(57)【要約】【課題】癌、肥満、及び微生物感染症の治療方法を提供する。【解決手段】  以下の一般式：【化１】2010509335.tif 000038で表される化合物、この化合物を含む医薬組成物、ならびにこのような組成物を用いる癌、肥満、及び微生物感染症の治療方法を提供する。【選択図】  図３
2010509335.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式
【化１】
2010509335.tif 000030
（式中、Ｒ１＝Ｈ、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アリール、アリールアルキル、又はアルキルアリール、−ＯＣＨ３、−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ３又は−ＯＣ（Ｏ）ＣＦ３であり、
Ｒ２＝−ＯＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨＮＨ−Ｒ５であり、ここで、Ｒ５は、
（ａ）１つ又は複数のハロゲンによって任意で置換されたフェニル、ハロゲン、−ＯＨ、−ＯＲ６（式中、Ｒ６はハロゲンによって任意で置換されたＣ１〜Ｃ８アルキルである）によって任意で置換されたＣ１〜Ｃ８アルキルであるか、あるいは
（ｂ）ハロゲン、−ＯＨ、−ＯＲ６（式中、Ｒ６はハロゲンによって任意で置換されたＣ１〜Ｃ８アルキルである）によって任意で置換された２−、３−、又は４−ピリジルであるか、あるいは
（ｃ）イミダゾール、チアゾール、ベンゾイミジゾール、ベンゾオキサゾール、ベンゾチアゾール、テトラゾール、トリアゾール、及びアミノチアゾールからなる群から選択される複素環であるか、あるいは
（ｄ）−Ｃ（Ｏ）Ｒ７（式中、Ｒ７は、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アリール、アリールアルキル、又はアルキルアリール、もしくはピリジル、イミダゾール、チアゾール、ベンゾイミジゾール、ベンゾオキサゾール、ベンゾチアゾール、テトラゾール、トリアゾール、及びアミノチアゾールからなる群から選択される複素環である）であり、そして
Ｒ３及びＲ４は互いに同じでも異なっていてもよく、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アリール、アリールアルキル、又はアルキルアリールであり、
ただし、Ｒ１が−Ｈ、−ＯＣＨ３、又は−ＯＣ（Ｏ）ＣＦ３であり、Ｒ３が−（ＣＨ２）７ＣＨ３である場合、Ｒ２は−ＯＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨＮＨ−Ｒ５（式中、Ｒ５は−ｐ−Ｃ６Ｈ４Ｃｌ、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、又は
【化２】
2010509335.tif 000031
である）ではないことを条件とする）
の化合物。
【請求項２】
Ｒ１がＨである請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ５が、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アリール、アリールアルキル、又はアルキルアリールである請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ３が、−Ｈ又は−ＣＨ３である請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ４が、ｎ−Ｃ６〜Ｃ８アルキルである請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
前記化合物が、
【化３】
2010509335.tif 000032
からなる群から選択される請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
医薬希釈剤及び請求項１に記載の化合物を含む医薬組成物。
【請求項８】
Ｒ１がＨである請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
Ｒ５がＣ１〜Ｃ１０アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アリール、アリールアルキル、又はアルキルアリールである請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
Ｒ３が、−Ｈ又は−ＣＨ３である請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
Ｒ４が、ｎ−Ｃ６〜Ｃ８アルキルである請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記化合物が、
【化４】
2010509335.tif 000033
からなる群から選択される請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
動物又はヒト被験者において癌を治療する方法であって、請求項７に記載の医薬組成物を前記被験者に有効量投与することを含む方法。
【請求項１４】
前記被験者がヒトである請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記被験者が動物である請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記医薬組成物が、
【化５】
2010509335.tif 000034
からなる群から選択される化合物を含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記医薬組成物が、
【化６】
2010509335.tif 000035
からなる群から選択される化合物を含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
動物又はヒト被験者において脂肪酸シンターゼ活性を阻害する方法であって、請求項７に記載の医薬組成物を前記被験者に有効量投与することを含む方法。
【請求項１９】
前記被験者がヒトである請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記被験者が動物である請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
動物又はヒト被験者において侵襲性微生物細胞の増殖を阻害する方法であって、請求項７に記載の医薬組成物を前記被験者に有効量投与することを含む方法。
【請求項２２】
前記被験者がヒトである請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記被験者が動物である請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記化合物が、
【化７】
2010509335.tif 000036
からなる群から選択される請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記化合物が、
【化８】
2010509335.tif 000037
からなる群から選択される請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
脂肪酸シンターゼ
脂肪酸は、細胞の生理機能において３つの主要な役割を果たす。第１に、これらは生体膜の構成要素（building bock）である。第２に、脂肪酸誘導体は、ホルモン及び細胞内メッセンジャーとしての機能を果たす。第３に、そして本発明に特に重要であるが、脂肪酸は、中性脂肪としても知られるトリアシルグリセロールとして脂肪組織に貯蔵することができる燃料分子である。
【０００３】
脂肪酸合成経路には４つの主要な酵素が関与しており、それらは、脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）、リンゴ酸酵素、及びクエン酸リアーゼである。主たる酵素のＦＡＳは、前駆体マロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡのＮＡＤＰＨ依存性縮合を触媒して、脂肪酸を産生する。ＮＡＤＰＨは、一般にＦＡＳの反応サイクルの２箇所において必須の電子供与体としての機能を果たす還元剤である。他の３つの酵素（すなわち、ＡＣＣ、リンゴ酸酵素、及びクエン酸リアーゼ）は、必要な前駆体を産生する。他の酵素、例えば、ＮＡＤＰＨを産生する酵素も脂肪酸合成に関与する。
【０００４】
ＦＡＳは酵素委員会（Ｅ．Ｃ．）番号２．３．１．８５を有し、脂肪酸シンターゼ、脂肪酸リガーゼ、及びその系統名アシル−ＣｏＡ：マロニル−ＣｏＡ  Ｃ−アシルトランスフェラーゼ（脱炭酸化、オキソアシル−及びエノイル−還元、ならびにチオエステル加水分解）としても知られている。脂肪酸のＦＡＳ触媒合成には７つの別個の酵素（又は触媒ドメイン）が関与しており、それらは、アセチルトランスアシラーゼ、マロニルトランスアシラーゼ、β−ケトアシルシンテターゼ（縮合酵素）、β−ケトアシルレダクターゼ、β−ヒドロキシアシルデヒドラーゼ、エノイルレダクターゼ、及びチオエステラーゼである（Wakil, S．J., Biochemistry, 28：4523-4530, 1989）。これらの７つ全ての酵素は一緒にＦＡＳを形成する。
【０００５】
脂肪酸のＦＡＳ触媒合成は、例えば下等生物などにおいても、例えばヒトなどの高等生物においても同様であるが、いくつかの重要な違いがある。細菌では、７つの酵素反応は、関連のない７つの別々のポリペプチドによって行われる。これは、ＩＩ型ＦＡＳとして分類される。対照的に、マイコバクテリア、酵母菌及びヒトにおける酵素反応は、多機能ポリペプチドによって行われる。例えば、酵母菌は２つの別々のポリペプチドからなる複合体を有するが、マイコバクテリア及びヒトでは、７つ全ての反応が単一のポリペプチドによって行われる。これらは、Ｉ型ＦＡＳとして分類される。
【０００６】
ＦＡＳ阻害薬
様々な化合物が、脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）を阻害することが示されている。ＦＡＳ阻害薬は、精製ＦＡＳの酵素活性を阻害する化合物の能力によって同定することができる。ＦＡＳ活性は、放射標識された前駆体（すなわち、アセチルＣｏＡ又はマロニルＣｏＡ）の脂肪酸への取込みを測定することによって、あるいはＮＡＤＰＨの酸化を分光光度的に測定することによってアッセイすることができる（Dils, et al., Methods Enzymol., 35:74-83）。
【０００７】
以下に示される表１は、いくつかのＦＡＳ阻害薬を記載する。
【０００８】
【表１】
2010509335.tif 000003
【０００９】
