(57)【要約】本発明は、異種核酸の配列がインフルエンザＡウイルスクラスＨ５抗原に由来する、薬物、特にワクチンの製造のための、異種核酸を含む組み換え修飾ワクシニアウイルス・アンカラ（ＭＶＡ）の使用に関する。本発明の別の一態様では、本発明は、（ａ）異種核酸がＭＶＡのゲノム内の非必須位置に組み込まれている、（ｂ）異種核酸がワクシニアウイルスプロモーター、またはオルソポックスウイルスプロモーター、またはポックスウイルス特異的プロモーターの調節下にある、および、（ｃ）異種核酸がインフルエンザＡウイルスクラスＨ５に由来する遺伝子または遺伝子の一部をコードする核酸の群から選択される、異種核酸を含む組み換え修飾ワクシニアウイルス・アンカラ（ＭＶＡ）に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種核酸の配列がインフルエンザＡウイルスクラスＨ５抗原に由来する、薬物の、特にワクチンの製造のための、異種核酸を含む組み換え修飾ワクシニアウイルス・アンカラ（ＭＶＡ）の使用。
【請求項２】
異種核酸がＭＶＡのゲノム内の非必須部位に組み込まれている、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
異種核酸がＭＶＡゲノムへ欠失ＩＩＩの部位にて組み込まれている、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
異種核酸が、ワクシニアウイルス特異的プロモーター、またはオルソポックスウイルス特異的プロモーター、またはポックスウイルス特異的プロモーターの調節下にある、請求項１から３に記載の使用。
【請求項５】
異種核酸の配列が、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ３、Ｈ５Ｎ２、Ｈ５Ｎ７、Ｈ７Ｎ１、Ｈ７Ｎ７、Ｈ７Ｎ３、およびＨ９Ｎ２配列の群から選択される、請求項１から４に記載の使用。
【請求項６】
異種核酸の配列がＨ５Ｎ１に由来し、および、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／０４、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／３０４６／０４、Ａ／Ｈｏｎｇｋｏｎｇ／１５６／９７、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／２１２／０３、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／２１３／０３、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５、Ａ／Ｃｋ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／ＢＬ０３／０３、Ａ／Ｇｒｅｙ ｈｅｒｏｎ／ＨＫ／７９３．１／０２、Ａ／Ｂｌａｃｋ Ｈｅａｄｅｄ Ｇｕｌｌ／ＨＫ／１２．１／０３、Ａ／Ｄｋ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１／０４、Ａ／Ｃｋ／Ｖｉｅｔｎａｍ／３３／０４、Ａ／Ｃｋ／Ｖｉｅｔｎａｍ／Ｃ−５８／０４、Ａ／Ｄｋ／ＴＨ／Ｄ４ＡＴ／０４、Ａ／Ｇｓ／ＴＨ／Ｇ７ＣＳ／０４、Ａ／Ｄｋ／ＦＪ／１７３４／０５、Ａ／Ｃｋ／ＧＸ／４６３／０６、Ａ／Ｃｋ／ＨＫ／９４７／０６と呼ばれる株の群から選択される、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
Ｈ５Ｎ１の異種核酸の配列が、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／０４、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５、Ａ／Ｂａｒ ｈｅａｄｅｄ ｇｏｏｓｅ／Ｑｉｎｇｈａｉ／１Ａ／２００５、Ａ／Ｗｈｏｏｐｅｒ ｓｗａｎ／Ｍｏｎｇｏｌｉａ／２４４／２００５、Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｔｕｒｋｅｙ／１／２００５、および Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５株の配列である、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
異種核酸の配列が、ヌクレオチド１ないし１５００、ヌクレオチド１ないし１１００またはヌクレオチド４０ないし１１００のヘマグルチニン遺伝子の配列または配列の一部を含む、請求項１から７に記載の使用。
【請求項９】
核酸がＨＡ１およびＨＡ２サブユニットを含む、請求項６または７に記載の使用。
【請求項１０】
核酸が、
ａ．単一Ｈ５Ｎ１株の異なる遺伝子またはその一部および／または，
ｂ．異なるＨ５Ｎ１株
に由来する２つ以上の配列をコードする、請求項６から９に記載の使用。
【請求項１１】
２つ以上の配列が、ヘマグルチニン、またはヘマグルチニンの一部をコードし、および、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／０４、Ｖｉｅｔｎａｍ／３０４６／０４、Ａ／Ｂａｒ ｈｅａｄｅｄ ｇｏｏｓｅ／Ｑｉｎｇｈａｉ／１Ａ／２００５、Ａ／Ｗｈｏｏｐｅｒ ｓｗａｎ／Ｍｏｎｇｏｌｉａ／２４４／２００５、Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｔｕｒｋｅｙ／１／２００５、およびＡ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５、および／またはＡ／ＩＮＤ／５／０５に由来する、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
ａ．異種核酸がＭＶＡのゲノム内の非必須位置に組み込まれている、
ｂ．異種核酸がワクシニアウイルスプロモーター、またはオルソポックスウイルスプロモーター、またはポックスウイルス特異的プロモーターの調節下にある、および，
ｃ．異種核酸がインフルエンザＡウイルスクラスＨ５に由来する遺伝子または遺伝子の一部をコードする核酸の群から選択される、
異種核酸を含む組み換え修飾ワクシニアウイルス・アンカラ（ＭＶＡ）。
【請求項１３】
異種核酸が、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ３、Ｈ５Ｎ２、Ｈ５Ｎ７、Ｈ７Ｎ１、Ｈ７Ｎ７、Ｈ７Ｎ３、およびＨ９Ｎ２ゲノム配列の群から選択される、請求項１２に記載の組み換え修飾ワクシニアウイルス・アンカラ（ＭＶＡ）。
【請求項１４】
異種核酸がＨ５Ｎ１に由来し、および、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／０４、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／３０４６／０４、Ａ／Ｈｏｎｇｋｏｎｇ／１５６／９７、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／２１２／０３、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／２１３／０３、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５ 、Ａ／Ｃｋ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／ＢＬ０３／０３、Ａ／Ｇｒｅｙ ｈｅｒｏｎ／ＨＫ／７９３．１／０２、Ａ／Ｂｌａｃｋ Ｈｅａｄｅｄ Ｇｕｌｌ／ＨＫ／１２．１／０３、Ａ／Ｄｋ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１／０４、Ａ／Ｃｋ／Ｖｉｅｔｎａｍ／３３／０４、Ａ／Ｃｋ／Ｖｉｅｔｎａｍ／Ｃ−５８／０４、Ａ／Ｄｋ／ＴＨ／Ｄ４ＡＴ／０４、Ａ／Ｇｓ／ＴＨ／Ｇ７ＣＳ／０４、Ａ／Ｄｋ／ＦＪ／１７３４／０５、Ａ／Ｃｋ／ＧＸ／４６３／０６、Ａ／Ｃｋ／ＨＫ／９４７／０６と呼ばれる株の群から選択される、請求項１３に記載の組み換え修飾ワクシニアウイルス・アンカラ（ＭＶＡ）。
【請求項１５】
Ｈ５Ｎ１の異種核酸が、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／０４、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５、Ａ／Ｂａｒ ｈｅａｄｅｄ ｇｏｏｓｅ／Ｑｉｎｇｈａｉ／１Ａ／２００５、Ａ／Ｗｈｏｏｐｅｒ ｓｗａｎ／Ｍｏｎｇｏｌｉａ／２４４／２００５、Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｔｕｒｋｅｙ／１／２００５、および Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５株から選択される、請求項１４に記載の組み換え修飾ワクシニアウイルス・アンカラ（ＭＶＡ）。
【請求項１６】
異種核酸の配列が、ヘマグルチニン遺伝子の配列、または配列の一部を含む、請求項１５に記載の組み換え修飾ワクシニアウイルス・アンカラ（ＭＶＡ）。
【請求項１７】
核酸がＨＡ１およびＨＡ２サブユニットを含む、請求項１６に記載の組み換え修飾ワクシニアウイルス・アンカラ（ＭＶＡ）。
【請求項１８】
核酸が、
ａ．単一Ｈ５Ｎ１株の異なる遺伝子またはその一部および／または，
ｂ．異なるＨ５Ｎ１株
に由来する２つ以上の配列をコードする、請求項１２から１６に記載の組み換え修飾ワクシニアウイルス・アンカラ（ＭＶＡ）。
【請求項１９】
２つ以上の配列が、ヘマグルチニン、またはヘマグルチニンの一部をコードし、および、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／０４、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／３０４６／０４、Ａ／Ｈｏｎｇｋｏｎｇ／１５６／９７、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／２１２／０３、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／２１３／０３、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５、Ａ／Ｃｋ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／ＢＬ０３／０３、Ａ／Ｇｒｅｙ ｈｅｒｏｎ／ＨＫ／７９３．１／０２、Ａ／Ｂｌａｃｋ Ｈｅａｄｅｄ Ｇｕｌｌ／ＨＫ／１２．１／０３、Ａ／Ｄｋ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１／０４、Ａ／Ｃｋ／Ｖｉｅｔｎａｍ／３３／０４、Ａ／Ｃｋ／Ｖｉｅｔｎａｍ／Ｃ−５８／０４、Ａ／Ｄｋ／ＴＨ／Ｄ４ＡＴ／０４、Ａ／Ｇｓ／ＴＨ／Ｇ７ＣＳ／０４、Ａ／Ｄｋ／ＦＪ／１７３４／０５、Ａ／Ｃｋ／ＧＸ／４６３／０６ およびＡ／Ｃｋ／ＨＫ／９４７／０６に由来する配列から選択される、請求項１８に記載の組み換え修飾ワクシニアウイルス・アンカラ（ＭＶＡ）。
【請求項２０】
請求項１２から１９のいずれかに記載の修飾ワクシニアウイルス・アンカラ（ＭＶＡ）をコードする核酸。
【請求項２１】
請求項１６から２５のいずれかに記載の組み換えＭＶＡを用いた標的細胞の感染を含む、請求項１２から２０のいずれかに記載の組み換えＭＶＡを標的細胞へ導入する方法。
【請求項２２】
ヒトを含む動物生体の免疫化のための方法であって、必要とする前記ヒトを含む動物生体へ請求項１６から２０に記載のＭＶＡの治療上有効な量を投与することを含む、前記方法。
【請求項２３】
免疫化が予防的および／または治療的の両方でありうる、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、治療薬の分野、さらに特にワクチンの分野、さらに特にインフルエンザＡワクチンの分野、さらに特にＨ５Ｎ１ワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
序論
１９９７年のＨ５Ｎ１感染の最初のヒト症例以来、このサブタイプのインフルエンザウイルスは世界中で高病原性鳥インフルエンザの発生を引き起こし続け、鳥からヒトへの感染数は増加し続けている。９月１４日現在、２４６例のヒト症例が記録され、うち１４４例が致死的であったことが確認された（ＷＨＯ感染症発生状況２００６．鳥インフルエンザＨ５Ｎ１のヒト確認例（非特許文献１）。加えて、Ｈ５Ｎ１ウイルス感染は東南アジアから世界の他の大陸へ広がっている（非特許文献２）。これらのウイルスは鳥類の種だけでなくさまざまな哺乳類種を（非特許文献３）ヒトを含め（非特許文献４）感染させるため、鳥ウイルスの哺乳類種での複製への適応を通じて、または通常の流行性インフルエンザＡウイルスとの遺伝子領域の交換を通じて、新しいパンデミック株が出現するリスクがある。
【０００３】
感染家禽からヒトへの伝染がますます増加しているインフルエンザＨ５Ｎ１ウイルスによって引き起こされるパンデミック脅威を考慮して、安全および効果的な十分な数のワクチンが入手可能であることが優先事項と考えられている（非特許文献５）。
【０００４】
しかし、そのようなワクチンの開発および十分な投与量のワクチンの製造は容易ではなく、現在、すべての製造元の合計ワクチン製造能力は世界的接種活動に適時に供給するには不十分である。この問題を克服するのに役立つ代替のワクチン配送系および製造技術が明らかに必要である。
【０００５】
Ｈ５Ｎ１ウイルスのさまざまな抗原的に異なるクレード（ｃｌａｄｅ）が最近同定されているため、理想的なワクチンはまた、これらの抗原変異株に対する交差防御免疫を誘導する。最近、全不活化ウイルス（ＷＩＶ）およびスプリット・ビリオンワクチンといった、従来の不活化ワクチン製剤が評価された（非特許文献６）。これらは、そのようなワクチンは可能な有効期間について相当な追加の製品特徴づけを必要とするという欠点がある。さらに、ワクチン製造元によるそのような新しい工程の実施は、必ずしも成功せず、およびバリデーションのための試験を再実施する必要がありうる。パンデミックの危険の観点から、これらの欠点は重大である。安全および効果的なアジュバントは従来のワクチンの免疫原性を改善でき、および適切な抗体応答を誘導するのに必要な抗原品質を低減しうる（用量の節約）。結果はここではこの可能性を強調する（スティミューン（Ｓｔｉｍｕｎｅ）（登録商標）アジュバント化ＮＩＢＲＧ−１４全ウイルス製剤）。しかし、現在はそのような強力なアジュバント化処方は製造およびヒトでの使用に適しないと考えられ、および免疫原性の増大にアジュバントを必要としないワクチンが将来のワクチン開発における好ましい候補である。
【０００６】
