(57)【要約】メディカルキット及びその使用方法に関する。無菌及び滅菌処理されたキットとして、細胞を分離、培養、採取及び保存して体内に移植できるように全過程を段階別に分けて、その段階に対するセット化されたキット別にプロセッシングがなされるように軟骨再生キット10と骨再生キット20、臍帯血保存キット30を具備する。そして、前記軟骨再生キット10を利用して、軟骨組織採取工程;軟骨細胞分離工程;軟骨細胞培地交換及び継代培養工程;軟骨細胞治療剤製造工程;細胞分離/培養/製造/凍結保存に使われる培地;細胞分離/培養/凍結保存に使われる培地;によって軟骨を再生し、また前記骨再生キット20を利用して、骨髄採取工程;骨細胞分離工程;骨細胞培地交換及び継代培養工程;骨細胞治療剤製造工程;によって骨を再生し、また前記臍帯血保存キット30を利用して、へその緒血液採取工程;造血母細胞分離工程;造血母細胞凍結保存工程;によって臍帯血を保存する。
2010507389.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
無菌及び滅菌処理されたキットとして、細胞を分離、培養、採取及び保存して体内に移植
できるように全過程を段階別に分けて、その段階に対するセット化されたキット別にプロ
セッシングがなされるように軟骨再生キット１０を具備し、この軟骨再生キットには、軟
骨組織採取キット１１、軟骨細胞分離キット１２、軟骨細胞培地交換及び継代培養キット
１３、軟骨細胞治療剤の製造キット１４が具備されることを特徴とするメディカルキット
。
【請求項２】
前記軟骨組織採取キット１１には、
軟骨組織採取のために使用する硬組織採取キット、組織運搬のための内部容器であるユニ
バーサルコンテナ(universal container)、組織運搬のための外部容器である輸送ボトル(
transport bottle)、１mlの溶液を取るのに使用するブルーチップ(blue tip)(１ml)、冷
蔵状態で組織を運ぶための内部ボックスであるスタイロフォーム（Styrofoam；登録商標
）ボックス(box)、スタイロフォームボックスに輸送ボトルを入れるために使用するスポ
ンジ、冷蔵状態を維持するための冷却剤であるクールイット(Koolit；商標)が具備される
ことを特徴とする請求項１に記載のメディカルキット。
【請求項３】
前記軟骨細胞分離キット１２には、
溶液除去のために使われるパスツールピペット、プラグシール(plug-seal)キャップを持
つ細胞培養道具であるＴ２５(単位面積２５ｃｍ2フラスコ)、５０mL遠心分離チューブの
上に載せて、細胞と培養液を混合した懸濁液を注いで溶液から細胞を分離する細胞ろ過器
(cell strainer)、細胞を水洗するために遠心分離するのに使用するチューブ、 トリパン
ブルー（trypan blue）と細胞が入った培地の混合時に使用するＥチューブ（E-tube）、
１mLの溶液を取るのに使用するブルーチップ(blue tip)、溶液移動時に使用するピペット
、溶液をろ過するために使用するシリンジフィルター(syringe filter)、細胞培養道具で
あるＴ２５、細胞を冷凍保存時に使用する道具であるクリオチューブ(cryo tube)が具備
されることを特徴とする請求項１に記載のメディカルキット。
【請求項４】
前記軟骨細胞培地交換及び継代培養キット１３には、
溶液除去のために使用するパスツールピペット、細胞を水洗するために遠心分離するのに
使用するチューブ、溶液移動時に使用するピペット、大きい嵩の溶液移動時に使用するピ
ペット、少ない嵩の溶液を取るのに使用するイエローチップ(yellow tip)、 トリパンブ
ルー（trypan blue）と細胞が入った培地の混合時に使用するＥチューブ（E-tube）、細
胞培養道具であるＴ７５、細胞を冷凍保存時に使用する道具であるクリオチューブ(cryo 
tube)が具備されることを特徴とする請求項１に記載のメディカルキット。
【請求項５】
前記軟骨細胞治療剤の製造キット１４には、
溶液除去のために使用するパスツールピペット、細胞を冷凍保存時に使用する道具である
クリオチューブ(cryo tube)、 トリパンブルー（trypan blue）と細胞が入った培地の混
合時に使用するＥチューブ（E-tube）、細胞を水洗するために遠心分離するのに使用する
チューブ、溶液移動時に使用するピペット、大きい嵩の溶液移動時に使用するピペット、
５０mL遠心分離チューブの上に載せて、細胞と培養液を混合した懸濁液を注いで溶液から
細胞を分離する細胞ろ過器(ｃell strainer)、溶液を取るのに使用するフィルター ブル
ーチップ(blue tip)、バイアルに着せるゴム栓であるラバーキャップ(rubber cap)とアル
ミニウム栓であるアルミニウムキャップ(aluminum cap)、軟骨細胞治療剤の製造のために
細胞を盛るのに使用する１mLのＶバイアル（ V-vial）、冷蔵状態で組織を運ぶための内
部ボックスであるスタイロフォーム（登録商標）ボックス、スタイロフォームボックスに
軟骨細胞治療剤バイアルを入れるために使用するスポンジ、冷蔵状態を維持するための冷
却剤であるクールイット(Koolit；商標)及び欠損部位に細胞を移植させるのに使用するデ
バイス２セット（device ２sets）が具備されることを特徴とする請求項１に記載のメデ
ィカルキット。
【請求項６】
前記軟骨再生キット１０には、
細胞の分離/培養/製造/凍結保存に使われる培地キット１５と細胞の分離/培養/凍結保存
に使われる培地キット１６がさらに具備されることを特徴とする請求項１に記載のメディ
カルキット。
【請求項７】
請求項１に具備された軟骨再生キット１０を利用して、軟骨組織採取工程；軟骨細胞分離
工程；軟骨細胞培地交換及び継代培養工程；軟骨細胞治療剤の製造工程；細胞分離/培養/
製造/凍結保存に使われる培地；細胞分離/培養/凍結保存に使われる培地；によって軟骨
を再生することを特徴とするメディカルキットの使用方法。
【請求項８】
前記軟骨組織採取工程には、
１．軟骨ＲＭキット(cartilage RM kit)内に含まれているＣＲＭ輸送キット(transport k
it)の外部紙ボックス包装を封切りする工程；
２．封切られた外部包装は手術室の外に残して、手術室の内部には内部包装のスタイロフ
ォーム（登録商標）ボックスのみを運ぶ工程；
３．スタイロフォーム（登録商標）ボックス内部にある滅菌処理された硬組織採取器を利
用して軟骨組織を採取して、採取された軟骨組織は赤色の培地が入っている軟骨組織運搬
容器に盛って、再びスタイロフォームボックスと外部紙ボックス包装で二重包装して細胞
培養室に移す工程；
が含まれることを特徴とする請求項７に記載のメディカルキットの使用方法。
【請求項９】
前記軟骨細胞分離工程のＣＲＭ開始キット(initiation kit)には、
１．CRM分離キット(CRM  isolation kit)を引き出して７０％アルコールを充分に噴霧し
た後、無菌作業台に移す工程；
２．無菌作業台内でＣＲＭ輸送キット(transport kit)に運ばれて来た軟骨組織の重さを
、５０mLチューブを利用して測定する工程；
３．軟骨組織を５０mLチューブに移した後、ＣＳＢ-Iを２５mLピペットを利用して分株し
た後、軟骨組織を水洗する工程；
４．パスツールピペットで軟骨組織を水洗した溶液を除去した後、"３"の手順を繰り返す
工程；
５．水洗された軟骨組織をディッシュ(dish)に移した後、１０、１１番のブレード(blade
)を利用して細かく切る工程；
６．切られた軟骨組織を１５mLチューブに移す工程；
７．１０mLピペットにＣＳＢ-Iをチューブに分株する工程；
８．軟骨組織を入れたチューブを１２００rpmで１分間処理する工程；
９．水洗後、パスツールピペットで上層液を除去する工程；
１０．前記"８"、"９"の手順を３回繰り返す工程；
１１．２個のＴ２５フラスコ(plug seal)を準備した後、一つのＴ２５フラスコにはカテ
ィセポー(Cartisepor)を、残りのフラスコにはカティセポー(Cartisepor)に抗生剤を混合
して１０mLピペットに分株する工程；
１２．水洗された軟骨組織の１/３はＣＳＢ-Iがあるフラスコに、残りの２/３はＣＳＢ-I
Iがあるフラスコに移す工程；
１３．フラスコに移した後、３７℃、ＣＯ2恒温器で１２〜１６時間を経った後、３７℃
、１００rpmで３０分間撹拌する工程；
１４．細胞ろ過器(ｃell strainer)を５０mLチューブに装着した後、フラスコ内の浮遊液
をろ過する工程；及び
前記軟骨細胞分離工程のＣＲＭ一次キット(primary kit)には、
１．軟骨ＲＭキット(cartilage RM kit)のビニール包装されたＣＲＭ一次キット(primary
kit)を引き出して７０％アルコールを充分に噴霧した後、無菌作業台に移す工程；
２．ＣＳＭを１０mLピペットで５０mLチューブに分株する工程；
３．これを遠心分離して水洗した後、パスツールピペットで上層液を除去、再びＣＳＭを
分株して水洗する工程；
４．１/２０に該当する細胞をクリオチューブ(cryo tube)にＰＣＦと混合して凍結保存す
る工程；
５．翌日、２５Ｔフラスコに付着しない浮遊細胞を１５mLチューブに回収してＴ２５フラ
スコに接種する工程；
が含まれることを特徴とする請求項７に記載のメディカルキットの使用方法。
【請求項１０】
前記軟骨細胞培地交換及び継代培養工程のＣＲＭ-Ｐ１ 培地交換キット(medium change k
it)には、
１．軟骨ＲＭキット(cartilage RM kit)のビニール包装されたＣＲＭ-Ｐ１ 培地交換キッ
ト(medium change kit)を引き出して７０％アルコールを充分に噴霧した後、無菌作業台
に移す工程；
２．パスツールピペットを利用してフラスコ内部の培養培地を除去する工程；
３．２５mLピペットを使って５０mLチューブにＣＳＭを分株する工程；
４．分株されたチューブからの一定量をフラスコに再び分株する工程；及び
前記軟骨細胞培地交換及び継代培養工程のＣＲＭ-Ｐ１ 継代培養キット(subculture kit)
には、
１．軟骨ＲＭキット(cartilage RM kit)のビニール包装されたＣＲＭ-Ｐ１ 継代培養キッ
ト(subculture kit)を引き出して７０％アルコールを充分に噴霧した後、無菌作業台に移
す工程；
２．Ｔ２５フラスコの培養培地を５０mLチューブに集めた後、混合する工程；
３．このうちの一部を５０mLチューブとＥチューブ（E-tube）にサンプリングする工程；
４．パスツールピペットで残っている培養培地を除去する工程；
５．ＣＳＢ-IIをフラスコに分株して振って水洗した後、パスツールピペットで上層液を
除去する工程；
６．前記"５"を３回繰り返す工程；
７．パスソリューション(pass solution)を１０mLピペットでフラスコに分株した後、略
３分間恒温器に置く工程；
８．ニュートロソリューション(neutro solution)を１０mLピペットに分株する工程；
９．１５mLチューブに細胞を採取する工程；
１０．ＣＳＭでフラスコを水洗する工程；
１１．ＣＣＢにイエローチップ(yellow tip)を使って細胞を一定量分株後、細胞数を測定
する工程；
１２．細胞数を測定した後、Ｔ７５フラスコに接種する工程；
１３．クリオチューブ(cryo tube)に余分の細胞とセルストックソリューション(cell sto
ck solution)を混合して凍結保存する工程；及び
前記軟骨細胞培地交換及び継代培養工程のＣＲＭ-Ｐ２ 培地交換キット(medium change k
