(57)【要約】例えば、間葉系幹細胞等の幹細胞から、例えば、有毛細胞および支持細胞等の内耳の細胞を生成するための方法、ならびに内耳細胞を含む組成物を提供する。また、難聴の治療のための内耳細胞の治療上の使用のための方法も記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
有毛細胞の集団を提供する方法であって、
神経性潜在力を有する幹細胞の集団を取得するステップと、
内耳前駆細胞への少なくとも一部の前記幹細胞の分化を誘発するのに十分な条件下で、前記幹細胞を培養するステップと、
少なくとも一部の前記内耳前駆細胞が、有毛細胞に分化することを誘発するのに十分な量および時間で、前記内耳前駆細胞内のＡｔｏｈ１の発現を誘発し、それによって、有毛細胞の集団を提供するステップと、
を含む、方法。
【請求項２】
有毛細胞の集団を提供する方法であって、
神経性潜在力を有する幹細胞の集団を取得するステップと、
内耳前駆細胞への少なくとも一部の前記幹細胞の分化を誘発するのに十分な条件下で、前記幹細胞を培養するステップと、
少なくとも一部の前記内耳前駆細胞が、有毛細胞に分化することを誘発するのに十分な量および時間で、前記内耳前駆細胞をＮｏｔｃｈシグナル阻害剤と接触させ、それによって、有毛細胞の集団を提供するステップと、
を含む、方法。
【請求項３】
有毛細胞の集団を提供する方法であって、
神経性潜在力を有する幹細胞の集団を取得するステップと、
内耳前駆細胞への少なくとも一部の前記幹細胞の分化を誘発するのに十分な条件下で、前記幹細胞を培養するステップと、
少なくとも一部の前記内耳前駆細胞が、有毛細胞に分化するのに十分な時間および条件下で、ニワトリ耳胞の存在下において前記内耳前駆細胞を培養し、それによって、有毛細胞の集団を提供するステップと、
を含む、方法。
【請求項４】
前記Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤は、γセクレターゼ阻害剤である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記前駆細胞を単離するステップをさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記有毛細胞を単離するステップをさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記内耳前駆細胞は、ネスチン、ｓｏｘ２、ｍｕｓａｓｈｉ、Ｂｒｎ３Ｃ、Ｐａｘ２、およびＡｔｏｈ１を発現する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記有毛細胞は、Ａｔｏｈ１、ｊａｇｇｅｄ２、Ｂｒｎ３ｃ、ｐ２７Ｋｉｐ、Ｎｇｎ１、ＮｅｕｒｏＤ、ミオシンＶＩＩａおよびエスピンから成る群から選択される１つ以上の遺伝子を発現する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記有毛細胞は、ｊａｇｇｅｄ２、Ｂｒｎ３ｃ、ミオシンＶＩＩａおよびエスピンを発現する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記有毛細胞は、前記細胞の頂端膜側上にＶパターンでＦアクチンを発現する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
支持細胞の集団を提供する方法であって、
神経性潜在力を有する幹細胞の集団を取得するステップと、
内耳前駆細胞への少なくとも一部の前記幹細胞の分化を誘発するのに十分な条件下で、前記幹細胞を培養するステップと、を含み、
（ｉ）少なくとも一部の前記内耳前駆細胞が支持細胞に分化することを誘発するのに十分な量および時間で、前記内耳前駆細胞内でＡｔｏｈ１の発現を誘発するステップ、
（ｉｉ）少なくとも一部の前記前駆細胞が支持細胞に分化することを誘発するのに十分な量および時間で、前記内耳前駆細胞をＮｏｔｃｈシグナル阻害剤と接触させるステップ、または
（ｉｉｉ）少なくとも一部の前記内耳前駆細胞が、支持細胞に分化するのに十分な時間および条件下で、ニワトリ耳胞細胞の存在下において前記内耳前駆細胞を培養し、