脂肪酸合成経路における４つの酵素のうち、ＦＡＳは脂肪酸への経路内でのみ作用するが、他の３つの酵素は他の細胞機能にも関係するので、ＦＡＳは阻害のための好ましい標的である。したがって、他の３つの酵素のうちの１つを阻害すると、正常細胞に影響を与える可能性が高い。ＦＡＳによって行われる７つの酵素ステップのうち、縮合酵素（すなわち、β−ケトアシルシンテターゼ）及びエノイルレダクターゼによって触媒されるステップは、脂肪酸合成を低減又は停止させる阻害薬のための最も一般的な候補となっている。ＦＡＳ複合体の縮合酵素は、構造及び機能に関して十分に特徴付けられている。縮合酵素の活性部位は重要なシステインチオールを含有し、これは、例えば阻害薬セルレニンなどの抗高脂血症薬の標的である。
【００１０】
縮合酵素の好ましい阻害薬には広範な化合物が含まれ、アルキル化剤、酸化剤、及びジスルフィド交換を受けることができる試薬が含まれる。酵素の結合ポケットは、長鎖Ｅ，Ｅジエンを好む。
【００１１】
主に、側鎖ジエン及びチオラートアニオンとの反応性を示す基を含有する試薬は、縮合酵素の良好な阻害薬であり得る。セルレニン［（２Ｓ，３Ｒ）−２，３−エポキシ−４−オキソ−７，１０ドデカジエノイルアミド］は一例である。
【化１】
2010509335.tif 000004
セルレニンは、脂肪酸シンターゼの縮合酵素の活性部位における重要なシステインチオール基に共有結合し、この重要な酵素ステップを不活性化する（Funabashi, et al., J. Biochem., 105:751-755, 1989）。セルレニンは他の活性を有することが示されているが、これらはヒト細胞の関連モデルではない微生物において生じる（例えば、真菌におけるコレステロール合成の阻害、Omura(1976), Bacteriol. Rev., 40: 681-697、又はウイルスにおけるＲＮＡ合成の低下、Perez, et al. (1991), FEBS, 280: 129-133）か、実質的により高い薬物濃度で生じる（５ｍｇ／ｍｌでのウイルスＨＩＶプロテアーゼの阻害、Moelling, et al. (1990), FEBS, 261:373-377）か、あるいは内因性脂肪酸合成の阻害の直接的な結果であり得る（Ｂリンパ球及びマクロファージにおける抗原プロセシングの阻害、Falo, et al. (1987), J. Immunol., 139: 3918-3923）。あるデータは、セルレニンがタンパク質のミリストイル化を特異的に阻害しないことを示唆する（Simon, et al., J. Biol. Chem., 267:3922-3931, 1992）。
【００１２】
さらにいくつかのＦＡＳ阻害薬が米国特許第５，６１４，５５１号に開示されており、その開示は参照によって本明細書に援用される。脂肪酸シンターゼ、クエン酸リアーゼ、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ、及びリンゴ酸酵素の阻害薬が含まれる。
【００１３】
Tomodaら（Tomoda et..al., Biochim. Biophys. Act 921:595-598 1987、Omura el. al., J. Antibiotics 39:1211-1218 1986）は、天然に存在するアシル−ＣｏＡシンテターゼ阻害薬のトリアクシン（Triacsin）Ｃ（ＷＳ−１２２８Ａと呼ばれることもある）について記載しており、これはストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種ＳＫ−１８９４の産物である。トリアクシンＣの化学構造は１−ヒドロキシ−３−（Ｅ，Ｅ，Ｅ−２’，４’，７’−ウンデカトリエニリジン）トリアゼンである。トリアクシンＣは、８．７μＭでラット肝臓アシル−ＣｏＡシンテターゼの５０％の阻害を引き起こし、関連化合物のトリアクシンＡは、長鎖脂肪酸と競合するメカニズムによってアシルＣｏＡ−シンテターゼを阻害する。アシル−ＣｏＡシンテターゼの阻害は、動物細胞にとって有毒である。Tomodaら（Tomoda el. al., J. Biol. Chem. 266:4214-4219, 1991）は、トリアクシンＣが１．０μＭでＲａｊｉ細胞において増殖阻害を引き起こすことを教示しており、またＶｅｒｏ及びＨｅｌａ細胞の増殖を阻害することも示されている。Tomodaらはさらに、アシル−ＣｏＡシンテターゼが動物細胞において必須であること、そして酵素の阻害が致死的な効果を有することを教示している。
【００１４】
化合物群（γ−置換−α−メチレン−β−カルボキシ−γ−ブチロラクトン）は、米国特許第５，９８１，５７５号（その開示は参照によって本明細書に援用される）において、脂肪酸合成を阻害し、腫瘍細胞の増殖を阻害し、そして体重減少を誘発すると示されている。米国特許第５，９８１，５７５号に開示される化合物は、治療用途のために天然産物のセルレニンを越えるいくつかの利点を有する：［１］セルレニンの高度に反応性のエポキシド基を含有しない、［２］水溶液中で安定かつ可溶性である、［３］２段階合成反応によって製造され、したがって容易に大量で製造され得る、そして［４］生化学的及び薬理学的分析のために容易に高比活性にトリチウム化される。脂肪酸シンターゼ阻害薬であるこの化合物群の合成は、米国特許第５，９８１，５７５号に記載されており、ＦＡＳを発現する腫瘍細胞を治療するための手段としてのその使用及び体重を減少させるための手段としてのその使用も記載されている。また米国特許第５，９８１，５７５号は、体重を減少させる手段として脂肪細胞塊（脂肪細胞の数又はサイズ）を体系的に減少させるための脂肪酸シンターゼ阻害薬の使用も開示している。
【００１５】
マウス及びヒトにおける脂肪酸合成の主要部位は、肝臓（Roncari, Can. J. Biochem., 52:221-230, 1974、Triscari et al., 1985, Metabolism, 34:580-7、Barakat et al., 1991, Metabolism, 40:280-5を参照）、授乳中の乳腺（Thompson, et al., Pediatr. Res., 19:139-143, 1985を参照）、及び脂肪組織（Goldrick et al., 1974, Clin. Sci. Mol. Med., 46:469-79）である。
【００１６】
抗菌薬としての脂肪酸合成の阻害薬
セルレニンは、最初は、潜在的な抗真菌抗生物質としてセファロスポリウム・カエルレセンス（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｃａｅｒｕｌｅｎｓ）の培養ブロスから単離された。構造的には、セルレニンは、（２Ｒ，３Ｓ）−エポキシ−４−オキソ−７，１０−トランス，トランス−ドデカン酸アミドとして特徴付けられている。その作用メカニズムは、脂肪酸の生合成に必要とされる縮合酵素であるであるβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼの不可逆結合による阻害であることが示されている。セルレニンは、主にカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）及びサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種に対する抗真菌薬として分類されている。さらに、ある種の細菌、放線菌、及びマイコバクテリアに対していくらかのインビトロ活性が示されているが、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に対する活性は見られなかった。脂肪酸合成の阻害薬、特にセルレニンの活性は、トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）などの原生動物、又はニューモシスティス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ）、ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａ）、プラスモディウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種、膣トリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、トリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）及びシストソーマ（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）などの他の感染性真核病原体に対して評価されていない。
【００１７】
治療の影響を特に受けやすい感染症は、感染動物の外部から接近可能な表面に病変を生じる疾患である。外部から接近可能な表面には、非侵襲的な手段（皮膚を切断又は穿刺することなく）により到達することができる全ての表面が含まれ、皮膚表面そのもの、鼻、口、胃腸、又は尿生殖器表面を覆うような粘膜、及び肺胞嚢などの肺表面が挙げられる。影響を受けやすい疾患としては、（１）特に、小胞子菌（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ）、白癬菌（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）、表皮菌（Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ）、又は粘膜皮膚カンジダ症（Ｍｕｃｏｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｃａｎｄｉｄｉａｓｉｓ）、によって引き起こされる場合の皮膚真菌症又は白癬、（２）特に、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）又はカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）によって引き起こされる場合の真菌性角膜炎、（３）特に、アカントアメーバ（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ）によって引き起こされる場合のアメーバ性角膜炎、（４）特に、ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａ）、エントアメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ）、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、ミクロスポリジウム（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、又はカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）によって引き起こされる場合の胃腸疾患（免疫無防備状態の動物において最も一般的）、（５）特に、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）又は膣トリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）によって引き起こされる場合の泌尿生殖器感染、そして（６）特に、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、又はニューモシスティス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ）によって引き起こされる場合の肺疾患が挙げられる。脂肪酸合成阻害薬による治療の影響を特に受けやすい感染性生物としては、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、特に多剤耐性菌株、及びトキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）などの原生動物が挙げられる。
