(57)【要約】  本発明は、血液などの試料物質中の病原菌を測定する方法及び手段に関する。本方法において、細菌ＤＮＡは最初に試料物質の全ＤＮＡから濃縮され、次いで濃縮されたＤＮＡは特定のプライマー対を用いて増幅される。得られた増幅産物の検出により、試料物質中に含まれる細菌及び真菌並びにこれらの耐性菌の正確な同定が可能になる。本発明の方法及び手段は、特に未発見の感染症（ＳＩＲＳ）を含む炎症性疾患並びに敗血症、特発性細菌性腹膜炎及び心内膜炎などの感染性疾患の早期診断を可能にする。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料物質中に含まれる細菌及び真菌の測定方法であって、下記のステップを含む測定方法：
ａ）試料物質中に含まれる細菌及び真菌ＤＮＡの濃縮；
ｂ）（ｉ）〜（ｖｉｉ）の群の少なくとも２つの群より選ばれるプライマー対を用いる、ステップａ）で得られたＤＮＡの増幅：
（ｉ）複数の細菌ファミリーに特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも１つのプライマー対；
（ｉｉ）複数の真菌ファミリーに特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも１つのプライマー対；
（ｉｉｉ）選択された細菌属に特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも１つのプライマー対；
（ｉｖ）選択された細菌種に特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも１つのプライマー対；
（ｖ）選択された抗菌剤又は抗真菌剤耐性の発現に特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも１つのプライマー対；
（ｖｉ）選択された真菌属に特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも１つのプライマー対；及び
（ｖｉｉ）選択された真菌種に特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも１つのプライマー対；並びに任意に、
ｃ）ステップｂ）で生成される増幅産物の検出。
【請求項２】
試料物質は環境試料、食品試料又は生物試料であって、特に臨床試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
特に臨床試料である試料物質は、ヒト又は動物試料である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ヒト又は動物試料が、組織試料、体液又はこれらに由来する産物である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
試料が体液又は体液に由来する産物であって、特に血液又血液産物、例えば全血、血漿、血清又は濃縮血小板、脳脊髄液、液、尿、胸膜液、腹水、心膜液、腹膜液及び滑液である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
細菌及び／又は真菌ＤＮＡの濃縮が、試料物質から得られる全ＤＮＡを非メチル化ＣｐＧモチーフに結合する能力があるタンパク質又はポリペプチドと接触させることにより行われる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
（ｉ）群の少なくとも１つのプライマー対が、細菌１６Ｓ ｒＤＮＡに対する遺伝子の核酸配列に特異的にハイブリダイズするプライマー対である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
（ｉｉ）群の少なくとも１つのプライマー対が、真菌１８Ｓ ｒＤＮＡに対する遺伝子の核酸配列に特異的にハイブリダイズするプライマー対である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ステップｂ）における増幅は、増幅産物が検出可能なマーカーにより標識される条件下で行われる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップｂ）における増幅は、非定量的ＰＣＲによって行われる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ステップｂ）における増幅は、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって行われる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ステップｂ）において得られる増幅産物の検出が、ゲル電気泳動法又はヌクレオチドに基づくハイブリダイゼーション法によって行われる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ステップｂ）において得られる増幅産物の検出が、マイクロアレイによって行われる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
治療決定の補助としての、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
濃縮血小板の汚染を検出するための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
未発見の感染症（ＳＩＲＳ）を含む炎症性疾患の病原菌及び／又は耐性菌を検出するための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
感染症、特に全身性感染症を検出するための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
敗血症の早期診断のための、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
突発性細菌性腹膜炎の早期診断のための、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
心内膜炎の早期診断のための、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
試料物質中に含まれる細菌及び真菌を測定するための診断キットであって、
ａ）試料物質中に含まれる細菌及び真菌ＤＮＡの濃縮手段；
ｂ）（ｉ）〜（ｖｉｉ）の群の少なくとも２つの群より選ばれるプライマー対を含むＤＮＡの増幅手段：
（ｉ）複数の細菌ファミリーに特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも１つのプライマー対；
（ｉｉ）複数の真菌ファミリーに特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも１つのプライマー対；
（ｉｉｉ）選択された細菌属に特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも１つのプライマー対；
（ｉｖ）選択された細菌種に特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも１つのプライマー対；
（ｖ）選択された抗菌剤又は抗真菌剤耐性の発現に特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも１つのプライマー対；
（ｖｉ）選択された真菌属に特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも１つのプライマー対；及び
（ｖｉｉ）選択された真菌種に特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも１つのプライマー対；並びに任意に、
ｃ）ｂ）のプライマー対を用いて生成される増幅産物の検出手段；
を含むキット。
【請求項２２】
細菌及び／又は真菌ＤＮＡの濃縮手段が、非メチル化ＣｐＧモチーフに結合する能力があるタンパク質又はポリペプチドを含む、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
（ｉ）群の少なくとも１つのプライマー対が、細菌１６Ｓ ｒＤＮＡに対する遺伝子の核酸配列に特異的にハイブリダイズするプライマー対である、請求項２１又は２２に記載のキット。
【請求項２４】
（ｉｉ）群の少なくとも１つのプライマー対が、真菌１８Ｓ ｒＤＮＡに対する遺伝子の核酸配列に特異的にハイブリダイズするプライマー対である、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２５】
ＤＮＡの増幅手段が、増幅中に検出可能なマーカーを含む増幅産物を与える手段を含む、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２６】
ＤＮＡの増幅手段が、非定量的ＰＣＲを行うための手段を含む、請求項２１〜２５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２７】
ＤＮＡの増幅手段が、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を行うための手段を含む、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２８】
ｂ）のプライマー対により得られる増幅産物の検出手段が、電気泳動ゲルの調製試薬を含む、請求項２６に記載のキット。
【請求項２９】
ｂ）のプライマー対により得られる増幅産物の検出手段が、マイクロアレイの実行手段を含む、請求項２６に記載のキット。
【請求項３０】
試料物質中に含まれる病原性細菌及び真菌を測定するための、請求項２１〜２９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３１】
試料物質は環境試料、食品試料又は生物試料であって、特に臨床試料である、請求項２１〜２９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３２】
特に臨床試料である試料物質は、ヒト又は動物試料である、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
ヒト又は動物試料が、組織試料、体液又はこれらに由来する産物である、請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】
試料が体液又は体液に由来する産物であって、特に血液又血液産物、例えば全血、血漿、血清又は濃縮血小板、脳脊髄液、液、尿、胸膜液、腹水、心膜液、腹膜液及び滑液である、請求項３３に記載のキット。
【請求項３５】
濃縮血小板の汚染を検出するための、請求項２１〜３４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３６】
未発見の感染症（ＳＩＲＳ）を含む炎症性疾患の病原菌及び／又は耐性菌を検出するための、請求項２１〜３４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３７】
感染症、特に全身性感染症を検出するための、請求項２１〜３４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３８】
敗血症の早期診断のための、請求項３７に記載のキット。
【請求項３９】
突発性細菌性腹膜炎の早期診断のための、請求項３７に記載のキット。
【請求項４０】
心内膜炎の早期診断のための、請求項３７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特異的な核酸配列を検出することによる試料物質中の細菌、真菌及びこれらの抗菌剤又は抗真菌剤耐性菌の測定に関する。
【背景技術】
【０００２】
試料物質中の細菌や真菌などの病原微生物を測定することは、多くの分野で、特に医学において非常に重要である。例えば濃縮血小板における細菌汚染は、輸血による罹患率と死亡率に関して重大な要因であり、現在のところ輸血において最も多い感染合併症である。感染に関与する微生物病原体の早期検出は、例えば敗血症、突発性細菌性腹膜炎（ＳＢＰ）及び心内膜炎患者における迅速で効果的な抗菌剤治療に不可欠である。またこれに関連して、病院、特に集中治療室において、しばしば患者の免疫防御不全や、不衛生の結果かもしれないが、より高い感染リスクと関連する侵襲的治療の増加が原因となる未知の病原菌による感染の増大は深刻な問題を引き起こす。
【０００３】
これらの感染を引き起こす微生物はほとんどの場合不明であるが、非常に多くの異なる属や種に属する。従って汚染や感染があることを迅速に確認するためには、できるだけ多くの候補微生物について、試料物質を同時に検査することが必要である。これは、例えばそれぞれの病原菌に適合させた抗菌剤療法などの効果的な治療は分析結果次第であるように、特に臨床試料の場合において非常に重要である。
【０００４】
感染性疾患の病原微生物の検出は、しばしば血液の培養またはその他の体液の培養と、その後の生化学的分類及び抗菌剤耐性の検出によって行われる。しかしながら現在までのところ、血液培養は高い割合で偽陰性であるとの検査結果になるため、患者は確立された微生物学的証拠なしに抗菌剤治療を受ける（Bosshard et al., 2003, CID 37:167-172; Gauduchon et al., 2003, J.
Clin. Microbiol. 41:763-766; Grijalva et al., 2003, Heart 89:263-268）。
【０００５】
微生物学的診断の他に、例えば髄膜炎菌であるインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、グループＡ／Ｂ連鎖球菌（streptococci）（McLellan et al., 2001 Infect. Immun. 69(5):2943-2949）又は肺炎球菌（pneumococci）によって引き起こされる敗血症若しくは髄膜炎の診断のための直接免疫蛍光法、凝集試験又はＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫測定法）を使用するタンパク質生化学的抗原検出などの特殊な応用に対して、さらに特異的な検出法がある。
【０００６】
細菌感染を診断する１つの迅速かつ的確な方法はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）であり、細菌ゲノムの特定の領域が増幅される。当該特定の領域には、例えば非常に多様性のある１６Ｓ又は２３Ｓ
ｒＤＮＡ領域（Anthony et al. 2000）、１６Ｓ−２３Ｓ ｒＤＮＡスペーサー領域におけるｔＲＮＡ遺伝子、及び、アドヘシン（adhesin）、溶血素（hemolysin）又は種々の毒素などの病原菌特異的遺伝子（Belanger et al., 2002, J. Clin. Microbiol.
40(4):1436-1440（非特許文献１）; Depardieu et al., 2004, J. Clin.
