(57)【要約】本明細書は、希土類ナノロッド（例えば無機水酸化ランタニドナノロッド）等の希土類粒子に関する方法および材料を提供する。例えば、水酸化ユウロピウムナノロッド等の希土類（例えばランタニド）粒子、希土類粒子（例えば水酸化ユウロピウムナノロッド）を作製する方法および材料、ならびに、希土類粒子（例えば水酸化ユウロピウムナノロッド）を造影剤として、および／または血管新生を促進するために使用する方法および材料が提供される。
2010501002.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
硝酸ランタニドと水酸化アンモニウム水溶液の混合物をマイクロ波加熱するステップを含む、水酸化ランタニドナノ粒子を作製するための方法。
【請求項２】
前記ランタニドがユウロピウムである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ナノ粒子が水酸化ユウロピウムナノロッドである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記水酸化ユウロピウムナノロッドが、１０ｎｍから５００ｎｍの間の長さである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記水酸化ユウロピウムナノロッドの直径が、１ｎｍから１００ｎｍの間である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
１０ｎｍから５００ｎｍの間の長さおよび１ｎｍから１００ｎｍの直径を有する水酸化ランタニドナノ粒子であって、該ナノ粒子が血管新生を促進する、水酸化ランタニドナノ粒子。
【請求項７】
前記ランタニドがユウロピウムである、請求項６に記載の水酸化ランタニドナノ粒子。
【請求項８】
前記ナノ粒子が水酸化ユウロピウムナノロッドである、請求項６に記載の水酸化ランタニドナノ粒子。
【請求項９】
細胞を水酸化ランタニドナノ粒子と接触させるステップを含む、血管新生を促進するための方法。
【請求項１０】
前記ランタニドがユウロピウムである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ナノ粒子が水酸化ユウロピウムナノロッドである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記水酸化ユウロピウムナノロッドが、１０ｎｍから５００ｎｍの間の長さである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記水酸化ユウロピウムナノロッドの直径が、１ｎｍから１００ｎｍの間である、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、２００６年８月１４日に出願された米国仮特許出願第６０／８３７，８０７号への優先権を請求する。
【０００２】
（政府支援の研究に関する陳述）
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈにより授与された助成金番号ＣＡ７８３８３およびＨＬ７０５６７の下、政府支援により行われた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
（背景）
（技術分野）
本明細書は、ナノ粒子（例えば希土類ナノロッド）に関与する方法および材料に関する。例えば、本明細書は、ネオジム、サマリウム、ユウロピウム、ガドリニウム、およびテルビウムナノ粒子に関与する材料および方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
（背景）
ナノテクノロジーは、生物医学研究へと急速に拡大している。ナノバイオテクノロジーは、生体イメージング、医療診断、および疾患治療に新たな道を開いている。最近では、無機蛍光性ナノ粒子プローブを用いた生体イメージングが、生物学および医学において幅広い関心を呼んでいる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（要旨）
本明細書は、希土類ナノロッド（例えば無機水酸化ランタニドナノロッド）等の希土類粒子に関する方法および材料を提供する。例えば、本明細書は、水酸化ネオジム［ＮｄＩＩＩ（ＯＨ）３］、水酸化サマリウム［ＳｍＩＩＩ（ＯＨ）３］、水酸化ユウロピウム［ＥｕＩＩＩ（ＯＨ）３］、水酸化ガドリニウム［ＧｄＩＩＩ（ＯＨ）３］、および水酸化テルビウム［ＴｂＩＩＩ（ＯＨ）３］ナノロッドを提供する。これらのナノロッドは、単純、迅速、清浄、効率的、経済的、非毒性、および環境に優しいマイクロ波技術を使用して調製することができる。本明細書で提供される水酸化ユウロピウムナノロッドは、蛍光性であり得、細胞に進入することができ、一旦細胞に進入してもその蛍光特性を維持することができる。さらに、本明細書で提供される水酸化ユウロピウムナノロッドは、画像化、治療、および／または診断を目的として、ナノロッドに付着した薬剤または生体分子の細胞内への内在化を可視化するために使用することができる。本明細書で提供される水酸化ユウロピウムナノロッドは、非毒性、蛍光性、および無機の水酸化ユウロピウム（ＩＩＩ）ナノロッドであり得、インビボで血管新生促進剤として使用することができる。
【０００６】
血管新生のプロセスは、既存の血管構造からの新たな血管の成長により、胚形成、創傷治癒、および腫瘍形成において役割を果たし得る。本明細書で提供される水酸化ユウロピウムナノロッドは、虚血組織等の組織における血管新生を促進するために使用することができる。ある場合には、水酸化ユウロピウム無機蛍光性ナノロッドは、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）および塩基性線維芽細胞増殖因子（ＢＦＧＦ）の代わりに、またはそれらと組み合わせて、血管新生促進剤として使用することができる。本明細書で提供される水酸化ユウロピウムナノロッドは、細胞増殖アッセイ、細胞周期アッセイ、および／またはＣＡＭアッセイにより観察されるように非毒性ナノロッドであり得、内皮細胞増殖を誘発することができる。本明細書で提供される水酸化ユウロピウムナノロッドは、ヒトにおける心臓または四肢の虚血組織の治療に使用することができる。ＥｕＩＩＩ（ＯＨ）３ナノロッドと同様に、ＮｄＩＩＩ（ＯＨ）３、ＳｍＩＩＩ（ＯＨ）３、およびＴｂＩＩＩ（ＯＨ）３ナノロッドも、細胞増殖アッセイにより観察されるように、非毒性である。
【０００７】
有機色素（フルオレセイン、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（商標）、リサミンローダミンＢ、テトラメチルローダミン等）および蛍光タンパク質（緑色蛍光タンパク質、ＧＦＰ）と比較して、本明細書で提供される無機蛍光性水酸化ユウロピウムナノロッドは、いくつかの独特な光学的および電子的特性（例えば、可視波長から赤外波長までサイズおよび組成の調整が可能な発光、大きなストークスシフト、対称的な発光スペクトル、複数の蛍光色の同時励起、非常に高レベルの輝度および光安定性）を有することができる。
【０００８】
一般に、本明細書の一態様は、水酸化ユウロピウムナノロッドを作製する方法を特徴とする。この方法は、ＬｎＩＩＩ（ＮＯ３）３（式中、Ｌｎ＝Ｎｄ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、またはＴｂである）と水酸化アンモニウム水溶液の混合物をマイクロ波加熱するステップを含むか、または実質的にこのステップからなる。水酸化ランタニド［ＬｎＩＩＩ（ＯＨ）３］ナノロッドは、１０ｎｍから５００ｎｍの間の長さであり得る。水酸化ランタニドナノロッドの直径は、１ｎｍから１００ｎｍの間であり得る。
【０００９】
他の態様において、本明細書は、１０ｎｍから５００ｎｍの間の長さおよび１ｎｍから１００ｎｍの間の直径を有する水酸化ランタニドナノロッドであって、このナノロッドが血管新生を促進する、水酸化ランタニドナノロッドを特徴とする。
【００１０】
他の態様において、本明細書は、血管新生を促進する方法を特徴とし、この方法は、細胞を水酸化ユウロピウムナノロッドと接触させるステップを含むか、または実質的にこのステップからなる。水酸化ユウロピウムナノロッドは、１０ｎｍから５００ｎｍの間の長さであり得る。水酸化ユウロピウムナノロッドの直径は、１ｎｍから１００ｎｍの間であり得る。
【００１１】
別段に定義されていない限り、本明細書で使用されている技術的および科学的用語はすべて、本発明が関連する技術分野の当業者により一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または等価の方法および材料を使用して本発明を実施することができるが、好適な方法および材料を以下に記載する。本明細書において言及されるすべての出版物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参考としてその全体が援用される。不一致が生じる場合は、定義を含めて本明細書が優先される。さらに、材料、方法、および実施例は例示のみを目的としており、限定を意図するものではない。
【００１２】
