(57)【要約】  本発明は好熱性のアラビノース異性化酵素及びそれを用いたタガトースの製造方法に関するものであって、より詳しくは、サーモトーガ  ネアポリタナ  ＤＳＭ５０６８（Thermotoga neapolitana DSM5068）由来のアラビノース異性化酵素をコードする遺伝子、前記遺伝子を含む組換え発現ベクター、前記組換え発現ベクターで形質転換されたＧＲＡＳ菌株のコリネバクテリウム属菌株から食品安全型に発現された好熱性のアラビノース異性化酵素を製造する方法及び前記酵素を用いてガラクトースからタガトースを生産する方法を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
コリネバクテリウム属菌株から発現されたアラビノース異性化酵素。
【請求項２】
前記アラビノース異性化酵素が７０乃至９０℃の範囲において最適反応温度を有するサーモトーガ（Thermotoga sp.）、サーモス（Thermus sp.）またはスルフォロバス（Sulforobus sp.）属菌株由来であることを特徴とする請求項１に記載のアラビノース異性化酵素。
【請求項３】
前記アラビノース異性化酵素がサーモトーガ  ネアポリタナ  ＤＳＭ ５０６８（Thermotoga neapolitana DSM 5068）菌株由来であることを特徴とする請求項２に記載のアラビノース異性化酵素。
【請求項４】
前記アラビノース異性化酵素が配列番号３で表示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１に記載のアラビノース異性化酵素。
【請求項５】
請求項１に記載のアラビノース異性化酵素を用いたガラクトースからのタガトースの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はコリネバクテリウム属菌株から発現されたアラビノース異性化酵素とそれを用いたタガトースの製造方法に関するものであって、より詳しくは、サーモトーガ  ネアポリタナ  ＤＳＭ５０６８（Thermotoga neapolitana DSM 5068）由来のアラビノース異性化酵素をコードする遺伝子、前記遺伝子を含む組換え発現ベクター、前記組換え発現ベクターで形質転換されたＧＲＡＳ菌株のコリネバクテリウム属菌株から食品安全型に発現された好熱性のアラビノース異性化酵素を製造する方法及び前記酵素を用いてガラクトースからタガトースを生産する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
最近、健康に対する関心が高くなってきており、砂糖が各種成人病を誘発させ得る主要因子の一つであることより、副作用の少ないタガトースが砂糖の代替品として開発されてきた。タガトースはガラクトースの異性体であり、フルクトースと類似の物理化学的な性質を有していると知られている。最近、タガトースは低カロリー天然糖であり、米国ＦＤＡからＧＲＡＳ（Generally Recognized As Safe）として認められて食品、飲料、健康食品、ダイエット添加物などに甘味料として使用を許可されている。
【０００３】
ＧＲＡＳ（Generally Recognized As Safe）は一般に安全であると認められる物質を示し、物質の意図された使用条件・目的下で科学的手続きと試験を通じて、経験と訓練を経た専門家によって判断される。ＧＲＡＳ制度は米国のみが有している独特な制度であって、安全性の高い（一定の使用条件下で）食品及び食品化学物質に適用されるが、その認識が米国内だけでなく国際的にも認識されているため今後の推移が注目される制度である。
【０００４】
タガトースを生産する方法としては、主にガラクトースに触媒を用いて異性化方法によって生産する化学的方法と、異性化酵素を用いて酵素的な方法で転換させる生物学的方法がある。化学的生産方法は経済性や収率の側面からは優秀であるが、高温高圧の化学工程を有して工程そのものが複雑であり産業廃棄物を発生させる問題点を持っているから、環境にやさしい生物学的生産方法に対する要求が増加しつつある。
【０００５】