it)には、
１．軟骨ＲＭキット(cartilage RM kit)のビニール包装されたＣＲＭ-Ｐ２ 培地交換キッ
ト(medium change kit)を引き出して７０％アルコールを充分に噴霧した後、無菌作業台
に移す工程；
２．パスツールピペットで培養培地をフラスコから除去する工程；
３．２５mLピペットを使って５０mLチューブにＣＰＭを分株する工程；
４．分株されたチューブからの一定量をフラスコに再び分株する工程；及び
前記軟骨細胞培地交換及び継代培養工程のＣＲＭ-Ｐ２ 継代培養キット(subculture kit)
には、
１．軟骨ＲＭキット(cartilage RM kit)のビニール包装されたＣＲＭ-Ｐ２ 継代培養キッ
ト(subculture kit)を引き出して７０％アルコールを充分に噴霧した後、無菌作業台に移
す工程；
２．Ｔ７５フラスコの培養培地を５０mLチューブに集めた後、混合する工程；
３．このうちの一部を５０mLチューブとＥチューブ（E-tube）にサンプリングする工程；
４．パスツールピペットを利用して残っている培養培地を除去する工程；
５．ＣＳＢ-IIをフラスコに分株して振って水洗した後、パスツールピペットで上層液を
除去する工程；
６．前記"５"を３回繰り返す工程；
７．パスソリューション(pass solution)を１０mLピペットでフラスコに分株した後、略
３〜５分間恒温器に置く工程；
８．ニュートロソリューション(neutro solution)を１０mLピペットで分株する工程；
９．１５mLチューブに細胞を採取する工程；
１０．ＣＳＭでフラスコを軽く振って水洗する工程；
１１．ＣＣＢにイエローチップ(yellow tip)を使って細胞を一定量分株した後、細胞数を
測定する工程；
１２．細胞数を測定した後、Ｔ１５０フラスコに接種する工程；
１３．クリオチューブ(cryo tube)に余分の細胞とセルストックソリューション(cell sto
ck solution)を混合して凍結保存する工程；及び
前記軟骨細胞培地交換及び継代培養工程のＣＲＭ-Ｐ３ 培地交換キット(medium change k
it)には、
１．軟骨ＲＭキット(cartilage RM kit)のビニール包装されたＣＲＭ-Ｐ２ 培地交換キッ
ト(medium change kit)を引き出して７０％アルコールを充分に噴霧した後、無菌作業台
に移す工程；
２．パスツールピペットで培養培地をフラスコから除去する工程；
３．２５mLピペットを使って５０mLチューブにＣＰＭを分株する工程；
４．分株されたチューブからの一定量をフラスコに再び分株する工程；
が含まれることを特徴とする請求項７に記載のメディカルキットの使用方法。
【請求項１１】
前記軟骨細胞治療剤の製造工程のＣＲＭ採取キット(collection kit)には、
１．軟骨ＲＭキット(cartilage RM kit)のビニール包装されたＣＲＭ採取キット(collect
ion kit)を引き出して７０％アルコールを充分に噴霧した後、無菌作業台に移す工程；
２．完製品出庫３日前、５０mLチューブに培養培地の一部を２５mLピペットでサンプリン
グする工程；
３．製品出庫当日、Ｔ１５０フラスコ内の培養培地を５０mLチューブに集めた後、混合す
る工程；
４．このうちの一部を５０mLチューブとＥチューブ（E-tube）にサンプリングする工程；
５．パスツールピペットを利用してフラスコ内部に残っている培養培地を除去する工程；
６．ＣＳＢ-IIを２５mLピペットでフラスコに分株した後、水洗する工程；
７．前記"６"を３回繰り返す工程；
８．パスソリューション(pass solution)を１０mLピペットでフラスコに分株した後、略
４〜５分間恒温器に置く工程；
９．ニュートロソリューション(neutro solution)を１０mLピペットで分株する工程；
１０．細胞ろ過器(cell strainer)を５０mLチューブ２個にそれぞれ載せておく工程；
１１．パスソリューション(pass solution)を処理したフラスコ内の浮遊液を２５mLピペ
ットを使って細胞ろ過器(cell strainer))が載せられているチューブに分株する工程；
１２．ＣＣＢにイエローチップ(yellow tip)で細胞を分株した後、細胞数を合計３回測定
する工程；
１３．１mL バイアル(vial)にＣＣＭを分株した後、フィルターブルーチップ(blue tip)
を利用して細胞と混合する工程；
１４．ラバーキャップ(rubber cap)、アルミニウムキャップ(aluminum cap)を１mL バイ
アル(vial)にキャップする工程；及び
前記軟骨細胞治療剤の製造工程のＣＲＭ送達キット(delivery kit) ＆ ＣＲＭ培地包装キ
ット(medium packaging kit)には、
１．軟骨ＲＭキット(cartilage RM kit)内に含まれているＣＲＭ送達キット(delivery ki
t)とＣＲＭ培地包装キット(medium packaging kit)の外部紙ボックス包装を封切りする工
程；
２．封切られた外部包装は手術室の外に残して、手術室の内部には内部包装のスタイロフ
ォーム（登録商標）ボックスのみを運ぶ工程；
３．手術室に運ばれたボックス内部で１、４番と明記されているバイアルを取り出してＣ
ＲＭ移植キット(implantation kit)と混合して使用するように準備する工程；
前記軟骨細胞治療剤の製造工程のＣＲＭ移植キット(implantation kit)には、
１．ＣＲＭ移植キット(implantation kit)内部にあるミキシングチップ(mixing tip)を利
用してデバイス２セット（device ２set）にある軟骨細胞治療剤と混合して使用する基質
に培地を混合する工程；
２．混合した基質と培地組成物がよく溶解されたことを確認した後、１８ゲージの注射針
を注射器に装着して、患者の軟骨欠損部位に注入する工程；
が含まれることを特徴とする請求項７に記載のメディカルキットの使用方法。
【請求項１２】
無菌及び滅菌処理されたキットとして、細胞を分離、培養、採取及び保存して体内に移植
できるように全過程を段階別に分けて、その段階に対するセット化されたキット別にプロ
セッシングがなされるように骨再生キット２０を具備し、この骨再生キットには骨髄採取
キット２１、骨細胞分離キット２２、骨細胞培地交換及び継代培養キット２３及び骨細胞
治療剤の製造キット２４が具備されることを特徴とするメディカルキット。
【請求項１３】
前記骨髄採取キット２１には、
組織運搬のための内部容器であるユニバーサルコンテナ(universal container)、１mlの
溶液を取るのに使用するブルーチップ(blue tip)、冷蔵状態で組織を運ぶための内部ボッ
クスであるスタイロフォーム（登録商標）ボックス、スタイロフォームボックスに輸送ボ
トル(transport bottle)を入れるために使用するスポンジ及び冷蔵状態を維持するための
冷却剤であるクールイット(Ｋｏｏｌｉｔ；商標)が具備されることを特徴とする請求項１
２に記載のメディカルキット。
【請求項１４】
前記骨細胞分離キット２２には、
溶液除去のために使用するパスツールピペット、遠心分離チューブの上に載せて、細胞と
培養液を混合した懸濁液を注いで溶液から細胞を分離する細胞ろ過器(ｃell strainer)、
細胞を水洗するために遠心分離するのに使用するチューブ、 トリパンブルー（trypan bl
ue）と細胞計数のための細胞が入った培地を混合時に使用するＥチューブ（E-tube）、１
mlの溶液を取るのに使用するブルーチップ(blue tip)、溶液移動時に使用するピペット、
細胞培養道具であるＴ７５及び細胞を冷凍保存時に使用する道具であるクリオチューブ(c
ryo tube)が具備されることを特徴とする請求項１２に記載のメディカルキット。
【請求項１５】
前記骨細胞培地交換及び継代培養キット２３には、
溶液除去のために使用するパスツールピペット、細胞を水洗するために遠心分離するのに
使用するチューブ、溶液移動時に使用するピペット、大きい嵩の溶液移動時に使用するピ
ペット、少ない嵩の溶液を取るのに使用するイエローチップ(yellow tip)、 トリパンブ
ルー（trypan blue）と細胞が入った培地の混合時に使用するＥチューブ（E-tube）、細
胞培養道具であるＴ７５及び細胞を冷凍保存時に使用する道具であるクリオチューブ(cry
o tube)が具備されることを特徴とする請求項１２に記載のメディカルキット。
【請求項１６】
前記骨細胞治療剤の製造キット２４には、
溶液除去のために使用するパスツールピペット、細胞を冷凍させるのに使用するクリオチ
ューブ(cryo tube)、 トリパンブルー（trypan blue）と細胞計数のための細胞が入った
培地を混合時に使用するＥチューブ（E-tube）、細胞を水洗するために遠心分離するのに
使用するチューブ、溶液移動時に使用するピペット、遠心分離チューブの上に載せて、細
胞と培養液を混合した懸濁液を注いで溶液から細胞を分離する細胞ろ過器(ｃell straine
r)、溶液を取るのに使用するフィルター ブルーチップ(blue tip)、バイアルに着せるゴ
ム栓であるラバーキャップ(rubber cap)とアルミニウム栓であるアルミニウムキャップ(a
luminum cap)、骨細胞治療剤の製造のために細胞を盛るのに使用する１mL のＶバイアル
（V-vial）、冷蔵状態で骨細胞治療剤を運ぶための内部ボックスであるスタイロフォーム
（登録商標）ボックス、スタイロフォームボックスに骨細胞治療剤バイアルを入れるため
に使用するスポンジ及び冷蔵状態を維持するための冷却剤であるクールイット(Ｋｏｏｌ
ｉｔ；商標)が具備されることを特徴とする請求項１２に記載のメディカルキット。
【請求項１７】
前記骨再生キット２０には、
骨細胞の分離、培養、製造、凍結保存に使われる培地キット２５と骨細胞の分離、培養、
凍結保存に使われる培地キット２６がさらに具備されることを特徴とする請求項１２に記
載のメディカルキット。
【請求項１８】
請求項１２に具備された骨再生キット２０を利用して骨髄採取工程；骨細胞分離工程；骨
細胞培地交換及び継代培養工程；骨細胞治療剤の製造工程；によって骨を再生することを
特徴とするメディカルキットの使用方法。
【請求項１９】
前記骨髄採取工程には、
１．骨RMキット(bone RM kit)内に含まれているＢＲＭ輸送キット(transport kit)の外部
紙ボックス包装を封切りする工程；
２．封切られた外部包装は手術室の外に残して、手術室の内部には内部包装のスタイロフ
ォーム（登録商標）ボックスのみを運ぶ工程；
３．スタイロフォームボックス内部にある赤色の培地が入っている骨髄組織運搬容器に骨
髄を盛って再びスタイロフォームボックスと外部紙ボックス包装で二重包装して細胞培養
室に移す工程；
が含まれることを特徴とする請求項１８に記載のメディカルキットの使用方法。
【請求項２０】
前記骨細胞分離工程のＢＲＭ開始キット(initiation kit)には、
１．ＢＲＭ分離キット(isolation kｉｔ)を引き出して７０％アルコールを充分に噴霧し
た後、無菌作業台に移す工程；
２．無菌作業台内でＢＲＭ輸送キット(transport kit)に運ばれて来た骨髄組織の重さを
、５０mLチューブを利用して測定する工程；
３．骨髄を５０mLチューブに移した後ＢＳＢ-Iを２５mLピペットを利用して分株した後、
骨髄を水洗する工程；
４．パスツールピペットで骨髄組織を水洗した溶液を除去した後、前記"３"の手順を繰り
返す工程；
