(57)【要約】  Ｗｎｔ共受容体ＬＲＰ５の高骨量（ＨＢＭ）変異（Ｇ１７１Ｖ）がカノニカルＷｎｔシグナル伝達を調節するメカニズムを調べた。変異は、Ｄｋｋタンパク質−１媒介アンタゴニズムを低下させることが既に示されており、Ｇ１７１が位置する第１のＹＷＴＤ反復領域がＤｋｋタンパク質媒介アンタゴニズムを引き起こし得ることが示唆された。しかし、第１の反復領域でなく、第３のＹＷＴＤ反復領域が、ＤＫＫ１媒介アンタゴニズムに必要とされることを見いだした。その代わり、Ｇ１７１Ｖ変異は、ＬＲＰ５と、共受容体の細胞表面への輸送に必要とされるＬＲＰ５／６のためのシャペロンタンパク質であるＭｅｓｄとの相互作用を妨げ、細胞表面上のＬＲＰ５分子が少なくなることを見いだした。細胞表面ＬＲＰ５分子のレベルの低下により、パラクリンパラダイムにおいてＷｎｔシグナル伝達の低下がもたらされたが、変異は、オートクリンパラダイムにおいて同時発現Ｗｎｔの活性に影響を与えないようであった。骨芽細胞がオートクリンカノニカルＷｎｔ、Ｗｎｔ７ｂを生成すること、および骨細胞がパラクリンＤｋｋ１を生成するという所見と相俟って、Ｇ１７１Ｖ変異は、オートクリンＷｎｔの活性に影響を与えずに、パラクリンＤｋｋ１がアンタゴナイズするように目標の数を減少させることによって、骨芽細胞におけるＷｎｔ活性の増加を生じさせ得ると考える。【特許請求の範囲】
【請求項１】
病態生理学的過程を調節することを必要とする対象において病態生理学的過程を調節する方法であって、前記病態生理学的過程が、糖代謝、コレステロール代謝、脂質代謝、トリグリセリド代謝、脂質生成、腫瘍形成、神経形成または任意の骨関連活性を含み、前記対象に以下の構造（Ｉ）を有する化合物を前記病態生理学的過程を調節するのに有効な量で投与することを含む方法
【化１】
2010537950.tif 000051
（式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２またはＲ１３の少なくとも１つは、水素原子であり、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２またはＲ１３の少なくとも１つは、水素原子以外の原子を含む）。
【請求項２】
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１３が、独立して、水素、酸素、ヒドロキシ、ハロゲン、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）アルキル基、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）置換アルキル基、シクロアルキル基、置換シクロアルキル基、複素環式基、置換複素環式基、アリールアルキル基、置換アリールアルキル基、ヘテロアリールアルキル基、置換ヘテロアリールアルキル基、アルコキシ基、置換アルコキシ基、アルケン基、置換アルケン基、アシル基、アミン基、アミド基、硝酸塩、硝酸エステル、カルボキシル基、カルボキシルエステル、硫化物、スルホキシド、スルホン酸塩、スルホン酸エステル、スルホン、スルホンアミド、リン酸塩、リン酸エステル、ホスホン酸塩、ホスホン酸エステル、ホスファミド、ホスホラミド、チオリン酸塩、チオリン酸エステル、チオホスホン酸塩あるいはチオホスホン酸エステルを含み、Ｒ１およびＲ１１、Ｒ１１およびＲ１２、Ｒ１２およびＲ３、Ｒ３およびＲ４、Ｒ１３およびＲ６が、独立して、互いに縮合して、１つ以上の環または前述したものの任意の組合せを形成することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｒ１１およびＲ１２を含むアミン基の窒素が、荷電しており、Ｒ１５をさらに含み、Ｒ１５は、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１３について前述した通りである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記病態生理学的活性が、骨関連活性である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記骨関連活性が、骨形成、骨リモデリング、骨芽細胞分化、破骨細胞分化、骨芽細胞生存、破骨細胞生存、骨芽細胞活性または破骨細胞活性を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記腫瘍形成が、卵巣腫瘍形成、前立腺腫瘍形成または結腸腫瘍形成を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記投与が、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、Ｗｎｔ、Ｄｋｋ、フリズルド、ディシブルド、ベータ−カテニンまたはＬＥＦ−１／ＴＣＦタンパク質に対するタンパク質の結合を調節する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記結合の部位が、ＬＲＰ５またはＬＲＰ６のＹＷＴＤ反復領域である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記タンパク質が、Ｄｋｋファミリーのメンバーである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記タンパク質が、Ｗｎｔファミリーのメンバーである、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記タンパク質が、スクレロスチンである、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記タンパク質が、ＰＡ受容体である、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＰＡ受容体が、ＴＥＭ８またはＣＭＧ２を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６およびＲ１３が、Ｈであり、Ｒ１１およびＲ１２が、ＣＨ３基である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６およびＲ１３が、Ｈであり、Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１５が、ＣＨ３基である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６およびＲ１３が、Ｈであり、Ｒ１１およびＲ１２が、ＣＨ３基であり、Ｒ１５が、エチル基である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６およびＲ１３が、Ｈであり、Ｒ１１およびＲ１２が、ＣＨ３基であり、Ｒ１５が、プロピル基である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６およびＲ１３が、Ｈであり、Ｒ１１およびＲ１２が、ＣＨ３基であり、Ｒ１５が、ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）３を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
骨折、骨疾患、骨傷害または骨異常の治療を必要とする対象における骨折、骨疾患、骨傷害または骨異常を治療するための方法であって、前記対象に構造（Ｉ）を有する化合物を前記骨折、骨疾患、骨傷害または骨異常を治療するのに有効な量で投与することを含む方法
【化２】
2010537950.tif 000052
（式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２またはＲ１３の少なくとも１つは、水素原子であり、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２またはＲ１３の少なくとも１つは、水素原子以外の原子を含む）。
【請求項２０】
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１３が、独立して、水素、酸素、ヒドロキシ、ハロゲン、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）アルキル基、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）置換アルキル基、シクロアルキル基、置換シクロアルキル基、複素環式基、置換複素環式基、アリールアルキル基、置換アリールアルキル基、ヘテロアリールアルキル基、置換ヘテロアリールアルキル基、アルコキシ基、置換アルコキシ基、アルケン基、置換アルケン基、アシル基、アミン基、アミド基、硝酸塩、硝酸エステル、カルボキシル基、カルボキシルエステル、硫化物、スルホキシド、スルホン酸塩、スルホン酸エステル、スルホン、スルホンアミド、リン酸塩、リン酸エステル、ホスホン酸塩、ホスホン酸エステル、ホスファミド、ホスホラミド、チオリン酸塩、チオリン酸エステル、チオホスホン酸塩あるいはチオホスホン酸エステルを含み、Ｒ１およびＲ１１、Ｒ１１およびＲ１２、Ｒ１２およびＲ３、Ｒ３およびＲ４、Ｒ１３およびＲ６が、独立して、互いに縮合して、１つ以上の環または前述したものの任意の組合せを形成することができる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
Ｒ１１およびＲ１２を含むアミン基の窒素が、荷電しており、Ｒ１５をさらに含み、Ｒ１５は、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１３について前述した通りである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
糖尿病、高血糖症または任意の代謝疾患の治療を必要とする対象における糖尿病、高血糖症または任意の代謝疾患を治療するための方法であって、前記対象に構造（Ｉ）を有する化合物を前記糖尿病、高血糖症または代謝疾患を治療するのに有効な量で投与することを含む方法
【化３】
2010537950.tif 000053
（式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２またはＲ１３の少なくとも１つは、水素原子であり、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２またはＲ１３の少なくとも１つは、水素原子以外の原子を含む）。
【請求項２３】
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１３が、独立して、水素、酸素、ヒドロキシ、ハロゲン、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）アルキル基、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）置換アルキル基、シクロアルキル基、置換シクロアルキル基、複素環式基、置換複素環式基、アリールアルキル基、置換アリールアルキル基、ヘテロアリールアルキル基、置換ヘテロアリールアルキル基、アルコキシ基、置換アルコキシ基、アルケン基、置換アルケン基、アシル基、アミン基、アミド基、硝酸塩、硝酸エステル、カルボキシル基、カルボキシルエステル、硫化物、スルホキシド、スルホン酸塩、スルホン酸エステル、スルホン、スルホンアミド、リン酸塩、リン酸エステル、ホスホン酸塩、ホスホン酸エステル、ホスファミド、ホスホラミド、チオリン酸塩、チオリン酸エステル、チオホスホン酸塩あるいはチオホスホン酸エステルを含み、Ｒ１およびＲ１１、Ｒ１１およびＲ１２、Ｒ１２およびＲ３、Ｒ３およびＲ４、Ｒ１３およびＲ６が、独立して、互いに縮合して、１つ以上の環または前述したものの任意の組合せを形成することができる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
Ｒ１１およびＲ１２を含むアミン基の窒素が、荷電しており、Ｒ１５をさらに含み、Ｒ１５は、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１３について前述した通りである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
病態生理学的過程の調節を必要とする対象における病態生理学的過程を調節する方法であって、前記病態生理学的過程が、糖代謝、コレステロール代謝、脂質代謝、トリグリセリド代謝、脂質生成、腫瘍形成、神経形成または任意の骨関連活性を含み、前記対象に構造（ＩＩ）を有する化合物を前記病態生理学的過程を調節するのに有効な量で投与することを含む方法
【化４】
2010537950.tif 000054
（式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３またはＲ１４の少なくとも１つは、水素原子であり、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３またはＲ１４の少なくとも１つは、水素原子以外の原子を含む）。
【請求項２６】
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３およびＲ１４が、独立して、水素、酸素、ヒドロキシ、ハロゲン、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）アルキル基、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）置換アルキル基、シクロアルキル基、置換シクロアルキル基、複素環式基、置換複素環式基、アリールアルキル基、置換アリールアルキル基、ヘテロアリールアルキル基、置換ヘテロアリールアルキル基、アルコキシ基、置換アルコキシ基、アルケン基、置換アルケン基、アシル基、アミン基、アミド基、硝酸塩、硝酸エステル、カルボキシル基、カルボキシルエステル、硫化物、スルホキシド、スルホン酸塩、スルホン酸エステル、スルホン、スルホンアミド、リン酸塩、リン酸エステル、ホスホン酸塩、ホスホン酸エステル、ホスファミド、ホスホラミド、チオリン酸塩、チオリン酸エステル、チオホスホン酸塩あるいはチオホスホン酸エステルを含み、Ｒ１およびＲ１１、Ｒ１１およびＲ１２、Ｒ１２およびＲ３、Ｒ３およびＲ４、Ｒ１３およびＲ６が、独立して、互いに縮合して、１つ以上の環または前述したものの任意の組合せを形成することができる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記病態生理学的活性が、骨関連活性である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記骨関連活性が、骨形成、骨リモデリング、骨芽細胞分化、破骨細胞分化、骨芽細胞生存、破骨細胞生存、骨芽細胞活性または破骨細胞活性を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記腫瘍形成が、卵巣腫瘍形成、前立腺腫瘍形成または結腸腫瘍形成を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記投与が、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、Ｗｎｔ、Ｄｋｋ、フリズルド、ディシブルド、ベータ−カテニンまたはＬＥＦ−１／ＴＣＦタンパク質に対するタンパク質の結合を調節する、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記結合の部位が、ＬＲＰ５またはＬＲＰ６のＹＷＴＤ反復領域である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記タンパク質が、Ｄｋｋファミリーのメンバーである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記タンパク質が、Ｗｎｔファミリーのメンバーである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記タンパク質が、スクレロスチンである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記タンパク質が、ＰＡ受容体である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＰＡ受容体が、ＴＥＭ８またはＣＭＧ２を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６およびＲ１３が、Ｈであり、Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１４が、ＣＨ３基である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３８】
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４およびＲ６が、Ｈであり、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３およびＲ１４が、ＣＨ３基である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３９】
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４およびＲ６が、Ｈであり、Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１３が、ＣＨ３基であり、Ｒ１４が、Ｃ（ＣＨ３）３である、請求項２５に記載の方法。
【請求項４０】
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６およびＲ１３が、Ｈであり、Ｒ１１およびＲ１２が、ＣＨ３基であり、Ｒ１４が、（ＣＨ２）２ＣＨ（ＣＨ３）２である、請求項２５に記載の方法。
【請求項４１】
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６およびＲ１３が、Ｈであり、Ｒ１１およびＲ１２が、ＣＨ３基であり、Ｒ１４が、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）である、請求項２５に記載の方法。
【請求項４２】
骨折、骨疾患、骨傷害または骨異常の治療を必要とする対象における骨折、骨疾患、骨傷害または骨異常を治療するための方法であって、前記対象に構造（ＩＩ）を有する化合物を前記骨折、骨疾患、骨傷害または骨異常を調節するのに有効な量で投与することを含む方法
【化５】
2010537950.tif 000055
（式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３またはＲ１４の少なくとも１つは、水素原子であり、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３またはＲ１４の少なくとも１つは、水素原子以外の原子を含む）。
【請求項４３】
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３およびＲ１４が、独立して、水素、酸素、ヒドロキシ、ハロゲン、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）アルキル基、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）置換アルキル基、シクロアルキル基、置換シクロアルキル基、複素環式基、置換複素環式基、アリールアルキル基、置換アリールアルキル基、ヘテロアリールアルキル基、置換ヘテロアリールアルキル基、アルコキシ基、置換アルコキシ基、アルケン基、置換アルケン基、アシル基、アミン基、アミド基、硝酸塩、硝酸エステル、カルボキシル基、カルボキシルエステル、硫化物、スルホキシド、スルホン酸塩、スルホン酸エステル、スルホン、スルホンアミド、リン酸塩、リン酸エステル、ホスホン酸塩、ホスホン酸エステル、ホスファミド、ホスホラミド、チオリン酸塩、チオリン酸エステル、チオホスホン酸塩あるいはチオホスホン酸エステルを含み、Ｒ１およびＲ１１、Ｒ１１およびＲ１２、Ｒ１２およびＲ３、Ｒ３およびＲ４、Ｒ１３およびＲ６が、独立して、互いに縮合して、１つ以上の環または前述したものの任意の組合せを形成することができる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
糖尿病、高血糖症または任意の代謝疾患の治療を必要とする対象における糖尿病、高血糖症または任意の代謝疾患を治療するための方法であって、前記対象に構造（ＩＩ）を有する化合物を前記糖尿病、高血糖症または代謝疾患を調節するのに有効な量で投与することを含む方法
【化６】
2010537950.tif 000056
（式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３またはＲ１４の少なくとも１つは、水素原子であり、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３またはＲ１４の少なくとも１つは、水素原子以外の原子を含む）。
【請求項４５】
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３およびＲ１４が、独立して、水素、酸素、ヒドロキシ、ハロゲン、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）アルキル基、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）置換アルキル基、シクロアルキル基、置換シクロアルキル基、複素環式基、置換複素環式基、アリールアルキル基、置換アリールアルキル基、ヘテロアリールアルキル基、置換ヘテロアリールアルキル基、アルコキシ基、置換アルコキシ基、アルケン基、置換アルケン基、アシル基、アミン基、アミド基、硝酸塩、硝酸エステル、カルボキシル基、カルボキシルエステル、硫化物、スルホキシド、スルホン酸塩、スルホン酸エステル、スルホン、スルホンアミド、リン酸塩、リン酸エステル、ホスホン酸塩、ホスホン酸エステル、ホスファミド、ホスホラミド、チオリン酸塩、チオリン酸エステル、チオホスホン酸塩あるいはチオホスホン酸エステルを含み、Ｒ１およびＲ１１、Ｒ１１およびＲ１２、Ｒ１２およびＲ３、Ｒ３およびＲ４、Ｒ１３およびＲ６が、独立して、互いに縮合して、１つ以上の環または換前述したものの任意の組合せを形成することができる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
病態生理学的過程の調節を必要とする対象における病態生理学的過程を調節する方法であって、前記病態生理学的過程が、糖代謝、コレステロール代謝、脂質代謝、トリグリセリド代謝、脂質生成、腫瘍形成、神経形成または任意の骨関連活性を含み、前記対象に構造（ＩＩＩ）を有する化合物を前記病態生理学的過程を調節するのに有効な量で投与することを含む方法
【化７】
2010537950.tif 000057
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７またはＲ８の少なくとも１つは、水素原子であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７またはＲ８の少なくとも１つは、水素原子以外の原子を含む）。
【請求項４７】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８が、独立して、水素、酸素、ヒドロキシ、ハロゲン、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）アルキル基、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）置換アルキル基、シクロアルキル基、置換シクロアルキル基、複素環式基、置換複素環式基、アリールアルキル基、置換アリールアルキル基、ヘテロアリールアルキル基、置換ヘテロアリールアルキル基、アルコキシ基、置換アルコキシ基、アルケン基、置換アルケン基、アシル基、アミン基、アミド基、硝酸塩、硝酸エステル、カルボキシル基、カルボキシルエステル、硫化物、スルホキシド、スルホン酸塩、スルホン酸エステル、スルホン、スルホンアミド、リン酸塩、リン酸エステル、ホスホン酸塩、ホスホン酸エステル、ホスファミド、ホスホラミド、チオリン酸塩、チオリン酸エステル、チオホスホン酸塩あるいはチオホスホン酸エステルを含み、Ｒ１およびＲ２、Ｒ３およびＲ４、Ｒ２およびＲ３、Ｒ５およびＲ６、Ｒ６およびＲ７ならびにＲ７およびＲ８が、独立して、互いに縮合して、１つ以上の環または前述したものの任意の組合せを形成することができる、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記病態生理学的過程活性が、骨関連活性である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記骨関連活性が、骨形成、骨リモデリング、骨芽細胞分化、破骨細胞分化、骨芽細胞生存、破骨細胞生存、骨芽細胞活性または破骨細胞活性を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記腫瘍形成が、卵巣腫瘍形成、前立腺腫瘍形成または結腸腫瘍形成を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】
前記投与が、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、Ｗｎｔ、Ｄｋｋ、フリズルド、ディシブルド、ベータ−カテニンまたはＬＥＦ−１／ＴＣＦタンパク質に対するタンパク質の結合を調節する、請求項４６に記載の方法。
【請求項５２】
前記結合の部位が、ＬＲＰ５またはＬＲＰ６のＹＷＴＤ反復領域である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記タンパク質が、Ｄｋｋファミリーのメンバーである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記タンパク質が、Ｗｎｔファミリーのメンバーである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
前記タンパク質が、スクレロスチンである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５６】
前記タンパク質が、ＰＡ受容体である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５７】
前記ＰＡ受容体が、ＴＥＭ８またはＣＭＧ２を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
骨折、骨疾患、骨傷害または骨異常の治療を必要とする対象における骨折、骨疾患、骨傷害または骨異常を治療する方法であって、前記対象に構造（ＩＩＩ）を有する化合物を前記対象における骨折、骨疾患、骨傷害または骨異常を治療するのに有効な量で投与することを含む方法
【化８】
2010537950.tif 000058
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７またはＲ８の少なくとも１つは、水素原子であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７またはＲ８の少なくとも１つは、水素原子以外の原子を含む）。
【請求項５９】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８が、独立して、水素、酸素、ヒドロキシ、ハロゲン、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）アルキル基、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）置換アルキル基、シクロアルキル基、置換シクロアルキル基、複素環式基、置換複素環式基、アリールアルキル基、置換アリールアルキル基、ヘテロアリールアルキル基、置換ヘテロアリールアルキル基、アルコキシ基、置換アルコキシ基、アルケン基、置換アルケン基、アシル基、アミン基、アミド基、硝酸塩、硝酸エステル、カルボキシル基、カルボキシルエステル、硫化物、スルホキシド、スルホン酸塩、スルホン酸エステル、スルホン、スルホンアミド、リン酸塩、リン酸エステル、ホスホン酸塩、ホスホン酸エステル、ホスファミド、ホスホラミド、チオリン酸塩、チオリン酸エステル、チオホスホン酸塩あるいはチオホスホン酸エステルを含み、Ｒ１およびＲ２、Ｒ３およびＲ４、Ｒ２およびＲ３、Ｒ５およびＲ６、Ｒ６およびＲ７ならびにＲ７およびＲ８が、独立して、互いに縮合して、１つ以上の環または前述したものの任意の組合せを形成することができる、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
糖尿病、高血糖症または任意の代謝疾患の治療を必要とする対象における糖尿病、高血糖症または任意の代謝疾患を治療するための方法であって、前記対象に構造（ＩＩＩ）を有する化合物を前記糖尿病、高血糖症または代謝疾患を治療するのに有効な量で投与することを含む方法
【化９】
2010537950.tif 000059
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７またはＲ８の少なくとも１つは、水素原子であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７またはＲ８の少なくとも１つは、水素原子以外の原子を含む）。
【請求項６１】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８が、独立して、水素、酸素、ヒドロキシ、ハロゲン、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）アルキル基、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）置換アルキル基、シクロアルキル基、置換シクロアルキル基、複素環式基、置換複素環式基、アリールアルキル基、置換アリールアルキル基、ヘテロアリールアルキル基、置換ヘテロアリールアルキル基、アルコキシ基、置換アルコキシ基、アルケン基、置換アルケン基、アシル基、アミン基、アミド基、硝酸塩、硝酸エステル、カルボキシル基、カルボキシルエステル、硫化物、スルホキシド、スルホン酸塩、スルホン酸エステル、スルホン、スルホンアミド、リン酸塩、リン酸エステル、ホスホン酸塩、ホスホン酸エステル、ホスファミド、ホスホラミド、チオリン酸塩、チオリン酸エステル、チオホスホン酸塩あるいはチオホスホン酸エステルを含み、Ｒ１およびＲ２、Ｒ３およびＲ４、Ｒ２およびＲ３、Ｒ５およびＲ６、Ｒ６およびＲ７ならびにＲ７およびＲ８が、独立して、互いに縮合して、１つ以上の環または前述したものの任意の組合せを形成することができる、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
病態生理学的過程の調節を必要とする対象における病態生理学的過程を調節する方法であって、前記病態生理学的過程が、糖代謝、コレステロール代謝、脂質代謝、トリグリセリド代謝、脂質生成、腫瘍形成、神経形成または任意の骨関連活性を含み、前記対象に構造（ＩＶ）を有する化合物を前記病態生理学的過程を調節するのに有効な量で投与することを含む方法
【化１０】
2010537950.tif 000060
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９またはＲ１０の少なくとも１つは、水素原子であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９またはＲ１０の少なくとも１つは、水素原子以外の原子を含む）。
【請求項６３】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９またはＲ１０が、独立して、水素、酸素、ヒドロキシ、ハロゲン、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）アルキル基、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）置換アルキル基、シクロアルキル基、置換シクロアルキル基、複素環式基、置換複素環式基、アラルアルキル基、置換アリールアルキル基、ヘテロアリールアルキル基、置換ヘテロアリールアルキル基、アルコキシ基、置換アルコキシ基、アルケン基、置換アルケン基、アシル基、アミン基、アミド基、硝酸塩、硝酸エステル、カルボキシル基、カルボキシルエステル、硫化物、スルホキシド、スルホン酸塩、スルホン酸エステル、スルホン、スルホンアミド、リン酸塩、リン酸エステル、ホスホン酸塩、ホスホン酸エステル、ホスファミド、ホスホラミド、チオリン酸塩、チオリン酸エステル、チオホスホン酸塩あるいはチオホスホン酸エステルを含み、Ｒ１およびＲ２、Ｒ２およびＲ３、Ｒ４およびＲ５、Ｒ３およびＲ４、Ｒ６およびＲ７、Ｒ７およびＲ８、Ｒ８およびＲ９ならびにＲ９およびＲ１０が、独立して、互いに縮合して、１つ以上の環または前述したものの任意の組合せを形成することができる、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記病態生理学的活性が、骨関連活性である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
