(57)【要約】本発明は、少なくとも２つの幹細胞集団を移植することによって、組織を修復、再生および再構築する方法に関し、個々で上記第１の幹細胞集団および上記第２の幹細胞集団は、約２〜約２４時間の時間間隔を隔てて、被験体に導入される。上記幹細胞は、臍帯、動員末梢血、または骨髄に由来する。少なくとも上記第２の集団の細胞は、成人幹細胞および前駆細胞について富化されている。本発明の方法は、骨髄破壊または化学療法後の被験体における造血回復を促進することにおいて有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における血液組織を再構築するための方法であって、該方法は、該被験体に、第１の細胞集団および第２の細胞集団を導入する工程を包含し、ここで該第２の細胞集団は、該第１の細胞集団の２時間後から２４時間後に導入され、そして少なくとも該第２の細胞集団は生着する能力がある、方法。
【請求項２】
前記第２の細胞集団は、前記第１の細胞集団の約４時間後に導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の細胞集団および前記第２の細胞集団の両方が生着する能力がある、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の細胞集団および前記第２の細胞集団は、臍帯血、骨髓、および動員末梢血（ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ）からなる群より選択される供給源から由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の細胞集団および前記第２の細胞集団は、同じ供給源に由来する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記第１の細胞集団および前記第２の細胞集団は、異なる供給源に由来する、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記被験体は、骨髓破壊（ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ａｂｌａｔｉｏｎ）後に造血再構築（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）の必要がある、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも前記第２の細胞集団は、成人幹細胞および前駆細胞が豊富である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第２の細胞集団は、前記第１の集団の約４時間後に導入される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
癌を有する被験体における骨髄破壊性処置後の血液機能を回復させるための方法であって、該方法は、第１の細胞集団および第２の細胞集団を該被験体に導入する工程を包含し、ここで該第２の細胞集団は、該第１の細胞集団の２時間後から２４時間後に導入され、少なくとも該第２の集団は生着する能力がある、方法。
【請求項１１】
少なくとも前記第２の細胞集団は、成人幹細胞および前駆細胞が豊富である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記被験体は、癌治療に関連した後遺症のための処置が必要である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
被験体における幹細胞集団の生着を強化するための方法であって、該方法は、第１の細胞集団および第２の細胞集団を該被験体に導入する工程を包含し、ここで該第２の細胞集団は、該第１の細胞集団の２時間後から２４時間後に導入され、少なくとも該第２の集団は生着する能力がある、方法。
【請求項１４】
少なくとも前記第２の細胞集団は、成人幹細胞および前駆細胞が豊富である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記被験体における好中球生着までの時間は、コントロール被験体における好中球生着までの時間と比較して短縮される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
血小板生着までの時間は、コントロール被験体における血小板生着までの時間と比較して短縮される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
遺伝性障害を有する被験体における骨髄破壊性処置後の血液機能を回復させるための方法であって、該方法は、第１の細胞集団および第２の細胞集団を該被験体に導入する工程を包含し、ここで該第２の細胞集団は、該第１の細胞集団の２時間後から２４時間後に導入され、少なくとも該第２の集団は生着する能力がある、方法。
【請求項１８】
少なくとも前記第２の細胞集団は、成人幹細胞および前駆細胞が豊富である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
癌を有する被験体における骨髄破壊性処置後の骨髄の幹細胞もしくは前駆細胞の活性を回復させるための方法であって、該方法は、第１の細胞集団および第２の細胞集団を該被験体に導入する工程を包含し、ここで該第２の細胞集団は、該第１の細胞集団の２時間後から２４時間後に導入され、少なくとも該第２の集団は富化されたＡＬＤＨｂｒ幹細胞集団である、方法。
【請求項２０】
遺伝性障害を有する被験体における骨髄破壊性処置後の骨髄の幹細胞もしくは前駆細胞の活性を回復させるための方法であって、該方法は、第１の細胞集団および第２の細胞集団を該被験体に導入する工程を包含し、ここで該第２の細胞集団は、該第１の細胞集団の２時間後から２４時間後に導入され、少なくとも該第２の集団は富化されたＡＬＤＨｂｒ幹細胞集団である、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、早期の前駆体細胞が豊富な幹細胞集団を使用して、組織を再構築、修復および再生するための改善された方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
過去１０年間にわたって、臍帯血（ＵＣＢ）移植は、移植治療で処置可能な難病（ｃａｔａｓｔｒｏｐｈｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ）を有する被験体において造血細胞移植のため代替生存ドナー幹細胞供給源であることが示された。ＵＣＢ細胞は、耐え難い急性または慢性の移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）なしに、部分的にミスマッチのＨＬＡ障壁と交差し得る（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。従って、十分にマッチしている、血縁関係にあるかもしくは血縁関係にない、生存している骨髓または生体幹細胞のドナーがいない多くの被験体は、骨髄破壊性の（ｍｙｅｌｏａｂｌａｔｉｖｅ）照射および／または化学療法の後に幹細胞を救うために、部分的にＨＬＡがマッチしているＵＣＢ細胞を利用し得る。ＵＣＢ細胞用量（レシピエントの体重１ｋｇあたりで表される）は、ＵＣＢ移植後の結果の最良の予測変数である（非特許文献４；非特許文献５）。結果と強く相関する細胞用量閾値は、同定された。低細胞用量を受容する被験体においては、恒久性の生着（ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ）が最終的に生じる一方で、骨髓および血小板生着における顕著な遅延が存在し（せいぜい、より長期間の入院を生じる）、そして供給源利用において顕著な増大を生じ、最悪の場合には、感染およびレジメンに関連する毒性から早期の死亡が増大する。
【０００３】
体重が＜４０ｋｇの幼児および子供では、被験体の９０％超において妥当な時間枠内で、首尾良い生着に重要な細胞用量（３×１０ｅ７個の有核細胞／ｋｇとして定義される）を送達する、十分にマッチしているＵＣＢ単位を見いだすことは可能である。体重が＞４０ｋｇのティーンエイジャーおよび成人では、これは、その時間の中でおそらく３０〜５０％である。ＵＣＢ単位は、比較的固定数の総有核細胞を含むので、体重＞７０ｋｇの被験体についての最適細胞投与量を送達する単位は、その時間の中で＜１５％で同定されるに過ぎない。ＵＣＢＴに利用可能な細胞用量を増大しようとする試みは、エキソビボ増殖および組み合わせ単位移植を含んだ。エキソビボでのＵＣＢ細胞の増殖は可能である一方で、増殖した細胞の注入の以前の第Ｉ相研究は、生着時間の短縮を生じなかった（非特許文献６；非特許文献７）。同様に、１回の骨髄破壊性移植のための最大５ＵＣＢの組み合わせは、好中球または血小板生着までの時間を短縮しなかった。
【０００４】
いくつかのストラテジーが、好中球および／血小板生着までの時間を短縮する目的で、移植に利用可能な細胞を増大させる方法に対処してきた。成功裏であれば、これらアプローチは、レジメン関連の毒性を少なくすることによって、移植手順の安全性を高めたであろう。ＵＣＢＴ後の生着は、総合的かつ事象なしの生存の主要な予測変数である。絶対好中球数（ＡＮＣ）回復までの時間および／または総合的生着可能性を低下させることによって生着を促進し得る介入は、有利である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｗａｇｎｅｒら．Ｂｌｏｏｄ（１９９６）８８（３）：７９５−８０２
【非特許文献２】Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎら．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ（１９９８）３３９（２２）：１５６５−１５７７
【非特許文献３】Ｒｏｃｈａら．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ（２０００）３４２（２５）：１８４６−１８５４
【非特許文献４】Ｋｕｒｔｚｂｅｒｇ  Ｊら．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ（１９９６）３３５：１５７−１６６
【非特許文献５】Ｓｔｅｖｅｎｓら．Ｂｌｏｏｄ（２００２）１００（７）：２６６２−２６６４
【非特許文献６】Ｊａｒｏｓｃａｋら．Ｂｌｏｏｄ（２００３）１０１（１２）：５０６１−５０６７
【非特許文献７】ＭｃＮｉｅｃｅら．Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ（２００４）６（４）：３１１−３１７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
被験体における組織を再構築、修復および再生するにあたって使用するための方法が、本明細書に提供され、この方法は、少なくとも第１の細胞集団および第２の細胞集団を上記被験体に導入することによる。上記第１の細胞集団は、ＵＣＢ、骨髓（ＢＭ）、動員末梢血（ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ）（ＭＰＢ）、またはＵＣＢ由来幹細胞、ＢＭ由来幹細胞、もしくはＭＰＢ由来幹細胞を含み得るか、非生存生細胞および細胞細片（例えば、代表的には、造血性移植片などとして従来から使用される融解された細胞生成物において見いだされるもの）とともに有核細胞、幹細胞、またはこのような細胞型の混合物を含み得るか、あるいは上記被験体への導入後に、肝臓および／または肺から、上記第２の幹細胞の細胞集団の放出を促進するように、そしてこの幹細胞集団の生着を強化するように、特異的に動作された薬剤を含み得る。上記第２の細胞集団は、臍帯、動員末梢血、または骨髄から単離された幹細胞を含む。いくつかの実施形態において、上記第１のおよび／または上記第２の幹細胞集団は、幹細胞および前駆細胞について実質的に富化されている。本発明の方法は、骨髄破壊性治療後に、好中球生着および／または血小板生着までの時間および免疫再構築を促進することにおいて特に有用であり、ここで上記細胞集団は中心静脈内ラインを介して投与される。上記方法は、悪性障害、遺伝性障害、免疫障害を有する患者を処置するために使用され得るか、または損傷後に組織を修復するために使用され得る。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