このような生物学的生産方法としてはアルドース（aldose）またはアルドースの誘導体をケトース（ketose）またはケトースの誘導体に酵素的な方法によって転換させる方法が当業界によく知られている。ガラクトースからタガトースへのアラビノース異性化酵素（arabinose isomerase）を用いた異性化反応は熱力学的に高い反応温度で比例的に高い転換率を有する反応である。従って、異性化酵素を用いたタガトースへの生物学的転換の産業への応用には、高温で安定した酵素の開発とこれを用いたタガトースの生産法が重要技術であると言える。高温菌由来のアラビノース異性化酵素の探索を通じて、産業化が可能である高温適合性異性化酵素の開発及びこれを用いた異性化工程の開発が各研究チームによって進められてきた。
【０００６】
韓国内では東洋製菓でアラビノース異性化酵素を用いた酵素異性化法を開発した。東洋製菓は大腸菌由来のアラビノース異性化酵素遺伝子を大腸菌で組換え技術を用いて大量発現し、この組換え異性化酵素は３０℃において２４時間反応させたとき、ガラクトースからタガトースの転換率が２５％で、熱安定性及び転換収率が低かった（特許文献１）。呉徳根教授チーム（世宗大学校）はゲオバチルスステアロサーモフィルス由来のアラビノース異性化酵素を大腸菌で組換え技術を用いて大量発現し、これを固定化してガラクトースのタガトースへの高温異性化工程を提案した。本研究チームはサーモトーガ  ネアポリタナから既存に報告されていないアラビノース異性化酵素の遺伝子をクローニングして大腸菌で大量発現し、これを用いた超高温条件におけるタガトースの生産技術を開発した（特許文献２）。
【０００７】
現在までの高温菌由来のアラビノース異性化酵素を用いたタガトースの生産技術は組換え大腸菌で大量発現された組換え酵素或いはこれを含む宿主を用いたガラクトースからタガトースへの異性化反応工程の開発のみに留まっている。しかし、このような組換え大腸菌を用いたタガトースの生物工学的生産は食品安全性の側面から実質的に食品素材としてのタガトースの生産に不適合である。食品添加物としてのタガトース生産には、産業的大量生産に適したＧＲＡＳ微生物宿主で発現されたアラビノース異性化酵素及びその大量生産が不可欠である。
【０００８】
コリネ型細菌はＬ−リシン、Ｌ−トレオニン及び各種核酸を含む飼料、医薬品及び食品などの分野において多様な用途を有する化学物質を生産する産業用微生物である。このようなコリネ型細菌はＧＲＡＳ（Generally Recognized As Safe）菌株であり、遺伝子操作及び大量培養に容易な菌株特性を有している。それだけでなく、多様な工程条件で高い安全性を有する菌株であり、他の細菌に比べて相対的に堅い細胞膜構造を有しており、従って高い糖濃度などによる高い浸透圧下においても菌体が安定的な状態で存在する生物学的特性を有している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】韓国特許出願第1999-16118号
【特許文献２】韓国特許登録番号10-0443865
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者らはＧＲＡＳ菌株であるコリネバクテリウム属菌株から超高温菌のサーモトーガネアポリタナ由来の好熱性のアラビノース異性化酵素を活性型で発現し、食品安全型に発現された前記組換え酵素を用いて高濃度のガラクトースからタガトースへの異性化反応技術を完成した。
【００１１】
本発明の目的は前記組換え酵素をコリネバクテリウム属菌株で大量発現することにより、高温及び高濃度のガラクトース基質の条件においても細胞内にアラビノース異性化酵素を安定的に含むＧＲＡＳ菌株を生産する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は既存の大腸菌のみで酵素を発現して適用した従来の技術から外れて、サーモトーガ由来のアラビノース異性化酵素をＧＲＡＳ菌株のコリネ型菌株で活性形で発現し、発現された組換え酵素或いはこれを含む宿主を用いてガラクトースから実質的に食品素材として利用可能なタガトースを生産する方法を提供する。
【００１３】
本発明を詳しく説明すると次の通りである。
【００１４】
