(57)【要約】本発明は、miR-34によって調節される遺伝子または遺伝子経路を同定するための、miR-34を使用して遺伝子もしくは遺伝子経路を調節するための、このプロファイルを使用して患者の状態を評価するための、および/または患者を適切なmiRNAによって処置するための、方法および組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
表1、3、4または5において特定される1種類または複数種類の遺伝子の発現を調節するのに十分な量でmiR-34核酸配列を含むある量の単離核酸を、細胞に投与する段階
を含む、細胞における遺伝子発現を調節する方法。
【請求項２】
前記細胞が、代謝性異常、免疫状態、感染性状態、心血管異常、消化異常、内分泌腺異常、眼の異常、尿生殖器異常、血液異常、筋骨格異常、神経系異常、先天性異常、呼吸器異常、皮膚異常、またはがん性状態を有する、それらを有すると疑われる、またはそれらを発症するリスクがある被験体の細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
感染性の疾患または状態が、寄生虫感染、細菌感染、ウイルス感染、または真菌感染である、請求項2記載の方法。
【請求項４】
がん性状態が、1種類または複数種類の遺伝子の調節が治療的反応には十分である、星状細胞腫; 未分化大細胞リンパ腫; 急性リンパ芽球性白血病; 急性骨髄性白血病; 血管肉腫; 乳がん; B細胞リンパ腫; 膀胱がん; 子宮頸がん; 頭頸部がん; 慢性リンパ球性白血病; 慢性骨髄性白血病; 結腸直腸がん; 子宮内膜がん; 神経膠腫; 膠芽細胞腫; 胃がん; ガストリン産生腫瘍; 肝芽腫; 肝細胞がん; ホジキンリンパ腫; カポジ肉腫; 白血病; 肺がん; 平滑筋肉腫; 喉頭扁平上皮がん; 黒色腫; 粘膜関連リンパ組織B細胞リンパ腫; 髄芽腫; 外套細胞リンパ腫; 髄膜腫; 骨髄性白血病; 多発性骨髄腫; 高リスク骨髄異形成症候群; 中皮腫; 神経繊維腫; 非ホジキンリンパ腫; 非小細胞肺がん; 卵巣がん; 食道がん; 口咽頭がん; 骨肉腫; 膵臓がん; 乳頭がん; 前立腺がん; 褐色細胞腫; 横紋筋肉腫; 頭頸部扁平上皮がん; 神経鞘腫; 小細胞肺がん; 唾液腺腫瘍; 散発性乳頭状腎細胞がん; 甲状腺がん; 精巣腫瘍; 尿路上皮がんである、請求項2記載の方法。
【請求項５】
がん性状態が肺がんである、請求項4記載の方法。
【請求項６】
肺がんが非小細胞肺がんである、請求項5記載の方法。
【請求項７】
非小細胞肺がんが、腺がん、扁平上皮がん、大細胞がん、腺扁平上皮がんまたは細気管支肺胞上皮がんである、請求項6記載の方法。
【請求項８】
がん性状態が前立腺がんである、請求項4記載の方法。
【請求項９】
前立腺がんが、検出可能な前立腺特異抗原(PSA)に関連している、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
前立腺がんがアンドロゲン非依存性である、請求項8記載の方法。
【請求項１１】
遺伝子の発現が下方制御される、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
遺伝子の発現が上方制御される、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞が、内皮細胞、中皮細胞、上皮細胞、間質細胞または粘膜細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞が、グリア細胞、白血病細胞、結腸直腸細胞、子宮内膜細胞、脂肪細胞、髄膜細胞、リンパ系細胞、結合組織細胞、網膜細胞、頸部細胞、子宮細胞、脳細胞、神経細胞、血液細胞、頸部細胞、食道細胞、肺細胞、心血管細胞、肝細胞、乳房細胞、骨細胞、甲状腺細胞、腺細胞、副腎細胞、膵臓細胞、胃細胞、腸細胞、腎細胞、膀胱細胞、前立腺細胞、子宮部細胞、卵巣細胞、精巣細胞、脾細胞、皮膚細胞、平滑筋細胞、心筋細胞または横紋筋細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞ががん細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
がん細胞が、神経細胞、グリア細胞、肺細胞、肝細胞、脳細胞、乳房細胞、膀胱細胞、血液細胞、白血病細胞、結腸細胞、結腸直腸細胞、子宮内膜細胞、上皮細胞、腸細胞、リンパ系細胞、中皮細胞、胃細胞、皮膚細胞、卵巣細胞、脂肪細胞、骨細胞、頸部細胞、食道細胞、膵臓細胞、前立腺細胞、腎細胞、筋細胞、副腎細胞、唾液腺細胞、精巣細胞または甲状腺細胞である、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
単離miR-34核酸が組換え核酸である、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
組換え核酸がRNAである、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
組換え核酸がDNAである、請求項17記載の方法。
【請求項２０】
組換え核酸がmiR-34発現カセットを含む、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
発現カセットが、ウイルスベクターまたはプラスミドDNAベクターに含まれる、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
ウイルスベクターが、1×105〜1×1014ウイルス粒子/用量の用量で投与されるか、または
プラスミドDNAベクターが、100 mg/患者〜4000 mg/患者の用量で投与される、
請求項21記載の方法。
【請求項２３】
miR-34核酸が合成核酸である、請求項1記載の方法。
【請求項２４】
前記核酸が、0.01 mg/kg体重〜10 mg/kg体重の用量で投与される、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
miR-34がhsa-miR-34である、請求項1記載の方法。
【請求項２６】
miR-34がmiR-34a、miR-34bまたはmiR-34cである、請求項1記載の方法。
【請求項２７】
前記核酸が経腸的にまたは非経口的に投与される、請求項1記載の方法。
【請求項２８】
経腸投与が経口によるものである、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
非経口投与が、血管内投与、頭蓋内投与、胸膜腔内投与、腫瘍内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、リンパ管内投与、腺内投与、皮下投与、局所投与、気管支内投与、気管内投与、鼻腔内投与、吸入投与、または滴下投与である、請求項27記載の方法。
【請求項３０】
前記核酸が薬学的製剤に含まれる、請求項1記載の方法。
【請求項３１】
薬学的製剤が脂質組成物である、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
薬学的製剤がナノ粒子組成物である、請求項30記載の方法。
【請求項３３】
薬学的製剤が生体適合性分子および/または生分解性分子からなる、請求項30記載の方法。
【請求項３４】
表1、3、4もしくは5において特定される1種類もしくは複数種類の遺伝子または表1、3、4もしくは5において特定される1種類もしくは複数種類の遺伝子に関連する遺伝子産物を含む細胞経路または生理的経路を調節するのに十分な量でmiR-34核酸配列を含む、ある量の単離核酸を、細胞に投与する段階
を含む、細胞経路または生理的経路を調節する方法。
【請求項３５】
2、3、4、5、6種類またはそれ以上のmiRNAを投与する段階
をさらに含む、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
2種類またはそれ以上のマイクロRNAが、hsa-miR-34aおよびhsa-miR-124a、hsa-miR-126、hsa-miR-147、hsa-let-7b、hsa-let-7cまたはhsa-let-7gの一つまたは複数を含む、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
miRNAが単一の組成物に含まれる、請求項35記載の方法。
【請求項３８】
少なくとも2種類の細胞経路または生理的経路が調節される、請求項35記載の方法。
【請求項３９】
少なくとも一つの遺伝子が、複数種類のmiRNAによって調節される、請求項35記載の方法。
【請求項４０】
遺伝子または遺伝子産物の発現が下方制御される、請求項34記載の方法。
【請求項４１】
遺伝子または遺伝子産物の発現が上方制御される、請求項34記載の方法。
【請求項４２】
前記細胞ががん細胞である、請求項34記載の方法。
【請求項４３】
前記細胞の生存能が低下するか、
該細胞の増殖が低下するか、
該細胞の転移が低下するか、または
治療に対する該細胞の感受性が増加する、
請求項42記載の方法。
【請求項４４】
がん細胞が、神経細胞、グリア細胞、肺細胞、肝細胞、脳細胞、乳房細胞、膀胱細胞、血液細胞、白血病細胞、結腸細胞、子宮内膜細胞、上皮細胞、腸細胞、中皮細胞、胃細胞、皮膚細胞、卵巣細胞、脂肪細胞、骨細胞、頸部細胞、食道細胞、膵臓細胞、前立腺細胞、腎細胞、筋細胞、副腎細胞、唾液腺細胞、または甲状腺細胞である、請求項42記載の方法。
【請求項４５】
単離miR-34核酸が組換え核酸である、請求項34記載の方法。
【請求項４６】
組換え核酸がDNAである、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
組換え核酸がウイルスベクターまたはプラスミドDNAである、請求項46記載の方法。
【請求項４８】
核酸がRNAである、請求項34記載の方法。
【請求項４９】
miR-34核酸が合成核酸である、請求項34記載の方法。
【請求項５０】
組換え核酸が合成核酸である、請求項45記載の方法。
【請求項５１】
(a) 細胞経路または生理的経路を調節するのに十分な量でmiR-34核酸配列を含むある量の単離核酸を、患者に投与する段階; および
(b)細胞経路または生理的経路の調節が第二の治療に対する患者の感受性を高める、第二の治療を実施する段階
を含む、miRNAによって調節される遺伝子に関連する病理学的な状態または疾患と診断されたまたはそれらを有すると疑われるもしくはそれらを発症すると疑われる患者を処置する方法。
【請求項５２】
1種類または複数種類の細胞経路または生理的経路が、表1、3、4または5において特定される1種類または複数種類の遺伝子を含む、請求項51記載の方法。
【請求項５３】
(a) 表1、3、4または5から選択される1種類または複数種類の遺伝子の発現プロファイルを判定する段階;
(b) 該発現プロファイルに基づきmiRNA治療に対する被験体の感受性を評価する段階; および
(c) 評価された感受性に基づき1種類または複数種類のmiRNAを選択する段階
を含む、病理学的な状態または疾患を有する、それらを有すると疑われる、またはそれらを発症する性向を有する被験体に投与されるmiRNAを選択する方法。
【請求項５４】
被験体を1、2、3、4、5、6、7、8、9、10種類またはそれ以上のmiRNAで処置する段階
をさらに含む、請求項53記載の方法。
【請求項５５】
各miRNAが、個別にまたは一つもしくは複数の組み合わせで投与される、請求項54記載の方法。
【請求項５６】
miRNAが単一の組成物中にある、請求項54記載の方法。
【請求項５７】
少なくとも一つの試料において表1、3、4または5からの1種類または複数種類の遺伝子の発現を評価する段階と組み合わせて、miR-34の発現を評価する段階
を含む、細胞、組織または被験体を評価する方法。
【請求項５８】
(a) 試料において表1、3、4または5からの1種類または複数種類の遺伝子の発現を評価する段階、および
(b) 試料においてmiR-34発現のレベルに基づきmiR-34の状態を判定する段階
を含む、試料においてmiR-34の状態を評価する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2007年6月8日付で出願された米国特許仮出願第60/942,971号の優先権を主張するものであり、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
I．発明の分野
本発明は、分子生物学および医学の分野に関する。具体的には本発明は、miR-34マイクロRNA、マイクロRNA発現、ならびにこれらによって直接的および間接的に調節される遺伝子および細胞経路による影響を受ける疾患もしくは状態の処置のための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
II．背景
2001年に複数のグループがクローニング法を使用して、線虫（C. elegans）、ショウジョウバエ（Drosophila）、およびヒトから多数の「マイクロRNA」（miRNA）を単離および同定した（Lagos-Quintana et al., 2001；Lau et al., 2001；Lee and Ambros, 2001）。内在性のsiRNAを有しないと考えられる数百種類のmiRNAが、植物および動物（ヒトを含む）で同定されている。したがって、siRNAに似ているものの、miRNAは異なる。
【０００４】
これまで同定されたmiRNAは、長さが約21〜22ヌクレオチドであり、非タンパク質コード遺伝子から転写されるより長い前駆体から生じる。これについては、CarringtonおよびAmbros（2003）の総説を参照されたい。前駆体は、自己相補的な領域内で自然に折りたたまれる構造を形成し；次に、ヌクレアーゼであるダイサー（動物の場合）またはDCL1（植物の場合）によるプロセシングを受けて短い2本鎖のmiRNAを生じる。miRNA鎖の一方は、RNA誘導サイレンシング複合体と呼ばれる、タンパク質とmiRNAとの複合体中に、統合される。miRNAはRISC複合体を標的mRNAへと導き、後に標的mRNAは、標的mRNAに対するmiRNAの配列相補性の程度に依存して切断されるか、または翻訳段階でサイレンシングされる。現在、最も一般的には植物で観察されるように、完全なまたはほぼ完全な相補性がmRNAの分解を招くと考えられている。これとは対照的に、不完全な塩基対合は、主に動物で見られるように翻訳段階のサイレンシングを導く。しかしながら最近のデータは、さらなる複雑性を示唆しており（Bagga et al., 2005；Lim et al., 2005）、miRNAによる遺伝子サイレンシングの機序に関する研究が活発に行われている。
【０００５】
最近の研究では、数多くのmiRNAの発現レベルにおける変化が、さまざまながんと関連することが報告されている（Esquela-Kerscher and Slack, 2006；Calin and Croce, 2006の総説）。miRNAは、細胞の成長、ならびにがんの発生と関連する細胞過程である細胞および組織の分化の調節とも関連づけられている。
【０００６】
本発明者らは、hsa-miR-34が、がん治療のならびに他の疾患および障害の治療の介入点となる多数の細胞活性の調節に関わることを以前に実証した(2005年5月31日付で出願された米国特許出願第11/141,707号および2005年11月14日付で出願された米国特許出願第11/273,640号、これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられる)。異なる24種類のヒト組織の調査において、本発明者らは、miR-34がヒトリンパ節組織において選択的または排他的に発現されることを認めた。ヒト由来の各種がん細胞株に形質転換した場合、miR-34aは前立腺がん細胞(22Rv1)、肺がん細胞(A549)、基底細胞がん細胞(TE354T)、子宮頸がん細胞(HeLa)および白血病T細胞(Jurkat)の増殖を阻害するが、miR-34aは正常ヒトT細胞には抗増殖作用を及ぼさなかった。形質転換によって、miR-34aは細胞におけるプログラム細胞死(アポトーシス)を増大し(Jurkat)または低減した(HeLa)。調節不能な細胞増殖はがんの特徴である。アポトーシスは、発がん性を有する細胞において死を誘導することにより、がんを調節する手助けとなる天然の細胞過程である。多くのがん遺伝子はアポトーシスの誘導を変化させることによって機能する。さらに最近では、他者らにより、がん性肝細胞においてmiR-34aが過剰発現されることが認められた(Meng et al., 2006)。
【０００７】
バイオインフォマティクス解析によって、任意のmiRNAが最大数百種類の異なる遺伝子に結合して、それらの発現を改変可能であることが示唆されている。また1つの遺伝子が複数のmiRNAによって調節される場合がある。したがって、個々のmiRNAは、遺伝子間の、遺伝子経路間の、および遺伝子ネットワーク間の複雑な相互作用を調節することが可能である。miRNAを含む、これらの調節経路および調節ネットワークの誤調節または変化は、がんなどの障害および疾患の発症に寄与する可能性が高い。バイオインフォマティクスのツールは、miRNAの結合標的の推定に有用であるが、どのツールにも限界がある。標的結合部位との相補性は不完全なので、miRNAのmRNA標的を、バイオインフォマティクスのツールのみで正確に推定することは困難である。また、miRNAと標的遺伝子間の相互作用的な調節ネットワークは複雑であることから、どの遺伝子が任意のmiRNAに反応して実際に誤調節されるかを正確に推定することは困難である。
【０００８】
miRNAの発現を操作することによって、またはmiRNAの誤調節を修復することによって遺伝子の発現エラーを修正することは、遺伝性疾患を修復する、およびがんのような疾患を治癒する有望な方法となる。現時点における、このアプローチの限界は、上述したように、miR-34を含む任意の所与のmiRNAの影響を受ける調節経路およびネットワークの詳細が、ほとんど不明なままである点である。これは、miR-34が重要な役割を果たす可能性のあるがんの治療の大きな制限となっている。has-miR-34発現による調節を受けるかまたはhas-miR-34発現を調節する可能性のある、遺伝子、遺伝子経路、および遺伝子ネットワークを同定することが求められている。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、miR-34調節の直接的な標的である遺伝子、またはmiR-34を介した別の遺伝子発現の修飾後の調節の間接的または下流の標的である遺伝子を同定することによって、さらなる組成物および方法を提供する。さらに本発明は、miR-34およびそのファミリーのメンバーによる影響を受ける遺伝子、疾患、ならびに/または生理学的経路およびネットワークについて記述する。特定の局面では、本発明の組成物は、代謝性の疾患もしくは異常、免疫の疾患もしくは状態、感染性の疾患もしくは状態、心血管の疾患もしくは異常、消化性疾患もしくは消化異常、内分泌腺の疾患もしくは異常、眼の疾患もしくは異常、尿生殖器の疾患もしくは異常、血液の疾患もしくは異常、筋骨格の疾患もしくは異常、神経系の疾患もしくは異常、先天性の疾患もしくは異常、呼吸器の疾患もしくは異常、皮膚の疾患もしくは異常、またはがん性の疾患もしくは状態を有するか、それらを有することと疑われるか、またはそれらを発症するリスクを有する被験体に、投与される。
【００１０】
特定の局面では、被験体もしくは患者は、1種類もしくは複数種類のmiRNAもしくはmRNAの発現および/または異常な発現に基づいて、治療のために選択され得る。さらなる局面では、被験体もしくは患者は、経路と関連する1種類もしくは複数種類の遺伝子の異常な発現、または経路と関連する1種類もしくは複数種類の遺伝子にコードされる1種類もしくは複数種類のタンパク質の異常な発現を含む、1種類もしくは複数種類の生物学的経路もしくは生理学的経路における異常に基づいて、治療のために選択され得る。さらにさらなる局面では、被験体もしくは患者は、miRNAの発現の異常、または生物学的経路および/もしくは生理学的経路の異常に基づいて選択され得る。被験体は、miRNAもしくはmRNAの発現もしくはその発現の欠如の評価および/または解析に基づく治療もしくは治療レジメンに対する感受性、耐性、および/または有効性に関して評価され得る。被験体の評価は、被験体もしくは患者に対するものもしくは治療の実施前、実施中、または実施後に、特定の治療に対する感受性に関して行われる。典型的には、推定または評価は、miRNAおよび/またはmRNAの解析によって、ならびに組織学的検査、免疫組織化学的検査、血液検査などを含むが、これらに限定されない他の評価法の組み合わせによって実施され得る。
【００１１】
いくつかの態様において、感染性の疾患または状態には細菌感染、ウイルス感染、寄生虫感染または真菌感染が含まれる。これらの遺伝子および経路の多くが種々のがんおよび他の疾患に関連している。がん性状態には、1種類または複数種類の遺伝子の調節が治療的反応には十分である、星状細胞腫、未分化大細胞リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、血管肉腫、乳がん、B細胞リンパ腫、膀胱がん、子宮頸がん、頭頸部がん、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸直腸がん、子宮内膜がん、神経膠腫、膠芽細胞腫、胃がん、ガストリン産生腫瘍、肝芽腫、肝細胞がん、ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、白血病、肺がん、平滑筋肉腫、喉頭扁平上皮がん、黒色腫、粘膜関連リンパ組織B細胞リンパ腫、髄芽腫、外套細胞リンパ腫、髄膜腫、骨髄性白血病、多発性骨髄腫、高リスク骨髄異形成症候群、中皮腫、神経繊維腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、卵巣がん、食道がん、口咽頭がん、骨肉腫、膵臓がん、乳頭がん、前立腺がん、褐色細胞腫、横紋筋肉腫、頭頸部扁平上皮がん、神経鞘腫、小細胞肺がん、唾液腺腫瘍、散発性乳頭状腎細胞がん、甲状腺がん、精巣腫瘍、尿路上皮がんが含まれるが、これらに限定されることはない。典型的には、がん性状態は、制御不能な増殖またはアポトーシスを含む、細胞死を起こせないことに関連した異常な過剰増殖状態である。
【００１２】
本発明は、miR-34調節の直接標的であるまたはmiR-34を介した上流遺伝子発現の修飾後の調節の下流標的である遺伝子を同定するための方法および組成物を提供する。さらに、本発明は、生体試料におけるmiR-34の発現によって影響を受ける遺伝子経路およびネットワークについて記述する。これらの遺伝子および経路の多くが種々のがんおよび他の疾患に関連している。細胞におけるmiR-34の発現または機能の変化は、これらの鍵遺伝子の発現の変化をもたらし、疾患または他の状態の発症の一因となりうる。miR-34 (miRNAが下方制御される疾患の場合)またはmiR-34阻害剤(miRNAが上方制御される疾患の場合)を疾患細胞または組織または被験体に導入することで、治療的反応が引き起こされると考えられる。miR-34によって直接的または間接的に調節される鍵遺伝子およびそれらが関連する疾患の身元（identity）が本明細書において提供される。ある局面において、細胞は、内皮細胞、中皮細胞、上皮細胞、間質細胞または粘膜細胞でありうる。ある局面において、細胞は、グリア細胞、白血病細胞、結腸直腸細胞、子宮内膜細胞、脂肪細胞、髄膜細胞、リンパ系細胞、結合組織細胞、網膜細胞、頸部細胞、子宮細胞、脳細胞、神経細胞、血液細胞、頸部細胞、食道細胞、肺細胞、心血管細胞、肝細胞、乳房細胞、骨細胞、甲状腺細胞、腺細胞、副腎細胞、膵臓細胞、胃細胞、腸細胞、腎細胞、膀胱細胞、前立腺細胞、子宮部細胞、卵巣細胞、精巣細胞、脾細胞、皮膚細胞、平滑筋細胞、心筋細胞または横紋筋細胞である。ある局面において、細胞、組織または標的はmiRNA発現を欠損していない場合があるが、miRNAの発現または過剰発現に治療的に応答しうる。これらの疾患のいずれかの治療標的としてmiR-34を使用することができる。ある態様において、被験体、臓器、組織または細胞におけるmiR-34の活性を調節するためにmiR-34を使用することができる。
【００１３】
細胞、組織または被験体は、がん細胞、がん組織であってよいか、がん組織を内部に持ってよいか、または疾患もしくは病気と診断されたもしくはそれらを発症するリスクがある被験体もしくは患者であってよい。ある局面において、がん細胞は、神経細胞、グリア細胞、肺細胞、肝細胞、脳細胞、乳房細胞、膀胱細胞、血液細胞、白血病細胞、結腸細胞、結腸直腸細胞、子宮内膜細胞、胃細胞、皮膚細胞、卵巣細胞、脂肪細胞、骨細胞、頸部細胞、食道細胞、膵臓細胞、前立腺細胞、腎細胞、上皮細胞、腸細胞、リンパ系細胞、筋細胞、副腎細胞、唾液腺細胞、精巣細胞または甲状腺細胞である。さらなる局面において、がんには、星状細胞腫、未分化大細胞リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、血管肉腫、乳がん、B細胞リンパ腫、膀胱がん、子宮頸がん、頭頸部がん、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸直腸がん、子宮内膜がん、神経膠腫、膠芽細胞腫、胃がん、ガストリン産生腫瘍、肝芽腫、肝細胞がん、ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、白血病、肺がん、平滑筋肉腫、喉頭扁平上皮がん、黒色腫、粘膜関連リンパ組織B細胞リンパ腫、髄芽腫、外套細胞リンパ腫、髄膜腫、骨髄性白血病、多発性骨髄腫、高リスク骨髄異形成症候群、中皮腫、神経繊維腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、卵巣がん、食道がん、口咽頭がん、骨肉腫、膵臓がん、乳頭がん、前立腺がん、褐色細胞腫、横紋筋肉腫、頭頸部扁平上皮がん、神経鞘腫、小細胞肺がん、唾液腺腫瘍、散発性乳頭状腎細胞がん、甲状腺がん、精巣腫瘍、尿路上皮がんが含まれるが、これらに限定されることはない。ある局面において、がん性状態は肺がんである。さらなる局面において、肺がんは非小細胞がんである。さらなる局面において、非小細胞がんは腺がん、扁平上皮がん、大細胞がん、腺扁平上皮がんまたは細気管支肺胞上皮がんである。ある局面において、がん性状態は前立腺がんである。さらなる局面において、前立腺がんはPSA陽性もしくは陰性であり、および/またはアンドロゲン依存性もしくは非依存性でありうる。
【００１４】
本発明の態様には、miR-34 miRNAによって正または負に調節された遺伝子の発現を調節するのに十分な量でmiR-34核酸、模倣体または阻害剤の配列を含むある量の単離核酸またはその模倣体を、細胞、組織または被験体に投与する段階を含む、細胞、組織または被験体における遺伝子発現、または生物学的もしくは生理学的経路を調節する方法が含まれる。「miR-34核酸配列」または「miR-34阻害剤」とは、miR-34の完全長前駆体、もしくはその相補体またはプロセシングされた(すなわち、成熟) miR-34配列および本明細書において記載される関連配列、ならびに前駆体miRNAもしくはプロセシングされたその配列、またはその相補体の5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29もしくはそれ以上のヌクレオチドを、その間の全ての範囲および整数を含めて含む。ある態様において、miR-34核酸配列またはmiR-34阻害剤は、プロセシングされた完全長のmiRNA配列またはその相補体を含み、「miR-34のプロセシングされた完全長の核酸配列」または「miR-34のプロセシングされた完全長の阻害剤配列」といわれる。さらなる局面において、miR-34核酸は、SEQ ID NO:1〜SEQ ID NO:73と少なくとも75、80、85、90、95、98、99または100%同一である、miR-34の少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、50ヌクレオチド(その間の全ての範囲および整数を含む)のセグメントまたは相補的セグメントを含む。miR-34という一般用語は、成熟miR-34配列の少なくとも一部を共有するmiR-34ファミリーの全てのメンバーを含む。成熟miR-34配列は、
2010529966.tif 000002
2010529966.tif 000003
またはその相補体を含む。ある局面において、記載したmiR-34ファミリーメンバーの全部ではなく一部を含む、これらのmiRNAのサブセットが使用される。一つの局面において、miR-34配列は、SEQ ID NO:72のコンセンサス配列を有する。一つの態様において、
2010529966.tif 000004
(ここで括弧付きのヌクレオチドは任意である) (SEQ ID NO:73)のコンセンサス配列を含む配列だけが含まれ、その他全てのmiRNAが除外される。miR-34という用語は、特に特定されていない限り、miR-34ファミリーの全てのメンバーを含む。ある局面において、記載したmiR-34ファミリーメンバーの全部ではなく一部を含む、これらのmiRNAのサブセットが使用される。例えば、一つの態様において、SEQ ID NO:73のコンセンサス配列を含む配列だけが含まれ、その他全てのmiRNAが除外される。
【００１５】
さらなる局面において、「miR-34核酸配列」は、miR-34ファミリーメンバーの完全長前駆体の全部またはセグメントを含む。miR-34ファミリーメンバーのステムループ配列は、.