５．水洗された骨髄組織に２５mLピペットでＢＤＢ溶液を入れる工程；
６．一定時間が経った後、１０mLピペットでＢＭＢ溶液を一定量取って中和する工程；
７．中和後、ＢＳＭ溶液にもう一度水洗する工程；
８．Ｔ７５フラスコに水洗された有核細胞を移して３７℃、ＣＯ2恒温器に置く工程；及
び
前記骨細胞分離工程のＢＲＭ一次キット(primary kit)には、
１．骨RMキット(bone RM kit)内のビニール包装されたＢＲＭ一次キット(primary kit)を
引き出して７０％アルコールを充分に噴霧した後、無菌作業台に移す工程；
２．３７℃、ＣＯ2恒温器に置いたＴ７５フラスコの浮遊細胞層を１０mLピペットを利用
して５０mLチューブに移す工程；
３．５０mLチューブを遠心分離した後、２５mLピペットでＢＳＭ溶液を混合してＴ７５フ
ラスコに接種する工程；
が含まれることを特徴とする請求項１８に記載のメディカルキットの使用方法。
【請求項２１】
前記骨細胞培地交換及び継代培養工程のＢＲＭ-Ｐ１ 培地交換キット(medium change kit
)には、
１．骨RMキット(bone RM kit)のビニール包装されたＢＲＭ-Ｐ１ 培地交換キット(medium
change kit)を引き出して７０％アルコールを充分に噴霧した後、無菌作業台に移す工程
；
２．パスツールピペットを利用してフラスコ内部の培養培地を除去する工程；
３．２５mLピペットを使って５０mLチューブにＢＳＭを分株する工程；
４．分株されたチューブからの一定量をフラスコに再び分株する工程；及び
前記骨細胞培地交換及び継代培養工程のＢＲＭ-Ｐ１ 継代培養キット(subculture kit)に
は、
１．骨RMキット(bone RM kit)のビニール包装されたＢＲＭ-Ｐ１ 継代培養キット(subcul
ture kit)を引き出して７０％アルコールを充分に噴霧した後、無菌作業台に移す工程；
２．Ｔ２５フラスコの培養培地を５０mLチューブに集めた後、混合する工程；
３．このうちの一部を５０mLチューブとＥチューブ（E-tube）にサンプリングする工程；
４．パスツールピペットで残っている培養培地を除去する工程；
５．ＢＳＭ-IIをフラスコに分株して振って水洗した後、パスツールピペットで上層液を
除去する工程；
６．前記"５"を３回繰り返す工程；
７．パスソリューション(pass solution)を１０mLピペットでフラスコに分株した後、略
３分間恒温器に置く工程；
８．ニュートロソリューション(neutro solution)を１０mLピペットに分株する工程；
９．１５mLチューブに細胞を採取する工程；
１０．ＢＳＭでフラスコを水洗する工程；
１１．ＢＣＢにイエローチップ(yellow tip)を使って細胞を一定量分株後、生きている細
胞数を測定する工程；
１２．生きている細胞数を測定した後、Ｔ７５フラスコに接種する工程；
１３．クリオチューブ(cryo tube)に余分の細胞とセルストックソリューション(cell sto
ck solution)を混合して凍結保存する工程；及び
前記骨細胞培地交換及び継代培養工程のＢＲＭ-Ｐ２ 培地交換キット(medium change kit
)には、
１．骨RMキット(bone RM kit)内のビニール包装されたＢＲＭ-Ｐ２ 培地交換キット(medi
um change kit)を引き出して７０％アルコールを充分に噴霧した後、無菌作業台に移す工
程；
２．パスツールピペットで培養培地をフラスコから除去する工程；
３．２５mLピペットを使って５０mLチューブにＢＰＭを分株する工程；
４．分株されたチューブからの一定量をフラスコに再び分株する工程；及び
前記骨細胞培地交換及び継代培養工程のＢＲＭ-Ｐ２ 継代培養キット(subculture kit)に
は、
１．骨RMキット(bone RM kit)のビニール包装されたＢＲＭ-Ｐ２ 継代培養キット(subcul
ture kit)を引き出して７０％アルコールを充分に噴霧した後、無菌作業台に移す工程；
２．Ｔ７５フラスコの培養培地を５０mLチューブに集めた後、混合する工程；
３．このうちの一部を５０mLチューブとＥチューブ（E-tube）にサンプリングする工程；
４．パスツールピペットを利用して残っている培養培地を除去する工程；
５．ＢＳＢ-IIをフラスコに分株して振って水洗した後、パスツールピペットで上層液を
除去する工程；
６．前記"５"を３回繰り返す工程；
７．パスソリューション(pass solution)を１０mLピペットでフラスコに分株した後、略
３〜５分間恒温器に置く工程；
８．ニュートロソリューション(neutro solution)を１０mLピペットに分株する工程；
９．１５mLチューブに細胞を採取する工程；
１０．ＢＳＭでフラスコを軽く振って水洗する工程；
１１．ＢＣＢにイエローチップ(yellow tip)を使って細胞を一定量分株した後、細胞数を
測定する工程；
１２．細胞数を測定した後、Ｔ１５０フラスコに接種する工程；
１３．クリオチューブ(cryo tube)に余分の細胞とセルストックソリューション(cell sto
ck solution)を混合して凍結保存する工程；及び
前記骨細胞培地交換及び継代培養工程のＢＲＭ-Ｐ３ 培地交換キット(medium change kit
)には、
１．骨RMキット(bone RM kit)のビニール包装されたＢＲＭ-Ｐ２ 培地交換キット(medium
change kit)を引き出して７０％アルコールを充分に噴霧した後、無菌作業台に移す工程
；
２．パスツールピペットで培養培地をフラスコから除去する工程；
３．２５mLピペットを使って５０mLチューブにＢＰＭを分株する工程；
４．分株されたチューブからの一定量をフラスコに再び分株する工程；
が含まれることを特徴とする請求項１８に記載のメディカルキットの使用方法。
【請求項２２】
前記骨細胞治療剤の製造工程のＢＲＭ採取キット(collection kit)には、
１．骨RMキット(bone RM kit)のビニール包装されたＢＲＭ採取キット(collection kit)
を引き出して７０％アルコールを充分に噴霧した後、無菌作業台に移す工程；
２．完製品出庫３日前、５０mLチューブに培養培地一部を２５mLピペットにサンプリング
する工程；
３．製品出庫当日、Ｔ１５０フラスコ内の培養培地を５０mLチューブに集めた後、混合す
る工程；
４．このうちの一部を５０mLチューブとＥチューブ（E-tube）にサンプリングする工程；
５．パスツールピペットを利用してフラスコ内部に残っている培養培地を除去する工程；
６．ＢＳＢ-IIを２５mLピペットでフラスコに分株した後、水洗する工程；
７．前記"６"を３回繰り返す工程；
８．パスソリューション(Pass solution)を１０mLピペットでフラスコに分株した後、略
４〜５分間恒温器に置く工程；
９．ニュートロソリューション(neutro solution)を１０mLピペットに分株する工程；
１０．細胞ろ過器(ｃell strainer)を５０mLチューブ２個にそれぞれ載せておく工程；
１１．パスソリューション(Pass solution)を処理したフラスコ内の浮遊液を２５mLピペ
ットを使って細胞ろ過器(ｃell strainer)が載せられているチューブに分株する工程；
１２．ＢＣＢにイエローチップ(yellow tip)で細胞を分株した後、細胞数を合計３回測定
する工程；
１３．１mL バイアル(vial)にＢＣＭを分株した後、フィルターブルーチップ(blue tip)
を利用して細胞と混合する工程；
１４．ラバーキャップ(rubber cap)、アルミニウムキャップ(aluminum cap)を１mL バイ
アル(vial)にキャップする工程；及び
前記骨細胞治療剤の製造工程のＢＲＭ送達キット(delivery kit) ＆ ＢＲＭ培地包装キッ
ト(medium packaging kit)には、
１．骨RMキット(bone RM kit)内に含まれているＢＲＭ送達キット(delivery kit)とＢＲ
Ｍ培地包装キット(medium packaging kit)の外部紙ボックス包装を封切りする工程；
２．封切られた外部包装は手術室の外に残して、手術室の内部には内部包装のスタイロフ
ォーム（登録商標）ボックスのみを運ぶ工程；
３．手術室に運ばれたボックス内部で１、４番と明記されているバイアルを取り出してＢ
ＲＭ移植キット(implantation kit)と混合して使用できるように準備する工程；及び
前記骨細胞治療剤の製造工程のＢＲＭ移植キット(implantation kit)には、
１．ＢＲＭ移植キット(implantation kit)内部にあるミキシングチップ(mixing tip)を利
用してデバイス２セット（device ２set）にある骨細胞治療剤と混合して使用する基質に
培地を混合する工程；
２．混合した基質と培地組成物がよく溶解されたことを確認した後、注射針を注射器に装
着して、患者の骨欠損部位に注入する工程；
が含まれることを特徴とする請求項１８に記載のメディカルキットの使用方法。
【請求項２３】
無菌及び滅菌処理されたキットとして、細胞を分離、培養、採取及び保存して体内に移植
できるように全過程を段階別に分けて、その段階に対するセット化されたキット別にプロ
セッシングがなされるように臍帯血保存キット３０を具備し、この臍帯血保存キットには
、へその緒血液採取キット３１、造血母細胞分離キット３２及び造血母細胞凍結保存キッ
ト３３が具備されることを特徴とするメディカルキット。
【請求項２４】
前記へその緒血液採取キット３１には、
多くの量の血液を集める時に使用する採血バッグ(blood collection bag)、採血バッグを
運ぶ時に使用するファイルケース(file case)、運送前まで採血バッグを保存するのに使
用するジッパーバッグ(zipper bag)及びファイルケース表面に付着するステッカーが具備
されることを特徴とする請求項２３に記載のメディカルキット。
【請求項２５】
前記造血母細胞分離キット３２には、
赤血球除去後造血母細胞を濃縮させるのに使用するプロセッシングバッグ(processing ba
g)、品質管理目的でサンプル抽出時に使用するシリンジ(syringe)、遠心分離チューブの
上に載せて、細胞と培養液を混合した懸濁液を注いで溶液から細胞を分離する細胞ろ過器
(ｃell strainer)、細胞を水洗するために遠心分離するのに使用するチューブ、無菌作業
を遂行するために使用するラテックスグローブ(latex glove)、造血母細胞を保存するた
めに細胞をバイアルに盛るＣＣＺ バイアル(vial)、バイアルに着せるアルミニウム栓で
あるアルミニウムシール(aluminum seal)、溶液を取るのに使用するブルーチップ(blue t
ip)及び トリパンブルー（trypan blue）と細胞が入った培地の混合時に使用するＥチュ
ーブ（E-tube）が具備されることを特徴とする請求項２３に記載のメディカルキット。
【請求項２６】
前記造血母細胞凍結保存キット３３には、
造血母細胞を冷凍させるのに使用する道具であるフリージングバッグ(freezing bag)、フ
リージングバッグ(freezing bag)を保護するために使用する包装式冷却剤（クリオラップ
；Cryowrap)、並びにフリージングバッグ(freezing bag)及び包装式冷却剤（クリオラッ
プ；Cryowrap)を保管するキャニスターが具備されることを特徴とする請求項２３に記載
のメディカルキット。
【請求項２７】
前記臍帯血保存キット３０には、
