(57)【要約】  ＴＬＲ３活性のモジュレーター、及びそれらの使用が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つのＴＬＲ３阻害性オリゴヌクレオチド（ｉＯＧＮ）を哺乳類に投与することを含む、前記哺乳類のＴｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）活性を抑制的に調節する方法。
【請求項２】
前記ｉＯＧＮが、長さにおいて約１７〜約７５ヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｉＯＧＮが、塩基、リボース、リン酸ジエステル、又はホスホロチオエート基に修飾を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ｉＯＧＮがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、３、４、５、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、１９、２０、２１、２２又は２３に示される配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記哺乳類がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ｉＯＧＮが、ＴＬＲ３に対して特異的な、モノクローナル抗体、抗体断片、代替的足場、タンパク、又はペプチドと連結している、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも一つの前記ｉＯＧＮ及びＴＬＲ３活性の別の非ｉＯＧＮモジュレーターを組み合わせて投与することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記非ｉＯＧＮモジュレーターが、ＴＬＲ３に対して特異的である、抗体、ミメティボディ（商標）コンストラクト、若しくは小分子、又は他のＴＬＲ受容体である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記非ｉＯＧＮモジュレーターが、ＴＬＲ３のリガンドに特異的である、抗体、ミメティボディ（商標）コンストラクト、若しくは小分子、又は他のＴＬＲ受容体である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも一つの前記ｉＯＧＮ及び抗炎症剤を組み合わせて投与することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも一つの前記ｉＯＧＮ及び抗菌剤を組み合わせて投与することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも一つの前記ｉＯＧＮ及び抗ウイルス剤を組み合わせて投与することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
治療のために有効な量のＴＬＲ３  ｉＯＧＮを、炎症状態の治療又は予防を必要とする患者に、炎症状態を治療又は予防するのに十分な時間にわたり投与することを含む、炎症状態の治療又は予防法。
【請求項１４】
前記炎症状態が感染に付随するものである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記炎症状態が、膵臓炎、円形脱毛症、アトピー性皮膚炎、自己免疫性肝炎、ベーチェット病、肝硬変、肝繊維症、クローン病、限局性腸炎、炎症性白斑、多発性硬化症、天疱瘡／類天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、強皮症、硬化性胆管炎、全身性紅斑性狼瘡、ループス腎炎、中毒性表皮壊死症、潰瘍性大腸炎、いぼ、肥厚性瘢痕、ケロイド、又はアセトアミノフェン誘発性障害である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
治療のために有効な量のＴＬＲ３  ｉＯＧＮを、壊死状態の治療又は予防を必要とする患者に、壊死状態を治療又は予防するのに十分な時間にわたり投与することを含む、壊死状態の治療又は予防法。
【請求項１７】
前記壊死状態が急性腎不全である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
治療のために有効な量のＴＬＲ３  ｉＯＧＮを、感染性疾患の治療又は予防を必要とする患者に、感染性疾患を治療又は予防するのに十分な時間にわたり投与することを含む、感染性疾患の治療又は予防法。
【請求項１９】
前記感染症が、炭疽病、クロストリジウム・ディフィシル（C. Difficile）感染、脳炎／髄膜炎、心内膜炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ／重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、肺炎、敗血症、火傷性又は外傷性皮膚適応症（burn or trauma-related skin indications）、又は全身性炎症反応症（ＳＩＲＳ）である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
治療のために有効な量のＴＬＲ３  ｉＯＧＮを、心臓血管疾患の治療又は予防を必要とする患者に、心臓血管疾患を治療又は予防するのに十分な時間にわたり投与することを含む、心臓血管疾患の治療又は予防法。
【請求項２１】
前記心臓血管疾患が、動脈硬化、心筋梗塞又は脳卒中である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２２】
治療のために有効な量のＴＬＲ３  ｉＯＧＮを、Ｉ型又はＩＩ型糖尿病の治療又は予防を必要とする患者に、Ｉ型又はＩＩ型糖尿病を治療又は予防するのに十分な時間にわたり投与することを含む、Ｉ型又はＩＩ型糖尿病の治療又は予防法。
【請求項２３】
治療のために有効な量のＴＬＲ３  ｉＯＧＮを、がんの治療又は予防を必要とする患者に、がんを治療又は予防するのに十分な時間にわたり投与することを含む、がんの治療又は予防法。
【請求項２４】
前記がんが、急性白血病、乳がん、慢性白血病、結腸直腸癌、食道がん、胃がん、ホジキン病、肺がん、リンパ腫、黒色腫、多発性骨髄腫、非ホジキン病、子宮がん、膵臓がん、前立腺がん、非上皮性悪性腫瘍、腎細胞がん、頭頸部癌、又はウイルス誘発性がんである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
治療のために有効な量のＴＬＲ３  ｉＯＧＮを、リウマチ疾患の治療又は予防を必要とする患者に、リウマチ疾患を治療又は予防するのに十分な時間にわたり投与することを含む、リウマチ疾患の治療又は予防法。
【請求項２６】
前記リウマチ性疾患が、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性血管炎、円板状紅斑性狼瘡、ループス腎炎、変形性関節症、多発性軟骨炎、リウマチ性多発筋痛症（polymyalgia rheumatica）、乾癬性関節炎、関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、又は全身性強皮症である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