2010529966.tif 000005
2010529966.tif 000006
2010529966.tif 000007
2010529966.tif 000008
またはその相補体を含む。
【００１６】
ある局面において、核酸のmiR-34核酸、またはそのセグメントもしくは模倣体は、前駆体miRNAまたはプロセシングされたその配列の5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29またはそれ以上のヌクレオチドを、その間の全ての範囲および整数を含めて含む。ある態様において、miR-34核酸配列は、プロセシングされた完全長のmiRNA配列を含み、「miR-34のプロセシングされた完全長の核酸配列」といわれる。さらなる局面において、miR-34は、本明細書において提供されるSEQ ID NOと少なくとも75、80、85、90、95、98、99または100%同一である、miR-34の少なくとも一つの5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、50ヌクレオチド(その間の全ての範囲および整数を含む)のセグメントを含む。
【００１７】
特定の態様において、miR-34またはmiR-34阻害剤を含む核酸は、hsa-miR-34もしくはhsa-miR-34阻害剤、またはその変種である。miR-34は、hsa-miR-34aまたはhsa-miR-34bまたはhsa-miR-34cでありうる。さらなる局面において、miR-34核酸またはmiR-34阻害剤は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10種類またはそれ以上のmiRNAまたはmiRNA阻害剤とともに投与することができる。miRNAまたはそれらの相補体は同時に、順番にまたは順序付けられた順で、投与することができる。ある局面において、miR-34またはmiR-34阻害剤は、let-7、let-7b、let-7c、let-7g、miR-15、miR-16、miR-20、miR-21、miR-26a、miR-124a、miR-126、miR-143、miR-147、miR-188、miR-200、miR-215、miR-216、miR-292-3pおよび/またはmiR-331核酸の一つまたは複数と組み合わせて投与することができる。miRNAまたはその阻害剤の全てまたは組み合わせを単一の製剤で投与することができる。投与は第二の治療の前、間または後であってよい。
【００１８】
miR-34核酸またはその相補体は、プロモーター、エンハンサーなどのような、さまざまな異種核酸配列、すなわち、天然においてmiR-34と機能的に結合していることが通常は見られない配列を含むこともできる。miR-34核酸は、組換え核酸であり、リボ核酸またはデオキシリボ核酸でありうる。組換え核酸は、miR-34またはmiR-34阻害剤発現カセット、すなわち、核酸合成のための成分を含んだ環境の中に導入された場合、核酸を発現する核酸セグメントを含むことができる。さらなる局面において、発現カセットは、ウイルスベクターもしくはプラスミドDNAベクターまたは他の治療用核酸ベクターもしくは送達媒体、例えばリポソームなどに含まれる。ある局面において、核酸は、RNAおよび/または合成核酸である。特定の局面において、miR-34核酸は合成核酸である。さらに、本発明の核酸は完全にまたは部分的に合成されてもよい。ある局面において、ウイルスベクターは、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014 pfuまたはウイルス粒子(vp)で投与することができる。
【００１９】
特定の局面では、miR-34核酸またはmiR-34阻害因子は、合成核酸である。さらに本発明の核酸は、完全に合成であるか、または部分的に合成である場合がある。さらにさらなる局面では、このような本発明の核酸をコードするDNAは、0.001 μgもしくは0.001 mg、0.01 μgもしくは0.01 mg、0.1 μgもしくは0.1 mg、1 μgもしくは1 mg、10 μgもしくは10 mg、20 μgもしくは20 mg、30 μgもしくは30 mg、40 μgもしくは40 mg、50 μgもしくは50 mg、100 μgもしくは100 mg、200 μgもしくは200 mg、400 μgもしくは400 mg、600 μgもしくは600 mg、800 μgもしくは800 mg、1000 μgもしくは1000 mg、2000 μgもしくは2000 mg〜4000 μgもしくは4000 mg（これらの間の全ての値および範囲を含む）で投与可能である。さらにさらなる局面では、合成核酸を含む本発明の核酸は、体重1 kgあたり0.001 μgまたはmg、0.01 μgまたはmg、0.1 μgまたはmg、1 μgまたはmg、10 μgまたはmg、20 μgまたはmg、30 μgまたはmg、40 μgまたはmg、50 μgまたはmg、100 μgまたはmg〜200 μgまたはmgで投与可能である。本明細書に記載する個々の量は、0.5分、1分、2分、3分、4分、5分、6分、7分、8分、9分、10分、0.5時間、1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、0.5日、1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、0.5週、1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、0.5か月、1か月、2か月、3か月、4か月、5か月、6か月、7か月、8か月、9か月、10か月、または0.5年、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年を含む期間で投与可能である（これらの間の全ての値および範囲を含む）。
【００２０】
ある態様では、組成物の投与は、経腸または非経口とすることができる。ある局面では、経腸投与は経口投与である。さらなる局面では、非経口投与は、病巣内投与、血管内投与、頭蓋内投与、胸膜内投与、腫瘍内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、リンパ内投与、腺内投与、皮下投与、局所投与、気管支内投与、気管内投与、鼻腔内投与、吸入投与、または滴下投与である。本発明の組成物は、局部的または局所的に投与可能であり、必ずしも病変内に直接的に投与する必要はない。
【００２１】
ある局面では、調節される遺伝子または遺伝子群は、表1、3、4、および/または5に記載する、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、100、150、200種類、もしくはそれ以上の遺伝子、または遺伝子の組み合わせを含む。さらにさらなる局面では、調節される遺伝子または遺伝子群は、表1、3、4、および/または5に記載する、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、100、150、175種類、もしくはそれ以上の遺伝子、または遺伝子の組み合わせを除外する場合がある。調節は、細胞内、組織内、または器官内における転写、mRNAのレベル、mRNAの翻訳、および/またはタンパク質のレベルの調節を含む。ある局面では、遺伝子の発現、またはmRNAやコードタンパク質などの遺伝子産物のレベルは、下方制御されるか、または上方制御される。特定の局面では、調節される遺伝子は、表1、3、4、および/または5に記載する遺伝子の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28種類、もしくは全て、またはこれらの任意の組み合わせを含むか、またはこれらから選択される（および除外する場合もある）。ある態様では、調節される遺伝子または調節されるように選択される遺伝子は、表1に由来する。さらなる態様では、調節される遺伝子または調節されるように選択される遺伝子は、表3に由来する。さらにさらなる態様では、調節される遺伝子または調節されるように選択される遺伝子は、表4に由来する。なおさらなる態様では、調節される遺伝子または調節されるように選択される遺伝子は、表5に由来する。本発明の態様は、治療様式、例えばmiR-34核酸、miR-34の阻害因子、またはこれらの模倣体の投与の様式を選択する段階の前に、標的細胞の遺伝子発現プロファイルまたはmiRNAプロファイルを得る段階または評価する段階を含む場合もある。アクセッション番号またはデータベースへの登録によって指定される全ての核酸および遺伝子に関連するデータベースの内容は、本出願の出願日の時点において、参照により本明細書に組み入れられる。本発明のある局面では、1種類もしくは複数のmiRNAもしくはmiRNA阻害因子は、単一の遺伝子を調節することができる。さらなる局面では、1種類もしくは複数の遺伝子経路、細胞経路、または生理学的経路中の1種類もしくは複数の遺伝子は、他のmiRNAと組み合わせた、miR-34核酸およびmiR-34阻害因子を含む1種類もしくは複数のmiRNAまたはその相補物によって調節可能である。
【００２２】
miR-34の核酸は、さまざまな異種核酸配列、すなわちプロモーターやエンハンサーなど、典型的には天然ではmiR-34と使用可能に結合した状態では存在しない配列を含んでもよい。miR-34の核酸は、組換え核酸であり、かつリボ核酸またはデオキシリボ核酸の可能性がある。組換え核酸は、miR-34の発現カセットを含んでもよい。さらなる局面では、発現カセットは、ウイルスもしくはプラスミドDNAのベクターまたは他の治療用核酸ベクター、またはリポソームなどを含む輸送用媒体中に含まれる。特定の局面では、miR-34の核酸は合成核酸である。さらに本発明の核酸は、全合成または部分合成であってよい。
【００２３】
本発明のさらなる態様は、細胞経路、具体的には表2に記述した経路または表1、3、4および/もしくは5の1種類もしくは複数種類の遺伝子を含むことが既知である経路の発現、機能、状態または状況を変化させるのに十分な量でmiR-34核酸配列を含むある量の単離核酸を、細胞に投与する段階を含む、細胞経路を調節する方法に関する。細胞経路の調節は1種類または複数種類の遺伝子の発現の調節を含むが、これに限定されることはない。遺伝子の調節は、内因性miRNAの機能の阻害または細胞、組織もしくは被験体への機能的miRNAの提供を含むことができる。調節は、遺伝子または関連するその遺伝子産物もしくはタンパク質の発現レベルまたは活性をいい、例えば、mRNAレベルを調節すること、またはmRNAの翻訳を調節することなどができる。調節は、遺伝子もしくは遺伝子産物を増大もしくは上方制御してもよく、または調節は、遺伝子もしくは遺伝子産物を低減もしくは下方制御してもよい。
【００２４】
さらなる態様には、
(a) 細胞経路の発現を調節するのに十分な量でmiR-34核酸配列を含むある量の単離核酸を、患者に投与する段階; および
(b) 細胞経路の調節が第二の治療に対する患者の感受性を高める、第二の治療を実施する段階
の一つまたは複数の段階を含む、病理学的状態を有する患者を処置する方法が含まれる。細胞経路は、以下の表2に記述した1種類もしくは複数種類の経路または表1、3、4および/もしくは5の1種類もしくは複数種類の遺伝子を含むことが既知である経路を含むことができるが、これらに限定されることはない。第二の治療は、第二のmiRNAもしくは治療用核酸の投与を含むことができ、または化学療法、放射線療法、薬物治療、免疫療法などのような、種々の標準的な治療を含むこともできる。本発明の態様は、適切な治療の選択のための遺伝子発現プロファイルの判定または評価を含むこともできる。
【００２５】
本発明の態様には、
(a) 表1、3、4および/または5から選択される1種類または複数種類の遺伝子の発現プロファイルを判定する段階;
(b) 発現プロファイルに基づき治療に対する被験体の感受性を評価する段階;
(c) 評価された感受性に基づき治療を選択する段階; ならびに
(d) 選択された治療を用いて被験体を処置する段階
の一つまたは複数の段階を含む、病理学的状態を有する被験体を処置する方法が含まれる。典型的には、病理学的状態は、一つの要素、指標または結果として表1、3、4および/または5の1種類または複数種類の遺伝子の誤調節を有する。
【００２６】
さらなる態様には、表1、3、4および/もしくは5、またはその任意の組み合わせの1種類または複数種類の遺伝子の発現評価を含む、細胞または組織におけるmiR-34の状態を示す発現プロファイルの特定および評価が含まれる。
【００２７】
「miRNA」という用語は、その通常のおよび明白な意味にしたがって用いられ、RNAに基づく遺伝子調節に関与する、真核生物において見られるマイクロRNA分子をいう。例えば、Carrington et al., 2003を参照されたく、これは参照により本明細書に組み入れられる。この用語は、前駆体からプロセシングされた一本鎖RNA分子または場合により前駆体それ自体をいうように用いることができる。
【００２８】
いくつかの態様において、細胞が特定のmiRNAを内因的に発現するかどうか、またはそのような発現が特定の条件の下で影響を受けるかどうか、もしくはそれが特定の疾患状態に存在する場合を知ることは有用でありうる。したがって、本発明のいくつかの態様において、方法には、細胞または細胞を含有する試料を、関心対象の遺伝子の発現レベルを示す1種類または複数種類のマーカー遺伝子もしくはmRNAまたは他の分析物の存在について評価する段階が含まれる。その結果、いくつかの態様において、方法には、試料のRNAプロファイルを作出する段階が含まれる。「RNAプロファイル」または「遺伝子発現プロファイル」という用語は、試料における1種類または複数種類の遺伝子または遺伝子マーカー(例えば、表1、3、4および/または5の1種類または複数種類のマーカーを同定する複数の核酸プローブ)の発現パターンに関する一連のデータをいい; 一連のRNAにより、例えば核酸増幅または当業者に周知のハイブリダイゼーション技術を用いて核酸プロファイルを得ることができることが企図される。患者由来の試料における発現プロファイル、および正常または非病理性の試料由来の発現プロファイルのような、基準発現プロファイルの差は、病理学的状態、疾患状態またはがん性状態を示す。対応するmRNAのセグメントを含むまたは同定する核酸またはプローブセットは、表1、3、4および/もしくは5に記載されるまたは本明細書において記述する方法によって同定される遺伝子、遺伝子マーカー、核酸、mRNAまたはそれらに典型的なプローブの
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またはそれ以上のヌクレオチドの全部または一部を、その間から導き出せる任意の整数または範囲を含めて含むことができる。
【００２９】
本発明のある態様は、患者由来の試料における発現プロファイルと正常試料の発現プロファイルまたは基準発現プロファイルとの差が病理学的状態、特にがんを示す、患者由来の試料中の1種類または複数種類のマーカーの発現プロファイルを測定するかまたは判定する段階を含む、患者における病理学的状態を評価するための、予後判定するための、または処置するための組成物および方法に関する。本発明のある局面において、細胞経路、遺伝子もしくは遺伝子マーカーは、任意の組み合わせを含めて表1、3、4および/もしくは5に記述した1種類もしくは複数種類の経路もしくはマーカーであるか、またはこれらの典型である。
【００３０】
本発明の局面には、病理学的状態の診断、評価もしくは処置、または病理学的状態が顕在化することの阻止が含まれる。例えば、本方法は、病理学的状態をスクリーニングするために、病理学的状態の予後を評価するために、病理学的状態を病期分類するために、治療に対する病理学的状態の反応を評価するために、あるいは第一の治療として遺伝子もしくは関連経路の発現を調節するためにまたは被験体を第二の治療に対して感受性にするもしくはより反応性にするために用いることができる。特定の局面において、患者の病理学的状態の評価は、患者の予後の評価でありうる。予後判定は、生存の時間または予測時間の推定、治療に対する反応の評価などを含むことができるが、これらに限定されることはない。ある局面において、1種類または複数種類の遺伝子またはマーカーの発現の変化は、病理学的状態を有する患者に対する予後徴候であり、ここでこのマーカーは、任意の組み合わせを含めて表1、3、4および/または5の1種類または複数種類である。
【００３１】
（表１）プレmiR hsa-miR-34aによるヒトがん細胞のトランスフェクション後に発現が増加(正の値)または減少(負の値)する遺伝子
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【００３２】
本発明のさらなる局面は、miR-34の核酸配列またはmiR-34阻害因子を含む単離核酸のある量を細胞に投与する段階を含む、細胞経路を調節する方法に関する。細胞、組織、もしくは被験体は、がん細胞、がん組織である場合があるか、またはがん組織を有する場合があるか、またはがん患者である場合がある。アクセッション番号またはデータベースへの登録によって指定される全ての核酸および遺伝子に関連するデータベースの内容は、本出願の出願時において、参照により本明細書に組み入れられる。
【００３３】
本発明のさらなる態様は、細胞経路、特に表2に記載する経路、または表1、3、4、および/または5に由来する1種類もしくは複数種類の遺伝子を含むことが既知である経路の、発現、機能、状況、または状態を調節するのに十分な量でmiR-34核酸配列を含む、ある量の単離核酸を、細胞に投与する段階を含む、細胞経路を調節する方法に関する。細胞経路の調節は、1種類もしくは複数種類の遺伝子の発現を調節する段階を含むが、これに限定されない。遺伝子の調節は、内在性のmiRNAの機能の阻害、または細胞、組織、もしくは被験体への機能性のmiRNAの提供を含む場合がある。調節とは、遺伝子、またはその関連遺伝子産物（例えばmRNA）またはタンパク質の発現のレベルもしくは活性、例えばmRNAレベルが調節され得るか、またはmRNAの翻訳が調節され得ることを意味する。調節は、遺伝子もしくは遺伝子産物を増加させる、すなわち上方制御してもよく、または遺伝子もしくは遺伝子産物（例えばタンパク質のレベルもしくは活性）を減少させる、すなわち下方制御してもよい。
【００３４】
さらにさらなる態様は、
（a）細胞経路の発現を調節するのに十分な量でmiR-34核酸配列またはmiR-34阻害因子を含むある量の単離核酸を、患者もしくは被験体に投与する段階；ならびに
（b）細胞経路の調節が、第二の治療に対する患者の感受性を高めるか、または第2の治療の有効性を高める、第2の治療を実施する段階
の1つもしくは複数の段階を含む、miRNAもしくはその模倣体を投与する方法、および/または病理学的状態を有する、病理学的状態を有することが疑われる、もしくは病理学的状態を発症するリスクを有する被験体もしくは患者を処置する方法を含む。有効性の上昇は、毒性の低減、第2の治療の用量の低減もしくは期間の短縮、または相加的もしくは相乗的な効果を含む場合がある。細胞経路は、以下の表2に記載する1種類もしくは複数種類の経路、または表1、3、4、および/または5の1種類もしくは複数種類の遺伝子を含むことが既知である経路を含むが、これらに限定されない場合がある。第2の治療は、単離核酸またはmiRNAもしくは阻害因子の投与前、投与中、および/または投与後に実施することができる。
【００３５】
第2の治療には、siRNAやアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの第2のmiRNAまたは治療的核酸の投与を含めることが可能であるか、または医薬、化学療法、放射線療法、薬剤治療、免疫療法などのさまざまな標準的な治療を含めてもよい。本発明の態様は、適切な治療法の選択を目的とした、遺伝子発現もしくは遺伝子発現プロファイルの判定または評価を含む場合もある。特定の局面では、第2の治療は化学療法である。化学療法は、パクリタキセル、シスプラチン、カルボプラチン、ドキソルビシン、オキサリプラチン、ラロタキセル（larotaxel）、タキソール、ラパチニブ、ドセタキセル、メトトレキセート、カペシタビン、ビノレルビン、シクロホスファミド、ゲムシタビン、アムルビシン、シタラビン、エトポシド、カンプトセシン、デキサメタゾン、ダサチニブ、ティピファニブ、ベバシズマブ、シロリムス、テムシロリムス、エベロリムス、ロナファルニブ（lonafarnib）、セツキシマブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、メシル酸イマチニブ、リツキシマブ、トラスツズマブ、ノコダゾール、ソラフェニブ、スニチニブ、ボルテゾミブ、アレムツズマブ、ゲムツズマブ、トシツモマブ、またはイブリツモマブを含むが、これらに限定されない場合がある。
【００３６】
本発明の態様は、
（a）表1、3、4、および/または5から選択される1種類もしくは複数種類の遺伝子の発現プロファイルを判定する段階；
（b）発現プロファイルに基づいて治療に対する被験体の感受性を評価する段階；
（c）評価された感受性に基づいて治療を選択する段階；ならびに
（d）選択された治療で被験体を治療する段階
の1つもしくは複数の段階を含む、疾患または状態を有する被験体を治療する方法を含む。典型的には、疾患または状態は、成分として指標を有するか、または表1、3、4、および/または5の1種類もしくは複数種類の遺伝子の誤調節を生じる。
【００３７】
ある局面では、2、3、4、5、6、7、8、9、10種類、もしくはそれ以上のmiRNAを、順にまたは組み合わせて、使用してもよく、例えば、miR-34またはmiR-34阻害因子と別のmiRNAの任意の組み合わせである。さらなる態様は、表1、3、4、および/または5に由来する1種類もしくは複数種類の遺伝子、または任意のこれらの組み合わせの発現の評価を含む、細胞中または組織中のmiR-34状態を示す発現プロファイルの同定および評価を含む。
【００３８】
「miRNA」という語句は、その一般的かつ単純な意味で使用され、かつRNAによる遺伝子調節に関与する、真核生物に存在するマイクロRNA分子を意味する。これについては例えば、参照により本明細書に組み入れられるCarringtonおよびAmbros, 2003を参照されたい。この語句は、前駆体からプロセシングを受けた1本鎖RNA分子、または場合によってはその前駆体を意味するように使用することができる。
【００３９】
いくつかの態様において、細胞が特定のmiRNAを内因的に発現するかどうか、またはそのような発現が特定の条件の下で影響を受けるかどうか、もしくはそれが特定の疾患状態に存在する場合を知ることは有用でありうる。したがって、本発明のいくつかの態様において、方法には、細胞または細胞を含有する試料を、関心対象の遺伝子の発現レベルを示す1種類または複数種類のマーカー遺伝子もしくはmRNAまたは他の分析物の存在について評価する段階が含まれる。その結果、いくつかの態様において、方法には試料のRNAプロファイルを作出する段階が含まれる。「RNAプロファイル」または「遺伝子発現プロファイル」という用語は、試料における1種類または複数種類の遺伝子または遺伝子マーカーまたはmiRNA (例えば、表1、3、4および/または5の1種類または複数種類のマーカーを同定する複数の核酸プローブ)の発現パターンに関する一連のデータをいい; 一連のRNAにより、例えば核酸増幅または当業者に周知のハイブリダイゼーション技術を用いて核酸プロファイルを得ることができることが企図される。患者由来の試料における発現プロファイル、および1種類または複数種類の遺伝子またはmiRNAの発現プロファイルのような、基準発現プロファイルの差は、どのmiRNAが投与されるべきかを示す。
【００４０】
ある局面において、miR-34またはmiR-34阻害剤およびlet-7は、乳がん、子宮頸がん、慢性リンパ芽球性白血病、結腸直腸がん、神経膠腫、膠芽細胞腫、胃がん、肝細胞がん、白血病、肺がん、多発性骨髄腫、非小細胞肺がん、卵巣がん、食道がん、膵臓がん、前立腺がん、頭頸部扁平上皮がん、甲状腺がんを有する患者に投与することができる。
【００４１】
さらなる局面には、乳がん、B細胞リンパ腫、子宮頸がん、結腸直腸がん、神経膠腫、膠芽細胞腫、胃がん、肝細胞がん、肺がん、多発性骨髄腫、非小細胞肺がん、卵巣がん、食道がん、膵臓がん、前立腺がん、横紋筋肉腫、頭頸部扁平上皮がん、甲状腺がんを有する患者へのmiR-34またはmiR-34阻害剤およびmiR-15の投与が含まれる。
【００４２】
さらにさらなる局面において、miR-34またはmiR-34阻害剤およびmiR-16は、乳がん、B細胞リンパ腫、結腸直腸がん、膠芽細胞腫、胃がん、肝細胞がん、多発性骨髄腫、非小細胞肺がん、卵巣がん、食道がん、膵臓がん、前立腺がん、横紋筋肉腫、頭頸部扁平上皮がん、甲状腺がんを有する患者に投与される。
【００４３】
ある局面において、miR-34またはmiR-34阻害剤およびmiR-20は、乳がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、神経膠腫、膠芽細胞腫、胃がん、肝細胞がん、白血病、脂肪腫、多発性骨髄腫、非小細胞肺がん、卵巣がん、食道がん、骨肉腫、膵臓がん、前立腺がん、頭頸部扁平上皮がん、甲状腺がんを有する患者に投与される。
【００４４】
本発明の局面には、miR-34またはmiR-34阻害剤およびmiR-21が、乳がん、結腸直腸がん、神経膠腫、膠芽細胞腫、胃がん、肝細胞がん、非小細胞肺がん、卵巣がん、食道がん、膵臓がん、前立腺がん、横紋筋肉腫、頭頸部扁平上皮がんを有する患者に投与される方法が含まれる。
【００４５】
さらにさらなる局面において、miR-34またはmiR-34阻害剤およびmiR-26aは、未分化大細胞リンパ腫、乳がん、B細胞リンパ腫、子宮頸がん、慢性リンパ芽球性白血病、結腸直腸がん、神経膠腫、膠芽細胞腫、胃がん、肝細胞がん、白血病、肺がん、多発性骨髄腫、非小細胞肺がん、卵巣がん、食道がん、骨肉腫、膵臓がん、前立腺がん、横紋筋肉腫、精巣腫瘍を有する患者に投与される。
【００４６】
さらにさらなる局面において、miR-34またはmiR-34阻害剤およびmiR-126は、乳がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、神経膠腫、膠芽細胞腫、胃がん、肝細胞がん、白血病、肺がん、中皮腫、非小細胞肺がん、卵巣がん、食道がん、骨肉腫、膵臓がん、前立腺がん、横紋筋肉腫、頭頸部扁平上皮がん、甲状腺がんを有する患者に投与される。
【００４７】
さらにさらなる局面において、miR-34またはmiR-34阻害剤およびmiR-143は、未分化大細胞リンパ腫、乳がん、B細胞リンパ腫、子宮頸がん、慢性リンパ芽球性白血病、結腸直腸がん、神経膠腫、膠芽細胞腫、胃がん、肝細胞がん、白血病、肺がん、多発性骨髄腫、非小細胞肺がん、卵巣がん、食道がん、骨肉腫、膵臓がん、前立腺がん、頭頸部扁平上皮がん、甲状腺がん、精巣腫瘍を有する患者に投与される。
【００４８】
さらにさらなる局面において、miR-34またはmiR-34阻害剤およびmiR-147は、乳がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、神経膠腫、膠芽細胞腫、胃がん、肝細胞がん、白血病、脂肪腫、多発性骨髄腫、非小細胞肺がん、卵巣がん、食道がん、骨肉腫、膵臓がん、前立腺がん、頭頸部扁平上皮がん、甲状腺がんを有する患者に投与される。
【００４９】
さらに別の局面において、miR-34またはmiR-34阻害剤およびmiR-188は、未分化大細胞リンパ腫、乳がん、B細胞リンパ腫、子宮頸がん、慢性リンパ芽球性白血病、結腸直腸がん、神経膠腫、膠芽細胞腫、胃がん、肝細胞がん、白血病、肺がん、多発性骨髄腫、非小細胞肺がん、卵巣がん、食道がん、膵臓がん、前立腺がん、頭頸部扁平上皮がん、甲状腺がん、精巣腫瘍を有する患者に投与される。
【００５０】
さらにさらなる局面において、miR-34またはmiR-34阻害剤およびmiR-200は、未分化大細胞リンパ腫、乳がん、B細胞リンパ腫、子宮頸がん、慢性リンパ芽球性白血病、結腸直腸がん、神経膠腫、膠芽細胞腫、胃がん、肝細胞がん、白血病、肺がん、多発性骨髄腫、中皮腫、非小細胞肺がん、卵巣がん、食道がん、骨肉腫、膵臓がん、前立腺がん、横紋筋肉腫、頭頸部扁平上皮がん、甲状腺がん、精巣腫瘍を有する患者に投与される。
【００５１】
他の局面において、miR-34またはmiR-34阻害剤およびmiR-215は、未分化大細胞リンパ腫、乳がん、B細胞リンパ腫、子宮頸がん、慢性リンパ芽球性白血病、結腸直腸がん、神経膠腫、膠芽細胞腫、胃がん、肝細胞がん、白血病、肺がん、脂肪腫、多発性骨髄腫、中皮腫、非小細胞肺がん、卵巣がん、食道がん、骨肉腫、膵臓がん、前立腺がん、横紋筋肉腫、頭頸部扁平上皮がん、甲状腺がん、精巣腫瘍を有する患者に投与される。
【００５２】
ある局面において、miR-34またはmiR-34阻害剤およびmiR-216は、乳がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、神経膠腫、膠芽細胞腫、胃がん、肝細胞がん、白血病、肺がん、非小細胞肺がん、卵巣がん、食道がん、骨肉腫、前立腺がん、頭頸部扁平上皮がん、精巣腫瘍を有する患者に投与される。
【００５３】
さらなる局面において、miR-34またはmiR-34阻害剤およびmiR-292-3pは、未分化大細胞リンパ腫、乳がん、B細胞リンパ腫、子宮頸がん、結腸直腸がん、神経膠腫、膠芽細胞腫、胃がん、肝細胞がん、白血病、肺がん、脂肪腫、多発性骨髄腫、非小細胞肺がん、卵巣がん、食道がん、骨肉腫、膵臓がん、前立腺がん、横紋筋肉腫、頭頸部扁平上皮がん、甲状腺がん、精巣腫瘍を有する患者に投与される。
【００５４】
さらにさらなる局面において、miR-34またはmiR-34阻害剤およびmiR-331は、未分化大細胞リンパ腫、乳がん、B細胞リンパ腫、子宮頸がん、慢性リンパ芽球性白血病、結腸直腸がん、神経膠腫、膠芽細胞腫、胃がん、肝細胞がん、白血病、肺がん、多発性骨髄腫、卵巣がん、食道がん、骨肉腫、膵臓がん、前立腺がん、横紋筋肉腫、頭頸部扁平上皮がん、甲状腺がん、精巣腫瘍を有する患者に投与される。
【００５５】
miR-34またはmiR-34阻害因子が、1種類もしくは複数種類の他のmiRNA分子と組み合わせて投与される場合、2種類の異なるmiRNAもしくは阻害因子は、同時にまたは連続的に投与され得ることが企図される。いくつかの態様では、治療は、1種類のmiRNAもしくは阻害因子によって開始され、かつこの治療に続いて、他のmiRNAもしくは阻害因子による治療が、1分、2分、3分、4分、5分、6分、7分、8分、9分、10分、15分、20分、25分、30分、35分、40分、45分、50分、55分、1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、11時間、12時間、13時間、14時間、15時間、16時間、17時間、18時間、19時間、20時間、21時間、22時間、23時間、24時間、1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、または1か月間、2か月間、3か月間、4か月間、5か月間、6か月間、7か月間、8か月間、9か月間、10か月間、11か月間、もしくは12か月間、または任意のこのような組み合わせの期間を経た後に実施される。
【００５６】
さらなる態様は、表1、3、4、および/または5に由来する1種類もしくは複数種類の遺伝子、または任意のこれらの組み合わせの発現の評価を含む、細胞もしくは組織中のmiR-34状態を示す発現プロファイルの同定および評価を含む。
【００５７】
「miRNA」という語句は、その一般的な意味および単純な意味で使用され、かつRNAによる遺伝子調節に関与し真核生物に存在するマイクロRNA分子を意味する。これについては例えば、参照により本明細書に組み入れられる、CarringtonおよびAmbros, 2003を参照されたい。この語句は、前駆体からプロセシングを受けた1本鎖RNA分子、または場合によっては前駆体そのものもしくはその模倣体を意味するように使用することができる。
【００５８】
いくつかの態様では、細胞が特定のmiRNAを内在的に発現するか否かを、またはそのような発現が特定の条件下で影響を受けるか否かを、または特定の疾患状態のどの時期にあるかを知ることが有用な場合がある。したがって、本発明のいくつかの態様では、方法は、細胞または細胞を含む試料を、対象遺伝子の発現レベルの指標となる1種類もしくは複数種類のmiRNAマーカー遺伝子もしくはmRNAまたは他の分析対象物の存在に関して分析する段階を含む。したがって、いくつかの態様では、方法は、試料のRNAプロファイルを作成する段階を含む。「RNAプロファイル」または「遺伝子発現プロファイル」という語句は、試料中の1種類もしくは複数種類の遺伝子または遺伝子マーカーの発現パターンに関する一連のデータを意味し（例えば表1、3、4、および/または5に由来する1種類もしくは複数種類のマーカーまたは遺伝子を同定する複数の核酸プローブ）；核酸のプロファイルが一連のRNAを使用して、例えば当業者に周知の核酸増幅法またはハイブリダイゼーション法で得られることが企図される。患者由来の試料の発現プロファイルと、正常試料または非病原性試料に由来する発現プロファイルまたはデジタル化された基準などの基準発現プロファイルとの差は、病的な疾患またはがん性の状態を示す。ある局面では、発現プロファイルは、そのような状態の発症の傾向または確率の指標（すなわち疾患もしくは状態のリスク因子）となる。このようなリスクまたは傾向は、治療、モニタリングの強化、予防的対策などを意味する場合がある。核酸またはプローブセットは、対応するmRNAのセグメントを含むか、またはそれらを同定する場合があり、かつ表1、3、4、および/または5に列挙されているか、または本明細書に記載する方法で同定される、遺伝子もしくは遺伝子マーカー、または核酸、mRNA、またはこれらを代表するプローブの、これらの間から導き出せる任意の整数もしくは範囲を含む、
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もしくはそれ以上のセグメントの全体もしくは一部を含む場合がある。
【００５９】
本発明のある態様は、患者由来の試料における発現プロファイルと、正常試料の発現プロファイルまたは基準発現プロファイルとの差が、病理学的状態、特にがんを示す、患者由来の試料中の1種類もしくは複数種類のmiRNAまたはマーカーの発現プロファイルを測定するかまたは決定する段階を含む、患者の病理学的状態を評価するための、予後判定するための、または治療するための組成物および方法に関する。本発明のある局面では、miRNA、細胞経路、遺伝子、または遺伝子マーカーは、任意の組み合わせを含む、表1、3、4、および/または5に記載した1種類もしくは複数種類の経路またはマーカーであるか、またはそれらの典型である。
【００６０】
