(57)【要約】  インプラント材料の物理化学的特性を変更して、適切なインプラントまたは生体適合性特性にするために、それらの表面上に特定の化学基を含む医学的または外科的用途のためのインプラント材料。
2010518998.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学基を含む炭水化物リンカー分子（ＣＬＭ）をポリマー性炭水化物材料（ＰＣＭ）に結合することにより、ＰＣＭを修飾することによって、インプラント材料を調製するための方法であって、ここで、前記化学基は、ＰＣＭに改善された生体適合性を与える、方法。
【請求項２】
化学基を含むＣＬＭが、次の工程：キシログルカンポリマーからキシログルカンフラグメントを調製する工程と、１つ以上の化学基を、キシログルカンフラグメントの還元末端および／または側鎖に結合させることであって、それによって、ＰＣＭに結合するのに有用な化学基を含むＣＬＭが生成される工程と、を含む方法によって調製される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＰＣＭを修飾する工程が、以下の工程：
（ａ）化学基を含む炭水化物ポリマーフラグメント（ＣＰＦ）を提供する工程と、
（ｂ）化学基を含む前記ＣＰＦ、および可溶性ポリマー性炭水化物（ＳＣＰ）からなる複合体の形成をもたらす条件下で、化学基を含む前記ＣＰＦを、ＳＣＰに接触させる工程であって、前記ＣＰＦおよびＳＣＰが一緒になって炭水化物リンカー分子（ＣＬＭ）を形成する工程と、
（ｃ）ＣＬＭがＰＣＭに結合する条件下で、前記ＣＬＭと、修飾しようとするＰＣＭとを接触させる工程と、
を使用して実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
改善された生体適合性をセルロース材料に与える化学基が結合されているキシログルカン誘導性分子を結合することにより、セルロース材料を修飾することによってインプラント材料を調製するための請求項１に記載の方法。
【請求項５】
以下の工程：
（ａ）改善された生体適合性を与える化学基が結合されているキシログルカン−オリゴ糖を提供する工程と、
（ｂ）結合した化学基を伴うキシログルカン−オリゴ糖およびキシログルカンから誘導される炭水化物ポリマーを含む炭水化物リンカー分子（ＣＬＭ）の形成をもたらす条件下で、前記キシログルカン−オリゴ糖を、キシログルカンから誘導される炭水化物ポリマーに接触させる工程と、
（ｃ）ＣＬＭがセルロース材料に結合し、そしてセルロース材料の生体適合性を改善する条件下で、前記ＣＬＭと、修飾しようとするセルロース材料とを接触させる工程と、
を含む、セルロース材料を修飾することによってインプラント材料を調製するための請求項４に記載の方法。
【請求項６】
改善された生体適合性を与える化学基がタンパク質またはペプチドである、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
共有結合した化学基が、キシログルカン−オリゴ糖の還元末端に結合している、請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ＣＬＭの形成が、キシログルカンエンドトランスグリコシラーゼ（ＸＥＴ、ＥＣ２．４．１．２０７）によって触媒される、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
ＰＣＭがセルロース材料であり、ＳＣＰがキシログルカンから誘導され、そしてＣＰＦがキシログルカンから誘導され、３〜１００のポリマー骨格単糖単位を含有し、そして化学基が改善された生体適合性を与える因子である、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
キシログルカンから誘導されるＣＰＦが４〜１０ポリマー骨格単糖単位を含有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
化学基がＣＰＦの還元末端に共有結合している、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１２】
化学基を含むＣＬＭをＰＣＭに接触および結合させる工程が、水性条件下で実施される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
化学基を含むＣＰＦ、およびＳＣＰの少なくとも一部からなる複合体の形成を促進することが可能であるグリコシル転移活性を有する酵素の存在下で、化学基を含む前記ＣＰＦがＳＣＰに接触される、請求項３、５〜７または９〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
グリコシル転移活性を有する前記酵素がキシログルカンエンドトランスグリコシラーゼ（ＸＥＴ、ＥＣ２．４．１．２０７）である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＣＰＦがキシログルカン−オリゴ糖（ＸＧＯ）であり、そしてＳＣＰの少なくとも一部がキシログルカン（ＸＧ）から誘導される、請求項３または１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ＰＣＭがセルロース材料の形態である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ＰＣＭが微生物由来のセルロースであり、そして好ましくは、微生物由来のセルロースが細菌アセトバクター・キシリナム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｍ）によって産生される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
改善された生体適合性をＰＣＭに与える化学基が、次のもの：細胞外マトリックス（ＥＣＭ）接着分子、増殖因子、細胞接着分子、または接着ペプチドフラグメントのうち少なくとも１つを含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
改善された生体適合性をＰＣＭに与える化学基が抗凝固因子を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
接着ペプチドフラグメントが：Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）含有ペプチド配列、Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ（ＹＩＧＳＲ）含有ペプチド配列、および／またはＩｌｅ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ（ＩＫＶＡＶ）含有ペプチド配列である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
化学基が少なくとも１つのＲＧＤ含有ペプチド配列を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
化学基が少なくとも１つのＧｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ（ＧＲＧＤＳ）ペプチド配列を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法に従って調製される医学的または外科的用途のためのインプラント材料。
【請求項２４】
組織工事のための足場の製造のための請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法に従って調製されるインプラント材料の使用。
【請求項２５】
人工血管、人工皮膚、神経足場または整形外科用インプラントの製造のための請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
人工血管の製造のための請求項２４に記載の使用。
【請求項２７】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法に従って調製される材料を含む、組織工事のための足場。
【請求項２８】
組織工事のための足場がインビトロで予め細胞が播種されている、請求項２７に記載の足場。
【請求項２９】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法に従って調製される材料を含む、人工血管。
【請求項３０】
人工血管がインビトロで予め細胞が播種されている、請求項２９に記載の人工血管。
【請求項３１】
以下の工程：
ａ）請求項１〜２２のいずれか一項に従って調製されるインプラント材料を含む組織工事のための足場を提供する工程と、
ｂ）前記材料を、それを必要とする被験体の適切なインプラント部位にインプラントする工程と、
を含む、インビボでの組織置換および／または再生の方法。
【請求項３２】
前記足場をインプラントする工程の前に、組織工事のための足場がインビトロで予め細胞が播種される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
組織工事のための足場が人工血管である、請求項３１または３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インプラント材料の物理化学的特性を変更して、適切なインプラントまたは生体適合性特性にする特定の化学基を含む医学的または外科的用途のための前記インプラント材料に関する。より詳細には、本発明は、ポリマー性炭水化物を含むインプラント材料、これらのインプラント材料を調製するための方法、ならびにこれらの方法によって生成される材料の使用、およびこれらの材料を含む製品に関する。
【背景技術】
【０００２】
器官または組織の不全は、重大な健康上の問題である。組織工事（tissue engineering）は、異なる供給源（即ち、自家（ａｕｔｏｇｅｎｉｃ）、同種、もしくは異種細胞）由来の機能的に健康な細胞、および／または細胞外の天然もしくは合成ポリマーを使用することによって、組織機能を回復する能力を提示する。
【０００３】
異なる様々な特性を伴う多くの合成ポリマー材料が、補綴、インプラントおよび組織工事のための足場のような医学および化粧品用途において、現在使用されている。これらの合成ポリマー材料は、一般的に、２つの主なグループ、一時的／生体吸収性および長期インプラント／生体非吸収性に分けることができる。生体吸収性合成材料の例として、ポリｌ−乳酸（ＰＬＬＡ）およびポリｌ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）を含むポリマーが挙げられる。長期インプラント可能材料および非生体非吸収性材料の例には、血管移植片ならびに組織修復シートおよびパッチを含む広範な医学的移植可能物品において使用されているポリ（テトラフルオロエチレン）ＰＴＦＥがある。
【０００４】
しかし、これらの合成材料はまた、インビボで炎症、感染、無菌性弛み、局所組織廃物（ｌｏｃａｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ｗａｓｔｅ）、およびインプラントカプセル化のような異物反応、ならびに血栓症および塞栓形成をもたらすポリマーと細胞との間の不適切な相互作用のような制限および欠点を有する。それ故、有望なポリマーの成功は、部分的に、その表面における目的の細胞の付着および増殖に依存する。表面化学は、材料に対する細胞応答を媒介し、そして細胞接着、増殖、移動、および表面に対する機能に影響を及ぼす。