造血母細胞の分離及び凍結保存に使われる培地キット３４、造血母細胞の分離及び凍結保
存に使われる培地キット３５がさらに具備されることを特徴とする請求項２３に記載のメ
ディカルキット。
【請求項２８】
請求項２３に具備された臍帯血保存キット３０を利用してへその緒血液採取工程；造血母
細胞分離工程；造血母細胞凍結保存工程；によって臍帯血を保存することを特徴とするメ
ディカルキットの使用方法。
【請求項２９】
前記へその緒血液採取工程は、
１．USC RMキット(USC RM kit)内に含まれているＵＳＣ ＲＭ輸送キット(transport kit)
のファイルケース(file case)を手術室に運ぶ工程；
２．運ばれたファイルケース(file case)のジッパーバッグ(zipper bag)を開いて、滅菌
処理された採血バッグ(blood collection bag)を利用してへその緒血液を採取する工程；
３．採取された血液は再びＵＳＣ ＲＭ輸送キット(transport kit)のファイルケース(fil
e case)に盛って工程室に移す工程；
が含まれることを特徴とする請求項２８に記載のメディカルキットの使用方法。
【請求項３０】
前記造血母細胞分離工程は、
１．採血バッグから１０mL注射器を利用して一定量の血液を採取してＥＰＰチューブに分
株する工程；
２．３０mL注射器を利用して一定量のＵＥＳ溶液を添加して撹拌した後、放置する工程；
３．一定時間放置後、半自動血漿分離器で１次血漿層をプロセッシングバッグ(processin
g bag)に分離する工程；
４．前記"２"、"３"の過程を反復する工程；
５．プロセッシングバッグ(processing bag)をバケツに固定した後、重さを測定して遠心
分離する工程；
６．遠心分離後、バケツでプロセッシングバッグ(processing bag)を分離する工程；
７．プロセッシングバッグ(processing bag)を自動血漿分離器に固定させる工程；
８．自動血漿分離器を利用して血漿を１５mlチューブに分株する工程；
９．自動血漿分離器を利用して残りの血漿を５０mlチューブに盛る工程；
１０．１０mL注射器を利用して５０mlチューブに盛られた血漿を採取してバキュテナー（
vacutainer）に分株する工程；
が含まれることを特徴とする請求項２８に記載のメディカルキットの使用方法。
【請求項３１】
前記造血母細胞凍結保存工程は、
１．プロセッシングバッグ(processing bag)を懸濁させた後、懸濁させたプロセッシング
バッグ(processing bag)から１０mL注射器で内容物を採取してＥＰＰチューブに分株する
工程；
２．１０mL注射器でセルストックソリューション(cell stock solution)を採取して氷水
に浸して懸濁させたプロセッシングバッグ(processing bag)に添加した後、よく混合する
ようにする工程；
３．プロセッシングバッグ(processing bag)の表面を７０％アルコールで消毒する工程；
４．フリージングバッグ(freezing bag)をプロセッシングバッグ(processing bag)に連結
して有核細胞濃縮層を移して気泡を除去する工程；
５．フリージングバッグ(freezing bag)を二重包装バッグに入れて圧縮包装をした後、消
毒する工程；
６．二重包装バッグに包装されたフリージングバッグ(freezing bag)をキャニスターに挿
入する工程；
が含まれることを特徴とする請求項２８に記載のメディカルキットの使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メディカルキット(medical kit)及びその使用方法に関するものであり、より
詳細には、軟骨及び骨の再生並びに臍帯血保存を目的とする細胞治療剤の製造及び移植並
びに臍帯血処理に係わるキットの使用方法に関するものであり、特に、細胞を分離、培養
、採取、移植及び保存する各プロセッシングに必要な種々の物質、各種培養培地及び溶液
を、易しくて簡便に一つのキットで製作して供給することを可能にすることにより既存の
細胞治療剤の製造及び臍帯血保存において発生する多額の生産費用、長い生産時間及び高
い人件費の節減効果をもたらすようにしたものであり、これにより製品の品質と信頼性を
大幅に向上させて消費者にとって良いイメージを植えることができるようにしたものであ
る。
【背景技術】
【０００２】
周知のように、現在、臓器の不足によって組織再生に対する関心はますます高くなってい
るが、このための代替法として細胞治療剤を開発する道は非常に難しい過程に違いなく、
また、臍帯血保存法を確立することも易しいことではない。特に、細胞治療剤は、現在の
医学分野において広く常用化されている治療法ではなくて、また、細胞治療剤を手軽くて
簡便に製造してターゲット領域に移植できるように無菌及び滅菌処理された器具の製作並
びに培養培地を単一のセットの形態でキット化した事例もやっぱりない。
【０００３】
また、組織工学は、損傷された組織や臓器を復元、再建、再生又は取り替えて正常な機能
をするようにすることにその目的がある。組織工学は、わずか数年前までは科学者らに疎
い学問であったが、現在はよく知られた急速に発展した科学分野になっている。タイム（
Ｔｉｍｅ）紙(２０００年５月号)に選ばれて、「２０世紀の最も有望な研究分野の一つ」
と命名されたように、組織工学は、著名な分野になった。これは、多くの分野に従事する
専門家らの絶え間ない努力の結果によると思われる。現在、韓国でも組織工学は関心度が
高い学問として浮び上がっている。
【０００４】
組織工学の初期の研究は、解剖学的又は組織学的に人体の組織と類似な組織又は臓器を作
ることに汲々としていたが、時間が経つにつれて形成された組織の機能に重点を置くよう
になった。その間、絶え間ない研究を経て、人工皮膚を始めとして多くの分野で組織工学
の生産物及び技術を臨床に適用しようと努力して来た。最近は、組織の再建と併せて再生
にも重点を置いている。
【０００５】
組織工学の基本的構成の一つは、細胞であり、同種、異種又は自家細胞などが組織工学の
研究に利用されて来た。同種や異種細胞は、免疫学的拒絶反応を避けるために細胞から人
体に必要な物質を分泌するように誘導して体内組織の機能を向上させることにその目的が
ある。
しかし、同種や異種細胞の使用は、現実的に利用に限界があって、免疫学的拒絶反応がな
い自家細胞を好むようになった。自家細胞を利用した多くの研究が進行して来たし、現在
、多数の領域では動物実験を経た後、臨床実験が進行しているし、結果も満足であると言
う。
このような自家細胞を利用した注射療法は、人工的な生体材料と違い、異物反応がないと
いう長所のために好まれている。注射療法による組織の形成は、既に多くの部位の組織で
臨床的に試みられている。特に、内視鏡の導入と支援がその使用範囲を拡張させたと言え
る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、このような自家細胞を利用した細胞治療剤を製造する全般にわたった過程は、少
し複雑で易しくない。細胞治療剤を製造するにおいて使われる各種プラスチックウェアと
培地を含めた溶液を扱ってみると人体の欠損部位に移植する細胞に汚染が発生することも
あって、また、細胞の培養期間が長くなって患者がタイムリーな移植機会を逃がしたりす
る。
【０００７】
本発明は、前記のような従来技術の諸般の問題点を解消するために案出したものであり、
軟骨及び骨の再生並びに臍帯血保存を目的とする細胞治療剤の製造及び移植並びに臍帯血
処理に係わるキットの使用方法に関するものであり、特に、細胞を分離、培養、採取、移
植及び保存する各プロセッシングに必要な種々の物質、各種培養培地及び溶液を易しくて
簡便に一つのキットとして製作して供給することを可能にすることにより、既存の細胞治
療剤の製造及び臍帯血保存において発生する多額の生産費用、長い生産時間及び高い人件
費の節減効果をもたらすようにすることを第１目的とする。
【０００８】
第２目的は、採取された軟骨、骨髄組織及びへその緒血液から安全に細胞を分離、培養、
採取及び保存して所望の細胞を体内のターゲットサイトに移植できる無菌及び滅菌処理さ
れたキットを提供することである。この目的のために、全過程を段階別に分けて、その段
階に対する機能化された特殊のキットセットに従ってプロセッシングがなされるようにメ
ディカルキットを単一のキットセットの形態にしたものである。
【０００９】
第３目的は、軟骨及び骨の再生を目的とする細胞治療剤の製造によるすべてのプロセッシ
ングを段階別に標準化して、標準化された過程に好適であるようにキットを製作すること
で、一度に手軽く、簡便に使用するようにすることで、細胞治療剤の製造をより活性化し
て、延いては組織工学を利用した新しい治療法を常用化しようとすることである。
【００１０】
第４目的は、臍帯血保存において、軟骨及び骨の再生用の上記のキットと同様な形態を持
つ標準化されたプロトコルを作って、各プロセッシング別にキットを製作して簡便に一度
に使用するようにして、既存の保存処理方法に比べて費用、時間及び人力の節減効果を達
成することである。
【００１１】
第５目的は、これにより製品の品質と信頼性を大幅に向上させて消費者にとって良いイメ
ージを植付けてくれることができるようにしたメディカルキット及びその使用方法を提供
することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
このような目的達成のために、本発明は、無菌及び滅菌処理されたキットとして、所望の
細胞を分離、培養、採取及び保存して体内のターゲットサイトに移植できるように全過程
を段階別に分けて、その段階に対するセット化されたキット別にプロセッシングがなされ
るように軟骨再生キットを具備する。
この軟骨再生キットには、軟骨組織採取キット、軟骨細胞分離キット、軟骨細胞培地交換
及び継代培養キット並びに軟骨細胞治療剤の製造キットが具備されている。それ故、前記
軟骨再生キット１０を利用して、軟骨組織採取工程；軟骨細胞分離工程；軟骨細胞培地交
換及び継代培養工程；軟骨細胞治療剤の製造工程；細胞分離/培養/製造/凍結保存に使わ
れる培地；細胞分離/培養/凍結保存に使われる培地；によって軟骨は再生される。
【００１３】
また、本発明は、無菌及び滅菌処理されたキットとして、細胞を分離、培養、採取及び保
存して体内に移植できるように全過程を段階別に分けて、その段階に対するセット化され
たキット別にプロセッシングがなされるように骨再生キットを具備し、この骨再生キット
には、骨髄採取キット、骨細胞分離キット、骨細胞培地交換及び継代培養キット並びに骨
細胞治療剤の製造キットが具備されて、前記骨再生キットを利用して骨髄採取工程；骨細
胞分離工程；骨細胞培地交換及び継代培養工程；骨細胞治療剤の製造工程；によって骨を
再生するようになる。
【００１４】
さらに本発明は、無菌及び滅菌処理されたキットとして、細胞を分離、培養、採取及び保
存して体内に移植できるように全過程を段階別に分けて、その段階に対するセット化され
たキット別にプロセッシングがなされることができるように、臍帯血保存キットを具備し
、この臍帯血保存キットには、へその緒血液採取キット、造血母細胞分離キット及び造血
母細胞凍結保存キットが具備されて、前記臍帯血保存キットを利用して、へその緒血液採
取工程；造血母細胞分離工程；造血母細胞凍結保存工程；によって造血母細胞を保存する
メディカルキット及びその使用方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、本発明に適用された軟骨再生キットの簡略構成図である。