Microbiol. 40(4):1436-1440（非特許文献２）; Kaltenboeck and Wang,
2005, Adv. Clin. Chem. 40:219-259（非特許文献３）; Patel et al.,
2007, J. Clin. Microbiol. 35(3):703-707（非特許文献４）; Sakai et
al., 2004, J. Clin. Microbiol. 42(12):5739-5744（非特許文献５））がある。さらに識別するために、例えば１６Ｓ
ｒＤＮＡ ＰＣＲ増幅産物の塩基配列決定が続いてもよい（Unemo et al., 2004, J. Clin. Microbiol. 42(7):2926-2934（非特許文献６））。国際公開第９７／０７２３８号パンフレット（特許文献１）には、真菌リボゾームの１８Ｓ
ｒＤＮＡのすべての型を増幅するプライマーを用いて、カンジダ属（Candida）やアスペルギルス属（Aspergillus）などの真菌を検出する方法が開示されている。分子生物学におけるこれらの検出法及び識別法は、現在のところどれも日常的には使用されず、又は標準法として確立されていない。
【０００７】
臨床試料に要求される検出感度を達成するため、この目的に必要な鋳型ＤＮＡは、陽性の血液培養から単離された細菌から得られる。検出すべき病原菌を培養できない場合（例えば血液試料が予め抗菌剤治療を受けている場合）、分子生物学的検出は結果的に陰性のままである。前培養ステップがない場合には、臨床試料中における原核生物ＤＮＡのヒトＤＮＡに対する比率は、細菌核酸の濃縮により増加する可能性がある。類似の方法は、例えば欧州特許出願公開第４００５８９Ａ１号明細書（特許文献２）、国際公開第２００５／０８５４４０Ａ号パンフレット（特許文献３）及び国際公開第２００６／１３３７５８Ａ号パンフレット（特許文献４）に記載されている。
【０００８】
その一方で、菌種の識別に適した技術には、ラマン／ＦＴＩＲ技術（フーリエ変換赤外分光；Rebuffo
et al., 2006, Appl. Environ. Microbiol. 72(2):994-1000; Rebuffo-Scheer et al.,
2007, Circulation 111:1352-1354）及びＳＥＲＳ技術（表面増強ラマン散乱；Kahraman
et al., 2007, Appl. Spectrosc. 61(5):479-485; Naja et al., 2007, Analyst
132(7):679-686）が含まれ、過去１０年間で個々の生細胞のスペクトルでさえも得ることができる検出感度レベルを達成している。しかしながら実際には、識別するための分光分析データを得るためには、純粋培養において最大１０００個までの細胞が必要である。このことが、これらの技術を特定の敗血症病原菌の迅速診断に不適切なものにしている（Kirschner, 2004, 博士論文、ベルリン大学）。
【０００９】
病原菌の診断の後には、病原菌に適合させた抗菌剤治療が続く。原因病原菌又は耐性の存在がそれぞれ確定できない場合、広域抗菌剤を使用する経験的かつ時間のかかる治療を始めることが必要となる。
【００１０】
しかしながら先行技術にはいくつかの難点が示されている。例えば、培養できない病原菌を伴う敗血症の場合、又は血液が（広域）抗菌剤で前治療された後に採取された場合には、血液培養は陰性のままである（細菌敗血症全症例の９０％までは血液培養陰性である）。従って、陽性血液培養から原核生物ＤＮＡの抽出に基づいた、その後の分子生物学的識別は、理論的には敗血症症例の１０％以下で可能であるに過ぎない。さらに、病原菌の非常に広いスペクトル及び以前に記述のない病原菌型の存在によって、個々の高度に特異的なプライマー及びプローブを創出しても、病原菌の明確な同定に対して限られた効果しかない。型レベルの識別や耐性記録の提供には、複数の選択されたプライマー／プローブ及びＰＣＲとハイブリダイゼーション技術の組み合わせが必要である。抗菌剤耐性のすべてがゲノムに暗号化されている、又は既知の翻訳領域を持っているとは限らないので、耐性マーカーの遺伝子型識別はあまり成功せず、時間のかかる表現型検査で補完しなければならない（Gradelski et al., 2001, J. Clin. Microbiol. 39(8):2961-2963）。前述のように、これは同様に病原菌が培養可能であることを必要とする。さらに多重感染の場合、１６Ｓ−ｒＤＮＡ増幅産物の塩基配列決定は、配列の重ね合わせによって、解釈することのできない結果を導く可能性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第９７／０７２３８号パンフレット
【００１２】
【特許文献２】欧州特許出願公開第４００５８９Ａ１号明細書
【００１３】
【特許文献３】国際公開第２００５／０８５４４０Ａ号パンフレット
【００１４】
【特許文献４】国際公開第２００６／１３３７５８Ａ号パンフレット
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Belanger et al., 2002, J. Clin. Microbiol.40(4):1436-1440
【００１６】
【非特許文献２】Depardieu et al., 2004, J. Clin. Microbiol. 40(4):1436-1440
【００１７】
【非特許文献３】Kaltenboeck and Wang, 2005, Adv. Clin. Chem. 40:219-259
【００１８】
【非特許文献４】Patel et al., 2007, J. Clin. Microbiol. 35(3):703-707
【００１９】
【非特許文献５】Sakai et al., 2004, J. Clin. Microbiol. 42(12):5739-5744
【００２０】
【非特許文献６】Unemo et al., 2004, J. Clin. Microbiol. 42(7):2926-2934
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
そのため本発明の目的は、試料物質中に存在する可能性のある細菌又は真菌の、簡便で信頼性のある測定を可能にする方法及び手段を提供することにある。
【００２２】
本発明の他の目的は、検出された病原菌に適合した治療処置の迅速な開始を可能にするために、試料物質中の病原性細菌及び真菌の早期の測定を可能にする方法及び手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明によれば、この目的は請求項１に記載の方法及び請求項２１に記載のキットによって達成される。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、驚くべきことに、全ＤＮＡから細菌及び真菌ＤＮＡを濃縮するステップと、選択されたプライマー対が個々の細菌及び真菌に対する検出感度を大幅に高めることを可能にするだけではなく、この方法で並行して多数の異なる細菌及び真菌の属種の検出をも可能にすることを含む増幅ステップとの組み合わせが見出された。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】全ＤＮＡの初期含量に関して、原核生物及び真菌ＤＮＡの濃縮依存性を示す図である。
【図２】原核生物及び真菌ＤＮＡの濃縮後の多重ＰＣＲによる、腹水中におけるエシェリキア・コリの検出に関するアガロースゲル電気泳動を示す図である。
【図３】ＤＮＡ濃縮及び多重ＰＣＲ後に５０の異なるプライマー対を用いて、種々の微生物のＤＮＡが添加された血液試料から細菌ＤＮＡを検出したことを示す図である。（Ａ）は使用されたプライマーが向けられた微生物リストを示す図である。（Ｂ）は添加された微生物のＰＣＲ増幅産物を含むアガロースゲルの写真である。（Ｃ）はゲルの写真（Ｂ）の試料割付けを示す図である。
【図４】特定の細菌、真菌及び耐性菌に特異的なビオチン標識ＰＣＲ増幅産物の、代表的な、プローブに基づく検出に対するマイクロアレイのプローブのスポット配置を示す図である。
【図５】エシェリキア・コリ特異的ビオチン標識ＰＣＲ増幅産物ｉｒｐ２とのハイブリダイゼーション後の図４のマイクロアレイの画像である。
【図６】カンジダ・アルビカンス及びストレプトコッカス・ピオゲネスの一夜培養を添加し機械的に溶解させた、健常ドナーからの全血試料の多重ＰＣＲのアガロースゲル電気泳動を示す図である。
【図７】カンジダ・アルビカンスの一夜培養を添加し機械的に溶解させた、健常ドナーからの全血試料のｑＰＣＲ評価を示す図である。
【図８】ストレプトコッカス・ピオゲネスの一夜培養を添加し機械的に溶解させた、健常ドナーからの全血試料のｑＰＣＲ評価を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
そのため本発明の目的は、試料物質中に含まれる細菌及び真菌の測定方法であって、当該方法は下記のステップを含む：
ａ）試料物質中に含まれる細菌及び真菌ＤＮＡの濃縮；
ｂ）（ｉ）〜（ｖｉｉ）の群の少なくとも２つの群より選ばれるプライマー対を用いる、ステップａ）で得られたＤＮＡの増幅：
（ｉ）複数の細菌ファミリーに特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも１つのプライマー対；
（ｉｉ）複数の真菌ファミリーに特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも１つのプライマー対；
（ｉｉｉ）選択された細菌属に特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも１つのプライマー対；
（ｉｖ）選択された細菌種に特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも１つのプライマー対；
（ｖ）選択された抗菌剤又は抗真菌剤耐性の発現に特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも１つのプライマー対；
（ｖｉ）選択された真菌属に特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも１つのプライマー対；及び
（ｖｉｉ）選択された真菌種に特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも１つのプライマー対；並びに任意に、
ｃ）ステップｂ）で生成された増幅産物の検出。
【００２７】
本発明の他の目的は、試料物質中に含まれる細菌及び真菌を測定するための診断キットであって、当該キットは、
ａ）試料物質中に含まれる細菌及び真菌ＤＮＡの濃縮手段；
ｂ）（ｉ）〜（ｖｉｉ）の群の少なくとも２つの群より選ばれるプライマー対を含むＤＮＡの増幅手段：
（ｉ）複数の細菌ファミリーに特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも１つのプライマー対；
（ｉｉ）複数の真菌ファミリーに特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも１つのプライマー対；
（ｉｉｉ）選択された細菌属に特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも１つのプライマー対；
（ｉｖ）選択された細菌種に特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも１つのプライマー対；
（ｖ）選択された抗菌剤又は抗真菌剤耐性の発現に特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも１つのプライマー対；
