(57)【要約】  本発明は核酸増幅の分野におけるものであり、特に、その改善をもたらす転写依存的増幅におけるものである。特に、本発明は、転写依存的増幅反応、特に多重反応を改善するプライマー、およびその使用方法を提供する。
2010508832.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）サンプルを、
（ａ）５’末端および３’末端を有する第１プロモーターオリゴヌクレオチド（第１プロモーターオリゴヌクレオチドは５’末端にＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含み、該ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列の３’側に、第１標的核酸の第１標的部分に相補的な配列を含む。）および
（ｂ）５’末端および３’末端を有する第２プロモーターオリゴヌクレオチド（第２プロモーターオリゴヌクレオチドは５’末端にＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含み、該ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列の３’側に、第２標的核酸の第１標的部分に相補的な配列を含み、ここで更に、第２プロモーターオリゴヌクレオチドは３’末端に遮断部分を含んでいて、それからの伸長が実質的に阻止される。）と接触させること、ならびに
（２）選択された試薬および条件を転写依存的増幅に供することを含んでなる、
２以上の標的核酸の増幅に特異的な試薬が存在する反応において、サンプル中の選択された第１標的核酸の特異的転写依存的増幅反応を行うための方法。
【請求項２】
第１標的核酸の増幅が、第２プロモーターオリゴヌクレオチドが遮断部分を欠く場合の第２プロモーターオリゴヌクレオチドの存在下、最低限度で検出可能であるまたは検出不可能である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該遮断部分が、いずれかの選択された増幅反応温度において、第２プロモーターオリゴヌクレオチドの３’末端に尚も存在する、請求項１および２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
転写依存的増幅のための条件が第１標的核酸に関して最適化される、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
転写依存的増幅のための条件が第２標的核酸に関して最適化される、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
選択された試薬が、第１標的核酸の第２標的部分（該第２標的部分は第１標的核酸の第１標的部分の５’側に存在する。）に相同な配列を含む第１プライマーオリゴヌクレオチドとおよび第２標的核酸の第２標的部分（該第２標的部分は第２標的核酸の第１標的部分の５’側に存在する。）に相同な配列を含む第２プライマーオリゴヌクレオチドとを含む、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
第１プロモーターオリゴヌクレオチドが更に、３’末端に遮断部分を含んでいて、それからの伸長が実質的に阻止される、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
第１プロモーターオリゴヌクレオチドの遮断部分が、いずれかの選択された増幅反応温度において、第１プロモーターオリゴヌクレオチドの３’末端に尚も存在する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
第１および第２の両方のプロモーターオリゴヌクレオチド上の遮断部分が、いずれかの選択された増幅反応温度において、それらのオリゴヌクレオチドの３’末端に尚も存在する、請求項７および８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
サンプルを、５’末端および３’末端を有する第３プロモーターオリゴヌクレオチド（第３プロモーターオリゴヌクレオチドは５’末端にＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含み、該ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列の３’側に、第３標的核酸の第１標的部分に相補的な配列を含む。）と接触させることを更に含む、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
該遮断部分がｄａｂｓｙｌである、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
該遮断部分がｄａｂｃｙｌである、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
該遮断部分がアミノ基である、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
該遮断部分がホスファートである、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
サンプルを更に、第１標的核酸の第３標的部分（第３標的部分は第１標的部分と第２標的部分との間に位置する。）に相同な検出可能な様態で標識された第１プローブオリゴヌクレオチドと接触させる、請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
サンプルを更に、第２標的核酸の第３標的部分（第３標的部分は第１標的部分と第２標的部分との間に位置する。）に相同な検出可能な様態で標識された第２プローブオリゴヌクレオチドと接触させる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
第１および第２（おそらくは第３など）標的核酸が同一生物の２つ（おそらくは３つなど）の株の核酸である、請求項１から１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
第１および第２（おそらくは第３など）標的核酸が、異なる生物の核酸である、請求項１から１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
該標的核酸がＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１から１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
転写のための選択された試薬が、
ｉ）逆転写酵素活性を有する酵素、
ｉｉ）ＲＮアーゼＨ活性を有する少なくとも１つの酵素、
ｉｉｉ）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、および
ｉｖ）十分な量のｄＮＴＰおよびｒＮＴＰ
を含む、請求項１から１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
第２（おそらくは第３など）プロモーターが、第１プロモーターオリゴヌクレオチドのプロモーターと同じポリメラーゼで機能的である、請求項１から２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
第１標的核酸がメチシリン耐性スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の第１株に存在し、第２標的核酸がメチシリン耐性スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の第２株に存在する、請求項１から２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
第２標的核酸がＨＩＶ−１に存在する、請求項１から２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
（１）サンプルを、
（ａ）５’末端および３’末端を有する第１プロモーターオリゴヌクレオチド（第１プロモーターオリゴヌクレオチドは５’末端にＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含み、該ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列の３’側に、第１標的核酸の第１標的部分に相補的な配列を含む。）および
（ｂ）５’末端および３’末端を有する第２プロモーターオリゴヌクレオチド（第２プロモーターオリゴヌクレオチドは５’末端にＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含み、該ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列の３’側に、第２標的核酸の第１標的部分に相補的な配列を含み、ここで更に、第２オリゴヌクレオチドは３’末端に遮断部分を含んでいて、それからの伸長が実質的に阻止される。）と接触させること、ならびに
（２）選択された試薬および条件を転写依存的増幅に供することを含んでなる、
２以上の標的核酸がサンプル中に存在する場合にそれらを増幅する反応において、サンプル中の選択された第１標的核酸の特異的転写依存的増幅反応を行うための方法
【請求項２５】
第１プロモーターオリゴヌクレオチドが５’末端にＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含み、該ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列の３’側に、第１標的核酸の第１標的部分に相補的な配列を含み、第２プロモーターオリゴヌクレオチドが５’末端および３’末端を有し、５’末端にＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含み、該ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列の３’側に、第２標的核酸の第１標的部分に相補的な配列を含み、ここで更に、第２プロモーターオリゴヌクレオチドが３’末端に遮断部分を含んでいて、それからの伸長が実質的に阻止される、５’末端および３’末端をそれぞれが有する２以上のプロモーターオリゴヌクレオチドを含んでなる、２以上の標的核酸に対する多重ハイブリド形成および該標的核酸の増幅を行うための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸配列のインビトロ増幅、特に、その改良をもたらす、転写依存的増幅に関する。特に、本発明は、２以上の増幅標的に対する試薬が存在する場合（例えば、多重増幅反応）の転写依存的増幅反応を改善する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
