(57)【要約】本発明は、癌を発症するように遺伝子的に改変されたトランスジェニックな非ヒト哺乳類動物を特徴とする。本発明はまた、染色体的に不安定な動物モデルを用いてヒトの癌に潜在的に関連する遺伝子または遺伝子エレメントを同定するための方法に関する。そのような遺伝子的改変に関する情報を使用して、癌治療の結果を予測し、治療効果を最大限にするために患者集団を階層化することができる。１つの態様において、本発明は、癌を発症するように遺伝子的に改変された非ヒトトランスジェニック哺乳類を提供し、この非トランスジェニック哺乳類は、この哺乳類に由来する癌細胞のゲノムが、遺伝子改変を有さない哺乳類における染色体構造異常の頻度よりも少なくとも５倍高い頻度において染色体構造異常を含む。
2010529834.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌を発症するように遺伝子的に改変された非ヒトトランスジェニック哺乳類であって、該哺乳類に由来する癌細胞のゲノムが、遺伝子改変を有さないそのような哺乳類における染色体構造異常の頻度よりも少なくとも５倍高い頻度において染色体構造異常を含む、哺乳類。
【請求項２】
げっ歯類である、請求項１記載の非ヒトトランスジェニック哺乳類。
【請求項３】
マウスである、請求項１記載の非ヒトトランスジェニック哺乳類。
【請求項４】
下記：
（ａ）ＤＮＡ修復機能に関与する蛋白質をコードする１つ以上の遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子およびテロメア長を合成し、そして維持する成分をコードする１つ以上の遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子；または、
（ｂ）ＤＮＡ修復機能に関与する蛋白質をコードする１つ以上の遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子およびＤＮＡ損傷チェックポイント蛋白質をコードする１つ以上の遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子；または、
（ｃ）ＤＮＡ損傷チェックポイント蛋白質をコードする１つ以上の遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子およびテロメア長を合成し、そして維持する成分をコードする１つ以上の遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子；
の操作された不活性化を含む、請求項１記載の非ヒトトランスジェニック哺乳類。
【請求項５】
前記ＤＮＡ修復機能に関与する蛋白質をコードする１つ以上の遺伝子が、非相同性の末端結合（ＮＨＥＪ）に関与する蛋白質、相同組み換えに関与する蛋白質、およびＤＮＡ修復ヘリカーゼからなる群より選択される、請求項４記載の非ヒトトランスジェニック哺乳類。
【請求項６】
前記関与する蛋白質がリガーゼ４、ＸＲＣＣ４、Ｈ２ＡＸ、ＤＮＡＰＫｃｓ、Ｋｕ７０、Ｋｕ８０、Ａｒｔｅｍｉｓ、Ｃｅｒｎｕｎｎｏｓ／ＸＬＦ、ＭＲＥ１１、ＮＢＳ１、およびＲＡＤ５０からなる群より選択されるＮＨＥＪである、請求項５記載の非ヒトトランスジェニック哺乳類。
【請求項７】
前記相同組み換えに関与する蛋白質がＲＡＤ５１、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５４、ＸＲＣＣ３、ＲＡＤ５１Ｃ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２（ＦＡＮＣＤ１）、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＢ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＤ２；ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦ、ＦＡＮＣＧ、ＦＡＮＣＪ（ＢＲＩＰ１／ＢＡＣＨ１）、ＦＡＮＣＬ、およびＦＡＮＣＭからなる群より選択される、請求項５記載の非ヒトトランスジェニック哺乳類。
【請求項８】
前記ＤＮＡ修復ヘリカーゼが、ＢＬＭおよびＷＲＮからなる群より選択される、請求項５記載の非ヒトトランスジェニック哺乳類。
【請求項９】
前記ＤＮＡ損傷チェックポイント蛋白質をコードする１つ以上の遺伝子がｐ５３、ｐ２１、ＡＰＣ、ＡＴＭ、ＡＴＲ、ＢＲＣＡ１、ＭＤＭ２、ＭＤＭ４、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、ＭＲＥ１１、ＮＢＳ１、ＲＡＤ５０、ＭＤＣ１、ＳＭＣ１、ＡＴＲＩＰ、およびクラスピンからなる群より選択される、請求項４記載の非ヒトトランスジェニック哺乳類。
【請求項１０】
テロメア長を合成または維持する成分をコードする１つ以上の遺伝子が、テロメア構造を維持する蛋白質である、請求項４記載の非ヒトトランスジェニック哺乳類。
【請求項１１】
前記テロメア構造を維持する蛋白質がＴＲＦ１、ＴＲＦ２、ＰＯＴ１ａ、ＰＯＴ１ｂ、ＲＡＰ１、ＴＩＮ２、およびＴＰＰ１からなる群より選択される、請求項１０記載の非ヒトトランスジェニック哺乳類。
【請求項１２】
前記哺乳類が低下したテロメラーゼ活性のために操作される、請求項１記載の非ヒトトランスジェニック哺乳類。
【請求項１３】
テロメラーゼ逆転写酵素（ｔｅｒｔ）遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化される、請求項４または１２記載の非ヒトトランスジェニック哺乳類。
【請求項１４】
前記テロメラーゼ逆転写酵素（ｔｅｒｔ）遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化される、請求項１３記載の非ヒトトランスジェニック哺乳類。
【請求項１５】
テロメラーゼＲＮＡ（ｔｅｒｃ）遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化される、請求項４または１２記載の非ヒトトランスジェニック哺乳類。
【請求項１６】
前記テロメラーゼＲＮＡ（ｔｅｒｃ）遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化される、請求項１５記載の非ヒトトランスジェニック哺乳類。
【請求項１７】
ｐ５３の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化される、請求項１、１２または１５の何れか１項に記載の非ヒトトランスジェニック哺乳類。
【請求項１８】
ｐ５３の両方の対立遺伝子が不活性化される、請求項１７記載の非ヒトトランスジェニック哺乳類。
【請求項１９】
毛細血管拡張性運動失調突然変異（ａｔｍ）遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化される、請求項１、１２、１５または１７の何れか１項に記載の非ヒトトランスジェニック哺乳類。
【請求項２０】
毛細血管拡張性運動失調突然変異（ａｔｍ）遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化される、請求項１、１２、１５または１７の何れか１項に記載の非ヒトトランスジェニック哺乳類。
【請求項２１】
前記哺乳類のゲノムが少なくとも１つの追加的な癌促進性の改変を含む、請求項１記載の非ヒトトランスジェニック哺乳類。
【請求項２２】
前記少なくとも１つの追加的な癌促進性の改変が活性化された癌遺伝子、不活性化された腫瘍抑制遺伝子、またはそれらの両方である、請求項２１記載の非ヒトトランスジェニック哺乳類。
【請求項２３】
前記活性化された癌遺伝子または前記不活性化された腫瘍抑制遺伝子が組み換え遺伝子である、請求項２２記載の非ヒトトランスジェニック哺乳類。
【請求項２４】
追加的な癌生成性の改変が誘導性である、請求項２１記載の非ヒトトランスジェニック哺乳類。
【請求項２５】
前記追加的な癌生成性の改変が組織特異性である、請求項２１記載の非ヒトトランスジェニック哺乳類。
【請求項２６】
前記追加的な癌生成性の改変がＫｒａｓ活性化である、請求項２２、２４、または２５記載の非ヒトトランスジェニック哺乳類。
【請求項２７】
Ｋｒａｓの活性化が膵臓特異的である、請求項２６記載の非ヒトトランスジェニック哺乳類。
【請求項２８】
ヒト癌に潜在的に関連する遺伝子または遺伝子エレメントの同定のための目的の染色体領域を同定する方法であって、非ヒト哺乳類由来の癌細胞の集団におけるＤＮＡコピー数の変化を同定する工程を含み、該非ヒト哺乳類のゲノムが、染色体不安定性を生じるように操作され、該ＤＮＡコピー数の変化の染色体領域が、ヒト癌に潜在的に関連する遺伝子または遺伝子エレメントの同定のための目的の染色体領域である、方法。
【請求項２９】
前記ＤＮＡコピー数の変化が再発性である、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
前記ＤＮＡコピー数の変化の再発が少なくとも２回である、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
前記ＤＮＡコピー数の変化がＤＮＡの増加である、請求項２８記載の方法。
【請求項３２】
前記ＤＮＡコピー数の変化がＤＮＡの減少である、請求項２８記載の方法。
【請求項３３】
前記非ヒト哺乳類のゲノムを操作して、
（ａ）ＤＮＡ修復機能に関与する蛋白質をコードする１つ以上の遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子およびテロメア長を合成し、そして維持する成分をコードする１つ以上の遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子；または、
（ｂ）ＤＮＡ修復機能に関与する蛋白質をコードする１つ以上の遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子およびＤＮＡ損傷チェックポイント蛋白質をコードする１つ以上の遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子；または、
（ｃ）ＤＮＡ損傷チェックポイント蛋白質をコードする１つ以上の遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子およびテロメア長を合成し、そして維持する成分をコードする１つ以上の遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子；
を不活性化する、請求項２８記載の方法。
【請求項３４】
前記ＤＮＡ修復機能に関与する蛋白質をコードする１つ以上の遺伝子が、非相同性の末端結合（ＮＨＥＪ）に関与する蛋白質、相同組み換えに関与する蛋白質、およびＤＮＡ修復ヘリカーゼからなる群より選択される、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記ＮＨＥＪに関与する蛋白質がリガーゼ４、ＸＲＣＣ４、Ｈ２ＡＸ、ＤＮＡＰＫｃｓ、Ｋｕ７０、Ｋｕ８０、Ａｒｔｅｍｉｓ、Ｃｅｒｎｕｎｎｏｓ／ＸＬＦ、ＭＲＥ１１、ＮＢＳ１、およびＲＡＤ５０からなる群より選択される、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
前記相同組み換えに関与する蛋白質がＲＡＤ５１、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５４、ＸＲＣＣ３、ＲＡＤ５１Ｃ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２（ＦＡＮＣＤ１）、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＢ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＤ２；ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦ、ＦＡＮＣＧ、ＦＡＮＣＪ（ＢＲＩＰ１／ＢＡＣＨ１）、ＦＡＮＣＬ、およびＦＡＮＣＭからなる群より選択される、請求項３４記載の方法。
【請求項３７】
前記ＤＮＡ修復ヘリカーゼが、ＢＬＭおよびＷＲＮからなる群より選択される、請求項３４記載の方法。
【請求項３８】
前記ＤＮＡ損傷チェックポイント蛋白質をコードする１つ以上の遺伝子がｐ５３、ｐ２１、ＡＰＣ、ＡＴＭ、ＡＴＲ、ＢＲＣＡ１、ＭＤＭ２、ＭＤＭ４、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、ＭＲＥ１１、ＮＢＳ１、ＲＡＤ５０、ＭＤＣ１、ＳＭＣ１、ＡＴＲＩＰ、およびクラスピンからなる群より選択される、請求項３３記載の方法。
【請求項３９】
テロメア長を合成または維持する成分をコードする１つ以上の遺伝子が、テロメア構造を維持する蛋白質である、請求項３３記載の方法。
【請求項４０】
前記テロメア構造を維持する蛋白質がＴＲＦ１、ＴＲＦ２、ＰＯＴ１ａ、ＰＯＴ１ｂ、ＲＡＰ１、ＴＩＮ２、およびＴＰＰ１からなる群より選択される、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
前記非ヒトトランスジェニック哺乳類が、低下したテロメラーゼ活性のために操作される、請求項２８記載の方法。
【請求項４２】
テロメラーゼ逆転写酵素（ｔｅｒｔ）遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が、前記非ヒトトランスジェニック哺乳類において不活性化される、請求項３３または４１記載の方法。
【請求項４３】
前記テロメラーゼ逆転写酵素遺伝子の両方の対立遺伝子が、前記非ヒトトランスジェニック哺乳類において不活性化される、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
テロメラーゼＲＮＡ（ｔｅｒｃ）遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化される、請求項３３または４１記載の方法。
【請求項４５】
テロメラーゼＲＮＡ遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化される、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
ｐ５３の少なくとも１つの対立遺伝子が、前記非ヒトトランスジェニック哺乳類において不活性化される、請求項２８、３３、３９、４１、４２または４４の何れか１項に記載の方法。
【請求項４７】
ｐ５３の両方の対立遺伝子が、前記非ヒトトランスジェニック哺乳類において不活性化される、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
毛細血管拡張性運動失調突然変異（ａｔｍ）遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が、前記非ヒトトランスジェニック哺乳類において不活性化される、請求項２８、３３、３９、４４または４６の何れか１項に記載の方法。
【請求項４９】
毛細血管拡張性運動失調突然変異（ａｔｍ）遺伝子の両方の対立遺伝子が、前記非ヒトトランスジェニック哺乳類において不活性化される、請求項４８の何れか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記非ヒトトランスジェニック哺乳類のゲノムが、追加的な癌促進性の改変を含む、請求項２８記載の方法。
【請求項５１】
前記追加的な癌促進性の改変が、活性化された癌遺伝子、不活性化された腫瘍抑制遺伝子、またはそれらの両方である、請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
前記活性化された癌遺伝子または該不活性化された腫瘍抑制遺伝子が組み換え遺伝子である、請求項５１記載の非ヒトトランスジェニック哺乳類。
【請求項５３】
追加的な癌生成性の改変が誘導性である、請求項５０記載の方法。
【請求項５４】
前記追加的な癌生成性の改変が組織特異性である、請求項５０記載の非ヒトトランスジェニック哺乳類。
【請求項５５】
前記追加的な癌生成性の改変がＫｒａｓ活性化である、請求項５１、５３または５４記載の非ヒトトランスジェニック哺乳類。
【請求項５６】
Ｋｒａｓの活性化が膵臓特異的である、請求項５５記載の非ヒトトランスジェニック哺乳類。
【請求項５７】
前記非ヒト哺乳類由来の癌細胞が固形腫瘍に由来する、請求項２８記載の方法。
【請求項５８】
前記固形腫瘍が造血系、間葉系または上皮系の起源のものである、請求項５７記載の方法。
【請求項５９】
前記非ヒト哺乳類由来の癌細胞が非固形腫瘍由来である、請求項２８記載の方法。
【請求項６０】
前記非ヒト哺乳類由来の癌細胞が、末端部黒子黒色腫、光線角化症、腺癌、腺様嚢胞癌、腺腫、腺肉腫、腺扁平上皮癌、副腎皮質癌、エイズ関連リンパ腫、肛門癌、退形成型神経膠腫、星状細胞腫瘍、星状細胞腫、バルトリン腺癌腫、基底細胞癌、胆道癌、骨癌、胆管癌、膀胱癌、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、乳癌、気管支腺癌腫、毛細管癌腫、カルチノイド、癌腫、癌肉腫、海綿状、中枢神経系のリンパ腫、大脳星状細胞腫、子宮頸癌、結合組織癌、胆管癌、軟骨肉腫、脈絡叢乳頭腫／癌腫、明細胞癌腫、結腸癌、結腸直腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、嚢胞腺腫、内胚葉洞腫瘍、子宮内膜過形成、子宮内膜間質部肉腫、類内膜腺癌、上衣、上衣細胞腫、類上皮、食道癌、ユーイング肉腫、生殖腺外生殖細胞腫瘍、眼癌、線維層、限局性結節過形成、胆嚢癌、神経節膠腫、胃癌、ガストリノーマ、生殖細胞腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍、多形性神経膠芽細胞腫、神経膠腫、グルカゴノーマ、頭部頸部癌、血管芽腫、血管内皮種、血管腫、肝細胞腺腫、肝臓腺腫症、肝細胞癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、視床下部および視路の神経膠腫、小児、インスリノーマ、上皮内新生物、上皮間扁平上皮細胞新生物、眼内黒色腫、上皮内新生物、侵襲性扁平上皮細胞癌腫、大細胞癌腫、島細胞癌腫、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、平滑筋肉腫、悪性黒子黒色腫、白血病関連障害、口唇および口腔の癌、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、悪性中皮腫、悪性胸腺腫、髄芽細胞腫、髄上皮腫、黒色腫、髄膜、メルケル細胞癌腫、中皮、転移癌腫、粘液性類表皮癌、多発性骨髄腫／プラズマ細胞新生物、菌状息肉腫、骨髄形成異常症候群、骨髄増殖性障害、鼻腔および副鼻腔の癌、鼻咽頭癌、神経芽腫、神経線維腫症、神経上皮腺癌結節黒色腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、燕麦細胞癌、稀突起神経膠、稀星状細胞腫、口腔癌、口腔咽頭癌、骨肉腫、膵臓ポリペプチド、卵巣癌、卵巣生殖細胞腫瘍、膵臓癌、乳頭血清腺癌、松果体細胞、下垂体腫瘍、プラズマ細胞腫、偽肉腫、肺芽腫、上皮小体癌、陰茎癌、褐色細胞腫、松果体およびテント上未分化神経外胚葉性腫瘍、下垂体腫瘍、プラズマ細胞新生物、胸膜肺芽腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、呼吸系の癌、網膜芽腫、横紋筋肉腫、肉腫、漿液癌腫、皮膚癌、小細胞癌腫、小腸癌、軟組織癌腫、ソマトスタチン分泌腫瘍、扁平上皮癌腫、扁平上皮細胞癌、胃癌、間質腫瘍、中皮下、表在拡大型黒色腫、テント上未分化神経外胚葉性腫瘍、精巣癌、甲状腺癌、未分化癌腫、尿道癌、子宮肉腫、ブドウ膜黒色腫、いぼ状癌、膣癌、ビポーマ、外陰部癌、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、十分に分化された癌腫、ならびにウイルムス腫瘍からなる群より選択される癌の型に由来する、請求項２８記載の方法。
【請求項６１】
前記非ヒト哺乳類がマウスである、請求項２８記載の方法。
【請求項６２】
ヒト癌に潜在的に関連する遺伝子または遺伝子エレメントの同定のための目的の染色体領域を同定する方法であって、非ヒト哺乳類由来の癌細胞の集団における染色体構造異常を同定する工程を含み、該非ヒト哺乳類のゲノムが染色体不安定性を生じるように操作され、該染色体構造異常を含有する染色体領域が、ヒト癌に潜在的に関連する遺伝子または遺伝子エレメントの同定のための目的の染色体領域である、方法。
【請求項６３】
前記非ヒト哺乳類由来の癌細胞の集団におけるＤＮＡコピー数の変化を同定する工程、および染色体構造異常およびＤＮＡコピー数の変化を含有する該非ヒト哺乳類の癌細胞のゲノム内の染色体領域を同定する工程を更に含み、染色体構造異常およびＤＮＡコピー数の変化を含有する該染色体領域が、ヒト癌に潜在的に関連する遺伝子または遺伝子エレメントの同定のための目的の染色体領域である、請求項６２記載の方法。
【請求項６４】
前記ＤＮＡコピー数の変化が再発性である、請求項６３記載の方法。
【請求項６５】
前記ＤＮＡコピー数の変化の再発が少なくとも２回である、請求項６４記載の方法。
【請求項６６】
前記ＤＮＡコピー数の変化の均一なコピー数セグメント境界を測定する工程を更に含む、請求項２８または６３記載の方法。
【請求項６７】
前記ＤＮＡコピー数の変化が再発性である、請求項６６記載の方法。
【請求項６８】
潜在的にヒトの癌に関連する遺伝子を同定するための方法であって、以下：
（ａ）請求項２８、６２または６３の方法により目的の染色体領域を同定する工程；
（ｂ）非ヒト哺乳類における目的の染色体領域内部の遺伝子または遺伝子エレメントを同定する工程；および、
（ｃ）工程（ｂ）において同定された遺伝子または遺伝子エレメントに相当するヒト遺伝子または遺伝子エレメントを同定する工程；
を含み、該ヒト遺伝子または遺伝子エレメントが、潜在的にヒトの癌に関連する遺伝子または遺伝子エレメントである、方法。
【請求項６９】
前記ヒト遺伝子が工程（ｂ）において同定された遺伝子または遺伝子エレメントに対してオーソロガス、パラロガス、または相同である、請求項６８記載の方法。
【請求項７０】
工程（ｂ）において同定された非ヒト哺乳類の遺伝子または遺伝子エレメント、工程（ｃ）において同定されたヒト遺伝子または遺伝子エレメント、またはそれらの両方における突然変異を検出する工程を更に含む、請求項６８記載の方法。
【請求項７１】
潜在的にヒト癌に関連する遺伝子または遺伝子エレメントを同定する方法であって、以下：
（ａ）非ヒト哺乳類に由来する癌細胞の集団におけるＤＮＡコピー数の変化を検出する工程であって、ここで該非ヒト哺乳類のゲノムはゲノム不安定性を生じるように操作される、工程；
（ｂ）工程（ａ）において検出されたＤＮＡコピー数の変化の境界内部に位置する遺伝子または遺伝子エレメントを同定する工程；
（ｃ）工程（ｂ）において同定された遺伝子または遺伝子エレメントに相当し、そしてヒト癌細胞中のＤＮＡコピー数の変化、または染色体構造異常の境界内部に位置するヒト遺伝子または遺伝子エレメントを同定する工程；
を含み、工程（ｃ）において同定されたヒト遺伝子または遺伝子エレメントが、ヒト癌に潜在的に関連する遺伝子または遺伝子エレメントである、方法。
【請求項７２】
前記ＤＮＡコピー数の変化が再発性である、請求項７１記載の方法。
【請求項７３】
潜在的にヒト癌に関連する遺伝子または遺伝子エレメントを同定する方法であって、以下：
（ａ）非ヒト哺乳類に由来する癌細胞の集団における染色体構造異常を検出する工程であって、ここで該非ヒト哺乳類のゲノムはゲノム不安定性を生じるように操作される、工程；
（ｂ）工程（ａ）において検出された染色体構造異常の部位に位置する遺伝子または遺伝子エレメントを同定する工程；
（ｃ）工程（ｂ）において同定された遺伝子または遺伝子エレメントに相当し、そしてヒト癌細胞中のＤＮＡコピー数の変化の境界内部、または染色体構造異常の部位に位置するヒト遺伝子または遺伝子エレメントを同定する工程；
を含み、工程（ｃ）において同定されたヒト遺伝子または遺伝子エレメントが、ヒト癌に潜在的に関連する遺伝子または遺伝子エレメントである、方法。
【請求項７４】
工程（ｂ）において同定された非ヒト哺乳類の遺伝子または遺伝子エレメント、工程（ｃ）において同定されたヒト遺伝子または遺伝子エレメント、またはそれらの両方における突然変異を検出する工程を更に含む、請求項７１または７３記載の方法。
【請求項７５】
コピー数のプロファイリング、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、ＰＣＲ、および核酸配列決定からなる群より選択される技術を用いて、前記ＤＮＡコピー数の変化を同定する、請求項２８、６３、７１または７３の何れか１項に記載の方法。
【請求項７６】
前記コピー数のプロファイリングが比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）である、請求項７５記載の方法。
【請求項７７】
前記ＣＧＨが、単一チャンネルハイブリダイゼーションプロファイリングまたは二重チャンネルハイブリダイゼーションプロファイリングである、請求項７６記載の方法。
【請求項７８】
前記ＣＧＨがアレイＣＧＨである、請求項７６記載の方法。
【請求項７９】
前記ＣＧＨが単一ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）ＣＧＨである、請求項７６記載の方法。
【請求項８０】
再発性の遺伝子コピー数の変化の最小共通領域（ＭＣＲ）を定義する工程を更に含む、請求項２８、６３、７１または７３の何れか１項に記載の方法。
【請求項８１】
前記ＭＣＲが２試料間のオーバーラップの境界により定義される、請求項８０記載の方法。
【請求項８２】