【００１８】
脂肪酸合成を阻害する化合物はどれも、微生物細胞の増殖を阻害するために使用することができる。しかしながら、患者に投与される化合物は、患者及び標的微生物細胞の両方に対して等しく毒性であってはならない。したがって、標的微生物細胞にのみ、又は主として標的微生物細胞に影響を与える阻害薬を選択することが有益である。
【００１９】
その独自の内因的に合成された脂肪酸に依存する真核微生物細胞は、Ｉ型ＦＡＳを発現し得る。これは、ＦＡＳ阻害薬が増殖阻害性であるということと、外因的に添加された脂肪酸はＦＡＳ阻害薬から正常な患者の細胞を保護できるがこれらの微生物細胞を保護できないということとの両方によって示されている。したがって、細胞による脂肪酸の合成を防止する薬剤は、感染を治療するために使用することができる。真核生物において、脂肪酸は、基質のアセチルＣｏＡ、マロニルＣｏＡ及びＮＡＤＰＨを用いてＩ型ＦＡＳによって合成される。したがって、この経路に基質を供給することができる他の酵素も脂肪酸合成の速度に影響し、したがって内因的に合成された脂肪酸に依存する微生物において重要であり得る。これらの酵素のいずれかの発現又は活性の阻害は、内因的に合成された脂肪酸に依存する微生物細胞の増殖をもたらす。
【００２０】
Ｉ型ＦＡＳの産物は種々の生物体で異なる。例えば、真菌Ｓ．セレビシエ（Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）では、産物は、主に、補酵素Ａとエステル化されたパルミテート及びステアレートである。マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）では、産物は、１６〜２４個の範囲の炭素長の飽和脂肪酸ＣｏＡエステルである。これらの脂質はさらにプロセシングされて、種々の脂質成分に対する細胞の要求を満たすことが多い。
【００２１】
下流の脂肪酸のプロセシング又は利用における重要な工程の阻害は、細胞が内因性の脂肪酸に依存するか、あるいは細胞外から供給される脂肪酸を利用するかに関わらず、細胞機能を阻害することが予想され、したがって、これらの下流工程の阻害薬は、内因性の脂肪酸に依存する微生物細胞に対して十分に選択的でない可能性がある。しかしながら、このような微生物にＩ型脂肪酸合成阻害薬を投与すると、下流の脂肪酸のプロセシング及び／又は利用の阻害薬による阻害に対してより感受性になることが発見された。この相乗効果のために、脂質の生合成及び／又は利用における下流の工程の１つ又は複数の阻害薬と組み合わせた脂肪酸合成阻害薬の投与は、内因的に合成された脂肪酸に依存する微生物細胞に選択的に影響を与え得る。好ましい組み合わせには、ＦＡＳ及びアセチルＣｏＡカルボキシラーゼの阻害薬、又はＦＡＳ及びＭＡＳの阻害薬が含まれる。
【００２２】
哺乳類がＩ型ＦＡＳを発現する生物体の細胞に感染したことが決定された場合、あるいは患者の生体液においてＦＡＳが発見された場合には、その哺乳類又は患者は、脂肪酸合成阻害薬を投与することによって治療することができる（特許第５，６１４，５５１号）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
癌細胞の増殖を阻害するためのＦＡＳ阻害薬の使用は、米国特許第５，７５９，８３７号に記載されており、その開示は参照によって本明細書に援用される。その出願は、本明細書において開示される化合物のいずれについても記載又は開示していない。
【００２４】
ＦＡＳ阻害薬として作用することができる１つの種類の化合物は国際公開第２００４／００５２７７号パンフレットに開示されており、その開示は、参照によって本明細書に援用される。その出願は、本明細書において権利請求される化合物のいずれについても記載又は開示していない。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
発明の概要
様々な治療的に有用な特性、例えばＦＡＳ阻害、並びに抗癌及び抗菌特性を有する新しい種類の化合物が発見された。
【００２６】
本発明の目的は、医薬希釈剤及び式Ｉの化合物を含む医薬組成物を投与することによって、動物及びヒトにおいて体重減少を誘発する方法を提供することである。
【００２７】
本発明の更なる目的は、医薬希釈剤及び式Ｉの化合物を含む医薬組成物を投与することによって、ヒト又は動物において脂肪酸シンターゼ活性を阻害する方法を提供することである。
【００２８】
本発明のさらなる目的は、医薬希釈剤及び式Ｉの化合物を含む医薬組成物を投与することによって、動物及びヒトにおいて癌を治療する方法を提供することである。
【００２９】
さらに本発明のさらなる目的は、医薬希釈剤及び式Ｉの化合物を含む医薬組成物を投与することによって、動物及びヒトにおいて癌細胞の増殖を予防する方法を提供することである。
【００３０】
本発明のさらなる目的は、医薬希釈剤及び式Ｉの化合物を含む医薬組成物を投与することによって、侵襲性微生物細胞の増殖を阻害する方法を提供することである。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
図面の簡単な説明
【図１】本発明に関連する化合物及び中間体を製造するための合成スキームを示す。
【図２】本発明に係る化合物を製造するための合成スキームを示す。
【図３】本発明の実施の形態に係る化合物である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
発明の詳細な説明
本発明の化合物は、従来の手段によって調製することができる。多数の化合物の合成は実施例に記載されている。化合物は、肥満、癌、又は微生物ベースの感染症の治療のために有用であり得る。
【００３３】
本発明の１つの実施形態は、以下の一般式：
【化２】
2010509335.tif 000005
で表される化合物であり、式中、
Ｒ１＝Ｈ、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アリール、アリールアルキル、又はアルキルアリール、シアノメチル、−ＯＣＨ３、−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ３又は−ＯＣ（Ｏ）ＣＦ３であり、
Ｒ２＝−ＯＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨＮＨ−Ｒ５であり、ここで、Ｒ５は、
（ａ）１つ又は複数のハロゲンによって任意で置換されたフェニル、ハロゲン、−ＯＨ、−ＯＲ６（式中、Ｒ６はハロゲンによって任意で置換されたＣ１〜Ｃ８アルキルである）によって任意で置換されたＣ１〜Ｃ８アルキルであるか、あるいは
（ｂ）ハロゲン、−ＯＨ、−ＯＲ６（式中、Ｒ６はハロゲンによって任意で置換されたＣ１〜Ｃ８アルキルである）によって任意で置換された２−、３−、又は４−ピリジルであるか、あるいは
（ｃ）イミダゾール、チアゾール、ベンゾイミダゾール、ベンゾオキサゾール、ベンゾチアゾール、テトラゾール、トリアゾール、及びアミノチアゾールからなる群から選択される複素環であるか、あるいは
（ｄ）−Ｃ（Ｏ）Ｒ７（式中、Ｒ７は、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アリール、アリールアルキル、又はアルキルアリール、もしくはピリジル、イミダゾール、チアゾール、ベンゾイミジゾール（benzimidizole）、ベンゾオキサゾール、ベンゾチアゾール、テトラゾール、トリアゾール、及びアミノチアゾールからなる群から選択される複素環である）であり、そして
Ｒ３及びＲ４は互いに同じでも異なっていてもよく、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アリール、アリールアルキル、又はアルキルアリールであり、
ただし、Ｒ１が−Ｈ、−ＯＣＨ３、又は−ＯＣ（Ｏ）ＣＦ３であり、Ｒ３が−（ＣＨ２）７ＣＨ３である場合、Ｒ２は−ＯＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨＮＨ−Ｒ５（式中、Ｒ５は−ｐ−Ｃ６Ｈ４Ｃｌ、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、又は
【化３】
2010509335.tif 000006
である）ではないことを条件とする。
【００３４】
該当する場合、上記化合物のケト互変異性形態も式Ｉに含まれることは理解されるべきである。
【００３５】
好ましい実施形態では、Ｒ１はＨである。
【００３６】
もう１つの好ましい実施形態では、Ｒ５は、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アリール、アリールアルキル、又はアルキルアリールである。
【００３７】
もう１つの好ましい実施形態では、Ｒ３は、−Ｈ又は−ＣＨ３である。
【００３８】
もう１つの好ましい実施形態では、Ｒ４は、ｎ−Ｃ６〜Ｃ８アルキルである。
【００３９】
もう１つの好ましい実施形態では、Ｒ６は、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルである。
【００４０】
本発明のもう１つの実施形態は、医薬希釈剤及び式Ｉの化合物を含む医薬組成物である。
【００４１】
本発明の組成物は、ヒト及び他の動物への投与のために、錠剤、カプセル剤、丸剤、粉末剤、顆粒剤、無菌非経口溶液又は懸濁液、経口溶液又は懸濁液、適切な量の化合物を含有する水中油及び油注水エマルジョン、坐剤などの単位剤形で、そして流動性の懸濁液及び溶液で提供することができる。本明細書において使用される場合、「医薬希釈剤」及び「医薬キャリア」は同じ意味を有する。経口投与のために、固体又は流体の単位剤形を調製することができる。錠剤などの固体組成物を調製するために、化合物は、タルク、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウム（dicalcium phosphate）、ケイ酸マグネシウムアルミニウム、硫酸カルシウム、デンプン、ラクトース、アカシア、メチルセルロース、及び医薬希釈剤又はキャリアと機能的に類似した材料などの従来の成分と混合することができる。
【００４２】
カプセル剤は、化合物を不活性な医薬希釈剤と混合し、混合物を適切な大きさの硬ゼラチンカプセル剤に充填することによって調製される。軟ゼラチンカプセル剤は、化合物と、許容できる植物油、軽流動ワセリン又は他の不活性油とのスラリーの機械カプセル化によって調製される。
【００４３】
