(57)【要約】  本発明はＩｇＥに対する結合要素、とりわけ抗体分子に関する。当該結合要素は、なかんずく、アレルギーおよび喘息などのＩｇＥが介在する障害の処置に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫グロブリンＥに特異的な単離された結合要素であって、ＲＢＬ−ＥＲ５１細胞において２５ｎｇ／ｍｌのＩｇＥが誘発するカルシウムシグナリングを阻害するために、１ｎＭ未満のＩＣ５０幾何平均値を示す結合要素。
【請求項２】
当該カルシウムシグナリングを阻害するためのＩＣ５０幾何平均値が０.１ｎＭ未満である、請求項１記載の単離された結合要素。
【請求項３】
免疫グロブリンＥに特異的な単離された結合要素であって、血清中免疫グロブリンＥに当該結合要素が結合するために、ゾレア(Xolair；登録商標)よりも少なくとも１０倍低いＩＣ５０を示す結合要素。
【請求項４】
当該結合要素がゾレア(Xolair；登録商標)よりも少なくとも５０倍低いＩＣ５０を示す請求項３記載の単離された結合要素。
【請求項５】
ＣＤＲのセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含んでなるヒト免疫グロブリンＥに特異的な単離された結合要素であって、該ＣＤＲのセットが１０個以下のアミノ酸の付加、置換、欠失および／または挿入を有し、参照すべきＣＤＲのセットにおいて、
ＨＣＤＲ１が配列番号１０３のアミノ酸配列を有し；
ＨＣＤＲ２が配列番号１０４のアミノ酸配列を有し；
ＨＣＤＲ３が配列番号１０５のアミノ酸配列を有し；
ＬＣＤＲ１が配列番号１０８のアミノ酸配列を有し；
ＬＣＤＲ２が配列番号１０９のアミノ酸配列を有し；
ＬＣＤＲ３が配列番号１１０のアミノ酸配列を有する；
当該結合要素。
【請求項６】
該アミノ酸置換が６個以下のアミノ酸置換である、請求項５記載のヒト免疫グロブリンＥに特異的な単離された結合要素。
【請求項７】
ＣＤＲのセット、すなわち、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含んでなる単離された結合要素であって、その場合のＨＣＤＲ３が配列番号１０５のアミノ酸配列を有する、結合要素。
【請求項８】
ＣＤＲのセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含んでなる請求項５記載の単離された結合要素であって、ここでＣＤＲのセットにおいて、
ＨＣＤＲ１が配列番号１０３のアミノ酸配列を有し；
ＨＣＤＲ２が配列番号１０４のアミノ酸配列を有し；
ＨＣＤＲ３が配列番号１０５のアミノ酸配列を有し；
ＬＣＤＲ１が配列番号１０８のアミノ酸配列を有し；
ＬＣＤＲ２が配列番号１０９のアミノ酸配列を有し；
ＬＣＤＲ３が配列番号１１０のアミノ酸配列を有する；
結合要素。
【請求項９】
１つ以上の以下の置換を有する抗体１  ＨＣＤＲ３(配列番号５)を含んでなる単離された結合要素またはＶＨドメイン：
Ｓ、Ｍ、またはＴに置換したＫａｂａｔ残基９６；
ＬまたはＧに置換したＫａｂａｔ残基９７；
Ｋに置換したＫａｂａｔ残基９８；
Ｓ、Ｗ、Ａ、Ｔ、またはＥに置換したＫａｂａｔ残基９９；
ＡまたはＩに置換したＫａｂａｔ残基１００。
【請求項１０】
１つ以上の以下の置換を有する抗体１  ＬＣＤＲ３(配列番号１０)を含んでなる単離された結合要素またはＶＬドメイン：
Ｔ、Ｒ、Ｄ、Ｐ、Ｅ、Ｎ、Ｈ、Ｑ、またはＡに置換したＫａｂａｔ残基９４；
Ｔ、Ｋ、Ｓ、Ｉ、Ｇ、Ｈ、Ｍ、Ｆ、Ｒ、Ｎ、ＫまたはＱに置換したＫａｂａｔ残基９５；
Ｌ、Ｈ、Ｄ、Ｇ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、ＫまたはＥに置換したＫａｂａｔ残基９５Ａ；
Ｔ、Ｈ、Ｓ、Ｙ、ＬまたはＮに置換したＫａｂａｔ残基９５Ｂ；
ＧまたはＡに置換したＫａｂａｔ残基９６；
Ｐ、ＳまたはＧに置換したＫａｂａｔ残基９７。
【請求項１１】
免疫グロブリンＥに特異的な単離された結合要素であって、第一のＩｇＥ重鎖からの構成分および第二のＩｇＥ重鎖からの構成分を含んでなるエピトープに結合する結合要素。
【請求項１２】
免疫グロブリンＥに特異的な単離された結合要素であって、当該結合要素が、第一のＩｇＥ重鎖においてＧｌｕ３９０からＡｓｎ３９４までの残基；および第二のＩｇＥ重鎖においてＬｅｕ３４０、Ａｒｇ３４２、Ａｌａ４２８からＴｈｒ４３４まで、Ｔｈｒ４３６、Ｓｅｒ４３７およびＧｌｕ４７２の残基を含んでなる、免疫グロブリンＥのエピトープに結合する、結合要素。
【請求項１３】
該エピトープがさらに第一のＩｇＥ重鎖に糖部分ＧｌｃＮＡｃ１およびＭａｎ６、および第二のＩｇＥ重鎖に糖部分Ｍａｎ５を含んでなる、請求項１２記載の免疫グロブリンＥに特異的な単離された結合要素。
【請求項１４】
免疫グロブリンＥに特異的な単離された結合要素であって、当該結合要素が、第一のＩｇＥ重鎖においてＧｌｕ３９０、Ｇｌｕ３９２からＡｓｎ３９４までの残基；および第二のＩｇＥ重鎖においてＬｅｕ３４０、Ａｒｇ３４２、Ａｌａ４２８からＴｈｒ４３４まで、Ｔｈｒ４３６、Ｓｅｒ４３７およびＧｌｕ４７２の残基を含んでなる免疫グロブリンＥのエピトープに結合する、結合要素。
【請求項１５】
該エピトープがさらに第一のＩｇＥ重鎖に糖部分ＧｌｃＮＡｃ１およびＭａｎ６を含んでなる、請求項１４記載の免疫グロブリンＥに特異的な単離された結合要素。
【請求項１６】
該結合要素がモノクローナル抗体である、請求項１ないし１５のいずれか１項に記載の結合要素。
【請求項１７】
請求項１ないし１６のいずれか１項に記載の結合要素をコードする単離された核酸分子。
【請求項１８】
請求項１７記載の核酸分子を形質移入した宿主細胞。
【請求項１９】
当該結合要素の製造条件下で、請求項１８記載の宿主細胞を培養することを含む、請求項１ないし１７のいずれか１項に記載の単離された結合要素の製造法。
【請求項２０】
請求項１ないし１６のいずれか１項に記載の結合要素と医薬的に許容される成分を含有してなる医薬組成物。
【請求項２１】
請求項１ないし１６のいずれか１項に記載の単離された結合要素；
２０ｍＭコハク酸塩；
１０５ｍＭ  ＮａＣｌ； 
１０ｍＭアルギニン；
ｐＨ６.００
からなる請求項２０記載の医薬組成物。
【請求項２２】
医薬として使用するための請求項２０または２１に記載の組成物。
【請求項２３】
ＩｇＥと関連する障害を処置するための請求項２２に記載の組成物の使用。
【請求項２４】
該障害がアレルギー、喘息、または気管支炎からの１種以上である請求項２０または２１に記載の組成物の使用。
【請求項２５】
該障害がアレルギー性鼻炎、アレルギー性接触皮膚炎、アトピー性皮膚炎、アナフィラキシー反応、食物アレルギー、蕁麻疹、炎症性腸疾患、好酸性胃腸炎、薬物誘発皮疹、アレルギー性眼病、アレルギー性結膜炎、気管支喘息、気道過敏症、化粧品アレルギー、薬物誘発アレルギー、薬物誘発過敏性症候群、金属アレルギー、職業性過敏症性肺炎、慢性過敏症性肺炎、寒冷過敏性反応、寄生ぜん虫感染誘発過敏症、ラテックスアレルギーおよび枯草熱からの１種以上である請求項２０または２１に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＩｇＥに対する結合要素、とりわけ抗体分子に関する。当該結合要素は、なかんずく、アレルギーおよび喘息などのＩｇＥが介在する障害の処置に有用である。
【背景技術】
【０００２】
ＩｇＥは免疫グロブリンファミリーの一員であり、喘息、食物アレルギー、Ｉ型過敏症および副鼻腔炎症などのアレルギー応答を仲介する。
【０００３】
ＩｇＥはＢ細胞により分泌され、その表面で発現される。簡単に説明すると、ＩｇＥは短い膜結合領域を介して成熟ＩｇＥ分子に結合する膜貫通ドメインにより、Ｂ細胞に固着される。また、ＩｇＥはそのＦｃ領域を介して、Ｂ細胞、単球、好酸球および血小板にも低親和性ＩｇＥ受容体(ＦｃεＲII、ＣＤ２３としても既知)経由で結合され得る。アレルゲンに曝されると、アレルゲン特異的ＩｇＥを産生するＢ細胞は、クローン性に増幅される。アレルゲン特異的ＩｇＥは、次いで、Ｂ細胞により循環系に放出され、そこで次にＦｃεＲIIを介してＢ細胞に、同様に高親和性受容体(ＦｃεＲＩ)を介して肥満細胞および好塩基球に結合する。かかる肥満細胞および好塩基球はそれによってアレルゲンに対して感作される。その後そのアレルゲンに曝されると、肥満細胞および好塩基球上で架橋が起こり、それによって、ヒスタミンと、臨床上の過敏症およびアナフィラキシーを引き起こす他の因子の放出を活性化する。
【０００４】
ＦｃεＲIIを同時に阻害して、または阻害せずに、ＦｃεＲＩへの結合と、ＦｃεＲＩを介する機能的活性とを阻害する結合要素は、ＩｇＥが仲介する疾患症状、例えば、アレルギーおよび喘息などを阻害するために有用である。
【０００５】
一般に理解されていることは、ＦｃεＲＩおよびＦｃεＲIIが、ＩｇＥの定常(Ｆｃ)ドメインの認識部位に結合することである。これらの認識部位を同定するために、様々な研究がなされている。例えば、ＩｇＥ分子の特異的な部分に相当するペプチドが、ＩｇＥ受容体結合の競合的インヒビターとして(Burt et al., Eur. J. Immun, 17:437-440 [1987]; Helm et al., Nature, 331:180-183 [1988]; Helm et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 86:9465-9469 [1989]; Vercelli et al., Nature, 338:649-651 [1989]; Nio et al., Peptide Chemistry, 203-208 [1990])、またはＩｇＥ−受容体相互作用を遮断する可能性のある抗ＩｇＥ抗体を誘導するために使用されている(Burt et al., Molec. Immun. 24:379-389 [1987]; Robertson et al., Molec. Immun., 25:103-113 [1988]; Baniyash et al., Molec. Immun. 25:705-711 [1988])。
【０００６】
より最近、ゾレア(Xolair；登録商標)(オマリズマブ(Omalizumab))が喘息患者の処置のために製造・販売されている。ゾレア(Xolair；登録商標)は、ヒトＩｇＥに選択的に結合するヒト化ＩｇＧ１ｋモノクローナル抗体であり、その結合により肥満細胞および好塩基球の表面での少なくともＦｃεＲＩに対するＩｇＥの結合を低下させる。ＦｃεＲＩ担持細胞上での表面結合ＩｇＥを低下させることにより、ゾレア(Xolair；登録商標)は、アレルギー応答のメディエーターの放出度合いを幾分低下させる。ゾレア(Xolair；登録商標)は国際特許出願公開番号：ＷＯ９３／０４１７３およびＷＯ９７／０４８０７に開示されている。
【０００７】
しかしながら、この有望な治療戦略を改善するために、ゾレア(Xolair；登録商標)よりも高い親和性および／または効力を有する他のＩｇＥ結合要素が必要である。
【発明の概要】
【０００８】
我々は、適切にデザインした選択技法とアッセイ法を利用することにより、ＦｃεＲIIを同時に阻害するかまたは阻害せずに、ＦｃεＲＩ(肥満細胞上に存在する高親和性ＩｇＥ受容体)への結合と、ＦｃεＲＩを介する機能的活性とを阻害する結合要素を開発した。
【０００９】
本発明の結合要素は、ＦｃεＲIIを同時に阻害するかまたは阻害せずに、ＦｃεＲＩへの結合と、ＦｃεＲＩを介する機能的活性とを阻害する。結合の阻害は、直接の阻害、例えば、ＩｇＥを中和することによるものであり得る。本発明の結合要素は、例えば、ＲＢＬ−ＥＲ５１カルシウムシグナリングアッセイ法により定量したとき、典型的には約１０ｎＭ未満のＩＣ５０値でヒトＩｇＥを中和する。一部の実施態様において、本発明の結合要素は、例えば、ＲＢＬ−ＥＲ５１カルシウムシグナリングアッセイ法により定量したとき、約１ｎＭ未満、または約０.５ｎＭ未満、または約０.２ｎＭ未満のＩＣ５０値でヒトＩｇＥを中和する。
【００１０】
本発明の結合要素は、非ヒトＩｇＥ、すなわち、本来ヒト以外の種に存在するＩｇＥオーソログにも結合し、中和し得る。
【００１１】
本発明の結合要素は、通常、他の免疫グロブリンを越えて、ＩｇＥに特異的であり、従って、選択的にＩｇＥに結合する。かかる選択性は、例えば、標準的な競合アッセイ法により定量するか、または証明することができる。
【００１２】
当該結合要素は、ＩｇＥが仲介する障害、とりわけ、アレルギーおよび喘息の処置および／または予防に有用である。
【００１３】
当該結合要素は、哺乳動物において循環している遊離ＩｇＥを低下させるために有用であり、また、インビボまたはインビトロのいずれかにおいて、アレルゲンが誘発する肥満細胞の脱顆粒を阻害するために有用である。
【００１４】
当該結合要素は、さらにインビボまたはインビトロのいずれかにおいて、ＦｃεＲIIに結合したＩｇＥが仲介する生物応答を同時に阻害するか、または阻害せずに、ＦｃεＲＩに結合したＩｇＥが仲介する生物応答を阻害するために有用である。
【００１５】
また、本発明の結合要素は、診断使用、例えば、喘息患者またはアレルギー患者からのサンプルなど、目的のサンプル中の、ＩｇＥの存在もしくはその量、またはアレルゲン特異的ＩｇＥの存在もしくはその量を検出するための使用を有する。
【００１６】
結合要素が結合する残基の配列を決定するためには、適切な方法を使用し得る。例えば、ペプチド結合走査として、本明細書の別の個所で詳細に記載するペプスキャン(PEPSCAN)に基づく酵素結合免疫アッセイ(ＥＬＩＳＡ)などを使用し得る。ペプスキャンシステムにより提供される類のペプチド結合走査においては、抗原由来の短い重複ペプチドが結合要素に結合するものとして系統的に選抜される。当該ペプチドは支持体表面に共有結合し、ペプチドのアレイを形成する。ペプチドは直鎖または束縛されたコンホメーションを採り得る。束縛されたコンホメーションは、ペプチド配列の各端末に末端Ｃｙｓ残基を有するペプチドを用いて製造し得る。Ｃｙｓ残基は当該ペプチドがループ状のコンホメーションを保持するように支持体表面に直接または間接的に共有結合させることができる。従って、本方法に使用されるペプチドは、抗原フラグメントの対応するペプチド配列の各端末に付加したＣｙｓ残基を有し得る。Ｃｙｓ残基が、ペプチド配列の中間に、またはその近傍に付加的に位置するダブル・ループ状ペプチドも使用可能である。当該Ｃｙｓ残基は当該ペプチドがダブル・ループ状コンホメーションを形成するように、中心のＣｙｓ残基の各側に１個のループを有して、支持体表面に直接または間接的に共有結合させることができる。ペプチドは合成的に生成させることができ、またそれ故、Ｃｙｓ残基は本来ＩｇＥ配列には存在していないにもかかわらず、遺伝子工学的に所望の位置に導入することができる。選択肢として、直鎖および束縛状態のペプチドは共にペプチド結合アッセイ法により選抜し得る。ペプチド結合走査は結合要素が結合するペプチドのセットを(例えば、ＥＬＩＳＡを用いて)同定することからなり、その場合、当該ペプチドはＩｇＥのフラグメントに対応するアミノ酸配列を有し(例えば、ＩｇＥの約５個、１０個または１５個の連続する残基)、結合要素が結合する残基のフットプリントを決定するためにはペプチドを一直線に整列させるが、そこでの当該フットプリントは重なり合うペプチドに共通の残基を含んでなる。
【００１７】
あるいは、またはさらに、ペプチド結合スキャン法は、当該結合要素が結合するペプチドを、少なくとも所定のシグナル／ノイズ比により同定することからなる。適切なペプチド結合走査による結合決定法の詳細は、当該技術分野で既知である。技術上周知であり、また抗体の結合した残基を決定するために、および／またはペプチド結合走査結果を確認するために使用し得る他の方法は、部位特異的変異誘発、水素重水素交換、質量分析、ＮＭＲ、およびＸ線結晶解析などである。
【００１８】
本発明の結合要素は、ＩｇＥ変異体に結合および／または中和してもしなくてもよい。従って、本発明の結合要素は、ＦｃεＲIIを同時に阻害するか、または阻害せずに、ＦｃεＲＩに対するＩｇＥ変異体の結合を阻害してもしなくてもよい。
【００１９】
ＩｇＥの直鎖エピトープ配列は、例えば、それらを含んでなる単離したペプチドフラグメントまたはポリペプチドとして、本発明の結合要素を同定し、生成させ、単離し、および／または試験するために使用することができる。
【００２０】
下記により詳しく記載するように、本発明による結合要素は、高効力でＩｇＥを中和することが示されている。中和とは、ＩｇＥの生物活性を阻害することを意味する。本発明の結合要素は、ＩｇＥの１種以上の生物活性を中和し得るが、典型的にはＦｃεＲIIへの結合を同時に阻害するか、または阻害せずに、ＦｃεＲＩに結合するＩｇＥを阻害する。
【００２１】
ＦｃεＲIIを同時に阻害するか、阻害せずに、ＦｃεＲＩに結合するＩｇＥの中和は、選択肢として、アレルゲン誘発肥満細胞の脱顆粒など、当該受容体の生物活性の機能として測定してもよい。
【００２２】
本発明の結合要素によりＩｇＥの中和を測定する適切なアッセイ法は、例えば、リガンド受容体生化学的アッセイ法および表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)(例えば、バイアコア(BIACORE))などである。
【００２３】
生物活性の阻害は、部分的または全体的であり得る。結合要素は、受容体結合または肥満細胞の脱顆粒などのＩｇＥ生物活性を、結合要素不存在下の活性の１００％、または代わりに、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、もしくは少なくとも５０％、阻害し得る。
【００２４】
結合要素の中和力は、通常、特に他に断りのない限り、ＩＣ５０値としてｎＭで表わされる。機能的アッセイ法において、ＩＣ５０とはその最大値の５０％まで生物応答を低下させる結合要素の濃度である。リガンド結合の研究において、ＩＣ５０は、最大特異結合レベルの５０％まで受容体結合を低下させる濃度である。ＩＣ５０は最大の生物応答を結合要素濃度の対数の関数として％プロットし、プリズム(グラフパッド；GraphPad)などのソフトウェアプログラムを用いて、ＩＣ５０値を生成するデータにシグモイド関数を適合させることにより計算し得る。効力は、当業者既知のおよび／または本明細書に記載もしくは言及した１種以上のアッセイ法を用い、決定または測定し得る。
【００２５】
結合要素の中和力は、幾何平均として表わすことができる。幾何平均(幾何学的平均としても知られる)は、本明細書にて使用する場合、データセットの対数値の平均を意味し、基数１０に変換し戻す。このことは少なくとも２つの測定値が存在することが必要であり、例えば、少なくとも２回、好ましくは少なくとも５回、より好ましくは少なくとも１０回、反復することを要する。当業者は反復数が大きいほど、幾何平均値がより確かなものとなることを認識しているはずである。反復数の選択は当業者の裁量に委ね得るものである。
【００２６】
本明細書に記載したアッセイ法における結合要素によるＩｇＥ活性の中和は、当該結合要素がＩｇＥに結合し、中和することを示している。ＩｇＥにたいする結合要素の結合を判定するために使用し得る他の方法は、ＥＬＩＳＡ、ウエスタン・ブロッティング、免疫沈降、アフィニティクロマトグラフィーおよび生化学的アッセイ法である。
【００２７】
本発明の別の実施態様においては、免疫グロブリンＥに特異的な単離された結合要素が提供され、その結合要素は、血清中の免疫グロブリンＥに対する当該結合要素の結合のためのＩＣ５０が、ゾレア(Xolair；商標)よりも少なくとも１０倍低く、または二者択一的に少なくとも２０倍低く、少なくとも５０倍低く、少なくとも７５倍低く、少なくとも１００倍低く、少なくとも１２５倍低く、少なくとも１５０倍低く、少なくとも２００倍低く、少なくとも３００倍低く、少なくとも４００倍低く、または少なくとも５００倍低い。
【００２８】
２種類の種のＩｇＥについて、結合要素の交差反応性の程度を評価するためには、第一の種(例えば、ヒト)からのＩｇＥを用いるアッセイ法で計算した場合の結合要素の中和力を、第二の種(例えば、カニクイザル)からのＩｇＥを用いる同様の条件下での同様のアッセイ法で、結合要素の中和力と比較するとよい。別法として、交差反応性は本明細書の別の個所でより詳細に記載するように、競合結合アッセイ法により評価してもよい。
【００２９】
本発明の結合要素は、ヒトＩｇＥ結合アッセイもしくは生物学的アッセイにおいて、ヒト以外の種からのＩｇＥによる同様のアッセイにおけるよりもより強い中和力を有し得る。従って、ヒトＩｇＥによるアッセイにおいて、結合要素の中和力は、ヒト以外の種からのＩｇＥによる同様のアッセイにおけるよりもより大きくなり得る。ヒトＩｇＥ結合アッセイもしくは生物学的アッセイにおける効力は、例えば、カニクイザルのＩｇＥを用いる同様のアッセイにおけるよりも約５倍強力であり得るか、または別の実施態様においては、約１５倍ないし２０倍強力であり得る。より具体的には、ヒトＲＢＬ−ＥＲ５１カルシウムシグナリングアッセイにおける効力は、２５ｎｇ／ｍｌのヒトＩｇＥの濃度について定量可能であり、また別な方法での同様の条件下で、１００ｎｇ／ｍｌのカニクイザルＩｇＥを用いる効力に比較し得る。ヒトＩｇＥおよびカニクイザルＩｇＥを用いる同様のＲＢＬ−ＥＲ５１カルシウムシグナリングアッセイにて得られるデータの例を、表２ｂに示す。
【００３０】
本発明の結合要素は、ヒトＩｇＥに対して、他の種のＩｇＥに対してよりもより強い親和性を有し得る。ヒトＩｇＥに対しての結合要素の親和性は、例えば、カニクイザルのＩｇＥに対してよりも約５倍ないし１０倍強くなり得るか、または別の実施態様においては、約１００倍強くなり得る。ヒトとカニクイザルのＩｇＥ両方について得られたデータの例を表２ａとｂに示す。
【００３１】
本発明の結合要素は、例えば、ＲＢＬ−ＥＲ５１カルシウムシグナリングアッセイにおいて、ヒトＩｇＥの濃度２５ｎｇ／ｍｌで、ＩｇＥ中和力を有するか、または約１０ｎＭ未満のＩＣ５０を有し得る。あるいは、ＩＣ５０は約３ｎＭ未満である。他の実施態様において、ＩＣ５０は約１ｎＭ未満、または約０.５ｎＭ未満、または約０.２ｎＭ未満である。
【００３２】
本発明の別の実施態様においては、免疫グロブリンＥに特異的な単離結合要素が提供され、その結合要素は、ＲＢＬ−ＥＲ５１細胞中、２５ｎｇ／ｍｌのＩｇＥにより誘発されるカルシウムシグナリングの阻害のために、１ｎＭ未満の幾何平均ＩＣ５０、あるいは、０.６ｎＭ未満、０.５ｎＭ未満、０.４ｎＭ未満、０.３ｎＭ未満、０.２ｎＭ未満、もしくは０.１ｎＭ未満の幾何平均ＩＣ５０を有する。
【００３３】
ヒトＩｇＥに対するＩｇＥ結合要素の結合速度論および親和性(平衡解離定数ＫＤとして表す)は、例えば、表面プラズモン共鳴(バイアコア)を用いて測定し得る。本発明の結合要素は、通常、ヒトＩｇＥに対して約１０ｎＭ未満の親和性(ＫＤ)を有し、一部の実施態様においては、約５ｎＭ未満のＫＤを有し、また他の実施態様においては２ｎＭ未満のＫＤを有する。カニクイザルのＩｇＥに対する親和性は、通常、約２０ｎＭ未満であり、一部の実施態様においては、約１０ｎＭ未満のＫＤを有する。
【００３４】
抗体とその抗原に対する結合親和性の測定のためには多くの方法論が利用可能である；かかる方法論の一つはＫｉｎＥｘＡである。速度論的排除アッセイ(ＫｉｎＥｘＡ)は一般的目的のイムノアッセイプラットフォーム(基本的にフロー分光蛍光光度計)で行い、抗原／抗体相互作用の平衡解離定数、および会合と解離の速度定数の測定を可能とする。ＫｉｎＥｘＡは平衡に達した後に実施されるため、多価抗原／ｍＡｂ相互作用のＫＤを測定するために使用するのが、有利な技法である。ＩｇＥ分子に対する抗体の結合は、多価抗原に対する結合の例である。ＫｉｎＥｘＡの使用は、多価抗原が１個を超える抗体と１個を越える抗原からなる抗体と抗原の多重合体の形成されていることを意味する場合に特に適切である。かかる複合体相互作用モデルにおいて、正確にＫＤを評価することは困難である。ＫｉｎＥｘＡ方法論は文献(Drake et al (2004) Analytical Biochemistry 328, 35-43)記載のように実施し得る。ＫｉｎＥｘＡ方法論で測定した場合、抗体１１は３５３ｐＭのＫＤを有するゾレア(Xolair；商標)よりも実質的に低い６.３ｐＭのＫＤを有する。
【００３５】
本発明の別の実施態様においては、ＫｉｎＥｘＡ方法論により測定した場合、３００ｐＭ以下のＫＤを有する免疫グロブリンＥに特異的な単離された結合要素が提供される。別法では、２００ｐＭ以下、１００ｐＭ以下、５０ｐＭ以下、２０ｐＭ以下または１０ｐＭ以下のＫＤを示す。
【００３６】
インビボ内在性ＩｇＥはグリコシル化を受け得るものであり、従って、グリコシル化ヒトＩｇＥはヒト治療のための治療標的である。細菌に由来し、グリコシル化され得ない組換えヒトＩｇＥは、本明細書に記載のアッセイ法には使用し得るが、本発明の結合要素は、Ｕ２６６.Ｂ１などの骨髄腫細胞株が産生するＩｇＥなど、グリコシル化されたヒトＩｇＥに結合し得る。このことは、グリコシル化ヒトＩｇＥがインビボでのヒトへの適用のための標的抗原であるため、本発明の結合要素の重要な長所を示すものである。
【００３７】
本発明の結合要素は、抗体分子、好ましくは、ヒト抗体分子またはヒト化抗体分子を含み得るものである。本発明の一側面において、該抗体分子はモノクローナル抗体である。
【００３８】
抗体の結合部位は、一般に、可変重鎖(ＶＨ)および可変軽鎖(ＶＬ)免疫グロブリンドメインにより形成され、またその抗原結合界面は、相補性決定領域(ＣＤＲ)と呼称される６個の表面ポリペプチドループにより形成される。各ＶＨには３種のＣＤＲ(ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３)が、また各ＶＬには、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３)が、枠組み領域(ＦＲ)と共に存在する。
【００３９】
本発明の結合要素は、通常、抗体のＶＨおよび／またはＶＬドメインを含んでなる。本発明のＶＨドメインはＨＣＤＲのセットを含んでなり、またＶＬドメインはＬＣＤＲのセットを含んでなる。抗体分子は、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２とＣＤＲ３および枠組みを含んでなる抗体ＶＨドメインを含み得る。また代わり得るものとして、抗体分子はＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２とＣＤＲ３および枠組みを含んでなる抗体ＶＬドメインをも含み得る。本発明による抗体ＶＨドメイン(配列番号：２、１２、２２、３２、４２、５２、６２、７２、８２、９２、１０２、１１２、１２２、１３２、１４２、１５２、１６２、１７２、１８２、１９２、２０２、２１２、２２２、２３２、２４２、２５２、２６２、２７２、２８２、２８８、３００、および３０６)および抗体ＶＬドメイン(配列番号：３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０、３４２、３４４、３４６、３４８、３５０、３５２、３５４、３５６、３５８、３６０、３６２、３６４、３６６、３６８、３７０、３７２、３７４、３７６、３７８および３８０)およびＣＤＲ(配列番号：３−５、８−１０、１３−１５、１８−２０、２３−２５、２８−３０、３３−３５、３８−４０、４３−４５、４８−５０、５３−５５、５８−６０、６３−６５、６８−７０、７３−７５、７８−８０、８３−８５、８８−９０、９３−９５、９８−１００、１０３−１０５、１０８−１１０、１１３−１１５、１１８−１２０、１２３−１２５、１２８−１３０、１３３−１３５、１３８−１４０、１４３−１４５、１４８−１５０、１５３−１５５、１５８−１６０、１６３−１６５、１６８−１７０、１７３−１７５、１７８−１８０、１８３−１８５、１８８−１９０、１９３−１９５、１９８−２００、２０３−２０５、２０８−２１０、２１３−２１５、２１８−２２０、２２３−２２５、２２８−２３０、２３３−２３５、２３８−２４０、２４３−２４５、２４８−２５０、２５３−２５５、２５８−２６０、２６３−２６５、２６８−２７０、２７３−２７５、２７８−２８０、２８３−２８５、２９６−２９８、２８９−２９１、２９６−２９８、３０１−３０３、３０７−３０９、および３１４−３１６)の例は、本開示の一部を形成する添付の配列リストに列記したとおりである(表３ａも参照)。さらに、ＣＤＲ類は下記および表１に開示する。本明細書に開示されたＶＨおよびＶＬ配列、ＣＤＲ配列、ＣＤＲのセットおよびＨＣＤＲのセットおよびＬＣＤＲのセット、これらすべては本発明の側面と実施態様を表すものである。
【００４０】
本明細書に記載する、ＣＤＲ類のセットはＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含んでなる。従って、ＨＣＤＲ類のセットはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３をいい、ＬＣＤＲ類のセットとは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３をいう。他に特に断りのない限り、ＣＤＲ類のセットはＨＣＤＲ類およびＬＣＤＲ類を含む。
【００４１】
あるいは、本発明の結合要素は、さらに下記で検討するように、非抗体タンパク質骨格における１つ以上のＣＤＲ、例えば、ＣＤＲ類のセットにより通常提供される非抗体分子内に、抗原結合部位を含み得る。
【００４２】
本明細書に記載する、親抗体分子は表１に示すようなＣＤＲ配列のセットを有するものとして単離された(抗体１参照)。最適化プロセスにより、我々は、親ＣＤＲ配列に由来し、表１に示した位置に修飾を有するＣＤＲ配列をもつ抗体クローン番号２−２８のパネルを作製した。従って、例えば、表１から理解し得ることは、抗体２が、親のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列を有し、さらに親のＨＣＤＲ３配列を有し、その場合、Ｋａｂａｔ残基９６がＳと置き換わり、Ｋａｂａｔ残基９７がＬと置き換わり、Ｋａｂａｔ残基９９がＳと置き換わり、Ｋａｂａｔ残基１００がＡと置き換わっている。
【００４３】
本明細書に記載の結合要素は、表１に示すとおりＣＤＲ類の親セットを含んでなり(抗体１)、その場合のＨＣＤＲ１は配列番号３である(Ｋａｂａｔ残基３１−３５)。ＨＣＤＲ２は配列番号４(Ｋａｂａｔ残基５０−６５)であり、ＨＣＤＲ３は配列番号５(Ｋａｂａｔ残基９５−１０２)であり、ＬＣＤＲ１は配列番号８(Ｋａｂａｔ残基２４−３４)であり、ＬＣＤＲ２は配列番号９(Ｋａｂａｔ残基５０−５６)であり、またＬＣＤＲ３は配列番号１０(Ｋａｂａｔ残基８９−９７)である。本発明による結合要素は表１に示す親結合要素でもあり得、その場合、１つ以上のＣＤＲが１つ以上の付加、置換、欠失、および／または挿入を有する。一部の実施態様において、当該結合要素は、抗体１１の親配列に関して、１個ないし１０個の付加、置換、欠失、および／または挿入を有するＣＤＲ類のセットを含んでなる。別の実施態様においては、抗体１１に関して１個ないし１０個の置換を有する。別の実施態様においては、抗体１の親配列に関して１個ないし１１個の付加、置換、欠失、および／または挿入を形成する。別の実施態様においては、抗体１に関して１個ないし１０個の置換を有する。
【００４４】
特定の実施態様において、本発明の結合要素は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＥＲ３を含んでなる；この場合、ＨＣＤＲ３は１個ないし５個のアミノ酸の付加、置換、欠失、および／または挿入を有してもよい配列番号５のアミノ酸配列を有する；またＬＣＤＲ３は１個ないし６個のアミノ酸の付加、置換、欠失、および／または挿入を有してもよい配列番号１０のアミノ酸配列を有する。かかる実施態様において、ＨＣＤＲ１は配列番号３のアミノ酸配列を有し得る；ＨＣＤＲ２は配列番号４のアミノ酸配列を有し得る；ＬＣＤＲ１は配列番号８のアミノ酸配列を有し得る；またＬＣＤＲ２は配列番号９のアミノ酸配列を有し得る。あるいは、該ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＬＣＤＲ１、およびＬＣＤＲ２はまた親配列に関して、集合的に１個以上のアミノ酸の付加、置換、欠失、および／または挿入を有し得る(抗体１)；例えば、１個ないし１０個の置換を有する。
【００４５】
本発明の結合要素は、本明細書に記載のＣＤＲの１つ、または組合せを含んでなり得る。例えば、本発明の結合要素は、配列番号３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１；配列番号４のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２；配列番号５、１５、２５、６５、７５、８５、９５、１４５、１５５、１７５および２５５からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３；配列番号８のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１；配列番号９のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２；および配列番号１０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０および２８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３；を含み得る。
【００４６】
特定の実施態様において、本発明の結合要素またはＶＨドメインは以下の置換の１つ以上をもつ親ＨＣＤＲ３(配列番号５)を含んでなる：
Ｓ、Ｍ、またはＴに置換したＫａｂａｔ残基９６；
ＬまたはＧに置換したＫａｂａｔ残基９７；
Ｋに置換したＫａｂａｔ残基９８；
Ｓ、Ｗ、Ａ、Ｔ、またはＥに置換したＫａｂａｔ残基９９；
ＡまたはＩに置換したＫａｂａｔ残基１００。
【００４７】
一部の実施態様において、結合要素、またはそのＶＬドメインはＫａｂａｔ残基９４がＴ、Ｒ、Ｄ、Ｐ、Ｅ、Ｎ、Ｈ、Ｑ、またはＡと置き換わった親ＬＣＤＲ３(配列番号１０)を含み得る。
【００４８】
特定の実施態様において、本発明の結合要素またはＶＬドメインは以下の置換の１つ以上をもつ親ＬＣＤＲ３(配列番号１０)を含んでなる：
Ｔ、Ｒ、Ｄ、Ｐ、Ｅ、Ｎ、Ｈ、Ｑ、またはＡに置換したＫａｂａｔ残基９４；
Ｔ、Ｋ、Ｓ、Ｉ、Ｇ、Ｈ、Ｍ、Ｆ、Ｒ、Ｎ、ＫまたはＱに置換したＫａｂａｔ残基９５；
Ｌ、Ｈ、Ｄ、Ｇ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、ＫまたはＥに置換したＫａｂａｔ残基９５Ａ；
Ｔ、Ｈ、Ｓ、Ｙ、ＬまたはＮに置換したＫａｂａｔ残基９５Ｂ；
ＧまたはＡに置換したＫａｂａｔ残基９６；
Ｐ、ＳまたはＧに置換したＫａｂａｔ残基９７。
【００４９】
