(57)【要約】本発明は、ポリマーｓｉＲＮＡ複合体を提供する。本複合体を用いる、ｉｎ ｖｉｖｏ およびｉｎ ｖｉｔｒｏにおける遺伝子発現のダウンレギュレーション、およびがん細胞の増殖の阻害のための方法についても開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）の化合物であって：
Ａ−Ｒ１−（Ｒ２）ｅ−Ｒ３
ここで、
Ａがキャップ基またはＲ'３−（Ｒ'２）ｅ'−であり；
Ｒ１が実質的に非抗原性の水溶性ポリマーであり；
Ｒ２およびＲ'２が独立して選択される遊離可能なリンカーまたは永続的リンカー、もしくはその組合せであり；
Ｒ３およびＲ'３が、同一のまたは異なるｓｉＲＮＡ含有部分であり；
（ｅ）および（ｅ'）が、同一のまたは異なる正の整数である、
化合物。
【請求項２】
Ｒ２がｓｉＲＮＡ含有部分のセンス鎖に結合していることを特徴とする、請求項１の複合体。
【請求項３】
ＡがＨ、ＮＨ２、ＯＨ、ＣＯ２Ｈ、Ｃ１−６アルコキシおよびＣ１−６アルキルから成る群より選択されることを特徴とする、請求項１の複合体。
【請求項４】
式：
Ｒ'３−（Ｒ'２）ｅ'−Ｒ１−（Ｒ２）ｅ−Ｒ３
を有する、請求項１の複合体。
【請求項５】
Ｒ２およびＲ'２が、ベンジル脱離系のリンカー、トリアルキルロック系のリンカー、ビシン系のリンカー、酸不安定性リンカー、リソソームで切断可能なペプチドおよびカプテプシン（capthepsin）Ｂ切断可能ペプチドから成る群より独立して選択されることを特徴とする、請求項１の複合体。
【請求項６】
Ｒ２およびＲ'２が、
【化１−１】
2010510810.tif 000031
【化１−２】
2010510810.tif 000032
から成る群より独立して選択され、
ここで、
Ｙ１１−１９は独立してＯ、ＳまたはＮＲ４８であり；
Ｒ３１−４８、Ｒ５０−５１およびＡ５１は独立して、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−１２分枝アルキル、Ｃ３−８シクロアルキル、Ｃ１−６置換アルキル、Ｃ３−８置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、Ｃ１−６ヘテロアルキル、置換Ｃ１−６ヘテロアルキル、Ｃ１−６アルコキシ、フェノキシおよびＣ１−６ヘテロアルコキシから成る群より選択され；
Ａｒはアリールまたはヘテロアリール部分であり；
Ｌ１１−１５は独立して選択される二官能性スペーサーであり；
ＪおよびＪ’は独立して、標的細胞内へ能動輸送される部分または
【化２】
2010510810.tif 000033
であり、
ここで、
Ｌ３は二官能性リンカーであり；
Ｙ４はＯ、ＳまたはＮＲ１１であり；
Ｒ１１は、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−１２分枝アルキル、Ｃ３−８シクロアルキル、Ｃ１−６置換アルキル、Ｃ３−８置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、Ｃ１−６ヘテロアルキル、置換Ｃ１−６ヘテロアルキル、Ｃ１−６アルコキシ、フェノキシおよびＣ１−６ヘテロアルコキシから成る群より選択され；
（ｃ１１）、（ｈ１１）、（ｋ１１）、（ｌ１１）、（ｍ１１）および（ｎ１１）は独立して選択される正の整数であり；
（ａ１１）、（ｅ１１）、（ｇ１１）、（ｊ１１）、（ｏ１１）および（ｑ１１）は独立して、ゼロまたは正の整数であり；
（ｂ１１）、（ｘ１１）、（ｘ’１１）、（ｆ１１）、（ｉ１１）および（ｐ１１）は独立してゼロまたは１である
ことを特徴とする、請求項１の複合体。
【請求項７】
Ｒ２およびＲ'２が、
【化３−１】
2010510810.tif 000034
【化３−２】
2010510810.tif 000035
から成る群より独立して選択され、
ここで、
Ｒ２１−２９は独立して、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−１２分枝アルキル、Ｃ３−８シクロアルキル、Ｃ１−６置換アルキル、Ｃ３−８置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、Ｃ１−６ヘテロアルキル、置換Ｃ１−６ヘテロアルキル、Ｃ１−６アルコキシ、フェノキシおよびＣ１−６ヘテロアルコキシから成る群より選択され；
（ｔ）および（ｔ’）は独立して、ゼロまたは正の整数であり；
（ｖ）および（ｖ’）は独立してゼロまたは１である
ことを特徴とする、請求項１の複合体。
【請求項８】
Ｒ２およびＲ'２が、独立して選択されるアミノ酸またはアミノ酸誘導体であることを特徴とする、請求項１の複合体。
【請求項９】
Ｒ２およびＲ'２が、
【化４】
2010510810.tif 000036
から成る群より独立して選択されることを特徴とする、請求項１の複合体。
【請求項１０】
（ｅ）および（ｅ'）が独立して１または２であることを特徴とする、請求項１の複合体。
【請求項１１】
Ｒ１が、直鎖、末端分枝またはマルチアームのポリアルキレンオキサイドを含むことを特徴とする、請求項１の複合体。
【請求項１２】
前記ポリアルキレンオキサイドが、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールから成る群より選択されることを特徴とする、請求項１１の複合体。
【請求項１３】
前記ポリアルキレンオキサイドが、
【化５】
2010510810.tif 000037
から成る群より選択され、
ここで、
Ｙ７１およびＹ７３が独立してＯ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、ＮＲ７３または結合であり；
Ｙ７２がＯ、Ｓ、またはＮＲ７４であり；
Ｒ７１−７４が、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ３−１９分枝アルキル、Ｃ３−８シクロアルキル、Ｃ１−６置換アルキル、Ｃ２−６置換アルケニル、Ｃ２−６置換アルキニル、Ｃ３−８置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、Ｃ１−６ヘテロアルキル、置換Ｃ１−６ヘテロアルキル、Ｃ１−６アルコキシ、アリールオキシ、Ｃ１−６ヘテロアルコキシ、ヘテロアリールオキシ、Ｃ２−６アルカノイル、アリールカルボニル、Ｃ２−６アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、Ｃ２−６アルカノイルオキシ、アリールカルボニルオキシ、Ｃ２−６置換アルカノイル、置換アリールカルボニル、Ｃ２−６置換アルカノイルオキシ、置換アリールオキシカルボニル、Ｃ２−６置換アルカノイルオキシおよび置換アリールカルボニルオキシから成る群より独立して選択され；
（ａ２）および（ｂ２）が独立してゼロまたは正の整数であり；
（ｎ）が約１０〜約２３００の整数である
ことを特徴とする、請求項１１の複合体。
【請求項１４】
前記ポリアルキレンオキサイドが式−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−のポリエチレングリコールであり、
ここで、（ｎ）が約１０〜約２，３００の整数である
ことを特徴とする、請求項１１の複合体。
【請求項１５】
Ｒ１が約２，０００〜約１００，０００の平均分子量を有することを特徴とする、請求項１の複合体。
【請求項１６】
Ｒ１が約５，０００〜約６０，０００の平均分子量を有することを特徴とする、請求項１の複合体。
【請求項１７】
Ｒ１が約２０，０００〜約４５，０００の平均分子量を有することを特徴とする、請求項１の複合体。
【請求項１８】
前記ｓｉＲＮＡ含有部分のアンチセンス鎖が、標的遺伝子と相補的な約１８から約２８ヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１の複合体。
【請求項１９】
前記ｓｉＲＮＡ含有部分のアンチセンス鎖が、配列番号：１の核酸配列と相補的な約１８から約２８ヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１の複合体。
【請求項２０】
前記ｓｉＲＮＡ含有部分のアンチセンス鎖が、配列番号：３の核酸配列を含むことを特徴とする、請求項１の複合体。
【請求項２１】
【化６−１】
2010510810.tif 000038
【化６−２】
2010510810.tif 000039
から成る群より選択され、
前記ｓｉＲＮＡ含有部分のセンス鎖が、前記ポリマーと複合体化されている
ことを特徴とする、請求項１の複合体。
【請求項２２】
【化７】
2010510810.tif 000040
から成る群より選択され、
ここで、
ｓｉＲＮＡが配列番号：２または３の核酸配列を含み；
前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖の５'末端がＰＥＧリンカーと複合体化するため、Ｃ６−アミノ尾部に修飾されている
ことを特徴とする、請求項１の複合体。
【請求項２３】
前記酸不安定性リンカーが、ジスルフィドリンカー、ヒドラゾン含有リンカーおよびチオプロピオネート含有リンカーから成る群より選択されることを特徴とする、請求項５の複合体。
【請求項２４】
ヒト細胞または組織を、請求項１の複合体と接触させる工程を有してなる、ヒト細胞または組織における遺伝子発現を阻害する方法。
【請求項２５】
前記細胞または組織が、がん細胞または組織であることを特徴とする、請求項２５の方法。
【請求項２６】
前記細胞または組織を化学療法剤と接触させる工程をさらに有してなる、請求項２６の方法。
【請求項２７】
ＢＣＬ２の発現が阻害されることを特徴とする、請求項２５の方法。
【請求項２８】
前記ｓｉＲＮＡ含有部分のアンチセンス鎖が配列番号：１の核酸配列と相補的な約１８から約２８ヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項２８の方法。
【請求項２９】
前記複合体が、
【化８】
2010510810.tif 000041
から成る群より選択されることを特徴とする、請求項２８の方法。
【請求項３０】
請求項１の複合体と共にがん細胞を含む、がん細胞の成長または増殖を阻害する方法。
【請求項３１】
前記ｓｉＲＮＡ含有部分のアンチセンス鎖が配列番号：１の核酸配列と相補的な約１８から約２８ヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項３１の方法。
【請求項３２】
前記、複合体が
【化９】
2010510810.tif 000042
から成る群より選択されることを特徴とする、請求項３１の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の説明】
【０００１】
本出願は、それぞれ参照することにより本開示に含まれる、２００６年１１月２７日出願の米国仮特許出願第６０／８６１，３８２号および２００７年４月１３日出願の米国仮特許出願第６０／９１１，７３９号の優先権の利益を主張する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、ポリマーｓｉＲＮＡ複合体に関する。
【背景技術】
【０００３】
小分子干渉ＲＮＡまたは低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は２本鎖ＲＮＡ分子である。ｓｉＲＮＡは遺伝子発現に干渉し、当該遺伝子から発現されるｍＲＮＡの分解を誘導する。したがって、ｓｉＲＮＡによって媒介されるＲＮＡ干渉は、ここ数年、潜在的に強力な抗がん治療剤として出現している。治療薬としての低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の開発は、しかし、その非効率なデリバリー、低い安定性および不十分な薬物動態（ＰＫ）プロファイルのために限定されている。
【０００４】
ｓｉＲＮＡを治療薬として用いるためのハードルを克服するためにいくつかの提案がなされている。デリバリーを改善してｓｉＲＮＡの細胞取り込みを促進するためのそのような試みの１つは、リポソームおよびナノ粒子を利用することを対象としている。非特許文献１；非特許文献２を参照。他の試みは、ヒアルロン酸ナノゲルなどのポリマーの使用を含む。非特許文献３を参照。あるいは、ｓｉＲＮＡのデリバリーを改善するための他の試みでは、ｓｉＲＮＡのデリバリーを改善する試みにトランスフェクション剤が用いられる。非特許文献４を参照。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｙａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０：７７２１−７７２６
【非特許文献２】Ｂａｒｔｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，１８：４５６−４６８
【非特許文献３】Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，"Ｔａｒｇｅｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｉＲＮＡ Ｕｓｉｎｇ Ｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ Ａ ｃｉｄ Ｎａｎｏｇｅｌｓ"，ｉｎ ｐｒｅｓｓ，２００７
