(57)【要約】本発明において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、９、２３、２５、３０、６０、６３、または６８のアミノ酸配列を含むペプチドは、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）誘導能を有することが示された。したがって本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、９、２３、２５、３０、６０、６３、および６８の群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを提供する。該ペプチドは、そのＣＴＬ誘導能が維持されている限り、１個、２個、または数個のアミノ酸置換または付加を含んでよい。さらに本発明は、これらのペプチドのいずれかを含む、腫瘍の治療および／もしくは予防、ならびに／または術後のその再発の防止のための調合薬剤を提供する。本発明の調合薬剤は、ワクチンを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞傷害性Ｔ細胞誘導能を有する単離されたノナペプチドまたはデカペプチドであって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたノナペプチドまたはデカペプチド。
【請求項２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、および９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、ノナペプチドまたはデカペプチド。
【請求項３】
細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）誘導能を有するペプチドであって、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、または９；および
（ｂ）１個、２個、または数個のアミノ酸が置換または付加されているＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、または９
の群より選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド。
【請求項４】
（ａ）Ｎ末端から２番目のアミノ酸が、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、およびトリプトファンの群より選択される、置換；ならびに
（ｂ）Ｃ末端のアミノ酸が、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、およびメチオニンの群より選択される、置換
からなる群より選択される、少なくとも１個の置換を有する、請求項３記載のペプチド。
【請求項５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３、２５、３０、６０、６３、および６８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、ノナペプチドまたはデカペプチド。
【請求項６】
ＣＴＬ誘導能を有するペプチドであって、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３、２５、３０、６０、６３、または６８；および
（ｂ）１個、２個、または数個のアミノ酸が置換または付加されているＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３、２５、３０、６０、６３、または６８
の群より選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド。
【請求項７】
（ａ）Ｎ末端から２番目のアミノ酸が、ロイシンまたはメチオニンである、置換；および
（ｂ）Ｃ末端のアミノ酸が、バリンまたはロイシンである、置換
からなる群より選択される、少なくとも１個の置換を有する、請求項６記載のペプチド。
【請求項８】
腫瘍の治療および／もしくは予防、ならびに／または術後のその再発の防止のための調合薬剤であって、請求項１〜７のいずれか一項記載の１種または複数種のペプチド、または該ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、調合薬剤。
【請求項９】
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ０２である対象への投与を意図した、請求項８記載の調合薬剤。
【請求項１０】
がんの治療を意図した、請求項９記載の調合薬剤。
【請求項１１】
ワクチンである、請求項１０記載の調合薬剤。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか一項記載のペプチドとＨＬＡ抗原とを含む複合体をその表面上に提示する、エキソソーム。
【請求項１３】
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２４である、請求項１２記載のエキソソーム。
【請求項１４】
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２４０２である、請求項１２記載のエキソソーム。
【請求項１５】
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ０２である、請求項１２記載のエキソソーム。
【請求項１６】
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ０２０１である、請求項１２記載のエキソソーム。
【請求項１７】
請求項１〜７のいずれか一項記載のペプチドまたは該ペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用による、高いＣＴＬ誘導能を有する抗原提示細胞を誘導するための方法。
【請求項１８】
請求項１〜７のいずれか一項記載のペプチドまたは該ペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用による、ＣＴＬを誘導する方法。
【請求項１９】
請求項１〜７のいずれか一項記載のペプチドまたは該ペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用による、高いＣＴＬ誘導能を有する抗原提示細胞を誘導するための方法であって、請求項１〜７のいずれか一項記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子を抗原提示細胞内に導入する工程を含む、方法。
【請求項２０】
請求項１〜７のいずれか一項記載のペプチドのいずれかを標的とする、単離された細胞傷害性Ｔ細胞。
【請求項２１】
請求項１〜７のいずれか一項記載のペプチドの使用によって誘導された、またはＨＬＡ−Ａ２４もしくはＨＬＡ−Ａ２という状況で、請求項１〜７のいずれか一項記載のペプチドと結合するＴＣＲサブユニットポリペプチドをコードする核酸を形質導入された、単離された細胞傷害性Ｔ細胞。
【請求項２２】
ＨＬＡ抗原と請求項１〜７のいずれか一項記載のペプチドとの複合体をその表面上に提示する、単離された抗原提示細胞。
【請求項２３】
（ａ）請求項１〜７のいずれか一項記載のペプチドもしくは該ペプチドをコードするポリヌクレオチドを使用すること；または
（ｂ）請求項１〜７のいずれか一項記載のペプチドもしくは該ペプチドをコードするポリヌクレオチドを使用し、抗原提示細胞が、請求項１〜７のいずれか一項記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子を抗原提示細胞内に導入することによって誘導されること
によって誘導された、抗原提示細胞。
【請求項２４】
請求項１〜７のいずれか一項記載のペプチド、免疫学的に活性なその断片、または該ペプチドまたは該断片をコードするポリヌクレオチドを含むワクチンを対象に投与する工程を含む、対象中で腫瘍関連内皮に対する免疫応答を誘導する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００７年４月１１日に提出された米国仮出願第６０／９１１，１９４号の恩典を主張し、その開示内容の全体は、あらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、生物科学の分野、より具体的には、がん治療の分野に関する。特に本発明は、がんワクチン、ならびに腫瘍の治療および防止のための薬物として極めて有効であるＴＥＭ８ペプチドに関する。
【背景技術】
【０００３】
ＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子上の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）由来のエピトープペプチドを認識し、その後、腫瘍細胞を殺傷することが証明されている。ＴＡＡの最初の例としてのメラノーマ抗原（ＭＡＧＥ）ファミリーの発見以来、他の多くのＴＡＡが免疫学的アプローチによって発見されており（Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80；Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9）、これらのＴＡＡのいくつかは、現在、免疫療法の標的として臨床開発の過程にある。
【０００４】
強力かつ特異的な抗腫瘍免疫応答を引き起こす新規なＴＡＡの同定は、様々な種類のがんにおけるペプチドワクチン接種戦略の臨床的応用のさらなる進展を保証する（Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55；Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42；Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9；van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14；Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8；Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72；Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66；Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94）。これまでに、これらの腫瘍関連抗原由来ペプチドを用いたいくつかの臨床試験が報告されている。残念ながらこれまでのところ、これらがんワクチン試験では低い客観的反応率しか観察され得なかった（Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80；Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42；Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15）。
【０００５】
有効性のこの相対的な欠如の、一つの可能性のある原因は、固形腫瘍で頻発しＴ細胞媒介性抗腫瘍応答を著しく損なう、腫瘍細胞上のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩ分子の発現の喪失または下方制御であり得る（Cormier JN et al., Int J Cancer 1998 Feb 9, 75(4): 517-24；Hicklin DJ et al., Mol Med Today 1999 Apr, 5(4): 178-86；Paschen A et al., Int J Cancer 2003 Mar 1, 103(6): 759-67）。たとえ腫瘍関連抗原を標的とするがんワクチンによって強力な細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）が誘導されたとしても、標的細胞が十分量のＨＬＡクラスＩ分子を発現していない場合には、ＣＴＬは標的細胞を認識できない。
【０００６】
腫瘍の血管新生は、腫瘍の進行に決定的に関与する。ＨＬＡクラスＩ分子は内皮細胞で下方制御されないため、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）１および２を標的とする内皮細胞に基づくアプローチに従って、腫瘍の血管新生に対して有効なワクチンが開発され得ることがすでに証明されている（Wada S et al., Cancer Res 2005 Jun 1, 65(11): 4939-46；Ishizaki H et al., Clin Cancer Res 2006 Oct 1, 12(19): 5841-9）。さらに、これらの治療標的は腫瘍非依存性であるため、腫瘍微小環境における血管内皮細胞の枯渇は、多様な悪性腫瘍に対して有効である可能性がある。さらに、腫瘍内皮細胞は血流中のリンパ球に容易に接近され、ＣＴＬは、他のいずれの組織種にも浸透することなく内皮細胞に直接ダメージを与えることができる。加えて、腫瘍血管系内のたとえ少数の内皮細胞の溶解でさえ、血管の完全性の破壊をもたらし、このようにして多数の腫瘍細胞の抑制をもたらし得る（Folkman J, Nat Med 1995 Jan, 1(1): 27-31）。したがって、腫瘍内皮細胞はがん免疫療法のための優れた標的である。腫瘍の血管新生を特異的かつ効率的なＣＴＬ応答で抑制するために、血管新生に関連する分子の中から適切な標的が選択される必要がある。
【０００７】
ＴＥＭ８を含む腫瘍内皮マーカー（ＴＥＭ）は、正常組織と比較して腫瘍関連内皮中で特異的に上昇していることが分かっている（St Croix B et al., Science 2000 Aug 18, 289(5482): 1197-202）。ＴＥＭ８転写産物は、肺および脳の腫瘍ならびに肝転移で発現された。ＴＥＭ８を標的とする治療は、広範な腫瘍の種類に適用可能である。例えばＷＯ ２００５／０４８９４３は、腫瘍関連抗原をコードするワクチンと共に、ＴＥＭ８の細胞外ドメインをコードするベクターを含むワクチンの使用を提案している。しかしながらこの文献は、ＴＥＭ８発現ベクターの導入が腫瘍関連内皮に対してＣＴＬの誘導を引き起こすといういかなる証拠も提供しておらず、またＴＥＭ８タンパク質内のエピトープの位置に関するいかなる情報も提供していない。
【発明の概要】
【０００８】
腫瘍微小環境を標的とするがん治療、特に腫瘍の血管新生を標的とするがん治療の臨床効果を改善することが重要である。本発明は、抗腫瘍免疫療法の標的として、腫瘍の血管に着目する。特に本発明は、ＴＥＭ８が広範な腫瘍の種類の血管で発現していると考えられていることから、腫瘍内皮マーカー８（ＴＥＭ８）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３２２０８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５）の遺伝子にコードされたＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿１１５５８４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６））を標的とする。本発明は、対応する分子に特異的なＣＴＬを誘導するエピトープペプチドを含むＴＥＭ８遺伝子産物を提供する。健常ドナーから得た末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＴＥＭ８由来の候補ペプチドに結合するＨＬＡ−Ａ＊２４０２またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１を用いて刺激した。さらに本発明は、それぞれの候補ペプチドをパルスした、ＨＬＡ−Ａ２４陽性またはＨＬＡ−Ａ０２陽性の標的細胞を特異的に認識する、樹立されたＣＴＬ、ならびに腫瘍の血管上に発現されたＴＥＭ８に対して強力かつ特異的な免疫応答を誘導し得るＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ０２拘束性エピトープペプチドを提供する。これらの結果は、ＴＥＭ８は免疫原性が強く、かつそのエピトープは腫瘍免疫療法の有効な標的であることを示している。
