(57)【要約】  本発明は、ＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１、およびＣＡ  ＩＸレベルの検出に基づき、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）に罹患している患者を分類する、またはその患者に化学療法を適用するか否かを決定するためのスクリーニング法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）に罹患している患者の生存を予測する方法であって、
ａ）患者の腫瘍サンプルからｍＲＮＡを単離し、
ｂ）前記サンプルにおけるＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１、およびＣＡ  ＩＸ遺伝子の遺伝子発現レベルを測定し、そして
ｃ）前記サンプルにおけるＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１、およびＣＡ  ＩＸ遺伝子の発現レベルを、ＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１、およびＣＡ  ＩＸ発現レベルに関する参照値と比較すること
を含んでなり、参照値よりも高いＥＧＦＲおよびＣＳＦ−１遺伝子の発現並びに低いＣＡ  ＩＸ遺伝子の発現が、その患者の生存予後が、ＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１、およびＣＡ  ＩＸ遺伝子の発現が変化していない患者のそれよりも低くなることを示すとする、方法。
【請求項２】
工程（ｂ）において、フィブロネクチン１（ＦＮ１）、インスリン受容体１（ＩＳＮＲ）、アニリン（ＡＮＬＮ）、プロリルヒドロラーゼ４（ＰＨ４）、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＮＴＲＫ１、およびＫＩＡＡ０９７４の群から選択される一以上の付加的遺伝子の発現レベルを検出し、そして
工程（ｃ）においてその付加的遺伝子の発現レベルを前記遺伝子の発現レベルに関する参照値と比較する
ことをさらに含んでなり、
参照値よりも高い前記遺伝子のいずれかの発現が、ＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１の高い発現およびＣＡ  ＩＸの低い発現と組み合わされば、前記患者の生存予後が、同じ遺伝子の発現が変化していない患者のそれよりも低くなることを示すとする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）に罹患している患者の生存を予測する方法であって、
ａ）患者の腫瘍サンプルからｍＲＮＡを単離し、
ｂ）前記サンプルにおけるＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１、およびＣＡ  ＩＸ遺伝子の遺伝子発現レベルを測定し、そして、
ｃ）そのＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１、およびＣＡ  ＩＸ遺伝子の発現レベルに基づき、式［０．９３×ＣＳＦ＋１．４×ＣＡ  ＩＸ＋１．１×ＥＧＦＲ］（式中、ＣＳＦ、ＣＡ  ＩＸ、およびＥＧＦＲは、ＣＳＦ−１、ＣＡ  ＩＸ、およびＥＧＦＲ遺伝子の発現レベルのｚスコアである）を用いてリスクスコアを算出すること
を含んでなり、リスクスコアが０より大きい場合に低い生存を示すこととする、方法。
【請求項４】
前記ＮＳＣＬＣが扁平上皮癌である、請求項１〜３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＮＳＣＬＣ患者が病期ＩＡ、ＩＢ、または病期ＩＩの患者である、請求項１〜４に記載の方法。
【請求項６】
ＮＳＣＬＣに罹患している患者が化学療法で処置されるべきか否かを決定する方法であって、
ａ）患者の腫瘍サンプルからｍＲＮＡを単離し、
ｂ）前記サンプルにおけるＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１、およびＣＡ  ＩＸ遺伝子の遺伝子発現レベルを測定し、そして
ｃ）前記サンプルにおけるＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１、およびＣＡ  ＩＸ遺伝子の発現レベルを、ＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１、およびＣＡ  ＩＸ発現レベルに関する参照値と比較すること
を含んでなり、参照値よりも高いＥＧＦＲおよびＣＳＦ−１遺伝子の発現並びに低いＣＡ  ＩＸ遺伝子の発現は、その患者が化学療法で処置されるべきであることを示すとする、方法。
【請求項７】
ＮＳＣＬＣに罹患している患者が化学療法で処置されるべきか否かを決定する方法であって、
ａ）患者の腫瘍サンプルからｍＲＮＡを単離し、
ｂ）前記サンプルにおけるＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１、およびＣＡ  ＩＸ遺伝子の遺伝子発現レベルを測定し、そして
ｃ）そのＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１、およびＣＡ  ＩＸ遺伝子の発現レベルに基づき、式［０．９３×ＣＳＦ＋１．４×ＣＡ  ＩＸ＋１．１×ＥＧＦＲ］（式中、ＣＳＦ、ＣＡ  ＩＸ、およびＥＧＦＲは、遺伝子発現レベルのｚスコアである）を用いてリスクスコアを算出すること
を含んでなり、リスクスコアが０より大きい場合に、その患者が化学療法で処置されるべきであることを示すとする、方法。
【請求項８】
前記ＮＳＣＬＣ患者が病期Ｉまたは病期ＩＩの患者である、請求項６または請求項７に記載の方法。
【請求項９】
遺伝子ＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１、およびＣＡ  ＩＸの変化した発現を検出するためのキットであって、ＥＧＦＲ遺伝子の領域を増幅することができる第１のプライマー対、ＣＳＦ−１遺伝子の領域を増幅することができる第２のプライマー対、およびＣＡ  ＩＸ遺伝子の領域を増幅することができる第３のプライマー対を含む、キット。
【請求項１０】
ＦＮ１、ＩＳＮＲ、ＡＮＬＮ、ＰＨ４、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＮＴＲＫ１、およびＫＩＡＡ０９７４の群から選択される遺伝子の領域を増幅することができる少なくとも１対のプライマーをさらに含む、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
逆転写酵素をさらに含む、請求項９または請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
ＮＳＣＬＣに罹患している患者の生存を予測するための、請求項９〜１１に記載されたキットの使用。
【請求項１３】
ＮＳＣＬＣに罹患している患者が化学療法で処置されるべきか否かを決定するための、請求項９〜１１に記載のキットの使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、非小細胞肺癌腫（ＮＳＣＬＣ）に罹患している患者の生存に関する予後マーカーとしての、並びにＮＳＣＬＣ患者に化学療法を適用するか否かを決定するための、ＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１、および／またはＣＡ  ＩＸの使用に関する。
【０００２】