前記骨関連活性が、骨形成、骨リモデリング、骨芽細胞分化、破骨細胞分化、骨芽細胞生存、破骨細胞生存、骨芽細胞活性または破骨細胞活性を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記腫瘍形成が、卵巣腫瘍形成、前立腺腫瘍形成または結腸腫瘍形成を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６７】
前記投与が、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、Ｗｎｔ、Ｄｋｋ、フリズルド、ディシブルド、ベータ−カテニンまたはＬＥＦ−１／ＴＣＦタンパク質に対するタンパク質の結合を調節する、請求項６２に記載の方法。
【請求項６８】
前記結合の部位が、ＬＲＰ５のＹＷＴＤ反復領域である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記タンパク質が、Ｄｋｋファミリーのメンバーである、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
前記タンパク質が、Ｗｎｔファミリーのメンバーである、請求項６７に記載の方法。
【請求項７１】
前記タンパク質が、スクレロスチンである、請求項６７に記載の方法。
【請求項７２】
前記タンパク質が、ＰＡ受容体である、請求項６７に記載の方法。
【請求項７３】
前記ＰＡ受容体が、ＴＥＭ８またはＣＭＧ２を含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
骨折、骨疾患、骨傷害または骨異常の治療を必要とする対象における骨折、骨疾患、骨傷害または骨異常を治療するための方法であって、前記対象に構造（ＩＶ）を有する化合物を前記骨折、骨疾患、骨傷害または骨異常を治療するのに有効な量で投与することを含む方法。
【化１１】
2010537950.tif 000061
【請求項７５】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９またはＲ１０が、独立して、水素、酸素、ヒドロキシ、ハロゲン、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）アルキル基、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）置換アルキル基、シクロアルキル基、置換シクロアルキル基、複素環式基、置換複素環式基、アラルアルキル基、置換アリールアルキル基、ヘテロアリールアルキル基、置換ヘテロアリールアルキル基、アルコキシ基、置換アルコキシ基、アルケン基、置換アルケン基、アシル基、アミン基、アミド基、硝酸塩、硝酸エステル、カルボキシル基、カルボキシルエステル、硫化物、スルホキシド、スルホン酸塩、スルホン酸エステル、スルホン、スルホンアミド、リン酸塩、リン酸エステル、ホスホン酸塩、ホスホン酸エステル、ホスファミド、ホスホラミド、チオリン酸塩、チオリン酸エステル、チオホスホン酸塩あるいはチオホスホン酸エステルを含み、Ｒ１およびＲ２、Ｒ２およびＲ３、Ｒ４およびＲ５、Ｒ３およびＲ４、Ｒ６およびＲ７、Ｒ７およびＲ８、Ｒ８およびＲ９ならびにＲ９およびＲ１０が、独立して、互いに縮合して、１つ以上の環または前述したものの任意の組合せを形成することができる、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
糖尿病、高血糖症または任意の代謝疾患の治療を必要とする対象における糖尿病、高血糖症または任意の代謝疾患を治療するための方法であって、前記対象に構造（ＩＶ）を有する化合物を前記糖尿病、高血糖症または代謝疾患を治療するのに有効な量で投与することを含む方法。
【化１２】
2010537950.tif 000062
【請求項７７】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９またはＲ１０が、独立して、水素、酸素、ヒドロキシ、ハロゲン、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）アルキル基、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）置換アルキル基、シクロアルキル基、置換シクロアルキル基、複素環式基、置換複素環式基、アラルアルキル基、置換アリールアルキル基、ヘテロアリールアルキル基、置換ヘテロアリールアルキル基、アルコキシ基、置換アルコキシ基、アルケン基、置換アルケン基、アシル基、アミン基、アミド基、硝酸塩、硝酸エステル、カルボキシル基、カルボキシルエステル、硫化物、スルホキシド、スルホン酸塩、スルホン酸エステル、スルホン、スルホンアミド、リン酸塩、リン酸エステル、ホスホン酸塩、ホスホン酸エステル、ホスファミド、ホスホラミド、チオリン酸塩、チオリン酸エステル、チオホスホン酸塩あるいはチオホスホン酸エステルを含み、Ｒ１およびＲ２、Ｒ２およびＲ３、Ｒ４およびＲ５、Ｒ３およびＲ４、Ｒ６およびＲ７、Ｒ７およびＲ８、Ｒ８およびＲ９ならびにＲ９およびＲ１０が、独立して、互いに縮合して、１つ以上の環または前述したものの任意の組合せを形成することができる、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
病態生理学的過程の調節を必要とする対象における病態生理学的過程を調節する方法であって、前記病態生理学的過程が、糖代謝、コレステロール代謝、脂質生成、腫瘍形成、神経形成または任意の骨関連活性を含み、前記対象に構造（Ｖ）を有する化合物を前記病態生理学的過程を調節するのに有効な量で投与することを含む方法
【化１３】
2010537950.tif 000063
（式中、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３またはＲ１４の少なくとも１つは、水素原子であり、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３またはＲ１４の少なくとも１つは、水素原子以外の原子を含む）。
【請求項７９】
Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３およびＲ１４が、独立して、水素、酸素、ヒドロキシ、ハロゲン、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）アルキル基、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）置換アルキル基、シクロアルキル基、置換シクロアルキル基、複素環式基、置換複素環式基、アリールアルキル基、置換アリールアルキル基、ヘテロアリールアルキル基、置換ヘテロアリールアルキル基、アルコキシ基、置換アルコキシ基、アルケン基、置換アルケン基、アシル基、アミン基、アミド基、硝酸塩、硝酸エステル、カルボキシル基、カルボキシルエステル、硫化物、スルホキシド、スルホン酸塩、スルホン酸エステル、スルホン、スルホンアミド、リン酸塩、リン酸エステル、ホスホン酸塩、ホスホン酸エステル、ホスファミド、ホスホラミド、チオリン酸塩、チオリン酸エステル、チオホスホン酸塩あるいはチオホスホン酸エステルを含み、Ｒ１およびＲ１１、Ｒ１１およびＲ１２、Ｒ１２およびＲ１３、Ｒ１３およびＲ１４、Ｒ１４およびＲ４、Ｒ４およびＲ５、Ｒ６およびＲ７、Ｒ７およびＲ８、Ｒ８およびＲ９ならびにＲ９およびＲ１０が、独立して、互いに縮合して、１つ以上の環または前述したものの任意の組合せを形成することができる、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記病態生理学的活性が、骨関連活性である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
前記骨関連活性が、骨形成、骨リモデリング、骨芽細胞分化、破骨細胞分化、骨芽細胞生存、破骨細胞生存、骨芽細胞活性または破骨細胞活性を含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記腫瘍形成が、卵巣腫瘍形成、前立腺腫瘍形成または結腸腫瘍形成を含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項８３】
前記投与が、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、Ｗｎｔ、Ｄｋｋ、フリズルド、ディシブルド、ベータ−カテニンまたはＬＥＦ−１／ＴＣＦタンパク質に対するタンパク質の結合を調節する、請求項７８に記載の方法。
【請求項８４】
前記結合の部位が、ＬＲＰ５またはＬＲＰ６のＹＷＴＤ反復領域である、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記タンパク質が、Ｄｋｋファミリーのメンバーである、請求項８３に記載の方法。
【請求項８６】
前記タンパク質が、Ｗｎｔファミリーのメンバーである、請求項８３に記載の方法。
【請求項８７】
前記タンパク質が、スクレロスチンである、請求項８３に記載の方法。
【請求項８８】
前記タンパク質が、ＰＡ受容体である、請求項８３に記載の方法。
【請求項８９】
前記ＰＡ受容体が、ＴＥＭ８またはＣＭＧ２を含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
骨折、骨疾患、骨傷害または骨異常の治療を必要とする対象における骨折、骨疾患、骨傷害または骨異常を治療するための方法であって、前記対象に構造（Ｖ）を有する化合物を前記骨折、骨疾患、骨傷害または骨異常を治療するのに有効な量で投与することを含む方法
【化１４】
2010537950.tif 000064
（式中、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３またはＲ１４の少なくとも１つは、水素原子であり、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３またはＲ１４の少なくとも１つは、水素原子以外の原子を含む）。
【請求項９１】
Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３およびＲ１４が、独立して、水素、酸素、ヒドロキシ、ハロゲン、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）アルキル基、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）置換アルキル基、シクロアルキル基、置換シクロアルキル基、複素環式基、置換複素環式基、アリールアルキル基、置換アリールアルキル基、ヘテロアリールアルキル基、置換ヘテロアリールアルキル基、アルコキシ基、置換アルコキシ基、アルケン基、置換アルケン基、アシル基、アミン基、アミド基、硝酸塩、硝酸エステル、カルボキシル基、カルボキシルエステル、硫化物、スルホキシド、スルホン酸塩、スルホン酸エステル、スルホン、スルホンアミド、リン酸塩、リン酸エステル、ホスホン酸塩、ホスホン酸エステル、ホスファミド、ホスホラミド、チオリン酸塩、チオリン酸エステル、チオホスホン酸塩あるいはチオホスホン酸エステルを含み、Ｒ１およびＲ１１、Ｒ１１およびＲ１２、Ｒ１２およびＲ１３、Ｒ１３およびＲ１４、Ｒ１４およびＲ４、Ｒ４およびＲ５、Ｒ６およびＲ７、Ｒ７およびＲ８、Ｒ８およびＲ９ならびにＲ９およびＲ１０が、独立して、互いに縮合して、１つ以上の環または前述したものの任意の組合せを形成することができる、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
糖尿病、高血糖症または任意の代謝疾患の治療を必要とする対象における糖尿病、高血糖症または任意の代謝疾患を治療するための方法であって、前記対象に構造（Ｖ）を有する化合物を前記糖尿病、高血糖症または代謝疾患を治療するのに有効な量で投与することを含む方法
【化１５】
2010537950.tif 000065
（式中、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３またはＲ１４の少なくとも１つは、水素原子であり、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３またはＲ１４の少なくとも１つは、水素原子以外の原子を含む）。
【請求項９３】
Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３およびＲ１４が、独立して、水素、酸素、ヒドロキシ、ハロゲン、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）アルキル基、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）置換アルキル基、シクロアルキル基、置換シクロアルキル基、複素環式基、置換複素環式基、アリールアルキル基、置換アリールアルキル基、ヘテロアリールアルキル基、置換ヘテロアリールアルキル基、アルコキシ基、置換アルコキシ基、アルケン基、置換アルケン基、アシル基、アミン基、アミド基、硝酸塩、硝酸エステル、カルボキシル基、カルボキシルエステル、硫化物、スルホキシド、スルホン酸塩、スルホン酸エステル、スルホン、スルホンアミド、リン酸塩、リン酸エステル、ホスホン酸塩、ホスホン酸エステル、ホスファミド、ホスホラミド、チオリン酸塩、チオリン酸エステル、チオホスホン酸塩あるいはチオホスホン酸エステルを含み、Ｒ１およびＲ１１、Ｒ１１およびＲ１２、Ｒ１２およびＲ１３、Ｒ１３およびＲ１４、Ｒ１４およびＲ４、Ｒ４およびＲ５、Ｒ６およびＲ７、Ｒ７およびＲ８、Ｒ８およびＲ９ならびにＲ９およびＲ１０が、独立して、互いに縮合して、１つ以上の環または前述したものの任意の組合せを形成することができる、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
病態生理学的活性を調節するための組成物であって、前記病態生理学的活性が、糖代謝、脂質生成、腫瘍形成、神経形成または任意の骨関連活性を含み、構造（Ｉ）を有する化合物を含む組成物
【化１６】
2010537950.tif 000066
（式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１１またはＲ１２の少なくとも１つは、水素原子であり、Ｒ１３は、水素原子以外の原子を含み、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１１またはＲ１２の少なくとも１つは、水素原子以外の原子を含む）。
【請求項９５】
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１３が、独立して、水素、酸素、ヒドロキシ、ハロゲン、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）アルキル基、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）置換アルキル基、シクロアルキル基、置換シクロアルキル基、複素環式基、置換複素環式基、アリールアルキル基、置換アリールアルキル基、ヘテロアリールアルキル基、置換ヘテロアリールアルキル基、アルコキシ基、置換アルコキシ基、アルケン基、置換アルケン基、アシル基、アミン基、アミド基、硝酸塩、硝酸エステル、カルボキシル基、カルボキシルエステル、硫化物、スルホキシド、スルホン酸塩、スルホン酸エステル、スルホン、スルホンアミド、リン酸塩、リン酸エステル、ホスホン酸塩、ホスホン酸エステル、ホスファミド、ホスホラミド、チオリン酸塩、チオリン酸エステル、チオホスホン酸塩あるいはチオホスホン酸エステルを含み、Ｒ１およびＲ１１、Ｒ１１およびＲ１２、Ｒ１２およびＲ３、Ｒ３およびＲ４、Ｒ１３およびＲ６が、独立して、互いに縮合して、１つ以上の環または前述したものの任意の組合せを形成することができる、請求項９４に記載の組成物。
【請求項９６】
Ｒ１１およびＲ１２を含むアミン基の窒素が、荷電しており、Ｒ１５をさらに含み、Ｒ１５は、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１３について前述した通りである、請求項９５に記載の組成物。
【請求項９７】
骨折、骨疾患、骨傷害または骨異常を治療するための組成物であって、構造（Ｉ）を有する化合物を含む組成物
【化１７】
2010537950.tif 000067
（式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１１またはＲ１２の少なくとも１つは、水素原子であり、Ｒ１３は、水素原子以外の原子を含み、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１１またはＲ１２の少なくとも１つは、水素原子以外の原子を含む）。
【請求項９８】
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１３が、独立して、水素、酸素、ヒドロキシ、ハロゲン、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）アルキル基、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）置換アルキル基、シクロアルキル基、置換シクロアルキル基、複素環式基、置換複素環式基、アリールアルキル基、置換アリールアルキル基、ヘテロアリールアルキル基、置換ヘテロアリールアルキル基、アルコキシ基、置換アルコキシ基、アルケン基、置換アルケン基、アシル基、アミン基、アミド基、硝酸塩、硝酸エステル、カルボキシル基、カルボキシルエステル、硫化物、スルホキシド、スルホン酸塩、スルホン酸エステル、スルホン、スルホンアミド、リン酸塩、リン酸エステル、ホスホン酸塩、ホスホン酸エステル、ホスファミド、ホスホラミド、チオリン酸塩、チオリン酸エステル、チオホスホン酸塩あるいはチオホスホン酸エステルを含み、Ｒ１およびＲ１１、Ｒ１１およびＲ１２、Ｒ１２およびＲ３、Ｒ３およびＲ４、Ｒ１３およびＲ６が、独立して、互いに縮合して、１つ以上の環または前述したものの任意の組合せを形成することができる、請求項９７に記載の組成物。
【請求項９９】
Ｒ１１およびＲ１２を含むアミン基の窒素が、荷電しており、Ｒ１５をさらに含み、Ｒ１５は、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１３について前述した通りである、請求項９８に記載の組成物。
【請求項１００】
高血糖症、糖尿病または任意の代謝疾患を治療するための組成物であって、構造（Ｉ）を有する化合物を含む組成物
【化１８】
2010537950.tif 000068
（式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１１またはＲ１２の少なくとも１つは、水素原子であり、Ｒ１３は、水素原子以外の原子を含み、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１１またはＲ１２の少なくとも１つは、水素原子以外の原子を含む）。
【請求項１０１】
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１３が、独立して、水素、酸素、ヒドロキシ、ハロゲン、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）アルキル基、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）置換アルキル基、シクロアルキル基、置換シクロアルキル基、複素環式基、置換複素環式基、アリールアルキル基、置換アリールアルキル基、ヘテロアリールアルキル基、置換ヘテロアリールアルキル基、アルコキシ基、置換アルコキシ基、アルケン基、置換アルケン基、アシル基、アミン基、アミド基、硝酸塩、硝酸エステル、カルボキシル基、カルボキシルエステル、硫化物、スルホキシド、スルホン酸塩、スルホン酸エステル、スルホン、スルホンアミド、リン酸塩、リン酸エステル、ホスホン酸塩、ホスホン酸エステル、ホスファミド、ホスホラミド、チオリン酸塩、チオリン酸エステル、チオホスホン酸塩あるいはチオホスホン酸エステルを含み、Ｒ１およびＲ１１、Ｒ１１およびＲ１２、Ｒ１２およびＲ３、Ｒ３およびＲ４、Ｒ１３およびＲ６が、独立して、互いに縮合して、１つ以上の環または前述したものの任意の組合せを形成することができる、請求項１００に記載の組成物。
【請求項１０２】
Ｒ１１およびＲ１２を含むアミン基の窒素が、荷電しており、Ｒ１５をさらに含み、Ｒ１５は、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１３について前述した通りである、請求項１０１に記載の組成物。
【請求項１０３】
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６およびＲ１３が、Ｈであり、Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１５が、ＣＨ３基である、請求項９４、９７または１００のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０４】
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６およびＲ１３が、Ｈであり、Ｒ１１およびＲ１２が、ＣＨ３基であり、Ｒ１５が、エチル基である、請求項９４、９７または１００のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０５】
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６およびＲ１３が、Ｈであり、Ｒ１１およびＲ１２が、ＣＨ３基であり、Ｒ１５が、プロピル基である、請求項９４、９７または１００のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０６】
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６およびＲ１３が、Ｈであり、Ｒ１１およびＲ１２が、ＣＨ３基であり、Ｒ１５が、ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）３を含む、請求項９４、９７または１００のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０７】
病態生理学的活性を調節するための組成物であって、前記病態生理学的活性が、糖代謝、コレステロール代謝、脂質生成、腫瘍形成、神経形成または任意の骨関連活性を含み、構造（ＩＩ）を有する化合物を含む組成物
【化１９】
2010537950.tif 000069
（式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３またはＲ１４の少なくとも１つは、水素原子であり、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３またはＲ１４の少なくとも１つは、水素原子以外の原子を含む）。
【請求項１０８】
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３およびＲ１４が、独立して、水素、酸素、ヒドロキシ、ハロゲン、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）アルキル基、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）置換アルキル基、シクロアルキル基、置換シクロアルキル基、複素環式基、置換複素環式基、アリールアルキル基、置換アリールアルキル基、ヘテロアリールアルキル基、置換ヘテロアリールアルキル基、アルコキシ基、置換アルコキシ基、アルケン基、置換アルケン基、アシル基、アミン基、アミド基、硝酸塩、硝酸エステル、カルボキシル基、カルボキシルエステル、硫化物、スルホキシド、スルホン酸塩、スルホン酸エステル、スルホン、スルホンアミド、リン酸塩、リン酸エステル、ホスホン酸塩、ホスホン酸エステル、ホスファミド、ホスホラミド、チオリン酸塩、チオリン酸エステル、チオホスホン酸塩あるいはチオホスホン酸エステルを含み、Ｒ１およびＲ１１、Ｒ１１およびＲ１２、Ｒ１２およびＲ３、Ｒ３およびＲ４、Ｒ１３およびＲ６が、独立して、互いに縮合して、１つ以上の環または前述したものの任意の組合せを形成することができる、請求項１０７に記載の組成物。
【請求項１０９】
骨折、骨疾患、骨傷害または骨異常を治療するための組成物であって、構造（ＩＩ）を有する化合物を含む組成物
【化２０】
2010537950.tif 000070
（式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３またはＲ１４の少なくとも１つは、水素原子であり、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３またはＲ１４の少なくとも１つは、水素原子以外の原子を含む）。
【請求項１１０】
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３およびＲ１４が、独立して、水素、酸素、ヒドロキシ、ハロゲン、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）アルキル基、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）置換アルキル基、シクロアルキル基、置換シクロアルキル基、複素環式基、置換複素環式基、アリールアルキル基、置換アリールアルキル基、ヘテロアリールアルキル基、置換ヘテロアリールアルキル基、アルコキシ基、置換アルコキシ基、アルケン基、置換アルケン基、アシル基、アミン基、アミド基、硝酸塩、硝酸エステル、カルボキシル基、カルボキシルエステル、硫化物、スルホキシド、スルホン酸塩、スルホン酸エステル、スルホン、スルホンアミド、リン酸塩、リン酸エステル、ホスホン酸塩、ホスホン酸エステル、ホスファミド、ホスホラミド、チオリン酸塩、チオリン酸エステル、チオホスホン酸塩あるいはチオホスホン酸エステルを含み、Ｒ１およびＲ１１、Ｒ１１およびＲ１２、Ｒ１２およびＲ３、Ｒ３およびＲ４、Ｒ１３およびＲ６が、独立して、互いに縮合して、１つ以上の環または前述したものの任意の組合せを形成することができる、請求項１０９に記載の組成物。
【請求項１１１】
糖尿病、高血糖症または任意の代謝疾患を治療するための組成物であって、構造（ＩＩ）を有する化合物を含む組成物
【化２１】
2010537950.tif 000071
（式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３またはＲ１４の少なくとも１つは、水素原子であり、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３またはＲ１４の少なくとも１つは、水素原子以外の原子を含む）。
【請求項１１２】
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３およびＲ１４が、独立して、水素、酸素、ヒドロキシ、ハロゲン、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）アルキル基、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）置換アルキル基、シクロアルキル基、置換シクロアルキル基、複素環式基、置換複素環式基、アリールアルキル基、置換アリールアルキル基、ヘテロアリールアルキル基、置換ヘテロアリールアルキル基、アルコキシ基、置換アルコキシ基、アルケン基、置換アルケン基、アシル基、アミン基、アミド基、硝酸塩、硝酸エステル、カルボキシル基、カルボキシルエステル、硫化物、スルホキシド、スルホン酸塩、スルホン酸エステル、スルホン、スルホンアミド、リン酸塩、リン酸エステル、ホスホン酸塩、ホスホン酸エステル、ホスファミド、ホスホラミド、チオリン酸塩、チオリン酸エステル、チオホスホン酸塩あるいはチオホスホン酸エステルを含み、Ｒ１およびＲ１１、Ｒ１１およびＲ１２、Ｒ１２およびＲ３、Ｒ３およびＲ４、Ｒ１３およびＲ６が、独立して、互いに縮合して、１つ以上の環または前述したものの任意の組合せを形成することができる、請求項１１１に記載の組成物。
【請求項１１３】
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６およびＲ１３が、Ｈであり、Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１４が、ＣＨ３基である、請求項１０７、１０９または１１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１４】
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４およびＲ６が、Ｈであり、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３およびＲ１４が、ＣＨ３基である、請求項１０７、１０９または１１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１５】
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４およびＲ６が、Ｈであり、Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１３が、ＣＨ３基であり、Ｒ１４が、Ｃ（ＣＨ３）３である、請求項１０７、１０９または１１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１６】
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６およびＲ１３が、Ｈであり、Ｒ１１およびＲ１２が、ＣＨ３基であり、Ｒ１４が、（ＣＨ２）２ＣＨ（ＣＨ３）２である、請求項１０７、１０９または１１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１７】
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６およびＲ１３が、Ｈであり、Ｒ１１およびＲ１２が、ＣＨ３基であり、Ｒ１４が、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）である、請求項１０７、１０９または１１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１８】
病態生理学的活性を調節するための組成物であって、前記病態生理学的活性が、糖代謝、コレステロール代謝、脂質生成、腫瘍形成、神経形成または任意の骨関連活性を含み、構造（ＩＩＩ）を有する化合物を含む組成物
【化２２】
2010537950.tif 000072
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７またはＲ８の少なくとも１つは、水素原子であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７またはＲ８の少なくとも１つは、水素原子以外の原子を含む）。
【請求項１１９】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８が、独立して、水素、酸素、ヒドロキシ、ハロゲン、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）アルキル基、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）置換アルキル基、シクロアルキル基、置換シクロアルキル基、複素環式基、置換複素環式基、アリールアルキル基、置換アリールアルキル基、ヘテロアリールアルキル基、置換ヘテロアリールアルキル基、アルコキシ基、置換アルコキシ基、アルケン基、置換アルケン基、アシル基、アミン基、アミド基、硝酸塩、硝酸エステル、カルボキシル基、カルボキシルエステル、硫化物、スルホキシド、スルホン酸塩、スルホン酸エステル、スルホン、スルホンアミド、リン酸塩、リン酸エステル、ホスホン酸塩、ホスホン酸エステル、ホスファミド、ホスホラミド、チオリン酸塩、チオリン酸エステル、チオホスホン酸塩あるいはチオホスホン酸エステルを含み、Ｒ１およびＲ２、Ｒ３およびＲ４、Ｒ２およびＲ３、Ｒ５およびＲ６、Ｒ６およびＲ７ならびにＲ７およびＲ８が、独立して、互いに縮合して、１つ以上の環または前述したものの任意の組合せを形成することができる、請求項１１８に記載の組成物。
【請求項１２０】
骨折、骨疾患、骨傷害または骨異常を治療するための組成物であって、構造（ＩＩＩ）を有する化合物を含む組成物
