(57)【要約】  本発明は、生きている細胞内のミトコンドリアの表面および内部における活性剤選択的局在化のための新規な方法、並びにさらなる補助薬なしで細胞膜を通って細胞に浸透し、かつミトコンドリアの表面および内部の両方に局在化することができる、相当する活性剤に関する。これらの活性剤は少なくとも１つのモノヒドロキシモノニトロフェニル残基またはモノヒドロキシジニトロフェニル残基で置換されている。
2010507607.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉの化合物：
【化１】
2010507607.tif 000024
（式中、
ｎは０〜３５の整数を表し、
各Ｅは互いに独立して、水素原子、置換もしくは非置換フェニル残基、置換もしくは非置換複素環式残基、保護基で任意に置換されたヌクレオベース、またはＤＮＡインターカレーターを表し、
各Ｒ1は互いに独立して、水素原子または天然由来もしくは非天然由来のアミノ酸の側鎖、または２０までの炭素原子を有する任意に置換されたアルキル、アルケニル、アルキルアリール、アリール、複素環式もしくは脂環式残基を表し、ここで、２０までの炭素原子を有する任意に置換されたアルキル、アルケニル、アルキルアリール、アリール、複素環式もしくは脂環式残基の少なくとも１つは、１つ以上のホスホン酸エステル官能基またはホスホン酸官能基で置換されており、
Ｋは、式−ＮＲ2Ｒ3、−Ｎ+Ｒ2Ｒ3Ｒ4、−ＮＲ2（ＣＯ）Ｒ3または−ＮＲ2（ＣＳ）Ｒ3の基を表し、ここで、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は互いに独立して、水素原子、アルキル、アルカリール、アルケニルもしくはアルキニル残基、アミノ保護基、リポーターリガンド、蛍光マーカー、インターカレーター、キレート化剤、アミノ酸、ペプチド、たんぱく質、炭水化物、脂質、ステロイド、脂肪酸、オリゴヌクレオチド、量子ドット、ＦＲＥＴ消光物質（蛍光共鳴エネルギー伝達消光物質）、または水に可溶性もしくは不溶性のポリマーを表し、上記残基のそれぞれは任意に置換されていてもよく、
Ｌは、式−ＮＲ5Ｒ6、−ＮＲ5（ＣＯ）Ｒ6、−ＮＲ5（ＣＳ）Ｒ6、−ＯＲ7またはＳＲ7の基を表し、ここで、Ｒ5およびＲ6は互いに独立して、水素原子、アルキル、アルカリール、アルケニルもしくはアルキニル残基、リポーターリガンド、蛍光マーカー、インターカレーター、キレート化剤、アミノ酸、アミノ酸アミド、ペプチド、ペプチドアミド、たんぱく質、炭水化物、脂質、ステロイド、脂肪酸、オリゴヌクレオチド、量子ドット、ＦＲＥＴ消光物質（蛍光共鳴エネルギー伝達消光物質）、または水に可溶性もしくは不溶性のポリマーを表し、Ｒ7は、水素原子、アルキル残基、リポーターリガンド、蛍光マーカー、インターカレーター、キレート化剤、アミノ酸、アミノ酸アミド、ペプチド、ペプチドアミド、たんぱく質、炭水化物、脂質、ステロイド、脂肪酸、オリゴヌクレオチド、量子ドット、ＦＲＥＴ消光物質、または水に可溶性もしくは不溶性のポリマーを表し、上記残基のそれぞれは任意に置換されていてもよく、
残基Ｋ、ＬまたはＲ1は互いに独立して、少なくとも１つのモノヒドロキシモノニトロフェニル残基またはモノヒドロキシジニトロフェニル残基で置換されている）。
【請求項２】
式Ｉの化合物が少なくとも１つの非対称中心を示す、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
少なくとも１つの残基Ｒ1が水素原子を表さず、式Ｉの化合物が少なくとも１つの非対称中心を示す、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
一つ置きの残基Ｒ1が互いに独立して、２０までの炭素原子を有する任意に置換されたアルキル、アルケニル、アルキルアリール、アリール、複素環式もしくは脂環式残基を表し、残りの残基Ｒ1が水素原子を表す、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
二つ置きの残基Ｒ1が互いに独立して、２０までの炭素原子を有する任意に置換されたアルキル、アルケニル、アルキルアリール、アリール、複素環式もしくは脂環式残基を表し、残りの残基Ｒ1が水素原子を表す、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
２、３またはそれ以上の隣接残基Ｒ1が互いに独立して、２０までの炭素原子を有する任意に置換されたアルキル、アルケニル、アルキルアリール、アリール、複素環式もしくは脂環式残基を表し、残りの残基Ｒ1が水素原子を表す、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
各Ｒ1が互いに独立して、２０までの炭素原子を有する任意に置換されたアルキル、アルケニル、アルキルアリール、アリール、複素環式もしくは脂環式残基を表す、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
１つ以上の残基Ｒ1が互いに独立して、ホスホン酸エステル官能基またはホスホン酸官能基を表す、請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
全ての非対称中心が同じ配置を示す、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
全ての非対称中心が（Ｓ）配置を示す、請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１１】
全ての非対称中心が（Ｒ）配置を示す、請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１２】
各Ｒ1が互いに独立して、１つ以上のホスホン酸エステル官能基またはホスホン酸官能基を表し、ここで、ホスホン酸エステル官能基が式−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＶ）2または−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＶ）（ＯＨ）を有し、各Ｖが互いに独立して、２０までの炭素原子を有する置換されていないアルキル、アルケニル、アルキルアリール、アリール、もしくは脂環式残基を表す、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１３】
各Ｖが互いに独立して、メチル、エチル、シクロヘキシルまたはベンジル残基を表す、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の少なくとも２つの化合物を含んでなり、該２つの化合物が互いにリンカーを経て接続されている化合物。
【請求項１５】
リンカーがアルキル鎖、ペプチド、オリゴヌクレオチド、または８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸の少なくとも３つの単位からなるオリゴマーを表す、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の少なくとも１つの化合物を含有する組成物。
【請求項１７】
少なくとも１種の担体、溶媒または他の薬学的補助薬と任意に組み合わせた、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の少なくとも１つの化合物または組成物を含有する医薬組成物。
【請求項１８】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の化合物もしくは組成物または請求項１７に記載の医薬組成物の、ミトコンドリア疾患の治療または予防用薬剤製造への使用。
【請求項１９】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の化合物もしくは組成物の、ミトコンドリア特性またはミトコンドリア疾患の診断への使用。
【請求項２０】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の化合物もしくは組成物または請求項１７に記載の医薬組成物の、ミトコンドリア疾患治療または予防への使用。
【請求項２１】
ミトコンドリア疾患が遺伝性疾患である、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２２】
癌の治療または予防への請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２３】
糖尿病の治療または予防への請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２４】
パーキンソン病の治療または予防への請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２５】
加齢現象の治療または予防への請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２６】
動脈硬化症の治療または予防への請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２７】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の化合物もしくは組成物または請求項１７に記載の医薬組成物の、細胞内または生体内におけるmtDNAの転写防止用薬剤製造への使用。
【請求項２８】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の化合物もしくは組成物または請求項１７に記載の医薬組成物の、細胞内または生体内におけるmtDNAの翻訳防止用薬剤製造への使用。
【請求項２９】
式Ｖの化合物：
Z-M-P  （Ｖ）
（式中、
Ｚは酸化または還元可能な官能基を表し、
Ｍはリンカー基を表し、そして
Ｐはモノヒドロキシモノニトロフェニル残基またはモノヒドロキシジニトロフェニル残基を表す）。
【請求項３０】
化合物が少なくとも１つのモノヒドロキシモノニトロフェニル残基またはモノヒドロキシジニトロフェニル残基で置換されていることを特徴とする、化合物をミトコンドリアの表面および内部の両方に選択的に局在化させる方法。
【請求項３１】
化合物が酸化または還元可能な官能基を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
化合物が抗酸化薬を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
化合物が請求項２９に記載の式Ｖの化合物である、請求項３０、３１または３２に記載の方法。
【請求項３４】
請求項２９に記載の化合物の少なくとも１つを含む組成物。
【請求項３５】
少なくとも１種の担体、溶媒または他の薬学的補助薬と任意に組み合わせた、請求項２９に記載の化合物の少なくとも１つまたは請求項３４に記載の組成物を含有する医薬組成物。
【請求項３６】
請求項２９に記載の化合物、請求項３４に記載の組成物または請求項３５に記載の医薬組成物の、ミトコンドリア疾患の治療または予防用薬剤製造への使用。
【請求項３７】
請求項２９に記載の化合物、請求項３４に記載の組成物または請求項３５に記載の医薬組成物の、ミトコンドリア特性またはミトコンドリア疾患の診断への使用。
【請求項３８】
請求項２９に記載の化合物、請求項３４に記載の組成物または請求項３５に記載の医薬組成物の、ミトコンドリア疾患の治療または予防への使用。
【請求項３９】
ミトコンドリア疾患が遺伝性疾患である、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４０】
癌の治療または予防への請求項３６〜３９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４１】
糖尿病の治療または予防への請求項３６〜３９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４２】
パーキンソン病の治療または予防への請求項３６〜３９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４３】
加齢現象の治療または予防への請求項３６〜３９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４４】
