(57)【要約】  本発明は、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドの活性を増大させる方法であって、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドを含む組成物に可溶性活性化二価金属カチオンを添加する工程を含み、可溶性活性化二価金属カチオンとセルロース分解増強活性を有するポリペプチドの存在が、可溶性活性化二価金属カチオン無しのセルロース分解増強活性を有するポリペプチドに比べて、セルロース分解酵素組成物によるセルロース含有材料の分解または転換を増大させる方法に関する。本発明は同様に、組成物、セルロース含有材料を分解または転換する方法および発酵産物の生産方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロース分解増強活性を有するポリペプチドの活性を増大させる方法であって、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドを含む組成物に可溶性活性化二価金属カチオンを添加する工程を含み、ここで、可溶性活性化二価金属カチオンが、セルロース含有材料の分解または転換の間、好ましくは約０．００１ｍＭ〜約５０ｍＭ、より好ましくは約０．０１ｍＭ〜約２５ｍＭ、より好ましくは約０．１ｍＭ〜約２５ｍＭ、より好ましくは約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ、さらに好ましくは約０．３ｍＭ〜約５ｍＭ、最も好ましくは約０．３ｍＭ〜約２．５ｍＭ、そしてさらに最も好ましくは約０．３ｍＭ〜約１ｍＭという有効濃度で存在し、かつ可溶性活性化二価金属カチオンとセルロース分解増強活性を有するポリペプチドの存在が、可溶性活性化二価金属カチオン無しのセルロース分解増強活性を有するポリペプチドに比べて、セルロース分解酵素組成物によるセルロース含有材料の分解または転換を増大させる方法。
【請求項２】
可溶性活性化二価金属カチオンが、Ｍｎ++、Ｃｏ++、Ｍｇ++、Ｃａ++およびその組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
セルロース分解増強活性を有するポリペプチドが、
（ａ）［ＩＬＭＶ］−Ｐ−Ｘ（４，５）−Ｇ−Ｘ−Ｙ−［ＩＬＭＶ］−Ｘ−Ｒ−Ｘ−［ＥＱ］−Ｘ（４）−［ＨＮＱ］および［ＦＷ］−［ＴＦ］−Ｋ−［ＡＩＶ］を含むセルロース分解増強活性を有し、式中Ｘが任意のアミノ酸であり、Ｘ（４，５）が４つまたは５つの隣接位置にある任意のアミノ酸であり、Ｘ（４）が４つの隣接位置にある任意のアミノ酸であるポリペプチド；および
（ｂ）［ＩＬＭＶ］−Ｐ−ｘ（４，５）−Ｇ−ｘ−Ｙ−［ＩＬＭＶ］−ｘ−Ｒ−ｘ−［ＥＱ］−ｘ（３）−Ａ−［ＨＮＱ］を含むセルロース分解増強活性を有し、式中Ｘが任意のアミノ酸であり、Ｘ（４，５）が４つまたは５つの隣接位置にある任意のアミノ酸であり、Ｘ（３）は、３つの隣接位置にある任意のアミノ酸であるポリペプチド；
からなる群から選択され、
ここで、［ＩＬＭＶ］−Ｐ−Ｘ（４，５）−Ｇ−Ｘ−Ｙ−［ＩＬＭＶ］−Ｘ−Ｒ−Ｘ−［ＥＱ］−Ｘ（４）−［ＨＮＱ］および［ＦＷ］−［ＴＦ］−Ｋ−［ＡＩＶ］を含むセルロース分解増強活性を有するポリペプチドが、任意にはさらに、
Ｈ−Ｘ（１，２）−Ｇ−Ｐ−Ｘ（３）−［ＹＷ］−［ＡＩＬＭＶ］、
［ＥＱ］−Ｘ−Ｙ−Ｘ（２）−Ｃ−Ｘ−［ＥＨＱＮ］−［ＦＩＬＶ］−Ｘ−［ＩＬＶ］、または
Ｈ−Ｘ（１，２）−Ｇ−Ｐ−Ｘ（３）−［ＹＷ］−［ＡＩＬＭＶ］および［ＥＱ］−Ｘ−Ｙ−Ｘ（２）−Ｃ−Ｘ−［ＥＨＱＮ］−［ＦＩＬＶ］−Ｘ−［ＩＬＶ］を含み、式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、Ｘ（１，２）は１つの位置または２つの隣接位置にある任意のアミノ酸であり、Ｘ（３）は３つの隣接位置にある任意のアミノ酸であり、Ｘ（２）は２つの隣接位置にある任意のアミノ酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
セルロース分解増強活性を有するポリペプチドが、
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４の成熟ポリペプチドに対する好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに一層好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）好ましくは少なくとも中度のストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中−高度のストリンジェンシー条件そして最も好ましくは少なくとも高度のストリンジェンシー条件下で、（ｉ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１または配列番号１３の成熟ポリペプチドコーディング配列、（ｉｉ）配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号１１の成熟ポリペプチドコーディング配列内に含まれたｃＤＮＡ配列または配列番号７、配列番号９または配列番号１３の成熟ポリペプチドコーディング配列を含むゲノムＤＮＡ配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）の全長相補ストランドとハイブリッド形成するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；
（ｃ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１または配列番号１３の成熟ポリペプチドコーディング配列に対する好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに一層好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；
（ｄ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８または配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４の成熟ポリペプチドの１つ以上のアミノ酸の置換、欠失および／または挿入を含む変異体；および
（ｅ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８または配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４の成熟ポリペプチドを含むかまたはそれからなるセルロース分解増強活性を有するポリペプチドまたは、セルロース分解増強活性を有するそのフラグメント
からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
セルロース分解増強活性を有するポリペプチドが、E. coli ＮＲＲＬ  Ｂ−３０６９９内に含まれるプラスミドｐＥＪＧ１２０、E. coli ＮＲＲＬ  Ｂ−３０８１３中に含まれるプラスミドｐＴｔｅｒ６１Ｃ、E. coli ＮＲＲＬ  Ｂ３０８１２中に含まれるプラスミドｐＴｔｅｒ６１Ｄ、E. coli ＮＲＲＬ  Ｂ−３０８１４中に含まれるプラスミドｐＴｔｅｒ６１Ｅ、E. coli ＮＲＲＬ  Ｂ−３０８１１中に含まれるプラスミドｐＴｔｅｒ６１、E. coli ＮＲＲＬ  Ｂ−３０７０４中に含まれるプラスミドｐＤＺＡ２−７またはE. coli ＮＲＲＬ  Ｂ−３０３７８中に含まれるプラスミドｐＴｒ３３３７の中に含まれるポリヌクレオチドによってコードされる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
セルロース含有材料を分解または転換する方法であって、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドと可溶性活性化二価金属カチオンを有効量含む有効量のセルロース分解酵素組成物でセルロース含有材料を処理する工程を含み、ここで、可溶性活性化二価金属カチオンが、セルロース含有材料の分解または転換の間、好ましくは約０．００１ｍＭ〜約５０ｍＭ、より好ましくは約０．０１ｍＭ〜約２５ｍＭ、より好ましくは約０．１ｍＭ〜約２５ｍＭ、より好ましくは約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ、さらに好ましくは約０．３ｍＭ〜約５ｍＭ、最も好ましくは約０．３ｍＭ〜約２．５ｍＭ、そしてさらに最も好ましくは約０．３ｍＭ〜約１ｍＭという有効濃度で存在する方法。
【請求項７】
可溶性活性化二価金属カチオンが、Ｍｎ++、Ｃｏ++、Ｍｇ++、Ｃａ++およびその組合せからなる群から選択されている、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
セルロース分解増強活性を有するポリペプチドが、
（ａ）［ＩＬＭＶ］−Ｐ−Ｘ（４，５）−Ｇ−Ｘ−Ｙ−［ＩＬＭＶ］−Ｘ−Ｒ−Ｘ−［ＥＱ］−Ｘ（４）−［ＨＮＱ］および［ＦＷ］−［ＴＦ］−Ｋ−［ＡＩＶ］を含むセルロース分解増強活性を有し、式中Ｘが任意のアミノ酸であり、Ｘ（４，５）が４つまたは５つの隣接位置にある任意のアミノ酸であり、Ｘ（４）が４つの隣接位置にある任意のアミノ酸であるポリペプチド；および
（ｂ）［ＩＬＭＶ］−Ｐ−ｘ（４，５）−Ｇ−ｘ−Ｙ−［ＩＬＭＶ］−ｘ−Ｒ−ｘ−［ＥＱ］−ｘ（３）−Ａ−［ＨＮＱ］を含むセルロース分解増強活性を有し、式中Ｘが任意のアミノ酸であり、Ｘ（４，５）が４つまたは５つの隣接位置にある任意のアミノ酸であり、Ｘ（３）は、３つの隣接位置にある任意のアミノ酸であるポリペプチド；
からなる群から選択され、
ここで、［ＩＬＭＶ］−Ｐ−Ｘ（４，５）−Ｇ−Ｘ−Ｙ−［ＩＬＭＶ］−Ｘ−Ｒ−Ｘ−［ＥＱ］−Ｘ（４）−［ＨＮＱ］および［ＦＷ］−［ＴＦ］−Ｋ−［ＡＩＶ］を含むセルロース分解増強活性を有するポリペプチドが、任意にはさらに、
Ｈ−Ｘ（１，２）−Ｇ−Ｐ−Ｘ（３）−［ＹＷ］−［ＡＩＬＭＶ］、
［ＥＱ］−Ｘ−Ｙ−Ｘ（２）−Ｃ−Ｘ−［ＥＨＱＮ］−［ＦＩＬＶ］−Ｘ−［ＩＬＶ］、または
Ｈ−Ｘ（１，２）−Ｇ−Ｐ−Ｘ（３）−［ＹＷ］−［ＡＩＬＭＶ］および［ＥＱ］−Ｘ−Ｙ−Ｘ（２）−Ｃ−Ｘ−［ＥＨＱＮ］−［ＦＩＬＶ］−Ｘ−［ＩＬＶ］を含み、式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、Ｘ（１，２）は１つの位置または２つの隣接位置にある任意のアミノ酸であり、Ｘ（３）は３つの隣接位置にある任意のアミノ酸であり、Ｘ（２）は２つの隣接位置にある任意のアミノ酸である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
セルロース分解増強活性を有するポリペプチドが、
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４の成熟ポリペプチドに対する好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに一層好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（ｂ）好ましくは少なくとも中度のストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中−高度のストリンジェンシー条件そして最も好ましくは少なくとも高度のストリンジェンシー条件下で、（ｉ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１または配列番号１３の成熟ポリペプチドコーディング配列、（ｉｉ）配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号１１の成熟ポリペプチドコーディング配列内に含まれたｃＤＮＡ配列または配列番号７、配列番号９または配列番号１３の成熟ポリペプチドコーディング配列を含むゲノムＤＮＡ配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）の全長相補ストランドとハイブリッド形成するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；
（ｃ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１または配列番号１３の成熟ポリペプチドコーディング配列に対する好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに一層好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；
（ｄ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８または配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４の成熟ポリペプチドの１つ以上のアミノ酸の置換、欠失および／または挿入を含む変異体；および
（ｅ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８または配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４の成熟ポリペプチドを含むかまたはそれからなるセルロース分解増強活性を有するポリペプチドまたは、セルロース分解増強活性を有するそのフラグメント
からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
セルロース分解増強活性を有するポリペプチドが、E. coli ＮＲＲＬ  Ｂ−３０６９９内に含まれるプラスミドｐＥＪＧ１２０、E. coli ＮＲＲＬ  Ｂ−３０８１３中に含まれるプラスミドｐＴｔｅｒ６１Ｃ、E. coli ＮＲＲＬ  Ｂ３０８１２中に含まれるプラスミドｐＴｔｅｒ６１Ｄ、E. coli ＮＲＲＬ  Ｂ−３０８１４中に含まれるプラスミドｐＴｔｅｒ６１Ｅ、E. coli ＮＲＲＬ  Ｂ−３０８１１中に含まれるプラスミドｐＴｔｅｒ６１、E. coli ＮＲＲＬ  Ｂ−３０７０４中に含まれるプラスミドｐＤＺＡ２−７またはE. coli ＮＲＲＬ  Ｂ−３０３７８中に含まれるプラスミドｐＴｒ３３３７の中に含まれるポリヌクレオチドによってコードされる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
有効量のベータ−グルコシダーゼで、セルロース含有材料を処理する工程をさらに含む、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ヘミセルラーゼ、エステラーゼ、プロテアーゼ、ラッカーゼ、ペルオキシダーゼまたはそれらの混合物からなる群から選択された１つ以上の有効量の酵素でセルロース含有材料を処理する工程をさらに含む、請求項６〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
可溶性活性化二価金属カチオンの有効濃度を好ましくは約０．００１ｍＭ〜約５０ｍＭ、より好ましくは約０．０１ｍＭ〜約２５ｍＭ、より好ましくは約０．１ｍＭ〜約２５ｍＭ、より好ましくは約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ、さらに一層好ましくは約０．３ｍＭ〜約５ｍＭ、最も好ましくは約０．３ｍＭ〜約２．５ｍＭ、そしてさらに一層好ましくは約０．３ｍＭ〜約１ｍＭに維持するべく可溶性活性化二価金属カチオンの濃度を補足する工程をさらに含む、請求項６〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
分解されたセルロース含有材料を回収する工程をさらに含む、請求項６〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
発酵産物を生産するための方法であって；（ａ）セルロース分解増強活性を有するポリペプチドおよび可溶性活性化二価金属カチオンを有効量含む有効量のセルロース分解酵素組成物でセルロース含有材料を糖化する工程であって、ここで可溶性活性化二価金属カチオンが、好ましくは約０．００１ｍＭ〜約５０ｍＭ、より好ましくは約０．０１ｍＭ〜約２５ｍＭ、より好ましくは約０．１ｍＭ〜約２５ｍＭ、より好ましくは約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ、さらに好ましくは約０．３ｍＭ〜約５ｍＭ、最も好ましくは約０．３ｍＭ〜約２．５ｍＭ、そしてさらに最も好ましくは約０．３ｍＭ〜約１ｍＭという有効濃度で存在している工程；（ｂ）工程（ａ）の糖化されたセルロース含有材料を１つ以上の発酵用微生物で発酵させて発酵産物を生産する工程；および（ｃ）発酵から発酵産物を回収する工程を含む方法。
【請求項１６】
可溶性活性化二価金属カチオンが、Ｍｎ++、Ｃｏ++、Ｍｇ++、Ｃａ++およびその組合せからなる群から選択されている、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
セルロース分解増強活性を有するポリペプチドが、
（ａ）［ＩＬＭＶ］−Ｐ−Ｘ（４，５）−Ｇ−Ｘ−Ｙ−［ＩＬＭＶ］−Ｘ−Ｒ−Ｘ−［ＥＱ］−Ｘ（４）−［ＨＮＱ］および［ＦＷ］−［ＴＦ］−Ｋ−［ＡＩＶ］を含むセルロース分解増強活性を有し、式中Ｘが任意のアミノ酸であり、Ｘ（４，５）が４つまたは５つの隣接位置にある任意のアミノ酸であり、Ｘ（４）が４つの隣接位置にある任意のアミノ酸であるポリペプチド；および
（ｂ）［ＩＬＭＶ］−Ｐ−ｘ（４，５）−Ｇ−ｘ−Ｙ−［ＩＬＭＶ］−ｘ−Ｒ−ｘ−［ＥＱ］−ｘ（３）−Ａ−［ＨＮＱ］を含むセルロース分解増強活性を有し、式中Ｘが任意のアミノ酸であり、Ｘ（４，５）が４つまたは５つの隣接位置にある任意のアミノ酸であり、Ｘ（３）は、３つの隣接位置にある任意のアミノ酸であるポリペプチド；
からなる群から選択されており、
ここで、［ＩＬＭＶ］−Ｐ−Ｘ（４，５）−Ｇ−Ｘ−Ｙ−［ＩＬＭＶ］−Ｘ−Ｒ−Ｘ−［ＥＱ］−Ｘ（４）−［ＨＮＱ］および［ＦＷ］−［ＴＦ］−Ｋ−［ＡＩＶ］を含むセルロース分解増強活性を有するポリペプチドが、任意にはさらに、
Ｈ−Ｘ（１，２）−Ｇ−Ｐ−Ｘ（３）−［ＹＷ］−［ＡＩＬＭＶ］、
［ＥＱ］−Ｘ−Ｙ−Ｘ（２）−Ｃ−Ｘ−［ＥＨＱＮ］−［ＦＩＬＶ］−Ｘ−［ＩＬＶ］、または
Ｈ−Ｘ（１，２）−Ｇ−Ｐ−Ｘ（３）−［ＹＷ］−［ＡＩＬＭＶ］および［ＥＱ］−Ｘ−Ｙ−Ｘ（２）−Ｃ−Ｘ−［ＥＨＱＮ］−［ＦＩＬＶ］−Ｘ−［ＩＬＶ］を含み、式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、Ｘ（１，２）は１つの位置または２つの隣接位置にある任意のアミノ酸であり、Ｘ（３）は３つの隣接位置にある任意のアミノ酸であり、Ｘ（２）は２つの隣接位置にある任意のアミノ酸である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
セルロース分解増強活性を有するポリペプチドが、
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４の成熟ポリペプチドに対する好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに一層好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（ｂ）好ましくは少なくとも中度のストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中−高度のストリンジェンシー条件そして最も好ましくは少なくとも高度のストリンジェンシー条件下で、（ｉ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１または配列番号１３の成熟ポリペプチドコーディング配列、（ｉｉ）配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号１１の成熟ポリペプチドコーディング配列内に含まれたｃＤＮＡ配列または配列番号７、配列番号９または配列番号１３の成熟ポリペプチドコーディング配列を含むゲノムＤＮＡ配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）の全長相補ストランドとハイブリッド形成するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；
（ｃ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１または配列番号１３の成熟ポリペプチドコーディング配列に対する好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに一層好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；
（ｄ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８または配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４の成熟ポリペプチドの１つ以上のアミノ酸の置換、欠失および／または挿入を含む変異体；および
（ｅ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８または配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４の成熟ポリペプチドを含むかまたはそれからなるセルロース分解増強活性を有するポリペプチドまたは、セルロース分解増強活性を有するそのフラグメント
からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
セルロース分解増強活性を有するポリペプチドが、E. coli ＮＲＲＬ  Ｂ−３０６９９内に含まれるプラスミドｐＥＪＧ１２０、E. coli ＮＲＲＬ  Ｂ−３０８１３中に含まれるプラスミドｐＴｔｅｒ６１Ｃ、E. coli ＮＲＲＬ  Ｂ３０８１２中に含まれるプラスミドｐＴｔｅｒ６１Ｄ、E. coli ＮＲＲＬ  Ｂ−３０８１４中に含まれるプラスミドｐＴｔｅｒ６１Ｅ、E. coli ＮＲＲＬ  Ｂ−３０８１１中に含まれるプラスミドｐＴｔｅｒ６１、E. coli ＮＲＲＬ  Ｂ−３０７０４中に含まれるプラスミドｐＤＺＡ２−７またはE. coli ＮＲＲＬ  Ｂ−３０３７８中に含まれるプラスミドｐＴｒ３３３７の中に含まれるポリヌクレオチドによってコードされる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
有効量のベータ−グルコシダーゼで、セルロース含有材料を処理する工程をさらに含む、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
ヘミセルラーゼ、エステラーゼ、プロテアーゼ、ラッカーゼ、ペルオキシダーゼまたはそれらの混合物からなる群から選択された１つ以上の有効量の酵素でセルロース含有材料を処理する工程をさらに含む、請求項１５〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
可溶性活性化二価金属カチオンの有効濃度を好ましくは約０．００１ｍＭ〜約５０ｍＭ、より好ましくは約０．０１ｍＭ〜約２５ｍＭ、より好ましくは約０．１ｍＭ〜約２５ｍＭ、より好ましくは約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ、さらに一層好ましくは約０．３ｍＭ〜約５ｍＭ、最も好ましくは約０．３ｍＭ〜約２．５ｍＭ、そしてさらに一層好ましくは約０．３ｍＭ〜約１ｍＭに維持するべく可溶性活性化二価金属カチオンの濃度を補足する工程をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
発酵産物がアルコール、有機酸、ケトン、アルデヒド、アミノ酸または気体である、請求項１５〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
セルロース分解増強活性を有するポリペプチドおよび可溶性活性化二価金属カチオンを含むセルロース分解酵素組成物であって、可溶性活性化二価金属カチオンが、セルロース含有材料の分解または転換の間、好ましくは約０．００１ｍＭ〜約５０ｍＭ、より好ましくは約０．０１ｍＭ〜約２５ｍＭ、より好ましくは約０．１ｍＭ〜約２５ｍＭ、より好ましくは約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ、さらに好ましくは約０．３ｍＭ〜約５ｍＭ、最も好ましくは約０．３ｍＭ〜約２．５ｍＭ、そしてさらに最も好ましくは約０．３ｍＭ〜約１ｍＭという有効濃度で存在し、かつ可溶性活性化二価金属カチオンとセルロース分解増強活性を有するポリペプチドの存在が、可溶性活性化二価金属カチオン無しのセルロース分解増強活性を有するポリペプチドに比べて、セルロース分解酵素組成物によるセルロース含有材料の分解または転換を増大させるセルロース分解酵素組成物。
【請求項２５】
可溶性活性化二価金属カチオンが、Ｍｎ++、Ｃｏ++、Ｍｇ++、Ｃａ++およびその組合せからなる群から選択されている、請求項２４に記載のセルロース分解酵素組成物。
【請求項２６】
セルロース分解増強活性を有するポリペプチドおよび可溶性活性化二価金属カチオンを含む組成物であって、可溶性活性化二価金属カチオンが、セルロース含有材料の分解または転換の間、好ましくは約０．００１ｍＭ〜約５０ｍＭ、より好ましくは約０．０１ｍＭ〜約２５ｍＭ、より好ましくは約０．１ｍＭ〜約２５ｍＭ、より好ましくは約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ、さらに好ましくは約０．３ｍＭ〜約５ｍＭ、最も好ましくは約０．３ｍＭ〜約２．５ｍＭ、そしてさらに最も好ましくは約０．３ｍＭ〜約１ｍＭという有効濃度で存在し、かつ可溶性活性化二価金属カチオンとセルロース分解増強活性を有するポリペプチドの存在が、可溶性活性化二価金属カチオン無しのセルロース分解増強活性を有するポリペプチドに比べて、セルロース分解酵素組成物によるセルロース含有材料の分解または転換を増大させる組成物。
【請求項２７】
可溶性活性化二価金属カチオンが、Ｍｎ++、Ｃｏ++、Ｍｇ++、Ｃａ++およびその組合せからなる群から選択されている、請求項２６に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表に関する言及
本出願は、コンピュータ可読形式での配列リストを含む。このコンピュータ可読形式は、本明細書に参照により援用される。
【０００２】
生物材料の寄託に関する言及
本出願は、生物材料の寄託に対する言及を含んでおり、かかる寄託は本発明に参照により援用される。
【０００３】
発明の分野
本発明は、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドの活性を増大させるための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
関連技術の記載
セルロースは、ベータ−１，４−連結によって共有結合された単糖グルコースのポリマーである。数多くの微生物が、ベータ連結グリカンを加水分解させる酵素を産生する。これらの酵素には、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、およびベータ−グルコシダーゼが含まれる。エンドグルカナーゼはセルロースポリマーをランダム位置で消化し、それをセロビオヒドロラーゼによる攻撃に対し開放する。セロビオヒドロラーゼは、セルロースポリマーの末端からセロビオース分子を連続的に放出する。セルビオースは、グルコースの水溶性ベータ−１，４−連結ダイマーである。ベータ−グルコシダーゼは、セロビオースをグルコースに加水分解する。
【０００５】
セルロース供給原料のエタノールへの転換には、大量の供給原料が容易に入手できること、材料の燃焼または埋立ての回避が望めることそしてエタノール燃料が清浄であること、といった利点がある。木材、農業残留物、草本作物および都市固形廃棄物が、エタノール生産用の供給原料とみなされてきた。これらの材料は主として、セルロース、ヘミセルロースおよびリグニンからなる。セルロースがひとたびグルコースへと転換されると、グルコースは、酵母により容易にエタノールに発酵される。
【０００６】
国際公開第２００５／０７４６４７号（WO2005/074647）は、Thielavia terrestris由来の、セルロース分解増強活性を有する単離ポリペプチドおよびそのポリヌクレオチドを開示している。国際公開第２００５／０７４６５６号（WO2005/074656）は、Thermoascus aurantlacus由来の、セルロース分解増強活性を有する単離ポリペプチドおよびそのポリヌクレオチドを開示している。米国特許出願公開第２００７／００７７６３０号（U. S. Published Application Serial No. 2007/0077630）は、Trichoderma reesei由来の、セルロース分解増強活性を有する単離ポリペプチドおよびそのポリヌクレオチドを開示している。
【０００７】
セルロース分解増強活性を有するポリペプチドの活性を改善することは、当該技術分野において１つの利点である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドの活性を増大するための方法および組成物に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドの活性を増大させる方法であって、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドを含む組成物に可溶性活性化二価金属カチオンを添加する工程を含む方法であって、可溶性活性化二価金属カチオンが、セルロース含有材料の分解または転換の間、約０．００１ｍＭ〜約５０ｍＭという有効濃度で存在し、かつ可溶性活性化二価金属カチオンとセルロース分解増強活性を有するポリペプチドの存在が、可溶性活性化二価金属カチオン無しのセルロース分解増強活性を有するポリペプチドに比べて、セルロース分解酵素組成物によるセルロース含有材料の分解または転換を増大させる方法に関する。
【００１０】
本発明は同様に、セルロース含有材料を分解または転換する方法であって、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドと可溶性活性化二価金属カチオンを有効量含む有効量のセルロース分解酵素組成物でセルロース含有材料を処理する工程を含み、可溶性活性化二価金属カチオンが、約０．００１μＭ〜約５０μＭという有効濃度で存在する方法に関する。
【００１１】
本発明は同様に、発酵産物を生産するための方法であって；（ａ）セルロース分解増強活性を有するポリペプチドおよび可溶性活性化二価金属カチオンを有効量含む有効量のセルロース分解酵素組成物でセルロース含有材料を糖化する工程であって、ここで可溶性活性化二価金属カチオンが、約０．００１ｍＭ〜約５０ｍＭという有効濃度で存在している工程；（ｂ）工程（ａ）の糖化されたセルロース含有材料を１つ以上の発酵用微生物で発酵させて発酵産物を生産する工程；および（ｃ）発酵から発酵産物を回収する工程、を含む方法にも関する。
【００１２】
本発明は同様に、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドおよび可溶性活性化二価金属カチオンを含む組成物であって、可溶性活性化二価金属カチオンが、セルロース含有材料の分解または転換の間、約０．００１ｍＭ〜約５０ｍＭという有効濃度で存在し、かつ可溶性活性化二価金属カチオンとセルロース分解増強活性を有するポリペプチドの存在が、可溶性活性化二価金属カチオン無しのセルロース分解増強活性を有するポリペプチドに比べて、セルロース分解酵素組成物によるセルロース含有材料の分解または転換を増大させる組成物にも関する。
【００１３】
本発明は同様に、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドおよび可溶性活性化二価金属カチオンを有効料含むセルロース分解酵素組成物であって、可溶性活性化二価金属カチオンが、セルロース含有材料の分解または転換の間、約０．００１ｍＭ〜約５０ｍＭという有効濃度で存在し、かつ可溶性活性化二価金属カチオンとセルロース分解増強活性を有するポリペプチドの存在が、可溶性活性化二価金属カチオン無しのセルロース分解増強活性を有するポリペプチドに比べて、セルロース分解酵素組成物によるセルロース含有材料の分解または転換を増大させるセルロース分解酵素組成物にも関する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ｐＭＪ０４の制限地図を示す。
【図２】ｐＣａＨｊ５２７の制限地図を示す。
【図３】ｐＭＴ２１８８の制限地図を示す。
【図４】ｐＣａＨｊ５６８の制限地図を示す。
【図５】ｐＭＪ０５の制限地図を示す。
【図６】ｐＳＭａｉ１３０の制限地図を示す。
【図７】Aspergillus oryzaeベータ−グルコシダーゼ天然シグナル配列のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す（配列番号５７および５８）。
【図８】Humicola insolensエンドグルカナーゼＶシグナル配列のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す（配列番号６１および６２）。
【図９】ｐＳＭａｌ１３５の制限地図を示す。
【図１０】ｐＳＭａｉ１４０の制限地図を示す。
【図１１】ｐＳａＭｅ−Ｆ１の制限地図を示す。
【図１２Ａ】Aspergillus oryzaeベータ−グルコシダーゼ変異体ＢＧ融合タンパク質のＤＮＡ配列および演繹されたアミノ酸配列を示す（それぞれ配列番号２５および２６）。
【図１２Ｂ】Aspergillus oryzaeベータ−グルコシダーゼ変異体ＢＧ融合タンパク質のＤＮＡ配列および演繹されたアミノ酸配列を示す（それぞれ配列番号２５および２６）。
【図１２Ｃ】Aspergillus oryzaeベータ−グルコシダーゼ変異体ＢＧ融合タンパク質のＤＮＡ配列および演繹されたアミノ酸配列を示す（それぞれ配列番号２５および２６）。
【図１２Ｄ】Aspergillus oryzaeベータ−グルコシダーゼ変異体ＢＧ融合タンパク質のＤＮＡ配列および演繹されたアミノ酸配列を示す（それぞれ配列番号２５および２６）。
【図１３】ｐＳａＭｅ−ＦＸの制限地図を示す。
【図１４Ａ】Aspergillus oryzaeベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質のＤＮＡ配列および演繹されたアミノ酸配列を示す（それぞれ配列番号２７および２８）。
【図１４Ｂ】Aspergillus oryzaeベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質のＤＮＡ配列および演繹されたアミノ酸配列を示す（それぞれ配列番号２７および２８）。
【図１４Ｃ】Aspergillus oryzaeベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質のＤＮＡ配列および演繹されたアミノ酸配列を示す（それぞれ配列番号２７および２８）。
【図１４Ｄ】Aspergillus oryzaeベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質のＤＮＡ配列および演繹されたアミノ酸配列を示す（それぞれ配列番号２７および２８）。
【図１５】ｐＡＩＬｏ４７の制限地図を示す。
【図１６】Trichoderma reeseiセルロース分解酵素、Aspergillus oryzaeベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質およびセルロース分解増強活性を有するThermoascus aurantiacus ＧＨ６１Ａポリペプチドを含む発酵ブロスを含む混合物に対する１０ｍＭの最終濃度に至るまでのさまざまな可溶性二価金属イオンの添加を伴う、前処理されたトウモロコシ茎葉中のセルロースの、グルコースおよびセロビオースへの転換を示す。
【図１７】セルロース分解増強活性を有するThermoascus aurantiacus ＧＨ６１Ａポリペプチドの添加を伴うおよび伴わないTrichoderma reeseiセルロース分解酵素およびAspergillus oryzaeベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質を含む発酵ブロスを含む混合物中の１ｍＭの最終濃度に至るまでのさまざまな二価金属イオンの添加を伴う、前処理されたトウモロコシ茎葉中のセルロースの、グルコースおよびセロビオースへの転換を示す。
【図１８】Trichoderma reeseiセルロース分解酵素、Aspergillus oryzaeベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質およびセルロース分解増強活性を有するThermoascus aurantiacus ＧＨ６１Ａポリペプチドを含む脱塩または非脱塩発酵ブロスを含む混合物中の０．０００１〜１０ｍＭの最終濃度に至るまでのＭｇＣｌ2およびＭｎＳＯ4の添加を伴う、前処理されたトウモロコシ茎葉中のセルロースの、グルコースおよびセロビオースへの転換を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
定義
セルロース分解増強活性：「セルロース分解増強活性」という用語は、本明細書において、セルロース分解活性を有するタンパク質によるセルロース含有材料の加水分解を増強させる生物活性として定義される。本発明では、セルロース分解増強活性は、５０℃で１〜７日間、ＰＣＳ中のセルロース１ｇあたり８０〜９９．５％ｗ／ｗのセルロース分解タンパク質およびセルロース分解増強活性を有する０．５〜２０％ｗ／ｗのタンパク質を含む１〜５０ｍｇの総タンパク質という条件下におけるセルロース分解タンパク質によるセルロース含有材料の加水分解に由来する還元糖の増加またはセロビオースとグルコースの合計の増加を、セルロース分解増強活性のない等しいタンパク質負荷（ＰＣＳ中のセルロース１ｇあたり１〜５０ｍｇのセルロース分解タンパク質）での対照加水分解に対比させて測定することによって決定される。好ましい態様では、セルラーゼタンパク質負荷の３％のAspergillus oryzaeベータ−グルコシダーゼ（国際公開第０２／０９５０１４号（WO02/095014）にしたがってAspergillus oryzae内で組換えにより産生されるもの）または３％のAspergillus fumigatusベータ−グルコシダーゼ（国際公開第０２／０９５０１４号（WO02/095014）の実施例２２にしたがってAspergillus oryzae内で組換えにより産生されるもの）の存在下でのＣＥＬＬＵＣＬＡＳＴ（登録商標）１．５Ｌ（Novozymes A/S、Bagsvaerd、Denmark）の混合物が、セルロース分解活性の標準として用いられる。
【００１６】
セルロース分解増強活性を有するポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２または１４の成熟ポリペプチドのセルロース分解増強活性の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに一層好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、そしてさらに最も好ましくは少なくとも１００％を有する。
【００１７】
セルロース分解増強活性を有するポリペプチドは、同じ加水分解度に達するのに必要とされるセルロース分解酵素の量を、好ましくは少なくとも０．１倍、より好ましくは少なくとも０．２倍、より好ましくは少なくとも０．３倍、より好ましくは少なくとも０．４倍、より好ましくは少なくとも０．５倍に削減して、セルロース分解活性を有するタンパク質を触媒とするセルロース含有材料の加水分解を、より好ましくは少なくとも１倍、より好ましくは少なくとも３倍、より好ましくは少なくとも４倍、より好ましくは少なくとも５倍、より好ましくは少なくとも１０倍、より好ましくは少なくとも２０倍、さらに一層好ましくは少なくとも３０倍、最も好ましくは少なくとも５０倍、そしてさらに最も好ましくは少なくとも１００倍増強させる。
【００１８】
セルロース分解活性：「セルロース分解活性」という用語は、本明細書において、セルロース含有材料を加水分解するセルラーゼ活性（例えばエンドグルカナーゼ（単複）、セロビオヒドロラーゼ（単複）、ベータ−グルコシダーゼ（単複）またはそれらの組合せ）として定義される。セルロース分解タンパク質は、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を加水分解し得るまたは加水分解し、かくしてインキュベーション（ＭＸ）の粘度を減少させる。結果として得られる粘度削減は、振動粘度計（例えばフランスSofraser社製ＭＩＶＩ３０００）によって決定可能である。セルラーゼ粘度単位（ＣＥＶＵ）で測定されるセルラーゼ活性を判定することを通して、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）溶液の粘度を削減する試料の能力を測定することによって試料中に存在する触媒活性の量が定量化される。検定は、セルロース分解タンパク質および基質に適した温度とｐＨで実施される。
【００１９】
本発明に関しては、セルロース分解活性は、５０℃で１〜７日間、ＰＣＳ中のセルロース１ｇあたり１〜５０ｍｇのセルロース分解タンパク質というという条件下におけるセルロース分解組成物によるセルロース含有材料の加水分解の増加をセルロース分解タンパク質無添加の対照加水分解に対比させて測定することによって決定される。
【００２０】
エンドグルカナーゼ：「エンドグルカナーゼ」という用語は、本明細書において、セルロース、セルロース誘導体（例えばカルボキシメチルセルロースおよびヒドロキシエチルセルロース）、リケニン、穀物ベータＤ−グルカンまたはキシログルカンなどの混合ベータ−１，３グルカン中のベータ−１，４結合、およびセルロース系構成要素を含有するその他の植物材料における１，４−ベータ−Ｄ−グリコシド連結のエンド型加水分解の触媒として作用するエンド−１，４−（１，３；１，４）−ベータ−Ｄ−グルカン・４グルカノヒドロラーゼ（E.C. No.3.2.1.4）として定義される。本発明では、エンドグルカナーゼ活性は、Ghose、１９８７年、Pure and Appl. Chem.、第５９号、２５７〜２６８頁の手順にしたがったカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）加水分解を用いて決定される。
【００２１】
セロビオヒドロラーゼ：「セロビオヒドロラーゼ」という用語は、本明細書において、鎖の還元または非還元末端からセロビオースを放出する任意のベータ−１，４−連結型グルコース含有ポリマー中における１，４−ベータ−Ｄ−グルコシド連結の加水分解の触媒として作用する１，４−ベータ−Ｄ−グルカンセロビオヒドロラーゼ（E.C.3.2.1.91）として定義される。本発明に関しては、セロビオヒドロラーゼ活性は、Leverら、１９７２年、Anal. Biochem.、第４７号、２７３〜２７９頁およびvan Tilbeurgh ら、１９８２年、FEBS Letters、第１４９号、１５２〜１５６頁；van TilbeurghおよびClaeyssens、１９８５年、FEBS Letters、第１８７号、２８３〜２８８頁により記述された手順にしたがって決定される。本発明では、トウモロコシ茎葉中のセルロースの加水分解を評価するためにはLeverらの方法が利用され、一方、蛍光二糖誘導体上でのセロビオヒドロラーゼ活性を決定するためには、Van Tibeurghらの方法が使用された。
【００２２】
ベータ−グルコシダーゼ：「ベータ−グルコシダーゼ」という用語は、本明細書において、ベータ−Ｄ−グルコースの放出を伴って末端非還元ベータ−Ｄ−グルコース残基の加水分解の触媒として作用するベータ−Ｄ−グルコシドグルコヒドロラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．２１）として定義される。本発明に関しては、本明細書において記述されている通り異なる条件が用いられたという点を除き、Venturiら、２００２年、J. Basic Microbiol.、第４２号５５〜６６頁によって記述された基本的手順にしたがってベータ−グルコシダーゼ活性が決定される。ベータ−グルコシダーゼ活性の１単位は、１００ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．０１％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０中の基質としての４ｍＭのｐ−ニトロフェニル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシドから５０℃、ｐＨ５で毎分生産される１．０μｍｏｌｅのｐ−ニトロフェノールとして定義される。
【００２３】
ファミリー７，１２，４５または６１グリコシドヒドロラーゼ：「ファミリー７グリコシドヒドロラーゼ」または「ファミリーＧＨ７」、「ファミリー１２グリコシドヒドロラーゼ」または「ファミリーＧＨ１２」、「ファミリー４５グリコシドヒドロラーゼ」または「ファミリーＧＨ４５」および「ファミリー６１グリコシドヒドロラーゼ」または「ファミリーＧＨ６１」という用語は、本明細書において、Henrissat、１９９１年、「A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities」、Biochem. J.、第２８０号、３０９〜３１６頁、ならびにHenrissat B.およびBairoch A.、１９９６年、「Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases」、Biochem. J.、第３１６号、６９５〜６９６頁にしたがってそれぞれグリコシドヒドロラーゼファミリー７、ファミリー１２、ファミリー４５、およびファミリー６１の範疇に入るポリペプチドとして定義される。現在、Henrissatは、ＧＨ６１ファミリーを未分類のものとして列挙しており、このファミリーに属するポリペプチドについては、機序、触媒求核試薬／塩基、触媒プロトン供与体、および３−Ｄ構造などの特性が未知であると指摘している。ＧＨ７、ＧＨ１２、またはＧＨ４５タンパク質は同様にそれぞれＣＥＬ７、ＣＥＬ１２、またはＣＥＬ４５タンパク質とも呼ばれている。
【００２４】
セルロース含有材料：バイオマスの一次細胞壁内の支配的な多糖類はセルロースであり、２番目に豊富であるのはヘミセルロース、そして３番目はペクチンである。細胞が成長を停止した後に産生された二次細胞壁も同様に多糖類を含有し、ヘミセルロースに対し共有結合により架橋されたポリマーリグニンによって強化されている。セルロースは、アンヒドロセロビオースのホモポリマー、ひいては直鎖状ベータ−（１，４）−Ｄ−グルカンであり、一方ヘミセルロースはさまざまな化合物、例えばキシラン、キシログルカン、アラビノキシランおよびマンナンを、一連の置換基を伴う複合分岐構造の形で含む。一般的には多形性であるものの、セルロースは、植物組織内で、主として平行なグルカン鎖の不溶性結晶質マトリックスとして見出される。ヘミセルロースは通常、セルロースならびにその他のヘミセルロースに水素結合し、このため細胞壁マトリックスを安定化する一助となる。
【００２５】
セルロース含有材料は、セルロースを含有する任意の材料であり得る。セルロースは一般的に、例えば、植物の茎、葉、外皮、殻、および穂軸または木の葉、枝および木材の中に見出される。セルロース含有材料は、草本材料、農業残留物、林業残留物、都市固形廃棄物、古紙およびパルプおよび製紙工場残留物であり得るが、これらに限定されるわけではない。セルロース含有材料は、木材資源、都市固形廃棄物、古紙、作物および作物残留物を含む（ただしこれらに限定されるわけではない）あらゆるタイプのバイオマスであり得る（例えば、Wiselogelら、１９９５年、Handbook on Bioethanol（Charles E. Wyman編）中である得る、１０５〜１１８頁、Taylor & Francis、Washington D.C.；Wyman、１９９４年、Bioresource Technology 第５０号、３〜１６頁；Lynd、１９９０年、Applied Biochemistry and Biotechnology 第２４／２５号、６９５〜７１９頁；Mosierら、１９９９年、「Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics」、Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology中、T. Scheper、編集主幹、第６５巻、２３〜４０頁、Springer-Verlag、New Yorkを参照のこと）。本明細書においては、セルロース含有材料が好ましくはリグノセルロース、例えば混合マトリックス中でリグニン、セルロースおよびヘミセルロースを含有する植物細胞壁材料の形をしているものとして理解される。
【００２６】
好ましい態様においては、セルロース含有材料はトウモロコシ茎葉である。別の好ましい態様では、セルロース含有材料はトウモロコシ繊維である。別の好ましい態様においては、セルロース含有材料はトウモロコシの穂軸である。別の好ましい態様では、セルロース含有材料は、スイッチグラスである。別の好ましい態様では、セルロース含有材料は稲わらである。別の好ましい態様では、セルロース含有材料は紙およびパルプ加工廃棄物である。別の好ましい態様においては、セルロース含有材料は木本または草本植物である。別の好ましい態様では、セルロース含有材料は、バガスである。
【００２７】
セルロース含有材料は、現状のままで使用されてもよいし、または当該技術分野において公知の従来の方法を用いて前処理に付されてもよい。例えば、物理的前処理技術としては、さまざまなタイプの製粉、照射、蒸気処理／蒸気爆発および水熱分解が含まれる可能性があり；化学的前処理技術には、希酸、アルカリ、有機溶媒、アンモニア、二酸化硫黄、二酸化炭素、およびｐＨ制御された水熱分解が含まれる可能性があり；生物学的前処理技術には、リグニン可溶化微生物の応用が関与し得る（例えば、Hsu、T.-A.、１９９６年、「Pretreatment of biomass」、Handbook on Bioethanol；Production and Utilization、Wyman、C. E.、編、Taylor & Francis、Washington、DC、１７９〜２１２頁中；Ghosh、P.、およびSingh、A.、１９９３年、「Physicochemical and biological treatments for enzymatic/microbial conversion of lignocellulosic biomass」、Adv. Appl. Microbiol.、第３９号、２９５〜３３３頁；McMillan、J. D.、１９９４年、「Pretreating lignocellulosic biomass: a review」、Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production、Himmel、M. E.、Baker、J. O.及びOverend、R. P.編、ACS Symposium Series 566、American Chemical Society、Washington、DC、第１５章中；Gong、C. S.、Cao、N. J.、Du、J.およびTsao、G. T.、１９９９年、「Ethanol production from renewable resources」、Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology、Scheper、T.編、Springer-Verlag Berlin Heidelberg、Germany、第６５号、２０７〜２４１頁中；Olsson、L.およびHahn-Hagerdal、B.、１９９６年、「Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanol production」、Em. Microb. Tech.第１８号、３１２〜３３１頁中；およびVallander、L.、およびEriksson、K.-E. L.、１９９０年、「Production of ethanol from lignocellulosic materials: State of the art」、Adv. Biochem. Eng./Biotechnol.、第４２号、６３〜９５頁を参照のこと）。