【０００５】
動脈血管再構築の分野では、機能的な小直径人工移植片（内径＜６ｍｍ）の必要性が増加している。例えば、患者における血管系の悪条件のため、自家置換（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）の血管が利用可能でない場合、外科医は、インプラント、合成ポリマーに基づく血管以外の代替物を有さない。インプラント後、これらの血管に関する初期の主要な問題は、比較的低い流動条件下での血液凝固および血小板沈着によるほぼ即時的な閉塞である。表面誘導性血栓症をもたらす相互作用が、血液−生体材料界面で生じるため、表面の修飾は、血液適合性を増加するための方法である。異なる修飾のうち、ヘパリンのような多糖類による修飾もまた、人工臓器に対する血栓形成を最小限にするために広範に使用されている。しかし、問題は、ヘパリンが表面に直接結合する場合、その活性が有意に減少することである。現在まで、正体適合性の最も首尾よいタイプは、端末点付着ヘパリン表面である。
【０００６】
別の魅力的な表面修飾は、血漿タンパク質吸着、血小板接着および血栓形成を防止することができる親水基を導入することである。問題は、移植血管のような長期間デバイスのために表面上にそれらを留めることである。特に、ポリアクリルアミド（ＰＡＡｍ）；ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）（ＰＤＭＡＡｍ）；ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、エチレン−ビニルアルコールコポリマー（ＥＶＡ）、およびポリ（２ヒドロキシエチルメタクリレート）（ＰＨＥＭＡ）のような水溶性ポリマーが、タンパク質吸着を防止するために固体表面上にグラフト化されている。
【０００７】
材料を修飾して、その血液適合性を改善するための他の発案は、生物学的に不活な表面を模倣することを扱うべきである。血管では、この不活表面は、内皮細胞の単分子層から構成される。発泡ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）およびポリエステルのような移植血管として使用される現在の材料は、ヒト内皮細胞の接着または増殖を促進しない。従って、表面修飾は、フィブリノーゲン、フィブロネクチンおよびｖｏｎ  Ｗｉｌｌｂｒａｎｄ因子のような接着タンパク質の活性部位の最小フラグメントであるフィブリノーゲン、フィブロネクチンまたは固定化されたＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）のいずれかによって、行われている。内皮細胞を、ＰＴＦＥ管ならびにヘパリンによる表面修飾に播種するための広範な研究および治験が行われている。但し、問題は、細胞を長い期間、表面上に保持することである。
【０００８】
しかし、上記のこれらの合成材料、例えば、ＰＴＦＥおよびポリエステルはまた、制限された範囲の物理的および生化学的特性を含む他の制限および欠点を有する。それ故、特定の外科的用途の使用により適した代替的インプラント材料を探求する必要性が依然としてある。
【０００９】
何人かの研究者は、セルロースおよびその誘導体）の組織生体適合性を研究し、そして材料のいくつかの特定の用途について調べている。具体的には、微生物によって産生されるセルロースが、組織工事における使用について調べられている。微生物由来のセルロースは、高結晶性および高い一軸配向性セルロースから構成される極めて精密なリボン形状の繊維が、相互に複雑にもつれているネットワーク構造を有し、そしてこのネットワーク構造は、その内部空洞に大量の液体を含有する。セルロースは、高い結晶化度を有する多くのリボン形状の繊維から構成されるため、セルロースは、湿潤状態においてさえも張力のような外力に抵抗性であり得る。微生物セルロースは、植物を起源とするセルロースと構造的に異なるが、しかし、上記の構造のような高次構造は微生物セルロースの特徴であるものの、植物起源のセルロースでは認められない。従って、微生物セルロースはゼラチン状であるが、それは高い強度を有する。
【００１０】
特許文献１は、組織工事のための足場の調製のための再生セルロース（ＲＣ）および酸化再生セルロース（ＯＲＣ）の使用を説明している。最初に、セルロースを溶媒系に溶解し、次いで、セルロースを所望される足場構造に再生することによって、ＲＣおよびＯＲＣ混成物が生成される。多孔性足場を生成するために、ポロゲンが溶媒系に導入されて、足場構造に孔を生成する。次いで、足場を酸化して、その表面上にカルボキシル、アルデヒド、および／またはケトン官能基を導入してもよい。これらの官能基は、細胞付着または細胞接着および以後の増殖を誘導するためのさらなる化学的修飾のための部位としての役割を果たす。
【００１１】
非特許文献１は、初代マウス肝細胞の合成細胞外マトリックスを調製するためのキシログルカン（ＸＧ）で修飾されたカルシウム−アルギン酸ポリ炭水化物カプセルについて説明している。増強された肝臓特異的機能は、ＸＧのガラクトース部分と肝細胞のアシアロ糖タンパク質受容体との間の特異的相互作用に帰する。
【００１２】
非特許文献２は、生体分子を使用する生分解性材料の表面修飾について考察している概説論文である。生分解性足場は、細胞治療の使用を容易にするのに重要であるといわれている。特に、生体適合性に関する足場材料の選択が考察されている。生体模倣足場の形成、足場の構成および微細構造を制御することが可能な新たな組み立て技術、ならびに注入可能かつインサイチュで架橋される足場の生成が、概説されている。適切に細胞を指向する能力を伴う生分解性足場を提供するための課題が残されており、それらが概説されている。
【００１３】
非特許文献３は、セルロースの表面修飾のための新たな生体材料および新規の方法を提供するための木部繊維の修飾を説明している木部繊維技術の分野における概説論文である。キシログルカンとセルロースとの間の高親和性相互作用、多糖−オリゴ糖カップリング反応および従来の炭水化物合成を触媒するためのキシログルカンエンドトランスグリコシラーゼの独特な特性を組み合わせることからなる、官能基の木材パルプへの付着のための新たな系が提示されている。
【００１４】
しかし、良好な生体適合性を伴う、特に、生理活性因子を含む表面を有するインプラント材料を提供するための課題が残されている。
【００１５】
特許文献１に従って生成される再生セルロース（ＲＣ）および酸化再生セルロース（ＯＲＣ）の使用は、様々な問題を提起している。例えば、そのような処置は、セルロース材料に対する構造変化によって、複雑にされ得るため、セルロースを溶媒で処置することは所望され得ない。これらの構造変化は、縮小および変更された形態、ならびにより脆性な材料をもたらし得る。
【００１６】
現在、上記で示されるように、インプラント材料は、それらの表面化学のようなそれらの物理および生化学的特性に関連する問題によって妨げられている。明らかに、現在、それらが医学的用途において首尾よく使用され得るように、新たなインプラント材料を開発し、そしてそれらの特性を改善する必要性が、長い間検討されてきたが、未だ満たされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】US 6 800 753
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Seo S et al.(“Alginate microcapsules prepared with xyloglucan as a synthetic extracellular matrix for hepatocyte attachment”, Biomaterials vol. 26 no. 17 (2005), pages 3607-3615)
【非特許文献２】Yang Y et al. (“Biodegradable scaffolds−delivery systems for cell therapies”, Expert Opinion on Biological Therapy vol. 6, no.5 (2006), pages 485-498)
【非特許文献３】Zhou Q et al. (“Xyloglucan and xyloglucan endotransglycosylases (XET): Tools for ex vivo cellulose surface modification”, Biocatalysis and Biotransformation, vol 24, no. 1-2 (2006), pages 107-120)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
従って、本発明の主な目的は、生体との極めて良好な適合性を伴うインプラント材料の調製のための改善された方法を提供すること、およびこの方法によって生成されるインプラント材料を提供することである。
【００２０】
本発明のさらなる目的は、機械的強度および引張強度、伸長ならびに縫合能（ｓｕｔｕｒｅａｂｉｌｉｔｙ）のような所望の機械的特性を伴うインプラント材料を提供することである。
【００２１】
本発明の別の目的は、細胞に対する付着部位または細胞接着、増殖、移動および機能に影響を及ぼす他の因子を備えたインプラント材料を提供することである。
【００２２】
本発明のさらなる目的は、インビボでのインプラントに適切なインプラント材料を提供することである。
【００２３】
上記の目的を達成するための方法および手段、ならびにその他については、以下に記載の本発明の説明から明らかになろう。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明の目的を満たすために、本発明者らは、化学基を含む炭水化物リンカー分子（ＣＬＭ）をポリマー性炭水化物材料（ＰＣＭ）に結合することにより、ＰＣＭを修飾することを含む、インプラント材料を調製するための新規の方法を提供し、ここで、前記化学基は、改善された生体適合性をＰＣＭに与える。
【００２５】
化学基によって修飾されたＰＣＭを含むインプラント材料を調製するための本発明の方法の主な利点の１つは、ＰＣＭの化学的処置が回避されることである。そのような処置は、ＰＣＭの構造または配向ならびに他の物理化学的特性を変更することができる。従って、本発明の方法は、それがなければ、一般にＰＣＭの直接的な化学的修飾によって遭遇する繊維構造および性能の消失を回避する。
【００２６】
例えば、バクテリアセルロースのようなハイドロゲルの化学的修飾は、有機溶媒の使用による構造変化によって複雑にされる。バクテリアセルロースの表面修飾のための水性化学酵素技術を使用することによって、本発明は、これらの構造変化を回避する。
【００２７】
本発明のさらなる態様では、本発明の方法に従って調製されるインプラント材料、組織工事のための足場の製造のためのインプラント材料の使用、本発明に従って調製される材料を含む組織工事のための足場、ならびにインビボでの組織置換および／または再生の方法が提供される。
【００２８】
特定の実施形態に従えば、本発明は、本発明に従って調製されるインプラント材料を含む人工血管を包含する。本発明の人工血管は、高い透過耐性、高い破裂圧および良好な生体適合性によって特徴付けられる。
【００２９】
