ−１０拮抗性プロペプチドの可溶形態は、以下を含む、さまざまなアイソタイプの重鎖定常領域に融合することができる。：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤおよびＩｇＥ。通常は、融合タンパク質は、ヒトＢＭＰ−１０レセプター、または、ＢＭＰ−１０プロペプチド（またはそれに相同的な配列）の細胞外領域、および、例えば、融合させた、ヒト免疫グロブリンＦｃ鎖、例えば、ヒトＩｇＧ（例えば、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ２またはその変異体）を含むことができる。
【０１５６】
Ｆｃ配列は、エフェクター細胞機能、Ｆｃレセプター結合および／または補体活性を低下させるために、一つ以上のアミノ酸で変異されることができる。抗体定常領域を変える方法は、公知技術である変えられた機能、例えば、エフェクター・リガンド（例えば細胞上のＦｃＲ）の換えられた親和性、または、補体のＣ１成分を有する抗体は、抗体の恒常的な部分の少なくとも一つのアミノ酸残基を異なる残基に置き換えることによって製造することができる(例えば、EP 388,151 A1, U.S. Pat. No. 5,624,821 and U.S. Pat. No. 5,648,260、参照)。類似のタイプの改変は、記載されていることができ、それは、ネズミまたは他の種の免疫グロブリンに適用される場合に、これらの機能を低下または除去する。例えば、特定された残基をその側鎖上に適切な機能を有する残基に置き換えることによって、または、荷電される機能的な基、例えば、グルタミン酸塩またはアスパラギン酸、または、おそらく芳香族無極性残基（例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンまたはアラニンを導入することによって、ＦｃＲ（例えば、ＦｃγＲ１）のための、または、Ｃ１ｑ結合のための抗体（例えば、ＩｇＧ、例えば、ヒトＩｇＧ）のＦｃ領域の親和性を変えることは、可能である（例えば、米国特許第５，６２４，８２１号、参照）。
【０１５７】
実施態様において、第２のポリペプチドは、野生型免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域のエフェクター機能より少ないエフェクター機能を有する。Ｆｃエフェクター機能は、例えば、Ｆｃレセプター結合、補体結合およびＴ細胞減少活性を含む（例えば、米国特許第６，１３６，３１０号参照）。Ｔ細胞減少活性、Ｆｃエフェクター機能、そして、抗体安定性を測定する方法は、公知技術である。一の実施態様において、第２のポリペプチドは、Ｆｃレセプターに対する低いか少しも検出可能でない親和性を有する。別の実施態様において、第２のポリペプチドは、補体タンパク質Ｃ１ｑのための低いか少しも検出可能でない親和性を有する。
【０１５８】
本明細書において記載されている抗体分子および可溶性レセプターまたは融合タンパク質は、抗体（例えば、二重特異性またはマルチ特有性の抗体）、毒素、放射性同位元素、細胞毒性または細胞増殖抑制性剤のような一つ以上の他の分子存在物に機能的に結合（例えば、化学的結合、遺伝子の融合、非共有結合等によって）されることができることが理解されるであろう。
【０１５９】
結合領域融合変異体
さらに別の実施態様ではＢＭＰ−１０アゴニスト／アンタゴニストは、結合領域融合変異体または低分子である。結合領域融合変異体は、通常は、融合するかまたはヒンジまたはヒンジ作用する領域ポリペプチドに接続している結合領域ポリペプチドを含む変異体分子の例を提供し、それは、次に、ＣＨ１（例えば、ＩｇＧおよびＩｇＡのＣＨ２およびＣＨ３領域またはＩｇＥのＣＨ３およびＣＨ４領域）以外の重鎖からの、天然の、または、設計された定常領域の一つ以上からなる領域に融合または接続している(例えば、さらに詳しい説明は、U.S. 05/0136049 by Ledbetter, J. et al.、参照)。結合領域−融合タンパク質は、ヒンジ領域ポリペプチドおよび天然の、または、設計された重鎖ＣＨ３定常領域ポリペプチド（または全体的にあるいは部分的にＩｇＥに由来するものの場合、ＣＨ４）に融合または接続し、ＣＨ２定常領域ポリペプチド（または全体的にあるいは部分的にＩｇＥに由来するものの場合、ＣＨ３）に融合または接続している、天然または設計された重鎖ＣＨ２定常領域ポリペプチド（または全体的にあるいは部分的にＩｇＥに由来するものである場合、ＣＨ３）を含む領域を更に含むことができる。通常は、このような結合領域―融合タンパク質は、融合タンパク質に依存する細胞媒介細胞障害性、補体結合、および／または、標的、例えば、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプターに対する結合からなる群から選択される少なくとも一つの活性を有する。
【０１６０】
通常は、結合領域融合変異体または低分子は、哺乳動物（例えば、ヒト、ＢＭＰ−１０またはＢＭＰ−１０レセプター）と、少なくとも約107 M-1、典型的には、約108 M-1、そして、より典型的には、約109 M-1 to 1010 M-1またはより高い親和性で結合し、そして、本明細書において記載されているように、一つ以上のＢＭＰ−１０生物活性を低下および／または阻害する。実施態様において、結合領域融合変異体または低分子は、成熟したＢＭＰ−１０配列（例えば、図２；配列番号２で示されるヒトＢＭＰ−１０のアミノ酸約３１４〜４２４、３１４〜３２５、３２５〜３３５、３３５〜３４５、３４５〜３５５、３５５〜３６５、３６５〜３７５、３７５〜３８５、３８５〜３９５、３９５〜４０５、４０５〜４１５、４１５〜４２４のアミノ酸配列からなる成熟したＢＭＰ−１０配列）またはそれに実質的に相同的な配列に結合し、そして、ＢＭＰ−１０の一つ以上の活性を阻害、低下または中和する。実施態様において、ＢＭＰ−１０レセプターは、アクチビン・レセプター様キナーゼ（ＡＬＫ）−１、−３または−６（例えば、図３Ｄ（配列番号４）および図４Ｃ（配列番号６）に示される、哺乳動物（例えば、ヒト）のＡＬＫ−１および−３に同一のアミノ酸配列からなるＡＬＫ−１または−３）、または、それに実質的に相同的な配列であり、そして、ＢＭＰ−１０の一つ以上の活性を阻害、低下または中和する。
【０１６１】
他のＢＭＰ−１０アンタゴニスト
例えば、ＢＭＰ−１０アンタゴニストは、密接にヒト表面活性物質タンパク質Ｂ（ＳＰＢ）の特性に類似するように設計されている、天然ヒト肺表面活性物質（例えば、ＫＬ−４タンパク質のような物質）の設計されたバージョンであることができる。
【０１６２】
他の実施態様において、ＢＭＰ−１０アンタゴニストは、その自然に生じるアンタゴニストまたはその機能的な断片または変異体である。自然に生じるＢＭＰ−１０アンタゴニストの例は、ＵＳＡＧ−１、スクレロジン（sclerosin）、コーディン、ねじれ原腸形成、エンンドグリン、および、Yanagita, M. (2005) Cytokine & Growth Factors Reviews 16:309-317（本書にその内容が参考文献として内含される）に記載されている他のアンタゴニストを含む。
【０１６３】
さらに別の実施態様では、ＢＭＰ−１０アンタゴニストは、ＢＭＰ−１０またはＢＭＰ−１０レセプターをコード化している核酸の発現を阻害する。このようなＢＭＰ−１０アンタゴニストの例としては、核酸分子、例えば、アンチセンス分子、リボザイム、ＲＮＡｉ、ＢＭＰ−１０またはＢＭＰ−１０レセプターをコード化している核酸にハイブリダイズする三重らせん分子または転写調節領域を含み、そして、ＢＭＰ−１０またはＢＭＰ−１０レセプターのｍＲＮＡ発現を遮断または低下させる。
【０１６４】
実施態様において、核酸アンタゴニストは、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプターをコード化している内因性遺伝子の発現を減少させるために用いられる。一の実施態様において、核酸アンタゴニストは、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプターをコード化しているｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡである。他のタイプの拮抗的な核酸は、例えば、ｄｓＲＮＡ、リボザイム、トリプルヘリックス形成剤またはアンチセンス核酸が用いられることもできる。したがって、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター―コード化核酸分子に対する核酸阻害剤、例えば、アンチセンス、ＲＮＡｉである単離された核酸分子が提供される。
【０１６５】
「アンチセンス」核酸は、例えば、二本鎖のｃＤＮＡ分子またはｍＲＮＡ配列のコード鎖に相補的なタンパク質をコード化している「センス」核酸に相補的な核酸配列を含むことができる。アンチセンス核酸は、全てのＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター・コード鎖に、または、その部分だけに相補的であることができる。他の実施態様において、アンチセンス核酸分子は、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプターをコード化している核酸配列のコード鎖の「非コード領域」（例えば、５’および３’非翻訳領域）にアンチセンスである。アンチセンス剤は、例えば、約８〜約８０の核酸塩基、（すなわち、約８〜約８０のヌクレオチド）、例えば、約８〜約５０の核酸塩基、または約１２〜約３０の核酸塩基を含むことができる。アンチセンス化合物は、リボザイム、外部ガイド配列（ＥＧＳ）、オリゴヌクレオチド（オリゴザイム）、および、標的核酸にハイブリダイズして、その発現を調整する触媒性ＲＮＡまたは触媒性オリゴヌクレオチドを含む。アンチセンス化合物は、標的遺伝子の配列と相補的である少なくとも８つの連続的な核酸塩基の範囲を含むことができる。オリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズ可能なその標的核酸配列に１００％相補的である必要はない。標的に対するオリゴヌクレオチドの結合が有用性の低下を引き起こすために標的分子の通常機能を妨げるときに、オリゴヌクレオチドは特異的にハイブリダイズ可能であり、そして、対象外の配列へのオリゴヌクレオチドの非特異的な結合を回避するために、特異的結合が要求される条件の下で、すなわち、生理的条件の下で、インビボでの分析または治療的な処置の場合、または、インビトロ分析の場合、相補性の充分な段階がある。
【０１６６】
ｍＲＮＡを有するアンチセンスオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成は、ｍＲＮＡの通常機能の一つ以上を妨げることができる。阻害されるｍＲＮＡの機能は、すべての主要な機能、例えば、タンパク質翻訳の部位に対するＲＮＡの転位、ＲＮＡからのタンパク質の翻訳、一つ以上のｍＲＮＡ種を得るＲＮＡのスプライシングおよびＲＮＡによって関与される異かもしれない触媒活性を含む。ＲＮＡに対する特異的タンパク質の結合は、ＲＮＡへのアンチセンス・オリゴヌクレオチド・ハイブリッド形成によっても阻害されるかもしれない。
【０１６７】
典型的なアンチセンス化合物は、特異的に標的核酸にハイブリダイズするＤＮＡまたはＲＮＡ配列、例えば、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプターをコード化しているｍＲＮＡを含む。補完的な領域は、約８〜約８０の間で延長することができる。その化合物は、一つ以上の変更された核酸塩基を含むことができる。変更された核酸塩基は、例えば、５置換ピリミジン、例えば、５−ヨードウラシル、５−ヨードシトシンおよびＣ５―プロピニル・ピリミジン、例えば、Ｃ５−プロピニル・シトシンおよびＣ５−プロピニル・ウラシルを含むかもしれない。他の適切な変更された核酸塩基は、N4 --(C1 -C12)アルキル・アミノ・シトシンおよびN4,N4 --(C1 -C12)ジアルキル・アミノ・シトシンを含む。変更された核酸塩基は、７−置換−８−アザ−７−ジアザプリンおよび７−置換−７−ジアザプリン、例えば、７−ヨウ化−７−ジアザプリン、７−シアノ−７−ジアザプリン、７−アミノカルボニル−７−ジアザプリンも含むかもしれない。これらの例は、６−アミノ−７−ヨウ化−７−ジアザプリン、６−アミノ−７−シアノ−７−ジアザプリン、６−アミノ−７−アミノカルボニル−７−アザプリン、２−アミノ−６−ドロキシ−７−ヨウ化−７−ジアザプリン、２−アミノ−６−ヒドロキシ−７−シアノ−７−ジアザプリンおよび２−アミノ−６−ヒドロキシ−７−アミノカルボニル−７−ジアザプリン含む。さらに、N6 -メチル・アミノ・アデニンおよびN6,N6 -ジメチルアミノ・アデニンを含むN6 --(C1 -C12)アルキル・アミノプリンおよびN6,N6 --(C1 -C12)ジアルキル・アミノプリンも、適切な変更された核酸塩基である。同様に、例えば、６‐チオグアニンを含んでいる他の６置換プリンは、適切な変更された核酸塩基を構成するかもしれない。他の適切な核酸塩基は、２‐チオウラシル、８−臭化アデニン、８−臭化グアニン、２−フルオロアデニンおよび２−フルオロ・グアニンを含む。上述した変更された核酸塩基のいずれかの誘導体も、適切である。前述の化合物のいずれかの置換基は、Ｃ１−Ｃ３０アルキル、Ｃ２−Ｃ３０アルケニル、Ｃ２―Ｃ３０アルキニル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ハロゲン、アミノ、アミド、ニトロ、チオ、アルコキシル、スルホニル、カルボキシル、アルキルカルボニル、アルコキシカルボニルなどを含むかもしれない。他のタイプの核酸試剤の説明も、利用可能である。例えば、U.S. Patent Nos. 4,987,071;. 5,116,742; および 5,093,246; Woolf et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA; Antisense RNA and DNA, D.A. Melton, Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988); 89:7305-9; Haselhoff and Gerlach (1988) Nature 334:585-59; Helene, C. (1991) Anticancer Drug Des. 6:569-84; Helene (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:27-36; and Maher (1992) Bioassays 14:807-15、参照。
【０１６８】
本発明のアンチセンス核酸分子は、被験者に典型的に投与（例えば、組織部位の直接噴射によって）されるか、または、それらがＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプタータンパク質をコード化している細胞ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡによって交雑するかまたは結合するように、in situに生成され、このことにより、例えば、転写および／または翻訳を阻害することによって、タンパク質の発現を阻害する。別の実施態様では、アンチセンス核酸分子は、選択セルを目標とするために変更されることができ、そして、全身的に投与される。全身投与のために、それらが選択された細胞表面に発現されるレセプターまたは抗原に特異的に結合するように、例えば、アンチセンス核酸分子を細胞表面レセプターまたは抗原と結合するペプチドまたは抗体に結合することによって、アンチセンス分子は修正されることができる。アンチセンス核酸分子は、本明細書において記載されているベクターを使用して、細胞に伝達されることもできる。アンチセンス分子の充分な細胞内濃度を達成するために、アンチセンス核酸分子が強いpol IIまたはpol IIIプロモータの制御下に配置されるベクター構造物が好ましい。
【０１６９】
さらに別の実施態様では、本発明のアンチセンス核酸分子は、α-アノマー核酸分子である。α-アノマー核酸分子は、相補ＲＮＡと特異的二本鎖のハイブリッドを形成し、通常のβ-単位とは反対に、鎖は、互いに平行している。アンチセンス核酸分子は、２’-ｏ-メチル・リボヌクレオチド(Inoue et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:6131-6148)、または、キメラＲＮＡ-ＤＮＡの類似体(Inoue et al. (1987) FEBS Lett. 215:327-330)からなることもできる。
【０１７０】
ｓｉＲＮＡｓは、選択的に突出部を含む小さい二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡｓ）である。例えば、ｓｉＲＮＡの二重領域は、約１８〜２５の長さのヌクレオチド、例えば、１９、２０、２１、２２、２３、または２４の長さのヌクレオチドである。通常は、ｓｉＲＮＡ配列は、正確に標的ｍＲＮＡと相補的である。特に、ｄｓＲＮＡｓおよびｓｉＲＮＡｓは、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）の遺伝子発現を静まらせるために用いることができる。ｉＲＮＡｓは、２９-塩基対ステムおよび２-ヌクレオチド３’突出部を有する短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡｓ）も含む。例えば、Clemens et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6499-6503; Billy et al. (2001) Proc. Natl. Sci. USA 98:14428-14433; Elbashir et al. (2001) Nature. 411:494-8; Yang et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:9942-9947; Siolas et al. (2005), Nat. Biotechnol. 23(2):227-31; 20040086884; U.S. 20030166282; 20030143204; 20040038278; and 20030224432、参照。
【０１７１】
さらに他の例では、本発明のアンチセンス核酸は、リボザイムである。ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター―コード化核酸への特異性を有するリボザイムは、本明細書（すなわち、配列番号１または配列番号３）において開示されるＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプターｃＤＮＡの核酸配列と相補的な一つ以上の配列、および、ｍＲＮＡの裂開に関する役割を持つ公知の触媒配列を有する配列を含むことができる(例えば、U.S. Pat. No. 5,093,246 or Haselhoff and Gerlach (1988) Nature 334:585-591、参照)。例えば、テトラヒメナＬ−１９ ＩＶＳ ＲＮＡの誘導体は、その活性部位の核酸配列が、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター―コード化ｍＲＮＡ中において切断される核酸配列に相補的に構築されることができる。例えば、Cech et al. U.S. Patent No. 4,987,071; and Cech et al. U.S. Patent No. 5,116,742、参照。別の実施態様では、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプターｍＲＮＡは、特異的なリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡをＲＮＡ分子のプールから選択するために用いられることができる。例えば、Bartel, D. and Szostak, J.W. (1993) Science 261:1411-1418、参照。
【０１７２】
ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター遺伝子発現は、標的細胞のＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター遺伝子の転写を防止する三重ら旋構造を形成するために、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプターの調節領域（例えば、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター・プロモータおよび／またはエンハンサ）と相補的な標的としている核酸配列によって阻害されることができる。一般的に、 Helene, C. (1991) Anticancer Drug Des. 6:569-84; Helene, C. i (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:27-36; and Maher, L.J. (1992) Bioassays 14:807-15、参照。三重らせん形態を目標とすることができる潜在的配列は、いわゆる「スイッチバック」核酸分子をつくることによって増加することができる。スイッチバック分子は、二重鎖の最初の１つの鎖、そして、それから、もう一つの鎖で塩基対を形成するように、交互の５´−３、３´−５の方法において合成され、プリンまたはピリミジンの大きい伸展が二重鎖の１つの鎖に存在する必要を除去する。
【０１７３】
本発明は、検出可能的に標識されたオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブ分子も提供する。通常は、このようなラベルは、化学発光、蛍光性、放射能、比色計である。
【０１７４】
ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター核酸分子は、例えば、分子の安定性、ハイブリッド形成または溶解性を改善するために、塩基部分、糖残基またはリン酸塩骨格鎖において修飾されることができる。修飾を有する合成オリゴヌクレオチドの非限定的な例は、Toulme (2001) Nature Biotech. 19:17 and Faria et al. (2001) Nature Biotech. 19:40-44を参照。このようなホスホラミダイト・オリゴヌクレオチドは、有効なアンチセンス剤であることができる。
【０１７５】
例えば、核酸分子のデオキシリボース・リン酸塩骨格は、ペプチド核酸を生成するために変更されることができる(Hyrup B. et al. (1996) Bioorganic & Medicinal Chemistry 4: 5-23参照)。本明細書で用いられる場合、用語「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、核酸の疑似体、例えば、ＤＮＡ疑似体を意味し、ここにおいて、デオキシリボース・リン酸塩骨格鎖は、偽ペプチド骨格鎖によって置き換えられ、そして、４つの天然の核酸塩基だけが保持される。ＰＮＡの中性の骨格鎖は、低いイオン強度の状態の下で、ＤＮＡおよびＲＮＡに特異的ハイブリッド形成を許すことができる。ＰＮＡオリゴマの合成は、Hyrup B. et al. (1996) supra and Perry-O'Keefe et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 14670-675に開示される標準的な固相ペプチド合成プロトコルを使用して、実施されることができる。
【０１７６】
ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター核酸分子のＰＮＡｓは、治療的および診断用アプリケーションで使われることができる。例えば、ＰＮＡｓは、例えば、転写または翻訳停止を誘発するかまたは複製を阻害することによって、遺伝子発現の配列特異的な調節のためのアンチセンスまたはアンチジーン剤として使われることができる。ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター核酸分子のＰＮＡｓは、他の酵素（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ(Hyrup B. et al. (1996) supra)）と併用して使われるときに「人工制限酵素」として、または、ＤＮＡ塩基配列決定またはハイブリッド形成のためのプローブまたはプライマーとして、（例えば、ＰＮＡに誘導されたＰＣＲクランピングによって）遺伝子の単一の塩基対突然変異の分析において使われることもできる(Hyrup B. et al. (1996) supra; Perry-O'Keefe supra)。
【０１７７】