一実施態様において、本発明は、ＨＣＤＲ１が配列番号１０３のアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ２が配列番号１０４のアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ３が配列番号１０５のアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ１が配列番号１０８のアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ２が配列番号１０９のアミノ酸配列を有し、またＬＣＤＲ３が配列番号１１０のアミノ酸配列を有する結合要素である。例えば、表１の抗体１１参照。
【００５０】
さらに本発明の他の実施態様は、ヒトＩｇＥに結合する表１の抗体１１などの本発明の抗体と競合し得る、抗体分子などの結合要素であり、当該結合要素は本明細書に記載のアッセイ法において、約１ｎＭ未満のＩＣ５０で、または約０.５ｎＭ未満のＩＣ５０で、ヒトＩｇＥを中和する。一部の実施態様において、ＩＣ５０は約０.２ｎＭ未満である。
【００５１】
本発明は、抗体１ないし２８のいずれかのＨＣＤＲ１および／またはＨＣＤＲ２および／またはＨＣＤＲ３、および／または抗体１ないし２８のいずれかのＬＣＤＲ１および／またはＬＣＤＲ２および／またはＬＣＤＲ３を含んでなる結合要素、例えば、表１に示した抗体１ないし２８のいずれかのＣＤＲ類のセットを含む結合要素を提供する。該結合要素はこれらの抗体の１つのＶＨ  ＣＤＲ類のセットを含み得る。選択肢として、該要素はこれらの抗体の１つのＶＬ  ＣＤＲ類のセットを含み得るものであり、また該ＶＬ  ＣＤＲはＶＨ  ＣＤＲと同じであるか、または異なる抗体からのものでもよい。抗体１ないし２８のいずれかのＨＣＤＲ類のセットを含んでなるＶＨドメイン、および／または抗体１ないし２８のいずれかのＬＣＤＲ類のセットを含んでなるＶＬドメインもまた本発明により提供される。
【００５２】
典型的に、ＶＨドメインはＶＬドメインと対合して抗体の抗原結合部位を提供するが、さらに以下に記載するとおり、ＶＨまたはＶＬドメインは単独で使用して抗原に結合させることができる。抗体１のＶＨドメイン(表１参照)は抗体１のＶＬドメインと対合させることが可能であり、結果として抗体１のＶＨとＶＬドメインの両方を含んでなる抗体の抗原結合部位が形成される。類似の実施態様が本明細書に開示した他のＶＨおよびＶＬドメインについて提供される。他の実施態様においては、抗体１のＶＨが該抗体１のＶＬ以外のＶＬドメインと対合する。軽鎖の乱交雑については当該技術分野にて完全に確立されている。再び、類似の実施態様が本発明により、本明細書に開示した他のＶＨおよびＶＬドメインについて提供される。従って、親のＶＨまたは抗体２ないし２８のいずれかのＶＨは、親のＶＬまたは抗体２ないし２８のいずれかのＶＬと対合し得る。
【００５３】
結合要素は親の抗体または抗体２ないし２８のいずれかのＨおよび／またはＬ  ＣＤＲのセットを含み得るが、開示したＨおよび／またはＬ  ＣＤＲのセット内には、多い場合、２０個、１６個、１０個、９個の、または少なくは、例えば、１個、２個、３個、４個または５個のアミノ酸の付加、置換、欠失、および／または挿入を含む。あるいは結合要素は、親の抗体または抗体２ないし２８のいずれかのＨおよび／またはＬ  ＣＤＲのセットを含み得るが、開示したＨおよび／またはＬ  ＣＤＲのセット内には、多い場合、２０個、１６個、１０個、９個の、または少なくは、例えば、１個、２個、３個、４個または５個のアミノ酸の置換を含む。かかる修飾は、潜在的にＣＤＲセット内のいずれの残基においてなされてもよい。例えば、修飾は表１に示すように、抗体２ないし２８のいずれかの修飾される位置でなし得る。従って、１ヶ所以上の修飾は、以下の残基での１つ以上の置換を含み得る：ＨＣＤＲにおけるＫａｂａｔ残基９６、９７、９８、９９および１００；およびＬＣＤＲにおけるＫａｂａｔ残基９４、９５、９５Ａ、９５Ｂ、９６、および９７。
【００５４】
結合要素は抗体の枠組み内に、１個以上のＣＤＲ、例えば、ＣＤＲ類のセットをもつ抗体分子を含み得る。例えば、１個以上のＣＤＲまたは抗体のＣＤＲ類のセットは、枠組み(例えば、ヒトの枠組み)に移植し、抗体分子を提供し得る。当該枠組み領域は、ヒトの生殖系列遺伝子配列のもの、または非ヒト生殖系列のものでもよい。従って、当該枠組みは、枠組み内の１つ以上の残基を最も近似のヒト生殖系列枠組みにおける等しい位置の残基に調和するように変化させた場合に、生殖系列化し得る。従って、本発明の結合要素は、ヒト生殖系列枠組み、例えば、ヒト生殖系列ＩｇＧ  ＶＨ枠組みのＨＣＤＲ類のセットを含んでなるＶＨドメインを有する単離ヒト抗体分子であってもよい。結合要素はまた、例えば、ヒト生殖系列ＩｇＧのＶＬフラグメントのＬＣＤＲ類のセットを含んでなるＶＬドメインをも有する。
【００５５】
ＶＨおよび／またはＶＬ枠組み残基は考察したように修飾可能であり、ここでは、例えば、部位特異的突然変異誘発を使用することが例示となる。本発明によるＶＨもしくはＶＬドメイン、またはかかるＶＬドメインを含んでなる結合要素は、好ましくは表３の抗体のＶＨおよび／またはＶＬドメイン配列を有する。
【００５６】
非生殖系列抗体分子は同じＣＤＲを有するが、生殖系列抗体分子に比較して、異なる枠組みを有する。生殖系列抗体は、これらの抗体について本明細書に示したＶＨおよびＶＬドメイン配列の枠組み領域を生殖系列化することにより産生させ得る。
【００５７】
本発明の結合要素は、共にＩｇＥに結合するいずれかの結合要素と、ＩｇＥへの結合に対して競合し、ＶＨおよび／またはＶＬドメイン、ＣＤＲ(例えば、ＨＣＤＲ３)、および／または本明細書に開示したＣＤＲ類のセットなどの結合要素を含んでなるものであり得る。結合要素間の競合は、インビトロで、例えば、ＥＬＩＳＡを用いるか、および／または１種以上の他の非標識結合要素の存在下に、１つの結合要素に特異的レポーター分子を標識し、同一のエピトープまたは重なり合うエピトープに結合する結合要素を同定可能とすることにより容易にアッセイし得る。かかる方法は当業者が容易に知り得るものであり、また本明細書により詳しく記載してある。従って、本発明のさらなる側面は、抗体分子と競合するヒト抗体の抗原結合部位を含んでなる結合要素を提供する；該抗体分子は、ヒトＩｇＥに結合するもので、例えば、とりわけ、ＶＨおよび／またはＶＬドメイン、ＣＤＲ(例えば、ＨＣＤＲ３)または抗体１ないし２８の親抗体もしくはそのいずれかのＣＤＲ類のセットを含んでなる抗体分子である。一実施態様において、本発明の結合要素は、表１の抗体１１と競合する。
【００５８】
本発明の実施態様では、ＩｇＥの特異的領域に結合する結合要素を提供する。結合は、例えば、結合要素とＩｇＥの残基との特異的相互作用を、例えば、Ｘ線結晶解析を用いて決定し得る結合要素：ＩｇＥ複合体の構造中で、検出または観察することにより決定し得る。Ｘ線結晶解析により決定されるヒトＩｇＥのＣε３−Ｃε４ドメインに結合した抗体１１の構造は、当該結晶内の抗体１１のＦａｂとＩｇＥとの２つの相互作用を研究する機会を提供した。ＩｇＥは２本の軽鎖と２本の重鎖が存在するので二価の抗原である。Ｘ線結晶解析の研究は、そのＦａｂが２本のＩｇＥ重鎖をわたって伸びるエピトープに結合することを示した。
【００５９】
第一の相互作用は、抗体１１の相互作用部位が、一方のＩｇＥ重鎖のＧｌｕ３９０からＡｓｎ３９４までの残基と糖部分ＧｌｃＮＡｃ１およびＭａｎ６、および他のＩｇＥ重鎖のＬｅｕ３４０、Ａｒｇ３４２、Ａｌａ４２８からＴｈｒ４３４まで、Ｔｈｒ４３６、Ｓｅｒ４３７とＧｌｕ４７２、および糖部分Ｍａｎ５を含んでなることを示していた。
【００６０】
本発明の一実施態様においては、免疫グロブリンＥに特異的な単離された結合要素が提供されるが、その場合の当該結合要素は以下からなる免疫グロブリンＥのエピトープに結合する：
第一のＩｇＥ重鎖において残基Ｇｌｕ３９０からＡｓｎ３９４、および第二のＩｇＥ重鎖のＬｅｕ３４０、Ａｒｇ３４２、Ａｌａ４２８からＴｈｒ４３４まで、Ｔｈｒ４３６、Ｓｅｒ４３７およびＧｌｕ４７２；
さらなる実施態様において、第一のＩｇＥ重鎖の糖部分ＧｌｃＮＡｃ１およびＭａｎ６、および第二のＩｇＥ重鎖の糖部分Ｍａｎ５をさらに含んでなる当該エピトープ。
【００６１】
第二の相互作用は、抗体１１の相互作用部位が、第一のＩｇＥ重鎖のＧｌｕ３９０、Ｇｌｎ３９２からＡｓｎ３９４までの残基と糖部分ＧｌｃＮＡｃ１およびＭａｎ６、および第二のＩｇＥ重鎖のＬｅｕ３４０、Ａｒｇ３４２、Ａｌａ４２８からＴｈｒ４３４まで、Ｔｈｒ４３６、Ｓｅｒ４３７およびＧｌｕ４７２を含んでなることを示していた。
【００６２】
本発明のさらなる実施態様においては、免疫グロブリンＥに特異的な単離された結合要素が提供されるが、その場合の当該結合要素は以下からなる免疫グロブリンＥのエピトープに結合する：
第一のＩｇＥ重鎖において残基Ｇｌｕ３９０、Ｇｌｎ３９２からＡｓｎ３９４まで、および第二のＩｇＥ重鎖のＬｅｕ３４０、Ａｒｇ３４２、Ａｌａ４２８からＴｈｒ４３４まで、Ｔｈｒ４３６、Ｓｅｒ４３７およびＧｌｕ４７２；
さらなる実施態様において、第一のＩｇＥ重鎖の糖部分ＧｌｃＮＡｃ１およびＭａｎ６をさらに含んでなる当該エピトープ。
【００６３】
本発明のさらなる実施態様においては、免疫グロブリンＥに特異的な単離された結合要素が提供されるが、その場合の当該結合要素は以下からなる免疫グロブリンＥのエピトープに結合する：
第一のＩｇＥ重鎖において残基Ｇｌｕ３９０、Ｇｌｕ３９２からＡｓｎ３９３まで、および第二のＩｇＥ重鎖のＬｅｕ３４０、Ａｒｇ３４２、Ａｌａ４２８からＴｈｒ４３４まで、Ｔｈｒ４３６、Ｓｅｒ４３７およびＧｌｕ４７２；
さらなる実施態様において、第一のＩｇＥ重鎖の糖部分ＧｌｃＮＡｃ１およびＭａｎ６をさらに含んでなる当該エピトープ。
【００６４】
本発明のさらなる実施態様においては、免疫グロブリンＥに特異的な単離された結合要素であって、第一のＩｇＥ重鎖からの要素と第二のＩｇＥ重鎖からの要素を含んでなるエピトープに結合する結合要素が提供される。
【００６５】
さらなる側面において、本発明はヒトＩｇＥに結合するための抗体抗原結合部位と競合するヒト抗体抗原結合部位を含んでなる結合要素が提供される；その場合の抗体抗原結合部位がＶＨドメインとＶＬドメインから構成され、またそのＶＨおよびＶＬドメインは、本明細書に開示するように、抗体２ないし２８の親(抗体１)の、またはそのいずれかのＣＤＲ類のセットを含んでなる。
【００６６】
さらなる側面において、本発明は本発明による結合要素、ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインをコードする配列を含んでなる単離核酸を提供する。例えば、配列番号１、１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１、９１、１０１、１１１、１２１、１３１、１４１、１５１、１６１、１７１、１８１、１９１、２０１、２１１、２２１、２３１、２４１、２５１、２６１、２７１、２８１、２８７、２９９および３０５は、模範となる本発明のＶＨドメインをコードし、また配列番号３１７、３１９、３２１、３２３、３２５、３２７、３２９、３３１、３３３、３３５、３３７、３３９、３４１、３４３、３４５、３４７、３４９、３５１、３５３、３５５、３５７、３５９、３６１、３６３、３６５、３６７、３６９、３７１、３７３、３７５、３７７および３７９は、模範となる本発明のＶＬドメインをコードする。本発明はまた、本発明の結合要素、ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインの調製法を包含し、当該方法は当該結合要素、ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインを産生させる条件下で当該核酸を発現させ、該結合要素を単離または精製することによりそれを回収することからなる。
【００６７】
本発明の別の側面では、本明細書に開示したＶＨ  ＣＤＲまたはＣＬ  ＣＤＲ配列をコードする、一般的に単離された核酸を提供する。
【００６８】
さらなる側面では、本発明の核酸を含む宿主細胞またはその核酸で形質転換した宿主細胞を提供する。
【００６９】
本発明のさらなる側面では、本発明の結合要素を含む組成物、および治療によるヒトまたは動物身体の処置方法を含む、ＩｇＥを阻害および／または中和する方法におけるそれらの使用を提供する。
【００７０】
例えば、本発明による結合要素は、ヒトもしくは動物身体(例えば、ヒト患者)の生物学的応答、疾患、障害、または症状の処置および／または予防方法に使用し得るか、またはそれらの診断方法に、またはインビトロで使用し得る。
【００７１】
当該処置および／または予防方法は、測定可能にＩｇＥを中和する十分な量の本発明の結合要素を当該患者に投与することからなる。本発明により処置し得る症状とは、アレルギーおよび喘息など、ＩｇＥが役割を演じる症状である。
【００７２】
本発明のこれらのおよび他の側面につき、以下にさらに詳細に記載する。
本明細書にて使用する場合、「および／または」とは、２つの特定した特徴または成分のそれぞれを、他方をも含め、または含めずに、特定して開示したと解釈すべきであることを指摘しておくことが好都合である。例えば、「Ａおよび／またはＢ」とは、本明細書では個々にそれぞれについて述べてあるとしても、(ｉ)Ａ、(ii)Ｂ、および(iii)ＡおよびＢのそれぞれを特定して開示していると解釈すべきである。
【００７３】
ＩｇＥとは免疫グロブリンＥである。ヒトＩｇＥ定常領域のアミノ酸配列は、公的に入手可能である。一部の実施態様において、ＩｇＥはヒトまたはカニクイザルのＩｇＥであり得る。本明細書の他の個所で記載するように、ＩｇＥは組換え体でもよいし、および／またはグリコシル化または未グリコシル化体であってもよい。ＩｇＥは本来インビボでは、例えば、Ｕ２６６.Ｂ１細胞中、グリコシル化形状で発現される。グリコシル化ＩｇＥは組換えシステムで発現されてもよい。
【００７４】
結合要素は一般に互いに結合する一対の分子の一方の要素をいう。結合する対の要素は天然に由来するか、または全体もしくは部分的に合成的に製造し得る。分子対の一方の要素は、その表面の面積または空洞をもち、それが分子対の他方の要素の特定の空間的および極性組織に結合し、従って相補性である。この型の結合対の例は、抗原−抗体、ビオチン−アビジン、ホルモン−ホルモン受容体、受容体−リガンド、酵素−基質である。本発明は一般に抗原−抗体型の反応に関する。
【００７５】
結合要素は通常抗原結合部位を有する分子を含んでなる。例えば、結合要素は抗体分子でもよいし、または抗原結合部位を含んでなる非抗体タンパク質でもよい。
【００７６】
抗原結合部位は、フィブロネクチンまたはシトクロームＢなどの非抗体タンパク質骨格上のＣＤＲの配列により[１、２、３]、または所望の標的に結合特異性を付与するタンパク質骨格内にループ上のアミノ酸残基をランダム化するか、または変異することにより提供し得る。タンパク質に新しい結合部位を設計作製した骨格については、ナイグレンら(Nygren et al.)[３]が詳細に概説している。抗体模倣体のタンパク質骨格は、国際特許ＷＯ／００３４７８４(参照によりその全文を本明細書の一部とする)に開示されている；そこで発明者らは少なくとも１個のランダム化ループを有するフィブロネクチン型IIIドメインを含むタンパク質(抗体模倣体)を記載している。１個以上のＣＤＲ、例えば、ＨＣＤＲ類のセットを移植する適切な骨格は、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのいずれかのドメイン要素により提供し得る。該骨格はヒトまたは非ヒトタンパク質であり得る。非抗体タンパク質骨格の利点は、それが少なくとも一部の抗体分子よりもより小さく、および／またはより容易に製造し得る骨格分子の抗原結合部位を提供し得ることである。結合要素の小さなサイズは、細胞に侵入する能力、組織に深く入り込む能力、もしくは他の構造内の標的に達する能力、または標的抗原のタンパク質空洞内に結合する能力などの有用な生理的性質を付与し得る。非抗体タンパク質骨格における抗原結合部位の使用については、文献(Wess, 2004)[４]に概説されている。典型的なのは、安定な骨格と１種以上の可変ループを有するタンパク質であり、その場合、１つ以上のループのアミノ酸配列は、特異的にまたは無作為に変異して、標的抗原に結合する抗原結合部位を創出する。かかるタンパク質は、黄色ブドウ球菌(S. aureus)からのプロテインＡのＩｇＧ結合ドメイン、トランスフェリン、テトラネクチン、フィブロネクチン(例えば、１０番目のフィブロネクチンIII型ドメイン)、リポカリン並びにガンマ結晶性および他のアフィリン(Affilin；商標)骨格(シル・プロテインズ；Scil Proteins)を包含する。他の方法の例は、シクロチド(cyclotide)に基づく合成「微小体」−分子内ジスルフィド結合を有する小型タンパク質、ミクロプロテイン(ベルサボディ(Versabodies(登録商標)、アミュニックス(Amunix))およびアンキリン繰返しタンパク質(ダーピンズ(DARPins)、モレキュラーパートナーズ)を包含する。かかるタンパク質はまた、小型の遺伝子工学的に作製したタンパク質ドメイン、例えば、イムノドメイン(参照例：米国特許公開第 2003082630 および 2003157561 号明細書)などを包含する。イムノドメインは抗体の少なくとも１つの相補性決定領域(ＣＤＲ)を含んでいる。
【００７７】
抗体配列および／または抗原結合部位に加えて、本発明による結合要素は、例えば、折り畳まれたドメインなどのペプチドもしくはポリペプチドを形成する他のアミノ酸、または抗原に結合する能力に加えて、該分子に別の機能的特徴を与える他のアミノ酸を含み得る。本発明の結合要素は検出可能な標識を担持し得るか、または毒素もしくは標的部分もしくは酵素に接合し得る(例えば、ペプチジル結合またはリンカーを経由)。例えば、結合要素は触媒部位(例えば、酵素ドメインにおいて)並びに抗原結合部位を含み得る；その場合、抗原結合部位は抗原に結合する、従って、触媒部位を抗原への目標に定める。触媒部位は抗原の生物的機能を、例えば、切断することにより阻害し得る。
【００７８】
特に言及したように、ＣＤＲは非抗体骨格により支えられ得るが、ＣＤＲまたは本発明のＣＤＲ類のセットを支える構造は、一般に、抗体重鎖もしくは軽鎖配列またはその実質的部分であり、そこでのＣＤＲまたはＣＤＲのセットは、再配列された免疫グロブリン遺伝子がコードする天然産ＶＨおよびＶＬ抗体の可変ドメインのＣＤＲまたはＣＤＲのセットに相当する位置に位置する。免疫グロブリン可変ドメインの構造と位置は、引用文献(Kabat, et al., 1987)[５]により決定可能であり、その最新情報はインターネット検索エンジンにより、“Kabat”で見出し得る。
【００７９】
ＣＤＲ領域またはＣＤＲとは、文献(Kabat et al. 1991[６]および以降の版)に定義されているとおり、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の超可変領域を示すものとする。抗体は典型的に３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲを含む。用語ＣＤＲまたはＣＤＲ類とは、ここではその状況に応じて、これらの領域の１ヶ所または数ヶ所、またはさらにはそれら領域の全体を示すために使用するものであって、それらの領域は、それが認識する抗原またはエピトープに対する抗体の親和性によって結合を担うアミノ酸残基の大多数を含むものである。
【００８０】
６種の短鎖ＣＤＲ配列の内、重鎖の第三ＣＤＲ(ＨＣＤＲ３)は大きなサイズ可変性を有する(それを惹き起こす遺伝子の配列メカニズムに実質的に依存する大きな多様性)。その長さはアミノ酸２個と短いが、既知の最長サイズは２６個である。また、ＣＤＲの長さは特定の基礎をなす枠組みによって調整し得る長さに従って変化し得る。機能的に、ＨＣＤＲ３は抗体の特異性の決定に一部で役割を演じている[参照：７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４]。本発明の別の実施態様においては、表３ａから選択されるＨＣＤＲ３配列を含んでなる単離結合要素が提供される。
【００８１】
抗体分子はそれが天然産であろうと、または部分的もしくは全体として合成的に産生されたものであろうと、免疫グロブリンをいう。この用語はまた抗体抗原結合部位を含んでなるポリペプチドまたはタンパク質をも包含する。理解すべきことは、本発明は天然型の抗体に関係するものではないこと、言い換えると、それらはその自然環境にはないが、天然資源からの精製により単離もしくは入手し得るか、または遺伝子組み換えにより、または非天然アミノ酸による修飾を含む化学合成により入手し得ることである。抗体抗原結合部位を含んでなる抗体フラグメントは、限定されるものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂおよびＦｄなどの分子を含む。１つ以上の抗体抗原結合部位を含む種々の他の抗体分子は、例えば、Ｆａｂ２、Ｆａｂ３、ダイアボディ(diabodies)、トリアボディ(triabodies)、テトラボディ(tetrabodies)およびミニボディ(minibodies)を含め、遺伝子工学的に作製されている。抗体分子およびその構築方法、およびその使用については、文献[１５]に記載されている。
【００８２】
モノクローナルおよび他の抗体を採用すること、また標的抗原に結合する他の抗体またはキメラ分子を生産する組換えＤＮＡ技術を使用することが可能である。かかる技術は抗体の免疫グロブリン可変領域またはＣＤＲをコードするＤＮＡを、異なる免疫グロブリンの定常領域または定常領域プラス枠組み領域に導入することからなる。参照例：EP-A-184187、GB 2188638A または EP-A-239400、および多数の二次文献。抗体を産生するハイブリドーマまたは他の細胞は遺伝子突然変異または他の変化に付し得るものであり、それらは生産された抗体の結合特異性を変化させるものであっても、なくてもよい。
【００８３】
抗体は多くの方法で修飾することができるので、用語「抗体分子」は抗体抗原結合部位をもつ結合要素または物質を、抗原に対する所望の特異性および／または結合により変化することと解釈すべきである。従って、この用語は、それが天然産であろうと、または部分的もしくは全体として合成的なものであろうと、抗体抗原結合部位を含んでなるいずれものポリペプチドを含め、抗体のフラグメントおよび誘導体を包含する。キメラ分子は、抗体抗原結合部位または等価物を含むか、または別のポリペプチド(例えば、別の種に由来するか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する)に融合しており、従ってそれらも包含される。キメラ抗体のクローニングおよび発現については、ＥＰ−Ａ−０１２０６９４およびＥＰ−Ａ−０１２５０２３、および多数の二次文献に記載されている。
【００８４】
抗体遺伝子工学分野で利用可能なさらなる技術は、ヒトおよびヒト化抗体の単離を可能としている。例えば、ヒトハイブリドーマは文献(Kontermann & Dubel)[１６]記載のように作製し得る。結合要素を生成させる別の確立された技術であるファージディスプレイについては、多くの確立された公表文献に詳細に記載されている；例えば、Kontermann & Dubel[１６]およびＷＯ９２／０１０４７(さらに下記で考察)、および米国特許ＵＳ５,９６９,１０８、ＵＳ,５,５６５,３３２、ＵＳ５,７３３,７４３、ＵＳ５,８５８,６５７、ＵＳ５,８７１,９０７、ＵＳ５,８７２,２１５、ＵＳ５,８８５,７９３、ＵＳ５,９６２,２５５、ＵＳ６,１４０,４７１、ＵＳ６,１７２,１９７、ＵＳ６,２２５,４４７、ＵＳ６,２９１,６５０、ＵＳ６,４９２,１６０およびＵＳ６,５２１,４０４。
【００８５】
マウス免疫系の他の成分を未変化のままとして、マウスの抗体遺伝子を不活性化し、かつヒト抗体遺伝子と機能的に置換したトランスジェニックマウスは、ヒト抗体を単離するために使用することができる[１７]。ヒト化抗体は当該技術分野で既知の技術、例えば、WO91/09967、US 5,585,089、EP592106、US 5,565,332 および WO93/17105 に記載されている技術を用いて製造し得る。さらに、WO2004/006955 には、ヒト抗体遺伝子(例えば、生殖系列抗体遺伝子セグメント)から可変領域枠組み配列を選択することに基づき、非ヒト抗体の可変領域のＣＤＲ配列についての標準的ＣＤＲ構造型を、ヒト抗体配列のライブラリーから、対応するＣＤＲについて標準的ＣＤＲ構造に比較することにより、抗体をヒト化する方法が記載されている。非ヒトＣＤＲに類似の標準的ＣＤＲ構造型を有するヒト抗体可変領域は、ヒト枠組み配列を選択した要素ヒト抗体配列のサブセットを形成する。サブセット要素は、さらにヒトおよび非ヒトＣＤＲ配列間のアミノ酸類似性によりランク付けし得る。WO2004/006955 の方法では、トップランクのヒト配列を選択し、キメラ抗体を構築するための枠組み配列を提供する；該キメラ抗体は、選択したサブセット要素ヒト枠組みを用いて、ヒトＣＤＲ配列を非ヒトＣＤＲ相対物と機能的に置き換え、それによって非ヒト抗体とヒト抗体間の枠組み配列を比較する必要なしに、高親和性と低免疫原性のヒト化抗体を提供する。本方法により作製されるキメラ抗体もまた開示されている。
【００８６】
合成抗体分子は、適切な発現ベクター内に合成し、組み上げたオリゴヌクレオチドにより生成させた遺伝子からの発現により創出し得る；例えば、文献(Knappik et al.)[１８]または文献(Krebs et al.)[１９]に記載されている。
【００８７】
全抗体のフラグメントは、結合抗原の機能を遂行し得ることが示されている。結合フラグメントの例は以下のとおりである：(ｉ)ＶＬ、ＶＨ、定常軽鎖ドメイン(ＣＬ)および定常重鎖ドメイン１(ＣＨ１)ドメインからなるＦａｂフラグメント；(ii)ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；(iii)単一抗体のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；(iv)ＶＨまたはＶＬドメインからなるｄＡｂフラグメント[２０、２１、２２]；(ｖ)単離ＣＤＲ領域；(vi)Ｆ(ａｂ’)２フラグメント、２つの結合したＦａｂフラグメントからなる二価フラグメント；(vii)一本鎖Ｆｖ分子(ｓｃＦｖ)、ただし、ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、２つのドメインが会合して抗原結合部位の形成を可能とするペプチドリンカーにより結合している[２３、２４]；(viii)二重特異的一本鎖Ｆｖ二量体(PCT/US92/09965)；および(ix)「ダイアボディ」、遺伝子融合により構築される多価または多重特異的フラグメント(WO94/13804；[２５])。Ｆｖ、ｓｃＦｖまたはダイアボディ分子は、ＶＨおよびＶＬドメインを連結するジスルフィド橋の取り込みにより安定化し得る[２６]。ＣＨ３ドメインに結合したｓｃＦｖを含んでなるミニボディもまた作製し得る[２７]。結合フラグメントの他の例は、Ｆａｂ’(重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端の２〜３の残基の付加により、Ｆａｂフラグメントとは異なり、抗体ヒンジ領域からの１個以上のシステインを含む)およびＦａｂ’−ＳＨ(定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を有するＦａｂ’フラグメント)である。
【００８８】
本発明の抗体フラグメントは、親抗体分子または該抗体分子１ないし２８から出発して、例えば、ペプシンもしくはパパインなどの酵素による消化などの方法により、および／または化学還元によるジスルフィド橋の切断により、入手することができる。別の方法では、本発明に包含される抗体フラグメントを、同様に当業者周知の遺伝子組換え技法により、または、例えば、アプライド・バイオシステムズなどの企業が供給するものなど、自動ペプチド合成機により、または核酸合成および発現により入手し得る。
【００８９】
本発明による機能的抗体フラグメントは、化学的修飾により、とりわけＰＥＧ化によるか、またはリポソームへの取り込みにより半減期が増大した機能性フラグメントである。
【００９０】
ｄＡｂ(ドメイン抗体)は、抗体の小型単量体抗原結合フラグメント、すなわち、抗体重鎖または軽鎖の可変領域である[２２]。ＶＨ ｄＡｂはラクダ科の動物(例えば、ラクダ、ラマ)に本来存在し、ラクダ科動物を標的抗原で免疫し、抗原特異的Ｂ細胞を単離し、個々のＢ細胞からｄＡｂ遺伝子を直接クローニングすることにより産生させるとよい。ｄＡｂは細胞培養により生産し得る。それらの小さいサイズ、良好な溶解性および温度安定性がそれらを特に生理学的に有用なものとし、また選択と親和性熟成のために適切なものとする。ラクダ科動物のＶＨ ｄＡｂは「ナノボディズ(nanobodies；商標)」の名称で、治療用として開発されつつある。本発明の結合要素は本明細書に実質的に提示したＶＨもしくはＶＬ、または本明細書に実質的に提示したＣＤＲ類のセットを含んでなるＶＨもしくはＶＬドメインを含んでなるｄＡｂであってもよい。
【００９１】
二重特異性または二重機能性抗体は、２つの異なる可変領域が同一の分子内で組み合わさっている第二世代のモノクローナル抗体を形成する[２８]。それらの使用は、新しいエフェクター機能を供給するか、または腫瘍細胞の表面上の数種の分子を標的とするそれらの能力から、診断分野および治療分野の両方で証明されている。二重特異性抗体が使用されるべきである場合、これらは従来型の二重特異性抗体(様々な方法[２９]で製造することができる、例えば、化学的にまたはハイブリッド・ハイブリドーマから調製し得る)であるか、または上記の二重特異性フラグメントのいずれであってもよい。これらの抗体は化学的方法[３０、３１]または体細胞法[３２、３３]により入手し得るが、同様に、また優先的には遺伝子工学的方法により入手し得る；この方法はヘテロ二量体形成を推し進めることを可能とし、また従って、求める抗体の精製工程を容易にする[３４]。二重特異性抗体の例は、ＢｉＴＥ(商標)技法の例であり、該技法では異なる特性をもつ２種の抗体の結合ドメインが用いられ、短い柔軟なペプチドを介して直接結合する。このものは短い一本のポリペプチド鎖上に２つの抗体を組み合わせている。ダイアボディおよびｓｃＦｖは可変ドメインのみを用いてＦｃなしに構築し得るものであり、抗イディオタイプの反応の影響を強力に低下させる。
【００９２】
二重特異性抗体は、全ＩｇＧとして、二重特性Ｆａｂ’２として、Ｆａｂ’ＰＥＧとして、ダイアボディとして、またはさもなくば二重特異性ｓｃＦｖとして構築することができる。さらに、２つの二重特異性抗体は、当該技術分野で既知の常套の方法により結合して、四価の抗体を形成することができる。
【００９３】
二重特異性全抗体に対するものとして、二重特性ダイアボディは、それらが大腸菌において容易に構築され、発現される故に特に有用である。適切な結合特異性のダイアボディ(および抗体フラグメントなど、多くの他のポリペプチド)は、ファージディスプレイ(WO94/13804)を用いて、ライブラリーから容易に選択することができる。もしダイアボディの一方のアームが、例えば、ＩｇＥに対して向けられた特異性と共に一定に維持されているならば、他方のアームが多様であるライブラリーを作製し、適切な特異性の抗体を選択することができる。二重特異性全抗体は文献(Ridgeway et al., 1996)[３５]に記載された代替法となる工学的方法により作製し得る。
【００９４】
ＩｇＥに対する抗体を得るための技術分野においては、様々な方法が利用可能である。該抗体はモノクローナル抗体、とりわけヒト、マウス、キメラまたはヒト化起源のモノクローナル抗体であり、これらは当業者周知の標準的方法に従い入手することができる。
【００９５】
一般に、モノクローナル抗体またはその機能的フラグメント、とりわけマウス起源のものの調製のためには、手引書「アンチボディズ(Antibodies)」[３６]に特定して記載された技法、または文献(Koehler and Milstein)[３７]に記載されたハイブリドーマからの調製技法を引用することが可能である。
【００９６】
モノクローナル抗体は、例えば、ＩｇＥに対して免疫した動物細胞から、または当該モノクローナル抗体により認識されるエピトープを含むそのフラグメントの１つから入手し得る。それらを構成する適当なフラグメントおよびペプチドまたはポリペプチドを使用して動物を免疫し、ＩｇＥに対する抗体を生成させることができる。当該ＩｇＥ、またはそのフラグメントの１つは、とりわけ、通常の作業方法に従って、ＩｇＥもしくはそのフラグメントをコードするｃＤＮＡ配列に含まれる核酸配列とで出発する遺伝子組換えにより、またはＩｇＥおよび／またはそのフラグメントのペプチド配列に含まれるアミノ酸の配列から出発するペプチド合成により生産することができる。
【００９７】
該モノクローナル抗体は、例えば、当該モノクローナル抗体が認識するエピトープを含むＩｇＥまたはそのフラグメントを予め固定したアフィニティカラムで精製することができる。より詳しくは、モノクローナル抗体はプロテインＡ及び／またはＧでのクロマトグラフィーにより精製し、さらに要すれば、残りのタンパク質混入物並びにＤＮＡおよびＬＰＳを本質的に除去すること目的とするイオン交換クロマトグラフィーに付し、さらに要すれば二量体または他の多量体の存在による潜在的な凝集を除くために、セファロース上の排除クロマトグラフィーに付すことにより精製し得る。一実施態様において、これら技法のすべては、同時に、または連続的に使用することができる。
【００９８】
抗原結合部位は、標的抗原の全部または一部に結合し、相補性である分子の部分である。抗体分子においては、それを抗体抗原結合部位といい、標的抗原の全部または一部に結合し、相補性である抗体の部分を構成する。抗原が大きい場合、抗体は抗原の特定の部分にのみ結合する；その部分はエピトープと呼称される。抗体抗原結合部位は、１つ以上の抗体可変ドメインにより提供され得る。抗体抗原結合部位は抗体の軽鎖可変領域(ＶＬ)および抗体重鎖可変領域(ＶＨ)を含み得る。
【００９９】
単離したとは、本発明の結合要素またはかかる結合要素をコードする核酸が、一般的に本発明に従っている状態をいう。従って、本発明による結合要素、ＶＨおよび／またはＶＬドメイン、およびコードしている核酸分子とベクターが、例えば、それらの自然環境から単離および／または精製された実質的に純粋なもしくは均一な形状で、または核酸の場合には、要求される機能をもつポリペプチドをコードする配列以外の起源の核酸もしくは遺伝子を含まない、または実質的に含まないものとして提供される。単離された要素および単離された核酸は、天然に会合している物質を含まない、または実質的に含まないもの、例えば、それらと共にそれらの自然環境に見出される他のポリペプチドもしくは核酸、またはかかる調製が、インビトロもしくはインビボで実施された組換えＤＮＡ技法によるものである場合のそれらが調製された環境(例えば、細胞培養)に見出される他のポリペプチドもしくは核酸を含まない、または実質的に含まないものである。要素および核酸は賦形剤またはアジュバントで製剤化してもよく、また実用目的上単離されていてもよい；例えば、当該要素は、通常、イムノアッセイに使用するためにマイクロタイタープレートに被覆して使用する場合、ゼラチンもしくは他の担体と混合するか、または診断もしくは治療に使用する場合には、医薬的に許容される担体もしくは賦形剤と混合する。結合要素は本来的に、または異種真核細胞(例えば、ＣＨＯまたはＮＳＯ(ECACC 85110503)細胞)の系によりグリコシル化されていてもよいし、またはそれらは(例えば、原核細胞中での発現により生産されるならば)未グリコシル化のものでもよい。