シロップ剤、エリキシル剤、及び懸濁液などの流体単位剤形又は経口投与を調製することができる。これらの剤形は、糖又は別の甘味料、芳香族香味料及び防腐剤と一緒に水性媒体中に溶解させて、シロップ剤を形成することができる。懸濁液は、アカシア、トラガカント、メチルセルロースなどの懸濁剤を用いて水性媒体と共に調製することができる。
【００４４】
非経口投与のために、流体単位剤形は、化合物及び無菌媒体を用いて調製することができる。溶液の調製において、化合物は、注射のために水中に溶解させ、適切なバイアル又はアンプルに充填し密閉する前にろ過滅菌することができる。局所麻酔薬、防腐剤及び緩衝剤などの補助剤が媒体中に溶解され得る。組成物はバイアルに充填された後、凍結され、真空下で水が除去され得る。次に、凍結乾燥した粉末は、バイアル中で計量され、使用する前に再構成され得る。
【００４５】
本発明の化合物について想定される臨床治療的な兆候には、（１）ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）及び腸球菌（ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ）などの侵襲性微生物による感染、（２）その細胞が脂肪酸シンターゼを過剰発現する多くの組織に生じる癌、ならびに（３）過剰なカロリーの摂取による肥満が含まれる。用量及び治療期間は、（１）患者の年齢、体重、及び臓器機能（例えば、肝臓及び腎臓の機能）、（２）治療される疾患過程の性質及び程度、ならびに現存する重要な併存症及び服用される併用薬、そして（３）投与経路、治癒を達成するために必要な投薬の頻度及び期間、ならびに薬物の治療指数などの薬物関連パラメータを含む様々な因子に依存し得る。一般に、用量は、標的部位で約１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌの有効濃度を達成することを目的として、１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの血清レベルを達成するように選択され得る。
【実施例】
【００４６】
実施例
本発明は、以下の実施例によって例示されるが、これらによって限定されない。
【００４７】
本発明に係る一連の化合物は、以下に記載されるように合成した。特定の化合物の生物学的活性は、以下のようにプロファイルした。化合物は、次のうちの少なくともいくつかについて試験した：［１］精製ヒトＦＡＳの阻害、［２］全細胞における脂肪酸合成活性の阻害、及び［３］高レベルのＦＡＳ及び脂肪酸合成活性を有することが知られている培養ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞に対する細胞毒性（クリスタルバイオレット及びＸＴＴアッセイを用いる）。次に、低レベルの細胞毒性を有する選択化合物を、Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおける体重減少について試験した。また特定の化合物は、グラム陽性及び／又は陰性細菌に対する活性についても試験した。
【００４８】
化合物の化学合成
Ｏ−酢酸ヒドラジドを有するＴＬＭ誘導体の合成
【化４】
2010509335.tif 000007
オクチルトリフラート（１）
−４０℃に冷却したＣＨ２Ｃｌ２（２１２ｍＬ）中のオクタノール（４．６ｇ、３５．３ｍｍｏｌ）に、ピリジン（ＣａＨ２から新たに蒸留、３．２８ｍＬ、４０．６ｍｍｏｌ）、及びトリフル酸無水物（６．４１ｍＬ、３８．１ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を−４０℃で２０分間撹拌した。次に、反応混合物を３時間にわたってゆっくりと室温まで温めた。次にセライトによって白色固体をろ過し、これをペンタン（２×７０ｍＬ）で洗浄した。溶媒のほとんどを蒸発させ、約５〜１０ｍＬの溶媒が残り、白色沈殿物が存在した。熱いペンタン（７０ｍＬ）を添加し、この混合物をろ過して、残りのピリジン塩を除去した。再度ろ液を蒸発させ、透明な薄オレンジ色の油１が得られた（ＴＬＣにより定量、ｒｆ＝０．６４  １０％ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ）、これをすぐに使用した。
【００４９】
【化５】
2010509335.tif 000008
２，２，４−トリメチル−［１，３］オキサチオラン−５−オン（２）
０℃に冷却したチオ乳酸（１４．０ｇ、１３２．０ｍｍｏｌ）に、添加漏斗を用いて２−メトキシプロペン（５０．５ｍＬ、５２８ｍｍｏｌ）を滴下添加した。溶液を室温まで温め、次に４８時間加熱還流させた。室温まで冷却してから、Ｅｔ２Ｏ（２００ｍＬ）を添加し、この混合物をＮａ２ＣＯ３（１Ｎ、３×１５０ｍＬ）で抽出し、塩水（２×１００ｍＬ）で洗浄した。合わせた有機物を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、ろ過及び蒸発させて、黄色の粗製油が得られた。これを８０〜９５℃で蒸留し（Ｈ２Ｏアスピレーター圧力、２５〜３５トル）、純粋な２（９．９ｇ、５２％）が得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１．５６（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ）、１．７２（ｓ，３Ｈ）、１．７４（ｓ，３Ｈ）、４．１０（ｑ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，１Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１７．９、３０．８、３１．４、４２．５、８６．２、１７５．０。
【００５０】
【化６】
2010509335.tif 000009
２，２，４−トリメチル−４−オクチル−［１，３］−オキサチオラン−５−オン（３）
−７８℃のＴＨＦ（４７ｍＬ）中のＬｉＨＭＤＳ（３１．７ｍＬ、３１．７ｍｍｏｌ、ＴＨＦ中１Ｍ）の混合物に、カニューレによって、ＴＨＦ（４７ｍＬ）中の２（４．３ｇ、２９．４ｍｍｏｌ）を滴下添加し、得られた黄色の溶液を−７８℃で３０分間撹拌した。次に、ペンタン（８ｍＬ）中のオクチルトリフラート１（９．０ｇ、３５ｍｍｏｌ）をカニューレによって−７８℃のエノラートの溶液に室温でゆっくり添加した。−７８℃で２時間撹拌した後、１ＮのＨＣｌ（２００ｍＬ）を添加し、溶液をＥｔ２Ｏ（３×７５ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、ろ過及び蒸発させた。フラッシュクロマトグラフィ（２％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により、純粋な３（５．４５ｇ、７２％）が得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３δ０．８６（ｂｓ，３Ｈ）、１．２５（ｍ，１０Ｈ）、１．６３（ｓ，３Ｈ）、１．７３（ｓ，３Ｈ）、１．８０（ｓ，３Ｈ）、１．５−１．８１（ｍ，４Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１４．０、２２．６、２５．５、２９．０、２９．１、２９．３、２９．４、３１．８、３２．５、３３．５、４１．４、５８．１、８４．７、１７７．７。
【００５１】
【化７】
2010509335.tif 000010
２−アセチルスルファニル−２−メチル−デカン酸エチルエステル（４）
ＥｔＯＨ（無水、１４．６ｍＬ）中の３（５．３３ｇ、２０．６ｍｍｏｌ）に、ＮａＯＥｔ（２．１Ｍ、１２．７ｍＬ、２６．９ｍｍｏｌ）［ＥｔＯＨ（２４ｍＬ）中のＮａ金属（１．２４ｇ、５４ｍｍｏｌ）から新たに調製］を添加し、溶液を室温で撹拌した。３０分後、溶液をＮＨ４Ｃｌ（ｓａｔ）／１ＮのＨＣｌ（１００ｍＬ、３：２）中に注いで、Ｅｔ２Ｏ（３×７５ｍＬ）で抽出した。次に、合わせた有機物をＨ２Ｏで十分に洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、ろ過、蒸発させ、ＣＨ２Ｃｌ２（１２９ｍＬ）中に再溶解させた。この予め冷却した溶液（０℃）に、ＮＥｔ３（４．３ｍＬ、３０．９ｍｍｏｌ）及び塩化アセチル（３．２ｍＬ、４１．２ｍｍｏｌ）を添加した。０℃で４０分後、ＮＨ４Ｃｌ（ｓａｔ）（２００ｍＬ）を添加し、溶液をＣＨ２Ｃｌ２（３×７０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、ろ過及び蒸発させた。フラッシュクロマトグラフィ（５％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって純粋な４（３．１ｇ、５４％）が得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ０．８７（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ）、１．２２−１．２７（ｍ，１５Ｈ）、１．６１（ｓ，３Ｈ）、１．７５−１．８４（ｍ，２Ｈ）、２．２６（ｓ，３Ｈ）、４．１８（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１３．９、１４．１、２２．６、２３．４、２４．４、２９．１、２９．２、２９．６、３０．３、３１．８、３８．３、５５．８、６１．５、１７３．１、１９５．８。ＩＲ（ＮａＣｌ）３４３０、１８６８、１６９３、１６４４ｃｍ−１。分析値（Ｃ１５Ｈ２８Ｏ３Ｓ）Ｃ，６２．５、Ｈ，９．７８、実測値：Ｃ，６２．６、Ｈ，９．８３。
【００５２】
【化８】
2010509335.tif 000011
４−ヒドロキシ−５−メチル−５−オクチル−５−Ｈ−チオフェン−２−オン（５）
−７８℃のＴＨＦ（１５５ｍＬ）中の４（３．１１ｇ、１０．８ｍｍｏｌ）に、ＬｉＨＭＤＳ（１３．４ｍＬ、１３．４ｍｍｏｌ、ＴＨＦ中１．０Ｍ）を添加し、溶液を２時間にわたって−５℃までゆっくり温め、次に、−５℃でさらに２０分間保持した。次に、溶液を１ＮのＨＣｌ（２００ｍＬ）中に注ぎ、Ｅｔ２Ｏ（３×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、ろ過及び蒸発させた。フラッシュクロマトグラフィ（２０％ＥｔＯＡｃ／２％ＣＨ３ＣＯ２Ｈ／ヘキサン）により、５（１．２ｇ、４６％）が得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）（ケト互変異性体）δ０．８６（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ）、１．１９−１．２４（ｍ，１０Ｈ）、１．４８−１．５３（ｍ，２Ｈ）、１．６５（ｓ，３Ｈ）、１．７７−１．８５（ｍ，１Ｈ）、１．９４−２．０１（ｍ，１Ｈ）、３．３６（ｓ，２Ｈ）。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）（エノール互変異性体）０．８７−０．８９（ｍ，３Ｈ）、１．２９（ｍ，１０Ｈ）、３．２９（ｓ，３Ｈ）、１．８１−１．８７（ｍ，２Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）（エノール互変異性体）δ１４．７、２３．８、２６．４、２７．１、３０．５、３０．６、３０．８、３３．２、３９．８、６１．３、１０３．１（ｍ）、１８９．８、１９７．８。ＩＲ（ＮａＣｌ）３４２２、１５９３ｃｍ−１。分析値（Ｃ１３Ｈ２２Ｏ２Ｓ）Ｃ，６４．４、Ｈ，９．１５、実測値：Ｃ，６４．３、Ｈ，９．１０。