それによって、支持細胞の集団を提供するステップ、
のうちの１つ以上を含む、方法。
【請求項１２】
前記支持細胞を単離するステップをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記支持細胞は、クローディン１４、コネキシン２６、ｐ７５Ｔｒｋ、Ｎｏｔｃｈ１、およびＳ１００Ａのうちの１つ以上を発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記内耳前駆細胞は、ネスチン、ｓｏｘ２、ｍｕｓａｓｈｉ、Ｂｒｎ３Ｃ、Ｐａｘ２、およびＡｔｏｈ１を発現する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
それを必要としている対象に、前記細胞を移植するステップをさらに含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記幹細胞の集団は、前記移植を必要としている対象から取得される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項６に記載の方法によって取得される、有毛細胞の単離集団。
【請求項１８】
請求項１２に記載の方法によって取得される、支持細胞の単離集団。
【請求項１９】
有毛細胞および／または支持細胞の移植で治療可能な障害を有する、または発症する危険性がある対象を治療する方法であって、請求項１７または１８に記載の前記細胞を、前記対象の蝸牛に移植し、それによって、前記対象を治療する、方法。
【請求項２０】
幹細胞の集団は、前記移植を必要としている前記対象から取得された、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞内でＡｔｏｈ１の発現を誘発するステップは、前記細胞内で外因性Ａｔｏｈ１の発現を誘発するステップを含む、請求項１または１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞内で外因性Ａｔｏｈ１の発現を誘発するステップは、Ａｔｏｈ１ポリペプチドをコードするベクターを有する前記細胞を形質導入するステップを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ベクターは、ウイルスベクターである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ベクターは、プラスミドベクターある、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記幹細胞内で外因性Ａｔｏｈ１の発現を誘発するステップは、内因性Ａｔｏｈ１の発現を増加させるステップを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
少なくとも一部の前記幹細胞が、有毛細胞に分化するのに十分な時間および条件下で、ニワトリ耳胞細胞の存在下において前記幹細胞を培養するステップは、ＩＧＦ、ＥＧＦ、およびＦＧＦを含む培地中で前記幹細胞を培養するステップを含む、請求項３または１１に記載の方法。
【請求項２７】
前記幹細胞は、間葉系幹細胞である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記幹細胞は、ヒト幹細胞である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本出願は、２００６年１１月１５日に出願された米国暫定特許出願第６０／８５９，０４１号の利益を主張するものであり、その全体の内容は、参照することにより本願明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府の支援による研究または開発