治療のために有効な量のＴＬＲ３  ｉＯＧＮを、肺疾患の治療又は予防を必要とする患者に、肺疾患を治療又は予防するのに十分な時間にわたり投与することを含む、肺疾患の治療又は予防法。
【請求項２８】
前記肺疾患が、急性肺障害、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、急性喘息悪化、急性ＣＯＰＤ悪化、特発性肺繊維症、又は類肉腫である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
治療のために有効な量のＴＬＲ３  ｉＯＧＮを、神経疾患の治療又は予防を必要とする患者に、神経疾患を治療又は予防するのに十分な時間にわたり投与することを含む、神経疾患の治療又は予防法。
【請求項３０】
前記神経疾患が、脳卒中、アルツハイマー型認知症、髄膜炎、脊髄障害、外傷、脱髄疾患、又は痛みである請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、１９、２０、２１、２２、又は２３に示される配列を有するｉＯＧＮ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）活性のオリゴヌクレオチド・モジュレーターとその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
固有の免疫系受容体は、サイトカイン生成をもたらす複雑な生体反応のカスケードを制御するための有望な標的である4。これらの受容体は、病原体のリガンドをその分子シグネチャーを介して認識し、そのときに遺伝子発現を変化させるいくつかのシグナル伝達カスケードを使用することにより、このプロセスに関与する。前記Ｔｏｌｌ様受容体は、病原体感染を見張る、構造的に関連する膜１回通過型のクラスＩタンパクのファミリーである5〜7。哺乳類のゲノム中には、それらが認識する、高度に保存された微生物タンパク、病原体の細胞壁構成成分、病原体に付随する核酸などの病原体分子の種類によって分けられる、少なくとも１１種類のＴＬＲが特定されている8。
【０００３】
以下の４種類の核酸結合性ＴＬＲが存在する：Ｔｏｌｌ様受容体７及び８であり、これらは一本鎖のＲＮＡを認識する4〜6；ＴＬＲ９であり、これは過少にメチル化された（hypomethylated）ＣｐＧモチーフを含む一本鎖のＤＮＡ分子を認識する9、及びＴＬＲ３であり、これは二本鎖のＲＮＡを認識する10。実験室の研究では、合成二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡアナログであるｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）は、ｄｓＲＮＡのモデル及びＴＬＲ３のリガンドとして機能する11。ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）は特に低ｐＨ領域でＴＬＲ３に結合され、このことはたぶん、ＴＬＲ３がその局限される酸性の小胞内の境界内でｄｓＲＮＡリガンドと結合することを示唆している12、13。ヒトＴＬＲ３のアミノ酸配列の全長がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示される。
【０００４】
ＴＬＲ３の同族リガンドへの結合は、ＮＦ−κＢ因子の転写の活性化を通じて、下流のサイトカインとケモカインの産生を調節し、ＮＦ−κＢ因子は細胞核に転座して遺伝子発現を調節する14、15。ウイルス感染におけるＴＬＲ３の役割は、ＴＬＲ３ノックアウト・マウスがサイトメガロ・ウイルス感染に対して完全な応答ができないという事実の実証に基づいて示唆され16、たぶんＴＬＲ３は初期感染後の細胞傷害性Ｔ細胞の応答に寄与していると考えられる17。
【０００５】
ＮＦ−κＢ活性化に基づくＴＬＲ３のリポーター・アッセイ（reporter assay）は確立されており、当業者により一般に使われている14、15。インターフェロン・ガンマ、ＩＬ−１α、ＩＰ−１０及びＭＩＧなどの産生されるサイトカイン及びケモカインの量の算定によってもＴＬＲ３の効果のモニターは可能である18。ＮＦ−κＢレポーターのＴＬＲ３による活性化、又はサイトカインの産生は「ＴＬＲ３活性」として認識される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＴＬＲ３活性により産生されるサイトカインの種類と量は、病原体による感染の転帰を決定付け、また結腸炎、喘息、乾癬、敗血症性ショックを含むいくつかの疾患を特徴付ける、一連の炎症に付随したシステムを引き起こす1〜3。更に壊死性疾患では、細胞膜損傷後の細胞内物質の放出が、サイトカイン、ケモカイン、及び他の因子の炎症による発現を引き起こし、これらは、死んだ細胞の断片の清掃と損傷の修復を促進する。壊死はしばしば、慢性又は異常な炎症のプロセスを永続化させ、二次的損傷や影響のカスケードを引き起こす。このように、ＴＬＲ３活性の抑制的調節を通じたサイトカイン産生制御の必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一態様は、少なくとも一つのＴＬＲ３抑制的調節活性を有するオリゴヌクレオチド（ｉＯＧＮ）を哺乳類に投与することを含む、前記哺乳類でのＴｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）活性の抑制的調節のための方法である。
【０００８】
本発明の別の態様は、ＴＬＲ３  ｉＯＧＮの有効治療量を、炎症性疾患の治療又は予防を必要とする患者に、炎症性疾患の治療又は予防に必要な十分な時間にわたって投与することを含む、炎症性疾患の治療又は予防法である。
【０００９】
本発明の別の態様は、ＴＬＲ３  ｉＯＧＮの有効治療量を、壊死性疾患の治療又は予防を必要とする患者に、壊死性疾患の治療又は予防に必要な十分な時間にわたって投与することを含む、壊死性疾患の治療又は予防法である。
【００１０】
本発明の別の態様は、ＴＬＲ３  ｉＯＧＮの有効治療量を、炎症性疾患の治療又は予防を必要とする患者に、炎症性疾患の治療又は予防に必要な十分な時間にわたって投与することを含む、炎症性疾患の治療又は予防法である。
【００１１】
本発明の別の態様は、ＴＬＲ３  ｉＯＧＮの有効治療量を、心臓血管疾患の治療又は予防を必要とする患者に、心臓血管疾患の治療又は予防に必要な十分な時間にわたって投与することを含む、心臓血管疾患の治療又は予防法である。
【００１２】
本発明の別の態様は、ＴＬＲ３  ｉＯＧＮの有効治療量を、Ｉ又はＩＩ型糖尿病の治療又は予防を必要とする患者に、Ｉ又はＩＩ型糖尿病の治療又は予防に必要な十分な時間にわたって投与することを含む、Ｉ又はＩＩ型糖尿病の治療又は予防法である。
【００１３】
本発明の別の態様は、ＴＬＲ３  ｉＯＧＮの有効治療量を、がんの治療又は予防を必要とする患者に、がんの治療又は予防に必要な十分な時間にわたって投与することを含む、がんの治療又は予防法である。
【００１４】
本発明の別の態様は、ＴＬＲ３  ｉＯＧＮの有効治療量を、リウマチ疾患の治療又は予防を必要とする患者に、リウマチ疾患の治療又は予防に必要な十分な時間にわたって投与することを含む、リウマチ疾患の治療又は予防法である。
【００１５】
本発明の別の態様は、ＴＬＲ３  ｉＯＧＮの有効治療量を、肺疾患の治療又は予防を必要とする患者に、肺疾患の治療又は予防に必要な十分な時間にわたって投与することを含む、肺疾患の治療又は予防法である。
【００１６】