動脈硬化症の治療または予防への請求項３６〜３９のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生きている細胞内のミトコンドリアの表面および内部における活性剤選択的局在化のための新規な方法、並びにさらなる補助薬なしで細胞膜を通って細胞に浸透し、かつミトコンドリアの表面および内部の両方に選択的に局在化する、相当する活性剤に関する。
【０００２】
ミトコンドリアの表面または内部における活性剤の局在化とは、それぞれ本出願全体において、ミトコンドリアの表面または内部それぞれにおける活性剤の蓄積を意味する。ミトコンドリアの表面または内部における「局在化」という表現は、それぞれ本出願全体において、ミトコンドリアの表面または内部それぞれにおける「蓄積」を意味する。
【背景技術】
【０００３】
ミトコンドリアは細胞の半自律性小器官である。それらは、−核ゲノム近くに−それらのたんぱく質の一部をコードする独自のゲノム(mtDNA)を有する。ミトコンドリオンによってコードされるたんぱく質は、ミトコンドリオンによっても転写、翻訳および合成される。ミトコンドリアにおける重要な代謝経路はエネルギー生成のために働き、従って、細胞の活力に欠くことができないものである。
【０００４】
ミトコンドリア疾患には、例えば、多くの遺伝性疾患、癌、糖尿病、パーキンソン病および動脈硬化症が含まれる。とりわけ、ミトコンドリア代謝障害は加齢現象、例えば難聴または視力低下を招く。加齢現象は、例えば、ミトコンドリアDNAの変異または欠失それぞれに原因があるとも考えられる。("Mitochondria as targets for detection and treatment of cancer", Josephine S. Modica-Napolitano, Keshav K. Singh, Expert Reviews in Molecular Medicine, (02)00445-3a.pdf (short code: txt001ksb); 11 April 2002, ISSN 1462-3994 (copyright)2002 Cambridge University Press. "Mitochondrial defects in cancer", Jennifer S Carew, Peng Huang, Molecular Cancer, 2002, I:9.; G. A. Cortopassi, Aliu Wong, Biochimica et Biophysica Acta (BBA)- Bioenergetics, 1999, 1410 (2), 183-193.)。
【０００５】
ミトコンドリア疾患の土台を形成する遺伝子欠陥は、突発的に生じるおよび純粋に母系遺伝された位置およびmtDNAの長さ突然変異から、核ゲノム内での突然変異時の常染色体優性または劣性それぞれに遺伝された形にまでに及ぶ。さらに、mtDNAにおける突然変異が複雑な遺伝と共に多遺伝子疾患で役割を果たすことも議論されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
これらの疾患の特徴は、臨床徴候の多様性、診断の複雑さ、および利用可能な治療対処法がこれまでは限られた方法のみであることである。従って、ミトコンドリアのはっきりした性質、例えば、ミトコンドリアDNAの突然変異またはミトコンドリア代謝障害の研究および診断は、ミトコンドリア疾患に対する適切な活性剤開発のための重要な必須条件である。細胞内のミトコンドリア表面における活性剤の選択的局在化も、ミトコンドリア表面における活性剤の局所濃度が高くなり、それが最終的には活性剤をミトコンドリアへ運び込むことになるので重要な側面である。
【０００７】
従って、本発明の目的は、ミトコンドリア活性剤、例えば小さい分子またはアンチセンス活性剤が、細胞内でミトコンドリアの表面および内部の両方に選択的に局在化することができる方法を提供することである。
ミトコンドリア活性剤は、ミトコンドリアの表面および内部の両方における効果、例えばミトコンドリア疾患の治療における効果またはミトコンドリアの表面および内部の両方での診断法に関しての効果が得られる物質である。
【０００８】
さらに、本発明の目的は、ミトコンドリアにおけるアンチセンスまたはアンチゲノム効果を生じるために、さらなる補助薬なしで細胞膜を通って細胞へ浸透し、かつミトコンドリアの表面および内部の両方に選択的に局在化するアンチセンス活性剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
これらの目的は一般式Ｉの化合物で解決される。
【００１０】
【化１】
2010507607.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、１つのモノヒドロキシモノニトロフェニル残基で置換された本発明による一般式Ｉの化合物を含むHeLa細胞を示す。
【図２】図２は、１つのモノヒドロキシモノニトロフェニル残基で置換された本発明による一般式Ｉの化合物を含むHeLa細胞を示す。
【図３】図３は、１つのモノヒドロキシジニトロフェニル残基で置換された本発明による一般式Ｉの化合物を含むHeLa細胞を示す。
【図４】図４は、１つのモノヒドロキシジニトロフェニル残基で置換された本発明による一般式Ｉの化合物を含む１４３Ｂペアレント細胞を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
式中、ｎは０〜３５、好ましくは１〜２８、さらに好ましくは９〜２８、最も好ましくは１３〜２０の整数である。
【００１３】
残基Ｋ、ＬまたはＲ1は互いに独立して、少なくとも１つのモノヒドロキシモノニトロフェニル残基、好ましくは４−ヒドロキシ−３−ニトロフェニル残基、さらに好ましくは４−ヒドロキシ−２−ニトロフェニル残基、さらに好ましくは３−ヒドロキシ−６−ニトロフェニル残基で、またはモノヒドロキシジニトロフェニル残基、好ましくは３，５−ジニトロ−４−ヒドロキシフェニル残基、さらに好ましくは２，５−ジニトロ−４−ヒドロキシフェニル残基、さらに好ましくは２，４−ジニトロ−５−ヒドロキシフェニル残基で置換されており、ここで、フェニル残基の残基Ｋ、ＬまたはＲ1との結合位置は１位として定められ、さらに、フェニル残基は１つ以上のフッ素、塩素、臭素またはヨウ素原子で、あるいは−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＲ8、−ＣＳＯＨ、−ＣＳＯＲ8、−ＣＯＳＨ、−ＣＯＳＲ8、−ＣＯＮＨ2、−ＣＯＮＨＲ9、−ＣＯＲ10Ｒ11、−ＯＨ、−ＯＲ8、−ＳＨ、−ＳＲ8、−ＮＨ2、−ＮＨＲ9、−ＮＲ10Ｒ11、−ＮＲ12ＮＯＨ、−ＮＯＲ13、ホスホン酸エステル官能基またはホスホン酸官能基で、あるいはＣ1−Ｃ6アルキル、Ｃ2−Ｃ6アルケニル、Ｃ2−Ｃ6アルキニル、Ｃ1−Ｃ6ヘテロアルキル、Ｃ3−Ｃ10シクロアルキル、Ｃ3−Ｃ10ヘテロシクロアルキル、Ｃ6−Ｃ10アリール、Ｃ5−Ｃ9ヘテロアリール、Ｃ7−Ｃ12アラルキルまたはＣ2−Ｃ11ヘテロアラルキル基で置換されていてもよく、ここで、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11、Ｒ12およびＲ13は互いに独立してＣ1−Ｃ6アルキル残基を表す。
【００１４】
Ｅは互いに独立して、水素原子、置換もしくは非置換フェニル残基、置換もしくは非置換複素環式残基、保護基で任意に置換されたヌクレオベース、例えば天然もしくは非天然由来のヌクレオベース、またはＤＮＡインターカレーターを表す。
好ましくは、各Ｅは互いに独立して、アデニニル、シトシニル、プソイドイソシトシニル、グアニニル、チミニル、ウラシリルまたはフェニル残基である。
【００１５】
各残基Ｒ1は互いに独立して、水素原子または２０までの炭素原子を有する任意に置換されたアルキル、アルケニル、アルキルアリール、アリール、複素環式もしくは脂環式残基を表し、ここで、少なくとも１つの残基Ｒ1は水素原子を表さず、１つ以上のホスホン酸エステル官能基またはホスホン酸官能基で置換されている。
残基Ｒ1が１つ以上のホスホン酸エステル官能基またはホスホン酸官能基で置換されていないならば、それは互いに独立して、例えば、天然由来または非天然由来のアミノ酸の側鎖を１つ以上、および好ましくは、２０までの炭素原子を有する任意に置換されたアルキル、アルケニル、アルキルアリール、アリール、複素環式もしくは脂環式残基を有していてもよい。
好ましくは、各残基Ｒ1は互いに独立して１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の炭素原子を含む。
各残基Ｒ1は互いに独立して枝分かれしていても、枝分かれしていなくてもよい。
【００１６】
「任意に置換された」という表現は、本出願全体において、１つ以上の水素原子がフッ素、塩素、臭素またはヨウ素原子で、あるいは−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＲ8、−ＣＳＯＨ、−ＣＳＯＲ8、−ＣＯＳＨ、−ＣＯＳＲ8、−ＣＯＮＨ2、−ＣＯＮＨＲ9、−ＣＯＲ10Ｒ11、−ＯＨ、−ＯＲ8、＝Ｏ、−ＳＨ、−ＳＲ8、＝Ｓ、−ＮＨ2、＝ＮＨ、−ＮＨＲ9、−ＮＲ10Ｒ11、−ＮＲ12ＮＯＨ、−ＮＯＲ13または−ＮＯ2基、ホスホン酸エステル官能基またはホスホン酸官能基で置き換えられている基に関する。さらに、この表現は、非置換Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ2−Ｃ6アルケニル、Ｃ2−Ｃ6アルキニル、Ｃ1−Ｃ6ヘテロアルキル、Ｃ3−Ｃ10シクロアルキル、Ｃ2−Ｃ9ヘテロシクロアルキル、Ｃ6−Ｃ10アリール、Ｃ5−Ｃ9ヘテロアリール、Ｃ7−Ｃ12アラルキルまたはＣ2−Ｃ11ヘテロアラルキルで置換されている基にも関係し、ここで、残基Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11、Ｒ12およびＲ13は互いに独立してＣ1−Ｃ6アルキル残基を表す。
【００１７】
ホスホン酸エステル官能基は、例えば、式−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＶ）2または−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＶ）（ＯＨ）を示しうる。ここで、各Ｖは互いに独立して、２０まで、より好ましくは７までの炭素原子を有する非置換アルキル、アルケニル、アルキルアリール、アリール、脂環式残基、最も好ましくはメチル、エチル、シクロヘキシルまたはベンジル残基を表してもよい。
本発明の化合物において、ホスホン酸官能基は、例えば、式−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）2を示しうる。
【００１８】
最も好ましくは、各残基Ｒ1は互いに独立して、式−（Ｃ1−Ｃ10）アルキル−［Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ−Ｖ）2］（式中、各Ｖは互いに独立して、水素原子、メチル、エチル、シクロヘキシルまたはベンジル残基を表す）の基から選択される。
【００１９】
Ｋは、式−ＮＲ2Ｒ3、−Ｎ+Ｒ2Ｒ3Ｒ4、−ＮＲ2（ＣＯ）Ｒ3または−ＮＲ2（ＣＳ）Ｒ3の基を表し、ここで、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は互いに独立して、水素原子、アルキル、アルカリール、アルケニルまたはアルキニル残基、アミノ保護基、リポーターリガンド、蛍光マーカー、インターカレーター、キレート化剤、アミノ酸、ペプチド、たんぱく質、炭水化物、脂質、ステロイド、脂肪酸、オリゴヌクレオチド、量子ドット、ＦＲＥＴ消光物質（蛍光共鳴エネルギー伝達消光物質）、または水に可溶性もしくは不溶性のポリマーを表し、上記残基のそれぞれは任意に置換されていてもよい。
【００２０】
好ましくは、Ｋは、−ＮＨ2官能基、−ＮＨ（ＣＯ）ＣＨ3残基、−ＮＨ（ＣＯ）−（Ｃ1−Ｃ10）アルキル官能基、−ＮＨ（ＣＯ）−（Ｃ1−Ｃ10）アルカリール官能基、−ＮＨ（ＣＯ）−（Ｃ1−Ｃ10）アルケニル官能基、−ＮＨ（ＣＯ）−（Ｃ1−Ｃ10）アルキニル官能基、式−ＮＲ2Ｒ3または−Ｎ+Ｒ2Ｒ3Ｒ4または−ＮＲ2（ＣＯ）Ｒ3の基を表し、ここで、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は互いに独立して、水素原子、天然由来もしくは非天然由来のアミノ酸、アミノ酸もしくはペプチド、またはそれぞれホスホン酸エステル官能基もしくはホスホン酸官能基で置換されたまたは置換されていないアルキル、アルカリール、アルケニルもしくはアルキニル残基を表し、ここで、上記残基のそれぞれは任意に置換されていてもよい。
【００２１】