バキュロウイルスによって発現される組み換えＨＡに基づくワクチンが試験されている（非特許文献７）。抗原的にナイーブな個体ではこれらのワクチンはしかし中等度に免疫原性であり、およびより重要なことに、感知可能な抗体応答は、高用量、またはミョウバンのようなアジュバントとの組み合わせが用いられた場合だけ誘導された（非特許文献６）。
【０００７】
明らかに、特にＨ５Ｎ１インフルエンザパンデミックの場合におけるワクチンの破滅的な不足を克服するために、新規のワクチンが緊急に必要とされる。また、パンデミックがもたらす結果を回避するために、上記で概説された欠点は速やかに克服されなければならない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】ＷＨＯ ｄｉｓｅａｓｅ ａｌｅｒｔ ２００６．Ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｈｕｍａｎ ｃａｓｅｓ ｏｆ ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｈ５Ｎ１）−http://www.who.int/csr/disease/avian_influenza/country/cases_table_2007_10_17/en/index.html，２００７年１０月１７日アクセス
【非特許文献２】ＷＨＯ．２００７．『２００３年以降のＨ５Ｎ１鳥インフルエンザの確認例の被害地、２００７年８月１０日現在の状況』（Ａｆｆｅｃｔｅｄ ａｒｅａｓ ｗｉｔｈ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｃａｓｅｓ ｏｆ Ｈ５Ｎ１ ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｓｉｎｃｅ ２００３，ｓｔａｔｕｓ ａｓ ｏｆ ０８．１０．２００７）
【非特許文献３】バーレンカンプ（Ｖａｈｌｅｎｋａｍｐ），Ｔ．Ｗ．，および Ｔ．Ｃ．ハーダー（Ｈａｒｄｅｒ）．２００６．『哺乳類におけるインフルエンザウイルス感染』（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｓ．）Ｂｅｒｌ Ｍｕｎｃｈ Ｔｉｅｒａｒｚｔｌ Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ １１９：１２３−３１
【非特許文献４】ビーゲル（Ｂｅｉｇｅｌ），Ｊ．Ｈ．，Ｊ．ファーラー（Ｆａｒｒａｒ），Ａ．Ｍ．ハン（Ｈａｎ），他 ２００５．『ヒトにおける鳥インフルエンザＡ（Ｈ５Ｎ１）感染』（Ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ．）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５３：１３７４−８５
【非特許文献５】ＷＨＯ．２００７．『Ｈ５Ｎ１ウイルスの抗原特性および遺伝的特性およびプレパンデミックワクチンとしての潜在的使用のために開発されたＨ５Ｎ１ワクチンウイルス候補』（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ Ｈ５Ｎ１ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｃａｎｄｉｄａｔｅ Ｈ５Ｎ１ ｖａｃｃｉｎｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｆｏｒ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｕｓｅ ａｓ ｐｒｅ−ｐａｎｄｅｍｉｃ ｖａｃｃｉｎｅｓ）−http://www.who.int/csr/disease/avian_influenza/guidelines/summaryH520070403.pdf
【非特許文献６】ニコルソン（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ），Ｋ．Ｇ．，Ａ．Ｅ．コールゲート（Ｃｏｌｅｇａｔｅ），Ａ．ポダ（Ｐｏｄｄａ），他．２００１．『非アジュバント化およびＭＦ５９アジュバント化インフルエンザＡ／Ｄｕｃｋ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／９７（Ｈ５Ｎ３）ワクチンの安全性および抗原性：Ｈ５Ｎ１インフルエンザに対する２種類の潜在ワクチンの無作為化試行』（Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｎｏｎ−ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ ａｎｄ ＭＦ５９−ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ／Ｄｕｃｋ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／９７ （Ｈ５Ｎ３） ｖａｃｃｉｎｅ： ａ ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ ｔｒｉａｌ ｏｆ ｔｗｏ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｈ５Ｎ１ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ．）Ｌａｎｃｅｔ ３５７：１９３７−４３
【非特許文献７】トリーノー（Ｔｒｅａｎｏｒ），Ｊ．Ｊ．，Ｂ．Ｅ．ウィルキンソン（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ），Ｆ．マサウド（Ｍａｓｓｅｏｕｄ），他 ２００１．『ヒトにおけるＨ５インフルエンザのための組み換えヘマグルチニンワクチンの安全性および免疫原性』（Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｖａｃｃｉｎｅ ｆｏｒ Ｈ５ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ．）Ｖａｃｃｉｎｅ １９：１７３２−７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
インフルエンザウイルスＡは、ウイルス分類でオルトミクソウイルス（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）というウイルス科の１属である。インフルエンザウイルスＡは１種のみであり、その種を「インフルエンザＡウイルス」という。インフルエンザＡウイルスは、「鳥インフルエンザ」（別名鳥インフル（bird flu）、鳥インフルエンザ（avian flu）、インフルエンザウイルスＡインフル（Influenzavirus A flu）、Ａ型インフルエンザ（type A flu）、またはＡ属インフルエンザ（genus A flu））を意味する。それは鳥類を宿主とするが、しかし数種の哺乳類に感染しうる。既知のすべてのサブタイプは鳥類に固有である。
【００１０】
本発明は上記で概説される問題を解決する。本発明は、異種核酸の配列がインフルエンザＡウイルスクラスＨ５抗原に由来する、薬物の、特にワクチンの製造のための、単離異種核酸を含む組み換え修飾ワクシニアウイルス・アンカラ（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ Ａｎｋａｒａ）（ＭＶＡ）の使用を教示する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
「単離ＤＮＡ」は、（１）本発明に記載の天然に存在する配列のどれとも同一でない配列を含むＤＮＡ、または（２）天然に存在する配列を有するＤＮＡ（たとえば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）に関連して、目的ＤＮＡを含む遺伝子が天然に存在する生物のゲノム中の、目的ＤＮＡを含む遺伝子に隣接する少なくとも１つの遺伝子を含まないＤＮＡ、のどちらかである。その語はしたがって、ベクターに組み込まれた、自己複製プラスミドまたはウイルスに組み込まれた、または原核生物または真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれた組み換えＤＮＡを含む。その語はまた、対応するゲノムＤＮＡがイントロンおよびしたがって異なる配列を有するｃＤＮＡ；隣接遺伝子のうち少なくとも一方を欠くゲノム断片；ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって作製されおよび隣接遺伝子のうち少なくとも一方を欠くｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの断片；隣接遺伝子のうち少なくとも一方を欠く制限断片；融合タンパク質、ムテイン、または任意のタンパク質の断片といった天然に存在しないタンパク質をコードするＤＮＡ；およびｃＤＮＡまたは天然に存在する核酸の縮重変異体である核酸といった別々の分子を含む。加えて、それは、ハイブリッド遺伝子、すなわち、天然に存在しない融合タンパク質をコードする遺伝子の一部である組み換えヌクレオチド配列を含む。単離ＤＮＡは、たとえば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリまたは、たとえば、制限消化反応混合物または電気泳動ゲル切片中のゲノムＤＮＡ制限消化物中の、数百から数百万の他のＤＮＡ分子の中に存在するＤＮＡを意味しないことは前記から明らかとなる。
【００１２】
（ａ）異種核酸がＭＶＡのゲノム内の非必須位置に組み込まれている、（ｂ）異種核酸がワクシニアウイルスプロモーター、またはオルソポックスウイルスプロモーター、またはポックスウイルス特異的プロモーターの調節下にある、および、（ｃ）異種核酸がインフルエンザＡウイルスクラスＨ５に由来する遺伝子または遺伝子の一部をコードする核酸の群から選択される、異種核酸を含む組み換え修飾ワクシニアウイルス・アンカラ（ＭＶＡ）。
【００１３】
「ベクター」の語は、細胞へ導入されうる、または細胞に含まれるタンパク質および／または核酸を導入することができる、タンパク質またはポリヌクレオチドまたはその混合物をいう。導入されるポリヌクレオチドにコードされるタンパク質は、ベクターの導入に際して細胞内で発現されるのが好ましい。
【００１４】
「薬物、特にワクチンの製造に好ましい核酸」、すなわち配列番号１から３および１１から１５、はここではまた、ここで特に列記されるものと９５％、好ましくは９８％、非常に好ましくは９９％同一である核酸もいう。２つの配列間のパーセント同一性の決定は、カーリン（Ｋａｒｌｉｎ）およびアルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）（１９９３） ＰＮＡＳ．９０： ５８７３−５８７７）の数学的アルゴリズムを用いて達成される。そのようなアルゴリズムは、アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）他（１９９０） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０のＢＬＡＳＴＮ およびＢＬＡＳＴＰプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＢＬＡＳＴＮプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて、ヌクレオチド配列ＥＰＯ変異ポリペプチドをコードする核酸と相同なヌクレオチド配列を得るために実施される。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＢＬＡＳＴＰプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて、ＥＰＯ変異ポリペプチドと相同なアミノ酸配列を得るためにそれぞれ実施される。比較目的でギャップ付きアラインメントを得るために、ギャップ付きＢＬＡＳＴがアルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）他（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５： ３３８９−３４０２に記載される通り用いられる。ＢＬＡＳＴおよびギャップ付きＢＬＡＳＴプログラムを用いる際、各プログラムのデフォルトパラメーターが用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】１０3ＴＣＩＤ50のインフルエンザウイルスＡ／Ｈｏｎｇｋｏｎｇ／１５６／９７（Ａ）、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／０４（Ｂ）、またはＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５（Ｃ）に鼻腔内感染したマウスの体重減少。平均体重減少は感染前の元の体重の百分率として表される。（＊）は（ｐ＜０．０５）の統計的有意差を示す。
【図２】インフルエンザウイルスＡ／Ｈｏｎｇｋｏｎｇ／１５６／９７（Ａ）、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／０４（Ｂ）、またはＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５（Ｃ）のいずれかに感染後４日目の臓器組織におけるウイルス力価。結果をｗｔＭＶＡ、ＭＶＡ−ＨＡ−ＨＫ／９７、ＭＶＡ−ＨＡ−ＶＮ／０４、スティミューン（Ｓｔｉｍｕｎｅ）（登録商標）アジュバント化ＮＩＢＲＧ−１４およびＰＢＳ免疫化マウスについて示す。力価を脳（黒棒）、腸（灰棒）、肺（白棒）および脾臓（濃灰棒）で測定し、およびグラム組織当たりＴＣＩＤ５０（Ｌｏｇ１０）で示す。（＊）は表示の臓器について少なくとも１匹が検査で陽性となったことを示す。
【図３】接種によって誘導される抗体応答。３つのチャレンジウイルス：インフルエンザウイルスＡ／Ｈｏｎｇｋｏｎｇ／１５６／０７（黒棒）、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／０４（灰棒）およびＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５（濃灰棒）に対する抗体力価をＨＩアッセイによって測定した（Ａ＋Ｂ）。１回目免疫化の２８日後（Ａ）および２回目免疫化の２８日後（Ｂ）。力価はＧＭＴ（Ｌｏｇ２）で示す。次に、３つの異なるチャレンジウイルス：インフルエンザウイルスＡ／Ｈｏｎｇｋｏｎｇ／１５６／０７（黒棒）、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／０４（灰棒）およびＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５（濃灰棒）に対する抗体力価をＶＮアッセイによって測定した（Ｃ＋Ｄ）。１回目免疫化（Ｃ）および２回目免疫化（Ｄ）の２８日後。力価はＧＭＴ（Ｌｏｇ２）で示す。
