(57)【要約】  本発明は、微細流路型センサー複合構造物に関するものである。より詳細には、基準電極、作用電極及び電極連結部を備えた下部基板と、前記下部基板上に積層される中間基板であって、試料導入部と前記試料導入部からＴ型に分岐するように設計され、基準電極及び作用電極が露出する検出部に連結して、それぞれ選択的に酵素接合体貯蔵所または基質貯蔵所が配置されている２個の微細流路、試料溶液によって溶解された基質溶液が前記検出部に時間的に遅れて到達するように前記基質貯蔵所が配置されている微細流路上に付加される通気部及び空気排出口を備えた混合部、前記検出部を通過した流体が吸収される吸収部、前記吸収部末端に通気部を備える中間基板と、前記中間基板に形成された微細流路に毛細管現象を誘導するように積層される上部基板とを備える微細流路型センサー複合構造物を提供する。本発明の微細流路型センサー複合構造物は、一回の試料注入で免疫反応、洗浄、電気化学測定まで可能であるので、測定時間が短くて簡便かつ優秀な敏感度及び選択性を有し、簡単な方法で製作可能で大量生産が容易であり、小型測定機として測定が可能で、現場の測定用センサーとして使用できる。
2010534831.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基準電極、作用電極及び電極連結部を備えた下部基板と、
前記下部基板上に積層される中間基板であって、試料導入部と前記試料導入部からＴ型に分岐するように設計されて基準電極及び作用電極が露出する検出部に連結され、それぞれ選択的に酵素接合体貯蔵所または基質貯蔵所が配置されている２つの微細流路、試料溶液によって溶解された基質溶液が前記検出部に時間的に遅れて到達するように前記基質貯蔵所が配置されている微細流路上に付加する通気部及び空気排出口を備えた混合部、前記検出部を通過した流体が吸収される吸収部、前記吸収部末端に通気部を備える前記中間基板と、
前記中間基板に形成された微細流路に毛細管現象を誘導するように積層される上部基板とを備える微細流路型センサー複合構造物。
【請求項２】
前記下部基板が、中間基板の吸収部末端での試料到達を感知する流動性感知電極をさらに備えることを特徴とする、請求項１に記載の微細流路型センサー複合構造物。
【請求項３】
前記流動性感知電極が、試料の到達を感知することにより、基質溶液の注入時点を知らせることを特徴とする、請求項２に記載の微細流路型センサー複合構造物。
【請求項４】
前記下部基板が、検出信号の偏差を最小化することができる単数または複数の検定電極をさらに備えることを特徴とする、請求項１に記載の微細流路型センサー複合構造物。
【請求項５】
前記検定電極が、基礎信号を測定する第１検定電極と飽和または一部飽和された酵素接合体の飽和信号を測定する第２検定電極であることを特徴とする、請求項４に記載の微細流路型センサー複合構造物。
【請求項６】
前記中間基板が、分析物質のみを選別して試料導入部に供給することができるフィルターパッド部及びフィルターパッドをさらに備えることを特徴とする、請求項１に記載の微細流路型センサー複合構造物。
【請求項７】
前記フィルターパッドが、血液の血清のみを選別して試料導入部に供給する血液フィルターパッドであることを特徴とする、請求項６に記載の微細流路型センサー複合構造物。
【請求項８】
前記作用電極に試料が到達する順序が、試料溶液によって溶解された酵素接合体溶液が到達して、一定時間経過後に基質溶液が到達することを特徴とする、請求項１に記載の微細流路型センサー複合構造物。
【請求項９】
前記作用電極には、試料内の分析物質と免疫反応を誘導することができる抗体または分子認知物質が固定化されていることを特徴とする、請求項１に記載の微細流路型センサー複合構造物。
【請求項１０】
前記検出部が、抗体または分子認識物質と試料内の分析物質間の免疫反応後酵素接合体及び基質溶液間の酵素−基質反応によって発生する電気化学的信号を検出装置に送信して、分析物質の定量的な情報を得ることを特徴とする、請求項１に記載の微細流路型センサー複合構造物。
【請求項１１】
前記吸収部が、毛細管現象によって試料の流れを持続的に維持させることにより、検出部での反応を持続させて、未反応物質に対する洗浄効果を高めて高感度の検出信号を得ることを特徴とする、請求項１に記載の微細流路型センサー複合構造物。
【請求項１２】
前記上部基板が、微細流路型センサー複合構造物全体で毛細管現象が維持されるように試料導入部と通気部が解放されるように積層されることを特徴とする、請求項１に記載の微細流路型センサー複合構造物。
【請求項１３】
請求項１ないし請求項１２の中いずれか一項の微細流路型センサー複合構造物を使用した分析物質濃度の高感度及び定量的測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一回の試料注入によって微細流路内で免疫反応、洗浄、測定が可能な微細流路型センサー複合型構造物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