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）の国立聴覚・伝達障害研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｎ  Ｄｅａｆｎｅｓｓ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｖｅ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ：ＮＩＤＣＤ）からの認可番号Ｆ３３  ＤＣ００６７８９、ＲＯ１  ＤＣ００７１７４、およびＰ３０  ＤＣ０５２０９の下で政府支援によりなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、内耳損傷を治療するために、骨髄間葉系幹細胞を使用し、例えば、有毛細胞および支持細胞等の内耳細胞を再生する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
神経細胞および有毛細胞は、難聴の細胞補充療法に用いられ得るため、内耳細胞を再生するための感覚細胞および神経細胞の源は、臨床的応用のための有益な手段を提供するであろう。最近の研究は、有毛細胞および神経細胞が内耳の内因性幹細胞と区別されることを示し（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９，１２９３−１２９９（２００３）；Ｒａｓｋ−Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅａｒ  Ｒｅｓ  ２０３，１８０−１９１（２００５））、他の研究は、前神経転写因子Ａｔｏｈ１が外因的に発現される時に、感覚上皮の内因性細胞を、有毛細胞に転換できることを示しているが（Ｉｚｕｍｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １１，２７１−２７６（２００５）、Ｚｈｅｎｇ  ａｎｄ  Ｇａｏ，Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ３，５８０−５８６（２０００））、内耳の内因性幹細胞は、有毛細胞を自発的には生成しない。致死的な放射線を浴びたマウスを再構成するための、全骨髄の注入は、内耳間葉系細胞および線維細胞によって占有された領域内においてこれらの細胞の生着をもたらしたが、有毛細胞は得られなかった（Ｌａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｏｍｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  ４９６，１８７−２０１（２００６））。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、少なくとも一部分において、幹細胞を誘発して有毛細胞および支持細胞に分化させるために使用することができる方法の発見に基づいている。したがって、有毛細胞および／または支持細胞の集団を提供するための方法、該細胞を含む組成物、ならびに、例えば、難聴である、または難聴を発症する危険性がある対象を治療するためにそれを使用する方法に関して本明細書に記載する。
【０００６】
一態様において、本発明は、有毛細胞および／または支持細胞の集団を提供するための方法を提供する。該方法は、
神経性潜在力を有する幹細胞の集団を取得するステップと、
内耳前駆細胞への少なくとも一部の該幹細胞の分化を誘発するのに十分な条件下で、該幹細胞を培養するステップと、
（ｉ）少なくとも一部の該内耳前駆細胞が有毛細胞に分化することを誘発するのに十分な量および時間で、該内耳前駆細胞内でＡｔｏｈ１の発現を誘発するステップ、
（ｉｉ）少なくとも一部の該内耳前駆細胞が有毛細胞に分化することを誘発するのに十分な量および時間で、該内耳前駆細胞をＮｏｔｃｈシグナル阻害剤（例えば、γセクレターゼ阻害剤または阻害性核酸）と接触させるステップ、または
（ｉｉｉ）該内耳前駆細胞の少なくとも一部が、有毛細胞に分化するのに十分な時間および条件下で、ニワトリ耳胞細胞の存在下において該内耳前駆細胞を培養し、
それによって、有毛細胞および／または支持細胞の集団を提供するステップ、
のうちの１つ（または１つ以上）を行うステップと、を含む。
【０００７】
一部の実施形態においては、該方法は、内耳前駆細胞、有毛細胞、および／または支持細胞を単離し、例えば、それらの精製集団を提供するステップを含む。
【０００８】