【００５３】
【化９】
2010509335.tif 000012
５−メチル−５−オクチル−２−オキソ−チオフェン−４−イルオキシ）−酢酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（７）
−４０℃に冷却したＤＭＦ（２３ｍＬ）中の５（１．４ｇ、５．８ｍｍｏｌ）に、ＮａＨ（３２６ｍｇ、８．１５ｍｍｏｌ、鉱油中６０％）を添加し、溶液を温め、０℃で３０分間撹拌した。次に、ブロモ酢酸ｔ−ブチル６（１．２９ｍＬ、８．７３ｍｍｏｌ）を直接添加し、混合物を温め、室温で３時間撹拌した。ＮＨ４Ｃｌ（ｓａｔ）／１ＮのＨＣｌ（６：１、１００ｍＬ）を添加し、溶液をＥｔ２Ｏ（３×７０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物をＨ２Ｏで洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、ろ過及び蒸発させた。フラッシュクロマトグラフィ（１５％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって、純粋な７（１．７ｇ、８２％）が得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ０．８６（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ）、１．２４（ｓ，１２Ｈ）、１．４９（ｓ，９Ｈ）、１．６８（ｓ，３Ｈ）、１．８３−１．８６（ｍ，２Ｈ）、４．４３（ｓ，２Ｈ）、５．１９（ｓ，１Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１４．０、２２．６、２５．２、２６．３、２８．１、２９．２、２９．３、２９．５、３１．８、３８．９、５９．７、６８．５、８３．４、１０２．１、１６５．２、１８５．５、１９３．４。分析値（Ｃ１９Ｈ３２Ｏ４Ｓ）Ｃ，６４．０、Ｈ，９．０５、実測値：Ｃ，６４．１、Ｈ，９．０８。
【００５４】
【化１０】
2010509335.tif 000013
５−メチル−５−オクチル−２−オキソ−チオフェン−４−イルオキシ）−酢酸（８）
ＣＨ２Ｃｌ２（３２ｍＬ）中に溶解した７（１．７ｇ、４．７ｍｍｏｌ）に、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（９．１ｍＬ）を添加し、溶液を室温で４〜５時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、粗製材料にクロマトグラフィを行い（４０％ＥｔＯＡｃ／２％ＣＨ３ＣＯ２Ｈ／ヘキサン）、純粋な８（１．１、７７％）が得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ０．８６（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ）、１．２４（ｓ，１１Ｈ）、１．４７−１．４８（ｍ，１Ｈ）、１．６８（ｓ，３Ｈ）、１．８４−１．８８（ｍ，２Ｈ）、４．６２（ｓ，２Ｈ）、５．３１（ｓ，１Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１４．１、２２．６、２５．１、２６．１、２９．２、２９．３、２９．５、３１．８、３８．９、６０．１、６７．７、１０２．４、１６９．８、１８５．８、１９５．４。ＩＲ（ＮａＣｌ）３４４２、１６４５ｃｍ−１。分析値（Ｃ１５Ｈ２４Ｏ４Ｓ）Ｃ，５９．９、Ｈ，８．０５、実測値：Ｃ，６０．０、Ｈ，８．０９。
【００５５】
【化１１】
2010509335.tif 000014
（５−メチル−５−オクチル−２−オキソ−チオフェン−４−イルオキシ）−酢酸−Ｎ’−（４−クロロフェニル）−ヒドラジド（９）
ＣＨ２Ｃｌ２（１７．３ｍＬ）中の８（１．１ｇ、３．６７ｍｍｏｌ）の冷却溶液（０℃）に、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（１．４ｇ、７．３ｍｍｏｌ）、４−クロロフェニルヒドラジン塩酸塩（８５４ｍｇ、４．７７ｍｍｏｌ）、ＮＥｔ３（０．５１ｍＬ、３．６７ｍｍｏｌ）、及びＤＭＡＰ（６７ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を０℃で３０分間撹拌し、次に室温まで温め、１２時間撹拌した。溶液をＮＨ４Ｃｌｓａｔ：ＨＣｌ（１Ｎ）（４：１、１００ｍｌ）中に注ぎ、ＣＨ２Ｃｌ２（３×３０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機物を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、ろ過及び蒸発させて、粗製９が得られた。フラッシュクロマトグラフィ［３０％ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ（副生成物を除去する）−次に３５％ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ（５００ｍＬ）−４０％ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ（３００ｍＬ）］によって純粋な９（１．２ｇ、７７％）が得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ０．８６（ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，３Ｈ）、１．２４（ｍ，１１Ｈ）、１．４６−１．５４（ｍ，１Ｈ）、１．７１（ｓ，３Ｈ）、１．８２−１．９０（ｍ，２Ｈ）、４．５７（ｓ，２Ｈ）、５．３９（ｓ，１Ｈ）、６．７５（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ）、７．１８（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ）、７．３８（ｓ，１Ｈ）、８．０９（ｓ，１Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１４．１、２２．６、２５．３、２６．１、２９．２、２９．３、２９．５、３１．８、３８．８、５９．７、６９．７、１０３．２、１１４．７、１２６．４、１４５．８、１２９．２、１６５．９、１８４．３、１９３．５。ＩＲ（ＮａＣｌ）２９５７、１６９５、１６５８、１６０９ｃｍ−１。
【００５６】
一般的手順Ａ：
ＣＨ２Ｃｌ２（１．０ｍＬ）中の８（０．０５ｍｍｏｌ、１．０当量）の冷却溶液（０℃）に、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（０．１ｍｍｏｌ、２．０当量）、ヒドラジン誘導体（０．０６５ｍｍｏｌ、１．３当量）、及びＤＭＡＰ（０．００７５ｍｍｏｌ、０．１５当量）、ならびに反応において塩酸塩を使用した場合にはトリエチルアミン（１．０当量）を添加した。混合物を０℃で３０分間撹拌し、次に室温まで温め、１２時間撹拌した。ＣＨ２Ｃｌ２を満たしたシリカゲルカラムに反応混合物を移した。フラッシュクロマトグラフィ（２０％エーテル／ＣＨ２Ｃｌ２）によって純粋な生成物が得られた。
【００５７】
【化１２】
2010509335.tif 000015
（５−メチル−５−オクチル−２−オキソ−チオフェン−４−イルオキシ）−酢酸−Ｎ’−フェニルヒドラジド（１０）
８（１５．０ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）及びフェニルヒドラジン（６．４μＬ、０．０６５ｍｍｏｌ）に対して、一般的手順Ａに従って、化合物１０が油（シス：トランス比−２７：７３）として得られた（１５．０ｍｇ、７７％）。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ０．８０（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，３Ｈ）、１．１０−１．２４（ｍ，１１Ｈ）、１．４１−１．５１（ｍ，１Ｈ）、１．６６（ｓ，３Ｈ）、１．７８−１．８４（ｍ，２Ｈ）、４．５０（ｓ，２Ｈ）、５．３３（ｓ，１Ｈ）、６．７５（ｄｄ，Ｊ＝１．２、８．０Ｈｚ，２Ｈ）、６．９０（ｄｄ，Ｊ＝８．０、１６．０Ｈｚ，１Ｈ）、７．２０（ｄｄ，Ｊ＝８．０、１６．０Ｈｚ，２Ｈ）、８．０３（ｓ，１Ｈ）。シス化合物の典型的なピーク：１．６２（ｓ，３Ｈ）、４．７５（ｓ，２Ｈ）、５．１３（ｓ，１Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨＺ，ＣＤＣｌ３）δ１４．１、２２．６、２５．４、２６．３、２９．２、２９．３、２９．５、３１．８、３９．０、５９．４、７０．０、１０３．５、１１３．６、１２２．０、１２９．４、１４７．０、１６５．６、１８３．９、１９３．０。
【００５８】
【化１３】
2010509335.tif 000016
（５−メチル−５−オクチル−２−オキソ−チオフェン−４−イルオキシ）−酢酸−Ｎ’−（３−メチルフェニル）−ヒドラジド（１１）
８（１５．０ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）及び１−（３−メチルフェニル）ヒドラジン塩酸塩（１０．２ｍｇ、０．０６５ｍｍｏｌ）に対して、一般的手順Ａに従って、化合物１１が油（シス：トランス比−２９：７１）として得られた（７．０ｍｇ、３５％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ０．８７（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，３Ｈ）、１．１９−１．２９（ｍ，１１Ｈ）、１．５１−１．５７（ｍ，１Ｈ）、１．７４（ｓ，３Ｈ）、１．８５−１．９１（ｍ，２Ｈ）、２．３０（ｓ，３Ｈ）、４．５９（ｓ，２Ｈ）、５．１４（ｓ，１Ｈ）、６．６２−６．６５（ｍ，２Ｈ）、６．７７（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）、７．０７−７．１９（ｍ，１Ｈ）、７．９３（ｓ，１Ｈ）。シス化合物の典型的なピーク：１．６９（ｓ，３Ｈ）、２．３３（ｓ，３Ｈ）、４．８２（ｓ，２Ｈ）、５．２３（ｓ，１Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１４．１、２１．５、２２．６、２５．０、２６．４、２９．２、２９．４、２９．６、３１．８、３８．５、５９．０、７０．０、１０３．０、１１０．５、１１４．０、１２２．５、１２９．０、１３９．０、１４７．０、１６５．０、１８４．０、１９３．０。
【００５９】
【化１４】
2010509335.tif 000017
