(57)【要約】  本発明は、標的ＲＮＡ活性の調節のためのオリゴヌクレオチドに関する。すなわち本発明は、標的ＲＮＡのマイクロＲＮＡ結合部位に結合するオリゴヌクレオチドを提供する。オリゴヌクレオチドは、ＲＮａｓｅＨ又はＲＮＡｉを活性化してもよい。好適な実施態様において、オリゴヌクレオチドは、マイクロＲＮＡが標的ＲＮＡの結合部位に結合することを阻止し、こうしてマイクロＲＮＡが標的ＲＮＡを制御することを阻止する。このようなオリゴヌクレオチドは、新しい治療薬の研究と開発における有用性を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜５６のいずれかの、又は１、２若しくは３個の置換を含む配列番号１〜５６のいずれかの、少なくとも８個の連続的塩基に相補的な連続的配列を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
塩基対合が、少なくとも７個の塩基、少なくとも８個の塩基、少なくとも９個の塩基、少なくとも１０個の塩基、少なくとも１１個の塩基、少なくとも１２個の塩基、少なくとも１３個の塩基、少なくとも１４個の塩基、少なくとも１５個の塩基、少なくとも１６個の塩基、少なくとも１７個の塩基、少なくとも１８個の塩基、少なくとも１９個の塩基、少なくとも２０個の塩基、少なくとも２２個の塩基、少なくとも２５個の塩、基少なくとも３０個の塩基、及び少なくとも３５個の塩基よりなる群から選択される長さにわたって連続的である、請求項１のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
塩基対合が、配列番号１〜５６のいずれかの２２〜２７位を含む、請求項１又は２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
塩基対合が２８位で終止する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
塩基対合が７位で開始する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
塩基対合が、８〜２８、８〜２７、９〜２７、１０〜２７、１１〜２７、１２〜２７、１３〜２７、１４〜２７、１５〜２７、１６〜２７、１７〜２７、１８〜２７、１９〜２７、２０〜２７、２１〜２７、９〜２８、１０〜２８、１１〜２８、１２〜２８、１３〜２８、１４〜２８、１５〜２８、１６〜２８、１７〜２８、１８〜２８、１９〜２８、２０〜２８、及び２１〜２８位を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
配列番号１〜５６のいずれかと、又は１若しくは２個の置換を含む配列番号１〜５６のいずれかと塩基対合することができる、請求項１〜６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
配列番号１〜５６のいずれかと、又は１個の置換を含む配列番号１〜５６のいずれかと塩基対合することができる、請求項１〜７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
配列番号１〜５６のいずれかと、又は２２〜２７位のいずれかに１個の置換を含む配列番号１〜５６のいずれかと塩基対合することができる、請求項１〜８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
配列番号１〜５６のいずれかと塩基対合することができる、請求項１〜９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
オリゴヌクレオチドがＲＮａｓｅＨを活性化することができる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
オリゴヌクレオチドがＲＮＡｉ機構を動員することができる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
オリゴヌクレオチドが、ＲＮａｓｅＨを活性化することができず、かつＲＮＡｉ機構を誘導及び動員することができない、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
オリゴヌクレオチドが、特定の標的ＲＮＡでＲＮＡｉ機構の活性をブロックすることができる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
オリゴヌクレオチドが、特定の標的ＲＮＡでマイクロＲＮＡの制御活性をブロックすることができる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
オリゴヌクレオチドが、標的ＲＮＡの正の調節因子である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
オリゴヌクレオチドが、標的ＲＮＡの負の調節因子である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
オリゴヌクレオチドが、相補配列に対する親和性を上昇させるヌクレオチドモノマーを含むか、又は親和性を上昇させる修飾を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
オリゴヌクレオチドが、ホスホロチオエート結合のようなその生体安定性及び／又は生物学的利用能を上昇させる修飾を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
オリゴヌクレオチドが、ＩＮＡ単位、ＰＮＡ単位、ＬＮＡ単位、２’位で置換された単位、又は特異的塩基対合が可能な任意の他のヌクレオチド単位を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
オリゴヌクレオチドが、２’位で置換されたヌクレオチド単位、及び／又は骨格修飾を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２２】
１つ又はそれ以上のＬＮＡ単位の、及び２’位で置換された１つ又はそれ以上の単位の、繰り返しパターンを含むオリゴヌクレオチド。
【請求項２３】
オリゴヌクレオチドがＲＮＡ単位を含まない、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２４】
オリゴヌクレオチドがＤＮＡ単位を含まない、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２５】
オリゴヌクレオチドが、モルホリノ単位及び／又はＬＮＡ単位を含まない、請求項１〜２４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２６】
オリゴヌクレオチドがユニバーサル塩基を含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２７】
オリゴヌクレオチドが、相補的オリゴヌクレオチドに塩基対合していないか、又は相補的オリゴヌクレオチドに対合した塩基とともに使用することを目的としない、請求項１〜２６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２８】
オリゴヌクレオチドが、相補的オリゴヌクレオチドに塩基対合している、請求項１〜２７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２９】
ａ．標的ＲＮＡを含む系を提供する工程、
ｂ．標的ＲＮＡの請求項１〜２８のいずれかのオリゴヌクレオチドを系に導入する工程、
ｃ．こうして標的ＲＮＡの活性を調節する工程、
を含んでなる、標的ＲＮＡの活性を調節する方法。
【請求項３０】
オリゴヌクレオチドが、標的ＲＮＡでマイクロＲＮＡの活性を阻止し、こうして標的ＲＮＡの活性を制御する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
オリゴヌクレオチドが標的ＲＮＡのＲＮａｓｅＨ切断を誘導し、こうして標的ＲＮＡの活性を制御する、請求項２９〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記系が細胞抽出物又は細胞である、請求項２９〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記方法が、インビボ、エクスビボ、又はインビトロで行われる、請求項２９〜３２のいずれかの一項に記載の方法。
【請求項３４】
治療的有効量の請求項１〜２８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物。
【請求項３５】
治療的有効量の請求項１〜２８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、又は請求項３４に記載の医薬組成物を、それを必要とするヒトに投与することを含む治療法。
【請求項３６】
医薬として使用するための、請求項１〜２８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３７】
癌、ウイルス感染、免疫疾患、又は心血管疾患の治療用の薬剤を製造するための、請求項１〜２８のいずれかの一項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的ＲＮＡの活性に影響を与えるのに使用できるオリゴヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
このようなオリゴヌクレオチドの第１世代は、標的ｍＲＮＡの活性に影響を与えることを目的としたアンチセンスオリゴヌクレオチドである。このようなオリゴヌクレオチドへの関心の１つの理由は、特異的塩基対合により実現される適切で予測可能な特異性の可能性である。すなわち理論的には、ある核酸（例えばｍＲＮＡ）に非常に特異性の高いオリゴヌクレオチドを設計することが非常に簡単である。
【０００３】
しかし、単純な塩基対合は、特定の標的ｍＲＮＡの制御を行うのに充分ではなく、すなわち、特定の標的ｍＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドが、標的ｍＲＮＡの活性に必ずしも影響を与えないことが明らかになってきた。オリゴヌクレオチドがｍＲＮＡの読みとり枠を標的とする場合、これは例えば、翻訳機構が単に翻訳中にオリゴヌクレオチドを追い出しているのかも知れない。したがってオリゴヌクレオチドの制御活性を改善する手段が開発された。
【０００４】
例えば標的ｍＲＮＡのＲＮａｓｅＨ切断を活性化できるオリゴヌクレオチドが開発された。このようなオリゴヌクレオチドの１つの可能性のある欠点は、これらが、目的の標的ｍＲＮＡではなく他のＲＮＡの切断を仲介するかも知れないこと、すなわちオフターゲット作用を引き起こすかも知れないことである。しかし、ＲＮａｓｅＨ切断を介して作用するそのようなオリゴヌクレオチドは、種々の疾患の治療のために臨床治験中である。
【０００５】
