(57)【要約】  パパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）又はＰａｐＭＶのコートタンパク質由来のウイルス様粒子（ＶＬＰ）に、複数の親和性部分を介して複合体化される１以上の抗原を含む、親和性で複合体化された抗原系（ＡＣＡＳ）が提供される。親和性部分は、対象とする抗原（単数もしくは複数）に特異的に結合できる分子又は化合物であり、これは、例えば、化学的もしくは遺伝子工学的手段により、ＰａｐＭＶ又はＰａｐＭＶ  ＶＬＰのコートタンパク質に取り付けられ得る。ＡＣＡＳは、必要に応じて、１以上の追加抗原をさらに含み得、これは、ＡＣＡＳにより含まれる複合体化された抗原（単数もしくは複数）と同一又は異なっていてもよい。また、ＡＣＡＳを含むワクチンを含めた免疫原性組成物も提供される。免疫原性組成物は、動物における体液性及び／又は細胞性応答が必要とされる、種々の疾病及び疾患の、予防を含めた治療において有用である。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１以上の抗原及びパパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）又はＰａｐＭＶコートタンパク質由来のウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む親和性で複合体化された抗原系であって、該ＰａｐＭＶ又はＶＬＰがＰａｐＭＶもしくはＶＬＰのコートタンパク質に取り付けられた複数の親和性部分を含み、該親和性部分が前述の１以上の抗原に結合でき、該系が動物における免疫応答を誘導することができる、抗原系。
【請求項２】
前述の１以上の親和性部分がＰａｐＭＶ又はＶＬＰのコートタンパク質に化学的に取り付けられた、請求項１に記載の親和性で複合体化された抗原系。
【請求項３】
該系がＶＬＰを含み、かつ前述の１以上の親和性部分がＶＬＰのコートタンパク質に対して遺伝子工学的に融合された、請求項１に記載の親和性で複合体化された抗原系。
【請求項４】
前述の１以上の親和性部分がペプチドである、請求項１、２又は３のいずれか１項に記載の親和性で複合体化された抗原系。
【請求項５】
前述の１以上の抗原がそれぞれ、腫瘍関連抗原、自己抗原、アレルゲン、ウイルス抗原、細菌性抗原又は寄生虫抗原である、請求項１、２、３又は４のいずれか１項に記載の親和性で複合体化された抗原系。
【請求項６】
前述の１以上の抗原がそれぞれ、細菌、ウイルス、原生動物、菌類、寄生虫又は感染粒子由来である、請求項１、２、３又は４のいずれか１項に記載の親和性で複合体化された抗原系。
【請求項７】
前述の１以上の抗原がウイルス由来である、請求項１、２、３又は４のいずれか１項に記載の親和性で複合体化された抗原系。
【請求項８】
前述の１以上の抗原が細菌由来である、請求項１、２、３又は４のいずれか１項に記載の親和性で複合体化された抗原系。
【請求項９】
該免疫応答が体液性応答を含む、請求項１、２、３、４、５、６、７又は８のいずれか１項に記載の親和性で複合体化された抗原系。
【請求項１０】
該免疫応答が細胞性応答を含む、請求項１、２、３、４、５、６、７又は８のいずれか１項に記載の親和性で複合体化された抗原系。
【請求項１１】
該系が１以上の追加抗原をさらに含む、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０のいずれか１項に記載の親和性で複合体化された抗原系。
【請求項１２】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１のいずれか１項に記載の親和性で複合体化された抗原系、及び薬学的に許容される担体を含む、免疫原性組成物。
【請求項１３】
有効量の請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１のいずれか１項に記載の親和性で複合体化された抗原系を動物に投与することを含む、該動物における免疫応答を誘導する方法。
【請求項１４】
該免疫応答が抗体の産生を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
該免疫応答が細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答の誘導を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
該系が注射により投与される、請求項１３、１４又は１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
該系が鼻腔内に投与される、請求項１３、１４又は１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
該動物が哺乳動物である、請求項１３、１４、１５、１６又は１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
該動物がヒトである、請求項１３、１４、１５、１６又は１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
該動物が非ヒト動物である、請求項１３、１４、１５、１６又は１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
該方法が追加免疫投与量の前述の１以上の抗原を該動物に投与することをさらに含む、請求項１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
有効量の請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１のいずれか１項に記載の抗原提示系を動物に投与することを含む、該動物における疾病又は疾患を予防又は治療する方法。
【請求項２３】
体液性免疫応答の誘導が該疾病もしくは疾患の予防又は治療に効果的である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
該疾病又は疾患が細菌により引き起こされたものである、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
該疾病又は疾患がウイルスにより引き起こされたものである、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２６】
該系が注射により投与される、請求項２２、２３、２４又は２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
該系が鼻腔内に投与される、請求項２２、２３、２４又は２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
該動物が哺乳動物である、請求項２２、２３、２４、２５、２６又は２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
該動物がヒトである、請求項２２、２３、２４、２５、２６又は２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
該動物が非ヒト動物である、請求項２２、２３、２４、２５、２６又は２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
該方法が追加免疫投与量の前述の１以上の抗原を該動物に投与することをさらに含む、請求項２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
それを必要とする動物における免疫応答を誘導するための、有効量の請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１のいずれか１項に記載の親和性で複合体化された抗原系の使用。
【請求項３３】
該免疫応答が抗体の産生を含む、請求項３２に記載の使用。
【請求項３４】
該免疫応答が細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答の誘導を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
該系が注射による投与のために製剤化される、請求項３２、３３又は３４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３６】
該系が経鼻投与のために製剤化される、請求項３２、３３又は３４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３７】
該動物が哺乳動物である、請求項３２、３３、３４、３５又は３６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３８】
該動物がヒトである、請求項３２、３３、３４、３５又は３６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３９】
該動物が非ヒト動物である、請求項３２、３３、３４、３５又は３６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４０】
該使用が追加免疫投与量の前述の１以上の抗原をさらに含む、請求項３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８又は３９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４１】
それを必要とする動物における疾病もしくは疾患の予防又は治療のための、有効量の請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１のいずれか１項に記載の親和性で複合体化された抗原系の使用。
【請求項４２】
体液性免疫応答が該疾病もしくは疾患を予防又は治療するために有効である、請求項４１に記載の使用。
【請求項４３】
該疾病又は疾患が細菌により引き起こされたものである、請求項４１又は４２に記載の使用。
【請求項４４】
該疾病又は疾患がウイルスにより引き起こされたものである、請求項４１又は４２に記載の使用。
【請求項４５】
該系が注射による投与のために製剤化される、請求項４１、４２、４３又は４４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４６】
該系が経鼻投与のために製剤化される、請求項４１、４２、４３又は４４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４７】
該動物が哺乳動物である、請求項４１、４２、４３、４４、４５又は４６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４８】
該動物がヒトである、請求項４１、４２、４３、４４、４５又は４６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４９】
該動物が非ヒト動物である、請求項４１、４２、４３、４４、４５又は４６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５０】
該使用が追加免疫投与量の前述の１以上の抗原をさらに含む、請求項４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８又は４９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５１】
薬物の製造におけるパパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）又はＰａｐＭＶコートタンパク質由来のウイルス様粒子（ＶＬＰ）の使用であって、該ＰａｐＭＶ又はＶＬＰが該ＰａｐＭＶもしくはＶＬＰのコートタンパク質に取り付けられた複数の親和性部分を含む、使用。
【請求項５２】
前述の複数の親和性部分がＰａｐＭＶ又はＶＬＰのコートタンパク質に化学的に取り付けられた、請求項５１に記載の使用。
【請求項５３】
前述の複数の親和性部分がＶＬＰのコートタンパク質に対して遺伝子工学的に融合された、請求項５１に記載の使用。
【請求項５４】
該ＶＬＰが前述の複数の親和性部分に対して複合体化された１以上の抗体をさらに含む、請求項５１、５２又は５３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５５】
薬物の製造における、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１のいずれか１項に記載の親和性で複合体化された抗原系の使用。
【請求項５６】
１以上の抗原をパパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）又はＰａｐＭＶコートタンパク質由来のウイルス様粒子（ＶＬＰ）と混合することを含む、免疫原性組成物を調製する方法であって、該ＰａｐＭＶ又はＶＬＰが該ＰａｐＭＶ又はＶＬＰのコートタンパク質に取り付けられた複数の親和性部分を含み、該親和性部分が前述の１以上の抗原に結合できる、方法。
【請求項５７】
請求項５６に記載の方法により調製された、免疫原性組成物。
【請求項５８】
ＨＣＶコアタンパク質に結合できる親和性ペプチドに対して融合されたパパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）コートタンパク質を含む融合タンパク質。
【請求項５９】
該親和性ペプチドが配列番号８、１５、１６、１７、１８、１９又は２０のいずれか１つに示された配列の少なくとも４つの連続したアミノ酸を含む、請求項５８に記載の融合タンパク質。
【請求項６０】
請求項５８又は５９に記載の融合タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６１】
ウイルス様粒子を調製するための、請求項５８もしくは５９に記載の融合タンパク質又は請求項６０に記載のポリヌクレオチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫原性組成物の分野、特にパパイヤモザイクウイルスに基づく免疫原性組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫は、感染症の予防及び治療のための有効な方法を提供し、前世紀の公衆衛生における最も大きな利益のひとつをもたらした。早期の免疫戦略は、免疫原として生きた、弱毒化された又は不活化された病原体を用いた。しかしながら、社会的関心が、より明確で、より安全なワクチンのための探索を助長した。本探索は、個々の抗原が単離されるか又は組換え技術によって発現させられ、かつ免疫原として接種される、研究の新しい方向性を促進した。しかしながら、そのようなワクチンは、単離されたタンパク質が典型的には防御免疫応答を起こすために十分な免疫原性ではないために、抗原に対する十分な免疫応答を起こすためにアジュバントの添加をしばしば必要とする。完全フロイントアジュバント等のいくつかの強いアジュバントが知られているが、多くが望ましくない副作用を有した（Lerner, R. A．，ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:3403- 3407 (1981); Bhatnagar, P. K.,らProc. Natl. Acad. Sci. USA 79:4400-4404 (1982); Neurath, A. R.,ら、J. Gen. Virol. 65: 1009-1014 (1984)；及びMuller, G. M.,ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:569-573 (1982)）。
【０００３】
免疫原としての合成ペプチドの使用もまた、より安全かつより有効なワクチンを調製する目的で精力的に研究されてきた(Lerner, R. A., Green, N., Alexander, H., Liu, F. -T., Sutcliffe, J. G.,及びShinnick, T. M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:3403-3407 (1981); Bhatnagar, P. K., Papas, E., Blum, H. E., Milich, D. R., Nitecki, D. Karels, M. J.,及びVyas, G. N. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:4400-4404 (1982); Neurath, A. R., Kent, S. B. H.,及びStrick, N. J. Gen. Virol. 65:1009-1014 (1984))。しかしながら、合成ペプチドワクチンの開発もまた、望ましいアジュバント及び担体の探索が妨げになっている。
【０００４】
最近になって、免疫系による自己と異物との識別の原理に関する研究により、組織化の程度及びウイルスの表面における抗原の反復が、抗原が異物として認識されるための非常に強いシグナルであることが明らかになってきた(Bachmann & Zinkernagel, Immunol. Today 17:553 558 (1996))。ウイルス構造の本特性は、ウイルス構造の免疫原性及び複製不可能なワクチンという改良された安全特性を組み合わせた、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）に基づく有望な新規ワクチンの設計に用いられた。
【０００５】
動物ウイルスに基づく２つのＶＬＰワクチンである、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）及びヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）は、ヒトにおいて効果的に機能することが示されている(Faganら、1987, J. Med. Virol, 21:49-56; Harper ら、2004, Lancet, 364: 1757-1765) 。例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）主要カプシドタンパク質Ｌ１でできているＶＬＰは、女性における子宮頸癌の進行に対して、１００％の防御を提供することが示されている(Ault, K.A., 2006, Obstet. Gynecol. Surv. 61:S26-S31; Harperら、2004, Lancet 364: 1757-1765, 国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０ｌ／１８７０１（ＷＯ０２／０４００７）もまた参照)。バクテリオファージＱＢ(Maurer ら、2005, Eur. J. Immunol. 35:2031-2040)、ウイルスコアタンパク質でできたＢ型肝炎ウイルスＶＬＰ(Mihailova ら、 2006, Vaccine 24:4369-4377; Pumpens ら、2002, Intervirology 45:24-32)及びパルボウイルスＶＬＰ(Antonis ら、 2006, Vaccine 24:5481-5490; Ogasawara ら、 2006, In Vivo 20:319-324)等のプラットフォームもまた、エピトープを輸送する能力、並びに強い抗体応答を誘導する能力を示している。同様に、米国特許第６６２７２０２号は、エピトープ送達系としての使用のために、ＨＢＶカプシド結合性ペプチドにより架橋された抗原を含むＨＢＶコアタンパク質を記載しており、抗原としては、種々のウイルス及び細菌を標的にしているか又はそれらに由来する抗原が含まれる。
【０００６】
エピトープ提示系としての植物ウイルス由来のＶＬＰの使用が記載されている。植物ウイルスは、免疫原性が高く、かつ複雑な、反復性の結晶の構成を有する、タンパク質から主に構成される。さらに、植物ウイルスは、動物免疫系から系統発生学的に離れており、このことが植物ウイルスをワクチン開発へのふさわしい候補者としている。例えば、ササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）、セイバンモロコシモザイクウイルス（ＪＧＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、及びアルファルファモザイクウイルス（ＡＩＭＶ）は、対象とするエピトープの提示のために改変がなされた(Canizares, M. C. ら、2005, Immunol. Cell. Biol. 83:263-270; Brennan ら、2001, Molec. Biol. 17:15-26; Saini and Vrati, 2003, J. Virol. 77:3487- 3494)。国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ９７／０１０６５（ＷＯ９７／３９１３４）号は、コートタンパク質及び非ウイルスタンパク質を含むキメラのウイルス様粒子を記載し、これらは、例えば、ペプチドエピトープの提示のために用いられ得る。国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳＯｌ／０７３５５（ＷＯ０１／６６７７８）号は、植物ウイルスコートタンパク質、特に、Ｎ末端におけるリンカーを介して、病原微生物のエピトープを含み得る対象とするポリペプチドと融合されたタバコモザイクウイルスコートタンパク質を記載している。国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳＯｌ／２０２７２（ＷＯ０２／００１６９）号は、外来ペプチド、特にニューカッスル病ウイルス又はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のエピトープと融合された、ジャガイモＹウイルスコートタンパク質又は切断されたインゲン黄斑モザイクウイルスコートタンパク質のいずれかを含むワクチンを記載している。また、米国特許第６０４２８３２号は、免疫応答を引き起こすために、アルファルファモザイクウイルス又はイラルウイルスカプシドタンパク質と共に動物へ、病原体エピトープ等のポリペプチドの融合体を投与する方法を記載している。
【０００７】
最近になって、パパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）のコートタンパク質由来のＶＬＰ及び免疫賦活剤としてのこれらの使用が記載されている（国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ０３／００９８５（ＷＯ２００４／００４７６１）号）。Ｅ．コリ内でのＰａｐＭＶコートタンパク質の発現は、反復性及び結晶性の様式で組織化された数百のＣＰサブユニットからなるＶＬＰの自己集合をもたらす(Tremblayら、 2006, FEBS J 273: 14)。ＰａｐＭＶ  ＣＰ欠失コンストラクトの発現及び精製の研究は、ＣＰサブユニットの自己集合（又は多量体化）が、機能に重要であることをさらに示唆している(Lecoursら、2006, Protein Expression and Purification, 47:273-280)。ｇｐ１００又はインフルエンザウイルスＭ１タンパク質のいずれか由来のエピトープを含むＰａｐＭＶ  ＶＬＰについては、特定のヒトＴ細胞の増殖をもたらすエピトープのＭＨＣクラスＩ交差提示を誘導する能力が示されている(Leclerc, D.ら、J. Virol, 2007, 81(3): 1319-26; Epub. ahead of print November 22, 2006)。さらに、Ｃ型肝炎ウイルスＥ２エンベロープタンパク質由来のエピトープを含むＰａｐＭＶ  ＶＬＰは、ＰａｐＭＶ  ＶＬＰ及びＥ２ペプチドに対するマウスにおける体液性応答を誘導することが示された(Denisら, 2007, Virology, 363(1): 59-68)。
【０００８】
ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＥＢＶ又はインフルエンザウイルス由来の種々の抗原決定基を担持するジャガイモＸウイルス（ＰＶＸ）由来のＶＬＰが記載されている（欧州特許出願第１１６７５３０号）。ＨＩＶエピトープを担持するＰＶＸ  ＶＬＰの、体液性及び細胞性経路を介してのマウスにおける抗体産生を誘導する能力もまた、記載されている。本効果を高めるために、追加のアジュバントが、ＰＶＸ  ＶＬＰと併せて用いられた。
【０００９】
Ｂ型肝炎コアタンパク質又はパルボウイルスＶＬＰは、これらが遺伝情報を持ったない場合でさえもＣＴＬ応答を誘導すると報告されており(Ruedlら、 2002, Eur. J. Immunol. 32; 818-825; Martinezら、 2003, Virology, 305; 428-435)、これらが入り込んだ細胞内で活発に複製することができない。リンパ性脈絡髄膜炎（lymophocytic choriomeningitis）ウイルス（ＬＣＭＶ）又は鶏卵アルブミン由来のエピトープを担持する該ＶＬＰの、インビボでの樹状細胞による交差提示もまた記載されている(Ruedlら、2002, 前掲; Moron,ら、 2003, J. Immunol. 171 :2242-2250)。ＬＣＭＶ由来のエピトープを担持するＢ型肝炎コアタンパク質ＶＬＰのＣＴＬ応答を刺激する能力もまた記載されている。しかしながら、本ＶＬＰは、単独で投与された場合、ＣＴＬ応答を誘導することができず、また、ウイルスチャレンジからの有効な防御を仲介することができなかった。ＶＬＰが抗ＣＤ−４０抗体又はＣｐＧオリゴヌクレオチドと併せて用いられる場合のみ、有効なＣＴＬ応答が誘導された（Storniら、2002, J. Immunol. 168:2880-2886）。先の報告は、ＬＣＭＶ由来のペプチドを担持するブタパルボウイルス様粒子（ＰＰＭＶ）が、致死のＬＣＭＶチャレンジに対してマウスを防御できたことを示唆した(Sedlikら、2000, J. Virol. 74:5769-5775)。
【００１０】