【化２３】
2010537950.tif 000073
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７またはＲ８の少なくとも１つは、水素原子であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７またはＲ８の少なくとも１つは、水素原子以外の原子を含む）。
【請求項１２１】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８が、独立して、水素、酸素、ヒドロキシ、ハロゲン、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）アルキル基、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）置換アルキル基、シクロアルキル基、置換シクロアルキル基、複素環式基、置換複素環式基、アリールアルキル基、置換アリールアルキル基、ヘテロアリールアルキル基、置換ヘテロアリールアルキル基、アルコキシ基、置換アルコキシ基、アルケン基、置換アルケン基、アシル基、アミン基、アミド基、硝酸塩、硝酸エステル、カルボキシル基、カルボキシルエステル、硫化物、スルホキシド、スルホン酸塩、スルホン酸エステル、スルホン、スルホンアミド、リン酸塩、リン酸エステル、ホスホン酸塩、ホスホン酸エステル、ホスファミド、ホスホラミド、チオリン酸塩、チオリン酸エステル、チオホスホン酸塩あるいはチオホスホン酸エステルを含み、Ｒ１およびＲ２、Ｒ３およびＲ４、Ｒ２およびＲ３、Ｒ５およびＲ６、Ｒ６およびＲ７ならびにＲ７およびＲ８が、独立して、互いに縮合して、１つ以上の環または前述したものの任意の組合せを形成することができる、請求項１２０に記載の組成物。
【請求項１２２】
糖尿病、高血糖症または任意の代謝疾患を治療するための組成物であって、構造（ＩＩＩ）を有する化合物を含む組成物
【化２４】
2010537950.tif 000074
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７またはＲ８の少なくとも１つは、水素原子であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７またはＲ８の少なくとも１つは、水素原子以外の原子を含む）。
【請求項１２３】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８が、独立して、水素、酸素、ヒドロキシ、ハロゲン、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）アルキル基、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）置換アルキル基、シクロアルキル基、置換シクロアルキル基、複素環式基、置換複素環式基、アリールアルキル基、置換アリールアルキル基、ヘテロアリールアルキル基、置換ヘテロアリールアルキル基、アルコキシ基、置換アルコキシ基、アルケン基、置換アルケン基、アシル基、アミン基、アミド基、硝酸塩、硝酸エステル、カルボキシル基、カルボキシルエステル、硫化物、スルホキシド、スルホン酸塩、スルホン酸エステル、スルホン、スルホンアミド、リン酸塩、リン酸エステル、ホスホン酸塩、ホスホン酸エステル、ホスファミド、ホスホラミド、チオリン酸塩、チオリン酸エステル、チオホスホン酸塩あるいはチオホスホン酸エステルを含み、Ｒ１およびＲ２、Ｒ３およびＲ４、Ｒ２およびＲ３、Ｒ５およびＲ６、Ｒ６およびＲ７ならびにＲ７およびＲ８は、独立して、互いに縮合して、１つ以上の環または前述したものの任意の組合せを形成することができる、請求項１２２に記載の組成物。
【請求項１２４】
病態生理学的活性を調節するための組成物であって、前記病態生理学的活性が、糖代謝、コレステロール代謝、脂質生成、腫瘍形成、神経形成および骨関連活性を含み、構造（ＩＶ）を有する化合物を含む組成物
【化２５】
2010537950.tif 000075
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９またはＲ１０の少なくとも１つは、水素原子であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９またはＲ１０の少なくとも１つは、水素原子以外の原子を含む）。
【請求項１２５】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９またはＲ１０が、独立して、水素、酸素、ヒドロキシ、ハロゲン、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）アルキル基、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）置換アルキル基、シクロアルキル基、置換シクロアルキル基、複素環式基、置換複素環式基、アリールアルキル基、置換アリールアルキル基、ヘテロアリールアルキル基、置換ヘテロアリールアルキル基、アルコキシ基、置換アルコキシ基、アルケン基、置換アルケン基、アシル基、アミン基、アミド基、硝酸塩、硝酸エステル、カルボキシル基、カルボキシルエステル、硫化物、スルホキシド、スルホン酸塩、スルホン酸エステル、スルホン、スルホンアミド、リン酸塩、リン酸エステル、ホスホン酸塩、ホスホン酸エステル、ホスファミド、ホスホラミド、チオリン酸塩、チオリン酸エステル、チオホスホン酸塩あるいはチオホスホン酸エステルを含み、Ｒ１およびＲ２、Ｒ２およびＲ３、Ｒ４およびＲ５、Ｒ３およびＲ４、Ｒ６およびＲ７、Ｒ７およびＲ８、Ｒ８およびＲ９ならびにＲ９およびＲ１０が、独立して、互いに縮合して、１つ以上の環または前述したものの任意の組合せを形成することができる、請求項１２４に記載の組成物。
【請求項１２６】
骨折、骨疾患、骨傷害または骨異常を治療するための組成物であって、構造（ＩＶ）を有する化合物を含む組成物
【化２６】
2010537950.tif 000076
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９またはＲ１０の少なくとも１つは、水素原子であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９またはＲ１０の少なくとも１つは、水素原子以外の原子を含む）。
【請求項１２７】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９またはＲ１０が、独立して、水素、酸素、ヒドロキシ、ハロゲン、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）アルキル基、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）置換アルキル基、シクロアルキル基、置換シクロアルキル基、複素環式基、置換複素環式基、アリールアルキル基、置換アリールアルキル基、ヘテロアリールアルキル基、置換ヘテロアリールアルキル基、アルコキシ基、置換アルコキシ基、アルケン基、置換アルケン基、アシル基、アミン基、アミド基、硝酸塩、硝酸エステル、カルボキシル基、カルボキシルエステル、硫化物、スルホキシド、スルホン酸塩、スルホン酸エステル、スルホン、スルホンアミド、リン酸塩、リン酸エステル、ホスホン酸塩、ホスホン酸エステル、ホスファミド、ホスホラミド、チオリン酸塩、チオリン酸エステル、チオホスホン酸塩あるいはチオホスホン酸エステルを含み、Ｒ１およびＲ２、Ｒ２およびＲ３、Ｒ４およびＲ５、Ｒ３およびＲ４、Ｒ６およびＲ７、Ｒ７およびＲ８、Ｒ８およびＲ９ならびにＲ９およびＲ１０が、独立して、互いに縮合して、１つ以上の環または前述したものの任意の組合せを形成することができる、請求項１２６に記載の組成物。
【請求項１２８】
糖尿病、高血糖症または任意の代謝疾患を治療するための組成物であって、構造（ＩＶ）を有する化合物を含む組成物
【化２７】
2010537950.tif 000077
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９またはＲ１０の少なくとも１つは、水素原子であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９またはＲ１０の少なくとも１つは、水素原子以外の原子を含む）。
【請求項１２９】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９またはＲ１０が、独立して、水素、酸素、ヒドロキシ、ハロゲン、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）アルキル基、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）置換アルキル基、シクロアルキル基、置換シクロアルキル基、複素環式基、置換複素環式基、アリールアルキル基、置換アリールアルキル基、ヘテロアリールアルキル基、置換ヘテロアリールアルキル基、アルコキシ基、置換アルコキシ基、アルケン基、置換アルケン基、アシル基、アミン基、アミド基、硝酸塩、硝酸エステル、カルボキシル基、カルボキシルエステル、硫化物、スルホキシド、スルホン酸塩、スルホン酸エステル、スルホン、スルホンアミド、リン酸塩、リン酸エステル、ホスホン酸塩、ホスホン酸エステル、ホスファミド、ホスホラミド、チオリン酸塩、チオリン酸エステル、チオホスホン酸塩あるいはチオホスホン酸エステルを含み、Ｒ１およびＲ２、Ｒ２およびＲ３、Ｒ４およびＲ５、Ｒ３およびＲ４、Ｒ６およびＲ７、Ｒ７およびＲ８、Ｒ８およびＲ９ならびにＲ９およびＲ１０が、独立して、互いに縮合して、１つ以上の環または前述したものの任意の組合せを形成することができる、請求項１２８に記載の組成物。
【請求項１３０】
病態生理学的活性を調節するための組成物であって、前記病態生理学的活性が、糖代謝、コレステロール代謝、脂質生成、腫瘍形成、神経形成または任意の骨関連活性を含み、構造（Ｖ）を有する化合物を含む組成物
【化２８】
2010537950.tif 000078
（式中、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３またはＲ１４の少なくとも１つは、水素原子であり、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３またはＲ１４の少なくとも１つは、水素原子以外の原子を含む）。
【請求項１３１】
Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３およびＲ１４が、独立して、水素、酸素、ヒドロキシ、ハロゲン、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）アルキル基、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）置換アルキル基、シクロアルキル基、置換シクロアルキル基、複素環式基、置換複素環式基、アリールアルキル基、置換アリールアルキル基、ヘテロアリールアルキル基、置換ヘテロアリールアルキル基、アルコキシ基、置換アルコキシ基、アルケン基、置換アルケン基、アシル基、アミン基、アミド基、硝酸塩、硝酸エステル、カルボキシル基、カルボキシルエステル、硫化物、スルホキシド、スルホン酸塩、スルホン酸エステル、スルホン、スルホンアミド、リン酸塩、リン酸エステル、ホスホン酸塩、ホスホン酸エステル、ホスファミド、ホスホラミド、チオリン酸塩、チオリン酸エステル、チオホスホン酸塩あるいはチオホスホン酸エステルを含み、Ｒ１およびＲ１１、Ｒ１１およびＲ１２、Ｒ１２およびＲ１３、Ｒ１３およびＲ１４、Ｒ１４およびＲ４、Ｒ４およびＲ５、Ｒ６およびＲ７、Ｒ７およびＲ８、Ｒ８およびＲ９ならびにＲ９およびＲ１０が、独立して、互いに縮合して、１つ以上の環または前述したものの任意の組合せを形成することができる、請求項１３０に記載の組成物。
【請求項１３２】
骨疾患、骨折、骨傷害または骨異常を治療するための組成物であって、構造（Ｖ）を有する化合物を含む組成物
【化２９】
2010537950.tif 000079
（式中、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３またはＲ１４の少なくとも１つは、水素原子であり、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３またはＲ１４の少なくとも１つは、水素原子以外の原子を含む）。
【請求項１３３】
Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３およびＲ１４が、独立して、水素、酸素、ヒドロキシ、ハロゲン、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）アルキル基、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）置換アルキル基、シクロアルキル基、置換シクロアルキル基、複素環式基、置換複素環式基、アリールアルキル基、置換アリールアルキル基、ヘテロアリールアルキル基、置換ヘテロアリールアルキル基、アルコキシ基、置換アルコキシ基、アルケン基、置換アルケン基、アシル基、アミン基、アミド基、硝酸塩、硝酸エステル、カルボキシル基、カルボキシルエステル、硫化物、スルホキシド、スルホン酸塩、スルホン酸エステル、スルホン、スルホンアミド、リン酸塩、リン酸エステル、ホスホン酸塩、ホスホン酸エステル、ホスファミド、ホスホラミド、チオリン酸塩、チオリン酸エステル、チオホスホン酸塩あるいはチオホスホン酸エステルを含み、Ｒ１およびＲ１１、Ｒ１１およびＲ１２、Ｒ１２およびＲ１３、Ｒ１３およびＲ１４、Ｒ１４およびＲ４、Ｒ４およびＲ５、Ｒ６およびＲ７、Ｒ７およびＲ８、Ｒ８およびＲ９ならびにＲ９およびＲ１０が、独立して、互いに縮合して、１つ以上の環または前述したものの任意の組合せを形成することができる、請求項１３２に記載の組成物。
【請求項１３４】
糖尿病、高血糖症または任意の代謝疾患を治療するための組成物であって、構造（Ｖ）を有する化合物を含む組成物
【化３０】
2010537950.tif 000080
（式中、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３またはＲ１４の少なくとも１つは、水素原子であり、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３またはＲ１４の少なくとも１つは、水素原子以外の原子を含む）。
【請求項１３５】
Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３およびＲ１４が、独立して、水素、酸素、ヒドロキシ、ハロゲン、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）アルキル基、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）置換アルキル基、シクロアルキル基、置換シクロアルキル基、複素環式基、置換複素環式基、アリールアルキル基、置換アリールアルキル基、ヘテロアリールアルキル基、置換ヘテロアリールアルキル基、アルコキシ基、置換アルコキシ基、アルケン基、置換アルケン基、アシル基、アミン基、アミド基、硝酸塩、硝酸エステル、カルボキシル基、カルボキシルエステル、硫化物、スルホキシド、スルホン酸塩、スルホン酸エステル、スルホン、スルホンアミド、リン酸塩、リン酸エステル、ホスホン酸塩、ホスホン酸エステル、ホスファミド、ホスホラミド、チオリン酸塩、チオリン酸エステル、チオホスホン酸塩あるいはチオホスホン酸エステルを含み、Ｒ１およびＲ１１、Ｒ１１およびＲ１２、Ｒ１２およびＲ１３、Ｒ１３およびＲ１４、Ｒ１４およびＲ４、Ｒ４およびＲ５、Ｒ６およびＲ７、Ｒ７およびＲ８、Ｒ８およびＲ９ならびにＲ９およびＲ１０が、独立して、互いに縮合して、１つ以上の環または前述したものの任意の組合せを形成することができる、請求項１３４に記載の組成物。
【請求項１３６】
構造（ＶＩ）を有する単離された化合物
【化３１】
2010537950.tif 000081
（Ｒ１５は、直鎖状または分枝状アルキル基である）。
【請求項１３７】
Ｒ１５が、直鎖状または分枝状Ｃ１〜５アルキル基である、請求項１３６に記載の化合物。
【請求項１３８】
Ｒ１５が、メチル基である、請求項１３６に記載の組成物。
【請求項１３９】
Ｒ１５が、エチル基である、請求項１３６に記載の組成物。
【請求項１４０】
Ｒ１５が、プロピル基である、請求項１３６に記載の組成物。
【請求項１４１】
Ｒ１５が、ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）３である、請求項１３６に記載の組成物。
【請求項１４２】
請求項１３６に記載の化合物を得るための方法であって、前記化合物の形成を促進する条件下でガロシアニンとハロゲン化アルキルとを反応させることを含む方法。
【請求項１４３】
請求項１３６に記載の化合物を含む組成物。
【請求項１４４】
構造（ＶＩＩ）を有する化合物
【化３２】
2010537950.tif 000082
（式中、Ｒ１３およびＲ１４は、それぞれ独立して、Ｈあるいは直鎖状または分枝状アルキル基である）。
【請求項１４５】
Ｒ１３およびＲ１４が、独立して、Ｈあるいは直鎖状または分枝状のＣ１〜５直鎖状または分枝状アルキル基である、請求項１４４に記載の化合物。
【請求項１４６】
Ｒ１３が、Ｈであり、Ｒ１４が、ＣＨ３基である、請求項１４４に記載の化合物。
【請求項１４７】
Ｒ１３およびＲ１４が、ＣＨ３基である、請求項１４４に記載の化合物。
【請求項１４８】
Ｒ１３が、ＣＨ３基であり、Ｒ１４が、Ｃ（ＣＨ３）３である、請求項１４４に記載の化合物。
【請求項１４９】
Ｒ１３が、Ｈであり、Ｒ１４が、（ＣＨ２）２ＣＨ（ＣＨ３）２である、請求項１４４に記載の化合物。
【請求項１５０】
Ｒ１３が、Ｈであり、Ｒ１１およびＲ１２が、ＣＨ３基であり、Ｒ１４が、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）である、請求項１４４に記載の化合物。
【請求項１５１】
請求項１４４に記載の化合物を得るための方法であって、
（ａ）ガロシアニンとＣＯＯＨ基を脱離基で置き換えるための試剤とを反応させて、中間体を得ること、および
（ｂ）工程（ａ）で得た化合物とアルキルアミンとを反応させて、前記化合物を得ることを含む方法。
【請求項１５２】
請求項１４４に記載の化合物を含む組成物。
【請求項１５３】
構造（ＶＩＩＩ）を有する単離された化合物
【化３３】
2010537950.tif 000083
（式中、Ｒ１３は、直鎖状または分枝状アルキル基あるいは置換または非置換のシクロアルキル基である）。
【請求項１５４】
Ｒ１３が、直鎖状または分枝状Ｃ２〜４基である、請求項１５３に記載の単離された化合物。
【請求項１５５】
Ｒ１３が、シクロアルキルＣ３〜８基である、請求項１５３に記載の単離された化合物。
【請求項１５６】
請求項１５３に記載の化合物を含む組成物。
【請求項１５７】
ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、Ｗｎｔ、Ｄｋｋ、フリズルド、ディシブルド、ベータ−カテニンまたはＬＥＦ−１／ＴＣＦタンパク質に対するタンパク質の結合を妨げる化合物を同定するための方法であって、
（ａ）ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、Ｗｎｔ、Ｄｋｋ、フリズルド、ディシブルド、ベータ−カテニンまたはＬＥＦ−１／ＴＣＦタンパク質に結合する化合物を同定すること、および
（ｂ）（ａ）で同定された化合物が、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、Ｗｎｔ、Ｄｋｋ、フリズルド、ディシブルド、ベータ−カテニンまたはＬＥＦ−１／ＴＣＦタンパク質に対するタンパク質の結合を調節するかどうかを判定することを含む方法。
【請求項１５８】
前記化合物が、小分子、タンパク質ペプチド、ポリペプチド、環式分子、複素環式有機分子、核酸、脂質、荷電脂質、極性脂質、無極性脂質、糖、糖タンパク質、糖脂質、リポタンパク質、化学物質、あるいは複素環式有機分子、核酸、脂質、荷電脂質、極性脂質、無極性脂質、糖、糖タンパク質、糖脂質、リポタンパク質または化学物質を含む化合物の断片である、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１５９】
工程（ａ）における前記化合物が、
（ａ）ＵＮＩＴＹプログラムを使用して、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、Ｗｎｔ、Ｄｋｋ、フリズルド、ディシブルド、ベータ−カテニンまたはＬＥＦ−１／ＴＣＦの腔または結合部位に適合する化合物をスクリーニングすること、
（ｂ）Ｆｌｅｘｘプログラムを使用して、前記化合物を該腔にドッキングさせること、および
（ｃ）Ｃｓｃｏｒｅプログラムを使用して、最も結合親和性の高い化合物を同定することによって同定される、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１６０】
ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、Ｗｎｔ、Ｄｋｋ、フリズルド、ディシブルド、ベータ−カテニンまたはＬＥＦ−１／ＴＣＦタンパク質または受容体に対するタンパク質の結合を妨げる化合物を同定するための方法であって、
（ａ）Ｗｎｔシグナル伝達を調節する化合物を同定すること、および
（ｂ）（ａ）で同定された化合物が、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、Ｗｎｔ、Ｄｋｋ、フリズルド、ディシブルド、ベータ−カテニンまたはＬＥＦ−１／ＴＣＦタンパク質に結合するかどうかを判定することを含む方法。
【請求項１６１】
（ａ）Ｗｎｔシグナル伝達経路の一部である対象となるタンパク質の構造を決定する工程、
（ｂ）前記対象となるタンパク質の変異分析を実施する工程であって、前記分析は、前記対象となるタンパク質がＷｎｔ経路に関与する第２のタンパク質と相互作用する結合腔を定める工程、
（ｃ）化合物のライブラリーのバーチャルスクリーニングを実施して、該化合物の前記腔に対する潜在的な結合親和性を評価する工程、
（ｄ）特定の好ましい化合物をそれらの結合親和性に基づいて同定する工程、
（ｅ）前記好ましい化合物の存在によって引き起こされるＷｎｔ活性の変化を測定するＷｎｔ依存性生物学的アッセイで前記好ましい化合物を試験する工程、および
（ｆ）前記生物学的アッセイに基づいて試験された前記好ましい化合物から１つ以上の化合物を選択して、組成物を形成する工程
によって選択される、組成物。
【請求項１６２】
前記タンパク質が、カノニカルＷｎｔシグナル経路に関与する、請求項１６１に記載の組成物。
【請求項１６３】
前記タンパク質が、非カノニカルＷｎｔシグナル経路に関与する、請求項１６１に記載の組成物。
【請求項１６４】
前記構造決定の工程が、Ｘ線結晶構造解析、前記タンパク質もしくは前記タンパク質の一部に結合されたリガンドを用いたＸ線結晶構造解析、ＮＭＲ分光写真法、ペプチドマッピング、アラニン走査、変異分析、その構造が既知の関連タンパク質との類比、または前述したものの任意の組合せを含む、請求項１６１に記載の組成物。
【請求項１６５】
前記選択された化合物が、前記生物学的アッセイにおいてＷｎｔ活性の増加を示した、請求項１６１に記載の組成物。
【請求項１６６】
前記選択された化合物が、前記生物学的アッセイにおいてＷｎｔ活性の低下を示した、請求項１６１に記載の組成物。
【請求項１６７】
前記第２のタンパク質に対して前記好ましい化合物の親和性を測定する別のアッセイが実施される、請求項１６１に記載の組成物。
【請求項１６８】
前記ライブラリーが、バーチャルライブラリーであり、前記化合物が、前記バーチャルスクリーニング工程の後に合成される、請求項１６１に記載の組成物。
【請求項１６９】
前記化合物のライブラリーが、有機化合物、ペプチド、核酸、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項１６１に記載の組成物。
【請求項１７０】
前記ペプチドライブラリーが、ランダムペプチド、一連の置換ペプチド、前記対象となるタンパク質に結合する抗体の断片、前記第２のタンパク質の断片、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項１６９に記載の組成物。
【請求項１７１】
前記核酸が、アプタマーまたはタンパク質結合配列を含む、請求項１６９に記載の組成物。
【請求項１７２】
前記対象となるタンパク質が、Ｄｋｋファミリーのメンバー、Ｗｎｔファミリーのメンバー、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、クレメン、アキシン、ディシブルド、フリズルド、ＧＳＫ３、ベータ−カテニン、ＬＥＦ−１またはＭｅｓｄである、請求項１６１に記載の組成物。
【請求項１７３】
前記第２のタンパク質が、Ｄｋｋファミリーのメンバー、Ｗｎｔファミリーのメンバー、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、クレメン、アキシン、ディシブルド、フリズルド、ＧＳＫ３、ベータ−カテニン、ＬＥＦ−１またはＭｅｓｄである、請求項１６１に記載の組成物。
【請求項１７４】
（ａ）Ｗｎｔシグナル伝達経路の一部である対象となるタンパク質の構造を決定する工程、
（ｂ）前記対象となるタンパク質の変異分析を実施する工程であって、前記分析は、前記対象となるタンパク質がＷｎｔ経路に関与する第２のタンパク質と相互作用する結合腔を定める工程、
（ｃ）化合物のライブラリーのバーチャルスクリーニングを実施して、該化合物の前記腔に対する潜在的な結合親和性を評価する工程、
（ｄ）特定の好ましい化合物をそれらの結合親和性に基づいて同定する工程、
（ｅ）前記好ましい化合物の存在によって引き起こされるＷｎｔ活性の変化を測定するＷｎｔ依存性生物学的アッセイで前記好ましい化合物を試験する工程、および
（ｆ）前記生物学的アッセイに基づいて試験された前記好ましい化合物から１つ以上の化合物を選択して、組成物を形成する工程
によって選択される、組成物。
【請求項１７５】
前記タンパク質が、カノニカルＷｎｔシグナル経路に関与する、請求項１７４に記載の組成物。
【請求項１７６】
前記タンパク質が、非カノニカルＷｎｔシグナル経路に関与する、請求項１７４に記載の組成物。
【請求項１７７】
前記構造決定の工程が、Ｘ線結晶構造解析、前記タンパク質もしくは前記タンパク質の一部に結合されたリガンドを用いたＸ線結晶構造解析、ＮＭＲ分光写真法、ペプチドマッピング、アラニン走査、変異分析、その構造が既知の関連タンパク質との類比、または前述したものの任意の組合せを含む、請求項１７４に記載の組成物。
【請求項１７８】
前記選択された化合物が、前記生物学的アッセイにおいてＷｎｔ活性の増加を示した、請求項１７４に記載の組成物。
【請求項１７９】
前記選択された化合物が、前記生物学的アッセイにおいてＷｎｔ活性の低下を示した、請求項１７４に記載の組成物。
【請求項１８０】
前記第２のタンパク質に対して前記好ましい化合物の親和性を測定する別のアッセイが実施される、請求項１７４に記載の組成物。
【請求項１８１】
前記ライブラリーが、バーチャルライブラリーであり、前記化合物が、前記バーチャルスクリーニング工程の後に合成される、請求項１７４に記載の組成物。
【請求項１８２】
前記化合物のライブラリーが、有機化合物、ペプチド、核酸、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項１７４に記載の組成物。
【請求項１８３】
前記ペプチドライブラリーが、ランダムペプチド、一連の置換ペプチド、前記対象となるタンパク質に結合する抗体の断片、前記第２のタンパク質の断片、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項１８２に記載の組成物。
【請求項１８４】
前記核酸が、アプタマーまたはタンパク質結合配列を含む、請求項１８２に記載の組成物。
【請求項１８５】
前記対象となるタンパク質が、Ｄｋｋファミリーのメンバー、Ｗｎｔファミリーのメンバー、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、クレメン、アキシン、ディシブルド、フリズルド、ＧＳＫ３、ベータ−カテニン、ＬＥＦ−１またはＭｅｓｄである、請求項１７４に記載の組成物。
【請求項１８６】
前記第２のタンパク質が、Ｄｋｋファミリーのメンバー、Ｗｎｔファミリーのメンバー、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、クレメン、アキシン、ディシブルド、フリズルド、ＧＳＫ３、ベータ−カテニン、ＬＥＦ−１またはＭｅｓｄである、請求項１７４に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その開示内容が参照により本明細書に組み入れられる「骨形成を刺激するための組成物および方法（Compositions and Methods for Stimulation of Bone Formation）」という名称の２００３年９月２２日出願の米国仮特許出願第６０／５０４，８６０号の利益を主張するものである。
【０００２】
本出願は、２００４年５月１９日に出願のＤａｎ  Ｗｕらによる「骨形成および細胞の自己再生を刺激または増強するための組成物および方法（Compositions and Methods for the Stimulation or Enhancement of Bone Formation and the Self-Renewal of Cells）」という題名の特許出願に関連し、該特許出願の全内容がそのまま全部参照により本明細書に組み入れられる。
【０００３】
本出願は、いずれの開示内容も参照により本明細書に組み入れられる、２００４年５月１９日出願の出願第１０／８４９，０６７号の一部継続である、２００５年３月１８日出願の出願第１１／０８４，６６８号の一部継続である、２００５年４月１日出願の出願第１１／０９７，５１８号の一部継続である。
【０００４】
本発明は、骨折、骨疾患、骨損傷、骨異常、腫瘍、成長またはウィルス感染の治療における、ならびにグルコース代謝、脂質代謝、トリグリセリド代謝、脂質生成、腫瘍形成、神経形成および骨関連活性を含むがそれらに限定されない病態生理学的過程を調節するための、治療方法、組成物およびそれらの使用の分野に関する。より詳細には、本発明の方法および組成物は、骨形成または骨リモデリングの刺激、増強および阻害を指向する。
【背景技術】
【０００５】
骨粗鬆症は、主要な周知の健康問題であり、特に高齢化人口に多い（１、１５、２１）。６５歳以上の人に生じる骨折の大半は、骨粗鬆症による（１５、４０）。最大骨量は、骨粗鬆症骨折のリスクを確立する上で決定的な因子であり（Ｈｅａｎｅｙら、２０００年）、遺伝因子が最大骨量の差に有意に寄与することが研究によって示されている。骨量を調節する遺伝子の１つが、ポジショナルクローニングにより最近同定された。カノニカルＷｎｔシグナル伝達経路に対する共受容体である低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質５（ＬＲＰ５）における機能的変異の欠失（２７）は、ヒトにおける骨密度の低下を示す常染色体性劣性障害である骨粗鬆症偽膠腫症候群（ＯＰＰＧ）に関連することが判明した（９）。加えて、家族性高骨量（ＨＢＭ）表現型を示す２つの独立した家系は、ＬＲＰ５におけるＶａｌ置換変異（Ｇ１７１Ｖ）に対するＧｌｙ１７１を含むことが判明した。より最近になって、Ｇ１７１Ｖ変異の同一の構造領域（structural domain）にさらなるＨＢＭ変異が報告された（３６）。ＬＲＰ５遺伝子が遺伝子ターゲッティングによって不活性化されたマウスは、ＯＰＰＧ患者のそれと類似の表現型を示し（１６）、マウスにおけるＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖの遺伝子導入発現がＨＢＭをもたらした（２）。さらに、マウスの一次骨芽細胞は、ＬＲＰ５の不在下でＷｎｔに対する応答性の低下を示し（１６）、Ｗｎｔ（９）または活性化ベータカテニン（４）は、カノニカルＷｎｔシグナル伝達活性を刺激し、骨芽様細胞における骨芽マーカアルカリホスファターゼ（ＡＰ）の生成を誘発した。併せて、これらの証拠は、カノニカルＷｎｔシグナル伝達経路が骨発育の調節に重要な役割を果たすことを示している。
【０００６】
Ｗｎｔ