本発明の局面は、病的な状態の診断、評価、もしくは治療、または病的な状態の出現の予防を含む。例えば方法は、病理学的状態のスクリーニングのために；病理学的状態の予後の評価のために；病理学的状態の病期決定のために；治療に対する病理学的状態の反応の評価のために；または第1の治療としての遺伝子、遺伝子群、もしくは関連経路の発現の調節のために、または被験体を第2の治療に感受性にするか、もしくは第2の治療に大きく反応させるために、使用することができる。特定の局面では、患者の病理学的状態の評価は、患者の予後の評価である場合がある。予後は、生存期間すなわち推定生存期間の推定、治療に対する反応の評価などを含むが、これらに限定されない場合がある。ある局面では、1種類もしくは複数種類の遺伝子またはマーカーの発現の変化によって、病的な状態を有する患者の予後を予測できる（マーカーは、任意の組み合わせを含む、表1、3、4、および/または5の1種類もしくは複数種類である）。
【００６１】
（表２）ヒトがん細胞におけるhsa-miR-34aの過剰発現の後に著しく影響を受けた機能的細胞経路
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【００６２】
（表３）予測されるhsa-miR-34a標的遺伝子
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【００６３】
（表４）pre-miR hsa-miR-34aによるトランスフェクション後にヒトがん細胞においてmRNA発現レベルの変化を示した予測されるhsa-miR-34a標的
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【００６４】
予測される遺伝子標的を表3に示す。mRNA発現レベルがhsa-miR-34によって影響を受ける標的遺伝子は、その発現レベルの操作を通じたがん治療および他の疾患または状態の治療の特に有用な候補に相当する。
【００６５】
本発明のある態様は、1種類もしくは複数種類のマーカー、遺伝子、または1種類もしくは複数種類の遺伝子を代表する核酸セグメントの発現を、増幅アッセイ、ハイブリダイゼーションアッセイ、またはタンパク質アッセイなどの、当業者に周知のアッセイで判定する段階を含む。ある局面では、増幅アッセイは、定量的RT-PCRなどの定量的増幅アッセイである場合がある。さらにさらなる局面では、ハイブリダイゼーションアッセイは、アレイハイブリダイゼーションアッセイまたは溶液ハイブリダイゼーションアッセイを含む場合がある。試料に由来する核酸は、試料から標識することが可能であり、かつ/または標識された核酸を1種類もしくは複数種類の核酸プローブにハイブリダイズさせることができる。核酸、mRNA、および/または核酸プローブは、支持体に結合させることができる。このような支持体は、当業者に周知であり、ガラス、プラスチック、金属、またはラテックスを含むが、これらに限定されない。本発明の特定の局面では、支持体は、平面状か、またはビーズもしくは他の幾何学的形状、または当技術分野で既知の配置を取り得る。タンパク質は典型的には、イムノブロット、クロマトグラフィー、もしくは質量分析、または当業者に既知の他の方法で分析される。
【００６６】
本発明は、本発明の組成物または本発明の方法を実施するための組成物を含むキットにも関する。いくつかの態様では、キットを使用して、1種類もしくは複数種類のマーカー分子を評価することができ、かつ/または1種類もしくは複数種類のmiRNAまたはmiRNA阻害因子を発現させることができる。ある態様では、キットは、評価対象のマーカー、または発現対象もしくは調節対象のmiRNAもしくはmiRNA阻害因子と関連する、少なくともまたは最大で
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種類もしくはそれ以上のプローブ、組換え核酸、または合成核酸分子を含み、かつこれらの中から導き出せる任意の範囲または組み合わせを含む場合がある。キットは、チューブ、ボトル、バイアル、シリンジ、または他の適切な容器手段などの、個別に包装可能なまたは容器内に配置可能な成分を含む場合がある。個々の成分は、濃縮された量でキット内に提供することも可能であり；いくつかの態様では、成分は、他の成分を含む溶液中にある場合と同じ濃度で個別に提供される。成分の濃度は、1×、2×、5×、10×、もしくは20×、またはそれ以上として提供され得る。治療、予後判定、または診断的応用のための本発明のプローブ、合成核酸、組換え核酸、または非合成核酸を使用するキットは、本発明の一部として含まれる。特に企図されるのは、本明細書に記載する生物学的活性、または1種類もしくは複数種類のマーカー遺伝子の発現または遺伝子経路に影響することが報告されている任意のmiRNAに対応する任意のそのような分子である。ある局面では、陰性対照および/または陽性対照が、キットのいくつかの態様に含まれる。対照分子を使用して、トランスフェクション効率および/またはトランスフェクションによって誘導される細胞の変化の制御を検証することができる。
【００６７】
ある態様は、適当な容器具の中に、2種類またはそれ以上の核酸ハイブリダイゼーションまたは増幅試薬を含む、試料の核酸プロファイリングによる患者における病理学的状態の評価または病理学的状態を発症するリスクの評価のためのキットに関する。このキットは、試料中の核酸を標識するための試薬および/または核酸ハイブリダイゼーション試薬を含むことができる。ハイブリダイゼーション試薬は、典型的には、ハイブリダイゼーションプローブを含む。増幅試薬は、増幅用プライマー、試薬および酵素を含むが、これらに限定されることはない。
【００６８】
本発明のいくつかの態様において、発現プロファイルは、
(a) 試料中の核酸を標識する段階；
(b) 核酸をいくつかのプローブとハイブリダイズする段階、またはいくつかの核酸を増幅する段階、ならびに
(c) 発現プロファイルが作出される、プローブとの核酸のハイブリダイゼーションを判定するおよび/もしくは定量化するか、または増幅産物を検出および定量化する段階
を含む段階によって、作出される。米国特許仮出願第60/575,743号および米国特許仮出願第60/649,584号、ならびに米国特許出願第11/141,707号および米国特許出願第11/273,640号を参照されたく、これらの全てが参照により本明細書に組み入れられる。
【００６９】
本発明の方法は、miRNAおよび/またはマーカー核酸の発現プロファイルに基づき、患者の予後を診断するおよび/または評価する段階を伴う。ある態様において、細胞における特定の遺伝子もしくは遺伝子経路または一連の核酸の発現レベルの上昇または低下は、正常または非病理性の細胞または組織試料におけるその同じものの発現レベルに比べて疾患状態または病理学的状態と相関性がある。評価している生体試料における1種類または複数種類の核酸の発現レベルを測定し、次いで、正常または非病理性の細胞または組織試料における発現レベルと比べた場合に、この相関関係によって診断法および/または予後判定法を行うことが可能になる。本出願において論じられるmiRNAおよび/または核酸のいずれかまたはセットを評価することによって患者、特に、がんのような特定の疾患または状態の性向を有すると疑われるまたはそれらを有する患者に対する発現プロファイルを作出できることが特に企図される。患者から作出される発現プロファイルは、特定の疾患または状態に関する情報を与えるものであると考えられる。多くの態様において、このプロファイルは、核酸ハイブリダイゼーションまたは増幅(例えば、アレイハイブリダイゼーションまたはRT-PCR)により作出される。ある局面において、発現プロファイルを、組織診断、血清中のタンパク質プロファイルおよび/または細胞遺伝学的評価のような他の診断検査および/または予後判定検査と併せて用いることができる。
【００７０】
（表５）さまざまな悪性病変の処置のための予後判定的または治療的価値を有するhsa-miR-34aによって変化した腫瘍関連mRNA
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略語: AC, 星状細胞腫; ALCL, 未分化大細胞リンパ腫; ALL, 急性リンパ芽球性白血病; AML, 急性骨髄性白血病; AS, 血管肉腫; BC, 乳がん; BCL, B細胞リンパ腫; BldC, 膀胱がん; CeC, 子宮頸がん; CHN, 頭頸部がん; CLL, 慢性リンパ球性白血病; CML, 慢性骨髄性白血病; CRC, 結腸直腸がん; EC, 子宮内膜がん; G, 神経膠腫; GB, 膠芽細胞腫; GC, 胃がん; GI, ガストリン産生腫瘍; HB, 肝芽腫; HCC, 肝細胞がん; HL, ホジキンリンパ腫; KS, カポジ肉腫; L, 白血病; LC, 肺がん; LMS, 平滑筋肉腫; LSCC, 喉頭扁平上皮がん; M, 黒色腫; MALT BCL, 粘膜関連リンパ組織B細胞リンパ腫; MB, 髄芽腫; MCL, 外套細胞リンパ腫; MG, 髄膜腫; ML, 骨髄性白血病; MM, 多発性骨髄腫; MSS, 高リスク骨髄異形成症候群; MT, 中皮腫; NF, 神経繊維腫; NHL, 非ホジキンリンパ腫; NSCLC, 非小細胞肺がん; OC, 卵巣がん; OepC, 食道がん; OrpC, 口咽頭がん; OS, 骨肉腫; PaC, 膵臓がん; PapC, 乳頭がん; PC, 前立腺がん; PCC, 褐色細胞腫; RMS, 横紋筋肉腫; SCCHN, 頭頸部扁平上皮がん; Schw, 神経鞘腫; SCLC, 小細胞肺がん; SGT, 唾液腺腫瘍; SPRC, 散発性乳頭状腎臓がん; TC, 甲状腺がん; TT, 精巣腫瘍; UC, 尿路上皮がん
【００７１】
本方法は、
(a) 患者から試料を得る段階、
(b) 試料から核酸を単離する段階、
(c) 試料から単離された核酸を標識する段階、および
(d) 標識された核酸を1種類または複数種類のプローブとハイブリダイズする段階
を含む、一つまたは複数の段階をさらに含むことができる。本発明の核酸は、表1、3、4および/または5中の遺伝子またはマーカーの1種類または複数種類に典型的な核酸の配列またはそれに相補的な配列を有する少なくとも一つのセグメントを含む1種類または複数種類の核酸を含む。
【００７２】
本明細書において記述される任意の方法または組成物は、本明細書において記述される他の方法または組成物のいずれに対しても実施できることおよび異なる態様を組み合わせられることが企図される。本発明のmiRNA分子、miRNA、遺伝子およびある態様に関して本明細書において論じられる任意の方法および組成物は、当業者に公知であるさまざまな、増幅アッセイ法、ハイブリダイゼーションアッセイ法またはタンパク質アッセイ法を用いることによる、1種類または複数種類のマーカー、遺伝子、またはそれらに典型的な核酸の発現の判定を含むことが特に企図される。ある局面において、増幅アッセイ法は、定量的RT-PCRなどのような定量的増幅アッセイ法でありうる。さらなる局面において、ハイブリダイゼーションアッセイ法には、アレイハイブリダイゼーションアッセイ法または溶液ハイブリダイゼーションアッセイ法が含まれうる。試料由来の核酸を試料から標識し、および/または標識された核酸を1種類もしくは複数種類の核酸プローブとハイブリダイズしてもよい。核酸、mRNA、および/または核酸プローブを支持体にカップリングしてもよい。そのような支持体は、当業者に周知であり、ガラス、プラスチック、金属またはラテックスを含むが、これらに限定されることはない。本発明の特定の局面において、支持体は、平面状もしくはビーズの形態、または当技術分野において公知の他の幾何学的形態もしくは形状でありうる。タンパク質は、典型的には、免疫ブロッティング、クロマトグラフィーもしくは質量分析、または当業者に公知の他の方法によってアッセイされる。
【００７３】
本発明は同様に、本発明の組成物または本発明の方法を実施するための組成物を含むキットに関する。いくつかの態様において、キットは、1種類もしくは複数種類のマーカー分子を評価するために、および/または1種類もしくは複数種類のmiRNAを発現させるために用いることができる。ある態様において、キットは、評価されるマーカーまたは発現されるもしくは調節されるmiRNAに関連する
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種類またはそれ以上のプローブ、組換え核酸または合成核酸分子を含むか、少なくともそれらを含むか、または多くともそれらを含み、その中から導き出せる任意の範囲または組み合わせを含むことができる。キットは、チューブ、ボトル、バイアル、シリンジ、または他の適当な容器具などの、容器の中に個々に包装するまたは入れることが可能な、構成成分を含むことができる。個々の構成成分は、キットにおいて高濃度で提供されてもよく；いくつかの態様において、構成成分は、他の構成成分を含む溶液中にあるのと同じ濃度で個々に提供される。構成成分の濃度は、1×、2×、5×、10×もしくは20×またはそれ以上として提供されてもよい。治療的適用、予後判定的適用、または診断的適用に本発明のプローブ、合成核酸、組換え核酸または非合成核酸を用いるためのキットは、本発明の一部として含まれる。特に企図されるのは、本明細書において記述される1種類または複数種類のマーカー遺伝子または遺伝子経路の生物活性または発現に影響を与えることが報告されている任意のmiRNAに対応する、そのような任意の分子である。ある局面において、陰性および/または陽性対照が、いくつかのキットの態様において含まれる。対照分子は、細胞におけるトランスフェクションの効率を検証するために、および/またはトランスフェクション誘導性の変化を制御するために用いることができる。
【００７４】
ある態様は、適切な容器手段中に、2種類もしくはそれ以上の核酸ハイブリダイゼーション用試薬または増幅用試薬を含む、試料の核酸プロファイリングによって、患者における病理学的状態または病理学的状態を発症するリスクを評価するためのキットに関する。キットは、試料中の核酸を標識するための試薬、および/または核酸ハイブリダイゼーション用試薬を含む場合がある。ハイブリダイゼーション用試薬は典型的には、ハイブリダイゼーション用プローブを含む。増幅用試薬は、増幅用プライマー、試薬、および酵素を含むが、これらに限定されない。
【００７５】
本発明のいくつかの態様では、発現プロファイルは、
（a）試料中の核酸を標識する段階；
（b）核酸をいくつかのプローブにハイブリダイズさせるか、またはいくつかの核酸を増幅する段階；ならびに
（c）発現プロファイルが作出される、プローブに対する核酸ハイブリダイゼーションを決定および/または定量するか、または増幅産物を検出および定量する段階
を含む段階によって、作出される。これについては、いずれも参照により本明細書に組み入れられる米国特許仮出願第60/575,743号および米国特許仮出願第60/649,584号、ならびに米国特許出願第11/141,707号および米国特許出願第11/273,640号を参照されたい。
【００７６】
本発明の方法は、miRNAおよび/またはマーカー核酸の発現プロファイルに基づいて患者の予後を診断および/または評価する段階を含む。ある態様では、細胞中の特定の遺伝子もしくは遺伝子経路、または一群の核酸の発現のレベルの上昇または低下は、正常または非病原性の細胞試料もしくは組織試料におけるこれらの発現レベルと比較して、疾患状態または病理学的状態と相関する。評価している生物学的試料における1種類もしくは複数種類の核酸の発現レベルを測定し、次いで、正常または非病原性の細胞試料もしくは組織試料の発現レベルと比べる場合に、この相関によって、診断法および/または予後判定法を行うことが可能となる。患者、特にがんなどの特定の疾患もしくは状態を有することが疑われるか、またはその性向を有する患者の発現プロファイルが、本出願で説明された任意の、または一群のmiRNAおよび/または核酸を評価することで作出可能であることが特に企図される。患者から作出される発現プロファイルは、特定の疾患または状態に関する情報を提供するプロファイルとなる。多くの態様において、プロファイルは、核酸のハイブリダイゼーションまたは増幅（例えばアレイハイブリダイゼーションもしくはRT-PCR）を用いて作出される。ある局面において、発現プロファイルを、組織学的検査、血清中のタンパク質プロファイル、および/または細胞遺伝学的評価などの他の診断検査および/または予後判定検査と併せて用いることができる。
【００７７】
本方法は、
（a）患者から試料を得る段階、
（b）試料から核酸を単離する段階、
（c）試料から単離核酸を標識する段階、および
（d）標識された核酸を1種類もしくは複数種類のプローブとハイブリダイズさせる段階を含む1つもしくは複数の段階をさらに含むことができる。本発明の核酸は、表1、3、4、および/または5の1種類もしくは複数種類の遺伝子またはマーカーを代表する核酸の配列または相補的配列を有する少なくとも1つのセグメントを含む1種類もしくは複数種類の核酸を含む。
【００７８】
本明細書に記載する任意の方法または組成物は、本明細書に記載する他の任意の方法または組成物に関して実行可能であること、および異なる態様を組み合わせることが可能であることが企図される。遺伝子を代表するmiRNA分子、miRNA、遺伝子、および核酸に関して本明細書で説明された任意の方法および組成物は、合成核酸に関して実施可能であることが特に企図される。いくつかの態様では、合成核酸は、生理学的な環境におけるmiRNAなどといったプロセシングを受けた核酸、すなわち成熟核酸となることを可能とする適切な条件に曝露される。当初出願された請求項は、出願された任意の請求項または出願された請求項のさまざまな組み合わせに複数従属する請求項を包含することが企図されている。
【００７９】
また、特定の遺伝子（その代表的な断片を含む）、mRNA、または指定のmiRNAを含む本発明の任意の態様も、配列が、指定のmiRNAの成熟配列と少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一なmiRNAを含む態様を包含することが企図される。
【００８０】
遺伝子もしくはそのマーカーまたはmiRNAに関する一般的な記述が、特に明記した部分を除いて、その遺伝子ファミリーのメンバー（番号によって識別される）またはそれらの代表的な断片の任意のものを意味するように、簡便な表記法が使用されることがさらに理解されると考えられる。当業者であれば、「遺伝子ファミリー」が、同じコード配列またはmiRNAのコード配列を有する一群の遺伝子を意味することを理解する。典型的には、遺伝子ファミリーのmiRNAのメンバーは、いくつかの以下のイニシャルによる記述法によって特定される。例えば、miR-16-1およびmiR-16-2は、miR-16遺伝子ファミリーのメンバーであり、かつ「mir-7」は、miR-7-1、miR-7-2、およびmiR-7-3を意味する。さらに、特に明記した部分を除いて、簡便な表記法は、関連するmiRNA（文字で区別される）を意味する。このような簡便な表記法以外の表記法が使用される場合もある。
【００８１】
本発明の他の態様は、本出願を通じて説明される。本発明の1つの局面に関して説明される任意の態様は、本発明の他の局面に適用する（逆も同様）。「実施例」および「詳細な説明」のセクションにおける態様は、本発明の全ての局面に適用可能な本発明の態様であると理解される。
【００８２】
「阻害する」、「低下させる」、もしくは「予防」、またはこれらの語句に類する任意の語句は、特許請求の範囲および/または明細書において使用される場合に、所望の結果を達成するための任意の測定可能な低下もしくは完全な阻害を含む。
【００８３】
特許請求の範囲および/または明細書において、「〜を含む（comprising）」という語句とともに使用される場合における、「1つの（a）」または「1つの（an）」という語句の使用は、「1つ（one）」を意味する場合があるが、「1つまたは複数の（one or more）」、「少なくとも1つの（at least one）」、および「1つまたは複数の（one or more than one）」という意味とも一致する。
【００８４】
本出願を通じて、「約」という語句は、値が、その値の決定に使用される装置または方法における標準偏差を含むことを意味するように使用される。
【００８５】
特許請求の範囲における「または」という語句の使用は、特に二者択一のみを意味するか、または二者択一が相互排他的であると明示的に記載する場合を除いて、「および/または」を意味するように使用されるが、本開示は、二者択一のみ、および「および/または」を意味する定義を支持する。
【００８６】
本明細書および特許請求の範囲で使用するように、「〜を含む（comprising）」（および「〜を含む（comprise）」および「〜を含む（comprises）」など「含む」の任意の語形）、「〜を有する（having）」（および「〜を有する（have）」および「〜を有する（has）」など「有する」の任意の語形）、「〜を包含する（including）」（および「〜を包含する（includes）」および「〜を包含する（include）」など「包含する」の任意の語形）、または「〜を含有する（containing）」（および「〜を含有する（contains）」および「〜を含有する（contain）」など「含有する」の任意の語形）という語句は、包含的であるかまたは制限がなく、かつ他の記載されていない要素または方法の段階を除外しない。
【００８７】
本発明の他の目的、特性、および利点は、以下の詳細な説明から明らかになると思われる。しかしながら、詳細な説明および特定の実施例は、本発明の特定の態様を意味する一方で、説明を目的としてのみ示されると理解されるべきである。というのは、本発明の趣旨および範囲内における、さまざまな変更および改変は、その詳細な説明から当業者に明らかになるからである。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明のある局面をさらに実証するために含まれる。本発明は、これらの図面の一つまたは複数を、本明細書において示される具体的な態様の詳細な説明と組み合わせて参照することによってさらによく理解することができる。
【００８９】
【図１】陰性対照miRNAで処理した細胞(100%)に対しての、hsa-miR-34aおよびその他の化合物で処理した8種類のヒト肺がん細胞株の増殖割合(%)。略語：miR-34a, hsa-miR-34a; siEg5, モータータンパク質キネシン11 (Eg5)に対するsiRNA; Etopo, エトポシド; NC, 陰性対照miRNA。グラフ中には標準偏差を示してある。
【図２】培養ヒトH226肺がん細胞数に及ぼすhsa-miR-34aの長期的作用。等しい数のH226細胞を、1.6 μM hsa-miR-34a (白四角形)または陰性対照miRNA (NC, 黒菱形)で電気穿孔処理し、播種し、通常の増殖培地中で増殖させた。対照細胞が集密度に達した時点(6日目、17日目および25日目)で、細胞を収集し、計数し、各miRNAで再び電気穿孔処理した。集団倍加数および累積細胞数を計算し、均等目盛でプロットした。矢印は電気穿孔処理日を表す。略語：miR-34a, hsa-miR-34a; NC, 陰性対照miRNA。
【図３】各種組み合わせのマイクロRNA投与後のH460肺がん細胞の増殖割合(%)。グラフ中の各棒線下のプラス記号は、投与された組み合わせにおいてmiRNAが存在したことを示す。グラフ中には標準偏差を示してある。略語：miR-34a, hsa-miR-34a; miR-124a, hsa-miR-124a; miR-126, hsa-miR-126; miR-147, hsa-miR-147; let-7b, hsa-let-7b; let-7c, hsa-let-7c; let-7g, hsa-let-7g; Etopo, エトポシド; NC, 陰性対照miRNA。
【図４】ヒトH460肺がん異種移植片を保有しているマウス6匹(n=6)の群における平均腫瘍体積。触知可能な腫瘍を11日目、14日目および17日目(矢印)にhsa-miR-34a (白四角形)で処置し、または陰性対照miRNA (NC, 黒菱形)で処置した。グラフ中には標準偏差を示してある。p値<0.1、<0.05および<0.01を有するデータ点をそれぞれ、十字形、星印または円形により示してある。略語：miR-34a, hsa-miR-34a; NC, 陰性対照miRNA。
【図５】陰性対照miRNAで処理した細胞(100%)に対しての、hsa-miR-34a処理ヒト前立腺がん細胞の増殖割合(%)。略語：miR-34a, hsa-miR-34a; siEg5, モータータンパク質キネシン11 (Eg5)に対するsiRNA; NC, 陰性対照miRNA。グラフ中には標準偏差を示してある。
【図６】培養ヒトPPC-1、PC3およびDu145前立腺がん細胞に及ぼすhsa-miR-34aの長期的作用。等しい数の細胞を1.6 μM hsa-miR-34a (白四角形)または陰性対照miRNA (NC, 黒菱形)で電気穿孔処理し、播種し、通常の増殖培地中で増やした。対照細胞が集密度に達した時点(PPC-1の場合4日目および11日目、PC3およびDu145の場合7日目および14日目)で、細胞を収集し、計数し、各miRNAで再び電気穿孔処理した。集団倍加数および累積細胞数を計算し、均等目盛でプロットした。矢印は電気穿孔処理日を表す。PC3およびDu145細胞による実験は、三通り行った。グラフ中には標準偏差を示してある。略語：miR-34a, hsa-miR-34a; NC, 陰性対照miRNA。
【図７】ヒトPPC-1前立腺がん異種移植片を保有しているマウス7匹(n=7)の群における平均腫瘍体積。ヒトPPC-1前立腺腫瘍細胞を0日目、7日目、13日目、20日目および25日目(矢印)にhsa-miR-34a (白四角形)で処置し、または陰性対照miRNA (NC, 黒菱形)で処置した。腫瘍増殖を32日間カリパス測定によって判定した。グラフ中には標準偏差を示してある。全てのデータ点でp値<0.01を得た。22日目のデータから得られたp値を円形により示してある。略語：miR-34a, hsa-miR-34a; NC, 陰性対照miRNA。
【図８】陰性対照miRNA (右)またはhsa-miR-34a (左)で処理したPPC-1前立腺がん細胞から発生した腫瘍の組織像。画像はヘマトキシリンおよびエオシンで染色した腫瘍を示す。矢印は、外見上生存している細胞を有するポケットを示す。略語: miR-34a, hsa-miR-34a; NC, 陰性対照miRNA。
【図９】陰性対照miRNA (上パネル)またはhsa-miR-34a (下パネル)で処理したPPC-1腫瘍の免疫組織化学。hsa-miR-34aで処理した腫瘍の場合、図8に示されるように分析は、外見上生存している細胞を有する領域に限られる。左の画像はヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)で染色した腫瘍細胞を示し；真ん中の画像はKi-67抗原に対する抗体による免疫組織化学分析(濃い斑点領域)を示し；右の画像はカスパーゼ3に対する抗体による免疫組織化学分析を示す。アポトーシス活性の増大している領域は、模範として矢印により示してある。略語: miR-34a, hsa-miR-34a; NC, 陰性対照miRNA。
【発明を実施するための形態】
【００９０】
発明の詳細な説明
本発明は、同定された遺伝子の発現によって表されるように、遺伝子およびこれらの遺伝子に関係する生物学的経路の同定および特徴付け、ならびにそのようなものに関係するmiRNAの、治療的適用、予後判定的適用、および診断的適用のための使用に関係する組成物および方法、特に、miR-34の発現またはその異常な発現に直接的または間接的に関係する病理学的状態の評価および/または特定に関係する方法および組成物に関する。
【００９１】
ある局面において、本発明は、ある遺伝子が、miR-34ファミリーメンバー(SEQ ID NO:1〜SEQ ID NO:71を含むが、これらに限定されない)のいずれか一つもしくは組み合わせの発現の増加もしくは減少の結果として(通常に比べ)発現の減少もしくは増加を有するような細胞もしくは被験体の評価、分析および/もしくは治療のための方法、ならびに/またはmiR-34ファミリーメンバーの一つもしくは組み合わせの発現の増加もしくは減少の結果として(通常に比べ)発現の増加を有する遺伝子に関する。miR-34の発現または阻害に対する発現プロファイルおよび/または反応は、疾患、または状態、例えば、がんを有する個体を示しうる。
【００９２】
列記したmiRNAまたは列記したマーカー（それらの代表的な核酸を含む）の任意の1種類または組み合わせを特徴とする予後判定アッセイを用いて、患者を評価して、どの治療レジメン（もしあれば）が正当化されるかを判定することができる。上記の診断アッセイに関しては、低い発現を定義する絶対値は、miRNAの測定に使用されるプラットフォームに依存する。診断アッセイに関して記載した同じ方法を、予後判定アッセイに使用することができる。
【００９３】
I．治療法
本発明の態様は、細胞へ導入されると内在性のmiRNAの活性を発現するか、または内在性のmiRNAを阻害する核酸に関する。ある局面では、核酸は合成または非合成のmiRNAである。配列特異的なmiRNA阻害因子を使用することで、細胞内における1種類もしくは複数種類の内在性のmiRNAの活性、ならびに内在性のmiRNAによる調節を受けるこれらの遺伝子および関連する経路を、連続的にまたは組み合わせて阻害することができる。
【００９４】
本発明は、いくつかの態様では、細胞内においてmiRNAとしてまたはmiRNA阻害因子として機能する、短い核酸分子に関する。「短い」という語句は、1本のポリヌクレオチドの長さが、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、50、100、もしくは150ヌクレオチド、またはこれ未満（これらの間から導き出せる全ての整数または範囲を含む）であることを意味する。核酸分子は典型的には合成である。「合成」という語句は、単離された核酸分子、および天然では細胞内で作られない核酸分子を意味する。ある局面では、その配列（配列全体）および/または化学構造は、内在性の前駆体miRNAもしくはmiRNA分子、またはこれらの相補物などの天然の核酸分子とは異なる。いくつかの態様では、本発明の核酸は、天然の核酸の配列と同一であるか、または相補的な全体の配列を有しないが、そのような分子は、天然の配列またはその相補物の全体もしくは一部を含む場合がある。しかしながら、細胞に投与された合成核酸はその後、その構造または配列が、成熟miRNA配列などの非合成もしくは天然の核酸と同じとなるように、細胞内で修飾または改変され得ることが企図される。例えば合成核酸は、前駆体miRNA配列とは異なる配列を有する場合があるが、その配列は細胞内に入ると、内在性の、プロセシングを受けるmiRNA、またはその阻害因子と同じとなるように変化する場合がある。「単離された」という語句は、本発明の核酸分子が最初に、（配列もしくは構造に関して）異なる、および望ましくない核酸分子から、単離核酸の集団が少なくとも約90%相同であり、かつ他のポリヌクレオチド分子に対して少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%相同である場合があるように分離されることを意味する。本発明の多くの態様では、核酸は、インビトロで合成されて、細胞内の内在性の核酸から単離される。しかしながら、単離核酸はその後、混合可能であるか、またはまとめてプール可能であることが理解されると考えられる。ある局面では、本発明の合成miRNAはRNAまたはRNA類似体である。miRNA阻害因子は、DNAもしくはRNA、またはこれらの類似体である場合がある。本発明のmiRNAおよびmiRNA阻害因子は、集合的に「合成核酸」と呼ばれる。
【００９５】
いくつかの態様では、17〜130残基の長さを有するmiRNAまたは合成miRNAが存在する。本発明は、これらの間の任意の整数または任意の範囲を含む、少なくとも、もしくは最大で
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もしくはそれ以上の長さの残基のmiRNA分子もしくは合成miRNA分子に関する。
【００９６】
ある態様では、合成miRNAは、（a）配列または結合領域が5'→3'の方向で成熟miRNA配列の全体もしくは一部と同一か、または相補的である「miRNA領域」、および（b）配列が5'→3'の方向で（a）のmiRNA配列に対して60%〜100%相補的な「相補的領域」を有する。ある態様では、これらの合成miRNAも、上記の手順で単離される。「miRNA領域」という語句は、天然の成熟miRNA配列またはこれらの相補物の配列全体と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、または100%（これらの間の全ての整数を含む）同一である、合成miRNA上の領域を意味する。ある態様では、miRNA領域は、天然のmiRNAの配列、またはこれらの相補物と
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同一であるか、または少なくとも同一である。
【００９７】
「相補的領域」または「相補物」という語句は、天然の成熟miRNA配列に対して60%相補的か、または少なくとも60%相補的な、核酸または模倣体の領域を意味する。相補的領域は、
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またはこれらから導き出される任意の範囲の割合で相補的であるか、または少なくとも相補的である。1つのポリヌクレオチド配列には、miRNA領域と相補的領域との化学的結合の結果としてヘアピンループ構造が存在する場合がある。他の態様では、相補的領域はmiRNA領域ではなく、異なる核酸分子上に存在する。この場合、相補的領域は相補鎖上に存在し、miRNA領域は活性鎖上に存在する。
【００９８】
本発明の他の態様では、miRNA阻害因子である合成核酸が存在する。miRNA阻害因子は約17〜25ヌクレオチドの長さであり、かつ成熟miRNAの5'→3'配列に対して少なくとも90%相補的な5'→3'配列を含む。ある態様では、miRNA阻害因子分子は、17ヌクレオチド、18ヌクレオチド、19ヌクレオチド、20ヌクレオチド、21ヌクレオチド、22ヌクレオチド、23ヌクレオチド、24ヌクレオチド、もしくは25ヌクレオチドか、またはこれらの間の任意の範囲の長さである。さらにmiRNA阻害因子は、成熟miRNA、特に天然の成熟miRNAの5'→3'配列に対して、
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またはこれらの間の任意の範囲の割合で相補的であるか、または少なくとも相補的である配列（5'→3'）を有する場合がある。当業者であれば、miRNA阻害因子の配列として、成熟miRNAの配列に相補的なmiRNA配列の一部を使用することができる。さらに、核酸配列の一部を、成熟miRNAの配列に対して適切なパーセンテージの相補性を保持するように改変することができる。
