(57)【要約】  本発明は、幹細胞または前駆細胞の集団において心筋形成および心臓前駆体の増加を誘発する方法を提供するものであり、この方法は概して、幹細胞または前駆細胞において古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路を誘発することを伴うものである。本発明は、幹細胞または前駆細胞の集団から心筋細胞または心臓前駆体の集団を生成する方法を提供するものであり、この方法は概して、幹細胞または前駆細胞を、古典的Ｗｎｔシグナル伝達を誘発する作用物質と接触させることを伴うものである。本発明の方法は、研究への応用および治療への応用に用いることができる心筋細胞または心臓前駆体の集団を生成するために有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞または前駆細胞の集団において心筋形成を誘発する方法であって、幹細胞または前駆細胞において古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路を誘発することを含む方法。
【請求項２】
前記古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路が、幹細胞をＷｎｔリガンドと接触させることにより誘発される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｗｎｔリガンドが可溶性のＷｎｔ３ａである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記誘発が中胚葉の運命決定の前に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも約１０％の幹細胞集団が心筋細胞に分化する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
約１０％から約５０％の幹細胞集団が心筋細胞に分化する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも約５０％の幹細胞集団が心筋細胞に分化する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
幹細胞または前駆細胞の集団から心筋細胞の集団を生成する方法であって、幹細胞または前駆細胞を、古典的Ｗｎｔシグナル伝達を誘発する作用物質と接触させることを含む方法。
【請求項９】
作用物質がＷｎｔリガンドである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
Ｗｎｔリガンドが可溶性のＷｎｔ３ａである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記接触がインビトロで行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも約１０％の幹細胞集団が心筋細胞に分化する、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
約１０％から約５０％の幹細胞集団が心筋細胞に分化する、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも約５０％の幹細胞集団が心筋細胞に分化する、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
非心筋細胞から心筋細胞を分離することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記分離が、細胞を、心筋細胞特異的細胞表面マーカーに特異的な抗体と接触させることを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
心筋細胞特異的細胞表面マーカーがトロポニンおよびトロポミオシンから選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
細胞がマトリクス内に存在する、請求項８に記載の方法。
【請求項１９】
幹細胞または前駆細胞の集団において心筋形成を誘発する方法であって、幹細胞におけるβ−カテニンのレベルを増大させることを含む方法。
【請求項２０】
幹細胞または前駆細胞を、β−カテニンをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物で遺伝的に修飾することを含む、請求項１９に記載の方法であって、コードされるβ−カテニンが幹細胞または前駆細胞において産生される方法。
【請求項２１】
発現構築物がウイルス構築物である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
発現構築物が組換えアデノ随伴ウイルス構築物である、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
当技術分野において、研究への応用、および治療への応用のために、心筋細胞の生成方法が求められている。
【発明の概要】
【０００２】
本発明は、幹細胞または前駆細胞の集団において心筋形成および心臓前駆体の増加を誘発する方法を提供するものであり、この方法は概して、幹細胞または前駆細胞において古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路を誘発することを伴うものである。本発明は、幹細胞または前駆細胞の集団から心筋細胞または心臓前駆体の集団を生成する方法を提供するものであり、この方法は概して、幹細胞または前駆細胞を、古典的Ｗｎｔシグナル伝達を誘発する作用物質と接触させることを伴うものである。本発明の方法は、研究への応用および治療への応用に用いることができる心筋細胞または心臓前駆体の集団を生成するために有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００３】
【図１】図１Ａ及び１Ｂ。図１Ａは、組織特異的なｎｕｌｌおよび安定なβ−カテニンの生成を示す図である。図１Ｂは、Ｎｋｘ２．５−ｃｒｅ、ｃｔｎｎｂｌｔｍ２Ｋｅｍのヘテロ接合体、ホモ接合体（左）、および野生型、Ｎｋｘ２．５−ｃｒｅ、β−カテニン／ｌｏｘＰ（ｅｘ３）のヘテロ接合体（右）の胚から得た心室のウェスタン・ブロットを示す図である。
【図２】短尾の発現プロフィールを示す図である。
【図３】図３Ａ及び３Ｂは、初期および後期の心臓遺伝子の発現プロフィールを示す図である。
【図４】図４Ａ〜４Ｅは、ＥＳ細胞における心臓の誘導および分化に対する古典的Ｗｎｔシグナル伝達の効果を示す図である。
【図５】Ｅ９．５の、対照（Ｉｓｌｅｔ１−ｃｒｅ、左）、野生型（Ｒｏｓａ−ＹＦＰ、Ｉｓｌｅｔ１−ｃｒｅ、中央）、および突然変異体（Ｉｓｌｅｔ１−ｃｒｅ、β−カテニン（ｅｘ３）ｌｏｘＰ、右）の胚から得たＹＦＰ＋細胞集団を示すヒストグラムを示す図である。
【図６】ＷＴ（Ｒｏｓａ−ＹＦＰ、Ｉｓｌｅｔ１−ｃｒｅ、左のバー）およびＭｕｔ（Ｒｏｓａ−ＹＦＰ、Ｉｓｌｅｔ１−ｃｒｅ、β−カテニン（ｅｘ３）ｌｏｘＰ、右のバー）の胚から選別したＹＦＰ＋細胞から得た、表示した遺伝子の定量リアル・タイムＲＴ−ＰＣＲを示す図である。
【図７】ヒトＥＳ細胞に対する古典的Ｗｎｔの効果を示す図である。
【図８Ａ】Ｗｎｔ３ａタンパク質のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。
【図８Ｂ】Ｗｎｔ３ａタンパク質のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。
【図９Ａ】β−カテニンをコードしているヌクレオチド配列のアラインメントを示す図である。
【図９Ｂ】β−カテニンをコードしているヌクレオチド配列のアラインメントを示す図である。
【図９Ｃ】β−カテニンをコードしているヌクレオチド配列のアラインメントを示す図である。
【図９Ｄ】β−カテニンをコードしているヌクレオチド配列のアラインメントを示す図である。
【図９Ｅ】β−カテニンをコードしているヌクレオチド配列のアラインメントを示す図である。
【図９Ｆ】β−カテニンをコードしているヌクレオチド配列のアラインメントを示す図である。
【図９Ｇ】β−カテニンをコードしているヌクレオチド配列のアラインメントを示す図である。
【図９Ｈ】β−カテニンをコードしているヌクレオチド配列のアラインメントを示す図である。
【図１０Ａ】β−カテニンのアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。
【図１０Ｂ】β−カテニンのアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。
【図１０Ｃ】β−カテニンのアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００４】
定義
本明細書において用いる場合、「幹細胞」という用語は、増殖を誘発され得る未分化細胞を言う。幹細胞は自己維持が可能であり、このことは、各細胞が分裂すると、１つの娘細胞もまた幹細胞となることを意味する。幹細胞は胚組織、誕生後の組織、幼若組織、または成体組織から得ることができる。「前駆細胞」という用語は、本明細書において用いる場合、幹細胞に由来するがそれ自体は幹細胞ではない未分化細胞を言う。いくつかの前駆細胞は、２つ以上の細胞型に分化し得る子孫細胞を産生することができる。
【０００５】
本明細書において用いる場合、「処理」、「処理する」などの用語は、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを言う。この効果は、疾患もしくはその症状を完全にもしくは部分的に防ぐという観点から予防的であり得、かつ／または疾患および／もしくは疾患に起因する悪影響を部分的にもしくは完全に治癒するという観点から治療的であり得る。本明細書において用いる場合、「治療」は、哺乳動物、特にヒトにおける疾患のあらゆる治療を網羅するものであり、（ａ）疾患に罹患しやすい可能性があるがまだ疾患を有しているとは診断されていない対象における疾患の発生を防ぐこと、（ｂ）疾患を阻害すること、すなわち、疾患の発症を阻むこと、および（ｃ）疾患を軽減すること、すなわち、疾患の退縮を生じさせることを含む。
【０００６】
本明細書において同様の意味で用いられる「個体」、「対象」、「宿主」、および「患者」という用語は、限定するものではないが、ネズミ（ラット、マウス）、ヒト以外の霊長類、ヒト、イヌ科の動物、ネコ科の動物、有蹄動物（例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ）などを含む哺乳動物を言う。
【０００７】
「治療有効量」または「効果的な量」は、疾患を治療するために哺乳動物または他の対象に投与した際に、疾患に対するそのような治療を達成するために十分である化合物の量または細胞の数を意味する。「治療有効量」は、化合物または細胞、疾患およびその重篤度、ならびに治療する対象の年齢、体重などによって変化する。
【０００８】