（５−メチル−５−オクチル−２−オキソ−チオフェン−４−イルオキシ）−酢酸−Ｎ’−（４−トリフルオロメチルフェニル）−ヒドラジド（１２）
８（１５．０ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）及び１−［４−（トリフルオロメチル）−フェニル］ヒドラジン塩酸塩（１４．０ｍｇ、０．０６５ｍｍｏｌ）に対して、一般的手順Ａに従って、化合物１２が油（シス：トランス比−１７：８３）として得られた（１２．０ｍｇ、５３％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ０．８０（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，３Ｈ）、１．１０−１．２５（ｍ，１１Ｈ）、１．４５−１．５１（ｍ，１Ｈ）、１．６８（ｓ，３Ｈ）、１．７８−１．８５（ｍ，２Ｈ）、４．５６（ｓ，２Ｈ）、５．３６（ｓ，１Ｈ）、６．２９（ｓ，１Ｈ）、６．８１（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ）、７．４３（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ）、７．９４（ｓ，１Ｈ）。シス化合物の典型的なピーク：１．６２（ｓ，３Ｈ）、４．７４（ｓ，２Ｈ）、５．１８（ｓ，１Ｈ）。
【００６０】
【化１５】
2010509335.tif 000018
（５−メチル−５−オクチル−２−オキソ−チオフェン−４−イルオキシ）−酢酸−Ｎ’−（４−メトキシフェニル）−ヒドラジド（１３）
８（１５．０ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）及び１−（４−メトキシフェニル）ヒドラジン塩酸塩（１１．３ｍｇ、０．０６５ｍｍｏｌ）に対して、一般的手順Ａに従って、化合物１３が油（シス：トランス比−２５：７５）として得られた（７．０ｍｇ、３３％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ０．８０（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，３Ｈ）、１．０８−１．２４（ｍ，１１Ｈ）、１．４１−１．５１（ｍ，１Ｈ）、１．６６（ｓ，３Ｈ）、１．８０−１．８４（ｍ，２Ｈ）、３．６９（ｓ，３Ｈ）、４．５０（ｓ，２Ｈ）、５．３３（ｓ，１Ｈ）、６．７６（ｓ，４Ｈ）、７．９０（ｓ，１Ｈ）。シス化合物の典型的なピーク：１．６３（ｓ，３Ｈ）、３．７１（ｓ，３Ｈ）、４．７６（ｓ，２Ｈ）、５．１５（ｓ，１Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１４．１、２２．６、２５．４、２６．４、２９．２、２９．４、２９．５、３１．８、３９．０、５５．６、５９．４、６９．９、１０３．５、１１４．３、１１４．７、１３９．７、１５５．３、１６５．５、１８３．８、１９２．９。
【００６１】
【化１６】
2010509335.tif 000019
（５−メチル−５−オクチル−２−オキソ−チオフェン−４−イルオキシ）−酢酸−Ｎ’−（２，４−ジクロロフェニル）−ヒドラジド（１４）
８（１９．０ｍｇ、０．０６３ｍｍｏｌ）及び１−（２，４−ジクロロフェニル）ヒドラジン塩酸塩（１７．５ｍｇ、０．０８２ｍｍｏｌ）に対して、一般的手順Ａに従って、化合物１４が固体（シス：トランス比−２０：８０）として得られた（１７．０ｍｇ、５９％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ０．８６（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ）、１．１５−１．３１（ｍ，１１Ｈ）、１．４２−１．５１（ｍ，１Ｈ）、１．７２（ｓ，３Ｈ）、１．８２−１．９０（ｍ，２Ｈ）、４．７７（ｓ，２Ｈ）、５．４１（ｓ，１Ｈ）、６．３８（ｓ，１Ｈ）、６．７６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ）、７．１４（ｄｄ，Ｊ＝２．０、８．４Ｈｚ，１Ｈ）、７．３２（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ）、８．１１（ｓ，１Ｈ）。シス化合物の典型的なピーク：１．６５（ｓ，３Ｈ）、４．７５（ｓ，２Ｈ）、５．２０（ｓ，１Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１４．１、２２．６、２５．４、２６．３、２９．２、２９．４、２９．５、３１．８、３９．０、５９．５、６９．８、１０３．５、１１４．４、１２０．５、１２６．５、１２７．８、１２９．４、１４１．９、１６５．５、１８３．９、１９３．０。
【００６２】
【化１７】
2010509335.tif 000020
（５−メチル−５−オクチル−２−オキソ−チオフェン−４−イルオキシ）−酢酸−Ｎ’−（３，４−ジクロロフェニル）−ヒドラジド（１５）
８（１９．０ｍｇ、０．０６３ｍｍｏｌ）及び１−（３，４−ジクロロフェニル）ヒドラジン塩酸塩（１７．５ｍｇ、０．０８２ｍｍｏｌ）に対して、一般的手順Ａに従って、化合物１５が半固体（シス：トランス比−１７：８３）として得られた（１２．０ｍｇ、４２％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ０．８０（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）、１．０９−１．２３（ｍ，１１Ｈ）、１．３６−１．５３（ｍ，１Ｈ）、１．６７（ｓ，３Ｈ）、１．７７−１．８４（ｍ，２Ｈ）、４．５４（ｓ，２Ｈ）、５．３５（ｓ，１Ｈ）、６．２１（ｓ，１Ｈ）、６．６０（ｄｄ，Ｊ＝２．４、８．８Ｈｚ，１Ｈ）、６．８４（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ）、７．２１（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ）、８．０（ｓ，１Ｈ）。シス化合物の典型的なピーク：１．６５（ｓ，３Ｈ）、４．７３（ｓ，２Ｈ）、５．１８（ｓ，１Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１４．１、２２．６、２５．４、２６．３、２９．２、２９．４、２９．５、３１．８、３９．０、５９．５、６９．８、１０３．５、１１３．２、１１５．２、１２４．８、１３０．９、１３３．２、１４６．７、１６５．９、１８４．０、１９３．２。
【００６３】
【化１８】
2010509335.tif 000021
（５−メチル−５−オクチル−２−オキソ−チオフェン−４−イルオキシ）−酢酸−Ｎ’−［２−クロロ−５−（トリフルオロメチル）フェニル］−ヒドラジド（１６）
８（１５．０ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）及び１−［２−クロロ−５−（トリフルオロメチル）フェニル］ヒドラジン（１３．６ｍｇ、０．０６５ｍｍｏｌ）に対して、一般的手順Ａに従って、化合物１６が油（シス：トランス比−１４：８６）として得られた（１０．４ｍｇ、４２％）。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ０．８０（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ）、１．０６−１．２４（ｍ，１１Ｈ）、１．４１−１．５０（ｍ，１Ｈ）、１．６７（ｓ，３Ｈ）、１．７６−１．８９（ｍ，２Ｈ）、４．５８（ｓ，２Ｈ）、５．３７（ｓ，１Ｈ）、６．５３（ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，１Ｈ）、６．９８（ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，１Ｈ）、７．０７（ｄｄ，Ｊ＝１．８、８．４Ｈｚ，１Ｈ）、７．３７（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ）、８．０３（ｓ，１Ｈ）。シス化合物の典型的なピーク：１．６０（ｓ，３Ｈ）、４．７７（ｓ，２Ｈ）、５．２８（ｓ，１Ｈ）。
【００６４】
【化１９】
2010509335.tif 000022
（５−メチル−５−オクチル−２−オキソ−チオフェン−４−イルオキシ）−酢酸−Ｎ’−（２−ベンゾチアゾール）−ヒドラジド（１７）
８（２２．０ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）及び２−ヒドラジノベンゾチアゾール（１４．６ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）に対して、一般的手順Ａに従って、化合物１７が固体（単一の異性体）として得られた（１４．０ｍｇ、４５％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ０．８８（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ）、１．２６−１．８３（ｍ，１１Ｈ）、１．５２（ｍ，１Ｈ）、１．７５（ｓ，３Ｈ）、１．８６−１．９９（ｍ，２Ｈ）、４．８６（ｓ，２Ｈ）、５．２２（ｓ，２Ｈ）、５．３２（ｓ，１Ｈ）、７．３６（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ）、７．４８（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ）、７．８１（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）、７．８５（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）。ｍ．ｐ．１５１〜１５２℃。
【００６５】
【化２０】
2010509335.tif 000023
（５−メチル−５−オクチル−２−オキソ−チオフェン−４−イルオキシ）−酢酸−Ｎ’−［６−メチル−４−（トリフルオロメチル）−２−ピリジル］−ヒドラジド（１８）
８（１５．０ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）及び１−［６−メチル−４−（トリフルオロメチル）−２−ピリジル］ヒドラジン（１２．５ｍｇ、０．０６５ｍｍｏｌ）に対して、一般的手順Ａに従って、化合物１８が油（シス：トランス比−１０：９０）として得られた（１２．５ｍｇ、５３％）。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ０．７９（ｔ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，３Ｈ）、１．１０−１．２９（ｍ，１１Ｈ）、１．４４−１．５２（ｍ，１Ｈ）、１．７０（ｓ，３Ｈ）、１．８２−１．８９（ｍ，２Ｈ）、２．４１（ｓ，３Ｈ）、４．５７（ｓ，２Ｈ）、５．３７（ｓ，１Ｈ）、６．５９（ｓ，１Ｈ）、６．８１（ｓ，１Ｈ）、７．３１（ｂｓ，１Ｈ）、８．７０（ｂｓ，１Ｈ）。シス化合物の典型的なピーク：１．６２（ｓ，３Ｈ）、４．７４（ｓ，２Ｈ）、５．２９（ｓ，１Ｈ）。
