(57)【要約】本発明は、癌の治療における使用に適した部分のキットに関し、ここにおいて、前記キットは以下を含み：（ｉ）１または複数の腫瘍関連抗原の１または複数のエピトープを有する１または複数のポリペプチドを含む組換えタンパク質（ここにおいて、前記ポリペプチドは、アデニル酸シクラーゼ（ＣｙａＡ）タンパク質またはその断片の同一または異なる許容部位（ｐｅｍｉｓｓｉｖｅ  ｓｉｔｅｓ）に挿入されており、前記ＣｙａＡ断片は、抗原提示細胞を標的とする前記アデニル酸シクラーゼタンパク質の特質を維持している）、または、そのような組換えタンパク質の混合物（ここにおいて、少なくとも１つの前記エピトープ、または腫瘍関連抗原、またはＣｙａＡタンパク質の挿入部位、または前記ＣｙａＡタンパク質の断片は、混合物中の様々な組換えタンパク質の間で異なっている）；および、前記部分のキットは更に、少なくとも１つの以下の化合物を含む；（ｉｉ）患者における制御性免疫応答の調整に適した薬剤、および、任意に、（ｉｉｉ）患者における先天性免疫応答の活性化に適したアジュバント成分。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗癌療法における使用に適した化合物を含む部分のキットであって、ここにおいて前記部分のキットの前記化合物は、
（ｉ）１または複数の腫瘍関連抗原の１または複数のエピトープを有する１または複数のポリペプチドを含む組換えタンパク質（ここにおいて、前記ポリペプチドは、アデニル酸シクラーゼ（ＣｙａＡ）タンパク質またはその断片の同一または異なる許容部位に挿入されており、前記ＣｙａＡ断片は、抗原提示細胞を標的化する前記アデニル酸シクラーゼタンパク質の特質を維持している）、または、そのような組換えタンパク質の混合物（ここにおいて、少なくとも１つの前記エピトープ、または腫瘍関連抗原、またはＣｙａＡタンパク質の挿入部位、または前記ＣｙａＡタンパク質の断片は、混合物中の様々な組換えタンパク質の間で異なっている）を含み；更に、
（ｉｉ）患者における制御性細胞応答の調整に適した薬剤、
を含む部分のキット。
【請求項２】
以下のそれぞれの化合物を含む、請求項１に記載の部分のキット：
（ｉ）１または複数の腫瘍関連抗原の１または複数のエピトープを有する１または複数のポリペプチドを含む組換えタンパク質（ここにおいて、前記ポリペプチドは、アデニル酸シクラーゼ（ＣｙａＡ）タンパク質またはその断片の同一または異なる許容部位に挿入されており、前記ＣｙａＡ断片は、抗原提示細胞を標的とする前記アデニル酸シクラーゼタンパク質の特質を維持している）、または、そのような組換えタンパク質の混合物（ここにおいて、少なくとも１つの前記エピトープ、または腫瘍関連抗原、またはＣｙａＡタンパク質の挿入部位、または前記ＣｙａＡタンパク質の断片は、混合物中の様々な組換えタンパク質の間で異なっている）；
（ｉｉ）患者における制御性細胞応答の調整に適した薬剤；および
（ｉｉｉ）患者における先天性免疫応答の活性化に適したアジュバント成分。
【請求項３】
請求項１または２に記載の部分のキットであって、同一または異なる腫瘍関連抗原の異なるエピトープを有する、少なくとも２つの異なる組換えＣｙａＡタンパク質またはその断片を含む部分のキット。
【請求項４】
請求項２または３に記載の部分のキットであって、患者における先天性免疫応答の活性化に適した前記アジュバント成分が、核酸、ペプチドグリカン、炭水化物、ペプチド、サイトカイン、ホルモンおよび小分子から成る成分の群から選択され、前記アジュバント成分が、パターン認識受容体（ＰＲＲｓ）を介したシグナル伝達が可能である部分のキット。
【請求項５】
請求項４に記載の部分のキットであって、前記アジュバント成分によって標的化されるパターン認識受容体が、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、ヌクレオチド結合オリゴマー形成ドメイン（ＮＯＤ）タンパク質またはＣ型レクチンである部分のキット。
【請求項６】
請求項２から５の何れか１項に記載の部分のキットであって、患者の先天性免疫応答の活性化に適した前記アジュバント成分が、ＴＬＲアゴニストである部分のキット。
【請求項７】
請求項６に記載の部分のキットであって、前記ＴＬＲアゴニストが、ＴＬＲ−９、ＴＬＲ−８、ＴＬＲ−３およびＴＬＲ−７アゴニストの群から選択される部分のキット。
【請求項８】
請求項６または７に記載の部分のキットであって、前記ＴＬＲアゴニストが、合成ＴＬＲアゴニストまたは合成ＴＬＲアゴニストの組み合わせである部分のキット。
【請求項９】
請求項８に記載の部分のキットであって、前記ＴＬＲアゴニストが、ＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮｓ）、一本鎖ＲＮＡポリウリジン（ｐＵ）、イミダゾキノリンアミン誘導体、例えばＲ８４８（レスキモド）またはＲ８３７（イミキモド）、ポリシチジル酸（ＰＩＣ）の群から選択される部分のキット。
【請求項１０】
請求項１から９の何れか１項に記載の部分のキットであって、制御性細胞応答の調整に適した前記薬剤が、患者における制御性Ｔ細胞応答の調整に適した薬剤であり、且つ、制御性Ｔ細胞の免疫抑制能力を低下させまたは遮断することができる部分のキット。
【請求項１１】
請求項１から９の何れか１項に記載の部分のキットであって、制御性細胞応答の調整に適した前記薬剤が、患者における骨髄性サプレッサー細胞（ＭＳＣｓ）の活性の調整に適した薬剤である部分のキット。
【請求項１２】
請求項１１に記載の部分のキットであって、制御性Ｔ細胞応答を調節する前記薬剤が、これらの細胞を減少または失活させることによって、前記制御性Ｔ細胞の輸送を変化させることによって、または、前記細胞の分化およびシグナル伝達を変化させることによって、前記制御性Ｔ細胞を標的化する部分のキット。
【請求項１３】
請求項１０または１１に記載の部分のキットであって、制御性応答を調節する前記薬剤が、ＡＰＣｓまたはＴ細胞における抑制性の分子を標的化する、または、可溶性抑制分子を標的化する部分のキット。
【請求項１４】
請求項１から１２の何れか１項に記載の部分のキットであって、制御性応答を調節する前記薬剤が、腫瘍の負担を減少させること、腫瘍細胞のＣＴＬ感受性を増加させること、または、免疫制御性Ｔ細胞の数および／または活性を減少させることにおけるその特性のために選択された化学療法剤である部分のキット。
【請求項１５】
請求項１０から１４の何れか１項に記載の部分のキットであって、前記化学療法剤が、シクロホスファミドといったアルキル化剤である部分のキット。
【請求項１６】
請求項１０から１４の何れか１項に記載の部分のキットであって、前記化学療法剤が、挿入剤である部分のキット。
【請求項１７】
請求項２から１６の何れか１項に記載の部分のキットであって、前記アジュバント成分、特にＴＬＲ−アゴニストが、リポソーム懸濁剤として処方される部分のキット。
【請求項１８】
請求項１から１７の何れか１項に記載の部分のキットであって、抗癌療法における使用に適した（ｉ）組換えタンパク質および（ｉｉ）ＴＬＲアゴニストが、時間的に同時の投与のために処方される部分のキット。
【請求項１９】
請求項１４、１５または１６に記載の部分のキットであって、前記化学療法剤が、組換えタンパク質ＴＬＲリガンドに関して、先の、後のまたはその両方の経時的投与のために処方される部分のキット。
【請求項２０】
請求項１から１９の何れか１項に記載の部分のキットであって、ＨＰＶ感染に苦しむ患者における免疫応答を刺激および／または増強するための使用のための部分のキット。
【請求項２１】
請求項１から２０の何れか１項に記載の部分のキットであって、前記腫瘍関連抗原が、腫瘍関連ＨＰＶ抗原である部分のキット。
【請求項２２】
請求項２０に記載の部分のキットであって、癌がＨＰＶ感染に関連する抗癌療法における使用のための部分のキット。
【請求項２３】
請求項１から１９の何れか１項に記載の部分のキットであって、腫瘍関連抗原が、メラノーマ、特に転移性メラノーマ；肺癌；頭頚部癌；食道癌；膀胱癌、特に浸潤性膀胱癌；前立腺癌；乳癌；結腸直腸癌；腎臓細胞癌；肉腫；白血病；骨髄腫に特有である部分のキット。
【請求項２４】
請求項１から２３の何れか１項に記載の部分のキットであって、前記腫瘍が、血管新生化、浸潤性または転移性腫瘍を含む、確立された腫瘍である、または、前記癌が進行癌である部分のキット。
【請求項２５】
請求項１から２４の何れか１項に記載の部分のキットであって、前記組換えタンパク質が、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８抗原提示細胞を標的化する前記アデニル酸シクラーゼタンパク質の特性を維持するＣｙａＡタンパク質の断片を含む部分のキット。
【請求項２６】
請求項２５に記載の部分のキットであって、前記組換えタンパク質が、前記標的化細胞の細胞質への、前記ポリペプチドの前記エピトープの移行または前記ポリペプチドの移行を可能にするＣｙａＡの特性を維持するＣｙａＡタンパク質の断片を含む部分のキット。
【請求項２７】
請求項１から２６の何れか１項に記載の部分のキットであって、前記組換えタンパク質が、ＣｙａＡタンパク質の断片の同一または異なる許容部位に挿入された、１または複数の腫瘍関連抗原、特にＨＰＶ抗原の１または複数のエピトープを有するポリペプチドを含み、前記断片が約３０から約１３００のアミノ酸残基を含み、前記断片が、前記ＣｙａＡタンパク質のアミノ酸残基１２０８から１２４３または前記ＣｙａＡタンパク質のアミノ酸残基１１６６から１２８１を包含する部分のキット。
【請求項２８】
請求項１から２４の何れか１項に記載の部分のキットであって、前記組換えタンパク質が、前記ポリペプチドの、前記標的化細胞の細胞質への移行を可能にする能力を有する全長ＣｙａＡタンパク質である部分のキット。
【請求項２９】
請求項２８に記載の部分のキットであって、前記ＣｙａＡタンパク質が、コドン２２４から２２５の間の位置に相当する位置における、１または複数のポリペプチドの挿入によって組み込まれた部分のキット。
【請求項３０】
請求項１から２９の何れか１項に記載の部分のキットであって、前記組換えタンパク質が、約５から約５００若しくは約５から約２００若しくは約１０から約５０のアミノ酸残基または約３０若しくは５０から２００のアミノ酸残基を含むポリペプチド、および／または、前記アミノ酸残基を一緒に含む複数のポリペプチドを含む部分のキット。
【請求項３１】
請求項１から３０の何れか１項に記載の部分のキットであって、前記ポリペプチドに対する抗原特異的応答を誘発することができる部分のキット。
【請求項３２】
請求項２０から２２の何れか１項に記載の部分のキットであって、１または複数のエピトープを有し、前記組換えタンパク質に含まれる少なくとも１つのポリペプチドが、発癌性ＨＰＶ、特にＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５２またはＨＰＶ５８に由来する部分のキット。
【請求項３３】
請求項２０から２２の何れか１項または請求項３２に記載の部分のキットであって、１または複数のエピトープを有し、前記組換えタンパク質に含まれるポリペプチドが、Ｌ１、Ｌ２、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４およびＥ５タンパク質の中から選択されるＨＰＶ抗原に由来する部分のキット。
【請求項３４】
請求項１から２２の何れか１項または請求項３２に記載の部分のキットであって、１または複数のエピトープを有し、前記組換えタンパク質に含まれるポリペプチドが、ＨＰＶ１６および／またはＨＰＶ１８のＥ６またはＥ７タンパク質に由来する部分のキット。
【請求項３５】
請求項１から２２の何れか１項または請求項３２から３４の何れか１項に記載の部分のキットであって、１または複数のエピトープを有し、前記組換えタンパク質に含まれる複数のポリペプチド（前記ポリペプチドは、１または複数のＨＰＶ抗原に由来する）を含む部分のキット。
【請求項３６】
請求項３４または３５に記載の部分のキットであって、１または複数のエピトープを有するポリペプチドが、ＨＰＶ１６のＥ７タンパク質に、または、ＨＰＶ１８のＥ７タンパク質に由来する部分のキット。
【請求項３７】
請求項３４から３６の何れか１項に記載の部分のキットであって、１または複数のエピトープを有し、前記組換えタンパク質に含まれるポリペプチドが、全長Ｅ６またはＥ７タンパク質である部分のキットである。
【請求項３８】
請求項１から３７の何れか１項に記載の部分のキットであって、前記ＣｙａＡ配列またはその断片の異なる許容部位に挿入される、組換えタンパク質に含まれる複数のポリペプチドを含む部分のキット。
【請求項３９】
請求項３８に記載の部分のキットであって、前記組換えタンパク質に含まれる複数のポリペプチドが、ＨＰＶ１６のＥ７タンパク質の残基１から２９を含む断片および／または残基４２から９８を含む断片、または両断片を包含し、前記ポリペプチドが、前記ＣｙａＡタンパク質またはその断片の異なる許容部位に挿入される部分のキット。
【請求項４０】
請求項１から３９の何れか１項に記載の部分のキットであって、前記組換えタンパク質に含まれるポリペプチドが、アミノ酸配列ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ（Ｅ７４９−５７）および／またはＧＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣＣＫＣＤＳＴＬＲＬＣＶＱＳＴＨＶＤＩＲ（Ｅ７４３−７７）または（Ｉ／Ａ）（Ｄ／Ｓ）ＧＶＮＨＱＨＬを含む断片を包含する、または前記断片から成る部分のキット。
【請求項４１】
請求項１から４０の何れか１項に記載の部分のキットであって、前記組換えタンパク質に含まれる前記ポリペプチドまたは前記複数のポリペプチドが、分裂したナイーブＨＰＶ抗原から成り、前記分裂が、前記ＨＰＶ抗原の酸性領域の１または複数のアミノ酸残基の欠失から成り、および／または、前記アデニル酸シクラーゼの少なくとも２つの許容部位に挿入される前記ＨＰＶ抗原の少なくとも２つのポリペプチド断片に存する部分のキット。
【請求項４２】
請求項１から４１の何れか１項に記載の部分のキットであって、前記組換えタンパク質ＣｙａＡタンパク質が細菌性タンパク質である部分のキット。
【請求項４３】
請求項４２に記載の部分のキットであって、前記ＣｙａＡタンパク質が、ボルデテラ種、特にボルデテラ・ペルツシスに由来する部分のキット。
【請求項４４】
請求項１から４３の何れか１項に記載の部分のキットであって、前記組換えタンパク質がＣｙａＡタンパク質を含み、酵素活性が不活性化されており、特に遺伝的に不活性化されており、または、シクラーゼ活性に関するＣｙａＡのアミノ酸配列の部位にジペプチドが挿入された結果として不活性化された部分のキット。
【請求項４５】
請求項１から４４の何れか１項に記載の部分のキットであって、前記組換えタンパク質が、１または複数の抗原の１または複数のエピトープを有する１または複数のポリペプチドを含み、前記ポリペプチドが、アデニル酸シクラーゼ（ＣｙａＡ）タンパク質またはその断片の同一または異なる許容部位に挿入されており、前記ＣｙａＡ断片が、抗原提示細胞に標的化する前記アデニル酸シクラーゼタンパク質の特性を維持しており、少なくとも１つの前記エピトープが、亜優占的潜在性Ｔ細胞エピトープであり、および、前記組換えタンパク質が、前記ポリペプチドに対する抗原特異的応答を誘発できる部分のキット。
【請求項４６】
請求項４５に記載の部分のキットであって、前記潜在性エピトープが、ＨＰＶのエピトープ、特にＨＰＶのＥ７タンパク質のエピトープである部分のキット。
【請求項４７】
請求項４６に記載の部分のキットであって、前記潜在性エピトープが、ＨＰＶ１８  Ｅ７タンパク質のエピトープ、特に配列ＩＤＧＶＮＨＱＨＬを有するエピトープである部分のキット。
【請求項４８】
請求項２から４７の何れか１項に記載の部分のキットであって、（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）として示される前記化合物のうち２つが組成物として処方され、第３の化合物が独立して存在する部分のキット。
【請求項４９】
請求項４８に記載の部分のキットであって、ａ）前記組成物が、（ｉ）１または複数の腫瘍関連抗原の１または複数のエピトープを有する１または複数のポリペプチドを含む組換えタンパク質（ここにおいて、前記ポリペプチドは、アデニル酸シクラーゼ（ＣｙａＡ）タンパク質またはその断片の同一または異なる許容部位に挿入されており、前記ＣｙａＡ断片は、抗原提示細胞を標的化する前記アデニル酸シクラーゼタンパク質の特質を維持している）、または、そのような組換えタンパク質の混合物（ここにおいて、少なくとも１つの前記エピトープ、または腫瘍関連抗原、またはＣｙａＡタンパク質の挿入部位、または前記ＣｙａＡタンパク質の断片は、混合物中の様々な組換えタンパク質の間で異なっている）；および（ｉｉ）患者における先天性免疫応答の活性化に適したアジュバント成分を含み、および、ｂ）患者における制御性応答の調整に適した薬剤が独立に存在する部分のキット。
【請求項５０】
請求項１から４７の何れか１項に定義される化合物を含む組成物。
【請求項５１】
哺乳類宿主における細胞介在性免疫応答の誘発のための、請求項１から４７の何れか１項に記載の部分のキットまたは請求項５０に記載の組成物。
【請求項５２】
細胞介在性細胞溶解性免疫応答の誘発のための、請求項１から４７の何れか１項に記載の部分のキットまたは請求項５０に記載の組成物。
【請求項５３】
体液性免疫応答の誘発のための、請求項１から４７の何れか１項に記載の部分のキットまたは請求項５０に記載の組成物。
【請求項５４】
患者におけるＨＰＶ感染に起因した悪性転換の開始および維持の予防または治療のための、請求項１から４７の何れか１項に記載の部分のキットまたは請求項５０に記載の組成物。
【請求項５５】
浸潤性または血管新生化または転移性腫瘍の治療における使用のための請求項１から４７の何れか１項に記載の部分のキットまたは請求項５０に記載の組成物。
【請求項５６】
メラノーマ、癌腫、肉腫または白血病の治療における使用のための請求項１から４７の何れか１項に記載の部分のキットまたは請求項５０に記載の組成物。