他の実施態様において、オリゴヌクレオチドは、他の追加される群、例えば、ペプチド（例えば、インビボで宿主細胞レセプターを標的とするために）または細胞膜全体(例えば、Letsinger et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6553-6556; Lemaitre et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:648-652; W088/09810、参照)、または、血液脳関門(例えば、W0 89/10134、参照)の輸送を容易にしている剤を含んでもよい。さらに、オリゴヌクレオチドは、ハイブリッド形成を起動する裂開試薬(例えば、Krol et al. (1988) Bio-Techniques 6:958-976、参照) または挿入剤(例えば、Zon (1988) Pharm. Res. 5:539-549、参照)によって修正されることができる。このために、オリゴヌクレオチドは、他の分子（例えば、ペプチド、ハイブリッド形成起動する架橋剤、輸送試薬またはハイブリッド形成を起動する裂開試薬）に結合されてもよい。
【０１７８】
III．組換え発現ベクター、宿主細胞および遺伝子工学による細胞
別の実施態様においては、本発明は、本明細書において記載されているポリペプチドをコード化している核酸を含む、ベクター、好ましくは発現ベクターを含む。本明細書で用いられる場合、「ベクター」という用語は、それが結合された他の核酸を輸送することができる核酸分子を指し、そして、プラスミド、コスミドまたはウイルス性ベクターを含むことができる。ベクターは自律増殖ができ、または、それは宿主ＤＮＡに統合されることができる。ウィルス・ベクターは、例えば、複製に欠陥あるレトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルスを含む。
【０１７９】
ベクターは、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター核酸を、宿主細胞の核酸の発現に適している形で含むことができる。好ましくは、組換え発現ベクターは、有効に発現される核酸配列に結合される一つ以上の制御配列を含む。「制御配列」という用語は、プロモータ、エンハンサおよび他の発現調節領域（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含む。制御配列は、組織に特異的な調節性のおよび／または誘導可能な配列と同様に、核酸配列の構成要素の発現を導くものを含む。発現ベクターの設計は、形質転換された宿主細胞、要求されるタンパク質の発現レベルなどの選択のような要因に依存することができる。本発明の発現ベクターは、このことにより、本明細書において記載されている核酸によってコード化される融合タンパク質またはポリペプチド（例えば、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプタータンパク質、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプタータンパク質の変異体形、融合タンパク質など）を含む、タンパク質またはポリペプチドを生じるために、宿主細胞に導入されることができる。
【０１８０】
本明細書において使われるとき、「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）という用語は、組換え発現ベクターが導入された細胞を指すことを意図する。このような用語は、特定の被験者細胞だけでなく、このような細胞の子孫をも指すことを意図すると理解すべきである。特定の修飾が、突然変異または環境影響のため次の生成で起こるかもしれないので、このような子孫は、事実、親細胞と同一ではないかもしれないが、本明細書で用いられるとき、依然として「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。
【０１８１】
本発明の組換え発現ベクターは、原核生物であるか真核生物細胞のＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプタータンパク質の発現のために設計されることができる。例えば、本発明のポリペプチドは、大腸菌、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現ベクターを使用して）、酵母菌または哺乳動物細胞において発現されることができる。適切な宿主細胞は、更にGoeddel, (1990) Gene Expression Technology:  Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA中に開示される。別の実施態様では、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモータ制御配列およびＴ７ポリメラーゼを使用して、インビトロで転写または翻訳されることができる。
【０１８２】
原核生物のタンパク質の発現は、多くの場合、融合または非融合タンパク質の発現を導いている構成的または誘導可能なプロモータを含んでいるベクターを有する大腸菌において実施される。融合ベクターは、多くのアミノ酸を、コード化されるタンパク質に、通常、組換えタンパク質のアミノ末端に加える。このような融合ベクターは、通常は３つの目的を満たす。１）組換えタンパク質の発現を増加させるため；２）組換えタンパク質の溶解性を増加させるため；そして、３）親和性による精製におけるリガンドとして作用することによる組換え型タンパク質の精製を補助するため。融合タンパク質の精製に続く融合部分から組換えタンパク質の分離を可能にするために、しばしば、タンパク分解性切断部位は、融合部分および組換えタンパク質が結合する所に導入される。このような酵素およびそれらの同族の認識配列は、Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼを含む。典型的な融合発現ベクターは、標的組換え型タンパク質にグルタチオンＳ―トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質またはプロテインＡを、それぞれ、融合させるｐＧＥＸ(Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B. and Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40)、ｐＭＡＬ(New England Biolabs, Beverly, MA)およびｐＲＩＴ５(Pharmacia, Piscataway, NJ)を含む。
【０１８３】
精製された融合タンパク質は、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター活性分析（例えば、以下に詳細に記載されている直接的な分析または競合的な分析）において、または、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプタータンパク質に特異的な抗体を生成するために使われることができる。好ましい実施例において、本発明のレトロウイルスの発現ベクターにおいて発現される融合タンパク質は、照射を受けたレセプターにその後、移植される骨髄細胞を感染させるために用いられることができる。充分な時間が過ぎた（例えば、６週）あと、被験者レセプターの症状はそれから診察される。
【０１８４】
大腸菌における組換えタンパク質の発現を最大にすることは、組換えタンパク質をタンパク分解性に切断する障害性の能力を有する宿主細菌においてタンパク質を発現することである(Gottesman, S., (1990) Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California 119-128)。他のストラテジーは、発現ベクターに挿入される核酸の核酸配列を変えることであり、それによって、各アミノ酸の個々のコドンが大腸菌において優先して利用されるようにすることである(Wada et al., (1992) Nucleic Acids Res. 20:2111-2118)。本発明の核酸配列のこのような改変は、標準的なＤＮＡ合成技術によって行われることができる。
【０１８５】
ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター発現ベクターは、酵母発現ベクター、昆虫細胞における発現のためのベクター、例えば、バキュロウイルス発現ベクター、または、哺乳動物細胞の発現に適しているベクターであることができる。
【０１８６】
哺乳動物細胞において用いられるときに、発現ベクターの制御機能はウイルス性調節エレメントによって提供されることができる。例えば、一般的に用いられるプロモータは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびサルウイルス４０から誘導される。
【０１８７】
他の実施態様において、プロモータは、誘導性プロモータ、例えば、ステロイドホルモン、ポリペプチドホルモン、（例えば、シグナル伝達経路によって）または、異種ポリペプチド（例えば、テトラサイクリン誘導可能な系、「Ｔｅｔ−Ｏｎ」および「Ｔｅｔ−Ｏｆｆ」；Clontech Inc., CA, Gossen and Bujard (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547, および Paillard (1989) Human Gene Therapy 9:983参照）によって制御されるプロモータである。
【０１８８】
他の実施態様において、組換え哺乳類の発現ベクターは、特定の細胞タイプにおいて、優先して核酸の発現を導くことができる（例えば、組織特異的な調節エレメントは、核酸を発現するために用いられる）。適切な組織特異なプロモータの非限定的な例は、アルブミン・プロモータ（肝臓特異的；Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1:268-277）、リンパ様特異的プロモータ(Calame and Eaton (1988) Adv. Immunol. 43:235-275)、Ｔ細胞レセプター(Winoto and Baltimore (1989) EMBO J. 8:729-733)および免疫グロブリン(Banerji et al. (1983) Cell 33:729-740; Queen and Baltimore (1983) Cell 33:741-748)の特定のプロモーター、ニューロン特異的プロモータ（例えば、神経細線維プロモータ：Byrne and Ruddle (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5473-5477）、膵臓特異的プロモータ(Edlund et al. (1985) Science 230:912-916)、そして、乳腺特異的プロモータ、（例えば、ミルク乳漿プロモータ；U.S. Patent No. 4,873,316 and European Application Publication No. 264,166）を含む。発生的に調整されたプロモータ、例えば、ネズミｈｏｘプロモータ(Kessel and Gruss (1990) Science 249:374-379) およびα−フェトプロテイン・プロモータ(Campes and Tilghman (1989) Genes Dev. 3:537-546)も含まれる。
【０１８９】
本発明は、更に、アンチセンス方向の発現ベクターにクローンされる本発明のＤＮＡ分子からなる組換え発現ベクターを提供する。アンチセンス方向においてクローンされる核酸に有効に結合される制御配列（例えば、ウイルス・プロモータおよび／またはエンハンサ）は、選択されることができ、それは、様々な細胞タイプのアンチセンスＲＮＡの構成的な、組織特異的な、または、細胞タイプ特異的な発現を導く。アンチセンス発現ベクターは、組換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒ウイルスの形であることができる。
【０１９０】
本発明の他の実施態様は、本明細書において記載されている核酸分子、例えば、宿主細胞のゲノムの特異的な部位への相同的な再結合を許す配列を含む、組換え発現ベクターまたはＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター核酸分子の範囲内のＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター核酸分子を含む宿主細胞を提供する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、交換可能に本明細書において使われる。このような用語は、特定の被験者細胞だけでなく、このような細胞の子孫または潜在的子孫も指す。特定の修飾が突然変異または環境影響のため後継の世代で起こるかもしれないので、このような子孫は、実際には、親細胞と同一でないかもしれないが、本明細書で用いられる用語の範囲内にまだ含まれる。
【０１９１】
宿主細胞は、任意の原核生物であるか真核生物細胞であることができる。例えば、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプタータンパク質は、細菌性細胞（例えば大腸菌）、昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞、例えば、ＣＯＳ−７細胞、ＣＶ−１起源ＳＶ４０細胞：Gluzman (1981) Cell 23:175-182）において発現されることができる。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。
【０１９２】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換または形質導入技術を介して宿主細胞に導入されることができる。本明細書で用いられる場合、用語「形質転換」および「形質導入」は、外来の核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための、様々な人工的に認識された技術（リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストランによって媒介される形質移入、リポフェクションまたは電気穿孔法を含む）を指すことを意図する。
【０１９３】
本発明の宿主細胞は、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプタータンパク質を生産する（すなわち、発現する）ために用いられることができる。したがって、本発明は、更に、本発明の宿主細胞を用いたＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプタータンパク質を生産する方法を提供する。一の実施態様において、その方法は、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプタータンパク質が生産されるこのような適切な培地で、本発明の宿主細胞（それに、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプタータンパク質をコード化している組換え発現ベクターが導入された）を培養することを含む。他の実施態様において、この方法は、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプタータンパク質を培地または宿主細胞から分離することを更に含む。
【０１９４】
別の実施態様においては、本発明は、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター導入遺伝子を含み、または、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプターを誤って発現する細胞または細胞の精製された調製物を特徴とする。細胞調製物は、ヒトまたは非ヒトの細胞、例えば、齧歯目の細胞（例えば、マウスまたはネズミ細胞、ウサギ細胞またはブタ細胞）からなることができる。好ましい実施態様において、細胞は、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター導入遺伝子、例えば、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプターの非相同の形態、例えば、（非ヒト細胞の場合）ヒトに由来する遺伝子を含む。ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター導入遺伝子は、例えば、過剰発現するかまたは過小発現して誤った発現がなされることがある。他の好ましい実施態様において、細胞は、例えば、内因性のＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター（例えば、発現が途絶する遺伝子、例えば、ノックアウト）を誤って発現する遺伝子を含む。このような細胞は、変異される、または、誤って発現されるＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター対立遺伝子に関する疾患を調査するために、または、に、または、薬物スクリーニングに用いるために、モデルとして役立つことができる。
【０１９５】
細胞、好ましくはヒト細胞、例えば、線維芽細胞も、また提供され、そこでは、内因性のＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプターは、通常、内因性のＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター遺伝子の発現を制御しない制御配列の制御下にある。細胞（例えば、セル・ラインまたは微生物）の中の内因性遺伝子の発現の特徴は、挿入された調節性の要素が内因性のＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター遺伝子に使用可能な状態で結合されるように、細胞のゲノムに異種性のＤＮＡ調節性の要素を挿入することによって修正されることができる。例えば、「転写的にサイレントな」、例えば、正常に発現されないか、または単に非常に低レベルで発現される内因性のＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター遺伝子は、その細胞の正常に発現された遺伝子産物の発現を促進することができる調節性の要素を挿入することによって、活性化されるかもしれない。標的とされる相同的組換えのような技術は、Chappel, US 5,272,071; WO 91/06667, published in May 16, 1991中で記載されている異種性のＤＮＡを挿入するために用いられることができる。
【０１９６】
好ましい実施態様において、本明細書において記載されている組換え型細胞は、被験者の代償療法の用に供することができる。例えば、使用可能な状態で誘導性プロモータ（例えば、ステロイドホルモン・レセプターを調整されたプロモータ）に結合されるＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター・ポリペプチドをコード化している核酸は、ヒトまたは非ヒト、例えば、哺乳動物（例えば、豚の組換え型細胞）に導入される。細胞は、培養されて、生物適合材料（例えば、ポリ・リシン・アルギン酸）にカプセル化されて、被験者にその後、インプラントされた。例えば、Lanza (1996) Nat. Biotechnol. 14:1107; Joki et al. (2001) Nat. Biotechnol. 19:35; and U.S. Patent No. 5,876,742、参照。ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター・ポリペプチドの生産は、被験者に試薬（例えば、ステロイドホルモン）を投与することによって、被験者において調整されることができる。他の好ましい実施態様において、インプラントされた組換え型細胞は、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター・ポリペプチドに特異的な抗体を発現し、そして、分泌する。抗体は、本明細書において記載されている任意の抗体または任意の抗体誘導体であることができる。
【０１９７】
IV. スクリーニング分析
本発明は、モジュレータ、すなわち、候補またはテスト化合物または試薬（例えば、タンパク質、ペプチド、タンパク質疑似体、ペプトイド、低分子または他の薬物）を特定する方法（また、本明細書において、「スクリーニング分析」と称される）を提供し、それは、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプタータンパク質と結合して、例えば、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター発現またはＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター活性への刺激性または抑制性作用を有するか、または、例えば、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター基質の発現または活性への刺激性または抑制性作用を有する。このように特定される化合物は、治療的なプロトコルにおいて、標的遺伝子産物の生物学的機能を詳しく述べるために、または、通常の標的遺伝子の相互作用を途絶させる化合物を特定するために、標的遺伝子産物（例えば、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター遺伝子）の活性を調整するために用いられることができる。一の実施態様において、本発明は、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプタータンパク質またはポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分に結合するか、または、その活性を調整する候補またはテスト化合物をスクリーニングするための分析を提供する。
【０１９８】
したがって、本発明は、内皮細胞または血管機能を調整する、化合物、例えば、テスト化合物を特定する方法または分析を提供する。その方法または分析は、以下からなる：(i)（選択的に）例えば、ＢＭＰ−１０またはＢＭＰ−１０レセプターに相互作用、例えば、結合するテスト試薬を提供または特定すること；および／または、(ii) 対照（例えば、対照サンプル）と比較して、テスト試薬の存在下のＢＭＰ−１０応答性細胞（例えば、血管および／または心臓の細胞および／または組織）の活性の変化を評価すること。
【０１９９】
テスト化合物または試薬は、抗体分子；ペプチド；可溶性ＢＭＰ−１０レセプターまたはその融合；結合領域融合変異体；低分子（例えば、組合せのまたは天然の生産物ライブラリのメンバー）；核酸；アンチセンス分子；リボザイム；ＲＮＡｉ；三重らせん分子；または任意のそれらの組み合わせであることができる。一の実施態様において、テスト化合物は、ＢＭＰ−１０またはＢＭＰ−１０レセプター・ポリペプチドまたは核酸の活性または発現を調整（例えば、減少または増加）する。例えば、ＢＭＰ−１０またはＢＭＰ−１０レセプター核酸の発現は、例えば、ｍＲＮＡ転写、ｍＲＮＡ安定性などを変更することによって、変調されることができる。
【０２００】
実施態様において、評価ステップは、以下の一つ以上と接触することを含み、：ＢＭＰ−１０またはＢＭＰ−１０レセプター・ポリペプチド（例えば、本明細書において記載されているＢＭＰ−１０またはＢＭＰ−１０レセプター）、またはＢＭＰ−１０またはＢＭＰ−１０レセプターをコード化している核酸（テスト化合物を有する）；そして、所定レベル（例えば、テスト化合物のないコントロール試料）と比較して、テスト化合物がある場合には、ＢＭＰ−１０またはＢＭＰ−１０レセプターのポリペプチドまたは核酸の一つ以上の活性の変化を評価することを含む。
【０２０１】
実施態様において、評価ステップは、ＢＭＰ−１０またはＢＭＰ−１０レセプター・ポリペプチド（例えば、本明細書において記載されているＢＭＰ−１０またはＢＭＰ−１０レセプター）、またはＢＭＰ−１０またはＢＭＰ−１０レセプターをコード化している核酸（テスト化合物を有する）の一つ以上と接触すること、および、所定レベル（例えば、テスト化合物のないコントロール試料）と比較して、テスト化合物がある場合のＢＭＰ−１０またはＢＭＰ−１０レセプターのポリペプチドまたは核酸の一つ以上の活性の変化を評価することを含む。接触ステップは、インビトロ（培養細胞、例えば、ＨＵＶＥＣＳまたはＨＡＥＣＳまたは再構成された系において）、または、インビボ（例えば、非ヒトの被験者、例えば、ＢＭＰＲ２またはＮＫＸ２−５遺伝子の突然変異を有する動物モデルにテスト化合物を投与することによって）で有効であることができる。接触ステップおよび／またはテスト化合物の投与は、繰り返されることができる。