【図２】図２は、本発明に適用された骨再生キットの簡略構成図である。
【図３】図３は、本発明に適用された臍帯血保存キットの簡略構成図である。
【図４】図４は、本発明に適用された軟骨組織採取キットの図面代用写真である。
【図５】図５は、本発明に適用された軟骨細胞分離キットの図面代用写真である。
【図６】図６は、本発明に適用された軟骨細胞培地交換キットに適用されたＣＲＭ-Ｐ１ 培地交換キット(medium change kit)の図面代用写真である。
【図７】図７は、本発明に適用された軟骨細胞培地交換キットに適用されたＣＲＭ-Ｐ２ 培地交換キット(medium change kit)の図面代用写真である。
【図８】図８は、本発明に適用された軟骨細胞培地交換キットに適用されたＣＲＭ-Ｐ３ 培地交換キット(medium change kit)の図面代用写真である。
【図９】図９は、本発明に適用された軟骨細胞継代培養キットに適用されたＣＲＭ-Ｐ１ 継代培養キット(subculture kit)の図面代用写真である。
【図１０】図１０は、本発明に適用された軟骨細胞継代培養キットに適用されたＣＲＭ-Ｐ２ 継代培養キット(subculture kit)の図面代用写真である。
【図１１】図１１は、本発明に適用された軟骨細胞治療剤の製造キットのうち細胞採取キットに適用されたＣＲＭ採取キット(collection kit)の図面代用写真である。
【図１２】図１２は、本発明に適用された軟骨細胞治療剤の製造キットのうち送達キットに適用されたＣＲＭ送達キット(delivery kit)の図面代用写真である。
【図１３】図１３は、本発明に適用された軟骨細胞治療剤の製造キットのうち移植キットに適用されたＣＲＭ移植キット(implantation kit)の図面代用写真である。
【図１４】図１４は、本発明に適用された細胞分離、培養、製造、凍結保存に使われる培地キットの図面代用写真である。
【図１５】図１５は、本発明に適用された細胞分離、培養、凍結保存に使われる培地キットの図面代用写真である。
【図１６】図１６は、本発明に適用されたへその緒血液採取キットの図面代用写真である。
【図１７】図１７は、本発明に適用された造血母細胞分離キットの図面代用写真である。
【図１８】図１８は、本発明に適用された造血母細胞分離、凍結保存に使われる培地キットの図面代用写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下では、このような目的達成のための本発明の望ましい実施例を添付された図面によっ
て詳しく説明する。
【００１７】
本発明に適用されたメディカルキット及びその使用方法は、図１ないし図１８に示すよう
に構成されるものである。
【００１８】
下記で本発明を説明するにおいて、係わる公知機能又は構成に対する具体的な説明が本発
明の要旨を不明瞭にすることがあると判断される場合には、その詳細な説明は省略する。
【００１９】
そして、後述される用語は、本発明での機能を考慮して設定された用語として、これは生
産者の意図又は慣例によって変わることがあるので、その定義は、本明細書全般にわたっ
た内容に基づいてなされるべきである。
【００２０】
先ず、本願発明の技術的構成は、軟骨再生を目的とするキット、骨再生を目的とするキッ
ト及び臍帯血の保存を目的とするキットで大きく三つに分けて構成される。
【００２１】
すなわち、前記軟骨再生を目的とするキット１０は、プラスチックウェアキットであり、
１．軟骨組織採取キット(ＣＲＭ輸送キット)、
２．軟骨細胞分離キット(ＣＲＭ開始キット)[ＣＲＭ分離キット、ＣＲＭ一次キット])、
３．軟骨細胞培地交換及び継代培養キット(ＣＲＭプロセッシングキット[ＣＲＭ-Ｐ１継
代培養キット、ＣＲＭ-Ｐ２継代培養キット、ＣＲＭ-Ｐ１培地交換キット、ＣＲＭ-Ｐ２ 
培地交換キット、ＣＲＭ-Ｐ３ 培地交換キット])及び
４．軟骨細胞治療剤の製造キット(ＣＲＭ生成物キット[ＣＲＭ採取キット、ＣＲＭ送達キ
ット、ＣＲＭ培地包装キット、ＣＲＭ移植キット])
の四つで構成されて、これらはそれぞれ各種サブキットで構成されている。
【００２２】
軟骨再生キットは、さらに、細胞の分離/培養/製造/凍結保存に使われる培地キット(ＣＲ
Ｍ-ＲＦ kｉｔ[ＣＳＢ-Ｉ、ＣＳＢ-ＩＩ、ＣＳＭ、ＣＰＭ、ＣＣＭ、ＣＣＢ])及び細胞の
分離/培養/凍結保存に使われる培地キット(ＣＲＭ-ＦＺ kｉｔ[Cartisepor、ＳＴＡ、Ｐ
ＣＦ、pａｓｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、cｅｌｌ ｓｔｏｃｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、ＣＳＭ ＡＤ
ｓｏｌｕｔｉｏｎ、ＣＰＭ ＡＤ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、nｅｕｔｒｏ ｓｏｌｕｔｉｏｎ])
がさらに構成されて、細胞の分離、培養、採取及び移植を助ける。
【００２３】
また、前記骨再生を目的とするキット２０の場合は、プラスチックウェアキットであり、
１．骨髄採取キット(ＢＲＭ輸送キット)、
２．骨細胞分離キット(ＢＲＭ開始キット)[ＢＲＭ分離キット、ＢＲＭ一次キット])、
３．骨細胞培地交換及び継代培養キット(ＢＲＭプロセッシングキット[ＢＲＭ-Ｐ１ 継代
培養キット、ＢＲＭ-Ｐ２ 継代培養キット、ＢＲＭ-Ｐ１ ４．培地交換キット、ＢＲＭ-
Ｐ２ 培地交換キット、ＢＲＭ-Ｐ３ 培地交換キット])、
４．骨細胞治療剤の製造キット(ＢＲＭ生成物キット[ＢＲＭ採取キット、ＢＲＭ送達キッ
ト、ＢＲＭ培地包装キット、ＢＲＭ移植キット])、
５．骨細胞の分離/培養/製造/凍結保存に使われる培地キット(ＢＲＭ-ＲＦ kｉｔ[ＯＳＢ
、ＢＳＢ、ＢＳＭ、ＢＰＭ、ＢＣＭ、ＢＣＢ、ＢＤＢ、ＢＮＢ])及び
６．骨細胞の分離/培養/凍結保存に使われる培地キット(ＢＲＭ-ＦＺ kｉｔ[ＳＴＡ、Ｐ
ＣＦ、pａｓｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、cｅｌｌ ｓｔｏｃｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、ＯＳＭ ＡＤ
ｓｏｌｕｔｉｏｎ、ＯＰＭ ＡＤ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、nｅｕｔｒｏ ｓｏｌｕｔｉｏｎ])
がセットで構成される。
【００２４】
最後に、臍帯血保存を目的とするキット３０の場合は、
１．へその緒血液採取キット(ＵＳＣ ＲＭ輸送キット)、
２．造血母細胞分離キット(ＵＳＣ ＲＭプロセッシングキット)及び
３．造血母細胞凍結保存キット(ＵＳＣ ＲＭ保存キット)
の三つで構成されて、さらに、
造血母細胞分離及び凍結保存に使われる培地(ＵＳＣ ＲＭ-ＲＦ kｉｔ)並びに造血母細胞
分離及び凍結保存に使われる培地(ＵＳＣ ＲＭ-ＦＺ kｉｔ)で構成されている。
【００２５】
以下、本発明をより具体的に説明する。
図１に示すように、無菌及び滅菌処理されたキットとして、細胞を分離、培養、採取及び
保存して体内に移植できるように全過程を段階別に分けて、その段階に対するセット化さ
れたキット別にプロセッシングがなされるように軟骨再生キット１０を具備し、この軟骨
再生キットには、軟骨組織採取キット１１、軟骨細胞分離キット１２、軟骨細胞培地交換
及び継代培養キット１３並びに軟骨細胞治療剤の製造キット１４が具備される。
【００２６】
この時、前記軟骨組織採取キット１１には、軟骨組織採取のために使用する硬組織採取キ
ット、組織運搬のための内部容器であるユニバーサルコンテナ(universal container)、
組織運搬のための外部容器である輸送ボトル(transport bottle)、１mLの溶液を取るのに
使用するブルーチップ(blue tip)(１mL)、冷蔵状態で組織を運ぶための内部ボックスであ
る「スタイロフォーム」（Styrofoam；押出法ポリスチレンフォームの登録商標、以下同
じ）ボックス(box)、スタイロフォームボックスに輸送ボトル(transport bottle)を入れ
るために使用するスポンジ及び冷蔵状態を維持するための冷却剤であるクールイット(Ｋ
ｏｏｌｉｔ；商標、以下同じ)が具備される。
【００２７】
また、前記軟骨細胞分離キット１２には、溶液除去のために使われるパスツールピペット
、プラグシールキャップを持つ細胞培養道具であるＴ２５(単位面積２５ｃｍ2フラスコ)
、５０mL遠心分離チューブの上に載せて、細胞と培養液を混合した懸濁液を注いで溶液か
ら細胞を分離する細胞ろ過器(cell strainer)、細胞を水洗するために遠心分離するのに
使用するチューブ、 トリパンブルー（trypan blue）と細胞が入った培地の混合時に使用
するＥチューブ（E-tube）、１mlの溶液を取るのに使用するブルーチップ(blue tip)、溶
液移動時に使用するピペット、溶液を濾過するために使用するシリンジフィルター(syrin
ge filter)、細胞培養道具であるＴ２５及び細胞を冷凍保存時に使用する道具であるクリ
オチューブ(cryo tube)が具備される。
【００２８】
また、本発明に適用された前記軟骨細胞培地交換及び継代培養キット１３には、溶液除去
のために使用するパスツールピペット、細胞を水洗するために遠心分離するのに使用する
チューブ、溶液移動時に使用するピペット、大きい嵩の溶液移動時に使用するピペット、
少ない嵩の溶液を取るのに使用するイエローチップ(yellow tip)、トリパンブルー（tryp
an blue）と細胞が入った培地の混合時に使用するＥチューブ（E-tube）、細胞培養道具
であるＴ７５及び細胞を冷凍保存時に使用する道具であるクリオチューブ(cryo tube)が
具備される。
【００２９】
そして、本発明は、前記軟骨細胞治療剤の製造キット１４には、溶液除去のために使用す
るパスツールピペット、細胞を冷凍保存時に使用する道具であるクリオチューブ(cryo tu
be)、 トリパンブルー（trypan blue）と細胞が入った培地の混合時に使用するＥチュー
ブ（E-tube）、細胞を水洗するために遠心分離するのに使用するチューブ、溶液移動時に
使用するピペット、大きい嵩の溶液移動時に使用するピペット、５０mL遠心分離チューブ
の上に載せて、細胞と培養液を混合した懸濁液を注いで溶液から細胞を分離する細胞ろ過
器(cell strainer)、溶液を取るのに使用するフィルター ブルーチップ(blue tip)、バイ
アルに着せるゴム栓であるラバーキャップ(rubber cap)とアルミニウム栓であるアルミニ
ウムキャップ(aluminum cap)、軟骨細胞治療剤の製造のために細胞を盛るのに使用する１
Ml のＶバイアル（V-vial）、冷蔵状態で軟骨細胞治療剤を運ぶための内部ボックスであ
るスタイロフォームボックス(Styrofoam box)、スタイロフォームボックスに軟骨細胞治
療剤バイアルを入れるために使用するスポンジ、冷蔵状態を維持するための冷却剤である
クールイット(Koolit)及び欠損部位に細胞を移植させるのに使用するデバイス２セット（
device ２sets）が具備される。
【００３０】
さらに、本発明に適用された前記軟骨再生キット１０には、細胞分離/培養/製造/凍結保
存に使われる培地キット１５及び細胞分離/培養/凍結保存に使われる培地キット１６が具
備される。
【００３１】
本発明を下記の実施例を参照してより詳細に説明する。これらの実施例は、本発明を具体