本発明についてさらに記載する前に、本発明が、記載される特定の実施形態に限定されるものではなく、したがって当然のことながら変化し得ることを理解されたい。また、本明細書において用いる用語は特定の実施形態のみを記載する目的のためのものであり、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるものであるため、前記用語は限定するためのものではないことも理解されたい。
【０００９】
値の範囲が示されている場合、文脈により別段の指示が明らかでない限り下限の単位の１０分の１までの、その範囲の上限および下限の間に存在する各値、ならびにその規定された範囲内のあらゆる他の規定された値または間に存在する値が本発明に含まれることを理解されたい。これらのより狭い範囲の上限および下限は、独立してそのより狭い範囲に含まれ得、また、規定された範囲において具体的に除外されるあらゆる限界値に従って、本発明に包含される。規定された範囲が限界値の一方または両方を含む場合、これらの含まれる限界値の一方または両方を除外した範囲もまた本発明に含まれる。
【００１０】
別段の定義がない限り、本明細書において用いる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書において記載するものと同様であるかまたは同等であるあらゆる方法および材料も、本発明の実施または試験において用い得るが、好ましい方法および材料を以下に記載する。本明細書において述べる全ての刊行物は、刊行物を引用する目的である方法および／または材料を開示および記載するために、参照により本明細書に組み込まれる。
【００１１】
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いる場合、単数形態である「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈により別段の指示が明らかでない限り、複数形の指示対象を含むことに注意されたい。したがって、例えば、「幹細胞（ａ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）」という言及は、複数のそのような幹細胞を含み、「心筋細胞（ｔｈｅ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ）」という言及は、１つまたは複数の心筋細胞および当業者に知られているその同等物についての言及を含み、その他も同様である。特許請求の範囲があらゆる任意選択的な要素を排除するように記載され得ることもさらに注意されたい。したがって、この記述は、特許請求の範囲の要素の記載に関連して「のみ（ｓｏｌｅｌｙ）」、「のみ（ｏｎｌｙ）」などのような排他的な用語を用いるための、または「負の」限定を用いるための先行詞としての役割を有することを意図するものである。
【００１２】
本明細書において述べる刊行物は、本願の出願日より前の開示についてのみ提供されるものである。本明細書におけるいずれの刊行物も、本発明が、先行発明によりこのような刊行物に先行する資格を有さないということを承認するものとして解釈されるものではない。さらに、提供される刊行物の日付は実際の公開日とは異なり得、それは個別に確認する必要があり得る。
【００１３】
詳細な説明
本発明は、幹細胞または前駆細胞の集団において心筋形成および心臓前駆体の増加を誘発する方法を提供するものであり、この方法は概して、幹細胞または前駆細胞において古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路を誘発することを伴うものである。本発明は、幹細胞または前駆細胞の集団から心筋細胞または心臓前駆体の集団を生成する方法を提供するものであり、この方法は概して、幹細胞または前駆細胞を、古典的Ｗｎｔシグナル伝達を誘発する作用物質と接触させることを伴うものである。本発明の方法は、研究への応用および治療への応用に用いることができる心筋細胞または心臓前駆体の集団を生成するために有用である。
【００１４】
心筋形成および心臓前駆体の増加を誘発する方法
本発明は、幹細胞または前駆細胞の集団において心筋形成を誘発する方法および心臓前駆体の増加（数の増大）のための方法を提供する。いくつかの実施形態において、この方法は概して、幹細胞または前駆細胞において古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路を誘発することを伴う。他の実施形態において、本方法は、幹細胞または前駆細胞においてβ−カテニンのレベルを増大させることを含む。
【００１５】
いくつかの実施形態において、本発明の方法を用いると、少なくとも約１０％の幹細胞または前駆細胞の集団が心筋細胞に分化する。例えば、いくつかの実施形態において、約１０％から約５０％の幹細胞または前駆細胞の集団が心筋細胞に分化する。他の実施形態において、少なくとも約５０％の幹細胞または前駆細胞の集団が心筋細胞に分化する。例えば、いくつかの実施形態において、約５０％から約６０％、約６０％から約７０％、約７０％から約８０％、または約８０％から約９０％、またはそれ以上の幹細胞または前駆細胞の集団が心筋細胞に分化する。
【００１６】
いくつかの実施形態において、本発明の方法により、心臓前駆体の数が増大する。例えば、いくつかの実施形態において、本発明の方法により、心臓前駆体における増殖が誘発され、それにより心臓前駆体の数が増大する。したがって、例えばいくつかの実施形態において、本発明の方法により、心臓前駆体の数が、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約１００％（もしくは２倍）、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約５０倍、または少なくとも約１００倍、またはそれ以上増大する。
【００１７】
いくつかの実施形態において、本発明の方法により、幹細胞または前駆細胞の集団から得られる、拍動を有する胚様体の数が増大し、例えば、本発明の方法により、約１０％から約５０％、約５０％から約１００％（もしくは２倍）、約２倍から約５倍、約５倍から約１０倍、約１０倍から約２５倍、約２５倍から約５０倍、または約５０倍から約１００倍、または１００倍以上、拍動を有する胚様体の数が増大し得る。
【００１８】
いくつかの実施形態において、本発明の方法により、Ｉｓｌ１（Ｉｓｌｅｔ１）、トロポミオシン、Ｎｋｘ２．５、Ｔｂｘ５、Ｈａｎｄ２、およびサルコメア遺伝子の１つまたは複数を発現する、集団における細胞の数が増大する。いくつかの実施形態において、本発明の方法により、約１０％から約５０％、約５０％から約１００％（もしくは２倍）、約２倍から約５倍、約５倍から約１０倍、約１０倍から約２５倍、約２５倍から約５０倍、または約５０倍から約１００倍、または１００倍以上、Ｉｓｌ１（Ｉｓｌｅｔ１）、トロポミオシン、Ｎｋｘ２．５、Ｔｂｘ５、Ｈａｎｄ２、およびサルコメア遺伝子の１つまたは複数を発現する、集団における細胞の数が増大する。
【００１９】
幹細胞または前駆細胞が心筋細胞に分化しているかは、容易に判定することができる。例えば、いくつかの実施形態において、心筋細胞への分化は、細胞により産生される心筋細胞特異的マーカーを検出することにより確認される。適切な心筋細胞特異的細胞表面マーカーには、限定するものではないが、トロポニンおよびトロポミオシンが含まれる。
【００２０】
いくつかの実施形態において、本発明の方法はインビトロで実施される。他の実施形態において、本発明の方法はインビボで実施される。本発明の方法がインビトロで実施される場合、いくつかの実施形態において、心筋細胞はその後、生存している生物内に導入される。
【００２１】
いくつかの実施形態において、幹細胞または前駆細胞がマトリクス内に存在している状態で、本発明の方法が実施される。これらの実施形態のいくつかにおいて、本発明の方法は、人工心臓組織の生産に適している。
【００２２】
古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路の誘発
本発明は、幹細胞または前駆細胞の集団において心筋形成および／または心臓前駆体の増加を誘発する方法を提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、幹細胞または前駆細胞において古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路を誘発することを伴うものである。古典的Ｗｎｔ経路は、ＷｎｔリガンドがＦｒｉｚｚｌｅｄファミリーの細胞表面受容体に結合した時に生じる一連の事象を表すものであり、それにより、受容体がＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄファミリー・タンパク質を活性化し、最終的には、核に到達するβ−カテニンの量が変化する。Ｓｍａｌｌｅｙら（（２００５）、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．、１１８：５２７９ページ）；ＬｏｇａｎおよびＮｕｓｓｅ、（２００４）、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ、２０：７８１〜８１０ページ；Ｂｅｊｓｏｖｅｃ、（２００５）、Ｃｅｌｌ、１２０：１１〜１４ページ。
【００２３】
いくつかの実施形態において、古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路は、幹細胞または前駆細胞を、Ｗｎｔリガンド、例えばＷｎｔアゴニストと接触させることにより誘発される。適切なＷｎｔアゴニストには、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ／１３、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ７ｃ、Ｗｎｔ８、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ８ｃ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１４、Ｗｎｔ１５、またはＷｎｔ１６のうちの１つまたは複数のアゴニストが含まれる。例えば、米国特許出願公開第２００６／０１４７４３５号を参照。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔリガンドは可溶性のＷｎｔ３ａである。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔアゴニストはｗｎｔポリペプチド、ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄポリペプチド、またはβ−カテニン・ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、誘発段階または接触段階は中胚葉の運命決定の前に行われる。