【０１００】
抗ＩｇＥ抗体分子を含んでなる異種調製物も本発明の一部を形成する。例えば、かかる調製物は完全長重鎖およびＣ−末端リジンを欠落する重鎖をもち、様々な度合いのグリコシル化をもつか、および／または誘導化アミノ酸、例えば、ピログルタミン酸残基を形成するＮ−末端グルタミン酸の環化などをもつ抗体の混合物でもよい。
【０１０１】
本明細書にて使用する場合、「実質的に提示したように」という文言は、結合要素ＶＨまたはＶＬドメインの当該ＣＤＲの特性が、本明細書に提示した配列の特定の領域に一致しているか、または高度に類似していることをいう。本明細書に記載する場合、１つ以上の可変ドメインの特定した領域に関して「高度に類似」という文言は、１個ないし約６個のアミノ酸置換、例えば、１個ないし５個、さらに１個ないし３個、または１個もしくは２個、または３個もしくは４個のアミノ酸置換が、ＣＤＲおよび／またはＶＨもしくはＶＬドメインにおいてなされ得ることを予期するものである。
【０１０２】
発明の詳細な説明
上記で特に言及したとおり、本発明による結合要素は、ＩｇＥの生物活性を調節し、中和し得る。本明細書に記載するように、本発明のＩｇＥ結合要素は、中和力を最適化し得る。一般に、効力最適化は、選択した結合要素の配列(通常、抗体の可変ドメイン配列)を変異して結合要素のライブラリーを生成させ、次いでそれを効力についてアッセイし、より強力な要素を選択することからなる。このように選択した「効力最適化した」結合要素は、生成させたライブラリーからの結合要素よりも高い効力を示す傾向がある。それにもかかわらず、高効力の結合要素はまた最適化を経ずに入手し得る；例えば、高効力結合要素は当初の選抜から直接、例えば、生化学的中和アッセイにより入手し得る。「効力最適化した」結合要素は、特定の活性または下流機能の最適化した中和力をもつ結合要素をいう。アッセイおよび効力については、本明細書の別の個所で詳細に記載する。本発明は効力最適化および非最適化結合要素、並びに選択した結合要素から効力を最適化する方法を提供する。従って、本発明は当業者が高い効力をもつ結合要素を生成させることを可能とする。
【０１０３】
効力の最適化は所定の結合要素からより高い効力の結合要素を生成させるために使用し得るが、留意すべきことは、高い効力の結合要素は効力の最適化を行わずとも入手可能であることである。
【０１０４】
さらなる側面において、本発明は抗原に結合し得る１種以上の結合要素を得る方法、本発明による結合要素のライブラリーと当該抗原とを接触させ、当該抗原に結合し得るライブラリーの１種以上の結合要素を選択することからなる方法を提供する。
【０１０５】
当該ライブラリーは、粒子または分子複合体、例えば、酵母、バクテリアもしくはバクテリオファージ(例：Ｔ７)粒子、ウイルス、細胞、または共有結合性、リボソーム性もしくは他のインビトロ提示システムなどの複製可能な遺伝子パッケージに提示可能であり、それぞれの粒子または分子複合体は、その上に提示された抗体ＶＨ可変ドメインを、また選択肢として、もし存在するなら、表示されるＶＬドメインをもコードする核酸を含む。ファージディスプレイについては、ＷＯ９２／０１０４７および例えば、米国特許ＵＳ５,９６９,１０８、ＵＳ５,５６５,３３２、ＵＳ５,７３３,７４３、ＵＳ５,８５８,６５７、ＵＳ５,８７１,９０７、ＵＳ５,８７２,２１５、ＵＳ５,８８５,７９３、ＵＳ５,９６２,２５５、ＵＳ６,１４０,４７１、ＵＳ６,１７２,１９７、ＵＳ６,２２５,４４７、ＵＳ６,２９１,６５０、ＵＳ６,４９２,１６０およびＵＳ６,５２１,４０４に記載されている；これらのそれぞれをその全文につき参照により本明細書の一部とする。
【０１０６】
抗原に結合し得る結合要素を選択し、バクテリオファージまたは他のライブラリー粒子もしくは分子複合体に提示した後、核酸は、選択された結合要素を提示するバクテリオファージまたは他の粒子もしくは分子複合体から取り出し得る。かかる核酸は、引き続き当該選択された結合要素を提示するバクテリオファージまたは他の粒子もしくは分子複合体から取り出された核酸の配列をもつ核酸の発現により、結合要素または抗体ＶＨもしくはＶＬ可変ドメインの生産に使用し得る。
【０１０７】
当該選択された結合要素の抗体ＶＨ可変ドメインのアミノ酸配列をもつ抗体ＶＨ可変ドメインは、かかるＶＨドメインを含んでなる結合要素であり得るものとして、単離された形状で提供し得る。
【０１０８】
ＩｇＥに結合する能力はさらに試験可能であり、また、例えば、ＩｇＥに対しての結合につき、親抗体分子または抗体分子２ないし２８(例えば、ｓｃＦｖフォーマットおよび／またはＩｇＧフォーマット、例えば、ＩｇＧ１)と競合する能力も試験し得る。ＩｇＥを中和する能力は、本明細書の他の個所でさらに記載するとおりに、試験し得る。
【０１０９】
本発明による結合要素は、親抗体分子もしくは他の抗体分子、例えば、ｓｃＦｖ、または抗体２ないし２８の１つ、例えば、ＩｇＧ１の親和性により、またはより良好な親和性により、ＩｇＥに結合し得る。
【０１１０】
本発明による結合要素は、親抗体分子もしくは他の抗体分子、抗体２ないし２８の１つ、例えば、ｓｃＦｖ、もしくはＩｇＧ１の効力により、またはより良好な効力により、ＩｇＥの生物活性を中和し得る。
異なる結合要素の結合親和性および中和力は適切な条件下で比較することができる。
【０１１１】
本発明のＶＨおよびＶＬドメインおよびＣＤＲの変異体は、アミノ酸配列が本明細書に提示したもの、およびＩｇＥに対しての結合要素として使用し得るものをも含め、配列変更または突然変異および所望の特性を有する抗原結合要素をスクリーニングする方法により入手することができる。所望の特性の例は、限定されるものではないが、以下のとおりである：
・  抗原に対し特異的である既知の抗体に相対的に抗原に対しての結合親和性を増大
・  活性が既知であるならば、抗原に対し特異的である既知の抗体に相対的に抗原活性の中和性を増大
・  特定モル比での抗原に対する既知抗体またはリガンドとの特定の競合能力
・  複合体を免疫沈降する能力
・  特定エピトープに結合する能力
ｏ  直線エピトープ、例えば、本明細書に記載のペプチド結合走査により同定したペプチド配列、例えば、直線および／または制約されたコンホメーションで選抜されたペプチドを使用
ｏ  非連続残基により形成されるコンホメーションエピトープ
・  ＩｇＥまたは下流分子の新しい生物活性を調節する能力。
かかる方法も本明細書で提供される。
【０１１２】
本明細書に開示した抗体分子の変異体は、それを生産し、本発明にて使用し得る。多変量データ解析法を構造／性質−活性相関性に適用するに際し、計算機化学の先例に倣い[３８]、抗体の定量的活性−性質の相関性は、周知の数学的方法、例えば、統計的回帰、パターン認識および類別などを用いて誘導し得る[３９、４０、４１、４２、４３、４４]。抗体の性質は、抗体の配列、機能および三次元構造の経験的および理論的モデル(例えば、可能性のある接触残基または計算された理化学的性質の解析)から誘導可能であり、これらの性質は単一であり、また組合せであると考えられる。
【０１１３】
ＶＨドメインおよびＶＬドメインから構成される抗体抗原結合部位は、典型的には６個のポリペプチドループによって形成される；その３個は軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)から、また他の３個は重鎖可変ドメイン(ＶＨ)からなる。既知原子構造の抗体を分析することにより、抗体組合せ部位の配列と三次元構造の関連性を解明した[４５、４６]。これらの関連性は、ＶＨドメインの第三の領域(ループ)を例外として、結合部位ループが少数の主鎖コンホメーション：限界構造の１つを有することを示唆する。特定のループに形成される限界構造は、その大きさおよびループと枠組み領域双方におけるキーとなる部位の特定残基の存在によって決定されることが示されている[４５、４６]。
【０１１４】
配列−構造の相関性の研究は、未知三次元構造のものを除いて、既知配列の抗体におけるそれらの残基の予測に使用し得る；それらの残基は、そのＣＤＲループの三次元構造を維持する上で重要であり、それ故、結合特異性を維持する。これらの予測は、その予測を先行する最適化実験からの結果と比較することにより実証し得る。構造からの研究方法においては、ＷＡＭ[４８]などの容易に入手し得るか、または市販品のパッケージを用いて、抗体分子のモデルを創出することができる[４７]。タンパク質可視化および解析ソフトウェアパッケージ、例えば、インサイトII(アクセリス・インク；Accelrys, Inc.)またはディープビュー[４９]を次いで用いて、ＣＤＲの各位置における可能な置換を評価してもよい。この情報は次いで、活性に最少のまたは有益な影響をもつように置換を行うために使用し得る。
【０１１５】
ＣＤＲ、抗体ＶＨまたはＶＬドメインおよび結合要素のアミノ酸配列内で置換を行うために必要な技法は、一般に、当該技術分野で利用可能である。変異体配列は活性に最少のまたは有益な影響をもつと予測し得る、または予測しなくてもよい置換により調製し得、ＩｇＥに結合する、および／または中和する能力について、および／または他の所望の性質について試験し得る。
【０１１６】
その配列が本明細書に具体的に開示されているＶＨおよびＶＬドメインのいずれかの可変ドメインアミノ酸配列変異体は、記載したとおり、本発明に従って採用し得る。
【０１１７】
本発明のさらなる側面は、表３および添付の配列リストに示した抗体１ないし２８のいずれかのＶＨドメインとの、または表１に示したＨＣＤＲ(例えば、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、またはＨＣＤＲ３)とのアミノ酸配列同一性が少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８または９９％であるＶＨドメインを含んでなる抗体分子である。該抗体分子はまた、選択肢として抗体１ないし２８のいずれかのＶＬドメインとの、または表１に示したＬＣＤＲ(例えば、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、またはＬＣＤＲ３)とのアミノ酸配列同一性が少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８または９９％であるＶＬドメインを含み得る。２種のアミノ酸の％同一性の計算に使用し得るアルゴリズムは、例えば、ブラスト(BLAST)[５０]、ファスタ(FASTA)[５１]、または例えば、デフォルトパラメータを使用するスミス−ウォーターマン(Smith-Waterman)アルゴリズム[５２]などである。
【０１１８】
特定の変異体は、１つ以上のアミノ酸の配列変化(アミノ酸残基の付加、欠失、置換および／または挿入)を含み得る。特定の実施態様において、変異体は約２０未満のかかる変化を有する。
【０１１９】
変化は１つ以上の枠組み領域および／または１つ以上のＣＤＲについて実施し得る。その変化は通常、機能の喪失には至らず、従ってこのように変化させたアミノ酸配列を含んでなる結合要素は、ＩｇＥに結合する能力、および／またはＩｇＥを中和する能力を保持する。それは、例えば、本明細書に記載したアッセイ法により測定した場合、当該変化がなされていない結合要素と同じ定量的結合能力および／または中和能力を保持し得る。このように変化させたアミノ酸配列を含んでなる結合要素は、ＩｇＥに結合する、および／またはＩｇＥを中和する改善された能力を有し得る。
【０１２０】
変化は１個以上のアミノ酸残基を非天然産もしくは非標準アミノ酸と置き換えること、１個以上のアミノ酸残基を非天然産もしくは非標準的形状に修飾すること、または１個以上の非天然産もしくは非標準的アミノ酸を当該配列に挿入することからなり得る。本発明の配列における変化の数と位置の例は、本明細書の他の個所に記載する。天然産のアミノ酸は２０種の「標準」のＬ−アミノ酸であり、それらの標準的１文字コードにより、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｃ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｅにより同定する。非標準アミノ酸は、ポリペプチド骨格に取り込ませ得るか、または既存のアミノ酸残基の修飾から生じ得る何らかの他の残基である。非標準アミノ酸は、天然産または非天然産のものでよい。数種の天然産非標準アミノ酸が当該技術分野で既知である；例えば、４−ヒドロキシプロリン、５−ヒドロキシリジン、３−メチルヒスチジン、Ｎ−アセチルセリンなどである[５３]。それらのＮ−アルファ−位置で誘導化されるそれらアミノ酸残基はアミノ酸配列のＮ−末端においてのみ位置することとなる。通常、本発明におけるアミノ酸はＬ−アミノ酸であるが、Ｄ−アミノ酸であってもよい。従って、変化はＬ−アミノ酸をＤ−アミノ酸に修飾するか、またはＤ−アミノ酸と置き換えることからなる。アミノ酸のメチル化、アセチル化および／またはリン酸化も既知であり、本発明のアミノ酸もかかる修飾に付し得る。
【０１２１】
本発明の抗体ドメインと結合要素のアミノ酸配列は、上記の非天然または非標準アミノ酸を含み得る。非標準アミノ酸(例えば、Ｄ−アミノ酸)は、合成に際し、アミノ酸配列に取り込ませるか、またはアミノ酸配列の合成後に「当初」の標準アミノ酸の修飾または置き換えにより取り込ませ得る。
【０１２２】
非標準および／または非天然産アミノ酸の使用は、構造と機能の多様性を増大させ、また従って、本発明の結合要素における所望のＩｇＥ−結合性および中和性を達成する可能性を増大させ得る。さらに、Ｄ−アミノ酸および類似体は、例えば、ヒトなどの動物に投与した後、Ｌ−アミノ酸を有するポリペプチドのインビボでの分解のために、標準的Ｌ−アミノ酸と比較して、より良好な薬物動態プロファイルを有することが示されている。
【０１２３】
本発明のＣＤＲ−由来配列を担持する新規のＶＨまたはＶＬ領域は、１つ以上の選択したＶＨおよび／またはＶＬ遺伝子をランダム突然変異誘発して、全可変ドメイン内に突然変異を生成させることにより生成させ得る。かかる技法はグラムら(Gram et al.)[５４]が記載している；かれらは変異導入型ＰＣＲを用いた。一部の実施態様においては、１つまたは２つのアミノ酸置換が全可変ドメインまたはＣＤＲのセット内で実施される。
【０１２４】
使用し得る別の方法は、ＶＨまたはＶＬ遺伝子のＣＤＲ領域に突然変異誘発を導くことである。かかる技法は文献(Barbas et al.[５５]およびSchier et al.[５６])に開示されている。
【０１２５】
上記の技法は当該技術分野においてそれ自体既知であり、当業者は当該技術の常套的方法論を用い本発明の結合要素を提供するために、かかる技法を使用することができる。
【０１２６】
本発明のさらなる側面では、ＩｇＥに対する抗体抗原結合部位を入手する方法を提供するが、当該方法は本明細書に提示したＶＨドメインのアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸の付加、欠失、置換または挿入により提供し、選択肢としてこのように提供されたＶＨドメインを１つ以上のＶＬドメインと組合せ、そのＶＨドメインまたはＶＨ／ＶＬの組合せを試験して、結合要素またはＩｇＥに対する抗体抗原結合部位を、選択肢として１つ以上の所望の性質、例えば、ＩｇＥ活性を中和する能力と共に、同定することからなる。当該ＶＬドメインは実質的に本明細書に提示したとおりのアミノ酸配列を有し得る。類似の方法として、本明細書に開示したＶＬドメインの１種以上の配列変異体が１種以上のＶＨドメインと組み合わせる方法も採用し得る。
【０１２７】
上記したとおり、本明細書に実質的に提示したＣＤＲアミノ酸配列は、ヒト抗体可変ドメインまたはその実質的な部分にＣＤＲとして担持され得る。本明細書に実質的に提示したＨＣＤＲ３配列は、本発明の実施態様を表わし、それらの一つ一つがヒト重鎖可変ドメインまたはその実質的な部分にＨＣＤＲ３として担持され得る。
【０１２８】
本発明で採用される可変ドメインは、いずれかの生殖系列もしくは再配列ヒト可変ドメインから入手または誘導可能であり、または既知のヒト可変ドメインの共通配列もしくは実配列に基づく合成可変ドメインであってもよい。可変ドメインは非ヒト抗体から誘導し得る。本発明のＣＤＲ配列(例えば、ＣＤＲ３)は、組換えＤＮＡ技法を用い、ＣＤＲ(例えば、ＣＤＲ３)を欠落する可変ドメインのレパートリーに導入し得る。例えば、マークスら(Marks et al.)[５７]は抗体可変ドメインのレパートリーの製造法について記載している；この方法では、可変ドメイン領域の５’−末端に、またはその隣接に向けられた共通プライマーが、ヒトＶＨ遺伝子の第三の枠組み領域に対する共通プライマーと共に使用して、ＣＤＲ３を欠落するＶＨ可変ドメインのレパートリーを提供する。マークスらはさらにこのレパートリーをどのように特定の抗体のＣＤＲ３と組合せ得るかを記載している。類似の技法を用い、本発明のＣＤＲ３−由来配列は、ＣＤＲ３を欠落するＶＨまたはＶＬドメインのレパートリーと混ぜ合わせることが可能であり、その混ぜ合わせた完全ＶＨまたはＶＬドメインは、同族体ＶＬまたはＶＨドメインと組み合わせて、本発明の結合要素を提供し得る。次いで、このレパートリーは適切な宿主システム、例えば、WO92/01047(参照によりその全文を本明細書の一部とする)またはケイら(Kay, Winter & McCafferty)の文献[５８]を含め、その後の大量の文献に記載されたファージディスプレイシステムに提示することが可能であり、結果として適切な結合要素を選択し得る。レパートリーは１０４以上の個々の要素、例えば、少なくとも１０５、少なくとも１０６、少なくとも１０７、少なくとも１０８、少なくとも１０９または少なくとも１０１０またはそれ以上からのいずれかから構成され得る。他の適切な宿主システムは、限定されるものではないが、酵母ディスプレイ、バクテリアディスプレイ、Ｔ７ディスプレイ、ウイルスディスプレイ、細胞ディスプレイ、リボソームディスプレイおよび共有結合ディスプレイなどである。
【０１２９】
提供されるＩｇＥに対する結合要素の調製方法は、以下から構成される：
(ａ)置き換わるべきＣＤＲ３を含むか、またはＣＤＲ３コード領域を欠失するＶＨドメインをコードする核酸の出発レパートリーを提供し；
(ｂ)供与体核酸がレパートリーのＣＤＲ３領域に挿入され、ＶＨドメインをコードする核酸の生成物レパートリーを生じるように、当該レパートリーを、ＶＨ ＣＤＲ３について本明細書に実質的に提示したアミノ酸配列をコードする供与体核酸と組み合わせ；
(ｃ)当該生成物レパートリーの核酸を発現させ；
(ｄ)ＩｇＥに対する結合要素を選択し；そして
(ｅ)当該結合要素またはそれをコードする核酸を回収する。
【０１３０】
再度、本発明のＶＬ  ＣＤＲ３を、置き換わるべきＣＤＲ３を含むか、またはＣＤＲ３コード領域を欠失するＶＬドメインをコードする核酸のレパートリーと組み合わせる類似の方法を採用し得る。
【０１３１】
同様に、１種以上、または３種すべてのＣＤＲは、ＶＨまたはＶＬドメインのレパートリーに移植可能であり、それを次いでＩｇＥに対する１つ以上または複数の結合要素についてスクリーニングする。
【０１３２】
例えば、親抗体もしくは抗体２ないし２８のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３の１つ以上、または親抗体もしくは抗体２ないし２８のＨＣＤＲ類のセットの１つ以上を採用し得るし、および／または親抗体もしくは抗体２ないし２８のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３の１つ以上、または親抗体もしくは抗体２ないし２８のＬＣＤＲ類のセットの１つ以上を採用し得る。
同様に、本明細書に開示した他のＶＨおよびＶＬドメイン、ＨＣＤＲ類のセット、および／またはＬＣＤＲ類のセットを採用し得る。
【０１３３】
免疫グロブリン可変ドメインの本質的部分は、少なくとも３つのＣＤＲ領域を、それらの介在する枠組み領域と共に含み得る。当該部分は、第一および第四の枠組み領域のいずれかまたは両方の少なくとも約５０％を含み、その５０％が第一の枠組み領域のＣ−末端５０％および第四の枠組み領域のＮ−末端５０％である。可変ドメインの本質的部分のＮ−末端またはＣ−末端にあるさらなる残基は、通常、天然産の可変ドメイン領域と会合していないものであり得る。例えば、組換えＤＮＡ技法により作製される本発明の結合要素の構築は、クローニングまたは他の操作ステップを容易にするために導入されたリンカーによりコードされるＮ−またはＣ−末端残基の導入に至る。他の操作ステップとは、本明細書の他の個所でより詳細に考察した、抗体定常領域、他の可変ドメイン(例えば、ダイアボディの生産における)または検出可能な／機能的標識を含むさらなるタンパク配列に、本発明の可変ドメインを結合するためのリンカーの導入などである。
【０１３４】
本発明の一部の側面において、結合要素は一対のＶＨおよびＶＬドメインを含むが、ＶＨまたはＶＬドメイン配列に基づく単一の結合要素は、本発明のさらなる側面を形成する。単一の免疫グロブリンドメイン、とりわけＶＨドメインは特異的な方式で標的抗原に結合することができる。例えば、上記のｄＡｂの考察を参照されたい。
【０１３５】
単一結合ドメインのいずれの場合にも、これらのドメインはＩｇＥに結合し得る２ドメイン結合要素を形成することの可能な相補性ドメインをスクリーニングするために使用し得る。このことはＷＯ９２／０１０４７(参照によりその全体を本明細書の一部とする)に開示されたいわゆる階層的二重コンビナトリアル方法を用いるファージディスプレイスクリーニング法により達成し得る；この場合、Ｈ鎖またはＬ鎖クローンのいずれかを含む個々のコロニーは他の鎖(ＬまたはＨ)をコードするクローンの完全なライブラリーに感染させるために使用し、得られる二本鎖結合要素を、上記文献に記載された技法など、ファージディスプレイ法に従い選択する。この技法は上記のマークスら(Marks et al)の文献にも開示されている。
【０１３６】
本発明の結合要素は、さらに抗体定常領域またはその一部、例えば、ヒト抗体定常領域またはその部分を含み得る。例えば、ＶＬドメインは、ヒトＣκまたはＣλ鎖を含む抗体の軽鎖定常ドメインに、そのＣ−末端で付着させ得る。同様に、ＶＨドメインに基づく結合要素をそのＣ−末端で、いずれかの抗体イソ型、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＭおよびそのイソ型サブクラス、特にＩｇＧ１およびＩｇＧ２などに由来する免疫グロブリン重鎖の全部または一部(例えば、ＣＨ１ドメイン)に付着させ得る。ＩｇＧ１がその製造の容易さと安定性、例えば、半減期、の故に有利である。これらの性質を有し、可変領域を安定化させるいずれかの合成の、または他の定常領域変異体も本発明において有用である。
【０１３７】
結合要素は検出可能なまたは機能的標識で標識し得る。従って、結合要素または抗体分子は検出可能なおよび／または定量可能なシグナルを得るような免疫接合体の形状で存在することができる。免疫接合体は検出可能なまたは機能的標識と接合した本発明の抗体分子を含み得る。標識はシグナルを生じるか、またはシグナルの生成を誘導し得る分子であり、限定されるものではないが、発蛍光体、放射標識、酵素、化学発光体または光増感剤などである。従って、結合は蛍光もしくは発光、放射能、酵素活性または吸光度を検出および／または測定するとよい。
【０１３８】
適切な標識は以下のものであるが、これらは説明のためのものであり、限定するものではない：
−  酵素：アルカリホスファターゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ(“Ｇ６ＰＤＨ”)、アルファ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコースアミラーゼ、炭酸脱水酵素、アセチルコリンエステラーゼ、リゾチーム、マレイン酸デヒドロゲナーゼ、およびペルオキシダーゼ、例えば、西洋わさびペルオキシダーゼなど；
−  色素；
−  蛍光標識または発蛍光体：フルオレセインおよびその誘導体、蛍光色素、ローダミン化合物および誘導体、ＧＦＰ(“グリーン蛍光タンパク質”用のＧＦＰ)、ダンシル、ウンベリフェロン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、およびフルオレスカミン；発蛍光団、例えば、
ランタニドクリプテートおよびキレート、例えば、ユーロピウムなど(パーキン・エルマーおよびシスバイオインターナショナル)；
−  化学発光標識または化学発光体：イソルミノール、ルミノールおよびジオキセタンなど；
−  生物発光標識：ルシフェラーゼとルシフェリンなど；
−  増感剤；
−  補酵素；
−  酵素基質；
−  放射標識：限定されるものではないが、以下を包含：臭素７７、炭素１４、コバルト５７、フッ素８、ガリウム６７、ガリウム６８、水素３(トリチウム)、インジウム１１１、インジウム１１３、ヨウ素１２３ｍ、ヨウ素１２５、ヨウ素１２６、ヨウ素１３１、ヨウ素１３３、水銀１０７、水銀２０３、リン３２、レニウム９９ｍ、レニウム１０１、レニウム１０５、ルテニウム９５、ルテニウム９７、ルテニウム１０３、ルテニウム１０５、スカンジウム４７、セレン７５、イオウ３５、テクネチウム９９、テクネチウム９９ｍ、テルル１２１ｍ、テルル１２２ｍ、テルル１２５ｍ、ツリウム１６５、ツリウム１６７、ツリウム１６８、イットリウム１９９および本明細書に言及した他の放射標識；
−  粒子：ラテックスまたは炭素粒子；金属ゾル；クリスタライト；リポソーム；細胞など；これらはさらに色素、触媒または他の検出可能な基により標識し得る；
−  分子：ビオチン、ジゴキシゲニンまたは５−ブロモデオキシウリジン；
−  毒素部分：例えば、シュードモナス外毒素(ＰＥまたは細胞傷害性フラグメントまたはその突然変異体)、ジフテリア毒素またはその細胞傷害性フラグメントもしくは突然変異体、ボツリヌス毒素Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥもしくはＦ、リシンまたはその細胞傷害性フラグメント(例えば、リシンＡ)、アブリンまたはその細胞傷害性フラグメント、サポリンまたはその細胞傷害性フラグメント、アメリカヤマゴボウ抗ウイルス毒素またはその細胞傷害性フラグメントおよびブリオジン１またはその細胞傷害性フラグメントからなる群より選択される毒素部分。
【０１３９】
適切な酵素および補酵素については、文献(Litman, et al., US 4,275,149, および Boguslaski, et al., US4318980；それぞれにつき参照によりその全文を本明細書の一部とする)に開示されている。適切な発蛍光体おより化学発光体は、文献(Litman, et al., US 4275149；参照によりその全文を本明細書の一部とする)に開示されている。標識はさらに、化学的部分、例えば、特異的同族体検出可能部分(例えば、標識したアビジンまたはストレプトアビジン)に結合を介して検出し得るビオチンなどである。検出可能な標識は、当該技術分野で既知の常套の化学により、本発明の抗体に付着させ得る。
【０１４０】
免疫接合体またはその機能的フラグメントは、当業者既知の方法により調製することができる。それらは酵素に、または蛍光標識に、直接、またはスペーサー基もしくは連結基の、例えば、ポリアルデヒド(例えば、グルタルアルデヒド)、エチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)、ジエチレン−トリアミン五酢酸(ＤＰＴＡ)などの仲介体により、または治療用接合体について上に記載したものなどのカップリング剤の存在下にカップル結合させることができる。フルオレセイン型の標識を含む接合体は、イソチオシアナートとの反応により調製することができる。
【０１４１】
治療用放射性同位体を該抗体に直接または上記のＥＤＴＡ、ＤＴＰＡなどのキレート化剤を介してカップリング結合させる当業者既知の既存の方法は、診断に使用される放射性元素のために使用することができる。同様に、クロラミンＴ法によるナトリウム１２５での標識[５９]、またはクロックフォードら(Crockford et al.,(US4424200)；参照によりその全文を本明細書の一部とする)の技法によるテクネチウムでの標識を実施すること、または文献(Hnatowich(US 4,479,930)；参照によりその全文を本明細書の一部とする)記載のようにＤＴＰＡを介して付着させることが可能である。
【０１４２】
該標識が外的手段により、例えば、可視実験、電磁波、熱、および化学試薬などにより検出可能なシグナルを生じさせる方法は多数存在する。該標識は本発明の抗体に結合する別の結合要素に、または支持体に結合させることもできる。
【０１４３】
該標識は直接的にシグナルを生じ得る；それ故、追加の成分はシグナルを生じる必要がない。多くの有機分子、例えば、発蛍光体は紫外線および可視光を吸収することができ、その場合、光の吸収はこれらの分子にエネルギーを転移させ、それら分子を励起エネルギー状態に上昇させる。この吸収されたエネルギーは、次いで、第二の波長での光の放射により放散される。第二波長での発光はさらに標識した受容体分子にエネルギーを転移し、得られたエネルギーは、光の放射により、例えば、蛍光共鳴エネルギー転移(ＦＲＥＴ)により、受容体分子から放散される。直接的にシグナルを生じる他の標識は、放射性同位体および色素である。
【０１４４】
別の態様において、該標識はシグナルを生じるために他の成分を必要とし得る；シグナル生成システムは、その場合、測定可能なシグナルの生成に必要な成分のすべてを含むこととなる；かかる成分は、基質、補酵素、エンハンサー、追加の酵素、酵素産物と反応する物質、触媒、活性化因子、補助因子、インヒビター、捕捉剤、金属イオン、およびシグナル生成物質の結合に必要な特異結合物質などである。適切なシグナル生成システムの詳細な考察は文献(Ullman, et al. US 5,185,243；参照によりその全文を本明細書の一部とする)に見出し得る。
【０１４５】
本発明は本明細書にて提供するとおり、ＩｇＥに対する結合メンバーの結合を惹き起こすか、または可能とすることを特徴とする方法を提供する。特に言及したように、かかる結合は、インビボで、例えば、結合要素またはコードする核酸をヒトまたは動物(例えば、哺乳動物)に投与した後に、起こり得るか、またはインビトロで、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタン・ブロッティング、免疫細胞化学、免疫沈降、アフィニティクロマトグラフィー、および生化学的または細胞に基づくアッセイにおいて起こり得る。
【０１４６】
一般に、本発明の結合要素とＩｇＥ間の複合体は、とりわけ、酵素結合イムノアッセイ、放射分析、免疫沈降、蛍光イムノアッセイ、化学発光アッセイ、免疫ブロットアッセイ、ラテラルフローアッセイ、凝集アッセイおよび粒子に基づくアッセイなどにより検出し得る。
【０１４７】
また、本発明は、本発明による結合要素を用い、例えば、バイオセンサーシステムにより、直接抗原レベルを測定するために提供される。例えば、本発明はＩｇＥへの結合を検出および／または測定する方法からなる；該方法は、(ｉ)当該結合要素をＩｇＥと接触させ、(ii)当該結合要素のＩｇＥに対する結合を検出することからなり、その場合の結合は本明細書に記載したいずれかの方法または検出可能な標識を用いて検出する。この方法、および本明細書に記載のいずれかの他の結合検出方法は、この方法を遂行する者が直接、例えば、検出可能標識を目視観察することにより、判断し得る。あるいは、この方法または本明細書に記載のいずれかの他の結合検出方法は、その方法の結果をオートラジオグラフ、写真、コンピュータープリントアウト、フローサイトメトリーレポート、グラフ、チャート、結果を含む試験管もしくは容器もしくはウェル、または他の視覚的もしくは物理的表現の形でレポートを提示し得る。
【０１４８】
結合要素とＩｇＥとの結合量は定量し得る。定量は診断対象であり得る試験サンプル中の抗原の量に関するものである。ＩｇＥ結合および／またはその定量のためのスクリーニングは、例えば、本明細書に言及した疾患または障害、または異常なＩｇＥの産生、発現および／または活性の関わる他の疾患または障害について、患者をスクリーニングする上で有用であり得る。
【０１４９】
本発明の診断方法は、(ｉ)被験者から組織または液状サンプルを採取すること；(ii)当該組織または液状サンプルを本発明の１種以上の結合要素に接触させること；および(iii)結合したＩｇＥを対照のサンプルと比較して検出することからなり、その場合に、対照と比較して結合しているＩｇＥの量が増加しているなら、ＩｇＥの産生、発現または活性のレベルが異状であることを示している可能性がある。試験すべき組織または液状サンプルは、血液、血清、尿、剖検材料、腫瘍、または異常なＩｇＥレベルを含む疑いのある組織である。異状ＩｇＥレベルまたは活性が陽性と試験結果の出た被験者は、本明細書の後に開示する処置方法の恩恵をも受け得る。
【０１５０】
本発明の診断方法は、さらに固定化した抗原を介して、結合要素とＩｇＥとの複合体を捕捉することからなる。例えば、抗原は対象サンプル中の抗原特異的ＩｇＥを捕捉するために、ラテラルストリップアッセイ上に固定化し得る。
【０１５１】
当業者は、本明細書に開示された方法を考慮して、それらの優先性と一般的知識に従って、抗原に対する結合要素の結合を判定する適当な方式を選択することができる。
【０１５２】
サンプル中の結合要素の反応性は適切な手段により判定し得る。放射免疫アッセイ(ＲＩＡ)は１つの可能性である。放射性標識抗原を非標識抗原(テストサンプル)と混合し、該結合要素に結合させる。結合した抗原は未結合抗原から物理的に分離し、結合要素に結合した放射性抗原の量を定量する。テストサンプル中により多くの抗原が存在する程、より少ない放射性抗原が結合要素に結合する。競合結合アッセイもレポーター分子に連結した抗原または類似体を用いて、非放射性抗原と共に使用してもよい。レポーター分子はスペクトルとして分離した吸収または発光特性をもつ蛍光色素、リン光体またはレーザー色素でよい。適当な蛍光色素は、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリスリンとテキサスレッド、およびランタニド・キレートまたはクリプテートである。適当な色素原色素はジアミノベンジジンである。
【０１５３】
他のレポーターは、高分子コロイド粒子または粒子状物質、例えば、着色、磁性もしくは常磁性のラテックスビーズ、および目視観察されるか、電子的に検出されるか、またはその他の方法で記録される検出可能なシグナルを直接または間接にもたらし得る生物学的にまたは化学的に活性な作用因子を含む。これらの分子は、発色させ、または色を変化させる反応を触媒し、または例えば、電気的性質に変化を起こす酵素でもよい。それらは分子的に励起可能であり、その結果、エネルギー状態間の電子遷移が特徴的なスペクトル吸収または発光に至る。それらはバイオセンサーと共に使用される化学的因子を含み得る。ビオチン／アビジンまたはビオチン／ストレプトアビジンおよびアルカリホスファターゼ検出システムを採用してもよい。