【０００９】
したがって本発明は、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導能を有する単離されたノナペプチドまたはデカペプチドを提供し、該ノナペプチドまたはデカペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む。具体的には、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、９、２３、２５、３０、６０、６３、および６８の群より選択されるアミノ酸配列を含みかつＣＴＬ誘導能を有するペプチドを提供する。本発明のペプチドは、改変されたペプチドが元のＣＴＬ誘導能を維持している限り、１個、２個、またはそれ以上のアミノ酸が置換または付加されているペプチドを含む。
【００１０】
対象に投与した場合、本発明のペプチドは抗原を発現する細胞の表面上に提示され、その後それぞれのペプチドを標的とするＣＴＬを誘導する。したがって、本発明の一態様において、本発明のペプチドのいずれかを提示する抗原提示細胞およびエキソソーム、ならびに抗原提示細胞を誘導するための方法も提供される。
【００１１】
本発明のＴＥＭ８ポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにＴＥＭ８ポリペプチドを提示するエキソソームおよび抗原提示細胞の投与によって、抗腫瘍免疫応答が誘導される。したがって本発明は、該ポリペプチドまたはそれらをコードするポリヌクレオチド、ならびにそれらの活性成分として該エキソソームおよび抗原提示細胞を含む調合薬剤を提供する。本発明の調合薬剤は、ワクチンとして使用される。
【００１２】
さらに本発明は、がん（腫瘍）を治療および／もしくは予防する（すなわち、防止する）、ならびに／または術後のその再発を防止する方法、ならびにＣＴＬを誘導する方法、腫瘍関連内皮に対する免疫応答および同様に抗腫瘍免疫を誘導する方法を提供し、該方法は、ＴＥＭ８ポリペプチド、ＴＥＭ８ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＴＥＭ８ポリペプチドを提示するエキソソームもしくは抗原提示細胞、または本発明の調合薬剤を投与する工程を含む。
【００１３】
さらに、本発明のＴＥＭポリペプチドを標的とするＣＴＬは、腫瘍関連内皮を標的とする免疫応答を増強する。したがって本発明は、本発明のＴＥＭポリペプチドを標的とするＣＴＬを提供する。本発明のＣＴＬはまた、がんに対するワクチンとしても使用される。
【００１４】
前述の本発明の概要および以下の詳細な説明の両方は、例示的な態様であって、本発明または本発明の他の代替の態様を限定するものではないと理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＴＥＭ８由来のペプチドを用いて誘導されたＣＴＬについてのＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示した写真を示す。ＴＥＭ８−Ａ２４−９−３９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）で刺激したウェル番号＃５および＃６におけるＣＴＬ（ａ）、ＴＥＭ８−Ａ２４−９−２７７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）で刺激したウェル番号＃６におけるＣＴＬ（ｂ）、ＴＥＭ８−Ａ２４−１０−２７７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）で刺激したウェル番号＃３におけるＣＴＬ（ｃ）、ＴＥＭ８−Ａ０２−９−３３７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）で刺激したウェル番号＃３におけるＣＴＬ（ｄ）、ＴＥＭ８−Ａ０２−９−３３８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）で刺激したウェル番号＃６におけるＣＴＬ（ｅ）、ＴＥＭ８−Ａ０２−９−２７８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）で刺激したウェル番号＃３におけるＣＴＬ（ｆ）、ＴＥＭ８−Ａ０２−１０−３３８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０）で刺激したウェル番号＃２におけるＣＴＬ（ｇ）、ＴＥＭ８−Ａ０２−１０−２６５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３）で刺激したウェル番号＃５におけるＣＴＬ（ｈ）、ならびにＴＥＭ８−Ａ０２−１０−３３３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８）で刺激したウェル番号＃４におけるＣＴＬ（ｉ）は、それぞれ対照と比較して、強力なＩＦＮ−γ産生を示した。対照的に、ネガティブデータ（ＣＴＬ誘導なし）の典型例として、ペプチドパルスした標的細胞に対して、ＴＥＭ８−Ａ０２−９−２０７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６）で刺激したＣＴＬからの特異的ＩＦＮ−γ産生は示されなかった（ｊ）。予測したペプチドの大部分がＣＴＬ誘導を示さず、したがって本発明では、ポジティブデータ（ＣＴＬ誘導）に的を絞った。これら画像のウェル上にある四角は、対応するウェルからの細胞が増殖してＣＴＬ株を樹立したことを示す。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。
【図２】ＴＥＭ８−Ａ２４−９−３９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）（ａ）、ＴＥＭ８−Ａ２４−９−２７７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）（ｂ）、ＴＥＭ８−Ａ２４−１０−２７７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）（ｃ）、ＴＥＭ８−Ａ０２−９−３３７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）（ｄ）、ＴＥＭ８−Ａ０２−９−３３８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）（ｅ）、ＴＥＭ８−Ａ０２−９−２７８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）（ｆ）、ＴＥＭ８−Ａ０２−１０−３３８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０）（ｇ）、ＴＥＭ８−Ａ０２−１０−２６５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３）（ｈ）、およびＴＥＭ８−Ａ０２−１０−３３３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８）（ｉ）で刺激したＣＴＬ株の樹立について、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡアッセイを用いた結果を示した折れ線グラフを示す。各ペプチドでの刺激によって樹立されたＣＴＬ株は、対照と比較して、強力なＩＦＮ−γ産生を示すことが証明された。対照的に、ネガティブデータの典型例として、ペプチドパルスした標的細胞に対して、ＴＥＭ８−Ａ０２−９−２０７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６）で樹立したＣＴＬ株からの特異的ＩＦＮ−γ産生は示されなかった（ｊ）。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。
【図３】ＴＥＭ８−Ａ２４−９−２７７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）（ａ）、ＴＥＭ８−Ａ２４−１０−２７７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）（ｂ）、ＴＥＭ８−Ａ０２−９−３３７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）（ｃ）、ＴＥＭ８−Ａ０２−９−３３８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）（ｄ）、およびＴＥＭ８−Ａ０２−１０−２６５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３）（ｅ）を用いて刺激したＣＴＬクローンの樹立を示した折れ線グラフを示す。各ペプチドでの刺激によって樹立されたＣＴＬクローンは、対応するペプチドをパルスした標的細胞に対して、強力なＩＦＮ−γ産生を示した。一方、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対しては、ＩＦＮ−γ産生を示さなかった。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。
【図４】ＴＥＭ８およびＨＬＡ−Ａ＊２４０２またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１を内発的に発現している標的細胞に対する特異的ＣＴＬ活性を示した折れ線グラフを示す。ＴＥＭ８遺伝子の全長をトランスフェクトした、またはＴＥＭ８由来の適切でないペプチドを用いてパルスすることにより対応するＨＬＡ遺伝子をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞を、対照として調製した。（ａ）ＴＥＭ８−Ａ２４−９−２７７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）を用いて樹立したＣＴＬクローンは、ＴＥＭ８およびＨＬＡ−Ａ２４の両方をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞に対して高い特異的ＣＴＬ活性を示した（黒いひし形の印）。一方、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２（白抜きの三角形の印）またはＴＥＭ８（白抜きの円）のいずれかを発現している標的細胞に対しては、有意な特異的ＣＴＬ活性は検出されなかった。（ｂ）ＴＥＭ８−Ａ０２−１０−２６５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３）で樹立したＣＴＬクローンは、ＴＥＭ８およびＨＬＡ−Ａ０２の両方をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞に対して、高い特異的ＣＴＬ活性を示した（黒いひし形の印）。一方、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１（白抜きの三角形の印）またはＴＥＭ８（白抜きの円）のいずれかを発現している標的細胞に対しては、有意な特異的ＣＴＬ活性は検出されなかった。
【図５】ＴＥＭ８−Ａ２４−９−２７７ペプチドを用いたワクチン接種のインビボの免疫原性および抗腫瘍効果を示す。（ａ）「材料と方法」に記載したプロトコールに従って、ＴＥＭ８エピトープペプチドのインビボ免疫原性を調べた。不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）とコンジュゲートしたＴＥＭ８−Ａ２４−９−２７７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）（Ｍ１〜Ｍ５）またはＩＦＡのみ（Ｎ１およびＮ２）を、ＢＡＬＢ／ｃマウスに注射した。図中、「＋」は、ペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し（黒い棒線）、「−」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す（白い棒線）。ワクチン接種したマウス由来の脾細胞は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対してはＩＦＮ−γを産生することなく、ＴＥＭ８−Ａ２４−９−２７７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）をパルスしたＲＬｍａｌｅ１細胞に対してはＩＦＮ−γを産生した。ＳＦＣは、スポットを形成している細胞を示す。（ｂ）ＴＥＭ８エピトープペプチドを用いたワクチン接種による抗腫瘍効果を、予防的設定（ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ ｓｅｔｔｉｎｇ）として試験した。ＴＥＭ８−Ａ２４−９−２７７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）とコンジュゲートしたＩＦＡ（黒い三角形の印）またはペプチドとコンジュゲートしていないＩＦＡ（白抜きのひし形の印）を、７日前および０日目にＢＡＬＢ／ｃマウスに注射した。０日目に、５×１０４個のＣＴ２６マウス結腸直腸癌細胞株を、ワクチン接種したマウスに皮下注射した。腫瘍サイズを５匹のマウスの平均として示す。エピトープペプチドのワクチン接種により、腫瘍増殖の抑制の有意な差が観察された（＊；Ｐ＜０．０５）。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
発明の詳細な説明
Ｉ．定義
本明細書において用いる「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という単語は、特に指示がなければ「少なくとも１つ」を意味する。
【００１７】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーに言及するために本明細書において区別なく使用される。この用語は、１個または複数のアミノ酸残基が修飾された残基であるか、または例えば対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学的模倣体等の天然に存在しない残基であるアミノ酸ポリマーと、天然に存在するアミノ酸ポリマーとに適用される。
【００１８】