【００２４】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、幹細胞または前駆細胞の集団をＷｎｔ３ａポリペプチドと接触させることを伴う。Ｗｎｔ３ａポリペプチドは当技術分野において知られており、古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路の誘導因子として機能し得るあらゆるＷｎｔ３ａポリペプチドを用いることができる。いくつかの実施形態において、本発明の方法における使用に適しているＷｎｔ３ａポリペプチドは、配列番号１で示されるアミノ酸配列と少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有しているアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本発明の方法における使用に適しているＷｎｔ３ａポリペプチドは、配列番号１で示されるアミノ酸配列の約２５０個のアミノ酸から約２７５個のアミノ酸、約２７５個のアミノ酸から約３００個のアミノ酸、約３００個のアミノ酸から約３２５個のアミノ酸、約３２５個のアミノ酸から約３５０個のアミノ酸の連続した長さと、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有しているアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本発明の方法における使用に適しているＷｎｔ３ａポリペプチドは、配列番号１で示されるアミノ酸配列の２５〜３５２番アミノ酸と少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有しているアミノ酸配列を含み、ここでＷｎｔ３ａポリペプチドは、シグナル配列（例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列の１〜２４番アミノ酸に対応するシグナル配列）を欠いている。いくつかの実施形態において、本発明の方法における使用に適しているＷｎｔ３ａポリペプチドは、配列番号１の２５〜３５２番アミノ酸で示されるアミノ酸配列の約２５０個のアミノ酸から約２７５個のアミノ酸、約２７５個のアミノ酸から約３００個のアミノ酸、または約３００個のアミノ酸から約３２８個のアミノ酸の連続した長さと、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有しているアミノ酸配列を含む。
【００２５】
ヒト（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿１４９１２２、配列番号１）、マウス（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０３３５４８、配列番号２）、ニワトリ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＹ８７４５６、配列番号４）、およびカエル（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００１０７９３４３、配列番号３）のアミノ酸配列のアラインメントを図８Ａおよび８Ｂに示す。下線を引いた配列はシグナルペプチドである。２３個の保存されたシステイン残基は太字で示されている。このアラインメントは、ヒト、マウス、ニワトリ、およびカエルのＷｎｔ３ａの間で保存されているアミノ酸を示している。所与のＷｎｔ３ａタンパク質において変化し得るアミノ酸には、例えば、１３２番アミノ酸（例えば、１３２番アミノ酸がスレオニンまたはセリンであり得る場合）、１３４番アミノ酸（例えば、１３４番アミノ酸がアラニンまたはスレオニンであり得る場合）、１４０番アミノ酸（例えば、１４０番アミノ酸がスレオニンまたはセリンであり得る場合）、１４３番アミノ酸（例えば、１４３番アミノ酸がリジンまたはグルタミンであり得る場合）、１９４番アミノ酸（例えば、１９４番アミノ酸がセリンまたはアラニンであり得る場合）、２３０番アミノ酸（例えば、２３０番アミノ酸がチロシンまたはフェニルアラニンであり得る場合）、２６０番アミノ酸（例えば、２６０番アミノ酸がチロシンまたはフェニルアラニンであり得る場合）、２７２番アミノ酸（例えば、２７２番アミノ酸がイソロイシンまたはバリンであり得る場合）、３００番アミノ酸（例えば、３００番アミノ酸がスレオニンまたはセリンであり得る場合）、３２０番アミノ酸（例えば、３２０番アミノ酸がスレオニンまたはアラニンであり得る場合）、および３３０番アミノ酸（例えば、３３０番アミノ酸がイソロイシンまたはバリンであり得る場合）が含まれる。
【００２６】
いくつかの実施形態において、適切なＷｎｔ３ａポリペプチドは融合タンパク質であり、ここで、Ｗｎｔ３ａ融合タンパク質は、異種タンパク質（融合パートナー）に融合したＷｎｔ３ａポリペプチドを含む。適切な異種タンパク質には、エピトープタグ、Ｗｎｔ３ａ融合タンパク質を可溶性にするポリペプチド、Ｗｎｔ３ａ融合タンパク質の安定性を増大させるポリペプチド、検出可能なシグナルを付与するポリペプチドなどが含まれる。検出可能なシグナルを付与するポリペプチドには、例えば、発光生成物、着色生成物、蛍光生成物などのような直接検出することが可能な生成物を得るための基質に作用する酵素や、蛍光タンパク質などが含まれ、蛍光タンパク質としては、例えば、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質などである。
【００２７】
いくつかの実施形態において、Ｗｎｔ３ａポリペプチドは、細胞培養培地１ｍｌ当たり約５ｎｇから培養培地１ｍｌ当たり約５０００ｎｇの濃度で幹細胞および／または前駆細胞が存在する細胞培養培地に含められる。例えば、いくつかの実施形態において、幹細胞および／または前駆細胞は、細胞培養培地１ｍｌ当たり約５ｎｇから約１０ｎｇ、約１０ｎｇから約２５ｎｇ、約２５ｎｇから約５０ｎｇ、約５０ｎｇから約１００ｎｇ、約１００ｎｇから約２５０ｎｇ、約２５０ｎｇから約５００ｎｇ、約５００ｎｇから約７５０ｎｇ、約７５０ｎｇから約１０００ｎｇ、約１０００ｎｇから約２０００ｎｇ、約２０００ｎｇから約３０００ｎｇ、約３０００ｎｇから約４０００ｎｇ、または約４０００ｎｇから約５０００ｎｇ、または５０００ｎｇ以上の濃度でＷｎｔ３ａポリペプチドを含む培地において培養される。
【００２８】
β−カテニンのレベルの増大
本発明は、幹細胞または前駆細胞の集団において心筋形成および／または心臓前駆体の増加を誘発する方法を提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、幹細胞または前駆細胞におけるβ−カテニンのレベルを増大させることを含む。
【００２９】
いくつかの実施形態において、本方法は概して、幹細胞または前駆細胞を、β−カテニンをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物で遺伝的に修飾することを伴い、ここで、コードされるβ−カテニンは幹細胞または前駆細胞において産生され、遺伝的に修飾された幹細胞または前駆細胞におけるβ−カテニンのレベルは、発現構築物で遺伝的に修飾されていない幹細胞または前駆細胞におけるβ−カテニンのレベルよりも高く、高いレベルのβ−カテニンは心筋形成を誘発する。いくつかの実施形態において、発現構築物はウイルス構築物、例えば、組換えアデノ随伴ウイルス構築物、組換えアデノウイルス構築物、組換えレンチウイルス構築物などである。
【００３０】
β−カテニンをコードするヌクレオチド配列は当技術分野において知られており、機能的なβ−カテニンをコードするあらゆるヌクレオチド配列が使用に適している。いくつかの実施形態において、適切なポリヌクレオチドは、配列番号５（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ８７８３８、図９Ａ〜Ｈ）で示されるヌクレオチド配列と少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有しているヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、適切なポリヌクレオチドは、配列番号５で示されるヌクレオチド配列の約１５００個のヌクレオチドから約１７５０個のヌクレオチド、約１７５０個のヌクレオチドから約２０００個のヌクレオチド、または約２０００個のヌクレオチドから約２３４６個のヌクレオチドの連続した長さと、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有しているヌクレオチド配列を含む。
【００３１】
図９Ａ〜Ｈは、ヒトβ−カテニン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ８７８３８、配列番号５）、マウスβ−カテニン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＢＣ０５３０６５、配列番号６）、ニワトリβ−カテニン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ８２９６４、配列番号７）、およびカエルβ−カテニン（ＢＣ１０８７６４、配列番号８）をコードするヌクレオチド配列のヌクレオチド配列アラインメントを示す。この配列のアラインメントから、ヌクレオチド配列に生じ得る変化が一目で明らかである。
【００３２】
図１０Ａ〜Ｃは、ヒトβ−カテニン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＡ６１１０７、配列番号９）、マウスβ−カテニン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＨ５３０６５、配列番号１０）、ニワトリβ−カテニン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＢ８０８５６、配列番号１１）、およびカエルβ−カテニン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＩ０８７６５、配列番号１２）のアミノ酸配列のアミノ酸配列アラインメントを示す。
【００３３】
いくつかの実施形態において、適切なポリヌクレオチドは、配列番号９で示されるアミノ酸配列と少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有しているポリペプチドをコードするアミノ酸配列を含むものである。いくつかの実施形態において、適切なポリヌクレオチドは、配列番号９で示されるアミノ酸配列の約６００個のアミノ酸から約６５０個のアミノ酸、約６５０個のアミノ酸から約７００個のアミノ酸、約７００個のアミノ酸から約７５０個のアミノ酸、または約７５０個のアミノ酸から約７８１個のアミノ酸の連続した長さと、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくも約９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有しているポリペプチドをコードするアミノ酸配列を含むものである。
【００３４】
いくつかの実施形態において、発現構築物はウイルス構築物、例えば、組換えアデノ随伴ウイルス構築物（例えば、米国特許第７，０７８，３８７号を参照）、組換えアデノウイルス構築物、組換えレンチウイルス構築物などである。
【００３５】