本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細を、添付の図面および以下の説明に記載する。本発明の他の特徴、目的、および利点は、説明および図面、ならびに請求項から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】（ａ）５分、（ｂ）１０分、（ｃ）２０分、（ｄ）４０分、および（ｅ）６０分の異なる反応時間での、マイクロ波支援による合成直後の水酸化ユウロピウム［ＥｕＩＩＩ（ＯＨ）３］のＸＲＤパターンをプロットしたグラフである。
【図２】６０分間のマイクロ波加熱後の、マイクロ波支援による合成直後の水酸化ネオジム［ＮｄＩＩＩ（ＯＨ）３］、水酸化サマリウム［ＳｍＩＩＩ（ＯＨ）３］、水酸化ガドリニウム［ＧｄＩＩＩ（ＯＨ）３］、および水酸化テルビウム［ＴｂＩＩＩ（ＯＨ）３］のＸＲＤパターンをプロットしたグラフである。
【図３】マイクロ波支援による合成直後の水酸化ユウロピウムナノロッドの、熱重量分析（ＴＧＡ；パネルＡおよびＣ）および示差走査熱量測定（ＤＳＣ）プロット（パネルＢおよびＤ）のグラフである。パネルＡおよびＢ：５分サンプル。パネルＣおよびＤ：６０分サンプル。
【図４】６０分間のマイクロ波加熱後の、マイクロ波支援による合成直後の水酸化ネオジム［ＮｄＩＩＩ（ＯＨ）３］（パネルＡ）、水酸化サマリウム［ＳｍＩＩＩ（ＯＨ）３］（パネルＢ）、水酸化ガドリニウム［ＧｄＩＩＩ（ＯＨ）３］（パネルＣ）、および水酸化テルビウム［ＴｂＩＩＩ（ＯＨ）３］（パネルＤ）の熱重量分析（ＴＧＡ）のグラフである。
【図５】５分（パネルＡ）、１０分（パネルＢ）、２０分（パネルＣ）、４０分（パネルＤ）、６０分（パネルＥ；低倍）、および６０分（パネルＦ；高倍）の様々な時間のマイクロ波加熱における、合成直後のＥｕＩＩＩ（ＯＨ）３ナノロッドのＴＥＭ画像である。
【図６】１分（パネルＡ）、５分（パネルＢ）、１０分（パネルＣ）、２０分（パネルＤ）、４０分（パネルＥ）、および６０分（パネルＦ）の長さの時間マイクロ波加熱した後の、合成直後の水酸化ネオジム［ＮｄＩＩＩ（ＯＨ）３］ナノロッドのＴＥＭ画像である。
【図７】１分（パネルＡ）、５分（パネルＢ）、１０分（パネルＣ）、２０分（パネルＤ）、４０分（パネルＥ）、および６０分（パネルＦ）の長さの時間マイクロ波加熱した後の、合成直後の水酸化サマリウム［ＳｍＩＩＩ（ＯＨ）３］ナノロッドのＴＥＭ画像である。
【図８】６０分間のマイクロ波加熱後の、一部ナノロッドである可能性がある合成直後のＧｄＩＩＩ（ＯＨ）３（パネルＡ）およびＴｂＩＩＩ（ＯＨ）３（パネルＢ）ナノ粒子のＴＥＭ画像である。
【図９−１】図９ＡおよびＢは、マイクロ波支援による合成直後のＥｕ（ＯＨ）３の励起スペクトルの２つのグラフである。パネルＢのグラフは、パネルＡのグラフを拡大したものである。
【図９−２】図９Ｃは、マイクロ波支援による合成直後のＥｕＩＩＩ（ＯＨ）３の発光スペクトルのグラフである。
【図１０】ａ＝５μｇ／ｍＬ、ｂ＝１０μｇ／ｍＬ、ｃ＝２０μｇ／ｍＬ、ｄ＝５０μｇ／ｍＬ、およびｅ＝１００μｇ／ｍＬの濃度のナノロッドで処理された内皮細胞内のＥｕＩＩＩ（ＯＨ）３ナノロッドの発光スペクトルをプロットしたグラフである。対照実験では発光ピークはなかった。
【図１１】ナノロッドありおよびナノロッドなしのＨＵＶＥＣのＤＩＣ顕微鏡写真である。パネルＡ：処理なしの対照ＨＵＶＥＣ；ナノロッドは観察されない。パネルＢ〜Ｄ：以下の濃度のＥｕ（ＯＨ）３ナノロッドで処理されたＨＵＶＥＣ。パネルＢ：２０μｇ／ｍＬ、パネルＣ：５０μｇ／ｍＬ、およびパネルＤ：１００μｇ／ｍＬ。細胞内のナノロッドは、いくつかの場所で白矢印（パネルＢ〜Ｄ）でマークされている。
【図１２】内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の蛍光（左のパネル）および対応する位相画像（右のパネル）である。パネルＡは、処理されていない対照内皮細胞の画像を含む。パネルＡにおける若干の緑色は、自己蛍光によるものである。パネルＢおよびＣは、２０μｇ／ｍＬ（パネルＢ）または５０μｇ／ｍＬ（パネルＣ）のＥｕ（ＯＨ）３ナノロッドで処理された内皮細胞の共焦点顕微鏡画像である。矢印は、細胞内に位置する粒子の蛍光を示す。
【図１３】内皮細胞の細胞質成分内のＥｕＩＩＩ（ＯＨ）３ナノロッドのＴＥＭ写真である。ナノロッドの画像は、２０μｇ／ｍＬ（パネルＡ〜Ｃ）または５０μｇ／ｍｌ（パネルＤ〜Ｆ）のナノロッドで処理されたＨＵＶＥＣの細胞質成分内でＴＥＭにより可視化された。パネルＢおよびＣは、パネルＡからの拡大画像である。パネルＥおよびＦは、パネルＤからの拡大画像である。
【図１４】内皮細胞の細胞質成分内のＴｂＩＩＩ（ＯＨ）３ナノロッドのＴＥＭ写真である。ナノロッドの画像は、５０μｇ／ｍＬのナノロッドで処理されたＨＵＶＥＣの細胞質成分内でＴＥＭにより可視化された。パネルＢ、Ｃ、およびＤは、パネルＡからの拡大画像である。
【図１５】［３Ｈ］チミジン取込みアッセイを使用して観察され、刺激倍数として示される、異なる濃度の水酸化ユウロピウムナノロッドの血清飢餓ＨＵＶＥＣに対する効果をプロットしたグラフである。Ｅｕ−２０、Ｅｕ−５０、Ｅｕ−１００は、それぞれ、２０、５０、および１００μｇ／ｍＬの水酸化ユウロピウムで処理された細胞を示す。ＶＦは、ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）で処理された細胞を示す。データは、刺激倍数を表し、３回ずつ行う３通りの個別実験の平均±ＳＤとして示されている。データは、ｐ≦０．０５で統計的に有意である。
【図１６】［３Ｈ］チミジン取込みアッセイを使用して観察され、刺激倍数として示される、異なる濃度の水酸化ネオジムナノロッドの血清飢餓ＨＵＶＥＣに対する効果をプロットしたグラフである。Ｎｄ−１０、Ｎｄ−２０、Ｎｄ−５０は、それぞれ、１０、２０、および５０μｇ／ｍＬの水酸化ネオジムで処理された細胞を示す。
【図１７】［３Ｈ］チミジン取込みアッセイにより観察され、刺激倍数として表現される、異なる濃度の水酸化サマリウムナノロッドの血清飢餓ＨＵＶＥＣに対する効果をプロットしたグラフである。Ｓｍ−２０、Ｓｍ−５０、Ｓｍ−１００は、それぞれ、２０、５０、および１００μｇ／ｍＬの水酸化サマリウムで処理された細胞を示す。
【図１８】［３Ｈ］チミジン取込みアッセイにより観察され、刺激倍数として表現される、異なる濃度の水酸化テルビウムナノロッドの血清飢餓ＨＵＶＥＣに対する効果をプロットしたグラフである。Ｔｂ−２０、Ｔｂ−５０、Ｔｂ−１００は、それぞれ、２０、５０、および１００μｇ／ｍＬの水酸化テルビウムで処理された細胞を示す。ＴｂＮは、２０μｇ／ｍＬの濃度の硝酸テルビウムで処理された細胞を示す。
【図１９】アポトーシスに関しＴｕｎｎｅｌアッセイに供されたＨＵＶＥＣの写真である。パネルＡ〜Ｃは、アポトーシスを誘発するために、３７℃で４時間、カンプトテシンで処理されたＨＵＶＥＣの画像を含む。カンプトテシン処理細胞は、陽性対照の役目を果たした。ＨＵＶＥＣのＴＭＲ赤色染色核は、アポトーシス細胞の存在により赤色となる（パネルＡ）。ＤＡＰＩ染色核は青色となった（パネルＢ）。パネルＣは、パネルＡおよびＢを合わせた写真である。パネルＤ〜Ｆは、未処理ＨＵＶＥＣの画像である。パネルＧ〜Ｉは、５０μｇ／ｍＬのＥｕＩＩＩ（ＯＨ）３で３７℃で２０時間のインキュベーションを施したＨＵＶＥＣの画像である。パネルＪ〜Ｌは、１００μｇ／ｍＬのＥｕＩＩＩ（ＯＨ）３で３７℃で２０時間のインキュベーションを施したＨＵＶＥＣの画像である。第１の列（パネルＡ、Ｄ、Ｇ、およびＪ）に示されるＨＵＶＥＣの核を、ＴＭＲ  ｒｅｄで染色した。赤色染色は、アポトーシス細胞が存在しないことから観察されなかった。第２の列（パネルＢ、Ｆ、Ｈ、およびＫ）に示される細胞のＤＡＰＩ染色核は、青色となる。第３の列（パネルＣ、Ｆ、Ｉ、およびＬ）の各行は、同じ行の第１および第２の列における２つの画像を合わせた画像である。
【図２０】異なる用量のＥｕＩＩＩ（ＯＨ）３ナノロッド（０〜１００μｇ／ｍＬ）の存在下での、内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の細胞周期分析のグラフである。Ｓ相（Ｓ）は、５０μｇ／ｍＬの濃度のＥｕＩＩＩ（ＯＨ）３ナノロッドで最も高い。データは、３回ずつ行う３通りの個別実験の平均±ＳＤとして示され、ｐ≦０．０５で統計的に有意である。
【図２１】リン酸化ｍａｐキナーゼおよび総ｍａｐキナーゼを分析したウェスタンブロットである。溶解物は、示された時間（５分から６時間）ＥｕＩＩＩ（ＯＨ）３ナノロッド（５０μｇ／ｍＬ）で処理されたか、または５分間ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）で処理されたＨＵＶＥＣから調製された（パネルＡ）。パネルＢは、模擬処理（対照）されたか、または２０μｇ／ｍＬ（Ｅ２０）もしくは５０μｇ／ｍＬ（Ｅ５０）のＥｕ（ＯＨ）３ナノロッドで２４時間処理されたＨＵＶＥＣ中のリン酸化ｍａｐキナーゼおよび総ｍａｐキナーゼを分析したウェスタンブロットである。