最近の科学技術の発達と共に、生活の質の向上に対する関心が高まり、日々の生活において、疾病診断及び予防、食品と環境の大切さは、日々拡大している。その結果、人間の疾病を診断したり食品化学や工業化学分野で特定工程のために、または環境分野で汚染物質を分析するために、試料中の有機物または無機物濃度測定に対する必要性が高まり、それに対する多くの努力が払われている。その中で、臨床実験、食品の新鮮度及び汚染度測定、生物工程制御、環境モニタリングなど多くの分野で、既存の伝統的な試験方法の代案の一つとして、多種の成分に対して連続的かつ迅速な試験を可能にするバイオセンサーの開発に多くの関心が集中している。
【０００３】
バイオセンサーは、酵素、微生物、抗体、レセプター、ＤＮＡプローブなどの生体物質を電気的、物理化学的素子（ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ）に結合させて測定分析物質との反応から発生する電極活性物質や物理的な変化を電気化学式、光学式、熱式、圧電式で信号を感知して濃度を測定する装置を意味する。その中で、抗体を使用した免疫センサーは、抗原と抗体の特異的認識によって高い選択性と低い検出限界を有しており、医療用診断センサーとして大きな関心を注がれている。
【０００４】
免疫センサーは、主にサンドイッチ固相酵素免疫分析法を使用して測定される。サンドイッチ固相酵素免疫分析法は、固定された抗体に抗原が結合して以後抗原の他の免疫結合部位に２次抗体−酵素接合体が結合するが、反応が特異的に起きるので、他の酵素免疫分析法よりすぐれた敏感性を示す。すなわち、固相競争酵素免疫分析法の場合、反応が起きるマトリックス内で他の物質の立体障害による妨害作用が起こり得、信号を妨害することがあるが、サンドイッチ酵素免疫分析法の場合、免疫結合が起きる部位にのみ免疫反応が起きるので、マトリックス内で他の物質による妨害作用を受け難くなるので、信号に影響がなく特異的な反応と言える。与えられた試料及び標準物質内の分子量が大きいタンパク質分析物質である病原菌、ウイルス、細胞などは、固定された抗体に結合して、洗浄後、２次抗体−酵素接合体が結合するようになる。したがって、固相に残る標識酵素の量は、分析物質の量に比例するようになる。その後、結合しない２次抗体−酵素接合体を洗浄して除去した後、固相に免疫結合で残っている標識酵素の量を基質との反応速度測定で知ることができる。サンドイッチ酵素免疫分析法は、特にタンパク質分析物質を定量する時に、最良の特異性と敏感性を示すので、臨床的に重要な血液タンパク質を分析するのに一般的に使用されている。
【０００５】
ラブ−オン−ア−チップ（Ｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ）は、半導体製作に使用されるエッチング技術を使用してガラス、シリコンまたはプラスチックからなる数ｃｍ２サイズのチップ上に分析に必要な様々な装置をマイクロマシニング技術を使用して集積させた化学マイクロプロセッサーで、高速、高効率、低費用の自動化された分析が可能である。この技術は、最近急速に成長する製薬産業分野で、新薬探索に必要な費用と時間を減らすことができる重要な技術として浮上している。そればかりではなく、医療診断装備、家庭や病床での健康検診器機、化学や生物工程モニタリング、携帯可能な環境汚染物質分析器機、化生放用無人化学／生物作用剤探知／識別装置などの多様な分野に応用できる核心基盤技術である。ラブ−オン−ア−チップ技術は、１９９０年初にハリソン（Ｈａｒｒｉｓｏｎ）などが開発した毛細管電気泳動を使用した方法を基礎にしている。これらは、溶液が満たされた微細なチャンネル両端に電圧をかけて溶液の流れを作る毛細管電気滲透現象を使用し、別途のポンプやバルブなしに溶液の流れを制御することができ、毛細管電気泳動を使用して分離分析ができるので、小さな実験室をチップ上に製作することが可能であることを示した。しかし、前記材料は、毛細管を微細に形成するには適切であるが、大量生産において多くの問題点を抱えている。大部分のラブ−オン−ア−チップ応用が、使い捨て生化学的センサーであるという点で、前記の材料は再現性を有していて安価に生産することが難しい。また、前記チェンバー間に流体を移動させるために微細バルブ装置などを使用して、洗浄過程が必要であり、装置が複雑になるという問題がある。
【０００６】
それで、本発明者等は、製造が簡便で携帯が容易で、構造が単純かつ安価に大量生産できるバイオセンサーを開発するために研究中、微細流体を使用して一回のサンプル注入で、免疫反応、洗浄及び電気化学測定が可能な微細流路型センサー複合構造物を開発して本発明を完成した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】欧州特許第１６８８７４２号明細書