適切な発現ベクターには、限定するものではないが、ウイルス・ベクター、例えば、ワクシニア・ウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルスに基づいたウイルス・ベクター（例えば、Ｌｉら、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ、３５：２５４３〜２５４９ページ、１９９４；Ｂｏｒｒａｓら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、６：５１５〜５２４ページ、１９９９；ＬｉおよびＤａｖｉｄｓｏｎ、ＰＮＡＳ、９２：７７００〜７７０４ページ、１９９５；Ｓａｋａｍｏｔｏら、Ｈ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、５：１０８８〜１０９７ページ、１９９９；ＷＯ９４／１２６４９；ＷＯ９３／０３７６９；ＷＯ９３／１９１９１；ＷＯ９４／２８９３８；ＷＯ９５／１１９８４；ならびにＷＯ９５／００６５５を参照）、アデノ随伴ウイルスに基づいたウイルス・ベクター（例えば、Ａｌｉら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、９：８１〜８６ページ、１９９８；Ｆｌａｎｎｅｒｙら、ＰＮＡＳ、９４：６９１６〜６９２１ページ、１９９７；Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ、３８：２８５７〜２８６３ページ、１９９７；Ｊｏｍａｒｙら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、４：６８３〜６９０ページ、１９９７；Ｒｏｌｌｉｎｇら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、１０：６４１〜６４８ページ、１９９９；Ａｌｉら、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ、５：５９１〜５９４ページ、１９９６；ＳｒｉｖａｓｔａｖａによるＷＯ９３／０９２３９；Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒ．、（１９８９）、６３：３８２２〜３８２８ページ；Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎら、Ｖｉｒｏｌ．、（１９８８）、１６６：１５４〜１６５ページ；およびＦｌｏｔｔｅら、ＰＮＡＳ、（１９９３）、９０：１０６１３〜１０６１７ページを参照）、ＳＶ４０に基づいたウイルス・ベクター、単純ヘルペス・ウイルスに基づいたウイルス・ベクター、ヒト免疫不全ウイルスに基づいたウイルス・ベクター（例えば、Ｍｉｙｏｓｈｉら、ＰＮＡＳ、９４：１０３１９〜１０３２３ページ、１９９７；Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７３：７８１２〜７８１６ページ、１９９９を参照）、レトロウイルス・ベクター（例えば、ネズミ白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ならびに、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳腺腫瘍ウイルスのようなレトロウイルスに由来するベクター）などが含まれる。
【００３６】
多くの適切な発現ベクターが当業者に知られており、多くは市販されている。例として、真核性の宿主細胞には、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）といったベクターが提供されている。しかし、宿主細胞に適合している限り、あらゆる他のベクターが使用可能である。
【００３７】
用いる宿主／ベクター・システムに従って、構成的プロモーターおよび誘導プロモーター、転写エンハンサー・エレメント、転写ターミネーターなどを含む、いくつかの適切な転写調節エレメントおよび翻訳調節エレメントの全てを、発現ベクターにおいて用いることができる（Ｂｉｔｔｅｒら、（１９８７）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５３：５１６〜５４４ページを参照）。
【００３８】
適切な真核性のプロモーター（真核細胞において機能的なプロモーター）の非限定的な例には、ＣＭＶ前初期プロモーター、ＨＳＶチミジン・キナーゼ・プロモーター、初期および後期のＳＶ４０のプロモーター、レトロウイルスのＬＴＲのプロモーター、ならびにマウス・メタロチオネイン−Ｉプロモーターが含まれる。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、当業者のレベルで良好に行われる。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネーターも含み得る。発現ベクターはまた、発現を増幅させるための適切な配列も含み得る。
【００３９】
いくつかの実施形態において、β−カテニンをコードするヌクレオチド配列は、心臓特異的転写調節エレメント（ＴＲＥ）に機能可能に連結しており、ＴＲＥは、プロモーターおよびエンハンサーを含んでいる。適切なＴＲＥには、限定するものではないが、ミオシンの軽鎖−２、α−ミオシンの重鎖、ＡＥ３、心臓トロポニンＣ、および心臓アクチンの遺伝子に由来するＴＲＥが含まれる。Ｆｒａｎｚら、（１９９７）、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．、３５：５６０〜５６６ページ；Ｒｏｂｂｉｎｓら、（１９９５）、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、７５２：４９２〜５０５ページ；Ｌｉｎｎら、（１９９５）、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．、７６：５８４〜５９１ページ；Ｐａｒｍａｃｅｋら、（１９９４）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１４：１８７０〜１８８５ページ；Ｈｕｎｔｅｒら、（１９９３）、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ、２２：６０８〜６１７ページ；およびＳａｒｔｏｒｅｌｌｉら、（１９９２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：４０４７〜４０５１ページ。
【００４０】
宿主細胞に核酸を導入する方法は当技術分野において知られており、あらゆる既知の方法を、幹細胞または前駆細胞に核酸（例えば、β−カテニン・ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物）を導入するために用いることができる。適切な方法には、例えば、感染、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストランを用いたトランスフェクション、リポソームを用いたトランスフェクションなどが含まれる。
【００４１】
混合細胞集団からの心筋細胞の分離
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、ａ）幹細胞または前駆細胞の集団において心筋形成を誘発し、未分化幹細胞および／または未分化前駆細胞と心筋細胞との混合集団を生成すること、ならびにｂ）未分化細胞（非心筋細胞）から心筋細胞を分離することを含む。いくつかの実施形態において、分離段階は、細胞を、心筋細胞特異的細胞表面マーカーに特異的な抗体と接触させることを含む。適切な心筋細胞特異的細胞表面マーカーには、限定するものではないが、トロポニンおよびトロポミオシンが含まれる。
【００４２】
分離は、例えばあらゆる様々な選別方法、例えば蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、負の選択方法などを含む、周知の方法を用いて行うことができる。選択された細胞を選択されていない細胞から分離し、選択された（「選別された」）細胞の集団を生成する。選択された細胞集団は、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または９９％以上の心筋細胞であり得る。
【００４３】
細胞選別（分離）方法は、当技術分野において周知である。分離の手順には、抗体で被覆した磁気ビーズを用いた磁気分離、アフィニティー・クロマトグラフィー、および例えばプレートなどの固体マトリクスに付着した抗体との「パニング」、または他の都合の良い技術が含まれ得る。正確な分離を得るための技術には、複数の色チャネル、ロー・アングルかつ鈍角の光散乱検出チャネル、インピーダンスチャネルなどのような、精巧さの程度が様々であり得る蛍光活性化細胞選別装置が含まれる。死細胞は、死細胞に関連する色素（ヨウ化プロピジウム［ＰＩ］、ＬＤＳ）での選択によって排除され得る。選択された細胞の生存能力に対して過度に有害ではない、あらゆる技術を採用することができる。選択において１つまたは複数の抗体を用いる場合、抗体は、特定の細胞型の分離を容易にするために標識と結合していてもよく、標識は例えば、磁気ビーズ、アビジンまたはストレプトアビジンに対して高い親和性で結合するビオチン、蛍光活性化細胞選別装置と共に用い得る蛍光色素、ハプテンなどである。多色分析を、ＦＡＣＳと共に、または免疫磁気分離およびフロー・サイトメトリーと組み合わせて採用することができる。
【００４４】
有用性
本発明の方法は、心筋細胞または心臓前駆体の集団を生成するために有用であり、この心筋細胞または心臓前駆体は、人口心臓組織を生成するための研究への応用、および治療方法において使用することができる。
【００４５】
研究への応用
本発明の方法は、研究への応用のための心筋細胞または心臓前駆体を生成するために用いることができる。研究への応用には、例えば、心筋細胞または心臓前駆体をヒト以外の動物の疾患（例えば心臓病）モデルに導入し、疾患の治療における心筋細胞または心臓前駆体の有効性を決定すること、スクリーニング方法において心筋細胞を用いて、心臓障害の治療における使用に適している候補作用物質を同定することなどが含まれる。例えば、本発明の方法を用いて生成された心筋細胞または心臓前駆体を試験作用物質と接触させることができ、また、心筋細胞または心臓前駆体の生物学的活性に対する試験作用物質の効果がもしある場合には、それを評価することができ、この場合、心筋細胞または心臓前駆体の生物学的活性に対する効果を有する試験作用物質は、心臓障害を治療するための候補作用物質である。別の実施例として、本発明の方法を用いて生成された心筋細胞または心臓前駆体を、ヒト以外の動物の心臓障害モデルに導入することができ、障害の改善に対する心筋細胞または心臓前駆体の効果をヒト以外の動物モデルにおいて試験することができる。
【００４６】
治療方法
本発明の方法は、人工心臓組織を生成するために、例えば、それを必要とする哺乳動物対象に移植するために有用である。本発明の方法は、損傷した心臓組織（例えば虚血性心臓組織）を取り替えるために有用である。本発明の方法は、心臓に固有の内因性幹細胞を刺激して心筋形成を生じさせるために有用である。本発明の方法が、個体に心筋細胞を導入する（移植する）ことを伴う場合、同種移植または自家移植を実施し得る。