【０２０２】
実施態様において、以下の一つ以上の対照、例えば、対照サンプル（例えば、テスト化合物にさらされないコントロールサンプル）と比較して、テスト化合物がある場合のＢＭＰ−１０応答性細胞（例えば、血管および／または心臓の細胞および／または組織）の活性の変化は、変化を測定することによって評価される：(i) Ｓｍａｄタンパク質のリン酸エステル化（例えば、Ｓｍａｄ１、５および／または８のリン酸エステル化）；(ii) ミオスタチン、エンドグリンおよび／または抑制性Ｓｍａｄの遺伝子発現（例えば、Ｓｍａｄ６および／または７の発現の誘導）；(iii) プロ血管形成遺伝子（例えば、ＶＥＧＦ、ＩＤ１およびＩＤ２）の発現；(iv) Ｒａｓ関連タンパク質−１ａ（Ｒａｐ１ａ）の発現；(v) 図22−28において特定されたインビトロまたはインビボの内皮細胞のＢＭＰ−１０刺激に応答する一つ以上の遺伝子の発現；(vi) ストロマ由来の分化因子（ＳＤＦ−１）、および／または、マトリックスメタロペプチダーゼ９（ＭＭＰ−９）の血清レベル；および／または、(vii) 血管異常（例えば、血管異形成、大量出血、毛細管拡張症、および／または動静脈奇形）。実施態様において、一つ以上の(i)−(iii)および (vi)における減少、そして、(iv)における増加は、ＢＭＰ−１０機能のアンタゴニストを表し、そして、このように、ＢＭＰ−１０拮抗作用が望ましい、血管および／または心臓性の疾患の処置の候補を表わす。他の実施態様において、一つ以上の(i)-(iii)および(vi)における増加、そして、(iv)における減少は、ＢＭＰ−１０機能のアゴニストを表し、そして、このように、ＢＭＰ−１０アゴニストが望ましい血管および／または心臓性の疾患の処置の候補を表わす。
【０２０３】
特定の実施態様において、テスト化合物であるＢＭＰ−１０またはＢＭＰ−１０レセプターの間の相互作用が評価される。このような相互作用は、形態の変化を検出することによって評価され、および／または、テスト化合物とＢＭＰ−１０および／またはＢＭＰ−１０レセプター間の複合体の安定性は、以下の一つ以上を検出することによって決定されることができる。：例えば、生化学検出、親和性に基づく検出（例えば、ウエスタンブロット、アフィニティーカラム）、免疫沈降法、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）に基づく分析、分光光度的な手法（例えば、円偏光二色性、吸光度および溶液特性の他の測定）による複合体自体の結合または物理的な形態の変化；シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄｓのリン酸エステル化）および／またはＢＭＰ−１０関連の遺伝子の転写活性の変化（例えば、増加または減少）；ストロマ由来の分化因子（ＳＤＦ−１）および／またはマトリックスメタロペプチダーゼ９（ＭＭＰ−９）の血清レベルの変化（例えば、増加または減少）；および／または、血管（例えば、血管異形成、大量出血、毛細管拡張症、および／または、動静脈奇形）の異常の変化（例えば、増加または減少）。
【０２０４】
一の実施態様において、テスト化合物は、同じまたは異なる分析において確認され、再テストされる。例えば、テスト化合物は、インビトロまたは無細胞系において確認され、動物モデルまたは細胞に基づく分析において再テストされる。分析の任意の順序または組合せが、用いられることができる。例えば、高いスループット分析法が、動物モデルまたは組織培養と組み合わせて用いられることができる。分析の任意の順序または組合せが、使われることができる。例えば、ハイスループット分析法が、動物モデルまたは組織培養と組み合わせて用いられることができる。
【０２０５】
他の実施態様において、方法または分析は、近接に依存するシグナル発生に基づくステップ、例えば、第１の融合タンパク質（例えば、ＢＭＰ−１０部分からなる融合タンパク質）および第２の融合タンパク質（例えば、ＢＭＰ−１０レセプターからなる融合タンパク質）を含む２ハイブリッド分析を提供すること、および、２つのハイブリッド分析法が複合体の形態および／または安定性の変化を検出する条件、例えば、複合体の形態がリポーター遺伝子の転写活性化を開始する条件で、テスト化合物を２ハイブリッド分析と接触することを含む。
【０２０６】
１つの非限定的な実施態様において、ＢＭＰ−１０の活性部位の三次元構造は、酵素および周知の抑制物質によって形成される複合体を結晶化させることによって決定される。合理的な薬物設計は、それから、周知の抑制物質の構造を改変することによって、または、酵素の活性部位と結合する低分子化合物を設計することによって、新しいテスト試薬を特定するために用いられる。同様に、合理的な薬物設計は、ＢＭＰ−１０レセプターのアンタゴニストを設計するためにも用いられることができ、それは、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプターの生産を調整する際にも有用であることを、当業者は認識する。
【０２０７】
本発明のテスト化合物は、公知技術の組合せのライブラリ法（以下を含む）の多数のアプローチのいずれかを用いて得られることができる。：生物学的ライブラリ；ペプトイド・ライブラリ（ペプチドの機能を有するが、酵素的分解に抵抗し、生理活性を維持する、新規な非ペプチド骨格鎖を有する分子のライブラリ；Zuckermann, R.N. et al. (1994) J. Med. Chem. 37:2678-85、参照）；空間的にアドレス指定可能な平行した固相または液相ライブラリ；ディコンボリューションを必要としている合成ライブラリ方法；「１−ビーズ、１−化合物」ライブラリ方法；そして、アフィニティークロマトグラフィ選択を用いた合成ライブラリ方法。その他の４つのアプローチは、ペプチド、非ペプチド、オリゴマまたは低分子ライブラリに適用できるが、生物学的ライブラリおよびペプトイド・ライブラリのアプローチは、ペプチド・ライブラリに限定される。
【０２０８】
分子ライブラリの合成の方法の例は、技術文献において見つけられることができえる。例えば、：DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909; Erb et al. (1994)  Proc. Natl. Acad. Sci. USA  91:11422; Zuckermann et al. (1994). J. Med. Chem. 37:2678; Cho et al. (1993) Science 261:1303; Carrell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; および Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37:1233。
【０２０９】
化合物のライブラリは、溶液(例えば、Houghten (1992) Biotechniques 13:412-421)、または、ビーズ(Lam (1991) Nature 354:82-84)、チップ(Fodor (1993) Nature 364:555-556)、細菌(Ladner, U.S. Patent No. 5,223,409)、胞子(Ladner U.S. Patent No. 5,223,409)、プラスミド(Cull et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:1865-1869)、または、ファージ(Scott and Smith (1990) Science 249:386-390; Devlin (1990) Science 249:404-406; Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci.  87:6378-6382; Felici (1991) J. Mol. Biol. 222:301-310; Ladner supra.)において提示されてもよい。
【０２１０】
一の実施態様において、分析は、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプタータンパク質またはその生物学的に活性な部分を発現する細胞がテスト化合物に接触される細胞に基づく分析であり、そして、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター活性を調整するテスト化合物の能力は測定される。ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター活性を調整するテスト化合物の能力を決定することは、例えば、Ｓｍａｄタンパク質リン酸エステル化および／または転写活性をモニタリングによって達成されることができる。細胞は、例えば、哺乳類の由来、例えば、ヒト（例えば、ＨＵＶＥＣＳまたはＨＡＥＣＳ）であることができる。
【０２１１】
化合物（例えば、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター基質）へのＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター結合を調整する、または、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプターと結合するテスト化合物の能力も評価されることができる。これは、例えば、化合物（例えば、基質）を放射性同位元素または酵素標識に連結することによって達成されることができ、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプターに対する化合物（例えば、基質）の結合は、複合体の標式化合物（例えば、基質）を検出することによって測定されることができる。別の実施態様では、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプターは、複合体のＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター基質へのＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター結合を調整するテスト化合物の能力をモニターするために、放射性同位元素または酵素標識に連結することができる。例えば、直接的または間接的に化合物（例えば、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター基質）は、125I、35S、14Cまたは3Hでラベルされることができ、そして、放射性同位元素は、放射性エミッションを直接に計数することによって、または、シンチレーション計数によって検出されることができる。別の実施態様では、化合物は、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼまたはルシフェラーゼ、および、生成物への適切な基質の転換の測定によって検出される酵素標識により酵素的にラベルされることができる。
【０２１２】
反応体のいずれかの標識の有無にかかわらずＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプターと相互作用する化合物（例えば、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター基質）の能力は、評価されることができる。例えば、ミクロ生理学メーターは、化合物またはＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプターの標識のないＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプターを有する化合物の相互作用を検出するために用いられることができる。McConnell, H. M. et al. Science 257:1906-1912, 1992。本明細書で用いられる場合、「ミクロ生理学メーター」（例えば、Ｃｙｔｏｓｅｎｓｏｒ）は、細胞が光アドレス指定可能な電位差測定のセンサ（ＬＡＰＳ）を使用しているその環境を酸性化する割合を測定する分析機器である。この酸性化割合の変化は、化合物とＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプターの間の相互作用のインジケータとして使われることができる。
【０２１３】
さらに別の実施態様では、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプタータンパク質またはその生物学的に活性な部分がテスト化合物によって接触され、そして、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプタータンパク質またはその生物学的に活性な部分と結合するテスト化合物の能力が評価される無細胞分析が提供される。本発明の分析において使われるＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプタータンパク質の好適な生物学的に活性な部分は、非ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０受容分子（例えば、高い表層可能性スコアを有する断片）を有する相互作用に関与する断片を含む。
【０２１４】
単離されたタンパク質（例えば、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプタータンパク質またはその生物学的に活性な部分）の可溶性のおよび／または膜結合形態が、本発明の無細胞分析において用いられることができる。タンパク質の膜結合形態が使われるときに、可溶化剤を利用することは、望ましいかもしれない。そのような可溶化剤の例は、以下のものを含む。非イオン性界面活性剤、例えばｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Triton（登録商標） X-100、Triton（登録商標） X-114、Thesit（登録商標）、Isotridecypoly（エチレン・グリコールエーテル）ｎ、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアミノ］−１−プロパン・スルホン酸塩（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−胆汁アミド・プロピル）ジメチルアミノ］−２−ヒドロキシ−１−プロパン・スルホン酸塩（ＣＨＡＰＳＯ）またはＮ−ドデシル＝Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパン・スルホン酸塩。
【０２１５】
無細胞分析は、２つの成分が相互作用および結合を許すのに十分な条件および時間の下で、標的遺伝子タンパク質およびテスト化合物の反応混合物を準備することが必要であり、このようにして、除去および／または検出されることができる複合体を形成する。
【０２１６】
２つの分子の間の相互作用は、例えば、蛍光エネルギー移動(FET)を使用して検出されることもできる(例えば、Lakowicz et al., U.S. Patent No. 5,631,169; Stavrianopoulos, et al., U.S. Patent No. 4,868,103、参照)。その発された蛍光エネルギーが第２の『レセプター』分子の蛍光ラベルによって吸収されるように、第１の『ドナー』分子の蛍光ラベルは選択され、それは、次に、吸収エネルギーのため蛍光を発することができる。あるいは、『ドナー』タンパク質分子は、単にトリプトファン残基の自然の蛍光エネルギーを利用してもよい。光の異なる波長を発するラベルは選択され、そうすると、『レセプター』分子ラベルは『ドナー』のそれと区別されるかもしれない。ラベル間のエネルギー転移の効率が分子を分離している距離に関連あるので、分子の空間関係は評価されることができる。結合が分子の間に発生する状況において、分析の『レセプター』分子ラベルの蛍光放出は、最大でなければならない。FETを結合している現象は、公知技術の標準的な蛍光定量的検出手段によって（例えば、蛍光光度計を使用して）、都合よく測定されることができる。
【０２１７】
他の実施態様において、標的分子と結合するＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプタータンパク質の能力を測定することは、リアルタイム生物分子相互作用分析（ＢＩＡ）を使用して達成されることができる(例えば、Sjolander, S. and Urbaniczky, C. (1991) Anal. Chem. 63:2338-2345 and Szabo et al. (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705、参照)。反応体（例えば、BIAcore）のいずれかにラベルをつけずに、「表面プラスモン共鳴」または「ＢＩＡ」は、リアルタイムの生物特異的な相互作用を検出する。結合面（結合現象を表す）の塊の変化は、表面（表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）の光学現象）の近くで、光の屈折率の改変という結果をもたらし、生体分子間のリアルタイム反応の徴候として使われることができる検出可能なシグナルという結果をもたらす。
【０２１８】
一の実施態様において、標的遺伝子産物または検体は、固相に固定される。固相に固定される標的遺伝子産物／テスト化合物複合体は、反応の終わりに検出されることができる。好ましくは、標的遺伝子産物は、固体の表面上へ固定されることができ、そして、テスト化合物（それは、固定されない）は、直接的または間接的に、本明細書において述べられる検出可能なラベルにより標識されることができる。
【０２１９】
分析の自動化に対応するのと同様に、タンパク質の非複合型形態から複合型ものの分離を容易にするために、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター、抗ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター抗体またはその標的分子のいずれかを固定することは、望ましいかもしれない。ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプタータンパク質に対するテスト化合物の結合、または、候補化合物の存在下および非存在下の標的分子とのＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプタータンパク質の相互作用は、反応物を含むことに適している任意の容器において達成されることができる。このような容器の例は、マイクロタイタープレート、試験管およびミクロ遠心管が含まれる。一の実施態様において、タンパク質の一方または両方がマトリックスに密接に結びつくことを許す領域を加える融合タンパク質が提供されることができる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター融合タンパク質またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／標的融合タンパク質はグルタチオン・セファロース・ビーズ(Sigma Chemical, St. Louis, MO)、または、グルタチオンに誘導されたマイクロタイタープレート上へ吸着されることができ、それは、それからテスト化合物、または、テスト化合物および非吸着標的タンパク質、または、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプタータンパク質、および、複合体形成を引き起こす条件下（例えば、塩およびｐＨについて生理的条件）でインキュベートされる混合物と結合される。インキュベーション後、マイクロタイタープレート・ウェルは、任意の非結合の成分、ビーズの場合のマトリックス、例えば、上記の通りに、直接的または間接的に測定される複合体を取り除くために洗浄される。別の実施態様では、複合体はマトリックスから解離することができ、そして、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター結合または活性のレベルは標準的な技術を使用して測定された。
【０２２０】
ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプタータンパク質またはマトリックス上の標的分子を固定するための他の技術は、ビオチンおよびストレプトアビジンの結合を使用することを含む。ビオチン化されたＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプタータンパク質または標的分子は、公知技術の（例えば、ビオチン化キット、Pierce Chemicals, Rockford, IL）技術を使用しているビオチン―ＮＨＳ（Ｎ―ヒドロキシ―スクシンイミド）から調製されることができ、ストレプトアビジン被覆９６穴プレート(Pierce Chemical)のウェルにおいて固定されることができる。
【０２２１】
分析を実行するために、非固定化成分は、固定された成分を含んでいるコーティング表面に加えられる。反応が終了したあと、形成される任意の複合体が固体の表面に固定されるままである条件下、反応していない成分は（例えば、洗浄によって）取り除かれる。固体の表面に固定される複合体の検出は、多くの方法で達成されることができる。すでに非固定化成分が予めラベルをつけられる所で、表面に固定されるラベルの検出は複合体が形成されたことを示す。すでに非固定化成分が予めラベルをつけられない所で、間接的なラベルは、例えば、固定化成分に特異的な標識抗体を使用して（次に、抗体は、直接的にラベルされるか、または、間接的に、例えば、標識抗免疫グロブリン抗体によりラベルされることができる。）、表面に固定される複合体を検出するために用いることができる。
【０２２２】
一の実施態様において、この分析はＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプタータンパク質または標的分子に反応性の抗体を利用して実行されるが、それはその標的分子へのＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプタータンパク質の結合を妨げない。このような抗体は、プレートのウェルに誘導体化され、また、非結合の標的またはＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプタータンパク質は、抗体結合によってウェルに閉じ込められる。このような複合体を検出する方法は、ＧＳＴ固定化複合体のための上記方法に加えて、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプタータンパク質または標的分子に反応性の抗体を使用している複合体の免疫検出（ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプタータンパク質または標的分子と結合される酵素活性を検出することに依存する酵素結合分析と同様に）を含む。
【０２２３】
別の実施態様では、細胞フリーな分析は、液相において実行されることができる。このような分析において、これに限定されないが、以下を含むが、多くの標準的な技術のいずれかによって、反応生成物は、反応していない成分から切り離される。：分画遠心分離法(例えば、Rivas, G., and Minton, A.P., (1993) Trends Biochem Sci 18:284-7、参照)；クロマトグラフィ（ゲル濾過クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ）；電気泳動法(例えば、Ausubel, F. et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology 1999, J. Wiley: New York.、参照)；そして、免疫沈降法(例えば、Ausubel, F. et al., eds. (1999) Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley: New York、参照)。このような樹脂およびクロマトグラフィの技術は、当業者に公知である(例えば、Heegaard, N.H., (1998) J Mol Recognit 11:141-8; Hage, D.S., and Tweed, S.A. (1997) J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 699:499-525、参照)。更に、本明細書において記載されているように、水溶液から複合体の更なる精製なしで結合を検出するために、蛍光エネルギー転移も、都合よく利用されるかもしれない。
【０２２４】