一部の実施形態においては、該内耳前駆細胞は、ネスチン、ｓｏｘ２、ｍｕｓａｓｈｉ、Ｂｒｎ３Ｃ、Ｐａｘ２、およびＡｔｏｈ１を発現する。
【０００９】
一部の実施形態においては、該有毛細胞は、Ａｔｏｈ１、ｊａｇｇｅｄ２、Ｂｒｎ３ｃ、ｐ２７Ｋｉｐ、Ｎｇｎ１、ＮｅｕｒｏＤ、ミオシンＶＩＩａおよびエスピンから成る群から選択される１つ以上の遺伝子を発現する。一部の実施形態においては、該有毛細胞は、ｊａｇｇｅｄ２、Ｂｒｎ３ｃ、ミオシンＶＩＩａおよびエスピンを発現する。一部の実施形態においては、該有毛細胞該細胞の頂端膜側上にＶパターンでＦアクチンを発現する。
【００１０】
一部の実施形態においては、該支持細胞は、クローディン１４、コネキシン２６、ｐ７５Ｔｒｋ、Ｎｏｔｃｈ  １、およびＳ１００Ａのうちの１つ以上を発現する。
【００１１】
一部の実施形態においては、該方法は、それを必要としている対象に、例えば、該対象の感覚上皮またはその付近に、該細胞を移植するステップをさらに含む。一部の実施形態においては、幹細胞の集団は、該移植を必要としている対象から取得される。
また、本明細書に記載した方法によって取得される有毛細胞、支持細胞、および内耳前駆細胞の単離集団に関しても本明細書に記載する。
【００１２】
別の態様において、本発明は、例えば、聴覚障害または前庭障害等の障害を有する、または発症する危険性がある対象を治療するための方法を特徴とし、該障害は、有毛細胞および／または支持細胞の移植で治療可能であり、該方法は、本明細書に記載した方法によって取得された細胞を、該対象の蝸牛に移植し、それによって、該対象を治療するステップを含む。これらの実施形態においては、これは、幹細胞の集団が、該移植を必要としている該対象から取得された場合に好適である。
【００１３】
一部の実施形態においては、該細胞内でＡｔｏｈ１の発現を誘発するステップは、例えば、アデノウイルス、レンチウイルス、またはレトロウイルス等の、例えば、プラスミドベクターまたはウイルスベクター等のＡｔｏｈ１ポリペプチドをコードするベクターを有する該細胞を形質導入することによって、該細胞内で外因性Ａｔｏｈ１の発現を誘発するステップを含む。
【００１４】
一部の実施形態においては、該幹細胞内で外因性Ａｔｏｈ１の発現を誘発するステップは、例えば、Ａｔｏｈ１プロモーターの活性を増加させることによって、または内因性Ａｔｏｈ１プロモーターを、より高活性プロモーターで置換することによって、内因性Ａｔｏｈ１の発現を増加させるステップを含む。
一部の実施形態においては、少なくとも一部の該幹細胞が、有毛細胞に分化するのに十分な時間および条件下で、ニワトリ耳胞細胞の存在下において該幹細胞を培養するステップは、ＩＧＦ、ＥＧＦ、およびＦＧＦを含む培地中で該幹細胞を培養するステップを含む。
【００１５】
一部の実施形態においては、本明細書に記載した方法で使用される幹細胞は、間葉系幹細胞である。一部の実施形態においては、本明細書に記載した方法で使用される幹細胞は、ヒト幹細胞である。
【００１６】
上記のように、本発明は、本明細書に記載した方法によって単離される細胞、ならびにそれらを含有する組成物も特徴とする。
【００１７】
難聴である、または発症する危険性のある対象（例えば、ヒト等の哺乳類）を治療するための方法もまた本明細書に記載する。これらの方法は、細胞または細胞の集団（本明細書に記載されているように、例えば、幹細胞の集団を分化することによって取得された有毛細胞の集団）を、患者の耳に、例えば、蝸牛に投与するステップを含む。該投与された細胞は、本明細書に記載した方法によって取得され得、出発物質は、治療される患者から取得された幹細胞であり得る。
【００１８】
難聴を治療するために、本明細書に記載した該細胞を利用する特定の利点があり得る。例えば、該幹細胞は、臨床的応用のためにヒトから取得することができる。該幹細胞はヒトから採取することができ、具体的には、治療を必要としているヒトから採取することができるため、異種および同種移植実験によく見られる免疫学的障害を大幅に回避することができる。
【００１９】
