(57)【要約】  本発明は、Ｎ5，Ｎ10−メチレン−ＴＨＦが増加している微生物、特にＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍに関する。また、本発明はメチオニンを生産するためのそのような微生物の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物が出発生物と比較してＮ5，Ｎ10−メチレン−ＴＨＦをより産生するように、前記微生物が出発生物から遺伝子組換えによって誘導されている微生物を培養するステップを含む、少なくとも１種の微生物においてメチオニンを生産する方法。
【請求項２】
前記微生物が腸内細菌、エシェリキア、クレブシェラ、コリネバクテリウム、バシラス、サッカロミケス、シゾサッカロミケス、ピチア、クルイヴェロマイシス、アシュビア、アスペルギルス、ブレビバクテリウムおよびストレプトミセス属の微生物を含む群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記微生物が好ましくはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｊｅｉｅｋｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａおよびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｆｆｉｚｉｅｎｓ種を含む群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記微生物がＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの菌株から誘導される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記微生物が、ホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼの量および／または活性が出発生物と比較して前記微生物において増加するように出発生物から遺伝子組換えによって誘導される、請求項１から４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記微生物が、ホルミル−ＴＨＦ−デホルミラーゼの量および／または活性が出発生物と比較して前記微生物において減少するように出発生物から遺伝子組換えによって誘導される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記微生物が、Ｎ5，Ｎ10−メテニル−ＴＨＦ−シクロシンテターゼ、Ｎ5，Ｎ10−メテニル−ＴＨＦ−レダクターゼおよび／またはＮ5，Ｎ10−メチレン−ＴＨＦ−レダクターゼの量および／または活性が出発生物と比較して前記微生物において増加するように出発生物から遺伝子組換えによって誘導される、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
前記ホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼのコード配列がＣ．ｊｅｉｋｅｉｕｍまたはＥ．ｃｏｌｉから誘導される、請求項５から７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記微生物が、グリシン開裂系（ＧＣＳ）の酵素活性が出発生物と比較して前記微生物において増加するように出発生物から遺伝子組換えによって誘導される、請求項１から４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記微生物が、ｇｃｖＰ、ｇｃｖＴおよびｇｃｖＨの量および／または活性が出発生物と比較して前記微生物において増加するように出発生物から遺伝子組換えによって誘導される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ｌｉｐＡ、ｌｉｐＢまたはｌｉｐＡおよびｌｉｐＢの量および／または活性が出発生物と比較して前記微生物において増加する、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
ｌｐｌＡの量および／または活性が出発生物と比較して前記微生物において増加する、請求項９から１１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ｌｐｄの量および／または活性が出発生物と比較して前記微生物において増加する、請求項９から１２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ｇｃｖＰ、ｇｃｖＴ、ｇｃｖＨ、ｌｐｌＡ、ｌｉｐＡおよびｌｉｐＢのコード配列がＣ．ｊｅｉｋｅｉｕｍまたはＥ．ｃｏｌｉから誘導される、請求項１０から１３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記微生物がリポ酸および／またはリポアミドの存在下で培養される、請求項９から１４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼの量および／または活性ならびにグリシン開裂系（ＧＣＳ）の酵素活性が出発生物と比較して前記微生物において増加する、請求項１から４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼ、ｇｃｖＰ、ｇｃｖＴおよびｇｃｖＨの量および／または活性が出発生物と比較して前記微生物において増加する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ｌｉｐＡ、ｌｉｐＢまたはｌｉｐＡおよびｌｉｐＢの量および／または活性が出発生物と比較して前記微生物において増加する、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
ｌｐｌＡの量および／または活性が出発生物と比較して前記微生物において増加する、請求項１６から１８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ｌｐｄの量および／または活性が出発生物と比較して前記微生物において増加する、請求項１６から１９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ｇｃｖＰ、ｇｃｖＴ、ｇｃｖＨ、ｌｐｌＡ、ｌｉｐＡおよびｌｉｐＢのコード配列がＣ．ｊｅｉｋｅｉｕｍまたはＥ．ｃｏｌｉから誘導される、請求項１６から２０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記微生物がリポ酸および／またはリポアミドの存在下で培養される、請求項１６から２１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
微生物が出発生物と比較してＮ5，Ｎ10−メチレン−ＴＨＦをより産生するように、前記微生物が出発生物から遺伝子組換えによって誘導される、微生物。
【請求項２４】
前記微生物が腸内細菌、エシェリキア、クレブシェラ、コリネバクテリウム、バシラス、サッカロミケス、シゾサッカロミケス、ピチア、クルイヴェロマイシス、アシュビア、アスペルギルス、ブレビバクテリウムおよびストレプトミセス属の微生物を含む群から選択される、請求項２３に記載の微生物。
【請求項２５】
前記微生物が好ましくはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｊｅｉｅｋｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａおよびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｆｆｉｚｉｅｎｓ種を含む群から選択される、請求項２４に記載の微生物。
【請求項２６】
前記微生物がＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株から誘導される、請求項２５に記載の微生物。
【請求項２７】
前記微生物が、ホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼの量および／または活性が出発生物と比較して前記微生物において増加するように出発生物から遺伝子組換えによって誘導される、請求項２３から２６までのいずれか一項に記載の微生物。
【請求項２８】
前記微生物が、ホルミル−ＴＨＦ−デホルミラーゼの量および／または活性が出発生物と比較して前記微生物において減少するように出発生物から遺伝子組換えによって誘導される、請求項２７に記載の微生物。
【請求項２９】
前記微生物が、Ｎ5，Ｎ10−メテニル−ＴＨＦ−シクロシンテターゼ、Ｎ5，Ｎ10−メテニル−ＴＨＦ−レダクターゼおよび／またはＮ5，Ｎ10−メチレン−ＴＨＦ−レダクターゼの量および／または活性が出発生物と比較して前記微生物において増加するように出発生物から遺伝子組換えによって誘導される、請求項２７または２８に記載の微生物。
【請求項３０】
前記微生物が、グリシン開裂系（ＧＣＳ）の酵素活性が出発生物と比較して前記微生物において増加するように出発生物から遺伝子組換えによって誘導される、請求項２３から２６までのいずれか一項に記載の微生物。
【請求項３１】
前記微生物が、ｇｃｖＰ、ｇｃｖＴおよびｇｃｖＨの量および／または活性が出発生物と比較して前記微生物において増加するように出発生物から遺伝子組換えによって誘導される、請求項３０に記載の微生物。
【請求項３２】
ｌｉｐＡ、ｌｉｐＢまたはｌｉｐＡおよびｌｉｐＢの量および／または活性が出発生物と比較して前記微生物において増加する、請求項３０または３１に記載の微生物。
【請求項３３】
ｌｐｌＡの量および／または活性が出発生物と比較して前記微生物において増加する、請求項３０から３２までのいずれか一項に記載の微生物。
【請求項３４】
ｌｐｄの量および／または活性が出発生物と比較して前記微生物において増加する、請求項３０から３３までのいずれか一項に記載の微生物。
【請求項３５】
ｇｃｖＰ、ｇｃｖＴ、ｇｃｖＨ、ｌｐｌＡ、ｌｉｐＡおよびｌｉｐＢのコード配列がＣ．ｊｅｉｋｅｉｕｍまたはＥ．ｃｏｌｉから誘導される、請求項３０から３５までのいずれか一項に記載の微生物。
【請求項３６】
ホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼの量および／または活性ならびにグリシン開裂系（ＧＣＳ）の酵素活性が出発生物と比較して前記微生物において増加する、請求項２３から２６までのいずれか一項に記載の微生物。
【請求項３７】
ホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼ、ｇｃｖＰ、ｇｃｖＴおよびｇｃｖＨの量および／または活性が出発生物と比較して前記微生物において増加する、請求項３６に記載の微生物。
【請求項３８】
ｌｉｐＡ、ｌｉｐＢまたはｌｉｐＡおよびｌｉｐＢの量および／または活性が出発生物と比較して前記微生物において増加する、請求項３６または３７に記載の微生物。
【請求項３９】
ｌｐｌＡの量および／または活性が出発生物と比較して前記微生物において増加する、請求項３３から３８までのいずれか一項に記載の微生物。
【請求項４０】
ｌｐｄの量および／または活性が出発生物と比較して前記微生物において増加する、請求項３６から３９までのいずれか一項に記載の微生物。
【請求項４１】
ｇｃｖＰ、ｇｃｖＴ、ｇｃｖＨ、ｌｐｌＡ、ｌｉｐＡおよびｌｉｐＢのコード配列がＣ．ｊｅｉｋｅｉｕｍまたはＥ．ｃｏｌｉから誘導される、請求項３６から４０までのいずれか一項に記載の微生物。
【請求項４２】
ホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼ、ｇｃｖＰ、ｇｃｖＴ、ｇｃｖＨ、ｌｐｄ、ｌｐｌＡ、ｌｉｐＡまたはｌｉｐＢの量および／または活性が、ホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼ、ｇｃｖＰ、ｇｃｖＴ、ｇｃｖＨ、ｌｐｄ、ｌｐｌＡ、ｌｉｐＡもしくはｌｉｐＢをコードしている核酸配列のコピー数を増加させること、ホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼ、ｇｃｖＰ、ｇｃｖＴ、ｇｃｖＨ、ｌｐｄ、ｌｐｌＡ、ｌｉｐＡもしくはｌｉｐＢをコードしている核酸配列の転写および／もしくは翻訳を増加させること、ホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼ、ｇｃｖＰ、ｇｃｖＴ、ｇｃｖＨ、ｌｐｄ、ｌｐｌＡ、ｌｉｐＡもしくはｌｉｐＢをコードしている核酸配列に突然変異を導入すること、またはその組合せによって増加する、請求項２７から４１までのいずれか一項に記載の微生物。
【請求項４３】
遺伝子コピー数がホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼ、ｇｃｖＰ、ｇｃｖＴ、ｇｃｖＨ、ｌｐｄ、ｌｐｌＡ、ｌｉｐＡもしくはｌｉｐＢをコードしていている核酸配列を含む自己複製ベクターを独立して使用することによって、および／またはホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼ、ｇｃｖＰ、ｇｃｖＴ、ｇｃｖＨ、ｌｐｄ、ｌｐｌＡ、ｌｉｐＡもしくはｌｉｐＢをコードしている核酸配列の更なるコピーの出発生物のゲノムへの染色体組込みによって増加する、請求項４２に記載の微生物。
【請求項４４】
転写が好ましくはＰEFTu、ＰgroES、ＰSOD、Ｐ15およびλＰRを含む群から選択される強力なプロモーターを使用することによって増加する、請求項４３に記載の微生物。
【請求項４５】
メチオニンを生産するための請求項２３から４４までのいずれか一項に記載の微生物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌ−メチオニンを生産するための微生物および方法に関する。特に、本発明は、ホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼ活性および／または機能的グリシン開裂系を示すコリネ型細菌に関する。
【０００２】
現在、メチオニンの年間生産量は全世界で約５０万トンである。メチオニンは、家畜の家禽および飼料の第一制限アミノ酸であり、このため主に飼料の添加物として利用される。
【０００３】
他の工業的アミノ酸とは対照的に、メチオニンは、化学合成によって生産されるＤ−およびＬ−メチオニンのラセミ体として、ほぼ例外なく利用される。動物はメチオニンの両方の立体異性体を代謝することができるので、化学的に生産されたラセミ混合物の直接の給餌が可能である（Ｄ’Ｍｅｌｌｏ  ａｎｄ  Ｌｅｗｉｓ，Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ  ｉｎ  Ａｎｉｍａｌｓ：Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，Ｒｅｃｈｇｉｇｌ（Ｅｄ．），ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｓｅｒｉｅｓ  ｉｎ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ，４４１−４９０，１９７８）。
【０００４】
しかし、バイオテクノロジーのプロセスによりもっぱらＬ−メチオニンだけを生産する既存の化学生産を替えることに、依然として非常に関心が持たれている。このことは、低いレベルの補充Ｌ−メチオニンがＤ−メチオニンより硫黄アミノ酸の良好な供給源であるという事実による（Ｋａｔｚ  ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ（１９７５）Ｐｏｕｌｔ．Ｓｃｉ．５４５：１６６７−７４）。さらに、化学プロセスでは、むしろ有害化学物質を使用して、重大な廃棄物の流れを引き起こす。化学生産に関するこれら全ての不都合は、効率的なバイオテクノロジーのプロセスにより回避される可能性がある。
【０００５】
今日、アミノ酸、芳香族化合物、ビタミンおよび補因子などのファインケミカルの発酵生産は、典型的にＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｓｃｈｉｚｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｓ  ｐｏｍｂｅ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ａｓｈｂｙａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓまたはＧｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓなどの微生物において実施されている。
【０００６】
したがって、グルタミンなどのアミノ酸は、発酵法を使用して生産される。これらの目的のために、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）などの特定の微生物が特に適していることが証明されている。また、発酵によるアミノ酸の生産は、とりわけ、Ｌ−アミノ酸だけが生産され、化学合成において典型的に使用される溶媒などの環境的に問題のある化学物質は避けられるという利点を持つ。
【０００７】
Ｅ．ｃｏｌｉおよびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなどの微生物においてアミノ酸、脂質、ビタミンまたは炭水化物などの真の化学物質を生産するための先行技術のいくつかの試みでは、例えば、それぞれのファインケミカルの生合成経路に関係する遺伝子の発現を増加させることによって、この目的を達成しようと努めてきた。
【０００８】
例えば、リシンの生産を、リシン産生の生合成経路において関係する遺伝子の発現をアップレギュレーションすることによって増加させる試みが、例えば、国際特許出願公開第０２／１０２０９号、同第２００６００８０９７号、同第２００５０５９０９３号、またはＣｒｅｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，（１９９１），５７（６），１７４６−１７５２）に記載されている。
【０００９】
しかし、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなどの微生物におけるメチオニンの産生に有益に影響を与えるために使用することができる代謝経路における更なる標的を同定する強い必要性が残る。
【００１０】
本発明の１つの目的は、微生物におけるＬ−メチオニンの生産の方法を提供することである。
【００１１】
本発明の更なる目的は、Ｌ−メチオニンを産生する微生物を提供することである。
【００１２】
本発明のこれらおよび更なる目的は、続く説明から明らかになるように、独立請求の主題によって達成される。
【００１３】
本発明の更なる実施形態は、従属請求によって定義される。
【００１４】
本発明の一態様によれば、出発生物と比較して微生物がよりＮ5，Ｎ10−メチレン−テトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ）を産生するように出発生物から遺伝子組換えによって誘導される微生物を培養するステップを含む、微生物において好ましいＬ−メチオニンを生産するための方法を提供する。
【００１５】
本方法では、腸内細菌、コリネバクテリウム、バシラスおよびストレプトマイセス属の微生物を含む群から選択される微生物を使用する。Ｃｏｌｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ種の使用が、特に好ましい。
【００１６】
本発明の好ましい実施形態の１つにおいて、本方法はホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼの量および／または活性が出発生物と比較して増加するように出発生物からの遺伝子組換えにより誘導される微生物を培養するステップを含む。
【００１７】
本発明のこの後者の実施形態の好ましい態様は、さらにホルメート−ＴＨＦ−デホルミラーゼの量および／もしくは活性が出発生物と比較して減少し、ならびに／またはＮ5，Ｎ10−メテニル−ＴＨＦ−シクロシンテターゼ、Ｎ5，Ｎ10−メテニル−ＴＨＦ−レダクターゼおよび／もしくはＮ5，Ｎ10−メチレン−ＴＨＦ−レダクターゼの量および／もしくは活性が出発生物と比較して増加する、微生物の培養に関する。
【００１８】
本発明の他の好ましい実施形態の１つは、グリシン開裂系（ＧＣＳ）の酵素活性が出発生物と比較して増加するように、出発生物から遺伝子組換えによって誘導される微生物を培養する方法に関する。
【００１９】
これは、ＰＬＰ依存性グリシンデカルボキシラーゼ（ｇｃｖＰ、Ｐ−タンパク質）、リポアミド含有アミノメチルトランスフェラーゼ（ｇｃｖＨ、Ｈ−タンパク質）およびＮ5，Ｎ10−メチレン−ＴＨＦ−合成酵素（ｇｃｖＴ、Ｔ−タンパク質）の量および／または活性が出発生物と比較して増加するように出発生物の遺伝子組換えによって達成し得る。これらの遺伝子組換えは、蓄積されたグリシンがＮＨ4+、ＣＯ2およびＮ5，Ｎ10−メチレン−ＴＨＦに変換することを確実にする。本発明のこの後者の態様の更なる詳細において、微生物は、リポ酸および／またはリポアミドの存在下で培養される。
【００２０】
代わりにまたは付加的に、微生物を、微生物がリポ酸シンターゼ（ｌｉｐＡ）、リポイルトランスフェラーゼ（ｌｉｐＢ）および／またはリポ酸シンテターゼ（ｌｐｌＡ）の量および／または生物活性が増加するように、さらに遺伝子組換えすることができる。
【００２１】
培養された微生物を、代わりにまたは付加的に、ＮＡＤ+依存的、ＦＡＤ要求リポアミドデヒドロゲナーゼ（ｌｐｄ）の量および／または活性を増加させるために遺伝子組換えしてもよい。
【００２２】
本発明の好ましい実施態様において、方法は、ホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼの量および／または生物活性が増加し、機能的グリシン開裂系が確立されているように遺伝子組換えされている微生物を培養することによってＬ−メチオニンを生産することを可能にする。そのような微生物は、ホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼ、ｇｃｖＨ、ｇｃｖＰおよびｇｃｖＴ（ｇｃｖＨＰＴ）の量および／または生物活性が典型的に増加する。本発明の一態様において、これら後者の微生物は、リポ酸および／またはリポアミドの存在下で培養される。代わりにまたは付加的に、微生物を、ｌｉｐＡ、ｌｉｐＢおよび／またはｌｐｌＡの量および／または活性を増加させるために、さらに遺伝子組換えすることができる。また、微生物は、ｌｐｄの量および／または生物活性を増加し得る。
【００２３】
本発明による方法の上記の実施形態は、好ましくはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ種の微生物を培養することによって行われる。上記の遺伝子組換えは、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ野生型株に導入することができる。好ましい実施形態において、これらの遺伝子改変は、すでにメチオニン産生株であると考えられているＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株に導入される。
【００２４】
上述のホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼ、ｇｃｖＰ、ｇｃｖＴ、ｇｃｖＨ、ｌｐｌＡ、ｌｉｐＡおよびｌｉｐＢのためのコード配列は、好ましくはＣ．ｊｅｉｋｅｉｕｍまたはＥ．ｃｏｌｉから誘導される。Ｃ．ｊｅｉｋｅｉｕｍの配列は、特に、方法がＣ．ｇｌｕｉｔａｍｉｃｕｍ株を培養することによって行われる場合に考慮される。
【００２５】
別の態様において、本発明は、出発生物と比較してＮ5，Ｎ10−メチレン−ＴＨＦをより生産するために、出発微生物から遺伝子組換えによって誘導されている微生物に関する。再度、微生物は、腸内細菌、コリネ型細菌、コリネ型細菌とバシラスおよびストレプトミセス属を含む群（特に、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ種が好ましい）から選択することができる。
【００２６】
本発明の本態様の一実施例において、微生物は、ホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼの量および／または活性が出発生物と比較して増加するように出発生物から遺伝子組換えによって誘導される。本発明のこの後者の実施形態の更なる詳細は、ホルメート−ＴＨＦ−デホルミラーゼの量および／もしくは活性が減少し、ならびに／またはＮ5，Ｎ10−メテニル−ＴＨＦ−シクロシンテターゼ、Ｎ5，Ｎ10−メテニル−ＴＨＦ−レダクターゼおよび／もしくはＮ5，Ｎ10−メチレン−ＴＨＦ−レダクターゼのいずれかの活性が増加する微生物を含む。
【００２７】
本発明の別の態様は、グリシン開裂系の酵素活性が出発生物と比較して前記微生物において増加するように、出発生物から遺伝子組換えによって誘導される微生物に関する。
【００２８】
このためには、微生物は、ｇｃｖＰ、ｇｃｙＴおよびｇｃｖＨの量および／または活性を増加させるために遺伝子改変させることができる。さらに、微生物は、外部から提供されたリポ酸および／もしくはリポアミドの取り込みのための能力、ならびに／または内因的にリポ酸を合成するための能力を増加させるために、さらに遺伝子組換えすることができる。このためには、ｌｐｌＡ、ｌｉｐＡおよび／またはｌｉｐＢの量および／または活性を、前記微生物において増加させることができる。また、ｌｐｄの量および／または活性を、出発生物と比較して増加させることができる。
【００２９】
微生物は、好ましくはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ種から誘導される。遺伝子改変を、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの野生型株、またはメチオニン産生株であるとすでに考えられている菌株に導入することができる。
【００３０】
好ましい本発明の態様は、ホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼ、ｇｃｖＰ、ｇｃｖＴおよびｇｃｖＨの量および／または生物活性が出発生物と比較して増加する微生物に関する。本発明の本態様の更なる詳細において、ｌｐｌＡ、ｌｉｐＡおよび／またはｌｉｐＢの量および／または活性を、出発生物と比較して増加させることができる。代わりにおよび／または付加的に、ｌｐｄの量および／または活性を増加させることができる。
【００３１】
微生物は、好ましくはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ種から誘導される。遺伝子改変を、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの野生型株、またはメチオニン産生株であるとすでに考えられている菌株に導入することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】Ｃ．ｊｅｉｅｋｅｕｍおよびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるｌｐｄのアミノ酸配列の配列比較を示す。
【００３３】
本発明は、遺伝子組換え微生物を培養するステップと、場合によってメチオニンを単離するステップとを含む、Ｌ−メチオニンを生産する方法に関する。また、本発明は、Ｌ−メチオニンを産生することができる遺伝子組換え微生物に関する。
【００３４】
本発明は、微生物が、得られた微生物が出発生物と比較してよりＮ5，Ｎ10−メチレン−テトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ）を産生するように出発生物から遺伝子組換えされている場合、そのような微生物において、Ｌ−メチオニン（またメチオニンとも呼ばれる）の効率的な生産が達成されるという知見に基づく。
【００３５】
本発明の例示的な実施形態を詳細に述べる前に、以下の定義を示す。
【００３６】
遺伝子名またはタンパク質名（例えば、ホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼ、ｇｃｖＰＴＨ、ｌｉｐＡ、ｌｉｐＢ、ｌｐｌＡ、ｌｐｄおよびいずれか他の本明細書に含まれる遺伝子またはタンパク質名、しかしこれらに限定されるものではない）は、本名称が使用される文脈に応じて、遺伝子および／または前記遺伝子によってコードされるタンパク質もしくは酵素のいずれかまたは両方をいう。
【００３７】
本発明の文脈において「約」という用語は、当業者が問題になっている特徴に対して一般的であると理解する精度の間隔を意味する。本用語は、示した数値からの＋／−１０％、および好ましくは＋／−５％の偏差を示す。
【００３８】
本発明の目的において「微生物」という用語は、原核生物および下等真核生物をいう。
【００３９】