好ましい実施態様において、分析法は、分析の混合物を形成するためにＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプターを結合する周知の化合物によってそのＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプタータンパク質または生物学的に活性な部分と接触すること、テスト化合物を分析の混合物と接触すること、そして、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプタータンパク質と相互作用するテスト化合物の能力を測定することを含み、そこにおいて、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプタータンパク質と相互作用するテスト化合物の能力を測定することは、周知の化合物と比較して、優先してＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプターまたはその生物学的に活性な部分と結合するか、または、標的分子の活性を調整するために、テスト化合物の能力を測定することを含む。
【０２２５】
本発明の標的遺伝子産物は、インビボで、一つ以上の細胞性または細胞外巨大分子（例えば、タンパク質）と相互作用することができる。この考察のために、このような細胞性および細胞外巨大分子は、本明細書において、「結合パートナー」と称される。このような相互作用を損なう化合物は、標的遺伝子産物の活性を調整する際に有用であることができる。このような化合物は、これらに限定されないが、分子、例えば、抗体、ペプチドおよび低分子を含む。この実施態様に用いられる好ましい標的遺伝子／生成物は、本明細書において特定されたＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター遺伝子である。別の実施態様において、本発明は、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター標的分子の下流のエフェクターの活性の調節によりＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプタータンパク質の活性を調整するテスト化合物の能力を測定する方法を提供する。例えば、適切な標的上のエフェクター分子の活性は、測定されることができ、または、前述したように、適切な標的に対するエフェクターの結合は測定されることができる。
【０２２６】
標的遺伝子産物およびその細胞性または細胞外結合パートナーの間の相互作用を阻害する化合物を特定するために、標的遺伝子産物および結合パートナーを含んでいる反応混合物は、２つの生成物に複合体の形成を許すのに十分な条件及び時間の下で、調製される。抑制性試薬をテストするために、反応混合物は、テスト化合物の存在下および非存在下において提供される。テスト化合物は、最初に反応混合物に含まれることがあるか、または、標的遺伝子およびその細胞性または細胞外結合パートナーの付加に続く時刻に加えられることができる。制御反応混合物は、テスト化合物なしで、または、プラセボによってインキュベートされる。標的遺伝子産物間および細胞性または細胞外結合パートナーの間の任意の複合体の形態は、それから検出される。テスト化合物を含んでいる反応混合物ではなく、コントロール反応における複合体の形態は、化合物が標的遺伝子産物および相互作用性のある結合パートナーの相互作用を阻害することを示す。さらに、テスト化合物および通常の標的遺伝子産物を含んでいる反応混合物内の複合体形成は、テスト化合物および変異体標的遺伝子産物を含んでいる反応混合物内の複合体形成と比較されることもできる。この比較は、突然変異であるが、正常でない標的遺伝子産物の相互作用を損なう化合物を特定することが望ましい場合に重要である。
【０２２７】
これらの分析は、異種であるか同種の形態において実行されることができる。異種の分析法は、固相上へ標的遺伝子産物または結合パートナーを固定すること、および、反応の終わりに固相に固定される複合体を検出することが必要である。同種の分析において、全ての反応は、液相において実施される。いずれのアプローチにおいても、テストされている化合物に関する異なる情報を得るために、反応物の付加の序列は、変化されることができる。例えば、標的遺伝子産物と結合パートナーとの相互作用を（例えば、競合によって）阻害するテスト化合物は、検体が存在する場合には、反応を実行することによって特定されることができる。別の実施態様では、予備成形された複合体（例えば、複合体からの成分のうちの１つを移すより高い結合定数を有する化合物）を破壊するテスト化合物は、複合体が形成されたあと、テスト化合物を反応混合物に加えることによってテストされることができる。さまざまな形態は、以下で簡単に説明される。
【０２２８】
異種の分析系において、標的遺伝子産物または相互作用的な細胞性または細胞外結合パートナーは固体の表面（例えば、マイクロタイタープレート）上へ固定され、その一方で、直接的、または、間接的に、非固定された種はラベルをつけられる。固定された種は、非共有であるか共有結合性付着によって固定されることができる。別の実施態様では、固定される種に特異的な固定化抗体は、種を固体の表面に固定するために用いることができる。
【０２２９】
分析を実行するために、固定化種のパートナーは、テスト化合物の有無にかかわらずコーティング表面にさらされる。反応が終了していたあと、反応していない成分は（例えば、洗浄によって）取り除かれ、そして、形成される任意の複合体は固体の表面に固定されるままである。非固定化種が予めラベルをつけられる所で、表面に固定されるラベルの検出は複合体が形成されたことを示す。非固定化種が予めラベルをつけられない所で、間接的なラベルは、例えば、初めに非固定化種に特異的な標識抗体を使用して、表面に固定される複合体を検出するために用いられることができる。（抗体は、次に、直接的にラベルされるか、または、間接的に、例えば、標識抗免疫グロブリン抗体によりラベルされることができる。）反応成分の付加の序列によって、複合体形成を阻害する、または、予備成形された複合体を破壊するテスト化合物は、検出されることができる。
【０２３０】
別の実施態様では、反応はテスト化合物の有無の液相において実施されることができ、反応生成物は反応していない成分と分離され、そして、複合体は検出される。（例えば、水溶液において形成された任意の複合体、および、固定された複合体を検出するための他のパートナーに特異的な標識抗体を固定するために結合成分のうちの１つに特異的な固定化抗体を使用して）さらにまた、液相に対する反応物の付加の序列によって、複合体を阻害する、または、予備成形された複合体を破壊するテスト化合物は、特定されることができる。
【０２３１】
本発明の別の実施態様において、同種の分析法が、用いられることができる。例えば、標的遺伝子産物またはそれらの結合パートナーはラベルされることで、標的遺伝子産物および相互作用性の細胞性または細胞外の結合パートナー生成物の予備成形された複合体は調製されるが、ラベルによって発生するシグナルは複合体形成のため消光される(例えば、U.S. Patent No.4,109,496 that utilizes this approach for immunoassays、参照)。本発明の別の実施態様において、種のうちの１つを予備成形された複合体から争って、置き換える検体の添加は、上記背景のようにシグナルの発生という結果になる。このようにして、標的遺伝子産物−結合パートナーの相互作用を破壊する検体は、特定されることができる。
【０２３２】
さらに他の実施態様では、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター（「ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター―結合タンパク質」または「ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター―ｂｐ」）と結合するかまたは相互作用し、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター活性に関係している他のタンパク質を特定するために、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプタータンパク質が、２ハイブリッド分析または３ハイブリッド分析(例えば、U.S. Patent No. 5,283,317; Zervos et al. (1993) Cell 72:223-232; Madura et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:12046-12054; Bartel et al. (1993)  Biotechniques 14:920-924; Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693-1696; and Brent WO94/10300、参照)の「おとりタンパク質」として使われることができる。このようなＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター−ｂｐｓは、例えば、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプターに媒介されるシグナル伝達経路の下流の要素として、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプタータンパク質またはＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター標的によるシグナルの活性化物質または抑制物質であることができる。
【０２３３】
２ハイブリッド系は大部分の転写因子のモジュール式の性質に基づき、そして、それは分離可能なＤＮＡ−結合および活性化領域からなる。簡潔には、分析は、２つの異なるＤＮＡ構築物を利用する。１つの構築物において、それがＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプタータンパク質をコード化する遺伝子は、公知の転写制御因子（例えば、ＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合領域をコード化している遺伝子に融合する。他の構築物において、ＤＮＡ塩基配列のライブラリからの、未確認のタンパク質（「餌食」または「サンプル」）をコード化するＤＮＡ塩基配列は、公知の転写因子の活性化領域をコード化する遺伝子に融合する。（あるいは、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプタータンパク質は、活性化物質領域に融合されることができる。）「おとり」および「餌食」タンパク質が、インビボで、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプターに依存する複合体を形成して相互作用することが可能である場合、転写因子のＤＮＡ−結合および活性化領域は近い付近に挿入される。この付近は、転写因子に応答する転写調節部位に使用可能な状態で結合されるリポーター遺伝子（例えば、ｌａｃＺ）の転写を許す。リポーター遺伝子の発現は検出されることができ、そして、機能的な転写因子を含んでいる細胞群体は分離されることができ、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプタータンパク質と相互作用するタンパク質をコード化するクローンされた遺伝子を得るために用いられることができる。
【０２３４】
他の実施態様において、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター発現のモジュレータは、特定される。例えば、細胞または細胞フリーな混合物は、候補化合物に接触され、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプターｍＲＮＡまたはタンパク質の発現は、候補化合物の非存在下でのＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプターｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のレベルと比較して評価される。ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプターｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が、候補化合物が存在する場合に、その不存在の場合より大きいときに、候補化合物はＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプターｍＲＮＡまたはタンパク質の発現の刺激物質として特定される。別の実施態様では、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプターｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が、候補化合物が存在する場合に、その不存在の場合より少ない（統計学的に著しくより少ない）ときに、候補化合物はＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプターｍＲＮＡまたはタンパク質の発現の抑制物質として特定される。ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプターｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のレベルは、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプターｍＲＮＡまたはタンパク質を検出するために本明細書において記載されている方法で測定されることができる。
【０２３５】
別の実施態様においては、本発明は、本明細書において記載されている分析のうちの２つ以上の組合せに関係する。例えば、モジュレートする試薬は、細胞に基づく、または、細胞フリーな分析を使用して特定されることができ、そして、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプタータンパク質の活性を調整する試薬の能力は、例えば、炎症性肺疾患（例えば、喘息）の動物モデルのような動物においてインビボで特定されることができる。
【０２３６】
本発明は、更に、上記のスクリーニング分析によって特定される新規試薬に関係する。本明細書において記載されているように、このような試薬を有する処置の有効性、毒性、副作用または作用メカニズムを測定するために、適切な動物モデルにおいて、更に特定される試薬（例えば、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプターを調整する試薬、アンチセンスＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター核酸分子、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター−特異的抗体、または、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター−結合パートナー）
を使用することは、本発明の範囲内である。さらにまた、上記のスクリーニング分析によって特定される新規試薬は、本明細書において記載されている処置のために用いられることができる。
【０２３７】
本発明のスクリーニング方法は、インビトロ（例えば、細胞に基づく分析、または、酵素活性分析におけるＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター活性をモニターすることによって）、または、インビボ（例えば、組織サンプル（例えば、哺乳類にテスト試薬を投与した後のＢＡＬ）のＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプターの活性または発現をモニターすることによって）で実施される。典型的な哺乳類は、これに限定されないが、ヒト、マウス、ネズミおよびイヌを含む。
【０２３８】
本発明は、非ヒトのトランスジェニック動物も提供する。このような動物は、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプタータンパク質の機能および／または活性を研究するため、および、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター活性のモジュレータを特定および／または評価するために有用である。
【０２３９】
本明細書で用いられる場合、「トランスジェニック動物」は非ヒトの動物、好ましくは、哺乳類、より好ましくは、ネズミまたはマウスのような齧歯動物であり、動物の細胞の一つ以上は導入遺伝子を含む。トランスジェニック動物の他の例は、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類等を含む。導入遺伝子は外因性のＤＮＡまたは再編成（例えば、内因性の染色体ＤＮＡの削除）であり、それは、好ましくは、トランスジェニック動物の細胞のゲノムに統合されるかまたは発生する。導入遺伝子は、トランスジェニック動物の細胞タイプまたは組織の一つ以上において、コード化された遺伝子産物の発現を導くことができ、他の導入遺伝子（例えば、ノックアウト）は、発現を低下させる。従つて、トランスジェニック動物は、内因性のＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター遺伝子が、動物の開発の前に、例えば、動物（例えば、動物の胚細胞）の細胞に導入される内因性遺伝子と外因性のＤＮＡ分子の間の相同的組換えによって、変更されたものであることができる。
【０２４０】
イントロン配列およびポリアデニル化シグナルも、導入遺伝子の発現の効率を上昇させるために、導入遺伝子に含まれることができる。組織特異的な制御配列は、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプタータンパク質の発現を特定の細胞に導くために、本発明の導入遺伝子に、使用可能な状態で結合されることができる。初代トランスジェニック動物は、そのゲノムにおけるＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター導入遺伝子の存在、および、動物の組織または細胞のＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプターｍＲＮＡの発現に基づいて特定されることができる。初代トランスジェニック動物は、それから、導入遺伝子を担持している追加的な動物を育てるために用いられることができる。さらに、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプタータンパク質をコード化している導入遺伝子を担持しているトランスジェニック動物は、他の導入遺伝子を担持している他のトランスジェニック動物に、更に育てられることができる。
【０２４１】
ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプタータンパク質またはポリペプチドは、トランスジェニック動物または植物において発現されることができ、例えば、タンパク質またはポリペプチドをコード化している核酸は、動物のゲノムに導入されることができる。好ましい実施態様において、核酸は、組織特異的なプロモータ（例えば、ミルクまたは卵に特異的なプロモータ）の制御下に配置され、動物によって生産されるミルクまたは卵から回収される。適切な動物は、マウス、ブタ、ウシ、ヤギおよびヒツジである。
【０２４２】
例えば、以下に述べられるように、本発明は、トランスジェニック動物からの細胞集団も含む。
【０２４３】
Ｖ．診断および予後の分析
別の実施態様においては、本発明は、試験サンプルにおける血管に関連するＢＭＰ−１０および／または心臓性の疾患（例えば、本明細書において記載されている疾患）の事前評価、診断、および／または、進行をモニターする方法を提供する。その方法は、ＢＭＰ−１０またはＢＭＰ−１０関連の遺伝子から選択される核酸またはポリペプチドの発現または活性を評価することを含み、対照サンプル（例えば、正常な被験者から、または、処置の前に得られたサンプル）と比較した核酸またはポリペプチドのレベルの違いは、疾患の存在または進行を表す。典型的なＢＭＰ−１０関連の遺伝子は、これに限定されないが、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−１０、エンドグリン、抑制性Ｓｍａｄ（例えば、Ｓｍａｄ６および／または７）および、プロ血管形成遺伝子（例えば、ＶＥＧＦ、ＩＤ１およびＩＤ２）を含む。特定の実施態様において、試験サンプルのＢＭＰ−１０またはＢＭＰ−１０関連の遺伝子のレベルの増加は、対照サンプルと比較して、ＢＭＰ−１０機能の拮抗作用が望ましいＢＭＰ−１０血管および／または心臓の疾患（例えば、本明細書において記載されている血管および／または心臓の疾患）の診断と関連する。他の実施態様において、試験サンプルのＢＭＰ−１０またはＢＭＰ−１０関連の遺伝子のレベルの減少は、対照サンプルと比較して、ＢＭＰ−１０機能のアゴニズムが望ましいＢＭＰ−１０血管および／または心臓の疾患の診断と関連する。
【０２４４】
一の実施態様において、評価ステップは、インビトロまたはエクスビボで行われる。例えば、サンプル（例えば、血清サンプル）は、被験者から得られる。
【０２４５】
他の実施態様において、評価ステップは、インビボで発生する。例えば、被験者に、ＢＭＰ−１０またはＢＭＰ−１０に関連する核酸またはポリペプチドと相互作用する検出可能的に標識試薬を投与することによって、シグナルが核酸またはポリペプチドの活性または発現のレベルと関連して発生する。
【０２４６】
発現のモニタリングおよびプロファイリング
生体試料のＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０受容体タンパク質または核酸の存在、レベルまたは不存在は、テスト被験者から生体試料を得ること、および、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０受容体タンパク質または核酸の存在が生体試料において検出されるように、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０受容体タンパク質をコード化するＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０受容体タンパク質または核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）を検出することができる化合物または試薬に生体試料を接触することによって、評価されることができる。「生体試料」という用語は、被験者内に存在する組織、細胞および体液と同様に、被験者から分離される組織、細胞および生物的な体液を含む。好適な生体試料は、血清である。ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター遺伝子の発現のレベルは、これに限定されないが、以下を含む多くの方法により測定されることができる。：ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター遺伝子によってコード化されるｍＲＮＡを測定すること；ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター遺伝子によってコード化されるタンパク質の量を計量すること；またはＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター遺伝子によってコード化されるタンパク質の活性を測定すること。
【０２４７】
細胞のＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター遺伝子に対応するｍＲＮＡのレベルは、インサイツ（in situ）およびインビトロの形式の両方で測定されることができる。
【０２４８】
単離されたｍＲＮＡは、これに限定されないが、サザンまたはノーザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応法分析およびプローブ・アレイを含む、ハイブリッド形成または増幅分析において用いられることができる。ｍＲＮＡレベルの検出のための１つの好適な診断法は、検出されている遺伝子によってコード化されるｍＲＮＡにハイブリダイズすることができる核酸分子（プローブ）に、単離されたｍＲＮＡを接触することを含む。核酸プローブは、例えば、完全長ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター核酸、例えば、配列番号１の核酸、または、その部分、例えば、長さにおいて、少なくとも７、１５、３０、５０、１００、２５０または５００ヌクレオチドであり、ストリンジェントな条件下でＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプターｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチドであることができる。プローブは、アレイ（例えば、後述するアレイ）のアドレスに配置されることができる。診断検査法に用いられる他の適切なプローブは、本明細書において記載されている。