【図４−１】表示の通りインフルエンザウイルスＡ／Ｈｏｎｇｋｏｎｇ／１５７／９７、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／０４またはＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５のいずれかに感染したマウスの肺における細気管支および肺胞の組織病理および免疫組織化学。インフルエンザウイルスＡ／Ｈｏｎｇｋｏｎｇ／１５６／９７感染は、ｗｔＭＶＡ（Ａ）およびＰＢＳ免疫化マウス（Ｅ）の細気管支壁にウイルス陽性細胞を、軽度の細気管支周囲浸潤と同時に生じ、一方で、ＭＶＡ−ＨＡ−ＨＫ／９７（Ｂ）、ＭＶＡ−ＨＡ−ＶＮ／０４（Ｃ）およびスティミューン（Ｓｔｉｍｕｎｅ）アジュバント化ＮＩＢＲＧ−１４（Ｄ）免疫化マウスの肺では、ウイルスは検出されなかった。インフルエンザウイルスＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／０４の感染は、ｗｔＭＶＡ（Ｆ）、ＭＶＡ−ＨＡ−ＨＫ／９７（Ｇ）およびＰＢＳ（Ｊ）免疫化マウスの細気管支壁にウイルス陽性細胞を、また中等度の細気管支周囲浸潤（ＰＢＳ免疫化マウスを除く）と同時に結果として生じる。ウイルス複製または形態変化はＭＶＡ−ＨＡ−ＶＮ／０４（Ｈ）およびスティミューン（Ｓｔｉｍｕｎｅ）アジュバント化ＮＩＢＲＧ−１４免疫マウス（Ｉ）では検出されなかった。インフルエンザウイルスＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５の接種は、ｗｔＭＶＡ（Ｋ）、ＭＶＡ−ＨＡ−ＨＫ／９７（Ｌ）およびＰＢＳ（Ｏ）免疫化マウスの細気管支の重度感染を、中等度の細気管支周囲浸潤と同時に、結果として生じた。一方、ＭＶＡ−ＨＡ−ＶＮ／０４（Ｍ）免疫化マウスの細気管支壁においては最小量の細胞だけが感染し、中等度の浸潤を伴った。インフルエンザウイルスＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５の感染後に、スティミューン（Ｓｔｉｍｕｎｅ）アジュバント化ＮＩＢＲＧ−１４（Ｎ）免疫化マウスの肺にはウイルスは検出されなかった。
【図４−２】表示の通りインフルエンザウイルスＡ／Ｈｏｎｇｋｏｎｇ／１５７／９７、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／０４またはＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５のいずれかに感染したマウスの肺における細気管支および肺胞の組織病理および免疫組織化学。インフルエンザウイルスＡ／Ｈｏｎｇｋｏｎｇ／１５６／９７感染は、ｗｔＭＶＡ（Ａ）およびＰＢＳ免疫化マウス（Ｅ）の細気管支壁にウイルス陽性細胞を、軽度の細気管支周囲浸潤と同時に生じ、一方で、ＭＶＡ−ＨＡ−ＨＫ／９７（Ｂ）、ＭＶＡ−ＨＡ−ＶＮ／０４（Ｃ）およびスティミューン（Ｓｔｉｍｕｎｅ）アジュバント化ＮＩＢＲＧ−１４（Ｄ）免疫化マウスの肺では、ウイルスは検出されなかった。インフルエンザウイルスＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／０４の感染は、ｗｔＭＶＡ（Ｆ）、ＭＶＡ−ＨＡ−ＨＫ／９７（Ｇ）およびＰＢＳ（Ｊ）免疫化マウスの細気管支壁にウイルス陽性細胞を、また中等度の細気管支周囲浸潤（ＰＢＳ免疫化マウスを除く）と同時に結果として生じる。ウイルス複製または形態変化はＭＶＡ−ＨＡ−ＶＮ／０４（Ｈ）およびスティミューン（Ｓｔｉｍｕｎｅ）アジュバント化ＮＩＢＲＧ−１４免疫マウス（Ｉ）では検出されなかった。インフルエンザウイルスＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５の接種は、ｗｔＭＶＡ（Ｋ）、ＭＶＡ−ＨＡ−ＨＫ／９７（Ｌ）およびＰＢＳ（Ｏ）免疫化マウスの細気管支の重度感染を、中等度の細気管支周囲浸潤と同時に、結果として生じた。一方、ＭＶＡ−ＨＡ−ＶＮ／０４（Ｍ）免疫化マウスの細気管支壁においては最小量の細胞だけが感染し、中等度の浸潤を伴った。インフルエンザウイルスＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５の感染後に、スティミューン（Ｓｔｉｍｕｎｅ）アジュバント化ＮＩＢＲＧ−１４（Ｎ）免疫化マウスの肺にはウイルスは検出されなかった。
【図５】本発明に記載の組み換えＭＶＡの構築ＭＶＡ導入ベクターｐＩＩＩΔＨＲへワクシニアプロモーターの調節下への遺伝子の導入後、遺伝子をＭＶＡゲノムの欠失ＩＩＩへ、隣接領域（ｆｌａｎｋ１およびｆｌａｎｋ２）の相同組み換えによって挿入した。組み換えウイルスの選択は、宿主範囲遺伝子Ｋ１Ｌの発現によって実施した。
【図６】多価ＭＶＡ−Ｈ５Ｎ１ワクチンのための構築計画Ｈ５Ｎ１抗原コード配列を下記の通りＭＶＡゲノムへ導入した：Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１サブタイプ）のマトリクスタンパク質（Ｍ１）−、イオンチャンネルタンパク質（Ｍ２）−およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）−遺伝子配列を、ワクシニア特異的プロモーターＰ７．５、ＰｍＨ５、Ｐ１１の転写調節下に配置されている欠失ＩＩの部位へターゲッティングする。Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４およびＡ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１５６／９７（共にＨ５Ｎ１サブタイプ）の核タンパク質（ＮＰ）遺伝子配列はＰｍＨ５プロモーターによって調節され、およびＭＶＡゲノムの欠失ＩＶへ導入された（詳細は図７を参照）。Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４およびＡ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１５６／９７（共にＨ５Ｎ１サブタイプ）のヘマグルチニン遺伝子配列はワクシニアプロモーターＰｓｙｎＩＩの調節下の欠失ＩＩＩの部位へ挿入された。
【図７】２つの異なるＭＶＡ−Ｈ５Ｎ１−ＮＰワクチンの構築ＭＶＡ導入ベクタープラスミドｐＶＩｄＨＲ−ＮＰ−ＶＮ０４またはｐＶＩｄＨＲ−ＮＰ−ＨＫ９７からＭＶＡ感染細胞へのＤＮＡのトランスフェクションは、組み換えウイルスＭＶＡ−ＮＰ−ＶＮ０４およびＭＶＡ−ＮＰ−ＨＫ９７の生成を可能にした。ＮＰ遺伝子は、相同組み換えによって欠失ＶＩの部位へ隣接領域（ｆｌａｎｋ ＶＩ1 およびｆｌａｎｋ ＶＩ2）を用いてＭＶＡゲノムに組み込まれている。組み換えウイルスの単離は、宿主範囲遺伝子Ｋ１Ｌの一過性発現を用いる増殖選択によって実施した。
【図８】組み換えＭＶＡ−Ｈ５Ｎ１−ＮＰウイルスの多段階増殖分析インフルエンザウイルスＡ／Ｈｏｎｇｋｏｎｇ／１５６／９７（ＭＶＡ−ＮＰ−ＨＫ９７）またはＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／０４（ＭＶＡ−ＮＰ−ＶＮ０４）由来ＮＰ遺伝子を有する組み換えＭＶＡを、ニワトリ胚線維芽細胞細胞（ＣＥＦ）の培養で複製能力について分析した。両方の組み換えウイルスの増殖能および増殖動態は、非組み換えＭＶＡ（ｗｔＭＶＡ）について測定されたものと非常に似ていた。
【図９】ＭＶＡ−Ｈ５Ｎ１−ＮＰコンストラクトによるＮＰ抗原の発現インフルエンザウイルス核タンパク質の合成は、ＭＶＡ−ＮＰ−ＨＫ／９７およびＭＶＡ−ＮＰ−ＶＮ０４組み換えウイルスを用いたＣＥＦの感染に際して確認された。空感染したＣＥＦおよびＡ／ＰｕｅｒｔｏＲｉｃｏ／０８／３４（サブタイプＨ１Ｎ１）を含む尿膜液を対照として用いた。ＮＰタンパク質は、インフルエンザウイルス核タンパク質（ＡＴＣＣ番号ＨＢ−６５）に対して向けられたマウスモノクローナル抗体ＨＢ−６５を用いて検出した。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明者らは、異種核酸の配列がインフルエンザＡウイルスクラスＨ５抗原に由来する、薬物、特にワクチンの製造のための、異種核酸を含む組み換え修飾ワクシニアウイルス・アンカラ（ＭＶＡ）の使用が、上記に概説された問題を解決することを見出している。特にインフルエンザＨ５Ｎ１ウイルスのＨＡを産生するＭＶＡの接種は、一回の接種の後でさえ、強力な抗体応答を誘導し、それは同種および異種チャレンジ感染に対する防御と相関した。非常に驚くべきことに、本発明者らは、特定の第１のＨ５Ｎ１株（ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１５６／９７）由来の特異的抗原を産生するＭＶＡの接種が、異種の第２のＨ５Ｎ１（Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／０４）株での感染に際して疾患に対する良好な防御を誘導することを示すことができる。この防御が前記第２の株に対する検出可能な抗体の非存在下で起こることは非常に驚くべきことである。本発明は、ヒトだけでなく他の動物における鳥インフルエンザの治療のための、薬物、特にワクチンの産生のための異種核酸を含む組み換え修飾ワクシニアウイルス・アンカラ（ＭＶＡ）の使用であって、異種核酸の配列がインフルエンザＡウイルスクラスＨ５抗原に由来する前記使用に関する。
【００１７】
ＭＶＡは元々１２０，０００人以上でヒト天然痘に対する特に安全なワクチンとして試験されている（マイヤー（Ｍａｙｒ），Ａ．，およびＫ．ダナー（Ｄａｎｎｅｒ）．１９７８．『免疫抑制条件下での種痘に対する接種』（Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｐｏｘ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｕｎｄｅｒ ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．）Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ Ｓｔａｎｄ ４１：２２５−３４）。
【００１８】
ＭＶＡベクターワクチンを用いる利点は、ヒトにおける確立された安全性プロファイル、臨床試験における異種抗原のデリバリーの際の効力、およびＧＭＰの要件下でのワクチン大量生産のための技術の利用可能性を含む。
【００１９】
本発明者らは、インフルエンザウイルスＡ／Ｈｏｎｇｋｏｎｇ／１５６／９７（Ａ／ＨＫ／１５６／９７）またはＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／０４（Ａ／ＶＮ／１１９４／０４）のヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子配列も発現するさまざまな組み換えＭＶＡウイルスを構築している。これらのウイルスは、３つの異なるＨ５Ｎ１ウイルスに対する防御免疫の誘導を評価するために、マウスモデルにおけるワクチン候補の役割を果たした。２回投与免疫化法は、異種Ｈ５Ｎ１ウイルスと部分的に交差反応した強い抗体応答を誘導し；導かれた抗体応答は、同種および異種インフルエンザウイルスでのチャレンジ感染に対する防御と相関した。
【００２０】
本発明に記載のワクチン（ＭＶＡ）は、感染を引き起こす株がワクチン抗原と完全には一致しない場合でさえ、重度の臨床徴候および気道における組織病理学的変化から個体を保護する幅広い免疫応答を誘導しうる。本発明に記載の組み換えＭＶＡベクターは、ヒトにおける使用のための好ましいワクチン候補となるいくつかの性質を有する。
【００２１】
まず、本発明に記載の組み換えＭＶＡは、哺乳類細胞におけるそれらの明確な複製不全、および、免疫抑制マカク（ｍａｃａｑｕｅ）におけるＭＶＡの安全性（スティテラー（Ｓｔｉｔｔｅｌａａｒ），Ｋ．Ｊ．，Ｔ．クイケン（Ｋｕｉｋｅｎ），Ｒ．Ｌ．デ・スワート（ｄｅ Ｓｗａｒｔ），他 ２００１．『免疫抑制マカクにおける修飾ワクシニアウイルス・アンカラ（ＭＶＡ）の安全性』（Ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ Ａｎｋａｒａ （ＭＶＡ） ｉｎ ｉｍｍｕｎｅｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ ｍａｃａｑｕｅｓ．）Ｖａｃｃｉｎｅ １９：３７００−９．）またはＨＩＶ感染者に対する高用量の組み換えＭＶＡの無害な使用（ハラー（Ｈａｒｒｅｒ），Ｅ．；Ｍ．バウアール（Ｂａｕｅｒｌｅ），Ｂ．フェスツル（Ｆｅｒｓｔｌ），他２００５．『ＨＡＡＲＴ中のＨＩＶ−１感染患者の組み換えＨＩＶ−１ｎｅｆ発現ＭＶＡの治療的接種：安全性、免疫原性および治療中断中のウイルス量に対する影響』（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ＨＩＶ−１−ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｏｎ ＨＡＡＲＴ ｗｉｔｈ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＨＩＶ−１ ｎｅｆ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ＭＶＡ：ｓａｆｅｔｙ，ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｎ ｖｉｒａｌ ｌｏａｄ ｄｕｒｉｎｇ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｉｏｎ．）Ａｎｔｉｖｉｒ Ｔｈｅｒ １０：２８５−３００；グーネチレケ（Ｇｏｏｎｅｔｉｌｌｅｋｅ），Ｎ．，Ｓ．ムーア（Ｍｏｏｒｅ），Ｌ．ダリー（Ｄａｌｌｙ），他 ２００６．『ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープと結合したＨＩＶ−１ Ｇａｇを発現する、ＤＮＡベクターおよび修飾ワクシニアウイルス・アンカラベクターワクチンのプライムブースト法を用いることによる、健常人において増殖可能な１型ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）特異的多機能性Ｔ細胞の誘導』（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ （ＨＩＶ−１）−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｅａｌｔｈｙ ｓｕｂｊｅｃｔｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ａ ｐｒｉｍｅ−ｂｏｏｓｔ ｒｅｇｉｍｅｎ ｏｆ ＤＮＡ− ａｎｄ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ Ａｎｋａｒａ−ｖｅｃｔｏｒｅｄ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ＨＩＶ−１ Ｇａｇ ｃｏｕｐｌｅｄ ｔｏ ＣＤ８＋ Ｔ−ｃｅｌｌ ｅｐｉｔｏｐｅｓ．）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８０：４７１７−２８）を含む、それらのよく確立されたｉｎ ｖｉｖｏ非病原性のため、極めて安全なウイルスベクターと考えることができる。