（発明の詳細な説明）
Ｉ．概観
幹細胞および前駆細胞（ｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ）（ＳＰＣ）は再生されかつ特定の生物学的シグナルが特定の細胞型もしくは組織型へと上記細胞を分化するように誘導するまで、発生的潜在能力を維持する。成人幹細胞および前駆細胞（ａｄｕｌｔ  ｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ）（ＡＳＰＣ）は、誕生後に生物の組織において保持される小さなＳＰＣ集団であり、生涯にわたって連続的に再生される。インビトロコロニーアッセイは、骨髄（ＢＭ）、動員末梢血（ＭＰＢ）、および臍帯血（ＵＣＢ）はすべて種々のＡＳＰＣを含むことを実証した。骨髄は、多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ）ＡＳＰＣが特に豊富である。
【０００８】
本明細書において使用される場合、「幹細胞」とは、分化および自己再生の能力、ならびに組織を再生させる能力を有する細胞をいう。幹細胞は、本願において臍帯血幹細胞を使用することに関して主に記載されるが、本発明は、臍帯血幹細胞を使用することに限定されず、他の器官の成人幹細胞（肝臓幹細胞、膵臓幹細胞、神経幹細胞、骨髄幹細胞、末梢血幹細胞、臍帯血幹細胞またはこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない）を含み得る。いくつかの実施形態において、本発明は、胚性幹細胞の使用を除く。さらに、本発明は、いずれの特定の供給源から得られるいずれの特定の幹細胞の移植にも限定されないが、互いに混合されている「複数の幹細胞供給源」由来の幹細胞を含み得る。従って、間葉系間質細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ）は、生着の量を増大させるために、単一のまたは複数の幹細胞供給源から得られた幹細胞の同時移植において使用され得る。
【０００９】
本明細書において使用される場合、「生着」および「インビボ再生」とは、移植された（ｉｍｐｌａｎｔｅｄ  ｏｒ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ）幹細胞が宿主生物においてそれら自身を再生し、そして/または分化した細胞子孫を生成し、ならびに/あるいは上記宿主における失われたもしくは損傷した細胞を置換する生物学的プロセスをいう。
【００１０】
同種異系細胞治療は、種々の疾患もしくは病理学的状態を処置するために使用される。同種異系細胞治療は、いくつかのタイプの悪性疾患およびウイルス性疾患のための重要な治癒力のある治療である。同種異系細胞治療は、被験体への細胞の注入もしくは移植を要し、それによって、上記注入もしくは移植された細胞は、上記被験体以外のドナーから由来する。本明細書において使用される場合、用語「由来する（ｄｅｒｉｖｅ）」もしくは「〜に由来する（ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ）」とは、細胞もしくは目的の生物から物理的物質もしくは情報物質（目的の生物からの単離形態、収集物、および推論（ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ）を含む）を得ることが意図される。
【００１１】
同種異系細胞治療プロトコルに利用された同種異系ドナーのタイプとしては、以下が挙げられる：ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）マッチしている同胞、マッチしている生物学的に血縁関係にないドナー、部分的にマッチしている生物学的に血縁関係にあるドナー、生物学的に血縁関係にある臍帯血ドナー、および生物学的に血縁関係にない臍帯血ドナー。上記同種異系ドナー細胞は、通常、骨髄採取、末梢血の回収物、もしくは誕生時の胎盤の臍帯血（ｐｌａｃｅｎｔａｌ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ）によって得られる。
【００１２】
本発明の方法は、２つの細胞調製物（または「集団」）の投与もしくは導入を包含し、ここで各々の投与は、造血を促進するようにタイミングを合わせて隔てられる。「投与」もしくは「導入」とは、本明細書に記載される細胞集団を被験体に静脈内導入することをいう。いくつかの実施形態において、上記２つの細胞調製物の投与は、骨髄破壊性治療の後に続く。上記細胞集団の各々についての投与方法は、同じである必要はない。例えば、上記第１の細胞集団は、注入によって投与され、上記第２の細胞集団は、注射によって投与され得る。
【００１３】
本発明の目的のために、一方の細胞調製物は、「第１の細胞集団」といわれ、他方の細胞調製物は、「第２の細胞集団」または「追加細胞集団（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）」といわれる。上記第２の細胞集団は、第１の細胞集団のわずか約１時間後、わずか約１．５時間後、約２時間後、約２．５時間後、約３時間後、約３．５時間後、約４時間後、約４．５時間後、約５時間後、約５．５時間後、約６時間後、約６．５時間後、約７時間後、約７．５時間後、約８時間後、約８．５時間後、約９時間後、約９．５時間後、約１０時間後、約１１時間後、約１２時間後、約１３時間後、約１４時間後、約１５時間後、約１６時間後、約１７時間後、約１８時間後、約１９時間後、約２０時間後、約２１時間後、約２２時間後、約２３時間後、またはわずか約２４時間後に被験体に投与される。
【００１４】
上記第１の細胞集団は、ＵＣＢ、ＢＭ、ＭＰＢ、またはＵＣＢ由来幹細胞、ＢＭ由来幹細胞もしくはＭＰＢ由来幹細胞を含み得、有核細胞、幹細胞、もしくはこのような細胞タイプの混合物を、非生細胞および細胞細片（代表的には、造血移植片などとして従来から使用される融解した細胞生成物において見いだされるようなもの）とともに含み得る。さらに、上記第１の集団は、被験体への導入後に、肝臓および／または肺からの上記第２の幹細胞の細胞集団の放出を促進するように特異的に操作される薬剤を含み得る。このような薬剤としては、幹細胞の管外遊出に関与する内皮細胞レセプターに特異的にもしくは非特異的に結合し得る任意の分子、または以下で議論されるように、細網内皮マクロファージによるファゴサイトーシスをブロックすることができる任意の分子（例えば、コロイド鉄、抗セレクチン抗体など）が挙げられ得る。上記第２の細胞集団は、生着できる任意の細胞集団を含み得る。「生着可能」な細胞集団は、レシピエント被験体におけるドナー細胞の増殖および機能を生じるものである。一実施形態において、上記細胞集団は、胚性幹細胞を含まない。別の実施形態において、上記第２の細胞集団は、始原幹細胞集団について精製されているおよび／または富化されている、ＵＣＢ由来細胞、ＢＭ由来細胞、ＭＰＢ由来細胞を含む。上記第１の細胞集団および上記第２の細胞集団は、異なる細胞供給源から得られてもよいし、異なる細胞供給源に由来していてもよい。例えば、上記第１の細胞集団は、臍帯に由来し得るのに対して、上記第２の細胞集団は、骨髄またはＭＰＢに由来し得る。あるいは、上記第１の細胞集団および上記第２の細胞集団は、同じドナーからの同じ供給源（例えば、ＵＣＢ、ＭＰＢ、もしくはＢＭ）に由来し得る。別の実施形態において、上記第１の細胞集団および上記第２の細胞集団は、異なる供給源から由来し得るが、ただし、ドナー細胞は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）および／または移植片拒絶（例えば、部分的もしくは完全ＨＬＡマッチングによる）の発生に関する可能性を最小限にするために、従来の方法によって選択または操作される。上記第１の細胞集団および第２の細胞集団が同じドナーに由来する場合、上記ドナーから回収したＵＣＢ、ＢＭ、またはＭＰＢは、上記第１の細胞集団および上記第２の細胞集団について、それぞれ、約８０％／２０％、約７５％／２５％、約６０％／４０％、約６５％／３５％、約６０％／４０％、約５５％／４５％、または約５０％／５０％の比率（ｓｐｌｉｔ）に配分され得る。この比率は、特定の時間で回収された１つの細胞バッチの配分（例えば、上記ドナーから回収された血液もしくは血液製剤の単一のバッグ、上記パラメーターに従う比率）であり得るか、あるいはこの比率は、ある期間にわたって上記ドナーから回収された血液もしくは血液製剤の総量（例えば、上記ドナーからプールされたバッチ）の配分であり得る。
【００１５】
各注入に必要とされる有核細胞数は、上記第１の細胞集団の組成物に依存する。例えば、上記第１の細胞集団が、上記被験体への導入後に、肝臓および／または肺からの上記第２の幹細胞の細胞集団の放出を促進するに十分な細胞数を含む場合、上記第２の細胞集団は、いくつかの幹細胞を含み得る。あるいは、またはさらに、上記第２の細胞集団が生着に十分な幹細胞数を含む場合、上記第１の細胞集団は、豊富なＡＳＰＣも、さらにいかなるＡＳＰＣも必要としない可能性がある。第１の細胞集団および第２の細胞集団の両方の最適な用量は、本明細書の他の場所で議論される。
【００１６】
いかなる特定の理論にも作用機構にも拘束されないが、初期の細胞調製物の注入が肝臓および肺（注入された細胞を隔離する傾向がある）におけるレセプターなどを結合し得、生着のために骨髄へ戻る生存性幹細胞の数を制限し得ると考えられる。移植における移植片材料の注入のための現在の方法はすべて、中心線（ｃｅｎｔｒａｌ  ｌｉｎｅ）を介した静脈内注入を伴う。この経路は、肺循環へすぐに、注入される物質を導く。上記注入される物質の大部分は、肺における微小血管（ここで肺静脈性毛細血管が、肺胞の周りの領域における肺動脈に連絡している）によって妨害される。この領域は、粒状物質および死につつある細胞を除去し得る肺マクロファージで覆われている。上記粒状物質および死につつある細胞はともに、融解されたＵＣＢ、ＢＭ、およびＭＰＢに由来する未精製移植片調製物中によく見られる。この微小血管系を介する物質の流れは、上記移植片における細片および死細胞の蓄積によって示され、このことは、続いて、おそらく、細網内皮系におけるファゴサイトーシスによって、幹細胞／前駆細胞が循環に向かって肺を出る能力を遅らせるかまたは阻害する（Ｈａｌｌ（１９８５）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ６（５）：１４９−１５２において概説され、これはその全体が本明細書に参考として援用される）。
【００１７】
上記細網内皮系（ＲＥＳ）は、肝臓、脾臓、肺、および骨髄の固定マクロファージからなり、上記宿主に種々の免疫学的防御（感染からの防御、新生物形成サーベイランス、および外来抗原の認識を含む）を提供する（Ｇｉｌｂｒｅａｔｈら（１９８５）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３４：６４２０；Ｓａｂａ（１９８１）Ａｒｃｈ  Ｉｎｔ  Ｍｅｄ  １２６：１０３１）。抗原をプロセシングする後者の機能は、上記宿主が同種異系の組織および器官の移植物を拒絶する能力を増強し、そして移植された組織の拒絶を調節するために、上記ＲＥＳの抑制に関与するものを刺激した。デキストラン硫酸および炭素での動物の前処置は、どうやら上記ＲＥＳの細胞の取り込み能力の飽和の結果として、上記ＲＥＳの貪食細胞によるリポソームの取り込みの減少を生じた（Ｓｏｕｈａｍｉら（１９８１）Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ６７４：３５４）。
【００１８】