分泌性糖タンパク質のＷｎｔファミリーは、発育上重要なシグナル伝達分子の主なファミリーの１つであり、糖代謝、骨リモデリング、脂質生成、神経形成、幹細胞生物学および腫瘍形成を含む広範な生物学的過程および病態生理学的過程を調節することが示された。カノニカルＷｎｔシグナル伝達経路は、カノニカルＷｎｔがＬＤＬ受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）５／６およびフリズルド（Ｆｚ）タンパク質からなるそれらの受容体複合体に結合することによって開始される。まだ十分に特性決定されていないメカニズムを介して、Ｗｎｔの不在下でユビキチン媒介タンパク質分解を介して分解されるベータカテニンが安定化されて、細胞基質レベルのβ−カテニンが増加する。遊離ベータカテニンは、核に入り、ＴＣＦ／ＬＥＦ−１転写因子を有する複合体における遺伝子転写を活性化させる（６１〜６６）。加えて、Ｗｎｔ経路は、ポリペプチドのＤｉｃｋｋｏｐｆ（Ｄｋｋ）ファミリーを含む多くの天然アンタゴニストによって負に調節される（６７、６８）。Ｄｋｋは、ＬＲＰ５／６に結合し、恐らくは受容体タンパク質の不活性化をもたらす（３４）。ヒトおよびマウスの両方の遺伝子的根拠は、Ｗｎｔ共受容体ＬＲＰ５が骨リモデリングの調節に重要な役割を果たすことを示している。低次形態対立遺伝子またはゼロ対立遺伝子は、骨粗鬆症の早期の発症をもたらす（１４）のに対して、異なる変異対立遺伝子は、高骨量表現型に関連する（３２、５、５１）。変異は、カノニカルＷｎｔシグナル伝達のＤｋｋ媒介アンタゴニズムを間接的に低下させたこと（６９）が以前に示されており、骨量の増加のための潜在的な治療目標としてのＤｋｋ−ＬＲＰ５相互作用が示唆されている。
【０００７】
最近まで、カノニカルＷｎｔシグナル伝達経路は、ＷｎｔがフリズルドＦｚタンパク質に結合したときに開始すると考えられていた。７つの膜貫通領域含有Ｆｚタンパク質が、ディシブルドタンパク質を含む定義が不十分なメカニズムを通じて、ベータカテニンのグリコーゲン合成酵素キナーゼ３（ＧＳＫ３）独立リン酸化を抑制する。この抑制は、ベータカテニンの安定化をもたらす。次いで、ベータカテニンは、リンパ系増強因子−１（ＬＥＦ−１）およびＴ細胞因子（ＴＣＦ）を含む転写調節剤（transcription regulator）と相互作用して、遺伝子転写を活性化させる（７、１０、３８）。最近、遺伝子および生化学の研究により、Ｆｚタンパク質に加えて、共受容体もカノニカルＷｎｔシグナル伝達に必要であることを示す堅実な証拠が提示された（２７、２８）。ＬＲＰ５／６（ＬＲＰ５またはＬＲＰ６）のフライオルソログ（fly ortholog）であるアロー（Arrow）は、Ｗｎｔ−１のフライオルソログであるＷｇのシグナル伝達に必要であることが判明した（３７）。ＬＲＰ５およびＬＲＰ６は、基本的には同様に機能するが、異なる発現パターンを示す密接な相同体である。加えて、ＬＲＰ６は、Ｗｎｔ１に結合し、ツメガエル胎児におけるＷｎｔ誘発発育過程を調節することが判明した（３４）。さらに、ＬＲＰ６が欠如したマウスは、様々なＷｎｔタンパク質における欠陥によって引き起こされるものと類似した発育欠陥を示した（３０）。さらに、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６およびアローは、アキシンを結合し、アキシン分解およびベータカテニン安定化をもたらすことによって、カノニカルＷｎｔシグナルの形質導入に関与する（２５、３５）ことが見いだされた。ＬＲＰ５／６媒介シグナル過程は、ディシブルドタンパク質に依存しないようである（１８、３１）ことが見いだされた。最近、シャペロンタンパク質、Ｍｅｓｄは、細胞表面へのＬＲＰ５／６輸送に必要であることが確認された（６、１１）。
【０００８】
骨成長の抑制または拡大を誘発するのにＷｎｔ経路が関与していることは、低骨量（１４、８８）または骨量の増加（３２、５、５１）を生じるように機能した骨格構造に対するＬＲＰ５における変異の様々な影響について記載した幾つもの文献で実証されている。さらに最近になって、ＬＲＰ５の両染色体複製物（ＬＲＰ５−／−ノックアウト）における破壊によって低骨量表現型が生ずる骨粗鬆症用遺伝子操作マウスモデルが記載されている（８９）。しかし、上記参考文献は、ＬＲＰ５に関するものであっても、Ｗｎｔシグナル伝達経路に沿う他の点への介入も、本発明の方法を通じて同定された化合物の投与の恩恵を受けることが可能であることが明らかであることに留意されたい。Ｗｎｔ経路と骨成長の相互関連の最近の論評については（引用参考文献８２、９０および９１を参照のこと）。
【０００９】
Ｄｋｋタンパク質
ツメガエルＤｉｃｋｋｏｐｆ（Ｄｋｋ）−１は、頭形成に重要な役割を果たすＷｎｔアンタゴニストとして最初に発見された（８）。これまで、哺乳動物においてＤｋｋの４つのメンバーが同定された（１７、２６）。これらは、Ｄｋｋ１、Ｄｋｋ２、Ｄｋｋ３およびＤｋｋ４を含む。Ｄｋｋ１およびＤｋｋ２は、ＬＲＰ５またはＬＲＰ６および単一の膜貫通タンパク質であるクレメン（Kremen）に同時に結合することによってカノニカルＷｎｔシグナル伝達を阻害する（３、２３、２４、３２）。ＬＲＰ５  ＨＢＭ  Ｇ１７１Ｖ変異は、カノニカルＷｎｔシグナル伝達に対するＤｋｋ１媒介アンタゴニズムを減弱させるようであったことが既に報告されている（５）。本発明は、この減弱のメカニズムについて記載する。
【００１０】
Ｗｎｔシグナル伝達のＤｋｋ媒介アンタゴニズムに必要とされるＬＲＰ５の第３のＹＷＴＤ反復領域が既に同定されている（６９）。加えて、Ｄｋｋ結合腔および該腔内の重要な残基が、部位指向性突然変異誘発によって明確にされている（６９）。この腔は、６つのベータプロペラで構成されるＹＷＴＤ反復領域の筒様構造体の大きな開口に位置する（図１７Ａ）。重要なことは、Ｄｋｋとの相互作用における２つの最も重要な残基、すなわち残基Ｇｌｕ７２１およびＴｒｐ７８０（６９）が、この腔の底に位置しており、この腔に結合する小さな分子化学物質が、この重要な残基への接触を阻止することによって、Ｄｋｋ−ＬＲＰ５相互作用を破壊することが可能であり得ることが示唆される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本明細書に記載されているように、本発明は、骨形成または骨リモデリングに関与する受容体または共受容体の領域上の腔と、Ｄｋｋ、Ｗｎｔ、Ｍｅｓｄ、または同様に機能する他のタンパク質との機能的相互作用を説明するモデルを提供する。これらの受容体には、ＬＲＰ５受容体、ＬＲＰ６受容体およびフリズルド受容体が含まれるが、それらに限定されない。ＬＲＰ５およびＬＲＰ６受容体は、４つのＹＷＴＤ反復領域を含む。各領域は、アミノ酸の複数のＹＷＴＤ反復を含む。ＬＲＰ５およびＬＲＰ６受容体は、ＬＤＬ受容体反復をも含む。ＬＲＰ５およびＬＲＰ６は、ともに密接な相同体であり、基本的には同様に機能するが、異なる発現パターンを有する。
【００１２】
本発明は、これらの腔に結合するか、またはこれらの腔と相互作用して、Ｗｎｔシグナル伝達、ならびに骨形成、腫瘍形成、およびＷｎｔシグナル伝達によって調節されるあらゆる他の生物学的および病理学的過程の刺激、阻害または調節をもたらす非天然（non-native）または外来性化合物を同定するための方法を提供する。特に、本発明は、ディシブルド、ベータカテニンまたはＬＥＦ−１／ＴＣＦタンパク質または受容体を指向する。特定の実施形態において、本発明は、タンパク質のＬＲＰ５、ＬＲＰ６、Ｗｎｔ、Ｄｋｋ、フリズルド、ディシブルド、ベータカテニンまたはＬＥＦ−１／ＴＣＦタンパク質または受容体との結合を妨げる化合物を同定するための方法を指向する。一実施形態において、該方法は、
（ａ）ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、Ｗｎｔ、Ｄｋｋ、フリズルド、ディシブルド、ベータカテニンまたはＬＥＦ−１／ＴＣＦタンパク質に結合する化合物を同定すること、および
（ｂ）（ａ）で同定された化合物が、タンパク質のＬＲＰ５、ＬＲＰ６、Ｗｎｔ、Ｄｋｋ、フリズルド、ディシブルド、ベータカテニンまたはＬＥＦ−１／ＴＣＦタンパク質または受容体との結合を調節するかどうかを判定することを含む。
【００１３】
工程（ａ）の化合物は、
（ａ）ＵＮＩＴＹプログラムを使用して、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、Ｗｎｔ、Ｄｋｋ、フリズルド、ディシブルド、ベータカテニンまたはＬＥＦ−１／ＴＣＦの腔、または結合部位に適合する化合物をスクリーニングすること、
（ｂ）Ｆｌｅｘｘプログラムを使用して、前記化合物を腔に入れること、および
（ｃ）Ｃｓｃｏｒｅプログラムを使用して、最も高い結合親和性を有する化合物を同定することによって同定され得る。
【００１４】
別の実施形態において、該方法は、
（ａ）Ｗｎｔシグナル伝達を調節する化合物を同定すること、および
（ｂ）（ａ）で同定された化合物が、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、Ｗｎｔ、Ｄｋｋ、フリズルド、ディシブルド、ベータカテニンまたはＬＥＦ−１／ＴＣＦタンパク質または受容体と相互作用または結合するかどうかを判定することを含む。
【００１５】
同定された化合物は、小分子、タンパク質ペプチド、ポリペプチド、環式分子、複素環式有機分子、核酸、脂質、荷電脂質、極性脂質、非極性脂質、糖、糖タンパク質、糖脂質、リポタンパク質、化学物質、または複素環式有機分子、核酸、脂質、荷電脂質、極性脂質、非極性脂質、糖、糖タンパク質、糖脂質、リポタンパク質もしくは化学物質を含む化合物の断片であってもよい。
【００１６】
本発明の方法を用いて同定された非天然化合物は、外部供給源から導入されない非天然化合物と異なり、細胞または生態に天然にまたは通常見られない化合物を含む。以下にさらに詳細に記載するように、それらの化合物を、様々なスクリーニング方法およびアッセイを通じて、国立癌研究所（ＮＣＩ）データベースから同定することができる。これらの化合物を改変して、効果的に機能するＮＣＩデータベースまたは天然に見られない誘導体または類似体を生成することも可能である。ＤｋｋとＬＲＰ５／６の相互作用、ＷｎｔとＬＲＰ５／６の相互作用およびＭｅｓｄとＬＲＰ５／６の相互作用を破壊した化合物が同定される。
【００１７】
特定の実施形態において、本発明は、糖代謝、コレステロール代謝、脂質生成、腫瘍形成、神経形成および／または骨関連活性を含むが、それらに限定されない病態生理学的過程を調節するための方法および／または組成物、ならびに本発明のスクリーニング方法を用いて同定された化合物を使用して、骨折、骨疾患、骨傷害または骨異常、糖尿病、高血糖症あるいは任意の代謝疾患を治療するための方法または組成物を指向する。特定の実施形態において、該化合物は、構造（Ｉ）：
【化１】
2010537950.tif 000002
（式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２またはＲ１３の少なくとも１つは、水素原子であり、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２またはＲ１３の少なくとも１つは、水素原子以外の原子を含む）；
構造（ＩＩ）：
【化２】
2010537950.tif 000003
（式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３またはＲ１４の少なくとも１つは、水素原子であり、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３またはＲ１４の少なくとも１つは、水素原子以外の原子を含む）；
構造（ＩＩＩ）：
【化３】
2010537950.tif 000004
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７またはＲ８の少なくとも１つは、水素原子であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７またはＲ８の少なくとも１つは、水素原子以外の原子を含む）；
構造（ＩＶ）：
【化４】
2010537950.tif 000005
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９またはＲ１０の少なくとも１つは、水素原子であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９またはＲ１０の少なくとも１つは、水素原子以外の原子を含む）；または
構造（Ｖ）：
【化５】
2010537950.tif 000006
（式中、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３またはＲ１４の少なくとも１つは、水素原子であり、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３またはＲ１４の少なくとも１つは、水素原子以外の原子を含む）を有することができる。
【００１８】
これらの化合物は、前記病態生理学的過程を調節するのに有効な量で、または前記骨折、骨疾患、骨傷害もしくは骨異常、糖尿病もしくは高血糖症を治療するのに有効な量で、該治療を必要とする対象に対して、本発明の方法で投与されるか、または本発明の組成物に存在する。一実施形態において、対象は、哺乳動物の対象である。特定の実施形態において、対象は、ヒトの対象である。
【００１９】
具体的な実施形態において、本発明は、以下の構造を有する単離された化合物を指向する。
構造（ＶＩ）：
【化６】
2010537950.tif 000007
（式中、Ｒ１５は、直鎖状または分枝状アルキル基である）；
構造（ＶＩＩ）：
【化７】
2010537950.tif 000008
（式中、Ｒ１３およびＲ１４は、それぞれ独立して、Ｈであるか、あるいは直鎖状または分枝状アルキル基である）；または
構造（ＶＩＩＩ）：
【化８】
2010537950.tif 000009
（式中、Ｒ１３は、直鎖状または分枝状アルキル基、あるいは置換または非置換のシクロアルキル基である）。
【００２０】
本発明は、化合物（ＶＩ）〜（ＶＩＩＩ）を得るための方法を指向する。具体的な実施形態において、化合物（ＶＩ）は、前記化合物の形成を促進する条件下で、ガロシアニンとハロゲン化アルキルを反応させることによって得られる。（ａ）ガロシアニンとＣＯＯＨ基を脱離基で置き換えるための試剤とを反応させて、中間体を得ること、および（ｂ）工程（ａ）で得られた化合物とアルキルアミンとを反応させて化合物を得ることによって、化合物（ＶＩＩ）を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】野生型ＬＲＰ５およびその欠失変異体の概略図である。
【図２】Ｇ１７１Ｖ変異がＬＲＰ５輸送を妨げることを示す図である。ＨＥＫ細胞に図に示すように発現プラスミドをトランスフェクションした。１日後、細胞を溶解させ、抗Ｆｌａｇ抗体を使用して免疫沈降を行った。Ｍｅｓｄは、Ｆｌａｇ標識されたのに対して、すべてのＬＲＰ５分子は、ＨＡ標識された。Ｇ１７１Ｖ変異は、ＬＲＰ５とＭｅｓｄ（図２Ａ、レーン１および３）およびＲ１２とＭｅｓｄ（図２Ｂ、レーン１および２）の両方の相互作用を妨げたが、Ｅ７２１変異は、該相互作用に影響を与えなかった（図２Ａ、レーン２および３）。図２Ａおよび図２Ｂの下側パネルは、免疫沈降に対して投入された等量のＷｔおよび変異ＬＲＰ５を示す［ＨＥＫ細胞を図に示されるＭｅｓｄプラスミドおよび発現プラスミドでトランスフェクションした］。Ｒ１２ＴＧＶ、Ｒ１２Ｔ、Ｒ１〜４およびＲ１〜４ＧＶ（ＧＶ）は、細胞培養物の上清に分泌され得る膜貫通領域を欠くＬＲＰ５変異体であるＡＰ融合タンパク質である。１日後、調整培地（ＣＭ）を回収し、高速で遠心した。上清を抗ＨＡ抗体によって免疫沈降させるか（図２Ｃ）、またはＡＰアッセイに使用した（図２Ｄ）。また、細胞をＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液に溶解させ、ウェスタンブロッティングによって分析した（図２Ｃおよび図２Ｄの下側パネル）。そのデータは、Ｇ１７１Ｖ変異がＲ１２およびＲ１〜４の分泌を阻害したことを示す。図２Ｅは、Ｇ１７１Ｖ変異が、細胞表面上のＬＲＰ５を検出する結合アッセイの使用を介して、ＬＲＰ５の細胞表面輸送を妨げることを確認するものである。細胞表面をビオチン化し、ＬＲＰ５分子を抗ＨＡ抗体で沈殿させた後に、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＳＡ−ＨＲＰ）を使用して、細胞表面ＬＲＰ５分子の量をウェスタン分析によって検出した（図２Ｅ、上面）。免疫複合体におけるＬＲＰ５の量を図２Ｅの下側パネルに示す。
【図３】ＬＲＰ５のＨＢＭ  Ｇ１７１Ｖ変異が、同時発現Ｗｎｔ活性のＤｋｋ１媒介阻害を受けにくいことを示す図である。図３Ａの左面は、Ｗｎｔ１の存在下または不在下で、ＬＥＦ−１ルシフェラーゼレポータプラスミドとともに示されるプラスミドでＨＥＫ細胞をトランスフェクションしたときに、ＨＢＭ  Ｇ１７１Ｖ変異が、野生型（Ｗｔ）ＬＲＰ５（ＬＲＰ５ｗｔ）と比較してＬＥＦ−１独立転写活性の増加をもたらさなかったことを示す。図３Ａの右パネルはＬＲＰ５タンパク質に担持されるＨＡ標識に特異的な抗体または抗ＬＲＰ６抗体によって測定されたＬＲＰ５、ＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖ、ＬＲＰ６およびＬＲＰ６Ｇ１５８Ｖの発現量を示す。図３Ｂは、図に示されるＷｔまたはＧ１７１Ｖ  ＬＲＰ５の存在下でＬＥＦ−１ルシフェラーゼレポータプラスミド、Ｗｎｔ−１、Ｄｋｋ１およびクレメンでＨＥＫ細胞をトランスフェクションしたことを示す。ＬＥＦ−１レポータが示すＷｎｔ活性は、Ｄｋｋが存在するときにＬＲＰ５ｗｔを発現するものよりＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖを発現するＨＥＫ細胞での方が有意に強い。Ｄｋｋ１、クレメンおよびＬＲＰ５のタンパク質発現量を図３Ｃに示すウェスタンブロッティングによって検証した。
【図４】ＬＲＰ５Ｇ１７１を発現する細胞が、ＬＲＰ５ｗｔを発現するものより少ないＤｋｋ１結合部位を示すことを示す図である（図４Ａ）。図４Ｂは、トランスフェクション後における等量のＷｔおよび変異ＬＲＰ５発現を示す。
【図５】ＬＲＰ５の第２の領域がＷｎｔ活性に必要とされることを示す図である。ＨＥＫ細胞にＬＥＦ活性レポータプラスミドおよび発現プラスミドをトランスフェクションした。１日後、先述のようにＬＥＦレポータ活性を測定した。図５の結果は、ＬＲＰ５Ｒ４９４ＱおよびＬＲＰ５Ｇ４７９Ｖ（第２の領域に点突然変異を有するＬＲＰ５）が、ＬＲＰ５ｗｔと比較してＷｎｔシグナル伝達を破壊することができることを示している。
【図６】ＬＲＰ５の第３の領域がＤｋｋ媒介アンタゴニズムに必要とされることを示す図である。図６Ａは、第３のＹＷＴＤ反復領域がＤｋｋ媒介阻害に必要とされることを示す。ＨＥＫ細胞をＬＥＦ活性レポータプラスミド、クレメン１プラスミドおよび発現プラスミドでトランスフェクションした。ＬＲＰ５Ｒ３４でなく、ＬＲＰ５Ｒ１２またはＬＲＰ５Ｒ１２４は、依然としてＷｎｔ刺激ＬＥＦ−１活性を強めることが可能であり、ＬＲＰ５Ｒ１２またはＬＲＰ５Ｒ１２４がＷｎｔ共受容体機能を保持することが示唆される。しかし、Ｄｋｋ１は、クレメンの発現にもかかわらず、ＬＲＰ５Ｒ１２またはＬＲＰ５Ｒ１２４が存在するときにＷｎｔシグナル伝達を阻害することができない。これは、第３のＹＷＴＤ反復領域がＤｋｋ１媒介阻害に必要とされることを示唆している。ＬＲＰ５ｗｔおよびその変異体分子の発現量を図６Ｂに示す。図６Ｃは、ＬＲＰ５Ｒ３４がＤｋｋ１結合部位を含み、Ｒ３４におけるＥ７２１がＤｋｋ１結合に必要とされることを示す。図６Ｄは、変異の概略図である。
【図７】相互作用表面からなる第３のＹＷＴＤ反復領域におけるアミノ酸残基がＷｎｔのＤｋｋ媒介阻害に必要とされることを示す図である。図７Ａにおいて、第３のＹＷＴＤ反復領域の空間実体モデルをＬＤＬ受容体ＹＷＴＤ反復領域の構造に基づいて推定した（１３）。三次元構造に基づいて、第３のＹＷＴＤ反復領域の表面にＡｌａ置換変異を含む１９個のＬＲＰ５変異体を生成した。Ｄｋｋ１媒介阻害に抵抗するこれらの変異体ＬＲＰ５タンパク質の能力を測定した。変異体のうちの９個（５％を超える）は、Ｄｋｋ１媒介阻害に対する感度の変化を示し、それらはすべて同一の表面上に位置する変異を含んでいた。図７Ｂにおいて、ＨＥＫ細胞をＬＥＦ活性レポータプラスミド、クレミン１プラスミドおよび発現プラスミドでトランスフェクションした。Ｗｔおよび変異体ＬＲＰ５分子の発現を下面に示す。１９個の変異の中で、Ｅ７２１変異は、ＷｎｔのＤｋｋ１媒介阻害に対する最大の影響を示し、続いてＷ７８１であり、次がＹ７１９であった。ＬＲＰ５Ｇ１７１ｖもＷｎｔのＤｋｋ１媒介阻害に対する影響を示した。
【図８】国立癌研究所（ＮＣＩ）から入手した３つの化合物の二次元構造を示す図である。ＮＣＩ１０６１６４（図８Ａ）は、Ｄｋｋ１結合に対して６８％の阻害効果を示し、ＮＣＩ３９９１４（図８Ｂ）およびＮＣＩ６６０２２４（図８Ｃ）は、Ｄｋｋ１結合をそれぞれ６５４％および２７６％増加させる。
【図９】ＮＣＩ３９９１４およびＮＣＩ６６０２２４の共通の下部構造であるアントラ−９，１０−キノンの二次元構造（図９Ａ）を示す図である。図９Ｂは、ＮＣＩ６５７５６６の二次元構造を示す。図９Ｃは、二次元類似性調査に使用された鋳型を示す。
【図１０】Ｄｋｋ１−ＬＲＰ５相互作用を特異的に妨げ、Ｄｋｋ１によるＷｎｔシグナル伝達の阻害を反転させる化合物ＮＣＩ３６６２１８（ＩＩＣ８、図１０Ａ）およびＮＣＩ８６４２（ＩＩＩＣ３、図１０Ｂ）の二次元構造を示す図である。
【図１１】ＮＣＩ３６６２１８およびＮＣＩ８６４２がＤｋｋ１阻害を反転させることを示す図である。ＨＥＫ細胞をＬＥＦ−１発現プラスミド、ＬＥＦ−１ルシフェラーゼレポータプラスミドおよびＧＦＰ発現プラスミドとともにＬＲＰ５プラスミドでトランスフェクションした。次いで、細胞を異なる濃度のＮＣＩ３６６２１８およびＮＣＩ８６４２化合物で処理し、続いて対照のＣＭ、Ｗｎｔ３ａ  ＣＭまたはＷｎｔ３ａ／Ｄｋｋ１  ＣＭ混合物で６時間処理した。ＤＭＳＯで処理された細胞からのレポータ活性を１００％とした。図１１は、ある特定の濃度において、ＮＣＩ３６６２１８（図１１Ａ）およびＮＣＩ８６４２（図１１Ｂ）がＷｎｔ活性のＤｋｋ媒介阻害を有意に反転できることを示す。
【図１２】ＮＣＩ３６６２１８およびＮＣＩ８６４２がＬＲＰ５に対するＤｋｋ１結合を阻害できることを示す図である。ＨＥＫ細胞をＭｅｓｄプラスミドおよびＬＲＰ５またはＬＲＰ５Ｒ３４でトランスフェクションした。１日後、細胞を異なる濃度のＮＣＩ３６６２１８およびＮＣＩ８６４２で処理し、ｍＤｋｋ１−ＡＰを発現するＨＥＫ細胞から調製された調整培地（ＣＭ）を用いて氷上でインキュベートした。ＡＰ活性を先述のように測定した。ＤＭＳＯで処理した細胞からのＡＰ活性を１００％とした。図１２は、ＮＣＩ３６６２１８（図１２Ａ）およびＮＣＩ８６４２（図１２Ｂ）が、ＬＲＰ５ｗｔに対するＤｋｋ１の結合およびＬＲＰ５Ｒ３４に対するＤｋｋタンパク質の結合を阻害することを示す。
【図１３】ＮＣＩ３６６２１８（ＩＩＣ８）が骨芽細胞分化を刺激できることを示す図である。ＧＦＰを骨芽細胞のマーカとして使用できる、２．３Ｋｂ  ＣｏｌｌＡ１プロモータ（２．３Ｃｏｌ−ＧＦＰ）１１によって制御された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）導入遺伝子を担持する３カ月のマウスから骨髄間質（ＢＭＳ）細胞を単離した。８日目および１２日目に、培養物をそれぞれ９μＭおよび２６μＭのＩＩＣ８化合物で処理した。同一時点で、培養物を対照としてＤＭＳＯで処理した。図１３は、ＢＭＳ培養物をＩＩＣ８で処理すると、骨芽細胞分化マーカ２．３Ｃｏｌ−ＧＦＰが活性化したことを示す。
【図１４】骨形成アッセイを示す図である。一次骨髄間質骨芽細胞をＮＣＩ３６６２１８の存在下および不在下で培養し、分化させた。２０日後、骨形成過程を反映する骨芽細胞の鉱化（mineralization）をキシレンオレンジ染色で観察した。ＮＣＩ３６６２１８は、鉱化を２倍刺激した。
【図１５】ＬＲＰ５Ｒ１２およびＬＲＰ５Ｒ３４の両方がＤｋｋ１結合部位を含み、Ｒ３４におけるＥ７２１がＤｋｋ１結合に必要とされ、Ｇ１７１ＶＬＲＰ５変異体が細胞表面に対するＤｋｋ結合を破壊し得ることを示す図である。図１５Ａは、Ｄｋｋ１はＬＲＰ５Ｒ１２およびＬＲＰ５Ｒ３４の両方に結合できるが、Ｒ１２ＧＶ（ＬＲＰ５Ｒ１２におけるＧ１７１Ｖ変異）およびＲ３４Ｅ（Ｅ７２１変異を担持するＬＲＰ５Ｒ３４）がトランスフェクションされた細胞では細胞表面に対するＤｋｋ１の結合が有意に低かったことを示す。図１５Ｂは、トランスフェクション後における等量のＷｔおよび変異体ＬＲＰ５発現を示す。
【図１６】骨形成細胞におけるＤｋｋ１およびＷｎｔ７ｂ発現を示す図である。全ＲＮＡを、分化誘発後異なる時点で骨髄間質細胞培養物から単離した。ＤｋｋおよびＷｎｔ発現量をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって測定した。Ｗｎｔ７ｂは、分化誘発後に発現の顕著な増加を示した（図１６Ａ）。ＬＥＦ−１レポータ遺伝子を刺激するＷｎｔ７ｂの能力を調べたところ、それは、カノニカルＷｎｔ経路を刺激することが可能であった（図１６Ｂ）。図１６Ｃは、マウス長骨部のインサイチューハイブリダイゼーションの写真である。Ｄｋｋ１の大半が骨細胞に発現されることを示している。図Ｄは、クレメン、Ｄｋｋ、ＬＲＰ、ＷｎｔおよびＦｚの間の相互作用を示す。
【図１７】Ｄｋｋ結合腔および化学物質の構造を示す図である。図１７Ａは、我々の初期の形状ベースのバーチャルスクリーニングに使用された３つの主要残基を示す。黄色のボックスは、腔を表す。図１７Ｂ〜１７Ｇは、ＩＣ１３（Ｂ）、ＩＣ１５（Ｃ）、ＩＩＣ８（Ｄ）、ＩＩＣ１５（Ｅ）、ＩＩＣ２４（Ｆ）およびＩＩＩＣ３（Ｇ）の化学構造を示す。アントラ−９，１０−キノンコアがボックスに示されている。
【図１８】Ｗｎｔ活性およびＤｋｋ結合に対する化合物の影響を示す図である。図１８Ａおよび１８Ｂにおいて、細胞をＷｎｔ活性レポータ遺伝子でトランスフェクションした。異なる濃度の化合物にＷｎｔ３ａ  ＣＭ、Ｗｎｔ３ａ＋Ｄｋｋ１  ＣＭまたは対照ＣＭ（基本）を添加した。６時間後、Ｗｎｔレポータ遺伝子活性を測定した。（ＡＵ：任意単位）。誤差は、５％未満であった。（Ｃ，Ｄ）細胞を野生型ＬＲＰ５（Ｃ）またはＬＲＰ５Ｒ３４（Ｄ）でトランスフェクションした。細胞に対するＤｋｋ−１−ＡＰの結合を測定した。ＬａｃＺを発現する細胞に対するＤｋｋ−１−ＡＰの結合を差し引いたデータを示す。
【図１９】Ｗｎｔアンタゴニスト化合物および分子のモデルリングを示す図である。図１９Ａは、Ｗｎｔ３ａ刺激Ｗｎｔレポータ遺伝子活性およびＬＲＰ５に対するＤｋｋ１−ＡＰの結合に対するＩＣ１５の影響を示す。図１９Ｂ〜１９Ｅは、ＬＲＰ５の第２および第３のＹＷＴＤ反復領域に対するＩＩＩＣ３およびＩＣ１５の結合の分子モデリングを示す。括弧内は、対応する残基である。
【図２０】ＩＩＩＣ３の骨形成に対する影響を示す図である。図２０Ａおよび２０Ｂは、頭蓋冠骨形成に対する影響を示す。対照媒体（ａ）、ｂ−ＦＧＦ（ｂ）またはＩＩＩＣ３（ｃ）を５日間にわたって１日３回頭皮の下に注射した。最後の注射の２週間後に、頭蓋冠を回収し、固定し、脱灰し、切断した。新しい骨層にマーキングする。新しい骨層の厚さを定量し、それをＢに示す。図２０Ｃ〜Ｅは、骨塩量（ＢＭＤ）に対する影響を示す。マウス（ｎ＝２０）に処理等を施した後、ＢＭＤおよび体重を測定した。
【図２１】Ｗｎｔ刺激ベータカテニン活性の阻害に対するＥｎｚｏＭ０１およびＩＣ１５の影響を示す図である。
【図２２】ＥｎｚｏＭ１４およびＥｎｚｏＭ１５の両方によるＷｎｔ刺激ベータカテニン活性の阻害を示す図である。
【図２３】ＥｎｚｏＭ０２（図２３Ａ）およびＥｎｚｏＭ０３（図２３Ｂ）によるＷｎｔシグナル伝達活性のＤｋｋ１阻害の反転を示す図である。
【図２４】異なる細胞密度、すなわち（Ａ）５００細胞／ウェル、（Ｂ）１０００細胞／ウェルおよび（Ｃ）２０００細胞／ウェルにおけるＰＣ−３腫瘍細胞の生存度に対する３つの化合物の影響を示す図である。
【図２５】（Ａ及びＢ）異なる腫瘍細胞系におけるベータカテニン生成に対するＥｎｚｏＭ０１の影響を示す。
【図２６】高カロリーの餌が与えられたマウスにおける糖代謝に対するＥｎｚｏＭ０１（図２６Ａ）、ＩＣ１５（図２６Ｂ）およびＩＩＩＣ３（図２６Ｃ）の影響を示す図である。
【図２７】高カロリーの餌が与えられたマウスにおけるトリグリセリドおよびコレステロールの血清値に対する（図２７Ａ）ＥｎｚｏＭ０１および（図２７Ｂ）ＩＣ１５の影響を示す図である。
【図２８】ｄｂ／ｄｂマウスにおけるグルコース（図２８Ａ）およびインシュリン（図２８Ｂ）値に対するＩＩＩＣ３の影響を示す図である。
【図２９】第２（赤色）および第３（青色）の領域の結合部位におけるアミノ酸の比較を示す図である。共通のアミノ酸を黒色で示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の範囲は、添付の請求項によってのみ限定されるため、本明細書に用いられている用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定することを意図しない。
【００２３】
ある範囲の値が示される場合には、各介在値は、その範囲およびその指定範囲内の任意の他の指定または介在値の上限と下限の間において、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、下限の単位の１０分の１まで本発明に包括される。これらのより小さい範囲の上限および下限をより小さい範囲に独立して含めることができることも、指定範囲における任意の具体的に除外される範囲を条件として、本発明の範囲内に包括される。指定範囲がそれらの限界値の一方または双方を含む場合には、それらの含まれる限界値のいずれかまたは双方を除外する範囲も本発明に含まれる。
【００２４】
特に規定のない限り、本明細書に用いられている技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者に広く理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等のあらゆる方法および材料を本発明の実施または試験に使用することもできるが、好ましい方法および材料を以下に記載する。
【００２５】
本明細書および添付の請求項に用いられているように、単数形の「ａ」、「ａｎｄ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを示さなければ、複数のものを含むことに留意すべきである。
【００２６】
本発明は、細胞に提供されると、骨形成または骨リモデリングの刺激、増強、阻害または調節に関与する共受容体の領域に見られる部位または腔と結合、相互作用または適合する化合物を同定した。これらの受容体は、ＬＲＰ５受容体、ＬＲＰ６受容体、フリズルド受容体、またはＬＲＰ５もしくはＬＲＰ６（ＬＲＰ５／６）受容体系に関与する任意の他の受容体を含む。ＬＲＰ５およびＬＲＰ６は、カノニカルＷｎｔ系にどのように関与するかに関して幾つもの共有の特徴があるため、一般に文献ではＬＲＰ５／６と称する。ＬＲＰ５およびＬＲＰ６は、アミノ酸レベルで７０％の相同性を共有する。ＬＲＰ５に結合する能力について選択された化合物の多くは、ＬＲＰ６受容体とも相互作用できることが予想される。フリズルド受容体は、Ｗｎｔ活性を増強または低下させるように機能するＷｎｔ結合部位であるＣＲＤを含む領域を有する共受容体である。
【００２７】
ＬＲＰ５およびＬＲＰ６受容体は、ＹＷＴＤ反復領域を含む。概して、ＬＲＰ５およびＬＲＰ６受容体のＹＷＴＤ反復領域を含む部分は、類似の構造体がこれらの領域の各々によって形成されるのに十分なアミノ酸相同体を互いに共有するが、形成されたポケットの寸法の一部が異なり、タンパク質／タンパク質相互作用に重要である可能性が高いアミノ酸の一部に差がある程の相違点を有する。特定の実施形態において、本発明の方法および／または組成物に使用される化合物は、ＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６受容体の第３のＹＷＴＤ領域と相互作用または結合する。当該化合物は、他のＹＷＴＤ領域に結合することが可能であっても、なくてもよい。特定の実施形態において、該化合物は、ＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６受容体の第１および第２のＹＷＴＤ領域に結合することができる。
【００２８】
これらの化合物のいくつかは、ＤｋｋおよびＬＲＰ５相互作用を妨げることができる。他の化合物は、ＷｎｔのＬＲＰ５／６に対する結合を阻害することによってＷｎｔシグナル伝達を阻害する。本明細書の以下に記載するように、本発明は、また、Ｄｋｋとクレミン、ＬＥＦ／ＴＣＦ−１とベータカテニン、Ｗｎｔとフリズルドの相互作用を調節する化合物を同定した。本発明の化合物は、細胞に存在せず、外部供給源に由来する非天然または外来化合物である。それらは、受容体と結合して事象を開始することができる作用物質であるアゴニスト、受容体と結合してアゴニストの効果を阻害する作用物質であるアンタゴニスト、ならびにアゴニストおよびアンタゴニストの両方の特性を有する、すなわちときには作用を引き起こし、ときには例えばアゴニストの効果を低下させることによって作用を阻害する部分アゴニストを含む。これらの化合物のいくつかは、親和性、あるいは薬物または化合物が受容体結合部位に引きつけられる程度を高めることもできる。
【００２９】
候補化合物の同定
本発明の組成物および方法に使用される化合物を、本明細書に記載のスクリーニング方法を用いて同定する。
ＬＲＰ５の特定の領域と相互作用する化合物のスクリーニング。
ＬＲＰ５の領域ＩＩＩを鋳型として使用する化合物のスクリーニング。
【００３０】
バーチャルスクリーニング