前記ＭＣＲが、ある単一の腫瘍の、少なくとも１つの他の腫瘍におけるより大きい改変のバックグラウンドに対する境界により定義される、請求項８０記載の方法。
【請求項８３】
前記ＭＣＲが１０Ｍｂ未満である、請求項８０記載の方法。
【請求項８４】
前記ＭＣＲが、±０．１５（ｌｏｇ２尺度）の最小のコピー数の変化の幅を有する、請求項８０記載の方法。
【請求項８５】
前記染色体構造異常がスペクトル核タイピング（ＳＫＹ）を用いて検出される、請求項６２、７１、または７３に記載の方法。
【請求項８６】
γ−セクレターゼ阻害剤療法に対して低下した応答を有する場合がある、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）を有する対象を同定するための方法であって、該対象に由来する腫瘍細胞におけるＦＢＸＷ７の発現または活性を検出することを含み、ここで対照と比較した場合のＦＢＸＷ７の低下した発現または活性が、該対象がγ−セクレターゼ阻害剤療法に対して低下した応答を有する場合があることを示す、方法。
【請求項８７】
前記対象がヒトである、請求項８６記載の方法。
【請求項８８】
前記対象に由来する腫瘍細胞中のＮＯＴＣＨ１の発現または活性を検出することを更に含み、ここで対照と比較した場合のＮＯＴＣＨ１の上昇した発現または活性が、該対象がγ−セクレターゼ阻害剤療法に対して低下した応答を有する場合があることを示す、請求項８６記載の方法。
【請求項８９】
前記対照が、前記対象に由来する同じ細胞型の非腫瘍細胞である、請求項８６または８８記載の方法。
【請求項９０】
ＦＢＸＷ７の発現または活性の低下が、ＦＢＸＷ７遺伝子の遺伝子改変により引き起こされる、請求項８６記載の方法。
【請求項９１】
ＦＢＸＷ７遺伝子の遺伝子改変が、少なくとも１つのＦＢＸＷ７遺伝子の欠失である、請求項９０記載の方法。
【請求項９２】
前記ＦＢＸＷ７遺伝子の遺伝子改変が、ＦＢＸＷ７遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子における突然変異である、請求項９０記載の方法。
【請求項９３】
ＦＢＸＷ７遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子における突然変異が、１つ以上のヌクレオチドの挿入または欠失である、請求項９２記載の方法。
【請求項９４】
１つ以上のヌクレオチドの欠失が、少なくとも１つのＦＢＸＷ７遺伝子の５’末端、３’末端またはそれらの両方からのトランケーションをもたらす、請求項９３記載の方法。
【請求項９５】
前記挿入または欠失が、ＦＢＸＷ７遺伝子の５’未翻訳領域、３’未翻訳領域、またはコーディング領域において生じる、請求項９３記載の方法。
【請求項９６】
ＦＢＸＷ７遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子における突然変異が、１つ以上のヌクレオチドの置換である、請求項９２記載の方法。
【請求項９７】
前記置換がＦＢＸＷ７遺伝子の５’未翻訳領域、３’未翻訳領域、またはコーディング領域において生じ、そして該コーディング領域における置換はアミノ酸変化をもたらす、請求項９６記載の方法。
【請求項９８】
ＦＢＸＷ７遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子における突然変異が、ミスセンス突然変異またはナンセンス突然変異である、請求項９２記載の方法。
【請求項９９】
ＦＢＸＷ７遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子における突然変異が、該ＦＢＸＷ７遺伝子の第３のＷＤ４０ドメインまたは第４のＷＤ４０ドメインにある、請求項９２記載の方法。
【請求項１００】
ＦＢＸＷ７遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子における突然変異が、Ｇ４２３Ｖ、Ｒ４６５Ｃ、Ｒ４６５Ｈ、Ｒ４７９Ｌ、Ｒ４７９Ｑ、Ｒ５０５ＣおよびＤ５２７Ｇからなる群より選択される、請求項９２記載の方法。
【請求項１０１】
低下したＦＢＸＷ７発現が、前記腫瘍細胞におけるＦＢＸＷ７  ｍＲＮＡレベルを計測することにより測定される、請求項８６記載の方法。
【請求項１０２】
低下したＦＢＸＷ７発現が、前記腫瘍細胞におけるＦＢＸＷ７蛋白質レベルを計測することにより測定される、請求項８６記載の方法。
【請求項１０３】
低下したＦＢＸＷ７発現が、前記腫瘍細胞におけるＦＢＸＷ７活性レベルを計測することにより測定される、請求項８６記載の方法。
【請求項１０４】
上昇したＮＯＴＣＨ１発現が、前記腫瘍細胞におけるＮＯＴＣＨ１  ｍＲＮＡレベルを計測することにより測定される、請求項８８記載の方法。
【請求項１０５】
上昇したＮＯＴＣＨ１発現が、前記腫瘍細胞におけるＮＯＴＣＨ１蛋白質レベルを計測することにより測定される、請求項８８記載の方法。
【請求項１０６】
上昇したＮＯＴＣＨ１発現が、細胞における切断核内（ＩＣＮ）型のＮＯＴＣＨ１蛋白質の検出；ＮＯＴＣＨ１により調節される標的遺伝子へのＩＣＮのＮＯＴＣＨ１の上昇した結合の検出により計測される、請求項８８記載の方法。
【請求項１０７】
上昇したＮＯＴＣＨ１発現が、前記腫瘍細胞におけるＮＯＴＣＨ１活性レベルを計測することにより測定される、請求項８８記載の方法。
【請求項１０８】
ＦＢＸＷ７の発現を上昇させる薬剤で前記対象を治療することを更に含む、請求項８６記載の方法。
【請求項１０９】
前記薬剤が組み換えＦＢＸＷ７蛋白質またはその機能的に活性なフラグメントもしくは誘導体である、請求項１０８記載の方法。
【請求項１１０】
前記薬剤がＦＢＸＷ７蛋白質またはその機能的に活性なフラグメントもしくは誘導体をコードする核酸である、請求項１０８記載の方法。
【請求項１１１】
ＰＩ３Ｋ経路阻害剤での治療から利益を被る場合がある、Ｔ−ＡＬＬを有する対象を同定するための方法であって、該対象に由来する腫瘍細胞中のＰＴＥＮの発現または活性を検出することを含み、ここで対照と比較した場合のＰＴＥＮの低下した発現または活性が、該対象がＰＩ３Ｋ阻害剤での治療から利益を被る場合があることを示す、方法。
【請求項１１２】
前記対象がヒトである、請求項１１１記載の方法。
【請求項１１３】
前記ＰＴＥＮの発現または活性の低下が、ＰＴＥＮ遺伝子の遺伝子改変により引き起こされる、請求項１１１記載の方法。
【請求項１１４】
前記ＰＴＥＮ遺伝子の遺伝子改変が、少なくとも１つのＰＴＥＮ遺伝子の欠失である、請求項１１３記載の方法。
【請求項１１５】
前記ＰＴＥＮ遺伝子の遺伝子改変が、ＰＴＥＮ遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子における突然変異である、請求項１１３記載の方法。
【請求項１１６】
前記ＰＴＥＮ遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子における突然変異が、１つ以上のヌクレオチドの挿入または欠失である、請求項１１５記載の方法。
【請求項１１７】
前記１つ以上のヌクレオチドの欠失が、少なくとも１つのＰＴＥＮ遺伝子の５’末端、３’末端またはそれらの両方からのトランケーションをもたらす、請求項１１６記載の方法。
【請求項１１８】
前記挿入または欠失が、ＰＴＥＮ遺伝子の５’未翻訳領域、３’未翻訳領域、またはコーディング領域において生じる、請求項１１６記載の方法。
【請求項１１９】
前記ＰＴＥＮ遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子における突然変異が、１つ以上のヌクレオチドの置換である、請求項１１５記載の方法。
【請求項１２０】
前記置換がＰＴＥＮ遺伝子の５’未翻訳領域、３’未翻訳領域、またはコーディング領域において生じ、そして該コーディング領域における置換はアミノ酸変化をもたらす、請求項１１９記載の方法。
【請求項１２１】
低下したＰＴＥＮ発現が、前記腫瘍細胞におけるＰＴＥＮ  ｍＲＮＡレベルを計測することにより測定される、請求項１１１記載の方法。
【請求項１２２】
低下したＰＴＥＮ発現が、前記腫瘍細胞におけるＰＴＥＮ蛋白質レベルを計測することにより測定される、請求項１１１記載の方法。
【請求項１２３】
低下したＰＴＥＮ発現が、前記腫瘍細胞におけるＰＴＥＮ活性レベルを計測することにより測定される、請求項１１１記載の方法。
【請求項１２４】
前記対象に由来する腫瘍細胞中のホスホＡＫＴレベルを検出することを更に含み、ここで対照と比較した場合の上昇したホスホＡＫＴレベルが、該対象がＰＩ３Ｋ阻害剤での治療から利益を被る場合があることを示す、請求項１１１記載の方法。
【請求項１２５】
前記対照が、該対象に由来する同じ細胞型の非腫瘍細胞である、請求項１１１または１２４記載の方法。
【請求項１２６】
ＰＴＥＮの発現を上昇させる薬剤で前記対象を治療することを更に含む、請求項１１１記載の方法。
【請求項１２７】
前記薬剤が、組み換えＰＴＥＮ蛋白質またはその機能的に活性なフラグメントもしくは誘導体である、請求項１２６記載の方法。
【請求項１２８】
前記薬剤が、ＰＴＥＮ蛋白質またはその機能的に活性なフラグメントもしくは誘導体をコードする核酸である、請求項１２６記載の方法。
【請求項１２９】
ＰＩ３Ｋ阻害剤で前記対象を治療することを更に含む、請求項１１１記載の方法。
【請求項１３０】
対象が癌に罹患しているか、または癌を発症する危険性を有するかどうかを評価する方法であって、該対象に由来する生物学的試料における、表１の増幅されたＭＣＲ中に位置する少なくとも１つの癌遺伝子または候補癌遺伝子の発現または活性のレベルを計測することを含み、ここで対照と比較した場合の該遺伝子の発現または活性の上昇が、該対象が癌に罹患しているか、または癌を発症する危険性を有することを示す、方法。
【請求項１３１】
対象が癌に罹患しているか、または癌を発症する危険性を有するかどうかを評価する方法であって、該対象に由来する生物学的試料における、表１の欠失したＭＣＲ中に位置する少なくとも１つの癌遺伝子または候補癌遺伝子の発現または活性のレベルを計測することを含み、ここで対照と比較した場合の該遺伝子の発現または活性の低下が、該対象が癌に罹患しているか、または癌を発症する危険性を有することを示す、方法。
【請求項１３２】
前記癌がリンパ腫である、請求項１３０または１３１記載の方法。
【請求項１３３】
前記リンパ腫がＴ−ＡＬＬである、請求項１３２記載の方法。
【請求項１３４】
対象が癌に罹患しているか、または癌を発症する危険性を有するかどうかを評価する方法であって、該方法が、該対象に由来する生物学的試料における、表１に列挙した少なくとも１つの増幅された最小共通領域（ＭＣＲ）のコピー数を測定することを含み、ここで該ＭＣＲの正常なコピー数と比較した場合の該試料中の該ＭＣＲの増大したコピー数が、該対象が癌に罹患しているか、または癌を発症する危険性を有することを示す、方法。
【請求項１３５】
対象が癌に罹患しているか、または癌を発症する危険性を有するかどうかを評価する方法であって、該方法が、該対象に由来する生物学的試料における、表１に列挙した少なくとも１つの欠失した最小共通領域（ＭＣＲ）のコピー数を測定することを含み、ここで該ＭＣＲの正常なコピー数と比較した場合の該試料中の該ＭＣＲの減少したコピー数が、該対象が癌に罹患しているか、または癌を発症する危険性を有することを示す、方法。
【請求項１３６】
前記癌がリンパ腫である、請求項１３４または１３５記載の方法。
【請求項１３７】
前記リンパ腫がＴ−ＡＬＬである、請求項１３６記載の方法。
【請求項１３８】
対象における癌の進行をモニタリングするための方法であって、該方法が、以下：
ａ）表１に列挙する癌遺伝子または候補癌遺伝子の発現または活性のレベルを、第１の時点における該対象由来の生物学的試料中で測定する工程；
ｂ）その後の時点において工程ａ）を反復する工程；および、
ｃ）工程ａ）およびｂ）における遺伝子の発現または活性を比較し、そしてそれから該対象における癌の進行をモニタリングする工程；
を含む、方法。
【請求項１３９】
前記癌がリンパ腫である、請求項１３８記載の方法。
【請求項１４０】
前記リンパ腫がＴ−ＡＬＬである、請求項１３９記載の方法。
【請求項１４１】
対象における癌を治療するための試験薬剤の薬効を評価する方法であって、該方法が、以下：
ａ）該試験薬剤の存在下、該対象由来の生物学的試料中の表１の増幅されたＭＣＲ中に位置する少なくとも１つの癌遺伝子または候補癌遺伝子の発現または活性のレベルを測定する工程；および、
ｂ）該試験薬剤の非存在下、該対象由来の生物学的試料中の該遺伝子の発現または活性のレベルを測定する工程；
を含み、ここで工程（ｂ）と比較した場合の工程（ａ）における該遺伝子の低下した発現または活性が、該対象における該癌を治療するための該試験薬剤の潜在的な薬効を示す、方法。
【請求項１４２】
対象における癌を治療するための試験薬剤の薬効を評価する方法であって、該方法が、以下：
ａ）該試験薬剤の存在下、該対象由来の生物学的試料中の表１の欠失したＭＣＲ中に位置する少なくとも１つの癌遺伝子または候補癌遺伝子の発現または活性のレベルを測定する工程；および、
ｂ）該試験薬剤の非存在下、該対象由来の生物学的試料中の該遺伝子の発現または活性のレベルを測定する工程；
を含み、ここで工程（ｂ）と比較した場合の工程（ａ）における該遺伝子の上昇した発現または活性が、該対象における該癌を治療するための該試験薬剤の潜在的な薬効を示す、方法。
【請求項１４３】
前記癌がリンパ腫である、請求項１４１または１４２記載の方法。
【請求項１４４】
前記リンパ腫がＴ−ＡＬＬである、請求項１４３記載の方法。
【請求項１４５】
対象における癌を治療するための療法の効力を評価する方法であって、該方法が、以下：
ａ）該対象に該療法の少なくとも一部分を提供する前に、該対象由来の生物学的試料中の表１の増幅されたＭＣＲ中に位置する少なくとも１つの癌遺伝子または候補癌遺伝子の発現または活性のレベルを測定する工程；および、
ｂ）該療法の一部分の提供の後の該対象由来の生物学的試料中の該遺伝子の発現または活性のレベルを測定する工程；
を含み、ここで工程（ｂ）と比較した場合の工程（ａ）における該遺伝子の低下した発現または活性が、該対象における該癌を治療するための該療法の潜在的な効力を示す、方法。
【請求項１４６】
対象における癌を治療するための療法の効力を評価する方法であって、該方法が、以下：
ａ）該対象に該療法の少なくとも一部分を提供する前に、該対象由来の生物学的試料中の表１の欠失したＭＣＲ中に位置する少なくとも１つの癌遺伝子または候補癌遺伝子の発現または活性のレベルを測定する工程；および、
ｂ）該療法の一部分の提供の後の該対象由来の生物学的試料中の該遺伝子の発現または活性のレベルを測定する工程；
を含み、ここで工程（ｂ）と比較した場合の工程（ａ）における該遺伝子の上昇した発現または活性が、該対象における該癌を治療するための該療法の潜在的な効力を示す、方法。
【請求項１４７】
前記癌がリンパ腫である、請求項１４５または１４６記載の方法。
【請求項１４８】
前記リンパ腫がＴ−ＡＬＬである、請求項１４７記載の方法。
【請求項１４９】
癌に罹患した対象を治療する方法であって、表１の増幅されたＭＣＲ中に位置する少なくとも１つの癌遺伝子または候補癌遺伝子の発現または活性のレベルを低下させる薬剤を該対象に投与することを含む、方法。
【請求項１５０】
癌に罹患した対象を治療する方法であって、表１の欠失したＭＣＲ中に位置する少なくとも１つの癌遺伝子または候補癌遺伝子の発現または活性のレベルを上昇させる薬剤を該対象に投与することを含む、方法。
【請求項１５１】
前記癌がリンパ腫である、請求項１４９または１５０記載の方法。
【請求項１５２】
前記リンパ腫がＴ−ＡＬＬである、請求項１５１記載の方法。
【請求項１５３】
前記薬剤が、表１に列挙する癌遺伝子または候補癌遺伝子に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項１４９または１５０記載の方法。
【請求項１５４】
対象が癌に罹患しているか、または癌を発症する危険性を有するかどうかを評価する方法であって、該方法が、該対象に由来する生物学的試料における、表５に列挙した少なくとも１つの最小共通領域（ＭＣＲ）のコピー数を測定することを含み、ここで該ＭＣＲの正常なコピー数と比較した場合の該試料中の該ＭＣＲのコピー数の変化が、該対象が癌に罹患しているか、または癌を発症する危険性を有することを示す、方法。
【請求項１５５】
前記癌がリンパ腫である、請求項１５４記載の方法。
【請求項１５６】
前記リンパ腫がＴ−ＡＬＬである、請求項１５５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
この出願は、200７年５月２１日に出願された米国仮出願第60/９３１，２９４号（この内容は、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益およびそれに対する優先権を主張する。
【０００２】
（政府支援）
本明細書に記載される研究は、認定番号ＣＡ８４６２８（ＲＯ１）およびＣＡ８４３１３（ＵＯ１）により全体および部分において資金援助されている。合衆国政府は、本発明における特定の権利を有する場合がある。
【０００３】
本発明は、一般的に癌遺伝子の発見のためのゲノム不安定な動物癌モデルの使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
癌は、突然変異の確率論的な獲得により駆動され、そして自然の選択により形状付与される遺伝的疾患である。多くのヒト癌の特徴であるゲノムの不安定性は、これらの突然変異を拡大し、調節不能な成長に至る臨界的な障壁を細胞が乗り越えることができるようにし、そしてこのため、悪性への転換における決定的事象を予測することになる。ゲノムの不安定性は、染色体異常、例えば転座および増幅により顕在化する。腫瘍進行の過程の間にどのようにして、かついつ、有意なゲノム不安定性が生じるか、そしてその時点の後に癌が治癒できるのか、またはなお含有されるのかが極めて重要で、大部分が未解決の問題となっている。
【０００５】
ヒト癌腫に関する動物モデルは、癌の治療の検討および開発のための価値ある手段である。自身のゲノムに取り込まれた癌遺伝子または抑制された腫瘍サプレッサー遺伝子を有するネズミモデルは、ヒト癌の研究のために広範に使用されている。しかしながら、ヒト癌遺伝子発見の取り組みの指針となるネズミモデルの最大の利用に対する障害は、大部分の標準的な癌の遺伝子操作マウスモデルの相対的に良性の細胞遺伝的なプロファイルである（例えば、非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４参照）。これらのモデルはヒト癌の多くの型に関連する全般的な染色体異常を反映していない。
【０００６】
ヒト癌の過剰な染色体不安定性をより緊密に模倣している、数種の癌易発症性のネズミモデルが最近開発されている。例えば、Ａｒｔａｎｄｉ等は、テロメラーゼ定義ｐ５３突然変異体マウスモデルにおける上皮癌の発症を記載しており（非特許文献５）；Ｚｈｕ等は、ｐ５３および非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の両方が欠損しているマウスモデルにおける癌遺伝子の転座および増幅を記載しており（非特許文献６）；Ｏｌｉｖｅ等は、優性ｐ５３突然変異体対立遺伝子を有するリー・フラウメニ症候群マウスモデルを記載しており（非特許文献７）；Ｌａｎｇ等は、ｐ５３ミスセンス突然変異を有するリー・フラウメニ症候群マウスモデルを記載しており（非特許文献８）；そしてＨｉｎｇｏｒａｎｉ等は、ＴＰ５３およびＫＲＡＳ２の突然変異体型を発現する膵臓腺管癌のマウスモデルを記載している（非特許文献９）。しかしながら、これらのマウスモデルにおける染色体異常の頻度は相対的に低値であり、そしてトランスジェニックマウスは必ずしも悪性の癌を発症しない。癌ゲノム解析を促進するためには、ヒト癌に匹敵する頻度の染色体異常を有する、癌を発症するように遺伝子的に改変された新しい哺乳類モデルを作成する必要がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｎ．Ｂａｒｄｅｅｓｙ等、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（２００６）１０３（１５），５９４７
【非特許文献２】Ｍ．Ｋｉｍ等、Ｃｅｌｌ（２００６）１２５（７），１２６９
【非特許文献３】Ｌ．Ｚｅｎｄｅｒ等、Ｃｅｌｌ（２００６）１２５（７），１２５３
【非特許文献４】Ａ．Ｓｗｅｅｔ−Ｃｏｒｄｅｒｏ等、Ｇｅｎｅｓ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ（２００６）４５（４），３３８
【非特許文献５】Ａｒｔａｎｄｉ等、Ｎａｔｕｒｅ（２０００）４０６（６７９６），６４１
【非特許文献６】Ｚｈｕ等、Ｃｅｌｌ（２００２）１０９（７），８１１
【非特許文献７】Ｏｌｉｖｅ等、Ｃｅｌｌ（２００４）１１９（６），８４７
【非特許文献８】Ｌａｎｇ等、Ｃｅｌｌ（２００４）１１９（６），８６１
【非特許文献９】Ｈｉｎｇｏｒａｎｉ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ（２００５）７（５），４６９
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
高度に再配列され突然変異された癌ゲノムは、癌の過程を駆動する病因事象の同定における重大な難点を呈している。本明細書において、本発明者等は、癌遺伝子の発見における動物モデルの利用性および癌関連コピー数変化における異種間のオーバーラップの程度を評価するために、染色体不安定性を有するリンパ腫易発症性のマウスを操作した。ターゲティングされた再配列決定との統合で、本発明者等の比較癌ゲノム試験によって、ヒトＴ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫（Ｔ−ＡＬＬ）における共通して欠失または突然変異された腫瘍サプレッサーとしてＦＢＸＷ７およびＰＴＥＮを同定した。より一般的には、ネズミ癌は、ヒトＴ−ＡＬＬのみならず造血系、間葉系および上皮系型の多様な腫瘍中に存在する改変にシンテニーな遺伝子座をターゲティングする広範な再発性のクローン増幅および欠失を獲得する。即ちこれらの結果は、ネズミおよびヒトの腫瘍は、悪性の表現型に向かって進化するに従い、オーソロガスな遺伝子事象により駆動される共通の生物学的過程を経験しているという見解を裏付けている。ゲノム事象の高度に一致する性質は、ヒト癌において生物学的に関連性のある駆動事象の発見におけるゲノム不安定な動物癌モデルの使用を促すものである。
【０００９】
１つの態様において、本発明は、癌を発症するように遺伝子的に改変された非ヒトトランスジェニック哺乳類であって、哺乳類に由来する癌細胞のゲノムが、遺伝子改変を有さないそのような哺乳類における染色体構造異常の頻度よりも少なくとも５倍高い頻度において染色体構造異常を含むような、非トランスジェニック哺乳類を提供する。特定の実施形態においては、哺乳類はげっ歯類である。特定の実施形態においては、哺乳類はマウスである。
【００１０】
特定の実施形態においては、哺乳類は、ＤＮＡ修復機能に関与する蛋白質（例えば非相同末端結合（ＮＨＥＪ）に関与する蛋白質、相同組み換えに関与する蛋白質、またはＤＮＡ修復ヘリカーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子、およびテロメア長を合成および維持する成分をコードする１つ以上の遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子の操作された不活性化を含む。あるいは、哺乳類は、ＤＮＡ修復機能に関与する蛋白質をコードする１つ以上の遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子、および、ＤＮＡ損傷チェックポイント蛋白質をコードする１つ以上の遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子の操作された不活性化を含んでよい。あるいは、哺乳類は、ＤＮＡ損傷チェックポイント蛋白質をコードする１つ以上の遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子、およびテロメア長を合成および維持する成分をコードする１つ以上の遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子の操作された不活性化を含んでよい。
【００１１】
特定の実施形態においては、哺乳類のゲノムは更に、活性化された癌遺伝子、不活性化された腫瘍抑制遺伝子、またはそれらの両方のような、少なくとも１つの追加的な癌促進性の改変を含む。
【００１２】
別の態様において、ヒト癌に潜在的に関連する遺伝子または遺伝子エレメントの同定のための目的の染色体領域を同定する方法であって、染色体不安定性を生じるように操作された非ヒト哺乳類由来の癌細胞の集団におけるＤＮＡコピー数の変化を同定する工程を含む、方法を提供する。ＤＮＡコピー数の変化の染色体領域は、ヒト癌に潜在的に関連する遺伝子または遺伝子エレメントの同定のための目的の染色体領域である。
【００１３】
特定の実施形態においては、ＤＮＡコピー数の変化は、非ヒト哺乳類由来の２つ以上の癌細胞において再発性である。ＤＮＡコピー数の変化はＤＮＡの増加またはＤＮＡの減少であり得る。
【００１４】
別の態様において、ヒト癌に潜在的に関連する遺伝子または遺伝子エレメントの同定のための目的の染色体領域を同定する方法であって、染色体不安定性を生じるように操作された非ヒト哺乳類由来の癌細胞の集団における染色体構造異常を同定する工程を含む、方法を提供する。染色体構造異常を含有する染色体領域は、ヒト癌に潜在的に関連する遺伝子または遺伝子エレメントを同定するための目的の染色体領域である。
【００１５】