【特許文献２】韓国特許出願公開第１０−２００３−０００４９３３号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、微細流路型センサー複合構造物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記目的を達成するために本発明は、基準電極、作用電極及び電極連結部を備えた下部基板と；前記下部基板上に積層される中間基板であって、試料導入部と前記試料導入部からＴ型に分岐するように設計され、基準電極及び作用電極が露出する検出部に連結され、それぞれ選択的に酵素接合体貯蔵所または基質貯蔵所が配置されている２つの微細流路、試料溶液によって溶解された基質溶液が前記検出部に時間的に遅れて到達するように前記基質貯蔵所が配置されている微細流路上に付加する通気部及び空気排出口を備えた混合部、前記検出部を通過した流体が吸収される吸収部、前記吸収部末端に通気部を備える前記中間基板と；前記中間基板に形成された微細流路に毛細管現象を誘導するように積層される上部基板を含んで具備される微細流路型センサー複合構造物を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
上記で詳しくみたように、本発明の微細流路型センサー複合構造物は、別途の操作なしに毛細管現象のみで試料が移動し、一回の試料注入で、免疫反応、洗浄、電気化学測定まで可能であるので、測定時間が短く簡便かつ優れた敏感度及び選択性を有する。
【００１１】
また、一般的に使用される有機高分子を使用して、簡単な方法で製作が可能で大量生産が容易であり、電気化学検出法を使用することにより、小型の測定機で測定が可能で、現場測定用センサーとして使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の一実施形態による微細流路型センサー複合構造物の分解斜視図である。
【図２】図１の微細流路型センサー複合構造物の結合斜視図及び平面図である。
【図３】図１の微細流路型センサー複合構造物の微細流路の平面図である。
【図４】本発明の一実施形態による微細流路型センサー複合構造物の反応経路を示した図である。
【図５】本発明の一実施形態による微細流路型センサー複合構造物の分解斜視図である。
【図６】図５の微細流路型センサー複合構造物の結合斜視図及び平面図である。
【図７】図５の微細流路型センサー複合構造物の微細流路の平面図である。
【図８】本発明の一実施形態による微細流路型センサー複合構造物の微細流路の平面図である。
【図９】本発明の一実施形態による微細流路型センサー複合構造物の微細流路製作方法を示す図である。
【図１０】本発明の一実施形態による微細流路型センサー複合構造物を使用してミオグロビンの量によって電流値を測定した検定曲線である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明による微細流路型センサー複合構造物は、基準電極、作用電極及び電極連結部を備えた下部基板と、試料導入部と前記試料導入部からＴ型に分岐するように設計されて基準電極及び作用電極が露出する検出部に連結され、それぞれ選択的に酵素接合体貯蔵所または基質貯蔵所が配置されている２つの微細流路、試料溶液によって溶解された基質溶液が前記検出部に時間的に遅れて到達するように前記基質貯蔵所が配置されている微細流路上に付加される通気部及び空気排出口を備えた混合部、前記検出部を通過した流体が吸収される吸収部、前記吸収部末端に通気部を備え前記下部基板上に積層される中間基板と、
前記中間基板に形成された微細流路に毛細管現象を誘導するように積層される上部基板とを備える。
【００１４】
ここで、微細流路の長さは変形可能で、流路に配置された酵素接合体貯蔵所と基質貯蔵所の位置、大きさ及び個数を変えることができる。前記作用電極には、抗体及び分子認知物質が固定され、分析物質の種類によって試料導入部、酵素接合体貯蔵所及び基質貯蔵所には、他の物質を配置することもできる。
【００１５】
本発明による微細流路型センサー複合構造物において、前記下部基板は、中間基板の吸収部末端での試料到達を感知する流動性感知電極をさらに備えることが好ましい。
本発明による微細流路型センサー複合構造物において、前記流動性感知電極は、試料の到達を感知することによって、基質溶液の注入時点を知らせることが好ましい。
【００１６】
本発明による微細流路型センサー複合構造物において、前記下部基板は、検出信号の偏差を最小化することができる単数または複数の検定電極をさらに備えることが好ましい。
本発明による微細流路型センサー複合構造物において、前記検定電極は、基礎信号を測定する検定電極（第１検定電極）と飽和または一部飽和された酵素接合体の飽和信号を測定する検定電極（第２検定電極）であることが好ましい。
【００１７】
本発明による微細流路型センサー複合構造物において、前記中間基板は、分析物質のみを選別して試料導入部に供給することができるフィルターパッド部及びフィルターパッドをさらに備えることが好ましい。