特に定義のない限り、本明細書で使用する全ての技術および科学用語は、本発明の属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本発明において使用するための方法および材料を本明細書に記載し、また、当技術分野において既知の他の適切な方法および材料も使用することができる。該材料、方法、および実施例は、例示的であるに過ぎず、限定することを意図するものではない。全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリー、および本明細書に言及される他の参考文献は、参照することによってそれら全体が本願明細書に組み込まれる。矛盾する場合、定義を含み、本明細書が優先する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
本発明の他の特徴および利点は、以下の発明を実施するための形態および図面から、ならびに特許請求項の範囲から明らかになろう。
【図１Ａ】ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ３４およびＳｃａ−１に対する抗体、続いて、ＴＲＩＴＣ（ミディアムグレー、原文では赤で示される）で標識されたマウス免疫グロブリンに対する２次抗体で免疫染色した３代継代からの骨髄ＭＳＣの４つの顕微鏡写真の列である。ＣＤ３４およびＣＤ４５に対する染色は陰性であったが、ＣＤ４４およびＳｃａ−１が発現された。核は、ＤＡＰＩ（暗いグレー、原文では青）で染色した。
【図１Ｂ】ＣＤ４４（最初のパネル、ミディアムグレー、原文では赤で示される）およびネスチン（２番目のパネル、明るいグレー、緑で示される）に対して免疫標識された３代継代からの骨髄ＭＳＣの４つの顕微鏡写真の列である。３番目のパネルは、ＤＡＰＩ核染色（原文では青）である。最も右のパネルの混合画像は、両方のマーカー（最も明るいグレー、原文では黄色／オレンジ）を有する細胞の集団の共染色を示す。
【図１Ｃ】Ｓｃａ−１（最初のパネル、原文では赤）およびネスチン（２番目のパネル、原文では緑）の同時発現に対して染色された３代継代からの骨髄ＭＳＣの４つの顕微鏡写真の列である。最も右のパネルの混合画像は、共染色を示す。
【図１Ｄ】列挙した抗体（ＣＤ４４は最初のパネル、Ｓｃａ−１は２番目のパネル、ＣＤ３４は３番目のパネル、およびＣＤ４５は最後のパネル）のそれぞれに対する免疫陽性細胞の割合を示すチップフローサイトメトリーによる骨髄ＭＳＣの分析結果を示す４つの図の列であり、軸は、「蛍光」および「現象数」である。
【図１Ｅ】ＴＧＦ−βでの骨髄ＭＳＣの治療後の軟骨細胞および細胞外基質の形成によって示される、系列分化の可能性を示す一対の顕微鏡写真である。微小凝集塊（左）から増殖した細胞は、ＩＩ型コラーゲン（右）に対して染色した。
【図１Ｆ】神経細胞増殖補充剤およびｂＦＧＦを含有する無血清培地中の分化による、神経細胞への骨髄ＭＳＣの分化を示す一対の顕微鏡写真である。神経フィラメント（ＮＦ−Ｍ）に対する染色を、これらの細胞において示す。
【図２Ａ】ＩＧＦ−１、ＥＧＦおよびｂＦＧＦで１４日間処理し、続いて分析したＭＳＣのＲＴ−ＰＣＲによる神経前駆体マーカーに関する遺伝分析結果を示すゲルである。ＭＳＣ（骨髄ＭＳＣ）、ＮＰ（前駆体形成の誘発後２週間の神経前駆体）。分析したこれらの遺伝子をゲルの左側に示す。
【図２Ｂ】ＦＩＴＣ（２Ｂ、２Ｃ右上パネル、原文では緑で示される）で標識された２次抗体を使用し、免疫組織化学で可視化した神経前駆体マーカーであるネスチンが、ＣＤ４４（２Ｂ、左上パネル、原文では赤で示される）およびＳｃａ−１（２Ｃ、左上パネル、原文では赤で示される）と同時発現されたことを示す２セットの２つの顕微鏡写真である。ＤＡＰＩは、青で示す（各図の左下パネル）。スケールバーは５０μｍである。各図の右下パネルにおける混合画像は、ネスチンおよびＣＤ４４（２Ｂ）またはＳｃａ１（２Ｃ）（全ての細胞は、原文では緑で表示され、同時発現を示す）の同時発現を示す。
【図２Ｃ】ＦＩＴＣ（２Ｂ、２Ｃ右上パネル、原文では緑で示される）で標識された２次抗体を使用し、免疫組織化学で可視化した神経前駆体マーカーであるネスチンが、ＣＤ４４（２Ｂ、左上パネル、原文では赤で示される）およびＳｃａ−１（２Ｃ、左上パネル、原文では赤で示される）と同時発現されたことを示す２セットの２つの顕微鏡写真である。ＤＡＰＩは、青で示す（各図の左下パネル）。スケールバーは５０μｍである。各図の右下パネルにおける混合画像は、ネスチンおよびＣＤ４４（２Ｂ）またはＳｃａ１（２Ｃ）（全ての細胞は、原文では緑で表示され、同時発現を示す）の同時発現を示す。
