(57)【要約】  トランスジーン発現を増強させるため、ウイルスベースベクター類を遺伝子工学で作製し、抗ウイルス免疫系の阻害剤類（例  Ｉ型インターフェロン応答阻害剤類）を発現させる。前記トランスジーン類は、抗原類または他の治療剤をコードできる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞１型インターフェロン（ＩＦＮ）応答サプレッサー因子をコードする１種以上の遺伝子工学で作製された核酸類と、
１種以上の宿主細胞活性アミノ酸配列類をコードする１種以上の遺伝子工学で作製された核酸類と
を含む組換えウイルスベクターであって、
前記１種以上の宿主細胞活性アミノ酸配列類をコードする前記１種以上の遺伝子工学で作製された核酸類が、前記宿主細胞で過剰発現されることを特徴とする組換えウイルスベクター。
【請求項２】
前記宿主細胞１型ＩＦＮ応答サプレッサー因子がロタウイルスＮＳＰ１またはインフルエンザウイルスＮＳ１である請求項１記載の組換えウイルスベクター。
【請求項３】
前記宿主細胞１型ＩＦＮ応答サプレッサー因子が、ロタウイルスＮＳＰ１、インフルエンザウイルスＮＳ１、エクトロメリアウイルスＣ１２Ｒたんぱく質、Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ３／４Ａプロテアーゼ、ワクチニアウイルスνＩＦＮ−α／βＲｃたんぱく質、アデノウイルスＥ１Ａたんぱく質、パラミキソウイルスのＣたんぱく質類およびヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６オンコプロテインから構成される群から選択される請求項１記載の組換えウイルスベクター。
【請求項４】
前記組換えウイルスベクターが、アデノウイルス類、バキュロウイルス類、ポックスウイルス類、麻疹ウイルス類、ポリオウイルス類、レンチウイルス類、肝炎ウイルス類、アルボウイルス類および水疱性口内炎ウイルス類から構成される群から選択される請求項１記載の組換えウイルスベクター。
【請求項５】
前記１種以上の免疫刺激性アミノ酸配列類が、ロタウイルス、インフルエンザウイルス、エクトロメリアウイルス、肝炎ウイルス類、ワクチニアウイルス、アデノウイルス、パラミキソウイルス、ＨＰＶ，ＨＩＶ，ＨＴＬＶ、エンテロウイルス類、ヘルペスウイルス類、ＥＥＥ，ＶＥＥ，西ナイルウイルス、ノーウォークウイルス、パルボウイルス類、デングウイルス、および出血熱ウイルスの１種以上に由来する請求項１記載の組換えウイルスベクター。
【請求項６】
前記１種以上の宿主細胞活性アミノ酸配列類が抗原である請求項１記載の組換えウイルスベクター。
【請求項７】
前記抗原がマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）抗原である請求項６記載の組換えウイルスベクター。
【請求項８】
個体の宿主細胞中における調節された応答を惹起する方法であって、
前記個体の前記宿主細胞に対して組換えウイルスベクター、すなわち
前記組換えウイルスベクターが、宿主細胞１型インターフェロン（ＩＦＮ）応答サプレッサー因子をコードする１種以上の遺伝子工学で作製された核酸類と、
１種以上の宿主細胞活性アミノ酸配列類をコードする１種以上の遺伝子工学で作製された核酸類と
を含む組換えウイルスベクターを投与する過程を含み、
前記１種以上の宿主細胞活性アミノ酸配列類をコードする前記１種以上の遺伝子工学で作製された核酸類が、前記宿主細胞で調節された量で過剰発現されること、および、前記１種以上の宿主細胞活性アミノ酸配列類の前記宿主細胞中における過剰発現が前記宿主細胞中における前記調節された応答を惹起することと、
前記調節された量が、（ａ）前記宿主細胞１型ＩＦＮ応答サプレッサー因子をコードする前記１種以上の遺伝子工学で作製された核酸類に関連し、（ｂ）前記１種以上の宿主細胞１型ＩＦＮ応答サプレッサー因子をコードする前記１種以上の遺伝子工学的に作製された核酸類または前記１種以上の宿主細胞活性アミノ酸配列類をコードする前記１種以上の遺伝子工学で作製された核酸類のプロモータに関連し、または（ｃ）前記宿主細胞１型インターフェロン応答サプレッサー因子をコードする前記１種以上の遺伝子工学で作製された核酸類または前記１種以上の宿主細胞活性アミノ酸配列類をコードする前記１種以上の遺伝子工学で作製された核酸類のコピー数に関連していることと
を特徴とする方法。
【請求項９】
前記１種以上の宿主細胞活性アミノ酸配列類が免疫刺激性であり、かつ前記調節された応答が前記個体による免疫応答である請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記１種以上の宿主細胞活性アミノ酸配列類が前記宿主細胞にとって治療的でありかつ前記調節された応答が前記個体にとって治療的である請求項８記載の方法。
【請求項１１】
前記宿主細胞が癌細胞で、前記１種以上の宿主細胞活性アミノ酸配列類がアポトーシスを促進するかまたはそうでない場合には癌細胞を死滅させる配列類であり、かつ、前記調節された応答が前記癌細胞のアポトーシスすなわち死である請求項８記載の方法。
【請求項１２】
１種以上の免疫原性アミノ酸配列類に対する免疫応答を個体で惹起させる方法であって、
前記個体に対して、
宿主細胞１型インターフェロン（ＩＦＮ）応答サプレッサー因子をコードする１種以上の遺伝子工学で作製された核酸類と、
１種以上の宿主細胞活性アミノ酸配列類をコードする１種以上の遺伝子工学で作製された核酸類と
を含む組換えウイルスベクターを投与する過程を含み、
前記組換えウイルスベクターからの前記１種以上の免疫原性アミノ酸配列類の発現が、前記個体中において前記１種以上の免疫原性アミノ酸配列類に対する免疫応答を惹起することを特徴とする方法。
【請求項１３】
前記１種以上の免疫原性アミノ酸配列類が結核またはマラリアにとって抗原類である請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
個体において癌を治療する方法であって、
前記個体に対して、
宿主細胞１型インターフェロン（ＩＦＮ）応答サプレッサー因子をコードする１種以上の遺伝子工学で作製された核酸類と、
１種以上のアポトーシス誘発アミノ酸配列類をコードする１種以上の遺伝子工学で作製された核酸類と
を含む組換えウイルスベクターを投与する過程を含み、
前記１種以上のアポトーシス誘発アミノ酸配列類の前記組換えウイルスベクターからの発現が、前記個体における癌細胞のアポトーシスの原因となることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概括的には、ウイルスベースベクター類からのトランスジーン発現の増強に関する。本発明は、より詳しくいうと、宿主細胞活性応答類（例  免疫刺激性、治療または選択的にアポトーシス性）を付与する問題の遺伝子類とともに、Ｉ型インターフェロン応答の遺伝子工学的に作製された阻害剤類をコードするウイルスベースベクター類を提供し、それによって、トランスジーン発現を増強する。
【背景技術】
【０００２】
自然免疫系は、細菌類またはウイルス類を含む侵襲性病原体類に対する防御システムの最も重要な系列として作用している。真核細胞は、トル（Ｔｏｌｌ）様レセプター類（ＴＬＲｓ）、ノッド様（ヌクレオチド結合オリゴマー形成ドメイン）レセプター類およびＲＮＡヘリカーゼ類ＲＩＧ−Ｉ（レチノイン酸誘発可能遺伝子−Ｉ）およびＭＤＡ５（メラノーマ分化関連遺伝子５）のような細胞表面および細胞内の生殖細胞にコードされたいくつかのパターン認識レセプター類（ＰＲＲｓ）により、ウイルス類および微生物類の構成要素類を認識する先天的能力を有している。これらのレセプター類によるウイルスまたは細菌構成要素類の結合が、抗菌性および抗ウイルス性エフェクター類のアップレギュレーションおよび産生を媒介する。
【０００３】
獲得免疫系を進化させた顎のある脊椎動物類はまた、オートクリンおよびパラクリンの感染存在シグナル伝達に邁進しかつウイルス類および細胞内細菌類を含む感染性物質に対する防御を付与する細胞間コミュニケーションを促進するインターフェロンサイトカインファミリを発達させた。同様に、それらは、異物の細胞性プロセスまたは分解を中断させることによって感染を限定することを目的とした感染細胞内機構類を活性化させることもある。インターフェロン（ＩＦＮ）―αおよび−βは、Ｉ型ＩＦＮファミリを含み、細胞上に抗ウイルス状態を付与する液性因子類として最初に同定された。Ｉ型ＩＦＮｓの抗ウイルス作用に必須のオートクリンＩＦＮ誘発エフェクターおよびモジュレータたんぱく質類には、ＲＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）、２，５´−オリゴアデニレートシンセターゼ（ＯＡＳ）、ＲＮａｓｅ  Ｌ、およびＭｘプロテインＧＴＰａｓｅ類がある。二重鎖または高次構造のＲＮＡは、ＲＮＡ翻訳を停止させるＩＦＮ誘発可能ＰＫＲキナーゼおよびＲＮＡを分解するＯＡＳ依存性ＲＮａｓｅ  Ｌによりそれぞれ触媒されたたんぱく質リン酸化およびＲＮＡ分解の修飾ならびにＩＦＮ誘発可能ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ１）によるＲＮＡ編集に中心的役割を果たす。ＩＦＮ−α／βの発現は、ＩＦＮ制御因子（ＩＲＦ）ファミリの転写因子類によって効果的に制御されている。例えば、二重鎖ＲＮＡおよびリポ多糖がＴＬＲ３およびＴＬＲ４によりそれぞれ認識されると、ＩＲＦ−３およびＩＲＦ−４活性化につながる；ＴＬＲ７およびＴＬＲ９は、一重鎖ＲＮＡおよびＣｐＧ  ＤＮＡを検出し、ＩＲＡＫ１／４およびＴＲＡＦ６をも巻き込むＭｙＤ８８依存性経路によりＩＲＦ−５およびＩＲＦ−７を刺激する。
【０００４】