【００１８】
本発明による微細流路型センサー複合構造物において、前記フィルターパッドは、血液の血清のみを選別して試料導入部に供給する血液フィルターパッドであることが好ましい。
【００１９】
本発明による微細流路型センサー複合構造物において、前記作用電極に試料が到達する順序は、試料溶液によって溶解された酵素接合体溶液が到達して、一定時間経過後に基質溶液が到達することが好ましい。
【００２０】
本発明による微細流路型センサー複合構造物において、前記作用電極には、試料内の分析物質と免疫反応を誘導することができる抗体または分子認知物質が固定化されていることが好ましい。
【００２１】
本発明による微細流路型センサー複合構造物において、前記検出部は、抗体または分子認識物質と試料内の分析物質間の免疫反応後、酵素接合体及び基質溶液間の酵素−基質反応によって発生する電気化学的信号を検出装置に送信して、分析物質の定量的な情報を得ることが好ましい。
【００２２】
本発明による微細流路型センサー複合構造物において、前記吸収部は、毛細管現象によって試料の流れを持続的に維持させることで、検出部での反応を持続させて、未反応物質に対する洗浄効果を高めて、高感度の検出信号を得ることが好ましい。
【００２３】
本発明による微細流路型センサー複合構造物において、前記上部基板は、微細流路型センサー複合構造物全体で毛細管現象が維持されるように試料導入部と通気部が解放されるように積層することが好ましい。
【００２４】
また、本発明は、前記微細流路型センサー複合構造物を使用した分析物質濃度の高感度及び定量的測定方法を提供する。
以下、図参照して本発明をさらに詳しく説明する。
【００２５】
図１は、本発明の一実施形態による微細流路型センサー複合構造物の分解斜視図で、図２はその結合図及び平面図である。
本発明による微細流路型センサー複合構造物は、電極部（作用電極１０１、基準電極１０２及び電極連結部１０３）が形成された下部基板１００；試料が試料導入部２０３から前記電極部を経て前記吸収部２０９に至るように構成された微細流路を含む中間基板２００；及び上部基板（またはカバー）３００が積層された構造からなる。
【００２６】
前記下部基板１００は、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリカーボネートなどの有機高分子材料を使用して形成され、その上の電極部は、スクリーン印刷法または物理的／化学的蒸気蒸着法を使用して電極形成物質を下部基板上に形成させることによって形成される。
【００２７】
次に、微細流路を含む中間基板２００は、前記下部基板１００材料にプレスを使用した成形を通じて形成することができ、前記有機高分子材料で作られた両面テープにプレス金型を使用して形成することもでき、好ましくは感光剤（ｄｒｙ  ｐｈｏｔｏｒｅｓｉｓｔ）フィルムを使用してエッチング法を使用して図案にしたがって微細流路を形成させることができる。一例として、感光剤フィルムを使用時、前記感光剤フィルムを下部基板１００と７０℃の熱で圧着させた後、微細流路が図案されたフォトマスクフィルムを載せて露光し、エッチング溶液で露光された部分を除去すると、下部基板１００と微細流路が形成された中間基板２００が積層されて完成する（図９参照）。
【００２８】
上部基板３００は、毛細管現象を誘導することができる流路を形成できるように中間基板上に積層するカバーである。前記上部基板３００は、透明または不透明であって、流路を形成する方法によってその種類を変えることができる。例えば、感光剤フィルムを使用して中間基板２００を製作する場合、上部基板３００は、中間基板２００と積層される面が粘着剤で処理された有機高分子材料を使用することができる。
【００２９】
試料導入部２０３及び吸収部２０９の流路の末端が露出するように、上部基板３００は中間基板２００上に配置される。当該露出した末端部分は、通気部２１０として機能して毛細管現象を誘導する。
【００３０】
図３は、前記図１の微細流路型センサー複合構造物から上部基板３００を除いた下部基板１００と中間基板２００が積層された平面図である。
図３に示したように、微細流路が形成されている中間基板２００には、試料が導入される試料導入部２０３から反応に必要な酵素接合体貯蔵所２０４及び基質貯蔵所２０５、空気排出口２０７、検出部２０８及び試料の流れを維持させて反応及び洗浄効果を持続させる吸収部２０９が含まれる。試料導入部２０３以後の流路は、二つの流路に分岐し、分岐流路上にそれぞれ酵素接合体貯蔵所２０４と前記酵素接合体に反応する基質が貯蔵されている基質貯蔵所２０５が位置する。
【００３１】
本発明による微細流路型センサー複合構造物での試料内の分析物質の反応経路を図４に示した。
