(57)【要約】２つの重要なヒトタンパク質（インスリン成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）およびインスリン成長因子結合タンパク質３（ＩＧＦＢＰ−３））を単子葉植物で生成した。これらのタンパク質を単子葉植物中で産生することにより、本発明は、初めて、ヒトの治療のための使用または獣医学的状況での使用に適合可能な形態において十分な量での提供が可能である有用なタンパク源を提供する。組み換え技術によって生成したタンパク質は天然型に公知の活性を示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）をコードするヌクレオチド配列またはインスリン様成長因子結合タンパク質３（ＩＧＦＢＰ−３）をコードするヌクレオチド配列の発現のためのＤＮＡ構築物を含有するように改変した単子葉植物細胞であって、該ＤＮＡ構築物は、単子葉植物細胞中での発現のために制御配列と作動可能に連結した該コードするヌクレオチド配列を含む、細胞。
【請求項２】
前記ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦＢＰ−３はヒトタンパク質である、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
前記制御配列は、単子葉植物の種子中で作動可能なプロモーターおよび単子葉植物の種子中で作動可能な終止配列を含む、請求項１または２に記載の細胞。
【請求項４】
前記コードするヌクレオチド配列は、小胞体（ＥＲ）分泌経路に導くシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列によりＮ末端で伸長される、請求項１または２に記載の細胞。
【請求項５】
前記コードするヌクレオチド配列は、ＥＲ保持シグナルをコードするヌクレオチド配列によりＣ末端で伸長される、請求項１または２に記載の細胞。
【請求項６】
前記細胞はイネ細胞である、請求項１または２に記載の細胞。
【請求項７】
請求項１または２に記載の細胞を含む遺伝子組み換え植物または植物部位。
【請求項８】
ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦＢＰ−３を含む単子葉植物細胞。
【請求項９】
前記ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦＢＰ−３はヒト由来のものである、請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
前記細胞はイネ細胞である、請求項８または９に記載の細胞。
【請求項１１】
請求項８または９に記載の細胞を含む植物または植物部位。
【請求項１２】
前記植物部位は種子組織である、請求項１１に記載の植物部位。
【請求項１３】
前記植物または植物部位はイネである、請求項１１に記載の植物または植物部位。
【請求項１４】
前記植物部位は種子組織である、請求項１３に記載の植物部位。
【請求項１５】
単子葉植物においてＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦＢＰ−３を産生する方法であって、請求項１または２に記載の植物細胞を培養する工程を包含する、方法。
【請求項１６】
単子葉植物においてＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦＢＰ−３を産生する方法であって、請求項１１に記載の植物を培養する工程を包含する、方法。
【請求項１７】
前記植物はイネである、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連する出願への相互参照
本願は、２００７年２月２０日に出願された米国仮特許出願第（“ＵＳＳＮ”）６０／８９０，８２３号に対する優先権の利益を主張する。前記出願は、その全体が本明細書中に参考として、そして全ての目的のために明白に援用される。
【０００２】
ＥＦＳ−ＷＥＢを介して提出された配列表への参照
本願は、ＭＰＥＰ§１７３０ＩＩ．Ｂ．２（ａ）（Ａ）において公認され定められたように、ＵＳＰＴＯ  ＥＦＳ−ＷＥＢサーバーを介して電子的に出願され、そしてこの電子出願は、電子的に提出された配列（配列番号）表を含む。この配列表の全ての内容は、全ての目的のために参考として本明細書中に援用される。配列表は、以下に示す電子的に出願されたテキストファイル上で確認される：
【０００３】
【化１】
2010518825.tif 000002
本発明は、単子葉植物における哺乳類、特に、ヒトのタンパク質の産生に関する。これについて、遺伝子組み換えイネにおけるＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦＢＰ−３の良好な産生により説明する。
【背景技術】
【０００４】
インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）およびインスリン様成長因子結合タンパク質３（ＩＧＦＢＰ−３）は、細胞および組織の生存、成長、ならびに分化の調節において重要なタンパク質である。
【０００５】
ヒトＩＧＦ−Ｉは、第１２染色体上の単一遺伝子によりコードされた７０個のアミノ酸残基からなる一本鎖ポリペプチドである。これは、プロインスリンおよびインスリンと４８％のアミノ酸配列同一性を有する。ＩＧＦ−Ｉは、Ａ２０−Ｂ１８、Ａ６−Ａ１１、およびＡ７−Ｂ６に３つの鎖内ジスルフィド架橋を有するが、糖鎖付加部位は有さない。血中ＩＧＦ−Ｉの大半は肝臓で合成され、成長ホルモン（ＧＨ）、インスリン、および栄養摂取により調節される。血中ＩＧＦ−Ｉレベルは、主に、その分泌成分パターンおよびＩＧＦ−Ｉと高親和性結合タンパク質の結合により相対的に安定している。しかしながら、ＩＧＦ−Ｉの調節異常がインスリン耐性の発現および他の代謝異常に関与することが示唆されている。