親和性ペプチドと融合されたパパイヤモザイクウイルスＶＬＰは、真菌性疾患の検出においてモノクローナル抗体の代替品として提案されている(Morinら、 2007, J. Biotechnology, 128: 423-434 [epub ahead of print October 26, 2006])。高い結合活性でネコブカビ（Plasmodiophara brassicae）胞子に結合することができるＶＬＰが開発され、１つのコンストラクトの胞子への結合は、ポリクローナル抗体のそれに相当するレベルであることが実証された。
【００１１】
本背景情報は、出願人により本願発明に関連し得ると考えられている公知の情報を公表する目的で提供される。前述の情報のいずれかが本願発明に対する先行技術を構成することを認めることは必ずしも意図されておらず、また、そのように解釈されるべきではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的はパパイヤモザイクウイルスに基づく親和性で複合体化された抗原系免疫原性の親和性で複合体化された抗原系免疫原性の親和性で複合体化された抗原系及びその使用を提供することである。本発明の一態様にしたがって、１以上の抗原及びパパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）又はＰａｐＭＶコートタンパク質由来のウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む親和性で複合体化された抗原系が提供され、該ＰａｐＭＶ又はＶＬＰが、ＰａｐＭＶのコートタンパク質もしくはＶＬＰに取り付けられた複数の親和性部分を含み、該親和性部分が前述の１以上の抗原に結合することができ、該系が動物における免疫応答を誘導することができる、抗原系が提供される。
【００１３】
本発明の別の態様にしたがって、本発明の親和性で複合体化された抗原系及び薬学的に許容される担体を含む免疫原性組成物が提供される。
【００１４】
本発明の別の態様にしたがって、有効量の本発明の親和性で複合体化された抗原系を動物に投与することを含む、該動物における免疫応答を誘導する方法が提供される。
【００１５】
本発明の別の態様にしたがって、動物における疾病又は疾患を予防又は治療する方法であって、該方法が有効量の本発明の抗原提示系を該動物に投与することを含む、方法が提供される。
【００１６】
本発明の別の態様にしたがって、それを必要とする動物における免疫応答を誘導するための有効量の本発明の親和性で複合体化された抗原系の使用が提供される。
【００１７】
本発明の別の態様にしたがって、それを必要とする動物における疾病又は疾患を予防又は治療するための有効量の本発明の親和性で複合体化された抗原系の使用が提供される。
【００１８】
本発明の別の態様にしたがって、医薬の製造におけるパパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）又はＰａｐＭＶコートタンパク質由来のウイルス様粒子（ＶＬＰ）の使用であって、該ＰａｐＭＶ又はＶＬＰが該ＰａｐＭＶもしくはＶＬＰのコートタンパク質に取り付けられた複数の親和性部分を含む、使用が提供される。
【００１９】
本発明の別の態様にしたがって、医薬の製造における本発明の親和性で複合体化された抗原系の使用が提供される。
【００２０】
本発明の別の態様にしたがって、１以上の抗原を、パパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）又はＰａｐＭＶコートタンパク質由来のウイルス様粒子（ＶＬＰ）と混合することを含む、免疫原性組成物を調製する方法がであって、該ＰａｐＭＶ又はＶＬＰが該ＰａｐＭＶもしくはＶＬＰのコートタンパク質に取り付けられた複数の親和性部分を含み、該親和性部分が前述の１以上の抗原に結合できる、方法が提供される。
【００２１】
本発明の別の態様にしたがって、１以上の抗原をパパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）又はＰａｐＭＶコートタンパク質由来のウイルス様粒子（ＶＬＰ）と混合することを含む方法により調製される免疫原性組成物であって、該ＰａｐＭＶ又はＶＬＰが該ＰａｐＭＶもしくはＶＬＰのコートタンパク質に取り付けられた複数の親和性部分を含み、該親和性部分が前述の１以上の抗原に結合できる、組成物が提供される。
【００２２】
本発明の別の態様にしたがって、ＨＣＶコアタンパク質に結合できる親和性ペプチドと融合されたパパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）コートタンパク質を含む、融合タンパク質が提供される。
【００２３】
本発明の別の態様にしたがって、ＨＣＶコアタンパク質に結合できる親和性ペプチドに融合されたパパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）コートタンパク質を含む融合タンパク質をコードする、単離されたポリヌクレオチドが提供される。
【００２４】
本発明の別の態様にしたがって、ＨＣＶコアタンパク質に結合できる親和性ペプチドに融合されたパパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）コートタンパク質を含む融合タンパク質、又はＨＣＶコアタンパク質に結合できる親和性ペプチドに融合されたパパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）コートタンパク質を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの、ウイルス様粒子を調製するための使用が提供される。
【００２５】
図面の簡単な説明
本発明のこれら及び他の特徴は、添付の図面を参照する以下の詳細な説明においてより明確にされるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、（Ａ）パパイヤモザイクウイルス外殻（又はカプシド）タンパク質のアミノ酸配列（GenBank Accession No. NP_044334.1;配列番号：１）、（Ｂ）パパイヤモザイクコートタンパク質をコードするヌクレオチド配列（GenBank Accession No. NC_001748 (ヌクレオチド5889-6536);配列番号：２）及び（Ｃ）変異体ＰａｐＭＶコートタンパク質ＣＰΔＮ５のアミノ酸配列（配列番号：３）を示す。
【図２】図２は、抗原単独、抗原に加えてＰａｐＭＶ、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）又はＥ．コリＯ１１１：Ｂ４由来のＬＰＳで免疫０日目に免疫したＢＡＬＢ／ｃマウス（３匹／群）における、モデル抗原（Ａ）鶏卵リゾチーム（ＨＥＬ）及び（Ｂ）オボアルブミン（ＯＶＡ）に対する抗体応答を強化するＰａｐＭＶの能力を示す。２つの実験に由来する代表的結果を示す。免疫した動物から採取した血清の抗体は、モデル抗原（ＨＥＬ又はＯＶＡ）での、（Ｃ）ＩｇＧ１、（Ｄ）ＩｇＧ２ａ及び（Ｅ）ＩｇＧ２ｂについてＥＬＩＳＡによりイソタイプを判別した。
【図３】図３は、（Ａ）親和性ペプチドのＰａｐＭＶコートタンパク質のＣ−末端におけるＯｍｐＣ又はＯｍｐＦ（それぞれコンストラクトＰａｐＭＶ  ＯｍｐＣ及びＰａｐＭＶ  ＯｍｐＦ）との融合を含む組換えコンストラクトの略図；（Ｂ）精製タンパク質ＰａｐＭＶ、ＰａｐＭＶ  ＯｍｐＣ、ＰａｐＭＶ  ＯｍｐＦ、ＯｍｐＣ及びＯｍｐＦのプロファイルを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ、［第１レーン：分子量マーカー、第２レーン；ＰａｐＭＶ  ＶＬＰ、第３レーン；ＰａｐＭＶ  ＯｍｐＣ  ＶＬＰ、第４レーン；ＰａｐＭＶ  ＯｍｐＦ  ＶＬＰ、第５レーン；精製ＯｍｐＣ、第６レーン；精製ＯｍｐＦ］、並びに（Ｃ）組換えＰａｐＭＶ  ＯｍｐＣ及びＰａｐＭＶ  ＯｍｐＦ  ＶＬＰの高速ペレットの電子顕微鏡写真を示す。
【図４】図４は、それらのそれぞれの抗原に対するＰａｐＭＶ  ＶＬＰの高い親和力の結合を示す。（Ａ）は、ＯｍｐＣ抗原に対する高結合活性ＰａｐＭＶ  ＯｍｐＣ  ＶＬＰ結合を示すＥＬＩＳＡを示す。（Ｂ）は、ＯｍｐＦ抗原に対する高結合活性ＰａｐＭＶ  ＯｍｐＦ  ＶＬＰ結合を示すＥＬＩＳＡを示す。
【図５】図５は、マウスおけるＳ．チフィ（S.typhi）でのチャレンジに対する保護アッセイの結果を示す。（Ａ）は、ＯｍｐＣ単独で免疫したマウス及びＯｍｐＣ＋ＰａｐＭＶ  ＯｍｐＣ  ＶＬＰを含む製剤で免疫したマウスにおける、１００ＬＤ５０のＳ．チフィに対する防御能を表し；（Ｂ）は、ＯｍｐＦ単独で免疫したマウス及びＯｍｐＦ＋ＰａｐＭＶ  ＯｍｐＦ  ＶＬＰを含む製剤で免疫したマウスにおける、１００ＬＤ５０のＳ．チフィに対する防御能を表し；（Ｃ）は、ＯｍｐＣ単独で免疫したマウス及びＯｍｐＣ＋ＰａｐＭＶ  ＯｍｐＣ  ＶＬＰを含む製剤で免疫したマウスにおける、５００ＬＤ５０のＳ．チフィに対する防御能を表し、並びに（Ｄ）は、ＯｍｐＦ単独で免疫したマウス及びＯｍｐＦ＋ＰａｐＭＶ  ＯｍｐＦ  ＶＬＰを含む製剤で免疫したマウスにおける、５００ＬＤ５０のＳ．チフィに対する防御能を表す。
【図６】図６は、ＯｍｐＣに対する抗体応答の評価を示しており；イソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ及びＩｇＧ３のＯｍｐＣに対するＩｇＧ応答をＯｍｐＣ又はＯｍｐＣ＋ＰａｐＭＶ  ＯｍｐＣ  ＶＬＰを含むワクチンで免疫したマウスの間で測定した。
【図７】図７は、ＯｍｐＣ及びＰａｐＭＶ  ＯｍｐＣのマウスに対する同時免疫に続くＳ．チフィのチャレンジが、ＯｍｐＣ又はＰａｐＭＶ  ＯｍｐＣ単独による免疫と比較した場合、Ｓ．チフィ感染（生存％によって示している）に対するマウスの長期に渡る活発な防御を助けることを示している。
【図８】図８は、ＰａｐＭＶウイルスがＯｍｐＣポーリンの防御能を上昇させたことを示している；１００（黒記号）又は５００致死量５０（ＬＤ５０）（白記号）のＳ．チフィで行ったチャレンジの結果を、チャレンジ後１０日間記録した生存率と共に示す。
【図９】図９は、Salmonella enterica 亜種enterica serovar Typhi Ty2（GenBank Accession No. P0A264）由来のＯｍｐＣ前駆体タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：４）を示す；
【図１０】図１０は、Salmonella enterica亜種 enterica serovar Typhi CTl 8（GenBank Accession No. CAD05399）由来のＯｍｐＦ前駆体タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：５）を示す。
【図１１】図１１は、（Ａ）ＯｍｐＣに結合するための親和性ペプチドを含むＰａｐＭＶコートタンパク質［配列番号：６］、及び（Ｂ）ＯｍｐＦに結合するための親和性ペプチドを含むＰａｐＭＶコートタンパク質［配列番号：７］のアミノ酸配列を示す。クローン化された配列と野生型配列との間の差異は、太字及び下線で特筆する；親和性ペプチド配列を下線で、並びにヒスチジンタグを斜字体で示す。
【図１２】図１２は、（Ａ）Ｅ．コリから精製したＰａｐＭＶ  ＶＬＰの電子顕微鏡写真；（Ｂ）親和性ペプチドＳＴＡＳＹＴＲ［配列番号：８］（ＰａｐＭＶＣＰ−ＳＴＡＳＹＴＲ）を含むＰａｐＭＶ  ＶＬＰの電子顕微鏡写真；（Ｃ）ＰａｐＭＶＣＰ−ＳＴＡＳＹＴＲのＨＣＶコアタンパク質（１−１７０）ＮＬＰ（１μｇ／ｍｌ）への結合を示すＥＬＩＳＡを示す。灰色のバーはＰａｐＭＶＣＰ−ＳＴＡＳＹＴＲで得られたシグナルを表し；点のバーはＰａｐＭＶ  ＶＬＰ単独で得られたバックグラウンドシグナルを表し；並びに（Ｄ）１μｇ／ｍｌの遊離ＨＣＶコアタンパク質（１−１７０）をＥＬＩＳＡプレートにロードするために使用した以外はＣと同様である。全てのＥＬＩＳＡは、ＰａｐＭＶコートタンパク質に対するポリクローナルウサギ抗体及びアルカリホスファターゼに結合したヤギ抗ウサギ抗体により明らかにされた。
【図１３】図１３は、ＨＣＶコアタンパク質及びＰａｐＭＶ  ＶＬＰに対するマウスにおける免疫応答を示している：（Ａ）はＨＣＶコアタンパク質（１−８２）ＮＬＰ（「コア」）、親和性ペプチドＳＴＡＳＹＴＲ［配列番号：８］を含むＰａｐＭＶ  ＶＬＰ（「ＰａｐＳＴＡ」）、及びＨＣＶコアタンパク質（１−８２）ＮＬＰと併用したＰａｐＳＴＡ（「ＰａｐＳＴＡ＋コア」）に対する抗体価（全ＩｇＧ）を表す。並びに（Ｂ）ＰａｐＳＴＡ、ＨＣＶコアタンパク質（１−８２）ＮＬＰ、又はＨＣＶコアタンパク質（１−８２）ＮＬＰと併用したＰａｐＳＴＡで免疫した後、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１−３８２を発現する組換えワクチンウイルスでチャレンジしたマウスの両方の卵巣から回収された組換えワクチンウイルスの抗体価を表す。
【図１４】図１４は、（Ａ）ＨＣＶコアタンパク質断片（ＰａｐＭＶＣＰ−ＳＴＡＳＹＴＲ；配列番号：４８）に結合するための親和性ペプチドを含むＰａｐＭＶコートタンパク質のヌクレオチド配列、及び（Ｂ）ＰａｐＭＶＣＰ−ＳＴＡＳＹＴＲコンストラクト（配列番号：４２）のアミノ酸配列を表す。開始コドンを太字斜字体で、終止コドンを太字及び下線で、並びにヒスチジンタグを斜字体で示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
パパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）又はＰａｐＭＶのコートタンパク質由来のウイルス様粒子（ＶＬＰ）に対して複数の親和性部分を介して複合体化された１以上の抗原を含む、親和性で複合体化された抗原系（ＡＣＡＳ）が提供される。「由来」は、野生型コートタンパク質の配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するコートタンパク質を含むＶＬＰを意味する。親和性部分は、対象とする抗原に特異的に結合できる分子又は化合物であり、これらは、例えば化学的もしくは遺伝子工学的手段によりＰａｐＭＶもしくはＰａｐＭＶ  ＶＬＰのコートタンパク質に取り付けられて、親和性ＰａｐＭＶ（「ａＰａｐＭＶ」）もしくは親和性ＶＬＰ（「ａＶＬＰ」）を形成することができる。１つの実施形態では、本発明にしたがうａＰａｐＭＶ及びａＶＬＰは、高分子等の大きな抗原に複合体化するために特に有用である。
【００２８】
抗原は、本発明のＡＣＡＳにおいてａＰａｐＭＶ又はａＶＬＰに「複合体化され」ているとして、本明細書内に記載されているが、ＡＣＡＳにおける抗原（単数もしくは複数）及びａＰａｐＭＶ／ａＶＬＰは、局所的な環境に応じて時々又は常に、非複合体化の状態で提示されてもよいと考えられる。同様に、ＡＣＡＳに存在する全ての抗原が、同種のａＰａｐＭＶ／ａＶＬＰに複合体化され得るわけではないと考えられる。例えば、当業者によって理解されるように、非常に高いあるいは低いｐＨもしくは塩濃度、又は高希釈のＡＣＡＳといった条件は、抗原（単数もしくは複数）の同種のａＰａｐＭＶ／ａＶＬＰへの結合に影響を及ぼし得るであろう。
【００２９】
本発明のＡＣＡＳは、必要に応じて、１以上のさらなる孤立した抗原（すなわちＡＩＡ）をさらに含み得る。本発明の文脈では、ＡＩＡは、ａＰａｐＭＶ／ａＶＬＰにより含まれる親和性部分が結合できる抗原（単数又は複数）以外の抗原である。
【００３０】
本発明の一態様にしたがって、ＡＣＡＳは免疫原性であり、かつ動物に投与された場合に免疫応答を誘導することができる。免疫応答は、体液性応答、細胞性応答または両方であってもよい。したがって、本発明は、ＡＣＡＳを構成する免疫原性組成物（ワクチンを含む）を提供する。免疫原性組成物は、動物における体液性及び／又は細胞性応答を必要とする種々の疾病及び疾患の、治療（予防を含む）において有用である。本発明の１つの実施形態において、ＡＣＡＳは、動物の体液性免疫応答の関与を必要とする疾病又は疾患の予防を含む治療において特に有用である。
【００３１】
定義
別に定義しない限り、本明細書内で用いられる全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同様の意味を有する。
【００３２】
本明細書内で用いられる用語「約（about）」は、所与の値からおよそ＋／−１０％の変動を言う。はっきりと言及していようがなかろうが、そのような変動は常に本明細書内で与えられた任意の所与の値にも含まれると理解すべきである。
【００３３】
本明細書内で用いられる用語「アジュバント（adjuvant）」は、動物における免疫応答を増強、刺激、作動、促進及び／又は調節する、剤を言う。
【００３４】
本明細書内で用いられる用語「免疫原性（immunogenic）」は、物質の、動物における検出可能な免疫応答を誘導する能力を言う。
【００３５】
本明細書内で同じ意味で用いられる用語「免疫刺激（immune stimulation）」及び「免疫賦活（immunostimulation）」は、動物病原体もしくは疾病とは無関係であるＰａｐＭＶもしくはＰａｐＭＶ  ＶＬＰ等の分子が、免疫系を刺激すること及び／又は感染もしくは疾病に対して応答する免疫系の能力を改善することにより、病原体による感染又は疾病に対する防御を提供する能力を言う。免疫賦活は、予防的効果、治療的効果、又はそれらの組み合わせを有してもよい。
【００３６】
本明細書内で用いられる用語「免疫応答（immune response）」は、物質（例えば、化合物、分子、材料等）の投与に対する応答における動物の免疫系の反応性の変化を言い、並びにこれは、抗体産生、細胞性免疫の誘導、補体活性化、免疫寛容の発達もしくはそれらの組み合わせを伴い得る。
【００３７】
本明細書内で用いられる用語「免疫（vaccination）」は、免疫防御応答を起こす目的のために対象へのワクチンの投与を言う。免疫は、予防効果、治療効果、又はそれらの組み合わせを有していてもよい。免疫は、治療される対象対象に応じて種々の方法を用いて行うことができ、これらに限定されないが、腹腔内投与（i.p.）、静脈内投与（i.v.）又は筋肉内投与（i.m.）等の非経口投与；経口投与；経鼻投与；皮内投与；経皮投与及び液浸等が挙げられる。
【００３８】
本明細書内で用いられる用語「ワクチン（vaccine）」は、免疫防御応答を引き起こすことができる組成物を言う。
【００３９】
本明細書内で用いられる用語「疾病又は疾患惹起薬剤」は、宿主における疾病又は疾患を惹起し得る剤を言う。限定されない例としては、癌、感染症、アレルギー反応、自己免疫疾患を引き起こす剤、又は薬物、ホルモン、又は毒素に対する免疫応答を誘導し得る剤が挙げられる。感染症としては、例えば細菌、ウイルス、原生生物、菌類及び寄生虫といった種等の病原体によって引き起こされるものが挙げられる。
【００４０】
本明細書内で用いられる用語「病原体（pathogen）」は、宿主における疾病又は疾患を引き起こし得る生物を言い、これらに限定されないが、細菌、ウイルス、原生生物、菌類及び寄生虫が挙げられる。
【００４１】
本明細書内で用いられる用語「天然に存在する（Naturally-occurring）」は、物に対して適用する場合、その物が自然界において発見され得ることを言う。例えば、生物（ウイルスを含む）、又は自然界のソースから単離され得る生物中に存在するポリペプチドもしくはポリヌクレオチド配列であって、かつ人によって研究室内で意図的に改変されていないものは天然に存在するものである。
【００４２】
本明細書内で用いられる用語「ポリペプチド（polypeptide）」又は「ペプチド（peptide）」は、ペプチド結合によってつながった少なくとも４つのアミノ酸がある分子を意味することを意図している。
【００４３】
本明細書内で用いられる表現「ウイルス核酸（viral nucleic acid）」は、ウイルスのゲノム（もしくはその大部分）、又は該ゲノムに対する塩基配列において相補的な核酸分子であり得る。ウイルスＲＮＡに対して相補的なＤＮＡ分子もまた、ウイルスＤＮＡに対する塩基配列において相補的であるＲＮＡ分子と同様、ウイルス核酸と見なされる。
【００４４】
本明細書内で用いられる用語「ウイルス様粒子」（ＶＬＰ）は、ウイルス粒子と似た外観を有する自己集合性粒子を言う。ＶＬＰは、ウイルス核酸を含んでも、含んでいなくてもよい。ＶＬＰは、通常、複製することができない。
【００４５】
本明細書内で用いられる用語「偽ウイルス（pseudovirus）」は、プラスミド形態の核酸を含むＤＮＡ又はＲＮＡ等の核酸配列を含むＶＬＰを言う。偽ウイルスは、通常、複製することができない。
【００４６】
本明細書内で用いられる用語「免疫原（immunogen）」及び「抗原（antigen）」は、単独又はアジュバントとの併用により対象における免疫応答を誘導することができる、分子（単数、複数）、分子の一部（単数もしくは複数）、又は分子の組み合わせ、並びにそれらを含めて全細胞及び組織までを言う。免疫原／抗原は、単一のエピトープを含んでもよく、又は複数のエピトープを含んでもよい。したがって、該用語は、ウイルス、ペプチド、炭水化物、タンパク質、核酸並びに、細菌及び寄生虫を含めた種々の微生物の全体又は一部を包含する。ハプテンもまた、本明細書内で用いられる用語「免疫原」及び「抗原」により包含されると考えられる。
【００４７】
本明細書内で用いられる用語「刺激（prime）」及びその文法的変化は、抗原による追加免疫を投与する前に、動物における抗原に対する免疫応答を刺激及び／又は作動することを意味する。
【００４８】
本明細書内で用いられる用語「治療する（treat）」、「治療される（treated）」又は「治療すること（treating）」は、疾病又は病原体に関して用いる場合、疾病もしくは病原体による感染に対する対象の耐性を増加させる（即ち、対象が病気にかかるもしくは病原体により感染する可能性を低下させる）治療、並びに対象が病気にかかったもしくは疾病もしくは感染と戦う（例えば、疾病もしくは感染を低減、除去、寛解もしくは安定させる）ための感染後の治療を言う。
【００４９】
本明細書内で用いられる用語「対象（subject）」又は「患者（patient）」は、治療を必要とする動物を言う。
【００５０】
本明細書内で用いられる用語「動物（animal）」は、ヒト及び非ヒト動物の両方を言い、これらに限定されないが、哺乳動物、鳥類、及び魚類が挙げられ、並びに、例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ又は他の有蹄動物、イヌ、ネコ、ニワトリ、アヒル、ヒトでない霊長類、モルモット、ウサギ、フェレット、ラット、ハムスター及びマウス等の家畜（domestic）、家畜（farm）、動物園の動物、実験動物及び野生動物を包含する。
【００５１】
核酸又はアミノ酸配列に関して本明細書内で用いられる用語「実質的に同一」は、、例えば以下に記載する方法を用いて必要に応じてアラインした場合、、核酸又はアミノ酸配列が、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を、規定された第２の核酸又はアミノ酸配列（すなわち「参照配列」）と共有することを示す。「実質的な同一性」は、完全長配列、機能的ドメイン、コーディング配列及び／又は調節配列、プロモーター、及びゲノム配列等、種々の型及び長さの配列を参照するために用いられ得る。２つのアミノ酸又は核酸配列の間の同一性のパーセントは、当業者の技術の範囲内の種々の方法で決定され得、例えば、Smith Waterman Alignment (Smith, T. F. and M. S. Waterman (1981) JMol Biol 147: 195- 7); GeneMatcher PlusTM内に組み込まれた"BestFit" (Smith 及びWaterman, Advances in Applied Mathematics, 482-489 (1981))、Schwarz及びDayhof (1979) Atlas of Protein Sequence and Structure, Dayhof, M. O.,編 pp 353-358; BLAST program (Basic Local Alignment Search Tool (Altschul, S. F., W. Gish,ら(1990) J Mol Biol 215: 403-10等、公的に入手可能なコンピュータソフトウェア、並びにBLAST-2、BLAST-P、BLAST-N、BLAST-X、WU-BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2、CLUSTAL、及びMegalign (DNASTAR)ソフトウェアを含むそれらの変形を用いて決定され得るさらに、当業者は、比較している配列に渡って最大のアライメントを達成するために必要なアルゴリズムを含む、アライメントを評価するのための適切なパラメータを決定し得る。一般に、アミノ酸配列に対して、比較配列の長さは少なくとも１０アミノ酸であるだろう。当業者は、実際の長さが、比較される配列の全体の長さに依存するであろうこと、並びにそれらが少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、もしくは少なくとも２００のアミノ酸であってもよく、又はアミノ酸配列の全長であってもよいと理解するだろう。核酸に関して、比較配列の長さは、通常、少なくとも２５ヌクレオチドであるだろうが、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも５００、少なくとも５５０、もしくは少なくとも６００ヌクレオチドであってもよく、又は核酸配列の全長であってもよい。
【００５２】
用語「一致している（corresponding to）」又は「一致する（corresponds to）」は、核酸配列が参照核酸配列の全て又は一部と同一であることを示す。対照的に、用語「相補的（complementary to）」は、核酸配列が参照核酸配列の相補鎖の全て又は一部と同一であることを示すために本明細書内で用いられる。説明のために、核酸配列“ＴＡＴＡＣ”は、参照配列“ＴＡＴＡＣ”と一致し、参照配列“ＧＴＡＴＡ”に相補的である。
【００５３】
親和性で複合体化された抗原系（ＡＣＡＳ）