【請求項５７】
少なくとも１つの前記部分のキットの化合物または組成物の２回以上の投与を包含する治療プロトコールにおける使用のための請求項５１から５６の何れか１項に記載の部分のキットまたは組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の概要】
【０００１】
本発明は、患者における免疫応答の適応性、先天性および／または制御性成分の標的化に基づく、癌の治療の設計に適した成分に関する。
【０００２】
本発明は、特に、適応性並びに先天性および／または制御性の免疫応答の成分を誘発することによりヒト患者における免疫系を標的化するのに適した化合物の、部分のキット（ａ  ｋｉｔ  ｏｆ  ｐａｒｔｓ）における、組み合わせ（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）に関する。
【０００３】
本発明は、それゆえ、それを必要とする患者の治療のための、特に悪性腫瘍または癌に苦しむ患者の治療のための、または、腫瘍の悪性転換の開始または維持を妨げるための部分のキットに関する化合物の仕様に関する。
【０００４】
特に、本発明は、ウィルスに誘導された癌、特に宿主におけるパピローマウイルス感染の後に誘導される癌の分野に関する。
【０００５】
古典的ワクチンの２つの主要な成分（すなわち抗原送達システムおよびアジュバント）を改善する熱心な努力にもかかわらず、ヒト悪性病変のためのマウス腫瘍モデルにて開発される免疫療法的アプローチの良好な実現は、主要な挑戦として残っている。樹状細胞（ＤＣｓ）に対する抗原を標的とするために、本発明者らはボルデテラ・ペルツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）のアデニル酸シクラーゼ（ＣｙａＡ）に基づく新規の送達系を開発した。ＣｙａＡは、αＭβ２インテグリン（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）に特異的に結合し（１）、その触媒ドメインをＣＤ１１ｂ＋細胞のサイトゾルに送達する（２）。この為、ＣｙａＡの触媒部位に挿入されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは、プロセスされ、それぞれＭＨＣクラスＩＩおよびＩ分子によってＤＣの表面に提示される（３）。本発明者らは、オボアルブミンタンパク質を保持する組換えＣｙａＡによる、この抗原を発現する腫瘍に対する処理によって、マウスにおいて強力な治療的抗腫瘍性免疫が誘導されたことを以前に報告した（４）。近年、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６のＥ７タンパク質の修飾された形態を保持する組換えＣｙａＡ（ＣｙａＡ−Ｅ７）は、Ｅ６／Ｅ７を発現するＴＣ−１細胞（ＨＰＶ関連異常増殖に対する免疫療法の有効性を試験するための実証モデル）の皮下移植によってもたらされる触診可能な腫瘍の根絶を誘導することが示された（５）（ＷＯ２００５／０８９７９２）。
【０００６】
子宮頚癌は、世界の女性において、乳癌に続いて２番目に頻度の高い癌であり、全体では５番目に頻度が高く、罹患率は１，４００，０００例と推定される（６）。現在、子宮頚癌は、一部の粘膜志向性のタイプのＨＰＶによる生殖器官の慢性感染症に起因することが示されている（７）。ＨＰＶ発癌性タンパク質Ｅ６およびＥ７の発現は、悪性転換の開始（８）および維持（９）に必要とされる。興味深いことに、Ｅ７に対する細胞性免疫は、ＨＰＶ誘導性の病変の臨床的および細胞学的な、回復に関連していることがわかった（１０）。これらの発見は、ＨＰＶ異常増殖の免疫療法戦略の開発のための有益な候補とする。
【０００７】
本発明者らは、現在、現在利用できる抗癌ワクチンについてどのような改善が実現できるかを検討している。彼らは、先天性免疫の刺激を通して、特に、感染に対する天然のセンサーであるＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲｓ）を通して、そのような改善を達成できるという仮説をたてた。ＴＬＲファミリーのメンバーの全てが、特定の構造的および機能的特性を共有するにもかかわらず、さまざまなＴＬＲｓによって送達されるシグナルは、質的および量的に異なる免疫応答を誘発する可能性がある（１１）。その他に想定される別のアプローチは、適応性免疫応答を誘発するワクチン候補と化学療法的化合物との組み合わせである。化学療法は、腫瘍の負担を減少させることによって、腫瘍細胞のＣＴＬ感受性を増加させることによって（１２）、または、免疫制御性細胞を殺す／不活性化させることによって（１３）、抗腫瘍性免疫の増強を助けることができる。
【０００８】
本発明において、本発明者らは異なる治療法を設計し、腫瘍関連抗原が組み込まれたＣｙａＡにより誘導される抗腫瘍性免疫を増強するそれらの能力について、特に、このワクチンが、巨大で確立した腫瘍の成長を制御できないような腫瘍の環境において比較した。
【０００９】
本発明は、抗癌療法における使用に適した化合物の部分のキットを提供し、ここにおいて前記部分のキットは、
（ｉ）１または複数の腫瘍関連抗原の１または複数のエピトープを有する１または複数のポリペプチドを含む組換えタンパク質（ここにおいて、前記ポリペプチドは、アデニル酸シクラーゼ（ＣｙａＡ）タンパク質またはその断片の同一または異なる許容部位（ｐｅｍｉｓｓｉｖｅ  ｓｉｔｅｓ）に挿入されており、前記ＣｙａＡ断片は、抗原提示細胞を標的化する前記アデニル酸シクラーゼタンパク質の特質を維持している）、または、そのような組換えタンパク質の混合物（ここにおいて、少なくとも１つの前記エピトープ、または腫瘍関連抗原、またはＣｙａＡタンパク質の挿入部位、または前記ＣｙａＡタンパク質の断片は、混合物中の様々な組換えタンパク質の間で異なっている）を含み；更に、
（ｉｉ）患者における制御性細胞応答の調整に適した薬剤を含む。
【００１０】
本発明の特定の実施態様において、調節される制御性細胞応答は、腫瘍（腫瘍微環境を含む）によって誘導される、リンパ系サプレッサー細胞応答、特に制御性Ｔ細胞応答の調節を包含する。
【００１１】
特定の実施態様において、調節される制御性細胞応答は、腫瘍（腫瘍微環境を含む）によって誘導される、骨髄性サプレッサー細胞（ＭＳＣ）反応の調節を包含する。
【００１２】
本発明の特定の実施態様において、部分のキットは、以下の化合物をそれぞれ含む：
（ｉ）１または複数の腫瘍関連抗原の１または複数のエピトープを有する１または複数のポリペプチドを含む組換えタンパク質（ここにおいて、前記ポリペプチドは、アデニル酸シクラーゼ（ＣｙａＡ）タンパク質またはその断片の同一または異なる許容部位に挿入されており、前記ＣｙａＡ断片は、抗原提示細胞を標的とする前記アデニル酸シクラーゼタンパク質の特質を維持している）、または、そのような組換えタンパク質の混合物（ここにおいて、少なくとも１つの前記エピトープ、または腫瘍関連抗原、またはＣｙａＡタンパク質の挿入部位、または前記ＣｙａＡタンパク質の断片は、混合物中の様々な組換えタンパク質の間で異なっている）；および、前記部分のキットは更に、少なくとも１つの以下の化合物を含む；
（ｉｉ）患者における制御性細胞応答の調整に適した薬剤、および
（ｉｉｉ）患者における先天性免疫応答の活性化に適したアジュバント成分。
【００１３】
本発明の別の特定の実施態様において、部分のキットの活性成分は、化合物（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のそれぞれから構成される。
【００１４】
「部分のキット」という表現は、それを必要とする患者に対して意図される治療法における、上に定義しおよび本願に開示される少なくとも２つの異なる化合物の組み合わせであって、これらの化合物の１つを、それを必要とする患者に単独で投与した場合では等しく得ることができない治療的効果を提供するための組み合わせに関する。前記組み合わせは、本発明にて定義される少なくとも２つの化合物（それらの化合物は別々に存在する）の、別々のまたは同時の、使用を必要とする。本願に定義される化合物の本発明による組み合わせは、それらの併用療法における使用により得られる新規の効果を提供する。
【００１５】
本発明によると、治療は、特に、ヒトさらに動物を含む、哺乳類の宿主（すなわち患者）のために意図される。
【００１６】
本発明の特定の実施態様において、部分のキットは、２以上の本願で定義される組換えＣｙａＡタンパク質を含む。
【００１７】
本発明はまた、以下を含む化合物に関する：（ｉ）１または複数の腫瘍関連抗原の１または複数のエピトープを有する１または複数のポリペプチドを含む組換えタンパク質（ここにおいて、前記ポリペプチドは、アデニル酸シクラーゼ（ＣｙａＡ）タンパク質またはその断片の同一または異なる許容部位に挿入されており、前記ＣｙａＡ断片は、抗原提示細胞を標的とする前記アデニル酸シクラーゼタンパク質の特質を維持している）、または、そのような組換えタンパク質の混合物（ここにおいて、少なくとも１つの前記エピトープ、または腫瘍関連抗原、またはＣｙａＡタンパク質の挿入部位、または前記ＣｙａＡタンパク質の断片は、混合物中の様々な組換えタンパク質の間で異なっている）；および、（ｉｉ）患者における制御性細胞応答の調整に適した薬剤。
【００１８】
組成物はまた、（ｉｉｉ）患者における先天性免疫応答の活性化に適したアジュバント成分を含んでもよい。
【００１９】
組成物において、成分は、好ましくは混合物中に存在する。
【００２０】
本発明はまた、上記の通り定義した（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の化合物を含む部分のキットであって、これらの化合物のうちの２つが組成物において組み合わせられ、第３の化合物は独立して存在するキットに関する。
【００２１】
本発明による特定の部分のキットは、１または複数の腫瘍関連抗原の１または複数のエピトープを有する１または複数のポリペプチドを含む組換えタンパク質（ここにおいて、前記ポリペプチドは、アデニル酸シクラーゼ（ＣｙａＡ）タンパク質またはその断片の同一または異なる許容部位に挿入されており、前記ＣｙａＡ断片は、抗原提示細胞を標的とする前記アデニル酸シクラーゼタンパク質の特質を維持している）、または、そのような組換えタンパク質の混合物（ここにおいて、少なくとも１つの前記エピトープ、または腫瘍関連抗原、またはＣｙａＡタンパク質の挿入部位、または前記ＣｙａＡタンパク質の断片は、混合物中の様々な組換えタンパク質の間で異なっている）、および、患者における先天性免疫応答の活性化に適したアジュバント成分、および、独立した化合物としての、患者における制御性細胞応答の調整に適した薬剤を含む組成物を含む。
【００２２】
部分のキットまたは組成物の化合物の先天性免疫応答を活性化する能力は、最初に、スクリーニング、特にインビトロにおける機能的スクリーニングを用いて評価できる。
【００２３】
従って、免疫増強物質またはアジュバントはインビトロで免疫細胞を刺激し、それにより、免疫細胞によって、またはヒト末梢血単核細胞を含む一次性の細胞（ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｅｌｌｓ）によって、誘導されるサイトカインおよび／または生産されるケモカインの測定が可能となることが認められているため、先天性免疫応答の活性化は、インビトロにおいて、樹状細胞といった細胞で試験できる。測定は、ＥＬＩＳＡアッセイといったアッセイを行うことで実施できる。先天性免疫応答の推定されるまたは既知の増強物質の活性を測定するためのその他の試験は、本発明によるアジュバント成分として作用する能力を測定するために、実施例に開示される。
【００２４】
本願に記述される組換えＣｙａＡタンパク質の機能的活性に依存する適応性免疫応答の活性化は実施例に示されるように試験することができ、特に、前記組換えＣｙａＡタンパク質による処理の後に、四量体またはインビボ溶解によるＴ細胞の細胞毒性活性を測定することによって、または、腫瘍細胞が播種された動物（特に哺乳類）における腫瘍成長を測定することによって試験することができる。後述する実施例に開示されるように、腫瘍成長はモデルと比較して測定することができる。
【００２５】
制御性細胞応答、特にＴ細胞の制御性細胞応答またはMSC反応の調節に適した薬剤は、制御性免疫細胞の減少を達成することに、または制御性免疫細胞を機能的に失活させることに、または担癌宿主における有害な免疫抑制効果を誘導する制御性免疫細胞応答を後退させることに適している。それは、さらに、または、代わりに、前記制御性免疫細胞の生成物の生産または活性を抑制してもよい。
【００２６】
制御性免疫応答の、特に腫瘍誘導された制御性Ｔ細胞応答の変化は、後述の実施例にて行われる試験を含む、インビボまたはインビトロにおける様々な試験を通して試験できる。適切な試験はまた、インビトロで実行できる。制御性Ｔ細胞は、ＣＤ４＋細胞（Ｔｒｅｇ細胞）の、またはヒトのＣＤ８＋細胞（ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞）およびマウスのＣＤ４＋細胞のサブグループを含む。アッセイの説明のために、特にＺｏｕらによる文献（Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ／Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ｖｏｌ  ６，  Ａｐｒｉｌ  ２００６，  ｐ２６５−３０５）が参照される。特に、ＡＰＣ（抗原提示細胞）における制御性Ｔ細胞の活性は、特に、ＡＰＣによるＢ７−Ｈ４発現の誘導（制御性Ｔ細胞によれば通常可能である）の検出によって、または、代わりに、Ｔ細胞またはＡＰＣの死滅の検出によって、インビトロで試験できる。制御性Ｔ細胞の活性およびこの活性における選択された化合物の効果のためのインビボ試験は、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）およびトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦベータ）の放出を測定することによって実行することが可能であり（これは、制御性Ｔ細胞がこれらの因子をインビボで放出するため可能である）、または、制御性Ｔ細胞活性が抑制されない場合にＴ細胞活性またはＡＰＣ機能の阻害をもたらすＣＤ８０、ＣＤ８６およびＩＬ−１２といったＭＨＣ分子の発現の阻害によって実行することが可能である。
【００２７】
本発明者らは、制御性細胞応答、特にＴ細胞応答またはＭＳＣ応答の減少に適した薬剤は、表在性のまたは非確立された腫瘍にそれが作用する場合よりも効果的に、浸潤性もしくは血管新生化腫瘍または転移性腫瘍に相当する段階にある腫瘍を有する対象の免疫コンパートメントに関して作用する可能性があることを発見した。
【００２８】
腫瘍を示している宿主にて認められるＴｒｅｇ細胞の増大は、腫瘍自身にて検出しよく、および／または、それらの一部について、脾臓またはリンパ節といったその他のコンパートメントにおいて検出してよい。
【００２９】
Ｔｒｅｇ細胞の例は、ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞および特にＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞、またはＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔｒｅｇ細胞である。Ｔｒｅｇ細胞のより特別な例は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋細胞またはＣＤ４＋ＣＤ２５−ＦＯｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞である。ヒトの制御性Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔｒｅｇ細胞のサブセット、例えば、ＣＤ８＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞またはＣＤ８＋ＣＤ２５−Ｔ細胞またはＣＤ８＋ＩＬ１０＋Ｔ細胞であってよいことがわかっている。ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞は、自然発生するＴｒｅｇ細胞または適応的に誘導性Ｔｒｅｇ細胞であってよい。
【００３０】
Ｔｒｅｇ細胞の別の例は、ＮＫＴ制御性細胞を含む。
【００３１】
別の実施態様によると、制御性細胞応答の調節に適した薬剤は、抑制活性を有する細胞のその他のカテゴリーの活性も調節し、そのため、薬剤は、非抑制性の表現型への成熟といった不活性化または変化を可能にする。細胞のそのようなカテゴリーは、造血細胞に由来し、腫瘍に直面する対象において蓄積する骨髄性サプレッサー細胞を包含する。例として、骨髄由来ＣＤ１１ｂ＋ＧＲ１＋細胞集団は、ここに記載されるような腫瘍に冒される対象において増大することがわかっている。
【００３２】
本発明の部分のキットのまたは組成物の化合物は、それらの取込みを促進するために処方でき、特に、医薬的に許容可能な媒体、担体とともに、または、ワクチンに利用できる適切な送達系、例えば、リポソーム、水中油乳剤、表面活性薬、微小粒子とともに処方できる。
【００３３】
上に定義されたＣｙａＡタンパク質は、特に、腫瘍に存在する１または複数の抗原のＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを保持し、これは、前記タンパク質の許容部位に挿入されていてよく、特にＣｙａＡの触媒部位に挿入されていてよい。その結果、患者に投与される場合、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋エピトープは、プロセスされ、樹状細胞（ＤＣｓ）の表面においてＭＨＣクラスＩＩおよびＩ分子によってそれぞれ提示され、それによって、患者において免疫の、適応的な、応答の刺激が可能となる。
【００３４】