背景技術
非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）は全ての肺癌のおよそ８０％を占め、世界中で毎年１２００万の新たな症例を生じる。ＮＳＣＬＣは、２００１年には１００万人を超える死者を出し、男性および女性（それぞれ３１％および２５％）とも癌関連の死亡率の主因である。
【０００３】
ＮＳＣＬＣは、その予後および管理がほぼ同じであることから、ともに分類された異質な疾病群を含む。しかしながら、それらの組織学に基づいて次のサブタイプが識別可能である：（ｉ）ＮＳＣＬＣの３０％〜４０％を占める扁平上皮癌（ＳＣＣ）は大きな呼吸管でも発症するが、増殖は遅く、これは診断の際にこれらの腫瘍の大きさが変動することを意味する、（ｉｉ）腺癌はＮＳＣＬＣの最も多いサブタイプであり、ＮＳＣＬＣの５０％〜６０％を占め、肺のガス交換表面付近で発症し、サブタイプの気管支肺胞上皮癌を含み、処置に対して異なる応答を示し得る、そして（ｉｉｉ）大細胞癌は肺の表面付近で増殖する増殖の早い形態である。それは基本的に除外診断であり、さらに検討を行えば、大抵、扁平上皮癌か、腺癌かに再分類される。
【０００４】
ＴＮＭサブセット（Ｔ＝原発腫瘍、Ｎ＝限局性リンパ節、Ｍ＝遠位転移）におけるＮＳＣＬＣ患者の病期分類により、類似の予後および治療選択肢を有する患者群の同定が可能となる。病期は次のように定義される。
病期Ｉ：癌が一方の肺にだけ存在し、隣接するリンパ節または胸部外には拡散していない。
病期ＩＩ：癌が一方の肺に存在し、同側胸部のリンパ節を含み得るが、肺間の空間（縦隔）または胸部外のリンパ節は含まない。
病期ＩＩＩＡ：癌が隣接する臓器に浸潤していない単一の腫瘍または塊状であり、腫瘍から離れているが、胸部外ではない一以上のリンパ節を含む。
病期ＩＩＩＢ：癌が胸部内の２箇所以上に拡散しているが、胸部外ではない。
病期ＩＶ：癌が肝臓、脳、または他の臓器を含み得る身体の異なる部位に拡散または転移している。
【０００５】
進行したＮＳＣＬＣの予後は悪い。最近の１１５５名の患者のEastern Cooperative Oncology Group治験では、用いた化学療法：シスプラチン／パクリタキセル、シスプラチン／ゲムシタビン、シスプラチン／ドセタキセル、およびカルボプラチン／パクリタキセル間に違いは無かった。全進行期間中央値は３．６か月であり、生存期間中央値は７．９か月であった。
【０００６】
ＮＳＣＬＣ患者の全５年生存率は過去２０年間１５％に満たないままであった。しかしながら、５年生存率は患者のＴＮＭサブセットによって異なる。病期ＩＡおよびＩＢでは６０％前後であり、病期ＩＩＢ（Ｔ１−２Ｎ１Ｍ０、Ｔ３Ｎ０Ｍ０）では３４％であり、病期ＩＩＩＡ（Ｔ３Ｎ１Ｍ０、Ｔ１−２−３Ｎ２Ｍ０）では１３％であり、病期ＩＩＩＢ（Ｔ４Ｎ０−１−２Ｍ０）では７％と低かった。
【０００７】
病期Ｉおよび病期ＩＩのＮＳＣＬＣ患者では、病期Ｉの患者のおよそ４０％および病期ＩＩのＮＳＣＬＣ患者の６６％が、主として遠位転移の発生のために外科術の５年以内に死に至る。この群には補助化学療法から著しい利益を得る可能性のある患者が含まれる。残念なことに、これまでのところ、利用可能な再発の、信頼性のある臨床的予測因子は存在しない。
【０００８】
過去３０年間、腫瘍学者は癌患者の結果を至適化することに注力して来、まさに今般、利用可能な新技術が化学療法を最適化するために種々の癌患者群において施された療法の結果および影響を推定することを目的とした多型、遺伝発現レベル、および遺伝子突然変異の検討を可能とする。代表的な例としては、ＴＳ  ｍＲＮＡ発現と抗葉酸に対する応答および生存の間の関係（欧州特許第１３８１６９１号公報参照）、βチューブリンＩＩＩ  ｍＲＮＡレベルと、チューブリン相互作用薬に対する応答との間の関係、ＰＴＥＮメチル化と、ＣＰＴ−１１に対する耐性との間の関係、およびＳＴＡＴ３の過剰発現と、ＥＧＦ相互作用薬に対する耐性との間の関係が含まれる。
【０００９】
多くのデータにより、いくつかの遺伝子転写物のレベルの変化がＮＳＣＬＣ患者の生存余命および同じＴＮＭサブセットを有するＮＳＣＬＣ患者間の示差的化学感受性に影響を及ぼし得ることが示されているが、これまでのところ、処置を最適化するために用いられる化学療法応答の推定遺伝子マーカーは存在しない。ＮＳＣＬＣ患者の生存をさらに向上させるためには、分子変化に基づくそれらの予後分類が重要である。このような分類はより正確かつ有用な手段、ひいてはより有効な治療の選択肢を提供する。
【００１０】
上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）は、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）の受容体である。それは、ＥｒｂＢファミリー受容体のメンバー、すなわち、近縁の四つの受容体チロシンキナーゼ：ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ−１）、ＨＥＲ２／ｃ−ｎｅｕ（ＥｒｂＢ−２）、Ｈｅｒ  ３（ＥｒｂＢ−３）、およびＨｅｒ  ４（ＥｒｂＢ−４）のサブファミリーである。ＥＧＦＲは細胞表面に存在し、上皮細胞増殖因子およびトランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦα）を含むその特異的リガンドの結合により活性化される。その増殖因子リガンドによって活性化された際、ＥＧＦＲは不活性な単量体型から活性なホモ二量体へ遷移を受ける。ＥＧＦＲ二量体形成はその内在性の細胞内タンパク質チロシンキナーゼ活性を刺激する。結果として、ＥＧＦＲのＣ末端ドメインの五つのチロシン残基の自己リン酸化が起こる。この自己リン酸化は下流においてそれらの固有のホスホチロシン結合ＳＨ２ドメインを介してリン酸化されたチロシンと会合する他のいくつかのタンパク質による活性化およびシグナル伝達を惹起する。これらの下流のシグナル伝達タンパク質はいくつかのシグナル伝達カスケード、主として、ＭＡＰＫ、Ａｋｔ、およびＪＮＫ経路を誘発し、ＤＮＡ合成および細胞増殖をもたらす。このようなタンパク質は、細胞の移動、接着、および増殖などの表現型を調節する。ＥＧＦＲのキナーゼドメインは、それとともに凝集している他の受容体のチロシン残基も交差リン酸化し、それ自体、このようにして活性化され得る。
【００１１】
ＥＧＦＲの過剰発現（アップレギュレーションとして知られる）または過剰活性をもたらす突然変異は、多形性膠芽腫および肺癌を含むいくつかの癌と関連づけられている。特に、Jeon Y-K.ら(Lung Cancer. 2006 Dec;54(3):387-98)により、ＥＧＦＲ遺伝子発現レベルと、ＳＣＣ、特に病期ＩのＳＣＣにおける生存の低下との間の関係が示されている。さらに、ＥＧＦＲの増幅は、リンパ節転移陽性ＳＣＣにおける短い生存期間と関連づけられている。また、Hirsch, F. R.ら(J Clin Oncol. 2003 Oct 15;21(20):3798-807)によっても、ＮＳＣＬＣの６２％でＥＧＦＲタンパク質の過剰発現が示され、非ＳＣＣよりもＳＣＣで頻度が高いことが報告されている。
【００１２】
マクロファージコロニー刺激因子（ＣＳＦ−１）としても知られるＣＳＦ−１は、単球の生存および走化性を担う。Chen JJ,ら(J Clin Oncol. 2005, 23:953-64)により、ＮＳＣＬＣを含む多くの癌でのＣＳＦ−１の過剰発現に腫瘍関連マクロファージの顕著な浸潤が伴うことが記載されている。ＣＳＦ−１は、マクロファージと同時に培養した後、肺癌細胞において２倍を超えてアップレギュレーションされることが確認されている(Uemura,Y. et al. 2004, Int.J.Cancer, 109:826-832)。Mroczkoら(Pol Arch Med Wewn. 2001 Mar;105(3):203-9)により、ＮＳＣＬＣ患者由来の血清中には対照群よりも高いレベルのＣＳＦ−１が見られることが記載されている。