Ｌは、式−ＮＲ5Ｒ6、−ＮＲ5（ＣＯ）Ｒ6、−ＮＲ5（ＣＳ）Ｒ6、−ＯＲ7またはＳＲ7の基を表し、ここで、Ｒ5およびＲ6は互いに独立して、水素原子、アルキル、アルカリール、アルケニルまたはアルキニル残基、リポーターリガンド、蛍光マーカー、インターカレーター、キレート化剤、アミノ酸、アミノ酸アミド、ペプチド、ペプチドアミド、たんぱく質、炭水化物、脂質、ステロイド、脂肪酸、オリゴヌクレオチド、量子ドット、ＦＲＥＴ消光物質（蛍光共鳴エネルギー伝達消光物質）、または水に可溶性もしくは不溶性のポリマーを表し、Ｒ7は、水素原子、アルキル残基、リポーターリガンド、蛍光マーカー、インターカレーター、キレート化剤、アミノ酸、アミノ酸アミド、ペプチド、ペプチドアミド、たんぱく質、炭水化物、脂質、ステロイド、脂肪酸、オリゴヌクレオチド、量子ドット、ＦＲＥＴ消光物質、または水に可溶性もしくは不溶性のポリマーを表し、上記残基のそれぞれは任意に置換されていてもよい。
【００２２】
好ましくは、Ｌは、ＯＨ官能基、−ＮＨ2官能基、−ＮＨ−（Ｃ1−Ｃ10）アルキル官能基、−ＮＨ−（Ｃ1−Ｃ10）アルカリール官能基、−ＮＨ−（Ｃ1−Ｃ10）アルケニル官能基、−ＮＨ−（Ｃ1−Ｃ10）アルキニル官能基、天然由来もしくは非天然由来のアミノ酸、アミノ酸、アミノ酸アミド、ペプチドもしくはペプチドアミド単位を表し、これらの全てはホスホン酸エステル官能基もしくはホスホン酸官能基で置換されていても、置換されていなくてもよく、上記残基のそれぞれは任意に置換されていてもよい。
【００２３】
本出願全体において、アルキル残基は１〜６個の炭素原子を有するのが好ましく、例えば、それらはメチル、エチル、プロピルまたはブチルで表されうる。本出願全体における「アラルキル」、「アルカリール」および「アリールアルキル」という表現は、脂肪族および芳香族部分を有する基を意味する。
【００２４】
Ｒ1が水素原子を表さないならば、残基Ｒ1の一般的化合物Ｉの主鎖への結合により結合位置において非対称中心（*）が生じる。従って、各非対称中心において、Ｒ配置またはＳ配置が存在する。
【００２５】
ここにおいて、非対称中心での配置はCahn-Ingold-Prelog規則に従って定義されるのが好ましく、さらに、配位子は常に次のように優先されることになっている：非対称中心における窒素原子は常に優先度１である。非対称中心におけるカルボキシル基の炭素原子は常に優先度２である。非対称中心における残基Ｒ1の炭素原子は常に優先度３である。非対称中心における水素原子は常に優先度４である。
【００２６】
本発明では、一般式Ｉの化合物は少なくとも１つの非対称中心を示し、少なくとも１つの残基Ｒ1は１つ以上のホスホン酸エステル官能基またはホスホン酸官能基で置換されている。
【００２７】
本発明のさらに好ましい態様では、一つ置きの残基Ｒ1は互いに独立して、天然由来または非天然由来のアミノ酸の側鎖、好ましくは、２０までの炭素原子を有する任意に置換されたアルキル、アルケニル、アルキルアリール、アリール、複素環式もしくは脂環式残基に相当し、少なくとも１つの残基Ｒ1は、１つ以上のホスホン酸エステル官能基またはホスホン酸官能基で置換された、２０までの炭素原子を有する任意に置換されたアルキル、アルケニル、アルキルアリール、アリールまたは脂環式残基を表し、残りの残基Ｒ1は水素原子を表す。
【００２８】
本発明のさらに好ましい態様では、二つ置きの残基Ｒ1は互いに独立して、天然由来または非天然由来のアミノ酸の側鎖、好ましくは、２０までの炭素原子を有する任意に置換されたアルキル、アルケニル、アルキルアリール、アリール、複素環式もしくは脂環式残基に相当し、少なくとも１つの残基Ｒ1は、１つ以上のホスホン酸エステル官能基またはホスホン酸官能基で置換された、２０までの炭素原子を有する任意に置換されたアルキル、アルケニル、アルキルアリール、アリールまたは脂環式残基を表し、残りの残基Ｒ1は水素原子を表す。
【００２９】
本発明のさらに好ましい態様では、２、３またはそれ以上の隣接残基Ｒ1は互いに独立して、天然由来または非天然由来のアミノ酸の側鎖、好ましくは、２０までの炭素原子を有する任意に置換されたアルキル、アルケニル、アルキルアリール、アリール、複素環式もしくは脂環式残基に相当し、少なくとも１つの残基Ｒ1は、１つ以上のホスホン酸エステル官能基またはホスホン酸官能基で置換された、２０までの炭素原子を有する任意に置換されたアルキル、アルケニル、アルキルアリール、アリールまたは脂環式残基を表し、残りの残基Ｒ1は水素原子を表す。
【００３０】
本発明のさらに好ましい態様では、各残基Ｒ1は互いに独立して、天然由来または非天然由来のアミノ酸の側鎖、好ましくは、２０までの炭素原子を有する任意に置換されたアルキル、アルケニル、アルキルアリール、アリール、複素環式もしくは脂環式残基に相当し、少なくとも１つの残基Ｒ1は、２０までの炭素原子を有する任意に置換されたアルキル、アルケニル、アルキルアリール、アリールまたは脂環式残基を表し、１つ以上のホスホン酸エステル官能基またはホスホン酸官能基で置換されている。
【００３１】
本発明のさらに好ましい態様では、残基Ｒ1の１つ以上は互いに独立して、少なくとも１つのホスホン酸エステル官能基またはホスホン酸官能基を示す。
【００３２】
本発明のさらに好ましい態様では、次のとおりである：
もし１つ以上の非対称中心および１つ以上のホスホン酸エステル官能基またはホスホン酸官能基を有する１つ以上の任意に置換された残基Ｒ1が一般式Ｉの化合物に存在するならば、１つ以上のホスホン酸エステル官能基またはホスホン酸官能基をもつ残基を有する非対称中心の数の少なくとも５０％はＲ配置を示し、好ましくは６６％、より好ましくは７０％、より好ましくは７５％、より好ましくは８０％、より好ましくは８５％、より好ましくは９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは１００％がＲ配置を示す。
【００３３】
本発明の別の好ましい態様では、次のとおりである：
もし１つ以上の非対称中心および１つ以上のホスホン酸エステル官能基またはホスホン酸官能基を有する１つ以上の任意に置換された残基Ｒ1が一般式Ｉの化合物に存在するならば、１つ以上のホスホン酸エステル官能基またはホスホン酸官能基をもつ残基を有する非対称中心の数の少なくとも５０％はＳ配置を示し、好ましくは６６％、より好ましくは７０％、より好ましくは７５％、より好ましくは８０％、より好ましくは８５％、より好ましくは９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは１００％がＳ配置である。
【００３４】
別の態様では、残基Ｒ1の数の多くても８０％はホスホン酸エステル官能基またはホスホン酸官能基で置換されており、残りの残基Ｒ1は水素原子を表す。
別の態様では、残基Ｒ1の数の多くても６０％はホスホン酸エステル官能基またはホスホン酸官能基で置換されており、残りの残基Ｒ1は水素原子を表す。
別の態様では、残基Ｒ1の数の多くても５０％はホスホン酸エステル官能基またはホスホン酸官能基で置換されており、残りの残基Ｒ1は水素原子を表す。
別の態様では、残基Ｒ1の数の多くても４０％はホスホン酸エステル官能基またはホスホン酸官能基で置換されており、残りの残基Ｒ1は水素原子を表す。
別の態様では、残基Ｒ1の数の多くても３０％はホスホン酸エステル官能基またはホスホン酸官能基で置換されており、残りの残基Ｒ1は水素原子を表す。
別の態様では、残基Ｒ1の数の多くても２０％はホスホン酸エステル官能基またはホスホン酸官能基で置換されており、残りの残基Ｒ1は水素原子を表す。
別の態様では、残基Ｒ1の数の多くても１０％はホスホン酸エステル官能基またはホスホン酸官能基で置換されており、残りの残基Ｒ1は水素原子を表す。
別の態様では、残基Ｒ1の数の多くても４％はホスホン酸エステル官能基またはホスホン酸官能基で置換されており、残りの残基Ｒ1は水素原子を表す。
【００３５】
本発明の別の好ましい態様では、一般的化合物Ｉの全ての非対称中心（*）は同じ配置を示す。
本発明の別の好ましい態様では、一般的化合物Ｉの全ての非対称中心（*）はＳ配置を示す。
本発明の別の好ましい態様では、一般的化合物Ｉの全ての非対称中心（*）はＲ配置を示す。
【００３６】
さらに、本発明の組成物は、通常の補助薬と任意に組み合わせた本発明の１種以上の化合物を含有する。
【００３７】
一般式Ｉの化合物の合成は光学的対掌的に純粋なモノマーから実施されるのが好ましい。一般式Ｉの化合物の合成中、化学合成条件により、個々の非対称中心は先の定められた配置が少しの割合で変化する。しかしながら、合成中に形成される一般式Ｉの化合物の最大割合は立体異性体的に純粋である。また、これらの組成物は本発明の目的を実現することができる。
【００３８】
一般式Ｉの化合物はリンカーとしての残基ＫおよびＬを通して第２の一般式Ｉの化合物に結合してもよい。これらの残基は上で定義されている。第１の一般式Ｉの化合物における非対称中心での配置は、リンカーによって結合している第２の一般式Ｉの化合物における非対称中心での配置とは関係ない。従って、例えば、第１の一般式Ｉの化合物における全ての非対称中心はＲ配置を示し、結合した第２の一般式Ｉの化合物における全ての非対称中心はＳ配置を示してもよい。例えば、また、第１の一般式Ｉの化合物における全ての非対称中心はＲ配置を示し、結合した第２の一般式Ｉの化合物における全ての非対称中心はＲ配置を示してもよい。
【００３９】
リンカーおよびシングルストランドＲＮＡもしくはＤＮＡまたはダブルストランドＤＮＡを有する２つの一般式Ｉの化合物間で、それぞれ、相互作用がそれぞれのヌクレオベースにより生じうるように、リンカーは２つの一般式Ｉの化合物間の距離を調整する目的に特に役立つ。
【００４０】
リンカーとして、あらゆる公知のリンカーおよびあらゆるリンカー分子は、この目的に用いるのに適しているか、あるいは適用できる。例えば、そのようなリンカーは任意に置換されたアルキル鎖、ペプチド、オリゴヌクレオチド、または８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸（ｅｇ１単位）の少なくとも３つの単位でできているオリゴマーを表しうる。
【００４１】
ホスホン酸エステル官能基またはホスホン酸官能基で置換されている残基Ｒ1の数および配列は、それぞれ、本発明に従って自由に選択することができる。従って、各、一つ置き、二つ置き、三つ置き、四つ置き、五つ置き、六つ置き、七つ置き、八つ置き、または９つ置きの残基Ｒ1は、例えば、ホスホン酸エステル官能基またはホスホン酸官能基でそれぞれ置換されていてもよい。ホスホン酸エステル官能基またはホスホン酸官能基での置換は、それぞれ、規則的であっても、あるいはどのような位置にあってもよい。
【００４２】
さらに、いくつかの残基Ｒ1は、続けて（隣接した配列で）ホスホン酸エステル官能基またはホスホン酸官能基でそれぞれ置換されていてもよい。一般式Ｉの化合物では、もっと多くのこれら隣接配列を含んでいてもよい。
【００４３】
しかしながら、例えば、いずれかの位置の単一の残基Ｒ1のみがホスホン酸エステル官能基またはホスホン酸官能基でそれぞれ置換されていてもよい。
【００４４】
ホスホン酸エステル官能基またはホスホン酸官能基で置換された単一の残基Ｒ1を次に有する位置はそれぞれ任意である。
【００４５】
EP 1157031には、ホスホン酸エステル官能基またはホスホン酸官能基で置換されている、従って、良好な細胞透過性を示す化合物が記載されている。
EP 1157031に記載の化合物に対して、ここに記載の本発明の化合物は少なくとも１つのモノヒドロキシモノニトロフェニル残基またはモノヒドロキシジニトロフェニル残基でさらに置換されている。
【００４６】
本発明のこれら化合物の場合において、発明者等は、生きている細胞内のミトコンドリア表面および内部の両方における予想外の選択的局在化について調べた。本発明の化合物は、ミトコンドリアの表面および内部の両方におけるそれらの選択的局在化の後、ミトコンドリア内での驚くほど強力なアンチセンスまたはアンチゲノム効果によってそれらの効果を生じることができる。
【００４７】
ミトコンドリアの表面および内部の両方における局在化を調べるため、細胞内の緑の蛍光による共焦点顕微鏡での細胞透過性についての実験でこれらの化合物を検出することができるように、本発明の化合物を蛍光染料ビオチンで標識した。ミトコンドリアの染色のために、商業的に入手しうる「MitoTracker」を用いた。それを用いることによって、ミトコンドリアは赤の蛍光により共焦点顕微鏡によって見分けることができる。同時に、細胞核は青の蛍光により「DAPI」染色によって識別された。細胞はビオチン標識された本発明の化合物の１０μＭ溶液と共に２４時間インキュベートし、その後、共焦点顕微鏡により分析した。様々なラインスキャンを、細胞を通して測定した。