（ｖｉ）選択された真菌属に特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも１つのプライマー対；及び
（ｖｉｉ）選択された真菌種に特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも１つのプライマー対；並びに任意に、
ｃ）ｂ）のプライマー対を用いて生成された増幅産物の検出手段；
を含む。
【００２８】
試料物質は細菌及び真菌が存在する可能性のある任意の物質を含む。通常、試料物質は環境試料、食品試料、又は臨床試料などの生物試料である。生物試料は植物試料、生体試料又は臨床試料であってもよいが、一般的にはヒト又は動物試料であり、特に哺乳動物からの試料である。通常は、試料はヒト若しくは動物の組織試料又は体液である。例えば組織試料は生検である。好ましくは、試料は体液又は体液に由来する産物であり、例えば全血、血清、血漿、濃縮血小板、脳脊髄液、液、尿、及び胸膜液、腹水、心膜液、腹膜液又は滑液である。試料物質は通常の方法で得ることができる；例えば臨床試料は、生検、血液採取又は穿刺によって得ることができる。
【００２９】
試料物質からの原核生物及び真菌ＤＮＡの濃縮は、試料物質から全ＤＮＡを抽出した後に行われる。従って本発明のキットは、実施例として以下に記載されているように、試料物質中に含まれる細胞から全ＤＮＡを抽出する手段を含んでいてもよい。実際の濃縮ステップの前の全ＤＮＡの抽出のために、試料中に存在している細菌及び真菌細胞を含む細胞は、最初に破壊又は溶解させる。細胞の破壊及び溶解は周知の方法、例えば高圧ホモジナイザー、好ましくはガラスビーズ及びボルテックス処理を使用して機械的に、溶媒、界面活性剤又はアルカリを使用して化学的に、溶解酵素を使用して酵素的に、又はこれらの技術の組み合わせにより行うことができる。細菌細胞の酵素溶解は、消化に対して一般的に使われるリゾチーム又はムタノリジンによるのが好ましく、アルカリ、界面活性剤及びタンパク質分解酵素との組み合わせが有利である。真菌細胞の消化は、通常は機械的に、例えばガラス微粒子と共にボルテックスにより、有利にはアルカリ、界面活性剤及びさらなるタンパク質分解酵素との組み合わせにより行われる。しかしながら消化は、酵素として用いられているザイモラーゼによって酵素的に行ってもよい。全ＤＮＡの抽出は、ＤＮＡ結合マトリックスへ吸着させることにより周知の方法により行うことができる。全ＤＮＡを単離するキットは市販されており、製造者の仕様書に従い使用することができる。例えば全ＤＮＡの単離に必要な要素は、全ＤＮＡから細菌及び真菌ＤＮＡを濃縮するためのルックスター（LOOXSTER、登録商標）キットに含まれている。マトリックスの溶出の後に全ＤＮＡを含む試料が得られるが、このＤＮＡは水溶液中に存在している。
【００３０】
全ＤＮＡを含む試料からの細菌及び真菌ＤＮＡの実際の濃縮は、細菌及び真菌ＤＮＡを特異的に結合する手段、具体的には細菌及び真菌ＤＮＡを特異的に結合するタンパク質及びポリペプチドを用いて行う。一般的に原核生物及び真菌ＤＮＡの濃縮は、欧州特許出願公開第４００５８９Ａ１号明細書、国際公開第２００５／０８５４４０Ａ号パンフレット及び国際公開第２００６／１３３７５８Ａ号パンフレットに記載された方法に従って実施され、これらは参照することにより本願明細書に援用される。そのなかに記載された方法と手段は、試料中に含まれる他のＤＮＡ、特にヒト又は動物ＤＮＡに比較して低い原核生物及び真菌ＤＮＡの比率を増加させることを可能にする。ここでは、全ＤＮＡの調製後に溶液中に存在するＤＮＡを、非メチル化ＣｐＧモチーフに結合する能力があるタンパク質又はポリペプチドと接触させる。非メチル化ＣｐＧモチーフは、ヒト又は動物ＤＮＡなどの高等真核生物ＤＮＡ中よりも、細菌又は真菌ＤＮＡ中において顕著に高い頻度で存在するので、細菌又は真菌ＤＮＡはこれらのタンパク質又はポリペプチドに好んで結合する。このタンパク質又はポリペプチドは微粒子などの支持体に結合させることができる。このようにして形成されたタンパク質／ポリペプチド−ＤＮＡ複合体は、例えば濾過、遠心分離又は磁気法によりヒト又は動物ＤＮＡから容易に分離することができる。これらのタンパク質及びポリペプチドへの原核生物及び真菌ＤＮＡの選択的結合は、５倍以上のＤＮＡ濃縮をもたらす。全ＤＮＡから細菌及び真菌ＤＮＡを濃縮するキットは、商標名ルックスター（LOOXSTER、登録商標）（SIRS-LAB GmbH, 07745イエナ、ドイツ）として市販されており、またこのキットは全ＤＮＡの調製手段を含んでいる。
【００３１】
細菌及び真菌ＤＮＡが濃縮されたＤＮＡは、次いで非定量的又は定量的増幅方法により、具体的には、細菌、真菌又は抗菌剤若しくは抗真菌剤耐性に特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅を可能にする異なるプライマー対の１セット又はプールの存在下、非定量的又は定量的ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）により増幅される。細菌、真菌若しくは選択されたこれらの属種、又は抗菌剤及び抗真菌剤耐性に特異的な核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ及びＴＩＧＲ又は他の市販遺伝子ライブラリーなどの公的にアクセス可能な遺伝子ライブラリーから得ることができる。また当業者は、例えば公的にアクセス可能なウェブサイト「Ｐｒｉｍｅｒ３」（例えばＭＩＴのhttp://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgiを参照）又は他の商用ソフトウェアを用いて、日常的にかつ過度の負担なく、対応する適切なプライマーを設計することができる。
【００３２】
本発明によれば、増幅は上記（ｉ）〜（ｖｉｉ）の群の少なくとも２つの群に由来するプライマー対を用いて実施され、増幅に関して、プライマー対が所定の予め知られた長さを持つ増幅産物をもたらすようにプライマー対が選択される。少なくとも1つのプライマー対（ｉ）を用いて形成される増幅産物が予期された長さをもって存在することは、細菌が存在することを示し；少なくとも1つのプライマー対（ｉｉ）を用いて形成される増幅産物が存在することは、真菌が存在することを示し；少なくとも1つのプライマー対（ｉｉｉ）を用いて形成される増幅産物が存在することは、少なくとも1つの特定の細菌属が存在することを示し；少なくとも1つのプライマー対（ｉｖ）を用いて形成される増幅産物が存在することは、少なくとも1つの特定の細菌種が存在することを示し；少なくとも1つのプライマー対（ｖ）を用いて形成される増幅産物が存在することは、少なくとも1つの特定の抗菌剤又は抗真菌剤耐性菌が存在することを示し；少なくとも1つのプライマー対（ｖｉ）を用いて形成される増幅産物が存在することは、少なくとも1つの特定の真菌属が存在することを示し；及び、少なくとも1つのプライマー対（ｖｉｉ）を用いて形成される増幅産物が存在することは、少なくとも1つの特定の真菌種が存在することを示す。
【００３３】
（ｉ）群のプライマー対は、複数又はすべての細菌ファミリーに共通である高度に保存された核酸配列に特異的にハイブリダイズする一般的なプライマーである。感染や汚染において特に高頻度で存在するため、その存在を（ｉ）群のプライマー対を用いて効果的に検査することができる細菌ファミリーには、例えばシュードモナス科（Pseudomonadaceae）、エンテロバクター科（Enterobacteriaceae、腸内細菌科）、ストレプトコッカス科（Streptococcaceae、連鎖球菌科）、スタフィロコッカス科（Staphylococcaceae）、リステリア科（Listeriaceae）、ナイセリア科（Neisseriaceae）、パスツレラ科（Pasteurellaceae）、レジオネラ科（Legionellaceae）、バークホルデリア科（Burkholderiaceae）、バチルス科（Bacillaceae）、クロストリジウム科（Clostridiaceae）、モラクセラ科（Moraxellaceae）、エンテロコッカス科（Enterococcaceae）、及び／又はバクテロイデス科（Bacteroidaceae）がある。すべての細菌ファミリーにおいて高度に保存されている核酸配列の例として、１６Ｓ
ｒＤＮＡ遺伝子、２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子及び１６Ｓ／２３Ｓ間隙領域の配列がある。細菌リボゾーム１６Ｓ ｒＤＮＡに対する遺伝子の核酸配列に特異的にハイブリダイズし、本発明によって用いられるプライマー対の1例は次のプライマー対である：
5'-TAAGTCCSGCAACGAGCGCA-3'（SEQ ID No.1）（順方向プライマー）
5'-GTGACGGGCGGTGWGTACAA-3'（SEQ ID No.2）（逆方向プライマー）
ここでＳは塩基Ｃ（シトシン）又はＧ（グアニン）を表し、またＷは塩基Ａ（アデニン）又はＴ（チミン）を表す。少なくとも１つプライマー対（ｉ）を用いた増幅後に形成される増幅産物が検出されることは、試料物質中に細菌が存在することを示す。
【００３４】
（ｉｉ）群のプライマー対は、複数又はすべての真菌ファミリーに共通である高度に保存された核酸配列にハイブリダイズする一般的なプライマーである。汚染や感染において特に高頻度で存在するため、その存在を（ｉｉ）群のプライマー対を用いて効果的に検査することができる真菌ファミリーには、例えばトリココマセエ（Trichocomaceae）ファミリーやカンジダ（Candida）ファミリーの真菌がある。すべての真菌ファミリーにおいて高度に保存されている核酸配列の１例として、真菌１８Ｓ
ｒＤＮＡに対する遺伝子配列がある。真菌１８Ｓ ｒＤＮＡに対する遺伝子の核酸配列に特異的にハイブリダイズし、本発明によって用いられるプライマー対の1例は次のプライマー対である：
5'-caactttcgatggtaggat-3'（SEQ ID No.3）（順方向プライマー）
5'-atcgtcttcgatcccctaac-3'（SEQ ID No.4）（逆方向プライマー）
このプライマー対は増幅により約６７０〜６９０塩基対の長さを持つ増幅産物を与える。少なくとも１つプライマー対（ｉｉ）を用いた増幅後に形成される増幅産物が検出されることは、試料物質中に真菌が存在することを示す。
【００３５】
（ｉｉｉ）群のプライマー対は、ファミリーのすべての細菌種についてではないが、特定の属の複数又はすべての細菌種に共通である高度に保存された核酸配列にハイブリダイズするプライマーである。感染や汚染において特に高頻度で存在するため、その存在を（ｉｉｉ）群のプライマー対を用いて効果的に検査することができる細菌属には、例えばスタフィロコッカス菌種（Staphylococcus spp、ブドウ球菌種）、ストレプトコッカス菌種（Streptococcus spp、連鎖球菌種）、エンテロコッカス菌種（Enterococcus spp、腸球菌）、エシェリキア菌種（Escherichia spp、大腸菌種）、シュードモナス菌種（Pseudomonas spp）、及びエンテロバクター菌種（Enterobacter spp）がある。スタフィロコッカス（Staphylococcus、ブドウ球菌）属の細菌のＤＮＡに属特異的にハイブリダイズし、本発明によって用いられるプライマー対の1例は次のプライマー対である：
5'-TTTAGGGCTAGCCTCAAGTGA-3'（SEQ ID No.5）（順方向プライマー）
5'-CACTTCTAAGCGCTCCACAT-3'（SEQ ID No.6）（逆方向プライマー）