【００１３】
二酸化炭素と水との炭酸、プロトン、および重炭酸イオンへの迅速な相互変換を触媒する炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡ  ＩＸ）は、ＣＡαファミリーの膜会合ＣＡの群に属す。低酸素条件においては、低酸素症誘発因子１α（ＨＩＦ−Ｉα）が、ＣＡ  ＩＸのアップレギュレーションを含む適応応答のマスター転写レギュレーターとして働く。進行した腎細胞癌を有する患者においては、低いＣＡ  ＩＸ発現が生存の悪さの強力な予測因子であることが記載されている(Bui et al. 2003, Clin Cancer Res 9:802-11)。しかしながら、別の研究においては、ＣＡ  ＩＸ  ｍＲＮＡレベルは、初期段階のＮＳＣＬＣでは予後価値を持つとは実証されていないが(Simi, L. et al, Lung Cancer. 2006 Apr; 52(1):59-66)、その次の免疫組織化学的研究においては、高い発現と、悪い結果との間の相関が報告されている(Kon-no, H. et al. Lung Cancer. 2006 Dec; 54(3):409-18)。腎臓癌および肺癌の他、低いＣＡ  ＩＸ発現（ｍＲＮＡ）と悪い予後との間の関係は他の腫瘍でもGreiner Jら(Blood, 2006, 108:4109-17)により観察されている。ＣＡ  ＩＸの総発現は進行および転移の発生に伴って低下するものと思われ、腫瘍増殖の後期においては、継続的なＣＡ  ＩＸ発現がもはや必要でないという仮説が持ち上がる(Bui, M.H. et al. 2003, Clin. Cancer Res. 9:802-811)。他の点では、ＣＡ  ＩＸの高い発現は低酸素条件中で生存するのに不十分な腫瘍のマーカー、おそらくは低酸素症誘発性のアポトーシスのマーカーと見ることができよう。
【００１４】
予後方法の信頼性は、その発現レベルがＮＳＣＬＣ患者間の生存に関連するいくつかの遺伝子の発現を同時に測定することにより高めることができる。これまでのところ、ＮＳＣＬＣにおける遺伝子発現プロファイルの予後価値に取り組んだ研究は少数しかない(Raponi, M. et al. 2006, Cancer Res. 66:7466-7472, Chen, J.J. et al. 2005, J. Clin. Oncol. 23:953-964, Inamura,K. et al., 2005, Oncogene, 24:7105-7113, Potti, A. et al. 2006, N. Engl. J. Med., 355:570-580)。遺伝子の集合体の発現の同時検出は、例えば、ＮＳＣＬＣの臨床結果と関連する五つの遺伝子サイン(five-gene signature)を記載しているChenら(NEJM, 2007, 356:11-19)のｃＤＮＡマイクロアレイを用いて行うことができる。
【００１５】
また、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）も、ＮＳＣＬＣの生存を予測する遺伝子を同定するのに有用であり、これは正確かつ再現性あるＲＮＡ定量を見込め、ｃＤＮＡマイクロアレイよりも安価であり、労力も小さく、パラフィン包埋腫瘍組織で行うことができる。Endoh (J Clin Oncol. 2004, 22:811-9)は、ＲＴ−ＰＣＲにより８遺伝子の発現レベルが肺腺癌における生存と相関があったことを記載している。さらに最近同定された５遺伝子サイン（腫瘍の進行に関連のある腫瘍−マクロファージ相互作用に結びつけられている遺伝子を含む）（ＲＴ−ＰＣＲ）も、ＮＳＣＬＣの生存を予測することができた(Chen et al., J Clin Oncol. 2005, 23:953-64)。初期段階のＮＳＣＬＣにおいて５６の受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）がＲＴ−ＰＣＲにより調べられたところ、それらのうちの８つ（ＥＧＦＲ、ＮＴＲＫ１、およびＩＮＲ１を含む）を過剰発現する腫瘍で転移発生の危険が高まっていた(Muller-Tidow, C et al., 2005, Cancer Res 65:1778-82)。しかしながら、これらの研究に、初期段階のＮＳＣＬＣに罹患している患者の生存を予測することに焦点を合わせたものは無かった。
【００１６】
よって、当技術分野では、依然として、ＮＳＣＬＣ患者、特に初期段階のＮＳＣＬＣ患者の結果に予測マーカーとして使用可能な、従って、患者が化学療法の候補となるかならないかを決定するために使用可能な信頼性のあるマーカーが必要とされている。
【発明の概要】
【００１７】
本発明の目的は、ＮＳＣＬＣ患者の予後を予測するため、ならびにＮＳＣＬＣにおいて化学療法を適用するか否かを決定するために用いる手段を提供することである。本発明者らは、ＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１、およびＣＡ  ＩＸが独立した予後因子であること、およびそれらの三つの発現値を組み合わせれば、患者の生存に関する有意な予後値ともなるリスクスコアが得られることを見出した。よって、これは化学療法を適用するか否かを決定するために使用することができ、この非常に頻度が高く、致死的な疾病における生存を向上させるためにＮＳＣＬＣ化学療法をカスタマイズするための重要な手段を提供することができる。
【００１８】
よって、第一の態様において、本発明は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）に罹患している患者の生存を予測する方法であって、
ａ）患者の腫瘍サンプルからｍＲＮＡを単離し、
ｂ）前記サンプルにおけるＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１、およびＣＡ  ＩＸ遺伝子の遺伝子発現レベルを測定し、そして
ｃ）サンプルにおけるＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１、およびＣＡ  ＩＸ遺伝子の発現レベルを、ＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１およびＣＡ  ＩＸ発現レベルに関する参照値と比較すること
を含んでなり、参照値よりも高いＥＧＦＲおよびＣＳＦ−１遺伝子の発現並びに低いＣＡ  ＩＸ遺伝子の発現が、その患者の生存予後が、ＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１およびＣＡ  ＩＸ遺伝子の発現が変化していない患者のそれよりも低くなることを示すとする方法を提供する。
【００１９】
さらなる実施形態において、本発明は、サンプルにおけるＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１、およびＣＡ  ＩＸ遺伝子の遺伝子発現レベルを測定することに加え、参照値に対するフィブロネクチン１フィブロネクチン１（ＦＮ１）、インスリン  受容体１（ＩＳＮＲ）、アニリン（ＡＮＬＮ）、プロリルヒドロラーゼ４（ＰＨ４）、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＮＴＲＫ１、またはＫＩＡＡ０９７４の群から選択される一以上の付加的遺伝子の発現レベルも測定され、前記遺伝子のいずれかの高い発現がＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１の高い発現およびＣＡ  ＩＸの低い発現と組み合わされば、前記患者の生存予後が、同じ遺伝子の発現が変化していない患者のそれよりも低くなることを示すとする方法を含む。