本発明の生物は、したがって、微生物がアミノ酸、ビタミン、酵素補因子などのファインケミカルの生産に有用であると当技術分野で公知である微生物を含む。これらは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍに特に重点を置いたコリネバクテリウム属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉに特に重点を置いた腸内細菌属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓに特に重点を置いたバシラス属、放線細菌属、シアノバクテリア属、プロテオバクテリア属、好塩菌属、メタノコッカス属、ミコバクテリア属、サルモネラ属、シゲラ属およびストレプトミセス属から選択することができる。また、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ａｓｈｂｙａ  ｇｏｓｙｐｉｉおよびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓなどの酵母も「微生物」という用語に含まれると理解される。
【００４０】
以下の記述によって詳細に説明されるように、本発明は、主に、特定の酵素の量および／または活性を増加させるために、遺伝子組換えされている微生物に関する。
【００４１】
本発明の意味の範囲内における「遺伝子組換え」および「遺伝子改変」という用語ならびにこれらの文法的変化は、それぞれの微生物に自然に存在し得る１種以上のタンパク質、それぞれの微生物に自然に存在しない１種以上のタンパク質、またはそれぞれの非組換え微生物のタンパク質と比較して活性が変えられた１種以上のタンパク質の量を変えるように、微生物が遺伝子工学によって組み換えられていることを意味するものと意図される。非組換え微生物は、「出発生物」と考えられ、遺伝子改変の結果、本発明による微生物を生じる。
【００４２】
「出発生物」という用語は、したがって、生物の野生型をいうことができる。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの場合、これは、例えばＡＴＣＣ１３０３２であり得る。しかし、本発明の目的において「出発生物」という用語は、それぞれの種の野生型生物と比較して遺伝子改変をすでに有するが、その上、本発明による生物を得るためにさらに遺伝子組換えされる生物にもいうことができる。
【００４３】
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの場合、したがって、出発生物は、ＡＴＣＣ１３０３２などの野生型Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株であり得る。しかし、出発生物は、好ましくは、メチオニン産生のためにすでに操作されている例えばＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株でもあり得る。
【００４４】
そのようなメチオニン産生出発生物は、例えば、野生型コリネ型細菌から誘導することができ、ならびに好ましくは以下のａｓｋfbr、ｈｏｍfbrおよびｍｅｔＨ遺伝子の少なくとも１つで遺伝子改変を含む野生型Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細菌から誘導することができ、この場合、遺伝子改変はこれら遺伝子のいずれかの過剰発現を引き起こし、したがって、遺伝子改変がない場合に産生するメチオニンと比較してメチオニンの産生が増加する。好ましい実施形態において、そのようなメチオニン産生出発生物は、ａｓｋfbr、ｈｏｍfbrおよびｍｅｔＨで同時に遺伝子改変を含み、したがって、遺伝子改変がない場合に産生するメチオニンと比較してメチオニンの産生が増加する。
【００４５】
これらの出発生物において、ａｓｋおよびｈｏｍの内因性コピーは、リシン、スレオニン、メチオニンによる、またはこれらアミノ酸の組合せによるフィードバック阻害をもはや受けないフィードバック耐性対立遺伝子に典型的に変化する。これは、突然変異および選択によるか、またはフェードバック阻害が低下もしくは減少されたタンパク質をコードする突然変異対立遺伝子との遺伝子の規定された遺伝子置換のいずれかにより行うことができる。これらの遺伝子改変を含むＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株は、例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＤＳＭ１７３２２である。当業者は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＤＳＭ１７３２２の発生に関して以下に記述されている遺伝子改変の代わりの遺伝子改変を、ａｓｋfbr、ｈｏｍfbrおよびｍｅｔＨの過剰発現を達成するためにも使用できることに気づくであろう。
【００４６】
本発明の目的において、ａｓｋfbrは、フィードバック耐性アスパラギン酸キナーゼを意味する。ｈｏｍfbrは、フィードバック耐性ホモセリンデヒドロゲナーゼを意味する。ｍｅｔＨは、ビタミンＢ１２依存性メチオニンシンターゼを意味する。
【００４７】
他の好ましい実施形態において、メチオニン産生出発生物は、野生型コリネ型細菌から誘導することができ、ならびに好ましくは以下のａｓｋfbr、ｈｏｍfbr、ｍｅｔＨ、ｍｅｔＡ（またｍｅｔＸとも呼ばれる）、ｍｅｔＹ（またｍｅｔＺとも呼ばれる）およびｈｓｋ（突然変異）遺伝子の少なくとも１つで遺伝子改変を含む野生型Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細菌から誘導することができ、この場合、遺伝子改変はこれら遺伝子のいずれかの過剰発現を引き起こし、したがって、遺伝子改変がない場合に産生するメチオニンと比較してメチオニンの産生が増加する。好ましい実施形態において、そのようなメチオニン産生出発生物は、ａｓｋfbr、ｈｏｍfbr、ｍｅｔＨ、ｍｅｔＡ（またｍｅｔＸとも呼ばれる）、ｍｅｔＹ（またｍｅｔＺとも呼ばれる）およびｈｓｋ（突然変異）で同時に遺伝子改変を含み、したがって、遺伝子改変がない場合に産生するメチオニンと比較してメチオニンの産生が増加する。
【００４８】
これらの出発生物において、ａｓｋ、ｈｏｍおよびｈｓｋの内因性コピーは、ａｓｋfbrおよびｈｏｍfbrに関して先に述べたように、典型的にａｓｋfbr、ｈｏｍfbrおよびｈｓｋ（突然変異）によって置換される。これらの遺伝子改変を含むＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株は、例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  Ｍ２０１４である。当業者は、特にＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  Ｍ２０１４の発生に関して以下に記述されている遺伝子改変の代わりの遺伝子改変を、ａｓｋfbr、ｈｏｍfbr、ｍｅｔＨ、ｍｅｔＡ（またｍｅｔＸとも呼ばれる）、ｍｅｔＹ（またｍｅｔＺとも呼ばれる）およびｈｓｋ（突然変異）の過剰発現を達成するためにも使用できることに気づくであろう。
【００４９】
本発明の目的において、ｍｅｔＡは、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のホモセリンサクシニルトランスフェラーゼを意味する。ｍｅｔＹは、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼを意味する。ｈｓｋ（突然変異）は、酵素活性を減少させるために突然変異させたホモセリンキナーゼを意味する。これは、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｃｇｌ１１８４）のｈｓｋのＴ１９０に対応する位置でセリンまたはアラニンとスレオニンを交換することによって達成することができる。代わりにまたは付加的に、ＴＴＧ開始コドンとＡＴＧ開始コドンを置換することができる。そのような突然変異は、非突然変異ｈｓｋ遺伝子と比較して、得られたｈｓｋタンパク質の酵素活性の減少を引き起こす。
【００５０】
他の好ましい実施形態において、メチオニン産生出発生物は、野生型コリネ型細菌から誘導することができ、ならびに好ましくは以下のａｓｋfbr、ｈｏｍfbr、ｍｅｔＨ、ｍｅｔＡ（またｍｅｔＸとも呼ばれる）、ｍｅｔＹ（またｍｅｔＺとも呼ばれる）、ｈｓｋ（突然変異）およびｍｅｔＦ遺伝子の少なくとも１つで遺伝子改変を含む野生型Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細菌から誘導することができる。ここで、遺伝子改変は、以下のｓｅｒＡ遺伝子（遺伝子改変がこの遺伝子の発現を減少させる）の１つの遺伝子改変と組み合わせて、これら遺伝子のいずれかの過剰発現を引き起こす。そして、この組合せは、組合せがない場合のメチオニンの産生と比較して微生物によるメチオニンの産生を増加させる。
【００５１】
これらの出発生物において、ａｓｋ、ｈｏｍ、ｈｓｋの内因性コピーは上記の通りに置換され、ｓｅｒＡの内因性コピーは典型的に機能的に阻害される。これらの遺伝子改変を含むＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株は、例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＯＭ２６４Ｃである。また、当業者は、特にＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＯＭ２６４Ｃの発生に関して以下に記述されている遺伝子改変の代わりの遺伝子改変を、ａｓｋfbr、ｈｏｍfbr、ｍｅｔＨ、ｍｅｔＡ（またｍｅｔＸとも呼ばれる）、ｍｅｔＹ（またｍｅｔＺとも呼ばれる）、ｈｓｋ（突然変異）およびｍｅｔＦの過剰発現、ならびにｓｅｒＡの発現減少を達成するためにも使用できることに気づくであろう。
【００５２】
本発明の目的において、ｓｅｒＡは、３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼを意味する（第１表参照）。
【００５３】
他の好ましい実施形態において、メチオニン産生出発生物は、野生型コリネ型細菌から誘導することができ、ならびに好ましくは以下のａｓｋfbr、ｈｏｍfbr、ｍｅｔＨ、ｍｅｔＡ（またｍｅｔＸとも呼ばれる）、ｍｅｔＹ（またｍｅｔＺとも呼ばれる）、ｈｓｋ（突然変異）およびｍｅｔＦ遺伝子の少なくとも１つで遺伝子改変を含む野生型Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細菌から誘導することができる。ここで、遺伝子改変は、以下のｍｃｂＲおよびｍｅｔＱ遺伝子の少なくとも１つの遺伝子改変（遺伝子改変がこれら遺伝子のいずれかの発現を減少させる）と組み合わせて、これら遺伝子のいずれかの過剰発現を引き起こす。そして、この組合せは、組合せがない場合のメチオニンの産生と比較して微生物によるメチオニンの産生を増加させる。好ましい実施形態において、そのようなメチオニン産生出発生物は、ａｓｋfbr、ｈｏｍfbr、ｍｅｔＨ、ｍｅｔＡ（またｍｅｔＸとも呼ばれる）、ｍｅｔＹ（またｍｅｔＺとも呼ばれる）、ｈｓｋ（突然変異）およびｍｅｔＦで同時に遺伝子改変を含み、ここで、遺伝子改変は、ｍｃｂＲおよびｍｅｔＱの遺伝子改変（遺伝子改変がこれら遺伝子のいずれかの発現を減少させる）と組み合わせて、これら遺伝子のいずれかの過剰発現を引き起こす。そして、この組合せは、組合せがない場合のメチオニンの産生と比較して微生物によるメチオニンの産生を増加させる。
【００５４】
これらの出発生物において、ａｓｋ、ｈｏｍおよびｈｓｋの内因性コピーは上記の通りに典型的に置換されるが、一方、ｍｃｂＲおよびｍｅｔＱの内因性コピーは典型的に機能的に阻害または除去される。これらの遺伝子改変を含むＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株は、例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＯＭ４６９である。当業者は、特にＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＯＭ４６９Ｃの発生に関して以下に記述されている遺伝子改変の代わりの遺伝子改変を、ａｓｋfbr、ｈｏｍfbr、ｍｅｔＨ、ｍｅｔＡ（またｍｅｔＸとも呼ばれる）、ｍｅｔＹ（またｍｅｔＺとも呼ばれる）、ｈｓｋ（突然変異）およびｍｅｔＦの過剰発現、ならびにｍｃｂＲおよびｍｅｔＱの発現減少を達成するためにも使用できることに気づくであろう。
【００５５】
本発明の目的において、ｍｅｔＦは、Ｎ５，１０−メチレン−テトラヒドロ葉酸レダクターゼ（ＥＣ  １．５．１．２０）を意味する。ｍｃｂＲは、硫黄代謝のＴｅｔＲ型転写調節因子を意味する（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＡＡＰ４５０１０）。ｍｅｔＱは、メチオニン移入で機能するＤ−メチオニン結合リポタンパク質を意味する。
【００５６】
更なる好ましい実施形態において、メチオニン産生出発生物は、野生型コリネ型細菌から誘導することができ、ならびに好ましくは以下のａｓｋfbr、ｈｏｍfbr、ｍｅｔＨ、ｍｅｔＡ（またｍｅｔＸとも呼ばれる）、ｍｅｔＹ（またｍｅｔＺとも呼ばれる）、ｈｓｋ（突然変異）、ｍｅｔＦ、ｔｋｔ、ｔａｌ、ｚｗｆおよび６ｐｇｌ遺伝子の少なくとも１つで遺伝子改変を含む野生型Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細菌から誘導することができる。ここで、遺伝子改変は、以下のｍｃｂＲ、ｍｅｔＱおよびｓｄａ遺伝子の少なくとも１つでの遺伝子改変（遺伝子改変がこれら遺伝子のいずれかの発現を減少させる）と組み合わせて、これら遺伝子のいずれかの過剰発現を引き起こす。そして、この組合せは、組合せがない場合のメチオニンの産生と比較して微生物によるメチオニンの産生を増加させる。好ましい実施形態において、そのようなメチオニン産生出発生物は、ａｓｋfbr、ｈｏｍfbr、ｍｅｔＨ、ｍｅｔＡ（またｍｅｔＸとも呼ばれる）、ｍｅｔＹ（またｍｅｔＺとも呼ばれる）、ｈｓｋ（突然変異）、ｍｅｔＦ、ｔｋｔ、ｔａｌ、ｚｗｆおよび６ｐｇｌで同時に遺伝子改変を含み、ここで、遺伝子改変は、ｍｃｂＲ、ｍｅｔＱおよびｓｄａの遺伝子改変（遺伝子改変がこれら遺伝子のいずれかの発現を減少させる）と組み合わせて、これら遺伝子のいずれかの過剰発現を引き起こす。そして、この組合せは、組合せがない場合のメチオニンの産生と比較して微生物によるメチオニンの産生を増加させる。
【００５７】
これらの遺伝子改変を含むＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株は、例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＧＫ１２５９である。また、当業者は、特にＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＧＫ１２５９の発生に関して以下に記述されている遺伝子改変の代わりの遺伝子改変を、ａｓｋfbr、ｈｏｍfbr、ｍｅｔＨ、ｍｅｔＡ（またｍｅｔＸとも呼ばれる）、ｍｅｔＹ（またｍｅｔＺとも呼ばれる）、ｈｓｋ（突然変異）、ｍｅｔＦ、ｔｋｔ、ｔａｌ、ｚｗｆおよび６ｐｇｌの過剰発現、ならびにｍｃｂＲ、ｍｅｔＱおよびｓｄａの発現減少を達成するためにも使用できることに気づくであろう。
【００５８】
本発明の目的において、ｔｋｔはトランスケトラーゼを意味し、ｔａｌはトランスアルドラーゼを意味し、ｚｗｆはグルコース−６−ホスフェート−デヒドロゲナーゼを意味し、６ｐｇｌは６−ホスホ−グルコノ−ラクトナーゼを意味し、ｓｄａはセリンデアミナーゼを意味する（第１表参照）。当業者は、ｚｗｆの量および／または活性を増加させるために、ｚｗｆの構造的足場タンパク質として役割を果たすｏｐｃａの量および／または活性も増加させることを理解する。ＧＫ１２５９において、これは、ｔｋｔ、ｔａｌ、ｚｗｆおよび６ｐｇｌを含む、ペントースリン酸オペロンの転写を同時に増加させるＰＳＯＤプロモーターの使用によって達成される。
【００５９】
先に述べているように、本発明の遺伝子組換え微生物は、Ｎ5，Ｎ10−メチレン−ＴＨＦの量が増加するという点を特徴とする。
【００６０】
典型的に、Ｎ5，Ｎ10−メチレン−ＴＨＦの量は、本発明による微生物において、それぞれの出発生物と比較して、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、または少なくとも約２０％増加する。他の好ましい実施形態において、Ｎ5，Ｎ10−メチレン−ＴＨＦの量は、少なくとも約３０％、少なくとも約５０％または少なくとも約７５％増加する。なお一層好ましい実施形態は、Ｎ5，Ｎ10−メチレン−ＴＨＦの量が少なくとも約２倍、少なくとも約５倍または少なくとも約１０倍増加する微生物に関する。
【００６１】
本発明による方法および微生物を使用して、以下に概説されるような遺伝子組換えされていないそれぞれの出発生物を培養する状況と比較して、より多くメチオニンを生産することができる。また、本発明の微生物および方法を、メチオニン合成の効率を上昇させるために使用することができる。
【００６２】
「メチオニン合成の効率」という用語は、メチオニンの炭素収率を述べる。この効率は、炭素基質の形態で系に入るエネルギー入力の百分率として算出される。本発明の全体を通じて、この値は、パーセント値で示す（（モルメチオニン）（モル炭素基質（−1×１００）。
【００６３】
「メチオニン合成の効率の増加」という用語は、したがって、出発生物と下記の酵素の少なくとも１つの量および／または活性が増加している実際のコリネ型細菌との比較に関する。
【００６４】
本発明による好ましい炭素源は、単糖類、二糖類または多糖類などの糖類である。例えば、グルコース、フルクトース、ハノース、ガラクトース、リボース、ソルボース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、デンプンまたはセルロースを含む群から選択される糖類は、特に好ましい炭素源として機能し得る。
【００６５】
また、本発明による方法およびコリネ型細菌は、出発生物と比較してより多くのメチオニンを生産するために使用することができる。
【００６６】
また、本発明による方法およびコリネ型細菌は、出発生物と比較して、より速い速度でメチオニンを生産するために使用することができる。例えば、典型的な生産期間を考える場合、本方法およびコリネ型細菌は、より早い速度でメチオニンを生産すること可能にする（すなわち、同一量のメチオニンが出発生物と比較して、より早い時点で生産される）。これは、特に対数増殖期にあてはまる。
【００６７】
本発明による方法およびコリネ型細菌は、菌株を振盪フラスコインキュベーションでインキュベートする場合、少なくとも約３ｇのメチオニン／Ｌ培養量を生産することを可能にする。菌株を振盪フラスコインキュベーションでインキュベートする場合、少なくとも約４ｇのメチオニン／Ｌ培養量、少なくとも約５ｇのメチオニン／Ｌ培養量または少なくとも約７ｇのメチオニン／Ｌ培養量の力価が好ましいと思われる。菌株を振盪フラスコインキュベーションでインキュベートする場合、より好ましい値は、少なくとも約１０ｇのメチオニン／Ｌ培養量およびなお一層好ましくは少なくとも約２０ｇのメチオニン／Ｌ細胞量になる。
【００６８】
本発明による方法およびコリネ型細菌は、菌株を、撹拌および炭素源フィード発酵槽を使用した発酵試験においてインキュベートする場合、少なくとも約２５ｇのメチオニン／Ｌ培養量を生産することを可能にする。菌株を、撹拌および炭素源フィード発酵槽を使用した発酵試験においてインキュベートする場合、少なくとも約３０ｇのメチオニン／Ｌ培養量、少なくとも約３５ｇのメチオニン／Ｌ培養量または少なくとも約４０ｇのメチオニン／Ｌ培養量の力価が好ましいと思われる。菌株を、撹拌および炭素源フィード発酵槽を使用した発酵試験においてインキュベートする場合、より好ましい値は、少なくとも約５０ｇのメチオニン／Ｌ培養量およびなお一層好ましくは少なくとも約６０ｇのメチオニン／Ｌ細胞量になる。
【００６９】
好ましい実施形態において、本発明の方法および微生物は、メチオニン合成の効率性ならびに／またはメチオニンの量ならびに／またはメチオニン合成の力価および／もしくは速度を、出発生物と比較して少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％または少なくとも約２０％増加させることを可能にする。好ましい実施形態において、メチオニン合成の効率性ならびに／またはメチオニンの量ならびに／または力価および／もしくは速度は、出発生物と比較して少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％増加する。なお一層好ましいのは、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約５倍および少なくとも約１０倍の増加である。
【００７０】
「代謝産物」という用語は、前駆体、中間体および／または最終産物として生物の代謝経路に使用される化学物質をいう。そのような代謝産物は、化学基礎単位として役割を果たし得るだけでなく、酵素に対する調節活性およびこれらの触媒活性を発揮し得る。そのような代謝産物が、酵素の活性を阻害または刺激し得ることが文献から知られている（Ｓｔｒｙｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００２）Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。
【００７１】
「標準条件」という用語は、特定の化合物に富まない標準的培地における微生物の培養をいう。温度、ｐＨおよびインキュベーション時間は、後で詳しく述べるように変動し得る。
【００７２】
微生物に関する標準の培養条件は、"Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ"，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１）などのテキストを含む文献から得ることができる。
【００７３】
「最少培地」は、野生型または突然変異細胞の増殖のために必要不可欠な物だけを含有する培地である（すなわち、無機塩、炭素源および水）。突然変異細胞の場合、最少培地は、実質的に純粋な化学物質の１種以上の添加剤を含有でき、そのような化合物の産生が不足している突然変異細胞の増殖を可能にする。
【００７４】
対照的に、「強化培地」は、特定の生物の全ての増殖要求を満たすためにデザインされている（すなわち、最小培地の内容物に加えて、例えば、アミノ酸、増殖因子、酵素補助因子などを含有する）。
【００７５】
本発明の文脈において出発生物と比較して少なくとも１種のタンパク質（ホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼなど）の「量を増加させる」という用語は、出発微生物を、より多量の例えば上述の酵素の１種を発現させるために遺伝子組換えすることを意味する。例えば、１種の酵素の量を増加させることが機能的酵素の量が増加する状況をいうことは理解されよう。本発明の文脈においてホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼなどの酵素は、それぞれの反応を触媒できるならば、機能的であると考えられる。
【００７６】
コリネ型細菌などの微生物においてタンパク質の量を増加させる様々な選択肢が存在し、これらは当業者に周知である。これらの選択肢は、それぞれのタンパク質をコードする核酸配列のコピー数を増加させること、そのような核酸配列の転写および／もしくは翻訳を増加させること、またはその組合せを含む。これらの様々な選択肢は、以下でさらに詳細に検討される。
【００７７】
少なくとも１種のタンパク質の「活性を増加させること」という用語は、少なくとも１つの突然変異がタンパク質のそれぞれの野生型配列に導入され、これにより同一量の野生型タンパク質が発現される状況と比較して、より多くのメチオニンの生産に至る状況をいう。これは、例えば、酵素の活性を増加させることができる特定の突然変異を有する酵素を使用することによって達成し得る。そのような突然変異は、例えば、フィードバック阻害の原因となる酵素の領域を不活発にすることができる。例えば、非保存的点突然変異を導入することによりこれらの位置を突然変異させることによって、酵素は、もはやフィードバック調節を提供できず、したがって、酵素の活性は、例えば、より多くの生成分子が産生された場合、ダウンレギュレーションされない。さらに、酵素の活性は、酵素の触媒ターンオーバーを増加させる突然変異を導入することによって増加させることができる。そのような突然変異は、それぞれの酵素をコードしている遺伝子の内因性コピーに導入することができるか、またはこれらを、そのような酵素をコードしている外因性の核酸配列から対応する突然変異体を過剰発現させることによって提供することができる。そのような突然変異は、点突然変異、欠失または挿入を含み得る。点突然変異は、保存的（相当する生化学的および物理化学的特性のアミノ酸とのアミノ酸の置換）、または非保存的（生化学的および物理化学的特性に関して相当しないもう１つのアミノ酸とのアミノ酸の置換）であり得る。さらに欠失は、わずか２または３つのアミノ酸からそれぞれのタンパク質の完全なドメインまで含み得る。一例を挙げれば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号、Ｃｇｌ１５７４）のトランスケトラーゼの場合には、Ａ２９３に対応する位置でのアラニンのＲおよび／またはＡ３２７に対応する位置でのアラニンのＴへの交換の突然変異は、酵素に酵素活性の向上をもたらす。当業者は、本明細書に提供される情報に基づき更なるまたは代わりの突然変異を開発することができる。
【００７８】
したがって、少なくとも１種の酵素の「活性を増加させること」という用語は、フィードバック阻害などの負の調節機構を減少および／または酵素の触媒ターンオーバーを増加させるために、突然変異をそれぞれの野生型配列に導入する状況をいう。
【００７９】
酵素などのタンパク質の量および／または活性の増加は、例えば、転写、翻訳またはタンパク質レベルで抑制調節機構を切断することによる、および／または例えば、内因性遺伝子を誘発するか、もしくはタンパク質をコードしている核酸配列を導入することにより出発生物と比較してこのタンパク質をコードしている核酸の遺伝子発現を増加させることによる異なる経路によって達成し得る。
【００８０】
当然、酵素などのタンパク質の量および／または活性を増加させるアプローチを組み合わせることができる。したがって、例えば、コリネ型細菌の酵素の内因性コピーを、そのフィードバック非感受性型をコードする突然変異体と置換することが可能である。この突然変異したコピーの転写が強力なプロモーターの制御下で設定される場合、それぞれの酵素の量および活性は増加する。この場合、酵素が通常関与する反応を触媒することが依然として可能であるにちがいないと考えられる。
【００８１】
酵素などのタンパク質をコードしている核酸配列は、内因性または外因性の起源であり得る。したがって、例えば、それぞれの出発微生物内で自然発生する核酸配列の発現を増加させるか（例えば、更なる核酸配列の染色体組込みにより）、内因性遺伝子の前で強力なプロモーターを使用するかのいずれかにより、酵素などのタンパク質の量を増加させることができる。また、代わりにまたは付加的に、酵素などのタンパク質の量を、別の生物由来のこの酵素の相同体をコードしている核酸配列を発現させることによって増加させることができる。この後者のシナリオの例を以下で提示する。
【００８２】
したがって、例えば、自己複製ベクター、もしくはさらに挿入した染色体コピー（以下参照）のいずれか由来の、それぞれのＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ配列を過剰発現させることによってＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのｌｐｄの量を増加させることができるか、または例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓもしくはＥ．ｃｏｌｉ由来の対応する酵素を使用して、例えば、自己複製可能なベクターの使用によりこの酵素を過剰発現させることができる。
【００８３】
ある状況においては、例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの内因性コード配列が、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ発現のためのコドン使用頻度に関してすでに最適化されているので、内因性酵素を使用することが好ましい可能性がある。
【００８４】
以下に記述の文脈において、特定の酵素などのタンパク質の量および／または活性が出発生物と比較して減少するはずであると述べられる場合、上記の定義が準用される。
【００８５】
酵素などのタンパク質の量および／または活性の減少は、それぞれのタンパク質をコードしている核酸配列を部分的にもしくは完全に欠失させることによって、例えば、弱いプロモーターを導入することにより転写を阻害することによって、それに応じてコドン使用頻度を修正することにより翻訳を阻害することによって、タンパク質が機能しなくなるようにする、それぞれのタンパク質をコードしている核酸配列に突然変異を導入することによって、および／またはその組合せによって達成し得る。
【００８６】
以下に記述の文脈において、「機能的相同体」という用語が使用される。本発明の目的において「機能的相同体」という用語は、特定の酵素活性が定義されたアミノ酸配列の特定のタンパク質によって提供されるだけでなく、他の（非）近縁の生物由来の同様な配列のタンパク質によって提供されうるという事実をいう。