特定の実施形態においては、該方法は更に、（１）非ヒト哺乳類由来の癌細胞の集団におけるＤＮＡコピー数の変化を同定する工程、および（２）染色体構造異常およびＤＮＡコピー数の変化を含有する非ヒト哺乳類の癌細胞のゲノム内の染色体領域を同定する工程を含む。染色体構造異常およびＤＮＡコピー数の変化を含有する染色体領域は、ヒト癌に潜在的に関連する遺伝子または遺伝子エレメントの同定のための目的の染色体領域である。特定の実施形態においては、該方法は更に、ＤＮＡコピー数の変化の均一なコピー数のセグメントの境界を測定する工程を含む。
【００１６】
別の態様において、本発明は、潜在的にヒトの癌に関連する遺伝子を同定するための方法であって、以下の工程：（ａ）目的の染色体領域（例えばヒト癌に潜在的に関連する遺伝子または遺伝子エレメントを含むもの）を同定すること；（ｂ）非ヒト哺乳類における目的の染色体領域内部の遺伝子または遺伝子エレメントを同定すること；および、（ｃ）工程（ｂ）において同定された遺伝子または遺伝子エレメントに相当するヒト遺伝子または遺伝子エレメントを同定することを含む、方法を提供する。ヒト遺伝子または遺伝子エレメントは潜在的にヒトの癌に関連する遺伝子または遺伝子エレメントである。特定の実施形態においては、ヒト遺伝子は工程（ｂ）において同定された遺伝子または遺伝子エレメントに対してオーソロガス、パラロガス、または相同である。特定の実施形態においては、該方法は更に、工程（ｂ）において同定された非ヒト哺乳類の遺伝子または遺伝子エレメント、工程（ｃ）において同定されたヒト遺伝子または遺伝子エレメント、またはそれらの両方における突然変異を検出する工程を含む。
【００１７】
別の態様において、本発明は、潜在的にヒト癌に関連する遺伝子または遺伝子エレメントを同定する方法であって、以下の工程：（ａ）ゲノム不安定性を生じるように操作された非ヒト哺乳類に由来する癌細胞の集団におけるＤＮＡコピー数の変化を検出すること、（ｂ）工程（ａ）において検出されたＤＮＡコピー数の変化の境界内部に位置する遺伝子または遺伝子エレメントを同定すること、および（ｃ）工程（ｂ）において同定された遺伝子または遺伝子エレメントに相当し、そしてヒト癌細胞中のＤＮＡコピー数の変化、または染色体構造異常の境界内部に位置するヒト遺伝子または遺伝子エレメントを同定することを含む、方法を提供する。工程（ｃ）において同定されたヒト遺伝子または遺伝子エレメントは、ヒト癌に潜在的に関連する遺伝子または遺伝子エレメントである。
【００１８】
別の態様において、本発明は、潜在的にヒト癌に関連する遺伝子または遺伝子エレメントを同定する方法であって、以下の工程：（ａ）ゲノム染色体不安定性を生じるように操作された非ヒト哺乳類に由来する癌細胞の集団における染色体構造異常を検出すること、（ｂ）工程（ａ）において検出された染色体構造異常の部位に位置する遺伝子または遺伝子エレメントを同定すること、および（ｃ）工程（ｂ）において同定された遺伝子または遺伝子エレメントに相当し、そしてヒト癌細胞中のＤＮＡコピー数の変化の境界内部に、または染色体構造異常の部位に位置するヒト遺伝子または遺伝子エレメントを同定することを含む、方法を提供する。工程（ｃ）において同定されたヒト遺伝子または遺伝子エレメントは、ヒト癌に潜在的に関連する遺伝子または遺伝子エレメントである。特定の実施形態においては、該方法は更に、工程（ｂ）において同定された非ヒト哺乳類の遺伝子または遺伝子エレメント、工程（ｃ）において同定されたヒト遺伝子または遺伝子エレメント、またはそれらの両方における突然変異を検出する工程を含む。
【００１９】
特定の実施形態においては、該方法は、再発性の遺伝子コピー数の変化の最小共通領域（ＭＣＲ）を定義する工程を更に含む。特定の実施形態においては、ＭＣＲは２つ以上の試料の間のオーバーラップの境界により定義される。特定の実施形態においては、ＭＣＲは、ある単一の腫瘍の少なくとも１つの他の腫瘍におけるより大きい改変のバックグラウンドに対する境界により定義される。
【００２０】
別の態様において、本発明は、γ−セクレターゼ阻害剤療法に対して低下した応答を有する場合がある、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）を有する対象を同定するための方法であって、該対象に由来する腫瘍細胞におけるＦＢＸＷ７の発現または活性を検出することを含む、方法を提供する。対照と比較した場合のＥＢＸＷ７の低下した発現または活性は、該対象がγ−セクレターゼ阻害剤療法に対して低下した応答を有する場合があることを示している。
【００２１】
特定の実施形態においては、該方法は更に、対象に由来する腫瘍細胞中のＮＯＴＣＨ１の発現または活性を検出することを含む。対照と比較した場合のＮＯＴＣＨ１の上昇した発現または活性は、該対象がγ−セクレターゼ阻害剤療法に対して低下した応答を有する場合があることを示している。
【００２２】
別の態様において、本発明は、ＰＩ３Ｋ経路阻害剤での治療から利益を被る場合がある、Ｔ−ＡＬＬを有する対象を同定するための方法であって、該対象に由来する腫瘍細胞中のＰＴＥＮの発現または活性を検出することを含む、方法を提供する。対照と比較した場合のＰＴＥＮの低下した発現または活性は、該対象がＰＩ３Ｋ阻害剤での治療から利益を被る場合があることを示している。特定の実施形態においては、該方法は更にＰＩ３Ｋ阻害剤で該対象を治療することを含む。
【００２３】
別の態様において、本発明は、対象が癌に罹患しているか、または癌を発症する危険性を有するかどうかを評価する方法であって、該対象に由来する生物学的試料における、表１の増幅されたＭＣＲ中に位置する少なくとも１つの癌遺伝子または候補癌遺伝子の発現または活性のレベルを測定することを含む、方法を提供する。対照と比較した場合の遺伝子の発現または活性の上昇は、該対象が癌に罹患しているか、または癌を発症する危険性を有することを示している。あるいは、対照と比較した場合に、表１の欠失したＭＣＲ中に位置する癌遺伝子または候補癌遺伝子の発現または活性のレベルの低下がある場合は、低下した発現または活性のレベルはまた、該対象が癌に罹患しているか、または癌を発症する危険性を有することを示している。
【００２４】
別の態様において、本発明は、対象が癌に罹患しているか、または癌を発症する危険性を有するかどうかを評価する方法であって、該方法が、該対象に由来する生物学的試料における、表１に列挙した少なくとも１つの増幅された最小共通領域（ＭＣＲ）のコピー数を測定することを含む、方法を提供する。ＭＣＲの正常なコピー数と比較した場合の試料中のＭＣＲの増大したコピー数は、該対象が癌に罹患しているか、または癌を発症する危険性を有することを示している。あるいは、ＭＣＲの正常なコピー数と比較した場合の試料中の欠失したＭＣＲ（同じく表１に列挙）の減少したコピー数は、該対象が癌に罹患しているか、または癌を発症する危険性を有することを示している。ＭＣＲの正常なコピー数は、典型的には染色体当たり１つである。
【００２５】
別の態様において、本発明は、対象における癌の進行をモニタリングするための方法であって、該方法が以下の工程：ａ）表１に列挙する癌遺伝子または候補癌遺伝子の発現または活性のレベルを、第１の時点において該対象由来の生物学的試料中で測定すること；ｂ）その後の時点において工程ａ）を反復すること；およびｃ）工程ａ）およびｂ）における遺伝子の発現または活性を比較すること、そしてそれから該対象における癌の進行をモニタリングすることを含む、方法を提供する。
【００２６】
別の態様において、本発明は、対象における癌を治療するための試験薬剤の薬効を評価する方法であって、以下の工程：ａ）試験薬剤の存在下、該対象由来の生物学的試料中の表１の増幅されたＭＣＲ中に位置する少なくとも１つの癌遺伝子または候補癌遺伝子の発現または活性のレベルを測定すること；およびｂ）試験薬剤の非存在下、該対象由来の生物学的試料中の遺伝子の発現または活性のレベルを測定することを含む、方法試験薬剤を提供する。工程（ｂ）と比較した場合の工程（ａ）における遺伝子の低下した発現または活性は、該対象における癌を治療するための試験薬剤の潜在的な薬効を示している。あるいは、試験薬剤が表１における欠失したＭＣＲ中に位置する少なくとも１つの癌遺伝子または候補癌遺伝子の発現または活性を上昇させる場合、該試験薬剤はまた、該対象における癌を治療するために潜在的に有効である。
【００２７】
別の態様において、本発明は、対象における癌を治療するための療法の効力を評価する方法であって、以下の工程：ａ）該対象に療法の少なくとも一部分を提供する前に、該対象由来の生物学的試料中の表１の増幅されたＭＣＲ中に位置する少なくとも１つの癌遺伝子または候補癌遺伝子の発現または活性のレベルを測定すること；およびｂ）該療法の一部分の提供の後の該対象由来の生物学的試料中の遺伝子の発現または活性のレベルを測定することを含む、方法を提供する。工程（ｂ）と比較した場合の工程（ａ）における遺伝子の低下した発現または活性は、該対象における癌を治療するための療法の効力を示している。あるいは、療法が表１における欠失したＭＣＲ中に位置する少なくとも１つの癌遺伝子または候補癌遺伝子の発現または活性を上昇させる場合、該療法はまた、対象における癌を治療するために潜在的に有効である。
【００２８】
別の態様において、本発明は癌に罹患した対象を治療する方法であって、表１の増幅されたＭＣＲ中に位置する少なくとも１つの癌遺伝子または候補癌遺伝子の発現または活性のレベルを低下させる薬剤を該対象に投与することを含む、方法を提供する。あるいは、本発明は、癌に罹患した対象を治療する方法であって、表１の欠失したＭＣＲ中に位置する少なくとも１つの癌遺伝子または候補癌遺伝子の発現または活性のレベルを上昇させる薬剤を該対象に投与することを含む、方法を提供する。
【００２９】
特定の実施形態においては、該薬剤は、表１に列挙する癌遺伝子または候補癌遺伝子に特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合フラグメントである。
【００３０】
別の態様において、本発明は、対象が癌に罹患しているか、または癌を発症する危険性を有するかどうかを評価する方法であって、該対象に由来する生物学的試料における、表５に列挙した少なくとも１つの最小共通領域（ＭＣＲ）のコピー数を測定することを含む、方法を提供する。ＭＣＲの正常なコピー数と比較した場合の、試料中のＭＣＲのコピー数の変化は、該対象が癌に罹患しているか、または癌を発症する危険性を有することを示している。ＭＣＲの正常なコピー数は、典型的には染色体当たり１つである。
【００３１】
特定の実施形態においては、癌はリンパ腫である。特定の実施形態においては、リンパ腫はＴ−ＡＬＬである。
【００３２】
別の態様において、本発明は、ゲノム不安定性非ヒト哺乳類モデル（本発明のゲノム不安定性マウスモデルを包含する）を用いて同定されたＭＣＲのコピー数を、ＭＣＲの正常なコピー数と比較することにより、対象が癌に罹患しているか、または癌を発症する危険性を有するかどうかを評価する方法を提供する。ＭＣＲの正常なコピー数は、典型的には染色体当たり１つである。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１Ａ】ＴＫＯ腫瘍のスペクトル核型（ＳＫＹ）プロファイル。テロメア機能不全を伴うか伴わない、選択されたＴＫＯ腫瘍に関する代表的な中期のＧバンドおよびＳＫＹ画像。図１Ａは、Ｇ０（ｍＴｅｒｃ＋／＋または＋／−）を示し、図１Ｂは、Ｇ１−Ｇ４（ｍＴｅｒｃ−／−）ＴＫＯ腫瘍を示す。写真はテロメア機能不全を有するＴＫＯ腫瘍における染色体構造異常の頻度の全体的上昇を示す。非相互転座および染色体フラグメントは矢印で示す。図１Ｃは、合成ネズミＴＫＯ（左；Ａ６８９）およびヒト（右；ＨＰＢ−ＡＬＬ）ＴＣＲＢ欠失の代表的なアレイＣＧＨのＬｏｇ２比のプロットを示す。Ｙ軸、コピー数のｌｏｇ２比（通常はｌｏｇ２＝０に設定）；この軸に対して増幅は上、欠失は下となる；Ｘ軸、染色体位置。
【図１Ｂ】ＴＫＯ腫瘍のスペクトル核型（ＳＫＹ）プロファイル。テロメア機能不全を伴うか伴わない、選択されたＴＫＯ腫瘍に関する代表的な中期のＧバンドおよびＳＫＹ画像。図１Ａは、Ｇ０（ｍＴｅｒｃ＋／＋または＋／−）を示し、図１Ｂは、Ｇ１−Ｇ４（ｍＴｅｒｃ−／−）ＴＫＯ腫瘍を示す。写真はテロメア機能不全を有するＴＫＯ腫瘍における染色体構造異常の頻度の全体的上昇を示す。非相互転座および染色体フラグメントは矢印で示す。図１Ｃは、合成ネズミＴＫＯ（左；Ａ６８９）およびヒト（右；ＨＰＢ−ＡＬＬ）ＴＣＲＢ欠失の代表的なアレイＣＧＨのＬｏｇ２比のプロットを示す。Ｙ軸、コピー数のｌｏｇ２比（通常はｌｏｇ２＝０に設定）；この軸に対して増幅は上、欠失は下となる；Ｘ軸、染色体位置。
【図１Ｃ】ＴＫＯ腫瘍のスペクトル核型（ＳＫＹ）プロファイル。テロメア機能不全を伴うか伴わない、選択されたＴＫＯ腫瘍に関する代表的な中期のＧバンドおよびＳＫＹ画像。図１Ａは、Ｇ０（ｍＴｅｒｃ＋／＋または＋／−）を示し、図１Ｂは、Ｇ１−Ｇ４（ｍＴｅｒｃ−／−）ＴＫＯ腫瘍を示す。写真はテロメア機能不全を有するＴＫＯ腫瘍における染色体構造異常の頻度の全体的上昇を示す。非相互転座および染色体フラグメントは矢印で示す。図１Ｃは、合成ネズミＴＫＯ（左；Ａ６８９）およびヒト（右；ＨＰＢ−ＡＬＬ）ＴＣＲＢ欠失の代表的なアレイＣＧＨのＬｏｇ２比のプロットを示す。Ｙ軸、コピー数のｌｏｇ２比（通常はｌｏｇ２＝０に設定）；この軸に対して増幅は上、欠失は下となる；Ｘ軸、染色体位置。
【図２】ＴＫＯモデルの特性化。図２Ａは、ｐ５３野生型、ヘテロ接合およびヌルバックグラウンドに対するＧ３−Ｇ４ＴＫＯマウスに関する胸腺リンパ腫非含有生存のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線を示すグラフである。図２Ｂは、ＰＣＲを用いたｐ５３に関するヘテロ接合性の損失を示す；Ｎ、正常；Ｔ、腫瘍。図２Ｃは、細胞表面マーカーＣＤ４およびＣＤ８に対する抗体を用いたＴＫＯ腫瘍の代表的ＦＡＣＳプロファイルである。図２Ｄは、Ｇ０（上）およびＧ１−Ｇ４（下）の胸腺リンパ腫からの中期スプレッドより得られた代表的なＳＫＹ画像である。等しい数量の中期スプレッド（９０）のうち、４５３３染色体当たり４１０異常（９％）がＧ０で観察されたのに対し、Ｇ１−Ｃ４ＴＫＯ腫瘍では３６５９中１２５４（３４％）であった。倍数性のレベルには有意差は観察されなかった。図２Ｅは、Ｇ０（青）およびＧ１−Ｇ４（赤）の胸腺リンパ腫におけるＳＫＹにより検出された細胞遺伝的異常の総数の定量を示すプロットである。暗色は非相互転座を示す事象の比率を示し、そして明色は二動原体／ロバートソニアン様再配列を表す比率を示す。図２Ｆは、３５ＴＫＯリンパ腫に関するアレイＣＧＨにより定義されたＣＮＡの再発プロットである。Ｘ軸は各染色体の物理的位置を示し、そしてＹ軸はコピー数の変化を示す腫瘍の％を示す。各遺伝子座の獲得、増幅、損失および欠失を保有している腫瘍のパーセントを以下のスキームにより、即ち暗赤色（ｌｏｇ２比による獲得＝＞０．３）および緑色（ｌｏｇ２比による損失＜＝−０．３）を明赤色（ｌｏｇ２比による増幅＝＞０．６）および明緑色（ｌｏｇ２比による欠失＜＝−０．６）とともにプロットする。Ｔｃｒβ、Ｔｃｒα／δ、およびＴｃｒγにおける生理学的に関連性のあるＣＮＡの位置は矢印で示し、そして本文中考察した他の遺伝子座（Ｎｏｔｃｈ１、Ｐｔｅｎ）はアスタリスクで示す。
【図３Ａ】Ｎｏｔｃｈ１アレイＣＧＨおよびＳＫＹ。図３Ａは、Ｎｏｔｃｈ１の３’末端をターゲティングする限局的増幅を示すネズミＴＫＯリンパ腫Ａ１０５２に由来する代表的なアレイＣＨＧＨｌｏｇ２比プロット、およびその領域における他の遺伝子に相対的なその位置を示す（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／，ＮＢＣＩ  ｍｏｕｓｅ  ｂｕｉｌｄ３４）。Ｙ軸、コピー数のｌｏｇ２比（通常はｌｏｇ２＝０に設定）；この軸に対して増幅は上、欠失は下となる；Ｘ軸、染色体位置。図３Ｂは、Ｎｏｔｃｈ１の３’末端をターゲティングする染色体２増幅を保有するネズミＴＫＯ腫瘍Ａ１０５２およびＡ８９５細胞のＳＫＹ解析である。上側パネル：矢印で標示したネズミ染色体２の関与する非相互転座を示す、記載された腫瘍に由来する中期スプレッド；アスタリスクは異常なバンドｃｈｒ２Ａ３を示す。下側パネル：記載されるように、染色体２および他の染色体の関与する個々の再配列した染色体の代表的ＳＫＹ画像。各パネルは、記載した再配列染色体に関するそのままのスペクトル画像（左）、ＤＡＰＩ画像（中）、およびコンピューター解釈スペクトル画像（右）の複合物である。図３Ｃは、ＦＩＳＨを用いたＮｏｔｃｈ１においてオーバーラップしている２つの近接ＢＡＣプローブを分離する切断点を示す。赤シグナル、ＢＡＣプローブＲＰ２４−３６９Ｌ２３；緑シグナル、ＢＡＣプローブＲＰ２３−４１２Ｏ１３。
【図３Ｂ】Ｎｏｔｃｈ１アレイＣＧＨおよびＳＫＹ。図３Ａは、Ｎｏｔｃｈ１の３’末端をターゲティングする限局的増幅を示すネズミＴＫＯリンパ腫Ａ１０５２に由来する代表的なアレイＣＨＧＨｌｏｇ２比プロット、およびその領域における他の遺伝子に相対的なその位置を示す（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／，ＮＢＣＩ  ｍｏｕｓｅ  ｂｕｉｌｄ３４）。Ｙ軸、コピー数のｌｏｇ２比（通常はｌｏｇ２＝０に設定）；この軸に対して増幅は上、欠失は下となる；Ｘ軸、染色体位置。図３Ｂは、Ｎｏｔｃｈ１の３’末端をターゲティングする染色体２増幅を保有するネズミＴＫＯ腫瘍Ａ１０５２およびＡ８９５細胞のＳＫＹ解析である。上側パネル：矢印で標示したネズミ染色体２の関与する非相互転座を示す、記載された腫瘍に由来する中期スプレッド；アスタリスクは異常なバンドｃｈｒ２Ａ３を示す。下側パネル：記載されるように、染色体２および他の染色体の関与する個々の再配列した染色体の代表的ＳＫＹ画像。各パネルは、記載した再配列染色体に関するそのままのスペクトル画像（左）、ＤＡＰＩ画像（中）、およびコンピューター解釈スペクトル画像（右）の複合物である。図３Ｃは、ＦＩＳＨを用いたＮｏｔｃｈ１においてオーバーラップしている２つの近接ＢＡＣプローブを分離する切断点を示す。赤シグナル、ＢＡＣプローブＲＰ２４−３６９Ｌ２３；緑シグナル、ＢＡＣプローブＲＰ２３−４１２Ｏ１３。
【図３Ｃ】Ｎｏｔｃｈ１アレイＣＧＨおよびＳＫＹ。図３Ａは、Ｎｏｔｃｈ１の３’末端をターゲティングする限局的増幅を示すネズミＴＫＯリンパ腫Ａ１０５２に由来する代表的なアレイＣＨＧＨｌｏｇ２比プロット、およびその領域における他の遺伝子に相対的なその位置を示す（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／，ＮＢＣＩ  ｍｏｕｓｅ  ｂｕｉｌｄ３４）。Ｙ軸、コピー数のｌｏｇ２比（通常はｌｏｇ２＝０に設定）；この軸に対して増幅は上、欠失は下となる；Ｘ軸、染色体位置。図３Ｂは、Ｎｏｔｃｈ１の３’末端をターゲティングする染色体２増幅を保有するネズミＴＫＯ腫瘍Ａ１０５２およびＡ８９５細胞のＳＫＹ解析である。上側パネル：矢印で標示したネズミ染色体２の関与する非相互転座を示す、記載された腫瘍に由来する中期スプレッド；アスタリスクは異常なバンドｃｈｒ２Ａ３を示す。下側パネル：記載されるように、染色体２および他の染色体の関与する個々の再配列した染色体の代表的ＳＫＹ画像。各パネルは、記載した再配列染色体に関するそのままのスペクトル画像（左）、ＤＡＰＩ画像（中）、およびコンピューター解釈スペクトル画像（右）の複合物である。図３Ｃは、ＦＩＳＨを用いたＮｏｔｃｈ１においてオーバーラップしている２つの近接ＢＡＣプローブを分離する切断点を示す。赤シグナル、ＢＡＣプローブＲＰ２４−３６９Ｌ２３；緑シグナル、ＢＡＣプローブＲＰ２３−４１２Ｏ１３。
【図４Ａ】ネズミおよびヒトＴ−ＡＬＬの両方におけるＮＯＴＣＨ１改変。図４Ａは、ネズミＴＫＯおよびヒトＴ−ＡＬＬ腫瘍におけるＮｏｔｃｈ１に影響する配列改変の位置のグラフ表示である。各マーカーは個々の細胞系統／患者を示す。図４Ｂは、ネズミ完全長Ｎｏｔｃｈ１（ＦＬ；上）、切断された活性Ｎｏｔｃｈ１（Ｖ１７４４；中）およびチューブリン負荷対照（下）のウエスタンブロット解析を示す。高レベルの活性化Ｎｏｔｃｈ１蛋白質が多くのＴＫＯ腫瘍、例えば３’転座（青色：Ａ５７７、Ａ１０５２、Ａ１２５１）およびトランケーション欠失突然変異（赤色：Ａ４９４、Ａ１０４０）を保有するものにおいて発現され、これらにおいてはより急速に遊走するＶ１７４４型が著明である。ヒトＡＬＬ−ＳＩＬ（左）および正常マウス胸腺（右）を対照に対して負荷した。図４Ｃは、高レベルのＮｏｔｃｈ１ｍＲＮＡは、ＴＫＯ腫瘍の発現プロファイルにより評価されるように、Ｎｏｔｃｈ１蛋白質の公知の下流標的の高いｍＲＮＡレベルと相関していることを示している。各バーは個々のプローブセットを示す。図４Ｂに示す通り、青字の試料はＮｏｔｃｈ１の近傍の３’転座を保有しており、赤字の試料はトランケーション欠失突然変異を保有していることを示す。
【図４Ｂ】ネズミおよびヒトＴ−ＡＬＬの両方におけるＮＯＴＣＨ１改変。図４Ａは、ネズミＴＫＯおよびヒトＴ−ＡＬＬ腫瘍におけるＮｏｔｃｈ１に影響する配列改変の位置のグラフ表示である。各マーカーは個々の細胞系統／患者を示す。図４Ｂは、ネズミ完全長Ｎｏｔｃｈ１（ＦＬ；上）、切断された活性Ｎｏｔｃｈ１（Ｖ１７４４；中）およびチューブリン負荷対照（下）のウエスタンブロット解析を示す。高レベルの活性化Ｎｏｔｃｈ１蛋白質が多くのＴＫＯ腫瘍、例えば３’転座（青色：Ａ５７７、Ａ１０５２、Ａ１２５１）およびトランケーション欠失突然変異（赤色：Ａ４９４、Ａ１０４０）を保有するものにおいて発現され、これらにおいてはより急速に遊走するＶ１７４４型が著明である。ヒトＡＬＬ−ＳＩＬ（左）および正常マウス胸腺（右）を対照に対して負荷した。図４Ｃは、高レベルのＮｏｔｃｈ１ｍＲＮＡは、ＴＫＯ腫瘍の発現プロファイルにより評価されるように、Ｎｏｔｃｈ１蛋白質の公知の下流標的の高いｍＲＮＡレベルと相関していることを示している。各バーは個々のプローブセットを示す。図４Ｂに示す通り、青字の試料はＮｏｔｃｈ１の近傍の３’転座を保有しており、赤字の試料はトランケーション欠失突然変異を保有していることを示す。
【図４Ｃ】ネズミおよびヒトＴ−ＡＬＬの両方におけるＮＯＴＣＨ１改変。図４Ａは、ネズミＴＫＯおよびヒトＴ−ＡＬＬ腫瘍におけるＮｏｔｃｈ１に影響する配列改変の位置のグラフ表示である。各マーカーは個々の細胞系統／患者を示す。図４Ｂは、ネズミ完全長Ｎｏｔｃｈ１（ＦＬ；上）、切断された活性Ｎｏｔｃｈ１（Ｖ１７４４；中）およびチューブリン負荷対照（下）のウエスタンブロット解析を示す。高レベルの活性化Ｎｏｔｃｈ１蛋白質が多くのＴＫＯ腫瘍、例えば３’転座（青色：Ａ５７７、Ａ１０５２、Ａ１２５１）およびトランケーション欠失突然変異（赤色：Ａ４９４、Ａ１０４０）を保有するものにおいて発現され、これらにおいてはより急速に遊走するＶ１７４４型が著明である。ヒトＡＬＬ−ＳＩＬ（左）および正常マウス胸腺（右）を対照に対して負荷した。図４Ｃは、高レベルのＮｏｔｃｈ１ｍＲＮＡは、ＴＫＯ腫瘍の発現プロファイルにより評価されるように、Ｎｏｔｃｈ１蛋白質の公知の下流標的の高いｍＲＮＡレベルと相関していることを示している。各バーは個々のプローブセットを示す。図４Ｂに示す通り、青字の試料はＮｏｔｃｈ１の近傍の３’転座を保有しており、赤字の試料はトランケーション欠失突然変異を保有していることを示す。
【図５Ａ】ＦＢＸＷ７改変はヒトＴ−ＡＬＬにおいて共通であり、そしてネズミＴＫＯ腫瘍において保存されている。図５Ａは、マウスＴＫＯおよびヒトＴ−ＡＬＬ細胞系統の両方においてＦＢＸＷ７の欠失をもたらすＣＮＡの保存を示す、ｌｏｇ２比アレイＣＧＨプロットのグループであり、Ｆｂｘｗ７のゲノム位置は緑色で示す。Ｙ軸、コピー数のｌｏｇ２比（通常はｌｏｇ２＝０に設定）；この軸に対して増幅は上、欠失は下となる；Ｘ軸、染色体位置。図５Ｂは、記載したネズミＴＫＯ腫瘍におけるリアルタイムｑＰＣＲにより評価した場合の、マウスＦｂｘｗ７  ｍＲＮＡの相対的発現レベルを示す。図５Ｃは、ヒトＴ−ＡＬＬ患者および細胞系統のパネルにおいて同定されたヒトＦＢＸＷ７における突然変異の位置のグラフ表示である。各マーカーは個々の細胞系統／患者を示す。
【図５Ｂ】ＦＢＸＷ７改変はヒトＴ−ＡＬＬにおいて共通であり、そしてネズミＴＫＯ腫瘍において保存されている。図５Ａは、マウスＴＫＯおよびヒトＴ−ＡＬＬ細胞系統の両方においてＦＢＸＷ７の欠失をもたらすＣＮＡの保存を示す、ｌｏｇ２比アレイＣＧＨプロットのグループであり、Ｆｂｘｗ７のゲノム位置は緑色で示す。Ｙ軸、コピー数のｌｏｇ２比（通常はｌｏｇ２＝０に設定）；この軸に対して増幅は上、欠失は下となる；Ｘ軸、染色体位置。図５Ｂは、記載したネズミＴＫＯ腫瘍におけるリアルタイムｑＰＣＲにより評価した場合の、マウスＦｂｘｗ７  ｍＲＮＡの相対的発現レベルを示す。図５Ｃは、ヒトＴ−ＡＬＬ患者および細胞系統のパネルにおいて同定されたヒトＦＢＸＷ７における突然変異の位置のグラフ表示である。各マーカーは個々の細胞系統／患者を示す。
【図５Ｃ】ＦＢＸＷ７改変はヒトＴ−ＡＬＬにおいて共通であり、そしてネズミＴＫＯ腫瘍において保存されている。図５Ａは、マウスＴＫＯおよびヒトＴ−ＡＬＬ細胞系統の両方においてＦＢＸＷ７の欠失をもたらすＣＮＡの保存を示す、ｌｏｇ２比アレイＣＧＨプロットのグループであり、Ｆｂｘｗ７のゲノム位置は緑色で示す。Ｙ軸、コピー数のｌｏｇ２比（通常はｌｏｇ２＝０に設定）；この軸に対して増幅は上、欠失は下となる；Ｘ軸、染色体位置。図５Ｂは、記載したネズミＴＫＯ腫瘍におけるリアルタイムｑＰＣＲにより評価した場合の、マウスＦｂｘｗ７  ｍＲＮＡの相対的発現レベルを示す。図５Ｃは、ヒトＴ−ＡＬＬ患者および細胞系統のパネルにおいて同定されたヒトＦＢＸＷ７における突然変異の位置のグラフ表示である。各マーカーは個々の細胞系統／患者を示す
【図６Ａ】ＴＫＯ腫瘍におけるＰｔｅｎの限局的欠失。図６Ａは、Ｐｔｅｎを包含する限局的欠失を呈しているＴＫＯリンパ腫に由来する代表的なアレイＣＧＨｌｏｇ２比プロット、およびその領域における他の遺伝子に相対的なその位置を示す（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／，ＮＢＣＩｍｏｕｓｅ  ｂｕｉｌｄ３４）。Ｙ軸、コピー数のｌｏｇ２比（通常はｌｏｇ２＝０に設定）；この軸に対して増幅は上、欠失は下となる；Ｘ軸、染色体位置。図６Ｂは、リアルタイムｑＰＣＲの結果（数種の腫瘍における欠失を示す）を総括したものであり、記載した領域に対するプライマーセット（矢印）およびアレイＣＧＨ６０量体オリゴプローブ（Ａｇｉｌｅｎｔ  ４４Ｋ  アレイ）の位置を用いたリアルタイムｑＰＣＲをグラフに表示している。Ａ４９４は欠失の証拠を有さない対照として示す。