本発明の親和性で複合体化された抗原系（ＡＣＡＳ）は、対象とする抗原に結合できる複数の親和性部分を含むように改変されたＰａｐＭＶ又はＶＬＰ（それぞれ親和性ＰａｐＭＶ（ａＰａｐＭＶ）又は親和性ＶＬＰ（ａＶＬＰ）を言う）を含み、それと共に、親和性部分を介してａＰａｐＭＶ又はａＶＬＰに複合体化された１以上の対象とする抗原を含む。ＡＣＡＳは必要に応じて、上述の通り、１以上の追加の孤立した抗原（すなわちＡＩＡ）を含んでもよい。
【００５４】
親和性パパイヤモザイクウイルス（ａＰａｐＭＶ）及び親和性ＰａｐＭＶ  ＶＬＰ（ａＶＬＰ）
本発明のＡＣＡＳに含めるために好適なａＰａｐＭＶは、そのコートタンパク質が、複数の親和性部分を含むように例えば化学的に改変されたＰａｐＭＶである。ａＰａｐＭＶを調製するために用いられるＰａｐＭＶは、野生型ＰａｐＭＶ又はそれらの天然に存在する変異体であり得る。
【００５５】
ＡＣＡＳに含めるために好適なＰａｐＭＶ  ａＶＬＰは、多量体化及び自己集合してＶＬＰを形成し得る組換えＰａｐＭＶコートタンパク質から形成される。集合した場合、各ＶＬＰはコートタンパク質サブユニットの長いらせん配列を含む。野生型ウイルスは１２００を超えるコートタンパク質サブユニットを含み、約５００ｎｍの長さである。しかしながら、野生型ウイルスよりもより短いか又はより長いかのいずれかであるＰａｐＭＶ  ＶＬＰはなお効果的であり得る。本発明の１つの実施形態において、ＶＬＰは少なくとも４０のコートタンパク質サブユニットを含む。別の実施形態において、ＶＬＰは約４０から約１６００の間のコートタンパク質サブユニットを含む。代替的な実施形態において、ＶＬＰは少なくとも４０ｎｍの長さである。別の実施形態において、ＶＬＰは約４０ｎｍから約６００ｎｍの間の長さである。
【００５６】
集合した場合の最終的なａＶＬＰが同一のコートタンパク質サブユニットを含むように、ａＶＬＰは、同一のアミノ酸配列を有する複数の組換えコートタンパク質から調製され得、又は、集合した場合の最終的なａＶＬＰがコートタンパク質サブユニットにおけるばらつきを含むように、ａＶＬＰは、異なるアミノ酸配列を有する複数の組換えコートタンパク質から調製され得る。
【００５７】
ａＶＬＰを形成するために用いられるコートタンパク質は、全体のＰａｐＭＶコートタンパク質もしくはそれらの部分であり得、又はそれはＰａｐＭＶコートタンパク質の遺伝子工学的に改変された形（例えば、１以上のアミノ酸欠失、挿入、置換等を含む形）であり得る（但しコートタンパク質がＶＬＰ内に多量体化及び集合する能力を保つという条件で）。野生型ＰａｐＭＶ外殻（又はカプシド）タンパク質のアミノ酸配列は、当該技術分野で公知であり（Sit ら 1989, J. Gen. Virol, 70:2325-2331、及び GenBank Accession No. NP_044334.1参照）、配列番号：１として本明細書では与えられている（図１Ａ参照）。ＰａｐＭＶコートタンパク質のヌクレオチド配列もまた当該技術分野で公知であり（Sit,ら、 前掲.,及び GenBank Accession No. NC_001748 (ヌクレオチド5889-6536参照)）、配列番号：２として本明細書では与えられている（図１Ｂ参照）。
【００５８】
上述の通り、ＶＬＰにより含まれる組換えＰａｐＭＶコートタンパク質のアミノ酸配列は、親の配列に対して正確に一致している必要はなく、即ちそれは改変されたか又は「変異体配列」であってもよい。例えば組換えタンパク質は、その部位における残基が親の（参照）配列と一致しないように、１以上のアミノ酸残基の置換、挿入又は欠失により変異されてもよい。しかしながら、当業者は、そのような変異は、大規模なものではなく、組換えコートタンパク質がＶＬＰ内に多量体化及び集合する能力に劇的に影響を与えることがないであろうと理解するだろう。ＰａｐＭＶコートタンパク質の変異型が多量体内に集合してＶＬＰを形成する能力は、本明細書で与える実施例に示した例示的な方法のような、例えば標準的な方法の後の電子顕微鏡検査により評価され得る。
【００５９】
したがって、ＶＬＰ内に多量体化及び集合する能力を保った野生型タンパク質の断片（即ち、「機能性」断片）である組換えコートタンパク質もまた、本発明により意図される。例えば、断片は、タンパク質のＮ末端、Ｃ末端、もしくは内部、またはそれらの組み合わせからの、１以上のアミノ酸の欠質を含んでもよい。一般に、機能性断片は、少なくとも１００アミノ酸の長さである。本発明の１つの実施形態において、機能性断片は、少なくとも１５０アミノ酸、少なくとも１６０アミノ酸、少なくとも１７０アミノ酸、少なくとも１８０アミノ酸、及び少なくとも１９０アミノ酸の長さである。タンパク質のＮ末端において起こった欠失は、該タンパク質が多量体化する能力を保つために一般に２５未満のアミノ酸の削除であるべきである。
【００６０】
本発明にしたがって、組換えコートタンパク質が変異体配列を含む場合、変異体配列は参照配列と、少なくとも約７０％同一である。１つの実施形態において、変異体配列は参照配列と、少なくとも約７５％同一である。他の実施形態において、変異体配列は参照配列と、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、及び少なくとも約９７％同一である。特定の実施形態において、参照アミノ酸配列は配列番号：１である。
【００６１】
本発明の１つの実施形態において、ａＶＬＰは、ＰａｐＭＶコートタンパク質の遺伝子工学的に改変された（即ち変異体）版を含む。別の実施形態において、ＰａｐＭＶコートタンパク質は、タンパク質のＮ末端もしくはＣ末端からアミノ酸を削除するように、及び／又は１以上のアミノ酸の置換を含めるように、遺伝子工学的に改変されている。さらなる実施形態において、ＰａｐＭＶコートタンパク質は、タンパク質のＮ末端又はＣ末端から約１から約１０の間のアミノ酸を削除するように、遺伝子工学的に改変されている。
【００６２】
特定の実施形態において、ＰａｐＭＶコートタンパク質は、タンパク質のＮ末端の近位（即ち、配列番号：１の１及び６の位置）に存在して翻訳を開始させ得る２つのメチオニンコドンのうちの１つを除去するように、遺伝子工学的に改変されている。翻訳開始コドンのうちの1つの除去は、タンパク質の均質集団の産生を可能にする。選択されたメチオニンコドンは、例えば、該コドンを作るヌクレオチドの１つ以上を置換して、該コドンがメチオニンを除くアミノ酸をコードするか、又はナンセンスコドンとなるようにすることによって除去され得る。代替的には、全てもしくは一部のコドン、又は選ばれたコドンを含むタンパク質をコードする核酸の５’領域が、削除され得る。本発明の特定の実施形態において、ＰａｐＭＶコートタンパク質は、タンパク質のＮ末端から１から５の間のアミノ酸を削除するように、遺伝子工学的に改変されている。さらなる実施形態において、遺伝子工学的に改変されたＰａｐＭＶコートタンパク質は、配列番号３と実質的に同一であるアミノ酸配列を有する。
【００６３】
組換えコートタンパク質が、１以上のアミノ酸置換を包含する変異体配列を含む場合、これらは「保存的（conservative）」置換又は「非保存的（non-conservative）」置換であり得る。保存的置換は、類似した側鎖の特性を有する別の残基による１つのアミノ酸残基の置換を伴う。当該技術分野で公知のように、２０の天然に存在するアミノ酸は、それらの側鎖の物理化学的特性にしたがって分類され得る。好適な分類としては、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニン及びトリプトファン（疎水性側鎖）；グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミン（極性、非荷電側鎖）；アスパラギン酸及びグルタミン酸（酸性側鎖）及びリジン、アルギニン及びヒスチジン（塩基性側鎖）が挙げられる。アミノ酸の別の分類は、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン（芳香族側鎖）である。保存的置換は、同一グループからの別のアミノ酸によるアミノ酸の置換を伴う。非保存的置換は、異なる側鎖の特性を有する別の残基による１つのアミノ酸残基の置換を伴い、例えば、中性残基又は塩基性残基による酸性残基の置換、酸性残基又は塩基性残基による中性残基の置換、疎水性残基による疎水性残基の置換等である。
【００６４】
本発明の１つの実施形態において、変異体配列は１以上の非保存的置換を含む。異なる特性を有する別のアミノ酸による１つのアミノ酸の置換は、コートタンパク質の特性を改善し得る。例えば、本明細書に記載されるように、コートタンパク質の残基１２８の変異は、ＶＬＰ内への該タンパク質の集合を改善する。したがって、本発明の１つの実施形態において、コートタンパク質は、コートタンパク質の残基１２８における変異を含み、この位置のグルタミン酸残基が中性残基により置換される。さらなる実施形態において、１２８位のグルタミン酸残基はアラニン残基により置換される。
【００６５】
同様に、組換えコートタンパク質をコードする核酸配列は親の参照配列との正確な一致を必要とせず、遺伝コードの縮退により及び／又はそれが上述の変異体アミノ酸配列をコードするように、変動してもよい。したがって、本発明の１つの実施形態において、組換えコートタンパク質をコードする核酸配列は、参照配列と、少なくもと約７０％同一である。別の実施形態において、組換えコートタンパク質をコードする核酸配列は、参照配列と、少なくとも約７５％同一である。他の実施形態において、組換えコートタンパク質をコードする核酸配列は、参照配列と、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％又は少なくとも約９０％同一である。特定の実施形態において、参照核酸配列は配列番号：２である。
【００６６】
より詳細に下記に記載する通り、ａＶＬＰにより含まれるコートタンパク質もまた、ＡＣＡＳにより含まれる１以上の抗原との複合体化のための１以上の親和性部分を含むように、例えば化学的又は遺伝子工学的に改変されている。一つの実施形態において、ａＶＬＰは、１以上の親和性部分又は親和性ペプチドに対して遺伝子工学的に融合されたコートタンパク質を含む。
【００６７】
親和性部分
本発明のＡＣＡＳを使用するために選ばれた親和性部分は、対象とする抗原に望ましくは特異的に結合でき、並びに、例えば化学的もしくは遺伝子工学的手段により、ＰａｐＭＶコートタンパク質に望ましくは取り付けられることができる。種々の親和性部分が当該技術分野で公知であり、対象とする標的抗原に結合するのに好適な親和性部分は、当業者により容易に選ばれ得る。
【００６８】
好適な親和性部分の例としては、これらに限定されないが、抗体及び抗体断片（Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ’−ＳＨ、断片（Fab'-SH, fragments）、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ダイアボディ（diabodies）、及び単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子等）、（ビオチン標識抗原に結合する）ストレプトアビジン、天然リガンド（もしくはリガンドの結合ドメイン）、ペプチド又はタンパク質断片（レセプタータンパク質断片等）が挙げられ、これらは、抗原に特異的に結合する。本発明の抗原への特異性を有する合成親和性部分もまた、本明細書では意図されている。
【００６９】
リガンドの例としては、これらに限定されないが、タンパク質、改変タンパク質（例えば、糖タンパク質）、炭水化物、プロテオグリカン、脂質、ムチン分子、及び当該技術分野で公知の他の類似分子が挙げられる。
【００７０】
所与の抗原に結合することができる種々の親和性部分は当該技術分野で公知であり、多数の抗体、抗体断片、レセプター及びレセプター断片、並びにリガンドが市販されている（例えば、特にInvitrogen Corp., Carlsbad, CA; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA; ABR-Affinity Bioreagents, Golden, CO, 及び Abeam Inc., Cambridge, MA）。さらに、所与の標的分子に特異的な抗体及び抗体断片を産生する方法は、当該技術分野で公知である（例えば、Current Protocols in Immunology, Coligan ら編、J. Wiley & Sons, New York, NY参照）。
【００７１】
リガンドに関して、タンパク質−リガンド相互作用（Protein-Ligand INTeractions）（ＰｒｏＬＩＮＴ）のためのウェブベースの公共にアクセス可能なデータベースは、結合データ、タンパク質に関する配列及び構造情報、リガンドに関する構造情報、並びにタンパク質−リガンド相互作用に関する実験の詳細を含む。リガンドとそれらの標的タンパク質との間の相互作用についての知識は、ＱＳＡＲ解析（Kitajima ら、2002. Genomic Information, 13:498-499）を用いて特徴付けられ得、並びに当該技術分野で公知の技術を用いた新規リガンドの設計に用いられ得る。
【００７２】
親和性部分として用いるのに好適なペプチド又は抗体（抗体断片を含む）はまた、ファージ又は酵母提示技術等の、当業者に公知の技術により選ばれ得る。ペプチド又は抗体は、天然に存在する、組換え、合成、又はこれらの組み合わせであり得る。例えば、ペプチドは天然に存在するタンパク質又はポリペプチドの断片であり得る。本明細書内で用いられる用語ペプチドはまた、ペプチドアナログ、ペプチド誘導体及びペプチド模倣化合物を包含する。そのような化合物は当該技術分野で周知であり、並びに、例えば、より高い化学的安定性、タンパク質分解に対する上昇した耐性、強化された薬理学特性（半減期、吸収、効力及び有効性等）及び／又は低下した抗原性を含む天然に存在するペプチドを越える利点を有してもよい。
【００７３】
本発明の１つの実施形態において、親和性部分はペプチドである。好適なペプチドは、約３アミノ酸の長さから約５０アミノ酸の長さの範囲であり得る。本発明の１つの実施形態によれば、ＡＣＡＳにおける使用に好適な親和性ペプチドは、少なくとも５アミノ酸の長さである。本発明の別の実施形態にしたがって、ＡＣＡＳにおける使用に好適な親和性ペプチドは、少なくとも７アミノ酸の長さである。本発明の別の実施形態にしたがって、ＡＣＡＳにおける使用に好適な親和性ペプチドは、約５から約５０の間のアミノ酸の長さである。本発明の別の実施形態にしたがって、ＡＣＡＳにおける使用に好適な親和性ペプチドは、約７から約５０の間のアミノ酸の長さである。本発明の他の実施形態にしたがって、ＡＣＡＳにおける使用に好適な親和性ペプチドは、約５から約４５の間のアミノ酸の長さ、約５から約４０の間のアミノ酸の長さ、約５から約３５の間のアミノ酸の長さ並びに約５から約３０の間のアミノ酸の長さである。本発明の特定の実施形態にしたがって、ＡＣＡＳにおける使用に好適な親和性ペプチドは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５アミノ酸の長さである。当業者によって理解されるように、ペプチドがＰａｐＭＶコートタンパク質と遺伝子工学的に融合される場合、選ばれたペプチドの長さは、コートタンパク質がＶＬＰ内に自己集合する能力を妨げるべきではない。
【００７４】
親和性部分がペプチドを含むＰａｐＭＶ又はＶＬＰにより含まれる場合、親和性部分は単一のペプチドであり得、又はペプチドのタンデムな又は多重の配列を含み得る。
【００７５】
大きな抗原の結合を促進するために、親和性部分とコートタンパク質との間に所望によりスペーサーを含めてもよい。好適なスペーサーは、グリシン等の中性アミノ酸の短い伸長を含む。例えば、約３から約１０の間の中性アミノ酸の伸長である。１つの実施形態において、約３から約１０の間のアミノ酸の伸長は、ＰａｐＭＶコートタンパク質と親和性部分との間に挿入される。
【００７６】
上述の通り、ファージ提示は、標準的な技術（例えばCurrent Protocols in Immunology, Coliganら編、 J. Wiley & Sons, New York, NY参照）及び／又は市販のファージ提示キット（例えばNew England Biolabsから入手可能なPh.D.シリーズのキット、及びNovagenから入手可能なT7-Select（登録商標）kit）を用いて対象とする抗原性タンパク質に結合する特異的ペプチドを選ぶために用いられ得る。ファージ提示によるペプチドの選択の例もまた、下記の実施例３及び７で与えられる。
【００７７】
ファージ提示により同定された所与の抗原に結合する代表的なペプチドを表１に示す。当業者は、これらのペプチドは例にすぎず、対象とする抗原に対する親和性を有する他のペプチドが当業者に公知の技術を用いて容易に同定され得ることを理解するだろう。例えば、少なくとも４つの連続したアミノ酸を含む、表１に説明した配列の切断バージョンもまた、意図される。本発明の１つの実施形態にしたがって、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、又は配列番号：１４に示す配列の全て又は一部を含む１以上の親和性ペプチドを含むＰａｐＭＶ又はＶＬＰを含む、ＡＣＡＳが提供される。別の実施形態において、配列番号：８、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９又は配列番号：２０に示す配列の全て又は一部を含む１以上の親和性ペプチドを含むＰａｐＭＶ又はＶＬＰを含む、ＡＣＡＳを提供する。
【００７８】
【表１】
2010508857.tif 000003
【００７９】
抗原
本発明の親和性で複合体化された抗原系（ＡＣＡＳ）は、親和性部分を介してａＰａｐＭＶ又はａＶＬＰに複合体化された１以上の抗原を含む。ＡＣＡＳはまた、必要に応じて、１以上のＡＩＡを含んでもよく、これは複合体化された抗原（単数もしくは複数）と同一又は異なっていてもよい。
【００８０】
種々の疾病又は疾患に関連する多様多種の抗原は当該技術分野で公知である。本発明のＡＣＡＳに含めるのに適切な抗原は、例えば、目的とする疾病もしくは疾患及び／又は投与される動物等、組成物の所望の最終使用に基づいて、当業者により容易に選ばれ得る。
【００８１】
例えば、抗原は、癌、感染症、アレルギー反応、もしくは自己免疫疾患等、動物における疾病もしくは疾患を引き起こし得る剤由来であり得、又は薬物、ホルモンもしくは毒素に関連する疾病もしくは疾患に対する免疫応答を誘導するための使用に好適な抗原であり得る。抗原は、例えば、細菌、ウイルス、原生生物、菌類、寄生虫等、当該技術分野で公知の病原体、又はプリオン等の感染粒子由来であってもよく、又は腫瘍関連抗原、自己抗原もしくはアレルゲンであってもよい。
【００８２】
ＡＣＡＳ内に組み込むための抗原（単数又は複数）は、様々な大きさであってよく、並びに、例えば、ペプチド、タンパク質、核酸、多糖類、小分子、もしくは病原体全体もしくはその一部（例えば、生きた、不活化された又は弱毒化された病原体の形）まで含む、それらの組み合わせであってもよい。１つの実施形態において、ＡＣＡＳ内に組み込まれる抗原（単数もしくは複数）は、例えばタンパク質（糖タンパク質、リポタンパク質等を含む）、タンパク質の大きな断片（例えば、約２０アミノ酸以上の長さ）、多糖類、多糖類断片、核酸、核酸断片、病原体全体もしくは病原体の一部等の巨大分子である。別の実施形態において、ＡＣＡＳ内に組み込まれる抗原（単数もしくは複数）は、タンパク質又はペプチドの短い断片である（例えば、約４から約２０の間のアミノ酸の長さ）。
【００８３】
ＡＣＡＳが１つより多くの抗原を含む場合、ＡＣＡＳに組み込むために選ばれた抗原は同一であり得、又はそれらは異なり得、並びに単独のソースもしくは複数のソース由来であってもよい。抗原は、特異的免疫応答を誘発することができる単独のエピトープをそれぞれ有し得、又は各抗原は１つより多くのエピトープを含んでもよい。
【００８４】
抗原は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージにおける表面構造、クラスＩもしくはクラスＩＩ  ＡＰＣ関連細胞表面構造、又はそれらの組み合わせにより認識されるエピトープを含んでもよい。１つの実施形態において、本発明は、ＡＣＡＳが弱い免疫原性抗原に対してとりわけ有用であることを意図する。
【００８５】
公知の抗原に加えて、本発明のＡＣＡＳに組み込むための抗原もまた、当業者公知の方法により対象とする病原体又は他のソースから選ばれてもよく、並びに当該技術分野で公知の標準的な免疫学的技術を用いて動物における免疫応答を誘導するこれらの能力について選別されてもよい。例えば、抗原性タンパク質内のエピトープを予測する方法はNussinov R and Wolfson H J, Comb Chem High Throughput Screen (1999) 2(5):261に記載され；並びにＣＴＬエピトープを予測する方法はRothbardら、EMBO J. (1988) 7:93-100及びde Groot M S ら、Vaccine (2001) 19(31):4385-95に記載されている。他の方法は、Rammensee H-G.ら、Immunogenetics (1995) 41 :178-228及びSchirle Mら、Eur J Immunol (2000) 30(18):2216-2225に記載されている。
【００８６】
例えば、有用なウイルス抗原としては、アデノウイルス科（Adenoviradae）；アレナウイルス科（例えば、イッピイウイルス及びラッサウイルス）；ビルナウイルス科；ブニヤウイルス科；カルシウイルス科；コロナウイルス科；フィロウイルス科；フラビウイルス科（例えば、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス及びＣ型肝炎ウイルス）；ヘパドナウイルス科（Hepadnaviradae）（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）；ヘルペスウイルス科（Herpesviradae）（例えば、ヒト単純ヘルペスウイルス１型）；オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルスＡ型、Ｂ型及びＣ型）；パラミクソウイルス科（例えば、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス及び呼吸器合胞体ウイルス）；ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルス及びＡ型肝炎ウイルス）；ポックスウイルス科；レオウイルス科；レトロウイルス科（Retroviradae）（例えば、ＢＬＶ−ＨＴＬＶレトロウイルス、ＨＩＶ−１型、ＨＩＶ−２型、ウシ免疫不全ウイルス及びネコ免疫不全ウイルス）；ラブドウイルス（Rhabodoviridae）（例えば、狂犬病ウイルス）、並びにトガウイルス科（例えば、風疹ウイルス）のメンバー由来のものが挙げられる。１つの実施形態において、組成物は、種々の肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、種々のインフルエンザウイルス、ウエストナイルウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、インフルエンザウイルス、狂犬病ウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、ポリオーマウイルス、又はＳＡＲＳコロナウイルス等の、主要なウイルス病原体由来の１以上の抗原を含む。
【００８７】
Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）及びＧ型肝炎ウイルスを含む、肝炎ウイルス由来のウイルス抗原は、当該技術分野で公知である。抗原は、例えば、ＨＣＶコアタンパク質、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質、ＮＳ３及び他のタンパク質（ＮＳ２、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ及びＮＳ５ｂ）由来、ＨＢＶ  ＨｂｓＡｇ抗原又はＨＢＶコア抗原由来、並びにＨＤＶデルタ−抗原由来であり得る（例えば、米国特許第５３７８８１４号参照）。例えば、米国特許第６５９６４７６号；第６５９２８７１号；第６１８３９４９号；第６２３５２８４号；第６７８０９６７号；第５９８１２８６号；第５９１０４０４号；第６６１３５３０号；第６７０９８２８号；第６６６７３８７号；第６００７９８２号；第６１６５７３０号；第６６４９７３５号及び第６５７６４１７号は、ＨＣＶコアタンパク質に基づく種々の抗原を記載する。１つの実施形態において、ＨＣＶコアタンパク質の抗原性部分が、本発明のＡＣＡＳに含められる。例えば、好適な抗原性部分としては、ＨＣＶコアタンパク質の最初の（Ｎ末端）８２アミノ酸及びＨＣＶコアタンパク質の最初の（Ｎ末端）１７０アミノ酸が挙げられる。
【００８８】
ヘルペスウイルス科由来の公知の抗原の限定されない例としては、ＨＳＶ−１型及びＨＳＶ−２型糖タンパク質ｇＢ、ｇＤ及びｇＨ等の単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１型及び２型由来のものが挙げられる。
【００８９】
ＨＩＶ抗原の限定されない例としては、ｇｐ１２０由来の抗原、ｇｐ１６０及びｇｐ４１等の種々のエンベロープタンパク質由来の抗原、ｐ２４ｇａｇ及びｐ５５ｇａｇ等のｇａｇ抗原、並びにＨＩＶのｐｏｌ、ｅｎｖ、ｔａｔ、ｖｉｆｒｅｖ、ｎｅｆｖｐｒ、ｖｐｕ及びＬＴＲ領域由来のタンパク質が挙げられる。ＨＩＶの種々の遺伝子工学的サブタイプのメンバーを含む、多数のＨＩＶ−１型及びＨＩＶ−２型分離株由来のｇｐ１２０の配列は公知である（例えば、Myers ら、 Los Alamos Database, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, N. Mex. (1992);及びModrowら、J. Virol. (1987) 61 :570 578参照）。
【００９０】