【図２２】活性酸素種（ＲＯＳ）に関して分析されたＨＵＶＥＣの画像である。パネルＡ〜Ｃは、対照未処理ＨＵＶＥＣの画像である。パネルＤ〜Ｆは、陽性ＲＯＳ誘導剤としての１００μＭ／ｍＬのｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド（ＴＢＨＰ）で処理されたＨＵＶＥＣの画像である。パネルＧ〜Ｌは、２０μｇ／ｍＬ（パネルＧ〜Ｉ）または５０μｇ／ｍＬ（パネルＪ〜Ｌ）のＥｕＩＩＩ（ＯＨ）３ナノロッドで処理されたＨＵＶＥＣの画像である。
【図２３−１】ＴＥ（トリス−ＥＤＴＡ）緩衝液（パネルＡ）、ＶＥＧＦ（５０ｎｇ；パネルＢ）、またはＴＥ緩衝液中１μｇもしくは１０μｇのナノロッド（パネルＣおよびＤ）で処理されたニワトリの絨毛尿膜（ＣＡＭ）の写真である。パネルＥは、ＣＡＭアッセイ結果をプロットしたグラフである。血管新生は、３通りの個別実験からの最少１０検体からの、第３の血管から派生している分岐点を計数することにより定量化した。
【図２３−２】ＴＥ（トリス−ＥＤＴＡ）緩衝液（パネルＡ）、ＶＥＧＦ（５０ｎｇ；パネルＢ）、またはＴＥ緩衝液中１μｇもしくは１０μｇのナノロッド（パネルＣおよびＤ）で処理されたニワトリの絨毛尿膜（ＣＡＭ）の写真である。パネルＥは、ＣＡＭアッセイ結果をプロットしたグラフである。血管新生は、３通りの個別実験からの最少１０検体からの、第３の血管から派生している分岐点を計数することにより定量化した。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（詳細な説明）
本明細書は、希土類ナノロッド等の希土類粒子に関する方法および材料を提供する。例えば、本明細書は、希土類（例えばランタニド）粒子（例えば、水酸化ネオジム（Ｎｄ）、水酸化サマリウム（Ｓｍ）、水酸化ユウロピウム（Ｅｕ）、水酸化ガドリニウム（Ｇｄ）、および水酸化テルビウム（Ｔｂ）ナノロッド）、希土類粒子（例えば水酸化ネオジム、水酸化サマリウム、水酸化ユウロピウム、水酸化ガドリニウム、および水酸化テルビウムナノロッド）を作製する方法および材料、ならびに希土類粒子（例えば水酸化ネオジム、水酸化サマリウム、水酸化ユウロピウム、水酸化ガドリニウム、および水酸化テルビウムナノロッド）を造影剤として、および／または血管新生を促進するために使用する方法および材料を提供する。
【００１５】
本明細書で提供される水酸化ランタニド（例えばネオジム、サマリウム、ユウロピウム、ガドリニウム、およびテルビウム）ナノ粒子（例えばナノロッド）は、任意の寸法であり得る。例えば、本明細書で提供される水酸化ユウロピウムナノロッドは、５０ｎｍから５００ｎｍの間（例えば１００ｎｍから４００ｎｍの間、１５０ｎｍから３５０ｎｍの間、および２００ｎｍから３００ｎｍの間）の長さであり得、また１０ｎｍから１００ｎｍの間（例えば２０ｎｍから９０ｎｍ、２５ｎｍから７５ｎｍの間、または３０ｎｍから５０ｎｍの間）の厚さを有し得る。水酸化ランタニドナノ粒子を作製するために、いかなる適切な方法も使用することができる。例えば、本明細書に記載されるようなマイクロ波技術を使用して、水酸化ランタニド（例えばネオジム、サマリウム、ユウロピウム、ガドリニウム、およびテルビウム）ナノロッドを作製することができる。
【００１６】
いくつかの場合において、本明細書で提供される水酸化ランタニドナノ粒子は、哺乳動物（例えばヒト）への送達のために薬剤または他の治療薬と結合することができる。例えば、水酸化ユウロピウムナノ粒子（例えばナノロッド）に薬剤が共有結合することができる。そのような場合、水酸化ユウロピウムナノ粒子（例えばナノロッド）は、哺乳動物内の薬剤の場所および／または濃度を追跡するために使用することができる。水酸化ランタニドナノ粒子と結合することができる治療薬の例としては、ポリペプチド、抗体、Ｃ２２５、ゲムシタビン、シスプラチン、および活性官能基を含有する有機薬物分子が挙げられるが、それらに限定されない。
【００１７】
水酸化ランタニドナノ粒子を治療薬と結合させるために、いかなる適切な方法も使用することができる。例えば、治療薬を水酸化ランタニドナノ粒子に結合させることができる。治療薬（例えば薬物分子）を水酸化ランタニドナノ粒子（例えば水酸化ユウロピウムナノロッド）と結合させる前に、ナノ粒子（例えばナノロッド）の表面を活性官能基（例えばアミノ基またはメルカプト基）で改変することができる。例えば、他の文献（Ｆｅｎｇら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、７５：５２８２〜５２８６頁（２００３年））に記載のように、アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＴＭＳ）またはメルカプト−プロピルトリメトキシシラン（ＭＰＴＭＳ）を使用して、水酸化ランタニドナノロッドの表面を官能化することができる。ある場合には、ナノ粒子（例えばナノロッド）は、本明細書に記載されるようなマイクロ波技術を使用して官能化することができる。表面改変された水酸化ランタニドナノ粒子は、共有結合形成により異なる治療薬（例えば、有機薬物分子、ポリペプチド、または抗体）と結合することができる。
【００１８】
本明細書に記載されるように、水酸化ユウロピウムナノロッド等の水酸化ランタニドナノ粒子は、哺乳動物内での血管新生を促進するために使用することができる。例えば、ある哺乳動物は、血管新生促進剤が必要であると特定され得る。特定されると、本明細書で提供される水酸化ランタニドナノ粒子をこの哺乳動物に投与することができる。そのような投与は、全身または局所投与であってもよい。例えば、血管新生を必要とする組織に水酸化ユウロピウムナノロッドを直接注入することができる。投与後、哺乳動物をモニタリングして、血管新生が促進されたか否かを決定するか、または追加の投与が必要か否かを決定することができる。
【００１９】
請求項に記載の本発明の範囲を制限しない以下の実施例において、本発明をさらに説明する。
【実施例】
【００２０】
（実施例１）
材料
硝酸ネオジム（ＩＩＩ）六水和物（９９．９％）、硝酸サマリウム（ＩＩＩ）六水和物（９９．９９％）、硝酸ユウロピウム（ＩＩＩ）水和物［Ｅｕ（ＮＯ３）３．ｘＨ２Ｏ、９９．９９％］、硝酸ガドリニウム（ＩＩＩ）六水和物（９９．９９９％）、硝酸テルビウム（ＩＩＩ）六水和物（９９．９９９％）、および水酸化アンモニウム水溶液［ＮＨ４ＯＨ水溶液、２８〜３０％］を、Ａｌｄｒｉｃｈ（米国）から購入し、さらなる精製を行わずに使用した。［３Ｈ］チミジンをＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ニュージャージー州ピスカタウェイ）から購入した。カルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を、Ｃｅｌｌｇｒｏ  Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（バージニア州ハーンドン）から購入した。抗菌薬を含まない内皮細胞基本培地（ＥＢＭ）、トリプシン／ＥＤＴＡ（０．２５ｍｇ／ｍＬ）、トリプシン中和液（ＴＮＳ）、ならびに、１組の５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、０．４％ウシ脳抽出物、および０．１％ゲンタマイシン硫酸塩アムホテリシンＢを、Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．（メリーランド州ウォーカースビル）から得て、ＥＢＭ完全培地を作製するのに使用した。Ｆａｌｃｏｎ組織培養皿をＢｅｃｋｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ（Ｂｅｃｋｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、米国ニュージャージー州）から購入した。Ｔｕｎｎｅｌアッセイで使用するためのインサイチュ細胞死検出キット、ＴＭＲ  ｒｅｄを、Ｒｏｃｈｅ（カタログ番号＃１２  １５６  ７９２  ９１０）から購入した。モノクローナルマウスＩｇＧ（カタログ番号＃  ＯＰ７２−１００ＵＧ）、抗リン酸化ｍａｐキナーゼ（ウサギポリクローナルＩｇＧ、カタログ番号＃  ０７−４６７）抗体、および抗マウスＩｇＧまたは抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（カタログ番号＃  Ｓｃ−２３０１）を、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（米国カリフォルニア州サンタクルーズ）から購入した。Ｉｍａｇｅ−ｉＴ（商標）ＬＩＶＥ  Ｇｒｅｅｎ  Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｏｘｙｇｅｎ  Ｓｐｅｃｉｅｓ  （ＲＯＳ）  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉ３６００７）を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（オレゴン州ユージーン）から購入した。
【００２１】
（実施例２）
マイクロ波支援による水酸化ユウロピウム［Ｅｕ（ＯＨ）３］ナノロッド合成