核酸増幅は、感染症および病的ゲノム異常ならびにいずれの病態とも関連づけられ得ない核酸多型の検出および／または診断を含む多数の臨床用途において有用であることが判明している。標的化核酸の量が、サンプル中に存在する他の核酸と比べて比較的少ない場合、少量の標的化核酸しか入手可能でない場合、検出技術が低感度を有する場合またはより迅速な検出が望ましい場合に、核酸増幅は特に有用である。例えば、感染性因子は、特定の特徴的な核酸配列の検出により正確に特定されうる。サンプル中には比較的少数の病原生物しか存在していない可能性があるため、これらの生物から抽出される核酸は、典型的には、サンプル中の全核酸のごく一部でしかない。特徴的な核酸配列が存在する場合、その特異的増幅は検出および識別方法の感度および特異性を著しく増大させる。
【０００３】
一般に、酵素増幅反応が変性温度、プライマーアニーリング温度およびアンプリコン（核酸の酵素増幅反応の産物）合成温度の間の連続的温度循環により駆動される（サーモサイクリング増幅）かどうか、または酵素増幅過程の全体にわたって温度が一定に維持される（等温増幅）かどうかに基づいて、現在公知の増幅方法は大雑把に２つのクラスに分類されうる。典型的な循環核酸増幅技術（サーモサイクリング）はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）である。そのような反応の具体的なプロトコールは、例えば、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２版，Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２）第１５章に記載されている。等温である反応には、とりわけ、転写媒介反応（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＴＭＡ）、核酸配列依存的増幅（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＮＡＳＢＡ）および鎖置換増幅（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＤＡ）が含まれる。
【０００４】
等温標的増幅方法には、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列がプライマー伸長産物内に増幅初期段階で組込まれ（ＷＯ  ８９／０１０５０）、さらに、標的配列または標的相補的配列が転写工程およびＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド中間産物内のＲＮＡ鎖の消化により増幅される転写依存的増幅法が含まれる。例えば、米国特許第５，１６９，７６６号および第４，７８６，６００号を参照されたい。これらの方法には、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、セルフサステインド配列複製（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（３ＳＲ）、核酸配列依存的増幅（ＮＡＳＢＡ）およびこれらの変法が含まれる。例えば、Ｇｕａｔｅｌｌｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：１８７４−１８７８（１９９０）；米国特許第５，７６６，８４９号；第５，３９９，４９１号；第５，４８０，７８４号；第５，７６６，８４９号；および第５，６５４，１４２号（ＴＭＡ）；第５，１３０，２３８号（Ｍａｌｅｋら）；第５，４０９，８１８号およびＥＰ０３２９８２２（Ｄａｖｅｙら）；第５，６５４，１４２号（Ｋｉｅｖｉｔｓ）；および第６，３１２，９２８号（Ｖａｎ  Ｇｅｍｅｎら）（核酸依存的増幅（ＮＡＳＢＡ）技術）；ならびにＫｗｏｈら，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３−１１７７；Ｇｕａｔｅｌｌｉら，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４−１８７８；ＰＣＴ特許公開番号ＷＯ  ９２／０８８００）（３ＳＲ）を参照されたい。米国特許第５，７４４，３１１（Ｆｒａｉｓｅｒ）、第５，６４８，２１１号（Ｆｒａｉｓｅｒ）、第５，４５５，１６６号（Ｗａｌｋｅｒ）および第５，６３１，１４７号（Ｌｏｈｍａｎ）は、鎖置換増幅（ＳＤＡ）に基づく等温増幅系を記載している。
【０００５】
ＤＮＡ  ＮＡＳＢ法（ＲＮＡアンプリコンを与えるＤＮＡ標的増幅）も記載されている（例えば、‘Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｕｓｉｎｇ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ’（ＷＯ  ０２／０７０７３５）、‘Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＢＶ  ＤＮＡ  ｕｓｉｎｇ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ’（ＷＯ  ０２／０７２８８１）および‘Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｔｈａｔ  ｃａｎ  ｂｅ  ｕｓｅｄ  ａｓ  ｐｒｉｍｅｒｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｂｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＳＶ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＳＶ  ＤＮＡ  ｕｓｉｎｇ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ’（ＥＰ０４０７８１６６．８）を参照されたい）。
【０００６】
米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号はＰＣＲの説明を記載している。米国特許第５，７９２，６０７号（Ｂａｃｋｍａｎ）は、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ；ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ，１９８９，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４：５６０−５６９ならびにＢａｒａｎｙ，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１８９−１９３も参照されたい）と称される増幅方法を記載している。他のアプローチには、ポリメラーゼリガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ，１９９１，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃ．１：５−１６）が含まれる。ギャップＬＣＲ（ＰＣＴ特許公開番号ＷＯ  ９０／０１０６９）、修復連鎖反応（Ｒｅｐａｉｒ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）（欧州特許公開番号４３９，１８２  Ａ２）、Ｑ−ベータレプリカーゼ、転写媒介イソＣＲサイクリングプローブ技術およびカスケードローリングサークル増幅（ＣＲＣＡ）が含まれる。核酸増幅を記載している他の米国特許文献には、米国特許第４，８７６，１８７号、第５，０３０，５５７号、第５，３９９，４９１号、第５，４８５，１８４号、第５，５５４，５１７号、第５，４３７，９９０号、第５，３９９，４９１号、第５，５５４，５１６号および第６，５５１，７７８号が含まれる。増幅系の概説がＡｂｒａｍｓｏｎおよびＭｙｅｒｓ，１９９３，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：４１−４７に記載されている。
【０００７】
標準的なＮＡＳＢＡ反応においては、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）もしくはＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）または二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）から大量の一本鎖ＲＮＡが生じる（米国特許第５，６５４，１４２号）。ＲＮＡをＮＡＳＢＡで増幅する場合、ｓｓＲＮＡが、ＲＮＡポリメラーゼ認識部位を含有する第１プライマーの伸長による第１ＤＮＡ鎖の合成のための鋳型として用いられる。このＤＮＡ鎖が今度は、二本鎖活性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター部位を与える、第２プライマーの伸長による第２の相補的なＤＮＡ鎖の合成のための鋳型として用いられ、第２ＤＮＡ鎖は、ＲＮＡポリメラーゼの助けにより、ｓｓＲＮＡである大量の第１鋳型の合成のための鋳型として用いられる（米国特許第５，４０９，８１８号）。
【０００８】
転写依存的増幅技術は、ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーターを含む鋳型からの複数のＲＮＡコピーの転写を含む。これらの方法により、ＲＮＡポリメラーゼにより認識される機能性プロモーターを含むＤＮＡ鋳型から複数のＲＮＡコピーが転写される。これらのコピーは、再び、標的として使用され、該標的から新たな量のＤＮＡ鋳型が得られ、これが繰返される。等温転写依存的増幅が実施可能であり（Ｄａｖｅｙら，ＥＰ  ３２３８２２（ＮＡＳＢＡ）；Ｇｉｎｇｅｒａｓら，ＥＰ０３７３９６０；Ｋａｃｉａｎら，ＥＰ０４０８２９５）、また、より高い温度での該反応の実施を可能にする熱安定酵素を使用して、転写依存的増幅反応が実施可能である（例えば、ＥＰ０６８２１２１，Ｔｏｙｏ  Ｂｏｓｅｋｉ  ＫＫ）。