【０００６】
糖質代謝の調節におけるＩＧＦ−Ｉの正確な役割はまだ明確にされていないが、代謝の調節において明らかに重要なものである。健康な被験者では、組み換えヒトＩＧＦ−Ｉ（ｒｈＩＧＦ−Ｉ）は急性的な血糖低下作用を生じ得るが、ｒｈＩＧＦ−Ｉは同等の投与量のインスリンよりも１０倍効力が低い。対照的に、ＩＧＦ−Ｉはインスリンよりもタンパク質代謝に対する影響が顕著であり、グルコースを低下させる同等の投与量のインスリンと比較して、全体的な正味アミノ酸フラックスを減少させる。さらに、ＩＧＦ−Ｉは、脾臓インスリン放出の強力な阻害剤である。１型糖尿病患者では、ｒｈＩＧＦ−Ｉを使用することにより血中ＩＧＦ−Ｉレベルが改善し、ＧＨ過分泌が好転し、インスリン必要量が低減し、血糖管理が改善する。２型糖尿病患者では、空腹時血漿グルコース、インスリン、およびＣペプチドレベルを低減するためにより多くの投与量のｒｈＩＧＦ−Ｉが必要であった。また、ｒｈＩＧＦ−Ｉ治療は脂肪量の低減と関連づけられていたが、これは、インスリン感受性に対する上記の有益な影響を部分的に説明するものである。
【０００７】
６個のヒトＩＧＦ結合タンパク質が同定されている。これら６個の結合タンパク質のうち、ＩＧＦＢＰ−３は、血清中の９５パーセントを超えるＩＧＦ−Ｉと結合する。これは、分子量が２９ｋＤ程度と計算される２６４個のアミノ酸残基を含有する。潜在的に３つのＮ糖鎖付加部位（Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）がＩＧＦＢＰ−３中央部のＡｓｎ８９、Ａｓｎ１０９、およびＡｓｎ１７２の位置に存在するが、炭水化物単位はＩＧＦ結合には必須ではないと思われる。ＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦＢＰ−３二量体が「酸に不安定なサブユニット」と三重複合体を形成し、これにより、ＩＧＦ−Ｉの半減期が延長され、その受容体に対するＩＧＦ−Ｉの供給が漸増する。
【０００８】
ＩＧＦＢＰ−３は多くの組織において局所的に産生される４０〜４５ｋＤａの糖タンパク質であり、それらの組織において、細胞成長およびアポトーシスの調節における自己分泌および傍分泌調節因子として作用する。ＩＧＦＢＰ−３は、ＩＧＦと結合することにより細胞増殖および生存を阻害し、ＩＧＦが標的細胞上のＩＧＦ−Ｉ受容体を活性化することを妨げる。ＩＧＦＢＰ−３はまた、細胞増殖を負に調節し、ＩＧＦに依存せずにアポトーシスを誘発することが分かっている。ＩＧＦ−Ｉが存在しない場合、ＩＧＦＢＰ−３は、ｐ５３、レチノイン酸、腫瘍壊死因子−α、および形質転換成長因子−β等の多数の成長抑制タンパク質および薬剤と相互作用することができる。ＩＧＦＢＰ−３の過剰発現は細胞増殖の阻害、腫瘍形成の低減を行い、正常臓器の成長をわずかに阻害する。最近の研究では、ＩＧＦＢＰ−３が乳癌、前立腺癌、肺癌、卵巣癌、および結腸直腸癌を阻害するため、ＩＧＦＢＰ−３が抗癌剤として有効であることが実証されている。
【０００９】
それゆえ、ヒトＩＧＦ−ＩおよびヒトＩＧＦＢＰ−３はともに、薬学的価値を確立している。ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦＢＰ−３の両方の使用に関する重大な障害は、それらの製造コストである。これらのタンパク質は、主に、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ等の細菌から組み換えによって製造されるか、または肉腫細胞株もしくは赤血球系細胞から抽出され、かつ／または遺伝子導入マウス中で産生される。これらのシステムは、設備および製造コストが高く、病原菌で汚染される可能性があるため大量生産には適さない。ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦＢＰ−３は他の哺乳類でも同様に発生し、同様の機能を果たす。
【００１０】
植物細胞は、原核生物および真核生物源からの遺伝子を含む幅広い生物から遺伝子情報を受け取り、発現するように改変することができる。植物細胞は真核性であるため、適切なタンパク質または酵素機能に必要とされることが多い適切な翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、プレニル化、およびジスルフィド架橋の形成）により哺乳類タンパク質を産生することができる。また、多くの植物種の種子が食用に適しており、種子中に組み換えタンパク質を蓄積することが可能である。投与量レベルおよび頻度が制御される場合には、組み換えタンパク質は、経口送達の前にさらなる処理および精製を必ずしも必要としないこともあるが、これは、各タンパク質が特有の酸およびプロテアーゼ耐性を有するためである。バイオカプセルおよび植物組織等の送達ビヒクルを用いて胃および内臓におけるタンパク質の分解を防ぐことも可能である（非特許文献１）。種子に基づくプラットホームはまた、医薬用タンパク質の生物学的集合および産生のために開発されている（非特許文献２）。それらの結果は、生物医薬品の産生および「錠剤種子」経路（’ｓｅｅｄ  ａｓ  ｐｉｌｌ’  ｒｏｕｔｅ）を介した送達のためのビヒクルとしての植物種子の使用は実行可能な選択肢であることを示唆している。
【００１１】