【０２４９】
１つの形態において、例えば、アガロースゲル上で単離されたｍＲＮＡを走らせて、ゲルから膜（例えば、ニトロセルロース）へｍＲＮＡを移すことによって、ｍＲＮＡ（またはｃＤＮＡ）は、表面に固定されて、プローブに接触される。他の形態において、プローブは表面に固定され、そして、ｍＲＮＡ（またはｃＤＮＡ）は、例えば、後述する二次元の遺伝子チップ・アレイにおいて、プローブと接触される。当業者は、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター遺伝子によってコード化されるｍＲＮＡのレベルを検出するために、公知のｍＲＮＡ検出方法を適用することができる。
【０２５０】
ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプターのうちの１つによってコード化されるサンプルのｍＲＮＡのレベルは、核酸増幅、例えば、ｒｔＰＣＲ(Mullis (1987) U.S. Patent No. 4,683,202)、リガーゼ連鎖反応(Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193)、自己持続配列複製法(Guatelli et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878)、転写増幅系(Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177)、Ｑ−βレプリカーゼ(Lizardi et al. (1988) Bio/Technology 6:1197)、ローリングサークル複製法(Lizardi et al. U.S. Patent No. 5,854,033)または任意の他の核酸増幅方法（公知技術を用いて増幅された分子の検出が続く）によって評価されることができる。本明細書で用いられる場合、増幅プライマーは、遺伝子の5' または 3'領域（それぞれプラスおよびマイナス鎖、または、逆もまた同じ）にアニール化されることができ、その間の短い領域を含むことができる一対の核酸分子であるとして明らかにされる。一般に、増幅プライマーは、長さにおいて約１０〜３０のヌクレオチドについてからであり、長さにおいて約５０〜２００のヌクレオチドからの領域の側面に位置する。適切な条件の下で、そして、適切な試薬とともに、このようなプライマーは、プライマーが側面に並んでいる核酸配列からなる核酸分子の増幅ができるようにする。
【０２５１】
インサイツの方法のために、細胞または組織サンプルは、調製され／処理され、支持体（通常はガラススライド）上に固定され、そして、分析されているＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター遺伝子をコード化するｍＲＮＡにハイブリダイズすることができるプローブに接触される。
【０２５２】
他の実施態様において、その方法は、更に、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプターｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出することができる化合物または試薬をコントロール試料と接触すること、および、試験サンプルのＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプターｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在と、コントロール試料のＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプターｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在を比較することである。さらに別の実施態様において、遺伝子発現の連続分析法は、米国特許第５，６９５，９３７号にて説明されるように、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター転写物レベルを検出するために用いられる。
【０２５３】
様々な方法は、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプターによってコード化されるタンパク質のレベルを測定するために用いられることができる。一般に、サンプルのタンパク質のレベルを評価するために、これらの方法は、選択的にタンパク質（例えば、抗体）と結合する試薬をサンプルと接触することを含む。好ましい実施態様において、抗体は、検出可能なラベルを持つ。抗体は、ポリクローナル、または、より好ましくは、モノクローナルであることができる。完全な抗体またはその断片（例えば、Fab または F(ab')2）が使われることができる。「標識される」という用語は、プローブまたは抗体に関して、検出可能な物質との反応性によるプローブまたは抗体の間接的な標識と同様に、プローブまたは抗体に検出可能な物質をカプリング（すなわち、物理的に結合）することによって、プローブまたは抗体を直接的にラベルすることを含むことを意図する。検出可能な物質の例は、本明細書において提供される。
【０２５４】
検出方法は、インビボと同様に、インビトロで生体試料のＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０受容体タンパク質を検出するために用いられることができる。ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０受容体タンパク質の検出のインビトロでの技術は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降法、免疫蛍光検査、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）およびウエスタンブロット解析を含む。ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０受容体タンパク質の検出のインビボでの技術は、標識抗ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター抗体を被験者に導入することを含む。例えば、抗体は、被験者の存在および位置が標準的な映像技術によって検出されることができる放射性標識でラベルされることができる。他の実施態様において、サンプルは、ラベル化、例えば、ビオチン化され、それから抗体（例えば、抗体アレイに配置される抗ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター抗体）に接触される（後述するように）。サンプルは、例えば、アビジンを蛍光ラベルに連結して検出されることができる。
【０２５５】
他の実施態様において、その方法は、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０受容体タンパク質を検出することができる化合物または試薬をコントロール試料と接触すること、および、コントロール試料のＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０受容体タンパク質の存在を試験サンプルのＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０受容体タンパク質の存在と比較することを更に含む。
【０２５６】
本発明は、生体試料のＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプターの存在を検出するためのキットも含む。例えば、キットは、生体試料のＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０受容体タンパク質またはｍＲＮＡを検出することができる化合物または試薬、および、標準物質を含むことができる。化合物または試薬は、適切な容器で包まれることができる。キットは、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０受容体タンパク質または核酸を検出するためのキットを使用するための説明書から更になることができる。
【０２５７】
抗体に基づくキットのために、キットは、以下を含むことができる。：(1) 本発明の標識に対応するポリペプチドと結合する（例えば、担体に取り付けられる）第１の抗体；および、選択的に、(2) ポリペプチドまたは第１の抗体と結合して、検出可能な試薬に結合する第２の異なる抗体。
【０２５８】
オリゴヌクレオチドに基づくキットのために、キットは、以下を含むことができる。：(1) 本発明の標識に対応するポリペプチドをコード化している核酸配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（例えば、検出可能的に標識されたオリゴヌクレオチド）、または、(2) 本発明の標識に対応する核酸分子を増幅するために有用な一対のプライマー。キットは、緩衝剤、防腐剤またはタンパク質分解防止剤を含むこともできる。キットは、検出可能な試薬を検出するために必要な成分を含むこともできる（例えば、酵素または基質）。キットは、検定され、試験サンプルと比較することができるコントロール試料または一連のコントロール試料を含むこともできる。キットの各成分は、個々の容器内に封入されることができ、そして、さまざまな容器の全ては、キットを使用して実行される分析の結果を説明するための説明書とともに、単一のパッケージ内にあることができる。
【０２５９】
本明細書において記載されている診断法は、誤って発現された、または、異常な、または、不必要なＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０受容体発現または活性に関連する疾病または疾患を有する、または、発症する危険性のある被験者を特定することができる。本明細書で用いられる場合、「不必要である」という用語は、生物学的反応（例えば、気道炎症）を伴う不必要な現象を含む。
【０２６０】
一の実施態様において、異常であるか不必要なＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０受容体発現または活性と関連する疾病または疾患は、特定される。試験サンプルは、被験者から得られ、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０受容体タンパクまたは核酸（例えば、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡ）は評価され、そこにおいて、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０受容体タンパク質または核酸のレベル（例えば、有無）は、異常であるか不必要なＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０受容体発現または活性と関連する疾病または疾患を有する、または、発症の危険率を有する被験者のために診断である。本明細書で用いられる場合、「試験サンプル」とは、関心のある被験者から得られる生体試料をいい、生体液（例えば、血清）、細胞サンプルまたは組織を含む。
【０２６１】
本明細書において記載されている予後の分析は、異常であるか不必要なＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０受容体発現または活性と関連する疾病または疾患を治療するために、被験者が試薬（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプトイド疑似体、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子または他の薬物候補）を投与されることができるかどうかを決定するために用いられることができる。例えば、このような方法は、被験者がＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０受容体発現または活性を拮抗または阻害する試薬により有効に治療されることができるかどうかを決定するために用いられることができる。
【０２６２】
別の実施態様においては、本発明は、複数のデジタル的にコード化されたデータレコードを有するコンピュータ・メディアを特徴とする。各データレコードは、サンプルのＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプターの発現のレベルを示す値、および、サンプルの記述を含む。サンプルの記述は、サンプル、サンプルが誘導された被験者（例えば、患者）、診断または処置（例えば、好適な処置）の識別子であることができる。好ましい実施態様において、データレコードは、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター以外の遺伝子（例えば、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター―疾患と関連する他の遺伝子またはアレイ上の他の遺伝子）の発現のレベルを示す値を更に含む。データレコードは、テーブル、例えば、リレーショナル・データベース（例えば、Oracle または Sybaseのデータベース環境のＳＱＬデータベース）のようなデータベースの一部であるテーブルとして構築されることができる。
【０２６３】
さらに、特徴は、サンプルを評価する方法である。その方法は、例えば、被験者からのサンプルを提供すること、および、サンプルの遺伝子発現プロフィールを決定することを含み、そこにおいて、プロフィールはＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０受容体発現のレベルを示す値を含む。その方法は、値またはプロフィール（すなわち、複数の値）を対照値または対照プロフィールと比較することを更に含むことができる。サンプルの遺伝子発現プロフィールは、本明細書において記載されている方法のいずれかによって（例えば、サンプルからの核酸を提供して、アレイに核酸を接触することによって）得られることができる。その方法は、被験者の気道炎症性疾患を診断するために用いられることができ、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０受容体発現または活性の増加は、被験者が喘息を含む慢性気道炎症性疾患を有する、または、有するように処置されているという指標である。その方法は、被験者の喘息の処置をモニターするために用いられることができる。例えば、遺伝子発現プロフィールは、処置を受けている被験者からのサンプルについて決定されることができる。プロフィールは、対照標準プロフィールに、または、処置の前、または、疾患の発症の前に被験者から得られるプロフィールに比較されることができる(例えば、Golub et al. (1999) Science 286:531、参照)。
【０２６４】
さらに他の実施態様では、本発明は、テスト化合物を評価する方法を特徴とする（また、上記の「スクリーニング分析」参照）。その方法は、細胞およびテスト化合物を提供すること；細胞をテスト化合物と接触すること；接触された細胞のための被験者発現プロフィールを得ること；そして、被験者発現プロフィールを一つ以上の対照標準プロフィールと比較することを含む。プロフィールは、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０受容体発現のレベルを示す値を含む。好ましい実施態様において、被験者発現プロフィールは、標的プロフィール、例えば、正常な細胞の、または、細胞の所望の障害のプロフィールと比較される。被験者発現プロフィールが非接触細胞から得られる発現プロフィールより標的プロフィールと類似している場合、テスト化合物は有利に評価される。
【０２６５】
別の実施態様においては、本発明は、被験者を評価する方法を特徴とする。その方法は、以下からなる。：a) 被験者、例えば、介護者、例えば、被験者からサンプルを得る介護者からサンプルを得ること；b) サンプルの被験者発現プロフィールを決定すること。任意には、その方法は、次のステップのどちらかまたは両方とも更に含む。：c) 被験者発現プロフィールを一つ以上の対照標準発現プロフィールと比較すること；そして、d) 被験者対照標準プロフィールと最も類似の対照標準プロフィールを選択すること。被験者発現プロフィールおよび対照標準プロフィールは、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０受容体発現のレベルを示す値を含む。様々な日常的な統計的な手段は、２つの対照標準プロフィールを比較するために用いることができる。１つの可能な測定基準は、２つのプロフィールの違いである距離ベクターの長さである。被験者および対照標準プロフィールの各々は多次元ベクトルとして示され、そこにおいて、各ディメンションはプロフィールの値である。
【０２６６】
その方法は、結果を介護者に発信することを更に含むことができる。その結果は、被験者発現プロフィール、被験者発現プロフィールと他のプロフィールとの比較の結果、非常に類似する対照標準プロフィールまたは前述の者のいずれかの記述であることができる。結果は、コンピュータ・ネットワーク全体に送信されることができ、例えば、結果は、コンピュータ伝送（例えば、搬送波に記憶されるコンピュータ・データ・シグナル）の形であることができる。
【０２６７】
次の工程を実施するための実行コードを有するコンピュータ・メディアも特徴である：
被験者発現プロフィールを受けること；対照標準発現プロフィールのデータベースにアクセスすること；および、i) 被験者発現プロフィールと最も類似のマッチしている対照標準プロフィールを選択すること、または、ii) 少なくとも一つの対照標準プロフィールに対する被験者発現プロフィールの類似性の最低１つの比較スコアを決定することのいずれか。被験者発現プロフィールおよび対照標準発現プロフィールは、各々、ＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター発現のレベルを示す値を含む。
【０２６８】
続く実施例は、本発明を理解する際に補助するために記載されるが、いかなる形であれその範囲を限定するように意図されていないし、また、そのように解釈されてはならない。
【実施例】
【０２６９】
実施例１：成人ヒトおよびマウス組織のヒトＢＭＰ−１０のｍＲＮＡ発現分析
実験Ａ．ヒト成人組織におけるＢＭＰ−１０  ｍＲＮＡ転写物のノーザンブロット解析
方法
ＢＭＰ−１０ｍＲＮＡ発現のノーザンブロット解析は、製造会社の推薦（Clontech）を使用して実行された。全てのコード領域を示しているヒトＢＭＰ−１０のための放射性同位元素で識別されたプローブは、製造会社によって調製され、ヒト心臓、骨格筋、コロン、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺および末梢血リンパ球組織のＢＭＰ−１０  ｍＲＮＡの発現を評価するために用いられた。
【０２７０】
結果
ＢＭＰ−１０  ｍＲＮＡ発現は、図７Ａのノーザンブロットに示されるように、ヒト成人心臓、腎臓および肝臓組織において検出された。
【０２７１】
実験Ｂ．成人ヒト組織のＢＭＰ−１０発現
方法
ヒト成人組織のＢＭＰ−１０  ｍＲＮＡの検出は、複数の組織ノーザンドットブロット（Clontech cat #636806）を使用して実行された。全てのコード領域を示している放射性同位元素で識別されたＢＭＰ−１０ｃＤＮＡプローブは、ランダム・プライマー放射性標識のための製造会社の指示に従って生成された。ハイブリッド形成は、製造会社の推薦に従って実行された。
【０２７２】
結果
成人ヒト心臓組織において見られるＢＭＰ−１０ｍＲＮＡ発現のハイレベルに加えて、他の成人ヒト組織、特に、リンパ節組織および肝臓組織は、有意なｍＲＮＡ発現を示した（図７Ｂおよび７Ｃ）。
【０２７３】
実施例２．マウスのヒトＡｄＢＭＰ―１０過剰発現のインビボでの観察および症状
実験Ａ．ＡｄＢＭＰ−１０を注射されるマウスのインビボの全体観察
方法
組換えアデノウイルスは、以下の通りに構成された。Adori 1-2 ヒトＢＭＰ−１０（ｈＢＭＰ−１０）ベクターは、pED6dpc-hBMP-10を消化して、アデノウイルス・ベクターAdori 1-2 に１．２７ｋｂのｈＢＭＰ−１０ｃＤＮＡ断片を結紮することによって誘導された。構築物は、プラスミド（AdBMP−10）の中へのｃＤＮＡ挿入物の広範囲な制限消化分析および塩基配列決定によって確認された。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（ＡｄＧＦＰ）、分泌されたアルカリ性ホスファターゼ（ＳＥＡＰ）（ＡｄＳＥＡＰ）またはベータ−ガラクトシダーゼ（B-gal）（Ad B-gal）をコードするアデノウイルス・ベクターも用いられた。ｈＢＭＰ―１０  ｃＤＮＡ、Ｂ−ｇａｌおよびＧＦＰの発現は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモータおよびエンハンサから可動される。
【０２７４】
複製に欠陥がある、Ｅ１およびＥ３が欠損した組換え体、タイプ５のアデノウイルスが、ヒト胚腎臓２９３細胞(ATCC, Rockville, Maryland)の相同的組換えによって生成された。組換え体アデノウイルスは２９３の細胞において増幅され、そして、ウイルスは３サイクルの凍結融解によって感染した細胞から放出された。ウイルスは、２つの塩化セシウム遠心沈降勾配によって更に精製され、リン酸緩衝液食塩水（ＰＢＳ）pH 7.2、４℃に対して透析された。透析の後、グリセロールは１０％の濃度にまで加えられ、そして、ウイルスは８０℃で利用まで保存された。ウイルス濃度（粒子／ｍｌで表現される）は、２６０ナノメートルで光学濃度を測定することによって決定された。内毒素レベルは、Limulus Amebocyte Lysate kit (BioWhittaker, Walkersville, MD)を用いて測定されて、分析の検出限界より下にあった。ウイルスは、ベクター特異的プライマーを使用し、ＰＣＲ生成物の末端を配列決定する挿入物のＰＣＲ増幅によって更に特徴づけられた。ｈＢＭＰ−１０の発現は、３５Ｓ−メチオニン／システインを用いて代謝的にラベルされ変換された２９３細胞、および、ドデシル硫酸ナトリウム−（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動法((PAGE)Novex, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)による調整培地の分析によって検査された。実施例３にて説明したように、ＢＭＰ−１０の非相同の発現は、ＨＥＫ２９３細胞の形質移入の後、ウエスターンイムノブロット分析によって更に確認された。
【０２７５】
ｈＢＭＰ−１０をコード化している組換え体アデノウイルスの５×１０１０の粒子の単一投与量は、雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（年齢７―８週）の尾部静脈に注入された。コントロール・マウスは、B-galまたはＧＦＰをコード化しているアデノウイルスを導入したか、または緩衝液コントロールとしてＰＢＳ／１０％のグリセロールを注射された。各実験群からのマウスは、注射後の予定の時点で安楽死され、そして、終末の体重が得られた。血液は後方の眼窩洞を経て集められ、そして、差動カウントが血液塗抹標本に実施された。血液学的なおよび血清化学分析のために、血液は、心臓穴によって集められた。肉眼による分析はすべての動物に実行され、そして、選択された組織は重量を測定された。組織は、収集されて、１０％の中性緩衝ホルマリンにおいて固定されて、調整されて、パラフィンに封埋されて、切断されて、組織変化のためのヘマトキシリンおよびエオシンで染色された。ＲＮＡ分析のための組織は、液体窒素において凍結され、分析の前に−８０℃で保存される。
【０２７６】
結果
ｖＢＭＰ−１０の過剰発現の作用は３日目までに明らかであり、そして、マウスは７日目で瀕死であった。顕著な虚弱および痩せ衰えのため、すべての動物は、７日目までに分析された。脳および肝臓において全体的に観察される皮下血管の顕著な増加によって、血管異形成が明示された。代表的なコントロール・マウス、AdGFP day 5の全身動物の概観は、図８に示される。対照的に、代表的なAdBMP-10 day 5マウスおよび代表的なAdBMP-10 day 7マウスは、多数の器官（脂肪、脳および肺）の赤い変色、皮下の赤色化（血管異形成）、全体的な消耗、および、体脂肪の減少を有した（図８）。綿密に詳細に研究されるとき、脳および肝臓は、ＢＭＰ−１０過剰発現に応答して血管異形成の他の徴候を示した。図９は、代表的なAdBMP-10 day 7 マウスの脳の顕著な血管を示し、比較のために、コントロールAdGFP day 7マウスの脳が示される。