具体的な実施形態において、ＵＮＩＴＹ（商標）プログラム（Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．）を使用して、ＬＲＰ５のＹＷＴＤ反復領域の領域ＩＩＩ上の腔に適合することが可能な化学化合物について、国立癌研究所（ＮＣＩ）データベース（ｈｔｔｐ：／／１２９．４３．２７．１４０／ｎｃｉｄｂ２）をスクリーニングすることができる。このデータベースは、自由に検索可能であり、２５０２５１個の小さな化学化合物の座標を含む。検索質問（search query）は、０．３Åの許容誤差を有するＲ７６４およびＥ７２１、ならびに腔に向かってＴｒｐ７８１から３．２Å離れた１．０Åの許容誤差を有する疎水性の中心で構成されるように設計されている。化合物の柔軟性を考慮して、ＵＮＩＴＹ（商標）プログラムにおける定方向Ｔｗｅａｋアルゴリズムは、構造的に柔軟な高速の三次元検索に対応する（２１）。
【００３１】
次いで、ＵＮＩＴＹ（商標）プログラムを使用して得られた候補化合物を、リガンドを迅速かつ柔軟にタンパク質結合部位にドッキングさせる（４４）、エネルギー最小化のためのＦｌｅｘＸ（商標）プログラム（Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．）（１７）を使用してＤｋｋ１結合表面にドッキングさせる。Ｄｋｋ１の認識に重要であることが示された残基Ｅ７２１、Ｗ８６４、Ｙ７１９、Ｒ７６４、Ｄ８７７、Ｆ８８８、Ｇ７８２、Ｗ７８１およびＭ８９１（図７Ａ）を考慮に入れて計算する。ドッキング手順に続いて、Ｃｓｃｏｒｅ（商標）プログラムを使用して、Ｄｋｋ１結合ポケットに結合するそれらの想定される能力に基づいて化合物のランク付けを行う。Ｃｓｃｏｒｅ（商標）は、タンパク質−リガンド複合体の個々のスコアリング機能がどの程度十分に果たされたかに基づいて相対的なコンセンサススコアを生成する（８）。次いで、Ｃｓｃｏｒｅ（商標）に最終的なマニュアル目視検査を施す。
【００３２】
生物学的アッセイ
Ｄｋｋ−１結合アッセイ
同定された化合物を、当該技術分野で知られている方法によって、例えば、Ｄｋｋ−ＡＰＰアッセイ（実施例および（６９）参照）によって、ＬＲＰ−５に対するＤｋｋ−１の結合に影響を与えるそれらの能力についてスクリーニングすることができる。
【００３３】
Ｗｎｔ活性
同定された化合物をＷｎｔ活性についてスクリーニングすることもできる。ＬＲＰ５の第２および第３の領域がＷｎｔシグナル伝達に必要とされ、これらの領域は、恐らくはＷｎｔ分子と直接相互作用する。これらの領域は、高度なアミノ酸配列相同体を共有するため、第３の領域に結合するある特定の化合物は、第１の２つの領域にも結合して、潜在的にＷｎｔ活性を阻害できることが考えられる。該化合物を１）基本（basal）レポータ活性阻害；２）Ｗｎｔ活性阻害；および３）Ｗｎｔ活性のＤｋｋ媒介阻害の反転について調べることができる。
【００３４】
骨形成アッセイ
インビトロまたはインビボ骨形成アッセイを用いて、同定された化合物を試験することができる。
【００３５】
（ａ）インビトロアッセイ
Ｗｎｔは、培養された骨芽細胞の増殖および分化を刺激し、Ｄｋｋは、この過程を阻害する。したがって、これらの化合物は、骨形成を増加させる。これを鉱化の調査、またはＢＳＰ、オステオカルシンおよびコラーゲンの発現を含む骨形成マーカの発現によってモニタリングすることができる。
【００３６】
（ｂ）インビボアッセイ
インビボのこれらの化合物の効果についての試験を実施して、該化合物がインビボで骨形成を増加させるかどうかを判定することができる。様々な化合物投与物を頭蓋冠の外表面および骨髄腔に注入することができる。骨形成の増加を組織学的に、およびｐＱＣＴ、ＤＮＸおよびＸ線ラジオオートグラフィーの使用を介して調べることができる。
【００３７】
ベータカテニンレベルアッセイ
サイトゾルβ−カテニンは、Ｗｎｔシグナル伝達によって安定化される。これらの化合物のＷｎｔシグナル伝達に対する影響を、得られたβ−カテニンレベルによって調べることができる。
【００３８】
ＬＲＰ５／６のＰＰＰＳＰ部位のリン酸化
Ｗｎｔは、ＬＲＰ５の細胞内領域におけるＰＰＰＳＰモチーフでのＬＲＰ５のリン酸化を刺激することが最近発見された（４９）。実施例に記載され、当該技術分野で知られているように、リン酸化ＰＳＰＰＰに特異的な抗体を得て、Ｗｎｔ活性を調べるのに使用することができる（４９）。
【００３９】
ＬＲＰ５の領域ＩＩを鋳型として使用する化合物のスクリーニング
バーチャルスクリーニング
上記のように、相同性モデリングを用いて、この領域の構造を推定することができる。実施例に記載するように、部位指向性突然変異誘発を用いて、Ｗｎｔシグナル伝達に必要とされる残基を特定する。上記の方法を用いて、バーチャルスクリーニング方法をこのＷｎｔシグナル伝達表面に適用する。領域ＩＩは、Ｗｎｔシグナル伝達に関与するため、領域ＩＩを鋳型として使用して同定された化合物は、Ｗｎｔシグナル伝達を増加させるか、またはＷｎｔシグナル伝達を減少させることができる。領域ＩＩおよび領域ＩＩＩは、相同であるため、バーチャルスクリーニングを用いて同定された化合物は、１）Ｄｋｋ結合を増加させる；２）Ｄｋｋ結合を減少させる；３）Ｄｋｋアンタゴニズムを増加させる；および／または４）Ｄｋｋアンタゴニズムを減少させることができる。
【００４０】
生物学的アッセイ
上記の生物学的アッセイを用いて化合物を試験する。上記の方法を用いて、Ｗｎｔ活性を増加または減少させる化合物を同定する。上記のアッセイを用いて、Ｄｋｋ１結合を増強または阻害する化合物を確認する。上記のアッセイを用いて、Ｄｋｋ１アンタゴニズムを増強または阻害する化合物を確認する。
【００４１】
ＬＲＰ５の領域Ｉを鋳型として使用することによる化合物のスクリーニング
バーチャルスクリーニング
上記のように、相同性モデリングを用いて、この領域の構造を推定することができる。図２に記載するように、部位指向性突然変異誘発を用いて、Ｍｅｓｄ結合および機能に必要とされる残基を特定する。実施例５．１（Ａ）に記載の方法を用いて、バーチャルスクリーニング方法をこのＭｅｓｄ結合表面に適用する。領域Ｉは、Ｍｅｓｄ機能に関与するため、領域Ｉを鋳型として使用して同定された化合物は、細胞表面に対するＬＲＰ５の提供を増加または減少させることによって、Ｗｎｔシグナル伝達を増加または減少させ、および／またはＤｋｋアンタゴニズムを増加または減少させることができる。領域Ｉおよび領域ＩＩは、相同であるため、バーチャルスクリーニングを用いて同定された化合物は、Ｗｎｔシグナル伝達を増加または減少させることができる。領域Ｉおよび領域ＩＩＩは、相同であるため、バーチャルスクリーニングを用いて同定された化合物は、１）Ｄｋｋ結合を増加させる；２）Ｄｋｋ結合を減少させる；３）Ｄｋｋアンタゴニズムを増加させる；および／または４）Ｄｋｋアンタゴニズムを減少させることができる。
【００４２】
生物学的アッセイ
上記の方法を用いて、Ｗｎｔ活性を増加または減少させる化合物を同定する。実施例５．１に記載のアッセイを用いた特定の実施形態において、Ｄｋｋ１結合およびアンタゴニズムを増強または阻害する化合物を確認することができる。図２に示されるアッセイを用いて、Ｍｅｓｄ機能に影響を与える化合物を確認する。
【００４３】
ＬＲＰ５の他の領域と相互作用する化合物のスクリーニング
本明細書の上記に記載されているＬＲＰの細胞外部分の３つの領域は、バーチャルスクリーニングのための候補になる唯一の潜在的な部位ではない。例えば、ＬＲＰ５の細胞外部分にも存在するＥＧＦ反復部は、タンパク質／タンパク質相互作用のための結合部位である可能性が高く、本発明の方法に使用され得る。また、ＬＲＰ５の細胞内部分は、潜在的な目標部位でもある、タンパク質相互作用に関与する部位を有することが知られている。
【００４４】
フリズルド受容体のＣＲＤと相互作用する化合物のスクリーニング
Ｗｎｔは、フリズルドファミリーの膜貫通受容体を通じてシグナル伝達を行う。このフリズルド受容体は、数回にわたって細胞膜を通過する。フリズルドのＮ末端細胞外領域上に位置する保存されたシステインリッチ領域（ＣＲＤ）は、Ｗｎｔ結合部位として作用する。分泌されたフリズルド関連タンパク質Ｆｒｚｂ−１は、ＣＲＤを含み、Ｗｎｔシグナル伝達発現のアンタゴニストとして機能する。
【００４５】
マウスからのフリズルド８および分泌されたフリズルド関連タンパク質３のＣＲＤの結晶構造が確認された（１２）。Ｗｎｔ結合部位をＷｎｔ結合および変異アッセイによって確認することができる。
【００４６】
バーチャルスクリーニング
上記のバーチャルスクリーニング方法を用いて、ＣＲＤと相互作用してＷｎｔシグナル伝達経路を調節する潜在的な化合物をスクリーニングする。マウスタンパク質からの既知のＣＲＤ構造を鋳型として使用して、相同性モデルを作成する。他のフリズルドファミリーメンバーまたはヒトフリズルドタンパク質ＣＲＤ領域に対する相同性モデルを作成する。ＣＲＤ−Ｗｎｔ相互作用に関与する構造およびアミノ酸に基づいて、エネルギー最小化方法を用いて、各化合物の生物活性をさらに試験するために化合物をスクリーニングした。より高い生物活性を示すものについては、同様の構造的照会を用いて、さらなる候補化合物を同定した。
【００４７】
生物学的アッセイ
Ｗｎｔ結合アッセイを用いて、フリズルドタンパク質のＣＲＤ領域に対する化合物の影響をスクリーニングすることができる。ＣＲＤペプチド（またはフリズルドタンパク質）が、検出可能なマーカ（例えば、Ｍｙｃ標識）で細胞の表面に発現した。該化合物およびＷｎｔアルカリリン酸塩融合タンパク質（例えば、Ｗｎｔ８−ＡＰ）を含む培地を使用した。インキュベーション後、免疫−組織化学染色を用いて結合を確認した。
【００４８】
候補化合物がＷｎｔ結合に対する影響を示すと、上記の他の生物学的アッセイを適用して、Ｗｎｔシグナル伝達に対する各化合物の影響を測定する（２７、３８、１２）。
【００４９】
ＬＲＰ６と相互作用する化合物のスクリーニング
ＬＲＰ５およびＬＲＰ６は、それらがカノニカルＷｎｔ系にどのように関与するかに関して幾つもの共有する特徴があるため、文献では一般にＬＲＰ５／６と称する。したがって、ＬＲＰ５に結合する能力について選択された化合物の多くもＬＲＰ６と相互作用できるはずである。しかし、ＬＲＰ５およびＬＲＰ６は、アミノ酸レベルで７０％の相同性を共有するにすぎない。したがって、ＬＲＰ６の配列を鋳型として使用して、ＬＲＰ５の場合と同様にしてＷｎｔ系の作動体を同定して、本発明の方法で使用される化合物を得ることができる。ＬＲＰ６の第１、第２および第３のＹＷＴＤ反復領域を、化合物のバーチャルライブラリーの相互作用を予測するための選択的部位として使用することができる。次に、ＬＲＰ６に対する結合について選択された化合物の多くがＬＲＰ５と相互作用することも可能であると予想される。
【００５０】
Ｄｋｋと相互作用する化合物のスクリーニング
バーチャルスクリーニング
Ｄｋｋ１の構造を解明し、本明細書の実施例に記載されているように、変異を利用してクレメンおよびＬＲＰ５／６に対するその相互作用表面を特定することができる。上記の方法に従ってバーチャルスクリーニングを実施する。化合物は、ＬＲＰ５またはクレメンに対するＤｋｋの結合を増加または減少させるか、あるいはＷｎｔのＤｋｋ媒介阻害を増加または減少させることがわかる。
【００５１】
生物学的アッセイ
ＬＲＰ５に対するＤｋｋの結合を増加または減少させる化合物を上記のように確認する。クレメンに対するＤｋｋの結合を増加または減少させる化合物を、ＬＲＰ５の代わりにクレメンで細胞をトランスフェクションすることを除いて上記のように確認する。特定の実施形態において、Ｄｋｋアンタゴニズムを増加または減少させる化合物を実施例５．１に記載されるように確認することができる。
【００５２】
ディシブルド（ＤＳＬ）領域と相互作用する化合物のスクリーニング
細胞質ディシブルド（ＤＳＬ）タンパク質は、Ｗｎｔフリズルド受容体複合物によって活性化される。それらは、カノニカルおよび非カノニカルＷｎｔシグナル伝達経路の両方において不可欠である。ＤＳＬタンパク質は、Ｎ末端ＤＩＸ領域、中央ＰＤＺ領域およびＣ末端ＤＥＰ領域で構成される。これらの３つの保存領域は、それぞれ異なるタンパク質と関連することによって、それぞれ異なる経路で機能する。
【００５３】
ＤＩＸ領域は、ホモダインとして存在し、主に螺旋形の構造体を形成する。これは、パルス電界傾斜ＮＭＲ試験を用いて測定された。ＤＩＸ領域は、インビボのアクティング張力繊維および細胞質ベシクルに対するターゲッティングを媒介する。それによって、Ｗｎｔシグナル伝達の分岐点を表すことができる。カノニカルＷｎｔシグナル伝達を通じてのβ−カテニンの安定化は、ＤＳＬの膜ターゲッティングを含む。マウスＤｖ１２におけるＬｅｅｓ５８、Ｓｅｒ５９およびＭｅｔ６０は、アクティング相互作用に強く関与する。Ｌｅｅｓ６８およびＧｌｕｅ６９は、細胞質ベシクルの位置確認に重要である。
【００５４】
ＰＤＺ領域は、いくつかの分子と相互作用し、カノニカルおよび非カノニカルＷｎｔ経路の両方に重要な役割を果たす。三次元のＸｅｎｏｐｕｓ  ＰＤＺ領域構造が確認された（７）。化学シフト摂動ＮＭＲ分光分析および結合アッセイの使用を通じて、フリズルドの保存モチーフＫＴＸＸＸＷとマウスＤｖｌ１のＰＤＺ領域との間に直接的な相互作用が存在する。これにより、結合領域を確認することが可能になる（５７）。
【００５５】
ＤＳＬタンパク質のＤＥＰ領域は、Ｗｎｔ経路におけるＤｖｌの下流の作動体タンパク質にシグナルを伝達する。ディシブルドのＤＥＰ領域は、哺乳動物細胞におけるβ−カテニン活性のアップレギュレーションおよびＬｅｆ−１媒介転写の刺激に必要とされる。マウスＤｖｌ１ＤＥＰ領域の構造が確認された（Ｗｏｎｇら）。Ｌｙｓ４３４、Ａｓｐ４４５およびＡｓｐ４４８は、タンパク質−タンパク質相互作用に重要な役割を果たすこと、それらの変異Ｗｎｔ−１がＬｅｆ−１活性化を誘発したことが示された。
【００５６】
バーチャルスクリーニング
ＤＩＸ領域の機能的残基および二次構造が確認されたため、既存のタンパク質領域のスクリーニングは、三次構造構成および潜在的な候補についての情報を提供することができ、それに対するシミュレーションは、結合分析のための候補化合物を生成することができる。結合に影響を与える候補化合物を分析することができ、新しい類似化合物群を生物学的にアッセイすることができる。
【００５７】
ＰＤＺおよびＤＥＰの三次元構造が知られているため、上記の方法に類似したバーチャルスクリーニング法を用いることができる。この構造を鋳型として使用して、ヒトタンパク質領域または他の類似の機能的タンパク質領域に対する相同性モデルを作成することができる。特定の機能に関与する構造およびアミノ酸に基づいて、エネルギー最小化方法を用いて化合物をスクリーニングすることができる。各化合物の生物活性を試験することができる。高い生物活性を示す化合物については、類似の構造的質問を用いてより多くの候補化合物を見いだすことができ、生物活性をさらにアッセイすることになる。
【００５８】
生物学的アッセイ
アクチン結合領域に対するアクチン結合阻害アッセイ、およびＸｎｒ３またはＳｉａｍｏｉｓ発現量をＤＩＸ領域ベシクルの位置確認に用いることができる。化合物処理後に、標識ＤＩＸを含む組立ベクターを細胞にトランスフェクションすることができる。次いで、免疫蛍光染色を用いて、アクチン結合阻害を確認することができる。ＲＴ−ＰＣＲを用いて、ベシクル位置確認のためのＸｎｒ３またはＳｉａｍｏｉｓ量の検出を行うことができる。
【００５９】
インビトロ結合アッセイをＰＤＺ領域の初期スクリーニングに用いることができる。ＤｖｌのＰＤＺ領域に結合するペプチド（例えば、Ｄｒｐ  Ｃ末端領域）を使用することができる。ビーズに結合した精製標識ペプチドをＰＤＺ領域および各化合物と混合し、インキュベーション後、抗体を使用して、結合した化合物を検出することができる。各化合物の結合効率効果を測定することができる。
【００６０】
カノニカルＷｎｔ経路に影響を与える化合物をスクリーニングするために、その領域に対してルシフェラーゼアッセイを用いることができる。細胞にＤｖｌ領域をトランスフェクションすることができる。これらの細胞が化合物とともにインキュベートされると、Ｗｎｔ／β−カテニン活性化ルシフェラーゼ活性をアッセイすることによって、各化合物の効果を測定することができる。
【００６１】
次いで、化合物をそれらの構造に基づいて分類し、同定された化合物をさらにスクリーニングする。タンパク質結合に影響を与える候補化合物が同定されると、上記の他の生物学的アッセイを用いて、各化合物のＷｎｔシグナル伝達に対する影響を測定することができる（５７、６、５８、５５および７）。
【００６２】
β−カテニンと相互作用する化合物のスクリーニング
β−カテニンは、Ｗｎｔシグナルの核内への伝達を媒介することによって、目標遺伝子を活性化させる。Ｗｎｔシグナルは、β−カテニン分解を防止して、β−カテニンが蓄積し、続いて核に転位して、タンパク質のＴｃｆ／ＬＥＦファミリーのメンバーと転写性活性化複合体を形成することを可能にする。
【００６３】
β−カテニン、ならびにそれがアキシン、Ｌｅｆ、ＴＣＦおよびいくつかの他のタンパク質と形成する複合体の結晶構造が解明された。この情報を、カノニカルＷｎｔシグナル伝達を調節する化合物のスクリーニングに使用することができる。
【００６４】
β−カテニンは、ＡＰＣ、ＬＥＦ／ＴＣＦ、Ｅ−カドヘリンおよびコンダクチン／アキシンに対する結合部位であるＮ末端アルマジロ反復部を含む。すべての結合部位は、β−カテニンのアルマジロ反復単位３〜８に位置する。それらの因子の結合は、溝を占有するため、他の競合するβ−カテニンパートナーの同時結合を妨げる。
【００６５】
バーチャルスクリーニング
上記のバーチャルスクリーニングと類似の改造手法を、結合に対するβ−カテニン相互作用について化合物を同定するのに用いることができる。β−カテニンを鋳型として使用して、異なる種からのβ−カテニンの相同性モデルを生成することができる。ＬＥＦ／ＴＣＦ、アキシンおよびＡＰＣとの相互作用に関与する構造および重要アミノ酸に基づいて、エネルギー最小化方法を用いて化合物をスクリーニングして、候補化合物群を生成することができる。上記すべてのタンパク質がβ−カテニン上の同様の位置を占有するため、生物学的アッセイを各化合物のスクリーニングに用いるときに、すべての４つの相互作用を試験する。初期の生物活性に基づいて、効果的な化合物の構造を分析し、同様の方法を用いて新しい化合物群を試験する。さらなる生物学的アッセイを実施して、最も効果的な化合物を同定することができる。
【００６６】
生物学的アッセイ
すべてのβ−カテニンパートナーが同様の位置を占有するため、インビトロ翻訳およびタンパク質結合アッセイを用いて、各化合物の効果を測定することができる。標識β−カテニン、ＴＣＦ、ＡＰＣ、ＬＥＦまたはアキシン構造体をインビトロで転写および翻訳することができる。それらが該化合物とともにインキュベートされると、免疫ブロット法を用いて結合を検出することができる。
【００６７】
Ｗｎｔ結合に影響を与える化合物が同定されると、セクション５．１（Ｂ）に記載されている他の生物学的アッセイを用いて、Ｗｎｔシグナル伝達に対する各化合物の影響を測定することができる（５２、４３、１６、５９および１１）。
【００６８】
ＬＥＦ−１／ＴＣＦ転写因子と相互作用する化合物のスクリーニング
リンパ系エンハンサー結合因子（ＬＥＦ）は、調節核タンパク質複合体の組立および機能において構造的役割を果たすＤＮＡ結合タンパク質である。それは、高移動グループ（ＨＭＧ）領域を通じて特異的なヌクレオチド配列を認識する。ＴＣＲ−α遺伝子エンハンサーからの最適結合部位を含む１５塩基対オリゴヌクレオチド二重鎖と複合したマウスＬＥＦ−１のＨＭＧ領域の溶液構造が解明された。
【００６９】
バーチャルスクリーニング
上記のバーチャルスクリーニングと類似した手法を用いて、ＨＭＧ−オリゴヌクレオチド結合と相互作用することによって、遺伝子発現調節の活性に影響を与える潜在的な化合物をスクリーニングすることができる。該構造に基づいて、ＨＭＧ領域を含むタンパク質は、それらが結合するＤＮＡを屈曲させる。ＤＮＡ屈曲または結合能力に影響を与える任意の化合物は、遺伝子発現の調節に対して影響を有する。既知の構造を鋳型として使用して、異なる種についてのＬＥＦ  ＨＭＧ領域に対する相同性モデルを作成することができる。ＨＭＧ−オリゴ相互作用に関与する構造およびアミノ酸に基づいて、エネルギー最小化方法を用いて、化合物をスクリーニングすることができる。屈曲を強行する、または屈曲を妨げることができる化合物を選択する。ＤＮＡ結合活性を用いて、化合物をスクリーニングする。はるかに高いまたははるかに低い生物活性を示す化合物については、同様の構造的質問を用いて、さらなる候補化合物を同定することができる。
【００７０】
生物学的アッセイ
ＤＮＡ結合アッセイを用いて、化合物をスクリーニングすることができる。オリゴヌクレオチドおよびＨＭＧ領域を化合物とともにインキュベートする。ゲル遅延アッセイを用いて、ＤＮＡ結合を測定する。結合の実験を均一に１３Ｃ標識されたＮＭＲで改造して、領域屈曲を分析することができる。ＬＥＦ制御遺伝子調節は、直接影響されるため、化合物の効果を検出するためにルシフェラーゼアッセイを用いてもよい。タンパク質結合に影響を与える化合物が同定されると、他の生物学的アッセイを用いて、Ｗｎｔシグナル伝達に対する各化合物の影響を測定することができる（３３）。
【００７１】
ライブラリーのバーチャルスクリーニングを実施する上で、ライブラリーそのものが物理的ライブラリー（ＮＣＩライブラリーのスクリーニングに代表される）であり得るか、またはバーチャルライブラリー（化合物Ｅｎｚ１〜Ｅｎｚ７２を含む実施例６に代表される）であり得ることが理解される。ライブラリーは、対象となるタンパク質目標と相互作用し、別のタンパク質とのその相互作用に影響を与えることができるあらゆる化合物で構成され得る。当該化合物の例としては、有機分子、ペプチドおよび核酸を挙げることができるが、それらに限定されない。該ペプチドとしては、ランダムな性質のペプチドのライブラリー、アミノ酸の置換可能系列、対象となるタンパク質に対する抗体の断片、および対象となるタンパク質と相互作用するタンパク質の断片を挙げることができるが、それらに限定されない。該核酸としては、アプタマーおよびタンパク質結合配列のライブラリーを挙げることができるが、それらに限定されない。
【００７２】
より効果的な化合物を見いだすための構造比較の使用
化合物の効果の知識は、初期化合物のコア構造に追加される基が異なる新規の類似体または化合物のファミリーの有意義な設計をも可能にする。特定の実施形態で得られる新規の化合物は、ＬＲＰ５またはＬＲＰ６に対するタンパク質の結合を調節する。本明細書に用いられるように、「調節（modulate）」は、ＬＲＰ５またはＬＲＰ６、好ましくはＬＲＰ５またはＬＲＰ６のＹＷＴＤ反復領域へのタンパク質の結合および／または結合安定性を増強するまたは妨げることを指す。タンパク質としては、Ｄｋｋファミリーのメンバー、Ｗｎｔファミリーのメンバー、スクレロスチンまたはＰＡ受容体（例えば、ＴＥＭ８またはＣＭＧ２）を挙げることができるが、それらに限定されない。
【００７３】
例えば、ＮＣＩ８６４２（ＩＩＩＣ３とも称する）は、以下の構造を有する。
【化９】
2010537950.tif 000010
【００７４】
コア構造を保持し、様々な置換が生じ得る場所を示して、この化合物の類似体のファミリーについての一般式は、以下（Ｉ）の通りであり得る。
【化１０】
2010537950.tif 000011
（式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２またはＲ１３の少なくとも１つは、水素原子であり、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２またはＲ１３の少なくとも１つは、水素原子以外の原子を含む）。特定の実施形態において、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１３は、独立して、水素、酸素、ヒドロキシ、ハロゲン、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）アルキル基、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）置換アルキル基、シクロアルキル基、置換シクロアルキル基、複素環式基、置換複素環式基、アリールアルキル基、置換アリールアルキル基、ヘテロアリールアルキル基、置換ヘテロアルアリールアルキル基、アルコキシ基、置換アルコキシ基、アルケン基、置換アルケン基、アシル基、アミン基、アミド基、硝酸塩、硝酸エステル、カルボキシル基、カルボキシルエステル、硫化物、スルホキシド、スルホン酸塩、スルホン酸エステル、スルホン、スルホンアミド、リン酸塩、リン酸エステル、ホスホン酸塩、ホスホン酸エステル、ホスファミド、ホスホラミド、チオリン酸塩、チオリン酸エステル、チオホスホン酸塩あるいはチオホスホン酸エステルを含み、Ｒ１およびＲ１１、Ｒ１１およびＲ１２、Ｒ１２およびＲ３、Ｒ３およびＲ４、Ｒ１３およびＲ６は、独立して、互いに縮合して、１つ以上の環または前述したものの組合せを形成することができる。Ｒ１１およびＲ１２を含むアミン基の窒素が荷電する場合は、Ｒ１５をさらに含み、Ｒ１５は、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１３について前述した通りである。特定の実施形態において、該化合物は、構造（ＶＩＩＩ）を有する。
【化１１】
2010537950.tif 000012
（式中、Ｒ１３は、直鎖状または分枝状アルキル基あるいは置換または非置換のシクロアルキル基である）。最も具体的な実施形態において、Ｒ１３は、直鎖状または分枝状Ｃ２〜４基である。別の特定の実施形態において、Ｒ１３は、シクロアルキルＣ３〜８基である。
【００７５】
さらに環構造を保持し、上記構造に示されるカルボキシル基またはエステル基に対する置換を可能にすることによってこのコア化合物を一般化して、以下のような一連の他の類似体についての式（ＩＩ）を得ることができる。
【化１２】
2010537950.tif 000013
（式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３またはＲ１４の少なくとも１つは、水素原子であり、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３またはＲ１４の少なくとも１つは、水素原子以外の原子を含む）。
【００７６】
特定の実施形態において、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３およびＲ１４は、独立して、水素、酸素、ヒドロキシ、ハロゲン、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）アルキル基、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）置換アルキル基、シクロアルキル基、置換シクロアルキル基、複素環式基、置換複素環式基、アラルアルキル基、置換アリールアルキル基、ヘテロアリールアルキル基、置換ヘテロアリールアルキル基、アルコキシ基、置換アルコキシ基、アルケン基、置換アルケン基、アシル基、アミン基、アミド基、硝酸塩、硝酸エステル、カルボキシル基、カルボキシルエステル、硫化物、スルホキシド、スルホン酸塩、スルホン酸エステル、スルホン、スルホンアミド、リン酸塩、リン酸エステル、ホスホン酸塩、ホスホン酸エステル、ホスファミド、ホスホラミド、チオリン酸塩、チオリン酸エステル、チオホスホン酸塩あるいはチオホスホン酸エステルを含み、Ｒ１およびＲ１１、Ｒ１１およびＲ１２、Ｒ１２およびＲ３、Ｒ３およびＲ４、Ｒ１３およびＲ６は、独立して、互いに縮合して、１つ以上の環または前述したものの組合せを形成することができる。
【００７７】
特定の実施形態において、該化合物は、構造（ＶＩＩ）を有する。
【化１３】
2010537950.tif 000014
（式中、Ｒ１３およびＲ１４は、それぞれ独立して、Ｈあるいは直鎖状または分枝状アルキル基である）。より具体的な実施形態において、Ｒ１３およびＲ１４は、独立して、Ｈあるいは直鎖状または分枝状Ｃ１〜５直鎖状または分枝状アルキル基である。最も具体的な実施形態において、Ｒ１３はＨであり、Ｒ１４は、ＣＨ３基（Ｅｎｚ  Ｍ１４）であり；Ｒ１３およびＲ１４は、ＣＨ３基（ＥｎｚＭ１５）であり；Ｒ１３は、ＣＨ３基であり、Ｒ１４は、Ｃ（ＣＨ３）３（ＥｎｚＭ２５）であり；Ｒ１３はＨであり、Ｒ１４は、（ＣＨ２）２ＣＨ（ＣＨ３）２（ＥｎｚＭ３５）であり；Ｒ１３はＨであり、Ｒ１１およびＲ１２は、ＣＨ３基であり、Ｒ１４は、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）（ＥｎｚＭ３９）である。
【００７８】
（ＶＩＩ）に包括される化合物は、
（ａ）ガロシアニンとガロシアニン上のＣＯＯＨ基を脱離基で置き換えるための試剤とを反応させること；
（ｂ）工程（ａ）で得られた化合物とアルキルアミンとを反応させて、前記化合物（ＶＩＩ）を得ること
によって得ることができる。
【００７９】
本発明は、さらに、構造（ＶＩ）を有する新規の化合物を指向する。
【化１４】
2010537950.tif 000015
（式中、Ｒ１５は、直鎖状または分枝状アルキル基である）。特定の実施形態において、Ｒ１５は、直鎖状または分枝状Ｃ１〜５アルキル基である。最も具体的な実施形態において、Ｒ１５は、メチル基（ＥｎｚＭ０１）であり；Ｒ１５は、エチル基（ＥｎｚＭ０２）であり；Ｒ１５は、プロピル基（ＥｎｚＭ０３）であり；Ｒ１５は、ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）３（ＥｎｚＭ１２）である。
【００８０】
この化合物を前記化合物の形成を促進する条件下でガロシアニンとハロゲン化アルキルを反応させることによって得ることができる。
【００８１】
同様にして、ＩＣ１５およびＩＣ５を出発点として使用して、対象となり得る一連の化合物を設計することができる。
【化１５】
2010537950.tif 000016
【００８２】
既に述べたように、これらの２つの化合物における共通のアントラ−９，１０−キノン構造をＵＮＩＴＹ（商標）による二次スクリーニングに使用した後に、ＦｌｅｘＸ（商標）とドッキングさせ、生物学的アッセイを行った。これにより、Ｗｎｔ活性に対する影響を実証するＩＩＣ８、ＩＩＣ１０、ＩＩＣ１８およびＩＩＣ１９（いずれもアントラ−９，１０−キノンを共有する）の同定が行われた。したがって、この場合、類似体のファミリーは、一般構造（ＩＩＩ）を有する。
【化１６】
2010537950.tif 000017
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７またはＲ８の少なくとも１つは、水素原子であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７またはＲ８の少なくとも１つは、水素原子以外の原子を含む）。好ましい実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８は、独立して、水素、酸素、ヒドロキシ、ハロゲン、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）アルキル基、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）置換アルキル基、シクロアルキル基、置換シクロアルキル基、複素環式基、置換複素環式基、アラルアルキル基、置換アラルアルキル基、ヘテロアリールアルキル基、置換ヘテロアリールアルキル基、アルコキシ基、置換アルコキシ基、アルケン基、置換アルケン基、アシル基、アミン基、アミド基、硝酸塩、硝酸エステル、カルボキシル基、カルボキシルエステル、硫化物、スルホキシド、スルホン酸塩、スルホン酸エステル、スルホン、スルホンアミド、リン酸塩、リン酸エステル、ホスホン酸塩、ホスホン酸エステル、ホスファミド、ホスホラミド、チオリン酸塩、チオリン酸エステル、チオホスホン酸塩あるいはチオホスホン酸エステルを含み、Ｒ１およびＲ２、Ｒ２およびＲ３、Ｒ３およびＲ４、Ｒ５およびＲ６、Ｒ６およびＲ７、Ｒ７およびＲ８は、独立して、互いに縮合して、１つ以上の環または前述したものの組合せを形成することができる。
【００８３】
本発明は、ＩＩＣ１５（構造を以下に示す）がＷｎｔ調節に対して興味のある影響を示した、上記の二次スクリーニングに基づき得た化合物のファミリーをさらに提供する。
【化１７】
2010537950.tif 000018
【００８４】
この化合物と共通の構造的要素を共有し、Ｗｎｔ活性に対する影響を示す他の化合物は、構造が表ＩＶに示されるＩＩＣ１、ＩＩＣ２、ＩＩＣ７およびＩＩＩＣ１０である。
【００８５】
したがって、本発明は、構造（ＩＶ）を有する化合物を提供する。
【化１８】
2010537950.tif 000019