とりわけ、図面を参照して、本発明を以下により詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、修飾されていないポリマー性炭水化物材料（ＰＣＭ）（１）、および修飾されたＰＣＭ（６）を例示する。修飾されたＰＣＭは、炭水化物リンカー分子（ＣＬＭ）（２）を含み、前記ＣＬＭ（２）は、可溶性ポリマー性炭水化物（ＳＣＰ）の少なくとも一部（３）、および化学基（５）を含み、そして場合により、化学基を含む炭水化物ポリマーフラグメント（ＣＰＦ）（４）と複合体を形成する。
【図２】図２は、酵素およびＣＰＦ（４）を使用するＣＬＭ（２）の調製を例示する。ＳＣＰ（８）は、酵素（７）、および化学基（５）を含むＣＰＦ（４）と接触される。酵素（７）は、ＳＣＰを切断し、そして化学基を伴うＣＰＦを組み入れ、生成物ＣＬＭ（２）を生じる。
【図３】図３は、Ｄｉｒｅｃｔ  Ｒｅｄ２８（Ｃｏｎｇｏ  Ｒｅｄ）で染色したバクテリアセルロース▲およびコットンリンター●のＬａｎｇｍｕｉｒ吸着等温泉を例示する（Ａ）。図Ｂの線は、線形回帰の結果を示す。
【図４】図４は、キシログルカン●およびキシログルカン−ＧＲＧＤＳ▲が吸着したバクテリアセルロースのＬａｎｇｍｕｉｒ吸着等温泉を例示する（Ａ）。図Ｂの線は、線形回帰の結果を示す。
【図５】図５は、キシログルカン●およびキシログルカン−ＧＲＧＤＳ▲が吸着したコットンリンターのＬａｎｇｍｕｉｒ吸着等温泉を例示する（Ａ）。図Ｂの線は、線形回帰の結果を示す。
【図６】図６は、セルロース基質の比表面積に応じた、キシログルカン●およびキシログルカン−ＧＲＧＤＳ▲の吸着量を示す。線は、線形回帰の結果を示す。
【図７】図７は、バクテリアセルロース、コットンリンターおよびリヨセルの結晶化度を示す。
【図８】図８は、ＧＲＧＤＳキシログルカンオリゴ糖（ＸＧＯ−ＧＲＧＤＳ）の化学構造を示す。
【図９】図９は、セルロースに対する細胞培養培地のＱＣＭ吸着等温泉（−）、セルロースに対するキシログルカンの吸着（・・・）、それに続く細胞培養培地を例示する。セルロース（−・・）に対するキシログルカン−ＧＲＧＤＳ吸着、それに続く細胞培養培地。矢印は水洗浄を表す。
【図１０】図１０は、修飾されていないバクテリアセルロース（Ａ）、キシログルカン修飾バクテリアセルロース（Ｂ）およびキシログルカン−ＧＲＧＤＳ修飾バクテリアセルロース（Ｃ）上のＥＣの光学顕微鏡画像を示す。
【図１１】図１１は、非処置バクテリアセルロース（Ａ）、アセトンにおける処置後のバクテリアセルロース（Ｂ）およびキシログルカン−ＧＲＧＤＳによって修飾されたバクテリアセルロース（Ｃ）のＳＥＭ画像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明は、インプラント用ポリマー性炭水化物材料（ＰＣＭ）の物理化学的特性を変更するためにそれらの表面上に特定の化学基を含む医学的または外科的用途のための前記材料の開発に関する。特に、前記化学基は、例えば、細胞に対する付着部位または細胞接着、増殖、移動、および表面上の機能に影響を及ぼす他の因子を提供することによって、改善された生体適合性をＰＣＭに与える。
【００３２】
さらに加えて、本発明は、本発明のインプラント材料を調製するための方法、ならびにこれらの方法によって生成される材料、およびこれらの材料を含む製品の使用に関する。
【００３３】
本明細書では、他で特定しない限り、単数形（「ａ」または「ａｎ」）は、「１つ以上」を意味する。
【００３４】
本発明に関して、用語「生体適合性」は、材料の特性、即ち、生体と適合可能であるべき材料の特性に関する。言い換えれば、生命と調和すること、生物学的機能に毒性または有害な影響を及ぼさないことである。材料を身体の一部に接触させる場合、例えば、有害作用が誘導されるならば、材料は生体との不良な適合性を有する。この有害作用は、炎症、感染、無菌性弛み、局所組織廃物、およびインプラントカプセル化のような異物反応、ならびに血栓症および塞栓形成をもたらすことがある。対照的に、そのような有害作用が生じていなければ、生体との良好な適合性が認められる。さらに加えて、改善された生体適合性は、材料と生体との改善された適合性を意味する。生体適合性の例には、血液適合性、即ち、血液と適合性であるべき材料の特性がある。
【００３５】
インプラント材料を調製するための方法
本発明の第１の態様に従えば、化学基を含む炭水化物リンカー分子（ＣＬＭ）をポリマー性炭水化物材料（ＰＣＭ）に結合することにより、ＰＣＭを修飾することによって、インプラント材料を調製するための方法が提供され、ここで、前記化学基は、改善された生体適合性をＰＣＭに与える。
【００３６】
修飾されていないＰＣＭ（１）、ならびに炭水化物リンカー分子（ＣＬＭ）（２）（前記ＣＬＭ（２）は、ＳＣＰの少なくとも一部（３）、および化学基（５）を含み、そして場合により、化学基を含む炭水化物ポリマーフラグメント（ＣＰＦ）（４）と複合体を形成する）を示す本方法の実施形態を、図１に例示する。ＣＬＭはＰＣＭに結合することが可能であるため、ＰＣＭとＣＬＭとを接触させる場合、結合が生じる。
【００３７】
本発明の実施形態では、方法は次の工程を含む：（ａ）化学基を含む炭水化物ポリマーフラグメント（ＣＰＦ）を提供する工程と、（ｂ）化学基を含む前記ＣＰＦ、および可溶性ポリマー性炭水化物（ＳＣＰ）からなる複合体の形成をもたらす条件下で、化学基を含む前記ＣＰＦを、ＳＣＰに接触させる工程であって、前記ＣＰＦおよびＳＣＰは、一緒になって炭水化物リンカー分子（ＣＬＭ）を形成する工程と、（ｃ）複合体がＰＣＭに結合する条件下で、前記複合体と、修飾しようとするＰＣＭとを接触させる工程。
【００３８】
好適な実施形態では、化学基を含むＣＬＭをＰＣＭに接触および結合させる工程は、水性条件下で実施される。これは、ＣＬＭをＰＣＭに接触および結合させる工程中に、ＰＣＭの形態学の変化を生じないという利点を生じる。
【００３９】
化学基を含むＣＬＭを調製するプロセス、即ち、前記ＣＬＭおよび前記化学基を含む複合体を調製するプロセスは、ＰＣＭとは個別に実施される。それによって、化学基を含むＣＬＭを調製するプロセスは、大規模化することができ、そしていくつかの工程および厳しい条件を含み得る。
【００４０】
「ＰＣＭ」と略称される用語「ポリマー性炭水化物材料」は、全体的または部分的に１つ以上の単糖類の反復単位からできている水不溶性のポリマー性炭水化物材料および／または水溶性ポリマー性炭水化物材料を含む材料に関する。そのようなＰＣＭは、しばしば、２つ以上の異なるタイプのポリマー性炭水化物または炭水化物ポリマーおよびタンパク質のような別のポリマーとの混成物である。
【００４１】
本発明に従うＰＣＭは、インプラント材料、例えば、組織工事のための足場の主要成分としての使用に適切な任意のポリマー性炭水化物材料であってもよい。本発明において使用することができる、異なるＰＣＭについては、例えば、WO 03/033 813に記載されている。
【００４２】
１つの特定の実施形態では、ＰＣＭは、セルロース材料の形態であり、即ち、セルロースを含む。本発明に関して、セルロースは、例えばアマ、アサもしくは穀物のような一年生植物から抽出してもよく、または例えば、ワタ、ポプラ、カバ、ヤナギ、ユーカリ、カラマツ、マツもしくはトウヒのような多年生植物から抽出してもよい。適切なセルロース材料の例として、精製されたワタ、コットンリンター、α−セルロース、木材パルプ、精製された木材パルプ、粉末セルロース、結晶セルロース、および／または他のポリマーに修飾されたセルロースが挙げられる。
【００４３】
植物セルロースと比較して異なる特性を有するセルロースの別の供給源は、微生物由来のセルロースである。微生物由来のセルロースは、生体材料として使用するのに興味深いものであることが示されている。所定の用途のためにそれを異なる形状に成形することができること、ならびにその生体適合性および高純度が主な理由である。このセルロースは、菌体外多糖であり、そしてアセトバクター・キシリナム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｍ）を培養することによって、かなり安価に産生される。植物セルロースと比較すると、セルロースは、その純粋な形態で押し出され、そして他のいずれのポリマーまたはタンパク質とも会合しない。バクテリアセルロースは、水酸化ナトリウムで効果的に精製することができ、血液に接触するインプラントにためのＦＤＡに関するエンドトキシン値、即ち、１デバイスあたり＜２０ＥＵを達成する。バクテリアセルロースは、９９％の水を含有し、そして定義によるものではないが、ハイドロゲルとしてみなすことができる。その低い固体含有量にもかかわらず、ナノセルロースフィブリルの分岐ネットワークは、大きな機械的構造を提供する。
【００４４】
用語「微生物由来のセルロース」は、上記の細菌のような微生物によって産生されるセルロースに関する。本発明の１つの好適な実施形態では、アセトバクター・キシリナム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｍ）種のようなセルロース合成細菌の培養を使用する。
【００４５】
（ＳＣＰ）と略称される用語「可溶性炭水化物ポリマー」は、水性または有機溶媒に溶解することができる１つ以上の異なる単糖類またはそれらの誘導体を含むポリマーに関する。例として、ヘミセルロース（β（１−４）結合グルコース単位、即ち、セルロースのみからは構成されない炭水化物ポリマー）、ペクチン（ポリウロン酸およびエステル）、およびデンプン（α（１−６）側鎖分岐を伴うまたは伴わないα（１−４）結合ポリグルコース）として分類される多糖類が挙げられる。それら自体、フコースおよびアラビノースのような他の糖類でさらに置換することができるα（１−６）キシロース残基でデコレートされたβ（１−４）結合ポリグルコース骨格から構成される多糖であるキシログルカンは、そのようなＳＣＰ、具体的には、ヘミセルロースの例である。好適な実施形態では、ＳＣＰは、例えば、１つ以上の水素結合、イオン相互作用、１つ以上の共有結合、ファン・デル・ワールス力またはこれらの任意の組み合わせを介して、ＰＣＭに結合することが可能である。本発明の実施形態では、ＳＣＰは、下記の説明に従うＣＰＦであってもよい。好適な実施形態では、ＳＣＰは、キシログルカン（ＸＧ）から誘導される。
【００４６】
「キシログルカンから誘導される」とは、それら自体、フコースおよびアラビノースのような他の糖類でさらに置換することができるα（１−６）キシロース残基でデコレートされたβ（１−４）結合ポリグルコース骨格から構成される多糖、およびさらに化学的に置換され、そして修飾された変種、ならびにそれらのフラグメントを意味する。
【００４７】
「ＣＰＦ」と略称される用語「炭水化物ポリマーフラグメント」は、酵素的または化学的に調製されるＳＣＰのフラグメントであり得る分子に関連する。そのようなフラグメントの例は、前記ＳＣＰの反復単位の任意のメンバーを含む。
【００４８】
それ故、適切なフラグメントは、２〜１０、４〜１０、３〜１００、１１〜１５、２０〜２５、２６〜４０、４１〜６０、６１〜１００、１０１〜２００、２０１〜３００、３０１〜４００、４０１〜５００、５０１〜１０００、１００１〜２０００、２００１〜３０００、３００１〜４０００または４００１〜５０００単糖単位のようなポリマー骨格において、２〜約５０００単糖単位を含有してもよい。ＣＰＦは、異なる長さおよび組成の側鎖をさらに含み得る。具体例として、キシログルコ−オリゴ糖（ＸＧＯ）またはそれらのフラグメント、あるいは１つ以上のフコシル残基もしくは他の単糖類でさらに修飾されたものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４９】