形質転換タバコ中において組み換えヒトＩＧＦ−Ｉおよび組み換えヒトＩＧＦＢＰ−３が産生されており、これらの結果は３件のポスター発表で報告されている（５ｔｈ  Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｒｉｓｋ  Ｆａｃｔｏｒｓ，Ｅａｓｔ  Ｍｅｅｔｓ  Ｗｅｓｔ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２００３（”Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）  ａｎｄ  Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ３（ＩＧＦＢＰ−３）  ｉｎ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｔｏｂａｃｃｏ”）；６４ｔｈ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｅｓｓｉｏｎｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｊｕｎｅ  ２００４（”Ｐｌａｎｔｓ  ａｓ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）  ａｎｄ  Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−３（ＩＧＦＢＰ−３）”）；および２００４  ａｎｎｕａｌ  ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔｓ，Ｊｕｌｙ  ２００４（”Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−３（ＩＧＦＢＰ−３）  ｉｎ  Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｓｅｅｄｓ”）。これらのタンパク質のタバコ苗における産生には、トウモロコシ、イネ、小麦、および大麦等の食用に適した単子葉植物における産生のような利点がない。単子葉植物には、サトウキビ、パイナップル、ナツメヤシ、およびバナナ等の主要食用作物も含まれる。これらの単子葉植物は、食用に適した原料の代表的な増殖源である。
【００１２】
世界の人口の４０％を超える人々によって日々消費されるイネは、世界中の農業に定着しており、製薬上および商業上重要なタンパク質およびワクチンを製造するためのモデルバイオリアクタ（ｍｏｄｅｌ  ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）として認識されている（非特許文献３）。これは、タバコが含有するようなニコチンおよび毒性アルカロイド等の有害化学物質を含有しておらず、アレルギー誘発性が低い。イネ中の組み換えタンパク質は１％粒重まで蓄積可能である。（最大で総種子粒数（ｔｏｔａｌ  ｓｅｅｄ  ｇｒａｉｎ）の９１％となる）イネの胚乳領域における組み換えタンパク質の産生および貯蔵を目的とする特定のプロモーターおよびシグナル配列の使用により、タンパク質蓄積量を粒重の２．７％まで増加することができる（Ｌｉｕ，Ｑ．Ｑ．，Ｔｈｅｓｉｓ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００２）Ｙａｎｇｚｈｏｕ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（中国）およびｔｈｅ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ（香港））。単一のイネ苗は、１０，０００を超える穀粒を生成する分げつを最大で１００個有することが有り、これにより、大量の種子および組み換えタンパク質を迅速に産生することができる。また、早生（１年当たり３〜４回）型のイネｊａｐｏｎｉｃａ亜種は、産生用のバイオリアクター苗（ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ  ｐｌａｎｔｓ）として用いることができる。乾燥種子の貯蔵および流通は単純であり、５ヶ月以上室温で貯蔵を行っても、穀粒中の組み換えタンパク質の収量および活性が著しく損なわれることはない（非特許文献４）。低含水率の条件では、穀粒は生存能力を失うことなく３〜５年貯蔵することができる（Ｈｕａｎｇ，Ｎ．，ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（２００２）Ｊａｎ：５４−５９）。
【００１３】
タンパク質が家畜での使用を対象とする場合には、オート麦等の代替的な穀物中での産生がより適切な場合がある。
【００１４】
過去の研究では、コドン使用頻度の偏りが遺伝子発現レベルと強い相関関係を有することが示されている。高度に発現した遺伝子は、「最適」コドンと呼ばれるコドンのサブセットを優先的に用いる（非特許文献５）。さらに、これらの最適コドンは最も豊富なｔＲＮＡに対応しており、翻訳精度および効率が向上する（非特許文献６）。下記の実施例では、２つの種子貯蔵タンパク質において用いられる植物優先コドンに基づいて、ヒトＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦＢＰ−３のＤＮＡ配列に改変を加え、これらのタンパク質についてイネにおけるタンパク質産生の向上を試みた。形質転換シロイヌナズナ中での高度な発現および安定した蓄積（ＬＲＰおよびＰＮ２Ｓについて、それぞれ、全抽出種子タンパク質の３〜１０％および３〜１５％）が過去の研究において観察されたため、シカクマメ由来のリジンに富んだタンパク質（ＬＲＰ）およびパラダイスナッツ由来のメチオニンに富んだ２Ｓアルブミン（ＰＮ２Ｓ）のコドン使用頻度を改変のベースとして選択した。
【００１５】