【００８７】
例えば、ホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼの活性は、Ｃ．ｊｅｉｋｅｉｕｍ（配列番号１：核酸配列、配列番号２：アミノ酸配列、ジーンバンク登録番号（ＮＰ_９３９６０８））のホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼ（またはその機能的相同体によって）をコードする核酸配列を発現させることによってＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいて確立し得る。
【００８８】
他の生物由来のタンパク質の相同体は、相同性分析によって当業者が容易に同定することができる。これは、類似性、すなわち、推定上の相同体のアミノ酸または核酸配列と遺伝子またはこれらによってコードされるタンパク質の配列（例えば、ホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼ、ｇｃｖＨ、ｇｃｖＰ、ｇｃｖＴ、ｌｐｄ、ｌｐｌＡ、ｌｉｐＡ、ｌｉｐＡの核酸配列）の同一性率を測定することによって行うことができる。
【００８９】
同一性率は、例えば、目視検査によって、または、アルゴリズムベースの相同性を使用することによって測定することができる。
【００９０】
例えば、２つのアミノ酸配列の同一性率を測定するために、アルゴリズムでは、最適の比較目的のために配列を整列させる（例えば、別のタンパク質のアミノ酸配列との最適なアラインメントのために、ギャップを１つのタンパク質のアミノ酸配列に導入し得る）。その次に、対応するアミノ酸位置のアミノ酸残基が比較される。１つの配列の位置が、他の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基によって占められるときに、その時、分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性率は、配列により共有される同一位置数の関数である（すなわち、％同一性＝同一位置の数／位置の総数×１００）。
【００９１】
様々なコンピュータプログラムが、これらの目的に関して当技術分野で公知である。例えば、２つの核酸またはアミノ酸配列の同一性率は、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１２：３８７に記述され、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＵＷＧＣＧ）から入手できるＧＡＰコンピュータプログラムを使用して配列情報を比較することによって決定することができる。また、同一性率は、Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ（商標））プログラム（Ｔａｔｕｓｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１７４：２４７に記載されているように）を使用して２つの核酸またはアミノ酸配列を整列させることによって決定することができる。
【００９２】
本特許出願の出願日に、ＢＬＡＳＴプログラムを提供している標準的ソフトウェアパッケージを、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）のＢＬＡＳＴウェブサイトに見つけることができる。例えば、上述の配列番号のいずれかを使用する場合、核酸配列またはアミノ酸配列ベースのＢＬＡＳＴ検索を実施し、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓ．ｃｅｒｖｉｓｉａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓなどにおけるそれぞれの酵素の極めて近縁の相同体を同定することができる。例えば、ＢＬＡＳＴ（商標）プログラムを使用する核酸配列アラインメントでは、デフォルト設定は以下のようになる：ｒｅｗａｒｄ  ｆｏｒ  ｍａｔｃｈが２、ｐｅｎａｌｔｙ  ｆｏｒ  ｍｉｓｍａｔｃｈが−２、ｏｐｅｎ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙおよびｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙがそれぞれ５および２、ｇａｐ×ｄｒｏｐｏｆｆが５０、予測が１０、文字サイズが１１、フィルターがオフ。
【００９３】
類似の配列の検索および分析を、ＥＭＢＬデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｍｂｌ．ｏｒｇ）またはＥｘｐａｓｙホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／）で実施することができる。全ての上記の配列の検索は、本出願の出願日にデーターベースプロバイダーによってプレインストールされているので、典型的にデフォルトパラメータによって実施される。また、相同性検索は、ＣＬＵＳＴＡＬ方法（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９），Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，５（２）１５１）を使用するＤＮＡ  Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．（米国ウィスコンシン州マディソン）のレーザー遺伝子ソフトウェアなどのソフトウエアプログラムを使用してルーチン的に実施し得る。
【００９４】
当業者は、２種のタンパク質が、上述のようなある程度の同一性を共有する場合、同じ機能を発揮し得る（例えば、同じ酵素活性を提供する）ことを理解する。アミノ酸レベルに関する典型的な下限は、典型的に少なくとも約２５％の同一性である。核酸レベルでは、下限は典型的に少なくとも５０％である。
【００９５】
両方のタイプの配列に関する好ましい同一性グレードは、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％または少なくとも約７０％である。より好ましい同一性グレードは、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％である。これらの同一性レベルは、有意であると考えられる。
【００９６】
本明細書で使用する「相同性」および「相同の」は、理論的に共通な遺伝子の祖先を有するタンパク質を表すだけに限定されるものではなく、それでもやはり、同様な機能を発揮および／または同様な構造を有するように進化した遺伝的に無関係でありうるタンパク質を含む。相同体が機能的であるべきであるという要求は、本明細書に記載の相同体が比較タンパク質と実質的に同じ活性を有するタンパク質を含むことを意味する。機能的相同性を有するタンパク質では、必ずしも、これらがこれらのアミノ酸配列において有意な同一性を有する必要がなく、むしろ、機能的相同性を有するタンパク質が同様または同一の活性（例えば、酵素活性）を有することによってそのように定義される。
【００９７】
好ましくは、例えば、宿主のコリネ型細菌より別の生物由来の酵素は、少なくとも有意な類似性（すなわち、アミノ酸レベルで約５０％の配列同一性）を示し、コリネ型細菌におけるその対応物と同じ反応を触媒する場合、機能的相同体であると考えられる。同じ酵素活性をもたらし、アミノ酸レベルで少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％または少なくとも約９０％の配列相同性などの高度の同一性を共有する機能的相同体がさらに好ましい機能的相同体である。
【００９８】
当業者は、コリネ型細菌由来の上述の酵素および他の生物におけるこれらの機能的相同体の断片または突然変異型も、これらの断片および突然変異型が同じタイプの機能的活性を示す限り使用できることを知っている。典型的な機能的活性断片は、Ｎ末端および／またはＣ末端欠失を示すが、一方、突然変異型は典型的に欠失、挿入または点突然変異を含む。
【００９９】
一例として、Ｅ．ｃｏｌｉの配列は、配列番号２に対してアミノ酸レベルで上述した同一性レベルを示し、同じ酵素活性を示す場合、Ｃ．ｊｅｉｋｅｉｕｍのホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼの機能的相同体をコードすると考えられる。例は第１表から得ることができる。また、得られたタンパク質が完全長酵素と同じタイプの反応を依然として触媒する限り、これら配列の断片または例えば点突然変異を使用することができる。
【０１００】
酵素の量を増加させる例は、ホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼ、ｇｃｖＴＨＰ、ｌｐｌＡ、ｌｉｐＡおよびｌｉｐＢに関して以下に示す。酵素の量を減少させる例は、セリンデアミナーゼに関して提供する。
【０１０１】
微生物のホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼの量および／または活性の増加
本発明の一好適態様は、ホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼの量および／または活性が出発生物と比較して得られた微生物で増加するというように、出発生物が遺伝子操作される微生物に関する。また、本発明は、上述の微生物を培養するステップを含む微生物でメチオニンを生産する方法に関する。
【０１０２】
Ｅ．ｃｏｌｉおよびＣ．ｊｅｉｋｅｉｕｍなどの微生物において、ホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼの配列が知られている。そのような微生物において、ホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼの量および／または活性を増加させることは、例えば、この酵素活性をコードしている核酸配列を過剰発現させることによって、それぞれの出発生物のレベルより上にこの酵素の量および／または活性を上げることを必要とする。
【０１０３】
本発明の好ましい宿主生物であるＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいて、ホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼは知られていない。以下の一節は、いかにホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼ活性がＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいて確立できるか述べている。それにもかかわらず、当業者はホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼの量および／または活性がいかにＣ．ｊｅｉｋｅｉｕｍおよびＥ．ｃｏｌｉなどの他の微生物において増加し得るか気づくであろう。
【０１０４】
したがって、本発明は、とりわけ、ホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼの量および／または活性が増加するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ微生物およびメチオニンを生産するためのそのような微生物の使用に関する。これは、例えば、ホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼをコードしている核酸配列のコピー数を増加させること、ホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼをコードしている配列の転写および／もしくは翻訳を増加させること、またはその組合せによって達成し得る。
【０１０５】
本発明の目的において、Ｃ．ｊｅｉｋｅｉｕｍ由来のホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼを使用し得る。このホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼの核酸配列は、配列番号１で示され、一方、アミノ酸配列は配列番号２で示される。ジーンバンク登録番号は、ＹＰ_２５０６６３．１である。この配列は、またＫ４１１と表わされるＣ．ｊｅｉｋｅｉｕｍ  ＮＣＴＣ  Ｋ１１９１５株から誘導される。またホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼは、ＤＳＭＺ  ７１７１株から得ることができる。
【０１０６】
この場合、核酸配列は配列番号５１によって示され、アミノ酸配列は配列番号５２によって示される。
【０１０７】
当然、配列番号１および２によって表されるホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼの機能的断片またはその機能的相同体も使用し得る。標準的な相同性検索を使用することによって同定できるいくつかの相同体を第１表に示す。
【０１０８】
ホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼをコードしている核酸配列のコピー数は、例えば、自己複製プラスミド由来の配列を発現させること、またはそれぞれの核酸配列の更なるコピーを微生物および好ましくはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのゲノムに組み込むことのいずれかによって、微生物および好ましくはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいて増加できる。
【０１０９】
自己複製可能なベクターの場合には、これらを、例えばコリネ型細菌内で安定して保持できる。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるポリペプチドおよびホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼなどの酵素を発現させるための典型的ベクターは、Ｂｏｔｔ，Ｍ．ａｎｄ  Ｅｇｇｅｌｉｎｇ，Ｌ．，ｅｄｓ．Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ．ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  ＬＬＣ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ；Ｄｅｂ，Ｊ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．（１９９９），１７５（１），１１−２０）、Ｋｉｒｃｈｎｅｒ  Ｏ．ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００３），１０４（１−３），２８７−２９９）、国際特許出願公開第２００６０６９７１１号および同第２００７０１２０７８号に記述されているようにｐＣｌｉＫ、ｐＢおよびｐＥＫＯを含む。
【０１１０】
コリネ型細菌のポリペプチドをコードしている核酸配列のコピー数を増加させるための別のアプローチでは、そのようなポリペプチドをコードしている核酸配列の更なるコピーをＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの染色体に組み込むことができる。染色体組込みは、例えば、それぞれのポリペプチドの内因性コピーが局在化する座で起こり得る。付加的におよび／または代わりに、ポリペプチドをコードしている核酸配列の染色体増殖は、コリネ型細菌のゲノムの他の座で起こり得る。
【０１１１】
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの場合には、染色体組込みによって遺伝子コピー数を増加させるための当業者に公知の様々な方法がある。１つのそのような方法は、例えば、ベクターｐＫ１９  ｓａｃＢを使用し、Ｓｃｈａｅｆｅｒ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９４  １７６（２３）：７３０９−７３１９の出版物に詳細に記述されている。ポリペプチドをコードしている核酸配列の染色体組込み用の他のベクターは、国際特許出願公開第２００５０５９０９３号および同第２００７０１１８４５号に記述されるようなｐＣＬＩＫ  ｉｎｔ  ｓａｃＢを含む。
【０１１２】
微生物および特にＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼの量および／または活性を増加させるための別の好ましいアプローチは、強力なプロモーターの使用によりコード配列の転写を増加させることである。
【０１１３】
内因性ホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼの活性が強力なプロモーターの使用により増加される場合、その時、「強力なプロモーター」という用語は、新しく導入されたプロモーターからの転写が自然の内因性プロモーターからの転写より強力であることを意味する。
【０１１４】
しかし、ホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼが、この種の酵素が知られていないＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいて発現される場合、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの内因性遺伝子の強力な発現をもたらすことが知られているプロモーターを使用することができる。
【０１１５】
この文脈における好ましいプロモーターは、プロモーターＰSOD（配列番号３）、ＰgroES（配列番号４）、ＰEFTu（配列番号５）ファージＳＰ０１プロモーターＰ15（配列番号４２）およびλＰR（配列番号６）（時にはラムダＰRとも呼ばれる）である。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいて、λＰRプロモーターは、ＰSODプロモーターより強力であり得る。ＰSODプロモーターは、ＰgroESプロモーターより強力と思われ、ＰgroESプロモーターは、ＰEFTuプロモーターまたはＰ15プロモーターより弱いと思われる。ＰEFTuプロモーターは、ＰSODプロモーターより強力であり得る。しかし、プロモーターの強さが、プロモーターが遺伝子工学によって入れられる状況によって大きく異なる可能性があるので、いずれかの生物におけるプロモーターの強さは、必ずしもプロモーターの固有の特性であるわけではない。
【０１１６】
微生物および特にＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼの量および／または活性の増加は、炭素源としてホルメートを含む培地で微生物を増殖することを可能にする。また、様々な生合成経路の間の代謝産物として生じるホルメートの使用も、Ｎ5，Ｎ10−メチレン−ＴＨＦの生産を増加させることを可能にする。Ｎ5，Ｎ10−メチレン−ＴＨＦの濃度の増加は、メチル−ＴＨＦの生産およびメチオニンの生産の増加につながる。
【０１１７】
本発明は、したがって、上記の微生物を培養すること、および場合によってメチオニンを単離することを含む方法にも関する。
【０１１８】
ホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼの量および／または活性を、微生物および好ましくはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいて増加させる本発明の上記の実施形態の更なる詳細において、さらにＮ5，Ｎ10−メチレン−ＴＨＦの量を、ホルミル−ＴＨＦ−デホルミラーゼの量および／または活性を減少させることによって増加させることができる。ホルミル−ＴＨＦ−デホルミラーゼの核酸配列は配列番号７で示され、アミノ酸配列は配列番号８で示される。第１表は、この酵素活性のジーンバンク登録番号を示す。
【０１１９】
代わりにまたは付加的に、Ｎ5，Ｎ10−メテニル−ＴＨＦ−シクロシンテターゼ、Ｎ5，Ｎ10−メテニル−ＴＨＦ−レダクターゼおよび／またはＮ5，Ｎ10−メチレン−ＴＨＦ−レダクターゼの量および／または活性は、出発生物と比較して増加する。好ましい実施形態において、出発生物と比較してホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼの量および／または活性は増加し、ホルミル−ＴＨＦ−デホルミラーゼの量および／または活性は減少し、Ｎ5，Ｎ10−メテニル−ＴＨＦ−シクロシンテターゼ、Ｎ5，Ｎ10−メテニル−ＴＨＦ−レダクターゼおよびＮ5，Ｎ10−メテニル−レダクターゼの量および／または活性は増加する。これらの上述した全ての酵素活性が微生物において、さらにＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼを除く）において存在するので、本発明による微生物および好ましくはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおける、それぞれの酵素活性の量および／または活性を増加および／または減少させるために内因性核酸配列を使用することが好ましいと思われる。
【０１２０】
タンパク質の量および／または活性を増加させるためのアプローチを、以下に詳細に記述する。これらのアプローチは、当然、ホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼにも適用し得る。微生物においてタンパク質の量および／または活性を減少させるためのアプローチを、以下に記述する。これらのアプローチは、当然、ホルミル−ＴＨＦ−デホルミラーゼのダウンレギュレーションにも適用し得る。
【０１２１】
当然、Ｃ．ｊｅｉｋｅｉｕｍのホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼまたは他の前述の酵素の機能的相同体も使用することができる。これらの機能的相同体は、配列番号１または配列番号２に対して上述の同一性グレードを示し、同じタイプの酵素活性をもたらす。Ｃ．ｊｅｉｋｅｉｕｍ以外の生物由来のホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼの登録番号を第１表に示す。
【０１２２】
好ましい実施形態は、ホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼを発現するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ微生物に関する。また、本発明は、好ましくはメチオニンの生産における、これらのＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ生物の使用に関する。これらの菌株は、さらに、ホルミル−ＴＨＦ−デホルミラーゼ、Ｎ5，Ｎ10−メテニル−ＴＨＦ−シクロシンテターゼ、Ｎ5，Ｎ10−メテニル−ＴＨＦ−レダクターゼおよび／またはＮ5，Ｎ10−メチレン−ＴＨＦ―レダクターゼに関して述べた上述の遺伝子改変を示し得る。
【０１２３】
出発生物として使用することができる典型的なＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株は、野生型株（例えば、ＡＴＣＣ１３０３２）である。しかし、メチオニン産生の増加を確実にするためにすでに遺伝子組換えされている出発生物を使用することが好ましいことがある。そのような生物は、ＤＳＭ１７３２３の特性を示し、したがってａｓｋfbr、ｈｏｍfbrおよびｍｅｔＨの量および／または活性が増加し得る。また、好ましい出発株は、Ｍ２０１４の特性を持ち、ａｓｋfbr、ｈｏｍfbr、ｍｅｔＨ、ｍｅｔＡ、ｍｅｔＹおよびｈｓｋ（突然変異）の量および／または活性が増加し得る。他の好ましい出発生物は、ＯＭ４６９の特性を持ち、ａｓｋfbr、ｈｏｍfbr、ｍｅｔＨ、ｍｅｔＡ、ｍｅｔＹ、ｈｓｋ（突然変異）およびｍｅｔＦの量および／または活性が増加し、ｍｃｂＲおよびｍｅｔＱの量および／または活性が減少し得る。さらに他の好ましい出発生物は、ＧＫ１２５９の特性を持ち、ａｓｋfbr、ｈｏｍfbr、ｍｅｔＨ、ｍｅｔＡ、ｍｅｔＹ、ｈｓｋ（突然変異）、ｔｋｔ（そして、場合によってｇ６ｐｄｈ、ｚｗｆａおよび６ｐｇｌ）およびｍｅｔＦの量および／もしくは活性が増加し、ｍｃｂＲ、ｍｅｔＱおよびｓｄａの量および／もしくは活性が減少し得るか、またはＭ２６１６の特性を持ち、ａｓｋfbr、ｈｏｍfbr、ｍｅｔＨ、ｍｅｔＡ、ｍｅｔＹ、ｈｓｋ（突然変異）、ｔｋｔ（そして、場合によってｇ６ｐｄｈ、ｚｗｆａおよび６ｐｇｌ）およびｍｅｔＦの量および／もしくは活性が増加し、ｍｃｂＲ、ｍｅｔＱおよびｓｅｒＡの量および／もしくは活性が減少し得る。
【０１２４】
さらに、本発明者らは、ホルメートの量を増加した培地で、ホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼの量および／または活性が増加する上記の微生物を培養する場合、メチオニンの産生が、さらに刺激される可能性のあることを発見した。
【０１２５】
ホルメートが目的にかなうように培地に加えられる本発明による方法のこの実施形態は、ホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼの上記の活性を示すために遺伝子組換えされている、および他の遺伝子改変Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株で特に好ましくは実施される。また、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいてＣ．ｊｅｉｋｅｉｕｍの対応する配列を発現させることによってホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼまたは機能的相同体およびその断片の活性を増加させることが好ましい。
【０１２６】
グリシン開裂系の量および／または活性が増加した微生物
一態様において、本発明は、グリシン開裂系の酵素活性が増加した微生物および好ましくはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍに関する。また、本発明は、微生物を培養し、場合によってメチオニンを単離することによって、メチオニンの生産のためにこれら微生物を使用する方法に関する。
【０１２７】
いくつかの工業的用途において、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなどの微生物は、副産物としてグリシンを産生できる。本発明は、グリシン開裂系の活性が増加した微生物を提供することによってこの副産物を使用する。
【０１２８】
微生物のグリシン開裂系は、典型的に４〜５つのサブユニットから成る。
【０１２９】
第１のサブユニットは、ＰＬＰ依存性グリシンデカルボキシラーゼ（ＧｃｖＰ、また単にＰ−タンパク質とも呼ばれる）である。第２のサブユニットは、リポアミド含有アミノメチルトランスフェラーゼ（ＧｃｖＨ、またＨ−タンパク質とも呼ばれる）である。第３のサブユニットは、Ｎ5，Ｎ10−メチレン−ＴＨＦ−合成酵素（ＧｃｖＴ）である。また、これらの３つの因子は、時にはｇｃｖＰＴＨと表わされる。第４のサブユニットは、ＮＡＤ+依存性、ＦＡＤ要求リポアミドデヒドロゲナーゼ（ｌｐｄ、また単にＬ−タンパク質とも呼ばれる）である。対応する遺伝子は、それぞれ、ｇｃｖＰ、ｇｃｖＴ、ｇｃｖＨおよびｌｐｄの名称である。この種のＧＣＳの例は、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＣ．ｊｅｉｋｅｉｕｍで見つけられる。また、ｌｐｄサブユニットは、少なくとも２つの他の多サブユニット酵素（すなわち、ピルビン酸デヒドロゲナーゼおよびα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ）によって典型的に共有される。
【０１３０】
ＧＣＳ系の酵素活性が増加する場合、細胞塊に必要なグリシンを上回るグリシンは、好ましくはＮＨ4+、ＣＯ2およびＮ5，Ｎ10−メチレン−ＴＨＦに代謝され、その時、例えば、メチオニン合成の増加のために使用される可能性がある。しかし、例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなどのいくつかの微生物は、天然のＧＣＳ系が欠如している。それにもかかわらず、そのような生物は、通常、上述した２つの酵素系で用いるためのサブユニットをコードしているｌｐｄ遺伝子を持つ。
【０１３１】
以下に示すように、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの天然のＬｐｄタンパク質は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｔｃｕｍにおいて活性ＧＣＳ機能を得るために、ｇｃｖＰ、ｇｃｖＴおよびｇｃｖＨ遺伝子だけが組み込まれ、発現する必要があるというように、変性ＧＣＳと共に機能することができる。しかし、変性ｌｐｄ遺伝子を過剰発現させることも好ましいことがある。これはこの遺伝子が特異的および効率的にｇｃｖＰ、ｇｃｖＴおよびｇｃｖＨ因子と相互作用することがより可能であり得るためである。
【０１３２】