【００２８】
前処理済みトウモロコシ茎葉：「ＰＣＳ」または「前処理済みトウモロコシ茎葉という用語は、本明細書において、熱および希酸での処理によりトウモロコシ茎葉から誘導されたセルロース含有材料として定義される。本発明において、ＰＣＳは、実施例２０で記述されている方法、または時間、温度および酸の量についてのその変形形態によって作られる。
【００２９】
単離ポリペプチド：本明細書中で使用される「単離ポリペプチド」という用語は、供給源から単離されているポリペプチドを意味する。好ましい態様において、ポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定される通り、純度が少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％、より好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも６０％、さらに一層好ましくは少なくとも８０％、そして最も好ましくは少なくとも９０％である。
【００３０】
実質的に純粋なポリペプチド：「実質的に純粋なポリペプチド」という用語は、本明細書において、天然にまたは組換えにより会合されているその他のポリペプチド材料を多くとも１０重量％、好ましくは多くとも８重量％、より好ましくは多くとも６重量％、より好ましくは多くとも５重量％、より好ましくは多くとも４重量％、より好ましくは多くとも３重量％、さらに一層好ましくは多くとも２重量％、最も好ましくは多くとも１重量％、そしてさらに最も好ましくは多くとも０．５重量％含有するポリペプチド調製物を意味する。したがって、実質的に純粋なポリペプチドは、純度が、調製物中に存在する合計ポリペプチド材料の重量で少なくとも９２％、少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、さらに一層好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは少なくとも９９．５％そしてさらに最も好ましくは１００％であることが好ましい。本発明のポリペプチドは、好ましくは実質的に純粋な形態をしている、すなわちこのポリペプチド調製物は、本質的に、それが天然にまたは組換えにより会合されているその他のポリペプチド材料を含まない。これは、例えば、周知の組換え型方法または古典的精製方法によりポリペプチドを調製することにより達成可能である。
【００３１】
成熟ポリペプチド：「成熟ポリペプチド」という用語は、本明細書において、翻訳または任意の翻訳後修飾例えばＮ末端プロセッシング、Ｃ末端切断、グリコシル化、リン酸化などの後のその最終形態にある、生物活性例えば酵素活性を有するポリペプチドとして定義される。
【００３２】
成熟ポリペプチドコーディング配列：「成熟ポリペプチドコーディング配列」という用語は、本明細書において、生物活性を有する成熟ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列として定義される。
【００３３】
同一性：２つのアミノ酸配列の間または２つのヌクレオチド配列の間の関連性は、「同一性」パラメータによって記述される。
【００３４】
本発明に関しては、２つのアミノ酸配列間の同一性度は、好ましくはバージョン３．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージ（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite、Riceら、２０００年、Trends in Genetics 第１６号、２７６〜２７７頁）のNeedleプログラムの中で実施されている通りのNeedleman-Wunschアルゴリズム（NeedlemanおよびWunsch、１９７０年、J. MoI. Biol.第４８号、４４３〜４５３頁）を用いて決定される。使用される任意のパラメータは、１０のギャップ開始ペナルティ、０．５のギャップ伸張ペナルティおよびＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。Needle標識された「最長同一性」（-nobriefオプションを用いて得られるもの）の出力は、同一性百分率として使用され、以下のように計算される：
（同一残基×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメント内のギャップの合計数）
【００３５】
本発明に関しては、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の同一性度は、好ましくはバージョン３．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージ（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite、Riceら、２０００年、上掲書）のNeedleプログラムの中で実施されている通りのNeedleman-Wunschアルゴリズム（NeedlemanおよびWunsch、１９７０年、上掲書）を用いて決定される。使用される任意のパラメータは、１０のギャップ開始ペナルティ、０．５のギャップ伸張ペナルティおよびＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。Needle標識された「最長同一性」（-nobriefオプションを用いて得られるもの）の出力は、同一性百分率として使用され、以下のように計算される：
（同一デオキシリボヌクレオチド×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメント内のギャップの合計数）
【００３６】
相同性配列：「相同性配列」という用語は本明細書において、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス、ワードサイズ３、ギャップ存在コスト１１、ギャップ伸張コスト１、低複雑度ろ過（low complexity filtration）無しで、かつ成熟タンパク質配列をクエリとして、（タンパク質データベースについての）ｂｌａｓｔｐまたは（核酸データベースについての）ｔｂｌａｓｈアルゴリズムを用いて、０．００１未満のＥ値（または予想スコア）をもつ配列として定義される。Altschulら、１９９７年、Nucleic Acids Res., 第２５号、３３８９〜３４０２頁を参照のこと。
【００３７】
ポリペプチドフラグメント：「ポリペプチドフラグメント」という用語は、本明細書において、成熟ポリペプチドまたはその相同性配列のアミノおよび／またはカルボキシル末端から欠失された１つ以上（複数）のアミノ酸を有するポリペプチドとして定義され、ここでこのフラグメントはその成熟ポリペプチドのような活性を有している。
【００３８】
サブ配列：「サブ配列」という用語は、本明細書において、成熟ポリペプチドコーディング配列またはその相同性配列の５’および／または３’末端から欠失された１つ以上（複数）のヌクレオチドを有するヌクレオチド配列として定義され、ここでサブ配列はその成熟ポリペプチドのような活性を有するポリペプチドフラグメントをコードする。
【００３９】
対立遺伝子変異体：「対立遺伝子変異体」という用語は、本明細書において、同じ染色体遺伝子座を占有する遺伝子の２つ以上の代替的形態のいずれかを表わす。対立遺伝子変異は、突然変異を通して自然に発生し、個体群の内部で多型を結果としてもたらし得る。遺伝子突然変異は、サイレント（コードされたポリペプチド内で変化無し）であり得、そうでなければ、改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする可能性もある。ポリペプチドの対立遺伝子変異体は、遺伝子の対立遺伝子変異体によってコードされるポリペプチドである。
【００４０】
単離ポリヌクレオチド：本明細書中で使用される「単離ポリヌクレオチド」という用語は、供給源から単離されているポリペプチドを意味する。好ましい態様において、ポリヌクレオチドは、アガロース電気泳動によって決定される通り、純度が少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％、より好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも６０％、さらに一層好ましくは少なくとも８０％、そして最も好ましくは少なくとも９０％である。
【００４１】
実質的に純粋なポリヌクレオチド：本明細書で使用される「実質的に純粋なポリヌクレオチド」という用語は、その他外来のまたは望まれないヌクレオチドを含まずかつ遺伝的に工学処理されたタンパク質生産システム内で使用するのに適した形態にあるポリヌクレオチド調製物を意味する。したがって実質的に純粋なポリヌクレオチドは、天然にまたは組換えにより会合されているその他のポリペプチド材料を多くとも１０重量％、好ましくは多くとも８重量％、より好ましくは多くとも６重量％、より好ましくは多くとも５重量％、より好ましくは多くとも４重量％、より好ましくは多くとも３重量％、さらに一層好ましくは多くとも２重量％、最も好ましくは多くとも１重量％、そしてさらに最も好ましくは多くとも０．５重量％含有する。しかしながら、実質的に純粋なポリヌクレオチドは、プロモータおよびターミネータなどの天然に発生する５’および３’の未翻訳領域を含む可能性がある。実質的に純粋なポリペプチドは、純度が、少なくとも９０重量％、好ましくは少なくとも９２重量％、より好ましくは少なくとも９４重量％、より好ましくは少なくとも９５重量％、より好ましくは少なくとも９６重量％、より好ましくは少なくとも９７重量％、さらに一層好ましくは少なくとも９８重量％、最も好ましくは少なくとも９９重量％、そしてさらに最も好ましくは少なくとも９９．５重量％であることが好ましい。本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは実質的に純粋な形態をしている、すなわちこのポリヌクレオチド調製物は、本質的に、それが天然にまたは組換えにより会合されているその他のポリペプチド材料を含まない。ポリヌクレオチドは、ゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成由来、またはそれらの任意の組合せであってよい。
【００４２】
ｃＤＮＡ：「ｃＤＮＡ」という用語は、真核細胞から得られたスプライスされた成熟ｍＲＮＡ分子から逆転写によって調製可能なＤＮＡ分子として定義される。ｃＤＮＡには、対応するゲノムＤＮＡ内に通常存在するイントロン配列が欠如している。初期の一次ＲＮＡ写しは、成熟スプライスｍＲＮＡとして現われる前に一連の工程を通してプロセッシングされるｍＲＮＡの前駆体である。これらの工程には、スプライシングと呼ばれるプロセスによるイントロン配列の除去が含まれる。したがってｍＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡには、あらゆるイントロン配列が欠如している。
【００４３】
核酸構成体：本明細書中で使用される「核酸構成体という用語は、天然に発生する遺伝子から単離されるかまたは、そうでなければ自然の中で存在するはずのない形で核酸のセグメントを含有するように修飾されるかまたは合成である、１本鎖または２本鎖のいずれかの核酸分子を意味する。核酸構成体という用語は、それが本発明のコーディング配列の発現のために必要とされる制御配列を含有する場合、「発現力セット」という用語と同義である。
【００４４】
制御配列：「制御配列」という用語は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現に必要な全ての構成要素を含むものとして定義される。各々の制御配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対し未変性または外来性であってもよいし、或いはまた互いに未変性または外来性であってもよい。かかる制御配列は、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモータ、シグナルペプチド配列、および転写ターミネータを含むが、これらに限定されるわけではない。制御配列は、プロモータおよび転写および翻訳停止シグナルを最低限含む。制御配列には、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のコーディング領域での制御配列のライゲーションを容易にする特異的制限部位を導入する目的でリンカーが備わっていてよい。
【００４５】
作動的に連結された：作動的に連結されたという用語は、本明細書においては、制御配列がポリペプチドのコーディング配列の発現を導くような形でポリヌクレオチド配列のコーディング配列との関係において適切な位置に制御配列が置かれている立体配置を表わす。
【００４６】
コーディング配列：本明細書中で使用される場合、「コーディング配列」という用語は、そのタンパク質産物のアミノ酸配列を直接特定するヌクレオチド配列を意味する。コーディング配列の境界は、一般に、通常ＡＴＧ開始コドンまたは代替的開始コドン例えばＧＴＧおよびＴＴＧで始まり、停止コドン例えばＴＡＡ、ＴＡＧおよびＴＧＡで終わる、読取り枠によって決定される。コーディング配列は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成または組換え型ヌクレオチド配列であってよい。
【００４７】
発現：「発現」という用語には、転写、転写後修飾、翻訳後修飾、および分泌を含む（ただしこれらに限定されるわけではない）ポリペプチドの産生に関与するあらゆる工程が含まれる。
【００４８】
発現ベクター：「発現ベクター」という用語は、本明細書では、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、発現を提供する付加的なヌクレオチドに対し作動的に連結された直鎖状または環状ＤＮＡ分子として定義づけされる。
【００４９】
宿主細胞：本明細書中で使用される宿主細胞という用語は、ポリヌクレオチドを含む核酸構成体または発現ベクターでの形質転換、トランスフェクション、形質導入などを受けることのできるあらゆる細胞型を含む。
【００５０】
修飾：「修飾」という用語は本明細書では、成熟ポリペプチドまたはその相同性配列のあらゆる化学的修飾、ならびにかかるポリペプチドをコードするＤＮＡの遺伝子操作を意味する。修飾は、１つ以上（複数）のアミノ酸の置換、欠失および／または挿入ならびに１つ以上（複数）のアミノ酸側鎖の置き換えであり得る。
【００５１】
人工変異体：本明細書中で使用される場合、「人工変異体」という用語は、成熟ポリペプチドコーディング配列またはその相同性配列の修飾されたヌクレオチド配列を発現する生体によって産生されたポリペプチドを意味する。修飾されたヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド配列またはその相同性配列の修飾によって、人間の介入を通して得られる。
【００５２】
発明の詳細な説明
本発明は、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドの活性を増大させる方法において、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドを含む組成物に可溶性活性化二価金属カチオンを添加する工程を含む方法であって、可溶性活性化二価金属カチオンが、セルロース含有材料の分解または転換の間、約０．００１ｍＭ〜約５０ｍＭという有効濃度で存在し、かつ可溶性活性化二価金属カチオンとセルロース分解増強活性を有するポリペプチドの存在が、可溶性活性化二価金属カチオン無しのセルロース分解増強活性を有するポリペプチドに比べて、セルロース分解酵素組成物によるセルロース含有材料の分解または転換を増大させる方法に関する。
【００５３】
本発明は同様に、セルロース含有材料を分解または転換する方法において、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドと可溶性活性化二価金属カチオンを有効量含む有効量のセルロース分解酵素組成物でセルロース含有材料を処理する工程を含み、可溶性活性化二価金属カチオンが、約０．００１ｍＭ〜約５０ｍＭという有効濃度で存在する方法にも関する。
【００５４】
本発明は同様に、発酵産物を生産するための方法において；（ａ）セルロース分解増強活性を有するポリペプチドおよび可溶性活性化二価金属カチオンを有効量含む有効量のセルロース分解酵素組成物でセルロース含有材料を糖化する工程であって、ここで可溶性活性化二価金属カチオンが、約０．００１ｍＭ〜約５０ｍＭという有効濃度で存在している工程；（ｂ）工程（ａ）の糖化されたセルロース含有材料を１つ以上の発酵用微生物で発酵させて発酵産物を生産する工程；および（ｃ）発酵から発酵産物を回収する工程、を含む方法にも関する。
【００５５】
本発明は同様に、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドおよび可溶性活性化二価金属カチオンを含む組成物において、可溶性活性化二価金属カチオンが、セルロース含有材料の分解または転換の間、約０．００１ｍＭ〜約５０ｍＭという有効濃度で存在し、かつ可溶性活性化二価金属カチオンとセルロース分解増強活性を有するポリペプチドの存在が、可溶性活性化二価金属カチオン無しのセルロース分解増強活性を有するポリペプチドに比べて、セルロース分解酵素組成物によるセルロース含有材料の分解または転換を増大させる組成物にも関する。
【００５６】
本発明は同様に、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドおよび可溶性活性化二価金属カチオンを有効量含むセルロース分解酵素組成物において、可溶性活性化二価金属カチオンが、セルロース含有材料の分解または転換の間、約０．００１ｍＭ〜約５０ｍＭという有効濃度で存在し、かつ可溶性活性化二価金属カチオンとセルロース分解増強活性を有するポリペプチドの存在が、可溶性活性化二価金属カチオン無しのセルロース分解増強活性を有するポリペプチドに比べて、セルロース分解酵素組成物によるセルロース含有材料の分解または転換を増大させるセルロース分解酵素組成物にも関する。
【００５７】
二価金属カチオン
本発明では、任意の可溶性活性化二価金属カチオンを使用することができる。好ましい態様においては、可溶性活性化二価金属カチオンは、Ｍｎ++、Ｃｏ++、Ｍｇ++、Ｃａ++およびそれらの組合せからなる群から選択される。より好ましい態様においては、可溶性活性化二価金属カチオンはＭｎ++である。別のより好ましい態様においては、可溶性活性化二価金属カチオンはＣｏ++である。別のより好ましい態様においては、可溶性活性化二価金属カチオンはＭｇ++である。別のより好ましい態様においては、可溶性活性化二価金属カチオンはＣａ++である。別のより好ましい態様においては、可溶性活性化二価金属カチオンは、Ｍｎ++、Ｃｏ++、Ｍｇ++およびＣａ++からなる群から選択された２つ以上（複数の）カチオンである。最も好ましい態様においては、可溶性活性化二価金属カチオンはＭｎ++である。別の最も好ましい態様においては、可溶性活性化二価金属カチオンはＭｇ++である。
【００５８】
可溶性活性化二価金属カチオンは、セルロース含有基質の分解または転換の間に好ましくは約０．００１ｍＭ〜約５０ｍＭ、より好ましくは約０．０１ｍＭ〜約２５ｍＭ、より好ましくは約０．１ｍＭ〜約２５ｍＭ、より好ましくは約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ、さらに好ましくは約０．３ｍＭ〜約５ｍＭ、最も好ましくは約０．３ｍＭ〜約２．５ｍＭ、そしてさらに最も好ましくは約０．３ｍＭ〜約１ｍＭという有効濃度で添加される。
【００５９】
好ましい態様においては、可溶性活性化二価金属カチオンは、セルロース含有基質の分解または転換の間に約０．００１ｍＭ〜約５０ｍＭの有効濃度で添加される。より好ましい態様においては、可溶性活性化二価金属カチオンはセルロース含有基質の分解または転換の間に、約０．０１ｍＭ〜約２５ｍＭの有効濃度で添加される。より好ましい態様においては、可溶性活性化二価金属カチオンは、セルロース含有基質の分解または転換の間に約０．１ｍＭ〜約２５ｍＭの有効濃度で添加される。より好ましい態様においては、可溶性活性化二価金属カチオンは、セルロース含有基質の分解または転換の間に、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの有効濃度で添加される。さらに一層好ましい態様においては、可溶性活性化二価金属カチオンはセルロース含有基質の分解または転換の間に、約０．３ｍＭ〜約５ｍＭの有効濃度で添加される。最も好ましい態様においては、可溶性活性化二価金属カチオンは、セルロース含有基質の分解または転換の間に、約０．３ｍＭ〜約２．５ｍＭの有効濃度で添加される。さらに最も好ましい態様においては、可溶性活性化二価金属カチオンは、セルロース含有基質の分解または転換の間に、約０．３ｍＭ〜約１ｍＭの有効濃度で添加される。
【００６０】
可溶性活性化二価金属カチオンは好ましくは、可溶性塩例えば硫酸塩、炭酸塩、塩化物、クエン酸塩、硝酸塩、亜硝酸塩、フッ化物またはヨウ化物の塩として添加される。しかしながら、セルロース性バイオマスが数多くの二価金属カチオンを含み得るということは、当該技術分野において周知である。例えば、F. B. SalisburyおよびC. W. Ross: Plant Physiology、Wadsworths Publishing Company、Belmont、California (１９９２年)を参照のこと。したがって、セルロース性バイオマスは、部分的にまたは全面的に金属カチオンの供給源として使用可能である。活性化二価金属カチオンは可溶性であっても不溶性であってもよい。「可溶性活性化二価金属カチオン」という用語は、本明細書においては、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドの活性を増大させるために溶解状態で利用可能な二価金属カチオンとして定義される。「不溶性活性化二価金属カチオン」という用語は、本明細書においては、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドの活性を増大させるために溶解状態では利用できない二価金属カチオンとして定義される。二価金属カチオンは、例えばＥＤＴＡまたはＥＧＴＡなどによってキレート化されているかまたはピロリン酸塩などのセルロース性バイオマスの構成要素と錯化されているために利用可能でない可能性がある。
【００６１】
セルロース性バイオマスは、セルロース分解を阻害する可溶性二価金属カチオン（以下「可溶性阻害性二価金属カチオン」と呼ぶ）を供給することもできる。例えば、阻害性二価金属カチオンはＺｎ++またはＦｅ++である。その結果、セルロース分解を活性化するものもあれば阻害するものもある可溶性二価金属カチオンの混合物が存在する条件下で、阻害性二価金属カチオンの阻害効果を克服するために、余剰の可溶性活性化二価金属カチオンが添加される。このような状況において、阻害性二価金属カチオンがセルロース分解増強活性をもつポリペプチドに対し不利な影響を及ぼすのを妨げるために、本発明の方法はさらに、セルロース含有材料を分解または転換するのに充分な期間好ましくは約０．００１ｍＭ〜約５０ｍＭ、より好ましくは約０．０１ｍＭ〜約２５ｍＭ、より好ましくは約０．１ｍＭ〜約２５ｍＭ、より好ましくは約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ、さらに一層好ましくは約０．３ｍＭ〜約５ｍＭ、最も好ましくは約０．３ｍＭ〜約２．５ｍＭ、そしてさらに最も好ましくは約０．３ｍＭ〜約１ｍＭの範囲内に可溶性活性化二価金属カチオンの有効濃度を維持するために可溶性活性化二価金属カチオンの濃度を補足する工程を含んでいる。
【００６２】
好ましい態様においては、可溶性活性化二価金属カチオンの濃度は、セルロース含有基質の分解または転換の間、約０．００１ｍＭ〜約５０ｍＭの有効濃度を維持するように補足される。より好ましい態様においては、可溶性活性化二価金属カチオンの濃度は、セルロース含有基質の分解または転換の間、約０．０１ｍＭ〜約２５ｍＭの有効濃度を維持するように補足される。より好ましい態様においては、可溶性活性化二価金属カチオンの濃度は、セルロース含有基質の分解または転換の間、約０．１ｍＭ〜約２５ｍＭの有効濃度を維持するように補足される。より好ましい態様においては、可溶性活性化二価金属カチオンの濃度は、セルロース含有基質の分解または転換の間、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの有効濃度を維持するように補足される。さらに一層好ましい態様においては、可溶性活性化二価金属カチオンの濃度は、セルロース含有基質の分解または転換の間、約０．３ｍＭ〜約５ｍＭの有効濃度を維持するように補足される。最も好ましい態様においては、可溶性活性化二価金属カチオンの濃度は、セルロース含有基質の分解または転換の間、約０．３ｍＭ〜約２．５ｍＭの有効濃度を維持するように補足される。さらに最も好ましい態様においては、可溶性活性化二価金属カチオンの濃度は、セルロース含有基質の分解または転換の間、約０．３ｍＭ〜約１ｍＭの有効濃度を維持するように補足される。
【００６３】
セルロース性バイオマス中の二価金属カチオンの濃度は、例えば原子吸光、電気化学的電極、金属イオンバイオセンサー、または光学センサーまたはキレート化による滴定などの当該技術分野において公知の任意の方法を用いて決定可能である（例えばMethods in Enzymology、第１５８巻（複数の章にわたる）、Haugland、R. P. Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals、第６版；Molecular Probes、Inc.: Eugene、OR、１９９６年、Thompsonら. Anal. Chem.、第７０号（２２）、４７１７〜４７２３頁、１９９８年；Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry、Akbar Montaser （編）、１９９８年５月を参照のこと）。
【００６４】
本発明の方法においては、可溶性活性化二価金属カチオンは、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドの活性を、好ましくは少なくとも０．１倍、より好ましくは少なくとも０．２倍、より好ましくは少なくとも０．３倍、より好ましくは少なくとも０．４倍、より好ましくは少なくとも０．５倍、より好ましくは少なくとも１倍、より好ましくは少なくとも３倍、より好ましくは少なくとも４倍、より好ましくは少なくとも５倍、より好ましくは少なくとも１０倍、より好ましくは少なくとも２０倍、さらに一層好ましくは少なくとも３０倍、最も好ましくは少なくとも５０倍、そしてさらに最も好ましくは少なくとも１００倍増強させる。
【００６５】
本発明は同様に、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドおよび可溶性活性化二価金属カチオンを含む組成物において、可溶性活性化二価金属カチオンが、セルロース含有材料の分解または転換の間、好ましくは約０．００１ｍＭ〜約５０ｍＭ、より好ましくは約０．０１ｍＭ〜約２５ｍＭ、より好ましくは約０．１ｍＭ〜約２５ｍＭ、より好ましくは約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ、さらに好ましくは約０．３ｍＭ〜約５ｍＭ、最も好ましくは約０．３ｍＭ〜約２．５ｍＭ、そしてさらに最も好ましくは約０．３ｍＭ〜約１ｍＭという有効濃度で存在し、かつ可溶性活性化二価金属カチオンとセルロース分解増強活性を有するポリペプチドの存在が、可溶性活性化二価金属カチオン無しのセルロース分解増強活性を有するポリペプチドに比べて、セルロース分解酵素組成物によるセルロース含有材料の分解または転換を増大させる、組成物にも関する。
【００６６】
本発明は同様にセルロース分解増強活性を有するポリペプチドおよび可溶性活性化二価金属カチオンを有効量含むセルロース分解酵素組成物において、可溶性活性化二価金属カチオンが、セルロース含有材料の分解または転換の間、好ましくは約０．００１ｍＭ〜約５０ｍＭ、より好ましくは約０．０１ｍＭ〜約２５ｍＭ、より好ましくは約０．１ｍＭ〜約２５ｍＭ、より好ましくは約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ、さらに好ましくは約０．３ｍＭ〜約５ｍＭ、最も好ましくは約０．３ｍＭ〜約２．５ｍＭ、そしてさらに最も好ましくは約０．３ｍＭ〜約１ｍＭという有効濃度で存在し、かつ可溶性活性化二価金属カチオンとセルロース分解増強活性を有するポリペプチドの存在が、可溶性活性化二価金属カチオン無しのセルロース分解増強活性を有するポリペプチドに比べて、セルロース分解酵素組成物によるセルロース含有材料の分解または転換を増大させるセルロース分解酵素組成物にも関する。
【００６７】
本発明の方法においては、セルロース分解酵素組成物は、上述のとおり、セルロース含有材料からグルコースへ、またはヘミセルロースからキシロース、マンノース、ガラクトース、およびアラビノースへのプロセッシングに関与するあらゆるタンパク質、それらのポリマーまたはそれらから誘導された生成物を含んでいてよい。１つの態様においては、セルロース分解酵素組成物はエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ−グルコシダーゼまたはその組合せを含む。別の態様においては、セルロース分解酵素組成物はさらに、セルロース含有材料の分解を改善するための１つ以上の付加的な酵素活性を含む。好ましい付加的酵素は、ヘミセルロース、エステラーゼ（例えばリパーゼ、ホスホリパーゼ、および／またはクチナーゼ）、プロテアーゼ、ラッカーゼ、ペルオキシダーゼまたはその混合物である。
【００６８】
セルロース分解酵素組成物は、一成分調製物、例えばエンドグルカナーゼ、多成分調製物例えばエンドグルカナーゼ（単複）、セロビオヒドロラーゼ（単複）およびベータ−グルコシダーゼ（単複）または多成分および一成分タンパク質調製物の組合せであってよい。セルロース分解タンパク質は、酸性、中性またはアルカリ性のいずれのｐＨ範囲内でも活性を有しうるすなわちセルロース含有材料を加水分解し得る。
【００６９】
上述の通り、本発明において使用されるセルロース分解タンパク質は、一成分調製物、すなわちその他のセルロース分解性構成要素を本質的に含まない構成要素であってよい。単一の構成要素は、組換え型構成要素であり得る、すなわち単一の構成要素をコードするＤＮＡ配列のクローニングによって産生され、その後ＤＮＡ配列で細胞形質転換され宿主内で発現され得る（例えば国際公開第９１／１７２４３号（WO 91/17243）および国際公開第９１/１７２４４号（WO 91/17244）を参照のこと）。宿主細胞は、異種宿主（酵素が宿主にとって外来性である）であってよく、そうでなければ宿主は野生型宿主（酵素が宿主にとって天然である）であってもよい。一成分セルロース分解タンパク質は同様に発酵ブロスからこのようなタンパク質を精製することによって調製されてもよい。
【００７０】
本発明の中で使用される酵素は、本明細書中で記述されているプロセスにおいて使用するのに適したあらゆる形態、例えば細胞を伴うまたは伴わない粗発酵ブロス、乾燥粉末または粒状物、非粉塵性粒状物、液体、安定化液体、または保護された酵素などの形態をしていてよい。粒状物は、例えば米国特許第４，１０６，９９１号（U.S. Patent No. 4,106,991）および第４，６６１，４５２号（No. 4,661,452）の中で開示されている通りに生成されてよく、任意には公知のプロセスによってコーティングされてよい。液体酵素調製物は、例えば、確立されたプロセスに準じて、糖、糖アルコールまたは別のポリオールおよび／または乳酸および別の有機酸といった安定剤を添加することによって安定化されてよい。保護された酵素は、欧州特許第２３８，２１６号（EP 238,216）で開示されているプロセスにしたがって調製されてよい。
【００７１】
セルロース分解酵素活性を有するポリペプチドは、あらゆる属の微生物から得ることができる。「〜から得られた」という用語は、ここでは、酵素が、天然酵素として酵素を天然に産生する生体から単離されたものであってよいことを意味する。「〜から得られた」という用語は、本明細書において同様に、酵素が宿主生体の中で組換えにより産生されたものであり得ることを意味し、ここで組換えにより生産された酵素は宿主生体にとって天然かまたは外来性であるか、或いは修飾されたアミノ酸配列を有し、例えば欠失、挿入および／または置換された１つ以上のアミノ酸を有する、すなわち当該技術分野において公知の核酸シャッフリングによって生成された酵素または天然アミノ酸配列の突然変異体および／またはフラグメントである組換えにより生産された酵素である。天然酵素の意味合いの中には、自然変異体が包含され、外来性酵素の意味合いの中には部位特異的突然変異誘発またはシャッフリングといった化学的または組換え型突然変異誘発によって得られた変異体が包含される。したがってセルロース分解タンパク質の化学的に修飾されたまたはタンパク質工学処理された突然変異体も同様に本発明において使用可能である。好ましい態様においては、所与の供給源から得たポリペプチドは、細胞外で分泌される。
【００７２】
セルロース分解酵素活性を有するポリペプチドは、細菌ポリペプチドであってよい。例えばポリペプチドは、セルロース分解酵素活性を有するBacillus、Streptococcus、Streptomyces、Staphylococcus、Enterococcus、Lactobacillus、Lactococcus、Clostridium、GeobacillusまたはOceanobacillusポリペプチドなどのグラム陽性菌ポリペプチド、または、セルロース分解酵素活性を有するE. coli、Pseudomonas、Salmonella、Campylobacter、Helicobacter、Flavobacterium、Fusobacterium、llyobacter、NeisseriaまたはUreaplasmaポリペプチドなどのグラム陰性菌ポリペプチドであってよい。
【００７３】
好ましい態様においては、ポリペプチドは、セルロース分解酵素活性を有するBacillus alkalophilus、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus brevis、Bacillus circulans、Bacillus clausii、Bacillus coagulans、Bacillus firmus、Bacillus lautus、Bacillus lentus、Bacillus licheniformis、Bacillus megaterium、Bacillus pumilus、Bacillus stearothermophilus、Bacillus subtilisまたはBacillus thuringiensisポリペプチドである。
【００７４】
別の好ましい態様においては、ポリペプチドは、セルロース分解酵素活性を有するStreptococcus equisimilis、Streptococcus pyogenes、Streptococcus uberisまたはStreptococcus equi 亜種 Zooepidemicusポリペプチドである。
【００７５】
別の好ましい態様においては、ポリペプチドは、セルロース分解酵素活性を有するStreptomyces achromogenes、Streptomyces avermitilis、Streptomyces coelicolor、Streptomyces griseusまたはStreptomyces licidansポリペプチドである。
【００７６】
セルロース分解酵素活性を有するポリペプチドは同様に、真菌ポリペプチドそしてより好ましくはセルロース分解酵素活性を有するCandida、Kluyveromyces、Pichia、Saccharomyces、SchizosaccharomycesまたはYarrowiaポリペプチドといった酵母ポリペプチド、またはより好ましくは、セルロース分解酵素活性を有するaan Acremonium、Agaricus、Alternaria、Aspergillus、Aureobasidium、Botryospaeria、Ceriporiopsis、Chaetomidium、Chrysosporium、Claviceps、Cochliobolus、Coprinopsis、Coptotermes、Corynascus、Cryphonectria、Cryptococcus、Diplodia、Exidia、Filibasidium、Fusarium、Gibberella、Holomastigotoides、Humicola、Irpex、Lentinula、Leptospaeria、Magnaporthe、Melanocarpus、Meripilus、Mucor、Myceliophthora、Neocallimastix、Neurospora、Paecilomyces、Penicillium、Phanerochaete、Piromyces、Poitrasia、Pseudoplectania、Pseudotrichonympha、Rhizomucor、Schizophyllum、Scytalidium、Talaromyces、Thermoascus、Thielavia、Tolypocladium、Trichoderma、Trichophaea、Verticillium、VolvariellaまたはXylariaポリペプチドといった糸状菌ポリペプチドであってもよい。
【００７７】
好ましい態様においては、ポリペプチドは、セルロース分解酵素活性を有するSaccharomyces carlsbergensis、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces diastaticus、Saccharomyces douglasii、Saccharomyces kluyveri、Saccharomyces norbensisまたはSaccharomyces oviformisポリペプチドである。
【００７８】
別の好ましい態様においては、ポリペプチドは、セルロース分解酵素活性を有するAcremonium cellulolyticus、Aspergillus aculeatus、Aspergillus awamori、Aspergillus fumigatus、Aspergillus foetidus、Aspergillus japonicus、Aspergillus nidulans、Aspergillus niger、Aspergillus oryzae、Chrysosporium keratinophilum、Chrysosporium lucknowense、Chrysosporium tropicum、Chrysosporium merdarium、Chrysosporium inops、Chrysosporium pannicola、Chrysosporium queenslandicum、Chrysosporium zonatum、Fusarium bactridioides、Fusarium cerealis、Fusarium crookwellense、Fusarium culmorum、Fusarium graminearum、Fusarium graminum、Fusarium heterosporum、Fusarium negundi、Fusarium oxysporum、Fusarium reticulatum、Fusarium roseum、Fusarium sambucinum、Fusarium sarcochroum、Fusarium sporotrichioides、Fusarium sulphureum、Fusarium torulosum、Fusarium trichothecioides、Fusarium venenatum、Humicola grisea、Humicola insolens、Humicola lanuginosa、Irpex lacteus、Mucor miehei、Myceliophthora thermophila、Neurospora crassa、Penicillium funiculosum、Penicillium purpurogenum、Phanerochaete chrysosporium、Thielavia achromatica、Thielavia albomyces、Thielavia albopilosa、Thielavia australeinsis、Thielavia fimeti、Thielavia microspora、Thielavia ovispora、Thielavia peruviana、Thielavia spededonium、Thielavia setosa、Thielavia subthermophila、Thielavia terrestris、Trichoderma harzianum、Trichoderma koningii、Trichoderma iongibrachiatum、Trichoderma reesei、Trichoderma virideまたはTrichophaea saccataポリペプチドである。
【００７９】
本発明の方法においては、任意のエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼおよび／またはベータ−グルコシダーゼならびに任意のその他のセルロース分解酵素を使用することができる。
【００８０】
本発明において使用可能な細菌エンドグルカナーゼの例としてはAcidothermus cellulolyticus エンドグルカナーゼ （国際公開第９１／０５０３９号（WO 91/05039）；国際公開第９３／１５１８６号（WO 93/15186）；米国特許第５，２７５，９４４号（U.S. Patent No. 5,275,944）；国際公開第９６／０２５５１号（WO 96/02551）；米国特許第５，５３６，６５５号（U.S. Patent No. 5,536,655）、国際公開第００／７００３１号（WO 00/70031）、国際公開第０５／０９３０５０号（WO 05/093050））；Thermobifida fusca エンドグルカナーゼ III （国際公開第０５／０９３０５０号（WO 05/093050））；およびThermobifida fusca エンドグルカナーゼ V（国際公開第０５／０９３０５０号（WO 05/093050））が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００８１】
本発明において使用できる真菌エンドグルカナーゼの例としては、Trichoderma reesei エンドグルカナーゼＩ（Penttilaら、１９８６年、Gene第４５号、２５３〜２６３頁；GenBankTM 登録番号Ｍ１５６６５）；Trichoderma reesei エンドグルカナーゼＩＩ（Saloheimoら、１９８８年、Gene第６３号、１１〜２２頁；GenBankTM 登録番号ｍ１９３７３）；Trichoderma reesei エンドグルカナーゼＩＩＩ（Okadaら、１９８８年、Appl. Environ. Microbiol.、第６４号、５５５〜５６３頁；GenBankTM 登録番号ＡＢ００３６９４)；Trichoderma reesei エンドグルカナーゼＩＶ（Saloheimoら、１９９７年、Eur. J. Biochem. 第２４９号、５８４〜５９１頁；GenBankTM 登録番号Ｙ１１１１３)；およびTrichoderma reesei エンドグルカナーゼＶ（Saloheimoら、１９９４年、Molecular Microbiology 第１３号、２１９〜２２８頁；GenBankTM 登録番号Ｚ３３３８１）；Aspergillus aculeatus エンドグルカナーゼ（Ooiら、１９９０年、Nucleic Acids Research、第１８号、５８８４頁）；Aspergillus kawachii エンドグルカナーゼ（Sakamotoら、１９９５年、Current Genetics、第２７号、４３５〜４３９頁）；Chrysosporium 種Ｃ１（米国特許第６，５７３，０８６号（U.S. Patent No. 6,573,086）；GenPept 登録番号ＡＡＱ３８１５０)；Corynascus heterothallicus (米国特許第６，８５５，５３１号（U.S. Patent No. 6,855,531）；GenPept 登録番号ＡＡＹ００８４４)；Erwinia carotovara エンドグルカナーゼ (Saarilahtiら、１９９０年、Gene、第９０号、９〜１４頁)；Fusarium oxysporum エンドグルカナーゼ（GenBankTM 登録番号Ｌ２９３８１）；Humicola grisea 変種 thermoidea エンドグルカナーゼ（GenBankTM 登録番号ＡＢ００３１０７）；Melanocarpus albomyces エンドグルカナーゼ（GenBankTM 登録番号ＭＡＬ５１５７０３）；Neurospora crassa エンドグルカナーゼ（GenBankTM 登録番号ＸＭ＿３２４４７７）；Piromyces equi（Eberhardtら、２０００年、Microbiology、第１４６号、１９９９〜２００８頁；GenPept 登録番号ＣＡＢ９２３２５)；Rhizopus oryzae （Moriyaら、２００３年、J. Bacteriology、第１８５号、１７４９〜１７５６頁；GenBankTM 登録番号ＡＢ０４７９２７、ＡＢ０５６６６７およびＡＢ０５６６６８）；および Thielavia terrestris （国際公開第２００４／０５３０３９号（WO 2004/053039）；EMBL 登録番号ＣＱ８２７９７０）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００８２】
その他のエンドグルカナーゼは、Henrissat B.、１９９１年、「A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities」、Biochem. J.、第２８０号、３０９〜３１６頁、ならびにHenrissat B.およびBairoch A.、１９９６年、「Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases」、Biochem. J.、第３１６号、６９５〜６９６頁に準じた分類を用いて、グリコシルヒドロラーゼファミリーのうちの１３以上のものにおいて開示されている。
【００８３】
好ましい態様においては、エンドグルカナーゼは、Trichoderma reeseiエンドグルカナーゼＩ（ＣＥＬ７Ｂ）である。別の好ましい態様においては、エンドグルカナーゼはTrichoderma reeseiエンドグルカナーゼＩＩ（ＣＥＬ５Ａ）である。別の好ましい態様において、エンドグルカナーゼは、Trichoderma reesei エンドグルカナーゼＩＩＩ（ＣＥＬ１２Ａ）である。別の好ましい態様においては、エンドグルカナーゼはTrichoderma reeseiエンドグルカナーゼＶ（ＣＥＬ４５Ａ）である。別の好ましい態様においては、エンドグルカナーゼはMyceliophthora thermophilaＣＥＬ７エンドグルカナーゼである。別の好ましい態様においては、エンドグルカナーゼは、Chrysosporium lυcknowenseＣＥＬ１２エンドグルカナーゼである。別の好ましい態様においては、エンドグルカナーゼは、Chrysosporium lυcknowense ＣＥＬ４５エンドグルカナーゼである。
【００８４】
より好ましい態様においては、Trichoderma reeseiエンドグルカナーゼＩ（ＣＥＬ７Ｂ）は配列番号７４の成熟ポリペプチドまたはそのオルソログまたは変異体である。別のより好ましい態様においては、Trichoderma reeceiエンドグルカナーゼＩＩ（ＣＥＬ５Ａ）は配列番号７６の成熟ポリペプチドまたはそのオルソログまたは変異体である。別のより好ましい態様においては、Trichoderma reeceiエンドグルカナーゼＩＩＩ（ＣＥＬ１２Ａ）は、配列番号７８の成熟ポリペプチドまたはそのオルソログまたは変異体である。別のより好ましい態様においては、Trichoderma reeceiエンドグルカナーゼＶ（ＣＥＬ４５Ａ）は、配列番号８０の成熟ポリペプチドまたはそのオルソログまたは変異体である。別のより好ましい態様においては、Myceliophthora thermophilaＣＥＬ７エンドグルカナーゼは、配列番号８２の成熟ポリペプチドまたはそのオルソログまたは変異体である。別のより好ましい態様においては、Myceliophthora thermophilaＣＥＬ１２エンドグルカナーゼは、配列番号８４の成熟ポリペプチドまたはそのオルソログまたは変異体であるである。別のより好ましい態様においては、Myceliophthora thermophilaＣＥＬ４５エンドグルカナーゼは、配列番号８６の成熟ポリペプチドまたはそのオルソログまたは変異体であるである。
【００８５】
別のより好ましい態様においては、Trichoderma reeceiエンドグルカナーゼＩ（ＣＥＬ７Ｂ）は、配列番号７３の成熟ポリペプチドコーディング配列またはそのオルソログまたは変異体によってコードされる。別のより好ましい態様においては、Trichoderma reeceiエンドグルカナーゼＩＩ（ＣＥＬ５Ａ）は、配列番号７５の成熟ポリペプチドコーディング配列またはそのオルソログまたは変異体によってコードされる。別のより好ましい態様においては、Trichoderma reeceiエンドグルカナーゼＩＩＩ（ＣＥＬ１２Ａ）は、配列番号７７の成熟ポリペプチドコーディング配列またはそのオルソログまたは変異体によってコードされる。別のより好ましい態様においては、Trichoderma reeceiエンドグルカナーゼＶ（ＣＥＬ４５Ａ）は配列番号７９の成熟ポリペプチドコーディング配列またはそのオルソログまたは変異体によってコードされる。別のより好ましい態様においては、Myceliophthora thermophilaＣＥＬ７エンドグルカナーゼは、配列番号８１の成熟ポリペプチドコーディング配列またはそのオルソログまたは変異体によってコードされる。別のより好ましい態様においては、ChrysosporiumＣＥＬ１２エンドグルカナーゼは、配列番号８３の成熟ポリペプチドコーディング配列またはそのオルソログまたは変異体によってコードされる。別のより好ましい態様においては、ChrysosporiumＣＥＬ４５は、配列番号８５の成熟ポリペプチドコーディング配列またはそのオルソログまたは変異体によってコードされる。
【００８６】
Trichoderma reeceiエンドグルカナーゼＩ（ＣＥＬ７Ｂ）は、Penttilaら、１９８６年、Gene、第４５号、２５３〜２６３頁にしたがって得ることができる。Trichoderma reeceiエンドグルカナーゼＩＩ（ＣＥＬ５Ａ）は、Saloheimoら、１９８８年、Gene、第６３号、１１〜２２頁にしたがって得ることができる。Trichoderma reeceiエンドグルカナーゼＩＩＩ（ＣＥＬ１２Ａ）は、Okadaら、１９８８年、Appl. Environ. Microbiol.、第６４号、５５５〜５６３頁にしたがって得ることができる。Trichoderma reeceiエンドグルカナーゼＶ（ＣＥＬ４５Ａ）は、Saloheimoら、１９９４年、Molecular Microbiology、第１３号、２１９〜２２８頁にしたがって得ることができる。Myceliophthora thermophilaＣＥＬ７エンドグルカナーゼは国際公開第９５／０２４４７１号（WO 95/024471）にしたがって得ることができる。Chrysosporium lucknowenseＣＥＬ１２エンドグルカナーゼは、国際公開第２００１／２５４６８号（WO 2001/25468）にしたがって得ることができる。Chrysosporium lucknowenseＣＥＬ４５エンドグルカナーゼは、国際公開第２０００／２０５５５号（WO 2000/20555）に従って得ることができる。