【図６Ｂ】ＴＫＯ腫瘍におけるＰｔｅｎの限局的欠失。図６Ａは、Ｐｔｅｎを包含する限局的欠失を呈しているＴＫＯリンパ腫に由来する代表的なアレイＣＧＨｌｏｇ２比プロット、およびその領域における他の遺伝子に相対的なその位置を示す（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／，ＮＢＣＩｍｏｕｓｅ  ｂｕｉｌｄ３４）。Ｙ軸、コピー数のｌｏｇ２比（通常はｌｏｇ２＝０に設定）；この軸に対して増幅は上、欠失は下となる；Ｘ軸、染色体位置。図６Ｂは、リアルタイムｑＰＣＲの結果（数種の腫瘍における欠失を示す）を総括したものであり、記載した領域に対するプライマーセット（矢印）およびアレイＣＧＨ６０量体オリゴプローブ（Ａｇｉｌｅｎｔ  ４４Ｋ  アレイ）の位置を用いたリアルタイムｑＰＣＲをグラフに表示している。Ａ４９４は欠失の証拠を有さない対照として示す。
【図７】ヒトおよびマウスＴ−ＡＬＬにおけるＰＴＥＮ遺伝子改変の保存。図７Ａは、マウスＴＫＯおよびヒトＴ−ＡＬＬ細胞系統の両方における、ＰＴＥＮの欠失をもたらすＣＮＡの保存を示すｌｏｇ２比アレイＣＧＨプロットのグループであり、Ｐｔｅｎのゲノム位置は緑色で示す。Ｙ軸、コピー数のｌｏｇ２比（通常はｌｏｇ２＝０に設定）；この軸に対して増幅は上、欠失は下となる；Ｘ軸、染色体位置。図７Ｂは、ネズミＴＫＯおよびヒトＴ−ＡＬＬ細胞系統のパネルにおけるＰＴＥＮ、ホスホＡｋｔ、およびＡｋｔの発現レベルを示すウエスタンブロット解析を示す。ＢＥ１３およびＰＥＥＲは同一分類群系統である。負荷対照としてチューブリンを同時にプローブした。赤色の試料は確認された配列の突然変異を保有しており、青色の試料はＣＧＨ検出欠失を保有している。図７Ｃは、ネズミＴＫＯ腫瘍におけるＰｔｅｎ−Ａｋｔ軸の他のメンバーに対するＣＮＡの効果を示すｌｏｇ２比アレイＣＧＨプロットのグループである。各遺伝子（Ａｋｔ１、Ｔｓｃ１）の位置は緑色で示す。
【図８】Ｐｔｅｎ突然変異／欠失を有するＴＫＯ細胞は、薬物トリシリビンによるホスホＡｋｔの阻害に対して感受性である。細胞を３連でプレーティングし、そして４８時間トリシリビンまたはビヒクル単独の記載用量に曝露し、そして次に生細胞に関してＭＴＳ試験により定量した。生存細胞の画分をビヒクル単独における生存（１に設定）と相対比較しながらプロットする。腫瘍Ａ１０４０は野生型のＰｔｅｎ発現を保持しており、そしてＡ１００５はＰｔｅｎの１コピーにおける点突然変異を保有しているのに対し、細胞系統Ａ５７７、Ａ１２４０、Ａ１２５２、およびＡ４９４はＰｔｅｎ発現に関して欠損性である。
【図９】ネズミＴＫＯリンパ腫および多様な起源のヒト腫瘍のゲノム改変間の多大なオーバーラップ。図９Ａは、異種間のオーバーラップの統計学的解析の結果を総括したものである。本発明者等は、記載した腫瘍の型に由来するヒトアレイＣＧＨプロファイルを入手した。本発明者等は、更に実施例のセクション（特に実施例４）に記載したようにＭＣＲを定義した。各セットの特徴をパネルの左側部分に列挙する。相当するヒトＣＧＨデータセットとのシンテニーなオーバーラップを有するＴＫＯ  ＭＣＲ（ａｍｐ、増幅；ｄｅｌ、欠失）の数をパネルの右側に記載し、各々に対するｐ値は１０，０００順列に基づく。図９Ｂは、１つまたは多数のヒト腫瘍型（セグメントの異なる色で示す）において同定されたシンテニーなオーバーラップを有するＴＫＯ  ＭＣＲ（各セグメント内に記載）の数のＰｉｅチャート表示のグループである；左、増幅；右、欠失。例えば、図９Ａ中の６１シンテニー増幅のうち２１が２つの異なるヒト腫瘍ＣＧＨデータセット中に観察された。図９Ｃは、ネズミＴＫＯ  ＭＣＲおよびＴ−ＡＬＬ、多発性骨髄腫、または固形腫瘍（神経膠芽細胞腫、黒色腫、および膵臓、肺、および結腸の腺腫）のヒト癌由来のＭＣＲの間のオーバーラップの程度のベン図表示のグループである。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
（発明の詳細な説明）
癌関連遺伝子および治療上の癌標的の発見のために用いられるインビボの癌モデルは、典型的には良性の染色体プロファイル、即ちほぼ正常な染色体安定性を有する癌細胞を生じる。これとは対照的に、天然に存在するヒト癌においては、癌細胞ゲノムは、染色体構造異常により明らかなように、広範な不安定性を呈する。従って、本発明は脱安定化されたゲノム（「ゲノム不安定」）を有するインビボの癌モデルを提供する。
【００３５】
本発明のゲノム不安定モデルに由来する癌細胞のゲノムは、ヒト癌細胞ゲノムにより呈される染色体不安定性を模倣している。従って、本発明のゲノム不安定癌モデルは、ヒトの癌の開始、維持および進行に関与する遺伝子および遺伝子エレメントの発見のために多大な利益を与える。モデルに由来する癌細胞における染色体異常、特に再発性の異常は、「良性」の染色体プロファイルを有する癌モデルにおいては不可能である癌における染色体事象の検討を可能にする。そのような染色体異常はまた、癌関連エレメントを保有する可能性がより高いゲノムの特定の領域に着目させるものである。ヒト癌の多数の型における場合を反映している染色体の事象および遺伝子の事象を発生させるゲノム不安定マウス癌モデルの本明細書における有効性は、ヒト癌に関連する癌関連遺伝子および治療上の標的の発見のための重要な新しい手段を与える。ヒト癌に関連する遺伝子および遺伝子エレメントを発見するためにそれ自体有用であるが、本発明のゲノム不安定モデルはまた、既知の癌モデルを包含する他の癌モデルを確立するためのバックグラウンドとして使用することもできる。既知の癌遺伝子および／または腫瘍サプレッサーにおける遺伝子改変を本発明のゲノム不安定モデルに重ね合わせることにより、天然に存在する癌をより緊密に複写する改良されたモデルが提供される。より重要な点としては、本発明のゲノム不安定モデルは、共有されている染色体および遺伝子の事象を同定するためのヒト癌ゲノムとの異種間比較を可能にする。そのような共有されている事象は、癌関連遺伝子および治療標的の発見のための強力な指針を与える。
【００３６】
１．定義
本明細書および実施形態を通じて、「含む」またはその変形、例えば「含んでいる」などの単語は、記載した整数または整数の群の包含を意味しており、任意の他の整数または整数の群の除外を意味するわけではないと理解されたい。
【００３７】
本明細書において特段の記載が無い限り、本発明に関連して使用される科学技術用語は、当業者により一般的に理解されている意味を有するものとする。更にまた、文脈により別様に必要とされない限り、単数表記は複数表記を含み、複数表記は単数表記を含むものとする。一般的に、本明細書に記載される細胞および組織の培養、分子生物学、細胞および癌の生物学、ウィルス学、免疫学、微生物学、遺伝学ならびに蛋白質および核酸の化学に関連して使用される命名法およびその手法は、当該分野で良く知られているものであり、かつ使用されているものである。
【００３８】
２．動物モデル
癌の最も標準的な遺伝子操作されているマウスモデルは、比較的良性の細胞遺伝プロファイルを有する。これらのゲノム的に安定なモデルは、癌におけるヒトのゲノムに典型的な広範な染色体不安定性を反映しない。最も「ゲノム安定な」ネズミ腫瘍モデルにおいて、ゲノム当たり約２０〜４０の染色体異常、または染色体当たり０．１未満の染色体再配列が検出されていることが報告されている。
【００３９】
従って、１つの態様において、本発明は、癌を発症するように遺伝子的に改変された非ヒト動物であって、この場合、動物に由来する癌細胞のゲノムは、ヒト癌細胞において見られるものに近似または合致する染色体構造異常の頻度により明らかなように、増強された染色体不安定性を呈する。種々の実施形態において、非ヒト動物モデル由来の癌細胞の集団における染色体構造異常の頻度は、遺伝子改変を有さないそのような哺乳類における染色体構造異常の頻度よりも少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、または１０倍高値であり、これはゲノム当たり、または染色体当たりの何れを基本として定義されるかに関わらない。
【００４０】
染色体異常の頻度は、ゲノム当たりもしくは染色体当たりのそのような異常の平均数、またはゲノム当たりの染色体異常の特定の型の平均数、または特定の染色体における異常の平均数に基づくことができる。染色体異常を計測する方法は当該分野で知られており（例えばＲ．Ｃ．Ｏ’Ｈａｇａｎ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６３（１７），５３５２（２００３）；Ｎ．Ｂａｒｄｅｅｓｙ等、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０３（１５），５９４７（２００６）；Ｍ．Ｋｉｍ等、Ｃｅｌｌ  １２５（７），１２６９（２００６）；Ｌ．Ｚｅｎｄｅｒ等、Ｃｅｌｌ  １２５（７），１２５３（２００６）参照）、そして後述において更に開示する。本発明のゲノム不安定非ヒト動物モデルに由来する癌細胞は、上記したパラメーターの少なくとも１つまで、上記したゲノム脱安定化機序を欠いている同等の非ヒト動物モデルから誘導された細胞と比較して、染色体異常の増大した頻度を有することになる。
【００４１】
染色体構造異常は、ＤＮＡの増加または損失、ＤＮＡ増幅、ＤＮＡ欠失、およびＤＮＡ転座に起因する何れかの染色体異常であってよい。例示される染色体構造異常は、例えば姉妹染色分体交換、多中心染色体、反転、獲得、損失、相互および非相互転座（ＮＲＴ）、相同および／または非相同染色体のｐ−ｐロバートソン様転座、ｐ−ｑ染色体アーム融合、ならびにｑ−ｑ染色体アーム融合を包含する。
【００４２】
本発明のゲノム不安定動物モデルの遺伝子改変は、動物を癌易罹患性とし、かつゲノム構造またはゲノム安定性に影響する何れかの遺伝子または遺伝子エレメントであり得るので、そのようなゲノム脱安定化機序を欠いている同等の動物モデルにおけるゲノムおよび／または染色体と比較して、動物において発症する癌のゲノムおよび／または染色体における染色体構造異常の上昇した頻度により明らかなように、改変がゲノムを脱安定化する。遺伝子エレメントは、マイクロＲＮＡのような蛋白質産物を産生するように翻訳されないＤＮＡ、発現制御配列、例えばＤＮＡ転写因子結合部位、ＲＮＡ転写開始部位、プロモーター、エンハンサー、応答エレメント等を包含する。一部の実施形態においては、遺伝子改変は、染色体構造の安定性または一体性に関与する遺伝子または遺伝子エレメントを不活性化する。不活性化は、遺伝子または遺伝子エレメントを直接不活性化することによるか、発現を抑制することによるか、または、核酸産物、例えばＲＮＡもしくは蛋白質遺伝子産物であり得る遺伝子産物の活性を不活性化または阻害することによるかであってよい。
【００４３】
一部の実施形態においては、遺伝子改変は、ＤＮＡ修復に関与する１つ以上の遺伝子または遺伝子エレメントの少なくとも１つの対立遺伝子の不活性化、およびＤＮＡ損傷チェックポイントに関与する１つ以上の遺伝子または遺伝子エレメントの少なくとも１つの対立遺伝子の不活性化を含む。一部の実施形態においては、遺伝子改変は更にテロメア維持に関与する遺伝子または遺伝子エレメントの少なくとも１つの対立遺伝子の不活性化を含む。上記実施形態の何れかにおいて、ＤＮＡ修復関連、ＤＮＡ修復チェックポイント関連および／またはテロメア維持関連の遺伝子または遺伝子エレメントの両方の対立遺伝子が不活性化されてよい。
【００４４】
ＤＮＡ修復またはＤＮＡ損傷チェックポイントに関与する何れかの遺伝子または遺伝子エレメントを、本発明のゲノム不安定モデルにおいて不活性化することができる。ヒトおよび他の哺乳類における多くのそのような遺伝子および遺伝子エレメントは、当業者の知る通りとなる。例えばＲ．Ｄ．Ｗｏｏｄ等、Ｈｕｍａｎ  ＤＮＡ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｇｅｎｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９１：１２８４−１２８９（Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２００１）；Ｒ  Ａ  Ｂｕｌｍａｎ，Ｓ  Ｄ  Ｂｏｕｆｆｌｅｒ，Ｒ  ＣｏｘおよびＴ  Ａ  Ｄｒａｇａｎｉ，Ｌｏｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｄａｍａｇｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  Ｃｏｒｅｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｉｓｋ  Ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒａｄｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ｂｏａｒｄ  Ｒｅｐｏｒｔ，Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２００４（ＩＳＢＮ  ０−８５９５１−５４４−３）を参照。マウスＤＮＡ修復遺伝子データベースは、ＵＫ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｇｅｎｃｙのウエブサイトにおいて入手できる。
【００４５】
それらは例えば塩基除去修復（ＢＥＲ）蛋白質をコードする遺伝子、例えばｕｎｇ、ｓｍｕｇ１、ｍｂｄ４、ｔｄｇ、ｏｆｆ１、ｍｙｈ、ｎｔｈ１、ｍｐｇ、ａｐｅ１、ａｐｅ２、ｌｉｇ３、ｘｒｃｃ１、ａｄｐｒｔ、ａｄｐｒｔｌ２およびａｄｐｒｔｌ３またはその種相同体；ミスマッチ除去修復蛋白質、例えばｍｓｈ２、ｍｓｈ３、ｍｓｈ４、ｍｓｈ５、ｍｓｈ６、ｐｍｓ１、ｐｍｓ３、ｍｌｈ１、ｍｌｈ３、ｐｍｓ２ｌ３およびｐｍｓ２ｌ４またはその種相同体；ヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）蛋白質、非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）蛋白質、相同組み換え蛋白質、ＤＮＡポリメラーゼ、編集およびプロセシングヌクレアーゼならびにＤＮＡ修復ヘリカーゼ等を包含する。上記Ｗｏｏｄ等を参照。
【００４６】
例示されるＮＨＥＪ蛋白質は、リガーゼ４、ＸＲＣＣ４、Ｈ２ＡＸ、ＤＮＡＰＫｃｓ、Ｋｕ７０、Ｋｕ８０、Ａｒｔｅｍｉｓ、Ｃｅｒｎｕｎｎｏｓ／ＸＬＦ、ＭＲＥ１１、ＮＢＳ１およびＲＡＤ５０を包含する。例示される相同組み換え蛋白質は、ＲＡＤ５１、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５４、ＸＲＣＣ３、ＲＡＤ５１Ｃ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２（ＦＡＮＣＤ１）、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＢ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＤ２；ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦ、ＦＡＮＣＧ、ＦＡＮＣＪ（ＢＲＩＰ１／ＢＡＣＨ１）、ＦＡＮＣＬ、およびＦＡＮＣＭを包含する。例示されるＤＮＡ修復ヘリカーゼは、ＢＬＭおよびＷＲＮを包含する。
【００４７】
ＤＮＡ損傷チェックポイントに関与する何れかの遺伝子または遺伝子エレメントを、本発明のゲノム不安定モデルにおいて使用できる。多くのそのような遺伝子および遺伝子エレメントに関する情報は容易に入手でき、そして当業者に良く知られているものとなる。例示されるＤＮＡチェックポイント蛋白質は、センサー蛋白質、例えばＲＡＤ１、ＲＡＤ９、ＲＡＤ１７、ＨＵＳ１、ＭＲＥ１１、Ｒａｄ５０、およびＮＢＳ１；メディエーター、例えばＡＴＲＩＰ；ホスホイノシチド３−キナーゼ関連キナーゼ（ＰＩＫＫ）ファミリー蛋白質、例えばＡＴＭ、ＡＴＲ、ＳＭＧ−１およびＤＮＡ−ＰＫ；チェックポイントキナーゼ、例えばＣｈｋ１およびＣｈｋ２；エフェクター蛋白質、例えばｐ５３、ｐ６３、ｐ７３、ＣＤＣ２５Ａ、ＢおよびＣ、ｐ２１および１４−３−３β、γ、ξ、σ、ε、η、τＡＰＣ；ＢＲＣＡ１、ＭＤＭ２、ＭＤＭ４、ＮＢＳ１、ＲＡＤ２４、ＲＡＤ２５、ＲＡＤ５０、ＭＤＣ１、ＳＭＣ１、およびクラスピンを包含する。
【００４８】
本発明のゲノム不安定モデルの１つの実施形態において、非ヒトトランスジェニック動物は更に、テロメア長を合成または維持することに関与する１つ以上の遺伝子または遺伝子エレメントの少なくとも１つの対立遺伝子の操作された不活性化を含む。一部の実施形態においては、非ヒトトランスジェニック哺乳類は、例えばテロメラーゼ逆転写酵素、Ｔｅｒｔ、またはテロメラーゼＲＮＡ（Ｔｅｒｃ）の不活性化により、低下したテロメラーゼ活性のために操作される。一部の実施形態においては、遺伝子改変は、キャッピング機能のようなテロメア構造に影響する蛋白質の活性を低下させる。テロメア構造に影響する例示される蛋白質は、ＴＲＦ１、ＴＲＦ２、ＰＯＴ１ａ、ＰＯＴ１ｂ、ＲＡＰ１、ＴＩＮ２、およびＴＰＰ１を包含する。
【００４９】
本発明の非ヒトゲノム不安定モデルは、何れかの動物、例えば魚類、鳥類、哺乳類、爬虫類、両生類であってよい。好ましくは、該動物は哺乳類、例えばげっ歯類、霊長類、ネコ、イヌ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ウシである。好ましい実施形態においては、該哺乳類はマウスである。
【００５０】
本発明のゲノム不安定動物モデルは、細胞の全てまたは一部分のみがゲノム不安定性を生じさせる遺伝子改変を含む動物を含む。一部の実施形態においては、該動物の生殖細胞が遺伝子改変を含む。
【００５１】
一部の実施形態においては、ゲノム不安定モデルはａｔｍ、ｔｅｒｃもしくはｐ５４またはこれらの遺伝子の何れかの組み合わせの対立遺伝子の一方またはそれらの両方の不活性化を含む。特定の実施形態においては、３遺伝子全ての対立遺伝子の一方またはそれらの両方が不活性化される。一部の実施形態においては、ａｔｍの両方の対立遺伝子が不活性化される。特定の実施形態においては、３遺伝子全ての両方の対立遺伝子が不活性化される。
【００５２】
同様に本発明に包含されるものは、本発明のゲノム不安定モデルに由来する組織および細胞、例えば体細胞、生殖細胞、幹細胞、例えば胚性幹細胞、分化した細胞および未分化の細胞である。該細胞は癌細胞、非癌細胞、または前癌細胞であってよい。
【００５３】
本発明のゲノム不安定動物モデルにおける遺伝子または遺伝子エレメントの不活性化は、何れかの手段により達成することができ、その大部分が当業者に良く知られている。そのような手段は、遺伝子もしくは遺伝子エレメントの全てもしくは部分の欠失、または遺伝子もしくは遺伝子エレメント内への不活性化突然変異（病変）の導入を包含する。遺伝子または遺伝子エレメントの全てまたは一部分の欠失は、ノックアウトによるもの、例えば相同組み換えまたはＣｒｅリコンビナーゼ（例えばＣｒｅ−Ｌｏｘ系）を用いる手法によるものであってよい。ノックアウトを包含する欠失は、条件的ノックアウトであることができ、その場合、核酸配列の改変は、例えば遺伝子改変を促進する物質への動物の曝露、遺伝子部位における組み換えを促進する酵素（例えばＣｒｅ−ｌｏｘ系におけるＣｒｅ）の導入、または遺伝子改変を指向するための他の方法により、生じることができる。条件的または構成的ノックアウトは組織特異的、時間特異的（例えば特定の発達段階の間に生じる）またはそれらの両方であることができる。
【００５４】
不活性化突然変異は何れかの手段を用いて導入してよく、その大部分は良く知られている。そのような方法は、例えば相同組み換えまたはＰＣＲを用いた部位指向性の突然変異誘発を包含する。そのような突然変異は、遺伝子の５’未翻訳領域（ＵＴＲ）内、例えば発現制御領域内、コーディング領域内（イントロンもしくはエクソン）、または３’ＵＴＲ内に導入してよい。
【００５５】
遺伝子または遺伝子エレメントの発現または活性はまた、何れかの手段、限定しないが例えばＲＮＡ干渉、アンチセンス、例えば３重らせん形成、ならびにリボザイム、例えばＲＮアーゼＰ、リードザイム、ヘアピンリボザイムおよびハンマーヘッドリボザイムにより達成し得る。
【００５６】
一部の実施形態においては、本発明のゲノム不安定動物モデルは、更に１つ以上の追加的な癌誘発性の遺伝子改変、限定しないが例えば、１つ以上の活性化された癌遺伝子の導入、１つ以上の癌遺伝子の発現を増大させる改変、１つ以上の腫瘍サプレッサーのターゲティングされた不活性化、または上記の組み合わせを含む。そのような追加的な癌誘発性の改変は、誘導性、組織特異性、時間特異性、または３者の何れかの組み合わせであってよい。例えば、癌遺伝子は、転写の５’−３’方向において、特定の組織型における遺伝子発現に関連する転写および翻訳の開始領域、癌遺伝子、および宿主動物において機能性である転写および翻訳の終止領域を包含する発現カセットを用いてゲノム内に導入できる。１つ以上のイントロンも存在してよい。目的の癌遺伝子に加えて、検出可能なマーカー、例えばＧＦＰ（およびその変異体）、ルシフェラーゼ、およびｌａｃＺを場合により癌遺伝子に作動可能に連結させ、そして同時発現させてよい。同様に、腫瘍サプレッサー遺伝子を例えば遺伝子ターゲティング技術を用いて不活性化してよい。
【００５７】
本明細書に記載するゲノム不安定動物モデル内に追加的癌誘発性改変を導入することは、癌遺伝子発見の強力な手段をもたらす。例えば、膵臓におけるＫｒａｓの活性化およびｐ５３の突然変異は、ヒトにおける膵臓癌を誘発することが知られている。膵臓特異的Ｋｒａｓ活性化、ｐ５３活性化（および場合により低下したテロメア機能）を有するゲノム不安定モデルは、ヒトにおける膵臓癌遺伝子の発見を大きく促進することになる。
【００５８】
ゲノム不安定モデルにおける癌は、何れかの型の癌、例えば癌腫、肉腫、骨髄腫、白血病、リンパ腫または混合型の癌である。癌は、何れかの組織型、例えば上皮組織、間葉組織、神経組織および造血組織から生じ、そして身体の何れかの臓器または組織中に位置することができる。染色体異常の頻度は、上記した癌の何れかに由来する細胞において測定することができ、そして原発腫瘍、二次腫瘍、転移腫瘍、癌になるように当業者により導入された追加的癌遺伝子の活性化および腫瘍サプレッサー遺伝子の不活性化を介してインビトロで遺伝子的に操作された前記ゲノム的に不安定なモデルから誘導された腫瘍再発性の恐らくは正常な細胞に由来することができる。
【００５９】
本発明のゲノム不安定マウスモデルは何れかの癌、限定しないが例えば、末端部黒子黒色腫、光線角化症、腺癌、腺様嚢胞癌、腺腫、腺肉腫、腺扁平上皮癌、副腎皮質癌、エイズ関連リンパ腫、肛門癌、退形成型神経膠腫、星状細胞腫瘍、星状細胞腫、バルトリン腺癌腫、基底細胞癌、胆道癌、骨癌、胆管癌、膀胱癌、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、乳癌、気管支腺癌腫、毛細管癌腫、カルチノイド、癌腫、癌肉腫、海綿状、中枢神経系のリンパ腫、大脳星状細胞腫、子宮頸癌、結合組織癌、胆管癌、軟骨肉腫、脈絡叢乳頭腫／癌腫、明細胞癌腫、結腸癌、結腸直腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、嚢胞腺腫、内胚葉洞腫瘍、子宮内膜過形成、子宮内膜間質部肉腫、類内膜腺癌、上衣、上衣細胞腫、類上皮、食道癌、ユーイング肉腫、生殖腺外生殖細胞腫瘍、眼癌、線維層、限局性結節過形成、胆嚢癌、神経節膠腫、胃癌、ガストリノーマ、生殖細胞腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍、多形性神経膠芽細胞腫、神経膠腫、グルカゴノーマ、頭部頸部癌、血管芽腫、血管内皮種、血管腫、肝細胞腺腫、肝臓腺腫症、肝細胞癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、視床下部および視路の神経膠腫、小児、インスリノーマ、上皮内新生物、上皮間扁平上皮細胞新生物、眼内黒色腫、上皮内新生物、侵襲性扁平上皮細胞癌腫、大細胞癌腫、島細胞癌腫、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、平滑筋肉腫、悪性黒子黒色腫、白血病関連障害、口唇および口腔の癌、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、悪性中皮腫、悪性胸腺腫、髄芽細胞腫、髄上皮腫、黒色腫、髄膜、メルケル細胞癌腫、中皮、転移癌腫、粘液性類表皮癌、多発性骨髄腫／プラズマ細胞新生物、菌状息肉腫、骨髄形成異常症候群、骨髄増殖性障害、鼻腔および副鼻腔の癌、鼻咽頭癌、神経芽腫、神経線維腫症、神経上皮腺癌結節黒色腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、燕麦細胞癌、稀突起神経膠、稀星状細胞腫、口腔癌、口腔咽頭癌、骨肉腫、膵臓ポリペプチド、卵巣癌、卵巣生殖細胞腫瘍、膵臓癌、乳頭血清腺癌、松果体細胞、下垂体腫瘍、プラズマ細胞腫、偽肉腫、肺芽腫、上皮小体癌、陰茎癌、褐色細胞腫、松果体およびテント上未分化神経外胚葉性腫瘍、下垂体腫瘍、プラズマ細胞新生物、胸膜肺芽腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、呼吸系の癌、網膜芽腫、横紋筋肉腫、肉腫、漿液癌腫、皮膚癌、小細胞癌腫、小腸癌、軟組織癌腫、ソマトスタチン分泌腫瘍、扁平上皮癌腫、扁平上皮細胞癌、胃癌、間質腫瘍、中皮下、表在拡大型黒色腫、テント上未分化神経外胚葉性腫瘍、精巣癌、甲状腺癌、未分化癌腫、尿道癌、子宮肉腫、ブドウ膜黒色腫、いぼ状癌、膣癌、ビポーマ、外陰部癌、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、十分に分化された癌腫、ならびにウイルムス腫瘍を発症してよい。