他のウイルス抗原の限定されない例としては、水痘帯状ヘルペスウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）並びにＣＭＶ  ｇＢ及びｇＨを含むサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のもの；並びにＨＨＶ６及びＨＨＶ７等の他のヒトヘルペスウイルス由来の抗原が挙げられる(例えば、Cheeら(1990) Cytomegaloviruses（J. K. McDougall,編., Springer- Verlag, pp. 125 169; McGeoch ら(1988; J. Gen. Virol. 69:1531 1574; U.S. Pat. No. 5,171,568; Baer ら(1984) Nature 310:207 211; 及びDavisonら (1986) J. Gen. Virol. 67: 1759 1816参照）。
【００９１】
抗原はまた、インフルエンザウイルス由来、例えば、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、ヌクレオプロテイン（ＮＰ）Ｍ１及びＭ２タンパク質由来であり得る。これらタンパク質の配列は当該技術分野で公知であり、並びにNational Center for Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）により維持されるＧｅｎＢａｎｋデータベースから容易にアクセスできる。ＨＡ、ＮＰ及びマトリックスタンパク質の好適な抗原性断片としては、これらに限定されないが、ヘマグルチニンエピトープ:ＨＡ９１−１０８、ＨＡ３０７−３１９及びＨＡ３０６−３２４(Rothbard, Cell, 1988, 52:515-523)、ＨＡ４５８−４６７(J. Immunol. 1997, 159(10):4753-61)、ＨＡ２１３−２２７、ＨＡ２４１−２５５、ＨＡ５２９−５４３及びＨＡ５３３−５４７(Gao, W. al., J. Virol, 2006, 80:1959-1964); ヌクレオプロテインエピトープ: NP206-229(Brett, 1991, J. Immunol. 147:984-991)、ＮＰ３３５−３５０及びＮＰ３８０−３９３(Dyer and Middleton, 1993, Histocompatibility testing, a practical approach中(編集: Rickwood, D. and Hames, B. D.)IRL Press, Oxford, p. 292; Gulukota and DeLisi, 1996, Genetic Analysis: Biomolecular Engineering, 13:81)、ＮＰ３０５−３１３(DiBrino, 1993, PNAS 90:1508-12);ＮＰ３８４−３９４(Kvist, 1991, Nature 348:446-448);ＮＰ８９−１０１(Cerundolo, 1991, Proc. R. Soc. Lon. 244: 169-7);ＮＰ９１−９９(Silver et al,1993, Nature 360: 367-369);ＮＰ３８０−３８８(Suhrbier, 1993, J. Immunology 79:171- 173);ＮＰ４４−５２及びＮＰ２６５−２７３(DiBrino, 1993,（前掲));及びＮＰ３６５−３８０(Townsend, 1986, Cell 44:959-968);マトリックスタンパク質（Ｍ１）エピトープ:Ｍ１  ２−２２、Ｍ１  ２−１２、Ｍ１  ３−１１、Ｍ１  ３−１２、Ｍ１  ４１−５１、Ｍ１  ５０−５９、Ｍ１  ５１−５９、Ｍ１  １３４−１４２、Ｍ１  １４５−１５５、Ｍ１  １６４−  １７２、Ｍ１  １６４−１７３(全て Nijman, 1993, Eur. J. Immunol. 23: 1215-1219に記載); Ｍ１  １７−３１、Ｍ１  ５５−７３、Ｍ１  ５７−６８(Carreno, 1992, MoI Immunol 29:1131-1140);Ｍ１  ２７−３５、Ｍ１  ２３２−２４０(DiBrino, 1993, （前掲）)、Ｍ１  ５９−６８及びＭ１  ６０−６８（Eur. J. Immunol.1994, 24(3): 777-80);及びＭ１  １２８−１３５(Eur. J. Immunol. 1996, 26(2): 335-39)のうち１つ以上を含む断片が挙げられる。
【００９２】
他の関連する抗原性領域及びインフルエンザウイルスタンパク質のエピトープもまた、公知である。例えば、Ｍ２ｅペプチド（Ｍ２の細胞外ドメイン）を含むインフルエンザイオンチャネルタンパク質（Ｍ２）の断片である。このペプチドの配列はインフルエンザの様々な菌株に渡って高度に保存されている。Ｍ２ｅペプチド配列の例は、配列番号：２１として表２に示す。この配列の変異株が同定されており、そのような変異形のいくつかの例もまた、表２に示す。
【００９３】
【表２】
2010508857.tif 000004
【００９４】
Ｍ２ｅ配列全体又はＭ２ｅ配列の一部が用いられてもよく、例えば、アミノ酸２から１０により定義された領域を含む断片、又は保存されたエピトープＥＶＥＴＰＩＲＮ［配列番号：２６］（Ｍ２ｅ配列のアミノ酸６−１３）等の変異形に渡って保存されている部分配列である。６−１３エピトープは、ＧｅｎＢａｎｋにおいて入手可能なヒトインフルエンザＡ型株の８４％で不変であることが明らかになっている。同定もされている、この配列の変異形としては、ＥＶＥＴＬＴＲＮ[配列番号：２７](９．６％)、ＥＶＥＴＰＩＲＳ[配列番号：２８]（２．３％）、ＥＶＥＴＰＴＲＮ[配列番号：２９](１．１％)、ＥＶＥＴＰＴＫＮ[配列番号：３０](１．１％)並びにＥＶＤＴＬＴＲＮ[配列番号：３１]、ＥＶＥＴＰＩＲＫ[配列番号：３２]及びＥＶＥＴＬＴＫＮ[配列番号：３３](各０．６％)が挙げられる（Zou, P., et al., 2005, Int Immunopharmacology, 5:631-635; Liu et al. 2005, Microbes and Infection, 7:171-177）。
【００９５】
他の有用な抗原としては、不活性化ポリオウイルス（Jiang ら、J. Biol. Stand., (1986) 14: 103-9）、Ａ型肝炎ウイルスの弱毒化株（Bradleyら、J. Med. Virol, (1984) 14:373-86）、弱毒化麻疹ウイルス（James ら、N. Engl. J. Med., (1995) 332:1262-6）等の生ウイルス、弱毒化ウイルス及び不活性化ウイルス並びに百日咳ウイルスのエピトープ（例えば、ACEL-IMUNETMacellular DTP, Wyeth- Lederle Vaccines and Pediatrics）が挙げられる。
【００９６】
抗原はまた、当業者に公知である、クル病、クロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）、スクレイピー、伝染性ミンク脳症、及び慢性消耗性疾患の原因物質等の特殊なウイルスもしくはウイルス様剤由来、又は狂牛病に関連するプリオン等のタンパク質性感染粒子由来であり得る。
【００９７】
有用な細菌性抗原としては、例えば、リポ多糖類等の細菌表面の抗原性成分、莢膜抗原（タンパク質性（proteinacious）もしくは天然の多糖類）、又は鞭毛構成成分を含み、並びにこれらは、ジフテリア、百日咳、破傷風、結核、細菌性もしくは真菌肺炎、コレラ、チフス、ペスト、細菌性赤痢もしくはサルモネラ症、レジオネラ症（Legionaire's Disease）、ライム症、ハンセン病、マラリア、鉤虫症、オンコセルカ症、住血吸虫症、トリパノソーマ症（Trypamasomialsis）、リーシュマニア症（Lesmaniasis）、ジアルジア、アメーバ症、フィラリア症、ボレリア、及び旋毛虫症等の疾病に関与する公知の原因物質から得てもまたそれ由来であってもよい。
【００９８】
腸内細菌科のグラム陰性菌由来の抗原の例としては、これらに限定されないが、Ｓ．チフィＶｉ(莢膜多糖類)抗原、Ｅ．コリＫ及びＣＦＡ（莢膜成分）抗原並びにＥ．コリ繊毛アドへシン抗原（Ｋ８８及びＫ９９）が挙げられる。抗原性タンパク質の例としては、ポーリンとしても知られる外膜タンパク質（Ｏｍｐ）（Secundino ら、2006, Immunology 117:59）；Ｓ．チフィ鉄制御外膜タンパク質等の関連ポーリン（IROMP, Sood ら、2005, Mol Cell Biochem 273:69-78）、及び、限定されないがＳ．チフィＨＳＰ４０を含む熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）が挙げられる（Sagi ら、2006, Vaccine 24:7135-7141）。抗原性ポーリンの限定されない例としては、ＯｍｐＣ及びＯｍｐＦが挙げられ、これらは、多数のサルモネラ属及びエシェリキア属種中に見られる。ＯｍｐＣ及びＯｍｐＦのオルソログはまた、他の腸内細菌科に見られ、並びにこれらは本発明の目的のための好適な抗原性タンパク質である。さらに、腸内細菌科のポーリンタンパク質中に見られる配列の保存領域に基づいて、Ｏｍｐ１Ｂ（Shigella flexneri）、ＯｍｐＣ２（Yersinia pestis）、ＯｍｐＤ（S. enterica）、ＯｍｐＫ３６（Klebsiella pneumonie）、ＯｍｐＮ（E. coli）及びＯｍｐＳ（S. enterica）が好適であり得る（Diaz-Quinonezら, 2004, Infect. and Immunity 72:3059-3062）。
【００９９】
種々の腸内細菌由来の抗原性タンパク質の配列は、当該技術分野で公知であり、並びにNational Center for Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）により維持されるＧｅｎＢａｎｋデータベースから容易にアクセス可能である。例えば、GenBank Accession No.P0A264(図９［配列番号：４］にも示す)及びGenBank Accession No.NP_804453:ＯｍｐＣ(S. enterica 亜種enterica serovar Typhi Ty2)；GenBank Accession No.CAD05399 (図１０［配列番号：５］にも示す)：ＯｍｐＦ前駆体タンパク質 (S. enterica亜種enterica serovar Typhi CT 18)；GenBank Accession No.16761195:ＯｍｐＣ(S. enterica serovar Typhimurium)；GenBank Accession No.47797:ＯｍｐＣ(S. enterica serovar Typhi)；GenBank Accession No.8953564：ＯｍｐＣ(S. enterica serovar Minnesota)；GenBank Accession No.19743624：ＯｍｐＣ(S. enterica serovar Dublin)；GenBank Accession No.19743622：ＯｍｐＣ(S. enterica serovar Gallinarum)；GenBank Accession No.26248604:ＯｍｐＣ(E. coli)；GenBank Accession No.24113600：Omp1B (Shigella flexneri)；GenBank Accession No.16764875：ＯｍｐＣ２(Yersinia pestis)；GenBank Accession No.16764916：ＯｍｐＤ(S. enterica Serovar Typhimurium)；GenBank Accession No.151149831：ＯｍｐＫ３６(Klebsiella pneumonie)；GenBank Accession No.3273514：ＯｍｐＮ(E. coli)、並びにGenBank Accession No.16760442：ＯｍｐＳ(S. enterica serovar Typhi)である。
【０１００】
種々の腫瘍関連抗原が当該技術分野で公知である。代表的な例としては、これらに限定されないが、Ｈｅｒ２(乳癌);ＧＤ２(神経芽細胞腫);ＥＧＦ−Ｒ(悪性神経膠芽腫);ＣＥＡ（甲状腺髄様癌);ＣＤ５２(白血病);ヒトメラノーマタンパク質ｇｐ１００;ヒトメラノーマタンパクｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１;ＮＡ１７−Ａ ｎｔタンパク質;Ｐ５３タンパク質;ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ２、ＭＡＧＥ３(ＨＬＡ−Ａ１ペプチド)及びＭＡＧＥ４を含む種々のＭＡＧＥ(メラノーマ関連抗原Ｅ);種々のチロシナーゼ(ＨＬＡ−Ａ２ペプチド)；変異ｒａｓ;ｐ９７メラノーマ抗原;進行癌に関連するＲａｓペプチド及びｐ５３ペプチド;子宮頸癌に関連するＨＰＶ１６／１８及びＥ６／Ｅ７抗原;乳癌に関連するＭＵＣｌ−ＫＬＨ抗原;結腸直腸癌に関連するＣＥＡ(癌胎児性抗原),肺癌に関連するＤＫＫ−１(Dickkopf-1タンパク質)及び前立腺癌に関連するＰＳＡ抗原が挙げられる。
【０１０１】
有用なアレルゲンとしては、これらに限定されないが、花粉、動物のフケ、草、カビ、埃、抗生物質、刺咬昆虫毒に由来するアレルゲン、並びに様々な環境、薬物及び食物アレルゲンが挙げられる。ありふれた樹木のアレルゲンとしては、ハコヤナギ、ポプラ（popular）、セイヨウトネリコ、カバノキ、カエデ、オーク、ニレ、ヒッコリー、及びペカンの木由来の花粉が挙げられる。ありふれた植物アレルゲンとしては、ライムギ、ブタクサ、イギリスオオバコ、ソレル−ドック（sorrel-dock）及びアカザ由来のものが挙げられ、並びに植物接触アレルゲンとしては、ウルシ、ツタウルシ及びイラクサ由来のものが挙げられる。ありふれた草アレルゲンとしては、チモシー、ジョンソン、バミューダ、フェスク及びブルーグラスアレルゲンが挙げられる。ありふれたアレルゲンはまた、アルテルナリア属、フサリウム属、ホルモデンドラム属、アスペルギルス属、ミクロポリスポラ属、ケカビ属及び好熱性放線菌類等のカビ又は真菌から入手できる。ペニシリン、スルホンアミド及びテトラサイクリンはありふれた抗生物質アレルゲンである。表皮性アレルゲンは、ハウスダストもしくは有機塵（典型的には真菌起源）から、イエダニ（ヤケヒョウヒダニ（dermatphagoides pterosinyssis））等の昆虫から、もしくは羽毛、並びにネコ及びイヌのフケ等の動物ソースから入手できる。ありふれた食物アレルゲンとしては、牛乳及びチーズ（乳製品（diary））、卵、コムギ、ナッツ（例えば、ピーナッツ）、海産物（例えば、甲殻類）、エンドウマメ、マメ及びグルテンアレルゲンが挙げられる。ありふれた薬物アレルゲンとしては、局所麻酔薬及びサリチル酸アレルゲンが挙げられ、並びにありふれた昆虫アレルゲンとしては、ミツバチ、スズメバチ（hornet）、カリバチ（wasp）及びアリ毒、並びにゴキブリ腎杯アレルゲン（cockroach calyx allergens）が挙げられる。
【０１０２】
特に十分に特徴づけられたアレルゲンとしては、これらに限定されないが、イエダニアレルゲンＤｅｒ  ｐＩ及びＤｅｒ  ｐＩＩ(Chua,ら、J. Exp. Med., 167:175 182, 1988;及び Chua, ら、Int. Arch. Allergy Appl. Immunol, (1990) 91 : 124-129参照)、Ｄｅｒ  ｐＩＩアレルゲンのＴ細胞エピトープペプチド（Joost van Neerven,ら、 J. Immunol, (1993) 151 :2326-2335参照)、高度に大量の抗原E(Amb aI)ブタクサ花粉アレルゲン（Rafnar, ら、J. Biol. Chem., (1991) 266:1229-1236参照)、ホスホリパーゼＡ２(ハチ毒)アレルゲン及びその中のＴ細胞エピトープ( Dhillon, ら、 J. Allergy Clin. Immunol, (1992) 42参照)、シラカバ花粉(Betvl)(Breiteneder,ら、EMBO, (1989) 8:1935-1938参照)、Fel dＩ主要イエネコアレルゲン(Rogers,ら、 MoI Immunol, (1993) 30:559-568参照)、樹木花粉(Elsayedら、Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl, (1991) 204:17-31参照)並びに複数エピトープの組換え草アレルゲンｒＫＢＧ８．３(CaoらImmunology (1997) 90:46-51)が挙げられる。これら及び他の好適なアレルゲンは市販されており並びに／又は公知の技術にしたがって容易に調製され得る。
【０１０３】
自己抗原に関連する病気に関する抗原もまた、当業者に公知である。そのような抗原の代表的な例としては、これらに限定されないが、リンホトキシン、リンホトキシン受容体、核内因子ｋＢリガンドの受容体活性化因子(ＲＡＮＫＬ)、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、血管内皮増殖因子受容体(ＶＥＧＦ−Ｒ)、インターロイキン５、インターロイキン１７、インターロイキン１３、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＬ１２、ＳＤＦ−１、ＭＣＰ−１、エンドグリン、レジスチン、ＧＨＲＨ、ＬＨＲＨ、ＴＲＨ、ＭＩＦ、エオタキシン、ブラジキニン、ＢＬＣ、腫瘍壊死因子アルファ及びアミロイドベータペプチド、並びに免疫応答を誘発するために用いられ得る各断片が挙げられる。
【０１０４】
有用な毒素は、一般的に有毒植物、動物及び微生物の天然物、又はこれらの化合物の断片である。そのような化合物としては、例えば、アフラトキシン、シガテラ毒素、百日咳毒素及びテトロドトキシンが挙げられる。
【０１０５】
レクリエーションドラッグ中毒に関して有用な抗原は、当該技術分野で公知であり、例えば、コデイン、フェンタニル、ヘロイン、モルヒネ及びアヘン等のオピオイド及びモルヒネ誘導体；アンフェタミン、コカイン、ＭＤＭＡ（メチレンジオキシメタンフェタミン(methylenedioxymethamphetamine)）、メタンフェタミン、メチルフェニデート及びニコチン等の刺激物質；ＬＳＤ、メスカリン及びシロシビン等の幻覚剤；ハシッシュ及びマリファナ等の大麻類、他の中毒性薬物又は化合物、並びにそのような化合物の誘導体、副生物、変異形及び複合体が挙げられる。
【０１０６】
本発明の１つの実施形態において、ＡＣＡＳに含まれる抗原（単数又は複数）は、タンパク質抗原である。タンパク質抗原は、全長タンパク質、実質的に全長のタンパク質（例えば、約２５あるいはそれ未満のアミノ酸のＮ末端及び／もしくはＣ末端欠失を含むタンパク質）、タンパク質の抗原性断片、又はそれらの組み合わせであり得る。全長タンパク質は、それが利用できる場合、該タンパク質の前駆形態又は該タンパク質の成熟（プロセシングされた）形態であり得る。タンパク質は、例えば糖タンパク質又はリポタンパク質といった、翻訳後修飾されたものであってもよい。抗原性断片は、１又は複数のエピトープを含み得、したがって、数個のアミノ酸（例えば、少なくとも４個のアミノ酸）のペプチドから数百のアミノ酸の長さのポリペプチドまで、大きさに幅があってもよい。本発明の１つの実施形態において、ＡＣＡＳに組み込むために好適な抗原性断片は、少なくとも２０アミノ酸の長さである。別の実施形態において、ＡＣＡＳに組み込むために好適な抗原性断片は、約２０アミノ酸から約５００アミノ酸の間の長さである。別の実施形態において、ＡＣＡＳに組み込むために好適な抗原性断片は、約２０アミノ酸から約４５０アミノ酸の間の長さである。他の実施形態において、ＡＣＡＳにおける封入体に好適な抗原性断片は、約２０アミノ酸から約４００アミノ酸の間の長さ、約２０アミノ酸から約３５０アミノ酸の間の長さ、約２０アミノ酸から約３００アミノ酸の間の長さ、約２０アミノ酸から約２５０アミノ酸の間の長さ、約２０アミノ酸から約２００アミノ酸の間の長さ、及び約２０アミノ酸から約１５０アミノ酸の間の長さである。別の実施形態において、ＡＣＡＳに含まれるタンパク質抗原は、全長又は実質的に全長のタンパク質である。
【０１０７】
ＡＣＡＳの作製
ａＰａｐＭＶ及びａＶＬＰ
ＰａｐＭＶは当該技術分野で公知であり、例えば、ATCC No.PV-204TMとして、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手できる。ウイルスは、維持され得、並びに標準プロトコル(例えば、Erickson, J. W. & Bancroft, J. B., 1978, Virology 90:36-46参照)にしたがって、パパイヤ（Carica papaya）及びキンギョソウ（Antirrhinum majus）等の宿主植物で維持され得、かつ該宿主植物から精製（purified form）され得る。選ばれた親和性部分は、例えばリジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸及び／又はシステイン残基を介して、ウイルスの表面上に配置された反応基を通じてａＰａｐＭＶを形成するためにＰａｐＭＶのコートタンパク質に取り付けられ得る。
【０１０８】
一般に、親和性部分はＰａｐＭＶのコートタンパク質に化学的に取り付けられる。「化学的に取り付けられる」とは、例えば、共有又は非共有（イオン性結合、疎水性結合、水素結合等）結合により、親和性部分がコートタンパク質に化学的に架橋されていることを意味する。親和性部分及び／又はコートタンパク質は、当該技術分野で公知のように、そのような架橋を促進するために改変されてもよく、それは例えば、例えば、Ｃ末端もしくはＮ末端又は内部の位置での、該タンパク質及び／又は抗原に対する官能基又は化学的部分の付加によるものである。例示的な改変としては、Ｓ−アセチルメルカプトコハク酸無水物（ＳＡＭＳＡ）もしくはＳ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）等の官能基の付加、又は１以上のシステイン残基の付加が挙げられる。他の架橋剤は当該技術分野で公知であり、かつその多くが市販されている（例えば、Pierce Chemical Co.及びSigma-Aldrichからのカタログ参照）。例としては、これらに限定されないが、１，６−ジアミノヘキサン、１，３−ジアミノプロパン及び１，３−ジアミノエタン等のジアミン；グルタルアルデヒド等のジアルデヒド；エチレングリコール−ｂｉｓ(コハク酸Ｎ-ヒドロキシコハク酸イミドエステル)、ジコハク酸イミドグルタル酸エステル、ジコハク酸イミドスベリン酸エステル、Ｎ−（ｇ−マレイミドブチリルオキシ)スルホスクシンイミドエステル及びエチレングリコール−ｂｉｓ(スクシンイミジルスクシネート)等のコハク酸イミドエステル；ヘキサメチレンジイソシアネート等のジイソシアネート；１，４ブタンジイルジグリシジルエーテル等のビスオキシラン;ジサリチル酸スクシニル（succinyidisalicylate）等のジカルボン酸;３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル等が挙げられる。上述の架橋剤の多くは、ＶＬＰから親和性部分を遠ざけるスペーサーを組み込んでいる。他のスペーサーの使用もまた、本発明により意図されている。種々のスペーサーが当該技術分野で公知であり、該スペーサーとしては、これらに限定されないが、６−アミノヘキサン酸；１，３−ジアミノプロパン；１，３−ジアミノエタン；及び１から５のアミノ酸のポリグリシン配列等の短いアミノ酸配列が挙げられる。
【０１０９】
コートタンパク質への１以上の親和性部分の共有結合を促進するために、ＰａｐＭＶの表面に露出され、かつ、親和性部分の化学結合のための適切な部位を提供するように、短いペプチド又はアミノ酸リンカーが、まずコートタンパク質に結合され得る。例えば、システイン残基、又は、共有結合（例えば酸性及び塩基性残基）を形成することができるか、もしくは共有結合を形成するように容易に改変され得るその他のアミノ酸残基を含む短いペプチドが当該技術分野で公知である。アミノ酸リンカー又はペプチドは、例えば、１から約２０アミノ酸の間の長さであり得る。１つの実施形態において、コートタンパク質は、上述したような好適な架橋剤を用いることにより、１つ以上のリジン残基（これが共有結合され得る）を例えばシステイン残基と共に有する短いペプチドと、該部分において融合される。特定の実施形態において、コートタンパク質は、グリシン及びリジン残基の短いペプチド配列と融合される。別の実施形態において、ペプチドは配列：ＧＧＫＧＧを含む。
【０１１０】
本発明のａＶＬＰを調製するために用いられ得る組換えコートタンパク質は、野生型タンパク質の配列が与えられた、当業者によって標準的な遺伝子工学技術により、容易に調製され得る。タンパク質を遺伝子操作する方法は、野生型ＰａｐＭＶコートタンパク質の配列（配列番号：１及び２参照）と同様に、当該技術分野で周知である（例えば、Ausubel ら. (1994 & 更新版) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York参照）。
【０１１１】
野生型タンパク質をコードする核酸配列の単離及びクローニングは、標準的な技術を用いて達成され得る（例えば、Ausubelら、（前掲）参照）。例えば、核酸配列は、標準的な技術によりＲＮＡを抽出し、次いで、該ＲＮＡテンプレートから（例えばＲＴ−ＰＣＲによって）ｃＤＮＡを合成することによりＰａｐＭＶから直接得ることができる。ＰａｐＭＶは、モザイク病の症状を示す感染した植物の葉から、標準的な技術により精製され得る（例えば、本明細書に与える実施例１参照）。
【０１１２】
コートタンパク質をコードする核酸配列は、次いで、直接又は１以上のサブクローニング工程の後に、好適な発現ベクター内に挿入される。当業者は、用いられる正確なベクターは、本発明にとって重要ではないことを理解するだろう。好適なベクターの例としては、これらに限定されないが、プラスミド、ファージミド、コスミド、バクテリオファージ、バキュロウイルス、レトロウイルス又はＤＮＡウイルスが挙げられる。以下により詳細に記載するように、コートタンパク質は次いで、発現及び精製され得る。
【０１１３】