硝酸ランタニドおよび水酸化アンモニウム水溶液（２８〜３０％  Ａ．Ｃ．Ｓ試薬）を、それぞれＡｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．およびＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、それ以上精製せずに受け取り時の状態のまま使用した。硝酸Ｌｎ（ＩＩＩ）水溶液およびＮＨ４ＯＨ水溶液の混合液を開放還流システムにおいて大気圧下でマイクロ波加熱することにより、ＬｎＩＩＩ（ＯＨ）３（式中、Ｌｎ＝Ｎｄ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、またはＴｂである）ナノロッドを調製した。典型的な合成において、１０ｍＬのＮＨ４ＯＨ水溶液を、１００ｍＬ丸底フラスコ内の２０ｍＬの０．０５Ｍ硝酸Ｌｎ（ＩＩＩ）水溶液（ｐＨ＝５．５）に添加した。ＮＨ４ＯＨの硝酸Ｌｎ（ＩＩＩ）溶液への添加後、特別な形態のないコロイド状沈殿物を得た。反応の前および後の溶液のｐＨは、それぞれ９．４および７．５であった。反応を制御し、溶媒の過熱の危険性を低減するために、サンプルに対して機器の出力の６０％（オン／オフ照射周期比３／２）で１分間から６０分間照射した。マイクロ波還流装置は、他の文献（Ｍａｔｓｕｍｕｒａ  Ｉｎｏｕｅら、Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．、２４４３頁（１９９４年））に記載の、出力２．４５ＧＨｚの改良型家庭用電子レンジ（ＧＯＬＤ  ＳＴＡＲＲ  １０００Ｗ、ＬＡ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．、アラバマ州ハンツビル）である。反応後の処理において、得られた生成物を収集し、１５０００ｒｐｍで遠心分離し、蒸留水を使用して数回洗浄し、次いで室温で一晩真空中で乾燥した。調製された生成物の収率は、水酸化ランタニドナノ粒子のすべてに対して９５％を超えた。上記実験を数回行ったところ良好な再現性を示した。
【００２２】
（実施例３）
実験手順
微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）顕微鏡法、共焦点顕微鏡法、活性酸素種（ＲＯＳ）の決定、ｔｕｎｎｅｌアッセイ（アポトーシス）、蛍光分光法、透過分光法、およびトリパンブルー色素排除試験の細胞培養実験を行った。
【００２３】
ヒト臍帯静脈内皮（ＨＵＶＥＣ）細胞を、６ウェルプレートで、１０５細胞／２ｍＬ、２４時間、３７℃、および５％ＣＯ２でＥＢＭ完全培地で培養した。細胞局在化を調査するために、細胞をガラスカバースリップ上に播種し、６ウェルプレートで９０％の密集度まで増殖させ、次いで２０〜１００μｇ／ｍＬの濃度範囲のＥｕＩＩＩ（ＯＨ）３ナノロッドともにインキュベートした。２４時間のインキュベーション後、カバースリップをリン酸緩衝生理食塩水で十分に洗浄し、新たに調製したＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで１５分間室温で細胞を固定し、次いでＰＢＳで再び水和した。すべての細胞を固定した後、この細胞を有するカバースリップをＦｌｕｏｒ  Ｓａｖｅ封入剤によりガラススライド上に封入し、ＤＩＣおよび共焦点顕微鏡を使用して検査した。活性酸素種（ＲＯＳ）の形成を調査するために、Ｉｍａｇｅ−ｉＴ（商標）ＬＩＶＥ  Ｇｒｅｅｎ  Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｏｘｙｇｅｎ  Ｓｐｅｃｉｅｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（カタログ番号＃Ｉ３６００７；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、米国）を、製造元の説明に従い使用し、最後に処理済および未処理細胞をＦｌｕｏｒ  Ｓａｖｅ封入剤によりガラススライド上に封入し、共焦点顕微鏡を使用して検査した。ｔｕｎｎｅｌアッセイのために、ＤＡＰＩ（４’−６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）とともに封入剤で細胞をガラススライド上に封入し、製造元の説明（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号＃１２  １５６  ７９２  ９１０）に従い共焦点顕微鏡を使用して検査した。
【００２４】
他の組において、ＨＵＶＥＣ細胞（１０５細胞／２ｍＬ）を６ウェルプレートで培養し、カバースリップなしでＥＢＭ完全培地内でＥｕＩＩＩ（ＯＨ）３またはＴｂＩＩＩ（ＯＨ）３ナノロッドで処理した。ナノロッドによる２４時間のインキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理し、中和した。遠心分離により細胞を洗浄し、ＰＢＳ中に再び懸濁させ、蛍光分光法およびＴＥＭを使用して検査した。他の組の細胞の細胞生存能力を、トリパンブルーで染色することにより決定し、血球計算板を使用して細胞を計数した。
【００２５】
細胞生存能力および細胞増殖試験：正常内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に対する［３Ｈ］チミジン取込みアッセイを使用した増殖抑制についてのインビトロ毒性分析を、他の文献（Ｂａｓｕら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ．、７：５６９頁（２００１年））に記載のように行った。簡潔には、内皮細胞（ＨＵＶＥＣ；２×１０４）を２４ウェルプレートに播種し、ＥＢＭ中で１日培養し、２４時間血清飢餓状態とし（０．１％血清）、次いで異なる濃度（０、２０、５０、または１００μｇ／ｍＬ）のＥｕＩＩＩ（ＯＨ）３（図１５）、ＳｍＩＩＩ（ＯＨ）３（図１７）、またはＴｂＩＩＩ（ＯＨ）３（図１８）で処理した。また、ＨＵＶＥＣを異なる濃度（０、１０、２０、および５０μｇ／ｍＬ）のＮｄＩＩＩ（ＯＨ）３（図１６）で処理した。２４時間後、１μＣｉ［３Ｈ］チミジンを各ウェルに添加した。４時間後、細胞を低温ＰＢＳで洗浄し、１００％低温メタノールで固定し、トリクロロ酢酸沈殿性放射能の測定のために収集した。実験は３回繰り返した。
【００２６】
アポトーシスアッセイ：ｔｕｎｎｅｌアポトーシスアッセイを行うために、ウェル毎に１０５細胞／２ｍＬ培地の密度で細胞を６ウェルプレート内に播種し、カバースリップ上で一晩増殖させた。異なる濃度のＥｕＩＩＩ（ＯＨ）３ナノロッドで細胞をインキュベートし、ＤＡＰＩ（４’−６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）とともにＦｌｕｏｒ  Ｓａｖｅ封入剤でガラススライド上に封入し、製造元の説明（Ｒｏｃｈｅ、米国、カタログ番号＃１２  １５６  ７９２  ９１０）に従い共焦点顕微鏡を使用して検査した。顕微鏡を使用して赤色のアポトーシス細胞を可視化し、計数（サンプル毎に６領域）し、デジタル蛍光カメラを使用して撮像した。
【００２７】
細胞周期：以下の標準的手順に従い細胞周期分析を行った。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で細胞を染色した後、ＤＮＡ含量を測定した。ＥｕＩＩＩ（ＯＨ）３ナノロッドの処理後、ＨＵＶＥＣ細胞をＰＢＳ中で洗浄し（３×）、９５％エタノール中で１時間固定した。細胞を再び水和させ、ＰＢＳ中で洗浄し、ＲＮａｓｅＡ（１ｍｇ／ｍＬ）で処理後、ＰＩ（１００μｇ／ｍＬ）で染色した。対照細胞（ＥｕＩＩＩ（ＯＨ）３ナノロッドなし）に対して同様の実験を行った。ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でフローサイトメトリーによるＤＮＡの定量を行い、Ｍｏｄｆｉｔソフトウェアを使用してデータ分析を行った。
【００２８】
Ｍａｐキナーゼリン酸化のウェスタンブロット：収集したＨＵＶＥＣ細胞を低温ＰＢＳで２回洗浄し、０．０１％プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ）を新たに添加した氷冷放射性免疫沈降（ＲＩＰＡ）緩衝液で溶解した。氷上で１０分間インキュベートした後、細胞を４℃で１０分間、１３，０００ｒｐｍで遠心分離した。測光法を使用したタンパク質濃度の測定後、２０μｇのタンパク質を１０％（トリス−ＨＣｌ）調製ポリアクリルアミドゲル上で還元条件下で電気泳動し、ウェットブロッティングによりニトロセルロース膜に移した。膜を片に切断し、トリス緩衝生理食塩水中５％の粉乳で１時間ブロックし、総ｍａｐキナーゼに対しモノクローナルマウスＩｇＧ（カタログ番号＃ＯＰ７２−１００ＵＧ）を使用して、または抗リン酸化ｍａｐキナーゼ（ウサギポリクローナルＩｇＧ、カタログ番号＃０７−４６７）抗体を使用して一晩インキュベートし、次いでＨＲＰ結合第２抗体（抗マウスＩｇＧまたは抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（カタログ番号＃Ｓｃ−２３０１））を使用して３７℃で４０分間インキュベートした。検出は、化学発光基材を使用して行った。
【００２９】