本発明の別の態様は、ＴＬＲ３  ｉＯＧＮの有効治療量を、神経疾患の治療又は予防を必要とする患者に、神経疾患の治療又は予防に必要な十分な時間にわたって投与することを含む、神経疾患の治療又は予防法である。
【００１７】
本発明の別の態様は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、１９、２０、２１、２２、２２、又は２３に示される配列を有するＯＧＮである。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）存在下でのＯＤＮ２００６のＴＬＲ３及びＴＬＲ９活性への影響。
【図１Ｂ】ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）存在下でのＯＤＮ２００６のＴＬＲ３及びＴＬＲ９活性への影響。
【図２】ＯＤＮ２００６濃度のＴＬＲ３活性への影響。
【図３】ＯＤＮ２００６によるＴＬＲ３活性阻害へのｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の影響。
【図４】ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）による活性化後の、ＯＤＮ２００６のＴＬＲ３活性への影響。
【図５】タイプＡ及びタイプＢオリゴヌクレオチドのＴＬＲ３活性への影響と制御。
【図６】オリゴヌクレオチドのＴＬＲ３活性の安定性への影響。
【図７】リン酸ジエステル型オリゴヌクレオチドのＴＬＲ３活性への影響。
【図８】オリゴヌクレオチドの長さのＴＬＲ３活性への影響。
【図９】ヒトＰＢＭＣによるインターフェロン−γ（ＩＦＮγ）の産生。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
特許及び特許出願を含み、それらには限定されない全ての刊行文献は、本明細書への参照により、完全に説明されているごとくに、本願に包含される。
【００２０】
本願で用いられる「ＴＬＲ３阻害性オリゴヌクレオチド（ｉＯＧＮ）」又は「ｉＯＧＮ」という用語は、直接的又は間接的にＴＬＲ３の生理活性又はＴＬＲ３受容体の活性化を実質的に低減させる能力を有する分子を示すか、言及するか、又は記述するものである。これらの用語は単数又は複数を指し示すために使用される。
【００２１】
本願で用いられる「〜と組み合わせて（in combination with）」という用語は、記述の対象である薬剤が、他の薬剤と共に、混合物中で一緒に、又は単独薬剤として同時に、又は単独薬剤として順次に任意の順序で、動物に投与されうることを意味する。
【００２２】
本発明は、ＴＬＲ３活性の抑制的モジュレーターである一本鎖の阻害性オリゴヌクレオチド（ｉＯＧＮ）に関する。本発明の前記モジュレーターはオリゴデオキシリボヌクレオチド又はオリゴデオキシヌクレオチドであってもよく、顕著にヒトＴｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）により開始される遺伝子の発現パターンを抑制的に調節して、それによりサイトカイン産生を調節制御する。サイトカイン分泌は免疫応答形成の鍵となる中間段階である。本発明の前記ｉＯＧＮモジュレーターは、ヒトのような哺乳類での炎症又は壊死を特徴とする病理学的な疾患の治療又は予防に有用である。
【００２３】
ネズミ科動物の細胞でのＴＬＲ３及びＴＬＲ９リガンドの組み合わせの効果についての刊行された報告は、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）及びＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）による活性化後の増大されたサイトカイン応答を示している23。予期されなかったことに、本発明では、ヒト細胞において、ある種のＯＤＮが、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）により引き起こされたＴＬＲ３活性化の抑制的調節活性を有し、結果として、サイトカイン産生の減少を引き起こすことが観察された。ＴＬＲ３の抑制的調節活性の有る、これらのＯＤＮ、その誘導体、及び他のオリゴヌクレオチドは、以下では阻害的オリゴヌクレオチド（ｉＯＧＮ）と識別される。
【００２４】
ＴＬＲ３を抑制的に調節するｉＯＧＮ分子の配列は、関連するＴｏｌｌ様受容体であるＴＬＲ９を活性化するものとは明白に異なっている。更に、これらのｉＯＧＮ分子は、リン酸ジエステルとホスホロチオエートの混合した連鎖又はリン酸ジエステル単独の連鎖を持つことができる。典型的なｉＯＧＮ配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、１９、２０、２１、２２、２２、又は２３に示される。更に、前記ｉＯＧＮの抑制的調節活性は、ＴＬＲ１、２、４、５、６、７、又は８のいずれの存在によっても全く影響を受けない。更に、本発明のｉＯＧＮが修飾された塩基、リボース誘導体、及び／又は他のリン酸ジエステル若しくはホスホロチオエートの連鎖誘導体を含むことができることが予期される。修飾には、天然のホスホロアミダイト、２’−ｏＭｅ、固定型核酸（locked nucleic acid）（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（peptide nucleic acid）（ＰＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、Ｆ−ＲＮＡ及び他の修飾塩基が含まれる。
【００２５】
本発明は、更にＴＬＲ３の調節活性を持つｉＯＧＮの設計に関する。調節の程度は、その長さ、塩基配列、及び修飾の程度などの前記ｉＯＧＮ分子の性質により操作可能である。本発明のｉＯＧＮで観察された構造−活性相関は、炎症と壊死により特徴付けられる病理学的疾患に重点を置いた、莫大な数のヒトの疾患の転帰に影響することができる分子の設計の基盤として有用である。
【００２６】
一実施例では、本発明は、哺乳類（ヒトのような）においてＴＬＲ３活性の抑制的調節を行いＴＬＲ３により活性化されるサイトカイン及びケモカイン産生を低減するための、一つの非修飾ｉＯＧＮ又は一つの非修飾ｉＯＧＮと一つ又は複数の異なった鎖長及び／又は塩基配列の非修飾ｉＯＧＮを組み合わせて使用する方法を提供する。
【００２７】
別の実施例では本発明の方法は、少なくとも一つのｉＯＧＮと、他のＴＬＲ３活性のモジュレーターの非ｉＯＧＮを組み合わせて使用する方法を提供する。前記非ｉＯＧＮモジュレーターは、抗体、ミメティボディ（MIMETIBODY）（商標）コンストラクト（construct）、又はＴＬＲ３また或いは他のＴＬＲ受容体に特異的な小分子であることができる。ミメティボディ（MIMETIBODY）（商標）コンストラクトは、下記一般式（Ｉ）を有する：
（Ｂｐ−Ｌｋ−（Ｖ２）y−Ｈｇ−ＣH２−ＣH３）(t)
（Ｉ）
ここにおいて、Ｂｐは標的分子に結合する能力を有するペプチド又はポリペプチド、Ｌｋはポリペプチド又は化学的連鎖、Ｖ２は免疫グロブリンの可変部分のＣ−端末部分、Ｈｇは少なくとも免疫グロブリンの可変ヒンジ領域、ＣH２は免疫グロブリン重鎖のＣH２定常領域、及びＣH３は免疫グロブリン重鎖のＣH３定常領域、ｙは０又は１であり、ｔは独立する１から１０までの整数である。
【００２８】