さらに、いくつかの生物で、グリシン開裂系が５つのサブユニットから成る点に留意する必要がある。例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓでは、Ｐ−サブユニットは、例えば、２種の遺伝子（時にはｇｃｖＰ１およびｇｃｖＰ２と呼ばれる）によってコードされる２種のポリペプチド（時にはＰ１およびＰ２と呼ばれる）に分けられる。
【０１３３】
上記したように、本発明は、好ましい実施形態において、グリシン開裂系活性を増加させるために遺伝子組換えされている微生物に関する。そのようなグリシン開裂系活性の増加は、ｇｃｖＰ、ｇｃｖＨおよびｇｃｖＴによってコードされる酵素活性の量および／または活性を増加させることによって達成することができる。これが本発明の好ましい実施形態であるので、どのようにＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいてグリシン開裂系活性の増加が確立できるか以下で対処する。それにもかかわらず、当業者は、グリシン開裂系活性の増加がどのように他の生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＣ．ｊｅｉｋｅｉｕｍ）において達成し得るかについても明らかに気づくであろう。
【０１３４】
本発明の一態様は、ｇｃｖＰ、ｇｃｖＨおよびｇｃｖＴ（集合的にｇｃｖＰＨＴと呼ばれる）によってコードされる酵素活性の量および／または活性が、出発生物と比較して遺伝子改変によって増加する、微生物および特にＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍに関する。
【０１３５】
これはＣ．ｊｅｉｋｅｉｕｍのそれぞれの酵素の量および／または活性を増加させることによって達成し得る。ｇｃｖＰの核酸配列は、配列番号９で示され、アミノ酸配列は、配列番号１０で示される。Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号は、ＣＡＩ３６３６１．１である。
【０１３６】
Ｃ．ｊｅｉｋｅｉｕｍのｇｃｖＨの核酸配列は、配列番号１１で示される。アミノ酸配列は、配列番号１２で示される。Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号は、ＣＡＩ３６３６３．１である。
【０１３７】
Ｃ．ｊｅｉｋｅｉｕｍのｇｃｖＴの核酸配列は、配列番号１３で示される。アミノ酸配列は、配列番号１４で示される。Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号は、ＣＡＩ３６３６２．１である。
【０１３８】
本発明の目的において、Ｃ．ｊｅｉｋｅｉｕｍから誘導される上記の配列を使用することが好ましいことがある。
【０１３９】
微生物および特にＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるグリシン開裂系の活性は、上述した配列を単独および組み合わせて（後者は、特に本発明の好ましい実施形態である）発現および好ましくは過剰発現させることによって増加させることができる。したがって、本発明は、特に、ｇｃｖＰＨＴの酵素活性が付随して増加するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ微生物に関する。これは配列番号９〜１４によって示されるｇｃｖＰ、ｇｃｖＨおよびｇｃｖＴの配列、その機能的断片またはその機能的相同体を過剰発現させることによって達成し得る。
【０１４０】
ｇｃｖＰ、ｇｃｖＨおよびｇｃｖＴの上述した配列の機能的相同体は、関連のデータベースの配列相同性検索によって容易に同定することができ、Ｅ．ｃｏｌｉなどの他の微生物における配列が得られる。他の生物由来のこれらの酵素の登録番号を第１表に示す。Ｃ．ｊｅｉｋｅｉｕｍの特にＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのｇｃｖＰ、ｇｃｖＨおよびｇｃｖＴの配列の使用は、これらの遺伝子がオペロンにクラスター形成するので好ましい（Ｔａｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８７，４６７１−４６８２）。さらに、Ｃ．ｊｅｉｋｅｉｕｍおよびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのｌｐｄ遺伝子は、高度な配列同一性を示す（図１参照）。ｇｃｖＰ、ｇｃｖＨおよびｇｃｖＴ因子がＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのｌｐｄと円滑および効率的に相互作用すると仮定することは理にかなっている。ｇｃｖＰ、ｇｃｖＨおよびｇｃｖＴの量および／または活性は、上記のホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼの文脈で述べた方法によって、微生物および好ましくはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいて増加させることができる。したがって、例えば、ｇｃｖＰ、ｇｃｖＨおよびｇｃｖＴのコード配列を含む機能単位を作成し、例えば、自己複製プラスミドまたは微生物のゲノムおよび好ましくはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのゲノムに組み込むプラスミドを使用することにより、この単位を含む核酸配列のコピー数を増加させることができる。
【０１４１】
代わりにまたは付加的に、このオペロンの前に、プロモーターを取り付けて、ｇｃｖＰ、ｇｃｖＨおよびｇｃｖＴのコード配列の強力な転写を確実にさせることができる。そのようなプロモーターは、好ましくはＰEFTu、ＰgroES、ＰSOD、Ｐ15およびλＰRプロモーターの群から選択することができる。
【０１４２】
原則として、ｌｐｄ因子の量および／または活性を増加させることは必要ではない。この因子は、典型的にｇｃｖＰ、ｇｃｖＨおよびｇｃｖＴの量および／または活性を増加させるために遺伝子操作される宿主微生物によって十分に大量に存在する。それにもかかわらず、本発明のいくつかの実施形態において、ｌｐｄの量および／または活性を増加させることが好ましいこともある。このために、ｌｐｄの内因性配列を上記の方法のいずれかによって過剰発現させることができ、このことについては以下にもう少し詳細に提示する。
【０１４３】
出発生物のｌｐｄとｇｃｖＰ、ｇｃｖＨおよびｇｃｖＴ因子がとられる生物のｌｐｄの類似性によって、内因性または外因性ｌｐｄの発現を増加させることによってｌｐｄの量および／または活性を増加させることが好ましいことがある。この場合、好ましくは、グリシン開裂系の他の因子がとられるその生物のｌｐｄを選択する。
【０１４４】
したがって、本発明の一実施例は、得られた微生物が因子のｇｃｖＰ、ｇｃｖＨおよびｇｃｖＴの量および／または活性を増加させるように出発生物から誘導される微生物に関する。また、本発明は、微生物を培養すること、および場合によってメチオニンを単離することによって、メチオニン生産のためにこれらの微生物を使用する方法に関する。
【０１４５】
好ましい実施形態は、配列番号９〜１４で示されるようなＣ．ｊｅｉｋｅｉｕｍのｇｃｖＰ、ｇｃｖＨおよびｇｃｖＴ因子、または機能的相同体およびその機能的断片を発現するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ微生物に関する。また、本発明は、好ましくはメチオニンの生産における、これらのＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ生物の使用に関する。
【０１４６】
出発生物として使用することができる典型的なＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株は、野生型株（例えば、ＡＴＣＣ１３０３２）である。しかし、メチオニン産生の増加を確実にするためにすでに遺伝子組換えされている出発生物を使用することが好ましいことがある。そのような生物は、ＤＳＭ１７３２３の特性を示し、したがってａｓｋfbr、ｈｏｍfbrおよびｍｅｔＨの量および／または活性が増加し得る。また、好ましい出発株は、Ｍ２０１４の特性を持ち、ａｓｋfbr、ｈｏｍfbr、ｍｅｔＨ、ｍｅｔＡ、ｍｅｔＹおよびｈｓｋ（突然変異）の量および／または活性が増加し得る。他の好ましい出発生物は、ＯＭ４６９の特性を持ち、ａｓｋfbr、ｈｏｍfbr、ｍｅｔＨ、ｍｅｔＡ、ｍｅｔＹ、ｈｓｋ（突然変異）およびｍｅｔＦの量および／または活性が増加し、ｍｃｂＲおよびｍｅｔＱの量および／または活性が減少し得る。
【０１４７】
さらに、当業者は、グリシン開裂系での増加に関する上述した全ての実施形態において、好ましくは上述したＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株のうちの１つである出発微生物が、さらに、セリン生合成経路に関わる酵素に関して遺伝子組換えを示すことに明らかに気づいている。
【０１４８】
「セリン生合成経路」という用語は、当業者に認識されており、野生型生物で起こり、セリンの生合成につながる一連の反応について述べている。この経路は、生物から生物まで様々である。生物特有の経路の詳細は、テキストおよび例えば、ウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ．に一覧されている科学文献から得ることができる。
【０１４９】
セリンは、３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（ｓｅｒＡ）の作用によってホスホヒドロキシピルビン酸に最初に酸化される解糖中間体３−ホスホグリセリン酸から合成される。第２のステップにおいて、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ（ＳｅｒＣ）によって触媒されるホスホヒドロキシピルビン酸のアミノ基転移は、ホスホセリンの形成につながり、続いて、ホスホセリンホスファターゼ（ＳｅｒＢ）によって脱リン酸化されてＬ−セリンを生ずる。Ｌ−セリンは、セリンデヒドラターゼ（ｓｄａＡ）によりピルビン酸に、また、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＳＨＭＴまたはｇｌｙＡ）によりグリシンおよびメチレンテトラヒドロ葉酸に変換できる。
【０１５０】
本発明の目的において、出発生物に対して、改善されたグリシン開裂系を導入し、リポ酸および／またはリポアミドの使用の改善を確実にすることを意図する上記の遺伝子組換えを行うことに加えて、Ｄ−３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（ｓｅｒＡ）、ホスホセリンホスフォターゼ（ＳｅｒＢ）、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ（ＳｅｒＣ）およびセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＳＨＭＴ）から成る群から選択される酵素の量および／または活性が増加される。代わりにまたは付加的に、セリンデアミナーゼ（ＳｄａＡ）の量および／または活性が減少し得る。セリン生合成経路の上述した酵素の配列の例は、第１表で見ることができる。
【０１５１】
好ましい出発菌株は、したがって、ＯＭ２６４Ｃの特性を持ち、ａｓｋfbr、ｈｏｍfbr、ｍｅｔＨ、ｍｅｔＡ、ｍｅｔＹおよびｈｓｋ（突然変異）の量および／または活性が増加し、ｓｅｒＡの量および／または活性が減少し得る。メチオニン生産のための別の好ましい出発菌株は、ＧＫ１２５９の特性を持ち、ａｓｋfbr、ｈｏｍfbr、ｍｅｔＨ、ｍｅｔＡ、ｍｅｔＹ、ｈｓｋ（突然変異）、ｍｅｔＦ、ｔｋｔ、ｔａｌ、ｚｗｆおよび６ｐｇｌの量および／または活性が増加し、ｍｃｂＲ、ｍｅｔＱおよびｓｄａの量および／または活性が減少し得る。
【０１５２】
当然、これらの微生物は、特に好ましくは、本発明による方法のメチオニンの生産のために使用し得る。
【０１５３】
さらに、本発明者らは、微生物が（ｉ）外部のリポ酸および／もしくはリポアミドと提供される、ならびに／または（ｉｉ）出発生物と比較してより多くリポ酸および／もしくはリポアミドを産生するようにさらに遺伝子組換えされている場合、Ｎ5，Ｎ10−メチレン−ＴＨＦおよびメチオニンの産生が上記の通りにグリシン開裂系の活性を増加させた微生物において増加し得ることを発見した。
【０１５４】
したがって一態様において本発明は、グリシン開裂系のｇｃｖＰ、ｇｃｖＨおよびｇｃｖＴ因子の（および、場合によってｌｐｄ因子の）量および／または活性が増加し、リポ酸および／またはリポアミドの量を増加した培地で培養される上記の微生物を使用する方法に関する。本発明の本態様の目的において、リポ酸および／またはリポアミドは、少なくとも約０．１ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１ｍｇ／Ｌおよび好ましくは少なくとも約１０ｍｇ／Ｌの最終濃度まで、培地に加えることができる。
【０１５５】
リポアミド（時にはリポ酸アミドと呼ばれている）が、一部の生物において酵素のリポイル化のためにリポ酸の代わりに成り得ることは当技術分野で公知である（Ｒｅｅｄ，Ｌ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９５８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３２，１４３−１５８）。このように、リポアミドを供給することは、本明細書で開示される本発明のリポ酸を供給することの代わりになり得る。言い換えれば、その様々な形態でリポ酸として同じ供給業者から市販されているリポアミド（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号Ｔ５８７５、Ｔ５６２５、Ｔ１３９５、Ｔ８２６０）も、本明細書で開示される本発明の微生物および方法においてグリシン開裂活性を刺激または増加するために使用することができる。これらの２種の化合物の酸化および還元された形態を、これら形態のいずれかの様々な塩およびエステルと同様に、使用することができる。したがって、リポイル基の供給源は、様々に変わる可能性がある。
【０１５６】
リポ酸またはリポアミドが目的にかなうように培地に加えられる本発明による方法のこの実施形態は、グリシン開裂系のｇｃｖＰ、ｇｃｖＨおよびｇｃｖＴ因子の活性を示すために、遺伝子組換えされているＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株により特に好ましくは実施される。また、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいてＣ．ｊｅｉｋｅｉｕｍの対応する配列を発現させることによってグリシン開裂系または機能的相同体およびその断片の活性を増加させることが好ましい。本発明の本態様の更なる詳細において、内因性Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ配列または外因性配列（第１表参照）のいずれかを使用することによって、ｌｐｄ因子の量および／または活性を増加させることができる。
【０１５７】
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの場合、培地中のリポ酸および／またはリポアミドの最終濃度は、少なくとも約０．１ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１ｍｇ／Ｌおよび好ましくは少なくとも約１０ｍｇ／Ｌとなる。
【０１５８】
ｇｃｖＰ、ｇｃｖＨおよびｇｃｖＴ因子の量および／または活性が増加することによって、グリシン開裂系における活性が増加する本発明による微生物は、さらに遺伝子組換えして、内部で合成されるリポ酸および／またはリポアミドの量を増加させることができる。
【０１５９】
リポ酸を使用し、これを標的のタンパク質に連結するための２つの異なる経路がある。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、これらの２つの経路は、ｌｐｌＡ依存性およびｌｉｐＢ依存性経路として表わされる（Ｍｏｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７７，１−１０）。
【０１６０】
ｌｐｌＡ遺伝子は、リポイルシンテターゼ（ＬｐｌＡタンパク質）をコードする。この酵素は、ＡＴＰでリポ酸を活性化し、続いてリポイル−ＡＭＰをｇｃｖＨに結合する。
【０１６１】
ｌｉｐＢ依存性経路は、２種の酵素を含む（Ｍｏｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７，１−１０）。ｌｉｐＡは、リポ酸シンターゼ（ＬｉｐＡタンパク質）をコードする。ｌｉｐＢ遺伝子は、リポイルトランスフェラーゼ（ＬｉｐＢタンパク質）をコードする。ｌｉｐＡは、オクタノイル−ＡＣＰをリポイル−ＡＣＰに変換する。第２のステップにおいて、ｌｉｐＢは、リポイル部分をｇｃｖＨおよび他のリポイル化タンパク質のリポイルドメインに結合する。
【０１６２】
したがって、ｌｐｌＡの量および／または活性の増加は、外部から加えたリポ酸のより良好な取込みを可能にする一方、ｌｉｐＡおよび／またはｌｉｐＢの量、タイプおよび／または活性の増加は、ＧｃｖＨへ転送される内部で合成されるリポ酸の量を増加させる。
【０１６３】
Ｅ．ｃｏｌｉのｌｐｌＡの核酸配列は、配列番号１５で示される。アミノ酸配列は、配列番号１６で示される。ジーンバンク登録番号は、ＥＧ１１７９６である。
【０１６４】
Ｃ．ｊｅｉｋｅｉｕｍのｌｉｐＡのコード配列は、配列番号１７で示される。アミノ酸配列は、配列番号１８で示される。ジーンバンク登録番号は、ＧｅｎｅＩＤ：３４３３５７０である。
【０１６５】
Ｃ．ｊｅｉｋｅｉｕｍのｌｉｐＢの核酸配列は、配列番号１９で示される。アミノ酸配列は、配列番号２０で示される。ジーンバンク登録番号は、ＧｅｎｅＩＤ：３４３３５７１である。
【０１６６】
本発明の目的において、Ｃ．ｊｅｉｋｅｉｕｍから誘導される上記の配列を使用することが好ましいと思われる。
【０１６７】
グリシン開裂系因子のｇｃｖＰ、ｇｃｖＨおよびｇｃｖＴの量および／または活性が増加した本発明による微生物は、したがって、ｌｐｌＡの量および／または活性を増加させることによって、Ｎ5，Ｎ10−メチレン−ＴＨＦおよびメチオニン合成に関してさらに最適化することができる。このためには、配列番号１５または機能的相同体およびその断片を使用することによって、ｌｐｌＡの発現を増加させることができる。そのような微生物は、外部から加えたリポ酸および／またはリポアミドのより良好な取込みを示し、したがって、微生物がリポ酸および／またはリポアミドで補充された培地において培養される本発明によるそれらの方法に特に適すると思われる。
【０１６８】
他の好ましい実施形態において、本発明は、グリシン開裂系因子のｇｃｖＰ、ｇｃｖＨおよびｇｃｖＴの量および／または活性の増加に加えて、ｌｉｐＡ、ｌｉｐＢまたはｌｉｐＡおよびｌｉｐＢの量および／または活性が増加した微生物に関する。ｇｃｖＰ、ｇｃｖＨおよびｇｃｖＴの量および／または活性の増加に加えて、ｌｉｐＡおよびｌｉｐＢの量および／または活性が増加した微生物が特に好ましい。これらの微生物は、内因的に合成されるリポ酸および／またはリポアミドのより良好な形成および適応を示し、したがって、Ｎ5，Ｎ10−メチレン−ＴＨＦおよびメチオニンの産生に関与し得る。
【０１６９】
当然、これらの微生物は、リポ酸および／またはリポアミドを補充された培地でグリシン開裂系活性が増加した遺伝子組換え生物の培養に関する本発明による方法でも使用することができる。本態様の更なる詳細において、ｇｃｖＰ、ｇｃｖＨおよびｇｃｖＴの量および／または活性の増加に加えて、ｌｐｌＡ、ｌｉｐＡおよびｌｉｐＢの量および／または活性が増加した微生物を生産および使用することができる。
【０１７０】
重ねて、本発明の特に好ましい実施形態は、出発Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ生物の遺伝子組換えを介して、グリシン開裂系因子のｇｃｖＰ、ｇｃｖＨおよびｇｃｖＴの量および／または活性が増加し、ｌｐｌＡ、ｌｉｐＡおよび／またはｌｉｐＢの量および／または活性を増加させるために遺伝子組換えすることによって、外部から提供されたリポ酸および／もしくはリポアミドの適応が改善し、ならびに／または内部で産生されたリポ酸および／もしくはリポアミドの形成および適応が改善したＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ微生物に関する。本発明の好ましい実施形態は、したがって、ｇｃｖＰ、ｇｃｖＨおよびｇｃｖＴならびにｌｐｌＡの量および／または活性が出発生物と比較して増加するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ微生物に関する。別の等しく好ましい実施形態において、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ微生物は、ｇｃｖＰ、ｇｃｖＨおよびｇｃｖＴならびにｌｉｐＡまたはｌｉｐＢの量および／または活性が増加する。なお一層好ましい実施形態は、ｇｃｖＰ、ｇｃｖＨおよびｇｃｖＴ、ｌｉｐＡおよびｌｉｐＢの量および／または活性が増加したＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ微生物である。ｇｃｖＰ、ｇｃｖＨおよびｇｃｖＴ、ｌｐｌ、ｌｉｐＡおよびｌｉｐＢの量および／または活性が増加したＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ微生物は、特に好ましいと思われる。
【０１７１】
上述の遺伝子組換えを導入するために使用されるＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ出発生物が野生型株（例えば、ＡＴＣＣ１３０３２）であり得ることは当業者に理解される。しかし、メチオニン産生の増加を確実にするためにすでに遺伝子組換えされている出発生物を使用することが好ましいことがある。そのような生物は、ＤＳＭ１７３２３の特性を示し、したがってａｓｋfbr、ｈｏｍfbrおよびｍｅｔＨの量および／または活性が増加し得る。また、好ましい出発株は、Ｍ２０１４の特性を持ち、ａｓｋfbr、ｈｏｍfbr、ｍｅｔＨ、ｍｅｔＡ、ｍｅｔＹおよびｈｓｋ（突然変異）の量および／または活性が増加し得る。他の好ましい出発生物は、ＯＭ４６９の特性を持ち、ａｓｋfbr、ｈｏｍfbr、ｍｅｔＨ、ｍｅｔＡ、ｍｅｔＹ、ｈｓｋ（突然変異）およびｍｅｔＦの量および／または活性が増加し、ｍｃｂＲおよびｍｅｔＱの量および／または活性が減少し得る。
【０１７２】
さらに、当業者は、グリシン開裂系での増加ならびにリポ酸および／またはリポアミドの取り込み、形成および適応の改善に関する全ての上述した実施形態において、好ましくは上述したＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株の１つである出発微生物が、上述のようにセリン生合成経路に関わる酵素に関して更なる遺伝子組換えを示すことに明らかに気づいている。
【０１７３】
好ましい出発菌株は、したがって、ＯＭ２６４Ｃの特性を持ち、ａｓｋfbr、ｈｏｍfbr、ｍｅｔＨ、ｍｅｔＡ、ｍｅｔＹおよびｈｓｋ（突然変異）の量および／または活性が増加し、ｓｅｒＡの量および／または活性が減少し得る。別の好ましい出発菌株は、ＧＫ１２５９の特性を持ち、ａｓｋfbr、ｈｏｍfbr、ｍｅｔＨ、ｍｅｔＡ、ｍｅｔＹ、ｈｓｋ（突然変異）、ｍｅｔＦ、ｔｋｔ、ｔａｌ、ｚｗｆおよび６ｐｇｌの量および／または活性が増加し、ｍｃｂＲ、ｍｅｔＱおよびｓｄａの量および／または活性が減少し得る。
【０１７４】
ホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼおよびグリシン開裂系の量および／または活性が増加した微生物
本発明の別の好ましい実施形態は、上述の生物の特性（すなわち、ホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼの量および／または活性の増加、ならびにグリシン開裂系活性の増加）を併せ持つ微生物に関する。また、上記の特に好ましい実施形態が、本発明の本態様のために組み合わされることが理解される。
【０１７５】
したがって、本発明による微生物は、ホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼ、ｇｃｖＰ、ｇｃｖＨおよびｇｃｖＴの量および／または活性が増加するように遺伝子組換えされる。
【０１７６】
別の好ましい実施例では、微生物は、ｌｐｌＡの量および／または活性を増加させるために、さらに遺伝子組換えされる。
【０１７７】
また、本発明の好ましい実施形態は、ホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼ、ｇｃｖＰ、ｇｃｖＨおよびｇｃｖＴならびにｌｉｐＡまたはｌｉｐＢの活性が増加した微生物に関する。なお一層好ましいのは、ホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼ、ｇｃｖＰ、ｇｃｖＨおよびｇｃｖＴ、ｌｉｐＡおよびｌｉｐＢの量および／または活性が増加した微生物である。
【０１７８】
別の好ましい実施形態は、ホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼ、ｇｃｖＰ、ｇｃｖＨおよびｇｃｖＴ、ｌｐｌＡ、ｌｉｐＡおよびｌｉｐＢの量および／または活性が増加した微生物に関する。
【０１７９】
また、微生物は、当然ｌｐｄの量および／または活性を増加し得る。
【０１８０】
上述した実施形態がＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ微生物において優先的に実現化されることが理解される。そのようなＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株は、野生型株（例えば、ＡＴＣＣ１３０３２）であり得る。しかし、メチオニン産生の増加を確実にするためにすでに遺伝子組換えされている出発生物を使用することが好ましいことがある。そのような生物は、ＤＳＭ１７３２３の特性を示し、したがってａｓｋfbr、ｈｏｍfbrおよびｍｅｔＨの量および／または活性が増加し得る。また、好ましい出発株は、Ｍ２０１４の特性を持ち、ａｓｋfbr、ｈｏｍfbr、ｍｅｔＨ、ｍｅｔＡ、ｍｅｔＹおよびｈｓｋ（突然変異）の量および／または活性が増加し得る。他の好ましい出発生物は、ＯＭ４６９の特性を持ち、ａｓｋfbr、ｈｏｍfbr、ｍｅｔＨ、ｍｅｔＡ、ｍｅｔＹ、ｈｓｋ（突然変異）およびｍｅｔＦの量および／もしくは活性が増加し、ｍｃｂＲおよびｍｅｔＱの量および／もしくは活性が減少し得るか、またはＭ２６１６の特性を持ち、ａｓｋfbr、ｈｏｍfbr、ｍｅｔＨ、ｍｅｔＡ、ｍｅｔＹ、ｈｓｋ（突然変異）、ｔｋｔ（そして、場合によってｇ６ｐｄｈ、ｚｗｆａおよび６ｐｇｌ）およびｍｅｔＦの量および／もしくは活性が増加し、ｍｃｂＲ、ｍｅｔＱおよびｓｅｒＡの量および／もしくは活性が減少し得る。
【０１８１】
さらに、当業者は、グリシン開裂系での増加ならびにリポ酸および／またはリポアミドの取り込み、形成および適応の改善に関する全ての上述した実施形態において、好ましくは上述したＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株の１つである出発微生物が、さらに、上述のようにセリン生合成経路に関わる酵素および／またはホルミルの代謝に関わる酵素（例えば、ホルミル−ＴＨＦ−デホルミラーゼ、Ｎ5，Ｎ10−メテニル−ＴＨＦ−シクロシンテターゼ、Ｎ5，Ｎ10−メテニル−ＴＨＦ−レダクターゼおよび／またはＮ5，Ｎ10−メチレン−ＴＨＦ−レダクターゼ）に関して遺伝子組換えを示すことに明らかに気づいている。
【０１８２】
好ましい出発菌株は、したがって、ＯＭ２６４Ｃの特性を持ち、ａｓｋfbr、ｈｏｍfbr、ｍｅｔＨ、ｍｅｔＡ、ｍｅｔＹおよびｈｓｋ（突然変異）の量および／または活性が増加し、ｓｅｒＡの量および／または活性が減少し得る。別の好ましい出発菌株は、ＧＫ１２５９の特性を持ち、ａｓｋfbr、ｈｏｍfbr、ｍｅｔＨ、ｍｅｔＡ、ｍｅｔＹ、ｈｓｋ（突然変異）、ｍｅｔＦ、ｔｋｔ、ｔａｌ、ｚｗｆおよび６ｐｇｌの量および／または活性が増加し、ｍｃｂＲ、ｍｅｔＱおよびｓｄａの量および／または活性が減少し得る。
【０１８３】
上述した酵素の量および／または活性を増加させるために、それぞれの出発微生物が必要とされる活性を提供するかどうかによって、これらの酵素をコードしている内因性核酸配列に依存するか、または外因性配列を使用し得る。
【０１８４】
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ微生物の場合には、ホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼ、ｇｃｖＰ、ｇｃｖＨおよびｇｃｖＴ、ｌｐｌＡ、ｌｉｐＡ、ｌｉｐＡおよび／またはｌｐｄの量および／または活性を増加させるために、Ｃ．ｊｅｉｋｅｉｕｍのコード配列を使用することが好ましい。これらの酵素の配列は、配列番号１および２ならびに９〜２０で示される。当業者は、当然、上述した配列番号の機能的相同体または断片をコードしている配列も使用できることに気づいている。そのような機能的相同体は、他の供給源（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の配列を含み得る。第１表では、対応するジーンバンク登録番号を詳述することによって可能な配列の概要を提供する。