ＸＧＯは、一般に、Fry et al. (1993) Physiologia Plantarum, 89, 1-3において概説されている命名法に従って命名され、ここで、とりわけ、Ｇは、非置換型β−グルコピラノシル残基を表し、Ｘは、キシロピラノシル−α（１−６）グルコピラノシル単位を表し、Ｌは、ガラクトピラノシル−β（１−２）−キシロピラノシル−α（１−６）グルコシル単位を表し、Ｆは、フコピラノシル−α（１−２）−ガラクトピラノシル−β（１−２）−キシロピラノシル−α（１−６）−グルコシル単位を表す。これらの様々な単位は、グルコピラノシル単位間のβ（１−４）結合を介して接続して、β（１−４）−グルカン多糖骨格を形成してもよい。この命名法を使用して、タマリンドキシログルカンのエンドグルカナーゼ消化後に一般に単離されるＸＧＯは、ＸＸＸＧ、ＸＬＸＧ、２５ＸＸＬＧ、およびＸＬＬＧである。これらのオリゴ糖の還元末端のグルコース（Ｇ）が還元型のアルジトール形態である場合、この単位は、「Ｇｏｌ」によって表される。それ故、例えば、タマリンドキシログルカン由来の上記のオリゴ糖の還元型の（アルジトール）誘導体は、ＸＸＸＧｏｌ、ＸＬＸＧｏｌ、ＸＸＬＧｏｌ、およびＸＬＬＧｏｌと称される。
【００５０】
好ましくは、ＣＰＦは、キシログルカンから誘導され、そして４〜１０ポリマー骨格単糖単位を含む３〜１００単位を含有してもよい。
【００５１】
「ＣＬＭ」と称される用語「炭水化物リンカー分子」は、上記の説明に従うＳＣＰの少なくとも一部および化学基を含有する分子または複合体に関する。ＣＬＭは、例えば、１つ以上の水素結合、イオン相互作用、１つ以上の共有の５つの結合、ファン・デル・ワールス力またはこれらの任意の組み合わせを介して、ＰＣＭに結合することが可能である。
【００５２】
ＣＬＭは、有機もしくは化学合成によっておよび／または所定の酵素の触媒活性を使用することによって、調製してもよい。
【００５３】
本発明の実施形態では、ＣＬＭは、WO 2004/094646 A1に記載の方法を使用して、調製してもよい。例えば、化学基を含むＣＬＭは、次の工程を含む方法によって調製することができる：キシログルカンポリマーからキシログルカンフラグメントを調製する工程と、１つ以上の化学基をキシログルカンフラグメントの還元末端および／または側鎖に結合させる工程であって、それによって、ＰＣＭへの結合に有用な化学基を含むＣＬＭが生成される工程。
【００５４】
酵素およびＣＰＦを使用してＣＬＭを調製する実施形態を、図２に例示する。ＳＣＰ（８）は、酵素（７）、および化学基（５）を含むＣＰＦ（４）と接触される。本発明の実施形態では、酵素（７）は、ＳＣＰを切断し、そしてその代わりに化学基を伴うＣＰＦを組み入れ、生成物ＣＬＭ（２）を生じる。
【００５５】
ＣＬＭは、１つ以上の化学基を含み得る。
【００５６】
本発明の実施形態では、ＣＬＭは、生来の、または化学的に修飾された単糖またはオリゴ糖を、オリゴ糖または多糖類の末端に転移することが可能な酵素を使用して、調製してもよい。そのような酵素として、グリコシル転移活性が高いが、加水分解活性が低い酵素、生得的に高いグリコシル転移活性を伴うグルコシルヒドロラーゼ、それらのグリコシル転移活性を増強するために操作されている酵素、ならびに基質としてヌクレオチド糖を使用するグリコシルトランスフェラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５７】
本発明に従って使用し得る、異なる酵素およびそれらの特性ならびに前記酵素を入手する方法については、WO 03033813に詳細に記載されている。
【００５８】
本発明の好適な実施形態では、酵素はキシログルカンエンドトランスグリコシラーゼ（ＸＥＴ、ＥＣ２．４．１．２０７）である。
【００５９】
天然では、ＸＥＴ酵素のようなグリコシル転移酵素は、植物生体においてインビボで機能し、そのため、酵素は、水性環境下で作用することが明らかに可能である。それ故、本発明に従う方法は、水溶液中で行ってもよく、またはそれは、緩衝液および／または湿潤剤および／または安定剤および／またはポリマーおよび／またはＤＭＳＯのような水分活性を減少する有機成分のような所定の成分の存在下、水中で行ってもよい。これらの成分のさらに詳細については、WO 03/033 813を参照のこと。
【００６０】
本発明の特定の実施形態に従えば、まず、ＸＥＴ酵素を使用して、化学的に修飾されたＸＧＯを溶液中のキシログルカン（ＸＧ）にカップリングさせ、続いて、セルロース材料上に修飾されたＸＧを収着させることによって、キシログルカンを本来的に含有しないセルロース材料に、新たな化学基を付加することができる。
【００６１】
本発明に関して、用語「化学基」は、ＰＣＭの修飾に潜在的に興味深い任意の化学基に関する。修飾は、ＰＣＭの機能的特性を変更することとして定義される。ＰＣＭの機能的特性を変更する能力は、この意味において、化学基に固有である。本発明に従えば、修飾は、改善された生体適合性をＰＣＭに与える。従って、化学基は、前記ＰＣＭの物理化学的特性を変更し、それをより生体適合性にする。
【００６２】
生体適合性は、生体と適合可能であるべき材料の特性に関する。材料の生体適合性を改善する１つの方法は、材料と接触または相互作用する細胞の接着、発達、移動、増殖、分化、形状、極性、および／または代謝機能に影響を及ぼすことである。材料の生体適合性を改善する１つの特定の方法は、材料と接触する血液の凝固を誘導する材料の傾向を減少することである。そのような抗凝固剤特性は、人工血管において使用される材料に特に有用である。
【００６３】
ＰＣＭの物理化学的特性を変更して、それをより生体適合性にする本発明の化学基に含まれる要素として、次のものが挙げられるが、これらに限定されない：抗凝固剤因子、ＥＣＭ接着分子、増殖因子、細胞接着分子、および接着ペプチドフラグメント、ならびに細胞培養基質および細胞栄養物。この要素の列挙によってすべてが網羅されているわけではなく、そしてＰＣＭの物理化学的特性を変更して、それをより生体適合性にする他の適切な要素も本発明において使用し得ることが、当業者には明らかであろう。
【００６４】
本発明において、用語「抗凝固因子」は、血液が凝固する傾向を減少する分子に関する。本発明による使用のためのそのような分子の好適な例には、ヘパリン、低分子量ヘパリンならびにフォンダパリナックスおよびイドラパリナックスのような第Ｘａ因子の五糖インヒビターがある。
【００６５】
本発明に関連して、用語「ＥＣＭ接着分子」は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を構成する細胞外巨大分子に関する。これらの巨大分子、主にタンパク質および多糖類は、局所的に分泌され、そしてほとんどの組織の細胞外空間において組織化された３Ｄ網に集成する。ＥＣＭ分子として、グリコサミノグリカン、ならびにプロテオグリカン、例えば、コンドロイチン硫酸、フィブロネクチン、ヘパリン硫酸、ヒアルロン、デルマタン硫酸、ケラチン硫酸、ラミニン、コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、およびエラスチンが挙げられる。細胞外マトリックスは、細胞内細胞骨格、細胞分化ならびに細胞および組織の空間的構成の組織化を調節する。事実、ＥＣＭは、細胞の発達、移動、増殖、分化、形状、極性および代謝機能に影響を及ぼすことによって、それに接触する細胞の挙動を調節するのに重要な役割を果たす。
【００６６】
本発明に関連して、用語「増殖因子」は、細胞増殖を引き起こす生物学的に活性なポリペプチドに関する。これらは、上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子、神経成長因子、酸性および塩基性繊維芽細胞増殖因子および血管新生因子、血小板由来増殖因子、インスリンならびにソマトメジンを含むインスリン様増殖因子、粘液腫およびワクシニアウイルス誘導性増殖因子を含むが、それらに限定されない。
【００６７】
本発明に関連して、用語「細胞接着分子」は、細胞結合配列を含有する細胞接着分子に関する。細胞接着分子の例として、インテグリン、カドヘリン、セクレチン、ならびにＶＣＡＭ、ＩＣＡＭ、ＰＥＣＡＭ、およびＮＣＡＭのような免疫グロブリンスーパーファミリーの接着分子が挙げられる。
【００６８】
用語「ＥＣＭ接着分子」、「増殖因子、または「細胞接着分子」は、任意の活性なアナログ、活性なフラグメント、またはそれらの活性な誘導体を含む。
【００６９】
本発明に関連して、用語「接着ペプチドフラグメント」は、細胞に対する付着部位または細胞接着、増殖、移動、および表面における機能に影響を及ぼす他の因子を提供するペプチド配列、例えば、細胞付着効率を改善するペプチド配列に関する。
【００７０】
いくつかのそのような接着ペプチドフラグメントは、当該技術分野において公知である。特定のペプチドフラグメントは、標準的な技術に従って、その結合能または接着能について試験することができる。そのようなペプチド配列の例として次のものが挙げられるが、これらに限定されない：ＲＧＤ−含有ペプチド配列、ＹＩＧＳＲ−含有ペプチド配列、および／またはＩＫＶＡＶ−含有ペプチド配列。
【００７１】
Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）−含有ペプチド配列は、細胞認識モチーフとして、広範に認識される。ＲＧＤペプチドは、細胞接着を効率的に誘発するだけではなく、所定の細胞系統に選択的に扱い、そして特定の細胞応答を引き出すために使用することができる。本発明において使用することができる、異なるＲＧＤ含有ペプチドおよびそこでの特定の特性についてのさらなる詳細は、Hersel et al, Biomaterials 24 (2003) 4385-4415に記載されている。
【００７２】
本発明において使用し得るＲＧＤ−含有ペプチド配列の例として、次のものが挙げられるが、これらに限定されない：ＲＧＤ、ＲＧＤＳ、ＧＲＧＤＳ、ＧＲＧＤ、ＹＲＧＤＳ、ＹＲＧＤＧ、ＹＧＲＧＤ、ＧＲＧＤＳＰ、ＧＲＧＤＳＧ、ＧＲＧＤＳＹ、ＧＲＧＤＳＰＫ、ＣＧＲＧＤＳＹ、ＧＣＧＹＧＲＧＤＳＰＧ、およびＲＧＤＳＰＡＳＳＫＰ。
【００７３】
本発明の１つの好適な実施形態では、ペプチド配列は、Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ（ＧＲＧＤＳ）である。
【００７４】
Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ（ＹＩＧＳＲ）−含有ペプチド配列は、ラミニンのＢ１鎖において見出され、上皮細胞付着を促進する（Graf et al., Biochemistry, 26, pp. 6896-900 (1987)）。
【００７５】
Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ（ＩＫＶＡＶ）−含有ペプチド配列は、ラミニンのＡ鎖において見出され、そして神経突起伸長を促進することが報告されている（Tashiro et al., J. Biol. Chem., 264, pp. 16174-182 (1989。
【００７６】