【０１５４】
個々の結合要素−レポーター接合体が生成するシグナルは、サンプル(正常およびテスト)中の当該結合要素の定量可能な絶対データまたは相対データを誘導するために使用し得る。
【０１５５】
本発明のいずれかの側面または実施態様による結合要素を含んでなるキットは、本発明の一側面としても提供される。当該キットにおいて、該結合要素は、例えば、以下にさらに記載するように、サンプル中のその反応性を判定し得るように標識するとよい。さらに、該結合要素は固体支持体に付着させてもよいし、させなくてもよい。キットの成分は一般に滅菌し、封印したバイアルまたは他の容器に収容する。キットは診断用分析または結合要素を有用とする他の方法に採用し得る。キットは、例えば、本発明に従う方法などの方法における成分の使用についての説明書を含み得る。かかる方法の実施に役立つ、または実施を可能とする補助材料は、本発明のキット内に含め得る。当該補助材料は第一の結合要素に結合し、検出し得る標識(例えば、蛍光標識、放射性同位体または酵素)に接合させる第二の異なる結合要素を含む。抗体に基づくキットはまた、免疫沈降を実施するためのビーズを含み得る。該キットの各成分は、一般に、それ自体の適当な容器に容れる。従って、これらのキットは、一般に、各結合要素に適する個別の容器からなる。さらに、該キットは、当該アッセイの実施とアッセイを実施して得られるデータの解釈および解析の方法についての説明書を含み得る。
【０１５６】
また、本発明は競合アッセイにおいて抗原レベルを測定するための上記の結合要素の使用、換言すると、競合アッセイにおいて、本発明により提供される結合要素を採用することにより、サンプル中の抗原レベルを測定する方法を提供する。これは、未結合の抗原から結合した抗原を物理的に分離する必要がない場合によい。結合したことで物理的または光学的変化が起こるように、結合要素にレポーター分子を連結することは、一つの可能性である。レポーター分子は直接的または間接的に検出可能なシグナルを生成し得るが、そのシグナルは定量可能であり得る。レポーター分子の連結は、直接的または間接的に、共有結合として、例えば、ペプチド結合を介して、または非共有結合としてのものであり得る。ペプチド結合を介する連結は、抗体とレポーター分子をコードする遺伝子融合の組換え発現の結果としてのものでもよい。
【０１５７】
種々の側面および実施態様において、本発明は、ＩｇＥへの結合に対して、本明細書に定義したいずれかの結合要素、例えば、ＩｇＧ１フォーマットにおける、例えば、親抗体または抗体２ないし２８のいずれかの結合要素と競合する結合要素にまで拡張する。結合要素間の競合はインビトロで容易にアッセイし得る；例えば、特異的レポーター分子を一方の結合要素(他方の未タグ標識結合要素の存在下に検出し得る)にタグ標識化し、同じエピトープまたは重なり合うエピトープに結合する結合要素の同定を可能とする。競合は、例えば、ＥＬＩＳＡにより判定し得る；ＥＬＩＳＡではＩｇＥをプレートに固定化し、第一のタグ化または標識化結合要素を、１種以上の他の未タグ化または未標識化結合要素と共にプレートに加える。タグ化結合要素と競合する未タグ化結合要素の存在を、タグ化結合要素が発するシグナルの低下により観察する。
【０１５８】
例えば、本発明は以下から構成されるＩｇＥ結合化合物の同定法を包含する：(ｉ)ＩｇＥを支持体に固定化する；(ii)当該固定化したＩｇＥを同時にまたは段階的様式で、本発明による少なくとも１種のタグ化もしくは標識化結合要素および１種以上の未タグ化もしくは未標識化テスト結合化合物を接触させる；および(iii)タグ化結合要素から結合したタグの量の減少を観測することにより、新たなＩｇＥ結合化合物を同定する。かかる方法はマルチウェルまたはアレイフォーマットを用いる高速大量処理様式で実施することができる。かかるアッセイはまた溶液中でも実施し得る。参照例：US 5,814,468(参照によりその全文を本明細書の一部とする)。上記のように、結合の検出は本方法を実施する者が直接、例えば、検出可能な標識を、またはその存在の減少を目視観察することにより判定し得る。あるいは、本発明の結合方法は、その方法の結果をオートラジオグラフ、写真、コンピュータープリントアウト、フローサイトメトリーレポート、グラフ、チャート、結果を含む試験管もしくは容器もしくはウェル、または他の視覚的もしくは物理的表現の形でレポートを提示し得る。
【０１５９】
競合アッセイはエピトープのマッピングにも使用し得る。一例において、エピトープマッピングは最適化した中和および／または調節特性を任意に有し得るＩｇＥ−結合要素が結合するエピトープを同定するために使用し得る。かかるエピトープは直鎖状またはコンホメーション(立体配座)状である。コンホメーションエピトープは少なくとも２種の異なるＩｇＥのフラグメントを含み得、その場合の当該フラグメントは、その三級または四級構造に折り畳まれたとき、互いに接近して位置し、ＩｇＥ−結合要素など、ＩｇＥのインヒビターが認識するコンホメーションエピトープを形成する。競合について試験する際には、抗原のペプチドフラグメント、とりわけ、対象のエピトープを含むペプチドまたは実質的にそれから構成されるペプチドを採用し得る。いずれかの末端に該エピトープ配列と１種以上のアミノ酸を有するペプチドを使用し得る。本発明による結合要素は、抗原に対するそれらの結合が所定の配列をもつかまたは含むペプチドにより阻害されるようなものでもよい。
【０１６０】
本発明はさらに本発明の結合要素をコードする単離された核酸を提供する。核酸はＤＮＡおよび／またはＲＮＡを包含し得る。一例において、本発明は上記で定義した本発明のＣＤＲもしくはＣＤＲ類のセット、またはＶＨドメインまたはＶＬドメインまたは抗体抗原結合部位または抗体分子、例えば、ｓｃＦｖもしくはＩｇＧ１などをコードする核酸を提供する。
【０１６１】
また、本発明は上記の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含んでなるプラスミド、ベクター、転写または発現カセットの形状の構築物を提供する。
【０１６２】
また、本発明は上記の１種以上の構築物を含んでなる組換え宿主細胞を提供する。提供されたＣＤＲもしくはＣＤＲ類のセット、またはＶＨドメインまたはＶＬドメインまたは抗体抗原結合部位または抗体分子、例えば、ｓｃＦｖもしくはＩｇＧ１などいずれかをコードする核酸は、それ自体、本発明の一側面、例えば、コードされた生産物の生産方法を形成する；該方法はそれをコードする核酸から発現することからなる。発現は適切な条件下に当該核酸を含む組換え宿主細胞を培養することにより好適に達成し得る。発現による生産の後、ＶＨもしくはＶＬドメイン、または結合要素を、その際適切であるとして使用されている適当な方法により、単離および／または精製し得る。
【０１６３】
本発明による核酸はＤＮＡまたはＲＮＡを含み得るが、その全部または一部が合成のものであってもよい。本明細書に提示したヌクレオチド配列との関連では、その状況が他の状況を要しない限り、特定した配列をもつＤＮＡ分子を包含し、またＵがＴと置換した特定の配列をもつＲＮＡ分子を包含する。
【０１６４】
なおさらなる側面においては、抗体ＶＨ可変ドメインの生産方法を提供し、該方法はコードする核酸から発現させることからなる。かかる方法は当該抗体ＶＨ可変ドメインの生産条件下に宿主細胞を培養することからなり得る。
ＶＨおよび／またはＶＬドメインを含んでなるＶＬドメインと結合要素の類似の生産方法が、本発明のさらなる側面として提供される。
【０１６５】
一生産方法は該生産物の単離および／または精製の工程からなり得る。一生産方法は該生産物を、医薬的に許容される添加剤など、少なくとも１種の追加の成分を含む組成物に製剤化することからなり得る。
【０１６６】
様々な異なる宿主細胞におけるポリペプチドのクローニングと発現のためのシステムは周知のものである。適当な宿主細胞は、バクテリア、哺乳動物細胞、植物細胞、線維状真菌、酵母およびバキュロウイルス系およびトランスジェニック植物および動物である。原核細胞中での抗体と抗体フラグメントの発現は、当該技術分野で十分に確立されている。総説としての参照例：Plueckthun[６０]。共通のバクテリア宿主は大腸菌である。
【０１６７】
真核細胞中での培養による発現も、結合要素生産のために、オプションとして当業者が利用し得る[６１、６２、６３]。異種ポリペプチドの発現のために技術的に入手可能な哺乳動物細胞株は、チャイニーズ・ハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、ヒーラ細胞、新生児ハムスター腎細胞、ＮＳＯマウスメラノーマ細胞、ＹＢ２／０ラット骨髄腫細胞、ヒト胎児腎細胞、ヒト胎児網膜細胞等である。
【０１６８】
適当なベクターは適切な調節配列、例えば、プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子およびその他の適切とされる配列を含むものを選択するか、または構築することができる。ベクターは適切なものとしてプラスミド、例えば、ファージミド、またはウイルス性のもの、例えば、‘ファージである[６４]。核酸の取り扱いについての多くの既知技法およびプロトコール、例えば、核酸構築物の調製、突然変異誘発、配列決定、細胞へのＤＮＡの導入と遺伝子発現、およびタンパク質の分析については文献(Ausubel et al.)[６５]に詳細に記載されている。
【０１６９】
本発明のさらなる側面では、本明細書に開示した核酸を含む宿主細胞が提供される。かかる宿主細胞はインビトロのものでもよし、また培養物でもよい。かかる宿主細胞はインビボのものでもよい。インビボで存在する宿主細胞は、「イントラボディ」または細胞内抗体として本発明の結合要素の細胞内発現を可能とし得る。イントラボディは遺伝子療法に使用し得る。
【０１７０】
なおさらなる側面においては、宿主細胞に本発明の核酸を導入することからなる方法が提供される。該導入にはいずれか導入可能な技法を採用し得る。真核細胞の場合、適切な技法はリン酸カルシウム形質移入、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム仲介形質移入、およびレトロウイルスまたは他のウイルス、例えば、ワクシニアを使用する形質導入であり、または昆虫の場合、バキュロウイルスを使用する形質導入である。宿主細胞、とりわけ、真核細胞に核酸を導入するには、ウイルスまたはプラスミドに基づくシステムを使用し得る。該プラスミドシステムは遺伝子副体として維持し得るか、または宿主細胞に、もしくは人工染色体に取り込ませ得る。取り込みは、単一または複数遺伝子座での１つ以上のコピーのランダムな、または標的化した組み込みのいずれかであり得る。バクテリア細胞の場合、適切な技法は、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーションおよびバクテリオファージを用いる形質移入であり得る。
【０１７１】
当該導入は核酸からの発現を惹き起こすか、または可能とすることにより、例えば、遺伝子発現のための条件下に宿主細胞を培養することにより遂行し得る。発現した産物の精製は当業者既知の方法で達成し得る。
【０１７２】
本発明の核酸は宿主細胞のゲノム(例えば、染色体)に組み込み得る。組込みは標準的技法に従って、ゲノムでの組換えを促進する配列の封入により促進し得る。
本発明はまた、上記の結合要素またはポリペプチドを発現するために、発現システムに上に述べた構築物を使用することからなる方法を提供する。
【０１７３】
本発明の結合要素は、ヒトまたは動物対象、とりわけヒトの診断または処置方法に使用し得る。ＩｇＥに対する結合要素は、ＩｇＥが仲介する生物作用により特徴づけられる障害、特にアレルギーと喘息の処置に有用であり得る。例えば、本発明の結合要素は、アレルギー性鼻炎、アレルギー性接触皮膚炎、アトピー性皮膚炎、アナフィラキシー反応、食物アレルギー、蕁麻疹、炎症性腸疾患、好酸性胃腸炎、薬物誘発皮疹、アレルギー性眼病、またはアレルギー性結膜炎の処置に使用し得る。
【０１７４】
ＩｇＥに対する結合要素は、インビボまたはインビトロでアレルゲン誘発肥満細胞脱顆粒を阻害し、インビボまたはインビトロでのＦｃεＲＩ−仲介生物応答を低下させ、同様に、ヒトまたは動物患者におけるＩｇＥの循環を低下させるために使用し得る。
【０１７５】
従って、本発明は、哺乳動物におけるアレルゲン誘発肥満細胞脱顆粒を阻害する方法であって、当該哺乳動物に本発明の結合要素、例えば、抗体、ＶＨドメイン、またはＶＬドメインを、ＩｇＥを中和するために十分な量、投与することを特徴とする方法を提供する。
【０１７６】
本発明はさらにＦｃεＲII仲介生物応答を同時に低下させながら、または低下させることなくＦｃεＲＩ生物応答を低下させる方法であって、ＦｃεＲＩおよび／またはＦｃεＲIIを発現する細胞を、ＩｇＥの存在下、結合要素、例えば、本発明の抗体、ＶＨドメイン、またはＶＬドメインと接触させることを特徴とする方法を提供する。
【０１７７】
本発明なさらにＦｃＥＲII仲介生物応答を同時に低下させながら、または低下させることなくＦｃＥＲＩ仲介生物応答を低下させる方法であって、ＦｃεＲＩおよび／またはＦｃεＲIIを発現する細胞を、ＩｇＥの存在下、結合要素、例えば、本発明の抗体、ＶＨドメイン、またはＶＬドメインと接触させることを特徴とする方法を提供する。
【０１７８】
試験細胞を本発明の結合要素とインビトロで接触させるとき、対照細胞は陽性対照として(例えば、結合要素を含まない反応)および／または陰性対照(例えば、ＩｇＥおよび／または抗原を含まない反応)としても使用し得る。
【０１７９】
細胞をインビボで結合要素により接触させる場合、例えば、ＦｃεＲＩ−および／またはＦｃεＲII−仲介生物応答を示す哺乳動物に、本発明の結合要素を投与することにより接触させる場合、本発明の結合要素はＩｇＥを中和するために十分な量で投与する。
【０１８０】
なおさらに、本発明はヒトなどの哺乳動物において循環するＩｇＥを低下させる方法であって、本発明の結合要素、例えば、抗体、ＶＨドメイン、またはＶＬドメインを、循環する遊離のＩｇＥを中和し、低下させるために十分な量、投与することを特徴とする方法を提供する。
【０１８１】
本発明の結合要素は限定されるものではないが、以下の１種以上の疾患または障害の診断または処置に使用し得る：、アレルギー性鼻炎、アレルギー性接触皮膚炎、アトピー性皮膚炎、アナフィラキシー反応、食物アレルギー、蕁麻疹、炎症性腸疾患、好酸性胃腸炎、薬物誘発皮疹、アレルギー性眼病、鼻結膜炎、アレルギー性結膜炎、気管支喘息、気道過敏症、化粧品アレルギー、薬物誘発アレルギー、薬物誘発過敏性症候群、金属アレルギー、職業性過敏症性肺炎、慢性過敏症性肺炎、寒冷過敏性反応、寄生ぜん虫感染誘発過敏症、ラテックスアレルギーおよび枯草熱。
【０１８２】
ＩｇＥの結合と中和に関して本明細書にて提示したデータは、従って、本発明の結合要素がかかる障害の、その重篤度の低下も含めた処置または予防に使用し得ることを物語っている。従って、本発明は本明細書に言及した障害のいずれかの少なくとも１つの症候の重篤度を処置または低下する方法であって、それを必要とする患者に、１種以上の本発明結合要素の有効量を単独で、または技術上既知の、もしくは本明細書に記載した別の適切な医薬との組合せ治療計画に従って投与し、上記障害のいずれかの少なくとも１つの症候の重篤度が低減されるようにすることを特徴とする。
本発明の結合要素は適切な動物および疾患の動物モデル、とりわけサルにおいて使用し得る。
【０１８３】
従って、本発明の結合要素は、ＩｇＥの関与、例えば、ＩｇＥ生産、発現および／または活性、とりわけ異常生産、発現、または活性の関与する疾患または障害の処置における治療剤として有用である。投与方法は本発明結合要素の有効量を、それを必要とする患者に投与することからなり、それによってＩｇＥの生産、発現および／または活性を低下させる。処理方法は、(ｉ)例えば、上記の診断方法を用いてＩｇＥレベルまたは活性を示している患者を同定すること；および(ii)本発明結合要素の有効量を該患者に投与することからなり、それによって、ＩｇＥの生産、発現および／または活性を低下させる。代わりとなる処置法は、(ｉ)明確なＩｇＥレベルの増大を示していないが、本発明の結合要素の投与が有益であると信じられる患者を同定すること；および(ii)本発明の結合要素の有効量を該患者に投与することからなり得る。本発明による有効量は、増加したＩｇＥの生産、発現および／または活性を低下させ、処置する特定の疾患または障害の少なくとも１つの症候の重篤度を低下させるか、または低減させる量であり、必ずしもその疾患または障害を治癒するものではない。
【０１８４】
また、本発明は少なくとも１つのＩｇＥの作用に拮抗する方法であって、本発明の１種以上の結合要素と接触させるか、それを投与して、当該少なくとも１つのＩｇＥの作用に拮抗するようにすることからなる方法を提供する。本発明により拮抗され得るＩｇＥの作用は、ＦｃεＲＩおよび／またはＦｃεＲIIが仲介する生物応答、およびこれらの結合反応の結果として生じる何らかの下流作用である。
【０１８５】
従って、本発明のさらなる側面においては、本明細書にて考察したＩｇＥと関連するか、またはＩｇＥが介在する障害を処置するための医薬の製造のために、本発明の抗体、ＶＨドメインまたはＶＬドメインなどの単離した結合要素の使用が提供される。医薬もしくは医薬組成物のかかる使用または製造法は、該結合要素を医薬的に許容される添加物で製剤化することからなる。
【０１８６】
医薬的に許容される添加物は、二次的な反応を惹き起こすことなく医薬組成物に入る化合物または化合物の組合せであり、また、例えば、活性化合物の投与を容易ならしめ、体内でのその寿命および／またはその有効性を増大させ、溶液中でのその溶解性を増大させ、またはさらにはその保存性を改善し得るものである。これらの医薬的に許容される媒体は周知のものであり、選択した活性化合物の性質および投与様式を関数として当業者が適合させるものである。
【０１８７】
本発明の結合要素は、通常、医薬組成物の形状で投与するものであり、該組成物は当該結合要素に加えて、少なくとも１種の成分を含み得る。従って、本発明による医薬組成物、また本発明に従って使用する医薬組成物は、有効成分に加えて、医薬的に許容される添加物、担体、緩衝剤、安定剤または当業者周知の他の物質を含み得る。かかる物質は非毒性であるべきであり、また有効成分の有効性に干渉すべきではない。該担体または他の物質の正確な性質は、以下に考察する投与経路、すなわち、経口、吸入、気管内、局所、小胞内、または注射によるなどの経路に左右される。
【０１８８】
経口投与用医薬組成物、例えば、単一ドメイン抗体分子(例えば、“ナノボディズ”；商標)などが本発明にて予見される。かから経口製剤は、錠剤、カプセル、散剤、液状または半固体形状のものであり得る。錠剤はゼラチンまたはアジュバントなどの固形担体を含み得る。液状医薬組成物は一般に、水、石油、動物もしくは植物油、鉱油または合成油などの液状担体を含む。生理食塩溶液、デキストロースもしくは他の糖溶液、またはグリコール、例えば、エチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールなどが包含され得る。
【０１８９】
静脈内注射または罹患部位での注射の場合、有効成分は、発熱物質不含の、適切なｐＨ、等張性および安定性を有する非経口的に許容される水溶液の形状とする。当業者は、例えば、等張性媒体を使用する適当な溶液、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸加リンゲル注射液などを容易に調製し得る。保存剤、安定化剤、緩衝剤、抗酸化剤および／または他の添加物を必要に応じて採用し得るが、それらは緩衝剤、例えば、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸類；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸およびメチオニン；保存剤(例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３’−ペンタノール；およびｍ−クレゾール)；低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン；グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む単糖類、二糖類および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；糖類、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属複合体(例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体)；および／または非イオン性界面活性剤、例えば、トゥイーン(商標)、プルロニックス(商標)またはポリエチレングリコール(ＰＥＧ)である。
【０１９０】
本発明の結合要素は、分子の理化学的性質およびその送達経路に応じて、液状、半固体または固体の形状に製剤化し得る。製剤は、例えば、糖、アミノ酸および界面活性剤などの添加剤、または添加剤の組合せを含み得る。液状製剤は広い範囲の抗体濃度とｐＨを含み得る。固体製剤は、例えば、凍結乾燥、スプレードライ、または超臨界流体法による乾燥により製造し得る。抗ＩｇＥの製剤化は企図する送達経路による；例えば、肺送達用の製剤は、吸入による深部肺への浸透を確実にする物理的性質をもつ粒子から成り得る；局所用製剤(例えば、皮膚瘢痕などの瘢痕形成の処置のため)は粘稠度改変剤を含み得る；この改変剤は作用部位に薬物が存在する時間を引き延ばす。結合要素は急速な放出に対して結合要素を保護する担体で調製し得る；例えば、制御放出製剤は、インプラント、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化送達システムなどを包含する。生分解性生体適合性ポリマーは、酢酸エチレンビニル、ポリアンヒドリド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などを使用し得る。かかる製剤の調製法については多くが当業者既知である[６６]。
【０１９１】
抗ＩｇＥ処置は経口(例えば、単一ドメイン抗体分子など(例えば、“ナノボディズ”商標))、注射により(例えば、皮下、関節内、静脈内、腹腔内、動脈内または筋肉内)、吸入により、気管内、小胞内経路により(膀胱への点滴)、または局所的(例えば、眼内、鼻腔内、直腸、皮膚外傷)に投与し得る。該処置はパルス注入により、特に結合要素の用量を減少させながら投与するのがよい。投与経路は、処置の理化学的特性により、疾患に対する特別の考慮により、または効果を最適化するかまたは副作用を最小化するための要件により決定し得る。特定投与経路の一つは静脈内投与である。本発明の医薬組成物を投与する別の経路は皮下投与である。抗ＩｇＥ処置は臨床での使用に限定されるものではないことが予見される。従って、無針器具による皮下注射もまた有利である。
【０１９２】
静脈内製剤の例は以下のとおりである：
製剤(１)の構成：
本発明の単離された結合要素(当該結合要素、例えば、抗体、選択肢として１０、５０、１００または１５０ｍｇ／ｍｌ)
５０ｍＭ酢酸ナトリウム
１００ｍＭ−ＮａＣｌ
ｐＨ５.５
【０１９３】
製剤(２)の構成：
本発明の単離された結合要素(当該結合要素、例えば、抗体、選択肢として１０、５０、１００または１５０ｍｇ／ｍｌ)
２０ｍＭコハク酸塩
１０５ｍＭ−ＮａＣｌ
１０ｍＭアルギニン
ｐＨ６.０
組成物は単独で、または他の処置剤と組み合わせて、処置すべき症状に応じて、同時にまたは連続的に投与し得る。
【０１９４】
ＩｇＥに対する結合要素は、さらなる医薬成分との共存下における併用療法の一部として使用し得る。組み合わせ処置、特に、抗ＩｇＥ結合要素と１種以上の他の薬物との組み合わせは、有意な相乗作用を提供するために使用し得る。ＩｇＥに対する結合要素は、本明細書に掲載した１つ以上の症状の処置のために、別の１種もしくはそれ以上の治療剤と共に同時にまたは連続的にまたは組み合わせ製剤として投与し得る。
【０１９５】
本発明の結合要素は、喘息およびアレルギー障害、またはＩｇＥ仲介作用の関与する他の障害のために、他の利用可能な処置剤と組み合わせて製剤化および／または使用し得る。
【０１９６】
本発明による結合要素は、以下の１種以上の薬剤と組み合わせて、または添加して提供し得る：
サイトカインまたはサイトカイン機能のアゴニストもしくはアンタゴニスト(例えば、サイトカインシグナル伝達経路に作用する薬剤、例えば、ＳＯＣＳシステムのモジュレーターなど)、例えば、アルファ−、ベータ−および／またはガンマ−インターフェロン；インスリン様増殖因子Ｉ型(ＩＧＦ−１)、その受容体および関連する結合タンパク質；インターロイキン(ＩＬ)、例えば、ＩＬ−１ないし−３３の１種以上、および／またはインターロイキンアンタゴニストもしくはインヒビター、例えば、アナキンラ；インターロイキンファミリーメンバー受容体のインヒビターまたはかかる受容体の特異的サブユニットのインヒビター、腫瘍壊死因子アルファ(ＴＮＦ−α)インヒビター、例えば、抗ＴＮＦモノクローナル抗体(例えば、インフリキシマブ(infliximab)、アダリムマブ(adalimumab)および／またはＣＤＰ−８７０)および／またはＴＮＦ受容体アンタゴニスト、例えば、免疫グロブリン分子(エタナーセプト(etanercept)など)および／または低分子量薬剤、例えば、ペントキシフィリン(pentoxyfylline)：
【０１９７】
Ｂ細胞モジュレーター、例えば、モノクローナル抗体標的化Ｂ−リンパ球(例えば、ＣＤ２０(リツキシマブ)またはＭＲＡ−ａＩＬ１６Ｒ)またはＴ−リンパ球(例えば、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、ＨｕＭａｘＩ１−１５またはアバタセプト(Abatacept)；
破骨細胞活性を阻害するモジュレーター、例えば、ＲＡＮＫＬに対する抗体；
【０１９８】
ケモカインまたはケモカイン受容体機能のモジュレーター、例えば以下のアンタゴニスト：ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ２Ａ、ＣＣＲ２Ｂ、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０およびＣＣＲ１１(Ｃ−Ｃファミリーに対し)；ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４およびＣＸＣＲ５およびＣＸＣＲ６(Ｃ−Ｘ−Ｃファミリーに対して)およびＣ−Ｘ３−Ｃファミリーに対するＣＸ３ＣＲ１；
【０１９９】
マトリックス・メタロプロテアーゼ(ＭＭＰ)、すなわち、１種以上のストロメリシン、コラゲナーゼおよびゼラチナーゼ並びにアグリカナーゼ、とりわけ、コラゲナーゼ−１(ＭＭＰ−１)、コラゲナーゼ−２(ＭＭＰ−８)、コラゲナーゼ−３(ＭＭＰ−１３)、ストロメリシン−１(ＭＭＰ−３)、ストロメリシン−２(ＭＭＰ−１０)および／またはストロメリシン−３(ＭＭＰ−１１)および／またはＭＭＰ−９および／またはＭＭＰ−１２、例えば、ドキシサイクリンなどの薬剤；
【０２００】
ロイコトリエン生合成インヒビター、５−リポキシゲナーゼ(５−ＬＯ)インヒビターまたは５−リポキシゲナーゼ活性化タンパク質(ＦＬＡＰ)アンタゴニスト、例えば、ジロイトン(zileuton)；ＡＢＴ−７６１；フェンロイトン(fenleuton)；テポキサリン(tepoxalin)；アボット−７９１７５；アボット−８５７６１；Ｎ−(５−置換)−チオフェン−２−アルキルスルホンアミド；２，６−ジ−tert−ブチルフェノールヒドラジン；メトキシテトラヒドロピラン、例えば、ゼネカＺＤ−２１３８；化合物ＳＢ−２１０６６１；ピリジル−置換−２−シアノナフタレン化合物、例えば、Ｌ−７３９,０１０；２−シアノキノリン化合物、例えば、Ｌ−７４６,５３０；インドールおよび／またはキノリン化合物、例えば、ＭＫ−５９１、ＭＫ−８８６および／またはＢＡＹ  ｘ  １００５；
【０２０１】
ロイコトリエン(ＬＴ)Ｂ４、ＬＴＣ４、ＬＴＤ４、およびＬＴＥ４に対する受容体アンタゴニストであり、以下からなる群より選択される：フェノチアジン−３−１ｓ、例えば、Ｌ−６５１,３９２；アミジノ化合物、例えば、ＣＧＳ−２５０１９ｃ；ベンズオキサラミン、例えば、オンタゾラスト(ontazolast)；ベンゼンカルボキシミダジド、例えば、ＢＩＩＬ２８４／２６０；および化合物類、例えば、ザフィルルカスト(zafirlukast)、アブルカスト(ablukast)、モンテルカスト(montelukast)、プランルカスト(pranlukast)、ベルルカスト(verlukast)(ＭＫ−６７９)、ＲＧ−１２５２５、Ｒｏ−２４５９１３、イラルカスト(iralukast)(ＣＧＰ４５７１５Ａ)およびＢＡＹ  ｘ  ７１９５；
【０２０２】
ホスホジエステラーゼ(ＰＤＥ)インヒビター、例えば、メチルキサンタニン、例えば、テオフィリンおよび／またはアミノフィリン；および／または選択的イソ酵素インヒビター、例えば、ＰＤＥ４インヒビターおよび／またはイソ型ＰＤＥ４Ｄのインヒビターおよび／またはＰＤＥ５のインヒビター；
【０２０３】
ヒスタミン１型受容体アンタゴニスト、例えば、セチリジン(cetirizine)、ロラタジン(loratadine)、デスロラタジン(desloratadine)、フェキソフェナジン(fexofenadine)、アクリバスチン(acrivastine)、テルフェナジン(terfenadine)、アステミゾール(astemizole)、アゼラスチン(azelastine)、レボカバスチン(levocabastine)、クロルフェニラミン、プロメタジン、サイクリジン、および／またはミゾラスチン(mizolastine)(一般に、経口、局所または非経口で投与)；
【０２０４】
プロトンポンプインヒビター(例えば、オメプラゾール)または胃保護ヒスタミン２型受容体アンタゴニスト；
ヒスタミン４型受容体アンタゴニスト；
【０２０５】
アルファ−１／アルファ−２アドレナリン受容体アゴニスト血管収縮因子交感神経興奮剤、例えば、プロピルヘキセドリン、フェニレフリン、フェニルプロパノールアミン、エフェドリン、シュードエフェドリン、塩酸ナファゾリン、塩酸オキシメタゾリン、塩酸テトラヒドロゾリン、塩酸キシロメタゾリン、塩酸トラマゾリンおよび塩酸エチルノルエピネフリン；
【０２０６】
抗コリン作動薬、例えば、ムスカリン受容体(Ｍ１、Ｍ２、およびＭ３)アンタゴニスト、例えば、アトロピン、ヒヨスチン、グリコピロレート、臭化イプラトロピウ、臭化チオトロピウム、臭化オキシトロピウム、ピレンゼピン(pirenzepine)およびテレンゼピン(telenzepine)；
【０２０７】
ベータ−アドレナリン受容体アゴニスト(ベータ受容体サブタイプ１−４を含む)、例えば、シソプレナリン、サルブタモール、フォルモテロール、サルメテロール、テルブタリン、オルシプレナリン、メシル酸ビルトルテロールおよび／またはピルブテロール、例えば、そのキラルエナンチオマー；
【０２０８】
クロモン、例えば、クロモグリカル酸ナトリウムおよび／またはネドクロミルナトリウム(nedocromil sodium)；
グルココルチコイド、例えば、フルニソリド、トリアムシノロンアセトニド、ジプロピオン酸ベクロメタソン、ブデソニド、プロピオン酸フルチカゾン、シクレソニド、および／またはフロ酸モメタゾン；
【０２０９】
核ホルモン受容体を調節する作用因子、例えば、ＰＰＡＲ；
免疫グロブリン(Ｉｇ)またはＩｇ標品またはＩｇ機能を調節するアンタゴニストもしくは抗体、例えば、本発明の結合要素として同一のもしくは異なるエピトープに結合する抗ＩｇＥなど；
【０２１０】
その他の全身的または局所的に適用する抗炎症剤、例えば、サリドマイドもしくはその誘導体、レチノイド、ジスラノール(dithranol)および／またはカルシポトリオール(calcipotriol)；
アミノサリチル酸エステルとスルファピリジンの組み合わせ、例えば、スルファサラジン、メサラジン、バルサラジド、およびオルサラジン；および免疫調節剤、例えば、チオプリン；およびコルチコステロイド、例えば、ブデソニド；
【０２１１】
抗菌剤、例えば、ペニシリン誘導体、テトラサイクリン、マクロライド、例えば、ベータ−ラクタム、フルオロキノロン、メトロニダゾールおよび／または吸入アミノグリコシド；および／または抗ウイルス剤、例えば、アシクロビル、ファムシクロビル、バラシクロビル、ガンシクロビル、シドフォビル；アマンタジン、リマンタジン；リバビリン；ザナマビル(zanamavir)および／またはオセルタマビル(oseltamavir)；プロテアーゼインヒビター、例えば、インジナビル(indinavir)、ネルフィナビル(nelfinavir)、リトナビル(ritonavir)および／またはサキナビル(saquinavir)；ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター、例えば、ジダノシン(didanosine)、ラミブダジン(lamivudine)、スタブジン(stavudine)、ザルシタビン(zalcitabine)、ジドブジン(zidovudine)；非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター、例えば、ネビラピン(nevirapine)、エファビレンツ(efavirenz)；
【０２１２】
心臓血管用剤、例えば、カルシウムチャンネル遮断薬、ベータ−アドレナリン受容体遮断薬、アンギオテンシン変換酵素(ＡＣＥ)インヒビター、アンギオテンシン−２受容体アンタゴニスト；脂質低下剤、例えば、スタチンおよび／またはフィブレート；血液細胞形態のモジュレーター、例えば、ペントキシフィリン；血栓融解剤および／または抗凝血剤、例えば、血小板凝集インヒビター；
【０２１３】
ＣＮＳ剤、例えば、抗うつ剤(セルトラリンなど)、抗パーキンソン病薬(例えば、デプレニル、Ｌ−ドーパ、ロピニロール、プラミペキソール；ＭＡＯＢインヒビター、例えば、セレギン(selegine)およびラサギリン(rasagiline)；comＰインヒビター、例えば、タスマール(tasmar)；Ａ−２インヒビター、ドーパミン再吸収インヒビター、ＮＭＤＡアンタゴニスト、ニコチンアゴニスト、ドーパミンアゴニストおよび／またはニューロン一酸化窒素シンターゼのインヒビター)および抗アルツハイマー剤、例えば、ドネペジル(donepezil)、リバスチミン(rivastigmine)、タクリン(tacrine)、ＣＯＸ−２インヒビター、プロペントフィイリン(propentofylline)またはメトリフォネート(metrifonate)；
【０２１４】
急性および慢性疼痛処置用薬剤、例えば、中枢または末梢に作用する解熱剤、例えば、オピオイド類似体または誘導体、カルバマゼピン、フェニトイン、バルプロン酸ナトリウム、アミトリプチリンまたは他の抗うつ剤、パラセタモール、または非ステロイド抗炎症剤；
【０２１５】
非経口的または局所的に適用する(吸入を含む)局所麻酔剤、例えば、リグノカインまたはその類似体；