【００２２】
次に、ＭＶＡワクチンの工業規模生産は、オルソポックスウイルス関連の生物脅威に対する第３世代ワクチンとしてＭＶＡを開発するために行われた努力のために、非常に実現可能性が高いように見える（ボルマー（Ｖｏｌｌｍａｒ），Ｊ．，Ｎ．アーンツ（Ａｒｎｄｔｚ），Ｋ．Ｍ．エクル（Ｅｃｋｌ），他 ２００６．『第三世代天然痘ワクチンとしての有望候補インバミュンの安全性および免疫原性』（Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ＩＭＶＡＭＵＮＥ，ａ ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ａｓ ａ ｔｈｉｒｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｍａｌｌｐｏｘ ｖａｃｃｉｎｅ．）Ｖａｃｃｉｎｅ １５；２４：２０６５−７０）。
【００２３】
３つめに、本発明に記載のＭＶＡベクターワクチンは、複数の異種抗原を送ることができ、および高レベルの体液性および細胞性免疫の同時誘導を可能にし、多価ワクチンを開発する可能性を提供する。
【００２４】
さらに、ＭＶＡに基づくワクチンの製造は、従来のインフルエンザワクチンのための既存の製造能力に依存しない。このように、ＭＶＡに基づくワクチンの製造は、パンデミック出現時に、ワクチン用量の予見される不足を低減するのに役立ちうる。もう１つの利点は、これらのワクチンの優れた免疫原性が、アジュバントの使用に依存しないことである。
【００２５】
修飾ワクシニアウイルス・アンカラ（ＭＶＡ）は、ワクシニアウイルスのニワトリ細胞適応株である。動物接種時に見出されたその非病原性および哺乳類起源の大部分の細胞において相当量の新しいウイルス子孫を生じる能力の著しい不全のため、ＭＶＡはバイオセイフティーレベル１の実験室条件下で使用されうる。ＭＶＡは著しい副作用を起こすことなく、天然痘予防接種を受けた１０００００人以上で予備免疫化について試験されているため、ＭＶＡは、高い安全性プロファイルを有する、組み換え遺伝子の発現のための効率的なベクターウイルス（サッター（Ｓｕｔｔｅｒ），Ｇ．，およびＢ．モス（Ｍｏｓｓ）．１９９２．『非複製ワクシニアベクターが組み換え遺伝子を効率的に発現する』（Ｎｏｎｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｅｃｔｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｇｅｎｅｓ．）ＰＮＡＳ ８９：１０８４７−５１．）および組み換えワクチン候補（モス（Ｍｏｓｓ），Ｂ．，Ｍ．Ｗ．キャロル（Ｃａｒｒｏｌｌ），Ｌ．Ｓ．ワイアット（Ｗｙａｔｔ），他 １９９６．『ワクチン候補としての宿主範囲が限定された非複製ワクシニアウイルスベクター』（Ｈｏｓｔ ｒａｎｇｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ，ｎｏｎ−ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｓ ｖａｃｃｉｎｅ ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ．）Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ ３９７：７−１３）の役割を果たす。いくつかのＭＶＡベクターワクチンが既に臨床評価に入っている（マクコンキー（ＭｃＣｏｎｋｅｙ），Ｓ．Ｊ．，Ｗ．Ｈ．リース（Ｒｅｅｃｅ），Ｖ．Ｓ．モーシー（Ｍｏｏｒｔｈｙ），他 ２００３．『ヒトにおいて組み換え修飾ワクシニアウイルス・アンカラでブーストされたプラスミドＤＮＡワクチンのＴ細胞免疫原性増大』（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｔ−ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｂｏｏｓｔｅｄ ｂｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ Ａｎｋａｒａ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ．）Ｎａｔ Ｍｅｄ ９： ７２９−３５； コスマ（Ｃｏｓｍａ），Ａ．，Ｒ．ナガラジ（Ｎａｇａｒａｊ），Ｓ．ビューラー（Ｂｕｅｈｌｅｒ），他 ２００３．『慢性ＨＩＶ−１感染者においてＭＶＡ−ＨＩＶ−１ ｎｅｆの治療的接種はＮｅｆ特異的Ｔヘルパー細胞応答を導く』（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＭＶＡ−ＨＩＶ−１ ｎｅｆ ｅｌｉｃｉｔｓ Ｎｅｆ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ−ｈｅｌｐｅｒ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃａｌｌｙ ＨＩＶ−１ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ．）Ｖａｃｃｉｎｅ ２２： ２１−９）。つい最近、ＭＶＡは天然痘に対する第２世代ワクチン候補として再評価されている。本発明によると、本発明に記載の異種核酸は、ＭＶＡのゲノムの非必須領域に組み込まれる。本発明によると、任意のＭＶＡ株が使用されうる。
【００２６】
ＷＯ０３／０９７８４４ Ａ１は４ページでいくつかのＭＶＡ株を開示する。本発明にしたがって使用されうる１つの株は、ＭＶＡ−ＢＮ株またはその誘導体である（ＷＯ ０２／４２４８０）。本発明に記載される非必須領域は、（ｉ）ワクシニアウイルス・コペンハーゲン（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ）株のゲノムに関してＭＶＡゲノムの天然に存在する欠失部位または（ｉｉ）ＭＶＡゲノムの遺伝子間領域から選択されうる。「遺伝子間領域」の語は、好ましくは、コード配列も調節配列も含まない２個の隣接する遺伝子の間に位置するウイルスゲノムの部分をいう。しかし、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ細胞）といった少なくとも１つの細胞培養系で増幅および増殖されうる組み換えを得ることが可能である限り組み込みはウイルスゲノムのどこでもよいことは本発明の範囲内であるため、本発明に記載の異種核酸の組み込みのための挿入部位（非必須領域）は、これらの好ましい挿入部位に限定されない。したがって、非必須領域はまた、ＭＶＡの増殖に用いられる細胞系によって機能が補われうる１または複数の非必須遺伝子でありうる。好ましい一実施形態では、異種核酸はＭＶＡのゲノム内の非必須部位へ組み込まれる。
【００２７】
特に好ましい一実施形態では、本発明に記載の異種核酸は、ＭＶＡゲノムに欠失（ＩＩＩ）の部位で組み込まれる。本発明に記載の異種核酸の組み込みは、ＭＶＡゲノムへの組み込み前に最初に本発明に記載の異種核酸を含む、いわゆる導入ベクターの隣接領域の相同組み換えによって優先的に実施される。相同組み込みに際して組み換えウイルスの選択が実施される。組み換えウイルスを選択するための方法の１つは、宿主範囲遺伝子Ｋ１Ｌの発現である（図５および７を参照）。
【００２８】
好ましい一実施形態では、異種核酸はＭＶＡゲノムに欠失（ＩＩＩ）の部位で組み込まれる。
【００２９】
本発明によると、異種核酸は、ワクシニアウイルス特異的プロモーター、またはオルソポックスウイルス特異的プロモーター、またはポックスウイルス特異的プロモーターの調節下にある。いくつかのプロモーターが本発明に使用されうる。本発明に記載の異種核酸の発現のためには、いくつかのプロモーター、たとえば３０Ｋおよび４０Ｋプロモーター（ＵＳ ５，７４７，３２４，『強力な合成初期後期プロモーター』（Ａ Ｓｔｒｏｎｇ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｅａｒｌｙ−Ｌａｔｅ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ）； サッター（Ｓｕｔｔｅｒ）， Ｇ．，Ｌ．Ｓ．ワイアット（Ｗｙａｔｔ），Ｐ．Ｌ．フォレー（Ｆｏｌｅｙ），他 １９９４．『ワクシニアウイルスの宿主範囲限定および高度弱毒化ＭＶＡ株に由来する組み換えベクターがマウスにおいてインフルエンザウイルスに対する防御免疫を刺激する』（Ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖｅｃｔｏｒ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｈｏｓｔ ｒａｎｇｅ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ａｎｄ ｈｉｇｈｌｙ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ＭＶＡ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ ｍｉｃｅ ｔｏ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ．） Ｖａｃｃｉｎｅ １２：１０３２−１０４０）、 Ｐ７．５プロモーター（エンドウ（Ｅｎｄｏ），Ａ．，Ｓ．イタムラ（Ｉｔａｍｕｒａ），Ｈ．リヌマ（Ｉｉｎｕｍａ），他 １９９１．『インフルエンザウイルスのヘマグルチニンまたは核タンパク質を発現する組み換えワクシニアウイルスによるマウスにおけるインフルエンザウイルス感染に対するホモタイプおよびヘテロタイプ防御』（Ｈｏｍｏｔｙｐｉｃ ａｎｄ ｈｅｔｅｒｏｔｙｐｉｃ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｅ ｂｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｏｒ ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ．）Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ７２： ６９９−７０３）、ＰｍＨ５、Ｐ１１および牛痘ウイルスＡ型封入体（ＡＴＩ）遺伝子由来プロモーター（リー（Ｌｉ），Ｙ．，Ｒ．Ｌ．ホール（Ｈａｌｌ），Ｓ．Ｌ．ヤン（Ｙａｎ），Ｒ．Ｗ．モイヤー（Ｍｏｙｅｒ）．１９９８．『アムサクタ・ムーレイ・エントモポックスウイルススフェロイジンの高レベル発現は遺伝子内の配列に依存する』（Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ａｍｓａｃｔａ ｍｏｏｒｅｉ ｅｎｔｏｍｏｐｏｘｖｉｒｕｓ ｓｐｈｅｒｏｉｄｉｎ ｄｅｐｅｎｄｓ ｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｇｅｎｅ．）Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ７９：６１３−２２）。これらのプロモーターのすべてが本発明にしたがって使用されうる。一実施形態では、異種核酸が多量に発現されることが望ましい。ＷＯ０３／０９７８４４Ａ１はＰ７．５、ＰｍＨ５およびＰ１１といったプロモーターが好ましいことを開示する。
【００３０】
本発明によると、異種核酸の配列は、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ３、Ｈ５Ｎ２、Ｈ５Ｎ７、Ｈ７Ｎ１、Ｈ７Ｎ７、Ｈ７Ｎ３およびＨ９Ｎ２配列の群から選択される。好ましくは当該配列はＨ５Ｎ１に由来する。
【００３１】
異種核酸がＨ５Ｎ１に由来する場合、それは好ましくはＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／０４、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／３０４６／０４、Ａ／Ｈｏｎｇｋｏｎｇ／１５６／９７、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／２１２／０３、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／２１３／０３、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５、Ａ／Ｃｋ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／ＢＬ０３／０３、Ａ／Ｇｒｅｙｈｅｒｏｎ／ＨＫ／７９３．１／０２、Ａ／Ｂｌａｃｋ Ｈｅａｄｅｄ Ｇｕｌｌ／ＨＫ／１２．１／０３、Ａ／Ｄｋ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１／０４、Ａ／Ｃｋ／Ｖｉｅｔｎａｍ／３３／０４、Ａ／Ｃｋ／Ｖｉｅｔｎａｍ／Ｃ−５８／０４、Ａ／Ｄｋ／ＴＨ／Ｄ４ＡＴ／０４、Ａ／Ｇｓ／ＴＨ／Ｇ７ＣＳ／０４、Ａ／Ｄｋ／ＦＪ／１７３４／０５、Ａ／Ｃｋ／ＧＸ／４６３／０６およびＡ／Ｃｋ／ＨＫ／９４７／０６と呼ばれる株の群から選択される。
【００３２】
Ｈ５Ｎ１の異種核酸が、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／０４，Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５，Ａ／Ｂａｒ ｈｅａｄｅｄ ｇｏｏｓｅ／Ｑｉｎｇｈａｉ／１Ａ／２００５，Ａ／Ｗｈｏｏｐｅｒ ｓｗａｎ／Ｍｏｎｇｏｌｉａ／２４４／２００５，Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｔｕｒｋｅｙ／１／２００５，およびＡ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５株から選択されることが好ましい。
【００３３】