ＲＥＳ活性に影響を及ぼすことに加えて、いかなる特定の理論によっても機構によっても拘束されないが、上記第１の集団における細胞および細胞細片は、上記第２の集団における治療的に活性な細胞上に発現されるリガンドの内皮レセプターを占有し続けることによって、肺内皮細胞への上記第２の集団における細胞の接着を制限し得る。本質において、上記第１の集団は、類似のリガンドを発現する上記第２の集団における細胞から、上記内皮を隠すかまたは「マスク」する。上記第２の集団における細胞は、従って、より自由に肺を離れ、血液から骨髄へと移動し、そして成功裏の生着のために重要な骨髄微小環境ニッチについて競合する。
【００１９】
他者は、初期および追加の細胞調製物注入の使用を記載したが、第１の細胞集団のみを受容している被験体と比較したとき、治療的応答は改善されなかった（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら（２００３）Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ．３１（６）：５３５−４４；Ｓｈｐａｌｌら（２００２）Ｂｉｏｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．８（７）：３６８−３７６）。これら研究者らは、上記第２の細胞集団が、上記第１の細胞集団の投与後数日または数週間で投与されることによるプロトコルを記載している。対照的に、本発明の方法は、上記第１の集団の２４時間以内に上記第２の細胞集団を投与することを企図する。いかなる特定の理論によっても機構によっても拘束されないが、上記最初の細胞集団と上記第２の細胞集団との間の時間の遅延が長すぎると、ＲＥＳ活性および上記内皮への接着をブロックすることによって媒介されるいかなる有益な効果も認められないことがあり得る。
【００２０】
従って、第１の細胞集団および第２の細胞集団を含む本発明の組成物は、血液組織または他の幹細胞機能および前駆細胞機能を再構築するための方法において有用であり、ここで上記方法は、上記第２の細胞集団を、上記第１の細胞集団の２時間から２４時間後に被験体に導入する工程を包含する。これらおよび他の実施形態において、少なくとも上記第２の集団は、生着可能である。特定の実施形態において、少なくとも上記第２の集団は、ＡＳＰＣについて富化されている。
【００２１】
ＩＩ．適応症
本明細書に記載される細胞集団は、広く種々の処置プロトコルのために使用され得る。このプロトコルにおいて、身体の組織または器官は、これら細胞集団の生着、移植もしくは注入によって、増大させられるか、修復されるかまたは置換される。本明細書において使用される場合、「処置」とは、有益なもしくは望ましい臨床結果（すなわち、「治療的応答」）を得るためのアプローチである。本発明の目的に関して、有益なもしくは望ましい臨床結果としては、検出可能であろうと、検出不能であろうと、症状の緩和、疾患の事象の減少、疾患の安定化（すなわち、悪化していない）、疾患進行の遅延もしくは鈍化、上記疾患状態の改善もしくは軽減、および寛解（部分的であろうと完全であろうと）が挙げられるが、これらに限定されない。「処置」とはまた、処置を受けていないかまたは異なる処置（すなわち、単一の細胞用量のみ、または２４時間より長く間隔を空けて複数の細胞用量、または本明細書に包含されないいくつかの他の処置）を受けている場合に予期される生存と比較して、長期の生存を意味し得る。「処置」とは、治療的処置および予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ  ｏｒ  ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）手段の両方に言及する。処置を必要とするものは、障害を既に有するもの、および上記障害が予防されるべきものを包含する。疾患を「緩和」するとは、処置も異なる処置もない状況と比較して、疾患状態の程度および／または望ましくない臨床的発現が少なくされるか、そして／あるいはその進行の時間的推移が鈍化されるかまたは短縮されることを意味する。代表的には、上記「処置」は、上記被験体に、有効な幹細胞および前駆細胞を付加的に投与して、組織（特に、造血細胞）を再生する工程を包含する。
【００２２】
本明細書に記載される方法において有用な細胞集団は、種々の状況において利用され得る。一実施形態において、上記細胞は、血液学的な回復を促進するために、１種以上の疾患、処置、またはこれらの組み合わせから生じる血液機能が減少した被験体に投与され得る。
【００２３】
例えば、本発明の方法は、以下を有する患者の処置に有用である：正常の血球生成および成熟がないことまたはその機能不全から生じる疾患、過剰増殖性幹細胞障害、再生不良性貧血、汎血球減少症、血小板減少症、赤血球無形成（ｒｅｄ  ｃｅｌｌ  ａｐｌａｓｉａ）、薬物、照射もしくは感染、突発性に起因するブラックファン−ダイアモンド症候群；造血性悪性疾患（急性リンパ芽球性（リンパ性）白血病、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性悪性骨髄硬化症、多発性骨髄腫、真性赤血球増多症、原因不明の骨髄化生、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫が挙げられる）；悪性の固形腫瘍（悪性の黒色腫、胃癌、卵巣癌、乳癌、小細胞肺癌、網膜芽細胞腫、精巣癌、神経膠芽細胞腫、横紋筋肉腫、神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、リンパ腫が挙げられる）を有する被験体における免疫抑制；自己免疫疾患、関節リウマチ、糖尿病Ｉ型、慢性肝炎、多発性硬化症、および全身性エリテマトーデス；遺伝性（先天性）障害、貧血、家族性再生不良性ファンコニ症候群、ブルーム症候群、赤芽球癆（ＰＲＣＡ）、先天性角化異常症（ｄｙｓｋｅｒａｔｏｓｉｓ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ）、ブラックファン−ダイアモンド症候群、先天性赤血球異形成症候群（ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｄｙｓｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ）Ｉ−ＩＶ、ＭＰＳ  Ｉ、ＭＰＳ  ＩＩ、ＭＰＳ  ＩＩＩ、ＭＰＳ  ＩＶ、ＭＰＳ  Ｖ、小児性（Ｉｎｆａｎｔｉｌｅ）クラッベ病、副腎脳白質ジストロフィー症、異染性白質ジストロフィー、テイ・サックス病、シュバッハマン−ダイアモンド症候群（Ｃｈｗａｃｈｍａｎｎ−Ｄｉａｍｏｎｄ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損症、ホルムアミノトランスフェラーゼ欠損症、レッシュ−ナイハン症候群、先天性球状赤血球症、先天性楕円赤血球症、先天性有口赤血球症、先天性Ｒｈヌル病（Ｒｈ  ｎｕｌｌ  ｄｉｓｅａｓｅ）、発作性夜間血色素尿症、Ｇ６ＰＤ（グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ）、ｖａｒｉａｎｔｓ  １，２，３，  ピルビン酸キナーゼ欠損症、先天性エリスロポエチン感受性欠損症、鎌状赤血球症および鎌状赤血球形成傾向、αサラセミア、βサラセミア、γサラセミア、メトヘモグロビン血症、免疫の先天性障害、重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）、ベアリンパ球症候群、イオノフォア応答性複合型免疫不全症（ｉｏｎｏｐｈｏｒｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ，  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）、キャッピング異常性を伴う複合型免疫不全症（ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｗｉｔｈ  ａ  ｃａｐｐｉｎｇ  ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｙ）、ヌクレオシドホスホリラーゼ欠損症、顆粒球アクチン欠損症（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ａｃｔｉｎ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）、小児性顆粒球減少症、ゴーシェ病、アデノシンデアミナーゼ欠損症、コストマン症候群、細網異形成症、先天性白血球機能不全症候群；大理石骨病、骨髄硬化症、後天性溶血性貧血、後天性免疫不全症、リンパ球セットにおける不均化に拘わる障害および加齢している食細胞障害に起因する免疫機能障害、コストマン顆粒球減少症、慢性肉芽腫症、チェディアック−東症候群（Ｃｈｅｄｉａｋ−Ｈｉｇａｃｈｉ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、好中球アクチン欠損症（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ａｃｔｉｎ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）、好中球膜ＧＰ−１８０欠損症（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ＧＰ−１８０  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）、代謝性蓄積症（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）、ムコ多糖沈着症、ムコリピドーシス、免疫機構に関する種々の障害、ウィスコット−アルドリッチ症候群、およびα１アンチトリプシン欠損症。
【００２４】
高用量化学療法剤の複数サイクルにより認められる血液毒性続発症は、自己由来造血性幹細胞の連結的な投与（ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖｅ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）によって軽減されることもまた示された。従って、本発明の方法は、骨髄破壊性化学療法後の幹細胞の再注輸が記載されてきた疾患（急性白血病、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫、神経芽細胞腫、精巣癌、乳癌、多発性骨髄腫、サラセミア、および鎌状赤血球貧血が挙げられる）に有用である（Ｃｈｅｓｏｎら．（１９８９）Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．３０  １１０：５１；Ｗｈｅｅｌｅｒら（１９９０）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．８：６４８；Ｔａｋｖｏｒｉａｎら（１９８７）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１６：１４９９；Ｙｅａｇｅｒら（１９８６）Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１５：１４１；Ｂｉｒｏｎら（１９８５）Ｉｎ  Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｉｒｓｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，Ｄｉｃｋｅら編，ｐ．２０３；ｐ．１８９のＰｅｔｅｒｓ（１９８５）ＡＢＭＴ（同書）；Ｂａｒｌｏｇｉｅ，（１９９３）Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ７：１０９５；Ｓｕｌｌｉｖａｎ，（１９９３）Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ７：１０９８−１０９９）。
【００２５】
癌細胞を標的とし破壊するために使用される大部分の化学療法剤は、すべての増殖しつつある細胞（すなわち、細胞分裂を経験している細胞）を死滅させることによって作用する。骨髄は、身体において最も活動的に増殖している組織のうちの１つであるので、造血性幹細胞は、化学療法剤によって頻繁に損傷されるかまたは破壊され、結果として、血球生成は、減少されるかまたは中止される。従って、本発明は、化学療法後の血小板生着および好中球生着を促進することによって、骨髄破壊性移植の結果を改善するために有用である。