最近、哺乳動物細胞を含む真核細胞が、ＲＮＡを特異性決定物として使用する複雑な遺伝子制御系（ここではＲＮＡｉ機構とも呼ぶ）を含むことが、研究により証明された。この系は、いわゆるｓｉＲＮＡが目的の細胞中に導入されて、標的ｍＲＮＡの活性を制御することにより開始することができる。現在、標的ＲＮＡ特に標的ｍＲＮＡの特異的制御のために、ｓｉＲＮＡを用いてＲＮＡｉ機構を開始させるために多大の努力がなされている。このアプローチは、新しい治療薬の開発のために極めて有望であると広く見なされている。後に概説するように、このアプローチの大きな利点は、ｓｉＲＮＡの特異性がｓｉＲＮＡのガイド鎖と標的ＲＮＡとの相補性の程度にあること、すなわち標的特異性を制御できることである。しかし、ｓｉＲＮＡは当初考えられたほど特異的ではないかも知れないことがわかってきた。最初は、ｓｉＲＮＡのガイド鎖に完全な相補性の区間を有する標的ＲＮＡのみが影響を受けるであろうこと、すなわちＲＮＡｉ機構の標的とされると考えられた。新しい研究は、ｓｉＲＮＡが実際は大きなオフターゲット作用を引き起こすこと、すなわち目的としない標的の制御を引き起こすことを示す。現在は、これらのオフターゲットが、ｓｉＲＮＡのガイド鎖ではなくｓｉＲＮＡに由来して、マイクロＲＮＡとして作用していると考えられている。
【０００６】
マイクロＲＮＡは、最近発見され、ｓｉＲＮＡとしてＲＮＡｉ機構を介して機能する内因性ＲＮＡ分子の一群である。現在約５００個のヒトマイクロＲＮＡが発見されており、その数は急速に増加している。現在ヒトの遺伝子の３分の１以上がマイクロＲＮＡにより制御されると考えられている。したがって、マイクロＲＮＡ自体が標的ＲＮＡの活性を制御するのに使用でき、したがって例えば治療薬として使用できるかも知れない。
【０００７】
しかし、マイクロＲＮＡは、一般に、２つ以上の標的ＲＮＡに対して作用し、すなわち無差別的である。したがって細胞へのマイクロＲＮＡの導入又はマイクロＲＮＡレベルの制御は、２つ以上の標的ｍＲＮＡの活性に作用し、しばしば好ましくないオフターゲット作用を引き起こすであろう。
【０００８】
マイクロＲＮＡの活性を阻害することにより標的ＲＮＡの活性が制御されるという最近の研究が発表されている。マイクロＲＮＡは、アンチマー（ａｎｔｉｍｅｒ）及びアンタゴマー（ａｎｔａｇｏｍｅｒ）と呼ばれる相補的オリゴヌクレオチドを使用して阻害することができる。マイクロＲＮＡ自体は無差別的であるため、アンチマー又はアンタゴマーも無差別的であり、２つ以上の標的ＲＮＡの活性に影響を与える。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、標的ＲＮＡの活性を調節するためのオリゴヌクレオチドに関する。本発明のオリゴヌクレオチドは、ＲＮａｓｅＨ、ＲＮＡｉを活性化するか、又はＲＮＡｉを阻止する。好適な実施態様において本発明のオリゴヌクレオチドは、マイクロＲＮＡが標的ＲＮＡを制御することを阻止することができる。
【００１０】
すなわち本発明の第１の態様は、配列番号１〜５６のいずれかの、又は１、２若しくは３個の置換を含む配列番号１〜５６のいずれかの、少なくとも８個の連続的塩基に相補的な連続的配列を含むオリゴヌクレオチドである。
【００１１】
本発明の他の態様は、標的ＲＮＡの活性を調節する方法、本発明のオリゴヌクレオチドの有効量を含む医薬組成物、医薬として使用される本発明のオリゴヌクレオチド、及び必要なヒトに本発明のオリゴヌクレオチドの治療的有効量を投与することを含む治療法に関する。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
発明の詳細な説明
定義
以前の出願（ＰＡ２００７００８６０）（マイクロＲＮＡ標的からのエクスマー）では、発明のオリゴヌクレオチドについて言及するとき、エクスマー（Ｘｍｉｒ）という用語が使用された。本出願では、用語エクスマーより、本発明のオリゴヌクレオチド又はブロックマー（ｂｌｏｃｋｍｉｒ）という用語が優先的に使用される。すなわち用語エクスマー又はブロックマーが使用されるときは、本発明のオリゴヌクレオチドが言及されている。ブロックマーは本発明のオリゴヌクレオチドの特に好適な実施態様であり、ここでオリゴヌクレオチドは、特異的標的ＲＮＡのマイクロＲＮＡ制御を阻止するのに使用することができる。
【００１３】
用語「制御する（ｒｅｇｕｌａｔｅ）」と「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」は、本明細書において同義に使用される。
【００１４】
「標的ｍＲＮＡの活性」に言及するとき、これは典型的には標的ｍＲＮＡの発現、すなわちタンパク質又はペプチドへの翻訳を意味する。したがって、標的ｍＲＮＡの活性の制御は、ｍＲＮＡの分解及び／又は翻訳制御を含む。制御はまた、ｍＲＮＡの細胞内輸送に影響を与えることを含む。本発明の好適な実施態様においてオリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡの発現を制御することができる。別の好適な実施態様においてオリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡの分解を仲介する。この活性はまた複製でもよい。
【００１５】
標的ＲＮＡがウイルスＲＮＡであるとき、本発明のオリゴヌクレオチドは、ウイルスの複製に影響を与えるか、又はウイルスの増殖を妨害する。
【００１６】
本明細書において制御は、正の制御又は負の制御でもよい。すなわち、調節因子（ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）（例えば，オリゴヌクレオチド又はマイクロＲＮＡ）は、標的（例えば標的ｍＲＮＡ）の活性を上昇させるか、又は標的の活性を低下させる。
【００１７】
「ＲＮＡの標的配列」に言及するとき、これは、マイクロＲＮＡ制御に関与するか又は必要なＲＮＡの領域を意味する。標的領域及び標的配列という用語は、本明細書において同義に使用される。理論に拘束されるつもりはないが、この領域は、標的ＲＮＡのマイクロＲＮＡ制御中に、マイクロＲＮＡと直接相互作用する塩基を含む。好適な実施態様において標的配列は、マイクロＲＮＡ制御に必要な標的ＲＮＡの領域である。このような領域は、レポーター系を使用して定義され、ここで、標的配列を規定する活性について標的ＲＮＡの組織的な欠失が試験される。明細書から明らかなように、本発明のオリゴヌクレオチドはまた、マイクロＲＮＡ制御に必要な標的ＲＮＡの領域を定義するのに使用される。好ましくは標的配列は、アンチシード（ａｎｔｉｓｅｅｄ）配列を含み、これはマイクロＲＮＡのシード配列に相補的であり、本発明のオリゴヌクレオチドのガイド配列に相補的でもある。
【００１８】
本明細書においてマイクロＲＮＡという用語は、典型的に当該技術分野で使用されるものと同じ意味を有する。すなわち、マイクロＲＮＡという用語は、標的ｍＲＮＡの活性を制御することができる典型的には１８〜２２個のヌクレオチドの小さい非翻訳ＲＮＡを示す。マイクロＲＮＡは典型的には、プリマイクロＲＮＡから処理されて、プレマイクロＲＮＡと呼ばれる小ステム−ループ構造になり、最後に成熟ｍｉＲＮＡになる。プレマイクロＲＮＡのステムの両方の鎖は、処理されて成熟マイクロＲＮＡになる。
【００１９】
ｍｉＲＢａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ／）は、既知のマイクロＲＮＡを集めたものである。またこのサイトには、マイクロＲＮＡの予測される及び既知の標的が存在する。
【００２０】
本明細書においてｓｉＲＮＡ（小干渉ＲＮＡ）という用語は、典型的に当該技術分野で使用されるものと同じ意味を有し、すなわちｓｉＲＮＡという用語は、その鎖が典型的には１８〜２２ヌクレオチドの長さである２本鎖ＲＮＡ複合体を示す。しばしばこの複合体は３’オーバーハングを有する。
【００２１】
本明細書においてＲＮＡｉ機構について言及するとき、これは、ｓｉＲＮＡ及びマイクロＲＮＡの活性に必要な、又はＲＮＡｉ経路に必要な細胞成分を意味する。ＲＮＡｉ機構の主要なプレーヤーは、ＲＮＡ誘導性サイレンス化複合体（ＲＩＳＣ複合体）である。
【００２２】
本明細書においてＲＮＡユニットは、ＲＮＡポリマーを構成するモノマーの１つである。すなわち、ＲＮＡ単位はまた、ＲＮＡモノマー又はＲＮＡヌクレオチドと呼ばれる。同様にＤＮＡ単位は、ＤＮＡポリマーを構成するモノマーの１つであり、ＤＮＡユニットはまた、ＤＮＡモノマー又はＤＮＡヌクレオチドと呼ばれる。
【００２３】
塩基について言及するとき、これはヌクレオチドの塩基である。塩基は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＩＮＡ、ＬＮＡ、又は任意の他の核酸若しくは特異的塩基対合が可能な核酸の一部である。塩基はまた、ＰＮＡ（ペプチド核酸）又はモルホリノの一部でもよい。ある実施態様において塩基はユニバーサル塩基でもよい。
【００２４】
配列の長さについて言及するとき、ユニットの数又は塩基の数が言及される。
相補配列について言及するとき、ＧはＣと対合し、ＡはＴ及びＵと対合し、逆も真である。好適な実施態様において、ＧはまたＵと対合し、逆もあり、いわゆるゆらぎ塩基対（ｗｏｂｂｌｅ  ｂａｓｅ  ｐａｉｒ）を形成する。別の好適な実施態様において、塩基イノシン（Ｉ）は、本発明のマイクロＲＮＡ又はオリゴヌクレオチドに含まれる。ＩはＡ、Ｃ、及びＵと塩基対合する。さらに別の好適な実施態様において、ユニバーサル塩基が使用される。ユニバーサル塩基は、典型的にはＧ、Ｃ、Ａ、Ｕ、及びＴと塩基対合する。ユニバーサル塩基はしばしば、別の鎖上の相対する塩基と水素結合を形成しない。さらに別の好適な実施態様において、相補配列は、ワトソン−クリック塩基対の連続的配列のみを意味する。
【００２５】
本明細書において用語「と塩基対合することができる」は、「に相補的である」と同義に使用される。すなわちある実施態様において、オリゴヌクレオチドは１つ又はそれ以上のイノシン塩基を含む。
【００２６】
第１の態様
第１の態様において本発明は、配列番号１〜５６のいずれか、又は１、２若しくは３個の置換を含む配列番号１〜５６のいずれかの、少なくとも８個の連続的塩基に相補的な連続的配列を含むオリゴヌクレオチドを提供する。本明細書において置換について言及する特異的、これは、ある特定の位置の塩基が別の塩基で置換されることを意味する。置換は、標的ＲＮＡ中の単一のヌクレオチド多型の存在のためである。ある実施態様において置換という用語はまた、欠失と付加とを包含する。さらに好ましくは置換という用語は、欠失と付加を包含しない。
【００２７】
配列番号１〜５６は、証明されたマイクロＲＮＡ標的（標的ＲＮＡとも呼ぶ）又は推定マイクロＲＮＡ標的の配列である。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜５６が実際にマイクロＲＮＡ標的を含み、マイクロＲＮＡ制御を受けるかどうかを証明するのに使用することができる。さらに本発明のオリゴヌクレオチドはまた、標的ＲＮＡの活性を調節するために、例えば基礎研究において制御ネットワークを研究するために使用される。
【００２８】
本発明のオリゴヌクレオチドはまた、例えば、特定のマイクロＲＮＡがアップレギュレートされ、標的ＲＮＡの不要なマイクロＲＮＡ制御を引き起こすときに、治療的用途を見出してもよい。別の状況は、ＳＮＰ（単一ヌクレオチド多型）の存在がマイクロＲＮＡ標的を生成させ、したがって、不要なマイクロＲＮＡ制御を引き起こす場合である。例はさらに実施例の欄で示される。
【００２９】
【表１】
2010529847.tif 000002
【００３０】
【表２】
2010529847.tif 000003
【００３１】
【表３】
2010529847.tif 000004
【００３２】
連続的相補配列
別の実施態様において本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜５６のいずれか、又は１、２若しくは３個の置換を含む配列番号１〜５６のいずれかの、少なくとも９個の連続的塩基、少なくとも１０個の連続的塩基、少なくとも１１個の連続的塩基、少なくとも１２個の連続的塩基、少なくとも１３個の連続的塩基、少なくとも１４個の連続的塩基、少なくとも１５個の連続的塩基、少なくとも１６個の連続的塩基、少なくとも１７個の連続的塩基、少なくとも１８個の連続的塩基、少なくとも１９個の連続的塩基、少なくとも２０個の連続的塩基、少なくとも２２個の連続的塩基、少なくとも２５個の連続的塩基、少なくとも３０個の連続的塩基、及び少なくとも３５個の連続的塩基よりなる群から選択される配列に、相補的な連続的配列を含む。