【非特許文献４】Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，"Ａｎ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｍｅｔｈｏｄ Ｆｏｒ ｓｉＲＮＡ Ｂｙ Ａｎ Ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｒｉｃｈ Ｐｅｐｔｉｄｅ"，ｉｎ ｐｒｅｓｓ，２００７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、トランスフェクションは、治療用ｓｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏの使用には望ましくない。現在のところは、直接的な区画内注射が主な投与経路である。試みおよび進歩にもかかわらず、依然としてｓｉＲＮＡの改善されたデリバリーシステムを提供することが必要とされている。本発明はこの必要性に対処する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の問題を克服するため、およびｓｉＲＮＡデリバリーのための技術を改善するため、新規のポリマーｓｉＲＮＡデリバリーシステムを提供する。
【０００８】
本発明の１つの態様では、式（Ｉ）のｓｉＲＮＡ複合体が提供され：
Ａ−Ｒ１−（Ｒ２）ｅ−Ｒ３
ここで、
Ａはキャップ基またはＲ'３−（Ｒ'２）ｅ'−を含み；
Ｒ１は実質的に非抗原性の水溶性ポリマーを含み；
Ｒ２およびＲ'２は独立して選択される遊離可能なまたは永続的リンカーまたはその組み合わせであり；
Ｒ３およびＲ'３は、同一のまたは異なるｓｉＲＮＡ含有部分であり；
（ｅ）および（ｅ'）は、同一のまたは異なる正の整数であり、好ましくは１または２である。
【０００９】
好ましくは、Ｒ２および、存在する場合は、Ｒ'２は、ｓｉＲＮＡ含有部分のセンス鎖に結合している。
【００１０】
本発明の好ましい態様では、ｓｉＲＮＡ含有部分は、本明細書に記載の化合物のポリマー部分と、遊離可能なリンカーを介して結合している。あるいは、遊離可能なリンカーは、好ましくは細胞内不安定性リンカーおよび／または酸不安定性リンカーである。
【００１１】
本発明の別の好ましい態様では、たとえばＢＣＬ２について、遺伝子発現を阻害する方法が提供される。当該方法は、がん細胞または組織などのヒト細胞を、本明細書に記載されるＰＥＧ−ｓｉＲＮＡ複合体と接触させることを含む。当該複合体は、ヒト細胞および組織中の処理されている細胞において、ＢＣＬ２ ｍＲＮＡまたはタンパク質のダウンレギュレーションを媒介する。
【００１２】
さらに別の好ましい態様では、本明細書に記載されるＰＥＧ−ｓｉＲＮＡ複合体を用いた治療は、ＢＣＬ２ ｍＲＮＡの抑制的調節を可能にし、それとともに、がん細胞の増殖の阻害などの悪性疾患の治療において付随的な利益を可能にする。そのような治療法は、単回治療として、または１つ以上の有用なおよび／または承認された治療との併用療法の一部として、実施されうる。
【００１３】
本発明の１つの長所は、カスタマイズされた遊離可能ＰＥＧリンカー技術がｓｉＲＮＡ分子のｉｎ ｖｉｖｏ投与のための方法を提供する点である。このデリバリー技術は、ｓｉＲＮＡの生物安定性および治療効果の向上を可能にする。
【００１４】
本明細書に記載されるｓｉＲＮＡ複合体は、体液中でｓｉＲＮＡを安定化する。理論に縛られることなく、当該複合体が、ヌクレアーゼに対する耐性の上昇を通じて、ｓｉＲＮＡの安定性を少なくとも部分的に高めると考えられている。ポリマーｓｉＲＮＡ複合体もまた緩衝液条件下で安定である。さらに、ｓｉＲＮＡは複合体の一部であるため、ｓｉＲＮＡは身体から時期尚早に排泄されない。
【００１５】
もう１つの長所は、本明細書に記載される複合体が、ｓｉＲＮＡの薬物動態特性の調節を可能にすることである。ポリマー複合体からのｓｉＲＮＡの放出速度／部位は改変されうる。本明細書に記載されるポリマーに結合したｓｉＲＮＡは、所定のおよび予測可能な速度で放出でき、それによって当業者が治療用ｓｉＲＮＡの所望のバイオアベイラビリティの達成を可能にする。負に荷電した治療用ｓｉＲＮＡの放出部位もまた改変、すなわち細胞のさまざまな区画で放出されうる。したがって、本明細書に記載されるポリマーデリバリーシステムは、十分な量の治療用ｓｉＲＮＡを、目的の標的範囲、すなわち細胞質にて選択的に利用可能にさせる。特に、ｓｉＲＮＡはセンス鎖を介してポリマーと複合体化しているため、ｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、細胞質の酸性環境でｓｉＲＮＡ２本鎖から解離し、所望のＲＮＡ干渉を誘導しうる。アンチセンス鎖は、ポリマー複合体化によっては完全に邪魔されない。単独で、および治療剤の放出と組み合わせた、時間的および空間的改変は、疾患の治療にとって有利である。
【００１６】
本発明の他の長所は、本明細書に記載される複合体が、トランスフェクション剤の非存在下で、がん細胞において、細胞取り込み、および特異的ｍＲＮＡダウンレギュレーションを可能にすることである。これは先行技術に対して顕著な長所であり、したがって、治療計画を顕著に単純化する。この技術は治療用ｓｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ投与に適用することができる。
【００１７】
他の、およびさらなる長所は、下記の説明から明らかになるであろう。
【００１８】
本発明の目的では、「残基」の語は、化合物、すなわちＰＥＧ、オリゴヌクレオチドなどの、別の化合物との置換反応を受けた後に残る部分をいうことを意味すると解されるものとする。
【００１９】
本発明の目的では、「ポリマー残基」または「ＰＥＧ残基」の語は、それぞれポリマーまたはＰＥＧの、他の化合物、部分などとの反応に供された後に残る部分を意味すると解されるものとする。
【００２０】
本発明の目的では、本明細書で用いられる「アルキル」の語は、直鎖、分枝鎖、および環状アルキル基を含む、飽和脂肪族炭化水素をいう。「アルキル」の語はまた、アルキル−チオ−アルキル、アルコキシアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、Ｃ１−６ヒドロカルボニル基を含む。アルキル基は１から１２個の炭素を有することが好ましい。炭素約１から７個がより好ましく、さらには炭素約１から４個の低級アルキルがより好ましい。アルキル基は置換または非置換でありうる。置換されている場合は、置換基は、ハロ、オキシ、アジド、ニトロ、シアノ、アルキル、アルコキシ、アルキル−チオ、アルキル−チオ−アルキル、アルコキシアルキル、アルキルアミノ、トリハロメチル、ヒドロキシル、メルカプト、ヒドロキシ、シアノ、アルキルシリル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、アルケニル、アルキニル、Ｃ１−６ヒドロカルボニル、アリール、およびアミノ基が好ましい。
【００２１】
本発明の目的では、ここで用いられる「置換」の語は、官能基または化合物に含まれる１つ以上の原子を、ハロ、オキシ、アジド、ニトロ、シアノ、アルキル、アルコキシ、アルキル−チオ、アルキル−チオ−アルキル、アルコキシアルキル、アルキルアミノ、トリハロメチル、ヒドロキシル、メルカプト、ヒドロキシ、シアノ、アルキルシリル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、アルケニル、アルキニル、Ｃ１−６ヒドロカルボニル、アリール、およびアミノ基の群からの部分の１つと付加またはそれで置き換えることをいう。
【００２２】
ここで用いられる「アルケニル」の語は、直鎖、分枝鎖、および環状基を含む、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む基をいう。アルケニル基は約２から１２個の炭素を有することが好ましい。炭素約２から７個、さらにより好ましくは炭素約２から４個の低級アルケニルであることがより好ましい。アルケニル基は置換または非置換でありうる。置換されている場合は、置換基は、ハロ、オキシ、アジド、ニトロ、シアノ、アルキル、アルコキシ、アルキル−チオ、アルキル−チオ−アルキル、アルコキシアルキル、アルキルアミノ、トリハロメチル、ヒドロキシル、メルカプト、ヒドロキシ、シアノ、アルキルシリル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、アルケニル、アルキニル、Ｃ１−６ヒドロカルボニル、アリール、およびアミノ基が好ましい。
【００２３】
ここで用いられる「アルキニル」の語は、直鎖、分枝鎖、および環状基を含む、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む基をいう。アルキニル基は約２から１２個の炭素を有することが好ましい。炭素約２から７個、さらにより好ましくは炭素約２から４個の低級アルキニルであることがより好ましい。アルキニルは置換または非置換でありうる。置換されている場合は、置換基は、ハロ、オキシ、アジド、ニトロ、シアノ、アルキル、アルコキシ、アルキル−チオ、アルキル−チオ−アルキル、アルコキシアルキル、アルキルアミノ、トリハロメチル、ヒドロキシル、メルカプト、ヒドロキシ、シアノ、アルキルシリル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、アルケニル、アルキニル、Ｃ１−６ヒドロカルボニル、アリール、およびアミノ基が好ましい。「アルキニル」の例として、プロパルギル、プロピン、および３−ヘキシンが挙げられる。
【００２４】
ここで用いられる「アリール」の語は、少なくとも１つの芳香族環を含む、芳香族炭化水素環系をいう。芳香族環は、随意的に、他の芳香族炭化水素環または非芳香族炭化水素環と融合または結合されうる。アリール基の例としては、たとえば、フェニル、ナフチル、１，２，３，４−テトラヒドロナフタレンおよびビフェニルが挙げられる。アリール基の好ましい例として、フェニルおよびナフチルが挙げられる。
【００２５】
「シクロアルキル」の語は、本明細書では、Ｃ３−８環状炭化水素のことをいう。シクロアルキルの例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルおよびシクロオクチルが挙げられる。
【００２６】
「シクロアルケニル」の語は、本明細書では、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含むＣ３−８環状炭化水素のことをいう。シクロアルケニルの例としては、シクロペンテニル、シクロペンタジエニル、シクロヘキセニル、１，３−シクロヘキサジエニル、シクロヘプテニル、シクロヘプタトリエニル、およびシクロオクテニルが挙げられる。
【００２７】
「シクロアルキルアルキル」の語は、本明細書では、Ｃ３−８シクロアルキル基で置換されたアルキル基のことをいう。シクロアルキルアルキル基の例としては、シクロプロピルメチルおよびシクロペンチルエチルが挙げられる。
【００２８】
「アルコキシ」の語は、本明細書では、酸素架橋を介して親分子部分と結合している、示された炭素原子数のアルキル基をいう。アルコキシ基の例としては、たとえば、メトキシ、エトキシ、プロポキシおよびイソプロポキシが挙げられる。
【００２９】
「アルキルアリール」基は、本明細書では、アルキル基で置換されたアリール基をいう。
【００３０】
「アラルキル」基は、本明細書では、アリール基で置換されたアルキル基をいう。
【００３１】
「アルコキシアルキル」基の語は、本明細書では、アルコキシ基で置換されたアルキル基をいう。
【００３２】
「アルキル−チオ−アルキル」の語は、本明細書では、アルキル−Ｓ−アルキルチオエーテル、たとえばメチルチオメチルまたはメチルチオエチルをいう。
【００３３】
「アミノ」の語は、本明細書では、１つ以上の水素ラジカルが有機ラジカルによって置換されたアンモニアから生じる、本分野で公知の通りの窒素含有基をいう。たとえば、「アシルアミノ」および「アルキルアミノ」の語は、それぞれアシルおよびアルキル置換基を有する特定のＮ−置換有機ラジカルをいう。
【００３４】
「アルキルカルボニル」の語は、本明細書では、アルキル基で置換されたカルボニル基をいう。
【００３５】
「ハロゲン」または「ハロ」の語は、本明細書では、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素をいう。
【００３６】
「ヘテロシクロアルキル」の語は、本明細書では、窒素、酸素、および硫黄から選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含む非芳香族環系をいう。ヘテロシクロアルキル環は、随意的に、他のヘテロシクロアルキル環および／または非芳香族炭化水素環と融合または付加されうる。好ましいヘテロシクロアルキル基は、３〜７員である。ヘテロシクロアルキル基の例は、たとえば、ピペラジン、モルホリン、ピペリジン、テトラヒドロフラン、ピロリジン、およびピラゾールを含む。好ましいヘテロシクロアルキル基は、ピペリジニル、ピペラジニル、モルホリニル、およびピロリジニルを含む。
【００３７】
「ヘテロアリール」の語は、本明細書では、窒素、酸素、および硫黄から選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含む芳香族環系をいう。ヘテロアリール環は、１つ以上のヘテロアリール環、芳香族または非芳香族炭化水素環またはヘテロシクロアルキル環と融合または付加されうる。ヘテロアリール基の例は、たとえば、ピリジン、フラン、チオフェン、５，６，７，８−テトラヒドロイソキノリンおよびピリミジンを含む。ヘテロアリール基の好ましい例としては、チエニル、ベンゾチエニル、ピリジル、キノリル、ピラジニル、ピリミジル、イミダゾリル、ベンズイミダゾリル、フラニル、ベンゾフラニル、チアゾリル、ベンゾチアゾリル、イソキサゾリル、オキサジアゾリル、イソチアゾリル、ベンズイソチアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピロリル、インドリル、ピラゾリル、およびベンゾピラゾリルが挙げられる。