本発明は、高温、特に８０℃以上の高温条件或いは嫌気条件が最適生育環境であることより産業的に直接的な菌体培養による収得が困難な微生物由来のアラビノース異性化酵素の遺伝子を、食品安全型宿主に挿入することにより組換え酵素を生産する方法、および、これを用いてガラクトースからタガトースを生産する方法を提供する。
【００１５】
前記アラビノース異性化酵素は７０乃至９０℃の範囲において最適反応温度を有するサーモトーガ（Thermotoga sp.）、サーモス（Thermus sp.）またはスルフォロバス（Sulforobus sp.）属菌株由来であることが望ましい。
【００１６】
本発明のアラビノース異性化酵素の遺伝子は、望ましくは超高温菌由来のものであって、最も望ましくは超高温菌のサーモトーガ  ネアポリタナ  ＤＳＭ５０６８（Thermotoga neapolitana DSM 5068）由来のものであり、配列番号３に表示されるアミノ酸配列を有する。
【００１７】
本発明のアラビノース異性化酵素の遺伝子は従来知られている突然変異誘発法、例えば、方向性進化法（Directed evolution）及び部位特異的突然変異法などによって当業者により容易に修飾されることができる。従って、任意に選ばれるＧＲＡＳ宿主に一定程度、例えば７０％以上、望ましくは８０％以上、さらに望ましくは９０％以上の相同性を有している宿主細胞、その宿主で活性型で発現される組換え酵素及びこれを含む宿主細胞はすべて本発明の範囲に含まれるものと解釈されなければならない。
【００１８】
本発明は本発明のアラビノース異性化酵素をコードする遺伝子が含まれているベクターを提供する。本発明のベクターは典型的にクローニングのためのベクターまたは発現のためのベクターとして構築されることができる。本発明のベクターは特別に限定されるものではなく、当業界に知られた任意のベクターを使用することができる。
【００１９】
本発明のベクターは好熱性の異性化酵素を活性型で発現するためにコリネバクテリウムで活性を有するプロモータを使用した。前記コリネバクテリウムでの遺伝子発現のためのプロモータ配列は大腸菌や枯草菌などのような異種産業微生物とは異なって一般的な構造が知られていない。従って、産業的によく用いられるコリネバクテリウム由来であり、大腸菌でも発現可能な強力なプロモータが開発された。tacプロモータは従来最も強力なプロモータ活性を有するものの一つとして広く知られていた。tacプロモータとは大腸菌のトリプトファンオペロンプロモータの−３５領域から得られた配列と大腸菌の乳糖オペロンプロモータの−１０領域から得られた配列を融合して得られたプロモータを意味する。本発明に使用されたＣＪ−１又はＣＪ−７で構成されたプロモータはコリネバクテリウム属バクテリア細胞でtacプロモータより効率的に遺伝子を発現させることが確認された（韓国特許公開番号10-2006-0068505）。
【００２０】
本発明で使用されたコリネ型プロモータはコリネバクテリウム属微生物のみならずエシェリキア属バクテリア及び大腸菌細胞でもプロモータ活性を有する。特に、本研究で使用されたプロモータはエシェリキア属バクテリア細胞でもtacプロモータに比べて２倍以上さらに強力なプロモータ活性を有する。
【００２１】
本発明の食品安全型宿主はＧＲＡＳ（Generally Recognized As Safe）型菌株であってコリネバクテリウムを含み、望ましくはコリネバクテリウム  グルタミカム  ＫＣＴＣ１０３０２（Corynebacterium glutamicum KCTC 10302）が用いられる。
【００２２】
本発明は前記ベクターでコリネバクテリウムを形質転換して製造された組換え菌株を培養して、これから食品安全型アラビノース異性化酵素を提供する。宿主細胞の培養は選ばれる宿主細胞によって従来知られた任意の培養培地及び培養条件を使用してなされる。
【００２３】
本発明は、組換えアラビノース異性化酵素、及び、該酵素を細胞内部に含む宿主細胞を固定化することによるガラクトースからタガトースを製造する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】サーモトーガ  ネアポリタナ  ＤＳＭ５０６８菌株に由来した好熱性のアラビノース異性化酵素をコードする遺伝子を含む組換え発現ベクターpCJ-1-TNAI及びpCJ-7-TNAIの製造過程を示す図面である。