【００３３】
さらに別の実施態様において本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜５６のいずれか、又は１、２、若しくは３個の置換を含む配列番号１〜５６のいずれかの、８個以下の連続的塩基、９個以下の連続的塩基、１０個以下の連続的塩基、１１個以下の連続的塩基、１２個以下の連続的塩基、１３個以下の連続的塩基、１４個以下の連続的塩基、１５個以下の連続的塩基、１６個以下の連続的塩基、１７個以下の連続的塩基、１８個以下の連続的塩基、１９個以下の連続的塩基、２０個以下の連続的塩基、２２個以下の連続的塩基、２５個以下の連続的塩基、３０個以下の連続的塩基、及び３５個以下の連続的塩基よりなる群から選択される配列に、相補的な連続的配列を含む。
【００３４】
別の実施態様において本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜５６のいずれか、又は１、２、若しくは３個の置換を含む配列番号１〜５６のいずれかの、８個の連続的塩基、９個の連続的塩基、１０個の連続的塩基、１１個の連続的塩基、１２個の連続的塩基、１３個の連続的塩基、１４個の連続的塩基、１５個の連続的塩基、１６個の連続的塩基、１７個の連続的塩基、１８個の連続的塩基、１９個の連続的塩基、２０個の連続的塩基、２１個の連続的塩基、２２個の連続的塩基、２３個の連続的塩基、２４個の連続的塩基、２５個の連続的塩基、３０個の連続的塩基、及び３５個の連続的塩基よりなる群から選択される配列に、相補的な連続的配列を含む。
【００３５】
さらに好ましくは本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜５６のいずれか、又は１、２若しくは３個の置換を含む配列番号１〜５６のいずれかに相補的な、８〜２５個の塩基、１０〜２２個の塩基、及び１２〜２０個の塩基よりなる群から選択される連続的配列を含む。
【００３６】
すなわち、本発明のオリゴヌクレオチドと、配列番号１〜５６のいずれか又は１、２、若しくは３個の置換を含む配列番号１〜５６のいずれかの間で連続的塩基対を形成することができる。
【００３７】
好ましくは連続的塩基対は、配列番号１〜５６のいずれか又は１、２若しくは３個の置換を含む配列番号１〜５６のいずれかの２２〜２７位を含む。すなわち、好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜５６のいずれか又は１、２若しくは３個の置換を含む配列番号１〜５６のいずれかの２２〜２７位に相補的な連続的配列を含む。
【００３８】
２２〜２７位を含む連続的塩基対は、この領域がマイクロＲＮＡのシード領域に対応するため、重要である。ある実施態様において塩基対合は２７位で終止する。別の実施態様において塩基対合は、それぞれ２８、２９、３０、３１、３２、及び３２位で終止する。
【００３９】
別の実施態様において、塩基対合は２２位で開始する。別の実施態様において塩基対合は、それぞれ２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、及び５位で開始する。
【００４０】
さらに別の実施態様において、塩基対合は、８〜２８、８〜２７、９〜２７、１０〜２７、１１〜２７、１２〜２７、１３〜２７、１４〜２７、１５〜２７、１６〜２７、１７〜２７、１８〜２７、１９〜２７、２０〜２７、２１〜２７、９〜２８、１０〜２８、１１〜２８、１２〜２８、１３〜２８、１４〜２８、１５〜２８、１６〜２８、１７〜２８、１８〜２８、１９〜２８、２０〜２８、及び２１〜２８位を含む。
【００４１】
オリゴヌクレオチドの長さ
実施例の欄にも概説されるように、オリゴヌクレオチドは種々の基準を満たすように長さを調整することができる。標的ＲＮＡへの強い結合のために、長さを増加させてもよい。ある場合には、より短いオリゴヌクレオチドを使用することにより、細胞内への導入が改良される。さらに別の場合には、標的ＲＮＡのアンチシード配列に対するオリゴヌクレオチドの位置はそれぞれ調整でき、すなわち表１（配列番号１〜５６）の標的ＲＮＡの２２〜２７位に相補的な塩基の位置は、これらをオリゴヌクレオチドの５’末端、３’末端、又は真ん中にあるように調整される。好ましくは２２〜２７位に相補的塩基の位置は、これらが、１位、２位、３位、４位、５位、若しくは６位の位置で、１位、２位、３位、４位、５位、若しくは６位の上流の位置で、又は１位、２位、３位、４位、５位、若しくは６位の下流の位置（ここで位置は、オリゴヌクレオチドの５’末端から数える）で開始するように、オリゴヌクレオチド中に置かれる。
【００４２】
好ましくは本発明のオリゴヌクレオチドは、８〜２５塩基の長さである。さらに好ましくは本発明のオリゴヌクレオチドは、１０〜２０塩基の長さである。
【００４３】
置換
ある実施態様において配列番号１〜５６のいずれも、１又は２つの置換を含んでよい。
【００４４】
さらに別の実施態様において配列番号１〜５６のいずれも、１つのみの置換を含んでよい。
【００４５】
さらなる実施態様において、配列番号１〜５６のいずれも、いくつでも置換を含んでよい。
【００４６】
さらに別の実施態様において配列番号１〜５６のいずれの置換も、本発明のオリゴヌクレオチドと配列番号１〜５６のいずれかとの相補性の領域中に存在する。
【００４７】
置換は、種々の理由により配列番号１〜５６のいずれに存在してもよい。これらは、例えば特定の標的ＲＮＡのマイクロＲＮＡ制御を増強するか又は低下させるＳＮＰでもよい。ＳＮＰは、新しいマイクロＲＮＡ標的部位を作り出して、特定の標的ＲＮＡの異常なマイクロＲＮＡ制御を引き起こすことがある。ＲＮＡ編集（ＲＮＡ  ｅｄｉｔｉｎｇ）も置換を引き起こし得る。
【００４８】
さらに別の実施態様において、配列番号１〜５６のいずれかの２２〜２７位に１つのみの置換が存在してもよい。この実施態様において、標的配列中にさらなる置換が存在してもよい。すなわち、例えば２２〜２７位に１つの置換があり、標的ＲＮＡの別の場所（配列番号１〜５６のいずれか）に１つ又は２つ以上の置換があってもよい。
【００４９】
本発明のオリゴヌクレオチドの活性
ＲＮａｓｅＨ活性化
本発明のある実施態様においてオリゴヌクレオチドは、ＲＮａｓｅＨを活性化することができる。ＲＮａｓｅＨは、ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡ部分を切断し、ＲＮａｓｅＨ活性化についての構造的要件は当業者に公知である。この機構はしばしば、例えばいわゆるギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）を用いることにより、従来のアンチセンス制御を行うのに使用される。ギャップマーは、デオキシ糖（ギャップ）と修飾端部を有する中心領域を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。ギャップマーはしばしば、生体安定性を改善するためのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、端部（ｆｌａｎｋ）は例えば、これも生体安定性（すなわち、ヌクレオチド分解攻撃に対する耐性）を改善する２−Ｏ−修飾を含む。端部はまた、相補的核酸に塩基対合したギャップマーの融解温度を上昇させる修飾を含む。端部でのいくつかの２−Ｏ−修飾（例えば、２−Ｏ−メチル及びＬＮＡ）は、生体安定性を改善することと、相補的核酸に塩基対合したギャップマーの融解温度を上昇させることの両方ができる。
【００５０】
すなわちある好適な実施態様において本発明のオリゴヌクレオチドは、ＲＮａｓｅＨ活性化を可能にし、したがって、標的ＲＮＡの切断を可能にする、少なくとも５単位のデオキシヌクレオチドの連続的配列を含む。さらに好ましくは、６、７、又は８個の連続デオキシヌクレオチドがすべきである。
【００５１】
別の実施態様において本発明のオリゴヌクレオチドは、ＲＮａｓｅＨを活性化することができない。この実施態様ではオリゴヌクレオチドは、３塩基、４塩基、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、１０塩基、及び１１塩基よりなる群から選択される長さを超える非修飾ＤＮＡの連続的配列を含まない。さらに好ましくは、非修飾ＤＮＡの区画は３塩基を超えない。当業者は、あるオリゴヌクレオチドが実際にＲＮａｓｅＨを活性化するかどうかを、容易に試験することができるであろう。
【００５２】
ＲＮＡｉ活性化
ＲＮＡｉ機構は、ＲＮＡに支配される高度な遺伝子制御系である。すなわち、マイクロＲＮＡは、ＲＮＡｉ機構を標的ｍＲＮＡ（又は他の標的ＲＮＡ、例えばウイルス標的ＲＮＡ）に誘導して、標的ｍＲＮＡの活性に影響を与える。ＲＮＡｉ機構は、ｍＲＮＡの翻訳に直接影響を与えるか、又は標的ｍＲＮＡの安定性に影響を与える（すなわち、標的ｍＲＮＡの直接分解を仲介する）。理論に拘束されるつもりはないが、マイクロＲＮＡと標的ｍＲＮＡとの相補性の程度は、標的ｍＲＮＡが翻訳制御又は分解を受けるかどうかについての重要な要素である。
【００５３】
内因性マイクロＲＮＡは、前駆体ステム−ループからプロセシングされ、いわゆるＲＮＡ誘導性サイレンス化複合体（ＲＩＳＣ複合体）中に取り込まれる。このプロセスの詳細は、まだ充分に理解されていない。
【００５４】
ｓｉＲＮＡと呼ぶ合成２本鎖ＲＮＡ複合体を細胞中に導入することにより細胞性ｍＲＮＡの活性に影響を与えるのに、細胞性ＲＮＡｉ機構が広く使用されている。上記したようにｓｉＲＮＡは、パセンジャー鎖と相補的ガイド鎖とを含む短い２本鎖ＲＮＡ複合体である。ｓｉＲＮＡのガイド鎖はＲＩＳＣ複合体中に取り込まれ、ここで、ＲＩＳＣ複合体は、ガイド鎖に相補的な配列を有するｍＲＮＡの活性に影響を与えることができる。すなわち、ｓｉＲＮＡは、任意のｍＲＮＡを効率的かつ特異的に標的化できると考えられる新しいクラスの化合物であり、したがって、ｓｉＲＮＡは新しいクラスの治療薬と見なされる可能性がある。
【００５５】
ｓｉＲＮＡとマイクロＲＮＡの共通の特徴は、これらが細胞性ＲＮＡｉ機構を動員して標的ＲＮＡの活性に影響を与えることである。
【００５６】
ある実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｉ機構を動員し、ＲＮＡｉ機構を標的ＲＮＡに向けることができる。これは、標的ＲＮＡの切断又は標的ＲＮＡの翻訳抑制を引き起こす。この実施態様においてオリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡでもよい。すなわちオリゴヌクレオチドは、相補的オリゴヌクレオチド（典型的には２０〜２２塩基の長さを超えて、しばしば１〜３塩基の３’オーバーハングを有する）にハイブリダイズする。オリゴヌクレオチドはまた、天然に存在するマイクロＲＮＡと同一ではないが、マイクロＲＮＡとして作用する。天然のマイクロＲＮＡが典型的に多くの標的ＲＮＡを制御する場合、マイクロＲＮＡとして作用する本発明のオリゴヌクレオチドは、数個の標的ＲＮＡのみ又は１個の標的ＲＮＡのみを制御するように設計される。マイクロＲＮＡとして機能する本発明の遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、例えば配列番号１〜５６のいずれかの２２〜２８位、例えば７〜１６位又は７〜１８位にも塩基対合することができる。
【００５７】