あるいは、コートタンパク質をコードする核酸配列は、当該技術分野で公知の標準的なインビトロでの部位特異的突然変異誘発技術により、上述したような１以上の突然変異を導入するためにさらに改変され。得る突然変異は、コーディング配列を形成する１以上の適切なヌクレオチドの欠失、挿入、置換、逆位又はそれらの組み合わせにより導入され得る。これは、例えば、１以上のヌクレオチドのミスマッチ、挿入もしくは欠失を組み込んだプライマーを設計するためのＰＣＲに基づく技術により、達成され得る。突然変異の存在は、例えば制限解析又はＤＮＡ配列決定といった数多くの標準的な技術により確認され得る。
【０１１４】
上述の通り、親和性部分がペプチド、タンパク質又はタンパク質断片である場合、コートタンパク質もまた、親和性部分をコートタンパク質に対して遺伝子工学的に融合させるために改変され得る。ａＶＬＰの表面上における親和性部分の提示を可能にし、それにより、親和性部分に結合した抗原の免疫認識を増強するために、親和性部分は、好ましくは、ａＶＬＰの外表面に配置されたコートタンパク質の領域に対して融合される。したがって、親和性部分は、例えば、コートタンパク質のアミノ（Ｎ）又はカルボキシ（Ｃ）末端において取り付けられ得、又はａＶＬＰの外表面に配置されたコートタンパク質の内部ループに対して取り付けられ得る。本発明の１つの実施形態において、親和性部分は、ＰａｐＭＶコートタンパク質のＣ末端又はその近位において遺伝子工学的に融合される。
【０１１５】
融合タンパク質を作製する方法は、当業者に周知である。融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、上述の通りの好適な発現ベクター内に挿入され得る。
【０１１６】
当業者は、コートタンパク質をコードするＤＮＡは、コードされたタンパク質の活性に影響を及ぼすことなく種々の手段で改変され得ると理解するだろう。例えば、ＤＮＡ配列における変動は、タンパク質を発現させるのに用いられる宿主細胞におけるコドン選択用に最適化するために用いられてもよく、又は発現を促進する他の配列変化を包含していてもよい。
【０１１７】
当業者は、発現ベクターは、コートタンパク質又は融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列の効率的な転写のために必要とされる、転写要素等の調節要素をさらに含んでもよいと理解するだろう。ベクター内に組み込まれ得る、調節要素の例としては、これらに限定されないが、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、及びポリアデニル化シグナルが挙げられる。したがって、本発明は、遺伝子組換えされたコートタンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結された調節要素を含むベクターを提供する。当業者は、好適な調節要素の選択は、遺伝子組換えされたコートタンパク質の発現のために選ばれた宿主細胞に依存し、またそのような調節要素は、細菌、真菌、ウイルス、哺乳動物もしくは昆虫の遺伝子を含む、種々のソース由来であり得ることを理解するだろう。
【０１１８】
本発明の文脈では、発現ベクターは、発現されたタンパク質の精製を促進する異種核酸配列をさらに包含してもよい。該異種核酸配列の例としては、これらに限定されないが、金属親和性タグ、ヒスチジンタグ、アビジン／ストレプトアジビンをコードする配列、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）をコードする配列及びビオチンをコードする配列等の親和性タグが挙げられる。該核酸の発現に対応するアミノ酸は、当該技術分野で公知の方法にしたがって、用いる前に発現されたコートタンパク質から除去され得る。代替的に、異種核酸配列の発現に対応するアミノ酸は、それらがその後のＶＬＰ内への集合を妨げない場合、コートタンパク質上で保たれてもよい。
【０１１９】
本発明の１つの実施形態において、コートタンパク質はヒスチジンタグを付したタンパク質として発現される。ヒスチジンタグは、コートタンパク質のカルボキシ末端又はアミノ末端に位置し得る。
【０１２０】
発現ベクターは、当該技術分野で公知の様々な方法の１つによって好適な宿主細胞又は組織内に導入され得る。そのような方法は、概してはAusubelら（前掲）に記載されているのを見出すことができ、例えば、組換えウイルスベクターを用いた、安定的な又は一過性のトランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、及び感染が挙げられる。当業者は、コートタンパク質の発現に適切な宿主細胞の選択は、選ばれたベクターに依存するであろうことを理解するだろう。宿主細胞の例としては、これらに限定されないが、細菌、酵母、昆虫、植物及び哺乳動物の細胞が挙げられる。用いられる正確な宿主細胞は本発明にとって重要ではない。コートタンパク質は、原核生物宿主（例、Ｅ．コリ、Ａ．サルモニシダもしくはＢ．スブチリス）又は真核生物宿主（例、酵母類もしくはピキア；哺乳動物細胞、例、ＣＯＳ、ＮＩＨ、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３もしくはＨｅＬａ細胞；又は昆虫細胞）において産生され得る。１つの実施形態において、コートタンパク質は原核生物細胞において産生され得る。
【０１２１】
組換えコートタンパク質は、ＶＬＰ内に多量体化及び集合することができる。一般に、集合はコートタンパク質を発現する宿主細胞において起こる。ＶＬＰは、本明細書に与える実施例の項に記載されるような、標準的な技術により宿主細胞から単離され得る。ＶＬＰは、混入した宿主細胞タンパク質もしくはＬＰＳ等の他の化合物を除去するために、クロマトグラフィー等の標準的な技術によりさらに精製され得る。本発明の１つの実施形態において、ＶＬＰはＬＰＳを除去するために精製される。必要に応じて、コートタンパク質は、タンパク質の同定を確かめるために、インタクトなタンパク質もしくはそのタンパク質分解断片のいずれかを用いて標準的なペプチド配列決定技術により配列決定され得る。
【０１２２】
親和性ペプチド、タンパク質もしくはドメインに取り付けられた組換えコートタンパク質及びコートタンパク質は、標準的な技術によって、ＶＬＰ内に多量体化及び自己集合する能力について解析され得る。例えば、電子顕微鏡により精製タンパク質を視覚化することによる（例えば、実施例７参照）。ＶＬＰの形成はまた、超遠心分離法により測定されてもよく、並びに円偏光二色性（ＣＤ）分光分析は、組換えもしくは修飾タンパク質の二次構造をＷＴウイルスと比較するために用いられてもよい（例えば、実施例７参照）。
【０１２３】
ＶＬＰの安定性は、必要に応じて、当該技術分野で公知の技術、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びプロテイナーゼＫ分解解析により測定され得る。本発明の１つの実施形態にしたがって、本発明のＰａｐＭＶ  ＶＬＰは上昇した温度において安定であり、室温で容易に保管され得る。
【０１２４】
本発明の１つの実施形態において、コートタンパク質は、宿主細胞において集合してウイルスもしくは偽ウイルスを提供し、並びに核酸及び融合タンパク質を含む感染性ウイルス粒子を作り出すために用いられ得る。これは、感染性ウイルスもしくは偽ウイルス粒子による隣接する細胞の感染並びにそこでの融合タンパク質の発現を可能にし得る。本実施形態において、ウイルスもしくは偽ウイルスを複製するために用いられる宿主細胞は、ウイルスの複製を可能にするであろう、植物細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞もしくは細菌細胞であり得る。本発明の１つの実施形態において、該細胞は、Ｅ．コリ等の細菌性細胞である。細胞は、ウイルス様粒子が由来するウイルスのための天然宿主細胞であり得るが、これが必要なわけではない。宿主細胞は、粒子形態（すなわち、核酸及びタンパク質を含む集合した桿状）のウイルスもしくは偽ウイルスで、最初に感染させ得るか、あるいは最初の感染に用いられるウイルス核酸が複製して、融合タンパク質を有するウイルス粒子全体の産生を引き起こすことができる限り、核酸状態（すなわち、ウイルスＲＮＡなどのＲＮＡ；ｃＤＮＡもしくはｃＤＮＡから作製された流出転写物）で最初に感染され得る。
【０１２５】
親和性部分が、ＶＬＰへの集合の後、コートタンパク質に化学的に取り付けられ得る場合、親和性部分は、ＰａｐＭＶに関して上述したとおり、種々の化学的方法によって結合され得る。
【０１２６】
ａＰａｐＭＶ又はａＶＬＰへの抗原の複合体化
抗原は、該抗原をａＰａｐＭＶ又はａＶＬＰに接させることにより、ａＰａｐＭＶ又はａＶＬＰに複合体化され得る。複合体化は、例えば、水素結合、イオン結合、疎水性相互作用もしくはファンデルワールス相互作用といった少なくとも１つの非共有化学結合によって起こり得る。親和性部分への抗原の共有結合もまた、意図される。
【０１２７】
複合体化は、例えば、撹拌の有無に関わらず溶液中で抗原とａＰａｐＭＶ又はａＶＬＰとを単純に混合することにより、達成され得る。上述の通り、当該技術分野で公知のように、適切な化学剤を該混合液に加えて、ａＰａｐＭＶもしくはａＶＬＰと抗原との間の共有結合の形成を誘導し、それによりａＰａｐＭＶもしくはａＶＬＰと抗原との間の取り付けの強さを改善することができる。複合体化されたの後、あらゆる複合体化されなかった抗原及び／又はａＰａｐＭＶもしくはａＶＬＰ及び／又は架橋剤（単数もしくは複数）は、標準的な技術、例えば、複合体化されなかったパートナーからより大きなタンパク質を単離する、クロマトグラフィーゲルろ過技術を用いて、必要に応じて除去され得る。超遠心分離法もまた、ａＰａｐＭＶ／ａＶＬＰ及び複合体化された複合体から抗原を分離するために用いられ得る。
【０１２８】
抗原：ａＰａｐＭＶ／ａＶＬＰの最適比は、当業者により容易に決定され得る。例えば、重量：重量ベース（basis）で、約１０：１から１：１０の間の抗原：ａＰａｐＭＶ／ａＶＬＰの比が、有用であり得る。１つの実施形態において、重量：重量ベースで約９：１から１：９の間の抗原：ａＰａｐＭＶ／ａＶＬＰの比が、ＡＣＡＳを形成するために用いられる。別の実施形態において、重量：重量ベースで約８：１から１：８の間の抗原：ａＰａｐＭＶ／ａＶＬＰの比が、ＡＣＡＳを形成するために用いられる。他の実施形態において、重量：重量ベースで約７：１から１：７、約６：１から１：６、約５：１から１：５の間の抗原：ａＰａｐＭＶ／ａＶＬＰの比が、ＡＣＡＳを形成するために用いられる。
【０１２９】
ａＰａｐＭＶもしくはａＶＬＰがその標的抗原に結合する能力は、例えば、フローサイトメトリー（例えば、Morin ら、 2007, J. Biotechnology, 128: 423-434参照）、電子顕微鏡、超遠心分離法を用いたプルダウンアッセイ又はＥＬＩＳＡ型アッセイ（本明細書に与えた実施例参照）といった標準的技術により、測定され得る。
【０１３０】
有効性の評価
上述の通り、本発明のＡＣＡＳは、動物において免疫応答を誘導することができる。免疫応答は、体液性応答、細胞性応答もしくは体液性及び細胞性応答の組み合わせであり得る。本発明のＡＣＡＳが動物において免疫応答を誘導する能力は、以下及び実施例中に記載するように、当業者公知の方法により試験され得る。例えば、ＡＣＡＳは好適な動物モデルに対して、例えば皮下注射によりもしくは鼻腔内に投与され得、並びに例えばＥＬＩＳＡにより、抗体の進展が評価された。
【０１３１】
細胞性免疫応答もまた、当該技術分野で公知の標準的な技術により評価され得る。例えば、細胞性免疫応答は、インビトロ及びインビボにおいて、樹状細胞により、ａＰａｐＭＶ又はａＶＬＰに複合体化した抗原の、特異的Ｔリンパ球に対するプロセシング及び交差提示を評価することにより測定され得る。細胞性免疫（Ｔリンパ球）の誘導を評価するための他の有用な技法としては、例えば、サイトカインの誘導をモニターするためのＥＬＩＳＡ（例えば、Leclerc, D., et al., J. Virol, 2007, 81(3):1319-26）により、Ｔ細胞増殖及びＩＦＮ−γ分泌放出をモニタリングすることが挙げられる。
【０１３２】
本発明のＡＣＡＳのワクチンとしての有効性を評価するために、チャレンジ研究が行われ得る。そのような研究は、標準的な方法による、本発明のＡＣＡＳでの実験動物（マウス等）の群の接種を伴う。非接種動物及び／又は市販のワクチンで接種された動物を含む対照群、あるいは他の陽性対照を並行して用意する。免疫後の適切な期間の後、動物を適切な病原体、アレルゲンなどを用いてチャレンジする。次いで、接種前及び後並びにチャレンジ後の動物から採取した血液サンプルを、抗体応答について解析する。抗体応答のための好適な試験としては、これらに限定されないが、ウエスタンブロット解析及び酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）が挙げられる。動物はまた、抗原を含有する物質もしくは生物に関する条件の進展についてモニターされ得る。
【０１３３】
同様に、腫瘍関連抗原を含むＡＣＡＳは、実験動物の接種、及び、例えば皮下的に、動物内に癌細胞を移植することによるその後のチャレンジ、並びに該動物内での腫瘍の成長のモニタリングによって、その予防効果について試験され得る。代替的に、腫瘍関連抗原を含むＡＣＡＳの治療的効果は、癌細胞の移植及び腫瘍の確立の後、実験動物にＡＣＡＳを投与し、その後で腫瘍の増殖及び／もしくは転移をモニタリングすることにより、試験され得る。
【０１３４】
免疫原性組成物
本発明は、1以上の本発明のＡＣＡＳを１以上の非中毒性の薬学的に許容できる担体、希釈剤及び／又は賦形剤と共に含む、免疫原性組成物を提供する。そのような組成物は、例えば、疾病もしくは疾患の予防及び／又は治療のためのワクチンもしくは免疫賦活剤として用いられるのに好適である。必要に応じて、他の活性成分、アジュバント及び／もしくは免疫賦活剤を、該組成物に含めてもよい。したがって、本発明の１つの実施形態において、免疫原性組成物は、１以上のＰａｐＭＶ、ＶＬＰ、ａＰａｐＭＶもしくはａＶＬＰと共に、１以上のＡＣＡＳを含んでもよい。
【０１３５】
免疫原性組成物は、種々のルートにより投与するために処方され得る。例えば、組成物は、経口、局所、直腸もしくは非経口投与又は吸入もしくは噴霧による投与のために処方され得る。本明細書内で用いられる用語、非経口的には、皮下接種、静脈内、筋肉内、くも膜下腔内、胸骨内投与又は点滴手法が含まれる。本発明の１つの実施形態において、組成物は、局所、直腸もしくは非経口投与又は吸入もしくは噴霧による投与のために処方され得る。別の実施形態において、組成物は非経口投与のために製剤化される。
【０１３６】
免疫原性組成物は、好ましくは、有効量の１以上の本発明のＡＣＡＳを含む。本明細書内で用いられる用語「有効量」は、動物において検出可能な免疫応答を産み出すために必要とされるＡＣＡＳの量を言う。所与の兆候に対するＡＣＡＳの有効量は、例えば、細胞培養アッセイ、又は動物モデル、通常、げっ歯類、ウサギ、イヌ、ブタもしくは霊長類のいずれかにおいて最初に推定され得る。動物モデルはまた、適切な濃度範囲及び投与ルートを決定するためにも用いられ得る。そのような情報は、次いで、ヒトを含む治療される動物における投与のための有効投与量及びルートを決定するために用いられ得る。本発明の１つの実施形態において、単位用量は、約１０μｇから約１０ｍｇの間のコートタンパク質を含む。別の実施形態において、単位用量は、約１０μｇから約５ｍｇの間のコートタンパク質を含む。さらなる実施形態において、単位用量は、約４０μｇから約２ｍｇの間のコートタンパク質を含む。１以上の用量が、動物を免疫するために用いられてもよく、また1以上の用量が、同日又は数日もしくは数週間に渡って投与されてもよい。
【０１３７】
上述の通り、本発明のＡＣＡＳは、複数の抗原を含んでもよく、並びにしたがって、単一のＡＣＡＳが多価ワクチン製剤を提供し得る。多価ワクチンはまた、疾病又は疾患惹起薬剤の群の様々な異なるメンバーの間で保存されている、抗原を含むＡＣＡＳの使用を通じて提供され得る。各ＡＣＡＳが異なる抗原を含んでいる、複数のＡＣＡＳを含む多価ワクチン組成物もまた、意図されている。多価ワクチンは、例えば、１より多くの細菌、ウイルス、菌類、原生生物、寄生虫、癌、自己免疫疾患もしくはアレルゲンに対する防御を提供するため、又はこれらの疾病もしくは疾患惹起薬剤の組み合わせに対する防御を提供するために、有用である多価ワクチン製剤処方としては、より高い価数を有するワクチンに加えて、二価及び三価製剤が挙げられる。本発明の１つの実施形態は、多価ワクチンを提供する。本発明の別の実施形態は、複数の疾病又は疾患惹起薬剤に渡って保存された抗原を含む多価ワクチンを提供する。さらなる実施形態は、各ＡＣＡＳが異なる抗原を含んでいる、複数の（即ち２以上の）ＡＣＡＳを含む多価ワクチンを提供する。
【０１３８】
各ＡＣＡＳが異なる抗原を含んでいる、複数の（即ち２以上の）ＡＣＡＳを含むワクチン製剤処方はまた、該製剤中のエピトープがより多いことによる改善された防御を提供し得る。したがって、本発明の１つの実施形態は、各ＡＣＡＳが異なる抗原を含んでいる、２以上のＡＣＡＳを含むワクチン製剤を提供する。別の実施形態において、各ＡＣＡＳが同一の疾病又は疾患惹起薬剤由来の異なる抗原を含んでいる、少なくとも２つのＡＣＡＳを含むワクチン製剤を提供する。別の実施形態において、各ＡＣＡＳが疾病又は疾患惹起薬剤の異なる部分を含んでいる、少なくとも２つのＡＣＡＳを含むワクチン処方を提供する。
【０１３９】
経口使用のための組成物は、例えば、錠剤、トローチ剤、ロゼンジ、水性もしくは油性の懸濁液、分散性粉末もしくは顆粒剤、エマルションの硬もしくは軟カプセル剤、又はシロップもしくはエリキシル剤として製剤化され得る。そのような組成物は、医薬組成物の製造のために当業者に公知の標準的な方法にしたがって調製され得、並びに、薬剤的に的確で、かつ口当たりのよい調製を提供するために、甘味剤、香料剤（flavouring agents）、着色剤（colouring agent）及び保存剤からなる群より選ばれる１以上の剤を含有してもよい。錠剤は、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムもしくはリン酸ナトリウム等の不活性希釈剤；コーンスターチもしくはアルギン酸等の造粒剤及び崩壊剤；デンプン、ゼラチンもしくはアカシア等の結合剤、並びにステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸もしくはタルク等の平滑剤を含む、好適な非中毒性の、薬学的に許容される賦形剤との混合物中にＡＣＡＳを含む。錠剤はコーティングされていなくてもよく、又は、消化管内での崩壊及び吸収を遅らせるために公知の技術によりコーティング被膜されていてもよく、その結果、より長い期間に渡る持続性作用を提供する。例えば、モノステアリン酸グリセリン（glyceryl monosterate）又はジステアリン酸グリセリル等の時間遅延物質が用いられ得る。
【０１４０】
経口使用のための組成物もまた、ＡＣＡＳが、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムもしくはカオリンといった、不活性固形希釈剤と混合された、硬ゼラチンカプセルとしてあるいは、活性成分が、水又はピーナッツ油、流動パラフィンもしくはオリーブ油等の油媒体と混合された、軟ゼラチンカプセルとして提供され得る。
【０１４１】
水性懸濁液として製剤化された組成物は、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（hydropropylmethylcellulose）、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、トラガントゴム及びアカシア等の懸濁剤；天然に存在するホスファチ（例、レシチン）、又はアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合物（例、ポリオキシエチレンステアリンエテアラート）、又はエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合物（例、ヘプタ−デカエチレンオキシセタノール）、又は、エチレンオキシドと脂肪酸及びヘキシトール由来の部分エステルとの縮合物（例、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート）、又は、エチレンオキシドと脂肪酸及び無水ヘキシトール由来の部分エステルとの縮合物（例、ポリエチレンソルビタンモノオレエート）、等の分散剤又は湿潤剤、１以上の好適な賦形剤との混合物中にＡＣＡＳを含有する。水性懸濁液もまた、１以上の保存料（例、エチルもしくは、ｎ−プロピル  ｐ−ヒドロキシ−ベンゾエート）、１以上の着色剤（colouring agents）、１以上の香料剤（flavouring agents）もしくはスクロース又はサッカリン等の１以上の甘味剤を含有してもよい。
【０１４２】
組成物は、植物油（例、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油もしくはココナッツ油）中、又は流動パラフィン等の鉱油中のＡＣＡＳを懸濁することにより油性懸濁液として製剤化され得る。油性懸濁液は、増粘剤（例、蜜ろう、固形パラフィンもしくはセチルアルコール）を含有してもよい。口当たりのより経口剤を提供するために上に説明したような甘味剤、及び／又は香料剤（flavouring agents）を添加してもよい。これらの組成物は、アスコルビン酸等の酸化防止剤の添加により保存され得る。
【０１４３】
免疫原性組成物は、後に、水の添加により水性懸濁液を調製するために用いられ得る、分散性粉末もしくは顆粒剤として製剤化され得る。そのような分散性粉末もしくは顆粒剤は、１以上の分散剤もしくは湿潤剤、懸濁剤及び／又は保存料との混合物中のＡＣＡＳを提供する。好適な分散剤もしくは湿潤剤及び懸濁剤は、既に上述したものにより例示される。追加の賦形剤（例、甘味剤、香料剤及び着色剤）もまた、これら組成物に含まれ得る。
【０１４４】
本発明の免疫原性組成物はまた、オイルインウォーターエマルションとして製剤化され得る。油相は、植物油（例、オリーブ油もしくはラッカセイ油）、もしくは鉱油（例、流動パラフィン）であり得、もしくはこれらの油の混合物であってもよい。これらの組成物に組み込むために好適な乳化剤としては、天然に存在するガム（例、アカシアゴムもしくはトラガントゴム）；天然に存在するリン脂質（例、ダイズ、レクチン）；又は脂肪酸及びヘキシトール、無水物に由来するエステルもしくは部分エステル（例、ソルビタンモノオレエート）、並びに該部分エステルのエチレンオキシドとの縮合物（例、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）が挙げられる。エマルションもまた、必要に応じて、甘味剤及び香味料を含有し得る。
【０１４５】
組成物は、ＡＣＡＳを１以上の甘味剤（例、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトールもしくはスクロース）とあわせることにより、シロップもしくはエリキシル剤として製剤化され得る。そのような製剤としては、必要に応じて、１以上の粘滑薬、保存料、香料剤及び／又は着色剤を含有し得る。
【０１４６】
免疫原性組成物は、当該技術分野で公知の方法にしたがって、及び、上述したような好適な１以上の分散剤もしくは湿潤剤及び／又は懸濁剤を用いることにより、無菌注射用の水性もしくは油性懸濁液として製剤化され得る。無菌注射用製剤は、非中毒性で非経口的に許容される希釈液もしくは溶媒に中の無菌注射用溶液もしくは懸濁液、例えば１，３−ブタンジオール溶液であり得る。使用され得る許容されるビヒクル及び溶媒としては、これらに限定されないが、水、リンガー溶液、乳酸リンガー溶液及び等張塩化ナトリウム溶液が挙げられる。他の例としては、溶媒もしくは懸濁媒体剤として従来より使用される、無菌の固定油、及び例えば、合成のモノもしくはジグリセリドを含む、様々な無菌性固定油が挙げられる。オレイン酸等の脂肪酸もまた、注射剤の調製に用いられ得る。
【０１４７】
必要に応じて、本発明の組成物は、抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤、及び不活性ガス等の保存料及び／又は炭水化物（例、ソルビトール、マンニトール、デンプン、スクロース、グルコース、もしくはデキストラン）等の安定剤、タンパク質（例、アルブミンもしくはカゼイン）又はタンパク質含有剤（例、ウシ血清もしくはスキムミルク）を好適なバッファ（例、リン酸バッファ）と共に含有してもよい。組成物の様々な成分のｐＨ及び正確な濃度は、周知のパラメータにしたがって調整されてもよい。
【０１４８】
さらに、アジュバント活性を有する１以上の化合物が、必要に応じてワクチン組成物に添加されてもよい。好適なアジュバントとしては例えば、（水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムもしくは酸化アルミニウム；オイルエマルション（例、バイオールＦ（登録商標）のエマルションもしくはマルコール５２(登録商標)のエマルション）；サポニン、又はビタミンＥ可溶化物（solubilisate）が挙げられる。これらの免疫活性化作用に起因して、ＰａｐＭＶもしくはＰａｐＭＶ  ＶＬＰ（ａＰａｐＭＶ及びａＶＬＰを含む）はまた、必要に応じて、アジュバントとして免疫原性組成物に添加され得る。オプソニン化ワクチン組成物もまた、本発明により包含され得る（例、前もってワクチンで免疫された動物もしくはヒトから単離された抗体を含む、ワクチン組成物）。前もってワクチンで免疫された動物もしくはヒトから単離された抗体に基づく組換え抗体もまた、ワクチン組成物をオプソニン化するために用いられ得る。
【０１４９】
本発明のＡＣＡＳを含む組成物と市販のワクチンとの組み合わせもまた、本発明に包含される。
【０１５０】
他の医薬組成物及び医薬組成物を調製する方法は、当該技術分野で公知であり、例えば、”Remington：The Science and Practice of Pharmacy" (かつての"Remingtons Pharmaceutical Sciences"); Gennaro, A., Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2000)に記載されている。