【図２】組換えコリネバクテリウム菌株の培養時間別生育の結果である。最適化培地において３０℃、２４時間培養した結果を示す図面である。
【図３】組換えコリネバクテリウム菌株から発現されたアラビノース異性化酵素の分離精製段階別粗酵素液に含まれている全体蛋白質パターンのSDS-PAGE（Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis）分析結果を示す図面である。各蛋白質バンドは次のようである。M：広い範囲の蛋白質標準マーカー（Bio-Rad, U.S.A.）、１：粗酵素液、２：熱処理された酵素上澄液、３：アニオン交換クロマトグラフィ（anion exchange chromatography; HiTrap Q column, GE Healthcare, U.S.A.）後の酵素断片、４：サイズ別排除クロマトグラフィ（size exclusion chromatography; Superdex 200 pg column, GE Healthcare, U.S.A.）後の精製された酵素断片
【図４】アラビノース異性化酵素を活性形に発現して内部に含まれている組換えコリネバクテリウム及び組換え大腸菌をそれぞれ０、１０、２０、３０、４０％のガラクトース基質を含んでいるＰＢＳ（Phosphate-buffered saline）バッファーで２時間高温（７０℃）において撹拌反応させた後、そのバッファーに溶出された酵素の量を示す図面である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下、本発明を実施例を通じてより詳しく説明する。しかし、これら実施例は本発明を例示的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限られるものではない。
【００２６】
本発明の実施例では高度好熱性の微生物のサーモトーガ  ネアポリタナ  ＤＳＭ５０６８（Thermotoga neapolitana DSM5068）由来の好熱性のアラビノース異性化酵素（arabinose isomerase）をコードする遺伝子を大腸菌−コリネバクテリウムシャトルベクターのｐＣＪ−１及びｐＣＪ−７（韓国特許公開番号10-2006-0068505）にそれぞれ挿入して、最終的に宿主のコリネバクテリウム  グルタミカム  ＫＣＴＣ１３０３２（Corynebacterium glutamicum KCTC13032）で前記蛋白質を大量発現した。収得された組換え菌株のコリネバクテリウム  グルタミカム  CJ-1-TNAI（KCCM10786P）及びCJ-7-TNAI（KCCM10787P）を培養して培養各段階で細胞抽出物を得、タガトース生産活性を測定して各培養時期別に生産される活性型組換え蛋白質の量を測定した。このように最適発現された培養結果物は、細胞破砕、熱処理、イオン交換樹脂及びゲルクロマトグラフィなどを通じて分離精製された。最終的にアミノ基末端のアミノ酸塩基配列を通じて確認した後、蛋白質活性測定を通じてタガトース生産活性があることを確認した。
【実施例１】
【００２７】
アラビノース異性化酵素のクローニング
【００２８】
サーモトーガ  ネアポリタナ  ＤＳＭ５０６８を嫌気条件で培養した後、この菌体を８,０００xgで１０分間遠心分離して収得した。前記収得した菌体から細胞培養ＤＮＡミディキット（Cell culture DNA Midi Kit：Qiagen, U.S.A.）を使用してゲノミックＤＮＡを分離して使用した。前記ゲノミックＤＮＡからそれぞれEcoRVとPst1制限酵素の切断塩基配列が導入された5'−CCCGA TATCATGATCGATCTCAAACAGTATGAG−3'（配列番号１）と5'−TGCACTGCAGTCATCT TTTTAAAAGTCCCC−3'（配列番号２）のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して重合連鎖反応（Polymerase Chain Reaction; PCR）を行った。サーモトーガネアポリタナ由来のアラビノース異性化酵素の遺伝子を含む１５０９bpサイズのＤＮＡを増幅した。前記増幅された遺伝子がコードしているアラビノース異性化酵素を大量発現するために、保有しているコリネバクテリウム属由来のベクターの中で蛋白質大量発現性能が優秀な２つのベクターを優先選別して本実験に使用した。前記選別されたベクターは大腸菌DH5alphaに形質転換して２００４年１１月６日付で国際寄託機関の韓国微生物保存センターに寄託した遺伝子源（受託番号KCCM-10611及びKCCM-10617）を使用した（表１）。