本明細書において用いる「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然に存在するアミノ酸とは、遺伝子コードによってコードされたアミノ酸、ならびに細胞中で翻訳後に修飾されたアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリン）のことである。「アミノ酸類似体」という語句は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造（水素、カルボキシ基、アミノ基、およびＲ基に結合したα炭素）を有するが、改変されたＲ基または改変された骨格（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニン、スルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）を有する化合物を指す。「アミノ酸模倣体」という語句は、異なる構造を有するが、一般的アミノ酸と同様の機能を有する化合物を指す。
【００１９】
本明細書において、アミノ酸は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会によって推奨される、それらの一般的に公知の三文字表記または一文字表記によって表されてもよい。
【００２０】
「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、および「核酸」という用語は、特に指示がなければ本明細書において区別なく使用され、かつそれらの一般的に受け入れられている一文字コードによって表されるアミノ酸と類似している。
【００２１】
特に定義されなければ、本明細書において用いるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって共通して理解される用語と同じ意味を有する。
【００２２】
ＩＩ．ペプチド
ＴＥＭ８由来のペプチドが、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によって認識される抗原として機能することを証明するために、ＴＥＭ８（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿１１５５８４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６））由来のペプチドを分析し、それらが、通常ＨＬＡ対立遺伝子に見られるＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ０２によって拘束される抗原エピトープであるかどうかを確認した（Date Y et al., Tissue Antigens 47: 93-101, 1996；Kondo A et al., J Immunol 155: 4307-12, 1995；Kubo RT et al., J Immunol 152: 3913-24, 1994）。ＨＬＡ−Ａ２４およびＨＬＡ−Ａ０２ に結合する、ＴＥＭ８由来のペプチドの候補を、ＨＬＡ−Ａ２４およびＨＬＡ−Ａ０２に対するそれらの結合親和性に関する情報を用いて同定した。これらのペプチドを保持した樹状細胞（ＤＣ）によるＴ細胞のインビトロでの刺激後、以下の各ペプチドを用いてＣＴＬの樹立に成功した。
ＴＥＭ８−Ａ２４−９−３９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、
ＴＥＭ８−Ａ２４−９−２７７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、
ＴＥＭ８−Ａ２４−１０−２７７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）、
ＴＥＭ８−Ａ０２−９−３３７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）、
ＴＥＭ８−Ａ０２−９−３３８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）、
ＴＥＭ８−Ａ０２−９−２７８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）、
ＴＥＭ８−Ａ０２−１０−３３８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０）、
ＴＥＭ８−Ａ０２−１０−２６５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３）、および
ＴＥＭ８−Ａ０２−１０−３３３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８）。
【００２３】
これらの樹立されたＣＴＬは、それぞれのペプチドをパルスした標的細胞に対して強力な特異的ＣＴＬ活性を示した。これらの結果は、ＴＥＭ８がＣＴＬによって認識される抗原であること、かつ以下のペプチドがＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ０２によって拘束されるＴＥＭ８のエピトープペプチドであることを示している。
ＴＥＭ８−Ａ２４−９−３９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、
ＴＥＭ８−Ａ２４−９−２７７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、
ＴＥＭ８−Ａ２４−１０−２７７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）、
ＴＥＭ８−Ａ０２−９−３３７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）、
ＴＥＭ８−Ａ０２−９−３３８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）、
ＴＥＭ８−Ａ０２−９−２７８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）、
ＴＥＭ８−Ａ０２−１０−３３８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０）、
ＴＥＭ８−Ａ０２−１０−２６５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３）、および
ＴＥＭ８−Ａ０２−１０−３３３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８）。
【００２４】
ＴＥＭ８遺伝子は大部分のがん患者で過剰に発現しているため、これは向上した臨床効果を有する免疫療法のための優れた標的である。したがって本発明は、ＣＴＬに認識されるＴＥＭ８由来のエピトープのノナペプチド（９個のアミノ酸残基からなるペプチド）およびデカペプチド（１０個のアミノ酸残基からなるペプチド）を提供する。本発明において、ノナペプチドまたはデカペプチドのアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６から選択してもよい。したがって本発明は、細胞傷害性Ｔ細胞誘導能を有する単離されたペプチドを提供し、該ペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６のアミノ酸配列から選択される９個または１０個の連続したアミノ酸配列を含む。より具体的には、いくつかの態様において、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、９、２３、２５、３０、６０、６３、および６８の群より選択されるアミノ酸配列からなるペプチドを提供する。
【００２５】
一般的に、インターネット上で現在入手可能なソフトウェアプログラム、例えばParker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1, 152(1): 163-75に記載されているソフトウェアプログラム等を用いて、インシリコで種々のペプチドとＨＬＡ抗原との間の結合親和性を算出することができる。例えばParker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1, 152(1): 163-75；およびKuzushima K et al., Blood 2001, 98(6): 1872-81に記載されているように、ＨＬＡ抗原との結合親和性を測定することができる。結合親和性を決定する方法は、例えばJournal of Immunological Methods, 1995, 185: 181-190；Protein Science, 2000, 9: 1838-1846に記載されている。したがって本発明は、そのような公知のプログラムによってＨＬＡ抗原に結合すると判定されたＴＥＭ８のペプチドを包含する。
【００２６】
さらに、本発明のこれらのペプチドを、該ペプチドがそのＣＴＬ誘導能を維持している限り、付加的アミノ酸残基を隣接させることができる。ＣＴＬ誘導能を有するそのようなペプチドは、例えば約４０アミノ酸未満、しばしば約２０アミノ酸未満、通常約１５アミノ酸未満である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、９、２３、２５、３０、６０、６３、および６８の群より選択されるアミノ酸配列からなるペプチドに隣接するアミノ酸配列は、元のペプチドのＣＴＬ誘導能を損なわない限り、限定されずかつ任意の種類のアミノ酸から構成可能である。したがって本発明は、ＣＴＬ誘導能を有するペプチドであって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、９、２３、２５、３０、６０、６３、および６８の群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチドも提供する。
【００２７】
一般的に、あるタンパク質中の１個もしくは複数のアミノ酸の改変が該タンパク質の機能に影響を及ぼさないこと、または、ある場合には元のタンパク質の所望の機能を促進することさえあることが知られている。実際、改変したペプチド（すなわち、元の参照配列に対して１個、２個、または数個のアミノ酸残基を置換または付加することによって改変したアミノ酸配列から構成されるペプチド）が元のペプチドの生物活性を維持することが知られている（Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81: 5662-6；Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 1982, 10: 6487-500；Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 1982, 79: 6409-13）。したがって、本発明の一態様において、ＣＴＬ誘導能を有する本発明のペプチドは、１個、２個、またはさらにそれ以上のアミノ酸が付加および／または置換された、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、９、２３、２５、３０、６０、６３、または６８のアミノ酸配列を含むアミノ酸から構成可能である。
【００２８】
１アミノ酸またはわずかな割合のアミノ酸を変化させる、アミノ酸配列に対する個々の付加または置換が、結果的に元のアミノ酸側鎖の特性の保存をもたらすこと；ゆえに、それは「保存的置換」または「保存的改変」と称され、タンパク質の改変が結果的に同様の機能を有するタンパク質をもたらすことを、当業者は認識するであろう。機能的に類似しているアミノ酸を提示する保存的置換の表は、当技術分野において周知である。アミノ酸側鎖の特性の例としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、ならびに以下の官能基または特徴を共通して有する側鎖である：脂肪族側鎖（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）；ヒドロキシル基を含む側鎖（Ｓ、Ｔ、Ｙ）；硫黄原子を含む側鎖（Ｃ、Ｍ）；カルボン酸とアミドを含む側鎖（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）；塩基を含む側鎖（Ｒ、Ｋ、Ｈ）；および、芳香族を含む側鎖（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）。さらに、以下の８つのグループはそれぞれ、相互に保存的置換であるアミノ酸を含む：
（１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
（２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
（３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
（４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
（５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
（６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
（７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および
（８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Creighton, Proteins 1984を参照）。
【００２９】
このような保存的に改変したペプチドもまた、本発明のペプチドと見なされる。しかしながら、本発明のペプチドはそれに限定されず、該ペプチドがＣＴＬ誘導能を維持している限り、非保存的な改変を含むことができる。さらに、この改変したペプチドは、ＴＥＭ８の、多型バリアント、種間ホモログ、および対立遺伝子のＣＴＬ誘導可能なペプチドを排除しない。
【００３０】
必要なＣＴＬ誘導能を維持するために、少数の（例えば、１個、２個、もしくは数個の）またはわずかな割合のアミノ酸を改変する（付加または置換する）ことが可能である。本明細書において、「数個」という用語は、５個またはそれ未満のアミノ酸、例えば３個またはそれ未満を意味する。改変するアミノ酸の割合は、２０％またはそれ未満、例えば１５％またはそれ未満、例えば１０％または１〜５％であってよい。
【００３１】
本発明のペプチドであるＴＥＭ８−Ａ２４−９−３９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、ＴＥＭ８−Ａ２４−９−２７７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、ＴＥＭ８−Ａ２４−１０−２７７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）、ＴＥＭ８−Ａ０２−９−３３７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）、ＴＥＭ８−Ａ０２−９−３３８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）、ＴＥＭ８−Ａ０２−９−２７８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）、ＴＥＭ８−Ａ０２−１０−３３８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０）、ＴＥＭ８−Ａ０２−１０−２６５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３）、およびＴＥＭ８−Ａ０２−１０−３３３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８）のホモロジー解析により、それらは他の任意の公知のヒト遺伝子産物に由来するペプチドとは有意な相同性を有しないことが示された。このことは、免疫療法に用いた場合に未知または望ましくない免疫応答の可能性を低める。したがって、この観点からも、これらのペプチドは、腫瘍関連内皮上のＴＥＭ８に対する腫瘍患者の免疫を誘発するために使用される。