【００３８】
「ヘテロ原子」の語は、本明細書では、窒素、酸素、および硫黄をいう。
【００３９】
一部の実施の形態では、置換アルキルはカルボキシアルキル、アミノアルキル、ジアルキルアミノｓ、ヒドロキシアルキルおよびメルカプトアルキルを含み；置換アルケニルはカルボキシアルケニル、アミノアルケニル、ジアルケニルアミノ、ヒドロキシアルケニルおよびメルカプトアルケニルを含み；置換アルキニルはカルボキシアルキニル、アミノアルキニル、ジアルキニルアミノ、ヒドロキシアルキニルおよびメルカプトアルキニルを含み；置換シクロアルキルは４−クロロシクロヘキシルなどの部分を含み；アリールはナフチルなどの部分を含み；置換アリールは３−ブロモフェニルなどの部分を含み；アラルキルはトリル（tolyl）などの部分を含み；ヘテロアルキルはエチルチオフェンなどの部分を含み；置換ヘテロアルキルは３−メトキシ−チオフェンなどの部分を含み；アルコキシはメトキシなどの部分を含み；フェノキシは３−ニトロフェノキシなどの部分を含む。ハロはフルオロ、クロロ、ヨードおよびブロモを含むと解されるものとする。
【００４０】
本発明の目的では、「正の整数」は、当業者に理解されるように、当業者によって合理性の範囲内であるとされるべき、１以上の整数を含むと解され、すなわち、好ましくは１〜約１０であり、一部の実施の形態では、より好ましくは１または２である。
【００４１】
本発明の目的では、「結合した」の語は、１つの基が別の基に、共有的（好ましい）または 非共有的に付加すること、すなわち化学反応の結果と解されるものとする。
【００４２】
本発明の目的では、「有効量」および「十分量」の語は、当業者に理解される効果として所望の効果または治療効果を達成する量を意味するものとする。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、実施例１に記載される合成の方法を図式的に示す。
【図２】図２は、実施例２に記載される合成の方法を図式的に示す。
【図３】図３は、実施例３に記載される合成の方法を図式的に示す。
【図４】図４は、実施例５に記載されるＰＥＧ−ｓｉＲＮＡ安定性を示す。
【図５】図５は、実施例６に記載されるｉｎ ｖｉｔｒｏ ＢＣＬ２発現試験を示す。
【図６】図６は、実施例７に記載されるｉｎ ｖｉｖｏ ＢＣＬ２発現試験を示す。
【図７】図７は、実施例９に記載されるＰＫ試験を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
Ａ．概要
本発明の１つの態様では、式（Ｉ）のｓｉＲＮＡ複合体が提供され：
Ａ−Ｒ１−（Ｒ２）ｅ−Ｒ３
ここで、
Ａはキャップ基またはＲ'３−（Ｒ'２）ｅ'−を含み；
Ｒ１は実質的に非抗原性の水溶性ポリマーを含み；
Ｒ２およびＲ'２は独立して選択される遊離可能なまたは永続的リンカー、もしくはその組合せであり；
Ｒ３およびＲ'３は、同一のまたは異なるｓｉＲＮＡ含有部分であり；
（ｅ）および（ｅ'）は、同一のまたは異なる正の整数であり、好ましくは１または２である。
【００４５】
好ましくは、Ｒ２および、存在する場合はＲ'２は、ｓｉＲＮＡ含有部分のセンス鎖に結合する。
【００４６】
本発明の１つの態様では、本明細書に記載される複合体は、Ｈ、ＮＨ２、ＯＨ、ＣＯ２Ｈ、Ｃ１−６アルコキシおよびＣ１−６アルキルなどのキャップ基を含む。１つの好ましい態様では、キャップ基はＣＨ３またはＣＨ３Ｏを含む。
【００４７】
本発明の別の１つの態様では、複合体は下記の式を有する：
Ｒ'３−（Ｒ'２）ｅ'−Ｒ１−（Ｒ２）ｅ−Ｒ３
【００４８】
したがって、この態様で意図されるポリマーは、直鎖ＰＥＧ、ビス−ＰＥＧ、Ｕ−ＰＥＧおよびマルチアームＰＥＧを含みうる。
【００４９】
好ましい実施の形態では、本明細書に記載される複合体は下記の式を有することができ：
Ａ１−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｚ  （ＩＩａ）、
Ｚ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｚ  （ＩＩｂ）、
【化１】
2010510810.tif 000002
【００５０】
ここで、
（ｎ）は約１０〜約２３００の整数であり、ここでポリマー部分の合計分子量は約２，０００〜約１００，０００であり；
Ａ１は、Ｈ、ＮＨ２、ＯＨ、ＣＯ２Ｈ、Ｃ１−６アルコキシおよびＣ１−６アルキル、およびＣ１−６アルキル置換アミンなどのキャップ基であり、ＣＨ３またはＣＨ３Ｏが好ましく；
１つ以上のＺが−（Ｒ２）ｅ−Ｒ３であって差し支えなく； 
他のすべての変数は先に定義されている。別の態様では、１つ以上のＺ基が、−（Ｒ２）ｅ−Ｒ３以外の、たとえばキャップ基など、すなわちＨ、ＯＨ、ＣＨ３、ＯＣＨ３、またはｎ−ブチルアミンなどのＣ１−６アルキル置換アミンでありうる。好ましくは、８アームポリマーなどのマルチアーム・ポリマーを用いる複合体では、１つのＺ基が−（Ｒ２）ｅ−Ｒ３を含み、別のＺ基がキャップ基または官能基を含む。
【００５１】
本発明の１つの好ましい態様では、遊離可能なＰＥＧ（ｒＰＥＧ）リンカー技術を用いてポリマーｓｉＲＮＡ複合体が提供される。ｓｉＲＮＡ含有部分は、本明細書に記載される化合物のポリマー部分と、遊離可能なリンカーを介して、好ましくは２本鎖のセンス鎖に結合する。遊離可能なリンカーには、ベンジル脱離系のリンカー、トリアルキルロック系のリンカー、ビシン系のリンカー、ジスルフィド結合、ヒドラゾンを含むリンカーおよびチオプロピオネートを含むリンカーがある。あるいは、遊離可能なリンカーは、細胞内不安定性リンカー、細胞外リンカーまたは酸不安定性リンカーでありうる。より好ましくは、遊離可能なリンカーは、細胞内不安定性リンカーまたは酸不安定性リンカーである。
【００５２】
あるいは、ｓｉＲＮＡは、センス鎖結合に関して記載された方法を用いて、アンチセンス鎖を介してポリマーと結合されうる。しかしながら、この態様では、ｓｉＲＮＡをポリマーと遊離可能に結合するために選択されるリンカーは、細胞内でアンチセンス鎖の放出または生成を促進するものであるべきである。そのようなリンカーは、たとえば、本明細書に記載される酸不安定性リンカーおよび／または細胞内不安定性リンカー（すなわち、ジスルフィド基）を含む。
【００５３】
本発明の別の好ましい態様では、遊離可能なリンカーを有するポリマーｓｉＲＮＡ複合体はＢＣＬ２ｓｉＲＮＡを用いる。ＢＣＬ２タンパク質は多くの種類の腫瘍において過剰発現されている。あるいは、当業者は、がんまたは他の疾患に対して同様の生物活性を有する代替的な適当ながん遺伝子が、ポリマーｓｉＲＮＡ複合体に使用されうることを理解する。本発明のより好ましい態様では、ＰＥＧリンカーと複合体化するために、ｓｉＲＮＡ２本鎖のセンス鎖の５'末端がＣ６−アミノ尾部と結合している、遊離可能なＰＥＧ−ｓｉＲＮＡ複合体が提供される。
【００５４】
Ｂ．実質的に非抗原性のポリマー
本明細書に記載される化合物に用いられるポリマーは、ポリアルキレンオキサイド（ＰＡＯ）のように、好ましくは水溶性ポリマーであり、実質的に非抗原性である。
【００５５】
本発明の１つの態様では、本明細書に記載される化合物は、直鎖、末端分枝またはマルチアーム・ポリアルキレンオキサイドを含みうる。本発明の一部の好ましい実施の形態では、ポリアルキレンオキサイドはポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールを含む。
【００５６】
ポリアルキレンオキサイドは、本発明の大部分の態様において、約２，０００〜約１００，０００の平均分子量を有する。好ましくはポリマーは、約５，０００〜約６０，０００、より好ましくは約２０，０００〜約４５，０００でありうる。さらにより好ましくは、ポリマーは約３０，０００の平均分子量を有する。当業者の要求に対応するために、他の分子量もまた考えられる。
【００５７】
ポリアルキレンオキサイドは、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールを含む。より好ましくは、ポリアルキレンオキサイドはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。ＰＥＧは一般的に下記の構造で表され：
−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−
ここで（ｎ）は、約１０〜約２，３００の整数であり、マルチアーム・ポリマーが用いられる場合はポリマーアームの数に依存する。あるいは、本発明のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）残基部分は下記の構造で表され：
【化２】
2010510810.tif 000003
【００５８】
ここで、
Ｙ７１およびＹ７３は独立してＯ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、ＮＲ７３または結合であり；
Ｙ７２はＯ、Ｓ、またはＮＲ７４であり；
Ｒ７１−７４は、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ３−１９分枝アルキル、Ｃ３−８シクロアルキル、Ｃ１−６置換アルキル、Ｃ２−６置換アルケニル、Ｃ２−６置換アルキニル、Ｃ３−８置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、Ｃ１−６ヘテロアルキル、置換Ｃ１−６ヘテロアルキル、Ｃ１−６アルコキシ、アリールオキシ、Ｃ１−６ヘテロアルコキシ、ヘテロアリールオキシ、Ｃ２−６アルカノイル、アリールカルボニル、Ｃ２−６アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、Ｃ２−６アルカノイルオキシ、アリールカルボニルオキシ、Ｃ２−６置換アルカノイル、置換アリールカルボニル、Ｃ２−６置換アルカノイルオキシ、置換アリールオキシカルボニル、Ｃ２−６置換アルカノイルオキシおよび置換アリールカルボニルオキシから独立して選択され；
（ａ２）および（ｂ２）は独立してゼロまたは正の整数であり、好ましくはゼロまたは約１〜約６の整数、より好ましくは１であり；
（ｎ）は約１０〜約２３００の整数である。
【００５９】
分枝またはＵ−ＰＥＧ誘導体は、参照することにより本明細書にそれぞれの開示が援用される、米国特許第５，６４３，５７５、５，９１９，４５５、６，１１３，９０６および６，５６６，５０６号明細書に記載されている。そのようなポリマーの非限定的な一覧は、下記の構造を有するポリマー系（ｉ）〜（ｖｉｉ）に相当し：
【化３−１】
2010510810.tif 000004
【化３−２】
2010510810.tif 000005
【００６０】
ここで：
Ｙ６１−６２は独立してＯ、ＳまたはＮＲ６１であり；
Ｙ６３はＯ、ＮＲ６２、Ｓ、ＳＯまたはＳＯ２であり
（ｗ６２）、（ｗ６３）および（ｗ６４）は独立して、０または正の整数、好ましくはゼロ または約１〜約３の整数であり；
（ｗ６１）は０または１であり；
ｍＰＥＧはメトキシＰＥＧであり
ここでＰＥＧは既に規定されており、およびポリマー部分の合計分子量は約２、０００〜約１００、０００であり；
Ｒ６１およびＲ６２は独立して、Ｒ７３に使用されうるのと同じ部分である。
【００６１】
さらに別の１つの態様では、ポリマーは、マルチアームＰＥＧ−ＯＨまたは、参照することにより本明細書にその開示が援用される、ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．ドラッグデリバリーシステムカタログ，Ｖｅｒ．８，Ａｐｒｉｌ ２００６に記載されるもののような「星型ＰＥＧ」製品を含む。参照することにより本明細書にその開示が援用される、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの２００１カタログ「Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ ａｎｄ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ」も参照。そのマルチアーム・ポリマー複合体は４以上のポリマーアームおよび好ましくは４または８のポリマーアームを含む。
【００６２】
説明目的で、および限定目的でなく、マルチアーム・ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）残基は下記であることができ：
【化４】
2010510810.tif 000006
【００６３】
ここで：
（ｘ）は０および正の整数、すなわち約０〜約２８であり；
（ｎ）は重合度である。
【００６４】
本発明の特定の一実施形態では、マルチアームＰＥＧは下記の構造を有し：
【化５】
2010510810.tif 000007
【００６５】
ここで（ｎ）は正の整数である。本発明の好ましい実施の形態では、ポリマーは約５，０００〜約６０，０００，および好ましくは２０，０００〜４５，０００の合計分子量を有する。
【００６６】
さらに別の特定の一実施形態では、マルチアームＰＥＧは下記の構造を有し：
【化６】
2010510810.tif 000008
【００６７】