ＣＡＭアッセイ：他の文献（Ｖｌａｈａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８２（２０）：１５１８７〜１５１９６頁（２００７年））に記載のように、ニワトリの卵を加湿した３９℃のインキュベータ（Ｌｙｏｎ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ、カリフォルニア州）内で維持した。０．５％メチルセルロースおよび組み換えヒトＶＥＧＦ−Ａ（５０ｎｇ）またはｂＦＧＦ（１５０ｎｇ）を含有するペレットを、１０日齢のニワトリの無菌胚のＣＡＭ（ＳＰＡＦＡＳ；Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、マサチューセッツ州ウィルミントン）の上に置いた。卵の殻に小さい窓を切り出すことによりＣＡＭを露出し、ペレットの配置が容易となるようにした。ＶＥＧＦポリペプチドによる刺激から２４時間後に、関連抗体または作動薬／拮抗薬の化合物をその部位に塗布した。いくつかの場合において、マイクロシリンジを使用して、トリス−ＥＤＴＡ緩衝液中の水酸化ユウロピウムナノロッド懸濁液を塗布した。Ｚｅｉｓｓ実体顕微鏡に装着されたデジタルカメラ（Ｃａｎｏｎ  Ｓｕｐｅｒｓｈｏｔ６）を使用して、固定および切除から１３日後に、または、リアルタイムライブ画像によりＣＡＭを画像化した。血管新生は、３通りの個別の実験からの最少１０検体からの、第３の血管から派生している分岐点を計数することにより定量化した。
【００３０】
（実施例４）
特性決定技法
ＥｕＩＩＩ（ＯＨ）３ナノロッドを特性決定するために以下の技法を行った。
【００３１】
Ｘ線回折（ＸＲＤ）：合成直後のサンプルの構造および相純度を、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＸＳ  Ｄ８  Ａｄｖａｎｃｅ  ＰｏｗｄｅｒＸ線回折装置（ＣｕＫαλ＝１．５４１８Å放射線使用）を使用したＸ線回折（ＸＲＤ）分析により決定した。
【００３２】
熱重量（ＴＧ）および示差走査熱量（ＤＳＣ）分析：ＭＥＴＴＬＥＲ  ＴＯＬＥＤＯ  ＴＧＡ／ＳＴＤＡ  ８５１を使用して、合成直後のサンプルのＴＧＡを、窒素流下で、３０℃から７００℃まで１０℃／分の加熱速度で行った。ＭＥＴＴＬＥＲ  ＴＯＬＥＤＯ  ＴＣ  １５で、合成直後のサンプルのＤＳＣ分析を、窒素流（２０ｍＬ／分）を使用して、圧着アルミニウムるつぼ内で、３０℃から６００℃まで４℃／分の加熱速度で行った。
【００３３】
透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）による検討：粒子形態（サンプルの微細構造）を、動作電圧８０ＫＶのＦＥＩ  Ｔｅｃｈｎａｉ  １２のＴＥＭにより検証した。ＴＥＭを使用して細胞の細胞質成分内の粒子の内在化を可視化するために、他の文献（ＭｃＤｏｗｅｌｌおよびＴｒｕｍｐ、Ａｒｃｈ．Ｐａｔｈ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．、１００：４０５頁（１９７６年）およびＳｐｕｒｒ、Ｊ．Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔ．Ｒｅｓ．、２６：３１頁（１９６９年））に記載の手順に従った。
【００３４】
蛍光分光法：励起および発光（蛍光）スペクトルを、単色光分光器励起源としてキセノンランプを装備したＦｌｕｏｒｏｌｏｇ−３  Ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（ＨＯＲＩＢＡ  ＪＯＢＩＮＹＶＯＮ、Ｌｏｎｇｊｕｍｅａｕ、フランス）で記録した。
【００３５】
微分干渉コントラスト（ＤＩＶ）顕微鏡法：カバースリップ上への細胞の固定後、Ｆｌｕｏｒ  Ｓａｖｅ封入剤で細胞をガラススライド上に封入し、ＤＩＣについて検査した。ＡＸＩＯＶＥＲＴ  １３５  ＴＶ顕微鏡（ＺＥＩＳＳ、ドイツ）を使用して、ＡＸＩＯＣＡＭ高解像度デジタルカメラにより写真を撮影した。
【００３６】
ＥｕＩＩＩ（ＯＨ）３の共焦点蛍光顕微鏡法、Ｔｕｎｅｌアッセイ、およびＲＯＳ：アルゴンイオンレーザ（４８８ｎｍ励起）とともに、Ｃ−Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ  ６３  Ｘ／ＮＡ  １．２水浸レンズを備えたＬＳＭ  ５１０共焦点レーザ走査顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｏｂｅｒｋｏｃｈｃｎ、ドイツ）を使用して、二次元共焦点蛍光顕微鏡画像を収集した。ＥｕＩＩＩ（ＯＨ）３ナノロッド、未処理細胞、およびＥｕＩＩＩ（ＯＨ）３ナノロッドで処理された細胞の蛍光発光を、５１５ｎｍロングパスフィルタを介して収集した。
【００３７】
ｔｕｎｎｅｌアッセイに関しては、ＤＡＰＩとともに細胞をガラススライドに封入した後、Ｃ−Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ  ６３  Ｘ／１．２ｎａ水浸レンズを備えたＬＳＭ  ５１０共焦点レーザ走査顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｏｂｅｒｋｏｃｈｃｎ、ドイツ）を使用して画像を収集した。ＤＡＰＩ青色染色核に対しては、３６４ｎｍのアルゴンイオンレーザ励起とともに３８５〜４７０ｎｍのバンドパスフィルタを介して蛍光発光を収集した。ＴＭＲ赤色染色アポトーシス核に対しては、５４３ｎｍのＨｅＮｅ１イオンレーザ励起とともに５６０〜６１５ｎｍのバンドパスフィルタを介して蛍光発光を収集した。
【００３８】
ＲＯＳに関しては、Ｃ−Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ  ６３  Ｘ／１．２ｎａ水浸レンズを備えたＬＳＭ  ５１０共焦点レーザ走査顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｏｂｅｒｋｏｃｈｃｎ、ドイツ）を使用して画像を収集した。緑色蛍光（カルボキシ−Ｈ２ＤＣＦＤＡの酸化生成物）発光は、４８８ｎｍのアルゴンイオンレーザ励起とともに５０５〜５５０ｎｍのバンドパスフィルタを介して収集した。Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２青色染色核の青色蛍光発光は、３６４ｎｍのアルゴンイオンレーザ励起とともに３８５〜４７０ｎｍのバンドパスフィルタを介して収集した。
【００３９】
（実施例５）
無機蛍光ナノロッドおよびその血管新生促進特性
Ｘ線回折による検討：合成直後の材料の結晶構造を、Ｘ線回折（ＸＲＤ）分析（図１Ａ〜Ｅ）により同定した。図１中の曲線ａ−、ｂ−、ｃ−、ｄ−、およびｅ−は、溶媒としての水中での硝酸ユウロピウム（ＩＩＩ）および水酸化アンモニウムの相互作用による、それぞれ５分、１０分、２０分、４０分、および６０分のＭＷ照射後に得られた合成直後の水酸化ユウロピウムＥｕＩＩＩ（ＯＨ）３形成のＸＲＤパターンを示す。異なる時間に合成された合成直後の材料のＸＲＤパターンは、生成物が結晶性であることを示していた。すべての反射は、ＥｕＩＩＩ（ＯＨ）３材料の純粋な六方相に明確に帰属することができた。回折ピークは、すべての反射について、標準データファイル（ＪＣＰＤＳカードＮｏ．０１−０８３−２３０５）と一致していた。同様に、マイクロ波支援による合成直後の生成物（６０分のマイクロ波照射後）の構造を、Ｘ線回折（ＸＲＤ）により分析した。これらの実験の結果（図２）は、水酸化ランタニド生成物ＮｄＩＩＩ（ＯＨ）３（曲線−ａ）、ＳｍＩＩＩ（ＯＨ）３（曲線−ｂ）、ＧｄＩＩＩ（ＯＨ）３（曲線−ｃ）、およびＴｂＩＩＩ（ＯＨ）３（曲線−ｄ）が結晶性であることを示している。
【００４０】
ＴＧＡおよびＤＳＣ：マイクロ波支援による合成直後の生成物（６０分のマイクロ波照射時間）の化学的性質（水酸化ユウロピウムまたは酸化ユウロピウム）を決定するため、ＴＧＡおよびＤＳＣを行った。合成直後の生成物の代表的なＴＧＡ−ＤＳＣプロファイルが得られた（図３Ａ〜Ｂ）。合成直後の生成物のＴＧＡパターン（図３Ａ）は、３０℃から６００℃の間に３段階で生じる、３つの明確な質量損失（全体で１６．１％の質量損失）を示した。また、ＤＳＣパターンも、同じ温度範囲において３段階で３つの明確な吸熱ピークを示した。第１のピーク、ＤＳＣ曲線（図３Ａ）において３０℃から２００℃の温度範囲にある広い吸熱ピークは、合成直後の材料の表面上に物理吸着した２．４ｗｔ％の残留水の放出に関連するものであった。ＴＧＡにおける第２の８．８７ｗｔ％の質量損失（理論上の８．９％の質量損失と比較して）ステップは、２００℃付近で始まり３８０℃で終了し、また対応する明確な吸熱ピークが３３３℃での鋭いピーク（図３Ｂ）とともに同じ温度領域に観察された。この第２の質量損失は、六方Ｅｕ（ＯＨ）３の脱水によるＥｕ（ＯＨ）３からＥｕＯ（ＯＨ）への転換に起因するものと説明することができる（方程式−ｉ）。ＴＧＡにおける４．８ｗｔ％の第３の質量損失（理論上の４．９％の質量損失と比較して）ステップは、３８０℃付近で始まり６００℃で終了し、また対応する明確な吸熱ピーク（図３Ｂ）が４４４℃での鋭いピークとともに同じ温度領域に観察された。この第３の質量損失は、ＥｕＯ（ＯＨ）からＥｕ２Ｏ３への分解に起因するものと説明することができる（方程式−ｉｉ）。これらの第２および第３のステップは、以下のように概略的に表現することができる。
【００４１】
【化１】
2010501002.tif 000003