このプライマー対はブドウ球菌に特異的な２３Ｓ領域の核酸配列に特異的にハイブリダイズし、増幅により４１８塩基対の長さを持つブドウ球菌特異的な増幅産物を与える。少なくとも１つプライマー対（ｉｉｉ）を用いた増幅後に形成される増幅産物が検出されることは、試料物質中に特定の細菌属が存在することを示す。例えば、上記プライマー対を用いた増幅産物はスタフィロコッカス属（ブドウ球菌属）の細菌の存在を示す。
【００３６】
（ｉｖ）群のプライマー対は、ある属のすべての細菌種についてではないが、特定の種の複数又はすべての細菌に共通である保存された核酸配列にハイブリダイズするプライマーである。汚染や感染において特に高頻度で存在するため、その存在を（ｉｖ）群のプライマー対を用いて効果的に検査することができる細菌種には、例えば前記細菌属の細菌種について例を挙げると、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus、黄色ブドウ球菌）、スタフィロコッカス・ヘモリチカス（Staphylococcus haemolyticus）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae、肺炎連鎖球菌）、ビリダンス連鎖球菌群（Viridans streptococci、緑色連鎖球菌群）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis、大便連鎖球菌）、モルガネラ・モルガニー（Morganella morganii、モルガン菌）、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae、肺炎桿菌）、クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）、エシェリキア・コリ（Escherichia coli、大腸菌）、バークホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia、セパシア菌）、プレボテラ・メラニノゲニカ（Prevotella melaninogenica）、ステノトロホモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）、シュードモナス・エルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa、緑膿菌）、プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）、エンテロバクター・エロゲネス（Enterobacter aerogenes）及びエンテロバクター・クロアカ（Enterobacter cloacae）がある。何ら限定するものではないが、保存された種特異的核酸配列の例として、スタフィロコッカス・アウレウス（黄色ブドウ球菌）のｅｍｐ（エムデン・マイヤーホフ・パルナス）遺伝子、エシェリキア・コリ（大腸菌）のｉｒｐ２遺伝子、及びクレブシエラ・ニューモニエ（肺炎桿菌）のｕｒｅＡ遺伝子がある。スタフィロコッカス・アウレウス（黄色ブドウ球菌）種の細菌のＤＮＡに種特異的にハイブリダイズし、本発明によって用いられるプライマー対の1例は次のプライマー対である：
5'-GCATCAGTGACAGAGAGTGTTGAC-3'（SEQ ID No.7）（順方向プライマー）
5'-TTATACTCGTGGTGCTGGTAAGC-3'（SEQ ID No.8）（逆方向プライマー）
このプライマー対はｅｍｐ遺伝子の核酸配列に特異的にハイブリダイズし、９４８塩基対の長さを持つ増幅産物を生成する。少なくとも１つプライマー対（ｉｖ）を用いた増幅後に形成される増幅産物が検出されることは、試料物質中に特定の細菌種が存在することを示す。例えば、上記プライマー対を用いた増幅産物はスタフィロコッカス・アウレウス（黄色ブドウ球菌）種の細菌の存在を示す。
【００３７】
（ｖ）群のプライマー対は、選択された抗菌剤又は抗真菌剤耐性に特異的な核酸配列、例えば対応する耐性遺伝子の核酸配列の増幅を可能にするプライマーである。汚染や感染において特に高頻度で存在するため、その存在を（ｖ）群のプライマー対を用いて効果的に検査することができる細菌種には、例えばメチシリン耐性について例を挙げると、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）がある。抗菌剤又は抗真菌剤耐性の発現に特異的で、高度に保存された核酸配列の例としては、メチシリン耐性に対する遺伝子の核酸配列、例えばｍｅｃＡなどがある。メチシリン耐性に関与する遺伝子に特異的にハイブリダイズし、本発明によって用いられるプライマー対の1例は次のプライマー対である：
5'-GCAATCGCTAAAGAACTAAG-3'（SEQ ID No.9）（順方向プライマー）
5'-GGGACCAACATAACCTAATA-3'（SEQ ID No.10）（逆方向プライマー）
このプライマー対はｍｅｃＡ遺伝子の核酸配列に特異的にハイブリダイズし、２２２塩基対の長さを持つ増幅産物を生成する。少なくとも１つのプライマー対（ｖ）を用いた増幅後に形成される増幅産物が検出されることは、試料物質中に含まれる細菌又は真菌について抗菌剤又は抗真菌剤耐性が存在することを示す。例えば上記プライマー対の使用により、メチシリン耐性のあることが示される。
【００３８】
細菌属又は細菌種に対して前述したプライマー対と同様に、（ｖｉ）群のプライマー対は、ファミリーのすべての真菌属についてではないが1つの属の複数又はすべての真菌種に共通である高度に保存された核酸配列にハイブリダイズするプライマーである。汚染や感染において特に高頻度で存在するため、その存在を当該プライマーにより効果的に検査することができる真菌属には、例えばアスペルギルス（Aspergillus）属及びカンジダ（Candida）属の真菌がある。同様に（ｖｉｉ）群のプライマー対は、１つの属のすべての真菌種についてではないが、特定の種の複数又はすべての真菌に共通である高度に保存された核酸配列にハイブリダイズするプライマーである。汚染や感染において特に高頻度で存在するため、その存在を当該プライマーにより効果的に検査することができる真菌種には、例えばアスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）種及びカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）種がある。従って、少なくとも１つプライマー対（ｖｉ）又は（ｖｉｉ）を用いた増幅後に形成される増幅産物が検出されることは、試料物質中に特定の属又は種の真菌が存在することを示す。
【００３９】
上記の組み合わせにより検査することのできる細菌及び真菌のファミリー、属並びに種、並びに抗菌剤及び抗真菌剤耐性菌は基本的には限定されない。上記で指定されたファミリー、属及び種、また言及されたプライマー対は、本発明の方法に対する例示実施態様を示すに過ぎない。先に説明したように、細菌、真菌若しくはこれらの特定の属や種、又は抗菌剤及び抗真菌剤耐性菌に対して特異的な核酸配列は、公的にアクセス可能な遺伝子ライブラリーから得ることができる。また当業者は、日常的にかつ過度の負担なく、対応する適切なプライマーを作成することができる。
【００４０】
本発明の方法の増幅ステップは、少なくとも２つのプライマー対を用いて同時に、すなわち多重方式として行われる。本発明によれば、増幅のために（ｉ）〜（ｖｉｉ）群のプライマー対を任意に組み合わせて使用することができる。好ましい実施態様によると、少なくとも（ｉ）及び（ｉｉ）群からのプライマー対が増幅のために使用される。他の好ましい実施態様によると、（ｉ）及び（ｉｉ）群；（ｉｉｉ）、（ｉｖ）及び（ｖ）群；（ｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）群；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）群；並びに（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｖ）群からのプライマー対が増幅のために使用される。増幅は、特に好ましくは（ｉ）〜（ｖｉ）群からのプライマー対を用いて行われ、特にきわめて好ましくは（ｉ）〜（ｖｉｉ）群すべてからのプライマー対を用いて行われる。全体でのプライマー対の数及び各群から採用されたプライマー対の数はなんら特段の制限を受けるものではなく、基本的には調べるべき試料中に存在すると推測される微生物、並びに治療関連性及び求められる範囲、特に試験結果の詳細について求められる精度にのみ依存する。従って、例えば感染についての臨床試料の検査において、すべての連鎖球菌に対する治療パターンは基本的に同じであるので、連鎖球菌種のすべてについて検査する必要はない。本発明の方法は１５０以上の異なるプライマー対を用いて容易に行うことができ、通常は少なくとも１０以上、好ましくは少なくとも２０以上、特に好ましくは少なくとも３０以上の異なるプライマー対を用いて行われる。
【００４１】
多重増幅はランダム、非定量的又は定量的増幅法によって行うことができる。好ましくは、増幅は非定量的ＰＣＲ又は(定量的)リアルタイムＰＣＲ（以下、ｑＰＣＲと称する）によって行われる。しかしながら以下において本発明は、ＰＣＲについて限定することなく記載する。
【００４２】
多重ＰＣＲは１個の又はいくつかの反応容器で行うことができる。実際上の理由のため、多数の異なるプライマー対が増幅において使用される場合は特に、多重ＰＣＲは高い頻度でいくつかの反応容器で行われる。その結果、一般的にはすべての反応容器は異なるプライマー対を含む。好ましくは、多重ＰＣＲは１個又は２個の反応容器で行われる。
【００４３】
好ましい実施態様によると、増幅は非定量的ＰＣＲにより行われる。増幅は、増幅条件すなわち、核酸の形態を持つ出発物質のインビトロでの複製を可能にする周期的に変化する反応条件に適した当業者に周知の方法で行われる。一般的にＰＣＲは、温度サイクラー内で実行される２５〜５０サイクル数から成る。初期化後、各サイクルは、変性ステップ、プライマーハイブリダイゼーション（アニーリング）、及び伸長反応から成り、これらは選択されたプライマー対及び使用された酵素に依存した温度で行われる。選択的に複製される核酸部分に対する基本単位である増幅産物は、反応混合物中で、出発物質中の相補領域に付着するプライマー対及び適切な通常は耐熱性のポリメラーゼと共に、デオキシヌクレオチド三リン酸の形態で存在する。適切な増幅条件、例えばカチオン濃度、ｐＨ値、容量、選択されたプライマー対に依存する周期的に繰り返される１つの反応ステップの時間と温度、及び使用される酵素は、日常的に当業者により選択される。
【００４４】
本発明の１つの有利な実施態様において、増幅は、増幅産物が検出可能なマーカーにより標識される条件下で行われる。これは、例えば、検出可能なマーカーを備えた１つまたはいくつかのヌクレオチドを含む、ＰＣＲにおいて使用されるヌクレオチドによって達成される。検出可能なマーカーを備えた当該ヌクレオチドは、増幅中に増幅産物中に組み込まれ、このマーカーを手段としてこの増幅産物の検出を可能にする。１つの実施態様において、放射活性マーカー、例えば３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３３Ｐ又は３Ｈが検出可能なマーカーとして使用される。本発明の好ましい実施態様によれば、非放射性マーカー、特に色若しくは蛍光マーカー、酵素若しくは免疫マーカー、量子ドット又はその他の検出可能な分子、例えばビオチンなどの結合反応の結果としての検出可能な分子が検出可能なマーカーとして使用され、これらの検出は当業者に周知の方法で行うことができる。特に好ましくは色及び蛍光マーカー並びにビオチンマーカーである。さらに好ましくは、ＰＣＲにおいてビオチン標識ヌクレオチドが使用される。例えばビオチン標識ｄＵＴＰ（デオキシウリジン三リン酸）は、ストレプトアビジンへの結合によって検出することができるビオチン標識増幅産物をもたらす。適切なマーカーの選択は当業者にとって通常の業務である。