【００２６】
ＩＩＩ．細胞調製物の供給源
本発明の方法は、一般に、同種異系幹細胞治療の使用を包含する。同種異系細胞治療は、悪性疾患およびウイルス背得疾患のいくつかのタイプの重要な治癒力のある治療である。同種異系細胞治療は、被験体への細胞の注入もしくは移植（この注入もしくは移植される細胞は、上記被験体以外のドナーに由来する）を包含する。同種異系細胞治療プロトコルに利用されている同種異系ドナーのタイプとしては、以下が挙げられる：ＨＬＡがマッチしている同胞（ｓｉｂ）、マッチしていない血縁関係にないドナー、部分的にマッチしている家族構成員のドナー、血縁関係にある臍帯血ドナー、および血縁関係にない臍帯血ドナー。上記同種異系ドナー細胞は、通常、骨髄採取、末梢血回収または誕生時の胎盤の臍帯血回収によって得られる。
【００２７】
同種異系細胞は、好ましくは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）適合性ドナーから選択される。一般に、ＨＬＡ適合性リンパ球は、完全にＨＬＡマッチした親族（例えば、両親、兄弟もしくは姉妹）から得られ得る。しかし、ドナーリンパ球は、同胞ドナーが単一遺伝子座ミスマッチであるとしても、望ましい結果を得るために、レシピエントと十分にＨＬＡ適合性であり得る。ドナーが上記レシピエントと血縁関係がなければ、好ましくは、上記ドナーリンパ球は、上記レシピエントと完全にＨＬＡがマッチしている。一実施形態において、上記細胞は、６／６遺伝子座においてＨＬＡがマッチしているドナーから得られる。別の実施形態において、上記細胞は、５／６遺伝子座においてＨＬＡがマッチしているドナーから得られる。なお別の実施形態において、上記細胞は、４／６遺伝子座においてＨＬＡがマッチしているドナーから得られる。Ａ遺伝子座におけるミスマッチは、Ｂ遺伝子座におけるミスマッチよりも好ましい。Ｂ遺伝子座におけるミスマッチは、ＤＲ遺伝子座におけるミスマッチよりも好ましい。ＵＣＢを利用する種々の実施形態において、投与前に上記細胞のＨＬＡタイプ分けすることは必ずしも必要ではない。
【００２８】
従って、一実施形態において、本発明は、少なくとも１名（１つ）のドナーから回収された第１の細胞集団および第２の細胞集団を個体に投与する工程を包含する、上記個体を処置するための方法を提供する。この状況において「ドナー」とは、成人、小児、乳児または胎盤を意味する。別の実施形態において、上記方法は、複数のドナーから回収されかつプールされた第１の細胞集団および／または第２の細胞集団を上記個体に投与する工程を包含する。あるいは、上記第１の幹細胞集団および上記第２の幹細胞集団は、別々に複数のドナーから得られて、別個に投与されてもよい（例えば、１名（１つ）以上のドナーが、上記第１の細胞集団のために利用され、同じまたは異なるドナーのうちの１名（１つ）以上が、上記第２の細胞集団に利用される。
【００２９】
本明細書に記載される方法は、一般に、ドナー細胞の同種異系移植を記載しているが、種々の実施形態に関して、宿主（または「被験体」）細胞の自家移植が行われることが企図される。上記第１の細胞集団は同種異系であり得る一方で上記第２の細胞集団は自己由来であるか、または上記第１の細胞集団は自己由来であり得る一方で上記第２の細胞集団は同種異系であることがさらに企図される。造血組織以外の組織（または、いくつかの実施形態において、造血組織を含む）の修復のために、例えば、損傷もしくは疾患後の組織再生もしくは修復のために、上記被験体からのＵＣＢ由来細胞、ＢＭ由来細胞、またはＭＰＢ由来細胞を利用することが特に有利であり得る。
【００３０】
ＩＶ．回収方法
臍帯血は、任意の医療的にまたは薬学的に受容可能な様式で回収され得る。臍帯血の回収のための種々の方法が、記載されている。例えば、Ｃｏｅ，米国特許第６，１０２，８７１号；Ｈａｓｗｅｌｌ，米国特許第６，１７９，８１９  Ｂ１号を参照のこと。ＵＣＢは、例えば、血液バッグ、移動用バッグ（ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｂａｇ）、または滅菌プラスチックチューブに回収され得る。それらから由来するＵＣＢまたは幹細胞は、投与のために単一の個体（すなわち、単一単位として）から回収されたのと同様に貯蔵され得るか、またはその後の投与のために他の単位とともにプールされ得る。
【００３１】
骨髄は、最も好ましくは、後腸骨稜から吸引することによって得られ得る。前駆細胞はまた、末梢血前駆細胞を移動させるフィルグラスチム（顆粒球コロニー刺激因子、すなわち、Ｇ−ＣＳＦ［Ｎｅｕｐｏｇｅｎ，Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ，ＣＡ］）での処置によってドナーまたは被験体から単離され得る（Ｂｒｕｇｇｅｒら．（１９９３）Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．８４（３）：４０２−７）。上記細胞は、Ｂｒｕｇｇｅｒ（１９９３）に記載されるように、白血球アフェレーシスで回収され得る。
【００３２】
凍結される場合、上記細胞は、適切な極低温の容器に移され、そして上記容器は、一般に、−１２０℃から−１９６℃まで温度が下げられ、その温度で維持される。必要とされる場合、上記細胞の温度（すなわち、極低温容器の温度）は、上記被験体への導入と適合する温度に上昇させられ（一般に、ほぼ室温からほぼ体温へ（例えば、約２０℃から約３７．６℃へ（両端含む）））、上記細胞は、以下で議論されるように被験体へ導入される。
【００３３】
Ｖ．幹細胞の富化
本発明の種々の実施形態において、少なくとも上記第２の細胞集団は、ＡＳＰＣについて富化される。いくつかの実施形態において、上記第１の細胞集団および上記第２の細胞集団はともに、本明細書に記載されるかまたは当該分野で公知の富化方法のうちの１つ以上を（任意の組み合わせにおいて）使用して富化される。本明細書で使用される場合、用語「富化される」または「富化」とは、細胞集団におけるＡＳＰＣ数と組み合わせて使用される場合に、ＡＳＰＣの総数が操作されていない細胞集団と比較したか、または本明細書で開示されていない様式によって操作された集団と比較したときに、上記細胞集団中の総細胞数と比例して、一定であるかまたは増大されていることを意味する。
【００３４】
細胞表面マーカーおよび他のマーカー（例えば、細胞内酵素および上記細胞の光散乱特性）の組み合わせを使用して、本発明の細胞集団は、有利には、これら特性に基づいて、上記細胞を分類もしくは単離することによって、特定の治療的用途に「合わせて作られ」得る。また、これら独特の幹細胞集団のうちのいくつかは、特定の細胞系統を表すので、上記集団は、インビボで特定の細胞系統を選択的に再構築するために使用され得る。造血系統を生じる幹細胞は、移植される幹細胞の濃度および有効性を増すために使用され得、それによって、毒性を低下させ得る。有利には、これら細胞は、自己由来骨髄および末梢血から分類され得るので、拒絶の可能性をさらに低下させかつ幹細胞移植片の有効性を増大させ得る。間葉性組織（例えば、骨、神経、希突起神経膠細胞、筋肉、脈管構造、骨髄間質、および真皮）を生じる幹細胞は、罹患したもしくは損傷した組織を修復または置換するために使用され得る。「分類される」または「単離される」とは、哺乳動物から回収され、細胞マーカー（抗体に対してが挙げられるが、これに限定されない）（結合体化していようと結合体化していなかろうと）、蛍光マーカー、酵素マーカー、色素、染料などと接触された幹細胞を意図する。
【００３５】
「細胞表面マーカー」とは、特定の抗体を介して検出可能な細胞表面に発現されたタンパク質である。本発明において有用な細胞表面マーカーとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＣＤ（分化のクラスター）抗原であるＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１１５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２４、ＣＤ１２７、ＣＤ１３０、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４４、ＣＤ１６６、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＶＥＧＦレセプター１（ＶＥＧＦ−Ｒ１）、ＶＥＧＦレセプター−２（ＶＥＧＦ−Ｒ２）、およびグリコホリンＡ。「細胞内マーカー」とは、遺伝子の発現または遺伝子生成物（例えば、検出可能な酵素）を意図する。例えば、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）は、大部分の造血性幹細胞において発現される細胞内酵素である。これは、蛍光物質を使用することによって、フローサイトメトリーを介して検出され得る（例えば、米国特許第５，８７６，９５６号、同第６，６２７，７５９号、および同第６，９９１，８９７号、ならびに米国特許出願第１１／２４７，７６４号および同第１０／５８９，１７３号（これらの各々は、その全体が本明細書に参考として援用される）を参照のこと）。
【００３６】
集団は、側方散乱チャネル（ＳＳＣ）光度および前方散乱チャネル（ＦＳＣ）光度に基づく上記細胞の光散乱特性に基づいてさらに富化され得る。「側方散乱」とは、フローサイトメトリーによって測定される場合、直角に（レーザー源の方向から約９０°）散乱した光の量を意図する。「前方散乱」とは、レーザー源の方向から概して９０°未満で散乱した光の量を意図する。一般に、細胞顆粒性が増大するにつれて側方散乱が増大し、そして細胞直径が増大するにつれて前方散乱が増大する。側方散乱および前方散乱は、光強度として測定される。当業者は、側方散乱の量が、ユーザーが規定した設定を使用して微分され得ることを認識する。用語「低側方散乱」および「ＳＳＣｌｏ」とは、上記フローサイトメーターの側方散乱チャネルにおいて、約５０％強度未満、約４０％強度未満、約３０％強度未満、またはさらに低い強度を意図する。逆に、「高側方散乱」または「ＳＳＣｈｉ」細胞は、ＳＳＣｌｏではない、逆の関係にある細胞集団である。前方散乱は、側方散乱と同じ様式で規定されるが、その光は、前方散乱チャネルで集められる。従って、本発明の実施形態は、幹細胞供給源から得られた細胞の細胞表面マーカー、細胞内マーカー、および光散乱特性の組み合わせに基づいた幹細胞集団の選択を包含する。
【００３７】
本明細書に開示される方法において有用な少なくとも上記第２の幹細胞集団は、マーカーの陽性発現に基づいて分類され得るＡＳＰＣを含み得る。いくつかの実施形態において、上記第１の細胞集団および上記第２の細胞集団はともに、マーカーの陽性発現に基づいて分類される。「発現について陽性」とは、目的のマーカー（細胞内であろうと細胞外であろうと）が任意の方法（フローサイトメトリーが挙げられるが、これらに限定されない）を使用して細胞の中または細胞上で検出可能であることを意図する。用語「発現について陽性」、「陽性に発現している」、「発現している」、上付文字で使用される「＋」および上付文字で使用される「ｐｏｓ」とは、本明細書で交換可能に使用される。「発現について陰性」とは、目的のマーカー（細胞内であろうと細胞外であろうと）が、いかなる特定の方法（フローサイトメトリーが挙げられるが、これらに限定されない）を用いても、細胞の中でも細胞上でも検出できないことを意図する。用語「発現について陰性」、「陰性発現」、「発現していない」、上付文字で使用される「−」および上付文字で使用される「ｎｅｇ」とは、本明細書において交換可能に使用される。
【００３８】