図４に示したように、試料導入部を通じて注入された試料は、毛細管現象で二つの流路に同時に移送される。前記試料は、酵素接合体貯蔵所２０４が含まれている流路と前記酵素接合体に反応する基質が貯蔵されている基質貯蔵所２０５が含まれている流路に、試料が同時に移送されて酵素接合体貯蔵所２０４に塗布されている酵素接合体及び基質貯蔵所２０５に塗布されている基質を溶解させて流路にしたがって継続して移送される。ここで、酵素接合体貯蔵所で溶解された酵素接合体は、試料内分析物質の特定部位と結合する。しかし、電極が形成されている検出部２０８接点入口で二つの流路にしたがって移送されてきた試料の流れは異なる。すなわち、酵素接合体と結合された分析物質を含む試料は、検出部２０８に含まれている電極に移動する一方、基質を溶解させながら流れた試料は、検出部の近い位置にある酵素接合体貯蔵所流路によって移送された試料で空気排出が塞がれて、毛細管現象を維持することができなくなる。ここで、電極中で抗体または分子認知物質が固定されている作用電極１０１では免疫反応が起きる。前記免疫反応後、空気排出口２０７を開放すると、溶解された基質が混合部２０６で試料と混じった後、吸収部２０９による毛細管現状の持続によって作用電極１０１に移送される。注入された基質は、検出部２０８で反応できなかった酵素接合体を洗浄すると同時に信号発生を誘導させ、分析物質によって信号強度が変わるようになり、これを通じて電気化学方法で測定することができる。
【００３２】
したがって、本発明による微細流路型センサー複合構造物は、その微細流路の構造によって、一回の試料注入で免疫反応、洗浄及び電気化学測定を可能にする。
図５は、本発明の他の一実施形態による微細流路型センサー複合構造物の分解斜視図である。図６はその結合図及び平面図であり、図７はその微細流路の平面図を示す。
【００３３】
本発明による微細流路型センサー複合構造物は、中間基板に分析物質のみを選別して試料導入部に供給することができるフィルターパッド部及びフィルターパッドをさらに備えることが好ましい。
【００３４】
図５ないし図７に示したように、本発明による微細流路型センサー複合構造物は、試料導入部２０３に血液フィルターパッド部２０１と血液フィルターパッド２０２のようなフィルターパッド部及びフィルターパッドを導入することができる。前記血液フィルターパッド２０２は、血液の血球をろ過して血清のみを試料導入部２０３に注入する。前記分析物質は、主に血清内に存在し、血球は体積が大きいため分析物質の測定を妨害するので、前記血液フィルターパッドを通じて血球をあらかじめろ過すると分析物質をさらに正確に測定することができる。
【００３５】
また、本発明による微細流路型センサー複合構造物は、下部基板に中間基板の吸収部末端での試料の到達を感知する感知手段を備えることが好ましい。
試料が試料導入部２０３に移動して流路にしたがって流れ込み酵素接合体貯蔵所２０４、検出部２０８を経て吸収部２０９まで満たされると、基質貯蔵所２０５流路にとどまっている基質を検出部２０８に移動させて信号を検出することができる。ここで、基質を検出部２０８に移動させる時点を知らせる感知手段を備えることが好ましく、前記感知手段としては、一例として流動性感知電極を使用することができる。吸収部２０９内に配置されている流動性感知電極１０４は、試料の流入を感知した時に微細信号を読んで音に変換して注入時点を知らせることができる。前記感知手段によって測定結果の再現性を高めることができる。ここで、感知手段は、吸収部２０９の構造によって一定位置に配置することができ、好ましくは、免疫反応が終わって洗浄作用が目的どおりに起きるように吸収部２０９の末端に位置させる。また、基質が注入される量を把握して感知手段を備えた以後の流路の長さと幅を調節することができる。
【００３６】
前記感知手段が、試料の流入を感知して注入時点を知らせると、物理的に例えば、針のような鋭い道具で空気排出口２０７を形成するかまたはすでに形成させておいた空気排出口２０７を開放させて基質を注入させた後、検出部で電気化学的方法で測定することにより、血液内に存在する診断物質を濃度別に測定することができる。
【００３７】
ここで、前記検出部は、抗体または分子認識物質と試料内の免疫反応後、酵素接合体及び基質溶液間の酵素−基質反応によって発生する電気化学的信号を検出装置に送信して、分析物質の定量的な情報を得られるようにする役割をする。
【００３８】
また、前記吸収部は、毛細管現象によって試料の流れを持続的に維持させることで、検出部での反応を持続させ、未反応の物質に対する洗浄効果を高めて高感度の検出信号を得られるようにする役割をする。
【００３９】
さらに、本発明による微細流路型センサー複合構造物は、検出信号の偏差を最小化することができる単数または複数の検定電極を前記下部基板にさらに備えることが好ましい。
図８は、本発明のまた他の一実施形態による検出部２０８に自体検定機能の検定電極（第１検定電極１０５、第２検定電極１０６を含んだ微細流路型センサー複合構造物の平面図を示したものである。
【００４０】
検定電極を使用して反覆的な信号を測定してそれらの平均値を求めてその値を標準信号値（基礎信号値、飽和信号値）と決定した後、作用電極１０１で得られる検出信号を標準信号値と比較、補正すると実験個体間に生じる偏差を減らすことができる。