【００９９】
本発明のいくつかの態様では、合成miRNAまたは阻害因子は、1つもしくは複数の設計要素（design element）を含む。設計要素は、以下を含むが、これらに限定されない：
（i）相補的領域の5'末端におけるヌクレオチドのリン酸またはヒドロキシルの置換基；
（ii）相補的領域の先頭または最後の1〜6残基内の1か所もしくは複数の糖修飾；または
（iii）相補的領域の3'末端の1〜5残基内の1つもしくは複数のヌクレオチドと、miRNA領域の対応するヌクレオチドとの間の非相補性。
さまざまな設計の改変が当技術分野で既知である（以下参照）。
【０１００】
ある態様では、合成miRNAは、その相補的領域の5'末端に、リン酸基および/またはヒドロキシル基が別の化学基と置換されたヌクレオチドを有する（「置換設計（replacement design）」と呼ばれる）。場合によっては、リン酸基が置換され、一方その他ではヒドロキシル基が置換される。特定の態様では、置換基は、ビオチン、アミン基、低級アルキルアミン基、アミノヘキシルリン酸基、アセチル基、2'O-Me（2'酸素-メチル）、DMTO（酸素が付加した4,4'-ジメトキシトリチル）、フルオレセイン、チオール、またはアクリジンであるが、他の置換基が当業者に周知であり、同様に使用することができる。この設計要素は、miRNA阻害因子とともに使用することもできる。
【０１０１】
他の態様は、相補的領域の先頭または最後の1〜6残基中に1か所もしくは複数の糖修飾を有する合成miRNAに関する（「糖置換設計（sugar replacement design）」と呼ばれる）。場合によっては、1か所もしくは複数の糖修飾が、相補的領域の先頭の1残基、2残基、3残基、4残基、5残基、6残基、もしくはそれ以上の残基、またはこれらの間の任意の範囲中に存在する。場合によっては、1か所もしくは複数の糖修飾は、相補的領域の最後の1残基、2残基、3残基、4残基、5残基、6残基、もしくはそれ以上の残基、またはこれらの間の任意の範囲が糖修飾を有する。「先頭」および「最後」という語句は、領域の5'末端から3'末端への残基の順序に関すると理解されると考えられる。特定の態様では、糖修飾は、6'位の炭素に連結したカルボキシ基における2'O-Me修飾、2'F修飾、2'H修飾、2'アミノ修飾、4'チオリボース修飾またはホスホロチオエート修飾である。さらなる態様では、1か所もしくは複数の糖修飾が、相補的領域の先頭もしくは最後の2〜4残基中、または相補的領域の先頭または最後の4〜6残基中に存在する。この設計要素は、miRNA阻害因子とともに使用することもできる。したがって、miRNA阻害因子は、上述したように、この設計要素、および/または置換基を、5'末端のヌクレオチド上に有する場合がある。
【０１０２】
本発明の他の態様では、相補的領域の3'末端の1〜5残基中の1つもしくは複数のヌクレオチドが、miRNA領域の対応するヌクレオチドに対して相補的ではない（「非相補的」）合成miRNAまたは阻害因子が存在する（「非相補的設計（noncomplementarity design）」と呼ばれる）。非相補性は、相補的なmiRNAの最後の1残基、2残基、3残基、4残基、および/または5残基中に存在する場合がある。ある態様では、相補的領域中の少なくとも2ヌクレオチドとの間に非相補性が存在する。
【０１０３】
本発明の合成miRNAは、置換設計、糖修飾設計、または非相補的設計の1つもしくは複数を有することが企図される。場合によっては、合成RNA分子はこれらの2つを有し、別の場合は、これらの分子は3つ全ての設計を適所に有する。
【０１０４】
miRNA領域および相補的領域は、同じポリヌクレオチド上か、または別のポリヌクレオチド上に存在する場合がある。これらが同じポリヌクレオチド上に、または同じポリヌクレオチド中に含まれる場合は、miRNA分子は1つのポリヌクレオチドであると見なされることになる。異なる領域が別のポリヌクレオチド上に存在する態様では、合成miRNAは2つのポリヌクレオチドを含むと見なされることになる。
【０１０５】
RNA分子が1本のポリヌクレオチドである場合は、miRNA領域と相補的領域の間にリンカー領域が存在し得る。いくつかの態様では、1本のポリヌクレオチドは、miRNA領域と相補的領域の結合の結果としてヘアピンループ構造を形成可能である。リンカーはヘアピンループを含む。いくつかの態様では、リンカー領域は、
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残基の長さ、またはこれらの間の任意の範囲であるか、少なくともこの長さであるか、または最大でこの長さであることが企図される。ある態様では、リンカーは3〜30残基の長さである（3塩基および30塩基を含む）。
【０１０６】
miRNAまたは阻害因子の領域および相補的領域を有することに加えて、領域の5'末端または3'末端のいずれかに隣接する配列も存在する場合がある。いくつかの態様では、1ヌクレオチド、2ヌクレオチド、3ヌクレオチド、4ヌクレオチド、5ヌクレオチド、6ヌクレオチド、7ヌクレオチド、8ヌクレオチド、9ヌクレオチド、10ヌクレオチド、もしくはそれ以上の、または少なくともこれらのヌクレオチド、もしくはこれらの間の任意の範囲が、これらの領域の片側または両側に隣接する。
【０１０７】
本発明の方法は、
miRNA阻害因子を細胞に導入する段階を含む、細胞内における1種類もしくは複数種類のmiRNAの活性を低下させるかまたは除去する段階（本明細書では全体としてmiRNAと記載され、miRNAへの言及は、適切であればmiRNA阻害因子も意味する）；または
細胞内における1種類もしくは複数種類のmiRNAの活性を供給もしくは促進する段階
を含む。本発明は、特異的な合成miRNA分子や合成miRNA阻害因子分子などの特定の核酸を細胞に提供することによって、特定の細胞の特徴を誘導することにも関する。しかしながら、本発明の方法では、miRNA分子またはmiRNA阻害因子は合成である必要はない。これらは、天然のmiRNAと同一の配列を有してもよく、または任意の設計改変を有さなくてもよい。ある態様では、miRNA分子および/またはmiRNA阻害因子は、上述したように合成である。
【０１０８】
細胞に提供される特定の核酸分子は、細胞内の特定のmiRNAに対応すると理解され、したがって細胞内のmiRNAは、「対応するmiRNA」と呼ばれる。指定されたmiRNA分子を細胞中に導入する状況では、対応するmiRNAは、miRNAの機能が誘導されたかもしくは阻害されたと理解されることになる。しかしながら、細胞中に導入されたmiRNA分子は、成熟miRNAではなく、適切な生理学的な条件で成熟miRNAとなるか、または成熟miRNAとして機能することが可能であることが企図される。特定の対応するmiRNAがmiRNA阻害因子によって阻害される場合は、特定のmiRNAは「標的化miRNA」と呼ばれることになる。多数の対応するmiRNAが関与する場合があることが企図される。特定の態様では、複数のmiRNA分子が細胞中に導入される。さらに他の態様では、複数のmiRNA阻害因子が細胞中に導入される。さらに、miRNA分子とmiRNA阻害因子の組み合わせが細胞中に投与される場合がある。本発明者らは、miRNAの組み合わせが、異常な表現型を有する細胞の細胞経路の1つもしくは複数の点において作用する可能性があること、およびこのような組み合わせが、正常細胞に悪影響を及ぼすことなく、標的細胞に対する有効性を高める可能性があることを企図している。したがって、miRNAの組み合わせは、状態の改善、細胞の成長阻害、標的細胞の細胞死、細胞の表現型または生理の変化、細胞の成長速度の低下、第2の治療に対する感受性増大、特定の治療に対する感受性増大などの十分な治療効果を提供しながら、被験体もしくは患者に対して最小限の有害作用しか有さない場合がある。
【０１０９】
方法は、そのような細胞の特徴の誘導を必要とする細胞または患者を同定する段階を含む。また、細胞または生物体に提供される合成核酸の量が、特定の細胞の特徴の誘導などの望ましい目的を達成するのに必要な量（または十分な量）を意味する「有効量」であることが理解されると考えられる。
【０１１０】
方法のある態様は、望ましい生理学的な結果を達成するのに有効な量で、細胞中の成熟miRNAに対応する核酸分子を細胞に提供する段階または導入する段階を含む。
【０１１１】
さらに方法は、合成または非合成のmiRNA分子を提供する段階を含む場合がある。これらの態様では、方法は、1種類のみもしくは複数種類の合成miRNA分子、または1種類のみもしくは複数種類の非合成miRNA分子の提供に制限される場合もあれば制限されない場合もあることが企図される。したがって、ある態様では、方法は、合成と非合成のmiRNA分子の両方を提供する段階を含む場合がある。この状況では、細胞または細胞群は、特定のmiRNA分子に対応する合成miRNA分子、および異なるmiRNA分子に対応する非合成miRNA分子を提供する可能性が極めて高い。さらに、マーカッシュ群の表現を使用するmiRNAのリストを使用して表現される任意の方法は、マーカッシュ群の表現、およびこれに代えて離接的な品詞（すなわち、「または」）を用いずに表現され得る。
【０１１２】
いくつかの態様において、(i) miRNA阻害剤分子または(ii) miRNA配列に対応する合成もしくは非合成miRNA分子の有効量を、細胞に導入するまたは供与する段階を含む、細胞における細胞増殖を低減するまたは阻害するための方法がある。ある態様において、この方法は、(i) 1種類または複数種類の成熟miRNAの5'から3'配列に少なくとも90%相補的である5'から3'配列を有するmiRNA阻害剤分子の有効量を、細胞に導入する段階を伴う。
【０１１３】
本発明のある態様には、病理学的状態、特にがん、例えば、肺がんまたは肝がんを処置する方法が含まれる。一つの局面において、この方法は、標的細胞と、miRNA配列の全部または一部を有する少なくとも一つの核酸セグメントを含む1種類または複数種類の核酸、合成miRNAまたはmiRNAとを接触させる段階を含む。セグメントは、間にある全ての整数を含めて、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30またはそれ以上のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体でありうる。本発明の局面には、がん細胞などの、標的細胞内での遺伝子発現、miRNA発現もしくは機能またはmRNA発現もしくは機能の調節が含まれる。
【０１１４】
典型的には、内在性の遺伝子、miRNA、またはmRNAは細胞内で調節される。特定の態様では、核酸配列は、1種類もしくは複数種類のmiRNAもしくは遺伝子配列と核酸配列中の少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、または100%同一な、少なくとも1つのセグメントを含む。内在性の遺伝子、miRNA、またはmRNAの発現またはプロセシングの調節は、mRNAのプロセシングの調節によって可能である（このようなプロセシングは、細胞内における転写、輸送、および/または翻訳を含む）。調節は、細胞、組織、または器官内におけるmiRNA活性の阻害または増強によって可能となる場合もある。このようなプロセシングは、コードされた産物の発現、またはmRNAの安定性に影響を及ぼす可能性がある。さらに他の態様では、核酸配列は、修飾された核酸配列を含む場合がある。ある局面では、1種類もしくは複数種類のmiRNA配列は、修飾された核酸塩基または核酸配列を含むか、または包含する場合がある。
【０１１５】
本発明の方法では、細胞または生物体（患者を含む）などの他の生物学的物質が、細胞内に存在すると対応するmiRNAとして機能する核酸分子を細胞もしくは生物体に投与することによって、miRNA分子、または特定のmiRNAに対応するmiRNA分子を提供し得ることが理解されると考えられる。細胞に提供される分子の形状は、細胞内に入るとmiRNAとして作用する形状ではない場合がある。したがって、いくつかの態様では、合成miRNAまたは非合成miRNAは、細胞のmiRNAプロセシング機序にアクセスすると、プロセシングされて成熟および活性なmiRNAとなるように提供されることが企図される。ある態様では、提供されるmiRNA分子は、成熟miRNA分子ではなく、miRNAプロセシング機序にアクセスすると、プロセシングされて成熟miRNAになる核酸分子であることが特に企図される。miRNAに関して「非合成」という語句は、miRNAが本明細書で定義されるような「合成」ではないことを意味する。さらに、合成miRNAの使用に関する本発明の態様では、対応する非合成miRNAの使用も本発明の局面であると見なされることが企図される（逆も同様）。「提供する」という語句は、薬剤が、患者に薬剤を「投与する」段階を含むように使用されることが理解されると考えられる。
【０１１６】
ある態様では、方法は、miRNAを標的化して細胞内または生物体内で調節する段階も含む。「miRNAを標的化して調節する」という語句は、本発明の核酸が、選択されるmiRNAが調節されるように使用されることを意味する。いくつかの態様では、調節は、標的化されるmiRNAを細胞または生物体に効率的に提供する、標的化されるmiRNAに対応する合成または非合成のmiRNAによって達成される（正の調節）。他の態様では、調節は、細胞または生物体において標的化されるmiRNAを有効に阻害するmiRNA阻害因子によって達成される（負の調節）。
【０１１７】
いくつかの態様では、調節されるように標的化されるmiRNAは、疾患、状態、または経路に影響を及ぼすmiRNAである。ある態様ではmiRNAは、標的化されるmiRNAの負の調節によって治療を提供可能にするために、標的化される。他の態様ではmiRNAは、標的化されるmiRNA、またはその標的の正の調節によって治療を提供可能にするために、標的化される。
【０１１８】
本発明のある方法では、選択されたmiRNAモジュレーターを、標的化されるmiRNAの調節に関連する処理を必要とするか、または本明細書で説明された生理学的もしくは生物学的な結果（特定の細胞経路に関する結果や、細胞の生存能の低下のような結果など）を必要とする細胞、組織、器官、または生物体（集合的に「生物学的物質」）に投与する他の段階が存在する。したがって、本発明のいくつかの方法では、miRNAモジュレーターによって提供され得る治療を必要とする患者を同定する段階が存在する。有効量のmiRNAモジュレーターがいくつかの態様で投与可能であることが企図される。特定の態様では、生物学的物質に与えられる治療的利益が存在する。ここで「治療的利益」とは、疾患もしくは状態と関連する1つもしくは複数の状態または症状の改善、または疾患に関する予後、期間、もしくは状態の改善を意味する。治療的利益は、痛みの緩和、罹患率の低下、症状の緩和を含むが、これらに限定されないことが企図される。例えばがんに関しては、治療利益は、腫瘍の成長の阻害、転移の予防、転移数の減少、がん細胞の増殖の阻害、がん細胞の細胞死の誘導、がん細胞近傍の血管形成の阻害、がん細胞のアポトーシスの誘導、痛みの軽減、再発リスクの低下、がん細胞の化学療法もしくは放射線療法に対する感受性の誘導、寿命の延長、および/またはがんに直接的もしくは間接的に関連する死の遅延である場合があることが企図される。
【０１１９】
さらにmiRNA組成物は、治療の一環として、従来の治療用または予防用薬剤とともに患者に提供され得ることが企図される。さらに、治療に関して説明された任意の方法は、特に、潜在的に治療の必要があるかまたは治療が必要な状態もしくは疾患のリスクがあると同定された患者に対して、予防的に適用され得ることが企図される。
【０１２０】
加えて本発明の方法は、miRNAに対応する1種類もしくは複数種類の核酸、および治療薬の使用に関する。核酸は、薬剤の作用もしくは有効性を高めること、任意の副作用もしくは毒性を軽減すること、その生物学的利用能を修飾すること、および/または必要な用量もしくは頻度を低減させることが可能である。ある態様では、治療薬はがんの治療薬である。したがって、いくつかの態様では、がんの治療薬と、がんの治療薬の有効性を改善するかまたは非がん細胞を保護する少なくとも1種類の有効量のmiRNA分子とを患者に投与する段階を含む、患者のがんを治療する方法が存在する。がんの治療は、化学療法と放射線による治療の両方を使用する、さまざまな併用治療も含む。併用化学療法は例えば、5-フルオロウラシル、アレムツズマブ、アムルビシン、ベバシズマブ、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブスルファン、カンプトセシン、カペシタビン、シスプラチン（CDDP）、カルボプラチン、セツキシマブ、クロランブシル、シスプラチン（CDDP）、シクロホスファミド、カンプトセシン、COX-2阻害剤（例えばセレコクシブ）、シクロホスファミド、シタラビン、ダクチノマイシン、ダサチニブ、ダウノルビシン、デキサメタゾン、ドセタキセル、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、EGFR阻害剤（ゲフィチニブおよびセツキシマブ）、エルロチニブ、エストロゲン受容体結合剤、エトポシド（VP16）、エベロリムス、ファルネシル-タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ゲムツズマブ、イブリツモマブ、イホスファミド、メシル酸イマチニブ、ラロタキセル（larotaxel）、ラパチニブ、ロナファルニブ（lonafarnib）、メクロレタミン、メルファラン、メトトレキセート、マイトマイシン、ナベルビン、ニトロソ尿素、ノコダゾール、オキサリプラチン、パクリタキセル、プリカマイシン、プロカルバジン、ラロキシフェン、リツキシマブ、シロリムス、ソラフェニブ、スニチニブ、タモキシフェン、タキソール、タキソテール、テムシロリムス、ティピファニブ、トシツモマブ、トランスプラチナ（transplatinum）、トラスツズマブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、もしくはビノレルビン、または上記の任意の類似体もしくは誘導体の変形を含むが、これらに限定されない。
【０１２１】
一般にmiRNAの阻害因子は、内在性のmiRNAの活性を低下させるために与えられることが可能である。同様に、成熟miRNAに対応する核酸分子は、miRNAの阻害剤が与えられた場合と比較して反対の作用を達成するために、与えられることが可能である。例えば、細胞増殖を高めるmiRNA分子の阻害因子は、増殖を増加させるかまたは細胞増殖を低下させるために、細胞に提供され得る。本発明は、本明細書に開示されたさまざまなmiRNA分子およびmiRNA阻害因子によって観察されるさまざまな生理学的な作用に関して、これらの態様を企図している。これらは、以下の生理学的作用を含むが、これらに限定されない：細胞増殖の上昇および低下、アポトーシスの増加または減少、形質転換率の上昇、細胞生存能の上昇または低下、キナーゼ（例えばErk）の活性化または阻害、hTertの活性化/誘導または阻害、成長促進経路（例えばStat3シグナル伝達）の刺激の阻害、生細胞数の減少または増加、ならびに細胞周期の特定の相における細胞数の減少または増加。本発明の方法は全体として、1種類もしくは複数種類の異なるmiRNA分子に対応する1種類もしくは複数種類の異なる核酸分子を提供するまたは導入する段階を含むことが企図されている。以下の数の、少なくとも以下の数の、もしくは多くて以下の数の、またはこれらの間の任意の範囲の、異なる核酸もしくはmiRNA分子を提供または導入することができることが企図される。
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これは、細胞中に提供または導入され得る異なるmiRNA分子の数にも当てはまる。
【０１２２】
II．薬学的製剤および送達
本発明の方法は、有効量のmiRNAまたは同miRNAをコードする発現コンストラクトの送達を含む。薬学的組成物の「有効量」は全体として、記載された所望の結果を達成するために、例えば疾患もしくはその症状の程度を寛解させるために、軽減するために、最小限に抑えるために、または制限するために、検出可能かつ反復可能に十分な量であると定義される。疾患の除去、根絶、または治癒を含む、他のより厳密な定義を使用することができる。
【０１２３】
A．投与
ある態様では、細胞を死滅させること、細胞の成長を阻害すること、転移を阻害すること、腫瘍もしくは組織のサイズを縮小させること、および/または細胞の悪性もしくは疾患の表現型を逆転もしくは低減させることが望ましい。投与経路は、標的となる病変または部位の位置および性質によって必然的に変動することになり、かつ例えば、皮内投与、皮下投与、局所投与、非経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、鼻腔内投与、全身投与、ならびに経口投与および製剤化を含む。分離した、固体状で、到達可能な腫瘍、または他の到達可能な標的領域である場合には、直接注射、腫瘍内への注射、または腫瘍血管系中への注射が特に企図される。局所投与、限局的投与、または全身投与が適切な場合もある。4 cmを上回る腫瘍の場合は、投与対象の容量は約4〜10 ml（好ましくは10 ml）となり、4 cm未満の腫瘍の場合は、約1〜3 mlの容量（好ましくは3 ml）が使用される。
【０１２４】
単回投与として実施される複数注入は、約0.1〜約0.5 mlの用量を含む。本発明の組成物は、複数の注射によって腫瘍または標的部位に投与することができる。ある局面では、注射は約1 cmの間隔を設けて実施できる。
【０１２５】
外科的介入の場合は、本発明は、手術不能の腫瘍被験体を切除可能とするために術前に使用することができる。あるいは本発明を、残存疾患もしくは転移性疾患を治療するために、手術の時点で、および/または手術後に使用することができる。例えば、切除済みの腫瘍床を、miRNAもしくはmiRNAの組み合わせを含む製剤とともに注入または潅流することができる。投与は例えば、手術部位に埋め込まれたカテーテルを留置することで、切除後に継続することができる。周期的な術後処置も想定される。発現コンストラクトまたはウイルスコンストラクトの連続潅流も企図される。
【０１２６】
例えば腫瘍または他の望ましくない影響を受けた領域が切除され、かつ腫瘍床または標的部位が残存する微視的病巣を除去するように処理される場合には、必要に応じて連続的な投与を実施することもできる。シリンジを介した送達、またはカテーテルの留置が企図される。このような持続的な潅流は、治療の開始から約1〜2時間、約2〜6時間、約6〜12時間、約12〜24時間、約1〜2日日間、約1〜2週間、またはそれ以上の期間を要する場合がある。全体として、持続的な潅流を介した治療的組成物の用量は、潅流時間が調整された単回または複数回の注射による場合と同等となる。
【０１２７】
治療レジメンもまた多様であり、腫瘍のタイプ、腫瘍の位置、免疫条件、標的部位、疾患の進行、ならびに患者の健康および年齢にしばしば依存する。ある腫瘍タイプは、より積極的な治療を必要とする。医師は、そうした決定を、治療的製剤の既知の有効性および毒性（もしあれば）に基づいて適切に行う。
【０１２８】
ある態様では、治療対象となる腫瘍または患部は、少なくとも当初は切除できない場合がある。本発明の組成物による治療は、周縁部における収縮のために、または特定の浸潤性部分の除去によって、腫瘍の切除可能性を高める場合がある。治療後に、切除が可能な場合がある。切除後の追加的な治療によって、腫瘍または標的部位における微視的な残存疾患を除去可能な場合がある。
【０１２９】
治療は、さまざまな「単位用量」を含む場合がある。単位用量は、所定量の治療的組成物を含むと定義される。投与量、ならびに特定の経路および剤形は、臨床分野の当業者の技能の範囲内にある。単位用量は、単回注射で投与される必要はなく、一定の時間をかけた持続的な注入を含む場合がある。本発明のウイルス成分に関しては、単位用量は、利便性を考慮して、μg単位またはmg単位のmiRNAもしくはmiRNA模倣体として表すことができる。あるいは指定の量は、平均して毎日、平均して毎週、または平均して毎月、投与される量である場合がある。
【０１３０】
miRNAは、患者に、以下の用量または少なくとも以下の用量で投与することができる：約
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μgもしくはmgまたはそれ以上、またはこれらの間の任意の範囲の用量。あるいは指定の量は、平均して毎日、平均して毎週、または平均して毎月、投与される量であってもよく、またはmg/kg単位で表されてもよい（kgは患者の体重を意味し、mgは上記で指定される）。他の態様では、指定の量は、上記の任意の数字であるが、（腫瘍サイズまたは患者の表面積に関して）mg/m2で表される。
【０１３１】
B．注射可能な組成物および製剤
いくつかの態様では、miRNAもしくはそれをコードする発現コンストラクト、またはこれらの組み合わせを送達する方法は全身投与による。しかしながら、本明細書に開示された薬学的組成物は、米国特許第5,543,158号、同第5,641,515号、および同第5,399,363号（いずれもその全体が参照により本明細書に具体的に組み入れられる）に記載されているように、非経口で、皮下に、直接的に、気管内に、静脈内に、皮内に、筋肉内に、またはさらには腹腔内に投与することができる。
【０１３２】
核酸の注射は、シリンジによって、または核酸および任意の関連成分が注射に必要な特定のゲージのニードルを通過可能な限りにおいて、溶液の注射に使用される他の任意の方法によって、実施可能である。シリンジシステムは、所定量の溶液の複数回の注射を任意の深度で正確に可能とする、遺伝子治療における使用に関しても記述されている（米国特許第5,846,225号）。
【０１３３】
遊離塩基または薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中で調製することができる。分散液を、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、これらの混合物中に、および油中で調製することもできる。保存および使用の通常の条件では、これらの調製物は、微生物の成長を防ぐための保存剤を含む。注射可能な使用に適した薬学的剤形は、無菌の水溶液または分散液、および無菌の注射可能な溶液または分散液の即時調製用の無菌粉末を含む（全体が参照により本明細書に具体的に組み入れられる米国特許第5,466,468号）。いずれの場合も剤形は無菌でなければならず、かつシリンジへの充填が容易な溶液でなければならない。これは、製造および保存の条件で安定でなければならず、かつ細菌および真菌などの微生物による汚染作用を受けないように保存されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、これらの適切な混合物、および/または植物油を含む溶媒もしくは分散媒である場合がある。適切な流動性は例えば、レシチンなどのコーティング剤を使用することで、分散液の場合は必要な粒子径を維持することで、および界面活性剤を使用することで維持することができる。微生物の作用の防止は、さまざまな抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって実現できる。多くの場合、等張剤、例えば糖または塩化ナトリウムを含めることが好ましいと考えられる。注射可能な組成物の長期吸収は、薬剤吸収を遅らせる組成物、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを使用することで実現できる。
【０１３４】
ある製剤では水性の製剤が使用され、一方別の製剤では脂質ベースとすることができる。本発明の特定の態様では、腫瘍抑制タンパク質、または同タンパク質をコードする核酸を含む組成物は、水性の製剤である。他の態様では、製剤は脂質ベースである。
【０１３５】
例えば、水溶液の非経口投与の場合は、必要であれば、溶液を適切に緩衝するべきであり、かつ液体希釈物を最初に、十分な生理食塩水またはグルコースによって等張性とすべきである。このような特定の水溶液は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、腫瘍内投与、病巣内投与、および腹腔内投与に特に適している。これと関連して、使用可能な無菌の水性溶媒は、本開示に鑑みて当業者には既知であると考えられる。例えば、1回分の投与量を1 mlの等張性NaCl溶液に溶解し、1000 mlの皮下注射溶液に添加するか、または注射しようとする部位に注射することができる（例えば「Remington's Pharmaceutical Sciences」第15版の1035〜1038ページおよび1570〜1580ページを参照）。投与量については、治療対象の状態に依存して、いくつかのバリエーションが設けられる。いずれにせよ、投与に対して責任のある者が、個々の被験体に適した用量を決定することになる。さらに、ヒトへの投与の場合は、調製物は、FDA Office of Biologicsの基準が求める、無菌、発熱性、一般的な安全性および純度の基準に適合しているべきである。
【０１３６】
本明細書で用いる「担体」は、任意の、およびあらゆる溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング剤、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁液、コロイドなどを含む。薬学的活性物質に対する、このような溶媒および薬剤の使用は、当技術分野で周知である。任意の従来の溶媒または薬剤が活性成分に適合しない場合を除いて、治療的組成物におけるその使用が企図される。補助的な活性成分を組成物中に配合することもできる。
【０１３７】
「薬学的に許容される」という語句は、ヒトへの投与時にアレルギー反応や類似の望ましくない反応を生じない分子体および組成物を意味する。
【０１３８】
核酸は、投与剤形に適合した様式で、および治療的に有効となる量で投与される。投与される量は、例えば疾患またはがんの悪性度、任意の腫瘍または病変のサイズ、治療歴または他の一連の治療を含む、治療される被験体に依存する。投与に必要とされる活性成分の正確な量は、実施者の判断に拠る。初回投与および続く投与の適切なレジメンも多様であるが、典型的には、初回投与の後に他の投与を行う。このような投与は、全身投与とすることが可能であり、単回投与として、10分、20分、30分、40分、50分、60分、および/または1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、11時間、12時間、13時間、14時間、15時間、16時間、17時間、18時間、19時間、20時間、21時間、22時間、23時間、24時間、もしくはそれ以上の期間、および/または1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、もしくはそれ以上の期間にわたって継続することができる。さらに投与は、製剤化および/または投与様式によって実行可能な、徐放すなわち持続的な放出機序とすることが可能である。
【０１３９】
核酸送達のためのさまざまな方法が、例えば、Sambrook et al., 1989およびAusubel et al., 1994に記述されている。そのような核酸送達系は、例示であって限定ではないが「裸の」核酸として「裸の」形態でか、あるいは陽イオン性分子もしくはリポソーム形成性脂質との複合体中などの送達に適した媒体中に、またはベクターの成分もしくは薬学的組成物の成分として製剤化されているかのどちらかで、所望の核酸を含む。核酸送達系は、これと細胞とを接触させることによってなど直接的に、または任意の生物学的過程の作用を通じてなど間接的に、細胞に供与することができる。例示であって限定ではないが、核酸送達系は、飲食作用により、受容体標的化により、天然または合成の細胞膜断片との結合により、電気穿孔などの物理的手段により、核酸送達系を高分子担体、例えば制御放出フィルムあるいはナノ粒子もしくはマイクロ粒子または生体適合性分子もしくは生分解性分子と、ベクターと、組み合わせることにより、細胞に供与することができる。核酸送達系は、細胞周辺の体液または組織に注射されてもよく、あるいは細胞膜を越えての核酸送達系の拡散により、または細胞膜を越えての任意の能動もしくは受動輸送機構により投与されてもよい。さらに、核酸送達系は、ウイルスベクターの、抗体を介した固定化および抗体に関連した標的化などの技術を用いて細胞に供与することもできる。
【０１４０】
C．併用治療
ある態様では、本発明の組成物および方法は、miRNA、またはmiRNAをコードする発現コンストラクトを含む。このようなmiRNA組成物は、miRNA治療の効果を高めるために、または使用される別の治療の治療効果を高めるために、第2の治療と組み合わせて使用することができる。これらの組成物は、がん細胞の死滅、および/または細胞の過剰増殖の阻害などの所望の効果を達成するのに有効な組み合わされた量で提供される場合がある。この過程には、細胞に、miRNAをまたは第2の治療を同時もしくは異なる時間に接触させる段階を含めることができる。これは、1種類または複数種類の薬剤を含む1種類もしくは複数種類の組成物もしくは薬理学的製剤を細胞に接触させることによって、または2種類もしくはそれ以上の異なる組成物もしくは製剤を細胞に接触させることによって達成できる（1種類の組成物は、（1）miRNA；および/または（2）第2の治療を提供する）。第2の組成物、または、化学療法、放射線療法、外科的治療、免疫療法、もしくは遺伝子治療を含む方法を投与することができる。
【０１４１】
患者にmiRNA治療および第2の治療を、相互に約12〜24時間以内に、およびより好ましくは相互に約6〜12時間以内に提供可能であることが企図される。しかしながら、状況によっては、治療の期間を有意に延長することが望ましい場合があり、個々の投与間に数日（2日、3日、4日、5日、6日、または7日）〜数週間（1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間、または8週間）が設けられる。
【０１４２】
ある態様では、一連の治療は、
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日またはそれ以上にわたって続けられる。1種類の薬剤が、
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日目またはこれらの任意の組み合わせで投与され、かつ別の薬剤が、