上付文字で使用される「ｂｒ」とは、（例えば、ＦＡＣＳを用いて）蛍光によって測定される場合に、同様に発現について陽性である他の細胞よりも明るい、目的のマーカーの陽性発現を意図する。当業者は、光度が検出閾値に基づくことを認識する。一般に、当業者は、陰性コントロールサンプルを最初に分析し、ＦＳＣおよびＳＳＣによって目的の集団の周りにゲート（ビットマップ（ｂｉｔｍａｐ））を設定し、光電子倍増管電圧を調節し、上記細胞のうちの９７％が陰性コントロールと一致して、蛍光マーカーで染色されていないようにみえるように、望ましい放射波長における蛍光を得る。一旦これらパラメーターが確立されると、染色された細胞は分析され、蛍光が、上記染色されていない蛍光細胞集団に対する相対的存在として記録される。本明細書で使用される場合、用語「明るい」または上付文字の「ｂｒ」とは、染色されていないコントロール細胞に対して検出可能な蛍光において、約２０倍より大きい、約３０倍より大きい、約４０倍より大きい、約５０倍より大きい、約６０倍より大きい、約７０倍より大きい、約８０倍より大きい、約９０倍より大きい、約１００倍より大きい、またはそれ以上の増加を意図する。逆に、本明細書において使用される場合、用語「薄暗い（ｄｉｍ）」または上付文字の「ｄｉｍ」とは、「明るい」または「ｂｒ」として規定されるものの逆の関係にある集団を意図する。
【００３９】
いくつかの実施形態において、少なくとも上記第２の細胞集団は、マーカーの発現に基づいて富化され得る。例えば、限定なく、いくつかの細胞によるＣＤ３４（非常にグリコシル化されたＩ型膜貫通タンパク質）またはＣＤ１３３（５回膜貫通糖タンパク質）の発現は、幹細胞活性および前駆細胞活性と関連しており、これら抗原のいずれか一方または両方を発現する細胞は、治療的用途のために、細胞分類によって単離され得る。他の実施形態において、上記第１の細胞集団および上記第２の細胞集団はともに、このようなマーカーの陽性発現に基づいて分類される。
【００４０】
いくつかの実施形態において、少なくとも上記第２の細胞集団は、細胞表面マーカーの発現の欠如に基づいて富化され得る（すなわち、上記富化された集団は、これらマーカーを発現する細胞を「実質的に含まない」）。例えば、限定なく、ＣＤ４５を発現する細胞は、代表的には、造血系統の範囲であるが、これら細胞は、細胞分類または他の方法によって取り出されて、治療目的で、非造血要素について富化された細胞集団（例えば、内皮前駆細胞）を生成し得る。他の実施形態において、上記第１の細胞集団および上記第２の細胞集団はともに、これら細胞表面マーカーの発現の欠如に基づいて富化され得る。
【００４１】
いくつかの実施形態において、本発明の方法において有用な少なくとも上記第２の細胞集団内のＡＳＰＣのうちの少なくとも１０％、２０％または３０％は、目的の細胞マーカーを発現する；他の実子形態において、少なくとも上記第２の細胞集団内のＡＳＰＣのうちの少なくとも４０％、５０％、または６０％は、目的の細胞マーカーを発現する；なお他の実施形態において、少なくとも上記第２の細胞集団内のＡＳＰＣのうちの少なくとも７０％、８０％、または９０％は、目的の細胞マーカーを発現する；さらに他の実施形態において、少なくとも上記第２の細胞集団内のＡＳＰＣのうちの少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはさらに１００％は、目的の細胞マーカーを発現する。「実質的に含まない」とは、上記集団中の細胞のうちの約５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満またはさらに０％が、目的のマーカーを発現することを意図する。臍帯血から精製された細胞集団の用途は、本明細書で具体的に例示されるが、他の供給源（骨髄、末梢血、および胎児肝臓を含む）由来のこのような細胞の用途はまた、企図される。
【００４２】
当該分野で公知および本明細書で記載される選択方法は、ＡＳＰＣをさらに富化するために使用され得る。一般に、ＡＳＰＣの供給源をモノクローナル抗体と反応させて、同種の細胞表面抗原を発現する細胞部分集団を、補体媒介性溶解、凝集法、または蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって免疫磁性ビーズを陽性的にまたは陰性的にいずれか一方で選択する。規定された細胞表面表現型を有する得られた部分集団のこの機能的属性は、次いで、コロニー形成アッセイを使用して決定される。ＡＳＰＣ活性を有するおよび有さない細胞の表現型が一旦既知になれば、これら方法は、治療的移植に適切なＡＳＰＣを選択するために使用され得る。
【００４３】
望ましい場合、最終的に分化した細胞の大部分は、陰性選択分離工程を最初に使用することによって除去され得る。例えば、磁性ビーズ分離は、少なくとも上記第２の細胞集団からの多数の系統が約束された細胞を除去するために最初に使用され得る。望ましくは、総細胞のうちの少なくとも約８０％、通常は、少なくとも約７０％が、除去される。
【００４４】
細胞分離のための手順としては、抗体がコーティングされた磁性ビーズを使用した磁性分離による陽性選択または陰性選択、アフィニティークロマトグラフィー、モノクローナル抗体に結合されるかまたはモノクローナル抗体とともに使用される細胞傷害性薬剤（補体および細胞毒素が挙げられるが、これらに限定されない）、および固体マトリクス（例えば、プレート）に結合された抗体での「パニング」、エラトリエーション（ｅｌｕｔｒｉａｔｉｏｎ）または任意の他の便利な技術が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４５】
正確な細胞分離を提供する技術としては、フローサイトメトリーが挙げられるが、これに限定されない。フローサイトメトリーは、種々の程度の洗練化（ｓｏｐｈｉｓｔｉｃａｔｉｏｎ）（例えば、複数のカラーチャネル、ローアングル（ｌｏｗ  ａｎｇｌｅ）および鈍い光散乱検出チャネル、インピーダンスチャネルなど）を有し得る。種々の特定の用途に分けられた（ｄｅｄｉｃａｔｅｄ）系統のための抗体は、種々の蛍光色素によって明るくされ得る。マルチカラー分析における使用が見いだされ得る蛍光色素としては、フィコビリプロテイン（例えば、フィコエリトリンおよびアロフィコシアニン）；フルオレセイン；およびデキサスレッドが挙げられる。少なくとも上記第２の細胞集団の細胞はまた、死細胞において選択的に蓄積する色素（例えば、ヨウ化プロピジウムおよび７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ））を使用することによって、死細胞に対して選択され得る。好ましくは、上記細胞は、約２％  ウシ胎児血清（ＦＣＳ）または０．２％  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む培地中に回収される。例えば、Ｆａｌｌｏｎら（２００３）Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１２１：１（本明細書に参考として援用される）を参照のこと。
【００４６】
陽性選択のための他の技術が使用され得、正確な分離を可能にする（例えば、アフィニティーカラムなど）。選択された方法は、少なくとも上記第２の細胞集団の望ましい集団のうちの約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、または約５％未満の残余量にまで非前駆細胞の除去を可能にするはずである。
【００４７】
上記富化工程のために使用される単離手順に拘わらず、少なくとも上記第２の集団の得られた細胞は、治療的に重要な特性を有する。一実施形態において、本発明の方法において有用な少なくとも上記第２の細胞集団は、ＡＬＤＨｂｒ細胞を含む。ＡＬＤＨｂｒ細胞は、高レベルの酵素アルデヒドデヒドロゲナーゼを発現し、フローサイトメトリー分析において低い側方散乱シグナルを与える。ＡＬＤＨｂｒ細胞集団の種々の特性およびこれらを得る方法は、当該分野で周知である。例えば、米国特許第６，５３７，８０７号；米国特許第６，６２７，７５９号；Ｓｔｏｒｍｓら（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６：９１１８；ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００５／０８３０６１；Ｓｔｏｒｍｓら（２００５）Ｂｌｏｏｄ  １０６（１）：９５−１０２；およびＨｅｓｓら（２００４）Ｂｌｏｏｄ  １０４（６）：１６４８−５５（これらの各々は、それら全体が本明細書に参考として援用される）を参照のこと。
【００４８】
これらＡＬＤＨｂｒ細胞は、造血系統のうちのいずれかの細胞（骨髄系細胞（例えば、血小板、巨核球、および赤血球）およびリンパ性細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、および抗原提示細胞）が挙げられるが、これらに限定されない）を生成するために使用され得る。これら細胞はまた、造血系統のうちのいずれかの細胞（骨髄性細胞（例えば、血小板、巨核球、および赤血球）およびリンパ性細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、および抗原提示細胞）が挙げられるが、これらに限定されない）を生成することができる。
【００４９】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、造血性幹細胞とよく似て、抗体のパネルを使用して特徴付けられた。ＭＳＣは、一般に、ＣＤ１４、ＣＤ３４およびＣＤ４５の発現を欠いている。ＭＳＣは、一般に、ＣＤ１０５およびＣＤ７３に対して陽性である。培養された間葉細胞を同定するために研究者によって使用される他のマーカーとしては、ＣＤ２９、Ｔｈｙ−１（ＣＤ９０）、ＣＤ１１５、ＣＤ１４４、ＣＤ１６６、およびＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、もしくはＨＬＡ−Ｃのようなマーカーの陽性発現が挙げられる。機能的には、ＭＳＣは、脂肪生成細胞コロニー、骨形成細胞コロニー、筋形成細胞コロニー、および軟骨形成細胞コロニーへと分化するそれらの能力についてインビトロで試験され得る。
【００５０】
他の実施形態において、ＵＣＢから単離される、本発明の方法において有用な少なくとも上記第２の細胞集団は、例えば、ＡＬＤＨｂｒである。なお他の実施形態において、骨髄および動員末梢血から単離された、少なくとも上記第２の細胞集団は、例えば、ＡＬＤＨｂｒである。
【００５１】
他の幹細胞精製もしくは濃縮の方法としては、対向流遠心分離エラトリエーション（ｃｏｕｎｔｅｒｆｌｏｗ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ｅｌｕｔｒｉａｔｉｏｎ）、平衡密度遠心分離、単位重力での速度沈降、免疫ロゼット形成および免疫付着、ならびにＴリンパ球除去のような技術の使用が挙げられ得る。
【００５２】
富化されたＡＳＰＣは、その後の移植の際に、特定のタイプの細胞の発生を促進するためにエキソビボで操作され得るかまたは増殖され得る。例えば、ＵＣＢ細胞は、同種異系移植後の好中球、赤血球、および血小板の生着を促進しようとするために、増殖されてきた。エキソビボ増殖のための技術は、当該分野で十分に記載されている。例えば、ＭｃＮｉｅｃｅ  ａｎｄ  Ｂｒｉｄｄｌｅ（２００１）Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２９：３；ＭｃＮｉｅｃｅら（２０００）Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２８：１１８６；Ｊａｒｏｓｃａｋら（２００３）Ｂｌｏｏｄ  １０１：５０６１を参照のこと。本発明は、このように増殖されたかまたは操作された細胞集団（この細胞集団は、実際に、培養を介して選択された細胞集団を含む）はまた、上記第１の細胞集団または上記第２の細胞集団のために使用され得ることを予測する。
【００５３】
ＶＩ．投与