的に説明するためにのみ記載されるのであって、本発明の範囲および精神を限定するもの
と解釈すべきではない。
【００３２】
前記のように構成された本発明は、軟骨再生キット１０を利用して、軟骨組織採取工程；
軟骨細胞分離工程；軟骨細胞培地交換及び継代培養工程；軟骨細胞治療剤の製造工程；細
胞分離/培養/製造/凍結保存に使われる培地；細胞分離/培養/凍結保存に使われる培地；
によって軟骨を再生する。これの実施例をより詳しく説明する。
【実施例１】
【００３３】
前記軟骨組織採取工程には、
１．軟骨ＲＭキット(cartilage RM kit)内に含まれているＣＲＭ輸送キット(transport k
it)の外部紙ボックス包装を封切りする工程；
２．封切られた外部包装は手術室の外に残して、手術室の内部には内部包装のスタイロフ
ォームボックスのみを運ぶ工程；及び
３．スタイロフォームボックス内部にある滅菌処理された硬組織採取器を利用して軟骨組
織を採取して、採取された軟骨組織は赤色の培地が入っている軟骨組織運搬容器に盛って
再びスタイロフォームボックスと外部紙ボックス包装で二重包装して細胞培養室に移す工
程；でなされる。
【００３４】
また、前記軟骨細胞分離工程のＣＲＭ開始キット(initiation kit)には、
１．CRM分離キット(CRM isolation kit)を引き出して７０％アルコールを充分に噴霧した
後、無菌作業台に移す工程；
２．無菌作業台内でＣＲＭ輸送キット(transport kit)に運ばれて来た軟骨組織を、５０m
Lチューブを利用して軟骨組織自体の重さを測定する工程；
３．軟骨組織を５０mLチューブに移した後、ＣＳＢ-Iを、２５mLピペットを利用して分株
した後、軟骨組織を水洗する工程；
４．パスツールピペットで軟骨組織を水洗した溶液を除去した後"３"の手順を繰り返す工
程；
５．水洗された軟骨組織をディッシュ(dish)に移した後、１０、１１番のブレード(blade
)を利用して細かく切る工程；
６．切られた軟骨組織を１５mLチューブに移す工程；
７．１０mLピペットでＣＳＢ-Iをチューブに分株する工程；
８．軟骨組織を入れたチューブを１２００rpmで１分間処理する工程；
９．水洗後、パスツールピペットで上層液を除去する工程；
１０．前記"８"、"９"の手順を３回繰り返す工程；
１１．２個のＴ２５フラスコ(plug seal)を準備した後、一つのＴ２５フラスコにはカテ
ィセポー(Cartisepor)を、残りのフラスコにはカティセポー(Cartisepor)に抗生剤を混合
して１０mLピペットに分株する工程；
１２．水洗された軟骨組織の１/３は、ＣＳＢ-Iがあるフラスコに、残りの２/３はＣＳＢ
-IIがあるフラスコに移す工程；
１３．フラスコに移した後、３７℃、ＣＯ2恒温器で１２〜１６時間が経った後、３７℃
、１００rpmで３０分間撹拌する工程；及び
１４．細胞ろ過器(cell strainer)を５０mLチューブに装着した後、フラスコ内の浮遊液
をろ過する工程；
並びに前記軟骨細胞分離工程のＣＲＭ一次キット(primary kit)には、
１．軟骨ＲＭキット(cartilage RM kit)のビニール包装されたＣＲＭ一次キット(primary
kit)を引き出して７０％のアルコールを充分に噴霧した後、無菌作業台に移す工程；
２．ＣＳＭを１０mLピペットで５０mLチューブに分株する工程；
３．これを遠心分離して水洗した後、パスツールピペットで上層液を除去、再びＣＳＭを
分株して水洗する工程；
４．１/２０に該当する細胞をクリオチューブ(cryo tube)にＰＣＦと混合して凍結保存す
る工程；及び
５．翌日、Ｔ２５フラスコに付着しない浮遊細胞を１５mLチューブで回収してＴ２５フラ
スコに接種する工程；でなされる。
【００３５】
また、本発明の前記軟骨細胞培地交換及び継代培養工程のＣＲＭ-Ｐ１ 培地交換キット(m
edium change kit)には、
１．軟骨ＲＭキット(cartilage RM kit)のビニール包装されたＣＲＭ-Ｐ１ 培地交換キッ
ト(medium change kit)を引き出して７０％アルコールを充分に噴霧した後、無菌作業台
に移す工程；
２．パスツールピペットを利用してフラスコ内部の培養培地を除去する工程；
３．２５mLピペットを使って５０mLチューブにＣＳＭを分株する工程；及び
４．分株されたチューブからの一定量をフラスコに再び分株する工程；
並びに前記軟骨細胞培地交換及び継代培養工程のＣＲＭ-Ｐ１ 継代培養キット(subcultur
e kit)には、
１．軟骨ＲＭキット(cartilage RM kit)のビニール包装されたＣＲＭ-Ｐ１ 継代培養キッ
ト(subculture kit)を引き出して７０％アルコールを充分に噴霧した後、無菌作業台に移
す工程；
２．Ｔ２５フラスコの培養培地を５０mLチューブに集めた後、混合する工程；
３．このうちの一部を５０mLチューブとＥチューブ（E-tube）にサンプリングする工程；
４．パスツールピペットに残っている培養培地を除去する工程；
５．ＣＳＢ-IIをフラスコに分株して振って水洗した後、パスツールピペットで上層液を
除去する工程；
６．前記"５"を３回繰り返す工程；
７．パスソリューション(pass solution)を１０mLピペットで、フラスコに分株した後、
略３分間恒温器に置く工程；
８．ニュートロソリューション(neutro solution)を１０mLピペットに分株する工程；
９．１５mLチューブに細胞を採取する工程；
１０．ＣＳＭでフラスコを水洗する工程；
１１．ＣＣＢにイエローチップ(yellow tip)を使って細胞を一定量分株後、細胞数を測定
する工程；
１２．細胞数を測定した後、Ｔ７５フラスコに接種する工程；及び
１３．クリオチューブ(cryo tube)に余分の細胞とセルストックソリューション(cell sto
ck solution)を混合して、凍結保存する工程；
並びに前記軟骨細胞培地交換及び継代培養工程のＣＲＭ-Ｐ２ 培地交換キット(medium ch
ange kit)には、
１．軟骨ＲＭキット(cartilage RM kit)のビニール包装されたＣＲＭ-Ｐ２ 培地交換キッ
ト(medium change kit)を引き出して７０％アルコールを充分に噴霧した後、無菌作業台
に移す工程；
２．パスツールピペットで培養培地をフラスコから除去する工程；
３．２５mLピペットを使って５０mLチューブにＣＰＭを分株する工程；及び
４．分株されたチューブからの一定量をフラスコに再び分株する工程；
並びに前記軟骨細胞培地交換及び継代培養工程のＣＲＭ-Ｐ２ 継代培養キット(subcultur
e kit)には、
１．軟骨ＲＭキット(cartilage RM kit)のビニール包装されたＣＲＭ-Ｐ２ 継代培養キッ
ト(subculture kit)を引き出して７０％アルコールを充分に噴霧した後、無菌作業台に移
す工程；
２．Ｔ７５フラスコの培養培地を５０mLチューブに集めた後、混合する工程；
３．このうちの一部を５０mLチューブとＥチューブ（E-tube）にサンプリングする工程；
４．パスツールピペットを利用して残っている培養培地を除去する工程；
５．ＣＳＢ-IIをフラスコに分株して振って水洗した後、パスツールピペットで上層液を
除去する工程；
６．前記"５"を３回繰り返す工程；
７．パスソリューション(pass solution)を１０mLピペットでフラスコに分株した後、略
３〜５分間恒温器に置く工程；
８．ニュートロソリューション(neutro solution)を１０mLピペットに分株する工程；
９．１５mLチューブに細胞を採取する工程；
１０．ＣＳＭでフラスコを軽く振って水洗する工程；
１１．ＣＣＢにイエローチップ(yellow tip)を使って細胞を一定量分株した後、細胞数を
測定する工程；
１２．細胞数を測定した後、Ｔ１５０フラスコに接種する工程；及び
１３．クリオチューブ(cryo tube)に余分の細胞とセルストックソリューション(cell sto
ck solution)を混合して凍結保存する工程；
並びに前記軟骨細胞培地交換及び継代培養工程のＣＲＭ-Ｐ３ 培地交換キット(medium ch
ange kit)には、
１．軟骨ＲＭキット(cartilage RM kit)のビニール包装されたＣＲＭ-Ｐ２ 培地交換キッ
ト(medium change kit)を引き出して７０％アルコールを充分に噴霧した後、無菌作業台
に移す工程；
２．パスツールピペットで培養培地をフラスコから除去する工程；
３．２５mLピペットを使って５０mLチューブにＣＰＭを分株する工程；及び
４．分株されたチューブからの一定量をフラスコに再び分株する工程；でなされる。
【００３６】
さらに、本発明に適用された前記軟骨細胞治療剤の製造工程のＣＲＭ採取キット(collect
ion kit)には、
１．軟骨ＲＭキット(cartilage RM kit)のビニール包装されたＣＲＭ採取キット(collect
ion kit)を引き出して７０％アルコールを充分に噴霧した後、無菌作業台に移す工程；
２．完製品出庫３日前、５０mLチューブに培養培地の一部を２５mLピペットにサンプリン
グする工程；
３．製品出庫当日、Ｔ１５０フラスコ内の培養培地を５０mLチューブに集めた後、混合す
る工程；
４．このうちの一部を５０mLチューブとE-tubeにサンプリングする工程；
５．パスツールピペットを利用してフラスコ内部に残っている培養培地を除去する工程；
６．ＣＳＢ-IIを２５mLピペットでフラスコに分株した後、水洗する工程；
７．前記"６"を３回繰り返す工程；
８．パスソリューション(pass solution)を１０mLピペットでフラスコに分株した後、略
４〜５分間恒温器に置く工程；
９．ニュートロソリューション(neutro solution)を１０mLピペットで分株する工程；
１０．細胞ろ過器(cell strainer)を５０mLチューブ２個にそれぞれ載せておく工程；
１１．パスソリューション(pass solution)を処理したフラスコ内の浮遊液を２５mLピペ
ットを使って細胞ろ過器(cell strainer)が載せられているチューブに分株する工程；
１２．ＣＣＢにイエローチップ(yellow tip)で細胞を分株した後、細胞数を合計３回測定
する工程；
１３．１mL バイアル(vial)にＣＣＭを分株した後、フィルターブルーチップ(blue tip)
を利用して細胞と混合する工程；及び
１４．ラバーキャップ(rubber cap)、アルミニウムキャップ(aluminum cap)を１mL バイ
アル(vial)にキャップする工程；
並びに前記軟骨細胞治療剤の製造工程のＣＲＭ送達キット(delivery kit) ＆ ＣＲＭ培地
包装キット(medium packaging kit)には、
１．軟骨ＲＭキット(cartilage RM kit)内に含まれているＣＲＭ送達キット(delivery ki
t)とＣＲＭ培地包装キット(medium packaging kit)の外部紙ボックス包装を封切りする工
程；
２．封切られた外部包装は手術室の外に残して、手術室の内部には内部包装のスタイロフ
ォームボックスのみを運ぶ工程；及び
３．手術室に運ばれたボックス内部で１、４番と明記されているバイアルを取り出してＣ
ＲＭ移植キット(implantation kit)と混合して使用できるように準備する工程；
並びに前記軟骨細胞治療剤の製造工程のＣＲＭ移植キット(implantation kit)には、
１．ＣＲＭ移植キット(implantation kit)内部にあるミキシングチップ(mixing tip)を利