ＲＮａｓｅＨ活性化又はＲＮＡｉ活性化用に設計された本発明のオリゴヌクレオチドは、マイクロＲＮＡ標的部位（これは、アンチセンス機構を介して相互作用するように進化してきて、したがって、平均的部位よりアクセスが容易である）を標的とするため、ＲＮａｓｅＨ活性化又はＲＮＡｉ活性化用に設計された平均的オリゴヌクレオチドより強力であろう。
【００５８】
ブロックマー（ｂｌｏｃｋｍｉｒ）
別の実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｉ機構を動員することができない。この実施態様において本発明のオリゴヌクレオチドは、特定の標的ＲＮＡでＲＮＡｉ機構の活性をブロックできることが好ましい。オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｉ機構が標的配列（これは、本発明のオリゴヌクレオチドに塩基対合しているため）を認識しないように、標的ＲＮＡの標的配列（マイクロＲＮＡ結合部位）を隔離することにより、これを行ってもよい。この活性を有する本発明のオリゴヌクレオチドはまた、特定の標的ＲＮＡでのあるマイクロＲＮＡの制御活性をブロックするため、ブロックマーとも呼ばれる。
【００５９】
すなわち、好適な実施態様においてオリゴヌクレオチドは、特定の標的ＲＮＡでのマイクロＲＮＡの制御活性をブロックすることができる。好ましくは、マイクロＲＮＡは内因性マイクロＲＮＡである。
【００６０】
マイクロＲＮＡが標的ＲＮＡの正の調節因子である場合、オリゴヌクレオチドは標的ＲＮＡの負の調節因子であろう。
【００６１】
しばしばマイクロＲＮＡは、標的ＲＮＡの負の調節因子である。すなわち、別の実施態様においてオリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡの正の調節因子であり、したがって、標的ＲＮＡの活性を増強する。これは、標的ＲＮＡの翻訳抑制及び／又は分解を仲介することにより、典型的には負の調節因子として作用する従来のアンチセンスオリゴヌクレオチド、マイクロＲＮＡ、及びｓｉＲＮＡとは反対である。
【００６２】
オフターゲット作用
多くの実施態様においてブロックマーのオフターゲット結合は、ほとんど又は全く効果がない。これは、アンチマー、ｓｉＲＮＡ及びマイクロＲＮＡが介在するＲＮＡｉ、及びＲＮａｓｅＨ介在アンチセンス制御（これらはすべて、オフターゲット作用を示す）とは異なる。ブロックマーは目的の標的（すなわちマイクロＲＮＡ標的領域）に結合したときのみ効果を有し、したがって、標的ＲＮＡのマイクロＲＮＡ制御を阻止する。
【００６３】
すなわち、好適な実施態様において、ブロックマーは、アンチマーを使用して標的ｍＲＮＡの活性を制御することと比較して、オフターゲット作用が低下している。
【００６４】
本明細書において、アンチマーは、マイクロＲＮＡと塩基対合でき、したがって、マイクロＲＮＡの活性を阻害できるオリゴヌクレオチドである。多くのマイクロＲＮＡは無差別的、すなわちこれらは２つ以上の標的を制御するため、特定のマイクロＲＮＡの制御は、２つ以上の標的ｍＲＮＡの活性に影響を与えるであろう。すなわち、ある特定の標的ｍＲＮＡの活性のみを制御することが好ましい場合、他の標的ｍＲＮＡの制御はアンチマーのオフターゲット作用を見なされる。このような作用はまた、アンチマーの目的ではない作用又は副作用と呼ばれる。
【００６５】
アンチマーの代わりにマイクロＲＮＡを使用して、標的ｍＲＮＡの活性に影響を与えるか又はこれを制御することはまた、明らかオフターゲット作用を有するであろう。
【００６６】
結論として、本発明のブロックマーは、標的ＲＮＡのマイクロＲＮＡ制御を阻止することにより、標的ＲＮＡの活性に影響を与えるとう点で特徴的である。すなわち、本発明のブロックマーは、従来のアンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチマー、及びマイクロＲＮＡやｓｉＲＮＡを使用するＲＮＡｉ介在制御と比較して、低下したオフターゲット作用を有するであろう。
【００６７】
構造（ａｒｔｉｔｅｃｈｔｕｒｅ）と化学
本発明のオリゴヌクレオチドの活性は、構造と化学により影響を受ける。
【００６８】
すなわち、オリゴヌクレオチドが、ＲＮａｓｅＨを活性化すること、及び／又はＲＮＡｉ機構を動員できることを阻止するために、異なる修飾が異なる位置に置かれる。別の実施態様においてこれらは、ＲＮａｓｅＨ活性化及び／又はＲＮＡｉ機構の動員を可能にするように置かれる。
【００６９】
本明細書において、天然ではないヌクレオチドはオリゴヌクレオチドの修飾体と呼ばれる。修飾体は非天然の塩基、例えばユニバーサル塩基でもよい。これは、骨格糖又はリン酸塩への修飾体、例えばＬＮＡ若しくはホスホロチオエート結合を含む２’−Ｏ−修飾体でもよい。本明細書において、取り込みの前にヌクレオチド上に修飾が存在するか、又は合成後にオリゴヌクレオチドが修飾されるかどうかは、差はない。
【００７０】
好適な修飾体は、相補配列に対するオリゴヌクレオチドの親和性を上昇させるもの、すなわち相補配列に塩基対合したオリゴヌクレオチドのｔｍ（融解温度）を上昇させるものである。
【００７１】
このような修飾体には、２’−Ｏ−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチルがある。またＬＮＡ（ロックされた核酸）単位、ＰＮＡ（ペプチド核酸）単位、又はＩＮＡ（インターカレーティング核酸）単位の使用が好ましい。より短いオリゴヌクレオチドについては、より高率の親和性上昇性修飾が存在することが好ましい。オリゴヌクレオチドが１２又は１０単位未満の長さである場合、これは完全にＬＮＡ単位からなってよい。
【００７２】
２’−Ｏ−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチルを含むオリゴヌクレオチドの生体安定性を上昇させる修飾体もまた好ましい。またＬＮＡ（ロックされた核酸）単位、ＰＮＡ（ペプチド核酸）単位、又はＩＮＡ（インターカレーティング核酸）単位の使用が好ましい。広範囲の他の非天然の単位も、オリゴヌクレオチド中に構築される。例えば、モルホリノ、２’−デオキシ−２’−フルオロ−アラビノ核酸（ＦＡＮＡ）、及びアラビノ核酸（ＡＮＡ）。
【００７３】
好適な実施態様において、塩基若しくは糖で修飾されない単位に対して、塩基若しくは糖で修飾される単位の割合は、９９％未満、９５％未満、９０％未満、８５％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、１％未満、９９％より大きい、９５％より大きい、９０％より大きい、８５％より大きい、７５％より大きい、７０％より大きい、６５％より大きい、６０％より大きい、５０％より大きい、４５％より大きい、４０％より大きい、３５％より大きい、３０％より大きい、２５％より大きい、２０％より大きい、１５％より大きい、１０％より大きい、５％より大きい、１％より大きい、よりなる群から選択される。
【００７４】
脂質及び／又はペプチドもまた、オリゴヌクレオチドに結合されてよい。このような結合は、生物学的利用能を改善し、かつオリゴヌクレオチドがＲＮａｓｅＨを活性化及び／又はＲＮＡｉ機構を動員することを阻止してもよい。好ましくはオリゴヌクレオチドの中心部分（例えば、最も中心にある５単位のいずれか）に、より大きな成分の結合が行われる。あるいは、配列番号１〜５６のいずれかの２２〜２７位の１つに相補的な塩基の１つで。さらに別の実施態様において、成分はオリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端で結合される。
【００７５】
好適な疎水性成分はコレステロール成分であり、これはオリゴヌクレオチドに結合して、オリゴヌクレオチドがＲＮＡｉ機構を動員することを阻止し、オリゴヌクレオチドの生物学的利用能を改善する。コレステロール成分は、配列番号１〜５６のいずれかの２２〜２７位の１つに相補的な塩基の１つで、オリゴヌクレオチドの３’末端で又は５’末端で結合してもよい。
【００７６】
さらに好適な実施態様において、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合は単位を連結して、オリゴヌクレオチドの生体安定性を改善する。オリゴヌクレオチドのすべての結合はホスホロチオエート結合でもよい。別の実施態様においてホスホロチオエート結合の割合は、９５％未満、９０％未満、８５％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５０％未満、９５％より大きい、９０％より大きい、８５％より大きい、７５％より大きい、７０％より大きい、６５％より大きい、６０％より大きい、及び５０％より大きい、よりなる群から選択される。
【００７７】
さらに別の実施態様においてオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドがＲＮａｓｅＨを活性化するのを阻止し、同時にオリゴヌクレオチドがＲＮＡｉ機構を動員するのに阻止するように、ＤＮＡ単位とＲＮＡ単位の混合物を含んでよい。例えば、ＤＮＡ単位の後にＲＮＡ単位が続き、これに再度ＤＮＡ単位が続くなど。ＤＮＡ単位とＲＮＡ単位はブロックとして存在してもよい。ブロックは、２単位、３単位、４単位、５単位、又は６単位の長さでもよく、異なる長さの単位が同じオリゴヌクレオチド中に含まれてもよい。
【００７８】
別の好適な実施態様において、オリゴヌクレオチドは、ＬＮＡ単位とＲＮＡ単位の２’−Ｏ−メチルとの混合物を含む。このようなＬＮＡ／２’−Ｏ−メチル混合物は、ヒト免疫不全症ウイルス１型Ｔａｔ−依存性トランス活性化及びＨＩＶ−１感染性の立体ブロックインヒビターとして使用されている。
【００７９】
Ｌｎａ−ｄｎａ
ある実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドはＲＮＡ単位を含まない。オリゴヌクレオチドがＲＮＡｉ機構を動員できることを阻止するために、ほとんど又は全くＲＮＡ単位は使用されない。上記で概説したように、化学修飾体／非天然単位は同じことができる。そのような例の１つは、ＬＮＡ単位とＤＮＡ単位とを含むオリゴヌクレオチドである。好適な実施態様において、オリゴヌクレオチドは、ＬＮＡ単位とＤＮＡのみを含み、これらは、上記で概説したようにホスホロチオエート結合により連結される。
【００８０】
別の実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドはＤＮＡ単位を含まない。
さらに別の実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、モルホリノ単位及び／又はＬＮＡ単位を含まない。
【００８１】
好適な実施態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１単位、少なくとも２単位、少なくとも３単位、少なくとも４単位、少なくとも５単位、少なくとも６単位、少なくとも７単位、少なくとも８単位、少なくとも９単位、少なくとも１０単位、少なくとも１１単位、少なくとも１２単位、少なくとも１３単位、少なくとも１４単位、少なくとも１５単位、少なくとも１６単位、少なくとも１７単位、少なくとも１８単位、少なくとも１９単位、少なくとも２０単位、少なくとも２１単位、及び少なくとも２２単位よりなる群から選択される相補配列に対する親和性を上昇させる数のヌクレオチド単位を含む。
【００８２】