【００８７】
別の好ましい態様においては、セロビオヒドロラーゼは、Trichoderma reeseiセロビオヒドロラーゼＩ（ＣＥＬ７Ａ）である。別の好ましい態様においては、セロビオヒドロラーゼは、Trichoderma reeseiセロビオヒドロラーゼＩＩ（ＣＥＬ６Ａ）である。別の好ましい態様においては、セロビオヒドロラーゼは、セルロース結合ドメインを伴うChrysosporium lucknowenseＣＥＬ７セロビオヒドロラーゼである。別の好ましい態様においては、セロビオヒドロラーゼはセルロース結合ドメインを伴わないMyceliophthora thermophilaセロビオヒドロラーゼである。別の好ましい態様においては、セロビオヒドロラーゼは、Trichoderma reeseiセロビオヒドロラーゼである。
【００８８】
別のより好ましい態様においては、Trichoderma reeseiセロビオヒドロラーゼＩ（ＣＥＬ７Ａ）は、配列番号８８の成熟ポリペプチドまたはそのオルソログまたは変異体であるである。別の好ましい態様においては、Trichoderma reeseiセロビオヒドロラーゼＩＩ（ＣＥＬ６Ａ）は、配列番号９０の成熟ポリペプチドまたはそのオルソログまたは変異体であるである。別のより好ましい態様においては、セルロース結合ドメインを伴うChrysosporium lucknowenseＣＥＬ７セロビオヒドロラーゼは、配列番号９２の成熟ポリペプチドまたはそのオルソログまたは変異体であるである。別のより好ましい態様においては、セルロース結合ドメインを伴わないMyceliophthora thermophilaＣＥＬ７セロビオヒドロラーゼは、配列番号９４の成熟ポリペプチドまたはそのオルソログまたは変異体である。別のより好ましい態様においては、Thielavia terrestrisセロビオヒドロラーゼは、配列番号９６の成熟ポリペプチドまたはそのオルソログまたは変異体である。
【００８９】
別のより好ましい態様においては、Trichoderma reeseiセロビオヒドロラーゼＩ（ＣＥＬ７Ａ）セロビオヒドロラーゼは、配列番号８７の成熟ポリペプチドコーディング配列またはそのオルソログまたは変異体によってコードされる。別のより好ましい態様においては、Trichoderma reeceiエンドグルカナーゼＩＩ（ＣＥＬ６Ａ）セロビオヒドロラーゼは、配列番号８９の成熟ポリペプチドコーディング配列またはそのオルソログまたは変異体によってコードされる。別のより好ましい態様においては、セルロース結合ドメインを伴うChrysosporium lucknowenseＣＥＬ７セロビオヒドロラーゼは、配列番号９１の成熟ポリペプチドコーディング配列またはそのオルソログまたは変異体によってコードされる。別のより好ましい態様においては、セルロース結合ドメインを伴わないMyceliophthora thermophilaＣＥＬ７セロビオヒドロラーゼは、配列番号９３の成熟ポリペプチドコーディング配列またはそのオルソログまたは変異体によってコードされる。別のより好ましい態様においては、Thielavia terrestrisセロビオヒドロラーゼは、配列番号９５の成熟ポリペプチドコーディング配列またはそのオルソログまたは変異体によってコードされる。
【００９０】
Trichoderma reeseiセロビオヒドロラーゼＩ（ＣＥＬ７Ａ）は、Shoemakerら、１９８３年、Biotechnology (N.Y.)、第１号、６９１〜６９６頁にしたがって得ることができる。Trichoderma reeseiセロビオヒドロラーゼＩＩ（ＣＥＬ６Ａ）は、Terriら、１９８７年、Gene、第５１号、４３〜５２頁にしたがって得ることができる。Chrysosporium lucknowenseＣＥＬ７セルロース結合ドメインを伴うChrysosporium lucknowenseＣＥＬ７セロビオヒドロラーゼは、国際公開第２００１／７９５０７号（WO 2001/79507）にしたがって得ることができる。セルロース結合ドメインを伴わないMyceliophthora thermophilaＣＥＬ７セロビオヒドロラーゼは、国際公開第２００３／０００９４１号（WO 2003/000941）にしたがって得ることができる。Thielavia terrestrisセロビオヒドロラーゼは国際公開第２００６／０７４４３５号（WO 2006/074435）にしたがって得ることができる。
【００９１】
別の好ましい形態においては、ベータ−グルコシダーゼは、Aspergillus oryzaeから得られる。別の好ましい形態においては、ベータ−グルコシダーゼはAspergillus fumigatusから得られる。別の好ましい形態においては、ベータ−グルコシダーゼは、Penicillium brasilianum例えばPenicillium brasilianum菌株ＩＢＴ２０８８８から得られる。別の好ましい形態においては、ベータ−グルコシダーゼは、Aspergillus nigerから得られる。別の好ましい形態においては、ベータ−グルコシダーゼは、Aspergillus aculeatusから得られる。
【００９２】
より好ましい態様においては、Aspergillus oryzaeベータ−グルコシダーゼは、配列番号１６の成熟ポリペプチドまたはそのオルソログまたは変異体である。別のより好ましい態様においては、Aspergillus fumigatusベータ−グルコシダーゼは、配列番号１８の成熟ポリペプチドまたはそのオルソログまたは変異体である。別のより好ましい態様においては、Penicillium brasilianumベータ−グルコシダーゼは、配列番号２０の成熟ポリペプチドまたはそのオルソログまたは変異体である。別のより好ましい態様においては、Aspergillus nigerベータ−グルコシダーゼは、配列番号２２の成熟ポリペプチドまたはそのオルソログまたは変異体である。別のより好ましい態様においては、Aspergillus aculeatusベータ−グルコシダーゼは、配列番号２４の成熟ポリペプチドまたはそのオルソログまたは変異体である。別のより好ましい態様においては、Aspergillus oryzaeベータ−グルコシダーゼは、配列番号１５の成熟ポリペプチドコーディング配列またはそのオルソログまたは変異体によってコードされる。別のより好ましい態様においては、Aspergillus fumigatusベータ−グルコシダーゼは、配列番号１７の成熟ポリペプチドコーディング配列またはそのオルソログまたは変異体によってコードされる。別のより好ましい態様においては、Penicillium brasilianumベータ−グルコシダーゼは、配列番号１９の成熟ポリペプチドコーディング配列またはそのオルソログまたは変異体によってコードされる。別のより好ましい態様においては、Aspergillus nigerベータ−グルコシダーゼは、配列番号２１の成熟ポリペプチドコーディング配列またはそのオルソログまたは変異体によってコードされる。別のより好ましい態様においては、Aspergillus aculeatusベータ−グルコシダーゼは、配列番号２３の成熟ポリペプチドコーディング配列またはそのオルソログまたは変異体によってコードされる。
【００９３】
ベータ−グルコシダーゼ活性を有するAspergillus oryzaeポリペプチドは、国際公開第２００２／０９５０１４号（WO 2002/095014）にしたがって得ることができる。ベータ−グルコシダーゼ活性を有するAspergillus fumigatusポリペプチドは、国際公開第２００５／０４７４９９（WO 2005/047499）にしたがって得ることができる。ベータ−グルコシダーゼ活性を有するPenicillium brasilianumポリペプチドは、国際公開第２００７／０１９４４２（WO 2007/019442）にしたがって得ることができる。ベータ−グルコシダーゼ活性を有するAspergillus nigerポリペプチドは、Danら、２０００年、J. Biol. Chem.、第２７５号、４９７３〜４９８０頁にしたがって得ることができる。ベータ−グルコシダーゼ活性を有するAspergillus aculeatusポリペプチドは、Kawaguchiら、１９９６年、Gene、第１７３号、２８７〜２８８頁にしたがって得ることができる。
【００９４】
別の好ましい形態においては、配列番号１６の成熟ポリペプチドは、E. coli ＤＳＭ１４２４０中に含まれるプラスミドの中に含まれたポリヌクレオチドによってコードされる。別の好ましい形態においては、配列番号１８の成熟ポリペプチドは、E. coli ＮＲＲＬＢ−３０６９５中に含まれるプラスミドｐＥＪＧ１１３中に含まれたポリヌクレオチドによってコードされる。別の好ましい形態においては、配列番号２０の成熟ポリペプチドは、E.coli ＮＲＲＬＢ−３０８６０中に含まれるプラスミドｐＫＫＡＢの中に含まれたポリヌクレオチドによってコードされる。
【００９５】
別の好ましい形態においては、ベータ−グルコシダーゼは、配列番号２６のAspergillus oryzaeベータ−グルコシダーゼ変異体ＢＧ融合タンパク質である。別の好ましい形態においては、Aspergillus oryzaeベータ−グルコシダーゼ変異体ＢＧ融合タンパク質は、配列番号２５のポリヌクレオチドによってコードされる。別の好ましい形態においては、ベータ−グルコシダーゼは、配列番号２８のAspergillus oryzaeベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質である。別の好ましい形態においては、Aspergillus oryzaeベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質は、配列番号２７のポリヌクレオチドによりコードされる。
【００９６】
本発明において使用可能なその他のベータ−グルコシダーゼの例としては、Aspergillus oryzae ベータ−グルコシダーゼ(国際公開第０２／０９５０１４号（WO 02/095014）；国際公開第０４／０９９２２８号（WO 04/099228）)；Aspergillus aculeatus ベータ−グルコシダーゼ (Kawaguchiら、１９９６年、Gene、第１７３号、２８７〜２８８頁)；Aspergillus avenaceusベータ−グルコシダーゼ（GenBankTM 登録番号ＡＹ９４３９７１)；Aspergillus fumigatusベータ−グルコシダーゼ（GenBankTM 登録番号ＸＭ７４５２３４）；Aspergillus kawachiiベータ−グルコシダーゼ（GenBankTM 登録番号ＡＢ００３４７０）；Aspergillus niger ベータ−グルコシダーゼ（GenBankTMＡＪ１３２３８６）；Magnaporthe griseaベータ−グルコシダーゼ（GenBankTM 登録番号ＡＹ８４９６７０）；Phanerochaete chrysosporiumベータ−グルコシダーゼ（GenBankTM 登録番号ＡＢ２５３３２７）；Talaromyces emersoniiベータ−グルコシダーゼ（GenBankTM 登録番号ＡＹ０７２９１８）、およびTrichoderma reeseiベータ−グルコシダーゼ（GenBankTM 登録番号Ｕ０９５８０、ＡＢ００３１１０、ＡＹ２８１３７４、ＡＹ２８１３７５、ＡＹ２８１３７７、ＡＹ２８１３７8およびＡＹ２８１３７９）が含まれるがこれらに限定されるわけではない。国際公開第０４／０９９２２８号（WO 04/099228）に記述されているものといったベータ−グルコシダーゼの変異体も同様に使用可能である。
【００９７】
その他のベータ−グルコシダーゼは、Henrissat B.、１９９１年、「A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities」、Biochem. J.、第２８０号、３０９〜３１６頁、ならびにHenrissat B.およびBairoch A.、１９９６年、「Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases」、Biochem. J.、第３１６号、６９５〜６９６頁に準じた分類を用いて、グリコシルヒドロラーゼファミリーのうちの１３以上のものにおいて開示されている。
【００９８】
前述の種については、本発明が、知られている種名称とは無関係に完全状態および不完全状態の両方そして、その他の分類学的等価物、例えばアナモルフを包含することがわかる。当業者であれば、適切な等価物の同一性を容易に認識する。
【００９９】
これらの種の菌株は、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（ＤＳＭ）、Centraalbureau Voor Schimmelcultures（ＣＢＳ）およびAgricultural Research Service Patent Culture Collection、Northern Regional Research Center（ＮＲＲＬ）といった数多くの培養収集機関において一般に容易に利用できるものである。
【０１００】
その上、かかるポリペプチドは、上述のプローブを用いて自然（例えば土壌、たい肥、水など）から単離される微生物を含めたその他の供給源から同定し獲得しうる。自然の生息環境から微生物を単離するための技術は、当該技術分野において周知である。ポリヌクレオチドは、その後、かかる微生物のゲノムまたはｃＤＮＡライブラリを類似の要領でスクリーニングすることによって得ることができる。ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列がひとたびプローブ（単複）を用いて検出されたならば、当業者にとって周知の技術（例えばSambrookら、１９８９年、上掲書を参照）を用いてポリヌクレオチドを単離するかまたはクローニングすることができる。
【０１０１】
セルロース分解酵素活性を有するポリペプチドには、別のポリペプチドがセルロース分解酵素活性を有するポリペプチドまたはそのフラグメントのＮ末端またはＣ末端で融合されている融合されたポリペプチドまたは分割可能な融合ポリペプチドも含まれる。融合されたタンパク質は、別のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（または一部分）を、セルロース分解酵素活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド（またはその一部分）に融合させることによって生産される。融合ポリペプチドを生産するための技術は当該技術分野において公知であり、これには、ポリペプチドをコードするコーディング配列が枠内にありかつ、融合タンパク質の発現が同じプロモータ（単複）およびターミネータの制御下にあるような形で、このコーディング配列をライゲートする工程が含まれる。
【０１０２】
融合ポリペプチドはさらに、分割部位をも含む。融合タンパク質の分泌の時点で、部位は分割され、セルロース分解酵素活性を有するポリペプチドを融合タンパク質から放出する。分割部位の例としては、ジペプチドＬｙｓ−ＡｒｇをコードするＫｅｘ２部位（Martinら、２００３年、J. lnd Microbiol. Biotechnol.、第３号、５６８〜７６頁；Svetinaら、２０００年、J. Biotechnol.、第７６号、２４５〜２５１頁；Rasmussen- Wilsonら、１９９７年、Appl. Environ. Microbiol.、第６３号、３４８８〜３４９３頁；Wardら、１９９５年、Biotechnology、第１３号、４９８〜５０３頁；および Contrerasら、１９９１年、Biotechnology、第９号、３７８〜３８１頁）；アルギニン残基の後Ｘａ因子プロテアーゼにより分割されるＩｌｅ−（ＧｌｕまたはＡｓｐ）−Ｇｌｙ−Ａｒｇ部位（Eatonら、１９８６年、Biochem.、第２５号、５０５〜５１２頁）；リジンの後エンテロキナーゼによって分割されるＡｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ部位（Collins-Racieら、１９９５年、Biotechnology、第１３号、９８２〜９８７頁）；ゲネナーゼＩによって分割されるＨｉｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ部位またはＨｉｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ部位（Carterら、１９８９年、Proteins: Structure、Function、and Genetics、第６号、２４０〜２４８頁）；Ａｒｇの後トロンビンにより分割されるＬｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ部位（Stevens、２００３年、Drug Discovery World、第４号、３５〜４８頁）；Ｇｌｎの後ＴＥＶプロテアーゼにより分割されるＧｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ部位（Stevens、２００３年、上掲書）；およびＧｌｎの後ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼの遺伝子操作された形態により分割されるＬｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ部位（Stevens、２００３年、上掲書）が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
【０１０３】
好ましい態様においては、セルロース分解酵素組成物は、ベータ−グルコシダーゼ；Trichoderma reeseiセロビオヒドロラーゼＩ（ＣＥＬ７Ａ）、Trichoderma reeseiセロビオヒドロラーゼＩＩ（ＣＥＬ６Ａ）およびTrichoderma reeceiエンドグルカナーゼＩ（ＣＥＬ７Ｂ）を含む。
【０１０４】
別の好ましい形態においては、セルロース分解酵素組成物は、ベータ−グルコシダーゼ；Trichoderma reeseiセロビオヒドロラーゼＩ（ＣＥＬ７Ａ）、Trichoderma reeseiセロビオヒドロラーゼＩＩ（ＣＥＬ６Ａ）、およびTrichoderma reeceiエンドグルカナーゼＩ（ＣＥＬ７Ｂ）、を含み、さらにTrichoderma reeceiエンドグルカナーゼＩＩ（ＣＥＬ５Ａ）、Trichoderma reeceiエンドグルカナーゼＶ（ＣＥＬ４５Ａ）およびTrichoderma reeceiエンドグルカナーゼＩＩＩ（ＣＥＬ１２Ａ）からなる群から選択された１つ以上の酵素を含む。
【０１０５】
別の好ましい形態においては、セルロース分解酵素組成物は、ベータ−グルコシダーゼ；Trichoderma reeseiセロビオヒドロラーゼＩ（ＣＥＬ７Ａ）、Trichoderma reeseiセロビオヒドロラーゼＩＩ（ＣＥＬ６Ａ）およびTrichoderma reeceiエンドグルカナーゼＩ（ＣＥＬ７Ｂ）を含み、さらにThielavia terrestrisセロビオヒドロラーゼを含む。
【０１０６】
別の好ましい形態においては、セルロース分解酵素組成物は、ベータ−グルコシダーゼ；Trichoderma reeseiセロビオヒドロラーゼＩ（ＣＥＬ７Ａ）、Trichoderma reeseiセロビオヒドロラーゼＩＩ（ＣＥＬ６Ａ）、およびTrichoderma reeceiエンドグルカナーゼＩ（ＣＥＬ７Ｂ）を含み、さらに、（１）Trichoderma reeceiエンドグルカナーゼＩＩ（ＣＥＬ５Ａ）、Trichoderma reeceiエンドグルカナーゼＶ（ＣＥＬ４５Ａ）およびTrichoderma reeceiエンドグルカナーゼＩＩＩ（ＣＥＬ１２Ａ）からなる群から選択された１つ以上の酵素を含み、かつ／またはさらに（２）Thielavia terrestrisセロビオヒドロラーゼを含む。
【０１０７】
別の好ましい形態においては、セルロース分解酵素組成物は、エンドグルカナーゼ活性を有するMyceliophthora thermophilaＣＥＬ７ポリペプチド、エンドグルカナーゼ活性を有するChrysosporium lucknowenseＣＥＬ１２ポリペプチド、エンドグルカナーゼ活性を有するChrysosporium lucknowenseＣＥＬ４５ポリペプチド、セルロース結合ドメインを伴うセロビオヒドロラーゼ活性を有するChrysosporium lucknowenseＣＥＬ７ポリペプチドおよびセルロース結合ドメインを伴わないセロビオヒドロラーゼ活性を有するMyceliophthora thermophilaＣＥＬ７ポリペプチドからなる群から選択された１つ以上（複数）の構成要素を含む。別の好ましい形態においては、セルロース分解酵素組成物は、エンドグルカナーゼ活性を有するMyceliophthora thermophilaＣＥＬ７ポリペプチド、エンドグルカナーゼ活性を有するChrysosporium lucknowenseＣＥＬ１２ポリペプチド、エンドグルカナーゼ活性を有するChrysosporium lucknowenseＣＥＬ４５ポリペプチド、セルロース結合ドメインを伴うセロビオヒドロラーゼ活性を有するＣＥＬ７ポリペプチドおよびセルロース結合ドメインを伴わないセロビオヒドロラーゼ活性を有するMyceliophthora thermophilaＣＥＬ７ポリペプチドを含む。別の好ましい形態においては、上述の組成物はさらに、ベータ−グルコシダーゼ活性を有する１つ以上（複数）のポリペプチドをさらに含む。
【０１０８】
セルロース分解酵素組成物は同様に、市販の調製物でもあり得る。本発明において使用するのに適した市販のセルロース分解酵素調製物の例としては、CELLUCLASTTM（Novozyme A/Sより入手可）およびNOVOZYMTM188（Novozyme A/Sより入手可）が含まれる。使用可能なその他の市販の調製物としては、ELLUZYMETM、CEREFLOTM および ULTRAFLOTM（Novozymes A/S）、LAMINEXTM および SPEZYMETM CP（Genencor Int.）、ROHAMENTTM 7069 W（Rohm GmbH）および FIBREZYME（登録商標） LDI、FIBREZYME（登録商標） LBR、またはVISCOSTAR（登録商標） 150L（Dyadic International、Inc.、Jupiter、FL、USA）が含まれる。
【０１０９】
本発明において有用であり得るその他のセルロース分解タンパク質は、欧州特許第４９５，２５７号（EP495,257）、欧州特許第５３１，３１５号（EP531,315）、欧州特許第５３１，３７２号（EP 531,372）、WO８９／０９２５９号（WO 89/09259）、国際公開第９４／０７９９８号（WO 94/07998）、国際公開第９５／２４４７１号（WO 95/24471）、国際公開第９６／１１２６２号（WO96/11262）、国際公開第９６／２９３９７号（WO 96/29397）、国際公開第９６／０３４１０８号（WO 96/034108）、国際公開第９７／１４８０４号（WO 97/14804）、国際公開第９８／０８９４０号（WO 98/08940）、国際公開第９８／０１２３０７号（WO98/012307）、国際公開第９８／１３４６５号（WO 98/13465）、国際公開第９８／０１５６１９号（WO 98/015619）、国際公開第９８／０１５６３３号（WO 98/015633）、国際公開第９８／０２８４１１号（WO 98/028411）、国際公開第９９／０６５７４号（WO 99/06574）、国際公開第９９／１０４８１号（WO 99/10481）、国際公開第９９／０２５８４６号（WO 99/025846）、国際公開第９９／０２５８４７号（WO 99/025847）、国際公開第９９／０３１２５５号（WO 99/031255）、国際公開第２０００／００９７０７号（WO 2000/009707）、国際公開第２００２／０５０２４５号（WO 2002/050245）、国際公開第２００２／００７６７９２号（WO 2002/0076792）、国際公開第２００２／１０１０７８号（WO 2002/101078）、国際公開第２００３／０２７３０６号（WO 2003/027306）、国際公開第２００３／０５２０５４号（WO 2003/052054）、国際公開第２００３／０５２０５５号（WO 2003/052055）、国際公開第２００３／０５２０５６号（WO 2003/052056）、国際公開第２００３／０５２０５７号（WO 2003/052057）、国際公開第２００３／０５２１１８号（WO 2003/052118）、国際公開第２００４／０１６７６０号（WO 2004/016760）、国際公開第２００４／０４３９８０号（WO 2004/043980）、国際公開第２００４／０４８５９２号（WO 2004/048592）、国際公開第２００５／００１０６５号（WO 2005/001065）、国際公開第２００５／０２８６３６号（WO 2005/028636）、国際公開第２００５／０９３０５０号（WO 2005/093050）、国際公開第２００５／０９３０７３号（WO 2005/093073）、国際公開第２００６／０７４００５号（WO 2006/074005）、国際公開第２００６／１１７４３２号（WO 2006/117432）、国際公開第２００７／０７１８１８号（WO 2007/071818）、国際公開第２００７／０７１８２０号（WO 2007/071820）、国際公開第２００８／００８０７０号（WO 2008/008070）、国際公開第２００８／００８７９３号（WO 2008/008793,） 米国特許第４，４３５，３０７号（U.S. Patent No. 4,435,307）、米国特許第５，４５７，０４６号（U.S. Patent No. 5,457,046）、米国特許第５，６４８，２６３号（U.S. Patent No. 5,648,263）、米国特許第５，６８６，５９３号（U.S. Patent No. 5,686,593）、米国特許第５，６９１，１７８号（U.S. Patent No. 5,691 ,178）、米国特許第５，７６３，２５４号（U.S. Patent No. 5,763,254）および米国特許第５，７７６，７５７号（U.S. Patent No. 5,776,757）の中に記述されている。
【０１１０】
本発明の方法において使用されるセルロース分解タンパク質は、当該技術分野において公知の手順を用いて、適切な炭素および窒素供給源および無機塩を含有する栄養培地上で上述の微生物菌株を発酵することによって生産できる（例えばBennett、J.W.およびLaSure、L.（編）、More Gene Manipulations in Fungi、Academic Press、CA、１９９１年を参照のこと）。適切な培地は、商業的供給業者から入手可能であり、そうでなければ公開された組成（例えばAmerican Type Culture Collectionのカタログ中）にしたがって調製してもよい。成長およびセルロース分解タンパク質の産生に適した温度範囲およびその他の条件は、当該技術分野において公知である（例えばBailey、J.E.、および Ollis、D.F.、Biochemical Engineering Fundamentals、McGraw-Hill Book Company、NY、１９８６年を参照のこと）。
【０１１１】
発酵は、セルロース分解タンパク質の発現または単離を結果としてもたらす細胞のあらゆる培養方法であり得る。したがって、発酵は、セルロース分解タンパク質を発現または単離させることのできる条件下で適切な培地中で実施される実験室または工業用発酵装置における（連続発酵、バッチ発酵または固形発酵を含めた）小規模または大規模発酵、または振盪フラスコ培養を含むものとして理解されてよい。上述の方法により生産される。結果として得られたセルロース分解タンパク質は、発酵培地から回収され、本明細書において記述されている通りの従来の手順によって精製され得る。
【０１１２】
セルロース分解増強活性を有するポリペプチド
第１の態様においては、セルロース分解増強活性を有する単離されたポリペプチドは、以下のモチーフを含む：
［ＩＬＭＶ］−Ｐ−Ｘ（４，５）−Ｇ−Ｘ−Ｙ−［ＩＬＭＶ］−Ｘ−Ｒ−Ｘ−［ＥＱ］−Ｘ（４）−［ＨＮＱ］および［ＦＷ］−［ＴＦ］−Ｋ−［ＡＩＶ］、
なお式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、Ｘ（４，５）は４つまたは５つの隣接位置にある任意のアミノ酸であり、Ｘ（４）は４つの隣接位置にある任意のアミノ酸である。
【０１１３】
上述のモチーフを含む単離されたポリペプチドは、さらに以下のものを含む：
Ｈ−Ｘ（１，２）−Ｇ−Ｐ−Ｘ（３）−［ＹＷ］−［ＡＩＬＭＶ］、
［ＥＱ］−Ｘ−Ｙ−Ｘ（２）−Ｃ−Ｘ−［ＥＨＱＮ］−［ＦＩＬＶ］−Ｘ−［ＩＬＶ］、または
Ｈ−Ｘ（１，２）−Ｇ−Ｐ−Ｘ（３）−［ＹＷ］−［ＡＩＬＭＶ］および［ＥＱ］−Ｘ−Ｙ−Ｘ（２）−Ｃ−Ｘ−［ＥＨＱＮ］−［ＦＩＬＶ］−Ｘ−［ＩＬＶ］、
なお式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、Ｘ（１，２）は１つの位置または２つの隣接位置にある任意のアミノ酸であり、Ｘ（３）は、３つの隣接位置にある任意のアミノ酸であり、Ｘ（２）は２つの隣接位置にある任意のアミノ酸である。上述のモチーフの中では、一般に認められたＩＵＰＡＣの一文字アミノ酸略語が用いられている。
【０１１４】
好ましい態様においては、セルロース分解増強活性を有する単離されたポリペプチドはさらに、Ｈ−Ｘ（１，２）−Ｇ−Ｐ−Ｘ（３）−［ＹＷ］−［ＡＩＬＭＶ］を含む。別の好ましい形態においては、セルロース分解増強活性を有する単離ポリペプチドは［ＥＱ］−Ｘ−Ｙ−Ｘ（２）−Ｃ−Ｘ−［ＥＨＱＮ］−［ＦＩＬＶ］−Ｘ−［ＩＬＶ］を含む。別の好ましい形態においては、セルロース分解増強活性を有する単離ポリペプチドはさらに、Ｈ−Ｘ（１，２）−Ｇ−Ｐ−Ｘ（３）−［ＹＷ］−［ＡＩＬＭＶ］および［ＥＱ］−Ｘ−Ｙ−Ｘ（２）−Ｃ−Ｘ−［ＥＨＱＮ］−［ＦＩＬＶ］−Ｘ−［ＩＬＶ］を含む。
【０１１５】
第２の態様においては、セルロース分解増強活性を有する単離ポリペプチドは、以下のモチーフを含む：
［ＩＬＭＶ］−Ｐ−ｘ（４，５）−Ｇ−ｘ−Ｙ−［ＩＬＭＶ］−ｘ−Ｒ−ｘ−［ＥＱ］−ｘ（３）−Ａ−［ＨＮＱ］、
なお式中、ｘは任意のアミノ酸であり、ｘ（４，５）は４つまたは５つの隣接位置にある任意のアミノ酸であり、ｘ（３）は３つの隣接位置にある任意のアミノ酸である。以上のモチーフの中では、一般に認められたＩＵＰＡＣの一文字アミノ酸略語が用いられている。
【０１１６】
第３の態様においては、セルロース分解増強活性を有する単離ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４の成熟ポリペプチドに対する好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに一層好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、そしてさらに最も好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性度を有するアミノ酸配列を有し、これらはセルロース分解増強活性を有する（以下「相同性ポリペプチド」と呼ぶ）。好ましい態様においては、相同性ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４の成熟ポリペプチドと、アミノ酸１０個、好ましくはアミノ酸５個、より好ましくはアミノ酸４個、さらに一層好ましくはアミノ酸３個、最も好ましくはアミノ酸２個、そしてさらに最も好ましくはアミノ酸１個だけ異っているアミノ酸配列を有する。
【０１１７】
セルロース分解増強活性を有するポリペプチドは好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列またはその対立遺伝子変異体、またはセルロース分解増強活性を有するそのフラグメントを含む。好ましい態様においては、ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。別の好ましい形態においては、ポリペプチドは、配列番号２の成熟ポリペプチドを含む。別の好ましい形態においては、ポリペプチドは、配列番号２の成熟ポリペプチドを含む。別の好ましい形態においては、ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸２０〜３２６、またはその対立遺伝子変異体；またはセルロース分解増強活性を有するそのフラグメントを含む。別の好ましい形態においては、ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸２０〜３２６を含む。別の好ましい形態においては、ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列またはその対立遺伝子変異体；またはセルロース分解増強活性を有するそのフラグメントからなる。別の好ましい形態においては、ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列からなる。別の好ましい形態においては、ポリペプチドは、配列番号２の成熟ポリペプチドからなる。別の好ましい形態においては、ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸２０〜３２６、またはその対立遺伝子変異体；またはセルロース分解増強活性を有するそのフラグメントからなる。別の好ましい形態においては、ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸２０〜３２６からなる。
【０１１８】
セルロース分解増強活性を有するポリペプチドは好ましくは、配列番号４のアミノ酸配列またはその対立遺伝子変異体；またはセルロース分解増強活性を有するそのフラグメントを含む。好ましい態様においては、ポリペプチドは配列番号４のアミノ酸配列を含む。別の好ましい形態においては、ポリペプチドは、配列番号４の成熟ポリペプチドを含む。別の好ましい形態においては、ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸１８〜２４０；またはその対立遺伝子変異体；またはセルロース分解増強活性を有するそのフラグメントを含む。別の好ましい形態においては、ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸１８〜２４０を含む。別の好ましい形態においては、ポリペプチドは配列番号４のアミノ酸配列またはその対立遺伝子変異体；またはセルロース分解増強活性を有するそのフラグメントからなる。別の好ましい形態においては、ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列からなる。別の好ましい形態においては、ポリペプチドは、配列番号４の成熟ポリペプチドからなる。別の好ましい形態においては、ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸１８〜２４０またはその対立遺伝子変異体；またはセルロース分解増強活性を有するそのフラグメントからなる。別の好ましい形態においては、ポリペプチドは配列番号４のアミノ酸１８〜２４０からなる。
【０１１９】
セルロース分解増強活性を有するポリペプチドは好ましくは、配列番号６のアミノ酸配列またはその対立遺伝子変異体；またはセルロース分解増強活性を有するそのフラグメントを含む。好ましい態様においては、ポリペプチドは配列番号６のアミノ酸配列を含む。別の好ましい形態においては、ポリペプチドは、配列番号６の成熟ポリペプチドを含む。別の好ましい形態においては、ポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸２０〜２５８；またはその対立遺伝子変異体；またはセルロース分解増強活性を有するそのフラグメントを含む。別の好ましい形態においては、ポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸２０〜２５８を含む。別の好ましい形態においては、ポリペプチドは配列番号６のアミノ酸配列またはその対立遺伝子変異体；またはセルロース分解増強活性を有するそのフラグメントからなる。別の好ましい形態においては、ポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列からなる。別の好ましい形態においては、ポリペプチドは、配列番号６の成熟ポリペプチドからなる。別の好ましい形態においては、ポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸２０〜２５８またはその対立遺伝子変異体；またはセルロース分解増強活性を有するそのフラグメントからなる。別の好ましい形態においては、ポリペプチドは配列番号６のアミノ酸２０〜２５８からなる。
【０１２０】
セルロース分解増強活性を有するポリペプチドは好ましくは、配列番号８のアミノ酸配列またはその対立遺伝子変異体；またはセルロース分解増強活性を有するそのフラグメントを含む。好ましい態様においては、ポリペプチドは配列番号８のアミノ酸配列を含む。別の好ましい形態においては、ポリペプチドは、配列番号８の成熟ポリペプチドを含む。別の好ましい形態においては、ポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸１９〜２２６；またはその対立遺伝子変異体；またはセルロース分解増強活性を有するそのフラグメントを含む。別の好ましい形態においては、ポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸１９〜２２６を含む。別の好ましい形態においては、ポリペプチドは配列番号８のアミノ酸配列またはその対立遺伝子変異体；またはセルロース分解増強活性を有するそのフラグメントからなる。別の好ましい形態においては、ポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列からなる。別の好ましい形態においては、ポリペプチドは、配列番号８の成熟ポリペプチドからなる。別の好ましい形態においては、ポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸１９〜２２６またはその対立遺伝子変異体；またはセルロース分解増強活性を有するそのフラグメントからなる。別の好ましい形態においては、ポリペプチドは配列番号８のアミノ酸１９〜２２６からなる。
【０１２１】
セルロース分解増強活性を有するポリペプチドは好ましくは、配列番号１０のアミノ酸配列またはその対立遺伝子変異体；またはセルロース分解増強活性を有するそのフラグメントを含む。好ましい態様においては、ポリペプチドは配列番号１０のアミノ酸配列を含む。別の好ましい形態においては、ポリペプチドは、配列番号１０の成熟ポリペプチドを含む。別の好ましい形態においては、ポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸２０〜３０４；またはその対立遺伝子変異体；またはセルロース分解増強活性を有するそのフラグメントを含む。別の好ましい形態においては、ポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸２０〜３０４を含む。別の好ましい形態においては、ポリペプチドは配列番号１０のアミノ酸配列またはその対立遺伝子変異体；またはセルロース分解増強活性を有するそのフラグメントからなる。別の好ましい形態においては、ポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列からなる。別の好ましい形態においては、ポリペプチドは、配列番号１０の成熟ポリペプチドからなる。別の好ましい形態においては、ポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸２０〜３０４またはその対立遺伝子変異体；またはセルロース分解増強活性を有するそのフラグメントからなる。別の好ましい形態においては、ポリペプチドは配列番号１０のアミノ酸２０〜３０４からなる。
【０１２２】
セルロース分解増強活性を有するポリペプチドは好ましくは、配列番号１２のアミノ酸配列またはその対立遺伝子変異体；またはセルロース分解増強活性を有するそのフラグメントを含む。好ましい態様においては、ポリペプチドは配列番号１２のアミノ酸配列を含む。別の好ましい形態においては、ポリペプチドは、配列番号１２の成熟ポリペプチドを含む。別の好ましい形態においては、ポリペプチドは、配列番号１２のアミノ酸２３〜２５０；またはその対立遺伝子変異体；またはセルロース分解増強活性を有するそのフラグメントを含む。別の好ましい形態においては、ポリペプチドは、配列番号１２のアミノ酸２３〜２５０を含む。別の好ましい形態においては、ポリペプチドは配列番号１２のアミノ酸配列またはその対立遺伝子変異体；またはセルロース分解増強活性を有するそのフラグメントからなる。別の好ましい形態においては、ポリペプチドは、配列番号１２のアミノ酸配列からなる。別の好ましい形態においては、ポリペプチドは、配列番号１２の成熟ポリペプチドからなる。別の好ましい形態においては、ポリペプチドは、配列番号１２のアミノ酸２３〜２５０またはその対立遺伝子変異体；またはセルロース分解増強活性を有するそのフラグメントからなる。別の好ましい形態においては、ポリペプチドは配列番号１２のアミノ酸２３〜２５０からなる。
【０１２３】
セルロース分解増強活性を有するポリペプチドは好ましくは、配列番号１４のアミノ酸配列またはその対立遺伝子変異体；またはセルロース分解増強活性を有するそのフラグメントを含む。好ましい態様においては、ポリペプチドは配列番号１４のアミノ酸配列を含む。別の好ましい形態においては、ポリペプチドは、配列番号１４の成熟ポリペプチドを含む。別の好ましい形態においては、ポリペプチドは、配列番号１４のアミノ酸２０〜２４９またはその対立遺伝子変異体；またはセルロース分解増強活性を有するそのフラグメントを含む。別の好ましい形態においては、ポリペプチドは、配列番号１４のアミノ酸２０〜２４９を含む。別の好ましい形態においては、ポリペプチドは配列番号１４のアミノ酸配列またはその対立遺伝子変異体；またはセルロース分解増強活性を有するそのフラグメントからなる。別の好ましい形態においては、ポリペプチドは、配列番号１４のアミノ酸配列からなる。別の好ましい形態においては、ポリペプチドは、配列番号１４の成熟ポリペプチドからなる。別の好ましい形態においては、ポリペプチドは、配列番号１４のアミノ酸２０〜２４９またはその対立遺伝子変異体；またはセルロース分解増強活性を有するそのフラグメントからなる。別の好ましい形態においては、ポリペプチドは配列番号１４のアミノ酸２０〜２４９からなる。
【０１２４】
好ましくは、配列番号２の成熟ポリペプチドのフラグメントは少なくとも２７７個のアミノ酸残基、より好ましくは少なくとも２８７個のアミノ酸残基、そして最も好ましくは少なくとも２９７個のアミノ酸残基を含む。好ましくは、配列番号４の成熟ポリペプチドのフラグメントは、少なくとも１８５個のアミノ酸残基、より好ましくは少なくとも１９５個のアミノ酸残基、そして最も好ましくは少なくとも２０５個のアミノ酸残基を含む。好ましくは、配列番号６の成熟ポリペプチドのフラグメントは少なくとも２００個のアミノ酸残基、より好ましくは少なくとも２１２個のアミノ酸残基、そして最も好ましくは少なくとも２２４個のアミノ酸残基を含む。好ましくは、配列番号８の成熟ポリペプチドのフラグメントは、少なくとも１７５個のアミノ酸残基、より好ましくは少なくとも１８５個のアミノ酸残基、そして最も好ましくは少なくとも１９５個のアミノ酸残基を含む。好ましくは、配列番号１０の成熟ポリペプチドのフラグメントは少なくとも２４０個のアミノ酸残基、より好ましくは少なくとも２５５個のアミノ酸残基そして最も好ましくは少なくとも２７０個のアミノ酸残基を含む。好ましくは、配列番号１２の成熟ポリペプチドのフラグメントは、少なくとも１７５個のアミノ酸残基、より好ましくは少なくとも１９０個のアミノ酸残基、そして最も好ましくは少なくとも２０５個のアミノ酸残基を含む。好ましくは、配列番号１４の成熟ポリペプチドのフラグメントは、少なくとも２００個のアミノ酸残基、より好ましくは少なくとも２１０個のアミノ酸残基そして最も好ましくは少なくとも２２０個のアミノ酸残基を含む。
【０１２５】
好ましくは、配列番号１の成熟ポリペプチドコーディング配列のサブ配列は少なくとも８３１個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも８６１個のヌクレオチド、そして最も好ましくは少なくとも８９１個のヌクレオチドを含む。好ましくは、配列番号３の成熟ポリペプチドコーディング配列のサブ配列は、少なくとも５５５個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも５８５個のヌクレオチド、そして最も好ましくは少なくとも６１５個のヌクレオチドを含む。好ましくは、配列番号５の成熟ポリペプチドコーディング配列のサブ配列は、少なくとも６００個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも６３６個のヌクレオチド、そして最も好ましくは少なくとも６７２個のヌクレオチドを含む。好ましくは、配列７の成熟ポリペプチドコーディング配列のサブ配列は少なくとも５２５個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも５５５個のヌクレオチド、そして最も好ましくは少なくとも５８５個のヌクレオチドを含む。好ましくは、配列番号９の成熟ポリペプチドコーディング配列のサブ配列は少なくとも７２０個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも７６５個のヌクレオチド、そして最も好ましくは少なくとも８１０個のヌクレオチドを含む。好ましくは、配列番号１１のヌクレオチド６７〜７９６の成熟ポリペプチドコーディング配列のサブ配列は、少なくとも５２５個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも５７０個のヌクレオチド、そして最も好ましくは少なくとも６１５個のヌクレオチドを含む。好ましくは、配列番号１３の成熟ポリペプチドコーディング配列のサブ配列は少なくとも６００個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも６３０個のヌクレオチド、そして最も好ましくは少なくとも６６０個のヌクレオチドを含む。
【０１２６】
第４の態様においては、セルロース分解増強活性を有する単離ポリペプチドは、少なくとも超低ストリンジェンシー条件下、好ましくは少なくとも低ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中−高ストリンジェンシー条件、さらに一層好ましくは少なくとも高ストリンジェンシー条件、そして最も好ましくは少なくとも超高ストリンジェンシー条件下で、（ｉ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、または配列番号１３の成熟ポリペプチドコーディング配列、（ｉｉ）配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号１１の成熟ポリペプチドコーディング配列内に含まれるｃＤＮＡ配列、あるいは配列番号７、配列番号９または配列番号１３の成熟ポリペプチドコーディング配列を含むゲノムＤＮＡ配列、（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）のサブ配列または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）の全長相補的ストランドとハイブリッド形成するポリヌクレオチドによりコードされる（J. Sambrook, E.F. FritschおよびT. Maniatus、１９８９年、上掲書）。配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１または配列番号１３の成熟ポリペプチドコーディング配列のサブ配列は少なくとも１００個の隣接ヌクレオチドまたは好ましくは少なくとも２００個の隣接ヌクレオチドを含む。その上、サブ配列は、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドフラグメントをコードしてよい。好ましい実施形態においては、成熟ポリペプチドコーディング配列は、配列番号１のヌクレオチド３８８〜１３３２、配列番号３のヌクレオチド９８〜８２１、配列番号５のヌクレオチド１２６〜９７８、配列番号７のヌクレオチド５５〜６７８、配列番号９のヌクレオチド５８〜９１２、配列番号１１のヌクレオチド６７〜７９６、または配列番号１３のヌクレオチド７７〜７６６である。
【０１２７】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１または配列番号１３のヌクレオチド配列またはそのサブ配列；ならびに配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８または配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のアミノ酸配列またはそのフラグメントを用いて、上記のとおりの異なる属または種の菌株由来のセルロース分解増強活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを同定しクローニングするための核酸プローブを設計してもよい。
【０１２８】
本発明に関しては、ハイブリダイゼーションは、ヌクレオチド配列が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１または配列番号１３の成熟ポリペプチドコーディング配列、配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号１１の成熟ポリペプチドコーディング配列の中に含まれるｃＤＮＡ配列または、配列番号７、配列番号９または配列番号１３の成熟ポリペプチドコーディング配列を含むゲノムＤＮＡ配列、その全長相補的ストランドまたはそのサブ配列に対応する標識された核酸プローブに対して、上記の通り超低乃至超高ストリンジェンシー条件下でハイブリッド形成することを表わす。
【０１２９】
好ましい態様においては、核酸プローブは、配列番号１の成熟ポリペプチドコーディング配列である。別の好ましい形態においては、核酸プローブは、配列番号１のヌクレオチド３８８〜１３３２である。別の好ましい形態においては、核酸プローブは、配列番号２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列またはそのサブ配列である。別の好ましい形態においては、核酸プローブは、配列番号１である。別の好ましい形態においては、核酸プローブは、E. coli ＮＲＲＬ  Ｂ−３０６９９内に含まれるプラスミドｐＥＪＧ１２０中に含まれ、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列である。別の好ましい形態においては、核酸プローブは、E. coli ＮＲＲＬ  Ｂ−３０６９９内に含まれるプラスミドｐＥＪＧ１２０中に含まれた成熟ポリペプチドコーディング配列である。
【０１３０】
別の好ましい形態においては、核酸プローブは、配列番号３の成熟ポリペプチドコーディング配列である。別の好ましい形態においては、核酸プローブは、配列番号３のヌクレオチド９８〜８２１である。別の好ましい形態においては、核酸プローブは、配列番号４のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列またはそのサブ配列である。別の好ましい形態においては、核酸プローブは、配列番号３である。別の好ましい形態においては、核酸プローブは、E. coli ＮＲＲＬ  Ｂ−３０８１３内に含まれるプラスミドｐＴｔｅｒ６１Ｃ中に含まれ、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列である。別の好ましい形態においては、核酸プローブは、E. coli ＮＲＲＬ  Ｂ−３０８１３内に含まれるプラスミドｐＴｔｅｒ６１Ｃ中に含まれた成熟ポリペプチドコーディング配列である。