哺乳類の最も有効なウイルス病原体類は、これらのオートクリンおよびパラクリン応答の阻害機構を展開し、それらが感染を樹立できるようにした。さらに、あるウイルス類または二重鎖ＲＮＡは、ＴＬＲ非依存性ＰＲＲ応答類を活性化させ、それは、アダプター分子ＩＰＳ−１（インターフェロン−プロモータ刺激剤１）を介して細胞質ゾルＲＮＡヘリカーゼ類であるＲＩＧ−Ｉおよび／またはＭＤＡ５によりシグナルを出し、それによって、特異的応答遺伝子類のＩＲＦ−３およびＩＲＦ−７依存性転写を刺激する。この応答を克服するために放出されるウイルスたんぱく質類の例には、ＩＲＦ−３を結合し核トランスロケーションを防御するロタウイルスＮＳＰ１たんぱく質、ＩＦＮ−α／βを結合するエクトロメリアウイルスのＣ１２Ｒたんぱく質、ＩＲＦ−３の核トランスロケーションを防止しＲＩＧ−１依存性シグナル伝達に干渉するインフルエンザＮＳ１およびＩＦＮ−α／βの転写シグナル伝達に関与するＭＡＶおよびＴＲＩＦたんぱく質類を特異的に切断するＣ型肝炎ウイルスのＮＳ３／４Ａプロテアーゼが含まれるが、それらに限定されない。
【非特許文献１】KOPECKYet al. Contrasting Effects of Matrix Protein on Apoptosis in HeLa and BHK Cellsinfected with Vesicular Stomatitis Virus Are due to Inhibition of Host GeneExpression. JOURNAL OF VIROLOGY, 2003, Vol 77, No 8, pp 4658-4669
【特許文献１】US 6,239,260B1
【特許文献２】US2005/0118659 A1
【特許文献３】US2006/0210540 A1
【特許文献４】US7,067,301 B2
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ワクチン類は、多くの疾患発症の撲滅または低減に成功してきた。しかし、いくつかの疾患は、これまで免疫化努力に頑強に抵抗することが証明されてきた。中でも、現在用いられているワクチン類は、最適な効果を有していなかったり厄介な副作用を有したりしている。従って、ワクチン設計に対する新しい手法の必要性がまだ続いている。真核細胞に本質的に感染可能な弱毒化ウイルス類に基づくベクター類の使用が特に将来性がある。このようなベクター類は、問題の抗原類をコードするトランスジーン類を含み発現させるように、遺伝子工学で容易に作製できる。多くの場合、残念なことに、このようなベクター類を投与しても、レシピエントに防御性の免疫応答を惹起させるだけの十分な抗原類を産生させるに至っていない。このことは、しばしば、ワクチンベクターに感染した宿主細胞がウイルス感染性物質類と弱毒化ウイルスワクチンベクター類を識別しないことが理由となっている。宿主細胞は、真の感染性物質に対するのと同様にワクチンウイルスベクターに反応する：前記細胞は免疫応答、特にＩＦＮ  Ｉ応答を開始し、それにより、コードされた抗原類を産生するワクチンベクターの能力を破壊するかまたは減弱させ、それによってワクチン投与の目的に打ち勝つ。
【０００６】
新しいワクチンデリバリビヒクル類を開発しかつ既存のワクチンデリバリビヒクル類を改良する必要が今なお続いており、特に、ウイルスベースワクチンベクター類による抗原産生に宿主が干渉するという問題を解決する必要が、未だ続いている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、宿主細胞活性アミノ酸配列類（本明細書で時に、”コードされた因子類“と称し、酵素類、抗原類、抗体類、治療剤類、アポトーシス物質類（例  ＴＮＦ）、癌または腫瘍死滅物質類等を含む１種以上の問題のたんぱく質類またはペプチド類であり得る）をコードする核酸配列を含むように遺伝子工学で作製されていることに加えて、哺乳類抗ウイルス免疫応答を阻害する因子類（本明細書で時に、“サプレッサー因子類“または”干渉因子類“と称する）をコードする核酸配列類を含むようにも遺伝子工学で作製されたウイルスベクター類を提供する。例えば、前記ウイルスベクター中のコードされた因子類は、結核または他の疾患類（マラリア、ヒト免疫不全、インフルエンザ、デング熱等）に特異的な１種以上の抗原類であり得る。前記ベクターはまた、ウイルス類に対する哺乳類ＩＦＮ  Ｉ応答を阻害するサプレッサー因子類をコードするように遺伝子工学的に作製されるであろう。その結果、前記ベクターによってコードされた抗原類は、宿主細胞の抗ウイルス免疫応答による干渉なくまたは干渉が減弱されて真核宿主細胞中で転写されかつ翻訳される。従って、ヒトまたは他の哺乳類における免疫刺激応答を産生する能力が増大する。本発明はまた、宿主細胞抗ウイルス免疫応答による干渉がないかあるいは干渉が減弱しているであろうということから、前記ウイルスベクター類を用いて問題のたんぱく質類（例  インシュリン、腫瘍壊死因子等）のデリバリを増大させるための適用に関する。
【０００８】
本発明の目的は、宿主細胞１型インターフェロン（ＩＦＮ）応答サプレッサー因子をコードする１種以上の遺伝子工学作製核酸類；および１種以上の宿主細胞活性アミノ酸配列類をコードする１種以上の遺伝子工学作製核酸類を含む組換えウイルスベクターを提供することである。前記１種以上の宿主細胞活性アミノ酸配列類をコードする１種以上の遺伝子工学作製核酸類は、宿主細胞で過剰発現する。本発明の１態様において、前記宿主細胞１型ＩＦＮ応答干渉因子は、ロタウイルスＮＳＰ１またはインフルエンザウイルスＮＳ１である。別の態様において、宿主細胞ＩＦＮ型応答干渉因子は、ロタウイルスＮＳＰ１、インフルエンザウイルスＮＳ１、エクトロメリアウイルスＣ１２Ｒたんぱく質、Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ３／４Ａプロテアーゼ、ワクチニアウイルスνＩＦＮ−α／βＲｃたんぱく質、アデノウイルスＥ１Ａたんぱく質、パラミキソウイルスのＣたんぱく質類、またはヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６オンコプロテインである。さらに別の態様において、前記組換えウイルスベクターが、アデノウイルス類、バキュロウイルス類、ポックスウイルス類、麻疹ウイルス類、ポリオウイルス類、レンチウイルス類、肝炎ウイルス類、アルボウイルス類または水疱性口内炎ウイルス類（または、広く多様な他のウイルス類）から由来する。いくつかの態様において、前記コードされた因子類には、ロタウイルス、インフルエンザウイルス、エクトロメリアウイルス、肝炎ウイルス（例  Ｃ等）、ワクチニアウイルス、アデノウイルス、パラミキソウイルス、ＨＰＶ，ＨＩＶ、ＨＴＬＶ，エンテロウイルス類、ヘルペスウイルス類、ＥＥＥ、ＶＥＥ、西ナイルウイルス、ノーウォークウイルス、パルボウイルス類、デングウイルス、および出血熱ウイルス（または他の多様なウイルス類）の１種以上に由来する１種以上の免疫刺激アミノ酸配列類を含む。いくつかの態様において、前記１種以上の宿主細胞活性アミノ酸配列類は、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）抗原のような抗原類である。前記コードされた因子類はまた、酵素類、治療ペプチド類またはたんぱく質類、アポトーシス性または抗癌性の物質類等であることもでき、ここで、前記コードされた因子類の性質は、その適用に応じるであろう。
【０００９】
本発明の別の目的は、宿主細胞１型インターフェロン（ＩＦＮ）応答サプレッサー因子をコードする１種以上の遺伝子工学作製核酸類；および１種以上の宿主細胞活性アミノ酸配列類をコードする１種以上の遺伝子工学作製核酸類を含む組換えウイルスベクターを用いてインビトロまたはインビボ（例  ヒトのような哺乳類）において細胞に対して前記１種以上の宿主細胞活性アミノ酸配列類を提供する方法を提供することである。前記細胞に前記組換えウイルスベクターを感染させると、前記細胞が前記組換えウイルス類に対して有効な哺乳類ＩＦＮ  Ｉ応答を開始する能力を全く有していないかまたは減弱したその能力を有することになるだろうという理由から、前記アミノ酸類がより多く産生されるようになるであろう。前記１種以上の宿主細胞活性アミノ酸配列類をコードする前記１種以上の遺伝子工学作製核酸類は、前記宿主細胞で過剰発現される。本発明の１態様において、宿主細胞１型ＩＦＮ応答干渉因子は、ロタウイルスＮＳＰ１またはインフルエンザウイルスＮＳ１である。別の態様において、前記宿主細胞ＩＦＮ型応答干渉因子は、ロタウイルスＮＳＰ１、インフルエンザウイルスＮＳ１、エクトロメリアウイルスＣ１２Ｒたんぱく質、Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ３／４Ａプロテアーゼ、ワクチニアウイルスνＩＦＮ−α／βＲｃたんぱく質、アデノウイルスＥ１Ａたんぱく質、パラミキソウイルスのＣたんぱく質類、またはヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６オンコプロテインである。さらに別の態様において、前記組換えウイルスベクターは、アデノウイルス類、バキュロウイルス類、ポックスウイルス類、麻疹ウイルス類、ポリオウイルス類、レンチウイルス類、肝炎ウイルス類、アルボウイルス類または水疱性口内炎ウイルス類（または、多様な他のウイルス類）に由来する。さらに別の態様において、前記コードされた因子類には、ロタウイルス、インフルエンザウイルス、エクトロメリアウイルス、肝炎ウイルス類（例  Ｃ等）、ワクチニアウイルス、アデノウイルス、パラミキソウイルス、ＨＰＶ，ＨＩＶ、ＨＴＬＶ、エンテロウイルス類、ヘルペスウイルス類、ＥＥＥ，ＶＥＥ，西ナイルウイルス、ノーウォークウイルス、パルボウイルス類、デングウイルス、および出血熱ウイルス（または広く多様な他のウイルス類）の１種以上に由来する１種以上の免疫刺激アミノ酸配列類を含む。いくつかの態様において、前記１種以上の宿主細胞活性アミノ酸配列類は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原のような抗原類である。前記コードされた因子類はまた、酵素類、治療ペプチド類またはたんぱく質類、アポトーシス性または抗癌性の物質類等であることもでき、ここで、前記コードされた因子類の性質は、前記適用に依存するであろう。
【００１０】