下記実施例で用いた標的タンパク質の収量を増大する他の戦略は、細胞のタンパク質分解系による分解を防ぐために、組み換えタンパク質を特定部分に向けることである。小胞体（ＥＲ）分秘経路（ｓｅｃｒｅｔａｒｙ  ｐａｔｈｗａｙ）に導くシグナルペプチド配列、および外来遺伝子のＮおよびＣ末端のＥＲ保持シグナルであるテトラペプチドＫＤＥＬの付着は、一般に、その産物の高度な蓄積に必要とされることが報告されている（非特許文献７；および非特許文献８）。ＫＤＥＬテトラペプチドは、ゴルジ複合体とＥＲ間でリサイクルされる受容体との相互作用によるタンパク質局在化に寄与する。ＫＤＥＬシグナルは、植物ＥＲにおける可溶性タンパク質蓄積に十分である（非特許文献７；非特許文献９；および非特許文献１０）。ＫＤＥＬを含有する構築物で形質転換した細胞中では、ＫＤＥＬを含有しないものよりもｓｃＦｖレベルが６〜１４倍高いことが分かっている（非特許文献１１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｄａｎｉｅｌｌ，Ｈ．ら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．（２００１）６：２１９−２２６
【非特許文献２】Ｓａｒｄａｎａ，Ｒ．Ｋ．ら、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．（２００２）１１：５２１−５３１
【非特許文献３】Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｒ．ら、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．（２０００）９：２７９−２９９
【非特許文献４】Ｓｔｏｇｅｒ，Ｅ．ら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０００）４２：５８３−５９０
【非特許文献５】Ｍｏｒｉｙａｍａ，Ｅ．Ｎ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ（１９９７）４５：５１４−５２３
【非特許文献６】Ｍａｒａｉｓ，Ｇ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ（２００１）５２：２７５−２８０
【非特許文献７】Ｗａｎｄｅｌｔ，Ｃ．Ｉ．ら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．（１９９２）２：１８１−１９２
【非特許文献８】Ｈｅｒｍａｎ，Ｅ．Ｍ．ら、Ｐｌａｎｔａ（１９９０）１８２：３０５−３１２
【非特許文献９】Ｆｒｉｇｅｒｉｏ，Ｌ．ら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ（２００１）１３：１１０９−１１２６
【非特許文献１０】Ｎａｐｉｅｒ，Ｊ．ら、Ｐｌａｎｔａ（１９９７）２０３：４８８−４９４
【非特許文献１１】Ｃｏｎｒａｄ，Ｕ．ら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９８）３８：１０１−１０９
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、経済的かつ実用的な２つの重要な哺乳類タンパク（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦＢＰ−３）源を提供する。ヒト型での産生が好ましい。これらのタンパク質を単子葉植物中で産生することにより、本発明は、初めて、ヒトの治療のための使用または獣医学的状況での使用に適合可能な形態において十分な量での提供が可能である有用なタンパク源を提供する。
【００１８】
よって、１つの局面では、本発明は、ヒトＩＧＦ−Ｉおよび／またはヒトＩＧＦＢＰ−３を産生するように改変された単子葉植物細胞に関する。他の局面では、本発明は、そのような細胞を含む植物または植物部位に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】Ｊａｎｓｅｎ，Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８３）３０６：６０９−６１１で報告されたヒトＩＧＦ−Ｉ（配列番号１）をコードするヌクレオチド配列を示す。
【図２】Ｗｏｏｄ，Ｗ．Ｉ．ら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．（１９８８）２：１１７６−１１８５で報告されたヒトＩＧＦＢＰ−３（配列番号２）をコードするヌクレオチド配列を示す。
【図３】植物におけるコドン選択のために改変されたヒトＩＧＦ−Ｉ（配列番号３）をコードするヌクレオチド配列を示す。
【図４】植物におけるコドン選択に従って改変されたヒトＩＧＦＢＰ−３（配列番号４）のヌクレオチド配列を示す。
【図５】ヒトＩＧＦ−Ｉ（配列番号５）のアミノ酸配列を示す。
【図６】ヒトＩＧＦＢＰ−３（配列番号６）のアミノ酸配列を示す。
【図７】イネで生成したヒトＩＧＦ−ＩのＬ６細胞にラフリングを生じる能力、およびこの作用の商用ヒトＩＧＦＢＰ−３に対する反応を示すアッセイの結果を示す。
【図８】イネで生成したヒトＩＧＦＢＰ−３のＭＣＦ−７細胞の成長を阻害する効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
下記に示すように、２つの重要なヒトタンパク質であるＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦＢＰ−３が単子葉植物中において産生されたのは初めてのことである。単子葉植物は主要な栄養源を含み、有毒化合物を含まないため、ヒトの治療を目的としたタンパク質の産生に理想的である。これらはまた、草食性または雑食性哺乳類を治療する場合において、類似するタンパク質の産生にも理想的である。これらのタンパク質の産生は、これらのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を発現のために適切な制御配列に作動可能に連結した発現系を含むＤＮＡ構築物を適切に設計することにより促進可能である。