【０００９】
ＥＰ０３２３８２２、ＥＰ０３７３９６０およびＥＰ０４０８２９５に記載されている方法は等温連続法である。これらの方法では、増幅を達成するために、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮアーゼ（Ｈ）活性およびＲＮＡポリメラーゼ活性の４つの酵素活性が要求される。これらの活性の幾つかは１つの酵素に兼ね備わっているため、通常は２つ又は３つの酵素のみが必要とされる。ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素は、ＲＮＡ鋳型からＤＮＡを合成する酵素である。同様に、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡ鋳型からＤＮＡを合成する。転写依存的増幅反応においては、ＡＭＶ（ニワトリ骨髄芽球症ウイルス）またはＭＭＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）逆転写酵素のような逆転写酵素が使用されうる。そのような酵素はＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性の両方を有するが、固有のＲＮアーゼ活性をも有する。また、転写依存的増幅反応の反応混合物にＲＮアーゼ、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＮアーゼＨが加えられうる。
【００１０】
当技術分野の技量の範囲内である分子生物学および核酸化学の通常の技術は文献において十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，１９８４）；およびＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）のシリーズを参照されたい。核酸ハイブリド形成技術が、とりわけ、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら；米国特許第４，５６３，４１９号（Ｒａｎｋｉ）および第４，８５１，３３０号（Ｋｏｈｎｅ）ならびにＤｕｎｎら，Ｃｅｌｌ  １２，ｐｐ．２３−２６（１９７８）に記載されている。
【００１１】
核酸を使用する検出方法も公知である。核酸は、しばしば、種々の検出目的で標識される。例えば、米国特許第４，４８６，５３９号（Ｋｏｕｒｌｉｓｋｙ）、第４，４１１，９５５号（Ｗａｒｄ）、第４，８８２，２６９号（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）および第４，２１３，８９３号（Ｃａｒｒｉｃｏ）に記載されている方法は、特異的核酸配列を検出するための標識された検出プローブの製造を例示している。さらに、抽出された核酸をプローブにさらす前または後に、ビーズまたは磁気ビーズのような基体に結合した「捕捉プローブ」を使用して、標的核酸を直接的または間接的に標的捕捉手段により固定化することが可能である。標的捕捉法の具体例は、Ｒａｎｋｉら，米国特許第４，４８６，５３９号およびＳｔａｂｉｎｓｋｙ，米国特許第４，７５１，１７７号に記載されている。プローブの他の用途が例えば米国特許第５，２１０，０１５号、第５，４８７，９７２号、第５，８０４，３７５号、第５，９９４，０７６号に記載されている。
【００１２】
また、特異的核酸標的配列の均一な検出を促進する、分子ビーコンと称されるオリゴヌクレオチドプローブのクラスが記載されている（Ｐｉａｔｅｋら，（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６：３５９−３６３；ＴｙａｇｉおよびＫｒａｍｅｒ（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：３０３−３０８）。分子ビーコンは、発蛍光団および消光団（クエンチャー）を含有する核酸配列である。意図的に、分子ビーコンは、消光団の近傍に発蛍光団が配置されるステムループ構造に折り畳まれると予想される。蛍光基の励起波長に対応する光で分子ビーコンが照らされた場合には、蛍光は観察されない。なぜなら、蛍光基と消光基との間でエネルギー転移が生じて、励起に際して蛍光基から放出された光が消光基により吸収されるからである。分子ビーコンのループ領域は、関心のある標的配列に相補的なヌクレオチド配列を含有するように設計される。分子ビーコンを、該ループに相補的な配列と接触させると、該ループはこの配列にハイブリド形成する。形成される分子間二本鎖は、ステム領域において形成される分子内二本鎖より長く、したがって、より安定であるため、この過程はエネルギー的に有利である。この分子間二重らせんが形成するにつれて、ステム領域をほどくねじれ力が生じる。その結果、消光基は、もはや、蛍光基から放出された光を効率的に吸収し得ない。したがって、分子ビーコンのその標的核酸配列への結合は蛍光基からの蛍光放出における増加を伴う。分子ビーコンは、特異的標的配列との相互作用に際して分子間ハイブリド形成を受ける。分子ビーコンは、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方の特異的核酸配列の均一検出に使用されている（Ｌｅｏｎｅら，（１９９８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２６：２１５０−２１５５；Ｐｉａｔｅｋら（１９９８）；ＴｙａｇｉおよびＫｒａｍｅｒ（１９９６））。
【００１３】
いくつかの標的核酸は、容易に検出可能なレベルにまで、および／または適当な特異性で増幅することが困難であることが判明しており（例えば、とりわけ、ＨＣＶ（ＰａｖｉｏおよびＬａｉ，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．２８（３）：２８７−３０４（２００３））、したがって、増幅を改良するための方法が必要とされている。また、増幅に対する改良は、より早い結果が望まれるいずれの標的においても有用でありうる。さらに、いくつかの標的は、他の標的ならびに／または他の標的に特異的なプライマーおよびプローブを使用する多重反応の場合、増幅が困難であることが判明している。
【００１４】
増幅における幾つかの改良がなされている。米国特許第６，３３８，９５４号（ｖａｎ  Ｇｅｍｅｎ）は非特異的増幅のための方法を開示している。米国特許第６，５０９，１５７号は、ＰＣＲを開始させるために使用される温度でプライマーが脱遮断されるよう可逆的に遮断された、ＰＣＲにおいて使用される増幅プライマーを開示している。米国特許第５，８４９，４９７号は、ＰＣＲ反応における少なくとも１つの標的配列の増幅の抑制のための方法を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】国際公開第８９／０１０５０号パンフレット
【特許文献２】米国特許第５，１６９，７６６号明細書
【特許文献３】米国特許第４，７８６，６００号明細書
【特許文献４】米国特許第５，７６６，８４９号明細書
【特許文献５】米国特許第５，３９９，４９１号明細書
【特許文献６】米国特許第５，４８０，７８４号明細書
【特許文献７】米国特許第５，６５４，１４２号明細書
【特許文献８】米国特許第５，１３０，２３８号明細書
【特許文献９】米国特許第５，４０９，８１８号明細書
【特許文献１０】欧州特許第０３２９８２２号明細書
【特許文献１１】米国特許第６，３１２，９２８号明細書
【特許文献１２】国際公開第９２／０８８００号パンフレット
【特許文献１３】米国特許第５，７４４，３１１号明細書
【特許文献１４】米国特許第５，６４８，２１１号明細書
【特許文献１５】米国特許第５，４５５，１６６号明細書
【特許文献１６】米国特許第５，６３１，１４７号明細書
【特許文献１７】国際公開第０２／０７０７３５号パンフレット
【特許文献１８】国際公開第０２／０７２８８１号パンフレット
【特許文献１９】欧州特許出願公開第０４０７８１６６．８号明細書
【特許文献２０】米国特許第４，６８３，１９５号明細書
【特許文献２１】米国特許第４，６８３，２０２号明細書
【特許文献２２】米国特許第５，７９２，６０７号明細書
【特許文献２３】国際公開第９０／０１０６９号パンフレット
【特許文献２４】欧州特許公開番号４３９，１８２号明細書
【特許文献２５】米国特許第４，８７６，１８７号明細書
【特許文献２６】米国特許第５，０３０，５５７号明細書
【特許文献２７】米国特許第５，４８５，１８４号明細書
【特許文献２８】米国特許第５，５５４，５１７号明細書
【特許文献２９】米国特許第５，４３７，９９０号明細書
【特許文献３０】米国特許第５，５５４，５１６号明細書
【特許文献３１】米国特許第６，５５１，７７８号明細書
【特許文献３２】欧州特許第３２３８２２号明細書
【特許文献３３】欧州特許第０３７３９６０号明細書
【特許文献３４】欧州特許第０４０８２９５号明細書
【特許文献３５】欧州特許第０６８２１２１号明細書
【特許文献３６】米国特許第４，５６３，４１９号明細書
【特許文献３７】米国特許第４，８５１，３３０号明細書
【特許文献３８】米国特許第４，４８６，５３９号明細書
【特許文献３９】米国特許第４，４１１，９５５号明細書
【特許文献４０】米国特許第４，８８２，２６９号明細書
【特許文献４１】米国特許第４，２１３，８９３号明細書
【特許文献４２】米国特許第４，４８６，５３９号明細書
【特許文献４３】米国特許第４，７５１，１７７号明細書
【特許文献４４】米国特許第５，２１０，０１５号明細書
【特許文献４５】米国特許第５，４８７，９７２号明細書
【特許文献４６】米国特許第５，８０４，３７５号明細書
【特許文献４７】米国特許第５，９９４，０７６号明細書
【特許文献４８】米国特許第６，３３８，９５４号明細書
【特許文献４９】米国特許第６，５０９，１５７号明細書
【特許文献５０】米国特許第５，８４９，４９７号明細書
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２版，Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２
【非特許文献２】Ｇｕａｔｅｌｌｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：１８７４−１８７８（１９９０）