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日目またはこれらの任意の組み合わせで投与されることが企図される。患者には1日（24時間）以内に、1回または複数回の薬剤投与が実施される場合がある。さらに、一連の治療の後に、治療が行われない期間が設けられることが企図される。この期間は、予後、体力、健康などの患者の条件に依存して、1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、および/または1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、および/または1か月間、2か月間、3か月間、4か月間、5か月間、6か月間、7か月間、8か月間、9か月間、10か月間、11か月間、12か月間、もしくはそれ以上にわたって続けられる。
【０１４３】
例えばmiRNA治療を「A」とし、また第2の治療を「B」として、さまざまな組み合わせを使用することが可能である。
2010529966.tif 000119
【０１４４】
患者に対する本発明の任意の化合物または治療の投与は、ベクターもしくは任意のタンパク質、または他の薬剤の毒性（もしあれば）を考慮して、そのような化合物の投与に関する一般的なプロトコルに従う。したがって、いくつかの態様では、併用治療に帰せられる毒性をモニタリングする段階が設けられる。治療のサイクルは、必要であれば繰り返されることが予想される。さまざまな標準的な治療、ならびに外科的介入が、記載の治療と組み合わせて実施され得ることも企図される。
【０１４５】
特定の局面では、化学療法、放射線療法、免疫療法、外科的治療、または他の遺伝子治療などの第2の治療は、本明細書に記載されているように、miRNA治療と組み合わせて用いられることが企図される。
【０１４６】
1．化学療法
本発明では、極めて多様な化学療法剤を使用することができる。「化学療法」という語句は、がんを治療するための薬剤の使用を意味する。「化学療法剤」は、がんの治療で投与される化合物または組成物を意味するように用いられる。そのような薬剤または薬物は、細胞内におけるそれらの活性様式、例えば、細胞周期に影響を与えるか否か、およびどの段階で影響を与えるかによって分類される。あるいは薬剤は、DNAを直接的に架橋する能力、DNA中にインターカレートする能力、または核酸合成に影響を及ぼすことで染色体および有糸分裂異常を引き起こす能力に基づいて、特徴づけられ得る。大半の化学療法剤は、以下のカテゴリーに分類される：アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍性抗生物質、有糸分裂阻害剤、およびニトロソ尿素。
【０１４７】
a．アルキル化剤
アルキル化剤は、ゲノムDNAと直接的に相互作用してがん細胞の増殖を妨げる薬剤である。このカテゴリーの化学療法剤は、細胞周期の全ての相に影響を及ぼす、すなわち相に特異的でない薬剤である。アルキル化剤は、慢性白血病、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、多発性骨髄腫、ならびに乳房、肺、および卵巣の特定のがんの治療に使用することができる。アルキル化剤は、以下を含む：ブスルファン、クロランブシル、シスプラチン、シクロホスファミド（シトキサン）、ダカルバジン、イホスファミド、メクロレタミン（mustargen）、およびメルファラン。トログリタゾンは、任意の1種類もしくは複数種類の上記のアルキル化剤と組み合わせてがんの治療に使用することができる。
【０１４８】
b．代謝拮抗剤
代謝拮抗剤は、DNAおよびRNAの合成を破壊する。アルキル化剤とは異なり、代謝拮抗剤は、細胞周期のS期に特異的に影響を及ぼす。代謝拮抗剤は、乳房、卵巣、および消化管の腫瘍に加えて、慢性白血病の治療に使用されている。代謝拮抗剤は、5-フルオロウラシル（5-FU）、シタラビン（Ara-C）、フルダラビン、ゲムシタビン、およびメトトレキセートを含む。
【０１４９】
5-フルオロウラシル（5-FU）は、5-フルオロ-2,4（1H,3H）-ピリミジンジオンという化学名を有する。その作用機序は、デオキシウリジル酸からチミジル酸へのメチル化反応のブロックによると考えられている。したがって5-FUは、デオキシリボ核酸（DNA）の合成に干渉し、かつ、程度は低いものの、リボ核酸（RNA）の形成を阻害する。DNAおよびRNAは、細胞の分裂および増殖に不可欠なので、5-FUの作用は、細胞死を引き起こすチミジン不足を生じることであると考えられている。したがって5-FUの作用は、転移性がんの特徴である速やかに分裂する細胞に見出される。
【０１５０】
c．抗腫瘍性抗生物質
抗腫瘍性抗生物質は、抗菌活性と細胞障害性活性の両方を有する。この薬剤も、酵素および有糸分裂を化学的に阻害したり、細胞膜を変化させたりすることでDNAに干渉する。抗腫瘍性抗生物質は、相に特異的ではなく、細胞周期の全ての相で作用する。したがって抗腫瘍性抗生物質は、さまざまながんに対して広く使用されている。抗腫瘍性抗生物質の例は、一部については以下に詳述する、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、およびイダルビシンを含む。新生物の治療に臨床で広く使用されているこれらの化合物は、アドリアマイシンの場合は25〜75 mg/m2用量で21日の間隔を設けてボーラス注入で静脈内に投与され、エトポシドの場合は静脈内にまたは経口で35〜100 mg/m2の用量で投与される。
【０１５１】
d．有糸分裂阻害剤
有糸分裂阻害剤は、植物アルカロイド、および細胞分裂または有糸分裂のいずれかに必要なタンパク質合成を阻害可能な他の天然薬剤を含む。有糸分裂阻害剤は、細胞周期の特定の相で作用する。有糸分裂阻害剤は、ドセタキセル、エトポシド（VP16）、パクリタキセル、タキソール、タキソテール、ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビノレルビンを含む。
【０１５２】
e．ニトロソ尿素
ニトロソ尿素は、アルキル化剤と同様に、DNA修復タンパク質を阻害する。ニトロソ尿素は、脳腫瘍に加えて、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、悪性黒色腫の治療に使用されている。例には、カルムスチンおよびロムスチンなどがある。
【０１５３】
2．放射線療法
放射線治療（radiation therapy）とも呼ばれる放射線療法（radiotherapy）は、電離放射線によるがんおよび他の疾患の治療である。電離放射線は、細胞の遺伝物質を損なうことで、細胞が成長を続けることを不可能にすることによって、治療対象領域中の細胞を損なうか、または破壊するエネルギーを蓄積する。放射線はがん細胞と正常細胞の両方を損なうが、後者は自らを修復して適切に機能することが可能である。放射線療法は、皮膚、舌、喉頭、脳、乳房、または子宮頚部のがんなどの局所的な固形腫瘍の治療に使用することができる。放射線療法は、白血病やリンパ腫（それぞれ造血細胞およびリンパ系のがん）の治療に使用することもできる。
【０１５４】
本発明で使用される放射線療法は、γ線、X線の使用、および/または放射性同位元素の腫瘍細胞への直接送達を含む場合があるが、これらに限定されない。マイクロ波、陽子ビーム照射（米国特許第5,760,395号および同第4,870,287号）、ならびにUV照射などの他の形状のDNA損傷因子も企図される。これらの因子は全て、DNAに、DNA前駆体上の広範囲の損傷に、DNAの複製および修復に、ならびに染色体の集合および維持に影響する可能性が極めて高い。X線の線量範囲は、長期間（3〜4週間）に及ぶ50〜200レントゲンの1日線量から、2000〜6000レントゲンの単回照射まで幅がある。放射性同位元素の線量範囲は幅が極めて広く、同位体の半減期、放出される放射線の強度およびタイプ、ならびに腫瘍細胞による取り込みに依存する。放射線療法は、放射線の線量をがん部位に直接送達するために、放射標識抗体の使用を含む場合がある（放射免疫療法）。体内に注射された抗体はがん細胞を活発に捜し出し、がん細胞は、放射線の細胞死滅（細胞障害性）作用によって破壊される。この方法は、健康な細胞に対する放射線による損傷のリスクを最小限に抑えることができる。
【０１５５】
脳腫瘍および他の腫瘍に対する定位的放射線手術（ガンマナイフ）は、メスを使用しないが、極めて正確にガンマ放射線療法のビームを数百の異なる角度からあてる。放射線療法の1回のセッションには4〜5時間を要する。この治療法では、特注の金属の枠が頭部に装着される。次に、処置が必要とされる正確な領域を見つけるために、複数のスキャンおよびX線が実施される。脳腫瘍の放射線療法では、患者は、放射線療法のビームが通過する数百個の穴の開いた大きなヘルメットを頭部に装着する。関連する方法によって、身体の他の部位における腫瘍の治療のための位置づけが可能となる。
【０１５６】
3．免疫療法
がんの治療に関しては、免疫療法剤は一般に、がん細胞を標的として破壊する免疫エフェクター細胞およびエフェクター分子の使用に拠る。その一例がトラスツズマブ（Herceptin（商標））である。免疫エフェクターは例えば、腫瘍細胞の表面上の複数のマーカーに特異的な抗体である場合がある。抗体は、単独で治療のエフェクターとして機能する場合があり、または他の細胞を動員して細胞を死滅に導く場合もある。抗体を薬剤またはトキシン（化学療法剤、放射線核種、リシンA鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）に結合させることで、単純に標的用薬剤とすることもできる。あるいはエフェクターは、腫瘍細胞標的と直接的または間接的に相互作用する表面分子を有するリンパ球である場合がある。さまざまなエフェクター細胞は、細胞傷害性T細胞やNK細胞を含む。治療様式、すなわち直接的な細胞障害活性とErbB2の阻害または低下との組み合わせは、ErbB2を過剰発現するがんの治療に治療的利益をもたらす可能性がある。
【０１５７】
免疫療法の1つの局面では、腫瘍細胞または疾患細胞は、標的化を可能とする、すなわち他の大半の細胞には存在しない、いくつかのマーカーを有していなければならない。多くの腫瘍マーカーが存在し、かつその任意のマーカーが、本発明における標的化に適している可能性がある。一般的な腫瘍マーカーは、がん胎児性抗原、前立腺特異的抗原、泌尿器腫瘍関連抗原、胎児抗原、チロシナーゼ（p97）、gp68、TAG-72、HMFG、シアリルルイス（Sialyl Lewis）抗原、MucA、MucB、PLAP、エストロゲン受容体、ラミニン受容体、erbB、およびp155を含む。免疫療法の別の局面は、抗がん作用を免疫刺激作用と組み合わせることである。以下を含む免疫刺激分子も存在する：IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、γ-IFNなどのサイトカイン、MIP-1、MCP-1、IL-8などのケモカイン、およびFLT3リガンドなどの成長因子。免疫刺激分子をタンパク質の状態で使用するか、またはMDA-7などの腫瘍抑制因子を併用した遺伝子送達を使用することで抗腫瘍作用が高まることがわかっている（Ju et al., 2000）。さらに、これらの任意の化合物に対する抗体を、本明細書に記載する抗がん剤の標的化に使用することができる。
【０１５８】
現在研究中か、または使用されている免疫療法剤の例は、免疫アジュバント、例えばウシ型結核菌（Mycobacterium bovis）、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、ジニトロクロロベンゼン、および芳香族化合物（米国特許第5,801,005号および同第5,739,169号；Hui and Hashimoto, 1998；Christodoulides et al., 1998）、サイトカイン治療薬、例えばインターフェロンα、インターフェロンβ、およびインターフェロンγ；IL-1、GM-CSF、およびTNF（Bukowski et al., 1998；Davidson et al., 1998；Hellstrand et al., 1998）による遺伝子治療、例えばTNF、IL-1、IL-2、p53（Qin et al., 1998；Austin-Ward and Villaseca, 1998；米国特許第5,830,880号および同第5,846,945号）、ならびにモノクローナル抗体、例えば抗ガングリオシドGM2、抗HER-2、抗p185（Pietras et al., 1998；Hanibuchi et al., 1998；米国特許第5,824,311号）である。ハーセプチン（Herceptin）（トラスツズマブ）は、HER2-neu受容体をブロックするキメラ（マウス-ヒト）のモノクローナル抗体である。ハーセプチンは、抗腫瘍活性を有し、悪性腫瘍の治療における使用に認可されている（Dillman, 1999）。表6は、複数の既知の抗がん性免疫療法剤とその標的の非制限的なリストである。これらの1つもしくは複数の治療において、本明細書に記載するmiRNA治療が使用可能であることが企図される。
【０１５９】
がんの受動免疫療法のための多種多様な方法がある。それらは、以下のように広く分類可能である：抗体のみの注射；トキシンまたは化学療法剤に結合させた抗体の注射；放射性同位体に結合させた抗体の注射；抗イディオタイプ抗体の注射；および骨髄中の腫瘍細胞の一掃。
【０１６０】
（表６）がん免疫治療薬およびその標的
2010529966.tif 000120
【０１６１】
4．遺伝子治療
さらに別の態様では、併用療法は、1種類もしくは複数種類の治療的miRNAの投与前に、投与後に、または投与と同時に治療的ポリヌクレオチドが投与される遺伝子治療を含む。miRNAとの治療的ポリペプチドまたはコード核酸の送達は、標的組織に対する複合的な治療効果を有する場合がある。さまざまなタンパク質が本発明に含まれ、その一部について以下に説明する。本発明との組み合わせにおけるいくつかの形状の遺伝子治療用に標的化可能なさまざまな遺伝子は、細胞増殖の誘導因子、細胞増殖の阻害因子、プログラム細胞死の調節因子、サイトカインおよび他の治療的核酸、または治療的タンパク質をコードする核酸を含むが、これらに限定されない。
【０１６２】
腫瘍抑制性のがん遺伝子は、過剰な細胞増殖を阻害するように機能する。このような遺伝子の不活性化は、その阻害活性の破壊によって無制限の増殖につながる。腫瘍抑制因子（例えば治療的ポリペプチド）であるp53、FHIT、p16、およびC-CAMを使用することができる。
【０１６３】
p53に加えて、細胞増殖の別の阻害因子がp16である。真核生物の細胞周期の主要な移行は、サイクリン依存性キナーゼすなわちCDKによって引き起こされる。CDKの1つであるサイクリン依存性キナーゼ4（CDK4）は、G1への進行を調節する。同酵素の活性はRbをG1後期でリン酸化する場合がある。CDK4の活性は、活性化サブユニットであるD型サイクリンによって制御されており、かつ阻害性サブユニットによって、p16INK4は、CDK4に特異的に結合して阻害し、それによりRbのリン酸化を調節する可能性のあるタンパク質として、生化学的に特徴づけられている（Serrano et al., 1993；Serrano et al., 1995）。p16INK4タンパク質はCDK4阻害因子なので（Serrano, 1993）、この遺伝子の欠失は、CDK4の活性を高めてRbタンパク質の高リン酸化を導く可能性がある。p16はまた、CDK6の機能を調節することも知られている。
【０１６４】
p16INK4は、p16B、p19、p21WAF1、およびp27KIP1も含むCDK阻害性タンパク質の新たに明らかにされたクラスに属する。p16INK4遺伝子は、いくつかの腫瘍タイプで高頻度で欠失している染色体領域9p21にマッピングされる。p16INK4遺伝子のホモ接合性の欠失および変異は、ヒトの腫瘍細胞系で高頻度で認められる。この証拠は、p16INK4遺伝子が腫瘍抑制遺伝子であることを示唆する。しかしながら、この解釈は、p16INK4遺伝子の変化の頻度が、初代の非培養腫瘍では培養細胞系よりかなり低いという観察によって疑問視されている（Caldas et al., 1994；Cheng et al., 1994；Hussussian et al., 1994；Kamb et al., 1994；Mori et al., 1994；Okamoto et al., 1994；Nobori et al., 1995；Orlow et al., 1994；Arap et al., 1995）。プラスミド発現ベクターのトランスフェクションによる野生型p16INK4の機能の回復は、いくつかのヒトがん細胞系によるコロニー形成を減少させる（Okamoto, 1994；Arap, 1995）。
【０１６５】
本発明で使用可能な他の遺伝子は、Rb、APC、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-II、zac1、p73、VHL、MMAC1/PTEN、DBCCR-1、FCC、rsk-3、p27、p27/p16融合体、p21/p27融合体、抗血栓遺伝子（例えばCOX-1、TFPI）、PGS、Dp、E2F、ras、myc、neu、raf、erb、fms、trk、ret、gsp、hst、abl、E1A、p300、血管形成に関与する遺伝子（例えばVEGF、FGF、トロンボスポンジン、BAI-1、GDAIF、またはこれらの受容体）、およびMCCを含む。
【０１６６】
5．手術
がん患者の約60%が、予防的、診断的、または病期分類的、治癒的、および対症的な手術を含む、何らかの手術を受けることになる。治癒手術は、本発明の治療、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子治療、免疫療法および/または代替療法などの他の治療とともに使用可能ながん治療である。
【０１６７】
治癒手術は、がん性組織の全体もしくは一部が物理的に除去される、切除される、および/または破壊される切除を含む。腫瘍の切除は、腫瘍の少なくとも一部の物理的な除去を意味する。腫瘍の切除に加えて、手術による治療は、レーザー手術、冷凍外科療法、電気手術、および顕微鏡下手術（モース手術）を含む。さらに本発明は、表在がん、前がん、または偶発的な量の正常組織の除去とともに使用可能であることも企図される。
【０１６８】
がんの細胞、組織、または腫瘍の一部もしくは全体が切除されると、体内に空隙が形成される場合がある。治療は、追加的な抗がん治療剤による患部への潅流、直接注射、または局所投与によって達成する場合がある。このような治療は例えば、1日毎、2日毎、3日毎、4日毎、5日毎、6日毎、もしくは7日毎に、または1週毎、2週毎、3週毎、4週毎、もしくは5週毎に、または1か月毎、2か月毎、3か月毎、4か月毎、5か月毎、6か月毎、7か月毎、8か月毎、9か月毎、10か月毎、11か月毎、もしくは12か月毎に繰り返すことができる。これらの治療では、投与量も異なる場合がある。
【０１６９】
6．他の薬剤
治療の治療効果を改善するために、他の薬剤を本発明と組み合わせて使用可能であることが企図される。このような追加的な薬剤は、免疫調節剤、細胞表面受容体およびギャップ結合の上方制御に影響する薬剤、細胞増殖抑制剤および分化誘導剤、細胞接着の阻害剤、アポトーシス誘導因子に対する過剰増殖性細胞の感受性を高める薬剤、または他の生物学的薬剤を含む。免疫調節剤は、腫瘍壊死因子；インターフェロンα、インターフェロンβ、およびインターフェロンγ；IL-2および他のサイトカイン；F42Kおよび他のサイトカイン類似体；またはMIP-1、MIP-1beta、MCP-1、RANTES、および他のケモカインを含む。さらに、細胞表面受容体、またはFas/Fasリガンド、DR4もしくはDR5/TRAIL（Apo-2リガンド）などのそのリガンドの上方制御は、過剰増殖性細胞に対する自己分泌作用または傍分泌作用の確立によって本発明のアポトーシス誘導能を強化する可能性があることが企図される。ギャップ結合数の増加による細胞間シグナル伝達の亢進は、近傍の過剰増殖性細胞集団に対する抗過剰増殖性作用を高める可能性がある。他の態様では、治療の抗過剰増殖性の有効性を改善するために、細胞増殖抑制剤または分化誘導剤を本発明と組み合わせて使用することができる。細胞接着の阻害剤は、本発明の有効性を改善することが企図される。細胞接着阻害剤の例は、焦点接着キナーゼ（FAK）阻害剤およびロバスタチンである。さらに、治療の有効性を改善するために、抗体c225などの、アポトーシスに対する過剰増殖性細胞の感受性を高める他の薬剤が本発明と組み合わせて使用可能であることが企図される。
【０１７０】
Apo2リガンド（Apo2L、TRAILとも呼ばれる）は、腫瘍壊死因子（TNF）サイトカインファミリーのメンバーである。TRAILは、多種多様ながん細胞の速やかなアポトーシスを活性化するが、正常細胞には毒性を示さない。TRAILのmRNAは、さまざまな組織に存在する。大半の正常細胞は、TRAILの細胞障害作用に耐性を示すと考えられることから、TRAILによるアポトーシスの誘導を防ぐことが可能な機序が存在することが示唆される。デス（death）受容体4（DR4）と呼ばれる、TRAILに関して最初に報告された受容体は、細胞質の「デスドメイン」を含み；DR4は、TRAILが運ぶアポトーシスシグナルを伝達する。TRAILに結合する他の受容体が同定されている。DR5と呼ばれる1つの受容体は、細胞質のデスドメインを含み、かつDR4と同じようにアポトーシスのシグナルを伝達する。DR4およびDR5のmRNAは、多くの正常組織および腫瘍細胞系で発現されている。最近、TRAILによるDR4やDR5を介したアポトーシスの誘導を妨げるDcR1やDcR2などのデコイ受容体が同定されている。したがって、これらのデコイ受容体は、細胞の表面におけるアポトーシス誘導性サイトカインに直接的に対する感受性を調節する新たな機序となる。正常組織におけるこれらの阻害性受容体の優先的な発現は、TRAILが正常細胞を損なわずにがん細胞のアポトーシスを誘導する抗がん剤として有用である可能性があることを示唆している（Marsters et al., 1999）。
【０１７１】
細胞障害性の化学療法剤の導入によるがんの治療の進展は著しい。しかしながら、化学療法の結果の1つには、薬剤耐性の表現型の発生/獲得、および多剤耐性の発生がある。薬剤耐性の発生は、このような腫瘍の治療において依然として大きな問題であり、このため遺伝子治療などの代替的な方法が明らかに必要とされている。
【０１７２】
化学療法、放射線療法、または生物学的療法とともに使用される別の形式の治療は、患者の組織を高温（最高106゜F）に曝す手順である温熱療法を含む。局所的な温熱療法、局部的な温熱療法、または全身の温熱療法の適用には、外部または内部から加温する装置を含めることができる。局所的な温熱療法では、腫瘍などの小さな領域に熱を加える。熱は、体外の装置から発せられる、腫瘍を標的とする高周波によって、体外で発生させることができる。内部の熱は、温水で満たされた加熱された細いワイヤーもしくは中空チューブ、埋め込み型のマイクロ波アンテナ、または高周波電極を含む滅菌済み探索子を含む場合がある。
【０１７３】
局部的な治療では、患者の臓器または四肢が加熱され、これは磁石などの、高エネルギーを発生する装置を使用して達成される。あるいは、患者の血液の一部を除去して加熱後に、内部加熱される領域中に潅流することができる。がんが全身に拡がっている場合は、全身加熱を実施することもできる。この目的で、温水ブランケット、ホットワックス（hot wax）、誘導コイル、および温熱チャンバ（thermal chamber）を使用することができる。
【０１７４】
本発明とともに、または前述した他の任意のがん治療と組み合わせて、ホルモン療法を使用することもできる。テストステロンもしくはエストロゲンなどの特定のホルモンの作用のレベルを低下させるか、またはブロックするために、乳房、前立腺、卵巣、または子宮頚部のがんなどの特定のがんの治療にホルモンを使用することができる。この治療はしばしば、治療オプションとして、または転移のリスクを低減させるために、少なくとも1つの他のがん治療と組み合わせて使用される。
【０１７５】
本出願は、全体が参照により本明細書に組み入れられる、2005年2月8日に出願された米国特許仮出願第60/650,807号に対する優先権を主張する、2006年2月8日に出願された米国特許出願第11/349,727号を組み入れる。
【０１７６】
III．miRNA分子
マイクロRNA分子（「miRNA」）は一般に、21〜22ヌクレオチドの長さであるが、19ヌクレオチド、および最長23ヌクレオチドの長さのものが報告されている。miRNAはそれぞれ、より長い前駆体RNA分子（「前駆体miRNA」）からプロセシングを受ける。前駆体miRNAは、非タンパク質コード遺伝子から転写される。前駆体miRNAは、動物ではダイサーと呼ばれるリボヌクレアーゼIII様ヌクレアーゼ酵素によって切断されるステム-ループ様または折りたたみ様の構造の形成を可能とする2つの相補的領域を有する。プロセシングを受けたmiRNAは典型的にはステムの一部である。
【０１７７】
プロセシングを受けたmiRNA（「成熟miRNA」とも呼ばれる）は、特定の標的遺伝子またはその遺伝子産物を下方制御する大きな複合体の一部となる。動物のmiRNAの例は、標的と不完全に塩基対合して翻訳を停止させるmiRNAを含む（Olsen et al., 1999；Seggerson et al., 2002）。siRNA分子もダイサーによってプロセシングを受けるが、長い2本鎖RNA分子を形成する。siRNAは天然では動物細胞中に認められないが、RNA誘導サイレンシング複合体（RISC）を介して、mRNA標的の配列特異的な切断を誘導可能である（Denli et al., 2003）。
【０１７８】
A．アレイの作製
本発明のある態様は、複数の核酸、mRNAもしくはmiRNA分子、前駆体miRNA分子、またはmiR-34のmiRNAによって調節されるさまざまな遺伝子および遺伝子経路に由来する核酸に対して、（プローブ全体に対して）完全に、またはほぼ相補的であるか、または（プローブ全体に対して）同一な核酸分子（プローブ）のマクロアレイもしくはマイクロアレイであり、かつ支持体上もしくは支持体材料上に空間的に分離した配置で位置する、mRNAアレイもしくは核酸アレイ、miRNAアレイもしくは核酸アレイ、および/またはmiRNAアレイもしくは核酸プローブアレイの作製および使用に関する。マクロアレイは典型的には、表面にプローブがスポットされたニトロセルロースまたはナイロンのシートである。マイクロアレイは、核酸プローブを、最大10,000個の核酸分子が、典型的には1〜4 cm2の領域中に収まるように、より密に配置させる。マイクロアレイは、核酸分子、例えば遺伝子、オリゴヌクレオチドなどを基質上にスポットするか、または基質上にオリゴヌクレオチド配列をインサイチューで作ることで作製することができる。スポットされたか、または作られた核酸分子は、1 cm2あたり最大約30個か、もしくはそれ以上の非同一な核酸分子、例えば1 cm2あたり最大約100個もしくはさらには1000個の高密度マトリックスパターンで適用することができる。マイクロアレイは典型的には、フィルターアレイの場合のニトロセルロースベースの材料とは対照的に、固体支持体としてコーティングされたガラスを使用する。マーカーRNAおよび/またはmiRNAに相補的な核酸試料を整然と並んだアレイとすることで、各試料の位置を追跡したり、当初の試料に関連づけたりすることができる。
【０１７９】
複数の異なる核酸プローブが固体支持体の表面に安定的に結合される多種多様なアレイ装置が、当業者に既知である。アレイに有用な基質は、ナイロン、ガラス、金属、プラスチック、ラテックス、およびシリコンを含む。このようなアレイは、平均プローブ長、プローブの配列またはタイプ、プローブとアレイ表面間の結合の性質（例えば共有結合か非共有結合か）などのいくつかの点が異なる。本発明の標識法およびスクリーニング法、ならびにアレイは、プローブがmiRNAもしくは遺伝子、または遺伝子を代表する核酸であることを除いて、任意のパラメータに関して、その有用性は限定されないので；方法および組成物は、多種多様なタイプの核酸アレイとともに使用することができる。
【０１８０】
マイクロアレイを作製する代表的な方法および装置は例えば、全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,143,854号；同第5,202,231号；同第5,242,974号；同第5,288,644号；同第5,324,633号；同第5,384,261号；同第5,405,783号；同第5,412,087号；同第5,424,186号；同第5,429,807号；同第5,432,049号；同第5,436,327号；同第5,445,934号；同第5,468,613号；同第5,470,710号；同第5,472,672号；同第5,492,806号；同第5,525,464号；同第5,503,980号；同第5,510,270号；同第5,525,464号；同第5,527,681号；同第5,529,756号；同第5,532,128号；同第5,545,531号；同第5,547,839号；同第5,554,501号；同第5,556,752号；同第5,561,071号；同第5,571,639号；同第5,580,726号；同第5,580,732号；同第5,593,839号；同第5,599,695号；同第5,599,672号；同第5,610,287号；同第5,624,711号；同第5,631,134号；同第5,639,603号；同第5,654,413号；同第5,658,734号；同第5,661,028号；同第5,665,547号；同第5,667,972号；同第5,695,940号；同第5,700,637号；同第5,744,305号；同第5,800,992号；同第5,807,522号；同第5,830,645号；同第5,837,196号；同第5,871,928号；同第5,847,219号；同第5,876,932号；同第5,919,626号；同第6,004,755号；同第6,087,102号；同第6,368,799号；同第6,383,749号；同第6,617,112号；同第6,638,717号；同第6,720,138号、ならびに
2010529966.tif 000121
に記載されている。
【０１８１】
アレイは、2、20、25、50、80、100種類、またはそれ以上の異なるプローブを含むような高密度のアレイとすることが企図される。アレイは、1000、16,000、65,000、250,000、または1,000,000種類、もしくはそれ以上の異なるプローブを含む場合があることが企図される。プローブは、1種類もしくは複数種類の異なる生物体または細胞タイプにおいて、mRNA標的および/またはmiRNA標的に対する場合がある。オリゴヌクレオチドプローブの長さは、いくつかの態様では5〜50、5〜45、10〜40、9〜34、または15〜40ヌクレオチドである。ある態様では、オリゴヌクレオチドプローブの長さは、それらの間にある全ての整数および範囲を含む、5、10、15、20〜20、25、30、35、40ヌクレオチドである。
【０１８２】
アレイ中の個々の異なるプローブ配列の位置および配列は、一般に既知である。さらに、多数の異なるプローブが比較的小さな面積を占め、一般に1 cm2あたり約60、100、600、1000、5,000、10,000、40,000、100,000、または400,000種類の異なるオリゴヌクレオチドプローブより大きいプローブ密度を有する高密度アレイを提供する場合がある。アレイの表面積は、約1 cm2、約1.6 cm2、約2 cm2、約3 cm2、約4 cm2、約5 cm2、約6 cm2、約7 cm2、約8 cm2、約9 cm2、もしくは約10 cm2またはそれ未満である場合がある。
【０１８３】
さらに当業者であれば、アレイを使用して得られたデータを容易に解析できると思われる。このようなプロトコルは前記で開示されており、かつ、いずれも参照により具体的に組み入れられる、
2010529966.tif 000122
に見出される情報を含む。
【０１８４】
B．試料の調製
さまざまな試料のRNAおよび/またはmiRNAは、本発明のアレイ、プローブのインデックス、またはアレイ技術を使用して解析可能であることが企図される。内在性のmiRNAは、本発明の組成物および方法による使用が企図されているが、組換えmiRNA（内在性のmiRNAもしくは前駆体miRNAに相補的かまたは同一な核酸を含む）も、本明細書に記載する手順で扱うことが可能であり、かつ解析することができる。試料は生物学的試料である場合があり、この場合、生検材料、細針吸引物（fine needle aspirate）、剥離物、血液、組織、器官、精液、唾液、涙液、他の体液、毛包、皮膚、または生物学的細胞、特にがん細胞もしくは過剰増殖性細胞を含むか、またはこれらからなる任意の試料に由来する場合がある。ある態様では、試料は、生検材料または他の体液もしくは組織からある程度精製されたかもしくは濃縮された細胞である場合があるが、これらに限定されない。あるいは、試料は生物学的試料ではなく、無細胞反応混合物（1種類もしくは複数種類の生物学的酵素を含む場合がある）などの化学的混合物である場合がある。
【０１８５】
C．ハイブリダイゼーション
アレイまたは一連のプローブを準備し、かつ/または試料中の核酸もしくはプローブを標識した後に、標的核酸の集団をアレイまたはプローブに、ハイブリダイゼーション条件で接触させる。このような条件は、必要に応じて、実施される特定のアッセイを考慮して、特異性の最適なレベルを提供するように調節可能である。適切なハイブリダイゼーション条件は当業者に周知であり、Sambrook et al.（2001）およびWO 95/21944にまとめられている。多くの態様では、ハイブリダイゼーション中のストリンジェントな条件の使用に特に関心がもたれる。ストリンジェントな条件は、当業者に既知である。
【０１８６】
1つのアレイまたは一群のプローブが複数の試料に接触され得ることが特に企図される。試料は、試料を区別するために、さまざまな標識によって標識可能である。例えば、1つのアレイに、Cy3で標識された腫瘍組織試料と、Cy5で標識された正常組織試料を接触させることができる。アレイ上における、プローブに対応する特定のmiRNAの試料間の差は、容易に確認および定量することができる。
【０１８７】
アレイは表面積が小さいので、温度調節および塩含量などの均一なハイブリダイゼーション条件が可能となる。さらに、小さな面積が高密度のアレイで占められるので、ハイブリダイゼーションは、極めて少量の液量（例えば約5 μl、10 μl、25 μl、50 μl、60 μl、70 μl、80 μl、90 μl、100 μl、または約5 μl未満、10 μl未満、25 μl未満、50 μl未満、60 μl未満、70 μl未満、80 μl未満、90 μl未満、100 μl未満、またはこれらの間の任意の範囲の容量を含む、約250 μlまたはこれ未満）で実施することができる。小さな容量では、ハイブリダイゼーションは極めて速やかに進行する可能性がある。
【０１８８】
D．差次的発現の解析