ここで（ｎ）は正の整数である。本発明の好ましい実施の形態では、マルチアーム・ポリマーの重合度（ｎ）は約２８〜約３５０であって、合計分子量約５，０００〜約６０，０００、および好ましくは１２，０００〜４５，０００のポリマーを与える。これはポリマー鎖中の反復単位の数を表し、ポリマーの分子量に依存する。
【００６８】
ポリマーは、米国特許第５，１２２，６１４または５，８０８，０９６号明細書に記載された活性化法を用いて、適当に活性化されたポリマーへ変換されうる。具体的には、そのようなＰＥＧは次式であることができ：
【化７】
2010510810.tif 000009
【００６９】
ここで：
（ｕ’）は約４〜約４５５の整数であり；残基の３つまでの終端部分がメチルまたは他の低級アルキルでキャッピングされている。
【００７０】
一部の好ましい実施の形態では、４つすべてのＰＥＧアームが、芳香族基の結合を円滑化するために、適当な活性化基へ変換されうる。変換前のそのような化合物は下記を含む： 
【化８−１】
2010510810.tif 000010
【化８−２】
2010510810.tif 000011
【００７１】
ここで、含まれるポリマー物質は、好ましくは室温にて水溶性である。そのようなポリマーの非限定的なリストは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコールなどのポリアルキレンオキサイドホモポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール、その共重合体および、そのブロック共重合体の水溶性が維持されるならばブロック共重合体を含む。
【００７２】
別の一実施形態では、およびＰＡＯを基礎とするポリマーの代替として、１つ以上の有効に非抗原性の材料、たとえばデキストラン、ポリビニルアルコール、糖質を基礎とするポリマー、ヒドロキシプロピルメタクリルアミド（ＨＰＭＡ）、ポリアルキレンオキサイド、および／またはその共重合体が使用されうる。参照することにより本明細書にその開示が援用される、本発明と同一の譲受人に譲渡された米国特許第６，１５３，６５５号明細書も参照。ＰＥＧなどのＰＡＯについてここで記載されたのと同一の種類の活性化が用いられることが当業者に理解される。前記の一覧は単に説明であり、本明細書に記載される性質を有するすべてのポリマー材料が考慮されることが当業者にさらに理解される。本発明の目的では、「実質的にまたは有効に非抗原性」とは、哺乳類において非毒性であり、認識可能な免疫応答を起こさないと本分野で理解されるすべての材料を意味する。
【００７３】
一部の態様では、末端アミン基を有するポリマーは、本明細書に記載される化合物を作製するのに使用されうる。末端アミンを含むポリマーを高純度で調製する方法は、参照することにより本明細書にそれぞれの開示が援用される、米国特許出願第１１／５０８，５０７号および同第１１／５３７，１７２号の各明細書に記載されている。たとえば、アジドを有するポリマーは、トリフェニルホスフィンなどのホスフィンを基礎とする還元剤、またはＮａＢＨ４などのアルカリ金属ボロヒドリド還元剤と反応する。あるいは、脱離基を含むポリマーは、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルイミドジカルボナートのカリウム塩（ＫＮＭｅＢｏｃ）またはジ−ｔｅｒｔ−ブチルイミドジカルボナートのカリウム塩（ＫＮＢｏｃ２）などの保護アミン塩と反応し、次いで保護アミン基が脱保護される。これらの製法によって作製された末端アミンを含むポリマーの純度は、約９５％を上回り、９９％を上回ることが好ましい。
【００７４】
代替的な態様では、末端カルボン酸基を有するポリマーが、本明細書に記載されるポリマーデリバリー系に使用されうる。末端カルボン酸を有するポリマーを高純度で調製する方法は、参照することにより本明細書にその開示が援用される、米国特許出願第１１／３２８，６６２号明細書に記載されている。。その方法は、ポリアルキレンオキサイドの三級アルキルエステルをまず調製、次いでそのカルボン酸誘導体への変換を含む。その工程のＰＡＯカルボン酸の調製の第一段階は、ポリアルキレンオキサイドカルボン酸のｔ−ブチルエステルなどの中間体の形成を含む。この中間体は、ＰＡＯをハロ酢酸ｔ−ブチルと、カリウムｔ−ブトキシドなどの塩基の存在下で反応させることによって形成される。一旦ｔ−ブチルエステル中間体が形成されると、ポリアルキレンオキサイドのカルボン酸誘導体は、９２％を上回る，好ましくは９７％を上回る，より好ましくは９９％を上回る、および非常に好ましくは純度９９．５％を上回る純度で容易に提供されうる。
【００７５】
Ｃ．Ｒ２およびＲ'２基
本発明の１つの態様では、ｓｉＲＮＡは本明細書に記載される化合物のポリマー部分と、単独でまたは組み合わせて用いられる永続的リンカーおよび遊離可能なリンカーを介して結合されうる。本明細書に記載される複合体が２つ以上のリンカーを用いる、すなわち（ｅ）（または（ｅ'））がまたは２以上である場合、Ｒ２（またはＲ'２）のための２つ以上のリンカーは同一でありうるかまたは異なりうる。選択されたリンカーにかかわらず、それらは、当業者によく知られている合成法を用いて、複合体の残りの部分へ結合されることが理解される。下記の実施例１〜３も参照。
【００７６】
本発明の好ましい態様では、本明細書に記載される複合体は、遊離可能なリンカーに結合したｓｉＲＮＡを含む。本発明の１つの長所は、ｓｉＲＮＡが調節された方法で放出されうることである。
【００７７】
遊離可能なリンカーには、ベンジル脱離系のリンカー、トリアルキルロック系のリンカー（またはトリアルキルロックラクトン化を基礎とする）、ビシン系のリンカー、酸不安定性リンカー、リソソームで切断可能なペプチドおよびカプテプシン（capthepsin）Ｂ切断可能ペプチドがある。酸不安定性リンカーには、ジスルフィド結合、ヒドラゾンを含むリンカーおよびチオプロピオネートを含むリンカーが含まれうる。あるいは、遊離可能なリンカーは、細胞内不安定性リンカー、細胞外リンカーおよび酸不安定性リンカーである。好ましくは、遊離可能なリンカーは、細胞内不安定性リンカーおよび／または酸不安定性リンカーであり、式（Ｉ）の複合体からのｓｉＲＮＡの放出は細胞質内で円滑化されうる。
【００７８】
遊離可能なリンカーは下記の式を有し：
【化９−１】
2010510810.tif 000012
【化９−２】
2010510810.tif 000013
【００７９】
ここで
Ｙ１１−１９は独立してＯ、ＳまたはＮＲ４８であり；
Ｒ３１−４８、Ｒ５０−５１およびＡ５１は独立して、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−１２分枝アルキル、Ｃ３−８シクロアルキル、Ｃ１−６置換アルキル、Ｃ３−８置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、Ｃ１−６ヘテロアルキル、置換Ｃ１−６ヘテロアルキル、Ｃ１−６アルコキシ、フェノキシおよびＣ１−６ヘテロアルコキシの中から選択され；
Ａｒはアリールまたはヘテロアリール部分であり；
Ｌ１１−１５は独立して選択される二官能性スペーサーであり；
ＪおよびＪ’は独立して、標的細胞内へ能動輸送される部分、疎水性部分、二官能性結合部分およびその組み合わせの中から選択され；
（ｃ１１）、（ｈ１１）、（ｋ１１）、（ｌ１１）、（ｍ１１）および（ｎ１１）は独立して選択される正の整数、好ましくは１であり；
（ａ１１）、（ｅ１１）、（ｇ１１）、（ｊ１１）、（ｏ１１）および（ｑ１１）は独立して、ゼロまたは正の整数、好ましくは１であり；
（ｂ１１）、（ｘ１１）、（ｘ’１１）、（ｆ１１）、（ｉ１１）および（ｐ１１）は独立してゼロまたは１である。
【００８０】
標的細胞内へ能動輸送される部分は下記の構造を有することができ
【化１０】
2010510810.tif 000014
【００８１】
ここでＬ３は二官能性リンカーであり、Ｙ４はＯ、ＳまたはＮＲ１１であり、ここでＲ１１は、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−１２分枝アルキル、Ｃ３−８シクロアルキル、Ｃ１−６置換アルキル、Ｃ３−８置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、Ｃ１−６ヘテロアルキル、置換Ｃ１−６ヘテロアルキル、Ｃ１−６アルコキシ、フェノキシおよびＣ１−６ヘテロアルコキシの中から選択されうる。
【００８２】
ベンジル脱離を基礎とするかまたはトリアルキルロックを基礎とする、さまざまな遊離可能なリンカーが、たとえば、参照することにより本明細書にその開示が援用される、本発明と同一のの譲受人に譲渡された米国特許第６，１８０，０９５号、同第６，７２０，３０６号、同第５，９６５，１１９号、同第６６２４，１４２号、および同第６，３０３，５６９号の各明細書に記載されている。ビシン系のリンカーはまた、参照することにより本明細書にその開示が援用される、本発明と同一の譲受人に譲渡された米国特許第７，１２２，１８９号および同第７０８７，２２９号の各明細書および米国特許出願第１０／５５７，５２２号、同第１１／５０２，１０８号、および、同第１１／０１１，８１８号の各明細書に記載されている。
【００８３】
一部の好ましい実施の形態では、ｓｉＲＮＡは、本明細書に記載される複合体のポリマー部分と、酸不安定性リンカーを介して結合している。理論に縛られることなく、酸不安定性リンカーは、細胞内および特にリソソーム、エンドソーム、またはマクロピノソーム内で、親ポリマー化合物からのオリゴヌクレオチドの遊離を円滑化する。
【００８４】
Ｒ２およびＲ'２は、アミノ酸またはアミノ酸誘導体などの二官能性リンカーを含みうる。アミノ酸は、天然に存在するおよび天然に存在しないアミノ酸でありうる。疎水性または非疎水性の、天然に存在するアミノ酸の誘導体およびアナログ、およびさまざまな本分野で公知である天然に存在しないアミノ酸（ＤまたはＬ）、もまた本発明の範囲内と考えられる。非天然に存在するアミノ酸の適当な非限定的な一覧は、２−アミノアジピン酸、３−アミノアジピン酸、ベータ−アラニン、ベータ−アミノプロピオン酸、２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸、ピペリジン酸、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノイソ酪酸、２−アミノピメリン酸、２，４−アミノ酪酸、デスモシン、２，２−ジアミノピメリン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、Ｎ−メチルグリシン、サルコシン、Ｎ−メチル−イソロイシン、６−Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−メチルバリン、ノルバリン、ノルロイシン、およびオルニチンを含む。一部の好ましいアミノ酸残基は、グリシン、アラニン、メチオニンおよびサルコシンを含む。これらの二官能性リンカーは、Ｌ１１−１５基にも使用されうる。あるいは、Ｒ２およびＲ'２基は、下記の中から選択される二官能性リンカーでありうる
【化１１−１】
2010510810.tif 000015
【化１１−２】
2010510810.tif 000016
【００８５】
ここで：
Ｒ２１−２９は独立して、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−１２分枝アルキル、Ｃ３−８シクロアルキル、Ｃ１−６置換アルキル、Ｃ３−８置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、Ｃ１−６ヘテロアルキル、置換Ｃ１−６ヘテロアルキル、Ｃ１−６アルコキシ、フェノキシおよびＣ１−６ヘテロアルコキシから選択され；
（ｔ）および（ｔ’）は独立して、ゼロまたは正の整数、好ましくはゼロまたは約１〜約１２の整数、より好ましくは約１〜約８の整数、および非常に好ましくは１または２であり；
（ｖ）および（ｖ’）は独立してゼロまたは１である。
【００８６】
これらの二官能性リンカーは、Ｌ１１−１５基にも使用されうる。
【００８７】
好ましくは、二官能性リンカーは下記から選択でき：
【化１２−１】
2010510810.tif 000017
【化１２−２】
2010510810.tif 000018
【００８８】
ここで（ｒ）および（ｒ’）は独立してゼロまたは１であり、ただし（ｒ）および（ｒ’）の両方が同時にゼロではない。
【００８９】
本発明のさらに別の代替的な態様では、二官能性リンカーは下記を含み：
【化１３】
2010510810.tif 000019
【００９０】
これらの二官能基は、もう１つの物質を直接的に複合体化するのを可能にし、したがって、もう１つの物質を複合体化するための官能基を結合する必要を無くす。
【００９１】
代替的な実施形態では、二官能性リンカーは、上記で示すものと対応し、マレイミジル基の代わりにビニルのような基、ビニルスルホン、アミノ、カルボキシ、メルカプト、チオプロピオネート、ヒドラジド、カルバザートなどの残基を含む構造を含む。当業者に公知である他の永続的なまたは遊離可能なリンカーもまた、本明細書に記載される複合体の範囲内であると考えられる。
【００９２】
Ｄ．ｓｉＲＮＡ含有部分
本明細書に記載される複合体は、さまざまなｓｉＲＮＡを細胞または組織へ送達するために使用されうる。
【００９３】