【０１８５】
本発明による微生物および特にＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ微生物は、それらを培養し、場合によってメチオニンを単離することによって、メチオニンの生産において使用することができる。上記したように、組換えした生物を、ホルメートならびにリポ酸および／またはリポアミドの量を増加した培地において培養し得る。
【０１８６】
以下の表では、上述のいくつかの酵素の概要をさらに詳細に提供している。詳述したジーンバンク登録番号は、ウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／で見つけることができるジーンバンクを参照にしている。
【０１８７】
【表１】
2010518837.tif 000002
【０１８８】
【表２】
2010518837.tif 000003
【０１８９】
【表３】
2010518837.tif 000004
【０１９０】
【表４】
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【０１９１】
【表５】
2010518837.tif 000006
【０１９２】
【表６】
2010518837.tif 000007
【０１９３】
【表７】
2010518837.tif 000008
【０１９４】
【表８】
2010518837.tif 000009
【０１９５】
【表９】
2010518837.tif 000010
【０１９６】
【表１０】
2010518837.tif 000011
【０１９７】
【表１１】
2010518837.tif 000012
【０１９８】
【表１２】
2010518837.tif 000013
【０１９９】
【表１３】
2010518837.tif 000014
【０２００】
上記の登録番号は、Ｇｅｎｂａｎｋの公式登録番号であるか、またはＧｅｎｂａｎｋに相互参照を持つ登録番号の同物異名である。これらの番号は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／で検索して見つけることができる。
【０２０１】
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍおよびＥ．ｃｏｌｉのポリペプチドおよび遺伝子の量および／または活性を増加および減少させる方法について一般的な概要を以下に示す。それにもかかわらず、当業者は、適切なデータベース検索を実施することによって第１表の酵素の新しい相同体を同定するため、および／またはコリネ型細菌もしくはエシェリキア属の細菌以外の生物でこれらの酵素の発現を変更するためのいずれかの他の技術およびアプローチに気づくであろう。
【０２０２】
量および／または活性の増加または導入
量を増加させることに関しては、２つの基本的なシナリオを識別することができる。第１のシナリオでは、酵素の量を、それぞれのタンパク質の外因性異形の発現によって増加させる。もう一方のシナリオでは、内因性のタンパク質の発現を、例えば、プロモーターおよび／もしくはエンハンサーエレメントの活性ならびに／または転写、翻訳もしくは翻訳後のいずれかのレベルでそれぞれのタンパク質の活性を調節する他の調節活性に影響を及ぼすことによって増加させる。
【０２０３】
したがって、タンパク質の活性および量の増加は、異なる経路を通して達成することが可能であり、これらは、例えば、転写、翻訳およびタンパク質のレベルで抑制調節機構を切断するか、または例えば、強力なプロモーターにより内因性トランスケトラーゼを誘発することおよび／もしくはトランスケトラーゼをコードしている核酸を導入することによって出発生物と比較してこれらタンパク質をコードしている核酸の遺伝子発現を増加させることによるものである。
【０２０４】
一実施形態において、第１表の酵素の量および／または活性の増加は、第１表の酵素をコードしている核酸を微生物（例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍおよびＥ．ｃｏｌｉ）に導入することによって達成される。
【０２０５】
原則として、第１表に一覧にされたタンパク質の酵素活性を有する異なる生物のいずれかのタンパク質を使用することができる。イントロンを含む真核生物の供給源由来のそのような酵素のゲノム核酸配列については、宿主生物が対応するｍＲＮＡをスプライシング可能ではない、またはスプライシング可能にすることができないような場合、対応するｃＤＮＡのようなすでにプロセシングされた核酸配列が使用されることになる。記述の中で挙げた全ての核酸は、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはｃＤＮＡ配列であり得る。
【０２０６】
本発明によれば、タンパク質の量を増加または導入することは、典型的に以下のステップを含む：
ａ）以下の核酸配列、好ましくは５’−３’方向のＤＮＡ配列を含むベクターを生産するステップ：
−本発明の生物において機能的なプロモーター配列
−例えば、第１表のタンパク質、機能的相同体、機能的断片またはその機能的な突然変異型をコードしている、それに機能可能に結合したＤＮＡ配列
−場合によって、本発明の生物において機能的な終止配列
ｂ）ステップａ）で得たベクターを本発明の生物（例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）に移入および場合によってそれぞれのゲノムに組み込むステップ。
【０２０７】
先に述べたように、機能的断片は、例えば、第１表の酵素をコードしている核酸配列の断片に関し、その発現が依然としてそれぞれの完全長タンパク質の酵素活性と実質的に同様の酵素活性を有するタンパク質となる断片である。
【０２０８】
上述の方法は、例えば、第１表の酵素またはその機能的断片をコードしているＤＮＡ配列の発現を増加させるために使用することができる。プロモーターおよび終止配列がそうであるように、調節配列を含むそのようなベクターの使用は当業者に公知である。さらに、当業者は、どのようにステップａ）で得たベクターをＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍまたはＥ．ｃｏｌｉなどの生物に移入し、ベクターがこれらのゲノムに組み込み可能であるためにどの特性を持つ必要があるかを知っている。
【０２０９】
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなどの生物における酵素含量が、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのような別の生物由来の酵素をコードしている核酸を移入することによって増加する場合、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ由来の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を、遺伝暗号に従ってポリペプチド配列の逆翻訳により、生物特異的なコドン使用頻度に応じて、頻繁に使用されるこれらのコドンを主に含む核酸配列に移入することが望ましい。コドン使用頻度は、関連生物に関する他の公知の遺伝子についてのコンピュータ評価によって決定することができる。
【０２１０】
また、本発明によれば、第１表の酵素をコードしている核酸の遺伝子発現の増加は、生物、特にＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの内因性のそれぞれの内因性酵素における発現の操作であると理解される。これは、例えば、これらの酵素をコードしている遺伝子のプロモーターＤＮＡ配列を改変することによって達成することができる。これらの酵素の発現率の改変、好ましくは増加を引き起こすそのような改変は、強力なプロモーターとの置換によって、ならびにＤＮＡ配列の欠失および／または挿入によって達成することができる。
【０２１１】
内因性遺伝子のプロモーター配列の改変によって、通常、遺伝子の発現量の変化が生じ、したがって、細胞または生物において検出可能な活性の変化も生じる。
【０２１２】
さらに、それぞれ内因性遺伝子の発現の変化および増加は、形質転換された生物では生じないか、欠失しており、これらの遺伝子のプロモーターと相互作用する調節タンパク質によって達成することができる。そのような調節因子は、例えば、国際特許出願公開第９６／０６１６６号において記述されるようなＤＮＡ結合ドメインおよび転写アクチベータードメインから成るキメラタンパク質であり得る。
【０２１３】
内因性遺伝子の活性および含量を増加させるための更なる可能性は、例えば、過剰発現によって内因性遺伝子の転写に関係する転写因子をアップレギュレートすることである。転写因子の過剰発現のための手段は、当業者に公知である。
【０２１４】
第１表の内因性酵素のような内因性酵素の発現は、例えば、特に遺伝子のプロモーター配列に結合するアプタマーの発現を介して調節することができる。刺激または抑制するプロモーター領域に結合するアプタマーによって、第１表の酵素量は、例えば、増加し得る。
【０２１５】
さらに、内因性遺伝子の活性の改変は、内因性遺伝子コピーの標的突然変異誘発によって達成することができる。
【０２１６】
また、例えば、第１表の酵素をコードしている内因性遺伝子の改変は、酵素の翻訳後修飾に影響を与えることによって達成することができる。これは、例えば、過剰発現または遺伝子サイレンシングのような対応する手段によって酵素の翻訳後修飾に関係するキナーゼまたはホスファターゼのような酵素の活性を調節することによって起こり得る。
【０２１７】
別の実施形態において、酵素を、効率において、またはそのアロステリック制御領域を化合物産生のフィードバック阻害を防止するというように破壊することで改善し得る。同様に、分解酵素を、細胞の生存度を損なうことなく、その分解活性を第１表の所望の酵素に対して下げるというように、置換、欠失または付加によって欠失または改変し得る。いずれの場合にも、メチオニンの全収率、産生率または量が増加する。
【０２１８】
第１表の酵素の量および／または活性を増加または導入するためのこれら上述の方法は、制限することを意図するものではなく、これらの方法の変動は当業者に容易に理解される。
【０２１９】
酵素の量および／または活性の減少
メチオニン産生のためにすでに操作されている出発生物を使用するのが好ましい可能性があることについて上記で掲示している。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいて、例えば、ｍｅｔＱの活性をダウンレギュレートすることができる。
【０２２０】
酵素の量および／または活性を減少させるために、様々な方法が利用できる。
【０２２１】
第１表の内因性酵素などの内因性酵素の発現は、例えば、遺伝子のプロモーター配列に特異的に結合するアプタマーの発現を介して調節することができる。刺激または抑制するプロモーター領域へのアプタマーの結合によって、第１表の酵素の量およびこの場合活性は、例えば、減少し得る。
【０２２２】
また、アプタマーは、特に酵素自体に結合し、例えば、それぞれの酵素の触媒中心に結合することによって酵素の活性を減少させるという方法でデザインすることができる。アプタマーの発現は、通常、ベクターベースの過剰発現（上記参照）によって達成され、これは、アプタマーのデザインおよび選択と共に、当業者に周知である（Ｆａｍｕｌｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２４３，１２３−３６）。
【０２２３】
さらに、第１表の内因性酵素の量および活性の減少は、当業者に周知である様々な実験的な手段によって達成することができる。これらの手段は、通常、「遺伝子サイレンシング」という用語で要約される。例えば、内因性遺伝子の発現は、アンチセンスの順序で酵素またはその一部をコードしているＤＮＡ配列を有する上述したベクターを生物（例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）に移入することによってサイレンシングすることができる。これは、細胞におけるそのようなベクターの転写により、内因性遺伝子によって転写されるｍＲＮＡとハイブリッド形成することが可能で、したがって、その翻訳を防ぐＲＮＡを生じるという事実に基づく。
【０２２４】
原則として、アンチセンス方法は、リボザイム方法と併用することができる。リボザイムは触媒的に活性なＲＮＡ配列であり、アンチセンス配列に連結する場合、触媒作用で標的配列を切断する（Ｔａｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．２３（３），２５７−７５）。これは、アンチセンス方法の有効性を高めることができる。
【０２２５】
相同の組換え微生物を構築するために、欠失、付加または置換を導入することによって、内因性遺伝子が改変されている（例えば、機能的に損なわれた）、第１表の酵素をコードしている遺伝子の少なくとも一部を含むベクターを調製する。
【０２２６】
一実施形態において、ベクターは、相同組換えされると同時に、内因性遺伝子が機能的に阻害される（すなわち、機能タンパク質をもはやコードしない）ようにデザインされる。この代わりに、ベクターを、相同組換えされると同時に、内因性遺伝子が突然変異するか、または改変されるが、依然として機能タンパク質をコードするというようにデザインすることができる（例えば、上流の調節領域を改変して、これによって第１表の内因性酵素の発現を変更することができる）。このアプローチは、酵素の発現が完全に無効にされず、しかし、必要な最小レベルに減少されるという利点を持ち得る。当業者は、ベクターが内因性配列を置換するか、または欠失させるために使用できることを知っている。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの染色体配列を阻害するための具体的な説明を以下に提供する。
【０２２７】
さらに、遺伝子抑制が転写因子の量を減少することによって可能である。
【０２２８】
また、標的タンパク質自体を阻害する因子を、細胞に導入することができる。タンパク質結合因子は、例えば、上述のアプタマーあり得る（Ｆａｍｕｌｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４３，１２３−３６）。
【０２２９】
更なるタンパク質結合因子で、発現されると、第１表の酵素の量および／または活性の減少を引き起こすことができる因子として、酵素特異的抗体を考慮することができる。単鎖抗体などの組換え酵素特異的抗体の産生は、当技術分野で公知である。また、抗体の発現は、文献から公知である（Ｆｉｅｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３，２０５−２１６；Ｍａｙｎａｒｄ  ａｎｄ  Ｇｅｏｒｇｉｏｕ（２０００）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．２，３３９−７６）。
【０２３０】
前述の技術は、当業者に周知である。したがって、当業者は、例えば、アンチセンス方法のために使用される核酸構築物が持たなければならい典型的な大きさ、およびそれぞれの核酸配列が持たなければならない相補性、相同性または同一性を知っている。相補性、相同性および同一性という用語は、当業者に公知である。
【０２３１】
相補性という用語は、２つの相補的な塩基間で水素結合によってもう１つの核酸分子とハイブリッド形成する核酸分子の特性をいう。当業者は、２つの核酸分子が互いにハイブリッド形成できるために１００％の相補性を示す必要のないことを知っている。もう１つの核酸配列とハイブリッド形成する核酸配列は、それぞれ、好ましくは少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、特に好ましくは少なくとも８０％、また特に好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％で、最も好ましくは少なくとも９８または１００％前記のもう１つの核酸配列と相補性である。
【０２３２】
内因性ｍＲＮＡ配列とアンチセンス配列のハイブリッド形成は、細胞条件下のｉｎ  ｖｉｖｏまたは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで典型的に起こる。本発明によれば、ハイブリッド形成は、特定のハイブリッド形成を確実にするのに十分にストリンジェントな、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏの条件下で実施される。
【０２３３】
ストリンジェントなｉｎ  ｖｉｔｒｏでのハイブリッド形成条件は、当業者に公知あって、文献から入手することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）参照）。「特異的ハイブリッド形成」という用語は、核酸配列が例えばＤＮＡまたはＲＮＡ分子の複合混合物の部分である場合、分子がストリンジェントな条件の下で優先的に特定の核酸配列と結合する場合をいう。
【０２３４】
したがって「ストリンジェントな条件」という用語は、核酸配列が優先的に標的配列と結合するが、しかし他の配列には結合しないか、少なくともかなり少ない程度で結合する条件をいう。
【０２３５】
ストリンジェントな条件は状況に依存する。長い配列は、特に高い温度でハイブリッド形成する。一般に、ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度および定義されたｐＨ値でハイブリッド形成温度が特定の配列の融点（Ｔｍ）の約５°Ｃ以下であるというような方法で選択される。Ｔｍは、（定義されたｐＨ値、定義されたイオン強度および定義された核酸濃度で）標的配列と相補的である分子の５０％が前記の標的配列とハイブリット形成する温度である。
【０２３６】
典型的に、ストリンジェントな条件は、０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン（または別の塩イオン）の塩濃度と７．０〜８．３のｐＨ値を含む。温度は、短い分子では（例えば、１０〜５０の核酸を含むそのような分子では）少なくとも３０°Ｃである。さらに、厳密な条件は、例えば、ホルムアミドのような不安定化剤の添加を含み得る。典型的なハイブリッド形成および洗浄緩衝液は、以下の組成物である。
【０２３７】
プレハイブリダイゼーション溶液：
０．５％  ＳＤＳ
５×ＳＳＣ
５０ｍＭ  ＮａＰＯ4、ｐＨ６．８
０．１％  Ｎａ−ピロリン酸塩
５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ試薬
１００μｇ／サケ精液
ハイブリッド形成溶液：プレハイブリダイゼーション溶液
１×１０6ｃｐｍ／ｍｌプローブ（５〜１０秒  ９５℃）
２０×ＳＳＣ：３Ｍ  ＮａＣｌ
０．３Ｍクエン酸ナトリウム
ＨＣｌでｐＨ７に調製
５０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ試薬：フィコール  ５ｇ
ポリビニルピロリドン５ｇ
ウシ血清アルブミン５ｇ
ａｄ  ５００ｍｌ  Ａ．ｄｅｓｔ
ハイブリッド形成のための典型的手順は、以下の通りである：
任意：６５℃で、１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で３０分間洗浄ブロット、
プレハイブリダイゼーション：５０〜５５℃で少なくとも２時間
ハイブリッド形成：５５〜６０℃で終夜
洗浄：０５分間、２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ
ハイブリッド形成温度
３０分間、２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ
ハイブリッド形成温度
３０分間、１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ
ハイブリッド形成温度
４５分間、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、６５℃
５分間、０．１×ＳＳＣ、室温
アンチセンスの目的では、１００核酸、８０核酸、６０核酸、４０核酸および２０核酸の配列の長さを超える相補性で十分であり得る。また、より長い核酸長では、間違いなく十分である。また、上述の方法の併用が考えられる。
【０２３８】
本発明に従って、生物内で活性なプロモーターに５’−３’方向で機能可能に結合しているＤＮＡ配列が使用される場合、一般に生物の細胞への移入後に、コード配列の過剰発現を可能にするか、それぞれ、内因性核酸配列およびこれより発現するタンパク質の抑制または競合および遮断を引き起こすことができるベクターを構築し得る。
【０２３９】
また、特定の酵素の活性は、生物内でその非機能的突然変異体を過剰発現させることによって減少し得る。ゆえに、当該反応を触媒することはできないが、例えば、基質または補因子を結合することができる非機能的突然変異体は、過剰発現を介して、内因性酵素を打ち負かし、したがって、この反応を阻害することができる。宿主細胞の酵素の量および／または活性を減少させるための更なる方法は、当業者に周知である。
【０２４０】
本発明によれば、非機能的酵素は、基本的に、機能的酵素およびその機能的断片と、それぞれ同じ核酸配列およびアミノ酸配列を持つが、ある位置で、非機能的酵素がそれぞれの反応を触媒できないか、または非常に限られた程度でしか触媒できない影響を持つ核酸またはアミノ酸の点突然変異、挿入または欠失を有する。これらの非機能的酵素は、それぞれの反応を依然として触媒することできるが、これ以上フィードバック制御されない酵素と混同してはならない。本発明によれば、「非機能的酵素」という用語は、それぞれアミノ酸レベルおよび核酸レベルで、それぞれの機能的酵素に対して実質的な配列相同性を持たないそのようなタンパク質を含まない。それぞれの反応を触媒することができず、それぞれの酵素と実質的な配列相同性を持たないタンパク質は、したがって、定義上、本発明の「非機能的酵素」という用語によって表されない。本発明の範囲内では、非機能的酵素は、不活化または不活性酵素とも呼ばれる。
【０２４１】
したがって、上述の点突然変異、挿入および／または欠失を有する本発明による例えば第１表の非機能的酵素は、本発明による例えば第１表の野生型酵素またはその機能的に同等の部分に対する実質的な配列相同性によって特徴付けられる。実質的な配列相同性を決定するために、上述の同一性グレードが適用される。
【０２４２】
ベクターおよび宿主細胞
本発明の一態様は、上記のように修飾された核酸配列を含む、ベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本明細書で使用する、「ベクター」という用語は、結合されている別の核酸を運ぶことが可能な核酸分子をいう。
【０２４３】
あるタイプのベクターは「プラスミド」であり、更なるＤＮＡ断片を連結し得る環状の二本鎖ＤＮＡループをいう。ベクターの別のタイプは、更なるＤＮＡ断片がウイルスのゲノムに連結し得るウイルス性ベクターである。
【０２４４】
特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞内で自律複製が可能である（例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクトルおよびエピソーム性哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入と同時に宿主細胞のゲノムに組み入れられ、それによって、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクターは、機能可能なように結合する遺伝子の発現を誘導することができる。
【０２４５】
そのようなベクターは、本明細書において、「発現ベクター」という。
【０２４６】
一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドが最も一般的に使用されるベクターの形態であるので、交換可能なように使用されることがある。しかし、本発明は、同等の機能を発揮するウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルス）などの他の形態の発現ベクターを含むことを意図している。
【０２４７】
本発明の組換え発現ベクターは、上記のように宿主細胞内でそれぞれの核酸の発現に適した形態で修飾された核酸を含むことがあり、これは組換え発現ベクターが、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択され、発現される核酸配列に機能可能に結合されている１つ以上の調節配列を含むことを意味する。
【０２４８】
組換え発現ベクターの範囲内で、「作動可能に結合した」は、関心対象の核酸配列が核酸配列の発現を可能にするという様式で（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系において、またはベクターが宿主細胞に導入される場合は宿主細胞において）調節配列に結合していることを意味するよう意図されている。「調節配列」という用語は、プロモーター、リプレッサー結合部位、アクチベーター結合部位、エンハンサーおよび他の発現調節領域（例えば、ターミネーター、ポリアデニル化シグナルまたはｍＲＮＡ二次構造の他のエレメント）を含むよう意図されている。そのような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に記述されている。調節配列は、多くのタイプの宿主細胞において核酸配列の構成的発現を誘導する配列、および特定の宿主細胞のみで核酸配列の発現を誘導する配列を含む。好ましい調節配列は、例えば、ｃｏｓ−、ｔａｃ−、ｔｒｐ−、ｔｅｔ−、ｔｒｐ−、ｔｅｔ−、ｌｐｐ−、ｌａｃ−、ｌｐｐ−ｌａｃ−、ｌａｃＩｑ−、Ｔ７−、Ｔ５−、Ｔ３−、ｇａｌ−、ｔｒｃ−、ａｒａ−、ＳＰ６−、ａｒｎｙ、ＳＰ０２、ファージラムダＰR、ファージラムダＰL、ファージＳｐ０１  Ｐ15、ファージＳｐ０１  Ｐ26、ｐＳＯＤ、ＥＦＴｕ、ＥＦＴｓ、ＧｒｏＥＬ、ＭｅｔＺ（最後の５つはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍから）などのプロモーターであり、これらは好ましくは細菌において使用される。更なる調節配列は、例えば、ＡＤＣ１、ＭＦａ、ＡＣ、Ｐ−６０、ＣＹＣ１、ＧＡＰＤＨ、ＴＥＦ、ｒｐ２８、ＡＤＨ、ＥＮＯ２などの酵母および真菌由来のプロモーター、ＣａＭＶ／３５Ｓ、ＳＳＵ、ＯＣＳ、ｌｉｂ４、ｕｓｐ、ＳＴＬＳ１、Ｂ３３、ｎｏｓなどの植物由来のプロモーターまたはユビキチンもしくはファゼオリンプロモーターである。また、人工プロモーターを使用することも可能である。発現ベクターのデザインが形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの因子によって決定し得ることは当業者によって理解されるであろう。本発明の発現ベクターを、宿主細胞に導入し、このことによって、上述の修飾された核酸配列によってコードされた融合タンパクまたはペプチドを含むタンパク質またはペプチドを産生させることができる。
【０２４９】
原核生物におけるタンパク質の発現は、多くの場合、融合タンパク質または非融合タンパク質の発現を誘導する構成的または誘導性プロモーターを含むベクターによって実施される。
【０２５０】
融合ベクターは、多くのアミノ酸を、その中にコードされるタンパク質に加え、通常は、組換えタンパク質のアミノ末端に加えられるが、Ｃ末端にも加えられ、またはタンパク質の適切な領域内に融合させる。そのような融合ベクターは、典型的に、１）組換えタンパク質の発現を増加させること、２）組換えタンパク質の溶解性を増加させること、および３）親和性精製におけるリガンドとして作用することによって組換えタンパク質の精製を助けること、４）後のタンパク質の検出のために"タグ"を提供することの４つの役目を果たす。しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク分解による切断部位を、融合部分と組換えタンパク質の接合部に導入し、融合タンパク質の精製後に融合部分から組換えタンパク質を分離することを可能にする。そのような酵素およびそれらのコグネイト認識配列は、第Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼを含む。
【０２５１】
典型的融合発現ベクターは、それぞれグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質またはタンパク質Ａを融合させるｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を含む。
【０２５２】