【図３Ａ】ＮＴ３、ＦＧＦおよびＢＤＮＦ（内耳内の神経および感覚細胞前駆体を支持する）中でインキュベートされた前駆体細胞のＲＴ−ＰＣＲによる遺伝分析結果を示すゲルである。遺伝子プロファイルは、Ｏｃｔ４、ネスチン、Ｏｔｘ２、およびＭｕｓａｓｈｉ、ならびに前神経転写因子である、ＧＡＴＡ３、ＮｅｕｒｏＤ、Ｎｇｎ１、Ａｔｏｈ１、Ｂｒｎ３ｃ、およびＺｉｃ２の発現を含んだ。これらの細胞は、有毛細胞遺伝子ミオシンＶＩＩａおよびエスピンを発現しなかった。
【図３Ｂ】ＮＴ３、ＦＧＦ、およびＢＤＮＦでの誘発後に取得された細胞のＲＴ−ＰＣＲによる遺伝分析結果を示すゲルである。支持細胞（クローディン１４、コネキシン２６、ｐ７５Ｔｒｋ、Ｎｏｔｃｈ１、およびＳ１００Ａ）の特徴を示す遺伝子も観察された。したがって、これらの前駆細胞は、神経または感覚前駆体の特徴を示す発現プロファイルを有した。分析した遺伝子をゲルの左側に示す。
【図４Ａ】骨髄ＭＳＣ中のＡｔｏｈ１の外因性発現を示す顕微鏡写真であり、発現（原文では緑）は、ベクターからのＧＦＰの発現に起因して、細胞および核で観察された。
【図４Ｂ】Ａｔｏｈ１を形質移入し、次いで、ＮＴ３、ＦＧＦおよびＢＤＮＦでの細胞で処理した細胞内の遺伝子発現の結果を示すゲルである。結果は、このプロトコルが、前神経遺伝子であるＮｇｎ１およびＮｅｕｒｏＤに加えて、エスピン、ミオシンＶＩＩａ、ｊａｇｇｅｄ２、およびＢｒｎ３ｃ、ならびにｐ２７Ｋｉｐを含む、有毛細胞遺伝子を発現する細胞にその後成長する前駆細胞を生じさせることを示す。
【図４Ｃ】４Ｂに記述した分化条件下における、細胞のさらなる遺伝分析結果を示すゲルであり、結果は、細胞が、支持細胞表現型を有する一部の細胞と一致して、Ｓ１００Ａ、ｐ７５Ｔｒｋ、クローディン１４、コネキシン２６、およびＮｏｔｃｈ１もまた発現したことを示した。
【図４Ｄ】Ｚｅｏｃｉｎ中で選択されたＭＳＣ細胞株の顕微鏡写真であり、細胞は、血清中で培養された時に、ＧＦＰ発現（原文では緑）の高い割合を有した。
【図４Ｅ】Ｍｙｏ７ａ（最初のパネル）、Ｍａｔｈ１／Ａｔｏｈ１（２番目のパネル）、またはＤＡＰＩ（３番目のパネル）に対して染色した細胞の４つの顕微鏡写真の列であり、最後のパネルは混合画像である。分化後、ＤＡＰＩ核当たりの有毛細胞様の細胞の数は上昇し、これらの細胞を、ミオシンＶＩＩａ（最初のパネルに赤で示される）およびＡｔｏｈ１（２番目のパネルに緑で示される、２番目および最後のパネルの矢印）に対して染色した。
【図４Ｆ】Ｂｒｎ３ｃ（２番目の縦列、原文では緑、矢印で示される）に対して免疫陽性であり、ミオシンＶＩＩａ（最初の縦列、原文では赤、矢印で示される）に対して細胞質陽性であった、核を有する細胞に分化した細胞株を発現するＡｔｏｈ１の２列の４つの顕微鏡写真である。核は、ＤＡＰＩ（３番目の列、原文では青）で染色した。
【図４Ｇ】分化した細胞が、不動毛束（矢印）の形で細胞の尖部から突出するＦアクチンに対して陽性であったことを示す３つの顕微鏡写真の列である。
【図４Ｈ】Ｆアクチン染色が、頂端膜側上に特徴的なＶパターンで整列されたことを示す３つの顕微鏡写真の列である。
【図５Ａ】骨髄ＭＳＣ由来の前駆体が、マイトマイシンＣ（ＭｉｔｏＣ）で処理されたニワトリ耳胞細胞とともに、２１日間同時培養した遺伝子分析の結果を示すゲルであり、結果は、ｊａｇｇｅｄ２、ｐ２７Ｋｉｐ、Ａｔｏｈ１、Ｂｒｎ３ｃ、ミオシンＶＩＩａおよびエスピンの発現が増加した一方で、ニワトリ細胞内のこれらの遺伝子の発現が検出不可能であったことを示した。パラホルムアルデヒドでのインキュベーションによって固定されたニワトリ耳胞細胞は、固定されていない細胞よりも効果が弱かった（ＰＦＡ）が、前駆体の分化を生じさせた。ニワトリ細胞（Ｃｎｄ  Ｍｅｄ）からの馴化培地は、効果が無かった（これらのマーカーの発現レベルは、分化条件に関して以前に示されたデータと同様）。