【非特許文献３】Ｋｗｏｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６，１９８９：１１７３−１１７７，
【非特許文献４】Ｇｕａｔｅｌｌｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７，１９９０：１８７４−１８７８
【非特許文献５】ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４，１９８９：５６０−５６９
【非特許文献６】Ｂａｒａｎｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８，１９９１：１８９−１９３
【非特許文献７】Ｂａｒａｎｙ，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃ．１，１９９１，：５−１６
【非特許文献８】ＡｂｒａｍｓｏｎおよびＭｙｅｒｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４，１９９３：４１−４７
【非特許文献９】Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ
【非特許文献１０】Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（１９８４）
【非特許文献１１】Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（１９８４）
【非特許文献１２】Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）
【非特許文献１３】Ｄｕｎｎら，Ｃｅｌｌ  １２，ｐｐ．２３−２６（１９７８）
【非特許文献１４】Ｐｉａｔｅｋら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６（１９９８）：３５９−３６３
【非特許文献１５】ＴｙａｇｉおよびＫｒａｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４（１９９６）：３０３−３０８
【非特許文献１６】ＬｅｏｎｅらＮｕｃｌｅｉｃ，Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２６（１９９８）：２１５０−２１５５
【非特許文献１７】ＰａｖｉｏおよびＬａｉ，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．２８（３）：２８７−３０４（２００３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
このように、核酸の増幅の分野においては多くの進歩が達成されているが、多重アッセイの場合のように２以上の標的に特異的な試薬が存在する場合には特に、そして更には多重アッセイにおける１つの標的の増幅が該アッセイにおけるもう１つの標的の増幅より優勢である場合には特に、収率を改善し、特定の標的に対する感度の改善を達成し、そしてひいては、より有用なアッセイを得ることが、尚も必要とされている。本発明は、多数の選択された標的核酸およびそれらの組合せに適用されうる、特定の標的の転写依存的増幅を改善するための方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
発明の概括
本発明は、２以上の標的核酸の増幅に特異的な試薬が存在する反応において、サンプル中の選択された第１標的核酸の特異的転写依存的増幅反応を行うための方法を提供し、
この方法は、
（１）該サンプルを、
（ａ）５’末端および３’末端を有する第１プロモーターオリゴヌクレオチド（第１プロモーターオリゴヌクレオチドは５’末端にＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含み、該ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列の３’側に、第１標的核酸の第１標的部分に相補的な配列を含む。）および
（ｂ）５’末端および３’末端を有する第２プロモーターオリゴヌクレオチド（第２プロモーターオリゴヌクレオチドは５’末端にＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含み、該ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列の３’側に、第２標的核酸の第１標的部分に相補的な配列を含み、ここで更に、第２プロモーターオリゴヌクレオチドは３’末端に遮断部分を含んでいて、それからの伸長が実質的に阻止される。）
と接触させること、ならびに
（２）選択された試薬および条件を転写依存的増幅に供すること
を含んでなる。
【００１９】
本発明は更に、２以上の標的核酸がサンプル中に存在する場合にそれらを増幅する反応において、サンプル中の選択された第１標的核酸の特異的転写依存的増幅反応を行うための方法を提供し、
この方法は、
（１）該サンプルを、
（ａ）５’末端および３’末端を有する第１プロモーターオリゴヌクレオチド（第１プロモーターオリゴヌクレオチドは５’末端にＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含み、該ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列の３’側に、第１標的核酸の第１標的部分に相補的な配列を含む。）および
（ｂ）５’末端および３’末端を有する第２プロモーターオリゴヌクレオチド（第２プロモーターオリゴヌクレオチドは５’末端にＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含み、該ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列の３’側に、第２標的核酸の第１標的部分に相補的な配列を含み、ここで更に、第２オリゴヌクレオチドは３’末端に遮断部分を含んでいて、それからの伸長が実質的に阻止される。）
と接触させること、ならびに
（２）選択された試薬および条件を転写依存的増幅に供することを
含んでなる。
【００２０】
本発明はまた、５’末端および３’末端を有する第１プロモーターオリゴヌクレオチド（第１プロモーターオリゴヌクレオチドは５’末端にＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含み、該ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列の３’側に、第１標的核酸の第１標的部分に相補的な配列を含む。）と、５’末端および３’末端を有する第２プロモーターオリゴヌクレオチド（第２プロモーターオリゴヌクレオチドは５’末端にＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含み、該ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列の３’側に、第２標的核酸の第１標的部分に相補的な配列を含み、ここで更に、第２プロモーターオリゴヌクレオチドは３’末端に遮断部分を含んでいて、それからの伸長が実質的に阻止される。）とを含んでなる、２以上の標的核酸に対する多重ハイブリド形成および該標的核酸の増幅を行うための組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、遮断されたＰ１プライマーを使用するＮＡＳＢＡの提示メカニズムを示す。
【図２】図２は、３’−Ｄａｂｓｙｌ  ＣＰＧ、変異体３’−Ｄａｂｓｙｌ  ＰＳ（ポリスチレン（ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｅｎ））および３’−Ｄａｂｃｙｌ  ＣＰＧの化学構造を示す。
【図３】図３は、多重エンテロＨＳＶ  ＮＡＳＢＡ増幅を示す。増幅において投入量２００ｃｐｓのエンテロＩＣ  ＲＮＡまたは１００ｃｐｓのＨＳＶ  ＤＮＡを使用した。未遮断ＨＳＶ  ｐ１または３’ＤａｂＳｙｌ遮断ＨＳＶ  ｐ１（ＨＳＶ参照ｐ１、表１）と組合された標準的なエンテロプライマーおよびビーコン（エンテロ参照ｐ１＆ｐ２、エンテロＩＣビーコン、表１）、標準的なＨＳＶ  ｐ２（ＨＳＶ参照ｐ２、表１）、ＨＳＶビーコン（ＨＳＶ  ＷＴ  ＭＢ）の存在下で増幅を行った。
【図４】図４は、ＨＩＶプライマーの存在下のエンテロＮＡＳＢＡ増幅を示す。エンテロＷＴ転写産物５０００、５００、５０および５ｃｐｓの系列希釈を投入に使用した。鋳型を含有しないサンプル（ＮＴ）を陰性対照として使用した。参照反応においては、エンテロプライマーおよびビーコンのみが存在する。その他の反応においては、共に標準的ＨＩＶ参照ｐ２プライマーと組合された３’ＤａｂＳｙｌ遮断または未遮断ＨＩＶ参照ｐ１プライマーを加えた。
【図５】図５は、エンテロ非遮断プライマーの存在下のＨＩＶ  ＮＡＳＢＡ増幅を示す。投入量５０  ＩＵのＨＩＶ−１亜型ＢのＷＲＳ（５サンプル）を投入に使用した。鋳型を含有しないサンプル（ＮＴ）を陰性対照として使用した。両方の該エンテロプライマー、３’ＤａｂＳｙｌ遮断ＨＩＶ参照ｐ１プライマー、ＨＩＶ参照ｐ２プライマーおよびＨＩＶ特異的分子ビーコン（ＨＩＶ  ＷＴ  ＭＢ、表１）の存在下、該増幅を行った。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
発明の詳細な説明
一般に、本発明は、増幅反応の性能を増強するための方法、より詳しくは、転写依存的増幅アッセイ、例えばＮＡＳＢＡ、ＴＭＡおよび３ＳＲにおいて、１以上がその３’末端において遮断されている（すなわち、遮断部分を付加することにより遮断されている。）、選択された標的に特異的なプライマーを増幅反応において使用することにより、増幅反応の性能を向上させるための方法に関する。該遮断プライマーは伸長不可能であり、標的に特異的である（すなわち、それは非特異的オリゴｄＴプライマーとの使用のためのものではない。）。また、この増幅反応においては、高い増幅レベルを得るために、第２の、典型的には遮断されていない逆鎖標的特異的プライマー（しばしば、「Ｐ２」と称される。）が使用される。該遮断プライマーはＰ１（すなわち、Ｔ７  Ｐｏｌ部位含有）プライマーである。転写依存的増幅反応における遮断プライマーはＰ１の逆転写酵素媒介伸長を遮断し、おそらく、これらの反応の代替的開始をもたらすであろう。
【００２３】