【００６０】
本明細書に記載する動物モデルは、典型的にはトランスジェニック技術を用いて得られる。トランスジェニック技術は当該分野で良く知られている。例えば、トランスジェニックマウスは多くの方法において製造できる。主題のトランスジェニック動物を作成するための例示される方法は、接合体の注入によるものである。この方法は、例えば米国特許４，７３６，８６６に記載されている。該方法では、受精卵または接合体にＤＮＡを注入し、そして次に疑似妊娠母体中で該卵を発生させる。接合体は同じ系統の雌雄動物を用いるか、または異なる系統の雌雄動物から得ることができる。出生したトランスジェニック動物は始祖と称され、そしてそれを育種することにより同じＤＮＡ挿入を有するより多くの動物を製造する。トランスジェニック動物を作成するこの方法において、外因性のＤＮＡは典型的には、非相同性の組み換え事象により、ゲノム内にランダムに組み込まれる。ＤＮＡの数千コピーに対して１つがゲノム内の１部位において組み込まれる場合がある。
【００６１】
３．癌関連遺伝子を同定する方法
別の態様において、本発明は、本発明のゲノム不安定モデルを利用してヒトにおける癌の開始、維持および／または進行に関与する遺伝子および遺伝子エレメントを同定するための方法を提供する。遺伝子の発見および同定の方法は、ゲノム不安定マウスモデルにおける癌細胞中の染色体構造異常、コピー数変化および突然変異が、ヒト癌細胞におけるシンテニー対応物（即ち進化的に関連する染色体領域において生じるもの）を有するという、本明細書に記載された驚くべき発見に基づいている。
【００６２】
従って、１つの実施形態において、本発明は、ヒト癌に潜在的に関連する遺伝子の同定のための目的の染色体領域を同定する方法であって、上記した非ヒトゲノム不安定哺乳類由来の癌細胞の集団におけるＤＮＡコピー数の変化を同定する工程を含む、方法を提供する。ＤＮＡコピー数変化が生じている染色体領域が、ヒト癌に潜在的に関連する遺伝子または遺伝子エレメント（例えばマイクロＲＮＡ）の同定のための目的の染色体領域である。
【００６３】
ＤＮＡコピー数変化はＤＮＡの増加（例えばゲノム領域の増幅）またはＤＮＡの減少（例えばゲノム領域の欠失）であってよい。特定のゲノム領域のコピー数を評価する方法は当該分野で良く知られており、そしてハイブリダイゼーションおよび増幅系のアッセイを包含する。本発明の方法によれば、ＤＮＡコピー数変化は，比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）（二重チャンネルハイブリダイゼーションプロファイリングおよび単一チャンネルハイブリダイゼーションプロファイリング（例えばＳＮＰ−ＣＧＨ）の両方を含む）のようなコピー数プロファイリングを用いて同定してよい。他の適当な方法、例えば蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、ＰＣＲ、核酸配列決定、およびヘテロ接合性損失（ＬＯＨ）解析を本発明に従って使用してよい。
【００６４】
本発明の１つの実施形態において、ゲノム中のＤＮＡコピー数変化はコピー数プロファイリングにより測定する。
【００６５】
本発明の一部の実施形態においては、ＤＮＡコピー数変化はＣＧＨを用いて同定する。比較ゲノムハイブリダイゼーション法においては、核酸の「試験」収集物（例えば腫瘍または癌性の細胞に由来）を第１の標識で標識し、第２の収集物（例えば正常細胞または組織に由来）を第２の標識で標識する。核酸のハイブリダイゼーションの比は、アレイ中の各繊維に結合した第１および第２の標識の比により測定される。例えば、試験収集物中の遺伝子増幅に起因する２標識からのシグナルの比における差が検出され、そして比は使用する特異的プローブに相当する遺伝子コピー数の尺度を与える。ＤＮＡコピー数の変化の細胞遺伝的表示は、ＣＧＨにより作成することができ、これは示差的に標識された試験および参照のゲノムＤＮＡに由来する染色体の長さに沿った蛍光の比を与える。
【００６６】
本発明の一部の実施形態においては、ＤＮＡコピー数変化は、マイクロアレイ系ＣＧＨ（アレイＣＧＨ）により解析される。マイクロアレイ技術は高い分解能を与える。例えば、伝統的なＣＧＨは一般的に２０Ｍｂの限定されたマッピング分解能を有するのに対し、マイクロアレイ系ＣＧＨにおいては示差的に標識された試験および参照のゲノムＤＮＡの蛍光の比がＤＮＡコピー数変化の遺伝子座毎の尺度を与え、これにより上昇したマッピング分解能が達成される。種々のマイクロアレイ法の詳細は、文献に見出すことができる。例えば、米国特許６，２３２，０６８；Ｐｏｌｌａｃｋ等、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２３（１）：４１−６（１９９９），Ｐａｓｔｉｎｅｎ（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．７：６０６−６１４；Ｊａｃｋｓｏｎ（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：１６８５；Ｃｈｅｅ（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：６１０；ＷＯ９６／１７９５３，Ｐｉｎｋｅｌ等（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２０：２０７−２１１等を参照。
【００６７】
ＣＧＨアレイを製造するために使用するＤＮＡは重要ではない。例えば、アレイはゲノムＤＮＡ、例えば所望の遺伝子を含有するゲノムまたは遺伝子そのものの一部分の高分解能スキャンを可能にするオーバーラップクローンを包含できる。ゲノム核酸は、例えばＨＡＣ、ＭＡＣ、ＹＡＣ、ＢＡＣ、ＰＡＣ、ＰＩｓ、コスミド、プラスミド、ゲノムクローンのインターＡｌｕ  ＰＣＲ産物、ゲノムクローンの制限切断物、ｃＤＮＡクローン、増幅（例えばＰＣＲ）産物等から得ることができる。アレイはまた、オリゴヌクレオチド合成技術を用いて得ることもできる。例えば、高密度オリゴヌクレオチドアレイの光指向性コンビナトリアル合成は、米国特許５，１４３，８５４およびＰＣＴ特許公開ＷＯ９０／１５０７０およびＷＯ９２／１００９２を参照。
【００６８】
ハイブリダイゼーションアッセイの感度は、検出された標的核酸を増幅する核酸増幅系の使用を介して増大させてよい。そのような系の例は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）系およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）系を包含する。他の適当な方法は、核酸配列系増幅（ＮＡＳＢＡＯ，Ｃａｎｇｅｎｅ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ）およびＱベータレプリカーゼ系を包含する。
【００６９】
本発明の１つの実施形態において、ゲノム中のＤＮＡコピー数変化は、単一ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）−ＣＧＨのような単一チャンネルプロファイリングにより測定される。伝統的なＣＧＨデータは、２対立遺伝子に相当する２つのチャンネル強度データよりなる。参照と対象試料の間の正規化された強度の比較が、伝統的アレイＣＧＨの根幹である。単一チャンネルプロファイリング（例えばＳＮＰ−ＣＧＨ）は、２つの遺伝子タイピングパラメーター、即ち正規化された強度の尺度および対立遺伝子比の組み合わせを解析する点において異なっている。総括すれば、これらのパラメーターは、染色体異常のより高感度で正確なプロファイルを与える。ＳＮＰ−ＣＧＨはまた、異常を起こしている遺伝子座の遺伝子情報（ハプロタイプ）を提供する。重要な点として、ＳＮＰ−ＣＧＨは、アレイＣＧＨでは検出できなかった遺伝子変換のようなコピーニュートラルなＬＯＨ事象を同定する能力を有する。
【００７０】
別の実施形態においては、ＦＩＳＨを使用することによりゲノム中のＤＮＡコピー数変化を測定する。蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）は当業者に知られている（Ａｎｇｅｒｅｒ，１９８７  Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：６４９参照）。一般的に、インサイチュハイブリダイゼーションは以下の主要な工程、即ち（１）分析すべき組織または生物学的構造の固定；（２）標的ＤＮＡの接触し易さを増大するため、および非特異的結合を低減するための生物学的構造のハイブリダイゼーション前の処理；（３）生物学的構造または組織における核酸への核酸の混合物のハイブリダイゼーション；（４）ハイブリダイゼーション中に結合しない核酸フラグメントを除去するためのハイブリダイゼーション後の洗浄、ならびに（５）ハイブリダイズした核酸フラグメントの検出、を含む。
【００７１】
典型的なインサイチュハイブリダイゼーションアッセイにおいては、細胞または組織の切片を固体支持体、典型的にはスライドガラスに固定化する。核酸をプローブする場合、細胞は典型的には熱またはアルカリで変性する。次に細胞を中温度でハイブリダイゼーション溶液に接触させることにより、蛋白質をコードする核酸配列に特異的な標識されたプローブのアニーリングを可能にする。次に標的物（例えば細胞）を典型的には所定のストリンジェンシーにおいて、または漸増ストリンジェンシーにおいて適切なシグナル／ノイズ比が得られるまで洗浄する。
【００７２】
そのような用途において使用されるプローブは、典型的には例えば放射性同位体または蛍光レポーターにより標識される。好ましいプローブは、ストリンジェントな条件下で、標的核酸への特異的ハイブリダイゼーションを可能にするために十分な長さ、例えば約５０、１００、または２００ヌクレオチド〜約１０００以上のヌクレオチドである。
【００７３】
一部の用途においては、反復配列のハイブリダイゼーション能力をブロックすることが必要である。即ち、一部の実施形態においては、ｔＲＮＡ、ヒトゲノムＤＮＡ、またはＣｏｔ−１ＤＮＡを用いて非特異的ハイブリダイゼーションをブロックする。
【００７４】
別の実施形態においては、サザンブロッティングを用いてゲノム中のＤＮＡコピー数変化を測定する。サザンブロッティングを実施するための方法は当業者に知られている（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ１９，Ａｕｓｕｂｅｌ等編、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９５またはＳａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄＥｄ．ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８９参照）。そのようなアッセイにおいて、ゲノムＤＮＡ（典型的にはフラグメント化し、電気泳動ゲル上で分離される）を標的領域に対して特異的なプローブにハイブリダイズする。標的領域に対するプローブから得られたハイブリダイゼーションシグナルの強度を正常なゲノムＤＮＡ（例えば同じまたは関連する細胞、組織、臓器等に由来するゲノムＤＮＡ）の解析で得られた対照プローブシグナルと比較することにより、標的核酸の相対的なコピー数の推定が可能となる。
【００７５】
１つの実施形態において、増幅系アッセイ、例えばＰＣＲを用いることによりゲノムのＤＮＡコピー数変化を測定する。そのような増幅系アッセイにおいては、コピー数変化の起こったゲノム領域は増幅反応における鋳型として機能する。定量的増幅において、増幅産物の量は、元試料における鋳型の量に比例することになる。適切な対照との比較により、ゲノム領域のコピー数の尺度が与えられる。
【００７６】
「定量的」増幅の方法は当業者に良く知られている。例えば、定量的ＰＣＲでは、同じプライマーを使用して対照配列の既知量を同時共増幅する。これによりＰＣＲ反応を調整するために使用してよい内標準が得られる。定量的ＰＣＲに関する詳細なプロトコルは、例えばＩｎｎｉｓ等（１９９０）ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．に記載されている。
【００７７】
リアルタイムＰＣＲは、ＤＮＡコピー数変化を測定するために本発明の方法において使用できる（例えば、Ｇｉｂｓｏｎ等、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：９９５−１００１，１９９６；Ｈｅｉｄ等、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：９８６−９９４，１９９６を参照）。リアルタイムＰＣＲは、増幅中のＰＣＲ産物の蓄積のレベルを評価する。ＤＮＡコピー数を計測するためには、全ゲノムＤＮＡを試料から単離する。リアルタイムＰＣＲは、例えばＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）７７００Ｐｒｉｓｍの機材を用いて実施できる。合致するプライマーおよび蛍光プローブは、例えばＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）により提供されるプライマー発現プログラムを用いて目的の遺伝子に対して設計できる。プライマーおよびプローブの最適な濃度は、まず当業者によって測定することができ、そして対照（例えばベータアクチン）プライマーおよびプローブは、例えばＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）から商業的に入手してよい。試料中の目的の特異的核酸の量を定量するためには、対照を用いて標準曲線を作成する。標準曲線はアッセイにおいて使用される目的の核酸の初期濃度に関連するリアルタイムＰＣＲにおいて測定されるＣｔ値を用いて求めてよい。目的の遺伝子の１０〜１０６コピーの範囲の標準希釈物で一般的には十分である。更にまた、標準曲線は対照配列に関して作成する。これにより、比較目的のための対照の量に対する組織試料における目的の核酸の初期含有量の標準化が可能となる。
【００７８】
ＴａｑＭａｎプローブを用いたリアルタイム定量的ＰＣＲの方法は、当該分野で良く知られている。リアルタイム定量的ＰＣＲの詳細なプロトコルは、例えばＲＮＡに関してはＧｉｂｓｏｎ等、１９９６，Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＲＴ−ＰＣＲ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ，１０：９９５−１００１；そしてＤＮＡに関してはＨｅｉｄ等、１９９６，Ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，１０：９８６−９９４に記載されている。
【００７９】
ＴａｑＭａｎ系のアッセイはまた、ＤＮＡコピー数変化に関して特定のゲノム領域を定量するために使用できる。ＴａｑＭａｎ系のアッセイは、５’蛍光染料および３’クエンチング剤を含有する蛍光発生オリゴヌクレオチドプローブを使用している。プローブはＰＣＲ産物にハイブリダイズするが、それ自体は、３’末端におけるブロッキング剤のために伸長され得ない。ＰＣＲ産物を後のサイクルにおいて増幅する場合、ポリメラーゼ、例えばＡｍｐｌｉＴａｑの５’ヌクレアーゼ活性は、ＴａｑＭａｎプローブの切断をもたらす。この切断は、５’蛍光染料と３’クエンチング剤を分離し、これにより増幅の関数としての蛍光の増大をもたらす（例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ２．ｐｅｒｋｉｎ−ｅｌｍｅｒ．ｃｏｍ参照）。
【００８０】
他の適当な増幅方法は、限定しないが例えばリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ（１９８９）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４：５６０，Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ等（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７、ならびにＢａｒｒｉｎｇｅｒ等（１９９０）Ｇｅｎｅ  ８９：１１７参照）、転写増幅（Ｋｗｏｈ等（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３）、自己持続性配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ等（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：１８７４）、ドットＰＣＲ、およびリンカーアダプターＰＣＲ等を包含する。
【００８１】
１つの実施形態において、ＤＮＡ配列決定を使用してゲノム中のＤＮＡコピー数変化を測定する。ＤＮＡ配列決定のための方法は当業者に知られている。
【００８２】
１つの実施形態において、核タイピング（例えばスペクトル核タイピング、ＳＫＹ）を用いることによりゲノム中の染色体構造異常を測定する。核タイピングのための方法は当業者に知られている。例えば、ＳＫＹのためには、１つの染色体のユニークな領域に対して各々相補であるＤＮＡプローブの収集物を作成し、そして特定の染色体のために設計された蛍光色素で標識してよい。ＤＮＡの増幅、欠失、転座または他の構造異常は、プローブの蛍光放出に基づいて測定してよい。
【００８３】
特定の実施形態においては、本発明の２つ以上のゲノム不安定動物モデルに由来する腫瘍試料をＤＮＡコピー数変化に関して解析し、そして少なくとも２つの試料においてコピー数変化が起こっている共通のゲノム領域を同定する。そのような再発性のＤＮＡコピー数変化が特に有利である。
【００８４】
再発性のＤＮＡコピー数変化の最小共通領域（ＭＣＲ）は、２つ以上の試料のコピー数変化を比較する場合に定義してよい。１つの実施形態において、ＭＣＲは２試料の間のオーバーラップの境界により、または少なくとも１つの他の腫瘍におけるより大きい改変のバックグラウンドに対する単一の腫瘍の境界により定義される。
【００８５】
ＭＣＲを測定するための方法は当該分野で知られている（例えば、Ｄ．Ｒ．Ｃａｒｒａｓｃｏ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ９（４），３１３（２００６）；Ａ．Ｊ．Ａｇｕｉｒｒｅ等、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１（２４），９０６７（２００４）参照）。慨すれば、「セグメント化された」データセットは、均一なコピー数セグメント境界を測定すること、そして次にプローブを含有するセグメントの平均ｌｏｇ２比で各プローブに関するそのままのｌｏｇ２比を置き換えることにより作成した。次に最小コピー数変化（ＣＮＡ）を示している閾値を選択することによりノイズを除去する。例えば、プラットホームに関する２倍変化のメジアンｌｏｇ２比を閾値として選択してよい。例示される実施形態においては、ＣＮＡを示す閾値は±０．６（Ａｇｉｌｅｎｔ  ２２Ｋ  ａ−ＣＧＨプラットホーム）および±０．８（Ａｇｉｌｅｎｔ  ４４Ｋ／２４４Ｋ  ａ−ＣＧＨプラットホーム）であり、そしてＭＣＲの幅は１０Ｍｂ未満である。
【００８６】
ＭＣＲの境界は、サザンブロッティングまたはＰＣＲのような当該分野で知られている。何れかの方法によりマッピングできる。
【００８７】
ＭＣＲ内に位置する遺伝子および遺伝子エレメントは、潜在的にはヒト癌に関連し、そしてそのような遺伝子および遺伝子エレメントは、追加的な解析に付すことにより更に特性化できる。例えば、アレイＣＧＨで最初に同定された遺伝子を定量的に増幅してよい。同定されたゲノムＤＮＡまたは相当するＲＮＡの何れかの定量的増幅で、ＤＮＡの獲得または損失を確認できる。あるいは、配列が蛋白質をコードしている場合は、ｍＲＮＡレベル、蛋白質レベル、またはコードされた蛋白質の活性レベルを計測してよい。対照と比較した場合のＲＮＡ／蛋白質／活性レベルの上昇は、ＤＮＡ増幅を確認するものであり、対照と比較した場合のＲＮＡ／蛋白質／活性レベルの低下は、ＤＮＡ欠失を確認するものである。
【００８８】
初期スクリーニングを介して同定された遺伝子または遺伝子エレメントを再配列決定することにより、増幅または欠失を確認し得る。更にまた、ＤＮＡ配列決定および蛋白質発現プロファイリングを用いることにより、腫瘍形成性に関連し得る遺伝子突然変異を同定し得る。
【００８９】
別の態様において、本発明は、ヒト癌に潜在的に関連する遺伝子または遺伝子エレメントの同定のための目的の染色体領域を同定する方法であって、本発明のゲノム不安定動物モデルに由来する癌細胞の集団における染色体構造異常を同定する工程を含む、方法を提供する。染色体構造異常を含有する染色体領域は、ヒト癌に潜在的に関連する遺伝子または遺伝子エレメントの同定のための目的の染色体領域である。
【００９０】
一部の実施形態においては、染色体構造異常はＳＫＹのような核タイピングを用いて検出する。一部の実施形態においては、該方法は更に上記したようにＤＮＡコピー数変化を測定することを含む。染色体構造異常およびＤＮＡコピー数変化の両方を含有する染色体領域は、ヒト癌に潜在的に関連する遺伝子または遺伝子エレメントの同定のための目的の染色体領域である。
【００９１】
別の態様において、本発明は、潜在的にヒトの癌に関連する遺伝子または遺伝子エレメントを同定する方法であって、以下の工程、即ち（ａ）本明細書に記載するように目的の染色体領域を同定すること；（ｂ）非ヒト哺乳類における目的の染色体領域内部の遺伝子または遺伝子エレメントを同定すること；および（ｃ）工程（ｂ）において同定された遺伝子または遺伝子エレメントに相当するヒト遺伝子または遺伝子エレメントを同定することを含む、方法を提供する。
【００９２】
更にまた、多くの公的および私的なデータベースが癌遺伝子の情報を提供しており（例えばＳａｎｇｅｒ’ｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｃｅｎｓｕｓ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｇｅｎｅｔｉｃｓ／ＣＧＰ／Ｃｅｎｓｕｓ）、そして該情報を使用して特定の染色体領域に既知癌遺伝子をマッピングしてよい。
【００９３】
遺伝子または遺伝子エレメントがヒト癌に潜在的に関連することがわかった場合、相当するヒト遺伝子は相同体マッピング、オーソログマッピング、パラログマッピング等の方法により同定してよい。本明細書においては、相同体は共通の先祖のＤＮＡ配列に由来する家系により第２の遺伝子に関連付けられた遺伝子であり、オーソログは種分化により共通の先祖遺伝子から進化した異なる種における遺伝子であり、そしてパラログはゲノム内部の重複により関連付けられた遺伝子である。
【００９４】
１つの実施形態において、ヒト相同体は例えばＮＣＢＩホモロジーンウェブサイト、
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ｄｂ＝ｈｏｍｏｌｏｇｅｎｅを用いることにより同定される。
【００９５】
一部の実施形態においては、該方法は更に、同定された非ヒト遺伝子または遺伝子エレメント中の突然変異を検出することを含む。別の実施形態においては、相当するヒト遺伝子または遺伝子エレメント中の突然変異を同定する。別の実施形態においては、非ヒト遺伝子または遺伝子エレメントおよびヒト遺伝子または遺伝子エレメントの両方における突然変異を同定し、そしてその突然変異を比較する。
【００９６】
別の態様において、本発明は、潜在的にヒト癌に関連する遺伝子または遺伝子エレメントを同定する方法であって、以下の工程、即ち（ａ）非ヒト哺乳類に由来する癌細胞の集団におけるＤＮＡコピー数の変化を検出すること、ここで非ヒト哺乳類のゲノムはゲノム不安定性を生じるように操作される、（ｂ）工程（ａ）において検出されたＤＮＡコピー数の変化の境界内部に位置する遺伝子または遺伝子エレメントを同定すること、（ｃ）工程（ｂ）において同定された遺伝子または遺伝子エレメントに相当し、そしてヒト癌細胞中のＤＮＡコピー数の変化、または染色体構造異常の境界内部に位置するヒト遺伝子または遺伝子エレメントを同定することを含む、方法を提供する。工程（ｃ）において同定されたヒト遺伝子または遺伝子エレメントは、ヒト癌に潜在的に関連する。
【００９７】
コピー数変化または染色体構造異常を検出するための方法は、上記詳述した通りである。コピー数変化の境界内部に位置する遺伝子または遺伝子エレメントを同定するための方法もまた、上記詳述した通りである。
【００９８】
１つの実施形態において、本発明の非ヒト動物モデルにおけるコピー数変化または染色体構造異常は、ヒト癌細胞におけるコピー数変化または染色体構造異常と比較される。潜在的に関連するヒト癌関連遺伝子または遺伝子エレメントは、シンテニーに基づいて同定される。シンテニーは、関連する種の間の遺伝子の保存された順序および方向を説明するものである。非ヒト動物モデルとヒト癌のシンテニーな染色体領域の比較は、腫瘍形成における特定の遺伝子改変の保存された性質を明らかにする場合がある。
【００９９】
シンテニーに基づいた異種間の比較はいくつかの利点を有する。第１は目的の染色体領域を狭小化する能力であり、特定のゲノム改変がある種において他の種よりもより限局的となり、そして異種間比較がそのような種特異的事象を排除する場合がある。第２に、最少共通領域（ＭＣＲ）が典型的には多くの遺伝子を含有し、シンテニー領域の異種間比較は、非ヒト哺乳類（特にマウス）とヒトとの間のゲノムのシンテニー領域が相対的に小区分中にある場合があるため、遺伝子の数を低減するための効率的な方法をもたらす。シンテニーＭＣＲ内部に位置する遺伝子は、ヒト癌に高度に関連している場合がある。
【０１００】