本発明の化学基は、反復ペプチド配列（ペプチドモノマー）を含み得る。反復ペプチド配列は、単一の反復ペプチドモノマーからなるホモポリマーであってもよく、あるいは２つ以上の異なる反復ペプチドモノマーまたはサブユニットからなるヘテロポリマーであってもよい。一般に、化学基は、２〜１００のペプチドモノマー、通常、２〜５０、好ましくは、３〜１５からなり得る。各ペプチドモノマーは、２〜４０アミノ酸残基の長さ、通常、２〜３０、好ましくは、２〜１０の範囲であり得る。
【００７７】
当業者であれば、ペプチドモノマーは、化学的に合成されていてもよく、または組み換え遺伝学によって産生されていてもよいことを認識するであろう。同様に、反復ペプチド配列を含む化学基は、ペプチドモノマーを一緒に化学的に連結することによって得てもよく、あるいはそれらを、組み換え的に発現させることもできる。
【００７８】
本発明の１つの特定の実施形態では、本発明の化学基は、ＲＧＤ−含有ペプチド配列の反復ペプチド配列を含む。
【００７９】
組織工事のための足場
本発明に従って調製されるインプラント材料は、組織工事のための足場の製造のために使用することができる。本発明のインプラント材料の利点の１つは、それが改善された生体適合性を足場に与える化学基を含むことである。
【００８０】
本発明に関連する用語「組織工事のための足場」は、組織置換物またはインプラント、例えば、（損傷した）組織の機能的置換に関する。
【００８１】
本発明は、ヒトおよび獣医学ならびに美容外科手術における広範な特定の用途を提供し、そして組織工事のための先に記載の足場の任意およびすべての適応症、ならびに当該技術分野において文献的に未だ開示されていないが、当業者によって容易に確認することができる他の目的のために、使用し得る。
【００８２】
本発明に従うインプラント材料の特定の用途の例として、次のものが挙げられるが、これらに限定されない：血管（即ち、人工血管）、リンパ管、尿管（ｕｔｅｔｅｒ）、気管、消化管、皮膚、口腔、食道、腹壁、尿道、ならびに歯周（ｐｅｒｉｄｏｎｔａｌ）組織、軟骨組織、および皮下組織のための置換材料または組織インプラント。さらなる用途は、微小神経縫合の保護カバー、および培養皮膚キャリアである。
【００８３】
本発明の足場は、そのそれぞれの用途について特異的に形成される。可能な異なる形状として、中空管、細長片、円筒、棒および薄層が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８４】
所定の実施形態に従えば、微生物由来のセルロースは、本発明の足場におけるＰＣＭとして使用される。微生物セルロースは、これに関して多くの有利な利点を有し、例えば、それは、非常に優れた形状保持を伴う様々な形状またはサイズで合成することができる。微生物セルロースのこれらの特性は、ほとんどが、その独特な薄層ミクロフィブリル３次元構造に帰する。不織様式で配置されたミクロフィブリルは、ワタ繊維のような植物セルロースより約２００倍細く、１単位容積あたり非常に大きな表面積を生じる。形成された微生物セルロース材料を生成するためのプロセスについては、例えば、JP 8 126 697 A2、EP 186 495、JP 3 165 774 A1およびJP 63 205 109 A1に記載されている。さらに加えて、血管置換物としての使用のための中空管微生物セルロースの生成については、JP 3 272 772 A2およびEP 396 344 A2に記載されている。
【００８５】
本発明の足場はまた、本発明に従うインプラント材料に加えて、補助材料を含み得る。この目的のための適切な補助材料として、水溶性、極性溶媒−可溶性または親水性ゲル形成ポリマー材料、例えば、寒天、デキストラン、ポリアクリルアミド、ポリビニルピロリドン、アルギン酸塩、ヒアルロン酸、カードラン、ポリアクリル酸塩、ヘパリン、硫酸化多糖類、プルラン、カラギーナン、グルコマンナン、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ゼラチン、コラーゲン、ラミニトール、フィブロネクチン、ケラチン、絹加水分解物、ポリアミノ酸、ポリ有機酸および酵素が挙げられる。本発明に従うインプラント材料は、含浸、積層または吸着のような手段によって上記のような補助材料と組み合わされて、混成物が得られる。
【００８６】
所定の実施形態に従えば、本発明の足場は、誘導体化されたＰＣＭに接触または相互作用する細胞の接着、発達、移動、増殖、分化、形状、極性、および／または代謝機能に影響を及ぼす要素を含む化学基によって誘導体化されたＰＣＭを含む。
【００８７】
それ故、本発明の組成物および方法に従えば、適切な分子モチーフを提供することによって、任意の細胞タイプの挙動（即ち、接着、発達、移動、増殖、分化、形状、極性、および／または代謝機能）に影響を及ぼすことが可能であり得る。
【００８８】
特に、細胞接着に影響を及ぼす要素を含む化学基は、本発明に従って使用される。
【００８９】
本発明のＰＣＭを使用して、多様な細胞タイプに対し、細胞接着分子、または接着ペプチドフラグメントを提示することができる。これらの細胞タイプは、通常、インビボでインプラントされた材料と接触する任意の細胞を含む。そのような細胞として、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、筋芽細胞、軟骨芽細胞、骨芽細胞、および幹細胞が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の方法および製品において有用であり得る他の細胞として、シュワン細胞、星状細胞、希突起膠細胞およびそれらの前駆体、副腎クロム親和細胞などが挙げられる。
【００９０】
幹細胞は、培養において容易に拡張され得る細胞のクラスを表し、そしてその子孫は、特定の増殖因子の投与によって最終的に分化され得る。筋芽細胞は、中胚葉系幹細胞集団、例えば、Ｌ−６およびＯ−ＣＨ３細胞から本来誘導される筋肉前駆体細胞である。
【００９１】
本発明に使用するための化学基の選択は、例えば、所望される標的細胞タイプに依存し得ることが理解されよう。当業者であれば、任意の特定の細胞接着分子または接着ペプチドフラグメントモチーフを、選択された細胞タイプに対するその接着能について、日常的にアッセイすることができる。
【００９２】
他の実施形態では、本発明の足場は、インビトロで予め細胞を播種することができ、それによって、細胞は、ＰＣＭに曝露される。異なる供給源（即ち、自家、同種、もしくは異種細胞）由来の機能的に健康な細胞を使用することができる。これらの細胞播種足場は、組織置換プロトコルにおいて有用である。これらの実施形態に従えば、組織を、インビトロで再構成し、次いで、それを必要とする宿主にインプラントすることができる。例えば、心筋芽細胞を、本発明の足場に懸濁して、心臓壁に対応する厚さの組織パッチを作製してもよい。次いで、再構成された心臓パッチを、組織置換治療の一部としてインプラントし得る。血管、軟骨、腱、骨、皮膚、神経、および他の組織のための類似のプロトコルも考慮される。
【００９３】
本発明の方法の使用により、目的の部位におけるインプラント材料、即ち、足場を修飾することも可能である。例えば、足場のシートまたは管の１つの面だけを修飾することも可能である。ＰＣＭの密度ならびにＣＬＭの長さは、ＰＣＭのネットワーク全体が修飾されるか、または１つの面だけが修飾されるかに影響を及ぼす。従って、ＰＣＭの密度またはＣＬＭの長さを変更し、それによってＣＬＭのアクセス性を変更して、透過および吸着することによって、ＰＣＭの修飾の程度および修飾の部位を最適化することが可能である。本実施形態に従えば、本発明は、特定の部位において修飾し、それによって、二重の機能性を足場／インプラントに与えることを可能にする。例えば、人工血管の内壁は、ヒト内皮細胞の接着または増殖を促進する化学基で修飾することができるが、一方、同じ人工血管の外壁は、血管の周囲の組織との生体適合性を促進する化学基で修飾することができる。
【００９４】
本発明の足場は、材料に対する細胞播種の前に、細胞培養培地においてＰＣＭをプレインキュベートすることによって、さらに修飾してもよい。これは、細胞の材料への接着を改善するために行われる。
【００９５】
所定の実施形態では、本発明の足場は、人工血管の調製において使用し得る。ＰＣＭを含む人工血管を得るためのプロセスは、当該技術分野において周知である。本発明の人工血管は、任意のディメンション、線状、先細および／または分岐であり得る。
【００９６】
本発明の好適な実施形態に従えば、人工血管は、微生物由来のセルロースを含む。EP 0 396 344およびJP 3 272 772は、微生物由来のセルロースを含む人工血管を得るためのプロセスについて説明している。微生物セルロースは、例えば、セロファン、Ｔｅｆｌｏｎ、ケイ素、セラミックス、不織布または織布から構成されるキャリアの内表面および／または外表面においてセルロース産生微生物を、例えば、培養することによって、得ることができる。
【００９７】
Bodin et al., Influence of cultivation conditions on mechanical and morphological properties of bacterial cellulose tubes, Biotechnol Bioeng, 2006 Dec 29（印刷に先駆けてオンラインにて公開中）は、微生物由来を含む人工血管を得るための改善された方法について記載している。この方法に従って、酸素添加された支持体としてのシリコーン管の頂部においてアセトバクター・キシリナム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｍ）を発酵させ、そして異なる濃度の酸素、即ち、２１％（空気）、３５％、５０％および１００％を吹き込むことによって、管形態でバクテリアセルロースが沈積された。
【００９８】
さらに加えて、人工血管の微生物セルロースが、本発明の方法に従って、改善された生体適合性および血液適合性を与える化学基の上記の微生物セルロースへの結合によって、修飾される。本発明の人工血管の改善された生体適合性および血液適合性は、閉塞のような問題の危険性を大いに減少する。閉塞は、主要な問題であり、そして小さな直径の人工血管の比較的低い流動条件下で一般的である。閉塞は、血液凝固および血小板沈着によって生じる。これらの問題をもたらす相互作用は、血液−インプラント界面において生じるため、本発明に従う修飾は、血液適合性を増加し、そして閉塞を伴う問題を減少する方法である。
【００９９】
本発明の人工血管は、高い透過耐性および高い破裂圧によって、さらに特徴付けられる。
【０１００】
本発明の好適な実施形態では、人工血管のインプラント材料は、少なくとも１つのＲＧＤ−含有ペプチド配列を含む化学基を含む。これらの配列は、ヒト内皮細胞の血管壁への接着または増殖を促進する。
【０１０１】
さらに加えて、人工血管は、インプラントの前に、予め内皮細胞を播種することができる。
【０１０２】
組織置換および再生
本発明に従うインプラント材料を含む足場は、様々な医学的または外科的用途を有する。
【０１０３】
本発明のさらなる態様に従えば、次の工程を含む、インビボ組織置換および／または再生の方法が提供される：ａ）本発明に従って調製されるインプラント材料を含む組織工事のための足場を提供する工程と、ｂ）前記材料を、それを必要とする被験体の適切なインプラント部位にインプラントする工程。
【０１０４】