【００４８】
HeLa細胞またはペアレント細胞１４３Ｂそれぞれを通した図１〜４のラインスキャン分析は、ミトコンドリアについてのおよび細胞核についての一般式Ｉの化合物の信号強度を示す。モノヒドロキシモノニトロフェニル残基（図１〜２）またはモノヒドロキシジニトロフェニル残基（図３〜４）をそれぞれ有する本発明による一般式Ｉの化合物およびミトコンドリアのパラレル信号強度によって、ミトコンドリアの表面および内部の両方における一般式Ｉの化合物の選択的局在化をはっきり認めることができる。しかしながら、細胞核内では、本発明の化合物は認めることができない。これにより、本発明の化合物は、ミトコンドリアのための商業的に入手しうる染色試薬「MitoTracker」と、ミトコンドリアの表面および内部の両方における局在化に関して同等の選択性を示す。
【００４９】
本発明の化合物はまた、ミトコンドリア内で驚くほど強力なアンチセンスおよびアンチゲノム効果も示す。ミトコンドリアたんぱく質COX1の発現に影響を与える本発明の化合物は、１０μＭの濃度において、HeLa細胞内でCOX1のたんぱく質レベルを、未処理HeLa細胞と比較して、３日後に７１％に、９日後に２０％に減じる。時間依存性効果の他に、濃度依存性効果も観察することができる。従って、例えば、９日のインキュベーションの後、COX1のたんぱく質レベルは２．５μＭの濃度で５５％に、５００ｎＭの濃度でも８０％に減少する。
【００５０】
HeLa細胞内でのミトコンドリアＤＮＡのコピーの数も本発明の化合物（アンチCOX1配列を有する）での処理によって時間および濃度依存性の状態で減少する。mtDNAの減少は、１０μＭの濃度において、３日後ではまだ効果は見られないが、６日後に８１％に、９日後に６２％に減少することが観察できる。これらの値は、未処理HeLa細胞と、または本発明による化合物で処理されたがmtDNAに対して相補的配列をもたないHeLa細胞（ネガティブ対照）と、それぞれ比較すべきである。
【００５１】
異なる濃度の本発明による化合物（アンチCOX1配列を有する）で処理されたHeLa細胞の場合、mtDNAのコピー数は、例えば９日後に１０μＭで６２％に、２．５μＭで８２％に、そして５００ｎＭで８３％に減少する。
【００５２】
従って、本発明による化合物はトリフェニルホスホニウム残基と結合した公知のペプチド核酸(A. Muratovska, R. N. Lightowlers, R. W. Taylor, D. M. Turnbull, R. A. J. Smith, J. A. Wilce, S. W. Martin, M. P. Murphy, Nucleic Acid Research, 2001, Vol. 29, No. 9, 1852-1863)よりも明らかにすぐれている。この出版物に記載されている分子は無細胞系においてのみミトコンドリアＤＮＡへの結合を示す。さらに、これらの分子は細胞の外側の細胞膜を通り抜け、そしてミトコンドリアへ結合することが実際にできるが、それらは細胞内のミトコンドリアにおいて、アンチセンスまたはアンチゲノム効果のような効果を示さない。
【００５３】
置換基Ｋ、ＬまたはＲ1にモノヒドロキシモノニトロフェニル残基またはモノヒドロキシジニトロフェニル残基をもたない一般式Ｉの化合物は均一に細胞内に分配されるか、あるいはそれらはミトコンドリアとは異なる他の細胞コンパートメントへ結合する。意外なことに、一般式Ｉの化合物をモノヒドロキシモノニトロフェニル残基またはモノヒドロキシジニトロフェニル残基で置換すると、ミトコンドリア表面および内部の両方におけるこれらのミトコンドリア活性剤の選択的局在化が生じる。
【００５４】
そのために、本発明はまた、化合物、例えば、トランスフェクション試薬の助けでまたは助けなしで、５０μＭ未満の細胞外濃度にて、外側の細胞膜を通り抜けて細胞内部へ浸透することができる化合物が、モノヒドロキシモノニトロフェニル残基またはモノヒドロキシジニトロフェニル残基との共有結合により細胞内のミトコンドリア表面および内部の両方に選択的に局在化され、その後、ミトコンドリア表面および内部においてそれらの効果を生じることができる方法を提供する。
【００５５】
例えば、本方法はまた、ミトコンドリア疾患に選択的に影響を与える活性剤を得る手段として、モノヒドロキシモノニトロフェニル残基またはモノヒドロキシジニトロフェニル残基を、（任意にリンカーＭを通して）酸化または還元が可能な活性剤、例えば抗酸化薬へ共有結合させることを含む。
【００５６】
これらの方法に基づいて、本発明は一般式Ｖの化合物をさらに提供する：
Ｚ−Ｍ−Ｐ    （Ｖ）
（式中、
Ｚは、酸化または還元可能な官能基を表し、
Ｍは、リンカー基を表し、そして
Ｐは、モノヒドロキシモノニトロフェニル残基またはモノヒドロキシジニトロフェニル残基をあらわす。）
【００５７】
好ましくは、Ｚは、式ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩまたはＩＸの基を表す：
【００５８】
【化２】
2010507607.tif 000004
（式中、ｍおよびｍ´は０〜３の整数を表す。）
【００５９】
各ＹおよびＹ´は互いに独立して、アルコキシ、チオアルキル、ハロアルキル、ハロゲン、アミノ、ニトロまたは任意に置換されたアルキルもしくはアリール残基を表すか、あるいはｍが２または３であるならば、２つの残基Ｙは一緒になって１もしくは２もしくは３個の脂肪族、複素環式（複素原子はＯ、ＳまたはＮである）または芳香族環を形成してもよく、これらはアリール環と縮合される。
好ましくは、ＹおよびＹ´は互いに独立して、メチルまたはメトキシ基を表す。
【００６０】
好ましくは、Ｍは、カルボン酸エステル、エーテル、アミンまたはカルボン酸アミド官能基をこれらの鎖の構成要素として任意に有する、分枝もしくは非分枝の任意に置換されたアルキル、アルケニル、アルキニルまたはアルキルアリール鎖を表し、ここで、Ｍは合計３０までの炭素原子を有し、より好ましくは、Ｍは−（ＣＨ2）p−を表し、ここで、ｐは１〜２０の整数を表し、最も好ましくは、Ｍはエチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニルまたはデシル鎖を表す。
【００６１】
最も好ましくは、Ｚは以下のいずれかの式の基を表す。
【００６２】
【化３】
2010507607.tif 000005
【００６３】
【化４】
2010507607.tif 000006
【００６４】
【化５】
2010507607.tif 000007
【００６５】
【化６】
2010507607.tif 000008
【００６６】
従って、本発明の化合物および本発明の方法はミトコンドリア疾患の治療並びにミトコンドリアに関連する診断目的に適している。これらには、例えば、遺伝性疾患、癌、パーキンソン病および糖尿病が含まれる。本発明の化合物はアンチエイジング薬としても用いうる。
【００６７】
本発明の化合物を病気の予防および／または治療用薬剤の製造に用いることは、本発明の構成要件でもある。一般に、本発明の化合物は公知のおよび許容される方法を用いて、単独でまたは他の治療薬と組み合わせて投与される。例えば、次の経路の１つで投与することができる：例えば、糖衣錠、被覆錠剤、ピル、半固体、ソフトおよびハードカプセル、溶液、エマルジョンまたは懸濁液として経口的に；例えば、注射溶液として非経口的に；座薬として直腸へ；例えば、粉末配合物またはスプレーとして吸入によって、あるいは経皮的にまたは鼻腔内へ投与される。そのような錠剤、ピル、半固体、被覆錠剤、糖衣錠およびハードゼラチンカプセルの製造には、治療に用いうる生成物は、薬理学的に不活性な無機もしくは有機薬剤担体物質と、例えば、ラクトース、サッカロース、グルコール、ゼラチン、麦芽、シリカゲル、デンプンもしくはその誘導体、タルカム、ステアリン酸もしくはその塩、および無脂肪粉末ミルク等と混合してもよい。ソフトカプセルの製造には、薬剤担体物質、例えば、植物油、鉱油、動物もしくは合成油、ワックス、脂肪、ポリオールを用いうる。溶液およびシロップの製造には、薬剤担体物質、例えば、水、アルコール、水性塩溶液、水性デキストロース、ポリオール、グリセロール、植物油、鉱油、動物もしくは合成油を用いうる。座薬には、薬剤担体物質、例えば、植物油、鉱油、動物もしくは合成油、ワックス、脂肪、ポリオールを用いうる。エアロゾル配合物には、この目的に適した圧縮ガス、例えば、酸素、窒素、クロロフルオロ炭化水素、フルオロ炭化水素、クロロ炭化水素および二酸化炭素を用いうる。薬学的に用いうる薬剤はまた、保存、安定化のための添加剤、乳化剤、甘味料、香味料、浸透圧を変えるための塩類、バッファー物質、被覆のための添加剤、および抗酸化薬を含有していてもよい。
【００６８】
本発明の一般式Ｉの化合物は、例えば文献に記載の方法により一般式ＩＩの化合物を公知の方法で反応させることによって製造しうる（例えば、L. Christensen, R. Fitzpatrick, B. Gildea, K.H. Petersen, H.F. Hansen, T. Koch, M. Egholm, O. Buchardt, P.E. Nielsen, J. Coull, R.H. Berg, J. Pept. Sci. 3, 1995, 175-183. T. Koch, H.F. Hansen, P. Andersen, T. Larsen, H.G. Batz, K. Otteson, H. Orum, J. Pept. Res. 49, 1997, 80-88. F. Bergmann, W. Bannwarth, S. Tam, Tetrahedron Lett. 36, 1995, 6823-6826）。
【００６９】
モノヒドロキシモノニトロフェニル残基またはモノヒドロキシジニトロフェニル残基の置換基としての本発明の化合物への導入は、例えば、一般式ＩＩＩまたはＩＶの化合物の残基Ｋ、ＬまたはＲ1中のアミン官能基への結合によって行いうる。
【００７０】
【化７】
2010507607.tif 000009
【００７１】
以下において、一般式ＩＩＩの化合物はＭＮＰＡ（「モノニトロ−ヒドロキシ−フェニル−アセテート」）と省略し、一般式ＩＶの化合物はＤＮＰＡ（「ジニトロ−ヒドロキシ−フェニル−アセテート」）と省略する。
【００７２】
一般式ＩＩの化合物では、残基Ｒ14は、例えば、水素原子またはアルキル、ベンジル、エチルもしくはメチル残基、あるいは可溶性もしくは不溶性ポリマーを表す。
【００７３】
【化８】
2010507607.tif 000010
【００７４】
Ｐｒは、水素原子または切り離し可能なアミン保護基を表す。アミン保護基はヌクレオベース保護基の存在下で選択的に切り離し可能でなければならない。好ましくは、Ｐｒは、水素原子、オキソカルバメートまたはチオカルバメート保護基、最も好ましくは、Ｐｒは、水素原子またはＦｍｏｃ、Ｂｏｃ、Ｃｂｚ、ＭｍｔまたはＢｈｏｃ保護基である。
Ｅおよび残基Ｒ1は上記定義どおりである。
残基Ｒ1が結合する非対称中心（*）は、ＲまたはＳ配置でありうる。
【００７５】
例えば、一般式ＩＩの化合物は次の方法によって製造してもよい。
【００７６】
非対称中心におけるＲ配置での一般式ＩＩの化合物の製造：
【００７７】
【化９】
2010507607.tif 000011
【００７８】
ピラジン成分のＳ配置から出発して、手順は、例えば、文献に記載のように行いうる (U. Schollkopf, U. Busse, R. Lonsky, R. Hinrichs, Liebigs Ann. Chem. 1986, 2150-2163; A. Schick, T. Kolter, A. Giannis, K. Sandhoff, Tetrahedron 51, 1995, 11207-11218)。
【００７９】
【化１０】
2010507607.tif 000012
【００８０】
例えば、手順は、文献に記載のように行いうる(U. Schollkopf, U. Busse, R. Lonsky, R. Hinrichs, Liebigs Ann. Chem. 1986, 2150-2163)。
【００８１】
【化１１】
2010507607.tif 000013
【００８２】
塩基（例えば、ＮａＨＣＯ3、ＮＨ3）によりアミンをそれらの塩酸塩から離した後、反応工程２からの生成物混合物は次の反応に用いうる。還元アミノ化のこの反応は文献に記載のように行なうことができる(G. Haaima, A. Lohse, O. Buchardt, P.E. Nielsen, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35, 1996, No 17, 1939-1942)。シアノ硼水素化ナトリウムの代わりに、他の還元剤、例えば水素および触媒（例えばＰｄ／Ｃ）も用いることができる。反応生成物はクロマトグラフィーによって分離される。