【００２９】
【表１】
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【００３０】
制限酵素EcoRV及びPst1で切断したシャトルベクターpCJ-1及びpCJ-7に制限酵素EcoRVとPst1で切断された前記増幅されたＰＣＲ産物を挿入して、組換え発現ベクターpCJ-1-TNAI及びpCJ-7-TNAIを製作した（図１参照）。組換え発現ベクターｐCJ-1-TNAI及びｐCJ-7-TNAIでコリネバクテリウム  グルタミカム  KCTC 13032をそれぞれ形質転換させて組換え菌株を製造した後、これをそれぞれ「コリネバクテリウム  グルタミカム  CJ-1-TNAI」及び「コリネバクテリウムグルタミカム  CJ-7-TNAI」と命名し、それを2006年10月18日付けで韓国ソウル特別市西大門区弘済１洞３６１−２２１番地に所在する国際寄託機関の韓国種菌協会付設韓国微生物保存センターに受託番号KCCM10786P及びKCCM10787Pで寄託した。
【実施例２】
【００３１】
コリネバクテリウムでアラビノース異性化酵素の発現
【００３２】
前記実施例１から製造された組換え菌株コリネバクテリウム  グルタミカム  CJ-1-TNAI及びCJ-7-TNAI（各受託番号KCCM10786P及びKCCM10787P）をそれぞれ１０μｇ/ml濃度のカナマイシンを含むＭＢ培地（Bacto-trypton 10g/L、Bacto-yeast extract 5g/L、NaCl 10g/L、Soytone 5g/L）に初期濃度O.D.600＝0.1で接種し、３０℃で２４時間培養して組換えアラビノース異性化酵素の発現を誘導した。発現されたアラビノース異性化酵素の活性を測定するために、培養液を８０００xgで１０分間遠心分離して菌体を回収した後、５０mM Tris-HCl（pH7.0）バッファー溶液に再懸濁し、これを超音波処理で細胞を破砕処理して上澄液を粗酵素液として使用して、ガラクトース異性化反応を行った。ガラクトース異性化反応は４０mMのガラクトースを基質として含む酵素溶液１００μｌと１mlの反応バッファー溶液（50mM Tris-HCl, pH 7.0）を混合して使用した。この際、反応液内に最終濃度５mMの塩化マンガン（MnCl2）と最終濃度１mMの塩化コバルト（CoCl2）をそれぞれ添加して使用した。前記製造された粗酵素反応液は６５℃で２０分間反応し、前記粗酵素の活性測定はシステイン−カルバゾール−硫酸法（cystein-carbazol-sulfuric acid method; Dische, Z., and E. Borenfreund., A New Spectrophotometric Method for the Detection and Determination of Keto Sugars and Trioses, J. Biol. Chem., 192:583-587, 1951）で測定した。粗酵素液内の蛋白質定量はブラッドフォード検定法（Bradford assay kit, Biorad, U.S.A.）を使用し、その結果、異性化酵素活性０.２０５０（mg-tagatose/mg-protein・h）でガラクトース異性化反応の産物であるタガトースが正常的に生成されることを確認することができた。
【実施例３】
【００３３】
組換え菌株の大量発現のための培養条件最適化
【００３４】