【図５Ｂ】Ａｔｏｈ１−ＧＦＰマウスからの細胞におけるＡｔｏｈ１（Ｍａｔｈ−１、中央パネル、原文では緑）およびミオシンＶＩＩａ（上パネル、原文では赤）の発現が、核においてこのマーカーの誘発に対応して緑色蛍光を示し、細胞質においてミオシンＶＩＩａの発現を有したことを示す３つの顕微鏡写真のセットである。
【図６Ａ】Ａｔｏｈ１を発現する細胞への骨髄細胞の転換を示唆する蛍光（原文では緑）の増加を示す４つの顕微鏡写真のセットである。細胞は、Ａｔｏｈ１（Ｍａｔｈ１、左下、原文では緑）、ミオシンＶＩＩａ（左上、原文では赤）およびＤＡＰＩ（右上、原文では青）に対して染色した。混合画像はを右下パネルに示す。
【図６Ｂ】Ａｔｏｈ１を発現する細胞が、ニワトリ４耳上皮の組織内に取り込まれたことが発見されたことを示す顕微鏡写真である。ニワトリ有毛細胞は、ニワトリに特異的なマーカーであるＨＣＡ（原文では白）およびミオシンＶＩＩａ（原文では赤）で染色したが、Ａｔｏｈ−１を発現するマウス細胞は、ＧＦＰ（矢印）の発現のために緑色であった。
【図６Ｃ】緑色蛍光を有さなかった細胞内のＨＣＡ（矢印、下パネル）の存在によって示される細胞融合の欠乏およびニワトリ細胞のためのマーカーであるＨＣＡに対して染色しなかった細胞内でのみのＡｔｏｈ１−ＧＦＰ（矢印、右縦列）の欠乏を示す４つの顕微鏡写真のセットである。これらの実験において、ＧＦＰおよびＨＣＡの両方を有する細胞は観察されなかった。スケールバーは、１００μｍである。
【図７】γセクレターゼの阻害剤よるＮｏｔｃｈシグナルの阻害が有毛細胞マーカーの発現を増加させる後の、細胞の遺伝子分析の結果を示すゲルである。γセクレターゼ阻害剤で処理したＭＳＣにおける遺伝子発現は、Ｎｏｔｃｈシグナルの損失がＡｔｏｈ１発現を増加させたことを示した。阻害のタイミングは非常に重要であり、生体外における合計１０日間の分化において、第１日目に添加したγセクレターゼ阻害剤は、有毛細胞マーカーであるミオシンＶＩＩａおよびエスピンの増加をもたらしたが、その一方で、第３日目で添加した阻害剤は、有毛細胞マーカーを誘発しなかった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
幹細胞は、内耳に存在するが（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  １０，３０９−３１５（２００４）、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９，１２９３−１２９９（２００３）、Ｒａｓｋ−Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅａｒ  Ｒｅｓ  ２０３，１８０−１９１（２００５））、有毛細胞は損傷後に再生せず、したがって、これらの感覚細胞の治療的置換における細胞移植のために使用される可能性がある細胞源は、感音難聴の治療にとって重要な意味を有する。骨髄は採取され、臨床的応用において広範に使用されており、また、患者の骨髄からの細胞が、免疫拒絶の問題なく移植され得る可能性があるので、極めて望ましい源である。本発明の方法は、本明細書に記載した方法によって取得された有毛細胞の移植を含む、難聴の治療計画を含む。
【００２２】
内耳における有毛細胞形成に必要とされる、増殖因子刺激および転写因子であるＡｔｏｈ１の発現の組み合わせによって、本発明者らは、幹細胞、例えば、骨髄に由来する間葉系幹細胞を有毛細胞に分化するように誘発することができることを実証する。さらに、骨髄から取得した神経感覚前駆体は、Ａｔｏｈ１発現の非存在下においてさえも、発生中の感覚上皮の細胞とともに同時培養することによって、感覚細胞に転換することができる。
【００２３】