別の実施例では、増大された安定性、増大された細胞及び細胞膜の通過能力、増大されたＴＬＲ３活性に影響する特異性を含み、それらには限定されない所望の性質を授与しうる、化学的にかつ共有結合により修飾されたｉＯＧＮを単独又は組み合わせにより、ＴＬＲ３によるサイトカイン及びケモカイン産生の調節に使用できる。前記修飾は、小分子部分、又は染料により構成されることができ、そのいくつかの例は、ヌクレオチド中のヌクレオチド塩基、リボース及びリン酸ジエステルへの付加、又は改変を含む。前記修飾は更に、共有結合又は非共有結合によりＤＮＡに連結することのできる、タンパク、又は他のＤＮＡ、ＲＮＡ及び多糖類のような巨大分子を含むことができる。前記修飾は更に、一つ若しくは複数の小分子若しくは巨大分子、又は小分子若しくは幾つかのサブユニットを有する巨大分子を含むことができる。更に、前記修飾は生物学的利用性を向上するために、エステル化された、又は部分的にエステル化されたホスホノ酢酸を含むことができる。
【００２９】
本発明更に別の実施例では、前記ｉＯＧＮは、ＴＬＲ３特異的な、モノクローナル抗体、抗体の断片、設計アンキリン反復タンパク（ＤＡＲＰｉｎｓ）22、24のような代替的足場、タンパク、ミメティボディ（商標）コンストラクト、又はペプチドに連結されることができる。
【００３０】
更に別の実施例では、本発明の方法は抗炎症剤と組み合わせた、少なくとも一つのｉＯＧＮの使用を提供する。
【００３１】
更に別の実施例では、本発明の方法は、抗真菌剤又は抗原生動物剤を含む抗菌剤と組み合わせた、少なくとも一つのｉＯＧＮの使用を提供する。
【００３２】
更に別の実施例では、本発明の方法は、抗ウイルス剤と組み合わせた、少なくとも一つのｉＯＧＮの使用を提供する。
【００３３】
いかなる特定の理論に束縛されることも望まないが、前記本発明のｉＯＧＮは、たぶんＴＬＲ３分子内の一つ又は複数の部位に結合することにより、直接ＴＬＲ３に作用するか、又は、たぶん付属タンパク質がＴＬＲ３の機能に寄与することを防止することにより、間接的にＴＬＲ３に作用すると考えられる。
【００３４】
ＴＬＲ３の抑制的調節活性を有するｉＯＧＮは、炎症性疾患、壊死性疾患、感染性疾患、心臓血管疾患、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、がん、リウマチ疾患、肺疾患及び神経疾患を含むが、これらには限定されない一連の哺乳類の疾患状態の治療又は予防に有用である。
【００３５】
典型的な炎症性疾患には、感染に付随する炎症とともに、膵臓炎、円形脱毛症、アトピー性皮膚炎、自己免疫性肝炎、ベーチェット病、肝硬変、肝繊維症、クローン病、限局性腸炎、炎症性白斑、多発性硬化症、天疱瘡／類天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、強皮症、硬化性胆管炎、全身性紅斑性狼瘡、ループス腎炎、中毒性表皮壊死症、潰瘍性大腸炎、いぼ、肥厚性瘢痕、ケロイド及びアセトアミノフェン誘発性障害が含まれる。
【００３６】
典型的な壊死性疾患には、急性腎不全が含まれる。
【００３７】
典型的な感染性疾患には、炭疽病、クロストリジウム・ディフィシル（C. Difficile）感染、脳炎／髄膜炎、心内膜炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ／重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、肺炎、敗血症、火傷性又は外傷性皮膚適応症（burn or trauma-related skin indications）及び全身性炎症反応症（ＳＩＲＳ）が含まれる。
【００３８】
典型的な心臓血管疾患には、動脈硬化、心筋梗塞及び脳卒中が含まれる。
【００３９】
典型的ながんには、急性白血病、乳がん、慢性白血病、結腸直腸癌、食道がん、胃がん、ホジキン病、肺がん、リンパ腫、黒色腫、多発性骨髄腫、非ホジキン病、子宮がん、膵臓がん、前立腺がん、非上皮性悪性腫瘍、腎細胞がん、頭頸部癌及びウイルス誘発性がんが含まれる。
【００４０】
典型的なリウマチ疾患には、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性血管炎、円板状紅斑性狼瘡、ループス腎炎、変形性関節症、多発性軟骨炎、リウマチ性多発筋痛症（polymyalgia rheumatica）、乾癬性関節炎、関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡及び全身性強皮症を含む。
【００４１】
典型的な肺疾患には、急性肺障害、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、急性喘息悪化、急性ＣＯＰＤ悪化、特発性肺繊維症又は類肉腫が含まれる。
【００４２】
典型的な神経疾患には、脳卒中、アルツハイマー型認知症、髄膜炎、脊髄障害、外傷、脱髄疾患及び痛みが含まれる。
【００４３】
本発明で有用な前記ｉＯＧＮは、当業者にはよく知られたオリゴヌクレオチド合成技術により作成できる。
【００４４】
本発明の前記ｉＯＧＮを使用する治療又は予防のための投与の態様は、薬剤をホストに送達できるいずれの適切な経路であってもよい。前記ＯＤＮ、及び小分子、抗体、抗体の断片並びにミメティボディ、並びにこれらを含む薬学的な組成物を含むいずれの治療の相手の組み合わせも、非経口的投与、すなわち局所又はアエロゾル投与経路と同時に、皮下、筋肉内、皮内、静脈内、又は鼻腔内投与により、直接肺などの標的器官に送達されることができる。
【００４５】
本発明の前記ｉＯＧＮは、薬学的に受容可能なキャリア内の活性成分として、その薬剤の有効量を含有する薬学的組成物として調製することができる。直ちに注入可能な、好ましくは生理的ｐＨに緩衝された、前記薬剤を含む水性けん濁液又は溶液が好適である。非経口的投与のための前記組成物は、通常、本発明の結合薬剤の溶液、又は、該溶液と、好適には水性のキャリアである薬学的に受容可能なキャリアとの混合物よりなることができる。例えば、０．４％生理食塩水や０．３％グリセリンなどの、種々の水性キャリアを援用することができる。
【００４６】
これらの薬学的組成物の溶液は無菌であり、通常は特定の粒子状の物質を含まない。これらの溶液は、従来の、よく知られた殺菌技術（例えば、ろ過）などにより殺菌される。前記組成物は、生理学的状態に近づける場合に必要な、ｐＨ調整剤や緩衝剤のような薬学的に許容可能な補助物質を含むことができる。そのような薬学的製剤中の本発明のＯＤＮの濃度は、幅広く変化することができ、すなわち、重量百分率で約０．５％未満から、通常は約１％又は少なくとも約１％から、１５又は２０％まで変化でき、主に選択された投与の態様に適合した液体の容積、粘度などに基づいて選択される。
【００４７】
このように、筋肉内注射用の本発明の薬学的組成物は、１１ｍＬの無菌緩衝水、及び約１ｎｇから約１００ｍｇの間の、例えば約５０ｎｇから約３０ｍｇの間の、又はより具体的には約５ｍｇから約２５ｍｇの間の本発明のｉＯＧＮを含むように調製されることができる。同様に、静脈内注射用の本発明の薬学的組成物は、２５０ｍＬの無菌リンゲル溶液、及び約１ｍｇから約３０ｍｇの、又はより具体的には、約５ｍｇから約２５ｍｇの本発明のＯＤＮを含むように調製されることができる。非経口的投与可能な組成物の実際の調製方法は、当業者には周知又は自明であり、その詳細は例えば「レミントン：薬局の科学と実務（以前の題名は「レミントンの薬科学」）」第１９版、マック・パブリッシング・カンパニー、イーストン、ペンシルバニア州（１９９５）（"Remington：The Science and Practice of Pharmacy（Formerly Remington's Pharmaceutical Sciences）", 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA（1995））などに記載されている。