【０１５１】
ＡＣＡＳの使用
本発明は、ＡＣＡＳの多くの適用及び使用並びにそれを含む免疫原性組成物を提供する。本発明の１つの実施形態は、例えばアジュバント、免疫賦活物質、免疫賦活剤もしくはワクチンとして投与されたときに、動物において免疫応答を誘導するためのＡＣＡＳの使用を提供する。免疫応答は、体液性応答、細胞性応答、又はその両方であってもよい。本発明の１つの実施形態において、ＡＣＡＳは、動物における体液性応答を誘導することができる。別の実施形態において、ＡＣＡＳは、動物における細胞性応答を誘導することができる。さらなる実施形態において、ＡＣＡＳは、動物において細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を誘導することができる。別の実施形態において、ＡＣＡＳは、動物において体液性及び細胞性応答の両方を誘導することができる。
【０１５２】
本発明はまた、ａＰａｐＭＶもしくはａＶＬＰに複合体化された抗原（単数もしくは複数）に結合できる抗体を選択するためのＡＣＡＳの使用を提供する。本発明は、アジュバント、免疫増強剤、免疫賦活剤、ワクチン及び／又は医薬組成物等の、診断及び薬剤の調製のための組成物の使用をさらに提供する。
【０１５３】
したがって、本発明のＡＣＡＳは、免疫応答の誘導を必要とする動物における疾病もしくは疾患の予防を含めた治療における使用に好適である。疾病又は疾患の性質に応じて、治療は、体液性免疫応答、細胞性免疫応答もしくはその両方の誘導を必要とし得る。例えば、特定の感染は、単に動物における体液性応答の誘導により効果的に予防され得、一方、他の疾病に対する完全な防御は、体液性及び細胞性応答の両方の誘導を必要とするかもしれない。例としては、体液性応答を誘導するワクチンは、腸チフス、狂犬病、ポリオ、コレラ、髄膜炎（ナイセリア・メニンギティディス（Neisseria meningitides）に起因する）、Ｂ型肝炎、ヒトメタニューモウイルス（metapheumovirus）及びインフルエンザのいくつかの種に対して効果的であり得る。他の疾病又は疾患に対する防御は、細胞性応答も誘導された場合に、最も効果的である（例、Ｃ型肝炎、マラリア、森林型熱帯リーシュマニア感染、ＨＩＶ及びヒト結核菌感染）。
【０１５４】
したがって、本発明は、疾病もしくは疾患の予防を含めた治療のための単剤としてのＡＣＡＳの使用、並びに、より複雑な免疫応答を必要とする疾病／疾患のための、併用ワクチンの成分もしくは治療としてのＡＣＡＳの使用を提供する。そのような併用としては、例えば、追加ワクチン、アジュバント及び／又は抗原を挙げることができる。この文脈では、ＡＣＡＳは、治療されている動物における免疫応答を強めるための免疫賦活剤もしくはアジュバントとして作用し得る。ＡＣＡＳもまた、二次ワクチンの投与前の免疫系を刺激するために用いられ得る。したがって、この文脈でのＡＣＡＳの投与は、二次ワクチン、アジュバントもしくは抗原の投与の前、後もしくは同時に起こり得る。
【０１５５】
本発明のＡＣＡＳは、ヒト並びに家畜（domestic）及び家畜（farm animals）を含む、非ヒト動物における使用に好適である。組成物についての投与方針は、任意の他の一般に認められた免疫計画と異なる必要はない。例えば、上述の通り、効果的な免疫応答を誘発するのに十分な量のＡＣＡＳの単回投与を、用いてもよく、あるいは、ＡＣＡＳの初回投与に続き抗原単独もしくはＡＣＡＳで追加免疫する、他の方針が用いられ得る。同様に、ＡＣＡＳもしくは抗原のいずれかによる追加免疫を時々起こして、初回投与後に抗体価が許容されるレベルを下回る場合にうまくいくようにしてもよい。ＡＣＡＳの投与の正確な方法は、例えばＡＣＡＳの構成成分、治療され得る動物及び治療の望ましい最終的な効果に依存するだろう。投与の適切な方法は、当業者により容易に決定され得る。
【０１５６】
該方針が、ＡＣＡＳ及び追加抗原（単数もしくは複数）の投与を含む場合、免疫応答が求められる対象の必要性に応じてＡＣＡＳ構成成分は、抗原（単数もしくは複数）と同時に投与され得、又は抗原（単数もしくは複数）の投与の前もしくは後に投与され得る。
【０１５７】
本発明の１つの実施形態は、従来のワクチンとの複合体化における本発明のＡＣＡＳの使用を提供する。本実施形態によれば、ＡＣＡＳは従来のワクチンと同時に投与されてもよく（例、２つの組成物をあわせることによる）、又は従来のワクチンの投与の前もしくは後に投与され得る。
【０１５８】
本発明のＡＣＡＳは、予防的に用いられ得（例、ウイルス、細菌もしくは他の感染粒子による感染、又は腫瘍の進行を予防するため）、又は、感染、自己免疫もしくはアレルギー反応、薬物添加もしくは癌に関連する疾病もしくは疾患の影響を寛解させるために治療的に用いられてもよい。本発明の１つの実施形態において、ＡＣＡＳは、動物における疾病もしくは疾患を予防するために予防的に用いられる。ＡＣＡＳが投与される動物は、ヒト又は、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ニワトリ、アヒル、シチメンチョウ、非ヒト霊長類、モルモット、ウサギ、フェレット、ラット、ハムスター、マウス、魚類もしくは鳥類等の非ヒト動物であってもよい。
【０１５９】
上述の通り、本発明のＡＣＡＳは、例えば、病気を治療するための活性化を必要とする経路、及び組成物に似含めるため又は組成物と使用するために選ばれた抗原に応じて、種々の疾病もしくは疾患の予防もしくは治療において用いられ得る。限定されない例としては、インフルエンザ（種々のインフルエンザウイルス由来の抗原を用いて）、腸チフス（Ｓ．チフィ由来の抗原を用いて）、ＨＣＶ感染（ＨＣＶ抗原を用いて）、ＨＢＶ感染（ＨＢＶ抗原を用いて）、ＨＡＶ感染（ＨＡＶ抗原を用いて）、デルタ肝炎（ＨＤＶ抗原を用いて）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ抗原を用いて）、Ｇ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ抗原を用いて）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ抗原を用いて）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ抗原を用いて）、エプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ抗原を用いて）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ抗原を用いて）、他のヒトヘルペスウイルス（例えば、ＨＨＶ６もしくはＨＨＶ７抗原を用いて）、ＨＩＶ感染（ＨＩＶ抗原を用いて）、ポリオ（ポリオウイルス抗原を用いて）、ジフテリア（ジフテリア毒素由来の抗原を用いて）、アレルギー反応（種々のアレルゲンを用いて）及び癌（種々の腫瘍関連抗原を用いて）が挙げられる。他の使用としては、例えば炎症性疾患（例えば、関節炎）の予防もしくは治療並びに、鳥インフルエンザウイルス、ヒト呼吸器合胞体ウイルス、デングウイルス、麻疹ウイルス、ヒトパピローマウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ブタロタウイルス、ブタパルボウイルス、ニューカッスル病ウイルス、口蹄疫ウイルス、ブタコレラウイルス、アフリカブタ熱ウイルス、ウシ感染性鼻気管炎ウイルス、感染性喉頭気管炎ウイルス、ラクロスウイルス、新生仔ウシの下痢ウイルス、ウシ呼吸器合胞体ウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ、連鎖球菌性細菌、淋菌性細菌、腸内細菌及び寄生虫による感染（例えば、リーシュマニアもしくはマラリア）が挙げられる。
【０１６０】
本発明もまた、「自己」遺伝子産物に起因するかもしくはこれにより悪化する疾病もしくは疾患を予防及び／又は弱毒化する抗体を産生するためのＡＣＡＳの使用を提供する。そのような疾病もしくは症状の例としては、移植片対宿主病、ＩｇＥ介在アレルギー反応、アナフィラキシー、成人呼吸促迫症候群、クローン病、アレルギー性喘息、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、糖尿病、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、グレーブス病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、炎症性自己免疫疾患、重症筋無力症、免疫増殖性疾患リンパ節症（immunoproliferative disease lymphadenopathy）（ＩＰＬ）、血管免疫増殖性リンパ節症（ＡＩＬ）、免疫芽球性リンパ節症（ＩＢＬ）、関節リウマチ、糖尿病、多発性硬化症、アルツハイマー病、骨粗鬆症、並びに、リウマチ熱、デング熱、ライム病染を含む特定の感染、及び感染性多発性関節炎に関連する自己免疫症状が挙げられる。
【０１６１】
本発明は、ホルモン、薬物及び毒性化合物等の化合物に対する免疫応答を刺激するＡＣＡＳの使用をさらに提供する。様々な薬物、ホルモン及び毒性化合物に対する免疫応答は、該化合物に曝露された個体における治療として、該化合物への曝露の危険性がある個体を防御するため、又は該化合物に対する中毒を予防もしくは治療するために用いられる。
【０１６２】
本発明もまた、例えば、ＡＣＡＳに複合体化する抗原に対する抗体をスクリーニングするための、スクリーニング剤としての、ＡＣＡＳの使用を提供する。ＡＣＡＳは、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）又はウエスタンブロット等の従来の免疫学的技術に対して容易に適応し得、したがって診断及び研究の文脈において有用である。
【０１６３】
キット
本発明は、１以上のＡＣＡＳを含む薬学的キットをさらに提供する。キットの個々の構成要素は、別々の容器中に包装され、医薬品もしくは生物学的製品の製造、使用又は販売を規制する行政機関により定められた形態の表示がそのような容器に関連付けられてもよく、ここで該表示は、製造、使用又は販売の該機関による承認を反映したものである。キットは、必要に応じて、ＡＣＡＳの使用方法もしくは投与計画の概要を述べた指示書もしくは説明書を包含してもよい。
【０１６４】
キットの１以上の構成要素が溶液として提供される場合（例、水溶液もしくは滅菌水溶液）、容器手段は、それ自体が、そこから溶液が対象に投与され得るか、又はキットのほかの構成要素に適用されて混合され得る、吸入器（inhalant）、シリンジ、ピペット、点眼器又は他のそのような器具であってもよい。
【０１６５】
キットの構成要素はまた、乾燥又は凍結乾燥形態で提供されてもよく、並びにキットは、凍結乾燥成分の再構成のための好適な溶媒を含有し得る。容器の数もしくは種類に関係なく、本発明のキットもまた、患者に対する組成物の投与を補助するための装置を含んでもよい。そのような装置は、吸入器（inhalant）、シリンジ、ピペット、鉗子、計量スプーン、点眼器もしくは類似の医学的に承認された送達媒体であり得る。
【０１６６】
抗体検出における使用のための、１以上の本発明のＡＣＡＳを含有するスクリーニングキットも、提供される。キットは、診断キット又は研究目的のために意図されたキットであり得る。キットの個々の構成要素は、別々の容器中に包装され、医薬品もしくは生物学的製品の製造、使用又は販売を規制する行政機関により定められた形態の表示がそのような容器に関連付けられてもよく、ここで該表示は、製造、使用又は販売の該機関による承認を反映したものである。キットは、必要に応じて、ＡＣＡＳの使用方法もしくは投与計画の概要を述べた指示書もしくは説明書を包含してもよい。
【０１６７】
以下の実施例は、本明細書内に記載した本発明のより良い理解を得るために示している。これらの実施例は、本発明の例示的な実施形態を記載することを意図しており、いかなる意味でも本発明の範囲を限定することは意図していない。
【実施例】
【０１６８】
実施例１：ＰａｐＭＶのアジュバント効果
ＰａｐＭＶの精製
モザイク病の症状を示す感染したパパイヤの葉から分画遠心法により、ＰａｐＭＶを精製した。感染した葉（１００ｇ）を１０ｍＭ  ＥＤＴＡ含有１００ｍＬ  ５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中で、市販のブレンダー内で粉砕した。粉砕した葉をチーズクロスに通してろ過し、１％のトリトンＸ−１００をろ液に添加し、ろ液を穏やかに１０分間撹拌した。ろ液の４分の１の量に等しい量までクロロホルムを滴下した。溶液をさらに３０分間４℃で撹拌し、１００００ｇで２０分間遠心分離し、沈殿を除去した。上清を、１２０分間の高速（１０００００ｇ）遠心分離に供した。ウイルスペレットを懸濁し、スクロースクッション（３０％  スクロース）を通した、１０００００ｇで３．５時間の別の高速遠心分離に供した。最終ウイルスペレットを、１０ｍＬの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）に懸濁した。色が持続した場合、クロロホルムで追加の清澄を行った。精製したウイルスを、超遠心分離法により回収した。
【０１６９】
抗原
ＬＰＳフリーＯＶＡグレードＶＩを、Sigma-Aldrich Chemical Co, St Louis, MOから購入した。ニワトリ卵白リゾチーム（ＨＥＬ）をResearch Organics Inc. Cleveland, OHから購入した。Ｅ．コリＯ１１１：Ｂ４由来のＬＰＳをSigma-Aldrich, St Louis, MOから購入した。
【０１７０】
免疫
ＢＡＬＢ／ｃマウス、６−８週齢を、メキシコ国立自治大学（ＵＮＡＭ）、医学部、実験的医薬研究部門の動物施設下で飼育及び維持し、優良実験室規範のガイドラインにしたがって世話をした。アジュバントの効果を調べるために、マウスの群を、２ｍｇのＯＶＡもしくはＨＥＬ単独で、又は３０ｍｇのＰａｐＭＶ、ＣＦＡ１：１（ｖ／ｖ）、もしくは５ｍｇのＥ．コリＯ１１１：Ｂ４由来のＬＰＳ（Sigma-Aldrich）と共に、０日目に腹腔内に免疫した。対照マウスに食塩溶液のみを注射した。図２に示すように、種々の時間において、血液試料を逆眼窩血脈洞から採取した。個々の血清試料を、解析まで−２０℃で保管した。３匹のマウスを各実験に用いた。
【０１７１】
ＥＬＩＳＡによる抗体価の測定
高結合９６ウェルポリスチレンプレート（Highpbinding 96-well polystyrene plates）（Corning（登録商標）, New York, NY）を、０．１Ｍ  炭酸塩−重炭酸塩バッファ（ｐＨ９．５）中の１ｍｇ／ｍＬのＰａｐＭＶ、１００ｍｇ／ｍＬのＨＥＬ、又は１５０ｍｇ／ｍＬ  ＯＶＡでコートした。プレートを１時間３７℃で、次いで終夜４℃でインキュベートした。翌朝使用する前に、プレートを０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ（ｐＨ７．２）（ＰＢＳ−Ｔ）(Sigma-Aldrich)で３回洗浄した。非特異的結合を、ＰＢＳで希釈した５％脱脂粉乳（ＰＢＳ−Ｍ）で1時間、３７℃でブロックした。洗浄の後、マウス血清をＰＢＳ−Ｍで１：４０に希釈し、２倍の段階希釈液をウェルに添加した。プレートを１時間３７℃でインキュベートし、次いで、ＰＢＳ−Ｔで４回洗浄したペルオキシダーゼ抱合ウサギ抗マウスＩｇＭ（最適希釈１：１０００）ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ抗体（Zymed, San Francisco, CA）又はＩｇＧ３（最適希釈１：３０００）（Rockland, Gilbertsville, PA）を添加し、プレートを１時間３７℃でインキュベートし、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。３０％  過酸化水素を含有する０．１Ｍ  クエン酸バッファ（ｐＨ５．６）中のオルトフェニレンジアミン（０．５ｍｇ／ｍＬ；Sigma-Aldrich）を、酵素基質として用いた。反応を２．５Ｎ  Ｈ２ＳＯ４で停止し、BIOLINX 2.22ソフトウェアを備えた自動ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Dynex Technologies MRII, Chantilly, VA, USA）を用いて、４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。抗体価は、−ｌｏｇ２希釈×４として与えられる。陽性の力価は、陰性対照の平均値よりの３ＳＤ高いものとして定義した。
【０１７２】
結果
アジュバントが低免疫原性ワクチンに対して共投与される場合の、抗体応答への自然免疫応答の転換を観察した。アジュバントは、抗原に対する抗体もしくは細胞性免疫応答を強化又は増強することができる。ＰａｐＭＶが、他の抗原に対する長期に渡る抗体応答を促進し得るアジュバントであるかどうかを判定するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ＯＶＡ又はＨＥＬを、単独又は以下のアジュバント：ＰａｐＭＶ、ＣＦＡもしくはＬＰＳと共にのいずれかで免疫した。ＯＶＡ又はＨＥＬに特異的なＩｇＧ抗体価は、ＥＬＩＳＡにより、示したタイムポイントにおいて測定した（図２Ａ及びＢ）。ＰａｐＭＶのアジュバント効果は、免疫した動物におけるＯＶＡ及びＨＥＬに対する総ＩｇＧ応答で見られた。ＰａｐＭＶにより誘導されたアジュバント効果は、免疫後３０日目のＨＥＬに関して見られ、その時、ＨＥＬ単独により増加した抗体価と比較して、抗体価が８倍になった。抗体価におけるこの差異は、１２０日目までは維持されたが、４００日目までは維持されなかった（図２Ａ）。ＬＰＳは、免疫後最初の３０日間においてのみアジュバント効果を誘導したが、ＣＦＡは、免疫後８日目から実験終了の４００日目までが、最も強いアジュバント効果を示した（図２Ａ）。ＯＶＡでの免疫について、総ＩｇＧ抗体価におけるアジュバント効果が、最初の免疫後１２０日目までにのみ見られ、その後抗体価は時間と共に減少し、４００日目にはＯＶＡと比較すると４倍の高さであった（図２Ｂ）。ＯＶＡ及びＯＶＡとアジュバントとの共免疫（ＰａｐＭＶは総ＩｇＧ応答においてアジュバント効果を示さなかった）により、どのＩｇＧサブクラスが誘導されたかを同定するために、２０日目にさらなる解析を行った。ＰａｐＭＶ、ＬＰＳ、及びＣＦＡは、ＯＶＡ特異的ＵｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂ抗体価を誘導し、一方ではＯＶＡ単独が、ＩｇＧ１特異的抗体価のみを誘導した（図２Ｃ−Ｅ）。ＯＶＡが使用されるアジュバントのいずれかと共免疫される場合、ＩｇＧ１に対するアジュバント効果は見られなかった。これらの結果は、ＰａｐＭＶ、ＬＰＳ、及びＣＦＡが、ＯＶＡに対するＩｇＧサブクラス応答においてアジュバント効果を誘導することを示す。さらに、ＰａｐＭＶは、モデル抗原に対する特異的抗体価の長期に渡る増加を誘導する、アジュバント特性を示す。総合すると、これらのデータは、ＰａｐＭＶが、観察された、抗原特異的である長期に渡る抗体応答への先天性応答の転換を介在し得る、固有のアジュバント特性を有することを示唆する。
【０１７３】
実施例２：Ｓ．チフィポーリンタンパク質の精製
以下の精製手順を、ＯｍｐＣ及びＯｍｐＦの精製に用いた。精製手順は、Secundino ら(2006), Immunology 117:59に記載されたものに基づく。
【０１７４】
２つのタンパク質をＳ．チフィから共精製した。ＯｍｐＣ及びＯｍｐＦの個々の精製は、ＯｍｐＣ[STYC 171 (ＯｍｐＣ-)]又はＯｍｐＦ[STYF302 (ＯｍｐＦ-)]オープンリーディングフレームが中断された、Ｓ．チフィノックアウト変異体を用いて達成した。細菌のノックアウト変異型由来の個々のタンパク質の精製の手順は、共精製の場合にしたがった。本手順を以下に概説する。
【０１７５】
細菌種、Ｓ．チフィ９，１２，Ｖｉ：ｄ（ATCC 9993）を、酵母エキス、マグネシウム及びグルコースを添加した最少培地Ａ中で、３７℃、２００ｒｐｍで成育した。酵母エキス、マグネシウム及びグルコースを添加した、１０Ｌ  最少培地Ａについての処方は：５．０ｇの無水クエン酸Ｎａ（ＮａＣ６Ｈ５Ｏ７：２Ｈ２Ｏ）、３１．０ｇ  一塩基のＮａＰＯ４（ＮａＨ２ＰＯ４）、７０．０ｇ  二塩基のＮａＰＯ４（Ｎａ２ＨＰＯ４）、１０．０ｇ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、２００ｍＬ  酵母抽出溶液５％（３００ｍＬ中１５．０ｇ）である。１．４３４Ｌ  培地を４Ｌの三角フラスコに分配した。滅菌を１２１℃、１５ｌｂｓpression/in2、１５分で行った。次いで、各フラスコに（o each flask）：６．０ｍＬの滅菌ＭｇＳＯ４溶液  ２５％及び６０．０ｍＬのグルコース溶液  １２．５％を添加した。フラスコに、終夜培養のＳ．チフィを接種し、ＯＤ５４０が１．０に達した時に、培養を停止し、７５００ｒｐｍで１５分間、４℃で培養物を遠心分離した。ペレットを１００ｍＬ  最終Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．７（６．０ｇ  Ｔｒｉｓ塩基／Ｌ）で懸濁し、バイオマスを９０分間、氷上で超音波処理し、次いで７５００ｒｐｍで、２０分間４℃で遠心分離した。各１０ｍＬの上清に：２．７７ｍＬ  ＭｇＣｌ２  １Ｍ、２５ｍｌ  ＲＮａｓｅＡ（１００００Ｕ／ｍＬ）、２５ｍｌ  ＤＮａｓｅＡ（１００００Ｕ／ｍＬ）を添加した。次いで、混合物を３７℃及び１２０ｒｐｍで３０分間インキュベートした。
【０１７６】
混合物からのポーリンの抽出は、まず４５０００ｒｐｍで、４５分間４℃で混合物を超遠心分離をし、そして、及びペレットを保持することにより行った。次いで、ペレットを１０ｍＬ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ−ＳＤＳ  ２％に懸濁し、続いてホモジナイズした。次に、インキュベーションことを３２℃、１２０ｒｐｍ、３０分間で行い、混合物を４００００ｒｐｍ、３０分間、２０℃で（fat）超遠心分離し、ペレットを保持した。ペレットを５ｍＬ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ−ＳＤＳ  ２％に再懸濁し、続いてホモジナイズ及び３２℃、１２０ｒｐｍ、３０分間のインキュベーションことを行った。４００００ｒｐｍ、３０分間、２０℃での別の超遠心分離ことを行い、ペレットを保持した。ペレットを、２０ｍＬ  Nikaidoバッファ−ＳＤＳ  １％に再懸濁し、続いてホモジナイズした。［１ＬのNikaidoバッファとして：６．０ｇ  Ｔｒｉｓ塩基、１０．０ｇ  ＳＤＳ、２３．４ｇ  ＮａＣｌ、１．９ｇ  ＥＤＴＡを水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．７に調整した。次いで、０．５ｍＬ  β−メルカプトエタノール溶液を添加した。］次いで、混合物を３７℃で、１２０ｒｐｍ、１２０分間インキュベートした。最後に、混合物を４００００ｒｐｍ、４５分間、２０℃で超遠心分離し、ポーリン抽出物を含有する上清を回収した。
【０１７７】
ポーリンは、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）を用いて、上清から精製した。精製工程の間、β−メルカプトエタノールを含まない０．５×Nikaidoバッファ（上記参照）を使用した。タンパク質は、流速：１０ｍＬ／分でSephacryl S-200 (FPLC WATERS 650 E)を用いて分離した。カラムに２２ｍＬの上清をロードした。溶出画分を２６０ｎｍ及び２８０ｎｍでモニターした。精製ポーリンを含有するメインピークを保持し、４℃で保管した。精製ポーリンは、長期間安定であった（１年以上）。
【０１７８】
結果
図３Ｂは、上述の手順により精製された、ポーリン、ＯｍｐＣ及びＯｍｐＦのＳＤＳ−ＰＡＧＥのプロファイルを示す。
【０１７９】
実施例３：ＯｍｐＣ又はＯｍｐＦに対する親和性ペプチドを含むＰａｐＭＶ  ＶＬＰの産生及び遺伝子操作
【０１８０】
親和性ペプチドの選択
Ph.D-7 Phage Display Peptide Library Kit(New England Biolabs, Inc.)を用いて、精製ＯｍｐＣ及びＯｍｐＦに対する特異的ペプチドを選んだ。以下のプロトコルは、「パニング(panning)」として知られるｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択方法であり、これは、製造者のプロトコルにしたがって行った。簡潔に述べれば、２×１０１１ファージをＥＬＩＳＡプレートのウェルの底に結合させた１０μｇの精製ＯｍｐＣ又はＯｍｐＦに添加し、ウェルの内容物を室温で１時間、穏やかに混合した。結合しなかったファージを１ｍｌの２００ｍＭ  グリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．２）を用いて、室温で１０分間インキュベーションすることにより溶出した。上清を中和するために、並びにファージが死滅するのを防ぐために、１５０μｌのＩＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．１）を添加した。次いで、溶出したファージを増幅し、結合配列に有利なようにプールを濃縮するための、さらなる結合／増幅サイクルを通じて採取した。ウォッシュバッファはパニングの最初のラウンドのために０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有し、続くラウンドのために０．５％に増やした。各パニングラウンドの間に、選ばれたファージをＥ．コリＥＲ２７３８中で増幅した。サイクルを３回繰り返し、それぞれのポーリンタンパク質についての最も高い親和性を伴うペプチドを選んだ。このようにして同定されたペプチドを図３に示す。
【０１８１】
【表３】
2010508857.tif 000005
【０１８２】
選ばれた親和性ペプチドに融合された、高結合活性ＰａｐＭＶ  ＶＬＰの遺伝子操作、発現、及び精製
【０１８３】