転写依存的増幅技術は、ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーターを含む鋳型からの複数のＲＮＡコピーの転写を含む。また、転写依存的増幅技術は、典型的には、開始鋳型を得るために、選択された制限エンドヌクレアーゼを使用して、投入核酸としてのＤＮＡで機能するよう適合化されている（例えば、実施例３を参照されたい。）。等温転写依存的増幅が実施可能であり、あるいは熱安定酵素（および該プロモーター−プライマーにおいて使用される対応熱安定ポリメラーゼプロモーター配列）を使用して転写依存的増幅反応が行われうる。標準的な等温転写依存的増幅は、通常、約４１℃の温度で行われ、一方、熱安定酵素は、より高い温度（例えば、５０〜７０℃）での該反応の実施を可能にする（例えば、ＥＰ０６８２１２１，Ｔｏｙｏ  Ｂｏｓｅｋｉ  ＫＫ）。
【００２４】
等温連続法においては、増幅を達成するために、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮアーゼ（Ｈ）活性およびＲＮＡポリメラーゼ活性の４つの酵素活性が要求される。好ましい実施形態においては、これらの活性の幾つかは１つの酵素に兼ね備わっているため、２つ又は３つの酵素のみが必要とされる。転写依存的増幅反応においては、ＡＭＶ（ニワトリ骨髄芽球症ウイルス）またはＭＭＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）逆転写酵素のような逆転写酵素が使用されうる。そのような酵素はＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性の両方を有するが、固有のＲＮアーゼ活性をも有する。また、転写依存的増幅反応の反応混合物にＲＮアーゼ、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＮアーゼＨが加えられうる。
【００２５】
ＤＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼは、該ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーターを含むＤＮＡ鋳型から複数のＲＮＡコピーを合成する。ＲＮＡポリメラーゼの具体例としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ならびにバクテリオファージＴ７、Ｔ３およびＳＰ６からのポリメラーゼが挙げられる。転写依存的増幅法で一般に使用されるＲＮＡポリメラーゼの一例として、Ｔ７ポリメラーゼが挙げられる。したがって、本発明の好ましい実施形態においては、ＲＮＡの複数のコピーを転写するために使用される鋳型内に組込まれたプロモーターはＴ７プロモーターであろう。本発明の増幅反応は、該サンプル、同時に前記活性を与える適当な酵素、それぞれが第１標的に特異的であるＰ１プロモーター（場合によっては、その３’末端において遮断されているもの）および対応するＰ２プライマー、ならびにそれぞれが第２標的に特異的である（典型的には）３’遮断Ｐ１プライマーおよび対応するＰ２プライマーを、標準的なバッファーと共に、酵素が熱安定性であるかどうかに応じたＮＡＳＢＡ（または他の選択された増幅反応）のための適当な温度で一緒にすることにより開始されうる。
【００２６】
転写依存的増幅方法は、投入物質が一本鎖ＲＮＡである場合に特に有用であるが、一本鎖または二本鎖ＤＮＡも投入物質として同様に使用されうる。まず最初に、多重増幅において生じうるいずれかの単一の増幅に焦点を絞ると、増幅すべき標的配列（そのような標的配列は３’末端（「第１標的部分」）および５’末端（「第２標的部分」）を有する。）を含む一本鎖ＲＮＡ（「プラス」鎖の一本鎖ＲＮＡ）を含有するサンプルに対して転写依存的増幅方法を行う場合、簡便に使用されるオリゴヌクレオチドのペアは、標的核酸の第１標的部分に（本明細書において定義されているとおりに）相補的な配列を組込むことにより、標的配列の３’末端に（ハイブリド形成の所望の特異性を達成するための適度にストリンジェントな条件で）ハイブリド形成しうる第１オリゴヌクレオチド（本明細書においては典型的には「Ｐ１プライマー」と称される。）（Ｐ１プライマーオリゴヌクレオチドのハイブリド形成部分は、投入物質として使用されるプラスＲＮＡとは逆の極性を有する。）を含み又は実質的にそれらよりなり、該オリゴヌクレオチドは更に、その５’末端に結合したポリメラーゼプロモーター（該増幅においてＴ７ポリメラーゼを使用する場合には、好ましくは、これはＴ７ポリメラーゼプロモーターである。）の配列、および、場合によっては、その３’末端に結合した遮断部分を有する。一本鎖オリゴヌクレオチドを説明する場合の「ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列」または「ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの配列を有する。」は、二本鎖になった場合にＲＮＡポリメラーゼプロモーターとして機能しうる配列を意味する。試薬は、標的配列の５’末端の部分（「第２標的部分」）を含む又は実質的にそれよりなる第２オリゴヌクレオチド（「Ｐ２プライマー」）をも含みうる（Ｐ２プライマーオリゴヌクレオチドは、プラスＲＮＡと同じ極性を有する。）。第２（Ｐ２）オリゴヌクレオチドは、ハイブリド形成の所望の特異性を達成するための適度にストリンジェントな条件で、それに完全に相補的な核酸へのハイブリド形成を達成するのに十分な、第２標的部分に対する相同性を有する配列を含む又は実質的にそれよりなる。各プライマーは、遮断されていない場合には標準的な条件下でプライマーの伸長を支持しうる。
【００２７】
多重増幅においては、第２（またはそれ以上）の標的核酸の増幅のための試薬も存在し、Ｐ１プライマーの１以上はその３’末端において遮断されている。そのような試薬は、５’末端および３’末端を有する第２プロモーターオリゴヌクレオチド（第２Ｐ１プライマー）を含むことが可能であり、第２プロモーターオリゴヌクレオチドは５’末端にＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列（好ましくは、第１プロモーターオリゴヌクレオチドのプロモーターと同じポリメラーゼで機能的なもの）を含み、該ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列の３’側に、第２標的核酸の第１標的部分に相補的な配列を含み、ここで更に、第２プロモーターオリゴヌクレオチドは、場合によっては、３’末端に遮断部分を含んでいて、それからの伸長が実質的に阻止される。これらの試薬は、第２標的核酸の第２標的部分に相同な配列を含む第２プライマーオリゴヌクレオチド（第２  Ｐ２プライマー）をも含むことが可能であり、この第２標的部分は第２標的核酸の第１標的部分の５’側にある。
【００２８】
選択された増幅方法のための適当な活性を有する全ての酵素、ならびに必要なリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの十分な供給と共に、増幅オリゴヌクレオチドのセットの２以上（典型的には、それぞれの選択された標的核酸に対する１つのＰ１プライマーおよび１つのＰ２プライマー；Ｐ１プライマーの少なくとも１つ、あるいは２、３またはそれ以上（おそらくは該反応における全てのＰ１プライマー、または該反応に存在する核酸当たり少なくとも１つのＰ１プライマー）がその３’末端において遮断されうる。）を１つの反応混合物中で一緒し、適当な増幅条件（例えば、すべて当技術分野で公知である適当なバッファー条件および適当な温度）下、十分な時間にわたって維持すると、等温連続的増幅反応が開始する。該反応容器中に全ての試薬が存在するため、この方法の全ての工程は同時に生じうる。
【００２９】
本発明は更に、転写依存的増幅反応の特異性を増加させるための手段を提供する。特に、本発明の１以上の遮断プライマー「Ｐ１」の使用が、本明細書中に記載され例示されている多重増幅における１以上の個々のＮＡＳＢＡ増幅の特異性を増加させるための一般的手段として用いられうる。したがって、ある多重反応においては、「標的」核酸は、その増幅が３’遮断プライマーの使用により修飾（軽減）されて、しばしば、もう１つの「標的」核酸の増幅の改善または増強を可能にするような核酸でありうることに注目されるべきである。
【００３０】
したがって、本発明は、２以上の標的核酸の増幅に特異的な試薬が存在する反応において、サンプル中の選択された第１標的核酸の特異的転写依存的増幅反応を行うための方法を提供し、この方法は（１）該サンプルを、（ａ）５’末端および３’末端を有する第１プロモーターオリゴヌクレオチド（第１プロモーターオリゴヌクレオチドは５’末端にＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含み、該ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列の３’側に、第１標的核酸の第１標的部分に相補的な配列を含む。）および（ｂ）５’末端および３’末端を有する第２プロモーターオリゴヌクレオチド（第２プロモーターオリゴヌクレオチドは５’末端にＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含み、該ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列の３’側に、第２標的核酸の第１標的部分に相補的な配列を含み、ここで更に、第２プロモーターオリゴヌクレオチドは３’末端に遮断部分を含んでいて、それからの伸長が実質的に阻止される。）と接触させること、ならびに（２）選択された試薬および条件を転写依存的増幅に供することを含んでなる。第１プロモーターオリゴヌクレオチドまたは第２プロモーターオリゴヌクレオチドのいずれか一方または両方は、３’末端において、遮断部分により遮断されうる。選択された試薬は、第１標的核酸の第２標的部分（該第２標的部分は第１標的核酸の第１標的部分の５’側に存在する。）に相同な配列を含む第１プライマーオリゴヌクレオチドと、第２標的核酸の第２標的部分（該第２標的部分は第２標的核酸の第１標的部分の５’側に存在する。）に相同な配列を含む第２プライマーオリゴヌクレオチドとを含みうる。該サンプルを更に、第１標的核酸の第３標的部分（該第３標的部分は第１標的部分と第２標的部分との間に位置する。）に相同な、検出可能な様態で標識された第１プローブオリゴヌクレオチド、および、所望により、第２標的核酸の第３標的部分（該第３標的部分は第１標的部分と第２標的部分との間に位置する。）に相同な、検出可能な様態で標識された第２プローブオリゴヌクレオチドと接触させることが可能である。