【００４８】
本発明の前記ｉＯＧＮは、薬学的組成物内にあるときには、単位用量の形で存在することができる。適切な治療に有効な投与量は、当業者にとっては直ちに決定することができる。決定された投与量は、必要ならば、治療期間中、医師により適切として選ばれた適切な時間的間隔をおいて、反復投与することができる。
【００４９】
本発明の前記ｉＯＧＮは、保存のために凍結乾燥することができ、使用前に適切なキャリア中に再構成できる。この技術は従来の免疫グロブリン及びタンパクの調製において有効であることが示されており、周知の凍結乾燥と再構成の技術を援用することができる。
【００５０】
ここで、以下の具体的かつ非限定的な実施例を参照して、本発明を説明する。
【実施例】
【００５１】
（実施例１）
培養下のヒト細胞による一本鎖ＤＮＡのサイトカイン／ケモカイン産生への効果の判定
ヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ  ２９３Ｔ）を活発に増殖している培養液から収穫してコスター・ホワイト（CoStar White）９６−孔プレートに４．４×１０4／孔の濃度で形質移入のために播種した。細胞が約８５から９０％に密集したときに、それらをリポフェクタミン（Lipofectamine）２０００（インビトロジェン社、サン・ディエゴ、カリフォルニア州（Invitrogen Inc., San Diego, CA））及びプラスミドｐＮＦ−κＢ−Ｌｕｃ（ストラタジェン（Stratagene））又は各々ホタルのルシフェラーゼ・レポーター、野生型ＴＬＲ３の全長、及びウミシイタケのルシフェラーゼをコードしている、ｐＮｉＦｔｙ−Ｌｕｃ（インビトロジェン社、サン・ディエゴ、カリフォルニア州（Invitrogen Inc., San Diego, CA））、ｐＵＮＯ−ｈｕＴＬＲ３（インビトロジェン）、及びｐｈＲＬ−ＴＫ（プロメガ社、マディソン、ウイスコンシン州（Promega Corp., Madison, WI））の混合物により形質移入した。プラスミドからの発現を可能にするために、前記細胞を２４時間インキュベートした。その後、適切な形質移入された細胞の集合に、ＴＬＲ３依存性ＮＦ−κＢ活性を生じさせるために、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（２．５μｇ／ｍＬ）及び／又はＯＤＮ２００６として知られる前記一本鎖の修飾ＤＮＡを加えた。Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）は、ＧＥアマシャム（GE Amersham）より購入し、ＰＢＳ中で５０℃に加熱しながら再構成した。ＯＤＮ２００６はインビトロジェンから得た。更に２４時間のインキュベーションの後、前記細胞はデュアルグロ（Dual Glo）ルシフェラーゼ・アッセイ・システム（プロメガ社、マディソン、ウイスコンシン州（Promega Inc., Madison WI））を用いて収穫した。発光は、フルオスター・オプチマ・プレート・リーダー（FLUOstar OPTIMA Plate Reader）（ＢＭＧラボテック社（BMG Labtech, Inc））を用いて測定した。データはＮＦ−ｋＢホタル相対光単位（firefly relative light units：RLUs）を対照であるウミシイタケルのＲＬＵで除して得られるルシフェラーゼの率か、又は全ての処理群のルシフェラーゼ率を活性化されないＴＬＲ３形質移入細胞のルシフェラーゼ率で除した倍率（fold induction）かによって表されている。
【００５２】
ＴＬＲ３の活性化は、その同族リガンドを必要とし、例として、二本鎖のＲＮＡミミック（mimic）であるｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）は、非誘導対照に比して、そのＮＦ−κＢレポーター産生を４から１６倍活性化する（図１Ａ）。ＴＬＲ９の活性化は、ＯＤＮ２００６の添加を必要とし、通常は非誘導対照に比して、３から８倍活性化される（図１Ａ）。ＯＤＮ２００６は、ホスホロチオエートの骨格とＣｐＧモチーフを有し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示される配列を有する19、20。ホスホロチオエートは、細胞内分子の安定性を増大させることが知られている21。
【００５３】
図１に示される結果は、ＯＤＮ２００６が、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）に誘発されるＴＬＲ３活性化により媒介されるＮＦ−κＢの活性化を阻害し、ＴＬＲ９活性にはなんら影響しないことを示している。ＴＬＲ９ではなく、ＴＬＲ３がｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）及びＯＤＮ２００６の存在により阻害される。図１Ａで、ＮＦ−κＢプロモーターとチミジン・キナーゼ・プロモーターの存在下で、ＴＬＲ３又はＴＬＲ９を発現できるプラスミドは、ホタル・ルシフェラーゼをコードする受容体プラスミドと共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質移入される。２４時間にわたるプラスミドの発現後、前記細胞はｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）又はＯＤＮ２００６のいずれかと誘導される。棒グラフは、非誘導対照に対するＴＬＲ活性の倍率（倍率）を示し、棒グラフの上の数字により倍率が示されている。図１Ｂでは、上述のようにセル・ベースド・アッセイ（cell based assay）を行い、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、ＯＤＮ２００６又はその両方と誘導されている。ＴＬＲ３及びＴＬＲ９活性の倍率がプロットされた。
【００５４】
Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（２．５μｇ／ｍＬ）及びＯＤＮ２００６（２μＭ）が添加されたとき、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）単独の場合の７倍に比較して、ＴＬＲ３活性はバックグラウンドの１．３倍まで誘導された（図１Ｂ）。更に、このＴＬＲ３誘導の阻害は、二つの異なる濃度のＴＬＲ３発現プラスミドに形質移入された細胞でも観察された。二つのリガンドの組み合わせはＴＬＲ９活性には影響せず、そのことにより阻害効果はＴＬＲ３に特異的であることが示される（図１Ｂ）。
【００５５】
（実施例２）
他の核酸のＴＬＲ３活性調節効果
二つのプラスミドＤＮＡ及びｐｏｌｙ（Ｉ）、ｐｏｌｙ（Ｃ）、及びｐｏｌｙ（Ｕ）からなる一本鎖のＲＮＡの、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）により誘発されたＴＬＲ３活性への影響が試験された（表１）。ＴＬＲ３活性は実施例１の方法により測定された。ＯＤＮ２００６とは異なり、これらの他の形態の核酸はＴＬＲ３活性を７３％以下には低減しなかった（表１）。これらの結果は、一本鎖のＯＤＮ２００６が、ＴＬＲ３活性阻害に要求される特徴を含んでいることを実証した。
【００５６】
【表１】
2010527633.tif 000002
【００５７】
（実施例３）