各ポーリン、ＯｍｐＣ及びＯｍｐＦに対して、１つの親和性ペプチドを、上述のパニング過程において同定されたものより選んだ。対応するＤＮＡ配列を、ＰａｐＭＶコートタンパク質(ＣＰ)のＣ末端においてクローン化された。ＰａｐＭＶ  ＣＰ  ＣＰΔＮ５（Tremblay, M-H.,ら、 2006, FEBSJ., 273:14-25）を、テンプレートとして用いた。各選ばれたペプチドをコードしている配列を、ＰＣＲを用いて導入し、ｐＥＴ−３Ｄ発現ベクター(Stratagene, La Jolla, CA)内にクローン化した。つまり、フォワードオリゴヌクレオチド（配列番号：３４；表４）及びオリゴヌクレオチドＰａｐＯｍｐＣ（配列番号：３５；表４）を、ＰａｐＭＶ  ＣＰ遺伝子ＰａｐＭＶ  ＣＰ  ＣＰΔＮ５をテンプレートとするＰＣＲ反応に用いた。
【０１８４】
得られたＰＣＲ断片は、ＰａｐＭＶ  ＣＰのＣ末端に、ペプチドＥＡＫＧＬＩＲの融合を持つ。同一のアプローチを用いて、フォワードオリゴヌクレオチド（配列番号：３４；表４）及びオリゴヌクレオチドＰａｐＭＶＯｍｐＦ（配列番号：３６；表４）を、ＰＣＲによるＰａｐＭＶ  ＣＰのＣ末端でのペプチドFHENWPSの融合を導入するために用いた。2つのそれぞれのＰＣＲ断片を、制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで消化し、同一の酵素で消化したｐＥＴ  ３−Ｄベクター内にクローン化した該ペプチドがＰａｐＭＶ  ＣＰを伴うフレーム内にあることを確認するために、クローンを配列決定した。
【０１８５】
【表４】
2010508857.tif 000006
【０１８６】
親和性ペプチドを含む遺伝子操作したＰａｐＭＶ  ＣＰを、以前に記載されているようにして、Ｅ．コリＢＬ２１  ＲＩＬにおいて発現した（Tremblay, M-H.,ら、 2006, FEBS J., 273:14-25; Secundino ら, 2006, Immunology 1 17:59）。簡潔に述べれば、細菌を、フレンチプレスを通して溶解し、Ni2+カラム上にロードし、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ５０ｍＭ  イミダゾール  ０．５％  トリトンＸ１００  ｐＨ８で、次いで、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ、５０ｍＭ  イミダゾール、１％  Zwittergent  ｐＨ８で洗浄し、エンドトキシン混入を除去した。ポーリンを、１２０分間、Beckman 50.2 TIローターにおける高速遠心分離（１０００００ｇ）供した。ＶＬＰペレットを、エンドトキシンフリーＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）に再懸濁した。タンパク質を、０．４５μＭフィルターを用いて、使用前にろ過した。タンパク質の純度をＳＡＳ−ＰＡＧＥにより測定した。BCA protein Kit（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてタンパク質の量を評価した該精製タンパク質中のＬＰＳレベルを、製造者の使用説明書にしたがって(Cambrex)リムルス試験により評価し、０．００５エンドトキシンユニット（ＥＵ）／μｇより低いタンパク質であった。
【０１８７】
２つのＰａｐＭＶコートタンパク質の配列を図１１に示す（配列番号：６−ＯｍｐＣ親和性ペプチドを含むＰａｐＭＶコートタンパク質、及び配列番号：７−ＯｍｐＦ親和性ペプチドを含むＰａｐＭＶコートタンパク質）。野生型と比較して、２つのアミノ酸差異がＰａｐＭＶ  ＯｍｐＣのコートタンパク質の配列において観察され（図１１における太字及び下線）、これは恐らくＰＣＲ反応の間に導入されたようである。
【０１８８】
ＥＬＩＳＡ
各実験のために、１０μｇのそれぞれの標的タンパク質（ＯｍｐＣ又はＯｍｐＦ）を用いて、ＥＬＩＳＡプレートをコートした。それぞれのＰａｐＭＶ  ＶＬＰｓの増加量を、結合アッセイに用いた。それらの標的のためのＶＬＰの親和性を、ＰａｐＭＶ  ＣＰに対するポリクローナルマウス抗体及びペルオキシダーゼに結合した二次的抗マウス抗体を用いて明らかにした。
【０１８９】
結果
親和性ペプチドの選択
ファージ提示を用いて、ＯｍｐＣ又はＯｍｐＦに結合する特異的なペプチドを選んだ。ＯｍｐＣに結合した８つのファージ及びＯｍｐＦに結合した５つのファージを配列決定した。これらのペプチドの配列及び発生頻度を表３に示す。ペプチドＥＡＫＧＬＩＲ［配列番号：１０］は、最も高い頻度を示し、したがって、ＯｍｐＣに対する親和性ペプチドとして選ばれた。ペプチドＦＨＥＮＷＰＳ[配列番号：１２]は、ＯｍｐＦスクリーニングにおいて最も頻繁であり、したがって、ＯｍｐＦに対する親和性ペプチドとして選ばれた。興味深いことに、７つのうち５つのアミノ酸が同定され、並びに親和性ペプチドにおける同一の位置において発見されていることから、ＯｍｐＦに対する両方の親和性ペプチドは相同である。
【０１９０】
高結合活性ＰａｐＭＶ  ＶＬＰの合成
ペプチド配列ＥＡＫＧＬＩＲ[配列番号：１０]及びＦＨＥＮＷＰＳ[配列番号：１２]をＰａｐＭＶコートタンパク質のＣ末端において融合された（図３Ａ）。続いて、融合ペプチドを６×Ｈで標識し、精製過程を促進した（Tremblay, M-H.,ら、2006, FEBS J., 273:14-25）。組換えコンストラクトをＥ．コリ内で発現し、Ni２+カラム上の親和性クロマトグラフィーにより精製した。タンパク質は、５００ｍＭ  イミダゾールを用いて溶出し、透析し、１０００００ｇで超遠心分離して、ＶＬＰをペレット化した（図３Ｂ）。電子顕微鏡（ＥＭ）観察により、ＰａｐＭＶ  ＣＰのＣ末端におけるそれぞれのペプチドの添加は、タンパク質がＶＬＰ内に自己集合する能力に影響を与えないことが確認された（図３Ｃ）。ＶＬＰの長さは、２０１±８０ｎｍの範囲のサイズで様々である。２０１ｎｍの長さのタンパク質は、反復したつくりでペプチドが存在する５６０コピーのＣＰを示す。
【０１９１】
これらのそれぞれの抗原に対する各ＰａｐＭＶ  ＶＬＰの高結合活性を、ＥＬＩＳＡ型結合アッセイにより示した。両方のＶＬＰ（「ＰａｐＭＶ  ＯｍｐＣ」及び「ＰａｐＭＶ  ＯｍｐＦ」）について、それらのそれぞれの抗原への結合が明確に示され、かつ、アッセイにおいて用いたＶＬＰの量と共に増加した（図４Ａ及びＢ）。したがって、１：１の割合（重量／重量）で溶液中で混合した場合、ＰａｐＭＶ  ＶＬＰは、同種の抗原に結合し、複合体を形成するだろうと想定された。
【０１９２】
実施例５：親和性に複合体化されたＰａｐＭＶ  ＶＬＰ−ＯｍｐＣ及びＰａｐＭＶ  ＶＬＰ−ＯｍｐＦによる、Ｓ．チフィに対する免疫
【０１９３】
マウス
メスＢＡＬＢ／ｃマウス、６−８週齢（Harlan, Mexico or Charles River, Canada）を用いて、メキシコ国立自治大学（ＵＮＡＭ）、医学部、実験的医薬研究部門の動物施設下で維持した。
【０１９４】
チャレンジアッセイ
外部のアジュバント非存在下で、１０μｇ  ＯｍｐＣ、１０μｇ  ＯｍｐＣ＋１０μｇ  ＰａｐＭＶ  ＯｍｐＣ、１０μｇ  ＯｍｐＦ、１０μｇ  ＯｍｐＦ＋１０μｇ  ＰａｐＭＶ  ＯｍｐＦ、１０μｇ  ＰａｐＭＶ  ＯｍｐＣ、１０μｇ  ＰａｐＭＶ  ＯｍｐＦ又は生理食塩水（ＳＳＩ）で、マウス（１０匹／群）を腹腔内（i.p）免疫した（０日目）。１５日目に、アジュバントなしで１０μｇ  ＯｍｐＣ又は１０μｇ  ＯｍｐＦそ用いて、マウスを腹腔内追加免疫した。ＰａｐＭＶ  ＯｍｐＣ及びＯｍｐＣを、免疫の１から２４時間前に混合し、４℃で保管した。
【０１９５】
２５日目又は１４０日目に、５％  胃ムチン（Ｓｉｇｍａ）含有５００μｌ  ＴＥバッファ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．２、５ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再懸濁した、１００又は５００ＬＤ５０のＳ．チフィ（ATCC 9993）でマウスを腹腔内チャレンジした。防御は、チャレンジ後１０日の生存率として定義した。９００００ＣＦＵでの１ＬＤ５０を測定した。
【０１９６】
免疫
外部のアジュバント非存在下で、１０μｇ  ＯｍｐＣ、１０μｇ  ＯｍｐＣ＋１０μｇ  ＰａｐＭＶ  ＯｍｐＣ、１０μｇ  ＰａｐＭＶ  ＯｍｐＣ又は等張生理食塩水（ＩＳＳ）で、５匹のマウスの群を腹腔内（i.p）免疫した（０日目）。１５日目に、アジュバントなしで、１０μｇ  ＯｍｐＣを用いて、マウスを腹腔内追加免疫した。血液試料を、図５から７に示すような、種々の時間において、頚静脈から採取した。解析まで、個々の血清試料を−２０℃で保管した。
【０１９７】
ＥＬＩＳＡ
高結合９６ウェルポリスチレンプレート（High binding 96-well polystyrene plates）（Ｎｕｎｃ）を、０．１Ｍ  炭酸塩−重炭酸塩バッファ  ｐｈ９．５中の１０μｇ／ｍＬのＯｍｐＣでコートした。プレートを１時間、３７℃で、続いて４℃で終夜、インキュベートした。プレートを蒸留したＨ２Ｏ−０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０で４回洗浄した。非特異的結合をブロッキングバッファ（ＰＢＳ  ｐＨ７．４−２％  ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ））で３７℃で１時間ブロックした。洗浄後、プールしたマウス血清をブロッキングバッファで１：４０に希釈し、２倍段階希釈液をウェルに添加した。プレートを１．５時間、３７℃でインキュベートし、続いて４回洗浄した。ＨＲＰ抱合ヤギ抗マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ（Jackson Immunochemicals）又はＩｇＧ３（Rockland）(1 :10000)を添加し、１時間、３７℃でインキュベートし、続いて４回洗浄した。検出系として、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質（Fitzgerald）を用いた。暗所で１０分間、３７℃でインキュベーション後、２．５Ｎ  Ｈ２ＳＯ４で反応を停止し、自動ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。抗体価は、−log2希釈×４０として与えられる。陽性の力価は、陰性対照の平均値よりの３ＳＤ高いものとして定義した。
【０１９８】
受動免疫及びチャレンジ
外部のアジュバント非存在下で、１０μｇ  ＯｍｐＣ、１０μｇ  ＯｍｐＣ＋１０μｇ  ＰａｐＭＶ  ＯｍｐＣ、１０μｇ  ＰａｐＭＶ  ＯｍｐＣ又は等張生理食塩水（ＳＳＩ）で、５匹のマウスの群を腹腔内（i.p）免疫した（０日目）。１５日目に、アジュバントなしで１０μｇ  ＯｍｐＣを用いて、マウスを腹腔内追加免疫した。２３日目に心穿刺を行い、各群由来の血清試料をプールし、−２０℃で保管した。ナイーブマウス（５匹／群）に、２００μｌのプールした補体不活性化免疫血清を腹腔内投与した。転移から３時間後、上述のようにして、ムチンで再懸濁した１００ＬＤ５０のＳ．チフィでマウスをチャレンジした。防御は、チャレンジ後１０日の生存率として定義した。
【０１９９】
結果
ＰａｐＭＶ  ＶＬＰは、ポーリンの防御能を改善する。
【０２００】
精製タンパク質ＯｍｐＣ及びＯｍｐＦは、マウスでのＳ．チフィに対する防御を提供し、ＯｍｐＣ単独では、１００ＬＤ５０に対して６０％防御を提供することが以前に示されている(Secundino ら、 2006, Immunology 117:59)。ポーリン、ＯｍｐＣ及びＯｍｐＦそれぞれの免疫原性を改善するために、それぞれ、ＰａｐＭＶ  ＶＬＰを含むワクチン製剤を調製した。２つの異なる製剤、ＰａｐＭＶ  ＯｍｐＣ  ＶＬＰ＋ＯｍｐＣ及びＰａｐＭＶ  ＯｍｐＦ  ＶＬＰ＋ＯｍｐＦを、１００及び５００ＬＤ５０のＳ．チフィに対してマウスを保護する能力についてマウスにおいて試験し、結果をＯｍｐＣ又はＯｍｐＦ単独で免疫したマウスを用い得られるものと比較した。ＰａｐＭＶ  ＶＬＰとそれらのそれぞれのポーリンとの間の割合を、１：１に維持した。
【０２０１】
ＯｍｐＣへのＰａｐＭＶ  ＯｍｐＣ  ＶＬＰの添加は、１００ＬＤ５０のＳ．チフィにチャレンジした状態で、Ｏｍｐの防御能を７０％から１００％へ改善した（図５Ａ）。防御効果の改善は、マウスを５００ＬＤ５０でチャレンジした時にさらに大きく、ＯｍｐＣがＰａｐＭＶ  ＯｍｐＣ  ＶＬＰと結合した時には、３０％から９０％へ増加した防御が観察された（図５Ｃ）。同様に、ＰａｐＭＶ  ＯｍｐＦ  ＶＬＰは、１００ＬＤ５０のＳ．チフィのチャレンジ状態で、ＯｍｐＦの防御能を６０％から９０％へ改善した（図５Ｂ）が、チャレンジを５００ＬＤ５０のＳ．チフィで行った場合、わずかな差異のみが見られた（図５Ｄ）。この結果は、Ｓ．チフィチャレンジに対する防御に関して、ＯｍｐＣは、ＯｍｐＦよりもより良い抗原であることを示す。両方の場合において、ＰａｐＭＶ  ＶＬＰは、ポーリンの防御能をかなり改善した。
【０２０２】
ＰａｐＭＶ  ＶＬＰがＯｍｐＣに対する抗体価を改善するかを判定するために、１０μｇ  ＯｍｐＣ又は１０μｇ  ＯｍｐＣ及び１０μｇ  ＰａｐＭＶ  ＯｍｐＣ  ＶＬＰ含有複合体化ワクチンで免疫したマウスのＩｇＧの力価を測定した。いずれかの処理を伴う、異なるＩｇＧイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ及びＩｇＧ３の力価において、有意な差異は見られず（図６）、ＰａｐＭＶ  ＶＬＰで見られた防御の改善は、抗体自体の産生の増加よりむしろ、Ｓ．チフィ感染の中和における、ＣＴＬ応答及び／又は抗体の結合効率における改善に関連するものであり得ることを示している。
【０２０３】
ＰａｐＭＶ  ＶＬＰでの免疫は、ポーリンに対するメモリー応答を改善する
ＯｍｐＣと組み合わせてＰａｐＭＶ  ＶＬＰを含むワクチン製剤のメモリー応答を評価するために、マウスを２週間の間をあけて２回、ＯｍｐＣ単独もしくはＰａｐＭＶ  ＯｍｐＣ  ＶＬＰ及びＯｍｐＣを含むワクチン製剤のいずれかで免疫し、続いて１５日目にＯｍｐＣ単独で追加免疫した。１４０日目に、マウスを１００ＬＤ５０のＳ．チフィにチャレンジした。結果は、ＰａｐＭＶ  ＯｍｐＣ  ＶＬＰ及びＯｍｐＣを含むワクチン製剤による刺激が、免疫したマウスの防御能を有意に改善した（３倍の改善）ことを明らかに示している（図７）。したがって、本実験は、ＰａｐＭＶ  ＶＬＰがＳ．チフィチャレンジに対するマウスの保護を改善するだけでなく、より良いメモリー応答をも提供することを実証している。
【０２０４】
実施例５：Ｓ．チフィに対するＰａｐＭＶとＯｍｐＣとの組み合わせの防御能
【０２０５】
ＰａｐＭＶの精製
ＰａｐＭＶを、実施例１に記載のように精製した。
【０２０６】
保護アッセイ
ＢＡＬＢ／ｃマウス（１０群）を、１０μｇのＯｍｐＣ又は、３０μｇのＰａｐＭＶと共に１時間４℃で予めインキュベートしておいた、１０μｇのＯｍｐＣで０日目に腹腔内免疫した。１５日目に、１０μｇのＯｍｐＣ単独で追加免疫を行った。対照マウスには、生理食塩水のみを接種した。２１日目に、マウスを、５％ムチンに懸濁した１００及び５００ＬＤ５０のＳ．チフィ（STYC302 DompF菌株）（前述の通り）でチャレンジし、以前に記載されたようにしてチャレンジし、生存率をチャレンジ後１０日間モニターした。
【０２０７】
結果
感染した植物から単離したＰａｐＭＶウイルスの、ＯｍｐＣにより提供される防御の増加におけるアジュバント能を試験するために、ＯｍｐＣで免疫したマウスと、ＰａｐＭＶ精製ウイルスと混合したＯｍｐＣで免疫し、続いてＳ．チフィにチャレンジしたマウスとを比較した。ＰａｐＭＶ精製ウイルスと混合したＯｍｐＣを、ＯｍｐＣ単独との比較として用いた場合、１００ＬＤ５０又は５００ＬＤ５０のいずれかのＳ．チフィでチャレンジ後に、２０％から３０％高い生存率が見られた（図８）。したがって、ＰａｐＭＶ及びＳ．チフィＯｍｐＣポーリンの共投与は、Ｓ．チフィチャレンジに対する防御能を増加させることを見ることができる。
【０２０８】
実施例１から４に概説した実験の結果は、ＰａｐＭＶが、抗原特異的免疫グロブリンの切り換えを誘導することができ、モデル抗原に対する持続性の長期に渡る抗体応答を提供することができ、並びにＯｍｐＣ又はＯｍｐＦ単独の防御能を増加させることができるという、固有のアジュバント特性を有することを示唆する。これらのデータは、ＰａｐＭＶ及びＰａｐＭＶ  ＶＬＰが、ＯｍｐＣポーリンにより誘発される、生得的及び適応的免疫応答の、Ｓ．チフィチャレンジに対する防御への転換を増強することを示唆する。
【０２０９】
実施例６：ＨＣＶコアタンパク質の精製
【０２１０】
Ｅ．コリ中でのＨＣＶコアタンパク質のクローニング及び発現
ＨＣＶコアタンパク質の最初のＮ末端８２及び１７０アミノ酸（それぞれＨＣＶ−Ｃ８２及びＨＣＶ−Ｃ１７０と表す）を、Ｅ．コリ中での翻訳に最も代表的なコドンで最適化し、以下のように、精製のためにＣ末端においてＨｉｓ６−タグと融合された。
【０２１１】
プラスミドｐＣＶ−Ｈ７７ｃ（J. Bukh, NIHの厚意により提供された）を用いてＨＣＶコアコンストラクトを作製した。ＨＣＶ−Ｃ１７０を、プライマーＣ１７０−６ｈ(5'-CATGGGATCCTTACTAATGGTGATGGTGATGGTGACGCGTGGTACTAGTA GGAAGGTTCCCTGTTGCATAGTTCACGCC-3'[配列番号：４３])を、プライマーＣ  Ｎ９(5'-CATGAACCATGGCGAGCACGAATCCTAAACCTCAAAGAAAAACC-３'[配列番号：４４])と共に用いたＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ産物を、制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで消化し、ｐＥＴ３ｄ発現ベクター（New England Biolabs）内にクローン化したコアＣ末端欠失コンストラクトＨＣＶ−Ｃ８２をテンプレートＤＮＡとしてＣ１−１７０クローンを用い、かつプライマー８２(5'-CATGACTAGTAGGGTACCCGGGCTGAGC-3'[配列番号：４５])、Ｃ７９(5'-ACGTACTAGTGGGCTGAGCCCAGGTCCTGCC-3'[配列番号：４６])を、プライマーｃ９−６ｈ−Ｐｅｔ(5'-CATGACTAGTACCACGCGTCACC-S' [配列番号：４７])と共に用いてＰＣＲにより作製し、ＳｐｅＩによるＤＮＡの消化の後、ライゲーションによりクローンを環状化した。ＨＣＶクローンの配列を、ＤＮＡ配列決定により確認した。Ｅ．コリ発現菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬ（Stratagene）を、Ｃ−タンパク質発現ｐＥＴ３ｄコンストラクトで形質転換し、５０ｍｇ  アンピシリンｍ１２１（Ｄｉｆｃｏ）を添加した２６ＹＴ培地［１６ｇ  バクトペプトン１２１（Ｄｉｆｃｏ）、１０ｇ  酵母エキス１２１（Ｄｉｆｃｏ）、５ｇ  ＮａＣｌ１２１、ｐＨ７．０に調整］中で維持した。細菌細胞を３７℃で、ＯＤ６００が０．６になるまで生育し、タンパク質発現を１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導した。誘導を２時間、２５℃で継続した（Majeau, N.,ら(2004) J. Gen. Virol, 85; 971-981参照）。２時間の誘導後、６０００ｇで１５分間の遠心分離により細胞をペレット化した。
【０２１２】
ＨＣＶ−Ｃ８２の精製
採取した細胞を、プロテアーゼインヒビターの１×カクテル（Roche Diagnostics GmbH）を添加した、３０ｍｌの氷冷溶解バッファ（５０ｍＭ  リン酸塩、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ１２．０）で再懸濁し、−８０℃で凍結した。次いで、ソニックディスメンブレーター(sonic dismembranator)モデル５００（Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて、１０秒間の超音波処理及びそれに続く各超音波処理の間の５０秒間の冷却の２４サイクルにより細胞を溶解した。次いで、溶解物を、２７０００ｇで３０分間遠心分離した。４℃で撹拌しながら、上清をＮｉ−ＮＴＡ樹脂（ＱＩＡＧＥＮ）に添加した。結合の９０分後、５０ｍｌのウォッシュバッファ１（５０ｍＭ  リン酸塩、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ１２．０）でビーズを洗浄し、３０分間撹拌した。５０ｍＬのウォッシュバッファ２（５０ｍＭ  リン酸塩、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ１２．０）でビーズを再度洗浄し、さらに３０分間撹拌した。次いで、ＨＣＶ−Ｃ８２をアセンブリーバッファ、１．７ｍＭ  酢酸Ｍｇ、１００ｍＭ  酢酸Ｋ、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６、５００ｍＭ  イミダゾールで溶出した。全てのことを４℃で行った。
【０２１３】
ＨＣＶ−１７０の精製
採取した細胞を５００μｍ  ＰＭＳＥを添加した３０ｍｌ  溶解バッファ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ（７．４）、８Ｍ  尿素、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ）中に再懸濁し、−８０℃で凍結した。次いで、細胞をソニックディスメンブレーター(sonic dismembranator)モデル５００（Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて、１０秒間の超音波処理及びそれに続く各超音波処理の間の５０秒間の冷却の２４サイクルにより細胞を溶解した。次いで、溶解物を、２７０００ｇで３０分間遠心分離した。上清を、撹拌しながら、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂（ＱＩＡＧＥＮ）に添加した。結合の９０分後、５０ｍｌのウォッシュバッファ１（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ（７．４）、４Ｍ  尿素、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  イミダゾール、１ｍＭ  ＤＴＴ）でビーズを洗浄し、30分間撹拌した。５０ｍＬのウォッシュバッファ２（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ（７．４）、２Ｍ  尿素、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  イミダゾール、１ｍＭ  ＤＴＴ）でビーズを再度洗浄し、さらに３０分間撹拌した。次いで、ＨＣＶ−Ｃ１７０を溶出バッファ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ（７．４）、２Ｍ  尿素、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５００ｍＭ  イミダゾール、１ｍＭ  ＤＴＴ）で溶出した。全てのこれらのことを室温で行った。
【０２１４】
ＨＣＶ−コアタンパク質の逆相ＨＰＬＣ精製
ＨＰ１０５０シリーズ(Hewlett Packard)ＨＰＬＣで、ＵＶ検出器及びＶＹＤＡＣ  Ｃ４カラム（250mm×4.6mm、5μm、及び300A）を用いて、逆相ＨＰＬＣを行った。勾配に用いた溶媒は、水中の０．０５％  トリフルオロ酢酸（溶媒Ａ）及びアセトニル中の０．０５％  トリフルオロ酢酸（溶媒Ｂ）であった。流速は、溶媒Ｂで０．８ｍｌ／分であり、ＨＣＶ−Ｃ８２に関して、３５分で１０％から５０％に、並びにＨＣＶ−Ｃ１７０に関して、１５分で１０％から５０％に、２０分で６０％に増加した。クロマトグラフは、２２０ｎｍ及び２８０ｎｍにおいて記録し、並びにＬＣ３Ｄ用ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ（Agilent Technologies）を用いてデータを解析した。採取した画分を、凍結乾燥し、さらなる研究のためにＰＢＳ中で再構成した。
【０２１５】
タンパク質特性解析
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）及びビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質アッセイキット（Pierce）により、タンパク質純度及び含量を見積もった。
【０２１６】
ＨＣＶ−Ｃ８２及びＨＣＶ−Ｃ１７０はＮＬＰ内に集合する
インビトロでの集合反応を、精製ＨＣＶ  Ｃタンパク質及びｔＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ）を用いて行った。１６プロテアーゼインヒビターカクテル及び０．５Ｕ  ＲＡａｓｅインヒビター(Roche)の存在下で、精製タンパク質（５０ｍｌ  アセンブリーバッファ；（１ｍＭ  酢酸マグネシウム、１００ｍＭ  酢酸カリウム、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）中２５ｍｇ）を、２５０ｎｇ  ｔＲＮＡと混合した。反応物を、３７℃で１０分間インキュベートし、続いて、氷上で１５分インキュベートした（Majeau, N.,ら(2004)J Gen. Virol., 85; 971-981参照）。
【０２１７】
実施例７：ＨＣＶコア親和性ペプチドを含むＰａｐＭＶ  ＶＬＰの産生及び遺伝子操作
【０２１８】
ファージ提示