【０１３１】
別の好ましい形態においては、核酸プローブは、配列番号５の成熟ポリペプチドコーディング配列である。別の好ましい形態においては、核酸プローブは、配列番号５のヌクレオチド１２６〜９７８である。別の好ましい形態においては、核酸プローブは、配列番号６のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列またはそのサブ配列である。別の好ましい形態においては、核酸プローブは、配列番号５である。別の好ましい形態においては、核酸プローブは、E. coli ＮＲＲＬ  Ｂ−３０８１２内に含まれるプラスミドｐＴｔｅｒ６１Ｄ中に含まれ、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列である。別の好ましい形態においては、核酸プローブは、E. coli ＮＲＲＬ  Ｂ−３０８１２内に含まれるプラスミドｐＴｔｅｒ６１Ｄの中に含まれた成熟ポリペプチドコーディング配列である。
【０１３２】
別の好ましい形態においては、核酸プローブは、配列番号７の成熟ポリペプチドコーディング配列である。別の好ましい形態においては、核酸プローブは、配列番号７のヌクレオチド５５〜６７８である。別の好ましい形態においては、核酸プローブは、配列番号８のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列またはそのサブ配列である。別の好ましい形態においては、核酸プローブは、配列番号７である。別の好ましい形態においては、核酸プローブは、E. coli ＮＲＲＬ  Ｂ−３０８１４内に含まれるプラスミドｐＴｔｅｒ６１Ｅ中に含まれ、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列である。別の好ましい形態においては、核酸プローブは、E. coli ＮＲＲＬ  Ｂ−３０８１４内に含まれるプラスミドｐＴｔｅｒ６１Ｅ中に含まれた成熟ポリペプチドコーディング配列である。
【０１３３】
別の好ましい形態においては、核酸プローブは、配列番号９の成熟ポリペプチドコーディング配列である。別の好ましい形態においては、核酸プローブは、配列番号９のヌクレオチド５８〜９１２である。別の好ましい形態においては、核酸プローブは、配列番号１０のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列またはそのサブ配列である。別の好ましい形態においては、核酸プローブは、配列番号９である。別の好ましい形態においては、核酸プローブは、E. coli ＮＲＲＬ  Ｂ−３０８１１内に含まれるプラスミドｐＴｔｅｒ６１Ｇ中に含まれ、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列である。別の好ましい形態においては、核酸プローブは、E. coli ＮＲＲＬ  Ｂ−３０８１１内に含まれるプラスミドｐＴｔｅｒ６１Ｇ中に含まれた成熟ポリペプチドコーディング配列である。
【０１３４】
別の好ましい形態においては、核酸プローブは、配列番号１１の成熟ポリペプチドコーディング配列である。別の好ましい形態においては、核酸プローブは、配列番号１１のヌクレオチド６７〜７９６である。別の好ましい形態においては、核酸プローブは、配列番号１２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列またはそのサブ配列である。別の好ましい形態においては、核酸プローブは、配列番号１１である。別の好ましい形態においては、核酸プローブは、E. coli ＮＲＲＬ  Ｂ−３０７０４内に含まれるプラスミドｐＤＺＡ２−７中に含まれ、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列である。別の好ましい形態においては、核酸プローブは、E. coli ＮＲＲＬ  Ｂ−３０７０４内に含まれるプラスミドｐＤＺＡ２−７中に含まれた成熟ポリペプチドコーディング配列である。
【０１３５】
別の好ましい形態においては、核酸プローブは、配列番号１３の成熟ポリペプチドコーディング配列である。別の好ましい形態においては、核酸プローブは、配列番号１３のヌクレオチド７７〜７６６である。別の好ましい形態においては、核酸プローブは、配列番号１４のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列またはそのサブ配列である。別の好ましい形態においては、核酸プローブは、配列番号１３である。別の好ましい形態においては、核酸プローブは、E. coli ＮＲＲＬ  Ｂ−３０８７８内に含まれるプラスミドｐＴｒ３３３中に含まれ、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列である。別の好ましい形態においては、核酸プローブは、E. coli ＮＲＲＬ  Ｂ−３０８７８内に含まれるプラスミドｐＴｒ３３３中に含まれた成熟ポリペプチドコーディング配列である。
【０１３６】
長さが少なくともヌクレオチド１００個である長いプローブについては、超低乃至超高ストリンジェンシー条件は、本明細書中で定義されている通りである。
【０１３７】
長さが少なくともヌクレオチド１００個である長いプローブについては、担体材料は最終的に本明細書で定義されている通りに洗浄される。
【０１３８】
長さがヌクレオチド約１５個〜約７０個である短いプローブについては、ストリンジェンシー条件は、本明細書で定義されている通りである。
【０１３９】
長さがヌクレオチド約１５個〜約７０個である短いプローブについては、担体材料は、本明細書で定義されている通りに洗浄される。
【０１４０】
第５の態様において、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、または配列番号１３の成熟ポリペプチドコーディング配列に対する好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに一層好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、そしてさらに最も好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性度を有するヌクレオチド配列を含むかまたはこれらからなりかつセルロース分解増強活性を有する活性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによってコードされる。
【０１４１】
好ましい態様においては、成熟ポリペプチドコーディング配列は、配列番号１のヌクレオチド３８８〜１３３２、配列番号３のヌクレオチド９８〜８２１、配列番号５のヌクレオチド１２６〜９７８、配列番号７のヌクレオチド５５〜６７８、配列番号９のヌクレオチド５８〜９１２、配列番号１１のヌクレオチド６７〜７９６、または配列番号１３のヌクレオチド７７〜７６６である。本明細書中のポリヌクレオチドの項を参照のこと。
【０１４２】
かかる態様においては、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８または配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４またはその相同配列の成熟ポリペプチドの１つ以上（単複）のアミノ酸の置換、欠失および／または挿入を含む人工的変異体である。かかる人工的変異体の調製方法は上述の通りである。
【０１４３】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、または配列番号１４の成熟ポリペプチドのアミノ酸置換、欠失および／または挿入の合計数は、１０、好ましくは９、より好ましくは８、より好ましくは７、より好ましくは多くとも６、より好ましくは５、より好ましくは４、さらに一層好ましくは３、最も好ましくは２、そしてさらに最も好ましくは１個である。
【０１４４】
セルロース分解増強活性を有するポリペプチドの供給源
セルロース分解増強活性を有するポリペプチドは、任意の属の微生物から得ることができる。好ましい態様においては、所与の供給源から得られるポリペプチドは、細胞外で分泌される。
【０１４５】
セルロース分解増強活性を有するポリペプチドは、細菌ポリペプチドであってよい。例えば、ポリペプチドは、セルロース分解酵素活性を有するBacillus、Streptococcus、Streptomyces、Staphylococcus、Enterococcus、Lactobacillus、Lactococcus、Clostridium、GeobacillusまたはOceanobacillusポリペプチドなどのグラム陽性菌ポリペプチド、または、セルロース分解増強酵素活性を有するE. coli、Pseudomonas、Salmonella、Campylobacter、Helicobacter、Flavobacterium、Fusobacterium、llyobacter、NeisseriaまたはUreaplasmaポリペプチドなどのグラム陰性菌ポリペプチドであってよい。
【０１４６】
好ましい態様においては、ポリペプチドは、セルロース分解増強活性を有するBacillus alkalophilus、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus brevis、Bacillus circulans、Bacillus clausii、Bacillus coagulans、Bacillus firmus、Bacillus lautus、Bacillus lentus、Bacillus iicheniformis、Bacillus megaterium、Bacillus pumilus、Bacillus stearothermophilus、Bacillus subtilisまたはBacillus thuringiensisポリペプチドである。
【０１４７】
別の好ましい態様においては、ポリペプチドは、セルロース分解増強活性を有するStreptococcus equisimilis、Streptococcus pyogenes、Streptococcus uberisまたはStreptococcus equi 亜種 Zooepidemicusポリペプチドである。
【０１４８】
別の好ましい態様においては、ポリペプチドは、セルロース分解増強活性を有するStreptomyces achromogenes、Streptomyces avermitilis、Streptomyces coelicolor、Streptomyces griseusまたはStreptomyces IMdansポリペプチドである。
【０１４９】
セルロース分解増強活性を有するポリペプチドは同様に、真菌ポリペプチドそしてより好ましくはセルロース分解増強活性を有するCandida、Kluyveromyces、Pichia、Saccharomyces、SchizosaccharomycesまたはYarrowiaポリペプチドといった酵母ポリペプチド、またはより好ましくは、セルロース分解増強活性を有するaan Acremonium、Agaricus、Alternaria、Aspergillus、Aureobasidium、Botryospaeria、Ceriporiopsis、Chaetomidium、Chrysosporium、Claviceps、Cochliobolus、Coprinopsis、Coptotermes、Corynascus、Cryphonectha、Cryptococcus、Diplodia、Exidia、Filibasidium、Fusarium、Gibberella、Holomastigotoides、Humicola、Irpex、Lentinula、Leptospaeria、Magnaporthe、Melanocarpus、Meripilus、Mucor、Myceliophthora、Neocallimastix、Neurospora、Paecilomyces、Penicillium、Phanerochaete、Piromyces、Poitrasia、Pseudoplectania、Pseudotrichonympha、Rhizomucor、Schizophyllum、Scytalidium、Talaromyces、Thermoascus、Thielavia、Tolypocladium、Trichoderma、Trichophaea、Verticillium、VolvariellaまたはXylariaポリペプチドといった糸状菌ポリペプチドであってもよい。
【０１５０】
好ましい態様においては、ポリペプチドは、セルロース分解増強活性を有するSaccharomyces carlsbergensis、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces diastaticus、Saccharomyces douglasii、Saccharomyces kluyveri、Saccharomyces norbensisまたはSaccharomyces oviformisポリペプチドである。
【０１５１】
別の好ましい態様においては、ポリペプチドは、セルロース分解増強活性を有するAcremonium cellulolyticus、Aspergillus aculeatus、Aspergillus awamori、Aspergillus fumigatus、Aspergillus foetidus、Aspergillus japonicus、Aspergillus nidulans、Aspergillus niger、Aspergillus oryzae、Chrysosporium keratinophilum、Chrysosporium lucknowense、Chrysosporium tropicum、Chrysosporium merdarium、Chrysosporium inops、Chrysosporium pannicola、Chrysosporium queenslandicum、Chrysosporium zonatum、Fusarium bactridioides、Fusarium cerealis、Fusarium crookwellense、Fusarium culmorum、Fusarium graminearum、Fusarium graminum、Fusarium heterosporum、Fusarium negundi、Fusarium oxysporum、Fusarium reticulatum、Fusarium roseum、Fusarium sambucinum、Fusarium sarcochroum、Fusarium sporotrichioides、Fusarium sulphureum、Fusarium torulosum、Fusarium trichothecioides、Fusarium venenatum、Humicola grisea、Humicola insolens、Humicola lanuginosa、Irpex lacteus、Mucor miehei、Myceliophthora thermophila、Neurospora crassa、Penicillium funiculosum、Penicillium purpurogenum、Phanerochaete chrysosporium、Thielavia achromatica、Thielavia albomyces、Thielavia albopilosa、Thielavia australeinsis、Thielavia fimeti、Thielavia microspora、Thielavia ovispora、Thielavia peruviana、Thielavia spededonium、Thielavia setosa、Thielavia subthermophila、Thielavia terrestris、Trichoderma harzianum、Trichoderma koningii、Trichoderma Iongibrachiatum、Trichoderma reesei、Trichoderma virideまたはTrichophaea saccataポリペプチドである。
【０１５２】
より好ましい態様においては、ポリペプチドはセルロース分解増強活性を有するThielavia terrestrisである。最も好ましい実施形態においては、ポリペプチドは、セルロース分解増強活性を有するThielavia terrestrisＮＲＲＬ８１２６ポリペプチド、例えば配列番号２、４、６、８または１０の成熟ポリペプチドまたはセルロース分解増強活性を有するそのフラグメントである。
【０１５３】
別のより好ましい態様においては、ポリペプチドはThermoascus auratiacusポリペプチド例えば、配列番号１２の成熟ポリペプチドである。
【０１５４】
別のより好ましい態様においては、ポリペプチドは、セルロース分解増強活性を有するTrichoderma reeseiポリペプチドである。別の最も好ましい態様においては、ポリペプチドは、セルロース分解増強活性を有するTrichoderma reesei ＲｕｔＣ３０（ＡＴＣＣ５６７６５）ポリペプチド、例えば配列番号１４の成熟ポリペプチド、またはセルロース分解増強活性を有するそのフラグメントである。
【０１５５】
前述の種については、本発明が、知られている種名称とは無関係に完全状態および不完全状態の両方そして、その他の分類学的等価物、例えばアナモルフを包含することがわかる。当業者であれば、適切な等価物の同一性を容易に認識する。
【０１５６】
これらの種の菌株は、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（ＤＳＭ）、Centraalbureau Voor Schimmelcultures（ＣＢＳ）およびAgricultural Research Service Patent Culture Collection、Northern Regional Research Center（ＮＲＲＬ）といった数多くの培養収集機関において一般に容易に利用できるものである。
【０１５７】
その上、かかるポリペプチドは、本明細書において記述された通り、上述のプローブを用いて自然（例えば土壌、たい肥、水など）から単離される微生物を含めたその他の供給源から同定し獲得しうる。
【０１５８】
セルロース分解増強活性を有するポリペプチドは、別のポリペプチドがセルロース分解増強活性を有するポリペプチドまたはそのフラグメントのＮ末端またはＣ末端で融合されている融合されたポリペプチドまたは分割可能な融合ポリペプチドを含み、本明細書中で記述されている通り、さらに分割部位を含み得る。
【０１５９】
セルロース分解増強活性を有するポリペプチドおよびそのポリヌクレオチドに関するさらなる詳細については、本明細書に参照により援用されている国際公開第２００５／０７４６４７号（WO 2005/074647）、国際公開第２００５／０７４６５６号（WO 2005/074656）および米国特許出願公開第２００７／００７７６３０号（U.S. Published Application Serial No. 2007/0077630）を参照のこと。
【０１６０】
セルロース分解増強活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
セルロース分解増強活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを、本明細書中で記述されている通りに単離し本発明の方法を実践するために利用することができる。
【０１６１】
ポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、または配列番号１３の成熟ポリペプチドコーディング配列に対する好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに一層好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、そしてさらに最も好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性度を有するヌクレオチド配列を含み、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドをコードする。
【０１６２】
好ましい態様においては、ヌクレオチド配列は、配列番号１を含むかまたはこれからなる。別のより好ましい態様においては、ヌクレオチド配列は、Escherichia coli ＮＲＲＬ  Ｂ−３０６９９中に含まれるプラスミドｐＥＪＧ１２０の中に含まれた配列を含むかまたはこれからなる。別の好ましい形態においては、ヌクレオチド配列は、配列番号１の成熟ポリペプチドコーディング配列を含むかまたはこれからなる。別のより好ましい態様においては、ヌクレオチド配列は、Escherichia coli ＮＲＲＬ  Ｂ−３０６９９中に含まれるプラスミドｐＥＪＧ１２０の中に含まれた成熟ポリペプチドコーディング配列を含むかまたはこれからなる。本発明は同様に、遺伝子コードの縮退のため配列番号１と異なっている配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその成熟ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をも包含する。本発明は同様に、セルロース分解増強活性を有する配列番号２のフラグメントをコードする配列番号１のサブ配列にも関する。
【０１６３】
別の好ましい形態においては、ヌクレオチド配列は、配列番号３を含むかまたはこれからなる。別のより好ましい態様においては、ヌクレオチド配列は、Escherichia coli ＮＲＲＬ  Ｂ−３０８１３の中に含まれるプラスミドｐＴｔｅｒ６１Ｃ中に含まれた配列を含むかまたはこれからなる。別の好ましい形態においては、ヌクレオチド配列は、配列番号３の成熟ポリペプチドコーディング配列を含むかまたはこれからなる。別のより好ましい態様においては、ヌクレオチド配列は、Escherichia coli ＮＲＲＬ  Ｂ−３０８１３の中に含まれるプラスミドｐＴｔｅｒ６１Ｃ中に含まれた成熟ポリペプチドコーディング配列を含むかまたはこれからなる。本発明は同様に、遺伝子コードの縮退のため配列番号３と異なっている配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその成熟ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をも包含する。本発明は同様に、セルロース分解増強活性を有する配列番号４のフラグメントをコードする配列番号３のサブ配列にも関する。
【０１６４】
別の好ましい形態においては、ヌクレオチド配列は、配列番号５を含むかまたはこれからなる。別のより好ましい態様においては、ヌクレオチド配列は、Escherichia coli ＮＲＲＬ  Ｂ−３０８１２中に含まれるプラスミドｐＴｔｅｒ６１Ｄの中に含まれた配列を含むかまたはこれからなる。別の好ましい形態においては、ヌクレオチド配列は、配列番号５の成熟ポリペプチドコーディング配列を含むかまたはこれからなる。別のより好ましい態様においては、ヌクレオチド配列は、Escherichia coli ＮＲＲＬ  Ｂ−３０８１２の中に含まれるプラスミドｐＴｔｅｒ６１Ｄの中に含まれた成熟ポリペプチドコーディング配列を含むかまたはこれからなる。本発明は同様に、遺伝子コードの縮退のため配列番号５と異なっている配列番号６のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその成熟ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をも包含する。本発明は同様に、セルロース分解増強活性を有する配列番号６のフラグメントをコードする配列番号５のサブ配列にも関する。
【０１６５】
別の好ましい形態においては、ヌクレオチド配列は、配列番号７を含むかまたはこれからなる。別のより好ましい態様においては、ヌクレオチド配列は、Escherichia coli ＮＲＲＬ  Ｂ−３０８１４の中に含まれるプラスミドｐＴｔｅｒ６１Ｅ中に含まれた配列を含むかまたはこれからなる。別の好ましい形態においては、ヌクレオチド配列は、配列番号７の成熟ポリペプチドコーディング配列を含むかまたはこれからなる。別のより好ましい態様においては、ヌクレオチド配列は、Escherichia coli ＮＲＲＬ  Ｂ−３０８１４の中に含まれるプラスミドｐＴｔｅｒ６１Ｅ中に含まれた成熟ポリペプチドコーディング配列を含むかまたはこれからなる。本発明は同様に、遺伝子コードの縮退のため配列番号７と異なっている配列番号８のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその成熟ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をも包含する。本発明は同様に、セルロース分解増強活性を有する配列番号８のフラグメントをコードする配列番号７のサブ配列にも関する。
【０１６６】
別の好ましい形態においては、ヌクレオチド配列は、配列番号９を含むかまたはこれからなる。別のより好ましい態様においては、ヌクレオチド配列は、Escherichia coli ＮＲＲＬ  Ｂ−３０８１１の中に含まれるプラスミドｐＴｔｅｒ６１Ｇ中に含まれた配列を含むかまたはこれからなる。別の好ましい形態においては、ヌクレオチド配列は、配列番号９の成熟ポリペプチドコーディング配列を含むかまたはこれからなる。別のより好ましい態様においては、ヌクレオチド配列は、Escherichia coli ＮＲＲＬ  Ｂ−３０８１１の中に含まれるプラスミドｐＴｔｅｒ６１Ｇの中に含まれた成熟ポリペプチドコーディング配列を含むかまたはこれからなる。本発明は同様に、遺伝子コードの縮退のため配列番号９と異なっている配列番号１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその成熟ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をも包含する。本発明は同様に、セルロース分解増強活性を有する配列番号１０のフラグメントをコードする配列番号９のサブ配列にも関する。
【０１６７】
別の好ましい形態においては、ヌクレオチド配列は、配列番号１１を含むかまたはこれからなる。別のより好ましい態様においては、ヌクレオチド配列は、Escherichia coli ＮＲＲＬ  Ｂ−３０７０４の中に含まれるプラスミドｐＤＺＡ２−７中に含まれた配列を含むかまたはこれからなる。別の好ましい形態においては、ヌクレオチド配列は、配列番号１１の成熟ポリペプチドコーディング配列を含むかまたはこれからなる。別のより好ましい態様においては、ヌクレオチド配列は、Escherichia coli ＮＲＲＬ  Ｂ−３０７０４の中に含まれるプラスミドｐＤＺＡ２−７中に含まれた成熟ポリペプチドコーディング配列を含むかまたはこれからなる。本発明は同様に、遺伝子コードの縮退のため配列番号１１と異なっている配列番号１２のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその成熟ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をも包含する。本発明は同様に、セルロース分解増強活性を有する配列番号１２のフラグメントをコードする配列番号１１のサブ配列にも関する。
【０１６８】
別の好ましい形態においては、ヌクレオチド配列は、配列番号１３を含むかまたはこれからなる。別のより好ましい態様においては、ヌクレオチド配列は、Escherichia coli ＮＲＲＬ  Ｂ−３０８７８の中に含まれるプラスミドｐＴｒ３３３７の中に含まれた配列を含むかまたはこれからなる。別の好ましい形態においては、ヌクレオチド配列は、配列番号１３の成熟ポリペプチドコーディング配列を含むかまたはこれからなる。別のより好ましい態様においては、ヌクレオチド配列は、Escherichia coli ＮＲＲＬ  Ｂ−３０８７８の中に含まれるプラスミドｐＴｒ３３３７中に含まれた成熟ポリペプチドコーディング配列を含むかまたはこれからなる。本発明は同様に、遺伝子コードの縮退のため配列番号１３またはその成熟ポリペプチドコーディング配列と異なっている配列番号１４のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその成熟ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をも包含する。本発明は同様に、セルロース分解増強活性を有する配列番号１４のフラグメントをコードする配列番号１３のサブ配列にも関する。
【０１６９】
本発明は同様に、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１または配列番号１３の成熟ポリペプチドコーディング配列内に少なくとも１つの突然変異を含む突然変異ポリヌクレオチドにおいて、突然変異ヌクレオチド配列が配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８または配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４をコードする突然変異ポリヌクレオチドにも関する。好ましい態様においては、成熟ポリヌクレオチドは、配列番号２のアミノ酸２０〜３２６、配列番号４のアミノ酸１８〜２４０、配列番号６のアミノ酸２０〜２５８、配列番号８のアミノ酸１９〜２２６、または配列番号１０のアミノ酸２０〜３０４、配列番号１２のアミノ酸２３〜２５０、または配列番号１４のアミノ酸２０〜２４９である。別の好ましい形態においては、成熟ポリペプチドコーディング配列は、配列番号１のヌクレオチド３８８〜１３３２、配列番号３のヌクレオチド９８〜８２１、配列番号５のヌクレオチド１２６〜９７８、配列番号７のヌクレオチド５５〜６７８、配列番号９のヌクレオチド５８〜９１２、配列番号１１のヌクレオチド６７〜７９６、または配列番号１３のヌクレオチド７７〜７６６である。
【０１７０】
先に記述した通り、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離またはクローニングするのに用いられる技術は当該技術分野において公知であり、ゲノムＤＮＡからの単離、ｃＤＮＡからの調製またはそれらの組合せを含む。
【０１７１】
ポリヌクレオチドは同様に、本明細書で定義されているように、少なくとも超低ストリンジェンシー条件下、好ましくは少なくとも低ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中−高ストリンジェンシー条件、さらに一層好ましくは少なくとも高ストリンジェンシー条件、そして最も好ましくは少なくとも超高ストリンジェンシー条件下で、（ｉ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、または配列番号１３の成熟ポリペプチドコーディング配列、（ｉｉ）配列番号１、配列番号１、配列番号５または配列番号１１の成熟ポリペプチドコーディング配列内に含まれるｃＤＮＡ配列、あるいは配列番号７、配列番号９または配列番号１３の成熟ポリペプチドコーディング配列を含むゲノムＤＮＡ配列、あるいは（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）の全長相補的ストランドまたはその対立遺伝子変異体またはサブ配列とハイブリッド形成するセルロース分解増強活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであってもよい（Sambrookら、１９８９年、上掲書）。好ましい実施形態においては、成熟ポリペプチドコーディング配列は、配列番号１のヌクレオチド３８８〜１３３２、配列番号３のヌクレオチド９８〜８２１、配列番号５のヌクレオチド１２６〜９７８、配列番号７のヌクレオチド５５〜６７８、配列番号９のヌクレオチド５８〜９１２、配列番号１１のヌクレオチド６７〜７９６、または配列番号１３のヌクレオチド７７〜７６６である。
【０１７２】
核酸構成体
セルロース分解増強活性を有するポリペプチドまたはセルロース分解酵素活性を有するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドは、制御配列と相容性ある条件下で適切な宿主細胞内でコーディング配列の発現を導く１つ以上の制御配列に作動的に連結されたポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを含む核酸構成体を構築することによってポリペプチドの発現を提供するべく、さまざまな手法で操作され得る。ベクター内への挿入に先立つポリヌクレオチドの配列の操作は、発現ベクターに応じて望ましいかまたは必要であり得る。組換え型ＤＮＡ方法を利用してポリヌクレオチド配列を修飾するための技術は、当該技術分野において周知である。
【０１７３】
制御配列は、かかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞によって認識されるヌクレオチド配列である適切なプロモータ配列であってよい。プロモータ配列は、ポリペプチドの発現を媒介する転写制御配列を含む。プロモータは、突然変異体、切形およびハイブリッドプロモータを含めた選択された宿主細胞内で転写活性を示すあらゆるヌクレオチドであってよく、宿主細胞に相同であるかまたは非相同である細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。
【０１７４】
特に細菌宿主細胞の中で核酸構成体の転写を導くための適切なプロモータの例としては、E. coli lacオペロン、Streptomyces coelicolorアガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、Bacillus subtillisレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、Bacillus licheniformisアルファ−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、Bacillus stearothermophilusマルトース生成型アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、Bacillus amyloliquefaciensアルファ−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、Bacillus licheniformisペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、Bacillus subtilis ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子、および原核生物ベータ−ラクタマーゼ遺伝子（Villa-Kamaroffら、１９７８年、Proceedings of the National Academy of Sciences USA、第７５号、３７２７〜３７３１頁）から得られたプロモータ、ならびにｔａｃプロモータ（DeBoerら、１９８３年、Proceedings of the National Academy of Sciences USA、第８０号、２１〜２５頁）がある。さらなるプロモータについては、「Useful proteins from recombinant bacteria」、Scientific American中、１９８０年、第２４２号、７４〜９４頁；およびSambrookら、１９８９、上掲書中に記述されている。
【０１７５】
糸状菌宿主細胞中で核酸構成体の転写を導くための適切なプロモータの例としては、Aspergillus oryzae ＴＡＫＡアミラーゼ、Rhizomucor mieheiアスパラギン酸プロテイナーゼ、Aspergillus niger中性アルファ−アミラーゼ、Aspergillus niger酸安定アルファ−アミラーゼ、Aspergillus niger または Aspergillus awamoriグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、Rhizomucor mieheiリパーゼ、Aspergillus oryzaeアルカリプロテアーゼ、Aspergillus oryzaeトリオースリン酸イソメラーゼ、Aspergillus nidulansアセトアミダーゼ、Fusarium venenatumアミログリコシダーゼ（国際公開第００／５６９００号（WO 00/56900））、Fusarium venenatum Daria（国際公開第００／５６９００号（WO 00/56900））、Fusarium venenatum Quinn（国際公開第００/５６９００号（WO 00/56900））、Fusarium oxysporumトリプシン様プロテアーゼ（国際公開第第９６／００７８７号（WO96/00787））、Trichoderma reeseiベータ−グルコシダーゼ、Trichoderma reeseiセロビオヒドロラーゼＩ、Trichoderma reeseiセロビオヒドロラーゼ II、Trichoderma reeseiエンドグルカナーゼＩ、Trichoderma reeseiエンドグルカナーゼＩＩ、Trichoderma reeseiエンドグルカナーゼＩＩＩ、Trichoderma reeseiエンドグルカナーゼＩＶ、Trichoderma reeseiエンドグルカナーゼＶ、Trichoderma reeseiキシラナーゼＩ、Trichoderma reeseiキシラナーゼＩＩ、Trichoderma reeseiベータ・キシラナーゼについての遺伝子から得られるプロモータ、ならびにＮＡ２−ｔｐｉプロモータ（Aspergillus niger中性アルファ−アミラーゼとAspergillus oryzaeトリオースホスフェートイソメラーゼについての遺伝子由来のプロモータのハイブリッド）；およびその突然変異体、切形およびハイブリッドプロモータがある。
【０１７６】
酵母宿主においては、有用なプロモータは、Saccharomyces cerevisiae エノラーゼ（ＥＮＯ−１）、Saccharomyces cerevisiaeガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、Saccharomyces cerevisiaeアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１、ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、Saccharomyces cerevisiaeトリオースホスフェートイソメラーゼ（ＴＰＩ）、Saccharomyces cerevisiaeメタロチオネイン（ＣＵＰ１）、およびSaccharomyces cerevisiae３−ホスホグリセレートキナーゼについての遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のためのその他の有用なプロモータについては、Romanosら、１９９２年、Yeast、第８号、４２３〜４８８頁が記述している。
【０１７７】
制御配列は同様に、転写を終結させるため宿主細胞により認識される配列である適切な転写ターミネータ配列であってもよい。ターミネータ配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の３’末端に作動的に連結される。選択された宿主細胞内で機能的であるあらゆるターミネータが、本発明において使用可能である。
【０１７８】
糸状菌宿主細胞のための好ましいターミネータは、Aspergillus oryzae ＴＡＫＡアミラーゼ、Aspergillus nigerグルコアミラーゼ、Aspergillus nidulansアントラニル酸シンターゼ、Aspergillus nigerアルファ−グルコシダーゼおよびFuserium oxysporumトリプシン様プロテアーゼについての遺伝子から得られる。
【０１７９】
酵母宿主細胞のための好ましいターミネータは、Saccharomyces cerevisiaeエノラーゼ、Saccharomyces cerevisiaeシトクロームＣ（ＣＹＣ１）およびSaccharomyces cerevisiaeグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼについての遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のためのその他の有用なターミネータは、Romanosら、１９９２年、上掲書により記述されている。
【０１８０】
制御配列は同様に、宿主細胞による翻訳にとって重要であるｍＲＮＡの未翻訳領域である適切なリーダー配列でもあり得る。リーダー配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の５’末端に作動的に連結されている。本発明においては、選択された宿主細胞内で機能的であるあらゆるリーダー配列が使用可能である。
【０１８１】
糸状菌宿主細胞のための好ましいリーダーは、Aspergillus oryzae TAKA アミラーゼおよびAspergillus nidulans トリオースホスフェートイソメラーゼについての遺伝子から得られる。
【０１８２】
宿主細胞のための適切なリーダーは、Saccharomyces cerevisiae enolase（ＥＮＯ−１）、Saccharomyces cerevisiae３−ホスホグリセレートキナーぜ、Saccharomyces cerevisiaeアルファ−因子、および Saccharomyces cerevisiaeアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）についての遺伝子から得られる。
【０１８３】
制御配列は、ヌクレオチド配列の３’末端に作動的に連結された配列であるポリアデニル化配列であってもよく、転写された場合、転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を添加するためのシグナルとして宿主細胞によって認識される。選択された宿主細胞内で機能的であるあらゆるポリアデニル化配列が、本発明において使用可能である。
【０１８４】
糸状菌宿主細胞のための好ましいポリアデニル化配列は、Aspergillus oryzaeＴＡＫＡアミラーゼ、Aspergillus nigerグリコアミラーゼ、Aspergillus nidulansアントラニレートシンターゼ、Fusarium oxysporumトリプシン様プロテアーゼおよび Aspergillus nigerアルファ−グリコシダーゼについての遺伝子から得られる。
【０１８５】
酵母宿主細胞のための有用なポリアデニル化配列は、GuoおよびSherman、１９９５年、Molecular Cellular Biology、第１５号、５９８３〜５９９０頁によって記述されている。
【０１８６】
制御配列は同様に、ポリペプチドのアミノ末端に連結されたアミノ酸配列についてコードし、細胞の分泌経路内へとコードされたポリペプチドを導くシグナルペプチドコーディング配列であってもよい。ヌクレオチド配列のコーディング配列の５’末端は、分泌されたポリペプチドをコードするコーディング領域のセグメントと翻訳読取り枠内で自然に連結されたシグナルペプチドコーディング配列を本質的に含んでいてよい。代替的には、コーディング配列の５’末端は、コーディング配列にとって外来性であるシグナルペプチドコーディング配列を含んでいてよい。コーディング配列がシグナルペプチドコーディング配列を自然に含まない場合には、外来性シグナルペプチドコーディング配列が必要とされる可能性がある。代替的には、外来性シグナルペプチドコーディング配列を、ポリペプチドの分泌を増強するため自然のシグナルペプチドコーディング配列と単純に置換えてもよい。しかしながら、発現されたポリペプチドを、選択された宿主細胞すなわち培地内に分泌された宿主細胞の分泌経路内へと導くあらゆるシグナルペプチドコーディング配列が、本発明において使用可能である。
【０１８７】
細菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコーディング配列は、BacillusＮＣＩＢ  １１８３７マルトース生成アミラーゼ、Bacillus stearothermophilusアルファ−アミラーゼ、Bacillus licheniformisスブチリシン、Bacillus lichenifoπvisベータ−ラクタマーゼ、Bacillus stearothermophilus中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）およびBacillus subtilisｐｒｓＡについての遺伝子から得られたシグナルペプチドコーディング配列である。さらなるシグナルペプチドはSimonenおよびPalva、１９９３年、Microbiological Reviews、第５７号、１０９〜１３７頁によって記述されている。
【０１８８】
糸状菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコーディング配列は、Aspergillus oryzaeＴＡＫＡアミラーゼ、Aspergillus niger中性アミラーゼ、Aspergillus nigerグリコアミラーゼ、Rhizomucor mieheiアスパラギン酸プロテイナーゼ、Humicola insolensセルラーゼ、Humicola insolensエンドグルカナーゼＶおよびHumicola lanuginosaリパーゼについての遺伝子から得られたシグナルペプチドコーディング配列である。
【０１８９】
好ましい態様においては、シグナルペプチドは、配列番号２のアミノ酸１〜１９を含むかまたはこれらからなる。別の好ましい態様においては、シグナルペプチドコーディング領域は、配列番号１のヌクレオチド３３０〜３８７を含むかまたはこれらからなる。
【０１９０】
別の好ましい態様においては、シグナルペプチドは、配列番号４のアミノ酸１〜１７を含むかまたはこれらからなる。別の好ましい態様においては、シグナルペプチドコーディング領域は、配列番号３のヌクレオチド４７〜９７を含むかまたはこれらからなる。
【０１９１】
別の好ましい態様においては、シグナルペプチドは、配列番号６のアミノ酸１〜１９を含むかまたはこれらからなる。別の好ましい態様においては、シグナルペプチドコーディング領域は、配列番号５のヌクレオチド６９〜１２５を含むかまたはこれらからなる。
【０１９２】
別の好ましい態様においては、シグナルペプチドは、配列番号８のアミノ酸１〜１８を含むかまたはこれらからなる。別の好ましい態様においては、シグナルペプチドコーディング領域は、配列番号７のヌクレオチド１〜５４を含むかまたはこれらからなる。
【０１９３】
別の好ましい態様においては、シグナルペプチドは、配列番号１０のアミノ酸１〜１９を含むかまたはこれらからなる。別の好ましい態様においては、シグナルペプチドコーディング領域は、配列番号９のヌクレオチド１〜５７を含むかまたはこれらからなる。
【０１９４】
別の好ましい態様においては、シグナルペプチドは、配列番号１２のアミノ酸１〜２２を含むかまたはこれらからなる。別の好ましい態様においては、シグナルペプチドコーディング領域は、配列番号１１のヌクレオチド１〜６６を含むかまたはこれらからなる。
【０１９５】
別の好ましい態様においては、シグナルペプチドは、配列番号１４のアミノ酸１〜１９を含むかまたはこれらからなる。別の好ましい態様においては、シグナルペプチドコーディング領域は、配列番号１３のヌクレオチド２０〜７６を含むかまたはこれらからなる。
【０１９６】
酵母宿主細胞のための有用なシグナルペプチドは、Saccharomyces cerevisiaeアルファ−因子およびSaccharomyces cerevisiaeインベルターゼについての遺伝子から得られる。その他の有用なシグナルペプチドコーディング配列はRomanosら、１９９２年、上掲書によって記述されている。
【０１９７】
制御配列は同様に、ポリペプチドのアミノ末端に位置づけされたアミノ酸配列についてコードするプロペプチドコーディング配列であってもよい。結果として得られるポリペプチドは、プロ酵素またはプロポリペプチド（または一部のケースでは酵素原）として知られている。プロポリペプチドは一般に不活性であり、プロポリペプチドからプロペプチドへの触媒または自己触媒分割により、成熟活性ポリペプチドへと転換され得る。プロペプチドコーディング配列は、Bacillus subtilis alkalineプロテアーゼ（ａｐｒＥ）、Bacillus subtilis中性プロテアーゼ （ｎｐｒＴ）、Saccharomyces cerevisiae アルファ−因子、Rhizomucor mieheiアスパラギン酸プロテイナーゼ、および Myceliophthora thermophilaラッカーゼ；国際公開第９５／３３８３６号（WO 95/33836）についての遺伝子から得ることができる。
【０１９８】
シグナルペプチドとプロペプチド配列の両方がポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、プロペプチド配列は、ポリペプチドのアミノ末端の次に位置づけされ、シグナルペプチド配列はプロペプチド配列のアミノ末端の次に位置づけされる。
【０１９９】
宿主細胞の成長との関係においてポリペプチドの発現を調節できるようにする調節配列を付加することが望ましいこともある。調節系の例としては、調節化合物の存在を含めた化学的または物理的刺激に応答して遺伝子の発現をオンオフ切換えする調節系がある。原核細胞系中の調節系には、ｌａｃ、ｔａｃおよびｔｒｐオペレータ系が含まれる。酵母においては、ＡＤＨ２系またはＧＡＬ１系を使用してよい。糸状菌においては、ＴＡＫＡ−アルファ−アミラーゼプロモータ、Aspergillus nigerグルコアミラーゼプロモータおよびAspergillus oryzaeグルコアミラーゼプロモータを調節配列として使用してよい。調節配列のその他の例は、遺伝子増幅を可能にする調節配列がある。原核細胞系においては、これらの調節配列には、メトトレキセートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、および重金属で増幅されるメタロチオネイン遺伝子が含まれる。これらのケースでは、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は調節配列と作動的に連結されると考えられる。
【０２００】
発現ベクター
本明細書中で記述されているさまざまな核酸および制御配列を一緒に連結させて、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドまたはセルロース分解酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、プロモータおよび転写および翻訳停止シグナルを含む組換え型発現ベクターを生成することができる。発現ベクターは、１つ以上の適切な制限部位を含み、かかる部位においてポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の挿入または置換を可能にすることができる。代替的には、発現のための適切なベクター内にポリヌクレオチド配列またはその配列を含む核酸構成体を挿入することによって、かかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現させることができる。発現ベクターを作り出すにあたっては、コーディング配列は、それが発現のための適切な制御配列と作動的に連結されるような形でベクター内で位置設定される。
【０２０１】
組換え型発現ベクターは、適切に組換え型ＤＮＡ手順に付すことができかつポリヌクレオチド配列の発現をもたらすことのできるあらゆるベクター（例えばプラスミドまたはウイルス）であってよい。ベクターの選択は、標準的に、そのベクターが導入される予定の宿主細胞とベクターの相容性によって左右される。ベクターは直鎖状であっても、閉鎖環状プラスミドであってもよい。
【０２０２】