ＯＤＮ２００６及びｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）濃度と、添加時間の調節活性への影響
ＴＬＲ３活性の阻害の阻害がＯＤＮ２００６濃度に依存するか否かを試験するために、最終濃度で０．１から２μＭのＯＤＮ２００６をＴＬＲ３活性のアッセイ系に加えた（図２）。阻害効果はＯＤＮ２００６の濃度に依存することが見出され、５０％阻害は約０．１μＭで見出された。
【００５８】
ＯＤＮ２００６に媒介されるＴＬＲ３の阻害が、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）濃度に影響されるか否かを試験するために２．５から２０μｇ／ｍＬのｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を細胞に加え、一方でＯＤＮ２００６は一定値の２μＭに保たれた（図３）。２４時間の発現後に、２．５から２０μｇ／ｍＬまでの異なる量のｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を、２．０μＭのＯＤＮ２００６と共に加え、ホタル・ルシフェラーゼのウミシイタケ・ルシフェラーゼに対する率を測定してプロットした。ＴＬＲ３活性は実施例１の方法で測定した。ＴＬＲ３活性の非誘導対照に対する倍率（倍率）はグラフ下部に示され、各濃度のｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）でのＯＤＮ２００６処理による非処理に対する倍率（倍率）はグラフの上部に示されている。ＯＤＮ２００６非存在下でも、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の増加はＴＬＲ３活性のレベルに影響するため、前記ＯＤＮ２００６による阻害率は計算により求められている。全ての試験された濃度において、前記阻害率は６．２から７．０倍の間にとどまり、より高濃度のｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）はＯＤＮ２００６による阻害を明確に逆転させはしなかった（図３）。
【００５９】
ＯＤＮ２００６のＴＬＲ３活性化に対する影響がｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）添加のタイミングに依存するか否かを分析するために、ＴＬＲ３を発現するように形質移入された２９３Ｔ細胞にｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）処理の８時間後にＯＤＮ２００６を添加するか、又はその逆の順序の処理を行った（図４）。その結果、ＯＤＮ２００６がｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）と同時に添加された場合には、ＮＦ−κＢ活性化はバックグラウンドと同程度であった。しかしながら、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）処理の８時間後にＯＤＮを添加した場合に、４０％の活性が観察された。これらの結果は、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）がＯＤＮ２００６の添加までの間ＴＬＲ３を活性化できる可能性を示唆する。更に、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）がＴＬＲ３活性を誘導する機会を持った後にでも、ＯＤＮ２００６はＴＬＲ３活性を阻害することができる。
【００６０】
いかなる特定の理論にも束縛されることを望まないが、前記結果は、図１から４に示されるＯＤＮ２００６によるＴＬＲ３活性の阻害は、以下の３つの可能な機構により説明できる可能性があることを示していると考えられる：１）ＯＤＮ２００６はＴＬＲ３に対してｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）より高い親和性を有する；２）ＯＤＮ２００６はＴＬＲ３又はＴＬＲ３及びＴＬＲ９に共通のアダプターである可能性のある因子に対して競合している；又は３）ＯＤＮ２００６は、細胞外領域から細胞内領域へのリガンドの輸送を補助する因子に対して競合している。
【００６１】
（実施例４）
ＴＬＲ３突然変異体におけるＴＬＲ３調節活性に対するＯＤＮ２００６の影響
以前は、野生型ＴＬＲ３活性にとり優性阻害（ドミナント・ネガティブ（dominant negative））であると特徴付けられたＴＬＲ３突然変異体が発現された。ＴＬＲ３の優性阻害型は、それ自身は不活性であるが、ＷＴ  ＴＬＲ３と共に形質移入されると、前記優性阻害型はＷＴ  ＴＬＲ３と二量化し、不活性複合体を形成することにより、ＷＴ  ＴＬＲ３活性が低減される13。突然変異体ＴＬＲ３ΔＴＩＲは、細胞内シグナル伝達ドメインの欠損したものであり、優性阻害突然変異体であることが立証されている。ＴＬＲ３ΔＴＩＲはＯＤＮ２００６の非存在下にＴＬＲ３活性を２０％阻害した。ＯＤＮ２００６の存在下でのＴＬＲ３阻害は、活性の６％の阻害までに低下した。更に優性阻害型として機能しない二つの付加的なＴＬＲ３突然変異体では、ループ１とループ２が欠損しており（表２）、これらも０．２μＭのＯＤＮ２００６の存在により阻害された。これらの結果は、ＴＬＲ３がヘテロ接合体として存在している場合にＯＤＮ２００６をその阻害に用いることができることを示している。
【００６２】
【表２】
2010527633.tif 000003
【００６３】
ＴＬＲ３と共に、他のＴＬＲが発現した場合の、ＯＤＮ２００６によるＴＬＲ３活性阻害に対する影響も更に試験された。ＴＬＲ１からＴＬＲＢ８までを、ＴＬＲ３と同じモル比で、共に２９３Ｔ細胞に形質移入し、０．２μＭのｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）及びＯＤＮ２００６を前記細胞に添加して、上述のようにＴＬＲ３活性を測定した。その結果、他の全てのＴＬＲの存在下で、ＯＤＮ２００６がｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）により媒介されたＴＬＲ３の活性化をバックグラウンドのレベルまで阻害できることが示された（表３）。これらの結果は、ＴＬＲ１から８までの存在下で、ＯＤＮ２００６がＴＬＲ３活性を阻害できることを実証した。
【００６４】
【表３】
2010527633.tif 000004
【００６５】
（実施例５）
ＯＤＮ２００６活性の特異性
他のＴＬＲ９活性の活性化物質と同様に、ＴＬＲ９活性を活性化できない幾つかの一本鎖デオキシオリゴヌクレオチドについて、それらのＴＬＲ３阻害活性を試験した（図５）。ＯＤＮ２００６ｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）は、ＯＤＮ２００６内部のＣｐＧヌクレオチドがＧｐＣにより置換されたＯＤＮ２００６の変異体であり、この変化に付随してＴＬＲ９活性化能力が失われている。ＯＤＮ２２１６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）はＡ型ヒトＴＬＲ９リガンドであり、一方変異体のＯＤＮ２２１６ｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）は、ＯＤＮ２２１６をＴＬＲ９に対して機能しないリガンドにする塩基の置換を含んでいる。ＴＬＲ３活性はウミシイタケのルシフェラーゼに対するホタルのルシフェラーゼの率で表されている。その結果、４つの核酸の全てが同程度にＴＬＲ３を阻害し、それにより阻害がＣｐＧ配列に特異的ではないこと、及びＴＬＲ３阻害能がＴＬＲ９活性化能とは関係しないことが示唆された。これらの結果は、他のＤＮＡ配列及び構造がＴＬＲ３活性に対して阻害性であることを示唆する。