【００３２】
免疫療法に用いた場合、本発明のペプチドは、ＨＬＡ抗原との複合体として細胞またはエキソソームの表面上に提示される。したがって、それらのＣＴＬ誘導能に加えて、ＨＬＡ抗原に対する高い結合親和性を有するペプチドを選択することが可能である。さらに、より高い結合親和性を達成するために、アミノ酸残基の置換、付加等によってペプチドを改変することができる。天然に提示されるペプチドに加えて、ＨＬＡ抗原への結合によって提示されるペプチド配列の規則性はすでに公知であるため（J Immunol 1994, 152: 3913；Immunogenetics 1995, 41: 178；J Immunol 1994, 155: 4307）、そのような規則性に基づいた改変を本発明の免疫原性ペプチド内に導入することができる。例えば、高いＨＬＡ−Ａ２４結合親和性を示すペプチドは、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシン、メチオニン、またはトリプトファンで置換されており、かつ、Ｃ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、またはメチオニンで置換されているペプチドも、有利に使用することができる。したがって、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシン、メチオニン、もしくはトリプトファンで置換されているＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、もしくは９のアミノ酸配列を有するペプチド、および／またはＣ末端がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、もしくはメチオニンで置換されているペプチドは、本発明に包含される。
【００３３】
一方、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がロイシンまたはメチオニンで置換されており、かつＣ末端のアミノ酸がバリンまたはロイシンで置換されているペプチドを、高いＨＬＡ−０２結合親和性を有するペプチドとして用いることができる。したがって、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がロイシンもしくはメチオニンで置換されており、かつ／またはＣ末端がバリンもしくはロイシンで置換されている、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３、２５、３０、６０、６３、および６８のアミノ酸配列のいずれかを有するペプチドは、本発明に包含される。末端のアミノ酸においてだけでなく、ペプチドの潜在的なＴＣＲ認識の部位においても、置換を導入することができる。いくつかの研究は、例えばＣＡＰ１、ｐ５３（２６４−２７２）、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ（３６９−３７７）、またはｇｐ１００（２０９−２１７）等、ペプチド中のアミノ酸置換が元のものと同等またはより優れたものであり得ることを証明している（Zaremba et al., Cancer Res. 57, 4570-4577, 1997；T.K. Hoffmann et al., J Immunol. (2002) Feb 1, 168(3): 1338-47；S.O. Dionne et al., Cancer Immunol immunother. (2003) 52: 199-206；およびS.O. Dionne et al., Cancer Immunology, Immunotherapy (2004) 53, 307-314）。
【００３４】
さらに、本発明のペプチドのＮおよび／またはＣ末端に１個〜２個のアミノ酸を付加することもできる。高いＨＬＡ抗原結合親和性を有し、かつＣＴＬ誘導能を維持しているそのような改変ペプチドもまた本発明に包含される。
【００３５】
しかしながら、このペプチド配列が、異なる機能を有する内在性または外来のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一である場合、自己免疫異常または特定の物質に対するアレルギー症状等の副作用が誘発される可能性がある。したがって、ペプチドの配列が別のタンパク質のアミノ酸配列と一致する状況を回避するために、使用可能なデータベースを用いてホモロジー検索を実施することができる。ホモロジー検索から、対象ペプチドに対して１個または２個のアミノ酸の違いを有するペプチドさえも存在しないことが明らかになった場合には、前記副作用のいかなる危険も伴わずにＨＬＡ抗原とのその結合親和性を増大させかつ／またはそのＣＴＬ誘導能を増強させるために、この対象ペプチドを改変することができる。
【００３６】
前述のように、ＨＬＡ抗原に対する高い結合親和性を有するペプチドは非常に効果的であると期待されるが、指標としての高い結合親和性の存在に依って選択された候補ペプチドを、ＣＴＬ誘導能の存在についてさらに検討する。本明細書において「ＣＴＬ誘導能」という語句は、抗原提示細胞上に提示された場合に、ＣＴＬを誘導するペプチドの能力を表す。さらに「ＣＴＬ誘導能」は、ＣＴＬ活性化を誘導する、ＣＴＬ増殖を誘導する、ＣＴＬによる標的細胞の溶解を促進する、ならびにＣＴＬのＩＦＮ−γ産生を増加させる、ペプチドの能力を含む。
【００３７】
ＣＴＬ誘導能の確認は、ヒトＭＨＣ抗原を保持する抗原提示細胞（例えば、Ｂリンパ球、マクロファージ、および樹状細胞（ＤＣ））、またはより具体的にはヒト末梢血単核白血球由来のＤＣを誘導し、ペプチドを用いた刺激後にＣＤ８陽性細胞と混合し、その後、標的細胞に対するＣＴＬによって産生かつ放出されたＩＦＮ−γを測定することによってなされる。反応系として、ヒトＨＬＡ抗原を発現するように作製されたトランスジェニック動物（例えば、BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 2000 Aug, 61(8): 764-79, Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice: dependence on HLA class II restricted T(H) responseに記載されているもの）を用いることができる。例えば、標的細胞を５１Ｃｒ等で放射標識することができ、該標的細胞から放出された放射能から細胞傷害活性を算出することができる。あるいは、固定化したペプチドを保持する抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下でＣＴＬによって産生かつ放出されたＩＦＮ−γを測定し、抗ＩＦＮ−γモノクローナル抗体を用いて培地上の阻害領域を可視化することによって、細胞傷害活性を調べることができる。
【００３８】
前述のようにペプチドのＣＴＬ誘導能を検討した結果、ＨＬＡ抗原に対する高い結合親和性を有するペプチドは、必ずしも高い誘導能を有するペプチドではなかった。さらに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、９、２３、２５、３０、６０、６３、および６８によって示されるアミノ酸配列を含むペプチドから選択されたノナペプチドまたはデカペプチドは、ＨＬＡ抗原に対する高い結合親和性に加えて、特に高いＣＴＬ誘導能を示した。したがって、これらのペプチドは本発明の例示的な態様である。
【００３９】
前述の本発明のペプチドの改変に加えて、本発明のペプチドを、それらがＣＴＬ誘導能を維持している限り、他の物質にさらに連結させることができる。例示的な物質には、ペプチド、脂質、糖および糖鎖、アセチル基、天然および合成のポリマー等が含まれる。前記ペプチドは、修飾によって本明細書において記載したペプチドの生物活性が損なわれない限り、糖鎖付加、側鎖酸化、またはリン酸化等の修飾を含み得る。これらの種類の修飾を、ポリペプチドに付加的機能（例えば、標的化機能および送達機能）を与える、またはポリペプチドを安定化するために実施することができる。
【００４０】
例えば、ポリペプチドのインビボ安定性を増大させるために、Ｄ−アミノ酸、アミノ酸模倣体、または非天然アミノ酸を導入することが当技術分野において公知であり、この概念を本発明のペプチドにも適合させることができる。いくつもの方法でポリペプチドの安定性をアッセイすることができる。例えば、ペプチダーゼ、ならびにヒト血漿および血清等の種々の生物学的媒質を用いて安定性を試験することができる（例えば、Verhoef et al., Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986, 11: 291-302を参照）。
【００４１】
本明細書において、本発明のペプチドを「ＴＥＭ８ペプチド」または「ＴＥＭ８ポリペプチド」と記載することもできる。
【００４２】
ＩＩＩ．ＴＥＭ８ペプチドの調製
周知の技術を用いて、本発明のペプチドを調製することができる。例えば、組換えＤＮＡ技術または化学合成によって、ペプチドを合成的に調製することができる。本発明のペプチドは、個々に、または２個以上のペプチドを含むより長いポリペプチドとして合成可能である。ペプチドを単離すること、すなわち、他の天然に存在する宿主細胞タンパク質およびその断片、または他の任意の化学物質を実質的に含まないように精製または単離することが可能である。
【００４３】
選択されたアミノ酸配列に基づく化学合成によって、本発明のペプチドを得ることができる。例えば、該合成に適合させることのできる従来のペプチド合成法としては、以下が挙げられる：
（ｉ）Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966；
（ｉｉ）The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976；
（ｉｉｉ）Peptide Synthesis（日本語）, Maruzen Co., 1975；
（ｉｖ）Basics and Experiment of Peptide Synthesis（日本語）, Maruzen Co., 1985；
（ｖ）Development of Pharmaceuticals（第二版）（日本語）, Vol. 14(peptide synthesis), Hirokawa, 1991；
（ｖｉ）ＷＯ９９／６７２８８；および
（ｖｉｉ）Barany G. & Merrifield R.B., Peptides Vol. 2, “Solid Phase Peptide Synthesis", Academic Press, New York, 1980, 100-118。
【００４４】
あるいは、ペプチドを作製するための任意の公知の遺伝子工学方法（例えば、Morrison J, J Bacteriology 1977, 132: 349-51；Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology（Wu et al.版）1983, 101: 347-62）を適合させて、本発明のペプチドを得ることができる。例えば、まず、発現可能な形態（例えば、プロモーター配列に相当する調節配列の下流）で対象ペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する適切なベクターを調製し、適切な宿主細胞を形質転換する。次いで、該宿主細胞を培養して、関心対象のペプチドを産生させる。また、インビトロ翻訳系を適合させてインビトロでも、該ペプチドを産生させることができる。
【００４５】
ＩＶ．ポリヌクレオチド
本発明は、前述の本発明のペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドを提供する。これらは、天然に存在するＴＥＭ８遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３２２０８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５））由来のポリヌクレオチド、およびその保存的に改変されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む。本明細書において「保存的に改変されたヌクレオチド配列」という語句は、同一または実質的に同一のアミノ酸配列をコードする配列を表す。遺伝子コードの縮重のため、多数の機能的に同一な核酸が任意の特定のタンパク質をコードする。例えば、ＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵのコドンはすべて、アミノ酸のアラニンをコードする。したがって、あるコドンによってアラニンが特定されるあらゆる位置において、コードされたポリペプチドを変えることなく、該コドンを記載された相当するコドンのいずれかに変更することができる。このような核酸の変異は「サイレント変異」であり、保存的に改変した変異の１種である。あるペプチドをコードする本明細書中のあらゆる核酸配列はまた、該核酸のあらゆる潜在的なサイレント変異も説明する。核酸中の各コドン（通常メチオニンに対する唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンに対する唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を改変して、機能的に同一な分子を作製することが可能であることを、当業者は認識するであろう。したがって、ペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、公開された各配列において非明示的に記載されている。
【００４６】
ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびその誘導体から、本発明のポリヌクレオチドを構成することができる。ＤＮＡはＡ、Ｔ、Ｃ、およびＧ等の塩基から適宜構成され、ＲＮＡではＴはＵに置き換わる。
【００４７】
本発明のポリヌクレオチドは、介在するアミノ酸配列を間に伴って、または伴わずに、本発明の複数のペプチドをコードすることができる。例えば、介在するアミノ酸配列により、ポリヌクレオチドまたは翻訳されたペプチドの切断部位（例えば、酵素認識配列）を提供することができる。さらに、ポリヌクレオチドは、本発明のペプチドをコードするコード配列に対する任意の付加的配列を含むことができる。例えば、ポリヌクレオチドは、ペプチドの発現に必要な調節配列を含む組換えポリヌクレオチドであってよく、または、マーカー遺伝子等を有する発現ベクター（プラスミド）であってもよい。一般に、例えばポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼを用いる従来の組換え技術によりポリヌクレオチドを操作することによって、そのような組換えポリヌクレオチドを調製することができる。
【００４８】