特定の実施態様において、全長ＣｙａＡまたはその断片を含むＣｙａＡタンパク質（前記「断片」は２を超えるアミノ酸残基を含む）はまた、それに挿入にされたエピトープの、または前記エピトープを含むポリペプチドの、標的細胞の細胞基質への移行を可能とするＣｙａＡの特質を維持している。エピトープまたは前記エピトープを含むポリペプチドの、標的細胞の細胞基質への移行は、ＣｙａＡの断片が、その触媒ドメインの移行を可能にするタンパク質のドメインを保持していれば可能である。
【００３５】
ポリペプチドは、ＣｙａＡまたは断片において、コドン２２４および２２５の間の位置に相当する位置に挿入される。
【００３６】
本発明の組換えタンパク質は、組換え技術によって調製することができる。それは、合成によって、特に化学合成によって得ることができる。それゆえ、「組換えタンパク質」という用語は、タンパク質のキメラの形態を意味する。
【００３７】
ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８細胞を標的にする組換えタンパク質の能力は、特に、ＥＰ０３２９１４８６．３およびＥｌ−Ａｚａｍｉ−Ｅｌ−Ｉｄｒｉｓｓｉ  Ｍ．らによる文献（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８（４０）３８５１４−２１）またはＷＯ０２／２２１６９に開示される方法に従ってアッセイすることができる。更に、エピトープまたは前記エピトープを含むポリペプチドを標的細胞の細胞基質に移行させる組換えタンパク質の能力は、ＷＯ０２／２２１６９に開示される方法を適用してアッセイすることができる。
【００３８】
特定の実施態様において、組換えタンパク質に使用されるＣｙａＡの断片は、ＣｙａＡの２つの異なる部分であって、本来ＣｙａＡにおいて隣接しないものから構成できる。例えば、ＣｙａＡの触媒ドメイン、すなわち、ＣｙａＡのＮ末端の部分の４００のアミノ酸残基およびアミノ酸残基１２０８〜１２４３を含む断片（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８抗原提示細胞の標的化に要求される）が例として挙げられている。
【００３９】
上の定義において、「ポリペプチド」という表現は、アミノ酸配列を有する何れかの分子であって、翻訳後修飾を受けたアミノ配列、特に少なくとも６つのアミノ酸残基を有する特にアミノ酸配列、および、特に５から５００残基または約５から約１００または約５から約２００または約１０から約５０残基または約３０または約５０から２００残基または約１００から約２５０（または特に２１０）または約１００から約２００残基を有するアミノ酸配列（前記アミノ酸配列は少なくとも１のエピトープを含み、すなわち、標的細胞、好都合には宿主、特に哺乳類、特にヒト宿主へのその送達の後に、免疫応答が得られる可能性のあるアミノ酸配列を含む）を含むものを意味する。この定義によるポリペプチドは、従ってエピトープに、さらには固有のエピトープに制限されることができ、または、複数の異なるまたは同一のエピトープを含むことができ、または、病原体すなわちヒトパピローマウイルスからの全長抗原または腫瘍関連抗原またはエピトープ自身を包含することもできる。本発明に含まれるエピトープは、体液性免疫応答および／または細胞介在性免疫応答、特にＴ細胞免疫応答に関与するアミノ酸配列を有する分子を包含する。従って、本発明の組換え分子のポリペプチドにおけるエピトープは、宿主においてＡＰＣ（抗原提示細胞）にプロセスされるもの、特に、ＭＨＣ（主要組織適合複合体）クラスＩ分子との結合にて認識されるもの、例えば、標的細胞がＣＤ８＋Ｔリンパ球であるエピトープ、または、ＭＨＣクラスＩＩ分子との結合にて認識されるエピトープ、例えば、標的細胞がＣＤ４＋Ｔリンパ球細胞であるものを含む。
【００４０】
本発明によると、上述のとおり、アデニル酸シクラーゼ（ＣｙａＡ）は、全長タンパク質として、または、その断片として使用される。
【００４１】
好都合に、ＣｙａＡタンパク質またはその断片は、タンパク質またはその断片であり、ここにおいて、タンパク質は、細胞、特に組換え細胞における、ｃｙａＡおよびｃｙａＣ遺伝子の同時発現の結果である。標的細胞のための浸潤特性を有するためには、ＣｙａＡは、ｃｙａＡおよびｃｙａＣの両遺伝子の発現によって可能となる翻訳後修飾を受けなければならないことが示唆された（ＷＯ  ９３／２１３２４）。
【００４２】
本発明の特定の実施態様において、ＣｙａＡタンパク質の断片は、少なくとも約３０のアミノ酸残基を含む断片であり、最大約１３００、特に約５００のアミノ酸残基を有することができる；前記断片は、特定の実施態様において、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８標的細胞との相互作用のために、ＣｙａＡの約１１６６から約１２８１のアミノ酸残基またはＣｙａＡタンパク質の１２０８から１２４３のアミノ酸残基を含む。特別な断片は、したがって、未変性タンパク質のＣ末端の部分の全部または一部であって、当該部分は、標的細胞膜および／またはＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体へのタンパク質の結合の原因となり、および、その後の、細胞の細胞基質への、ポリペプチドに含まれるエピトープの送達の原因となる（Ｌａｄａｎｔ  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ７：１７２−１７６，  １９９９）。本発明によるＣｙａＡタンパク質の特別な断片は、ＣｙａＡタンパク質の３７２または３７３から１７０６のアミノ酸残基を含む。特別な別の断片は、アミノ酸残基２２５〜２３４が削除され、そのため１〜２２４および２３５〜１７０６の残基を含むＣｙａＡ断片を提供するＣｙａＡタンパク質に相当するものである。
【００４３】
本発明の特定の実施態様において、アデニル酸シクラーゼタンパク質は、細菌性タンパク質である。好ましい実施態様において、ＣｙａＡタンパク質はボルデテラ種に由来する。「ボルデテラ種に由来する」という表現は、タンパク質が、前記ボルデテラ種によって生産されるタンパク質を表すことを意味する。それは、何れかの利用可能な技術によって回収され、生産され、または発現される。
【００４４】
本発明による、関心あるボルデテラ種の中の１つは、ボルデテラ・ペルツシスである。その他の関心あるボルデテラ株は、ボルデテラ・パラペルツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）またはボルデテラ・ブロンキセプティカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）である。Ｂ．パラペルツシスのＣｙａＡタンパク質の配列は、登録番号ＮＣ００２９２８．３（１７４０のアミノ酸配列）として、および、Ｐａｒｋｈｉｌｌ  Ｊ．らによる文献（Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．  ＤＯＩ，  １０  （２００３）およびＢ．  ブロンキセプティカについてはＢｅｔｓｏｕ  Ｆ．らによる文献（Ｇｅｎｅ  １９９５，  Ａｕｇｕｓｔ  ３０；  １６２（１）：  １６５−６）に特別に開示されている。
【００４５】
アデニル酸シクラーゼ毒素（ＣｙａＡ）はバクテリアの決定的な病原性因子であり、Ｂ．ペルツシス感染に対する抗原保護のうちの１つである。
【００４６】
ボルデテラ・ペルツシスのアデニル酸シクラーゼタンパク質は、１７０６残基の二官能基タンパク質として記述される毒素であって、４００アミノ酸残基のＮ末端触媒ドメインおよび１３０６残基のＣ末端部分（毒素と標的細胞膜との結合の原因となり、その後の細胞細胞基質への触媒部分の送達の原因となる）を含む毒素である（Ｌａｄａｎｔ  ｅｔ  ａｌ，  １９９９）。
【００４７】
ＣｙａＡタンパク質は、２つの内部リジン残基（リジン８６０および９８３）の翻訳後パルミトイル化によって活性毒素に変換される、不活性プロトキシンとして合成される。この翻訳後修飾は、ｃｙａＡ遺伝子とともに、付属の遺伝子、すなわちＢ．ペルツシス染色体上においてｃｙａＡに近接するｃｙａＣの発現を必要とする。
【００４８】
ボルデテラ・ペルツシスのｃｙａＡは、Ｇｌａｓｅｒ，Ｐ．らの文献（１９８８  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２（１），  １９−３０）にて、アミノ酸配列およびヌクレオチド配列として記載されている。従って、Ｂ．ペルツシスのＣｙａＡタンパク質のアミノ酸残基もしくは配列またはヌクレオチドもしくはヌクレオチド配列が本発明において引用される場合、それらの位置は、Ｇｌａｓｅｒらによる１９８８年の前記文献に開示される配列に関して与えられる。
【００４９】
本発明において、「許容部位」とは、ＣｙａＡタンパク質の機能的な特性を実質的に影響することなく、特に細胞の標的化（特にＣｙａＡによるＡＰＣの標的化）に実質的に影響することなく、ポリペプチドを挿入できる、ＣｙａＡタンパク質の配列の部位であり、ＣＤ１１ｂ−ＣＤ１８受容体への特異的結合に実質的に影響せず、好都合に、標的細胞へのエピトープの移行の工程に関与するタンパク質のドメインに実質的に影響することなく、挿入できる配列を含む。
【００５０】
ＣｙａＡの触媒ドメインの移行を可能とし、それによりそのような許容部位に挿入されるエピトープの移行を可能とする、ボルデテラ・ペルツシスのアデニル酸シクラーゼの許容部位は、残基１３７−１３８（Ｖａｌ−Ａｌａ）、残基２２４−２２５（Ａｒｇ−Ａｌａ）、残基２２８−２２９（Ｇｌｕ−Ａｌａ）、残基２３５−２３６（Ａｒｇ−Ｇｌｕ）、および残基３１７−３１８（Ｓｅｒ−Ａｌａ）を含むが、これらに限定されない（Ｓｅｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，  ｐａｇｅｓ  ３８５１−３８５７）。以下の付加的な許容部位もまた、本発明の実施態様に含まれる：残基１０７−１０８（Ｇｌｙ−Ｈｉｓ）、残基１３２−１３３（Ｍｅｔ−Ａｌａ）、残基２３２−２３３（Ｇｌｙ−Ｌｅｕ）、および３３５−３３６（Ｇｌｙ−Ｇｌｎ）および３３６−３３７（Ｇｌａｓｅｒ  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ，  １９８８）。
【００５１】
その他のボルデテラ種について、対応する許容部位は、配列の比較および対応する残基の決定により決めることができる。
【００５２】
別の実施態様によると、ポリペプチドは、さらに、または代わりに、ＣｙａＡタンパク質またはその断片の１つのおよび／またはその他の末端に挿入することができる。
【００５３】
本発明の目的のために使用されるＣｙａＡタンパク質の特別な断片は、未変性のＣｙａＡタンパク質の最高１３００のアミノ酸、または、約３０から約５００のアミノ酸残基、好都合には約５０から約１５０のアミノ酸残基、特に約１１６６から約１２８１へのアミノ酸残基を包含するそのような断片、好都合には未変性のＣｙａＡタンパク質の１２０８〜１２４３を含む。
【００５４】
従って、本発明によると、いわゆる組換えタンパク質（「ハイブリッドタンパク質」とも称される）を提供するための、全長ＣｙａＡまたはその断片を含むＣｙａＡタンパク質におけるポリペプチドの「挿入」は、特に利用可能なＤＮＡ技術による遺伝的挿入を包含する。あるいは、「挿入」はまた、非遺伝的挿入を包含し、化学的挿入、例えば、ＣｙａＡまたはその断片の１つの末端にて行われる、共有結合性のカップリング、または非共有結合性のカップリングを含む。挿入されるポリペプチドが合成または半合成の場合、非遺伝的な挿入が特に重要であり得る。ポリペプチドに薬剤を結合する方法は、当該分野において既知であり、例えば、Ｎ−ピリジルスルホニル活性化スルフヒドリルを使用したジスルヒド結合を含む。
【００５５】
特に、Ｃｙａの標的細胞、例えばＡＣＰ、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８細胞、特に前記細胞の細胞基質をインビボ標的化のために、化学的結合によって、または、遺伝的挿入によって、特に本発明のポリペプチドを含む分子をＣｙａＡにつなぐことが可能である。実際、ジスルフィド結合によって、または、遺伝子移植によって、所望のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープに相当する分子を、解毒されたＣｙａＡの触媒ドメインに結合する場合、操作された分子は、インビボで特異的ＣＴＬ応答を誘発することができ、それによって、前記ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの、ＣＤ１１ｂを発現する細胞の細胞基質への移行が示される。
【００５６】
特定の実施態様において、タンパク質のベクターを製造するために使用される組換えアデニルシクラーゼは、前記アデニルシクラーゼの触媒ドメイン内に位置する遺伝的に挿入されたシステイン残基にジスルフィド結合によって化学的に結合した、１以上の分子（特に本発明のポリペプチドを含む）を含む、システイン残基の挿入によって特に修飾されたＣｙａＡまたはその断片である。
【００５７】
実際、特に本発明のポリペプチドを含む複数の分子は、触媒ドメイン内の異なる許容部位に位置する異なるシステイン残基にジスルフィド結合で結合させることによって、アデニルシクラーゼに化学的に結合させることができる。
【００５８】
本発明の別の特定の実施態様によると、エピトープを有するポリペプチドは、例えば、配列内の負に荷電するアミノ酸残基の数を減少させるために、未変性のアミノ酸配列に関して修飾された。そのような修飾は、特にエピトープの隣接する残基として、これらの負に荷電するアミノ酸残基の一部を除去することによって、または、正に荷電する一部のアミノ酸残基を添加することによって行うことができる。このように負の電荷がより低い残基を含むポリペプチドは、標的細胞の細胞基質における、ＣｙａＡタンパク質の触媒ドメインの移行に好都合である可能性がある。
【００５９】
エピトープを有しているポリペプチドはまた、それらがＣｙａＡまたはその断片に挿入されたときに折りたたみがほどけ、標的細胞へのポリペプチドの内部移行の効率が改善するように設計することができる。それらのアミノ酸の内容に応じて折りたたみを生じるポリペプチドにおける、そのような非折りたたみは、例えば、システイン残基の除去または置換により、ポリペプチドの折りたたみに関与する可能性のあるジスルフィド結合の形成を妨害することで行うことができる。場合によっては、還元剤の存在下でポリペプチドを作製してその折りたたみを防止し、インビボで再折りたたみを可能にすることで行うことができる。
【００６０】
特定の実施態様において、ポリペプチドが有するエピトープは潜在性エピトープ（ｃｒｙｐｔｉｃ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ）で有りうる。
【００６１】
本発明の特定の側面において、本発明者らは、実際に、（ａ）本願に開示される定義によるアデニル酸シクラーゼ（ＣｙａＡ）またはその断片と、（ｂ）１または複数の抗原の１または複数の抗原性断片を有するポリペプチドとを含む組換えタンパク質でできているキメラタンパク質構造物は、前記抗原の潜在性エピトープが、組換え構造物におけるそれらの提示の結果として、免疫原性となることを可能とすることを決定した。特に、本発明に定義されるＣｙａＡまたはその断片および特に治療的（ワクチン接種を含む）目的にとって重要な抗原に起因するポリペプチドに関与する前記キメラ構造物は、抗原の潜在性エピトープを含み得るが、当該エピトープは、免疫原性となることを可能とし、および特に宿主におけるＴ細胞、特にＣＴＬ応答の発生を可能とする。
【００６２】
従って、本発明はまた、本願に定義される部分のキットまたは組成物における、１または複数の抗原の１または複数のエピトープを有する１または複数のポリペプチドを含む組換えタンパク質（ここにおいて、前記ポリペプチドは、アデニル酸シクラーゼ（ＣｙａＡ）タンパク質またはその断片の、同一または異なる許容部位に挿入されており、前記ＣｙａＡ断片は、抗原提示細胞を標的とする前記アデニル酸シクラーゼタンパク質の特質を維持しており、少なくとも１つの前記エピトープは、亜優占的潜在性Ｔ細胞エピトープ（ｓｕｂｄｏｍｉｎａｎｔ  ｃｒｙｐｔｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ）であり、前記組換えタンパク質は、前記ポリペプチドに対する抗原特異的応答を誘発することができる）の使用に関する。
【００６３】
特定の実施態様において、本発明による部分のキットまたは組成物の組換えタンパク質の調製のために、ＣｙａＡタンパク質の酵素活性、すなわち、ＡＴＰを環状ＡＭＰに変換する能力、すなわち、その触媒活性が不活性化される。従って、部分のキットに使用される組換えタンパク質は解毒される。触媒活性のそのような不活性化は、遺伝的不活性化の結果として得られてよい。例えば、遺伝的不活性化は、ＣｙａＡの触媒部位の一部であるアミノ酸配列の部位（例えば残基１８８および１８９の間）へのジペプチドの導入の結果として得ることができる。そのような不活化されたＣｙａＡタンパク質はＰｒｅｖｉｌｌｅらの文献（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００５；  ６５：  ６４１−９）に例示され、およびその製造は以下の実施例に示される。
【００６４】
本発明の組換えタンパク質は、好都合に細胞介在性免疫応答を誘発することができる。それは、ＣＴＬおよびＴｈ、特にＴｈ１応答を含み、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞応答を含む。
【００６５】
この細胞介在性免疫応答を誘発する組換えタンパク質の能力は、特に、インビボでの腫瘍成長を妨げるのに十分であり、または、動物において腫瘍退縮を可能にするのに十分でありさえすることが示された。現在、ＴＬＲ活性化を通した免疫応答の先天性成分の活性化によって、および、化学療法剤の使用を通した免疫応答の制御性成分の下方活性化（ｄｏｗｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ）によって、増強されることも示されている。
【００６６】