【００６６】
ＯＤＮ２２１６及びＯＤＮ２２１６ｃは、その分子中のそれぞれ５’及び３’末端のリン酸ジエステル結合を置換した、各々一個及び五個のホスホロチオエート結合を有している。ＯＤＮ２２１６及びＯＤＮ２２１６ｃの両方ともＴＬＲ３の強力な阻害剤であるため、ホスホロチオエート結合の数は削減することができ、かつＴＬＲ３阻害は保持することができる。したがって、ｄＯＤＮ２００６と名付けられたＯＤＮ２００６のリン酸ジエステル型（ＯＤＮ２００６と同一の塩基配列を有する）が試験された。ｄＯＤＮ２００６はＴＬＲ３を阻害できなかった（図６）。ｄＯＤＮ２００６から誘導された他の変異体も、ＴＬＲ３を阻害できなかった（データは示されていない）。
【００６７】
いかなる理論にも束縛されることを望まないが、ＯＤＮ２００６内部のホスホロジチオエートが、ＴＬＲ３活性の阻害を可能とする分解速度を低下させたらしいと考えられる。その二次又は三次構造によって分解に対して本質的により安定である他の一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドが、ＴＬＲ３のいくらかの阻害を引き起こすことが予期される。この仮説の検証のためには、その配列と２５−から７５−ｎｔの長さの（図７）変化した七つのデオキシオリゴヌクレオチドのパネルが無作為に選ばれた（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６−１２）。２μＭでのＴＬＲ３阻害を測定した場合、ある範囲での阻害活性が観察された。興味深いことに、阻害活性の程度及びデオキシオリゴヌクレオチドの長さとの間には、長さが２５−ｎｔのデオキシオリゴヌクレオチドには明確な阻害活性がないという一般的傾向があった。ＴＬＲ３を阻害できないＯＤＮ２００６のリン酸ジエステル型が２４−ｎｔの長さであったことは注目される。これらの結果は、ホスホロチオエートの欠如したデオキシオリゴヌクレオチドがＴＬＲ３活性の阻害に使用できることを示す。潜在的なＴＬＲ３阻害剤であるＯＤＮ２００６のデータと呼応して、細胞内環境に置かれた際に、より分解に耐えることのできる長さの長いデオキシオリゴヌクレオチドは、それが最小の長さであるという前提で、よりよいＴＬＲ３阻害剤であることが期待される。
【００６８】
（実施例６）
デオキシオリゴヌクレオチドの長さのＴＬＲ３活性への影響
Ａリン酸ジエステル骨格を持つ３９−ｎｔの長さのデオキシオリゴヌクレオチド（５’Ｄ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）が、追加の操作の原型として選択された。倍率ＴＬＲ３活性の非誘導対照に対する倍率はプロットされ、その結果，５’Ｄがｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）により誘導されたＴＬＲ３の活性化を６０％阻害したことを示した（図８）。５’Ｄ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４−１７）の５’末端から、一連の次第に増加する長さのヌクレオチドを切除すると、阻害活性の段階的な消失がもたらされた。更に５’Ｄ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０，２１）の３’末端からの１５−又は２０−ｎｔの削除は、５−から１０−ｎｔを削除したもの（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８，１９）より活性の弱い阻害剤のＤＮＡをもたらした。これらの結果は、デオキシオリゴヌクレオチドの長さが、ＴＬＲ３活性阻害調節における因子であることを実証している。
【００６９】
（実施例７）
ＴＬＲ３活性に対するデオキシオリゴヌクレオチド配列の影響
デオキシオリゴヌクレオチドの塩基配列のＴＬＲ３阻害に対する影響を究明するために、それぞれ６個のヌクレオチドをｄＯＤＮ２００６（リン酸ジエステル骨格）の両側の末端に付加した。この付加により形成される構築ＨＰ１では、ヘアピン構造を形成する可能性、及び潜在的にヌクレアーゼに対する感受性を低減する可能性が生じる（表４）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）。ＴＬＲ３活性に対する影響を試験したときに、ＨＰ１はＴＬＲ３活性を３５％に低減させた。これはＴＬＲ３を阻害しないｄＯＤＮ２００６からは注目に値する改善であるが、ホスホロチオエートを含むＯＤＮ２００６ほどは強力ではない。土台としてＨＰ１を用い、前記ループ配列がｐｏｌｙ  Ｔ又はｐｏｌｙ  Ａトラクト（tract）で置換されたＯＤＮｓＨＰ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）及びＨＰ３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）を構築した。これらの分子は、ＴＬＲ３活性を阻害することができなかった。実際、ｐｏｌｙ  Ａトラクトを含むデオキシオリゴヌクレオチドはＴＬＲ３活性を少し刺激した。
【００７０】
【表４】
2010527633.tif 000005
【００７１】
これらの結果は、塩基配列が、直接（恐らく、タンパクに結合することにより）、又は間接的に（恐らく、分解に影響することにより）ＴＬＲ３活性の阻害に寄与することを示している。試験されたデオキシオリゴヌクレオチドの性質から、いくつかの配列は、その程度は変化するが、ＴＬＲ３活性を阻害することが示された。ＨＰ１及びその誘導体の観察により、ｉＯＧＮでは長さと同様に塩基配列（図７）も、各種のＴＬＲ３活性の阻害強度を有するｉＯＧＮ設計の土台として有用であることが示唆された。異なる医学的状態に対して、ｉＯＧＮの性質及び／又は濃度を変化させることにより達成される異なる程度のサイトカイン調節が必要とされるために、このことは有利である。
【００７２】
（実施例８）
ヒトＰＢＭＣでのデオキシオリゴヌクレオチドのサイトカイン産生に対する影響
ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を分離するために、ヒト・ドナーより全血をヘパリン被膜シリンジ又はヘパリン採集管に採集した。約５０ｍＬの無菌ハンクス平衡塩溶液（Hank's Balanced Salt Solution（ＨＢＳＳ））（インビトロジェン、カールスバーグ、カリフォルニア州（Invitrogen, Carlsbad, CA））を、各１００ｍＬの血液ごとに加えた。３８ｍＬの血液とＨＢＳＳ混合液を、５０ｍＬの円錐管に加え、１１ｍＬのフィコル−パーク・プラス（Ficoll-Paque Plus）溶液（ＧＥアマシャム、ピスカタウエイ、ニュー・ジャージー州（GE Amersham, Piscataway NJ））をゆっくりと前記混合液の下部に注入して横たえた。前記管を室温で４００×ｇで４０分間遠心分離した。密度勾配を保つために、遠心分離ブレーキはオフにされた。ＰＢＭＣは、フィコルのすぐ上に白い層を形成する。一つの円錐管からの前記ＰＢＭＣを、ピペットで吸い取り新しい５０ｍＬ円錐管に移した。その円錐管をＨＢＳＳで満たし、残留するフィコルを洗い流した。前記細胞を６００×ｇで１０１０分間回転させる。前記細胞は更に二回ＨＢＳＳで洗浄した。最終洗浄後に、ペレットを完全培地：ＲＰＭ  Ｉ１６４０培地／１０％ＦＢＳ／１Ｘ非必須アミノ酸／１Ｘピルビン酸ナトリウム塩／ゲンタマイシンに再けん濁させた。ゲンタマイシンはシグマから購入し、他の培地成分はインビトロジェンから購入した。生細胞計数のために、一定分量の前記細胞を除去し、５０μｇ／ｍＬのトリパンブルー（Trypan blue）と混合した。４８孔プレート上に前記細胞を３×１０6細胞／孔（０．５ｍＬ／／孔）の濃度で播種した。