本発明のアレイを使用して、2つの試料間の差を検出することができる。特に企図される応用は、正常な試料に由来するmiRNAまたは遺伝子の発現と、正常ではない試料に由来するmiRNAまたは遺伝子の発現との差、疾患もしくは状態と、そのような疾患もしくは状態を発現しない細胞との差、または2つの異なって処理された試料間の差を同定すること、および/または定量することを含む。また、miRNAまたは遺伝子の発現を、特定の疾患もしくは状態に対して感受性があると考えられる試料と、疾患もしくは状態に対して感受性がないか、または耐性を有すると考えられる試料との間で比較することができる。正常ではない試料とは、疾患もしくは状態の表現型もしくは遺伝子型の形質を示す試料か、またはそのような疾患もしくは状態に関して正常ではないと考えられる試料である。これは、疾患または状態に関して正常な細胞と比較することができる。表現型形質は、成分が遺伝的であるか、遺伝的である可能性があるか、遺伝的でない可能性があるか、または過剰増殖性細胞もしくは新生細胞もしくは細胞群に起因する疾患もしくは状態の症状、または疾患もしくは状態に対する感受性を含む。
【０１８９】
アレイは、核酸プローブが結合した固体支持体を含む。アレイは典型的には、基質の表面の異なる既知の位置に結合した複数の異なる核酸プローブを含む。「マイクロアレイ」または集合的に「チップ」とも表現される、このようなアレイは当技術分野で、例えば、それぞれがあらゆる目的で全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,143,854号、同第5,445,934号、同第5,744,305号、同第5,677,195号、同第6,040,193号、同第5,424,186号、およびFodor et al., （1991）に概説されている。機械的な合成法を使用するこのようなアレイの合成法は例えば、あらゆる目的で参照により全体が本明細書に組み入れられる米国特許第5,384,261号に記載されている。ある局面では平面的なアレイ表面が使用されるが、アレイは、実質的に任意の形状の表面上に、または多数の表面上にさえも作ることができる。アレイは、ビーズ、ゲル、高分子の表面、光ファイバーなどのファイバー、ガラス、または他の任意の適切な基質上の核酸である場合がある。これについては、あらゆる目的で参照により全体が本明細書に組み入れられる米国特許第5,770,358号、同第5,789,162号、同第5,708,153号、同第6,040,193号、および同第5,800,992号を参照されたい。アレイは、診断または全ての包括的な装置の他の操作を可能とするように組み立てることが可能である。これについては例えば、あらゆる目的で参照により全体が本明細書に組み入れられる米国特許第5,856,174号および同第5,922,591号を参照されたい。また、アレイ、その製造、およびその特徴に関する追加情報に関しては、あらゆる目的で参照により全体が本明細書に組み入れられる、2000年4月7日に出願された米国特許出願第09/545,207号も参照されたい。
【０１９０】
特に、アレイを使用して、試料をがんや関連する状態などの病理学的状態に関して評価することができる。本発明を使用して、良性、がん性、および転移性の組織間もしくは腫瘍間の差などの、疾患の病期間または下位分類間の差を評価可能であることが特に企図される。
【０１９１】
評価対象となる表現型形質は、寿命、罹患率、推定される生存、特定の薬剤または治療に対する感受性もしくは受容性（薬剤有効性）、および薬剤毒性のリスクなどの特徴を含む。これらの表現型形質が異なる試料も、記載された組成物および方法を使用して評価される場合がある。
【０１９２】
ある態様では、miRNAおよび/または発現プロファイルが作出されて、これらのプロファイルを評価し、かつ薬物動態または治療と相関させることができる。例えば、このようなプロファイルを作成して、発現が患者の治療転帰と相関するmiRNAもしくは遺伝子が存在するか否かを判定するために、患者が治療を受ける前か、または治療中に、患者の腫瘍および血液試料を評価することができる。差次的なmiRNAまたは遺伝子の同定は、どの薬剤レジメンを患者に提供すべきかを判定するために、腫瘍試料および/または血液試料を評価する診断アッセイにつながる可能性がある。加えて、これを使用して、特定の臨床試験に適した患者を同定または選択することができる。仮に発現プロファイルが、薬剤の有効性または薬剤の毒性と相関すると判定されれば、そのようなプロファイルは、患者が、薬剤の投与を受けるのに適しているか否か、薬剤の併用を受けるのに適しているか否か、または特定の投与量の薬剤の投与に適しているか否かの判断に関連する。
【０１９３】
上記の予後判定アッセイに加えて、さまざまな疾患を有する患者由来の試料を評価して、異なる疾患が、miRNAおよび/または関連遺伝子の発現レベルに基づいて同定可能か否かを判定することができる。診断アッセイは、医師が、疾患を有する個人か、または疾患を発症するリスクを有する個人の同定に使用可能なプロファイルに基づいて設計することができる。あるいは治療を、miRNAのプロファイリングに基づいて設計することができる。このような方法および組成物の例は、参照により全体が本明細書に組み入れられる、David Brown、Lance Ford、Angie ChengおよびRich Jarvisの名において2005年5月23日に出願された「Methods and Compositions Involving miRNA and miRNA Inhibitor Molecules」と題する米国特許仮出願に記載されている。
【０１９４】
E．その他のアッセイ
アレイおよびマイクロアレイの使用に加えて、いくつかの異なるアッセイで、miRNAまたは関連遺伝子、それらの活性、およびそれらの作用を解析可能であることが企図される。このようなアッセイは、核酸増幅、ポリメラーゼ連鎖反応、定量的PCR、RT-PCR、インサイチューハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション保護アッセイ（HPA）（GenProbe）、分岐DNA（bDNA）アッセイ（Chiron）、ローリングサークル増幅（RCA）、単分子ハイブリダイゼーション検出（US Genomics）、インベーダー（Invader）アッセイ（ThirdWave Technologies）、および/またはBridge Litigationアッセイ（Genaco）を含むが、これらに限定されない。
【０１９５】
IV．核酸
本発明は、標識可能な、アレイ解析に使用可能な、または特にがんなどの病理学的状態に関連する診断、治療、もしくは予後判定の応用に使用可能な核酸、修飾または模倣核酸、miRNA、mRNA、遺伝子、およびこれらの代表的な断片に関する。このような分子は、細胞内で内因的に産生させることが可能である、または化学的もしくは組換え的に合成または作製することができる。このような分子は、単離および/または精製することができる。本明細書に記載する個々のmiRNAは、これらのmiRNA配列に対応するSEQ ID NOおよびアクセッション番号を含む。miRNAの名称はしばしば省略され、「hsa-」という接頭辞をつけずに呼ばれ、かつ文脈に応じて理解される。特に明記した部分を除いて、本出願中で言及されるmiRNAは、miR-Xまたはlet-Xと記載されるヒト配列である（Xは数字および/または文字）。
【０１９６】
ある局面では、「5P」または「3P」の接尾辞によって指定されるmiRNAプローブを使用することができる。「5P」は、成熟miRNAが前駆体の5'末端に由来することを意味し、および対応する「3P」は、前駆体の3'末端に由来することを意味する（www.sanger.ac.ukに記載）。さらに、いくつかの態様では、既知のヒトmiRNAに対応しないmiRNAプローブが使用される。このような非ヒトmiRNAプローブは本発明の態様で使用可能であること、または非ヒトmiRNAに相同なヒトmiRNAが存在する可能性があることが企図される。他の態様では、任意の哺乳類細胞、生物学的試料、またはこれらの調製物を使用することができる。
【０１９７】
本発明のいくつかの態様では、miRNAを含む方法および組成物は、miRNA、マーカー（mRNA）、および/または他の核酸に関する場合がある。核酸は、以下の、少なくとも以下の、もしくは最大で以下の長さ、またはこれらの間の任意の範囲の長さであってよい。
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ヌクレオチド。このような長さは、プロセシングを受けたmiRNA、miRNAプローブ、前駆体miRNA、miRNAを含むベクター、mRNA、mRNAプローブ、対照核酸、ならびに他のプローブおよびプライマーの長さを包含する。
【０１９８】
多くの態様では、プロセシングを受けたmiRNA、および追加された任意の隣接領域の長さに依存して、miRNAの長さは19〜24ヌクレオチドであり、miRNAプローブの長さは19〜35ヌクレオチドである。miRNA前駆体は一般に、ヒトでは62〜110ヌクレオチドである。
【０１９９】
本発明の核酸は、別の核酸と同一または相補的な領域を有する場合がある。相補性または同一性を有する領域は、少なくとも5個の連続した残基である場合があることが企図されるが、領域は、以下の、少なくとも以下の、もしくは最大で以下の長さであることが特に企図される：
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の連続ヌクレオチド。さらに、前駆体miRNAもしくは他の核酸内における相補性の長さ、またはmiRNAプローブとmiRNAもしくはmiRNA遺伝子との間における相補性の長さが、このような長さであることも理解されたい。さらに相補性は、パーセンテージで表現される場合がある。つまり、プローブとその標的間の相補性は、プローブの全長に対して90%または90%以上である。いくつかの態様では、相補性は90%、95%、もしくは100%であるか、または少なくとも90%、95%、もしくは100%である。特に、このような長さは、本明細書に記載されたSEQ ID NOのいずれか、アクセッション番号、または本明細書に記載する他の任意の配列中に特定される核酸配列を含む任意の核酸に適用することができる。典型的には、miRNAおよびプロセシングを受けたmiRNA配列の一般に使用される名称が与えられる（その同定の源は接頭辞で表される。例えばヒト配列の場合は「hsa」）。特に明記した部分を除いて、接頭辞のないmiRNAは、ヒトmiRNAを意味すると理解される。さらに、miRNAの名称中の小文字は、小文字である場合もあれば小文字でない場合もあり；例えばhsa-mir-130bはmiR-130Bとも表記可能である。「miRNAプローブ」という語句は、特定のmiRNAまたは構造的に関連するmiRNAを同定可能な核酸プローブを意味する。
【０２００】
一部の核酸は、ゲノム配列または遺伝子に由来すると理解されたい。この点に関して、「遺伝子」という語句は、任意のmiRNAまたは遺伝子に関する前駆体核酸またはmiRNAをコードするゲノム配列を意味するために簡潔さを考慮して用いられる。しかしながら、本発明の態様は、発現に関与するmiRNAのゲノム配列（プロモーターや他の調節配列など）を含む場合がある。
【０２０１】
「組換え体」という語句が使用される場合があり、これは全体として、インビトロで操作された分子か、またはこのような分子の複製産物もしくは発現産物の分子を意味する。
【０２０２】
「核酸」という語句は当技術分野で周知である。本明細書で用いる「核酸」は全体として、核酸塩基を含む（1本もしくは複数の鎖の）DNA、RNA、またはこれらの誘導体もしくは類似体の分子を意味する。核酸塩基は例えば、DNA中に存在する天然のプリン塩基もしくはピリミジン塩基（例えばアデニン「A」、グアニン「G」、チミン「T」、もしくはシトシン「C」）か、またはRNA（例えばA、G、ウラシル「U」、もしくはC）を含む。「核酸」という語句は、いずれも「核酸」という表記の亜属である「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」という語句を含む。
【０２０３】
「miRNA」という語句は全体として1本鎖分子を意味するが、特定の態様では、本発明で実行される分子は、同じ1本鎖分子の別の領域に対して、または他の核酸に対して、部分的に（鎖の全長に対して10〜50%の相補性）、実質的に（鎖の全長に対して50%以上100%未満の相補性）、または完全に相補的な領域または追加的な鎖も含む。したがって、本発明の核酸は、1本もしくは複数の相補的な鎖または自己相補的な鎖、すなわち特定の配列の「相補物」を含む分子を包含してもよい。例えば前駆体miRNAは、最大で100%の相補性を有する自己相補的な領域を有する場合がある。本発明のmiRNAプローブまたは核酸は、標的に対して少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%相補的な配列を含む場合があるか、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%相補的な配列であるか、または少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%相補的な配列である。
【０２０４】
本発明の「合成核酸」は、核酸が、天然の核酸の化学的な構造または配列の全体もしくは一部を有さないことを意味すると理解されたい。したがって、「合成miRNA」という語句は、細胞内で、または天然のmiRNAと同様の生理学的状態で機能する「合成核酸」を意味すると理解されると考えられる。
【０２０５】
本発明の態様は、合成miRNAまたは合成核酸を含む場合があるが、本発明のいくつかの態様では、核酸分子は「合成」である必要はない。ある態様では、本発明の方法および組成物で使用される非合成の核酸またはmiRNAは、天然のmRNAもしくはmiRNA前駆体、または成熟mRNAもしくはmiRNAの全体の配列および構造を有する場合がある。例えば、本発明の方法および組成物で使用される非合成miRNAは、1種類もしくは複数種類の修飾型のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を有さない場合がある。これらの態様では、非合成miRNAは、組換え的に作製される場合もあれば組換え的に作製されない場合もある。特定の態様では、本発明の方法および/または組成物における核酸は、特に合成miRNAであり、非合成miRNA（すなわち「合成」であると認定されないmiRNA）ではないが；他の態様では、本発明は特異的に非合成miRNAを含み、合成miRNAを含まない。合成miRNAの使用に関して説明された任意の態様は、非合成miRNAにあてはまる（逆も同様）。
【０２０６】
「天然の」という語句は、人による任意の介入なく生物体に見出されるものを意味し；天然の野生型または変異型の分子を意味する場合があると理解される。いくつかの態様では、合成miRNA分子は、天然のmiRNA分子の配列を有さない。他の態様では、合成miRNA分子は、天然のmiRNA分子の配列を有する場合があるが、合成miRNA分子の化学的構造（非配列化学的構造）は、特に、正確な配列と特異的に関係しない部分において、そのような配列を有する天然のmiRNA分子の化学的構造とは異なる。場合によっては、合成miRNAは、天然のmiRNA中には見出されない配列および非配列の化学的構造の両方を有する。さらに合成分子の配列は、どのmiRNAが有効に提供されるか、または阻害されるかを明らかにし；内在性のmiRNAは、「対応するmiRNA」と呼ばれる。本発明で使用可能な、対応するmiRNA配列は、本明細書に記載したSEQ ID、ならびに他の任意のmiRNA配列、miRNA前駆体配列、またはこれらに相補的な任意の配列中の配列の全体もしくは一部を含むが、これらに限定されない。いくつかの態様では、この配列は、この配列とともに使用可能な特定のmiRNA（もしくは複数のmiRNAのセット）を標的とする本明細書に記載する配列の、全体もしくは一部であるか、または全体もしくは一部に由来するか、または全体もしくは一部を含む。
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のいずれかの配列または任意の数の配列またはそれらの間の任意の範囲の配列を、選択されないすべての配列を除いて選択してもよい。
【０２０７】
本明細書で用いる「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズする」、または「ハイブリダイズ可能な」という語句は、2本鎖もしくは3本鎖の分子、または部分的に2本鎖もしくは3本鎖の性質を有する分子の形成を意味すると理解されたい。本明細書で用いる「アニールする」という語句は、「ハイブリダイズする」と同義である。「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズする」、または「ハイブリダイズ可能な」という語句は、「ストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー」という語句、および「低ストリンジェンシー」または「低ストリンジェンシー条件」という語句を含む。
【０２０８】
本明細書で用いる「ストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー」は、相補的配列を含む1つもしくは複数の核酸鎖間のハイブリダイゼーション、または同核酸鎖内のハイブリダイゼーションは可能とするが、ランダムな配列ハイブリダイゼーションは除外する条件である。ストリンジェントな条件は、核酸鎖と標的鎖との間のわずかなミスマッチ（もしあれば）を許容する。このような条件は当業者で周知であり、高い選択性を必要とする応用に好ましい。非制限的な応用は、遺伝子もしくはその核酸セグメントなどの核酸の単離、または少なくとも1つの特異的なmRNA転写物もしくはその核酸セグメントなどの検出を含む。
【０２０９】
ストリンジェントな条件は、約42℃〜約70℃の温度における約0.02 M〜約0.5 MのNaClによって提供されるような、低塩および/または高温の条件を含む場合がある。望ましいストリンジェンシーの温度およびイオン強度は、部分的には、特定の核酸の長さ、標的配列の長さおよび核酸塩基の含量、核酸の電荷組成、ならびにハイブリダイゼーション混合物中のホルムアミド、テトラメチルアンモニウムクロライド、または他の溶媒の存在もしくは濃度によって決定されると理解されたい。
【０２１０】
ハイブリダイゼーションに関する、これらの範囲、組成、および条件が非制限的な例のみによって言及されること、および特定のハイブリダイゼーション反応の所望のストリンジェンシーがしばしば、1つもしくは複数の陽性または陰性の対照との比較によって実験的に決定されることも理解されたい。企図される応用に依存して、標的配列に対する核酸のさまざまな程度の選択性を達成するためには、ハイブリダイゼーションのさまざまな条件を使用することが好ましい。非制限的な例では、ストリンジェントな条件で核酸にハイブリダイズしない関連標的核酸の同定または単離は、低温および/または高イオン強度におけるハイブリダイゼーションによって達成される場合がある。このような条件は、「低ストリンジェンシー」または「低ストリンジェンシー条件」と呼ばれ、かつ低ストリンジェンシーの非制限的な例は、約20℃〜約50℃の温度範囲で約0.15 M〜約0.9 MのNaClで実施されるハイブリダイゼーションを含む。言うまでもなく、特定の応用に適したものとするために、低ストリンジェンシー条件または高ストリンジェンシー条件をさらに改変することは、当業者の能力の範囲内にある。
【０２１１】
A．核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、および修飾ヌクレオチド
本明細書で用いる「核酸塩基」は、例えば少なくとも1つの天然の核酸（すなわちDNAおよびRNA）中に見出される天然の核酸塩基（すなわちA、T、G、C、もしくはU）、ならびにこのような核酸塩基の天然または非天然の誘導体および類似体などの複素環塩基を意味する。核酸塩基は一般に、天然の核酸塩基対合と置換可能な様式で、少なくとも1種類の天然の核酸塩基と1つもしくは複数の水素結合（例えばAとT間、GとC間、およびAとU間の水素結合）を形成する（「アニールする」または「ハイブリダイズする」）ことが可能である。
【０２１２】
「プリン」核酸塩基および/または「ピリミジン」核酸塩基は、天然のプリン核酸塩基および/またはピリミジン核酸塩基を含み、かつ1つもしくは複数のアルキル部分、カルボキシアルキル部分、アミノ部分、ヒドロキシル部分、ハロゲン部分（すなわちフルオロ、クロロ、ブロモ、もしくはヨード）、チオール部分、またはアルキルチオール部分と置換されたプリンもしくはピリミジンを含むが、これらに限定されない、これらの誘導体および類似体も含む。好ましいアルキル（例えばアルキル、カルボキシアルキルなどの）部分は、約1個、約2個、約3個、約4個、約5個〜約6個の炭素原子を含む。プリンもしくはピリミジンの他の非制限的な例は、デアザプリン、2,6-ジアミノプリン、5-フルオロウラシル、キサンチン、ヒポキサンチン、8-ブロモグアニン、8-クロログアニン、ブロモチミン、8-アミノグアニン、8-ヒドロキシグアニン、8-メチルグアニン、8-チオグアニン、アザグアニン、2-アミノプリン、5-エチルシトシン、5-メチルシトシン、5-ブロモウラシル、5-エチルウラシル、5-ヨードウラシル、5-クロロウラシル、5-プロピルウラシル、チオウラシル、2-メチルアデニン、メチルチオアデニン、N,N-ジメチルアデニン、アザアデニン、8-ブロモアデニン、8-ヒドロキシアデニン、6-ヒドロキシアミノプリン、6-チオプリン、4-（6-アミノヘキシル/シトシン）などを含む。他の例は当業者に周知である。
【０２１３】
本明細書で用いる「ヌクレオシド」は、核酸塩基のリンカー部分に共有結合によって結合された核酸塩基を含む個々の化学的単位を意味する。「核酸塩基のリンカー部分」の非制限的な例は、デオキシリボース、リボース、アラビノース、または5-炭素糖の誘導体もしくは類似体を含むが、これらに限定されない5-炭素原子を含む糖（すなわち「5-炭素糖」）である。5-炭素糖の誘導体もしくは類似体の非制限的な例は、2'-フルオロ-2'-デオキシリボース、または炭素が糖環中の酸素原子と置換された炭素環糖（carbocyclic sugar）を含む。核酸塩基のリンカー部分に対する核酸塩基のさまざまなタイプの共有結合による結合は、当技術分野で既知である（Kornberg and Baker, 1992）。
【０２１４】
本明細書で用いる「ヌクレオチド」は、「バックボーン部分」をさらに含むヌクレオシドを意味する。バックボーン部分は一般に、ヌクレオチドを、ヌクレオチドを含む別の分子に、または別のヌクレオチドに共有結合によって結合させて核酸を形成する。天然のヌクレオチド中の「バックボーン部分」は典型的には、5-炭素糖に共有結合によって結合されるリン部分を含む。バックボーン部分の結合は典型的には、5-炭素糖の3'-位または5'-位のいずれかにおいて生じる。しかしながら、他のタイプの結合は、特にヌクレオチドが天然の5-炭素糖またはリン部分の誘導体もしくは類似体を含む場合には、当技術分野で既知である。
【０２１５】
核酸は、核酸塩基の誘導体もしくは類似体の全体、天然の核酸中に存在し得る核酸塩基のリンカー部分および/またはバックボーン部分を含むか、またはこれらから構成される。核酸類似体を有するRNAも本発明の方法で標識され得る。本明細書で用いる「誘導体」は、化学的に修飾されたか、または改変型の天然の分子を意味し、一方で「模倣体」または「類似体」は、天然の分子もしくは部分に構造的に似ている場合もあれば似ていない場合もあるが類似の機能を有する分子を意味する。本明細書で用いる「部分」は全体として、より大きな化学的構造または分子構造の、より小さな化学的成分または分子的成分を意味する。核酸塩基、ヌクレオシド、およびヌクレオチドの類似体または誘導体は、当技術分野で周知であり、かつ文献に記載されている（例えば参照により本明細書に組み入れられるScheit, 1980を参照）。
【０２１６】
ヌクレオシド、ヌクレオチド、または核酸の他の非制限的な例は、以下に記載されている例を含む：それぞれの全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,681,947号、同第5,652,099号および同第5,763,167号、同第5,614,617号、同第5,670,663号、同第5,872,232号、同第5,859,221号、同第5,446,137号、同第5,886,165号、同第5,714,606号、同第5,672,697号、同第5,466,786号、同第5,792,847号、同第5,223,618号、同第5,470,967号、同第5,378,825号、同第5,777,092号、同第5,623,070号、同第5,610,289号、同第5,602,240号、同第5,858,988号、同第5,214,136号、同第5,700,922号、同第5,708,154号、同第5,728,525号、同第5,637,683号、同第6,251,666号、同第5,480,980号、ならびに同第5,728,525号。
【０２１７】
本発明の標識法およびキットは特に、標識の結合用に修飾され、かつmiRNA分子中に組み入れ可能なヌクレオチドの使用を企図している。このようなヌクレオチドは、蛍光色素を含む色素によって、またはビオチンなどの分子によって標識され得るヌクレオチドを含む。標識されたヌクレオチドは、容易に入手可能であり；市販品を入手可能である、または当業者に既知の反応によって合成可能である。
【０２１８】
本発明で使用される修飾ヌクレオチドは天然のヌクレオチドではなく、分子上に官能基を有する調製されたヌクレオチドを意味する。対象となる特定の官能基は以下を含む：アミノ基、スルフヒドリル基、スルホキシル基、アミノスルフヒドリル基、アジド基、エポキシド基、イソチオシアネート基、イソシアネート基、無水物基、モノクロロトリアジン基、ジクロロトリアジン基、モノハロゲン置換ピリジン基もしくはジハロゲン置換ピリジン基、モノ置換ジアジン基もしくはジ置換ジアジン基、マレイミド基、エポキシド基、アジリジン基、ハロゲン化スルホニル基、酸ハロゲン基、ハロゲン化アルキル基、ハロゲン化アリール基、アルキルスルホニル基、N-ヒドロキシスクシニミドエステル基、イミドエステル基、ヒドラジン基、アジドニトロフェニル基、アジド基、3-（2-ピリジルジチオ）-プロピオンアミド基、グリオキサール基、アルデヒド基、ヨードアセチル基、シアノメチルエステル基、p-ニトロフェニルエステル基、o-ニトロフェニルエステル基、ヒドロキシピリジンエステル基、カルボニルイミダゾール基、および他の類似の官能基。いくつかの態様では、官能基は、ヌクレオチドに直接結合可能であるか、または結合基を介してヌクレオチドに結合可能である。官能基部分および任意のリンカーは、ヌクレオチドがmiRNAに付加され得るか、または標識され得る能力を実質的に損なわない。代表的な結合基は、典型的には約2〜18個、通常は約2〜8個の炭素原子の炭素含有結合基を含む。この場合、炭素含有結合基は、1個もしくは複数のヘテロ原子、例えばS、O、Nなどを含む場合もあれば含まない場合もあり、かつ1か所もしくは複数の不飽和部位を含む場合もあれば含まない場合もある。多くの態様で特に関心対象となるのは、アルキル結合基、典型的には1〜16個、通常は1〜4個の炭素原子の低級アルキル結合基である（結合基は1か所もしくは複数の不飽和部位を含む場合がある）。官能基が付与された標的の作製に関する上記の方法に使用される、官能基が付与されたヌクレオチド（またはプライマー）は既知のプロトコルを用いて作製可能である、または業者から、例えばSigma、Roche、Ambion、Biosearch Technologies、およびNENから購入することができる。官能基は、いずれも参照により組み入れられる米国特許第4,404,289号；同第4,405,711号；同第4,337,063号、および同第5,268,486号、ならびに英国特許第1,529,202号に記載された代表的な情報を含む、当業者に既知の方法で調製することができる。
【０２１９】
アミン修飾ヌクレオチドが本発明の複数の態様に使用される。アミン修飾ヌクレオチドは、標識の結合用の反応性アミン基を有するヌクレオチドである。任意のリボヌクレオチド（G、A、U、もしくはC）、またはデオキシリボヌクレオチド（G、A、T、もしくはC）が標識目的で修飾され得ることが企図される。例としては、以下の修飾型のリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドを含むが、これらに限定されない：5-（3-アミノアリル）-UTP；8-[（4-アミノ）ブチル]-アミノ-ATPおよび8-[（6-アミノ）ブチル]-アミノ-ATP；N6-（4-アミノ）ブチル-ATP、N6-（6-アミノ）ブチル-ATP、N4-[2,2-オキシ-ビス-（エチルアミン）]-CTP；N6-（6-アミノ）ヘキシル-ATP；8-[（6-アミノ）ヘキシル]-アミノ-ATP；5-プロパルギルアミノ-CTP、5-プロパルギルアミノ-UTP；5-（3-アミノアリル）-dUTP；8-[（4-アミノ）ブチル]-アミノ-dATPおよび8-[（6-アミノ）ブチル]-アミノ-dATP；N6-（4-アミノ）ブチル-dATP、N6-（6-アミノ）ブチル-dATP、N4-[2,2-オキシ-ビス-（エチルアミン）]-dCTP；N6-（6-アミノ）ヘキシル-dATP；8-[（6-アミノ）ヘキシル]-アミノ-dATP；5-プロパルギルアミノ-dCTP、および5-プロパルギルアミノ-dUTP。このようなヌクレオチドは、当業者に既知の方法で調製することができる。さらに、当業者であれば、5-（3-アミノアリル）-UTPに代えて、5-（3-アミノアリル）-CTP、GTP、ATP、dCTP、dGTP、dTTP、またはdUTPなどの同じアミン修飾を有する他のヌクレオチド体を調製することができる。
【０２２０】
B．核酸の調製
核酸は、例えば化学合成、酵素的産生、または生物学的産生などの、当業者に既知の任意の手法で作製することができる。本発明のmiRNAプローブは化学的に合成されることが特に企図される。
【０２２１】
本発明のいくつかの態様では、miRNAは生物学的試料から回収または単離される。miRNAは、組換え型であってもよく、または細胞に対して天然もしくは内在性であってもよい（細胞のゲノムから作られる）。生物学的試料は、miRNAなどの小型RNA分子の回収率を高めるような方法で処理可能であることが企図される。米国特許出願第10/667,126号は、このような方法について記載しており、同出願は、参照により特異的に本明細書に組み入れられる。全体としてこの方法は、細胞をグアニジニウムや界面活性剤を含む溶液で溶解する段階を含む。
【０２２２】
あるいは、核酸合成は、標準的な方法で実施される。これについては例えば、それぞれが参照により本明細書に組み入れられるItakura and Riggs（1980）、ならびに米国特許第4,704,362号、同第5,221,619号、および同第5,583,013号を参照されたい。合成核酸（例えば合成オリゴヌクレオチド）の非制限的な例は、参照により本明細書に組み入れられるEP 266,032に記載されているような、ホスホトリエステル、亜リン酸エステルを使用するインビトロ化学合成、またはホスホラミダイト化学および固相法で、または、それぞれが参照により本明細書に組み入れられるFroehler et al., 1986および米国特許第5,705,629号に記載されたデオキシヌクレオシドH-ホスホネート中間体によって作製される核酸を含む。オリゴヌクレオチド合成の多種多様な機序は例えば、それぞれが参照により本明細書に組み入れられる米国特許第4,659,774号、同第4,816,571号、同第5,141,813号、同第5,264,566号、同第4,959,463号、同第5,428,148号、同第5,554,744号、同第5,574,146号、同第5,602,244号に開示されている。
【０２２３】
酵素的に産生される核酸の非制限的な例は、PCR（商標）（例えばそれぞれが参照により本明細書に組み入れられる米国特許第4,683,202号および同第4,682,195号を参照）などの増幅反応で酵素的に産生された、または参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,645,897号に記載されたオリゴヌクレオチドの合成によって作製された核酸を含む。参照により本明細書に組み入れられるSambrook et al., 2001も参照されたい。
【０２２４】
オリゴヌクレオチドの合成は当業者に周知である。オリゴヌクレオチド合成の多種多様な機序は例えば、それぞれが参照により本明細書に組み入れられる米国特許第4,659,774号、同第4,816,571号、同第5,141,813号、同第5,264,566号、同第4,959,463号、同第5,428,148号、同第5,554,744号、同第5,574,146号、同第5,602,244号に開示されている。
【０２２５】
細胞内で核酸を産生させる組換え法は、当業者に周知である。このような方法は、核酸を標的細胞（例えばがん細胞）または単に宿主細胞（所望のRNA分子を大量に作製するため）などの細胞に送達するベクター（ウイルスベクターまたは非ウイルスベクター）、プラスミド、コスミド、および他の媒介物を含む。あるいは、このような媒介物は、RNA分子の作製用の試薬が存在する限りにおいて、無細胞系で使用することができる。このような方法は、参照により組み入れられるSambrook, 2003、Sambrook, 2001、およびSambrook, 1989に記載されている方法を含む。
【０２２６】
C．核酸の単離
核酸は、当業者に周知の手法で単離することができるが、特定の態様では、小型の核酸分子を単離する方法、および/またはRNA分子を単離する方法が使用され得る。クロマトグラフィーは、タンパク質からの、または他の核酸からの核酸の分離もしくは単離にしばしば使用される過程である。このような方法は、ゲルマトリックスを使用する電気泳動、フィルターカラム、アルコール沈殿法、および/または他のクロマトグラフィーを含む場合がある。仮に、細胞に由来するmiRNAが使用または評価される場合は、方法は全体として、細胞をカオトロピック試薬（例えばグアニジニウムイソチオシアネート）、および/または界面活性剤（例えばN-ラウロイルサルコシン）で溶解した後に、RNAの特定の集団を単離する過程を実施する段階を含む。
【０２２７】
他の核酸からmiRNAを分離する特定の方法では、ポリアクリルアミドを使用してゲルマトリックスが調製されるが、アガロースを使用することもできる。ゲルは濃度に勾配を設けることが可能である、または均一とすることができる。電気泳動用にゲルマトリックスを固定するために、プレートまたはチューブ類を使用することができる。核酸の分離には通常、1次元の電気泳動が使用される。プレートはスラブゲルの調製に使用され、チューブ類（典型的にはガラスまたはゴム）はチューブゲルの調製に使用され得る。「チューブ電気泳動」という語句は、ゲルの形成時にプレートの代わりにチューブまたはチューブ類を使用することを意味する。当業者であれば、チューブ電気泳動を実施するための材料を容易に調製できるか、またはC.B.S. Scientific Co., IncやScie-Plasなどから購入することができる。