【００３１】
本方法は、単一の多重反応における複数の標的、例えば、２、３、４、５、６またはそれ以上の標的に有用である。したがって、該方法は更に、該サンプルを、５’末端および３’末端を有する第３（第４、第５、第６など）プロモーターオリゴヌクレオチド（第３プロモーターオリゴヌクレオチドは５’末端にＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含み、該ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列の３’側に、第３標的核酸の第１標的部分に相補的な配列を含む。）と接触させることを含みうる。したがって、第３（第４、第５、第６など）Ｐ２プライマーも含まれうる。
【００３２】
標的核酸は、既知配列の、特異的な選択された核酸であり、Ｐ１プライマー（「プロモーターオリゴヌクレオチド」）およびＰ２プライマー（「プライマーオリゴヌクレオチド」）はそれに特異的にハイブリド形成するよう、すなわち、反応の目的に応じた所望の特異性を達成するのに十分な程度にストリンジェントなハイブリド形成条件下（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋらを参照されたい。）でハイブリド形成するよう設計される。いくつかの用途においては、例えば、生物の株の１つを別の株から識別するためには、該プライマーの配列および増幅反応は、Ｐ１プライマーおよび／またはＰ２プライマーが厳密な相補体のみに結合するよう設計されうる。他の用途においては、例えば、サンプル中に存在する生物のいずれかの株の検出を確実にするために、プライマーセットおよび増幅反応は、標的生物の多数または全ての核酸にハイブリド形成しそれを増幅するよう設計されうる。したがって、反応における標的核酸は、それぞれ、同一生物の、異なる株の核酸でありうる。あるいは、標的核酸は、異なる生物の核酸でありうる。
【００３３】
選択される特異性には無関係に、本方法は、この場合にも増幅の設計および目的に応じて、標的核酸の１以上の増幅を増強するために用いられうる。また、標的核酸はｍＲＮＡのポリＡ領域ではないと認識される。なぜなら、ポリＡ領域に結合するよう設計されたプライマーは実質的に任意のポリＡ  ＲＮＡに結合し、標的ＲＮＡに特異的および／または選択的には結合しないからである。
【００３４】
本発明は更に組成物を提供し、この組成物は、２以上の標的核酸への多重ハイブリド形成および該核酸の増幅を行うための、５’末端および３’末端をそれぞれが有する２以上のプロモーターオリゴヌクレオチド（少なくとも第１および第２プロモーターオリゴヌクレオチド）を含んでなり、第１プロモーターオリゴヌクレオチドは５’末端にＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含み、該ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列の３’側に、第１標的核酸の第１標的部分に相補的な配列を含み、第２プロモーターオリゴヌクレオチドは５’末端にＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含み、該ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列の３’側に、第２標的核酸の第１標的部分に相補的な配列を含み、ここで更に、第２プロモーターオリゴヌクレオチドは３’末端に遮断部分を含んでいて、それからの伸長が実質的に阻止される。
【００３５】
本発明は更に組成物を提供し、この組成物は、２以上の標的核酸への多重ハイブリド形成および該核酸の増幅を行うための、２以上のプロモーターオリゴヌクレオチドを含んでなり、第１プロモーターオリゴヌクレオチドは、（１）第１標的核酸の第１標的部分に相補的なヌクレオチド配列を含み５’末端および３’末端を有するハイブリド形成領域、（２）二本鎖になるとＲＮＡポリメラーゼプロモーターとして機能しうる配列を含む、該ハイブリド形成領域の５’側のプロモーター領域、ならびに（３）該ハイブリド形成領域の３’末端に結合した遮断部分を含み、第２プロモーターオリゴヌクレオチドは、（１）第２標的核酸の第１標的部分に相同なヌクレオチド配列を含み５’末端および３’末端を有するハイブリド形成領域、（２）二本鎖になるとＲＮＡポリメラーゼプロモーターとして機能しうる配列を含む、該ハイブリド形成領域の５’側のプロモーター領域、ならびに（３）該ハイブリド形成領域の３’末端に結合した遮断部分を含む。該組成物は、２以上のプロモーターオリゴヌクレオチドを含むことが可能であり、ここで、第１プロモーターオリゴヌクレオチドは、（１）第１標的核酸の第１標的部分に相補的なヌクレオチド配列を含み５’末端および３’末端を有するハイブリド形成領域、（２）二本鎖になるとＲＮＡポリメラーゼプロモーターとして機能しうる配列を含む、該ハイブリド形成領域の５’側のプロモーター領域、ならびに（３）該ハイブリド形成領域の３’末端に結合した遮断部分から実質的になる又はこれらからなることが可能であり、第２プロモーターオリゴヌクレオチドは、（１）第２標的核酸の第１標的部分に相同なヌクレオチド配列を含み５’末端および３’末端を有するハイブリド形成領域、（２）二本鎖になるとＲＮＡポリメラーゼプロモーターとして機能しうる配列を含む、該ハイブリド形成領域の５’側のプロモーター領域、ならびに（３）該ハイブリド形成領域の３’末端に結合した遮断部分から実質的になる又はこれらからなることが可能である。
【００３６】
本発明において有用な遮断部分は、オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端に結合した場合に該プライマーの伸長を実質的に遮断しうる任意の遮断部分であり、ここで、該プライマーは、適当な酵素（例えば、逆転写酵素）による転写依存的増幅反応において標的にハイブリド形成し、尚も、該プライマーの非遮断体を使用する同じＮＡＳＢＡ反応と比べて改善された、ＮＡＳＢＡ反応におけるＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡコピーの産生を可能にする。該遮断部分は、転写依存的増幅反応のＰ１（プロモーター含有）プライマーに結合している場合に特に有用である。この遮断部分は、好ましくは、ｄａｂｓｙｌ（図２を参照されたい）でありうる。また、ｄａｂｃｙｌ（−ＳＯ２−の代わりに−ＣＯ−の置換を伴う、ｄａｂｓｙｌと同じ基本化学構造）が遮断部分として使用されうる。Ｄａｂｓｙｌは、炭素が硫黄へと置き換わった置換を有するが、結合化学はｄａｂｓｙｌおよびｄａｂｃｙｌの両方に関して同じである（実施例を参照されたい）。ｄａｂｓｙｌおよびｄａｂｃｙｌはそれぞれ、遮断されていないプライマーからの、遮断されたプライマーの効率的な精製をもたらす。また、該遮断部分はアミノ基，−ＮＨ２−でありうる。該遮断部分はホスファート，−ＰＯ４でありうる。ｄａｂｓｙｌ化３’制御孔ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）（ＣＰＧ）支持体（３’Ｄａｂｓｙｌ  ＣＰＧ：１−ジメトキシトリチルオキシ−３−［Ｏ−（Ｎ−４’−スルホニル−４−（ジメチルアミノ）−アゾベンゼン）−３−アミノプロピル］−プロピル−２−Ｏ−スクシノイル−長鎖アルキルアミノ−ＣＰＧ）を使用する自動ＤＮＡ合成中、Ｄａｂｓｙｌ遮断部分はオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端に結合されうる。同様に、オリゴヌクレオチド合成の第１工程中に、ｄａｂｃｙｌおよびアミノ基が付加されうる。遮断部分として使用されうる部分の結合方法は当業者に公知である。該結合は、該プライマーの３’末端における遊離ヒドロキシルを遮断部分で置換することにより、容易に達成されうる。該遮断部分はまた、（標的に対して）非相補的なオリゴヌクレオチドでありうるが、用途によっては、これは、好ましい遮断部分ではないかもしれない。好ましい実施形態においては、該遮断部分の一方または両方（または、３以上の場合には全て）は、いずれかの選択されたＮＡＳＢＡ増幅反応温度において、第２プロモーターオリゴヌクレオチドの３’末端に存在したままである。言い換えると、それは、該転写依存的増幅の全体にわたって、該プライマー上に存在したままである。選択されるいずれの標的およびプライマーセットに関しても、好ましい遮断部分は、本明細書中の教示を用いて当業者により容易に決定されうる。
【００３７】
オリゴヌクレオチドからの伸長を「実質的」に阻止または遮断する遮断部分は、測定可能な様態で多重反応の増幅が改善されるよう、適当な酵素によるオリゴヌクレオチドの十分な伸長が抑制されることを意味する。好ましい実施形態においては、該抑制は完全であると思われるが、そのような場合、実際には僅か又は幾つかの伸長が生じている可能性があるとも認識される。さらに、本発明においては、少数または幾つかの分子の伸長は多重反応に有益でありうると想定され、該伸長は尚も「実質的」に阻止されているとみなされる。
【００３８】
本明細書中の教示に基づいて、当業者は、いずれかの与えられた多重反応に関して、結合した遮断部分を有する反応プライマーのいずれか又は全ての所望の比率を最適化することが可能である。一般に、増幅反応において使用されるいずれかの与えられたプライマーのバッチは、結合した部分を有する高比率のプライマーを有することが好ましい（本出願における幾つかの場合には、文脈により明らかなとおり、これは高純度と称される）。好ましくは、増幅反応において使用される個々の遮断プライマーの少なくとも８５％、より好ましくは、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％が、結合した部分を有する。一般に、合成の第１工程として、結合した遮断部分を有する合成プライマーのいずれかのバッチは、結合した部分を有するプライマーを高比率で有するべきである。所望により、ＨＰＬＣおよび／またはＰＡＧＥのような追加的な精製工程が行われうる。当業者により選択されたとおりに、結合した遮断部分を有するプライマーの比率を様々なものにするために、ＰＡＧＥおよび／またはＨＰＬＣによる精製が利用されうる。さらに、個々の標的、プライマーおよび反応に関する最適化ならびに／または望みに応じて、遮断されたプライマーがその他のものより高い純度を有するよう、すなわち、より高い比率を有するよう、多重反応における１つのプライマーを選択することが可能である。望まれるいずれかの個々の増幅結果に関する最適化に基づいて、遮断プライマー：非遮断プライマーの、望ましい比が選択されうる（例えば、８５：１５、９０：１０、９５：５、９９：１）。