【００４１】
例えば、図８において第１検定電極１０５は、基礎信号を測定する電極で、作用電極１０１は、分析しようとする分析物質の抗体を固定化させて分析物質の濃度別検出信号を測定する電極であり、第２検定電極１０６は、飽和されたあるいは一部飽和された酵素接合体の飽和信号を測定する電極である。第１検定電極１０５を通じて酵素接合体の非特異的吸着の問題なのかどうかを把握することができ、第２検定電極１０６を通じて酵素接合体の量あるいは溶解される程度の問題なのかを把握することができる。三つの電極（作用電極１０１、第１検定電極１０５、第２検定電極１０６）は、一つの基準電極１０２に連結されて測定するようになる。それは、このような測定が可能な検出装置で測定することができる。ここで、検定電極の個数と位置は、限定されない。
【００４２】
前記微細流路型センサー複合構造物は、次のような方法で製造することができる。
まず、下部基板１００の上部に炭素または金属導体物質を印刷または蒸着方法によって電極（作用電極１０１、基準電極１０２、電極連結部１０３、流動性感知電極１０４）を形成する。そして、中間基板を通じて試料導入部２０３、酵素接合体貯蔵所２０４、基質貯蔵所２０５、混合部２０６、空気排出口２０７、検出部２０８、吸収部２０９を含む微細流路を形成させる。ここで、微細流路は、プレスを使用した成形によって形成することができ、前記有機高分子材料で作られた両面テープにプレス金型を使用して形成することもでき、感光剤フィルムを使用してエッチング法を用いて形成することができる。以後、露出した作用電極１０１上に抗体または分子認知物質を固定化させて、酵素接合体貯蔵所２０４には酵素接合体を、基質貯蔵所２０５には基質を塗布する。適切な条件で物質の分散後に固着すると上部基板３００を微細流路型複合構造物全体で毛細管現象が維持されるよう、試料導入部と通気部が解放されるように付着させる。
【００４３】
前記作用動電極１０１表面に、抗体または分子認知物質を電極に固定化する方法は、物理的方法と化学的方法を併用することができ、前記物理的吸着方法は、電極表面と抗体間親油性結合力を使用して抗体を希釈して作用電極１０１上に滴下した後、適正条件で乾燥を行なうので、簡単かつ固定化時間が短い。また、化学的方法は、１次アミン、チオール、炭化水素基を使用して電極表面と抗体間の共有結合を誘導して、高密度の機能分子が長い間電極表面に配列されるようにする。
【００４４】
前記酵素接合体貯蔵所２０４に塗布された酵素接合体は、試料によって溶解してその機能を発揮しなければならない。最も好ましい塗布方法は、急速凍結乾燥であり、さまざまな添加剤を使用して溶解を促進させることができる。抗体の活性保存とタンパク質分解酵素から抗体を保護して、非特異的吸着を減少する機能を有するタンパク質類（ＢＳＡ、脱脂粉乳、カゼイン）とタンパク質乾燥時の結晶化予防及びタンパク質構造を維持して安定剤に使用される単糖類（グルコース）、多糖類（スクロース、トレハロース）などを含ませて酵素接合体溶液を製造する。また、非特異的吸着を防いで酵素活性を高める界面活性剤類（ツイーン２０、ツイーン８０、トリトンＸ−１００）を含み、酵素の種類によって活性に必要な金属イオンを含ませることもできる。酵素接合体に使用される酵素は、多様に選択することができる。一例として、グルコース酸化酵素を使用するとグルコースを基質に使用してチップに適用することができ、アルカリホスファターゼを使用すると、基質に４−アミノフェニルホスフェートを使用して測定することができる。また、西洋わさびの過酸化酵素は、基質である過酸化水素を使用して還元電流を測定することができる。このような酵素を標識に使用する場合、電気化学的検出が可能で、多様な抗体及び分子認識物質を使用すると、本発明である微細流路型センサー複合構造物にそれぞれ適用して生体試料と環境試料、農工業試料または食品試料中の多様な有機物または無機物濃度も同一な方法で定量することができる。
【００４５】
また、本発明は、前記微細流路型複合構造物を使用した分析物質濃度の高感度及び定量的測定方法を提供する。
このように製造された微細流路型センサー複合構造物を使用して、一例としてミオグロビンの量によって電流値を測定した結果、図１０に示したようにミオグロビンの量に電流値が比例することを確認し、その標準の標準偏差も０．０２〜０．１８と低いので、高感度で定量的測定が可能であることを確認した。したがって、前記構造を有する微細流路型センサー複合構造物は、様々な分析物質に適用することができるバイオセンサーに有用に使用することができる。
【００４６】