別の態様において、本発明は、潜在的にヒト癌に関連する遺伝子または遺伝子エレメントを同定する方法であって、以下の工程、即ち（ａ）非ヒト哺乳類に由来する癌細胞の集団における染色体構造異常を検出すること、ここで非ヒト哺乳類のゲノムはゲノム不安定性を生じるように操作される、（ｂ）工程（ａ）において検出されたコピー数変化の境界内に位置する遺伝子または遺伝子エレメントを同定すること、（ｃ）工程（ｂ）において同定された遺伝子または遺伝子エレメントに相当し、そしてヒト癌細胞中のコピー数変化、または染色体構造異常の境界内部に位置するヒト遺伝子または遺伝子エレメントを同定することを含む、方法を提供する。工程（ｃ）において同定されたヒト遺伝子または遺伝子エレメントは、ヒト癌に潜在的に関連する遺伝子または遺伝子である。
【０１０１】
４．診断および治療方法
１つの態様において、本発明は、ＦＢＸＷ７の不活性化がヒトＴ細胞悪性疾患に関連するという発見に基づき、γ−セクレターゼ阻害剤療法への低下または上昇した応答を有する場合のある、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）を有する対象を同定するための方法を提供する。
【０１０２】
１つの実施形態において、γ−セクレターゼ阻害剤療法への低下した応答を有する場合のある、Ｔ−ＡＬＬを有する対象を同定するための方法は、ＦＢＸＷ７の発現レベルまたは活性レベルを対象由来の癌細胞において検出することを含み、対照と比較した場合のＦＢＸＷ７の低下した発現／活性は、対象がγ−セクレターゼ阻害剤療法への低下した応答を有する場合があることを示している。癌細胞におけるＮＯＴＣＨ１の発現または活性レベルもまた同時に測定してよく、対照と比較した場合のＮＯＴＣＨ１の上昇した発現／活性は更に、対象がγ−セクレターゼ阻害剤療法への低下した応答を有する場合があることを示している。逆に、対照と比較した場合のＦＢＸＷ７の上昇した発現／活性（場合によりＮＯＴＣＨ１の低下した発現／活性と共に）は、対象がγ−セクレターゼ阻害剤療法に対して感受性である場合があることを示している。
【０１０３】
γ−セクレターゼは少なくとも４種の蛋白質、即ちプレセニリン（プレセニリン１または２）、ニカストリン、ＰＥＮ−２およびＡＰＨ−１よりなる複合体である。数種の蛋白質がγ−セクレターゼ切断のための基質として同定されており、ＮｏｔｃｈおよびＮｏｔｃｈリガンドであるＤｅｌｔａ１およびＪａｇｇｅｄ２、ＥｒｂＢ４、ＣＤ４４、およびＥ−カドヘリンが包含される（Ｗｏｎｇ，Ｇ．Ｔ．等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２７９，Ｉｓｓｕｅ  １３，１２８７６−１２８８２，Ｍａｒｃｈ  ２６，２００４）。γ−セクレターゼによるＮｏｔｃｈの切断がもっとも広範に研究されている。Ｎｏｔｃｈは細胞の成長および系統の特異化、特に胚発生の間の調節において進化的に保存された役割を果たしている。Ｎｏｔｃｈは数種のリガンド（Ｄｅｌｔａ、ＪａｇｇｅｄおよびＳｅｒｒａｔｅ）により活性化され、そして次に一連のリガンド依存性および非依存性の切断により蛋白質分解的にプロセシングされる。γ−セクレターゼは末端切断事象（Ｓ３切断）を触媒し、これはＮｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）として知られているフラグメントを放出する。次にＮＩＣＤフラグメントが核に転座し、そこで核転写因子として作動する。ＮｏｔｃｈＳ３切断におけるその役割から予測されるように、γ−セクレターゼ阻害剤はインビトロのＮＩＣＤ産生をブロックすることが分かっている。インビボにおいては、Ｎｏｔｃｈの機能はＴおよびＢリンパ球の適切な分化のために重要であると考えられ、そしてγ−セクレターゼ阻害剤は胸腺細胞数を低減し、そして胎児胸腺臓器培養における早期の段階において胸腺細胞の分化をブロックする。
【０１０４】
ＦＢＸＷ７遺伝子（ｈＣＤＣ４とも称する）は、染色体の安定性の制御に関与すると考えられているＥ３ユビキチンリガーゼの重要な成分をコードする（Ｍａｏ  Ｊ．等、Ｎａｔｕｒｅ  ４３２，７７５−７７９（２００４））。ＦＢＸＷ７は細胞内ＮＯＴＣＨ１のＰＥＳＴドメインへの結合を担っており、ユビキチン化およびプロテアソームによる分解をもたらす。ヒトＴ−ＡＬＬにおけるＮＯＴＣＨ１およびＦＢＸＷ７中のＰＥＳＴドメイン突然変異間には、統計学的に有意な逆相関が存在するため、ＦＢＸＷ７の低減した発現／活性を有するＴ−ＡＬＬ細胞は、γ−セクレターゼ阻害剤に応答する可能性は低くなる。
【０１０５】
癌療法の頻発する問題点の１つは、寛解中（手術、化学療法、放射線療法、またはそれらの組み合わせによる初期治療の後）の患者が再発を経験する場合があるという点である。これらの患者における再発癌は、多くは見掛け上効を奏した初期の治療に対して抵抗性である場合が多い。実際、疾患を最初に診断された患者における特定の癌は、従来の癌療法に対して、そのような治療に先ず曝露されていなくても、すでに抵抗性である場合がある。γ−セクレターゼ阻害剤療法は、患者にとって身体的に疲弊をもたらす場合がある。セクレターゼ阻害剤の副作用は体重減少、胃腸管構造の変化、壊死細胞破砕物の蓄積、腺窩部の拡張および炎症細胞の浸潤、吐き気、嘔吐、虚弱、下痢、白血球数の上昇、および食道障害を包含する（Ｓｉｅｍｅｒｓ  Ｅ等、２００５  Ｍａｙ−Ｊｕｎ；２８（３）：１２６−３２；Ｗｏｎｇ，ＧＴ等、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００４  Ｍａｒ  ２６；２７９（１３）：１２８７６−８２）。即ち、化学療法による治療から癌患者が利益を被るかどうかを治療の開始に先立って調べる必要がある。
【０１０６】
１つの実施形態において、癌患者は癌細胞試料中のＦＢＸＷ７、および場合によりＮＯＴＣＨ１の発現レベルに基づいてスクリーニングされる。
【０１０７】
ＦＢＸＷ７またはＮＯＴＣＨ１の発現レベルはＤＮＡレベル、ｍＲＮＡレベル、蛋白質レベル、活性レベル、または遺伝子もしくは蛋白質の発現のデータに反映されるかそれより誘導される他の量により計測し得る。例えば、遺伝子改変はＦＢＸＷ７の低下した発現をもたらし得る。共通の遺伝子改変は、ゲノムからの少なくとも１つのＦＢＸＷ７遺伝子の欠失、またはＦＢＸＷ７遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子における突然変異を包含する。突然変異はミスセンス突然変異；ナンセンス突然変異；１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換；５’末端（未翻訳領域またはコーディング領域の何れか）、３’末端（未翻訳領域またはコーディング領域の何れか）、またはそれらの両方からのトランケーション；５’未翻訳領域、３’未翻訳領域、コーディング領域（これはアミノ酸変化をもたらす）、または３者の組み合わせにおける１つ以上のヌクレオチドの置換であってよい。例示される遺伝子改変は、ＦＢＸＷ７の第３のＷＤ４０ドメインまたは第４のＷＤ４０ドメインにおける突然変異、Ｇ４２３Ｖ、Ｒ４６５Ｃ、Ｒ４６５Ｈ、Ｒ４７９Ｌ、Ｒ４７９Ｑ、Ｒ５０５ＣおよびＤ５２７Ｇ突然変異を包含する。遺伝子改変はまた、ＮＯＴＣＨ１遺伝子の転座またはコピー数増幅のような、Ｎｏｔｃｈ１の上昇した発現をもたらす場合がある。
【０１０８】
ＦＢＸＷ７またはＮＯＴＣＨ１のｍＲＮＡレベルは、何れかの当該分野で知られた方法、例えばＰＣＲ、ノーザンブロッティング、ＲＮアーゼ保護アッセイ、またはマイクロアレイハイブリダイゼーションを用いて計測し得る。例えば、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応、別称定量的リアルタイムＰＣＲ（ＱＲＴ−ＰＣＲ）または動的ポリメラーゼ連鎖反応が、標的遺伝子のｍＲＮＡレベルを計測するために当該分野で広範に使用されている。ＱＲＴ−ＰＣＲ操作法は、ポリメラーゼ連鎖反応の一般的パターンに従うが、ＤＮＡは増幅の各ラウンドの後に定量される。２つの通常の定量方法は、２本鎖ＤＮＡとインターカレートする蛍光染料および相補ＤＮＡとハイブリダイズした場合に蛍光性となる改変されたＤＮＡオリゴヌクレオチドを使用する。ＱＲＴ−ＰＣＲは、少量のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を定量するために逆転写ポリメラーゼ連鎖反応と組み合わせることができ、これにより特定の時点において、または特定の細胞または組織の型において、相対的な遺伝子発現を定量することが可能になる。
【０１０９】
ＦＢＸＷ７またはＮＯＴＣＨ１の発現レベルはまた、何れかの当該分野で知られた方法を用いて蛋白質レベルにより計測し得る。蛋白質定量のための伝統的な方法論は、２−Ｄゲル電気泳動、質量スペクトル解析および抗体結合を包含する。生物学的試料中の標的蛋白質レベルをアッセイするために頻繁に使用されている方法は、抗体系の手法、例えばイムノブロッティング（ウエスタンブロッティング）、免疫組織学的アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、または蛋白質チップを包含する。ゲル電気泳動、免疫沈降および質量スペクトル解析は標準的手法を用いて実施し得る。更にまた、ＮＯＴＣＨ１発現は、細胞における切断核内（ＩＣＮ）型のＮＯＴＣＨ１蛋白質の検出により計測し得る。
【０１１０】
ＦＢＸＷ７またはＮＯＴＣＨ１の発現レベルはまた、ＮＯＴＣＨ１の転写活性またはＦＢＸＷ７のリガーゼ活性のような当該分野で知られた方法を用いて遺伝子産物の活性レベルにより計測し得る。例えば、ＮＯＴＣＨ１活性は、ＩＣＮのＮＯＴＣＨ１の上昇した結合により計測し得る。あるいは、ＮＯＴＣＨ１の転写下流標的の発現レベルをＮＯＴＣＨ１活性の指標、例えばｃ−Ｍｙｃ、ＰＴＣＲＡ、Ｈｅｓ１等として計測し得る。
【０１１１】
特定の実施形態においては、対照に対してＦＢＸＷ７またはＮＯＴＣＨ１の発現／活性レベルを比較することが有用である。対照は、定量的な形態（例えば数、比、パーセンテージ、グラフ等）または定性的な形態（例えばゲルまたはブロット上のバンド強度等）におけるＦＢＸＷ７またはＮＯＴＣＨ１の発現レベルの計測であってよい。種々の対照を使用し得る。対象に由来する同じ細胞型の非癌細胞からのＦＢＸＷ７またはＮＯＴＣＨ１の発現のレベルを、対照として使用し得る。健常個体に由来する同じ細胞型からのＦＢＸＷ７またはＮＯＴＣＨ１の発現のレベルもまた、対照として使用し得る。あるいは、対照は、治療前のある時点または治療過程の早期の期間において、治療されている個体に由来するＦＢＸＷ７またはＮＯＴＣＨ１の発現レベルであり得る。更に他の対照は、データベース（例えば表、電子データベース、スプレッドシート等）中に存在する発現レベルまたは予め決定された閾値を包含し得る。
【０１１２】
本発明は更に、γ−セクレターゼ阻害剤による治療に対して感受性となる可能性のある、Ｔ−ＡＬＬ対象（上記方法を用いて同定）を治療する方法であって、γ−セクレターゼ阻害剤を患者に投与することを含む、方法を開示する。γ−セクレターゼ阻害剤は当該分野で知られており、例示されるγ−セクレターゼ阻害剤は、ＬＹ４５０１３９ジヒドレートおよびＬＹ４１１５７５を包含する。
【０１１３】
本発明は更に、ＦＢＸＷ７の低下した発現／活性を有することになるＴ−ＡＬＬ対象（上記方法を用いて同定）を、ＦＢＸＷ７の発現／活性を上昇させる薬剤を用いて治療する方法を開示する。該薬剤は、組み換えＦＢＸＷ７蛋白質またはその機能的に活性なフラグメントもしくは誘導体、ＦＢＸＷ７蛋白質またはその機能的に活性なフラグメントもしくは誘導体をコードする核酸、またはＦＢＸＷ７を活性化する薬剤であってよい。「機能的に活性な」ＦＢＸＷ７フラグメントまたは誘導体は、抗原性または免疫原性の活性、天然の細胞性物質に結合する能力等、完全長の野生型ＦＢＸＷ７蛋白質に関連する１つ以上の機能的活性を呈する。ＦＢＸＷ７蛋白質、誘導体およびフラグメントの機能的活性は、当業者に知られた種々の方法によりアッセイされ得る（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃｏｌｉｇａｎ等編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｓｏｍｅｒｓｅｔ，Ｎ．Ｊ．（１９９８））。
【０１１４】
別の態様において、本発明は、ＰＴＥＮ活性化がヒトＴ細胞悪性疾患に関連するという発見に基づき、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）経路阻害剤での治療から利益を被る場合がある、Ｔ−ＡＬＬを有する対象を同定するための方法を提供する。
【０１１５】
ＰＴＥＮは細胞周期を調節する腫瘍サプレッサー遺伝子として特性化されている。ＰＴＥＮはホスファチジルイノシトール（３，４，５）−トリホスフェート（ＰＩＰ３）の３’ホスフェート基を除去することにより、ホスホジエステラーゼおよびＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路の阻害剤として機能する。ＰＴＥＮが不活性化される場合、ＰＩＰ３の増大した産生がＡＫＴ（蛋白質キナーゼＢ）を活性化する。ＡＫＴ経路は細胞の増殖、成長、生存、および運動性を増強することにより、そしてアポトーシスを抑制することにより、腫瘍の進行を促進する。ＡＫＴはホスホイノシチド依存性キナーゼＰＤＫ１、即ちＰＩ３Ｋにより活性化される酵素により触媒される２つのホスホリル化事象により活性化される。
【０１１６】
１つの実施形態において、ＰＩ３Ｋ経路阻害剤による治療から利益を被る場合がある、Ｔ−ＡＬＬを有する対象を同定するための方法は、ＰＴＥＮの発現レベルまたは活性レベルを対象由来の腫瘍細胞において検出することを含む。対照と比較した場合のＦＢＸＷ７の低下した発現／活性は、対象がＰＩ３Ｋ阻害剤療法から利益を被る可能性があることを示している。
【０１１７】
対象由来の癌細胞中のホスホＡＫＴレベルはまた同時に測定してよく、対照と比較した場合の上昇したホスホＡＫＴレベルは、更に対象がＰＩ３Ｋ阻害剤療法から利益を被る可能性があることを示している。
【０１１８】
ＰＴＥＮの発現レベルは、ＤＮＡレベル、ｍＲＮＡレベル、蛋白質レベル、活性レベル、または遺伝子もしくは蛋白質の発現のデータに反映されるかそれより誘導される他の量により計測し得る。例えば、遺伝子改変はＰＴＥＮの低下した発現をもたらし得る。共通の遺伝子改変は、ゲノムからの少なくとも１つのＰＴＥＮ遺伝子の欠失、またはＰＴＥＮ遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子における突然変異を包含する。突然変異はミスセンス突然変異；ナンセンス突然変異；１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換；５’末端（未翻訳領域またはコーディング領域の何れか）、３’末端（未翻訳領域またはコーディング領域の何れか）、またはそれらの両方からのトランケーション；５’未翻訳領域、３’未翻訳領域、コーディング領域（これはアミノ酸変化をもたらす）、または３者の組み合わせにおける１つ以上のヌクレオチドの置換であってよい。
【０１１９】
ＰＴＥＮの発現レベルはまた、何れかの当該分野で知られた方法、例えばＰＣＲ、ノーザンブロッティング、ＲＮアーゼ保護アッセイ、またはマイクロアレイハイブリダイゼーションを用いて、ｍＲＮＡレベルにより計測し得る。
【０１２０】
ＰＴＥＮの発現レベルはまた、何れかの当該分野で知られた方法、例えば２−Ｄゲル電気泳動、質量スペクトル解析および抗体結合を用いて、蛋白質レベルにより計測し得る。
【０１２１】
ＰＴＥＮの発現レベルはまた、何れかの当該分野で知られた方法、例えばホスファターゼ活性の計測を用いてＰＴＥＮの活性レベルにより計測し得る。更にまた、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路に関与する他の蛋白質の発現または活性もまた、ＰＴＥＮ活性の代理として計測し得る。例えば、癌におけるホスホＡＫＴレベルは、一般的にＰＴＥＮ活性を反映しており、従ってＰＴＥＮ活性に関するマーカーとして計測し得る。
【０１２２】
特定の実施形態においては、対照を使用してＰＴＥＮの発現／活性レベルを比較し得る。上記において詳述したように、対照は、対象に由来する同じ型の非癌細胞、健常個体由来の同じ細胞型から誘導されるか、予め測定された値等であってよい。
【０１２３】
本発明は更に、ＰＩ３Ｋ阻害剤での治療から利益を被る場合がある、Ｔ−ＡＬＬ対象（上記方法を用いて同定）を治療する方法であって、ＰＩ３Ｋ阻害剤を患者に投与することを含む、方法を提供する。ＰＩ３Ｋ阻害剤は当該分野で良く知られている（例えばＰｉｎｎａ，ＬＡおよびＣｏｈｅｎ，ＰＴＷ（編）Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（２００４）およびＡｂｅｌｓｏｎ，ＪＮ，Ｓｉｍｏｎ，ＭＩ，Ｈｕｎｔｅｒ，Ｔ，Ｓｅｆｔｏｎ，ＢＭ（編）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２０１：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ，Ｐａｒｔ  Ｂ：Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（２００７））。
【０１２４】
本発明は更に、ＰＴＥＮの低下した発現／活性を有することになるＴ−ＡＬＬ対象（上記方法を用いて同定）をＰＴＥＮの発現／活性を上昇させる薬剤を用いて治療する方法を開示する。該薬剤は、組み換えＰＴＥＮ蛋白質またはその機能的に活性なフラグメントもしくは誘導体、ＰＴＥＮ蛋白質またはその機能的に活性なフラグメントもしくは誘導体をコードする核酸、またはＰＴＥＮを活性化する薬剤であってよい。
【０１２５】
別の態様において、本発明は、対象が癌に罹患しているか、または癌を発症する危険性を有するかどうかを評価する方法であって、対象に由来する生物学的試料における、表１の増幅されたＭＣＲ中に位置する少なくとも１つの癌遺伝子または候補癌遺伝子の発現または活性のレベルを測定することを含む、方法を提供する。対照と比較した場合の遺伝子の発現または活性の上昇は、対象が癌に罹患しているか、または癌を発症する危険性を有することを示している。あるいは、対照と比較して、表１の欠失したＭＣＲ中に位置する癌遺伝子または候補癌遺伝子の発現または活性に低下がある場合は、低下した発現または活性のレベルもまた、対象が癌に罹患しているか、または癌を発症する危険性を有することを示している。
【０１２６】
別の態様において、本発明は対象が癌に罹患しているか、または癌を発症する危険性を有するかどうかを評価する方法を提供し、該方法は、対象に由来する生物学的試料における、表１に列挙した少なくとも１つの増幅された最小共通領域（ＭＣＲ）のコピー数を測定することを含む。ＭＣＲの正常なコピー数と比較した場合の試料中のＭＣＲの増大したコピー数は、対象が癌に罹患しているか、または癌を発症する危険性を有することを示している。あるいは、ＭＣＲの正常なコピー数と比較した場合の試料中の欠失したＭＣＲ（やはり表１に列挙）の低下したコピー数もまた、対象が癌に罹患しているか、または癌を発症する危険性を有することを示している。ＭＣＲの正常なコピー数は、典型的には染色体当たり１つである。
【０１２７】
別の態様において、本発明は、対象における癌の進行をモニタリングするための方法を提供し、該方法は、以下の工程：ａ）表１に列挙する癌遺伝子または候補癌遺伝子の発現または活性のレベルを、第１の時点における対象由来の生物学的試料中で測定すること；ｂ）その後の時点において工程ａ）を反復すること；およびｃ）工程ａ）およびｂ）における遺伝子の発現または活性を比較すること、そしてそれから対象における癌の進行をモニタリングすることを含む。
【０１２８】
別の態様において、本発明は、対象における癌を治療するための試験薬剤の薬効を評価する方法であって、以下の工程：ａ）試験薬剤の存在下、対象由来の生物学的試料中の表１の増幅されたＭＣＲ中に位置する少なくとも１つの癌遺伝子または候補癌遺伝子の発現または活性のレベルを測定すること；およびｂ）試験薬剤の非存在下、対象由来の生物学的試料中の遺伝子の発現または活性のレベルを測定することを含む、方法を提供する。工程（ｂ）と比較した場合の工程（ａ）における遺伝子の低下した発現または活性は、対象における癌を治療するための試験薬剤の潜在的な薬効を示している。あるいは、試験薬剤が表１の欠失したＭＣＲ中に位置する少なくとも１つの癌遺伝子または候補癌遺伝子の発現または活性を上昇させる場合、試験薬剤はやはり対象における癌を治療するために潜在的に有効である。
【０１２９】
別の態様において、本発明は、対象における癌を治療するための療法の効力を評価する方法を提供し、該方法は以下の工程：ａ）対象に少なくとも一部分の療法を提供する前に、対象由来の生物学的試料中の、表１の増幅されたＭＣＲ中に位置する少なくとも１つの癌遺伝子または候補癌遺伝子の発現または活性のレベルを測定すること；および、ｂ）療法の一部分を提供した後に、対象由来の生物学的試料中の遺伝子の発現または活性のレベルを測定することを含む。工程（ｂ）と比較した場合の工程（ａ）における遺伝子の低下した発現または活性は、対象における癌を治療するための療法の効力を示している。あるいは、療法が表１の欠失したＭＣＲ中に位置する少なくとも１つの癌遺伝子または候補癌遺伝子の発現または活性を上昇させる場合、該療法はやはり対象における癌を治療するために潜在的に有効である。
【０１３０】
別の態様において、本発明は、癌に罹患した対象を治療する方法であって、表１の増幅されたＭＣＲ中に位置する少なくとも１つの癌遺伝子または候補癌遺伝子の発現または活性のレベルを低下させる薬剤を対象に投与することを含む、方法を提供する。あるいは、本発明は、癌に罹患した対象を治療する方法であって、表１の欠失したＭＣＲ中に位置する少なくとも１つの癌遺伝子または候補癌遺伝子の発現または活性のレベルを上昇させる薬剤を対象に投与することを含む、方法を提供する。
【０１３１】
特定の実施形態においては、薬剤は、表１に列挙する癌遺伝子または候補癌遺伝子に特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合フラグメントである。場合により、該抗体は毒素、または化学療法剤にコンジュゲートし得る。
【０１３２】
あるいは、薬剤は、表１における増幅されたＭＣＲ中の癌遺伝子もしくは候補癌遺伝子の発現を阻害するＲＮＡ干渉分子（例えばｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ分子）、または表１における増幅されたＭＣＲ中の癌遺伝子もしくは候補癌遺伝子に相補なアンチセンスＲＮＡ分子であってよい。
【０１３３】
あるいは、薬剤はペプチドまたはペプチドミメティック、小型有機分子、またはアプタマーであってよい。
【０１３４】
好ましくは、剤は製薬上許容しうる製剤で投与される。
【０１３５】
別の態様において、本発明は、対象が癌に罹患しているか、または癌を発症する危険性を有するかどうかを評価する方法を提供し、該方法は、対象に由来する生物学的試料における、表５に列挙した少なくとも１つの最小共通領域（ＭＣＲ）のコピー数を測定することを含む。ＭＣＲの正常なコピー数と比較した場合の、試料中のＭＣＲのコピー数の変化は、対象が癌に罹患しているか、または癌を発症する危険性を有することを示している。ＭＣＲの正常なコピー数は、典型的には染色体当たり１つである。
【０１３６】
特定の実施形態においては、癌はリンパ腫である。特定の実施形態においては、リンパ腫はＴ−ＡＬＬである。
【０１３７】
別の態様において、本発明は、ゲノム不安定非ヒト哺乳類モデル（例えば本発明のゲノム不安定マウスモデル）を用いて同定されたＭＣＲのコピー数をＭＣＲの正常なコピー数と比較することにより、対象が癌に罹患しているか、または癌を発症する危険性を有するかどうかを評価する方法を提供する。ＭＣＲの正常なコピー数は、典型的には染色体当たり１つである。
【実施例】
【０１３８】
実施例１：高度に複雑なゲノムを有するネズミＴ細胞リンパ腫の形成および特性化
本実施例においては、本発明者等はｐ５３依存性の態様においてＴリンパ腫形成を起こすためにＡｔｍ不全およびテロメア機能不全のゲノム不安定化作用を組み合わせるネズミリンパ腫モデル系を作成した。
【０１３９】
本発明者等はｍＴｅｒｃＡｔｍｐ５３ヘテロ接合マウスを異種繁殖させ、それらを病原体非含有の状態において維持した。本発明者等はｍＴｅｒｃ、Ａｔｍおよびｐ５３のヌル対立遺伝子を異種交配させることにより、この「３重」突然変異体コロニーから種々の遺伝子型の組み合わせを作成した（簡便のために、以降、このコロニーに由来する全遺伝子型につき「ＴＫＯ」と記載する）。
【０１４０】
本発明者等は１日おきに疾患健康の徴候に関して動物をモニタリングした。瀕死状態の動物は安楽死させ、完全な剖検に付し；死亡状態で発見されたマウスは特にリンパ腫の徴候に関して検死した。本発明者等は認可されたＩＡＣＵＣプロトコルに従って全動物の使用および操作を実施した。腫瘍をＴＫＯマウスから採取し、以下の態様において分配した。１区分はＤＮＡおよびＲＮＡ抽出のために瞬間凍結し、第２の部分は組織学的検査用に処理し、そして残余の部分はインビトロ培養用に凝集解離させた。腫瘍細胞の懸濁液は５０μＭのベータメルカプトエタノール、１０％Ｃｏｓｍｉｃウシ血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、０．５ｎｇ／ｍＬ組み換えＩＬ−２、および４ｎｇ／ｍＬ組み換えＩＬ−７（両方ともＰｅｐｒｏｔｅｃｈより入手）を添加したＲＰＭＩ中に維持した。腫瘍細胞はＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、およびＢ２２０／ＣＤ４５Ｒ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に対する抗体で免疫染色し、そしてＦＡＣＳ分析を行った。
【０１４１】