【００４７】
本発明は、個体における心臓障害を治療する方法を提供するものであり、本方法は概して、それを必要としている個体に、治療有効量の、ａ）古典的Ｗｎｔシグナル伝達を誘発する作用物質、ｂ）β−カテニンをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物、ｃ）本発明の方法を用いて調製した心筋細胞の集団、ｄ）本発明の方法を用いて調製した心臓前駆体の集団、およびｅ）本発明の方法を用いて調製した人工心臓組織の１つまたは複数を投与することを伴う。本発明を用いた治療を必要とする個体には、限定するものではないが、先天性心臓欠陥を有する個体、例えば冠動脈疾患を有する個体といった虚血性心臓組織をもたらす病気を有している個体などが含まれる。本発明の方法は、変性性筋肉疾患、例えば、家族性心筋症、拡張型心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、または虚血性心疾患をもたらす冠動脈疾患を治療するために有用である。
【００４８】
本発明の方法を用いた治療に適している個体には、例えば虚血性心臓組織をもたらす病気といった心臓の病気を有している個体（例えば哺乳動物対象、例えば、ヒト、ヒト以外の霊長類、マウスやラットなどの実験用のヒト以外の哺乳動物対象）、例えば、冠動脈疾患を有する個体などが含まれる。本発明の方法を用いた治療に適している個体には、変性性筋肉疾患、例えば、家族性心筋症、拡張型心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、または虚血性心疾患をもたらす冠動脈疾患を有する個体が含まれる。
【００４９】
哺乳動物宿主への投与のために、本発明の方法を用いて生成された心筋細胞集団または心臓前駆細胞集団を薬学的組成物として処方することができる。薬学的組成物は、生理学的に許容される担体（すなわち、心筋細胞の活性に干渉しない無毒性の物質）をさらに含む、無菌の水溶液または非水溶液、懸濁液または乳濁液であり得る。当業者に知られているあらゆる適切な担体を本発明の薬学的組成物に採用することができる。担体の選択は、部分的には、投与される物質（すなわち、細胞または化合物）の性質に依る。代表的な担体には、生理食塩水、ゼラチン、水、アルコール、天然もしくは合成の油、糖溶液、グリコール、オレイン酸エチルのような注射可能な有機エステル、またはこのような物質の組み合わせが含まれる。場合によっては、薬学的組成物は、防腐剤、ならびに／または、例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および／もしくは不活性ガスのような他の添加物、ならびに／または他の活性成分をさらに含み得る。
【００５０】
いくつかの実施形態において、心筋細胞集団または心臓前駆体集団は、マイクロカプセル化（米国特許第４，３５２，８８３号、米国特許第４，３５３，８８８号、および米国特許第５，０８４，３５０号を参照）を含む既知のカプセル化技術に従ってカプセル化される。心筋細胞または心臓前駆体がカプセル化されている場合、いくつかの実施形態において、心筋細胞または心臓前駆体は、米国特許第５，２８４，７６１号、米国特許第５，１５８，８８１号、米国特許第４，９７６，８５９号、米国特許第４，９６８，７３３号、米国特許第５，８００，８２８号、および公開されたＰＣＴ特許出願ＷＯ９５／０５４５２に記載されているようなマイクロカプセル化によってカプセル化される。
【００５１】
いくつかの実施形態において、心筋細胞集団または心臓前駆体集団は、以下に記載するように、マトリクス内に存在している。
【００５２】
心筋細胞集団または心臓前駆体集団の単位投与形態は、約１０３個の細胞から約１０９個の細胞、例えば、約１０３個の細胞から約１０４個の細胞、約１０４個の細胞から約１０５個の細胞、約１０５個の細胞から約１０６個の細胞、約１０６個の細胞から約１０７個の細胞、約１０７個の細胞から約１０８個の細胞、または、約１０８個の細胞から約１０９個の細胞を含み得る。
【００５３】
心筋細胞集団は、通常の手順に従って凍結保存し得る。例えば、凍結保存は、適切な増殖培地、１０％ＢＳＡ、および７．５％ジメチルスルホキシドを含み得る「冷凍」培地において、約１００万から１０００万個の細胞に対して実施することができる。細胞を遠心分離する。成長培地を吸引し、冷凍培地で置き換える。細胞を球体として再懸濁する。例えば−８０℃の容器内に置くことで、細胞を緩やかに冷凍する。細胞を３７℃の浴において回転させながら解凍し、新鮮な増殖培地内に再懸濁し、上述したように成長させる。
【００５４】
人工心臓組織
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、ａ）インビトロで幹細胞または前駆細胞の集団における心筋形成を誘発すること、例えば、幹細胞または前駆細胞がマトリクス内に存在し、このマトリクスにおいて心筋細胞の集団を生成させること、およびｂ）個体における既存の心臓組織内に、またはこの心臓組織上に、心筋細胞の集団を移植することを含む。したがって、本発明は、インビトロで人工心臓組織を生成し、人工心臓組織をインビボで移植するための方法を提供する。
【００５５】
人工心臓組織は、それを必要とする個体への同種移植または自家移植に用いることができる。人工心臓組織を産生するために、幹細胞または前駆細胞と接触させるためのマトリクスを用いることができ、このマトリクスにおいて、上述したように、本発明の方法を用いて幹細胞または前駆細胞が心筋形成するよう誘発する。このことは、（増加した幹細胞または前駆細胞の分化の前または最中に）このマトリクスが適切な血管内に運ばれること、および細胞を含む培地の層が最上部に位置することを意味している。「マトリクス」という用語は、この関連においては、細胞が付着または接着して、対応する細胞複合体、すなわち人工組織を形成することができる、あらゆる適切な担体材料を意味していると理解されたい。いくつかの実施形態において、マトリクスまたは担体材料はそれぞれ、その後の応用に望ましい３次元形態で既に存在している。例えば、ウシの心膜組織を、コラーゲンで架橋され、脱細胞化され、かつ光固定されたマトリクスとして用いる。
【００５６】
例えば、マトリクス（「生体適合性基材」とも呼ばれる）は、細胞集団を堆積し得る対象への移植に適している物質である。生体適合性基材は、対象内に一度移植されると、毒作用または損傷作用を生じさせない。一実施形態において、生体適合性基材は、修復または取り替えを必要とする所望の構造に成形され得る表面を有するポリマーである。ポリマーはまた、修復または取り替えを必要とする所望の構造の一部に成形することもできる。生体適合性基材は、細胞がそれに付着することおよびその上で成長することを可能にする、支持骨格を提供する。培養された細胞集団は、その後、細胞間の相互作用に必要な適切な間質距離を提供する生体適合性基材上で成長し得る。
【実施例】
【００５７】
以下の実施例は、本発明を実施する方法および使用する方法について完全な開示および記載を当業者に提供するためのものであり、本発明者らが本発明であると考える範囲を限定することを意図したものではなく、以下の実験が、実施された実験の全てまたは唯一のものであることを示すことを意図したものでもない。用いた数字（例えば、量、温度など）に関しての正確さを確実なものとするための尽力はしたが、ある程度の実験上の誤差および偏差は考慮されたい。別段の指示がない限り、割合は重量による割合であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、かつ圧力は大気圧かそれに近いものである。標準的な略語を用いている場合があり、例えば、ｂｐは塩基対、ｋｂはキロベース、ｐｌはピコリットル、ｓまたはｓｅｃは秒、ｍｉｎは分、ｈまたはｈｒは時間、ａａはアミノ酸、ｋｂはキロベース、ｂｐは塩基対、ｎｔはヌクレオチド、ｉ．ｍ．は筋肉内、ｉ．ｐ．は腹腔内、ｓ．ｃ．は皮下、などである。
【００５８】
実施例１：胚性幹細胞における心筋形成の誘発
幹細胞または前駆細胞を異なる系に導くことは、依然として、幹細胞の生物学において基本的な課題である。Ｗｎｔ経路のメンバーは胚における多くの極めて重要な事象を制御し（ＪｅｓｓｅｎおよびＳｏｌｎｉｃａ−Ｋｒｅｚｅｌ、Ｃｅｌｌ、１２０、７３６〜７３７ページ、（２００５）；Ｏｌｓｏｎ、Ｃｅｌｌ、１２５、５９３〜６０５ページ、（２００６）；Ｋａｒｎｅｒら、Ｓｅｍｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ、１７、２１４〜２２２ページ、（２００６））、古典的Ｗｎｔのリガンドはいくつかの種において中胚葉前駆体が心筋細胞に分化することを阻害すると考えられている（ＳｃｈｎｅｉｄｅｒおよびＭｅｒｃｏｌａ、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、１５、３０４〜３１５ページ、（２００１）；Ｍａｒｖｉｎら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、１５、３１６〜３２７ページ、（２００１）；ＴｚａｈｏｒおよびＬａｓｓａｒ、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、１５、２５５〜２６０ページ、（２００１））。しかし、古典的Ｗｎｔシグナル伝達の、必須の転写メディエーターであるβ−カテニンを介した細胞自立的な役割は知られていない。ここで、初期心臓前駆体がインビボでβ−カテニン・タンパク質に富んでいること、および心臓前駆細胞においてβ−カテニンを欠いているマウスがより少ない心筋細胞および心室低形成を有していることが示されている。β−カテニンを欠いている心筋細胞は増殖の欠陥を有しており、Ｗｎｔ／β−カテニン標的遺伝子であるサイクリンＤ２は突然変異体の心臓において下方調節された。逆に、心臓におけるβ−カテニンの安定化により、筋細胞の過剰な増殖およびサイクリンＤ２の上方調節が生じた。胚性幹細胞における発生の離散窓において、古典的Ｗｎｔシグナル伝達の活性化により心筋形成が促進され、古典的Ｗｎｔの阻害により心臓の分化が抑制された。これらの所見は、古典的Ｗｎｔシグナル伝達が、心臓形成の最初期の事象のいくつかを促進し、胚性幹細胞における心筋の分化を正に調節することを示すものである。
【００５９】
材料および方法
マウス系統および遺伝学。Ｎｋｘ２．５−ｃｒｅ、ｃｔｎｎｂｌｔｍ２ＫｅｍまたはＩｓｌｅｔ１−ｃｒｅ、ｃｔｎｎｂｌｔｍ２Ｋｅｍのホモ接合体の胚を、Ｎｋｘ２．５−ｃｒｅ、ｃｔｎｎｂｌｔｍ２Ｋｅｍ  ｆｌｏｘ／＋系統またはＩｓｌｅｔ１−ｃｒｅ、ｃｔｎｎｂｌｔｍ２Ｋｅｍ  ｆｌｏｘ／＋系統をそれぞれｃｔｎｎｂｌｔｍ２Ｋｅｍ  ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ系統と交配することで得た。Ｎｋｘ２．５−ｃｒｅ、β−カテニン／ｌｏｘＰ（ｅｘ３）のヘテロ接合体の胚を、Ｎｋｘ２．５−ｃｒｅ系統とβ−カテニン／ｌｏｘＰ（ｅｘ３）ｆｌｏｘ／＋系統とを交配することで得た。野生型の胚および突然変異体の胚を、記載されているように同定した。Ｊａｓｐａｒｄら、Ｍｅｃｈ  Ｄｅｖ、９０、２６３〜２６７ページ、（２０００）；およびＢｒａｕｌｔら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１２８、１２５３−１２６４ページ、（２００１）。