用してデバイス２セット内（device ２set）にある軟骨細胞治療剤と混合して使用する基
質に培地を混合する工程；及び
２．混合した基質と培地組成物がよく溶解されたことを確認した後、１８ゲージの注射針
を注射器に装着して、患者の軟骨欠損部位に注入する工程；でなされる。
【００３７】
一方、本発明は、図２に示すように構成することができることは勿論である。すなわち、
無菌及び滅菌処理されたキットとして、細胞を分離、培養、採取及び保存して体内に移植
できるように全過程を段階別に分けて、その段階に対するセット化されたキット別にプロ
セッシングがなされるように骨再生キット２０を具備し、この骨再生キットには、骨髄採
取キット２１、骨細胞分離キット２２、骨細胞培地交換及び継代培養キット２３並びに骨
細胞治療剤の製造キット２４が具備される。
【００３８】
この時、前記骨髄採取キット２１には、組織運搬のための内部容器であるユニバーサルコ
ンテナ(universal container)、１mlの溶液を取るのに使用するブルーチップ(blue tip)
、冷蔵状態で組織を運ぶための内部ボックスであるスタイロフォームボックス(Styrofoam
box)、スタイロフォームボックスに輸送ボトル(transport bottle)を入れるために使用
するスポンジ及び冷蔵状態を維持するための冷却剤であるクールイット(Koolit)が具備さ
れる。
【００３９】
また、前記骨細胞分離キット２２には、溶液除去のために使用するパスツールピペット、
遠心分離チューブの上に載せて、細胞と培養液を混合した懸濁液を注いで溶液から細胞を
分離する細胞ろ過器(ｃell strainer)、細胞を水洗するために遠心分離するのに使用する
チューブ、 トリパンブルー（trypan blue）と細胞計数のための細胞が入った培地を混合
時に使用するＥチューブ（E-tube）、１mLの溶液を取るのに使用するブルーチップ(blue 
tip)、溶液移動時に使用するピペット、細胞培養道具であるＴ７５及び細胞を冷凍保存時
に使用する道具であるクリオチューブ(cryo tube)が具備される。
【００４０】
本発明は、また、前記骨細胞培地交換及び継代培養キット２３には、溶液除去のために使
用するパスツールピペット、細胞を水洗するために遠心分離するのに使用するチューブ、
溶液移動時に使用するピペット、大きい嵩の溶液移動時に使用するピペット、少ない嵩の
溶液を取るのに使用するイエローチップ(yellow tip)、 トリパンブルー（trypan blue）
と細胞が入った培地の混合時に使用するＥチューブ（E-tube）、細胞培養道具であるＴ７
５及び細胞を冷凍保存時に使用する道具であるクリオチューブ(cryo tube)が具備される
。
【００４１】
そして、本発明の前記骨細胞治療剤の製造キット２４には、溶液除去のために使用するパ
スツールピペット、細胞を冷凍させるのに使用するクリオチューブ(cryo tube)、 トリパ
ンブルー（trypan blue）と細胞計数のための細胞が入った培地を混合時に使用するＥチ
ューブ（E-tube）、細胞を水洗するために遠心分離するのに使用するチューブ、溶液移動
時に使用するピペット、遠心分離チューブの上に載せて、細胞と培養液を混合した懸濁液
を注いで溶液から細胞を分離する細胞ろ過器(cell  strainer)、溶液を取るのに使用する
フィルター ブルーチップ(blue tip)、バイアルにキャップをするゴム栓であるラバーキ
ャップ(rubber cap)とアルミニウム栓であるアルミニウムキャップ(aluminum cap)、骨細
胞治療剤の製造のために細胞を盛るのに使用する１mLのＶバイアル（ V-vial）、冷蔵状
態で骨細胞治療剤を運ぶための内部ボックスであるスタイロフォームボックス(Styrofoam
box)、スタイロフォームボックスに骨細胞治療剤バイアルを入れるために使用するスポ
ンジ及び冷蔵状態を維持するための冷却剤であるクールイット(Koolit)が具備される。
【００４２】
さらに、本発明の前記骨再生キット２０には、骨細胞の分離/培養/製造/凍結保存に使わ
れる培地キット２５及び骨細胞の分離/培養/凍結保存に使われる培地キット２６が具備さ
れる。
【００４３】
前記のように構成された本発明は、骨再生キット２０を利用して骨髄採取工程；骨細胞分
離工程；骨細胞培地交換及び継代培養工程；骨細胞治療剤の製造工程；によって骨を再生
するものであり、これの実施例をより詳しく説明する。
【実施例２】
【００４４】
前記骨髄採取工程には、
１．骨RMキット(bone RM kit)内に含まれているＢＲＭ輸送キット(transport kit)の外部
紙ボックス包装を封切りする工程；
２．封切られた外部包装は手術室の外に残して、手術室の内部には内部包装のスタイロフ
ォームボックスのみを運ぶ工程；及び
３．スタイロフォームボックス内部にある赤色の培地が入っている骨髄組織運搬容器に骨
髄を盛って、再びスタイロフォームボックスと外部紙ボックス包装で二重包装して細胞培
養室に移す工程；でなされる。
【００４５】
また、前記骨細胞分離工程のＢＲＭ開始キット(initiation kit)には、
１．BRM分離キット(isolation kｉｔ)を引き出して７０％アルコールを充分に噴霧した後
、無菌作業台に移す工程；
２．無菌作業台内でＢＲＭ輸送キット(transport kit)に運ばれて来た骨髄組織の重さを
５０mLチューブを利用して測定する工程；
３．骨髄を５０mLチューブに移した後ＢＳＢ-Iを２５mLピペットを利用して分株した後、
骨髄を水洗する工程；
４．パスツールピペットで骨髄組織を水洗した溶液を除去した後、前記"３"の手順を繰り
返す工程；
５．水洗された骨髄組織に２５mLピペットでＢＤＢ溶液を入れる工程；
６．一定時間が経った後、１０mLピペットでＢＭＢ溶液を一定量取って中和する工程；
７．中和後、中和した骨髄組織をＢＳＭ溶液でもう一度水洗する工程；及び
８．Ｔ７５フラスコに水洗された有核細胞を移して３７℃、ＣＯ2恒温器に置く工程；
並びに前記骨細胞分離工程のＢＲＭ一次キット(primary kit)には、
１．骨RMキット(bone RM kit)内のビニール包装されたＢＲＭ一次キット(primary kit)を
引き出して７０％アルコールを充分に噴霧した後、無菌作業台に移す工程；
２．３７℃、ＣＯ2恒温器に置いたＴ７５フラスコの浮遊細胞層を１０mLピペットを利用
して５０mLチューブに移す工程；及び
３．５０mLチューブを遠心分離した後、２５mLピペットでＢＳＭ溶液を混合してＴ７５フ
ラスコに接種する工程；でなされる。
【００４６】
また、本発明の前記骨細胞培地交換及び継代培養工程のＢＲＭ-Ｐ１ 培地交換キット(med
ium change kit)には、
１．骨RMキット(bone RM kit)のビニール包装されたＢＲＭ-Ｐ１ 培地交換キット(medium
change kit)を引き出して７０％アルコールを充分に噴霧した後、無菌作業台に移す工程
；
２．パスツールピペットを利用してフラスコ内部の培養培地を除去する工程；
３．２５mLピペットを使って５０mLチューブにＢＳＭを分株する工程；及び
４．分株されたチューブからの一定量をフラスコに再び分株する工程；
並びに前記骨細胞培地交換及び継代培養工程のＢＲＭ-Ｐ１ 継代培養キット(subculture 
kit)には、
１．骨RMキット(bone RM kit)のビニール包装されたＢＲＭ-Ｐ１ 継代培養キット(subcul
ture kit)を引き出して７０％アルコールを充分に噴霧した後、無菌作業台に移す工程；
２．Ｔ２５フラスコの培養培地を５０mLチューブに集めた後、混合する工程；
３．このうちの一部を５０mLチューブとＥチューブ（E-tube）にサンプリングする工程；
４．パスツールピペットで残っている培養培地を除去する工程；
５．ＢＳＭ-IIをフラスコに分株して振って水洗した後、パスツールピペットで上層液を
除去する工程；
６．前記"５"を３回繰り返す工程；
７．パスソリューション(pass solution)を１０mLピペットで、フラスコに分株した後、
略３分間恒温器に置く工程；
８．ニュートロソリューション(neutro solution)を１０mLピペットに分株する工程；
９．１５mLチューブに細胞を採取する工程；
１０．ＢＳＭでフラスコを水洗する工程；
１１．ＢＣＢにイエローチップ(yellow tip)を使って細胞を一定量分株後、生きている細
胞数を測定する工程；
１２．生きている細胞数を測定した後、Ｔ７５フラスコに接種する工程；及び
１３．クリオチューブ(cryo tube)に余分の細胞とセルストックソリューション(cell sto
ck solution)を混合して凍結保存する工程；
並びに前記骨細胞培地交換及び継代培養工程のＢＲＭ-Ｐ２ 培地交換キット(medium chan
ge kit)には、
１．骨RMキット(bone RM kit)内のビニール包装されたＢＲＭ-Ｐ２ 培地交換キット(medi
um change kit)を引き出して７０％アルコールを充分に噴霧した後、無菌作業台に移す工
程；
２．パスツールピペットで、培養培地をフラスコから除去する工程；
３．２５mLピペットを使って５０mLチューブにＢＰＭを分株する工程；及び
４．分株されたチューブからの一定量をフラスコに再び分株する工程；
並びに前記骨細胞培地交換及び継代培養工程のＢＲＭ-Ｐ２ 継代培養キット(subculture 
kit)には、
１．骨RMキット(bone RM kit)のビニール包装されたＢＲＭ-Ｐ２ 継代培養キット(subcul
ture kit)を引き出して７０％アルコールを充分に噴霧した後、無菌作業台に移す工程；
２．Ｔ７５フラスコの培養培地を５０mLチューブに集めた後、混合する工程；
３．このうちの一部を５０mLチューブとＥチューブ（E-tube）にサンプリングする工程；
４．パスツールピペットを利用して残っている培養培地を除去する工程；
５．ＢＳＢ-IIをフラスコに分株して振って水洗した後、パスツールピペットで上層液を
除去する工程；
６．前記"５"を３回繰り返す工程；
７．パスソリューション(pass solution)を１０mLピペットでフラスコに分株した後、略
３〜５分間恒温器に置く工程；
８．ニュートロソリューション(neutro solution)を１０mLピペットに分株する工程；
９．１５mLチューブに細胞を採取する工程；
１０．ＢＳＭでフラスコを軽く振って水洗する工程；
１１．ＢＣＢにイエローチップ(yellow tip)を使って細胞を一定量分株した後、細胞数を
測定する工程；
１２．細胞数を測定した後、Ｔ１５０フラスコに接種する工程；及び
１３．クリオチューブ(cryo tube)に余分の細胞とセルストックソリューション(cell sto
ck solution)を混合して凍結保存する工程；
並びに前記骨細胞培地交換及び継代培養工程のＢＲＭ-Ｐ３ 培地交換キット(medium chan
ge kit)には、
１．骨RMキット(bone RM kit)のビニール包装されたＢＲＭ-Ｐ２ 培地交換キット(medium
change kit)を引き出して７０％アルコールを充分に噴霧した後、無菌作業台に移す工程
；
２．パスツールピペットで、培養培地をフラスコから除去する工程；
３．２５mLピペットを使って５０mLチューブにＢＰＭを分株する工程；及び
４．分株されたチューブからの一定量をフラスコに再び分株する工程；でなされる。
【００４７】
そして、本発明の前記骨細胞治療剤の製造工程のＢＲＭ採取キット(collection kit)には