Ｈ５Ｎ１の異種核酸が、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／０４株のものであることが非常に好ましい。
【００３４】
異種核酸の配列は、ヘマグルチニン遺伝子の配列、または配列の一部を含むことが好ましい。好ましい一実施形態では、異種核酸の配列は、ヘマグルチニン遺伝子のヌクレオチド１ないし１５００の配列、または配列の一部を含む。より好ましい一実施形態ではヌクレオチド１ないし１１００、および非常に好ましい一実施形態ではヌクレオチド４０ないし１１００である。非常に好ましい一実施形態では、異種核酸は、配列番号１、配列番号２および配列番号３から選択される、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／０４に由来するヘマグルチニン遺伝子の配列、または配列の一部を含む。配列番号３が非常に好ましい（表１を参照）。
【表１】
2010510281.tif 000002
2010510281.tif 000003
【００３５】
ヘマグルチニン（ＨＡ）は、インフルエンザウイルス（および多数の他の細菌およびウイルス）の表面上に見られる抗原性糖タンパク質である。それは感染されている細胞へのウイルスの結合を担う。ヘマグルチニンという名称は当該タンパク質が赤血球を互いに凝集させる能力に由来する （ネルソン（Ｎｅｌｓｏｎ） Ｄ．Ｌ．およびコックス（Ｃｏｘ） Ｍ．Ｍ．，２００５．『生化学』（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第４版，フリーマン・パフリッシャーズ（Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ），ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ））。
【００３６】
少なくとも１６の異なるＨＡ抗原が存在する。これらのサブタイプはＨ１からＨ１６と呼ばれる。最後のＨ１６は、スウェーデンおよびノルウェーからのユリカモメから単離されたインフルエンザＡウイルス上に、ごく最近になって発見された （フーシャー（Ｆｏｕｃｈｉｅｒ） ＲＡ，ムンスター（Ｍｕｎｓｔｅｒ） Ｖ，ウォーレンステン（Ｗａｌｌｅｎｓｔｅｎ）Ａ，他 ２００５．『ユリカモメから得られた新規インフルエンザＡウイルスヘマグルチニンサブタイプ（Ｈ１６）の特徴づけ』（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｓｕｂｔｙｐｅ （Ｈ１６） ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｂｌａｃｋ−ｈｅａｄｅｄ ｇｕｌｌｓ．）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７９：２８１４−２２．）。最初の３つのヘマグルチニンＨ１、Ｈ２、およびＨ３はヒトインフルエンザウイルスに見られる。
【００３７】
鳥ウイルス株Ｈ５型ヘマグルチニンにおける単一アミノ酸変化がヒト患者で見つかっており、それは鳥Ｈ５Ｎ１ウイルスの受容体特異性を顕著に変化させることができ、それらにヒトインフルエンザウイルスに最適な受容体と結合する能力を与える（ガンバリャン（Ｇａｍｂａｒｙａｎ），Ａ，Ａ．ツジコフ（Ｔｕｚｉｋｏｖ），Ｇ．パジニナ（Ｐａｚｙｎｉｎａ），他 ２００５．『インフルエンザＡ（Ｈ５）ウイルスの受容体結合表現型の進化』（Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ （Ｈ５） ｖｉｒｕｓｅｓ．）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３４４：４３２−８）。この知見は、通常はヒトに感染しないＨ５Ｎ１ウイルスがどのように変異しヒト細胞を効率的に感染させうるようになれるのかを説明するように見える。Ｈ５Ｎ１ウイルスのヘマグルチニンは、見かけ上タンパク質分解による活性型への変換の容易さのため、このインフルエンザウイルス株の高い病原性と結びつけられている（ハッタ（Ｈａｔｔａ），Ｍ．，Ｐ．ガオ（Ｇａｏ），Ｐ．ハーフマン（Ｈａｌｆｍａｎｎ），他 ２００１．『香港Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡウイルスの高毒性の分子的基礎』（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｆｏｒ Ｈｉｇｈ Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｏｆ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ Ｈ５Ｎ１ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ Ｖｉｒｕｓｅｓ．）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９３：１８４０−１８４２）。
【００３８】
当該核酸がＨＡ１およびＨＡ２サブユニットを含むことが好ましい。ＨＡはホモ三量体膜内在性糖タンパク質である。それは円筒のような形であり、および長さ約１３５Å（オングストローム）である。ＨＡを構成する３個の同一のモノマーは中心のαへリックスコイルにおいて構築され；３個の球状の頭部がシアル酸結合部位を含む。ＨＡモノマーは前駆体として合成され、次いでグリコシル化され、および切断されて２個のより小さいポリペプチドＨＡ１およびＨＡ２サブユニットになる。個々のＨＡモノマーは、ＨＡ２によって膜に繋がれおよび大きいＨＡ１小球が頂点にある長いらせん鎖から成る。ＨＡ１サブユニットが単独で用いられることもまた好ましい。
【００３９】
別の実施形態では、異種核酸は、アミノ酸１〜３５１、アミノ酸３５２〜５００、アミノ酸１５〜３５１、アミノ酸１２０〜１６０、アミノ酸１８０〜２３０およびアミノ酸１２０〜２３０から選択されるアミノ酸配列領域をコードする配列を含む。下記は非常に好ましいアミノ酸１２０〜１６０、アミノ酸１８０〜２３０およびアミノ酸１２０〜２３０である。最も好ましい領域は１２０〜１６０である。異種核酸が、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号１０から選択されるアミノ酸配列をコードすることが非常に好ましい。
【表２】
2010510281.tif 000004
【００４０】
特に好ましい実施形態では、異種核酸は（ａ）単一Ｈ５Ｎ１株の異なる遺伝子またはその一部および／または、（ｂ）異なるＨ５Ｎ１株、に由来する２つ以上の配列をコードする。異なるＨ５Ｎ１株に由来する２つ以上、３つ以上、または４つ以上のＨＡ配列が特に好ましい。さらに、当該２つ以上の異なる配列は、ウイルスのＨＡおよび別の遺伝子に由来しうる。
【００４１】
好ましい一実施形態では、異種核酸の配列は、ヌクレオチド１ないし１５００（配列番号１）のヘマグルチニン遺伝子の配列、または配列の一部を含む。より好ましい一実施形態ではヌクレオチド１ないし１１００（配列番号２）および非常に好ましい一実施形態ではヌクレオチド４０ないし１１００（配列番号３）である。
【００４２】
好ましい配列はノイラミニダーゼ（ＮＡ）である。ＮＡは、インフルエンザウイルスの表面上に見られる抗原性糖タンパク質酵素であるノイラミニダーゼをコードする。それは感染細胞からの子孫ウイルスの放出に役立つ。ＮＡは、インフルエンザウイルス特異的免疫応答、すなわち抗体、および異なるウイルス変異株またはサブタイプに対する交差防御に貢献しうるＴ細胞を導く、可能な標的抗原と考えられる。配列番号１５（ノイラミニダーゼ；Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４）が特に好ましい。
【００４３】
好ましい配列はマトリクス配列である。マトリクスをコードする遺伝子部分は、２つの表面タンパク質（ヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼ）と共にウイルスのキャプシド（保護被覆）を構成するマトリクスタンパク質（Ｍ１およびＭ２）である。Ｍ１はウイルスＲＮＡと結合するタンパク質である。配列番号１３（Ｍ１、Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４）が好ましい。
【００４４】
Ｍ２は、ウイルスを脱コートして内容物（８つのＲＮＡセグメント）を宿主細胞の細胞質へ曝露するタンパク質である。Ｍ２膜貫通タンパク質は、効率的な感染に必要なイオンチャンネルである（ロバートＢ．クーチ（Ｒｏｂｅｒｔ Ｂ．Ｃｏｕｃｈ），『オルトミクソウイルス』（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｕｓｅｓ），バロン（Ｂａｒｏｎ）Ｓ．（編）、『医療微生物学』（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ），第４版から，テキサス大学医学部ガルベストン校（Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｒａｎｃｈ ａｔ Ｇａｌｖｅｓｔｏｎ）．１９９６．ＩＳＢＮ ０−９６３１１７２−１−１）。一部Ｈ５Ｎ１遺伝子型Ｍ２のアミノ酸置換（Ｓｅｒ３１Ａｓｎ）はアマンタジン耐性と関連する （グアン（Ｇｕａｎ），Ｙ．，Ｌ．Ｌ．プーン（Ｐｏｏｎ），Ｃ．Ｙ．チューン（Ｃｈｅｕｎｇ），他 ２００４．『Ｈ５Ｎ１インフルエンザ：変幻自在なパンデミック脅威』（Ｈ５Ｎ１ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ： Ａ ｐｒｏｔｅａｎ ｐａｎｄｅｍｉｃ ｔｈｒｅａｔ）ＰＮＡＳ １０８：８１５６−８１６１；リー（Ｌｅｅ），Ｃ．−Ｗ．，Ｄ．Ｌ．スアレス（Ｓｕａｒｅｚ），Ｔ．Ｍ．タンピー（Ｔｕｍｐｅｙ），他 ２００５．『韓国で単離された高病原性Ｈ５Ｎ１鳥インフルエンザＡウイルスの特徴づけ』（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｉｇｈｌｙ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｈ５Ｎ１ Ａｖｉａｎ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ Ｖｉｒｕｓｅｓ Ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ．）ＪＶｉｒｏｌ，７９：３６９２−３７０２，また、ミネソタ大学感染症研究および政策学術健康センター・パンデミックインフルエンザセンター（Ｐａｎｄｅｍｉｃ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｐｏｌｉｃｙ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｃｅｎｔｅｒ −− Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ））。配列番号 １４ （Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４； Ｍ２）が好ましい。Ｍ１および Ｍ２は、インフルエンザウイルス特異的免疫応答、すなわち抗体、および異なるウイルス変異株またはサブタイプに対する交差防御に貢献しうるＴ細胞を導く、可能な標的抗原と考えられる。
【００４５】
このように、一実施形態では２つ以上のＨＡ抗原が用いられる。一実施形態では１つ以上のＨＡ抗原がＮＡ、Ｍ１、またはＭ２と組み合わされる。好ましい一実施形態ではＭ１、Ｍ２、ＮＡ、ＮＰおよびＨＡが組み合わされる。非常に好ましい一実施形態ではこれらは配列番号：１１（ＮＰ；ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１５６／９７）、１２（ＮＰ；Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／０４）、１３（Ｍ１；Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／０４）、１４（Ｍ２；Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／０４）および／または配列番号１５（ＮＡ；Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／０４）によってコードされる。
【００４６】
特に好ましい一実施形態では、当該２つ以上の配列は、ヘマグルチニン、またはヘマグルチニンの一部をコードし、およびＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／０４、Ｖｉｅｔｎａｍ／３０４６／０４、Ａ／Ｂａｒｈｅａｄｅｄｇｏｏｓｅ／Ｑｉｎｇｈａｉ／１Ａ／２００５、Ａ／Ｗｈｏｏｐｅｒｓｗａｎ／Ｍｏｎｇｏｌｉａ／２４４／２００５、Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｔｕｒｋｅｙ／１／２００５、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５、および／またはＡ／ＩＮＤ／５／０５に由来する。
【表３】
2010510281.tif 000005
2010510281.tif 000006
【００４７】