抗骨粗鬆剤、例えば、ホルモン剤、例えば、ラロキシフェン、またはビホスホネート、例えば、アレンドロネート；
【０２１６】
(ｉ)トリプターゼインヒビター；(ii)血小板活性化因子(ＰＡＦ)アンタゴニスト；(iii)インターロイキン変換酵素(ＩＣＥ)インヒビター；(iv)ＩＭＰＤＨインヒビター；(ｖ)ＶＬＡ−４アンタゴニストを含む接着分子インヒビター；(vi)カテプシン；(vii)キナーゼインヒビター、例えば、チロシンキナーゼのインヒビター(例えば、Ｂｔｋ、Ｉｔｋ、Ｊａｋ３  ＭＡＰインヒビターの例はゲフィチニブ、メシル酸イマチニブを含み得る)、セリン／スレオニンキナーゼ(例えば、ＭＡＰキナーゼのインヒビター、例えば、ｐ３８、ＪＮＫ、タンパク質キナーゼＡ、ＢおよびＣ、およびＩＫＫ)、または細胞周期調節に関与するキナーゼ(例えば、サイクリン依存性キナーゼ)；(viii)グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼインヒビター；(ix)キニン−Ｂ.サブ１−および／またはＢ.サブ２−受容体アンタゴニスト；(ｘ)痛風用剤、例えば、コルヒチン；(xi)キサンチンオキシダーゼインヒビター、例えば、アロプリノール；(xii)過尿酸症剤、例えば、プロベネシド、スルフィンピラゾン、および／またはベンズブロマロン；(xiii)成長ホルモン分泌促進剤；(xiv)形質転換増殖因子(ＴＧＦβ)；(xv)血小板由来増殖因子(ＰＤＧＦ)；(xvi)線維芽細胞増殖因子、例えば、塩基性線維芽細胞増殖因子(ｂＦＧＦ)；(xvii)顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(ＧＭ−ＣＳＦ)；(xviii)カプサイシンクリーム；(xix)タキキニンＮＫサブ１および／またはＮＫサブ３受容体アンタゴニスト、例えば、ＮＫＰ−６０８Ｃ、ＳＢ−２３３４１２(タルネタント(talnetant))および／またはＤ−４４１８；(xx)エラスターゼインヒビター、例えば、ＵＴ−７７および／またはＺＤ−０８９２；(xxi)ＴＮＦ−アルファ変換酵素インヒビター(ＴＡＣＥ)；(xxii)誘発一酸化窒素シンターゼ(ｉＮＯＳ)インヒビターまたは(xxiii)ＴＨ２細胞上に発現される走化性誘起作用受容体−相同分子(ＣＲＴＨ２アンタゴニストなど)；(xxiv)Ｐ３８のインヒビター；(xxv)トール様受容体(ＴＬＲ)の機能を調節する作用因子および(xxvi)プリン受容体の活性を調節する作用因子、例えば、Ｐ２Ｘ７；(xxvii)転写因子活性化のインヒビター、例えば、ＮＦκＢ、ＡＰＩ、および／またはＳＴＡＴＳ。
【０２１７】
インヒビターは特異的であるか、または混合インヒビターであってもよく、例えば、１つを超える上記の分子(例えば、受容体)または分子クラスを標的とするインヒビターである。
【０２１８】
該結合要素は、チロシンキナーゼインヒビターなどの化学療法剤と組み合わせて、同時投与で、または免疫接合体の形状で使用することもできる。当該抗体のフラグメントは、組換えメカニズム、または生化学的カップリング、および次いで上記の抗体の特異性とＩｇＥが関連する活性に関与する他の分子を認識し得る他の抗体の特異性とを会合させることにより得られる二重特異性抗体に使用し得る。
【０２１９】
炎症性疾患、例えば、リウマチ様関節炎、骨関節症、喘息、アレルギー性鼻炎、慢性閉塞性肺疾患(ＣＯＰＤ)、または乾癬の処置のためには、本発明の結合要素が１種以上の以下の薬剤と組み合わせ得る；局所的または全身的に適用される非選択的シクロオキシゲナーゼ(ＣＯＸ)−１／ＣＯＸ−２インヒビターを包含する非ステロイド抗炎症薬(以下、ＮＳＡＩＤ)、例えば、ピロキシカム、ジクロフェナック、プロピオン酸類、例えば、ナプロキセン、フルルビプロフェン、フェノプロフェン、ケトプロフェンおよびイブフロフェン、フェナミン酸類、例えば、メフェナム酸、インドメタシン、スリンダック、アザプロパゾン、ピラゾロン類、例えば、フェニルブタゾン、サリチル酸類、アスピリン)；選択的ＣＯＸ−２インヒビター(例えば、メロキシカム、セレコキシブ、ロフェコキシブ、バルデコキシブ、ルマロコキシブ、パレコキシブおよびエトリコキシブ)；一酸化窒素供与体を阻害するシクロオキシゲナーゼ(ＣＩＮＯＤ)；グルココルチコステロイド類(局所、経口、筋肉内、静脈内または関節内経路で投与される)；メトトレキセート、レフルノミド；ヒドロキシクロロキン、ｄ−ペニシラミン、オーラノフィン、または他の非経口もしくは経口用金製剤；鎮痛剤；ジアセレイン；関節内療法、例えば、ヒアルロン酸誘導体；およびグルコサミンなどの栄養補助剤。
【０２２０】
本発明の結合要素および１種以上の上記追加の医薬成分は、医薬の製造に使用し得る。該医薬は個々人に別個にまたは組み合わせて投与し得るものであり、従って、該結合要素と追加の成分とを組み合わせた製剤として、または別個の製剤として含み得る。別個の製剤は、別個のおよび連続したまたは同時投与を容易にするために使用可能であり、また該成分を別の経路、例えば、経口と非経口投与による投与を可能とする。
【０２２１】
本発明により提供される組成物は、哺乳動物に投与し得る。投与は通常、「治療有効量」でなされ、この量は患者に有益性を示すために十分な量である。かかる有益性は、少なくとも１つの症候を少なくとも改善することであり得る。実際の投与量、および投与の速度と時間経過は、処置すべきものの性質と重篤度、処置すべき特定の哺乳動物、個々の患者の臨床症状、障害の原因、組成物の送達部位、結合要素のタイプ、投与方法、投与スケジュールおよび他の医療従事者に既知の因子による。処置の処方、例えば、投与量などの決定は、一般的な実務者と他の医師の責任の範囲であり、処置すべき疾患の症候の重篤度および／または進行により得る。抗体の適切な用量は当該技術分野で周知である[６７、６８]。投与される医薬のタイプに適切である場合、本明細書または文献(Physician's Desk Reference (2003))に示された特定の投与量が使用され得る。本発明の結合要素の治療有効量または適当な用量は、そのインビトロ活性とインビボ活性を動物モデルにおいて比較し、決定し得る。マウスと他の試験動物における有効投与量をヒトに外挿する方法は既知である。正確な用量は多くのファクター、例えば、抗体が診断用であるのか、予防または処置のためのものであるのか、処置すべき領域の大きさと位置、抗体についての正確な性質(例えば、抗体全部、フラグメントまたはダイアボディ)および抗体に付着させた検出可能な標識または他の分子の性質などによる。典型的な抗体の用量は、全身適用の場合、１００μｇないし１ｇの範囲内であり、局所適用では１μｇないし１ｍｇの範囲である。開始時はより高い負荷用量とし、次いで１桁以下の用量を投与し得る。典型的には、該抗体は全抗体、例えば、ＩｇＧ１イソ型、ＩｇＧ２イソ型、ＩｇＧ３イソ型またはＩｇＧ４イソ型である。これは成人患者の単回処置のための用量であり、小児および幼児に対しては比例して調整し、また他の抗体フォーマットについても分子量に比例して調整し得る。処置は１日ごとに、週２回、週ごとに、または月単位の間隔で、医師の裁量で繰返し得る。処置は皮下投与の場合、２週ないし４週ごと、また静脈内投与の場合は、４週ないし８週ごとでよい。処置は定期的であるのがよく、また投与間の期間は約２週間以上、例えば、約３週間以上、約４週間以上、または１ヶ月に約１回である。処置は外科手術の前および／または後に施し、および／または投与するか、または外科処置の解剖学的部位に直接適用してもよい。
【０２２２】
[表の簡単な説明]
表１：抗体１−２８のそれぞれの重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を一欄表としたものである。
表２ａ：受容体−リガンド結合ＨＴＲＦ(登録商標)アッセイにて試験した場合の標的突然変異誘発ライブラリーから同定したクローンの効力を例示する。
表２ｂ：ＳＰＲ(バイアコア)を用い、ヒトＩｇＥおよびカニクイザルＩｇＥに対する例示としての本発明結合要素の結合親和性(ＫＤ)を示す。表２ｂはさらにＲＢＬ−ＥＲ５１カルシウムシグナリングアッセイ(２５ｎｇ／ｍｌのヒトＩｇＥまたは１００ｎｇ／ｍｌのカニクイザルＩｇＥと４時間)における例示としての本発明結合要素の効力(ＩＣ５０で表わす)を示す。
表３ａ：添付の配列表に示す例示としての本発明結合要素の配列を示す；配列番号は表３ａに示すものに対応する。
表３ｂ：添付の配列表に示す仮出願からの例示としての本発明結合要素のＶＬ・ＤＮＡ配列およびＶＬアミノ配列を示す；配列番号は表３ｂに示すものに対応する。
表４：生殖系列抗体についてのＢＩＡコアを用いる結合親和性計算結果およびＲＢＬ−ＥＲ５１カルシウムシグナリングアッセイを用いる効力測定値を例示する。
表５：相互作用１についてのＸ線結晶解析研究におけるＩｇＥ Ｃε３−Ｃε４および抗体１１Ｆａｂの間の直接の相互作用を示す。
表６：相互作用２についてのＸ線結晶解析研究におけるＩｇＥ Ｃε３−Ｃε４および抗体１１Ｆａｂの間の直接の相互作用を示す。
表７：Ｘ線結晶解析研究からの結晶パラメーターおよびＸ線データ処理精製統計データを示す。
表８：安全性研究における要約研究設計を示す(実施例８)。
【図面の簡単な説明】
【０２２３】
【図１】図１は実施例２.７に関するものであり、ｘ軸に対数で表わされる抗体のモル濃度およびｙ軸にＲＢＬ−ＥＲ５１カルシウムシグナリングアッセイにおけるピーク高さを示す。白抜き四角は抗体１１に関係し、十字記号は無関係のＩｇＧ１対照抗体に、また倒置白抜き三角は抗ＩｇＥ架橋抗体(バイオソース)に関係する。この図面においては、白抜き四角と十字記号は互いに重なり合っていることに留意されたい。
【図２】図２はカニクイザルＣε３−４ ＦＬＡＧ Ｈｉｓ１０の配列を示す。
【図３】図３はヒト抗エストラジオールｓｃＦｖ(Ｄ１２＿ＶＨ)およびカニクイザルＩｇＨＥ遺伝子ハプロタイプ(ｃｙＩｇＨＥ ＴＱ)の１つをコードする可変重鎖の配列を示す。
【図４】図４はヒト抗エストラジオールｓｃＦｖ(Ｄ１２＿ＶＨ)およびカニクイザルＩｇＨＥ遺伝子ハプロタイプ、ｃｙＩｇＨＥ ＭＥの１つをコードする可変重鎖の配列を示す。
【図５】図５はヒト抗エストラジオールｓｃＦｖ(Ｄ１２＿ＶＨ)の可変軽鎖の配列およびカニクイザルのラムダ定常領域遺伝子ｃｙＩＧＬＣ４、配列範囲：１ないし７０８を示す。
【図６】図６はヒト抗エストラジオールｓｃＦｖ(Ｄ１２＿ＶＨ)の可変軽鎖の配列およびカニクイザルのラムダ定常領域遺伝子Ｄ１２＿ＶＬ ｃｙＩＧＬＣ７を示す。
【図７】図７は実施例３に関するものであり、遮断抗ＩｇＥで処理していないＢ細胞における最大ＩｇＥ発現のパーセント阻害を示す；ただし、ｘ軸は抗体１１のｎＭでの濃度であり、ｙ軸はパーセント阻害である。上方のグラフは抗体１１に関するものであり、下方のグラフは対照の抗体に関する。
【図８】図８は実施例４に関するものであり、β−ヘキソサミニダーゼの総放出パーセント阻害±ＳＥＭを示す；ただし、ｘ軸は抗体１１のｎＭでの濃度であり、ｙ軸はパーセント阻害である。上方のグラフは抗体１１に関するものであり、下方のグラフは対照の抗体に関する。
【図９】図９は実施例５に関する。該図面は、抗ＩｇＥ抗体、抗体１１の濃度上昇に伴うヒト血清中の結合したＩｇＥのパーセントを示す。ｘ軸は抗体１１の濃度をマイクログラム／ｍｌで示し、またｙ軸は分析した遊離ＩｇＥのパーセントとして結合したＩｇＥの量を総ＩｇＥの関数としてプロットして示す。
【図１０】図１０は実施例７に関するものであり、以下を示す：  ａ)ＩｇＥ Ｃε３−Ｃε４二量体のリボン様標本；この場合、２つの単体はＩｇＥ１およびＩｇＥ２を表示し、２つの抗体１１Ｆａｂ分子と相互作用する。Ａｓｎ３９４でのグリコシル化は球−および−棒のモデルとして示される；および  ｂ)９０度回転して上方から見下ろした図であり、ＦａｂフラグメントからＩｇＥに対する相互作用の主要部が重鎖により提供されることを示す。この図はＰｙＭＯＬプログラム(デラノサイエンティフィックＬＬＣ、サンカルロス、カリフォルニア、米国)により作製する。
【図１１】図１１は実施例７に関係し、ＩｇＥのＡｓｎ３９４位置でのグリコシル化を示す。
【図１２】図１２は実施例８に関係し、カニクイザルにおける抗体１１ ＩｇＧ１、抗体１１ ＩｇＧ２およびＥ４８の、１ｍｇ／ｋｇ(第１日)、３０ｍｇ／ｋｇ(第８日)、および１００ｍｇ／ｋｇ(第１６日および以降)の投与後の平均トキシコキネティクスのプロファイルを示す。誤差バーは標準偏差を表わす。ｙ軸は血清中抗体濃度であり、ｘ軸は第１回投与からの時間(日数)である。第１群(抗体１１ ＩｇＧ１)は黒丸で示し、第２群(抗体１１ ＩｇＧ２)は白抜き三角で示し、第３群(異なる抗ＩｇＥ分子Ｅ４８)は黒四角で示す。
【図１３】図１３は実施例８に関係し、抗体１１ ＩｇＧ１、抗体１１ ＩｇＧ２およびＥ４８(第１日１ｍｇ／ｋｇ；第８日３０ｍｇ／ｋｇ；および第１６日以降１００ｍｇ／ｋｇ)の週単位投与を受けたカニクイザルにおける平均遊離ＩｇＥプロファイルを示す。誤差バーは標準偏差を表わす。ｙ軸はＩｇＥ濃度(ｎｇ／ｍｌ)であり、ｘ軸は時間(日数)である。第１群(抗体１１ ＩｇＧ１)は黒丸で示し、第２群(抗体１１ ＩｇＧ２)は白抜き三角で示し、第３群(異なる抗ＩｇＥ分子Ｅ４８)は黒四角で示す。
【図１４】図１４は実施例８に関係し、第１群(抗体１１処置群)の動物からの血漿濃度に対する２回の前投与平均からのパーセントの変化として表わされる血小板数(×１０９／Ｌ)のプロットを示す。このプロットは血小板に有意な影響を示さなかった３群中の他の１６匹の動物について表示したものである。ｘ軸は時間(時間)を示し、左ｙ軸は前処置平均レベルからのパーセント変化として血小板のレベルを示し、左ｙ軸は抗ＩｇＥ抗体の濃度をｎｍｏｌ／Ｌで示す。黒四角は血小板濃度を示し、黒菱形は抗ＩｇＥ抗体の濃度を示す。黒三角は抗ＩｇＥ抗体の投与量をｍｇ／ｋｇで示す。
【図１５】図１５は実施例８に関係し、２９日目の血小板数に一過性の有意な減少(基線下３５％)を示す第１群(抗体１１ ＩｇＧ１処置群)の動物からの血漿濃度に対する２回の前投与平均からのパーセントの変化として表わされる血小板数(×１０９／Ｌ)のプロットを示す。ｘ軸は時間(時間)を示し、左ｙ軸は事前処置平均レベルからのパーセント変化として血小板のレベルを示し、左ｙ軸は抗ＩｇＥ抗体の濃度をｎｍｏｌ／Ｌで示す。黒四角は血小板濃度を示し、黒菱形は抗ＩｇＥ抗体の濃度を示す。黒三角は抗ＩｇＥ抗体の投与量をｍｇ／ｋｇで示す。
【図１６】図１６は実施例９に関係し、ＩｇＥ／ＦｃｅＲＩ−仲介細胞毒性の抗体１１による阻害を示す。ｘ軸は抗体１１のモル濃度であり、ｙ軸はパーセント細胞毒性である。グラフ中の白抜き三角および黒丸はＭｏｖ１８ ＩｇＥの実験に関わり、その場合の白抜き三角はイソ型対照であり、黒丸は抗体１１である；また太線白抜き三角(グラフの左側の点の下に隠れている)と白抜き丸はＮＩＰ ＩｇＥ対照に関わり、その場合の白抜き太線三角はイソ型対照であり、白抜き丸は抗体１１である。
【図１７】図１７は実施例９に関係し、ＩｇＥ／ＣＤ２３−仲介食作用の抗体１１による阻害を示す。ｘ軸は抗体１１のモル濃度であり、ｙ軸はパーセント食作用である。グラフ中の三角および黒丸はＭｏｖ１８ ＩｇＥの実験に関わり、その場合の白抜き三角はイソ型対照であり、黒丸は抗体１１である；また、グラフにおいて、太線白抜き三角と白抜き丸はＮＩＰ ＩｇＥ対照に関わり、その場合の白抜き太線三角はイソ型対照であり、白抜き丸は抗体１１である。
【実施例】
【０２２４】
線維状ファージＭ１３に基づくファージミドベクターにクローン化したナイーブ・ヒト一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)ファージディスプレイライブラリーを選択に使用した[６９、７０]。
抗ＩｇＥ特異的ｓｃＦｖ抗体は、組換えヒトＩｇＥ上、一連の選択サイクルを用いてファージディスプレイライブラリーから単離する。
選択されたｓｃＦｖ抗体はヒトＩｇＥに対する結合のために、および／または効力について最適化し、ＩｇＧ抗体として再構成する。
【０２２５】
配列
例示としての本発明結合要素は、添付の配列表に示す；そこでの配列番号は下記表３ａに示すものに対応する；表中、
ｉ)抗体番号が例えば、８ＧＬのようにＧＬに付されている場合、これは抗体において１つ以上の残基が生殖系列形状に逆突然変異している場合の抗体をいう；一般に、ＧＬが使用される場合、認知し得る活性の喪失なしに生殖系列に逆突然変異し得るすべての非生殖系列残基が生殖系列化している；そして
ii)抗体番号が例えば、１１ＰＧＬのようにＰＧＬに付されている場合、これは抗体において１つ以上の残基が生殖系列形状に逆突然変異している場合の抗体をいう；一般に、ＰＧＬが使用される場合、ＧＬを超える残基が生殖系列に逆突然変異しているが、結果として非生殖系列以上の活性の一部喪失に至る。
【０２２６】
【表１】
2010518815.tif 000002
【表２】
2010518815.tif 000003
【表３】
2010518815.tif 000004
【表４】
2010518815.tif 000005
【表５】
2010518815.tif 000006
【表６】
2010518815.tif 000007
【表７】
2010518815.tif 000008
【表８】
2010518815.tif 000009
【表９】
2010518815.tif 000010
【表１０】
2010518815.tif 000011
【表１１】
2010518815.tif 000012
【０２２７】
仮出願(米国仮特許出願番号６０／９０１３０４)と共に提出した配列表において、ＶＬ ＤＮＡおよび対応するＶＬアミノ酸についてのヌクレオチドとアミノ酸配列に示された３’ｇｇｔコドンの配列、および対応するグリシン残基が、この抗体の発現されたｓｃＦｖおよびＩｇＧ配列に含まれていた。この配列のＣ末端グリシン残基はＫａｂａｔ残基１０８に相当する。この末端グリシンは該ＶＬ配列の一部ではなく、表３ａに列記された配列から除去されている。該仮出願からのＶＬ ＤＮＡとアミノ酸の配列は、配列表に包含されており、以下の表３ｂに列記されている。この残基の起源とそのコードする三連ｇｇｔについて以下に説明する。
【０２２８】
ＩｇＧの軽鎖を発現するために、抗体軽鎖をコードするヌクレオチド配列、すなわち、ＶＬドメインをコードする第一のエキソン、ＣＬドメインをコードする第二のエキソン、および第一エキソンと第二エキソンとを隔てるイントロンを含んでなる配列を準備した。通常の状況下で、イントロンを細胞性ｍＲＮＡプロセシング機構で切り出し、第一エキソンの３’末端を第二エキソンの５’末端に結合する。従って、当該ヌクレオチド配列をもつＤＮＡがＲＮＡとして発現された場合には、第一と第二のエキソンが共にスプライスされた。スプライスされたＲＮＡの翻訳は、ＶＬドメインとＣＬドメインを含んでなるポリペプチドを産生する。スプライシングの後、Ｋａｂａｔ残基１０８のＧｌｙはＶＬドメイン枠組み４配列の最後の塩基(ｇ)およびＣＬドメインの最初の２つの塩基(ｇｔ)によりコードされる。
【０２２９】
それ故、Ｋａｂａｔ残基１０８のグリシン残基は、仮出願中のＶＬ配列の配列表に含まれているが、上記のように、抗体分子のＶＬドメインのＣ末端残基であると考えるべきではなく、従って、表３ａの配列表から削除されている。
【０２３０】
【表１２】
2010518815.tif 000013
【表１３】
2010518815.tif 000014
【０２３１】
仮出願の配列表において、抗体２９〜３４として列記されている配列は、抗体８ＧＬ、８ＰＧＬ、１１ＧＬおよび１１ＰＧＬとして表３ａに掲載されている。これら抗体の一部は共通のＶＬドメインを共有し、結果として、該仮出願に示されている配列表の一部の配列番号は空欄となっている。該抗体の間違いのない組成は以下のとおりである：
抗体２９は８ＧＬ ＶＨドメインに対応する。
抗体３０は８ＰＧＬ ＶＨドメインに対応する。
抗体３１は８ＧＬと８ＰＧＬが共有するＶＨドメインに対応する。
抗体３２は１１ＧＬ ＶＨドメインに対応する。
抗体３３は１１ＰＧＬ ＶＨドメインに対応する。
抗体３４は１１ＧＬと１１ＰＧＬが共有するＶＬドメインに対応する。
配列番号：２８６、２９２、２９３、３０４、３１０および３１１は空欄である。これは表３ａで補正されている。
【０２３２】
ここで本発明を以下の非制限実施例により例示する。
【０２３３】
実施例１
先導単離
１.１  選択
線維状ファージＭ１３に基づくファージミドベクターにクローン化したナイーブ・ヒト一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)ファージディスプレイライブラリーを選択に使用した(Vaughan et al., Nature Biotechnology 14: 309-314 (1996), Hutchings, Antibody Engineering, R.Kontermann and S. Dubel, Editors. 2001, Springer Laboratory Manuals, Berlin. P93)。抗ＩｇＥ特異的ｓｃＦｖ抗体は、血漿精製ヒトＩｇＥκ(カルビオケム)または血漿精製ヒトＩｇＥλ(バイオデザイン)上、ボーガンら(Vaughan et al., Nature Biotechnology 14: 309-314 (1996))が以前に記載しているように、一連の選択サイクルを用いてファージディスプレイライブラリーから単離した。簡単に説明すると、パンニング選択のために、ＰＢＳ(ダルベッコＰＢＳ、ｐＨ７.４)中、ヒトＩｇＥをマキシソープ(Maxisorp)マイクロタイタープレート(ヌンク)のウェルに一夜、４℃で吸着させた。ウェルをＰＢＳで洗い、次いでＰＢＳ−マーベル(Marvel)(３％ｗ／ｖ)で１時間ブロックした。ＰＢＳ−マーベル(３％ｗ／ｖ)中の精製ファージをウェルに加え、被覆抗原を１時間結合させた。未結合ファージをＰＢＳ−トゥイーン(０.１％ｖ／ｖ)およびＰＢＳを用いて一連の洗浄サイクルにより除去した。結合したファージ粒子を溶出し、バクテリアに感染させ、次回選択のために回収した(Vaughan et al., Nature Biotechnology 14: 309-314 (1996))。交互に行う選択は、ＩｇＥのカッパおよびラムダ型を用いて実施した。
【０２３４】
１.２  未精製ｓｃＦｖによるＦｃεＲＩへのＩｇＥ結合の阻害
二回目の選択からの代表的数の個々のｓｃＦｖを９６穴プレート中で増殖させた。ｓｃＦｖはバクテリア周辺細胞質にて発現させ、均一ＦＲＥＴ(蛍光共鳴エネルギー転移)に基づくヒトＩｇＥ／ヒトＦｃεＲＩ−結合アッセイにより、それらの阻害活性につき選抜した。このアッセイにおいて、サンプルはユーロピウムキレート(パーキン・エルマー１２４４−３０２)で標識したヒトＩｇＥ(カルビオケム４０１１５２)に対しての結合と、ヒトＦｃεＲＩ−Ｆｃ(自家生産ＮＳＯ細胞)とで競合させた。詳細なアッセイ法は材料と方法の項で提供する。
【０２３５】
１.３  精製ｓｃＦｖによるＦｃεＲＩへのＩｇＥ結合の阻害
未精製周辺細胞質としてＩｇＥ：ＦｃεＲＩ相互作用に対して有意な阻害作用を示したＳｃＦｖをＤＮＡ配列決定に付した(Vaughan et al. 1996, Nature Biotechnology 14: 309-314；Osbourn 1996;Immunotechnology. 2, 181-196)。ユニークｓｃＦｖは再度バクテリアで発現させ、文献(Bannister et al (2006) Biotechnology and bioengineering, 94. 931-937)記載のようにアフィニティクロマトグラフィーにより精製した。これらのサンプルの効力は、ＦｃεＲＩ(自家生産ＮＳＯ細胞)に対する精製標品の希釈系列を、ユーロピウムキレート(パーキン・エルマー１２４４−３０２)で標識したヒトＩｇＥ(カルビオケム４０１１５２)と競合させることにより定量した。精製ｓｃＦｖ標品、例えば、抗体１は、ＩｇＥ−ＦｃεＲＩ相互作用を阻害し得た。詳細なプロトコールは材料と方法の項で提供する。
【０２３６】
１.４  ｓｃＦｖからＩｇＧ１への再フォーマット化
クローンはＶＨおよびＶＬドメインを全抗体重鎖および軽鎖をそれぞれ発現するベクターにサブクローニングすることにより、ｓｃＦｖからＩｇＧフォーマットに変換した。該ＶＨドメインはヒト重鎖定常ドメインと調節要素を含むベクター(ｐＥＵ１５.１またはｐＥＵ９.２)にクローン化した。同様に、哺乳動物細胞において全ＩｇＧ軽鎖を発現するために、ＶＬドメインをヒトカッパ軽鎖発現用のベクターｐＥＵ３.４またはヒトラムダ軽鎖定常ドメイン発現用のベクターｐＥＵ４.４に、調節要素と共にクローン化した。重鎖および軽鎖の発現用ベクターについては、ペルシックら(Persic, L., et al. (1997) Gene 187, 9-18)が初めて記載した。ケンブリッジ・アンチボディ・テクノロジーのベクターはＥＢＶオリップ(OriP)要素を含めて作製させたものである；この要素はＥＢＮＡ１タンパク質との組合せで、プラスミドのエピソーム複製を可能とする。ＩｇＧを得るために、重鎖および軽鎖ＩｇＧ発現ベクターをＥＢＮＡ−ＨＥＫ２９３哺乳動物細胞に形質移入した。ＩｇＧを発現させ、培地中に分泌させた。収穫物はプールして、精製前に濾過した。ＩｇＧはプロテインＡクロマトグラフィーにより精製した。培養上清をセラミックプロテインＡカラム(バイオセプラ(BioSepra))に負荷し、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ(ｐＨ８.０)、２５０ｍＭ−ＮａＣｌで洗った。結合したＩｇＧを０.１Ｍクエン酸ナトリウム(ｐＨ３.０)でカラムから溶出し、トリス−ＨＣｌ(ｐＨ９.０)を添加して中和した。溶出した物質はナップ(Nap)カラム(アマーシャム、＃１７−０８５４−０２)を用いて、ＰＢＳにバッファー交換し、ＩｇＧの濃度をＩｇＧのアミノ酸配列に基づく吸光係数を用いて分光光度法により定量した(Mach et al Anal. Biochem. 200(1): 20-26, 1992)。精製したＩｇＧは、ＳＥＣ−ＨＰＬＣを用い、またＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、凝集または分解について分析した。
【０２３７】
１.５  精製ｓｃＦｖおよびＩｇＧによるＲＢＬ−ＥＲ５１細胞におけるカルシウムシグナリングの阻害
ＦｃεＲＩを介して仲介されるヒトＩｇＥ生物活性に対する精製ｓｃＦｖとＩｇＧ標品の中和力を、ＲＢＬ−ＥＲ５１カルシウムシグナリングアッセイにより評価した。ＲＢＬ−２Ｈ３細胞(ラット好塩基球細胞株)にヒトＦｃεＲＩを安定に形質移入した(ＲＢＬ−ＥＲ５１細胞)。該細胞近傍の遊離のＩｇＥは細胞表面のＦｃεＲＩに結合し、引続く受容体結合ＩｇＥの架橋がカルシウムの可動化に導き、その可動化は蛍光測定画像プレートリーダー(ＦＬＩＰＲ)により検出可能である。プロトコールの詳細な説明は材料と方法の項で用意する。
【０２３８】
抗体１の精製ｓｃＦｖ標品は、ＲＢＬ−ＥＲ５１細胞のＩｇＥ誘発カルシウムシグナリングを、試験した最大濃度で阻害することができた。精製ＩｇＧとして試験した場合、抗体１のＩＣ５０は３４ｎＭと計算された。
【０２３９】
１.６  デルフィア(DELFIA；登録商標)エピトープ競合アッセイにおける抗体の選択性と種交差反応性
ＩｇＥおよび構造的に関連する分子：ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＧに対する抗体の種交差反応性および選択性は、デルフィア(DELFIA；登録商標)エピトープ競合アッセイを用いて確立した。本アッセイでは、各固定化抗ＩｇＥ抗体に結合するビオチン化ＩｇＥ(精製した血漿、バイオデザイン・インターナショナル)の阻害を測定することにより、相対的交差反応性を決定した。
【０２４０】
精製したＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＧ(すべてカルビオケム)の滴定は、各アッセイにおいて、各構造的に関連するタンパク質について特異性プロファイルを確立するために、このアッセイにおいてＩＣ５０値が測定されるのと同様に、試験した。
【０２４１】
カニクイザルＩｇＥ Ｃε３−Ｃε４ドメイン(自家誘導ＨＥＫ−ＥＢＮＡ)、ヒトＩｇＥ Ｃε３−Ｃε４ドメイン(自家誘導ＨＥＫ−ＥＢＮＡ)およびヒトＩｇＥラムダ(バイオデザイン・インターナショナル)を含むＩｇＥ種の滴定は、各アッセイにおいて、該抗体の種交差反応性を確立するために試験した。全長ヒトＩｇＥλは、ヒトおよびカニクイザルＩｇＥ Ｃε３−Ｃε４ドメインと同様に、阻害曲線を生成した。構造的に関連するタンパク質のいずれにも阻害は観察されなかった。これらのデータは抗体１が、ヒトＩｇＥλ、ＩｇＥのＣε３−Ｃε４ドメインに結合し、カニクイザルＩｇＥに交差反応性であることを証明している。しかし、抗体１は最もＩｇＥに関連性のあるヒトタンパク質のいずれにも結合しない。プロトコールの詳細な説明は材料と方法の項で用意する。
【０２４２】
１.７  精製ＩｇＥによるＣＤ２３に対するＩｇＥ結合の阻害
ＩＭ９細胞(ヒトＢ細胞株)は基本的な条件下にＣＤ２３を発現するが、ＦｃεＲＩは発現しないことが示された。ＩｇＥはＩＭ９細胞の表面上、ＣＤ２３に結合する。ＣＤ２３に結合したＩｇＥは、次いで、抗ＩｇＥ−フィコエリスリン(カルタッグ)と結合させることができ、それをフローサイトメトリーにより検出し得る(ＦＡＣＳカリバー、ＢＤバイオサイエンス)。
【０２４３】
抗体はＩｇＥ／ＣＤ２３相互作用の阻害について評価した。この手法の詳細なプロトコールは材料と方法の項で用意する。簡単に説明すると、試験するＩｇＧの滴定液をＩｇＥと混合し、次いで、ＩＭ９細胞とインキュベートした。１時間のインキュベーションの後、細胞を洗浄し、結合したＩｇＥを抗ＩｇＥ−フィコエリスリン(カルタッグ)により検出した。抗体１は１６ｎＭのＩＣ５０(ｎ＝３)でＩｇＥ／ＣＤ２３相互作用を阻害した。
【０２４４】
１.８  ＦｃεＲＩ−結合ＩｇＥの架橋
抗体は、ＲＢＬ−ＥＲ５１カルシウムシグナリングアッセイにより、架橋ＦｃεＲＩ−結合ＩｇＥに対する有効性について評価した。材料と方法に記載したＲＢＬ−ＥＲ５１細胞にＩｇＥを負荷した。抗体はＩｇＥ−負荷細胞とインキュベートし、カルシウム応答を刺激するそれらの能力について評価した。抗体１は検出可能なカルシウム応答を誘発し得た。
【０２４５】
実施例２
抗体の最適化
２.１  標的化突然変異誘発による親クローンの最適化
抗体１は標的化突然変異誘発法を用いて、親和性に基づくファージディスプレイ選択により最適化した。標的化突然変異誘発法のために、先導クローンから誘導した大型のｓｃＦｖファージライブラリーを、文献(Clackson and Lowman 2004(A Practical Approach, 2004. Oxford University Press))に記載されているように、可変重鎖(ＶＨ)および軽鎖(ＶＬ)相補性決定領域３(ＣＤＲ３)のオリゴヌクレオチド指向突然変異誘発により創出した。
【０２４６】
ＩｇＥに対してより高い親和性をもつ変異体を選択するために、このライブラリーを親和性に基づくファージディスプレイ選択に付した。その結果は、これらがＦｃεＲＩに結合するＩｇＥに対し改善された阻害活性を示すべきことであった。その選択は実質的にすでに記載されているとおりに実施した(Thompson 1996; Journal of Molecular Biology. 256. 77-88)。簡単に説明すると、ｓｃＦｖファージ粒子を溶液中でビオチニル化ヒトＩｇＥλ(文献[Ikeyama et. al. 1986. Molecular Immunology 23 (2); p159-167]由来、自家改変Ｕ２６６)とインキュベートした。抗原に結合したｓｃＦｖ−ファージは、次いで、製造業者の推奨に従って、ストレプトアビジン被覆常磁性ビーズ(ダイナビーズ(Ｖ；登録商標)Ｍ２８０)上に捕捉した。次いで、選択したｓｃＦｖ−ファージ粒子をすでに記載されているように回収した(Vaughan et al., Nature Biotechnology 14: 309-314 (1996))；この選択工程はバイオ−ヒトＩｇＥ濃度を低下させながら繰り返した(５回の繰返しに、２５０ｎＭから２５ｐＭ)。
【０２４７】
５回の選択の完結後、ＶＨおよびＶＬランダム化ライブラリーを組換えて、そのクローンがランダムに対合した個々のランダム化ＶＨ配列とＶＬ配列を含む単一のライブラリーを形成した。次いで、すでに記載したように、バイオ−ヒトＩｇＥ濃度を低下させながら選択を続けた(さらに３回の繰返しに、１００ｐＭから１ｐＭ)。
【０２４８】
２.２  抗体−リガンド生化学アッセイによる標的化突然変異誘発から改変したクローンの同定
標的化突然変異誘発選択生産からのｓｃＦｖは、バクテリア周辺細胞質に発現されるが、これを抗ヒトＩｇＥ(抗体１；実施例１にて単離)に結合するユーロピウムクリプテート(ＣＩＳバイオインターナショナル６２ＥＵＳＰＥＡ)で標識したヒトＩｇＥ(文献[Ikeyama et. al. 1986. Molecular Immunology 23 (2); p159-167]由来Ｕ２６６)の阻害について、エピトープ競合ＨＴＲＦ(登録商標)(均一時間分解蛍光)アッセイフォーマットにより選抜した。詳細なアッセイ法は、材料と方法の項で用意する。有意な阻害作用を示したＳｃＦｖは、ＤＮＡ配列決定に付し、ユニークｓｃＦｖは精製標品として調製した。
【０２４９】
２.３  精製ｓｃＦｖによるＦｃεＲＩに結合するＩｇＥの阻害
ｓｃＦｖは、ヒトＦｃεＲＩ−Ｆｃ(自家製造ＮＳＯ細胞)に結合するユーロピウムクリプテート(ＣＩＳバイオインターナショナル６２ＥＵＳＰＥＡ)で標識したヒトＩｇＥ(文献[Ikeyama et. al. 1986. Molecular Immunology 23 (2); p159-167]由来Ｕ２６６)またはカニクイザルＩｇＥ(組換え；材料と方法の項参照)の阻害について、受容体−リガンド結合ＨＴＲＦ(登録商標)(均一時間分解蛍光)アッセイフォーマットにより試験した。ｓｃＦｖの例示効力のデータを表２ａに示す。
【０２５０】
【表１４】
2010518815.tif 000015
【０２５１】
２.４  精製ＩｇＧによるＲＢＬ−ＥＲ５１細胞でのカルシウムシグナリングの阻害
ＩｇＧとして再構成した後、最適化クローンの効力は、ＲＢＬ−ＥＲ５１カルシウムシグナリングアッセイにより定量した。このアッセイはより強力な抗体の検出に対する感受性を改善するために、単離に導く際に使用される方法から改作した。このプロトコールの詳細な記載は、材料と方法の項に用意する。ヒトおよびカニクイザルのＩｇＥに対するＩＣ５０効力データを表２ｂに示す。
【０２５２】
【表１５】
2010518815.tif 000016
【０２５３】
２.５  生殖系列化
最適化抗ＩｇＥ抗体のＶＨおよびＶＬドメインのアミノ酸配列は、ＶＢＡＳＥデータベースにおける既知のヒト生殖系列配列に直線配列させ(Tomlinson 1997; Journal of Molecular biology. 224. 487-499)、最も類似する生殖系列を配列類似性により同定した。抗体１系列のＶＨドメインの場合、このものはＶｈ１ ＤＰ−３(１−ｆ)であった。ＶＬドメインでは、Ｖλ１ ＤＰＬ８(１ｅ)であった。
【０２５４】