【００４５】
他の実施態様によれば、増幅はリアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって行われる。ｑＰＣＲの方法は当業者に周知であり、詳細については例えば米国特許出願公開第２００６／００９９５９６Ａ１号明細書に記載されている。ｑＰＣＲにおいては、ＰＣＲの各サイクルにおけるＰＣＲ産物の生成が測定される。そのため増幅は、増幅中の蛍光信号を測定するための手段を備えた温度サイクラー中で測定される。この目的のために適切な装置は、例えばロシュ・ダイアグノスティックス社ライトサイクラー（登録商標）の商標名で市販されている。
【００４６】
生成した増幅産物の検出は、非標識及び標識増幅産物のいずれでも行うことができる。
【００４７】
得られた増幅産物が検出可能なマーカーを一切含まない場合、増幅産物の検出は、例えばそれらの既知のサイズに基づき、ゲル電気泳動による分離とその後の可視化、例えば臭化エチジウムによる染色と紫外光の使用による可視化により行うことができる。ゲル電気泳動は周知の方法、例えばアガロースゲル電気泳動又はポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により行うことができる。好ましくは、ゲル電気泳動はアガロースゲル上で行われる。ゲル電気泳動において分離された増幅産物は、サイズ決定のためのＤＮＡマーカーのラダーと比較される。この比較は、増幅において予期されるＤＮＡ断片の混合物を含むＤＮＡラダーを用いて適切に行われる。サイズがＤＮＡマーカーと一致した増幅混合物中の増幅産物の存在は、断片長が固有の微生物の存在を示す。
【００４８】
有利な実施態様において、ＰＣＲにおいて生成した増幅産物は検出可能なマーカーを含む。この場合検出は、好ましくはハイブリダイゼーション技術（アレイ）、例えばＤＮＡマイクロアレイなどのマイクロアレイにより行われる。好ましくは、検出はマイクロアレイを用いて行われる。この場合、ＰＣＲにおいて得られ、検査試料中における細菌や真菌の存在下、ビオチン標識などの標識増幅産物を含む増幅混合物は、ポリヌクレオチドに基づく一組のプローブと接触させる。当該プローブは、所定の場合にＰＣＲにおいて得られる増幅産物に相補的な核酸配列を含み、ハイブリダイゼーションを可能にする条件下、ラスターの規定された位置（「スポット」）においてガラス担体などの固相担体に塗布されている。適切なハイブリダイゼーション条件を調整するための設定値の選択は、一般に当業者に知られている。これらは遊離及び結合分子の熱力学的平衡の確立に影響し得る、物理的及び化学的設定値である。当業者であれば、最適なハイブリダイゼーション条件のためにプローブと試料分子間の接触時間、ハイブリダイゼーション緩衝液中のカチオン濃度、温度、容量、及びハイブリダイズした分子の濃度と比率を調整することができる。増幅産物とポリヌクレオチドプローブの特異的ハイブリダイゼーションは、結合しない核酸を洗い流した後、読み取り装置によって読み取ることができる。例えばビオチン標識増幅産物と固定化プローブの特異的ハイブリダイゼーションの検出は、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ複合物を用いて行うことができる。個々のスポットに添加された基質テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）の酵素的変換により生成した色沈殿物は、分析装置を用いて検出され読み取られる。マイクロアレイ技術は一般に当業者に知られている。本発明のＰＣＲにおいて得られた増幅産物の検出のために原理上使用することのできるプローブ系は、例えばＡＴ（登録商標）システム（クロンダイアグチップテクノロジーズ（Clondiag Chip Technologies）社、０７７４９イエナ、ドイツ）の商標名で市販されている。当業者はその専門知識によって、特定の微生物の検出に適合したマイクロアレイを開発することが容易にできる。
【００４９】
ｑＰＣＲの場合、増幅産物の検出は個々の増幅サイクル中に行われる。例えば、増幅産物を二本鎖ＤＮＡに結合する色素を用いて検出することができる。これらの色素は、適切な波長で刺激すると、二本鎖ＤＮＡに結合したときに高い蛍光強度を示す。二本鎖に結合する色素を用いた検出は、例えば欧州特許出願公開第０−５１２−３３４−Ａ号明細書に記載されている。好ましい実施態様によれば、増幅産物は、標的核酸に結合したときのみ蛍光シグナルを放射する蛍光標識ハイブリダイゼーションプローブを用いて検出される。ｑＰＣＲにおける検出に使用することのできるプローブの例は当業者に知られており、例えばTaqMan（登録商標）プローブ（例えば欧州特許出願公開第０−５４３−９４２−Ａ号明細書及び米国特許第５２１００１５Ａ号明細書を参照）、モレキュラービーコンズ（Molecular Beacons）（米国特許第５１１８８０１Ａ号明細書を参照）、スコーピオン−プライマーズ（Scorpion-Primers）、Ｌｕｘ（登録商標）プライマーズ（Lux
primers）及びＦＲＥＴプローブ（国際公開第９７／４６７０７号パンフレット、国際公開第９７／４６７１２号パンフレット及び国際公開第９７／４６７１４号パンフレットを参照）が含まれる。ＦＲＥＴプローブは、示された参考文献に記載されているように、融解曲線分析についても使用することができる。
【００５０】
非定量的及び定量的増幅のいずれについても、さらなる区別のために引き続き配列決定が行われてもよい。
【００５１】
本発明の方法及び手段はさまざまな分野で使用することができ、また一般的に、細菌及び／若しくは真菌並びに／又はこれらの耐性菌を見つけ出すために使用することができる。本発明の方法は、細菌及び真菌、特に病原性の細菌及び真菌が存在する可能性のある任意に所望する試料物質、例えば環境試料、食品試料又は臨床試料などの生物試料を検査するのに適している。生物試料は植物試料であってもよいが、一般的には生物又は臨床試料はヒト又は動物試料であり、特に哺乳動物からの試料である。通常は、試料はヒト又は動物の組織試料であり、例えば生検又は体液若しくは体液に由来する産物である。好ましくは、試料は体液又は体液に由来する産物であり、例えば全血、血清、血漿、濃縮血小板、脳脊髄液、液、尿、及び胸膜液、腹水、心膜液、腹膜液若しくは滑液などの血液又血液産物である。好ましい実施態様によれば、本発明の方法及び手段は、臨床試料中の病原性細菌、真菌並びに／又は抗菌剤及び抗真菌剤耐性菌を検出するのに使用することができる。有利な実施態様によれば、本発明の方法及び手段は、濃縮血小板における雑菌混入を検知するのに使用することができる。さらに好ましい実施態様によれば、本発明の方法及び手段は、未発見の感染症を含む炎症性疾患の病原菌及び／又は耐性菌の検出と早期診断に使用することができる。当該未発見の感染症は、米国胸部専門医学会／米国集中治療医学会コンセンサス会議（ＡＣＣＰ／ＳＣＣＭ）のコンセンサス会議基準（Crit. Care Med. 1992; 274:968 974）によれば「全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）」とも呼ばれる。他の有利な実施態様によれば、本発明の方法及び手段は、感染症、特に全身性感染症の検出と早期診断に使用することができる。他の特に好ましい実施態様によれば、本発明の方法及び手段は、敗血症の検出と早期診断に使用することができる。１つのさらに好ましい実施態様によれば、本発明の方法及び手段は、突発性細菌性腹膜炎の検出と早期診断に使用することができる。他の好ましい実施態様によれば、本発明の方法及び手段は、心内膜炎の検出と早期診断に使用することができる。これらのすべての場合においてプライマーは、好ましくは、試料物質中に予期される微生物または耐性菌の核酸配列にハイブリダイズし、それらの増幅を可能にするように選択される。従って、例えば図３Ａに示される微生物の核酸配列に特異的にハイブリダイズするプライマーは、好ましくは敗血症の早期診断に使用される。
【００５２】
要約すれば、本発明は上述したように、血液などの試料物質中の病原菌を測定する方法及び手段に関する。本方法において、細菌ＤＮＡは最初に試料物質の全ＤＮＡから濃縮され、次いで濃縮されたＤＮＡは特定のプライマー対を用いて増幅される。得られた増幅産物の検出により、試料物質中に含まれる細菌及び真菌並びにこれらの耐性菌の正確な同定が可能になる。本発明の方法及び手段は、試料物質中の細菌及び真菌の簡易で迅速な測定を可能にすることが特徴である。驚くべきことに、試料物質中の他のＤＮＡ、特にヒトＤＮＡとの関係において、細菌及び真菌ＤＮＡに対する特異的濃縮ステップ並びに増幅ステップの単純な組み合わせが、個々の細菌及び真菌に対する検出感度を大幅に高めることを可能にするだけではなく、この方法で、並行して高い感度をもって多数の異なる細菌及び真菌の属種の検出をも可能にすることが見出された。これは、病原菌を同時、迅速かつ確実に測定することを可能にし、また担当医が、検出された病原菌に対する治療を早急に最適に順応させることを可能にする。従って本発明の方法は、適切な治療処置に関する医師の決定において重要な補助になることを示している。本発明の方法は、細菌及び／又は真菌の全般的な検出を可能にするプライマーを用いて実行されるので、たとえ病原菌がこれまでは稀にしか発生しなかった又はまったく発生しなかった細菌及び真菌であっても、感染を検知することが可能である。
【００５３】
本発明は以下の実施例と図面によってより詳細に記載される。
【００５４】
以下の実例は単に本発明の実施例を示すに過ぎず、なんら本発明の範囲の限定を意図するものではない。
【実施例】
【００５５】
実施例１
特発性細菌性腹膜炎（ＳＢＰ）の病原菌の検出
試料採取
試料は、フリードリッヒ−シラー大学（イエナ、ドイツ）の胃腸病学、肝臓学及び感染症学部門の内科外来からもたらされた。腹水は、企画研究に関する現地倫理委員会の承認後、ＳＢＰが疑われる患者７５名から採取された。判断基準として全細胞数を計測し、細胞数が２５０細胞／μｌの場合、好中球数を測定した。腹水培養は、５ｍｌの腹水を播種した血液培養ボトル（好気性／嫌気性）で調製した。全ＤＮＡはナノドロップ（Nanodrop、登録商標）装置を用いて抽出後測定した。好中球数が判断基準の閾値を超える、若しくは腹水培養が陽性である、若しくは他の兆候（例えば血液培養を介して）が全身性感染を指し示す、又は以下に記載する第二段階において実施される１６Ｓ−ｒＤＮＡ−ｑＰＣＲが標的配列のコピー数を著しく増加させる患者１４例（女性６例（平均年齢６７才）、男性８例（平均年齢５７．６才））のサブグループを選択した。
【００５６】
核酸検査（ＮＡＴ）の試料調製のために、５０ｍｌの腹水を５０ｍｌ容−ファルコンチューブに入れた。細胞を計測し遠心分離した。沈渣は、残存している上清５ｍｌに再懸濁し、−８０℃で保管した。
【００５７】
腹水試料から全ＤＮＡの単離
全ＤＮＡの単離は、ルックスター（LOOXSTER、登録商標）を用いて製造者仕様書に従って行った。
【００５８】
（細胞溶解）
１００μｌのリゾチーム溶液を、解凍した腹水試料に添加し（終濃度１ｍｇ／ｍｌ）、短時間のボルテックス後、３７℃で１時間インキュベーションした。５ｍｌの溶解緩衝液Ａと１００μｌのプロテアーゼ溶液を添加し、短時間のボルテックス後、５０℃で１時間インキュベーションした。この試料を２０秒間ボルテックスし、５０ｍｌ容チューブの膜に注いだ。