【００２０】
第二の態様において、本発明は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）に罹患している患者の生存を予測する方法であって、
ａ）患者の組織、血液、または血漿サンプルからｍＲＮＡを単離し、
ｂ）前記サンプルにおけるＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１、およびＣＡ  ＩＸ遺伝子の遺伝子発現レベルを測定し、
ｃ）そのＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１、およびＣＡ  ＩＸ遺伝子の発現レベルに基づき、式［０．９３×ＣＳＦ＋１．４×ＣＡ  ＩＸ＋１．１×ＥＧＦＲ］（式中、ＣＳＦ、ＣＡ  ＩＸ、およびＥＧＦＲはそれぞれＣＳＦ−１、ＣＡ  ＩＸ、およびＥＧＦＲ遺伝子の発現レベルのｚスコアである）を用いてリスクスコアを算出すること
を含んでなり、リスクスコアが０より大きい場合に低い生存を示すこととする方法を提供する。
【００２１】
別の実施形態においては、本発明の方法が、ＮＳＣＬＣが扁平上皮癌である患者に適用される。
【００２２】
別の実施形態においては、本発明の方法が、病期ＩＡ、ＩＢ、または病期ＩＩのＮＳＣＬＣ患者に適用される。
【００２３】
さらに別の実施形態においては、核酸は患者の腫瘍サンプル、血液サンプル、または血清サンプルから単離される。
【００２４】
第三の態様において、本発明は、ＮＳＣＬＣに罹患している患者が化学療法で処置されるべきか否かを決定する方法であって、
ａ）患者の組織、血液、または血漿サンプルからｍＲＮＡを単離し、
ｂ）前記サンプルにおけるＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１、およびＣＡ  ＩＸ遺伝子の遺伝子発現レベルを測定し、
ｃ）前記サンプルにおけるＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１、およびＣＡ  ＩＸ遺伝子の発現レベルを、ＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１、およびＣＡ  ＩＸ発現レベルに関する参照値と比較すること
を含んでなり、参照値よりも高いＥＧＦＲおよびＣＳＦ−１遺伝子の発現並びに低いＣＡ  ＩＸ遺伝子の発現は、その患者が化学療法で処置されるべきであることを示すとする方法を提供する。
【００２５】
さらなる態様において、本発明は、ＮＳＣＬＣに罹患している患者が化学療法で処置されるべきか否かを決定する方法であって、
ａ）患者の組織、血液、または血漿サンプルからｍＲＮＡを単離し、
ｂ）前記サンプルにおけるＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１、およびＣＡ  ＩＸ遺伝子の遺伝子発現レベルを測定し、
ｃ）前記ＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１、およびＣＡ  ＩＸ遺伝子の発現レベルに基づき、式［０．９３×ＣＳＦ＋１．４×ＣＡ  ＩＸ＋１．１×ＥＧＦＲ］（式中、ＣＳＦ、ＣＡ  ＩＸ、およびＥＧＦＲは遺伝子発現レベルのｚスコアである）を用いてリスクスコアを算出すること
を含んでなり、リスクスコアが０より大きい場合に、その患者が化学療法で処置されるべきであることを示すとする方法を提供する。
【００２６】
別の実施形態においては、本発明の、ＮＳＣＬＣに罹患している患者が化学療法で処置されるべきか否かを決定する方法が、病期ＩＡ、ＩＢ、または病期ＩＩのＮＳＣＬＣ患者に適用される。
【００２７】
第五の態様において、本発明は、遺伝子ＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１、およびＣＡ  ＩＸの変化した発現を検出するためのキットであって、ＥＧＦＲ遺伝子の領域を増幅することができる第１のプライマー対、ＣＳＦ−１遺伝子の領域を増幅することができる第２のプライマー対、およびＣＡ  ＩＸ遺伝子の領域を増幅することができる第３のプライマー対を含むキットを提供する。
【００２８】
さらなる態様において、前記キットはまた、少なくとも、フィブロネクチン１（ＦＮ１）、インスリン受容体１（ＩＳＮＲ）、アニリン（ＡＮＬＮ）、プロリルヒドロラーゼ４（ＰＨ４）、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＮＴＲＫ１、またはＫＩＡＡ０９７４の領域を増幅することができるさらなるプライマー対を含む。
【００２９】
なおさらなる実施形態においては、前記キットはまた、逆転写酵素を含む。
【００３０】
さらなる実施形態において、本発明は、ＮＳＣＬＣに罹患している患者の生存を予測するため、およびＮＳＣＬＣに罹患している患者が化学療法で処置されるべきか否かを決定するための、遺伝子ＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１、およびＣＡ  ＩＸの変化した発現を検出するのに特異的なプライマーを含むキットの使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】リスクスコアによる患者の生存曲線。
【図２】リスクスコアによる４ｃｍ以下の腫瘍を有する患者（Ａ）、およびリスクスコアによる４ｃｍを超える腫瘍を有する患者（Ｂ）の生存曲線。
【発明の具体的説明】
【００３２】
本発明は、ＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１、およびＣＡ  ＩＸ  ｍＲＮＡの量がＮＳＣＬＣに罹患している患者の予後および生存と相関する特徴を提供するという知見による。よって、この特徴（高レベルのＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１  ｍＲＮＡと、低レベルのＣＡ  ＩＸ  ｍＲＮＡとを発現する腫瘍）を有する患者は低い生存余命を示し、この特徴を有する患者はより高い生存機会を持つ。さらに、この特徴は遠位転移の発生を予測するため、および化学療法を提供するか否かを決定するためにも使用可能である。従って、この特徴を有する患者は補助化学療法を検討すべきであるが、この特徴を示さない患者は化学療法から利益を得る見込みがない。よって、ＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１、およびＣＡ  ＩＸの発現レベルに由来する特徴は、ＮＳＣＬＣ化学療法をカスタマイズするための重要なパラメーターを提供する。
【００３３】
よって、第一の実施形態において、本発明は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）に罹患している患者の生存を予測する方法であって、
ａ）患者の腫瘍サンプルからｍＲＮＡを単離し、
ｂ）前記サンプルにおけるＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１、およびＣＡ  ＩＸ遺伝子の遺伝子発現レベルを測定し、