本発明のさらに別の目的は、１型ＩＦＮ応答の量をより多くまたはより少なく選択的に提供するために、宿主細胞においてインビトロまたはインビボで応答を調整する機構を提供することにある。異なる１型ＩＦＮサプレッサー因子類の中から選択することにより、サプレッサー因子と１種以上の宿主細胞活性アミノ酸配列類をコードする１種以上の遺伝子工学作製核酸類を有する組換えウイルスベクターが、提供できる。前記調整された組換えウイルスベクターは、インビトロまたはインビボ（例  ヒトのような哺乳類）において細胞に対して、ウイルスベクター中に遺伝子工学で作製された前記干渉因子に応じて、より多量またはより少量の前記１種以上の宿主細胞活性アミノ酸配列類を提供できる。調整はまた、異なるプロモータ類から選択することによって、問題のたんぱく質類をコードする核酸類の付加的コピーを提供することによって、および他の手段によって、達成することもできる。前記細胞に前記組換えウイルスベクターを感染させると、前記組換えウイルスベクターに対して効果的な哺乳類ＩＦＮ  Ｉ応答を開始する能力を前記細胞が全く有していないかまたは低下したその能力を有することになるだろうという理由から、前記アミノ酸類がより多く産生される結果となるであろう。前記産生増大した量は、いくつかの適用においては有意に高い産生が達成でき一方他の適用ではわずかに多い産生が達成されるように、組換えウイルスベクターを製造するために用いた調整によって加減できる。本文で考慮した調整では、宿主細胞におけるコードされた因子類の低から高生産まで全スペクトルに関連する。前記１種以上の宿主細胞活性アミノ酸配列類をコードする１種以上の遺伝子工学作製核酸類は、用いた調整により制御できる程度にまで宿主細胞中で過剰発現される。本発明の１態様において、宿主細胞１型ＩＦＮ応答干渉因子は、ロタウイルスＮＳＰ１またはインフルエンザウイルスＮＳ１である。別の態様において、前記宿主細胞ＩＦＮ型応答干渉因子は、ロタウイルスＮＳＰ１、インフルエンザウイルスＮＳ１、エクトロメリアウイルスＣ１２Ｒたんぱく質、Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ３／４Ａプロテアーゼ、ワクチニアウイルスνＩＦＮ−α／βＲｃたんぱく質、アデノウイルスＥ１Ａたんぱく質、パラミキソウイルスのＣたんぱく質類、またはヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６オンコプロテインである。さらに別の態様において、前記組換えウイルスベクターは、アデノウイルス類、バキュロウイルス類、ポックスウイルス類、麻疹ウイルス類、ポリオウイルス類、レンチウイルス類、肝炎ウイルス類、アルボウイルス類または水疱性口内炎ウイルス類、または広く多様な他のウイルス類に由来する。さらにいくつかの態様において、前記コードされた因子類には、ロタウイルス、インフルエンザウイルス、エクトロメリアウイルス、肝炎ウイルス類（例  Ｃ等）、ワクチニアウイルス、アデノウイルス、パラミキソウイルス、ＨＰＶ，ＨＩＶ、ＨＴＬＶ、エンテロウイルス類、ヘルペスウイルス類、ＥＥＥ，ＶＥＥ，西ナイルウイルス、ノーウォークウイルス、パルボウイルス類、デングウイルス、および出血熱ウイルス（または多様な他のウイルス類）の１種以上に由来する１種以上の免疫刺激アミノ酸配列類を含む。いくつかの態様において、前記１種以上の宿主細胞活性アミノ酸配列類は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原のような抗原類である。前記コードされた因子類は、また、酵素類、治療ペプチド類またはたんぱく質類、アポトーシス性または抗癌性の物質類等であることもでき、ここで、前記コードされた因子類の性質は、前記応用に依存するであろう。
【発明の効果】
【００１１】
新しいワクチンデリバリビヒクル類を提供し既存のワクチンデリバリビヒクルの改良を可能にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、宿主細胞中で活性の問題の１種以上のアミノ酸配列類（例  たんぱく質類、ペプチド類、酵素類または他のコードされた因子類または物質類）をコードする核酸配列類を含むように遺伝子工学で作製されたことに加えて、ウイルス類に対する宿主細胞免疫応答を阻害する１種以上の因子類（“サプレッサー因子”または“干渉因子”と本明細書で称する）をコードする核酸配列類を含むように同様に遺伝子工学で作製されたウイルスベクター類の開発に基づいている。その結果、前記ウイルスワクチンベクター類に感染した哺乳類宿主細胞が、宿主細胞の抗ウイルス免疫応答に妨害されることも阻害されることもなく、問題のたんぱく質（類）を産生する。前記アミノ酸類は、前記の遺伝子工学で作製された核酸類から発現し、宿主細胞活性ですなわちそれらは宿主細胞に有益な活性（性質、特徴等）を有している。いくつかの態様において、前記アミノ酸類は抗原類であり、前記ベクターから免疫応答阻害剤類も同様に発現させている細胞中においてこれらの抗原類の発現が増大したことで、前記抗原類に対する細胞および体液性の免疫応答向上につながる。さらに、トランスジーン発現の向上により、適切な免疫応答を達成するために必要なベクター用量を低下させることもできる。他の態様において、前記コードされた因子類は、他の点では性質が治療的であることもできる。本明細書で“治療的”とは、抗原類ではないが宿主細胞中でいくつかの他の有益な効果を有している因子類（例えば、インシュリン、第ＶＩＩＩ因子および他のペプチド類は、“治療的”である）を示すのに用いられる。前記コードされた因子類はまた、選択的にアポトーシス性であることもでき（例  ＴＮＦ）、抗癌剤として作用することもできる。
【００１３】
もし宿主細胞免疫応答を阻害する干渉因子類（通常、たんぱく質類）の起源がウイルス性であるならば、それらは、非相同性（すなわち、前記ウイルスワクチンベクターと異なるウイルスタイプに由来する、すなわちそれに派生する）であるかまたは相同性（すなわち、同一ウイルスタイプに由来する、すなわちそれに派生する）である。例えば、アデノウイルスベクターは、インフルエンザウイルスのような例えば非相同性ウイルスに由来する免疫系阻害剤を含みかつ発現するように遺伝子工学で作製することもできる。これとは別に、たとえ前記ウイルスベクターが既に本来前記阻害剤をコードできるにしても、アデノウイルスベクターを、相同性アデノウイルス免疫系阻害剤を含み過剰発現するように遺伝子工学で作製することもできる。後者の場合、前記相同性免疫系阻害剤は、起源ウイルス中における正常または特徴的発現レベルを超えたレベルにおいて前記遺伝子工学作製ベクター中で過剰発現されるし、または、本発明による遺伝子工学で作製される以前に前記ウイルスベクター中で過剰発現される。このことは、例えば、前記ウイルスベクターを遺伝子工学処理して前記阻害剤をコードする遺伝子の多コピーを含むようにさせるか、または前記ウイルスベクターを遺伝子工学処理して前記阻害剤の転写がより有効なプロモータ（例  スーパープロモータ）によって駆動されるようにすることによって、またはこれらの手段の組み合わせなどによって、達成される。
【００１４】
さらに本発明の別の面は、レシピエント宿主細胞内部における免疫系阻害因子の量または活性が所望のレベルになるように“調節された”または”調整可能な”ウイルスベクター類を提供することである。このような調節は、例えば、免疫応答を阻害する１種以上の因子類の本質および／または発現パターンを操作するかまたは変化させることによって、実行することもできる。例えば、因子または問題のたんぱく質の転写を駆動させるプロモータは、転写所望レベルに到達するように選択でき、もし高レベルの転写を望むならば非常に活性のプロモータを使用するし、もし低レベルの転写を望むならば弱いプロモータを用いる。さらに、免疫応答の特定の経路を、この選択された経路を狭い範囲でまたは特異的に阻害する因子類を差分発現させることで、特異的に標的とすることもできる。例えば、インフルエンザＡのＮＳ１たんぱく質は、ＩＲＦ−３の核トランスロケーションを妨害し、感染初期にＲＩＧ−１依存性シグナル伝達を防止し、一方、Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３／４Ａプロテアーゼは、ＩＦＮ−α／βの翻訳に直接関与する因子類を応答後期に関連のない機構により切断し、エクトロメリアウイルスのＣ１２Ｒたんぱく質は、感染応答後期に産生されるＩＦＮ−α／βをさらに別の機構で結合し不活性化させる。構築体内部で使用する特定プロモータ類を選択的に選択することによってかつ構築体によりコードされる特定因子類または因子類組み合わせを選択的に選択することによって、調整された宿主細胞応答を惹起させることができる。前記因子類の発現を変化させる他の方法には、誘発可能プロモータ類の使用；細胞または組織特異的プロモータ類の使用；転写を増大または低下させるさまざまな遺伝的要素類（例  エンハンサー配列類等）の導入；好適なまたは好適でないコドン配列類の使用等が含まれるが、これらに限定されない。さらに、問題の前記因子類または宿主細胞活性たんぱく質類は、ベクター投与の目的に応じて増大活性または低下活性を有するように、変化させ、または、選択することもできる。
【００１５】
免疫応答を“阻害”するとは、真核細胞中におけるウイルスの存在により惹起される典型的すなわち正常な免疫応答が完全にまたは部分的に阻害され、減弱され、低下し、妨害等されることを意味している。このような阻害は、抗ウイルス免疫応答（例  ＩＦＮα、ＩＦＮβ等）の指標であるかそれに特徴的であるかまたはそれに関連している物質の量、活性または属性の低下を検出することを含めて当業者が思いつく数種の方法のいずれかで、検出でき測定できる。阻害レベルは、一般的に、少なくとも約２５％、好適には約５０％およびさらに好適には約６０、７０、８０、９０または１００％である。阻害レベルは、本発明のウイルスベクター（１種以上のトランスジーンプラス１種以上の免疫系阻害剤類をコードするベクター）を移入した宿主細胞中で産生される１種以上の物質類の量を、対照細胞（前記１種以上のトランスジーンをコードするが免疫系阻害剤はコードしないウイルスベクターを移入された細胞）で産生された同一物質の量と比較しその差を検出することで、通常、測定する。
【００１６】