【００３９】
特許請求の範囲およびその裏付け部分において用いられている単数表現は、文脈に矛盾しない限り、単数または複数を意味しうる。
【００４０】
出発物質は、任意の所望の起源、例えば、ヒトまたは他の哺乳動物からのサンプル（例えば、組織、細胞、血液、血漿、ＣＳＦ、喀痰、スワブなど）、環境サンプル、生産または製造ラインからの製品サンプルなどに由来しうる。例えば、出発物質には、全血、血清、バフィーコート、尿、糞便、脳脊髄液、精液、唾液組織、細胞培養、食品、ワクチン、ウイルスまたは細菌に感染した乳、植物物質、グラム陽性細菌、酵母、カビ、体液、およびウイルスまたは細菌に感染した可能性のある生物学的物質が含まれうる。増幅において使用するそのようなサンプルからの核酸の単離は当技術分野でよく知られている。
【００４１】
標的へのハイブリド形成のための配列に加えて、（二本鎖になった場合に）ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーター配列を有するオリゴヌクレオチドは、典型的には、本明細書において「Ｐ１プライマー」と称される。特に有用な、しばしば使用されるＲＮＡポリメラーゼはＴ７ポリメラーゼおよびＴ７ポリメラーゼプロモーター領域である。Ｔ７プロモーター配列を含むオリゴヌクレオチドはプライマーとして有用である可能性があり、そのようなものとして使用される場合、本明細書においては、「Ｐ１プライマー」、「Ｐ１型プライマー」、「プロモーター−オリゴヌクレオチド」または単に「Ｐ１」と称されうる。当技術分野で公知のとおり、転写依存的増幅反応（例えば、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡ）においては、これらのＴ７プロモーター配列は、該増幅反応の先行段階により二本鎖にされると、該増幅反応において、標的鋳型からＲＮＡの転写を始動するという機能を有する。本明細書において「Ｐ１」型のプライマーとして例示されているプライマーのヌクレオチド配列は、典型的には、Ｔ７プロモーター配列を伴わないで列挙されるが、該実験においては、そのようなＴ７プロモーター配列が存在する。使用されるＴ７プロモーター配列は以下のものを含むが、これらに限定されるものではない：ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ（配列番号１）およびＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ（配列番号２）。Ｔ７ポリメラーゼプロモーターの核酸配列は当業者によく知られており、本明細書中には特定の配列が例示されているが、僅かな変更を有する機能的等価体が設計されうる。本明細書に記載されているとおり、これらの配列は、標的特異的配列の領域の５’に存在するＰ１プライマーの領域において使用される。プライマーは、標準的なオリゴヌクレオチド合成技術により、これらの配列を含むよう容易に合成される。さらに、（ＲＮＡポリメラーゼ）プロモーター配列と関心標的に相補的な配列との間に余分なヌクレオチド伸長を有する、プロモーターオリゴヌクレオチドとも称されるＰ１プライマーを提示することも本発明の範囲内である。この余分なヌクレオチド伸長は、好ましくは、１〜５ヌクレオチド長により構成され、該ヌクレオチドはプロモーター配列の一部ではなく、また、該標的に相補的でもない。特に興味深い実現方法においては、該伸長は２〜３ヌクレオチド長である。特に興味深い実現方法においては常に、該伸長は、主として、プリンヌクレオチド（ＡおよびＧ）により構成される。
【００４２】
本明細書および特許請求の範囲において、それらにおいて用いられている「５’末端および３’末端を有するプロモーターオリゴヌクレオチド（第１プロモーターオリゴヌクレオチドは５’末端にＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含み、該ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列の３’側に、標的核酸の標的部分に相補的な配列を含む。）」は、前記のとおりの余分のヌクレオチド伸長が該プロモーター配列と関心標的に相補的な配列との間に存在しうることを意味する。
【００４３】
ハイブリド形成は、典型的には、ストリンジェントなハイブリド形成条件下で行われる。ストリンジェントなハイブリド形成条件はＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，Ｄｅｃ．１９８９に記載されている。しかし、ハイブリド形成条件は、選択されたプライマーのＴｍおよび増幅反応を行う温度を含む個々の反応設計に適合するよう修飾され選択されうる。当業者は、選択されたタイプの増幅のための並びに標的およびプライマーの選択された組合せのための適当な反応条件を適切に設計することが可能である。
【００４４】
「相補的」は、文脈に応じて、標的核酸に厳密に相補的であること、または増幅反応のための選択されたハイブリド形成条件下で標的核酸に対する特異的ハイブリド形成を可能にするのに十分な程度に相補的であることを意味しうる。同様に、標的核酸に「相同」な配列は、それが、該標的核酸に厳密に相補的な核酸に特異的にハイブリド形成するよう、該配列が該核酸と厳密に又はほぼ厳密に同一であることを意味しうる。本明細書中で用いるストリンジェントなハイブリド形成条件は、選択された標的に対して選択的ハイブリド形成をもたらす条件である。本明細書中で用いる「選択的ハイブリド形成」は、該反応中に存在しうるが関心の無い核酸への有意なハイブリド形成を伴うことなく、十分なストリンジェンシーの条件下、核酸が標的核酸にハイブリド形成しうることを意味する。条件は、例えば同一生物の関連株の場合のように、例えば１、２または３個のミスマッチを有する例えば１以上の関連核酸の検出を可能にするよう選択されうる。あるいは、ハイブリド形成、増幅および検出の目的に応じて、それらは、１つの選択された標的だけに対してハイブリド形成が生じるよう、例えば、それが２つの株間を識別するよう選択されうる。そのような条件の選択は当業者に公知である。
【００４５】
該標的は、行う増幅反応に応じて、いずれかの選択された核酸でありうる。選択された特異的標的領域は、当業者に公知の原理を適用することにより最適化されうる。標的配列が選択されたら、Ｐ１プライマーの５’末端において使用するＴ７プロモーター配列を含めることにより、Ｐ１プライマーが設計されることが可能であり、該Ｔ７プロモーター配列は、標的に特異的な選択された配列の５’末端に直接的または間接的（後者の場合、Ｔ７プロモーターとハイブリド形成配列との間にプリン伸長が存在しうる。）に連結される。遮断部分はＰ１プライマーの３’末端に結合される。標的に特異的な配列は、標的配列に相補的となるよう、特に、選択されたハイブリド形成条件において標的核酸への該プライマーのハイブリド形成を可能にするのに十分な程度に相補的となるよう選択される。本明細書中に教示されている方法を用いることにより、Ｐ１プライマーの標的特異的部分の結合に関する特異性が適合化されうる。好ましい標的は、本明細書に開示されている３’遮断Ｐ１プライマーの使用により転写依存的増幅が改善される標的である。特に、本発明方法が有用である標的は、２以上の標的の増幅のための試薬の場合に、優先的には増幅されない標的である。該方法は、いずれかの多重増幅により達成される全標的の全体的な増幅を改善するためにも用いられうる。
【００４６】
標的核酸は、例えば、メチシリン耐性スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ）の複数の株でありうる。メチシリン耐性スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の複数の株を増幅するそのような方法の場合、またはメチシリン耐性スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の複数の株を増幅するための試薬を含むキットの場合、第１標的核酸は、メチシリン耐性スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の第１株に存在する、その第１株に特異的なものであることが可能であり、第２標的核酸は、メチシリン耐性スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の第２株に存在する、その第２株に特異的なものであることが可能である。所望により、第３、第４などの株が同様に含まれうる。第１および／または第２プロモーターオリゴヌクレオチド（Ｐ１プライマー）はその３’末端において遮断されうる。当業者は、与えられた反応において検出されるよう選択された特異的株、プロモーターオリゴヌクレオチド上の遮断部分の最適な使用（すなわち、どれを遮断し、どれを遮断しないか）に関して、本明細書の教示を考慮して最適化することが可能である。
【００４７】
さらに、いずれかの選択されたオリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブにおけるヌクレオチドは、化学基の付加、または類似基による個々の残基の置換（例えば、２’−Ｏ−メトキシ体）により修飾されうる。追加的なそのような修飾ヌクレオチドは当技術分野で公知であり、いくつかの例には、ヒドロキシメチルヌクレオチド、メチル化ヌクレオチド、フッ素化ヌクレオチド、アルファチオホスファートヌクレオチド、アミン修飾ヌクレオチド、メトキシヌクレオチド、カルボキシメチルヌクレオチド、チオヌクレオチド、イノシンジヒドロウリジン、プソイドウリジン、ワイブトシン、キューオシン、Ｃ７ｄＧＴＰが含まれる。追加的な修飾ヌクレオチドは米国特許第５，４０５，９５０号および第５，６３３，３６４号（共にＭｏｃｋおよびＬｏｖｅｒｎ）に記載されている。特に有用な修飾は、核酸ハイブリッドの融解温度を増加させるものである。
【００４８】
実施例
プライマーの合成