本発明に関連する用語「組織置換」および「組織再生」は、一般に組織工事を指し、そして損傷した組織の機能的置換および組織再生を扱う。本発明のインプラント材料を含む足場は、組織置換として作用することができ、それによって、宿主組織は、インプラントされた材料によって、完全または部分的に置換される。さらに、本発明のインプラント材料を含む足場は、組織再生のための支持体として作用することができ、それによって、宿主細胞は材料に浸透する。本実施形態に従えば、宿主組織再生が容易にされる。
【０１０５】
本発明の足場をインプラントするために使用される手順は、例えば、一般外科、形成外科または神経外科において、組織工事に一般的に使用される手順である。これらの手順は、被験体およびインプラント部位に従って、採用される。インプラント部位は、原則として、生体の任意の部分、例えば、脈管系、リンパ系、皮膚、神経系などであり得る。本発明に従う被験体は、組織置換を必要とする任意の被験体、例えば、哺乳動物、好ましくは、ヒトであり得る。
【０１０６】
特定の実施形態では、足場は、前記足場をインプラントする工程の前に、インビトロで細胞が予め播種される。
【０１０７】
さらなる実施形態では、組織工事のための足場は、人工血管である。
【０１０８】
本発明を例示するために、以下の実施例を示す。但し、本発明が、これらの実施例に記載の特定の条件および詳細事項に限定されることを意図しないことが理解されるべきである。
【実施例】
【０１０９】
本発明者らは、キシログルカン−ＧＲＧＤＳコンジュゲートを伴う修飾されたバクテリアセルロースを公表し、そしてＧＲＧＤＳ修飾バクテリアセルロースの内皮細胞接着に対する効果について分析した。
【０１１０】
材料
バクテリアセルロース（ＢＣ）ハイドロゲル、および比較のために使用した純粋なコットンリンターから作製された  Ｗｈａｔｍａｎｎろ紙、グレード１を、Ｃｏｎｇｏ  Ｒｅｄおよびキシログルカンの吸着研究において調べた。トリメチルシリルセルロース（ＴＭＳＣ）を、ＱＣＭを使用する吸着研究に使用した。ＴＭＳＣを、Kontturi et al, Langmuir 19 (2003) 5735-5741に記載のように合成した。ＢＣを、Ｒｏｕｘフラスコ（稼動容積、１００ｍｌ）を、３０℃で３日間使用するコーンスティープ液体培地において、静置増殖させ、２ｍｍの薄膜を得た。生合成のために使用した株は、アセトバクター・キシリナム亜種スクロファーメンタス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｕｃｒｏｆｅｒｍｅｎｔａｓ）ＢＰＲ２００１、商品番号：１７００１７８ＴＭ  であった。株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから購入した。０．１ＭのＮａＯＨ中、６０℃で４時間、煮沸し、その後、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＴＭ水において煮沸を反復することによって、ＢＣを精製した。材料を蒸気滅菌し、そして使用前に冷蔵庫に貯蔵した。アセトン処置：凍結乾燥およびＳＥＭ分析の前に、バクテリアセルロースを、アセトンで１晩、処置した。
【０１１１】
実施例１
キシログルカンおよびキシログルカン−ＧＲＧＤＳの調製
ＸＸＸＧ、ＸＬＸＧ、ＸＸＬＧおよびＸＬＬＧキシログルコ−オリゴ糖（ＸＧＯ）の混合物（１５：７：３２：４６）を、本質的に、Greffe, L., et al., Glycobiology, 2005. 15(4): p. 437-445において先に記載のように、エンド−グルカナーゼ消化によるタマリンドの穀粒粉末（６０％キシログルカン含有量、Ｄ．Ｎ．Ｐａｌａｎｉ，Ｍｕｍｂａｉ，Ｉｎｄｉａ）の直接処置によって得た。以下のとおりに、１−デオキシ−１−アミノ−β−グリコシドを介して、対応する１−デオキシ−１−アミノスクシナマート誘導体（ＸＧＯ−ｓｕｃｃ）への変換によって、ＸＧＯを活性化した。ＸＧＯ（１ｇ、０．７８ｍｍｏｌ）を、脱イオン水（１０ｍＬ）に溶解し、続いて、炭酸水素アンモニウム（２．５ｇ）を添加し、次いで、炭酸水素アンモニウムを連続添加しながら、混合物を、４２℃で２８時間、撹拌して、飽和を維持した。反応の進行を、ＴＬＣ（７０／３０アセトニトリル／水）によって追跡した。過剰な炭酸水素アンモニウムを、３サイクルの凍結乾燥によって取り出して、ＸＧＯおよび１−デオキシ−１−アミノ−β−グリコシドの混合物からなる白色粉末を得た。変換の程度は、出発物質および生成物のアノマープロトンからの１Ｈ−ＮＭＲシグナルの積分に基づいて、８３％であった。粗生成物を水（１０ｍＬ）に溶解し、無水コハク酸（１５７ｍｇ、１．５７ｍｍｏｌ、２当量）を添加し、そして溶液を、ボルテックスミキサーにおいて、１０分間、激しく撹拌した。０．１％ＴＦＡを含有する水／アセトニトリル混合物による段階的溶出を使用する逆相（Ｃ１８シリカゲル）クロマトグラフィーにより、白色粉末としてＸＧＯ−スクシナマートを得た（８６０ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ、２工程で８０％収率）。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，２５℃）：δ＝２．５６（ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，２Ｈ；ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ）、２．６１（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，２Ｈ；ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ）、３．２４−３．９５（ｍ；Ｇａｌ，Ｇｌｃ，１−デオキシ−１−アミノスクシネート−ＧｌｃのＨ−２〜Ｈ−６およびＸｙｌのＨ−２〜Ｈ−５）、４．４４−４．５０（ｍ；ＧｌｃおよびＧａｌのＨ−１）、４．８５−４．８９（ｍ；ＸｙｌのＨ−１）、５．０８−５．１０（ｍ；Ｇａｌ−□（１−２）を所有するＸｙｌのＨ−１）。ＥＳＩ−ＭＳ［３７］：ＸＸＸＧ−ｓｕｃｃ［Ｍ＋２Ｎａ］２＋，６０３．６８０２理論値（６０３．７０９５測定値）；ＸＬＸＧ−ｓｕｃｃおよびＸＸＬＧ−ｓｕｃｃ［Ｍ＋２Ｎａ］２＋、６８４．７０６６理論値（６８４．７０７９測定値）；ＸＬＬＧ−ｓｕｃｃ［Ｍ＋２Ｎａ］２＋、７６５．７３３０理論値（７６５．７４７５測定値）。
【０１１２】
ペンタペプチドＧＲＧＤＳを、以下の例外を伴い、Engfeldt et al., Chembiochem FIELD Full Journal Title: Chembiochem: a European journal of chemical biology, 2005. 6(6): p. 1043-50に記載のプロトコルに従う標準的な固相Ｆｍｏｃ化学を使用して、０．２５ｍｍｏｌスケールで合成した。Ｆｍｏｃ保護アミノ酸を、ＤＩＰＥＡ（ＮＭＰ中２．０Ｍ）の存在下、ＨＢＴＵおよびＨＯＢｔ（両方ともＤＭＦ中０．４５Ｍ）で活性化した。キャッピング工程を除外した。最後のＦｍｏｃ切断工程後、樹脂のペプチド置換を、０．４７ｍｍｏｌ／ｇに決定した。ガラスフリットのフィルター（ポアサイズＰ２）を備える反応容器において、ＸＧＯ−ｓｕｃｃを、手動で樹脂結合ペプチドにコンジュゲートした。ＸＧＯ−ｓｕｃｃ（２６０ｍｇ、２当量）をＤＭＦ（６ｍＬ）に溶解し、そしてＤＩＰＥＡ（６６ｍＬ、４当量）の存在下、ＨＢＴＵ（２１５ｍｇ、６当量）およびＨＯＢｔ（８７ｍｇ、６当量）で活性化した。次いで、樹脂結合ペプチド（２００ｍｇ、１当量）を添加した。１時間後、エタノール、ＮＭＰ、ＤＩＰＥＡ（ＤＣＭ中５％）、ＮＭＰおよびＤＣＭ（各１０ｍＬ）による樹脂の広範な洗浄によって、カップリングを終結させた。続いて、減圧下で樹脂を乾燥させた。３ｍＬのＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＴＩＳ（９５：２．５：２：５）による３０分間、室温での側鎖保護基の同時脱離により、樹脂から糖ペプチドを切断した。反応物を水（４０ｍＬ）で希釈し、ｔＢＭＥ（３×４０ｍＬ）で抽出し、そしてガラス繊維を介してろ過した。水相を凍結乾燥して、白色固体（８２ｍｇ、４７％収率）を得た。同一条件下で、７５ｍｇの樹脂からの修飾されていないペプチドの切断および脱保護により、１５ｍｇのＧＲＧＤＳ（９０％収率）を得た。
【０１１３】
ＧＲＧＤＳ：１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，２５℃）：δ＝１．５２−１．８１（ｍ，４Ｈ；２Ｈβ−Ａｒｇ，２Ｈχ−Ａｒｇ）、２．６５（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ；Ｈβ−Ａｓｐ）、３．１６（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，２Ｈ；Ｈδ−Ａｒｇ）、３．８０−３．９２（ｍ，６Ｈ；４Ｈα−Ｇｌｙ，２Ｈβ−Ｓｅｒ）、４．２６（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，１Ｈ；Ｈα−Ａｒｇ）、４．３５（ｔ，Ｊ＝５Ｈｚ，１Ｈ；Ｈα−Ｓｅｒ）、４．６０（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１Ｈ；Ｈα−Ａｓｐ）。ＥＳＩ−ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋４９０．２３７６理論値（４９０．２１０９測定値）。
【０１１４】
ＸＧＯ−ｓｕｃｃ−ＧＲＧＤＳ：δ＝１．５３−１．８６（ｍ，４Ｈ；２Ｈβ−Ａｒｇ，２Ｈχ−Ａｒｇ）、２．５５−２．６０（ｍ，２Ｈ；Ｈβ−Ａｓｐ）、２．８０−２．９２（ｍ，４Ｈ；ＸＧＯ−ＮＨ−ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯ−Ｇｌｙ）、３．１２−３．１６（ｍ，２Ｈ；Ｈδ−Ａｒｇ）、３．２５−３．９８（ｍ：Ｈα−Ｇｌｙ，Ｈβ−Ｓｅｒ，Ｇａｌ，Ｇｌｃ，１−デオキシ−１−アミノスクシネート−ＧｌｃのＨ−２〜Ｈ−６およびＸｙｌのＨ−２〜Ｈ−５）、４．２５−４．３０（ｍ，１Ｈ；Ｈα−Ａｒｇ）、４．３４−４．３６（ｍ，１Ｈ；Ｈα−Ｓｅｒ）、４．６８−４．７４（ｍ，ＧｌｃおよびＧａｌのＨ−１）、４．８７−４．９１（ｍ，ＸｙｌのＨ−１）、５．０９−５．１１（ｍ，Ｇａｌ−□β（１−２）を所有するＸｙｌのＨ−１）。ＥＳＩ−ＭＳ：ＸＸＸＧ−ｓｕｃｃ−ＧＲＧＤＳ［Ｍ＋Ｈ＋Ｎａ］２＋、８２８．２９８８理論値（８２８．３０８０測定値）；ＸＸＬＧ−ｓｕｃｃ−ＧＲＧＤＳおよびＸＬＸＧ−ｓｕｃｃ−ＧＲＧＤＳ［Ｍ＋Ｈ＋２Ｎａ］３＋６１３．８８００理論値（６１３．８９１１測定値）、［Ｍ＋Ｈ＋Ｎａ］２＋９０９．３２５２理論値（９０９．３２８９測定値）；ＸＬＬＧ−ｓｕｃｃ−ＧＲＧＤＳ［Ｍ＋Ｈ＋２Ｎａ］３＋、６６７．８９７６理論値（６６７．９０４５測定値）、［Ｍ＋３Ｎａ］３＋６７５．２２４９理論値（６７５．２１９８測定値）、［Ｍ＋Ｈ＋Ｎａ］２＋９９０．３５１６理論値（９９０．３５５４測定値）。
【０１１５】