ベクターは、自己複製ベクターすなわち、プラスミド、染色体外要素、ミニ染色体または人工染色体などの、染色体複製とは無関係に複製する染色体外実体として存在するベクターであってよい。ベクターは、自己複製を行なうためのあらゆる手段を含んでいてよい。代替的には、ベクターは、宿主細胞内に導入された時点で、ゲノム内に組込まれ、それが組込まれた染色体（単複）と共に複製されるベクターであってよい。さらに、単一のベクターまたはプラスミドまたは共に宿主細胞のゲノム内に導入すべき全ＤＮＡまたはトランスポゾンを含有する２つ以上のベクターまたはプラスミドを使用してもよい。
【０２０３】
ベクターは好ましくは、形質転換、トランスフェクション、形質導入などを受けた細胞を容易に選択できるようにする１つ以上の選択可能なマーカーを含む。選択可能なマーカーは、その産物がバイオサイドまたはウイルス耐性、重金属耐性、栄養要求体に対する原栄養体などを提供する遺伝子である。
【０２０４】
細菌選択可能マーカーの例としては、Bacillus subtilisまたはBacillus licheniformis由来のｄａｌ遺伝子またはアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコールまたはテトラサイクリン耐性といった抗生物質耐性を付与するマーカーがある。酵母宿主細胞のための適切なマーカーとしては、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１、およびＵＲＡ３がある。糸状菌宿主細胞内で使用するための選択的マーカーには、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−ホスフェートデカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）およびｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）ならびにその等価物が含まれるが、これらに限定されるわけではない。Aspergillus細胞内で使用する上で好ましいものとしては、Aspergillus nidulansまたはAspergillus oryzaeのａｍｄＳおよびｐｙｒＧ遺伝子およびStreptomyces hygroscopicusのｂａｒ遺伝子がある。
【０２０５】
ベクターは好ましくは、宿主細胞のゲノム内へのベクターの組込みまたはゲノムとは無関係な細胞内でのベクターの自己複製を可能にする要素（単複）を含む。
【０２０６】
宿主細胞ゲノム内への組込みのためには、ベクターは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列または相同または非相同組換えによるゲノム内への組込みのためのベクターの任意のその他の要素に依存してよい。代替的には、ベクターは、染色体（単複）内の精確な場所（単複）での宿主細胞のゲノム内への相同組換えによる組込みを導くため、付加的なヌクレオチド配列を含んでいてよい。精確な場所における組込みの確率を高めるため、組込み要素は好ましくは、相同組換えの確率を増大させるのに充分な数で、対応する標的配列に対する高い同一性度を有する核酸を、つまり例えば１００〜１０，０００個の塩基対、好ましくは４００〜１００００個の塩基対そして最も好ましくは８００〜１０，０００個の塩基対を含むべきである。組込み要素は、宿主細胞のゲノム内の標的配列と相同であるあらゆる配列であってよい。その上、組込み要素は、コードしないまたはコードするヌクレオチド配列であってよい。他方で、ベクターは、非相同組換えにより宿主細胞のゲノム内に組込まれてよい。
【０２０７】
自己複製のためには、ベクターはさらに、それが問題の宿主細胞内で自律的に複製できるようにする複製起点を含んでいてよい。複製起点は、細胞内で機能する自己複製を仲介するあらゆるプラスミドレプリケータであってよい。「複製起点」または「プラスミドレプリケータ」という用語は、本明細書において、プラスミドまたはベクターが生体内で複製できるようにするヌクレオチド配列として定義される。
【０２０８】
細菌複製起点の例としては、E. coliにおける複製を可能にするプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７およびｐＡＣＹＣ１８４、およびBacillusにおける複製を可能にするｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＴＡ１０６０、およびｐＡＭβ１の複製起点がある。
【０２０９】
酵母宿主細胞において使用するための複製起点の例としては、２ミクロン複製起点、ＡＲＳ１、ＡＲＳ４、ＡＲＳ１とＣＥＮ３の組合せ、およびＡＲＳ４とＣＥＮ６の組合せがある。
【０２１０】
糸状菌細胞において有用な複製起点の例としては、ＡＭＡ１およびＡＮＳ１がある（Gemら、１９９１年、Gene、第９８号、６１〜６７頁；Cullenら、１９８７年、Nucleic Acids Research、第１５号、９１６３〜９１７５頁；国際公開第００／２４８８３号（WO 00/24883））。ＡＭＡ１遺伝子の単離および遺伝子を含むプラスミドまたはベクターの構築は、国際公開第００／２４８８３号（WO 00/24883）の中で開示されている方法にしたがって達成可能である。
【０２１１】
かかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの２つ以上のコピーを宿主細胞に挿入してポリペプチドの生産を増大させてよい。宿主細胞ゲノム内に配列の少なくとも１つの付加的なコピーを組込むことによってか、または（選択可能なマーカー遺伝子の増幅されたコピーひいてはポリヌクレオチドの付加的なコピーを含む細胞を適切な選択可能な作用物質の存在下での細胞の培養によって選択することができる）ポリヌクレオチドを伴った増幅可能な選択可能マーカー遺伝子の内含によって、ポリヌクレオチドのコピー数を増加することができる。
【０２１２】
組換え型発現ベクターを構築するべく上述した要素をライゲートするのに用いられる手順は、当業者にとって周知である（例えば例えばSambrookら、１９８９年、上掲書参照を参照のこと）。
【０２１３】
宿主細胞
セルロース分解増強活性を有するポリペプチドまたはセルロース分解酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換え型宿主細胞は有利には、ポリペプチドの組換え体産生において使用可能である。前述の通り、染色体組換え体としてかまたは自己複製する染色体外ベクターとしてベクターが維持されるように、かかるポリヌクレオチドを含むベクターが宿主細胞内に導入される。「宿主細胞」という用語は、複製中に発生する突然変異に起因する親細胞と同一ではない親細胞のあらゆる後代を包含する。宿主細胞の選択は、ポリペプチドをコードする遺伝子およびその供給源によって大きく左右される。
【０２１４】
宿主細胞は、単細胞微生物、例えば原核生物あるいは非単細胞微生物、例えば真核生物であってよい。
【０２１５】
細菌宿主細胞は、あらゆるグラム陽性菌またはグラム陰性菌であってよい。グラム陽性菌にはBacillus、Streptococcus、Streptomyces、Staphylococcus、Enterococcus、Lactobacillus、Lactococcus、Clostridium、GeobacillusおよびOceanobacillusが含まれるが、これらに限定されるわけではない。グラム陰性菌にはE. coli、Pseudomonas、Salmonella、Campylobacter、Helicobacter、Flavobacterium、Fυsobacterium、llyobacter、NeisseriaおよびUreaplasmaが含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【０２１６】
細菌宿主細胞は、あらゆるBacillus細胞であってよい。本発明の実践において有用なBacillus細胞には、Bacillus alkalophilus、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus brevis、Bacillus circulans、Bacillus clausii、Bacillus coagulans、Bacillus firmus、Bacillus lautus、Bacillus lentus、Bacillus licheniformis、Bacillus megaterium、Bacillus pumilus、Bacillus stearothermophilus、Bacillus subtilisおよびBacillus thuhngiensis細胞が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【０２１７】
好ましい態様においては、細菌宿主細胞は、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus lentus、Bacillus licheniformis、Bacillus stearothermophilusまたはBacillus subtilis細胞である。より好ましい態様においては、細菌宿主細胞は、Bacillus amyloliquefaciens細胞である。別のより好ましい態様においては、細菌宿主細胞はBacillus clausii細胞である。別のより好ましい態様においては、細菌宿主細胞はBacillus licheniformis細胞である。別のより好ましい態様においては、細菌宿主細胞はBacillus subtilis細胞である。
【０２１８】
細菌宿主細胞は同様にあらゆるStreptococcus細胞であってもよい。本発明の実践において有用なStreptococcus細胞としては、Streptococcus equisimilis、Streptococcus pyogenes、Streptococcus uberisおよびStreptococcus equi 亜種 Zooepidemicus細胞が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【０２１９】
好ましい態様においては、細菌宿主細胞は、Streptococcus equisimifis細胞である。別の好ましい態様においては、細菌宿主細胞はStreptococcus pyogenes細胞である。別の好ましい態様においては、細菌宿主細胞は、Streptococcus uberis細胞である。別の好ましい態様においては、細菌宿主細胞は、Streptococcus equi亜種Zooepidemicus細胞である。
【０２２０】
細菌宿主細胞は同様に、あらゆるStreptomyces細胞であってもよい。本発明の実践において有用なStreptomyces細胞としてはStreptomyces achromogenes、Streptomyces avermitilis、Streptomyces coelicolor、Streptomyces griseusおよびStreptomyces lividans細胞が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【０２２１】
好ましい態様においては、細菌宿主細胞は、Streptomyces achromogenes細胞である。別の好ましい態様においては、細菌宿主細胞はStreptomyces avermitilis細胞である。別の好ましい態様においては、細菌宿主細胞はStreptomyces avermitilis細胞である。別の好ましい態様においては、細菌宿主細胞は、Streptomyces coelicolor細胞である。別の好ましい態様においては、細菌宿主細胞は、Streptomyces griseus細胞である。別の好ましい態様においては、細菌宿主細胞は、Streptomyces lividans細胞である。
【０２２２】
Bacillus細胞内へのＤＮＡの導入は、例えば、プロトプラスト形質転換によって（例えばChangおよびCohen、１９７９年、Molecular General Genetics、第１６８号、１１１〜１１５頁を参照のこと）、コンピテント細胞を使用することによって（例えばYoungおよびSpizizen、１９６１年、Journal of Bacteriology、第８１：８２３〜８２９頁またはDubnauおよびDavidoff-Abelson、１９７１年、Journal of Molecular Biology、第５６、２０９〜２２１頁を参照のこと）、電気穿孔法によって（例えばShigekawaおよびDower、１９８８年、Biotechniques、第６号、７４２〜７５１頁を参照のこと）、または接合によって（例えばKoehlerおよびThome、１９８７年、Journal of Bacteriology、第１６９号、５２７１〜５２７８頁を参照のこと）実施されてよい。E. coli細胞内へのＤＮＡの導入は、例えば、プロトプラスト形質転換によって（例えばHanahan、１９８３年、J. MoI. Biol.、第１６６号、５５７〜５８０頁を参照のこと）かまたは電気穿孔法によって（例えばDowerら、１９８８年、Nucleic Acids Res.、第１６号、６１２７〜６１４５頁を参照のこと）実施されてよい。Streptomyces細胞内へのＤＮＡの導入は、例えば、プロトプラスト形質転換および電気穿孔法によって（例えばGongら、２００４年、Folia Microbiol.（Praha）、第４９号、３９９〜４０５頁を参照のこと）、接合によって（例えばMazodierら、１９８９年、J. Bactehol.、第１７１号、３５８３〜３５８５頁を参照のこと）、または形質導入によって（例えばBurkeら、２００１年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第９８号、６２８９〜６２９４頁を参照のこと）実施されてよい。Pseudomonas細胞内へのＤＮＡの導入は例えば、電気穿孔法（例えばChoiら、２００６年、J. Microbiol. Methods、第６４号、３９１〜３９７頁を参照のこと）、または接合（例えばPinedoおよびSmets、２００５年、Appl. Environ. Microbiol.、第７１号、５１〜５７頁を参照のこと）によって実施されてよい。Streptococcus細胞内へのＤＮＡの導入は、自然の受容能によって（例えばPerryおよびKuramitsu、１９８１年、Infect. Immun.、第３２号、１２９５−１２９７頁を参照のこと）、プロトプラスト形質転換によって（例えばCattおよびJollick、１９９１年、Microbios.、第６８号、１８９〜２０７０頁を参照のこと）、電気穿孔法によって（例えばBuckleyら、１９９９年、Appl. Environ. Microbiol.、第６５号、３８００〜３８０４頁を参照のこと）または接合によって（例えばClewell、１９８１年、Microbiol. Rev.、第４５号、４０９〜４３６頁を参照のこと）実施されてよい。しかしながら、宿主細胞内にＤＮＡを導入するための当該技術分野において既知のあらゆる方法を使用することができる。
【０２２３】
宿主細胞は、哺乳動物、昆虫、植物または真菌細胞といった真核生物であってもよい。
【０２２４】
好ましい態様においては、宿主細胞は真菌細胞である。本明細書において使用される「真菌」には、（Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi、第８版、１９９５年、CAB International、University Press、Cambridge、UK中でHawksworthらが定義している通りの）phyla Ascomycota、Basidiomycota、ChytridiomycotaおよびZygomycotaならびに（Hawksworthら、１９９５年、上掲書、１７１頁中で引用されている通りの）卵菌、および全ての栄養胞子真菌（Hawksworthら、１９９５年、上掲書）が含まれる。
【０２２５】
より好ましい態様においては、真菌宿主細胞は酵母細胞である。本明細書において使用される「酵母」には、子嚢胞子生成酵母（Endomycetales）、担子胞子生成酵母および不完全菌類に属する酵母（Blastomycetes）が含まれる。酵母の分類は将来において変更される可能性があることから、本発明に関しては、酵母は、Biology and Activities of Yeast（Skinner、F.A.、Passmore、S.M.、and Davenport、R.R.、eds、Soc. App. Bacteriol. Symposium Series 、第９号、１９８０年）に記述されている通りに定義されるものとする。
【０２２６】
さらに一層好ましい態様においては、酵母宿主細胞は、Candida、Hansenula、Kluyveromyces、Pichia、Saccharomyces、SchizosaccharomycesまたはYarrowia細胞である。
【０２２７】
最も好ましい態様においては、酵母宿主細胞は、Saccharomyces carlsbergensis、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces diastaticus、Saccharomyces douglasii、Saccharomyces kluyveri、Saccharomyces norbensisまたはSaccharomyces oviformis細胞である。別の最も好ましい態様においては、酵母宿主細胞は、Kluyveromyces lactis細胞である。別の最も好ましい態様においては、酵母宿主細胞はYarrowia lipolytica細胞である。
【０２２８】
別の最も好ましい態様においては、真菌宿主細胞は、糸状菌細胞である。「糸状菌」は、真菌門（Eumycota）および卵菌門（Oomycota）亜門（Hawksworthら、１９９５年、上掲書により定義されている）の全ての糸状形態を含んでいる。糸状菌は一般に、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、およびその他の複合多糖で構成された菌糸壁を特徴とする。栄養増殖は、菌糸伸張によるものであり、炭素異化は、偏性好気性である。これとは対照的に、Saccharomyces cerevisiaeなどの酵母による植生生長（vegetation groth）は、単細胞性葉状体の発芽によるものであり、炭素異化は発酵性である。
【０２２９】
さらに一層好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、Acremonium、Aspergillus、Aureobasidium、Bjerkandera、Ceriporiopsis、Chrysosporium、Coprinus、Coriolus、Cryptococcus、Filibasidium、Fusarium、Humicola、Magnaporthe、Mucor、Myceliophthora、Neocallimastix、Neurospora、Paecilomyces、Penicillium、Phanerochaete、Phlebia、Piromyces、Pleurotus、Schizophyllum、Talaromyces、Thermoascus、Thielavia、Tolypocladium、TrametesまたはTrichoderma細胞である。
【０２３０】
最も好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、Aspergillus awamori、Aspergillus fumigatus、Aspergillus foetidus、Aspergillus japonicus、Aspergillus nidulans、Aspergillus nigerまたはAspergillus oryzae細胞である。別の最も好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、Fusarium bactridioides、Fusarium cerealis、Fusarium crookwellense、Fusarium culmorum、Fusarium graminearum、Fusarium graminum、Fusarium heterosporum、Fusarium negundi、Fusarium oxysporum、Fusarium reticulatum、Fusarium roseum、Fusarium sambucinum、Fusarium sarcochroum、Fusarium sporotrichioides、Fusarium sulphureum、Fusarium torulosum、Fusarium trichothecioidesまたはFusarium venenatum細胞である。別の最も好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、Bjerkandera adusta、Ceriporiopsis aneirina、Ceriporiopsis aneirina、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、Ceriporiopsis subvermispora、Chrysosporium keratinophilum、Chrysosporium lucknowense、Chrysosporium tropicum、Chrysosporium merdarium、Chrysosporium inops、Chrysosporium pannicola、Chrysosporium queenslandicum、Chrysosporium zonatum、Coprinus cinereus、Coriolus hirsutus、Humicola insolens、Humiola lanuginosa、Mucor miehei、Myceliophthora thermophila、Neurospora crassa、Penicillium purpurogenum、Phanerochaete chrysosporium、Phlebia radiata、Pleurotus eryngii、Thielavia terrestris、Trametes villosa、Trametes versicolor、Trichoderma harzianum、Trichoderma koningii、Trichoderma longibrachiatum、Trichoderma reeseiまたはTrichoderma viride細胞である。
【０２３１】
真菌細胞は、プロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換および細胞壁の再生が関与するプロセスによってそれ自体既知の要領で形質転換されてよい。AspergillusおよびTrichoderma宿主細胞の形質転換のための適切な手順は、欧州特許第２３８０２３号（EP 238 023）およびYeltonら、１９８４年、Proceedings of the National Academy of Sciences USA、第８１号、１４７０〜１４７４頁において記述されている。Fusarium種を形質転換するための適切な方法が、Malardierら、１９８９年、Gene、第７８号、１４７〜１５６頁および国際公開第９６／００７８７号（WO 96/00787）によって記述されている。酵母は、BeckerおよびGuarente、In Abelson、J.N. and Simon、M.I.、editors、「Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology、Methods in Enzymology」、第１９４巻、１８２〜１８７頁、Academic Press、Inc.、New York；ltoら、１９８３年、Journal of Bacteriology、第１５３号、１６３頁；およびHinnenら、１９７８年、Proceedings of the National Academy of Sciences USA、第７５号、１９２０頁により記述された手順を用いて形質転換されてよい。
【０２３２】
生産方法
セルロース分解増強活性を有するポリペプチドまたはセルロース分解酵素活性を有するポリペプチドを生産するための方法は、ポリペプチドの生産を導く条件下で、その野生型においてポリペプチドを生産することのできる細胞を培養する工程および（ｂ）ポリペプチドを回収する工程を含む。
【０２３３】
代替的には、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドまたはセルロース分解酵素活性を有するポリペプチドを生産するための方法は、（ａ）ポリペプチドの生産を導く条件下で、組換え型宿主細胞を培養する工程；および（ｂ）ポリペプチドを回収する工程を含む。
【０２３４】
生産方法において、細胞は、当該技術分野において周知の方法を用いてポリペプチドの生産に適した栄養培地の中で培養される。例えば、細胞は、ポリペプチドを発現させかつ／または単離させることのできる条件下で適切な培養内で実施される実験室用または工業用発酵装置の中での小規模または大規模発酵（連続、バッチ、流加または固体発酵を含めた）、および振とうフラスコ培養によって培養されてよい。培養は、当該技術分野において公知の手順を用いて、炭素および窒素供給源および無機塩を含む適切な栄養培地の中で起こる。商業的供給業者から適切な培地を入手することができ、そうでなければ、公開された組成（例えばAmerican Type Culture Collectionのカタログ中）にしたがって調製してもよい。ポリペプチドが栄養培地内に分泌される場合、このポリペプチドを培地から直接回収できる。ポリペプチドが培地内に分泌されない場合、細胞溶解物からそれを回収することができる。
【０２３５】
セルロース分解増強活性またはセルロース分解酵素活性を有するポリペプチドは、本明細書中で記述された方法を用いて検出される。
【０２３６】
結果として得られたブロスをそのまま使用してもよいし、そうでなければ当該技術分野において公知の方法に用いてポリペプチドを回収してもよい。例えば、ポリペプチドを、遠心分離、ろ過、抽出、噴霧乾燥、蒸発または沈澱を含めた（ただしこれらに限定されるわけではない）従来の手順により栄養培地から回収してよい。
【０２３７】
クロマトグラフィ（例えばイオン交換、親和性、疎水性、クロマト分画およびサイズ排除）、電気泳動法手順（例えば分取等電点電気泳動法）、溶解度差（例えば、硫酸アンモニウム沈澱）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、または抽出（例えばProtein Purification、J.-C. Janson and Lars Ryden、editors、VCH Publishers、New York、１９８９年を参照のこと）を含めた（ただしこれらに限定されるわけではない）当該技術分野において公知のさまざまな手順によってポリペプチドを精製して、実質的に純粋なポリペプチドを得てもよい。
【０２３８】
セルロース含有材料の加工方法
本発明の組成物および方法を用いて、セルロース含有材料例えばリグノセルロースを発酵性糖へと加水分解（糖化）し、この発酵性糖を数多くの有用な物質、例えば化学物質および燃料へと転換させることができる。セルロース含有材料から所望の発酵産物を生産するためには、前処理、酵素加水分解（糖化）、および発酵が必要である。
【０２３９】
本発明にしたがったセルロース含有材料の加工は、当該技術分野において既知のプロセスを用いて達成可能である。その上、本発明の方法は、本発明にしたがって作動するように構成されたあらゆるバイオマス加工装置を用いて実施可能である。
【０２４０】
個別または同時加水分解（糖化）および発酵には、個別加水分解および発酵（ＳＨＦ）、同時糖化および発酵（ＳＳＦ）、同時糖化および共発酵（ＳＳＣＦ）、ハイブリッド加水分解および発酵（ＨＨＦ）、ＳＨＣＦ（個別加水分解および共発酵）、ＨＨＣＦ（ハイブリッド加水分解および発酵）そして直接微生物転換（ＤＭＣ）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。本明細書においては、前処理、酵素加水分解（糖化）、発酵またはその組合せを含む当該技術分野において公知のあらゆる方法を、本発明の方法の実施にあたって使用できるということが了解されている。
【０２４１】
従来の装置には、流加撹拌型反応器、バッチ撹拌型反応器、限外ろ過を伴う連続流撹拌型反応器および／または連続栓流カラム反応器（Fernanda de Castilhos Corazza、Flavio Faria de Moraes、Gisella Maria ZaninおよびIvo Neitzel、２００３年、「Optimal control in fed-batch reactor for the cellobiose hydrolysis、Acta Scientiarum」、Technology、第２５号、３３〜３８頁；Gusakov、A. V.およびSinitsyn、A. P.、１９８５年、「Kinetics of the enzymatic hydrolysis of cellulose: 1. A mathematical model for a batch reactor process」、Em. Microb. Technol.、第７号、３４６〜３５２頁）、摩耗反応器（Ryu、S. K.、および Lee、J. M.、１９８３年、「Bioconversion of waste cellulose by using an attrition bioreactor」、Biotechnol. Bioeng.、第２５号、５３〜６５頁）、または電磁場により誘発される集中的撹拌を伴う反応器（Gusakov、A. V.、Sinitsyn、A. P.、Davydkin、I. Y.、Davydkin、V. Y.、Protas、O. V.、１９９６年、「Enhancement of enzymatic cellulose hydrolysis using a novel type of bioreactor with intensive stirring induced by electromagnetic field」、Appl. Biochem. Biotechnol.、第５６号、１４１〜１５３頁）が含まれ得る。付加的な反応器タイプには、例えば、加水分解および／または発酵用の流動床、上向流床、固定化および押出し機タイプの反応器が含まれる。
【０２４２】
前処理。本発明の方法を実施する上で、セルロース含有材料の植物細胞壁構成要素を分断するために、当該技術分野において公知のあらゆる前処理プロセスを使用することができる。同様に、当該技術分野において公知の方法を用いて前処理する前にセルロース含有材料を予浸、湿潤または条件づけに付すことも可能である。従来の前処理には、蒸気前処理（爆発を伴うまたは伴わない）、希酸前処理、熱湯前処理、石灰前処理、湿式酸化、湿式爆発、アンモニア繊維爆発、オルガノソルブ前処理および生物学的前処理が含まれる。付加的な前処理には、超音波、電気穿孔法、マイクロ波、超臨界ＣＯ2、超臨界Ｈ2Ｏおよびアンモニアパーコレーションが含まれる。
【０２４３】
加水分解および／または発酵の前にセルロース含有材料を前処理することができる。前処理は、好ましくは加水分解の前に実施される。代替的には、前処理を、加水分解と同時に、例えばグルコースおよび／またはマルトースなどの発酵性糖を放出させるための１つ以上のセルロース分解酵素またはその他の酵素活性を用いたセルロース含有材料の処理と同時に実施することができる。大部分のケースにおいて、前処理工程はそれ自体、（酵素の不在下でさえ）バイオマスを発酵性糖に一部転換する結果となる。
【０２４４】
蒸気前処理。蒸気前処理においては、セルロース含有材料は加熱されて、リグニン、ヘミセルロースおよびセルロースを含む植物細胞壁構成要素を分断し、酵素がアクセスできるセルロースおよびその他の画分例えばヘミセルロースなどを作る。セルロース材料は、反応容器までまたはこれを通過させられて、この反応容器において蒸気が射出されて温度を所要の温度および圧力まで増加させ、所望の反応時間中その中に保持される。蒸気前処理は好ましくは１４０〜２３０℃、より好ましくは１８０〜２００℃、そして最も好ましくは１７０〜１９０℃で行なわれ、ここで最適温度は、化学触媒の添加によって左右される。蒸気前処理のための滞留時間は、好ましくは１〜１５分、より好ましくは３〜１２分、そして最も好ましくは４〜１０分であり、ここで最適滞留時間は、温度範囲および化学触媒の添加により左右される。蒸気前処理によって、固体負荷を比較的高くすることができ、このため、セルロース含有材料は一般に前処理の間だけ湿っていることになる。蒸気前処理は多くの場合、蒸気爆発、すなわちフラグメント化によりアクセス可能表面積を増大させることになる材料の大気圧への急速なフラッシングと乱流、として知られている前処理後の材料の爆発的排出と組合される（DuffおよびMurray、１９９６年、Bioresource Technology、第８５５号、１〜３３頁；GalbeおよびZacchi、２００２年、Appl. Microbiol. Biotechnol.、第５９号、６１８〜６２８頁；米国特許出願第２００２０１６４７３０号（U.S. Patent Application No. 20020164730））。
【０２４５】
蒸気前処理に先立ち、Ｈ2ＳＯ4またはＳＯ2といった触媒（標準的には０．３〜３％ｗ／ｗ）が添加されることが多く、これにより時間と温度は削減され、回収は増大し、酵素加水分解は改善される（Ballesterosら、２００６年、Appl. Biochem. Biotechnol.、第１２９〜１３２号、４９６−５０８頁；Vargaら、２００４年、Appl. Bioc hem. Biotechnol.、第１１３〜１１６号、５０９〜５２３頁；Sassnerら、２００６年、Enzyme Microb. Technol.、第３９号、７５６〜７６２頁）。
【０２４６】
化学的前処理：「化学的処理」という用語は、セルロース、ヘミセルロースおよび／またはリグニンの分離および／または放出を促進するあらゆる化学的前処理を意味する。適切な化学的前処理プロセスの例としては、例えば希酸前処理、石灰前処理、湿式酸化、アンモニア繊維／凍結爆発（ＡＦＥＸ）、アンモニアパーコレーション（ＡＰＲ）そしてオルガノソルブ前処理が含まれる。
【０２４７】
希酸前処理においては、セルロース含有材料は希酸、標準的にはＨ2ＳＯ4そして水と混合されてスラリーを形成し、所望の温度まで蒸気により加熱され、そして滞留時間の後大気圧までフラッシングされる。希酸前処理は、数多くの反応器設計、例えば栓流反応器、向流反応器または連続向流収縮床反応器を用いて実施可能である（DuffおよびMurray、１９９６年、上掲書；Schellら、２００４年、Bioresoυrce Technol.、第９１号、１７９〜１８８頁；Leeら、１９９９年、Adv. Biochem. Eng. Biotechnol.、第６５号、９３〜１１５頁）。
【０２４８】
アルカリ性条件下の幾つかの前処理方法も同様に使用可能である。これらのアルカリ前処理としては、石灰前処理、湿式酸化、アンモニアパーコレーション（ＡＰＲ）およびアンモニア繊維／凍結爆発（ＡＦＥＸ）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【０２４９】
石灰前処理は、８５〜１５０℃の低温、１時間〜数日の滞留時間で、炭酸カルシウム、水酸化ナトリウムまたはアンモニアを用いて実施される（Wymanら、２００５年、Bioresource Technol.、第９６号、１９５９〜１９６６頁；Mosierら、２００５年、Bioresource Technol.、第９６号、６７３〜６８６頁））。国際公開第２００６／１１０８９１号（WO 2006/110891）、国際公開第２００６／１１８９９号（WO 2006/11899）、国際公開第２００６／１１９００号（WO 2006/11900）および国際公開第２００６／１１０９０１号（WO 2006/110901）は、アンモニアを使用した前処理方法について開示している。
【０２５０】
湿式酸化は標準的に、過酸化水素といった酸化的作用物質の添加または酸素の過剰圧力を用いて５〜１５分間１８０℃〜２００℃で実施される熱前処理である（SchmidtおよびThomsen、１９９８年、Bioresource Technol.、第６４号、１３９〜１５１頁；Palonenら、２００４年、Appl. Biochem. Biotechnol.、第１１７号、１〜１７頁；Vargaら、２００４年、Biotechnol. Bioeng.、第８８号、５６７〜５７４頁；Martinら、２００６年、J. Chem. Technol. Biotechnol.、第８１号、１６６９〜１６７７頁）。この前処理は、好ましくは１〜４０％の乾物量、より好ましくは２〜３０％の乾物量、そして最も好ましくは５〜２０％の乾物量で実施され、多くの場合、炭酸ナトリウムといったようなアルカリの添加によって初期ｐＨは上昇する。
【０２５１】
湿式爆発（湿式酸化と蒸気爆発の組合せ）として知られている湿式酸化前処理方法の修正方法では、最高３０％の乾物量を扱うことができる。湿式爆発においては、酸化剤は、一定の滞留時間後の前処理の間に導入される。その後、前処理は、大気圧までのフラッシングによって終了される（国際公開第２００６／０３２２８２号（WO 2006/032282））。
【０２５２】
アンモニア繊維爆発（ＡＦＥＸ）には、９０〜１００℃などの緩やかな温度そして１７〜２０バールの高圧で５〜１０分間、液体または気体のアンモニアでセルロース含有材料を処理することが関与しており、ここで、乾物量含有量は６０％という高いものであり得る（Gollapalliら、２００２年、Appl. Biochem. Biotechnol.、第９８号、２３〜３５頁；Chundawatら、２００７年、Biotechnol. Bioeng.、第９６号、２１９〜２３１頁；Alizadehら、２００５年、Appl. Biochem. Biotechnol.、第１２１号、１１３３〜１１４１頁；Teymouriら、２００５年、Bioresource Technol.第９６号、２０１４〜２０１８頁）。
【０２５３】
オルガノソルブ前処理は、水性エタノール（エタノール４０〜６０％）を用い１６０〜２００℃で３０〜６０分間抽出することによってセルロース含有材料を脱リグニンする（Panら、２００５年、Biotechnol. Bioeng.、第９０号、４７３〜４８１頁；Panら、２００６年、Biotechnol. Bioeng.、第９４号、８５１〜８６１頁；Kurabiら、２００５年、Appl. Biochem. Biotechnol.、第１２１号、２１９〜２３０頁）。通常、触媒として硫酸が添加される。オルガノソルブ前処理においては、ヘミセルロースの大部分が除去される。
【０２５４】
適切な前処理方法のその他の例は、Schellら、２００３年、Appl. Biochem.およびBiotechnol. 第１０５−１０８巻、６９〜８５頁、およびMosierら、２００５年、Bioresource Technology、第９６号、６７３〜６８６頁、および米国特許出願公開第２００２／０１６４７３０号（U.S. Published Application 2002/0164730）により記述されている。
【０２５５】
１つの態様においては、化学的前処理は好ましくは酸処理として、そしてより好ましくは連続的希酸および／または弱酸処理として実施される。酸は、標準的に硫酸であるが、酢酸、クエン酸、硝酸、リン酸、酒石酸、コハク酸、塩化水素またはそれらの混合物といったようなその他の酸も使用可能である。弱酸性処理は、好ましくは１〜５、より好ましくは１〜４、そして最も好ましくは１〜３のｐＨ範囲内で行なわれる。１つの態様においては、酸濃度は、好ましくは０．０１〜２０重量％の酸、より好ましくは０．０５〜１０重量％の酸、さらに一層好ましくは０．１〜５重量％の酸、そして最も好ましくは０．２〜２．０重量％の酸という範囲内にある。酸はセルロース含有材料と接触させられ、例えば１秒から６０分といった秒単位乃至分単位の範囲の時間、例えば１６０〜２２０℃の範囲、好ましくは１６５〜１９５℃の範囲内の温度に保たれる。
【０２５６】
別の態様においては、前処理は、アンモニア繊維爆発工程（ＡＦＥＸ前処理工程）として実施される。
【０２５７】
別の態様においては、前処理は、水性スラリー内で行われる。好ましい態様においては、セルロース含有材料は、前処理の間、好ましくは１０〜８０重量％、より好ましくは２０〜７０重量％、そして最も好ましくは３０〜６０重量％、例えば５０重量％前後の量で存在する。前処理されたセルロース含有材料は、洗浄されないかまたは当該技術分野において公知のあらゆる方法（例えば水）で洗浄される。
【０２５８】
機械的前処理：「機械的前処理」という用語は、さまざまなタイプの粉砕またはミル粉砕（例えば乾式ミル粉砕、湿式ミル粉砕またはボールミル粉砕）を意味する。
【０２５９】
物理的前処理：「物理的前処理」という用語は、セルロース含有材料からのセルロース、ヘミセルロースおよび／またはリグニンの分離および／または放出を促進するあらゆる前処理を意味する。例えば、物理的前処理には、照射（例えばマイクロ波照射）、蒸気処理／蒸気爆発、熱水分解およびそれらの組合せが関与する可能性がある。
【０２６０】
物理的前処理には、高圧および／または高温（蒸気爆発）が関与し得る。１つの態様においては、高圧とは、好ましくは約３００〜約６００ｐｓｉ、より好ましくは約３５０〜約５５０ｐｓｉ、そして最も好ましくは約４００〜約５００ｐｓｉの範囲内、例えば４５０ｐｓｉ前後の圧力を意味する。別の態様においては、高温とは約１００〜約３００℃、好ましくは約１４０〜約２３５℃の範囲内の温度を意味する。好ましい態様においては、機械的前処理は、例えばSunds Defibrator AB、Swedenより入手可能なSunds Hydrolyzerといった以上で定義した通りの高圧高温を使用するバッチプロセス、スチームガン加水分解器システムの中で実施される。
【０２６１】
組合せ型物理化学的前処理：セルロース含有材料を物理的処理および化学的処理の両方で前処理することができる。例えば、前処理工程には、希酸および／または弱酸処理および高温および／または高圧処理が関与し得る。物理的および化学的前処理は、望まれる通りに、逐次的または同時に実施可能である。機械的前処理も含み入れることができる。
【０２６２】
したがって、好ましい態様においては、セルロース含有材料は、セルロース、ヘミセルロースおよび／またはリグニンの分離および／または放出を促進するべく、機械的、化学的または物理的前処理またはその任意の組合せに付される。
【０２６３】
生物学的前処理：「生物学的前処理」という用語は、セルロース含有材料からセルロース、ヘミセルロースおよび／またはリグニンの分離および／または放出を促進するあらゆる生物学的前処理を意味する。生物学的前処理技術には、リグニン可溶化微生物の応用が関与し得る（例えばHsu、T.-A.、１９９６年、「Pretreatment of biomass」、Handbook on Bioethanol: Production and Utilization、Wyman、C. E.、編、Taylor & Francis、Washington、DC、１７９〜２１２頁中；GhoshおよびSingh、１９９３年、「Physicochemical and biological treatments for enzymatic/microbial conversion of lignocellulosic biomass」、Adv. Appl. Microbiol.、第３９号、２９５〜３３３頁；McMillan、J. D.、１９９４年、「Pretreating lignocellulosic biomass: a review」、Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production中、Himmel、M. E.、Baker、J. O.、および Overend、R. P.、編、ACS Symposium Series 第５６６号、American Chemical Society、Washington、DC、第１５章；Gong、C. S.、Cao、N. J.、Du、J.、および Tsao、G. T.、１９９９年、「Ethanol production from renewable resources」、Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology中、Scheper、T.、編、Springer-Verlag Berlin Heidelberg、Germany、第６５号、２０７〜２４１頁；OlssonおよびHahn-Hagerdal、１９９６年、「Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanol production」、Enz. Microb. Tech.、第１８号、３１２〜３３１頁；およびVallanderおよびEriksson、１９９０年、「Production of ethanol from lignocellulosic materials: State of the art」、Adv. Biochem. Eng./Biotechnol.、第４２号、６３〜９５頁を参照のこと）。
【０２６４】
糖化。糖化としても知られている加水分解工程においては、前処理されたセルロース含有材料は加水分解されて、セルロースそして代替的にはヘミセルロースをも発酵性糖、例えばグルコース、キシロース、キシルロース、アラビノース、マルトース、マンノース、ガラクトースおよび／または可溶性オリゴ糖に分解する。加水分解は、有効量のセルロース分解増強活性を有するポリペプチドおよび可溶性活性化二価金属カチオンを含む本発明のセルロース分解酵素組成物を用いて酵素的に実施される。組成物の酵素構成要素は、逐次的に添加することもできる。
【０２６５】
酵素加水分解は好ましくは、当業者によって容易に決定され得る条件の下で、適切な水性環境内で実施される。好ましい態様においては、加水分解は、酵素（単複）の活性に適した、すなわち酵素（単複）にとって最適な条件下で実施される。加水分解は、前処理されたセルロース含有材料（基質）が例えば酵素含有加水分解溶液などに対して漸進的に補給される流加または連続プロセスとして実施可能である。
【０２６６】
糖化は、一般に、制御されたｐＨ、温度および混合条件下で、撹拌槽型反応器または発酵器内で実施される。適切なプロセス時間、温度およびｐＨ条件は、当業者であれば容易に決定可能である。例えば、糖化は最高２００時間持続し得るが、標準的には好ましくは約１２〜約９６時間、より好ましくは約１６〜約７２時間そして最も好ましくは約２４〜約４８時間実施される。温度は、好ましくは約２５℃〜約７０℃、より好ましくは約３０℃〜約６５℃そしてより好ましくは約４０℃〜６０℃の範囲内、特に約５０℃である。ｐＨは、好ましくは約３〜約８、より好ましくは約３．５〜約７、そして最も好ましくは約４〜約６の範囲内、特に約ｐＨ５である。乾燥固体含有量は、好ましくは約５〜約５０重量％、より好ましくは約１０〜約４０重量％、そして最も好ましくは約２０〜約３０重量％の範囲内にある。
【０２６７】
酵素およびセルロース分解増強活性を有するポリペプチドの最適量は、構成要素であるセルロース分解タンパク質の混合物、セルロース基質、セルロース基質の濃度、セルロース基質の前処理（単複）、温度、時間、ｐＨ、および発酵生体の封入（例えば同時糖化および発酵については酵母）を含めた（ただしこれらに限定されるわけではない）複数の要因に左右される。
【０２６８】
好ましい態様においては、セルロース含有材料に対するセルロース分解タンパク質（単複）の有効量は、セルロース含有材料１ｇあたり約０．５〜約５０ｍｇであり、好ましくは約０．５〜約４０ｍｇ、より好ましくは約０．５〜約２５ｍｇ、より好ましくは約０．７５〜約２０ｍｇ、より好ましくは約０．７５〜約１５ｍｇ、さらに一層好ましくは約０．５〜約１０ｍｇ、そして最も好ましくは約２．５〜約１０ｍｇである。
【０２６９】
別の好ましい態様においては、セルロース含有材料に対するセルロース分解増強活性を有するポリペプチドの有効量は、セルロース含有材料１ｇあたり約０．５〜約５０ｍｇであり、好ましくは約０．５〜約４０ｍｇ、より好ましくは約０．５〜約２５ｍｇ、より好ましくは約０．７５〜約２０ｍｇ、より好ましくは約０．７５〜約１５ｍｇ、さらに一層好ましくは約０．５〜約１０ｍｇ、そして最も好ましくは約２．５〜約１０ｍｇである。
【０２７０】
別の好ましい態様においては、セルロース含有材料に対するセルロース分解増強活性を有するポリペプチドの有効量は、セルロース含有材料１ｇあたり約０．０１〜約５０．０ｍｇ、好ましくは約０．０１〜約４０ｍｇ、より好ましくは約０．０１〜約３０ｍｇ、より好ましくは約０．０１〜約２０ｍｇ、より好ましくは約０．０１〜約１０ｍｇ、より好ましくは約０．０１〜約５ｍｇであり、より好ましくは約０．０２５〜約１．５ｍｇ、より好ましくは約０．０５〜１．２５ｍｇ、より好ましくは約０．０７５〜約１．２５ｍｇ、より好ましくは約０．１〜約１．２５ｍｇ、さらに一層好ましくは約０．１５〜約１．２５ｍｇ、そして最も好ましくは約０．２５〜約１．０ｍｇである。
【０２７１】
別の好ましい態様においては、セルロース分解タンパク質（単複）に対するセルロース分解増強活性を有するポリペプチドの有効量は、セルロース分解タンパク質（単複）１ｇあたり約０．００５〜約１．０ｇであり、好ましくは約０．０１〜約１．０ｇ、より好ましくは約０．１５〜約０．７５ｇ、より好ましくは約０．１５〜約０．５ｇ、より好ましくは約０．１〜約０．５ｇ、さらに一層好ましくは約０．１〜約０．５ｇ、そして最も好ましくは約０．０５〜約０．２ｇである。
【０２７２】
発酵。前処理され加水分解されたセルロース含有材料から得られた発酵性糖は、糖を直接的または間接的に所望の発酵産物へと発酵できる１つ以上の発酵微生物を用いて発酵させることができる。「発酵」または「発酵プロセス」というのは、あらゆる発酵プロセスまたは発酵工程を含むあらゆるプロセスを意味する。発酵プロセスは同様に、生物燃料産業、飲料用アルコール産業（例えばビールおよびワイン）、乳業（例えば発酵乳製品）、皮革産業およびタバコ産業で使用される発酵プロセスも含んでいる。発酵条件は、所望の発酵産物および発酵生体により左右され、当業者であれば容易に決定できる。
【０２７３】
発酵工程においては、前処理および酵素加水分解工程の結果としてセルロース含有材料から放出された糖が、酵母といった発酵生体によって例えばエタノールなどの産物へと発酵される。加水分解（糖化）および発酵は、個別または同時のものであり得る。かかる方法には、個別加水分解および発酵（ＳＨＦ）、同時糖化および発酵（ＳＳＦ）、同時糖化および共発酵（ＳＳＣＦ）、ハイブリッド加水分解および発酵（ＨＨＦ）、ＳＨＣＦ（個別加水分解および共発酵）、ＨＨＣＦ（ハイブリッド加水分解および発酵）そして直接微生物転換（ＤＭＣ）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【０２７４】
本発明を実践するにあたっては、発酵工程において、加水分解されたあらゆる適切なセルロース含有材料を使用することができる。材料は、一般に所望の発酵産物すなわち発酵から得られるべき物質そして当該技術分野において周知の通りの利用されるプロセスに基づいて選択される。
【０２７５】
「発酵培地」という用語は、発酵微生物（単複）が添加される前の培地、例えば糖化プロセスの結果得られる培地、ならびに例えば同時糖化および発酵プロセス（ＳＳＦ）において使用される培地を意味する。
【０２７６】
「発酵微生物」とは、発酵産物を産生するために所望の発酵プロセスにおいて使用するのに適した、細菌および真菌生体を含めたあらゆる微生物を意味する。発酵生体は、Ｃ6および／またはＣ5発酵生体またはその組合せであり得る。Ｃ6およびＣ5発酵生体は両方共、当該技術分野において周知である。適切な発酵微生物は、糖例えばグルコース、キシロース、キシルロース、アラビノース、マルトース、マンノース、ガラクトースまたはオリゴ糖を、所望の発酵産物へと直接的または間接的に発酵すなわち転換することができる。
【０２７７】
エタノールを産生する細菌および真菌発酵生体の例は、Linら、２００６年、Appl. Microbiol. Biotechnol.、第６９号、６２７〜６４２頁により記述されている。
【０２７８】