【００２１】
植物細胞の遺伝子改変を実施し、無傷植物を再構成する技術は、以前より当該分野において周知である。例えば、Ｇｅｌｖｉｎら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９０））；Ｄａｓｈｅｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９９７）を参照されたい。これに関する最新技術の有用な要約が２００４年１月１４日に公開された米国特許公報２００４／０００９４７６に見られるが、その植物の遺伝子操作のための適切な技術についての開示内容を本明細書中において参考として援用する。
【００２２】
組み換え構築物を含有する形質転換植物細胞が一旦得られると、そこから遺伝子組み換え植物を再生し、所望のタンパク質産生レベルを判断することができる。
【００２３】
植物中における変性ヌクレオチド配列の発現を最適化するためにいくつかの技術を用いることができる。下記の実施例においてさらに説明するように、植物細胞中における発現のためのコドン選択に応じて、コードするヌクレオチド配列に改変を加えることができる。そのような改変は、植物中におけるコドン選択を記載する公開データに基づくものである。次に、コードするヌクレオチド配列を伸長してシグナルおよび保持配列を加え、コードされたタンパク質を小胞体に向け、その保持を行ってもよい。これはまた、収量にも好影響を及ぼす。一般に、シグナル伝達ペプチドは所望のタンパク質のＮ末端に生成され、保持シグナルはそのＣ末端に生成される。
【００２４】
これらの技術を用いることにより、所望のＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦＢＰ−３の収量は目に見えて向上する。
【００２５】
適切なプロモーターを用いて発現を行うことはさらに有用である。例えば、適切なプロモーターとしては、３５Ｓ  ＣａＭＶ、イネアクチンプロモーター、ユビキチンプロモーター、またはノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）プロモーターが挙げられる。種子中での産生を促進する組織特異的プロモーターは種子特異的グルテリンプロモーター（Ｇｔ−１ｐｒｏ）を含むが、他の種子特異的プロモーターを用いてもよい。ノパリンシンターゼ終結シグナル等の終結シグナルを用いてもよい。
【００２６】
下記に示すように、植物最適化コード配列を駆動する２つの構築物群を設計し、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍにより媒介された形質転換によりイネに導入した。一方の構築物群はグルテリンシグナルペプチド（ＳＰ）を単独で含有するが、他方はＳＰとともに標的テトラペプチドＫＤＥＬシグナルを含有する。これらの構築物を合成し、タンパク質の発現を増加させ、貯蔵のためにタンパク質を区画内に入れるとともに、タンパク質安定性を向上させた。種子特異的グルテリンプロモーター（Ｇｔ−１ｐｒｏ）を用いて遺伝子組み換えイネ中におけるＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦＢＰ−３の発現を促進し、導入遺伝子の発現を分析した。遺伝子組み換えイネ穀粒から産生したｒｈＩＧＦ−ＩおよびｒｈＩＧＦＢＰ−３は生物活性を有していた。
【００２７】
上記構築物はまた、後で精製を行えるように、改変を加えてヒスチジン標識またはＦＬＡＧシーケンス等の精製補助物を含むようにしてもよく、かつ／または蛍光タンパク質等のマーカーを含むようにしてもよい。また、コードしたタンパク質と精製標識および／またはマーカー間に切断部位を設けてもよい。所望であれば標準的な精製技術を用いてもよく、または場合によっては、植物組織を経口投与し、植物の栄養価およびその低毒性を利用するようにしてもよい。
【００２８】
組み換え技術によって生成したＩＧＦ−Ｉは、１型または２型糖尿病患者のインスリン必要量を低減し、血糖管理を改善するために用いられる。ＩＧＦＢＰ−３はアポトーシスを引き起こすことが示されており、悪性腫瘍の治療に有用である。よって、所望であれば、組み換え技術によって生成したタンパク質を、これらのタンパク質を用いた治療を必要とする患者に投与するための組成物として製剤化してもよい。タンパク質および他の医薬品を製剤化するための一般的方法は、本明細書において参考として援用するＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｌａｔｅｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）において見ることができる。これらのタンパク質は、典型的には、注射または経皮的もしくは経粘膜的送達により非経口的に全身投与されるか、または経口投与される場合がある。リボソーム製剤、および脂質もしくは高分子等に基づくナノ粒子を含有する製剤を含む、特定の投与方式を対象とする各種の製剤を用いることができる。
【００２９】
以下の実施例は本発明を例示するためのものであり、限定するものではない。
【実施例】
【００３０】
（実施例１）
ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦＢＰ−３構築物を用いたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａの形質転換