キシログルカンエンド−トランスグリコシラーゼ（ＸＥＴ）−媒介カップリングを使用して、最終的キシログルカン−ＧＲＧＤＳグリココンジュゲートを、以下のとおりに調製した。タマリンドキシログルカン（Ｍｅｇａｚｙｍｅ，Ｉｒｅｌａｎｄ）を水（２ｍｇ／ｍＬ）に溶解し、そして２００ｍＬを、ＸＧＯ−ｓｕｃｃ−ＧＲＧＤＳ（１００ｍＬ、Ｈ２Ｏ中２ｍｇ／ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（５０ｍＬ）、およびＰｔｔＸＥＴ１６Ａ酵素（０．４単位／ｍＬ、１００ｍＭのＮａＯＡｃ、ｐＨ５．５中５０ｍＬ）の溶液と混合した。３５分後、溶液を８５℃まで、１時間、加熱することによって、反応を終結させた。ガラス繊維フィルター上でのろ過によって、変性した酵素を取り出し、そして生成物を、エタノール（３容積）の添加によって、ろ過物から沈殿させた。沈殿物を、ガラス繊維フィルター上で回収し、そして水（２０ｍＬ）中におけるフィルターの撹拌および穏やかな加熱によって、再溶解した。得られる溶液を凍結乾燥して、３９０ｍｇのＸＧ−ＧＲＧＤＳを得た。ＤＭＳＯ中ＨＰ−ＳＥＣによる分析によって、生成物が３２０００のＭｗ値（Ｍｗ／Ｍｎ１．７）を有することが示された。ＸＧＯをＸＧＯ−ｓｕｃｃ−ＧＲＧＤＳの代わりに使用したことを除いて、同じ手順を使用して、類似の分子量（Ｍｗ３６０００（Ｍｗ／Ｍｎ１．５）を伴う修飾されていないキシログルカンを精製した。
【０１１６】
キシログルカンおよびキシログルカン−ＧＲＧＤＳの調製のための代替的経路
タマリンドの穀粒粉末ＴＫＰ（キシログルカン、Ｍｗ１〜１５０００００ダルトン）を、セルラーゼで消化して、低分子量のキシログルカン（低Ｍｗ  ＸＧ）、Ｍｗ５０００〜５００００ダルトンを形成させた。ＧＲＧＤＳペプチドの低Ｍｗ  ＸＧへの連結の前に、低Ｍｗ  ＸＧを、スクシネートで活性化した（上記の説明を参照のこと）。ＧＲＧＤＳペプチドを、標準的な固相Ｆｍｏｃ化学によって合成し、そして上記の説明に従って、スクシネート化低Ｍｗ  ＸＧに連結した。これらのＧＲＧＤＳペプチド−低Ｍｗ  ＸＧを直接使用して、細菌−セルロースを修飾することができる。
【０１１７】
実施例２
Ｃｏｎｇｏ  ｒｅｄの吸着
対照として、バクテリアセルロースおよびワタの比表面積を、吸着されたＣｏｎｇｏ  Ｒｅｄ染料（Ｄｉｒｅｃｔ  Ｒｅｄ２８、Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ  Ｈａｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙより購入した）の最大量を決定することによって、評価した。６つのＷｈａｔｍａｎ紙Ｎｏ．１および６のバクテリアセルロースゲルを、各吸着濃度で使用した。セルロース材料を、０．５、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０（ｗ／ｗ）のＣｏｎｇｏ  ｒｅｄを含有する４ｍｌの水溶液中のＣｏｎｇｏ  Ｒｅｄに曝露し、そして２４時間、６０℃、１００：１の液体比で染色した。ＮａＣｌ（２０％ｗ／ｗ）を、電解質として添加した。標準曲線を使用して、４９２ｎｍにおけるＵＶ吸着から、Ｃｏｎｇｏ  Ｒｅｄの残留濃度［Ｅ、ｍｇ／ｍｌ］を計算した。繊維に対するＣｏｎｇｏ  ｒｅｄの吸着量［Ａ、ｍｇ／ｇ］を、結合反応の前および後の４９２ｎｍにおける吸着の差異を、溶液の１容積あたりの質量で割って計算した。
【０１１８】
実施例３
キシログルカン（ＸＧ）およびキシログルカン−ＧＲＧＤＳ（ＸＧ−ＧＲＧＤＳ）の吸着
対照としてのバクテリアセルロースおよびコットンリンターの比表面積を、ＸＧおよび吸着したＸＧ−ＧＲＧＤＳの最大量を決定することによって、評価した。６つのＷｈａｔｍａｎ紙Ｎｏ．１および６のバクテリアセルロースゲルを、各吸着濃度で使用した。セルロース材料を、５、１０、１５、２０％（ｗ／ｗ）のキシログルカンまたはキシログルカン−ＧＲＧＤＳを含有する４ｍｌの水溶液に浸漬した。吸着したＸＧを、Kooiman et al., （Recueil des Travaux Chimiques des Pays-Bas et de la Belgique 79 (1960) 675-678に記載の比色法によって測定した。０〜４８時間の様々な時間間隔で、２００μｌを抜き出し、そしての２０％（ｗ／ｖ）Ｎａ２ＳＯ４およびトリヨージド溶液の５：１溶液（０．５％Ｉ２＋１％ＫＩ）の１ｍｌと混合した。標準曲線を使用して、６２０ｎｍにおける吸着から、ＸＧの残留濃度［Ｅ、ｍｇ／ｍｌ］を計算した。繊維に対するＸＧの量［Ａ、ｍｇ／ｇ］を、結合反応の前および後の６２０ｎｍにおける吸着の差異を、溶液の１容積あたりの質量で割って計算した。
【０１１９】
実施例４
比表面積
Ｃｏｎｇｏ  Ｒｅｄ対キシログルカン対キシログルカン−ＧＲＧＤＳの吸着から誘導されるコットンリンターおよびバクテリアセルロースの比表面積を、Ｌａｎｇｍｕｉｒの吸着理論から誘導される式１から計算した：
【数１】
2010518998.tif 000003
(1)
式中、［Ｅ］（ｍｇ／ｍｌ）は、吸着平衡における吸着物の濃度であり、［Ａ］（ｍｇ／ｇセルロースサンプル）は、セルロース表面上に吸着した吸着物の量であり、［Ａｍａｘ］（ｍｇ／ｇセルロースサンプル）は、セルロース表面に吸着した吸着物の最大量であり、そしてＫａｄｓは、吸着平衡定数である。特定の表面Ａｓｐは、以下のとおりに表される：
【数２】
2010518998.tif 000004
(2)
式中、Ｍｗは、Ｃｏｎｇｏ  Ｒｅｄ（６５３  ｇ／ｍｏｌ）；キシログルカン（３６０００ｇ／ｍｏｌ）；キシログルカン−ＧＲＧＤＳ（３２０００ｇ／ｍｏｌ）の分子量であり、ＮＡはＡｖｏｇａｄｒｏの定数であり、そしてＡＣＲは、１つのＣｏｎｇｏ  Ｒｅｄ（１．７３ｎｍ２）；キシログルカン（６９ｎｍ２）；キシログルカン−ＧＲＧＤＳ（６１ｎｍ２）によって占められる面積である。Ｃｏｎｇｏ  Ｒｅｄの値を、Ougiya et al., Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 62 (1998) 1714-1719によって計算した。キシログルカンおよびキシログルカン−ＧＲＧＤＳに対する値を、分子量によりキシログルカンの占める面積の直線的減少を推測する、即ち、高い分子量のキシログルカン（９８００００ｇ／ｍｏｌ）に対するＡＣＲ１８７０ｎｍ２のＯｕｇｉｙａらの値を、より低い分子量のキシログルカン、即ち、３２０００および３６０００ｇ／ｍｏｌに外挿することによって、導き出した。
【０１２０】
図３Ｂに示されるように、式（１）から直線が得られ、Ｃｏｎｇｏ  Ｒｅｄの両方の基質に対する吸着が、Ｌａｎｇｍｕｉｒモデルに従うことが示唆された。それ故、Ｃｏｎｇｏ  Ｒｅｄは、おそらく、両方のセルロース表面上に単層として吸着する。勾配値から計算した吸着最大値（Ａｍａｘ）は、両方の基質とも、４７ｍｇ／ｇに到達した。ＢＣの比表面積（７９ｍ２／ｇ）は、多かれ少なかれ、コットンリンターの面積（７２ｍ２／ｇ）と同じである（式（２）を参照のこと）。コットンリンターの比表面積は、染色吸着研究についての文献に見出される値にかなりよく対応する一方、ＢＣの特定の表面は、先に報告された値より若干低かった。しかし、この場合のＢＣは分解し、そしておそらく、吸着のために曝露された表面をそれほど有さなかったため、この差異は予想されるものであった。
【０１２１】
キシログルカンおよびキシログルカン−ＧＲＧＤＳはまた、Ｌａｎｇｍｕｉｒ吸着挙動に従った（図４Ｂおよび５Ｂを参照のこと）。ＸＧおよびＸＧ−ＧＲＧＤＳの吸着最大値（Ａｍａｘ）は、ＢＣに対して約１８０ｍｇ／ｇに到達し、コットンリンターに対して、約３倍でしかなかった（図４Ａおよび５Ａを参照のこと）。キシログルカンおよびキシログルカン−ＧＲＧＤＳによって測定されたＢＣの比表面積は、約２００ｍ２／ｇであり、そしてコットンリンタ−６０ｍ２／ｇではほぼ３倍低かった。両方のセルロース表面は、より多量の吸着したキシログルカンに対応するより大きな表面積との直線関係に従う（図６を参照のこと）。
【０１２２】
吸着したキシログルカンの量の差異は、おそらく、バクテリアセルロースの膨潤したネットワークならびにコットンリンタ−と比較して、より曝露されたおよびアクセス可能な嵩によって説明することができる。吸着物分子のサイズが、アクセス可能な表面積に有意な影響を及ぼし、結果的に、キシログルカンの吸着に利用可能なワタ表面がより少なくなることは、公知である。Ｃｏｎｇｏ  Ｒｅｄ分子は、その縦軸に沿った長さが約２．５ｎｍである一方、ＤＰ２６を伴う十分に伸長したキシログルカン骨格は約３０ｎｍである。２つのセルロース基質に対するキシログルカンの特定の表面の差異はまた、結晶構造の差異によるものであり得る。バクテリアセルロースおよびコットンリンタ−は、同じ結晶構造、即ち、セルロースＩ（図７を参照のこと）を有し、そして相対的結晶化度は、両方の基質とも７０％である。しかし、材料は、異なる量の結晶サブ−異形仮像（ｓｕｂ−ａｌｌｏｍｏｒｐｈ）（ＩαまたはＩβ）を有し、ＢＣでは６０％Ｉα：４０％Ｉβであり、そしてコットンリンタ−では僅か３０％Ｉα：７０％Ｉβである。これは、セルロースの物理特性に影響を及ぼし得、異形仮像は、異なる結晶充填、分子配座および水素結合を有する。
【０１２３】
実施例５
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）
ＳＥＭを使用して、修飾されていないおよび修飾されたセルロース材料の表面形態学について研究した。乾燥凍結する前に、バクテリアセルロース材料を、液体窒素においてクエンチングした。次いで、分析前に、表面を金で被覆し、分析は、１０ｋＶで操作したＺｅｉｓｓ  ＤＳＭ  ９４０Ａで行った。
【０１２４】
実施例６
共焦点レーザー顕微鏡
ＡｒＫｒレーザーに結合したファイバーを備える共焦点顕微鏡を使用して、バクテリアセルロースの湿潤状態における形態学およびゲル全体を通しての修飾について研究した。染料の蛍光波長［λｅｘ＝４９５ｎｍおよびλｅｍ＝５１６］に関連するフィルターを選択した。蛍光標識されたキシログルカン（ＸＧ−ＦＩＴＣ）によって、湿潤バクテリアセルロースサンプルを、蛍光標識した。Brumer, H., et al., Journal of the American Chemical Society, 2004. 126(18): p. 5715-5721に記載のとおりに、ＸＧ−ＦＩＴＣを合成した。湿潤ゲルを、２４時間、２ｍｇ／ｍｌのＸＧ−ＦＩＴＣのストック溶液で染色した。染色後、１晩、穏やかに撹拌しながら脱イオン水中にサンプルを置くことによって、過剰のＸＧ−ＦＩＴＣを取り出した。
【０１２５】
実施例７
ＥＳＣＡ
バクテリアセルロースの化学組成を、キシログルカンによる表面修飾の前および後に、ＥＳＣＡにより決定した。修飾後および測定前に、材料を、３０℃でオーブン乾燥した。Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ製のＱｕａｎｔｕｍ  ２０００を、測定に使用した。分析した面積は５００×５００μｍ２であり、そしてビームサイズは１００μｍであった。サンプルと検出器との間の角度は、４５°であった。ピーク強度を測定し、そしてＰｈｙｓｉｃａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ製のＭｕｌｔｉＰａｋソフトウェアを使用して、曲線のあてはめを行った。セルロースの特徴的なＥＳＣＡスペクトルは、酸素に対する炭素の単結合に対応する２８６．７ｅＶにおいて１つのピーク、および２個の酸素に結合した炭素に対応する２８７．９ｅＶにおいて１つのピークを有する。異なる結合炭素の相対量を、最も高い分解能Ｃ１ピークのガウス曲線あてはめにより計算した。Ｃ−Ｃ、Ｃ−Ｏ、Ｏ−Ｃ−ＯまたはＣ＝ＯおよびＯ−Ｃ＝Ｏの異なる位置は、それぞれ、２８５．０±０．２ｅＶ、２８６．７±０．２ｅＶ、２８１．１±０．２ｅＶおよび２８９．４±０．２ｅＶであった。