【００６６】
【化２１】
2010509335.tif 000024
（５−メチル−５−オクチル−２−オキソ−チオフェン−４−イルオキシ）−酢酸−Ｎ’−（２−クロロフェニル）−ヒドラジド（１９）
８（９８．０ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）及び２−クロロフェニルヒドラジン塩酸塩（７７．０ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）に対して、一般的手順Ａに従って、化合物１９が得られた（９１．０ｍｇ、６０％）。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ０．８５（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ）、１．２３（ｍ，１１Ｈ）、１．４８−１．５１（ｍ，１Ｈ）、１．６９（ｓ，３Ｈ）、１．８１−１．８９（ｍ，２Ｈ）、４．５６（ｓ，２Ｈ）、５．３７（ｓ，１Ｈ）、６．４９−６．５１（ｍ，１Ｈ）、６．８４−６．９４（ｍ，２Ｈ）、７．１２−７．３５（ｍ，２Ｈ）、８．３１（ｄ，Ｊ＝３．１Ｈｚ，１Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１４．０、２２．５、２５．３、２６．２、２９．２、２９．３、２９．５、３１．７、３８．９、５９．５、６９．７、１０３．３、１１３．５、１１９．８、１２２．０、１２２．７、１２９．６、１４２．９、１６５．５、１８４．１、１９３．３。
【００６７】
【化２２】
2010509335.tif 000025
（５−メチル−５−オクチル−２−オキソ−チオフェン−４−イルオキシ）−酢酸−Ｎ’−（４−ピリジル）−ヒドラジド（２０）
８（１００．０ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）及びイソニコチン酸ヒドラジン（５９．０ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）に対して、一般的手順Ａに従って、フラッシュクロマトグラフィ（５％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）の後に化合物２０が得られた（１１８．０ｍｇ、８６％）。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ０．８５（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ）、１．２３（ｍ，１１Ｈ）、１．４４−１．４５（ｍ，１Ｈ）、１．６８（ｓ，３Ｈ）、１．８２−１．８８（ｍ，２Ｈ）、４．６９（ｓ，２Ｈ）、５．４２（ｓ，１Ｈ）、７．６４（ｄ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，２Ｈ）、８．６７（ｍ，２Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１４．０、２２．５、２５．３、２６．２、２９．２、２９．３、２９．５、３１．７、３８．９、５９．５、６９．７、１０３．３、１１３．５、１１９．８、１２２．０、１２２．７、１２９．６、１４２．９、１６５．５、１８４．１、１９３．３。
【００６８】
【化２３】
2010509335.tif 000026
（５−メチル−５−ヘキシル−２−オキソ−チオフェン−４−イルオキシ）−酢酸−Ｎ’−（４−クロロフェニル）−ヒドラジド（２１）
この化合物は、図２に示されるスキームに従って調製した。２６（８３．０ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）及び４−クロロフェニルヒドラジン塩酸塩（６８．０ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ）に対して、一般的手順Ａに従って、化合物２１が得られた（３４．０ｍｇ、３０％）。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ０．８６（ｍ，３Ｈ）、１．２６（ｍ，７Ｈ）、１．４５−１．５０（ｍ，１Ｈ）、１．７１（ｓ，３Ｈ）、１．８５−１．９０（ｍ，２Ｈ）、４．５７（ｓ，２Ｈ）、５．３９（ｓ，１Ｈ）、６．７４（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ）、７．２０（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ）、７．５９（ｓ，１Ｈ）、８．２１（ｓ，１Ｈ）。
【００６９】
生物学的及び生化学的方法
ＺＲ−７５−１ヒト乳癌細胞からのＦＡＳの精製
American Type Culture Collectionより入手した培養ＺＲ−７５−１ヒト乳癌細胞からヒトＦＡＳを精製した。Linn et at., 1981、及びKuhajda et al., 1994から適合された手順では、低張溶解、連続的なポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿、及びアニオン交換クロマトグラフィが使用される。ＺＲ−７５−１細胞は、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン及びストレプトマイシンを有するＲＰＭＩ培地中、５％ＣＯ２と共に３７℃で培養される。
【００７０】
コンフルエントな細胞の１０個のＴ１５０フラスコを、１．５ｍｌの溶解緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１ｍＭのフェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、０．１％のIgepal ＣＡ−６３０）により溶解し、氷上で２０ストロークの加圧型細胞破砕装置による処理を行う。４℃、２０，０００ｒｐｍで３０分間、ＪＡ−２０ローター（Beckman）において溶解物を遠心分離し、溶解緩衝液を用いて上澄みを４２ｍｌにする。溶解緩衝液中の５０％のＰＥＧ８０００の溶液を上澄みにゆっくり添加し、７．５％の最終濃度にする。４℃で６０分間振とうさせた後、４℃、１５，０００ｒｐｍで３０分間、ＪＡ−２０ローター（Beckman）において溶液を遠心分離する。次に、固体ＰＥＧ８０００を上澄みに添加して、１５％の最終濃度にする。上記のように振とう及び遠心分離を繰り返した後、ペレットを１０ｍｌの緩衝液Ａ（２０ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．４）中に４℃で一晩再懸濁する。０．４５μＭろ過の後、タンパク質溶液をＭｏｎｏ  Ｑ５／５アニオン交換カラム（Pharmacia）に適用する。１ｍｌ／分の緩衝液Ａでカラムを１５分間洗浄し、結合材料は、６０分間にわたって１ＭのＫＣｌまでの直線的な６０ｍｌの勾配で溶出させる。通常、ＦＡＳ（ＭＷ〜２７０ｋＤ）は、０．２５ＭのＫＣｌで３つの０．５ｍｌ画分において溶出し、クーマシー（Coomassie）Ｇ２５０染色（Bio-Rad）による４〜１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて同定される。ＦＡＳタンパク質濃度は、ＢＳＡを標準として使用し、製造業者の仕様書に従って、クーマシー・プラス（Coomassie Plus）タンパク質アッセイ試薬（Pierce）を用いて決定される。この手順は、クーマシー（Coomassie）染色ゲルにより判断されるように実質的に純粋なＦＡＳ調製物（＞９５％）をもたらす。
【００７１】
ＦＡＳ酵素活性の測定及び化合物のＩＣ５０の決定
ＦＡＳ活性は、９６ウェルプレートにおいてＯＤ３４０で分光光度的にＮＡＤＰＨのマロニル−ＣｏＡ依存性の酸化をモニタリングすることによって測定される（Dils et al and Arslanian et al, 1975）。各ウェルは、２μｇの精製ＦＡＳ、１００ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、ｐＨ６．５、１ｍＭのジチオスレイトール（Sigma）、及び１８７．５μＭのβ−ＮＡＤＰＨ（Sigma）を含有する。阻害薬の保存液は、ＤＭＳＯ中、２、１、及び０．５ｍｇ／ｍｌで調製され、各ウェルに１μｌの保存液が添加される場合２０、１０、及び５μｇ／ｍｌの最終濃度が得られる。それぞれの実験について、ＤＭＳＯ対照、阻害薬、及びブランク（ＦＡＳ酵素なし）と共に、セルレニン（Sigma）が正の対照として実行され、全てデュプリケートで行われる。
【００７２】
アッセイは、Molecular Devices SpectraMax Plus分光光度計において実施される。ＦＡＳ、緩衝液、阻害薬、及び対照を含有するプレートを、３７℃に加熱した分光光度計内に入れる。動力学的プロトコルを用いて、１００μｌの１００ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、ｐＨ６．５を含有するデュプリケートのウェルにおいてウェルをブランクにし、ＯＤ３４０においてプレートを１０秒間隔で５分間読み取り、ＮＡＤＰＨのマロニル−ＣｏＡに非依存性の酸化を測定する。プレートを分光光度計から取り出し、ブランクを除く各ウェルに、マロニル−ＣｏＡ（６７．４μＭ、ウェルあたりの最終濃度）及びアルキニル−ＣｏＡ（６１．８μＭ、ウェルあたりの最終濃度）を添加する。上記のように動力学的プロトコルによりプレートを再度読み取り、マロニル−ＣｏＡ依存性のＮＡＤＰＨの酸化を測定する。マロニル−ＣｏＡ依存性ＮＡＤＰＨ酸化及び非マロニル−ＣｏＡ依存性ＮＡＤＰＨ酸化のΔＯＤ３４０違いは、特異的なＦＡＳ活性である。ＦＡＳ調製物の純度のために、非マロニル−ＣｏＡ依存性ＮＡＤＰＨ酸化は無視できる。
【００７３】
ＦＡＳに対する化合物のＩＣ５０は、試験したそれぞれの阻害薬濃度についてΔＯＤ３４０をプロットし、直線回帰を実施し、そしてベストフィットライン、ｒ２値、及び９５％信頼区間を計算することによって決定される。ＦＡＳの５０％阻害をもたらす化合物の濃度がＩＣ５０である。ΔＯＤ３４０対時間のグラフは、SOFTmaxPROソフトウェア（Molecular Devices）によって各化合物濃度に対してプロットされる。直線回帰、ベストフィットライン、ｒ２、及び９５％信頼区間の計算は、Prism Version ３．０（Graph Pad Software）を用いて計算される。
【００７４】
クリスタルバイオレット細胞増殖アッセイ
クリスタルバイオレットアッセイは細胞増殖を測定するが、細胞毒性は測定しない。このアッセイは、９６ウェルプレート中の固定細胞のクリスタルバイオレット染色を用い、次いで、可溶化及び分光光度計におけるＯＤ４９０の測定が行われる。ＯＤ４９０は、測定される単位時間あたりの細胞増殖に相当する。細胞は、対象の化合物又は媒体対照で処置され、各化合物のＩＣ５０が計算される。
【００７５】