本発明の特定の実施態様において、腫瘍関連抗原は、パピローマウイルス（ＨＰＶ）の抗原である。
【００６７】
本発明の特定の実施態様において、組換えタンパク質は、従って、ＣｙａＡタンパク質またはその断片の１または複数の許容部位に挿入される、１または複数のＨＰＶ腫瘍関連抗原の１または複数のエピトープを有している１または複数のポリペプチドを含む。
【００６８】
本発明の組換えタンパク質は、好都合にＨＰＶ関連腫瘍に対する細胞介在性免疫応答を誘発することができる。それは、ＣＴＬおよびＴｈ、特にＴｈ１応答を含み、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞応答を含む。
【００６９】
本発明のキットまたは部分または組成物に適し、免疫応答（特に宿主における細胞介在性免疫応答）を誘発することができる化合物の設計に適した組換えタンパク質のために、および特にＨＰＶが感染した宿主にて認められる有害効果に対する免疫応答誘発することができるそのような化合物の設計のために、本発明者らは、非常に発癌性のＨＰＶ株から、および、特にＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５２またはＨＰＶ５８から選択される株由来の抗原から、エピトープを有しているポリペプチドを得ることを提案した。
【００７０】
これらの株の中で、ＨＰＶ１８およびＨＰＶ１６は特に重要である。ＨＰＶ１６は、哺乳類宿主（特にヒト）の子宮頚癌の発生との関連に起因して、ＨＰＶに感染した宿主の治療のための特に特別な標的である。
【００７１】
これらのＨＰＶ株から始めて、発明者等は、Ｌ１、Ｌ２、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４およびＥ５タンパク質の中から選択される抗原から、エピトープを有しているポリペプチドを得ることを提案する。
【００７２】
代わりとして、または、組合せにより、本発明者らはまた、ＨＰＶのＥ６またはＥ７タンパク質からエピトープを有しているそのようなポリペプチドを得ることを提案する。
【００７３】
本発明の特定の実施態様において、ＨＰＶ１６のＥ６またはＥ７タンパク質またはＨＰＶ１８からのＥ６またはＥ７タンパク質は、エピトープを有しているポリペプチドの設計に使用される。
【００７４】
ＨＰＶ抗原に由来するポリペプチドの設計に引用することができる特別なＨＰＶタンパク質は、ＨＰＶのＥ７タンパク質、特にＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８のＥ７である。本発明の実施態様によると、ポリペプチドは、異なるＨＰＶ株、特にＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８のいくつかのＥ７タンパク質に由来する。例えば、ポリペプチドは、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８の全長Ｅ７タンパク質であり、または、ＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８のＥ７タンパク質のそれぞれの１または複数の断片（前記断片の多量体、特に二量体を含む）である。
【００７５】
ＨＰＶのこれらのタンパク質およびそれらのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、ＨＰＶ１６についてはＳｅｅｄｏｒｆ，Ｋ．らによる文献（Ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １６  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  １４５：  １８１−１８５，  １９８５）、Ｃｏｌｅ  Ｓ．Ｔ．、Ｄａｎｏｓ  Ｏ．による文献（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １８  ｇｅｎｏｍｅ．  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ  ｏｆ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｐｅａｔｅｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅ６  ａｎｄ  Ｅ７  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９３：  ５９９−６０６  （１９８７））、または、Ｆｅｒｎａｎｄｏ  ＧＪ．らによる文献（Ｔ−ｈｅｌｐｅｒ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅ７  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １８  （ＨＰＶ１８）  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．  １９９５  Ａｐｒ．  ３６（１）：  １−１３）に開示されている。
【００７６】
Ｅ６およびＥ７タンパク質は、特に、ＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８によって、ウイルスの複製サイクル全体を通して発現される腫瘍性タンパク質であり、ＨＰＶ株の感染に伴う宿主細胞の悪性転換の開始および維持に必須であることが示された。それゆえ、これら両方の腫瘍特異性抗原は、養子性ＣＴＬ介在免疫療法の潜在的標的として考えられている。
【００７７】
本発明の特別な実施態様によれば、組換えタンパク質は、複数のポリペプチドを含み、それらの各々は、１または複数のＨＰＶ抗原の１または複数のエピトープを有する。
【００７８】
例えば、そのような複数のポリペプチドは、ＨＰＶ株の１つ、特にＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８のＥ６およびＥ７タンパク質に由来し得る。別の例によれば、これらの複数のポリペプチドは、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８の両方からのＥ６またはＥ７タンパク質に由来するエピトープを包含し得る。
【００７９】
複数のポリペプチドはまた、関心あるＣｙａＡタンパク質の異なる許容部位に挿入される、異なるエピトープを有する１つのタンパク質（例えばＥ７またはＥ６タンパク質）の断片から構成できる。
【００８０】
上の定義による特別な別の組換えタンパク質は、エピトープを有している複数のポリペプチドが、ＨＰＶ１６のＥ７タンパク質の残基１〜２９を含む断片または残基１〜２９からなる断片または残基４２〜９８を含む断片または残基４２〜９８からなる断片を含み、または、ＣｙａＡタンパク質の異なる許容部位に挿入される両断片を含むまたはこれらから成る複数のポリペプチドを含む、組換えＣｙａＡタンパク質である。
【００８１】
本発明による別の組換えタンパク質は、複数のポリペプチドが、アミノ酸配列ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ（Ｅ７４９−５７）および／またはＧＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣＣＫＣＤＳＴＬＲＬＣＶＱＳＴＨＶＤＩＲ（Ｅ７４３−７７）を有する断片を包含するタンパク質である。
【００８２】
ＣｙａＡタンパク質またはその断片の許容部位に挿入されたポリペプチドのアミノ酸残基の数は、全長抗原、特にＨＰＶの全長Ｅ６またはＥ７タンパク質から成るポリペプチドを、ＣｙａＡタンパク質またはその断片に挿入できるような数であることが認められた。
【００８３】
ＨＰＶ１６抗原の発現ベクターは、以下の通りに設計し、寄託された。それらは、本発明による組換えタンパク質をコードするプラスミド、すなわち、２００４年３月１８日にＣＮＣＭ（フランス、パリ）にＣＮＣＭ  Ｉ−３１９１という番号で寄託したｐＴＲＡＣＥ５−ＨＰＶ１６Ｅ７Ｆｕｌｌ（ＣｙａＡＥ５−ＨＰＶ１６Ｅ７ＦＵＬＬとも名付けられる）；２００４年３月１８日にＣＮＣＭ（フランス、パリ）にＣＮＣＭ  Ｉ−３１９０という番号で寄託したｐＴＲＡＣＥ５−ＨＰＶ１６Ｅ７Δ３０−４２（ＣｙａＡＥ５−ＨＰＶ１６Ｅ７Δ３０−４２とも名付けられる）、またはコンストラクトｐＴＲＡＣＥ５−ＨＰＶ１６Ｅ７４９−５７である。これらのベクターは、ＷＯ２００５／０８９７９２および本願の実施例に記述される。
【００８４】
本発明の特別な実施態様によると、組換えＣｙａＡに含まれるポリペプチドは、ＣｙａＡのコドン２２４および２３５の間、または、ＣｙａＡのコドン３１９および３２０の間に挿入される、Ｅ７タンパク質、特にＨＰＶ１６のＥ７タンパク質である。
【００８５】
別の実施態様において、本発明の組換えタンパク質は複数のポリペプチドを含み、その一部は、１または複数のＨＰＶのエピトープまたは複数のエピトープを有しているポリペプチドであり、その他は、腫瘍関連抗原のエピトープを有しているポリペプチドである。
【００８６】
特別な別の実施態様において、本発明の組換えタンパク質は更に、異なる病原性薬剤に由来する１または複数のエピトープを含む。クラミジア、または、ＨＩＶレトロウイルスまたはＨＰＶ、ＨＢＣ、ＨＣＶ、アデノウイルスＥＢＶ、ヘルペスウイルス、ＨＴＬＶ．１ウイルスおよびＣＭＶに由来するエピトープと、ＨＰＶに由来するエピトープとの組み合わせは、特に重要である。
【００８７】
特に、潜在性エピトープは、ＨＰＶ抗原、特に、ＨＰＶ１６および／またはＨＰＶ１８抗原、特にＥ７抗原に含まれる。
【００８８】
このように定義される組換えタンパク質は、特に、ＨＰＶ１８  Ｅ７タンパク質に由来するペプチド、すなわち、アミノ酸配列ＩＤＧＶＮＨＱＨＬを有するものを含む。
【００８９】
本発明はまた、この配列において、特に位置１および／または２に置換を有するペプチド、特に配列（Ｉ／Ａ）（Ｄ／Ｓ）ＧＶＮＨＱＨＬを有するペプチド（ここにおいて、位置１および２の残基の１つまたは２つが、記載される意味の何れかを有する）に関する。
【００９０】
特別な実施態様によれば、潜在性エピトープは、修飾でき、例えば、最初の２つの位置において置換を有することができ、例えば、ＡＳＧＶＮＨＱＨＬという配列を有することができる。
【００９１】
本発明はまた、前記ペプチドの変種であって、それらが免疫原性の特性（特に、Ｔ細胞、特にＣＴＬ応答を誘発できる特性）を有する程度の変種を含む。
【００９２】
ＣｙａＡタンパク質またはその断片を含む組換えタンパク質とは別に、本発明による部分のキットまたは組成物の更なる成分の１つは、患者において、腫瘍によって引き起こされる先天性免疫応答の活性化に適したアジュバント成分であってよい。
【００９３】
本発明の特定の実施態様において、アジュバント成分は、核酸、ペプチドグリカン、炭水化物、ペプチド、サイトカイン、ホルモンおよび小分子から成る成分の群から選択され、ここにおいて、前記アジュバント成分は、パターン認識受容体（ｐａｔｔｅｒｎ−ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）（ＰＲＲｓ）を介したシグナル伝達が可能である。
【００９４】
ＰＲＲｓは、病原体からのいわゆる進化的に保存されたサイン（ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ）（病原体関連分子パターン（ｐａｔｈｏｇｅｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｐａｔｔｅｒｎｓ）（ＰＡＭＰｓ））の認識によって、先天性免疫応答を病原体におよび腫瘍に仲介することが知られている。ＰＲＲｓは、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞を含む様々な免疫細胞に存在し、また、一部の非免疫細胞、例えば、上皮細胞または内皮細胞に存在する。ＰＲＲｓおよびそれらの先天性免疫応答との関係は、Ｐａｓｈｉｎｅ  Ａ．らによって記述されている（Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ｖｏｌｕｍｅ  １１，  Ｎ°  ４，  Ａｐｒｉｌ  ２００５）。
【００９５】
本発明による部分のキットは、それゆえ、ＰＲＲｓを標的とし、それによって、ＰＲＲｓを通したシグナル伝達を活性化する、先天性免疫応答の活性化のためのアジュバント成分を提供し、ここにおいて、前記ＰＲＲｓは、Ｔｏｌｌ様受容体またはヌクレオチド結合オリゴマー形成ドメイン（ＮＯＤ）またはＣ型レクチンを含む。
【００９６】
本発明の特定の実施態様において、アジュバント成分は、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニストである。
【００９７】
Ｔｏｌｌ様受容体アゴニストは、特に、患者の先天性免疫系を効率的に活性化するために処方される。
【００９８】
前記ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲを結合することができ、すなわち、ＴＬＲのリガンドであり、そのうえ前記ＴＬＲの制御下で誘発される免疫応答を増強することができる。
【００９９】
例として、ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ−９、ＴＬＲ−８、ＴＬＲ−３およびＴＬＲ−７アゴニストの群から選択される。しかしながら、例えばＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、…受容体のアゴニストといった、その他のＴＬＲ受容体のアゴニストを、本発明を実行するために使用してよい。
【０１００】
本発明に使用されるＴＬＲアゴニストは、天然のまたは合成アゴニストでありえる。それは、同一または異なるＴｏｌｌ様受容体の異なるアゴニストの組合せでありえる。
【０１０１】
本発明の特別な実施態様によれば、ＴＬＲアゴニストは、免疫賦活性ヌクレオチド配列、特に安定化されたヌクレオチド配列（例えば、ホスホロチオネート修飾のような構造的修飾の結果として安定化したもの）である。ヌクレオチド配列はまた、特定の製剤によって分解から保護することができる。特にそのリポソーム製剤、例えばリポソーム懸濁剤は、免疫賦活性ヌクレオチド配列の効果的な投与に好都合である。
【０１０２】
本発明の特定の実施態様において、免疫賦活性核酸配列は一本鎖ＲＮＡである。
【０１０３】
本発明の特定の実施態様において、免疫賦活性ヌクレオチド配列は、ＣｐＧモチーフを含み、特にＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮｓ）である。
【０１０４】
適切なＣｐＧオリゴヌクレオチドの例として、本発明は、ＴＬＲ−９リガンド、例えばＡ型ＣｐＧ  ＯＤＮ、すなわち、ヌクレオチド配列５’−ＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ−３’を有しているＣｐＧ  ２２１６、または、Ｂ型ＣｐＧ  ＯＤＮ、すなわち、ヌクレオチド配列５’−ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ−３’を有しているＣｐＧ  １８２６を提供する。
【０１０５】
ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、分解からそれを保護し、その取込みを促進するために、ＤＯＴＡＰ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍａｎｈｅｉｍ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）と複合体を成した後に使用することができる。
【０１０６】
本発明の別の特定の実施態様によると、ＴＬＲアゴニストは小分子である。
【０１０７】
ＴＬＲアゴニストとして適した小分子は、例えば、ＴＬＲ−７リガンドとして、イミダゾキノリンアミン誘導体、例えば、Ｒ８４８（レスキモド（ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ））と名付けられるもの、すなわち、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎから入手可能な４−アミノ−２−エトキシメチル−ａ，ａ，ジメチル−１−Ｈ−イミダゾ［４，５ｃ］キノリン−１−エタノール、または、ＴＬＲ−７アゴニストとして、Ａｌｄａｒａから入手可能なＲ８３７（イミキモド（ｉｍｉｑｉｍｏｄ））という名付けられるものである。
【０１０８】
ＴＬＲアゴニストとして適切なその他の分子は、ＴＬＲ−３リガンドとしてポリウリジン（ｐＵ）またはＴＬＲ−７リガンドとしてポリシチジル酸（ＰＩＣ）である。
【０１０９】
これらの分子は、それらの取込みを促進し、および／または、それらを分解から保護するように処方できる。
【０１１０】
これらの分子は、患者に対する投与のための、リポソーム製剤として、特にリポソーム懸濁剤として製造することもできる。
【０１１１】
本発明の別の特定の実施態様によると、アジュバント成分は、細胞に基づくアジュバント成分であり得る。その例は、主要なリンパ球応答が可能であることが知られる樹状細胞であり、そのような樹状細胞は、Ｔ細胞応答の刺激のそれらの活性を増加させるために、おそらくそれらの投与より前にエキソビボで条件付けされている。樹状細胞は、それ故、ＴＬＲリガンドまたはアゴニストを含むＰＲＲｓと相互作用するアジュバントで刺激される（Ｐａｓｈｉｎｅ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  Ｖｏｌｕｍｅ  １１，  Ｎ°４，  Ａｐｒｉｌ  ２００５  ｐ  Ｓ６３−Ｓ６８）。
【０１１２】
ＴＬＲアゴニストまたはその他のアジュバントの可能な存在とは別に、本発明の部分のキットはまた、特に制御性Ｔ細胞の免疫抑制能力を低下させまたは遮断することによる、患者における細胞応答に適した薬剤または分子を含む。
【０１１３】