【０２７７】
実験Ｂ．ＡｄＢＭＰ−１０マウスのインビボでの変化の全体的な組織病理学的分析
方法
組織病理学的な方法は、上記の、および／または、標準的な手順であった。
【０２７８】
結果
組織病理学的な分析で、拡張血管、広範囲にわたるうっ血および散在する出血がみられた。代表的なAdBMP-10 Day 7マウスの組織病理学的な分析は図１０に示され、うっ血、出血および軽度の壊死が見られる。代表的なＡｄＢＭＰ−１０、および、ＡｄＧＦＰコントロール・マウスの肝臓は、図１１に示される。ＡｄＢＭＰ−１０マウスの肝臓は、拡大肝細胞および凝固壊死の多病巣性領域を有する。
【０２７９】
実験Ｃ．コントロール・マウスと比較されるＡｄＢＭＰ−１０マウスの器官および体重
方法
ＡｄＢＭＰ−１０マウスの終末の体重は、ＡｄＢＭＰ−１０の５×１０１０の粒子の単一投与量を有する注射の後で、３日目および７日目に測定され、そして、緩衝液を注射されるか、またはアデノウイルスをコード化しているＧＦＰを注射されるコントロール・マウスと比較される。ＡｄＢＭＰ−１０マウスの器官（脾臓、肝臓、胸腺）の重量は、ＡｄＢＭＰ−１０の５×１０１０の粒子の単一投与量または緩衝液またはＡｄＢ−galのコントロール注射剤を有する注射の７および１４日後に計量された。すべてのＡｄＢＭＰ−１０マウスは、顕著な虚弱および痩せ衰えにより７日目で殺されなければならなかった。
【０２８０】
結果
注射の後の３日目または７日目のＡｄＢＭＰ−１０およびコントロール・マウスの群による終末の体重（ｇｍ）の分配は、図１２に示される。７日目までに、緩衝液およびＡｄＧＦＰコントロールと比較して、ＡｄＢＭＰ−１０マウスの終末の体重の劇的な減少があった。７日目のＡｄＢＭＰ−１０マウス、および、７日目および１４日目のコントロールＡｄＢ-galおよび緩衝液マウスの脾臓、肝臓および胸腺の器官の重量の分布は図１３に示される。ＡｄＢＭＰ−１０マウスの脾臓、肝臓および胸腺は、すべて、ＡｄＢ-galおよび緩衝液コントロール・マウスと比較して、著しい量の減少を示す。
【０２８１】
実験Ｄ．ＡｄＢＭＰ−１０マウスの細胞変化および血清化学の更なる病理分析
方法
ヒトＢＭＰ−１０（ＡｄＢＭＰ−１０）またはコントロール・ウイルス（ＡｄＢ gal、または、分泌されたアルカリ性ホスファターゼ（ＳＥＡＰ））をコード化している複製欠乏性組換え体アデノウイルスの５×１０１０の粒子の単一投与量は、上記の通りに静脈内にＣ５７ＢＬ／６マウス（年齢７−８週）に注射された。血清化学は、４日目に分析された。
【０２８２】
結果
遺伝子発現と関連すると考えられる大部分の変化は、顕著な虚弱に特徴的だった。これらの変化は、痩せ衰えの全体観察、胸腺、脾臓および場合により肝臓の萎縮、終末の体重、および、絶対的な、および／または、相対的な肝臓、脾臓および胸腺の重量の減少を含む。（上記の方法及び結果は、図８−１３にすべて含めて示される。）
【０２８３】
観察された全体的な変化の微視的な相関物は、腹部および皮下脂肪の萎縮および胸腺の萎縮であった。虚弱の更に微視的な指標は、リンパ節（リンパ様減少）および胃（単一の細胞壊死を有する腺粘膜の萎縮）において見られた。うっ血は、いくつかの器官（腹部および皮下脂肪、大腿骨および腸）において見られて、全体のレベルでこれらの器官において観察される変色と相関していた。
【０２８４】
すべての動物において、多病巣性肝壊死を緩和するための最小があった。この変化は、分布においてランダムであり、凝固壊死の小さい領域（小裂片の約１／４〜２／３の大きさ）によって特徴づけられた。壊死の領域のいくつかは、顆粒球の穏やかな流入と関連するふくれた水腫の壊死性肝細胞から成った（空胞変性および壊死）。これらの領域は、通常明確に境界を定められた。この壊死の現象の病態生理学は、明らかでなかった。この変化は、通常はマウスの虚弱と関係していない。ＡｄＢＭＰ−１０群からのすべての動物のこの変化の一貫した発生は、遺伝子発現との関連を強く示唆する。
【０２８５】
ＳＥＡＰ群と比較して、４日目のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）およびアルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）に統計的に有意および顕著な増加があった（図１４Ａ−１４Ｂ）。他の全ての血液学および臨床化学データ変動は、それらが軽微な振幅であり、対応する微視的な肝臓の変化がなく、時間とともに整合していたので、遺伝子発現への関連がないと考慮した（データは示されない）。他の微視的な肝変化は、ウイルス系と関連する病変と整合していて、特徴的な血清化学プロフィールと関連した。
【０２８６】
ＡｄＢＭＰ  １０マウスの特定の細胞性および血清化学の変化は、コントロール・ウイルスを注射されるマウスと比較して、統計的に有意であることがわかった。増加したヘマトクリット、増加したヘモグロビン、増加した赤血球、減少した血小板があった（図１５Ａ−１５Ｂ）。
【０２８７】
遺伝子発現をテストするために関連があると考慮される変化は、ＡｄＢＭＰ−１０群において見られ、ＡｄＢＭＰ−１０で治療された全ての動物の顕著な虚弱および痩せ衰えにあった。この変化は、ＡｄＢＭＰ−１０の治療７日目の全ての動物の早産の犠牲の原因となった。さらに、すべてのＢＭＰ−１０動物の肝臓の多病巣性ランダムな液化変性および凝固壊死があった。うっ血は、いくつかの器官（腹部および皮下脂肪、大腿骨および腸）において見られて、全体のレベルでこれらの器官において観察される変色と関連があった。
【０２８８】
実験Ｅ．ＡｄＢＭＰ−１０マウスのＢＭＰ−１０発現の形態学的作用の継続研究
方法
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの２つの群は治療され、一つはＡｄＢＭＰ−１０を有し、一つはコントロールとしてＡｄＳＥＡＰを有するものであった。投与のルートは、前述したようにＡｄＢＭＰ−１０またはアデノウイルスをコード化しているＳＥＡＰの静脈注射を介した。組織学的調製物および微視的な評価のための湿った組織は、標準的な技術を使用して調製された。統計学的に分析された器官の重量データ、臨床化学データ、血液学データおよび終末の体重データは、この報告の分析のためのスポンサによって提供された。
【０２８９】
結果
ＡｄＳＥＡＰコントロール・マウスにおいて観察されるすべての肉眼および微視的な病変は、マウスにおいて共通に観察される変化と整合していた。ＢＭＰ−１０の異所性発現と関連すると考えられる大部分の変化は、痩せ衰えおよび脱水を伴う顕著な虚弱に特徴的だった。これらの変化は、痩せ衰えの全体的なの観察、胸腺、膵臓、および、場合により肝臓および脾臓の萎縮、終末の体重、および、絶対的な、および／または、相対的な肝臓、脾臓および胸腺の重量の減少を含む。最も顕著な微視的な関連は、胸腺の中程度の萎縮および膵臓の軽度から中度の酵素原顆粒減少であった。多病巣性肝壊死を緩和する最小は、２匹の動物において見られ、肝臓変色の全体的な観察に関連があった。壊死は、中央ゾーン領域、および、場合により、小葉中心付近を包含する領域に優先的に分布される急性凝固壊死の散在する病巣によって特徴づけられた。この変化は肝臓の全体にわたって均一に分布されず、そして、肝臓のいくつかの領域は残された。肝壊死の原因は、明らかでなかった。通常はウイルス性曝露と関連する微視的な肝臓変化は、低下した（特に、細胞分裂反応）。３匹の動物の近位十二指腸の壁の出血に関連があるすべての動物において、幽門の赤い変色の全体的な観察が見られる。出血は、基底膜、粘膜下組織（ブルネル腺と関連する血球基質において）、および、筋肉の壁、特に、内側筋肉の層に位置した。内側筋肉の層は、区分的に出血によって消失し、１匹の動物において区分的に壊死にみえた。随時のフィブリン血栓は、粘膜下組織の拡張血管に存在した（ブルネル腺に関連して）。わずかな筋肉の壊死を伴うこの十二指腸経壁の出血の理由は、明らかでなかった。重積によって観察される虚血変化で特有症候でないにもかかわらず、この変化の形態は局所的な血管妥協を暗示する。
【０２９０】
血液学および血清化学の値は、著しい赤血球増加（増加した赤血球（ＲＢＣ）、ヘモグロビン（Ｈｂ）およびヘマトクリット（ＨＣＴ））を示した。骨髄および脾臓の赤血球過形成がない場合、赤血球増加は、顕著な脱水を表す。ＭＣＶのわずかな減少は、脱水にも関連があるかもしれない。ＭＣＨのわずかな減少の理由は、不明である。おそらく十二指腸出血の部位の適度な消費の結果、血小板は、適度に減少した。ＳＥＡＰ群と比較されるときに、ＡＳＴおよびＡＬＴは適度に増加した。この増加の大きさは、ウイルスベクター関連の肝障害に共通に関連する大きさの範囲内であった。ウイルス曝露を表す微視的な変化がその群に存在したことを考えると、ＳＥＡＰ群の肝臓酵素の類似の変動の欠如の理由は不明である。脱水は、通常はアルブミンおよび総蛋白の増加と関連する。アルブミン増加の欠如および総蛋白（ＴＰ）の比較的低い増加は、肝臓障害からなるか、または、タンパク質損失によるためかもしれない。
【０２９１】
腎機能不全または腸疾患を表す変化がない場合、上記の所見のクラスター形成は、痩せ衰えおよび脱水を伴う虚弱が食物および水の摂取量を減少させることに関連がある可能性を示唆する（膵臓酵素原顆粒減少、拡大胆嚢）。肝臓および／または十二指腸の微視的な変化は、この症候群の発症と関連するかもしれない。
【０２９２】
統計学的に、および／または、生物学的に重要な所見が以下の表１に示される。省略形は、以下の通りである：ＲＢＣ、赤血球数算定；Ｈｂ、ヘモグロビン；ＨＣＴ、ヘマトクリット；ＭＣＶ、平均細胞容量；ＭＣＨ；細胞ヘモグロビン；ＡＳＴ、分離人工酸塩アミノトランスフェラーゼ；ＡＬＴ、アラニンアミノ基転移酵素；ＡＬＰ、アルカリ性ホスファターゼ；ＴＰ、総蛋白；Plat、血小板。
【０２９３】
【表１】
2010529041.tif 000002
【０２９４】
要約すると、以下の顕著な組織病理学的な変化は、コントロール・マウスと比較して、ＡｄＢＭＰ−１０マウスにおいて見られた。近位十二指腸の壁の出血が見られ、幽門で赤い変色の全体的な観察に関連があった。十二指腸のブルネル腺の所見に関連して、フィブリン血栓は、粘膜下組織の拡張血管に存在した。わずかな筋肉の壊死を伴う十二指腸経壁の出血が観察され、局所的な血管障害を表した。ＡｄＢＭＰ−１０マウスの肝臓にはまだら状があり、散在する大量出血によって引き起こされる焦点性壊死から生じている。
【０２９５】
要約すると、ＡｄＢＭＰ−１０マウスは、顕著な皮下血管異形成、広範囲にわたるうっ血および散在する出血によって証明されたように、血管異形成を有することが観察され、脳、肝臓および肺の血管を増大した。ＡｄＢＭＰ−１０マウスは、衰弱して、７日目によって死んだ。皮下および内臓脂肪の損失とともに、体重の著しい減少があった。血小板減少に加えて、リンパ様萎縮は観察された。
【０２９６】
実施例３．ヒトの初代内皮細胞のシグナル伝達のＢＭＰ−１０活性化
内皮細胞は、血管恒常性において重要な役割を果たす。レセプターを介するセリン／スレオニン・キナーゼによるシグナル伝達を活性化するＢＭＰ−１０の能力は、ヒトの初代内皮細胞において研究された。ＢＭＰ−１０処置への細胞反応は、ＢＭＰ−１０処置後、抑制性レセプターＳｍａｄｓの発現レベルを決定するために定量的ＰＣＲを使用することに加えて、さらにレセプターＳｍａｄｓ（Ｒ−Ｓｍａｄ）のリン酸エステル化状態を評価することによって分析された。
【０２９７】
実験Ａ．ＨＵＶＥＣｓおよびＨＵＡＥＣｓにおけるＲ−Ｓｍａｄ１、５、８の活性化
方法
ＢＭＰ−１０およびＧＦＰ調整された培地は、以下の通りに生成された。ヒト胚腎臓細胞（ＨＥＫ２９３）は、ダルベッコの変更されたイーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０％熱不活化ウシ胎児血清＋２００ｍＭグルタミンの１０ｍｌｓを1 x 106 cells/p100の組織ペトリ皿の密度で塗布した。プレートは、３７℃、５％ＣＯ２、２４時間でインキュベートされた。細胞は、ＡｄＢＭＰ−１０プラスミドの１０ｕｇまたはfugeneを用いたＡｄＧＦＰプラスミドによって形質導入された（脂質に基づく形質移入方法）。プレートは、１８時間、インキュベーターに戻されて、そして、ＤＭＥＭ＋２００ｍＭグルタミンで１回、洗浄した。培地は、取り除かれて、ＤＭＥＭ＋２００ｍＭグルタミンの６ｍｌに置き換えられた。プレートは、更なる４８時間、インキュベートされた。培地は取り除かれて、浮動細胞を取り除くために３０００rpmで５分間、遠心分離されて、きれいな管へ転送された。ＢＭＰ−１０またはＧＦＰを含んでいる調整培地は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの非変性条件下で分析されて、ニトロセルロース膜に転送された。ＢＭＰ−１０の免疫検出は、製造会社の指示に従ってＢＭＰ−１０特異的抗体（Orbigen, Catalog Number PAB―10450）を使用して実行された（下記の実験Ｃ）。
【０２９８】
ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（Lonza Catalog Number CC-2517）およびヒト大動脈内皮細胞（ＨＵＡＥＣ）（Lonza Catalog Number CC-2520）は、製造会社のＥＧＭ完全培地(Lonza Catalog Number CC-3024)の指示に従って、ｐ６０組織培養シャーレにて３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートされて、培養され、それらが~70-80%の合流点に達するときに、完全な成長培地は取り除かれ、細胞は基礎培地（Lonza Catalog Number CC-3129）＋０．１％脱脂ＢＳＡ（BD Bioscience Catalog Number 354331）で１回、洗浄され、そして、０．１％脱脂ＢＳＡを有する３．６ｍｌの基礎培地が加えられ、そして、プレートは、４時間、インキュベートされた。４時間後に、ＢＭＰ−１０調整培地４００ｕｌ、または、ＧＦＰ（コントロール）調整培地４００ｕｌが細胞に加えられる。プレートは、１５、３０、６０または１２０分間、インキュベーターに戻された。決められたさまざまな時点で、プレートはインキュベーターから取り除かれ、培地は取り除かれ、そして、細胞は３ｍｌの冷えたＰＢＳで１回、洗浄された。ＰＢＳは取り除かれ、そして、細胞はイムノブロットサンプルのための３００ｕｌ細胞溶解緩衝液(Cell Signaling Technology Catalog Number 9803)プラス・プロテイナーゼ阻害剤によって溶解した。細胞可溶化物は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって切り離されて、ニトロセルロース膜へ転送された。リン酸化されたＳｍａｄ１、５、８の免疫検出は、製造会社の指示に従って、リン酸化Ｓｍａｄ１，５，８特異的抗体(Cell Signaling Technology Catalog Number 9511)を使用して実行された。
【０２９９】
結果
ＢＭＰ−１０調整培地は、図１６のイムノブロットに示されるように、明らかにＲ−Ｓｍａｄ１、５および８のリン酸エステル化を導き出した。Ｓｍａｄリン酸エステル化は、ＧＦＰ調整培地によってＨＵＶＥＣｓにおいて導き出されなかった。こうして、結果は、ＢＭＰ−１０含有の調整培地で治療される内皮細胞に特異的であるＢＭＰシグナル経路の活性化を示した。
【０３００】
方法
実験Ｂ．ＢＭＰ−１０調整培地に反応したＳｍａｄ６、７ｍＲＮＡ発現
ＢＭＰ−１０調整培地による処置のさまざまな時間（３０、６０、１２０分）以後、ＨＵＶＥＣｓは、定量的ポリメラーゼ連鎖反応法分析(TaqMan（登録商標）)またはオリゴヌクレオチド・アレイを使用している広域的な遺伝子発現分析を使用しているＲＮＡの分析のための全てのＲＮＡの回収に適している緩衝液において溶解されたことを除いて、調整培地を含んでいるＢＭＰ−１０またはＧＦＰは、上記の実験にて説明したように基本的に調製された（後者の実験は、実施例８で後述する）。定量的ＰＣＲ実験は、抑制性Ｓｍａｄｓ６および７のためのｍＲＮＡの誘導を測定するために実行され、実施例８の遺伝子発現プロファイリング結果を確認した。ヒトＳＭＡＤ６、ＳＭＡＤ７およびＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３‐燐酸デヒドロゲナーゼ）ｍＲＮＡレベルの分析は、製造会社の推薦にしたがって、TaqMan（登録商標） EZ RT-PCRコア試薬(Applied Biosystems)を使用して実行された。倍率変化の測定は標準曲線法を使用して算出され、そして、サンプルは製造会社によって記載されているＧＡＰＤＨに正常化された。
【０３０１】
使用されるプライマーは、以下の通りであった。
ヒトＳＭＡＤ６（図６Ａ〜６Ｂ、配列番号１６、Accession number NM_005585）
順方向プライマー
5'-GCCACTGGATCTGTCCGATT-3' (配列番号7)
逆方向プライマー
5'-CACCCGGAGCAGTGATGAG-3' (配列番号8)
プローブ
5'-FAM-ACATTGTCTTACACTGAAACGGAGGCTACCAACT-TAMRA-3' (配列番号9)
【０３０２】
ヒトSMAD7 (Hayashi et al. (1997) Cell 89:1165-1173)
順方向
5'-CAGAAGGTGCGGAGCAAAAT-3' (TM=59) (配列番号10)
逆方向
5'-TGTACACCCACACACCATCCA-3' (TM=59) (配列番号11)
プローブ
5'-FAM-CTGCGGCATCCAGCTGACGC-TAMRA-3' (配列番号12)
【０３０３】
ヒトGAPDH:
順方向プライマー
5'-CCACATCGCTCAGACACCAT-3' (配列番号13)
逆方向プライマー
GCGCCCAATACGACCAAA (配列番号14)
プローブ
5'-FAM-CGTTGACTCCGACCTTCACCTTCCC-TAMRA-3' (配列番号15)
【０３０４】
結果
抑制性Ｓｍａｄｓ６および７のｍＲＮＡの誘導の時間経過の研究は、図１７に示すことができる。ＧＦＰ処理された細胞と比較すると、Ｓｍａｄ７の発現は４〜６倍誘発され、そして、Ｓｍａｄ６は１２０分後に２倍に発現された。
【０３０５】
実験Ｃ．抗ＢＭＰ−１０プロ抗体イムノブロットによって確認される調整培地のＢＭＰ−１０の存在
方法
ＡｄＢＭＰ１０またはＡｄＧＦＰによって形質導入されるＨＥＫ２９３細胞からの調整培地は、実験Ａ（上記の）にて説明したように生成された。調整培地のサンプルは、ドデシル硫酸ナトリウム―（ＳＤＳ）ＰＡＧＥによって分離され、ニトロセルロースに転送され、抗―ＢＭＰ―１０ｐｒｏの一次抗体によって探索され、そして、標準的な免疫検出技術が続いた。
【０３０６】
結果
イムノブロット分析によって検出される調整培地のヒトＢＭＰ−１０タンパク質の存在は、図１８に示される。ＢＭＰ−１０は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ変性ゲルにおいて、約６０ｋＤａの予想される分子量とともに移動した。
【０３０７】
実施例４．ヒトの一次性腎臓近位尿細管上皮細胞のシグナル伝達のＢＭＰ−１０活性化
レセプターを介してセリン／スレオニン・キナーゼによるシグナル伝達を活性化するＢＭＰ−１０の能力は、ヒトの一次性腎臓上皮細胞において研究された。ＢＭＰ−１０処置への細胞反応は、ＢＭＰレセプターＳｍａｄｓ（Ｒ−Ｓｍａｄｓ１，５，８）のリン酸エステル化状態を評価することによって分析された。
【０３０８】
ＲＰＴＥＣｓにおけるＲ−Ｓｍａｄ１、５、８の活性化
方法
ヒトの一次性腎臓近位尿細管上皮細胞（ＲＰＴＥＣ）（Lonza Catalog Number CC-2517）は、６０ｍｍの組織培養プレートに添加された成長補助剤（Lonza Catalog Number CC-3190）を有する腎臓上皮成長培地（ＲＥＧＭ）において、製造会社指示に従って培養され、そして、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートされ、それらが~70-80%の合流点に到達するときに、完全な成長培地は取り除かれ、そして、細胞は、腎臓上皮基礎培地、REBM（Lonza Catalog Number CC-3191）＋０．１％脱脂ＢＳＡ（BD Bioscience Catalog Number 354331）により１回、洗浄され、そして、０．１％の脱脂ＢＳＡを有する４ｍｌのｒＲＥＢＭが加えられ、そして、プレートは３時間、インキュベートされた。３時間後に、細胞は、最終濃度１００ｎｇ／ｍｌの成熟した組換え体ＢＭＰ−１０タンパク質（R&D Systems Catalog Number 2926-BP）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）のいずれかで治療された。プレートは、６０分間のインキュベーターに戻された。６０分後に、培地は取り除かれた、そして、細胞は３ｍｌの冷えたＰＢＳにより１回、洗浄された。ＰＢＳは取り除かれ、そして、細胞はウエスターンイムノブロットを用いたタンパク質分析のための３００ｕｌ  細胞溶解緩衝液（Cell Signaling Technology Catalog Number 9803）プラス・プロテイナーゼ阻害剤（Roche Applied Science Catalog Number 11697498001）によって溶解された。細胞可溶化物は、ドデシル硫酸ナトリウム―ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって分離され、ニトロセルロース膜へ転送された。リン酸化されたＳｍａｄ１、５、８の免疫検出は、製造会社の指示に従って、リン酸化Ｓｍａｄ１、５、８特異的抗体（Cell Signaling Technology Catalog Number 9511）を使用して実行された。アクチン（Cell Signaling Technology Catalog Number 4967）の免疫検出は、サンプル・タンパク質のローディングを正常化するために用いられた。
【０３０９】
結果
ＢＭＰ−１０処置は、図１９のイムノブロットに示されるように、明らかにＲ−Ｓｍａｄ１、５および８のリン酸化を誘発した。Ｓｍａｄリン酸エステル化は、ＰＢＳ処置によってｈＲＰＴＥＣｓにおいて導き出されなかった。こうして、結果は、ＢＭＰ−１０タンパク質で治療される腎臓近位尿細管上皮細胞に特異的であるＢＭＰシグナル経路の活性化を示した。
【０３１０】
実施例５：可溶性アクチビン・レセプター様キナーゼ１（ＡＬＫ１）および可溶性アクチビン・レセプターＩＩｂ（ＡｃｔＲＩＩｂ）を用いたヒトの一次性腎臓近位尿細管上皮細胞のＢＭＰ−１０シグナル伝達の抑制
ＡＬＫ１は、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）系統のタンパク質のタイプＩレセプターである。ヒト臍静脈内皮細胞のＢＭＰ−１０シグナル伝達が可溶性ＡＬＫ１によって遮断されることがすでに報告された(David et al. (2007) Blood 109:1953-1961)。本発明者らは、一次性腎臓近位尿細管細胞のＢＭＰレセプターＳｍａｄｓ（Ｒ―Ｓｍａｄｓ  １、５、８）のリン酸エステル化を遮断する可溶性ＡＬＫ１およびＡｃｔＲＩＩｂの能力を試験した。
【０３１１】
可溶性のＡＬＫ―１および可溶性ＡｃｔＲＩＩｂを用いたＲＰＴＥＣｓのＲ―Ｓｍａｄ  １、５、８の抑制
方法