同様に、トランスジーンの発現を“増大”させるとは、一般的に、対照細胞に比較して、本発明のベクターを移入した宿主細胞中において発現（すなわち、転写ならびに翻訳）したトランスジーンの量の増大、増加等を意味する。このような増大は、例えば前記ベクターから産生されるトランスジーン産物の量、活性または属性の増大を検出すること；産生されるトランスジーン産物（例  ｍＲＮＡ、前記トランスジーン産物により産生される物質または効果、前記トランスジーン産物に対する抗体類）に関連する物質の量、活性または属性の増大を検出すること等当業者に思い浮かぶいくつかの方法のいずれによっても、測定できる。増大レベルは、一般的に、少なくとも約２５％、好適には約５０％およびより好適には約６０、７０、８０、９０または１００％、またはそれをはるかに超えている。
【００１７】
ウイルス感染に対する宿主防御としてのＩＦＮ系の基本的重要性は、さらに、いくつかのウイルス類が、ＩＦＮ誘発抗ウイルス応答に拮抗する遺伝子産物類をコードするという知見によって例示される。ウイルス類は、ＩＦＮ誘発可能たんぱく質類の誘発および作用を妨害するために数種の異なる戦略を用いる。ＤＮＡおよびＲＮＡウイルス類は両者ともに、ＩＦＮシグナル伝達経路の活性を不完全にするたんぱく質類をコードする。複数の機構類が関与しているようである。これらの中には、模倣が含まれる。ウイルス類がＩＦＮシグナル伝達経路の細胞成分類を模倣する産物類をコードする２−３の例がある。この分子模倣が、ＩＦＮシグナル伝達過程に対する拮抗をもたらすことができる。例えば、ポックスウイルス類は、可溶性ＩＦＮレセプターホモログ類をコードする（νＩＦＮ−Ｒｃ）。これらのνＩＦＮ−Ｒｃホモログ類は、ポックスウイルス感染細胞から分泌され、ＩＦＮ類を結合し、それによって、それらの天然レセプター類を介してそれらが抗ウイルス応答を惹起するように作用するのを妨害する。νＩＦＮ−α／βＲｃたんぱく質は、ワクチニアウイルスおよび他のいくつかのオルソポックスウイルス類により分泌される。νＩＦＮ−α／βＲｃレセプターホモログ、ウェスタンリザーブ（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ）株中のＢ１８Ｒ遺伝子産物およびコペンハーゲン（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ）株中におけるＢ１９Ｒ産物は、数種の異なるＩＦＮ−α亜種ならびにＩＦＮ−βを結合し、ＩＦＮ−α／βシグナル伝達活性を妨害する。ＩＦＮシグナル伝達に悪影響を及ぼす他の３種のＤＮＡウイルス類は、アデノウイルス、パピローマウイルスおよびヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ−８）である。前記アデノウイルスＥ１Ａたんぱく質は、ＩＳＧＦ−３活性化上流のあるところでＩＦＮ媒介シグナル伝達を妨害する。ＩＳＧＦ−３のＤＮＡ結合活性は、Ｅ１Ａにより阻害される。宿主細胞質で複製するパラミキソウイルスであるＳｅＶ（ＳｅＶ）のＣたんぱく質類は、ＩＦＮ誘発可能細胞性遺伝子類の転写活性化に干渉することにより、ＩＦＮ誘発抗ウイルス応答を回避させる。センダイ（Ｓｅｎｄａｉ）ウイルスの場合、前記Ｃたんぱく質類は、少なくとも２種の方法でＩＦＮ作用に干渉する。Ｃたんぱく質類は、ＳＴＡＴ−１の合成を防止し、それらはまた、ＳＴＡＴ−１ターンオ−バーの亢進を誘発する。ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６オンコプロテインは選択的にＩＲＦ−３に結合するが、しかし、ＩＲＦ−２およびＩＲＦ−９を含む他の細胞性ＩＲＦ類には非常に弱くしか結合しない。Ｅ６がＩＲＦ−３に会合してトランス活性化を阻害しそれによってＩＦＮ応答を回避する機構を、ＨＰＶに付与する。アデノウイルスＥ１Ａたんぱく質はまた、ｐ３００に結合するＥ１Ａ能力に依存性の機構によってＩＲＦ−３媒介転写活性化を阻害する。ＨＨＶ−８はカポジ肉腫に関連するガンマヘルペスウイルスであり、ＩＦＮ−α／βにより誘発された転写活性化のリプレッサーとして機能するＩＲＦホモログ（νＩＲＦ）を合成する。ＨＨＶ−８にコードされたνＩＲＦたんぱく質はまた、ＩＲＦ−１媒介転写活性化を抑制する。２種の他のヘルペスウイルスである帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）および��イトメガロウイルス（ＣＭＶ）もまた、ＩＦＮシグナル伝達経路の機能を破壊する。ＶＺＶは、ＳＴＡＴ−１およびＪＡＫ−２たんぱく質類の発現を阻害するが、ＪＡＫ−１に対してはほとんど効果を有していない。異なる拮抗戦略がＣＭＶ感染細胞で起こり、ＭＨＣクラスＩＩ発現もまた、そこで阻害される。ＣＭＶ感染線維芽細胞中でたんぱく質分解が増大するためＪＡＫ−１レベルが特異的に低下する。Ｉ型ＩＦＮレセプター類からのＩＦＮレセプター媒介シグナル伝達に関与する遺伝子産物類を、数種の非セグメント化マイナス鎖ＲＮＡウイルス類がコードする。例えば、シミアンウイルス５またはおたふくかぜウイルスによる感染は、ＳＴＡＴ−１のプロテオゾーム媒介分解増加につながり、一方、２型パラインフルエンザウイルスに感染した細胞中では、ＳＴＡＴ−２の分解が起こる。マイナス鎖ＲＮＡウイルスであるエボラウイルスのＶＰ３５たんぱく質は、Ｉ型ＩＦＮ拮抗剤として作用するが、前記拮抗作用の詳細な生化学的機構は未だ明らかになっていない。ＶＰ３５は、ＩＦＮ−βプロモータのウイルス誘発およびＩＳＲＥ駆動遺伝子発現のｄｓＲＮＡ−およびウイルス媒介活性化を阻害する。３種の例示阻害剤類（インフルエンザウイルスからのＮＳ１、ロタウイルスからのＮＳＰ１およびアデノウイルスからのＶＡＩ）をコードする核酸配列類を、図１Ａ−Ｃに示した。
【００１８】
ＩＦＮ抑制因子類はまた、他の非ウイルス起源からも得ることができ、例えば、宿主細胞からも得ることができ｛例  サイトカインシグナル伝達サプレッサー類（ＳＯＣＳ）、優性ＰＫＲネガティブおよび優性ＲＮａｓｅ  Ｌネガティブ｝、本発明の実施において利用することができる。このＩＦＮ応答を抑制するかまたは減弱させかつウイルス発現ベクター中に遺伝子工学で作製できかつウイルス発現ベクターから発現に成功した核酸配列によりコードされるいかなる因子（例  インターフェロン刺激遺伝子類に対するｓｉＲＮＡｓ）も、本発明の実施において使用できる。例には、上記に述べたようなもの、ならびにＲＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）；２，５´−オリゴアデニレートシンセターゼ（ＯＡＳ）；ＲＮａｓｅ  Ｌ；Ｍｘたんぱく質ＧＴＰａｓｅ類；ＩＦＮ誘発可能ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ１）；ＩＲＦ−５およびＩＲＦ−７のようなＩＦＮ制御因子類；ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７およびＴＬＲ９のような（ＩＲＦ）ファミリの転写因子類；ＩＲＡＫ１／４およびＴＲＡＦ６のような因子類；ＲＬＲ、ＭｙＤ８８、ＴＡＫ１、ＴＯＬＬＩＰ、ＴＩＦＡ等のようなＩ型ＩＦＮ類の抗ウイルス作用に必須のさまざまなオートクリンＩＦＮ誘発エフェクターおよびモジュレータたんぱく質類が含まれるが、それらに限定されない。
【００１９】
このような因子類の１種以上の機能性形態は、本発明のウイルスベクター類によって読み取り可能にコードされる。“機能性形態”とは、コードされる因子が例えば哺乳類宿主細胞のような適切な宿主細胞中で本発明のウイルスベクターから転写されると、通常の活性の少なくとも約２５％、好適には約５０％、さらに好適には約１００％以上を有することを意味する。“読み取り可能にコードされる”とは、前記因子をコードする核酸配列類が哺乳類細胞のような適切な宿主細胞中でうまく転写と翻訳を受けることを意味する。
【００２０】
本発明のベクター類は、ウイルスベースのベクター類である。“ウイルスベース”とは、天然に存在するウイルス類から由来するかそれに基づくベクター類またはビヒクル類を意味する。このようなベクター類は、一般的に、数種の可能な有益な方法のいずれかで遺伝子工学的にそれらの天然形態から変化させてあるであろう。例えば、前記ウイルスベクター類は一般的に弱毒化されており、その結果、それらは病気の症状を引き起こさないかあるいは緩和な病気症状しか引き起こさない；宿主細胞中で複製できないようにそれらを改変することもできる；それらは遺伝子工学で他の生物からの非相同性遺伝子類の導入を促進する核酸配列類または類似生物からの遺伝子類の多コピーを含ませることもできる；それらは、補体、ウイルスからのＩＲＥＳ、リーダーペプチド配列類、ｍＲＮＡ安定性を増加させるように設計した配列類等を活性化する遺伝子類における欠失をコードすることもできる。
【００２１】
本発明の目的のため特に、前記ウイルスベクター類は、１）問題の１種以上のたんぱく質類またはポリペプチド類および２）ウイルスによる侵入に対する哺乳類細胞の免疫応答を阻害する１種以上の因子類を含みかつ発現させるように遺伝子工学で処理する。さらに、前記１種以上のポリペプチド類および前記免疫応答を阻害する１種以上の因子類の本質および発現パターンを、宿主細胞中で調節または調整された応答を起こすように設計することができる。
【００２２】
一般的に、本発明の実施において、前記ウイルスベースベクター類は、非複製性であるか、標的細胞／組織中で限定された複製しかしないか、および／または前記宿主細胞抗ウイルス応答を阻害する因子類が細胞または組織特異的に発現される。ウイルス感染を回避する宿主細胞の能力の抑制が一時的に過ぎないかあるいは前記宿主の特異的位置に限定されるか、または、ある惹起された機構のみを選択的に下方制御し、前記宿主がウイルス類感染に全般的に感受性となるのを回避するのが、この理由である。例えば、アデノウイルスベースベクター類は、典型的にはＥ１−Ｅ３を欠失しており、ＣＭＶまたは他のウイルス／哺乳類プロモータの転写制御下でのトランスジーン類を有している。このＥ１−Ｅ３遺伝子産物は、正常には、ウイルスＤＮＡ転写、標的細胞の細胞骨格再構成、ＭＨＣ下方制御および新規ビリオン類の集合構築に関与している。Ｉ型ＩＦＮ応答のサプレッサーを含むことで前記翻訳を増大でき、ある場合にはおそらくベクターおよびパッセンジャー遺伝子配列類の両者の転写を増強できる一方、欠失遺伝子類または遺伝子機能の回復のための機構は提供しない。さらに、細胞表面および細胞内パターン認識により自然免疫応答を活性化する数多くの機構があるので、特にワクチンベクターの場合Ｉ型ＩＦＮ応答を完全に回避するのは困難でもありしかも望ましくない。また、ＩＦＮ  α／β応答がある局所パラクリン機能を有している一方、本発明の主な目的はオートクリン応答を下方制御するサプレッサー類を取り込ませることである。最後になるが、細胞内病原体に対する宿主免疫応答はＩ型ＩＦＮ類に限定されないし、Ｉ型ＩＦＮ類免疫は同種免疫に必須というわけではない。