本発明の別の一態様では、本発明は、（ａ）異種核酸がＭＶＡのゲノム内の非必須部位に組み込まれている、（ｂ）異種核酸がワクシニアウイルスプロモーター、またはオルソポックスウイルスプロモーター、またはポックスウイルス特異的プロモーターの調節下にあり、および、（ｃ）異種核酸がインフルエンザＡウイルスクラスＨ５に由来する遺伝子または遺伝子の一部をコードする核酸の群から選択される、異種核酸を含む組み換え修飾ワクシニアウイルス・アンカラ（ＭＶＡ）に関する。修飾ワクシニアウイルス・アンカラ（ＭＶＡ）は、ワクシニアウイルスのニワトリ細胞適応株である。動物接種時に見出されたその非病原性および哺乳類起源の大部分の細胞において相当量の新しいウイルス子孫を生じる能力の著しい不全のため、ＭＶＡはバイオセイフティーレベル１の実験室条件下で使用されうる。ＭＶＡは著しい副作用を起こすことなく、天然痘予防接種を受けた１０００００人以上で予備免疫化について試験されているため、ＭＶＡは、高い安全性プロファイルを有する、組み換え遺伝子の発現のための効率的なベクターウイルス（サッター（Ｓｕｔｔｅｒ），Ｇ．，および Ｂ．モス（Ｍｏｓｓ）．１９９２．『非複製ワクシニアベクターが組み換え遺伝子を効率的に発現する』（Ｎｏｎｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｅｃｔｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｇｅｎｅｓ．）ＰＮＡＳ ８９：１０８４７−５１．） および組み換えワクチン候補（モス（Ｍｏｓｓ），Ｂ．，Ｍ．Ｗ．キャロル（Ｃａｒｒｏｌｌ），Ｌ．Ｓ．ワイアット（Ｗｙａｔｔ），他 １９９６．『ワクチン候補としての宿主範囲限定された非複製ワクシニアウイルスベクター』（Ｈｏｓｔ ｒａｎｇｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ，ｎｏｎ−ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｓ ｖａｃｃｉｎｅ ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ．）Ｖａｃｃｉｎｅ Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ ３９７：７−１３）の役割を果たす。いくつかのＭＶＡベクターワクチンが既に臨床評価に入っている（マクコンキー（ＭｃＣｏｎｋｅｙ），Ｓ．Ｊ．，Ｗ．Ｈ．リース（Ｒｅｅｃｅ），Ｖ．Ｓ．モーシー（Ｍｏｏｒｔｈｙ），他 ２００３．『ヒトにおいて組み換え修飾ワクシニアウイルス・アンカラでブーストされたプラスミドＤＮＡワクチンのＴ細胞免疫原性増大』（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｔ−ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｂｏｏｓｔｅｄ ｂｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ Ａｎｋａｒａ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ．）Ｎａｔ Ｍｅｄ ９： ７２９−３５；コスマ（Ｃｏｓｍａ），Ａ．，Ｒ．ナガラジ（Ｎａｇａｒａｊ），Ｓ．ビューラー（Ｂｕｅｈｌｅｒ），他 ２００３．『慢性ＨＩＶ−１感染者においてＭＶＡ−ＨＩＶ−１ ｎｅｆの治療的接種は Ｎｅｆ特異的Ｔヘルパー細胞応答を導く』（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＭＶＡ−ＨＩＶ−１ ｎｅｆ ｅｌｉｃｉｔｓ Ｎｅｆ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ−ｈｅｌｐｅｒ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃａｌｌｙ ＨＩＶ−１ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ．）Ｖａｃｃｉｎｅ ２２： ２１−９）。つい最近、ＭＶＡは天然痘に対する第２世代ワクチン候補として再評価されている。本発明によると、本発明に記載の異種核酸は、ＭＶＡのゲノムの非必須領域に組み込まれる。本発明によると、任意のＭＶＡ株が使用されうる。
【００４８】
ＷＯ ０３／０９７８４４ Ａ１は４ページでいくつかのＭＶＡ株を開示する。本発明にしたがって使用されうる１つの株は、ＭＶＡ−ＢＮ株またはその誘導体である（ＷＯ ０２／４２４８０）。本発明に記載される非必須領域は、（ｉ）ワクシニアウイルス・コペンハーゲン（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ）株のゲノムに関してＭＶＡゲノムの天然に存在する欠失部位または（ｉｉ）ＭＶＡゲノムの遺伝子間領域から選択されうる。「遺伝子間領域」の語は、好ましくは、ウイルスゲノムの２個の隣接する遺伝子の間に位置する、コード配列も調節配列も含まない部分をいう。しかし、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ細胞）といった少なくとも１つの細胞培養系で増幅および増殖されうる組み換えを得ることが可能である限り組み込みはウイルスゲノムのどこでもよいことは本発明の範囲内であるため、本発明に記載の異種核酸の組み込みのための挿入部位（非必須領域）は、これらの好ましい挿入部位に限定されない。したがって、非必須領域はまた、ＭＶＡの増殖に用いられる細胞系によって機能が補われうる１または複数の非必須遺伝子でありうる。
【００４９】
好ましい一実施形態では、異種核酸はＭ１、Ｍ２、ＮＡ、ＮＰおよびＨＡを含み、ここでＭ１、Ｍ２およびＮＡは欠失ＩＩに位置し、ＮＰは欠失ＶＩに位置し、およびＨＡは欠失ＩＩＩに位置する。
【００５０】
これらは下記の株ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１５６／９７およびＶｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４に由来することが非常に好ましい。特に好ましい一実施形態ではこれらは配列番号１１、１２、１３、１４および１５の配列を有する。
【００５１】
異種核酸は、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ３、Ｈ５Ｎ２、Ｈ７Ｎ７、Ｈ３Ｎ２およびＨ７Ｎ３ゲノム配列の群から選択されるのが好ましい。
【００５２】
異種核酸は、Ｈ５Ｎ１に由来しおよびＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／０４、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／３０４６／０４、Ａ／Ｈｏｎｇｋｏｎｇ／１５６／９７、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／２１２／０３、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／２１３／０３、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５、Ａ／Ｃｋ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／ＢＬ０３／０３、Ａ／Ｇｒｅｙｈｅｒｏｎ／ＨＫ／７９３．１／０２、Ａ／Ｂｌａｃｋ Ｈｅａｄｅｄ Ｇｕｌｌ／ＨＫ／１２．１／０３、Ａ／Ｄｋ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１／０４、Ａ／Ｃｋ／Ｖｉｅｔｎａｍ／３３／０４、Ａ／Ｃｋ／Ｖｉｅｔｎａｍ／Ｃ−５８／０４、Ａ／Ｄｋ／ＴＨ／Ｄ４ＡＴ／０４、Ａ／Ｇｓ／ＴＨ／Ｇ７ＣＳ／０４、Ａ／Ｄｋ／ＦＪ／１７３４／０５、Ａ／Ｃｋ／ＧＸ／４６３／０６、Ａ／Ｃｋ／ＨＫ／９４７／０６と呼ばれる株の群から選択されるのが好ましい。
【００５３】
別の一実施形態では、異種核酸はＨ５Ｎ１に由来し、およびＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／０４、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５、Ａ／Ｂａｒ ｈｅａｄｅｄ ｇｏｏｓｅ／Ｑｉｎｇｈａｉ／１Ａ／２００５、Ａ／Ｗｈｏｏｐｅｒ ｓｗａｎ／Ｍｏｎｇｏｌｉａ／２４４／２００５、Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｔｕｒｋｅｙ／１／２００５、およびＡ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５と呼ばれる株の群から選択される。
【００５４】
Ｈ５Ｎ１の異種核酸はＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／０４株のものであることが非常に好ましい。
【００５５】
一実施形態では、異種核酸の配列は、ヘマグルチニン遺伝子の配列、または配列の一部を含む（上記参照）。別の実施形態では、異種核酸は、アミノ酸１〜３５１、アミノ酸３５２〜５００、アミノ酸１５〜３５１、アミノ酸１２０〜１６０、アミノ酸１８０〜２３０およびアミノ酸１２０〜２３０から選択されるアミノ酸配列をコードする配列を含む。下記が非常に好ましいアミノ酸１２０〜１６０、アミノ酸１８０〜２３０およびアミノ酸１２０〜２３０である。最も好ましい領域は１２０〜１６０である。
【００５６】
さらに、他の２つのウイルスとは抗原的に異なる第３のＨ５Ｎ１変異株Ａ／ＩＮＤ／５／０５がマウスのチャレンジ感染に用いられた。組み換えＭＶＡ−ＨＡ−ＨＫ／９７は高度に免疫原性であった。単回免疫化は既にインフルエンザウイルスＡ／ＨＫ／１５６／９７に対する強い抗体応答を誘導し、それがさらに第２の接種によってブーストされた。これらの抗体は、Ａ／ＶＮ／１１９４／０４またはＡ／ＩＮＤ／５／０５を用いたＨＩおよびＶＮアッセイでは交差反応性でなかった。ＭＶＡ−ＨＡ−ＶＮ／０４は免疫原性がより低かったが、しかし２回の免疫化後、相当な抗体応答が、相同ウイルスに対してだけでなく、Ａ／ＨＫ／１５６／９７に対しても、およびより低い程度でＡ／ＩＮＤ／５／０５に対しても観察された。観察された抗体反応性パターンは、感染後フェレット血清で感染されたものと同様である。このように、ＭＶＡ−ＨＡ接種によって誘導された抗体について観察された、抗体認識パターンにおけるこの非対称性は、元のインフルエンザウイルスでの感染後に誘導された抗体について観察されたものと全面的に似ていた。
【００５７】
実験動物における抗原特異的抗体の産生の研究において、全ウイルス抗原ＮＩＢＲＧ−１４ワクチン製剤は、陽性対照として実験に含められ、およびスティミューン（Ｓｔｉｍｕｎｅ）（登録商標）油中水アジュバント、別名スペコール（Ｓｐｅｃｏｌ）の使用と組み合わせて高度に免疫原性であった。この実験ワクチンは、相同インフルエンザウイルスＡ／ＶＮ／１１９４／０４に対してだけでなく、他の２つのＨ５Ｎ１株に対しても、強い抗体応答を誘導した。その３つのＨ５Ｎ１株に対して測定したＨＩおよびＶＮ抗体力価は、チャレンジ感染に対する防御と直接相関した。
【００５８】
ＭＶＡ−ＨＡ−ＨＫ／９７免疫化マウスは同種チャレンジ感染に対してのみ防御された。接種はウイルス複製を完全に防ぎ、および結果として、組織病理学的変化も臨床徴候もこれらのマウスには観察されなかった。ＭＶＡ−ＨＡ−ＨＫ／９７誘導型抗体はインフルエンザウイルスＡ／ＶＮ／１１９４／０４と交差反応しなかったが、このウイルスの複製は低減され、および免疫化動物は臨床徴候から防御された（表１）。
【００５９】
対照的に、インフルエンザウイルスＡ／ＩＮＤ／５／０５でのチャレンジ感染に対しては防御作用は見られなかった。ＭＶＡ接種は防御に貢献できた可能性がある（３）強いＣＴＬ応答を誘導できることが知られているが、Ｈ−２ｂに制限される交差反応性ＣＴＬエピトープがインフルエンザＨ５Ｎ１ウイルスのＨＡ分子上に存在するかどうかは現在不明である。ＭＶＡ−ＨＡ−ＶＮ／０４での免疫化は、相同株に対する完全排除（ｓｔｅｒｉｌｉｚｉｎｇ）免疫を誘導した。加えて、抗原的に異なるインフルエンザウイルスＡ／ＨＫ／１５６／９７およびＡ／ＩＮＤ／５／０５に対して強い防御作用が観察された。これらのウイルスの複製は大部分の免疫化動物で概ね低減され、それは気道における感染細胞の非存在および臨床徴候の欠如と相関した。防御はおそらく、肺胞上皮への循環から滲出するウイルス中和ＨＡ特異的血清抗体に基づく（イトウ（Ｉｔｏ），Ｒ．，Ｙ．Ａ．オザキ（Ｏｚａｋｉ），Ｔ．ヨシカワ（Ｙｏｓｈｉｋａｗａ），Ｈ．ハセガワ（Ｈａｓｅｇａｗａ），Ｙ．サトウ（Ｓａｔｏ），Ｙ．スズキ（Ｓｕｚｕｋｉ），Ｒ．イノウエ（Ｉｎｏｕｅ），Ｔ．モリシマ（Ｍｏｒｉｓｈｉｍａ），Ｎ．コンドウ（Ｋｏｎｄｏ），Ｔ．サタ（Ｓａｔａ），Ｔ．クラタ（Ｋｕｒａｔａ），および Ｓ．タムラ（Ｔａｍｕｒａ）．２００３．『致死性インフルエンザ肺炎の予防において接種マウスの気道のさまざまな部位における抗ヘマグルチニン ＩｇＡおよびＩｇＧ 抗体の役割』（Ｒｏｌｅｓ ｏｆ ａｎｔｉｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ＩｇＡ ａｎｄ ＩｇＧ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｉｔｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｔｒａｃｔ ｏｆ ｖａｃｃｉｎａｔｅｄ ｍｉｃｅ ｉｎ ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ ｌｅｔｈａｌ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ．）Ｖａｃｃｉｎｅ ２１：２３６２−７１）。
【００６０】
ＨＡ配列およびその他の配列は、全体が存在する必要は無い。それらは、たとえばより良く発現されるために、たとえばコドン最適化されうる。
【００６１】
本発明に記載の組み換え 修飾ワクシニアウイルス・アンカラ（ＭＶＡ）について、核酸がＨＡ１およびＨＡ２サブユニットを含むことが好ましい。
【００６２】
一実施形態では、本発明に記載の組み換え修飾ワクシニアウイルス・アンカラ（ＭＶＡ）の核酸は、（ａ）単一Ｈ５Ｎ１株の異なる遺伝子またはその一部および／または、（ｂ）異なるＨ５Ｎ１株、に由来する２つ以上の配列をコードする。そのような実施形態は上記に詳しく概説されている。
【００６３】
好ましい一実施形態では、当該２つ以上の配列は、ヘマグルチニン、またはヘマグルチニンの一部をコードし、およびＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／０４、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／３０４６／０４、Ａ／Ｈｏｎｇｋｏｎｇ／１５６／９７、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／２１２／０３、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／２１３／０３、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５、Ａ／Ｃｋ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／ＢＬ０３／０３、Ａ／Ｇｒｅｙ ｈｅｒｏｎ／ＨＫ／７９３．１／０２、Ａ／Ｂｌａｃｋ Ｈｅａｄｅｄ Ｇｕｌｌ／ＨＫ／１２．１／０３、Ａ／Ｄｋ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１／０４、Ａ／Ｃｋ／Ｖｉｅｔｎａｍ／３３／０４、Ａ／Ｃｋ／Ｖｉｅｔｎａｍ／Ｃ−５８／０４、Ａ／Ｄｋ／ＴＨ／Ｄ４ＡＴ／０４、Ａ／Ｇｓ／ＴＨ／Ｇ７ＣＳ／０４、Ａ／Ｄｋ／ＦＪ／１７３４／０５、Ａ／Ｃｋ／ＧＸ／４６３／０６ または Ａ／Ｃｋ／ＨＫ／９４７／０６に由来する。
【００６４】
一実施形態では本発明は、上記で概説される本発明に記載の修飾ワクシニアウイルス・アンカラ（ＭＶＡ）をコードする核酸に関する。
【００６５】