前記実施例２から得られた組換え菌株をそれぞれ１０μｇ/ml濃度のカナマイシンを含むＭＢ培地（Bacto-trypton 10g/L、Bacto-yeast extract 5g/L、Nacl 10g/L、Soytone 5g/L）に初期濃度O.D.600＝０.６で接種した。これを２種類のコリネ型細菌基本培地と知られているＭＢ培地（Bacto-trypton 10g/L、Bacto-yeast extract 5g/L、Nacl 10g/L、Soytone 5g/L）及び変異培地（Bacto-trypton 10g/L, Bacto-yeast extract 5g/L, NaCl 2.5g/L, Beef extract 5g/L）で生育を比較した。それぞれ２５、３０、３７℃で培養温度別及びｐH別生育比較、基本炭素源のグルコースとスクロースのそれぞれ濃度別の添加生育比較及び静置及び好気条件における生育比較実験を行った。このように選定された多様な条件における生育結果及び酵素発現量を時間別に測定して、組換えアラビノース異性化酵素の最適の大量発現条件を選定した（表２及び３）。
【００３５】
【表２】
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【００３６】
【表３】
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【００３７】
発現された組換えアラビノース異性化酵素の活性を測定するために、実施例２に記載した方法で酵素を処理し定量した。ガラクトース異性化反応の産物のタガトースはＭＢ培地にスクロース２.５％を添加し、好気条件で３０℃培養した場合、基本培養条件から得られた６０.９mU/mlに比べて１.４倍高い８５.１mU/mlの酵素活性を示したことを確認することができた。前記最適化培地での菌体生育結果を図２に示した。
【実施例４】
【００３８】
組換えアラビノース異性化酵素の分離精製及びＮ−末端アミノ酸配列分析を通じた活性型蛋白質発現確認
【００３９】
前記実施例３から得られた最適の培養条件で２Ｌ培養を行い、このようにして収得された培養液を８０００xgで１０分間遠心分離をして菌体を回収した後、５０mM Tris-HCl（pH７.０）バッファー溶液に再懸濁して蛋白質精製に使用した。前記細胞懸濁液は高圧細胞破砕器Ｔ−シリーズ４.０kW（T-series 4.0kW; Constant systems, UK）を用いて細胞を破砕した後、８０℃で２０分間熱処理を行い、１０,０００xgで１０分間遠心分離して発現された耐熱性のアラビノース異性化酵素を優先分離した。このようにして分離された組換え酵素液はイオン交換クロマトグラフィ（Anion-exchange chromatography; Hiprep Q 16/10, Amersham Bioscience, U.S.A.）、限外濾過（ultrafiltration; Centriprep 30, Amicon, Germany）、サイズ別排除クロマトグラフィ（Size-exclusion chromatography; Superdex 200pg, Amersham Bioscience, U.S.A.）を用いて分離精製した（表４）。この際、各精製段階別酵素液の蛋白質組成はSDS-PAGE（Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis）を用いて分析した（図３）。
【００４０】
【表４】
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【００４１】
前記過程を通じて純粋分離された組換え蛋白質を最終的にＮ−末端アミノ酸の塩基配列分析を通じて最終的に確認した。ゲルクロマトグラフィ（Gel chromatography）により最終的に精製された蛋白質を、SDS-PAGEにより分析した結果、その蛋白質は約５５kDaの分子量を有することを確認することができ、これは実際に知られたサーモトーガネアポリタナ属由来のアラビノース異性化酵素の分子量と一致することがわかった。このようにして得られた蛋白質バンドをＰＶＤＦメンブレインに転移して韓国基礎科学支援研究院に分析依頼を行った結果、分離精製された組換え蛋白質のアミノ末端のアミノ酸配列１０個の分析結果が'Met-Ile-Asp-Leu-Lys-Gln-Tyr-Glu-Phe-Trp'のＮ−末端蛋白質配列を有することを確認することができ、これは本研究で使用されたサーモトーガネアポリタナ由来のアラビノース異性化酵素の知られている蛋白質アミノ酸配列と一致することが確認できた（配列番号３）。