ヒトＩＧＦ−Ｉ（図１）およびＩＧＦＢＰ−３（図２）のＤＮＡ配列に、２つの種子貯蔵タンパク質に用いられる優先コドンに基づいて改変を加えた。シカクマメ由来のリジンに富んだタンパク質（ＬＲＰ）およびパラダイスナッツ由来のメチオニンに富んだ２Ｓアルブミン（ＰＮ２Ｓ）のコドン使用頻度（表１）を改変のベースとして選択したが、これは、過去の研究において、形質転換シロイヌナズナ中での高度な発現および安定した蓄積（ＬＲＰおよびＰＮ２Ｓについて、それぞれ全抽出種子タンパク質の３〜１０％および３〜１５％）が観察されたためである。
【００３１】
元のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列（図５および図６）をコードする改変ＩＧＦ−Ｉ（図３）およびＩＧＦＢＰ−３（図４）遺伝子をＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｍｐａｎｙから入手した。ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦＢＰ−３のコドン変化量は、それぞれ、２８．６％および１４．８％であった。
【００３２】
【表１−１】
2010518825.tif 000003
【００３３】
【表１−２】
2010518825.tif 000004
ｒｈＩＧＦ−ＩおよびｒｈＩＧＦＢＰ−３の安定性および収量を向上させるとともに、それらのグリコシル化を制御する構築物を設計した。２つのタンパク質標的シグナルを加え、標的タンパク質をイネ穀粒中の特定の区画に向けた（ゴルジ装置におけるグリコシル化のためのグルテリンシグナルペプチド（ＳＰ）または小胞体内におけるグリコシル化がない安定した蓄積のためのテトラペプチドＫＤＥＬのいずれか）。発現構築物を種子特異的グルテリンプロモーター（Ｇｔ−１ｐｒｏ）により駆動した。キメラ遺伝子構築物の詳細は以下のとおりである。
【００３４】
ＩＧＦ−Ｉ：
１）  （Ｇｔ−１ｐｒｏ）＋ＳＰ＋ＩＧＦ−Ｉ＊＋ＮＯＳｔｅｒ
２）  （Ｇｔ−１ｐｒｏ）＋ＳＰ＋ＩＧＦ−Ｉ＊＋ＫＤＥＬ＋ＮＯＳｔｅｒ
ＩＧＦＢＦ−３：
３）  （Ｇｔ−１ｐｒｏ）＋ＳＰ＋ＩＧＦＢＦ−３＊＋ＮＯＳｔｅｒ
４）  （Ｇｔ−１ｐｒｏ）＋ＳＰ＋ＩＧＦＢＦ−３＊＋ＫＤＥＬ＋ＮＯＳｔｅｒ
ここで、＊はＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦＢＰ−３の改変ｃＤＮＡを示し、ＮＯＳｔｅｒはノパリンシンターゼ停止剤を示す。
【００３５】
キメラ遺伝子カセットをスーパーバイナリーベクターｐＳＢ１３０に挿入し、イネカルスの感染に理想的なＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株（ＥＨＡ１０５）に形質転換した。（Ｃｈｅｎ，Ｈ．ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９４）１６：６６４−６６８、６７０に記載されるように）単純な凍結融解法を用いてＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを形質転換した。抗生物質ハイグロマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を用いて形質転換バクテリアを選択し、ＰＣＲにより標的遺伝子のＤＮＡ形質転換をさらに確認した。
【００３６】
（実施例２）
イネの形質転換、選択、および培養
カルス誘導のためにｊａｐｏｎｉｃａ９９８３の成熟種子の胚盤を切除し、カルス誘導培地（Ｎ６基礎培地、２ｍｇ／ｌの２，４−Ｄ、０．５ｇ／ｌのカゼイン加水分解液、３０ｇ／ｌのスクロース、２．５ｇ／ｌのＰｈｙｔａｇｅｌ（登録商標）、ｐＨ５．８）上で培養した。カルス誘導培地で４〜７日間培養した後すぐに、未熟胚由来のカルスを使用し、標的遺伝子を含有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＥＨＡ１０５と共培養した。
【００３７】
まず、５０ｍｇ／Ｌのリファンピシンおよび５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを添加した３ｍｌのＬＢブロスに、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを２８℃で一晩かけて植菌した後、２５ｍｌのＡＢ培地（３ｇ／ｌのＫ２ＨＰＯ４、１ｇ／ｌのＮａＨ２ＰＯ４、１ｇ／ｌのＮＨ４Ｃｌ、０．３ｇ／ｌのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１５ｇ／ｌのＫＣｌ、１０ｍｇ／ｌのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、２．５ｍｇ／ｌのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、５ｇ／ｌのグルコース、ｐＨ７．２）で５時間かけて継代培養を行い、引き続き、遠心分離および１５〜２５ｍｌのＡＡＭ培地（ＡＡ基礎培地、６８．５ｇ／ｌのスクロース、３６ｇ／ｌのグルコース、０．５ｇ／ｌのカゼイン加水分解液、ｐＨ５．２、１００μｍｏｌ／ｌのアセトシリンゴン）での再懸濁を行った。
【００３８】
イネカルスをＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ培養液に１０〜２０分間室温で浸し、不連続的に振とうした。次に、暗所において、１００μｍｏｌ／ｌのアセトシリンゴンを含有するＮ６Ｄ２Ｃ培地（Ｎ６Ｄ２、１０ｇ／ｌのグルコース、ｐＨ５．２）に３日間かけて２６〜２８℃で感染カルスを移した。共培養後、耐性カルスの選択のために、暗所において、このカルスをＮ６Ｄ２Ｓ培地（Ｎ６Ｄ２、５０ｍｇ／ｌのハイグロマイシンＢ、５００ｍｇ／ｌのセフォタキシム、ｐＨ５．８）上に２６℃で２週間静置した後、新たに形成された耐性カルスが現れるまで新たなＮ６Ｄ２Ｓ培地で培養を行った。