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０の少なくとも１つは、水素原子であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７またはＲ８の少なくとも１つは、水素原子以外の原子を含む）。具体的な実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９またはＲ１０は、独立して、水素、酸素、ヒドロキシ、ハロゲン、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）アルキル基、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）置換アルキル基、シクロアルキル基、置換シクロアルキル基、複素環式基、置換複素環式基、アリールアルキル基、置換アリールアルキル基、ヘテロアリールアルキル基、置換ヘテロアリールアルキル基、アルコキシ基、置換アルコキシ基、アルケン基、置換アルケン基、アシル基、アミン基、アミド基、硝酸塩、硝酸エステル、カルボキシル基、カルボキシルエステル、硫化物、スルホキシド、スルホン酸塩、スルホン酸エステル、スルホン、スルホンアミド、リン酸塩、リン酸エステル、ホスホン酸塩、ホスホン酸エステル、ホスファミド、ホスホラミド、チオリン酸塩、チオリン酸エステル、チオホスホン酸塩あるいはチオホスホン酸エステルを含み、Ｒ１およびＲ２、Ｒ２およびＲ３、Ｒ４およびＲ５、Ｒ３およびＲ４、Ｒ６およびＲ７、Ｒ７およびＲ８、Ｒ８およびＲ９ならびにＲ９およびＲ１０は、独立して、互いに縮合して、１つ以上の環または前述したものの組合せを形成することができる。
【００８６】
これらのコア構造の芳香族環上のＲ基を互いに縮合させて、より複雑な環構造を形成できることに留意されたい。したがって、例えば、Ｒ２およびＲ３の炭素鎖を互いに結合させて、構造（Ｖ）を有する一連の化合物を得ることが可能である。
【化１９】
2010537950.tif 000020
（式中、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０の少なくとも１つは、水素原子であり、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７またはＲ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ９、Ｒ１３の少なくとも１つは、水素原子以外の原子を含む）。具体的な実施形態において、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３およびＲ１４は、独立して、水素、酸素、ヒドロキシ、ハロゲン、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）アルキル基、直鎖状または分枝状（Ｃ１〜Ｃ１６）置換アルキル基、シクロアルキル基、置換シクロアルキル基、複素環式基、置換複素環式基、アリールアルキル基、置換アリールアルキル基、ヘテロアリールアルキル基、置換ヘテロアリールアルキル基、アルコキシ基、置換アルコキシ基、アルケン基、置換アルケン基、アシル基、アミン基、アミド基、硝酸塩、硝酸エステル、カルボキシル基、カルボキシルエステル、硫化物、スルホキシド、スルホン酸塩、スルホン酸エステル、スルホン、スルホンアミド、リン酸塩、リン酸エステル、ホスホン酸塩、ホスホン酸エステル、ホスファミド、ホスホラミド、チオリン酸塩、チオリン酸エステル、チオホスホン酸塩あるいはチオホスホン酸エステルを含み、Ｒ１およびＲ１１、Ｒ１１およびＲ１２、Ｒ１２およびＲ１３、Ｒ１３およびＲ１４、Ｒ１４およびＲ４、Ｒ４およびＲ５、Ｒ６およびＲ７、Ｒ７およびＲ８、Ｒ８およびＲ９ならびにＲ９およびＲ１０は、独立して、互いに縮合して、１つ以上の環または前述したものの組合せを形成することができる。
【００８７】
この構造を共有する試験化合物の例は、上記のＩＩＣ１およびＩＩＣ２である。
【００８８】
以上に開示したコア化合物を組み合わせて、上記の様々なコア化合物の様々な相互作用点に及ぶアマルガムである化合物を形成することができる。例えば、Ｗｎｔ活性に影響を与えることが示されたＩＣ１３は、互いに結合したＩＩＩ成分の２つを有し、それらの間の結合とともに、ＩＶ成分から誘導された類似構造体をも含む。このハイブリッド分子の構造を以下に示す。
【化２０】
2010537950.tif 000021
【００８９】
Ｗｎｔシグナル伝達経路の他のタンパク質表面目標
薬理学的化合物の投与によって影響され得るタンパク質／タンパク質相互作用に関係するＷｎｔシグナル伝達経路に関与する多くのタンパク質が存在する。ＬＲＰ５／６および／またはカノニカルおよび非カノニカルＷｎｔ経路におけるタンパク質／タンパク質相互作用に関係する様々なタンパク質の例が多くの参考文献（８２、６８、８３、８１、８４、８５、８６および８７）に記載されている。このグループの所定の目標タンパク質については、目標タンパク質と相互作用する様々な異なるタンパク質が存在し得る。これらの結合パートナーは、目標タンパク質上の異なる部位に結合することができるか、あるいは２つの異なる結合パートナーは、目標タンパク質上の同一部位または重複部位を共有することができる。本発明の方法を適用して各相互作用対に関与し、当業者に知られている任意の手段によって適切な構造および領域を同定することができる。これらの手段としては、目標タンパク質の様々な部分（例えば、細胞外および細胞内領域）を含むクローンを構築し、相互作用タンパク質パートナーの様々な欠失変異体との結合について試験すること；目標タンパク質をランダム変異させ、Ｗｎｔ活性またはいくつかの他の生物マーカに対する影響を測定した後、興味のある変異体のシークエンシングを行うこと；アラニンスキャニングで、選択された相互作用対のタンパク質／タンパク質相互作用の機能に関与する重要アミノ酸を同定し、目標タンパク質の様々な欠失変異体を構築し、Ｗｎｔ活性またはいくつかの他の生物マーカに影響を与えるそれらの能力を測定すること；目標タンパク質の欠失変異体のＡＰ融合型を構築すること；類似タンパク質を使用して、タンパク質構造のモデルを作成すること；ペプチドライブラリーを使用して、特定の目標に結合するペプチド配列を確認すること；Ｘ線結晶構造解析およびＮＭＲ分析を挙げることができるが、それらに限定されない。上述のように、これらの構造および部位の多くは、当該技術分野で知られており、目標タンパク質上の特定の部位をバーチャルスクリーニングのために選択し、様々な手段によってアッセイすることができる。他のタンパク質／タンパク質相互作用については、相互作用の存在が知られているが、特定の部位は、上記の手段のいずれかによるさらなる調査を必要とする。タンパク質目標および相互作用タンパク質に対するそれらの結合部位の例が以下に示され、それらの例としては、以下のものが挙げられるが、それらに限定されない。
【００９０】
【表１】
2010537950.tif 000022
【００９１】
タンパク質／タンパク質相互作用において、相互作用に関係する各構成成分上の部位が存在するため、いずれの表面は、バーチャルスクリーニングのための潜在的な目標として機能することができる。この手法によって達成される少なくとも２つの利点が存在する。第１に、Ｄｋｋ／ＬＲＰ反応に影響を与える化合物の潜在的な薬物類が、Ｄｋｋに対する親和性によって同定された化合物のまったく新しいファミリーを含めることによって広げられる。第２に、シグナル生成に関与するタンパク質の結合領域が多価性になる傾向がある。例えば、ＬＲＰ５／６上の結合領域は、目的および効果に差があるいくつかの異なるタンパク質によって使用される。本例に関して、Ｄｋｋは、ＬＲＰ５／６の第２および第３の領域に結合することができるが（７９）、スクレロスチンが第１および第２のＬＲＰ５／６領域に結合できること（８０）およびこれらの領域の一方が、アントラクスの毒性効果に対する結合部位として機能すること（８１）も最近示された。
【００９２】
したがって、特定の薬物がＬＲＰ５／６受容体上の単一部位に導かれる場合も、その部位に結合する薬物に影響され得るＤｋｋ以外の幾つもの異なるシグナル生成タンパク質が存在し得る。これらの効果も有益であり得るか、あるいは中立的、またはさらに有害であるため、治療用途の化合物の使用に影響を与え得る。同じように、Ｄｋｋ上の対応するＬＲＰ５／６結合部位が目標として選択される場合は、やはりこの部位を使用する様々な他のタンパク質／タンパク質相互作用が存在し得る。そのように、この部位に結合する薬物が同定されると、Ｄｋｋ上のＬＲＰ／Ｄｋｋ結合部位に対する結合について選択された薬物に影響され得る特定のタンパク質は、ＬＲＰ５／６上のＬＲＰ／Ｄｋｋ結合部位に対する結合について選択された薬物に影響されるものと異なるタンパク質群を表すことができる。
【００９３】
Ｗｎｔ／Ｄｋｋ反応の他の側面を目標とすることに加えて、先述の方法に対する潜在的な候補として、Ｗｎｔシグナル伝達に関与する他のタンパク質／タンパク質相互作用についても記載された。同様にして、それらは、上記に利点のいくつかを達成する。例えば、目標としてＬＲＰ５／６の代わりにＤｋｋを選択することと同様に、異なるタンパク質目標の使用は、Ｗｎｔシグナル伝達経路に影響を与えることができるまったく異なる化合物の集合体の発見を可能にするはずである。この場合、同じ効果（Ｗｎｔシグナル伝達に対する影響）を達成することが可能であるが、経路の異なる部分が影響される。タンパク質／タンパク質相互作用の各パートナーが薬物発見の候補である場合に二重の発見プログラムを実施できることも理解されたい。第２に、先に述べたように、ある特定のタンパク質／タンパク質相互作用に影響を与える化合物も、必ずしも主要な目標でなかった他のタンパク質／タンパク質相互作用に影響を与える可能性が高い。したがって、Ｗｎｔシグナル伝達経路のいくつかのメンバーは、所望の効果を達成する上で他のメンバーより特異的であり得ることを証明し得る。先に指定した特定のタンパク質／タンパク質相互作用に加えて、Ｗｎｔシグナル伝達のためのタンパク質／タンパク質相互作用に関係するすべてのタンパク質が、潜在的に、本発明の手順を実施するための候補になり得ることを理解されたい。これらのタンパク質目標は、カノニカルおよび非カノニカルシグナル伝達経路の両方に関与することができ、あるいはそれらを一方または他方の経路に制限することができる。
【００９４】
上述のように、本発明の組成物および方法に使用される化合物を使用して、病態生理学的過程を調節することができる。本明細書に定義されるように、「調節」は、特定の過程の量または速度を変化させること、過程を調整すること、あるいは適正な基準または割合に調整または維持することを含むが、それに限定されない。
【００９５】
カノニカルまたは非カノニカルＷｎｔシグナル伝達経路に影響されるか、または依存する多くの系に本発明を適用することができる。これらは、Ｗｎｔシグナル伝達経路の変化または欠陥によって引き起こされる疾患または状態であってもよく、Ｗｎｔ活性の調整によって、これらの疾患または状態を緩和することができる。あるいは、Ｗｎｔ活性自体についての問題によって引き起こされない疾患または状態が存在し得るが、Ｗｎｔ活性の操作によって治癒または治療効果を達成することができる。いずれも引用により本明細書に組み入れられる米国特許出願第２００５０１９６３４９号、米国特許出願第２００５０２６１１８１号および米国特許出願第２００６００３０５２３号に既に記載されているように、Ｗｎｔシグナル伝達系の操作によって有益な効果を提供できる応用例としては、骨形成およびリモデリングに影響を与えること、ならびに腫瘍および異常成長を治療することを挙げることができるが、それらに限定されない。
【００９６】
上述のように、本発明により同定された化合物は、腫瘍および異常成長の治癒または防止手段に応用され得る。骨細胞または骨組織の腫瘍または異常成長がこれらの化合物の目標になり得ることが先述の記載から理解されるであろうが、Ｗｎｔ活性は、より広範にわたり、他の細胞および組織の異常成長における要因である。第１のＷｎｔ遺伝子が単離されたときに、それは、原腫瘍遺伝子（proto-oncogene）であると考えられ（９２）、マウス乳房ウィルスがこの部位に組み込まれると腫瘍を生じさせる傾向があるため、「ｉｎｔ−１」と命名されたことを指摘しなけければならない。それが「Ｗｎｔ」と再命名されたのは、胚発育におけるこの遺伝子のファミリーの役割が明らかになったわずか数年後であった（３９）。Ｗｎｔ経路に関与する遺伝子は、広範な組織に発現されるため、Ｗｎｔ経路発現の変化に関連する極めて多様な異なる腫瘍型と同等に関連する。加えて、癌の特定の種類に応じて異なる効果がある。例えば、Ｗｎｔ５Ａは、造血細胞における腫瘍サプレッサーになり得る（９３）一方、Ｗｎｔ５Ａは、黒色腫における運動性および侵襲性を促進することによって、転移にある役割を有することができる（９４）という証拠が示された。Ｗｎｔ経路の相互作用および腫瘍形成または腫瘍維持、ならびにこれらの効果が見られる多くの種類の癌に関する検討（引用参考文献９５、９６、９７、６６、９８および９９参照）。Ｗｎｔの癌に対する影響と骨成長の制御との連関は、骨癌に限定される現象ではない。本質的に血液癌である多発性骨髄腫も骨成長に間接的な影響を及ぼし、脆弱性の増大が該疾患の特徴の１つである。この後者の影響は、骨髄腫細胞におけるＷｎｔ阻害薬Ｄｋｋ（１００）およびｓＦＲＰ−２（１０１）の量の増加に起因することが判明した。
【００９７】
Ｗｎｔ経路シグナル伝達系の変化に関連する疾患状態は、腫瘍または異常骨成長のみに限定されない。Ｗｎｔシグナル伝達系のメンバーの発現に関与する遺伝子における遺伝子欠陥は、様々な器官および系における欠陥を示す。同一の遺伝子についても、特定の部位またはさらには特定の変異が、欠陥の特定の表現型発現に影響を与えることが可能である。先に記載したように、ＬＲＰ５におけるある変異は、骨成長の増加をもたらし、他の変異は、骨成長の減少をもたらす。いくつかの遺伝子疾患は、Ｗｎｔシグナル伝達系の構成成分における欠陥に影響される発育過程に関連する可能性が高い。例えば、ＬＲＰ５またはＦＺＤ４における変異は、網膜の血管新生の欠如を特徴とする家族性浸出性硝子体網膜症をもたらし得る（１０２）。より過激な場合は、Ｗｎｔ３の欠陥によって引き起こされる第四肢と呼ばれる状態において、完全な肢形成不良が生じる（１０３）。他の遺伝子変異は、本質的に後胚性である恒常的過程におけるＷｎｔシグナル伝達の役割に影響を与え得る。例えば、骨量の増加または減少ならびに腫瘍形成事象をもたらす欠陥は、進行中の出産後過程である。しかし、上記のように、これらは、Ｗｎｔシグナル伝達に影響される唯一の恒常的過程でない。糖尿病に影響を与えるＷｎｔ経路遺伝子における変異の可能性は、ＬＲＰ５の両複製物が不足したマウスからの結果によって既に示された。これらのマウスは、骨粗鬆症に対する潜在的なモデルの背景で既に引用されたが、この系統は、血清コレステロール値の増加および耐糖応答の顕著な低下を含む他の表現型特性も示すことがさらなる研究によって示された（２０）。ＬＲＰ５遺伝子は、糖尿病に関連していたＩＤＤＭ４領域に近いため、最初に特定され、複製されたので、後者の結果は、驚くべきことではない（１８）。加えて、異型接合状態および同型接合状態の危険率がそれぞれ１．４５および２．４１である、ＴＣＦ７Ｌ２遺伝子（以前はＴＣＦ４と呼ばれていた）に対立遺伝子を有する個体における２型糖尿病の発達の確率の増加が最近の研究（１０４）によって示された。Ｗｎｔシグナル伝達系の様々なメンバーに関連することが判明した他の疾患または状態としては、多嚢胞性腎疾患（１０５）、腎線維症（１０６）、肺線維症（１０７）、侵襲性線維腫症（１０８）および統合失調症（１０９）が挙げられる（Ｗｎｔシグナル伝達経路と疾患の関係に関する詳細については、引用参考文献６３および６６参照）。
【００９８】
そのように、Ｗｎｔシグナル伝達の変化によって引き起こされるか、あるいは特定の疾患または状態の存在の結果としてＷｎｔシグナル伝達の差を示すあらゆる疾患過程には、本発明の使用を通じて同定された化合物を使用できる。
【００９９】
本発明の方法に使用される化合物は、Ｍｅｓｄ−ＬＲＰ５相互作用を調節、特に減弱させて、細胞表面に存在するＬＲＰ５受容体の減少をもたらすことで、骨形成または骨リモデリングを通じて骨密度を増加させることができる。
【０１００】
Ｄｋｋは、ＬＲＰ５受容体の第３の領域と結合、または相互作用すると、Ｗｎｔアンタゴニストとして作用する。Ｄｋｋ−ＬＲＰ５相互作用を阻害して、骨形成またはリモデリングを促進する化合物が同定された。以下の実施例に記載するように、１つの化合物、ＮＣＩ３６６２１８（ＩＩＣ８）は、組織培養モデルにおいて、骨芽細胞分化を刺激することが判明した。ＷｎｔおよびＤｋｋは間葉幹細胞の成長および分化を調節することが示された。骨形成の調節、ならびに造血性幹細胞の発育および分化のための間葉幹細胞調節剤として機能する化合物が同定された。
【０１０１】
Ｗｎｔは、造血性幹細胞の成長および分化を調節することが示された。骨形成の調節、ならびにインビボおよびインビトロの幹細胞の増殖および拡大のための造血性幹細胞調節剤として機能する化合物が同定された。
【０１０２】
組成物
本発明の方法に使用される化合物を組成物、特に医薬組成物に製剤化することができる。当該組成物は、典型的には、薬学的に許容し得る担体または賦形剤に製剤化された、および／または該担体または賦形剤とともに製剤化された本発明の代謝中間体の約０．１から９０重量％を含有する。医薬製剤化は、十分に確立された技術分野であり、Ｇｅｎｎａｒｏ（編）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（２０００）；Ａｎｓｅｌら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、第７版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（１９９９）；およびＫｉｂｂｅ（編）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、第３版（２０００）にさらに記載されている。
【０１０３】
手短に述べると、本発明の医薬組成物の製剤化は、投与のために選択された経路に依存する。本発明に利用される医薬組成物を、経口、静脈内、筋肉内、皮下、吸入、鞘内、心室内、経粘膜、経皮、鼻内、腹腔内および肺内を含む経腸および非経口経路の両方を含む様々な経路によって投与することができる。医薬組成物は、本発明の１つ以上の作用物質を含むことができる。
【０１０４】
経口剤形を患者が消化するための錠剤、丸剤、糖剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤および懸濁剤等として製剤化することができる。経口投与のための組成物の固体製剤は、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖；トウモロコシ、小麦、米、ジャガイモまたは他の植物からのデンプン；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロースまたは微結晶セルロースなどのセルロース；アラビアゴムおよびトラガカントゴムを含むゴム；ゼラチンおよびコラーゲンなどのタンパク質；カオリン、炭酸カルシウム、リン酸二カルシウム、塩化ナトリウムなどの無機物；ならびにアカシアおよびアルギン酸などの他の物質などの炭水化物またはタンパク質充填剤などの好適な担体または賦形剤を含有することができる。架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、またはアルギン酸ナトリウム等のその塩、微結晶セルロース、トウモロコシデンプン、グリコール酸ナトリウムデンプンおよびアルギン酸などの崩壊および／または溶解を促進する物質を添加することができる。使用できる錠剤結合剤としては、アカシア、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン（Ｐｏｖｉｄｏｎ（商標））、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、スクロース、デンプンおよびエチルセルロースが挙げられる。使用できる潤滑剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、シリコーン液、タルク、蝋、油およびコロイダルシリカが挙げられる。先述のものを含む充填剤、崩壊および／または溶解を促進する物質、錠剤結合剤および潤滑剤を単独で、または組み合わせて使用することができる。固体経口剤形は、全体的に均一である必要がない。例えば、糖剤のコアは、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコールおよび／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有することもできる高濃度糖溶液などの好適なコーティングと併用され得る。
【０１０５】
本発明の経口剤形は、ゼラチンで構成された押込嵌め（push-fit）カプセル剤、ならびにゼラチンおよびグリセロールまたはソルビトールなどのコーティング剤で構成された密封軟カプセル剤を含む。押込嵌めカプセル剤は、ラクトースまたはデンプンなどの充填剤または結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、ならびに任意に安定剤と混合された活性成分を含有することができる。軟質カプセル剤において、活性化合物を、脂肪油、液体、または安定剤を含む、または含まない液体ポリエチレングリコールに溶解または懸濁させることができる。また、製品同定のために、または活性化合物の量、すなわち投与量を特徴づけるために染料または顔料を錠剤または糖剤コーティングに添加することができる。
【０１０６】
経口（経腸）投与のための医薬組成物の液体製剤は、水または他の水性媒体で調製され、メチルセルロース、アルギン酸塩、トラガカント、ペクチン、ケルギン（kelgin）、カラゲナン、アカシア、ポリビニルピロリドンおよびポリビニルアルコールなどの様々な懸濁剤を含有することができる。液体製剤は、活性化合物とともに、湿潤剤、甘味料ならびに着色料および香料を含有する溶液、エマルジョン、シロップおよびエリキシルを含むこともできる。
【０１０７】
本発明の医薬組成物を非経口投与のために製剤化することもできる。非経口投与のための製剤は、水性または非水性等張性無菌注射液または懸濁液の形であり得る。
【０１０８】
静脈内注射では、本発明の化合物の水溶性形態を、５％デキストロース（「Ｄ５」）、生理緩衝食塩水、０．９％食塩水、ハンクス液またはリンガー液などの生理的に許容し得る液体媒体で製剤化するか、あるいは凍結乾燥物として提供される場合は、当該液体媒体と混合する。静脈内製剤は、限定することなく、カルシウム、ヒト血清アルブミン、クエン酸塩、酢酸塩、塩化カルシウム、炭酸塩および他の塩を含む担体、賦形剤または安定剤を含むことができる。
【０１０９】
筋肉内製剤、例えば、本発明の化合物の好適な可溶性の塩の形の無菌製剤を注射用水、０．９％食塩水または５％グルコース溶液などの医薬賦形剤に溶解させ、投与することができる。あるいは、該化合物の好適な不溶性の形を長鎖脂肪酸のエステル（例えば、オレイン酸エチル）、ゴマ油などの脂肪油、トリグリセリドまたはリポソームなどの水性ベースまたは薬学的に許容し得る油ベースの懸濁物として調製し、投与することができる。
【０１１０】
該組成物の非経口製剤は、植物油、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、乳酸エチル、炭酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール等）などの様々な担体を含有することができる。
【０１１１】
水性注射懸濁物は、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランなどの、懸濁物の粘度を高める物質を含有することもできる。非脂質性ポリカチオンアミノポリマーを送達に使用することもできる。所望により、該懸濁物は、好適な安定剤、または高濃度の溶液の調製を可能にするために化合物の溶解性を高める作用物質を含有することもできる。
【０１１２】
本発明の医薬組成物を、注射可能な長期堆積を可能にするように製剤化することもできる。ポリアクチド−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中に該化合物のマイクロカプセル材料を形成することによって注射可能なデポー剤を製造することができる。薬物のポリマーに対する比率および採用される特定のポリマーの性質に応じて、薬物放出速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。デポー注射可能製剤は、体組織と相溶性を有するミクロエマルジョンに薬物を閉じ込めることによっても調製される。
【０１１３】
吸入製剤を容易に製剤化することもできる。吸入については、様々な粉末および液体製剤を調製することができる。エアロゾル製剤については、該化合物または該化合物の塩の形の無菌製剤を計量投与吸入剤などの吸入剤およびネブライザに使用できる。エアロゾル化された形は、呼吸障害を治療するのに特に有用であり得る。
【０１１４】
あるいは、本発明の化合物は、送達時に適切な薬学的に許容し得る担体での再構成するための粉末形態であり得る。
【０１１５】
本発明の医薬組成物における医薬として活性な化合物を、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸およびコハク酸を含むが、それらに限定されない様々な酸の塩として提供することができる。塩は、対応する遊離塩基の形より水性溶媒または他のプロトン性溶媒に溶解しやすい。
【０１１６】
医薬組成物を調製した後、それらを適切な容器に梱包し、指定した状態の治療について標識する。
【０１１７】
活性化合物は、意図する目的を達成するのに有効な量で存在することになる。有効投与量の決定は、当業者の能力の範囲内に十分おさまる。
【０１１８】
本発明に使用される化合物の治療有効投与量を、最初に細胞培養アッセイなどのインビトロ試験を行い、続いてモデル動物、通常はマウス、ラット、ウサギ、イヌまたはブタにおけるアッセイを行うことによって推定することができる。動物モデルを使用して、最初の好ましい濃度範囲および投与経路を決定することができる。
【０１１９】
例えば、ＥＤ５０（集団の５０％において治療有効な投与量）およびＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な投与量）を動物モデル系の１つ以上の細胞培養で決定することができる。毒性効果の治療効果に対する投与量比は、ＬＤ５０／ＥＤ５０で表現することができる治療指数である。大きな治療指数を示す医薬組成物が好ましい。
【０１２０】
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒトにおける使用に対する最初の投与量範囲を策定するのに使用され、好ましくは、毒性をほとんどまたはまったく有さないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲を提供する。投与後、または連続的な投与の間において、活性薬の循環濃度は、採用される剤形、患者の感受性および投与経路等の当該技術分野で良く知られている薬物動態学的因子に応じて、この範囲内で変動する。
【０１２１】
正確な投与量は、治療を必要とする対象に特異的な因子に鑑みて、熟練者によって決定されることになる。熟練者が考慮できる要因としては、疾患状態の重度、対象の身体の健康状態、年齢、体重、対象の性別、食習慣、投与の時間および頻度、薬物の組合せ、反応感度、ならびに治療に対する耐性／応答が挙げられる。長時間作用する医薬組成物を、特定の製剤の半減期およびクリアランス速度に応じて、３から４日毎、毎週または２週間に１回投与することができる。
【０１２２】
通常の投与量は、投与経路に応じて、約１ｇの全投与量まで０．１から１０００００マイクログラムの範囲で変化してもよい。特定の実施形態において、日投与量は、患者の体重１ｋｇ当たり約０．０１ｍｇから３０ｍｇ（例えば、１ｍｇ／ｋｇから５ｍｇ／ｋｇ）である。所望される場合は、医薬製剤を１日当たり複数の投与量で投与して、所望の全日投与量を達成することができる。
【０１２３】
医薬技術分野の当業者に知られている従来の方法を用いて、本発明の医薬製剤を患者に投与することができる。本発明の医薬組成物を単独で、または他の治療薬または治療介入と組み合わせて投与することができる。具体的には、本発明の組成物は、本発明の複数の作用物質をさらに含むことができる。前述の方法のいずれかによる疾患の治療は、制御性細胞、免疫制御性細胞またはＮＫＴ細胞の数または機能を変化させる。この変化は、細胞の数または機能の低下、阻害または減少を包括する。この阻害は、ＣＤ１ｄ分子からの活性化要素の競合的置換によって生じ得る。変化は、細胞の数または機能の刺激または増加を含むこともできる。この刺激は、ＣＤ１ｄ分子からの活性化要素の結合の増加によって生じ得る。
【０１２４】
相乗効果および間接的な効果
生物学的アッセイで試験すると、ＬＲＰ５／６に対する結合部についてバーチャルスクリーニングによって選択された化合物は、ａ）Ｌｅｆ活性；ｂ）Ｗｎｔによるｌｅｆ活性の増強；およびｃ）ＤｋｋによるＷｎｔ増強の抑制（表Ｉに見られる）に対する様々な影響を示した。したがって、本発明の組成物は、対象における病態生理学的過程を調節する２つ以上の化合物を含んでもよい。
【０１２５】
小分子のタンパク質に対する結合は、タンパク質の構造を変化させることができることが良く知られている。例えば、基質を有するタンパク質および基質を有さないタンパク質の構造を調べて、結合部位および酵素の触媒機構に関する詳細を解明するために、多くの結晶解析調査を実施した。したがって、化合物の結合は、その活性を増強するまたはその活性を低下させることができるようにタンパク質の構造を変化させることができるということが容易に理解できるだけでなく、構造が変化しても活性自体が影響され得ないことが理解できる。しかし、小分子が結合したタンパク質は、その分子を有さないタンパク質と同じでないことがわかる。したがって、特定の目標タンパク質に結合することが可能であるが非天然タンパク質に影響を与えなかった小分子は、それが異なるコンホメーションにされた場合に目標タンパク質に影響を与え得る。同一のタンパク質目標に結合した２つの異なる化合物の組合せは、系の挙動を変化させることが既に示された１つの分子および単独で使用された場合に影響を示さなかった第２の分子からなっていてもよく、あるいはいずれも単独で活性を示さない２つのタンパク質からなる可能性がある。次いで、個々の化合物を試験するのに使用される同じアッセイ、すなわちＬｅｆ活性の変化、Ｗｎｔの存在に対するＬｅｆ活性の応答（Ｗｎｔ活性化）、ＤｋｋによるＷｎｔの阻害に対する応答、および最後にＬＲＰ５およびＤｋｋ−ＡＰの親和性の変化についてのアッセイを、存在する両化合物を用いる既に記載のアッセイに用いることができる。ガロシアニンまたはエンゾＭ０１などの化合物が、ＬＲＰ５／６に対する結合について選択された他の化合物の存在下で使用される一連の反応を実施することができる。一方、化合物の様々な組合せのマトリックスを実施するより広範な調査を採用することができる。
【０１２６】
本発明のさらなる態様は、２つ以上の薬理剤の混合物の投与の相補効果または相乗効果を利用することである。別の可能性は、より低い投与量での組合せで、通常の投与量の薬物の１つと同じ治療効果を提供できる２つ以上の薬物についてである。この方法の利点は、薬物の費用を低減することがあるか、より低い投与量の使用によって望ましくない副作用が低減され得ることであり得る。
【実施例】
【０１２７】
材料および方法
細胞培養、トランスフェクション、ＣＭの調製およびルシフェラーゼアッセイ
ヒト胚腎臓細胞（ＨＥＫ）系Ａ２９３Ｔおよびマウス線維芽細胞系ＮＩＨ３Ｔ３を維持し、前述のようにトランスフェクションした（１）。前骨芽細胞系２Ｔ３およびＭＣ３Ｔ３を、１０％ＦＣＳを含有するａ−ＭＥＭで培養した。ルシフェラーゼアッセイでは、２４ウェルプレートにおける細胞を５×１０４細胞／ウェル個で接種し、製造元の指示通りにリポフェクタミンプラス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州）を使用して１ウェル当たり０．５μｇのＤＮＡでトランスフェクションした。ＤＮＡ濃度をトランスフェクション毎に等しくするために、ＬａｃＺプラスミドを通常使用した。細胞抽出物をトランスフェクションから２４時間後に回収した。既に記載されているようにルシフェラーゼアッセイを実施した（１、２）。発光強度をＧＦＰの蛍光強度に対して規準化した。ＣＭを含有するＤｋｋ１−ＡＰを調製するために、ＨＥＫ細胞を４×１０５個／ウェルで６つのウェルプレートに接種し、１μｇのＤＮＡ／ウェルでトランスフェクションした。ＣＭをトランスフェクションから４８時間後に回収した。
【０１２８】
発現プラスミドの構築および突然変異誘発
高適合熱安定性ＤＮＡポリメラーゼＰｆｕ  Ｕｌｔｒａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州）を使用して、ヒトＬＲＰ５、ＬＲＰ６、マウスＷｎｔ１、Ｄｋｋ１およびＤｋｋ２の野生型および変異形をＰＣＲによって生成した。ＨＡまたはＦｌａｇエピトープ標識を全長および変異体分子のＣ末端に導入した。ＣＭＶプロモータによってこれらの分子の発現を導いた。ＬＥＦ−１レポータ遺伝子構造を外部供給源（３）から得た。
【０１２９】
Ｄｋｋ１−ＡＰ結合アッセイおよび免疫沈降アッセイ
２４ウェルプレートにおけるＨＥＫ細胞をＬＲＰ５およびその変異体でトランスフェクションした。１日後、細胞を低温洗浄緩衝液（ＢＳＡおよびＮａＮ３を含有するＨＢＢＳ）で洗浄し、マウスＤｋｋ１−ＡＰ調整培地とともに２時間にわたって氷上でインキュベートした。次いで、細胞を洗浄緩衝液で３回洗浄し、溶解させた。溶解物を６５℃で１０分間加熱し、Ｔｒｏｐｉｘ発光ＡＰアッセイキットを使用してそれらのＡＰ活性を測定した。既に記載されているように免疫沈降アッセイを実施した（４）。