本発明者等はＰｕｒｅＧｅｎｅキットにより製造元（Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の説明書に従ってＤＮＡ凍結腫瘍を作成した。本発明者等はＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により製造元の説明書に従って初期抽出によりＲＮＡを作成した。次にペレト化した全ＲＮＡをＲＱ１  ＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で消化し、その後、ＲＮＡ精製カラム（Ｇｅｎｔｒａ）を通して精製した。蛋白質は、３０秒間超音波バス中の超音波処理の後、溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによる）中で凝集解離することにより、細胞系統または腫瘍小片の何れかより入手した。溶解物を遠心分離して清澄化した後に、製造元の説明書（ＢｉｏＲａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ）に従って定量し、そして４〜１２％ＮｕＰａｇｅゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で分離した。
【０１４２】
本発明者等の観察によれば、ｐ５３＋／−またはｐ５３−／−であるＴＫＯマウスがｐ５３に関して野生型であるＴＫＯ動物と相対比較してより短い潜伏期間およびより高値の浸透度において致死的リンパ腫により死亡した（図２Ａ）。更にまた、ｐ５３に関してヘテロ接合であるＴＫＯマウスに由来するリンパ腫は１４標本（検査した１５標本中）においてホモ接合性への減数を示し（図２Ｂ）、この場合のリンパ腫形成の間にｐ５３を不活性化する強力な遺伝子的圧力を示していた。表現型的には、これらのＴＫＯ腫瘍はＣＤ４＋／ＣＤ８＋（一般性は低いがＣＤ４−／ＣＤ８−または混合型の単独／二重陽性）リンパ腫細胞による胸腺構造の消去を有する従来のＡｔｍ−／−マウスモデルにおけるリンパ腫を模倣していた（図２Ｃ）。総括すれば、遺伝子的および分子的な観察結果は、Ａｔｍ非依存性ｐ５３依存性テロメアチェックポイントはリンパ腫の発達を制約するために作動することを強力に示唆している。
【０１４３】
染色体再配列を定量するために、本発明者等はＳｐｅｃｔｒａｌ  Ｋａｒｙｏｔｙｐｅ（ＳＫＹ）分析を以下のプロトコルに従って使用した。中期のプリパレーションは典型的には、樹立後４８時間以内に得たが、数例においては細胞系統の樹立が良好な品質の中期を得るために必要であった。採取した細胞は１５分間１０５ｍＭＫＣｌ低張性緩衝液中でインキュベートした後、３：１メタノール：酢酸中で固定化した。スペクトル核タイピングはＳｋｙＰａｉｎｔ  ＫｉｔおよびＳｋｙＶｉｅｗ分析用ソフトウエア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｐｅｃｔｒａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いながら製造元のプロトコルに従って実施した。染色体異常はＣｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｅの規則を用いながら定義した。Ｇ０およびＧ１−Ｇ４細胞遺伝学的特徴の間のＴ検定による比較は各セットにつき９０ＳＫＹプロファイルに基づく（ＴＫＯリンパ腫の各々に対して１０中期スプレッド）。
【０１４４】
図１、図２Ｄ、および表３は９テロメア不全（Ｇ１−Ｇ４ｍＴｅｒｃ−／−）ＴＫＯリンパ腫および９テロメア見損傷（Ｇ０ｍＴｅｒｃ＋／＋またはｍＴｅｒｃ＋／−）ＴＫＯリンパ腫における染色体再配列のＳＫＹ分析を総括したものである。Ｇ０腫瘍と相対比較して、Ｇ１−Ｇ４ＴＫＯリンパ腫は、多中心染色体の多重度、非相互転座（ＮＲＴ）、相同および／または非相同染色体のｐ−ｐロバートソン様転座、ｐ−ｑ融合、およびｑ−ｑ融合を包含する種々の型の染色体構造異常の全体的に高値の頻度を示していた（それぞれ染色体当たり０．３４対０．０９、ｐ＜０．０００１、ｔ検定）。染色体毎に検査した場合、数種の染色体（特に２、６、８、１４、１５、１６、１７および１９）はＧ０ＴＫＯ腫瘍と相対比較してＧ１−Ｇ４において有意に高値の２動原体およびロバートソニアン様の再配列事象に関与していた（ｐ＜０．０５；ｔ検定；図２Ｅ）。特定の理論に制約されないが、ＴＫＯモデルにおけるこれらの染色体再配列の再発性の非ランダムの性質は、テロメア機能不全に対して耐容性であり、および／またはリンパ腫の発達において起因的役割を果たすための順応機序を与えている可能性がある（例えば染色体２、下記参照）。
【０１４５】
実施例２：ＴＫＯリンパ腫はヒトＴ細胞悪性疾患におけるものに対してシンテニーのゲノム改変を保有している。
【０１４６】
ネズミリンパ腫易罹患性ＴＫＯ不安定性モデルにおける、そしてヒトＴ−ＡＬＬおよび他の癌におけるシンテニーオーバーラップの程度を評価するために、本発明者等は多数のゲノム分析技術を適用しそして統合することにより、Ｔ−ＡＬＬおよび多様なセットの主要なヒト癌との比較のために癌関連改変を調査した。
【０１４７】
シンテニーは種の間で保存された遺伝子の順序および方向を説明するものである。染色体再配列により誘発されるシンテニーの破壊は、分岐進化の指標である。ＴＫＯマウスモデルおよびヒトＴ−ＡＬＬのシンテニー染色体領域の比較は、腫瘍形成における特定の遺伝子改変の保存された性質を明らかにする場合がある。
【０１４８】
ＴＫＯリンパ腫は複雑な非相互転座（ＮＲＴ）の多数を保有していたため、本発明者等はこれらのゲノム不安定腫瘍が増大した数の再発性の増幅および欠失を保有するかどうか調べることを試みた。この目的のために、本発明者等は３５ＴＫＯ腫瘍（表３）および比較のための２６ヒトＴ−ＡＬＬ細胞系統および腫瘍（表４Ａおよび４Ｂ）に関する高分解能のゲノムワイドのアレイＣＧＨのプロファイルを編集した
本実施例および実施例３〜７において使用したＴ−ＡＬＬ細胞系統を表４Ａに列挙する。サブセットは記載する通りアレイＣＧＨ（後に詳述）および再配列決定の両方に付した。
【０１４９】
本発明者等は本実施例において臨床ヒトＴ−ＡＬＬ試料の２コホートを使用した。８試料（表４Ｂ）のコホートは、Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ研究００−００１において治療されたＴ−ＡＬＬを有する小児科患者から診断時においてインフォームドコンセントおよびＩＲＢ認可とともに入手した低温保存されたリンパ芽球またはリンパ芽球細胞溶解物よりなるものであった。本発明者等はこれらの試料をゲノムワイドのアレイＣＧＨプロファイリングに付した。
【０１５０】
ゲノムワイドのアレイＣＧＨプロファイリングのために、本発明者等は以下のプロトコルを使用した。ゲノムＤＮＡプロセシング、標識およびＡｇｉｌｅｎｔ  ＣＧＨアレイへのハイブリダイゼーションは製造元のプロトコルに従って実施した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｏｍｅ．ａｇｉｌｅｎｔ．ｃｏｍ／ａｇｉｌｅｎｔ／ｈｏｍｅ．ｊｓｐｘ）。ネズミ腫瘍は個々のマッチした正常ＤＮＡ（例えば同じ個体に由来する同じ細胞型の非腫瘍細胞）、または、入手できない場合は、マッチする系統バックグラウンドのプールされたＤＮＡに対して、プロファイリングした。標識されたＤＮＡを、マウスに関しては４４Ｋまたは２４４Ｋのマイクロアレイ、そしてヒトに関しては２２Ｋおよび４４Ｋのマイクロアレイ上にハイブリダイズした。マウス４４Ｋアレイは４２，４０４の６０量体エレメントを含有し、それに対してユニークなマップ位置が定義されていた（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ｍｏｕｓｅ  Ｂｕｉｌｄ３４）。マッピングされたエレメントの間のメジアン間隔は２１．８ｋｂであり、間隔の９７．１％は＜０．３メガ塩基（Ｍｂ）であり、９９．３％が＜１Ｍｂであった。２４４Ｋアレイは２２４，６４１エレメントを含有し、それらに対して同じマウスゲノムビルドに基づいてユニークなマップ位置が定義されていた。ヒト２２Ｋアレイは発現プロファイリングのために設計された２２，５００エレメントを含有し、それらに対して、マッピングされたエレメント間のメジアン間隔５４．８ｋｂで、１６，０９７のユニークなマップ位置が定義されていた。ヒト４４Ｋマイクロアレイは４２，４９４の６０量体オリゴヌクレオチドプローブを含有し、それに対してユニークなマップ位置が定義されていた（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｈｕｍａｎ  Ｂｕｉｌｄ３５）。２４４Ｋアレイは２２６，９３２の６０量体オリゴヌクレオチドプローブを含有し、それらに対して同じヒトゲノムビルドに基づいてユニークなマップ位置が定義されていた。
【０１５１】
２４４Ｋ密度アレイ上で形成されたプロファイルは４４Ｋマイクロアレイ上の同じ４２Ｋプローブに関して抽出することにより２つの異なるプラットホーム上で形成されたプロファイルの組み合わせを可能とした。スキャンされた画像の蛍光比を規格化し、そして２つの対形成（染料交換）の平均として計算し、そして生データにおける変化点の有意性を決定するために順列を使用するアルゴリズムであるＣｉｒｃｕｌａｒ  Ｂｉｎａｒｙ  Ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎに基づいてコピー数プロファイルを作成した（Ａ．Ｂ．Ｏｌｓｈｅｎ等、Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ５（４），５５７（２００４））。
【０１５２】
ＴＫＯプロファイルは局所的および限局的な性質のもの両方の再発ＣＮＡを呈している全染色体との顕著なゲノム複合性を明らかにしていた（図２Ｆ）。多くのＣＮＡは高度に再発性であり、試料の４０％超において観察された（例えばマウス染色体１、２、３、４、５、９、１０、１２、１４、１５、１６、および１７上の異なる領域をターゲティングするアンプリコン；および６、１１、１２、１３、１４、１６、および１９上の欠失）。ゲノム改変のこれらのパターンは再配列事象におけるこれらの染色体の優勢な関与を示すＳＫＹ分析と十分相応していた。このプラットホームの頑健性および分解能を実証するものとして、Ｔ細胞受容体（Ｔｃｒ）遺伝子座の高度に再発性の生理学的欠失がクローンＣＤ４／ＣＤ８陽性Ｔ細胞に関して予測された通り容易に検出され（図２Ｆ、矢印）、例えば染色体６Ｔｃｒβ遺伝子座は２８／３５腫瘍における限局的欠失、並びに染色体１４Ｔｃｒα／Ｔｃｒδ遺伝子座および染色体１３Ｔｃｒδ遺伝子座の限局的欠失を維持していた（図１Ｃ；図２Ｆ）。
【０１５３】
これらの再発性ゲノム事象およびこの不安定性モデルの病因的関連性は、数種の独立したＴＫＯ腫瘍における染色体２に関する高増幅性のゲノム事象の統合的アレイＣＧＨおよびＳＫＹ分析により裏付けられる。これらのＣＮＡはアレイＣＧＨにより定義される共通の境界を共有しており、そしてＳＫＹにより異なる相手染色体を有する染色体２のＡ３バンドが関与する再発性ＮＲＴを含有していた（図３）。
【０１５４】
実施例３：ＴＫＯマウスモデルにおける頻発するＮＯＴＣＨ１再配列
ＴＫＯモデルにおける、そしてヒトＴ−Ａｌｌにおけるゲノム事象を更に比較するために、本発明者等はＮＯＴＣＨ１、ＦＢＸＷ７およびＰＴＥＮの再配列決定のための３８ヒト臨床標本（表４Ｃ）の別個のシリーズを使用した（実施例５〜６参照）。これらのＴ−ＡＬＬ試料はＲｏｙａｌ  Ｆｒｅｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｌｏｎｄｏｎにおいて診断された８人の小児および青年、および、ＭＲＣ  ＵＫＡＬＬ−ＸＩＩ治験に参加した３０人の成人患者から収集した。適切なインフォームドコンセントを患者（１８歳より年長の場合）またはその保護者（１８歳未満の場合）より入手し、そして研究はＥｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの認可を得ている。
【０１５５】
１．ＨＰＬＣおよび配列決定。遺伝子突然変異の状態は変性高速液体クロマトグラフィー（例えばＭ．Ｒ．Ｍａｎｓｏｕｒ等、Ｌｅｕｋｅｍｉａ２０（３），５３７（２００６）参照）、および２方向配列決定により樹立した。慨すれば、ゲノムＤＮＡをＱｉａｇｅｎ（Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のゲノム精製キットを用いながら抽出した。ＰＣＲプライマーはエクソンおよびフランキングするイントロン配列を増幅するように設計した。ＰＣＲ増幅および直接配列決定は当該分野で知られた方法に従って実施した（詳細はＨ．Ｄａｖｉｅｓ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ６５（１７），７５９１（２００５）参照）。配列トレースを手動分析とソフトウエア系分析の組み合わせを用いて分析し、その際、正常からの偏位は２つのオーバーラップする配列トレースの存在（１つの正常対立遺伝子および１つの突然変異体対立遺伝子のＤＮＡ配列の存在を示す）、または正常から偏位している単一の配列トレースの存在（突然変異体ＤＮＡ対立遺伝子のみの存在を示す）により示される。全ての変異体は第２の独立した増幅ＰＣＲ産物の２方向配列決定により確認した。
【０１５６】
２．発現プロファイリング。ビオチニル化標的ｃＲＮＡをＴＫＯモデルに由来する全試料ＲＮＡから作成し、そして正常対照ネズミ胸腺ＲＮＡに対するマウスオリゴヌクレオチドプローブアレイ（マウス発生オリゴマイクロアレイ、Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）に製造元のプロトコルに従ってハイブリダイズした。各遺伝子の発現値はマウスゲノムのＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｂｕｉｌｄ３４に基づいてゲノム位置にマッピングした。
【０１５７】
３．リアルタイムＰＣＲ。遺伝子遺伝子座を確認するために、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓまたはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＭＸ３０００リアルタイムサーモサイクラー上で３連の各腫瘍の操作から得られた２ｎｇのＤＮＡを用いながら、ＱｕａｎｔｉｔｅｃｔＳＹＢＲグリーンキット（Ｑｉａｇｅｎ  ＵＳＡ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）によりリアルタイムＰＣＲを実施した。各３連の操作は２回実施し；定量は標準曲線法を用いて実施し、そして組み合わせた操作に関する平均の倍数変化を計算した。プライマー配列は表８に記載する。
【０１５８】
４．ウエスタンブロッティング。ウエスタンブロットは以下の抗体、即ちＰＴＥＮ（９５５２）、Ａｋｔ（９２７２）、ホスホ−Ａｋｔ（９２７１）、Ｎｏｔｃｈ１、活性化Ｎｏｔｃｈ１Ｖａｌ１７４４（２４２１）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）、およびチューブリン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｉｕｓ，ＭＯ）を使用しながら製造元の説明書に従ってＰＶＤＦ膜上の清澄化された腫瘍溶解物に対して実施し、そしてＨＲＰ標識二次抗体（Ｐｉｅｒｃｅ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）および増強化学ルミネセンス基質で発色させた。
【０１５９】
５．ＮＯＴＣＨ１の共通境界分析。ＣＮＡの共通境界の詳細な構造的分析により、４つのＴＫＯ腫瘍におけるＮｏｔｃｈ１遺伝子の３’領域に近接する再配列を有するＮｏｔｃｈ１遺伝子座改変、および２つの追加的腫瘍におけるＮｏｔｃｈ１を包含する限局的増幅が明らかになった（図３；データ示さず）。Ｃ末端構造的改変および点突然変異によるＮｏｔｃｈ１の活性化はヒトＴ−ＡＬＬのシグネチャー事象である（Ａ．Ｐ．Ｗｅｎｇ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ３０６（５６９４），２６９（２００４）、Ｆ．Ｒａｄｔｋｅ等、Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ５（３），２４７（２００４），Ｌ．Ｗ．Ｅｌｌｉｓｅｎ等、Ｃｅｌｌ６６（４），６４９（１９９１）参照）。ＴＫＯ試料中の再配列の構造はヒトＴ−ＡＬＬにおけるＮＯＴＣＨ１転座を厳密に反映していなかったが（Ｌ．Ｗ．Ｅｌｌｉｓｅｎ等、Ｃｅｌｌ６６（４），６４９（１９９１））、Ｎｏｔｃｈ１を含むそれらの共通の共有境界はＴＫＯ腫瘍の潜在的関連性を示唆していた。従って、本発明者等はＮｏｔｃｈ１の再配列決定をこの遺伝子座においてゲノム再配列の証拠を有さない数種のＴＫＯリンパ腫において実施し、そしてＮｏｔｃｈ１ＰＥＳＴおよびヘテロ２量化（ＨＤ）ドメインにおけるトランケーション挿入／欠失突然変異および非保存的なアミノ酸置換、並びにＰＥＳＴドメインをコードするエクソン３４内部の遺伝子内３７９ｂｐ欠失の１例を明らかにしている（試料Ａ１０４０）（図４Ａ；表３）。この突然変異スペクトルは、ＰＥＳＴおよびＨＤドメインがＮＯＴＣＨ１突然変異の２つのホットスポットであることから、ヒトＴ−ＡＬＬにおいて観察されたものと同様である（図４Ａ、後述参照）（Ａ．Ｐ．Ｗｅｎｇ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ３０６（５６９４），２６９（２００４）。生化学的には種々の型のゲノム再配列、遺伝子内欠失および突然変異がＮｏｔｃｈ１の活性化を促進し、それは、Ｎｏｔｃｈ１蛋白質の完全長蛋白質および活性な切断型（Ｖ１７４４）を検出するように設計されたウエスタンブロットアッセイ（図４Ｂ）により、および、Ｎｏｔｃｈ１のｍＲＮＡレベルと良好な相関をしめしたＰｔｃｒａ、Ｈｅｓ１、Ｄｔｘ１、およびＣｄ３ｅを包含する数種のＮｏｔｃｈ１転写標的のアップレギュレーションを示す転写プロファイル（Ｆ．Ｒａｄｔｋｅ等、Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ５（３），２４７（２００４））（図４Ｃ）により明らかにされている。
【０１６０】
実施例４：コピー数変化の最少共通領域内の遺伝子のオーソログマッピングによる種間シンテニーの測定
本実施例において、本発明者等は更にＣＮＡの最少共通領域を定義し、そして特性化することによりＴＫＯマウスモデルにおけるＣＮＡを評価した。
【０１６１】
シンテニーは種の間で保存された遺伝子の順序および方向を説明するものである。染色体再配列により誘発されるシンテニーの破壊は、分岐進化の指標である。ＴＫＯマウスモデルおよびヒトＴ−ＡＬＬのシンテニー染色体領域の比較は、腫瘍形成における特定の遺伝子改変の保存された性質を明らかにする場合がある。
【０１６２】
ＴＣＲ遺伝子座の生理学的欠失およびＮｏｔｃｈ１のゲノムおよび突然変異の事象のヒト様パターンを観察したことにより、本発明者等は、コピー数変化の最小共通領域（ＭＣＲ）内部に居留する遺伝子のオーソログマッピングを用いながらヒトＴ−ＡＬＬにおけるＣＮＡに対してシンテニーの遺伝子座をターゲティングするＣＮＡをＴＫＯモデルの高度に不安定なゲノムがもたらす程度を評価することとした。
【０１６３】
１．ＭＣＲの定義。この比較を容易にするために、本発明者等は先ず、ＣＮＡ幅≦１０Ｍｂおよび振幅＞０．７５（ｌｏｇ２尺度）の基準と共に確立されたアルゴリズムによりＴＫＯゲノムにおけるＭＣＲを定義した（例えばＤ．Ｒ．Ｃａｒｒａｓｃｏ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ９（４），３１３（２００６）；Ａ．Ｊ．Ａｇｕｉｒｒｅ等、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ１０１（２４）、９０６７（２００４）参照）。慨すれば、「セグメント化された」データセットは、Ｏｌｓｈｅｎ（Ａ．Ｂ．Ｏｌｓｈｅｎ等、Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ５（４），５５７（２００４））の方法に従って均一なコピー数セグメント境界を決定すること、そして次にプローブを含有するセグメントの平均ｌｏｇ２比で各プローブに関する生のｌｏｇ２比を置き換えることにより作成した。２２Ｋおよび４４Ｋのプロファイルに関しては、最小ＣＮＡを示している閾値をそれぞれ±０．１５および±０．３に選択した。ＣＮＡを示している閾値をそれぞれ±０．４および±０．６に選択した。高い閾値を２２Ｋプロファイルに比較する４４Ｋプロファイルに対して使用することによりプラットホームの性能におけるシグナル対ノイズの検出の差に関して調節した。実施例３〜６に関しては、本発明者等は２２Ｋおよび４４Ｋのプロファイルに関してそれぞれ、±０．６０および±０．７５のｌｏｇ２比により定義される究極のＣＮＡ事象を示すために少なくとも１つの試料を必要とすることにより最小共通領域（ＭＣＲ）を選択し、そしてＭＣＲの幅は１０Ｍｂ未満とする。
【０１６４】
２．相同体マッピング。本発明者等はＮＣＢＩ  ＨＯＭＯＬＯＧＥＮＥデータベースを使用しながらマウスＴＫＯ  ＭＣＲ内部のＣＮＡの染色体構造変化の領域において遺伝子のヒト相同体を同定した。並行して本発明者等は７ヒト腫瘍データセット（膵臓、神経膠芽細胞腫、黒色腫、肺、結腸直腸および多発性骨髄腫）中のＣＮＡを同定した。次にヒト相同体遺伝子リストを用いることにより７ヒト腫瘍データセットの各々のＣＮＡ内の遺伝子とマージした。
【０１６５】
３．癌遺伝子マッピング。癌遺伝子マッピングのために、マウス相同体をＳａｎｇｅｒ’ｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｃｅｎｓｕｓ５５（ｈｔｔｐ：／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｇｅｎｅｔｉｃｓ／ＣＧＰ／Ｃｅｎｓｕｓ）に基づいて入手した。次にマウス癌遺伝子をＴＫＯのＭＣＲにマッピングした。
【０１６６】
本発明者等は増幅および欠失用にそれぞれ２．１２Ｍｂ（０．１５〜９．８２Ｍｂ）および２．３３Ｍｂ（０．７７〜９．６Ｍｂ）の平均サイズの１６０ＭＣＲのリストを入手した（表５）。ゲノム改変のこの頻度は大部分のヒト癌ゲノムのもの（例えば図９Ａ）と同等程度であり、そして大部分の遺伝子操作された「ゲノム安定な」ネズミ腫瘍モデルにおいて検出された典型的な２０〜４０事象よりも有意に高値であった（例えばＲ．Ｃ．Ｏ’Ｈａｇａｎ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ６３（１７），５３５２（２００３）；Ｎ．Ｂａｒｄｅｅｓｙ等、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ１０３（１５）、５９４７（２００６）；Ｍ．Ｋｉｍ等、Ｃｅｌｌ１２５（７），１２６９（２００６）；Ｌ．Ｚｅｎｄｅｒ等、Ｃｅｌｌ１２５（７），１２５３（２００６））。ヒトＴ−ＡＬＬにおける同様に定義されたＭＣＲリストと比較した場合、１６０ＭＣＲ中１８（１１％）がヒト相応物中に存在する定義されたゲノム事象とオーバーラップしていた（表１）。
【０１６７】
表１において、ヒトＴ−ＡＬＬデータセット中のＭＣＲとのシンテニーオーバーラップを有する各々のネズミＴＫＯ  ＭＣＲを、その染色体位置（細胞バンド／Ｃｈｒ）および塩基番号（開始および終了、Ｍｂ単位）に沿って、増幅および欠失により分離しながら列挙する。各ＭＣＲの最小サイズはｂｐで示す。ピーク比は各ＭＣＲに関する最大ｌｏｇ２アレイＣＧＨ比を指す。ＲｅｃはＭＣＲを定義した腫瘍の数を指す。増幅されたＭＣＲおよび欠失したＭＣＲに位置する癌遺伝子および候補癌遺伝子も列挙する。これらの癌遺伝子および候補癌遺伝子に関するＮＣＢＩアクセッション番号および識別番号を表９に列挙する。
【０１６８】
マウスＴＫＯと異なる組織学的な型のヒト癌の各々との間のＭＣＲオーバーラップの統計学的有意性を計算するために、本発明者等は、偶然のみにより同程度の２ゲノム間オーバーラップを達成する予測される頻度を求めるために、順列試験を実施した。詳しくは、本発明者等は、実際のＴＫＯゲノムと同じ数量およびサイズの増幅ＭＣＲを相当する染色体中に含有する刺激マウスゲノムをランダムに形成し、ヒト癌ゲノムの各々に対して同様のセットを作成した。マウスと各ヒトゲノムとの間のオーバーラップしている増幅の数を計算して保存した。このシミュレーション過程を１０，０００回反復した。次に増幅オーバーラップの有意性に関するｐ値を、１０，０００順列の間に実際に観察されたものと同等以上の程度のオーバーラップを無作為に達成する頻度を１０，０００で割ることにより、計算した。欠失のオーバーラップに関するｐ値を同様の態様において計算した。
【０１６９】
本発明者等はこの程度のオーバーラップは偶然により達成されなかったと結論した。第１に、統計学的有意性（欠失および増幅に関して、それぞれｐ＝０．００１および０．００４）がこの結論を裏付けており、これは種間オーバーラップの有意性を有効化するための厳格な順列試験により示されている。第２に、本発明者等はこれらの同定されたシンテニーＭＣＲ内部に存在するＣｒｅｂｂｐ、Ｉｋａｒｏｓ、およびＡｂｌのようなＴ−ＡＬＬ生物学において既に知られているか関与している数種の遺伝子を同定した。総括すれば、これらのデータはこの操作されたネズミモデルの関連するヒト癌への関連性、およびその有用性を裏付けている。
【０１７０】
実施例５：Ｔ−ＡＬＬにおける頻繁なＦｂｘｗ７の不活性化
本実施例において、本発明者等はＴＫＯマウスモデルにおける頻繁な不活性化または欠失の標的としてＦｂｘｗ７遺伝子を同定した。
【０１７１】