未変化のままに残っているバーニア残基(Foote & Winter 1992)を考慮せずに、抗体１のＶＨドメインの枠組みにおいては生殖系列から１０ヶ所の変化が、またＶＬドメインからは２ヶ所の変化があった。ＶＨドメイン中の変化の内の５ヶ所およびＶＬドメインの両方の変化を、ヒト抗体に同一調和するように最も近い生殖系列配列に復帰させた。ＶＨドメインのＫａｂａｔ番号１、２０、８２ａ、８３および８９の変化は、効力を維持するために未変化のままとした(抗体８ＧＬおよび抗体１１ＧＬ)。これらのアミノ酸残基の生殖系列化は、適切な変異原性プライマーによる標準的部位指向突然変異誘発法を用いて実施した。次いで、生殖系列ＩｇＧを再評価し、親和性または効力に減少のないことを確認した。生殖系列化(ＧＬ)抗体についての親和性と効力の例を表４に示す。
【０２５５】
【表１６】
2010518815.tif 000017
【０２５６】
２.６  精製ＩｇＧによるＣＤ２３へ結合するＩｇＥの阻害
一部の最適化抗体は、すでに記載したＩＭ９結合アッセイを用い、ＩｇＥ／ＣＤ２３相互作用の阻害について評価した。このシステムで試験した抗体はＩｇＥ／ＣＤ２３相互作用を阻害することが見出された。抗体８と抗体１１についてのＩＣ５０値は、それぞれ１６.５ｎＭおよび２３ｎＭであった。
【０２５７】
２.７  ＦｃεＲＩ−結合ＩｇＥの架橋
一部の最適化抗体は、ＲＢＬ−ＥＲ５１カルシウムシグナリングアッセイにより、ＦｃεＲＩ−結合ＩｇＥを架橋する可能性について評価した。方法と材料の項に記載したＲＢＬ−ＥＲ５１細胞には、最大値までＩｇＥが負荷していた。最適化した抗体はＩｇＥ−負荷細胞とインキュベートし、カルシウム応答を刺激するそれらの能力について評価した。シグナル伝達は検出できなかった(図１)。
【０２５８】
２.８  デルフィア(DELFIA；登録商標)エピトープ競合アッセイにおける最適化抗体の選択性と種交差反応性
先導抗体の選択性と種交差反応性は、すでに記載されているように、デルフィア(DELFIA；登録商標)エピトープ競合アッセイにより再評価した(１.６の項および材料と方法の項参照)。
精製したＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＧ(すべてカルビオケム)の滴定液を各アッセイ法により、該アッセイにおいてＩＣ５０値により測定したように、構造的に関連する各タンパク質の特異性プロファイルを確立するために試験した。
【０２５９】
ヒトＩｇＥλ(誘導Ｕ２６６)、ヒトＩｇＥκ(カルビオケム)、カニクイザルＩｇＥ Ｃε３−Ｃε４ドメイン(自家誘導ＨＥＫ−ＥＢＮＡ)およびヒトＩｇＥ Ｃε３−Ｃε４ドメイン(自家誘導ＨＥＫ−ＥＢＮＡ)を含むＩｇＥ種の滴定液を、該抗体の種交差反応性を確立するために、各アッセイ法において試験した。全長ヒトＩｇＥλおよびκについて、ヒトおよびカニクイザルＩｇＥ Ｃε３−Ｃε４ドメインと共に、阻害曲線を作製した。各構造的に関連するヒトタンパク質(ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＧ)のいずれについても阻害は観察されなかった。これらのデータは、一団の試験した抗体がヒトＩｇＥλおよびκ、ヒトＩｇＥのＣε３−Ｃε４ドメインに結合し、カニクイザルＩｇＥに交差反応性であることを証明している。しかし、これらの抗体はＩｇＥに関連する殆どのタンパク質に結合しない。
【０２６０】
２.９  ＢＩＡコアを用いる最適化クローンについての親和性データの結合親和性計算
代表的数のクローンの精製したＩｇＧサンプルのヒトおよびカニクイザルＩｇＥに対する結合親和性は、実質的に文献(Karlsson et al 1991; Journal of Immunological Methods 145 (1-2) 229-240)に記載されているとおりに、ＢＩＡコア２０００バイオセンサーを使用する表面プラズモン共鳴により定量した。簡単に説明すると、プロテインＧ’(シグマアルドリッチ、Ｐ４６８９)を製造業者の指示(ＢＩＡコア)に従って、標準的アミンカップリング試薬を用いてＣＭ５センサーチップの表面に共有カップル結合させた。このプロテインＧ’表面を用いて、精製した抗ＩｇＥ抗体をそのＦｃドメインを介して捕捉し、表面密度５０ＲＵとした。ＨＢＳ−ＥＰバッファー(ＢＩＡコアＡＢ)中で調製したヒトＩｇＥλまたはカニクイザルＩｇＥを、１２５ｎＭおよび７.６ｎＭの間の濃度範囲で、センサーチップ表面上を通過させた。その表面は各抗体注入間に、１０ｍＭグリシン(ｐＨ１.７５)で再生させた。得られるセンサー図について、ＢＩＡ評価３.１ソフトウェアを用いて評価し、二価被検体モデルに適合させ、相対的結合データを得た。試験したＩｇＧに対する親和性の例を表２ａおよび表４に示す。
【０２６１】
材料と方法  −  実施例１および２
未精製ｓｃＦｖによるＦｃεＲＩに対するＩｇＥ結合の阻害
選択結果は、ヒトＦｃεＲＩ−Ｆｃ(自家製造ＮＳＯ細胞)に結合するユーロピウムキレート(パーキン・エルマー１２４４−３０２)で標識したヒトＩｇＥ(カルビオケム４０１１５２)の阻害について、受容体−リガンド結合均一ＦＲＥＴ(蛍光共鳴エネルギー転移)に基づくアッセイフォーマットにより試験した。
【０２６２】
先導する単離に際しての結果は、５０ｍＭ−ＭＯＰＳバッファー(ｐＨ７.４)、０.５ｍＭ−ＥＤＴＡおよび０.５Ｍソルビトール中で調製した、未精製ｓｃＦｖを含む未希釈周辺細胞質抽出液として選抜した。
【０２６３】
未精製ｓｃＦｖサンプルを３８４穴アッセイプレート(パーキン・エルマー６００６２８０)に加えた。次いで、これに１５μｌの１１ｎＭヒトＦｃεＲＩ−Ｆｃ(ＭＷ２６０ｋＤａに基づく)、１５μｌの４０ｎＭ抗ヒトＦｃ ＩｇＧ(ＸＬ６６５で標識；ＣＩＳバイオインターナショナル、６１ＨＦＣＸＬＡ)およびさらに１５μｌの０.７５ｎＭユーロピウム標識ヒトＩｇＥを加えた。非特異的対照の結合は３００ｎＭヒトＩｇＥ(カルビオケム)により規定した。希釈はすべて２５０ｍＭ塩化ナトリウムと０.０５％トゥイーン２０を含む５０ｍＭトリス−ＨＣｌ(ｐＨ７.８)(アッセイバッファー)にて実施した。
【０２６４】
次いで、アッセイプレートを室温で１.５時間インキュベートし、次いで、ビクター２プレートリーダー(パーキンエルマー)を用い、６１５ｎｍおよび６６５ｎｍの発光波長で時間分解蛍光を連続的に読み取った。
【０２６５】
データはビクター２ソフトウェアで正規化し、１秒あたりのカウント(ＣＰＳ)を計算した。引続き、ＣＰＳ値は方程式１に記載するように、％特異的結合を計算するために使用した。
方程式１：
【数１】
2010518815.tif 000018
【０２６６】
精製ｓｃＦｖによるＦｃεＲＩに結合するＩｇＥの阻害
スクリーニングにより同定し、陽性クローンから精製したｓｃＦｖは、ヒトＦｃεＲＩ−Ｆｃ(自家製造ＮＳＯ細胞)に結合するユーロピウムキレート(パーキン・エルマー１２４４−３０２)で標識したヒトＩｇＥ(カルビオケム４０１１５２)の阻害について、受容体−リガンド結合均一ＦＲＥＴ(蛍光共鳴エネルギー転移)に基づくアッセイフォーマットにより試験した。
【０２６７】
このアッセイ法におけるＩＣ５０値により測定した場合のｓｃＦｖの効力を確立するために、ｓｃＦｖ濃度の滴定を使用した。精製ｓｃＦｖサンプルの滴定液１５μｌを３８４穴アッセイプレート(パーキン・エルマー６００６２８０)に加えた。次いで、これに１５μｌの１１ｎＭヒトＦｃεＲＩ−Ｆｃ(ＭＷ２６０ｋＤａに基づく)、１５μｌの４０ｎＭ抗ヒトＦｃ ＩｇＧ(ＸＬ６６５で標識；ＣＩＳバイオインターナショナル、６１ＨＦＣＸＬＡ)およびさらに１５μｌの０.７５ｎＭユーロピウム標識ヒトＩｇＥを加えた。非特異的対照の結合は３００ｎＭヒトＩｇＥ(カルビオケム)により定義した。希釈はすべて２５０ｍＭ塩化ナトリウムと０.０５％トゥイーン２０を含む５０ｍＭトリス−ＨＣｌ(ｐＨ７.８)(アッセイバッファー)にて実施した。
【０２６８】
次いで、アッセイプレートを室温で１.５時間インキュベートし、次いで、ビクター２プレートリーダー(パーキンエルマー)を用い、６１５ｎｍおよび６６５ｎｍの発光波長で時間分解蛍光を連続的に読み取った。
【０２６９】
データはビクター２ソフトウェアで正規化し、１秒あたりのカウント(ＣＰＳ)を計算した。引続き、ＣＰＳ値は方程式１に記載するように、％特異的結合を計算するために使用した。
方程式１：
【数２】
2010518815.tif 000019
【０２７０】
ＩＣ５０値は４−パラメーターロジスティック方程式(方程式２)を用いて適合する曲線により、グラフパッド・プリズム・ソフトウェアを用いて定量した。
方程式２：
【数３】
2010518815.tif 000020
式中：
Ｘは濃度の対数である。Ｙは特異的結合である。
Ｙは底部で始まり、シグモイド形状で頂部に向かう。
【０２７１】
ヒトＦｃεＲＩ(ＲＢＬ−ＥＲ５１細胞)で安定に形質移入したＲＢＬ−２Ｈ３細胞における精製ｓｃＦｖによるカルシウムシグナリングの阻害
ＦｃεＲＩを介して仲介されるヒトＩｇＥ生物活性に対する精製ｓｃＦｖとＩｇＧ標品の中和効力はＲＢＬ−ＥＲ５１カルシウムシグナリングアッセイにより評価した。ヒトＦｃεＲＩはヒト末梢血リンパ球からｐｃＤＮＡ３.１ベクターにクローン化し、標準的エレクトロポレーション法により、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞(ラット好塩基性細胞株)に形質移入した。形質移入した細胞は限界希釈によりクローン化し、表面ＦｃεＲＩ発現について分析した。得られたＲＢＬ−ＥＲ５１細胞は安定な受容体発現を維持するために、Ｇ４１８(インビトロゲン１０１３１−０２７)を含む培地に維持した。細胞近傍の遊離ＩｇＥはＦｃεＲＩに結合し、引続く受容体結合ＩｇＥの架橋がカルシウム移動につながる；それを蛍光測定画像プレートリーダー(ＦＬＩＰＲ)により検出することができる。
【０２７２】
ＲＢＬ−ＥＲ５１細胞を５×１０４／１００μｌ／ウェルとして、９６穴黒壁平底組織培養処理したプレート(コースター)中の培地[９％ｖ／ｖ非加熱不活化ＦＢＳ(インビトロゲン１０１００−１４７)および４００ｕｇ／ｍＬのＧ４１８(インビトロゲン１０１３１−０２７)を含むＤＭＥＭ(インビトロゲン４１９６６)]に播種し、５％ＣＯ２下、３７℃で１８〜２４時間インキュベートした。この時点後、培地を吸引除去して、未処理細胞単層を残し、５％ＣＯ２下、３７℃で１〜２時間、１００ｕＬ／ウェルのＦＬＵＯ−４ＡＭ負荷バッファー[０.１％ＦＢＳ、２０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ、２.５ｍＭプロベニシドおよび２ｕｇ／ｍＬのＦＬＵＯ−４ＡＭ(テフ・ラボ)を含むＤＭＥＭ]と置き換えた。負荷バッファーを吸引除去し、細胞を２００ｕＬ／ウェルのＰＢＳで３回洗浄した。最終洗液を吸引除去し、７０ｕＬ／ウェルのＦＬＩＰＲバッファー[１２５ｍＭ−ＮａＣｌ２、５ｎＭ−ＫＣｌ、１ｍＭ−ＭｇＣｌ２、１.５ｍＭ−ＣａＣｌ２、３０ｍＭヘペス、２.５ｍＭプロベニシド、５ｍＭグルコース、０.０１％ｖ／ｖＦＣＳ]と置き換えたた。プレートは５％ＣＯ２下、３７℃で５〜４５分間インキュベートした。
【０２７３】
精製したｓｃＦｖまたはＩｇＧの試験溶液(二重測定)をＶ字底プレート(グライナー)中、ＦＬＩＰＲバッファーに所望濃度に希釈した。ＩｇＥに向けられたものではない無関係の抗体を陰性対照として使用した。ＩｇＥ(カルビオケムまたはＵ２６６由来[Ikeyama et. al. 1986. Molecular Immunology 23 (2); p159-167])をＦＬＩＰＲバッファー中で調製し、適切な試験抗体と混合して、総容量４０μｌ／ウェル中、ＩｇＥ最終濃度３.３３μｇ／ｍＬとした。本アッセイにて使用したＩｇＥ濃度は、最終アッセイ濃度が約８０％の最大カルシウム応答を与える用量として選択した。サンプルはすべて室温で３０分間インキュベートし、次いで、３０μｌのＩｇＥ／抗体混合物を先に調製した色素負荷細胞に移した。アッセイプレートを３７℃で１０分間インキュベートし、遊離のＩｇＥをＲＢＬ−ＥＲ５１細胞に結合させた。
【０２７４】
架橋する抗ＩｇＥの添加後のカルシウムの可動を測定するために、ＦＬＩＰＲ(モレキュラーディバイス)を製造業者の指示に従って、適切な接触に向け検証した。ＦＬＩＰＲバッファーに希釈した抗ＩｇＥ(バイオソースＡＨＩ０５０１)をアッセイプレートに加え、最終濃度１０ｕｇ／ｍＬとした。ＦＬＵＯ−４ＡＭ色素の蛍光を１秒間隔で８０回測定し、次に、８秒の間隔で４０回測定した。各ウェルからのピーク応答をエクスポートし、次いで、グラフパッド・プリズム・ソフトウェアによりデータを解析した。
【０２７５】
ＲＢＬ−ＥＲ５１細胞における抗ＩｇＥ架橋化の測定
精製ＩｇＧがＦｃεＲＩ−結合ＩｇＥを架橋させる能力を測定するために、ＲＢＬ−ＥＲ５１細胞を調製し、阻害アッセイ法で記載したように色素負荷した。細胞は１００ｕＬの１ｕｇ／ｍＬヒトＩｇＥ(カルビオケムまたはＵ２６６−由来[Ikeyama et. al. 1986. Molecular Immunology 23 (2); p159-167])中、１０分間インキュベートし、ＦＬＩＰＲバッファーに希釈し、細胞表面上のＦｃεＲＩにＩｇＥを結合させた。本アッセイにて使用したＩｇＥ濃度は、約８０％の最大カルシウム応答を与える用量として選択した。架橋する抗ＩｇＥの添加後のカルシウムの可動を測定するために、ＦＬＩＰＲ(モレキュラーディバイス)を製造業者の指示に従って、適切な接触のために検証した。ＦＬＩＰＲバッファーに適切な濃度に希釈した試験抗体３０ｕＬをＩｇＥ負荷アッセイプレートに加えた。抗ＩｇＥ(バイオソースＡＨＩ０５０１)を陽性対照として用いた。ＦＬＵＯ−４ＡＭ色素(テフラボ)の蛍光を１秒間隔で８０回測定し、次に、８秒の間隔で４０回測定した。各ウェルからのピーク応答をエクスポートし、次いで、グラフパッド・プリズム・ソフトウェアによりデータを解析した。
【０２７６】
デルフィア(DELFIA；登録商標)エピトープ競合アッセイにおける抗体の選択性と種交差反応性
精製したＩｇＧを９６穴マキシソープマイクロタイタープレート(ヌンク)に、ビオチニル化ヒトＩｇＥを当該特定のＩｇＧについて大よそに推定されるＫＤで加えたときに、有意なシグナルを与える濃度で、ＰＢＳ中、吸着させた。過剰のＩｇＧはＰＢＳ−トゥイーン(０.１％ｖ／ｖ)で洗い流し、ウェルをＰＢＳ−マーベル(Marvel)(３％ｖ／ｖ)で１時間ブロックした。以下の競合体それぞれの希釈系列を、ビオチニル化ヒトＩｇＥとそれぞれのＩｇＧ間の相互作用のＫＤ値の約１０００倍の濃度で開始して、ＰＢＳ中で調製した；ヒトＩｇＥラムダ(Ｕ２６６−由来[Ikeyama et. al. 1986. Molecular Immunology 23 (2); p159-167])、ヒトＩｇＥカッパ(カルビオケム)、ヒトＩｇＥ Ｃε３−Ｃε４ドメイン(自家誘導ＨＥＫ−ＥＢＮＡ)、カニクイザルＩｇＥ Ｃε３−Ｃε４ドメイン(自家誘導ＨＥＫ−ＥＢＮＡ)、ヒトＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＤ(すべてカルビオケム)。この系列に、等容量の略ＫＤ濃度のビオチニル化ヒトＩｇＥを加えた(約１０００：１の競合体抗原：ビオチニル化ヒトＩｇＥの比で開始する系列とする)。次いで、これらの混合物をブロックしたＩｇＧに移し、１時間平衡化した。未結合抗原をＰＢＳ−トゥイーン(０.１％ｖ／ｖ)で洗浄除去し、一方、残りのビオチニル化ヒトＩｇＥは、ストレプトアビジン−ユーロピウム３＋接合体(デルフィア(DELFIA；登録商標)検出；パーキン・エルマー)により検出した。エンビジョン(EnVision)プレートリーダー(パーキン・エルマー)上、時間分解蛍光を６２０ｎｍで測定した。蛍光データはグラフ化プリズムまたはマイクロソフト(商標)エクセルソフトウェアにより解析した。
【０２７７】
抗体−リガンド生化学アッセイによる改善されたクローンの同定
選択結果は、抗ヒトＩｇＥ抗体(抗体１)に結合するユーロピウムクリプテート(ＣＩＳバイオインターナショナル６２ＥＵＳＰＥＡ)で標識したクリプテート標識ヒトＩｇＥ(Ｕ２６６由来[Ikeyama et. al. 1986. Molecular Immunology 23 (2); p159-167])の阻害について、エピトープ競合ＨＴＲＦ(登録商標)(均一時間分解蛍光)アッセイフォーマットにより選抜した。
【０２７８】
先導する単離に際しての選択結果は、５０ｍＭ−ＭＯＰＳバッファー(ｐＨ７.４)、０.５ｍＭ−ＥＤＴＡおよび０.５Ｍソルビトール中で調製した、未精製ｓｃＦｖを含む未希釈の、または希釈した周辺細胞質抽出液として選抜した。
【０２７９】
４ｎＭ抗ヒトＩｇＥ抗体を、ＸＬ６６５で標識した２０ｎＭ抗ヒトＦｃ ＩｇＧ(ＣＩＳバイオインターナショナル６１ＨＦＣＸＬＡ)と予め混合した。未精製ｓｃＦｖサンプル(１０μｌ)を３８４穴低容量アッセイプレート(コースター３６７６)に加えた。次いで、これに５μｌの抗ヒトＩｇＥ抗体  抗Ｆｃ−ＸＬ６６５混合物を加え、さらに５μｌのクリプテート標識ヒトＩｇＥの１／２４５希釈液(約２.３ｎＭクリプテート標識ヒトＩｇＥ)を加えた。非特異的対照結合は、３００ｎＭヒトＩｇＥ(Ｕ２６６由来[Ikeyama et. al. 1986. Molecular Immunology 23 (2); p159-167])を用いて定義した。すべての希釈は０.４Ｍフッ化カリウムおよび０.１％ＢＳＡを含むリン酸緩衝食塩水(ＰＢＳ)(アッセイバッファー)で実施した。
【０２８０】
次いで、アッセイプレートを１０００ｒｐｍ、室温で１分間遠心分離し、室温で３時間インキュベートし、その後、エンビジョンプレートリーダー(パーキン・エルマー)により６２０ｎｍおよび６６５ｎｍ発光波長での時間分解蛍光を読み取った。
【０２８１】
データは各サンプルについて％デルタＦ値を計算することにより解析した。デルタＦは方程式１に従って決定した。
方程式１：
【数４】
2010518815.tif 000021
【０２８２】
引き続き、％デルタＦ値を用いて、方程式２の記載のように％特異的結合を計算した。
方程式２：
【数５】
2010518815.tif 000022
【０２８３】
改善されたｓｃＦｖ(精製)によるＦｃεＲＩに結合するＩｇＥの阻害
精製したｓｃＦｖは、ヒトＦｃεＲＩ−Ｆｃ(自家製造ＮＳＯ細胞)に結合するユーロピウムクリプテート(ＣＩＳバイオインターナショナル６２ＥＵＳＰＥＡ)で標識したクリプテート標識ヒトＩｇＥ(Ｕ２６６由来[Ikeyama et. al. 1986. Molecular Immunology 23 (2); p159-167])またはカニクイザルＩｇＥ(組換え；材料と方法の項参照)の阻害について、受容体−リガンド結合ＨＴＲＦ(登録商標)(均一時間分解蛍光)アッセイフォーマットにより試験した。
【０２８４】
本アッセイにおいては、ＩＣ５０値により測定する場合、ｓｃＦｖの効力を確立するために、ｓｃＦｖ濃度の滴定を用いた。１.９ｎＭヒトＦｃεＲＩ−Ｆｃ(ＭＷ２６０ｋＤａに基づく)をＸＬ６６５(ＣＩＳバイオインターナショナル、６１ＨＦＣＸＬＡ)で標識した２０ｎＭ抗ヒトＦｃ ＩｇＧと予め混合した。精製したｓｃＦｖサンプルの滴定液(１０μｌ)を３８４穴低容量アッセイプレート(コースター３６７６)に加えた。次いで、これに５μｌのＦｃεＲＩ−Ｆｃ抗Ｆｃ−ＸＬ６６５混合物を加え、さらに５μｌのクリプテート標識ヒトまたはカニクイザルのＩｇＥの１／１９７希釈液(約２.９ｎＭクリプテート標識ヒトまたはカニクイザルＩｇＥ)を加えた。非特異的対照結合は、３００ｎＭヒトまたはカニクイザルＩｇＥ(自家誘導)を用いて定義した。すべての希釈は０.４Ｍフッ化カリウムおよび０.１％ＢＳＡを含むリン酸緩衝食塩水(ＰＢＳ)(アッセイバッファー)にて実施した。
【０２８５】
次いで、アッセイプレートを１０００ｒｐｍ、室温で１分間遠心分離し、室温で３時間インキュベートし、その後、エンビジョンプレートリーダー(パーキン・エルマー)により６２０ｎｍおよび６６５ｎｍ発光波長での時間分解蛍光を読み取った。
【０２８６】
データは各サンプルについて％デルタＦ値を計算することにより解析した。デルタＦは方程式１に従って決定した。
方程式１：
【数６】
2010518815.tif 000023
【０２８７】
引き続き、％デルタＦ値を用いて、方程式２の記載のように％特異的結合を計算した。
方程式２：
【数７】
2010518815.tif 000024
【０２８８】
ＩＣ５０値は４−パラメーターロジスティック方程式(方程式３)を用いて適合する曲線により、グラフパッド・プリズム・ソフトウェアを用いて定量した。
方程式３：
【数８】
2010518815.tif 000025
式中：
Ｘは濃度の対数である。Ｙは特異的結合である。
Ｙは底部で始まり、シグモイド形状で頂部に向かう。
【０２８９】
ＲＢＬ−ＥＲ５１カルシウムシグナリングアッセイにおける改良クローンの同定
改良抗体から精製したＩｇＧ標品の中和効力を、先導する単離について記載したＲＢＬ−ＥＲ５１カルシウムシグナリングアッセイの改良版により評価した。
【０２９０】
ＲＢＬ−ＥＲ５１細胞を５×１０４／１００ｕｌ／ウェルとして、９６穴黒壁平底組織培養処理したプレート(コースター)中の培地[９％ｖ／ｖ非加熱不活化ＦＢＳ(インビトロゲン１０１００−１４７)および４００ｕｇ／ｍＬのＧ４１８(インビトロゲン１０１３１−０２７)を含むＤＭＥＭ(インビトロゲン４１９６６)]に播種し、５％ＣＯ２下、３７℃で１８〜２４時間インキュベートした。この時点後、培地を吸引除去して、アッセイ培地[９％ｖ／ｖ非加熱不活化ＦＢＳ(インビトロゲン１０１００−１４７)、４００ｕｇ／ｍＬのＧ４１８(インビトロゲン１０１３１−０２７)および１.６％ペニシリン／ストレプトマイシン(インビトロゲン１５１４０−１２２)を含むＤＭＥＭ(インビトロゲン４１９６６)]中の試験抗体(６.６７ｎＭないし１.３３ｐＭ)の希釈液５０ｕＬ／ウェルと置き換え、アッセイ培地に希釈したＩｇＥ[ヒトＩｇＥ(Ｕ２６６由来[Ikeyama et. al. 1986. Molecular Immunology 23 (2); p159-167])またはカニクイザルＩｇＥ(組換え；材料と方法の項参照)]を加え、それぞれ２５ｍｇ／ｍＬおよび１００ｎｇ／ｍｌの最終ＩｇＥ濃度とした。アッセイプレートを５％ＣＯ２下、３７℃で４時間インキュベートした。
【０２９１】
この時点後、抗体／ＩｇＥ混合物を吸引除去して、未処理細胞単層を残し、５％ＣＯ２下、３７℃で１〜２時間、１００ｕＬ／ウェルのＦＬＵＯ−４ＡＭ負荷バッファー[０.１％ＦＢＳ、２０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ、２.５ｍＭプロベニシドおよび２ｕｇ／ｍＬのＦＬＵＯ−４ＡＭ(インビトロゲン)を含むＤＭＥＭ]と置き換えた。負荷バッファーを吸引除去し、細胞を２００ｕＬ／ウェルのＰＢＳで３回洗浄した。最終洗液を吸引除去し、１００ｕＬ／ウェルのＦＬＩＰＲバッファー[１２５ｍＭ−ＮａＣｌ２、５ｎＭ−ＫＣｌ、１ｍＭ−ＭｇＣｌ２、１.５ｍＭ−ＣａＣｌ２、３０ｍＭヘペス、２.５ｍＭプロベニシド、５ｍＭグルコース、０.０１％ｖ／ｖＦＣＳ]と置き換えた。プレートは５％ＣＯ２下、３７℃で５〜４５分間インキュベートした。
【０２９２】
架橋する抗ＩｇＥの添加後のカルシウムの可動を測定するために、ＦＬＩＰＲ(モレキュラーディバイス)を製造業者の指示に従って、適切な接触に向け検証した。ＦＬＩＰＲバッファーに希釈した抗ＩｇＥ(バイオソースＡＨＩ０５０１)をアッセイプレートに加え、最終濃度２.３ｕｇ／ｍＬ(ヒトＩｇＥを架橋させるため)または２０ｕｇ／ｍＬ(カニクイザルＩｇＥを架橋させるため)とした。ＦＬＵＯ−４ＡＭ色素の蛍光を１秒間隔で８０回測定し、次に、３秒の間隔で４０回測定した。各ウェルからのピーク応答をエクスポートし、次いで、グラフパッド・プリズム・ソフトウェアにより解析した。
【０２９３】
最適化抗体によるＦｃεＲＩ−結合ＩｇＥの架橋の測定
ＦｃεＲＩ−結合ＩｇＥを架橋する精製ＩｇＧの能力を測定するために、ＲＢＬ−ＥＲ５１細胞を、改良抗体の評価のための阻害アッセイにて記載したと同様に調製した。ＲＢＬ−ＥＲ５１細胞を５×１０４／１００ｕｌ／ウェルとして、９６穴黒壁平底組織培養処理したプレート(コースター)中の培地[９％ｖ／ｖ非加熱不活化ＦＢＳ(インビトロゲン１０１００−１４７)および４００ｕｇ／ｍＬのＧ４１８(インビトロゲン１０１３１−０２７)を含むＤＭＥＭ(インビトロゲン４１９６６)]に播種し、５％ＣＯ２下、３７℃で１８〜２４時間インキュベートした。この時点後、培地を吸引除去して、アッセイ培地[９％ｖ／ｖ非加熱不活化ＦＢＳ(インビトロゲン１０１００−１４７)、４００ｕｇ／ｍＬのＧ４１８(インビトロゲン１０１３１−０２７)および１.６％ペニシリン／ストレプトマイシン(インビトロゲン１５１４０−１２２)を含むＤＭＥＭ(インビトロゲン４１９６６)]中に１ｕｇ／ｍＬに希釈したヒトＩｇＥ(１００ｕＬ／ウェル)(Ｕ２６６誘導[Ikeyama et. al. 1986. Molecular Immunology 23 (2); p159-167])と置き換えた。ＩｇＥ濃度はＲＢＬ−ＥＲ５１細胞の最大負荷を生じるように選択した。アッセイプレートを５％ＣＯ２下、３７℃で４時間インキュベートした。
【０２９４】
この時点後、ＩｇＥ溶液を吸引除去して、未処理細胞単層を残し、５％ＣＯ２下、３７℃で１〜２時間、１００ｕＬ／ウェルのＦＬＵＯ−４ＡＭ負荷バッファー[０.１％ＦＢＳ、２０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ、２.５ｍＭプロベニシドおよび２ｕｇ／ｍＬのＦＬＵＯ−４ＡＭ(インビトロゲン)を含むＤＭＥＭ]と置き換えた。負荷バッファーを吸引除去し、細胞を２００ｕＬ／ウェルのＰＢＳで３回洗浄した。最終洗液を吸引除去し、１００ｕＬ／ウェルのＦＬＩＰＲバッファー[１２５ｍＭ−ＮａＣｌ２、５ｎＭ−ＫＣｌ、１ｍＭ−ＭｇＣｌ２、１.５ｍＭ−ＣａＣｌ２、３０ｍＭヘペス、２.５ｍＭプロベニシド、５ｍＭグルコース、０.０１％ｖ／ｖＦＣＳ]と置き換えた。プレートは５％ＣＯ２下、３７℃で５〜４５分間インキュベートした。
【０２９５】
架橋する抗ＩｇＥ(１.５３ｕＭないし２.３３ｎＭ)の添加後のカルシウムの可動を測定するために、ＦＬＩＰＲ(モレキュラーディバイス)を製造業者の指示に従って、適切な接触に向け検証した。ＦＬＩＰＲバッファーに適切な濃度に希釈した試験抗体(３０ｕＬ)をアッセイプレートに加えた。抗ＩｇＥ(バイオソースＡＨＩ０５０１)を陽性対照として使用した。ＦＬＵＯ−４ＡＭ色素(インビトロゲン)の蛍光を１秒間隔で８０回測定し、次に、３秒の間隔で４０回測定した。各ウェルからのピーク応答をエクスポートし、次いで、グラフパッド・プリズム・ソフトウェアによりデータを解析した。
【０２９６】
精製ＩｇＧによるＩＭ９細胞上のＣＤ２３に結合するＩｇＥの阻害
ＩＭ９細胞結合アッセイを用い、ＩｇＥ／ＣＤ２３相互作用の阻害につて抗体を評価した。ＩＭ９細胞(ヒトＢ細胞株)を標準的な組織培養手法により、培地[ＲＰＭＩ１６４０グルタマックス(インビトロゲン６１８７０−０１０)；９％加熱不活化ＦＢＳ(インビトロゲン１０１００−１４７]中に維持した。
【０２９７】
最適化ＩｇＧについて試験するために、ＩＭ９細胞を２５ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−４(ペプロテック、２００−０４)により、３７℃／５％ＣＯ２にて３日間、前処理し、ＣＤ２３の発現を上方制御した。ＩＭ９細胞を採取し、フローバッファー[１％ヤギ血清(シグマ)および０.１％ＢＳＡフラクションＶ(シグマ)を含むＰＢＳ]に１×１０６細胞／ｍＬで再懸濁した。Ｆｃ受容体の遮断は、Ｆｃフラグメント(ＴＥＢＵ−バイオ)を最終濃度５ｕｇ／ｍＬまで加えて実施した。この細胞懸濁液をＵ字底プロピレンプレート(グライナー)に１００ｕＬ／ウェルずつ塗布し、氷上３０分間インキュベートした。
【０２９８】
抗体希釈液(６６７ｎＭないし１ｎＭ)をＵ字底プロピレンプレート(グライナー)中で調製し、ＩｇＥ(Ｕ２６６誘導[Ikeyama et. al. 1986. Molecular Immunology 23 (2); p159-167])と混合して最終ＩｇＥ濃度１０ｕｇ／ｍＬとし、３０分間室温とした。細胞プレートを２０００ｒｐｍで２分間回転させ、上清を吸引除去し、未処理細胞ペレットを得た。細胞を１００ｕＬ／ウェルの抗体／ＩｇＥ混合物に再懸濁し、氷上で１時間インキュベートした。細胞プレートを２０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、抗体／ＩｇＥ上清を吸引除去した。細胞をフローバッファー２００ｕＬ／ウェルに再懸濁し、上記のように遠心分離することによって洗浄した。
【０２９９】
細胞表面に結合したＩｇＥは、１／３０(ｖ／ｖ)に希釈した抗ＩｇＥ−フィコエリシン(カルタッグ)１００ｕＬ／ウェルで検出した。アッセイプレートは氷上、暗所で２０分間インキュベートし、次いで、２０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上記のようにフローバッファー(２×２００ｕＬ)で洗った。細胞を１００ｕＬのセルフィックス(ＢＤバイオサイエンス)に再懸濁し、ＦＡＣＳカリバー(ＢＤバイオサイエンス)により分析し、ＦＬ２染色を検出した。
【０３００】
データをセルクエスト(CellQuest)ソフトウェア(ＢＤバイオサイエンス)にて解析した。ＦＬ２幾何平均蛍光をエクスポートし、次いで、マイクロソフトエクセルおよびグラフパッド・プリズム・ソフトウェアによりデータを解析した。
【０３０１】
ＦＬＡＧ Ｈｉｓ１０でＣ末端タグ標識したヒトＩｇＥ Ｃε３−４の生成
ヒトＩｇＥ Ｃε３−４のフラグメントは文献(Wurzburg et. al. (2000)；ヒトＩｇＥ Ｃε３−Ｃ４の構造は、抗体エフェクタードメインのコンホメーションの柔軟性を明らかにする)にすでに記載されたのと同じものであった。ヌクレオチド２１３５−２８６８を包含するｃＤＮＡフラグメント(ジェンバンク寄託番号Ｊ００２２２)は、ＩＬ１３刺激ヒトＰＢＭＣの全ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲにより増幅した。このＰＣＲ産物をｐＣＲ２.１ ＴＡ(インビトロゲン)にクローン化した。
【０３０２】
発現されたタンパク質の分泌を可能とし、枠組み内のＣ−末端ＦＬＡＧエピトープとポリヒスチジンタグ(Ｈｉｓ１０)を包含する配列を生成させるために、ＩｇＥ Ｃε３−４フラグメントを、５’ ＢｓｓＨII部位を組み込むプライマー、および３’ＦＬＡＧエピトープ、ポリヒスチジンタグ(Ｈｉｓ１０)およびＸｂａＩ部位を組み込むプライマーでＰＣＲ増幅し、次いで、ｐＥＵ８.２ベクターに挿入した。修飾したｐＥＵ８.２ベクターはＥＦ−１プロモーター、マウスＩｇＧ１リーダーペプチドのためのゲノム配列、ＥＢＮＡ−１遺伝子産物を発現する細胞株(ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞など)に形質移入したときにエピソームプラスミドの複製を可能とする複製のｏｒｉＰ起源を含む。
【０３０３】
タンパク質はＩＭＡＣクロマトグラフィーと、さらにサイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)を用いて、順化培地から精製した。
【０３０４】
ＦＬＡＧ Ｈｉｓ１０でＣ末端タグ標識したカニクイザルＩｇＥ Ｃε３−４の生成
カニクイザルＩｇＥ定常領域は、ヒトＩｇＨＥ(ＩｇＥの重鎖)遺伝子座(ジェンバンク寄託番号Ｊ００２２２)のヌクレオチド１１７４−２９８９を包含するプライマーを使用して、ゲノムＤＮＡから増幅したＰＣＲ産物を直接配列決定することにより決定した。そのエキソンはヒト配列との相同性により同定した；従って、カニクイザルＩｇＥ重鎖の定常領域のｃＤＮＡ配列を予知することが可能であった。
【０３０５】
マウスＩｇＧ１リーダーペプチドの配列、カニクイザルＣε３−４(図２)、およびＣ−末端ＦＬＡＧエピトープとポリヒスチジンタグをコードするｃＤＮＡを合成し、ｐＤＯＮＲ２２１(インビトロゲン)にクローン化した。次いで、ＬＲゲートウエイ(Gateway；登録商標)反応(インビトロゲン)を用いて、対象の遺伝子を発現ベクターｐＤＥＳＴ１２.２(インビトロゲン)に形質移入した；該ベクターは、ｐＣＥＰ４ベクター(インビトロゲン)からの複製のｏｒｉＰ起源を挿入し、ＥＢＮＡ−１遺伝子産物を発現する細胞株(ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞など)に形質移入することでエピソームプラスミド複製を可能とするように修飾した。
【０３０６】
タンパク質はＩＭＡＣクロマトグラフィーと、さらにサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、順化培地から精製した。
【０３０７】
キメラＤ１２可変領域とカニクイザルＩｇＥ定常領域の生成
ヒト抗エストラジオールｓｃＦｖ(Ｄ１２＿ＶＨ)をコードし、可変重鎖領域をコードするｃＤＮＡおよび２つの異なるハロタイプカニクイザルＩｇＨＥ遺伝子(ｃｙＩＧＨＥ ＴＱおよびｃｙＩＧＨＥ ＭＥ)のいずれか一方を合成し(ＤＮＡ２.０)、ｐＤＯＮＲ２２１(インビトロゲン)にクローン化した。また、可変軽鎖ヒト抗エストラジオールｓｃＦｖ(Ｄ１２＿ＶＬ)を提示するｃＤＮＡおよび２つのカニクイザル・ラムダ定常領域遺伝子(ｃｙＩＧＬＣ４およびｃｙＩＧＬＣ７)のいずれか一方を合成し(ＤＮＡ２.０)、ｐＤＯＮＲ２２１(インビトロゲン)にクローン化した。
【０３０８】
次いで、ＬＲゲートウエイ(Gateway；登録商標)反応(インビトロゲン)を用いて、対象の遺伝子を発現ベクターｐＤＥＳＴ１２.２(インビトロゲン)に形質移入した；該ベクターは、ｐＣＥＰ４ベクター(インビトロゲン)からの複製のｏｒｉＰ起源を挿入し、ＥＢＮＡ−１遺伝子産物を発現する細胞株(ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞など)に形質移入することでエピソームプラスミド複製を可能とするように修飾した。
【０３０９】
カニクイザルＩｇＥ Ｃε１−４に融合したヒト抗エストラジオールｓｃＦｖの可変重鎖領域(図３および４)、およびカニクイザル・ラムダ定常領域に融合したヒト抗エストラジオールｓｃＦｖの可変軽鎖領域(図５および６)を提示する組換えキメラＩｇＥタンパク質をＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞から発現させ、文献(Ikeyam et. al. (1986) Mol Immunol 23 p159-67)記載の方法に従い精製した。
【０３１０】
ヒトＦｃεＲＩ−Ｆｃ(自家製造ＮＳＯ細胞)
ヌクレオチド６７−７１１を包含するＦｃεＲＩ(ジェンバンク寄託番号ＮＭ＿００２００１)は文献(Persic et al. (1997) Gene 187; 9-18)に最初に記載されているｐＥＵ１.２からと同様に、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃのゲノム領域の上流にクローン化した。これをｐｃＤＮＡ３.１ ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ(配列番号３９１および３９２)にクローン化した。組換え融合タンパク質ＦｃεＲＩ＿Ｆｃの発現は、ＮＳＯ細胞にｐｃＤＮＡ３.１ＦｃεＲＩ＿Ｆｃ構築物を安定に形質移入することにより達成した。安定な発現は、Ｇ４１８による選択、限界希釈によるクローンの単離および高発現レベルでのクローンの同定により確立した。次いで、ＦｃεＲＩ＿Ｆｃ融合タンパク質を、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィー、さらに分取用サイズ排除クロマトグラフィーにより、順化培地から精製した。