New England Biolabs (Beverly, USA)から提供されたＰｈ．Ｄ．−７ファージライブラリーを用いた。本ライブラリーに用いた無作為提示されたヘプタペプチドは、Ｍ１３ファージのＰＩＩＩタンパク質のＮ末端において融合されている。ライブラリーは、１０μｌの供給されたファージにおいて起こり得る、各１．２８×１０９の７残基候補の７０コピーからなる。ＨＣＶ−Ｃ１７０をパニング手順のためのタンパク質標的としてに用い、０．１ＭのＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．６）中１００μｇ／ｍｌに希釈し、１５０μｌをマキシソープ９６ウェルポリスチレンプレート（Nunc, Roskilde, Denmark）の１つのウェルに吸着させた。４℃で終夜、穏やかな撹拌と共に、加湿された容器内でプレートをインキュベートした。吸着されなかったタンパク質を廃棄し、４００μｌのブロッキングバッファ（０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．６）＋５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ＋０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３）を添加すること、及びプレートを１時間４℃でインキュベートすることにより、ウェルをブロックした。各ウェルをＴｒｉｓバッファ生理食塩水（ＴＢＳ）：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０を添加した１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）、で６回洗浄した。１０μｌのファージライブラリーＰｈ.Ｄ．−７（２×１０１１ｐｆｕ）をＴＢＳＴ中に１ｍｌに希釈し、１００μｌを各ウェルに分配した。プレートを１時間、室温で、穏やかな撹拌と共にインキュベートした。ＴＢＳＴで１０回洗浄することにより、結合しなかったファージをウェルから除去した。結合したファージを、ＴＢＳ中１００μｇ／ｍｌの１００μｌの標的タンパク質ににより溶出した。本パニング手順を、２つの独立した実験系で計４ラウンド繰り返した。後の各パニングラウンドについて、ファージの投与量は２×１０１１ｐｆｕであった。各選択のストリンジェンシーは、非特異的なファージの結合の頻度を減少させるための最後の３回のパニングのラウンドについて、ＴＢＳ中の０．５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を用いることにより増加させた。
【０２１９】
ファージ滴定
Ｅ．コリＥＲ２７３８の単一コロニーを、１０ｍｌのＬＢに接種し、対数期の中間部（ＯＤ６００〜０．５）まで振盪培養した。溶出ファージの１０倍段階希釈液を、増幅ファージについては１０８−１０１１、又は粗パニング溶出液については１０１−１０４の範囲で、ＬＢ中で調製した。１０μｌの各希釈液を２００μｌの対数期の中間部細菌に添加し、室温で５分インキュベートした。感染した細胞を、予め温めた上層アガロース（４５℃）含有培養チューブに移し、すばやくボルテックスし、予め温めたＬＢ／ＩＰＴＧ／Ｘｇａｌプレート上に注いだ。プレートを終夜、３７℃でインキュベートし、〜１００の溶解プラークを含有するプレートを滴定用に計数した。
【０２２０】
プラークの増幅
Ｅ．コリＥＲ２７３８の終夜培養物を、ＬＢ中に１：１００で希釈し、１０から〜１００プラークを有するプレートより選ばれた青色プラークを接種した。接種したチューブを３７℃で、浸透しながら、４−５時間インキュベートした。インキュベーション後、培養物を３０秒間遠心分離し、上清を新たなチューブに移し、再びスピンした。ピペットを用いて、最高８０％の上清を清潔なチューブに移し、増幅したファージを次の過程まで４℃で保管した。
【０２２１】
ファージ配列決定
ＤＮＡ抽出のために、製造者の取り扱い説明書にしたがってＱＩＡｐｒｅｐ(登録商標)スピンＭ１３キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いた。各実験について最終パニング手順の１０クローンは、下記のプライマーを用いてＤＮＡ配列決定した：5'TGTATGGGATTTTGTAATACATCA 3'［配列番号：３７］。
【０２２２】
ＰａｐＭＶコートタンパク質のクローニング及びＰａｐＭＶＣＰ−ＳＴＡＳＹＴＲの生成
ＰａｐＭＶ  ＣＰ遺伝子を単離したウイルスＲＮＡから、プライマー5'-AGTCCCATGGCATCCACACCCAACATAGCCTTC-S'［配列番号：３８］及び5'-GATCGGATCCTTACTAATGGTGATGGTGATGGTGACGCGTGGTACTAGTTT CGGGGGGTGGAAGGAATTGGATGGTTGG-3'[配列番号：３９]：を用いてＲＴ−ＰＣＲにより増幅した。増幅断片をＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ断片として、ｐＥＴ３Ｄ(New England Biolabs)内にクローン化した。
【０２２３】
ＰａｐＭＶＣＰ−ＳＴＡＳＹＴＲコンストラクト（［配列番号：４２］；図１４参照）を作製するために、オリゴ5'CTAGTAGCACCGCGAGCTACACCAGAA-3'[配列番号：４０]及び5' CGCGTTCTGGTGTAGCTCGCGGTGCTA-3'[配列番号：４１]を共にアニールし、ＳｐｅＩ／ＭＩｕＩで直線化されたＰａｐＭＶ  ＣＰクローン内にライゲーションした。最終ＰａｐＭＶＣＰ−ＳＴＡＳＹＴＲコンストラクトの核酸配列を図１４Ａに示す［配列番号：４８］。
【０２２４】
ＰａｐＭＶＣＰタンパク質の作製及び精製
Ｅ．コリ発現菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬ（Stratagene）を、ＰａｐＭＶＣＰ−ＳＴＡＳＹＴＲ含有プラスミドｐＥＴ−３ｄで形質転換した。培養物を５０μｇ／ｍｌ  アンピシリンと共に、ＯＤ６００が約０．６になるまで３７℃で生育し、２２℃で終夜、１ｍＭ  ＩＰＴＧ（イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を用いて誘導し、６０００ｇで１５分間遠心分離した。ペレットを、氷冷溶解バッファ（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４［ｐＨ８．０］、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  イミダゾール、４０μＭ  ＰＭＳＦ、及び０．１ｍｇ／ｍｌ  リゾチーム）に再懸濁し、７５０ＰＳＩでフレンチプレスに１回通すことにより、細菌を溶解した。溶解物を３０分間、１３０００ｒｐｍで２回遠心分離し、細胞残屑を除去した。全精製手順を４℃で行った。上清を、１ｍｌのＮｉ−ＮＴＡ−アガロースマトリクス（QiagenD40724）と終夜混合した。タンパク質を、ポリプロピレンクロマトグラフィーカラム上の重力フロー(Econo-Pac Colomns, Bio-Rad Laboratories)により精製した。樹脂を、第１のウォッシュバッファ（２０ｍＭ  イミダゾールを添加した溶解バッファ）と共に１０ベッドボリュームで１回洗浄し、第２のウォッシュバッファ（５０ｍＭ  イミダゾールを添加した溶解バッファ）で１回洗浄した。調製物からＬＰＳ混入物を除去するために、これらを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ５０ｍＭ  イミダゾール  ０．５％  トリトンＸ１００  ｐＨ８で１回洗浄し、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ５０ｍＭ  イミダゾール  １％  Zwittergent  ｐＨ８で１回洗浄した。これらの洗浄ステップ後、第３のウォッシュバッファ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）及び５０ｍＭ  イミダゾール）での洗浄を行い、全ての微量の界面活性剤を除去した。タンパク質を終夜２．５ベッドボリュームの溶出バッファ（１Ｍ  イミダゾールを添加した第３のウォッシュバッファ）と共にインキュベートし、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で終夜透析した。試料中のＶＬＰ量を増加させるため、試料を３０００×ｇで９０分間、１０００ｋmacrosep(登録商標)遠心分離機(Pall life sciences)で遠心分離し、ＰＢＳで終夜透析した。
【０２２５】
タンパク質特性解析
ワクチン製剤のエンドトキシン含量を、リムルスアメーバ様細胞溶解物アッセイキット(Limulus amoebocyte lysate assay kit)（Cambrex）で見積もった。ＶＬＰ含量を、Superdex200(10/300)GL分析カラムを用いて、ＦＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィーにより評価した。
【０２２６】
電子顕微鏡観察
ＮＬＰ内へのＨＣＶコアタンパク質の集合後、１５０ｎｇの試料をＰＢＳで希釈し、４００メッシュ炭素絶縁被膜格グリッド(400-mesh carbon formvar grids)（Ｃａｎｅｍｃｏ）上に５分間吸着させた。グリッドをＴＢＳで１回洗浄し、ろ過処理した２％  酢酸ウラニル溶液で３分間染色した。グリッドを乾燥し、電子顕微鏡下において、６０ｋＶｏｌの加速電圧、１０００００の倍率で調べた。
【０２２７】
ＥＬＩＳＡ
コスター高結合９６ウェルプレート（Coster High Binding 96-well plates）（Corning, NY, U.S.A.）を終夜、４℃で、０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３バッファ  ｐＨ９．６中で、１μｇ／ｍｌの濃度まで希釈した１００μｌ／ウェルのＨＣＶ−Ｃ１７０ＮＬＰ又はフリー（即ち、非ＮＬＰ）ＨＣＶ−Ｃ１７０でコーティングした。プレートをＰＢＳ−０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０−２％  ＢＳＡ（１５０μｌ／ウェル）で、１時間３７℃でブロックした。１μｇ／ｍｌ又は２．５μｇ／ｍｌから始まるＰａｐＭＶＣＰ−ＳＴＡＳＹＴＲの２倍段階希釈液を試験した。
プレートを、ペルオキシダーゼ抱合ヤギ抗ウサギＩｇＧとのインキュベート前に、ＰＢＳＴ中で１／５０００でのＰａｐＭＶＣＰ  タンパク質に対する１００μｌのポリクローナルウサギ抗体と共にインキュベートした。３回の洗浄後、１００μｌのＴＭＢ−Ｓで、使用者の説明書にしたがって、ＩｇＧの存在を検出した；反応を、１００μｌの０．１８ｍＭ  Ｈ２ＳＯ４の添加により停止させ、４５０ｎｍにおけるＯＤを読んだ。
【０２２８】
結果
ＨＣＶコアタンパク質に結合できる親和性ペプチドを、ファージ提示により選んだ。ペプチドの配列及びこれらの頻度を表５に示す。
【０２２９】
【表５】
2010508857.tif 000007
【０２３０】
ペプチドＳＴＡＳＹＴＲ［配列番号：８］が最も高い頻度で見出され、したがってＰａｐＭＶコートタンパク質と融合するように選択した。電子顕微鏡（ＥＭ）観察により、ＰａｐＭＶ  ＣＰに対するペプチドの添加は、融合していないＰａｐＭＶ  ＣＰと比較して(図１２Ａ)、得られた融合タンパク質であるＰａｐＭＶＣＰ−ＳＴＡＳＹＴＲがＶＬＰ内へ自己集合する能力に影響を及ぼさなかったことが確認された(図１２Ｂ)。
【０２３１】
ＰａｐＭＶＣＰ−ＳＴＡＳＹＴＲのＨＣＶコアタンパク質（１−１７０）ＮＬＰ及びフリー（非ＮＬＰ）ＨＣＶ−Ｃ１７０との結合は、ＥＬＩＳＡ型結合アッセイにより示された。両方のアッセイについて、抗原への結合が明らかに実証され、アッセイに用いたＰａｐＭＶＣＰ−ＳＴＡＳＹＴＲの量と共に増加した(図１２Ｃ及びＤ)。
【０２３２】
実施例８：親和性に複合体化されたＰａｐＭＶ  ＶＬＰ−ＨＣＶコアでのＣ型肝炎に対する免疫
ＰａｐＭＶ−ＳＴＡＳＹＴＲ／ＨＣＶ−コアＡＣＡＳの調製
ＰａｐＭＶ−ＳＴＡＳＹＴＲ及びＨＣＶ−Ｃ８２を滅菌ＰＢＳバッファ中で、５：１  ＰａｐＭＶ−ＳＴＡＳＹＴＲ：ＨＣＶ−Ｃ８２の割合で混合し、次いで、１６時間４℃でインキュベートした。最初のインキュベーション後、混合物を９０分間２５℃(室温)での第２のインキュベーションに提示した。
【０２３３】
マウス
５匹の４−８週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１０μｇのＨＣＶ−Ｃ８２ＮＬＰ又は１０μｇのＣ８２ＮＬＰ＋５０μｇ  ＰａｐＭＶＣＰ−ＳＴＡＳＹＴＲ又は５０μｌ  ＰａｐＭＶＣＰ−ＳＴＡＳＹＴＲ又はＰＢＳエンドトキシンフリー（Ｓｉｇｍａ）を皮下的に注射した。
【０２３４】
一次免疫の後、２週間の間隔で２回の追加免疫投与を与えた。血液試料を異なる時点で取得し、解析まで−２０℃で保管した。最後の免疫から３週間後、マウスを、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１−３８２を発現する、５×１０６ＰＦＵの組換えワクチンウイルスＳｃ５９  ６Ｃ／Ｓに腹腔内にチャレンジした(Kozielら、1995 J Clin Invest. 96(5):2311-21)。チャレンジ前に、０．１ｍｌのケタミン（１５ｍｇ／ｍｌ）−キシラジン（１ｍｇ／ｍｌ）／１０ｇ体重で、マウスを麻酔した。チャレンジ後５日目にマウスを屠殺し、卵巣を回収し、ホモジナイズし、ＣＶ−Ｉ指標細胞のプレートにおける１０倍段階希釈液によりウイルス抗体価についてアッセイした。２日間の培養後、培地を除去し、ＣＶ−Ｉ細胞単層を、１％  メチレンブルー（Ｓｉｇｍａ）で１０分間染色し、水で１０分間洗浄し、並びに、ワクチンウイルスの滴定のためにウェルごとのプラークの数を計数した。
【０２３５】
ＥＬＩＳＡ
コスター高結合９６ウェルプレート(Costar High Binding 96-well plates)（Corning, NY, U.S.A.）を、０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３バッファ  ｐＨ９．６で１μｇ／ｍｌの濃度まで希釈した１００μｌ／ウェルのＨＣＶ−Ｃ１７０フリータンパク質で４℃で終夜コートした。プレートを、ＰＢＳ−０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０−２％  ＢＳＡ（１５０μｌ／ウェル）で、１時間３７℃でブロックした。ＰＢＳ−０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄後、血清を、添加された１：１００から始まる２倍段階希釈液中で検査し、１時間３７℃でインキュベートした。インキュベーション後に、プレートを３回洗浄し、１００μｌのペルオキシダーゼ抱合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Jackson Immunoresarch）と共に、ＰＢＳ／０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０／２％  ＢＳＡ中１／１００００の希釈度で、１時間３７℃でインキュベートした。３回の洗浄の後、ＩｇＧの存在を、使用者の説明書にしたがって、１００μｌのＴＭＢ−Ｓで検出した；反応を、１００μｌの０．１８ｍＭ  Ｈ２ＳＯ４を添加することにより停止し、４５０ｎｍでのＯＤを読んだ。ＯＤ値が、ＰＢＳマウス由来の血清の１：１００希釈で得られたバックグラウンド値の３倍である場合に決定された抗体終点力価として、結果を表す。
【０２３６】
統計的方法
データをX=(log y+1)で変換して分散を均一化にし、次いで、Ｔｕｋｅｙの多重比較をパラメータデータのためのポストテストとするＡＮＯＶＡ試験を用いて解析した。ｐ＜０．０５は、統計的に有意であると見なした。
【０２３７】
結果
ＨＣＶコア、ＰａｐＭＶＣＰ−ＳＴＡＳＹＴＲ、又はＨＣＶコア＋ＰａｐＭＶＣＰ−ＳＴＡＳＹＴＲでの免疫後のマウスにおける総ＩｇＧ力価を、図１３Ａに示す。ＨＣＶコア＋ＰａｐＭＶＣＰ−ＳＴＡＳＹＴＲでの免疫は、ＨＣＶコア単独又はＰａｐＭＶＣＰ−ＳＴＡＳＹＴＲ単独での免疫と比較したＩｇＧにおいて、統計的に有意な（ｐ＜０．０５）増加を示した。
【０２３８】
図１３Ｂは、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１−３８２を発現する、組換えワクチンウイルスＳｃ５９  ６Ｃ／Ｓでチャレンジ後の、感染したマウスの両方の卵巣から回収したウイルス価を示す。本実験において、ＰＢＳ、ＨＣＶコア、ＰａｐＭＶＣＰ−ＳＴＡＳＹＴＲ又はＨＣＶコア＋ＰａｐＭＶＣＰ−ＳＴＡＳＹＴＲでの免疫後に有意な差異は見られなかったにもかかわらず、総ＩｇＧ力価からすると、ＨＣＶコア＋ＰａｐＭＶＣＰ−ＳＴＡＳＹＴＲ組成物での免疫が、ＨＣＶコア単独で達成された免疫応答よりも、優れた免疫応答を生成することができることは明らかである。したがって、組成物の最適化及び／又は、例えば、抗原単独の追加免疫投与の追加による、日常投与の最適化は、ウイルスチャレンジに対する効果的な防御をもたらすであろうと予想される。そのような最適化は、本明細書に与えた教示を考慮すると当業者に用意に理解され得る。例えば、ＣＤ８＋ＨＣＶコア特異的増殖アッセイは、マウスにおける強力なＣＴＬ応答を誘発することができる、ＰａｐＭＶ-ＳＴＡＳＹＴＲとＨＣＶコアタンパク質との最適な割合、並びに最終ワクチン調製の適切投与量を決定するために行われる。１つの実施形態において、ＨＣＶコアタンパク質に対して４：１、３：１、２：１及び１：１のＰａｐＭＶ-ＳＴＡＳＹＴＲの割合が、ワクチン製剤に組み込むためのＡＣＡＳの調製について意図される。
【０２３９】
本発明を、特定の具体的な実施形態に関して説明してきたが、本発明の種々の改変は、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、当業者に明らかであるだろう。当業者に明らかであるような、そのような全ての改変が、添付の特許請求の範囲内に含まれることを意図している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年7月17日(2009.7.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１以上の抗原及びパパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）又はＰａｐＭＶコートタンパク質由来のウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む親和性で複合体化された抗原系であって、該ＰａｐＭＶ又はＶＬＰがＰａｐＭＶもしくはＶＬＰのコートタンパク質に取り付けられた複数の親和性部分を含み、該親和性部分が前述の１以上の抗原に結合でき、該系が動物における免疫応答を誘導することができる、抗原系。
【請求項２】
前述の１以上の親和性部分がＰａｐＭＶ又はＶＬＰのコートタンパク質に化学的に取り付けられた、請求項１に記載の親和性で複合体化された抗原系。
【請求項３】
該系がＶＬＰを含み、かつ前述の１以上の親和性部分がＶＬＰのコートタンパク質に対して遺伝子工学的に融合された、請求項１に記載の親和性で複合体化された抗原系。
【請求項４】
前述の１以上の親和性部分がペプチドである、請求項１、２又は３のいずれか１項に記載の親和性で複合体化された抗原系。
【請求項５】
前述の１以上の抗原がそれぞれ、腫瘍関連抗原、自己抗原、アレルゲン、ウイルス抗原、細菌性抗原又は寄生虫抗原である、請求項１、２又は３のいずれか１項に記載の親和性で複合体化された抗原系。
【請求項６】
前述の１以上の抗原がそれぞれ、細菌、ウイルス、原生動物、菌類、寄生虫又は感染粒子由来である、請求項１、２又は３のいずれか１項に記載の親和性で複合体化された抗原系。
【請求項７】
前述の１以上の抗原がウイルス由来である、請求項１、２又は３のいずれか１項に記載の親和性で複合体化された抗原系。
【請求項８】
前述の１以上の抗原が細菌由来である、請求項１、２又は３のいずれか１項に記載の親和性で複合体化された抗原系。
【請求項９】
該免疫応答が体液性応答を含む、請求項１、２又は３のいずれか１項に記載の親和性で複合体化された抗原系。
【請求項１０】
該免疫応答が細胞性応答を含む、請求項１、２又は３のいずれか１項に記載の親和性で複合体化された抗原系。
【請求項１１】
該系が１以上の追加抗原をさらに含む、請求項１、２又は３のいずれか１項に記載の親和性で複合体化された抗原系。
【請求項１２】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１のいずれか１項に記載の親和性で複合体化された抗原系、及び薬学的に許容される担体を含む、免疫原性組成物。
【請求項１３】
それを必要とする動物における免疫応答を誘導するための、有効量の請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１のいずれか１項に記載の親和性で複合体化された抗原系の使用。
【請求項１４】
該免疫応答が抗体の産生を含む、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
該免疫応答が細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答の誘導を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
該系が注射による投与のために製剤化される、請求項１３、１４又は１５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１７】
該系が経鼻投与のために製剤化される、請求項１３、１４又は１５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１８】
該動物が哺乳動物である、請求項１３、１４又は１５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１９】
該動物がヒトである、請求項１３、１４又は１５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２０】
該動物が非ヒト動物である、請求項１３、１４又は１５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２１】
該使用が追加免疫投与量の前述の１以上の抗原をさらに含む、請求項１３、１４又は１５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２２】
それを必要とする動物における疾病もしくは疾患の予防又は治療のための、有効量の請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１のいずれか１項に記載の親和性で複合体化された抗原系の使用。
【請求項２３】
体液性免疫応答が該疾病もしくは疾患を予防又は治療するために有効である、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
該疾病又は疾患が細菌により引き起こされたものである、請求項２２又は２３に記載の使用。
【請求項２５】
該疾病又は疾患がウイルスにより引き起こされたものである、請求項２２又は２３に記載の使用。
【請求項２６】
該系が注射による投与のために製剤化される、請求項２２又は２３に記載の使用。
【請求項２７】
該系が経鼻投与のために製剤化される、請求項２２又は２３に記載の使用。
【請求項２８】
該動物が哺乳動物である、請求項２２又は２３に記載の使用。
【請求項２９】
該動物がヒトである、請求項２２又は２３に記載の使用。
【請求項３０】
該動物が非ヒト動物である、請求項２２又は２３に記載の使用。
【請求項３１】
該使用が追加免疫投与量の前述の１以上の抗原をさらに含む、請求項２２又は２３に記載の使用。
【請求項３２】
薬物の製造におけるパパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）又はＰａｐＭＶコートタンパク質由来のウイルス様粒子（ＶＬＰ）の使用であって、該ＰａｐＭＶ又はＶＬＰが該ＰａｐＭＶもしくはＶＬＰのコートタンパク質に取り付けられた複数の親和性部分を含む、使用。
【請求項３３】
前述の複数の親和性部分がＰａｐＭＶ又はＶＬＰのコートタンパク質に化学的に取り付けられた、請求項３２に記載の使用。
【請求項３４】
前述の複数の親和性部分がＶＬＰのコートタンパク質に対して遺伝子工学的に融合された、請求項３２に記載の使用。
【請求項３５】
該ＶＬＰが前述の複数の親和性部分に対して複合体化された１以上の抗体をさらに含む、請求項３２、３３又は３４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３６】
薬物の製造における、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１のいずれか１項に記載の親和性で複合体化された抗原系の使用。
【請求項３７】
１以上の抗原をパパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）又はＰａｐＭＶコートタンパク質由来のウイルス様粒子（ＶＬＰ）と混合することを含む、免疫原性組成物を調製する方法であって、該ＰａｐＭＶ又はＶＬＰが該ＰａｐＭＶ又はＶＬＰのコートタンパク質に取り付けられた複数の親和性部分を含み、該親和性部分が前述の１以上の抗原に結合できる、方法。
【請求項３８】
請求項３７に記載の方法により調製された、免疫原性組成物。
【請求項３９】
ＨＣＶコアタンパク質に結合できる親和性ペプチドに対して融合されたパパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）コートタンパク質を含む融合タンパク質。
【請求項４０】
該親和性ペプチドが配列番号８、１５、１６、１７、１８、１９又は２０のいずれか１つに示された配列の少なくとも４つの連続したアミノ酸を含む、請求項３９に記載の融合タンパク質。
【請求項４１】
請求項３９又は４０に記載の融合タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４２】
ウイルス様粒子を調製するための、請求項３９又は４０に記載の融合タンパク質又は請求項４１に記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項４３】
請求項３９又は４０に記載の融合タンパク質を含む、ウイルス様粒子。
【国際調査報告】
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