【０２２８】
方法には、核酸、特に本発明の方法および組成物で使用されるmiRNAを単離するために、有機溶媒および/またはアルコールの使用を含めてもよい。いくつかの態様は、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願第10/667,126号に記載されている。全体として本開示は、細胞溶解物にアルコール溶液を添加する段階、およびアルコール/溶解物混合物を固体支持体に適用した後に固体支持体からRNA分子を溶出する段階を含む、細胞から小型RNA分子を効率的に単離する方法を提供する。いくつかの態様では、細胞溶解物に添加されるアルコールの量は、約55%〜60%のアルコール濃度を達成する。異なるアルコールを使用することが可能であるが、エタノールが良好に機能する。固体支持体は、任意の構造を取ることが可能であり、かつ負に帯電した官能基を有する金属支持体または高分子支持体を含めることが可能な、ビーズ、フィルター、およびカラムを含む。このような単離手順では、ガラス繊維のフィルターまたはカラムが特に良好に機能する。
【０２２９】
特定の態様では、miRNAの単離過程は、
a）試料中の細胞を、グアニジニウムを含む溶解液で溶解する段階（少なくとも約1 Mの濃度のグアニジニウム溶解物が得られる）；
b）フェノールを含む抽出用溶液によって、溶解物からmiRNA分子を抽出する段階；
c）溶解物にアルコール溶液を添加して、溶解物/アルコール混合物を生成させる段階（混合物中のアルコールの濃度は約35%〜約70%）；
d）溶解物/アルコール混合物を固体支持体に適用する段階；
e）イオン性溶液によって、固体支持体からmiRNA分子を溶出する段階；および
f）miRNA分子を捕捉する段階
を含む。典型的には、試料は、乾燥されて液体中に再懸濁されることで、体積が後の操作に適したものとなる。
【０２３０】
V．標識および標識技術
いくつかの態様では本発明は、標識されるmiRNAに関する。miRNAが、標識される前に最初に単離される、および/または精製されることが企図される。これによって、標識前にmiRNAが単離または精製されていない試料中の他のRNAに対して、miRNAをより効率的に標識する反応が達成され得る。本発明の多くの態様では、標識は非放射性である。全体として核酸は、標識済みのヌクレオチドを添加することで（1段階工程）、または添加済みのヌクレオチドを標識することで（2段階工程）、標識され得る。
【０２３１】
A．標識技術
いくつかの態様では、核酸は、標識済みのヌクレオチドまたはヌクレオチド群が核酸に触媒的に添加されることで標識される。1種類もしくは複数種類の標識済みヌクレオチドをmiRNA分子に添加することができる。これについては、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,723,509号を参照されたい。
【０２３２】
他の態様では、標識されていないヌクレオチドまたはヌクレオチド群がmiRNAに触媒的に添加され、標識されていないヌクレオチドは、後にそれを標識可能とする官能基部分によって修飾される。本発明の態様では、官能基部分は、ヌクレオチドがアミン修飾ヌクレオチドとなるような反応性アミンである。アミン修飾ヌクレオチドの例は当業者に周知であり、その多くが、Ambion、Sigma、Jena Bioscience、およびTriLinkなどから販売されている。
【０２３３】
合成過程でのcDNAの標識とは対照的に、miRNAの標識に関する問題は、既存の分子をいかに標識するかという点にある。本発明は、二リン酸または三リン酸のリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを、miRNAへの添加用の基質として使用可能な酵素の使用に関する。さらに特定の態様では、本発明は、miRNAの3'末端に付加される、修飾された二リン酸または三リン酸のリボヌクレオチドの使用を含む。このようなヌクレオチドの付加が可能な酵素は、ポリ（A）ポリメラーゼ、末端トランスフェラーゼ、およびポリヌクレオチドホスホリラーゼを含むが、これらに限定されない。本発明の特定の態様では、リガーゼは、標識の付加に使用される酵素ではなく、非リガーゼ酵素が使用されることが企図される。末端トランスフェラーゼは、核酸の3'末端へのヌクレオチドの付加を触媒する。ポリヌクレオチドホスホリラーゼは、プライマーを必要とすることなくヌクレオチド二リン酸を重合可能である。
【０２３４】
B．標識
miRNAまたはmiRNAプローブ上の標識は、比色標識（蛍光を含む可視スペクトルおよびUVスペクトルを含む）、発光標識、酵素標識、または陽電子放出標識（放射性物質を含む）とすることができる。標識は、直接的または間接的に検出することができる。放射性標識は、125I、32P、33P、および35Sを含む。酵素標識の例は、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、およびβ-ガラクトシダーゼを含む。標識は、発光特性を有するタンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質およびフィコエリトリンとすることもできる。
【０２３５】
コンジュゲートとしての使用が企図される比色標識および蛍光標識は、Alexa Fluor色素、BODIPY FLなどのBODIPY色素；Cascade Blue；Cascade Yellow；クマリン、ならびに7-アミノ-4-メチルクマリン、アミノクマリン、およびヒドロキシクマリンなどのクマリン誘導体；Cy3やCy5などのシアニン色素；エオシンおよびエリトロシン；フルオレセイン、およびフルオレセインイソチオシアナートなどのフルオレセイン誘導体；Quantum Dye（商標）などのランタニドイオンの大環状キレート；Marina Blue；Oregon Green；ローダミンレッド、テトラメチルローダミン、およびローダミン6Gなどのローダミン色素；テキサスレッド；チアゾールオレンジ-エチジウムヘテロダイマーなどの蛍光エネルギー転移色素；およびTOTABを含むが、これらに限定されない。
【０２３６】
色素の特定の例は、上記および下記の色素を含むが、これらに限定されない：Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 514、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 610、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、およびAlexa Fluor 750；BODIPY 493/503、BODIPY 530/550、BODIPY 558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY 630/650、BODIPY 650/655、BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY TMR、およびBODIPY-TRなどのアミン反応性のBODIPY色素；Cy3、Cy5、6-FAM、フルオレセインイソチオシアネート、HEX、6-JOE、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Pacific Blue、REG、ローダミングリーン、ローダミンレッド、Renographin、ROX、SYPRO、TAMRA、2',4',5',7'-テトラブロモスルホンフルオレセイン、ならびにTET。
【０２３７】
蛍光標識されたリボヌクレオチドの特定の例は、Molecular Probesから入手可能であり、Alexa Fluor 488-5-UTP、フルオレセイン-12-UTP、BODIPY FL-14-UTP、BODIPY TMR-14-UTP、テトラメチルローダミン-6-UTP、Alexa Fluor 546-14-UTP、Texas Red-5-UTP、およびBODIPY TR-14-UTPを含む。Cy3-UTPおよびCy5-UTPなどの他の蛍光リボヌクレオチドは、Amersham Biosciencesから入手できる。
【０２３８】
蛍光標識されたデオキシリボヌクレオチドの例は、ジニトロフェニル（DNP）-11-dUTP、Cascade Blue-7-dUTP、Alexa Fluor 488-5-dUTP、フルオレセイン-12-dUTP、Oregon Green 488-5-dUTP、BODIPY FL-14-dUTP、ローダミングリーン-5-dUTP、Alexa Fluor 532-5-dUTP、BODIPY TMR-14-dUTP、テトラメチルローダミン-6-dUTP、Alexa Fluor 546-14-dUTP、Alexa Fluor 568-5-dUTP、Texas Red-12-dUTP、Texas Red-5-dUTP、BODIPY TR-14-dUTP、Alexa Fluor 594-5-dUTP、BODIPY 630/650-14-dUTP、BODIPY 650/665-14-dUTP；Alexa Fluor 488-7-OBEA-dCTP、Alexa Fluor 546-16-OBEA-dCTP、Alexa Fluor 594-7-OBEA-dCTP、Alexa Fluor 647-12-OBEA-dCTPを含む。
【０２３９】
核酸は、2種類の異なる標識によって標識され得ることが企図される。さらに本発明の方法には、蛍光共鳴エネルギー転移（FRET）を用いることができる（例えばそれぞれ参照により組み入れられるKlostermeier et al., 2002；Emptage, 2001；Didenko, 2001）。
【０２４０】
あるいは、標識は、それだけでは検出されないが、間接的に検出可能か、または標的核酸の単離もしくは分離が可能な場合がある。例えば標識は、ビオチン、ジゴキシゲニン、多価陽イオン、キレーター群（chelator group）、および対抗体リガンドを含む他のリガンドである場合がある。
【０２４１】
C．可視化技術
標識核酸を可視化または検出する多くの手法は、容易に使用できる。このような手法は、顕微鏡、アレイ、蛍光定量法、Light cyclerもしくは他のリアルタイムPCR装置、FACS解析、シンチレーションカウンター、ホスホイメージャー、ガイガーカウンター、MRI、CAT、抗体ベースの検出法（ウェスタン、免疫蛍光、免疫組織化学）、組織化学的手法、HPLC（Griffey et al., 1997）、分光法、キャピラリゲル電気泳動（Cummins et al., 1996）、分光法；質量分光法；放射線法；および物質収支技術（mass balance technique）を含む。
【０２４２】
2種類もしくはそれ以上の異なって着色される標識が使用される場合は、蛍光共鳴エネルギー転移（FRET）法で、1種類もしくは複数種類の核酸の結合を解析することができる。また当業者であれば、標識核酸の可視化法、同定法、および解析法を十分に承知しているので、このようなプロトコルを本発明の一部として使用することができる。使用可能なツールの例は、蛍光顕微鏡、BioAnalyzer、プレートリーダー、Storm（Molecular Dynamics）、Array Scanner、FACS（蛍光活性化セルソーター）、または蛍光分子を励起および検出する能力を有する任意の装置も含む。
【０２４３】
VI．キット
本明細書に記載する任意の組成物は、キット中に含めることができる。非制限的な例では、アレイ、核酸増幅、および/またはハイブリダイゼーションを使用する、miRNAの単離用、miRNAの標識用、および/またはmiRNA集団の評価用の試薬を、血液試料からの試料の調製用の試薬とともにキットに含めることができる。キットにはさらに、miRNAプローブの作製用または合成用の試薬を含めることができる。したがってキットは、適切な容器手段中に、標識されたヌクレオチドまたは後に標識される非標識ヌクレオチドを組み入れることでmiRNAを標識するための酵素を含む。ある局面では、キットは増幅用試薬を含む場合がある。他の局面では、キットは、ガラス、ナイロン、ポリマービーズなどの、さまざまな支持体、および/または任意のプローブおよび/または標的核酸のカップリング用の試薬を含む場合がある。キットは、反応用緩衝液、標識用緩衝液、洗浄用緩衝液、またはハイブリダイゼーション用緩衝液などの1種類もしくは複数種類の緩衝液、miRNAプローブ調製用の化合物、およびmiRNA単離用の成分を含む場合もある。本発明の他のキットは、miRNAを含む核酸アレイの作製用の成分を含む場合があるので、例えば固体支持体を含む場合がある。
【０２４４】
本明細書に記載する本発明の方法を実施するためのキットが特に企図される。いくつかの態様では、多重標識用のmiRNAを調製するためのキット、ならびにmiRNAプローブおよび/またはmiRNAアレイを調製するためのキットが存在する。これらの態様では、キットは、適切な容器手段中に、以下の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個、もしくはそれ以上を含む：（1）ポリ（A）ポリメラーゼ；（2）非修飾ヌクレオチド（G、A、T、C、および/またはU）；（3）修飾ヌクレオチド（標識済み、もしくは非標識）；（4）ポリ（A）ポリメラーゼ緩衝液；ならびに（5）少なくとも1種類のマイクロフィルター；（6）ヌクレオチドに結合可能な標識；（7）少なくとも1種類のmiRNAプローブ；（8）反応緩衝液；（9）miRNAアレイ、またはこのようなアレイの作製用の成分；（10）酢酸；（11）アルコール；（12）miRNAまたはmiRNAのプローブもしくはアレイの作製、単離、濃縮、および精製用の溶液。他の試薬は、ホルムアミド、ローディング用色素、リボヌクレアーゼ阻害剤、およびDNaseなどの、RNAの操作に一般に使用される試薬を含む。
【０２４５】
特定の態様では、本発明のキットは、本出願に記載されているように、miRNAプローブを含むアレイを含む。アレイは、特定の状態にある生物体または特定の組織もしくは器官の全て既知のmiRNAに対応するか、またはこのようなプローブのサブセットに対応するプローブを有する場合がある。本発明のアレイ上のプローブのサブセットは、特定の診断、治療、または予後判定の応用に重要であることがわかっているサブセットであるか、またはこのようなサブセットを含む場合がある。例えばアレイは、
（1）疾患もしくは状態（急性骨髄性白血病）、
（2）特定の薬剤もしくは治療に対する感受性もしくは耐性；
（3）薬剤もしくは物質に由来する毒性に対する感受性；
（4）疾患もしくは状態の発症段階もしくは重症度（予後）；ならびに
（5）疾患もしくは状態に対する遺伝的素因
を意味するかまたは示唆する、1種類もしくは複数種類のプローブを含む場合がある。
【０２４６】
アレイを含む任意のキットの態様に関しては、本明細書に記載する任意のSEQ IDの全体もしくは一部に同一または相補的である配列を含むか、またはその変形である配列の増幅に使用可能な核酸分子が存在し得る。ある態様では、本発明のキットまたはアレイは、本明細書に記載するSEQ IDによって特定されるmiRNAに対する1種類もしくは複数種類のプローブを含む場合がある。上記の任意の核酸をキットの一部として組み込むことができる。
【０２４７】
キットの成分は、水性溶媒中か、または凍結乾燥状態のいずれかの状態で収容することができる。キットの容器手段は全体として、内部に成分を配置することが可能な、かつ好ましくは適切に分割され得る、少なくとも1本のバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、または他の容器手段を含む。キット中に複数の成分が存在する場合（標識用試薬および標識は、まとめて収容される場合がある）は、キットは全体として、内部に追加成分を個別に配置することが可能な、第2の、第3の、または他の追加の容器も含む。しかしながら、成分のさまざまな組み合わせを1本のバイアル中に含めることが可能である。本発明のキットは典型的には、核酸を入れる手段、および販売目的で厳密に密封された他の任意の試薬容器も含む。このような容器は、内部に所望のバイアルが収められる、射出成形または吹き込み成形されたプラスチック製容器を含む場合がある。
【０２４８】
キットの成分が1つおよび/または複数の溶液の状態で提供される場合は、溶液は水溶液であり、特に無菌の水溶液が好ましい。
【０２４９】
しかしながら、キットの成分は、乾燥粉末として提供される場合がある。試薬および/または成分が乾燥粉末として提供される場合、粉末は、適切な溶媒の添加によって再構成可能である。溶媒は、別の容器手段中に提供される場合もあることが企図される。いくつかの態様では、標識用色素は乾燥粉末として提供される。10 μg、20 μg、30 μg、40 μg、50 μg、60 μg、70 μg、80 μg、90 μg、100 μg、120 μg、120 μg、130 μg、140 μg、150 μg、160 μg、170 μg、180 μg、190 μg、200 μg、300 μg、400 μg、500 μg、600 μg、700 μg、800 μg、900 μg、1000 μgの乾燥色素、または少なくともこれらの重量の乾燥色素、もしくは最大でこれらの重量の乾燥色素が、本発明のキット中に提供されることが企図される。色素は後に、DMSOなどの任意の適切な溶媒で再懸濁され得る。
【０２５０】
このようなキットは、標識されたmiRNAの単離を容易にする成分を含む場合もある。キットは、miRNAを保存もしくは維持する成分、またはその分解を防ぐ成分を含む場合もある。このような成分は、RNAseを含まないかまたはRNAseの作用を防ぐ場合がある。このようなキットは全体として、適切な手段内に、個々の試薬または溶液用の個別の容器を含む。
【０２５１】
キットは、キット成分の使用、ならびに同キットに含まれない他の任意の試薬の使用に関する指示書も含む。指示書は、実行可能な変形形態を含む場合がある。
【０２５２】
本発明のキットは、以下の1つまたは複数を含む場合もある：対照RNA；ヌクレアーゼを含まない水；1.5 mlチューブなどのRNaseを含まない容器；RNaseを含まない溶出用チューブ；PEGまたはデキストラン；エタノール；酢酸；酢酸ナトリウム；酢酸アンモニウム；グアニジニウム；界面活性剤；核酸サイズマーカー；RNaseを含まないチューブチップ；およびRNaseまたはDNaseの阻害剤。
【０２５３】
このような試薬は、本発明のキットの態様であることが企図される。しかしながら、このようなキットは、上記の特定の品目に制限されず、miRNAの操作または解析に使用される任意の試薬を含む場合がある。
【０２５４】
VII．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を説明するために含まれる。当業者であれば、以下の実施例に開示された手法が、本発明者らによって、本発明の実施において良好に機能することが明らかにされた手法であること、したがって本発明の実施に関する好ましい様式を構成すると見なされ得ると理解すべきである。しかしながら当業者は、本開示に鑑みて、開示されている特定の態様に多くの変更が成され得ること、またそれでも本発明の趣旨および範囲から解離することなく同様または類似の結果が得られることを理解すべきである。
【０２５５】
実施例1：
hsa-miR-34aによるトランスフェクション後の遺伝子発現解析
miRNAは、標的mRNAの転写物に結合し、かつ（1）転写物の分解を開始するかまたは（2）転写物からのタンパク質の翻訳を変化させることによって、遺伝子発現を調節すると考えられている。タンパク質発現の変化を上下させるに至る翻訳段階における調節は、下流の遺伝子の産物と、後にこのようなタンパク質によって調節される遺伝子との活性および発現の変化につながる場合がある。これらの数多くの調節的作用は、大規模mRNA発現プロファイルの変化として明らかになる場合がある。マイクロアレイによる遺伝子発現解析を実施して、hsa-miR-34aの発現によって誤調節される遺伝子を同定した。
【０２５６】
合成pre-miR-34a（Ambion）、または2種類の負の対照であるmiRNA（pre-miR-NC1、Ambionカタログ番号AM17110、およびpre-miR-NC2、Ambionカタログ番号AM17111）を、それぞれ3つの時点におけるA549細胞の4通りの試料を対象にリバーストランスフェクトした。細胞のトランスフェクションは、siPORT NeoFX（Ambion）を使用して製造業者の推奨に従って、以下のパラメータを用いて行った：6ウェルプレートに1ウェルあたり200,000個の細胞、5.0 μlのNeoFX、最終濃度30 nMのmiRNA（容量2.5 ml）。トランスフェクションの4時間後、24時間後、および72時間後に細胞を回収した。全RNAの抽出は、RNAqueous-4PCR（Ambion）を使用して、製造業者の推奨プロトコルに従って行った。
【０２５７】
mRNAアレイ解析は、Asuragen Services（Austin, TX）によって、同社の標準操作手順に従って実施された。MessageAmp（商標） II-96 aRNA増幅キット（Ambion, cat #1819）が使用され、2 μgの全RNAが標的の調製およびビオチンによる標識に使用された。cRNAの収量は、Agilent Bioanalyzer 2100キャピラリ電気泳動プロトコルを使用して定量された。標識された標的を、Affymetrix mRNAアレイ（Human HG-U133A 2.0アレイ）に、製造業者の推奨および以下のパラメータを使用してハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションは、Affymetrix Model 640ハイブリダイゼーションオーブン内で、45℃で16時間かけて実施された。Affymetrix FS450 Fluidicsステーション上で、洗浄スクリプト（wash script）Midi_euk2v3_450が実行されてアレイが洗浄されて染色された。アレイは、Affymetrix GeneChip Scanner 3000でスキャンされた。画像シグナルデータ、群平均値、有意性フラッグが付記されたp値、対数比、およびアレイ上の各遺伝子の遺伝子注釈の要約が、Affymetrix Statistical Algorithm MAS 5.0（GCOS v1.3）を使用して作成された。データは、Affymetrixデータおよび結果ファイルを含むファイル（キャビネット）で、ならびにアレイの一次画像および処理済みの細胞強度を含むファイル（.cel）で報告された。データは、2つの負の対照マイクロRNA配列の平均によって観察される作用に関して標準化された後に、表示目的でまとめて平均化された。発現レベルが、負の対照の平均から少なくとも0.7 log2変動する遺伝子のリストが統合された。マイクロアレイによる遺伝子発現解析の結果を表1に示す。
【０２５８】
表1に列挙した遺伝子の発現レベルの操作は、hsa-miR-34aの発現の上昇または低下が疾患に役割を果たすがんおよび他の疾患の潜在的に有用な治療となる。
【０２５９】
実施例2：
hsa-miR-34aによって影響を受ける細胞経路
hsa-miR-34aによる遺伝子発現の誤調節（表1）は、がんならびに他の疾患および障害の制御の潜在的な治療標的となる多くの細胞経路に影響する。本発明者らは、hsa-miR-34aの発現によって誘導される調節カスケードの影響を受ける細胞の遺伝子経路の内容および性質を決定した。細胞経路解析は、Ingenuity Pathways Analysis（バージョン4.0, Ingenuity（登録商標） Systems, Redwood City, CA）を使用して実施した。任意の経路の変化は、Fisherの正確確率検定（Fisher, 1922）によって判定した。A549細胞において、hsa-miR-34aの過剰発現による影響を最も有意に受けた経路を表2に示す。
【０２６０】
これらのデータから、hsa-miR-34aは、数多くのがんに関連する遺伝子、細胞増殖関連遺伝子、細胞発生関連遺伝子、細胞シグナル伝達関連遺伝子、および細胞周期関連遺伝子の発現に、直接的または間接的に影響を及ぼし、したがってがん、細胞の成長、発生、および増殖に関連する機能経路に主に影響を及ぼすことがわかる。これらの細胞過程はすべて、さまざまながんの発生および進行に統合的な役割を果たす。表2に示された細胞経路における遺伝子の発現レベルの操作は、hsa-miR-34aの発現の上昇または低下が疾患に役割を果たすがんおよび他の疾患の潜在的に有用な治療となる。
【０２６１】
実施例3：
hsa-miR-34aの推定標的遺伝子
Krek et al.（2005）によって提案された方法の実行である特許取得アルゴリズムmiRNATarget（商標）（Asuragen）によって、hsa-miR-34aの結合およびhsa-miR-34aによる調節の遺伝子標的を推定した。推定標的遺伝子を表3に示す。
【０２６２】
pre-miR hsa-miR-34aによるトランスフェクション後のヒトがん細胞におけるmRNA発現レベルの変化を示した推定遺伝子標的を表4に示す。
【０２６３】
mRNAの発現レベルがhsa-miR-34aによる影響を受けるhsa-miR-34aの推定遺伝子標的は、その発現レベルの操作によるがんの治療および他の疾患の治療の、特に有用な候補となる。
【０２６４】
実施例4: HSA-MIR-34Aによって変化するがん関連遺伝子の発現
細胞増殖および生存の経路は、腫瘍においては一般的に変化している(Hanahan and Weinberg, 2000)。本発明者らは、hsa-miR-34aが、これらの経路の調節において重要なタンパク質の転写産物を直接的または間接的に調節することを明らかにした。さまざまながん種に関連するhsa-miR-34a標的の詳細な一覧を表5に示す。特に関心対象となるHsa-miR-34a標的は、細胞内シグナル伝達、細胞周期、染色体の維持、細胞接着および移動、mRNA翻訳、DNA複製、転写、アポトーシスならびにチオレドキシン酸化還元反応系の調節において機能する遺伝子およびその産物である。これらの標的の多くは固有の発がんまたは腫瘍の抑制活性を有し、調節されなくなると、インビトロおよびインビボでの悪性表現型の一因となる。
【０２６５】
Hsa-miR-34aは、さまざまな層での細胞内シグナル伝達に影響を及ぼし、分泌増殖因子、膜貫通増殖因子受容体および細胞質シグナル伝達分子の発現を制御する。hsa-miR-34aにより調節される分泌タンパク質の例は、アンフィレグリン(AREG)、結合組織増殖因子(CTGF)、腫瘍増殖因子β-2 (TGFB2)および炎症性ケモカイン・インターロイキン8 (IL8)である。IL-8は、多くの場合、種々のがんにおいて上方制御され、腫瘍の血管新生、転移および予後不良と相関関係がある(Rosenkilde and Schwartz, 2004; Sparmann and Bar-Sagi, 2004)。アンフィレグリンは上皮増殖因子受容体(EGFR)に対するリガンドとして機能し、EGFR依存的なシグナル伝達を活性化する(Hynes and Lane, 2005)。アンフィレグリンは卵巣がん、胃がんおよび膵臓がん、ならびに肝細胞がん組織および細胞株において高い頻度で発現される(Kitadai et al., 1993; Ebert et al., 1994; D'Antonio et al., 2002; Castillo et al., 2006)。アンフィレグリンは肝細胞がん細胞において分裂促進因子および抗アポトーシス増殖因子として作用し、肝がん細胞の形質転換表現型の一因となる。低分子干渉RNA (siRNA)または中和抗体によるアンフィレグリン機能の阻害は、アンフィレグリンを介した肝細胞がん細胞の自己分泌ループおよび発がん性を弱める(Castillo et al., 2006)。アンフィレグリンの発現はまた、前立腺がんの良性期から悪性期へと徐々に増加し、非小細胞肺がん(NSCLC)を有する患者ではFDA承認薬のイレッサ(ゲフィチニブ)による処置に対して不良な反応を示す(Bostwick et al., 2004; Ishikawa et al., 2005)。
【０２６６】
CTGF (インスリン様増殖因子結合タンパク質8; IGFBP8ともいわれる)は当初、臍帯静脈内皮細胞によって産生される分裂促進因子として報告された(Bradham et al., 1991)。CTGFは、増殖因子活性の調節因子として機能し、さまざまな腫瘍において過剰発現される(Hishikawa et al., 1999; Shimo et al., 2001; Lin et al., 2005; Yang et al., 2005)。CTGFは、低酸素症によって誘導され、血管新生ならびに腫瘍異種移植片の増殖を増強する(Shimo et al., 2001; Yang et al., 2005)。しかしながら、がんにおける一貫したCTGFの役割は、依然としてつかまえどころがなく、細胞の状況に依る可能性がある(Hishikawa et al., 1999; Lin et al., 2005)。TGF-β2は、腫瘍抑制因子として機能しうる受容体の類であるTGF-β受容体(TGFBR)に対応するリガンドである。これらの中には、hsa-miR-34aによって同様に調節されるTGFBR-2がある。TGFBR-2は、TGFBR-1と機能的な複合体を形成し、TGF-βに対する主要な受容体である(Massague et al., 2000)。TGF-βの中心的役割は、上皮細胞、内皮細胞、造血性・神経細胞および間葉細胞などの、多数の細胞種の細胞増殖の阻害である。マイクロサテライト不安定性を有する多くの乳がんおよび結腸直腸がんは、TGFBR-2の不活性化突然変異を持っており、それゆえTGF-βの増殖阻害機能を免れる(Markowitz et al., 1995; Lucke et al., 2001)。
【０２６７】
hsa-miR-34aにより調節される他の膜貫通増殖因子受容体には、MetおよびRas会合ドメインファミリータンパク質2 (RASSF2)が含まれる。RASSF2は、肺腫瘍細胞株において高頻度に下方制御される腫瘍抑制因子の候補である(Vos et al., 2003)。RASSF2は、K-Rasと相互作用し、細胞周期停止およびアポトーシスを促進する。Metは、肝細胞増殖因子(HGF)に対する受容体として作用し、当初は、化学的に形質転換されたヒト細胞株からがん遺伝子として単離された(Cooper et al., 1984; Dean et al., 1985)。Met活性化突然変異は、散発性乳頭状腎細胞がん、小児肝細胞がんおよび胃がんにおいて見られる(Danilkovitch-Miagkova and Zbar, 2002)。これらの体細胞突然変異は、さまざまながん腫における攻撃性の増大および広範な転移と関連している。いくつかの他のがん種では、自己分泌および傍分泌機構がMetシグナル伝達の活性化をもたらす。しかしながら、最も多いMet活性化機構は、結腸直腸がん、肝細胞がん、ガストリン産生腫瘍ならびに胃、膵臓、前立腺、卵巣および乳房のがんにおいて起こる過剰発現である(Boccaccio and Comoglio, 2006)。Metの過剰発現は、転移性腫瘍表現型および予後不良と相関性がある(Birchmeier et al., 2003)。hsa-miR-34aによって調節される細胞質シグナル伝達分子には、PIK3CD、ニューロフィブロミン1および2 (NF1、NF2)ならびにAKAP12が含まれる。グラビンまたはSSeCKS (Src抑制Cキナーゼ基質)ともいわれるAKAP12は、酵素・基質間の相互作用をつなぎ止めるキナーゼ足場タンパク質として機能する(Nauert et al., 1997)。AKAP12の発現は、インビトロにおいてSrcまたはJunがんタンパク質により誘導される発がん性細胞形質転換を妨げるが、白血病ならびに直腸、肺および胃のがんなどの多くのがんでは、失われているかまたは低下している(Lin and Gelman, 1997; Cohen et al., 2001; Xia et al., 2001; Wikman et al., 2002; Boultwood et al., 2004; Choi et al., 2004; Mori et al., 2006)。前立腺がんおよび胃がんにおけるAKAP12の明白な抗発がん活性が、このタンパク質を推定腫瘍抑制因子と特徴付けている(Xia et al., 2001; Choi et al., 2004)。PIK3CDは、クラスIAホスホイノシチド3-キナーゼ(PI3K)のδ触媒サブユニットp110δをコードする。p110δは、十分に特徴付けられているp110αアイソフォームと同様に、最も上流の受容体チロシンキナーゼに反応してAktシグナル伝達経路を活性化する(Vanhaesebroeck et al., 1997)。PIK3CDは、急性骨髄性白血病(AML)を有する患者由来の芽細胞において高いレベルで一貫して発現されており; PIK3CD活性の阻害によってAML細胞の増殖が特異的に遮断される(Sujobert et al., 2005; Billottet et al., 2006)。NF1およびNF2は正真正銘の腫瘍抑制因子であり、これらは、そのいずれかが失われているかまたは突然変異している場合、一般に最も遺伝する腫瘍素因症候群の一つである神経線維腫症の原因になる(Rubin and Gutmann, 2005)。NF1またはNF2機能の喪失は、他の悪性病変、例えばNF1の場合には星状細胞腫、神経膠腫および白血病ならびにNF2の場合には肝細胞がんおよび甲状腺がんにおいても起こる(McClatchey and Giovannini, 2005; Rubin and Gutmann, 2005)。NF1の腫瘍抑制機能は、NF1が本質的に発がん性のRASタンパク質に対するGTPase活性化タンパク質(GAP)として作用し、RAS関連GTPをGDPに触媒することによってRASを不活性化するという事実によって説明することができる。対照的に、NF2の腫瘍抑制因子としての役割はあまり明確ではない。メルリンまたはシュ��ノミンとしても知られるNF2は、細胞膜ならびに細胞骨格と結び付き、膜構成を調節する。NF2の過剰発現または構成的活性化は、細胞増殖および発がん性形質転換を遮断することができる(Tikoo et al., 1994; Lutchman and Rouleau, 1995; Jin et al., 2006)。
【０２６８】