組換え技術および化学合成技術の両方を、本発明のポリヌクレオチドを作製するために使用することができる。例えば、適切なベクター内に挿入することによってポリヌクレオチドを作製することができ、コンピテント細胞内にトランスフェクトした場合に発現させることが可能である。あるいは、ＰＣＲ技術または適切な宿主内での発現を用いることによって、ポリヌクレオチドを増幅させることができる（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989を参照）。あるいは、Beaucage SL & Iyer RP, Tetrahedron 1992, 48: 2223-311；Matthes et al., EMBO J 1984, 3: 801-5に記載されているように、固相技術を用いることによって、ポリヌクレオチドを合成することができる。
【００４９】
Ｖ．エキソソーム
本発明はさらに、エキソソームと称される細胞内小胞を提供し、それは本発明のペプチドとＨＬＡ抗原との間に形成される複合体をその表面上に提示する。例えば、日本国特許出願公表公報平１１−５１０５０７号およびＷＯ９９／０３４９９に詳述されている方法を用いることによって、ならびに治療および／または防止を受ける患者から得られたＡＰＣを用いることによって、エキソソームを調製することができる。本発明のペプチドと同様に、本発明のエキソソームをワクチンとして接種することができる。
【００５０】
複合体中に含まれるＨＬＡ抗原の型は、治療および／または防止を必要とする対象のものと一致しなければならない。例えば日本人に対して、ＨＬＡ−Ａ２４、特にＨＬＡ−Ａ２４０２が適合することが多い。日本人および白人の間で高発現するＡ−２４型またはＡ−０２型の使用は有効な結果を得るのに好ましく、Ａ−２４０２およびＡ−０２０１等のサブタイプが使用される。典型的に、臨床では、治療を必要とする患者のＨＬＡ抗原の型はあらかじめ検査されており、これにより、この抗原に対して高レベルの結合親和性を有するペプチド、または抗原提示によるＣＴＬ誘導能を有するペプチドの適切な選択が可能となる。さらに、高い結合親和性とＣＴＬ誘導能を示すペプチドを得るために、天然に存在するＴＥＭ８の部分的なペプチドのアミノ酸配列に基づいて、１個、２個、または数個のアミノ酸の置換または付加を行ってもよい。
【００５１】
本発明のエキソソームに対してＡ−２４型のＨＬＡ抗原を用いる場合、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、または９の配列を含むペプチドが使用され、一方、Ａ−０２型のＨＬＡ抗原を用いる場合、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３、２５、３０、６０、６３、または６８の配列を含むペプチドが使用される。
【００５２】
ＶＩ．抗原提示細胞（ＡＰＣ）
本発明はまた、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの間に形成される複合体をその表面上に提示するＡＰＣを提供する。本発明のペプチドに接触させることによって、または本発明のペプチドをコードするヌクレオチドを発現可能な形態で導入することによって得られるＡＰＣは、治療および／または防止を受ける患者に由来することができ、かつ、単独で、または本発明のペプチド、エキソソーム、もしくは細胞傷害性Ｔ細胞を含む他の薬物と組み合わせて、ワクチンとして投与することができる。あるいは、本発明はまた、ＨＬＡ抗原と共に本発明のペプチドを提示するＡＰＣも提供し、該ＡＰＣは、
（ａ）本発明のペプチドをＡＰＣと接触させる、または
（ｂ）前記ペプチドをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣ内に導入して、ＡＰＣを作製する
ことによって誘導される。
【００５３】
前記ＡＰＣは、特定の種類の細胞に限定されず、リンパ球によって認識されるようにその細胞表面上にタンパク質性抗原を提示することが知られているＤＣ、ランゲルハンス細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、および活性化Ｔ細胞を含む。ＤＣは、ＡＰＣの中で最も強力なＣＴＬ誘導作用を有する代表的なＡＰＣであり、ＤＣは本発明のＡＰＣとして使用される。
【００５４】
例えば、末梢血単球からＤＣを誘導し、次いで、それらをインビトロ、エクスビボ、またはインビボで本発明のペプチドと接触させる（で刺激する）ことによって、ＡＰＣを得ることができる。本発明のペプチドを対象に投与した場合、本発明のペプチドを提示するＡＰＣが該対象の体内で誘導される。「ＡＰＣを誘導する」とは、細胞を、本発明のペプチドまたは本発明のペプチドをコードするヌクレオチドと接触させて（で刺激して）、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの間に形成される複合体を細胞表面上に提示させることを含む。あるいは、ＡＰＣが本発明のペプチドを提示できるようにＡＰＣに該ペプチドを導入した後、該ＡＰＣをワクチンとして対象に投与することができる。例えば、エクスビボ投与は、以下の工程を含んでもよい：
ａ：第一の対象からＡＰＣを回収する工程；
ｂ：工程ａのＡＰＣと前記ペプチドを接触させる工程；および
ｃ：前記ペプチドを保持したＡＰＣを第二の対象に投与する工程。
【００５５】
前記第一の対象と第二の対象は、同一の個体であってよく、または異なる個体であってもよい。あるいは、本発明に従って、抗原提示細胞を誘導する薬学的組成物を製造するための本発明のペプチドの使用を提供する。さらに、本発明はまた、抗原提示細胞を誘導するための本発明のペプチドも提供する。工程ｂによって得られたＡＰＣを、ワクチンとして前記対象に投与することができる。
【００５６】
本発明の一態様において、ＡＰＣは高レベルのＣＴＬ誘導能を有する。「高レベルのＣＴＬ誘導能」という用語における高レベルとは、ペプチドと接触させないＡＰＣ、またはＣＴＬを誘導し得ないペプチドと接触させたＡＰＣのＣＴＬ誘導能レベルと比較したＣＴＬ誘導能レベルである。高レベルのＣＴＬ誘導能を有するそのようなＡＰＣを、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子をインビトロでＡＰＣに導入する工程を含む方法によって、調製することができる。導入する遺伝子は、ＤＮＡまたはＲＮＡの形態であってよい。導入の方法の例としては、特に限定されることなく、当技術分野において従来より実施される種々の方法が含まれ、例えばリポフェクション、エレクトロポレーション、およびリン酸カルシウム法を使用することができる。より具体的には、Cancer Res 1996, 56: 5672-7；J Immunol 1998, 161: 5607-13；J Exp Med 1996, 184: 465-72；公表特許公報第２０００−５０９２８１号に記載されているように、それを実施してもよい。遺伝子をＡＰＣ内に導入することによって、該遺伝子は細胞内で転写、翻訳等を受け、次いで、得られたタンパク質は、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩによって処理されて、提示経路を通過して部分的なペプチドが提示される。
【００５７】
ＶＩＩ．細胞傷害性Ｔ細胞
本発明のペプチドのいずれかに対して誘導された細胞傷害性Ｔ細胞は、インビボで腫瘍関連内皮を標的とする免疫応答を増強し、それゆえ、該ペプチドと同様にワクチンとして使用することができる。したがって本発明は、本発明のペプチドのいずれかよって特異的に誘導または活性化された、単離された細胞傷害性Ｔ細胞を提供する。好ましくは、本発明は、
（ａ）ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と共に本発明のペプチドを提示するＡＰＣと接触させる工程によって誘導された；または
（ｂ）ＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２という状況で、本発明のペプチドと結合するＴＣＲサブユニットポリペプチドをコードする核酸を形質導入された
単離された細胞傷害性Ｔ細胞を提供する。
【００５８】
そのような細胞傷害性Ｔ細胞は、（１）対象に投与する、または（２）対象由来のＡＰＣ、およびＣＤ８陽性細胞、もしくは末梢血単核白血球を、本発明のペプチドとインビトロで接触させる（刺激する）ことによって、得ることができる。
【００５９】
本発明のペプチドを提示するＡＰＣからの刺激によって誘導される細胞傷害性Ｔ細胞は、治療および／または防止を受ける患者に由来するものでよく、かつ、単独で、または効果を調節する目的で本発明のペプチドもしくはエキソソームを含む他の薬物と組み合わせて、投与することができる。得られた細胞傷害性Ｔ細胞は、本発明のペプチド、または例えば誘導に用いた同一のペプチドを提示する標的細胞に対して特異的に作用する。該標的細胞は、ＴＥＭ８を内発的に発現する細胞、またはＴＥＭ８遺伝子をトランスフェクトされた細胞であってよく、かつ本発明のペプチドによる刺激によって該ペプチドを細胞表面上に提示する細胞は、活性化されたＣＴＬの攻撃の標的となることもできる。
【００６０】
ＶＩＩＩ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）
本発明はまた、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のサブユニットを形成し得るポリペプチドをコードする核酸を含む組成物、およびそれを用いる方法を提供する。該ＴＣＲサブユニットは、ＴＥＭ８を提示する腫瘍細胞に対する特異性をＴ細胞に与えるＴＣＲを形成する能力を有する。当技術分野における公知の方法を用いることによって、本発明の１種または複数種のペプチドで誘導されたＣＴＬのＴＣＲサブユニットとしてのα鎖およびβ鎖の核酸を同定することができる（ＷＯ２００７／０３２２５５およびMorgan et al., J Immunol, 171, 3288 (2003)）。ＴＣＲ誘導体は、ＴＥＭ８ペプチドを提示する標的細胞と高い結合力で結合することができ、かつ任意でＴＥＭ８ペプチドを提示する標的細胞の効率的な殺傷をインビボおよびインビトロで媒介することができる。
【００６１】
ＴＣＲサブユニットをコードする核酸を、適切なベクター、例えばレトロウイルスベクターに組み込むことができる。これらのベクターは、当技術分野において周知である。該核酸またはそれらを含むベクターを、Ｔ細胞、例えば患者由来のＴ細胞内に有効に導入することができる。有利には、本発明は、患者自身のＴ細胞（または他の哺乳動物のＴ細胞）の迅速な改変により、優れたがん細胞殺傷特性を有する改変Ｔ細胞を迅速かつ容易に作製することを可能とする、容易に入手可能な組成物を提供する。
【００６２】
また本発明は、ＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２という状況で、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、９、２３、２５、３０、６０、６３、および６８のＴＥＭ８ペプチドに結合するＴＣＲサブユニットポリペプチドをコードする核酸を導入することによって調製されるＣＴＬを提供する。導入されたＣＴＬは、インビボでがん細胞に向かわせることが可能であり、かつインビトロで周知の培養方法によって増加させることができる（例えば、Kawakami et al., J Immunol., 142, 3452-3461 (1989)）。本発明のＴ細胞を用いて、治療または予防を必要としている患者のがんの治療または防止に有用な免疫原性組成物を形成することができる（ＷＯ２００６／０３１２２１）。
【００６３】
防止および予防は、疾患による死亡または罹患の負担を低下させる任意の行為を含む。防止および予防は、「第一、第二、および第三の予防レベルで」行われ得る。第一の防止および予防は、疾患の発生を回避するのに対し、第二および第三のレベルの防止および予防は、機能を回復させ、かつ疾患関連の合併症を減少させることによって、既存の疾患の悪影響を低下させるのに加え、疾患の進行および症状の出現を防止および予防することを目的とした行為を包含する。あるいは、防止および予防は、特定の疾患の重症度を軽減する、例えば、腫瘍の増殖および転移を減少させる、血管新生を減少させることを目的とした広範囲の予防的治療を含む。
【００６４】
がんの治療および／または予防、ならびに／あるいは術後のその再発の防止は、以下の、例えばがん細胞の外科的除去、がん性細胞の成長の阻止、腫瘍の退縮または後退、寛解誘導およびがんの発生の抑制、腫瘍の後退、ならびに転移の低減または阻止の任意の段階を含む。がんの効果的な治療および／または予防は、死亡率を減少させ、がんを有する個体の予後を改善し、血中の腫瘍マーカーレベルを低下させ、かつがんにともなう検出可能な症状を軽減する。例えば、症状の軽減または改善は効果的な治療の構成要素であり、かつ／または予防は１０％、２０％、３０％、もしくはそれ以上の軽減もしくは安定した疾患を含む。
【００６５】
ＩＸ．調合薬剤
ＴＥＭ８の発現は、正常組織と比較して腫瘍関連内皮において特に上昇しているため（St Croix B et al., Science 2000 Aug 18, 289(5482): 1197-202）、本発明のペプチドまたは該ペプチドをコードするポリヌクレオチドを、がんの治療および／もしくは予防、ならびに／または術後のその再発の防止に用いることができる。したがって本発明は、本発明のペプチドの１種もしくは複数種、または該ペプチドをコードするポリヌクレオチドを活性成分として含む、がんの治療および／もしくは予防のための、ならびに／または術後のその再発の防止のための調合薬剤を提供する。あるいは、調合薬剤としての使用のために、本発明のペプチドを、ＡＰＣ等の前述のエキソソームまたは細胞のいずれかの表面上に発現させることができる。さらに、本発明のペプチドのいずれかを標的とする前述の細胞傷害性Ｔ細胞もまた、本発明の調合薬剤の活性成分として使用することができる。
【００６６】
本発明の調合薬剤は、ワクチンとして使用される。本発明において、「ワクチン」（免疫原性組成物とも称される）という語句は、動物内に接種すると抗腫瘍免疫を誘導する作用を有する物質を表す。
【００６７】
本発明の調合薬剤を、ヒト、ならびにマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、サル、ヒヒ、およびチンパンジー、特に商業的に重要な動物または家畜を含むが、これに限定されない他の任意の哺乳動物を含む対象または患者における、がんの治療および／もしくは防止、ならびに／または術後のその再発の防止に用いることができる。
【００６８】
本発明において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、または９のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、腫瘍関連内皮に対して強力かつ特異的な免疫応答を誘導し得るＨＬＡ−Ａ２４拘束性エピトープペプチドであることが分かっている。したがって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、および９のアミノ酸配列を有するこれらのポリペプチドの任意のものを含む本発明の調合薬剤は、ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２４である対象への投与に特に適している。一方、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３、２５、３０、６０、６３、または６８のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、腫瘍関連内皮に対して強力かつ特異的な免疫応答を誘導し得るＨＬＡ−Ａ０２拘束性エピトープペプチドであることが分かっている。したがって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３、２５、３０、６０、６３、および６８のアミノ酸配列を有するポリペプチドのいずれかを含むこれらのペプチドの任意のものを含む調合薬剤は、ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ０２である対象への投与に特に適している。同じことが、これらのポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドを含む調合薬剤にもあてはまる。