【００３９】
次に、ＨＧＰＲ培地（Ｈｉｇｒｏｗ（登録商標）イネ培地（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）、５０ｍｇ／ｌのハイグロマイシンＢ、２００ｍｇ／ｌのセフォタキシム）上に、暗所において７日間と、明所において７日間２６℃で耐性カルスを静置した。再生前処理（ｐｒｅ−ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）後、再生のために、ＭＳＲ培地（ＭＳ基礎培地、３０ｇ／ｌのスクロース、０．５ｇ／ｌのカゼイン加水分解液、２ｍｇ／ｌの６−ＢＡ、０．５ｍｇ／ｌのＮＡＡ、０．５ｍｇ／ｌのＫＴ、ｐＨ５．８、５０ｍｇ／ｌのハイグロマイシンＢ、５００ｍｇ／ｌのセフォタキシム、２．５ｇ／ｌのＰｈｙｔａｇｅｌ（登録商標））に耐性カルスを２６℃で明所において１６時間／暗所において８時間かけて移した。
【００４０】
再生芽が出てくると、発根のために、それらを１／２倍量のＭＳＨ培地（１／２倍量のＭＳマクロ塩、Ｆｅ−ＥＤＴＡおよびミクロ塩、ＭＳビタミン、３０ｇ／ｌのスクロース、０．５ｍｇ／ｌのＮＡＡ、ｐＨ５．８、５０ｍｇ／ｌのハイグロマイシンＢ、５００ｍｇ／ｌのセフォタキシム、２．５ｇ／ｌのＰｈｙｔａｇｅｌ（登録商標））上に静置した。最後に、遺伝子組み換えイネ胚を土壌に移し、温室で栽培した。
【００４１】
（実施例３）
遺伝子組み換えイネの分析
サザンブロット分析
遺伝子組み換えイネ苗を分析し、イネゲノムへの標的遺伝子の組込みを確認した。臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）法により葉ゲノムＤＮＡを抽出した（Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｄ．ら、Ｆｏｃｕｓ（１９９０）１２：１３−１５）。１５μｇのゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩを用いて一晩かけて消化し、０．８％のアガロースゲル上で分離し、ＶａｃｕＧｅｎｅＸＬ真空ブロッティングシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて正に帯電したナイロン膜（Ｒｏｃｈｅ）に移した。ＤＩＧ核酸検出キット（Ｒｏｃｈｅ）に記載の方法に従ってハイブリダイゼーションおよび検出を行った。ＤＩＧ  ＤＮＡ標識キット（Ｒｏｃｈｅ）を用いてＰＣＲにより二本鎖ＤＩＧ標識ＤＮＡプローブ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦＢＰ−３）を準備した。これらのプローブを使用前に９９℃で加熱して変性させた。
【００４２】
この結果、イネゲノム中に構築物の存在が確認できた。
【００４３】
ウエスタンブロット分析
種子をすりつぶして粉末状にし、タンパク質抽出緩衝液（５０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ６．８、０．１ＭのＮａＣｌ、および１０％ＳＤＳ）と混合することにより全種子タンパク質を成熟イネ種子から抽出した。遠心分離した後、上澄液を新しいエッペンドルフチューブに移し、種子全タンパク質抽出液として保存した。次に、異なる量の全タンパク質を１７％トリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で分解し、ＰＶＤＦ膜上にブロットした。抗ヒトＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦＢＰ−３ポリクローナル抗体を用いてウエスタンブロット分析を行った。最後に、Ａｕｒｏｒａ（登録商標）Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＩＣＮ）のマニュアルに記載のとおり、化学発光Ｓｔａｒｌｉｇｈｔ（登録商標）基質（ＩＣＮ）を用いてブロットの非放射性検出を行った。
【００４４】
その結果、種子抽出液中にＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦＢＰ−３タンパク質の両方の存在が確認できた。
【００４５】
（実施例４）
イネで生成したｒｈＩＧＦ−Ｉの生物活性
インスリンと同様に、ＩＧＦ−Ｉは、筋細胞中で膜ラッフルおよびグルコース摂取を生じることが示されている。ＩＧＦＢＰ−３は、ＩＧＦ−Ｉと結合して、ＡＬＳ複合体を形成することができ、これにより、ＩＧＦ−Ｉにより生じた膜ラフリング作用が阻害される。イネで生成した組み換えｈＩＧＦ−Ｉをインスリンと同時にテストし、それらの生物活性を比較した。
【００４６】
ｃ−ｍｙｃエピトープ標識したグルコーストランスポーター４（ＧＬＵＴ４）を発現するラットＬ６骨格筋細胞（Ｌ６ｍｙｃ細胞）を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％（ｖ／ｖ）抗生物質−抗真菌薬溶液（１００Ｕ／ｍｌのペニシリンＧ、１０ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、および２５ｍｇ／ｍｌのアンフォテリシンＢ）を含有するα−最小必須培地において３７℃の５％ＣＯ２雰囲気で筋芽細胞単層培養を維持した。０．２５％トリプシンを用いてサブコンフルエント培地のトリプシン処理により細胞を継代培養した。筋管への分化のために、４×１０４程度の細胞数／ｍｌで２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含有する培地で筋芽細胞を培養し、自然融合させた。４８時間ごとに培地を交換し、培養後５〜７日間筋管を用いた。次に、６ウェルプレートに載せた２５ｍｍ径のガラスカバースリップ上でラットＬ６筋細胞を筋管の段階まで培養した。