本発明者等は最小Ｎｏｔｃｈ１発現を有する数種のＴＫＯ腫瘍が上昇したＮｏｔｃｈ４またはＪａｇｇｅｄ１（Ｎｏｔｃｈリガンド）ｍＲＮＡレベルを呈したことを観察した（データ示さず）。この観察事例を検討するために、本発明者等はＮｏｔｃｈ経路における既知成分のゲノムおよび発現の状況のより詳細な検査を実施した。Ｎｏｔｃｈシグナリング系の４つの中核的エレメントはＮｏｔｃｈ受容体、ＤＳＬ（Ｄｅｌｔａ、Ｓｅｒｒａｔｅ、Ｌａｇ−２）リガンド、ＣＳＬ（ＣＢＦ１、ヘアレスのサプレッサー、Ｌａｇ−１）転写補助因子、および標的遺伝子を包含する。リガンド結合時にはＮｏｔｃｈシグナリングはＣＳＬを転写リプレッサから転写活性化物質に変換する。ＴＫＯ試料Ａ５７７はＦｂｘｗ７遺伝子を包含するシンテニーＭＣＲを保有している２つの腫瘍の１つであった（ＭＣＲ＃１８、表１）。ヒトＴ−ＡＬＬにおいて、単一プローブ事象を有する１例を含む限局的なＦＢＸＷ７の欠失が検出された（図５Ａ、右パネル）。究極的に限局的であるものの、種にわたるシンテニーのオーバーラップは、そのような欠失事象がコピー数の多形を表しているという可能性を低めた。実際、ヒトＴ−ＡＬＬ臨床標本（ｎ＝３８）および細胞系統（ｎ＝２３）のコホートにおけるＦＢＸＷ７の再配列決定は（表４Ａ、４Ｃ、６）は、ＦＢＸＷ７がヒト細胞系統の１１／２３（４８％）および臨床試料の１１／３８（２９％）において突然変異または欠失していることを明らかにし、この遺伝子をヒトＴ−ＡＬＬにおいて最も一般的に突然変異しているものの１つとした（表２）。２４中１９のＴＫＯリンパ腫における非新生物性の胸腺と相対比較した場合のＦｂｘｗ７の低減した発現（図５Ｂ）と合致して、ヒトＴ−ＡＬＬにおけるこれらのＦＢＸＷ７突然変異は優勢にはミスセンスの突然変異であり、そして蛋白質の第３および第４のＷＤ４０ドメインの進化的に保存された残基において特にクラスタリングしていた（図５Ｃ）。更にまた、完全緩解した患者数人からのマッチした正常骨髄におけるＦＢＸＷ７の再配列決定によれば、２つの最も頻繁に突然変異した位置（Ｒ４６５，Ｒ４７９）は体細胞的に獲得されており（データ示さず）；同様に、同定された突然変異の何れも公的なＳＮＰデータベース中には存在しておらず、これらの突然変異は性質的には体細胞性であったという可能性を実証した。最後に、２１中１９の突然変異がヘテロ接合性であり、Ｆｂｘｗ７がハプロ不全性の腫瘍サプレッサー遺伝子として機能する場合があるという以前の報告と合致している。
【０１７２】
ＦＢＸＷ７は細胞内ＮＯＴＣＨ１のＰＥＳＴドメインの結合を担っているＥ３ユビキチンリガーゼの重要な成分であり、ユビキチン化およびプロテオソームによる分解をもたらす（Ｎ．Ｇｕｐｔａ−Ｒｏｓｓｉ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６（３７），３４３７１（２００１）；Ｃ．Ｏｂｅｒｇ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６（３８），３５８４７（２００１）；Ｇ．Ｗｕ等、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２１（２１），７４０３（２００１））。ヒトＴ−ＡＬＬにおけるＰＥＳＴドメイン突然変異は細胞内ＮＯＴＣＨ１の半減期を延長すると考えられており、ＦＢＸＷ７機能の損失がこの経路に対する同様の作用を誘発する可能性を生じさせている。これに着目して、本発明者等は更にＮＯＴＣＨ１突然変異に関してヒト細胞系統および臨床試料を特性化した（表２；表４Ａ、４Ｃ、６）。興味深いことに、ＮＯＴＣＨ１（ＨＤ−Ｎ、ＨＤ−ＣおよびＰＥＳＴドメイン）の既知の機能的突然変異とＦＢＸＷ７突然変異との間には関連性がなかった（ｐ＝０．１６）。しかしながらＮＯＴＣＨ１突然変異を有する試料のうち、ＦＢＸＷ７突然変異は、突然変異したＰＥＳＴドメインを有する試料（４／１９；２１％）において、ＨＤ−ＮまたはＨＤ−Ｃドメインのみの突然変異を有する試料（１３／２０；６５％；フィッシャーの正確確立検定によりｐ＝０．００９）よりも低い頻度で見られた。この観察結果の説明の１つとして、ＦＢＸＷ７およびＮＯＴＣＨ１のＰＥＳＴドメインの突然変異は同じ分解経路をターゲティングしており、そして両方の成分を突然変異させることからは白血病の大多数に与えられる選択的利点は殆ど無いことが挙げられる。同時に、ＮＯＴＣＨ１とＦＢＸＷ７の相互排他性の欠如はＮＯＴＣＨシグナリング以外の経路に対するＦＢＸＷ７による非オーバーラップ活性を示唆している可能性がある。
【０１７３】
実施例６：Ｐｔｅｎ不活性化はマウスおよびヒトのＴ細胞悪性疾患における共通の事象である。
【０１７４】
本実施例においては、本発明者等はＴＫＯマウスモデルにおける頻発する不活性化または欠失の標的としてＰｔｅｎ遺伝子を同定した。
【０１７５】
Ｐｔｅｎ遺伝子に集中する染色体１９上の限局的欠失はＴＫＯリンパ腫における最も共通したゲノム事象であった（表１、図２Ｆ）。リアルタイムＰＣＲ評価と組み合わせたアレイＣＧＨを用いながら本発明者等は１５／３５（４３％）ＴＫＯリンパ腫におけるＰｔｅｎのホモ接合欠失を明らかにした（図６、図７Ａ）。ＰＴＥＮはよく知られた腫瘍サプレッサーであり、そしてネズミ胸腺におけるその不活性化はＴ細胞腫瘍を発生させることがわかっている（Ａ．Ｓｕｚｕｋｉ等、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ８（２１），１１６９（１９９８））。相応して、アレイＣＧＨでは、２６中４つのヒトＴ−ＡＬＬ試料（２細胞系統および２原発腫瘍）が持続性のＰＴＥＮ遺伝子座再配列を有していることが確認された。更にまた、６１のＴ−ＡＬＬの細胞系統および臨床標本を再度配列決定したところ（表４）、９例において不活性化ＰＴＥＮ突然変異（これらの何れも公的なＳＮＰデータベースには記載されていない）が明らかになったが、ＮＯＴＣＨ１突然変異の状態との相関は不明であった（表２、表６）。更にまた、本発明者等はＰＴＥＮ突然変異が臨床標本（２／３８；５．２％）よりも細胞系統（７／２３；３０．４％）においてより頻繁に起こることを観察した（表６）。これらの臨床標本は新しく診断された症例から誘導されたのに対し、細胞系統は主に回帰例から樹立されていることから、特定の理論に制約されないが、突然変異頻度におけるこの差は、ＰＴＥＮ不活性化は、他の可能性よりも、進行に伴うより後期の事象であることを示唆している可能性がある。
【０１７６】
これらのゲノムおよび遺伝子の改変に加えて、ＴＫＯおよびヒトＴ−ＡＬＬ試料のノーザンおよびウエスタンブロット分析およびトランスクリプトームのプロファイリングによれば、上昇したホスホＡＫＴを有する低値〜検出不可能のＰＴＥＮ発現（図７Ｂ、データ示さず）を有する腫瘍のより広範な収集が明らかになった。低ＰＴＥＮ発現に加えて、限局的Ａｋｔ１増幅およびＴｓｃ１損失が２つのＴＫＯ試料に存在したことにより明らかにされる通りＡＫＴ活性化を駆動する追加的機序が存在すると考えられる（図７Ｃｌ；データ示さず）。最後に、ＴＫＯリンパ腫におけるＰｔｅｎの状態の生物学的有意性は、Ａｋｔホスホリル化をブロックすることが知られており、そしてＡｋｔ経路に対して依存性の細胞を抑制することが示されている薬物であるトリシリビンに応答したＰｔｅｎ依存的態様におけるＡｋｔ阻害に対するそれらの感受性（図８）により裏付けられる。慨すれば、２０，０００個の細胞を９６穴フォーマットにおいて３連でプレーティングし、そして３７℃の５％ＣＯ２において２日間、種々の用量のトリシリビン（ＢｉｏＭｏｌ，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ、ＰＡ）または等価な濃度のビヒクル（ＤＭＳＯ；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）とともに標準的な培地中でインキュベートした。インキュベーション期間の終了時において、細胞の増殖をＭＴＳアッセイ（ＡｑｕｅｏｕｓＯｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ；Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）で定量し、そして吸光度をＯＤ４９０で読み取った。等価な量のＤＭＳＯ単独における細胞系統の増殖に対して相対的な細胞増殖をプロットした。各細胞系統および用量に対して３〜５回実験を反復した。図８に示す通り、Ｐｔｅｎの突然変異または欠失を有するＴＫＯ細胞はトリシビンに対して感受性であった。
【０１７７】
実施例７：多様なヒト癌とのＴＫＯゲノムの広範な比較
実施例３〜６において、出願人等はＴＫＯマウスモデルを用いながらＦｂｘｗ７およびＰｔｅｎを同定および特性化した。Ｆｂｘｗ７およびＰｔｅｎは両方とも以前より腫瘍サプレッサー遺伝子として同定されている。よって、ヒトＴ−ＡＬＬにおいて突然変異された状態におけるそれらの同定は、出願人等の方策に関わる原理の証明をもたらしており、そして、本明細書に記載したマウスモデルが癌遺伝子発見のための強力な手段を提供することを明らかにしている。本実施例においては、出願人等は種間ゲノム分析を他のヒト癌にまで拡張した。
【０１７８】
上記した種間比較によりＴ細胞起源の癌における多くの一致した疾患が示されたが、この不安定性モデルが非造血系悪性疾患を含む多くの癌型への基本的関連性（例えばテロメア機能不全およびｐ５３突然変異）の機序によりもたらされるという事実は、他のヒト癌への潜在的に広範な関連性を示唆している。重要な例は、ＰＴＥＮが多数の癌型４９，５０に関する真の腫瘍サプレッサーであるという点において、上記Ｐｔｅｎの例が該当する。このことを評価するために、本発明者等は種間比較ゲノム分析を、多発性骨髄腫（ｎ＝６７）５３、神経膠芽細胞腫（ｎ＝３８）（未公開）および黒色腫（ｎ＝１２３）（未公開）、並びに膵臓の腺癌（ｎ＝３０）（未公開）、肺（ｎ＝６３）５４および結腸（ｎ＝７４）（未公開）を包含する造血系、間葉系および上皮系の起源の６つの他のヒト癌型（ｎ＝４２１）に拡張した。
【０１７９】
これらの癌の型の各々の同様に定義されたＭＣＲリスト（即ちＭＣＲ幅≦１０Ｍｂ；実施例４および図５Ａ参照）に対して比較した場合、出願人等は、ＴＫＯゲノムにおける１６０ＭＣＲ中１０２（６１増幅および４１欠失）（６４％）が１つのヒトアレイＣＧＨデータセットにおける少なくとも１つのＭＣＲとマッチしていることを発見し（図５Ａ）、この程度のオーバーラップの非ランダム性を実証する強力な統計学的有意性が伴っていた。これらのシンテニー事象の遺伝子的関連性における信頼性は更に、これらのシンテニーＭＣＲの半数超（６１増幅中３８、即ち６２％；４１欠失中２２、即ち５３％）が２つ以上のヒト腫瘍型において再発しているＭＣＲとオーバーラップしていたという観察事例により裏付けられた（図５Ｂ）。更にまた、ＴＫＯ  ＭＣＲのかなりの割合が非造血系の起源のヒト腫瘍において進化的に保存されている（図５Ｃ）。シンテニーヒットを有する６１増幅中、その５８（９５％）が固形腫瘍において観察されたのに対し、残余３例は黒色腫において固有に観察された（図５Ｃ）。同様に、４１シンテニー欠失中３３（８０％）が固形腫瘍中に存在していた（図５Ｃ）。特に、出願人等は、ｐ５３が７ヒト癌型中５つにおいて欠失ＭＣＲ中に存在していたのに対し、Ｍｙｃは６ヒト癌とオーバーラップしていた増幅の標的であったことを発見した。多様なヒト癌とのこの多大なオーバーラップは予測外であった。
【０１８０】
次に出願人等は、これらのＴＫＯゲノム事象に関して追加的レベルの有効化を行うために、これらのシンテニーＭＣＲが既知癌遺伝子をターゲティングするかどうかを調べた。癌遺伝子センサス５５上に列挙されている３６３遺伝子のうち、２３７遺伝子がＮＣＢＩホモロジーンに基づくマウス相同体を有している（実施例４参照）。これらのうち、２４の既知癌遺伝子が１０４シンテニーＭＣＲの１つの内部に居留していることがわかった（表７）。これらには増幅における１７の癌遺伝子および欠失における７腫瘍サプレッサーを包含していた。これらのシンテニーＭＣＲの大部分は既知癌遺伝子を含有しておらず、シンテニーＭＣＲの居留遺伝子に着目した再配列決定は、ＦＢＸＷ７およびＰＴＥＮの例により裏付けられる命題であるヒト癌における体性の突然変異を同定するための高収率の戦略を与えるかもしれないという強力な可能性を生じさせる。
【０１８１】
本発明の種々の態様の実施は、特段の記載が無い限り、当業者の知る範囲の細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組み換えＤＮＡ、および免疫学の従来の手法を使用してよい。そのような手法は文献に詳細に説明されている。例えば以下を参照のこと：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９８９）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＩおよびＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ等、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２および２００３の補遺）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｍｕｌｌｉｓ等、米国特許第４，６８３，１９５号；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４  ａｎｄ  １５５（Ｗｕ等編），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第Ｉ−ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８６）；Ｃｏｆｆｉｎ等、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９７）；Ｂａｓｔ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，第５版、Ｆｒｅｉ，Ｅｍｉｌ編、ＢＣ  Ｄｅｃｋｅｒ  Ｉｎｃ．Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｃａｎａｄａ（２０００）；Ｌｏｄｉｓｈ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第４版、���．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２０００）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ等、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，第７版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９９）；Ｇｉｌｂｅｒｔ等、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第６版、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（２０００）；およびＣｏｏｐｅｒ，Ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ−Ａ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，第２版、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（２０００）。本明細書において引用した全ての特許、特許出願および参考文献は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【０１８２】
【化１】
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【０１８３】
【化２】
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【０１８４】
【化３】
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【０１８５】
【化４】
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【０１８６】
【化５】
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【０１８７】
【化６】
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【０１８８】
【化７】
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【０１８９】
【化８】
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【０１９０】
【化９】
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【０１９１】
【化１０】
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【０１９２】
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【０１９３】
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【０１９４】
【化１３】
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【０１９５】
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【化１６】
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【０１９８】
【化１７】
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【０１９９】
【化１８】
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【０２００】
【化１９】
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【０２０１】
【化２０】
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【０２０２】
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【０２０４】
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【０２２０】
【化３９】
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【０２２１】
【化４０】
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【０２２２】
【化４１】
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【０２２３】
【化４２】
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【０２２４】
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【０２２７】
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【０２２８】
【化４７】
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【０２２９】
【化４８】
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【０２３０】
【化４９】
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【０２３１】
【化５０】
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【０２３２】
【化５１】
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【０２３３】
【化５２】
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【０２３４】
【化５３】
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【０２３５】
【化５４】
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【０２３６】
【化５５】
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【０２３７】
【化５６】
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【０２３８】
【化５７】
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【０２３９】
【化５８】
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【０２４０】
【化５９】
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【０２４１】
【化６０】
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【化６１】
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【０２４３】
【化６２】
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【０２４４】
【化６３】
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【０２４５】
【化６４】
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【０２４６】
【化６５】
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【０２４７】
【表１−１】
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【０２４８】
【表１−２】
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【０２４９】
【表２】
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【０２５０】
【表３−１】
2010529834.tif 000071
【０２５１】
【表３−２】
2010529834.tif 000072
【０２５２】
【表４】
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【０２５３】
【表５−１】
2010529834.tif 000074
【０２５４】
【表５−２】
2010529834.tif 000075
【０２５５】
【表５−３】
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【０２５６】
【表６−１】
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【０２５７】
【表６−２】
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【０２５８】
【表７】
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【０２５９】
【表８】
2010529834.tif 000080
【０２６０】
【表９】
2010529834.tif 000081
【図１Ａ】
2010529834.tif 000082
【図１Ｂ】
2010529834.tif 000083
【図３Ａ】
2010529834.tif 000084
【図３Ｂ】
2010529834.tif 000085
【図４Ｂ】
2010529834.tif 000086
【図４Ｃ】
2010529834.tif 000087
【図１Ｃ】
2010529834.tif 000088
【図２】
2010529834.tif 000089
【図３Ｃ】
2010529834.tif 000090
【図４Ａ】
2010529834.tif 000091
【図５Ａ】
2010529834.tif 000092
【図５Ｂ】
2010529834.tif 000093
【図５Ｃ】
2010529834.tif 000094
【図６Ａ】
2010529834.tif 000095
【図６Ｂ】
2010529834.tif 000096
【図７】
2010529834.tif 000097
【図８】
2010529834.tif 000098
【図９】
2010529834.tif 000099
【配列表】
2010529834000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成22年1月26日(2010.1.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５６】
【表６−１】
2010529834.tif 000163
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５７】
【表６−２】
2010529834.tif 000164
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2010529834000001.app
【国際調査報告】
2010529834.tif 000165
2010529834.tif 000166
2010529834.tif 000167
2010529834.tif 000168