ｃ）サンプルにおけるＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１、およびＣＡ  ＩＸ遺伝子の発現レベルをＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１、およびＣＡ  ＩＸ発現レベルに関する参照値と比較すること
を含んでなり、参照値よりも高いＥＧＦＲおよびＣＳＦ−１遺伝子の発現並びに低いＣＡ  ＩＸ遺伝子の発現は、その患者の生存予後が、ＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１およびＣＡ  ＩＸ遺伝子の発現が変化していない患者よりも低いことを示すとする方法を提供する。
【００３４】
患者の生存を予測し、化学療法を適用するか否かを決定するためには、腫瘍組織を検査することが好ましい。好ましい実施形態においては、腫瘍が採取される患者由来の正常組織の一部も検査される。好ましくは、これは化学療法前、通常には腫瘍切除の際に行われる。
【００３５】
本発明の方法の実施において、腫瘍細胞が好ましくは患者から単離される。腫瘍またはその一部は患者から外科的に切除されるか、または慣例の生検により得られる。冷凍または新鮮なサンプルから単離されたＲＮＡを、例えば、Sambrook, Fischer and Maniatis, Molecular, Cloning, a laboratory manual, (2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, (1989)など、当技術分野で典型的な方法のいずれかにより細胞から抽出する。好ましくは、抽出工程中にＲＮＡの分解を避けるよう注意する。
【００３６】
特定の実施形態においては、発現レベルは、ホルマリンで固定されたパラフィン包埋組織サンプルから得られるＲＮＡを用いて測定される。
【００３７】
腫瘍学の分野では保存可能な、または永久保存の組織サンプルが広く用いられるので固定およびパラフィン包埋した組織サンプルが好ましい。ＲＮＡは永久保存病理サンプルまたは生検サンプルから、まずパラフィン除去して、単離することができる。パラフィン除去法の例としては、パラフィン包埋サンプルを例えばキシレンなどの有機溶媒で洗浄することを含む。パラフィン除去サンプルは低級アルコールの水溶液で再水和させることができる。好適な低級アルコールとしては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、およびブタノールが挙げられる。パラフィン除去サンプルは、例えば漸減濃度の低級アルコール溶液で連続的に洗浄することで再水和させることもできる。あるいは、サンプルを同時にパラフィン除去し、再水和させる。その後、サンプルを溶解させ、サンプルからＲＮＡを抽出する。
【００３８】
遺伝子発現プロファイリングならびにプロテオミクス技術のあらゆる技術が本発明の以上の態様を実施する際に用いるのに好適であるが、遺伝子発現レベルは多くの場合、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により測定される。
【００３９】
標的ｍＲＮＡの発現の測定は、内部対照としての構成的ＲＮＡ、すなわち、その発現が検討する全ての腫瘍サンプルで一定であるＲＮＡの発現の同時測定を必要とする。好ましい参照ＲＮＡとしては、リボゾーム１８Ｓ  ＲＮＡ、β−アクチン  ｍＲＮＡ、およびＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡが挙げられる。最も好ましいのは、全ての腫瘍サンプルで最も安定な発現を示すことから、リボゾーム１８Ｓ  ＲＮＡである。次に、発現レベルの生データを内部参照遺伝子に対してノーマライズする。当業者に公知の他の方法も、ＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１、およびＣＡ  ＩＸの相対レベルがサンプルに割り付けられる限り、使用可能である。ｍＲＮＡまたは対応するタンパク質のレベルを測定すれば、ＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１、およびＣＡ  ＩＸ発現の相対レベルを得ることができる。当業者に周知の標準的な測定方法が用いられる（例えば、引用することにより本明細書の開示の一部とされる欧州特許第１３８１６８１号公報を参照）。
【００４０】
好ましい実施形態においては、遺伝子サンプルの発現が「上昇」しているか、「低下」しているかを決定するために用いる参照値は、ネオアジュバント化学療法薬処置の前に癌患者から生検によって得られた各腫瘍サンプルからの同量のＲＮＡをプールすることによって得られたＲＮＡサンプルで測定されたＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１、およびＣＡ  ＩＸの発現レベルの中央値に相当する。この中央値が一端確立されると、患者からの腫瘍組織で発現され、このマーカーのレベルをこの中央値と比較することができ、従って、レベルの「上昇」または「低下」を割り付けることができる。特定の実施形態においては、参照値と比べた場合に、参照値の少なくとも１．１倍、１．５倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、またはそれ以上に発現が上昇していれば、「高い」発現とみなされる。特定の実施形態においては、参照値と比べた場合に、少なくとも０．９倍、０．７５倍、０．２倍、０．１倍、０．０５倍、０．０２５倍、０．０２倍、０．０１倍、０．００５倍、またはそれ以下に発現が低下していれば、「低い」発現とみなされる。
【００４１】
被験者間の変動（例えば、年齢、人種などに関する側面）のため、ＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１、およびＣＡ  ＩＸの絶対的参照値を確立するのは極めて困難（実施不可能でなくても）である。よって、特定の実施形態では、「高い」または「低い」ＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１、およびＣＡ  ＩＸ発現の参照値は、正常被験者（すなわち、ＮＳＣＬＣの診断の無い者）から単離されたサンプル群の、ＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１、およびＣＡ  ＩＸの発現レベルを試験することを含む従来の手段によってパーセンタイルを算出することにより求められ、そして、「高い」レベルを、好ましくは、ＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１、およびＣＡ  ＩＸ遺伝子の発現レベルが正常集団において５０パーセンタイル以上である（例えば、正常集団において６０パーセンタイル以上、正常集団において７０パーセンタイル以上、正常集団において８０パーセンタイル以上、正常集団において９０パーセンタイル以上、正常集団において９５パーセンタイル以上の発現レベルを含む）サンプルに割り付けることができる。
【００４２】
本方法は、扁平上皮癌（ＳＣＣ）、腺癌（ＮＳＣＬＣの最も多いサブタイプである気管支肺胞上皮癌を含む）、および大細胞癌を含む、いずれの種類のＮＳＣＬＣに罹患している患者の生存を予測するのにも好適である。さらに、本方法はまた、遠位転移の発生を予測するのにも好適である。好ましくは、本方法はまた、病期Ｉ、病期ＩＩ、および腫瘍の大きさによって選択された病期ＩＩＩの腫瘍を含む、腫瘍が外科的に切除可能なＮＳＣＬＣ患者の生存を予測するのにも好適である。より好ましくは、本発明の方法は、４ｃｍ未満の腫瘍を有する患者の結果を予測するために、より一層好ましくは、病期ＩＡおよびＩＢの腫瘍を有する患者の結果を予測するために好適である。