【００８３】
【化１２】
2010507607.tif 000014
【００８４】
手順は文献に記載のように行うことができる(G. Haaima, A. Lohse, O. Buchardt, P.E. Nielsen, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35, 1996, No 17, 1939-1942)。ここで、ＤＣＣ／ＤＨＢＴの代わりに他のカップリング試薬も用いうる。化合物Ｅ−ＣＨ2−ＣＯＯＨ（例えば、Ｃ（ＰＧ）−ＣＨ2−ＣＯＯＨ、Ａ（ＰＧ）−ＣＨ2−ＣＯＯＨ、Ｇ（ＰＧ）−ＣＨ2−ＣＯＯＨまたはＴ−ＣＨ2−ＣＯＯＨ、Ｊ（ＰＧ）−ＣＨ2−ＣＯＯＨ（式中、Ａ＝アデニニル、Ｃ＝シトシニル、Ｇ＝グアニニル、Ｔ＝チミニル、Ｊ＝プソイドイソシトシニル、ＰＧ＝保護基、例えば、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、ベンジル（Ｂｚ）、アセチル（Ａｃ）またはアニソイル（Ａｎ））の生成は文献に記載のように行うことができる(S.A. Thomson, J.A. Josey, R. Cadilla, M.D. Gaul, F.C. Hassmann, M.J. Lazzio, A.J. Pipe, K.L. Reed, D.J. Ricca, R.W. Wiether, S.A. Noble, Tetrahedron 51, 1995, 6179-6194)。さらに可能な保護基はやはり文献に記載されている。 (G. Breitpohl, D.W. Will, A. Peymann, E. Uhlmann, Tetrahedron 53, 1997, 14671-14686; T. Kofoed, H.F. Hansen, H. Orum, T. Koch, J. Peptide Sci., 7, 2001, 402-412)。
【００８５】
【化１３】
2010507607.tif 000015
【００８６】
手順は文献に記載のように行うことができる(G. Haaima, A. Lohse, O. Buchardt, P.E. Nielsen, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35, 1996, No 17, 1939- 1942)。
【００８７】
反応工程５において生成物として生じる一般式ＩＩの化合物のさらに簡単な説明には、次の省略が用いられる：
【００８８】
例えばＡ（ＰＧ）−ＣＨ2−ＣＯＯＨを反応工程５で用いるならば、非対称中心を有する一般式ＩＩの相当する化合物が得られる。この化合物はここでは一般にＡR（ＰＧ）と省略される。ここで、略記Ａは、非対称中心を有する一般式ＩＩの化合物におけるヌクレオベースを意味し、上付きＲは化合物のＲ配置を意味し、略記ＰＧはヌクレオベースでの保護基を意味する。例えばフェニル酢酸を反応工程５で用いるならば、ＰRと省略される非対称中心を有する一般式ＩＩの化合物が得られる。
【００８９】
非対称中心をもたない一般式ＩＩの相当する化合物（Ｒ1＝Ｈ）は、非対称中心を有する一般式ＩＩの相当する化合物と同様に省略され、ヌクレオベースに対する大文字および配置に対する上付き文字（例えばＡR）の代わりに、それぞれの小文字ａが用いられる。例えば、ヌクレオベースとして、ＰＧで保護されたＣを有する非対称中心のない一般式ＩＩの化合物はｃ（ＰＧ）と省略される。
【００９０】
非対称中心でＳ配置を有する一般式ＩＩの化合物の生成では、Ｒ配置を有するピラジンが反応工程１で用いられ、反応工程１〜５は同様に行われる。次に、例えばＡS（ＰＧ）と省略される一般式ＩＩの化合物が得られる。
【００９１】
本発明の化合物は、例えば、公知の方法で一般式ＩＩの化合物の反応による固相合成により製造することができる。固相合成では、ヌクレオベースでの保護基が切り離されて、次のように省略される一般式ＩＩの化合物が得られる：
【００９２】
例えば、Ｒ配置の非対称中心を有する一般式ＩＩの化合物からもっぱら製造され、そして最終工程でＭＮＰＡ−ＯＨと結合され、その後、第１アミドとして樹脂から切り離される本発明の化合物は、ＭＮＰＡ−ＡRＣRＧRＧRＴRＣRＧRＧRＣRＧRＡRＡRＣRＡRＴR−ＮＨ2と省略される。
【００９３】
例えば、Ｒ配置の非対称中心を有する一般式ＩＩの化合物からおよび非対称中心をもたない一般式ＩＩの化合物から製造され、そして最終工程でＭＮＰＡ−ＯＨと結合され、その後、第１アミドとして樹脂から切り離される本発明の化合物は、ＭＮＰＡ−ＡRｃＧRｇＴRｃＧRｇＣRｇＡRａＣRａＴR−ＮＨ2と省略される。
【００９４】
例えば、Ｓ配置の非対称中心を有する一般式ＩＩの化合物からもっぱら製造され、そして最終工程でＤＮＰＡ−ＯＨと結合され、その後、第１アミドとして樹脂から切り離される本発明の化合物は、ＤＮＰＡ−ＡSＣSＧSＧSＴSＣSＧSＧSＣSＧSＡSＡSＣSＡSＴS−ＮＨ2と省略される。
【００９５】
例えば、Ｓ配置の非対称中心を有する一般式ＩＩの化合物からおよび非対称中心をもたない一般式ＩＩの化合物から製造され、そして最終工程でＤＮＰＡと結合され、その後、第１アミドとして樹脂から切り離される本発明の化合物は、ＤＮＰＡ−ＡSｃＧSｇＴSｃＧSｇＣSｇＡSａＣSａＴS−ＮＨ2と省略される。
【００９６】
例えば、Ｒ配置の非対称中心を有する一般式ＩＩの化合物からおよびBoc-Gly-PAM-MBHA樹脂で非対称中心をもたない一般式ＩＩの化合物からもっぱら製造され、そして最終工程でＤＮＰＡと結合され、その後、第１アミドとして樹脂から切り離される本発明の化合物は、DNPA-tGRcCRtARggactcRcARgCR-Gly-NH2として省略される。
【００９７】
例えば、Ｒ配置の非対称中心を有する一般式ＩＩの化合物から、非対称中心を有しない一般式ＩＩの化合物から、グリシンから、およびBoc-Gly-PAM-MBHA樹脂で２つのアミノ酸、例えば４−（ジエトキシ−ホスホリル）−２−（ｔ−ブトキシカルボニルアミノ）酪酸（Boc-DEPABS）から製造され、そして最終工程でDNPAと結合され、その後、第１アミドとして樹脂から切り離される本発明の化合物は、DNPA-(DEPABS)2-Gly-tGRcCRtARggactcRcARgCR-Gly-NH2と省略される。
【００９８】
例えば、Ｒ配置の非対称中心を有する一般式ＩＩの化合物から、非対称中心をもたない一般式ＩＩの化合物から、およびBoc-Gly-PAM-MBHA樹脂でキレート化剤１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸トリ−ｔ−ブチルエステル（DOTA）から製造され、そして最終工程でDNPAと結合され、その後、第１アミドとして樹脂から切り離される本発明の化合物は、DNPA-DOTA-gGRcTRcGRaARtARaGRgARgGR-Gly-NH2と省略される。
【実施例】
【００９９】
実施例
実施例１：  （２Ｒ，５Ｓ）−２−（２−（ジエトキシ−ホスホリル）エチル）−２，５−ジヒドロ−３，６−ジメトキシ−５−イソプロピルピラジンの製造
【０１００】
【化１４】
2010507607.tif 000016
【０１０１】
０．５２モルの（Ｓ）−２，５−ジヒドロ−３，６−ジメトキシ−２−イソプロピルピラジンをアルゴンの下で４００mlの無水ＴＨＦに溶解し、−７８℃に冷却する。攪拌しながら、２００mlのブチルリチウム（ヘプタン中）の２．７Ｍ溶液（０．５４モル）をゆっくり滴加する。その後、０．５２モルのジエチル−（２−ブロモメチル）ホスホネートの無水ＴＨＦ３００ml中の溶液を攪拌しながらゆっくり滴加し、混合物を−７８℃でさらに３時間攪拌する。次に、１１．７ml（約０．２モル）無水酢酸をゆっくり加える。反応混合物を室温にゆっくり温める。溶媒を除去し、残留物を６００mlのジエチルエーテルに溶解し、２００mlの水で洗浄する。水性相を各１００mlのジエチルエーテルで３回さらに抽出する。一緒にしたエーテル相をMgSO4で乾燥し、濾過し、そして溶媒を真空除去する。残留物をジエチルエーテルとヘキサン（１：１０）の混合物に溶解し、シリカゲル床で濾過する。その後、未反応成分をジエチルエーテルおよびヘキサン（１：５）で溶出する。最後に、生成物を酢酸エチルエステルで溶出する。
【０１０２】
収率：  約７０％の黄色液体
1H-NMR(CDCl3): 0.71, 1.04 (d, 6H, CH(CH3)2), 1.33 (t, 6H, P(O)(OCH2CH3)2), 1.68-2.25 (m, 4H, CHCH2CH2P), 3.65, 3.67 (s, 6H, OCH3), 4.02 (m, 1H), 4.10-4.20 (m, 4H, P(O)(OCH2CH3)2)．
【０１０３】
実施例２：  （２Ｒ，５Ｓ）−２−（８−（ジベンジルオキシ−ホスホリル）オクチル）−２，５−ジヒドロ−３，６−ジメトキシ−５−イソプロピルピラジンの製造
実施例１の製造法と同様に、（２Ｒ，５Ｓ）−２−（８−（ジベンジルオキシ−ホスホリル）オクチル）−２，５−ジヒドロ−３，６−ジメトキシ−５−イソプロピルピラジンを、（Ｓ）−２，５−ジヒドロ−３，６−ジメトキシ−２−イソプロピルピラジンおよびジベンジル−（８−ブロモオクチル）ホスホネートから出発して製造する。
【０１０４】
実施例３：  （２Ｓ，５Ｒ）−２−（４−（ジシクロヘキシルオキシ−ホスホリル）ブト−２−エニル）−２，５−ジヒドロ−３，６−ジメトキシ−５−イソプロピルピラジンの製造
実施例１の製造法と同様に、（２Ｓ，５Ｒ）−２−（４−（ジシクロヘキシルオキシ−ホスホリル）ブト−２−エニル）−２，５−ジヒドロ−３，６−ジメトキシ−５−イソプロピルピラジンを、（Ｒ）−２，５−ジヒドロ−３，６−ジメトキシ−２−イソプロピルピラジンおよびジシクロヘキシル−（４−ブロム−ブト−２−エニル）ホスホネートから出発して製造する。
【０１０５】
実施例４：  （２Ｒ）−２−［２−（ｔ−ブトキシカルボニルアミノ）エチル］−アミノ−４−（ジエトキシ−ホスホリル）酪酸メチルエステルの製造
【０１０６】
【化１５】
2010507607.tif 000017
【０１０７】
０．３８モルの（２Ｒ，５Ｓ）−２−（２−（ジエトキシ−ホスホリル）エチル）−２，５−ジヒドロ−３，６−ジメトキシ−５−イソプロピルピラジンを４００mlのジエチルエーテルに溶解する。この溶液に、塩酸の１Ｎ水溶液１１５０mlを加える。６０分後、反応が完了し、エーテルを除去する。生成物を貯蔵するならば、水も完全に真空除去する。生成物を直ちにさらに反応させるならば、約半分の水を回転蒸発器で除去し、その後、反応混合物のｐＨをアンモニア溶液で８〜９に調整する。塩基性溶液をジクロロメタンで６回抽出する。各回にｐＨ値を調整し、任意に修正する。ジクロロメタン層を一緒にし、MgSO4で乾燥し、溶媒を真空除去する。得られた黄色油は次の還元アミノ化の反応に直ちに用いる。
【０１０８】
【化１６】
2010507607.tif 000018
【０１０９】
黄色油（反応は完了していると思われる）を６００mlのメタノールに溶解し、０℃に冷却する。その後、０．７６モルのN-Boc-アミノアセトアルデヒドを加える。０℃で３０分間攪拌した後、まず０．９０モルの無水酢酸、次いで、０．４０モルのシアノ硼水素化ナトリウムを加える。ガスの発生が完了するまで、反応混合物を０℃で攪拌し、次に、溶媒を回転蒸発器で除去する。残留物を酢酸エチルエステル（約６００ml）に溶解し、さらに飽和炭酸水素ナトリウム（約２００ml）で１回、そして飽和塩化ナトリウム溶液（約１００ml）で１回洗浄する。有機相をMgSO4で乾燥し、濾過する。その後、溶媒を真空除去する。
【０１１０】
さらなる精製は、シリカゲルを詰めたガラスフリットでのSPEで行う。不純物および不要な生成物はまずヘキサンと酢酸エチルエステル（１：１）混合物、次いで、純粋な酢酸エチルエステルで溶出する。所望の生成物はジクロロメタン中の１０％メタノールで抽出することによって最後に得られる。
溶媒を除去した後、約７５％の生成物が黄色粘性油として得られる。
【０１１１】
1H-NMR(CDCl3): 1.35 (t, 6H, P(O)(OCH2CH3)2), 1.47 (s, 9H, C(CH3)3); 1.8-2.0 (m, 4H, CHCH2CH2P,), 2.5-2.6, 2.75-2.85, 3.0-3.4 (m, 4H, NCH2CH2N), 3.75 (s, 3H, OCH3), 4.0-4.2 (m, 4H, P(O)(OCH2CH3)2).