【００２３】
適切なウイルス由来ベクター類の例には、アデノウイルス（複製性および非複製性の両者）、バキュロウイルスベクター類ならびにポックスウイルス類、麻疹ウイルス類、ポリオウイルス類、インフルエンザウイルス類、小疱性口内炎ウイルス類、レトロウイルス類、レンチウイルス類等に由来するベクター類を含むが、それらに限定されない。さらに、さまざまなナノテクノロジーで作製した物質類（例  オルモシル（Ｏｒｍｏｓｉｌ））も使用できる。
【００２４】
本発明の１態様において、前記ベクターによりコードされるトランスジーン類に関して、前記トランスジーン類は、細胞または体液性免疫応答を惹起するのが望ましい抗原類をコードする。一般的に、このような抗原類は、ウイルス、細菌類または真核生物寄生体のような病気を引き起こす生物または物質に由来するたんぱく質類、ポリペプチド類またはペプチド類、またはその抗原性断片類である。前記抗原は、たんぱく質全体、たんぱく質の一部（例  １種以上のその抗原性領域類）、またはたんぱく質由来の１種以上の抗原性エピトープ類であることができる。一般的に、このようなエピトープ類は、例えば、長さが少なくともアミノ酸８個である。このようなウイルスベクター類は、いずれの血清型であってもよく、インフルエンザウイルス；ＲＳＶ，ＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−ＩＩのようなレトロウイルス類、ＨＰＶのようなパピローマウイルス類、ＥＢＶ，ＣＭＶまたは単純疱疹ウイルスのようなヘルペスウイルス類；ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２のようなレンチウイルス類；狂犬病のようなラブドウイルス類；ポリオウイルスのようなピコルノウイルス類；ワクチニアのようなポックスウイルス類；ロタウイルス類；およびアデノ関連ウイルス１、マイコバクテリウム種（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．），ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、サルモネラ種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．），シゲラ種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ．），大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ），リケッチア種（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｓｐｐ．），リステリア種（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｐｐ．），レジオネラ・ニューモニアエ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ），シュードモナス種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．），ビブリオ種（Ｖｉｂｒｉｏ  ｓｐｐ．），バシラス・アンスラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ），ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｅｌｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ），プラスモジウム・ファルフィパラム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｆｉｐａｒｕｍ）のようなプラスモジウム種（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｓｐｐ．）；トリパノゾーマ・クルジ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）のようなトリパノゾーマ種（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｅ  ｓｐｐ．）；ギアルジア・インテスチナリス（Ｇｉａｒｄｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）のようなギアルジア種（Ｇｉａｒｄｉａ  ｓｐｐ．）；ブーフィラス種（Ｂｏｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐｐ．），バベシア・ミクロチ（Ｂａｂｅｓｉａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）のようなバベシア種（Ｂａｂｅｓｉａ  ｓｐｐ．）；エンタメーバ・ヒストリチカ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）のようなエンタメータ種（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｓｐｐ．）；エイメリア・マキシマ（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｍａｘｉｍａ）のようなエイメリア種（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｓｐｐ．）；リューシュマニア種（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｓｐｐ．）；シストゾーム種（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍｅ  ｓｐｐ．），ブルギア種（Ｂｒｕｇｉａ  ｓｐｐ．），ファスシダ種（Ｆａｓｃｉｄａ  ｓｐｐ．），ジロフィラリア種（Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ  ｓｐｐ．），ウチェレリア種（Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ  ｓｐｐ．），オンコセレア種（���ｎｃｈｏｃｅｒｅａ  ｓｐｐ．）等のような疾患または病因性物質類関連抗原類を含むことができる。特に、Ｒｖ１７３３，Ｒｖ３１３０ｃ，Ｒｖ２６２７ｃ、Ｒｖ２６２８、Ｒｂ３６４１ｃ、Ｒｖ３１３５、Ｒｖ３１３６、Ｒｖ０３８３ｃ、Ｒｖ０３９４ｃ、Ｒｖ３５１４、Ｒｖ３５３２、Ｒｖ１９９７、Ｒｖ０１５９ｃ、Ｒｖ１０３９ｃ、Ｒｖ１１９７、Ｒｖ３６２０ｃ、Ｒｖ２３４７ｃ、およびＲｖ１７９２のようなＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原類；および／またはサーカムスポロゾイテたんぱく質（ＣＳＰ）またはそのペプチド断片類のようなマラリア抗原類が利用できる。
【００２５】
さらに、本発明のベクター類を用いて、癌抗原類に対する免疫反応を起こさせることができ、その例には、ｍｕｃ１、サバイビン、繊毛性神経栄養性因子、シクロオキシゲナーゼ１、繊維芽細胞成長因子、内皮分化因子、ＭＡＧＥ−１、チロシナーゼ等が含まれるがそれらに限定されない。
【００２６】
さらに、１種を超える抗原類を前記ウイルスベクター中で個別にまたはキメラ抗原としてすなわち２種以上の異なる抗原類を含む単一の翻訳可能遺伝子産物としてコードさせることができる。前記抗原類は同一疾患に関連しているかも知れない（例  数種の結核抗原類を、単一の連続的転写体中にコードさせることもできる）しまたは異なる疾患に関連しているかも知れない（例  ジフテリア、百日咳および破傷風抗原類を、単一転写体中に含ませることができる）。これとは別に、複数の抗原類を別々に、例えば、内部リボゾームエントリサイト（ＩＲＥＳ）、複数の各プロモータ類および停止シグナル類を用いるバイシストロニック発現を用いて、または複数のコードされたたんぱく質類、ポリペプチド類またはペプチド類を転写するための他の類似デバイス類を用いて、コードすることができる。さらに、前記抗原と抗ウイルス免疫応答を阻害する因子の配置を、別々にまたはキメラとしてまたは複数転写のためのデバイス等を用いて、コードさせることもできる。
【００２７】
本発明の他の態様において、抗原類以外のものも、前記ウイルスベクター類によってコードされる。例えば、有益な作用を有するさまざまなたんぱく質類／ポリペプチド類／ペプチド類もコードできるが、その例には、個体中で欠けているかまたは適切に機能していないたんぱく質類（例  インシュリン、ＣＦＴＲ等）が含まれるが、それらに限定されない。本発明の方法は、例えば、先天的障害矯正のためのたんぱく質類デリバリのために用いることができる。このような遺伝子類には、例えば、嚢胞性線維症のための嚢胞性線維症膜貫通型コンダクタンスレギュレータ（ＣＦＴＲ）遺伝子のような欠損遺伝子類の補充；またはＨＩＶ治療のためのインテグラーゼアンチセンス遺伝子のような新規遺伝子類の導入；またはインタロイキン−２７（ＩＬ−２７）のようなＩ型Ｔ細胞応答を増強するための遺伝子類；またはコレステロールとコレステロールレセプターまたはインシュリンとインシュリンレセプター類のようなあるレセプター類、代謝物類またはホルモン類の発現を修飾する遺伝子類；または腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連アポトーシス誘発リガンド（ＴＲＡＩＬ）のような癌細胞を死滅させることができる産物をコードする遺伝子類；または骨吸収を阻害する天然のたんぱく質オステオプロテジェリン（ＯＰＧ）；または完全長ヒト化抗体類を効率的に発現させるための例えば癌細胞上のＨＥＲ２／ｎｅｕ（ｅｒｂＢ２）レセプターに作用するヒト化モノクローナル抗体を含む。