Ｃ６糖を発酵できる発酵微生物の例としては、細菌および真菌生体、例えば酵母が含まれる。好ましい酵母には、Saccharomyces種、好ましくはSaccharomyces cerevisiaeの菌株が含まれる。
【０２７９】
Ｃ５糖を発酵できる発酵生体の例としては、細菌および真菌生体、例えば酵母が含まれる。好ましいＣ５発酵酵母には、Pichia、好ましくはPichia stipitis、例えばPichia stipitis ＣＢＳ５７７３の菌株；Candida好ましくはCandida boidinii、Candida brassicae、Candida sheatae、Candida diddensii、Candida pseudotropicalisまたはCandida utilisの菌株が含まれる。
【０２８０】
その他の発酵生体としては、Zymomonas、例えばZymomonas mobilis；Hansenula、例えばHansenula anomala；Klyveromyces、例えばK. fragilis；Schizosaccharomyces、例えば S. pombeの菌株、およびE. coli特にエタノールの収量を改善するために遺伝子操作されたE. coli菌株が含まれる。
【０２８１】
好ましい態様においては、酵母は、Saccharomyces 種である。好ましい態様においては、酵母は、Saccharomyces cerevisiaeである。別のより好ましい態様においては、酵母はSaccharomyces distaticusである。別のより好ましい態様においては、酵母はSaccharomyces uvarumである。別のより好ましい態様においては、酵母はKluyveromycesである。別のより好ましい態様においては、酵母はKluyveromuyces marxianusである。別のより好ましい態様においては、酵母はKluyveromuyces fragilisである。別のより好ましい態様においては、酵母はCandidaである。別のより好ましい態様においては、酵母はCandida boidiniiである。別のより好ましい態様においては、酵母はCandida brassicaeである。別のより好ましい態様においては、酵母はCandida diddensiiである。別のより好ましい態様においては、酵母はCandida pseudotropicalisである。別のより好ましい態様においては、酵母はCandida utilisである。別のより好ましい態様においては、酵母はClavisporaである。別のより好ましい態様においては、酵母はClavispora lusitaniaeである。別のより好ましい態様においては、酵母はClavispora opuntiaeである。別のより好ましい態様においては、酵母はPachysolenである。別のより好ましい態様においては、酵母はPachysolen tannophilusである。別のより好ましい態様においては、酵母はPichiaである。別のより好ましい態様においては、酵母はPichia stipitisである。別のより好ましい態様においては、酵母はBretannomycesである。別のより好ましい態様においては、酵母はBretannomyces clauseniiである（Philippidis、G. P.、１９９６年、「Cellulose biconversion technology」、Handbook on Bioethanol: Production and Utilization中、Wyman、C. E.、編、Taylor & Francis、Washington、DC、１７９〜２１２頁）。
【０２８２】
ヘキソースおよびペントースをエタノールへと効率良く発酵できる細菌としては、例えば、Zymomonas mobilisおよびClostridium thermocellumが含まれる（Philippidis、１９９６年、上掲書）。
【０２８３】
好ましい態様においては、細菌はZymomonasである。より好ましい態様においては、細菌はZymomonas mobilisである。別の好ましい態様においては、細菌はClostridiumである。別のより好ましい態様においては、細菌はClostridium thermoceliumである。
【０２８４】
エタノール産生に適した市販の酵母としては、例えばETHANOL REDTM 酵母（Fermentis/Lesaffre、USAより入手可能）、FALI TM（Fleischmann’s Yeast、USAより入手可能）、SUPERSTARTTMおよびTHERMOSACCTM 生酵母（Ethanol Technology、Wl、USAより入手可能）、BIOFERMTM AFTおよびXR（NABC - North American Byproducts Corporation、GA、USAより入手可能）、GERT STRANDTM （Gert Strand AB、Swedenより入手可能）およびFERMIOLTM（DSM Specialtiesより入手可能）が含まれる。
【０２８５】
好ましい態様においては、発酵微生物は、キシロース利用微生物、アラビノース利用微生物およびキシロースとアラビノースの同時利用微生物といったような、ペントース糖を発酵する能力を提供するように遺伝子操作されたものである。
【０２８６】
さまざまな発酵微生物内への非相同遺伝子のクローニングにより、ヘキソースおよびペントースをエタノールに転換できる生体が構築されるに至った（共発酵）（ChenおよびHo、１９９３年、「Cloning and improving the expression of Pichia stipitis xylose reductase gene in Saccharomyces cerevisiae」、Appl. Biochem. Biotechnol.、第３９〜４０号、１３５〜１４７頁；Hoら、１９９８年、「Genetically engineered Saccharomyces yeast capable of effectively cofermenting glucose and xylose」、Appl. Environ. Microbiol.、第６４号、１８５２〜１８５９頁； KotterおよびCiriacy、１９９３年、「Xylose fermentation by Saccharomyces cerevisiae」、Appl. Microbiol. Biotechnol.、第３８号、７７６〜７８３頁；Walfridssonら、１９９５年、「Xylose-metabolizing Saccharomyces cerevisiae strains overexpressing the TKL1 and TAL1 genes encoding the pentose phosphate pathway enzymes transketolase and transaldolase」、Appl. Environ. Microbiol.、第６１号、４１８４〜４１９０頁；Kuyperら、２００４年、「Minimal metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficient anaerobic xylose fermentation: a proof of principle」、FEMS Yeast Research、第４号、６５５〜６６４頁；Beallら、１９９１年、「Parametric studies of ethanol production from xylose and other sugars by recombinant Escherichia coli」、Biotech. Bioeng.、第３８号、２９６〜３０３頁；Ingramら、１９９８年、「Metabolic engineering of bacteria for ethanol production」、Biotechnol. Bioeng.、第５８号、２０４〜２１４頁；Zhangら、１９９５年、「Metabolic engineering of a pentose metabolism pathway in ethanologenic Zymomonas mobilis」、Science、第２６７号、２４０〜２４３頁；Deandaら、１９９６年、「Development of an arabinose-fermenting Zymomonas mobilis strain by metabolic pathway engineering」、Appl. Environ. Microbiol.第６２号、４４６５〜４４７０頁）。
【０２８７】
好ましい態様においては、遺伝子操作された発酵微生物は、Saccharomyces cerevisiaeである。別の好ましい態様においては、遺伝子操作された発酵微生物はZymomonas mobilisである。別の好ましい態様においては、遺伝子操作された発酵微生物は、Escherichia coliである。別の好ましい態様においては、遺伝子操作された発酵微生物は、Klebsiella oxytocaである。
【０２８８】
発酵微生物（単複）は標準的に、分解されたセルロースまたは加水分解物に添加され、発酵は約８時間〜約９６時間例えば約２４時間〜約６０時間実施される。温度は標準的に約２６℃〜約６０℃の間、特に約３２℃または５０℃であり、約ｐＨ３〜約ｐＨ８の間、例えばｐＨ４〜５、６または７前後にある。
【０２８９】
好ましい態様においては、発酵微生物（単複）は、分解されたセルロースまたは加水分解物に適用され、発酵は、約１２〜約９６時間、例えば標準的に２４〜６０時間実施される。好ましい態様においては、温度は好ましくは約２０℃〜約６０℃の間、より好ましくは約２５℃〜約５０℃の間そして最も好ましくは約３２℃〜約５０℃の間、特に約３２℃または５０℃であり、ｐＨは一般に約ｐＨ３〜約ｐＨ７、好ましくはｐＨ４〜７前後である。しかしながら、一部の例えば細菌発酵生体などは、より高い最適発酵温度を有する。発酵微生物（単複）は、好ましくは、発酵ブロス１ｍｌあたりおよそ１０5〜１０12、好ましくはおよそ１０7〜１０10、特におよそ２×１０6個の生存細胞計数という量で適用される。発酵のために酵母を用いることに関するさらなる指針は、例えば本発明に参照により援用されている「The Alcohol textbook」（Editors K. Jacques、T.P. LyonsおよびD. R. Kelsall、Nottingham University Press、United Kingdom １９９９年）の中に見出すことができる。
【０２９０】
エタノール生産のためには、発酵後に、発酵したスラリーを蒸留してエタノールを抽出する。本発明の方法にしたがって得られたエタノールは、例えば燃料エタノール、飲用エタノールすなわち飲用中性スピリッツまたは工業用エタノールとして使用可能である。
【０２９１】
発酵プロセス特に発酵微生物の性能例えば速度上昇およびエタノール収量をさらに改善するために、本明細書中で記述されている酵素プロセスのいずれかと組合せて発酵刺激物質を使用することができる。「発酵刺激物質」というのは、発酵微生物特に酵母を成長させるための刺激物質を意味する。成長のための好ましい発酵刺激物質にはビタミンおよびミネラルが含まれる。ビタミンの例としては、マルチビタミン、ビオチン、パントテン酸塩、ニコチン酸、メソイノシトール、チアミン、ピリドキシン、パラアミノ安息香酸、葉酸、リボフラビンおよびビタミンＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥが含まれる。例えば、本発明に参照により援用されているAlfenoreら、「Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae by a vitamin feeding strategy during fed-batch process」、Springer-Verlag（２００２年）を参照のこと。ミネラルの例としては、Ｐ、Ｋ、Ｍｇ、Ｓ、Ｃａ、Ｆｅ、Ｚｎ、ＭｎおよびＣｕを含む栄養素を供給できるミネラルおよび無機塩類が含まれる。
【０２９２】
発酵産物：発酵産物は、発酵に由来するあらゆる物質であり得る。発酵産物は、限定的な意味なく、アルコール（例えばアラビニトール、ブタノール、エタノール、グリセロール、メタノール、１，３−プロパンジオール、ソルビトール、およびキシリトール）；有機酸（例えば酢酸、アセトン酸、アジピン酸、アスコルビン酸、クエン酸、２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸、ギ酸、フマル酸、グルカン酸、グルコン酸、グルクロン酸、グルタル酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、イタコン酸、乳酸、リンゴ酸、マロン酸、シュウ酸、プロピオン酸、コハク酸およびキシロン酸）；ケトン（例えばアセトン）；アルデヒド（例えばホルムアルデヒド）；アミノ酸（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、リジン、セリンおよびトレオニン）；および気体（例えばメタン、水素（Ｈ2）、二酸化炭素（ＣＯ2）、および一酸化炭素（ＣＯ））であり得る。発酵産物は同様に、高価値産物としてタンパク質でもあり得る。
【０２９３】
好ましい態様においては、発酵産物はアルコールである。「アルコール」という用語は、１つ以上のヒドロキシル部分を含む物質を包含するものと理解される。より好ましい態様においては、アルコールはアラビニトールである。別のより好ましい態様においては、アルコールはブタノールである。別のより好ましい態様においては、アルコールはエタノールである。別のより好ましい態様においては、アルコールはグリセロールである。別のより好ましい態様においては、アルコールはメタノールである。別のより好ましい態様においては、アルコールは１，３−プロパンジオールである。別のより好ましい態様においては、アルコールはソルビトールである。別のより好ましい態様においては、アルコールはキシリトールである。例えばGong、C. S.、Cao、N. J.、Du、J.、およびTsao、G. T.、１９９９年、「Ethanol production from renewable resources」、 Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology中、Scheper、T.、編、Springer-Verlag Berlin Heidelberg、Germany、第６５号、２０７〜２４１頁；Silveira、M. M.、およびJonas、R.、２００２年、「The biotechnological production of sorbitol」、Appl. Microbiol. Biotechnol.第５９号、４００〜４０８頁；Nigam、P、およびSingh、D.、１９９５年、「Processes for fermentative production of xylitol - a sugar substitute」、Process Biochemistry、第３０号（２）、１１７〜１２４頁；Ezeji、T. C、Qureshi、N.およびBlaschek、H. P.、２００３年、「Production of acetone、butanol and ethanol by Clostridium beijerinckii BA101 and in situ recovery by gas stripping」、World Journal of Microbiology and Biotechnology、第１９号（６）、５９５〜６０３頁を参照のこと。
【０２９４】
別の好ましい態様においては、発酵産物は有機酸である。別のより好ましい態様においては、有機酸は酢酸である。別のより好ましい態様においては、有機酸はアセトン酸である。別のより好ましい態様においては、有機酸はアジピン酸である。別のより好ましい態様においては、有機酸はアスコルビン酸である。別のより好ましい態様においては、有機酸はクエン酸である。別のより好ましい態様においては、有機酸は２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸である。別のより好ましい態様においては、有機酸はギ酸である。別のより好ましい態様においては、有機酸はフマル酸である。別のより好ましい態様においては、有機酸はグルカン酸である。別のより好ましい態様においては、有機酸はグルコン酸である。別のより好ましい態様においては、有機酸はグルクロン酸である。別のより好ましい態様においては、有機酸はグルタン酸である。別のより好ましい態様においては、有機酸は３−ヒドロキシプロピオン酸である。別のより好ましい態様においては、有機酸はイタコン酸である。別のより好ましい態様においては、有機酸は乳酸である。別のより好ましい態様においては、有機酸はリンゴ酸である。別のより好ましい態様においては、有機酸はマロン酸である。別のより好ましい態様においては、有機酸はシュウ酸である。別のより好ましい態様においては、有機酸はプロピオン酸である。別のより好ましい態様においては、有機酸はコハク酸である。別のより好ましい態様においては、有機酸はキシロン酸である。例えばChen、R.、およびLee、Y. Y.、１９９７年、「Membrane-mediated extractive fermentation for lactic acid production from cellulosic biomass」、Appl. Biochem. Biotechnof.、第６３−６５号、４３５〜４４８頁を参照のこと。
【０２９５】
別の好ましい態様においては、発酵産物はケトンである。「ケトン」という用語は、１つ以上のケトン部分を含む物質を包含するものとして理解される。別のより好ましい態様においては、ケトンはアセトンである。例えばQureshiおよびBlaschek、２００３年、上掲書を参照のこと。
【０２９６】
別の好ましい態様においては、発酵産物はアルデヒドである。別のより好ましい態様においては、アルデヒドはホルムアルデヒドである。
【０２９７】
別の好ましい態様においては、発酵産物はアミノ酸である。別のより好ましい態様においては、有機酸はアスパラギン酸である。別のより好ましい態様においては、アミノ酸はグルタミン酸である。別のより好ましい態様においては、アミノ酸はグリシンである。別のより好ましい態様においては、アミノ酸はリジンである。別のより好ましい態様においては、アミノ酸はセリンである。別のより好ましい態様においては、アミノ酸はトレオニンである。例えばRichard、A.、およびMargaritis、A.、２００４年、「Empirical modeling of batch fermentation kinetics for poly（glutamic acid） production and other microbial biopolymers」、Biotechnology and Bioengineering、第８７号（４）、５０１〜５１５頁を参照のこと。
【０２９８】
別の好ましい態様においては、発酵産物は気体である。別のより好ましい態様においては、気体はメタンである。別のより好ましい態様においては、気体はＨ2である。別のより好ましい態様においては、気体はＣＯ2である。別のより好ましい態様においては、気体はＣＯである。例えばKataoka、N.、A. MiyaおよびK. Kiriyama、１９９７年、「Studies on hydrogen production by continuous culture system of hydrogen-producing anaerobic bacteria」、Water Science and Technology、第３６号（６−７）、４１〜４７頁；およびGunaseelan V.N.、Biomass and Bioenergy、第１３巻（１−２）中、８３〜１１４頁、１９９７年、「Anaerobic digestion of biomass for methane production: A review」を参照のこと。
【０２９９】
回収。発酵産物（単複）は任意には、クロマトグラフィ（例えばイオン交換、親和性、疎水性、クロマト分画およびサイズ排除）、電気泳動手順（例えば分取等電点電気泳動法）、溶解度差（例えば硫酸アンモニウム沈澱）、蒸留または抽出を含めた（ただしこれらに限定されるわけではない）当該技術分野において公知のあらゆる方法を用いて発酵培地から回収することができる。例えば、エタノールは、発酵されたセルロース含有材料から分離され、従来の蒸留方法によって精製される。最高約９６体積％の純度をもつエタノールを得ることができ、これを、例えば、燃料エタノール、飲用エタノールすなわち飲用中性スピリッツまたは工業用エタノールとして使用することができる。
【０３００】
本発明について以下の実施例によってさらに記述するが、これらの例は本発明の範囲を限定するものとしてみなされるべきではない。
【実施例】
【０３０１】
材料
緩衝液および基質として使用された化学物質は、少なくとも試薬グレードの市販の製品であった。
【０３０２】
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列決定は、ダイターミネータ化学（Gieseckeら、１９９２年、Journal of Virol. Methods、第３８号、４７〜６０頁）を用い、Applied Biosystems Model 3130X Genetic Analyzer（Applied Biosystems、Foster City、CA、USA）を使用して実施された。配列特異的プライマと共にｐｈｒｅｄ／ｐｈｒａｐ／ｃｏｎｓｅｄ（University of Washington、Seattle、WA、USA）を用いて配列を組立てた。
【０３０３】
培地
ＮＮＣＹＰ培地は、１リットルあたり５．０ｇのＮＨ4ＮＯ3、０．５ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．３ｇのＣａＣｌ2、２．５ｇのクエン酸、１．０ｇのバクトペプトン（Bacto Peptone）、５．０ｇの酵母抽出物、ＣＯＶＥ微量金属溶液そして、およそ５．４という最終ｐＨを達成するのに充分な量のＫ2ＨＰＯ4で構成されていた。
【０３０４】
ＣＯＶＥ微量金属溶液は、１リットルあたり０．０４ｇのＮａ2Ｂ4Ｏ7・１０Ｈ2Ｏ、０．４ｇのＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、１．２ｇのＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．７ｇのＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ、０．８ｇのＮａ2ＭｏＯ2・２Ｈ2Ｏおよび１０ｇのＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏで構成されていた。
【０３０５】
ＹＰ培地は、１０ｇの酵母抽出物と２０ｇのバクトトリプトン（bacto tripton）で構成されていた。
【０３０６】
セルラーゼ誘発培地は、１リットルあたり２０ｇのセルロース、１０ｇのトウモロコシスティープソリッド、１．４５ｇの（ＮＨ4）2ＳＯ4、２．０８ｇのＫＨ2ＰＯ4、０．２８ｇのＣａＣｌ2、０．４２ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏおよび０．４２ｍｌの微量金属溶液で構成されていた。
【０３０７】
微量金属溶液は、１リットルあたり２１６ｇのＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ、５８ｇのＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、２７ｇのＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ、１０ｇのＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、２．４ｇのＨ3ＢＯ3そして３３６ｇのクエン酸で構成されていた。
【０３０８】
ＳＴＣは、１Ｍのソルビトール、１０ｍＭのＣａＣｌ2、そして１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５で構成されていた。
【０３０９】
ＣＯＶＥ平板は、１リットルあたり３４２ｇのスクロース、１０ｍｌのＣＯＶＥ塩溶液、１０ｍｌの１Ｍアセトアミド、１０ｍｌの１．５ＭＣｓＣｌおよび２５ｇのノーブル寒天（Noble agar）で構成されていた。
【０３１０】
ＣＯＶＥ塩溶液は、１リットルあたり２６ｇのＫＣｌ、２６ｇのＭｇＳＯ4、７６ｇのＫＨ2ＰＯ4そして５０ｍｌのＣＯＶＥ微量金属溶液で構成されていた。
【０３１１】
ＣＯＶＥ２平板は、１リットルあたり３０ｇのスクロース、２０ｍｌのＣＯＶＥ塩溶液、２５ｇのノーブル寒天そして１０ｍｌの１Ｍアセトアミドで構成されていた。
【０３１２】
ＰＤＡ平板は、１リットルあたり３９グラムのポテトデキストロース寒天で構成されていた。
【０３１３】
ＬＢ培地は、１リットルあたり１０ｇのトリプトン、５ｇの酵母抽出物、５ｇの塩化ナトリウムで構成されていた。
【０３１４】
２Ｘ  ＹＴ−Ａｍｐ平板は、１リットルあたり１０ｇのトリプトン、５ｇの酵母抽出物、５ｇの塩化ナトリウムおよび１５ｇのバクト寒天（Bacto Ager）とそれに続く高圧蒸気殺菌後の５０ｍｇ／ｍｌのアンピシリンのろ過滅菌溶液２ｍｌで構成されていた。
【０３１５】
ＭＤＵ２ＢＰ培地は、１リットルあたり４５ｇのマルトース、１ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１ｇのＮａＣｌ、２ｇのＫ2ＨＳＯ4、１２ｇのＫＨ2ＰＯ4、２ｇの尿素、および５００μｌのＡＭＧ微量金属溶液で構成され、ｐＨは５．０に調整され、次に０．２２μｍのろ過ユニットでろ過滅菌された。
【０３１６】
ＡＭＧ微量金属溶液は、１リットルあたり１４．３ｇのＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、２．５ｇのＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、０．５ｇのＮｉＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、１３．８ｇのＦｅＳＯ4・Ｈ2Ｏ、８．５ｇのＭｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏおよび３ｇのクエン酸で構成されていた。
【０３１７】
最少培地平板は、６ｇのＮａＮＯ2、０．５２のＫＣｌ、１．５２ｇのＫＨ2ＰＯ4、１ｍｌのＣＯＶＥ微量金属溶液、２０ｇのノーブル寒天、２０ｍｌの５０％グルコース、２．５ｍｌの２０％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏおよび２０ｍｌのビオチン原液で構成されていた。
【０３１８】
ビオチン原液は、１リットルあたり０．２ｇのビオチンで構成されていた。
【０３１９】
ＳＯＣ培地は、２％のトリプトン、０．５％の酵母抽出物、１０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ2および１０ｍＭのＭｇＳＯ4とそれに続く高圧蒸気滅菌後の２０ｍＭまでのろ過滅菌されたグルコースで構成されていた。
【０３２０】
実施例１：ｐＭＪ０４発現ベクターの構築
以下で示されているプライマ９９３４２９（アンチセンス）および９９３４２８（センス）を用いてTrichoderma reesei ＲｕｔＣ３０ゲノムＤＮＡからTrichoderma reeseiエキソセロビオヒドラーゼ１遺伝子（ｃｂｈ１、ＣＥＬ７Ａ）ターミネータをＰＣＲ増幅することにより発現ベクターｐＭＪ０４を構築した。センスプライマの５’末端にＰａｃ  Ｉ部位をそして３’末端にＳｐｅＩ部位を有するようにアンチセンスプライマを工学処理した。
【０３２１】
プライマ９９３４２９（アンチセンス）：
５’−ＡＡＣＧＴＴＡＡＴＴＡＡＧＧＡＡＴＣＧＴＴＴＴＧＴＧＴＴＴ−３’（配列番号２９）
プライマ９９３４２８（センス）：
５’−ＡＧＴＡＣＴＡＧＴＡＧＣＴＣＣＧＴＧＧＣＧＡＡＡＧＣＣＴＧ−３’（配列番号３０）
【０３２２】
DNEASY（登録商標） Plant Maxi Kit（QIAGEN Inc.、Valencia、CA、USA）を用いて、Trichoderma reesei ＲｕｔＣ３０ゲノムＤＮＡを単離した。
【０３２３】
増幅反応（５０μｌ）は、１倍のThermo Pol Reaction Buffer New England Biolabs、Beverly、MA、USA、０．３ｍＭのｄＮＴＰ、１００ｎｇのTrichoderma reesei ＲｕｔＣ３０ゲノムＤＮＡ、０．３μＭのプライマ９９３４２９、０．３μＭのプライマ９９３４２８、および２単位のＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs、Beverly、MA、USA）で構成されていた。反応を、各々９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、および７２℃で６０秒のサイクル５回とそれに続く、各々９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、７２℃で１２０秒（最終伸張５分）のサイクル２５回にプログラミングしたEPPENDORF（登録商標） MASTERCYCLER（登録商標） 5333（Eppendorf Scientific、Inc.、Westbury、NY、USA内でインキュベートした。４０ｍＭのトリス塩基−２０ｍＭの酢酸ナトリウム−１ｍＭニナトリウムＥＤＴＡ（ＴＡＥ）緩衝液を用いて１．０％のアガロースゲル電気泳動により反応生成物を単離したが、ここでメーカーの指示事項にしたがい、QIAQUICK（登録商標） Gel Extraction Kit（QIAGEN Inc.、Valencia、CA、USA）を用いて２２９ｂｐの生成物バンドをゲルから切除し精製した。
【０３２４】
結果として得たＰＣＲフラグメントをＰａｃ  ＩおよびＳｐｅＩで消化し、Rapid Ligation Kit（Roche、Indianapolis、IN、USA）を用いて同じ制限酵素で消化させたｐＡ／Ｌｏ１（国際公開第０５／０６７５３１号（WO 05/067531））中にライゲートして、ｐＭＪＤ４を生成した（図１）。
【０３２５】
実施例２：ｐＣａＨｊ５６８の構築
ｐＣａＨｊ１７０（米国特許第５，７６３，２５４号（U.S. Patent No. 5,763,254））およびｐＭＴ２１８８からプラスミドｐＣａＨｊ５６８を構築した。プラスミドｐＣａＨｊ１７０は、Humicola insolensエンドグルカナーゼＶ（ＣＥＬ４５Ａ）全長コーディング領域を含む（配列番号３２のアミノ酸をコードする配列番号３１）を含む。以下で示すプライマ１４２７７９および１４２７８０を用いてｐＣａＨｊ４８３（国際公開第９８／００５２９号（WO 98/00529））からｐＵＣ１９複製起点をＰＣＲ増幅することによって、ｐＭＴ２１８８の構築を開始した。プライマ１４２７８０は、ＰＣＲフラグメント内にＢｂｕＩ部位を導入する。
【０３２６】
プライマ１４２７７９：
５’−ＴＴＧＡＡＴＴＧＡＡＡＡＴＡＧＡＴＴＧＡＴＴＴＡＡＡＡＣＴＴＣ−３’（配列番号３３）
プライマ１４２７８０：
５’−ＴＴＧＣＡＴＧＣＧＴＡＡＴＣＡＴＧＧＴＣＡＴＡＧＣ−３’（配列番号３４）
【０３２７】
この増幅のためには、メーカーの指示事項にしたがってEXPAND（登録商標） PCR System（Roche Molecular Biochemicals、Basel、Switzerland）を使用した。ＰＣＲ産物をアガロースゲル上で分離し、１１６０ｂｐのフラグメントをJetquick Gel Extraction Spin Kit（Genomed、Wielandstr、Germany）を用いて単離し精製した。
【０３２８】
ＥＸＰＡＮＤ（登録商標）ＰＣＲシステムを用いて以下で示すプライマ１４０２８８および１４２７７８を使用して、一般的Saccharomyces cerevisiaeクローニングベクターｐＹＥＳ２（Invitrogen、Carlsbad、CA、USA）からＵＲＡ３遺伝子を増幅した。プライマ１４０２８８は、ＰＣＲフラグメント内にＥｃｏ  ＲＩ部位を導入した。
【０３２９】
プライマ１４０２８８：
５’−ＴＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＧＴＡＡＴＡＡＣＴＧＡＴＡＴ−３’（配列番号３５）
プライマ１４２７７８：
５’−ＡＡＡＴＣＡＡＴＣＴＡＴＴＴＴＣＡＡＴＴＣＡＡＴＴＣＡＴＣＡＴＴ−３’（配列番号３６）
【０３３０】
ＰＣＲ産物を、アガロースゲル上で分離し、１１２６ｂｐのフラグメントをJetquick Gel Extraction Spin Kitを用いて単離し精製した。
【０３３１】
混合しオーバーラップスプライシング方法（Hortonら、１９８９年、Gene、第７７号、６１〜６８頁）により以上で示したプライマ１４２７８０および１４０２８８を用いて増幅することにより、２つのフラグメントを融合した。ＰＣＲ産物をアガロースゲル上で分離し、Jetquick Gel Extraction Spin Kitを用いて２２６３ｂｐのフラグメントを単離し精製した。
【０３３２】
結果として得たフラグメントをＥｃｏ  ＲＩおよびＢｂｕ  Ｉで消化し、標準プロトコルを用いて、同じ制限酵素で消化したｐＣａＨｊ４８３の最大フラグメントに対して標準プロトコルを用いてライゲートした。ライゲーション混合物を、Mandel and Higa、１９７０年、J. MoI. Biol.、第４５号、１５４頁の方法によって受容能が付与されたｐｙｒＦ−陰性E. coli菌株ＤＢ６５０７（ＡＴＣＣ３５６７３）へと形質転換した。１リットルあたり１ｇのカザミノ酸、５００μｇのチアミンおよび１０ｍｇのカナマイシンが補足された固体Ｍ９培地（Sambrookら、１９８９年、Molecular Cloning、A Laboratory Manual、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press）上で、形質転換体を選択した。１つの形質転換体からのプラスミドを単離し、これをｐＣａＨｊ５２７と呼称した（図２）。
【０３３３】
ｐＣａＨｊ５２７上に存在するＮＡＺ−ｔｐｉプロモータを、メーカーの指示事項にしたがってＥＸＰＡＮＤ（登録商標）ＰＣＲシステムを用いてＰＣＲによる部位特異的突然変異誘発に付した。ヌクレオチド１３４〜１４４を、以下に示す突然変異誘発を用いてＧＴＡＣＴＡＡＡＡＣＣ（配列番号３７）からＣＣＧＴＴＡＡＡＴＴＴ（配列番号３８）へと転換させた。
【０３３４】
プライマ１４１２２３：
５’−ＧＧＡＴＧＣＴＧＴＴＧＡＣＴＣＣＧＧＡＡＡＴＴＴＡＡＣＧＧＴＴＴＧＧＴＣＴＴＧＣＡＴＣＣＣ−３’（配列番号３９）
【０３３５】
以下に示す突然変異誘発プライマ１４１２２２を用いて、ＡＴＧＣＡＡＴＴＴＡＡＡＣＴ（配列番号４０）からＣＧＧＣＡＡＴＴＴＡＡＣＧＧ（配列番号４１）へとヌクレオチド４２３〜４３６を転換させた。
【０３３６】
プライマ１４１２２２：
５’−ＧＧＴＡＴＴＧＴＣＣＴＧＣＡＧＡＣＧＧＣＡＡＴＴＴＡＡＣＧＧＣＴＴＣＴＧＣＧＡＡＴＣＧＣ−３’（配列番号４２）
結果として得たプラスミドをｐＭＴ２１８８と呼称した（図３）。
【０３３７】
Humicola insolensエンドヌクレアーゼＶコーディング領域を、Ｂａｍ  ＨＩ−Ｓａｌ  ＩフラグメントとしてのｐＣａＨｊ１７０からＢａｍ  ＨＩおよびＸｈｏ  Ｉで消化されたｐＭＴ２１８８へと転送してｐＣａＨｊ５６８を生成した（図４）。プラスミドｐＣａＨｊ５６８は、Humicol insolensエンドグルカナーゼＶ全長コーディング配列に対して作動的に連結された突然変異ＮＡ２−ｔｐｉプロモータを含む。
【０３３８】
実施例３；ｐＭＪ０５の構築
以下に示すプライマＨｉＥＧＶ−ＦおよびＨｉＥＧＶ−Ｒを用いてｐＣａＨｊ５６８から９１５ｂｐのHumicola insolensエンドグルカナーゼＶ全長コーディング領域をＰＣＲ増幅することにより、プラスミドｐＭＪ０５を構築した。
【０３３９】
プライマＨｉＥＧＶ−Ｆ（センス）：
（５’−ＡＡＧＣＴＴＡＡＧＣＡＴＧＣＧＴＴＣＣＴＣＣＣＣＣＣＴＣＣ−３’（配列番号４３））
プライマＨｉＥＧＶ−Ｒ（アンチセンス）：
（５’−ＣＴＧＣＡＧＡＡＴＴＣＴＡＣＡＧＧＣＡＣＴＧＡＴＧＧＴＡＣＣＡＧ−３’（配列番号４４））
【０３４０】
増幅反応（５０μｌ）は、１倍のThermoPol Reaction Buffer（New England Biolabs、Beverly、MA、USA）、０．３ｍＭのｄＮＴＰｓ、１０ｎｇ／μｌのｐＣａＨｊ５６８、０．３μＭのＨｉＥＧＶ−Ｆプライマ、０．３μＭのＨｉＥＧＶ−Ｒプライマおよび２単位のＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs、Beverly、MA、USA）で構成されていた。反応を、各々９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、および７２℃で６０秒のサイクル５回とそれに続く、各々９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、７２℃で１２０秒（最終伸張５分）のサイクル２５回にプログラミングしたEPPENDORF（登録商標） MASTERCYCLER（登録商標） 5333内でインキュベートした。ＴＡＥ緩衝液を用いて１．０％のアガロースゲル電気泳動により反応生成物を単離したが、ここでメーカーの指示事項にしたがいQIAQUICK（登録商標） Gel Extraction Kitを用いて９３７ｂｐの生成物バンドをゲルから切除し、精製した。
【０３４１】
以下のプライマを用いたその後の増幅のための鋳型ＤＮＡとして、９３７ｂｐの精製済みフラグメントを使用した。
プライマＨｉＥＧＶ−Ｒ（アンチセンス）：
５’−ＣＴＧＣＡＧＡＡＴＴＣＴＡＣＡＧＧＣＡＣＴＧＡＴＧＧＴＡＣＣＡＧ−３’（配列番号４５）
プライマＨｉＥＧＶ−Ｆ−オーバーラップ（センス）：
５’−ＡＣＣＧＣＧＧＡＣＴＧＣＧＣＡＴＣＡＴＧＣＧＴＴＣＣＴＣＣＣＣＣＣＴＣＣ−３’（配列番号４６）
【０３４２】
イタリック体のプライマ配列は、Trichoderma reesei セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子（ｃｂｈ１）のプロモータ（国際公開第９１／１７２４３号（WO 91/17243））の１７ｂｐと相同であり、下線付きのプライマ配列はHumicola insolensエンドグルカナーゼＶコーディング領域の２９ｂｐと相同である。プロモータとコーディング配列の間の３６ｂｐのオーバーラップにより、Humicola insolensエンドヌクレアーゼＶコーディング領域を含む９１８ｂｐのフラグメントに対する、Trichoderma reesei ｃｂｈ１プロモータを含む９９４ｂｐのフラグメントの精確な融合が可能となった。
【０３４３】
増幅反応（５０μｌ）は、１倍のThermoPol Reaction Buffer、０．３ｍＭのｄＮＴＰｓ、１μｌの精製済み９３７ｂｐのＰＣＲフラグメント、０．３μＭのＨｉＥＧＶ−Ｆ−オーバーラッププライマ、０．３μＭのＨｉＥＧＶ−Ｒプライマおよび２単位のＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼで構成されていた。反応を、各々９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、および７２℃で６０秒のサイクル５回とそれに続く、各々９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、７２℃で１２０秒（最終伸張５分）のサイクル２５回にプログラミングしたEPPENDORF（登録商標） MASTERCYCLER（登録商標） 5333内でインキュベートした。ＴＡＥ緩衝液を用いて１．０％のアガロースゲル電気泳動により反応生成物を単離したが、ここでメーカーの指示事項にしたがいQIAQUICK（登録商標） Gel Extraction Kitを用いて９４５ｂｐの生成物バンドをゲルから切除し、精製した。
【０３４４】
以下に示すプライマを用いてTrichoderma reesei ＲｕｔＣ３０ゲノムＤＮＡ由来の遺伝子のＡＴＧ開始コドンの上流側９９４ｂｐから延びるTrichoderma reeseiｃｂｈ１プロモータ配列を増幅するために、別のＰＣＲを実施した（５’末端にＳａｌ  Ｉ制限部位を有するようにセンスプライマを工学処理した）。DN easy Plant Maxi Kitを用いて、Trichoderma reesei ＲｕｔＣ３０ゲノムＤＮＡを単離した。
【０３４５】
プライマＴｒＣＢＨＩｐｒｏ−Ｆ（センス）：
５’−ＡＡＡＣＧＴＣＧＡＣＣＧＡＡＴＧＴＡＧＧＡＴＴＧＴＴＡＴＣ−３’（配列番号４７）
プライマＴｒＣＢＨＩｐｒｏ−Ｒ（アンチセンス）：
５’−ＧＡＴＧＣＧＣＡＧＴＣＣＧＣＧＧＴ−３’（配列番号４８）
【０３４６】
増幅反応（５０μｌ）は、１倍のThermoPol Reaction Buffer、０．３ｍＭのｄＮＴＰｓ、１００ｎｇ／μｌのTrichoderma reesei ＲｕｔＣ３０ゲノムＤＮＡ、０．３μＭのＴｒＣＢＨＩｐｒｏ−Ｆプライマ、０．３μＭのＴｉＣＢＨＩｐｒｏ−Ｒプライマおよび２単位のＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼで構成されていた。反応を、各々９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、および７２℃で１２０秒（最終伸張５分）のサイクル３０回にプログラミングしたEPPENDORF（登録商標） MASTERCYCLER（登録商標） 5333内でインキュベートした。ＴＡＥ緩衝液を用いて１．０％のアガロースゲル電気泳動により反応生成物を単離したが、ここでメーカーの指示事項にしたがいQIAQUICK（登録商標） Gel Extraction Kitを用いて９９８ｂｐの生成物バンドをゲルから切除し精製した。
【０３４７】
以下に示すプライマを用いたその後の増幅のための鋳型ＤＮＡとして、精製された９９８ｂｐのフラグメントを使用した。
【０３４８】
プライマＴｒＣＢＨＩｐｒｏ−Ｆ：
５’−ＡＡＡＣＧＴＣＧＡＣＣＧＡＡＴＧＴＡＧＧＡＴＴＧＴＴＡＴＣ−３’（配列番号４９）
プライマＴｒＣＢＨＩｐｒｏ−Ｒ−オーバーラップ：
５’−ＧＧＡＧＧＧＧＧＧＡＧＧＡＡＣＧＣＡＴＧＡＴＧＣＧＡＣＧＴＣＣＧＣＧＧＴ−３’（配列番号５０）
【０３４９】
イタリック体の配列は、Trichoderma reeseiｃｂｈ１のプロモータの１７ｂｐと相同であり、下線付きの配列はHumicola insolensエンドグルカナーゼＶコーディング領域の２９ｂｐと相同である。プロモータとコーディング配列の間の３６ｂｐのオーバーラップによって、Humicola insolensエンドヌクレアーゼ全長Ｖコーディング領域を含む９１８ｂｐのフラグメントに対する、Trichoderma reeseiｃｂｈ１プロモータを含む９９４ｂｐのフラグメントの精確な融合が可能となった。
【０３５０】
増幅反応（５０μｌ）は、１倍のThermoPol Reaction Buffer、０．３ｍＭのｄＮＴＰｓ、１μｌの精製済み９９８ｂｐのＰＣＲフラグメント、０．３μＭのＴｒＣＢＨ１ｐｒｏ−Ｆプライマ、０．３μＭのＴｒＣＨ１ｐｒｏ−Ｒ−オーバーラッププライマおよび２単位のＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼで構成されていた。反応を、各々９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、および７２℃で６０秒のサイクル５回とそれに続く、各々９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、７２℃で１２０秒（最終伸張５分）のサイクル２５回にプログラミングしたEPPENDORF（登録商標） MASTERCYCLER（登録商標） 5333内でインキュベートした。ＴＡＥ緩衝液を用いて１．０％のアガロースゲル電気泳動により反応生成物を単離したが、ここでメーカーの指示事項にしたがいQIAQUICK（登録商標） Gel Extraction Kitを用いて１０１７ｂｐの生成物バンドをゲルから切除し精製した。
【０３５１】
オーバーラッピングＰＣＲを用いて９１８ｂｐのエンドグルカナーゼＶ全長コーディング領域に９９４ｂｐのｃｂｈ１プロモータを精確に融合させるように以下のプライマを用いたその後の増幅のための鋳型ＤＮＡとして、１０１７ｂｐのTrichoderma reeseiｃｂｈ１プロモータＰＣＲフラグメントおよび９４５ｂｐのHumicola insolensエンドグルカナーゼＶ  ＰＣＲフラグメントを使用した。
【０３５２】
プライマＴｒＣＢＨ１ｐｒｏ−Ｆ：
５’−ＡＡＡＣＧＴＣＧＡＣＣＧＡＡＴＧＴＡＧＧＡＴＴＧＴＴＡＴＣ−３’（配列番号５１）
プライマＨｉＥＧＶ−Ｒ：
５’−ＣＴＧＣＡＧＡＡＴＴＣＴＡＣＡＧＧＣＡＣＴＧＡＴＧＧＴＡＣＣＡＧ−３’（配列番号５２）
【０３５３】
増幅反応（５０μｌ）は、１倍のThermoPol Reaction Buffer、０．３ｍＭのｄＮＴＰｓ、０．３μＭのＴｒＣＢＨ１ｐｒｏ−Ｆプライマ、０．３μＭのＨｉＥＧＶ−Ｒプライマおよび２単位のＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼで構成されていた。反応を、各々９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、および７２℃で６０秒のサイクル５回とそれに続く、各々９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、７２℃で１２０秒（最終伸張５分）のサイクル２５回にプログラミングしたEPPENDORF（登録商標） MASTERCYCLER（登録商標） 5333内でインキュベートした。ＴＡＥ緩衝液を用いて１．０％のアガロースゲル電気泳動により反応生成物を単離したが、ここでメーカーの指示事項にしたがいQIAQUICK（登録商標） Gel Extraction Kitを用いて１９２６ｂｐの生成物バンドをゲルから切除し精製した。
【０３５４】
結果として得た１９２６ｂｐのフラグメントを、メーカーのプロトコルにしたがって、ZEROBLUNT（登録商標）TOPO（登録商標） ＰＣＲクローニングキット（Invitrogen、Carlsbad、CA、USA）を用いてpCR（登録商標）-Blunt-ll-TOPO（登録商標） ベクター（Invitrogen、Carlsbad、CA、USA）内にクローニングした。結果として得たプラスミドをNot IおよびＳａｌ  Ｉで消化させ、１９２６ｂｐのフラグメントをQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kitを用いてゲル精製し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Roche、Indianapolis、IN、USA）を用いてｐＭＪ０４中にライゲートし、これを同様に同じ２つの制限酵素で消化してｐＭＪ０５を生成した（図５）。プラスミドｐＭＪ０５は、Humicola insolensエンドグルカナーゼＶ全長コーディング配列に作動的に連結されたTrichoderma reesei セロビオヒドロラーゼＩプロモータおよびターミネータを含む。
【０３５５】
実施例４：ｐＳＭａｉ１３０発現ベクターの構築
Aspergillus oryzaeベータ−グルコシダーゼ全長コーディング配列（ｃＤＮＡ配列については配列番号１５、演繹されたアミノ酸配列については配列番号１６；E. coli  ＤＳＭ１４２４０）のＡＴＧ開始コドンからＴＡＡ停止コドンまでに及ぶ２５８６ｂｐのＤＮＡフラグメントを、以下に示すプライマ９９３４６７（センス）および９９３４５６（アンチセンス）を用いて鋳型としてのｐＪａＬ６６０（国際公開第２００２／０９５０１４号（WO 2002/095014））からＰＣＲにより増幅した。ライゲーションを容易にするためアンチセンスプライマの５’末端で、Ｓｐｅ  Ｉ部位を工学処理した。イタリック体のプライマ配列は、Trichoderma reeseiｃｂｈ１プロモータの２４ｂｐと相同であり、下線付き配列は、Aspergillus oryzaeベータ−グルコシダーゼコーディング領域の２２ｂｐと相同である。
【０３５６】
プライマ９９３４６７：
５’−ＡＴＡＧＴＣＡＡＣＣＧＣＧＧＡＣＴＧＣＧＣＡＴＣＡＴＧＡＡＧＣＴＴＧＧＴＴＧＧＡＴＣＧＡＧＧ−３’（配列番号５３）
プライマ９９３４５６：
５’−ＡＣＴＡＧＴＴＴＡＣＴＧＧＧＣＣＴＴＡＧＧＣＡＧＣＧ−３’（配列番号５４）
【０３５７】
増幅反応（５０μｌ）は、Ｐｆｘ amplification Buffer（Invitrogen、Carlsbad、CA、USA）、０．２５ｍＭのｄＮＴＰｓ、１０ｎｇのｐＪａＬ６６０、６．４μＭのプライマ９９３４６７、３．２μＭのプライマ９９３４５６、１ｍＭのＭｇＣｌ2および２．５単位のＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（Invitrogen、Carlsbad、CA、USA）で構成されていた。反応を、各々９４℃で１分、５５℃で１分、そして７２℃で３分（最終伸張１５分）のサイクル３０回にプログラミングしたEPPENDORF（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）５３３３内でインキュベートした。ＴＡＥ緩衝液を用いて１．０％のアガロースゲル電気泳動により反応生成物を単離したが、ここでメーカーの指示事項にしたがって、QIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kitを用いて、２５８６ｂｐの生成物バンドをゲルから切除し精製した。
【０３５８】
以下に示すプライマ９９３４５３（センス）およびプライマ（アンチセンス）を用いて、遺伝子のＡＴＧ開始コドンの上流側１０００ｂｐから延びるTrichoderma reeseiｃｂｈ１プロモータ配列を増幅するために、別のＰＣＲを実施して、１０００ｂｐのＰＣＲフラグメントを生成した。
【０３５９】
プライマ９９３４５３：
５’−ＧＴＣＧＡＣＴＣＧＡＡＧＣＣＣＧＡＡＴＧＴＡＧＧＡＴ−３’（配列番号５５）
プライマ９９３４６３：
５’−ＣＣＴＣＧＡＴＣＣＡＡＣＣＡＡＧＣＺＺＣＡＴＧＡＴＧＣＧＣＡＧＴＣＣＧＣＧＧＴＴＧＡＣＴＡ−３’（配列番号５６）
【０３６０】
イタリック体のプライマ配列は、Trichoderma reeseiｃｂｈ１プロモータの２４ｂｐと相同であり、下線付きプライマ配列はAspergillus oryzaeベータ−グルコシダーゼ全長コーディング領域の２２ｂｐと相同である。プロモータとコーディング配列の間の４６ｂｐのオーバーラップにより、Aspergillus oryzaeベータ−グルコシダーゼコーディング領域を含む２５８６ｂｐフラグメントに対するTrichoderma reeseiｃｂｈ１プロモータを含む１０００ｂｐのフラグメントの精確な融合が可能になった。
【０３６１】
増幅反応（５０μｌ）は、Ｐｆｘ amplification Buffer、０．２５ｍＭのｄＮＴＰｓ、１００ｎｇのTrichoderma reesei ＲｕｔＣ３０ゲノムＤＮＡ、６．４μＭのプライマ９９３４５３、３．２μＭのプライマ９９３４６３、１ｍＭのＭｇＣｌ2および２．５単位のＰｆｘＤＮＡポリメラーゼで構成されていた。反応を、各々９４℃で１分、５５℃で１分、そして７２℃で３分（最終伸張１５分）のサイクル３０回にプログラミングしたEPPENDORF（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）５３３３内でインキュベートした。ＴＡＥ緩衝液を用いて１．０％のアガロースゲル電気泳動により反応生成物を単離したが、ここでメーカーの指示事項にしたがって、QIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kitを用いて、１０００ｂｐの生成物バンドをゲルから切除し精製した。
【０３６２】
以上で示されたプライマ９９３４５３（センス）およびプライマ９９３４５６（アンチセンス）を用いるオーバーラッピングＰＣＲによるその後の増幅のための鋳型ＤＮＡとして、精製済みフラグメントを使用して、Aspergillus oryzaeベータ−グルコシダーゼ全長コーディング領域を含む２５８６ｂｐのフラグメントに対してTrichoderma reeseiｃｂｈ１プロモータを含む１０００ｂｐのフラグメントを精確に融合させた。