別の好適な実施態様においてオリゴヌクレオチドは、１単位以下、２単位以下、３単位以下、４単位以下、５単位以下、６単位以下、７単位以下、８単位以下、９単位以下、１０単位以下、１１単位以下、１２単位以下、１３単位以下、１４単位以下、１５単位以下、１６単位以下、１７単位以下、１８単位以下、１９単位以下、２０単位以下、２１単位以下、及び少なくとも２２単位以下よりなる群から選択される相補配列に対する親和性を上昇させる数のヌクレオチド単位を含む。
【００８３】
さらに別の好適な実施態様においてオリゴヌクレオチドは、１単位、２単位、３単位、４単位、５単位、６単位、７単位、８単位、９単位、１０単位、１１単位、１２単位、１３単位、１４単位、１５単位、１６単位、１７単位、１８単位、１９単位、２０単位、２１単位、及び少なくとも２２単位よりなる群から選択される相補配列に対する親和性を上昇させる数のヌクレオチド単位を含む。好適な実施態様において、相補配列に対する親和性を上昇させるヌクレオチド単位は、オリゴヌクレオチドの端部に位置する。例えばオリゴヌクレオチドが例えば１０個のＬＮＡ単位を含む場合、５個が５’末端に存在し、他の５単位が３’末端に存在してもよい。別の実施態様において、相補配列に対する親和性を上昇させるヌクレオチド単位は、オリゴヌクレオチドの中心部分にある。すなわちオリゴヌクレオチドが１８単位の長さを有し、そのうち８個がＬＮＡ単位である場合、５個の天然の単位の後に８個のＬＮＡ単位が続き、次に５個の天然の単位が続いてもよい。
【００８４】
相補配列に対する親和性を上昇させるヌクレオチド単位はまた、オリゴヌクレオチドの長さ全体にわたって均等に分布してもよい。例えば、それぞれ２、３、４、５、６位、又はこれらの任意の組合せ。
【００８５】
１本鎖又は２本鎖
本発明のオリゴヌクレオチドは好ましくは、相補的オリゴヌクレオチドと塩基対合しないか、又は相補的オリゴヌクレオチドと対合した塩基とともに使用することを目的としない。すなわちこれは、標的ＲＮＡとの相互作用を促進するために、及びある実施態様においてＲＮＡｉ機構の動員を阻止するために、１本鎖であるべきである。
【００８６】
別の実施態様においてオリゴヌクレオチドは、相補的オリゴヌクレオチドに塩基対合している。これは例えば、オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡ若しくはマイクロＲＮＡとして作用する場合、及び／又は、これはまたオリゴヌクレオチドの送達を改善するために使用される。すなわちある実施態様においてオリゴヌクレオチドは、これがその標的細胞に侵入するとき、ＲＮａｓｅＨにより分解されるＲＮＡ分子と塩基対合している。こうして、オリゴヌクレオチドはその場で放出される。
【００８７】
特異的配列
本発明のさらに別の実施態様において標的配列は、実施例３に概説されるように、Ｃ型肝炎ウイルスの５’非コード領域内に存在する。標的配列は実施例３で示される。
【００８８】
【化１】
2010529847.tif 000005
【００８９】
この実施態様においてオリゴヌクレオチドは、２５塩基、２４塩基、２３塩基、２２塩基、２１塩基、２０塩基、１９塩基、１８塩基、１７塩基、１６塩基、１５塩基、１４塩基、１３塩基、１２塩基、１１塩基、１０塩基、８塩基、７塩基、及び６塩基よりなる群から選択されるヌクレオチドの区間にわたって、標的配列に塩基対合することができる。
【００９０】
好ましくはエクスマー（ブロックマー）は、標的配列の少なくともアンチシード配列を包含し、したがって、アンチシード配列との相互作用においてｍｉｒ−１２２を阻止することができる。アンチシード配列はｍｉｒ−１２２のシード配列に相補的であり、すなわちｍｉｒ−１２２の少なくとも２〜８位に対して相補的である。
【００９１】
このようなオリゴヌクレオチドは、Ｃ型肝炎ウイルス感染の治療に有用であり、またｍｉｒ−１２２促進性ＨＣＶ複製の研究に有用である。重要なことは、オリゴヌクレオチドは、ｍｉｒ−１２２アンタゴマーが使用される場合のような他のｍｉｒ−１２２標的の発現には影響を与えないであろうということである。
【００９２】
本発明の第２の態様は、
ａ．標的ＲＮＡを含む系を提供する工程、
ｂ．標的ＲＮＡを標的とする本発明のオリゴヌクレオチドを系に導入する工程、
ｃ．こうして標的ＲＮＡの活性を調節する工程、
を含んでなる、標的ＲＮＡの活性を調節する方法である。
【００９３】
好ましくはオリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡでのマイクロＲＮＡの活性を阻止し、こうして標的ＲＮＡの活性を制御する。
【００９４】
別の実施態様においてオリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡのＲＮａｓｅＨ切断を誘導し、こうして標的ＲＮＡの活性を制御する。
【００９５】
さらに別の実施態様においてオリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡのＲＮＡｉ分解を誘導し、こうして標的ＲＮＡの活性を制御する。
【００９６】
本発明の第２の態様の好適な実施態様において、系は細胞抽出物又は細胞である。
【００９７】
本発明の第２の態様の別の好適な実施態様において、方法はインビボ、エクスビボ、又はインビトロで行われる。
【００９８】
医薬組成物と治療
本発明の第３の態様は、本発明のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物である。上記説明から当業者が理解できるように、オリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、及びアンチセンスオリゴヌクレオチドと同じように治療に使用され、これはこれらが、特定の遺伝子の発現に特異的に影響を与えるように使用できるためである。具体的な疾患分野や症状は、実施例の欄に記載される。
【００９９】
本発明の第４の態様は、本発明のオリゴヌクレオチド又は本発明の医薬組成物を、必要なヒトに投与することを含む治療法である。
【０１００】
本発明の第５の態様は、医薬として使用される本発明のオリゴヌクレオチドである。
【０１０１】
本発明の第６の態様は、癌、ウイルス感染、免疫疾患、又は心血管疾患の治療用薬剤を調製するための本発明のオリゴヌクレオチドの使用である。
【０１０２】
本発明の第７の態様は、標的ＲＮＡの活性を調節するためのオリゴヌクレオチドの使用である。
【実施例】
【０１０３】
実施例１
糖尿病の治療に有用なＭｔｐｎを標的とするエクスマー（ブロックマー）
ｍｉｒ−３７５が膵島インスリン分泌の調節因子であり、ミオトロフィン（Ｍｔｐｎ）がｍｉｒ−３７５制御の標的であることは、証明されている（Ｐｏｙ  ＭＮ，２００４）。さらに、ＭｔｐｎのｓｉＲＮＡ阻害が、グルコース刺激インスリン分泌とエキソサイトーシスに対するｍｉＲ−３７５の作用を模倣することが証明されている。すなわち、ｍｉＲ−３７５はインスリン分泌の調節因子であり、したがって、糖尿病治療のための新規な医薬標的となるかも知れないと結論付けられた。
【０１０４】
本発明で我々は、Ｍｔｐｎ  ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに対するＭｔｐｎ活性のｍｉｒ−３７５制御を阻害することにより、Ｍｔｐｎ発現を制御できるエクスマーを提供する。
【０１０５】
標的ｍＲＮＡの関連部分は以下である：
【０１０６】
【化２】
2010529847.tif 000006
【０１０７】
アンチシード配列を太字で示す。標的ＲＮＡのこの標的領域は、例えばアンチシード配列について標的ＲＮＡを検索することにより同定することができる。又は標的領域は、インターネットで利用できる適当なデータベース、例えばｈｔｔｐ：／／ｐｉｃｔａｒ．ｂｉｏ．ｎｙｕ．ｅｄｕ、ｗｗｗ．ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ．ｏｒｇ、ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋを使用して見つけることができる。
【０１０８】
明らかに、この情報はまた実験から又は科学文献（例えばＰｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）から入手できる。
【０１０９】
ｍｉｒ−３７５の配列は以下である：
【０１１０】
【化３】
2010529847.tif 000007
【０１１１】
シード配列をアンチシード配列に対合させると、例えば以下の相互作用が得られる。
【０１１２】
【化４】
2010529847.tif 000008
【０１１３】
全体的な相補性は小さいことがわかる。
【０１１４】
エクスマー
ｍｉｒ−３７５制御の阻害によりＭｔｐｎ発現を制御できるエクスマーは、標的領域のアンチシード配列を隔離（すなわち、塩基対合におけるアンチシード配列を隠す）できなければならないであろう。
【０１１５】
すなわち、標的配列（５’−３’方向で上の鎖）に塩基対合したＭｔｐｎのエクスマー（３’−５’方向で下の鎖）がここに例示される。
【０１１６】
【化５】
2010529847.tif 000009
【０１１７】
【化６】
2010529847.tif 000010
【０１１８】
以下の例について、この構造はさらなるブロックマーを設計するのに使用することができる：
【０１１９】
【化７】
2010529847.tif 000011
【０１２０】
上の鎖はマイクロＲＮＡであり、中央の鎖は標的ＲＮＡであり、下の鎖は、両端で末端切断することができるブロックマーである。
【０１２１】
上記で設計したエクスマーは、当該技術分野で公知の方法を使用して合成される。本明細書に記載のように、これらはＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、ＩＮＡとして、又は混合モノマーとともに合成される。
【０１２２】
明らかに、ＵモノマーはＴモノマーと交換されるが、まだ塩基対合は可能である。またＧ−Ｃ塩基対は、Ｇ−Ｕゆらぎ塩基対で置換してもよい。
【０１２３】
Ｍｔｐｎ  ｍＲＮＡを標的とする上記で設計されたエクスマーの種々の実施態様を合成する方法は、オリゴヌクレオチド合成分野の当業者に公知である。具体的な好適な実施態様が、本発明の詳細な説明に記載されている。
【０１２４】
エクスマーの例えばコレステロールへの結合もまた、当業者の一般的知識の範囲内である。
【０１２５】
実施例２
単純ヘルペスウイルス感染の治療のためのＴＧＦ−ベータとＳＭＡＤ３を標的とするエクスマー
最近、単純ヘルペスウイルス−１が、このウイルスを潜伏感染を確立することを可能にするマイクロＲＮＡをコードすることが証明された（Ｇｕｐｔａ  Ａ，２００６）。ｍｉｒ−ＬＡＴと命名されたこのマイクロＲＮＡは、ＴＧＦ−ベータとＳＭＡＤ３とを制御し、こうして細胞がアポトーシス（ウイルス子孫の産生を阻止するために、感染細胞が自己破壊する通常のプロセス）を受ける能力に影響を与えることがわかった。すなわち、ＴＧＦ−ベータとＳＭＡＤ３の発現に対するｍｉｒ−ＬＡＴの制御活性をブロックできることは、興味深い。
【０１２６】
ＴＧＦ−ベータ  ｍＲＮＡの標的領域の配列は以下である：
【０１２７】
【化８】
2010529847.tif 000012
【０１２８】
ｍｉｒ−ＬＡＴの配列は以下である：
【０１２９】
【化９】
2010529847.tif 000013
【０１３０】
すなわち以下の複合体が形成される：
【０１３１】
【化１０】
2010529847.tif 000014
【０１３２】
前記例で行ったように、一連のエクスマーも設計することができる。下の鎖は、エクスマーを３’−５’方向に示し、上の鎖はＴＧＦ−ベータ  ｍＲＮＡの標的領域である：
【０１３３】
【化１１】
2010529847.tif 000015
【０１３４】
以下の例について、この構造はさらにブロックマーを設計するのに使用することができる：