【００２８】
本発明のいくつかの態様において、前記ウイルスベクター類は、ワクチン調製物および／または免疫応答を惹起するための調製物類、または他の哺乳類治療タイプのための調製物類に含まれる。本発明の組成物類は、本文に記載のようにして実質的に精製されたウイルスベクター類、および薬理学的に適切な担体を含む。このような組成物類の調製は、当業者に周知である。典型的には、このような組成物類は液体溶液または懸濁物のいずれかとして調製されるが、錠剤、丸剤、粉剤等のような固体形状も同様に考えられる。固体形状または投与前溶液または懸濁液との混合に適した濃縮形状も同様に調製することができる。前記調製物も乳化できる。前記活性成分類は、薬学的に許容でき前記の活性成分類と相溶性の賦形剤類と混合することもできる。適切な賦形剤類は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等またはそれらの組み合わせである。さらに、前記組成物は、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤等のような少量の助剤類を含むことができる。もし、前記組成物の経口投与形態を投与することを望むならば、さまざまな増粘剤類、着香料、希釈剤類、乳化剤類、分散助剤または結合剤類等を添加できる。本発明の組成物は、前記組成物を投与に適した形態で付与するために、さらに追加の成分類を含むことができる。前記製剤類中のウイルスベクターの最終的な量は変えることができるが、一般的には、約１−９９％であろう。前記組成物類は、さらに、付加的アジュバントを含むことができ、その例には、セピック（Ｓｅｐｐｉｃ），クイルＡ（Ｑｕｉｌ  Ａ）、アルヒドロゲル（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ）のようなアルミニウムベースアジュバント類等が含まれるが、それらに限定されない。前記組成物類は単一タイプのウイルスベクターを含有できるが、１種を超えるウイルスベクタータイプを調製物中で利用することもでき、すなわち、前記調製物は、このようなベクター類の“カクテル”を含むことができる。
【００２９】
本発明の方法類は、薬理学的に許容できる担体中に１種以上のウイルスベースベクター類を含む組成物を哺乳類に投与することを必要とする。前記哺乳類は一般的にヒトであろうが、これは常にそうであるとは限らない。本発明の獣医学適用もまた、考慮している。前記調製物類を、注射によって、経口的に、経鼻的に、経皮的に、静脈内に、腹腔内に、皮下で、筋肉内に、吸入によって等を含む当業者に周知の多くの適切な手段のいずれかによって投与することができるが、これらに限定されない。さらに、前記組成物類は、単独でまたは他の医薬または免疫原性組成物と組み合わせて、例えば、多成分ワクチンの一部として投与することもできる。さらに、投与は単回でもよいし、複数ブースター用量をさまざまな時間的間隔で投与することもでき、例えば、ワクチンの場合免疫応答を増大させるため；癌のような他疾患の治療の場合第一回目の治療を逃れた癌細胞を消去するため；または他のいずれかの理由による。投与は好適には予防的に行われ、すなわち、疾病を起こす物質に暴露する前にまたは暴露が起こったことが疑わしいときである。しかし、投与はまた、前記事実の後、すなわち疾患の原因となる生物に暴露したことが公知であるかまたはその疑いがある場合、または、例えば疾患症状出現後のように治療上、行われる。
【００３０】
投与すべきウイルスベクターの量は、投与する対象の特性（例えば、種、性、年齢、遺伝的素因、全般的健康状態等）、および、治療しようとしている疾患または状態に応じて、変化させることができる。一般的に、用いた用量は、記載されているように（Ｓｈａｔａら、Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０：６２３−６２９（２００１）；ＳｈａｔａおよびＨｏｎｅ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：９６６５−９６７０（２００１））、約１０３乃至１０１１生存生体、好適には約１０３乃至１０９生ウイルス粒子（すなわち、ｐｆｕ）であることができる。
【００３１】
本発明はまた、その必要がある個体中でたんぱく質、ポリペプチドまたはペプチドの産生増加のための方法を提供する。前記方法には、ウイルスベクターからのたんぱく質／ポリペプチド／ペプチドを個体細胞中における抗ウイルス免疫応答を阻害する因子とともに共発現させることを含む。もし前記たんぱく質／ポリペプチド／ペプチドが疾患の原因となる物質に関連した抗原であるならば、その際には、前記方法は、前記個体中で免疫応答を誘発する方法となるであろう。もし惹起される免疫応答が防御性であるならば（すなわち、もし免疫応答が、疾患の原因となる物質による疾患症状発症を予防するかまたは低下させるならば）、その際には、前記方法は、前記個体をワクチン化する方法とも称されるであろう。これとは別に、本発明はまた、本発明のウイルスベクターを個体に投与することによる疾患治療方法または疾患症状低減方法を提供する。この場合、前記ウイルスベクタートランスジーンはウイルスベクターを投与する個体中で疾患を予防するかまたはその症状の低減に必要であるかあるいは役立つたんぱく質／ポリペプチド／ペプチドをコードする。
【実施例１】
【００３２】
ＩＦＮ拮抗剤遺伝子ＶＡＩは、ＴＢ．Ｓ抗原の発現を増加させる
【００３３】
この実験は、アデノウイルスベクター中にクローニングした結核抗原類の発現に及ぼすインターフェロン拮抗剤のマイナスの効果を低減するためのインターフェロン拮抗剤遺伝子の用途を記載する。実験は、下記のように設計し実施した。
【００３４】
Ａｄ３５−ＴＢ．Ｓは、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来の抗原類８５Ａ，８５ＢおよびＴＢ１０．４の融合たんぱく質をコードするアデノウイルス３５の複製欠損、Ｅ１欠失誘導体である。他のＢ群アデノウイルス類によるのと同様に、アデノウイルス３５は表面マーカーＣＤ４６を発現する哺乳類細胞に感染し、従って、全ての核化ヒト細胞のほとんどに感染することが可能である。この実験に用いた前記インターフェロン拮抗剤遺伝子は、ウイルス関連Ｉ（ＶＡＩ）ＲＮＡ遺伝子であった。ＶＡＩ  ＲＮＡ遺伝子産物は、インターフェロン誘発、二重鎖ＲＮＡ活性化プロテインキナーゼＰＫＲの活性化をブロックすることによって細胞性抗ウイルス応答類に対して防御する（Ｇａｌａｂｒｕ  Ｊ，Ｋａｔｚｅ  ＭＧ，Ｒｏｅｂｒｔ  Ｎ，Ｈｏｖａｎｅｓｓｉａｎ  ＡＧ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８９  Ｊａｎ２；１７８（３）５８１−９）。１７２４ｂｐ挿入体上の前記のＰＣＲ増幅ＶＡＩ  ＲＮＡ遺伝子を、ＺｅｒｏＢｌｕｎｔＲ  ＴＯＰＯＲ  ＰＣＲクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＰＯベクター中にクローニングした。いったんＶＡＩ  ＲＮＡ遺伝子が哺乳類細胞に導入されると、大量のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって転写される。
【００３５】
簡単に述べると、ＨｅＬａ細胞を、完全イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）中６ウェル組織培養プレートに接種し、＞８０％コンフルエンスになるまでインキュベーションした。翌日各群の試験ウェル中細胞数を計数し、希釈Ａｄ３５−ＴＢ．Ｓウイルスまたはカラウイルス（ＴＢ．Ｓをコードしないウイルス）１ｍｌを各ウェルに、感染多重度（ＭＯＩ）５０および１００で添加した。感染は、ＣＯ２インキュベータ中で４時間、実行した。４時間後、完全培地１ｍｌを各ウェル中感染混合物に添加し、ＶＡＩ遺伝子含有ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯプラスミドをＡｄ３５−ＴＢ．Ｓウイルスおよびカラウイルス感染細胞の両者に一時的に移入した。非感染細胞を含む対照細胞を同様に処理した。４８時間後、各ウェルからの細胞を溶解させ、Ａｇ−８５特異的抗血清によるイムノブロッティングにより分析した。
【００３６】
図２は、ＶＡＩ非移入ＨｅＬａ細胞（レーン１および３）に比較したＶＡＩ遺伝子移入Ｈｅｌａ細胞由来のアデノウイルス発現ＴＢ．Ｓ抗原の産生（レーン２および４）のイムノブロットを、比較して示している。見てわかるように、ＴＢ抗原ＴＢ．Ｓの発現は、ＶＡＩ移入細胞で有意に増加した。ＴＢ．Ｓ抗原のより高い発現が、ＶＡＩ感染細胞中で５０および１００ＭＯＩの両者で見られた。
【００３７】
この実施例は、宿主細胞中における抗原の発現が、ＶＡＩたんぱく質もこの宿主細胞中で発現されるならば、増加することを示している。
【実施例２】
【００３８】
ＩＦＮ拮抗剤遺伝子ＮＳ１は、ヘマグルチン（ＨＡ）たんぱく質の発現を増加させる
【００３９】
バイシストロニック発現カセット中インフルエンザウイルス由来ＩＦＮＩ阻害たんぱく質ＮＳ１および鳥インフルエンザＨ５Ｎ１のヘマグルチン（ＨＡ）たんぱく質をコードするアデノウイルスベクターワクチン構築体を調製する。このアデノウイルスワクチン構築体を感染させた細胞中におけるＨＡトランスジーンの発現を、Ａ５４９および同ＨＡトランスジーンを発現させるがＮＳ１たんぱく質は発現しない類似アデノウイルスワクチン構築体を感染されたＨｅＬａ細胞中で比較する。高レベルのＨＡが、ＮＳ１も発現する細胞中で発現される。本研究は、問題のトランスジーン類をコードし発現させることに加えて、Ｉ型インターフェロンサプレッサー類をコードしかつ発現させるアデノウイルスベクター類を用いる手法を確認している。
【実施例３】