また、５分、１０分、２０分、および４０分のマイクロ波加熱後に得られた他の合成直後の生成物に関しても、同様の挙動が観察された。ＸＲＤ、ＤＳＣ、およびＴＧＡの結果を組み合わせると、合成直後の材料は水酸化ユウロピウム（ＩＩＩ）［Ｅｕ（ＯＨ）３］であることが示された。
【００４２】
同様に、他の水酸化ランタニド生成物（６０分のマイクロ波照射後）の熱重量分析を図４Ａ〜Ｄに示す。結果は、生成物がＮｄＩＩＩ（ＯＨ）３（図４Ａ）、ＳｍＩＩＩ（ＯＨ）３（図４ＡＢ）、ＧｄＩＩＩ（ＯＨ）３（図４Ｃ）、およびＴｂＩＩＩ（ＯＨ）３（図４Ｄ）であることを示している。
【００４３】
ナノロッドの透過型電子顕微鏡分析：異なる時間でのマイクロ波加熱後に得られた合成直後の水酸化ユウロピウム（ＩＩＩ）［Ｅｕ（ＯＨ）３］材料の形態を、ＴＥＭにより特性決定した（図５Ａ〜Ｆ）。図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、５Ｄ、および５Ｅは、それぞれ、５分、１０分、２０分、４０分、および６０分のマイクロ波加熱後に得られた合成直後の生成物の画像を含む。図５Ｆは、図５Ｅの高倍画像である。合成直後の生成物のＴＥＭ画像により、ＥｕＩＩＩ（ＯＨ）３材料（図５Ａ〜Ｆ）が、完全に直径３５ｎｍから５０ｎｍ、長さ２００ｎｍから３００ｎｍのナノロッドからなることが明らかとなった。
【００４４】
異なる時間のマイクロ波加熱後に得られた合成直後の水酸化Ｎｄ（ＩＩＩ）［ＮｄＩＩＩ（ＯＨ）３］材料の形態を、ＴＥＭにより特性決定した（図６Ａ〜Ｆ）。図６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、６Ｅ、および６Ｆは、それぞれ、１分、５分、１０分、２０分、４０分、および６０分のマイクロ波加熱後に得られた合成直後の生成物の画像を含む。合成直後の生成物のＴＥＭ画像により、ＮｄＩＩＩ（ＯＨ）３材料（図６Ａ〜Ｆ）が、直径３５ｎｍから５０ｎｍの範囲、長さ２００ｎｍから３００ｎｍの範囲のナノロッドからなることが明らかとなった。
【００４５】
異なる時間のマイクロ波加熱後に得られた合成直後の水酸化Ｓｍ（ＩＩＩ）［ＳｍＩＩＩ（ＯＨ）３］材料の形態を、ＴＥＭにより特性決定した（図７Ａ〜Ｆ）。図７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｄ、７Ｅ、および７Ｆは、それぞれ、１分、５分、１０分、２０分、４０分、および６０分のマイクロ波加熱後に得られた合成直後の生成物の画像を含む。合成直後の生成物のＴＥＭ画像により、ＳｍＩＩＩ（ＯＨ）３材料（図７Ａ〜Ｆ）が、直径３５ｎｍから５０ｎｍの範囲、長さ２００ｎｍから３００ｎｍの範囲のナノロッドからなることが明らかとなった。
【００４６】
６０分マイクロ波加熱後に得られた合成直後の水酸化Ｇｄ（ＩＩＩ）［ＧｄＩＩＩ（ＯＨ）３］および水酸化Ｔｂ（ＩＩＩ）［ＴｂＩＩＩ（ＯＨ）３］材料の形態を、ＴＥＭにより特性決定した（図８Ａ〜Ｂ）。図８Ａおよび８Ｂは、それぞれ、６０分のマイクロ波加熱後に得られた合成直後の水酸化Ｇｄ（ＩＩＩ）および水酸化Ｔｂ（ＩＩＩ）ナノ材料の画像を含む。合成直後の生成物のＴＥＭ画像により、ＧｄＩＩＩ（ＯＨ）３（図８Ａ）およびＴｂＩＩＩ（ＯＨ）３材料（図８Ｂ）が、ナノロッドがほとんどないナノ粒子の混合からなることが明らかとなった。
【００４７】
蛍光分光法：ＥｕＩＩＩ（ＯＨ）３ナノロッド中のＥｕ３＋イオンの励起および発光スペクトルが、４ｆ殻内電子の遷移により生じた。水酸化ユウロピウムの蛍光発光および励起スペクトルを図９Ａ〜Ｂに示す。６１６ｎｍの発光波長に対し、３９４ｎｍ（大）、４１５ｎｍ（小）、４６４ｎｍ、および５２５ｎｍ（小）に励起スペクトルが観察された（図９Ａ）。上記波長のいずれかの励起後に、Ｅｕ（ＯＨ）３の主発光スペクトルが、５９２ｎｍ、６１６ｎｍ、６９０ｎｍ、および６９７ｎｍに観察された（図９Ｂ）。発光スペクトル（図９Ｂ）は、５Ｄ０−７ＦＪ（Ｊ＝１、２、３、４）の多様性のＥｕ３＋輝線から構成され、磁気双極子許容５Ｄ０−７Ｆ１遷移（５８８ｎｍ）が最も強い輝線である。
【００４８】
細胞内であってもそれらのＥｕＩＩＩ（ＯＨ）３ナノロッドの蛍光活性が変化せずに維持されるかどうかを決定するために、様々な濃度（５〜１００μｇ／ｍＬ）のこれらのナノロッドで２４時間インキュベートされた内皮細胞の発光（蛍光）スペクトルを、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で十分に洗浄した後、Ｆｌｕｏｒｏｌｏｇ−３  Ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒで記録した。図１０の曲線ａ−、ｂ−、ｃ−、ｄ−、およびｅ−は、それぞれ、５μｇ／ｍＬ（曲線−ａ）、１０μｇ／ｍＬ（曲線−ｂ）、２０μｇ／ｍＬ（曲線−ｃ）、５０μｇ／ｍＬ（曲線−ｄ）、および１００μｇ／ｍＬ（曲線−ｅ）の濃度のＥｕＩＩＩ（ＯＨ）３ナノロッドで処理された内皮細胞の発光スペクトルを示す。すべての場合において蛍光発光が観察された。これらのナノロッドは内皮細胞内で明確な蛍光特性を示したことから、これらのナノロッドが細胞内にあることが間接的に証明された（このことはＴＥＭにより直接的に証明された）。
【００４９】
微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）顕微鏡法、共焦点顕微鏡法、および透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）等の多くの方法を使用して、ナノロッドの細胞内軌跡を決定した。
【００５０】
ＤＩＣ：微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）顕微鏡写真（図１１Ａ〜Ｄ）により、対照細胞（図１１Ａ）と、様々な濃度のＥｕＩＩＩ（ＯＨ）３ナノロッドで処理された細胞（図１１Ｂ〜Ｄ）との間のコントラストにおける有意な差が明らかとなった。これらの結果から、ＥｕＩＩＩ（ＯＨ）３ナノロッドが細胞に進入することができることが間接的に証明された。
【００５１】
共焦点顕微鏡法：共焦点顕微鏡で検出された、無機蛍光ＥｕＩＩＩ（ＯＨ）３ナノロッドを投与したＨＵＶＥＣの蛍光特性およびそれらの対応する位相画像を、それぞれ図１２Ａ〜Ｃの第１列および第２列に示す。対照細胞（第１列、図１２Ａ）、ならびに２０μｇ／ｍＬ（第１列、図１２Ｂ）および５０μｇ／ｍＬ（第１列、図１２Ｃ）の濃度のＥｕＩＩＩ（ＯＨ）３ナノロッドで処理された細胞の蛍光（第１列）およびそれらの対応する位相画像（第２列）を、それぞれ図１２Ａ〜Ｃに示す。ＥｕＩＩＩ（ＯＨ）３ナノロッドは、３９４ｎｍ、４１５ｎｍ、４６４ｎｍ、および５２５ｎｍの波長で有用な励起を有し、３９４ｎｍで最大強度を有する。上記波長（共焦点顕微鏡で利用可能なレーザ励起波長とは整合していない）のいずれのＥｕＩＩＩ（ＯＨ）３ナノロッドの励起も、それぞれ、５９２ｎｍ、６１６ｎｍ、６４９ｎｍ、６９０ｎｍ、および６９７ｎｍでの発光ピークを生成する。この研究において、アルゴンイオンレーザ（４８８ｎｍ励起）とともにＣ−Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ  ６３  Ｘ／ＮＡ  １．２水浸レンズを備えたＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０共焦点レーザ走査顕微鏡を使用して、細胞の共焦点蛍光顕微鏡画像および位相画像を収集した。蛍光発光は、１００×顕微鏡対物で収集し、次いで５１５ｎｍロングパスフィルタを使用してスペクトルフィルタリングを行った。共焦点レーザ走査顕微鏡法（λ＝４８８ｎｍでの励起）による分析により、ナノロッドで処理された細胞の細胞質成分内に散乱したＥｕＩＩＩ（ＯＨ）３ナノロッド内のＥｕ３＋イオンの存在に起因する明るい緑色蛍光（図１２Ｂ〜Ｃ）の存在が明らかとなった。図１２Ａにおける対照ＨＵＶＥＣ細胞（ナノロッドなし）は、自己蛍光に起因する細胞内のわずかな緑色蛍光を明らかにした。全般的に、対照細胞と当該ナノロッドで処理された細胞との間には、蛍光に有意な差が存在した。これらの結果から、ＨＵＶＥＣ細胞内のＥｕＩＩＩ（ＯＨ）３ナノロッドの内在化が証明された。したがって、これらのナノロッドは、薬剤の検出および局在化のための画像化に使用することができる。
【００５２】
細胞内のナノロッドのＴＥＭ：細胞の細胞質成分内のＥｕＩＩＩ（ＯＨ）３ナノロッドの内在化の直接的な証拠は、異なる濃度のそれらのナノロッドで処理された細胞のＴＥＭ画像であった。図１３Ａ〜Ｃは、２０μｇ／ｍＬのＥｕＩＩＩ（ＯＨ）３ナノロッドで処理されたＨＵＶＥＣ（断面化の後）の異なる倍率でのＴＥＭ画像を含む。パネルＢおよびＣに示される画像は、パネルＡに示される画像より高倍率の画像である。図１３Ｄ〜Ｆは、５０μｇ／ｍＬのＥｕＩＩＩ（ＯＨ）３ナノロッドで処理されたＨＵＶＥＣ（断面化の後）の異なる倍率でのＴＥＭ画像を含む。パネルＥおよびＦに示される画像は、パネルＤに示される画像のより高倍の画像である。これらのナノロッドは、ＨＵＶＥＣ細胞の細胞質成分内で可視化された。細胞の形態は、細胞がこれらの材料の内在化の後も健康であることを明確に示した（図１３）。細胞は、ＴＥＭの前にトリプシン処理され、ＴＮＳで中和され、Ｔｒｕｍｐｓ溶液中で固定されたため（ＭｃＤｏｗｅｌｌおよびＴｒｕｍｐ、Ａｒｃｈ．Ｐａｔｈ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．、１００：４０５頁（１９７６年）およびＳｐｕｒｒ、Ｊ．Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔ．Ｒｅｓ．、２６：３１頁（１９６９年））、細胞は球形の形態を示した（図１３Ａおよび１３Ｄ）。図１３Ａおよび１３Ｄはまた、細胞の大多数におけるこれらのナノロッドの取込みを明らかにした。蛍光性ナノロッドによる内皮細胞のインキュベーション、およびその後のこれらのナノロッドの細胞の細胞質成分への内在化は、ナノロッドの形態を変化させた。これは、初期および後期エンドソームの非常に低いｐＨ（３．５）に起因している可能性がある。