【０１３５】
【化１２】
2010529847.tif 000016
【０１３６】
上の鎖はマイクロＲＮＡであり、中央の鎖は標的配列であり、下の鎖は、両端で末端切断することができるブロックマーの例である。
【０１３７】
このような配列の種々の実施態様の合成は、当業者の能力の範囲内である。具体的な好適な実施態様は、本発明の詳細な説明に記載されている。
【０１３８】
実施例３
Ｃ型肝炎感染の治療のためのＨＣＶを標的とするエクスマー
背景
ｍｉｒ−１２２は、ウイルスＲＮＡの複製を促進することによりＣ型肝炎ウイルスＲＮＡの量を調節する（Ｊｏｐｌｉｎｇ  ＣＬ，２００５）。ＨＣＶゲノムは、３’非コード領域と５’非コード領域の両方でｍｉｒ−１２２のシード配列と塩基対合することができる保存アンチシード配列を含む。
【０１３９】
さらに、ｍｉｒ−１２２がいわゆるアンタゴマーにより不活性化されるとき、ＨＣＶウイルスレプリコンＲＮＡのレベルが約８０％低下していることが証明された。
【０１４０】
ｍｉｒ−１２２とウイルスゲノムの５’非コード領域との遺伝的相互作用は、予測されたマイクロＲＮＡ結合部位の変異解析と、代償変異を含むｍｉｒ−１２２分子の異所性発現により証明された。
【０１４１】
著者は、ｍｉｒ−１２２を標的とするアンタゴマーが抗ウイルス治療に使用できることを示唆する。
【０１４２】
ＨＣＶを標的とするブロックマー
５’非コード領域中の標的領域の配列（アンチシード配列は太字）は以下である：
【０１４３】
【化１３】
2010529847.tif 000017
【０１４４】
下線を引いたシード配列を有するｍｉｒ−１２２の配列：
【０１４５】
【化１４】
2010529847.tif 000018
【０１４６】
シードとアンチシードとの塩基対合：
【０１４７】
【化１５】
2010529847.tif 000019
【０１４８】
すなわち、ＨＣＶのエクスマーはここに例示される（ＨＣＶの標的領域に塩基対合している）：
【０１４９】
【化１６】
2010529847.tif 000020
【０１５０】
【化１７】
2010529847.tif 000021
【０１５１】
エクスマーはＤＮＡ又はＲＮＡであり、すなわちＴはＵで置換される。他の実施態様は、本発明の詳細な説明に記載されている。
【０１５２】
実施例４
乾癬の治療のためのブロックマー
乾癬が、健常な皮膚、又は別の慢性炎症性疾患、アトピー性湿疹とは異なる特異的ｍＲＮＡ発現プロフィールが特徴であることは証明されている。乾癬で過剰発現されるｍｉＲＮＡの中では、ケラチン細胞特異的ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−２０３）及び白血球由来ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−１４６ａ）が同定された。
【０１５３】
乾癬プラークにおけるｍｉＲ−２０３のアップレギュレーションは、ｍｉＲ−２０３の進化的に保存されている標的であるサイトカインシグナル伝達のサプレッサー３（ＳＯＣＳ−３）（これは、炎症性応答とケラチン細胞機能に関与している；Ｓｏｎｋｏｌｙ  Ｅ，２００７，Ｊｕｌ  １１）のダウンレギュレーションと同時であった。
【０１５４】
別の研究は、乾癬特異的ｍｉＲＮＡの１つであるｍｉＲ−１４６ａが、ＩＲＡＫ−１（インターロイキン−１受容体関連キナーゼ１）とＴＲＡＦ−６（ＴＮＦ受容体関連因子６）タンパク質（両方とも、ＴＮＦ−ａシグナル伝達経路の調節因子である；Ｔａｇａｎｏｖ  ＫＤ，２００６）の発現を阻害することを証明した。したがって、ｍｉＲ−１４６ａは、皮膚においてＴＮＦ−ａシグナル伝達の調節を介して乾癬の病態に関与していると考えられる。
【０１５５】
乾癬の治療のためのブロックマー
ＳＯＣＳ−３
ＳＯＣＳ−３  ｍＲＮＡの標的領域は以下である：
【０１５６】
【化１８】
2010529847.tif 000022
【０１５７】
ここでｍｉＲ−２０３（上の鎖）に相補的であることが示され、またブロックマー候補（下の鎖）であることが示される：
【０１５８】
【化１９】
2010529847.tif 000023
【０１５９】
さらなるブロックマーの例が、ＳＯＣＳ−３  ｍＲＮＡの標的領域に塩基対合していることが。ここに示される：
【０１６０】
【化２０】
2010529847.tif 000024
【０１６１】
【化２１】
2010529847.tif 000025
【０１６２】
ブロックマーはＤＮＡ又はＲＮＡであり、すなわちＴはＵで置換される。他の実施態様は、本発明の詳細な説明に記載されている。
【０１６３】
同様に、Ｉｒａｋ１とＴｒａｆ−６へのｍｉＲ−１４６の結合を阻止するブロックマーを調製することができる。明らかに、ブロックマーは末端切断し、詳細な説明に記載のように修飾することができる：
【０１６４】
Ｔｒａｆ−６はｍｉｒ−１４６とブロックマーに塩基対合した：
【０１６５】
【化２２】
2010529847.tif 000026
【０１６６】
Ｉｒａｋ−１はｍｉｒ−１４６とブロックマーに塩基対合した：
【０１６７】
【化２３】
2010529847.tif 000027
【０１６８】
ブロックマーのさらなる例は、本発明の詳細な説明に記載されている。
【０１６９】
実施例５
癌の治療に有用なｐ２７Ｋｉｐ１を標的とするブロックマー
ｐ２７Ｋｉｐ１（細胞サイクルの主要な負の調節因子）のレベルは、癌ではしばしば低下している。多くの癌では、ｐ２７Ｋｉｐ１  ｍＲＮＡのレベルは変化せず、ｐ２７Ｋｉｐ１タンパク質のタンパク質分解の上昇が、このダウンレギュレーションの主要な機構であると考えられる。ｐ２７Ｋｉｐ１タンパク質レベルはまた、神経膠芽細胞腫や前立腺癌（ｌｅ  Ｓａｇｅ  Ｃ，２００７）（Ｇａｌａｒｄｉ  Ｓ，２００７）（Ｇｉｌｌｉｅｓ  ＪＫ，２００７）では、Ｍｉｒ−２２１及びｍｉｒ−２２２によりダウンレギュレートされており、マイクロＲＮＡが治療標的として示唆されることが最近証明された。
【０１７０】
２つのマイクロＲＮＡの配列は以下である：
Ｍｉｒ−２２１
【０１７１】
【化２４】
2010529847.tif 000028
【０１７２】
Ｍｉｒ−２２２
【０１７３】
【化２５】
2010529847.tif 000029
【０１７４】
ｍｉｒ−２２１とｍｉｒ−２２２の２つの標的が同定された。マイクロＲＮＡは同じシード配列を有し、標的領域が両方のマイクロＲＮＡについて同じであること、すなわち１つのブロックマーを、両方のマイクロＲＮＡによる制御を阻止するのに使用することができることに注目されたい。
【０１７５】
上記したように、標的配列は中央の配列であり、上の配列はマイクロＲＮＡであり、下の配列はブロックマーである。ブロックマーは末端切断し、詳細な説明に記載のように修飾することができる。
【０１７６】
【化２６】
2010529847.tif 000030
【０１７７】
さらなる推定標的領域が、ｐ２７Ｋｉｐ１  ３’ＵＴＲで同定された：
【０１７８】
【化２７】
2010529847.tif 000031
【０１７９】
【化２８】
2010529847.tif 000032
【０１８０】
実施例６
癌の治療に有用なＴＰＭ１を標的とするブロックマー
ＴＰＭ１（腫瘍サプレッサートロポミオシン１）は最近、ｍｉｒ−２１により標的とされることが証明された（Ｚｈｕ  Ｓ，２００７）。この名前が示すように、ＴＰＭ１は腫瘍サプレッサーであり、ｍｉｒ−２１を治療薬として使用することが提唱された。
【０１８１】
ｍｉｒ−２１の配列は以下である：
【０１８２】
【化２９】
2010529847.tif 000033
【０１８３】
標的領域に塩基対合しているとき：
【０１８４】
【化３０】
2010529847.tif 000034
【０１８５】
再度、マイクロＲＮＡは上の配列であり、ＴＰＭ１の標的配列は中央の配列であり、ブロックマーは下の配列で示される。ブロックマーは末端切断し、詳細な説明に記載のように修飾することができる。
【０１８６】
実施例７
癌の治療に有用なＬａｔｓ２を標的とするブロックマー
ｍｉｒ−３７２とｍｉｒ−３７３はＬａｔｓ２（ラージ腫瘍サプレッサーホモログ２）を標的とすることが証明されている（Ｖｏｏｒｈｏｅｖｅ  ＰＭ，  ２００６）。ｍｉＲＮＡは、おそらく腫瘍サプレッサーＬＡＴＳ２の発現の直接阻害によりｐ５３介在ＣＤＫ阻害を中和する。これらのｍＲＮＡは、ｐ５３経路を働かなくし、こうして野生型ｐ５３の存在下で腫瘍発生性増殖を可能にすることにより、ヒト睾丸生殖細胞の発生に参加する新規癌遺伝子候補であるという証拠が提供された。２つの標的領域が同定された。
【０１８７】
標的１：
【０１８８】
【化３１】
2010529847.tif 000035
【０１８９】
２つのマイクロＲＮＡは同じ標的領域を標的とし、同じシード配列を共有することに注目されたい。すなわち以下の整列で、有用なブロックマーを設計することができる：
【０１９０】
【化３２】
2010529847.tif 000036
【０１９１】
標的２：
【０１９２】
【化３３】
2010529847.tif 000037
【０１９３】
標的は、ｍｉｒ−３７２、ｍｉｒ−３７３、ｍｉｒ−９３、ｍｉｒ３０２ａ＋ｂ、及びｍｉｒ−５２０について重複していることに注目されたい。
【０１９４】
実施例８
癌の治療に有用なＲＢ１とＴＧＦＢＲ２を標的とするブロックマー
ｍｉｒ１０６ａ対ＲＢ１
ｍｉｒ−１０６ａは、腫瘍サプレッサーＲＢ１（網膜芽細胞腫１）とＴＧＦＢＲ２（トランスフォーミング増殖因子、ベータ受容体ＩＩ）を制御することが最近証明された（Ｖｏｏｒｈｏｅｖｅ  ＰＭ，２００６）。
【０１９５】
ｍｉｒ−１０６ａは、概説される複合体の下の鎖として示される：
【０１９６】
【化３４】
2010529847.tif 000038
【０１９７】
すなわち、上記で概説したように以下の構造からブロックマーを設計することができる：
【０１９８】
【化３５】
2010529847.tif 000039
【０１９９】
同様に、ｍｉｒ−２０対ＴＧＦＢＲ２：
【０２００】
【化３６】
2010529847.tif 000040
【０２０１】
実施例９
癌の治療に有用なＰＴＥＮを標的とするブロックマー
ｍｉｒ−２１は、いくつかの報告でＰＴＥＮを制御することが報告されている（Ｍｅｎｇ  Ｆ，  ２００７）。ＰＴＥＮは、ＦＡＫ脱リン酸化を介していくつかのＭＭＰの発現を抑制する腫瘍サプレッサーである。すなわちＰＴＥＮのｍｉｒ−２１制御を阻止することは興味深い。ｍｉｒ−２１とＰＴＥＮの３’ＵＴＲの間で形成されるいくつかの複合体候補を列記する：
【０２０２】
１）
ｍｆｅ：−２３．４ｋｃａｌ／ｍｏｌ
ｐ値：定義されていない
【０２０３】
１８１６位
【０２０４】
【化３７】
2010529847.tif 000041
【０２０５】
２）
ｍｆｅ：−２１．９ｋｃａｌ／ｍｏｌ
ｐ値：定義されていない
【０２０６】
４２３位
【０２０７】
【化３８】
2010529847.tif 000042
【０２０８】
３）
ｍｆｅ：−２１．６ｋｃａｌ／ｍｏｌ
ｐ値：定義されていない
【０２０９】
２５９６位
【０２１０】
【化３９】
2010529847.tif 000043
【０２１１】
４）
ｍｆｅ：−２０．８ｋｃａｌ／ｍｏｌ
ｐ値：定義されていない
【０２１２】
１７５９位
【０２１３】
【化４０】
2010529847.tif 000044
【０２１４】
５）
ｍｆｅ：−１８．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ
ｐ値：定義されていない
【０２１５】
８６位
【０２１６】
【化４１】
2010529847.tif 000045
【０２１７】