【００４０】
Ｉ型ＩＦＮ応答のサプレッサーを包含することによるワクチンの免疫原性増強
【００４１】
ウイルスベクター惹起免疫応答に及ぼすＩ型ＩＦＮ応答抑制の影響を明らかにするため、３群のＢＡＬＢ／ｃマウス１０匹に対して、下記のようにワクチン接種した。群１には、筋肉内に生理食塩水１００μｌのみを与え、群２には、筋肉内に、１０ｅ１０ｐｆｕのＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原類８５Ａ，８５ＢおよびＲＶ３４０７の融合物をコードするアデノ血清型３５ベクターを与え、群３には、筋肉内に１０ｅ１０ｐｆｕのＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原類８５Ａ，８５ＢおよびＲＶ３４０７の融合物およびＶＡＩ遺伝子をコードするアデノ血清型３５ベクターを与える。全動物に対して、プライム後２週で同一ワクチン類をブーストする。ブースト後２週で、全動物を安楽死させ、脾臓と血液を採取する。
【００４２】
動物モデル中におけるコードされた産物に対する免疫および他の生物学的応答の測定方法は、当業者に周知である。コードされたＭｔｂ抗原類に対する血清ＩｇＧおよびＩｇＡ応答を測定するため、血液４００−５００μｌを各試験管に採取し、氷上で４時間インキュベーションし血餅とする。５分間ミクロ遠心管中で遠心した後、血清を新しい試験管に移し、−８０℃で保存する。問題の遺伝子類により発現した抗原類に対する粘膜ＩｇＧおよびＩｇＡ応答を、ワクチン接種前および接種後定期的に採取する糞便ペレットおよび膣洗浄物を用いて、決定する（Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎら、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５３：４６２；１９９５；Ｓｔａａｔｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：４６２；１９９６）。標準的ＥＬＩＳＡを用いて、前記血清および粘膜サンプル中問題の抗原に対するＩｇＧおよびＩｇＡ応答を定量する（Ａｂａｃｉｏｇｌｕら、ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒ．１０；３７１；１９９４；Ｐｉｎｃｕｓら、ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒ．１２：１０４１；１９９６）。陰性対照抗原として各ＥＬＩＳＡで卵アルブミンを含めることができる。さらに、各ＥＬＩＳＡは、陽性対照血清、糞便ペレットまたは膣洗浄サンプルを適切であれば含むことができる。記載されているように（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：５２６７；１９９７）、コレラトキシン１０μｇと混合した問題の遺伝子により発現した抗原１０μｇを経鼻的にワクチン接種した動物から、前記陽性対照サンプルを採取する。終点での力価は、４９０ｎｍにおける吸光度が陰性対照列の平均プラス３標準誤差値を超える増加を示す最終血清希釈の逆数を得ることで、計算する。
【００４３】
細胞免疫は、細胞内サイトカイン染色（細胞内サイトカインサイトメトリとも称される）によってまたはＥＬＩＳＰＯＴ（Ｌｅｔｓｃｈ  Ａ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３１：１４３−４９；２００３）によって測定することができる。両方の方法とも抗原特異的免疫応答の定量を可能とするが、ただし、ＩＣＳは、抗原特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の表現型を特性解析する同時能力を付加する。このようなアッセイは、ＩＬ−２、ＩＬ−４，ＩＬ−５，ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−（Ｗｕら、ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒ．１３：１１８７；１９９７）を分泌する抗原特異的Ｔ細胞の数を評価する。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、市販の捕捉および検出ｍＡｂ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて記載されたように（Ｗｕら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６３：４９３３；１９９５）および先に使用されているように（Ｘｕ−Ａｍａｎｏら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：１３０９；１９９３；Ｏｋａｈａｓｈｉら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６４：１５１６；１９９６）、行う。各アッセイは、マイトジェン（ＣｏｎＡ）および卵アルブミン対照を含む。本文に記載の抗ＩＦＮコードベクター系は、ＩＦＮ耐性遺伝子類を有していないデリバリシステムよりもいくつか利点を有している。前記抗原類遺伝子類は、より高いレベルでかつより長い時間発現され、従って、より活発な免疫応答を誘発する。
【００４４】
本実施例は、Ｉ型インターフェロン応答サプレッサーおよび問題の免疫原の両者を発現するアデノウイルスベクターワクチン類惹起免疫応答が、前記免疫原のみをコードするアデノウイルスベクターに比較して、増大していることを示している。
【実施例４】
【００４５】
Ｉ型インターフェロン応答サプレッサー発現によるバキュロウイルスベースワクチンベクター類からのトランスジーン発現の増強
【００４６】
いくつかのウイルスベースベクター類を用いて、哺乳類細胞移入に成功した。それらには、アデノウイルス、アデノウイルス関連ウイルス（ＡＡＶ）、パポバウイルス類、およびワクチニアウイルスがある。アデノウイルスベクター類はよく研究されており、いくつかの遺伝子療法治験ならびにワクチン臨床治験において使用されてきた；しかし、米国内では、最近の否定的臨床治験結果により、その使用が制限されるかもしれない（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、７：１１０、２０００、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６、３−４、２００８）。また、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）を用いた臨床治験も行われてきた。
【００４７】
哺乳類細胞に感染させるために用いることができる別のベクターは、昆虫に感染するバキュロウイルスである（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０、１７３−１８０、２００２）。バキュロウイルスは桿状ウイルスであり、従って、カプシドベースのウイルス系に比較して、組換えバキュロウイルス中に挿入できる遺伝物質の量には制限がない。哺乳類ウイルス由来のウイルスベクター類と異なり、バキュロウイルス遺伝子発現は、昆虫特異的プロモータ類によって駆動される。従って、バキュロウイルス遺伝子はヒト細胞では発現しない（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １２５：１０７−１１７、１９８３）ので、免疫応答を惹起できない。さらに、哺乳類細胞は、バキュロウイルス遺伝子産物に対して既存の免疫性を全く有していない。さらに、哺乳類ウイルス類に基づくウイルスベクター類と異なり、既存のバキュロウイルスで哺乳類細胞中にあるものは全くない。従って、バキュロウイルスベクターの組み換えは起こらず、バキュロウイルス感染は、内因性のヒトウイルス類を産生できない。バキュロウイルス系の別の利点は、血清非含有培地中でバキュロウイルス類が大量に増殖でき、そのことにより、ウイルスおよびプリオンによる治療剤の血清夾雑という潜在的危険を免れる。
【００４８】
哺乳類プロモータ（例  ＣＡＧ）またはウイルス内部リボゾームエントリサイト（ＩＲＥＳ）例えば脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）ＩＲＥＳがバキュロウイルス中でトランスジーンの上流に挿入されると、哺乳類細胞でこのトランスジーンの発現がうまく達成できる。バキュロウイルスベクター類はワクチン開発にとって優れた候補であるようであり、バキュロウイルス系を用いたワクチン候補は、他のほとんどのワクチン系に勝る明らかな利点を有しているようである。残念なことに、外来性たんぱく質類の哺乳類細胞中におけるバキュロウイルス発現の結果、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）応答が生ずる（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７８、２３６１−２３６９、２００７）。このＩＦＮ応答は、プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）および２´、５´−オリゴアデニレートシンセターゼ（２´−５´ＯＡＳ）による外来性たんぱく質類の発現を制限する。活性化ＰＫＲは、真核細胞開始因子ｅＩＦ２のサブユニットをリン酸化することにより、翻訳をブロックする。一方、２−５Ａシンセターゼ類は、ｍＲＮＡおよびリボゾームＲＮＡを消化する一重鎖特異的エンドリボヌクレアーゼＲＮａｓｅ  Ｌを活性化する短い、２´−５´ＯＡＳ関連オリゴアデニレート類を産生する。これらの機構は、前記バキュロウイルス系にコードされたパッセンジャー核酸類の転写および翻訳を破壊するかまたは阻害するようである。
【００４９】