、
１．骨RMキット(bone RM kit)のビニール包装されたＢＲＭ採取キット(collection kit)
を引き出して７０％アルコールを充分に噴霧した後、無菌作業台に移す工程；
２．完製品出庫３日前、５０mLチューブに培養培地の一部を２５mLピペットにサンプリン
グする工程；
３．製品出庫当日、Ｔ１５０フラスコ内の培養培地を５０mLチューブに集めた後、混合す
る工程；
４．このうちの一部を５０mLチューブとＥチューブ（E-tube）にサンプリングする工程；
５．パスツールピペットを利用してフラスコ内部に残っている培養培地を除去する工程；
６．ＢＳＢ-IIを２５mLピペットでフラスコに分株した後、水洗する工程；
７．前記"６"を３回繰り返す工程；
８．パスソリューション(pass solution)を１０mLピペットでフラスコに分株した後、略
４〜５分間恒温器に置く工程；
９．ニュートロソリューション(neutro solution)を１０mLピペットに分株する工程；
１０．細胞ろ過器(cell strainer)を５０mLチューブ２個の上にそれぞれ載せておく工程
；
１１．パスソリューション(Pass solution)を処理したフラスコ内の浮遊液を２５mLピペ
ットを使って細胞ろ過器(cell strainer)が載せられているチューブに分株する工程；
１２．ＢＣＢにイエローチップ(yellow tip)で細胞を分株した後、細胞数を合計３回測定
する工程；
１３．１mL バイアル(vial)にＢＣＭを分株した後、フィルターブルーチップ(blue tip)
を利用して細胞と混合する工程；及び
１４．ラバーキャップ(rubber cap)、アルミニウムキャップ(aluminum cap)を１mL バイ
アル(vial)にキャップする工程；
並びに前記骨細胞治療剤の製造工程のＢＲＭ送達キット(delivery kit)＆ＢＲＭ培地包装
キット(medium packaging kit)には、
１．骨RMキット(bone RM kit)内に含まれているＢＲＭ送達キット(delivery kit)とＢＲ
Ｍ培地包装キット(medium packaging kit)の外部紙ボックス包装を封切りする工程；
２．封切られた外部包装は手術室の外に残して、手術室の内部には内部包装のスタイロフ
ォームボックスのみを運ぶ工程；及び
３．手術室に運ばれたボックス内部で１、４番と明記されているバイアルを取り出してＢ
ＲＭ移植キット(implantation kit)と混合して使用できるように準備する工程；
並びに前記骨細胞治療剤の製造工程のＢＲＭ移植キット(implantation kit)には、
１．ＢＲＭ移植キット(implantation kit)内部にあるミキシングチップ(mixing tip)を利
用してデバイス２セット（device ２set）にある骨細胞治療剤と混合して使用する基質に
培地を混合する工程；及び
２．混合した基質と培地組成物がよく溶解されたことを確認した後、注射針を注射器に装
着して、患者の骨欠損部位に注入する工程；でなされる。
【００４８】
一方、本発明は、図３に示すように構成することができる。
すなわち、無菌及び滅菌処理されたキットとして、細胞を分離、培養、採取及び保存して
体内に移植できるように全過程を段階別に分けて、その段階に対するセット化されたキッ
ト別にプロセッシングがなされるように臍帯血保存キット３０を具備し、この臍帯血保存
キットには、へその緒血液採取キット３１、造血母細胞分離キット３２及び造血母細胞凍
結保存キット３３が具備される。
【００４９】
この時、前記へその緒血液採取キット３１には、多くの量の血液を集める時に使用する採
血バッグ(blood collection bag)、採血バッグを運ぶ時に使用するファイルケース(file 
case)、運送前まで採血バッグを保存するのに使用するジッパーバッグ(zipper bag)及び
ファイルケース表面に付着するステッカーが具備される。
【００５０】
また、前記造血母細胞分離キット３２には、赤血球除去後に造血母細胞を濃縮させるのに
使用するプロセッシングバッグ(processing bag)、品質管理目的でサンプル抽出時に使用
するシリンジ(syringe)、遠心分離チューブの上に載せて、細胞と培養液を混合した懸濁
液を注いで溶液から細胞を分離する細胞ろ過器(cell strainer)、細胞を水洗するために
遠心分離するのに使用するチューブ、無菌作業を遂行するために使用するラテックスグロ
ーブ(latex glove)、造血母細胞を保存するために細胞をバイアルに盛るＣＣＺ バイアル
(vial)、バイアルにキャップをするアルミニウム栓であるアルミニウムシール(aluminum 
seal)、溶液を取るのに使用するブルーチップ(blue tip)及びトリパンブルー（trypan bl
ue）と細胞が入った培地の混合時に使用するＥチューブ（E-tube）が具備される。
【００５１】
また、本発明に適用された前記造血母細胞凍結保存キット３３には、造血母細胞を冷凍さ
せるのに使用する道具であるフリージングバッグ(freezing bag)、フリージングバッグ(f
reezing bag)を保護するために使用する包装式冷却剤（クリオラップ；Cryowrap)及びフ
リージングバッグ(freezing bag)と包装式冷却剤（クリオラップ；Cryowrap)を保存する
キャニスターが具備される。
【００５２】
そして、前記本発明に適用された前記臍帯血保存キット３０には、造血母細胞の分離及び
凍結保存に使われる培地キット３４並びに造血母細胞の分離及び凍結保存に使われる培地
キット３５が具備される。
【００５３】
前記のように構成された本発明は、臍帯血保存キット３０を利用してへその緒血液採取工
程；造血母細胞分離工程；造血母細胞凍結保存工程；によって臍帯血を保存する。これの
実施例をより詳しく説明する。
【実施例３】
【００５４】
前記へその緒血液採取工程は、
１．USC RMキット(USC RM kit)内に含まれているＵＳＣ ＲＭ輸送キット(transport kit)
のファイルケース(File case)を手術室に運ぶ工程；
２．運ばれたファイルケース(file case)のジッパーバッグ(zipper bag)を開いて、滅菌
処理された採血バッグ(blood collection bag)を利用してへその緒血液を採取する工程；
及び
３．採取された血液は再びＵＳＣ ＲＭ輸送キット(transport kit)のファイルケース(fil
e case)に盛って工程室に移す工程；でなされる。
【００５５】
また、前記造血母細胞分離工程は、
１．採血バッグで１０mL注射器を利用して一定量の血液を採取してEPPチューブ(EPP tube
)に分株する工程；
２．３０mL注射器を利用して一定量のＵＥＳ溶液を添加して撹拌した後、放置する工程；
３．一定時間放置後、半自動血漿分離器で１次血漿層をプロセッシングバッグ(processin
g bag)に分離する工程；
４．前記"２"、"３"の過程を反復する工程；
５．プロセッシングバッグ(processing bag)をバケツに固定した後、重さを測定して遠心
分離する工程；
６．遠心分離後、バケツでプロセッシングバッグ(processing bag)を分離する工程；
７．プロセッシングバッグ(processing bag)を自動血漿分離器に固定させる工程；
８．自動血漿分離器を利用して血漿を１５mLチューブに分株する工程；
９．自動血漿分離器を利用して残りの血漿を５０mLチューブに盛る工程；及び
１０．１０mL注射器を利用して５０mLチューブに盛られた血漿を採取してバキュテナー（
vacutainer）に分株する工程；でなされる。
【００５６】
さらに、前記造血母細胞凍結保存工程は、
１．プロセッシングバッグ(processing bag)を懸濁させた後、懸濁させたプロセッシング
バッグ(processing bag)で、１０mL注射器で内容物を採取してＥＰＰチューブに分株する
工程；
２．１０mL注射器でセルストックソリューション(cell stock solution)を、氷水に浸し
て懸濁させたプロセッシングバッグ(processing bag)に添加した後よく混合されるように
する工程；
３．プロセッシングバッグ(processing bag)の表面を７０％アルコールで消毒する工程；
４．フリージングバッグ(freezing bag)をプロセッシングバッグ(processing bag)に連結
して有核細胞濃縮層を移して気泡を除去する工程；
５．フリージングバッグ(freezing bag)を二重包装バッグに入れて圧縮包装をした後、消
毒する工程；及び
６．二重包装バッグに包装されたフリージングバッグ(freezing bag)をキャニスターに挿
入する工程；でなされる。
本発明は、前記の構成部を適用するにおいて多様に変形されることができるし、さまざま
な形態を取ることができる。
そして、本発明は、前記の詳細な説明で言及される特別な形態で限定されるものではない
ものとして理解されなければならないし、むしろ添付された請求範囲によって定義される
本発明の精神と範囲内にあるすべての変形物と均等物及び代替物を含むものとして理解さ
れなければならない。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
前記で詳しく説明したように、本発明は、軟骨及び骨の再生並びに臍帯血保存を目的とす
る細胞治療剤の製造及び移植並びに臍帯血処理に係わるキットの使用方法に関するもので
あり、特に細胞を分離、培養、採取、移植及び保存する各プロセッシングに必要な種々の
物質と各種培養培地及び溶液を易しくて簡便に一つのキットで製作して供給することを可
能にすることにより既存の細胞治療剤の製造及び臍帯血保存において発生する多額の生産
費用、長い生産時間及び高い人件費の節減効果をもたらすようにしたものである。
【００５８】
また、採取された軟骨、骨髄組織及びへその緒血液から安全に細胞を分離、培養、採取及
び保存して所望の細胞を体内のターゲットサイトに移植できる無菌及び滅菌処理されたキ
ットを提供することである。この目的のために、全過程を段階別に分けて、その段階に対
する機能化された特殊のキットセットに従ってプロセッシングがなされるようにメディカ
ルキットを単一のキットセットの形態にしたものである。
【００５９】
そして、軟骨及び骨の再生を目的とする細胞治療剤の製造によるすべてのプロセッシング
を段階別に標準化して、標準化された過程に好適であるようにキットを製作することで一
度に手軽く、簡便に使用できるようにすることで細胞治療剤の製造をより活性化して、延
いては組織工学を利用した新しい治療法を常用化しようとすることにその目的と効用があ
る。
【００６０】
さらに、臍帯血保存において、軟骨及び骨の再生用の上記のキットと同様な形態を持つ標
準化されたプロトコルを作って、各プロセッシング別にキットを製作して簡便に一度に使
用するようにして、既存の保存処理方法に比べて費用、時間及び人力の節減効果を達成す
ることにその目的と効用がある。
【００６１】
したがって、本発明は、前記した効果により製品の品質と信頼性を大幅に向上させて消費
者にとって良いイメージを植付けてくれることができるようにした非常に有用な発明であ
る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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