そこからブロックマーを設計できる完全な標的配列を表１に列記し、具体例は説明から明らかであろう。
【０２１８】
実施例１０
ＨＩＶ感染の治療に有用なＨＩＶを標的とするブロックマー
背景
ヒト免疫不全症ウイルスＩ型（ＨＩＶ−１）を潜伏型に維持するのに、マイクロＲＮＡがある役割を果たすことが最近証明された（Ｈｕａｎｇ  Ｊ，２００７Ｏｃｔ；１３（１０），Ｅｐｕｂ  ２００７  Ｓｅｐ  ３０）。このウイルスは休止ＣＤ４＋Ｔ細胞中で潜伏状態を確立し、この潜伏は、抑制性高活性抗レトロウイルス治療法（ＨＡＡＲＴ）を受けている患者において、ウイルスの根絶のための大きな障壁である。上記論文の著者は、ＨＩＶ−１の３’ＵＴＲが、細胞性ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−２８、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−２２３、及びｍｉＲ−３８２を含み、これらは、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞と比較して休止ＣＤ４＋Ｔ細胞中で濃縮されている）のクラスターにより標的とされることを見つけた。さらに、治療目的に潜伏ＨＩＶ−１を活性化するためにアンタゴマーを使用することが提唱された。
【０２１９】
潜伏比ＨＩＶ−１の活性化のためのブロックマー
各マイクロＲＮＡは標的ＲＮＡのパネルを有するため、アンタゴマーを用いて複数のマイクロＲＮＡを阻害することは、様々な有害作用があるかも知れない。したがって、我々は、ブロックマーを使用してＨＩＶ−１  ３’ＵＴＲとマイクロＲＮＡとの相互作用を特異的に破壊し、こうして潜伏ＨＩＶ−１を活性化し、このウイルスをＨＡＡＲＴに感受性にすることを提唱する。
【０２２０】
標的配列を次に列記する。マイクロＲＮＡは上の鎖として示され、標的配列は中央の鎖であり、ブロックマー配列は下の鎖として示す。ブロックマーの具体例は、発明の詳細な説明から明らかであろう。
【０２２１】
ｍｉｒ−１２５ｂ：ＨＩＶ−１相互作用：
【０２２２】
【化４２】
2010529847.tif 000046
【０２２３】
ｍｉｒ−１５０：ＨＩＶ−１相互作用：
【０２２４】
【化４３】
2010529847.tif 000047
【０２２５】
ｍｉｒ−２２３：ＨＩＶ−１相互作用：
【０２２６】
【化４４】
2010529847.tif 000048
【０２２７】
ｍｉｒ−３８２：ＨＩＶ−１相互作用：
【０２２８】
【化４５】
2010529847.tif 000049
【０２２９】
ｍｉｒ−２８：ＨＩＶ−１相互作用：
【０２３０】
【化４６】
2010529847.tif 000050
【０２３１】
ＨＩＶ−１感染の活性化のためのブロックマーは、個々に又は組合せて使用される。すなわちすべての５つの配列を標的とするブロックマーを同時に使用してもよい。あるいは、４、３、又は２個の標的配列を、同時にブロックマーの標的としてもよい。好ましくはｍｉｒ−１２５ｂとｍｉｒ−１５０がこれらの標的配列に結合することを阻止するために、同じブロックマーが使用される。これは、これらの標的配列が重複しているため可能である。
【０２３２】
ブロックマーは好ましくは、ＨＡＡＲＴ治療法と組合せて使用される。
【０２３３】
実施例１１
免疫刺激のためのブロックマー
ｍｉｒ−１５０がｃ−ｍｙｂの発現を制御できることは証明されている（Ｘｉａｏ  Ｃ，２００７  Ｏｃｔ  ５：１３１（１））。アンタゴマーによるｍｉｒ−１５０の阻害は、Ｂ１細胞拡張や体液性免疫応答の増強のような種々の表現型を与えた。すなわち種々の抗体の血清レベルが大幅に上昇した。
【０２３４】
著者は、免疫刺激に対するｍｉｒ−１５０の作用が、主に又はもっぱらｃ−ｍｙｂの制御に仲介されることを示唆する。我々は、Ｂ細胞及びＴ細胞活性化に対するｃ−ｍｙｂのｍｉｒ−１５０制御を阻止するために、ブロックマーを使用することを提唱する。こうしてこのようなブロックマーはワクチンと一緒に使用されて、ワクチンの作用を強化するか  又は免疫系が低下しているヒトについて使用される。
【０２３５】
ｍｉｒ−１５０対ｃ−ｍｙｂ
標的スキャンは、ｃ−ｍｙｂの３’ＵＴＲ中の４つのｍｉｒ−１５０標的を予測する。これらのうちの２つ（まずａとｂとして示す）は、実験的に証明されている。次に標的配列を示す。マイクロＲＮＡは上の鎖として示され、標的配列は中央の鎖であり、ブロックマー配列は下の鎖として示される。ブロックマーの具体例は、発明の詳細な説明から明らかであろう。
【０２３６】
【化４７】
2010529847.tif 000051
【０２３７】
免疫刺激のためのブロックマーは、別に又は組合せて使用される。最も好適なものはａ）とｂ）である。最大の強力な作用を得るために、これらは組合せて使用される。
【０２３８】
実施例１２
転移性乳癌の予防のためのブロックマー
異所性ｍｉＲ−１００発現が、本来は非転移性乳癌で腫瘍侵襲と転移とを引き起こし、したがって、強力な転移促進剤として作用することが、最近証明された。さらに、ホメオボックスＤ１０（ＨＯＸＤ１０）をコードするｍＲＮＡがｍｉｒ−１０ｂ制御の標的であること、及びＨＯＸＤ１０ダウンレギュレーションが、充分解析されている転移促進遺伝子であるＲＨＯＣのアップレギュレーションを引き起こすことが証明された（Ｍａ  Ｌ，２００７  Ｏｃｔ  １１；４４９（７１６３），Ｅｐｕｂ  ２００７  Ｓｅｐ  ２６）。すなわち我々は、ＨＯＸＤ１０のｍｉｒ−１０ｂ制御をブロックすること、及びこうして乳癌の転移を阻止するか又は低下させることを提唱する。
【０２３９】
ｍｉｒ−１０ｂ対ＨＯＸＤ１０
ＨＯＸＤ１０中の１つの標的が、実験的に証明されている。この標的配列を次に示す。マイクロＲＮＡは上の鎖として示され、標的配列は中央の鎖であり、ブロックマー配列は下の鎖として示される。ブロックマーの具体例は、発明の詳細な説明から明らかであろう。
【０２４０】
【化４８】
2010529847.tif 000052
【０２４１】
実施例１３
ＣＭＶ感染の治療のためのブロックマー
サイトメガロウイルスは、感染を促進するマイクロＲＮＡをコードする。すなわち、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＬ１１２は主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ関連鎖Ｂ（ＭＩＣＢ）を標的とすることを証明された。さらにＭＩＣＡ中に推定標的が同定された（Ｓｔｅｒｎ−Ｇｉｎｏｓｓａｒ  Ｎ，２００７  Ｊｕｌ  ２０；３１７（５８３６））。
【０２４２】
ＭＩＣＢは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性化受容体ＮＫＧ２Ｄのストレス誘導性リガンドであり、ウイルス感染細胞と腫瘍細胞のＮＫ細胞死にとって決定的に重要である。Ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＬ１１２は、ウイルス感染中にＭＩＣＢ発現を特異的にダウンレギュレートし、ＮＫＧ２Ｄ結合の低下とＮＫ細胞による死滅の低下を引き起こす。すなわち我々は、ブロックマーを使用して、ｈｃｍｖ−ｍｉｒ−ＵＬ１２がＭＩＣＢ及び／又はＭＩＣＡを制御するのを阻止することを提唱する。
【０２４３】
この標的配列を次に示す。マイクロＲＮＡは上の鎖として示され、標的配列は中央の鎖であり、ブロックマー配列は下の鎖として示される。ブロックマーの具体例は、発明の詳細な説明から明らかであろう。
【０２４４】
ｍｉｒ−ＵＬ１１２対ＭＩＣＢ
【０２４５】
【化４９】
2010529847.tif 000053
【０２４６】
ｍｉｒ−ＵＬ１１２対ＭＩＣＡ
【０２４７】
【化５０】
2010529847.tif 000054
【０２４８】
実施例１４
結腸直腸癌の治療又は予防のためのブロックマー
ｍｉｒ−２１は腫瘍サプレッサーＰｄｃｄ４の転写後調節因子であることが、最近証明された（Ａｓａｎｇａｎｉ  ＩＡ，２００７  Ｏｃｔ  ２９）。著者は、１０個の結腸直腸細胞株においてｍｉｒ−２１とＰｄｃｄ４との逆相関を証明し、ルシフェラーゼレポーターアッセイを使用してＰｄｃｄ４のｍｉｒ−２１制御を証明した。すなわち、アンチマー−２１のトランスフェクションは、Ｐｄｃｄ４の３’ＵＴＲを含有するルシフェラーゼ−レポーターの発現を上昇させ、ｐｒｅ−ｍｉｒ−２１のトランスフェクションは発現を低下させる。さらに、ｍｉｒ−２１が培養結腸癌細胞中の腫瘍細胞浸潤をアップレギュレートし、抗ｍｉｒ−２１のトランスフェクションが血管内異物侵入と遠隔転移の低下を引き起こすことが証明された。最後に、ｍｉｒ−２１とＰｄｃｄ４が、切除した患者の腫瘍で逆に発現されていることも証明された。
【０２４９】
ｍｉｒ−２１の作用の多くは、腫瘍サプレッサーＰｄｃ４の制御に仲介されている可能性があるため、我々は、癌を治療若しくは予防する手段として、さらに詳しくは血管内異物侵入と転移を治療又は予防する手段として、本発明のブロックマーを使用して、Ｐｄｃｄ４のｍｉｒ−２１制御を妨害することを提唱する。
【０２５０】
マイクロＲＮＡは上の鎖として示され、Ｐｄｃｄ４の標的配列は中央の鎖であり、ブロックマー配列は下の鎖として示される。ブロックマーの具体例は、発明の詳細な説明から明らかであろう。
【０２５１】
【化５１】
2010529847.tif 000055
【０２５２】
実施例１５
免疫調節に有用なｔｎｆ−ａｌｆａを標的とするブロックマー
マイクロＲＮＡ３６９−３対ｔｎｆ
最近の報告は、マイクロＲＮＡ３６９−３がｔｎｆ−ａｌｆａ（腫瘍壊死因子−アルファ）発現の調節因子であることを証明した（Ｖａｓｕｄｅｖａｎ  Ｓ，２００７  Ｎｏｖ  ２９［Ｅｐｕｂ印刷前］）。興味深いことに、制御は正であることが証明された。すなわちマイクロＲＮＡは、血清枯渇で誘導した細胞サイクル停止細胞中のｔｎｆ−ａｌｆａの翻訳を上昇させた。
【０２５３】
腫瘍壊死因子は通常、刺激されたリンパ球中で発現され、免疫応答と悪性腫瘍にとって重要である。すなわち種々のＴＮＦ−アルファアンタゴニストが、免疫関連症状（例えばリウマチ様関節炎及びクローン病）の治療のために販売されており、第２世代ＴＮＦ−アルファアンタゴニストが開発中である。
【０２５４】
炎症組織への血管外遊出のプロセス中又は血管形成促進性腫瘍浸潤で循環単核細胞が接着性になると、細胞増殖が停止し、サイトカイン発現の急激な変化（マクロファージへの成熟に必要な他のサイトカインをさらにアップレギュレートするｔｎｆ−ａｌｆａの変化を含む）を引き起こす。この応答は、血清枯渇により細胞培養で再現される。
【０２５５】
マイクロＲＮＡ  ３６９−３はｔｎｆ発現の正の調節因子であるため、マイクロＲＮＡ  ３６９−３のインヒビターはｔｎｆアンタゴニストとして使用できるかも知れない。１つのマイクロＲＮＡ  ３６９−３インヒビターは、マイクロＲＮＡに向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチド、すなわちアンチマー又はアンタゴマーかも知れない。
【０２５６】
我々は、例えば循環単核細胞が炎症組織に接着するとき、ブロックマーを使用してｔｎｆ−ａｌｆａ発現のマイクロＲＮＡ  ３６９−３刺激を阻止することを提唱する。このようなアプローチは、活性化単核細胞を優先的に標的とするという利点の可能性がある。
【０２５７】
ｔｎｆ−ａｌｆａの３’ＵＴＲは、ｍｉｒ−３６９−３に相補性を有する２つのアンチシード配列を有し、マイクロＲＮＡ制御に対するこれらの重要性は、Ｖａｓｕｄｅｖａｎらにより変異解析により証明された。
【０２５８】
２つのアンチシード配列は、以下の配列において太字で示される：
【０２５９】
【化５２】
2010529847.tif 000056