幸運なウイルス病原体が、ＩＦＮ類のオートクリンおよびパラクリン応答をブロックすることによって、それらに感染を樹立させる機構を展開させた。従って、宿主細胞Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）応答に干渉する１種以上のたんぱく質類をコードする核酸配列を含む組換えバキュロウイルスを創生することによって、前記組換えバキュロウイルス移入哺乳類細胞中で有意なトランスジーン発現が観察される。Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）経路の修飾ができるたんぱく質類の例には、ロタウイルスのＮＳＰ１たんぱく質、エクトロメリアウイルスのＣ１２Ｒたんぱく質およびインフルエンザのＮＳ１が含まれるがそれらに限定されない。このＣ１２Ｒたんぱく質はＩＦＮ−α／βに結合し、それによって免疫応答を修飾する。最近の研究では、ロタウイルス非構造たんぱく質ＮＳＰ１は、ＩＲＦ３と相互作用すること、およびこの相互作用の結果ＩＲＦ３のプロテアゾーム媒介分解が起こり、それが次にＩＦＮ−βを抑制することが示唆されている。インフルエンザのＮＳ１たんぱく質は、Ｉ型ＩＦＮ経路に数種の効果を有していることが明らかとなっている。ＮＳ１たんぱく質のカルボキシ末端ドメインの活性は、宿主ｍＲＮＡ処理機構を阻害するためである。このドメインはまた、細胞内翻訳開始因子ｅＩＦ４ＧＩと直接相互作用することによって、ウイルスｍＲＮＡの優先的翻訳を促進する。さらに、ｄｓＲＮＡに結合しかつ推定細胞性キナーゼ（類）と相互作用することで、前記ＮＳ１たんぱく質は、ＩＦＮ誘発可能ｄｓＲＮＡ活性化キナーゼ（ＰＫＲ）、２´、５´−オリゴアデニレートシンセターゼ系およびＮＦ−ＫＢまたはＩＲＦ−３およびｃ−Ｊｕｎ／ＡＴＦ２のようなサイトカイン転写因子類の活性化を防止する。結果として、ＮＳ１たんぱく質は、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−β遺伝子類の発現を阻害し、それによって、感染細胞におけるアポトーシス進行を防止するかまたは遅延させ、かつ、隣接細胞中における抗ウイルス状態の形成を防止しまたは遅延させる。従って、抗原と免疫応答モジュレータの両者をコードする核酸類を有するバキュロウイルス系を構築することで、優れたワクチン候補が作製される。
【００５０】
組換えバキュロウイルスの構築は、トランスファーベクターを用いて、実施する。問題の外来遺伝子または遺伝子類を取り込んだ組換えバキュロウイルスは、バキュロウイルス感染を受ける昆虫細胞に野生型バキュロウイルスと問題の遺伝子（類）を含むトランスファーベクターを感染させることによって、作製する。例えば、全ての内容を本文で断って引用するＰｅｌｌｅｔｔらの米国特許６，１２６、９４４は、翻訳開始部位にさらにヌクレオチド類を付加することなくこの開始部位でバキュロウイルスポリヘドリン遺伝子の近くにある外来遺伝子類の効率的発現のためのバキュロウイルストランスファーベクターの構築を述べている。
【００５１】
構築が容易であることおよび大きな外来性ＤＮＡ断片類（＞２０ｋｂｐ）を受け入れる容量により、トランスジーン発現のより安定で一時的かつ細胞型特異的制御とともに、拡大されたかまたは標的となった細胞向性を有するバキュロウイルス類の開発が可能となる。Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原類Ａｇ８５Ａ，Ａｇ８５ＢおよびＲｖ３４０７の融合たんぱく質をコードする組換えバキュロウイルスを、構築する。バキュロウイルス類は、哺乳類細胞に感染することが明らかとなっている；従って、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞類を組織培養フラスコ中で増殖させ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータの制御下にインフルエンザ−ＡのＮＳ１またはロタウイルスＮＳＰ１をコードするトランスファーベクターｐｃＤＮＡ３．１を移入させる。対照細胞には、ｐｃＤＮＡ３．１ベクターのみを感染させる。ゼオマイシン耐性安定形質転換体を増加させ、ＤＭＥＭを入れた６ウェル組織培養フラスコ中に接種し、＞６０％コンフルエンスになるまでインキュベーションする。各群の試験ウェルを計数し、新しい血清非含有培地中細胞に感染多重度（ＭＯＩ）１０、１００、１０００および５０００で１−２時間、前記組換えバキュロウイルスを感染させる。任意ではあるが、培地に１０ｍＭ酪酸ナトリウムを添加し、トランスジーン発現を最大にできる。前記ウイルスを除去した後新鮮培地を添加し、培養物を３７℃で４８時間、インキュベーションする。培養物を、イムノブロッティングにより抗原発現について調べる。ウェスタンブロット分析のため、細胞抽出物を変性ポリアクリルアミドゲル中で分離し、たんぱく質類をニトロセルロース膜に移し、標準的方法とＡｇ８５特異的抗血清を用いてイムノブロットする。ＮＳ１−およびＮＳＰ１−発現細胞は、ＮＳ１またはＮＳＰ１を発現しない対照細胞で観察されたものよりも多く、トランスジーン融合たんぱく質（類）を産生する。
【００５２】
バイシストロニック発現カセット中に、ＮＳ１および鳥インフルエンザＨ５Ｎ１のヘマグルチン（ＨＡ）をコードするトランスジーンの両者をコードする組換えバキュロウイルスを構築する。この組換えバキュロウイルス感染細胞中におけるトランスジーンの発現を、ＨＡトランスジーンを発現するがＮＳ１たんぱく質を発現しない対照組換えバキュロウイルス構築体における発現と比較する。前記比較は、有意により多くのＨＡたんぱく質がＮＳ１−ＨＡ組換え体感染細胞中で産生されることを示し、そのことが、Ｉ型インターフェロンサプレッサーをコードする組換えバキュロウイルスを用いる手法を有効と保証している。マウスにおける免疫原性研究は、ＨＡ免疫原のみを発現させる組換えバキュロウイルス類に感染した対照細胞類に比較して、ＮＳ１およびＨＡ免疫原の両者を発現する組換えバキュロウイルス類に感染した細胞中で惹起されるＨＡに対する免疫応答の大きさが高くなることを明確にしている。
【００５３】
これらの観察は、組換えバキュロウイルスワクチン類の開発と使用についての明確かつ重要な意味を有している。トランスジーン発現増大は、コードされた抗原類に対する細胞性かつ体液性免疫応答向上につながる。本発明は、従って、広く多様な疾患の予防および治療のため、ＩＦＮ応答を阻害する因子類をコードする組換えバキュロウイルスワクチン類について広範囲の適用を有している。
【実施例５】
【００５４】
Ｉ型ＩＦＮ応答を阻害する因子および１種以上の問題の抗原類を発現する組換えウイルスベクター類のワクチンとしての用途
【００５５】
Ｍｔｂ抗原類８５Ａ、８５ＢおよびＲｖ３４０７およびインフルエンザＡのＮＳ１たんぱく質をコードする組換えバキュロウイルスを構築し、ＮＳ１たんぱく質のみを欠いている類似ワクチンも構築する。このワクチンの非ヒト霊長類における防御効果を評価するため、体重および性をマッチさせたアカゲザル６匹の３群に対して、１）生理食塩水、２）ｒバキュロウイルスＡＢ３４０７または３）ｒバキュロウイルスＡＢ３４０７ＮＳ１をワクチン接種する。群２および３の各動物には、筋肉内注射によりそれぞれのｒバキュロウイルスを１×１０７ｖｐ投与する。ワクチン接種１５週後において、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｅｒｄｍａｎ約３００ｃｆｕを呼吸器内装具によりチャレンジさせる。全動物を６ヶ月にわたり毎月、結核臨床症状を胸部Ｘ線、体重、餌摂取、咳、嗜眠、およびＴＢ特異的たんぱく質類に対する免疫応答により評価する。６ヶ月の観察期間中に死亡した動物は全て剖検し、組織病理と臓器別Ｍｔｂ負荷を測定する。瀕死の動物は全て、人道的に安楽死させ、同様に検査する。チャレンジ６ヶ月後、生存している動物は全て安楽死させ、組織病理と肺、肝および脾臓中Ｍｔｂ負荷を調べるため、剖検する。ｒバキュロウイルスワクチン中にＮＳ１を含めることで死亡率が低下し、組織傷害低下および実験的に感染させた動物肺中におけるＭｔｂ生物の数減少が結果として得られる。
【００５６】
本発明を好適な態様の観点から説明してきたが、当業者は、本発明が付属の請求の範囲の真意と範囲内で改変して実行できることを認識するであろう。従って、本発明は、上記に記載のような態様に限定されるべきではなく、本文の明細書の精神と範囲の中でその修飾物ならびにその均等物全てを含むことになる。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
宿主細胞活性アミノ酸配列類をコードする拡散配列を含むように遺伝子工学で作成されるとともに哺乳類抗ウィルス免疫応答を阻害する因子類をコードする拡散配列類を含むように遺伝子工学で作成されたウィルスベクター類を提供し結核その他の疾患の治療のための選択肢拡大に寄与する。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１Ａ−Ｃ】抗ウイルス免疫応答阻害剤類の配列類。Ａ，インフルエンザウイルス由来ＮＳ１のＤＮＡ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１）；Ｂ，ロタウイルス由来ＮＳＰ１のＤＮＡ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２）；Ｃ，アデノウイルス由来ＶＡＩのＲＮＡ遺伝子配列（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３）。
【図２】ＩＦＮ拮抗剤遺伝子ＶＡＩは、ＴＢ．Ｓ抗原の発現を増強する。ＶＡＩ遺伝子移入ＨｅＬａ細胞由来アデノウイルス発現ＴＢ．Ｓ抗原の産生増大（レーン２および４）を、非移入ＨｅＬａ細胞（レーン１および３）と比較し、図示したイムノブロット。ＴＢ．Ｓ抗原の高発現が、５０および１００ＭＯＩｓの両者で観察された。カラベクターＡｄ３５を感染させたＶＡＩ移入（レーン６）および非移入（レーン５）のＨｅＬａ細胞では、ＴＢ．Ｓ抗原の発現が観察されなかった。レーン７および８は、ＶＡＩ遺伝子非移入および移入した非感染対照ＨｅＬａ細胞を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【国際調査報告】
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