【００７３】
ＰＢＭＣをは、４人のお互いに血縁ではないドナー（Ａ，Ｂ，Ｃ及びＤ）から上述のように収集された。５μｇ／ｍＬのｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）で処理したときのサイトカインであるＩＦＮγ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、Ｐ−１０、及びＭＩＧの産生量をルミネックス（Luminex）技術を用いて測定した。４人のドナーの間で、１２００から４０００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮγレベルが検出された（図９）。ＩＬ−１２、ＩＬ−１β、ＩＬ６、Ｐ−１０及びＭＩＧのレベルは予想された範囲内にあった（表５）。これらの結果は、個体差により予期されるべき範囲内でＰＢＭＣが適切に応答していることを確定した。
【００７４】
ＰＢＭＣを５μＭ（ドナーＡ）又は１０μＭ（ドナーＢ）のＯＤＮ２２１６、ＯＤＮ２００６、ＯＤＮ２２１６対照（ＯＤＮ２２１６ｃ）又はＯＤＮ２００６対照（ＯＤＮ２００６ｃ）（インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州により合成されたもの、若しくはインビボーゲン、サン・ディエゴ、カリフォルニア州より購入したもの）とインキュベートした。前記ｓｓＤＮＡは、１、２、又は５μＭの濃度でドナーＣ及びドナーＤの実験に用いられた。ＯＤＮ２２１６の配列は、５’−ｇｇＧ  ＧＧＡ  ＣＧＡ  ＴＣＧ  ＴＣｇ  ｇｇｇ  ｇｇ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）である。ＯＤＮ２２１６ｃ対照の配列は、５’−  ｇｇＧ  ＧＧＡ  ＧＣＡ  ＴＧＣ  ＴＧｇ  ｇｇｇ  ｇｃ  −３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）である。ＯＤＮ２００６の配列は、５’−ｔｃｇ  ｔｃｇ  ｔｔｔ  ｔｇｔ  ｃｇｔ  ｔｔｔ  ｇｔｃ  ｇｔｔ  −３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）である。配列ＯＤＮ２００６ｃ対照の配列は、５’−ｔｇｃ  ｔｇｃ  ｔｔｔ  ｔｇｔ  ｇｃｔ  ｔｔｔ  ｇｔｇ  ｃｔｔ  −３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）である。大文字で表された塩基は、リン酸ジエステル結合を有し、小文字で表された塩基は、ホスホロチオエート結合を有する。Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）はＧＥアマシャムから購入し、ＰＢＳ中５０℃に加熱しながら再構築して、５μｇ／ｍＬの濃度で使用した。浮遊物を２４時間又は４８時間後に収穫し、−２０℃で凍結した。ＴＬＲ３活性を決定するために、サイトカインのレベルを、アップステート（Upstate）（シャーロッツビル、ヴァージニア州（Charlottesville, VA））から購入したヒト１０−サイトカイン・ルミネックス・キットを用いて測定した。いくつかの実験ではサイトカインのレベルは、インビトロジェン（Carlsbad, CA）から購入したカスタム・ヒューマン１４−プレックス・キット（custom Human 14-plex kit）を用いて測定した。その結果を図９に示す。各棒グラフは、単一の培養孔につき二回の測定での平均値+／−１標準誤差（ＳＥＭ）（ドナーＡ及びＢ）か、又は二つの培養孔について、一つあたり一回測定した値である（ドナーＤ及びＣ）。
【００７５】
その結果、ＯＤＮ２００６がｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）と同時にＰＢＭＣに加えられたときには、３人のドナーについては、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）に誘発されたＩＦＮγのレベルはｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）単独で処理された場合に比べて、バックグラウンドのレベルまで低減されたことが示された。更に、試験された他のＯＤＮであるＯＤＮ２００６ｃ、ＯＤＮ２２１６及びＯＤＮ２２１６ｃの全てが、５μＭの最終濃度で細胞に加えられたときに、相当の効果を有し、前記効果は、ＯＤＮ２００６のみに限定されなかった。重要なことに、これらの結果は２９３Ｔ細胞で観察された結果（図５）に酷似しており、２９３Ｔ細胞で観察されたＯＤＮの前記効果は、より複雑な生物学的に関連するシステムを示している。
【００７６】
ＯＤＮの効果についての究明を拡張するために、ヒトＰＢＭＣによる幾つかのサイトカイン及びケモカインの産生を定量した。４人のドナー全員からのＰＢＭＣによるＩＬ−１２及びＭＩＧ産生は、ＯＤＮ２２１６又はＯＤＮ２２１６ｃにより低減された。３人のドナーからの細胞はＯＤＮ２００６又はＯＤＮ２００６ｃにより試験され、これらの細胞のＩＬ−１２及びＭＩＧ産生も低減された（表５）。前記ＯＤＮのうち３つのものがＯＤＮ２２１６より強力な阻害を示したので、ＩＰ−１０に対するＯＤＮの効果は注目すべきである。同時にこれらの結果は、ＯＤＮが一つ又は複数のサイトカイン及び／又はケモカインの産生の選択的な調節特性を保持するように設計できることを実証している。サイトカイン及びケモカインに対する、特定の配列を持つＯＤＮ及び／又は修飾されたＯＤＮの効果の追加的スクリーニングにより、更に阻害効果が改善される可能性がある。
【００７７】
【表５】
2010527633.tif 000006
【００７８】
【表６】
2010527633.tif 000007
【００７９】
本発明はここに完全に記述され、添付の本発明の請求項の趣旨及び範囲を逸脱しない範囲での、本発明に対する多くの変更及び改良をなしうることは、当業者にとり明白である。
【図１Ａ】
2010527633.tif 000008
【図１Ｂ】
2010527633.tif 000009
【図２】
2010527633.tif 000010
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2010527633.tif 000015
【図８】
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【図９】
2010527633.tif 000017
【配列表】
2010527633000001.app
【国際調査報告】
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2010527633.tif 000019
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