hsa-miR-34aによって調節される、別のクラスの遺伝子およびその対応するタンパク質は、細胞周期の進行において機能する。これらのタンパク質のいくつか、例えば網膜芽細胞腫様1 (RBL1)、サイクリンD1、D3、A2 (CCND1、CCND3、CCNA2)、サイクリン依存性キナーゼ4 (CDK4)およびCDK阻害因子2c (CDKN2C)は、G1期およびS期の移行において極めて重要な役割を果たす。その他のものは、染色体の安定性を維持するため有糸分裂間の姉妹染色分体の正しい分離に必要とされる。これらにはオーロラキナーゼB (AURKB、STK12)、乳がん1および2 (BRCA1; BRCA2)、ベンズイミダゾール無抑制性発芽1 (budding uninhibited by benzimidazoles 1) (BUB1)、ポロ様キナーゼ1 (PLK1)および細胞分裂周期23 (CDC23、後期促進複合体サブユニット8)が含まれる。BRCA1、BRCA2およびオーロラキナーゼBはさまざまな充実性腫瘍、例えば、乳房、卵巣、甲状腺、肺、前立腺および結腸直腸のがんにおいて無秩序な発現を示す(Wooster and Weber, 2003; Keen and Taylor, 2004; Turner et al., 2004; Smith et al., 2005; Chieffi et al., 2006; Ulisse et al., 2006)。PLK1 (セリン・トレオニンタンパク質キナーゼ13; STPK13ともいわれる)は、有糸分裂紡錘体機能を調節して染色体の安定性を維持するタンパク質キナーゼである(Strebhardt and Ullrich, 2006)。PLK1の発現は、細胞周期の間に強固に調節されており、M期においてピークに達する。PLK1は、本質的に発がん性であり、p53の腫瘍抑制機能を直接的に阻害する(Ando et al., 2004)。PLK1の過剰発現は、NIH3T3細胞の多核表現型および細胞形質転換を誘導する(Mundt et al., 1997; Smith et al., 1997)。同様に、PLK1は乳房、結腸、肺、胃および前立腺のがんを含め、大部分の充実性腫瘍において発現レベルの増加を示す(表5)。PLK1の過剰発現は、疾患の進行と関連しており、それが欠失時には、がん細胞においてアポトーシスを誘導する(Liu and Erikson, 2003; Strebhardt and Ullrich, 2006)。現在、PLK1は、将来の治療的介入のための種々の小分子阻害剤の標的として試験が行われている(Strebhardt and Ullrich, 2006)。
【０２６９】
p107としても知られるRBL1は、ポケットタンパク質p107、p130およびpRbを含む網膜芽細胞腫腫瘍抑制タンパク質ファミリーの一員である。pRbの原型と同様に、RBL1は、E2Fファミリーの転写因子と相互作用し、細胞周期進行およびDNA複製を遮断する(Sherr and McCormick, 2002)。したがって、一部のがんは、無秩序なRBL1発現を示す(Takimoto et al., 1998; Claudio et al., 2002; Wu et al., 2002; Ito et al., 2003)。サイクリンは、サイクリン依存性キナーゼ(CDK)の補因子である(Malumbres and Barbacid, 2001)。サイクリンの発現は、個々のCDKの活性を支配するように細胞周期の間に強固に制御されている。サイクリンA2はS期の間にCDK2と結び付き; サイクリンD1はG1期におけるCDK4/6の主な補因子である。多くのサイクリンは細胞増殖の促進因子であるので、サイクリンD1のようなサイクリンは、さまざまな腫瘍の種類において高いレベルで発現されることが多い(Donnellan and Chetty, 1998)。CDK4は、D1、D2およびD3を含むD型サイクリンと活性な複合体を形成する。CDK4の主な機能は、網膜芽細胞腫タンパク質ファミリーのメンバーを不活性化することである。CDK4は、多数のがんで過剰発現されるので、現在、潜在的な制がん剤の標的として調査されている(Malumbres and Barbacid, 2001)。
【０２７０】
hsa-miR-34aによって調節される転写因子には、ウィングド/ヘリックス・フォークヘッド（winged/helix forkhead）タンパク質FoxM1、ヒストンデアセチラーゼ1 (HDAC1)、Junおよびジンクフィンガータンパク質のLIMドメインonly 4 (LMO4)が含まれる。LMO-4は、本質的に発がん性であり、BRCA-1腫瘍抑制タンパク質を不活性化する(Sum et al., 2002; Sum et al., 2005)。LMO-4は、多数のがん種において高い頻度で過剰発現されており、乳がんでは予後不良を予測するものとなる(Visvader et al., 2001; Mizunuma et al., 2003; Sum et al., 2005; Taniwaki et al., 2006)。したがって、LMO-4に対して作製されたRNAiは、乳がん細胞の増殖および移動の低下を引き起こす(Sum et al., 2005)。LMO4と同様に、FoxM1もサイクリンBおよびDなどの、細胞周期遺伝子の発現を制御する(Wang et al., 2001)。FoxM1は、ヒト膠芽細胞腫において高いレベルで発現され、さまざまなモデル系において腫瘍原性活性を示す(Kalin et al., 2006; Kim et al., 2006; Liu et al., 2006)。FoxM1が欠損しているマウスは、化学的に誘導された肝細胞がんを発症することはない(Kalinichenko et al., 2004)。Junは、塩基性領域/ロイシンジッパー(bZIP)クラスの転写因子に属し、鳥類において腫瘍形成を誘導する鳥類がんタンパク質v-Junの細胞相同体である(Maki et al., 1987)。HDAC1は、一般的な転写阻害剤として作用し、網膜芽細胞腫腫瘍抑制タンパク質(Rb)と協調して、細胞成長および増殖を低減する(Wade, 2001)。
【０２７１】
Hsa-miR-34aはまた、どちらもアポトーシス経路に機能的につながりのある、FasおよびMCL1の発現を支配する。MCL1は、反対の機能を持った、選択的スプライスによる二つの遺伝子産物をもたらす抗アポトーシスBCL-2 (B細胞リンパ腫2)遺伝子ファミリーの一員である(Bae et al., 2000)。高レベルのMCL1は、卵巣がんを有する患者の予後不良と関連しており、白血病の再発を示す(Kaufmann et al., 1998; Shigemasa et al., 2002)。MCL1に対するRNA干渉は、胃がん細胞および肝細胞がん細胞において治療的反応を誘導する(Schulze-Bergkamen et al., 2006; Zangemeister-Wittke and Huwiler, 2006)。CD95またはAPO-1としても知られるFasは、そのリガンドFasLに反応してアポトーシスシグナルの伝達で機能する膜貫通細胞表面受容体である(Houston and O'Connell, 2004)。Fas発現の低下は、FasLを介した細胞死に対する感受性を減らす細胞の共通機構である。同様に、多くの異なるがん種がFas発現レベルの喪失または低減を示す(表5)。結腸直腸がんでは、Fasの発現は、正常上皮の形質転換から良性新生物、腺がんおよび転移に向かってだんだん減少する(Moller et al., 1994)。したがって、FasLの発現にもかかわらず、腫瘍細胞は、FasL誘発性のアポトーシスシグナルを免れることができる。hsa-miR-34aの一過性のトランスフェクションは、Fas転写産物の増大を引き起こし、それゆえ、がん細胞においてFasLに対する感受性を回復させることができる。
【０２７２】
hsa-miR-34aによって調節されるさらなる増殖関連遺伝子には、種々のタンパク質および多数の経路を標的にする、12 kDaのチオールレダクターゼであるチオレドキシン(TXN)が含まれる。チオレドキシンは、転写因子の活性を調節し、血管新生Hif-1α(低酸素誘導因子1α)およびVEGF (血管内皮増殖因子)の発現を誘導し、増殖因子および抗アポトーシス因子として作用しうる(Marks, 2006)。したがって、肺、膵臓、頸部および肝臓のがんは、チオレドキシンレベルの増加を示す。チオレドキシンの発現は、浸潤性腫瘍増殖、予後不良および化学耐性とも関連している(Marks, 2006)。
【０２７３】
要約すると、hsa-miR-34aは、細胞の増殖および生存の重要な調節因子であるタンパク質の活性を支配する。これらの標的はヒトがんにおいて調節解除されることが多い。miR-34aにより調節される遺伝子および関連経路に関するこの概説に基づくと、種々のがん細胞種にhsa-miR-34aまたは抗hsa-miR-34aを導入することで治療的反応が引き起こされる可能性が高い。
【０２７４】
実施例5: 合成によるHSA-MIR-34Aはヒト肺がん細胞の増殖を阻害する
本発明者らはこれまでに、hsa-miR-34は、がん療法の介入点ならびに他の疾患および障害の治療の介入点に相当する多数の細胞活性に関与していることを実証している(2005年5月31日付で出願された米国特許出願第11/141,707号および2005年11月14日付で出願された同第11/273,640号、これらのそれぞれが参照により組み入れられる)。例えば、hsa-miR-34の過剰発現は、ある正常細胞株またはがん性細胞株の増殖および/または生存能を低減する。
【０２７５】
有効な治療法の開発には、さまざまながんモデルおよび同一の疾患に対応する多数のがん細胞株において治療の有効性および有用性を示す証拠が必要とされる。本発明者らは、8種類の個別の肺がん細胞株を用いることによって肺がんに対するhsa-miR-34aの治療的作用を評価した。肺がん細胞の細胞増殖を測定するために、以下の非小細胞肺がん(NSCLC)細胞を用いた: 肺腺がんに由来する細胞(A549、H522、Calu-3、HCC2935)、肺扁平上皮がんに由来する細胞(H226)、肺腺扁平上皮がんに由来する細胞(H596)、細気管支肺胞上皮がんに由来する細胞(H1650)、および肺大細胞がんに由来する細胞(H460)。合成によるhsa-miR-34a (Pre-miR(商標)-hsa-miR-34a, Ambionカタログ番号AM17100)または陰性対照(NC)のmiRNA (Pre-miR(商標) マイクロRNA前駆体分子-陰性対照#2; Ambionカタログ番号AM17111)を、脂質に基づくトランスフェクションによってA549、H522、H596、Calu-3、HCC2935、H1650、H460細胞に送達し、電気穿孔によってH226細胞に送達した。
【０２７６】
脂質に基づく逆トランスフェクションは、公開されたプロトコル(Ovcharenko et al., 2005)および以下のパラメータにしたがって三通り行った: 細胞(96ウェルにつき5,000〜12,000個)、OptiMEM (Invitrogen) 20 μl中リポフェクトアミン(商標) 2000 (カタログ番号11668-019, Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA) 0.1〜0.2 μl、100 μl中にて終濃度30 nMのmiRNA。H226細胞の電気穿孔は以下の設定でBioRad Gene Pulser Xcell(商標)装置(BioRad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA)を用いて行った: 細胞5×106個にOptiMEM 200 μl中miRNA 5 μg (1.6 μM miRNA)、矩形波パルス5ミリ秒間250 Vを使用。電気穿孔処理したH226細胞を96ウェルにつき全量100 μl中に細胞7,000個で播種した。細胞増殖の評価のためトランスフェクションまたは電気穿孔から72時間後にCalu-3細胞を除く全ての細胞を収集した。Calu-3細胞は、トランスフェクションから10日後に収集した。増殖アッセイ法は、Alamar Blue (Invitrogen)を用い製造元の使用説明書にしたがって行った。細胞増殖の阻害の対照として、Eg5としても知られる、モータータンパク質のキネシン11に対するsiRNAを用いた。Eg5は、ほとんどの真核細胞の細胞生存に不可欠であり、その欠如によって細胞増殖の低減および細胞死が起こる(Weil et al., 2002)。miRNAに適用したのと同じ実験パラメータにしたがい脂質に基づくトランスフェクションでsiEg5を用いた。本発明者らはまた、miRNAの効力の内部標準として10 μMおよび50 μMの終濃度のDNAトポイソメラーゼII阻害剤エトポシドを用いた。エトポシドは、肺がんの処置でFDAにより承認されたDNAトポイソメラーゼII阻害剤である。種々の肺がん細胞に対するIC50値は、SCLCおよびNSCLC細胞では<1〜25 μMの範囲に及ぶことが報告されている(Tsai et al., 1993; Ohsaki et al., 1992)。Alamar Blueアッセイ法から得た増殖割合(%)の値を、陰性対照のmiRNAで処理した細胞から得た値に対して規準化した。陰性対照のmiRNAで処理した細胞(100%)に対するhsa-miR-34a処理細胞の増殖割合を表7および図1に示す。
【０２７７】
（表７）hsa-miR-34a、Eg5に特異的なsiRNA (siEg5)、エトポシドまたは陰性対照のmiRNA (NC)で処理した肺がん細胞株の増殖割合(%)
2010529966.tif 000126
値は、陰性対照のmiRNAをトランスフェクトした細胞から得た値(100%の増殖)に対して規準化してある。NC, 陰性対照のmiRNA; siEg5, Eg5に特異的なsiRNA; SD, 標準偏差; n.d., 未決定。
【０２７８】
hsa-miR-34aの送達は、肺がん細胞A549、H522、H596、Calu-3、HCC2935、H1650、H460およびH226の細胞増殖を阻害する(表7および図1)。平均して、hsa-miR-34aは細胞増殖を25.30%だけ阻害する(表7および図1)。hsa-miR-34aはCalu-3細胞において最大の阻害活性を有し、増殖を71.49%だけ低減する。hsa-miR-34aの増殖阻害活性は濃度 ≧10 μMのエトポシドのそれに匹敵する。hsa-miR-34aは、試験した全ての肺がん細胞において治療的反応を誘導するので、hsa-miR-34aは、肺がんおよび他の悪性病変を有する広範囲の患者に治療的有益性をもたらしうる。
【０２７９】
長期にわたるhsa-miR-34aの治療的活性を評価するため、本発明者らはH226肺がん細胞において最大31日間miRNAの存在下で増殖曲線実験を行った。合成miRNAのような、裸の干渉RNAのインビトロでのトランスフェクションは、本質的に一過性であり、進行している細胞分裂の間のオリゴの希釈によって損なわれるので、miRNAを複数の時点で投与した(Bartlett et al., 2006; Bartlett et al., 2007)。多量の細胞へのmiRNAの送達に適応させるため、hsa-miR-34aまたは陰性対照のmiRNAを電気穿孔法によって送達した。手短に言えば、H226 1×106個を、BioRad Gene Pulser Xcell(商標)装置(BioRad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA)を用いて1.6 μM hsa-miR-34aまたは陰性対照により三通り電気穿孔処理し、播種し、通常の増殖培地中で増やした。対照細胞が集密度に達した時点(6日目、17日目および25日目)で、細胞を収集し、計数し、各miRNAで再び電気穿孔処理した。両条件の処理が同様であることを確実にするため、および指数関数的増殖に適応させるため、2回目および3回目の電気穿孔に用いる細胞数を最も少ない計数に漸減した。これらの電気穿孔事象から式PD=ln(Nf/N0)/ln2を用いて、および新たに播種された細胞のおよそ72%がプレートに接着するという事実に合わせて集団の倍加を計算した。細胞数を外挿し、均等目盛でプロットした(図2)。矢印は電気穿孔処理日を表す。グラフ中には標準偏差を含めてある。
【０２８０】
hsa-miR-34aの反復投与は、ヒト肺がん細胞の増殖を強く阻害した(図2)。対照的に、陰性対照のmiRNAで処理した細胞は通常の指数関数的増殖を示した。対照細胞の増殖(100%)と比べて、hsa-miR-34aによる処理は31日目にH226細胞増殖の94.9%の阻害(5.1%の残存細胞)をもたらした。
【０２８１】
このデータは、hsa-miR-34aがヒト肺がん細胞の処理において有用な治療的手段を提供することを示している。
【０２８２】
実施例6: HSA-MIR-34Aは特異的なヒトマイクロ-RNAとの組み合わせで、ヒト肺がん細胞株の増殖を相乗的に阻害する
miRNAは、複数の細胞過程を制御する複数の経路において機能する。がん細胞はいくつかの異なる経路の異常を示すことが多く、それによってその発がん性が決まる。それゆえに、がん患者に複数のmiRNAを投与することで、単一のmiRNAの投与に比べて優れた治療的有益性が得られる場合がある。本発明者らは、hsa-miR-124a、hsa-miR-126、hsa-miR-147、hsa-let-7b、hsa-let-7cまたはhsa-let-7g (Pre-miR(商標) miRNA, Ambionカタログ番号AM17100)のいずれかと同時にhsa-miR-34aを投与して、対でのmiRNAの組み合わせの効力を評価した。600 pMの全オリゴヌクレオチドとなる終濃度300 pMの各miRNAにより、三通りでH460肺がん細胞を一過的に逆トランスフェクトした。陰性対照の場合、600 pMのPre-miR(商標)マイクロRNA前駆体分子-陰性対照#2 (Ambionカタログ番号AM17111)を用いた。各種組み合わせの作用を単独のmiRNAの作用と関連付けるため、300 pMの各miRNAを300 pMの陰性対照miRNAとも組み合わせた。逆トランスフェクションは以下のパラメータを用いて行った: 96ウェルにつき細胞7,000個、OptiMEM (Invitrogen) 20 μl中Lipofectamine(商標) 2000 (Invitrogen) 0.15 μl、トランスフェクション全量100 μl。miRNAの効力の内部対照として、トランスフェクションから24時間後、エトポシドを10 μMおよび50 μMでモックトランスフェクト細胞にその後48時間加えておいた。細胞をトランスフェクションから72時間後に収集し、Alamar Blueアッセイ法(Invitrogen)に供した。Alamar Blueアッセイ法から得た増殖割合の値を、600 pMの陰性対照miRNAで処理した細胞から得たものに対して規準化した。データを陰性対照のmiRNA処理細胞に対する増殖%として表す(表8、図3)。
【０２８３】
300 pMの陰性対照miRNAとの組み合わせでの300 pM hsa-miR-34aのトランスフェクションでは、H460細胞の増殖を0.42%だけ低減する(600 pMの陰性対照miRNAで処理した細胞に対して99.58%の増殖: 表8および図3)。対での組み合わせ(例えば、hsa-miR-147を加えたhsa-miR-34a)の相加的活性は、各miRNAの単独の活性よりも高い活性と定義される(例えば、hsa-miR-147を加えたhsa-miR-34aの活性はNCを加えたhsa-miR-34aで認められるものよりも高く、hsa-miR-147を加えたhsa-miR-34aの活性はNCを加えたhsa-miR-147で認められるものよりも高い)。対での組み合わせの相乗的活性は、各miRNAの単独の活性の和よりも高い活性と定義される(例えば、hsa-let-7gを加えたhsa-miR-34aの活性はNCを加えたhsa-miR-34aの活性およびNCを加えたhsa-let-7gの活性の和で認められるものよりも高い)。このデータはhsa-miR-124a、hsa-miR-126、hsa-miR-147、hsa-let-7b、hsa-let-7cまたはhsa-let-7gと組み合わせたhsa-miR-34aが、相加的または相乗的活性をもたらすことを示す(表8および図3)。それゆえ、hsa-miR-34aと他のmiRNAとの組み合わせをがん患者に投与することで、肺がんの処置において優れた治療的反応が誘導されうる。miRNAの組み合わせ使用はがんおよび他の疾患に潜在的に有用な治療に当たる。
【０２８４】
（表８）対でのmiR-34a miRNAの組み合わせの存在下におけるH460肺がん細胞の細胞増殖
2010529966.tif 000127
値は、600 pMの陰性対照(NC) miRNAをトランスフェクトした細胞から得た値に対して規準化してある。SD, 標準偏差; S, 相乗的作用; A, 相加的作用。
【０２８５】
実施例7: 合成HSA-MIR-34Aはマウスにおいてヒト肺がん異種移植片の腫瘍増殖を阻害する
本発明者らは、免疫不全マウスにおいて増殖されたヒト肺がん異種移植片におけるhsa-miR-34aの増殖阻害活性を評価した。各3×106個のヒトH460非小細胞肺がん細胞をBD Matrigel(商標), (BD Biosciences; San Jose, CA, USA; カタログ番号356237)と1:1の比率で混合し、23匹のNOD/SCIDマウス(Charles River Laboratories, Inc.; Wilmington, MA, USA)の背下部に皮下注射した。動物が触知可能な腫瘍を発現したら(異種移植片の移植後11日目)、11日目、14日目および17日目に動物6匹の群に、脂質に基づくsiPORT(商標)アミン送達剤(Ambion, Austin, TX; カタログ番号AM4502)により製剤化したhsa-miR-34a (Dharmacon, Lafayette, CO) 各6.25 μgの腫瘍内注射を与えた。動物6匹の対照群には、hsa-miR-34aに用いたのと同じ注射日程にしたがって、陰性対照miRNA (NC; Dharmacon, Lafayette, CO) 各6.25 μgの腫瘍内注射を与えた。20 gのマウス平均体重を考慮すると、この用量は0.3125 mg/kgに等しい。さらに、H460腫瘍を持ったマウス6匹の群に、いずれかのオリゴヌクレオチドを欠くsiPORT(商標)アミン送達製剤の腫瘍内注射を与え、動物5匹の群にリン酸緩衝生理食塩水(PBS)の腫瘍内注射を与えた。カリパス測定値を1〜2日ごとにとり、腫瘍体積を、体積 = 長さ×幅×幅/2、ここで長さが幅よりも大きいという式を用いて計算した。平均腫瘍体積、標準偏差およびp値を経時的に計算しプロットした(図4)。
【０２８６】
図4に示されるように、3用量のhsa-miR-34aによってH460樹立肺腫瘍の増殖が強く阻害された(白四角形)。19日目に、hsa-miR-34aで処理した腫瘍の平均体積は196 mm3であった。対照的に、陰性対照のmiRNAで処理した腫瘍(黒菱形)は、安定したペースで増殖し、19日目に421 mm3の平均サイズを有する腫瘍を生じた。陰性対照の腫瘍は、PBSまたはsiPORTアミンのみの対照のいずれかで処理した腫瘍と同じくらい早く発現し、hsa-miR-34aの治療的活性が特異的であることを示唆していた。
【０２８７】
このデータは、肺がんを有する患者の処置においてhsa-miR-34aが特に有用な候補に当たることを示している。hsa-miR-34aの治療的活性は、処置前に発現した腫瘍の腫瘍増殖をhsa-miR-34aが阻害するという事実が浮き彫りにしている。
【０２８８】
さらに、このデータは、脂質に基づく製剤におけるhsa-miR-34aの治療的有用性も実証している。
【０２８９】
実施例8: 合成HSA-MIR-34Aはヒト前立腺がん細胞の増殖を阻害する
本発明者らは、4種類の個別のヒト前立腺がん細胞株を用いることによって前立腺がんに対するhsa-miR-34aの治療的作用を評価した。前立腺がん細胞の細胞増殖を測定するため、以下の前立腺がん細胞株を用いた: 骨転移に由来するPPC-1; 脳転移に由来するDu145; ヒトパピローマウイルス18により不死化され、K-RASがん遺伝子により形質転換された前立腺細胞に由来するRWPE2; およびリンパ節転移に由来するLNCaP (Bello et al., 1997; Pretlow et al., 1993; Stone et al., 1978; Brothman et al., 1991; Horoszewicz et al., 1980)。PPC-1およびDu145細胞は、前立腺特異抗原(PSA)の発現を欠いており、アンドロゲン受容体(AR)シグナル伝達とは無関係である。対照的に、RWPE2およびLNCaP細胞は、PSAおよびARの検査の結果が陽性である。脂質に基づくトランスフェクション試薬を用い96ウェルの形式で、細胞に合成hsa-miR-34a (Pre-miR(商標)-hsa-miR-34a, Ambionカタログ番号AM17100)または陰性対照のmiRNA (NC; Pre-miR(商標) マイクロRNA前駆体分子-陰性対照#2; Ambionカタログ番号AM17111)をトランスフェクトした。脂質に基づく逆トランスフェクションは、公開されたプロトコル(Ovcharenko et al., 2005)および以下のパラメータにしたがって三通りで行った: 細胞(96ウェルにつき6,000〜7,000個)、OptiMEM (Invitrogen) 20 μl中リポフェクトアミン(商標) 2000 (カタログ番号11668-019, Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA) 0.1〜0.2 μl、100 μl中にて終濃度30 nMのmiRNA。増殖は、トランスフェクションから4〜7日後、Alamar Blue(商標) (Invitrogen)を用い製造元の使用説明書にしたがって評価した。細胞増殖の阻害の対照として、Eg5としても知られる、モータータンパク質のキネシン11に対するsiRNAを用いた。Eg5は、ほとんどの真核細胞の細胞生存に不可欠であり、その欠如によって細胞増殖の低減および細胞死が起こる(Weil et al., 2002)。miRNAに適用したのと同じ実験パラメータにしたがい脂質に基づくトランスフェクションでsiEg5を用いた。蛍光単位(FLU)を3時間後に測定し、対照に対して規準化し、増殖の割合の変化としてプロットした。陰性対照のmiRNAで処理した細胞(100%)に対するhsa-miR-34a処理細胞の増殖割合を表9および図5に示す。
【０２９０】
（表９）hsa-miR-34a、Eg5に特異的なsiRNA (siEg5)、または陰性対照のmiRNA (NC)で処理したヒト前立腺がん細胞株の増殖割合(%)
2010529966.tif 000128
値は、陰性対照のmiRNAをトランスフェクトした細胞から得た値(100%の増殖)に対して規準化してある。NC, 陰性対照のmiRNA; siEg5, Eg5に特異的なsiRNA; SD, 標準偏差。
【０２９１】
hsa-miR-34aの送達は、ヒト前立腺がん細胞PPC-1、Du145、LNCaPおよびRWPE2の細胞増殖を阻害する(表9および図5)。平均して、hsa-miR-34aは細胞増殖を37.18%だけ阻害する。hsa-miR-34aの増殖阻害活性は、Eg5に対するsiRNAのそれに匹敵する。hsa-miR-34aは試験した全ての前立腺がん細胞において治療的反応を誘導するので、hsa-miR-34aは、前立腺がんおよび他の悪性病変を有する広範囲の患者に治療的有益性をもたらしうる。
【０２９２】
長期にわたるhsa-miR-34aの治療的活性を評価するため、本発明者らは、最大22日間miRNAの存在下で増殖曲線実験を行った。合成miRNAのような、裸の干渉RNAのインビトロでのトランスフェクションは、本質的に一過性であり、進行している細胞分裂の間のオリゴの希釈によって損なわれるので、miRNAを複数の時点で投与した(Bartlett et al., 2006; Bartlett et al., 2007)。多量の細胞へのmiRNAの送達に適応させるため、本発明者らは電気穿孔法を用いて、hsa-miR-34aまたは陰性対照のmiRNAをPPC-1、PC3およびDu145ヒト前立腺がん細胞に送達した。手短に言えば、PPC-1もしくはPC3細胞1×106個、またはDu145細胞0.5×106個を、BioRad Gene Pulser Xcell(商標)装置(BioRad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA)を用いて1.6 μM hsa-miR-34aまたは陰性対照により電気穿孔処理し、播種し、通常の増殖培地中で増やした。PC3およびDu145細胞による実験は三通りで行った。対照細胞が集密度に達した時点(PPC-1の場合4日目および11日目; PC3およびDu145の場合7日目および14日目)で、細胞を収集し、計数し、各miRNAで再び電気穿孔処理した。両条件の処理が同様であることを確実にするため、および指数関数的増殖に適応させるため、2回目および3回目の電気穿孔に用いる細胞数を最も少ない計数に漸減した。これらの電気穿孔事象から式PD=ln(Nf/N0)/ln2を用いて、および新たに播種された細胞のおよそ72%がプレートに接着するという事実に合わせて集団の倍加を計算した。細胞数を外挿し、均等目盛でプロットした(図6)。矢印は電気穿孔処理日を表す。グラフ中には標準偏差を含めてある。
【０２９３】
hsa-miR-34aの反復投与は、ヒト前立腺がん細胞の増殖を強く阻害した(図6、白四角形)。対照的に、陰性対照のmiRNAで処理した細胞は通常の指数関数的増殖を示した(図6、黒菱形)。対照細胞の増殖(100%)と比べて、hsa-miR-34aによる処理は21日目にPC3細胞増殖の97.2%の阻害(陰性対照のmiRNAで電気穿孔処理した細胞に対して2.8%の細胞)をもたらし、19日目にDu145細胞増殖の93.1%の阻害(陰性対照のmiRNAで電気穿孔処理した細胞に対して6.9%の細胞)をもたらした。hsa-miR34aで電気穿孔処理したPPC-1細胞は全て22日目までになくなった。
【０２９４】
このデータは、hsa-miR-34aがヒト前立腺がん細胞の処理において有用な治療的手段を提供することを示している。
【０２９５】
実施例9: 合成HSA-MIR-34Aはマウスにおいてヒト前立腺がん異種移植片の腫瘍増殖を阻害する
インビトロでの研究は、培養ヒト前立腺がん細胞におけるhsa-miR-34aの治療的活性を実証するものである。それゆえ、hsa-miR-34aは動物において前立腺腫瘍の増殖を妨げる可能性が高い。この可能性を探るため、合成hsa-miR-34a miRNAの治療可能性を、PPC-1ヒト前立腺がん異種移植片を用い動物において評価した。動物1匹につきPPC-1細胞5×106個を、BD Matrigel(商標), (BD Biosciences; San Jose, CA, USA; カタログ番号356237)と1:1の比率で混合した1.6 μMの合成hsa-miR-34aまたは陰性対照miRNA (Pre-miR(商標)-hsa-miR-34a, Ambionカタログ番号AM17100; NC, Pre-miR(商標) マイクロRNA前駆体分子-陰性対照#2, Ambionカタログ番号AM17111)により電気穿孔処理し、NOD/SCIDマウス(Charles River Laboratories, Inc.; Wilmington, MA, USA)の背下部に皮下移植した。マウス7匹の群にhsa-miR-34a処理PPC-1細胞を注射し、動物7匹の群に陰性対照miRNAで処理したPPC-1細胞を注射した。安定したレベルのmiRNAを維持するため、脂質に基づくsiPORT(商標)アミン送達剤(Ambion, Austin, TX; カタログ番号AM4502)に抱合されたhsa-miR-34aまたは陰性対照miRNA各6.25 μgを腫瘍内注射により7日目、13日目、20日目および25日目に繰り返し投与した。20 gのマウス平均体重を考慮すると、この用量は0.3125 mg/kgに等しい。32日間1〜2日ごとにカリパス測定値をとることにより、腫瘍の増殖をモニタリングした。腫瘍体積を、体積 = 長さ×幅×幅/2、ここで長さは幅よりも大きいという式を用いて計算し、経時的にプロットした(図7)。グラフ中には標準偏差を示してある。全てのデータ点がp値 < 0.01を有していた。p値は、22日目に得られたデータの場合1.86×10-9ほどに低く、統計的有意性を示唆している。
【０２９６】
hsa-miR-34aを繰り返し投与したところ、ヒトPPC-1前立腺がん異種移植片の腫瘍増殖が遮断された(図7、白四角形)。hsa-miR-34aを受けた腫瘍の平均体積は32日目に151 mm3であった。新たに移植された腫瘍の体積は111〜155 mm3に及び(4〜7日目)、かくして、PPC-1腫瘍はhsa-miR-34a処理に反応して発現しえなかった。対照的に、陰性対照miRNAで局所的に処理した腫瘍は、影響を受けず、安定したペースで増殖し続けた(図7、黒菱形)。陰性対照miRNAで処理した腫瘍の平均体積は32日目に437 mm3であった。注目すべきは、hsa-miR-34aによる各単回投与が腫瘍体積の急性的退縮を引き起こした。この作用は陰性対照のmiRNAでは誘導されず、hsa-miR-34aの抗腫瘍活性が特異的であることが示唆された。
【０２９７】
組織学的分析により、陰性対照miRNAで処理したPPC-1腫瘍ではかなりの、生存可能な前立腺がん細胞が密集していることが明らかになった(図8)。対照的に、hsa-miR-34aで処理した腫瘍では、細胞残屑およびまばらに分布した細胞を含むマトリゲル、ならびに外見的には生存可能な細胞を含む散発的なポケットが大半を占めていた(図8、矢印)。これらの細胞の生物学的状態のさらなる洞察を得るため、増殖マーカーKi-67、およびアポトーシスの指標であるカスパーゼ3に特異的な免疫組織化学分析を行った。図9に示すように、hsa-miR-34aで処理した腫瘍において生存可能な細胞を含む領域は、Ki-67レベルの低下およびカスパーゼ3レベルの増加を示した。このデータは、hsa-miR-34aが抗増殖性のおよびアポトーシス促進性の機構によって腫瘍増殖を阻害することを示している。
【０２９８】
このデータは、hsa-miR-34aが、前立腺がんを有する患者の処置において強力な治療的手段を提供することを示している。
【０２９９】
さらに、このデータは、脂質に基づく製剤におけるhsa-miR-34aの治療的有用性を実証している。
【０３００】
参照文献
以下の参照文献は、本明細書において記載されるものを補完する例示的な手順の詳細またはその他の詳細を提供するという程度に、参照により本明細書に具体的に組み入れられる。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年5月18日(2010.5.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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