本発明の範囲をより完全に理解するために、下記の用語が定義される。「核酸」または「ヌクレオチド」の語は、特記されない限り、１本鎖でも２本鎖でも、デオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）、リボ核酸（「ＲＮＡ）およびその任意の化学修飾に該当すると当業者は理解する。「オリゴヌクレオチド」は一般的に、たとえば、大きさが長さ約２〜約２００塩基、またはより好ましくは約１０〜約３０塩基にわたる、相対的に短いポリヌクレオチドである。本発明に記載のオリゴヌクレオチドは、特記されない限り、一般的に合成核酸、および１本鎖である。「ポリヌクレオチド」および「ポリ核酸」の語はまたここでは同義語として使用されうる。
【００９４】
「アンチセンス、」または「アンチセンス鎖」の語は、本明細書では、ヌクレオチド
遺伝子産物をコードするかまたは調節配列をコードする特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列と相補的である配列をいう。細胞代謝の通常の動作では、ＤＮＡ分子のセンス鎖は、ポリペプチドおよび／または他の遺伝子産物をコードする鎖である。アンチセンス核酸分子は、目的の遺伝子を逆方向で、相補鎖の合成を可能にするウイルスプロモーターとライゲーションすることによる合成を含む、本分野で公知である任意の方法によって作製されうる。細胞へ一旦導入されると、この転写された鎖は、細胞によって産生される天然配列と組み合わさり、二本鎖を形成する。これらの二本鎖は次いで、さらなる転写または翻訳を遮断する。「負」または（−）の表示もまた、アンチセンス鎖をいうことが本分野で公知であり、「正」または（＋）もまた、センス鎖をいうことが本分野で公知である。
【００９５】
本発明の目的では、「相補的」とは、核酸配列が別のＲＮＡ配列と水素結合を形成することを意味すると理解される。パーセント相補性とは、水素結合、すなわち、ワトソン−クリック塩基対を別の核酸配列と形成できる、核酸分子中の連続残基の割合を示し、すなわち、１０個中５、６、７、８、９、１０個が５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、および１００％相補である。「完全に相補的な」とは、核 酸 配列のすべての連続 残基が、別の核 酸 配列の同数の連続 残基 と水素結合を形成することを意味する。
【００９６】
オリゴヌクレオチド（アナログ）は、単一種のオリゴヌクレオチドに限定されるのでなく、幅広いそのような部分と共に働くように設計され、リンカーは１つ以上の３'−または５'−末端、通常はヌクレオチドのＰＯ４またはＳＯ４基と結合できると理解される。考えられる核酸分子は、ホスホロチオエート・ヌクレオチド間結合修飾、糖修飾、核酸塩基修飾および／またはリン酸骨格修飾を含みうる。オリゴヌクレオチドは、天然ホスホロジエステル骨格またはホスホロチオエート骨格または任意の他の修飾骨格アナログ、たとえばＬＮＡ（ロックされた核酸）、ＰＮＡ（ペプチド骨格を有する核酸）、ＣｐＧオリゴマー、など、たとえば参照することにより本明細書にその開示が援用される、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅｓ，Ｍａｙ ６−８，２００２，Ｌａｓ Ｖｅｇａｓ，ＮＶおよびＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，１８ｔｈ ＆ １９ｔｈ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２００３，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙで開示されるようなものを含みうる。
【００９７】
本発明に記載のオリゴヌクレオチドはまた、下記の表１に列記されるものを含む、本分野で公知の任意の適当なヌクレオチドアナログおよび誘導体を随意的に含みうる。
【００９８】
2010510810.tif 000020
【００９９】
本発明で考慮されるオリゴヌクレオチドへの修飾は、たとえば、望ましいポリマーとのオリゴヌクレオチドの共有結合を可能にする官能基または部分での選択されたヌクレオチドへの付加またはその置換、および／または追加の電荷、分極率、水素結合、静電相互作用、および官能性をオリゴヌクレオチドへ組み込む官能性部分の付加または置換を含む。そのような修飾は、２'位糖修飾、５位ピリミジン修飾、８位プリン修飾、環外アミンでの修飾、４−チオウリジンの置換、５−ブロモまたは５−ヨードウラシルの置換、骨格修飾、メチル化、イソ塩基のイソシチジンおよびイソグアニジンなどの塩基対の組み合わせ、および類似の組み合わせを含むがそれらに限定されない。本発明の範囲内で考えられるオリゴヌクレオチドはまた、３'および／または５'キャップ構造を含みうる。参照することにより本明細書にそれぞれの開示が援用される、Ｆｒｅｉｅｒ ＆ Ａｌｔｍａｎｎ； Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９９７，２５，４４２９−４４４３およびＵｈｌｍａｎｎ； Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０００，３（２），２９３−２１３に記載されるヌクレオシドアナログのさらなる例を参照。
【０１００】
本発明の目的では、「キャップ構造」は、オリゴヌクレオチドのどちらかの末端に組み込まれている化学修飾を意味すると理解される。キャップは５'末端に（５'−キャップ）または３'末端に（３'−キャップ）存在でき、または両方の末端に存在しうる。５'−キャップの非限定的な例は、逆方向塩基脱落残基（部分）、４'，５'−メチレンヌクレオチド；１−（ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド、４'−チオヌクレオチド、炭素環ヌクレオチド；１，５−アンヒドロへキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；アルファ−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート結合；トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環式３'，４'−セコ（ｓｅｃｏ）ヌクレオチド；非環式３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；非環式３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、３'−３'−逆方向ヌクレオチド部分；３'−３'−逆方向塩基脱落部分；３'−２'−逆方向ヌクレオチド部分；３'−２'−逆方向塩基脱落部分；１，４−ブタンジオールリン酸；３'−ホスホルアミデート；リン酸ヘキシル；リン酸アミノヘキシル；３'−リン酸；３'−ホスホロチオエート；ホスホロジチオエート；または架橋または非架橋リン酸メチル部分を含む。詳細は、参照することにより本明細書にその開示が援用される、国際公開第９７／２６２７０号パンフレットに記載されている。３'−キャップは、たとえば４'，５'−メチレンヌクレオチド；１−（ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド；４'−チオヌクレオチド、炭素環ヌクレオチド；リン酸５'−アミノ−アルキル；リン酸１，３−ジアミノ−２−プロピル、リン酸３−アミノプロピル；リン酸６−アミノヘキシル；リン酸１，２−アミノドデシル；リン酸ヒドロキシプロピル；１，５−アンヒドロへキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；アルファ−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート；トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環式３'，４'−セコヌクレオチド；３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、Ｓ'−Ｓ'−逆方向ヌクレオチド部分；５'−５'−逆方向塩基脱落部分；５'−ホスホルアミデート；５'−ホスホロチオエート；１，４−ブタンジオールリン酸；５'−アミノ；架橋および／または非架橋５'−ホスホルアミデート、ホスホロチオエートおよび／またはホスホロジチオエート、架橋または非架橋メチルホスホナートおよび５'−メルカプト部分を含みうる。参照することにより本明細書にその開示が援用される、Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｉｙｅｒ，１９９３，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４９，１９２５も参照。
【０１０１】
本発明の好ましい態様では、考えられるｓｉＲＮＡは、腫瘍細胞の抗がん剤に対する耐性に関与する遺伝子またはタンパク質を阻害またはダウンレギュレートすることに関与する。たとえば、がん治療のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドによるダウンレギュレーションのためのＢＣＬ２などの、本分野で公知である任意の細胞タンパク質が本発明に使用されうる。参照することにより本明細書にその開示が援用される、２００４年４月９日出願の米国特許出願第１０／８２２，２０５号明細書を参照。好ましい治療薬の非限定的な一覧は、ＢＣＬ２ ｓｉＲＮＡ、ＨＩＦ−１α ｓｉＲＮＡおよびサバイビンｓｉＲＮＡを含みうる。
【０１０２】
好ましい態様では、ｓｉＲＮＡ含有部分の各鎖は、標的遺伝子と相補的な、長さ約１８から約２８ヌクレオチド、より好ましくは約２０から約２４ヌクレオチド、および非常に好ましくは約２１ヌクレオチドを含みうる。ヌクレオチドの長さはまた、当業者の必要および望まれる相補核酸の数にしたがって変化しうる。ｓｉＲＮＡの各鎖において、少なくとも約１４から２４ヌクレオチドが、好ましくは他方の鎖および／または標的遺伝子のヌクレオチドと完全に相補的である。ｓｉＲＮＡは好ましくは、長さ約２ヌクレオチドの３'オーバーハングを両端に含む。
【０１０３】
一実施形態では、２本鎖ｓｉＲＮＡ分子は、ＢＣＬ２遺伝子などの遺伝子発現を、ＲＮＡ干渉を介して阻害またはダウンレギュレートしうる。好ましい実施の形態では、ｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、ｓｉＲＮＡ分子がＲＮＡ干渉を介してＲＮＡの切断を導くために、ＢＣＬ２遺伝子のＲＮＡと相補的なヌクレオチド配列を含む。
【０１０４】
より好ましい実施の形態では、ｓｉＲＮＡ含有部分のアンチセンス鎖は、配列番号：１の核酸配列と相補的な約１８から約２８ヌクレオチドを含む。ＢＣＬ２遺伝子はまた、参照することにより本明細書にそれぞれの開示が援用される、米国特許第５，８３１，０６６号、同第６，０４０，１８１号、同第６，４１４，１３４号、および同第６，８４１，５４１号の各明細書に記載されている。特に好ましい実施の形態は、配列番号：３の核酸配列を含む、ｓｉＲＮＡ含有部分のアンチセンス鎖を用いる。
【０１０５】
ＢＣＬ２ ｓｉＲＮＡ：
2010510810.tif 000021
【０１０６】
ここでｄＴはＤＮＡを表す。
【０１０７】
本明細書に記載される複合体に用いられるｓｉＲＮＡ分子は、（ＣＨ２）ｗアミノリンカーでオリゴヌクレオチドの５'または３'末端にて修飾でき、ここで（ｗ）はこの態様では好ましくは約１〜約１０の正の整数、好ましくは６である。修飾オリゴヌクレオチドは、下記に示すＮＨ−（ＣＨ２）ｗ−オリゴヌクレオチドでありうる：
【化１４】
2010510810.tif 000022
【０１０８】
１つの実施の形態では、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の５’末端は修飾されている。たとえば、ポリマー複合体に使用されるｓｉＲＮＡは、５'−Ｃ６−ＮＨ２で修飾されている。
【０１０９】
代替的な態様では、本明細書に記載される複合体は、立体障害エステル含有（ＣＨ２）ｗアミノリンカーで修飾されたｓｉＲＮＡを含みうる。参照することによりそれぞれの内容が援用される、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳＯ７／７８５９７号パンフレット（表題"Ｈｉｎｄｅｒｅｄ−Ｅｓｔｅｒ −Ｂａｓｅｄ Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｌｉｎｋｅｒｓ Ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ"）および 国際出願第ＰＣＴ／ＵＳＯ７／７８５９３号パンフレット（表題"Ｐｏｌｙａｋｌｙｌｅｎｅ Ｏｘｉｄｅ Ｈａｖｉｎｇ Ｈｉｎｄｅｒｅｄ Ｅｓｔｅｒ −Ｂａｓｅｄ Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｌｉｎｋｅｒｓ"）を参照。ポリマー化合物はアミノ尾部を含まないオリゴヌクレオチドを放出しうる。たとえば、オリゴヌクレオチドは下記の構造を有することができる：
【化１５】
2010510810.tif 000023
【０１１０】
さらに別の態様では、ｓｉＲＮＡは（ＣＨ２）ｗスルフヒドリルリンカー（チオオリゴヌクレオチド）で修飾されうる。チオオリゴヌクレオチドは、リンカーのシステインと直接に、またはマレイミジル基を介して複合体化するのに使用されうる。チオオリゴヌクレオチドはＳＨ−（ＣＨ２）ｗ−オリゴヌクレオチドの構造を有しうる。チオオリゴヌクレオチドはまた、下記の構造を有する立体障害エステルを含みうる：
【化１６】
2010510810.tif 000024
【０１１１】
Ｅ．式Ｉに対応する好ましい実施の形態
たとえば、本発明にしたがって調製されたｓｉＲＮＡ複合体は下記： 