本発明の方法において有用な細胞集団は、種々の治療レジメンおよび診断レジメンにおける適用を有する。それら細胞集団は、好ましくは、被験体への投与の前に、適切なキャリア（例えば、緩衝化生理食塩水）中に希釈される。上記細胞は、任意の生理学的に受容可能なビヒクルにおいて投与され得る。細胞は、患者の臨床的管理を促進するために、中心線を介して、注射、カテーテルなどによって、従来どおり、血管内に投与される。この投与経路は、肺血管系を介して、最初の通過循環（ｐａｓｓ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）に細胞を送達する。通常、少なくとも約１×１０５個細胞／ｋｇおよび好ましくは、約１×１０６個細胞／ｋｇ以上が、上記第１の細胞集団において、または上記第１の細胞集団および上記第２の細胞集団の組み合わせで、投与される。例えば、Ｓｅｚｅｒら（２０００）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１８：３３１９およびＳｉｅｎａら（２０００）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１８：１３６０を参照のこと。望ましい場合、さらなる薬物（例えば、５−フルオロウラシルおよび／または増殖因子）がまた、同時に導入され得る。適切な増殖因子としては、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、γ−インターフェロン、およびエリスロポエチン）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本発明の細胞集団は、有益なサイトカインの分泌および／または幹細胞増殖、ホーミングもしくは分化を誘導するシグナルを送達し得る細胞表面タンパク質の提示が挙げられるが、これらに限定されない任意の手段によって、生着を支援または高める他の細胞集団と組み合わせて投与され得る。これらの実施形態において、上記第２の細胞集団のうちの１００％未満が、富化された幹細胞を含む。
【００５４】
いくつかの実施形態において、第１の肝細胞集団および／または第２の幹細胞集団は、標準的方法を使用して凍結および融解された後に、赤血球および／または顆粒球の除去によって整えられ得る（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）。
【００５５】
上記第１の幹細胞集団および／または上記第２の幹細胞集団は、任意の薬学的にもしくは医療的に受容可能な様式において（注射または輸液によるものが挙げられる）被験体に投与され得る。上記細胞集団または追加される細胞集団は、任意の薬学的に受容可能なキャリアを含み得るか、またはこのようなキャリア中に含まれ得る。例えば、本発明の薬学的組成物は、本明細書に記載されるように、１種以上の薬学的にまたは生理学的に受容可能なキャリア、希釈剤もしくは賦形剤と組み合わせて、標的細胞集団を含み得る。このような組成物は、緩衝液（例えば、中性緩衝化生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水など）；炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、スクロースもしくはデキストラン、マンニトール）；タンパク質；ポリペプチドもしくはアミノ酸（例えば、グリシン）；抗酸化剤；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡもしくはグルタチオン）；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および保存剤を含み得る。本発明の組成物は、好ましくは、静脈内投与のために処方される。上記第１の幹細胞集団および／または上記第２の幹細胞集団は、任意の薬学的にもしくは医療的に受容可能な容器（例えば、血液バッグ、移動用バッグ、プラスチックチューブもしくはバイアル）の中に入れて収容され得るか、貯蔵され得るか、または輸送され得る。
【００５６】
本発明の細胞組成物は、組織修復もしくは再生を達成するためにまたは望ましい疾患もしくは状態を処置するために十分な量で、被験体（好ましくは、ヒト）に導入されるべきである。好ましくは、少なくとも約２．５×１０７個細胞／ｋｇ、少なくとも約３．０×１０７個細胞／ｋｇ、少なくとも約３．５×１０７個細胞／ｋｇ、少なくとも約４．０×１０７個細胞／ｋｇ、少なくとも約４．５×１０７個細胞／ｋｇ、または少なくとも約５．０×１０７個細胞／ｋｇが、上記第１の細胞集団、上記第２の集団、または上記第１の幹細胞集団と上記第２の幹細胞集団との組み合わせのいずれか一方において、任意の処置のために使用される。いくつかのドナーからの臍帯血が使用される場合、被験体に導入される臍帯血幹細胞の数は、より多い可能性がある。上記第２の細胞集団が、ＡＳＰＣについて富化される場合、生着を容易にするかまたは促進するために必要な１ｋｇあたりの有核細胞数は、２．５×１０７個細胞／ｋｇより少ない可能性がある。従って、本発明の方法は、血液学的な回復のために必要な移植細胞数を減少させ得る。この方法は、移植に利用可能な細胞数（例えば、臍帯血に由来する）が制限される場合、特に有用である。
【００５７】
「治療上有効な量」が示される場合、本発明の組成物の投与されるべき正確な量は、被験体の年齢、体重、腫瘍の大きさ、感染もしくは転移の程度、および被験体の状態の考慮事項とともに、当業者によって決定され得る。上記細胞は、当該分野で一般に公知である注入もしくは注射技術を使用することによって投与され得る。
【００５８】
ＶＩＩ．補助療法
本発明の方法における第１の幹細胞集団および第２の幹細胞集団の使用によれば、上記ドナー細胞の免疫学的拒絶を低下させるために上記宿主を処置し得る（例えば、米国特許第５，８００，５３９号（１９９８年９月１日発行）；および米国特許第５，８０６，５２９号（１９９８年９月１５日発行）に記載されるもの（これらはともに、本明細書に参考として援用される））。
【００５９】
本発明の特定の実施形態において、本発明の細胞は、薬剤（例えば、骨髄破壊性（高用量）化学療法）、化学療法、照射、免疫抑制剤（例えば、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）、ブスルファン、ＩＶＩＧ、メルファラン、メチルプレドニゾンロン、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキセート、ミコフェノール酸、およびＦＫ５０６）、抗体、または他の免疫破壊性（ｉｍｍｕｎｏａｂｌａｔｉｖｅ）薬剤（例えば、ＣＡＭＰＡＴＨ）、抗ＣＤ３抗体もしくは他の抗体治療、サイトキシン（ｃｙｔｏｘｉｎ）、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン、および局所もしくは全身照射での処置の後に、被験体に投与される。これら薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリンを阻害する（シクロスポリンおよびＦＫ５０６）か、または増殖因子誘導性シグナル伝達に重要なｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する（ラパマイシン）（Ｌｉｕら，Ｃｅｌｌ  ６６：８０７−８１５，１９９１；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら，Ｉｍｍｕｎ．７３：３１６−３２１，１９９１；Ｂｉｅｒｅｒら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎ．５：７６３−７７３，１９９３；Ｉｓｏｎｉｅｍｉ（前出））。さらなる実施形態において、本発明の細胞組成物は、骨髄移植、いずれかの化学療法剤（例えば、フルダラビン）を使用するＴ細胞破壊性治療、外部ビーム放射療法（ｅｘｔｅｒｎａｌ−ｂｅａｍ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ）（ＸＲＴ）、シクロホスファミド、または抗体（例えば、ＯＫＴ３もしくはＣＡＭＰＡＴＨ）と組み合わせて（例えば、前、同時もしくは後）、被験体に投与される。別の実施形態において、本発明の細胞組成物は、Ｂ細胞破壊性治療（例えば、ＣＤ２０と反応する薬剤（例えば、Ｒｉｔｕｘａｎ））の後に投与される。例えば、一実施形態において、被験体は、高用量の化学療法による標準的な処置、続いて、幹細胞移植を受け得る。移植後、被験体は、本明細書に記載される２つの細胞集団の注入を受ける。
【００６０】
被験体に投与されるべき上記処置の投与量は、処置される状態の正確な性質および処置の被験体によって変動する。ヒト投与のための投与量の概算は、当該分野で受け入れられている実務に従って行われ得る。
【００６１】
ＶＩＩＩ．治療応答のモニタリング
被験体における治療応答をモニターするための方法は、被験体における、総合的かつ事象なしの生存、血小板生着、ＡＮＣ生着、疾患の再発などのうちの１種以上の評価を包含する。処置に対する応答は、適切なコントロールに対して比較され得る。これら応答をモニターするための方法は、当該分野で周知であり、本明細書において例示される。
【００６２】
本発明の目的のために、「被験体」とは、本発明の細胞調製物を投与している個体をいう。上記被験体は、ヒト、非ヒト霊長類、実験動物などであり得るが、好ましくは、ヒトである。「コントロール」とは、観察の性質に依存して、処置されていないか、偽処置されているか（例えば、上記個体は、第１の細胞集団および第２の細胞集団（ここで一方の集団および両方の集団は、本明細書に記載される細胞調製物を含まない）で処置されている）、生着を改善するためにおよび／または幹細胞移植に対する治療応答を改善するために、類似のまたは別個の方法で処置されているか、あるいは本明細書に記載される幹細胞マーカーのうちの１種以上について富化されていない細胞集団で処置されている個体（または個体群）を包含し得る。例えば、ＡＬＤＨｂｒ細胞について富化された第２の細胞集団で処置された上記被験体の治療応答を比較しようとする場合、適切なコントロールは、第２の細胞集団がＡＬＤＨｂｒ細胞について富化されていない被験体の治療応答を包含し得るか、または第２の細胞集団が代替の細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ３４）について富化された被験体の治療応答を包含し得る。あるいは、コントロールは、歴史的コントロール（ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ）であり得る。例えば、本発明の方法に対する上記被験体の応答は、生着を調節するためにおよび／または幹細胞移植に対する治療応答を改善するために、類似のまたは別個の手順を受けている被験体の以前に研究された集団において認められた応答に対して比較され得る。
【００６３】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、部分的には、Ｔ細胞集団を除去することによって、ＩＩＩ期および／またはＩＶ期の急性移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）の発生率および／または重篤度の低下を生じる。本発明の幹細胞集団からのこの除去は、同種異系移植のレシピエントにおけるＧｖＨＤの発生率および重篤度を低下させることが予期され得る。例えば、Ｈｏ  ａｎｄ  Ｓｏｉｆｆｅｒ（２００１）Ｂｌｏｏｄ  ９８：３１９２を参照のこと。ＧｖＨＤは、ドナーＴ細胞が標的器官損傷（これは、しばしば死をもたらす）を引き起こす、正常宿主細胞上の抗原に対して反応する場合に生じる。ＧｖＨＤの主要な標的器官は、免疫系、皮膚、肝臓および腸である。
【００６４】
ＧｖＨＤには２種類存在する：急性および慢性。急性ＧｖＨＤは、移植後最初の３ヶ月以内に現れる。急性ＧｖＨＤの徴候としては、皮膚剥離または皮膚水疱とともに、拡大しかつより重篤になり得る手および足上の赤らんだ皮膚の皮疹が挙げられる。ＧｖＨＤは、その重篤度に基づいてランク付けされる：段階（ｓｔａｇｅ）（または期（ｇｒａｄｅ））１は軽度であり、段階（または期）４は重篤である。慢性ＧｖＨＤは、移植後３ヶ月以降に発生する。慢性ＧｖＨＤの症状は、急性ＧｖＨＤのものに類似であるが、さらに、慢性ＧｖＨＤはまた、眼の粘液腺、口の唾液腺、および胃の内層および腸を潤滑にする腺に影響を及ぼし得る。
【００６５】