【０１２６】
ＥＳＣＡは、表面がキシログルカンで修飾されていることを示す。キシログルカンの側鎖基由来の酸素に結合した炭素の量の僅かな増加が、認められ得る。しかし、おそらく、基のサイズは小さく、そしてオーブン乾燥した場合、ゲルの内側に包埋および方向付けられ得るため、ＧＲＧＤＳの量を定量することは不可能である。また、キシログルカンおよびセルロース自体には、微量の窒素が存在し、これは、特徴付けをさらに複雑にする。
【０１２７】
実施例８
水に対する動的な接触角
静的接触角測定を、６つのオーブン乾燥したセルロースフィルム、修飾されていない、ならびにＸＧまたはＸＧ−ＧＲＧＤＳで修飾されたセルロースに対して行った。５μｌの液体小滴を、各セルロース表面上に適用した。接触角θｅを、固体と滴表面に対する正接との間で形成される角度を登録することによって、角度計を使用して、測定した。
【０１２８】
修飾されていないバクテリアセルロースと比較して、キシログルカンおよびキシログルカン−ＧＲＧＤＳで修飾される場合、湿潤性は、若干高い（表１）。
【０１２９】
【表１】
2010518998.tif 000005
【０１３０】
緻密な構造、毛管力のための孔が少ないこと、および高い結晶化度により利用可能な水酸基が少ないことにより、修飾されていないバクテリアセルロースでは、水に対する接触角が比較的高い。キシログルカンによる修飾は、利用可能な水酸基を増加し、従って、湿潤性を増加する。ＧＲＧＤＳを増加しても、湿潤性は、有意に低下しなかった（図８の構造を参照のこと）。なお、湿潤性は、修飾されていないＢＣと比較してより高い。
【０１３１】
実施例９
ＱＣＭを使用するタンパク質吸着
ＱＣＭ−Ｄ機器（Ｑ−ｓｅｎｓｅ  ＡＢ，Ｇｏｅｔｅｂｏｒｇ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して、表面修飾の効果としてのタンパク質のセルロース表面に対する吸着を研究した。モデルのセルロース表面を、金めっきしたＱＣＭ−Ｄ  ｃｒｙｓｔａｌにおいて調製した。表面を、ＵＶ／Ｏｚｏｎｅチャンバにおいて、１０分間、清浄化し、続いて、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水、Ｈ２Ｏ２（３０％）およびＮＨ３（２５％）の５：１：１混合物において、１０分間、７０℃で浸漬した。表面を、Ｍｉｌｌｉ−Ｑで洗浄し、そして窒素で乾燥した。金表面に被覆したトリメチルシリルセルロース（トルエン中１ｍｇ／ｍｌ）を、４０００ｒｐｍで１分間、スピンコーティングした。トリメチルシリル基を切断して離し、そしてセルロースを、塩化水素蒸気（１０％溶液）上で作製した。測定は、３次のオーバートーン（１５Ｈｚ）で行った。ｆの変化は、結晶の表面に結合した質量の量に反映する。薄い、一様に分配された剛性のフィルムでは、吸着誘起周波数のシフト（Δｆ）は、Ｓａｕｅｒｂｒｅｙ式で説明されるような質量の取り込みに関連する：
【数３】
2010518998.tif 000006
式中、ｍは質量（ｎｇ）であり、Ａは面積（ｃｍ２）であり、ｎｒはオーバートーン数（＝１、３．．．）であり、そしてＣは質量感度定数（１７．７ｎｇ／ｃｍ２／Ｈｚ）である。測定は、３回反復で行った。キシログルカンおよびキシログルカン−ＧＲＧＤＳを、２ｍｇ／ｍｌの濃度で吸着させた。各吸着後、続いて、細胞培養培地で誘導した後に、水による脱着工程を行った。細胞播種において使用した同じ培養培地を使用して、タンパク質吸着を研究した。細胞培養培地は、ＲＧＤモチ−フを所有する細胞接着タンパク質フィブロネクチンを含むタンパク質の混合物を含有する。ＸＧ−ＧＲＧＤＳによる修飾が、細胞培養培地からのタンパク質吸着（および特に、フィブロネクチン）の増加を生じたかどうかについて解明するために、吸着研究を、ＱＣＭ−Ｄを使用して、モデルのセルロース表面に対して行った。おそらくは吸着したタンパク質のいずれかがフィブロネクチンであったかどうかを確認するために、細胞培養培地を誘導した後、フィブロネクチンに対する抗体（フィブロネクチン抗体（ビオチン）（ａｂ６５８４）、Ａｂｃａｍ）を、誘導した。すべての吸着後、続いて、水による脱着工程を行った。
【０１３２】
図９に示されるように、細胞培養培地由来の約１００ｎｇ／ｃｍ２のタンパク質を、修飾されていないセルロース表面に吸着させた。キシログルカンを最初に吸着させた場合、タンパク質は吸着されなかった。セルロースを、接着ペンタペプチドを所有するキシログルカンで修飾した場合、修飾されていないセルロースと比較して、タンパク質はそれほど吸着されなかった（５０ｎｇ／ｃｍ２）。キシログルカン−ＧＲＧＤＳおよび細胞培養培地による修飾後、フィブロネクチンに対する抗体ＩｇＧを、誘導した。フィブロネクチンに対するＩｇＧは、吸着しなかったが、これは、吸着したタンパク質が接着タンパク質フィブロネクチンではなく、または少なくとも活性型でもないことを示す。
【０１３３】
実施例１０
広角Ｘ線散乱（ＷＡＸＳ）
ＢＣの凍結乾燥したペレットを、圧縮して、１ｃｍの直径を有するペレットにした。Ｘ線回折パターンを、Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｄ５０００回折計上で記録した。１．５４Åの波長を伴うＣｕＫαアノードを使用した。２θ＝５〜３０°を介して、走査を行った。非結晶質回折の結晶回折のピークの強度を測定した。相対的結晶化度を、結晶部分と全体部分との間の比として決定した。
【０１３４】
実施例１１
細胞播種
酵素的方法を使用して、伏在静脈の健康な部分から、内皮細胞（ＨＳＶＥＣ）を単離した。１．７〜３．４ｇ／ｄｌアルブミンおよび３〜４．５ｇ／ｍｌの全タンパク質含有量を伴う２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＧｍｂＨ）、ペニシリン−ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍＬ；ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＧｍｂＨ）、１．２ｍＭのＬ−グルタミン（ＰＡＡ）、ウシ脳抽出物（７５ｍｇ／５００ｍＬ；研究室において調製した）ならびにヘパリン（１３Ｕ／ｍＬ；Ｌｅｏ  Ｐｈａｒｍａ，Ｍａｌｍｏｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）を補充したＭ１９９（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＧｍｂＨ，Ｌｉｎｚ，Ａｕｓｔｒｉａ）において細胞を培養し、そして、３７℃、５％ＣＯ２を伴う加湿インキュベ−タ−において保持した。細胞播種前に、ＢＣを、キシログルカン、およびＢＣの乾燥重量の１５％に対応するＸＧ−ＧＲＧＤＳで、１晩修飾した。細胞播種前に、修飾したセルロースを、ＰＢＳで２回洗浄した。
【０１３５】
細胞形態学の評価のために、ＨＳＶＥＣを、修飾されたおよび修飾されていないＢＣの一片に、３×１０５個の細胞／ｃｍ２の密度で、播種した。評価のために、１日目および３日目に、サンプルを採取した。細胞を、３．７％ホルムアルデヒドで固定し、そして０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００において透過性にした。ｆ−アクチンを可視化するために、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＵＳＡ）にコンジュゲートしたファロイジンによって、細胞を染色した。ＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｓｗｅｄｅｎ  ＡＢ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）により、核を対比染色した。標本を、ＳｌｏｗｆａｄｅＴＭＡｎｔｉｆａｄｅ  ｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．）に装架し、そしてＡｘｉｏ  Ｉｍａｇｅｒ  Ｍ１（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で分析した。ＡｘｉｏＣａｍ  ＨＲｃ（Ｚｅｉｓｓ）により、写真をデジタル撮影した。
【０１３６】
細胞接着
初期の細胞接着研究は、細胞の接着は、キシログルカン−ＧＲＧＤＳ修飾セルロースにおける方が、修飾されていない、およびキシログルカン修飾されたセルロースにおけるよりも、迅速かつ良好であったことを示した。光学顕微鏡画像は、修飾された表面においてより多数の細胞が存在すること、ならびに伸長および接着がさらに進展していることを示す（図１０を参照のこと）。
【０１３７】
実施例１２
形態学
コットンリンタ−およびバクテリアセルロースの形態学は、多くの態様において異なる。コットンリンタ−は、表面がミクロフィブリルによって覆われている繊維から構成される。繊維のサイズは約６μｍである。一方、バクテリアセルロースは、７０〜１００ｎｍのサイズのナノ繊維からなる膨潤した３次元ネットワークである。水相においてキシログルカンでバクテリアセルロースを修飾すると、形態は変化しなかった（図１１Ｃ）。ネットワークが明らかに縮小する有機溶媒、例えば、アセトンにおいて修飾が行われる場合では、このようなことは認められない（図１１Ａと１１Ｂとを比較する）。ＢＣのネットワークを保存するためには、水中における修飾が好ましい。蛍光キシログルカン（キシログルカン−ＦＩＴＣ）による修飾されたバクテリアセルロースの共焦点におけるＺ−走査は、全体をとおして、ナノセルロース材料が均質に修飾されていることを示す。
【０１３８】
結論
本発明の本発明者らは、ナノフィブリルネットワークの形態学が影響を受けていない状態で、セルロースナノフィブリルを修飾するための新規の方法について説明している。バクテリアセルロースは、キシログルカン−ＧＲＧＤＳで首尾よく修飾され、これは、比色法によって確認された。吸着した量は、最大で１９０ｍｇ／ｇに到達した。ナノセルロース材料は、材料全体をとおして均質に修飾され、これは、ＳＥＭおよび共焦点顕微鏡におけるｚ−走査によって認められる。さらに、水相における修飾は、有機溶媒と比較して、形態学を保存するのに明らかに有利であった。修飾は湿潤性を増加させ、これは、ＱＣＭ−Ｄによって示される吸着されたタンパク質の減少またはほとんど認められない量を説明し得る。初期の細胞研究は、ＢＣハイドロゲルがキシログルカン−ＧＲＧＤＳで修飾される場合、内皮細胞の接着が改善されることを証明した。細胞接着の増加は、ＱＣＭ−Ｄによって実証されるように、培養培地由来のフィブロネクチンの非特異的吸着によるものではなく、但しその代わり、ＸＧによるＲＧＤエピト−プの特異的浸透によるものであった。
【０１３９】
本発明の特定の実施形態を、実施例によって詳細に説明してきたが、本発明の修飾および応用が、当業者に思い至ることは明らかである。しかし、そのような修飾および応用は、特許請求の範囲に記載の本発明の範囲内にあることは、明白に理解されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年10月27日(2009.10.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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