【０１１２】
実施例５：  （２Ｒ）−２−［２−（ｔ−ブトキシカルボニルアミノ）エチル］−アミノ−１０−（ジベンジルオキシ−ホスホリル）デカン酸メチルエステルの製造
実施例４の製造法と同様に、（２Ｒ）−２−［２−（ｔ−ブトキシカルボニルアミノ）エチル］−アミノ−１０−（ジベンジルオキシ−ホスホリル）デカン酸メチルエステルを、（２Ｒ，５Ｓ）−２−（８−（ジベンジルオキシ−ホスホリル）オクチル）−２，５−ジヒドロ−３，６−ジメトキシ−５−イソプロピルピラジンから出発して製造する。
【０１１３】
実施例６：  （２Ｓ）−２−［２−（ｔ−ブトキシカルボニルアミノ）エチル］−アミノ−６−（ジシクロヘキシルオキシ−ホスホリル）ヘキス−４−エノイック酸メチルエステルの製造
実施例４の製造法と同様に、（２Ｓ）−２−［２−（ｔ−ブトキシカルボニルアミノ）エチル］−アミノ−６−（ジシクロヘキシルオキシ−ホスホリル）ヘキス−４−エノイック酸メチルエステルを、（２Ｓ，５Ｒ）−２−（４−（ジシクロヘキシルオキシ−ホスホリル）オクチル）−ブト−２−エニル）−２，５−ジヒドロ−３，６−ジメトキシ−５−イソプロピルピラジンから出発して製造する。
【０１１４】
実施例７：  （Ｒ）−２−（［２−｛Ｎ４−ベンジルオキシカルボニルシトシン−１−イル｝−アセチル］−［２−ｔ−ブトキシカルボニルアミノエチル］−アミノ）−４−（ジエトキシ−ホスホリル）酪酸メチルエステルの製造
【０１１５】
【化１７】
2010507607.tif 000019
【０１１６】
３０．９６ミリモルの４−Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−シトシン−１−イル−酢酸および３０．９６ミリモルの３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン(DHBT-OH)の無水DMF１００ml中の攪拌溶液へ、３２．５１ミリモルのジシクロヘキシルカルボジイミドを加え、この溶液を４０℃で１時間攪拌する。その後、２３．８４ミリモルの（２Ｒ）−２−［２−（ｔ−ブトキシカルボニルアミノ）エチル］−アミノ−４−（ジエトキシ−ホスホリル）酪酸メチルエステルを加え、４０℃で攪拌する。反応はHPLCでモニターし、３日後に完了する。
【０１１７】
溶液を不溶性部分から濾過によって分離し、溶媒を真空除去する。残留物をジクロロメタンに溶解し、一晩冷蔵庫で貯蔵する。この方法では、さらにジシクロヘキシル尿素が沈殿し、濾過によって分離する。濾液を希釈炭酸水素ナトリウム溶液（１／３が飽和炭酸水素ナトリウム溶液、２／３が水）で２または３回、希釈硫酸水素カリウム溶液（１／３が飽和硫酸水素カリウム溶液、２／３が水）で１または２回洗浄し、MgSO4で乾燥し、そして回転蒸発器で濃縮する。さらなる精製は、酢酸エチルエステルに溶解し、一晩冷蔵庫に貯蔵することによって行い、さらに任意に沈殿したジシクロヘキシル尿素は濾過によって分離し、溶媒を再度除去する。粗生成物をジクロロメタンに溶解し（３ｇ粗生成物毎に５ml）、ジエチルエーテル（３ｇ粗生成物毎に２５ml）およびヘキサン（３ｇ粗生成物毎に５ml）で再度沈殿させる。不純物を含む溶媒を除去し、生成物を真空乾燥する。
【０１１８】
収率：約６５％の鮮やかな黄色固体
1H-NMR(CDCl3): 1.32 (t, 6H, P(O)(OCH2CH3)2); 1.44 (s, 9H, C(CH3)3); 1.75-2.45 (m, 4H, CHCH2CH2P); 3.2-3.85 (m, 4H, NCH2CH2N); 3.73 (s, 3H, OCH3); 4.07 (m, 4H, P(O)(OCH2CH3)2); 4.28 (m, 1H, NCHC(O)); 4.42/4.99 (2d, 2H, NCH2C(O)); 5.22 (s, 2H, OCH2Ph); 5.56 (t, br, 1H, C(O)NHCH2); 7.25 (d, 1H, CCH=CHN); 7.38 (s, 5H, Ph);7.55 (d, 1H, CCH=CHN).
【０１１９】
実施例８：  （Ｒ）−２−（［２−｛Ｎ４−ベンジルオキシカルボニルアミノ−シトシン−１−イル｝−アセチル］−［２−ｔ−ブトキシカルボニルアミノ−エチル］アミノ）−４−（ジエトキシ−ホスホリル）酪酸の製造
【０１２０】
【化１８】
2010507607.tif 000020
【０１２１】
１９．１ミリモルの（Ｒ）−２−（［２−｛Ｎ４−ベンジルオキシカルボニルシトシン−１−イル｝−アセチル］−［２−ｔ−ブトキシカルボニルアミノエチル］−アミノ）−４−（ジエトキシ−ホスホリル）酪酸メチルエステルを８０mlのTHFおよび水（２：３）に溶解し、０℃に冷却する。この溶液に、水酸化リチウムの１Ｍ溶液４８mlを滴加する（ｐＨ〜９）。反応の進行はDC（ジクロロメタン中の１０％メタノール）によってモニターする。反応完了後、反応溶液を１３０mlの水および塩化ナトリウム溶液で希釈し、ジクロロメタン（２００ml）で１回抽出する。水性相を２Ｍ硫酸水素ナトリウム溶液でｐＨ２〜３に調整し、ジクロロメタンで数回抽出する。それによって、ｐＨ値を調整し、任意に繰り返し修正する。一緒にした有機相をMgSO4で乾燥し、溶媒を真空除去する。必要ならば、粗生成物をジクロロメタンからジエチルエーテルで再沈殿させてもよい。最後に、生成物を凍結乾燥機で乾燥する。
【０１２２】
収率：  約８０％の白黄色固体
1H-NMR(DMSO-d6): 1.21 (t, 6H, P(O)(OCH2CH3)2); 1.39 (s, 9H, C(CH3)3); 1.70-2.30 (m, 4H, CHCH2CH2P); 2.90-3.60 (m, 4H, NCH2CH2N); 3.93-4.02 (m, 4H, P(O)(OCH2CH3)2); 4.25 (m, 1H, NCHC(O)); 4.50-4.83 (m, 2H, NCH2C(O)); 5.19 (s, 2H, OCH2Ph); 6.88 (m, br, 1H, C(O)NHCH2); 7.02 (d, 1H, CCH=CHN); 7.31-7.41 (m, 5H, Ph); 7.97 (d, 1H, CCH=CHN).
【０１２３】
実施例９：  一般式ＩＩのさらなる化合物の製造
実施例７および８と同様な合成によって、 C(Z)-CH2-COOHにもかかわらず、さらにそれぞれＺ保護された、ベンジル保護された(Bzl)、アニソイル保護された(An)またはアセチル保護された(Ac)、および保護されていないヌクレオベース酢酸成分、例えばA(Z)-CH2-COOH, A(An)-CH2-COOH, A(Bzl)-CH2-COOH, G(Z)-CH2-COOH, G(Ac)-CH2-COOH, C(An)-CH2-COOH, C(Bzl)-CH2-COOH, J(Z)-CH2-COOH, J(Bzl)-CH2-COOH, J(An)-CH2-COOH またはT-CH2-COOH (A =アデニニル、C =シトシニル、G =グアニニル、T=チミニル；J =プソイドイソシトシニル)並びにフェニル酢酸を用い、本発明の一般式ＩＩに従うさらに別の化合物が製造される。
【０１２４】
AR(Z):
1H-NMR(CH3OH-d4): 1.20 (t, 6H, P(O)(OCH2CH3)2); 1.34 (s, 9H, C(CH3)3); 1.70-2.30 (m, 4H, CHCH2CH2P); 3.00-3.80 (m, 4H, NCH2CH2N); 3.93-4.02 (m, 4H, P(O)(OCH2CH3)2); 4.10 (m, 1H, NCHC(O)); 5.18 (s, 2H, OCH2Ph); 5.20-5.40 (m, 2H, NCH2C(O)); 7.15-7.40 (m, 5H, Ph); 8.14 (s, 1H, N=CHN); 8.46 (s, 1H, N=CHN).
【０１２５】
AR(Bzl):
1H-NMR(DMSO-d6): 1.21 (t, 6H, P(O)(OCH2CH3)2), 1.40 (s, 9H, C(CH3)3); 1.70-2.20 (m, 4H, CHCH2CH2P,), 2.90-3.75 (m, 4H, NCH2CH2N); 3.90-4.10 (m, 4H, P(O)(OCH2CH3)2); 4.22 (m, 1H, NCHC(O)); 5.25-5.45 (m, 2H, NCH2C(O)); 6.96 (m, br, 1H, C(O)NHCH2); 7.50-8.10 (m, 5H, Ph); 8.42 (s, 1H, N=CHN); 8.69 (s, 1H, N=CHN).
【０１２６】
AR(An):
1H-NMR(DMSO-d6): 1.21 (t, 6H, P(O)(OCH2CH3)2); 1.41 (s, 9H, C(CH3)3); 1.70-2.20 (m, 4H, CHCH2CH2P); 2.90-3.750 (m, 4H, NCH2CH2N); 3.86 (s, 3H, OCH3); 3.90-4.10 (m, 4H, P(O)(OCH2CH3)2); 4.22 (m, 1H, NCHC(O)); 5.25-5.45 (m, 2H, NCH2C(O)); 6.96 (m, br, 1H, C(O)NHCH2); 7.08 (d, 2H, Ph); 8.05 (d, 2H, Ph); 8.42 (s, 1H, N=CHN); 8.69 (s, 1H, N=CHN).
【０１２７】
JR(Z):
1H-NMR(DMSO-d6): 1.32 (t, 6H, P(O)(OCH2CH3)2), 1.42 (s, 9H, C(CH3)3); 1.60-2.50 (m, 4H, CHCH2CH2P,), 3.10-3.55 (m, 4H, NCH2CH2N); 3.65-3.90 (m, 2H, NCH2C(O)); 4.00-4.15 (m, 4H, P(O)(OCH2CH3)2); 4.20 (m, 1H, NCHC(O)); 5.24 (s, 2H, OCH2Ph); 6.80 (m, br, 1H, C(O)NHCH2); 7.27 (d, 1H, C=CHN); 7.30-7.50 (m, 5H, Ph).
【０１２８】
JR(An):
1H-NMR(DMSO-d6): 1.22 (t, 6H, P(O)(OCH2CH3)2); 1.38 (s, 9H, C(CH3)3); 1.65-2.25 (m, 4H, CHCH2CH2P); 2.80-3.70 (m, 4H, NCH2CH2N); 2.80-3.70 (m, 2H, CCH2C(O)); 3.84 (s, 3H, OCH3); 3.90-4.05 (m, 4H, P(O)(OCH2CH3)2); 4.17 (m, 1H, NCHC(O)); 6.81 (m, br, 1H, C(O)NHCH2); 7.05 (d, 2H, Ph); 7.70 (s, 1H, NCH=C); 8.07 (d, 2H, Ph).
【０１２９】
GR(Z):
1H-NMR(DMSO-d6): 1.18 (t, 6H, P(O)(OCH2CH3)2), 1.37 (s, 9H, C(CH3)3); 1.70-2.30 (m, 4H, CHCH2CH2P,), 2.95-3.70 (m, 4H, NCH2CH2N); 3.90-4.10 (m, 4H, P(O)(OCH2CH3)2); 4.20 (m, 1H, NCHC(O)); 4.85-5.20 (m, 2H, NCH2C(O)); 5.269 (s, 2H, OCH2Ph); 6.95 (m, br, 1H, C(O)NHCH2); 7.30-7.50 (m, 5H, Ph); 7.85 (s, 1H, N=CHN).