適した誘導性非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例は、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６９：３０１−３１５）、ｐＬＧ３３８、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＫＣ３０、ｐＲｅｐ４、ｐＨＳ１、ｐＨＳ２、ｐＰＬｃ２３６、ｐＭＢＬ２４、ｐＬＧ２００、ｐＵＲ２９０、ｐＩＮ−ＩＩＩ１１３−Ｂ１、ｅｇｔｌｌ、ｐＢｄＣ１およびｐＥＴ  ｌｌｄを含む（Ｓｔｕｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９０）６０−８９、およびＰｏｕｗｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（１９８５）Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ＩＢＳＮ  ０  ４４４  ９０４０１８）。ｐＴｒｃベクターからの標的遺伝子発現は、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写に依存する。ｐＥＴ  ｌｌｄベクターからの標的遺伝子発現は、共発現されたウイルスＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ｇｎｌ）によって媒介されるＴ７ｇｎｌＯ−ｌａｃ融合プロモーターからの転写に依存する。このウイルスポリメラーゼは、ｌａｃＵＶ５プロモーターの転写調節下でＴ７ｇｎｌ遺伝子を有するレジデントＸプロファージ由来の宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）によって供給される。他の系統の細菌の形質転換のために、適切なベクターを、選択することができる。例えば、プラスミドｐＩＪ１０１、ｐＩＪ３６４、ｐＩＪ７０２およびｐＩＪ３６１はストレプトミセスを形質転換する際に有用であることが知られているが、一方、プラスミドｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４またはｐＢＤ２１４はバシラス種の形質転換に適している。コリネバクテリウムへの遺伝情報の転送で使用するいくつかのプラスミドは、ｐＨＭ１５１９、ｐＢＬ１、ｐＳＡ７７またはｐＡＪ６６７を含む（Ｐｏｕｗｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（１９８５）Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ＩＢＳＮ  ０  ４４４  ９０４０１８）。
【０２５３】
適したＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍおよびＥ．ｃｏｌｉシャトルベクターの例は、例えば、ｐＣｌｉｋ５ａＭＣＳ（国際特許出願公開第２００５０５９０９３号）であるか、Ｅｉｋｍａｎｎｓ  ｅｔ  ａｌ（Ｇｅｎｅ．（１９９１）１０２，９３−８）で見つけることができる。
【０２５４】
コリネ型細菌を操作するために適したベクターのための例は、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｅｇｇｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｂｏｔｔ，ＩＳＢＮ  ０−８４９３−１８２１−１，２００５）で見つけることができる。Ｅ．ｃｏｌｉ−Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍシャトルベクターのリスト（第２３．１表）、Ｅ．ｃｏｌｉ−Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍシャトル発現ベクターのリスト（第２３．２表）、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ染色体へのＤＮＡの組込みのために使用することができるベクターのリスト（第２３．３表）、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ染色体への組込みのための発現ベクターのリスト（第２３．４表）、およびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ染色体への部位特異的組込みのためのベクターのリスト（第２３．６表）を見つけることができる。
【０２５５】
別の実施形態において、タンパク質発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの発現のためのベクターの例は、ｐＹｅｐＳｅｃｌ（Ｂａｌｄａｒｉ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｅｍｂｏ  Ｊ．６：２２９−２３４）、２ｉ、ｐＡＧ−１、Ｙｅｐ６、Ｙｅｐｌ３、ｐＥＭＢＬＹｅ２３、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ  ａｎｄ  Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，（１９８２）Ｃｅｌｌ  ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｇｅｎｅ  ５４：  １１３−１２３）およびｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国カリフォルニア州サンディエゴ）を含む。他の真菌（例えば、糸状菌）で使用するために適したベクターおよびベクター構築のための方法は、ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｎｄｅｌ，Ｃ．Ａ，Ｍ，Ｊ．Ｊ．＆  Ｐｕｎｔ，Ｐ．Ｊ．（１９９１）ｉｎ：Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｆｕｎｇｉ，Ｊ．Ｆ．Ｐｅｂｅｒｄｙ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，ｐ．１−２８，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ａｎｄ  Ｐｏｕｗｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（１９８５）Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ： Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（ＩＢＳＮ  ０  ４４４  ９０４０１８）に詳細に述べられているものを含む。
【０２５６】
本発明の目的において、機能的な結合は、コード配列を発現するときに、それぞれの調節エレメントがその決定に従ってその機能を果たすことができるような、プロモーター、コード配列、ターミネーターおよび場合によって更なる調節エレメントの連続配置であることが理解される。
【０２５７】
原核生物および真核生物細胞のための他の適した発現系については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００３の１６および１７章を参照。
【０２５８】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換または形質移入技術を介して原核生物に導入することができる。本明細書で使用する「形質転換」および「形質移入」、「抱合」および「形質導入」という用語は、外部の核酸（例えば、直鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、線状化ベクターまたはベクターなしに遺伝子構築物単独））またはベクターの形態における核酸（例えば、プラスミド、ファージ、ファスミッド、ファージミド、トランスポゾンまたは他のＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための様々な当業者に認識された技術をいうことを意図し、これらはリン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介形質移入、リポフェクション、天然コンピテンス、化学物質介在移入または電気穿孔法を含む。宿主細胞を形質転換または形質移入させるための適した方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００３）および他の研究室マニュアルで見つけることができる。
【０２５９】
これらの要素を同定および選択するために、一般に、選択可能なマーカー（例えば、抗生物質耐性の）をコードする遺伝子を、関心対象の遺伝子と共に宿主細胞に導入する。好ましい選択可能なマーカーは、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、カナマイシン、テトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン（そして、他のペニシリン）、セファロスポリン、フルオロキノン、ナラジキシン酸、クロラムフェニコール、スペクチノマイシン、エルチスロマイシン、ストレプトマイシンおよびメトトレキセートなどの、しかしこれらに限定されるものではない、薬物に耐性を与えるマーカーを含む。他の選択可能なマーカーは、宿主または出発株で同等な遺伝子の突然変異型を補うことができる野生型遺伝子を含む。例えば、ｓｅｒＡなどの最小培地での培養に必須な遺伝子は、セリン栄養素要求株を構築するために本明細書で上述したように本発明のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ出発または宿主株のゲノムから突然変異または欠失させることができる。続いて、ｓｅｒＡ遺伝子の野生型または他の機能的コピーを含むベクターを使用して、形質転換体または要素を選択することができる。選択可能なマーカーをコードしている核酸を、上述の修飾された核酸配列をコードしている核酸と同じベクターで宿主細胞へ導入することができるか、別のベクターで導入することができる。導入された核酸で安定して形質移入された細胞は、薬物選択によって同定することができる（例えば、選択可能なマーカー遺伝子を取り込んだ細胞は生存するが、他の細胞は死滅する）。
【０２６０】
複製開始点および２つの異なるマーカー遺伝子のないプラスミドが使用される（例えば、ｐＣｌｉｋ  ｉｎｔ  ｓａｃＢ）ときに、ゲノムに挿入される挿入部を持つマーカーのない株を生成することも可能である。これは相同組換えの２つの連続的なイベントによって達成される（Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｌｏｇｙ，７１（１２），ｐ．８５８７−８５９６参照）。プラスミドｐＣｌｉｋ  ｉｎｔ  ｓａｃＢの配列は、国際特許出願公開第２００５０５９０９３号、配列番号２４で見つけることができ、本文書ではこのプラスミドはｐＣＩＳと呼ばれている。
【０２６１】
別の実施形態において、導入された遺伝子の調節発現を可能にする選択系を含む、組換え微生物を作製することができる。例えば、上述の核酸配列の１つをベクターに含ませ、ｌａｃオペロンの制御下に配置すると、ＩＰＴＧの存在下でのみ遺伝子の発現を可能にする。そのような調節系は、当技術分野で周知である。
【０２６２】
本発明の別の態様は、本発明の組換え発現ベクターが導入されている生物または宿主細胞に関する。「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」という用語は、本明細書において交換可能なように使用される。そのような用語は、特定の対象細胞をいうだけでなく、そのような細胞の子孫または潜在的子孫についてもいうことが理解される。特定の修飾が突然変異または外界の影響のため続く生成で起こり得るので、そのような子孫は、実際には、親細胞と同一ではありえないが、依然として本明細書で使用する用語の範囲内である。
【０２６３】
Ｅ．ｃｏｌｉおよびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの増殖−培地および培養条件
当業者は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍおよびＥ．ｃｏｌｉなどの一般の微生物の培養に精通している。したがって、一般的な教示は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの培養に関して、以下で示す。対応する情報は、Ｅ．ｃｏｌｉの培養のための標準的テキストから得ることができる。
【０２６４】
Ｅ．ｃｏｌｉ株は、それぞれＭＢおよびＬＢブロスにおいてルーチン的に培養される（Ｆｏｌｌｅｔｔｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５，４０９６−４１０３）。Ｅ．ｃｏｌｉおよびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍを含む細菌用の最小のいくつかの最小培地は当業者に周知である。Ｅ．ｃｏｌｉ用の最小培地は、それぞれＥ培地、Ｍ９培地および修飾型ＭＣＧＣを含むが、これらに限定されるものではない（Ｙｏｓｈｉｈａｍａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６２，５９１−５０７）。グルコースを、約０．２％〜１％の最終濃度で加えてもよい。抗生物質を以下の量で加えることができる（マイクログラム／ミリリットル）、アンピシリン（５〜１０００）、カナマイシン（２５）、ナリジキシン酸（２５）、クロラムフェニコール（５〜１２０）、スペクチノマイシン（５０〜１００）、テトラサイクリン（５〜１２０）。アミノ酸、ビタミンおよび他の添加物は、例えば、以下の量で加えることができる、メチオニン、９．３ｍＭ；アルギニン、９．３ｍＭ；ヒスチジン、９．３ｍＭ；チアミン、０．０５ｍＭ。Ｅ．ｃｏｌｉの細胞は、実施される特定の実験または方法によって、それぞれ１８〜３７  ４４℃でルーチン的に培養されている。
【０２６５】
遺伝子組換えコリネ型細菌は、典型的に合成または天然の増殖培地で培養される。コリネ型細菌のための多くの異なる増殖培地は、周知で、容易に入手できる（Ｌｉｅｂ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３２：２０５−２１０；ｖｏｎ  ｄｅｒ  Ｏｓｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ，（１９９８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１１：１１−１６；独国特許第４，１２０，８６７号；Ｌｉｅｂｌ（１９９２）"Ｔｈｅ  Ｇｅｎｕｓ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ，ｉｎ：Ｔｈｅ  Ｐｒｏｃａｒｙｏｔｅｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  ＩＩ，Ｂａｌｏｗｓ，Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）。指示は、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｅｇｇｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｂｏｔｔ，ＩＳＢＮ  ０−８４９３−１８２１−１，２００５）。
【０２６６】
これらの培地は、１種以上の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミンおよび微量元素から成る。好ましい炭素源は、単糖類、二糖類または多糖類などの糖類である。例えば、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、リボース、ソルボース、リボース、ラクトース、マルトース、スクロース、グリセロール、ラフィノース、デンプンまたはセルロースは、非常に良好な炭素源として用いられる。
【０２６７】
糖蜜または砂糖精製から得られる他の副産物などの錯化合物を介して培地に糖を供給することも可能である。また、異なる炭素源の混合物を供給することも有利であり得る。他の可能な炭素源は、メタノール、エタノール、酢酸または乳酸などのアルコールおよび有機酸である。窒素源は、通常有機もしくは無機の窒素化合物、またはこれらの化合物を含む物質である。典型的な窒素源は、アンモニアガスまたはアンモニア塩、例えばＮＨ4Ｃｌまたは（ＮＨ4）2ＳＯ4、ＮＨ4ＯＨ、硝酸塩、尿素、アミノ酸または複合窒素供給源、例えばコーンスティープリカー、ダイズ粉、ダイズタンパク質、酵母抽出物、肉抽出物等を含む。
【０２６８】
異なる硫黄供給源を使用して、メチオニンを過剰生産させることが可能である。硫酸塩、チオ硫酸塩、亜硫酸塩、ならびにＨ2Ｓおよび硫化物のようなより還元された硫黄源および誘導体も使用することができる。また、メチルメルカプタン、チオグリコレート、チオシアン酸塩およびチオ尿素のような有機硫黄源、システインのような含硫アミノ酸およびその他の含硫化合物を、効率的なメチオニン生産を達成するために使用することができる。また、ホルメートは、メタノールまたはホルムアルデヒドなどの他のＣ１供給源のように添加物として可能であり得る。
【０２６９】
培地に含有し得る無機塩化合物は、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、コバルト、水鉛、カリウム、マンガン、亜鉛、銅および鉄の塩化塩、亜リン酸塩または硫酸塩を含む。キレート化合物を、金属イオンを溶液状態のまま維持するために培地に加えることができる。特に有用なキレート化合物は、カテコールもしくはプロトカテキュエートのようなジヒドロキシフェノール、またはクエン酸などの有機酸を含む。また、培地がビタミンまたは増殖プロモーターなどの他の増殖因子を含むことはよくあることであり、例として、シアノコバラミン（またはビタミンＢ１２の他の形態）、ビオチン、リボフラビン、チアミン、葉酸、ニコチン酸、パントテン酸塩およびピリドキシンを含む。増殖因子および塩類は、しばしば酵母抽出物、糖蜜、コーンスティープリカーなどの天然培地成分に由来する。化合物の正確な組成は、目前の実験に強く依存し、特定の場合ごとに個々に決定される。培地最適化に関する情報は、テキスト"Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｅｄｓ．Ｐ．Ｍ．Ｒｈｏｄｅｓ，Ｐ．Ｆ．Ｓｔａｎｂｕｒｙ，ＩＲＬ  ｐｒｅｓｓ（１９９７）ｐｐ．５３−７３，ＩＳＢＮ  ０  １９  ９６３５７７  ３）で入手できる。増殖培地を、ｓｔａｎｄａｒｄ  １（Ｍｅｒｃｋ）またはＢＨＩ（ｇｒａｉｎ  ｈｅａｒｔ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ、ＤＩＦＣＯ）などのような商業的な供給業者から選択することも可能である。
【０２７０】
全ての培地成分は、熱（１．５バールおよび１２１℃で２０分間）または濾過殺菌法のいずれかにより滅菌すべきである。成分は、一緒に、または必要に応じて別々に滅菌することができる。
【０２７１】
全ての培地成分は、増殖の初期に存在させるか、または場合によって連続的にもしくはバッチ式に加えることができる。培養条件は、実験ごとに別々に定められる。
【０２７２】
温度は、通常１５℃〜４５℃の範囲であるべきであるが、好熱生物に対しては最高で１０５℃まで上げることができる。温度を一定に保つか、実験中に変えることができる。培地のｐＨは、５〜８．５、好ましくは７．０前後の範囲でよく、培地に緩衝液を添加することで一定に保つことができる。この目的のための典型的な緩衝液は、リン酸カリウム緩衝液である。ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＡＣＥＳなどの合成緩衝液を代わりに、または同時に使用することができる。増殖中に酢酸、硫酸、リン酸、ＮａＯＨ、ＫＯＨまたはＮＨ4ＯＨなどの酸または塩基を添加することより一定の培養ｐＨを保つことも可能である。酵母抽出物などの天然培地成分が使用される場合、多くの錯化合物は高い緩衝能力があるという事実によって、追加の緩衝液の必要性が減少し得る。微生物の培養に発酵槽を使用する場合、ｐＨはアンモニアガスを使用して制御することもできる。
【０２７３】
インキュベーション時間は通常数時間から数日の範囲である。この時間は、ブロス中にできるだけ大量の産物が蓄積されるように選択される。開示される増殖実験は、ミクロタイタープレート、ガラス管、ガラスフラスコ、または異なる大きさのガラスもしくは金属発酵槽などの種々の容器の中で行なうことができる。多数のクローンのスクリーニングのためには、微生物をミクロタイタープレート、ガラス管、振盪フラスコ中、バッフルの有無のいずれかで培養が行われる。好ましくは１００ｍｌまたは２５０ｍｌの振盪フラスコを使用し、これに約１０容量％の必要な増殖培地を装填する。フラスコを約１００〜３００‘ｒｐｍの速さの範囲を使用して、ロータリーシェーカー（振幅約２５ｍｍ）で振盪すべきである。蒸発減は湿潤雰囲気中に保つことによって少なくすることができる。或いは、蒸発減の数学的補正を行うべきである。
【０２７４】
遺伝子組換えクローンを実験する場合、組換えされていない対照のクローンまたはいかなる挿入もなされていない基本的なプラスミドを含む対照クローンの実験も行うべきである。３０℃でインキュベートしているＣＭプレート（１０ｇ／Ｌのグルコース、２．５ｇ／ＬのＮａＣｌ、２ｇ／Ｌの尿素、１０ｇ／Ｌのポリペプトン、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、５ｇ／Ｌの肉抽出物、２２ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｇ／Ｌの尿素、１０ｇ／Ｌのポリペプトン、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、５ｇ／Ｌの肉抽出物、２２ｇ／Ｌの寒天、ｐＨは２Ｍ  ＮａＯＨにより約６．８〜７．２に調整）などの寒天プレート上で増殖させた細胞を用いて、培地を０．５−１．５のＯＤ６００まで接種する。ＣＭプレートからのＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞の塩水性懸濁液の導入、またはこの細菌の前培養液の添加のいずれかにより培地の接種が達成される。
【０２７５】
一般的な方法
一般的な方法のためのプロトコールは、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ，（２００５）ｅｄｓ．：Ｌ．Ｅｇｇｅｌｉｎｇ，Ｍ．Ｂｏｔｔ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，ａｔ  Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８７）５，１３７−１４６），Ｇｕｅｒｒｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｅｎｅ（１９９４），１３８，３５−４１），Ｔｓｕｃｈｉｙａ  ｕｎｄ  Ｍｏｒｉｎａｇａ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８），６，４２８−４３０），Ｅｉｋｍａｎｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｅｎｅ（１９９１），１０２，９３−９８），欧州特許第０  ４７２  ８６９号，米国特許第４，６０１，８９３号，Ｓｃｈｗａｒｚｅｒ  ａｎｄ  Ｐｕｅｈｌｅｒ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９１），９，８４−８７，Ｒｅｉｎｓｃｈｅｉｄ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４），６０，１２６−１３２），ＬａＢａｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（１９９３），１７５，１００１−１００７），国際特許出願公開第９６／１５２４６号，Ｍａｌｕｍｂｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｅｎｅ（１９９３），１３４，１５−２４），日本特許出願公開第１０−２２９８９１号，ａｔ  Ｊｅｎｓｅｎ  ｕｎｄ  Ｈａｍｍｅｒ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（１９９８），５８，１９１−１９５），Ｍａｋｒｉｄｅｓ（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ（１９９６），６０，５１２−５３８）および遺伝学および分子生物学の周知のテキストにおいて見つけることができる。
【０２７６】
菌株、培地およびプラスミド
菌株は、例えば、以下のリストから得られるが、これらに限定されるものではない。
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２、
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１５８０６、
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１３８７０、
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１５３９、
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ  ＡＴＣＣ１７９６５、
Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６７、
Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９および
Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ  ＡＴＣＣ  １４０２０もしくはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＫＦＣＣ１００６５、ＤＳＭ１７３２２など、それから誘導された菌株または
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ２１６０８
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ  ＤＳＭＺ４４５４７、４４５４８、４４５４９。
【０２７７】
組換えＤＮＡ技術
プロトコールは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３rd  ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，Ｖｏｌ．１，２，３、およびＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（２００５）ｅｄｓ．Ｌ．Ｅｇｇｅｌｉｎｇ，Ｍ．Ｂｏｔｔ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓにおいて見つけることができる。
【０２７８】
アミノ酸およびメチオニン中間体の定量
分析は、保護カートリッジおよびＳｙｎｅｒｇｉ４μｍカラム（ＭＡＸ−ＲＰ  ８０Å，１５０＊４．６ｍｍ）（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、ドイツ国アシャッフェンブルク）を備えたＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００、Ａｇｉｌｅｎｔ、ドイツ国ヴァルトブロン）によって行う。注入前に、ｏ−フタルジアルデヒド（ＯＰＡ）および還元剤としてメルカプトエタノール（２−ＭＣＥ）を使用して分析物を誘導体化する。さらにスルフヒドリル基をヨード酢酸でブロックする。極性相として４０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4（溶出剤Ａ、ｐＨ＝７．８、ＮａＯＨで調整）および非極性相としてメタノール水混合物（１００／１）（溶出剤Ｂ）を使用して流速１ｍｌ／分で分離を実施する。以下の勾配を適用する：開始時０％、Ｂ；３９分、３９％、Ｂ；７０分、６４％、Ｂ；１００％、Ｂ、３．５分間；２分、０％、Ｂ（平衡化）。室温での誘導体化は下記のように自動化する。まずビシン（０．５Ｍ、ｐＨ８．５）中の０．５μｌの０．５％２−ＭＣＥを０．５μｌの細胞抽出物と混合する。続いて、ビシン（０．５Ｍ、ｐＨ８．５）中の５０ｍｇ／ｍｌヨード酢酸１．５μｌを加えた後、２．５μｌのビシンバッファー（０．５Ｍ、ｐＨ８．５）を加える。誘導体化を、１／４５／５４ｖ／ｖ／ｖの２−ＭＣＥ／ＭｅＯＨ／ビシン（０．５Ｍ、ｐＨ８．５）に溶解した１０ｍｇ／ｍｌ  ＯＰＡ試薬０．５μｌを加えることによって行う。最後に混合物を３２μｌのＨ2Ｏで希釈する。上記各ピペッティングステップの間に、１分間の待ち時間を設ける。３７．５μｌの総容量をカラムに注入する。留意すべきは、サンプル調製中（例えば、待ち時間中）およびその後にオートサンプラーの針を定期的に掃除すれば、分析結果を大きく改善できることである。検出は蛍光検出器によって実施する（励起３４０ｎｍ，発光４５０ｎｍ，Ａｇｉｌｅｎｔ、ドイツ国ヴァルトブロン）。定量に関しては、α−アミノ酪酸（ＡＢＡ）を内部標準とする。
【０２７９】
組換えプロトコールの定義
以下で、どのように、向上したメチオニン生産効率を増加させるＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株を構築して、上記予測の知見を実現することができるかを記述する。菌株の構築を記述する前に、以下で使用される組換えイベント／プロトコールの定義を挙げる。
【０２８０】