【０３６３】
増幅反応（５０μｌ）は、Ｐｆｘ amplification Buffer、０．２５ｍＭのｄＮＴＰｓ、６．４μＭのプライマ９９３３５３、３．２μＭのプライマ９９４５６、１ｍＭのＭｇＣｌ2および２．５単位のＰｆｘＤＮＡポリメラーゼで構成されていた。反応を、各々９４℃で１分、６０℃で１分、そして７２℃で４分（最終伸張１５分）のサイクル３０回にプログラミングしたEPPENDORF（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）５３３３内でインキュベートした。
【０３６４】
結果として得られた３５８６ｂｐのフラグメントをＳａｌ  ＩおよびＳｐｅ  Ｉで消化し、同じ２つの制限酵素で消化させたｐＭＪ０４中にライゲートして、ｐＳＭａｉ１３０を生成した（図６）。プラスミドｐＳＭａｉ１３０は、Aspergillus oryzae天然ベータ−グルコシダーゼシグナル配列およびコーディング配列（すなわち全長Aspergillus oryzaeベータ−グルコシダーゼコーディング配列）に対して作動的に連結されたTrichoderma reesei セロビオヒドロラーゼ１遺伝子プロモータおよびターミネータを含む。
【０３６５】
実施例５：ｐＳＭａｉ１３５の構築
Ｌｙｓ−２０からＴＡＡ停止コドンまでのAspergillus oryzaeベータ−グルコシダーゼ成熟コーディング領域（マイナス天然シグナル配列、図７参照；シグナルペプチドについては配列番号５７および５８、およびそのコーディング配列）を、以下で示すプライマ９９３７２８（センス）およびプライマ９９３７２７（アンチセンス）を用いて鋳型としてのｐＪａＬ６６０からＰＣＲ増幅した。
【０３６６】
プライマ９９３７２８：
５’−ＴＧＣＣＧＧＴＧＴＴＧＧＣＣＣＴＴＧＣＣＡＡＧＧＡＴＧＡＴＣＴＣＧＣＧＴＡＣＴＣＣＣ−３’（配列番号５９）
プライマ９９３７２７：
５’−ＧＡＣＴＡＧＴＣＴＴＡＣＴＧＧＧＣＣＴＴＡＧＧＣＡＧＣＧ−３’（配列番号６０）
【０３６７】
イタリック体の配列は、Humicola insolensエンドグルカナーゼＶシグナル配列の２０ｂｐと相同であり、下線付きの配列は、Aspergillus oryzaeベータ−グルコシダーゼコーディング領域の２２ｂｐと相同である。Ｓｐｅ  Ｉ部位を、アンチセンスプライマの５’末端へと工学処理した。
【０３６８】
増幅反応（５０μｌ）は、Ｐｆｘ amplification Buffer、０．２５ｍＭのｄＮＴＰｓ、１０ｎｇ／μｌのｐＪａＬ６６０、６．４μＭのプライマ９９３７２８、３．２μＭのプライマ９９３７２７、１ｍＭのＭｇＣｌ2および２．５単位のＰｆｘＤＮＡポリメラーゼで構成されていた。反応を、各々９４℃で１分、５５℃で１分、そして７２℃で３分（最終伸張１５分）のサイクル３０回にプログラミングしたEPPENDORF（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）５３３３内でインキュベートした。ＴＡＥ緩衝液を用いて１．０％のアガロースゲル電気泳動により反応生成物を単離したが、ここでメーカーの指示事項にしたがって、QIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kitを用いて、２５２３ｂｐの生成物バンドをゲルから切除し精製した。
【０３６９】
以下に示すプライマ９９３７２４（センス）およびプライマ９９３７２９（アンチセンス）を用いて、Trichoderma reeseiｃｂｈ１プロモータの１０００ｂｐおよびHumicola insolensエンドグルカナーゼＶシグナル配列の６３ｂｐ（ＡＴＧ開始コドン〜Ａｌａ−２１、図８、配列番号６１および６２）を増幅した。
【０３７０】
プライマ９９３７２４：
５’−ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＣＧＡＡＴＧＴＡＧＧＡＴＴＧＴＴＡＴＣＣ−３’（配列番号６３）
プライマ９９３７２９：
５’−ＧＧＧＡＧＴＡＣＧＣＧＡＧＡＴＣＡＴＣＣＴＴＧＧＣＡＡＧＧＧＣＣＡＡＣＡＣＣＧＧＣＡ−３’（配列番号６４）
【０３７１】
イタリック体のプライマ配列は、Humicola insolensエンドグルカナーゼＶシグナル配列の２０ｂｐと相同であり、下線付きプライマ配列は、Aspergillus oryzaeベータ−グルコシダーゼコーディング領域の２２ｂｐと相同である。
【０３７２】
ｃｂｈ１プロモータの制御下のHumicola insolensエンドグルカナーゼＶコーディング領域を含むプラスミドｐＭＪ０５を鋳型として用いて、Trichoderma reeseiｃｂｈ１プロモータおよびHumicola insolensエンドグルカナーゼＶシグナル配列フラグメントを含む１０６３ｂｐのフラグメントを生成した。Trichoderma reeseiｃｂｈ１プロモータおよびHumicola insolensエンドグルカナーゼＶシグナル配列およびAspergillus oryzaeベータ−グルコシダーゼ成熟コーディング配列が４２ｂｐのオーバーラップを共有して、２５２３ｂｐのAspergillus oryzaeベータ−グルコシダーゼコーディング領域のＡＴＧ開始コドンとプロモータの間の完全な連結を提供した。
【０３７３】
増幅反応（５０μｌ）は、Ｐｆｘ amplification Buffer、０．２５ｍＭのｄＮＴＰｓ、１０ｎｇ／μｌのｐＭＪ０５、６．４μＭのプライマ９９３７２８、３．２μＭのプライマ９９３７２７、１ｍＭのＭｇＣｌ2および２．５単位のＰｆｘＤＮＡポリメラーゼで構成されていた。反応を、各々９４℃で１分、６０℃で１分、そして７２℃で４分（最終伸張１５分）のサイクル３０回にプログラミングしたEPPENDORF（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）５３３３内でインキュベートした。ＴＡＥ緩衝液を用いて１．０％のアガロースゲル電気泳動により反応生成物を単離したが、ここでメーカーの指示事項にしたがって、QIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kitを用いて、１０６３ｂｐの生成物バンドをゲルから切除し精製した。
【０３７４】
オーバーラッピングＰＣＲによりAspergillus oryzaeベータ−グルコシダーゼ成熟コーディング領域枠を含む２５２３ｂｐのフラグメントに対して、Trichoderma reeseiｃｂｈ  ｆプロモータおよびHumicola insolensエンドグルカナーゼＶシグナル配列を含む１０６３ｂｐのフラグメントを精確に融合させるため、上述のプライマ９９３７２４（センス）およびプライマ９９３７２７（アンチセンス）を用いる増幅のための鋳型として、精製済みオーバーラッピングフラグメントを使用した。
【０３７５】
増幅反応（５０μｌ）は、Ｐｆｘ amplification Buffer、０．２５ｍＭのｄＮＴＰｓ、６．４μＭのプライマ９９３７２４、３．２μＭのプライマ９９３７２７、１ｍＭのＭｇＣｌ2および２．５単位のＰｆｘＤＮＡポリメラーゼで構成されていた。反応を、各々９４℃で１分、６０℃で１分、そして７２℃で４分（最終伸張１５分）のサイクル３０回にプログラミングしたEPPENDORF（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）５３３３内でインキュベートした。ＴＡＥ緩衝液を用いて１．０％のアガロースゲル電気泳動により反応生成物を単離したが、ここでメーカーの指示事項にしたがって、QIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kitを用いて、３５９１ｂｐの生成物バンドをゲルから切除し精製した。
【０３７６】
結果として得られた３５９１ｂｐのフラグメントをＳａｌ１およびＳｐｅ１で消化し、同じ制限酵素で消化させたｐＭＪ０４中にライゲートして、ｐＳＭａｉ１３５を生成した（図９）。プラスミドｐＳＭａｉ１３５は、Humicola insolensエンドグルカナーゼＶシグナル配列およびAspergillus oryzaeベータ−グルコシダーゼ成熟コーディング配列に対して作動的に連結されたTrichoderma reesei セロビオヒドロラーゼ１遺伝子プロモータおよびターミネータを含む。
【０３７７】
実施例６：Humicola insolensエンドグルカナーゼＶ分泌シグナルを用いたAspergillus oryzaeベータ−グルコシダーゼの発現
Humicola insolensエンドグルカナーゼＶ分泌シグナルに連結された成熟Aspergillus oryzaeベータ−グルコシダーゼをコードするプラスミドｐＳＭａｉ１３５（図８）を、ＰＥＧ媒介形質転換により、Trichoderma reesei ＲｕｔＣ３０内に導入した（Penttilaら、１９８７年、Gene、第６１号、１５５〜１６４頁）。プラスミドは、形質転換体が唯一の窒素源としてアセトアミド上で成長できるようにするためAspergillus nidulans ａｍｄＳ遺伝子を含んでいた。
【０３７８】
Trichoderma reesei ＲｕｔＣ３０を、２％（ｗ／ｖ）のグルコースおよび１０ｍＭのウリジンで補足されたＹＰ培地２５ｍｌ中で１７時間、２７℃および９０ｒｐｍで培養した。Vacuum Driven Disposable Filtration System（Millipore、Bedford、MA、USA）を用いたろ過により菌糸を収集し、脱イオン水で２回、１．２Ｍのソルビトールで２回洗浄した。１ｍｌあたり１５ｍｇのGLUCANEX（登録商標）（Novozymes A/S、Bagsvaerd、Denmark）と１ｍｌあたり０．３６単位のキチナーゼ（Sigma Chemical Co.、St. Louis、MO、USA）を含む１．２Ｍのソルビトール２０ｍｌ中に洗浄済み菌糸を懸濁させ、９０ｒｐｍで穏やかに振とうしながら３４℃で１５〜２５分間インキュベートすることにより、プロトプラストを生成した。４００×ｇで７分間遠心分離することによってプロトプラストを収集し、低温１．２Ｍソルビトールで２回洗浄した。血球計数器を用いてプロトプラストを計数し、１ｍｌあたり１×１０6個のプロトプラストという最終濃度までＳＴＣ中で再懸濁させた。余剰のプロトプラストをCryo１℃Freezing Container（Nalgene、Rochester、NY、USA）内で−８０℃で貯蔵した。
【０３７９】
ＰｍｅＩで消化されたおよそ７μｇのｐＳＭａｉ１３５を１００μｌのプロトプラスト溶液に添加し、穏やかに混合し、その後２６０μｌのＰＥＧ緩衝液を加えて混合し、３０分間室温でインキュベートし、その後ＳＴＣ（３ｍｌ）を添加し、混合し、Aspergillus nidulans ａｍｄＳ選択を用いてＣＯＶＥ平板上に形質転換溶液を平板固定した。平板を５〜７日間２８℃でインキュベートした。形質転換体をＣＯＶＥ２平板上に二次培養した。
【０３８０】
ｐＳＭａｉ１３５で得られたＳＭＡ１３５と呼称された６７の形質転換体を、アセトアミドを含む新鮮な平板上に二次培養し、２８℃で７日間胞子形成させた。
【０３８１】
形質転換体の胞子を接続したｐＨ６．０のセルラーゼ誘発培地２５ｍｌが入った１２５ｍｌ入りのバッフル付き振とうフラスコの中で６７個のＳＭＡ１３５Trichoderma reesei形質転換体を培養し、７日間２８℃、２００ｒｐｍでインキュベートした。対照としてTrichoderma reesei ＲｕｔＣ３０を走らせた。培養ブロス試料を７日目に除去した。微量遠心機の中で５分間１５，７００×ｇで各培養ブロス１ｍｌを遠心分離し、上清を新しい管に移した。酵素検定まで４℃で試料を貯蔵した。以下で記述する通り、基質としてｐ−ニトロフェニル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシドを用いて、ベータ−グルコシダーゼ活性について上清を検定した。
【０３８２】
ｐＨ５．０の５０ｍＭのコハク酸エステル中で基質としての０．５ｍｇ／ｍｌのｐ−ニトロフェニル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド２００μｌにおいて、ｐＨ５．０の５０ｍＭのコハク酸エステル中に１：１０の割合で希釈させた培養上清の２５μｌアリコートを用いて、周囲温度でベータ−グルコシダーゼ活性を決定した。１５分のインキュベーションの後、１００μｌの１Ｍトリス−ＨＣｌｐＨ８．０を添加して反応を停止させ、４０５ｎｍで分光光度法によって吸光度を読み取った。ベータ−グルコシダーゼ活性１単位は、ｐＨ５．０、周囲温度で１リットル１分あたり１μmolのｐ−ニトロフェニルの産生に対応していた。Aspergillus nigerベータ−グルコシダーゼ（NOVOZYM TM188、Novozymes A/S、Bagsvaerd、Denmark）を酵素標準として使用した。
【０３８３】
数多くのＳＭＡ１３５形質転換体が、Trichoderma reesei ＲｕｔＣ３０のものよりも数倍高いベータ−グルコシダーゼ活性を生成した。形質転換体ＳＭＡ１３５−０４は、最高のベータ−グルコシダーゼ活性を生成した。
【０３８４】
CRITERION（登録商標）System（Bio-Rad、Hercules、CA、USA）でCRITERION（登録商標）トリス−ＨＣｌ（５％分解）ゲル（Bio-Rad、Hercules、CA、USA）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。２倍濃度のLaemmli Sample Buffer（Bio-Rad、Hercules、CA、USA）中に５μｌの７日目の上清（上述参照）を懸濁させ、５％のベータ−メルカプトエタノールの存在下で３分間沸とうさせた。ポリアクリルアミドゲル上に上清試料を負荷し、ランニングバッファ（Bio-Rad、Hercules、CA、USA）として１倍のトリス／グリシン／ＳＤＳを用いて電気泳動に付した。結果として得られたゲルをBIO-SAFE（登録商標）Coomassie stain（Bio-Rad、Hercules、CA、USA）を用いて染色した。
【０３８５】
合計で、３８のうち２６のTrichoderma reeseiＳＭＡ１３５形質転換体が、対照としてのTrichoderma reesei ＲｕｔＣ３０中には見られなかったおよそ１１０ｋＤａのタンパク質を産生した。形質転換体Trichoderma reeseiＳＭＡ１３５−０４が最高レベルのベータ−グルコシダーゼを産生した。
【０３８６】
実施例７：発現ベクターｐＳＭａｉ１４０の構築
Ｎｃｏ  Ｉを用いて、Aspergillus oryzaeベータ−グルコシダーゼ変異体ＢＧ４１全長コーディング領域（配列番号２６のアミノ酸配列をコードする配列番号２５）を担持するプラスミドｐＳＡＴｅ１１１ＢＧ４１（国際公開第０４／０９９２２８号（WO 04/099228））を消化することによって、発現ベクターｐＳＭａｉ１４０を構築した。結果として得た１２４３ｂｐのフラグメントを、ＴＡＥ緩衝液を用いる１．０％のアガロースゲル電気泳動法によって単離し、メーカーの指示事項にしたがってQIAQUICK（登録商標） Gel Extraction Kitを用いて精製した。
【０３８７】
ＮｃｏＩで発現ベクターｐＳＭａｉ１３５を消化し、ＴＡＥ緩衝液を用いて、１．０％のアガロースゲル電気泳動により８２８６ｂｐのフラグメントを単離し、メーカーの指示事項にしたがって、QIAQUICK（登録商標） Gel Extraction Kitを用いて精製した。１２４３ｂｐのＮｃｏＩで消化されたAspergillus oryzaeベータ−グルコシダーゼ変異体ＢＧ４１フラグメントを次に、メーカーのプロトコルにしたがってＴ４ＤＮＡリガーゼ（Roche、Indianapolis、IN、USA）を用いて８２８６ｂｐのベクターフラグメントにライゲートして、発現ベクターｐＳＭａｉ１４０を作り上げた（図１０）。プラスミドｐＳＭａｉ１４０は、Humicola insolensエンドグルカナーゼＶシグナル配列およびAspergillus oryzaeベータ−グルコシダーゼ変異体成熟コーディング配列に対して作動的に連結されたTrichoderma reesei セロビオヒドロラーゼＩ（ＣＥＬ７Ａ）遺伝子プロモータおよびターミネータを含む。
【０３８８】
実施例８：ｐＳＭａｉ１４０を用いたTrichoderma reesei ＲｕｔＣ３０の形質転換
プラスミドｐＳＭａｉ１４０をＰｍｅＩで直鎖化し、実施例６で記述されている通りTrichoderma reesei ＲｕｔＣ３０菌株へと形質転換させた。合計１００の形質転換体を４回の独立した形質転換実験から得、その全てを、振とうフラスコ内でセルロース誘発培地上で培養し、実施例６中で記述した通り形質転換体の培地からベータ−グルコシダーゼ活性を測定した。数多くのTrichoderma reeseiＳＭＡ１４０形質転換体がTrichoderma reesei ＲｕｔＣ３０のものより数倍高いベータ−グルコシダーゼ活性を示した。
【０３８９】
培地中のAspergillus oryzaeベータ−グルコシダーゼ変異体ＢＧ４１タンパク質の存在を、実施例６の中で記述されている通りのＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動および酵素活性が分析された同じ１３個の培養上清からのクーマシー染色によって検出した。高いβ−グルコシダーゼ活性を有する１３の形質転換体は全て、同様に、変動する収量でおよそ１１０ＫＤのAspergillus oryzaeベータ−グルコシダーゼ変異体ＢＧ４１を発現した。
【０３９０】
ベータ−グルコシダーゼ活性検定およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって評価されるように、最高のベータ−グルコシダーゼ変異体を発現する形質転換体を、Trichoderma reeseiＳＭＡ１４０−４３と呼称した。
【０３９１】
実施例９：発現ベクターｐＳａＭｅ−Ｆ１の構築
Trichoderma reesei セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子プロモータの２０９ｂｐおよびHumicola insolensエンドグルカナーゼＶ遺伝子のコア領域（配列番号３２のアミノ酸１〜２３４をコードする配列番号３１のヌクレオチド１〜７０２；国際公開第９１／１７２４３号（WO 91/17243））を含むＤＮＡフラグメントを、鋳型としてのｐＭＪ０５そして以下に示したプライマを用いてＰＣＲ増幅させた。
【０３９２】
プライマ９９５１０３
５’−ｃｃｃａａｇｃｔｔａｇｃｃａａｇａａｃａ−３’（配列番号６５）
プライマ９９５１３７：
５’−ｇｇｇｇｇａｇｇａａｃｇｃａｔｇｇｇａｔｃｔｇｇａｃｇｇｃ−３’（配列番号６６）
【０３９３】
増幅反応（５０μｌ）は、１倍のＰｆｘ amplification Buffer、１０ｍＭのｄＮＴＰ、５０ｍＭのＭｇＳＯ4、１０ｎｇ／μｌのｐＭＪ０５、５０ピコモルの９９５１０３プライマ、５０ピコモルの９９５１３７プライマそして２単位のＰｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼで構成されていた。反応を、各々９４℃で３０秒、５５℃で３０秒そして７２℃で６０秒（最終伸張３分）のサイクル３０回にプログラミングしたEPPENDORF（登録商標） MASTERCYCLER（登録商標）５３３３内でインキュベートした。
【０３９４】
ＴＡＥ緩衝液を用いて１．０％のアガロースゲル電気泳動により反応生成物を単離したが、ここでメーカーの指示事項にしたがって、QIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kitを用いて、９１１ｂｐの生成物バンドをゲルから切除し精製した。
【０３９５】
Aspergillus oryzaeベータ−グルコシダーゼ変異体ＢＧ４１遺伝子の８０６ｂｐを含むＤＮＡフラグメントを、鋳型としてのｐＳＭａｉ１４０そして以下に示したプライマを用いてＰＣＲ増幅させた。
【０３９６】
プライマ９９５１３３
５’−ｇｃｃｇｔｃｃａｇａｔｃｃｃｃａｔｇｃｇｔｔｃｃｔｃｃｃｃｃ−３’（配列番号６７）
プライマ９９５１１１：
５’−ｃｃａａｇｃｔｔｇｔｔｃａｇａｇｔｔｔｃ−３’（配列番号６８）
【０３９７】
増幅反応（５０μｌ）は、１倍のＰｆｘ amplification Buffer、１０ｍＭのｄＮＴＰ、５０ｍＭのＭｇＳＯ4、１００ｎｇのｐＳＭａｉ１４０、５０ピコモルの９９５１３３プライマ、５０ピコモルの９９５１１１プライマそして２単位のＰｆｘＤＮＡポリメラーゼで構成されていた。反応を、各々９４℃で３０秒、５５℃で３０秒そして７２℃で１２０秒（最終伸張３分）のサイクル３０回にプログラミングしたEPPENDORF（登録商標） MASTERCYCLER（登録商標）５３３３内でインキュベートした。
【０３９８】
ＴＡＥ緩衝液を用いて１．０％のアガロースゲル電気泳動により反応生成物を単離したが、ここでメーカーの指示事項にしたがって、QIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kitを用いて、８０６ｂｐの生成物バンドをゲルから切除し精製した。
【０３９９】
その後上述の２つのＰＣＲフラグメントをオーバーラッピングＰＣＲに付した。上述のプライマ９９５１０３（センス）およびプライマ９９５１１１（アンチセンス）を用いた増幅のための鋳型として、精製済みオーバーラッピングフラグメントを使用して、オーバーラッピングＰＣＲによりAspergillus oryzaeベータ−グルコシダーゼ変異体ＢＧ４１コーディング領域の一部分を含む８０６ｂｐのフラグメントに対し、Trichoderma reesei セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子プロモータの２０９ｂｐおよびHumicola insolensエンドグルカナーゼＶコア配列を含む７０２ｂｐのフラグメントを精確に融合させた。
【０４００】
増幅反応（５０μｌ）は、１倍のＰｆｘ amplification Buffer、１０ｍＭのｄＮＴＰ、５０ｍＭのＭｇＳＯ4、２．５μｌの各フラグメント（２０ｎｇ／μｌ）、５０ピコモルの９９５１０３プライマ、５０ピコモルの９９５１１１プライマそして２単位の高忠実度ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼで構成されていた。反応を、９５℃で３分間の初期変性とそれに続く各々１分の変性、６０℃で１分のアニーリングそして７２℃で３分の伸張のサイクル３０回にプログラミングしたEPPENDORF（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）５３３３内でインキュベートした。
【０４０１】
ＴＡＥ緩衝液を用いて１．０％のアガロースゲル電気泳動により反応生成物を単離したが、ここでメーカーの指示事項にしたがって、QIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kitを用いて、１．７ｋｂの生成物バンドをゲルから切除し精製した。
【０４０２】
１．７ｋｂのフラグメントを、メーカーの指示事項にしたがって、ｐＣＲ（登録商標）４Bluntベクター（Invitrogen、Carlsbad、CA、USA）中にライゲートした。次に、構成体を、メーカーの高速化学形質転換手順にしたがってONESHOT（登録商標）TOP10 Chemically Competent E. coli細胞（Invitrogen、Carlsbad、CA、USA）へと形質転換した。プラスミド単離およびＨｉｎｄＩＩＩでの消化によりコロニーを選択し分析し、１．７ｋｂのオーバーラッピングＰＣＲフラグメントを放出した。
【０４０３】
プラスミドｐＳＭａｉ１４０を同様にＨｉｎｄＩＩＩで消化してプラスミドを直鎖化した。消化した両方のフラグメントを、メーカーの指示事項にしたがってRapid DNA Ligation Kitを用いたライゲーション反応の中で組合わせて、ｐＳａＭｅ−Ｆ１を生成した（図１１）。
【０４０４】
ライゲーション産物を用いて、E. coli XL 1-Blue Subcloning-Grade Competent Cells（Stratagene、La Jolla、CA、USA）を形質転換した。形質転換されたE.coliから精製したプラスミドからのTrichoderma reesei セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子プロモータ、Humicola insolensエンドグルカナーゼＶシグナル配列、Humicola insolensエンドグルカナーゼＶコア、Humicola insolensエンドグルカナーゼＶシグナル配列、Aspergillus oryzaeベータ−グルコシダーゼ変異体ＢＧ４１、およびTrichoderma reesei セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子ターミネータ配列のＤＮＡ配列決定によって、構成体の同一性を確認した。組換え型プラスミドを含む１つのクローンをｐＳａＭｅ−Ｆ１と呼称した。プラスミドｐＳａＭｅ−Ｆ１は、Trichoderma reesei セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子プロモータおよびターミネータおよびHumicola insolensエンドグルカナーゼＶコアペプチドに直接連結されたHumicola insolensエンドグルカナーゼＶシグナルペプチド配列を含み、これらは、Aspergillus oryzaeベータ−グルコシダーゼ変異体ＢＧ４１成熟コーディング配列に対し直接連結されているHumicola insolensエンドグルカナーゼＶシグナルペプチドに直接融合される。Aspergillus oryzaeベータ−グルコシダーゼ変異体ＢＧ融合タンパク質のＤＮＡ配列および演繹されたアミノ酸配列は、図１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、および１２Ｄに示されている（それぞれ配列番号２５および２６）。
【０４０５】
実施例１０：ｐＳａＭｅ−Ｆ１でのTrichoderma reesei ＲｕｔＣ３０の形質転換
２％のグルコースおよび１０ｍＭのウリジンで補足された２５ｍｌのＹＰ培地を含む振とうフラスコに、Trichoderma reesei ＲｕｔＣ３０の５×１０7個の胞子を接種した。９０ｒｐｍ、２７℃で一晩およそ１６時間インキュベートした後、Vaccum Driver Disposable Filtration Systemを用いて菌糸を収集した。１００ｍｌの脱イオン水中で２回、１．２Ｍのソルビトール中で２回、菌子を洗浄した。実施例８で記述されているようにプロトプラストを生成した。
【０４０６】
ＰｍｅＩで直鎖化されたｐＳａＭｅ−Ｆ１  ＤＮＡ２マイクログラム、１００μｌのTrichoderma reesei ＲｕｔＣ３０プロトプラストおよび５０％のＰＥＧ（４０００）を混合し、室温で３０分間インキュベートした。その後３ｍｌのＳＴＣを添加し、１０ｍＭのウリジンを補足したＣＯＶＥ平板上に中味を注ぎ込んだ。その後、平板を２８℃でインキュベートした。６日目までに形質転換体が出現し始め、これをＣＯＶＥ２平板に採取して２８℃で６日間成長させた。２２個のTrichoderma reesei形質転換体を回収した。
【０４０７】
振とうフラスコ中のセルラーゼ誘発培地上で形質転換体を培養し、実施例６で記述した通りベータ−グルコシダーゼ活性を測定した。数多くのｐＳａＭｅ−Ｆ１形質転換体がベータ−グルコシダーゼ活性を生成した。Trichoderma reeseiＳａＭｅＦ１−９と呼称した１つの形質転換体が最大量のベータ−グルコシダーゼを産生し、Aspergillus oryzaeベータ−グルコシダーゼ変異体を発現する菌株の活性の２倍の活性を有していた（実施例９）。
【０４０８】
Beguin、１９８３年、Analytical Biochem.、第１３１号（２）、３３３〜３３６頁にしたがってカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）オーバーレイ検定を用いてエンドグルカナーゼ活性を検定した。ブロス試料のうちの５つ（最高のベータ−グルコシダーゼ活性を有するもの）からの総タンパク質５μｇを、Native Sample Buffer（Bio-Rad、Hercules、CA、USA）中で希釈させ、１０倍のトリス／グリシンランニングバッファ（Bio-Rad、Hercules、CA、USA）を用いてCRITERION（登録商標）８〜１６％トリス−ＨＣｌゲル（Bio-Rad、Hercules、CA、USA）上を走らせ、次に、１％のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を含む平板の上面にゲルを置いた。３７℃で一時間インキュベートした後、ゲルを２０分間０．１％のCongo Redで染色した。その後、１ＭのＮａＣｌを用いて平板を脱染して、エンドグルカナーゼ活性を表わす透明化領域を同定した。１１０ｋＤａ前後の上部ゾーンと２５ｋＤａ前後の下部ゾーンという２つの透明化ゾーンが目に見えた。Humicola insolensエンドグルカナーゼＶおよびAspergillus oryzaeベータ−グルコシダーゼ変異体ＢＧ４１融合の予想されたタンパク質サイズは、２つのタンパク質が分割されず単一ポリペプチドとしてとどまっている場合、１１８ｋＤａであり；個々のエンドグルカナーゼＶコアドメインおよびベータ−グルコシダーゼのグリコシル化は、一次配列から予測されるものよりも高いｍｗでの個々のタンパク質の移動を導く。２個のタンパク質が分割された場合には、Humicola insolensエンドグルカナーゼＶコアドメインについての予測されたサイズは２４ｋＤａであり、Aspergillus oryzaeベータ−グルコシダーゼ変異体ＢＧ４１については９４ｋＤａである。１１０ｋＤａで透明化ゾーンが存在したことから、この結果は、最低限、エンドグルカナーゼとベータ−グルコシダーゼの融合タンパク質の集合が単一の大型タンパク質として無傷のままとどまるということを表わしていた。下部透明化ゾーンは、恐らく、内因性エンドグルカナーゼ活性を表わし、さらにAspergillus oryzaeベータ−グルコシダーゼからのHumicola insolensエンドグルカナーゼＶコアドメインの部分的分割の結果として得られると思われる。
【０４０９】
結果は、Humicola insolensエンドグルカナーゼＶコアが、たとえAspergillus oryzeaeベータ−グルコシダーゼに連結されたとしても活性であるということを実証していた。さらに、ベータ−グルコシダーゼ活性の増加は、非融合ベータ−グルコシダーゼの分泌効率に比べて増大したタンパク質の分泌の結果もたらされるように思われた。Aspergillus oryzeaeベータ−グルコシダーゼ変異体ＢＧ４１配列を効率良く分泌されたHumicola insolensエンドグルカナーゼＶコアに連結することによって、より多くのベータ−グルコシダーゼが分泌された。
【０４１０】
実施例１１：ベクターｐＳａＭｅ−ＦＸの構築
ｐＳａＭｅ−Ｆ１を修飾することによってプラスミドｐＳａＭｅ−ＦＸを構築した。プラスミドｐＳａＭｅＦ１をＢｓｔＺ１７およびＥｃｏ  ＲＩで消化して、ベータ−グルコシダーゼ変異体ＢＧ４１コーディング配列を含む１ｋｂのフラグメントおよびプラスミドの残りを含む９．２ｋｂのフラグメントを生成させた。ＴＡＥ緩衝液を使用した１．０％のアガロースゲル電気泳動によってフラグメントを分離し、メーカーの指示事項にしたがいQIAQUICK（登録商標） Gel Extraction Kitを用いて９．２ｋｂのフラグメントを切除し精製した。プラスミドｐＳＭａｉ１３５を同様にＢｓｔＺ１７およびでＥｃｏ  ＲＩで消化して、Aspergillus oryzeaeベータ−グルコシダーゼ変異体ＢＧ４１コーディング配列と相同な塩基を含む１ｋｂのフラグメントとプラスミドの残りを含む８．５ｋｂのフラグメントを生成させた。１ｋｂのフラグメントを上述の通りに単離し精製した。
【０４１１】
メーカーの指示事項にしたがいRapid DNA Ligation Kitを用いたライゲーション反応の中で９．２ｋｂおよび１ｋｂのフラグメントを組合せてｐＳａＭｅ−ＦＸを精製し、これは変異体成熟コーディング配列ではなくむしろ野生型ベータ−グルコシダーゼ成熟コーディング配列を含むという点を除いてｐＳａＭｅ−Ｆ１と同一であった。
【０４１２】
ライゲーション産物を用いてE. coli SURE（登録商標） Competent Cells（Stratagene、La Jolla、A、USA）を形質転換した。Trichoderma reesei セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子プロモータ、Humicola insolensエンドグルカナーゼＶシグナル配列、Humicola insolensエンドグルカナーゼＶコア配列、Humicola insolensエンドグルカナーゼＶシグナル配列、Aspergillus oryzaeベータ−グルコシダーゼ成熟コーディング配列、およびTrichoderma reesei セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子ターミネータ配列の存在を実証する形質転換されたE.coliから精製したプラスミドのＤＮＡ配列決定によって、構成体の同一性を確認した。組換え型プラスミドを含む１つのクローンをｐＳａＭｅ−ＦＸと呼称した（図１３）。Aspergillus oryzaeベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質のＤＮＡ配列および演繹されたアミノ酸配列は、図１４Ａ、１４Ｂ、１４Ｃ、および１４Ｄに示されている（それぞれ配列番号２７および２８）。
【０４１３】
実施例１２：Trichoderma形質転換体の形質転換および発現
ｐＳａＭｅ−ＦＸをＰｍｅＩで直鎖化し、実施例１０で記述されている通りにTrichoderma reesei ＲｕｔＣ３０菌株へと形質転換した。単一の形質転換から合計６３個の形質転換体を得た。振とうフラスコ内でセルラーゼ誘発培地上で形質転換体を培養し、実施例６内で記述した通りにベータ−グルコシダーゼ活性を測定した。数多くのｐＳａＭｅ−ＦＸ形質転換体が、ベータ−グルコシダーゼ活性を生成した。ＳａＭｅ−ＦＸ１６と呼称された１つの形質転換体が、Trichoderma reeseiＳａＭｅＦ１−９に比べて２倍の量のベータ−グルコシダーゼ活性を産生した（実施例１０）。
【０４１４】
実施例１３：Trichoderma reesei形質転換体の分析
（独自の天然シグナル配列を含む）Humicola insolensエンドグルカナーゼＶコアを、Humicola insolensエンドグルカナーゼＶシグナル配列に連結されたAspergillus oryzeaeベータ−グルコシダーゼ変異体ＢＧ４１成熟コーディング配列と融合させることにより、実施例９に記述されている通りに融合タンパク質を構築した。この融合構成体は、結果として、Humicola insolensエンドグルカナーゼＶシグナル配列に連結されたAspergillus oryzeaeベータ−グルコシダーゼ変異体ＢＧ４１成熟コーディング配列と比べて分泌されたベータ−グルコシダーゼ活性を２倍増大させた。Humicola insolensエンドグルカナーゼＶシグナル配列に連結されたAspergillus oryzeae野生型ベータ−グルコシダーゼコーディング配列と融合された（その独自のシグナル配列を含む）Humicola insolensエンドグルカナーゼＶコアからなる第２の融合構成体を、実施例１１に記述されている通りに作製し、これによりベータ−グルコシダーゼ活性はさらに改善した。野生型融合で形質転換された菌株は、ベータ−グルコシダーゼ変異体ＢＧ４１融合で形質転換された菌株に比べて２倍の分泌ベータ−グルコシダーゼ活性を有していた。
【０４１５】
実施例１４：ベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質をコードする配列のAspergillus oryzeae発現ベクターへのクローニング
以下に示す２つの合成オリゴヌクレオチドプライマは、ベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質をコードするｐＳａＭｅＦＸから全長読取り枠をＰＣＲ増幅するように設計された。
【０４１６】
ＰＣＲ順方向プライマ：
５’−ＧＧＡＣＴＧＣＧＣＡＧＣＡＴＧＣＧＴＴＣ−３’（配列番号６９）
ＰＣＲ逆方向プライマ：
５’−ＡＧＴＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＣＴＧＧＧＣＣＴＴＡＧＧＣＡＧＣＧ−３’（配列番号７０）
【０４１７】
ボールド体の文字はコーディング配列を表わす。順方向プライマ内の下線付き「Ｇ」は、ＳｐｈＩ制限部位を作り出すために導入される塩基変化を表わしている。残りの配列は、ｐＳａＭｅＦＸの挿入部位と比べた配列同一性を含む。逆方向プライマ内の下線付き配列は、発現ベクターｐＡＩＬｏ２（国際公開第０４／０９９２２８号（WO 04/099228））へのクローニングを容易にするために付加されるＰａｃ  Ｉ制限部位を表わしている。
【０４１８】
５０μｌの最終体積で、５０ｎｇのｐＳａＭｅＦＸ  ＤＮＡ、１倍のＰｆｘ amplification Buffer、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰの１０ｍＭ配合物６μｌ、２．５単位のPLATINUM（登録商標）Pfx DNA Polymeraseおよび５０ｍＭのＭｇＳＯ4１μｌを含むＰＣＲ反応において、上述の各プライマ５０ピコモルを使用した。２分間９８℃で１サイクル；および各３０秒９６℃、３０秒６１℃および３分６８℃のサイクル３５回にプログラミングしたEPPENDORF（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）５３３３を使用してフラグメントを増幅した。３５回のサイクル後、反応を１０分間６８℃でインキュベートし、その後さらに加工するまで１０℃に冷却した。ＴＡＥ緩衝液および１ｍｌあたり０．１μｇの臭化エチジウムを用いて０．８％のＧＴＧ−アガロースゲル（Cambrex Byproducts One Meadowlands Plaza East Rutherford、NJ、USA）上で３．３ｋｂのＰＣＲ反応生成物を単離した。紫外線により誘発される突然変異を回避するため、DARK READERTM（Clare Chemical Research、Dolores、CO、USA）を用いてＤＮＡを視覚化した。３．３ｋｂのＤＮＡバンドを使い捨てのかみそりの刃で切除し、メーカーの指示事項にしたがってULTRAFREE（登録商標）−ＤＡスピンカップ（Millipore、Billerica、MA、USA）で精製した。
【０４１９】
精製済みの３．３ｋｂのＰＣＲ産物を、ｐＣＲ（登録商標）４Blunt−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（Invitrogen、Carlsbad、CA、USA）へと、クローニングした。精製済みＰＣＲ産物４マイクロリットルを、２Ｍの塩化ナトリウム溶液１μｌおよびＴＯＰＯ（登録商標）ベクター１μｌと混合した。反応を１５分間室温でインキュベートし、その後、反応２μｌを使用して、メーカーの指示事項にしたがってOne Shot（登録商標）TOP10 Chemically Competent E. coli細胞を形質転換させた。形質転換反応の各８３μｌの３つのアリコートを、１ｍｌあたり１００μｇのアンピシリンを補足した１５０ｍｍの２ＸＹＴ平板上に広げ、一晩３７℃でインキュベートした。
【０４２０】
１ｍｌあたり１００μｇのアンピシリンを補足した３ｍｌのＬＢ培地を含む液体培養に接種するために、８つの組換え型コロニーを使用した。BIOROBOT（登録商標） 9600（QIAGEN Inc.、Valencia、CA、USA）を用いて３つの培養からプラスミドＤＮＡを調製した。Ｐａｃ  Ｉでの制限酵素消化により、クローンを分析した。各クローンからのプラスミドＤＮＡをＰａｃ  Ｉで消化し、ＴＡＥ緩衝液を用いた１．０％のアガロースゲル電気泳動によって分析した。８つのクローンは全て、予想された制限消化パターンを有し、クローニングされたインサート内に突然変異が一切存在しないことを確認するために配列決定するべくクローン５、６、７および８を選択した。それらの５’および３’末端の配列分析は、４つのクローン全てが正しい配列を有することを示した。さらなる配列決定のために、クローン５および７を選択した。ＰＣＲ誘発された誤差が一切存在しないようにするため、両方のクローン共、４０超のPhred Q値に配列決定した。クローン５および７は、予想された配列を有することが示され、ｐＡＩＬｏ２への再クローニングのためにはクローン５を選択した。
【０４２１】
クローン５からのプラスミドＤＮＡを、Ｓｐｈ  Ｉでの消化によって直鎖化した。直鎖化されたクローンを次に、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＣＴＰの１０ｍＭ配合物１．２μｌおよび６単位のＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（（New England Bioloabs、Inc.、Ipswich、MA、USA）を添加することによって平滑末端化した。混合物を２０分間１２℃でインキュベートし、その後、０．５ＭのＥＤＴＡ１μｌを付加し７５℃で２０分間加熱して酵素を不活性化することにより反応を停止させた。ベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質をコードする３．３ｋｂのフラグメントを、上述の通りの電気泳動および限外ろ過によって精製した。
【０４２２】
Ｎｃｏ  Ｉでの消化により、ベクターｐＡＩＬｏ２を直鎖化した。その後ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰの１０ｍＭ配合物を０．５μｌおよび１単位のＤＮＡポリメラーゼＩを添加することにより、直鎖化されたベクターを平滑末端化した。混合物を１５分間２５℃でインキュベートし、次に、１μｌの０．５ＭのＥＤＴＡを添加し、７５℃で１５分間加熱して酵素を不活性化することによって反応を停止させた。その後、ベクターをＰａｃ  Ｉで消化した。平滑末端化したベクターを、上述の通りのゲル電気泳動および限外ろ過によって精製した。
【０４２３】
直鎖化され精製されたｐＡＩＬｏ２ベクターへのベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質をコードする３．３ｋｂのフラグメントのクローニングを、Rapid Ligation Kitを用いて実施した。反応の１μｌ試料を用いて、メーカーの指示事項にしたがってE. coli XL10 SOLOPAC K（登録商標） Gold 細胞（Stratagene、La Jolla、CA、USA）を形質転換した。回収期間の後、形質転換反応からの２つの１００μｌアリコートを、１ｍｌあたり１００μｇのアンピシリンを補足した２枚の１５０ｍｍの２ＸＹＴ平板上に平板固定し、３７℃で一晩インキュベートした。選択平板から無作為に８個の推定上の組換え型クローンのセットを選択し、BIOROBOT（登録商標）９６００を用いて各々からプラスミドＤＮＡを調製した。ｐＡＩＬｏ２特異的プライマで配列決定するためにクローン１〜４を選択し、ベクター／インサートの連結部が正しい配列を有することを確認した。クローン３は完全なベクター／インサート連結部を有し、ｐＡＩＬｏ４７と呼称された（図１５）。
【０４２４】
無マーカー発現菌株を作り出す目的で、制限エンドヌクレアーゼ消化を実施し、抗生物質アンピシリンに対する耐性を付与するｂｌａＡ遺伝子を発現構成体の残りの部分から分離した。３０マイクログラムのｐＡＩＬｏ４７をＰｍｅＩで消化した。消化されたＤＮＡを次に上述の通りアガロースゲル電気泳動により精製した。発現構成体を含むもののｂｌａＡ遺伝子が欠如している６．４ｋｂのＤＮＡバンドをかみそりの刃で切除し、QIAQUICK（登録商標） Gel Extraction Kit.で精製した。
【０４２５】
実施例１５：Aspergillus oryzeae ＪａＬ３５５内のHumicola insolence／Aspergillus oryzeae ｃｅｌ４５Ａ−ｃｅｌ３Ａ融合遺伝子の発現
Aspergillus oryzeae ＪａＬ３５５（国際公開第００／２４０６９４号（WO 00/240694））プロトプラストを、Christensenら、１９８８年、Bio/Technology、第６号、１４１９〜１４２２頁の方法にしたがって調製した。実施例１４の精製済み発現構成体１０マイクロリットルを用いて、Aspergillus oryzeae ＪａＬ３５５プロトプラストを形質転換した。Aspergillus oryzeae ＪａＬ３５５の形質転換は、およそ９０個の形質転換体を生成した。５０個の形質転換体を個々のＰＤＡ平板に対し単離し、３４℃で５日間インキュベートした。
【０４２６】
３ｍｌの０．０１％のTWEEN（登録商標）８０で４８個の集密的胞子平板を洗浄し、胞子懸濁液を用いて、１２５ｍｌ入りのガラス製振とうフラスコ内でＭＤＵ２ＢＰ培地２５ｍｌに接種を行なった。２００ｒｐｍで常時振とうさせながら形質転換培養を３４℃でインキュベートした。６日後に、１２０００×ｇで各培養の１ｍｌアリコートを遠心分離し、その上清を収集した。各々の上清５μｌを、等体積の２倍のローディングバッファ（１０％のベータ−メルカプトエタノール）と混合し、１．５ｍｍの８％〜１６％のトリス−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に投入し、BIO-SAFE（登録商標）Coomassie Blue G250タンパク質染色（Bio-Rad、Hercules、CA、USA）で染色した。培養ブロスのＳＤＳ−ＰＡＧＥプロフィールは、４８個のうち３３個の形質転換体が、予想された１１８ｋＤａに極めて近い見かけの分子量をもつ新しいタンパク質を発現できるということを示した。形質転換体２１が最高の収量を生成し、さらなる研究のためにこれを選択した。
【０４２７】
実施例１６：Aspergillus oryzeae ＪａＬ３５５形質転換体２１の単胞子単離
Aspergillus oryzeae ＪａＬ３５５形質転換体２１胞子をＰＤＡ平板上に広げ、３４℃で５日間インキュベートした。集密的胞子平板の小さい面積を０．５ｍｌの０．０１％TWEEN（登録商標）８０で洗浄して、胞子を再懸濁させた。胞子懸濁液の１００μｌアリコートを、０．０１％のTWEEN（登録商標）８０で５ｍｌの最終体積まで希釈した。血球計を用いて、胞子濃度を決定し、１マイクロリットルあたり胞子０．１個という最終濃度まで希釈した。胞子希釈の２００μｌアリコートを１５０ｍｍの最少培地平板上に広げ、３４℃で２〜３日間インキュベートした。平板から新生コロニーを切除し、これをＰＤＡ平板に移し３４℃で３日間インキュベートした。その後、胞子を平板を横断して広げ、再び３４℃で５日間でインキュベートした。
【０４２８】
３ｍｌの０．０１％のTWEEN（登録商標）８０で集密的胞子平板を洗浄し、胞子懸濁液を用いて、１２５ｍｌ入りのガラス製振とうフラスコ内でＭＤＵ２ＢＰ培地２５ｍｌに接種を行なった。２００ｒｐｍで常時振とうさせながら単胞子培養を３４℃でインキュベートした。６日後に、１２０００×ｇで各培養の１ｍｌアリコートを遠心分離し、その上清を収集した。各々の上清５μｌを、等体積の２倍のローディングバッファ（１０％のベータ−メルカプトエタノール）と混合し、１．５ｍｍの８％〜１６％のトリス−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に投入し、BIO-SAFE（登録商標）Commasie Blue G250タンパク質染色液で染色した。培養ブロスのＳＤＳ−ＰＡＧＥプロフィールは、８個の形質転換体の全てが、非常に高レベルでベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質を発現することができ、Aspergillus oryzeae ＪａＬ３５５ＡＩＬｏ４７と呼称される１つの培養が最高の収量をを生成するということを示した。
【０４２９】
実施例１７：ｐＣＷ０８７の構築
以下に示した２つの合成オリゴヌクレオチドプライマを、プラスミドｐＤＺＡ２−７からのThermoascus aurantiacusＧＨ６１Ａポリペプチド遺伝子をＰＣＲ増幅するように設計した（国際公開第２００５／０７４６５６号（WO 2005/074656））。順方向プライマは結果として、平滑５’末端をもたらし、逆方向プライマは３’末端にＰａｃ  Ｉ部位を取込む。
【０４３０】
順方向プライマ
５’−ＡＴＧＴＣＣＴＴＴＴＣＣＡＡＧＡＴＡＡＴＴＧＣＴＡＣＴＧ−３’（配列番号７１）
逆方向プライマ
５’−ＧＣＴＴＡＡＴＴＡＡＣＣＡＧＴＡＴＡＣＡＧＡＧＧＡＧ−３’（配列番号７２）
【０４３１】
５０μｌの最終体積で、５０ｎｇのｐＤＺＡ２−７、１μｌのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰの１０ｍＭ配合物、５μｌの１０倍ACCUTAQTM ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（Sigma-Aldrich、St. Louis、MO、USA）、および５単位のACCUTAQTM ＤＮＡポリメラーゼ（Sigma-Aldrich、St. Louis、MO、USA）からなるＰＣＲ反応において、上述のプライマを各々５０ピコモル使用した。３分間９５℃で１サイクル、各々４５秒９４℃、６０秒５５℃および１分３０秒７２℃のサイクル３０回にプログラミングしたEPPENDORF（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）５３３３を用いてＤＮＡフラグメントを増幅した。２５回のサイクル後、１０分間７２℃で反応をインキュベートし、その後さらなる加工まで４℃で冷却した。Ｐａｃ  Ｉを用いて、Thermoascus aurantiacusＧＨ６１Ａ  ＰＣＲフラグメントの３’末端を消化した。消化産物を、メーカーの指示事項にしたがってMINELUTETM 反応清浄キット（QIAGEN Inc.、Valencia、CA、USA）を用いて精製した。
【０４３２】
５’末端にある平滑末端のＮｃｏ  Ｉ部位および３’末端にあるＰａｃ  Ｉ部位を用いてＧＨ６１ＡフラグメントをｐＳＭａｉ１５５（国際公開第２００５／０７４６４７号（WO2005/074647））へと直接クローニングした。ＮｃｏＩおよびＰａｃ  ＩでプラスミドｐＳＭａｉ１５５を消化した。その後、５’の凹型（recessed）ＮｃｏＩ部位を埋めるべくクレノウ酵素を用いて、ＮｃｏＩ部位を平滑末端にした。クレノウ反応は、ｐＳｍａ１５５消化反応ミックスと１ｍＭｄＮＴＰｓ２０μｌおよび１μｌのクレノウ酵素からなり、これを室温で短時間インキュベートした。メーカーの指示事項にしたがって、MINELUTETM Reaction Cleanup Kitを用いて、新たに直鎖化されたｐＳＭａｉ１５５プラスミドを精製した。これらの反応の結果、新たに生成されたＧＨ６１Ａフラグメントと相容性ある５’平滑末端および３’Ｐａｃ  Ｉ部位が作り上げられた。その後、メーカーの指示事項にしたがって急速ＤＮＡライゲーションキット（Roche、Indianapolis、IN、USA）を用いて、ＧＨ６１ＡフラグメントをｐＳＭａｌ１５５発現ベクターへとクローニングした。E. coli XL1- Blue Subcloning-Grade Competent Cells（Stratagene、La Jolla、CA、USA）をライゲーション産物で形質転換した。形質転換されたE. coliから精製されたプラスミドからのＧＨ６１Ａコーディング配列のＤＮＡ配列決定により、構成体の同一性を確認した。組換え型プラスミドを含む１つのE. coliクローンをｐＣＷ０８７−８と呼称した。
【０４３３】
実施例１８：ｐＳａＭｅ−Ｔａ６１Ａの構築