【０１３０】
GR(Ac):
1H-NMR(DMSO-d6): 1.20 (t, 6H, P(O)(OCH2CH3)2); 1.41 (s, 9H, C(CH3)3); 1.70-2.18 (m, 4H, CHCH2CH2P); 2.20 (s, 3H, CH3C(O)); 2.90-3.60 (m, 4H, NCH2CH2N); 3.90-4.10 (m, 4H, P(O)(OCH2CH3)2); 4.22 (m, 1H, NCHC(O)); 4.91-5.22 (m, 2H, NCH2C(O)); 7.00 (m, br, 1H, C(O)NHCH2); 7.88 (s, 1H, N=CH-N);.
【０１３１】
CR(Bzl):
1H-NMR(DMSO-d6): 1.21 (t, 6H, P(O)(OCH2CH3)2); 1.40 (s, 9H, C(CH3)3); 1.70-2.30 (m, 4H, CHCH2CH2P); 3.20-3.60 (m, 4H, NCH2CH2N); 3.93-4.02 (m, 4H, P(O)(OCH2CH3)2); 4.28 (m, 1H, NCHC(O)); 4.50-4.83 (m, 2H, NCH2C(O)); 6.90 (m, br, 1H, C(O)NHCH2); 7.33 (d, 1H, CCH=CHN); 7.50-7.55 (m, 2H, Ph); 7.62 (d, 1H, CCH=CHN); 8.00-8.10 (m, 3H, Ph).
【０１３２】
CR(An):
1H-NMR(DMSO-d6): 1.22 (t, 6H, P(O)(OCH2CH3)2); 1.39 (s, 9H, C(CH3)3); 1.65-2.10 (m, 4H, CHCH2CH2P); 3.20-3.60 (m, 4H, NCH2CH2N); 3.84 (s, 3H, OCH3); 3.85-4.05 (m, 4H, P(O)(OCH2CH3)2); 4.25 (m, 1H, NCHC(O)); 4.50-4.95 (m, 2H, NCH2C(O)); 6.90 (m, br, 1H, C(O)NHCH2); 7.04 (d, 2H, Ph); 7.30 (d, 1H, CCH=CHN); 8.00 (d, 1H, CCH=CHN); 8.03 (d, 2H, Ph).
【０１３３】
TR:
1H-NMR(DMSO-d6): 1.22 (t, 6H, P(O)(OCH2CH3)2); 1.39 (s, 9H, C(CH3)3); 1.65-2.20 (m, 4H, CHCH2CH2P); 1.75 (s, 3H, C=CCH3); 2.90-3.50 (m, 4H, NCH2CH2N); 3.90-4.10 (m, 4H, P(O)(OCH2CH3)2); 4.18 (m, 1H, NCHC(O)); 4.45-4.65 (m, 2H, NCH2C(O)); 6.86 (m, br, 1H, C(O)NHCH2); 7.37 (s, 1H, NCH=C).
【０１３４】
PR:
1H-NMR(DMSO-d6): 1.20 (t, 6H, P(O)(OCH2CH3)2); 1.38 (s, 9H, C(CH3)3); 1.46-2.30 (m, 4H, CHCH2CH2P); 3.00-3.45 (m, 4H, NCH2CH2N); 3.50-3.75 (m, 2H, CCH2C(O)); 3.80-4.00 (m, 4H, P(O)(OCH2CH3)2); 4.22 (m, 1H, NCHC(O)); 7.10-7.30 (m, 5H, Ph).
【０１３５】
実施例１０：  対称中心でＳ配置の一般式ＩＩのさらなる化合物の製造
Ｒ配置の一般式ＩＩの化合物についての製造法を、Ｓ配置の一般式ＩＩの相当する化合物の製造に同様に適用する。ここで、（Ｒ）−２，５−ジヒドロ−３，６−ジメトキシ−２−イソプロピルピラジンを実施例１に記載の合成において出発物質として用い、その後の合成は記載のように行う。
例えば、次の化合物が生成された：
【０１３６】
JS(Z):
1H-NMR(DMSO-d6): 1.32 (t, 6H, P(O)(OCH2CH3)2), 1.42 (s, 9H, C(CH3)3); 1.60-2.50 (m, 4H, CHCH2CH2P,), 3.10-3.55 (m, 4H, NCH2CH2N); 3.65-3.90 (m, 2H, NCH2C(O)); 4.00-4.15 (m, 4H, P(O)(OCH2CH3)2); 4.20 (m, 1H, NCHC(O)); 5.24 (s, 2H, OCH2Ph); 6.80 (m, br, 1H, C(O)NHCH2); 7.27 (d, 1H, C=CHN); 7.30-7.50 (m, 5H, Ph).
【０１３７】
実施例１１：  残基ＫにMNPA置換基を有する本発明の化合物の一般的な合成についての詳細：
非対称中心を有する一般式ＩＩの相当する化合物および／または非対称中心をもたない一般式ＩＩの相当する化合物および／またはアミノ酸および／またはアミノ酸誘導体および／または蛍光マーカーを固相ペプチド合成により順次結合することによって、本発明の化合物を製造する。
【０１３８】
次の合成手順が適用される：
段階１：  ジクロロメタン中での１０mgの樹脂(Boc-Gly-PAM-MBHA樹脂、０．５４ミリモル／ｇ)の３時間予備膨潤。
段階２：  合成サイクルの開始：ジクロロメタンでの洗浄４回。
段階３：  TFAおよびｍ−クレゾール（９５：５）との反応によるBoc基の切り離し。反応時間：２回×各３分。
段階４：  ジクロロメタンでの洗浄５回。
段階５：  NMPでの洗浄５回。
【０１３９】
段階６：  NMPとピリジン（２：１）中のHATU ３．８当量およびNMM９当量で、一般式ＩＩの相当する保護化合物のまたは相当する保護アミノ酸それぞれ４当量を、１分間予備活性化。
段階７：  一般式ＩＩの活性化保護化合物または相当する保護アミノ酸それぞれの固相との反応；（１．カップリング；時間：３０分）。
段階８：  NMPでの洗浄４回。
段階９：  ジクロロメタンでの洗浄１回。
段階１０：  段階６〜８の繰り返し（２．カップリング）。
【０１４０】
段階１１：  ニンヒドリンとのカップリング効率試験（カイザー試験；カイザー試験でポジティブな結果が示されたら、段階６〜８は一般式ＩＩの相当する保護化合物で繰り返さなければならない）。
段階１２：  ネガティブなカイザー試験の後、反応シークエンスはAc2O、NMPおよびピリジン（１：２５：２５）の溶液でそれぞれ４分間２回キャップする。
段階１３：  NMPでの洗浄５回。
段階１４：  一般式ＩＩの相当する最終保護化合物とのカップリングまでの合成サイクル（段階２〜１３）の繰り返し。その後、合成サイクル（段階２〜１３）は相当する最終保護アミノ酸とのカップリングまで任意に繰り返す。
段階１５：  ジクロロメタンでの洗浄４回。
【０１４１】
段階１６：  TFAおよびｍ−クレゾール（９５：５）との反応によるBoc基の切り離し。反応時間：２回×各３分。
段階１７：  ジクロロメタンでの洗浄５回。
段階１８：  NMPでの洗浄５回。
段階１９：  NMPとピリジン（２：１）中のHATU ５．７当量およびNMM１３当量で、MNPA-OH６当量を、１分間予備活性化。
段階２０：  活性化MNPA-OHの固相との反応（時間：３０分）。
【０１４２】
段階２１：  NMPでの洗浄４回。
段階２２：  段階１９〜２１の繰り返し（２．カップリング）。
段階２３：  ジクロロメタンでの洗浄５回。
段階２４：  乾燥：ジエチルエーテルでの洗浄５回。
【０１４３】
カルボン酸末端で樹脂に結合する一般式Ｉの化合物が得られる。
【０１４４】
本発明の化合物の樹脂からの切り離し：
本発明の化合物を含む樹脂を水性アンモニア溶液（H2O中の NH3２８〜３０重量％）中で６０℃にて２０時間攪拌する。その後、切り離された樹脂を濾過し、濾液を真空濃縮し、乾燥する。粗生成物は、メタノールおよび水でRP-C18カラムでの調製HPLCによって精製する。本発明の化合物は約５０％の収率で無色固体として得られる。本発明の化合物の分子量はMALDI-TOFによって明らかにされる。
【０１４５】
実施例１２：  残基ＫにDNPA置換基を有する本発明の化合物の一般的な合成についての詳細：
非対称中心を有する一般式ＩＩの相当する化合物および／または非対称中心をもたない一般式ＩＩの相当する化合物および／またはアミノ酸および／またはアミノ酸誘導体および／または蛍光マーカーを固相ペプチド合成によって順次結合することによって、本発明の化合物を製造する。
【０１４６】
次の合成手順が適用される：
段階１：  ジクロロメタン中での１０mgの樹脂(Boc-Gly-PAM-MBHA樹脂、０．５４ミリモル／ｇ)の３時間予備膨潤。
段階２：  合成サイクルの開始：ジクロロメタンでの洗浄４回。
段階３：  TFAおよびｍ−クレゾール（９５：５）との反応によるBoc基の切り離し。反応時間：２回×各３分。
段階４：  ジクロロメタンでの洗浄５回。
段階５：  NMPでの洗浄５回。
【０１４７】
段階６：  NMPとピリジン（２：１）中のHATU ３．８当量およびNMM９当量で、一般式ＩＩの相当する保護化合物または相当する保護アミノ酸それぞれ４当量を、１分間予備活性化。
段階７：  一般式ＩＩの活性化保護化合物または相当する保護アミノ酸それぞれの固相との反応；（１．カップリング；時間：３０分）。
段階８：  NMPでの洗浄４回。
段階９：  ジクロロメタンでの洗浄１回。
段階１０：  段階６〜８の繰り返し（２．カップリング）。
【０１４８】
段階１１：  ニンヒドリンとのカップリング効率試験（カイザー試験；カイザー試験でポジティブな結果が示されたら、段階６〜８は一般式ＩＩの相当する保護化合物で繰り返さなければならない）。
段階１２：  ネガティブなカイザー試験の後、反応シークエンスはAc2O、NMPおよびピリジン（１：２５：２５）の溶液でそれぞれ４分間２回キャップする。
段階１３：  NMPでの洗浄５回。
段階１４：  一般式ＩＩの相当する最終保護化合物とのカップリングまでの合成サイクル（段階２〜１３）の繰り返し。その後、合成サイクル（段階２〜１３）は相当する最終保護アミノ酸とのカップリングまで任意に繰り返す。
段階１５：  ジクロロメタンでの洗浄４回。
【０１４９】
段階１６：  TFAおよびｍ−クレゾール（９５：５）との反応によるBoc基の切り離し。反応時間：２回×各３分。
段階１７：  ジクロロメタンでの洗浄５回。
段階１８：  NMPでの洗浄５回。
段階１９：  NMPとピリジン（２：１）中のHATU ５．７当量およびNMM１３当量で、DNPA-OH６当量を１分間予備活性化。
段階２０：  活性化DNPA-OHの固相との反応（時間：３０分）。
【０１５０】
段階２１：  NMPでの洗浄４回。
段階２２：  段階１９〜２１の繰り返し（２．カップリング）。
段階２３：  ジクロロメタンでの洗浄５回。
段階２４：  乾燥：ジエチルエーテルでの洗浄５回。
【０１５１】
カルボン酸末端で樹脂に結合する一般式Ｉの化合物が得られる。
【０１５２】
本発明の化合物の樹脂からの切り離し：
本発明の化合物を含む樹脂を水性アンモニア溶液（H2O中の NH3２８〜３０重量％）中で６０℃にて２０時間攪拌する。その後、切り離された樹脂を濾過によって分離し、濾液を真空濃縮し、乾燥する。粗生成物は、メタノールおよび水でRP-C18カラムによる調製HPLCによって精製する。本発明の化合物は約５０％の収率で無色固体として得られる。本発明の化合物の分子量はMALDI-TOFによって明らかにされる。
【０１５３】
実施例１３：  残基ＫにリンカーおよびMNPA置換基またはDNPA置換基を有する本発明の化合物の一般的な合成についての詳細：
非対称中心を有する一般式ＩＩの相当する化合物および／または非対称中心をもたない一般式ＩＩの相当する化合物および／またはアミノ酸および／またはアミノ酸誘導体および／または蛍光マーカーと共に適切なリンカーモノマーを固相ペプチド合成によって順次結合することによって、本発明の化合物を製造する。
【０１５４】
次の合成手順が適用される：
合成手順：
段階１：  ジクロロメタン中での１０mgの樹脂(Boc-Gly-PAM-MBHA樹脂、０．５４ミリモル／ｇ)の３時間予備膨潤。