本発明の特別な実施態様によれば、制御性細胞応答におけるそのような効果は、制御性Ｔ細胞を調節するおよび／またはその他の細胞抑制性応答（例えば骨髄性サプレッサー細胞応答）を調節する薬剤であって、前記制御性細胞、特にＴ細胞を標的とする薬剤を用いて、これらの細胞を減少または失活させ（例えばＣＤ２５特異的抗体またはシクロホスファミドにより）、前記細胞、特に制御性Ｔ細胞の輸送を変化させ（例えばＣＣＬ２２特異的抗体）、または、前記細胞の分化およびシグナル伝達を変化させる（ＦＯＸＰ３（フォークヘッドボックスＰ３）シグナルを遮断することにより）ことで得られてよい。
【０１１４】
本発明の特別な実施態様によれば、制御性細胞応答を調節する薬剤は、抑制性の分子、特に、ＡＰＣｓに存在する分子（例えばＢ７−Ｈ１、Ｂ７−Ｈ４、ＩＤＯ（インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ）またはアルギナーゼ）またはＴ細胞に存在する分子（例えばＣＴＬＡ４（細胞障害性Ｔリンパ球関連抗原４）またはＰＤ１（プログラム細胞死１））を標的とし、または、可溶性免疫抑制因子（例えばＴＧＦベータ（トランスフォーミング成長因子）、ＩＬ−１０、ＶＥＧＦ（血管内皮成長因子）、ＣＯＸ２（シクロオキシゲナーゼ２））を標的とする。
【０１１５】
制御性細胞応答に対して効果を有する薬剤の例として、Ｔｒｅｇ細胞またはその他の免疫抑制の細胞を殺すことができる細胞障害性薬剤、または、それらの活性および／または発生および／または蓄積を遮断することができる細胞障害性薬剤が提案される。
【０１１６】
本発明の特定の実施態様において、制御性細胞応答、特に制御性Ｔ細胞応答を調節する薬剤は、化学療法剤である。特に、それは、抗癌薬として知られ化学療法にて使用される化学療法剤の中から選択される。そのような薬剤は、腫瘍の負担の減少を助けるもの、治療に対する腫瘍細胞の感受性を増加させて作用するもの、または免疫制御性細胞を死滅または失活させるものを含む。本発明の骨格において使用される化学療法剤は、それゆえ、抗腫瘍性免疫を増強する。
【０１１７】
本発明の特定の実施態様において、化学療法剤はアルキル化剤である。特に、それはシクロホスファミド（ＣＴＸ）（Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）である。シクロホスファミドは、制御性Ｔ細胞を減少または失活させることができる。
【０１１８】
本発明の特別な別の実施態様において、化学療法剤は挿入剤（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）である。
【０１１９】
特定の実施態様において、化学療法剤はドキソルビシン（ＤＯＸ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）である。
【０１２０】
化学療法剤は、好都合に、低用量にて投与される。
【０１２１】
部分のキットの組み合わせにて使用される、本発明を実行するための、本願にて記述される分子の様々な型は、別々に提示され、そして投与されるが、時間的に同時に（特に組換えタンパク質およびＴＬＲアゴニストについて）または時間的に別々に（特に組換えタンパク質および化学療法剤について）投与される。
【０１２２】
本発明の特定の実施態様において、部分のキットが組換えタンパク質および化学療法剤の両方の使用を含む場合、この薬剤は、治療ワクチンとして作用する組換えタンパク質の前に投与される。例として、化学療法剤は、ワクチンが投与される２４時間前に与えられる。
【０１２３】
化学療法剤の投与は、代わりに、組換えタンパク質および／またはＴＬＲアゴニストの投与の前および後に実行される。それはまた、時間的に経時的とすることができる。
【０１２４】
本発明の部分のキットまたは組成物にて採用されてよい特定の療法は、反復投与プロトコールにおけるその使用、特に、少なくとも１つの部分のキットの化合物または組成物の２回以上の投与を含むプロトコールにおける使用である。
【０１２５】
本発明の部分のキットの化合物または組成物は、静脈内投与、腫瘍内投与または皮下適用を通して、特に患者に与えることができる。
【０１２６】
本発明の部分のキットまたは組成物は、（ｉ）本願に開示される組換えＣｙａＡまたはその断片に関する組換えタンパク質を通した適応性免疫応答を標的化する能力、（ｉｉ）化学療法剤を通して制御性免疫応答をダウンレギュレートする能力、および、アジュバントが存在する場合には、（ｉｉｉ）アジュバントを通して前記先天的反応を活性化することによる免疫応答の先天性成分を標的化する能力を有する。
【０１２７】
本発明者らは、特に、３つの化合物、すなわち、組換えタンパク質、アジュバント成分（例えばＴＬＲアゴニスト）および制御性免疫応答の調節のための薬剤（例えば化学療法剤）の組み合わせの使用は、例えば進行癌の状況で生じる、確立された腫瘍（血管新生化または浸潤性腫瘍または転移性腫瘍を含む）を患う患者の症状の改善を可能とし、および、恐らく、そのような腫瘍および／または転移の根絶させ得ることを示した。特に、本発明による部分のキットは、単独の組換えタンパク質から成るワクチン、または単独の化学療法剤といった制御性Ｔ細胞免疫応答を変化させる薬剤、または単独で使用されるＴＬＲといった先天的反応のアジュバントよりも、腫瘍成長の後期の段階を治療することに適す可能性があることも発見された。
【０１２８】
本発明はまた、本願に開示される部分のキットまたは組成物の成分を投与する工程を含む、それを必要とする患者（ヒトまたは動物の患者）の治療法に関する。
【０１２９】
特に、本発明の特定の実施態様において、部分のキットまたは組成物またはヒトもしくは動物患者の治療方法は、腫瘍の分類のための認められた臨床判定基準に従って、浸潤性または血管新生化腫瘍対表在性腫瘍の治療に、または、転移性腫瘍対原発腫瘍の治療に、意図されおよび適している。
【０１３０】
固形腫瘍は、特に、本発明の部分のキットまたは組成物の化合物の使用を通した治療のための標的である。
【０１３１】
部分のキットまたは本発明の組成物による治療のための候補としてよい腫瘍の中で、腫瘍関連抗原について特徴づけられる以下のものが例として挙げられる：
メラノーマ、特に転移性メラノーマ；肺癌；頭頚部癌（Ｈｅａｄ  ＆  ｎｅｃｋ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）；子宮頚癌、食道癌；膀胱癌、特に浸潤性膀胱癌；前立腺癌；乳癌；結腸直腸癌；腎臓細胞癌；肉腫；白血病；骨髄腫。癌のこれらの様々な組織学的タイプのために、抗原性ペプチドは、腫瘍サンプルにて特異的に発現され、Ｔ細胞、特にＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞によって認識されることが示された。
【０１３２】
これらの腫瘍タイプにおいて腫瘍関連抗原として発見されたペプチドの総説は、Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｒｕｇｇｅｎ  Ｐ．らによって書かれている（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  ２００２，  ｖｏｌ  １８８：５１−６４）。特に、前記総説の表３に含まれるペプチドの開示は、本願ではそのような腫瘍関連抗原の提供される例として引用され、前記表３は本願に援用される。
【０１３３】
以下の抗原は、Ｋａｗａｋａｍｉ  Ｙ．らの文献（Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ，  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２００４，  ｖｏｌ．９５，  ｎｏ．  １０，  ｐ７８４−７９１）（これらの抗原または更なるもののスクリーニング法も提供している）によると、Ｔ細胞によって認識される腫瘍関連抗原の例として引用される：以下を含む様々な癌にて共有される抗原；メラノーマにおける、ＭＡＧＥ（特にメラノーマにて）、ＮＹ−ＥＳＯ−１、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＷＴ１、サバイビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）、ｈＴＥＲＴ、ＣＥＡ、ＡＦＰ、ＳＡＲＴ３、ＧｎＴ−Ｖ、一部の特定の癌に特異的な抗体（例えばβベータ−カテニン）、ＣＤＫ４、ＭＡＲＴ−２、ＭＵＭ３、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ−１、チロシナーゼ；白血病におけるｂｃｒ−ａｂｌ、ＴＥＬ  ＡＭＬ１；前立腺癌における、ＰＳＡ、ＰＡＰ、ＰＳＭ、ＰＳＭＡ；骨髄性白血病におけるプロテイナーゼ３；乳癌、卵巣癌または膵臓癌におけるＭＵＣ−１；リンパ腫、ＡＴＬまたは子宮頚癌におけるＥＢＶ−ＥＢＮＡ、ＨＴＬＶ−１  ｔａｘ；腎臓細胞癌における変異型ＨＬＡ−Ａ２；白血病／リンパ腫におけるＨＡ１。動物における腫瘍関連抗原もまた記述されており、例えば、腫瘍を患うネコまたはイヌにおけるサイクリンＤ１およびサイクリンＤ２が記述される。
【０１３４】
Ｔ細胞に認識される腫瘍関連抗原はまた、Ｎｏｖｅｌｌｉｎｏ  Ｌ．らによって記述されている（Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ２００４，  ５４：１８７−２０７：以下のサイトでも更新されているhttp://www.istitutotumori.mi.it/INT/AreaProfessionale/Human_Tumor/pdf/human_tumor_antigens.pdf）。
【０１３５】
より一般的には、本発明における関心あるＴＡＡは、変異された抗原、腫瘍細胞にて過剰発現される抗原、共有される抗原、組織特異的分化抗原またはウイルス性抗原に相当するものである。
【０１３６】
引用される抗原は、部分のキットまたは本発明の組成物における使用のための、組換えＣｙａＡ（その断片を含む）タンパク質の製造のための候補となり得る。
【０１３７】
特に、例示目的として、本発明において、先天性免疫応答のアジュバント、特にＴＬＲアゴニストは、特に組換えタンパク質がＥ７抗原または本願で定義されるその断片を有する場合に、ＨＰＶ感染後に生じる、進行した腫瘍における、本願で開示される組換えタンパク質の治療的効果を増大させることが示された。腫瘍関連抗原に再結合されたＣｙａＡと組み合わせられる一部のＴＬＲリガンドは、有意に大きな腫瘍の退行のパーセンテージを増大した。そのうえ、低用量のシクロホスファミドは、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の数および活性を制御することができることが示された（１３）。
【０１３８】
部分のキットまたは組成物は、治療した患者の腫瘍の容積または関連転移が、一過的にまたは明確に遮断されまたは減少し、および、より好ましくは根絶した場合に、治療的効果を達成したと考えられる。
【０１３９】
本発明のその他の特徴および特性は、以下の実施例および図に開示される。
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１．１】巨大担癌マウス（ｌａｒｇｅ  ｔｕｍｏｒ−ｂｅａｒｉｎｇ  ｍｉｃｅ）におけるＣｙａＡ−Ｅ７治療効果の抑止。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、０日目に５ｘ１０５ＴＣ−１細胞を播種し、その後４日目においてＰＢＳを与え（Ａ）、または、４日目（Ｂ）、７日目（Ｃ）、１１日目（Ｄ）、１８日目（Ｅ）、２５日目（Ｆ）または３０日目（Ｇ）において５０μｇのＣｙａＡ−Ｅ７を静脈内注射した。それぞれの曲線は、単一のマウスにおける腫瘍の平均直径を表す。含まれる動物の総数に対する１００日目における腫瘍を含まないマウスの数、１００日目における生存のパーセンテージおよびＰＢＳ処理群の腫瘍成長に対する腫瘍成長と比較した尤度比検定のＰ値が示される。Ｈ）は、マウス生存のカプラン−マイヤープロットである。腫瘍直径が２０ｍｍに達したとき、または、動物の生理状態によって必要となった場合に、マウスを殺処分した。２つの独立した実験のまとめたデータが示される。
【図１．２】ＲＡＧ−／−マウスにおける腫瘍成長に対するＣＴＸ効果。Ａ：Ｃ５７ＢＬ／６−ＲＡＧ−１−−／−マウスに、０日目において、５ｘ１０５ＴＣ−１細胞を注入した。２４日目において、腹腔内で２．５ｍｇＣＴＸまたは２００μｌのＰＢＳを与えた。含まれる動物の総数に対する６０日目における腫瘍を含まないマウスの数、６０日目における生存のパーセンテージおよびＣＴＸ処理群の腫瘍成長とＰＢＳ処理群の腫瘍成長とを比較する尤度比検定のＰ値が、それぞれの実験のセットにて示される。Ｂ：マウス生存のカプラン−マイヤープロット。ログランク検定を、ＣＴＸを受けている群とＰＢＳで処理した群との比較に使用した（ｐ＝０．２２）。腫瘍直径が２０ｎｍに達したとき、または動物の生理状態に起因して必要となった場合に、マウスを殺処分した。２つの独立した実験からのまとめたデータが示される。
【図２．１】ＣｙａＡ−Ｅ７および異なるＴＬＲ−リガンドによる、併用腫瘍治療。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、０日目において、５ｘ１０５ＴＣ−１細胞を播種した。２５日目において、ＰＢＳ（Ａ）、５０μｇのＣｙａＡ−Ｅ７単独（Ｂ）、６０μｇのＤＯＴＡＰと組み合わせた３０μｇのＣｐＧ−Ｂ（Ｃ）もしくは２５μｇのＰＩＣ（Ｄ）の何れかを与え、または、５０μｇのＣｙａＡ−Ｅ７とともに、５０μｇのＲ８４８（Ｅ）、３０μｇのｐＵ／ＤＯＴＡＰ（Ｆ）、３０μｇのＣｐＧ−Ａ／ＤＯＴＡＰ（Ｇ）または３０μｇのＣｐＧ−Ｂ／ＤＯＴＡＰ（Ｈ）、または２５μｇのＰＩＣ（Ｉ）を静脈注射した。それぞれの曲線は、単一のマウスにおける腫瘍の平均値直径を表す。含まれる動物の総数に対する１００日目における腫瘍を含まないマウスの数、１００日目における生存のパーセンテージおよびＰＢＳ処理群の腫瘍成長またはＰＢＳ処理群の腫瘍成長に対する腫瘍成長と比較した尤度比検定のＰ値が示される。Ｊ）マウス生存のカプラン−マイヤープロット。腫瘍直径が２０ｍｍに達したとき、または、動物の生理状態により必要となった場合に、マウスを殺処分した。２つの独立した実験のまとめたデータが示される。
【図２．２】ＣＴＸ用量の評価。Ａ：Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、０日目において、５ｘ１０５ＴＣ−１細胞を注射した。２４日目において、未処理のままとし、または、１００ｍｇ／ｋｇまたは３００ｍｇ／ｋｇのＣＴＸを腹腔内に与えた。２５日目において、ＰＢＳまたは５０μｇＣｙａＡ−Ｅ７を注射した。含まれる動物の総数に対する７５日目における腫瘍を含まないマウスの数、７５日目における生存のパーセンテージおよび３００ｍｇ／ｋｇのＣＴＸで処理した群の腫瘍成長と１００ｍｇ／ｋｇのＣＴＸで処理した群の腫瘍成長とを比較した尤度比検定のＰ値が、それぞれの実験のセットについて示される。Ｂ：マウス生存のカプラン−マイヤープロット。ログランク検定を、３００ｍｇｋｇのＣＴＸを受けた群と１００ｍｇ／ｍｇのＣＴＸを受けた群とを比較するために使用した（ｐ＝０．９５）。腫瘍直径が２０ｎｍに達したとき、または動物の生理状態に起因して必要となった場合に、マウスを殺処分した。２つの独立した実験のまとめたデータが示される。
【図３】ＣｙａＡ−Ｅ７と化学療法薬剤とによる併用腫瘍治療。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、０日目において、５ｘ１０５ＴＣ−１細胞を播種した。２４日目において、マウスは、未処理のままとし（Ａ、Ｂ）、または、２．５ｍｇのシクロホスファミド（ＣＴＸ）腹腔内（Ｃ、Ｄ）もしくは１２５μｇのドキソルビシン（ＤＯＸ）（静脈内）（Ｅ）の何れかを与えた。２５日目に、マウスに、ＰＢＳ（Ａ、Ｃ）または５０μｇのＣｙａＡ−Ｅ７（Ｂ、Ｄ、Ｅ）の何れかを静脈注射した。含まれる動物の総数に対する１００日目において腫瘍を含まないマウスの数、１００日目における生存のパーセンテージおよびＣｙａＡ−Ｅ７処理群の腫瘍成長に対するまたはＰＢＳ処理群の腫瘍成長に対する腫瘍成長とを比較する尤度比検定のＰ値が示される。Ｆ）マウス生存のカプラン−マイヤープロット。腫瘍直径が２０ｍｍに達したとき、または、動物の生理状態に要求された場合に、マウスを殺処分した。２つの独立した実験のまとめたデータが示される。
【図４】ＣｙａＡ−Ｅ７、ＣｐＧ−Ｂ／ＤＯＴＡＰおよびＣＴＸによる併用腫瘍治療（三重療法）。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、０日目において、５ｘ１０５ＴＣ−１細胞を播種し、２４日目において、未処理のままとし（Ａ、Ｂ）、２．５ｍｇのＣＴＸを腹腔内に投与した（Ｃ、Ｄ）。２５日目に、ＰＢＳ（Ａ）、５０μｇのＣｙａＡ−Ｅ７（Ｂ）、ＣｐＧ−Ｂ／ＤＯＴＡＰ（Ｃ）または５０μｇのＣｙａＡ−Ｅ７および３０μｇのＣｐＧ−Ｂ／ＤＯＴＡＰ（Ｄ）を静脈内投与した。含まれる動物の総数に対する１００日目において腫瘍を含まないマウスの数、１００日目における生存のパーセンテージおよびＣｙａＡ−Ｅ７処理群の腫瘍成長またはＰＢＳ処理群の腫瘍成長に対する腫瘍成長を比較する尤度比検定のＰ値が示される。Ｅ）マウス生存のカプラン−マイヤープロット。腫瘍直径が２０ｍｍに達したとき、または、動物の生理状態により必要となった場合に、マウスを殺処分した。２つの独立した実験のまとめたデータが示される。
【図５．１】三重療法の治療効果は、進行した腫瘍において低下する。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、０日目において、５ｘ１０５ＴＣ−１細胞を播種し、未処理のままとし（Ａ、Ｂ）または、２４日目において（Ｃ）、２９日目において（Ｄ）もしくは３９日目において（Ｅ）２．５ｍｇのＣＴＸを腹腔内投与した。２５日目において、コントロールマウスに、ＰＢＳ（Ａ）または５０μｇのＣｙａＡ−Ｅ７単独（Ｂ）を投与した。２５日目において（Ｃ）、３０日目おいて（Ｄ）または４０日目において（Ｅ）、マウスの群に、５０μｇのＣｙａＡ−Ｅ７および３０μｇのＣｐＧ−Ｂ／ＤＯＴＡＰを静脈投与した。含まれる動物の総数に対する１００日目における腫瘍を含まないマウスの数、１００日目における生存のパーセンテージおよび腫瘍成長と三重療法群の腫瘍成長とを比較する尤度比検定のＰ値が示される。Ｆ）マウス生存のカプラン−マイヤープロット。腫瘍直径が２５ｍｍに達したとき、または動物の生理状態によって必要となった場合に、マウスを殺処分した。２つの独立した実験のまとめたデータが示される。