【０１３０】
細胞表面タンパク質のビオチン化
ＨＥＫ細胞をＬａｃＺ、ＬＲＰ５およびＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖ発現プラスミドトランスフェクションした。細胞に氷冷ＰＢＳ中０．５ｍｇ／ｍｌスルホ−ＮＨＳ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）を標識し、洗浄し、既に記載されているように溶解させた（５）。細胞溶解物を抗ＨＡ抗体およびＡ／Ｇアガロースタンパク質で免疫沈降させた。
【０１３１】
一次骨芽細胞培養
生後３カ月のマウスからの骨髄間質（ＢＭＳ）骨芽細胞培養物を既に記載されているように生成した（６）。１０ｎＭのデキサメタソン、８ｍＭのβ−グリセロホスフェートおよび５０ｕｇ／ｍｌのアスコルビン酸の存在下で、骨形成分化するように細胞を誘発した。培地を２日毎に変えた。
【０１３２】
相同性モデリング
スイス−プロット／ＴｒＥＭＢＬデータベース（登録名Ｑ９ＵＰ６６（８））から得た配列を使用して、ＬＲＰ５の第３のＹＷＴＤ−ＥＧＦ領域の相同性モデルをＩＣＭ（Ｍｏｌｓｏｆｔ  Ｌ．Ｌ．Ｃ．、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、カリフォルニア州）で構築した。ＬＤＬ受容体（低密度リポタンパク質）ＹＷＴＤ−ＥＧＦ領域（ＰＤＢコード１ＩＪＱ（９））を鋳型として選択した。
【０１３３】
バーチャルスクリーニング
ＵＮＩＴＹ（商標）（Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．）プログラムを使用して、Ｇｌｕ４５６とともに末端に６つのプロペラで形成された腔に適合することが可能な化学化合物について国立癌研究所（ＮＣＩ）データベースをスクリーニングした。次いで、エネルギー最小化のために、ＦｌｅｘＸ（商標）プログラム（Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．）を使用して、候補化合物をＬＲＰ５領域のＤｋｋ１結合腔にドッキングした（１０）。計算において最も高い結合親和性を示す化学化合物を、さらなる実験的試験に向けて、国立癌研究所、癌治療診断部（Division of Cancer Treatment and Diagnosis）、開発治療薬プログラム（Development Therapeutics Program）、薬物合成および化学課（Drug Synthesis & Chemistry Branch）から入手した。生化学アッセイの結果に基づいて第２回および第３回目のスクリーニングを実施した。
【０１３４】
骨に対する化合物の影響の評価
ＩＩＩＣ３をＤＭＳＯに溶解させ、１：１０００に希釈して０．４４ｍｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳに含めた。頭蓋冠の局部注射では、既に記載されている注射方法（７４、７５）を用いて、１５マイクロリットルのＩＩＩＣ３（０．２２ｍｇ／Ｋｇ／日）、対照媒体または正の対照（ｂ−ＦＧＦ、１２．５ｕｇ／Ｋｇ／日）を生後４週間のＣＤ−１マウスの頭蓋冠の右側の皮下組織に５日間にわたって１日３回注射した。最初の注射から２２日後に頭蓋冠を回収し、切出しのために固定した。全身投与では、ＩＩＩＣ３（３ｍｇ／Ｋｇ／ｄ）および対照媒体を生後２カ月のＣ５７Ｂ１マウス（ｎ＝１９）に７日間にわたって１日１回腹腔内注射した。マウスを３週間安静にし、処理を１回繰り返した。最後の注射から３週間後に、マウスに麻酔をかけ、ＰＩＸＩｍｕｓ小動物ＤＸＡシステム（ＧＥ−Ｌｕｎａｒ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州）を使用して、全大腿および全身骨鉱物含有量（ＢＭＣ；グラム）ならびに骨面積（平方センチメートル）を測定し、ＢＭＤを計算した。全身測定では頭を除外した。これらのマウスの重量も同時に測定した。
【０１３５】
Ｗｎｔ活性レポータ遺伝子アッセイ
アッセイを既に記載されているように実施した（３０、７８）。手短に述べると、２４ウェルプレートにおける細胞を５×１０４個／ウェルで接種し、製造元の指示通りに、リポフェクタミンプラス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州）を使用して、１ウェル当たり０．１ｍｇのＧＦＰ、０．０２５ｕｇのＬＥＦ−１、０．０７５ｕｇのＬＥＦルシフェラーゼレポータ遺伝子および０．３ｕｇのＬａｃＺでトランスフェクションした。トランスフェクションから２４時間後に化合物および調整培地を添加した。６時間後、細胞抽出物を回収し、ルシフェラーゼアッセイを実施した。発光強度をＧＦＰの蛍光強度に対して規準化した。
【０１３６】
実施例１：ＬＲＰ５の欠失変異体
１組のＰＣＲプライマーを設計し、ＰＣＲ反応を実施し、ＰＣＲ断片をベクターにサブクローン化していくつかのＬＲＰ５欠失変異体を生成した。第３および第４の領域（残基６４６から１１９８）の欠失は、ＬＲＰ５Ｒ１２をもたらし、第１および第２の領域（残基１から６４６）の欠失は、ＬＲＰ５Ｒ３４をもたらし、第３の領域（残基９４７から１１９８）の欠失は、ＬＲＰ５Ｒ１２４をもたらした（図１Ａ）。
【０１３７】
実施例２：ＬＲＰ５の領域ＩはＭｅｓｄ媒介ＬＲＰ５機能に不可欠である
実施例２．１  ＬＲＰ５の第１の領域におけるＧ１７１Ｖ変異は、ＬＲＰ５輸送を妨げる
ＬＲＰ５とＭｓｅｄの相互作用
図２Ａに示されるように、ＨＥＫ細胞を発現プラスミドでトランスフェクションした。１日後、細胞を溶解させ、抗Ｆｌａｇ抗体を使用して免疫沈降を実施した。ＭｅｓｄをＦｌａｇ標識し、すべてのＬＲＰ５分子をＨＡ標識した。それらの結果により、領域ＩのＧ１７１Ｖ変異は、ＬＲＰ５とＭｅｓｄ（図２Ａ、レーン１および３）およびＲ１２とＭｅｓｄ（図２Ｂ、レーン１および２）の両方の相互作用を妨げるのに対して、領域ＩＩＩのＥ７２１変異は、相互作用に対する影響を示さない（図２Ａ、レーン２および３）ことが示された。
【０１３８】
ＬＲＰ５変異体は、細胞表面に効率的に発現しない
図２Ｂおよび図２Ｃに示されるように、ＨＥＫ細胞をＭｅｓｄプラスミドおよび発現プラスミドでトランスフェクションした。Ｒ１２ＴＧＶ、Ｒ１２Ｔ、Ｒ１−４およびＲ１−４ＧＶ（ＧＶ）は、細胞培養培地で分泌する膜貫通領域が欠如したＬＲＰ５変異体であるＡＰ融合タンパク質である。１日後、調整培地（ＣＭ）を回収し、高速で遠心した。上清を抗ＨＡ抗体によって免疫沈降させる（図２Ｃ）か、またはＡＰアッセイに使用した（図２Ｄ）。また、細胞をＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液に溶解させ、ウェスタンブロット法によって分析した（図２ＣおよびＤの下面）。それらの結果により、Ｇ１７１Ｖ変異は、ＬＲＰ５の細胞表面への発現を減弱させることが示される。
【０１３９】
細胞表面のＬＲＰ５レベルの評価
ＨＥＫ細胞をＬａｃＺ、野生型ＨＡ−ＬＲＰ５またはＨＡ−ＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖ発現プラスミドでトランスフェクションした。細胞表面をビオチン化し、ＬＲＰ５分子を抗ＨＡ抗体で沈降させた後に、ストレプトアビジン西洋ワサビペロキシダーゼ（ＳＡ−ＨＲＰ）を使用して、ウェスタン分析によって細胞表面のＬＲＰ５分子のレベルを検出した（図２Ｅ上面）。免疫複合体におけるＬＲＰ５のレベルを下面に示す。これらの結果は、Ｄ１７１Ｖ変異体の細胞表面の発現の減少を示す。
【０１４０】
実施例２．２  ＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖは、同時発現Ｗｎｔの活性のＤｋｋ１媒介阻害を受けにくい
カノニカルＷｎｔシグナル伝達活性に対するＧ１７１Ｖ変異の影響
図３Ａに示すように、ＨＥＫ細胞を、ＬＥＦ−１発現プラスミド、ＬＥＦ−１ルシフェラーゼレポータプラスミドおよびＧＦＰ発現プラスミドとともに、プラスミドでトランスフェクションされた。１日後、細胞を溶解させた。材料および方法に記載されているように、溶解した細胞のＧＦＰレベルおよびルシフェラーゼ活性を測定し、ＧＦＰレベルに対して規準化した。ＬａｃＺがトランスフェクションされた細胞による活性を１００％として、対照を確定した。ＬＲＰ５タンパク質に担持されるＨＡ標識に特異的な抗体、または抗ＬＲＰ６抗体を使用して、ＬＲＰ５、ＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖ、ＬＲＰ６およびＬＲＰ６Ｇ１５８Ｖの発現を検出した（図３Ａ）。それらの結果により、ＨＢＭ  Ｇ１７１Ｖ変異は、野生型（Ｗｔ）ＬＲＰ５（ＬＲＰ５Ｗｔ）と比較してそれ自体のＬＥＦ−１依存転写活性の増加、または同時発現Ｗｎｔのためのシグナル変換の増加をもたらさなかったことが示される。ＬＥＦ−１は、カノニカルＷｎｔシグナル伝達経路の下流目標転写因子である。ルシフェラーゼレポータ遺伝子アッセイによって測定されるその活性は、カノニカルＷｎｔ活性を測定するのに広く使用されてきた（１２、２０）。したがって、ＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖは、Ｗｎｔシグナル伝達を変換する上で本質的に活性でも、より強力でもない。驚いたことには、ＬＲＰ６上の対応する変異、すなわち残基Ｇ−１５８に対するＶａｌ残基の置換によって、それがＷｎｔ−１と相乗的に作用することが不可能になり（図３Ａ）、恐らくは受容体を不活性した。
【０１４１】
同時発現Ｗｎｔ１によって刺激されたカノニカルシグナル伝達活性に対するＧ１７１Ｖ変異の影響
図３Ｂに示されるように、ＬＲＰ５ＷｔまたはＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖの存在下でＨＥＫ細胞をＬＥＦレポータ、Ｗｎｔ−１、Ｄｋｋ１およびクレメンのプラスミドでトランスフェクションした。ヒトＨＥＫ細胞をＬａｃＺでトランスフェクションし、ＬＲＰ５またはＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖの存在下でＤｋｋ１、クレメン１およびＷｎｔ１で同時トランスフェクションした。クレメン１およびＤＫＫ１の両方の存在下で、Ｗｎｔは、ＬＲＰ５Ｗｔを発現するＨＥＫ細胞よりＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖを発現するＨＥＫ細胞においてより高い活性を示した（図３Ｂ）。これらの結果により、ＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖは、Ｄｋｋ１の存在下で野生型より多くのシグナルを変換することが示される。その差が多プラスミドトランスフェクションの結果でないことを確認するために、Ｄｋｋ１、クレミン１およびＬＲＰ５のタンパク質発現（図３）を調べた。自己分泌Ｗｎｔ１活性のＤｋｋ媒介阻害に対する抵抗の増加という同様の結果が、ＮＩＨ３Ｔ３細胞ならびに２つの骨芽様細胞系、ＭＣ３Ｔ３および２Ｔ３にも観察された。
【０１４２】
実施例２．３．Ｄｋｋ１−ＡＰのＬＲＰ５およびＬＲＰ５変異体に対する結合
図４に示されるように、ＨＥＫ細胞をＭｅｓｄプラスミドおよびＬＲＰ５プラスミドでトランスフェクションし、Ｄｋｋ１−ＡＰを発現するＨＥＫ細胞から調製されたＣＭとともに氷上でインキュベートした。材料および方法に記載されているように、ＡＰ活性を随意単位（ＡＵ）で測定した。Ｗｔおよび変異体ＬＲＰ５分子の発現を図４Ｂに示す。これらの結果により、ＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖ変異体を発現する細胞は、ＬＲＰ５Ｗｔを発現するものより低い見かけのＤｋｋ結合を示すことが示され（図４Ａ）、図２に示す細胞表面上のより少ないＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖと一致する。
【０１４３】
実施例３：ＬＲＰ５の領域ＩＩがＷｎｔ活性に必要とされる
図５に示されるように、ＨＥＫ細胞をＬＥＦ活性レポータプラスミドおよび発現プラスミドでトランスフェクションした。発現プラスミドＬＲＰ５Ｒ４９４ＱおよびＬＲＰ５Ｇ４７９Ｖは、点突然変異をそれらの第２の領域に有するＬＲＰ５レポータである。１日後、細胞を溶解させた。材料および方法に記載されているように、溶解した細胞のＧＦＰレベルおよびルシフェラーゼ活性を測定し、ＧＦＰレベルに対して規準化した。図５は、ＬＲＰ５Ｒ４９４ＱおよびＬＲＰ５Ｇ４７９ＶがＬＲＰ５Ｗｔと比較してＷｎｔシグナル伝達を無効にできることを示す。これらの結果は、領域ＩＩがＷｎｔ活性に必要とされることを示す。
【０１４４】
実施例４：領域ＩＩＩがＤｋｋ媒介阻害に必要とされる
実施例４．１  領域ＩＩＩの分析
ＬＲＰ５  Ｇ１７１Ｖは、Ｄｋｋ１媒介阻害を受けにくいかということを説明するための有力な仮説は、変異がＬＲＰ５とＤｋｋ１の相互作用を妨げ得るということであった。Ｇ１７１を含有する第１のＹＷＴＤ反復領域が、Ｄｋｋ１媒介アンタゴニズムに必要とされると仮定するのが合理的である。この仮説を試験するために、２つのＬＲＰ５欠失変異体、すなわち第３および第４のＹＷＴＤ反復領域が欠失したＬＲＰ５Ｒ１２ならびに第１および第２のＹＷＴＤ反復領域が欠失したＬＲＰ５Ｒ３４を生成した（図１）。Ｄｋｋ１媒介阻害に必要とされる配列をさらに明示するために、第３のＹＷＴＤ反復領域が欠失したさらなるＬＲＰ５変異体、すなわちＬＲＰ５Ｒ１２４を生成した。
【０１４５】
領域ＩＩＩの機能分析
図６Ａに示されているように、ＨＥＫ細胞にＬＥＦ活性レポータプラスミド、クレメン１プラスミドおよび発現プラスミドをトランスフェクションした。ＷｔＬＲＰ５およびその変異体分子の発現を図６Ｂに示した。その結果により、ＬＲＰ５Ｒ１２またはＬＲＰ５Ｒ１２４は、Ｗｎｔ刺激ＬＥＦ−１活性を依然として増強できるが、ＬＲＰ５Ｒ３４はできないこと（図６Ａ）が示され、ＬＲＰ５Ｒ１２またはＬＲＰ５Ｒ１２４はＷｎｔ共受容体機能を保持することが示唆される。しかし、ＬＲＰ５Ｒ１２またはＬＲＰ５Ｒ１２４が存在すると、Ｄｋｋ１は、Ｗｎｔシグナル伝達を阻害することができない（図６Ａ）。これは、領域ＩＩＩがＤｋｋ１媒介阻害に必要とされることを示唆するものである。
【０１４６】
ＬＲＰ５およびＬＲＰ５変異体に対するＤＫＫ１−ＡＰの結合
図６Ｃに示されているように、ＨＥＫ細胞をＭｅｓｄプラスミドおよびＬＲＰ５プラスミドでトランスフェクションし、Ｄｋｋ１−ＡＰを発現するＨＥＫ細胞から調製されたＣＭとともに氷上でインキュベートした。材料および方法に記載されているように、ＡＰ活性を随意単位で測定した。Ｗｔおよび変異体ＬＲＰ５分子の発現を図６Ｃの右面に示す。これらの結果により、ＬＲＰ５Ｒ３４は、Ｄｋｋ１結合部位を含み、Ｒ３４におけるＥ７２１がＤｋｋ１結合に必要とされることが示される（図６Ｃ）。
【０１４７】
実施例４．２．Ｄｋｋ阻害に必要とされる領域ＩＩＩ上の相互作用表面上のアミノ酸残基の同定
本明細書に記載するように、ＹＷＴＤ反復領域全体の欠失は、ＬＲＰ５における全体構造変化を引き起こし得るため、Ｄｋｋ１媒介阻害を妨げ得るこの領域における点突然変異を生成させた。
【０１４８】
相互作用表面ＩＩＩ上のＡｌａ置換変異の概略図
領域ＩＩＩの空間充填モデルをＬＤＬ受容体ＹＷＴＤ反復領域の構造に基づいて推定した（１３）。スイス−プロット／ＴｒＥＭＢＬデータベース（登録名Ｑ９ＵＰ６６［１８］）から得られた配列を使用して、Ｄｋｋ１の領域ＩＩＩの相同性モデルをＩＣＭ（Ｍｏｌｓｏｆｔ  Ｌ．Ｌ．Ｃ．、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、カリフォルニア州）で構築した。低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体ＹＷＴＤ−ＥＧＦ領域（ＰＤＢコード１ＩＪＱ（２２））を鋳型として選択した。三次元構造に基づいて、Ａｌａ置換変異を領域ＩＩＩの表面上に含む１９個のＬＲＰ５変異体を生成した（図７Ａ）。Ｄｋｋ１媒介阻害に抵抗するこれらの変異体ＬＲＰ５タンパク質の能力を測定し、それを図７Ａに示す。それらの変異体のうちの９つは、Ｄｋｋ１媒介阻害に対する（５％を超える）感受性の変化を示し、同一表面上に局在する変異を含んでいた（図７Ａ）。
【０１４９】
ＬＲＰ５のＷｎｔ共受容体活性に対する代表的な点突然変異の影響
図７Ｂに示されているように、ＨＥＫ細胞をＬＥＦ活性レポータプラスミド、クレメン１プラスミドおよび発現プラスミドでトランスフェクションした。Ｗｔおよび変異体ＬＲＰ５分子の発現を下面に示す。１９の変異のうち、Ｅ７２１変異が、Ｄｋｋ１媒介阻害に対して最大の影響を示し、Ｗ７８１、そしてＹ７１９がそれに続いた（図７Ｂ）。
【０１５０】
第１および第２のＹＷＴＤ反復領域（それぞれＤ１１１およびＤ４１８）におけるＥ７２１対応残基の変異は、Ｄｋｋ媒介阻害に対する感受性を有意に変化させなかった。Ｄｋｋ１媒介阻害に対する抵抗性を有するすべての変異体は、Ｄｋｋ２媒介阻害に対しても抵抗性を有していた。このすべてのデータは、第３のＹＷＴＤ反復領域がＤｋｋ媒介阻害に必要とされるという結論を裏づけるものである。
【０１５１】
第３のＹＷＴＤ反復領域がＤｋｋ媒介阻害に必要であることに対する明確な説明は、この領域がＤｋｋ１結合を引き起こすことである。ＨＥＫ細胞の表面に発現されたＬＲＰ５に対するＤｋｋ１−ＡＰ融合タンパク質の直接的な結合を測定した（２３）。
【０１５２】
実施例５：ＬＲＰ５の特定領域と相互作用する化合物のスクリーニング
実施例５．１（Ａ）領域ＩＩＩを鋳型として使用する化合物のスクリーニング
バーチャルスクリーニング
ＵＮＩＴＹ（商標）プログラム（Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．）を使用して、領域ＩＩＩ上の腔に適合することが可能な化学化合物について、国立癌研究所（ＮＣＩ）データベース（ｈｔｔｐ：／／１２９．４３．２７．１４０／ｎｃｉｄｂ２）をスクリーニングした。このデータベースは、自由に検索可能であり、２５０２５１個の小化学化合物の座標を含む。検索質問は、０．３Åの許容誤差を有するＲ７６４およびＥ７２１、ならびに腔に向かってＴｒｐ７８１から３．２Å離れた１．０Åの許容誤差を有する疎水性の中心で構築されるように設計された。化合物の柔軟性を考慮して、構造的に柔軟な高速の三次元検索を可能にするＵＮＩＴＹ（商標）プログラムにおける定方向Ｔｗｅａｋアルゴリズム（２１）を適用した。
【０１５３】
次いで、ＵＮＩＴＹ（商標）プログラムを使用して得られた候補化合物を、リガンドを迅速かつ柔軟にタンパク質結合部位にドッキングさせる（４４）、エネルギー最小化のためのＦｌｅｘＸ（商標）プログラム（Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．）（１７）を使用してＤｋｋ１結合表面にドッキングさせた。Ｄｋｋ１の認識に重要であることが示された残基Ｅ７２１、Ｗ８６４、Ｙ７１９、Ｒ７６４、Ｄ８７７、Ｆ８８８、Ｇ７８２、Ｗ７８１およびＭ８９１（図７Ａ）を考慮に入れて計算した。ドッキング手順に続いて、Ｃｓｃｏｒｅ（商標）プログラムを使用して、Ｄｋｋ１結合ポケットに結合するそれらの想定される能力に基づいて化合物のランク付けを行った。Ｃｓｃｏｒｅ（商標）は、タンパク質−リガンド複合体の個々のスコアリング機能がどの程度十分に果たされたかに基づいて相対的なコンセンサススコアを生成した（８）。次いで、Ｃｓｃｏｒｅ（商標）に最終的なマニュアル目視検査を施した。最大のコンセンサススコアを有する４０個の化合物がＮＣＩから要求されたが、入手不能により１７個しか得られなかった。次いで、これらの化合物にＤｋｋ−１結合アッセイを施した。これらの化合物のうちの３つが、ＬＲＰ−５に対するＤｋｋ１の結合に影響を与えることが判明した。ＮＣＩ１０６１６４（ＩＣ１４とも称する）（図８Ａ）Ｄｋｋ１結合を３２％阻害し、ＮＣＩ３９９１４（ＩＣ１３とも称する）（図８Ｂ）およびＮＣＩ６６０２２４（ＩＣ５とも称する）（図８Ｃ）は、Ｄｋｋ１結合をそれぞれ６４５％および２７５％刺激した。ＮＣＩ３９９１４およびＮＣＩ６６０２２４の刺激効果は、これらの化合物と、第３の領域のＤｋｋ１結合腔との相互作用の増強に起因し得る。この増強は、Ｄｋｋ１とＬＲＰ５の相互作用表面の間に存在する間隙の架橋に起因し得る。アントラ−９，１０−キノン（図９Ａ）は、化合物ＮＣＩ３９９１４（ＩＣ１３）およびＮＣＩ６６０２２４（ＩＣ５）の間の共通の下部構造であるため、アントラ−９，１０−キノンは、ＬＲＰ５との結合相互作用において重要な役割を果たすことができる。アントラ−９，１０−キノンと類似した、ＮＣＩデータベースに見いだされる化合物の二次元検索を、ＵＮＩＴＹ（商標）プログラムの類似性検索アルゴリズムを用いて実施した。次いで、既に記載されているように、ヒットしたものをＦｌｅｘＸ（商標）プログラムとドッキングさせた。最高のスコアを有する２５個の化合物をＮＣＩから入手し、試験した。化合物ＮＣＩ６５７５６６（図９Ｂ）およびＮＣＩ３６６２１８（図１０Ａ）は、Ｗｎｔシグナル伝達のＤｋｋ１媒介阻害を反転させることが可能であった。図９Ｃに示されるＮＣＩ３６６２１８誘導鋳型を使用して新しい二次元類似性検索を実施し、１３個の候補化合物を同定した。ＮＣＩ８６４２（図１０Ｂ）は、Ｗｎｔシグナル伝達のＤｋｋ媒介阻害の反転およびＬＲＰ５に対するＤｋｋ１の結合の破壊に最良の化合物であることが、（以下に記載する）生物学的アッセイによって示された。
【０１５４】
生物学的アッセイ
生物学的アッセイを用いて、バーチャルスクリーニングによって同定された化合物をスクリーニングした。
【０１５５】
Ｄｋｋ−１結合アッセイ
第１の２つの領域が欠如した全長ＬＲＰ５またはＬＲＰ５Ｒ３４変異体を発現するＨＥＫ細胞に対するＤｋｋ１−ＡＰの結合を実施例２に記載されるように実施した（図４）。１７個の化合物の第１のバッチを、全長ＬＲＰ５に対するＤｋｋ１の結合の阻害について最初にスクリーニングした。ＮＣＩ１０６１６４（ＩＣ１４）は、Ｄｋｋ１結合に対する６８％の阻害効果を示し、ＮＣＩ３９９１４（ＩＣ５）およびＮＣＩ６６０２２４（ＩＣ３）は、Ｄｋｋ１結合をそれぞれ６５４％および２７６％刺激した（表Ｉ参照）ことに留意すべきである。ＩＣ５およびＩＣ１３による結合の増強については、効果は、これらの対称性分子による受容体上で示されるオリゴマー化またはアロステリック効果の結果であり得る。重要なことは、ＩＣ５、ＩＣ１３（図８Ｂ）およびＩＣ１５（図８Ｃ）がいずれもアントラ−９，１０−キノンコア構造を含み、キノン構造は、分子が腔と相互作用するための基本的な相互作用力を提供できることが示唆される。Ｄｋｋ相互作用腔におけるいくつかの芳香族アミノ酸残基の存在が、この考え方を裏づけている。
【０１５６】
【表２】
2010537950.tif 000023
【０１５７】
【表３】
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【０１５８】
【表４】
2010537950.tif 000025
【０１５９】
表ＩＩおよび表ＩＩＩ
ＮＩＨ３Ｔ３細胞をＷｎｔ活性ルシフェラーゼレポータ遺伝子でトランスフェクションした。翌日、化合物を２ｍｇ／ｍｌでＤＭＳＯに溶解させ、２０ｕｇ／ｍｌに希釈して、組織培地（基本培地）、Ｗｎｔ３ａ（Ｗｎｔ）を含む培地、またはＷｎｔ３ａおよびＤｋｋ１（Ｗｎｔ＋Ｄｋｋ）の両方を含む培地に含めた。化合物を含まないＤＭＳＯを対照とした。６時間後、細胞を溶解させ、ルシフェラーゼアッセイを用いてＷｎｔ活性を測定した。示されるデータは、パーセントの基本活性である。Ｗｎｔ活性に影響を与えずに１００％を超えるＤｋｋ阻害の反転を示す化合物を赤色で示す。
【０１６０】
Ｗｎｔ活性アッセイ
ＬＲＰ５の第２および第３の領域がＷｎｔシグナル伝達に必要とされ、これらの領域は、恐らくＷｎｔ分子と直接相互作用する。これらの領域は、高度なアミノ酸配列相同性を共有するため、第３の領域に結合する特定の化合物は第１の２つの領域にも結合し、Ｗｎｔ活性の阻害を引き起こすことができることが見込まれる。化合物の第２のバッチを、最初にＷｎｔ活性アッセイを用いてスクリーニングし、続いてＤｋｋ阻害を反転させる化合物がＬＲＰ５に対するＤｋｋ結合を阻害したことを確認するための結合アッセイを用いてスクリーニングした。表ＩＩに示されるように、第２のバッチからの２５個の化合物を、Ｗｎｔ活性アッセイを用いてスクリーニングした。具体的には、ＮＩＨ３Ｔ３細胞をＷｎｔ活性ルシフェラーゼレポータ遺伝子でトランスフェクションした。翌日、それらの化合物を２ｍｇ／ｍｌでＤＭＳＯに溶解させ、２０ｕｇ／ｍｌに希釈して、Ｗｎ３ａ（Ｗｎｔ）を含む組織培地（Ｂ基本）またはＷｎｔ３ａおよびＤｋｋ１の両方（Ｗｎｔ＋Ｄｋｋ）を含む培地に含めた。いずれの化合物も含まないＤＭＳＯは対照としての機能を果たす。６時間後、細胞を溶解させ、ルシフェラーゼアッセイを用いてＷｎｔ活性を測定した。示されるデータは、パーセントの基本活性である。それらの化合物を１）基本レポータ活性阻害、２）Ｗｎｔ活性阻害および３）Ｗｎｔ活性のＤｋｋ媒介阻害の反転について調べた。表ＩＩに示されるように、２５個の化合物のうちの１７個が、３０％を超える割合でＷｎｔ活性を阻害することが判明した。２つの化合物、すなわちＮＣＩ３６６２１８およびＮＣＩ６５７５６６は、Ｗｎｔ活性に影響を与えずにＷｎｔシグナル伝達のＤｋｋ１媒介阻害を反転させることが判明した。
【０１６１】
どの化合物がＤｋｋ媒介阻害を反転させるかを判定するために、バーチャルスクリーニングを用いて第３のバッチの化合物を同定した。１３個の化合物を同定し、Ｗｎｔ活性スクリーニングを施した。表ＩＩＩに示されるように、３つの化合物が、Ｗｎｔ活性を著しく阻害することが判明し、１つの化合物（ＮＣＩ８６４２）がＤｋｋ媒介阻害を有意に反転させた。
【０１６２】
図１１および図１２に示されるように、Ｗｎｔ活性アッセイおよびＤｋｋ結合アッセイによって、ＮＣＩ８６４２およびＮＣＩ３６６２１８の両方の特性をさらに調べた。ＮＣＩ８６４２は、Ｄｋｋ媒介阻害の反転により効果的であった。ＮＣＩ８６４２は、また、ＮＣＩ３６６２１８より有効濃度の範囲が広かった。両化合物は、高濃度でＷｎｔ阻害を示し始めた。両化合物は、全長ＬＲＰ５、および第１の２つの領域が欠如したＬＲＰ５  Ｒ３４変異体に対するＤｋｋ１−ＡＰの結合を阻害したため、Ｄｋｋ１とＬＲＰ５の相互作用を破壊することによってＤｋｋ媒介阻害を反転させた。ＮＣＩ８６４２は、Ｄｋｋ１結合の阻害においてＮＣＩ３６６２１８より効果的であり、Ｗｎｔシグナル伝達に対するＤｋｋ媒介アンタゴニズムの反転の効果が増加したことと一致することが示された。
【０１６３】
骨形成アッセイ
Ｗｎｔは、培養された骨芽細胞の増殖および分化を刺激し、Ｄｋｋは、この過程を阻害する。したがって、これらの化合物は、骨形成を増加させる。これを、鉱化の調査、またはＢＳＰ、オステオカルシンおよびコラーゲンの発現を含む骨形成マーカの発現によってモニタリングすることができる。２．３Ｋｂ  ＣｏｌｌＡ１プロモータによって導かれるＧＦＰの発現もモニタリングした。図１３は、ＮＣＩ３６６２１８がＧＦＰ発現を刺激することを示し、骨芽細胞の分化の増加を示唆する。図１４は、ＮＣＩ３６６２１８が鉱化を刺激することを示す。ＮＣＩ３６６２１８は、頭蓋冠臓器培養において骨形成をも刺激する。
【０１６４】
実施例５．１（Ｂ）領域ＩＩＩを鋳型として使用する化合物のスクリーニング
この腔に潜在的に結合することが可能である化学化合物について、国立癌研究所（ＮＣＩ）データベース（ｈｔｔｐ：／／１２９．４３．２７．１４０／ｎｃｉｄｂ２）のさらなるバーチャルスクリーニングを実施した。このデータベースは、２５０２５１個の小（Ｍ．Ｗ．＜１０００Ｄａ）化学化合物の座標を含む。０．３Åの許容誤差を有するＬＲＰ５残基Ｇｌｕ７２１およびＡｒｇ７６４、ならびに腔に向かってＬＲＰ５残基Ｔｒｐ７８０（６９）から３．２Å離れた１．０Åの許容誤差を有する疎水性の中心で構成される検索質問を用いて、プログラムＵＮＩＴＹ（Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．）で最初のスクリーニングを実施した（図１７Ａ）。化合物の柔軟性を考慮に入れるために、高速かつ構造的に柔軟な３Ｄ検索（２１）を可能にするプログラムＵＮＩＴＹにおける指向性Ｔｗｅａｋアルゴリズムを適用した。
【０１６５】
次いで、リガンドを迅速かつ柔軟にタンパク質結合部位にドッキングすることができるプログラムＦｌｅｘＸ（Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．）を使用して、ＵＮＩＴＹスクリーニングによる候補化合物（〜２０００）をＤＫＫ１結合表面にドッキングさせた（７２、７３）。ＤＫＫ１結合に関与することが示されたＬＲＰ残基Ｇｌｕ７２１、Ｔｒｐ８６３、Ｔｙｒ７１９、Ａｒｇ７６４、Ａｓｐ８８７、Ｐｈｅ８８８、Ｇｌｙ７８１、Ｔｒｐ７８０およびＭｅｔ８９０（６９）を計算に含めた。ドッキング手順後に、プログラムＣｓｃｏｒｅを用いて、化合物をＤｋｋ１結合ポケットに対するそれらの想定される結合親和性に基づいてランク付けした。Ｃｓｃｏｒｅは、タンパク質−リガンド複合体の個々のスコアリング機能がどの程度十分に果たされるかに基づいて相対的なコンセンサススコアを生成する。次いで、Ｃｓｃｏｒｅの結果に最終的な目視検査を施した。
【０１６６】
最高のコンセンサススコアを有する１７個の化合物をさらに試験した（化合物ＩＣ１〜ＩＣ１７、表ＩＶ）。これらの化合物にＤｋｋ−１結合競合アッセイおよびＷｎｔ活性アッセイを施した。具体的には、ＮＩＨ３Ｔ３細胞をＷｎｔ活性ルシフェラーゼレポータ遺伝子でトランスフェクションした。翌日、２ｍｇ／ｍｌでＤＭＳＯに溶解させ、２０ｕｇ／ｍｌでＰＢＳに希釈した化合物を組織培地（基本）、Ｗｎｔ３ａ（Ｗｎｔ）またはＷｎｔ３ａおよびＤｋｋ１の両方（Ｗｎｔ＋Ｄｋｋ）を含む培地中に添加した。対照は、同量のＤＭＳＯを含む。６時間後、細胞を溶解させ、Ｗｎｔ活性をルシフェラーゼアッセイによって測定した。１０個の化合物が、基本レポータ遺伝子活性に有意に影響を与えずにＷｎｔ刺激レポータ遺伝子活性の５０％超の阻害を示した（表ＩＶ）。これらの１０個の化合物のうち、４つの化合物は、細胞表面に発現されたＬＲＰ５に対するＤｋｋアルカリホスファターゼ（ＡＰ）の結合に影響を与えた。ＩＣ１４およびＩＣ１５は、３０パーセントを超える阻害を示したのに対して、驚いたことには、ＩＣ５およびＩＣ１３は、結合の刺激を示した（表ＩＶ）。Ｗｎｔ活性の阻害は、恐らくはＷｎｔ分子との直接的な相互作用を通じて、Ｗｎｔ結合に関係していることが示された第１の２つのＹＷＴＤ反復領域に対する化合物の結合に起因し得る（３５、３６、４７）。重要なことは、ＩＣ５、ＩＣ１３（図１７Ｂ）およびＩＣ１５（図１７Ｃ）は、いずれもアントラ−９，１０−キノンコア構造を含み、キノン構造は、分子が腔と相互作用するための基本的な相互作用力を提供できることが示唆される。Ｄｋｋ相互作用腔におけるいくつかの芳香族アミノ酸残基の存在は、この考え方を裏づけるものである。
【０１６７】
【表５】
2010537950.tif 000026
【０１６８】
【表６】
2010537950.tif 000027
【０１６９】
【表７】
2010537950.tif 000028
【０１７０】
【表８】
2010537950.tif 000029
【０１７１】
【表９】
2010537950.tif 000030
【０１７２】
【表１０】
2010537950.tif 000031
【０１７３】
【表１１】
2010537950.tif 000032
【０１７４】
【表１２】
2010537950.tif 000033
【０１７５】
【表１３】
2010537950.tif 000034
【０１７６】
キノンコア構造は、相互作用に寄与できると仮定して、ＵＮＩＴＹプログラムの類似性検索アルゴリズムを使用して、ＮＣＩデータベースにおけるアントラ−９，１０−キノンに類似する化合物について第２回目のバーチャルスクリーニングおよび２Ｄ検索を実施した。次いで、ヒットしたものを既に記載されているようにＦｌｅｘＸとドッキングさせた。次いで、高得点が付けられた７つの化合物をＮＣＩから入手し、生物学的アッセイで試験した。化合物ＩＩＣ８（図１７Ｄ）を、Ｗｎｔシグナル伝達のＤｋｋ媒介阻害を反転させるその能力について同定した（表Ｖ）。
【０１７７】
アントラ−９，１０−キノン系化合物に加えて、第１のバーチャルスクリーニングによりそれらのスコア４１〜８０にランク付けされたさらなる１７個の化合物を入手した。これらの１７個の化合物の試験により、それらのうちの９つがＷｎｔシグナル伝達を５０％以上阻害することが明らかになった（表ＩＶにおける陰影部の化合物）。重要なことは、ＩＩＣ１５（図１７Ｅ）およびＩＩＣ２４（図１７Ｆ）を含む、このスクリーニングからの化合物のうちの４つは、Ｗｎｔシグナル伝達をそれ自体有意に阻害せずに、Ｗｎｔシグナル伝達のＤｋｋ媒介阻害を反転させる多少の能力を示した（表ＩＶ）。ＩＩＣ１５およびＩＩＣ２４を鋳型として使用して２Ｄ類似性検索を実施し、１３個のさらなる候補化合物をＷｎｔ活性アッセイのために入手した（表ＶＩおよびＶＩＩ）。ＩＩＣ２４系化合物の１つであるＩＩＩＣ３（図１７Ｇ）は、Ｗｎｔシグナル伝達のＤｋｋ媒介阻害の非常に強力なアンタゴニストであることが判明した（表ＶＩＩ）。
【０１７８】