【００５９】
（結合及び洗浄）
チューブは３０００×ｇで２分間遠心分離した。チューブを交換し、５ｍｌの溶解緩衝液Ｂを加えてもう一度遠心分離した。再び５ｍｌの溶解緩衝液Ｂを加え、もう一度遠心分離した。
【００６０】
（溶出）
チューブを交換し、２．５ｍｌの溶解緩衝液Ｃを膜に注いで、室温で２分間インキュベーションした。チューブは３０００×ｇで１分間遠心分離にかけ、さらに２．５ｍｌの溶解緩衝液Ｃを膜に注いで、チューブをもう一度遠心分離にかけた。膜インサートは廃棄し、溶出液を新しい１５ｍｌ容チューブに移した。
【００６１】
（沈殿）
４ｍｌのイソプロパノールを加えた後、注意深く混合し、３０００×ｇで６０分間遠心分離した。上清を除去し、沈渣を２ｍｌの氷冷７０％エタノールで洗浄した。チューブは３０００×ｇで５分間の遠心分離にかけ、沈渣を室温で乾燥させた。ＤＮＡは２００μｌの蒸留水（ＤＮＡ及びＤＮＡ分解酵素不含）に５０℃で１時間溶解させた。原核生物及び真菌ＤＮＡの濃縮前に、１６μｌをｑＰＣＲ分析のために取り置いた。残りの１８４μｌを、１８４μｌの２×緩衝液Ｄと混合した。
【００６２】
原核生物及び真菌ＤＮＡの濃縮
特定の細菌及び真菌のゲノムＤＮＡの濃縮は、ルックスターキットを用いて製造者仕様書に従って行った。キットはカラム、採取チューブ及び試薬を含む。当該試薬はヒト及び細菌ＤＮＡからなる混合ＤＮＡを含む試料から原核生物ＤＮＡを濃縮するためのものであるが、真菌ＤＮＡの濃縮にも適している。実験方法を以下に要約する。
【００６３】
（結合）
カラムは、ルックスターの製造者仕様書に従って調整した。緩衝液Ｄに溶解した３６８μｌのＤＮＡを、準備したカラムに添加した。マトリックス／ＤＮＡ混合物はピペットで注意深く吸入吐出し、室温で３０分間インキュベートした。カラムは室温、１０００×ｇで３０秒間遠心分離し、素通り画分は廃棄した。
【００６４】
（洗浄）
カラムに３００μｌの緩衝液Ｄを２度加え、室温、１０００×ｇで３０秒間の遠心分離を２度行った。
【００６５】
（溶出ステップ）
カラムを新しい２ｍｌ容チューブに移し、３００μｌの緩衝液Ｄを加えた。マトリックス／ＤＮＡ混合物はピペットで注意深く吸入吐出した。カラムは室温で５分間インキュベートし、室温、１０００×ｇで３０秒間遠心分離した。３００μｌの緩衝液Ｅを再びカラムに加え、１０００×ｇで３０秒間遠心分離した。溶出液の容量は６００μｌであった。
【００６６】
（沈殿）
溶出されたＤＮＡは、５μｌの溶液Ｇ（Solution G）、６０μｌの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）及び４８０μｌのイソプロパノールを加えることにより沈殿させた。短時間（１０秒間）のボルテックス後、試料を４℃、１６０００×ｇで６０分間遠心分離し、上清は廃棄した。沈渣は１ｍｌの氷冷７０％エタノールで２回洗浄して、１６０００×ｇで５分間遠心分離し、上清は廃棄した。沈渣は室温で乾燥させ、ＤＮＡ及びＤＮＡ分解酵素を含まない３０μｌの水に５０℃、１時間で溶解した。ＤＮＡ濃度はナノドロップ（Nanodrop、登録商標）装置を用いて測定した。
【００６７】
１６Ｓプライマーを用いたリアルタイムＰＣＲ
原核生物ＤＮＡの定量は、１６Ｓ ｒＤＮＡ ｑＰＣＲを用いて行った。全ＤＮＡ濃度は、１反応あたり２００ｎｇの最適濃度に調整した。単離されたＤＮＡの含量は低いが、濃縮あり及び濃縮なしでのこれら関連試料の濃度が同じであることは、ルックスターシステムにより調べた。ＤＮＡ不含水による陰性対照は、細菌ＤＮＡの取り扱いのための閾値（切り捨て値）を決定するため、患者試料と同様にして実施した。潜在的なＰＣＲ阻害を確認するため、細菌ＤＮＡ（１０５ゲノム複製物）を、それぞれの患者の試料の一定分量に添加した。テンプレートのない対照（ＮＴＣ）も含めた。検出は、二本鎖ＤＮＡ中にＳＹＢＲ（登録商標）グリーンが取り込まれた結果としての蛍光に基づいた。２５μｌの反応容量は、１０μｌの２００ｎｇ以下の全ゲノムＤＮＡ、１２．５μｌの２×QuantiTect（登録商標）ＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスターミックス（キアゲン（QIAGEN）、登録商標）、並びに、それぞれ１．２５μｌ（終濃度１０ｐｍｏｌ）の順方向プライマー及び逆方向プライマーで構成された。すべてのステップは、ロータージーン（Rotor-Gene）RG-3000 ｑＰＣＲ装置（コルベット・ライフサイエンス（Corbett Life Science）、シドニー、オーストラリア）を用い、２回繰り返して行った。始めのＤＮＡ変性を９４℃で１５分間行い、続いて９４℃で３０秒間、５０℃で３０秒間及び７２℃で１分間のサイクルを４５回行った。計算はロータージーン６ソフトウェアを用いて行った。
【００６８】
多重ＰＣＲ
最適な治療方法のための細菌及び真菌病原体の同定は非定量的ＰＣＲによって行った。反応は、２つのプライマープール（プライマープールＩ及びＩＩ）を持つ２つの反応容器中で行った。当該プライマープールは、一般に細菌及び真菌に対して特異的な核酸配列、並びに特定の細菌及び真菌属、特定の細菌種、及び選択された耐性菌に対して特異的な核酸配列を持つプライマー対を含んでいた。下表は本試験で対象とされた細菌、真菌及び耐性菌の概要を示す。
【００６９】
【表１】
2010537650.tif 000003
【００７０】
ＤＮＡ濃度は１反応あたり５００ｎｇ以下の最適濃度に調整した。単離されたＤＮＡ含量が不十分な場合、低濃度のものをルックスター処理に使用した。２５μｌの反応容量は、可変量の鋳型ＤＮＡ、１２．５μｌの２×マルチプレックスＰＣＲマスターミックス（キアゲン、登録商標）、２．５μｌのプライマーミックス（終濃度１０ｐｍｏｌ、プライマープールＩ及びＩＩとして使用）、並びにＤＮＡ及びＤＮＡ分解酵素を含まない水から構成された。始めのＤＮＡ変性は、HotStar Taq（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（キアゲン、登録商標）を活性化するため、９５℃、１５分間行い、続いて９４℃で３０秒間、５９℃で１．５分間及び７２℃で４５秒間のサイクルを３０回行った。すべてのステップはマスターサイクラー（登録商標）グラジエントＳ（エッペンドルフＡＧ、ハンブルグ、ドイツ）を用いて行った。試料は２％アガロースゲル上で分析した。
【００７１】
結果
多重ＰＣＲで得られたデータは、判断基準（２５０μｌ以上の腹水における増加した多形細胞数）及び腹水培養のデータと比較した。カラムに添加したＤＮＡ含量に依存したルックスター法の効率は、ルックスターの前後で、１６Ｓ−ｒＤＮＡ
ＰＣＲを用いて測定した。図１に示されるように、原核生物及び真菌ＤＮＡの濃縮の濃縮係数は、ＤＮＡ量が高くなるにつれて増加する。全血からは、２０μｇ以上のＤＮＡを単離することができる。ＤＮＡ濃度が１μｇ未満から２０μｇ超まで変動している腹水において、それぞれの場合について顕著な濃縮が観察された。
【００７２】
ＳＢＰが疑われる上述の１４例のサブグループの患者に由来する１９試料において、腹水培養が陽性であり、好中球数の増加が認められた場合すべてについて多重ＰＣＲは陽性であった。さらに、腹水培養と全細胞数が陰性（２５０細胞／μｌ未満）である場合には、患者はエンテロコッカス・フェカリス、エシェリキア・コリ及びエンテロコッカス・フェシウムで多重感染していることが検出された。表２は１９試料に関する調査結果を要約し、表３は、この調査に使用された本発明の方法によってＳＢＰが確認された患者の症例から選択したものを示す。図２は、患者２から２日以内に採取した２つの腹水試料についてエシェリキア・コリ感染を検出するため、アガロースゲル上での多重ＰＣＲのゲル電気泳動を示す。レーン１及び２はプライマープールＩで検査した試料を示す。２１８塩基対のバンドは、エシェリキア・コリの増幅産物に固有である。
【００７３】
【表２】
2010537650.tif 000004
【００７４】
【表３】
2010537650.tif 000005
【００７５】
核酸に基づくＰＣＲ法は、選択された３症例のすべてについて陽性の結果を与えた。全細胞数及び好中球数は増加し、腹水培養では２症例で陽性であった。さらに多重ＰＣＲでは、１症例（患者２）について多重感染であることを示したが、細胞数もｑＰＣＲにより測定されたコピー数も増加していなかった。この患者は、最初にセフトリアキソン／メトロニダゾールで治療された。血液及び腹水を採取した３日後、血液培養はエンテロコッカス・フェカリスについて陽性であったが、並行して行われた腹水培養では陰性のままであった。これに応じて治療は、エンテロコッカス・フェシウムの増殖を阻害しないタゾバクタムに変更された。さらに、エシェリキア・コリ、エンテロコッカス・フェカリス及びエンテロコッカス・フェシウムが創傷塗抹標本で見いだされた。また一方で、この同じ３種類の生物（エシェリキア・コリ、エンテロコッカス・フェカリス及びエンテロコッカス・フェシウム）は、多重ＰＣＲを用いても見いだされた。これは、多重ＰＣＲが、およそ６時間以内に、血液及び腹水培養が数日以内に出す結果と同じ結果をもたらすことを示す。このようにして、多重ＰＣＲを全ＤＮＡからの細菌及び真菌ＤＮＡの濃縮と組み合わせて使用することにより、迅速で早期の病原菌検出が可能になり、また適切で早期の抗菌剤治療が可能になる。
【００７６】
従ってもしそうであるなら、現在の判断基準法も１６Ｓ ｒＤＮＡ ｑＰＣＲも、単独ではＳＢＰの診断に十分ではないが、特定の抗菌剤治療に関してこれらの方法がいかなる情報ももたらさないという事実に言及するわけではない。
【００７７】
実施例２
ＰＣＲ及びゲル電気泳動による添加試料中の細菌及び真菌の検出
血液試料にスタフィロコッカス・アウレウス、エシェリキア・コリ及びクレブシエラ・ニューモニエの細菌ＤＮＡを添加した。全ＤＮＡ調製及びルックスター（LOOXSTER、登録商標）による細菌ＤＮＡの濃縮は、実施例１に記載した通りに行った。
【００７８】
得られたＤＮＡ試料は、図３Ａに示された細菌及び真菌の特定の核酸配列に特異的な、５０の敗血症特異的プライマー対を用いて増幅した。増幅は、実施例１に記載された非定量的多重ＰＣＲを用いて異なるバッチで行った。試料は２％アガロースゲル上で分析した。図３Ｂは、添加された細菌ＤＮＡのＰＣＲ増幅産物に対応するアガロースゲルを示す（Ｍはマーカーである）。図３Ｃは、関連付けられたゲル上の試料添加及び選択されたＰＣＲ標的に対して予期される増幅物サイズを示す。
【００７９】
本試験では、スタフィロコッカス・アウレウス、エシェリキア・コリ及びクレブシエラ・ニューモニエの３種類の細菌種が、ＤＮＡ濃縮と特異的プライマー対による多重ＰＣＲを経て検出されたことが示される。
【００８０】
実施例３
添加試料中のエシェリキア・コリの多重ＰＣＲとプローブに基づいた検出
血液試料に、実施例２に記載の通りにエシェリキア・コリの細菌ＤＮＡを添加した。全ＤＮＡ調製及びルックスター（LOOXSTER、登録商標）による細菌ＤＮＡの濃縮は、実施例１に記載の通りに行った。エシェリキア・コリの検出のために、ｉｒｐ２遺伝子に向けられたプライマーとともに、ビオチン−１６
ｄＵＴＰ存在下多重ＰＣＲを行った。
【００８１】