Ｎｓｉ  Ｉを用いてａｍｄＳ選択可能マーカーを包含するプラスミドｐＭＪ０９を消化させることによって（国際公開第２００５／０５６７７２号（WO 2005/056772））、発現ベクターｐＳａＭｅ−Ｔａ６１を構築し、これにより２．７ｋｂのａｍｄＳフラグメントが解放された。次に、この２．７ｋｂのａｍｄＳフラグメントをＴＡＥ緩衝液を用いて１．０％のアガロースゲル電気泳動により単離させ、QIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kitを用いて精製した。
【０４３４】
発現ベクターｐＣＷ０８７をＮｓｉ  Ｉで消化し、４．７ｋｂのフラグメントをＴＡＥ緩衝液を用いて１．０％のアガロースゲル電気泳動により単離し、QIAQUICK（登録商標） Gel Extraction Kitを用いて精製した。その後、メーカーの指示事項にしたがってＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Roche、Indianapolis、IN、USA）を用いて４．７ｋｂのベクターフラグメントに２．７ｋｂのａｍｄＳフラグメントをライゲートさせ、発現ベクターｐＳａＭｅ−Ｔａ６１Ａを作り上げた。プラスミドｐＳａＭｅ−Ｔａ６１Ａは、Thermoascus aurantiacusＧＨ６１Ａ成熟コーディング配列に作動的に連結されたTrichoderma reesei セロビオヒドロラーゼＩ（ＣＥＬ７Ａ）遺伝子プロモータおよびターミネータを含む。
【０４３５】
実施例１９：Trichoderma reesei菌株ＳａＭｅ−ＭＦ２６８の構築
Trichoderma reesei ＲｕｔＣ３０内にプラスミドｐＳａＭｅ−ＦＸおよびｐＳａＭｅ−Ｔａ６１Ａを導入するために、同時形質転換を使用した。ＰＥＧ媒介型形質転換によりTrichoderma reesei ＲｕｔＣ３０内にプラスミドｐＳａＭｅ−ＦＸおよびｐＳａＭｅ−Ｔａ６１Ａを導入した（Penttilaら、１９８７年、上掲書）。各プラスミドは、Aspergillus nidulans ａｍｄＳ遺伝子を含み、形質転換体が唯一の窒素源としてのアセトアミド上で成長できるようになっていた。
【０４３６】
２％（ｗ／ｖ）のグルコースおよび１０ｍＭのウリジンで補足したＹＰ培地２５ｍｌ中で２７℃、９０ｒｐｍで１７時間Trichoderma reesei ＲｕｔＣ３０を培養した。Vacuum Driven Disposable Filtration Systemを用いたろ過により菌糸を収集し、脱イオン水で２回、１．２Ｍのソルビトールで２回洗浄した。１ｍｌあたり１５ｍｇのGLUCANEX（登録商標）（Novozymes A/S、Bagsvaerd、Denmark）および１ｍｌあたり０．３６単位のキチナーゼ（Sigma Chemical Co.、St. Louis、MO、USA）を含む１．２Ｍのソルビトール２０ｍｌの中に洗浄済み菌糸を懸濁させ、９０ｒｐｍで穏やかに振とうしながら３４℃で１５〜２５分間インキュベートすることにより、プロトプラストを生成した。４００×ｇで７分間遠心分離することによってプロトプラストを収集し、低温１．２Ｍソルビトールで２回洗浄した。血球計を用いてプロトプラストを計数し、１ｍｌあたり１×１０8個のプロトプラストという最終濃度までＳＴＣ中で再懸濁させた。余剰のプロトプラストは、Cryo 1°C Freezing Container（Nalgene、Rochester、NY、USA）内に−８０℃で貯蔵した。
【０４３７】
抗生物質耐性マーカーａｍｐＲの除去を容易にするため、各々およそ４μｇのプラスミドｐＳａＭｅ−ＦＸおよびｐＳａＭｅ−Ｔａ６１ＡをＰｍｅＩで消化した。ＰｍｅＩでの消化後、直鎖状フラグメントをＴＡＥ緩衝液を用いて１％のアガロースゲル上に走らせて、さまざまなフラグメントを分離した。ｐＳａＭｅ−ＦＸからの７．５ｋｂのフラグメントおよびｐＳａＭｅ−Ｔａ６１Ａからの４．７ｋｂのフラグメントをゲルから切り取り、メーカーの指示事項にしたがってQIAQUICK（登録商標） Gel Extraction Kitを用いて精製した。これらの精製されたフラグメントは、ａｍｄＳ選択可能マーカーカセット、Trichoderma reesei ｃｂｈ  ｆ遺伝子プロモータおよびターミネータを含む。さらに、フラグメントはHumicola insolensＥＧＶコア／Aspergillus oryzeaeＢＧ融合コーディング配列またはT. aurantiacus ＧＨ６１Ａコーディング配列を含む。形質転換において用いられるフラグメントは、ａｍｐＲフラグメントがこのゲル精製工程によって除去されることから、抗生物質耐性マーカーを含んでいなかった。その後、精製済みのフラグメントを１００μｌのプロトプラスト溶液に添加し、穏やかに混合し、ひき続き２６０μｌのＰＥＧ緩衝液を添加し混合し、室温で３０分間インキュベートした。その後、ＳＴＣ（３ｍｌ）を添加し、混合し、形質転換溶液を、ａｍｄＳ選択を用いてＣＯＶＥ平板上に平板固定した。平板を５〜７日間２８℃でインキュベートした。形質転換体をＣＯＶＥ２平板上で二次培養して、２８℃で成長させた。
【０４３８】
４００以上の形質転換体を、アセトアミドの入った新鮮な平板上で二次培養し、２８℃で７日間胞子形成させた。
【０４３９】
形質転換体の胞子が接種され５日間２８℃２００ｒｐｍでインキュベートされたｐＨ６．０のセルラーゼ誘発培地２５ｍｌが入った１２５ｍｌ入りのバッフル付き振とうフラスコ内で、Trichoderma reesei形質転換体を培養した。対照としてTrichoderma reesei ＲｕｔＣ３０を走らせた。５日目に培養ブロス試料を除去した。各培養ブロス１ｍｌを微量遠心機内で５分間、１５，７００×ｇで遠心分離に付し、上清を新しい管に移した。
【０４４０】
CRITERION（登録商標）Systemを用いてCRITERION（登録商標）トリス−ＨＣｌ（５％分解）ゲルを使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。５日目の上清（以上参照）５μｌを２倍濃度のLaemmli Sample Buffer（Bio-Rad、Hercules、CA、USA）の中に懸濁させ、３日間５％のベータ−メルカプトエタノールの存在下で沸とうさせた。ポリアクリルアミドゲル上に上清試料を投入し、ランニングバッファ（Bio-Rad、Hercules、CA、USA）として１倍トリス／グリシン／ＳＤＳを用いた電気泳動に付した。結果として得たゲルを、ＢＩＯ−ＳＡＦＥ（登録商標）Coomassie Stainで染色した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上のバンドの視覚化によって見えるようにAspergillus oryzeaeベータ−グルコシダーゼで融合されたHumicola insolensエンドグルカナーゼＶコア（Ｃｅｌ４５Ａ）からなる融合タンパク質およびThermoascus aurantiacusＧＨ６１Ａポリペプチドの両方の発現を示す形質転換体を次に、最高の加水分解ブロスを産生する菌株の同定を目的としてＰＣＳ加水分解反応においてテストした。
【０４４１】
実施例２０：Trichoderma reesei菌株ＳａＭｅ−ＭＦ２６８の同定
Thermoascus aurantiacusＧＨ６１ＡポリペプチドおよびAspergillus oryzeaeベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質の両方の発現を示す形質転換体を、形質転換体の胞子が接種され５日間２８℃２００ｒｐｍでインキュベートされたｐＨ６．０のセルラーゼ誘発培地２５ｍｌの入った１２５ｍｌ入りのバッフル付き振とうフラスコの中で培養した。
【０４４２】
振とうフラスコ培養ブロスを、６０００×ｇで遠心分離し、加水分解に先立ち０．２２μｍまでSTERICUPTM EXPRESSTM（Millipore、Bedford、MA、USA）を用いてろ過した。培養ブロスの活性を、ＰＣＳを加水分解しその還元末端の化学的検定により検出可能な糖を産生するそれらの能力によって測定した。
【０４４３】
トウモロコシ茎葉は、米国エネルギー省再生可能エネルギー研究所（ＮＲＥＬ）、Boulder, CO, USAにおいて希硫酸を用いて前処理された。前処理には、以下の条件が用いられた：１９０℃で乾燥バイオマス１ｇあたり０．０４８ｇの硫酸および１分前後の間２５ｗ／ｗ％の乾燥固体。前処理されたトウモロコシ茎葉（ＰＣＳ）中の不水溶性固体は、グルコースおよびセロビオースを放出するＰＣＳの限界消化物によって決定されるように、５９．２％のセルロースを含有していた。酵素加水分解に先立ち、ＰＣＳを大量の二重脱イオン水で洗浄し、水洗浄したＰＣＳの乾燥重量は１７．７３％であることがわかった。
【０４４４】
１ｋｇの量のＰＣＳを二重脱イオン水およそ２リットル中に懸濁させ、ＰＣＳが沈下した後水を廃棄した。洗浄水のｐＨが４．０を超えるまでこれを反復し、その時点で還元糖は１リットルあたり０．０６ｇ未満であった。少量検定（例えば１ｍｌ）については、沈下したスラリーを１００メッシュのスクリーンに通してふるいがけしてピペットにより採取できるようにした。１０５℃のオーブンで少なくとも２４時間（重量が恒常になるまで）試料を乾燥させた後、湿潤重量と比較することによって洗浄したＰＣＳの乾燥重量含有率を決定した。
【０４４５】
ＡＬＰＳ３００TM実験室用自動平板密封機（ABgene Inc.、Rochester、NY、USA）により熱融着された９６深ウェル平板（Axygen Scientific）内において１ｍｌの体積で、ＰＣＳ加水分解を実施した。ＰＣＳ濃度は、ｐＨ５．０の５０ｍＭの酢酸ナトリウム中で１リットルあたり１０ｇであった。記述されている通りに試料を採取している間を除いて、付加的な撹拌無しで５０℃でＰＣＳ加水分解を実施した。各反応をトリプリケートで実施した。放出された還元糖を、ｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド（ＰＨＢＡＨ）試薬によって分析した。
【０４４６】
０．８ｍｌの体積のＰＣＳ（水中１リットルあたり１２．５ｇ）を９６深ウェル平板の各ウェルにピペットで採取し、その後ｐＨ５．０の０．５Ｍの酢酸ナトリウム０．１０ｍｌを、そして次に０．１０ｍｌの希釈酵素溶液をピペットで採取し、１リットルあたり１０ｇのＰＣＳ濃度および１．０ｍｌの最終反応体積で、反応を開始させた。平板を密封した。加水分解の開始時から各試料の測定時点を取上げる前に深ウェル平板を反転させることにより反応混合物を混合した。各々の試料測定時点で、平板を混合し、次に深ウェル平板を１０分間２０００ｒｐｍで遠心分離（ＲＴＨ−２５０の回転子を伴うSORVALL（登録商標）ＲＴ７）に付してから、２０μｌの加水分解物（上清）を取り出し、９６ウェルのマイクロプレートの中の１８０μｌの０．４％のＮａＯＨに添加した。この停止させた溶液を、必要とあらばさらに適正範囲の還元糖の中に希釈した。放出された還元糖を、パラヒドロキシ安息香酸ヒドラジド試薬（ＰＨＢＡＨ、Sigma、４−ヒドロキシベンジヒドラジド）によって検定した。５０μｌのＰＨＢＡＨ試薬（１．５％）をＶ字底９６ウェルTHERMOWELLTM平板（Costar６５１１）内で１００μｌの試料と混合し、１０分間９５℃で平板加熱ブロック上でインキュベートし、その後５０μｌの二重脱イオン水を各ウェルに添加し、混合し、１００μｌを別の平底９６ウェル平板（Costar９０１７）に移し、吸光度を４１０ｎｍで読取った。同じ条件下でグルコース較正曲線を用いて還元糖を計算した。還元糖へのセルロースの転換率は、以下のように計算した：
転換％＝還元糖（ｍｇ／ｍｌ）／（添加セルロース（ｍｇ／ｍｌ）×１．１１）
係数１．１１は、セルロースからグルコースへの加水分解における重量増加を補正する。
【０４４７】
１ｍｌのＰＣＳ加水分解試験の後、以下のプロトコルにしたがって発酵装置内で上位候補をデュプリケートで成長させた。５００ｍｌの振とうフラスコに対して、以下の振とうフラスコ培地１００ｍｌを添加した。この振とうフラスコ培地は、１リットルあたり２０ｇのデキストロース、１０ｇのトウモロコシスティープソリッド、１．４５ｇの（ＮＨ4）2ＳＯ4、２．０８ｇのＫＨ2ＰＯ4、０．３６ｇのＣａＣｌ2、０．４２ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏおよび０．４２ｍｌの微量金属溶液で構成されていた。微量金属溶液は、１リットルあたり２１６ｇのＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ、５８ｇのＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、２７ｇのＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ、１０ｇのＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、２．４ｇのＨ3ＢＯ3、および３３６ｇのクエン酸で構成されていた。振とうフラスコに、Trichoderma reeseiＳＭＡ１３５−０４の固体平板培養由来の２本のプラグを接種し、４８時間２００ｒｐｍの軌道振とう機上で２８℃でインキュベートした。５０ｍｌの振とうフラスコブロスを使用して、１リットルあたり３０ｇのセルロース、４ｇのデキストロース、１０ｇのトウモロコシスティープソリッド、３．８ｇの（ＮＨ4）2ＳＯ4、２．８ｇのＫＨ2ＰＯ4、２．６４ｇのＣａＣｌ2、１．６３ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１．８ｍｌの消泡剤および０．６６ｍの微量金属溶液で構成された１．８リットルの発酵バッチ培地の入った３リットル入り発酵容器に接種した。微量金属溶液は、１リットルあたり２１６ｇのＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ、５８ｇのＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、２７ｇのＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ、１０ｇのＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、２．４ｇのＨ3ＢＯ3および３３６ｇのクエン酸で構成されていた。発酵供給培地はデキストロースおよびセルロースで構成されており、これを１６５時間の間、０〜４ｇ／ｌ／時の速度で供給した。発酵容器を２８℃の温度に維持し、ｐＨを４．７５＋／−０．１の設定点に制御した。空気を１ｖｖｍの速度で容器に加え、１１００〜１３００ｒｐｍで回転するRushtonインペラによってブロスを撹拌した。
【０４４８】
総タンパク質濃度を決定し、ブロスを以下で記述した通り５０ｇのＰＣＳ加水分解反応中で再テストした。酵素希釈物を、各実験の前に、酵素原液から新鮮な状態で調製し、４℃に保管した。
【０４４９】
NREL Laboratory Analytical Protocol #008にしたがって５０ｇの合計反応質量を用いて１２５ｍｌ入りのネジ蓋付き三角フラスコ（VWR、West Chester、PA、USA）を使用して、ＰＣＳの加水分解を行なった。このプロトコルにおいては、上述の２リットルの発酵ブロス試料の（セルロース１グラムあたりのタンパク質のｍｇ数として表現された）異なるタンパク質負荷を用いて、ＰＣＲの加水分解（ＰＣＳ中およそ１１．４％そしてｐＨ５．０の水性５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液中６．８％のセルロース）を実施した。INNOVA（登録商標）４０８０  Incubator（New Brunswick Scientific、Edison、NJ、USA）を用いて１５０ｒｐｍでの軌道振とうを伴って５０℃で、ＰＣＳの加水分解能力の試験を実施した。加水分解中、７２、１２０および１６８時間でアリコートを採取し、遠心分離させ、上清液体をSORVALL（登録商標）ＲＴ７平板遠心機（Thermo Fisher Scientific、Waltham、MA、USA）を用いて１０分間、２０００ｒｐｍでの遠心分離によりMULTISCREEN（登録商標）ＨＶ０．４５μｍ膜（Millipore、Billerica、MA、USA）を用いてろ過した。直ちに使用されなかった場合、ろ過した糖様のアリコートを−２０℃で冷凍した。純粋糖試料によって較正されたCHEMSTATION（登録商標） AGILENT（登録商標） １１００ＨＰＬＣ（Agilent Technologies、Santa Clara、CA、USA）を用いた屈折率検出に由来するグルコースおよびセルビオースシグナルの積分による定量化を伴って、６５℃での４．６×２５０ｍｍのAMINEX（登録商標）ＨＰＸ−８７Ｈカラム（Bio-Rad、Hercules、CA、USA）から毎分０．４ｍｌの流速で０．００５ＭのＨ2ＳＯ4により溶出させた後に、０．００５ＭのＨ2ＳＯ4中に希釈された試料の糖濃度を測定した。結果として得た等価物を用いて、各反応についてセルロース転換の百分率を計算した。
【０４５０】
セルロースからグルコースプラスセロビオース糖への転換度（転換、％）を以下の等式を用いて計算した：
転換（％）＝（グルコース＋セロビオース×１．０５３）(mg/ml)×１００×１６２／（セロビオース(mg/ml)×１８０）＝（グルコース＋セロビオース×１．０５３）(mg/ml)×１００／（セルロース(mg/ml)×１．１１１）
【０４５１】
この等式中、係数１．１１１は、セルロースからグルコースへの転換における重量増加を反映しており、係数１．０５３はセロビオースからグルコースへの転換の際の重量増加を反映する。
【０４５２】
以上で記述した５０ｇフラスコ検定におけるＰＣＳ加水分解反応の結果は表１に示されている。最高の性能を示したブロスを産生した１つの菌株を、Trichoderma reeseiＳａＭｅ−ＭＦ２６８と呼称した。
【０４５３】
表１：１６８時間の時点における糖への転換百分率
タンパク質負荷に対する転換百分率（グルコースプラスセロビオース）
【０４５４】
【表１】
2010528621.tif 000002
【０４５５】
実施例２１：Thermoascus aurantiacusポリペプチドＧＨ６１ＡおよびAspergillus oryzeaeベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質を含有するTrichoderma reeseiブロスの調製
実施例２０で記述されている通りに調製した発酵ブロス試料から、９５００×ｇでおよそ２０分間遠心分離することによって細胞残屑を取り除いた。残屑を取除いたブロス試料を次にMILLEX（登録商標）GP ExpressTM膜ポリエーテルスルホン、０．２２μｍ（Millipore、Bedford、MA、USA）を用いてろ過した。ろ過したブロス試料を次に、HIPREPTM ２６／１０Desalting Column（AKTATM、GE Healthcare、Piscataway、NJ、USA）を用いて脱塩した。脱塩した材料のタンパク質濃度をBCATM Protein Assay Kit（Pierce、Rockford、IL、USA）を用いて決定したが、ここでは、タンパク質標準としてウシ血清アルブミンを使用し、ろ過されたブロス中のタンパク質について計算を行なった。標準的に８〜１６％のCRITERIONTM ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Bio-Rad、Hercules、CA; 200 V for 1 hour）上でアリコートを分析し、ここにはPRECISION PLUS PROTEINTM分子量標準（Bio-Rad、Hercules、CA、USA）を含み入れた。BIO-SAFETM Coomassie Stain（Bio-Rad、Hercules、CA、USA）を用いてタンパク質についてゲルを染色し、脱イオン水を用いて脱染した。Thermoascus aurantiacus ＧＨ６１ＡポリペプチドおよびHumicola insolensＧＨ４５コアタンパク質とAspergillus oryzeaeベータ−グルコシダーゼを含む融合タンパク質の量について、染色したゲルの走査の定量からかまたはEXPERIONTM毛管電気泳動（Bio-Rad、Hercules、CA、USA）による分析後のピークサイズによって推定した。
【０４５６】
実施例２２：金属イオンおよびThermoascus aurantiacusポリペプチドＧＨ６１Ａと組合わされた場合の、Aspergillus oryzeaeベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質を含有するTrichoderma reeseiブロスのセルロース分解活性の増加
トウモロコシ茎葉は、米国エネルギー省再生可能エネルギー研究所（ＮＲＥＬ）、において希硫酸を用いて前処理された。前処理には、以下の条件が用いられた：１９５℃で４．５分間１．４重量％の硫酸。余剰のセルラーゼ酵素での限界消化にしたがうと、前処理されたトウモロコシ茎葉（ＰＣＳ）中の不水溶性固体は、５９．２％のセルロースを含有していた。酵素加水分解に先立ち、可溶性酸および糖が除去されるまで、ＰＣＳを大量の脱イオン水で洗浄した。水洗浄したＰＣＳの乾燥重量は１９．１６％であることがわかった。
【０４５７】
NREL Laboratory Analytical Protocol #008にしたがって５０ｇの合計反応質量を用いて１２５ｍｌ入りのネジ蓋付き三角フラスコを使用して、ＰＣＳの加水分解を行なった。このプロトコルにおいては、表１に示された形で１０ｍＭの最終濃度の二価金属イオンの付加を伴ってまたは伴わずにAspergillus oryzeae融合タンパク質およびセルロース分解増強活性を有するThermoascus aurantiacusＧＨ６１Ａポリペプチドを含有するTrichoderma reesei発酵ブロスの（セルロース１グラムあたりのタンパク質のｍｇ数として表現された）異なるタンパク質負荷を用いて、ＰＣＲの加水分解（ＰＣＳ中およそ１１．３％そしてｐＨ５．０の水性５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液中６．７％のセルロース）を実施した。INNOVA（登録商標）４０８０  Incubator（New Brunswick Scientific、Edison、NJ、USA）を用いて１５０ｒｐｍでの軌道振とうを伴って５０℃で、ＰＣＳの加水分解能力の試験を実施した。加水分解中、７２および１２０時間でアリコートを取り上げた。アリコートを遠心分離させ、上清溶液をSORVALL（登録商標）ＲＴ７平板遠心機を用いて１５分間、２０００ｒｐｍでの遠心分離によりMULTISCREEN（登録商標）ＨＶ０．４５μｍ膜を用いてろ過した。直ちに使用されなかった場合、ろ過した糖様のアリコートを−２０℃で冷凍した。純粋糖試料によって較正されたCHEMSTATION（登録商標） AGILENT（登録商標） １１００ＨＰＬＣ（Agilent Technologies、Santa Clara、CA、USA）を用いた屈折率検出に由来するグルコースおよびセルビオースシグナルの積分による定量化を伴って、６５℃での４．６×２５０ｍｍのAMINEX（登録商標）ＨＰＸ−８７Ｈカラムから毎分０．４ｍｌの流速で０．００５ＭのＨ2ＳＯ4により溶出させた後に、０．００５ＭのＨ2ＳＯ4中に希釈された試料の糖濃度を測定した。結果として得た等価物を用いて、各反応についてセルロース転換の百分率を計算した。
【０４５８】
セルロースからグルコースプラスセロビオース糖への転換度（転換、％）を以下の等式を用いて計算した：
転換％＝（グルコース＋セロビオース×１．０５３）(mg/ml)×１００×１６２／（セロビオース(mg/ml)×１８０）＝（グルコース＋セロビオース×１．０５３）(mg/ml)×１００／（セルロース(mg/ml)×１．１１１）
【０４５９】
この等式中、係数１．１１１は、セルロースからグルコースへの転換における重量増加を反映しており、係数１．０５３はセロビオースからグルコースへの転換の際の重量増加を反映する。ＰＣＳ内のセルロースを、グルコースおよびセロビオースを放出するＰＣＳの限界消化物によって決定した。
【０４６０】
酵素希釈物を、各実験の前に、酵素原液から新鮮な状態で調製し、４℃に保管した。
【０４６１】
表２に示された結果は、１０ｍＭのＭｎＳＯ4を添加することによって、セルロース１ｇあたり４〜８ｍｇのタンパク質レベルで当量の発酵ブロス単独により得られるものを超えてグルコースへの転換を増大させることを実証した。同様にして、１０ｍＭまで添加されたＣａＣｌ2、ＭｇＣｌ2またはＣｏＣｌ2は、グルコースへの転換を、セルロース１ｇあたり４〜８ｍｇのタンパク質レベルで当量の発酵ブロス単独によりものを超えて増大させた。１０ｍＭのＺｎＣｌ2またはＦｅＳＯ4などのその他の二価金属塩の添加、または二価カチオンのキレート剤である１０ｍＭのＥＤＴＡの添加は、グルコースおよびセロビオースの収量を減少させた。７２時間の加水分解についての結果は、図１６に示されている。
【０４６２】
したがって、セルラーゼ含有溶液に対する１０ｍＭのＭｎＳＯ4、ＣａＣｌ2、ＭｇＣｌ2またはＣｏＣｌ2の添加は、その他の金属塩の添加に比べ、酸による前処理を受けたトウモロコシ茎葉（ＰＣＳ）の加水分解時のグルコースおよびセロビオースの収量を増大させた。
【０４６３】
【表２】
2010528621.tif 000003
【０４６４】
実施例２３：金属と組合わされた場合の脱塩されたTrichoderma reeseiブロスAspergillus oryzeaeベータ−グルコシダーゼのセルロース分解活性の増加は、ポリペプチドＧＨ６１Ａを含有する混合物に特異的なものである
セルロース分解増強活性を有するThermoascus aurantiacusポリペプチドＧＨ６１Ａを、国際公開第２００５／０７４６５６号（WO 2005/074656）にしたがってAspergillus oryzeaeＪａＬ２５０内で組換えにより産生させた。Aspergillus oryzeaeベータ−グルコシダーゼおよびTrichoderma reeseiセルラーゼを発現する真菌ブロスを、Trichoderma reesei菌株ＳＭＡ１３５−０４の中で組換えによって産生させた。以下で記述する通り、これらのタンパク質の各々について発酵を実行した。
【０４６５】
Aspergillus oryzeaeが関与する発酵のためには、５００ｍｌ入り振とうフラスコに対し振とうフラスコ培地１００ｍｌを添加した。振とうフラスコ培地は、１リットルあたり５０ｇのスクロース、１０ｇのＫＨ2ＰＯ4、０．５ｇのＣａＣｌ2、２ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、２ｇのＫ2ＳＯ4、２ｇの尿素、１０ｇの酵母抽出物、２ｇのクエン酸、そして０．５ｍｌの微量金属溶液で構成されていた。微量金属溶液は、１リットルあたり１３．８ｇのＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１４．３ｇのＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、８．５ｇのＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ、２．５ｇのＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏおよび３ｇのクエン酸で構成されていた。振とうフラスコに、Aspergillus oryzeaeの固体平板培養由来の２本のプラグを接種し、４８時間２００ｒｐｍの軌道振とう機上で３４℃でインキュベートした。５０ｍｌの振とうフラスコブロスを使用して、１リットルあたり１０ｇの酵母抽出物、２４ｇのスクロース、５ｇの（ＮＨ4）2ＳＯ4、２ｇのＫＨ2ＰＯ4、０．５ｇのＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、２ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１ｇのクエン酸、２ｇのＫ2ＳＯ4、０．５ｍｌの消泡剤および０．５ｍの微量金属溶液で構成された１．８リットルの発酵バッチ培地の入った３リットル入り発酵容器に接種した。微量金属溶液は、１リットルあたり１３．８ｇのＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１４．３ｇのＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、８．５ｇのＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ、２．５ｇのＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏおよび３ｇのクエン酸で構成されていた。発酵供給培地はマルトースおよび消泡剤で構成されていた。発酵供給培地を１８５時間の間、０〜４。４ｇ／ｌ／時の速度で供給した。発酵容器を３４℃の温度に維持し、ｐＨを６．１＋／−０．１の設定点に制御した。空気を１ｖｖｍの速度で容器に加え、１１００〜１３００ｒｐｍで回転するRushtonインペラによってブロスを撹拌した。
【０４６６】
Trichoderma reeseiが関与する発酵を、実施例２０で記述されている通りに実施した。
【０４６７】
粗ブロス試料から、９５００×ｇでおよそ２０分間遠心分離することによって細胞残屑を取り除いた。残屑を取除いたブロス試料を次にMILLEX（登録商標）GP ExpressTM膜ポリエーテルスルホン、０．２２μｍを用いてろ過した。ろ過したブロス試料を次に、HIPREPTM ２６／１０Desalting Columnを用いて脱塩した。脱塩した材料のタンパク質濃度をBCATM Protein Assay Kitを用いて決定したが、ここでは、タンパク質標準としてウシ血清アルブミンを使用し、ろ過されたブロス中のタンパク質について計算を行なった。標準的に８〜１６％のCRITERIONTM ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１時間２００Ｖ）上でアリコートを分析し、ここにはPRECISION PLUS PROTEINTM分子量標準を含み入れた。BIO-SAFETM Coomassie Stainを用いてタンパク質についてゲルを染色し、（脱イオン水を用いて脱染した。同様に発酵ブロス内に溶解した金属イオンを除去するための上述の通りの脱塩によってタンパク質が調製されており、表３および表４を見ればわかるように、ｄｓという接頭辞により表わされている。
【０４６８】
NREL Laboratory Analytical Protocol #008にしたがって５０ｇの合計反応質量を用いて１２５ｍｌ入りのネジ蓋付き三角フラスコを使用して、ＰＣＳの加水分解を行なった。このプロトコルにおいては、表２に示された形で１ｍＭの最終濃度の二価金属イオンの付加を伴ってまたは伴わずにThermoascus aurantiacusポリペプチドＧＨ６１Ａの付加を伴ってまたは伴わずにAspergillus oryzeaeベータ−グルコシダーゼを含むTrichoderma reeseiブロスを含む発酵ブロスの（セルロース１グラムあたりの酵素のｍｇ数として表現された）恒常な総タンパク質負荷を用いて、ＰＣＲの加水分解（ＰＣＳ中およそ１１．３％そしてｐＨ５．０の水性５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液中６．７％のセルロース）を実施した。実施例２２で記述されていた通りに、ＰＣＳの加水分解能力の試験を実施した。セルロースからグルコースプラスセロビオース糖への転換度（転換％）を、実施例２２で記述されている等式を用いて計算した。
【０４６９】
酵素希釈物を、各実験の前に、酵素原液から新鮮な状態で調製し、４℃に保管した。
【０４７０】
表３に示された結果は、１ｍＭの二価カチオンを単独で添加することでは、セルロース分解増強活性を有するThermoascus aurantiacusＧＨ６１Ａポリペプチドを内含しない当量の発酵ブロス単独により得られるものを超えてグルコースへの転換が増大しないことを実証した。同様にして、二価金属カチオンの添加なしのＧＨ６１Ａポリペプチドの内含も、グルコース転換を増大させなかった。７２時間の加水分解についての結果は、図１７にプロットされている。
【０４７１】
したがって、セルロース分解増強活性を有するThermoascus aurantiacusＧＨ６１Ａポリペプチドと共にセルラーゼ含有溶液に１ｍＭのＭｎＳＯ4またはＣａＣｌ2を添加することで、酸による前処理を受けたトウモロコシ茎葉（ＰＣＳ）の加水分解時のグルコースおよびセロビオースの収量は増大した。この増加は、Thermoascus aurantiacusＧＨ６１Ａポリペプチドの存在に依存していた。Ｚｎ++およびＦｅ++などのその他の金属１ｍＭを添加するかまたは１ｍＭのＥＤＴＡにより金属をキレート化することにより、酸による前処理を受けたトウモロコシ茎葉（ＰＣＳ）を加水分解した場合のグルコースおよびセロビオースの収量は減少した。
【０４７２】
【表３】
2010528621.tif 000004
【０４７３】
実施例２４：ＭｎＳＯ4およびＭｇＣｌ2と組合わされた場合のAspergillus oryzeaeベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質およびThermoascus aurantiacusＧＨ６１Ａポリペプチドを含有するTrichoderma reeseiブロスのセルロース分解活性の増加
セルロース分解増強活性を有するThermoascus aurantiacusＧＨ６１ＡポリペプチドおよびAspergillus oryzeaeベータ−グルコシダーゼと共にHumicola insolensＧＨ４５Ａコアからなる融合タンパク質を、実施例２０に記述されている通りにTrichoderma reeseiＳａＭｅ  ＭＦ２６８の中で組換えにより生産した。
【０４７４】
粗ブロス試料から、９５００×ｇでおよそ２０分間培養を遠心分離することによって細胞残屑を取り除いた。残屑を取除いたブロス試料を次にMILLEX（登録商標）GP ExpressTM膜ポリエーテルスルホン、０．２２μｍを用いてろ過した。ろ過したブロス試料を次に、HIPREPTM ２６／１０Desalting Columnを用いて脱塩した。脱塩した材料のタンパク質濃度をBCATM Protein Assay Kitを用いて決定したが、ここでは、タンパク質標準としてウシ血清アルブミンを使用し、ろ過されたブロス中のタンパク質について計算を行なった。標準的に８〜１６％のCRITERIONTM ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１時間２００Ｖ）上でアリコートを分析し、ここにはPRECISION PLUS PROTEINTM分子量標準を含み入れた。BIO-SAFETM Cooomassie Stainを用いてタンパク質についてゲルを染色し、（脱イオン水を用いて脱染した。同様に発酵ブロス内に溶解した金属イオンを除去するための上述の通りの脱塩によってタンパク質を調製した。
【０４７５】
NREL Laboratory Analytical Protocol #008にしたがって５０ｇの合計反応質量を用いて１２５ｍｌ入りのネジ蓋付き三角フラスコを使用して、ＰＣＳの加水分解を行なった。このプロトコルにおいては、表４に示されているような漸増的最終濃度のＭｎＳＯ4およびＭｇＣｌ2と共に、Thermoascus aurantiacusＧＨ６１Ａポリペプチド無しでAspergillus oryzeaeベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質を含有する脱塩または未脱塩Trichoderma reesei発酵ブロスの（セルロース１グラムあたりの酵素のｍｇ数として表現された）恒常的な総タンパク質負荷を用いて、ＰＣＳの加水分解（ＰＣＳ中およそ１１．３％そしてｐＨ５．０の緩衝液中６．７％のセルロース）を実施した。実施例２２で記述されている通りにＰＣＳの加水分解能力の試験を実施した。セルロースからグルコースプラスセロビオース糖への転換度（転換％）を、実施例２２で記述されている等式を用いて計算した。
【０４７６】
酵素希釈物を、各実験の前に酵素原液から新鮮な状態で調製し、４℃に保管した。
【０４７７】
表４に示された結果は、０．００１から０．０１、０．１、１または１０ｍＭまで漸増的濃度でＭｎＳＯ4およびＭｇＣｌ2を添加することによって、ＭｎＳＯ4無しの当量のTrichoderma reeseiＳａＭｅ  ＭＦ２６８により得られるものを超えてグルコース転換が増大することを実証した。同様に、脱塩Trichoderma reeseiＳａＭｅ  ＭＦ２６８発酵ブロスに添加された場合は、０．００１、０．０１、０．１、１または１０ｍＭのＭｎＳＯ4を添加しても、およそ１ｍＭまでは全く増大を示さなかった。７２時間の加水分解についての結果は図８に示されている。
【０４７８】
したがって、Trichoderma reeseiＳａＭｅ  ＭＦ２６８発酵ブロスを含有する溶液中に、０．００１、０．０１、０．１、１または１０ｍＭという各金属イオン最終濃度までＭｎＳＯ4およびＭｇＣｌ2を添加することにより、酸での前処理を受けたトウモロコシ茎葉（ＰＣＳ）の加水分解時点でのグルコースおよびセロビオースの収量は増大した。したがって、脱塩Trichoderma reeseiＳａＭｅ  ＭＦ２６８発酵ブロスを含有する溶液に対して１ｍＭまたは１０ｍＭの最終濃度までＭｎＳＯ4およびＭｇＣｌ2を添加することで、酸での前処理を受けたトウモロコシ茎葉（ＰＣＳ）の加水分解時点のグルコースおよびセロビオースの収量は増大した。
【０４７９】
【表４】
2010528621.tif 000005
【０４８０】
生物材料の寄託
以下の生物材料がブタペスト条約の条項に基づきAgricultural Research Service Patent Culture Collection、Northern Regional Research Center、1815 University Street、Peoria、Illinois、61604に寄託され、以下の登録番号が付与された：
寄託物  登録番号  寄託年月日
E. coli菌株ｐＥＪＧ１２０  ＮＲＲＬ  Ｂ−３０６９９  ２００３年１２月１９日
E. coli菌株ｐＴｔｅｒ６１Ｃ  ＮＲＲＬ  Ｂ−３０８２３  ２００５年１月２１日
E. coli菌株ｐＴｔｅｒ６１Ｄ  ＮＲＲＬ  Ｂ−３０８１２  ２００５年１月２１日
E. coli菌株ｐＴｔｅｒ６１Ｅ  ＮＲＲＬ  Ｂ−３０８１４  ２００５年１月２１日
E. coli菌株ｐＴｔｅｒ６１Ｇ  ＮＲＲＬ  Ｂ−３０８１１  ２００５年１月２１日
E. coli菌株ｐＤＺＡ２−７  ＮＲＲＬ  Ｂ−３０７０４  ２００４年１月３０日
E. coli菌株ｐＴｒ３３３７  ＮＲＲＬ  Ｂ−３０８７８  ２００５年９月２０日
E. coliＴＯＰ１０（ｐＥＪＧ１１３）  ＮＲＲＬ  Ｂ−３０６９５  ２００３年１０月１７日
E. coliＴＯＰ１０ｐＫＫＡＢ  ＮＲＲＬ  Ｂ−３０８６０  ２００５年７月８日
ＮＮ０４９５７３  ＤＳＭ  １４２４０  ２００１年４月１９日
【０４８１】
菌株は、特許及び商標局局長によって３７．Ｃ．Ｆ．Ｒ．第１．１４条および３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．第１２２条に基づき有資格者と判定された者が本特許出願の係属期間中その培養を入手できるようにする条件の下で寄託された。寄託物を、寄託対象菌株の実質的に純粋な培養である。寄託物は、対象出願の対応物またはその後代が登録されている国における外国特許法が要求する通りに入手可能である。ただし、寄託物の利用可能性は、行政措置によって付与される特許権から逸脱して対象発明を実践するための許諾を成すものでないことを理解すべきである。
【０４８２】
本明細書中で記述され請求されている発明は、本明細書中に開示されている具体的態様が本発明の複数の態様の例示として意図されていることを理由として、これらの具体的態様によりその範囲が制限されるべきものではない。等価のあらゆる態様が本発明の範囲内に入るように意図される。実際、当業者にとっては以上の記述から、本明細書中で示され記述されているものに加え本発明のさまざまな修正が明らかとなる。かかる修正は同様に、添付のクレームの範囲内に入るように意図されている。不一致がある場合には、定義を含め本開示が支配する。
【０４８３】
本明細書にはさまざまな参考文献が引用されており、それらはその開示全体が参照により援用される。
【図１】
2010528621.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５】
2010528621.tif 000026
【図１６】
2010528621.tif 000027
【図１７】
2010528621.tif 000028
【図１８】
2010528621.tif 000029
【配列表】
2010528621000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年1月28日(2010.1.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロース分解増強活性を有するポリペプチドの活性を増大させる方法であって、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドを含む組成物に可溶性活性化二価金属カチオンを添加する工程を含み、ここで、可溶性活性化二価金属カチオンが、セルロース含有材料の分解または転換の間、約０．００１ｍＭ〜約５０ｍＭという有効濃度で存在し、かつ可溶性活性化二価金属カチオンとセルロース分解増強活性を有するポリペプチドの存在が、可溶性活性化二価金属カチオン無しのセルロース分解増強活性を有するポリペプチドに比べて、セルロース分解酵素組成物によるセルロース含有材料の分解または転換を増大させる方法。
【請求項２】
可溶性活性化二価金属カチオンが、Ｍｎ++、Ｃｏ++、Ｍｇ++、Ｃａ++およびその組合せからなる群から選択されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
セルロース分解増強活性を有するポリペプチドが、
（ａ）［ＩＬＭＶ］−Ｐ−Ｘ（４，５）−Ｇ−Ｘ−Ｙ−［ＩＬＭＶ］−Ｘ−Ｒ−Ｘ−［ＥＱ］−Ｘ（４）−［ＨＮＱ］および［ＦＷ］−［ＴＦ］−Ｋ−［ＡＩＶ］を含むセルロース分解増強活性を有し、式中Ｘが任意のアミノ酸であり、Ｘ（４，５）が４つまたは５つの隣接位置にある任意のアミノ酸であり、Ｘ（４）が４つの隣接位置にある任意のアミノ酸であるポリペプチド；および
（ｂ）［ＩＬＭＶ］−Ｐ−ｘ（４，５）−Ｇ−ｘ−Ｙ−［ＩＬＭＶ］−ｘ−Ｒ−ｘ−［ＥＱ］−ｘ（３）−Ａ−［ＨＮＱ］を含むセルロース分解増強活性を有し、式中Ｘが任意のアミノ酸であり、Ｘ（４，５）が４つまたは５つの隣接位置にある任意のアミノ酸であり、Ｘ（３）は、３つの隣接位置にある任意のアミノ酸であるポリペプチド；
からなる群から選択され、
ここで、［ＩＬＭＶ］−Ｐ−Ｘ（４，５）−Ｇ−Ｘ−Ｙ−［ＩＬＭＶ］−Ｘ−Ｒ−Ｘ−［ＥＱ］−Ｘ（４）−［ＨＮＱ］および［ＦＷ］−［ＴＦ］−Ｋ−［ＡＩＶ］を含むセルロース分解増強活性を有するポリペプチドが、任意にはさらに、
Ｈ−Ｘ（１，２）−Ｇ−Ｐ−Ｘ（３）−［ＹＷ］−［ＡＩＬＭＶ］、
［ＥＱ］−Ｘ−Ｙ−Ｘ（２）−Ｃ−Ｘ−［ＥＨＱＮ］−［ＦＩＬＶ］−Ｘ−［ＩＬＶ］、または
Ｈ−Ｘ（１，２）−Ｇ−Ｐ−Ｘ（３）−［ＹＷ］−［ＡＩＬＭＶ］および［ＥＱ］−Ｘ−Ｙ−Ｘ（２）−Ｃ−Ｘ−［ＥＨＱＮ］−［ＦＩＬＶ］−Ｘ−［ＩＬＶ］を含み、式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、Ｘ（１，２）は１つの位置または２つの隣接位置にある任意のアミノ酸であり、Ｘ（３）は３つの隣接位置にある任意のアミノ酸であり、Ｘ（２）は２つの隣接位置にある任意のアミノ酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
セルロース含有材料を分解または転換する方法であって、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドと可溶性活性化二価金属カチオンを有効量含む有効量のセルロース分解酵素組成物でセルロース含有材料を処理する工程を含み、ここで、可溶性活性化二価金属カチオンが、約０．００１ｍＭ〜約５０ｍＭという有効濃度で存在する方法。
【請求項５】
可溶性活性化二価金属カチオンが、Ｍｎ++、Ｃｏ++、Ｍｇ++、Ｃａ++およびその組合せからなる群から選択されている、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
セルロース分解増強活性を有するポリペプチドが、
（ａ）［ＩＬＭＶ］−Ｐ−Ｘ（４，５）−Ｇ−Ｘ−Ｙ−［ＩＬＭＶ］−Ｘ−Ｒ−Ｘ−［ＥＱ］−Ｘ（４）−［ＨＮＱ］および［ＦＷ］−［ＴＦ］−Ｋ−［ＡＩＶ］を含むセルロース分解増強活性を有し、式中Ｘが任意のアミノ酸であり、Ｘ（４，５）が４つまたは５つの隣接位置にある任意のアミノ酸であり、Ｘ（４）が４つの隣接位置にある任意のアミノ酸であるポリペプチド；および
（ｂ）［ＩＬＭＶ］−Ｐ−ｘ（４，５）−Ｇ−ｘ−Ｙ−［ＩＬＭＶ］−ｘ−Ｒ−ｘ−［ＥＱ］−ｘ（３）−Ａ−［ＨＮＱ］を含むセルロース分解増強活性を有し、式中Ｘが任意のアミノ酸であり、Ｘ（４，５）が４つまたは５つの隣接位置にある任意のアミノ酸であり、Ｘ（３）は、３つの隣接位置にある任意のアミノ酸であるポリペプチド；
からなる群から選択され、
ここで、［ＩＬＭＶ］−Ｐ−Ｘ（４，５）−Ｇ−Ｘ−Ｙ−［ＩＬＭＶ］−Ｘ−Ｒ−Ｘ−［ＥＱ］−Ｘ（４）−［ＨＮＱ］および［ＦＷ］−［ＴＦ］−Ｋ−［ＡＩＶ］を含むセルロース分解増強活性を有するポリペプチドが、任意にはさらに、
Ｈ−Ｘ（１，２）−Ｇ−Ｐ−Ｘ（３）−［ＹＷ］−［ＡＩＬＭＶ］、
［ＥＱ］−Ｘ−Ｙ−Ｘ（２）−Ｃ−Ｘ−［ＥＨＱＮ］−［ＦＩＬＶ］−Ｘ−［ＩＬＶ］、または
Ｈ−Ｘ（１，２）−Ｇ−Ｐ−Ｘ（３）−［ＹＷ］−［ＡＩＬＭＶ］および［ＥＱ］−Ｘ−Ｙ−Ｘ（２）−Ｃ−Ｘ−［ＥＨＱＮ］−［ＦＩＬＶ］−Ｘ−［ＩＬＶ］を含み、式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、Ｘ（１，２）は１つの位置または２つの隣接位置にある任意のアミノ酸であり、Ｘ（３）は３つの隣接位置にある任意のアミノ酸であり、Ｘ（２）は２つの隣接位置にある任意のアミノ酸である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
有効量のベータ−グルコシダーゼで、セルロース含有材料を処理する工程をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
ヘミセルラーゼ、エステラーゼ、プロテアーゼ、ラッカーゼ、ペルオキシダーゼまたはそれらの混合物からなる群から選択された１つ以上の有効量の酵素でセルロース含有材料を処理する工程をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
可溶性活性化二価金属カチオンの有効濃度を約０．００１ｍＭ〜約５０ｍＭに維持するべく可溶性活性化二価金属カチオンの濃度を補足する工程をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
分解されたセルロース含有材料を回収する工程をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
発酵産物を生産するための方法であって；（ａ）セルロース分解増強活性を有するポリペプチドおよび可溶性活性化二価金属カチオンを有効量含む有効量のセルロース分解酵素組成物でセルロース含有材料を糖化する工程であって、ここで可溶性活性化二価金属カチオンが、約０．００１ｍＭ〜約５０ｍＭという有効濃度で存在している工程；（ｂ）工程（ａ）の糖化されたセルロース含有材料を１つ以上の発酵用微生物で発酵させて発酵産物を生産する工程；および（ｃ）発酵から発酵産物を回収する工程を含む方法。
【請求項１２】
可溶性活性化二価金属カチオンが、Ｍｎ++、Ｃｏ++、Ｍｇ++、Ｃａ++およびその組合せからなる群から選択されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
セルロース分解増強活性を有するポリペプチドが、
（ａ）［ＩＬＭＶ］−Ｐ−Ｘ（４，５）−Ｇ−Ｘ−Ｙ−［ＩＬＭＶ］−Ｘ−Ｒ−Ｘ−［ＥＱ］−Ｘ（４）−［ＨＮＱ］および［ＦＷ］−［ＴＦ］−Ｋ−［ＡＩＶ］を含むセルロース分解増強活性を有し、式中Ｘが任意のアミノ酸であり、Ｘ（４，５）が４つまたは５つの隣接位置にある任意のアミノ酸であり、Ｘ（４）が４つの隣接位置にある任意のアミノ酸であるポリペプチド；および
（ｂ）［ＩＬＭＶ］−Ｐ−ｘ（４，５）−Ｇ−ｘ−Ｙ−［ＩＬＭＶ］−ｘ−Ｒ−ｘ−［ＥＱ］−ｘ（３）−Ａ−［ＨＮＱ］を含むセルロース分解増強活性を有し、式中Ｘが任意のアミノ酸であり、Ｘ（４，５）が４つまたは５つの隣接位置にある任意のアミノ酸であり、Ｘ（３）は、３つの隣接位置にある任意のアミノ酸であるポリペプチド；
からなる群から選択され、
ここで、［ＩＬＭＶ］−Ｐ−Ｘ（４，５）−Ｇ−Ｘ−Ｙ−［ＩＬＭＶ］−Ｘ−Ｒ−Ｘ−［ＥＱ］−Ｘ（４）−［ＨＮＱ］および［ＦＷ］−［ＴＦ］−Ｋ−［ＡＩＶ］を含むセルロース分解増強活性を有するポリペプチドが、任意にはさらに、
Ｈ−Ｘ（１，２）−Ｇ−Ｐ−Ｘ（３）−［ＹＷ］−［ＡＩＬＭＶ］、
［ＥＱ］−Ｘ−Ｙ−Ｘ（２）−Ｃ−Ｘ−［ＥＨＱＮ］−［ＦＩＬＶ］−Ｘ−［ＩＬＶ］、または
Ｈ−Ｘ（１，２）−Ｇ−Ｐ−Ｘ（３）−［ＹＷ］−［ＡＩＬＭＶ］および［ＥＱ］−Ｘ−Ｙ−Ｘ（２）−Ｃ−Ｘ−［ＥＨＱＮ］−［ＦＩＬＶ］−Ｘ−［ＩＬＶ］を含み、式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、Ｘ（１，２）は１つの位置または２つの隣接位置にある任意のアミノ酸であり、Ｘ（３）は３つの隣接位置にある任意のアミノ酸であり、Ｘ（２）は２つの隣接位置にある任意のアミノ酸である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
有効量のベータ−グルコシダーゼで、セルロース含有材料を処理する工程をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
ヘミセルラーゼ、エステラーゼ、プロテアーゼ、ラッカーゼ、ペルオキシダーゼまたはそれらの混合物からなる群から選択された１つ以上の有効量の酵素でセルロース含有材料を処理する工程をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
可溶性活性化二価金属カチオンの有効濃度を、約０．００１ｍＭ〜約５０ｍＭに維持するべく可溶性活性化二価金属カチオンの濃度を補足する工程をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
セルロース分解増強活性を有するポリペプチドおよび可溶性活性化二価金属カチオンを含むセルロース分解酵素組成物であって、可溶性活性化二価金属カチオンが、セルロース含有材料の分解または転換の間、約０．００１ｍＭ〜約５０ｍＭという有効濃度で存在し、かつ可溶性活性化二価金属カチオンとセルロース分解増強活性を有するポリペプチドの存在が、可溶性活性化二価金属カチオン無しのセルロース分解増強活性を有するポリペプチドに比べて、セルロース分解酵素組成物によるセルロース含有材料の分解または転換を増大させるセルロース分解酵素組成物。
【請求項１８】
可溶性活性化二価金属カチオンが、Ｍｎ++、Ｃｏ++、Ｍｇ++、Ｃａ++およびその組合せからなる群から選択されている、請求項１７に記載のセルロース分解酵素組成物。
【請求項１９】
セルロース分解増強活性を有するポリペプチドおよび可溶性活性化二価金属カチオンを含む組成物であって、可溶性活性化二価金属カチオンが、セルロース含有材料の分解または転換の間、約０．００１ｍＭ〜約５０ｍＭという有効濃度で存在し、かつ可溶性活性化二価金属カチオンとセルロース分解増強活性を有するポリペプチドの存在が、可溶性活性化二価金属カチオン無しのセルロース分解増強活性を有するポリペプチドに比べて、セルロース分解酵素組成物によるセルロース含有材料の分解または転換を増大させる組成物。
【請求項２０】
可溶性活性化二価金属カチオンが、Ｍｎ++、Ｃｏ++、Ｍｇ++、Ｃａ++およびその組合せからなる群から選択されている、請求項１９に記載の組成物。
【国際調査報告】
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