【図５．２】三重療法の第２の投与の抗腫瘍効果。Ａ：Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、０日目において、５ｘ１０５ＴＣ−１細胞を注入した。３９日目において、未処理のままとし、または、２．５ｍｇのＣＴＸを腹腔内で投与した。４０日目において、コントロールマウスにＰＢＳを注入し、三重療法で処理するマウスに、５０μｇのＣｙａＡ−Ｅ７および３０μｇのＣｐＧ−Ｂ／ＤＯＴＡＰを静脈注射した。マウスの群はまた、５４日目において、ＣＴＸで処理し、５５日目において、ＣｙａＡ−Ｅ７およびＣｐＧ−Ｂ／ＤＯＴＡＰで処理した。含まれる動物の総数に対する処理後９０日の腫瘍を含まないマウスの数、処理後９０日の生存パーセント、および、４０日目に三重療法で処理した群における腫瘍成長とＰＢＳ処理群における腫瘍成長とを比較した尤度比検定のＰ値、または、４０および５５日目に三重療法で処理した群の腫瘍成長と４０日目に三重療法で処理した群における腫瘍成長とを比較した尤度比検定のＰ値が示される。Ｂ：マウス生存のカプラン−ミアープロット。ログランク検定を、４０日目に三重療法を受けた群とＰＢＳで処理した群との比較（ｐ＜０．０００１）、および、４０および５５日目に処理した群と４０日目に処理した群との比較（ｐ＝０．００１２）に使用した。腫瘍直径が２０ｎｍに達したとき、または、動物の生理状態に起因して必要となったときに、マウスは殺処分した。２つの独立した実験のまとめたデータが示される。
【図６】ＥＬ４−Ｅ７モデルにおける三重療法の評価。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、０日目において、４ｘ１０６のＥＬ４−Ｅ７細胞を播種し、未処理のままとし（Ａ）、または、６日目（Ｂ）、１３日目（Ｃ）または２０日目（Ｄ）において２．５ｍｇのＣＴＸを腹腔内に投与した。マウスに、２５日目においてＰＢＳを（Ａ）、または、７日目（Ｂ）、１４日目（Ｃ）または２１日目（Ｄ）において５０μｇのＣｙａＡ−Ｅ７および３０μｇのＣｐＧ−Ｂ／ＤＯＴＡＰを静脈注射した。含まれる動物の総数に対する１００日目において腫瘍を含まないマウスの数、１００日目における生存のパーセンテージが示される。Ｅ）マウス生存のカプラン−マイヤープロット。腫瘍直径が２５ｍｍに達したとき、または、動物の生理状態によって必要となったとき、マウスを殺処分した。２つの独立した実験のまとめたデータが示される。
【図７】腫瘍接種後の免疫細胞の変化。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、０日目において、５ｘ１０５ＴＣ−１細胞を播種し、３匹のマウスを、０日目、１０日目、２５日目および４０日目に殺処分した。脾臓、腫瘍流入領域リンパ節および腫瘍を摘出し、破砕して細胞懸濁液を調製し、染色してフローサイトメトリーで分析した。２回の実験のまとめたデータが示される（ｎ＝６−９マウス）。バーは平均値を表し、エラーバーは平均値の標準誤差に相当する。＊＜０．０５  ＊＊＜０．０１。Ａ）ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋細胞のパーセンテージ。Ｂ）ＣＤ２５およびＦｏｘＰ３を発現するＣＤ４＋細胞のパーセンテージ。Ｃ）ＣＤ１１ｃ＋細胞のパーセンテージ。Ｄ）ＣＤ１１ｂ＋細胞のパーセンテージ。Ｅ）ＧＲ１＋細胞のパーセンテージ。Ｆ）ＣＤ１１ｂ＋ＧＲ１＋ポジティブの細胞のパーセンテージ。
【図８】異なる処理後のコントロールおよび担癌マウスにおける腫瘍特異的免疫応答の分析。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、未処理のままとし（Ａ、Ｃ）または、０日目において、５ｘ１０５ＴＣ−１細胞を播種した（Ｂ、Ｄ）。２５日後、コントロールおよび担癌マウスに、５０μｇのコントロールＣｙａＡまたは５０μｇのＣｙａＡ−Ｅ７を、ＰＢＳを、または、３０μｇのＣｐＧ−ＢまたはｐＵ／ＤＯＴＡＰ、２５μｇのＰＩＣ、５０μｇのＲ８４８、２．５ｍｇのＣＴＸ（２４時間前）を、または、ＣＴＸおよびＣｐＧ−Ｂ／ＤＯＴＡＰを注射した。コントロール（Ａ）および担癌マウス（Ｂ）における、ＣＤ８＋四量体＋細胞のパーセンテージ。処理後７日目において、マウスを殺処分し、四量体ポジティブ細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーで分析した。コントロール（Ｃ）および担癌マウス（Ｄ）におけるインビボＣＴＬ。処理後７日目において、マウスに、ＣＦＳＥｈｉｇｈおよびＥ７４９−５７ペプチドを充填した５ｘ１０６の脾細胞を、およびＣＦＳＥｌｏｗを充填した５ｘ１０６の脾細胞を静脈内注射した。２４時間後において、脾臓を除去し、単細胞懸濁液をフローサイトメトリーで分析し、ＣＦＳＥｈｉｇｈとＣＦＳＥｌｏｗ細胞との比を決定した。２つの実験のまとめた結果を示す（ｎ＝６）。バーは平均値を表し、エラーバーは平均値の標準誤差に相当する。データは、ＡＮＯＶＡ、その後のダネット事後試験によって比較した。
【図９】２５日目における、三重療法後の免疫細胞の変化。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、０日目において、５ｘ１０５ＴＣ−１細胞を播種した。２４日目において、２．５ｍｇのＣＴＸを腹腔内に与え、２４時間後、５０μｇのＣｙａＡ−Ｅ７および３０μｇのＣｐＧ−Ｂ／ＤＯＴＡＰを与えた。マウスの群は、処理前に（０日目）、ＣＴＸ処理後の２４時間（１日目）にて、または、三重療法投与後４、７または１１日目において、殺処分した。脾臓、腫瘍流入領域リンパ節および腫瘍を摘出し、破砕して細胞懸濁液を作製し、染色してフローサイトメトリーで分析した。２つの実験のまとめたデータが示される（ｎ＝４−６マウス）。バーは平均値を表し、エラーバーは平均値の標準誤差に相当する。＊＜０．０５＊＊＜０．０１．Ａ）ＣＤ２５およびＦｏｘＰ３を発現するＣＤ４＋細胞のパーセンテージ。Ｂ）ＣＤ２５−およびＦｏｘＰ３＋であるＣＤ４＋細胞のパーセンテージ。Ｃ）ＦｏｘＰ３を発現するＣＤ４＋細胞のパーセンテージ。Ｄ）四量体＋およびＣＤ４４＋であるＣＤ８＋細胞のパーセンテージ。Ｅ）ＣＤ１１ｃ＋細胞のパーセンテージ。Ｆ）ＣＤ１１ｂ＋細胞のパーセンテージ。Ｇ）ＧＲ１＋細胞のパーセンテージ。Ｈ）ＣＤ１１ｂ＋ＧＲ１＋ポジティブ細胞のパーセンテージ。
【図１０】ＣＤ３の免疫染色。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、０日目において、５ｘ１０５ＴＣ−１細胞を注入した。２４または３９日目において、２．５ｍｇのＣＴＸを腹腔内に与えた。２５日または４０日目において、マウスに、５０μｇのＣｙａＡ−Ｅ７および３０μｇのＣｐＧ−Ｂ／ＤＯＴＡＰを静脈注射した。処理から１１日後、マウスを殺処分した。未処理の担癌マウスは、２５日および４０日目に殺処分した。ＣＤ３についての腫瘍の免疫染色は、材料および方法に記載されるとおり行った。
【図１１】三重療法によっておよび腫瘍成長によって誘導される骨髄性細胞の表現型。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、０日目において、５ｘ１０５ＴＣ−１細胞を注入した。三重療法で処理したマウスに、２４日目において２．５ｍｇのＣＴＸを腹腔内で与え、２４時間後、５０μｇのＣｙａＡ−Ｅ７および３０μｇのＣｐＧ−Ｂ／ＤＯＴＡＰで与えた。ＰＢＳ処理したマウスは、２５日目に２００μｌのＰＢＳを与えた。腫瘍をもたないコントロールマウスにも同様の処理を行った。全てのマウスは、処理後１１日目（腫瘍接種後の３６日目）に殺処分した。脾臓を摘出し、破砕して細胞懸濁液を作製し、染色してフローサイトメトリーで分析した。２つの代表的な実験が示される（ｎ＝６マウス）。バーは平均値を表し、エラーバーは平均値の標準誤差に相当する。ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１２４＋およびＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋細胞のパーセンテージが、それぞれパネルＡおよびＢに示される。
【実施例】
【０１４１】
免疫系の先天性（ＴＬＲ９リガンドによる）、適応性（ＣｙａＡ−Ｅ７による）および制御性（低用量のシクロホスファミドによる）成分の同時的な標的化に基づく三重療法が、処理した動物の約９０％において巨大腫瘍の十分な根絶を誘導することが示された。
【０１４２】
［材料および方法］
マウスおよび腫瘍
特定の病原体を含まない５週齢のメスＣ５７ＢＬ／６マウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅ，  Ｆｒａｎｃｅ）から購入し、パスツール研究所動物施設において、水および食物を自由に摂取させ、病原体フリーの条件に維持した。Ｃ５７ＢＬ／６−ＲＡＧ１−／−マウスは、米国のＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから得た。動物に関与する実験は、動物配慮のための施設内ガイドラインに従って実施した。
【０１４３】
原発性のマウス肺上皮細胞に由来する、ＨＰＶ１６−Ｅ６およびＨＰＶ１６−Ｅ７タンパク質を発現するＴＣ−１細胞は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＬＧＣ  Ｐｒｏｍｏｃｈｅｍ，  Ｍｏｌｓｈｅｉｍ，  Ｆｒａｎｃｅ）から得られる（１４）。ＥＬ４−Ｅ７細胞、ＨＰＶ１６−Ｅ７を発現するマウスリンパ腫（１５）。細胞は、ＧｌｕｔａＭＡＸを含み、１０％熱失活ウシ胎児血清、１００ユニット／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、０．４ｍｇ／ｍｌジェネティシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）および５ｘ１０−５ｍｏｌ／ｌの２−メルカプトエタノール（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｃｅｒｇｙ−Ｐｏｎｔｏｉｓｅ，  Ｆｒａｎｃｅ）を添加したＲＰＭＩ１６４０にて維持した。
【０１４４】
腫瘍細胞株（５ｘ１０５ＴＣ−１細胞または４×１０６ＥＬ４−Ｅ７細胞）を、２００μｌ量のＰＢＳにてＣ５７ＢＬ／６マウスの剪毛された左側背部に播種した。２つの垂直な直径の平均として表される腫瘍サイズ（ミリメートル）を、一定の間隔で測定した。
【０１４５】
試薬
ＨＰＶ１６−Ｅ７  Ｈ２−Ｄｂ制限エピトープ（１６）に相当する、合成ペプチドＥ７４９−５７（アミノ酸の１文字表記でＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）は、ＮｅｏＭＰＳ（Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ，Ｆｒａｎｃｅ）から購入した。
【０１４６】
切断型のＥ７タンパク質を保有するボルデテラ・ペルツシスのアデニル酸シクラーゼの解毒された形態（ＣｙａＡ−Ｅ７）および何れの挿入体も有さないコントロールアデニル酸シクラーゼ（ＣｙａＡ）は、（５）の記載及び以下に要約する通りに精製した。
【０１４７】
ＣｐＧ  ＯＤＮｓ
【化１】
2010509191.tif 000002
【０１４８】
は、Ｐｒｏｌｉｇｏ（Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）によって合成された。太字のヌクレオチドは、ホスホロチオネートのバックボーンに相当する。ポリウリジン（ｐＵ）はＳｉｇｍａ（Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から、Ｒ８４８はＰｈａｒｍａＴｅｃｈ（Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）から、ポリイノシン−ポリシチジル酸（ＰＩＣ）はＩｎｖｉｖｏｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，  ＵＳＡ）から購入した。３０μｇのＣｐＧ  ＯＤＮまたはｐＵは、５０μｌのＯｐｔｉｍｅｎ培地（Ｇｉｂｃｏ，  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，  ＮＹ，  ＵＳＡ）で希釈し、１００μｌのＯｐｔｉｍｅｎに希釈した６０  μｇのＤＯＴＡＰ（Ｒｏｃｈｅ，  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）と混合した。残りの試薬は、注入前にＰＢＳで希釈した。シクロホスファミド（ＣＴＸ）（Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）およびドキソルビシン（ＤＯＸ）  （Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）は、注入前に、それぞれＰＢＳおよび滅菌水に希釈した。
【０１４９】
異なる抗原性の製剤およびアジュバントは、化学療法剤をワクチンの２４時間前に投与した以外は、同時に注射した。静脈内投与は、２００μｌの量で、後眼窩注入（ｒｅｔｒｏｏｒｂｉｔａｌ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）によって行い、腫瘍内投与は、５０μｌの量で、注射によって行い、および皮下投与は２００μｌで行った。
【０１５０】
ＨＰＶ１６−Ｅ７エピトープを保有する組換えＢ．ペルツシスアデニル酸シクラーゼの構築および精製
使用される組換えアデニル酸シクラーゼは、酵素的に不活性なＣｙａＡをコードするプラスミドｐＴＲＡＣＥ５（５）の誘導体を用いて、Ｅ．コリにて発現させた（Ｄａｄａｇｌｉｏ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ  Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １５：  １４２３−１４３０，  ２００３）（Ｇｍｉｒａ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ  Ｒｅｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，  １５２：  ８８９−９００，  ２００１）。プラスミドｐＴＲＡＣＥ５は、Ｂ．ペルツシスＣｙａＡの酵素的に不活性で、ゆえに無細胞毒性の変種の発現ベクターである。それはまた、ＣｙａＡの翻訳後アシル化のために必要であるＢ．ペルツシスｃｙａＣ遺伝子を発現する。このプラスミドは、前述したｐＴＲＡＣＧプラスミドの誘導体である（Ｇｍｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｒｅｓ．  Ｍｉｃ．  １５２：  ８８９）。それは、ｃｙａＡ  ＤＮＡ配列の５’部分内に位置するＥｃｏＲＶサイトに、６ヌクレオチドＣＴＧＣＡＧを挿入することによって得た。これは、触媒部位の本質的部分内のＣｙａＡのＡｓｐ１８８からＩｌｅ１８９の間への、ジペプチドＬｅｕ−Ｇｌｎのインフレームの挿入に帰着する（Ｇｕｅｒｍｏｎｐｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．  ２０００，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ３２６：５２７）。
【０１５１】
プラスミドｐＴＲＡＣＥ５は、ＣｏｌＥ１複製開始点およびアンピシリン抵抗性マーカーをもっている。このプラスミドにおいて、ｃｙａＣおよび修飾されたｃｙａＡ遺伝子は、λファージＰｒプロモーターの制御の下、同じ転写ユニットに位置する。ｐＴＲＣＡＧプラスミドはまた、３２℃未満の温度でλＰｒプロモーターにて強く遺伝子の転写を抑制する温度感受性のλリプレッサーｃＩ８５７をコードする。
【０１５２】
Ｅ．コリ株  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）は、標準プロトコール（Ｍａｎｉａｔｉｓら）によって行った全てのＤＮＡ操作のために使用した。
【０１５３】