段階２：  合成サイクルの開始：ジクロロメタンでの洗浄４回。
段階３：  TFAおよびｍ−クレゾール（９５：５）との反応によるBoc基の切り離し。反応時間：２回×各３分。
段階４：  ジクロロメタンでの洗浄５回。
段階５：  NMPでの洗浄５回。
【０１５５】
段階６：  NMPとピリジン（２：１）中のHATU ３．８当量およびNMM９当量で、一般式ＩＩの相当する保護化合物または相当する保護アミノ酸それぞれ４当量を、１分間予備活性化。
段階７：  一般式ＩＩの相当する保護化合物または相当する保護アミノ酸それぞれの固相との反応；（１．カップリング；時間：３０分）。
段階８：  NMPでの洗浄４回。
段階９：  ジクロロメタンでの洗浄１回。
段階１０：  段階６〜８の繰り返し（２．カップリング）。
【０１５６】
段階１１：  ニンヒドリンとのカップリング効率試験（カイザー試験；カイザー試験でポジティブな結果が示されたら、段階６〜８は一般式ＩＩの相当する保護化合物で繰り返さなければならない）。
段階１２：  ネガティブなカイザー試験の後、反応シークエンスはAc2O、NMPおよびピリジン（１：２５：２５）の溶液でそれぞれ４分間２回キャップする。
段階１３：  NMPでの洗浄５回。
段階１４：  リンカーeg1（８−アミノ−２，６−ジオキサオクタン酸）のカップリングまでの合成サイクル（段階２〜１３）の繰り返し。
段階１５：  リンカーのカップリング：ジクロロメタンでの洗浄４回。
【０１５７】
段階１６：  TFAおよびｍ−クレゾール（９５：５）との反応によるBoc基の切り離し。反応時間：２回×各３分。
段階１７：  ジクロロメタンでの洗浄５回。
段階１８：  NMPでの洗浄５回。
段階１９：  NMPとピリジン（２：１）中のHATU ３．８当量およびNMM９当量で、４当量のeg1を１分間予備活性化。
段階２０：  活性化リンカーの固相との反応（１．カップリング；時間：３０分）。
【０１５８】
段階２１：  NMPでの洗浄４回。
段階２２：  ジクロロメタンでの洗浄１回。
段階２３：  段階１９〜２１の繰り返し（２．カップリング）。
段階２４：  ニンヒドリンとのカップリング効率試験（カイザー試験；カイザー試験でポジティブな結果が示されたら、段階１９〜２１を繰り返さなければならない）。
段階２５：  ネガティブなカイザー試験の後、反応シークエンスはAc2O、NMPおよびピリジン（１：２５：２５）の溶液でそれぞれ４分間２回キャップする。
【０１５９】
段階２６：  NMPでの洗浄５回。
段階２７：  (eg1)3についての合成段階（段階１５〜２６）の繰り返し２回。
段階２８：  一般式ＩＩの相当する最終保護化合物とのカップリングまでの合成サイクル段階（段階２〜１３）の繰り返し。その後、合成サイクル段階（段階２〜１３）は相当する最終保護アミノ酸とのカップリングまで任意に繰り返す。その後、MNPA-OHのカップリングの場合、実施例１１からの段階１５〜２４、またはDNPA-OHのカップリングの場合、実施例１２からの段階１５〜２４をそれぞれ行う。
【０１６０】
カルボン酸末端で樹脂に結合するリンカーを有する本発明の化合物が得られる。
【０１６１】
リンカーを有する本発明の化合物の樹脂からの切り離し：
リンカーを有する本発明の化合物を含む樹脂を水性アンモニア溶液（H2O中の NH3２８〜３０重量％）中で６０℃にて２０時間攪拌する。その後、切り離された樹脂を濾過し、濾液を真空濃縮し、乾燥する。粗生成物は、メタノールおよび水でRP-C18カラムによる調製HPLCによって精製する。リンカーを有する本発明の化合物は約５０％の収率で無色固体として得られる。本発明の化合物の分子量はMALDI-TOFによって明らかにされる。
【０１６２】
実施例１４：  配列のさらに別の例
実施例１１または１２からの一般的な合成を行うことによって、本発明のさらに別の化合物が製造された：
【０１６３】
MNPA-ARcGRgTRcGRgCRgARaCRaTR-Gly-NH2
MNPA-Bio-ARcGRgTRcGRgCRgARaCRaTR-Gly-NH2 (Bio＝リシン、リシン側鎖のアミノ官能基を介してビオチンで官能化されている)
DNPA-ARcGRgTRcGRgCRgARaCRaTR-Gly-NH2
DNPA-Bio-ARcGRgTRcGRgCRgARaCRaTR-Gly-NH2
DNPA-tGRcCRtARgGRaCRtCRcARgCR-Gly-NH2
DNPA-Bio-tGRcCRtARgGRaCRtCRcARgCR-Gly-NH2
DNPA-tGRcCRtARggactCRcARgCR-Gly-NH2
DNPA-Bio-tGRcCRtARggactCRcARgCR-Gly-NH2
DNPA-cGRaARtARaGRgARgGRcTRtAR-Gly-NH2
DNPA-Bio-cGRaARtARaGRgARgGRcTRtAR-Gly-NH2
DNPA-cGRaARtARaggagGRcTRtAR-Gly-NH2
DNPA-Bio-cGRaARtARaggagGRcTRtAR-Gly-NH2
【０１６４】
DNPA-gGRcTRcGRaARtARaGRgARgGR-Gly-NH2
DNPA-Bio-gGRcTRcGRaARtARaGRgARgGR-Gly-NH2
DNPA-gGRcTRcGRaataaGRgARgGR-Gly-NH2
DNPA-Bio-gGRcTRcGRaataaGRgARgGR-Gly-NH2
DNPA-aCRaARaTRgCRaTRgGRgCRtGR-Gly-NH2
DNPA-Bio-aCRaARaTRgCRaTRgGRgCRtGR-Gly-NH2
DNPA-aCRaARaTRgcatgGRgCRtGR-Gly-NH2
DNPA-Bio-aCRaARaTRgcatgGRgCRtGR-Gly-NH2
DNPA-cGRcCRtTRaTRcCRgTRaGRcCR-Gly-NH2
DNPA-Bio-cGRcCRtTRaTRcCRgTRaGRcCR-Gly-NH2
DNPA-cGRcCRtTRatccgTRaGRcCR-Gly-NH2
DNPA-Bio-cGRcCRtTRatccgTRaGRcCR-Gly-NH2
DNPA-tgccTRaGRgactcCRaGRc-Gly-NH2
DNPA-Dota-gGRcTRcGRaARtARaGRgARgGR-Gly-NH2 (DOTA＝リシン、リシン側鎖のアミノ官能基を介してDOTAで官能化されている)
【０１６５】
実施例１５：  一般式Ｖを有する本発明の化合物の合成についての詳細：
２mlのDMFおよび２mlのピリジンをスクリューカップに入れる。攪拌しながら、３８２mg（２．９５ミリモル）のDIPEA、その後、２９１mg（１．４８ミリモル）の４−ヒドロキシ−３−ニトロ−フェニル酢酸を加える。その後、２mlのDMFに溶解した５６２mg（１．４８ミリモル）のHATUを加える。反応混合物を５分間予備活性化する。予備活性化された溶液を、１０mlのDMFに溶解した２−（１０−ヒドロキシデシル）−５，６−ジメトキシ−３−メチルシクロヘキサ−２，５−ジエン−１，４−ジオン（イデベノン）５００ml（１．４８ミリモル）の溶液へ滴加し、その後４０℃に加熱する。２４時間の反応時間の後、溶媒を除去し、残留物を酢酸エチルエステルに溶解する。有機相を２Ｎ硫酸水素カリウム溶液で２回および飽和塩化ナトリウム溶液で１回洗浄し、その後、硫酸マグネシウムで乾燥する。粗生成物はクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサンおよび酢酸エチルエステル、１：１、ｖ／ｖ）で精製する。
【０１６６】
【化１９】
2010507607.tif 000021
【０１６７】
実施例１６：  モノヒドロキシモノニトロフェニル残基またはモノヒドロキシジニトロフェニル残基をそれぞれ有する一般式Ｉの化合物の選択的局在化
HeLa細胞または143Bペアレント細胞それぞれを、１０μＭの一般式Ｉのビオチン標識化合物溶液と共にインキュベートする。２４時間後、２μＭのMitoTracker溶液を加え、さらに４５分後、細胞をエタノールで固定する。その後、フルオレセインおよびアビジンの溶液（５μg/ml）を室温で３０分間細胞に作用させる。細胞を洗浄した後、ビオチニル化抗アビジン溶液（５μg/ml）を室温で３０分間細胞に作用させる。さらに細胞を洗浄した後、フルオレセインおよびアビジンの溶液（５μg/ml）を室温で３０分間細胞に再び作用させる。さらに洗浄した後、細胞核をDAPIカウンター染色によってマークする。その後、細胞内のミトコンドリア並びに細胞核の、一般式Ｉの化合物の立体分布または分散を共焦点顕微鏡によって調べる。
【０１６８】
実施例１７：  本発明の化合物DNPA-tGRcCRtARggactCRcARgCR-Gly-NH2で処理することによるHeLa細胞内のCOX1およびmtDNA量の減少
HeLa細胞は、異なる濃度(100nM, 250nM, 500nM, 1μM, 2.5μM, 5μM and 10μM)および異なる時間（３、６、９、１１および１７日）で、ミトコンドリアたんぱく質COX1のmtDNA/mtRNAコーディング位置へ送られるDNPA-tGRcCRtARggactCRcARgCR-Gly-NH2の溶液（「実施品」）と共にインキュベートする。３日以上行われる実験の場合、上澄みは同じ濃度の本発明の化合物DNPA-tGRcCRtARggactCRcARgCR-Gly-NH2を含む新しい媒質に３日毎に入れ代える。
【０１６９】
COX1レベルの測定は、濃度が本発明の化合物での処理によって影響されないたんぱく質である内部標準としてのミトコンドリア膜内外たんぱく質に対するウエスタンブロッティングによって行う。COX1の減少は未処理HeLa細胞との比較で示す。ここで、未処理HeLa細胞のCOX1濃度は１００％とする。
本発明の化合物の濃度10 μMで、HeLa細胞内のCOX1レベルは３日後に６７％に、そして９日後に２０％に減少する。
次の表は、９日間処理した後のCOX1減少の濃度依存状態を示す：
【０１７０】
【表１】
2010507607.tif 000022
【０１７１】
mtDNA量の測定は、本発明の化合物DNPA-tGRcCRtARggactCRcARgCR-Gly-NH2での処理によって影響されない内部標準としての細胞核のDNAに対する同時PCRによって行う。mtDNAの減少は未処理HeLa細胞との比較で示す。ここで、未処理HeLa細胞のmtDNAの量は１００％とする。さらなる比較として、mtDNA/mtRNAに対する相補的配列をもたない本発明の化合物を用いる（「負の対照」）。
【０１７２】
本発明の化合物DNPA-tGRcCRtARggactCRcARgCR-Gly-NH2 の濃度10 μMでは、３日後ではまだ効果がない。未処理HeLa細胞とまたは負の対照で処理したHeLa細胞とそれぞれ比較して、mtDNAは６日後に８１％に、９日後に６２％に減少したことが観察される。その後、mtDNAの減少量値は１１日後（６４％）および１７日後（６１％）において変化がない。
次の表は、負の対照と比較した、本発明の有効化合物で９日間処理した後のmtDNA減少の濃度依存状態を示す：
【０１７３】
【表２】
2010507607.tif 000023
【図１】
2010507607.tif 000025
【図２】
2010507607.tif 000026
【図３】
2010507607.tif 000027
【図４】
2010507607.tif 000028
【国際調査報告】
2010507607.tif 000029
2010507607.tif 000030
2010507607.tif 000031
2010507607.tif 000032
2010507607.tif 000033
2010507607.tif 000034
2010507607.tif 000035
2010507607.tif 000036
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2010507607.tif 000038
2010507607.tif 000039
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