うまく取り込まれた標識ヌクレオチドはサザンブロッティングにより検出された。ブロッティングのために、２層になったワットマン濾紙とニトロセルロース膜を０．５×ＴＢＥに浸漬し、引き続いて陰極（−）上に置いた。次いでゲルを膜上に置き、０．５×ＴＢＥに浸漬した２層のワットマン濾紙で覆った。最後に陽極（＋）を付け、装置を２Ａで１２分間接続した。固定のためには、紫外架橋結合を用いた。膜を紫外光により１５０ｍＪ／ｃｍ２で１分間照射し、その後空気中で３０分間乾燥させた。続いて、膜をブロッキング緩衝液により室温で１時間ブロックした。次いで膜をＴＢＳＴ緩衝液により５分間で３回洗浄した。膜は、ブロッキング緩衝液で１：２０００希釈したストレプトアビジン−西洋わさびペルオキシダーゼで処理し、続いて室温で３０分間インキュベートした。これにより、標準的なストレプトアビジン−ビオチン複合体が形成された。膜をＴＢＳＴ緩衝液により５分間で３回洗浄した後、基質を膜上に置いた。ＴＭＢを基質として使用した。ブロットの展開には１０分間を要した。ビオチンが取り込まれた場所に青色色素が生成した（データ示さず）。予期される２００塩基対のｉｒｐ２増幅産物はゲル電気泳動により検出した（データ示さず）。
【００８２】
その後、ビオチン標識された２００塩基対のｉｒｐ２増幅産物の存在は、以下のようにプローブに基づくアッセイ（マイクロアレイ）により検出した。
【００８３】
（プローブの設計とチップ製造）
選択されたオリゴヌクレオチドすべてについて、ＮＣＢＩ−ＧｅｎＢａｎｋ（ｎｒ、ｅｓｔヒト）に預けられた他のＤＮＡ配列すべてに対して、少なくとも７〜８塩基対のミスマッチ（温度差１４〜１６℃）があることに留意した。配列は下記の仕様のもと、アレイデザイナー（Arraydesigner、登録商標）プログラムを用いて計算した。
・プローブ長  ３５±５塩基
・融解温度  約７０℃
・平衡ＧＣ含量（Ａ／Ｔ：Ｇ／Ｃ＝１：１）
・特定の病原菌検出の標的あたり２つの非重複プローブ
・ヒト及び他の細菌標的との交差反応の回避
・アレイ上のプローブの可動性に対してプローブの３’末端にポリ−Ｔ（１０ Ｔ’ｓ）
・ＤＮＡマイクロアレイ表面への結合のためのオリゴヌクレオチド３’末端でのアミノ基修飾
【００８４】
使用された標的のプライマー／増幅産物のすべてに対する、使用されたすべての標的に規定されたプライマーの交差反応は、コンピューターによるプローブのマッチングにより排除した。
【００８５】
ＰＣＲ断片の検出は、ＡＴ（登録商標）システム（クロンダイアグチップテクノロジーズ（Clondiag
Chip Technologies）社、０７７４９イエナ、ドイツ）に基づいた。アレイチューブの調製は、ＤＮＡマイクロアレイ上の個々のオリゴヌクレオチドの配置を示す図４に表示されたスポットプランに従って、クロンダイアグ社において行われた。加えて、ビオチンプローブはアレイの辺縁領域に固定化された（ビオチンマーカー）。これらは陽性対照としての機能を果たすが、これは、ビオチンとストレプトアビジンの反応が検出に用いられたため、スポットの形成はビオチンプローブのところで常に生じるであろうということによる。さらに、ビオチンプローブの強度は、存在する遺伝子プローブに対する試料量の比率に関する記載を可能にする。特異的遺伝子プローブにより生成したスポットの強度は、ビオチンプローブの強度を超えるべきではない。これはＰＣＲ断片によるアレイの過負荷を示し、偽陽性の結果の原因となるためである。
【００８６】
（ハイブリダイゼーション）
ビオチン標識増幅産物を直接ハイブリダイゼーションに使用した。このために、４μｌのビオチン標識ＰＣＲ産物を９６μｌのハイブリダイゼーション緩衝液に入れ、アレイ−チューブ（Array-Tubes、登録商標）外で９５℃、５分間変性させ、その後直ちに氷上で１２０秒間冷却した。
【００８７】
アレイ−チューブは２回、前洗浄した。使用した溶液のすべては、反応時間終了後プラスチックパスツール・ピペットを用いて注意深く除去した。５００μｌの精製水を加え、熱混合器上で５０℃、５５０ｒｐｍで５分間変性させた。次に、５００μｌのハイブリダイゼーション緩衝液を加え、５０℃、５５０ｒｐｍで５分間インキュベートした。この後、１００μｌの変性試料をＡＴシステムにおいて、５０℃、５５０ｒｐｍで６０分間ハイブリダイゼーションさせた。３回の洗浄ステップ後、すなわち最初に５００μｌの洗浄溶液１（４０℃、５５０ｒｐｍで５分間）、次に５００μｌの洗浄溶液２（３０℃、５５０ｒｐｍで５分間）及び最後に５００μｌの洗浄溶液３（３０℃、５５０ｒｐｍで５分間）による洗浄後、背景シグナルを減衰させるため、新たに調製した２％ブロッキング緩衝液１００μｌをアレイ上に３０℃、５５０ｒｐｍで１５分間配置した。新たに調製したストレプトアビジン−西洋わさびペルオキシダーゼ複合体溶液のうち１００μｌをピペットでアレイ上に取り、３０℃、５５０ｒｐｍで１５分間結合させた。この後、５００μｌの洗浄溶液１により洗浄した。第２の洗浄ステップは、５００μｌの洗浄溶液２を添加し、２０℃、５５０ｒｐｍで５分間行った。最後に、５００μｌの洗浄溶液３をＡＴに添加し、２０℃、５５０ｒｐｍで５分間インキュベートした。アレイ−チューブは、ＡＴ読み取り装置の温度制御された読み取りトレイ（２５℃）に挿入した。ここでは、最後の洗浄溶液を当該読み取り装置のＣＣＤカメラを用いた視覚制御下で除去し、読み取り装置のカメラの焦点を合わせた。この直後、１００μｌのペルオキシダーゼ基質（ＴＭＢ）を加えることにより検出を行った。６０枚の画像を取得した。すなわち１０秒ごとに１枚の画像であった。ＣＣＤカメラはアレイ−チューブを通り抜けた白色光の透過を測定している。このようにして得られたデータはイコノクラスト（IconoClust、登録商標）ソフトウェアを用いて評価した。
【００８８】
図５は、エシェリキア・コリのビオチン標識ｉｒｐ２の１つのアッセイのハイブリダイゼーション結果の画像を示す。ｉｒｐ２遺伝子の２００塩基対増幅産物が他のプローブと交差反応することなく検出し得たことがわかった。
【００８９】
実施例４
全血試料中のストレプトコッカス・ピオゲネス（化膿性連鎖球菌）及びカンジダ・アルビカンスの検出のための非定量的及び定量的ＰＣＲ
カンジダ・アルビカンス（ＡＴＣＣ  ＭＹＡ−２８７６）及びストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｖａｒｉａ４２４４０（微生物医学研究所、イエナ）、敗血症陽性の血液培養）の一夜培養（１０５細胞）を、健常ドナーの全血試料に添加した。２ｇのガラスビーズ（Ｇ８７７２ガラスビーズ、酸洗浄済み、４２５〜６００μｍ、シグマ・アルドリッチ（Sigma Aldrich Chemie GmbH）、Schellendorf、ドイツ）及び１００μｌのプロテアーゼを添加した後に、細胞を２分間で２回のボルテックスと、それぞれについて引き続く５０℃で２分間のインキュベーションにより機械的に溶解させた。全ＤＮＡの単離はGenomic Maxi AX Bloodキット（A&A
Biotechnology, Gdynia, ポーランド）を用いて行い、細菌及び真菌ＤＮＡの濃縮は、実施例１に記載した通りにルックスター（LOOXSTER、登録商標）を用いて行った。
【００９０】
非定量的ＰＣＲ
カンジダ・アルビカンス及びストレプトコッカス・ピオゲネスの同定は非定量的多重ＰＣＲにより行った。多重ＰＣＲバッチにおいて、ルックスターからの溶出液のＤＮＡ濃度を５００ｎｇに調整した（ナノドロップ（Nanodrop、登録商標）ＤＮＡ濃度定量）。２５μｌの反応容量（いくつかの種特異的なプライマー対を含む２つのプライマープール、すなわち１試料あたり２反応バッチ）は、５μｌの鋳型ＤＮＡ、５μｌの細胞培養用ＤＮＡ不含水（ＰＡＡ）、１２．５μｌの２×マルチプレックスＰＣＲマスターミックス（キアゲン（QIAGEN、登録商標）、Hilden、ドイツ）及び２．５μｌの１０×プライマーミックス（終濃度１０ｐｍｏｌ）で構成された。９５℃で１５分間の最初の変性が、HotStarTaq（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（キアゲン）の活性化に必要であった。全ＰＣＲ温度サイクラープログラムは以下の表４に示される。
【００９１】
【表４】
2010537650.tif 000006
【００９２】
すべてのインキュベーションステップは、マスターサイクラー（登録商標）ｅｐグラジエントＳ（エッペンドルフＡＧ、ハンブルグ）上で行った。ＰＣＲ産物は１．５％アガロースゲルで分離した。結果は図６に示され、これは対応するアガロースゲルの写真を示している：Ｍ：ＤＮＡマーカー（塩基対（ｂｐ）で表示）、１：プライマープール１及び処理したカンジダ・アルビカンス血液試料、２：プライマープール２及び処理したカンジダ・アルビカンス血液試料、３：プライマープール１及び細胞培養用水（ＮＴＣ）、４：プライマープール１及び処理したストレプトコッカス・ピオゲネス血液試料、５：プライマープール２及び処理したストレプトコッカス・ピオゲネス血液試料、６：プライマープール２及び細胞培養用水（ＮＴＣ）。レーン４はストレプトコッカス・ピオゲネス検出のためのｓａｇＨ（６６２塩基対）及びｓｌｏ−（７３７塩基対）の増幅産物を示し（＃）、レーン２はカンジダ・アルビカンス検出のためのＴＥＦ２増幅産物を示す（＊）。
【００９３】
結果は、本発明の方法により血液中のカンジダ・アルビカンス及びストレプトコッカス・ピオゲネスを特異的に検出し得ることを示す。
【００９４】
機械的な細胞溶解後のリアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）
真菌及び細菌標的の定量化は、１８Ｓ ｒＤＮＡ及び遺伝子特異的プライマーを用いて定量的ＰＣＲ（それぞれｑＰＣＲ及びリアルタイムＰＣＲ）により行った。全ＤＮＡ量は１反応あたり２００ｎｇであった（ナノドロップＤＮＡ測定に基づくもの）。上記の通り、ルックスターにより濃縮したＤＮＡを使用した。陰性対照（病原菌ＤＮＡに対する閾値又は切り捨て値を決定するためのもの）として、細胞培養用ＤＮＡ不含水（ＰＡＡ）を使用した。検出は、ＤＮＡへの蛍光色素ＳＹＢＲ（登録商標）グリーンの挿入に基づいた。２５μｌの反応バッチは、１０μｌのゲノムＤＮＡ（２００ｎｇ）、１２．５μｌの２×QuantiTect（登録商標）ＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスターミックス（キアゲン（QIAGEN、登録商標））、並びに、それぞれ１．２５μｌ（終濃度１０ｐｍｏｌ）の順方向及び逆方向プライマーで構成された。カンジダ・アルビカンス検出には１８Ｓ−ｒＤＮＡプライマー対panfneu11/12を使用し、ストレプトコッカス・ピオゲネス検出には遺伝子特異的プライマー対sagAを使用した。
【００９５】
すべての反応ステップは、ロータージーン（Rotor-Gene、登録商標）RG-3000（コルベット・ライフサイエンス（Corbett Life Science）、シドニー、オーストラリア）を用いて２並行で行った。温度サイクラープログラムは以下の表５に示される。評価は、ロータージーン６ソフトウェア互換性のシステムを用いて行った。
【００９６】
【表５】
2010537650.tif 000007
【００９７】
結果
図７及び８は、ロータージーン６による評価後の結果を示す。相対的蛍光値（縦軸）はＰＣＲサイクル（横軸）に関してプロットした。計算に用いた基本は、Ｃｔ値、すなわち蛍光閾値（「閾値」）が初めて増幅産物特異的な１本の蛍光曲線を超えるサイクル数の決定であった。
【００９８】
図７は、カンジダ・アルビカンス（ＡＴＣＣ ＭＹＡ−２８７６）の一夜培養が添加され、機械的に溶解させた、健常ドナーからの全血試料のｑＰＣＲ評価を示す。相対的蛍光値はＰＣＲサイクル数に関してプロットした。示されているものは、１０７〜１０２コピーのカンジダ・アルビカンスの標準系列（黒点）である。機械的に処理されたカンジダ・アルビカンス試料について、添加された細胞数１０５の回収率は約１４％である（〜１０２．９コピーは、ゲノムコピーあたり３５ｆｇで〜４９０ｐｇの真菌ＤＮＡに相当する。）。
【００９９】