Ｐ１および／またはＰ２プライマーまたはプローブとして使用するオリゴヌクレオチドを、当技術分野で公知の標準的な自動ＤＮＡ合成法により合成した。プライマーをＰＡＧＥおよびＨＰＬＣにより精製した。ｄａｂｃｙｌ−、ｄａｂｓｙｌ−およびアミノ−遮断プライマーの製造手段を考慮すると、実施例において使用する実質的に全てのプライマーは、結合した遮断部分を有するはずである。すべてのＰ１プライマーに関して、該プライマーのＴ７ポリメラーゼプロモーター（５’）領域として以下の配列を使用した：ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ（配列番号１）；ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ（配列番号２）。Ｄａｂｃｙｌを使用した場合、それは、ｄａｂｃｙｌ化３’制御孔ガラス（ＣＰＧ）支持体を使用する自動ＤＮＡ合成中、該オリゴヌクレオチドの３’末端に結合された。Ｄａｂｓｙｌも同様に結合される。アミノを使用した場合、それは、ｄａｂｃｙｌ遮断プライマー合成と同様に、プライマー合成の第１工程中に結合された。ついでプライマーをＰＡＧＥおよび／またはＨＰＬＣにより精製した。
【００４９】
増幅
サンプル中の選択された標的の存在または非存在を決定するために、実施例に記載されているいずれかの特定の修飾を伴う標準的なＮＡＳＢＡアッセイを行った。
【実施例１】
【００５０】
３’遮断プライマーを使用するＨＳＶ−エンテロウイルス多重ＮＡＳＢＡ
遮断ｐ１プライマーの効果を試験するために、ＨＳＶおよびエンテロウイルスの多重ＮＡＳＢＡを行った。標準的なＮＡＳＢＡ試薬（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ８．５、１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、９０ｍＭ  ＫＣｌ、１５％ｖ／ｖ  ＤＭＳＯ、５ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭの各ｄＮＴＰ、２ｍＭ  ＡＴＰ、２ｍＭ  ＣＴＰ、２ｍＭ  ＵＴＰ、１．５ｍＭ  ＧＴＰ、０．５ｍＭ  ＩＴＰ、０．２μＭの各プライマー（フォワードプライマー（Ｐｌ）およびリバースプライマー（Ｐ２），表１）、０．１μＭ  分子ビーコンプローブ（表１）および１単位のＳａｌ１制限酵素）を使用して、増幅を行った。該混合物を４１℃で１５分間温置して、ＨＳＶ標的の制限酵素消化を行い、９５℃で５分間、該標的を変性させ、Ｓａｌ１酵素を不活性化し、４１℃で３分間、Ｐ１プライマーを該標的にハイブリド形成させた。ついでＮＡＳＢＡ酵素（０．８８Ｍ  ソルビトール（最終濃度）の存在下の、０．０８単位のＲＮアーゼＨ、３２単位のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ、６．４単位のＡＭＶ逆転写酵素、２．１μｇのＢＳＡ）を加え、該反応混合物を、穏やかな渦巻撹拌および短時間の遠心分離により混合し、増幅およびリアルタイム検出を開始した。ＮｕｃｌｉＳｅｎｓ  ＥａｓｙＱ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＮｕｃｌｉＳｅｎｓ，ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）において、３０秒ごとの蛍光モニターを行いながら該反応混合物を４１℃で１５０分間温置した。該反応を４８５ｎｍ（ＦＡＭ）および５７８ｎｍ（ＲＯＸ）で励起させ、発光シグナルを５１８ｎｍ（ＦＡＭ）および６０４ｎｍ（ＲＯＸ）で測定した。
【００５１】
投入量２００ｃｐｓのインビトロ転写エンテロウイルス内部対照（ＩＣ）ＲＮＡまたは１００ｃｐｓのＨＳＶ  ＤＮＡ（ＨＳＶ配列の一部を含有するプラスミド）を増幅において使用した。エンテロ参照ｐ１（エンテロ参照ｐ１、表１）および参照ｐ２（エンテロ参照ｐ２、表２）を、エンテロＩＣ特異的ビーコン（エンテロＩＣビーコン、表１）と組合せて使用した。標準的なＨＳＶ  ｐ２（ＨＳＶ参照ｐ２、表１）およびＨＳＶビーコン（ＨＳＶ１  ＷＴビーコン）を、非遮断（ＨＳＶ参照ｐ１、表１）または３’ＤａｂＳｙｌ遮断ＨＳＶ  ｐ１（ＨＳＶ参照ｐ１遮断、表１）と組合せて、該エンテロプライマーに加えた。
【００５２】
結果を図３に示す。非遮断ＨＳＶ参照ｐ１の添加はエンテロ増幅を全く引き起こさないが、３’遮断ＨＳＶ参照ｐ１の添加は良好なエンテロ増幅を引き起こす。ＨＳＶ増幅は該エンテロプライマーの存在によっては抑制されない。このことは、遮断ｐ１プライマーの使用が多重ＮＡＳＢＡを改善しうることを示している。
【００５３】
【表１】
2010508832.tif 000003
【実施例２】
【００５４】
エンテロウイルス−ＨＩＶ多重ＮＡＳＢＡにおける遮断ｐ１プライマーの使用
既に行った多重ＮＡＳＢＡ実験から、第２プライマーセットのみの添加は該反応の抑制を引き起こしうることが判明している。遮断ｐ１プライマーの効果を試験するために、エンテロウイルスとのＨＩＶの多重増幅を行った。標準的なＨＩＶ  ｐ２プライマーおよび非遮断または遮断ＨＩＶ  ｐ１プライマーの存在下、エンテロウイルス増幅を行った。
【００５５】
標準的なＨＩＶ増幅条件
細胞溶解バッファー（ＮｕｃｌｉＳｅｎｓ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔｓ，ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）で細胞溶解された細胞培養からのＨＩＶ粒子を増幅のための投入物質として使用した。亜型Ｂサンプルを使用した：国際単位（ＩＵ）で定められる、５００、５０および１０  ＩＵの投入量のＷＲＳ（Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ）を使用した。標準的なＮＡＳＢＡ試薬（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ８．５、１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、７０ｍＭ  ＫＣｌ、１５％ｖ／ｖ  ＤＭＳＯ、５ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭの各ｄＮＴＰ、２ｍＭ  ＡＴＰ、２ｍＭ  ＣＴＰ、２ｍＭ  ＵＴＰ、１．５ｍＭ  ＧＴＰ、０．５ｍＭ  ＩＴＰ、０．２μＭの各プライマー（フォワードプライマー（Ｐｌ）およびリバースプライマー（Ｐ２））および０．０１μＭ  分子ビーコンプローブ）を使用して、増幅を行った。該混合物を６５℃で２分間温置して、該ＲＮＡを変性させ、４１℃で２分間、Ｐ１プライマーを該標的にハイブリド形成させた。ついでＮＡＳＢＡ酵素（０．０８単位のＲＮアーゼＨ、３２単位のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ、６．４単位のＡＭＶ逆転写酵素および２．１μｇのＢＳＡ）を加え、該反応混合物を、穏やかな渦巻撹拌および短時間の遠心分離により混合し、増幅およびリアルタイム検出を開始した。ＮｕｃｌｉＳｅｎｓ  ＥａｓｙＱ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＮｕｃｌｉＳｅｎｓ，ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）において、３０秒ごとの蛍光モニターを行いながら該反応混合物を４１℃で６０分間温置した。該反応を４８５ｎｍで励起させ、発光シグナルを５１８ｎｍで測定した。
【００５６】
エンテロウイルスに最適な条件（すなわち、より高いＫＣｌ濃度（１００ｍＭ）を用い、０．５Ｍ  ソルビトールの存在下で該反応を行ったこと以外は、前記の標準的なＨＩＶ条件において記載されているのと同じ標準的なＨＩＶ  ＮＡＳＢＡ条件）で増幅を行った。インビトロ転写エンテロウイルスＲＮＡ（５０００、５００、５０および５ｃｐｓ）を投入体として用いた。エンテロ参照ｐ１（エンテロ参照ｐ１、表２）および参照ｐ２（エンテロ参照ｐ２、表２）を、エンテロ特異的ビーコン（エンテロＷＴビーコン、表２）と組合せて使用した。標準的なＨＩＶ  ｐ２（ＨＩＶ参照ｐ２、表２）を、非遮断ＨＩＶ参照ｐ１（表２）または３’ＤａｂＳｙｌ遮断ＨＩＶ参照ｐ１（表２）と組合せて、該エンテロ反応に加えた。
【００５７】
【表２】
2010508832.tif 000004
2010508832.tif 000005
【００５８】
結果を図４に示す。正常非遮断ＨＩＶ参照ｐ１（および標準的なＨＩＶ参照ｐ２）の添加はエンテロ増幅を全く引き起こさない。３’遮断ＨＩＶ参照ｐ１（および標準的なＨＩＶ  ｐ２）の添加は、エンテロプライマーのみが存在する参照反応と比較しうる良好なエンテロ増幅を引き起こす。このことは、遮断ｐ１プライマーの使用が多重ＮＡＳＢＡを改善しうることを示している。
【実施例３】
【００５９】
多重ＮＡＳＢＡにおける３’遮断ＨＩＶの検出
エンテロプライマーの存在下においてもＨＩＶが増幅されうるかどうかを調べるために、追加的実験を行った。前記の標準的なエンテロプライマー、３’ＤａｂＳｙｌ遮断ＨＩＶ参照ｐ１、標準的なＨＩＶ参照ｐ２およびＨＩＶ特異的分子ビーコン（ＨＩＶ  ＷＴ  ＭＢ、表１）を使用して、多重増幅を行った。ＨＩＶ亜型Ｂの投入量５０  ＩＵのＷＲＳ（５サンプル）を投入体として使用した。結果は、３’遮断ｐ１プライマーを使用するＨＩＶ増幅が該エンテロプライマーの存在下で行われうることを示している（図５）。このことは、遮断ｐ１プライマーの使用が多重ＮＡＳＢＡを改善しうる追加的用途を提供する。
【００６０】
本明細書の全体において、種々の刊行物が参照されている。本発明が関連する最先端技術をより詳細に記載するために、これらの刊行物の開示の全体を参照により本明細書に組み入れることとする。
【００６１】
本明細書においては、本発明の好ましい実施形態であると現在考えられているものが記載されているが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく他の及び更なる実施形態が実施可能であり、本発明の真の範囲内に含まれる全てのそのような更なる修飾および変更が包含されると意図される、と当業者は認識するであろう。
【００６２】
【化１】
2010508832.tif 000006
2010508832.tif 000007
【図１】
2010508832.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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