Ｗｎｔ活性アッセイおよびＤｋｋ結合アッセイでＩＩＣ８化合物およびＩＩＩＣ３化合物の両方の特性をさらに調べた。ＩＩＩＣ３は、ＩＩＣ８よりＤｋｋ阻害の反転に効果的であり、広い有効濃度範囲を有する（図１８Ａ、Ｂ）。ＩＩＣ８は、およそのＥＣ５０が１０μＭのマイクロモル濃度でＤｋｋ媒介阻害の反転を開始したのに対して、ＩＩＩＣ３は、ＥＣ５０が約２μＭの１μＭ未満の濃度でＤｋｋ阻害の反転を開始した。両化合物は、高濃度でＷｎｔシグナル伝達を阻害すると思われた。この阻害効果は、Ｗｎｔシグナル伝達に必要とされる第１の２つのＹＷＴＤ反復領域に対する化合物の低親和性に起因し得る。両化合物は、野生型ＬＲＰ５（図１８Ｃ）、および第１の２つのＹＷＴＤ反復領域が欠如しているが、Ｄｋｋ結合領域を保持するＬＲＰ５変異体（図１８Ｄ）に対するＤｋｋ１−ＡＰの結合を阻害したため（６９）、ＤＫＫ１とＬＲＰの相互作用を破壊することによってＤｋｋ阻害を反転させる可能性が最も高いと結論づけることが合理的である。加えて、ＩＩＩＣ３は、Ｄｋｋ１結合の阻害においてＩＩＣ８より効果的であり、それは、Ｗｎｔシグナル伝達に対するＤｋｋ媒介アンタゴニズムのその反転における効果が増加したことと一致する。また、ＬＲＰ５に対するＤｋｋ１の結合を阻止するためのこれらの化合物のＩＣ５０値（約１μＭ（ＩＩＩＣ３の場合）および１０μＭ（ＩＩＣ８の場合））は、これらの化合物がＤｋｋ阻害を反転させるためのＥＣ５０値と類似しており、これらの化合物は、ＤｋｋとＬＲＰの相互作用を破壊することによってＤｋｋ阻害を反転させるという結論が裏づけられる。
【０１７９】
化合物の機能および構造関係をより深く理解するために、Ｗｎｔ阻害化合物を再調査した。試験を行った５４個の化合物のうち、それらのほぼ半分（７４）が２０μｇ／ｍｌでＷｎｔ３ａの５０％を超える阻害を示した（表ＩＶ〜ＶＩＩ）。最も強力なＷｎｔ阻害薬は、ＩＣ１５（図１７Ｃ）。ＩＣ１５は、Ｗｎｔ３ａ活性を阻害するための約０．５μＭのＩＣ５０値を有する（図１９Ａ）。この値は、Ｄｋｋアンタゴニズムに必要とされる領域である第３のＹＷＴＤ  ＥＧＦ反復領域に対するＤｋｋの結合を阻害するためのＩＣ５０値（５μＭ）の約１０分の１である（図１９Ａ）。対照的に、Ｗｎｔを阻害するのに必要とされるＩＩＩＣ３の濃度は、Ｄｋｋの結合を阻害するのに必要とされる濃度の少なくとも１０倍であり、ＩＩＩＣ３がＤｋｋの結合を阻害するためのＩＣ５０値およびＤｋｋ阻害を反転するためのＩＣ５０値は、類似している（図１８）。これらの結論は、第２および第３のＹＷＴＤ反復領域に対するＩＩＩＣ３およびＩＣ１５の結合の分子モデリング分析によってさらに裏づけされる。ＬＲＰ５の第２および第３のＹＷＴＤ反復領域は、高度なアミノ酸配列相同性（４１％の同一性）を共有するが、これら２つの領域のリガンド結合腔に大きな差がある（図２９）。第２の領域上の腔は、第３の領域上の腔より大きいが、第３の領域の腔の方が深い（図１９Ｂ、Ｃ）。したがって、ＩＩＩＣ３より大きいＩＣ１５は、より良好に第２の領域の腔に合うことができるのに対して、ＩＩＩＣ３は、第３の領域の腔により良好に適合することができると予想するのは妥当である。実際、ＦｌｅｘＸドッキングモデルにおいて、ＩＩＩＣ３は、第３の領域の腔に十分に適合する（図３Ｂ）のに対して、ＩＣ１５は、第２の領域の腔に完璧に適合する（図１９Ｃ）。ＩＩＩＣ３複合構造において、第３の領域が第２の領域で置換されると、結合したＩＩＩＣ３は、Ｇｌｕ７２１、Ｔｙｒ７１９、Ｌｅｕ８２３およびＰｈｅ８８８を含む目標残基との多くの接触を失うことになる（図１９Ｄ）。一方、第２の領域がＩＣ１５複合体において第３の領域で置換されると、第３の領域上の残基、例えばＬｅｕ８２３およびＰｈｅ８８８は、結合したＩＣ１５と衝突することになる（図１９Ｅ）。
【０１８０】
次に、最も強力なＤｋｋアンタゴニスト化合物ＩＩＩＣ３がマウスにおける骨形成を刺激し得るかどうかを判断した。該化合物を局部的骨形成モデルで試験した。ＩＩＩＣ３をＤＭＳＯに溶解させ、１：１０００に希釈して０．４４ｍｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳに含めた。既に記載されている注射方法（７４、７５）を用いて、１５マイクロリットルのＩＩＩＣ３（０．２２ｍｇ／Ｋｇ／日）、対照媒体または正の対照（ｂ−ＦＧＦ、１２．５μｇ／Ｋｇ／日）を生後４週間のＣＤ−１マウスの頭蓋冠の右側の皮下組織に５日間にわたって１日３回注射した。最初の注射から２２日後に頭蓋冠を回収し、切出しのために固定した。図１９に示されるように、ｂ−ＦＧＦおよびＩＩＩＣ３処理頭蓋冠の両方に新しい骨が見いだされた。ＩＩＩＣ３は、骨形成を刺激する上でＦＧＦと同程度に強力であると思われた（図１９Ｂ）。全身骨形成アッセイにおける化合物の効果を評価するために、Ｃ５７Ｂ１マウス（生後８週間）にＩＩＩＣ３および対照媒体を腹腔内注射した。ＩＩＩＣ３が注射されたマウスには、対照と比較して、大腿および全身骨鉱物密度の両方に有意な増加（大腿についての２％および全体での２．５％の増加）が観察され（図１９Ｃ、Ｄ）、体重の有意な増加（７．１％、図１９Ｅ）を伴っていた。これらの結果により、骨形成を増加させるための潜在的な治療目標としてのＬＲＰ／Ｄｋｋ相互作用がさらに確認され、これらのＤｋｋアンタゴニストは、骨粗鬆症を治療するためのアナボリック治療薬へとさらに発展するための好適な誘導化合物になり得ることが実証された。
【０１８１】
タンパク質−タンパク質相互作用は、小分子化合物による破壊が困難であると一般に考えられている。この調査において、構造生物学と計算と生物学的アッセイとを組み合わせて、Ｄｋｋ−ＬＲＰ５相互作用を効率的に破壊できる小分子化合物を同定するスクリーニング手法を用いた。鋳型を用いずに目標の推定構造のみに基づいて、化学物質に対する新規の初期バーチャルスクリーニングを実施した。単に５４個の化合物の物理的スクリーニングから化合物を同定することができ、連続的な回数のスクリーニングによって、以前行われたものより良好な化合物が得られた。加えて、計算は、腔に適合する化合物を単に同定することを可能にするだけでなく、２つの類似の腔を区別する、すなわちＬＲＰ５の第１の２つのＹＷＴＤ反復領域から第３のＹＷＴＤ反復領域を区別することができる化合物を導く。その手法は、骨粗鬆症および癌を治療するための治療薬に発展する大きな潜在性を示した強力なＤｋｋおよびＷｎｔアンタゴニスト化合物を同定することを可能にした。加えて、これらの化合物は、Ｗｎｔシグナル伝達における治療目標検証および基本的研究のための有用なツールを提供する。
【０１８２】
実施例６：新しい変異体を設計するためのコア化合物としてのＩＩＩＣ３の使用
上述のように、Ｗｎｔ活性に作用するＩＩＩＣ３（ＮＣＩ８６４２）の能力は、この鋳型上のＲ基を変えることで、Ｗｎｔ活性に影響を与えることもできる他の分子の同定を可能にするコアモデルを設計するのにそれを使用することを可能にする。したがって、ＩＩＩＣ３のように、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４およびＲ６が水素であり、Ｒ８がヒドロキシル基であった場合は、以下のモデル化合物（ＶＩＩＩ）の残留位置でより限定された一連の化合物を製造することが可能であった。
【化２１】
2010537950.tif 000035
【０１８３】
このシリーズを開始するために、ＩＩＩＣ３のようにＲ１１およびＲ１２がメチル基であり、Ｒ１３がヒドロキシル基であり、アミン基が四級化されて構造（ＶＩ）を与える一連の化合物を設計した。
【化２２】
2010537950.tif 000036
【０１８４】
直鎖状アルカンおよび分枝状アルカンの両方を使用して、この化合物におけるＲ１５の変化に向けて一連の置換基を設計した。得られた化合物（ＥｎｚｏＭ０１〜ＥｎｚｏＭ１２）の構造を既に記載されているように走査して、それらの結合の確率についてのスコアを得る。ＥｎｚｏＭ０１〜ＥｎｚｏＭ１２に使用された特定の置換基のリストならびに得られたＣｓｃｏｒｅレーティングを以下に示す。
【０１８５】
【表１４】
2010537950.tif 000037
【０１８６】
別の手法において、ＮＣＩ８６４２のカルボキシル基をカルボキサミド基で置換して、一般構造（ＶＩＩ）を有する一連の化合物を生成する。
【化２３】
2010537950.tif 000038
【０１８７】
この一連の化合物（ＥｎｚｏＭ１３〜ＥｎｚｏＭ４１）に使用された特定の置換基のリストならびに得られたスコアを以下に示す。
【０１８８】
【表１５】
2010537950.tif 000039
【０１８９】
別の一連の化合物において、カルボキシル基をエステル化して、構造（ＶＩＩＩ）を与える。
【化２４】
2010537950.tif 000040
【０１９０】
様々な基で一連の化合物（ＥｎｚｏＭ４２〜ＥｎｚｏＭ７０）を設計した。これらの置換基およびｃＳｃｏｒｅを以下に示す。
【０１９１】
【表１６】
2010537950.tif 000041
【０１９２】
【表１７】
2010537950.tif 000042
【０１９３】
【表１８】
2010537950.tif 000043
【０１９４】
コア分子上のちょうど３つの部位に作られた様々な置換基は、単一分子を合成しなくてもバーチャルスクリーニングによって試験することができる多数の候補を生成できることが分かる。また、この一連の化合物を既に記載されている同じバーチャルスクリーニングプログラムで試験すると、７０個の化合物のうち４４個が５のｃＳｃｏｒｅ値を与えた。これは、これらの分子を設計するのに使用された化合物ＩＩＩＣ３が４の相対的ｃＳｃｏｒｅレーティングを有していたにすぎないため、新しい化合物を設計する上でのバーチャル置換技術の能力を実証するものである。
【０１９５】
実施例７：スコアの改良
先の実施例において高いｃＳｃｏｒｅを達成した化合物はいずれも試験の候補であるが、効果的である可能性が最も高い化合物を合成し、試験することがより効率的であろう。５のレーティング（最高の潜在的ｃＳｃｏｒｅ）を有する化合物が極めて多かったため、それらの化合物を分類するために異なる基準を用いなければならない。ｃＳｃｏｒｅを計算する上で、様々な要素スコアを集約して、最終的なレーティングを達成する。ＮＣＩライブラリーの最初のスクリーニングにおいて、鋳型化合物であるＮＣＩ１８６４２（ＩＩＩＣ３）は、これらのメンバーの１つの最高のレーティング、すなわちＦＲ−スコアを示した。そのように、このメンバースコアを用いて、５のｃＳｃｏｒｅを有するコア化合物の様々な類似体のランク付けを行った。このようにして検索した場合に、４４個の候補のうちの７個が、最初のＮＣＩ１８６４２より高いスコアが付けられた。これらの化合物に対する値（ならびにＩＩＩＣ３に対する値）を以下の表ＸＩに示す。
【０１９６】
【表１９】
2010537950.tif 000044
【０１９７】
このアプローチでも、生物学的アッセイで合成および試験する価値のある有望な候補を同定するバーチャルライブラリーをスクリーニングする能力が示される。それらのランキングがより高いために、当該候補がコア構造を定めた最初の化合物より強力であることを証明できる可能性がある。
【０１９８】
実施例８：実施例７から選択された化合物の合成
上記のバーチャルスクリーニング工程によって選択された化合物の合成を当該技術分野で知られているいくつかの手段によって実施することができる。例えば、類似化合物を取り、１つ以上の置換工程によって化学基を置換することによってこれらの化合物を作ることができる。この例において、ＩＩＩＣ３（ＮＣＩ１８６４２）は、ガロシアニンとして商業的に入手可能であり、多くの置換の出発点として機能することができる。あるいは、所望の化合物の前駆体を適切なＲ基で合成し、互いに結合させて、生物学的アッセイで試験する候補を合成することができる。
【０１９９】
（Ａ）ＥｎｚｏＭ１５の合成
６．０２ｇのガロシアニン（塩酸塩を含まない）を４０ｍｌのＤＭＦに溶解させた溶液に対して、６．６２ｇのテトラフルオロホウ酸スクシンイミド−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムを添加した後、６．９６ｍｌのジイソプロピルエチルアミンを添加し、室温で終夜攪拌した。ＤＭＦを除去した後、残渣を１０ｍｌの無水ＴＨＦに再懸濁させ、次いでＴＭＦ中１０ｍｌの２Ｍジメチルアミンを添加した。該混合物を５０〜６０℃で５時間加熱した。製造物を、シリカゲルを使用したカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／１％ＭｅＯＨ）で精製して、（以下に示す）０．８ｇ（収率１２％）のＥｎｚｏＭ１５を得た。
【化２５】
2010537950.tif 000045
【０２００】
（Ｂ）ＥｎｚｏＭ１４の合成
ＥｎｚｏＭ１５の合成に使用したジメチルアミンの代わりに１００ｍｌのメチルアミンを使用したことを除いては、基本的にＥｎｚｏＭ１５について記載したようにＥｎｚｏＭ１４の合成を実施した。加熱工程も５時間から終夜に延長した。シリカゲルによる精製を上記のように実施して、（以下に示す）０．７５ｇ（収率１２％）のＥｎｚｏＭ１４を得た。
【化２６】
2010537950.tif 000046
【０２０１】
（Ｃ）ＥｎｚｏＭ０１の合成
工程１．ヨウ化メチルの合成
攪拌磁石を備えた三口フラスコに温度計、分液漏斗、ならびに下方蒸留のためのコンデンサセットおよび氷水浴に維持された受取りフラスコに接続された小さい分留塔を装着した。８００ｇ（４．８モル）のヨウ化カリウムを４３０ｍｌの水に溶解させることによって溶液を調製し、これをフラスコに添加した。次いで、６０ｇの炭酸カルシウムを添加し、該混合物を攪拌しながら６０〜６５℃に加熱した。温度を６０〜６５℃に維持し、次いで２時間にわたって分液漏斗を通じて６３０ｇ（４７３ｍｌ、５モル）の「実用」硫酸メチルを徐々に添加した。ヨウ化メチル製造物が受取りフラスコに流入する蒸留を維持するように、炭酸カルシウムの添加速度を維持した。すべての炭酸カルシウムを添加した後、約４０分間にわたって温度を６５〜７０℃まで昇温させて、ヨウ化メチルの蒸留を完了させた。製造物を少量の水残渣から分離し、次いで製造物を無水塩化カルシウムで乾燥させた後、塩化メチルを乾燥した蒸留フラスコ内にデカントした。数滴のヨウ化カリウムを添加し、製造物を水浴から蒸留した。再蒸留された製造物は、６１５〜６４０ｇの収量（収率９０〜９４％）を示し、４１〜４３℃の沸点を有していた。
【０２０２】
工程２．ガロシアニンへのメチル基の添加
（塩化物を含まない）１．５ｇのガロシアニンを１０００ｍｌフラスコ中５００ｍｌのＤＭＦに溶解させた。該混合物を３０℃で１時間攪拌し、次いで上記の工程で調製した１０ｍｌのヨウ化メチルを添加した。次いで、該溶液を７２時間にわたって攪拌しながら加熱および還流させ、コンデンサ管をバルーンで密閉し、さらなる１０ｍｌのヨウ化メチルを１２時間毎に添加した。次いで、ＴＨＦを８０℃で蒸留除去した。残留する固体（ＥｎｚｏＭ０１）は、約９８％の収率を示した。
【０２０３】
（塩化物を含まない）１００ｍｇ（０．３３ミリモル）のガロシアニンと、５０ｍｌのメタノールと、３８μｌ（０．３３ミリモル）の２，６−ルチジンと、０．５ｍｌのヨウ化メチルとの混合物を、攪拌機を備えた圧力容器に入れた。該混合物を攪拌し、約１００℃で４日間加熱した。真空中で濃縮した後、残渣を５ｍｌのエタノールで洗浄した。濾過して９１ｍｇの固体製造物を得た。ＥｎｚｏＭ０１の構造を以下に示す。
【化２７】
2010537950.tif 000047
【０２０４】
（Ｄ）ＥｎｚｏＭ０２の合成
ＥｎｚｏＭ０１は、興味のある結果（以下の実施例に示される結果）を示したため、ＦＲ−スコアが最初のＩＩＩＣ３より低い関連化合物ＥｎｚｏＭ０２をも合成および生物学的試験のために選択した。化合物ＥｎｚｏＭ０２は、四級窒素上のメチル基の１つがエチル基になっていることを除いては、ＥｎｚｏＭ０１と基本的に類似している。そのため、四級化がヨウ化メチルの代わりにヨウ化エチルで生じ、より小規模で実施されたことを除いては、基本的にＥｎｚｏＭ１について記載したようにＥｎｚｏＭ０２を製造した。（塩化物を含まない）１００ｍｇ（０．３３ミリモル）のガロシアニンと、５０ｍｌのメタノールと、３８μｌ（０．３３ミリモル）の２，６−ルチジンと、０．５ｍｌのヨウ化メチルとの混合物を、攪拌機を備えた圧力容器に入れた。該混合物を攪拌し、約１００℃で４日間加熱した。真空中で濃縮した後、残渣を５ｍｌのエタノールで洗浄した。濾過製造物の収量は１３４ｍｇであり、ＥｎｚｏＭ０２の構造を以下に示す。
【化２８】
2010537950.tif 000048
【０２０５】
（Ｅ）ＥｎｚｏＭ０３の合成
ＥｎｚｏＭ０１に関連する別の化合物ＥｎｚｏＭ０３（ただし、ＦＲ−スコアがＩＩＩＣ３より低いという点でＥｎｚｏＭ０２に類似する）を合成のために選択した。化合物ＥｎｚｏＭ０３は、四級窒素上のメチル基の代わりにプロピル基を有することによってＥｎｚｏＭ０１と異なる。そのため、四級化がヨウ化エチルの代わりにヨウ化プロピルで生じることを除いては、基本的にＥｎｚｏＭ０２について記載したように化合物ＥｎｚｏＭ０３を製造した。濾過製造物の収量は、１３８ｍｇであり、ＥｎｚｏＭ０３の構造を以下に示す。
【化２９】
2010537950.tif 000049
【０２０６】
実施例９：実施例８で合成された化合物の試験
実施例８で記載した化合物の合成後に、それらをＷｎｔ活性およびＤｋｋ阻害に対する影響について既に記載されているように試験した。また、これまでのスクリーニングは、アッセイにおける試験化合物の単一濃度を使用していた。本実施例では少数の化合物を試験していたため、各試験化合物に対する様々な異なる入力をＷｎｔ活性に対して同時に試験することが可能であった。様々な濃度のＥｎｚｏＭ０１の結果を図２１に示し、比較として、ＩＣ１５による滴定も含める。それは、ＥｎｚｏＭ０１およびＩＣ１５の両方に見られ、Ｗｎｔ活性に対する影響に対して投与量応答が存在する。しかし、ＩＣ１５に見られるのと同じＷｎｔ活性の阻害のレベルが、およそ１５分の１のＥｎｚｏＭ０１の投与量においてみられる。より高いレベルのＥｎｚｏＭ０１（８．３３μＭ以上）においては、Ｗｎｔ活性に対する影響が変化し、恐らくはこの薬物に対するより複雑な応答が示唆されることも見られる。この特定のＥｎｚｏＭ０１調製物のＨＰＬＣ分析により、それが、より高い投与量における要因にもなり得る少量の未反応ガロシアニンで汚染されていることも示された。
【０２０７】
図２２に、ＥｎｚｏＭ１４およびＥｎｚｏＭ１５についての結果を示す。この実験において、ＥｎｚｏＭ１４は、Ｗｎｔ活性の低下に対する投与量応答を示すのに対して、ＥｎｚｏＭ１５は、６．１μＭ後により急激な応答を示す。これらの化合物は、Ｗｎｔ活性のＤｋｋ媒介阻害に明らかな影響を与えないこともわかる。
【０２０８】
図２３に、各化合物について基本的に類似の結果を伴うＥｎｚｏＭ０２およびＥｎｚｏＭ０３についての結果を示す。この実験に用いた濃度では、Ｗｎｔ活性そのものに対する影響が非常にわずかであった。しかし、用いられた最大濃度（６μＭおよび３０μＭ）では、これらの化合物は、Ｗｎｔ活性に対するＤｋｋの影響を減少させる能力を実証した。
【０２０９】
実施例１０：腫瘍細胞系の生存度に対する様々な化合物の影響
上述のように、Ｗｎｔ経路は、癌の成長および進行に関連づけられてきた。Ｗｎｔ活性に影響を洗えることが発見された化合物のうちの３つ（ＩＣ１５、ＩＩＩＣ３およびＥｎｚｏＭ０１）を、インビトロで成長する腫瘍細胞系（ＰＣ−３）に適用した。
【０２１０】
１０％ＦＢＳが補給されたハムＦ１２培地を含む９６ウェルプレート内にＰＣ−３腫瘍細胞をＡ）５００個／ウェル；Ｂ）１０００個／ウェル；およびＣ）２０００個／ウェルで接種した。様々な量のＩＣ１５、ＩＩＩＣ３またはＥｎｚｏＭ０１（最終１０μＭ、２０μＭまたは８０μＭ）を培地に添加し、１０日間成長を続けた。培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで２０％細胞タイタ９６アクエアスワンソルーションリージェント（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州）を含むＲＰＭＩ培地（フェノールレッドを含まない）とともに４時間インキュベートした。次いで、製造元の指示に従って、細胞増殖を吸収によって測定した。このアッセイの結果を図２４に示す。これらの化合物の存在は、実験の終了時に存在する生存ＰＣ−３細胞の数に大きな影響を有すると思われたが、薬物の効果は、最初の接種密度に依存していた。最も低い密度（５００個／ウェル）において、ＩＩＩＣ３およびＥｎｚｏＭ０１は、１０μＭで生存細胞の数の減少を示し、ＩＣ１５は、２０μＭで効果を示した。１０００個／ウェルの試料において、ＩＩＩＣ３およびＥｎｚｏＭ０１は、１０μＭレベルで生存細胞の数のそれぞれ１０％および１５％の低下を示し、２０μＭレベルでおよそ５０％の低下を示すのに対して、ＩＣ１５は、試験した最大濃度、すなわち８０μＭでのみ低下を示す。試験された最大細胞密度（２０００個／ウェル）において、すべての３つの化合物が、存在する試験化合物の２０μＭを超えるレベルで細胞毒性を実証した。結論として、本実施例により、ａ）ＬＲＰ５／６に結合し、ｂ）Ｗｎｔ活性に影響を与える能力について選択された３つの異なる化合物は、癌細胞系の増殖能力を低下させることが可能であることが実証される。
【０２１１】
実施例１１：β−カテニン活性に対する影響
タンパク質β−カテニンは、Ｗｎｔ経路の主要な下流目標であると考えられる。腫瘍に由来するいくつかの細胞系は、通常の細胞と比較してβ−カテニンのレベルが高いことが既に注目されていた。実際、β−カテニン活性を直接調節するａｐｃ（腺腫様ポリープ症）遺伝子における様々な変異および欠失が結腸癌の発生と強く関連づけられてきた。例えば、ａｐｃ遺伝子に欠陥を有するように遺伝子操作されたマウス系統（「多発性腸新生物形成」または「ｍｉｎ」系統）を予め遺伝子的に処理して、加齢するにつれて多数の腸腫瘍を発生するようにする。
【０２１２】
ＥＬＩＳＡアッセイで測定されるβ−カテニンの発現に対するＥｎｚｏＭ０１の影響について、いくつかの異なる腫瘍細胞系を試験した。腫瘍系を異なる腫瘍型、すなわち卵巣癌（ＰＡ−１）、前立腺癌（ＰＣ−３）、乳癌（ＨＴＢ−２４およびＨＴＢ２６）および結腸癌（Ｌｙｓ１７４Ｔ）から導いた。
【０２１３】
Ａ）細胞成長
以上に列記した様々な細胞系を約７０％の集密度まで成長させ、次いで様々な量のＥｎｚｏＭ０１を添加し、１６時間インキュベートした。培地を除去し、細胞を収穫し、細胞溶解物をＥＬＩＳＡアッセイに使用してβカテニンを測定した。
【０２１４】
Ｂ）ＥＬＩＳＡアッセイ
９６ウェルプレートのウェルに炭酸ナトリウム中捕捉抗体の抗β−カテニンモノクロナル抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）を４℃にてｐＨ９．０で終夜コーティングした。翌日、ウェルをＴＢＳＴ（０．０２％のＴｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝生理食塩水）で１回洗浄し、１％ＢＳＡ遮断溶液とともに室温で１時間インキュベートした。ウェルをＴＢＳＴで１回洗浄し、細胞溶解物を添加し、室温で１時間インキュベートした。次いで、抗β−カテニンポリクロナル抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）とともにウェルを室温で４５分間インキュベートした。ウェルをＴＢＳＴで３回洗浄し、次いでペロキシダーゼ共役抗ウサギＩｇＧ二次抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｎｖｅｒｓ、マサチューセッツ州）を各ウェルに添加し、２５分間インキュベートした。ウェルをＴＢＳＴで３回洗浄し、スーパーシグナルウェストピコ安定過酸化物溶液（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、イリノイ州）の１：１混合物とともにインキュベートすることによって蛍光を発生させた。
【０２１５】
Ｃ）結果
この実験の結果を図２５Ａに示す。ＬＳ１７４Ｔにおけるβ−カテニンの固有のレベルは、他の細胞系と比較してはるかに高いこと、および使用投与量におけるＥｎｚｏＭ０１によるＬＳ１７４Ｔに対する投与量応答効果がわずかであるが存在し、投与量が増加するに従ってβ−カテニン活性が徐々に高くなることがわかる。しかし、この細胞系ではβ−カテニンの活性が非常に高いため、β−カテニン活性の固有のレベルがはるかに低い他の細胞系に対する影響を不明瞭にする。よって、図２５Ｂにおいて省略されているＬＳ１７４Ｔデータとともにこのデータも提示する。乳癌細胞系ＨＴＢ−２６およびＨＴＢ２４ならびに前立腺癌細胞系ＰＣ−３ではβ−カテニンレベルに実質的に変化がなかったが、ＥｎｚｏＭ０１のより高い投与量において卵巣細胞系ＰＡ１にβ−カテニンレベルが選択的に低下したことがわかる。ＥｎｚｏＭ０１のＩＣ５０値は、２０〜４０μＭの範囲であった。
【０２１６】
実施例１２：腫瘍誘発および進行に対する様々な化合物の影響
結腸腫瘍の誘発および進行に対する食餌性の影響に関する調査において、ａｐｃｍｉｎ／＋マウスは、特定の食餌性サプリメント、β−グルコシルセラミドの存在または不在に応答することが示された（１１０）。この系統のマウスにおける自然発生的な腫瘍の頻度または大きさに影響を与える試薬の能力は、生きた動物における癌の誘発および進行に影響を与える上でのそれらの潜在性について既に同定された化合物のいくつかを試験する機会を提供する。
【０２１７】
ＬＲＰ５上の選択部位に結合する確率について、化合物ＩＣ１５およびＩＩＩＣ３をバーチャルスクリーニング法で同定した。これらの化合物の両方をいくつかのグループのａｐｃｍｉｎ／＋マウスに投与し、腫瘍の大きさおよび頻度を後の時点で測定した。
【０２１８】
Ａ）試験マウスの処理
これら２つの化合物のインビボでの効果を調べるために、生後８〜９週間のＣ５７ＢＬ／６ＪＡＰＣ（ｍｉｎ＋）／ＪをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、メイン州）から入手した。５４日間にわたってマウスに通常の食餌を与え、それから３６日間にわたって高脂肪食餌に切り換えた。この時点で、マウスに１ｍｌの容量の媒体、６２５μＭのＩＩＩＣ３または４２μＭのＩＣ１５を９０日間にわたって１日おきに注射した。処理期間の終了時に、マウスを殺し、それらの腸を取り出した後、メチレンブルーで染色して、腸における発生腫瘍の数および大きさを定量した。
【０２１９】
Ｂ）結果
様々な大きさの腫瘍の数を以下の表ＸＩＩに示す。
【０２２０】
【表２０】
2010537950.tif 000050
【０２２１】
これらの化合物の両方が、全体的な腫瘍の数を減少させたことがわかる。試験動物における平均腫瘍数は、対照では５９．４であり、ＩＩＩＣ３およびＩＣ１５で処理された動物ではそれぞれ３１．６７および３８．３３にすぎなかった。これは、これらの化合物で処理した後に４７％および３６％低下したことを示す。これらの化合物の効果は、より大きい腫瘍より、より小さい腫瘍に対してより顕著に思われることもわかる。これにより、これらの化合物は、発生を遅らせるものの、腫瘍が確定されると進行に対する影響は小さいことが示唆され得るが、他の説明も可能である。
【０２２２】
実施例１３：高カロリーの食餌が与えられたマウスにおけるグルコース、インシュリン、トリグリセリドおよびコレステロールのレベルに対する様々な化合物の効果
既に述べたように、ＬＲＰ５／６は、Ｗｎｔシグナル伝達経路において、通常のコレステロールおよびグルコース代謝のモジュレーションを含む多くの役割を果たすことが示された。１グループのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、最初に、５日間にわたって通常のカロリーの食餌を与え、その後終夜絶食させ、次いでＬｉｆｅｓｃａｎグルコメーター（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ）を使用して血糖値をアッセイした。次いで、１０日間にわたってそれらの動物に高カロリーの食餌を与え、その間異なる濃度のＥｎｚｏＭ０１、ＩＣ１５およびＩＩＩＣ３（ＥｎｚｏＭ０１については０．０２、０．０６および０．３０ｍｇ／ｋｇ／日、ＩＣ１５については０．２、０．６および３．０ｍｇ／ｋｇ／日、ならびにＩＩＩＣ３については０．５、２．０および８．０ｍｇ／ｋｇ／日）を同時に投与した。最終日に、動物を終夜絶食させ、次いで血糖値を測定した。
【０２２３】
結果
１０日間にわたって高カロリーの食餌を給餌した後、対照のマウスは、約３０％の血清糖値の増加を示した。図２６において、すべての３つの化合物は、血糖値を様々な程度まで様々に低下させたことがわかる。使用した最も高い濃度において、ＩＩＩＣ３およびＩＣ１５の両方は、通常の生理的血清値の１０％以内まで血糖値を戻したのに対して、ＥｎｚｏＭ０１での治療は、０．０２ｍｇ／ｋｇ／日の濃度において最も効果的であった。これらの結果は、３つのすべての化合物が、低血糖症を誘発することなく低血糖症のマウスを正常の血糖値に戻すことが可能であることを実証するものである。加えて、血液試料はまた、コレステロールおよびトリグリセリドレベルに関して分析された。これは、試料を患者の試料の場合と同じように測定する臨床研究室（Ｅｎｚｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ、ニューヨーク州）に血清試料を提出することによって実施された。図２７Ａに見られるように、ＥｎｚｏＭ０１はおよび（図２７Ｂにおいて）ＩＣ１５は、トリグリセリドレベルを低下させるのに効果的であった。使用された濃度において、ＥｎｚｏＭ０１は、コレステロールを低下させるのにも効果的であったことも図２７Ａからわかる。
【０２２４】
実施例１４：糖尿病マウスの処理
これらの化合物が、高カロリーの食餌を給仕された正常なマウスに与える影響を調べるのに加えて、明らかに糖尿病およびインシュリン抵抗性のｄｂ／ｄｂマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、メイン州）をＩＩＩＣ３によって治療することで試験した。該ｄｂ／ｄｂマウスは、高レプチン症であり、一部に、食物摂取の調節および体重の調節に有意な役割を果たす長形レプチン受容体における機能的欠陥により、肥満および重度の２型糖尿病を発生させる（１１１、１１２）。
【０２２５】
糖尿病の傾向のあるマウスに１２日間にわたって高カロリーの食餌を与え、その間それらに７ｍｇ／ｋｇ／日のＩＩＩＣ３を同時に投与した。この処理の終了時に、マウスを１２時間絶食させ、耐糖試験のために１ｇ／ｋｇのグルコースのＩＰ注射剤を投与した。注射後の様々な時間において、グルコースを既に記載されているように測定し、インシュリンをインシュリンウルトラセンシティブＥＩＡ（ＡＬＰＣＯ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｓａｌｅｍ、ニューハンプシャー州）によって測定することで血液中のグルコースおよびインシュリンの濃度を分析した。図２８Ａに見られるように、ＩＩＩＣ３で処理したマウスは、グルコース処理の能力の向上を示した。この効果は、また、血漿インシュリン値の有意な低下と平行していた（図２８Ｂ）。
【０２２６】
本明細書に開示されている特定の実施形態は、本発明のいくつかの態様の実例であることを意図するため、本明細書に記載され、請求されている発明は、それらの実施形態によって範囲が限定されるものではない。あらゆる同等の実施形態が、本発明の範囲内に含まれることを意図する。実際、本明細書に示され、記載されているものに加えて、本発明の様々な変更が、先述の説明から当業者に明らかになるであろう。当該変更も添付の特許請求の範囲内に含まれることを意図する。
【０２２７】
その開示内容が全面的に引用により組み入れられる様々な参考文献が本明細書に引用されている。
【０２２８】
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【図１】
2010537950.tif 000084
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2010537950.tif 000090
【図８】
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【図９】
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【図１０】
2010537950.tif 000093
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
2010537950.tif 000097
【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
2010537950.tif 000105
【図２３】
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【図２４】
2010537950.tif 000107
【図２５】
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【図２６】
2010537950.tif 000109
【図２７】
2010537950.tif 000110
【図２８】
2010537950.tif 000111
【図２９】
2010537950.tif 000112
【国際調査報告】
2010537950.tif 000113
2010537950.tif 000114