【００６０】
免疫組織化学およびｉｎ  ｓｉｔｕでのハイブリダイゼーション。胚の全体または凍結切片およびＥＢを以下の抗体で染色した。マウス抗−Ｉｓｌｅｔ１（１：２００）および抗トロポミオシン（１：１００）（ＤＳＨＢ）、ヤギ抗Ｗｎｔ８ａ（１５μｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ヤギ抗β−カテニン（１：５０）およびラット抗サイクリンＤ２（１：１００）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ウサギ抗ホスホ・ヒストンＨ３（１：１００、Ｕｐｓｔａｔｅ）、ならびにセイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ結合（ＴＳＡ  ｐｌｕｓ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒを用いた）二次抗体（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。ｍＲＮＡのｉｎ  ｓｉｔｕでのハイブリダイゼーションを、示したアンチセンス・プローブを用いて、記載されているように実施した。Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７０、１９９５〜１９９９ページ、（１９９５）。
【００６１】
ＥＳ細胞の培養および遺伝子発現分析。ネズミのＥＳ細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ  ＳＨ３００７１．０３）、１ｍＭのβ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ  Ｍ７５２２）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ  ２５０３０−０８１）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ  １１３６０−０７０）、非必須アミノ酸を含む０．１ｍＭの最小必須培地、およびＬＩＦ−調整培地（１：１０００）を補ったＧｌａｓｇｏｗ  ＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ  Ｇ５１５４）からなる維持培地において、未分化のまま増殖させた。ＥＢを、超低付着性の６ウェル・プレート（Ｃｏｓｔａｒ  ０７２００６０１）において、維持培地と同一の構成要素を含むが２０％ＦＢＳを有しておりＬＩＦを有していない分化培地（ＤＭ）においてＥＳ細胞（６×１０５個／ウェル）を３日間培養することにより形成した。初期の処理では、４日目の開始時に、Ｗｎｔ３ａ（１５０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）またはＤｋｋ１（５００ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を含むＤＭで培地を置き換え、６日目に、培地を新鮮なＤＭで置き換えた。後期の処理では、７日目の開始時に、Ｗｎｔ３ａまたはＤｋｋ１を含むＤＭでＤＭを置き換え、９日目に新鮮なＤＭに切り替えた。各培地を、初期の処理をしたＥＢ、後期の処理をしたＥＢ、および未処理のＥＢについて３日毎に交換した。８〜１２日目に、拍動についてＥＢを観察した。３日目から１２日目の間に、一定の時間間隔でＥＢを回収した。遺伝子発現分析のために、全ＲＮＡを単離し、リアル・タイムＰＣＲをＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ｓｙｓｔｅｍ（７９００ＨＴ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。この研究において用いたＴａｑＭａｎプライマーを表１に羅列する。全てのサンプルを３回ずつ実施した。リアル・タイムＰＣＲのデータはＳＤＳ２．２ソフトウェアを用いて正規化および標準化した。
【００６２】
【表１】
2010508846.tif 000002
2010508846.tif 000003
【００６３】
結果
原腸形成が開始するとすぐに、脊椎動物の心臓形成が、誘導性シグナルおよび抑制性シグナルの相互作用によって刺激された前中胚葉において開始する。ＯｌｓｏｎおよびＳｃｈｎｅｉｄｅｒ、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、１７、１９３７〜１９５６ページ、（２００３）；ＺａｆｆｒａｎおよびＦｒａｓｃｈ、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ、９１、４５７〜４６９ページ、（２００２）。隣接する内胚葉および外胚葉からのシグナルに応じて、中胚葉前駆体の２つのドメイン、すなわち第一および第二の心臓野が、心臓への分化を決定し、各々は異なる心臓領域に寄与する。Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ、６、８２６〜８３５ページ、（２００５）；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ、Ｃｅｌｌ、１２６、１０３７〜１０４８ページ、（２００６）。種を超えて心臓発生経路が保存されているにも関わらず、心臓形成におけるＷｎｔシグナル伝達の相反する役割が報告されている。
【００６４】
ハエにおいて、古典的Ｗｎｔファミリーの創始メンバーであるＷｉｎｇｌｅｓｓは、心臓系統の決定に必要である（Ｗｕら、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ、１６９、６１９〜６２８ページ、（１９９５）；Ｊａｇｌａら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１２４、９１〜１００ページ（１９９７））。しかし、カエルおよびヒヨコにおいて、古典的Ｗｎｔの過剰発現は、おそらく内胚葉への作用を介して、心筋細胞の運命決定または分化を阻害する。（ＳｃｈｎｅｉｄｅｒおよびＭｅｒｃｏｌａ、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、１５、３０４〜３１５ページ、（２００１）；Ｍａｒｖｉｎら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、１５、３１６〜３２７ページ、（２００１）；ＴｚａｈｏｒおよびＬａｓｓａｒ、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、１５、２５５〜２６０ページ、（２００１））。ＷｎｔリガンドがＦｒｉｚｚｌｅｄ膜貫通受容体に結合し、それにより、転写因子のＴＣＦ／ＬＥＦファミリーと相互作用してＷｎｔ標的遺伝子を活性化する転写コ・アクチベーターである、β−カテニンのタンパク質レベルが安定化すると、古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路が開始される。ＬｏｇａｎおよびＮｕｓｓｅ、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ、２０、７８１〜８１０ページ、（２００４）；Ｂｅｊｓｏｖｅｃ、Ｃｅｌｌ、１２０、１１〜１４ページ、（２００５）。中胚葉前駆体におけるいずれのＷｎｔ経路の細胞自立的な役割も知られていないが、Ｇタンパク質結合受容体に依存する細胞内カルシウムの変化が介在する、古典的でないＷｎｔシグナル伝達は、心臓形成を促進し得る（Ｐａｎｄｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ、４１８、６３６〜６４１ページ、（２００２））。
【００６５】
古典的Ｗｎｔシグナル伝達が心臓形成領域において活性であるかを決定するために、β−カテニン・タンパク質の発現をマウスの胚において調べた。胚期（Ｅ）８．５日目において、心筋層はβ−カテニンに富んでおり、このことは、心臓前駆体における活性な古典的Ｗｎｔシグナル伝達を示唆している。発生している心臓において発現している古典的Ｗｎｔ分子（Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ８ａ）のうち（Ｍｏｎｋｌｅｙら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１２２、３３４３〜３３５３ページ、（１９９６）；Ｂｏｎｄら、Ｄｅｖ  Ｄｙｎ、２２７、５３６〜５４３ページ、（２００３）；Ｊａｓｐａｒｄら、Ｍｅｃｈ  Ｄｅｖ、９０、２６３〜２６７ページ、（２０００））、Ｅ８．５の心臓前駆体においてＷｎｔ８ａが最も特異的に発現していることが明らかとなった。β−カテニンおよびＷｎｔ８ａの発現は発生のその後の段階でも持続した。
【００６６】
心筋細胞における古典的Ｗｎｔシグナル伝達の細胞自立的な役割を試験するために、ｃｔｎｎｂｌｔｍ２Ｋｅｍマウス（Ｂｒａｕｌｔら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１２８、１２５３〜１２６４ページ、（２００１））またはβ−カテニン／ｌｏｘＰ（ｅｘ３）マウス（Ｈａｒａｄａら、ＥＭＢＯ  Ｊ、１８、５９３１〜５９４２ページ、（１９９９））をそれぞれ用いて、心臓中胚葉前駆体においてβ−カテニンの発現を妨害するかまたは安定化させた。ｃｔｎｎｂｌｔｍ２Ｋｅｍマウスにおいて、Ｃｒｅレコンビナーゼ介在性のエキソン２〜６の削除により、β−カテニン−ｎｕｌｌ対立遺伝子が生じ、β−カテニン／ｌｏｘＰ（ｅｘ３）マウスにおいては、ｃｒｅの発現により、安定なβ−カテニンが生じることでＷｎｔ／β−カテニン・シグナル伝達が活性化する（図１Ａおよび１Ｂ）。Ｎｋｘ２．５−ｃｒｅ系統を用いて、初期の心臓の運命決定の事象が開始した直後に、Ｅ８．０で始まる心室の心臓形成前駆体におけるｃｒｅの発現を促進した。ＭｃＦａｄｄｅｎら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１３２、１８９〜２０１ページ、（２００５）。Ｃｒｅ−介在性の削除事象をウェスタン・ブロット分析で確認したところ、ほぼ完全なものであった（図１Ｂ）。
【００６７】
Ｎｋｘ２．５−ｃｒｅ、ｃｔｎｎｂｌｔｍ２Ｋｅｍのホモ接合体の胚は、心臓の機能不全によって約Ｅ１２．５で死亡し、心室、とりわけ右心室（ＲＶ）のサイズが著しく減少しており、心室壁における心筋細胞が減少していた。逆に、安定化したβ−カテニンを有する、Ｎｋｘ２．５−ｃｒｅ、β−カテニン／ｌｏｘＰ（ｅｘ３）のヘテロ接合体の胚は、心室壁が異常に厚くなった肥大した心臓を有しており、このことは、古典的Ｗｎｔシグナル伝達が心筋細胞の数を調節することを示唆している。
【００６８】