【００４３】
さらなる実施形態においては、本発明は、フィブロネクチン１（ＦＮ１）、ＨＩＦ−１αプロリルヒドロラーゼ（ＰＨ−４）、ＫＩＡＡ０９７４、アクチン結合タンパク質アニリン（ＡＮＬＮ）、インスリン受容体１（ＩＮＳＲ）、血管内皮増殖因子Ｃ（ＶＥＧＦＣ）、および神経栄養性チロシンキナーゼ受容体１型（ＮＴＲＫ１）の群から選択される少なくとも一つの付加的遺伝子の発現レベルを、同じ生体サンプルにおいて測定することを含む。
【００４４】
本発明はまた、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）に罹患している患者の生存を予測する方法であって、
ａ）患者の腫瘍組織からｍＲＮＡを単離し、
ｂ）前記サンプルにおけるＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１、およびＣＡ  ＩＸ遺伝子の遺伝子発現レベルを測定し、そして
ｃ）そのＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１、およびＣＡ  ＩＸ遺伝子の発現レベルに基づき、式［０．９３×ＣＳＦ＋１．４×ＣＡ  ＩＸ＋１．１×ＥＧＦＲ］（式中、ＣＳＦ、ＣＡ  ＩＸ、およびＥＧＦＲは、それぞれＣＳＦ−１、ＣＡ  ＩＸ、およびＥＧＦＲの遺伝子発現レベルのｚスコアである）を用いてリスクスコアを算出すること
を含んでなり、リスクスコアが０より大きい場合に低い生存を示すこととする方法を含む。
【００４５】
本発明で同定される遺伝子サインは、ＮＳＣＬＣに罹患している患者の生存を予測するために好適なだけでなく、ＮＳＣＬＣに罹患している患者が化学療法で処置されるべきか否かを決定することを可能とする。よって、さらなる態様において、本発明は、ＮＳＣＬＣに罹患している患者が化学療法で処置されるべきか否かを決定する方法であって、
ａ）患者の腫瘍組織からｍＲＮＡを単離し、
ｂ）前記サンプルにおけるＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１、およびＣＡ  ＩＸ遺伝子の遺伝子発現レベルを測定し、そして
ｃ）前記サンプルにおけるＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１、およびＣＡ  ＩＸ遺伝子の発現レベルをＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１、およびＣＡ  ＩＸ発現レベルに関する参照値と比較すること
を含んでなり、参照値よりも高いＥＧＦＲおよびＣＳＦ−１遺伝子の発現並びに低いＣＡ  ＩＸ遺伝子の発現は、その患者が化学療法で処置されるべきであることを示すとする方法を提供する。
【００４６】
さらに、本発明はまた、ＮＳＣＬＣに罹患している患者が化学療法で処置されるべきか否かを決定する方法であって、
ａ）患者の腫瘍組織からｍＲＮＡを単離し、
ｂ）前記サンプルにおけるＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１、およびＣＡ  ＩＸ遺伝子の遺伝子発現レベルを測定し、
ｃ）前記ＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１、およびＣＡ  ＩＸ遺伝子の発現レベルに基づき、式［０．９３×ＣＳＦ＋１．４×ＣＡ  ＩＸ＋１．１×ＥＧＦＲ］（式中、ＣＳＦ、ＣＡ  ＩＸ、およびＥＧＦＲはそれぞれＣＳＦ、ＣＡ  ＩＸ、およびＥＧＦＲの遺伝子発現レベルのｚスコアである）を用いてリスクスコアを算出すること
を含んでなり、リスクスコアが０より大きい場合に、その患者が化学療法で処置されるべきであることを示すとする方法を提供する。
【００４７】
化学療法とは、癌の処置を目的とした細胞傷害性物質による処置と理解される。いずれにも限定されるものではないが、本発明の方法は、患者を化学療法の対象とすべきか否かを予測するのに好適である。化学療法とは、シスプラチンまたはカルボプラチンを含むＮＳＣＬＣの標準的療法を構成する化学療法薬をゲムシタビン、パクリタキセル、ドセタキセル、エトポシド、またはビノレルビンと組み合わせた処置と理解される。
【００４８】
好ましい実施形態においては、シスプラチンおよびカルボプラチンは通常、エトポシド、ゲムシタビン、パクリタキセル、ドセタキセル、またはビノレルビンとの併用療法として投与される。
【００４９】
本発明の方法で使用される上記の化学療法薬は、一般に臨床使用される用量で投与される。このような用量は、例えば体表面積など、通常の様式で算出される。
【００５０】
本発明の方法は、扁平上皮癌（ＳＣＣ）、腺癌（ＮＳＣＬＣの最も多いサブタイプである気管支肺胞上皮癌を含む）、および大細胞癌を含む、いずれかの種類のＮＳＣＬＣに罹患している患者に化学療法を適用するか否かを決定するのに好適である。さらに、本方法はまた、病期Ｉ、病期ＩＩ、および腫瘍の大きさによって選択された病期ＩＩＩの腫瘍を含む、腫瘍が外科的に切除可能なＮＳＣＬＣ患者に化学療法を適用するか否かを決定するのにも好適である。より好ましくは、本発明の方法は、４ｃｍ未満の腫瘍を有する患者の結果を予測するために、より一層好ましくは、病期ＩＡおよびＩＢの腫瘍を有する患者の結果を予測するために好適である。
【００５１】
よって、本発明によれば、高いＥＧＦＲおよびＣＳＦ−１発現を示すと同時に、低いＣＡ  ＩＸ発現を示す患者は化学療法の候補とみなされるべきであり、一方、正常レベルのこれら三つの遺伝子を示す患者は化学療法から利益が得られない。
【００５２】
さらなる態様において、本発明は、遺伝子ＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１、およびＣＡ  ＩＸの変化した発現を検出するためのキットであって、ＥＧＦＲ遺伝子の領域を増幅することができる第１のプライマー対、ＣＳＦ−１遺伝子の領域を増幅することができる第２のプライマー対、およびＣＡ  ＩＸ遺伝子の領域を増幅することができる第３のプライマー対を含むキットを提供する。
【００５３】
本発明の特定の実施形態においては、血清または血漿は、ＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１、およびＣＡ  ＩＸｍＲＮＡの発現レベルの同定に直接用いることができる。別の特定の実施形態においては、本発明の最初の工程として血漿または血清から核酸を抽出する。このような場合、これらのサンプルから抽出された全ＲＮＡは、その後の増幅に好適な検討材料と言える。
【００５４】
核酸サンプルを取得後、ｄＮＴＰおよびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）を用い、逆転写の工程によって、サンプル中に存在するメッセンジャーＲＮＡ鋳型から相補的ＤＮＡが作製される。上記の成分を逆転写酵素バッファー中、好ましくは３７℃で１時間、ＤＮＡプライマーと組み合わせる。ｃＤＮＡの合成を行うのに有用な好ましい逆転写酵素は、ＭＭＬＶ逆転写酵素またはそのＲＮアーゼＨ欠損誘導体、ＡＭＶ逆転写酵素、およびＲＳＶ逆転写酵素である。
【００５５】