【化１７−１】
2010510810.tif 000025
【化１７−２】
2010510810.tif 000026
【０１１２】
であり、
ここで、ｓｉＲＮＡ含有部分のセンス鎖はポリマーと複合体化されている。
【０１１３】
好ましい実施の形態では、ｓｉＲＮＡ含有部分のアンチセンス鎖は、がん細胞または組織において発現または過剰発現されている核酸配列と相補的な約１８から約２８ヌクレオチドを含みうる。特に好ましい実施の形態では、ｓｉＲＮＡ含有部分は、配列番号：１の核酸配列と相補的なヌクレオチド、たとえば配列番号：３の核酸配列を含みうる。
【０１１４】
１つの特定のの実施形態では、複合体は下記の中にあり：
【化１８】
2010510810.tif 000027
【０１１５】
ここで、ｓｉＲＮＡは配列番号：２および３の核酸配列を有し；ｓｉＲＮＡのセンス鎖の５'末端は、ＰＥＧリンカーと複合体化するために、Ｃ６−アミノ尾部に修飾されている。
【０１１６】
Ｆ．ポリマーデリバリーシステムの合成
一般的に、ｓｉＲＮＡ複合体は、まず活性化ポリマーを調製し、それが今度はｓｉＲＮＡ含有部分と反応して、ポリマーｓｉＲＮＡ複合体を提供することによって調製されうる。付加の正確な順序はこの順序に限定されず、および当業者に明らかになる通り、ＰＥＧが最初にリンカーへ付加され、次いでリンカーが活性化される態様がある。
【０１１７】
本発明の一部の好ましい態様では、まずＯＨまたは脱離基を含むポリマー化合物が、遊離可能なリンカーを含む求核試薬と反応されうる。遊離可能なリンカーは次いで活性化され、および活性化リンカーが、ＯＨ、ＮＨ２またはＳＨ基を含むｓｉＲＮＡ含有部分の官能基と反応する。さまざまな活性化基を含むポリマーは、さまざまな 求核 部分に対する異なる化学反応性を提供しうる。 たとえば、マレイミジル基 および ビニルスルホン 基 は、ＳＨ含有部分と選択的に反応しうる。 この一実施形態の一部の好ましい態様に関する詳細は、下記の実施例に示される。
【０１１８】
本明細書に記載されるすべての反応は、当業者に公知である必要な段階および条件を含む標準的な化学反応を用いる。本明細書に記載される合成反応は、したがって不必要以上の実験を要しない。
【０１１９】
ＰＥＧまたは他のポリマーへのリンカー部分の付加は、ポリマーおよびカップリング試薬を用いて、または活性化ポリマーを利用することによって、当業者によく知られた標準的な化学合成法を用いて実施されうる。ＳＣ−ＰＥＧ、ＰＥＧ−アミン、ＰＥＧ酸などの活性化ポリマー部分は、購入可能であるかまたは過度の実験なしに当業者によって合成されうる。
【０１２０】
ポリマー部分へのリンカー部分の付加は、カップリング剤の存在下で実施される。適当なカップリング剤の非限定的なリストは、１，３−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）、任意の適当なジアルキルカルボジイミド、２−ハロ−１−アルキル−ピリジニウムハライド（向山試薬）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）、プロパンリン酸環状無水物（ＰＰＡＣＡ）およびジクロロリン酸フェニルなどを含み、たとえばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社などの販売者から入手可能であるかまたは公知の方法を用いて合成されうる。
【０１２１】
反応は、塩化メチレン、クロロホルム、ＤＭＦまたはその混合物などの不活性溶媒中で実施されることが好ましい。反応は好ましくは、酸が生じれば中和するための、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン、トリエチルアミンなどの塩基の存在下で実施されうる。反応は約０℃〜約２２℃（室温）の温度にて実施されうる。
【０１２２】
１つの態様では、ｓｉＲＮＡ含有部分と反応するポリマー化合物は、ｓｉＲＮＡ２本鎖構造の完全性を保存するために、ｐＨ約５〜約１０、好ましくは中性ｐＨの水系溶媒中で、ＰＢＳなどの緩衝液および室温を用いて調製されうる。
【０１２３】
好ましくは、ｓｉＲＮＡ含有部分のセンス鎖は、下記の種類のうちの１つでありうる：
（ｉ）（ＣＨ２）ｗアミノリンカーでオリゴヌクレオチドの５−'または３'末端にて修飾されたオリゴヌクレオチド；
（ｉｉ）（ＣＨ２）ｗスルフヒドリルリンカーでオリゴヌクレオチドの５−'または３'末端にて修飾されたオリゴヌクレオチド；
（ｉｉｉ）立体障害エステルを含む（ＣＨ２）ｗアミノリンカーまたは（ＣＨ２）ｗスルフヒドリルリンカーで修飾されたオリゴヌクレオチド。この態様における（ｗ）は、約１〜約１０の正の整数が好ましく、さらに好ましくは６である。
【０１２４】
ｓｉＲＮＡのセンス鎖の修飾は、本分野で公知である標準的な方法によって達成されうる。一部のＣ６−ＮＨ２修飾センス鎖は、米国カリフォルニア州サンディエゴ所在のＴｒｉＬｉｎｋ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからも購入可能である。次に、修飾センス鎖および非修飾アンチセンス鎖をアニーリングし、ｓｉＲＮＡの２本鎖構造を形成する。ｓｉＲＮＡ２本鎖のセンス鎖の、活性化ポリマーとの、本発明の選択的複合体化は、一部には、修飾ｓｉＲＮＡ２本鎖中の芳香族アミンが、水系条件およびｐＨ５〜１０などの複合体化反応条件下で反応するのに十分なほど求核性ではないことから、得ることができる。反応は、このように、センス鎖上のより求核性の修飾を含む末端にて進行する。
【０１２５】
立体障害エステル含有オリゴヌクレオチドの形成に関する説明は、参照することにより本明細書にその内容が援用される、本発明と同一の譲受人に譲渡された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０７／７８５９７号および同第ＰＣＴ／ＵＳ０７／７８５９３号の各パンフレットに記載されている。
【０１２６】
さらに別の態様では、本発明にしたがって調製されるｓｉＲＮＡ複合体は、１つ以上の遊離可能なリンカーを含みうる。参照することにより本明細書にその内容が援用される、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳＯ７／７８５９８号パンフレットを参照。
【０１２７】
Ｇ．治療の方法
上記を考慮して、ヒト細胞または組織において遺伝子発現をダウンレギュレートまたは阻害する方法もまた提供される。遺伝子発現のダウンレギュレーションまたは阻害は、ｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏで達成されうる。当該方法は、ヒト細胞または組織を、本明細書に記載される式（Ｉ）のｓｉＲＮＡ複合体と接触させる工程を有してなる。接触が生じる際に、ｍＲＮＡまたはタンパク質レベルでの遺伝子発現の阻害またはダウンレギュレーションの成功が、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでの測定で少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２０％以上実現される場合に、起こると見なされる。
【０１２８】
本発明の目的では、「阻害する」または「ダウンレギュレートする」は、たとえばＢＣＬ２などの、１つ以上のタンパク質サブユニットをコードする遺伝子の発現、すなわちＲＮＡまたは等価ＲＮＡのレベル、または１つ以上のタンパク質サブユニットの活性が、本明細書に記載される複合体の非存在下で観察されるよりも低減されることを意味すると解されるものとする。
【０１２９】
本発明の１つの好ましい態様では、本発明は、ＢＣＬ２をコードする遺伝子のような、がん細胞または組織に関連し、過剰発現されている遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ複合体を対象とする。１つの特定の実の施形態では、ｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、配列番号：１の核酸配列と相補的な約１８から約２８ヌクレオチドを含む。
【０１３０】
がん細胞または組織は、下記のうち１つ以上に由来しうる：固形腫瘍、リンパ腫、小細胞肺がん、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、膵臓がん、神経膠芽腫、卵巣がん、胃がん、乳がん、結腸直腸がん、前立腺がん、卵巣がんおよび脳腫瘍など。
【０１３１】
別の態様では、がんを有する患者の治療；哺乳類における腫瘍性疾患の治療、腫瘍量の低減、腫瘍の転移防止、および腫瘍の再発／新生物増殖の防止方法についても提供される。当該方法は、式（Ｉ）のｓｉＲＮＡ複合体を含む医薬組成物の有効量を、それを必要とする患者へ投与する工程を含む。たとえば、非複合体化ｓｉＲＮＡ（たとえば、未変化ＢＣＬ２ ｓｉＲＮＡ）が特定のがんまたは腫瘍細胞に対して効力を有する場合、当該方法は、未変化ｓｉＲＮＡに対して感受性を有する細胞へｓｉＲＮＡを含むポリマー複合体を送達する工程を含む。送達は、ｉｎ ｖｉｖｏで適当な医薬組成物の一部として、または直接的に細胞へｅｘ ｖｉｖｏ環境で、行うことができる。１つの特定の治療では、ｓｉＲＮＡ分子（配列番号：２および３）を含むポリマー複合体が使用されうる。
【０１３２】
さらに別の態様では、本発明は、がん細胞の成長または増殖をｉｎ ｖｉｖｏ または ｉｎ ｖｉｔｒｏで阻害する方法を提供する。当該方法は、がん細胞を本明細書に記載されるｓｉＲＮＡ複合体と接触させる工程を含む。好ましくは、本発明は、細胞がＢＣＬ２遺伝子を発現することを特徴とする、リンパ腫または白血病細胞の成長をｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで阻害する方法を提供する。リンパ腫または白血病細胞は、本明細書に記載される複合体から放出されたｓｉＲＮＡと接触する。ヒトＢＣＬ２遺伝子から発現されたｍＲＮＡと相補的なアンチセンス鎖は、リンパ腫または白血病細胞の成長を阻害し、リンパ腫または白血病細胞におけるＢＣＬ２遺伝子の発現を低下させる。あるいは、本発明は、がん細胞においてアポトーシスを調節する方法を提供する。
【０１３３】
さらに別の態様では、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでがん細胞または組織の化学療法剤に対する感受性を増加させる方法が提供される。１つの特定の態様では、当該方法は、ｓｉＲＮＡがＢＣＬ２遺伝子から発現されるｍＲＮＡと結合し、ＢＣＬ２遺伝子発現を低減することを特徴とする、がん細胞または組織におけるＢＣＬ２発現を低減するために本明細書に記載されるｓｉＲＮＡ複合体をがん細胞へ導入する工程を含む。
【０１３４】
さらに別の態様では、腫瘍細胞をｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで殺す方法が提供される。当該方法は、ＢＣＬ２遺伝子などの遺伝子発現を低下させるために本明細書に記載されるｓｉＲＮＡ複合体を腫瘍細胞へ導入すること、および腫瘍細胞を腫瘍細胞の一部を殺すのに十分な量の少なくとも１つの化学療法剤と接触させる工程を含む。したがって、腫瘍 細胞の殺された部分は、本明細書に記載されるｓｉＲＮＡ 複合体の非存在下で同量の化学療法剤によって殺されたであろう部分より大きくなりうる。
【０１３５】
本発明のさらなる態様では、化学療法剤は、本明細書に記載されるｓｉＲＮＡ複合体を用いる方法と組み合わせて、同時にまたは連続して、使用されうる。本明細書に記載されるｓｉＲＮＡ複合体は、化学療法剤と同時に、または化学療法剤の投与後に、投与されうる。よって、ｓｉＲＮＡ複合体は化学療法剤の治療中または後に投与されうる。
【０１３６】
たとえば、化学療法剤の非限定的なリストは下記を含む：
（ｉ）ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤：アドリアマイシン、アムサクリン、カンプトテシン、ＣＰＴ−１１、ＳＮ３８、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エニポシド（ｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、またはミトキサントロン；
（ｉｉ）タキサンのような微小管阻害薬、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ノコダゾール、エポチロンおよびナベルビンを含む；
（ｉｉｉ）ＤＮＡ傷害剤：アクチノマイシン、アムサクリン、アントラサイクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトテシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シトキサン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、ヘキサメチルメラミンオキサリプラチン（ｈｅｘａｍｅｔｈｙｌｍｅｌａｍｉｎｅｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）、イホスファミド、メルファラン、メルクロレタミン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ニトロソ尿素、プリカマイシン、プロカルバジン、タキソール、タキソテール、テニポシド、トリエチレンチオホスホルアミドまたはエトポシド（ＶＰ１６）；
（ｉｖ）代謝拮抗薬：葉酸拮抗薬；および