【００５３】
図１４Ａ〜Ｄは、ＴｂＩＩＩ（ＯＨ）３ナノロッドで処理されたＨＵＶＥＣ（断面化の後）の異なる倍率でのＴＥＭ画像を含む。ナノロッドは、ＨＵＶＥＣ細胞の細胞質成分内で可視化された。細胞の形態は、細胞がこれらの材料の内在化の後も健康であることを示した（図１４）。パネルＢ、Ｃ、およびＤに示される画像は、パネルＡに示される画像より高倍率の画像である。
【００５４】
総合すると、蛍光分光法、ＤＩＣ、共焦点顕微鏡法、およびＴＥＭの結果は、これらの蛍光性ナノロッドが細胞系に内在化することができ、また顕微鏡法により容易に可視化することができることを示している。したがって、これらのナノロッドは、特定の細胞に対する様々な分子の標的化のための興味深い蛍光プローブとなった。
【００５５】
細胞増殖および生存能力試験：無機ナノロッドを内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）内への蛍光標識として使用する前に、２０〜１００μｇ／ｍＬの異なる濃度のＥｕＩＩＩ（ＯＨ）３ナノロッドでの処理、および１〜２日間のインキュベーション後のＨＵＶＥＣの生存能力を試験し、アポトーシスを観察した。トリパンブルー排除アッセイによる分析では、対照細胞（処理なし）とこれらのナノロッドで処理された細胞との間で細胞死に差はなかった。これらのナノロッドは２４〜４８時間で細胞生存能力に影響しなかったことから、これらの結果はナノロッドが細胞との生体適合性を有することを示した。
【００５６】
増殖の抑制について、正常内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）への［３Ｈ］チミジン取込みアッセイ（Ｋａｎｇら、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．、１３：８０６〜８１６頁（２００２年））を使用して、ＥｕＩＩＩ（ＯＨ）３ナノロッドのインビトロでの毒性を検査した。これらのナノロッドは、ＨＵＶＥＣに対し毒性ではなかった（図１５）。ある種のナノ材料への曝露は、材料の化学的および物理的特性に依存すると思われる生物学的副作用につながる可能があることが示されている（Ｇａｏら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１６：６３頁（２００５年）およびＤｅｒｆｕｓら、Ｎａｎｏ．Ｌｅｔｔ．、４：１１頁（２００４年））。インビボでの毒性は、規制当局により蛍光プローブが人間の臨床用途に承認されるか否かを決定する上での因子となり得る。ＨＵＶＥＣのトリクロロ酢酸沈殿性放射能を使用したチミジン取込みアッセイ（Ｂａｓｕら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ．、７：５６９（２００１年））の結果（図１５）は、これらのナノロッドが用量依存的（２０〜１００μｇ／ｍＬ）に内皮細胞の増殖を誘発することを明確に示した。５０μｇ／ｍＬの濃度で最大増殖が観察され、これらのナノロッドは高濃度（１００μｇ／ｍＬ）では若干毒性を示した。ＨＵＶＥＣ細胞を硝酸ユウロピウム（ＩＩＩ）溶液（ＴＥ緩衝液中５０μｇ／ｍＬ）で処理すると、増殖は観察されなかった。実際、溶液は細胞に若干毒性であることが観察された。実験は３回繰り返した。これらの結果は、ＥｕＩＩＩ（ＯＨ）３ナノロッドが内皮細胞には非毒性であり、細胞の増殖を誘発するある特殊な性質を有することを示している。
【００５７】
ＮｄＩＩＩ（ＯＨ）３ナノロッドもＨＵＶＥＣに非毒性であることが観察された（図１６）。ＨＵＶＥＣを使用して行われたチミジン取込みアッセイの結果（図１６）から、ナノロッド（１０〜５０μｇ／ｍＬ）が用量依存的に内皮細胞の有意な増殖を誘発しないことが明らかとなった。
【００５８】
ＳｍＩＩＩ（ＯＨ）３ナノロッドもＨＵＶＥＣに非毒性であることが観察された（図１７）。ＨＵＶＥＣを使用して行われたチミジン取込みアッセイの結果（図１７）から、ナノロッド（２０〜１００μｇ／ｍＬ）が用量依存的に内皮細胞の有意な増殖を誘発しないことが明らかとなった。
【００５９】
ＴｂＩＩＩ（ＯＨ）３ナノロッドもＨＵＶＥＣに非毒性であることが観察された（図１８）。ＨＵＶＥＣを使用して行われたチミジン取込みアッセイの結果（図１８）から、これらのナノロッドが用量依存的（２０〜１００μｇ／ｍＬ）に内皮細胞の有意な増殖を誘発しないことが明らかとなった。ＴｂＩＩＩ（ＯＨ）３ナノロッドを、２０μｇ／ｍＬの濃度の硝酸テルビウムと比較した。
【００６０】
アポトーシス：ｔｕｎｎｅｌベースのアポトーシスアッセイによると、赤色核はｔｕｎｎｅｌ陽性であった（図１９Ａ〜Ｃ）。核を明確に示すためにＤＡＰＩで２回染色した。陽性対照として、細胞を２．５ｍＭのカンプトテシンで４時間処理した。赤色染色核の１００％が視認された（図１９Ａ）。対照未処理細胞（図１９Ｄ〜Ｆ）と、５０μｇ／ｍＬ（図１９Ｇ〜Ｉ）または１００μｇ／ｍＬ（図１９Ｊ〜Ｌ）の水酸化ユウロピウムナノロッドで処理された細胞との間で、赤色染色核の数に差はなかった（０％）。対照未処理細胞と比較して、ナノロッド処理（１００μｇ／ｍＬ；図１９Ｊ〜Ｋ）細胞では、赤色染色核の約１０％が視認された。これらの結果は、５０μｇ／ｍＬの濃度までは、ナノロッド処理によるＨＵＶＥＣのアポトーシスの誘発はないことを示した。
【００６１】
別のグループ（Ｋｉｒｃｈｎｅｒら、Ｎａｎｏ．Ｌｅｔｔ．、５：３３１頁（２００５年））は、安定なナノ材料の細胞毒性は、Ｃｄ元素の放出よりも第１に凝集に起因することを示した。しかし、本明細書に記載される研究は、カドミウム系材料とは完全に異なる材料のナノロッドを使用している。したがってＥｕＩＩＩ（ＯＨ）３ナノロッドの作用機序はＣｄ系材料と異なると思われ、またそのことが観察されている。
【００６２】
細胞周期：ＥｕＩＩＩ（ＯＨ）３ナノロッド存在下でのＨＵＶＥＣ細胞増殖機構を調査するために、細胞周期分析を行った（図２０）。真核生物における細胞周期は、大まかに４つの相、すなわちＧ１−染色体の複製のための成長および準備；Ｓ−ＤＮＡおよび中心体の合成；Ｇ２−有糸分裂の準備；およびＭ−有糸分裂（細胞が２つの娘細胞に分裂し、それぞれが染色体の完全な組を有する）に分類される。したがって、ＨＵＶＥＣ細胞の増殖は細胞周期に反映されるはずである。Ｓ相ではより多い数が予想され、Ｇ１相ではより少ない数が予想される（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．、１９：１６９２〜１６９４頁（２００５年））。ＨＵＶＥＣ細胞におけるＰＩ染色を使用した細胞周期分析により、対照細胞（処理なし；図２０）の場合と比較して、Ｓ相の細胞の割合の増加、および５０μｇ／ｍＬの濃度のＥｕＩＩＩ（ＯＨ）３ナノロッドでの有意な増加が明らかとなった。逆に、１００μｇ／ｍＬの濃度のＥｕＩＩＩ（ＯＨ）３ナノロッドでは、Ｓ相の細胞の割合は減少した。これらの細胞周期の結果は、増殖アッセイから得られた結果を裏付けている。
【００６３】
Ｍａｐキナーゼリン酸化：細胞増殖アッセイおよび細胞周期分析から得られた結果をさらに確認するために、対照ＨＵＶＥＣ細胞（未処理）および５０μｇ／ｍＬの濃度のＥｕＩＩＩ（ＯＨ）３ナノロッドで異なる時間（例えば５分から２４時間）処理されたＨＵＶＥＣ細胞のウェスタンブロット分析を行った。陽性対照実験（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａら、Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．、４（１２）：２４７９〜２４８１頁（２００４年））において、ＨＵＶＥＣ細胞を１０ｎｇ／ｍＬの濃度の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）で５分間処理した。
【００６４】
図２１Ａおよび２１Ｂは、ＥｕＩＩＩ（ＯＨ）３ナノロッド（５０μｇ／ｍＬ）で異なる長さの時間処理されたＨＵＶＥＣ細胞（パネルＡ）、または異なる濃度（０、２０、または５０μｇ／ｍＬ）のＥｕＩＩＩ（ＯＨ）３ナノロッドで２４時間処理されたＨＵＶＥＣ細胞（パネルＢ）における、ｍａｐキナーゼリン酸化のウェスタンブロット分析からのデータを含む。ＥｕＩＩＩ（ＯＨ）３ナノロッドによる処理は、ｍａｐキナーゼリン酸化を時間依存的に上方調節した（図２１Ａ）。１５分および３０分で最大のｍａｐキナーゼリン酸化が生じ、ＶＥＧＦ処理サンプルよりも上方調節されている。３０分後、ｍａｐキナーゼリン酸化は経時的に減少した。２４時間でレベルが回復したが、これは二相性の性質を示している。