ヒトの一次性腎臓近位尿細管上皮細胞（ＲＰＴＥＣ）（Lonza Catalog Number CC-2517）は、６０ｍｍの組織培養プレートに、添加された成長補助剤（Lonza Catalog Number CC-3190）を有するＲＥＧＭ培地において、製造会社指示に従って培養され、そして、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートされ、それらが~70-80%の合流点に達するときに、完全な成長培地が取り除かれ、そして、細胞は、腎臓上皮基礎培地，ＲＥＢＭ（Lonza Catalog Number CC-3191）＋０．１％の脱脂ＢＳＡ（BD Bioscience Catalog Number 354331）により１回、洗浄され、そして、０．１％の脱脂ＢＳＡを有する４ｍｌのＲＥＢＭが加えられ、そして、プレートは３時間、インキュベートされた。３時間の血清飢餓の後、培地は、取り除かれて、可溶性のＡＬＫ−１（R&D Systems Catalog Number 370-AL、ヒトＩｇＧ１１のＦｃ領域に融合する細胞外領域のアミノ酸残基１−１１８）、可溶性のＡｃｔＲＩＩｂ（ヒトＩｇＧ１に融合する細胞外領域）、または、可溶性のＡＬＫ−３（R&D Systems Catalog Number 315−BR、ヒトＩｇＧ１１のＦｃ領域に融合する細胞外領域のアミノ酸残基１−１５２）のいずれかの濃度を変化（ＢＭＰ−１０（８ｎＭ）と比較される２０、１０、２．５および１．２５倍のモル過剰）させて、３７℃で４５分間予めインキュベートされた１００ｎｇ／ｍｌ（R&D Systems Catalog Number 2926−BP）の濃度で成熟した組換え体ＢＭＰ−１０タンパク質を含んでいる４ｍｌの無血清基礎培地に置き換えられる。コントロールは、ＢＭＰ−１０単独、および、単独の１０倍のモル過剰でＦｃ構築物を含んだ。６０分後に、培地は取り除かれ、そして、細胞は３ｍｌの冷えたＰＢＳで１回、洗浄された。ＰＢＳは取り除かれ、そして、細胞はリン蛋白分析のための３００ｕｌ  細胞溶解緩衝液（Cell Signaling Technology Catalog Number9803）プラス・プロテイナーゼ阻害剤（Roche Applied Science Catalog Number 11697498001）によって溶解した。細胞可溶化物は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって分離されて、ニトロセルロース膜へ転送された。リン酸化されたＳｍａｄ１、５、８の免疫検出は、製造会社の指示に従って、リン酸化−Ｓｍａｄ１、５、８（ｐ−Ｓｍａｄ１、５、８）特異的抗体（Cell Signaling Technology Catalog Number9511）を使用して実行された。アクチン（Cell Signaling Technology Catalog Number 4967）の免疫検出は、サンプル・タンパク質ローディングを正常化するために用いられた。
【０３１２】
結果
可溶性ＡＬＫ１または可溶性のＡｃｔＲＩＩＢの処置は、明らかに、図２０のイムノブロットに示されるようにＢＭＰ−１０によって導き出されるＲ−Ｓｍａｄ１、５および８のリン酸エステル化を阻害した。こうして、結果は、ＢＭＰ−１０で治療される腎臓近位尿細管上皮細胞に特異的であるＢＭＰシグナル経路の阻害を示した。
【０３１３】
実施例６：ＢＭＰ−１０は、脂肪細胞分化のさまざまなステージで３Ｔ３−Ｌ１細胞を活性化する。
方法
脂肪細胞分化プロトコル
マウス線維芽細胞セル・ライン、３Ｔ３−Ｌ１（ATCC, Catalog Number CL-173）が、６ウェル培養皿（分化の２日目）の１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（ＦＢＳ）で補充されるダルベッコ変更されたイーグル培地（ＤＭＥＭ）で成長して集密度になり、そして、３７℃、１０％ＣＯ２でインキュベートした。ポスト集密度の２日後（分化の０日目）、細胞は、分化誘導培地（10%(v/v)FBS, 1μMデキサメタゾン(Sigma)、0.5mMイソブチルメチルキサンチン(Sigma)、１μｇ／ｍｌインシュリン(NovoNordisk)で補充されたＤＭＥＭ）によって刺激された。２日後（分化の２日目）、誘導培地はインシュリン培地（１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（ウシ胎児血清）、インシュリン(1 g/ml)を補充されたＤＭＥＭ）に置き換えられる。２日後（分化の４日目）、インシュリン培地は、取り除かれて、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳで補充されるＤＭＥＭに置き換えられ、そして、完全な分化が１０日目で達成されるまで、細胞は２日ごとに養われる。
【０３１４】
脂肪細胞分化の間の３Ｔ３―Ｌ１細胞のＢＭＰ−１０処置
３Ｔ３−Ｌ１細胞は、以下の通りに、脂肪細胞分化のさまざまなステージ（−２日目、０日目、２日目、４日目および１０日目）で、ＢＭＰ−１０（１００ｎｇ／ｍｌ）で治療された。：培地は取り除かれ、そして、細胞は無血清ＤＭＥＭ（０．１％脱脂ＢＳＡ（BD Bioscience Catalog Number 354331）で補充されるＤＭＥＭ）でリンスされた。３ｍｌの無血清ＤＭＥＭは６ウェルプレートの各ウェルに加えられ、そして、細胞は４時間の３７℃，１０％ＣＯ２でインキュベートされた。無血清培養基のインキュベーションの後、ＰＢＳの１００ｎｇ／ｌ（R&D Systems Catalog Number 2926-BP）または３ｌの濃度で、３ｌの成熟した組換え体ＢＭＰ−１０タンパク質は細胞に加えられ、そして、プレートはインキュベーターに戻された。処置の１時間後、培地は取り除かれ、そして、細胞は３ｍｌの冷えたＰＢＳで１回、洗浄された。ＰＢＳは取り除かれ、そして、細胞はウエスターン・イムノブロットを用いたタンパク質分析のため、３００ｌの細胞溶解緩衝液（Cell Signaling Technology Catalog Number9803）プラス・プロテイナーゼ阻害剤（Roche Applied Science Catalog Number 11697498001）によって溶解した。細胞可溶化物は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって分離され、ニトロセルロース膜へ転送された。リン酸化されたＳｍａｄ１、５、８の免疫検出は、製造会社の指示に従って、リン酸化−Ｓｍａｄ１，５，８特異的抗体（Cell Signaling Technology Catalog Number9511）を使用して実行された。アクチン（Cell Signaling Technology Catalog Number4967）の免疫検出は、サンプル・タンパク質ローディングを正常化するために用いた。
【０３１５】
結果
ＢＭＰ−１０処置は、図２１のイムノブロットに示されるように、脂肪細胞分化のさまざまなステージで、明らかにＲ−Ｓｍａｄ１、５および８のリン酸化を誘発した。Ｓｍａｄリン酸エステル化は、ＰＢＳ処置によって３Ｔ３−Ｌ１細胞において導き出されなかった。こうして、結果は、脂肪細胞分化の前、および、その間、ＢＭＰ−１０タンパク質で治療される線維芽細胞細胞に特異的であるＢＭＰシグナル経路の活性化を示した。
【０３１６】
実施例７．ヒトおよびマウス組織のヒトＢＭＰ−１０タンパク質発現の免疫組織化学（ＩＨＣ）分析
実験Ａ．ヒトの正常および疾病組織のＢＭＰ−１０タンパク質発現の免疫組織化学分析
方法
ペプチド選択および抗体産生：
ＢＭＰ−１０−ＬＰ９１６８の配列は、合成および抗体産生のための潜在的ペプチドを決定するために、HoppおよびWoodsのアルゴリズムによって分析された。ペプチドは、それから、特徴を決定して、結果として生じる抗体の特異性を予測するのを助けるＳｗｉｓｓｐｒｏｔデータベースに対してＢＬＡＳＴ化された。ペプチドＤＫＧＶＶＴＹＫＦＫＹＥ（配列番号２１）は選択され、合成され、そして、ウサギ・ポリクローナル抗血清は生成された。キャリアー蛋白質にペプチド結合を許すために、システイン残基は、ペプチドのＮ末端に加えられた。第３のブリードはペプチド親和性精製を受け、そして、結果として生じる抗血清がそれから免疫組織化学実験の一次抗体として用いられた。
【０３１７】
抗体滴定プロトコルおよびポジティブコントロール研究結果：
抗体滴定実験は、最小のバックグラウンドおよびシグナルの最大検出という結果になる濃度を確立するために、抗体ＢＭＰ−１０−ＬＰ９１６８（ウサギ・ポリクローナル）によって行われた。系列希釈は、２０ｕｇ／ｍｌ、１０ｕｇ／ｍｌ、５ｕｇ／ｍｌおよび２．５ｕｇ／ｍｌで実行された。系列希釈の研究は、パラフィン包埋、ホルマリン固定組織上の２．５ｕｇ／ｍｌの濃度で最も高い信号対雑音比を示した。この濃度が、研究のために使われた。抗体ＢＭＰ−１０−ＬＰ９１６８が一次抗体として使われ、そして、主要な検出系は、第２の抗ウサギベクター（ＢＡ−１０００）および赤色基質キットベクター（ＳＫ−５１００）を有するＡＢＣ−ＡＰキットベクター（ＡＫ−５０００）からなり、そして、それはホクシア色の沈着物を生産するために用いられた。
【０３１８】
組織抗原が保存されて、免疫組織化学的分析のためにアクセス可能であることを確認にするために、組織は、ポジティブコントロール抗体（ＣＤ３１）によっても染色された。ＣＤ３１のためにポジティブに着色した組織だけは、研究の剰余のために選択された。ネガティブコントロールは、一次抗体がない場合、隣接する断片に対して全免疫組織化学処置を行うことからなった。
【０３１９】
スライドは、ＤＶＣ１３１０Ｃデジタル・カメラをニコン顕微鏡に連結して撮像された。
画像は、Adobe Photoshopを使用しているＴＩＦＦファイルとして格納された。
【０３２０】
結果
肺性高血圧を有する患者からの選択された正常および糖尿病の組織、正常およびアテローム硬化型冠状動脈、正常および虚血心臓および正常な肺および肺のマッチされた検体と同様に、骨形態発生タンパク質１０（ＢＭＰ−１０）に対する抗体ＬＰ９１６８は、広範囲な一連の正常なヒト組織に評価された。他のタンパク質に対するＢＭＰ−１０の類似性のため、これは、分泌された標的であると考えられている。
【０３２１】
この抗体は、核染色および膜質染色も存在しなかったが、主に細胞質染色を示した。ポジティブとネガティブな細胞タイプの良好な差異により、染色の品質は十分であった。
【０３２２】
正常組織において、最も顕著な染色は、胎盤栄養膜細胞層、胸部上皮、副腎髄質、炎症性サブセット、卵巣卵濾胞、睾丸ライディッヒ細胞、精母細胞 の前駆体および子宮内膜において特定された。陽性染色法は、結腸表層上皮、前立腺上皮、腸管上皮、胃上皮、膵臓腺房および尿乳頭イウムにおいても特定された。
【０３２３】
末梢神経、神経節細胞、胃腸神経内分泌の細胞および膵島細胞サブセットは、陽性だった。焦点陽性は、脳の扁平上皮、肝細胞、胆管およびニューロンにおいて特定された。
【０３２４】
患部組織において、正常組織と比較されるときに、有意な変化が染色になかった。
【０３２５】
「[NTS2]」が続く報告セクションは、Normal Tissue Screen IIパネルの部分であったサンプルを示す。「[TIIDSI]」が続く報告セクションは、Type II Diabetic Screen Iパネルの部分であったサンプルを示す。「[Single Tissue]」が続く報告セクションは、個々の組織切片であったサンプルを示す。
【０３２６】
染色の細胞局在の説明
細胞質（Ｃ）、細胞外（Ｅ）、膜（Ｍ）、核（Ｎ）、核周囲（Ｐ）
胸部［ＮＴＳ２］
【表２】
2010529041.tif 000003
【表３】
2010529041.tif 000004
【０３２７】
結腸［ＮＴＳ２］
【表４】
2010529041.tif 000005
【表５】
2010529041.tif 000006
【０３２８】
肺［ＮＴＳ２］
【表６】
2010529041.tif 000007
【表７】
2010529041.tif 000008
【０３２９】
卵巣［ＮＴＳ２］
【表８】
2010529041.tif 000009
【表９】
2010529041.tif 000010
【０３３０】
膵臓［ＮＴＳ２］
【表１０】
2010529041.tif 000011
【表１１】
2010529041.tif 000012
【０３３１】
前立腺［ＮＴＳ２］
【表１２】
2010529041.tif 000013
【表１３】
2010529041.tif 000014
【０３３２】
皮膚［ＮＴＳ２］
【表１４】
2010529041.tif 000015
【表１５】
2010529041.tif 000016
【０３３３】
腎上体［ＮＴＳ２］
【表１６】
2010529041.tif 000017
【表１７】
2010529041.tif 000018
【０３３４】
膀胱［ＮＴＳ２］
【表１８】
2010529041.tif 000019
【表１９】
2010529041.tif 000020
【０３３５】
脳、皮質［ＮＴＳ２］
【表２０】
2010529041.tif 000021
【表２１】
2010529041.tif 000022
【０３３６】
心臓［ＮＴＳ２］
【表２２】
2010529041.tif 000023
【表２３】
2010529041.tif 000024
【０３３７】
肝臓［ＮＴＳ２］
【表２４】
2010529041.tif 000025
【表２５】
2010529041.tif 000026
【０３３８】
骨格筋［ＮＴＳ２］
【表２６】
2010529041.tif 000027
【表２７】
2010529041.tif 000028
【０３３９】
胎盤［ＮＴＳ２］
【表２８】
2010529041.tif 000029
【表２９】
2010529041.tif 000030
【０３４０】
小腸［ＮＴＳ２］
【表３０】
2010529041.tif 000031
【表３１】
2010529041.tif 000032
【０３４１】
脾臓［ＮＴＳ２］
【表３２】
2010529041.tif 000033
【表３３】
2010529041.tif 000034
【０３４２】
胃［ＮＴＳ２］
【表３４】
2010529041.tif 000035
【表３５】
2010529041.tif 000036
【０３４３】
精巣［ＮＴＳ２］
【表３６】
2010529041.tif 000037
【表３７】
2010529041.tif 000038
【０３４４】
胸腺［ＮＴＳ２］
【表３８】
2010529041.tif 000039
【表３９】
2010529041.tif 000040
【０３４５】
甲状腺［ＮＴＳ２］
【表４０】
2010529041.tif 000041
【表４１】
2010529041.tif 000042
【０３４６】
扁桃［ＮＴＳ２］
【表４２】
2010529041.tif 000043
【表４３】
2010529041.tif 000044
【０３４７】
子宮［ＮＴＳ２］
【表４４】
2010529041.tif 000045
【表４５】
2010529041.tif 000046
【０３４８】
腎臓、髄［ＮＴＳ２］
【表４６】
2010529041.tif 000047
【表４７】
2010529041.tif 000048
【０３４９】
腎臓、皮質［ＮＴＳ２］
【表４８】
2010529041.tif 000049
【表４９】
2010529041.tif 000050
【０３５０】
心臓［Ｓｉｎｇｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ］
【表５０】
2010529041.tif 000051
【表５１】
2010529041.tif 000052
【表５２】
2010529041.tif 000053
【０３５１】
動脈［Ｓｉｎｇｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ］
【表５３】
2010529041.tif 000054
【表５４】
2010529041.tif 000055
【表５５】
2010529041.tif 000056
【０３５２】
動脈、アテローム硬化［Ｓｉｎｇｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ］
【表５６】
2010529041.tif 000057
【表５７】
2010529041.tif 000058
【表５８】
2010529041.tif 000059
【０３５３】
脂肪性、皮下性、非糖尿病性［ＴＩＩＤＳ１］
【表５９】
2010529041.tif 000060
【表６０】
2010529041.tif 000061
【０３５４】
脂肪性、内臓性、非糖尿病性［ＴＩＩＤＳ１］
【表６１】
2010529041.tif 000062
【表６２】
2010529041.tif 000063
【０３５５】
結腸、非糖尿病性［ＴＩＩＤＳ１］
【表６３】
2010529041.tif 000064
【表６４】
2010529041.tif 000065
【０３５６】
心臓、非糖尿病性［ＴＩＩＤＳ１］
【表６５】
2010529041.tif 000066
【表６６】
2010529041.tif 000067
【０３５７】
腎臓、皮質、非糖尿病性［ＴＩＩＤＳ１］
【表６７】
2010529041.tif 000068
【表６８】
2010529041.tif 000069
【０３５８】
腎臓、髄、非糖尿病性［ＴＩＩＤＳ１］
【表６９】
2010529041.tif 000070
【表７０】
2010529041.tif 000071
【０３５９】
肝臓、非糖尿病性［ＴＩＩＤＳ１］
【表７１】
2010529041.tif 000072
【表７２】
2010529041.tif 000073
【０３６０】
肺、非糖尿病性［ＴＩＩＤＳ１］
【表７３】
2010529041.tif 000074
【表７４】
2010529041.tif 000075
【０３６１】
膵臓、非糖尿病性［ＴＩＩＤＳ１］
【表７５】
2010529041.tif 000076
【表７６】
2010529041.tif 000077
【０３６２】
骨格筋、非糖尿病性［ＴＩＩＤＳ１］
【表７７】
2010529041.tif 000078
【表７８】
2010529041.tif 000079
【０３６３】
脂肪性、皮下性、糖尿病性［ＴＩＩＤＳ１］
【表７９】
2010529041.tif 000080
【表８０】
2010529041.tif 000081
【０３６４】
脂肪性、内臓性、糖尿病性［ＴＩＩＤＳ１］
【表８１】
2010529041.tif 000082
【表８２】
2010529041.tif 000083
【０３６５】
結腸、糖尿病性［ＴＩＩＤＳ１］
【表８３】
2010529041.tif 000084
【表８４】
2010529041.tif 000085
【０３６６】
心臓、糖尿病性［ＴＩＩＤＳ１］
【表８５】
2010529041.tif 000086
【表８６】
2010529041.tif 000087
【０３６７】
腎臓、皮質、糖尿病性［ＴＩＩＤＳ１］
【表８７】
2010529041.tif 000088
【表８８】
2010529041.tif 000089
【０３６８】
腎臓、髄、糖尿病性［ＴＩＩＤＳ１］
【表８９】
2010529041.tif 000090
【表９０】
2010529041.tif 000091
【０３６９】
肝臓、糖尿病性［ＴＩＩＤＳ１］
【表９１】
2010529041.tif 000092
【表９２】
2010529041.tif 000093
【０３７０】
肺、糖尿病性［ＴＩＩＤＳ１］
【表９３】
2010529041.tif 000094
【表９４】
2010529041.tif 000095
【０３７１】
膵臓、糖尿病性［ＴＩＩＤＳ１］
【表９５】
2010529041.tif 000096
【表９６】
2010529041.tif 000097
【０３７２】
骨格筋、糖尿病性［ＴＩＩＤＳ１］
【表９７】
2010529041.tif 000098
【表９８】
2010529041.tif 000099
【０３７３】
心臓、虚血［Ｓｉｎｇｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ］
【表９９】
2010529041.tif 000100
【表１００】
2010529041.tif 000101
【表１０１】
2010529041.tif 000102
【０３７４】
肺［Ｓｉｎｇｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ］
【表１０２】
2010529041.tif 000103
【表１０３】
2010529041.tif 000104
【表１０４】
2010529041.tif 000105
【０３７５】
肺、高血圧［Ｓｉｎｇｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ］
【表１０５】
2010529041.tif 000106
【表１０６】
2010529041.tif 000107
【表１０７】
2010529041.tif 000108
【０３７６】
実験Ｂ．マウス組織のＢＭＰ−１０タンパク質発現の免疫組織化学分析
方法
免疫組織化学の方法は、上記の、および／または、標準的な手順であった。
【０３７７】
結果
この研究において、骨形態形成タンパク質１０（ＢＭＰ−１０）に対する抗体ＬＰ９１６８は、一連の選択されたマウス組織において評価された。ＢＭＰ−１０は、マウス心臓において確認され、胎児の心臓の発生に関与していると考えられている新規ＴＧＦ―βファミリーのメンバーである。他のタンパク質に対するＢＭＰ−１０の構造類似性のため、これは、分泌された標的であると考えられている。マウス組織において、大部分の染色は細胞質だったが、時々、核および細胞外染色も確認された。染色の分布は、この標的が利用できる限られた発表データと矛盾しなかった。
【０３７８】
最も顕著な染色は、心筋細胞、リンパ球サブセット、甲状腺の上皮および膵島において確認された。病巣の顕著な染色は、輸精前駆体および子宮内膜にも存在した。他の陽性細胞タイプは、尿路上皮、神経節細胞、肝細胞および腎尿細管上皮を含んだ。病巣の陽性は、皮膚付属構造、ニューロン、および、消化管（胃、腸および結腸）の内側を覆っている上皮に存在した。時々の弱い染色は、膵臓腺房、呼吸上皮および肺胞マクロファージに存在した。
【０３７９】
染色の細胞局在の説明
細胞質（Ｃ）、細胞外（Ｅ）、膜（Ｍ）、核（Ｎ）、核周囲（Ｐ）
マウス膀胱
【表１０８】
2010529041.tif 000109
【表１０９】
2010529041.tif 000110
【０３８０】
マウス脳、小脳
【表１１０】
2010529041.tif 000111
【表１１１】
2010529041.tif 000112
【０３８１】
マウス脳、大脳皮質
【表１１２】
2010529041.tif 000113
【表１１３】
2010529041.tif 000114
【０３８２】
マウス結腸
【表１１４】
2010529041.tif 000115
【表１１５】
2010529041.tif 000116
【０３８３】
マウス心臓
【表１１６】
2010529041.tif 000117
【表１１７】
2010529041.tif 000118
【０３８４】
マウス腎臓
【表１１８】
2010529041.tif 000119
【表１１９】
2010529041.tif 000120
【０３８５】
マウス肝臓
【表１２０】
2010529041.tif 000121
【表１２１】
2010529041.tif 000122
【０３８６】
マウス肺
【表１２２】
2010529041.tif 000123
【表１２３】
2010529041.tif 000124
【０３８７】
マウス膵臓
【表１２４】
2010529041.tif 000125
【表１２５】
2010529041.tif 000126
【０３８８】
マウス骨格筋
【表１２６】
2010529041.tif 000127
【表１２７】
2010529041.tif 000128
【０３８９】
マウス皮膚
【表１２８】
2010529041.tif 000129
【表１２９】
2010529041.tif 000130
【０３９０】
マウス小腸
【表１３０】
2010529041.tif 000131
【表１３１】
2010529041.tif 000132
【０３９１】
マウス脾臓
【表１３２】
2010529041.tif 000133
【表１３３】
2010529041.tif 000134
【０３９２】
マウス胃
【表１３４】
2010529041.tif 000135
【表１３５】
2010529041.tif 000136
【０３９３】
マウス精巣
【表１３６】
2010529041.tif 000137
【表１３７】
2010529041.tif 000138
【０３９４】
マウス胸腺
【表１３８】
2010529041.tif 000139
【表１３９】
2010529041.tif 000140
【０３９５】
マウス甲状腺
【表１４０】
2010529041.tif 000141
【表１４１】
2010529041.tif 000142
【０３９６】
マウス子宮
【表１４２】
2010529041.tif 000143
【表１４３】
2010529041.tif 000144
【０３９７】
実施例８．ヒトＢＭＰ−１０調整培地で治療されるヒト内皮細胞のインビトロの広域の遺伝子発現分析
実験Ａ．コントロール処置に対して、ＢＭＰ−１０で治療されるヒト大動脈内皮細胞（ＨＵＡＥＣｓ）において差別的に発現される遺伝子
方法
ＡｄＢＭＰ  １０またはＡｄＧＦＰによって形質転換されるＨＥＫ２９３細胞からの調整培地は、上記の実験３において説明されたように生成された。実施例３にて説明したように、ＣＭの一定分量は、調整培地に発現されたＢＭＰ−１０の存在を確認するためのＢＭＰ−１０ウエスタンブロットに用いるために凍結保存された。
【０３９８】