別の一実施形態では本発明は、本発明に記載の組み換えＭＶＡでの標的細胞の感染を含む、本発明に記載の組み換えＭＶＡを標的細胞へ導入する方法に関する。
【００６６】
本発明はまた、必要とするヒトを含む動物生体へ本発明に記載のＭＶＡの治療上有効な量を投与することを含む、ヒトを含む動物生体の免疫化のための方法に関する。
【００６７】
別の一実施形態では本発明は、本発明に記載のＭＶＡでの標的細胞の感染を含む、本発明に記載のＭＶＡを標的細胞へ導入する方法に関する。
【００６８】
ウイルスは標準的方法にしたがって増殖および力価測定される。ワクチン製剤を作製するために、ウイルスは定型的に、ショ糖による超遠心分離によって精製、およびたとえば１ｍＭトリス／ＨＣｌ ｐＨ９．０中で再構成されうる。ウサギ腎臓（ＲＫ１３、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−３７（商標））細胞は１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）添加最小基礎培地（ＭＥＭ）中で増殖および３７℃および５％ＣＯ2にて維持できる。ＣＥＦ細胞は６ウェル組織培養プレートで増殖および感染効率２０感染単位のＭＶＡで感染させうる。
【００６９】
低または高感染効率増殖プロファイルを測定するために、集密ＣＥＦ単層（６ウェルプレート上で増殖）を、細胞あたり各０．０５感染単位（ＩＵ）または１０ＩＵのＭＶＡまたは本発明に記載のＭＶＡでそれぞれ感染させる。６０分間３７°Ｃのウイルス吸収後、接種材料を除去する。細胞をＲＰＭＩ１６４０で２回洗浄し、および２％ＦＣＳを含む新しいＲＰＭＩ１６４０培地で３７℃および５％ＣＯ2にてインキュベートする。感染後（ｐ．ｉ．）複数の時点で、感染細胞を採集でき、および凍結融解と続いて簡潔な超音波処理によってウイルスが放出されうる。結果として生じる溶解物の連続希釈を６ウェルプレートで増殖させた集密ＣＥＦ単層に２連で播種し、および４８時間のインキュベート期間後、単層を氷冷アセトン：メタノール（１：１）中で短時間固定でき、および細胞を６０分間、ポリクローナルウサギ抗ワクシニア抗体（ＩｇＧ画分、バイオジェネシス社（Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｌｔｄ．）、英国プール（Ｐｏｏｌ））とインキュベートし、次いで４５分間、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ポリクローナルヤギ抗ウサギ抗体（ディアノバ社（Ｄｉａｎｏｖａ）、ハンブルク（Ｈａｍｂｕｒｇ））とインキュベートする。ＰＢＳで洗浄後、抗体標識化細胞をｏ−ジアニシジン（シグマ社（Ｓｉｇｍａ）、ドイツ、タウフキルヒェン（Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ））基質溶液を用いて発色させ、染色された細胞の群を計数し、およびウイルス力価をＩＵ／ｍｌとして計算できる。
【００７０】
本発明の一実施形態によると、本発明は、本発明に記載のＭＶＡの治療上有効な量を必要とするヒトを含む動物生体へ投与することを含む、ヒトを含む動物生体の免疫化のための方法に関する。本発明に記載の前記方法は、（成分およびキャリヤーに加えて）希釈剤、一般的な増量剤、塩、緩衝剤、安定剤、可溶化剤および本分野でよく知られている他の材料もまた含みうる組成物を含みうる。これらは薬学的に許容可能なものである必要がある。
【００７１】
「薬学的に許容可能な」の語は、本発明に記載のＭＶＡの生物活性の有効性に緩衝しない無毒性材料を意味する。キャリヤーの特徴は投与経路に依存する。医薬組成物はさらに、活性を増大する、または治療において使用する他の試薬を含みうる。そのような追加の因子および／または試薬は、相乗効果を生じるために、または副作用を最小化するために、本発明に記載の免疫化のための方法に用いるための医薬組成物に含まれうる。本発明に記載のＭＶＡの処方および投与のための方法は、『レミントン薬学科学』（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に見ることができる（マック・パブリッシング・カンパニー（Ｍｕｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ）、ペンシルベニア州イーストン（Ｅａｓｔｏｎ）、最新版）。
【００７２】
本発明に記載の免疫化のための方法は、ＭＶＡの治療上有効な量を利用する。治療上有効な用量とはさらに、症状の緩和、たとえばそのような症状の治療、治癒、予防または緩和を結果として生じるに十分な化合物／成分の量をいう。ワクチンを調製するために、本発明にしたがって作製されたＭＶＡワクシニアウイルスが、生理的に許容可能な形に変換される。これは、天然痘に対する接種に用いられるワクチンの調製の長年にわたる経験に基づいて実施されうる（カプラン（Ｋａｐｌａｎ）Ｃ．１９６９．『天然痘に対する免疫化』（Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｓｍａｌｌｐｏｘ．） Ｂｒ Ｍｅｄ Ｂｕｌｌ．２５：１３１−１３５）。典型的には、組み換えＭＶＡの約１０6〜１０7粒子を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１００ｍｌ中で、２％ペプトンおよび１％ヒトアルブミンの存在下でアンプル、好ましくはガラスアンプル内で凍結乾燥する。凍結乾燥物は、マンニトール、デキストラン、糖、グリシン、ラクトースまたはポリビニルピロリドンといった増量剤、または非経口投与に適する他の助剤（たとえば抗酸化剤、安定剤など）を含みうる。ガラスアンプルを次いで封じ、および好ましくは２０℃以下の温度にて、数ヶ月保存できる。接種のために、凍結乾燥物を０．１から０．２ｍｌの水系溶液、好ましくは生理食塩水に溶解し、およびたとえば皮内接種によって非経口的に投与できる。本発明に記載のワクチンは、好ましくは皮内に注射される。軽度の腫脹および発赤、時にはまたかゆみが注射部位に見出されうる。投与様式、用量および投与回数は、当業者によって公知の方法で最適化されうる。外来抗原に対する高レベルの免疫応答を得るために、必要に応じてワクチンを数回、長期間にわたって投与することが都合がよい。好ましい一実施形態では、免疫化は予防的および／または治療的の両方でありうる。
【００７３】
本発明は、ワクチン、ワクチンで充填済みのシリンジ、および保存および投与の他の様式を含む接種キットに関する。
【００７４】
一実施形態では、動物生体は哺乳類であり、一実施形態では動物生体は鳥類である。好ましい一実施形態では動物生体はニワトリまたはヒトである。
【００７５】
一実施形態では、前記免疫化は予防的および／または治療的の両方でありうる。
【実施例】
【００７６】
ワクチン調製
Ｈ５Ｎ１ウイルスはＭＤＣＫ細胞で増殖され、およびウイルスＲＮＡは培養上清から高純度ＲＮＡ単離キット（ロシュ社（Ｒｏｃｈｅ）、オランダ、アルメレ（Ａｌｍｅｒｅ））を用いて抽出された。続いてｃＤＮＡをｖＲＮＡからスーパースクリプト（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ）逆転写酵素（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国カリフォルニア州カールスバード（Ｃａｒｌｓｂａｄ））および５'−ＡＧＣＡＡＡＡＧＣＡＧＧ−３'（配列番号９）オリゴヌクレオチド（ユーロジェンテック社（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）、ベルギー、スラン（Ｓｅｒａｉｎｇ））をプライマーとして用いて合成した。次に、ＨＡ遺伝子配列を、ポリメラーゼ連鎖反応によってＰｆｕ （パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、ストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、米国カリフォルニア州ラ・ジョラ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ））を熱安定性ＤＮＡ ポリメラーゼとして用いて増幅した。プライマー配列を、クローニングプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋（ストラタジーン社、米国カリフォルニア州ラ・ジョラ））への指向的クローニングを円滑化するために、ＮｏｔＩおよびＸｈｏＩ制限部位を入れて伸長した。
【００７７】
ＨＡ遺伝子配列をこれらのプラスミドからＮｏｔＩ／ＸｈｏＩ消化によって調製し、クレノー（Ｋｌｅｎｏｗ）ポリメラーゼで処理して平滑断端を生じ、およびＭＶＡ発現プラスミドｐＩＩＩΔＨＲ−ＰｓｙｎＩＩのＰｍｅｌ部位へクローニングして、ＭＶＡベクタープラスミドｐＩＩＩ−ＨＡ−ＨＫ／９７およびｐＩＩＩ−ＨＡ−ＶＮ／０４を生じた。
【００７８】
ＭＶＡ感染細胞におけるトランスフェクションに際して、これらのプラスミドはＭＶＡゲノム内の欠失ＩＩＩの位置への外来遺伝子の挿入を導き（サッター（Ｓｕｔｔｅｒ），Ｇ．，およびＢ．モス（Ｍｏｓｓ）．１９９２．『非複製ワクシニアベクターが組み換え遺伝子を効率的に発現する』（Ｎｏｎｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｅｃｔｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｇｅｎｅｓ．）ＰＮＡＳ ８９：１０８４７−５１．）およびワクシニアウイルス特異的プロモーターＰｓｙｎＩＩの調節下のＨＡ標的遺伝子の転写を可能にする（ワイアット（Ｗｙａｔｔ），Ｌ．Ｓ．，Ｐ．Ｌ．アール（Ｅａｒｌ），Ｊ．Ｙ．リウ（Ｌｉｕ），他 ２００４．ＡＩＤＳ Ｒｅｓ Ｈｕｍ Ｒｅｔｒ ２０：６４５−６５３）。組み換えウイルスＭＶＡ−ＨＡ−ＨＫ／９７およびＭＶＡ−ＨＡ−ＶＮ／０４は初代ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）で、１μｇプラスミドＤＮＡを用いたトランスフェクション、０．０５感染単位／細胞ＭＶＡ単離物Ｆ６での感染に際して（サッター（Ｓｕｔｔｅｒ），Ｇ．，およびＢ．モス（Ｍｏｓｓ）．１９９２．『非複製ワクシニアベクターが組み換え遺伝子を効率的に発現する』（Ｎｏｎｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｅｃｔｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｇｅｎｅｓ．）ＰＮＡＳ ８９：１０８４７−５１．）、およびＲＫ−１３細胞でのプラーク選択によって生じた（スタイブ（Ｓｔａｉｂ），Ｃ．，Ｉ．ドレクスラー（Ｄｒｅｘｌｅｒ），およびＧ．サッター（Ｓｕｔｔｅｒ）．２００４．『組み換えＭＶＡの構築および単離』（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＭＶＡ．） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２６９：７７−１００）。組み換えＭＶＡゲノムをＰＣＲによって分析して、ＨＡ遺伝子挿入および遺伝的安定性を検証した（データ記載せず）。ＭＶＡベクターウイルスによるＨＡ抗原の産生は、ＭＶＡ−ＨＡ−ＨＫ／９７またはＭＶＡ−ＨＡ−ＶＮ／０４での感染後のさまざまな時点で採取したＣＥＦ細胞溶解物のウェスタンブロット分析によって確認された（データ記載せず）。ＣＥＦでの１段階および多段階増殖分析は、非組み換えＭＶＡと比較して、ＭＶＡ−ＨＡ−ＨＫ／９７およびＭＶＡ−ＨＡ−ＶＮ／０４の同一に近い複製能力を実証した（データ記載せず）。
【００７９】
ワクチン製剤を作製するために、ウイルスをＣＥＦで増幅し、ショ糖による超遠心分離によって精製し、および１ｍＭトリス／ＨＣｌ ｐＨ９．０中で再構成した。ＭＶＡワクチンをＰＢＳ１００μｌに希釈した１０8ＰＦＵの用量で使用した。
【００８０】
不活化全ＮＩＢＲＧ−１４ウイルスは、インフルエンザウイルスＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／０４を基礎として逆遺伝学によって作られたリアソータント（ｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔ）ワクチン株であり、陽性対照として用いられた。凍結乾燥された全ウイルス抗原を蒸留水で２μｇＨＡ／５０μｌの濃度にて再構成し、およびアジュバントのスティミューン（Ｓｔｉｍｕｎｅ）（登録商標）（セディ・ダイアグノスティックス社（Ｃｅｄｉ−Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、オランダ、レリスタッド（Ｌｅｌｙｓｔａｄ））と１：１で混合した。対照マウスにはＰＢＳを接種した。
【００８１】
インフルエンザウイルス
インフルエンザウイルスＡ／ＨＫ／１５６／９７、Ａ／ＶＮ／１１９４／０４およびＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５（Ａ／ＩＮＤ／５／０５）を１１日齢胚含有ニワトリ卵の尿膜腔に接種した。尿膜液を３日後に採取した。感染性ウイルス力価をメイディン・ダービー（Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ）イヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞で以前に記載された通り測定した（リンメルツワーン（Ｒｉｍｍｅｌｚｗａａｎ），Ｇ．Ｆ．，Ｍ．バールス（Ｂａａｒｓ），Ｅ．Ｃ．クラース（Ｃｌａａｓ），他 １９９８．『ｉｎ ｖｉｔｒｏインフルエンザウイルス複製の監視のための方法としてのＲＮＡハイブリダイゼーション、赤血球凝集アッセイ、感染性ウイルスの力価、および免疫蛍光の比較』（Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ＲＮＡ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ，ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｓ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．）Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ４：５７−６６）。
【００８２】
マウス
特定病原体不在雌６〜８週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスをチャールズ・リバー社（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒ）（ドイツ、ズルツフェルト（Ｓｕｌｚｆｅｌｄ））から購入した。マウス（ｎ＝９０）を１８匹の５群に分割し、およびＰＢＳ、ＭＶＡ−ＨＡ−ＨＫ／９７、ＭＶＡ−ＨＡ−ＶＮ／０４、ｗｔＭＶＡ、またはスティミューン（Ｓｔｉｍｕｎｅ）（登録商標）アジュバント化ＮＩＢＲＧ−１４のどれかで免疫した。