【実施例５】
【００４２】
組換え酵素発現菌株の高温及び高濃度反応安定性の確認
【００４３】
コリネ型細菌は多様な工程条件で高い安定性を有する菌株であり、他の細菌に比べて相対的に堅い細胞膜構造を有していることより、高い糖濃度などによる高い浸透圧下においても菌体が安定的な状態で存在する生物学的特性を有している。このような菌株特性は高濃度の基質における反応安定性の効果的増加に有利であることより、本研究チームはコリネバクテリウムを宿主として超高温性アラビノース異性化酵素を発現させた。
【００４４】
前記実施例３から得られた培養条件を通じて得られた組換えコリネバクテリウム菌株及びＬＢ培地（yeast extract 5g/L、Bacto-trypton 10g/L、Sodium chloride 10g/L）で培養後に得られた組換え大腸菌菌株の培養液をそれぞれ８０００xgで１０分間遠心分離して菌体を回収した後、これをＰＢＳ（Phosphate buffered saline）バッファー溶液に再懸濁して実験に使用した。それぞれの菌株の高濃度基質における菌株安定性を比較するために、それぞれ０、１０、２０、３０、４０％のガラクトース基質を溶液に追加し、これを７０℃の高温反応条件で０、１、２時間撹拌反応してその結果物を実験に使用した。それぞれの反応結果物はその細胞内蛋白質の溶出量の比較のために、１３０００xgで１０分間遠心分離して上澄液のみを得た。そして、それぞれＢＣＡ法（Bicinchonic acid. Protein assay method）を用いて溶出された（expressed）蛋白質の定量を行った。組換え大腸菌菌体と組換えコリネバクテリウム菌体でのそれぞれ基質濃度別に蛋白質溶出量を計算した結果、対照群の大腸菌に比べて比較群のコリネバクテリウムでの蛋白質溶出量が著しく少ないことがわかった。反応の結果、組換え大腸菌におけるガラクトース濃度が顕著に増加したこととは異なり、コリネバクテリウムでの蛋白質溶出量は対照群に比べて最大糖濃度の４０％ガラクトース条件においても、約２０％増加に留まることを確認することができた（図４）。
【００４５】
上記結果は、高濃度の基質条件下で当該菌における蛋白質溶出が、大腸菌と比較して、飛躍的に減少されることを示すものである。このように発現された酵素を内部に含んでいるコリネ型宿主は既存発明で適用した大腸菌宿主の場合と比較した時、高濃度の糖濃度で細胞内蛋白質の溶出が著しく減少したことが確認できた。
【００４６】
高温及び高濃度での反応の結果、コリネバクテリウム宿主は大腸菌宿主に比べて菌株安定性が著しく高いことがわかった。これは菌体固定化反応器での反応安定性を増加させて結果的に固定化菌体反応器の半減周期を比例的に増加させる結果を導出することができた。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
以上から詳細に説明したように、本発明は高度好熱性微生物のサーモトーガ属由来のアラビノース異性化酵素がコリネ型菌株で安定的に発現されることを確認し、このように発現された活性型酵素を内部に含んでいるコリネ型細菌を用いて効率的に固定化連続反応を行った。微生物酵素を用いた生物工学的食品素材の生産は製造工程中に使用された添加物の食品安全性が必須であり、本発明で完成された技術を通じてサーモトーガ属由来のアラビノース異性化酵素を食品安全形型に発現して連続反応工程に適用できるから、実質的な産業化の可能性がある。
【図１】
2010510774.tif 000007
【図２】
2010510774.tif 000008
【図３】
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【図４】
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【配列表】
2010510774000001.xml
【国際調査報告】
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2010510774.tif 000015
2010510774.tif 000016