心筋の変化の原因を同定するために、細胞周期の制御における変化を検出するための抗ホスホ・ヒストンＨ３（ＰＨ３）抗体を用いた免疫染色か、またはアポトーシスを検出するためのＴＵＮＥＬアッセイによって心臓を分析した。ＰＨ３染色は、Ｎｋｘ２．５−ｃｒｅ、ｃｔｎｎｂｌｔｍ２Ｋｅｍの心臓において減少し（３８％、Ｐ＜０．０１）、Ｎｋｘ２．５−ｃｒｅ、β−カテニン／ｌｏｘＰ（ｅｘ３）の心臓において増大した（１３２％、Ｐ＜０．０１）。細胞周期を促進する（Ｋｉｏｕｓｓｉら、Ｃｅｌｌ、１１１、６７３〜６８５、（２００２）；Ｈｕａｎｇら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、（２００７）、２６：２４７１ページ）Ｗｎｔ／β−カテニン・シグナル伝達の既知の標的であるサイクリンＤ２のレベルは、Ｎｋｘ２．５−ｃｒｅ、β−カテニン／ｌｏｘＰ（ｅｘ３）の心臓において増大し、Ｎｋｘ２．５−ｃｒｅ、ｃｔｎｎｂｌｔｍ２Ｋｅｍの心臓において減少した。アポトーシスは影響を受けなかった。したがって、Ｗｎｔ／β−カテニンは、左心室または右心室にそれぞれ寄与する第一および第二の心臓野の誘導体において、心臓前駆体を細胞自立的な増殖状態に維持するために必要である。
【００６９】
Ｎｋｘ２．５−ｃｒｅは未分化の中胚葉前駆体においては活性化されないため、前記の結果は、中胚葉前駆体が心臓系統に運命決定した後の、Ｗｎｔ／β−カテニン・シグナル伝達についての比較的後期の役割を示すと考えられる。その初期の役割を評価するために、ｃｔｎｎｂｌｔｍ２Ｋｅｍマウスを、ＲＶおよび流出路を生じさせる中胚葉前駆体においてＥ７．０〜７．５にｃｒｅが発現するＩｓｌｅ１−ｃｒｅマウスと交配させることにより、β−カテニンを、心臓分化の前の第二の心臓野の前駆体において欠失させた。Ｃａｉら、Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ、５、８７７〜８８９ページ、（２００３）。Ｉｓｌｅｔ１−ｃｒｅ、ｃｔｎｎｂｌｔｍ２Ｋｅｍのホモ接合体の胚において、第二の心臓野はＲＶを形成し得なかったが、左心室（ＬＶ）は比較的正常なサイズであった。ＬＶ特異的な転写産物であり、流出路でも発現するＨａｎｄ１（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｍｅｄ、９、１１〜１８ページ、（１９９９））を認識するプローブを用いたＩｎ  ｓｉｔｕでのハイブリダイゼーションによって、心室腔の同一性を確認した。突然変異体の心臓の切片により、縮小したＲＶおよび流出路ドメインにおける薄い心筋層が明らかになり、このことは、Ｎｋｘ２．５−Ｃｒｅでの後期の欠失よりもより重度のＲＶ前駆体の欠陥を示している。咽頭弓中胚葉におけるＩｓｌｅｔ１−Ｃｒｅの活性と一致して、β−カテニンの欠失によりこれらの構造の形成不全も同様に引き起こされた。したがって、第二の心臓野の中胚葉前駆体は、分化決定または増加のためにＷｎｔ／β−カテニン・シグナル伝達を必要とすると考えられる。Ｉｓｌｅｔ１の発現は正常であり、このことは、中胚葉前駆体は存在していたがＲＶに寄与する心筋への分化は行われなかったことを示唆している。
【００７０】
Ｗｎｔ／β−カテニンは心臓前駆細胞の発生に必要であったが、本発明者のインビボでのデータは、Ｗｎｔ／β−カテニン・シグナル伝達が初期心臓前駆体の誘導に必要であるかどうかを明らかにするものではなく、また、Ｗｎｔにより調節される初期の分子事象に対処し得るものでもない。これらの疑問に答えるために、発生の所定の段階の前駆体を利用可能にする、胚性幹（ＥＳ）細胞の分化システムを用いた。懸滴において成長させたＥＳ細胞は胚様体（ＥＢ）を形成し、この胚様体は、３つの胚葉の誘導体にランダムに分化し、頻度は低いながらも、拍動を有する心筋を形成し得る。頻度は、技術的に非常に容易でありＥＳ細胞からの心筋細胞の生成量を高める懸濁液においてＥＢを成長させた場合に、さらに低い。
【００７１】
古典的Ｗｎｔシグナル伝達を標的化するための最良の時間を決定するために、ＥＳの分化の際の中胚葉および心臓遺伝子の発現のプロフィールを明らかにした。初期中胚葉マーカーである短尾（Ｂｒｙ）はＥＢの分化の３日目（ＥＢ３）に強く誘発されたが、その後下方調節され、このことは、ＥＢ３までの中胚葉の運命決定を示唆している（図２）。転写因子Ｎｋｘ２．５、Ｔｂｘ５、Ｇａｔａ４、およびＭｅｓｐ１を含む他の初期心臓中胚葉マーカーは、ＥＢ４〜６の間で強く誘発された。サルコメア遺伝子Ｍｙｈ６、Ｍｙｈ７、Ｍｌｃ２ａ、およびＭｌｃ２ｖを含む後期心臓マーカーは、ＥＢ７〜９までに誘発された（図３Ａおよび３Ｂ）。
【００７２】
古典的Ｗｎｔシグナル伝達はインビボ（Ｈａｅｇｅｌら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１２１、３５２９〜３５３７ページ、（１９９５）；Ｌｉｕら、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ、２２、３６１〜３６５ページ、（１９９９））およびＥＢ（Ｌｉｎｄｓｌｅｙら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１３３、３７８７〜３７９６ページ、（２００６））での通常の中胚葉形成に必要である。心臓の分化に特異的な、Ｗｎｔシグナル伝達の効果の解釈を容易にするために、古典的Ｗｎｔシグナル伝達を、中胚葉の運命決定（ＥＢ３）の後、かつ初期心臓遺伝子（ＥＢ４〜５）の誘導の前に標的化した。利用可能な可溶性の古典的Ｗｎｔリガンドである可溶性Ｗｎｔ３ａ、および古典的Ｗｎｔの阻害剤であるｄｉｃｋｏｐｆｆ１（Ｄｋｋ１）を、Ｗｎｔ／β−カテニン・シグナル伝達を促進または妨害するために用いた。Ｂｒｙの発現は変化せず（図４Ａ）、このことは、ＥＢ３の後の古典的Ｗｎｔシグナル伝達の刺激または阻害が中胚葉前駆体の数を変化させなかったことを示唆している。逆に、ＥＢ４〜６の間に可溶性Ｗｎｔ３ａでＷｎｔ／β−カテニンを刺激すると、細胞を懸濁液において成長させた場合、ＥＢ１２での拍動を有するＥＢの数が１０％から５０％超まで増大した（図４Ｂ、左、Ｐ＜０．０１）。ＥＢ４〜６の間にＤｋｋ−１で古典的Ｗｎｔシグナル伝達を阻害すると、拍動を有するＥＢは全く存在せず（図４Ｂ、右）、このことは、古典的Ｗｎｔシグナル伝達がＥＳ細胞の分化システムにおける心筋細胞の形成に必要であることを示唆している。心臓前駆体はＷｎｔシグナル伝達によって同様に影響を受け、ＥＢにおけるＩｓｌ１陽性細胞およびトロポミオシン陽性細胞の数は、Ｗｎｔアゴニストにより増大し、Ｗｎｔアンタゴニストによって減少した（図４Ｃおよび４Ｄ）。
【００７３】
中胚葉前駆体を心臓系統に移行させる、Ｗｎｔの正の役割と一致して、初期心臓遺伝子Ｎｋｘ２．５およびＴｂｘ５の発現は、ＥＢ４〜６のＷｎｔ３ａへの暴露によって上方調節され、Ｄｋｋ−１への同様の暴露によって下方調節された（図４Ｅ、上）。第二の心臓野のマーカーであるＩｓｌｅｔ１、およびＲＶマーカーであるＨａｎｄ２（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｍｅｄ、９、１１〜１８ページ、（１９９９））は、Ｗｎｔ３ａおよびＤｋｋ−１に対して、心臓サルコメア遺伝子と同様の応答を示した（図４Ｅ、上）。
【００７４】
初期心臓中胚葉の誘導後の古典的Ｗｎｔシグナル伝達の効果を評価するために、ＥＢをＥＢ７〜９の間にＷｎｔ３ａまたはＤｋｋ−１で処理した。Ｗｎｔ３ａで処理し懸濁液内で成長させたＥＢのほぼ５０％がＥＢ１２までに拍動を有しており（図４Ｂ、左、Ｐ＜０．０１）、初期および後期の心臓マーカーのほとんどが上方調節され（図４Ｅ、下）、このことは、Ｗｎｔが、この比較的後期の段階であっても、心臓中胚葉の分化に対して正の効果を有していたことを示唆している。Ｄｋｋ−１で処理したＥＢの約１０％が拍動を有しており（対して、対照ＥＢでは１３％、図４Ｂ、右、Ｐ＞０．２）、心臓遺伝子の発現は変化しなかった（図４Ｅ、下）。したがって、心臓中胚葉の運命決定の後には、古典的Ｗｎｔシグナルは完全な心臓分化には必須ではないと考えられるが、依然として中胚葉前駆体を集めるかまたは心臓前駆体を増加させる可能性がある。
【００７５】
モデル・システムにおける古典的Ｗｎｔシグナル伝達アゴニストの異所性発現または過剰発現により、古典的Ｗｎｔシグナル伝達の阻害が脊椎動物の心臓形成に必要であるという一般的見解に至った（ＯｌｓｏｎおよびＳｃｈｎｅｉｄｅｒ、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、１７、１９３７〜１９５６ページ、（２００３）；ＥｉｓｅｎｂｅｒｇおよびＥｉｓｅｎｂｅｒｇ、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ、２９３、３０５〜３１５ページ、（２００６））。この理論を試験するために、時空間的に制限され、かつ細胞自立的な方法で、古典的Ｗｎｔシグナル伝達の機能喪失および機能獲得の研究を行った。一般的見解とは異なり、Ｗｎｔ／β−カテニン・シグナル伝達は、マウス胚およびＥＳ由来細胞における心臓前駆体の発生に必要であり、ここで、前記シグナル伝達は、中胚葉前駆体における心臓遺伝子の発現の最初期の兆候にさえも必要であった。これらの所見と一致して、古典的Ｗｎｔシグナル伝達は、ショウジョウバエにおける心臓前駆体の誘導および分化に必要である（ＺａｆｆｒａｎおよびＦｒａｓｃｈ、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ、９１、４５７〜４６９ページ、（２００２）；Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ、６、８２６〜８３５ページ、（２００５））。逆に、Ｗｎｔ／β−カテニン・シグナル伝達を刺激すると、より増殖した心臓細胞を有する肥大した心臓となり、このことは、おそらく部分的にはサイクリンＤ２に対する効果を介した、心臓細胞の増殖における指示的な役割を示唆している。懸濁液において成長させたＥＢからの拍動を有する心筋細胞の効果的な生成および心臓遺伝子の発現の誘導はさらに、心臓形成の促進における古典的Ｗｎｔシグナル伝達の正の役割を裏付けるものである。したがって、ここにおいて、Ｗｎｔ／β−カテニン・シグナル伝達が哺乳動物における心臓形成に必須であること、および古典的Ｗｎｔシグナル伝達がＥＳ細胞における心臓の決定および分化を調節するべく操作され得ることが示されている。
【００７６】
図１Ａおよび１Ｂ：組織特異的なｎｕｌｌおよび安定なβ−カテニンの生成。ｂ：Ｅ１２．０の、Ｎｋｘ２．５−ｃｒｅ、ｃｔｎｎｂｌｔｍ２Ｋｅｍのヘテロ接合体、ホモ接合体（左）、および野生型、Ｎｋｘ２．５−ｃｒｅ、β−カテニン／ｌｏｘＰ（ｅｘ３）のヘテロ接合体（右）の胚から得た心室の、β−カテニンおよびＧＡＰＤＨに対する抗体（それぞれ１：５０および１：１００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いたウェスタン・ブロット。ＧＡＰＤＨ抗体を対照として用いた。
【００７７】
図２：短尾の発現プロフィール。心臓遺伝子の発現における倍率の変化（ｙ軸）は、未分化ＥＳ細胞に関するものである。誤差のバーは標準偏差を示す。
【００７８】
図３Ａおよび３Ｂ：初期および後期の心臓遺伝子の発現プロフィール。ａ：ＷＴのＥＢにおいて６日目までに明らかに異なる、初期心臓遺伝子の発現レベル（Ｎｋｘ２．５、Ｔｂｘ５、Ｇａｔａ４、およびＭｅｓｐ１）。ｂ：ＷＴのＥＢにおいて９日目までに顕著に増大する後期心臓遺伝子（Ｍｙｈ６、Ｍｙｈ７、Ｍｌｃ２ａ、およびＭｌｃ２ｖ）の発現。心臓遺伝子の発現における倍率の変化（ｙ軸）は、未分化ＥＳ細胞に関するものである。誤差のバーは標準偏差を示す。