【０３１１】
実施例３：
ヒトＢ細胞  −  細胞内ＩｇＥの阻害
末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)をヒトヘパリン加全血から、ファイコール−パック勾配(ファルマシア)で遠心分離して単離した。次いで、Ｂ細胞をＰＢＭＣ固体群から、磁気ビーズ(ミルテニイ：Miltenyi)による陽性抗ＣＤ１９選択を用いて単離した。陽性および陰性Ｂ細胞フラクション両方を、その細胞が磁性カラムを通過した場合に捕集した。Ｂ細胞以外のすべてのＰＢＭＣ細胞を含む陰性Ｂ細胞フラクションからの細胞をマイトマイシンＣで処理して増殖を防止した。この細胞を５０μｇ／ｍＬのマイトマイシンＣと３０分間インキュベートし、次いで、組織培養培地(グルタマックス(ギブコ)／１０％ＦＣＳ(ギブコ)／５０Ｕ／ｍＬペニシリン／５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン(ギブコ)を含むＲＰＭＩ１６４０)で洗い、さらにＰＢＳと７０分間インキュベートし、最後の洗浄を行って、すべてのマイトマイシンＣを確実に除去した。Ｂ細胞の分化を誘発するために、４×１０４個のＢ細胞およびＢ細胞陰性フラクションからの９.２×１０５個の細胞を９６穴プレート中、３.５μＭベータ−メルカプトエタノール(シグマ)および２０μｇ／ｍＬのトランスフェリン(ケミコン)を補足した組織培養培地に塗布し、０.００１−１００ｎＭの抗ＩｇＥモノクローナル抗体または対照抗体で３０分間プレインキュベートし、その後、１０ｎｇ／ｍＬのヒトインターロイキン−４(ＩＬ−４)を加えた。引き続き、細胞を湿潤ＣＯ２インキュベーター中で、１２〜１４日間インキュベートした。１２〜１４日目に、プレートをさっと回転させ、上清を集め、以下のプロトコールに従って細胞内ＩｇＥを目的として細胞染色した。
【０３１２】
細胞は先ず１％ヒト血清を含むＰＢＳと１０分間インキュベートし、Ｆｃ受容体の結合を遮断した。次いで、ベクトン・ディッキンソン(Becton Dickinson)のサイトフィックス／サイトパームキットを用いて細胞を固定し、氷上で透過性を上げた。次いで、細胞を洗い、最終希釈１：６のウサギ抗ヒトＩｇＥ−ＦＩＴＣ抗体(ダコ)および最終希釈１：１０のモノクローナルマウス抗ヒトＣＤ１９−ＲＰＥ／Ｃｙ５抗体(ダコ)を添加した。重要なことは、残余の抗ＩｇＥ ＭＡｂ(モノクローナル抗体)からの干渉を回避するために完全に洗浄することである。３０分間のインキュベーションの後、細胞を洗い、ＨＴＳ９６穴プレート負荷装置を用いて、ＦＡＣＳカリバー上でサンプルを分析した。ＩｇＥを同時に発現するＣＤ１９＋個体群における細胞のパーセントが次いで記録され、細胞内ＩｇＥの発現は、遮断用抗ＩｇＥモノクローナル抗体で処理していない細胞中での最大ＩｇＥ発現の％阻害として提示される。抗体１１はＩｇＥ陽性細胞の誘発を阻害し、そのＩＣ５０は１.６ｎＭであった(図７−上のグラフ)。同じフォーマットの無関係の抗体が陰性対照(ＣＡＴ−００２)として使用されたが、この抗体はＩｇＥ陽性Ｂ細胞の誘発を阻害しなかった(図７−下のグラフ)。
【０３１３】
実施例４：
肥満細胞株(ＬＡＤ２)  −  β−ヘキソサミニダーゼ放出の阻害
ＬＡＤ２細胞[A. S. Kirshenbaum et al. Leukemia research 27 (2003)]を、ステムプロ−３４栄養サプリメント、２ｍＭ−Ｌ−グルタミンおよび１００ｎｇ／ｍＬの組換えヒト幹細胞ファクター(ｒｈＳＣＦ、Ｒ＆Ｄ)を補足した無血清培地(ステムプロ−３４；ライフ・テクノロジー)中、細胞密度０.２５〜０.６×１０６細胞／ｍＬで培養した。
【０３１４】
β−ヘキソサミニダーゼアッセイのために、細胞を９６穴ポリプロピレンプレート中、０.０００１−１００ｎＭの濃度範囲の遮断用抗ＩｇＥ ＭＡｂと共に、２.５×１０４細胞／ウェルの密度で播種し、プレインキュベートした。細胞を３７℃で３０分間インキュベートし、０.１５ｎＭ濃度のＩｇＥを加え、該細胞をさらに４時間インキュベートした。ＩｇＥとのインキュベーションの後、細胞をバッファーで洗い、過剰のＩｇＥを除去し、続いて、ＬＡＤ２細胞上のＦｃｅＲに結合したＩｇＥを３７℃で３０分間αＩｇＥ(６００μｇ／ｍＬヤギ抗ヒトＩｇＥ；シグマ)で架橋させた。冷却遠心分離によりインキュベーションを停止し、細胞上清を集め、９６穴プレートに移した。β−ヘキソサミニダーゼ含量は、スミスら[Smith J et al. Biochem. J. (1997)323, 321-328]が公開した方法の僅かに改良した方法を用いて分析した。簡単に説明すると、０.２Ｍクエン酸バッファー(ｐＨ４.５)中の２ｍＭのｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニドをヘキソサミニダーゼの基質として用いた。１Ｍトリス−バッファー(ｐＨ９.０)を加えて、反応を停止させた。モレキュラーディバイスのスペクトラマックスリーダーを用いて、分光光度法により４０５ｎｍ(５７０ｎｍの値を除する)で光学濃度を測定した。β−ヘキソサミニダーゼの放出を阻害する抗ＩｇＥ ＭＡｂの効果を計算し、総放出±ＳＥＭのパーセント阻害として表わした。抗体１１は０.０４ｎＭのＩＣ５０でβ−ヘキソサミニダーゼを阻害した(図８−上のグラフ)；一方、同じフォーマットの無関係のＭＡｂ(ＣＡＴ−００２)はβ−ヘキソサミニダーゼを阻害しなかった(図８−下のグラフ)。
【０３１５】
実施例５：
ＥＬＩＳＡによる血清中ＩｇＥの抗ＩｇＥ抗体結合
アッセイの説明
血清サンプルをヒト提供者からの血液サンプルから調製した。９６穴ＥＬＩＳＡプレート(ヌンク・マキシソープ、Ｎｏ.４４２４０４)をＰＢＳに希釈した１５０μｌ／ウェルの１μｇ／ｍｌ  ＦｃＥＲＩ−Ｆｃ−Ｈｉｓで被覆し、４℃で一夜インキュベートした。一夜インキュベーションの後、０.０５％トゥイーン２０を含むＰＢＳ(ＰＢＳＴ；メディカゴ０９−９４０１−１００)で３回洗った。バックグランドの結合を低減させるために、続いて、プレートを０.５％ＢＳＡ含有ＰＢＳからなる遮断バッファー２００μｌ／ウェルとインキュベートし、室温で２時間インキュベートし、上記のＰＢＳＴで３回洗った。サンプル(様々な量の抗ＩｇＥ抗体、抗体１１を含むヒト血清または血漿)および標準(イムノＣＡＰトータルＩｇＥ(ヒト)検証品、ファディア、ウプサラ)を０.０５％トゥイーン２０含有ＰＢＳで希釈し、それらを１５０μｌ／ウェルの容量でアッセイプレートに適用するまで、氷上に保持した。プレートをシールし、サンプルを室温で２時間インキュベートした。未結合サンプルを除去するために、プレートを上記のＰＢＳＴで３回洗った。次いで、ＰＢＳＴで希釈した０.２５μｇ／ｍｌ濃度のウサギ抗ヒトＩｇＥ(Ｄ∈１、３０−１９１７−００、４２００３６−０２、８４１２０４、９９１１３０２；ファディア、ウプサラ)１５０μｌ／ウェルを加え、結合したヒトＩｇＥを検出した。次いで、プレートを再びシールし、室温で１時間インキュベートした。未結合のウサギ抗ヒトＩｇＥ抗体を除去するために、プレートを上記のＰＢＳＴで３回洗った。ＨＲＰ−接合二次抗体(ヤギ−抗ウサギＩｇＧ、ＨＲＰ接合；ピアース；０.８ｍｇ／ｍｌ)を用い、ウサギ抗ヒトＩｇＥを検出した。該接合体をＰＢＳＴで１：２５０００に希釈し、ウェルあたり１５０μｌを加え、プレートをシールし、室温で１時間インキュベートした。次いで、プレートを上記同様、ＰＢＳＴで３回洗った。次いで、ＴＭＢ−基質溶液(ダコ基質−色素原、Ｎｏ.Ｓ１５９９)１５０μｌ／ウェルを各ウェルに加え、そのプレートを室温で１０分間インキュベートした。ストップ溶液(２Ｍ−Ｈ２ＳＯ４)１５０μｌ／ウェルを加えて反応を停止し、４５０ｎｍの吸光度をテカンサファイア(Tecan SAFIRE)装置で読み取った。
【０３１６】
ＩＣ５０の測定値がアッセイ中のリガンド(すなわち、ＩｇＥ)の濃度に依存するため、本アッセイにおいては、ＩＣ５０がヒト血清サンプルに存在するＩｇＥリガンドの量に依存して変化する。代表的な実験において、抗体１１は２０２ｐＭのＩＣ５０を示した(図９)。同じ実験においては、ゾレア(Xolair；商標)が５７ｎＭのＩＣ５０を示した。
【０３１７】
実施例６：
ＩｇＥおよび精製ＩｇＧ間の複合体形成の測定
精製ヒトＩｇＥおよび精製抗ＩｇＥ  ＩｇＧ(抗体１１)間で形成される免疫複合体の特性化は、高速サイズ排除液体クロマトグラフィーにより遂行した。さらに、オンライン多角光散乱(ＭＡＬＳ)を用いて複合体サイズを予測した。複合体は、ＩｇＥとＩｇＧを一緒にして３つの異なるモル比(それぞれ３：１、１：１および１：３)で、ダルベッコＰＢＳ中、１８℃で１時間インキュベートすることにより形成した。１：１モル比の場合、各タンパク質の濃度は２.５μＭであった。より高い比は当該タンパク質の濃度を７.５μＭに上昇させることにより達成した。これらのサンプルは縦列に配列した２本のＢｉｏ−Ｓｅｐ−ＳＥＣ−Ｓ４０００カラム(３００×７.８ｍｍ)で分析した。カラムは平衡化し、エイジレントＨＰ１１００ＨＰＬＣシステム上、１ｍｌ／分の流速でダルベッコＰＢＳでサンプルを分析した。ピークはダイオードアレイ検出器を用いて２２０および２８０ｎｍで検出し、溶出液はワイアットテクノロジーＤＡＷＮ  ＥＯＳ(ＭＡＬＳ)およびオプチラボｒＥＸ(屈折率)検出器に導いた。
【０３１８】
１：１モル比サンプルのクロマトグラフィーはピークの二重線(ＵＶ吸光度により検出)を与えたが、完全に分割されてはおらず、保持時間１３.８８分および１４.９分に相当する。これらの保持時間はＩｇＥとＩｇＧとの非共有結合複合体の形成を物語っている。ＭＡＬＳによる分析は分子質量１,０８５ｋＤａ(１３.８８分のピーク)および７０２ｋＤａ(１４.９分のピーク)を与えた。これらの質量は、ヘテロ四量体(予測質量６７４ｋＤａ；２ＩｇＥ：２ＩｇＧ)およびヘテロ六量体(予測質量１０１０ｋＤａ；３ＩｇＥ：３ＩｇＧ)に相当する複合体と矛盾しない。３：１および１：３のモル比(ＩｇＥ：ＩｇＧ)両方のクロマトグラフィーおよびＭＡＬＳの分析は、１：１サンプルに類似のプロファイルを示し、ＵＶ吸光度により検出可能なヘテロ四量体とヘテロ六量体に相当するピークを与えた。さらなるピークはサンプル中の過剰のＩｇＥまたはＩｇＧに相当するものとして検出された。
【０３１９】
実施例７：
生殖系列抗体１１が結合するエピトープの決定
正確なタンパク質の三次元構造を原子分解で決定するために、Ｘ線結晶解析を使用することは当業者周知であり、抗体と相互作用するタンパク質の部分を詳細に可視化するために使用されている(Padavattan et al, 2007; Karpusas et el., 2001)。これは最も信頼のおけるエピトープマッピング法であるが、かなりの努力が必要であり、十分な品質の結晶を入手し得ることが重要である；言い換えると、これはタンパク質サンプルの純度と品質、および適切な結晶化条件を見出し得る専門技術に依存するものである。タンパク質−抗体複合体の結晶が得られたなら、それらにＸ線を照射し、回折図を得る；これは確実な原子分布に依存する。この回折図は結晶学者が解析して、結晶中の原子の三次元位置相関を決定することができる。このことはタンパク質と抗体間の相互作用部位の詳細な精査を可能とする。
【０３２０】
７.１  ＩｇＥ Ｃε３−Ｃε４抗体複合体のＸ線結晶構造決定
ＩｇＥドメインＣε２−Ｃε３をクローン化、発現させ、構造決定を目的として精製した。同様に、Ｆａｂフラグメントを、ＩｇＥに結合させるために開発した全抗体１１を消化し、精製することにより調製した。複合体は混合により形成させ、サイズ排除クロマトグラフィーにより精製して、複合化していないＩｇＥドメインとＦａｂ分子を除去した。ＩｇＥ Ｃε３−Ｃε４／Ｆａｂ複合体の結晶は三方空間グループＰ３２２１に属するものとして得た。それらはフランス、グルノーブルの欧州シンクロトロン放射線施設にて分析した。２.８５Åの分解能の完全な回折データが得られた。構造は別個の探索モデルとしてＦａｂフラグメントの可変および定常部分を用いて、分子置換(Rossman, 1972)により解決し得た；これによって、結晶学的不斉単位のＦａｂフラグメントの方向付けおよび位置関係を明らかにし得た。全体として、３つのＦａｂフラグメントが不斉単位中に同定された。続いて、３つのＩｇＥ Ｃε３−Ｃε４分子を不斉単位に配置し得た。各ＩｇＥ二量体は２つのＦａｂ分子に結合し、従って、全体として不斉単位は１個半の完全ＩｇＥ／Ｆａｂ複合体からなる。
【０３２１】
７.１.１  ＩｇＥ Ｃε３−Ｃε４／抗体１１Ｆａｂ複合体の全体の説明
結晶構造は、各ＩｇＥ Ｃε３−Ｃε４二量体が対称または略対称の様式で２つのＦａｂフラグメントに結合していることを示す(図１０)。結晶の不斉単位は１個半のＩｇＥ／Ｆａｂ複合体を含んでいるため、不完全な複合体は２回転軸を経て、隣接する不斉単位において対称関連パートナーと二量体を形成する。
【０３２２】
ＩｇＥ１およびＩｇＥ２で示されるＩｇＥ二量体の両方の分子は、抗体１１のＦａｂフラグメントと相互作用する。相互作用の主要部はＦａｂ重鎖により提供され、それがＩｇＥ１およびＩｇＥ２の両方と相互作用するが、一方、軽鎖はＩｇＥ１とのみ相互作用することが観察される。抗原のエピトープは主としてドメインＣε３に位置し、ドメインＣε４のヒンジに近接して位置する１個のアミノ酸が寄与するものである。
【０３２３】
結晶の不斉単位におけるＩｇＥ Ｃε３−Ｃε４およびＦａｂの間の３つの相互作用部位は非常に似通っている。しかし、精製後、Ｆａｂ分子の１つは他の２つのＦａｂ分子よりも可なり秩序の低いものであることが明らかであった。このことは結晶構造に共通に見られるものであり、特定の領域が柔軟であって、結晶全体に異なる配向を採用して、結果として電子密度があまり明確ではなくなるという事実によって説明される。それ故、Ｆａｂ分子およびそれとＩｇＥ Ｃε３−Ｃε４分子との間の相互作用は、この分析では考慮しなかった。
【０３２４】
ＩｇＥはＦｃ領域の残基Ａｓｎ３９４でグリコシル化されていることが知られている(Wurzburg et al)。トリプシン消化後に質量分析により行ったＦｃグリコシル化の特性化は、２、３または４個のヘキソース、多分すべてがマンノースの伸張をもつコア構造Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる、Ａｓｎ３９４に結合する３つの異なるグリカン変異体を示した(図１１)。事実、３つすべてのＩｇＥ Ｃε３ドメインの残基Ａｓｎ３９４から伸張した電子密度は、二量体中の２つのＩｇＥ分子間の空間に突出している。この電子密度は各鎖に認め得る２つのＮ−アセチル−グルコサミン(ＧｌｃＮＡｃ)および３または４個のマンノース単位をもつ高−マンノース−型構造を示唆し、質量分析とも矛盾がない。コア構造の外側のヘキソースの１個のみ、Ｍａｎ４にカップル結合するＭａｎ６のみが、電子密度において認められ、残りの１〜３個のヘキソースが柔軟であることを物語っている。
【０３２５】
７.１.２  エピトープとパラトープの説明
この結晶構造はＩｇＥ Ｃε３−Ｃε４とＦａｂ間のエピトープ相互作用を原子の細部で実験することを可能とする。解明された構造中には２つの独立したＩｇＥ／Ｆａｂ相互作用が存在するが、第三のＦａｂ分子についてはその電子密度マップの輪郭が明瞭となっていないために除外してある；そのことを説明する。それらはＣε位置を用いて計算した０.３１Åの２つの等価のＦａｂ可変鎖フラグメント間(重ね合わせ、ＣＣＰ４  １９９４)およびそれぞれ０.８２と０.９６Åの等価のＩｇＥ単量体間の二乗平均偏差により極めて類似していることが示される。この高い類似性にもかかわらず、２つの相互作用は別々に説明され、またＩｇＥ／Ｆａｂ１およびＩｇＥ／Ｆａｂ２と表示される。相互作用の詳細は表５および表６にまとめる；ただし、残基番号は鎖インジケーター(ＨＣ：Ｆａｂ重鎖；ＬＣ：Ｆａｂ軽鎖；ＩｇＥ１、ＩｇＥ２)を含む。抗体１１のアミノ酸残基の数字はＫａｂａｔシステム(Kabat et al 1991)に従うものである。距離はＣＣＰ４プログラムコンタクト(CONTACT (CCP4, 1994))を用いて得た。
【０３２６】
両方の相互作用には、抗体フラグメントの重鎖および軽鎖両方からの相補性決定領域(ＣＤＲ)、枠組みからの残基(ＦａｂのＣＤＲ外部の領域)およびＩｇＥ Ｃε３−Ｃε４単量体における両方の単量体からのアミノ酸残基が関与する。抗体軽鎖はＩｇＥ Ｃε３−Ｃε４二量体と相互作用し、一方、該重鎖は両方の単量体と相互作用する。しかし、大多数の接触は重鎖と抗原の単量体ＩｇＥ２間のものである。２つの相互作用を以下に詳細に説明する。
【０３２７】
７.１.３  Ｆａｂ１とＩｇＥ間の相互作用の詳細な説明、相互作用１
ＩｇＥ Ｃε３−Ｃε４のエピトープを規定する相互作用部位は、１１００Å２の面積に及び(プログラム・エリアイモル(areaimol)を用いて計算；文献(CCP4, 1994)参照)、抗原のＩｇＥ１のアミノ酸残基Ｇｌｕ３９０からＡｓｎ３９４まで、およびＩｇＥ２のＬｅｕ３４０、Ａｒｇ３４２、Ａｌａ４２８からＴｈｒ４３４まで、Ｔｈｒ４３６、Ｓｅｒ４３７およびＧｌｕ４７２によって構成されている。さらに、ＩｇＥ１の糖部分ＧｌｃＮＡｃ１とＭａｎ６、およびＩｇＥのＭａｎ５がＦａｂ分子と接触する。糖部分を含む、抗原と相互作用する重鎖からのアミノ酸残基は、ＣＤＲ１からのＴｙｒ３２；ＣＤＲ２からのＡｓｐ５３およびＡｓｎ５４；ＣＤＲ３からのＶａｌ９５、Ｍｅｔ９６、Ｉｌｅ１００、Ｇｌｙ１００ｂ、Ｇｌｙ１００ｃ、Ａｓｐ１０１およびＴｙｒ１０２；および枠組みからのＧｌｕ１、Ｌｙｓ２３、Ｔｈｒ３０、Ａｌａ７１からＡｒｇ７７まで、およびＴｙｒ７９である。Ｆａｂ軽鎖から寄与する残基は、ＣＤＲ２からのＡｓｐ５０とＳｅｒ５６、および枠組みからのＬｅｕ４６とＴｙｒ４９である。この相互作用は非極性ファン・デル・ワールス接触に加えての１９の水素結合である。
【０３２８】
７.１.４  Ｆａｂ１とＩｇＥ間の相互作用の詳細な説明、相互作用２
ＩｇＥ Ｃε３−Ｃε４のエピトープを規定する相互作用部位は、１１６５Å２の面積に及び(プログラム・エリアイモル(areaimol)を用いて計算；文献(CCP4, 1994)参照)、抗原のＩｇＥ１のアミノ酸残基Ｇｌｕ３９０、Ｇｌｎ３９２からＡｓｎ３９４まで、およびＩｇＥ２のＬｅｕ３４０、Ａｒｇ３４２、Ａｌａ４２８からＴｈｒ４３４まで、Ｔｈｒ４３６、Ｓｅｒ４３７およびＧｌｕ４７２によって構成されている。さらに、ＩｇＥ１の糖部分ＧｌｃＮＡｃ１とＭａｎ６がＦａｂ重鎖と接触する。糖部分を含む、抗原と相互作用する重鎖からのアミノ酸残基は、ＣＤＲ１からのＴｙｒ３２；ＣＤＲ２からのＰｒｏ５２ａ、Ａｓｐ５３およびＡｓｎ５４；ＣＤＲ３からのＶａｌ９５、Ｍｅｔ９６、Ｉｌｅ１００、Ｇｌｙ１００ｂ、Ｇｌｙ１００ｃ、Ａｓｐ１０１およびＴｙｒ１０２；および枠組みからのＧｌｕ１、Ｌｙｓ１９、Ｌｙｓ２３、Ｔｈｒ３０、Ａｌａ７１からＡｒｇ７５まで、Ａｒｇ７７およびＴｙｒ７９である。Ｆａｂ軽鎖から寄与する残基は、ＣＤＲ２からのＳｅｒ５６、および枠組みからのＴｙｒ４９である。この相互作用は非極性ファン・デル・ワールス接触に加えての１９の水素結合である。
【０３２９】
【表１７】
2010518815.tif 000026
【表１８】
2010518815.tif 000027
水素結合について使用した距離カットオフは３.２Åであり、非極性相互作用については、４.０Åである。
【０３３０】
【表１９】
2010518815.tif 000028
【表２０】
2010518815.tif 000029
水素結合について使用した距離カットオフは３.２Åであり、非極性相互作用については、４.０Åである。
【０３３１】
実験７のための材料と方法
ＩｇＥ Ｃε３−Ｃε４の過剰発現
細胞株および培地
本研究では、エプスタイン−バーウイルス核抗原−１遺伝子を安定的に発現させる原接着性細胞株ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ(インビトロゲン、ストックホルム、スウェーデン)を使用した。細胞を懸濁増殖に適応させ、段階的培地交換によりＤＨＩ培地に移した(Davies et al. 2005)。使用したＤＨＩ培地はＣＡ２＋を含まないことで、原書の記載からわずかながら外れていた。適応後、作業細胞バンクを作製し、両細胞株を、４ｍＭグルタミン、２％ｖ／ｖ超低ＩｇＧ子ウシ血清、２５０μｇ／ｍｌのＧ４１８(すべてインビトロゲン、ストックホルム、スウェーデンから)および０.１％ｗ／ｖプルロニックＦ６８(シグマ−アルドリッチ、ストックホルム、スウェーデン)を補足したＣＡ２＋不含ＤＨＩ培地にて、常套的に最大２０回継代まで増殖させた。
【０３３２】
形質移入法
鎖状２５ｋＤａポリエチレンイミン(ポリサイエンス・ヨーロッパ、エッペンハイム、ドイツ)の１ｍｇ／ｍｌ保存液を水中で調製し、ｐＨを７.０に調整し、無菌濾過して小分けし、使用するまで−８０℃で保存した。形質移入カクテルは形質移入直前に、無添加ＤＨＩ培地中、形質移入容量の１／１０に等しい容量で調製した。形質移入カクテル調製のために、ＤＨＩ培地は２分割した。形質移入容量１ｍｌあたり０.８μｇのＤＮＡをＤＨＩ培地の１／２に加え、残り１／２には形質移入容量１ｍｌあたり２μｇのＰＥＩを加えた。２つの溶液をさっと振り混ぜ、５分間インキュベートした後、該ＤＮＡ溶液をＰＥＩ溶液にゆっくり加えた。形質移入カクテルを室温で２０〜３０分間インキュベートした後、ウエーブバイオリアクター(ウエーブバイオテックＡＧ、テイゲルスワンゲン(Tagelswangen)、スイス)に加えた。形質移入４時間後に、培養液を補足ＤＨＩ培地で最終生産容量とし、ＨｙｐＰｅｐ１５１０(ケリー・バイオ−サイエンス、アルマー、オランダ)を最終濃度０.３％(ｗ／ｖ)まで加えた。
【０３３３】
種培養
種培養拡張のために、細胞をプラスチック振盪ボトル中、回転シェーカー型インキュベーター(インフォースＡＧ、ボトミンゲン(Bottmingen)、スイス)に置き、３７℃、５％ＣＯ２下に増殖させた。細胞は略２×１０６細胞／ｍｌに達し、分割するまで、週に２回、常套的に継代した。細胞密度および生存度をセデックス自動細胞カウンター(インノバティスＡＧ、ビーレフェルド、ドイツ)にて評価した。波動培養のために、細胞を形質移入の１日前に１×１０６細胞／ｍｌに分割し、実験開始時に対数増殖期にあることを確実にした。波動培養液を直接シェーカーから接種した。すべての種培養液を遠心分離により濃縮し、新たな培地に再懸濁してバイオリアクターに加えた。
【０３３４】
波動培養
発現はウエーブバイオリアクター(ウエーブバイオテック、テイゲルスワンゲン(Tagelswangen)、スイス)にて、作業容量１０Ｌとして実施した。ウエーブバイオリアクターには、４.５Ｌの補足ＤＨＩ培地中、１×１０６細胞／ｍｌに播種した。２時間の適応期の後、培養液を０.５Ｌの形質移入カクテルで形質移入した。形質移入の４時間後、培養液を補足ＤＨＩ培地で１０Ｌ総容量とし、ＨｙＰｅｐ１５１０を加え、０.３％(ｗ／ｖ)の最終濃度とした。毎日サンプルを取り、細胞密度、生存度およびタンパク質濃度を測定した。
【０３３５】
発現ベクター
ヒトＩｇＥ Ｃε３−Ｃε４をＣ−末端フラグタグと１０−ヒスチジンタグと共に発現するベクターは、文献(Persic et al. (1997))記載のベクターから誘導した。このシステムはＥＦ１−ａプロモーターの制御下にある。
【０３３６】
ＩｇＥ Ｃε３−Ｃε４の精製
細胞上清２０Ｌを５倍に濃縮し、１０ｋＤａ分子量カット−オフ・クロスフロー膜(ペリコン２、ミリポア)により２×ＰＢＳ(３０８ｍＭ−ＮａＣｌ、２０ｍＭリン酸塩、ｐＨ７.４)にダイアフィルターした。培地は４℃で２時間、３０ｍＬのＮｉセファロース(ＧＥヘルスケア)とバッチ結合させ、５倍容量の２×ＰＢＳで洗い、ＸＫ２６カラムに詰めた。次いで、カラムを５倍カラム容量の４０ｍＭイミダゾール／ＰＢＳ(×２)で洗って、汚染するタンパク質を洗い流した。最終的にＩｇＥは４００ｍＭイミダゾール／ＰＢＳ(×２)で溶出した。プールは高純度のＩｇＥを含んでおり、これを約４倍に濃縮し(〜５ｍｇ／ｍＬ)、スーパーデックス２００  ５０／６０ＳＥＣ−カラム(１２００ｍＬ，ＧＥヘルスケア)に流し、２×ＰＢＳを流出バッファーとして使用した。一部の大型タンパク質を分離除去し、ＩｇＥは主ピークに見出された。他の２つのフラクションには夾雑があったため、主ピークフラクションのみをプールした。このステップはサンプルの純度を〜９９％まで上げた。総産生量は４２ｍｇであり、精製したＩｇＥは２ｍｇ／ｍｌの濃度を有していた。
【０３３７】
ＩｇＥ Ｃε３−Ｃε４のグリコシル化の分析
トリプシンによる溶液中消化
ヒトＩｇＥ最少ドメイン、ＩｇＥ Ｃε３−Ｃε４、２ｍｇ／ｍｌを、２×ＰＢＳ(組成：３０８ｍＭ−ＮａＣｌ、２０ｍＭリン酸塩、ｐＨ７.４)中、２５ｍＭ−ＮＨ４ＨＣＯ３中の０.０２ｍｇ／ｍｌトリプシン１００μｌと混合した。消化は３７℃で一夜進行させ、２μｌの６７％ギ酸／Ｈ２Ｏで停止した。
【０３３８】
ナノ−ＬＣ  ＭＳ／ＭＳ：
分析は、２０ｃｍ×５０μｍ(径)溶融シリカカラムにレプロシル−パー(ReproSil-Pur)Ｃ１８−ＡＱ  ３μｍ多孔性粒子を詰め、ＬＴＱ−オービトラップ質量分析計(サーモ(Thermo))に連接し、遂行した。サンプル８μｌを注入し(エイジレント・オートサンプラー)、ペプチドをプレカラム(４.５ｃｍ×１００μｍ、径)にトラップし、分離した。０.１％ギ酸による５分間の直線流出後、勾配は１０〜５０％アセトニトリルにより、５〜３０分間、２００ｎｌ／分として行い、溶出液は射出チップからエレクトロスプレーした。この装置はデータ依存モードで操作し、オービトラップ(ＦＴ−ＭＳ)探索走査と３つの最も豊富に増加するプロトン化イオンのイオントラップ(ＩＴ−ＭＳ／ＭＳ)間でスイッチした。
【０３３９】
静的エレクトロスプレーＭＳ／ＭＳ：
グリコペプチドフラグメントの電荷状態を証明するために、選択した前駆物質をＥＳＩニードルにより１.６ｋＶで分析し、フラグメント化し、ナノ−ＬＣ分析における直線イオントラップに対置するオービトラップで検出した。
【０３４０】
グリコペプチド・データ解析：
可能性のあるグリコペプチドの計算されたＭＨ＋質量は、グリコモッド・ツール(http:expasy.org/tools/glycomod)(Cooper et al 2001)を用いて、グリコシル化の存在について試験した。タンパク質配列および１０ｐｐｍの質量許容差を載録した。示唆されたグリコペプチドのすべてがグリカン含有フラグメントの存在についてチェックした。
【０３４１】
抗体１１Ｆａｂの生産
ＩｇＧ精製
抗体１１はＣＨＯ−ＥＮＮＡ一過性物質から、マブセレクト(MabSelect)ＳｕＲｅ(ＧＥヘルスケア)プロテインＡクロマトグラフィー媒体を用いて精製した。プロテインＡ溶出液はＰＤ−１０カラム(ＧＥヘルスケア)を用いてＰＢＳ(ｐＨ７.２)に交換し、次いで、ミレックス(Millex)−ＧＰシリンジチップフィルター(ミリポア)を用いて０.２２μｍで濾過した。
【０３４２】
Ｆａｂ消化と精製
ギブコＰＢＳ(インビトロゲン)に溶解した３０ｍＭ−ＤＬ−システイン塩酸塩の消化バッファーを調製した。パパイアラテックス(シグマ)からのパパインを消化バッファーにて再構成し、１０ｍｇ／ｍＬの溶液として、使用前の最少３０分間、室温に保持した。抗体１１ ＩｇＧにシステインを加えて３０ｍＭ溶液とし、１００ｍｇのＩｇＧに対し１ｍｇのパパインの割合でパパインを加えた。９０分後、０.５Ｍヨードアセトアミド(シグマ)を加えて消化を終結し、最終消化混合物中、５０ｍＭヨードアセトアミドを得た。Ｆａｂはマブセレクト(MabSelect)ＳｕＲｅ(ＧＥヘルスケア)プロテインＡクロマトグラフィー媒体を用いて、非結合様式で消化混合物から精製した。マブセレクト(MabSelect)ＳｕＲｅステップからのＦａｂフラクションは、ＰＤ−１０カラム(ＧＥヘルスケア)を用いて、５０ｍＭ酢酸ナトリウム／１００ｍＭ−ＮａＣｌ(ｐＨ５.５)にバッファー交換し、次いで、アミコン−ウルトラ−１５  ５ｋＤａ  ＭＷＣＯ遠心フィルター装置(ミリポア)を用いて〜１０ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。最終産物はさらにマスタングＱアクロディスク(ポール；Pall)により精製し、次いでミレックス(Millex)−ＧＰシリンジチップフィルター(ミリポア)を用いて０.２２μｍで濾過した。
【０３４３】
ＩｇＥ Ｃε３−Ｃε４抗体１１Ｆａｂ複合体の生成
３０８ｍＭ−ＮａＣｌおよび２０ｍＭリン酸塩のバッファー(ｐＨ７.４)中、２ｍｇ／ｍＬのＩｇＥ Ｃε３−Ｃε４を含む溶液を、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、１００ｍＭ−ＮａＣｌ、ｐＨ５.５中、１０.６ｍｇ／ｍＬの抗体１１ Ｆａｂを含む溶液と混合した；その化学量論比はＩｇＥ Ｆｃ３−４ホモ二量体および抗体１１ Ｆａｂヘテロ二量体、それぞれ１：１.１とした。この混合物を一夜氷中に放置し、２０ｍＭトリスＨＣｌ(ｐＨ７.６)と０.１５Ｍ−ＮａＣｌで平衡化したハイロード・スーパーデックス２００  １６／６０カラムでのゲル濾過に付した。該複合体を含む主ピークを集め、１０.４ｍｇ／ｍＬに濃縮して結晶化実験に使用した。
【０３４４】
ＩｇＥ Ｃε３−Ｃε４抗体１１Ｆａｂ複合体の結晶化
結晶化は垂下液滴気相拡散(sitting drop vapour diffusion)法に従い実施した。液滴は等容量のタンパク質と貯留溶液を含んでおり(１５０＋１５０ｎＬ)、貯留容量８０ｕＬのクリスタルクイック９６穴プレート(グライナー・バイオ−ワン)にて構成した。複合体結晶は、１００ｍＭ−ＭｇＣｌ２、１００ｍＭクエン酸ナトリウム(ｐＨ５.０)および１５％ＰＥＧ４０００からなる貯留溶液による液滴中、４℃、２〜３週間で成長した。この結晶を凍結保護溶液(１００ｍＭ−ＭｇＣｌ２、１００ｍＭクエン酸ナトリウム(ｐＨ５.０)および１５％ＰＥＧ４０００；１００％グリセロールの添加により２０％グリセロールとする)中に集め、液体窒素にて急速冷却した。
【０３４５】
ＩｇＥ Ｃε３−Ｃε４抗体１１Ｆａｂ複合体のデータ収集と構造解明
回折データは単結晶から、フランス、グルノーブルの欧州シンクロトロン放射線施設にて、ビーム線ＩＤ−２９で収集した。当初のデータセット(データセット１；表７)は３Åの分解能で記録されたが、その後、より高分解能のデータセットが２.８５Åの分解能で収集された；両方とも空間群Ｐ３２２１に属する。データはオートＰＲＯＣ(グローバル・フェイジング・リミッテドＧＰｈＬ、ケンブリッジ、英国)で処理した。データプロセシングからの統計値を表７に示す。不斉単位は３個のＦａｂ分子と３分子のＩｇＥ Ｃε３−Ｃε４を含み、溶媒含有率は５４％に相当する。その構造はプログラムフェザー(PHASER)(Read 2001, Storoni et al 2004, McCoy et al 2005)を使用する分子置換法により解明した。ＦａｂフラグメントとＩｇＥ Ｆｃドメインの当初のモデルは、すでに報告されている構造ＩＡＱＫ(Faber et al 1998)および１ＦＰ５(Wurzburg et al 2000)から生成させた。
【０３４６】
検索モデルとしての全Ｆａｂの使用は、可変ドメインと定常ドメインとの間のヒンジ領域のアングルが変動するために失敗であった。代わりに、可変ドメインと定常ドメインからなる２種類の別個の検索モデルをそれぞれ調製し、当初のフェザー(PHASER)(Read 2001, Storoni et al 2004, McCoy et al 2005)を実行することにより同定した。後に、これらは完全Ｆａｂフラグメントに結合した。全体で、２つのＦａｂフラグメントと１つの可変ドメインをこの方式で同定した。引続く分子置換についての実験では、３つのＩｇＥ Ｃε３−Ｃε４分子の位置を確認した；その一つについてはドメイン４からなるように切り戻さねばならなかった。この段階で、より良好な質のデータが集められた(データセット２；表７)；このモデルはプログラム自動バスター(グローバル・フェイジング・リミッテドＧＰｈＬ、ケンブリッジ、英国)を用いて、新データに対してより改善した。続いて、Ｆａｂ分子のアミノ酸をグラフ化プログラムＣＯＯＴ(Emsley & Cowtan 2004)を用いて抗体１１の正しい配列に手作業で変更した。レフマック(Refmac (CCP4 1994))の等方性Ｂファクター純化を用い、２回目の抑制された最も可能性のあるものを純化した後、最後のＦａｂおよびＩｇＥ分子の残りのドメインを手作業で電子密度に適合させた。伸張した電子密度の２つのさらなる特徴が、ＩｇＥ分子間の空間に、アミノ酸残基Ａｓｎ３９４から突出しているものとして観察された。これはグリコシル化、従って、２つのＮ−アセチル−グルコサミンと３ないし４つのマンノース単位がＩｇＥモデルに付加したと解釈された。さらに純化を進めた実験では、自動バスター(グローバル・フェイジング・リミッテドＧＰｈＬ、ケンブリッジ、英国)またはレフマック５(Murshudov et al 1997)が介在したＣＯＯＴ(Emsley & Cowtan 2004)により、ループ領域を手作業で再構築した；個々のドメインと非結晶学的対称性(ＮＣＳ)を適用すると、ＩｇＥ分子が拘束される。総計２１３個の水分子をレフマック５(Murshudov et al 1997)による水取り込み選択により組込ませ、次いで、手作業により検査した。最終の純化実験においては、ＮＣＳ拘束が解放された、Ｒ＝２０.０％およびＲフリー＝２７.０％の最終モデルが得られた。
【０３４７】
【表２１】
2010518815.tif 000030
Ｒフリーはユニーク反射５％のテストセットについて計算した交差検証Ｒ因子である。
【０３４８】
実施例７に引用された文献
Davies A. Greene A. Lullau E. Abbott WM. Optimisation and evaluation of a high-throughput mammalian protein expression system(高速大量処理タンパク質発現系の最適化と評価). Protein Expression & Purification. 42(1):111-21. (2005)
CCP4 (Collaborative Computational Project, Number 4(共同計算プロジェクトＮｏ.４)) (1994) The CCP4 suite: programs for protein crystallography(タンパク質結晶学用プログラム). Acta Crystallogr D 50: 760-763 
Cooper C.A., Gasteiger E., Packer N. GlycoMod - A software Tool for Determining Glycosylation Compositions from Mass Spectrometric Data(質量分析データからのグリコシル化組成を決定するソフトウェア・ツール), Proteomics 1:340-349 (2001). 