本明細書において記載される細胞集団の投与後に、上記被験体は、悪性細胞のレベルについて、すなわち、最小の後遺症（ｒｅｓｉｄｕａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ）の証拠についてモニターされ得る。このようなモニタリングは、再発の臨床的徴候についての被験体の追跡を含み得る。上記モニタリングはまた、適切である場合、いかなる残りの悪性細胞をも検出または定量するための種々の分子アッセイもしくは細胞アッセイを包含し得る。例えば、性別ミスマッチであるドナーおよびレシピエントの場合、残っている宿主由来の細胞は、適切な性別マーカー（例えば、Ｙ染色体特異的核酸プライマーもしくはプローブ）の使用を介して検出され得る。ドナーとレシピエントとの間で単一のＨＬＡ遺伝子座がミスマッチの場合、残っている宿主細胞は、上記ドナーとレシピエントとの間で異なるクラスＩ遺伝子座もしくはクラスＩＩ遺伝子座のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析によって詳細に記録され得る。あるいは、腫瘍細胞に特異的な適切な分子マーカーが使用され得る。例えば、慢性骨髄性白血病におけるｂｃｒ／ａｂｌ転座に対して、種々の腫瘍において活性な他の腫瘍遺伝子に対して、不活性化された腫瘍サプレッサ遺伝子、他の腫瘍特異的遺伝子、もしくは腫瘍細胞に対して特異的であることが公知の任意の他のアッセイ試薬に対して、特異的な核酸プライマーおよび／またはプローブが、使用され得る。これらもしくは機能的に匹敵する手順のいずれかが、残っている悪性細胞の証拠について上記被験体をモニターするために使用され得る。一実施形態において、本発明の方法は、コントロールと比較した場合、悪性細胞の存在において、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または少なくとも約１００％の減少を生じる。
【００６６】
本発明の方法に従う被験体の処置は、上記疾患、障害もしくは状態が、いずれかの方法で測定可能に改善される場合、有効であるとみなされ得る。このような改善は、多くの指標によって示され得る。測定可能な指標としては、例えば、特定の疾患、障害もしくは状態と関連した生理学的状態もしくは生理学的状態のセット（血圧、心拍数、呼吸率、種々の血球タイプの数、特定のタンパク質、炭水化物脂質もしくはサイトカインの血中レベル、または上記疾患、障害もしくは状態と関連した遺伝的マーカーの調節された発現が挙げられるが、これらに限定されない）における検出可能な変化が挙げられる。本発明の幹細胞もしくは追加細胞集団での個体の処置は、このような指標のうちのいずれか１つが、正常値範囲内もしくは正常値近くの値に変化することによってこのような測定に応答している場合、有効であるとみなされる。上記正常値は、種々の指標について当該分野で公知である正常範囲によって、またはコントロールにおけるこのような値に対する比較によって、確立され得る。医学においては、処置の有効性はまた、しばしば、個体の健康状態の個々の印象および主観的感覚によって特徴付けられる。従って、改善はまた、本発明の細胞集団の投与後に、主観的指標（例えば、個体の改善の主観的感覚、満足状態（ｗｅｌｌ−ｂｅｉｎｇ）の増大、健康状態の改善、エネルギーレベルの改善など）によって特徴付けられ得る。一実施形態において、本発明の方法は、コントロールと比較した場合に、上記の臨床的指標のうちの１種以上において、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約１２５％、約１５０％、約１７５％、約２００％、約２５０％、少なくとも約３００％、またはそれ以上の改善を生じる。
【００６７】
血液学的な回復の主な尺度は、好中球数である。好中球は、通常、血中の全白血球のうちの約４５〜７５％を構成する。上記好中球数が、血液１μｌあたり１，０００個細胞未満に低下すると、感染の危険性がある程度高まる；上記好中球数が１μｌあたり５００個細胞未満に低下すると、感染の危険性は、大きく高まる。好中球によって提供される重要な防御がない場合、感染制御は問題になり、そして被験体は、感染によって死亡する危険性がある。従って、臨床的状況（例えば、移植の状況）では、好中球数が早く回復するほど、被験体が病院から早く解放され得る。従って、好中球の臨床的に直接関連するレベルを達成するためにかかる時間の任意の短縮は、上記被験体にとって有益であり、血液学的な回復の促進として本明細書において企図される。本発明の目的のために、好中球生着は、少なくとも５００個の好中球／μｌの絶対好中球数（ＡＮＣ）として定義される。上記好中球数は、個々の被験体（または複数の被験体の平均）がＡＮＣ閾値に達する日付として、または移植後特定の日数までに５００個好中球／μｌのＡＮＣを有する被験体の割合（通常は、４２日目あたり）として、またはある個体が特定の日付までに特定の閾値に達する確率として報告され得る。一実施形態において、本発明の方法は、１０日目以前、１１日目以前、１２日目以前、１３日目以前、１４日目以前、１５日目以前、１６日目以前、１７日目以前、１８日目以前、１９日目以前、２０日目以前、２１日目以前、２２日目以前、２３日目以前、２４日目以前、２５日目以前、２６日目以前、２７日目以前、２８日目以前、２９日目以前、３０日目以前、３１日目以前、３２日目以前、３３日目以前、３４日目以前、３５日目以前、３６日目以前、３７日目以前、３８日目以前、３９日目以前、４０日目以前、４１日目以前、４２日目以前、４３日目以前、４４日目以前、４５日目以前、４６日目以前、４７日目以前、または４８日目以前に、好中球生着を生じる。別の実施形態において、正常とみなされる基準ＡＮＣ数に患者が達する日数は、コントロール患者群に対して、５日間、６〜１０日間、１１〜２０日間、または２０日間超まで促進される。
【００６８】
血液学的な回復はまた、血小板の臨床的に直接関連する回復によって測定され得る（当業者によって認識されるように、血液１μｌ単位で１５０，０００〜４５０，０００個の間の血小板が通常存在する）。従って、血小板の臨床的に直接関連する回復の速度の任意の増加は有利であり、本明細書で企図される。本発明の目的のために、血小板生着は、輸液の支援なしで、少なくとも５０，０００個の血小板／血液１μｌの血小板数の維持として定義される。上記血小板数は、個々の被験体（または複数の被験体の平均）が上記血小板数閾値に達する日付として、または移植後特定の日数までに（通常、約１８０日目）少なくとも５０，０００個血小板／μｌ血液の血小板数を有する上記被験体の割合（または少なくとも５０，０００個血小板／μｌ血液の血小板数に達する被験体の確率）として報告され得る。一実施形態において、本発明の方法は、５０日目以前、５５日目以前、６０日目以前、６５日目以前、７０日目以前、７５日目以前、８０日目以前、８５日目以前、９０日目以前、９５日目以前、または１００日目以前に、血小板生着を生じる。別の実施形態において、患者が正常であるとみなされる基準血小板数を達成する日数は、コントロール患者群に対して、５日間、６〜１０日間、１１〜２０日間、または２０日間超まで促進される。
【００６９】
特定の実施形態において、Ｔ細胞回復の速度はまた、血液学的な回復の促進の指標である。Ｔ細胞回復の指標は、上記被験体におけるＰＨＡ誘導性増殖に対する応答および／またはＣＤ４＋細胞数の増加が挙げられ得る。上記ＣＤ４＋の数は、個々の被験体（または複数の被験体の平均）がＣＤ４＋数の閾値に達する日付として、または移植後特定の基準日数までに（通常は、１００日目）、閾値ＣＤ４＋数を有する上記被験体の割合（または被験体が閾値ＣＤ４＋数に達する確率）として報告され得る。一実施形態において、本発明の方法は、１００日目に、コントロール集団の患者における数より少なくとも約２５％〜１００％以上であるＴ細胞数を生じる。別の実施形態において、患者が基準ＣＤ４数を達成する移植後日数は、コントロール群の患者が同じ基準ＣＤ４数を達成する日数よりも、約１０〜約２０日間早いか、約２０〜約３０日間早いか、約３０〜約４０日間早いか、約４０〜約５０日間早いか、または５０日間を超えて早い。
【００７０】
治療的応答はまた、総合的および／または事象なしの生存に関して測定され得る。事象なしの生存（ＥＦＳ）は、移植から最初の事象の日までの時間として定義される。事象は、移植失敗、自己再構築（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、再発、または死亡として定義される。白血病被験体における再発は、標準的基準によって決定される。第３のエンドポイントは、急性ＧｖＨＤの発生率の説明、および非再発死亡率の他の尺度が挙げられる。ＧｖＨＤは、標準的基準に従ってスコア付けされる（Ｐｒｚｅｐｉｏｒｋａら．（１９９５）Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１５：８２５−８２８）。一実施形態において、本発明の方法は、報告されるコントロールより少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、少なくとも約３００％、またはそれ以上の％改善された総合的および／または事象なしの生存（例えば、より少ない事象の発生率（特に、ＩＩＩ期および／またはＩＶ期の急性ＧｖＨＤ）、生存日数の数の増大、および／またはコントロール集団と比較した場合に移植後特定の日付まで生存している患者数がより多いこと）を生じる。
【００７１】
治療応答の別の包括的尺度は、１８０日目での総合的な生存である。この測定基準において、本発明に従って移植された患者群における生存は、従来の方法によって処置されたコントロール群における総合的な生存と比較される。本発明の一実施形態において、患者は、コントロール患者と比較して、少なくとも約５％の総合的な生存、少なくとも約６〜１０％の総合的な生存、少なくとも約１１〜１５％の総合的な生存、少なくとも約１６〜２０％の総合的な生存、または２０％超の総合的な生存の改善を示す。
【００７２】
以下の実施例は、例示のために提供されるのであって、限定のために提供されるのではない。
【実施例】
【００７３】
（実験）
実施例１：血縁関係にないミスマッチのＵＣＢ移植後の免疫再構築
免疫再構築は、ＵＣＢ移植の約１００名の生存者において評価し、６５０日間のメジアン（範囲は１２１〜２４５０日間）で追跡した。この研究の結果は、Ｋｌｅｉｎら（２００１）Ｂｉｏｌ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓ  ７：４５４−４６６において見いだされ得る。簡潔には、機能的パラメーターおよび免疫表現型パラメーターは、移植後３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、１２ヶ月、２４ヶ月および３６ヶ月で、移植した患者の末梢血においてアッセイした。患者を、一般に、移植後最初の３ヶ月間にわたってメチルプレドニゾロン（ｍｅｔｈｙｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）、および移植後最初の１年間にわたってシクロスポリンで維持した。移植後２年間および３年間に、免疫化を再び設けた。活動性の慢性のＧｖＨＤがない全ての生存している患者は、通常のＣＤＣ推奨に従って、死滅ワクチンおよび生ワクチンの完全な量（ｆｕｌｌ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を受けた。乳児および２歳齢未満の幼児は、ＣＤ４数およびＰＨＡ応答によって測定される場合、移植後６ヶ月までにＴ細胞免疫機能を回復した。２歳〜１２歳の小児は、移植後９〜１２ヶ月までに同様の機能を回復した。対照的に、ティーンエイジャーおよび成人は、移植後３年までに免疫機能を回復した。上記宿主の胸腺は、上記ＵＣＢ移植片からの免疫再構成に寄与するようである。患者が若くかつ胸腺が健康であるほど（例えば、移植前に放射線に曝露されていない）、胸腺の回復はより早くかつ上記移植片からの免疫再構築により早く寄与する。小児は、移植後１年までに正常化した一方で，成人は、移植後３年で年齢に対する正常の下限に近づいた。その間に、成人は、末梢機構によってＴ細胞を再構築した。より早い免疫再構築を有するそれらの患者は、全体的に、移植でより好転した。彼らは、移植後最初の２〜４ヶ月で、日和見感染症を発症させる可能性が低かった。この分類の患者は、優れた生存を有した。ＣＤ４細胞％は、日和見感染症なしという最良の予測変数であった（ｐ＝＜０．００１）。
【００７４】