【００７９】
図４Ａ〜Ｅ：古典的Ｗｎｔシグナル伝達はＥＳ細胞における心臓の誘導および分化を調節する。ａ：対照と比較した、０日目の未分化ＥＳ細胞、ならびに初期のＷｎｔ３ａ処理またはＤｋｋ−１処理の３、６、および９日後に採取したＥＢの、定量リアル・タイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって決定した、短尾の発現プロフィール。ｂ：懸濁液において成長させた拍動を有するＥＢを８〜１２日目に計数した。Ｗｎｔ３ａ（左）またはＤｋｋ−１（右）を用いた初期（４〜６日目）または後期（７〜９日目）の処理後の、拍動を有するＥＢのパーセンテージ。アステリスクは、未処理のＥＢに対する処理群の、拍動を有するパーセンテージの有意な差を示している（Ｐ＜０．０１）。ｃ、ｄ：抗Ｉｓｌｅｔ１（ｃ）または抗トロポミオシン（ｄ）を用いた、１２日目のＥＢの免疫組織化学。ｅ：Ｗｎｔ３ａまたはＤｋｋ−１を用いた初期（４〜６日目、上）または後期（７〜９日目、下）の処理後の心臓遺伝子の発現。ＥＢを３、６、および９日目（初期の処理）または６、９、および１２日目（後期の処理）に採取した。未分化ＥＳ細胞に関する、ＥＳにおける全ての表示した遺伝子の発現における倍率の変化（ｙ軸）を、ｑＰＣＲによって評価した。ＮＳは有意ではないことを示す。＊Ｐ＜０．０１である。
【００８０】
実施例２：安定化したβ−カテニンの影響を受ける遺伝子の同定
安定化したβ−アクチンの影響を受ける第二の心臓野（ＳＨＦ）の遺伝子についてゲノム全体の研究を行うために、Ｒｏｓａ−ＹＦＰ＋／−、Ｉｓｌｅｔ１−ｃｒｅ＋／−、β−カテニン（ｅｘ３）ｌｏｘＰｌｏｘＰ／＋の胚を生成した。これらの胚は、ＳＨＦ前駆体およびそれらの誘導体において黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）の発現を示した。胚期（Ｅ）９日目において、これらの胚を切開し、不必要な細胞（頭部および尾部の組織）を除去するように切り取った。この胚期は、心不全の後に生じ得る第二の遺伝子変化を避けるために選択された。ＹＦＰ＋細胞を、Ｇｌａｄｓｔｏｎｅ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｌａｂにおいて蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって精製した（図５）。Ｒｏｓａ−ＹＦＰ陰性胚組織をゲーティングの対照として用いた（図５、左）。
【００８１】
図５：Ｅ９．５の、対照（Ｉｓｌｅｔ１−ｃｒｅ、左）、野生型（Ｒｏｓａ−ＹＦＰ、Ｉｓｌｅｔ１−ｃｒｅ、中央）、および突然変異体（Ｉｓｌｅｔ１−ｃｒｅ、β−カテニン（ｅｘ３）ｌｏｘＰ、右）の胚から得たＹＦＰ＋細胞集団を示すヒストグラムである。選別に用いたＹＦＰ＋細胞は長方形内のものである。
【００８２】
各Ｅ９．５胚で３０００個までのＹＦＰ＋細胞および約１０ｎｇの全ＲＮＡが得られた。ＲＮＡの量（１０ｎｇ）はＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘアレイのための１つのサンプルを精製するには十分であった。このマイクロアレイ分析では３回の実験反復を行った。全ＲＮＡを、ＷＴ−Ｏｖａｔｉｏｎ  Ｐｉｃｏ  ＲＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて増幅し、ＦＬ−Ｏｖａｔｉｏｎ  ｃＤＮＡ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｍｏｄｕｌｅ  Ｖ２（Ｎｕｇｅｎ）を用いて断片化および標識した。簡潔に述べると、ＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ二本鎖の二本鎖ｃＤＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲによって全ＲＮＡから合成した。ｃＤＮＡをＳＰＩＡ等温線形増幅によってさらに増幅した。精製後、得られたｃＤＮＡを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐｓとのハイブリダイゼーションのために断片化および標識した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐｓのハイブリダイゼーション、染色、およびスキャンは、Ｇｌａｄｓｔｏｎｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｒｅ  Ｌａｂ．にて行った。生データをさらに分析し、潜在的な候補の数を絞り込んだ。表２は、このアレイにおいて有意に調節異常であった、選択された遺伝子を示す。
【００８３】
【表２】
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【００８４】
Ｄｋｋ、Ｗｉｆ１、Ａｐｃｄｄ１、およびＡｘｉｎ２のような、古典的Ｗｎｔの多くのフィードバック標的遺伝子（Ｗｎｔシグナル伝達の構成要素）が、突然変異体において上方調節され、このことは、一連のデータの質を裏付けるものである。とりわけ、Ｎｄｒｇ１、Ｎｄｒｌ、およびＭｙｃｔ１のような、細胞周期に関連する遺伝子は、突然変異体において非常に良く上方調節された。Ｎ−ｍｙｃ下流調節遺伝子１（Ｎｄｒｇ１）は、細胞の分化に関与する新規なタンパク質をコードする。Ｋｏｋａｍｅら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、１９９６、２７１：２９６５９〜２９６６５ページ；ｖａｎ  Ｂｅｌｚｅｎら、Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ、１９９７、７７：８５〜９２ページ。ｍｙｃ標的１（Ｍｙｃｔ１）は癌遺伝子であるｃ−Ｍｙｃの直接的な標的であり、癌に関与する遺伝子を調節する。ＣｏｈｅｎおよびＰｒｏｃｈｏｗｎｉｋ、Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ、２００６、５：３９２〜３９３ページ。同様に、Ｆｇｆ、Ｔｇｆ、およびＢＭＰのような、成長因子をコードする遺伝子も高度に上方調節された。ＳＲＹ−ｂｏｘを含む遺伝子であるＳｏｘ１７、１８、および１０もまた上方調節された。古典的Ｗｎｔシグナル伝達は、ＥＳ細胞における心臓の分化決定に必須であるＳｏｘ１７を正方向に調節する。Ｌｉｕら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、２００７、１０４：３８５９〜３８６４ページ。上方調節された遺伝子の組において、塩基性ヘリックス・ループ・ヘリックス・ドメイン含有クラスＢ２（Ｂｈｌｈｂ２）は、配列特異的な転写抑制因子をコードし、その相同体は、細胞周期、分化、および概日リズムの調節のプロセスに関与する。Ｚａｗｅｌら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、２００２、９９：２８４８〜２８５３ページ；Ｂｏｕｄｊｅｌａｌら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、１９９７、１１：２０５２〜２０６５ページ；Ｓｕｎら、Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００１、２：１０４０〜１０４７ページ；Ｈｏｎｍａら、Ｎａｔｕｒｅ、２００２、４１９：８４１〜８４４ページ。多くの上方調節された遺伝子の遺伝子座において保存されたＬｅｆ／Ｔｃｆ結合部位が見られ、このことは、それらがＷｎｔ／β−カテニン・シグナル伝達の直接的な標的であり得ることを示唆している。突然変異体においては、わずかな遺伝子が有意に下方調節されると考えられる。これらには、Ｉｓｌ１、Ｓｈｈ、Ｍｙｏｃｄ、およびＳｍｙｄｌが含まれる。Ｉｓｌ１はＳＨＦマーカーであり、ＳＨＦの発生に必要である。Ｃａｉら、Ｃｅｌｌ、（２００３）、５：８７７〜８８９ページ。Ｓｈｈは心臓の形態形成に必要であり、Ｉｓｌｅｔ１の下流標的である。Ｌｉｎら、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ、２００６、２９５：７５６〜７６３ページ。したがって、Ｓｈｈの下方調節は、Ｉｓｌｅｔ１の発現の減少によるものであり得る。しかし、保存されたＢｈｌｈｂ２結合部位がＳｈｈ遺伝子座において見られ、このことは、Ｗｎｔ／β−カテニン・シグナル伝達がＢｈｌｈｂ２を介してＳｈｈの発現も抑制し得ることを示唆している。Ｍｙｏｃａｒｄｉｎ（Ｍｙｏｃｄ）は筋形成に関与する転写コ・アクチベーターである。Ｐｉｐｅｓら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、２００６、２０：１５４５〜１５５６ページ。ＳＥＴ���よびＭＹＮＤドメイン含有１（Ｓｍｙｄ１）は、心臓の形態形成に重要なヒストン・メチルトランスフェラーゼである。Ｇｏｔｔｌｉｅｂら、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ、２００２、３１：２５〜３２ページ。興味深いことに、Ｓｍｙｄ１ノックアウト（ＫＯ）胚は、安定化したβ−カテニンを有する胚の心臓と同様の、肥大した心臓（上記のＧｏｔｔｌｉｅｂら（２００２））を示す。Ｋｗｏｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、２００７、１０４：１０８９４〜１０８９９ページ。候補遺伝子のいくつかは、定量リアル・タイムＰＣＲによるものであった（図６）。
【００８５】
図６：ＷＴ（Ｒｏｓａ−ＹＦＰ、Ｉｓｌｅｔ１−ｃｒｅ、左のバー）およびＭｕｔ（Ｒｏｓａ−ＹＦＰ、Ｉｓｌｅｔ１−ｃｒｅ、β−カテニン（ｅｘ３）ｌｏｘＰ、右のバー）の胚から選別されたＹＦＰ＋細胞から得た、表示した遺伝子の、定量リアル・タイムＲＴ−ＰＣＲ。誤差のバーは標準偏差を示す。
【００８６】
実施例３：
分化しているヒトの胚性幹（ＥＳ）細胞（Ｈ９）をＷｎｔ−３ａで処理した。図７に示すように、Ｗｎｔ−３ａは、拍動を有するｈＥＳ細胞の数を有意に増大させた。したがって、古典的Ｗｎｔは、心筋細胞へのヒトＥＳ細胞の分化を促進する。
【００８７】
本発明の特定の実施形態を参照して本発明を記載してきたが、当業者には、本発明の実際の趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な変化がなされ得、同等のものが代用され得るということを理解されたい。加えて、特定の状況、材料、物の組成、プロセス、プロセスの段階、または段階を、本発明の目的、趣旨、および範囲に適合させるために、多くの変更がなされ得る。全てのこのような変更は、本明細書に添付する特許請求の範囲の範囲内にあることを意図するものである。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図９Ｈ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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