ＣｙａＡ−Ｅ７４９−５７は、ＣｙａＡのコドン２２４から２３５の間に挿入される、９−アミノ酸長のポリペプチド配列（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）を含む。ＣｙａＡ−Ｅ７４９−５７のための発現プラスミドは、以下の通りに造った。２つの合成オリゴヌクレオチド（ＭＷＧ，  Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ，  Ｆｒａｎｃｅ）、ＢＴＰ１  （５’−ＣＴＡ  ＧＣＣ  ＧＴＧ  ＣＣＣ  ＡＴＴ  ＡＣＡ  ＡＴＡ  ＴＴＧ  ＴＡＡ  ＣＣＴ  ＴＴＧ  ＧＴＡ  Ｃ−３’コーディング鎖）およびＢＴＰ２  （５’−ＣＡＡ  ＡＧＧ  ＴＴＡ  ＣＡＡ  ＴＡＴ  ＴＧＴ  ＡＡＴ  ＧＧＧ  ＣＡＣ  ＧＧ−３’非コーディング鎖）をアニールさせ、ＮｈｅＩおよびＫｐｎＩで消化したｐＴＲＡＣＥ５につないだ。ＣｙａＡ−Ｅ７Ｆｕｌｌは、ｎ°  ＣＮＣＭ  Ｉ−３１９１の下、２００４年３月１８日にＣＮＣＭ（フランス、パリ）に寄託された、酵素的に不活性なＣｙａＡの同じ２２４の位置に挿入される、ＨＰＶ１６−Ｅ７タンパク質の完全な配列（すなわち９８アミノ酸）を含む。Ｅ７タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、特異的なプライマーＢＴＰ３（５’−ＧＧＧ  ＣＧＣ  ＴＡＧ  ＣＡＴ  ＧＣＡ  ＴＧＧ  ＡＧＡ  ＴＡＣ  ＡＣＣ  ＴＡＣ−３’）およびＢＴＰ４  （５’−ＧＧＧ  ＣＧＧ  ＴＡＣ  ＣＴＧ  ＧＴＴ  ＴＣＴ  ＧＡＧ  ＡＡＣ  ＡＧＡ  ＴＧＧ  Ｇ−３’）を使用して、ＨＰＶ１６  ＤＮＡ  （Ｓｅｅｄｏｒｆ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １４５：  １８１−１８５，  １９８５）から増幅した。得られたＰＣＲ生成物はＮｈｅＩおよびＫｐｎＩで消化し、ＮｈｅＩおよびＫｐｎＩで切断したｐＴＲＡＣＥ５に結合した。アニールされたオリゴヌクレオチドならびにＨＰＶ１６−Ｅ７の完全な配列に存在するＳｓｐＩサイトは、挿入された変異体の迅速な同定を可能にする。ＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０−４２は、ＣｙａＡのコドン３１９から３２０の間に挿入されるＨＰＶ１６−Ｅ７の最初の２９のアミノ酸残基並びにＣｙａＡのコドン２２４から２３５の間に挿入されるＨＰＶ１６−Ｅ７の４３から９８残基を含む。ＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０−４２のための発現プラスミドは、２段階で作製し、ｎ°  ＣＮＣＭ  Ｉ−３１９０  の下、２００４年３月１８日にＣＮＣＭに寄託した。ＨＰＶ１６−Ｅ７の（アミノ酸残基１〜２９）をコードする第１のＤＮＡ断片は、標的ＤＮＡとして合成ＨＰＶ１６−Ｅ７遺伝子（Ｅ．コリでの生産に適す、ＧＴＰ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｌａｂｅｇｅ，  Ｆｒａｎｃｅによって設計される）およびプライマーとしてＢＴＰ５  （５’−ＧＧＧ  ＣＡＣ  ＣＧＧ  ＴＡＡ  ＡＣＧ  ＴＡＴ  ＧＣＡ  ＣＧＧ  ＣＧＡ  ＴＡＣ  ＴＣＣ  Ｇ−３’）およびＢＴＰ６  （５’−ＣＧＴ  ＧＡＧ  ＣＡＴ  ＣＴＧ  ＧＣＴ  ＴＴＣ  ＡＣＴ  ＡＧＴ  ＡＣＧ  ＴＴＴ  ＧＴＴ  ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＣＴＣ  ＧＴＡ  ＧＣＡ−３’）を使用して、ＰＣＲで増幅した。ＣｙａＡのコドン３２０から３７２をコードする第２のＤＮＡ断片は、ｐＴＲＡＣＥ５を標的ＤＮＡとして、ＢＴＰ７（５’−ＧＧＧ  ＣＡＣ  ＴＡＧ  ＴＧＡ  ＡＡＧ  ＣＣＡ  ＧＡＴ  ＧＣＴ  ＣＡＣ  ＧＣＧ  ＣＧＧ  Ｇ−３’）および  ＢＴＰ８  （５’−ＡＧＴ  ＡＣＡ  ＴＣＣ  ＧＧＣ  ＧＡＧ  ＡＡＣ−３’）をプライマーとして使用して、ＰＣＲ増幅した。（部分的に重複する）こ���らの２つのＤＮＡ断片は、精製し、プライマーＢＴＰ５およびＢＴＰ８と組み合わせて、第３のＰＣＲにて、２９４ｂｐ長のＤＮＡ断片を増幅した。この断片は、ＡｇｅＩおよびＢｓｔＢＩによって消化し、ｐＴＲＡＣＥ５の対応する部位の間に挿入し、プラスミドｐＴＲＡＣＥ５−Ｅ７１−２９を得た。その後、ＨＰＶ１６−Ｅ７の４３から９８アミノ酸残基をコードするＤＮＡ断片を、合成ＨＰＶ１６−Ｅ７遺伝子を標的ＤＮＡとして、ＢＴＰ９  （５’−ＧＧＧ  ＣＧＣ  ＴＡＧ  ＣＧＧ  ＴＣＡ  ＡＧＣ  ＡＧＡ  ＡＣＣ  ＧＧＡ  Ｃ−３’）およびＢＴＰ１０（５’−ＧＧＧ  ＣＧＧ  ＴＡＣ  ＣＡＧ  ＧＴＴ  ＴＴＴ  ＧＡＧ  ＡＧＣ  ＡＡＡ  ＴＣＧ  ＧＡＣ  ＡＡＡ  ＣＡＡ  ＴＣＣ  ＣＣＡ  ＧＡＧ  ＴＡＣ  ＣＣＡ  ＴＣ−３’）をプライマーとして用いて、ＰＣＲ増幅した。精製したＰＣＲ断片を、ＮｈｅＩおよびＫｐｎＩによって消化し、同じ制限酵素で消化したプラスミドｐＴＲＡＣＥ５−Ｅ７１−２９につないだ。
【０１５４】
全ての組換えアデニル酸シクラーゼは、以前に記述されるように（２６）、大腸菌株ＢＬＲ（Ｎｏｖａｇｅｎ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）で作製した。組換えタンパク質は、以前に記述されるとおり（２６）、ＤＥＡＥ−セファロースおよびフェニル−セファロースクロマトグラフィーを含む２段階の手法によって、封入体から、ほぼ均一になるように精製した（図１Ｂ）。６０％イソプロパノール（２０ｍＭＨｅｐｅｓ−Ｎａ中、ｐＨ７．５）による付加的な洗浄工程を、混入する大部分のＬＰＳを除去するために、フェニル−セファロースクロマトグラフィーに添加した。ＬＰＳ内容物は、キットＱＣＬ−１０００（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ，  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）を使用して測定した。精製した組換えタンパク質は、ＳＤＳ−ゲル分析によって分析した。タンパク質濃度は１４２，０００Ｍ−１．ｃｍ−１の分子吸光係数を使用して２８０ｎｍの吸収から、分光光度的に測定した。
【０１５５】
フローサイトメトリー分析
腫瘍成長の間または治療の後における細胞の変化を分析するために、固形腫瘍、脾臓および鼠径リンパ節を摘出し、破砕して細胞懸濁液を作製し、その後染色した。
【０１５６】
染色に使用したモノクローナル抗体は、ＦＩＴＣ融合型抗ＣＤ１１ｂ、抗ＣＤ４、抗ＣＤ６９、抗ＣＤ８；ＰＥ融合型抗ＧＲ１＋、抗ＣＤ１２４、抗ＮＫ１．１；ＡＰＣ融合型抗ＣＤ２５、抗ＣＤ４４、抗ＣＤ６９、抗ＣＤ８、抗ＣＤ１１ｃであった（全てＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，  Ｅｒｅｍｂｏｄｅｇｅｍ，  Ｂｅｌｇｉｕｍから購入）。ＰＥ融合型Ｈ−２Ｄｂ／Ｅ７４９−５７四量体は、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  （Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）から得た。Ｔ制御性細胞の染色は、Ｍｏｕｓｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｓｔａｉｎｉｎｇキット（Ｅ−ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）を用いて行った。
【０１５７】
ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ  （Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，  Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，  ＮＪ，  ＵＳＡ）をフローサイトメトリーのために使用し、結果はＣＥＬＬＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，  Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，  ＮＪ，  ＵＳＡ）で分析した。
【０１５８】
インビボ死滅アッセイ
ナイーブ脾細胞に、９μＭのＥ７４９−５７ペプチドを、３７℃で３０分パルスした（ｐｕｌｓｅｄ）。大量に洗浄した後に、細胞を２．５μＭ  ＣＦＳＥ（ＣＦＳＥｈｉｇｈ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）でラベルした。コントロールの非ペプチド処理脾細胞は、０．２５μＭのＣＦＳＥ（ＣＦＳＥｌｏｗ）でラベルした。ＣＦＳＥｈｉｇｈおよびＣＦＳＥｌｏｗ細胞は１：１の比率で混合し、１０７細胞をナイーブ動物または免疫化した動物に静脈注射した。２４時間後、脾臓を取り出し、フローサイトメトリーによって単一の細胞懸濁液を分析し、ＣＦＳＥｈｉｇｈ細胞とＣＦＳＥｌｏｗ細胞との比率を測定した。特異的溶解のパーセンテージを、以下の様に算出した：％特異的溶解＝１００−（１００（％免疫化ＣＦＳＥｈｉｇｈ／％免疫化  ＣＦＳＥｌｏｗ）／（％コントロールＣＦＳＥｈｉｇｈ／％コントロールＣＦＳＥｌｏｗ））。
【０１５９】
抗ＣＤ３免疫組織化学
腫瘍サンプルは、ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した。３マイクロメーターの切片を、抗原の回収のために、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ  （０．００１Ｍ  ｐＨ９）において１０分間電子レンジで加熱し、内因性ペルオキシダーゼは、ペルオキシダーゼブロッキング剤（Ｄａｋｏ，  Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｏ，  ＣＡ）でクエンチした。組織切片は、親和性で精製した抗ヒトＣＤ３（Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｆｒｅｍｏｎｔ，  ＣＡ）をトリス緩衝食塩水で１：３００に希釈したものと一晩４℃でインキュベートした。ペルオキシダーゼ活性は、抗ウサギＥｎＶｉｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｄａｋｏ）およびＤＡＢ＋  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｄａｋｏ）で顕在化させた。最後に、切片をメチルグリーンで対比染色した。
【０１６０】
統計分析
腫瘍成長データは、Ｍｏｎｏｌｉｘソフトウェア（http://www.math.u-psud.fr/~lavielle/monolix/）を使用して、非線形混合効果モデルによって分析した。時簡に対する腫瘍の平均直径は、（１７）に記載されるモデルを使用して適合させ、処理は尤度比試験を使用して比較した。カプラン−マイヤープロットを生存の分析のために使用し、ログランク検定を、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，  Ｉｎｃ．  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＵＳＡ）を用いて、生存曲線の差の有意性を調べるために使用した。インビボＣＴＬおよび四量体染色からのデータは、ダネット事後試験に従うＡＮＯＶＡによって比較した。０．０５未満のｐ値を、統計学的に有意であると考えた。
【０１６１】
［結果］
ＣｙａＡ−Ｅ７の治療効果は、巨大担癌マウスにおいて抑制される
我々は以前に、５ｘ１０４ＴＣ−１腫瘍細胞の移植から１０日後における、ＨＰＶ  Ｅ７抗原を保有するＣｙａＡ組換えタンパク質（ＣｙａＡ−Ｅ７）の単一の注射は、腫瘍成長の完全な退行を誘導し、全ての処理したマウスの生存がもたらされることを示した（５）。そのような治療的ワクチン接種が、腫瘍成長の後期の段階でもなお有効であるかを決定するため、マウスに５ｘ１０５ＴＣ−１細胞を注入し、その後、様々な時点において５０μｇのＣｙａＡ−Ｅ７の単一の静脈注射で処理した。ＴＣ−１細胞の注入から４日後に処理したマウスにおいて、初期段階の成長の後、腫瘍は全ての動物において拒絶された。しかしながら、６０日後における腫瘍の再発が１匹のマウスで発見された（図１．１Ｂ）。ＣｙａＡ−Ｅ７の抗腫瘍効果の漸進的減少が、遅延性の処理を受けたマウスにおいて観察された。この為、ＴＣ−１細胞の注入から２５日後にＣｙａＡ−Ｅ７の処理を受けたマウスの２０％のみが、腫瘍成長から保護された。しかしながら、腫瘍成長の遅延および生存の増加は、ＰＢＳ処理マウスと比較して、なお有意であった（図１．１Ｆ、Ｈ）。腫瘍接種から３０日後に処理したマウスでは、ＰＢＳ処理群と比較して、腫瘍成長および生存の有意差は観察できなかった（図１．１Ｇ、Ｈ）。従って、腫瘍移植の１ヵ月後に注入される場合、ＣｙａＡ−Ｅ７は、治療的抗腫瘍性応答を誘導する能力を失った。
【０１６２】
ＴＬＲ−リガンドは、進行した腫瘍に対するＣｙａＡ−Ｅ７の治療効力を増加させる
次に、我々は、アジュバントが、進行性の腫瘍を患うマウスにおいて、ＣｙａＡ−Ｅ７投与によって誘導される抗腫瘍性の治療的応答を回復することができるかどうかを試験した。これらの実験のために、マウスは、腫瘍細胞注入から２５日後に処理した。これは、我々がＣｙａＡ−Ｅ７の治療的活性を検出できた最後の時点であったためである。
【０１６３】
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンドは、インビボでのＤＣ成熟を誘引するの能力により、近年大きな注目を集めている。我々は、これらの実験のために、５つの合成ＴＬＲリガンドを選択した：ＴＬＲ−３リガンド、ポリイノシン−ポリシチジル酸（ＰＩＣ）、２つのＴＬＲ−７のリガンド、ポリウリジン（ｐＵ）およびＲ８４８並びに２つのＴＬＲ−９リガンド、ＣｐＧ−ＡおよびＣｐＧ−Ｂ。ｐＵおよびＣｐＧｓは、ＤＯＴＡＰにて組み合わせて、それらを分解から保護し、それらの取り込みを促進した。
【０１６４】
腫瘍退縮の有意な増加は、ＴＣ−１細胞の注入から２５日後において、ＣｙａＡ−Ｅ７で処理したマウスおよびｐＵまたはＣｐＧｓまたはＰＩＣで処理したマウスでは観察されたが、Ｒ８４８で処理したマウスでは観察されなかった。生存パーセンテージは、ｐＵおよびＰＩＣによる４１％から、ＣｐＧ−Ｂによる５０％およびＣｐＧ−Ａによる５８％までの範囲であった（図２．１Ｆ、Ｇ、Ｈ、ＩおよびＪ）。２５日後におけるＣｙａＡ−Ｅ７およびこれらのＴＬＲアゴニストの注入の後、腫瘍は５から７日間成長を続け、１４ｍｍの直径まで達した。その後、大部分の腫瘍のサイズは減少を始め、治療的な免疫応答の良好な誘導を反映した。この状態は２５日間持続し、最終的に腫瘍の完全な治癒がもたらされた。しかしながら、一部のマウスでは、完全な根絶の前に、腫瘍の再発が観察された。
【０１６５】
ＣｙａＡ−Ｅ７ワクチンを伴わず、単独で投与された２つのこれらのＴＬＲリガンド（ＰＩＣおよびＣｐＧ−Ｂ）の治療的効果を、これらのＴＬＲリガンドが腫瘍によって刺激される免疫応答を増強できるかどうかを研究するために試験した。しかしながら、単独で投与したこれらのＴＬＲリガンドの何れも腫瘍成長に対して効果を示さなかった（図２．１Ｃ、ＤおよびＪ）。それゆえ、ＣｙａＡによるＥ７送達は、これらの大きな腫瘍の退行を達成するために必要とされる。
【０１６６】
我々は次に、化学療法剤が、巨大担癌マウスに投与した場合に、ＣｙａＡ−Ｅ７の治療的活性を回復できるかどうかを分析した。我々は、この目的のために２つの薬剤を選択した：シクロホスファミド（ＣＴＸ）（抗腫瘍性ワクチンの効力を長期間増強することが示された、ナイトロジェンマスタード型のアルキル化剤（２０）（２１））；およびドキソルビシン（ＤＯＸ）（トポイソメラーゼＩＩ酵素の作用を抑制し、腫瘍内注入後に腫瘍の成長を制御できる免疫原性の細胞死を誘導する挿入剤（２２））。我々の巨大腫瘍のモデルにおいて、ＤＯＸは、腫瘍内（図３Ｅ、Ｆ）または静脈内に投与された場合、ＣｙａＡ−Ｅ７  の効果を増強しなかった。対照的に、ＣｙａＡ−Ｅ７ワクチンの２４時間前に注射された低用量のＣＴＸは、全ての腫瘍の成長の遅延をもたらし、５８％のマウスで、完全に腫瘍が根絶した。ＴＬＲリガンドと異なり、ＣＴＸ単独の投与は、有意に腫瘍成長を遅延させたが、この効果は一過的で、腫瘍の根絶には至らなかった（図３Ｃ）。この腫瘍成長の遅延はＲＡＧ１−／−マウスで観察されず（図１．２）、このことは、この効果がＴ細胞によって仲介されることを強く示唆する。最後に、ＣＴＸおよびＣｙａＡ−Ｅ７の組み合わせの投与の抗腫瘍性の効力は、ＣＴＸ用量を３倍に増大することで改善されなかった（図２．２）。１００ｍｇ／ｋｇのＣＴＸは、最大の抗腫瘍効果を示し、この併用療法に関する潜在的な副作用を低減させた。
【０１６７】
化学療法、ＴＬＲ−９リガンドおよび抗腫瘍性ワクチンを組み合わせた三重療法治療による巨大腫瘍の根絶
次に、我々は、ｙａＡ−Ｅ７、ＣＴＸおよびＣｐＧが異なる作用機構を有するために、それらが相乗効果を有し得ると仮説をたてた。従って、我々は、２４日目の担癌マウスにＣＴＸを投与し、２４時間後、ＣｙａＡ−Ｅ７およびＣｐＧ−Ｂ（ＤＯＴＡＰ中）を注入した。この三重療法は、８７．５％の生存率という強力な抗腫瘍効果を示した。三重療法を受けた１６匹のマウスの内２匹のみは、腫瘍を根絶しなかった（図４Ｄ、Ｅ）。ＣｙａＡ−Ｅ７ワクチンはこの治療効果にとって必須であった。というのは、ＣＴＸおよびＣｐＧ−Ｂ／ＤＯＴＡＰの投与は腫瘍の退行を誘導できないものの、この処理は、ＣＴＸ単独の投与の後、以前に認められたように、腫瘍成長の有意な遅延を誘導したためである（図４Ｃ、Ｅ）。
【０１６８】
非常に巨大腫瘍を治療するための三重療法の可能性を決定するために、我々は、腫瘍接種後３０日または４０日おいて、担癌マウスにこの処理を施した。三重療法を３０日目に投与した場合、有効性の減少があったが、なお４１．７％の動物が腫瘍を根絶できた（図５．１Ｄ、Ｆ）。４０日目においても、腫瘍直径が１５から２０ｍｍの間であった場合、２匹のマウスは明確に腫瘍を根絶した。注目すべきは、全ての処理したマウスにいおいて、腫瘍は退行を開始し、これは、およそ２０日間持続する有効な免疫応答の誘導を示しており、その後腫瘍再発が続いた（図５．１Ｅ、Ｆ）。しかしながら、退行状態は、５５日における三重療法の第２の投与によって延長され、４３％の処理したマウスにおける腫瘍根絶がもたらされた（図５．２）。
【０１６９】
これらの結果をＨＰＶ誘導性腫瘍のその他のモデルに拡張するために、我々は、Ｅ７タンパク質を形質移入したＥＬ４細胞（ＥＬ４−Ｅ７細胞）をマウスに皮下注入した（１５）。これらの細胞の成長はＴＣ−１成長よりも速く、１４日目において、ＥＬ４−Ｅ７腫瘍は、３０日目のＴＣ−１腫瘍と同等のサイズに達した（図６Ａ、Ｅ）。腫瘍細胞の注入から７、１４または２１日後、マウスを三重療法で処理した。図６に示されるように、三重療法は、接種から１４日目まで、腫瘍を治療する効果があったが、接種から２１日後、腫瘍の根絶に失敗した。ＴＣ−１モデルと同様に、全ての腫瘍は、退行を開始したが、それらのほとんどが再発した。
【０１７０】
腫瘍発生の間の免疫細胞の変化