本明細書で使用する「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｉｎ」とは、環状二本鎖ＤＮＡ分子（例えば、プラスミドがｐＣＬＩＫ  ｉｎｔ  ｓａｃＢに基づく）全体が単一の相同組換えイベント（クロスインイベント）によって染色体に組み込まれていて、線状化形式の前記環状ＤＮＡ分子が、前記環状ＤＮＡ分子の第一のＤＮＡ配列に相同的な染色体の第１のＤＮＡ配列に効果的に挿入される、元の宿主細胞の形質転換体をいう。「Ｃａｍｐｂｅｌｌｅｄ  ｉｎ」とは、「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｉｎ」形質転換体の染色体に組み込まれている線状化ＤＮＡ配列をいう。「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｉｎ」は、第一の相同ＤＮＡ配列の重複を含有し、その各コピーは相同組換え交差点のコピーを含み、かつ取り巻く。この名称は、この種類の組換えを最初に提唱したＡｌａｎ  Ｃａｍｐｂｅｌｌ教授に由来する。
【０２８１】
本明細書で使用する「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｏｕｔ」とは、「Ｃａｍｐｂｅｌｌｅｄ  ｉｎ」ＤＮＡの線状化挿入済みＤＮＡ上に含有される第２のＤＮＡ配列と、前記線状化挿入の第２のＤＮＡ配列と相同である染色体起点の第２のＤＮＡ配列との間で第２の相同組換えイベント（クロスアウトイベント）が生じている「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｉｎ」形質転換体に由来する細胞を表し、この第２の組換えイベントは組み込み済みＤＮＡ配列の一部分の欠失（放棄）を生じさせるが、重要なことに、染色体中に残留する組み込み済みＣａｍｐｂｅｌｌｅｄ  ｉｎ  ＤＮＡの一部分（これはわずか一塩基でもよい）も生じさせ、元の宿主細胞と比較して、「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｏｕｔ」細胞が染色体中に１つ以上の意図的な変化を含有するようにする（例えば、一塩基置換、多塩基置換、異種遺伝子もしくはＤＮＡ配列の挿入、相同遺伝子または組換え相同遺伝子の追加コピーもしくはコピー群の挿入、または２つ以上の上記で列挙されるこれらの前述の例を含むＤＮＡ配列の挿入）。
【０２８２】
「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｏｕｔ」細胞または菌株は、通常、必ずしもではないが、「Ｃａｍｐｂｅｌｌｅｄ  ｉｎ」ＤＮＡ配列の一部分（放棄されることが望ましい部分）に含有される遺伝子、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、ｓａｃＢ遺伝子（約５％〜１０％スクロースの存在下で培養された細胞で発現されると致死である）に対する対抗選択によって得られる。対抗選択を用いても用いなくても、所望の「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｏｕｔ」細胞は、任意のスクリーニング可能な表現型を使用して所望の細胞に関してスクリーニングすることによって取得または同定することができ、このスクリーニング可能な表現型は、例えば、コロニーの形態、コロニーの色、抗生物質耐性の存在または不存在、ポリメラーゼ連鎖反応に基づく特定のＤＮＡ配列の存在または不存在、栄養素要求性の存在または不存在、酵素の存在または不存在、コロニー核酸ハイブリダイゼーション、抗体スクリーニングなどを含むが、これらに限定されるものではない。また、「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｉｎ」および「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｏｕｔ」という用語は、上記方法またはプロセスをいうために動詞として様々な時制で使用することもできる。
【０２８３】
「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｉｎ」または「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｏｕｔ」を生じさせる相同組換えイベントが相同ＤＮＡ配列内のＤＮＡ塩基の範囲にわたり生じる可能性があること、および相同配列がこの範囲の少なくとも一部分に関して互いに同一であるので、通常、クロスオーバーイベントが生じた位置を正確に特定することは可能でないことが理解される。いいかえれば、どの配列が最初は挿入ＤＮＡ由来であり、どの配列が最初は染色体ＤＮＡ由来であったかを正確に特定することは不可能である。さらに、第１の相同ＤＮＡ配列および第２の相同ＤＮＡ配列は、通常、部分的に非相同性の領域によって分離され、「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｏｕｔ」細胞の染色体中に沈着したままになるのはこの非相同性の領域である。
【０２８４】
実用性においては、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍでは、典型的に第１および第２の相同ＤＮＡ配列は、長さが少なくとも約２００塩基対であり、数千塩基対までの長さであり得るが、手順はより短いか、またはより長い配列に関して機能させることができる。例えば、第１および第２の相同配列の長さは約５００〜２０００塩基の範囲であることが可能で、「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｉｎ」から「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｏｕｔ」を得ることは、第１および第２の相同配列がほぼ同一の長さであり、好ましくは差が２００塩基対未満あり、最も好ましくは塩基対において２配列のうちの短い配列が長い配列の長さの少なくとも７０％であるように調整することによって促進される。「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ＩｎおよびＣａｍｐｂｅｌｌ  Ｏｕｔ法」は、国際特許出願公開第２００７０１２０７８号において記述されている。
【０２８５】
実施例
以下の実験は、ｌｉｐＢまたはｌｐｌと同様にＣ．ｊｅｉｅｋｅｉｕｍホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼおよびｇｃｖＨＴＰの過剰発現がどのようにメチオニン生産の増加につながるか実証している。しかし、これらの実験は、いかなる形であれ本発明を限定することを意味するものではない。
【０２８６】
振盪フラスコ実験およびＨＰＬＣアッセイ
標準糖蜜培地を用いる振盪フラスコ実験を二重または四重で菌株で実施した。糖蜜培地は、１リットルの培地中に以下の成分を含有していた。４０ｇのグルコース、６０ｇの糖蜜、２０ｇの（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．４ｇのＭｇＳＯ4＊７Ｈ2Ｏ、０．６ｇのＫＨ2ＰＯ4、１０ｇの酵母抽出物（ＤＩＦＣＯ）、５ｍｌの４００ｍＭスレオニン、２ｍｇのＦｅＳＯ4．７Ｈ2Ｏ、２ｍｇのＭｎＳＯ4．Ｈ2Ｏ、および５０ｇのＣａＣＯ3（Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ  Ｈａｅｎ）（ｄｄＨ2Ｏで容量を補う）。ｐＨは、２０％のＮＨ4ＯＨで７．８まで調整した。２０ｍｌの連続撹拌培地（ＣａＣＯ3を懸濁状態で維持するため）を２５０ｍｌバッフル付きＢｅｌｌｃｏ振盪フラスコに加え、フラスコを２０分間オートクレーブした。オートクレーブ処理に続いて、基本培地１リットルあたり４ｍｌの「４Ｂ溶液」を加えた（または８０μｌ／フラスコ）。「４Ｂ溶液」は、１リットルあたり、０．２５ｇの塩酸チアミン（ビタミンＢ１）、５０ｍｇのシアノコバラミン（ビタミンＢ１２）、２５ｍｇのビオチン、１．２５ｇの塩酸ピリドキシン（ビタミンＢ６）を含有し、ビオチンを溶解するために１２．５ｍＭ  ＫＰＯ4、ｐＨ７．０で緩衝化し、濾過滅菌した。Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃフロアシェーカー内に２００または３００ｒｐｍで、ゴムバンドよって固定されたＢｉｏｓｈｉｅｌｄペーパーでカバーされたバッフル付きフラスコ中で、約２８℃または３０℃で約４８時間、培養物を増殖させた。試料は、典型的に約２４時間および／または約４８時間で採取した。細胞を遠心によって除去し、次いで上清を等容量の６０％アセトニトリルまたは６０％エタノールで希釈し、次にＣｅｎｔｒｉｃｏｎ  ０．４５μｍスピンカラムを使用して溶液混合物を膜濾過した。ＨＰＬＣを使用して、濾液を、メチオニン、グリシンおよびホモセリン、Ｏ−アセチルホモセリン、スレオニン、イソロイシン、リシン、および他の指定アミノ酸の濃度に関して測定した。
【０２８７】
ＨＰＬＣアッセイでは、濾過した上清を０．４５μｍの濾過済み１ｍＭ  Ｎａ2ＥＤＴＡで１：１００に希釈し、１μｌの溶液をホウ酸バッファー（８０ｍＭ  ＮａＢＯ3、２．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ１０．２）中のＯＰＡ試薬（ＡＧＩＬＥＮＴ）で誘導体化し、２００×４．１ｍｍのＨｙｐｅｒｓｉｌ  ５μ  ＡＡ−ＯＤＳカラムに注入し、Ｇ１３２１Ａ蛍光検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズＨＰＬＣ（ＡＧＩＬＥＮＴ）上で泳動した。励起波長は３３８ｎｍであり、モニターした発光波長は４２５ｎｍであった。アミノ酸標準溶液をクロマトグラフィーにかけ、それを使用して、種々のアミノ酸の保持時間および標準ピーク領域を測定した。Ａｇｉｌｅｎｔによって提供される添付のソフトウェアパッケージであるＣｈｅｍ  Ｓｔａｔｉｏｎを、機器コントロール、データ収集およびデータ処理に使用した。ハードウェアは、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｉｎｄｏｗｓ  ＮＴ４．０（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｐａｃｋ（ＳＰ６ａ）でアップデート）をサポートしているＨＰ  Ｐｅｎｔｉｕｍ  ４コンピュータであった。
【０２８８】
（実施例１）Ｍ２０１４株の作製
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株ＡＴＣＣ１３０３２をＤＮＡ  Ａ（ｐＨ２７３とも呼ばれる）（配列番号２１）で形質転換し、「Ｃａｍｐｂｅｌｌｅｄ  ｉｎ」して「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｉｎ」株を得た。次に「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｉｎ」株を「Ｃａｍｐｂｅｌｌｅｄ  ｏｕｔ」して、フィードバック耐性ホモセリンデヒドロゲナーゼ酵素（ｈｏｍfbr）をコードしている遺伝子を含有する「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｏｕｔ」株Ｍ４４０を得た。得られたホモセリンデヒドロゲナーゼタンパク質は、Ｓ３９３がＦ３９３に変化しているアミノ酸変化を含んでいた（Ｈｓｄｈ  Ｓ３９３Ｆと呼ばれる）。
【０２８９】
続いてＭ４４０株を、ＤＮＡ  Ｂ（ｐＨ３７３とも呼ばれる）（配列番号２２）で形質転換して、「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｉｎ」株を得た。次に「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｉｎ」株を「Ｃａｍｐｂｅｌｌｅｄ  ｏｕｔ」して、フィードバック耐性アスパラギン酸キナーゼ酵素（Ａｓｋfbr）（ｌｙｓＣによってコードされる）をコードしている遺伝子を含有する「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｏｕｔ」株Ｍ６０３を得た。得られたアスパラギン酸キナーゼタンパク質では、Ｔ３１１がＩ３１１に変化した（ＬｙｓＣ  Ｔ３１１Ｉと呼ばれる）。
【０２９０】
Ｍ６０３株が約１７．４ｍＭのリシンを産生したが、一方、ＡＴＣＣ１３０３２株は測定可能な量のリシンを産生しなかったことが判明した。さらに第２表に要約するように、ＡＴＣＣ１３０３２株によっては測定可能な量が産生されないのに比較して、Ｍ６０３株は約０．５ｍＭのホモセリンを産生した。
【０２９１】
第２表  菌株ＡＴＣＣ１３０３２およびＭ６０３によって産生されたホモセリン、Ｏ−アセチルホモセリン、メチオニンおよびリシンの量
【表１４】
2010518837.tif 000015
【０２９２】
Ｍ６０３株をＤＮＡ  Ｃ（ｐＨ３０４とも呼ばれる）（配列番号２３）によって形質転換して、「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｉｎ」株を得た後、「Ｃａｍｐｂｅｌｌｅｄ  ｏｕｔ」して、「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｏｕｔ」株Ｍ６９０を得た。Ｍ６９０株は、ｍｅｔＨ遺伝子（Ｐ497  ｍｅｔＨと呼ばれる）の上流のＰｇｒｏＥＳプロモーターを含有していた。Ｐ497プロモーターの配列を配列番号４に示す。以下の第３表に示すように、Ｍ６９０株は約７７．２ｍＭのリシンおよび約４１．６ｍＭのホモセリンを産生した。
【０２９３】
第３表  菌株Ｍ６０３およびＭ６９０によって産生されたホモセリン、Ｏ−アセチルホモセリン、メチオニンおよびリシンの量
【表１５】
2010518837.tif 000016
【０２９４】
続いてＭ６９０株を以下のように突然変異させた。ＢＨＩ培地（ＢＥＣＴＯＮ  ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ）中で培養したＭ６０３の一晩培養物を５０ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ５．５で洗浄し、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソグアニジン（５０ｍＭクエン酸ｐＨ５．５中１０ｍｇ／ｍｌ）で３０℃で２０分間処理した。処理後、細胞を５０ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ５．５で再度洗浄し、以下の成分を含有する培地にまいた。（全ての記述される量は５００ｍｌ培地に関して算出される）１０ｇの（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．５ｇのＫＨ2ＰＯ4、０．５ｇのＫ2ＨＰＯ4、０．１２５ｇのＭｇＳＯ４＊７Ｈ2Ｏ、２１ｇのＭＯＰＳ、５０ｍｇのＣａＣｌ2、１５ｍｇのプロトカテク酸、０．５ｍｇのビオチン、１ｍｇのチアミン、および５ｇ／ＬのＤ，Ｌ−エチオニン（ＳＩＧＭＡ  ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ，ＣＡＴＡＬＯＧ  ＃Ｅ５１３９）（ＫＯＨでｐＨ７．０に調整）。さらに、培地は、１０ｇ／ＬのＦｅＳＯ4＊７Ｈ2Ｏ、１ｇ／ＬのＭｎＳＯ4＊Ｈ2Ｏ、０．１ｇ／ＬのＺｎＳＯ4＊７Ｈ2Ｏ、０．０２ｇ／ＬのＣｕＳＯ4、および０．００２ｇ／ＬのＮｉＣｌ2＊６Ｈ2Ｏから構成される０．５ｍｌの微量金属溶液を含有していた（全て０．１Ｍ  ＨＣｌ中に溶解）。最終培地を濾過によって滅菌し、培地に、４０ｍｌの滅菌５０％グルコース溶液（４０ｍｌ）および滅菌寒天を１．５％の最終濃度まで加えた。最終の寒天含有培地を寒天プレートに注ぎ、最少エチオニン培地とラベルをつけた。突然変異株をプレート（最少エチオニン）にまき、３０℃で３から７日間インキュベートした。培地上で増殖したクローンを単離し、同一の最少エチオニン培地上に再度画線した。メチオニン生産分析のためにいくつかのクローンを選択した。
【０２９５】
メチオニン生産を、以下のように分析した。菌株をＣＭ寒天培地上で３０℃で２日間培養した。培地は、１０ｇ／ＬのＤ−グルコース、２．５ｇ／ＬのＮａＣｌ、２ｇ／Ｌの尿素、１０ｇ／Ｌのバクトペプトン（ＤＩＦＣＯ）、５ｇ／Ｌの酵母抽出物（ＤＩＦＣＯ）、５ｇ／Ｌの牛肉抽出物（ＤＩＦＣＯ）、２２ｇ／Ｌの寒天（ＤＩＦＣＯ）を含有し、約１２１℃で２０分間オートクレーブした。
【０２９６】
菌株を増殖させた後、細胞をかき取り、０．１５Ｍ  ＮａＣｌに再懸濁した。本培養では、かき取った細胞の懸濁液を、０．５ｇの固形およびオートクレーブしたＣａＣＯ3（ＲＩＥＤＥＬ  ＤＥ  ＨＡＥＮ）とともに、出発ＯＤ６００ｎｍで約１．５〜１０ｍｌの培地ＩＩ（下記参照）に加え、細胞を、軌道振盪プラットホーム（約２００ｒｐｍ、３０℃）上で、バッフルのない１００ｍｌ振盪フラスコ中で７２時間インキュベートした。培地ＩＩは、４０ｇ／Ｌのスクロース、６０ｇ／Ｌの全糖（糖蜜由来）（糖度に関して算出）、１０ｇ／Ｌの（ＮＨ4）4ＳＯ4、０．４ｇ／ＬのＭｇＳＯ4＊７Ｈ2Ｏ、０．６ｇ／ＬのＫＨ2ＰＯ4、０．３ｍｇ／Ｌのチアミン＊ＨＣｌ、１ｍｇ／Ｌのビオチン、２ｍｇ／ＬのＦｅＳＯ4および２ｍｇ／ＬのＭｎＳＯ4を含んでいた。培地を、ＮＨ4ＯＨでｐＨ７．８に調整し、約１２１℃で約２０分間オートクレーブした。オートクレーブおよび冷却後、濾過滅菌ストック溶液（２００μｇ／ｍｌ）からビタミンＢ12（シアノコバラミン）（ＳＩＧＭＡ  ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ）を加えて、１００μｇ／Ｌの最終濃度にした。
【０２９７】
試料を培地から採取し、アミノ酸含量に関して測定した。生成アミノ酸（メチオニンを含む）を、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  Ｓｅｒｉｅｓ  ＬＣ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＨＰＬＣ（ＡＧＩＬＥＮＴ）でＡｇｉｌｅｎｔアミノ酸法を使用して測定した。オルト−フタルアルデヒドでの試料のプレカラム誘導体化により、Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  ＡＡ−ｃｏｌｕｍｎ（ＡＧＩＬＥＮＴ）での分離後に、産生アミノ酸の定量が可能になった。
【０２９８】
Ｍ６９０の少なくとも２倍のメチオニン力価を示したクローンを単離した。追加実験で使用されるそのような１クローンをＭ１１９７と命名し、２００５年５月１８日にＤＳＭＺ  ｓｔｒａｉｎ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに菌株番号ＤＳＭ１７３２２として寄託した。以下の第４表に要約したように、この菌株によるアミノ酸産生をＭ６９０株による産生と比較した。
【０２９９】
第４表  菌株Ｍ６９０およびＭ１１９７によって産生されたホモセリン、Ｏ−アセチルホモセリン、メチオニンおよびリシンの量
【表１６】
2010518837.tif 000017
【０３００】
Ｍ１１９７株をＤＮＡ  Ｆ（ｐＨ３９９とも呼ばれる、配列番号２４）によって形質転換して、「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｉｎ」株を得て、続いて、これを「Ｃａｍｐｂｅｌｌｅｄ  ｏｕｔ」してＭ１４９４株を得た。この菌株はホモセリンキナーゼの遺伝子中に突然変異を含有し、この突然変異は、得られたホモセリンキナーゼ酵素にＴ１９０からＡ１９０へのアミノ酸変化を生じさせる（ＨｓｋＴ１９０Ａと呼ばれる）。以下の第５表に要約したように、Ｍ１４９４株によるアミノ酸産生をＭ１１９７株による産生と比較した。
【０３０１】
第５表  菌株Ｍ１１９７およびＭ１４９４によって産生されたホモセリン、Ｏ−アセチルホモセリン、メチオニンおよびリシンの量
【表１７】
2010518837.tif 000018
【０３０２】
Ｍ１４９４株をＤＮＡ  Ｄ（ｐＨ４８４とも呼ばれる、配列番号２５）によって形質転換して「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｉｎ」株を得て、続いて、これを「Ｃａｍｐｂｅｌｌｅｄ  ｏｕｔ」してＭ１９９０株を得た。Ｍ１９９０株は、ｇｒｏＥＳプロモーターおよびＥＦＴＵ（伸長因子Ｔｕ）プロモーターの両者を使用してｍｅｔＹ対立遺伝子を過剰発現する（Ｐ497Ｐ1284  ｍｅｔＹと呼ばれる）。Ｐ497Ｐ1284プロモーターの配列を配列番号２６に記載する。以下の第６表に要約したように、Ｍ１４９４株によるアミノ酸産生をＭ１９９０株による産生と比較した。
【０３０３】
第６表  菌株Ｍ１４９４およびＭ１９９０によって産生されたホモセリン、Ｏ−アセチルホモセリン、メチオニンおよびリシンの量
【表１８】
2010518837.tif 000019
【０３０４】
ＤＮＡ  Ｅ（ｐＨ４９１とも呼ばれる、配列番号２７）によってＭ１９９０株を形質転換して、「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｉｎ」株を得て、次に、これを「Ｃａｍｐｂｅｌｌｅｄ  ｏｕｔ」して、「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｏｕｔ」株のＭ２０１４を得た。Ｍ２０１４株は、スーパーオキシドジスムターゼプロモーターを使用してｍｅｔＡ対立遺伝子を過剰発現する（Ｐ3119  ｍｅｔＡと呼ばれる）。Ｐ3119プロモーターの配列を配列番号３に記載する。以下の第７表に要約したように、Ｍ２０１４株によるアミノ酸産生をＭ１９９０株による産生と比較した。
【０３０５】
第７表  菌株Ｍ１４９４およびＭ１９９０によって産生されたホモセリン、Ｏ−アセチルホモセリン、メチオニンおよびリシンの量
【表１９】
2010518837.tif 000020
【０３０６】
（実施例２）Ｍ２０１４からのｍｃｂＲの欠失
ＲＸＡ００６５５欠失を含有するプラスミドｐＨ４２９（配列番号２８）を使用して、組込みおよび除去によってｍｃｂＲ欠失をＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍに導入した（国際特許出願公開第２００４／０５０６９４（Ａ１）号参照）。
【０３０７】
プラスミドｐＨ４２９を、カナマイシン耐性に対する選択によってＭ２０１４に形質転換した（Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｉｎ）。ｓａｃＢ対抗選択を使用して、おそらく除去によって組込みプラスミドが失われた（Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｏｕｔ）形質転換株のカナマイシン感受性誘導体を単離した。形質転換株は、小さなコロニーおよび大きなコロニーを作成したカナマイシン感受性誘導体を産生した。両方の大きさのコロニーを、ｍｃｂＲ欠失の存在を検出するために、ＰＣＲによってスクリーニングした。大きなコロニーで欠失を含有したものはなかったが、一方、小さなコロニーの６０〜７０％が予期したｍｃｂＲ欠失を含有していた。
【０３０８】
元の分離物をＢＨＩプレート上で単一コロニーに対して画線すると、ごく小さなコロニーと小さなコロニーが混合して現れた。ごく小さなコロニーをＢＨＩ上で再度画線すると、ふたたびごく小さなコロニーと小さなコロニーが混合して現れた。小さなコロニーをＢＨＩ上で再度画線すると、コロニーの大きさは、通常小さく、均一であった。２つの小さな単一コロニーの分離物（ＯＭ４０３−４およびＯＭ４０３−８と呼ばれる）を、追加研究のために選択した。
【０３０９】
振盪フラスコによる実験（第８表）は、ＯＭ４０３−８が親のＭ２０１４の少なくとも２倍のメチオニン量を産生することを示した。また、この菌株は、産生したリシンの量がＭ２０１４の５分の１未満であり、このことは炭素フラックスのアスパラギン酸セミアルデヒドからホモセリンへの転換を示唆している。３番目の著しい違いとして、Ｍ２０１４と比較して、ＯＭ４０３によるイソロイシンの蓄積に１０倍を超える増加が見られた。培養株は、標準糖蜜培地で４８時間増殖させた。
【０３１０】
第８表  新規増殖細胞を接種された振盪フラスコ培養におけるＯＭ４０３株の分離物によるアミノ酸産生
【表２０】
2010518837.tif 000021
【０３１１】
また、第９表に示すように、Ｍ２０１４と比較して、ＯＭ４０３によるＯ−アセチルホモセリンの蓄積に１５倍を超える減少が見られた。この結果の最も有望な説明は、Ｍ２０１４中に蓄積する大部分のＯ−アセチルホモセリンがＯＭ４０３のメチオニン、ホモシステインおよびイソロイシンに変換されているということである。培養株は、標準糖蜜培地で４８時間増殖させた。
【０３１２】
第９表  新規増殖細胞を接種された振盪フラスコ培養におけるＯＭ４０３の２つの分離物によるアミノ酸産生
【表２１】
2010518837.tif 000022
【０３１３】
（実施例３）ｍｅｔＱ発現の減少
ＯＭ４０３−８のメチオニンの移入を減少させるために、ｍｅｔＱ遺伝子のプロモーターおよび５’部分を欠失させた。ｍｅｔＱ遺伝子は、複合体が機能するために必要とされるメチオニン移入複合体のサブユニットをコードしている。これは、プラスミドｐＨ４４９（配列番号２９）での標準的Ｃａｍｐｂｅｌｌｉｎｇ  ｉｎおよびＣａｍｐｂｅｌｌｉｎｇ  ｏｕｔ技術を使用して達成した。ＯＭ４０３−８およびＯＭ４５６−２を、振盪フラスコアッセイにおいてメチオニン産生について測定した。この結果（第１０表）は、ＯＭ４５６−２がＯＭ４０３−８より多くのメチオニンを産生したことを示している。培養株は、標準糖蜜培地で４８時間増殖させた。
【０３１４】
第１０表  ＯＭ４５６−２の振盪フラスコアッセイ
【表２２】
2010518837.tif 000023
【０３１５】
（実施例４）ＯＭ４６９の構築
ＯＭ４５６−２のファージλＰRプロモーターとｍｅｔＦプロモーターを置換することによって、ｍｅｔＱの欠失およびｍｅｔＦの過剰発現の両方を含むＯＭ４６９と呼ばれる菌株を構築した。これは、プラスミドｐＯＭ４２７（配列番号３０）での標準的Ｃａｍｐｂｅｌｌｉｎｇ  ｉｎおよびＣａｍｐｂｅｌｌｉｎｇ  ｏｕｔ技術を使用して達成した。ＯＭ４６９の４つの分離物を、振盪フラスコ培養アッセイにおいてメチオニン産生について測定したところ、第１１表に示すように、これらは全てでＯＭ４５６−２よりメチオニンを多く産生していた。培養株は、２ｍＭスレオニンを含む標準糖蜜培地で４８時間増殖させた。
【０３１６】
第１１表  ｍｅｔＦプロモーターの代わりにファージラムダＰRプロモーターを含むＯＭ４５６−２の誘導体であるＯＭ４６９の振盪フラスコアッセイ
【表２３】
2010518837.tif 000024
【０３１７】
（実施例５）Ｍ２５４３の構築
ＯＭ４６９−２株を、プラスミドｐＣＬＩＫ５Ａ  ＰＳＯＤ  ＴＫＴ（配列番号３１に示す）を用いて電気穿孔法によって形質転換した。これは、標準的Ｃａｍｐｂｅｌｌｉｎｇ  ｉｎおよびＣａｍｐｂｅｌｌｉｎｇ  ｏｕｔ技術を使用して達成した。
【０３１８】
Ｍ２５４３とラベルを付けたＯＭ  ４６９  ＰＳＯＤ  ＴＫＴの分離物を、振盪フラスコ培養アッセイでメチオニン産生に関して測定したところ、これらはＯＭ４６９−２より多くのメチオニンを産生していた。Ｍ２５４３株の結果を第１２表に示す。
【０３１９】
第１２表  ＯＭ４６９およびＭ２５４３の振盪フラスコアッセイ
【表２４】
2010518837.tif 000025
【０３２０】
（実施例６）ＧＫ１２５９の構築
セリンデアミナーゼ（ｓｄａ）の発現を減少させるために、一部のｓｄａ遺伝子を欠失させた。これは、プラスミドｐＨ６２６  ｉｎｔ  ＳａｃＢデルタｓｄａＡ（配列番号３２）で標準的Ｃａｍｐｂｅｌｌｉｎｇ  ｉｎおよびＣａｍｐｂｅｌｌｉｎｇ  ｏｕｔ技術を使用して達成した。このために、Ｍ２５４３株を、プラスミドｐＨ６２６  ｉｎｔ  ＳａｃＢデルタｓｄａＡを用いて電気穿孔法によって形質転換した。得られた菌株は、ＧＫ１２５９と命名した。
【０３２１】
（実施例７）ＯＭ２６４Ｃの構築
プラスミドｐＯＭ２５３（配列番号３３）を使用して、ｓｅｒＡを欠失させ、これをＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株Ｍ２０１４のスペクチノマイシン耐性と置換した。得られた「Ｃａｍｐｂｅｌｌｅｄ  ｏｕｔ」株、Ｍ２０１４  ΔｓｅｒＡ：：ｓｐｅｃをＯＭ２６４Ｃと命名した。ＯＭ２６４Ｃは、セリン栄養素要求株である。機能的ＧＣＳも欠いているので、ＯＭ２６４Ｃは、セリンを欠いた最少培地では増殖できないが、グリシンを含む培地では増殖することができる。しかし、機能的ＧＣＳ系をＯＭ２６４Ｃに組み込んだ場合、グリシンを含む最小培地で増殖する能力を得る。
【０３２２】
最小（化学的に定義された）プレートの製法は以下の通りであった。
【０３２３】
【表２５】
2010518837.tif 000026
【０３２４】
１０×Ｓｐｉｚｉｚｅｎ塩
硫酸アンモニウム  ２０ｇ
リン酸水素二カリウム（三水和物）  １７４ｇ
リン酸二水素カリウム（無水）  ６０ｇ
クエン酸ナトリウム（二水和物）  １０ｇ
硫酸マグネシウム（七水和物）  ２ｇ
１リットルまで蒸留水
３．５ｍｌの０．４％ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ（濾過滅菌）および１ｍｌの微量元素溶液を添加（下記参照）。最終ｐＨは約７．２とすること
濾過滅菌。
【０３２５】
微量元素溶液：１リットルに対する量
Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ  ０．１５ｇ
Ｈ3ＢＯ3  ２．５ｇ
ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ  ０．７ｇ
ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ  ０．２５ｇ
ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ  １．６ｇ
ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０．３ｇ
１リットルまで蒸留水
濾過滅菌
４Ｂ溶液：１リットルに対する量
チアミンＨＣｌ（ビタミンＢ1）  ０．２５ｇ
シアノコバラミン（ビタミンＢ12）  ５０ｍｇ
ビオチン  ２５〜２８ｍｇ
ピリドキシンＨＣｌ（ビタミンＢ6）  １．２５ｇ
５０ｍＭ  リン酸カリウム（ｐＨ７．０）に溶解
濾過滅菌。暗所に貯蔵
【０３２６】
（実施例８）Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるＣ．ｊｅｉｋｅｉｕｍ  ｇｃｖＰＴＨ遺伝子を発現する菌株の構築
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍとは異なり、Ｃ．ｊｅｉｋｅｉｕｍと命名された近縁株は、ＧＣＳを含有する。Ｃ．ｊｅｉｋｅｉｕｍ染色体において、ｇｃｖＰ、ＴおよびＨ遺伝子は、オペロン内で一緒にクラスター形成する（Ｔａｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，ｖｏｌ  １８７，ｐｐ４６７１−４６８２）。このクラスターを、テンプレートとしてＣ．ｊｅｉｋｅｉｕｍ株Ｋ４１１染色体ＤＮＡを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、４つのオーバーラップするサブセット片にクローン化した。
【０３２７】
必要なＤＮＡは、配列を４つの小さな領域に分割し、４つの独立したより小さなＰＣＲ断片を得ることによって得た。４つの断片を、４つのプライマーセットで増幅した。人工ＸｂａＩ部位および人工リボソーム結合部位を、それぞれのセンスプライマーにおけるｇｃｖＰ開始コドンのすぐ上流で操作し、人工ＢａｍＨＩ部位は、それぞれのアンチセンスプライマーのｇｃｖＨ停止コドンのすぐ下流で操作した。これにより、ｇｃｖＰＴＨクラスターのコード配列を再構築し、ＢａｍＨＩ断片にＸｂａＩを担持たせることが可能となった。
【０３２８】
再構成されたｇｃｖＰＴＨクラスターを含有する、得られたＸｂａＩ＋ＢａｍＨＩ断片を、次に、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ｇｒｏＥＳＬプロモーター（本明細書ではＰ497と命名）またはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓファージＳＰＯ１プロモーター（本明細書ではＰ15と命名、配列番号４２）由来の遺伝子を発現させるようにデザインされたＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ複製プラスミドにクローン化した。得られたプラスミドを、それぞれｐＯＭ６１５（配列番号３４）およびｐＯＭ６１６（配列番号３５）と命名した。Ｐ497およびＰ15プロモーターは、下流に位置する遺伝子の構成的発現を促進する理由により使用した。特に、これらのプロモーターは、グリシン、セリン、メチオニン、チミジン、プリンなどの任意のグリシン関連代謝物に著明に代謝されることはない。
【０３２９】
（実施例９）Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるＣ．ｊｅｉｋｅｉｕｍ  ｇｃｖＰＴＨ遺伝子機能
プラスミドｐＯＭ６１５、ｐＯＭ６１６および空のベクターｐＣＬＩＫを、硫酸カナマイシン（２５ｍｇ／Ｌ）を含有するＢｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ（以前はＤｉｆｃｏ、現在Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）寒天プレート上での選択を用いて、それぞれ別々に検定系統Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株ＯＭ２６４Ｃおよびメチオニン産生株Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株ＧＫ１２５９に形質転換した。ＯＭ２６４Ｃ形質転換体を、セリンは欠いているが、グリシンを含有する最小プレート上で画線した。十分な量のこの補因子のＧｃｖＨが確実に存在するように、リポ酸を培地に加えて最終濃度１ｍｇ／Ｌとした。
【０３３０】
ｐＯＭ６１５およびｐＯＭ６１６の両者の誘導株である、ＯＭ２６４Ｃ（ｐＯＭ６１５）およびＯＭ２６４Ｃ（ｐＯＭ６１６）、ならびにＧＫ１２５９（ｐＯＭ６１５）およびＧＫ１２５９（ｐＯＭ６１６）は増殖したが、一方ｐＣＬＩＫ形質転換体（ＯＭ２６４Ｃ（ｐＣＬＩＫ）は増殖しなかった。
【０３３１】
（実施例１０）Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるＣ．ｊｅｉｋｅｉｕｍ機能由来のｌｉｐＢＡ遺伝子
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍはリポ酸原栄養菌であり、ピルビン酸デヒドロゲナーゼおよびα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼが活性を示すので、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍはおそらくリポイルシンテターゼを持つ。
【０３３２】
Ｅ．ｃｏｌｉにおいては、標的タンパク質にリポ酸が結合（連結）するための２つの異なる経路があり、これらは内因的に合成されるリポ酸のためのＬｉｐＢ依存性経路および供給されるリポ酸のためのＬｐｌＡ経路である（Ｍｏｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｖｏｌ  １７７，ｐｐ１−１０）。
【０３３３】
配列比較によると、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍは、ＬｉｐＢおよびＬｐｌＡの両方に対して良好な相同体を持つように見える。したがって、ｌｉｐＢ遺伝子およびこの天然プロモーターを、ｌｉｐＡ遺伝子と共に、テンプレートとしてＣ．ｊｅｉｋｅｉｕｍ株Ｋ４１１染色体ＤＮＡからのＰＣＲによってクローン化した。得られた平滑なＰＣＲ断片を、ｐＯＭ６１５またはｐＯＭ６１６の固有のＳｗａｌ部位に連結させ、それぞれｐＯＭ６２０ＡＦ（配列番号３６）およびｐＯＭ６２１ＡＲ（配列番号３７）を得た。
【０３３４】
プラスミドｐＯＭ６２０ＡＦおよびｐＯＭ６２１ＡＲを、それぞれＯＭ２６４Ｃ株に形質転換することによって、それぞれＯＭ２６４Ｃ（ｐＯＭ６２０ＡＦ）およびＯＭ２６４Ｃ（ｐＯＭ６２１ＡＲ）を得て、またメチオニン産生株ＧＫ１２５９に形質転換することによって、それぞれＧＫ１２５９（ｐＯＭ６２０ＡＦ）およびＧＫ１２５９（ｐＯＭ６２１ＡＲ）を得た。ＯＭ２６４Ｃ形質転換体を、上述の最小グリシンプレート上に画線し（しかし、リポ酸なしで）、両方の形質転換体は増殖したが、一方ＯＭ２６４Ｃ（ｐＣＬＩＫ）は増殖しなかった。このことは、この２つが一緒にＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいて発現するとき、Ｃ．ｊｅｉｋｅｉｕｍ  ＬｉｐＢ経路がＣ．ｊｅｉｋｅｉｕｍ  ＧｃｖＨタンパク質をリポイル化できることを実証するものである。
【０３３５】
ｐＯＭ６１５、ｐＯＭ６１６、ｐＯＭ６２０ＡＦ、ｐＯＭ６２１ＡＲおよびｐＣＬＩＫのＧＫ１２５９形質転換体を、メチオニンおよびグリシン産生について、リポ酸なし、または約１０ｍｇ／ｍｌの最終濃度までリポ酸を加えた糖蜜培地を使用して振盪フラスコで試験した。結果を、以下の第１３表および第１４表に示す。
【０３３６】
第１３表  ｌｉｐＢＡと共にＣ．ｊｅｉｋｅｉｕｍ  ｇｃｖＰＴＨを発現するようにデザインされ、糖蜜培地での振盪フラスコにおいて増殖された様々なプラスミドで形質転換されたＧＫ１２５９によるメチオニンおよびグリシン産生
【表２６】
2010518837.tif 000027
【０３３７】
第１４表  ｌｉｐＢＡと共にＣ．ｊｅｉｋｅｉｕｍ  ｇｃｖＰＴＨを発現するようにデザインされ、糖蜜培地での振盪フラスコにおいて増殖された様々なプラスミドで形質転換されたＯ２６４Ｃによるメチオニンおよびグリシン産生
【表２７】
2010518837.tif 000028
【０３３８】
＊メチオニンおよびグリシンの力価は、ｐＯＭ６１６＋リポ酸試料を除いて（単一試料）、２つの試料の平均である。
【０３３９】
これらの結果から、Ｃ．ｊｅｉｋｅｉｕｍ  ｇｃｖＰＴＨオペロンを発現させることによって、過剰なグリシン副産物が消費され、メチオニン力価が改善されることが明らかである。同じプラスミドからＣ．ｊｅｉｋｅｉｕｍ  ｇｃｖＰＴＨオペロンおよびＣ．ｊｅｉｋｅｉｕｍ  ｌｉｐＢＡオペロンを発現させることによって、更なる改善が達成される。
【０３４０】
（実施例１１）組み込んだカセットからのｇｃｖＰＴＨおよびｌｉｐＢＡの発現
上記で示した例において、ｇｃｖおよびｌｉｐ遺伝子を、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ内で複製するプラスミドに組み込んだ。しかし、これらの遺伝子は、組込みベクターを通して組み込むこともできる。例えば、プロモーターＰ15から発現されるＣ．ｊｅｉｋｅｉｕｍ  ｇｃｖＰＴＨオペロンを組込みベクターに連結させて、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのｂｉｏＢ座に組み込まれるようにデザインされているｐＯＭ６２７（配列番号３８）を得る。
【０３４１】
ｐＯＭ６２７は、ＯＭ４６９およびＧＫ１２５９株の「Ｃａｍｐｂｅｌｌｅｄ  ｉｎ」および「Ｃａｍｐｂｅｌｌｅｄ  ｏｕｔ」であり得る。上記の例のように、第１５表に示すようなメチオニン産生の改善およびグリシン蓄積の減少を見ることができる。
【０３４２】
第１５表  ｂｉｏＢでの組込み後にＰ15からＣ．ｊｅｉｋｅｉｕｍ  ｇｃｖＰＴＨを発現するようにデザインされ、リポ酸なしまたは１０ｍｇ／Ｌのリポ酸を加えた糖蜜培地での振盪フラスコにおいて増殖されたｐＯＭ６２７を使用したＯＭ４６９およびＧＫ１２５９の形質転換体によるメチオニンおよびグリシン産生
【表２８】
2010518837.tif 000029
【０３４３】
グリシンおよびメチオニン生産に及ぼす組込みプラスミドｐＯＭ６２７の効果は、複数のコピーを組み込むことによって、またはプロモーターの強さを増加させることによって改善できる。
【０３４４】
また、Ｃ．ｊｅｉｋｅｉｕｍ  ｌｉｐＢＡオペロンも、（複製ベクターまたは組込みベクターのいずれかに）加えることができる。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのｂｉｏＡＤ座に組込み後に、Ｐ497プロモーターからｌｉｐＢＡを発現させる組込みプラスミドの例は、ｐＯＭ１８０（配列番号３９）である。
【０３４５】
（実施例１２）Ｅ．ｃｏｌｉ  ＧＣＳ系は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいても機能する
Ｅ．ｃｏｌｉ  ｌｐｄ遺伝子を、ＰＣＲによって増幅し、組込みプラスミドに組み込んで、ｐＯＭ３３１（配列番号４０）を得た。組込み部位は、本明細書でｍｅｔＥ２と命名した遺伝子で、本遺伝子は、ｍｅｔＥの部分と相同であるが、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおける増殖またはメチオニン産生に不可欠であるようには見られない。
【０３４６】
ｐＯＭ３３１において、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｌｐｄ遺伝子は、Ｐ497プロモーターから発現する。ｐＯM３３１をＯM２６４Cに形質転換し、さらにＯＭ２６４ＣをＣａｍｐｂｅｌｌｅｄ  ｏｕｔして新規な株ＯＭ１９７を得た。本菌株は、適切な診断ＰＣＲによって組込みＰ497  ｌｐｄカセットを含有することを確認した。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｇｃｖＴＨＰオペロンを、ＰＣＲによって増幅し、複製ベクター内のＰ497プロモーターの直ぐ下流に連結し、ｐＯＭ３４４（配列番号４１）を得た。ｐＯＭ３４４およびｐＣＬＩＫを、ＯＭ１９７株に各々別に形質転換し、得られた菌株を、グリシンおよびリポ酸を含有しているが、セリンを欠いた最小グリシンプレート上に画線した（上記参照）。
【０３４７】
３０℃で数日後、ＯＭ１９７／ｐＯＭ３４４は増殖したが、ＯＭ１９７／ｐＣＬＩＫは増殖しなかった。このことはＥ．ｃｏｌｉ  ＧＣＳ系がＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいて機能していたことを実証するものである。
【０３４８】
上記の実施例において、２種の「ドナー」生物（各々とは比較的無関係である）のいずれかからクローン化された、ＧＣＳサブユニットＰ、ＴおよびＨをコードしている遺伝子、ならびにリポ酸連結または合成を触媒する酵素をコードしている遺伝子が、それぞれＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいて測定可能なＧＣＳ活性を発揮するように機能可能であり、これはグリシンを含有するが、セリンは含有しないプレート上でセリン栄養素要求性の相補性を示すことによるか、または関連の親株もしくは前駆体株（対照として空のベクターによって形質転換された）のグリシン産生と比較してメチオニン産生株によるグリシン産生の減少を示すことによるかのいずれかであることが示される。
【０３４９】
その延長上で、当業者は、本明細書に開示された実施例を理解し、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおける他のＧＣＳ系を再構成することができ、同じ（すなわち、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＣ．ｊｅｉｋｅｉｕｍ）または他のドナー生物由来の関連の遺伝子をクローン化することによって他の微生物において、ＧＣＳ活性を確立および／または増加することができると推測することは理にかなっているように見える。また、例えば、約０．１〜１０ｍｇ／Ｌでリポ酸を供給することによって、改善を達成することができる。
【０３５０】
（実施例１３）Ｍ２６ｌ６の構築
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  Ｍ２６１６を構築した。ｓｅｒＡ活性の欠失を示す本菌株は、ホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼ機能を検査することを可能にする。
【０３５１】
プラスミドｐＨＦ９６（配列番号４３）は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２と比較してＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株のｓｅｒＡ遺伝子における欠失−置換を構築するためにデザインされた組込みプラスミドである。プラスミドｐＨＦ９６  ｉｎｔ  ｓａｃＢデルタｓｅｒＡを、Ｍ２５４３の血清を欠失させるために使用した。プラスミドをＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  Ｍ２５４３に電気穿孔法によって形質転換し、カナマイシン耐性クローンを単離した。ＰＣＲによってこれらのカナマイシン耐性株を良好な「Ｃａｍｐｂｅｌｌｅｄ  ｉｎ」株と判定した後、この菌株を液体ＣＭ培地で終夜増殖させ、ＣＭ培地を含有するスクロース（１０％濃度）上にまいた。得られた「Ｃａｍｐｂｅｌｌｅｄ  ｏｕｔ」株のＭ２５４３デルタｓｅｒＡを、Ｍ２６１６と命名した。予期したように、Ｍ２６１６は、最小培地上で測定するとセリン栄養素要求株である。さらに、予期したように、機能的ホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼを欠いているので、Ｍ２６１６はセリンを欠く最小培地では増殖できないが、グリシンおよびホルメートを含有する培地では可能である（最小（化学的に定義された）培地の製法例参照）。機能的ホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼ系をＭ２６１６に組み込むならば、その時、グリシンを含有する最少培地で増殖する能力を得る。
【０３５２】
（実施例１４）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｊｅｉｋｅｉｕｍの２つの供給源由来の２つのホルミル−ＴＨＦ−シンテターゼ遺伝子のクローニング
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍと異なり、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｊｅｉｋｅｉｕｍと命名された近縁株は、ホルミル−ＴＨＦ−シンテターゼタンパク質（登録番号ＮＰ_９３９６０８）および対応する遺伝子（登録番号ＧｅｎｅＩＤ：２６４９８０８）を含有する。
【０３５３】
テンプレートの２つの供給源を、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｊｅｉｋｅｉｕｍ由来のホルミル−ＴＨＦ−シンテターゼのクローニングのために利用した。ＮＣＴＣ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  Ｌｏｎｄｏｎ（英国）、番号１１９１５（菌株表示Ｋ４１１）の菌株およびＤＳＭＺ株７１７１から誘導されたＤＮＡを使用した。染色体ＤＮＡは、製造業者の記述の通りＱｕｉａｇｅｎ  ＤＮＡキットを使用して調製した。オリゴヌクレオチドＨＳ１３０４（配列番号４４）およびＨＳ１３０５（配列番号４５）を使用して、ゲノムＤＮＡの２つの供給源（ＮＣＴＣ１１９１５およびＤＺＭＺ７１７１）由来のホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼ遺伝子のゲノム配列を増幅した。Ｒｏｃｈｅ  Ｍａｎｎｈｅｉｍから得たＰｗｏポリメラーゼを以下の条件で使用した。５２℃で３０秒アニーリングおよび７２℃で１２０秒伸長により約１７００ＢｐのＰＣＲ断片を得た。
【０３５４】
さらに、プライマーＨＳ１３０２（配列番号４６）およびＨＳ１３０３（配列番号４７）を使用して、ＡＴＣＣ１３０３２株から誘導した染色体ＤＮＡから記述のような配列でプロモーター発現ユニットを増幅した。Ｒｏｃｈｅ  Ｍａｎｎｈｅｉｍから得たＰｗｏポリメラーゼを以下の条件で使用した。５３℃で３０秒アニーリングおよび７２℃で３０秒伸長により約２００ＢｐのＰＣＲ断片を得た。
【０３５５】
両方の断片を３番目のＰＣＲ（プライマーＨＳ１３０３２およびＨＳ１３０５を加えた）に加えた。３番目のＰＣＲは、十分な量の末端から末端までのプライマーで制限量のＰＣＲ断片ＩおよびＩＩにより実施し、末端から末端までのプライマーを使用して融合させた。ＨＳ１３０２＋ＨＳ１３０５を使用して、プライマーＨＳ１３０２＋ＨＳ１３０３およびＨＳ１３０４＋ＨＳ１３０５に由来するＰＣＲ断片の融合構築物を増幅した。Ｒｏｃｈｅ  Ｍａｎｎｈｅｉｍから得たＰｗｏポリメラーゼを以下の条件で使用した。５５℃で３０秒アニーリングおよび７２℃で１２０秒伸長により約１９００ＢｐのＰＣＲ断片を得た。
【０３５６】
断片を、ＧＦＸ  ＰＣＲ精製キットで精製し、制限酵素ＭｌｕＩおよびＸｂａＩを使用して消化した。ホルミル−ＴＨＦ−シンテターゼ遺伝子の挿入断片を含有する陽性プラスミドを配列決定した。
【０３５７】
Ｃ．ｊｅｉｋｅｉｕｍ  ＮＣＴＣ  Ｋ１１９１５から誘導した遺伝子を配列決定した。この遺伝子の配列決定は、予想通りの配列を示した。Ｃ．ｊｅｉｋｅｉｕｍ  ＤＳＭＺ７１７１から誘導した遺伝子を配列決定した。この遺伝子の配列決定は、プラスミド配列ｐＨ６５７で述べたような配列を示した。
【０３５８】
ＮＣＴＣ  Ｋ１１９１５由来のホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼを含むプラスミドｐＨ６５５（配列番号４８）およびＤＳＭＺ７１７１由来のホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼを含むｐＨ６５７（配列番号４９）を、電気穿孔法によって機能的ｓｅｒＡ遺伝子を欠くＭ２６１６株に形質転換した。
【０３５９】
得られたＭ２６１６（ｐＨ６５５）およびＭ２６１６（ｐＨ６５７）株を、プラスミドを欠く菌株と共に、１０ｍＭスレオニン、２０ｍＭ  Ｎａホルメートおよび２０ｍＭグリシン＋−１０ｍＭセリンを含有する最少培地に画線した。ｐＣＬＩＫ５ａを除いたプラスミドｐＨ６５５およびｐＨ６５７を含有する菌株は、ホルメートおよびグリシンを含有する最少培地でコロニーを形成したが、一方、長期にわたるインキュベーションの後でさえ、Ｍ２６１６株はこのセリン欠いた培地でコロニーを生じなかった。セリン（２０ｍＭ）を加えていない、スレオニン、Ｎａホルメートおよびグリシンを加えた同じ最小培地で、Ｍ２６１６を含む全ての菌株がコロニーを形成した。
【０３６０】
この結果は、セリン合成においてホルメートを利用する菌株を提供するために、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｊｅｉｋｅｉｕｍ  ＮＣＴＣおよびＤＳＭＺ７１７１から誘導されるホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼの良好な機能的発現を示した。
【０３６１】
（実施例１５）ホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼ遺伝子を発現するメチオニン過剰産生株の構築
プラスミドｐＨ６５５およびｐＨ６５７を、電気穿孔法によってＧＫ１２５９株に形質転換した。得られたＧＫ１２５９（ｐＨ６５５）およびＧＫ１２５９（ｐＨ６５７）株を、プラスミドを含まない菌株と共に、前述のように振盪フラスコアッセイにおいてインキュベートした。さらに、２０ｍＭホルメートを増殖培地に加えた。ホルメート−ＴＨＦ―シンテターゼ遺伝子を欠く菌株に対して、ホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼ遺伝子の発現により菌株のメチオニン産生能を改善することが観察された。このデータは第１６表において見ることができる。
【０３６２】
第１６表  ＧＫ１２５９、およびホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼを過剰発現させているＧＫ１２５９（ｐＨ６５５）の振盪フラスコアッセイ
【表２９】
2010518837.tif 000030
【０３６３】
（実施例１６）Ｍ２５４３株におけるホルミル−ＴＨＦ−デホルミラーゼの欠失
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍがホルミル−ＴＨＦ−デホルミラーゼ（登録Ｎｃｇ１０３７１）と注釈されている遺伝子を含有することを配列比較によって検出した。この遺伝子は、代謝産物ホルミル−テトラヒドロ葉酸からホルメートを開裂させるホルミル−ＴＨＦ−デホルミラーゼの酵素活性を持つ酵素をコードしていると注釈されている（Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｌａｎｔ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｐｌａｎｔ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ（２００１）５２：１１９−１３７）。
【０３６４】
ＤＮＡ断片をクローン化することによって、ホルミル−ＴＨＦ−デホルミラーゼ（登録番号Ｎｃｇ１０３７１）のノックアウトを実施し、ここではＮｃｇｌ０３７１をコードしている遺伝子の上流領域（約５００Ｂｐ長）および同じ遺伝子の下流領域（約５００Ｂｐ長）を増幅し、融合ＰＣＲによって融合し、ベクターにクローン化し、結果としてｐＨ６７０  ｉｎｔ  ｓａｃＢデルタデホルミラーゼ（配列番号５０）を得た。プラスミドを、Ｍ２５４３株に形質転換し、最初の組換え体を得る（「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｉｎステップ」）。ＰＣＲにより正しい最初の組換え体を良好にスクリーニングした後、この菌株を、液体培養で終夜増殖し、１０％のスクロースを含有する増殖培地にまく。この処理（「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｏｕｔステップ」）により、カナマイシン耐性マーカーおよびプラスミドｐＨ６７０にコードされるレバンスクロース遺伝子が良好に染色体からカットされ、続いて染色体および細胞から失われるＧＫ１５４６と呼ばれる菌株を生じる。Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｏｕｔステップからの継代株を、記述したホルミル−ＴＨＦ−デホルミラーゼの５’および３’領域内に配列をコードしているプライマーを利用するＰＣＲスクリーニングによってホルミル−ＴＨＦ−デホルミラーゼの欠失と同定する。陽性クローンは、ホルミル―ＴＨＦ−デホルミラーゼ野生株からのＰＣＲ生成物より約９００ｂｐ短いＰＣＲ断片を示す。得られた菌株を、ＧＫ１５４６と命名した。
【０３６５】
（実施例１７）ホルミル−ＴＨＦ−デホルミラーゼが欠失し、ホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼを過剰発現する菌株の構築
ＧＫ１５４６株を、プラスミドｐＨ６５５およびｐＨ６５７で形質転換する。得られた菌株ＧＫ１５４６（ｐＨ６５５）およびＧＫ１５４６（ｐＨ６５７）は、Ｍ２５４３株に対して、セリンを含有しないホルメート、グリシンおよびスレオニンを含有する最小培地で増殖させると増殖行動の著明な改善を示す。
【０３６６】
（実施例１８）メチオニン産生のための機能的ホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼの発現
Ｍ２６１６株を、ｐＨ６５５（ホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼＮＣＴＣ１１９１５）およびｐＨ６５７（ホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼＤＳＭＺ７１７１）で形質転換した。得られた菌株Ｍ２６１６（ｐＨ６５５）およびＭ２６１６（ｐＨ６５７）を、前述のように振盪フラスコアッセイにおいて分析した。
【０３６７】
上述の通常の組成に加えて、培地に２０ｍＭグリシンおよび２０ｍＭ  Ｎａ−ホルメートを補充した。振盪フラスコを、３０℃で、２００ＲＰＭの振盪速度でインキュベートした。４８時間後、メチオニンを測定した。ホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼ発現プラスミドのない親のＭ２６１６株が、測定可能なＯＤまで増殖せず、特定の炭素源を利用しなかったことが判明した。上澄みを、上澄み中のホルメートについてＨＰＬＣによって測定した。プラスミドｐＨ６５５およびｐＨ６５７を含有する菌株は、培地に加えられた全てのホルメートを利用している。さらに、ホルメート、グリシンで増殖され、ホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼ遺伝子を発現する菌株は測定可能な量のメチオニンを産生したが、一方、Ｍ２６１６株はメチオニンをまったく産生しなかったことが観察されている。結果を第１７表に示す。
【０３６８】
第１７表  Ｍ２６１６およびＭ２６１６のプラスミド形質転換体におけるメチオニン産生
【表３０】
2010518837.tif 000031
【０３６９】
別の実験において、２０ｍＭセリンを、実施例１８で記述した培養株培地に加えた。Ｍ２６１６およびホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼＤＳＭＺ７１７１遺伝子を発現するＭ２６１６は、セリンの存在下で増殖し、これを産生されたメチオニンについて測定した。過剰発現の場合に得られたメチオニンの力価は、ホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼＤＳＭＺ遺伝子を発現したＭ２６１６株の場合において、ホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼ遺伝子を含有しない菌株と比較してより高いことが発見された。データは第１８表において見ることができる。
【０３７０】
第１８表  ホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼを過剰発現している菌株のメチオニンの過剰産生
【表３１】
2010518837.tif 000032
【図１】
2010518837.tif 000033
【配列表】
2010518837000001.app
【国際調査報告】
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