実施例２：先天性の代謝の間違い（Ｉｎｂｏｒｎ  Ｅｒｒｏｒｓ  ｏｆ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）を有する小児患者におけるＵＣＢ移植の臨床結果
臍帯血移植研究（ＣＯＢＬＴ）（複数施設の、見込みのある、ＮＩＨにより支援された、血縁関係にないドナー臍帯血移植の治験）からの最近の結果は、ＵＣＢＴの分野をさらに進化させた。Ｋｕｒｔｚｂｅｒｇら．（２００５）Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  １１（２）：２（ａｂｓｔ  ６）；Ｋｕｒｔｚｂｅｒｇら．（２００５）Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  １１（２）：８２（Ａｂｓｔ  ２４２）を参照のこと。
【００７５】
ＣＯＢＬＴ研究の異なる階層は、先天性の代謝の間違いを有する６９名の小児において臍帯血移植の有効性を評価した。小児性クラッベ病およびハーラー症候群（ＭＰＳ  Ｉ）を有する赤ん坊におけるＵＣＢＴの結果の事前および未決のままの報告が増加した。通常のプロトコルは、予備レジメン（ブスルファン、シクロホスファミド、ＡＴＧ）およびＧｖＨＤ予防（シクロスポリン、ステロイド）について使用した。ＭＰＳ  １−Ｖ（ｎ＝３６、２０名は以前に報告した）、グロボイド細胞型白質ジストロフィー（クラッベ病、ｎ＝１６）、副腎脳白質ジストロフィー症（ｎ＝８）、異染性白質ジストロフィー（ｎ＝６）およびテイ・サックス病（ｎ＝３）を有し、メジアン年齢１．８歳（範囲は０．１〜１１．７歳）およびメジアン体重１２．３ｋｇ（範囲３．９〜４２．３ｋｇ）の患者に、部分的にＨＬＡがミスマッチの、血縁関係にないドナー臍帯血（ＣＯＢＬＴ（８３％）もしくは他の（１７％）バンクから選択されたメジアン８．７ｘ１０ｅ７個有核細胞／ｋｇ（範囲２．８〜３８．８個細胞／ｋｇ）を与える）を移植した。ＣＢＵを、保菌者ドナー（ｃａｒｒｉｅｒ  ｄｏｎｏｒ）の使用を防ぐために、酵素活性についてスクリーニングした。患者の６４％が男性、７７％が白色人種であった。ＨＬＡクラスＩ  Ａ＆Ｂで低分解能タイプ分けおよびＨＬＡクラスＩＩ  ＤＲＢ１で高分解能タイプ分けすることによって測定される場合、上記患者のほぼ半数（４８％）が、４／６でＨＬＡ遺伝子座がマッチしているＵＣＢ単位を受けた。
【００７６】
好中球生着（ＡＮＣ  ５００／μＬ、１００日目までで９０％のドナーキメラ現象を伴う）の累積発生率は、７８％であった（メジアンは２６日間で起こった）。急性のＩＩ期〜ＩＶ期のＧｖＤＨの累積発生率は、４６％であった。１８０日間および１年間での生存確率は、それぞれ、８０％および７２％であった。レシピエントとドナーとの間のＨＬＡ不均衡のレベルは、生着にも、ＧｖＨＤにも、総合的な生存にも影響を及ぼさなかった。ＭＰＳ、ＴＳＤ、ＧＬＤおよびＭＬＤを有する生存している患者は全て、移植後の巧妙さ（ｓｋｉｌｌ）を安定化したおよび／または増した。ＡＬＤを有する８名の患者（そのうちの全員が、移植の紹介の時点で軽度から中程度の臨床的症状を有した）のうちの３名は、安定化の前に、神経学的悪化とともに疾患進行を経験した。症状の発生前に移植した、ハーラー症候群の重篤な表現型を有する赤ん坊（Ｋｕｒｔｚｂｅｒｇ，２００５（前出）およびＤｅｘｔｅｒら（１９７７）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ９１：３３５−３４４）およびクラッベ病を有する新生児（Ｇａｒｔｎｅｒら（１９８０）Ｇａｒｔｎｅｒ  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ７７：４７５６−４７５９）における結果は、年齢にあった正常な思考力指数を有する患者の大部分で前例がなかった。移植時の年齢が若いほどかつ上記疾患の過程において早期であるほど、総合的結果はよりよくなる。従って、臍帯血移植が、先天性の代謝の間違いを有する乳児、幼児および小児の早期の処置のための速やかに入手可能なドナー供給源を提供することは明らかである。
【００７７】
実施例３：ＡＬＤＨｂｒ  ＵＣＢ細胞を富化するための事前の精製工程
移植のために選択された臍帯血単位を、細胞、ヘスパン（ｈｅｓｐａｎ）および１０％  ＤＭＳＯの合計２５ｍｌで、２区画の低温保存バッグ（２０％／８０％  分割）中に保存する。移植の−５日目に、その２０％（５ｍｌ）画分を、液体窒素から取り出し（手順  ５Ｄ．１６０．０１）、どろどろした粘稠性になるまで３７℃で融解する。デキストラン／アルブミンを添加して、最初の容積の４倍に希釈し、上記細胞を洗浄し、ペレット化し、ＡＬＤＥＳＯＲＴ（登録商標）アッセイ緩衝液／１００Ｕ／ｍｌ  ＤＮａｓｅ  Ｉ（Ａｌｄａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）中に再懸濁する。赤血球  対  白血球の比を、＜１ｘ１０ｅ８個細胞／ｍｌに調節する。上記細胞は、細胞を標識するために、ＥＡＳＹＳＥＰ（登録商標）（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）抗グリコホリンＡおよびＣＤ１４カクテルで除去した系統である。上記標識した細胞を、ＥＡＳＹＳＥＰ（登録商標）磁性ナノ粒子と混合し、室温で１０分間インキュベートする。次いで、上記サンプルを、系統陽性細胞を除去するＥＡＳＹＳＥＰ（登録商標）磁性に露出する。残っている系統除去細胞を、コニカルチューブの中へと穏やかに吸引する。ＲＢＣ：ＷＢＣ比をチェックすると、＜１：１０であるはずである。ＲＢＣ：ＷＢＣ比がより高ければ、上記ＥＡＳＹＳＥＰ（登録商標）除去を反復する。
【００７８】
実施例４：高速ＦＡＣＳソーティングによるＡＬＤＨｂｒ  ＵＣＢ細胞の単離
上記系統除去細胞を、活性化ＡＬＤＥＳＯＲＴ（登録商標）試薬で染色し、３７℃で１５分間インキュベートする。上記反応を停止させ、コントロールを調製して、上記ＡＬＤＨｂｒ細胞を、ＦＡＣＳＡｒｉａソーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）での高速フローソーティングによって単離する。ＡＬＤＨｂｒ細胞を単離するための方法は、Ｓｔｏｒｍｓら，１９９９（前出）およびＰＣＴ公開番号ＷＯ  ２００５／０８３０６１（これらはともに、それらの全体が本明細書に参考として援用される）中により十分に記載される。上記細胞を凍結し得るか、または以下に記載されるようにすぐに注入し得る。
【００７９】
実施例５：従来からの操作していない移植片（第１の細胞集団）についてのＵＣＢ融解および注入
ＵＣＢのバッグを、フード下で無菌技術を使用して、実験室で融解する。上記ＵＣＢを３７℃のウォーターバス中で融解し、５％  アルブミン／デキストラン溶液［アルブミン２５％（１２．５ｇｍｓ／５０ｍｌ）（５００ｍｌデキストラン中に２５ｇｍｓ）］を使用して１：１容積まで希釈して、細胞生存性を保つ。上記５％  アルブミン／デキストラン溶液を、ストップコック付き移動用バッグを使用して、上記融解したＵＣＢにゆっくりと添加し、穏やかに混合する。上記融解しかつ希釈したＵＣＢを次に秤量し、遠心分離する（４℃で２０００ｒｐｍ×２０分間）。標本を、細胞数および生存性、培養、クローン産生性アッセイ、ならびに表現型のために得る。ＤＭＳＯおよび上記アルブミン／デキストラン溶液を含む上清を除去し、上記ＵＣＢペレットを、５％  アルブミン／デキストラン溶液を使用して１：１容積まで再び再懸濁する。上記ＵＣＢを患者同定情報で標識し、注入のためにベッドサイドに移動する。上記ＵＣＢを、上記患者の中心静脈カテーテルを介して、１〜３ｍｌ／分の速度で注入する。ＵＣＢを、インラインフィルターなしで注入し、照射しない。上記患者が胸部締め付けまたは他の症状を発生させる場合、注入の残りを続行する前に、短期間の休憩（１〜２分間）が必要とされ得る。大容積のＵＣＢ（＞１５ｍｌ／ｋｇ）が注入されるべきである場合、上記ＵＣＢの半分を注入し得、続いて、３０分間の休憩がとられ、次いで、上記ＵＣＢのその残りが注入される。バイタルサインを、注入が完了して２時間後まで、１５分ごとにとる。水和（２．５〜３．０ｍｌ／ｋｇ／時間）を、ＵＣＢ注入が完了して１２時間後にわたって維持する。容積過負荷または減少した尿排出が生じる場合、フロセミド（０．５〜１．０ｍｇ／ｋｇ／用量）を与える。
【００８０】
実施例６：ＡＬＤＨｂｒ細胞（第２の集団）の融解、分類および注入
上記ＵＣＢ細胞を融解し、ＡＬＤＨｂｒを分類する（凍結前に分類されない場合）。０日目（移植日）に、従来のＵＣＢ移植片を注入して約４時間後、上記ＡＬＤＨｂｒ  ＵＣＢ細胞を採取し、計数し、生存性およびグラム染色についてチェックし、注入セットに接続し、注入のための骨髄移植ユニットへと運ばれる。
【００８１】
実施例７：悪性状態を有する患者のコンディショニング（Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ）
同種異系ＢＭＴを受けているＡＬＬを有する患者のための標準的細胞減少（ｃｙｔｏｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）は、シクロホスファミド（１００〜２００ｍｇ／ｋｇ）および全身照射（ＴＢＩ、１，０００〜１４４０ｃＧｙ）を包含する。これらのレジメンを用いると、事象のない生存率は、２回目の軽減において、ＡＬＬを有する小児の２０〜４５％および成人の２０％で、およびマッチしている血縁関係のある同種異系ＢＭＴを受けているＡＮＬＬを有する患者の最大６０％で達成され得る。その後の軽減では、事象のない生存は、再発で移植した場合に治癒した患者のうちのわずか８％で減少する。ＡＴＧは、さらなる免疫抑制治療のために使用される；メチルプレドニゾロンは、患者がＡＴＧを許容できない場合の代わりになる。
【００８２】
ＣＯＢＬＴ研究からの生着速度、ＧｖＨＤ、再発および生存（Ｋｌｅｉｎら．２００１（前出）；Ｍａｒｔｉｎら，２００６（前出））を歴史的コントロールとして使用して、上記移植の成功をベンチマーク問題でテストする（ｂｅｎｃｈｍａｒｋ）。
【００８３】
実施例８：非悪性状態を有する患者のコンディショニング
同種異系ＢＭＴを受けている非悪性状態を有する患者についての標準的細胞減少は、４日間にわたってブスルファン１６ｍｇ／ｋｇ（ｍ２あたりの投与に対して小児患者について調節され、そして第１の用量ＰＫによる目的レベルで追跡される）、４日間にわたってシクロホスファミド２００ｍｇ／ｋｇおよび３日間にわたってＡＴＧ  ９０ｍｇ／ｋｇを含む。このレジメンを使用する血縁関係のないドナー臍帯血による生着速度は、８０〜９０％の間に及ぶ。ＴＢＩは、後期の有害事象（例えば、増殖遅延、内分泌機能不全、認知障害、慢性肺疾患または心筋症）を最小にするために避けられる。
【００８４】
実施例９：生着の評価
末梢血サンプルを、キメラ現象について＋３０日またはそのあたり、６０日またはそのあたり、および１００日またはそのあたりで試験する。骨髄吸引液および生検を、細胞質状（ｃｅｌｌｕｌａｒｉｔｙ）およびドナーキメラ現象について、４１〜４４日目に、上記患者がこのときまでに好中球回復を示していなければ行う。次いで、血小板数、ＡＮＣ、ＧｖＨＤ、および成功裏の生着の種々の他の臨床的指標を、当該分野で公知のように評価する。
【００８５】
本明細書に記載される、本発明の多くの改変および他の実施形態は、前述の詳細な説明および関連する図面において示される技術の恩恵を受ける、これら発明が属する分野の当業者にとって想起される。従って、本発明は、開示される特定の実施形態に限定されるのではなく、かつ改変および他の実施形態は、添付の特許請求の範囲および本明細書に開示される実施形態一覧の範囲内に含まれることが意図されることは、理解されるべきである。特定の用語が本明細書において使用されるが、それらは、広い意味でかつ説明の意味でのみ使用されるのであって、限定目的で使用されるのではない。
【００８６】
本明細書で言及される全ての刊行物および特許出願は、本発明が属する分野の当業者のレベルを示す。全ての刊行物および特許出願は、各個々の刊行物または特許出願が具体的にかつ個々に参考として援用されることを示されるかのように同程度まで、本明細書に参考として援用される。
【国際調査報告】
2010508854.tif 000002
2010508854.tif 000003