【００６９】
本発明の調合薬剤によって治療されるがんは限定されず、例えば膀胱癌、脳癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、子宮内膜症、食道癌、胃癌、肝臓癌、肺癌、神経芽細胞腫、骨肉腫、卵巣癌、黒色腫、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、精巣腫瘍、または結腸直腸癌を含む、ＴＥＭ８が関与するすべての種類のがんを含む（図５を参照）。
【００７０】
本発明の調合薬剤は、前述の活性成分に加えて、がん性細胞に対してＣＴＬを誘導する能力を有するその他のペプチド、該その他のペプチドをコードするその他のポリヌクレオチド、該その他のペプチドを提示するその他の細胞、またはそれと同様のものを含み得る。本明細書において、がん性細胞に対してＣＴＬを誘導する能力を有するその他のペプチドは、がん特異的抗原（例えば、同定されたＴＡＡ）によって例示されるが、これに限定されない。
【００７１】
必要に応じて、本発明の調合薬剤は、活性成分、例えば本発明のペプチドのいずれかの腫瘍関連内皮に対する抗腫瘍効果をその他の治療物質が阻害しない限り、活性成分として該物質を任意で含んでもよい。例えば、製剤は、抗炎症剤、鎮痛剤、化学療法剤等を含むことができる。医薬自体に他の治療物質を含めることに加えて、本発明の医薬を、１つまたは複数の他の薬理学的薬剤と連続してまたは同時に投与してもよい。医薬および薬理学的薬剤の量は、例えば、使用される薬剤の種類、治療する疾患、ならびに投与のスケジュールおよび経路によって決まる。
【００７２】
本明細書において特に言及した成分に加えて、本発明の調合薬剤は、問題の製剤の種類を考慮して、当技術分野において慣例的な他の薬剤を含んでもよいことが理解されるべきである。
【００７３】
本発明の一つの態様において、治療する疾患、例えばがんの病態を治療するのに有用な材料を含む製品およびキットに本発明の調合薬剤を含めてもよい。該製品は、ラベルを有する本発明の調合薬剤のいずれかの容器を含んでもよい。適切な容器は、ボトル、バイアル、および試験管を含む。容器は、ガラスまたはプラスチック等の様々な材料から形成されることが可能である。容器上のラベルには、前記薬剤が疾患の１つまたは複数の状態の治療または防止のために用いられることが示されるべきである。ラベルは、投与等に関する指示を示すこともできる。
【００７４】
前述の容器に加えて、本発明の調合薬剤を含むキットは、任意で、薬学的に許容される希釈剤を収容した第二の容器をさらに含んでもよい。それは、使用のための指示書とともに、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、注射針、シリンジ、および添付文書を含む、商業上および利用者の立場から見て望ましい他の材料をさらに含むこともできる。
【００７５】
必要に応じて、活性成分を含む一つまたは複数の剤形単位を含み得るパックまたはディスペンサー装置で、薬学的組成物を提供することができる。該パックには、例えばブリスターパック等の金属またはプラスチックホイルが含まれてよい。該パックまたはディスペンサー装置には、投与に関する指示書が添付されてよい。
【００７６】
（１）活性成分としてペプチドを含む調合薬剤
本発明のペプチドは、調合薬剤として直接投与されてもよく、あるいは必要であれば、従来の製剤方法によって製剤される。後者の場合、本発明のペプチドに加えて、薬物に通常用いられる担体、賦形剤等が特に制限なく適宜含まれ得る。そのような担体の例は、滅菌水、生理食塩水、リン酸緩衝液、培養液等である。さらに該調合薬剤は、必要に応じて、安定剤、懸濁液、保存剤、界面活性剤等を含むことができる。本発明の調合薬剤を、抗癌目的に用いることができる。
【００７７】
インビボでＣＴＬを誘導するために、本発明のペプチドを２種以上含む組み合わせで本発明のペプチドを調製することが可能である。該ペプチドは、カクテルの状態であっても、または標準的方法を用いて互いにコンジュゲートしていてもよい。例えば、該ペプチドを化学的に連結させても、または１個の融合ポリペプチド配列として発現させてもよい。組み合わせの中のペプチドは、同一であっても異なっていてもよい。本発明のペプチドを投与することによって、該ペプチドはＡＰＣ上のＨＬＡ抗原によって高密度で提示され、次いで、提示されたペプチドと該ＨＬＡ抗原との間に形成された複合体に特異的に反応するＣＴＬが誘導される。あるいは、本発明のペプチドで刺激した対象からＡＰＣ（例えば、ＤＣ）を取り出すことによって、本発明のペプチドのいずれかを細胞表面上に提示するＡＰＣを得、これらのＡＰＣ（例えば、ＤＣ）を前記対象に再度投与することによって該対象中でＣＴＬを誘導し、結果として、腫瘍関連内皮に対する攻撃性を増大させることができる。
【００７８】
活性成分として本発明のペプチドを含む、がんの治療および／または防止のための調合薬剤は、細胞性免疫が効果的に確立されるように、またはそれらを他の活性成分と共に投与できるように、およびそれらを顆粒内への製剤によって投与できるように、アジュバントを含んでもよい。アジュバントとは、免疫学的活性を有するタンパク質と一緒に（または、連続して）投与した場合に、該タンパク質に対する免疫応答を増強させる化合物を指す。利用できるアジュバントは、文献（Clin Microbiol Rev 1994, 7: 277-89）に記載されているものを含む。例示のアジュバントは、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ミョウバン、コレラ毒素、サルモネラ毒素等を含むが、これに限定されない。
【００７９】
さらに、リポソーム製剤、ペプチドが直径数マイクロメートルのビーズに結合している顆粒製剤、および脂質がペプチドに結合している製剤を好都合に用いてもよい。
【００８０】
いくつかの態様において、本発明の調合薬剤はＣＴＬを刺激する（ｐｒｉｍｅ）構成成分を含む。脂質は、ウイルス抗原に対してインビボでＣＴＬを刺激し得る作用物質として同定されている。例えば、パルミチン酸残基をリジン残基のεアミノ基およびαアミノ基に付着させ、次いで本発明のペプチドに連結させることができる。次いで、脂質付加したペプチドを、ミセルまたは粒子のいずれかの状態で直接投与すること、リポソーム中に取り込ませること、またはアジュバント中に乳化させることができる。ＣＴＬ応答の脂質による刺激の別の例として、適切なペプチドに共有結合している場合、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステインリセリル−セリン（Ｐ３ＣＳＳ）等の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）リポタンパク質を用いてＣＴＬを刺激することができる（例えば、Deres et al., Nature 1989, 342: 561-4を参照）。
【００８１】
投与方法は、経口、皮内、皮下、または静脈内注射等の投与、および全身投与または標的部位付近への局所投与であってよい。投与は、単回投与によって行われても、または複数回投与によって強化されてもよい。本発明のペプチドの用量を、治療する疾患、患者の年齢、体重、および投与方法等に従って適切に調節することができ、これは通常０．００１ ｍｇ〜１０００ ｍｇ、例えば０．００１ ｍｇ〜１０００ ｍｇ、例えば０．１ ｍｇ〜１０ ｍｇであり、数日から数ヶ月に一度投与することができる。当業者は、適当な用量を適切に選択することができる。
【００８２】
（２）活性成分としてポリヌクレオチドを含む調合薬剤
本発明の調合薬剤はまた、本明細書において開示されているペプチドをコードする核酸を発現可能な形態で含むことができる。本明細書中で「発現可能な形態で」という語句は、ポリヌクレオチドが、細胞内に導入された場合に、抗腫瘍免疫を誘導するポリペプチドとしてインビボで発現するであろうことを意味する。例示的な態様において、関心対象のポリヌクレオチドの核酸配列は、該ポリヌクレオチドの発現に必要な調節エレメントを含む。標的細胞のゲノム内への安定した挿入を実現するように、ポリヌクレオチドに必要なものを持たせることができる（相同的組換えカセットベクターの説明に関して、例えばThomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12を参照）。例えば、Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8；米国特許第５，５８０，８５９号；第５，５８９，４６６号；第５，８０４，５６６号；第５，７３９，１１８号；第５，７３６，５２４号；第５，６７９，６４７号；およびＷＯ ９８／０４７２０を参照されたい。ＤＮＡに基づく送達技術の例は、「裸のＤＮＡ」、促進された（ブピバカイン、ポリマー、ペプチド媒介性）送達、カチオン性脂質複合体、および粒子媒介性（「遺伝子銃」）または圧力媒介性の送達を含む（例えば、米国特許第５，９２２，６８７号を参照）。
【００８３】
ウイルスまたは細菌ベクターによって、本発明のペプチドを発現させることもできる。発現ベクターの例は、ワクシニアウイルスまたは鶏痘ウイルス等の弱毒化ウイルス宿主を含む。このアプローチは、例えば、ペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現させるためのベクターとして、ワクシニアウイルスの使用をともなう。宿主内へ導入すると、組換えワクシニアウイルスは免疫原性ペプチドを発現し、それによって、免疫応答を誘発する。免疫化プロトコールに有用なワクシニアベクターおよび方法は、例えば米国特許第４，７２２，８４８号に記載されている。別のベクターはＢＣＧ（カルメット−ゲラン桿菌）である。ＢＣＧベクターは、Stover et al., Nature 1991, 351: 456-60に記載されている。治療的投与または免疫化に有用である多種多様な他のベクター、例えばアデノおよびアデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）ベクター、および無毒化炭疽毒素ベクター等が明らかであろう。例えば、Shata et al., Mol Med Today 2000, 6: 66-71；Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806；Hipp et al., In Vivo 2000, 14: 571-85を参照されたい。
【００８４】
患者内へのポリヌクレオチドの送達は、直接的（この場合、ポリヌクレオチドを保持するベクターに患者を直接さらす）、または間接的（この場合、まず細胞を関心対象のポリヌクレオチドでインビトロで形質転換し、次いで該細胞を患者内に移植する）のいずれかであってよい。これら２つのアプローチは、それぞれ、インビボおよびエクスビボでの遺伝子治療として公知である。
【００８５】
遺伝子治療の方法の一般的概説に関しては、Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 1993, 12: 488-505；Wu and Wu, Biotherapy 1991, 3: 87-95；Tolstoshev, Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993, 33: 573-96；Mulligan, Science 1993, 260: 926-32；Morgan & Anderson, Ann Rev Biochem 1993, 62: 191-217；Trends in Biotechnology 1993, 11(5): 155-215を参照されたい。本発明にも用いることのできる組換えＤＮＡ技術の分野において一般に公知の方法は、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 1993版；およびKrieger, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990版に記載されている。
【００８６】
投与方法は、経口投与、皮内投与、皮下投与、または静脈内注射等であってよく、全身投与または標的部位付近への局所投与が用いられる。投与は、単回投与によって行われても、または複数回投与によって強化されてもよい。適切な担体中のポリヌクレオチドまたは本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドで形質転換した細胞の用量を、治療する疾患、患者の年齢、体重、投与方法等に従って適切に調節することができ、これは通常０．００１ ｍｇ〜１０００ ｍｇ、例えば０．００１ ｍｇ〜１０００ ｍｇ、例えば０．１ ｍｇ〜１０ ｍｇであり、数日毎に１回から数ヶ月毎に１回投与することができる。当業者は、適当な用量を適切に選択することができる。
【００８７】
Ｘ．ペプチド、エキソソーム、ＡＰＣ、およびＣＴＬを用いる方法
ＡＰＣおよびＣＴＬを誘導するために、本発明のペプチドおよび該ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いることができる。ＣＴＬを誘導するために、本発明のエキソソームおよびＡＰＣも用いることができる。該ペプチド、ポリヌクレオチド、エキソソーム、およびＡＰＣを、他の任意の化合物がそれらのＣＴＬ誘導能を阻害しない限り、該化合物と組み合わせて用いることができる。したがって、前述の本発明の調合薬剤の任意のものをＣＴＬを誘導するために用いることができ、それに加えて、前記ペプチドおよびポリヌクレオチドを含むものも、以下に説明するように、ＡＰＣを誘導するために用いることができる。
【００８８】
（１）抗原提示細胞（ＡＰＣ）を誘導する方法
本発明は、本発明のペプチドまたは該ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いた、ＡＰＣを誘導する方法を提供する。ＡＰＣの誘導は、前記の「ＶＩ．抗原提示細胞」の章に記載されているように行なうことができる。本発明はまた、高レベルのＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導する方法を提供し、その誘導は、上記の「ＶＩ．抗原提示細胞」の項目でも言及されている。好ましくは、本発明は、高いＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導する方法を提供し、該方法は、本発明のペプチドをＡＰＣと接触させて、または該ペプチドをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣ内に導入して、ＨＬＡ抗原と共に本発明のペプチドを提示するＡＰＣを作製する工程を含む。
【００８９】
（２）ＣＴＬを誘導する方法
さらに本発明は、本発明のペプチド、該ペプチドをコードするポリヌクレオチド、または該ペプチドを提示するエキソソームもしくはＡＰＣを用いた、ＣＴＬを誘導する方法を提供する。好ましい態様において、該方法はＣＤ８＋Ｔ細胞を以下と接触させる工程を含む：
（ａ）ＨＬＡ抗原と共に本発明のペプチドを提示するＡＰＣ；または
（ｂ）本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子を抗原提示細胞内に導入することによって誘導されたＡＰＣ。