【００８３】
免疫化は５０μｌを左後肢に、および５０μｌを右に、筋肉内に実施した。４週間後、眼窩穿刺によって採血し、および動物を再び上記の通り免疫した。さらに４週間後、採血し、および５つのワクチン群（ｎ＝１８）それぞれを各６匹の３部分群に分割した。
【００８４】
各ワクチン群の部分群に、１０3 ＴＣＩＤ50のインフルエンザウイルスＡ／ＨＫ／１５６／９７、Ａ／ＶＮ／１１９４／０４またはＡ／ＩＮＤ／５／０５を含むＰＢＳ５０μｌを鼻腔内経路によって接種した。６匹の非免疫化動物を陰性対照として用い、およびＰＢＳ５０μｌを接種した。動物を感染後４日まで毎日体重測定し、および次いで全採血によって屠殺した。
【００８５】
マウスを屠殺後、下記の臓器を切除した：脳、肺（ホルマリンで膨張させる）、脾臓および腸。すべての群の動物を、チャレンジ感染の時点で適切に年齢を一致させた。
【００８６】
実験プロトコルは実験の開始前に独立の動物倫理委員会によって承認された。筋肉内免疫化、鼻腔内感染、眼窩穿刺および安楽死は吸入イソフルランを用いて麻酔下で実施した。動物はフィルタートップケージ内で飼育し、および飼料および水を自由摂取とした。Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスでの感染の５日間に、動物は、バイオセイフティーレベル３封じ込め施設内でフィルタートップケージ内に置いた。ウイルス毎に１つのＢＳＬ−３アイソレータユニットを用いた。
【００８７】
臓器組織中のウイルス力価
臓器をエタノールを用いてドライアイス上で急速凍結し、および−７０℃にて保存した。臓器をポリトロン（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）ホモジナイザー（キネマティカＡＧ社（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ ＡＧ）、スイス、ルツェルン州リッタウ（Ｌｉｔｔａｕ−Ｌｕｃｅｒｎｅ））を用いて輸送培地（ハンクス（Ｈａｎｋｓ）培地（ＭＥＭ）、グリセロール、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、ポリミキシンＢ、ナイスタチン、ゲンタマイシン、７．５％ＮａＨＣＯ３、１Ｍヘペス（Ｈｅｐｅｓ））中でホモジナイズした。これらの試料の５連の１０倍連続希釈を用いて、ウイルス力価をメイディン・ダービー（Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ）イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ細胞）の集密層上で測定した。
【００８８】
血清学
コレラろ液での処理および５６℃にて熱不活性化後、血清を抗ＨＡ抗体の存在について検査した。この目的のために、１％シチメンチョウ赤血球および４ＨＡ単位のインフルエンザウイルスＡ／ＨＫ／１５６／９７、Ａ／ＶＮ／１１９４／０４またはＡ／ＩＮＤ／５／０５のどれかを用いて標準手順にしたがって、赤血球凝集阻害アッセイ（ＨＩ）を用いた（パーマー（Ｐａｌｍｅｒ），Ｄ．Ｆ．，Ｍ．Ｔ．コールマン（Ｃｏｌｅｍａｎ），Ｗ．Ｒ．ダウドル（Ｄｏｗｄｌｅ），他 １９７５．『インフルエンザ診断のための新検査法』（Ａｄｖａｎｃｅｄ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ），ｐ．５１−５２．免疫学（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）シリーズＮｏ．６．米国保健教育福祉省（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｗｅｌｆａｒｅ）、ワシントンＤ．Ｃ）。この目的のために、基本的な切断部位が除去された逆遺伝学ウイルスを作製した。これらの逆遺伝学ウイルスの使用を検証し、および得られた力価は野生型株に対するものと同等であった（データ記載せず）。血清をまた、微量ウイルス中和（ＶＮ）アッセイを各ウイルス１００ＴＣＩＤ５０を用いて、その３つのインフルエンザウイルスに特異的なウイルス中和抗体の存在について検査した（フランク（Ｆｒａｎｋ），Ａ．Ｌ．，Ｊ．パック（Ｐｕｃｋ），Ｂ．Ｊ．ヒューズ（Ｈｕｇｈｅｓ），他 １９８０．『連続細胞株および新鮮血清増強を用いるインフルエンザＡ および Ｂ および パラインフルエンザ １ および ２ ウイルスについての微量中和試験』（Ｍｉｃｒｏｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ａｎｄ Ｂ ａｎｄ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ １ ａｎｄ ２ ｖｉｒｕｓｅｓ ｔｈａｔ ｕｓｅｓ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ａｎｄ ｆｒｅｓｈ ｓｅｒｕｍ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ．）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １２：４２６−３２）。不活性化Ｈ５Ｎ２インフルエンザウイルスＡ／Ｄｕｃｋ／Ｐｏｔｓｄａｍ／１４０２／８６で２回免疫したハクチョウから得られた過免疫血清（インターベット社（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ）、オランダ、ボクスメール（Ｂｏｘｍｅｅｒ））を、３つの異なるインフルエンザＡウイルスに対する陽性対照として用いた。
【００８９】
組織病理
ホルマリンで膨張させた肺を１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋し、４μｍにて切片を作製し、および組織学的評価のためにヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。さらに、スライドを、インフルエンザＡウイルスの核タンパク質に対するモノクローナル抗体（クローンＨＢ６５ ＩｇＧ２ａ（米国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）））を用いて免疫ペルオキシダーゼ法を用いて染色した。ヤギ抗マウスＩｇＧ２ａＨＲＰ（サザンバイオテック社（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、米国アラバマ州バーミンガム（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ））を二次抗体として用いた。ペルオキシダーゼはジアミノベンジジンを基質として用いて明らかにされ、結果としてインフルエンザＡ感染細胞の核に深赤色の沈澱、および細胞質のより弱い赤色染色を生じた。切片をヘマトキシリンで対比染色した。
【００９０】
統計解析
ウイルス力価および抗体力価についてのデータを、両側スチューデント（Ｓｔｕｄｅｎｔ）ｔアッセイを用いて分析し、および差はＰ＜０．０５にて有意とした。
【００９１】
臨床徴候
感染後２日目から、ＰＢＳまたはｗｔＭＶＡで免疫されたマウスは、感染に用いたインフルエンザＨ５Ｎ１ウイルスとは無関係に、猫背、速い呼吸、被毛の乱れ、および筋力の低下といった臨床徴候を生じた。これらの臨床徴候は、ＭＶＡ−ＨＡ−ＨＫ／９７またはＭＶＡ−ＨＡ−ＶＮ／０４の接種後にインフルエンザウイルスＡ／ＨＫ／１５６／９７またはＡ／ＶＮ／１１９４／０４に感染したマウスでは観察されなかった。ＭＶＡ−ＨＡ−ＶＮ／０４接種はまた、インフルエンザウイルスＡ／ＩＮＤ／５／０５の感染によって引き起こされる臨床徴候の発症も防止した。臨床徴候に対する観察された防御は、感染後の体重減少の低減と相関した（図１）。ＰＢＳおよびｗｔＭＶＡ免疫化マウスでは、１６．２％および１１．５％の平均体重減少がインフルエンザウイルスＡ／ＨＫ／１５６／９７の感染後に（図１Ａ）、または１６．９％および１０．４％がインフルエンザウイルスＡ／ＶＮ／１１９４／０４の感染後に（図１Ｂ）、それぞれ観察された。この体重減少は、ＭＶＡ−ＨＡ−ＨＫ／９７またはＭＶＡ−ＨＡ−ＶＮ／０４の接種によって顕著に低減された（図１）。また、インフルエンザウイルスＡ／ＩＮＤ／５／０５の感染（図１Ｃ）はＰＢＳ免疫化対照マウスまたはｗｔＭＶＡ接種マウス（それぞれ１６．９％および１８．６％）において重度の体重減少を生じ、それはＭＶＡ−ＨＡ−ＶＮ／０４の接種によって顕著に低減されたが、しかしＭＶＡ−ＨＡ−ＨＫ／９７の接種では低減されなかった。
【００９２】
臓器におけるウイルス複製
感染性ウイルス力価を脳，腸，肺および脾臓において、インフルエンザウイルスＡ／ＨＫ／１５６／９７（図２Ａ），Ａ／ＶＮ／１１９４／０４（図２Ｂ）またはＡ／ＩＮＤ／５／０５（図２Ｃ）の感染後４日目に測定した。
【００９３】
感染後、最高のウイルス複製が肺で観察され、インフルエンザウイルスＡ／ＨＫ／１５６／９７、Ａ／ＶＮ／１１９４／０４またはＡ／ＩＮＤ／５／０５にそれぞれ後で感染した非防御ＰＢＳ接種マウスについて、平均肺ウイルス力価１０7.9、１０7.8および１０8.9ＴＣＩＤ50／グラム組織であった。また、ｗｔＭＶＡを接種したマウスは防御されず、および同様の平均ウイルス力価が感染マウスの肺で見られた。非防御マウスの両方の群の一部の動物で、ウイルス複製が脳、腸および脾臓を含む呼吸組織外で実証できた（表１）。
【００９４】
表１はマウス各個体で観察された感染性ウイルスの検出および重量減少を示す。６未満の群数は実験とは無関係の合併症のための死亡によって生じる。
【表４】
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【００９５】
ＭＶＡ−ＨＡ−ＨＫ／９７の接種は肺および他の臓器におけるインフルエンザウイルスＡ／ＨＫ／１５６／９７の複製を完全に防いだ一方、ＭＶＡ−ＨＡ−ＶＮ／０４接種では肺におけるウイルス複製の低減がマウス６匹中４匹で観察された。
【００９６】
インフルエンザウイルスＡ／ＶＮ／１１９４／０４のチャレンジ感染後は、逆であった：ＭＶＡ−ＨＡ−ＶＮ／０４の接種は複製を完全に防ぎ、一方、ＭＶＡ−ＨＡ−ＨＫ／９７の接種はウイルス複製を部分的に低減しただけであった。
【００９７】
低減はＰＢＳ接種マウスと比較して統計的に有意であり（ｐ＜０．０５）、一方、ｗｔＭＶＡ接種マウスについてはそのような差は観察されなかった。
【００９８】
ＭＶＡ−ＨＡ−ＶＮ／０４の接種はまた、インフルエンザウイルスＡ／ＩＮＤ／５／０５の複製を肺においてマウス６匹中４匹で防ぎ、ＰＢＳおよびｗｔＭＶＡ接種マウスと比較した平均肺力価の低下を結果として生じた。ＭＶＡ−ＨＡ−ＨＫ／９７の接種はインフルエンザウイルスＡ／ＩＮＤ／５／０５の複製を防がず、および６匹全部のマウスが検査で陽性となった（上の表１参照）。スティミューン（登録商標）でアジュバント化した不活性化全ウイルスワクチンＮＩＢＲＧ−１４の接種は相同株インフルエンザウイルスＡ／ＶＮ／１１９４／０４の複製だけでなくＡ／ＨＫ／１５６／９７およびＡ／ＩＮＤ／５／０５の複製も防いだ。
【００９９】
血清学
ＭＶＡ−ＨＡ−ＨＫ／９７の単回接種に際して、マウスは相同ウイルス株に対する強い抗体応答を生じたが、しかし抗体は、ＨＩおよびＶＮ検査によって測定した通り、インフルエンザウイルス株Ａ／ＶＮ／１１９４／０４またはＡ／ＩＮＤ／５／０５と交差反応しなかった（図３）（それぞれＧＭＴ１６２９および２３９）。ブースター接種後、ＨＩおよびＶＮアッセイにおける相同抗体力価はそれぞれ１３７０および７４４ＧＭＴであった。再び、残りのＨ５Ｎ１株との交差反応は観察されなかった。ＭＶＡ−ＨＡ−ＶＮ／０４ワクチン製剤は免疫原性がより低く、および単回接種後、１匹だけで、相同株に対する抗体がＶＮアッセイで検出可能であった。ブースター接種に際して、すべての動物が応答し、およびＧＭＴはＨＩおよびＶＮアッセイによる測定でそれぞれ２０および６４へ上昇した。ＭＶＡ−ＨＡ−ＶＮ／０４接種によって誘導された抗体は、Ｈ５Ｎ１株Ａ／ＨＫ／１５６／９７と、および限られた程度でＡ／ＩＮＤ／５／０５株と交差反応した。陽性対照として実験に含められたアジュバント化ＮＩＢＲＧ−１４ワクチン製剤は、相同Ａ／ＶＮ／１１９４／０４に対する頑健な抗体応答を誘導し、それはＨＩおよびＶＮアッセイの両方でＡ／ＨＫ／１５６／９７およびＡ／ＩＮＤ／５／０５株と交差反応した。
【０１００】
肺における病理変化およびウイルス複製
３つのＨＰＡＩウイルスのどれかの感染４日後、マウスを屠殺しおよびその肺をホルマリンで膨張させ、および組織学的に、および免疫組織化学を用いて検査した。ｗｔＭＶＡ免疫化およびＰＢＳ免疫化マウスへのインフルエンザウイルスＡ／Ｈｏｎｇｋｏｎｇ／１５６／９７の接種は、軽度の気管支周囲浸潤および軽度の細気管支壁の壊死を伴う、細気管支上皮および肺胞上皮の多巣性感染を結果として生じた（図４Ａ、Ｅ）。ＭＶＡ−ＨＡ−ＨＫ／９７およびＭＶＡ−ＨＡ−ＶＮ／０４免疫化マウスの肺では、感染後４日目にウイルスは検出されず、および組織病理学的変化は見られなかった（図４Ｂ、Ｃ）。インフルエンザウイルスＡ／ＶＮ／１１９４／０４感染は、細気管支周囲および肺胞上皮のより強い多巣性感染を、ＰＢＳおよびｗｔＭＶＡ免疫化マウスの両方で生じた（図ＡＦ、Ｊ）。さらにこれらのマウスは細気管支上皮の損失を基礎とする中等度の間質性肺炎、重度の気管支周囲浸潤および肺胞損傷に罹患した。ＭＶＡ−ＨＡ−ＨＫ／９７免疫化マウスの肺胞上皮の感染はより少ないように見えたが、しかし肺胞浸潤はより明瞭であった（図４Ｇ）。ＭＶＡ−ＨＡ−ＶＮ／０４免疫化マウスの肺では、ウイルス複製は検出されず、および形態は正常であった（図４Ｈ）。インフルエンザウイルスＡ／ＩＮＤ／５／０５の感染は、細気管支上皮および肺胞上皮の両方の広範囲の感染を、ｗｔＭＶＡ、ＰＢＳおよびＭＶＡ−ＨＡ−ＨＫ／９７免疫化マウスにおいて生じた（図４Ｋ、Ｌ、Ｏ）。さらに、細気管支上皮の消失および細気管支内細胞残渣の存在に次いで、細気管支および肺胞の両方における中等度の浸潤が見られた。ＭＶＡ−ＨＡ−ＶＮ／０４免疫化マウスは、中等度の細気管支周囲浸潤と同時に、少数の細気管支周囲インフルエンザウイルスＡ／ＩＮＤ／５／０５感染細胞を有した（図４Ｍ）。アジュバント化ＮＩＢＲＧ−１４で免疫化されたマウスは、正常な肺を有し、および３つのインフルエンザＨ５Ｎ１ウイルスのどれの感染後もウイルス複製は見られなかった（図４Ｄ、Ｉ、Ｎ）。
【図１】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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