図８は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｖａｒｉａ４２４４０（微生物医学研究所、イエナ）、敗血症陽性の血液培養）の一夜培養が添加され、機械的に溶解させた、健常ドナーからの全血試料のｑＰＣＲ評価を示す。相対的蛍光値はＰＣＲサイクル数に関してプロットした。示されているものは、１０７〜１０２コピーのストレプトコッカス・ピオゲネスの標準系列（黒点）である。機械的に処理されたストレプトコッカス・ピオゲネス試料について、添加された細胞数１０５の回収率は約５６％である（〜１０３．５コピーは、ゲノムコピーあたり２ｆｇで〜１１２ｐｇの細菌ＤＮＡに相当する。）。
【０１００】
結果は、血液試料中の細菌及び真菌を、細菌及び真菌ＤＮＡに特異的に結合するタンパク質によりこれらのＤＮＡを濃縮後、ｑＰＣＲによって検出し得ることを示す。ここで、ｑＰＣＲはさらに、血液試料中の病原菌濃度に関する記載を可能にする。
【図１】
2010537650.tif 000008
【図２】
2010537650.tif 000009
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2010537650.tif 000015
【配列表】
2010537650000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年7月30日(2010.7.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
感染の検出及び治療決定の支援又は汚染の検出のための、試料物質中の細菌及び真菌並びに／又はこれらの耐性菌の測定方法であって、当該方法が以下のステップを含む方法：
ａ）組織試料、体液及びこれらに由来する産物より選ばれるヒト又は動物試料の全ＤＮＡからの細菌及び真菌ＤＮＡの濃縮；
ｂ）（ｉ）〜（ｖｉｉ）の群の少なくとも２つの群のプライマー対より選ばれる少なくとも２０の異なるプライマー対を用いる、ステップａ）で得られる濃縮された細菌及び真菌ＤＮＡの多重増幅：
（ｉ）複数の細菌ファミリーに特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも１つのプライマー対；
（ｉｉ）複数の真菌ファミリーに特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも１つのプライマー対；
（ｉｉｉ）選択された細菌属に特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも１つのプライマー対；
（ｉｖ）選択された細菌種に特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも１つのプライマー対；
（ｖ）選択された抗菌剤又は抗真菌剤耐性の発現に特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも１つのプライマー対；
（ｖｉ）選択された真菌属に特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも１つのプライマー対；及び
（ｖｉｉ）細菌又は真菌の選択された菌種に特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも１つのプライマー対；並びに、
ｃ）ステップｂ）で生成される増幅産物の検出であって、
（ｉ）群の少なくとも1つのプライマー対を用いて形成される増幅産物が存在することは、細菌が存在することを示し；（ｉｉ）群の少なくとも1つのプライマー対を用いて形成される増幅産物が存在することは、真菌が存在することを示し；（ｉｉｉ）群の少なくとも1つのプライマー対を用いて形成される増幅産物が存在することは、選択された細菌属が存在することを示し；（ｉｖ）群の少なくとも1つのプライマー対を用いて形成される増幅産物が存在することは、選択された細菌種が存在することを示し；（ｖ）群の少なくとも1つのプライマー対を用いて形成される増幅産物が存在することは、選択された抗菌剤又は抗真菌剤耐性菌が存在することを示し；（ｖｉ）群の少なくとも1つのプライマー対を用いて形成される増幅産物が存在することは、選択された真菌属が存在することを示し；及び、（ｖｉｉ）群の少なくとも1つのプライマー対を用いて形成される増幅産物が存在することは、選択された真菌種が存在することを示す、検出。
【請求項２】
試料物質は体液又は体液に由来する産物であって、特に血液又血液産物、例えば全血、血漿、血清又は濃縮血小板、脳脊髄液、液、尿、胸膜液、腹水、心膜液、腹膜液及び滑液である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細菌及び／又は真菌ＤＮＡの濃縮が、試料物質から得られる全ＤＮＡを非メチル化ＣｐＧモチーフに結合する能力があるタンパク質又はポリペプチドと接触させることにより行われる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
（ｉ）群の少なくとも１つのプライマー対が、細菌１６Ｓ
ｒＤＮＡに対する遺伝子の核酸配列に特異的にハイブリダイズするプライマー対である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
（ｉｉ）群の少なくとも１つのプライマー対が、真菌１８Ｓ
ｒＤＮＡに対する遺伝子の核酸配列に特異的にハイブリダイズするプライマー対である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ステップｂ）における増幅は、増幅産物が検出可能なマーカーにより標識される条件下で行われる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ステップｂ）における増幅は、非定量的ＰＣＲによって行われる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ステップｂ）における増幅は、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって行われる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ステップｂ）において得られる増幅産物の検出が、ゲル電気泳動法又はヌクレオチドに基づくハイブリダイゼーション法によって行われる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップｂ）において得られる増幅産物の検出が、マイクロアレイによって行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
濃縮血小板の汚染を検出するための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
感染症、特に全身性感染症を検出するための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
敗血症の早期診断のための、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
突発性細菌性腹膜炎の早期診断のための、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
心内膜炎の早期診断のための、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
試料物質中に含まれる細菌及び真菌を測定するための診断キットであって、
ａ）試料物質の全ＤＮＡより試料物質中に含まれる細菌及び真菌ＤＮＡの濃縮手段；
ｂ）（ｉ）〜（ｖｉｉ）の群の少なくとも２つの群のプライマー対より選ばれる少なくとも２０の異なるプライマー対を含む、濃縮された細菌及び真菌ＤＮＡの多重増幅手段：
（ｉ）複数の細菌ファミリーに特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも１つのプライマー対；
（ｉｉ）複数の真菌ファミリーに特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも１つのプライマー対；
（ｉｉｉ）選択された細菌属に特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも１つのプライマー対；
（ｉｖ）選択された細菌種に特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも１つのプライマー対；
（ｖ）選択された抗菌剤又は抗真菌剤耐性の発現に特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも１つのプライマー対；
（ｖｉ）選択された真菌属に特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも１つのプライマー対；及び
（ｖｉｉ）選択された真菌種に特異的な特有の核酸配列領域の特異的増幅に適した少なくとも１つのプライマー対；並びに、
ｃ）ｂ）のプライマー対を用いて得られる増幅産物の検出手段；
を含むキット。
【請求項１７】
（ｉ）群の少なくとも１つのプライマー対が、細菌１６Ｓ
ｒＤＮＡに対する遺伝子の核酸配列に特異的にハイブリダイズするプライマー対である、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
（ｉｉ）群の少なくとも１つのプライマー対が、真菌１８Ｓ
ｒＤＮＡに対する遺伝子の核酸配列に特異的にハイブリダイズするプライマー対である、請求項１６又は１７に記載のキット。
【請求項１９】
ＤＮＡの増幅手段が、増幅中に検出可能なマーカーを含む増幅産物を与える手段を含む、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２０】
ＤＮＡの増幅手段が、非定量的ＰＣＲを行うための手段を含む、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２１】
ＤＮＡの増幅手段が、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を行うための手段を含む、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２２】
ｂ）のプライマー対により得られる増幅産物の検出手段が、電気泳動ゲルの調製試薬を含む、請求項２０に記載のキット。
【請求項２３】
ｂ）のプライマー対により得られる増幅産物の検出手段が、マイクロアレイの実行手段を含む、請求項２０に記載のキット。
【請求項２４】
濃縮血小板の汚染を検出するための、請求項１６〜２３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２５】
感染症、特に全身性感染症を検出するための、請求項１６〜２３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２６】
敗血症の早期診断のための、請求項１６〜２３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２７】
突発性細菌性腹膜炎の早期診断のための、請求項１６〜２３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２８】
心内膜炎の早期診断のための、請求項１６〜２３のいずれか１項に記載のキット。
【国際調査報告】
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