Emsley, P. & Cowtan, K. Coot: model-building tools for molecular graphics(分子図式化用モデル構築ツール). Acta Crystallogr D60: 2126-2132 (2004)
Faber, C., Shan, L., Fan, Z., Guddat, L.W., Furebring, C., Ohlin, M., Borrebaeck, C.A., Edmundson, A.B. Three-dimensional structure of a human Fab with high affinity for tetanus toxoid(破傷風毒素に高親和性を有するヒトＦａｂの三次元構造). Immunotechnology  3: 253-270   (1998)
Kabat,E.A., Wu,T.T., Perry,H., Gottesman,K. and Foeller,C. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫対象のタンパク質配列), Fifth Edition. NIH Publication No. 91-3242.
Karpusas, M., Lucci, J., Ferrant, J., Benjamin, C., Taylor, F.R., Strauch, K., Garber, E., Hsu, Y.M.  (2001) Structure of CD40 ligand in complex with the Fab fragment of a neutralizing humanized antibody(中和性ヒト化抗体のＦａｂフラグメントとの複合体におけるＣＤ４０リガンドの構造). Structure 9, 321, (2001)
Leslie A. (1991) Macromolecular data processing(高分子データプロセシング). In Moras,D., Podjarny,A.D. and Thierry,J.C. (eds), Crystallographic Computing V. Oxford University Press, Oxford, UK, pp. 27-38
McCoy, A.J., Grosse-Kunstleve, R.W., Storoni, L.C. & Read, R.J. Likelihood-enhanced fast translation functions(可能性上昇急速翻訳機能). Acta Cryst D61, 458-464 (2005)
Murshudov, G. N., Vagin, A. A., and Dodson, E. J. (1997) Refinement of Macromolecular structures by the maximum-likelihood method(最大可能性法による高分子構造の純化), Acta Crystallogr D53: 240-255
Padavattan, S., Schirmer, T., Schmidt, M., Akdis, C., Valenta, R., Mittermann, I., Soldatova, L., Slater, J., Mueller, U. & Markovic-Housley, Z. Identification of a B-cell Epitope of Hyaluronidase, a Major Bee Venom Allergen, from its Crystal Structure in Complex with a Specific Fab(ヒアルロニダーゼ、主ハチ毒アレルゲンの、特異的Ｆａｂとの複合体の結晶構造からのＢ−細胞エピトープの同定). J Mol Biol 368, 742-752. (2007)
Persic L. Roberts A. Wilton J. Cattaneo A. Bradbury A. Hoogenboom HR. An integrated vector system for the eukaryotic expression of antibodies or their fragments after selection from phage display libraries(ファージディスプレイライブラリーから選択後の抗体またはそれらのフラグメントの真核細胞発現用の組み込みベクターシステム). Gene. 187(1):9-18. (1997)
Read, R.J. Pushing the boundaries of molecular replacement with maximum likelihood(最大の可能性をもつ分子置換の範囲をプッシュ). Acta Cryst. D57, 1373-1382 (2001)
Rossmann, M.G. (edt): “The Molecular Replacement Method”(分子置換法) Gordon & Breach, New York (1972)
Storoni, L.C., McCoy, A.J. & Read, R.J. Likelihood-enhanced fast rotation functions(可能性を高めた急速回転機能). Acta Cryst D60, 432-438 (2004)
Wurzburg, B.A., Garman, S.C. and Jerdetzky, H.S. Structure of the human IgE-Fc C epsilon 3-C epsilon 4 reveals conformational flexibility in the antibody effector domains(ヒトＩｇＥ−ＦｃＣイプシロン３−Ｃイプシロン４の構造は、抗体エフェクタードメインにおけるコンホメーションの柔軟性を明らかにする).  Immunity, 13, 375-385 (2000)。
【０３４９】
実施例８：
若年カニクイザルにおける血小板数減少を誘発する生殖系列抗ＩｇＥｍＡｂの一般的安全性と許容能力の評価
本発明抗体、抗ＩｇＥｍＡｂ、抗体１１ＩｇＧ１、抗体１１ＩｇＧ２および血液血小板数の減少を惹き起こす別の抗ＩｇＥ抗体４８の一般的安全性および相対的能力を評価するために、若年カニクイザルにて調査(ＧＬＰ非準拠)研究を実施した。
【０３５０】
研究目的は：１)若年カニクイザルにおいて、血小板数／ＴＰＣの減少および関連する作用を誘発する３種の候補抗ＩｇＥ  ｍＡｂの一般的安全性および相対的能力を判定すること；２)サルにおけるｍＡｂの予備的薬物動力学のパラメーターを決定すること；３)遊離のＩｇＥの減少を惹き起こす３種の候補ｍＡｂの許容能力を評価し、ｍＡｂ濃度と遊離ＩｇＥレベル間の(ＰＫ／ＰＤ)関連性を判定すること；である。
【０３５１】
実施例８のための材料と方法
１８匹の目的飼育したカニクイザル(マカカ・ファシキュラリス；Macaca fascicularis)をバイオカルチャー、モウリチウス(Bioculture, Mauritius)から入手した。動物は投与開始時、６３ないし６７週令であった。サルは(１００匹の大きなプールから)高ＩｇＥレベル(Ｕ／ｍｌ)を有するものを予め選択した；これらを３群に交差して正規化し、その群それぞれが３匹のオスザルと３匹のメスザルからなり、抗体１１ ＩｇＧ１(第１群)、抗体１１ ＩｇＧ２(第２群)またはＥ４８(第３群)のいずれかを受容していた。３種のｍＡｂそれぞれは、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、１００ｍＭ−ＮａＣｌ、ｐＨ５.５中で製剤化し、投与容量２ｍＬ／ｋｇとして、１ｍＬ／分の低速で静脈内注入(動力化シリンジ／注入ポンプを使用)により投与した。動物には週に１回(５週間／５回)投与し、投与レベルは１ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇ(×３)と、第１、８、１６，２２および２９日目に増量した(表８)。抗体１１ ＩｇＧ１および抗体１１ ＩｇＧ２は第１群および２群それぞれに３７日目に投与した。２つの最高投与レベルは、若年カニクイザルにおいてゾレア(Xolair)により血小板減少症(ＴＣＰ)に至ることがすでに示されている血清濃度を達成すると予測された。低用量は遊離ＩｇＥレベルの低下に影響するｍＡｂの能力の判定を可能とすると期待された。
【０３５２】
【表２２】
2010518815.tif 000031
(Ａｂ１１＝抗体１１)
【０３５３】
動物は２８日目の投与後、８週間観察し、毒物学的影響からの回復について試験した。
すべての動物について、健康障害または明白な毒性の兆候、および体重と記録された食餌消費を毎日観察した。さらに、動物それぞれについて、投与期間中の毎日および非投与期間の少なくとも週１回、詳しい物理的試験を行った。すべての動物についても、各投与前におよび投与後の０.５、２、６、２４、４８および１６８時間目に観察した。
【０３５４】
標準の血液学的パラメーター(血小板計数を含む；ＥＤＴＡ中に収集)および凝固パラメーター(クエン酸三ナトリウムに収集)の解析のための血液サンプルを、処置前に２回(２週および１週前)、大腿血管／動脈から採取した。血小板計数および標準的血液学用のさらなるサンプルを各投与時(第２、７、９、１４、１７、２２、２３、２６、３０および３５日目；第１群および２群からのサンプルについては第３８および４３日目)の後の２４時間および１４４時間目、および８週の回収期間(第４３、５７、７１および８２日目)に２週間ごとに収集した。凝固用サンプルは各投与時(第７、１４、２２、２６および３５日目)の１４４時間後、および回収期間の末日(第８２日)に収集した。凝固用サンプルはまた５７日目にも採取した。補体活性化用血液サンプル(Ｃ３ａ、Ｃ３ｂおよびＢＢフラグメント)は処置前に１回(１週前)および処置期間終了(３０日目)の約２４時間後に採取した。
【０３５５】
ＴＫ分析用の血清サンプルは、投与前１日目、投与後、０.５、６、１２、２４、４８、１４４時間目、第８、１６、２２および２９日目の投与後の０.５、２４および１４４時間目、第２９日目(第３および４群のみ)の投与後の３３６、６７２、１００８、１２７２時間目、第３７日目(第１および２群のみ)の投与後の０.５、２４、１４４、４８０、８１６、１０８０時間目に、すべての群から採取した。サンプルは一般的サンドイッチイムノアッセイ(ｍＡｂに対するビオチン化ヒトＩｇＥおよびアレキサ(Alexa)−６４７標識マウス抗ヒトＩｇＧ検出試薬使用)およびギロラボ・バイオアフィ(Gyrolab Bioaffy)プラットホーム(ストレプトアビジンビーズカラムに取り込み)を使用して、ｍＡｂについて分析した。ＩｇＥ分析用のさらなる血清サンプルは、投与前１日目、投与後、０.５、６、１２、２４、４８、１４４時間目、第８、１６、２２および２９日目の投与後の０.５および１４４時間目、および研究終了時(第８２日目)、最終投与後の１２７２時間目(第３および４群)または１０８０時間目(第１および２群)に採取した。サンプルは、ＩｇＥ捕捉用のＩｇＧ−ＦｃεＲＩａおよび検出用のウサギ抗ヒトＩｇＥ(ＰＣＳ−接合体)によるイムノキャップシステム(ファディアＡＢ、ウプサラ、スウェーデン)を用いるイムノアッセイにより、遊離ＩｇＥについて分析した。
【０３５６】
８５日目、動物の終止により、最大限の巨視的検査を病理学者の全般的監督のもとに実施し、すべての病巣について記録した。絶対臓器重量および臓器：体重比を測定した。一連の臓器からの組織を集め、凍結保存したが、顕微鏡下での検査は実施しなかった(ただし、巨視的な異状または予定外の死亡例は例外、下記参照)。
【０３５７】
実施例８についての結果
一般的安全性の観察
３種すべてのｍＡｂは研究の全期間、健康障害の臨床的兆候を示さず、一般に十分に耐容性であった；例外として抗体１１を投与された１匹は、臨床症状の悪化と体重減少のため、スケジュールの進行に先立ち屍検に送った。この動物は回収期間に入っての悪化であり、これら動物の病態的または血液学的調査に際しては注目すべき知見はなかったため、観察された影響はｍＡｂが関わっているものとは信じられない。軟便または液状便の発生がすべての群で認められたが、これらの知見が投与量関連のものではなく、すべての動物にまたは同じ動物内でのすべての時点で見られたものでもなく、また投与と回収期間中にしばしば見られたことから、それらはｍＡｂ関連のものとは思われない。平均体重および平均体重獲得は、研究期間全般にわたり、各群内の動物の個々の変動を示した。しかし、すべての動物は処置期間に期待したとおりの体重を獲得し(ただし、１匹は上に考察したように例外)、群間に明瞭な差はなかった。絶対的または相対的臓器重量に対する明瞭な処置関連作用はいずれの群にも認めなかった。全般的な病理検査および微視的病理検査においては、検査した限定範囲の組織に、ｍＡｂ処置の影響を示唆するような何らの所見も認めなかった。
【０３５８】
トキシコキネティクス(ＴＫ)およびＩｇＥレベル
ＴＫの性差はこの研究で観察されなかった。一般に、その接触はこれら３種のｍＡｂについて同様であり、１〜１００ｍｇ／ｋｇの用量範囲の投与で直線的に現れた。抗体１１ ＩｇＧ１、抗体１１ ＩｇＧ２およびＥ４８の平均ＴＫプロファイルを図１２を示す。ＴＫに対する明瞭なＩｇＥ−低下作用は、最低用量レベルでも観察されなかった。これら３種の抗体のＴＫは、カニクイザルにおけるヒトＩｇＧにとって典型的であると思われた。
【０３５９】
最終１００ｍｇ／ｋｇ投与後の平均最大観察濃度(Ｃｍａｘ)は、抗体１１ ＩｇＧ１、抗体１１ ＩｇＧ２およびＥ４８について、それぞれ１８７００、１５９００および２４０００ｎＭであった。最終１００ｍｇ／ｋｇ投与後の平均終末ＴＫ半減期は、約１０〜１３日であった。これらの動物における霊長類抗ヒト抗体の潜在的発生により、ＴＫ接触が減少したという証拠はない。
【０３６０】
カニクイザルにおける種々投与レベルの抗体１１ ＩｇＧ１、抗体１１ ＩｇＧ２およびＥ４８の週ごとの投与後の平均遊離ＩｇＥプロファイルを図１３に示す。動物が最初の投与を受ける前の平均基線ＩｇＥは、抗体１１ ＩｇＧ１、抗体１１ ＩｇＧ２およびＥ４８群それぞれについて、５１４、４１４および６９０ｎｇ／ｍＬであった。第１日、１ｍｇ／ｋｇの用量は、投与の１時間後に遊離のＩｇＥを７５〜８０％減少させた。１ｍｇ／ｋｇ投与後の低接触のために、遊離ＩｇＥは１週間以内に基線レベルに戻った。より高い用量では、処置期間、遊離ＩｇＥが首尾一貫して抑制されるに至った。この研究の末期、２つの抗体１１群では遊離ＩｇＥが基線に戻る一方、Ｅ４８群における遊離のＩｇＥは抑制されたままであった。
【０３６１】
血小板に対する作用
３種のｍＡｂ(抗体１１ ＩｇＧ１、抗体１１ ＩｇＧ２またはＥ４８)は、いずれの動物においても、いずれの時点でも、血小板計数に有意な低下を誘発しなかった；例外として抗体１１ ＩｇＧ１を受けた１匹だけが、２９日目の単一時点(２８日目、３回目の１００ｍｇ／ｋｇ投与の２４時間後)で血小板の減少(３４.９％)を示した。３７日目、４回目の抗体１１ ＩｇＧ１および抗体１１ ＩｇＧ２の投与は、この動物において、またはこれら２群内のいずれの動物においても、さらに血小板を減少させることはなかった。
【０３６２】
図１４は第１群の動物(抗体１１ ＩｇＧ１で処置)からの血漿濃度に対する２回の前投与値の平均からパーセント変化といして表わした血小板数(×１０９／Ｌ)のプロットを示す。このプロットは血小板に対して有意な作用を示さなかった３群の他の１６匹の動物の代表である[抗体１１動物の場合の変化]。図１５は２９日目の血小板数における一過性の有意な降下(基線下３５％)を示した第１群(抗体１１ ＩｇＧ１−処置)の動物についての同じプロットを示す。
【０３６３】
興味深いことに、抗体１１ ＩｇＧ１−処置したサルは、２９日目の投与後に一過性の血小板数の低下を示しはしたが、この時には最高のＣｍａｘ値(２９４００ｎｍｏｌ／Ｌ)を有していた(しかし、接触ではない)。血漿レベルは引続き急速に低下し、血小板計数は投与前値に戻った。このことは、血漿濃度のより高い閾値が血小板数の低下を喚起することが要求されることの可能性を暗示するものである。しかし、１匹のＥ４８−処置動物は同様のレベル(２８５００ｎｍ／Ｌ)に達したが、相当する血小板作用はなかった(図１４)。他の血液学的作用。
【０３６４】
血小板計数を例外として(下記参照)、血液学的パラメーター(ヘモグロビン濃度、充填細胞量、平均細胞量、平均細胞ヘモグロビン濃度、赤血球分布幅、血小板臨界質量、血小板分布幅、赤血球数、平均細胞ヘモグロビン、ヘモグロビン分布幅、平均血小板量、網状赤血球計数、総量および分画白血球数)および血液凝固パラメーター(プロトロンビン時間、活性化部分トロンボプラスチン時間)の大部分について、ｍＡｂ処置の一貫した作用は認められなかった。網状赤血球数の増加がすべての群において観察されたが、しかしその変化は用量／接触に関係なく、また群内(群内の動物は投与前値より高いか、低いか、または未変化のレベルを有していた)または動物内(動物内の値が接触と無関係に時点間で上下した)で一貫性が見られず、また並行する対照群の不存在下、ｍＡｂ処置との関連性はこの時、十分に判定できない。いずれものかかる変化は一般に回収期間の終末点で逆転した。補体活性化(Ｃ５ａ、Ｃ３ａまたはＲＢフラグメント)に対する有意な処置関連作用は認めなかった。
【０３６５】
考察と結論
この研究は、抗ＩｇＥ ｍＡｂ、抗体１１ ＩｇＧ１、抗体１１ ＩｇＧ２およびＥ４８が、若年性カニクイザルに繰返し高用量レベル(１００ｍｇ／ｋｇまで)で投与した場合、有意な有害な毒性作用もなく、十分に耐容性であることを示すものであった。１８匹のサルの内、１匹のみが、１００ｍｇ／ｋｇの抗体１１ ＩｇＧ１の投与後の唯一の時点で、血小板数の有意な低下を示し、そのときのｍＡｂの血漿濃度は略３００００ｎｍｏｌ／Ｌに達していた。３種すべてのｍＡｂで到達した血漿Ｃｍａｘ濃度は、この研究で臨床的に達成されるであろう濃度をはるかに超えていると期待される(例えば、２００ｎｍｏｌ／Ｌ)。
【０３６６】
実施例９：
ＦｃεＲＩおよびＣＤ２３に対するＩｇＥ作用の機能的阻害
ＩｇＥとＦｃεＲＩおよびＣＤ２３の相互作用を機能的に阻害する最適化抗体１１の能力は、文献(Bracher et al. Journal Immunol. Methods 2007 323:160-171)から改良したＩｇＥ−仲介細胞殺作用アッセイにより評価した。ＩＬ−４で前処理したＵ９３７細胞は、ＦｃεＲＩおよびＣＤ２３の両方を発現することが示された。卵巣腫瘍細胞ＩＧＲＯＶ１細胞上で発現される抗原特異的ＩｇＥの存在下、ＩＧＲＯＶ１と同時培養した場合、Ｕ９３７細胞が腫瘍細胞を殺滅し得た。殺滅は細胞毒性および食作用メカニズムの両方が仲介した；このメカニズムはＵ９３７エフェクター細胞上、ＩｇＥとＦｃεＲＩおよびＣＤ２３とのそれぞれの相互作用を介して、引き金を引くことが示された。
【０３６７】
抗体１１およびイソ型対照はこのアッセイにより、ＦｃεＲＩまたはＣＤ２３を介するＩｇＥ−仲介殺滅の阻害について評価した。この方法についての詳細なプロトコールは材料と方法の項に用意する。簡単に説明すると、試験ＩｇＧの滴定液を標的特異的(ＭＯｖ１８)または非関連(ＮＩＰ)ＩｇＥと混合し、ＩＬ−４−刺激Ｕ９３７エフェクター細胞および標識化ＩＧＲＯＶ１標的細胞とインキュベートした。２.５時間のインキュベーションの後、細胞を洗い、抗ＣＤ８９−フィコエリスリン抗体(ＢＤバイオサイエンス)およびヨウ化プロピジウム(モレキュラープローブ)により染色した。洗浄後、細胞の蛍光をＦＡＣＳカリバー・フロー・サイトメーター(ＢＤバイオサイエンス)により分析した。上記の蛍光色素を用いて、細胞毒性により死滅した細胞および食作用により死滅した細胞から生存細胞を区別した。イソ型対照抗体とは対照的に、抗体１１はＩｇＥ／ＦｃεＲＩ−介在細胞毒性(図１６)およびＩｇＥ／ＣＤ２３−介在食作用(図１７)の両方を阻害し得た。
【０３６８】
材料と方法  −  実施例９
抗体はＵ９３７細胞によるＩｇＥ−仲介ＩＧＲＯＶ１腫瘍細胞死滅の阻害について評価した。ＩＧＲＯＶ１(ヒト卵巣癌腫細胞株)およびＵ９３７細胞(ヒト骨髄性単球細胞株)は、標準的組織培養手法を用い、培地[ＲＰＭＩ１６４０、１０％ｖ／ｖＦＣＳ、２ｍＭグルタミン、５０００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００ｕｇ／ｍｌストレプトマイシン(すべてインビトロゲンから)]に保持した。ＩＧＲＯＶ１細胞上に発現されるＦＢＰ(葉酸結合タンパク質)に対し向けられたＭＯｖ１８ ＩｇＥを腫瘍特異的抗体として使用した。ＮＩＰ(ヘプテン４−ヒドロキシ−３−ニトロ−フェナセチル)−特異的ＩｇＥを対照非関連抗体として使用した。ＮＯｖ１８およびＮＩＰ抗体は文献(Gould et al, (1999) Eur. J. Immunol. 29:3527-3537)記載どおりに調製した。
【０３６９】
Ｕ９３７細胞は、ＣＤ２３の発現を上流制御するために、死滅実験に先立つ４日間、１０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−４(Ｒ＆Ｄシステムズ)で前処理した。死滅実験の前日、ＩＧＲＯＶ１標的細胞を蛍光色素ＣＦＳＥ(カルボキシ−フルオレセイン・二酢酸スクシンイミジルエステル；モレキュラー・プローブス)で標識した。簡単に説明すると、細胞をトリプシン処理し(トリプシン／ＥＤＴＡ、ギブコ)、培地で洗浄し、ＰＢＳ中に、５０×１０６細胞／ｍｌとして再懸濁した。次いで、細胞を０.０１ｍＭのＣＦＳＥと３７℃で１０分間インキュベートした。標識後、細胞を氷冷培地中で１回洗い、次いで、５％ＣＯ２下、３７℃で一夜インキュベートした。
【０３７０】
抗体１１の阻害作用を評価するために、抗体希釈液を１２×７５ｍｍチューブ(ファルコン、ＢＤバイオサイエンス)中で調製し、２ｕｇのＭＯｖ１またはＮＩＰ ＩｇＥを加えて、最終容量８０ｕｌとした。この混合物を細胞なしで３０分間インキュベートした。ＩＬ−４刺激Ｕ９３７細胞を培地中で１回洗い、１.３３×１０６細胞／ｍｌに再懸濁した。ＣＦＳＥ−標識ＩＧＲＯＶ１細胞をトリプシン処理し、培地で１回洗い、４×１０５細胞／ｍｌに再懸濁した。この細胞を抗体(Ｕ９３７について１２０ｕｌおよびＩＧＲＯＶ１細胞については２００ｕｌ)を容れたチューブに加え、混合し、５％ＣＯ２下、３７℃で２.５時間インキュベートした。次いで、細胞を氷冷ＦＡＣＳバッファー(カルシウム／マグネシウム不含ＰＢＳ、５％正常ヤギ血清)で洗い、抗ＣＤ８９−フィコエリスリン抗体(ＢＤバイオサイエンス、１０ｕｇ／ｍｌ)と２５分間インキュベートしてＵ９３７エフェクター細胞を標識した。細胞を氷冷ＦＡＣＳバッファーでもう一度洗い、死亡した細胞を０.２５ｕｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム(モレキュラー・プローブス)の添加により染色した。４０℃で１５分後、細胞を氷冷ＦＡＣＳバッファーで洗い、２５０ｕｌの氷冷ＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、ＦＡＣＳカリバー・フロー・サイトメーター(ＢＤバイオサイエンス)を用いて、製造業者の指示書に従い、蛍光分析した。当該単一染色を示す細胞を用いて検出チャンネルの電位と補償を調整した(ＦＬ１、ＦＬ２およびＦＬ３)。
【０３７１】
本アッセイに使用する蛍光色素の組み合わせは、異なる細胞集団のゲート開閉を可能とした[生存エフェクター細胞(フィコエリスリン陽性)、食作用性ＩＧＲＯＶ１腫瘍細胞(フィコエリスリンおよびＣＦＳＥ陽性)、生存腫瘍細胞(ＣＦＳＥ陽性)、死腫瘍細胞(ＣＦＳＥおよびヨウ化プロピジウム陽性)、死エフェクター細胞(フィコエリスリンおよびヨウ化プロピジウム陽性)]。これらのゲートを使用して、ＦｃεＲＩ−仲介細胞毒性(方程式１)により、またはＣＤ２３−仲介食作用(方程式２)により死滅した標的細胞のパーセントを計算した。
【０３７２】
方程式１：  ％細胞毒性＝｛[(Ｒ１ＳＬ対照−Ｒ１)＋Ｒ３]／Ｒ１ＳＬ｝×１００
式中、
Ｒ１＝ＣＦＳＥ陽性腫瘍細胞の総数
Ｒ３＝死滅したが未処理の細胞数(断片化または食作用なし)
Ｒ１ＳＬ対照＝エフェクターの３種の対照サンプルおよび抗体をもたない標的細胞の平均Ｒ１(Ｒ１自発性消失対照)
【０３７３】
方程式２：  ％食作用＝(Ｒ２／Ｒ１ＳＬ対照)×１００
式中、
Ｒ２＝エフェクター細胞による食作用を受けた腫瘍細胞数
Ｒ１ＳＬ対照＝エフェクターの３種の対照サンプルおよび抗体をもたない標的細胞の平均Ｒ１(Ｒ１自発性消失対照)
【０３７４】
文献
本明細書のいずれかの個所で引用した文献は、上記のいずれかの個所で引用したものも含め、すべてその全文につきすべての目的のために、参照により本明細書の一部とする。
1 Haan & Maggos (2004) BioCentury, 12(5): A1-A6
2 Koide et al. (1998) Journal of Molecular Biology, 284: 1141-1151.
3 Nygren et al. (1997) Current Opinion in Structural Biology, 7: 463-469
4 Wess, L. In: BioCentury, The Bernstein Report on BioBusiness, 12(42), A1-A7, 2004
5 Kabat, E.A. et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4th Edition. US Department of Health and Human Services. 1987
6 Kabat, E.A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition. US Department of Health and Human Services, Public Service, NIH, Washington
7 Segal et al., PNAS, 71:4298-4302, 1974
8 Amit et al., Science, 233:747-753, 1986
9 Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901-917, 1987
10 Chothia et al., Nature, 342:877- 883, 1989
11 Caton et al., J. Immunol., 144:1965-1968, 1990
12 Sharon et al., PNAS, 87:4814-4817, 1990
13 Sharon et al., J. Immunol., 144:4863-4869, 1990
14 Kabat et al., J. Immunol., 147:1709-1719, 1991
15 Holliger & Hudson, Nature Biotechnology 23(9):1126-1136 2005
16 Kontermann, R & Dubel, S, Antibody Engineering, Springer-Verlag New York, LLC; 2001, ISBN: 3540413545
17 Mendez, M. et al. (1997) Nature Genet, 15(2): 146-156
18 Knappik et al. J. Mol. Biol. (2000) 296, 57-86
19 Krebs et al. Journal of Immunological Methods 254 2001 67-84
20 Ward, E.S. et al., Nature 341, 544-546 (1989)
21 McCafferty et al (1990) Nature, 348, 552-554
22 Holt et al (2003) Trends in Biotechnology 21, 484-490
23 Bird et al, Science, 242, 423-426, 1988
24 Huston et al, PNAS USA, 85, 5879-5883, 1988
25 Holliger, P. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448, 1993
26 Reiter, Y. et al, Nature Biotech, 14, 1239-1245, 1996
27 Hu, S. et al, Cancer Res., 56, 3055-3061, 1996
28 Holliger and Bohlen 1999 Cancer and metastasis rev. 18: 411-419
29 Holliger, P. and Winter G. Current Opinion Biotechnol 4, 446-449 1993
30 Glennie M J et al., 1987 J. Immunol. 139, 2367-2375
31 Repp R. et al., 1995 J. Hemat. 377-382
32 Staerz U. D. and Bevan M. J. 1986 PNAS 83
33 Suresh M. R. et al., 1986 Method Enzymol. 121: 210-228
34 Merchand et al., 1998 Nature Biotech. 16:677-681
35 Ridgeway, J. B. B. et al, Protein Eng., 9, 616-621, 1996
36 Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor N.Y., pp. 726, 1988
37 Kohler and Milstein, Nature, 256:495-497, 1975
38 Wold, et al. Multivariate data analysis in chemistry. Chemometrics -Mathematics and Statistics in Chemistry (Ed.: B. Kowalski), D. Reidel Publishing Company, Dordrecht, Holland, 1984 (ISBN 90-277-1846-6)
39 Norman et al. Applied Regression Analysis. Wiley-Interscience; 3rd edition (April 1998) ISBN: 0471170828
40 Kandel, Abraham & Backer, Eric. Computer-Assisted Reasoning in Cluster Analysis. Prentice Hall PTR, (May 11, 1995), ISBN: 0133418847
41 Krzanowski, Wojtek. Principles of Multivariate Analysis: A User’s Perspective (Oxford Statistical Science Series, No 22 (Paper)). Oxford University Press； (December 2000), ISBN： 0198507089
42 Witten, Ian H. & Frank, Eibe. Data Mining: Practical Machine Learning Tools and Techniques with Java Implementations. Morgan Kaufmann; (October 11, 1999), ISBN: 1558605525
43 Denison David G. T. (Editor), Christopher C. Holmes, Bani K. Mallick, Adrian F. M. Smith. Bayesian Methods for Nonlinear Classification and Regression (Wiley Series in Probability and Statistics). John Wiley & Sons; (July 2002), ISBN: 0471490369
44 Ghose, Arup K. & Viswanadhan, Vellarkad N.. Combinatorial Library Design and Evaluation Principles, Software, Tools, and Applications in Drug Discovery. ISBN: 0-8247-0487-8
45 Chothia C. et al. Journal Molecular Biology (1992) 227, 799-817
46 Al-Lazikani, et al. Journal Molecular Biology (1997) 273(4), 927-948
47 Chothia, et al. Science, 223,755-758 (1986)
48 Whitelegg, N.R.u. and Rees, A.R (2000). Prot. Eng., 12, 815-824
49 Guex, N. and Peitsch, M.C. Electrophoresis (1997) 18, 2714-2723
50 Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 405-410
51 Pearson and Lipman (1988) PNAS USA 85: 2444-2448
52 Smith and Waterman (1981) J. Mol Biol. 147: 195-197
53 Voet & Voet, Biochemistry, 2nd Edition, (Wiley) 1995.
54 Gram et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:3576-3580
55 Barbas et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91:3809-3813
56 Schier et al., 1996, J. Mol. Biol. 263:551-567
57 Marks et al Bio/Technology, 1992, 10:779-783
58 Kay, B.K., Winter, J., and McCafferty, J. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, San Diego: Academic Press
59 Hunter W. M. and Greenwood F. C. (1962) Nature 194:495
60 Plueckthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1991)
61 Chadd HE and Chamow SM (2001) Current Opinion in Biotechnology 12: 188-194
62 Andersen DC and Krummen L (2002) Current Opinion in Biotechnology 13: 117
63 Larrick JW and Thomas DW (2001) Current Opinion in Biotechnology 12:411-418
64 Sambrook and Russell, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 3rd edition, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press
65 Ausubel et al. eds., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 4th edition 1999
66 Robinson, J. R. ed., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, Marcel Dekker, Inc., New York, 1978
67 Ledermann J.A. et al. (1991) Int. J. Cancer 47: 659-664
68 Bagshawe K.D. et al. (1991) Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4: 915-922
69 Vaughan, T. J., et al. (1996). Nature Biotechnology 14, 309-314.
70 Hutchings, C. Generation of Naive Human Antibody Libraries, in Antibody Engineering, R. Kontermann and S. Dubel, Editors. 2001, Springer Laboratory Manuals, Berlin. p. 93
【０３７５】
【表２３】
2010518815.tif 000032
【０３７６】
【表２４】
2010518815.tif 000033
【０３７７】
【表２５】
2010518815.tif 000034
【０３７８】
【表２６】
2010518815.tif 000035
【図１】
2010518815.tif 000036
【図２】
2010518815.tif 000037
【図３】
2010518815.tif 000038
2010518815.tif 000039
2010518815.tif 000040
【図４】
2010518815.tif 000041
2010518815.tif 000042
2010518815.tif 000043
【図５】
2010518815.tif 000044
2010518815.tif 000045
【図６】
2010518815.tif 000046
2010518815.tif 000047
【図７】
2010518815.tif 000048
【図８】
2010518815.tif 000049
【図９】
2010518815.tif 000050
【図１０】
2010518815.tif 000051
【図１１】
2010518815.tif 000052
【図１２】
2010518815.tif 000053
【図１３】
2010518815.tif 000054
【図１４】
2010518815.tif 000055
【図１５】
2010518815.tif 000056
【図１６】
2010518815.tif 000057
【図１７】
2010518815.tif 000058
【配列表】
2010518815000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成21年10月13日(2009.10.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2010518815000001.app
【国際調査報告】
2010518815.tif 000396
2010518815.tif 000397
2010518815.tif 000398