オリジナルの一本鎖ｍＲＮＡから作製された一本鎖ｃＤＮＡを、次に増幅させる。特定の実施形態においては、ＤＮＡの増幅はＰＣＲの手段により行う。ＰＣＲの使用など、核酸の増幅および検出の一般原理および条件は当業者によく知られている。特に、本発明の方法によって行われるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、標的ｃＤＮＡを増幅することができる適当な酵素を用いる。標的核酸の増幅に用いる好ましい酵素は熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである。これらのＤＮＡポリメラーゼは、当技術分野で周知の技術によって、天然源または組換え源から単離することができる。単離する代わりに、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは商業的に入手することもできる。本発明の組成物および方法に用いるのに特に好ましい熱安定性ポリメラーゼとしては、限定されるものではないが、Ｔａｑ、Ｔｎｅ、Ｔｍａ、ＴｌｉＮＥＮＴ、ＤＥＥＰＶＥＮＴ、Ｐｆｕ、Ｐｗｏ、Ｔｆｉ、またはＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、またはその突然変異株もしくは誘導体が挙げられる。
【００５６】
増幅には、ＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１、およびＣＡ  ＩＸ標的配列を特異的に増幅することができるオリゴヌクレオチドプライマーの使用が必要である。
【００５７】
用語「オリゴヌクレオチドプライマー」または「増幅オリゴヌクレオチド」は、本明細書では区別無く用いられ、下限約２〜５残基、上限約５００〜９００残基の範囲の大きさのものを含む、一般に１，０００残基未満の高分子核酸を指す。好ましい実施形態においては、オリゴヌクレオチドプライマーは下限約５〜約１５残基、上限約１００〜２００残基の範囲の大きさである。より好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは下限約１０〜約１５残基、上限約１７〜１００残基の範囲の大きさである。オリゴヌクレオチドプライマーは天然核酸から精製することができるが、一般には、種々の周知の酵素的または化学的方法のいずれかを用いて合成される。
【００５８】
「増幅オリゴヌクレオチド」とは、標的核酸またはその相補物とハイブリダイズし、核酸増幅反応に関与するオリゴヌクレオチドを指す。増幅オリゴヌクレオチドとしては、そのオリゴヌクレオチドの３’末端が、鋳型として別の核酸鎖を用いて酵素的に延長されるプライマーおよびプロモータープライマーを含む。いくつかの実施形態においては、増幅オリゴヌクレオチドは、標的配列（またはその相補鎖）の領域と相補的な少なくとも約１０の連続する塩基、より好ましくは約１２の連続する塩基を含む。標的結合塩基は、それが結合する配列と好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは約９０％〜１００％相補的である。増幅オリゴヌクレオチドは好ましくは約１０〜約６０塩基長であり、修飾ヌクレオチドまたは塩基類似体を含んでもよい。「増幅する」または「増幅」とは、標的核酸配列またはその相補物もしくはそのフラグメントの複数のコピーを作り出す手法を指す（すなわち、その増幅産物は完全な標的配列に満たないものを含んでもよい）。例えば、フラグメントは、標的核酸の内部位とハイブリダイズし、そこから重合が開始する増幅オリゴヌクレオチドを使用することにより、標的核酸の部分を増幅することによって作製することができる。既知の増幅方法としては、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、レプリカーゼ媒介増幅、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）増幅、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、および転写関連または転写媒介増幅（ＴＭＡ）が挙げられる。ＰＣＲ増幅は、ＤＮＡポリメラーゼ、対鎖のプライマー、および複数コピーのＤＮＡまたはｃＤＮＡを合成する温度周期を用いる。レプリカーゼ媒介増幅は、ＲＮＡ配列を増幅するためにＱβ−レプリカーゼを用いる。ＬＣＲ増幅は、ハイブリダイゼーション、連結、および変性の周期を用いることで標的の相補鎖を増幅するために少なくとも四つの異なるオリゴヌクレオチドを用いる。ＳＤＡは、制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含むプライマーと、標的配列を含む半修飾ＤＮＡ二重らせんの一方の鎖を切断した後、一連のプライマー伸張および鎖置換工程を行うエンドヌクレアーゼとを用いる。エンドヌクレアーゼの切断に頼らない等温鎖置換増幅法も知られている。転写関連または転写媒介増幅は、プロモーター配列を含むプライマーと、標的配列から複数の転写物を生成し、従って、標的配列を増幅するための、プロモーターに特異的なＲＮＡポリメラーゼとを用いる。
【００５９】
本発明の好ましい実施形態は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅において本増幅オリゴヌクレオチドを用いてＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１、およびＣＡ  ＩＸ標的配列を増幅する。別の実施形態においては、本発明は、ＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１、およびＣＡ  ＩＸ標的配列と少なくとも一つの付加的遺伝子の同時検出を含む。本発明に従って検出される好ましい遺伝子は表２に示されている遺伝子である。最も好ましいのは、フィブロネクチン１（ＦＮ１）、インスリン受容体１（ＩＳＮＲ）、アニリン（ＡＮＬＮ）、プロリルヒドロラーゼ４（ＰＨ４）、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＮＴＲＫ１、またはＫＩＡＡ０９７４遺伝子であり、これらの遺伝子はＮＳＣＬＣ患者における発現レベルの変化と、生存予後との間に正の相関を示す。
【００６０】
逆転写および増幅反応は、ｃＤＮＡが独立した工程において逆転写により得られ、次に、このｃＤＮＡがもう一つの別の工程で増幅される、いわゆる「非連結(uncoupled)ＲＴ−ＰＣＲ」において連続的に行うことができる。この非連結(uncoupled)法は、逆転写と増幅との反応条件を各工程で適宜調整することができる。これに対し、いわゆる「連結(coupled) ＲＴ−ＰＣＲ」法では、逆転写とその後の増幅が同じ試験管で行われ、逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼの活性に適当な妥協的なバッファーの使用が必要となる。
【００６１】
本発明のキットはＮＳＣＬＣに罹患している患者の生存を予測するため、ならびにＮＳＣＬＣを化学療法の対象とすべきか否かを決定するために使用可能である。
【００６２】
このように本発明が記載されるが、本発明の実施を以下に示される実施例により説明する。当業者ならば、例に用いられる材料および方法が様々に改変できることが理解できるであろう。
【実施例】
【００６３】
材料および方法
患者
試験群は、２０００年〜２００４年の間に治療的肺切除を受けた６６人のＳｑＣＬＣ患者を含んだ。３３人の患者が外科術後に遠位転移を発症し、残りの３３人の患者は追跡期間中央値３７か月（範囲２４〜６４か月）後に遠位転移が無かった。手術後の転移を発症した３３人の患者のうち７人は局部的再発も有していた。２７人の患者の腫瘍は４ｃｍ未満であり、残りの３９人の腫瘍は表１に示されるように、より大きな直径を有していた。以下の基準：完全な肺切除、腫瘍標本の入手可能性（切除部の腫瘍組織の少なくとも６０％）、および非再発患者に対しては少なくとも２年の追跡期間を満たす連続的病期Ｉ〜ＩＩの患者を全て含めた。遠位転移を持たない２人の病期ＩＩＩＡの患者も含めた。患者の特徴を表１にまとめる。外科術は肺全摘（１８）、二葉切除（１１）、肺葉切除（３１）、区域切除（３）、および肺葉の管状切除（３）を含んだ。全ての場合で、縦隔リンパ節全摘を行い、切除断端は腫瘍不含（ＲＯ）であった。