本発明のペプチドを対象に投与した場合、該対象の体内でＣＴＬが誘導され、腫瘍関連内皮を標的とする免疫応答の強度が増強される。あるいは、対象由来のＡＰＣ、およびＣＤ８陽性細胞、または末梢血単核白血球を、インビトロで本発明のペプチドと接触させ（で刺激し）、ＣＴＬを誘導後、活性化したＣＴＬ細胞を該対象に戻すエクスビボの治療法に、前記ペプチドおよび該ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いることができる。例えば、該方法は、以下の工程を含むことができる：
ａ：対象からＡＰＣを回収する工程；
ｂ：工程ａのＡＰＣを前記ペプチドと接触させる工程；
ｃ：工程ｂのＡＰＣをＣＤ８＋Ｔ細胞と混合し、ＣＴＬを誘導するために共培養する工程；および
ｄ：工程ｃの共培養物からＣＤ８＋Ｔ細胞を回収する工程。
【００９０】
あるいは、本発明に従って、ＣＴＬを誘導する薬学的組成物を製造するための本発明のペプチドの使用を提供する。さらに、本発明はまた、ＣＴＬを誘導するための本発明のペプチドを提供する。
【００９１】
工程ｄによって得られた細胞傷害活性を有するＣＤ８＋Ｔ細胞を、ワクチンとして前記対象に投与することができる。前記の工程ｃにおいてＣＤ８＋Ｔ細胞と混合するＡＰＣを、前記の「ＶＩ．抗原提示細胞」の章で詳述されているように、本発明のペプチドをコードする遺伝子をＡＰＣ内に導入することによって調製することもできるが、それに限定されず、かつ前記Ｔ細胞に対して、本発明のペプチドを効果的に提示する任意のＡＰＣまたはエキソソームを本発明の方法に用いることができる。
【００９２】
本明細書中に記載されているものと同様または同等の方法および材料を、本発明の実施または試験に使用することができるが、適切な方法および材料が記載されている。本明細書中で言及するすべての出版物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照により組み入れられる。矛盾する場合、定義を含む本明細書に従う。さらに、前記の材料、方法、および例は例示に過ぎず、限定することを意図するものではない。
【００９３】
以下の実施例は、本発明を説明するため、ならびに当業者が同じものを作製および使用するのを支援するために提供される。該実施例は、本発明の範囲をいかなる形であれ他の方法で限定することを意図するものではない。
【００９４】
実施例
材料および方法
細胞株
ＨＬＡ−Ａ２４陽性ヒトＢリンパ球をエプスタインバーウイルスで形質転換することによって、Ａ２４リンパ芽球状細胞株（Ａ２４ＬＣＬ）を樹立した。ヒトＢリンパ芽球状細胞株であるＴ２（ＨＬＡ−Ａ２）、ＣＯＳ７、およびマウス結腸直腸癌細胞株のＣＴ２６を、ＡＴＣＣから購入した。マウスリンパ腫細胞株であるＲＬｍａｌｅ１を、東北大学附属医用細胞資源センターから購入した。
【００９５】
ＴＥＭ８由来のペプチドの候補選択
ＨＬＡ−Ａ＊２４０２およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子に結合するＴＥＭ８由来の９アミノ酸長および１０アミノ酸長のペプチドを、Parker KC et al.(J Immunol 1994, 152(1): 163-75）およびKuzushima K et al.(Blood 2001, 98(6): 1872-81）によってアルゴリズムが記載されている結合予測ソフトウェア「ＢＩＭＡＳ」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｂｉｍａｓ．ｃｉｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ＿ｂｉｎｄ）を用いることによって予測した。これらのペプチドを、標準的な固相合成法に従ってＳｉｇｍａ（札幌、日本）で合成し、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製した。該ペプチドの純度（＞９０％）および同一性を、それぞれ分析用ＨＰＬＣおよび質量分析によって測定した。ペプチドをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に２０ ｍｇ／ｍｌで溶解し、摂氏−８０℃で保存した。
【００９６】
インビトロでのＣＴＬ誘導
単球由来の樹状細胞（ＤＣ）を抗原提示細胞（ＡＰＣ）として用いて、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）上に提示されたペプチドに対して応答する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を誘導した。他で記載されているように、ＤＣをインビトロで作製した（Nakahara S et al., Cancer Res 2003 Jul 15, 63(14): 4112-8）。具体的には、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐｌａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）溶液によって正常なボランティア（ＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性）から単離した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、プラスチック製の組織培養ディッシュ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に付着させることによって分離して、それらを単球画分として濃縮した。２％の加熱不活性化した自己血清（ＡＳ）を含有するＡＩＭ−Ｖ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、１０００ Ｕ／ｍｌの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）および１０００ Ｕ／ｍｌのインターロイキン（ＩＬ）−４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）の存在下で、単球を濃縮した集団を培養した。培養７日後、サイトカインで誘導したＤＣに、ＡＩＭ−Ｖ培地中で３時間、摂氏３７℃にて、３μｇ／ｍｌのβ２−マイクログロブリンの存在下で、２０μｇ／ｍｌの各合成ペプチドをパルスした。作製した細胞は、その細胞表面上に、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、およびＨＬＡクラスＩＩ等のＤＣ関連分子を発現していた（データは示さず）。次いで、ペプチドパルスしたこれらのＤＣを、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）で不活性化し（３０μｇ／ｍｌで３０分間）、ＣＤ８ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｄｙｎａｌ）を用いたポジティブ選択によって得た自己ＣＤ８＋Ｔ細胞と１：２０の比率で混合した。これらの培養物を４８ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中に準備し；各ウェルは、０．５ ｍｌのＡＩＭ−Ｖ／２％ ＡＳ培地中に、１．５×１０４個のＤＣ、３×１０５個のペプチドパルスしたＣＤ８＋Ｔ細胞、および１０ ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）を含んだ。３日後、これらの培養物にＩＬ−２（ＣＨＩＲＯＮ）を最終濃度２０ ＩＵ／ｍｌまで補充した。７日目および１４日目に、ペプチドパルスした自己ＤＣでＴ細胞をさらに刺激した。該ＤＣを前述と同じ方法によって毎回調製した。２１日目に、３回目のペプチド刺激後、ペプチドパルスしたＡ２４ＬＣＬ細胞に対してＣＴＬを試験した（Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9；Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7；Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86；Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9；Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506）。
【００９７】
ＣＴＬ増幅手順
Riddell et al.(Walter EA et al., N Engl J Med 1995 Oct 19, 333(16): 1038-44； Riddell SR et al., Nat Med 1996 Feb, 2(2): 216-23）によって記載されている方法と同様の方法を用いて、培養下でＣＴＬを増殖させた。４０ ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の存在下で、ＭＭＣによって不活性化した２種類のヒトＢリンパ芽球状細胞株と共に、合計５×１０４個のＣＴＬを２５ ｍｌのＡＩＭ−Ｖ／５％ ＡＳ培地中に懸濁した。培養を開始して１日後、１２０ ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を該培養物に添加した。５、８、および１１日目に、３０ ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を含有する新しいＡＩＭ−Ｖ／５％ ＡＳ培地を、該培養物に供給した（Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9；Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7；Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86；Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9；Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506）。
【００９８】
ＣＴＬクローンの樹立
９６ウェル丸底マイクロタイタープレート（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）中に、１ウェル当たり０．３、１、および３ ＣＴＬとなるように希釈を行なった。１ウェル当たり合計１５０μｌの、５％ ＡＳを含有するＡＩＭ−Ｖ培地中、１ウェル当たり１×１０４細胞の２種類のヒトＢリンパ芽球状細胞株、３０ ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体、および１２５ Ｕ／ｍｌのＩＬ−２と共に、ＣＴＬを培養した。１０日後、ＩＬ−２の最終濃度が１２５ Ｕ／ｍｌに達するように、該培地に１ウェル当たり５０μｌのＩＬ−２を添加した。１４日目にＣＴＬ活性を試験し、前述と同じ方法を用いてＣＴＬクローンを増殖させた（Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86；Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9；Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506）。
【００９９】
特異的ＣＴＬ活性
特異的ＣＴＬ活性を調べるために、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ酵素結合イムノスポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイおよびＩＦＮ−γ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を行なった。具体的には、ペプチドパルスしたＡ２４ＬＣＬ（１×１０４個／ウェル）を、刺激細胞として調製した。４８ウェル中の培養細胞または限界希釈後のＣＴＬクローンを、レスポンダー細胞（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ ｃｅｌｌ）として用いた。ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよびＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡアッセイを、製造元の手順に従って行なった。
【０１００】
ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるエピトープペプチドの免疫原性
ペプチド特異的なＣＴＬを刺激するために、マウス１匹につき、５０μｌのＨＬＡ−Ａ２４拘束性ペプチドと５０μｌのＩＦＡを含有する１００μｌのワクチン混合物を用いて免疫化を行った。０日目の最初の免疫化にはマウスの右側腹部に、７日目の２回目の免疫化には左側腹部に、該ワクチンを皮下注射した。１４日目に、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ用に、ワクチン接種したマウス由来の脾細胞をレスポンダー細胞として用い、ペプチド有りまたはペプチド無しでパルスしたＲＬｍａｌｅ１細胞を刺激細胞として用いた。
【０１０１】
インビボ抗腫瘍効果
ＩＦＡコンジュゲートペプチドを用いて、７日前および０日目にワクチン接種を行なった。０日目に、ＢＡＬＢ／ｃマウスの右側腹部内にＣＴ２６細胞（マウス１匹につき５×１０４細胞）を皮下注射した。２つの垂直径の積（ｍｍ２）として腫瘍増殖を測定した。
【０１０２】
結果
ＨＬＡ−Ａ２４に結合するＴＥＭ８由来ペプチドの予測
表１は、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１に結合するＴＥＭ８のペプチドを、結合親和性の高い順に示す。潜在的なＨＬＡ−Ａ２４結合能を有する合計２１個のペプチドを選択して、エピトープペプチドを決定するために試験し（表１ａ）、潜在的なＨＬＡ−Ａ２結合能を有する合計５３個のペプチドを同様に選択して、エピトープペプチドを決定するために試験した（表１ｂおよび表１ｃ）。予測したペプチドの大部分がＣＴＬ誘導を示さなかった。したがって本発明では、ＣＴＬ誘導を示したペプチドに的を絞った。
【０１０３】
（表１ａ）ＨＬＡ−Ａ２４に結合するＴＥＭ８由来ペプチド（９アミノ酸長および１０アミノ酸長のペプチド）
2010523471.tif 000002
【０１０４】
（表１ｂ）ＨＬＡ−Ａ０２に結合するＴＥＭ８由来の９アミノ酸長ペプチド
2010523471.tif 000003
【０１０５】
（表１ｃ）ＨＬＡ−Ａ０２に結合するＴＥＭ８由来の１０アミノ酸長ペプチド
2010523471.tif 000004
開始位置は、ＴＥＭ８のＮ末端からのアミノ酸残基の数を示す。
結合スコアは、「ＢＩＭＡＳ」から導き出している。
【０１０６】
ＨＬＡ−Ａ＊２４０２またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１で拘束された、ＴＥＭ８由来の予測されたペプチドを用いたＣＴＬの誘導、およびＴＥＭ８由来ペプチドで刺激したＣＴＬ株の樹立