【００６５】
逆に、ＥｕＩＩＩ（ＯＨ）３ナノロッドの濃度（２０〜１００μｇ／ｍＬ）の増加とともに、ｍａｐキナーゼリン酸化は増加し、５０μｇ／ｍＬで最大に達した。Ｍａｐキナーゼリン酸化は、１００μｇ／ｍＬで減少した。これらの結果は、細胞増殖アッセイ結果を支持している。したがって、これらのナノロッドによる処理後のＨＵＶＥＣ細胞の細胞増殖は、ｍａｐキナーゼリン酸化経路を介して生じ得ると結論付けられる。
【００６６】
ＲＯＳ：対照実験においては、緑色蛍光は見られず（図２２Ａ〜Ｃ）、これはＲＯＳ形成がなかったことを示している。ＲＯＳの陽性対照実験では、ＨＵＶＥＣ細胞は、１μＭのｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド（ＴＢＨＰ）による１時間の処理により誘発された（図２２Ｄ〜Ｆ）。緑色蛍光（図２２Ｄ〜Ｆ）はカルボキシ−Ｈ２ＤＣＦＤＡの酸化生成物の形成を示し、これは細胞内のＲＯＳの減少を示唆していた。核を青色で明確に示すために、細胞をＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２で２回染色した。図２２Ｇ〜Ｉおよび図２２Ｊ〜Ｌは、それぞれ２０μｇ／ｍＬおよび５０μｇ／ｍＬの濃度のＥｕＩＩＩ（ＯＨ）３ナノロッドの存在下でのＲＯＳの生成を明らかにした。図２２の第３列（パネルＣ、Ｆ、Ｉ、およびＬ）は、第１列（緑）および第２列（青）の合成画像を示した。これらの実験は、内皮細胞が、ＲＯＳ媒介リン酸化ｍａｐキナーゼ経路を介して増殖し得ることを示していた。
【００６７】
ＣＡＭアッセイ（ナノ粒子はインビボでの血管新生を誘発する）：インビトロでの所見のインビボでの関連性を決定するために、ニワトリＣＡＭアッセイを行ってナノ粒子誘発血管新生を測定した。ＣＡＭをＴＥ（トリス−ＥＤＴＡ）緩衝溶液のみで処理する対照実験を行った（図２３Ａ）。ナノ粒子賦形剤で処理されたＣＡＭと比較すると、１μｇ／ｍＬおよび１０μｇ／ｍＬのＥｕＩＩＩ（ＯＨ）３ナノロッドが、有意な血管新生を誘発した（図２３Ｃ〜Ｄ）。この血管新生反応は、既知のＶＥＧＦ−Ａの血管新生促進刺激で観察される反応（図２３Ｂ）の約半分であった。より高い用量（２０μｇ／ｍＬ）のナノ粒子では、ＣＡＭ上にプラークが形成されることが分かり、これにより血管分岐点の正確な分析が不可能となった。多くの場合において、このプラークを別として、血管新生が認められた。これらの結果は、ＥｕＩＩＩ（ＯＨ）３ナノロッドが有意なインビボでの血管新生効果を発揮し得ることを示しており、インビトロでの所見を支持している。また、ナノロッドを使用した血管新生アッセイ（ＣＡＭアッセイ）の定量データもヒストグラムとして示した（図２３Ｅ）。
【００６８】
要約すると、無機蛍光性材料として使用可能な水酸化ユウロピウム（ＩＩＩ）ナノロッドが、単純、迅速、清浄、効率的、経済的、非毒性、および環境に優しいマイクロ波技術により合成された。水酸化ユウロピウム（ＩＩＩ）ナノロッドは、内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）内であってもその蛍光特性を維持した。蛍光分光法、微分干渉コントラスト顕微鏡法（ＤＩＣ）、共焦点顕微鏡法、および透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）によりそれらを特性決定した。ナノロッドは、生物学における蛍光標識として、従来の有機色素に勝るいくつかの利点を有する。例えば、これらのナノロッドは、［３Ｈ］チミジン取込みアッセイおよび細胞周期アッセイにより観察されるように、ＨＵＶＥＣ細胞増殖を促進することができる。さらに、血管新生および抗血管新生を検査するためのモデルとして十分に確立され広く使用されているＣＡＭアッセイを使用して、Ｅｕ（ＯＨ）３ナノロッドの血管新生促進特性が発見された。
【００６９】
本明細書で提供される水酸化ユウロピウムナノロッドは、（ａ）生物学および医学における安定で明るい蛍光標識、（ｂ）インビボ系における血管新生促進材料、および（ｃ）薬物分子と結合した後の薬物送達媒体として使用することができる。さらに、本明細書で提供される非毒性の水酸化ユウロピウムナノロッドは、人間の心臓または四肢の虚血組織に対して使用することができる。
【００７０】
（実施例６）
インビボ毒性研究
１８匹のヌードマウス（オス）を、０μｇ（トリス−ＥＤＴＡ溶液を投与した対照群）、２０μｇ（１ｍｇＫｇ−１日−１）、または１００μｇ（５ｍｇＫｇ−１日−１）のトリス−ＥＤＴＡ中水酸化ユウロピウム［ＥｕＩＩＩ（ＯＨ）３］ナノロッドを１週間、ＩＰ投与経路で投与される３つの群（各群６匹）に無作為化した。水酸化ユウロピウムナノロッドの通常の注射を行った１週間の間、１日１回、マウスの体重を量り、あらゆる副作用または臨床的兆候について検査した。取り扱いを容易にするために、ケタミン／キシラジンの混合物を使用してマウスを麻酔した。生化学的毒性および血液毒性分析のために、屠殺時に血液および血清を採取した。対照動物と比較したマウス中の水酸化ユウロピウムナノロッドの効果を評価するために、対照群のマウスは対応する実験群のマウスと同時に屠殺した。マウスは、血液採取後に二酸化炭素吸入法により屠殺した。血液学的検体には、示差ヘモグロビンを除くＣＢＣ、ヘマトクリット、赤血球、平均赤血球容積（ＭＣＶ）、ＲＢＣ分布幅、白血球および血小板数が含まれた。血液化学的検体には、アルカリ性リン酸塩、Ｓ（ＡＬＰ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、クレアチニン（ＣＲ）、総ビリルビン−Ｓ（ＴＢＬＩ）、および血中尿素窒素（ＢＵＮ）が含まれた。
【００７１】
７日間の毒性研究において、トリス−ＥＤＴＡ緩衝液中の水酸化ユウロピウムナノロッドの静脈注射（１ｍｇＫｇ−１日−１および５ｍｇＫｇ−１日−１）は、正常な血液学（表１）および血液化学（表２）を示した。これらの結果は、上述の用量にわたって水酸化ユウロピウムナノロッドはインビボモデルにおいて非毒性と思われることを示している。
【００７２】
（表１）
血液中に０ｍｇＫｇ−１日−１（陰性対照、ＴＥ緩衝液０．１ｍＬ）、１ｍｇＫｇ−１日−１（０．１ｍＬ）および５ｍｇＫｇ−１日−１（０．１ｍＬ）のＴＥ緩衝液懸濁水酸化ユウロピウムナノロッドを静脈注射したマウスの、７日目に採取した血液の血液学。測定毎に６匹の動物を使用したが、すべての値が正常範囲内であった。
【００７３】
【表１】
2010501002.tif 000004
（表２）
血液中に０ｍｇＫｇ−１日−１（陰性対照、ＴＥ緩衝液０．１ｍＬ）、１ｍｇＫｇ−１日−１（０．１ｍＬ）および５ｍｇＫｇ−１日−１（０．１ｍＬ）のＴＥ緩衝液懸濁水酸化ユウロピウムナノロッドを静脈注射したマウスの、７日目に採取した血清臨床化学。測定毎に６匹の動物を使用したが、すべての値が正常範囲内であった。
【００７４】
【表２】
2010501002.tif 000005
他の実施形態
その詳細な説明と併せて本発明を説明してきたが、上記説明は本発明を例示することを意図し、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の範囲を制限する意図はないことを理解されたい。他の態様、利点、および修正は、以下の特許請求の範囲内である。
【図１】
2010501002.tif 000006
【図２】
2010501002.tif 000007
【図３】
2010501002.tif 000008
【図４】
2010501002.tif 000009
【図５】
2010501002.tif 000010
【図６】
2010501002.tif 000011
【図７】
2010501002.tif 000012
【図８】
2010501002.tif 000013
【図９−１】
2010501002.tif 000014
【図９−２】
2010501002.tif 000015
【図１０】
2010501002.tif 000016
【図１１】
2010501002.tif 000017
【図１２】
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【図１３】
2010501002.tif 000019
【図１４】
2010501002.tif 000020
【図１５】
2010501002.tif 000021
【図１６】
2010501002.tif 000022
【図１７】
2010501002.tif 000023
【図１８】
2010501002.tif 000024
【図１９】
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【図２０】
2010501002.tif 000026
【図２１】
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【図２２】
2010501002.tif 000028
【図２３−１】
2010501002.tif 000029
【図２３−２】
2010501002.tif 000030
【国際調査報告】
2010501002.tif 000031
2010501002.tif 000032