ヒト大動脈内皮細胞は、実施例３にて説明したように、調整培地で処理された。細胞は、転写プロファイリングのために、３０分および６０分にＲＮＡのために溶解された。全ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙミニ・キット（Qiagen, Hidden, Germany）を使用して、細胞から分離された。ＲＮＡの分析および定量化は、マウス組織から分離されるＲＮＡのための実施例５において、後述するように、実施された。ビオチンのラベルが付いたｃＲＮＡプローブの第１および第２鎖ｃＤＮＡ合成および生成は、製造会社(Affymetrix, Inc)の指示に従って行われた。オリゴヌクレオチド・アレイ（GeneChip Human Genome U133_plus 2.0）に対するハイブリッド形成およびデータ分析は、マウス組織のための実施例１０において、後述するように実行された。
【０３９９】
結果
未処理の蛍光強度値は、集められて、記載されているように、低下した。発現が増加していることを決定する転写物には、「現在の」（「Ｐ」）コール（ＧＥＤＳ処理で決定される）、５ｐｐｍの最小限の度数（ハイブリッド形成サンプルに組み込まれる標準曲線との比較に基づく）および緩衝液コントロール試料と比較して２倍の発現の最小限の変化を有していなければならかった。処置によって減少していることを決定した遺伝子は、「Ｐ」と呼ばれ、緩衝液コントロール試料の５ｐｐｍの最小限の度数を有し、処理したサンプルの２倍の発現の最大の変化を有していなければならなかった。ＢＭＰ−１０により３０分間処理されるＨＵＶＥＣおよびＨＵＡＥＣｓからのｍＲＮＡの広域の遺伝子発現分析の結果は、図２２に示すことができ；６０分間処理されるＨＵＶＥＣおよびＨＵＡＥＣｓからの結果は、図２３Ａ−２３Ｄに示すことができる。
【０４００】
実験Ｂ．ＧＦＰに比較して、ＡｄＢＭＰ−１０で治療されるヒト臍静脈内皮細胞において差別的に発現される遺伝子
方法
ＡｄＢＭＰ  １０またはＡｄＧＦＰによって形質転換されるＨＥＫ２９３細胞からの調整培地は、実験３において前述したように生成された。調整培地は、形質転換後、４８時間後に収集された。実施例３にて説明したように、ＣＭの一定分量は、調整培地に発現されたＢＭＰ−１０の存在を確認するためのＢＭＰ−１０ウエスターンイムノブロット分析用に凍結保存された。
【０４０１】
ヒト臍静脈内皮細胞は、実施例３にて説明したように、ＡｄＢＭＰ―１０、または、ＡｄＧＦＰ調整培地で処理された。上記の実験にて説明したように、細胞は、広範な遺伝子発現分析に用いられるために、３０分および６０分にＲＮＡのために溶解された。
【０４０２】
結果
未処理蛍光強度値は集められ、記載されているように、低下した。発現が増加していることを決定する転写物は、「現在の」（「Ｐ」）コール（ＧＥＤＳ処理で決定される）、５ｐｐｍの最小限の度数（ハイブリッド形成サンプルに組み込まれる標準曲線との比較に基づく）および緩衝液コントロール試料と比較される２倍の発現の最小限の変化がなければならなかった。処置によって減少していることえお決定する遺伝子は、「Ｐ」と呼ばれ、緩衝液コントロール試料の５ｐｐｍの最小限の度数を有し、処理したサンプルの２倍の発現の最大の変化がなければならなかった。ＢＭＰ−１０により３０分間処理されるＨＵＶＥＣおよびＨＵＡＥＣｓからのｍＲＮＡの広範な遺伝子発現分析の結果は、図２２に示すことができる；６０分間処理されるＨＵＶＥＣおよびＨＵＡＥＣｓからの結果は、図２３Ａ−２３Ｄに示すことができる。
【０４０３】
実施例９．ＢＭＰ−１０を過剰発現させているヒト腎臓近位尿細管上皮細胞の遺伝子発現分析
方法
この実施例は、５および１７時間の時点における、ＡｄＢＭＰ−１０またはＡｄＧＦＰ（コントロール）によって変換されるヒト腎臓近位尿細管上皮細胞の遺伝子発現分析を示す。ＡｄＢＭＰ  １０またはＡｄＧＦＰによって変換されるＨＥＫ２９３細胞からの調整培地（ＣＭ）は、上記の実験３にて説明したように、生成された。実施例３にて説明したように、ＣＭの一定分量は、調整培地に発現されたＢＭＰ−１０の存在を確認するためのＢＭＰ−１０西のイムノブロット分析用に凍結保存された。ヒトの一次性腎臓近位尿細管上皮細胞（ＲＰＴＥＣ）（Lonza Catalog Number CC-2517）は、６０ｍｍの組織培養プレートに添加された成長補助剤（Lonza Catalog Number CC-3190）を有するＲＥＧＭ培地において、製造会社の指示に従って培養され、そして、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートされ、それらが~70-80%の合流点に到達するときに、完全な成長培地は取り除かれ、そして、細胞は、基礎培地（Lonza Catalog Number CC-3191）＋０．１％の脱脂ＢＳＡ（BD Bioscience Catalog Number 354331）により１回、洗浄され、そして、０．１％の脱脂ＢＳＡを有する４ｍｌの基礎培地が加えられ、そして、プレートは、３時間、インキュベートされた。３時間後に、細胞は、０．１％の脱脂ＢＳＡを有する基礎培地に１：１０に希釈したＣＭを含んでいるＡｄＢＭＰ−１０またはＡｄＧＦＰのいずれかで処理された。細胞は、処置の後、５時間および１７時間でＲＮＡのために溶解しされ、そして、全ＲＮＡはＲＮｅａｓｙミニ・キット(Qiagen, Hidden, Germany)を使用して細胞から分離された。ＲＮＡの分析および定量化は、マウス組織から分離されるＲＮＡのための実施例５にて説明したように、実施された。ビオチンのラベルが付いたｃＲＮＡプローブの第１および第２鎖ｃＤＮＡ合成および生成は、製造会社(Affymetrix, Inc)の指示に従って実施された。オリゴヌクレオチド・アレイ（GeneChip Human Genome U133_plus 2.0）に対するハイブリッド形成およびデータ分析は、マウス組織のための実施例１０にて説明したように、実行された。
【０４０４】
結果
５時間のＢＭＰ−１０処置の広範な遺伝子発現分析の結果は、図２４Ａ−２４Ｄに示され、そして、１７時間のＢＭＰ−１０処置の結果は、図２５Ａ−２５Ｅに示される。シグナル値は算出され、そして、データは以下の通りにフィルターに通された：ＡｄＢＭＰ−１０  ＣＭ処置により発現が増加していることを決定する転写物は、ＡｄＧＦＰ  ＣＭ処理コントロール試料の２倍以上の発現の変化、および、ｐ値＜０．０５により、「存在する」（シグナル値＞４３）とみなされなければならなかった。ＡｄＢＭＰ―１０  ＣＭ処置によって減少していることを決定する遺伝子は、ＡｄＧＦＰ  ＣＭ処理コントロール試料に比較して２倍以下の発現の変化、および、ｐ値＜０．０５により、ＡｄＧＦＰ  ＣＭコントロール試料に「存在する」（シグナル値＞４３）とみなされなければならなかった。
【０４０５】
実施例１０．コントロール・マウスに比較して、ＡｄＢＭＰ−１０マウスの心臓、筋肉および脂肪組織において差別的に発現される遺伝子のインビボでの広範な遺伝子発現分析
実験Ａ．ＡｄＢＭＰ−１０マウスの心臓組織からＲＮＡによるAffymetrix GeneChip MU11k Arrayを使用するインビボでの広範な遺伝子発現分析
方法
Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ヒトＢＭＰ−１０（ＡｄＢＭＰ−１０）またはコントロール・ウイルス（５×１０１０の粒子）をコード化している複製欠乏性組換え体アデノウイルスにより静脈内に注射され、注射の後、３日目または７日目に殺された。全ＲＮＡは、心臓組織から調製され（この実験のように）；そして、以下の２つの実験にしたがって、筋肉および脂肪組織から調整された。冷凍された組織（筋肉、脂肪および心臓）は、液体窒素において、乳鉢と乳棒を用いて粉砕され、組織溶解緩衝液(RNAgents Kit Catalog Number Z5110, Promega, Madison, WI)において溶解された。全ＲＮＡは、製造会社の推薦の修飾によって分離された。簡潔には、ＲＮＡは、イソプロパノールの添加によって沈殿して、冷たい７５％のエタノールにより、２回、洗浄した。ペレットはＲＮｅａｓｙミニ・キット・サンプル溶解緩衝液に溶かされ、そして、ＲＮＡは製造会社の推薦(Qiagen, Hidden, Germany)に従って精製された。全ＲＮＡは、２６０ナノメートルの紫外吸収の測定から数量化された。全ＲＮＡの一定分量は、アガロースゲル電気泳動を用いて分析され、そして、ＲＮＡの完全性は１８Ｓおよび２８ＳのリボソームＲＮＡバンドの相対的強度の目視比較から評価された。すべてのサンプルで、２８ＳのリボソームＲＮＡバンドの強度は、１８Ｓのバンドのそれを超えた。
【０４０６】
全ＲＮＡは、１００ｐＭＴ７／Ｔ２４−タグ付のオリゴｄｔプライマーにより、７００Ｃで１０分間のさまざまな組織から分離され、氷に冷やされた５ｇの全ＲＮＡを変性させることによって、ハイブリッド形成のために調製された。第１鎖ｃＤＮＡ合成は、以下の緩衝条件で実行された；１倍の第１鎖の緩衝液(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)、１０ｍＭのＤＴＴ(GIBCO/Invitrogen)、５００ｍの各ｄＮＴＰ(Invitrogen Life Technologies)、４００単位のSuperscript RT II (Invitrogen Life Technologies)、４０単位ＲＮａｓｅ抑制物質(Ambion, Austin,TX.)。反応は、１時間、４７℃で進行した。第２鎖ｃＤＮＡは、リストされる最終濃度の以下の試薬の添加によって合成された。１倍の第２鎖の緩衝液(Invitrogen Life Technologies)、追加的な２００ｍの各ｄＮＴＰ(Invitrogen Life Technologies)、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩの４０単位(Invitrogen Life Technologies)、２単位の大腸菌ＲＮａｓｅＨ(Invitrogen Life Technologies)および１０単位の大腸菌ＤＮＡリガーゼ。反応は、２時間、１５．８℃でインキュベートされ、そして、６単位のＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ(New England Biolabs, Beverly, MA)が加えられた。反応は、更に５分間、１５．８℃でインキュベートされた。以下の通りに、ＢｉｏＭａｇカルボキシル末端粒子を用いて、結果として生じる二重鎖ｃDNAが精製された；０．２ｍｇのＢｉｏＭａｇ粒子（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ（ＰＡ））は、０．５ＭのＥＤＴＡによって３回洗浄することによって平衡化され、０．５ＭのＥＤＴＡにおいて２２．２ｍｇ／ｍｌの濃度で再懸濁された。二重鎖ｃＤＮＡ反応は、１０％ＰＥＧ／１．２５Ｍ ＮａＣｌの最終濃度に希釈され、そして、ビーズ懸濁液は０．６１４ｍｇ／ｍｌの最終的なビーズ濃度になるように加えられた。反応は、１０分間、室温でインキュベートされた。ｃＤＮＡ／ビーズ複合体は、３００ｌの７０％エタノールによって洗浄され、エタノールは取り除かれ、そして、チューブは空気乾燥された。ｃＤＮＡは、２０ｌの１０ｍＭトリス―酢酸塩（ｐＨ  ７．８）の添加によって溶出させられ、２−５分間、インキュベートされ、そして、ｃＤＮＡを含んでいる上澄みは取り除かれた。
【０４０７】
１０ｌの精製された二重鎖ｃDNAは、以下を含むインビトロ転写（ＩＶＴ）反応に加えられた。１倍のＩＶＴ緩衝役(Ambion,Austin,TX)、５，０００単位のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ(Epicentre Technologies, Madison,WI)、３ｍＭのＧＴＰ、１．５ｍＭのＡＴＰ、１．２ｍＭのＣＴＰおよび１．２ｍＭのＵＴＰ(Amersham/Pharmacia, Uppsala, Sweden)、それぞれ０．４ｍＭのbio-16 UTPおよびbio-11 CTP(Enzo Diagnostics, Farmingdale, NY)および８０単位のRNase抑制物質(Ambion, Austin,TX)。反応は、１６時間、３７℃でインキュベートされた。標識ＲＮＡは、ＱｉａｇｅｎＲＮｅａｓｙミニ・キットＲＮＡクリーンアップ手順を使用して、カラムを通じて精製され、そして、ＲＮＡ収率は２６０ナノメートルで吸光度を測定することによって数量化された。
【０４０８】
Affymetrixオリゴヌクレオチド・アレイに対するハイブリッド形成は、以下の通りに実行された。ハイブリッド形成効率を改善するために、１５ｇのｃＲＮＡは、前述したように断片化された。断片的なｃＲＮＡプローブは、製造会社(Affymetrix, Santa Clara, CA)によって示唆されるGeneChipハイブリダイゼーション溶液をつくるために用いられた。ハイブリダイゼーション溶液は、終夜４５℃で２つのガラスビーズ(Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)に、プレ−ハイブリダイズされた。ハイブリダイゼーション溶液は、クリーンなチューブに取り除かれ、９５℃で１−２分間、加熱され、ペレット不溶層に高速で２分間、微量遠心分離された。これらの水溶液は、それからAffymetrixマイクロアレイにハイブリダイズされた。マイクロアレイは、４５℃で１８０ｕｌのハイブリダイゼーション溶液によってハイブリダイズされ、終夜、45-60 rpmで回転した。一晩のインキュベーションの後、ハイブリダイゼーション溶液は回収され、洗浄され、そして、チップは製造会社のプロトコル(Affymetrix, Santa Clara, CA)に従ってスキャンするために調製された。未処理蛍光データは集められ、主要なデータ（すなわち、算出された遺伝子の値）を構築するために、GeneChip 3.1 application (Affymetrix, Santa Clara, CA)を用いて低下された。
【０４０９】
結果
Affymetrix（登録商標） GeneChip MU11kによって測定される、ＡｄＢＭＰ−１０による注射の３日後に、マウスの心臓組織から分離されるＲＮＡの分析は、コントロールと比較された；結果は、図２６Ａ〜２６Ｂに示される。注射後７日目の広範な遺伝子発現分析の結果は、図２６Ｃ〜２６Ｌに示される。
【０４１０】
実験Ｂ．ＡｄＢＭＰ−１０マウスの筋肉組織からのＲＮＡを有するAffymetrix GeneChip MUIIkネズミ・アレイを使用するインビボでの転写プロファイリング
方法
ＡｄＢＭＰ−１０マウス（上記の通りに注射される）からの筋肉組織は、注射後３および７日に犠牲にされたマウスから上記の通りに調製された。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘオリゴヌクレオチド・アレイに対するハイブリッド形成は、上記の通りに実行された。
【０４１１】
結果
Affymetrix（登録商標） GeneChip MU11kネズミ・アレイによって測定される、ＡｄＢＭＰ−１０による注射後３および７日のマウスの筋肉組織の広範な遺伝子発現分析は、コントロールと比較された。注射後３日の結果は、図２７Ａ−２７Ｄに示される。；注射後７日の結果は、図２７Ｅ−２７Ｔに示される。
【０４１２】
実験Ｃ．ＡｄＢＭＰ−１０マウスの脂肪組織からのＲＮＡを有するAffymetrix GeneChip MU11kネズミ・アレイを使用する、インビボでの広範な遺伝子発現分析
方法
ＡｄＢＭＰ−１０マウス（上記の通りに注射される）からの脂肪組織からのＲＮＡは、３日目に殺されるマウスから上記の通りに調製された。Affymetrixオリゴヌクレオチド・アレイに対するハイブリッド形成は、上記の通りに実行された。
【０４１３】
結果
Affymetrix（登録商標） GeneChip MU11kネズミ・アレイによって測定される、ＡｄＢＭＰ−１０による注射の３日後のマウスの脂肪組織の広範な遺伝子発現分析は、コントロールと比較された。結果は、図２８Ａ―２８Ｄに示される。
【０４１４】
要約すると、ＡｄＢＭＰ−１０治療をうけているマウスの組織の顕著な遺伝子発現変化（網羅的ではないが図示する）は、以下の通りだった。ＧＤＦ８  ｍＲＮＡ発現は、筋肉において上流制御され；また、ミオスタチンとして知られているよう、ＧＤＦ８は、筋肉の成長のネガティブなレギュレータである。公知のＢＭＰに反応する遺伝子（例えば、Ｓｍａｄ６、Ｓｍａｄ７）およびＤＮＡ結合の抑制物質、Ｉｄ１、Ｉｄ２およびＩｄ４の発現も、増加した。Ｓｍａｄ６およびＩｄ１  ｍＲＮＡは、脂肪および心臓組織において増加した。Ｉｄタンパク質は、内皮細胞の活性化を示す。Ｓｍａｄ６は、ＢＭＰおよびＴＧＦＪシグナル伝達の抑制物質である。エンドグリン、ＴＧＦＪ−系統Ｔｙｐｅ  ＩＩＩ補助受容体は、ＡｄＢＭＰ−１０治療されたマウスの筋肉において増加した。ＡｄＢＭＰ−１０マウスの転写プロファイリングは、インテグリンおよび細胞間接着、Ｒａｓ関連のタンパク質−１ａ（Ｒａｐ１ａ）の重要なレギュレータの減少した発現を示した。
【０４１５】
実施例１１．ストロマ細胞誘導因子１（ＳＤＦ−１）およびＡｄＢＭＰ−１０マウスのマトリックスメタロペプチダーゼ９（ＭＭＰ９）の血清レベル
方法
ＥＬＩＳＡ分析は、ＡｄＢＭＰ−１０を注射したマウスの注射後１日の血清におけるストロマ細胞誘導因子１（ＳＤＦ−１）、および、マトリックスメタロペプチダーゼ９（ＭＭＰ９）の増加したレベルを示した。ｈＢＭＰ−１０をコード化している組換え体アデノウイルスの５×１０１０の粒子の単一投与量は、雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（年齢７−８週（ｎ＝３））の尾部静脈に注射された。コントロール・マウスは、アデノウイルスをコード化しているＧＦＰまたはＰＢＳ／１０％のグリセロール（ｎ＝３）を与えられた。動物は注射後２４時間後に犠牲にされ、血液は心臓の穴により集められて、血清を分離するために3000rpmで１０分間回転した。血清は、クリーンなチューブへ転送されて、―８０℃で凍結された。血清は、特注設計のSearchLight Multiplex Assayを使用する分析のため、Pierce Biotechnology, Inc.に送られた。テスト検体は、ＳＤＦ−１およびＭＭＰ９を含んだ。
【０４１６】
結果
ＳＤＦ−１およびＭＭＰ９の血清レベルは、１日目に、コントロールと比較して、ＡｄＢＭＰ−１０治療をうけているマウスにおいて増加した。（ｎ＝３、ｐ＜．０５）ＥＬＩＳＡ分析からの結果は、図２９に示される。
【図１】
2010529041.tif 000145
【図２】
2010529041.tif 000146
【図３Ａ】
2010529041.tif 000147
【図３Ｂ】
2010529041.tif 000148
【図３Ｃ】
2010529041.tif 000149
【図３Ｄ】
2010529041.tif 000150
【図４Ａ】
2010529041.tif 000151
【図４Ｂ】
2010529041.tif 000152
【図４Ｃ】
2010529041.tif 000153
【図５Ａ】
2010529041.tif 000154
【図５Ｂ】
2010529041.tif 000155
【図６Ａ】
2010529041.tif 000156
【図６Ｂ】
2010529041.tif 000157
【図７】
2010529041.tif 000158
【図８】
2010529041.tif 000159
【図９】
2010529041.tif 000160
【図１０】
2010529041.tif 000161
【図１１】
2010529041.tif 000162
【図１２】
2010529041.tif 000163
【図１３】
2010529041.tif 000164
【図１４Ａ】
2010529041.tif 000165
【図１４Ｂ】
2010529041.tif 000166
【図１５Ａ】
2010529041.tif 000167
【図１５Ｂ】
2010529041.tif 000168
【図１６】
2010529041.tif 000169
【図１７】
2010529041.tif 000170
【図１８】
2010529041.tif 000171
【図１９】
2010529041.tif 000172
【図２０】
2010529041.tif 000173
【図２１】
2010529041.tif 000174
【図２２】
2010529041.tif 000175
【図２３Ａ】
2010529041.tif 000176
【図２３Ｂ−１】
2010529041.tif 000177
【図２３Ｂ−２】
2010529041.tif 000178
【図２３Ｃ−１】
2010529041.tif 000179
【図２３Ｃ−２】
2010529041.tif 000180
【図２３Ｄ−１】
2010529041.tif 000181
【図２３Ｄ−２】
2010529041.tif 000182
【図２４Ａ】
2010529041.tif 000183
【図２４Ｂ】
2010529041.tif 000184
【図２４Ｃ】
2010529041.tif 000185
【図２４Ｄ】
2010529041.tif 000186
【図２５Ａ】
2010529041.tif 000187
【図２５Ｂ−１】
2010529041.tif 000188
【図２５Ｂ−２】
2010529041.tif 000189
【図２５Ｃ−１】
2010529041.tif 000190
【図２５Ｃ−２】
2010529041.tif 000191
【図２５Ｄ−１】
2010529041.tif 000192
【図２５Ｄ−２】
2010529041.tif 000193
【図２５Ｅ−１】
2010529041.tif 000194
【図２５Ｅ−２】
2010529041.tif 000195
【図２６Ａ】
2010529041.tif 000196
【図２６Ｂ】
2010529041.tif 000197
【図２６Ｃ】
2010529041.tif 000198
【図２６Ｄ−１】
2010529041.tif 000199
【図２６Ｄ−２】
2010529041.tif 000200
【図２６Ｅ−１】
2010529041.tif 000201
【図２６Ｅ−２】
2010529041.tif 000202
【図２６Ｆ】
2010529041.tif 000203
【図２６Ｇ】
2010529041.tif 000204
【図２６Ｈ】
2010529041.tif 000205
【図２６Ｉ】
2010529041.tif 000206
【図２６Ｊ】
2010529041.tif 000207
2010529041.tif 000208
【図２６Ｋ】
2010529041.tif 000209
【図２６Ｌ】
2010529041.tif 000210
【図２７Ａ】
2010529041.tif 000211
【図２７Ｂ】
2010529041.tif 000212
【図２７Ｃ】
2010529041.tif 000213
【図２７Ｄ】
2010529041.tif 000214
【図２７Ｅ】
2010529041.tif 000215
【図２７Ｆ】
2010529041.tif 000216
2010529041.tif 000217
【図２７Ｇ−１】
2010529041.tif 000218
【図２７Ｇ−２】
2010529041.tif 000219
【図２７Ｈ】
2010529041.tif 000220
【図２７Ｉ】
2010529041.tif 000221
【図２７Ｊ】
2010529041.tif 000222
【図２７Ｋ】
2010529041.tif 000223
【図２７Ｌ】
2010529041.tif 000224
【図２７Ｍ】
2010529041.tif 000225
2010529041.tif 000226
【図２７Ｎ−１】
2010529041.tif 000227
【図２７Ｎ−２】
2010529041.tif 000228
【図２７Ｏ−１】
2010529041.tif 000229
【図２７Ｏ−２】
2010529041.tif 000230
【図２７Ｐ】
2010529041.tif 000231
【図２７Ｑ−１】
2010529041.tif 000232
【図２７Ｑ−２】
2010529041.tif 000233
【図２７Ｒ−１】
2010529041.tif 000234
【図２７Ｒ−２】
2010529041.tif 000235
【図２７Ｓ−１】
2010529041.tif 000236
【図２７Ｓ−２】
2010529041.tif 000237
【図２７Ｔ−１】
2010529041.tif 000238
【図２７Ｔ−２】
2010529041.tif 000239
【図２８Ａ】
2010529041.tif 000240
【図２８Ｂ】
2010529041.tif 000241
【図２８Ｃ】
2010529041.tif 000242
【図２８Ｄ】
2010529041.tif 000243
【図２９】
2010529041.tif 000244
【配列表】
2010529041000001.xml
【国際調査報告】
2010529041.tif 000259
2010529041.tif 000260
2010529041.tif 000261