【００６４】
【表１】
2010523134.tif 000002
【００６５】
遺伝子発現分析
外科術の際に１ｃｍ３のブロックとして腫瘍サンプルを得、液体窒素中で凍結させた。ＡｌｌＰｒｅｐキット(Qiagen)で全ＲＮＡを抽出するまで、組織を−８０℃で保存した。一つの微小切片に６０％を超える腫瘍組織を含む腫瘍サンプルだけをさらなる処理に適するものとした。ＲＮＡ濃度はＮａｎｏ−ｄｒｏｐで評価し、得られたＲＮＡの質をアガロースゲルで調べた。Ｈｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ａｒｃｈｉｖｅキット(Applied Biosystems, Foster City, CA)を用い、１μｇの全ＲＮＡから第一鎖ｃＤＮＡを合成した。ABI PRISM 7900 HT Sequence Detection System (Applied Biosystems)にて、Applied Biosystems TaqMan Low Density Arrayss (マイクロ流体カード)を用い、２９遺伝子（表２）の定量的ＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。マイクロ流体カードの１チャネルに５５μＬのTaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems)と、全ＲＮＡ１００ｎｇに相当する５５μＬのｃＤＮＡ鋳型との混合物をのせた。
【００６６】
相対的遺伝子発現値を、Sequence Detection System (SDS) 2.1ソフトウエア(Applied Biosystems)を用い、ΔΔＣｔ法１４により算出した。このΔΔＣｔ法では、内在参照遺伝子に対してノーマライズされ、較正サンプル（総てのサンプルに対する参照）に相対的な標的遺伝子の量が得られる。本発明者らは、リボゾーム１８Ｓ  ＲＮＡが総ての腫瘍サンプルで最も安定な発現を示したことから、その発現に従って生の遺伝子発現の値をノーマライズした。ノーマライズした各遺伝子の発現を、ＲＮＡプール（各サンプルからの等量の全ＲＮＡをプールすることにより作製）および市販のUniversal Reference Human Total RNA (Stratagen)におけるその発現により較正した。本発明者らは、総ての遺伝子がこの較正物質で検出されたことから、腫瘍ＲＮＡに対して較正されたデータを提供する。
【００６７】
統計分析
本発明者らは、遺伝子発現プロファイルに基づいて予後が良いか悪いかについて、ＳｑＣＬＣ腫瘍を分類する方法を適用した。この方法は五つの工程から構成された：（１）遺伝子発現が総ての腫瘍サンプルでこの遺伝子発現の≦５０または＞５０パーセンタイルにランク付けされた場合に、その遺伝子発現をそれぞれ０（低い）または１（高い）とコード化し、（２）全生存期間を従属変数とする単変量コックスモデルを構築し、遺伝子発現レベルを独立変数として分類し、（３）この単変量分析において有意であった遺伝子を生存に関する多変量コックス比例ハザードに含め、（４）各患者のリスクスコアを算出し、（５）無疾病生存に関するログランク検定により最高の有意水準を見つけるために、リスクスコアに対する種々のカットオフ値を最小Ｐ値法で検定し、ここではカットオフ点は、生存曲線の比較のためのＰ値が最小となるように選択される。手術日から再発もしくは死亡時、またはデータが検閲された日までの患者のデータを分析した。各予後因子およびリスク群に関するカプラン−マイヤープロダクトリミット法で全生存期間および無疾病生存期間に関する曲線を得た。両側ログランク検定で比較を行った。患者の特徴を、マン−ホイットニー検定を用いて二つのリスク群の間で比較した。カイ二乗検定およびフィッシャーの正確確率検定を用いてカテゴリー変数を比較した。統計分析は総て、Statistical Package for the Social Sciencesバージョン１３(SPSS Inc, Chicago, IL)を用い、有意水準５％、検出力８０％で行った。
【００６８】
結果
調べた２９の遺伝子のうち、１０（ＣＳＦ１、ＦＮ１、ＣＡ  ＩＸ、ＰＨ４、ＫＩＡＡ０９７４、ＡＮＬＮ、ＶＥＧＦＣ、ＩＳＮＲ、ＮＴＲＫ１、ＥＧＦＲ）が、単変量コックス回帰分析において生存と有意な相関があること、すなわち、これらの遺伝子は０．０５より小さいｐ値を有していた（表２の太字の値）ことが分かった。
【００６９】
【表２】
2010523134.tif 000003
2010523134.tif 000004
2010523134.tif 000005
【００７０】
これらの遺伝子を、病期、分化、腫瘍サイズ（直径＜４ｃｍと＞４ｃｍ）、性別、および年齢とともに多変量コックス回帰分析に含めた。三つの遺伝子（ＣＳＦ−１、ＥＧＦＲ、ＣＡ  ＩＸ）と、腫瘍サイズとが独立した予後因子として浮かび上がった（表３）。
【００７１】
【表３】
2010523134.tif 000006
【００７２】
リスクスコアは、下記のように、遺伝子発現レベルのｚスコアにその対応する係数を掛けたものを足すことにより求めた：リスクスコア（ＲＳ）＝［０．９３×ＣＳＦ＋１．４×ＣＡ９＋１．１×ＥＧＦＲ］。このリスクスコアを用い、患者を高い（ＲＳ＞０）または低い（ＲＳ≦０）リスク発現プロファイルに分類した（高いリスクスコアは生存率が低いと予測される）。
【００７３】
高リスク患者の生存期間中央値は２４か月（９５％ＣＩ、１７．１〜３０．９）であり、低リスク群では未到達であった（ｐ＜０．００００１）（図１）。ＣＳＦ−１、ＥＧＦＲ、およびＣＡ  ＩＸを含むリスクスコアモデルは精度７０％で全生存期間を予測する。このモデルも遠位転移発生予測に関して、感受性６４％、特異性７３％で十分機能した。次に、４ｃｍより小さい腫瘍を有する患者と、それより大きな腫瘍を有する患者との群でリスクスコアに対する生存分析を行った。両場合とも、リスクスコアは極めて高レベルで予後の予測が可能であった。小さい腫瘍を有する患者集団においては（図２Ａ）、リスクスコアの低い患者は極めて予後が良かった（９３％が適切に分類された）。この群の高リスク患者の生存期間中央値は２７．５か月であった（ｐ＝０．００５）（図２Ａ）。４ｃｍより大きい腫瘍を有する患者では、１９人の高リスク患者は総て、切除後５年生存した患者はいなかったので、適切に分類された。この群では、低リスク患者の生存期間中央値は未到達であった（ｐ＝０．００２）（図２Ｂ）。興味深いことに、単変量分析においては、ＥＧＦＲ、ＦＮ１、ＩＮＲ１、ＡＮＬＮ、およびＫＩＡＡ０９７４の過剰発現は極めて悪い予後（５年生存率＜２０％）を正確に予測する。（以下の遺伝子の生存期間中央値曲線およびＣＳＦ１、ＰＨ４、ＶＥＧＦＣ、ＩＳＮＲ、およびＮＴＲＫ１については補足資料に示される）この遺伝子発現をρ  Ｓｐｅｒｍａｎ法により相関させたところ、これらの遺伝子間に生物学上有意な相関が見られた。例えば、高レベルのＰＨ４はＣＡ  ＩＸの低発現または無発現と相関していた（ρ＝−０．３３、ｐ＝０．００７）。
【図１】
2010523134.tif 000007
【図２Ａ】
2010523134.tif 000008
【図２Ｂ】
2010523134.tif 000009
【国際調査報告】
2010523134.tif 000010
2010523134.tif 000011
2010523134.tif 000012