このように、本発明による微細流路型センサー複合構造物は、一般的に使用される有機高分子を使用して簡単な方法で製作が可能で大量生産が容易であり、試料導入部に試料を導入すると、毛細管現象のみで移動が可能であり、その同一の試料で物質の溶解を通じた免疫反応、洗浄及び測定が可能な免疫センサーの製作が可能で、比較的早く正確な結果を得ることができる。また、流れの制御をバルブやポンプなしに毛細管流路の構造によって構成することで、安価で製作することができ、簡単な操作過程で測定が可能なので、様々な分析物質に適用することができるバイオセンサーに有用に使用することができる。
【００４７】
以下、本発明を実施例によってより詳細に説明する。
但し、下記の実施例は、本発明の内容を例示するだけのものであって、本発明の範囲が実施例によって限定されるのではない。
【００４８】
＜実施例１＞ミオグロビン定量分析用微細流路型センサー製作
（１）電極及び微細流路製作
微細流路の製作は、半導体製作工程の一部である光エッチング法を使用して製作した。使用するフィルムは、一般的に使用されるアクリルコーティングされたポリエチレンテレフタルレート（ＰＥＴ）フィルムを使用し、そのフィルム上に炭素ペーストでスクリーン印刷法を使用して作用電極、電極連結部及び流動性感知電極を、銀ペーストで基準電極と電極連結部を形成した。以後、液状ではない乾燥した感光剤フィルムを使用して、電極が形成されたフィルムと熱圧着して、露光機を使用して所望する微細流路を形成させた。所望する毛細管流路は、ＣＡＤプログラムを使用してデザインし、ＯＨＰフィルムに印刷してパターンマスクに使用した。一定光量で露光をさせた後、２％炭酸ナトリウムでエッチング過程を経て、パターンを精密化した。エッチング液は、３０℃程度に維持させた。製作されたセンサチップを陰条件で乾燥させて保管した。
【００４９】
（２）抗体、酵素接合体、基質固定化
作用電極に物理的な吸着方法で抗体を固定化させるためにミオグロビン抗体を０．０１Ｍリン酸緩衝溶液ｐＨ７．２に希釈して作用電極表面に滴下して２５℃で乾燥させた。酵素接合体貯蔵所に塗布する酵素接合体は、アルカリホスファターゼを使用した２次ミオグロビン抗体集合体を使用してサンドイッチ免疫分析法を適用した。酵素接合体貯蔵所上に酵素接合体を高濃度に希釈して適正量載せて２５℃で乾燥した。酵素接合体を希釈する緩衝溶液は、２０ｍＭリン酸緩衝溶液ｐＨ７．２に０．５％ＢＳＡ、１％トレハロース、０．１％ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、０．０１％ツイーン２０を添加した溶液を使用した。乾燥した酵素接合体が水和して流れやすいように酵素接合体希釈緩衝液に様々な添加剤を含ませた。基質貯蔵所には、アルカリホスファターゼの基質である４−アミノフェニルホスフェートを乾燥させた。基質も短時間内に水和させるために、１．０Ｍ炭酸塩緩衝溶液に、０．５％トレハロース、０．０５％ツイーン２０、０．５％ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）など、さまざまな添加剤を含ませた。
【００５０】
以後、上部基板としてポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルムの一方の面に接着テープからなるカバーテープを付着させ圧着して微細流路型センサーを製作した。
＜実施例２＞ミオグロビン定量分析用微細流路型センサー製作２
試料導入部に血液分離フィルターパッドを導入して、吸収部末端に流動感知電極を備えたことを除き実施例１と同一方法で微細流路型センサーを製作した。
【００５１】
ここで、使用した血液分離フィルターパッドは、Ｌｙｄａｌｌ  ＦｉｌｔｒａｔｉｏｎのＬｙＰｏｒｅ  Ｇｒａｄｅ  ９３８９を購入し、流動感知電極は、作用電極と同一に炭素ペーストを使用して製作した。
【００５２】
＜実施例３＞ミオグロビン定量分析用微細流路型センサー製作３
作用電極の他に二つの検定電極を追加したことを除き、実施例１と同一方法で微細流路型センサーを製作した。ここで、前記検定電極は、炭素ペーストで電極を製造した後、第１検定電極は、その上にＢＳＡを塗布して、第２検定電極はＩｇＧを塗布した。
【００５３】
第１検定電極は、ＢＳＡを塗布することで基礎信号を確認することができ、第２検定電極は、ラビットキットのコントロールラインのようなＩｇＧを塗布することで、反応に参加しない酵素接合体との結合を通じて酵素接合体の溶解程度、すなわち飽和信号を詳しく見ることができた。
【００５４】
＜実施例４＞抗生物質定量分析用の微細流路型センサー製作１
抗生物質（例えば、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、アンピシリン、スルファジメトキシン等）を定量分析するための微細流路型センサーの製作は、ミオグロビン定量分析用のものと同一である。低分子量のため、抗生物質は、サンドイッチ酵素免疫分析法ではなく、競争酵素免疫分析法で測定した。抗生物質と酵素の接合体は、抗体を作用電極上に固定することにより、競争的にすることができる。
【００５５】