（ｖ）ヌクレオシドアナログ：５−フルオロウラシル；シトシンアラビノシド、アザシチジン、６−メルカプトプリン、アザチオプリン；５−ヨード−２'−デオキシウリジン；６−チオグアニン、２−デオキシコホルマイシン、クラドリビン、シタラビン、フルダラビン、メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン、ＡＺＴ（ジドブジン）、ＡＣＶ、バラシクロビル、ファムシクロビル、アシクロビル、シドホビル、ペンシクロビル、ガンシクロビル、リバビリン、ｄｄＣ、ｄｄｌ（ザルシタビン）、ラミブジン（ｌａｍｕｖｉｄｉｎｅ）、アバカビル、アデホビル、ジダノシン、ｄ４Ｔ（スタブジン）、３ＴＣ、ＢＷ１５９２、ＰＭＥＡ／ビス−ＰＯＭ ＰＭＥＡ、ｄｄＴ、ＨＰＭＰＣ、ＨＰＭＰＧ、ＨＰＭＰＡ、ＰＭＥＡ、ＰＭＥＧ、ｄＯＴＣ；ＤＡＰＤ、Ａｒａ−ＡＣ、ペントスタチン、ジヒドロ−５−アザシチジン、チアゾフリン、サンギバマイシン、Ａｒａ−Ａ（ビダラビン）、６−ＭＭＰＲ、５−ＦＵＤＲ（フロクスウリジン）、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ；シトシンアラビノシド）、５−アザシチジン（アザシチジン）、ＨＢＧ[９−（４−ヒドロキシブチル）グアニン]、コハク酸（１Ｓ，４Ｒ）−４−[２−アミノ−６−シクロプロピル−アミノ）−９Ｈ−プリン−９−イル]−２−シクロペンテン−１−ｍ−エタノール（「１５９Ｕ８９」）、ウリジン、チミジン、イドクスウリジン、３−デアザウリジン、シクロシチジン、ジヒドロ−５−アザシチジン、トリシリビン、リバビリン、フルダラビン（ｆｌｕｄｒａｂｉｎｅ）、アシクロビル、１−β−Ｄ−アラビノフラノシル−Ｅ−５−（２−ブロモビニル）ウラシル、２'−フルオロ炭素環−２'−デオキシグアノシン；６'−フルオロ炭素環−２'−デオキシグアノシン；１−（β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５（Ｅ）−（２−ヨードビニル）ウラシル；{（１ｒ−１α，２β，３α）−２−アミノ−９−（２，３−ビス（ヒドロキシメチル）シクロブト−イル）−６Ｈ−プリン−６−オン}ロブカビル、９Ｈ−プリン−２−アミン、９−（（２−（１−メチルエトキシ）−１−（（１−メチルエトキシ）メチル）エトキシ）メチル）−（９Ｃｌ）；トリフルオロチミジン、９−＞（１，３−ジヒドロキシ−２−プロポキシ）メチルグアニン（ガンシクロビル）、５−エチル−２'−デオキシウリジン；Ｅ−５−（２−ブロモビニル）−２'−デオキシウリジン；５−（２−クロロエチル）−２'−デオキシウリジン、ブシクロビル、６−デオキシアシクロビル；９−（４−ヒドロキシ−３−ヒドロキシメチルブト−１−イル）グアニン、Ｅ−５−（２−ヨードビニル）−２'−デオキシウリジン、５−ビニル−１−β−Ｄ−アラビノフラノシルウラシル、１−β−Ｄ−アラビノフラノシルチミン；２'−ノル−２'デオキシグアノシン；および１−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニン。
【０１３７】
他の潜在的な抗がん剤は、アルトレタミン、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アスパラギナーゼ、ベグ（ｂｅｇ）、ビカルタミド、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、ホリナートカルシウム、カンプトテシン（ｃａｍｐｏｔｈｅｃｉｎ）、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、コルヒチン、クリサンタスパーゼ、シクロホスファミド、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエネストロール、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エストラジオール、エストラムスチン、エトポシド、エキセメスタン、フィルグラスチム、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、ゲニステイン、ゴセレリン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン、イロノテカン、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、レバミソール、ロムスチン、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニルタミド、ノコダゾール、オクトレオチド、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロン酸、ペントスタチン、プリカマイシン、ポルフィマー、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ストレプトゾシン、スラミン、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テストステロン、チオグアニン、チオテパ、チタノセンジクロリド、トポテカン、トラスツズマブ、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビンから選択される。他の多数の抗がん剤は、参照することにより本明細書にその内容が援用される、米国特許出願公開第２００６／０１３５４６８号明細書に列記されている。
【０１３８】
別の態様では、本発明は、哺乳類におけるさまざまな病状の治療方法を提供する。当該医薬組成物は、本明細書に記載されるｓｉＲＮＡ複合体を含み、多くの異なる疾患の治療に使用されうる。要約すると、ＰＥＧポリマーに結合されうる任意のｓｉＲＮＡが、そのような治療を必要とする細胞へｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで投与されうる。非複合体化状態で治療作用を有する任意のｓｉＲＮＡが、本明細書に記載されるように調製された複合形態で、細胞へ導入されうる。
【０１３９】
Ｈ．組成物／処方
本発明のｓｉＲＮＡ複合体を含む医薬組成物は、活性化合物を医薬品として使用されうる調製物への加工を円滑にする、添加物および助剤を含む、１種類以上の生理的に許容される担体と併用して製剤化して差し支えない。適切な製剤は、選択される投与経路、すなわち局所治療または全身治療が処置されるか否かによって決まる。本発明の多くの態様では、非経口経路が好ましい。
【０１４０】
本明細書に記載されるｓｉＲＮＡ複合体を含む医薬組成物の投与は、経口、肺、表皮・経皮・眼を含む局所、ならびに、膣および直腸デリバリーを含む粘膜、または静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内注射または輸液を含む非経口でありうる。１つの実施の形態では、ｓｉＲＮＡ複合体はＩＶ、ＩＰまたはボーラス注射として投与される。
【０１４１】
限定はしないが、静脈内、筋肉内および皮下注射を含む注射では、本発明の化合物は、水溶液に、好ましくは生理食塩緩衝液などの生理的に適合する緩衝液、または限定はしないがピロリドンまたはジメチルスルホキシドを含む極性溶媒の形態で製剤されうる。
【０１４２】
当該化合物はまた、たとえば、ボーラス注射または連続輸液による非経口投与用に製剤されうる。注射用製剤は、たとえば、アンプルなどの単位用量形態で、または複数回投与容器で提供されうる。有用な組成物は、限定はしないが、油性または水性媒体中の懸濁液、溶液または乳液を含み、懸濁剤、安定剤および／または分散剤などの添加物を含みうる。非経口投与用の医薬組成物は、限定はしないが、活性化合物の塩（好ましい）などの水溶性の形態の水溶液を含む。加えて、活性化合物の懸濁液は、親油性媒体中で調製されうる。適当な親油性媒体は、ゴマ油などの脂肪油、オレイン酸エチルおよびトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームなどの材料を含む。水系注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなど、懸濁液の粘度を高める物質を含みうる。随意的に、懸濁液はまた、適当な安定剤および／または、高濃度溶液の調製を可能にするために化合物の溶解度を高める物質を含みうる。あるいは、有効成分は、たとえば、滅菌パイロジェンフリー水などの適当な媒体で、使用前に再構成するための粉末の形態でありうる。
【０１４３】
経口投与では、化合物は、活性化合物を、当該分野で周知の医薬品として許容される担体と混合することによって製剤されうる。そのような担体は、本発明の化合物を、錠剤、丸剤、トローチ剤、糖衣剤、カプセル剤、液剤、ジェル、シロップ、ペースト、スラリー、溶液、懸濁液、濃縮溶液、および患者の飲料水で希釈するための懸濁液、患者の食事での希釈するためのプレミックスなどとして、患者による経口摂取用に製剤することを可能にする。経口用途の医薬品は、固体の添加物を用いて、得られた混合物を随意的に粉砕し、他の適当な助剤を必要に応じて加えた後、顆粒の混合物を加工して、錠剤をまたは糖衣剤の核を得ることによって調製されうる。有用な添加物は、特に、増量剤、たとえば乳糖、ショ糖、マンニトール、またはソルビトールを含む糖、セルロース調製物、たとえば、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプンおよびジャガイモデンプン、および他の材料、たとえばゼラチン、トラガントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピル−メチルセルロース、カルボキシ−メチルセルロースナトリウム、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）である。必要に応じて、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸などの崩壊剤を添加してもよい。アルギン酸ナトリウムなどの塩もまた使用して差し支えない。
【０１４４】
吸入による投与では、本発明の化合物は、加圧容器またはネブライザーおよび適当な噴霧剤を用いてエアロゾルスプレーの形態で便利に送達されうる。
【０１４５】
化合物はまた、たとえば、ココアバターまたは他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を用いて、坐剤または停留浣腸剤などの直腸用組成物として製剤されうる。
【０１４６】
前述の製剤に加えて、化合物はデポ製剤としても製剤されうる。そのような長期作用型の製剤は、埋め込みによって（たとえば、皮下にまたは筋肉内に）または筋肉内注射によって投与して差し支えない。本発明の化合物は、この投与経路のために、適当なポリマーまたは疎水性材料を用いて（たとえば、医薬品として許容される油との乳液で）、イオン交換樹脂を用いて、または、たとえば限定はしないが難溶性塩など、難溶性誘導体として、製剤されうる。
【０１４７】
リポソームおよび乳液などの他のデリバリーシステムも使用して差し支えない。
【０１４８】
加えて、複合体は、治療剤入りの固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスなどの徐放系を用いて送達されうる。さまざまな徐放材料が確立されており、当業者によく知られている。
【０１４９】
Ｉ．投与量
治療上有効な量の決定は、特に本明細書の開示に照らせば、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１５０】
本発明の方法に用いられる任意の複合体では、治療上有効な量は、最初にｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイから推定されうる。次いで、有効用量を含む循環濃度を達成するように、用量を動物モデル用途に製剤化することができる。次に、そのような情報を、患者に有用な用量をより正確に決定するために利用することができる。
【０１５１】
たとえばプロドラッグとして用いられる、組成物の投与量は、含まれる親分子（すなわち、非複合体化ｓｉＲＮＡの効力）に応じて決まるであろう。一般に、治療法に用いられるプロドラッグの量は、哺乳類において所望の治療結果を有効に達成する量である。当然、さまざまなプロドラッグ化合物の用量は、親化合物（ｓｉＲＮＡ）、ｉｎ ｖｉｖｏ加水分解の速度、ポリマーの分子量などにいくらか依存して変化するであろう。さらには、用量はもちろん、剤形および投与経路によっても変化しうる。しかしながら、一般的に、本明細書に記載されるｓｉＲＮＡ複合体は、約１ｍｇ／ｋｇ／週〜約１ｇ／ｋｇ／週、好ましくは約１〜約５００ｍｇ／ｋｇ／週およびより好ましくは１〜約１００ｍｇ／ｋｇ／週（すなわち、約２〜約６０ｍｇ／ｋｇ／週）の範囲の量で投与されて構わない。上記に示す範囲は例示であり、当業者は、臨床経験および治療の適応に基づいて、選択されたプロドラッグの最適用量を決定する。さらには、正確な製剤、投与経路および投与量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択されうる。さらに、本明細書に記載される化合物の毒性および治療効果は、本分野で周知の方法を用いて、細胞培養または実験動物において、標準的な薬学的手順によって測定されうる。
【０１５２】
より好ましい態様では、本発明の治療は、本明細書に記載されるｓｉＲＮＡ複合体を、約２〜約５０ｍｇ／ｋｇ／投与、および好ましくは約５〜約３０ｍｇ／ｋｇ／投与の量で哺乳類へ投与する工程を含む。
【０１５３】