ＴＥＭ８由来のペプチドに対するＣＴＬを、「材料と方法」に記載したプロトコールに従って作製した。ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって、ペプチド特異的なＣＴＬ活性を測定した（図１ａ〜ｉ）。これにより、ＴＥＭ８−Ａ２４−９−３９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、ＴＥＭ８−Ａ２４−９−２７７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、ＴＥＭ８−Ａ２４−１０−２７７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）、ＴＥＭ８−Ａ０２−９−３３７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）、ＴＥＭ８−Ａ０２−９−３３８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）、ＴＥＭ８−Ａ０２−９−２７８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）、ＴＥＭ８−Ａ０２−１０−３３８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０）、ＴＥＭ８−Ａ０２−１０−２６５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３）、およびＴＥＭ８−Ａ０２−１０−３３３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８）は、対照ウェルと比較して、強力なＩＦＮ−γ産生を示すことが明らかになった。さらに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で刺激した陽性のウェル番号＃５中の細胞、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で刺激した＃６中の細胞、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９で刺激した＃３中の細胞、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３で刺激した＃３中の細胞、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５で刺激した＃６中の細胞、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０で刺激した＃３中の細胞、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０で刺激した＃２中の細胞、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３で刺激した＃５中の細胞、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８で刺激した＃４中の細胞を増幅し、ＣＴＬ株を樹立した。それらのＣＴＬ株のＣＴＬ活性を、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡアッセイによって測定した（図２ａ〜ｉ）。これにより、すべてのＣＴＬ株は、ペプチドをパルスしなかった標的細胞と比較して、対応するペプチドをパルスした標的細胞に対して強力なＩＦＮ−γ産生を示すことが明らかとなった。一方、表１に示された他のペプチドはＨＬＡ−Ａ＊２４０２またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１との結合活性を有する可能性があるものの、それらを用いた刺激によって樹立されたＣＴＬ株はなかった。例えば、ＴＥＭ８−Ａ０２−９−２０７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６）で刺激したＣＴＬ応答の典型的なネガティブデータを、図１ｊと図２ｊに示す。結果的に、ＴＥＭ８由来の９個のペプチドが、強力なＣＴＬ株を誘導することができたことからスクリーニングされたことが示された。
【０１０７】
ＴＥＭ８特異的ペプチドに対するＣＴＬクローンの樹立
さらに、「材料と方法」の項目に記載されているように、限界希釈によって各ＣＴＬ株からＣＴＬクローンを樹立し、ペプチドをパルスした標的細胞に対するＣＴＬクローンからのＩＦＮ−γ産生を、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡアッセイによって測定した。図３において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３で刺激したＣＴＬクローンから、強力なＩＦＮ−γ産生が測定された。
【０１０８】
ＴＥＭ８およびＨＬＡ−Ａ＊２４０２またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１を内発的に発現している標的細胞に対する特異的ＣＴＬ活性
これらのペプチドに対して作製した前記の樹立したＣＴＬ株またはクローンについて、ＴＥＭ８およびＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子を内発的に発現している標的細胞を認識するそれらの能力を調べた。ＴＥＭ８遺伝子の全長およびＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子の遺伝子の両方をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞に対する特異的ＣＴＬ活性（ＴＥＭ８およびＨＬＡ−Ａ＊２４０２遺伝子を内発的に発現している標的細胞に対する特異的モデル）を、対応するペプチドによって作製したＣＴＬ株またはクローンをエフェクター細胞として用いて試験した。ＴＥＭ８遺伝子の全長またはＨＬＡ−Ａ＊２４０２のいずれかをトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞を対照として調製した。図４ａにおいて、ＣＴＬはＴＥＭ８およびＨＬＡ−Ａ２４の両方をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞に対して強力なＣＴＬ活性を示した。一方、前記対照に対して、有意な特異的ＣＴＬ活性は検出されなかった。さらに、ＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドに対して作製した樹立したＣＴＬ株またはクローンについても、ＴＥＭ８およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子を内発的に発現している標的細胞を認識するそれらの能力を調べた。ＴＥＭ８遺伝子の全長およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子の遺伝子の両方をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞に対する特異的ＣＴＬ活性を試験した。対応するＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドによって誘導されたＣＴＬ株またはクローンをエフェクター細胞として用いた。ＴＥＭ８遺伝子の全長またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１遺伝子のいずれかをトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞を対照として用いた。図４ｂにおいて、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３で刺激したＣＴＬは、ＴＥＭ８およびＨＬＡ−Ａ２の両方をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞に対して強力なＣＴＬ活性を示した。一方、前記対照に対して、有意な特異的ＣＴＬ活性は検出されなかった。したがって、これらのデータにより、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３は、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子を有する標的細胞上に天然に発現していること、かつ前記ＣＴＬによって認識されたことが明確に示された。さらにそれは、ＴＥＭ８由来のそれら２つのペプチドがＣＴＬを誘導し得るエピトープペプチドであること、かつそれがＴＥＭ８を発現している細胞を有する患者に対して該がんワクチンを適用するのに役立つ可能性があることを示した。
【０１０９】
ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるエピトープペプチドの免疫原性
ＢＡＬＢ／ｃマウスに対するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の免疫化を行ない、ＴＥＭ８エピトープペプチドの免疫原性を評価した。ＩＦＡとコンジュゲートした該ペプチドの２回目の注射後、ペプチド特異的ＣＴＬ活性をＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって測定した。ワクチン接種したマウスから回収した脾細胞をレスポンダー細胞として用いた場合、強力なＩＦＮ−γ産生が特異的に検出された。図５ａにおいて、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に特異的なＩＦＮ−γ産生は５匹中４匹のマウス（Ｍ１、Ｍ３、Ｍ４、およびＭ５）から検出されたが、対照マウス（Ｎ１およびＮ２）では検出されなかった。これらのデータにより、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４は、ペプチドパルスした標的細胞に対して特異的ＣＴＬをインビボで誘導することが示された。
【０１１０】
ＴＥＭ８エピトープペプチドによるワクチン接種の抗腫瘍効果
ペプチドを用いて抗腫瘍効果を調べるために、ＣＴ２６腫瘍細胞株を用いてインビボ抗腫瘍モデルを調べた。７日前および０日目にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の投与を行ない、０日目に、ＢＡＬＢ／ｃマウスにＣＴ２６結腸直腸癌細胞を皮下注射した。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４をワクチン接種したマウスでは、対照マウスと比較して、腫瘍増殖が明らかに抑制されていた（図５ｂ）。これにより、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４を用いたワクチン接種を受けたマウスにおける腫瘍増殖の抑制に関して、統計的に有意な差が示された（Ｐ＜０．０５）。
【０１１１】
抗原ペプチドのホモロジー解析
以下のペプチド：
ＴＥＭ８−Ａ２４−９−３９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、
ＴＥＭ８−Ａ２４−９−２７７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、
ＴＥＭ８−Ａ２４−１０−２７７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）、
ＴＥＭ８−Ａ０２−９−３３７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）、
ＴＥＭ８−Ａ０２−９−３３８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）、
ＴＥＭ８−Ａ０２−９−２７８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）、
ＴＥＭ８−Ａ０２−１０−３３８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０）、
ＴＥＭ８−Ａ０２−１０−２６５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３）、および
ＴＥＭ８−Ａ０２−１０−３３３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８）
で刺激したＣＴＬは、それぞれ、有意かつ特異的なＣＴＬ活性を示すことが立証された。この結果は、該ペプチドの配列が、ヒト免疫系を感作することが知られている他の分子に由来するペプチドと相同的であるという事実に起因する可能性がある。この可能性を排除するために、これらのペプチド配列に対して、有意な相同性を有する配列を示さないＢＬＡＳＴアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）をクエリーとして用いてホモロジー解析を行なった。このホモロジー解析の結果から、ＴＥＭ８−Ａ２４−９−３９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、ＴＥＭ８−Ａ２４−９−２７７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、ＴＥＭ８−Ａ２４−１０−２７７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）、ＴＥＭ８−Ａ０２−９−３３７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）、ＴＥＭ８−Ａ０２−９−３３８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）、ＴＥＭ８−Ａ０２−９−２７８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）、ＴＥＭ８−Ａ０２−１０−３３８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０）、ＴＥＭ８−Ａ０２−１０−２６５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３）、およびＴＥＭ８−Ａ０２−１０−３３３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８）の配列はそれぞれ固有のものであり、ゆえに、本発明者らの知る限りでは、これらの分子が、ある関連しない分子に対して予期しない免疫応答を引き起こす可能性はほとんどないことが示された。
【０１１２】
最終的に、ＴＥＭ８由来の新規なＨＬＡ−Ａ＊２４０２またはＡ＊０２０１エピトープペプチドを同定した。さらに、ＴＥＭ８のエピトープペプチドはがん免疫療法に適用可能であることが立証された。
【０１１３】
産業上の利用可能性
本発明は、血管新生に関連する広範囲な疾患で形成される内皮細胞を標的とするＣＴＬを誘導し、かつワクチンとして極めて有効な新規ペプチドを提供する。本発明はまた、これらのペプチドの任意のものを活性成分として含む、腫瘍等の血管新生に関連する疾患の治療および防止のための調合薬を提供する。本発明によれば、免疫を誘導するのに必要なペプチドの大きさは非常に小さい（例えば、９〜１０アミノ酸残基）。したがって、該ペプチドの合成および精製をきわめて簡単に行なうことができるという点で、本発明は特に有利である。
【０１１４】
本明細書中で引用したすべての出版物、特許、および特許出願は、参照により本明細書中に組み入れられる。
【図１】
2010523471.tif 000005
【図２】
2010523471.tif 000006
【図３】
2010523471.tif 000007
【図４】
2010523471.tif 000008
【図５】
2010523471.tif 000009
【配列表】
2010523471000001.app
【国際調査報告】
2010523471.tif 000010
2010523471.tif 000011