ｐＨ７．２の０．０１Ｍリン酸緩衝液中の抗生物質抗体の希釈液を作用電極上に滴下し、２５℃で乾燥させた。酵素接合体貯蔵所に付与された酵素接合体は、ＨＲＰを用いて抗生物質と直接に接合された抗生物質−ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）接合体であった。可溶化後に酵素接合体を移動させるように適合された種々の薬剤を上述の希釈緩衝液に添加した。基質貯蔵所では、ＨＲＰの基質として機能するペルオキシドとＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）をその溶液を乾燥させることにより濃縮した。
【００５６】
その後、その一面が粘着テープとして機能するポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルムを中間基板に付着させて微細流路型センサーを製作した。
＜実施例５＞抗生物質定量分析用の微細流路型センサー製作２
実施例４とは異なるように競争酵素免疫分析法を設計することができる。抗生物質−タンパク質接合体を作用電極上に固定することで、固定化された抗生物質−タンパク質接合体及び遊離の抗生物質の両方を、抗生物質抗体−酵素接合体上で競争的にすることができる。
【００５７】
抗生物質−ＢＳＡ（またはＢＴＧ，ＯＶＡ）を作用電極上に物理的固定し、乾燥させた。酵素接合体貯蔵所に付与された酵素接合体は、アルカリホスファターゼで処理された抗体−酵素接合体であった。基質貯蔵所では、アルカリホスファターゼの基質として機能する４−アミノフェニルホスフェートを付与した。
【００５８】
その後、中間基板に粘着テープを付着させて微細流路型センサーを製作した。
＜実験例１＞ミオグロビン濃度測定
本発明による微細流路型センサー複合型構造物を使用して製作した微細流路型センサーのバイオセンサーとしての作用を確認するために、次のような実験を行なった。
【００５９】
ミオグロビンを０、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１μｇ／ｍｌの濃度に変化させて、前記濃度のミオグロビンが存在する血漿を実施例１で製作されたミオグロビン微細流路型センサーの試料注入口に注入した。試料が吸収部の流動性感知電極に到達した時、空気排出口に針で穴を開けて水和した基質が電極に流入するようにした。以後、各電極をＥＺポテンシオスタットプログラムで＋１５０ｍＶの電圧をかけて６０秒間電流値を測定した。その結果を図１０及び表１に示した。
【００６０】
【表１】
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図１０及び表１に示したように、ミオグロビンの濃度によって電流値は変化し、感応傾きは、０〜０．１μｇ／ｍｌ濃度で線形性０．７８６を、０．１〜１μｇ／ｍｌで線形性０．９７７を示すことにより、バイオセンサーとしての定量的検出が可能であることを確認した。
【００６１】
したがって、本発明による微細流路型センサー複合構造物は、様々な分析物質に適用することができるバイオセンサーに有用に使用することができる。
【符号の説明】
【００６２】
１００：下部基板
１０１：作用電極
１０２：基準電極
１０３：電極連結部
１０４：流動性感知電極
１０５：第１検定電極
１０６：第２検定電極
２００：中間基板
２０１：血液フィルターパッド部
２０２：血液フィルターパッド
２０３：試料導入部
２０４：酵素接合体貯蔵所
２０５：基質貯蔵所
２０６：混合部
２０７：空気排出口
２０８：検出部
２０９：吸収部
２１０：通気部
３００：上部基板
【図１】
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【図２（Ａ）】
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【図２（Ｂ）】
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【図３】
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【図５】
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【図６（Ａ）】
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【図６（Ｂ）】
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【図７】
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【図８】
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【図４】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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