我々は、次に、巨大担癌マウスにおけるＣｙａＡ−Ｅ７の治療的活性の減少の根底にある機構を調べた。特に、我々は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）および／または骨髄性サプレッサー細胞（ＭＤＳＣｓ）の増大がＣｙａＡ−Ｅ７活性のそのような減少の原因であるかどうか調べた。従って、脾臓、鼠径流入領域リンパ節（ｉｎｇｕｉｎａｌ  ｄｒａｉｎｉｎｇ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅｓ）（ＤＬＮ）および腫瘍におけるこれらの細胞集団のパーセンテージを、ＴＣ−１細胞の注入の後の異なる時点において分析した（図７）。
【０１７１】
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋細胞の高いパーセンテージは、分析した全ての時点において腫瘍を浸潤させることがわかり、これらの細胞の特異的な動員および／または増大を示している。この集団はまた、担癌マウスの脾臓およびＤＬＮｓにおいて、次第に増加した。この増加はＤＬＮおいてより速く、１０日目までにおいて、腫瘍接種前の鼠径リンパ節との差は有意であり（１０．８  ｖｓ  ８．７  ％；  ｐ＜０．０５）、この差は、２５日目（１２．６  ｖｓ  ８．７％  ｐ＜０．０１）および４０日目（１６．１  ｖｓ  ８．７％；  ｐ＜０．０１）において更に増大した。脾臓では、有意差は４０日目において検出可能なだけであった（２０．７  ｖｓ  １１．０％；  ｐ＜０．０１）。
【０１７２】
骨髄由来ＣＤ１１ｂ＋ＧＲ１＋細胞集団は、担癌動物の脾臓においておよび４０日目において次第に増加し、これらの細胞における有意なより高いパーセンテージが、コントロールマウスと比較して担癌マウスの脾臓にてわかった（１１．６  ｖｓ  １．０％；  ｐ＜０．０１）。この集団はＩＬ−４受容体α鎖（ＣＤ１２４）を発現し、近年免疫抑制のＭＤＳＣｓとの関連が示された（図１１Ａ）（３６）。
【０１７３】
結論として、Ｔｒｅｇの著しい増大は、腫瘍内にて認められ、そしてまた系統的に認められたものの、脾臓およびリンパ節においてはより低く記録された。骨髄由来サプレッサー細胞ＣＤ１１ｂ＋ＧＲ１＋細胞の増大は、後期段階の担癌マウスの脾臓においてのみ検出された。
【０１７４】
コントロールおよび担癌マウスにおける三重療法によって誘導される抗腫瘍性の免疫応答の分析
異なる処理によって誘導される免疫応答の研究のために、我々は、四量体＋細胞のパーセンテージおよびコントロールおよび担癌マウスにて生じるインビボ細胞溶解活性を決定することで、Ｅ７４９−５７ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞応答を分析した。コントロールマウスにおいて、ＣｙａＡ−Ｅ７単独と比較して四量体＋細胞の数を有意に増大させた唯一の処理は、ＣＴＸの投与に依存してＣｐＧ−Ｂ／ＤＯＴＡＰおよびＣｙａＡ−Ｅ７による免疫化であった。驚くべきことに、三重療法は、そのより強力な抗腫瘍性の活性にもかかわらず、有効性はより低かった（図８Ａ）。対照的に、インビボＣＴＬアッセイは、ＣｙａＡ−Ｅ７  ＋  ＣｐＧ−Ｂ／ＤＯＴＡＰの両方又は三重療法による免疫化に続く、細胞溶解活性の有意な増加を明らかにした。
【０１７５】
免疫化の２５日前にＴＣ−１腫瘍細胞を移植されたマウスは、コントロール免疫化マウスよりも低い四量体＋細胞の増大を示し、試験した何れの組み合わせも、ＣｙａＡ−Ｅ７単独による免疫化に比べて有意に異なることはなかった（図８Ｂ）。対照的に、ＣｙａＡ−Ｅ７単独の場合に比べて、ＣＴＸの非存在または存在下でＣｙａＡ−Ｅ７  ＋  ＣｐＧ−Ｂ／ＤＯＴＡＰにより免疫化したマウスにおいて、有意により強力なインビボＣＴＬ活性が観察された（ｐ＜０．０５）（図８Ｄ）。ＣｙａＡ−Ｅ７を伴うＣＴＸの投与は、その強力な抗腫瘍活性にもかかわらず、ＣｙａＡ−Ｅ７により誘導される免疫応答を増強しなかった。
【０１７６】
ＴＣ−１注入から４０日後において、担癌マウスにおいて四量体＋細胞は検出されなかった。インビボ細胞溶解活性は、低くいものの検出された（図８Ｅ−Ｆ）。従って、ＴＣ−１成長に関する骨髄由来サプレッサー細胞およびＴｒｅｇの増大は、段階的に、三重療法によって誘導される抗腫瘍性の免疫応答を減じる。そのうえ、抗腫瘍性のデータと一致して、担癌マウスにおいて、三重療法は、試験される全ての組合せの最も高いインビボ細胞毒性活性を誘導した。
【０１７７】
２５日目における三重療法後の免疫細胞の変化
次に、我々は、腫瘍が拒絶される際に三重療法によって誘導される免疫系の変化を評価した。具体的には、我々は、Ｔ制御性細胞、骨髄性サプレッサー細胞、腫瘍特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の進化を分析した。
【０１７８】
予想通り、シクロホスファミドの投与は、７日目までに回復する、脾臓およびリンパ節における一時的なリンパ球枯渇（ｌｙｍｐｈｏｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）を誘導した。ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋集団は、全ＣＤ４＋細胞よりわずかに顕著な減少を示したが、脾臓および流入領域リンパ節では有意性に達しなかった（図９）。非常に興味深いことに、腫瘍関連制御性Ｔ細胞は有意に減少した。ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋／ＣＤ４＋細胞のパーセンテージは、処理の後の４および７日目において、非処理マウスの５０％から３０％まで降下した（図９のＡ）。驚くべきことに、三重療法の１１日後、ＣＤ２５−ＦｏｘＰ３＋細胞の増加は分析される全ての器官において認められ、脾臓および流入領域リンパ節におけるＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージの有意な増加および腫瘍における制御性Ｔ細胞パーセンテージの迅速な回復がもたらされた（図９Ｂ、Ｃ）。ＦｏｘＰ３＋細胞のこれらの増大と平行して、腫瘍特異性のＣＤ８＋Ｔ細胞の有意な増加は、脾臓、ＤＬＮおよび腫瘍において検出され、四量体ポジティブの細胞のパーセンテージは特に高かった（図９Ｄ）。免疫応答開始のその他の証拠は、たとえば、脾臓およびＤＬＮにおけるＮＫ細胞の一時的な活性化として検出され、更に免疫応答の開始を示している。抗ＣＤ３免疫組織化学は、三重療法後１１日目において劇的に増大した、非処理腫瘍の低いＴ細胞浸入を明らかにした。４０日目に処理した腫瘍は、２５日目に処理した腫瘍と比較して、Ｔ細胞浸入の減少を示した（図１０）。
【０１７９】
我々は、コントロールマウスと比較して、三重療法を受けたマウスの脾臓において、ＣＤ１１ｂ＋ＧＲ１＋細胞のパーセンテージが非常に高いこと発見した（最高３０％の細胞）。断言できないものの、コントロールと比較して、三重療法を受けたマウスのＤＬＮにおいて、ＣＤ１１ｂ＋ＧＲ１＋細胞のパーセンテージがより高かった（図９Ｆ、Ｇ、Ｈ）。この集団は、特異的な顆粒球マーカーＬｙ６Ｇを発現するが、ＩＬ−４受容体α鎖を発現しない。これらのマーカーは、この集団を非抑制性の顆粒球／好中球として同定した（図１１）。最後に、ＣＤ１１ｂ＋ＧＲ１＋骨髄性サプレッサー細胞の強力な増加が脾臓において認められ、およびＤＬＮでもより中程度に認められた（図９Ｆ、Ｇ、Ｈ）。
【０１８０】
［考察］
本研究の目的は、最近開発されたＣｙａＡ−Ｅ７治療ワクチンによって示される抗腫瘍活性を増強する組み合わせ治療を試験することであった。このワクチンは、いずれかのアジュバントが存在しない場合に、抗腫瘍性免疫を誘導する著しい特質を有するが、腫瘍の進行に伴って、その効果は消失する（図１）。我々の結果は、このワクチンの最大の活性を示すためには、先天性免疫系が活性化され、同時に、免疫系の制御性成分が下方制御されなければならないことを示す。
【０１８１】
先天性免疫系の活性化は、合成ＴＬＲリガンドによって容易に実行できる。にもかかわらず、全てのリガンドが良好に機能するわけではなく、我々は、ＤＯＴＡＰとの組み合わせによるＴＬＲ−７リガンド、Ｒ８４８およびｐＵの場合に、同じＴＬＲのリガンドの中においてでさえ差を検出することができた。この知見に対する説明は、オリゴヌクレオチドのリポソーム製剤に対する小分子Ｒ８４８の異なる薬物動態学的プロファイルでありえ、ＴＬＲ誘発に基づく新規のアジュバントの開発のための基礎的な範囲を強調している。最高の結果は、ＤＯＴＡＰとの組み合わせにおけるホスホロチオネートＣｐＧオリゴヌクレオチドにて得られ、接種から２５日目にて処理された腫瘍の５０から６０％の完全な根絶が得られた。残りの腫瘍において、成長の遅延を達成できたものの、最終的には成長した。この進行した腫瘍モデルでは、ＴＬＲリガンド単独の投与は、腫瘍成長に対して何ら効果を有しなかった。それゆえに、ＣｙａＡ−Ｅ７の同時投与が、治療効果を得るために要求された。
【０１８２】
試験した異なるアプローチは、免疫療法および化学療法の共同作用である。我々は、抗腫瘍性ワクチンの有効性を増強することが示されている（２１）、シクロホスファミドおよびドキソルビシンという名の２つの広く使用される薬剤を選択した。そのうえ、ドキソルビシンの腫瘍内注入は、腫瘍免疫拒否をもたらす免疫原性の細胞死を誘導することが近年示された（２２）。しかしながら、我々のモデルでは、シクロホスファミドのみが、ＣｙａＡ−Ｅ７と組み合わせた場合にアジュバント活性を有し、処理したマウスの約６０％において腫瘍の退縮が誘導された。対照的に、ドキソルビシンは、腫瘍内経路または静脈内経路にて使用された場合、何ら効果を示さなかった。シクロホスファミドの低用量の単回投与は、一過的に腫瘍成長を制御したが、完全な根絶を誘導することはできなかった。ＴＬＲリガンドの場合、ＣｙａＡ−Ｅ７の投与は不可欠であった。低用量のシクロホスファミドは、Ｔｒｅｇの数を減少させおよびＴｒｅｇを不活性化させることが近年示された（１３，２３，２４）。我々のモデルにおいて、ＣＤ４＋細胞に対するＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋細胞の高いパーセンテージは、腫瘍浸透型リンパ球（ｔｕｍｏｒ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）において検出され、このパーセンテージは、腫瘍の進行にともない、流入領域リンパ節および脾臓において増大した。シクロホスファミドの投与の４日後、脾臓および流入領域リンパ節において、これらの細胞のわずかな減少が検出されたが、最も強力な減少は腫瘍浸透型リンパ球にて検出され、ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋／ＣＤ４＋のパーセンテージは、約５０％から３０％未満まで減少し、腫瘍関連Ｔ制御性細胞（ＴＡ−Ｔｒｅｇ）のシクロホスファミドに対するより高い感受性を反映している。ＴＡ−Ｔｒｅｇの恒常性の変化は、ＣＴＸ処理に続く腫瘍間質細胞相互作用の障害における鍵となるステップである可能性がある（２５）。ＣＴＸ処理は、実際、ＩＦＮ−γを産生することができず、およびＩＬ−１０産生腫瘍浸潤性マクロファージをＩＦＮ−γ生産者に変更させることができないことが示され、腫瘍浸潤性Ｔ細胞の機能的プロファイルを修飾することが報告された。この障害は、我々のモデルにおいて完全な退行を誘導するには不十分であるものの、ＣｙａＡ−Ｅ７によって誘導される効果細胞の道を開く。それゆえ、ＣｙａＡ−Ｅ７によって誘導される効果細胞を増強する処理は、低用量シクロホスファミドと協同するということが予想できる。実際、最大の応答は、低用量シクロホスファミド、ＣｐＧ−Ｂ／ＤＯＴＡＰおよびワクチン接種のＣｙａＡ−Ｅ７との組み合わせによって達成された。ＤＣ由来エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅｓ）の形態におけるＣｐＧ、ＣＴＸおよびワクチンの組合せは、Ｔａｉｅｂらによって、大きなＢ１６Ａ２／ｇｐ１００腫瘍の治療のために研究されている（２３）。しかしながらこのモデルにおいて、ＣｐＧは、ＣＴＸとの組み合わせで投与されるＤＣ由来エキソソームの抗腫瘍性の有効性を増強しなかった。これらの結果と対照的に、我々は、三重療法の３つの成分、ＣｙａＡ−Ｅ７、ＣｐＧ−Ｂ／ＤＯＴＡＰおよびＣＴＸの間での強力な共同作用を認めた。この三重療法は、平均直径が８ｍｍの腫瘍の接種から２５日後において、治療した動物の８７％において、大きく、確立された腫瘍を根絶することができた。有効性は、大きな腫瘍であるが接種から４０日後に処理したマウスにおいてでさえ減少し、腫瘍の平均直径がおよそ２ｃｍに達したとき、全ての腫瘍が一時的なサイズ減少を示し、有効な免疫応答の誘導を反映している。注目に値するのは、これらの巨大な腫瘍を有する１２匹のマウスの内２匹が完全にそれらを根絶したことである。そのうえ、最初の処理から１５日目後の三重療法の第２の投与は、処理したマウスの４３％において腫瘍の根絶をもたらした。これらの結果は、Ｅ７タンパク質が形質移入されたＥＬ４細胞の接種に基づく異なる腫瘍モデルを使用して、更に確証された。
【０１８３】
三重療法によって誘導される免疫応答の分析は、ＣｐＧ／ＤＯＴＡＰ処理が、試験したアジュバントの内、ＣｙａＡ−Ｅ７単独と比較してＥ７特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞応答を有意に増大させることができた唯一のアジュバントであることを示した。担癌動物において、この差は減少し、その処理がなお四量体＋細胞のパーセンテージを増加させたにもかかわらず、差は統計学的に有意でなかった。ＣｐＧ／ＤＯＴＡＰおよびワクチンとのＣＴＸの投与は、おそらく全身リンパ球枯渇の結果として、Ｅ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を減少させた。対照的に、インビボＣＴＬ活性は、ＣｐＧ／ＤＯＴＡＰのそれと同等のレベルに維持され、または、担癌マウスにてより高かった。この為、三重療法によって誘導されるＣＴＬｓは、細胞あたりのより高い死滅活性を示した。ＣＴＸの投与は、担癌動物にてわずかに免疫応答を増加させたが、コントロールマウスでは増加させなかった。この増加は、ＣｐＧ／ＤＯＴＡＰによって誘導される場合以下であった。それゆえに、両処理は、ＣｙａＡ−Ｅ７の抗腫瘍性の活性を増強できるが、明らかに異なる作用機序によるものである。
【０１８４】
担癌宿主のワクチン接種後のＴｒｅｇの増大は、マウス（２６，２７）およびヒト（２８）の両方において報告され、治療的癌ワクチンが腫瘍特異性のＴ細胞耐性を強化できる可能性が強調される。我々の腫瘍モデルでは、処理されたマウスの約９０％において腫瘍の根絶をもたらす、三重療法によって誘導される強力な抗腫瘍性の免疫と平行して、ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋の増大は、脾臓および流入領域リンパ節において検出された。加えて、脾臓、流入領域リンパ節および腫瘍におけるＣＤ２５マーカーに関するＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋コンパートメントの組成は、三重療法後に変化し、ＣＤ２５−細胞の増加を示している。これは、以前に報告されたように、腫瘍誘導型制御性ＣＤ２５−ＣＤ４＋の増大を反映している可能性がある（２７）。細胞当たり細胞基準（ｃｅｌｌ  ｐｅｒ  ｃｅｌｌ  ｂａｓｉｓ）において、ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＦｏｘＰ３＋細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋細胞と同定度に制御性であることが示されている（３１）。我々は、三重療法に続いて、脾臓および流入領域リンパ節における好中球の実質的な増大を認めた。炎症反応の鍵となる成分として、好中球は、抗原提示細胞の動員、活性化およびプログラミングに対して重要な役割を果たし、第２の免疫応答の質に寄与する（３３、３４）。しかしながら、好中球の増大は、活性酸素種の分泌によって、進行中の抗腫瘍性の応答に対して、有害に影響する可能性がある（３５）。
【０１８５】
さらに、脾臓および流入領域リンパ節において、ＣＤ１１ｂ＋ＧＲ１＋骨髄性サプレッサー細胞は大きく増大し、このことは、ＮＯの分泌によって直接的に（２９）またはＴ制御性細胞のシミュレーションによって間接的に（３０）、進行中の抗腫瘍性の応答に有害な影響を及ぼす可能性がある。興味深いことに、これらの細胞はまた、ＴＣ−１成長の後期に、三重療法が完全な腫瘍退縮を誘導できなかった脾臓において増大した。
【０１８６】
この為、シクロホスファミドは、唯一、ワクチンの初回刺激段階の免疫系の制御性成分を制御し、エフェクター段階の制御システムの増大は、腫瘍接種後４０日に免疫化されたマウスにおけるエフェクター免疫応答の抑止の、部分的な原因となる可能性がある。従って、免疫応答のエフェクター段階の際における、免疫系の制御性成分の誘導を遮断するまたは不活性化を促進する新規の戦略は、エフェクター機能の利益となるようにバランスを変えて、評価されるべきである。
【０１８７】
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【図１．１】
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【図１．２】
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【図２．１】
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【図２．２】
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【図３】
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【図４】
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【図５．１】
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【図５．２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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