あるいは、本明細書に記載されるｓｉＲＮＡ複合体のデリバリーは、約０．１〜約１０００ｎＭ、好ましくは約１０〜約１０００ｎＭのｓｉＲＮＡの濃度を腫瘍細胞または組織とｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで接触させる工程を含む。
【０１５４】
組成物は、１日１回投与でき、または複数週治療プロトコルの一部として与えることができる複数回用量に分割してもよい。正確な用量は、当業者に理解されるように、症状のステージおよび重症度のみならず、腫瘍のポリマー−プロドラッグ組成物に対する感受性、および治療されている患者の個別の特徴に依存する。
【０１５５】
ポリマー複合体が投与される本発明のすべての態様において、言及される投与量は、投与されるポリマー複合体の量でなくｓｉＲＮＡ分子の量に基づいている。治療は、目的の臨床結果が得られるまで、１日以上にわたって与えられることが意図されている。本発明の化合物の正確な量、頻度および投与期間はもちろん、患者の性別、年齢および医学的症状、および主治医によって判定される疾患の重症度に依存して変化するであろう。
【０１５６】
さらに別の態様は、相乗または相加的利益のために、本明細書に記載される本発明の化合物を、他の抗がん療法と併用することを含む。
【実施例】
【０１５７】
下記の実施例は、本発明のさらなる理解を提供する役割を果たすが、いかなる形でも本発明の範囲を限定しないことが意図されている。実施例中に挙げられる太字の数字は、図１〜３中に示される数字に対応する。
【０１５８】
一般的手順
ＰＥＧリンカーとｓｉＲＮＡとの間のすべての複合体化反応は、ＰＢＳ緩衝液系中で室温にて実施された。陰イオン交換クロマトグラフィーを用いてＰＥＧ−ｓｉＲＮＡ複合体を反応しなかった過剰のＰＥＧリンカーおよび未変化ｓｉＲＮＡから分離して、純粋な産物を生じた。
【０１５９】
ＨＰＬＣ法
反応混合物、および中間体および最終産物の純度は、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ Ｇｏｌｄ（登録商標）ＨＰＬＣ機器によって監視した。それは Ｉｔ ｅｍｐｌｏｙｓ ａ Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ（登録商標）３００Ａ Ｃ１８逆相カラム（１５０×４．６ｍｍ）を光ダイオードアレイ装備ＵＶ検出器と共に用い、２５〜３５ ％アセトニトリル勾配を含む５０ ｍＭ ＴＥＡＡ緩衝液を流速１ｍＬ／分にて用いる。陰イオン交換クロマトグラフィーはＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ １００Ａで行い、ＷａｔｅｒｓのＡＰ−Ｅｍｐｔｙガラスカラムに充填したＡｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＰｏｒｏｓ ５０ＨＱ強陰イオン交換樹脂を用いた。脱塩はＡｍｅｒｓｈａｍ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＨｉＰｒｅｐ ２６／１０脱塩カラムを用いることによって達成した。
【０１６０】
実施例１．化合物３の調製
化合物１（３３０ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ、３０当量）および化合物２（５ｍｇ、０．３７μｍｏｌ、１．０当量）を含むＰＢＳ緩衝液（２．５ｍＬ、ｐＨ７．４）の溶液を室温にて５時間攪拌した。反応液をＭｉｌｌｉ−Ｑ水（２５ｍＬ）で希釈し、ＨＱ／１０ Ｐｏｒｏｓ強陰イオン交換カラム（１０ｍｍ×６０ｍｍ、ベッドボリューム〜６ｍＬ）に負荷した。未反応ＰＥＧリンカーは除去された。純粋な産物を含む画分をプールし、凍結乾燥して純粋な化合物３（６．５ｍｇ、０．１５ｕｍｏｌ、４０％）を得た。
【０１６１】
実施例２．化合物５の調製
化合物４を実施例１に記載の条件に供して、化合物５を得た。
【０１６２】
実施例３．化合物７の調製
化合物６を実施例１に記載の条件に供して、化合物７を得た。
【０１６３】
実施例４．生理食塩水中のｉｎ ｖｉｔｒｏ安定性試験
ｓｉＲＮＡのＰＥＧポリマーとの複合体化の作用を判定するために、ＰＥＧ化ｓｉＲＮＡの安定性を測定した。未変化ｓｉＲＮＡ（配列番号：２および３）またはＰＥＧ化ｓｉＲＮＡ複合体（化合物３、５および７）を生理食塩水に溶解して濃度約０．７ｍｇ／ｍＬとした。各被験化合物の１００μＬの部分標本を別々のエッペンドルフチューブに加え、３７℃にてそれぞれ３０分間、１時間、２時間、４時間、６時間、および２４時間インキュベートした。各時点での試料を、５０〜２００μＬの部分標本をＨＰＬＣに注入し、次いでＰＥＧ化ｓｉＲＮＡに対応するピークの面積を分析することによって分析した。分析は個々の被験化合物について２回繰り返した。結果を下記の表１に示す。
【０１６４】
実施例５．ラットおよびヒト血漿中のｉｎ ｖｉｔｒｏ安定性試験
ヒトおよびラット血漿中の未変化ｓｉＲＮＡおよびＰＥＧ化ｓｉＲＮＡの動態試験を、ｉｎ ｖｉｔｒｏＴ１／２を評価するために実施した。未変化ｓｉＲＮＡまたはＰＥＧ化ｓｉＲＮＡ複合体（化合物３、５および７）を新鮮血漿に溶解して濃度〜０．７ｍｇ／ｍＬとした。各被験化合物の１００μＬの部分標本を別々のエッペンドルフチューブに加え、３７℃にてそれぞれ５分間、１５分間、３０分間、１時間、２時間、４時間、６時間、および２４時間インキュベートした。未変化ｓｉＲＮＡをフェノール・クロロホルムで抽出し、ＨＰＬＣに注入する前に、ＰＥＧ−ｓｉＲＮＡ複合体を有機溶媒アセトニトリル／メタノールで抽出した。分析は個々の被験化合物について２回繰り返した。ＰＥＧ−ｓｉＲＮＡ複合体のｉｎ ｖｉｔｒｏ安定性特性を表１に示し、安定性曲線も図４に示す。
【表１】
2010510810.tif 000028
【０１６５】
結果は、ＰＥＧ−ｓｉＲＮＡ 複合体が血漿中でヌクレアーゼに対して高まった安定性を有することを示している。
【０１６６】
実施例６．ウェスタンブロットを用いるｉｎ ｖｉｔｒｏ効力試験
ｓｉＲＮＡおよび３つのＰＥＧ−ｓｉＲＮＡ複合体（化合物３、５および７）および未変化ｓｉＲＮＡについてのｉｎ ｖｉｔｒｏ効力試験を、ウェスタンブロットを用いることによって実施した。各被験化合物０．１ｎＭから１，０００ｎＭをＳｉＬｅｎＦｅｃｔ（ＢｉｏＲａｄ社製）と混合し、１０，０００個のＡＫ４３１Ｋ５細胞を含むＰＲＭＩ１６４０培地に加え、３７℃にて５％ＣＯ２雰囲気で７２時間インキュベートした。インキュベート後、ＡＫ４３１Ｋ５細胞タンパク質を各被験化合物でトランスフェクションされたＡＫ４３１Ｋ５細胞から抽出し、４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、Ｈｙｂｏｎｄ膜に転写した。膜を１／１０００希釈のＢＣＬ２に対するモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製ＳＣ７３２８）およびアルファ−チューブリンに対するモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製ＳＣ５２８６）中で４℃にて一晩インキュベートし、次いで１／２，０００希釈の抗マウスＩｇＧ（Ｓａｎｔ−Ｃｒｕｚ社製，ＳＣ ２０３１）中で室温にて１時間インキュベートした。膜を化学発光試薬中で発色させた。ウェスタンブロットからの結果を図５に示す。結果は、未変化ｓｉＲＮＡおよびＰＥＧ−ｓｉＲＮＡ複合体がＢＣＬ２タンパク質発現の用量依存的ダウンレギュレーションを示したことを示す。臨床医は患者の必要に応じて治療用オリゴヌクレオチドの投与量を調整するので、この性質は、がんの治療において長所となりうる。
【０１６７】
実施例７．ＲＴ−ＰＣＲを用いるｉｎ ｖｉｔｒｏ効力試験
３つのＰＥＧ−ｓｉＲＮＡ複合体（化合物３、５および７）および未変化ｓｉＲＮＡについてのｉｎ ｖｉｔｒｏ効力試験を、ＲＴ−ＰＣＲを用いることによって実施した。各被験化合物でトランスフェクションされたＨ４６０細胞から、ＲＮＡｑｕｅｏｕｓキット（ＡｍＢｉｏｎ社製）の取扱説明書にしたがって総ＲＮＡを抽出した。各試料に由来する総ＲＮＡ１００ｎｇを、ＴａｇＭａｎ遺伝子発現アッセイ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製Ｈｓ００６０８０２３ ｍｌ）を用いて相対定量検定法によって分析した。１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を内在性対照として用いた。ＲＴ−ＰＣＲからの結果を図６に示す。結果は、未変化ｓｉＲＮＡおよびＰＥＧ−ｓｉＲＮＡ複合体がＢＣＬ２ ｍＲＮＡ発現の用量依存的ダウンレギュレーションを示したことを示す。結果は、本発明に記載のｓｉＲＮＡデリバリー技術が、ｓｉＲＮＡの細胞取り込み、治療用の使用を可能にすることを示している。 
実施例８．ＩＣＲマウスにおけるＰＥＧ−ｓｉＲＮＡ複合体の薬物動態
被験化合物群当たり３０匹の雌マウスに単回低速ボーラス静脈内注射を側尾静脈から、５０ｍｇ／ｋｇ ｓｉＲＮＡまたは各ＰＥＧ−ｓｉＲＮＡ複合体（化合物３、５および７）についてｓｉＲＮＡ等量を投与した。投与後に、マウス（３匹／群）を心臓穿刺によってＥＤＴＡ入りチューブに、下記に示す時点で採血した。５分間４００×ｇにて血液の遠心分離後、血漿を回収し、直ちにドライアイス上で−８０℃にて凍結した。５匹の未処理マウスを陰性対照として採血した。血漿中の遊離ｓｉＲＮＡおよびＰＥＧ−ｓｉＲＮＡの濃度をＨＰＬＣによって測定した。薬物動態パラメータを、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｐｈａｒｓｉｇｈｔを用いて決定した。各動物を試験期間中に検査した。検査は、一般状態、皮膚および被毛、眼、鼻、腹部および外性器の観察、および呼吸の評価、および、あれば異常行動または毒性作用または薬理作用の臨床徴候の観察を含んだ。薬物動態結果を表２に示す。
【表２】
2010510810.tif 000029
【０１６８】
マウスに静脈内投与されたＰＥＧ−ｓｉＲＮＡ複合体の血漿濃度−時間曲線を図７に示す。未変化ｓｉＲＮＡおよび化合物５で試験したマウスには２５ｍｇ／ｋｇ ｓｉＲＮＡ当量にて投与した。化合物３および化合物７で試験したマウスには５０ ｍｇ／ｋｇ ｓｉＲＮＡ当量を投与した。非複合体化未変化ｓｉＲＮＡで処理したマウスでは、ｓｉＲＮＡは投与５分以内に血漿中に検出不能であった。結果は、ｓｉＲＮＡ複合体が未変化ｓｉＲＮＡと比較してｓｉＲＮＡの循環を顕著に延長したことを示す。理論に縛られるわけではないが、ｓｉＲＮＡの生物安定性などのｓｉＲＮＡの薬力学的性質は、分解すなわちヌクレアーゼに対するｓｉＲＮＡ耐性の上昇を通じて改善された。
【０１６９】
実施例９．ヒト肺腫瘍細胞を異種移植されたマウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ効力試験
異なるリンカーを用いて調製されたＰＥＧ−ｓｉＲＮＡ複合体（化合物３、５および７）のＢＣＬ２ダウンレギュレーション効力を、Ｎｕ／ｎｕマウス、Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（雌）で評価した。試験には、生理食塩水または未変化ｓｉＲＮＡを注射されたマウスの対照群も含めた。Ｈ４６０ヒト非小細胞肺腫瘍を、ヌードマウスにおいて２．５×１０６細胞／マウスの右腋側腹部への皮下注射によって確立した。腫瘍成長を週２回監視し、触知可能になるとすぐに計測した。腫瘍が平均量７０〜８０ｍｍ３に達した際に、マウスを実験群に分割した（１０匹／群）。各マウスについて腫瘍量を、ノギスを用いて２次元計測することによって測定し、式：腫瘍量＝（長さ×幅２）／２を用いて計算した。
【０１７０】
各被験化合物を含む溶液を生理食塩水で調製した。注射量は０．２ｍＬであった。投与用溶液は注射の直前に作製した。未変化ｓｉＲＮＡを腫瘍内に注射したのを除いて、各被験化合物（化合物３、５および７）を腹腔内に注射した。各被験化合物は試験終了まで１日１回１０ｍｇ／ｋｇ（ｓｉＲＮＡ当量）にて注射した。投与１日目をＤａｙ１とした。Ｄａｙ９に各試験群から３匹のマウスを殺処理して、腫瘍中のＢＣＬ２レベルを調べた。動物を殺処理した際に、動物からの腫瘍のほとんどを摘出した。一部の腫瘍は、大きい潰瘍形成が腫瘍試料の摘出を妨げたため、摘出されなかった。これらの組織についてＢＣＬ２ ｍＲＮＡレベルをＲＴ−ＰＣＲを用いて定量し、結果を表３に示す。
【表３】
2010510810.tif 000030
【０１７１】
ビシンを基礎とする遊離可能なリンカーを含むＰＥＧ−ｓｉＲＮＡ複合体は、Ｈ４６０ヒトがん細胞を異種移植されたマウスの組織において、ＢＣＬ２ ｍＲＮＡ発現を顕著にダウンレギュレートした。本発明に記載の複合体は、トランスフェクション剤の非存在下で、がん細胞におけるｓｉＲＮＡの細胞取り込み、ｍＲＮＡダウンレギュレーションを可能にする。この技術は、治療用ｓｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ投与に有益である。
【図１】
2010510810.tif 000043
【図２】
2010510810.tif 000044
【図３】
2010510810.tif 000045
【図４】
2010510810.tif 000046
【図５】
2010510810.tif 000047
【図６】
2010510810.tif 000048
【図７】
2010510810.tif 000049
【配列表】
2010510810000001.app
【国際調査報告】
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