特定の化合物の癌細胞に対する細胞毒性を測定するために、American Type Culture Collectionから入手される５×１０４のＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞を、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン、及びストレプトマイシンを有するＤＭＥＭ培地中で、２４ウェルプレートの各ウェルにプレーティングする。３７℃及び５％ＣＯ２において一晩培養した後、ＤＭＳＯ中に溶解した試験化合物を、以下の濃度：５０、４０、３０、２０、及び１０μｇ／ｍｌにおいてトリプリケートで、１μｌの体積でウェルに添加する。必要に応じてさらなる濃度を試験する。１μｌのＤＭＳＯを媒体対照としてトリプリケートのウェルに添加する。Ｃ７５は、正の対照としてトリプリケートで１０、及び５μｇ／ｍｌで実行される。
【００７６】
７２時間のインキュベーションの後、各ウェルにおいて０．５ｍｌのクリスタルバイオレット染色（２５％メタノール中０．５％）で細胞を染色する。１０分後、ウェルを洗浄し、空気乾燥し、次に０．５ｍｌの１０％ドデシル硫酸ナトリウムにより２時間振とうさせて可溶化する。各ウェルから１００μｌを９６ウェルプレートに移した後、Molecular Devices SpectraMax Plus 分光光度計においてプレートをＯＤ４９０で読み取る。SOFTmax Proソフトウェア（Molecular Devices）を用いて平均ＯＤ４９０値を計算し、Prism Version ３．０２（Graph Pad Software, San Diego）を用いる直線回帰分析によってＩＣ５０値を決定する。
【００７７】
ＸＴＴ細胞毒性アッセイ
ＸＴＴアッセイは、［５１Ｃｒ］放出細胞毒性アッセイの非放射性代替法である。ＸＴＴは、代謝的に活性な生細胞によってのみホルマザン色素に還元されるテトラゾリウム塩である。ＸＴＴの還元は、ＯＤ４９０−ＯＤ６５０として分光光度的に測定される。
【００７８】
特定の化合物の癌細胞に対する細胞毒性を測定するために、American Type Culture Collectionから入手される９×１０３のＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞を、１０％ウシ胎児血清、インスリン、ペニシリン、及びストレプトマイシンを有するＤＭＥＭ培地中で、９６ウェルプレートの各ウェルにプレーティングする。３７℃及び５％ＣＯ２において一晩培養した後、ＤＭＳＯ中に溶解した試験化合物を、以下の濃度：８０、４０、２０、１０、５、２．５、１．２５、及び０．６２５μｇ／ｍｌにおいてトリプリケートで、１μｌの体積でウェルに添加する。必要に応じてさらなる濃度を試験する。１μｌのＤＭＳＯを媒体対照としてトリプリケートのウェルに添加する。Ｃ７５は、正の対照としてトリプリケートで４０、２０、１０、１５、１２．５、１０、及び５μｇ／ｍｌで実行される。
【００７９】
７２時間のインキュベーションの後、製造業者の仕様書（Cell Proliferation Kit II (ＸＴＴ) Roche）に従って、細胞をＸＴＴ試薬と共に４時間インキュベートする。Molecular Devices SpectraMax Plus 分光光度計においてプレートをＯＤ４９０及びＯＤ６５０で読み取る。細胞を有さずにＸＴＴ試薬を含有する３つのウェルは、プレートブランクの役割を果たす。ＸＴＴデータは、ＯＤ４９０−ＯＤ６５０として報告される。平均及び標準誤差は、SOFTmax Proソフトウェア（Molecular Dynamics）を用いて計算される。
【００８０】
化合物のＩＣ５０は、対照と比較してＯＤ４９０−ＯＤ６５０の５０％減少をもたらす薬物の濃度であると定義される。ＯＤ４９０−ＯＤ６５０は、SOFTmax Proソフトウェア （Molecular Devices）によって各化合物濃度について計算される。ＩＣ５０は、直線回帰によって、対照に対する割合としてのＦＡＳ活性を、薬物濃度に対してプロットして計算される。直線回帰、ベストフィットライン、ｒ２、及び９５％信頼区間は、Prism Version ３．０（Graph Pad Software）を用いて決定される。
【００８１】
［１４Ｃ］アセテートの全脂質への取込みの測定及び化合物のＩＣ５０の決定
このアッセイは、［１４Ｃ］アセテートの全脂質への取込みを測定し、インビトロでの脂肪酸合成経路の活性の尺度である。これはインビトロでの脂肪酸合成の阻害を測定するために利用される。
【００８２】
上記のように培養したＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞を２４ウェルプレートの各ウェルに５×１０４細胞でプレーティングする。一晩インキュベーションした後、ＤＭＳＯ中に可溶化した試験化合物をトリプリケートで５、１０、及び２０μｇ／ｍｌで添加し、必要に応じてより低い濃度で試験する。媒体対照のためにＤＭＳＯをトリプリケートのウェルに添加する。Ｃ７５は、正の対照としてトリプリケートで５及び１０μｇ／ｍｌで実行される。４時間のインキュベーション後、０．２５μＣｉの［１４Ｃ］アセテート（１０μｌ体積）を各ウェルに添加する。
【００８３】
さらに２時間インキュベーションした後、培地をウェルから吸引し、８００μｌのクロロホルム：メタノール（２：１）及び７００μｌの４ｍＭのＭｇＣｌ２を各ウェルに添加する。各ウェルの内容物を１．５のエッペンドルフ（Eppendorf）管に移し、高速エッペンドルフ微小遠心分離機（Eppendorf Microcentrifuge ）５４１５Ｄにおいて２分間全速で回転させる。水（上）層を除去した後、さらに７００μｌのクロロホルム：メタノール（２：１）及び５００μｌの４ｍＭのＭｇＣｌ２を各管に添加し、次に、上記のように１分間遠心分離する。水層をパスツールピペットで除去し、廃棄する。さらに４００μｌのクロロホルム：メタノール（２：１）及び２００μｌの４ｍＭのＭｇＣｌ２を各管に添加し、次に遠心分離して、水層を廃棄する。下（有機）相をシンチレーションバイアルに移し、Ｎ２ガス下、４０℃で乾燥する。乾燥したら、３ｍｌのシンチラント（ＡＰＢ＃ＮＢＣ５１０４）を添加し、バイアルを１４Ｃについてカウントする。Beckmanシンチレーションカウンタによって、トリプリケートの平均ｃｐｍ値が計算される。
【００８４】
化合物のＩＣ５０は、対照と比較して［１４Ｃ］アセテートの脂質への取り込みの５０％減少をもたらす薬物の濃度であると定義される。これは、試験したそれぞれの阻害薬濃度について平均ｃｐｍをプロットし、直線回帰を実施し、そしてベストフィットライン、ｒ２値、及び９５％信頼区間を計算することによって決定される。平均ｃｐｍ値は、各化合物の濃度についてBeckmanシンチレーションカウンタ（モデルＬＳ６５００）によって計算される。直線回帰、ベストフィットライン、ｒ２、及び９５％信頼区間の計算は、Prism Version ３．０（Graph Pad Software）を用いて計算される。
【００８５】
新規のＦＡＳ阻害薬に対する体重減少スクリーン
初期体重減少スクリーニングのためにＢａｌｂ／Ｃマウス（Jackson Labs）が用いられる。温度及び１２時間の昼／夜サイクル室に動物を収容し、マウス餌及び水を自由に与える。実験ごとにトリプリケートで、それぞれの試験化合物及び媒体対照について３匹のマウスを用いた。実験のために、各試験化合物についてマウスを別々に、３匹を１つのケージに収容した。化合物をＤＭＳＯ中に１０ｍｇ／ｍｌで希釈し、約１００μｌのＤＭＳＯ中の６０ｍｇ／ｋｇを、又は媒体だけをマウスに腹腔内注射した。毎日マウスを観察し、体重を測定し、エクセル（Microsoft）で平均体重及び標準誤差を計算する。処置した動物がその処置前の体重に到達するまで実験を継続する。
【００８６】
抗菌特性
ブロス微量希釈アッセイ（broth microdilution assay）を用いて、化合物の抗菌活性を評価する。化合物は２倍連続希釈で試験され、可視的な増殖を阻害する濃度（対照の１０％でのＯＤ６００）はＭＩＣと定義される。試験した微生物には、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＡＴＣＣ＃２９２１３）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）（ＡＴＣＣ＃２９２１２）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＡＴＣＣ＃２７８５３）、及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（ＡＴＣＣ＃２５９２２）が含まれる。アッセイは、２つの増殖培地、Mueller Hinton Broth及びTrypticase Soy Brothにおいて実施される。
【００８７】
血液（Ｔｓｏｙ／５％ヒツジ血液）寒天板は、１０％のグリセロールを含有するＴｓｏｙブロス中に保持された凍結ストックから接種され、３７℃で一晩インキュベートされる。コロニーは、濁度が０．５ McFarland 標準の濁度と一致するように無菌ブロス中に懸濁させられる。接種材料を無菌ブロス（Mueller Hinton又はTrypticase soy）中に１：１０で希釈し、１９５ｕｌを９６ウェルプレートの各ウェルに分注する。以下の濃度：２５、１２．５、６．２５、３．１２５、１．５６及び０．７８ｕｇ／ｍｌにおいて、ＤＭＳＯ中に溶解した試験化合物を５ｕｌの体積でデュプリケートでウェルに添加する。必要に応じてさらなる濃度を試験する。デュプリケートのウェルに添加された５ｕｌのＤＭＳＯは、媒体対照である。正の対照の化合物、バンコマイシン（Ｅ．フェカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）及び黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ））及びトブラマイシン（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））の連続希釈が各実行に含まれる。
【００８８】
３７℃で２４時間のインキュベーションの後、Molecular Devices SpectraMax Plus 分光光度計において、プレートをＯＤ６００で読み取る。平均ＯＤ６００値は、SOFTmax Proソフトウェア（Molecular Devices）を用いて計算され、ＭＩＣ値は、Prism Version ３．０２（Graph Pad Software, San Diego）を用いて直線回帰分析によって決定される。ＭＩＣは、媒体対照の測定値の１０％に等しいＯＤ６００測定値を生じるために必要とされる化合物の濃度であると定義される。
【００８９】
【表２】
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【００９０】
【表３】
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【００９１】
【表４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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