【００４７】
３時間かけて筋管から血清を抜き、遺伝子組み換えイネから抽出したｒｈＩＧＦ−ＩおよびｒｈＩＧＦＢＰ−３を異なる濃度および組み合わせで１０分間かけて３７℃で処理した。これらのインキュベーションの後、筋管を３％（ｖ／ｖ）氷冷パラホルムアルデヒドＰＢＳ溶液で２０分間かけて凝固させた後、０．１ＭグリシンのＰＢＳ溶液で１０分間洗浄し、０．１％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００のＰＢＳ溶液で３分間透過処理した後、ＰＢＳで洗浄した。筋管を０．１％ＢＳＡ中で１時間塞いだ後、ファロイジン（０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ中で１：５００）中でインキュベーションを行った。このインキュベーションの後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ガラススライド上にＰｒｏＬｏｎｇ（登録商標）アンチフェード溶液として載せた。Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｌａｎ２イメージング顕微鏡およびＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０  ＭＥＴＡレーザー走査共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてサンプルを検査した。
【００４８】
遺伝子組み換えＩＧＦ−Ｉイネの粗タンパク質によりＬ６細胞の膜ラッフルが生じるが、そのラフリング作用は商用ｈＩＧＦＢＰ−３により大幅に低減することが可能である。これらの結果を図７に示す。図７に示すように、イネで生成したＩＧＦ−１は、１．２５ｍｇおよび５ｍｇで用量依存的にラフリングを生じる。この活性は、１２ｎＭ濃度の市販のＩＧＦＢＰ−３によって阻害された。
【００４９】
（実施例５）
イネで生成したｒｈＩＧＦＢＰ−３タンパク質の抗癌活性
ヒトＩＧＦＢＰ−３は、エストロゲン依存性および非依存性乳癌細胞の増殖を阻害することが示されている。イネで生成したｒｈＩＧＦＢＰ−３が制癌作用を有するか否かを検査するために、ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞を用いた。
【００５０】
１％ペニシリンおよびストレプトマイシン、０．１％ファンギゾム（ｆｕｎｇｉｚｏｍｅ）を５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）とともに添加したイーグル最小必須培地にＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞を通法により３７℃の５％ＣＯ２加湿雰囲気に維持した。ｒｈＩＧＦＢＰ−３の処理のために、ＭＣＦ−７細胞を血清含有培地で９６ウェルプレートに播種した。１日後、それらの細胞に、ｒｈＩＧＦＢＰ−３を含有するイネ形質転換体から抽出した異なる濃度の粗タンパク質を加えた。粗タンパク質抽出液を３日おきに新しいものと２度交換した。
【００５１】
７日間処理した後、ＭＴＴアッセイのために細胞を採取した。簡単に言えば、２０μｌのＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−臭化ジフェニルテトラゾリウム（ｄｉｐｈｅｎｙｌ  ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）溶液（５ｍｇ／ｍｌＭＴＴのＨＰＢＳ溶液、ｐＨ７．４）を各ウェルに加え、さらに３７℃で２時間かけてインキュベートした。１００μｌの酸イソプロパノールを各ウェルに加えて細胞を分解し、その紫色の結晶を溶解した。マイクロプレート分光光度計をＯＤ５７０で用いて、各ウェルにおける紫色の強度を測定した。
【００５２】
図８に示すように、イネで生成したＩＧＦＢＰ−３は、１．５６ｍｇおよび３．１２５ｍｇの濃度で用量依存的にＭＣＦ−７細胞の成長阻害を向上させることができた。
【００５３】
（実施例６）
組み換え技術によって生成したタンパク質の精製
親和性クロマトグラフィーを用いて上記実施例に記載の粗抽出液をさらに精製する。ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦＢＰ−３の各々をクロマトグラフィーカラムに塗布し、さらに精製するために、これらのカラムをそれぞれの抗体に結合する。カラムを介して不純物を洗浄し、ｐＨおよび塩濃度を調節してタンパク質を溶出する。
【００５４】
マーカータンパク質を含むように実施例１の構築物に改変を加えて精製を簡略化する。
【００５５】
（実施例７）
組み換えタンパク質収量の向上
実施例２に記載の苗から種子を得て、第２および第３世代の作物を得るために移植する。収量が向上した組み換えＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦＢＰ−３が得られる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2010518825.tif 000011
【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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