【０２６０】
次にマイクロＲＮＡと整列した標的配列を示す。マイクロＲＮＡは上の鎖として示され、標的配列は中央の鎖であり、ブロックマー配列は下の鎖として示される。ブロックマーの具体例は、発明の詳細な説明から明らかであろう。
【０２６１】
【化５３】
2010529847.tif 000057
【０２６２】
重要なことに、同じブロックマーが両方の標的部位をブロックするのに使用されることである。
【０２６３】
ｍｉｒ−１５５対ｔｎｆ
別の最近の文献は、マクロファージのＬＰＳ刺激により、ｍｉｒ−１５５のアップレギュレーションとｍｉｒ−１２５ｂのダウンレギュレーションが起きることを見いだし、ｍｉｒ−１５５とｍｉｒ−１２５ｂによるｔｎｆ制御を証明した（Ｔｉｌｉ  Ｅ，２００７  Ｏｃｔ  １５；１７９（８））。興味深いことに、ｍｉｒ−１５５による制御は正の制御であった。すなわち、ｍｉｒ−１５５がｔｎｆを制御することを阻止するブロックマーは、同様にｍｉｒ−３６９．３制御を阻止するブロックマーに使用される。著者は、ｔｎｆ−ａｌｆａ  ｍＲＮＡの３’ＵＴＲにおけるｍｉｒ−１５５の標的配列を報告しなかった。しかしＲＮＡ−ハイブリッドを使用する配列解析は、以下の非常に良好な標的部位を同定する（マイクロＲＮＡは上の鎖として示され、標的配列は中央の鎖として、ブロックマー配列は下の鎖として示される）：
【０２６４】
【化５４】
2010529847.tif 000058
【０２６５】
【化５５】
2010529847.tif 000059
【０２６６】
ｍｉｒ−１２５ｂ対ｔｎｆ
ｍｉｒ−１２５ｂは、マクロファージがＬＰＳで刺激されるとき、ｔｎｆ−ａｌｆａ発現の負の調節因子であることが証明された。ｔｎｆ−ａｌｆａの負の制御は、例えばｔｎｆ−ａｌｆａアンタゴニストで治療を受けている患者について、興味深い。このような治療が、潜伏結核感染を活性化するリスクと、感染症一般の感受性が上昇するリスクが発生させることはよく知られている。ｔｎｆ−ａｌｆａのｍｉｒ−１２５ｂ制御を阻止することはマクロファージ活性化を可能にし、こうして患者がｔｎｆ−ａｌｆａアンタゴニストで治療されているときでさえ、感染に対する免疫防御が可能になる。ほとんどのｔｎｆ−ａｌｆａアンタゴニストは細胞外（抗体又は可溶性受容体）であり、したがって、ｔｎｆ−ａｌｆａアンタゴニストを使用するとｔｎｆ−ａｌｆａは細胞外で低下し、ｔｎｆ−ａｌｆａ発現のｍｉｒ−１２５ｂ制御を阻止するブロックマーを使用すると細胞内で増加する可能性があることに注目されたい。
【０２６７】
さらに、ｔｎｆ−ａｌｆａ発現のｍｉｒ−１２５ｂ制御が実際に正である状況があるかも知れない。すなわち、上記したように、いくつかのマイクロＲＮＡは増殖細胞中でリプレッサーであり、細胞サイクル停止細胞中でアクチベーターであることが報告された。したがって、ｍｉｒ−１２５ｂ制御を阻止するブロックマーもまた、ｔｎｆ−ａｌｆａ発現を低下させるのに使用できるかも知れない。
【０２６８】
ＲＮＡ−ハイブリッドを使用する配列解析は、多くの標的部位を同定する。マイクロＲＮＡは上の鎖として示され、標的配列は中央の鎖であり、ブロックマー配列は下の鎖として示される。ブロックマーの具体例は、発明の詳細な説明から明らかであろう。
【０２６９】
【化５６】
2010529847.tif 000060
【０２７０】
【化５７】
2010529847.tif 000061
【０２７１】
ｍｉｒ−１２５ｂ−１＊（ｍｉｒ−１２５ｂと同じｐｒｅ−ｍｉｒからプロセシングされる）もまた、ｔｎｆ−ＵＴＲ中に標的部位を有する：
【０２７２】
【化５８】
2010529847.tif 000062
【０２７３】
実施例１６
サプレッサーＳｕＦｕとＦｕｓ−１を標的とするブロックマー
マイクロＲＮＡ−３７８は、２つの腫瘍サプレッサー（ＳｕＦｕとＦｕｓ−１）の発現を標的とすることにより、細胞生存、腫瘍増殖、及び血管形成を促進することが最近証明された（Ｌｅｅ  ＤＹ，２００７  Ｄｅｃ  １８，Ｅｐｕｂ  ２００７  Ｄｅｃ  １１）。特に、マイクロＲＮＡ結合部位は変異解析により確認された。マイクロＲＮＡ−３７８制御を阻止するブロックマーは、癌の治療又は予防に有用かも知れない。
【０２７４】
ｍｉｒ−３７８対ｓｕｆｕ
前記実施例のように、マイクロＲＮＡは上の鎖として示され、標的配列は中央の鎖として、ブロックマー配列は下の鎖として示される。ブロックマーの具体例は、発明の詳細な説明から明らかであろう。
【０２７５】
【化５９】
2010529847.tif 000063
【０２７６】
ｍｉｒ−３７８対ｆｕｓ−１
ａ）
【０２７７】
【化６０】
2010529847.tif 000064
【０２７８】
ｂ）別の標的部位候補は以下である：
【０２７９】
【化６１】
2010529847.tif 000065
【０２８０】
実施例１７
腫瘍浸潤と転移の阻止のためのブロックマー
マイクロＲＮＡであるｍｉｒ−３７３とｍｉｒ−５２０ｃは、腫瘍浸潤と転移を促進することが証明された（Ｈｕａｎｇ  Ｑ，２００８  Ｆｅｂ；Ｅｐｕｂ  ２００８  Ｊａｎ  １３）。著者は、細胞の遊走表現型であるｍｉｒ−３７３とｍｉｒ−５２０ｃが、ＣＤ４４のダウンレギュレーションにより説明できることを証明した。ヒアルロナンの細胞表面受容体をコードするＣＤ４４の発現低下は、遊走における役割とともに腫瘍進行の増強を引き起こすことがすでに報告されている。３’ＵＴＲ中の２つのマイクロＲＮＡ結合部位の証拠はまた論文にもあり、ＵＴＲの３’末端から約７０及び１４０ｎｔの近くの２つのマイクロＲＮＡ結合部位の欠失が、制御を破壊することが示された。著者は、２つのマイクロＲＮＡの他の標的が遊走表現型に関与していると推定している。しかし彼らはまた、ＣＤ４４のｓｉＲＮＡノックアウトもまた遊走表現型を有し、遊走と浸潤のためのＣＤ４４ダウンレギュレーションの重要性を支持していることを証明している。
【０２８１】
我々は、ブロックマーを使用してＣＤ４４ダウンレギュレーションをブロックすることを提唱する。２つの好適な標的部位は、ＵＴＲの３’末端に極めて近くに存在するものである（３００１位と２９２７位）：
【０２８２】
ｍｉｒ−３７３対ＣＤ４４
ｍｉｒ−３７３の１つの標的部位候補が、ＵＴＲの３’末端の近くに同定された。
【０２８３】
ＲＮＡハイブリッドからの複合体：
３００１位
【０２８４】
【化６２】
2010529847.tif 000066
【０２８５】
複合体は前記実施例のように示される；マイクロＲＮＡは上の鎖として示され、標的配列は中央の鎖として、ブロックマー配列は下の鎖として示される。ブロックマーの具体例は、発明の詳細な説明から明らかであろう。
【０２８６】
【化６３】
2010529847.tif 000067
【０２８７】
ｍｉｒ−５２０ｃ対ＣＤ４４
ｍｉｒ−５２０ｃの３つの標的部位候補が同定された：
まずＲＮＡハイブリッドからの複合体が示される。次に複合体は前記実施例のように示される。
ａ）
２０８３位
【０２８８】
【化６４】
2010529847.tif 000068
【０２８９】
ｂ）
４８５位
【０２９０】
【化６５】
2010529847.tif 000069
【０２９１】
ｃ）
２９２７位
【０２９２】
【化６６】
2010529847.tif 000070
【０２９３】
実施例１８
癌の治療のためのＰＴＥＮを標的とするブロックマー
ｍｉｒ−２１４は、ＰＴＥＮのダウンレギュレーションとＡｋｔ経路の活性化とを引き起こすＰＴＥＮの３’ＵＴＲを標的とすることにより、細胞生存とシスプラチン耐性を誘導することが証明されている（Ｙａｎｇ  Ｈ，  ２００８  Ｊａｎ）。ＰＴＥＮの３’ＵＴＲ中のｍｉｒ−２１４結合部位が証明された。マイクロＲＮＡ結合部位が、変異解析とレポーター系を使用して証明された。さらに、３’ＵＴＲが欠如したＰＴＥＮ  ｃＤＮＡを用いてＰＴＥＮのマイクロＲＮＡ制御を迂回することは、Ａｋｔインヒビターの導入とともに、細胞生存を低下させることが、証明された。すなわちブロックマーは、ＰＴＥＮのマイクロＲＮＡ制御を阻止するのに使用され、これは次にＡｋｔ経路の活性化を阻止するであろう。このようなブロックマーは、耐性の発生を防ぐために、シスプラチン又は他の化学療法剤とともに同時投与される。ｍｉｒ−２１４に対するアンチマーも使用されるが、この場合、副作用の確率が上昇する可能性がある。
【０２９４】
上記研究で同定されたｍｉｒ−２１４と標的部位との間に、以下の複合体が形成される：
ａ）
９９３位
【０２９５】
【化６７】
2010529847.tif 000071
【０２９６】
他の結合部位が以下の複合体中で示される：
ｂ）
６２９位
【０２９７】
【化６８】
2010529847.tif 000072
【０２９８】
ｃ）
３１９６位
【０２９９】
【化６９】
2010529847.tif 000073
【０３００】
実施例１９
癌の治療のためのブロックマー
マイクロＲＮＡ−２７ａは、Ｓｐ１、Ｓｐ３、及びＳｐ４の負の調節因子であるＺＢＴＢ１０のリプレッサーであることが最近証明された（Ｍｅｒｔｅｎｓ−Ｔａｌｃｏｔｔ  ＳＵ，２００７  Ｎｏｖ）。すなわちアンチセンスｍｉＲ−２７ａによるＥＲ−陰性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞のトランスフェクションは、ＺＢＴＢ１０  ｍＲＮＡの発現増加とＳｐ１、Ｓｐ３、及びＳｐ４の発現低下とを引き起こした。さらにアンチセンスｍｉＲ−２７ａトランスフェクションは、Ｓｐ−依存性生存及び血管形成遺伝子の発現低下（生存している血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）とＶＥＧＦ受容体１（ＶＥＧＦＲ１））を伴った。ＺＢＴＢ１０発現プラスミドのトランスフェクションにより、同様の結果が得られた。すなわちｍｉｒ−２７ａに対するアンチセンス分子は、癌を治療するのに使用できるかも知れない。我々は、ＺＢＴＢ１０に対するブロックマーを使用してＺＢＴＢ１０のｍｉｒ−２７ａ抑制をブロックすることを提唱する。
【０３０１】
ｍｉｒ−２７ａ対ＺＢＴＮ１０  ３’ＵＴＲ：
９６位
【０３０２】
【化７０】
2010529847.tif 000074
【０３０３】
【化７１】
2010529847.tif 000075
【０３０４】
前記実施例のように、上の配列はマイクロＲＮＡであり、中央の配列は標的配列であり、下の鎖は両端が末端切断できるブロックマーの例である。ブロックマーの具体例は、発明の詳細な説明から明らかであろう。
【０３０５】
ｍｉｒ−２７ａ対Ｍｙｔ−１
ｍｉｒ−２７ａはまた、Ｍｙｔ−１を制御し、マイクロＲＮＡの発癌活性にさらに寄与していることが証明された。Ｍｙｔ−１は、Ｇ２−Ｍでの細胞サイクル進行をブロックする。したがって、Ｍｙｔ−１のｍｉｒ−２７ａを阻止するブロックマーも興味深い。
【０３０６】
配列解析は、２つの推定標的部位と、マイクロＲＮＡとＭｙｔ−１の３’ＵＴＲとの間の対応する複合体を同定している。
ａ）
２６２０位
【０３０７】
【化７２】
2010529847.tif 000076
【０３０８】
ｂ）
２４１４位
【０３０９】
【化７３】
2010529847.tif 000077
【０３１０】
【化７４】
2010529847.tif 000078
【０３１１】
参考文献
【０３１２】
【化７５】
2010529847.tif 000079
【０３１３】
【化７６】
2010529847.tif 000080
【国際調査報告】
2010529847.tif 000081
2010529847.tif 000082
2010529847.tif 000083
2010529847.tif 000084
2010529847.tif 000085
2010529847.tif 000086