骨髄中の幹細胞は、全てのリンパ球および赤血球細胞のための前駆物質として既知であるが、骨髄中の間葉系幹細胞も骨、軟骨、および脂肪細胞への前駆物質の役割を果たす（Ｃｏｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９７，３２１３−３２１８（２０００）；Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４，１４３−１４７（１９９９））。間葉組織に加えて、これらの幹細胞は、膵臓細胞（Ｈｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２１，７６３−７７０（２００３））、筋細胞（Ｄｏｙｏｎｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０１，１３５０７−１３５１２（２００４））および神経細胞（Ｄｅｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１３，１７０１−１７１０（２００４）；Ｈｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１７，４４１１−４４２２（２００４）、Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １００  Ｓｕｐｐｌ  １，１１８５４−１１８６０（２００３））を含む、他の系列の細胞を生じさせることを示した。本明細書に提供した根拠は、感覚神経系列の細胞を含み、さらに内耳の有毛細胞への分化を含む、これらの骨髄由来の細胞に利用可能な広範囲の細胞の運命を実証する。
【００２４】
内耳の細胞を生成するための方法
前駆細胞ならびに有毛細胞および支持細胞を含む分化した内耳細胞を含む、内耳の細胞を生成するための方法を提供する。幹細胞は、広範な増殖が可能な未分化の細胞である。幹細胞は、多能性であり、神経細胞、筋細胞、血液細胞、上皮細胞，皮膚細胞、および内耳の細胞（例えば、有毛細胞およびらせん神経節の細胞）を含む、体内の殆どの細胞型に分化する能力を有すると考えられる（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆ．Ａｍ．２８０：６８（１９９９））。幹細胞は、分化することなく、生体外の継続的増殖が可能である。それらが分裂するにつれて、正常核型を保持して、成体細胞型するために分化する能力を保持する。
【００２５】
骨髄内にある造血幹細胞は、血液細胞源であるが、これらの造血幹細胞に加えて、骨髄は、全ての３つの胚葉の細胞型に分化することができる間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ：ＭＳＣ）を含有する（Ｃｏｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９７，３２１３−３２１８（２０００）、Ｄｏｙｏｎｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０１，１３５０７−１３５１２（２００４）、Ｈｅｒｚｏｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０２，３４８３−３４９３（２００３）、Ｈｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２１，７６３−７７０（２００３）、Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４１８，４１−４９（２００２）、Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４，１４３−１４７（１９９９））。これは、常在組織型に分化することができる特定の組織へ移植された骨髄細胞を追跡する研究において、生体内で実証されている（Ｍｅｚｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １００，１３６４−１３６９（２００３）、Ｗｅｉｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １００，２０８８−２０９３（２００３））。
【００２６】
これらの細胞の多くは移植のために使用されており、移植された細胞が、治療される患者から採取される時に免疫学的に一致するため、およびそれらの安全性が分かるように臨床的応用において広範に使用されているため、治療のための好適な新しい細胞源である。
【００２７】
幹細胞は、様々な程度に分化することができる。例えば、幹細胞は、懸滴培養において胚様体と称される細胞集合体を形成することができる。胚様体は、中間フィラメントタンパク質をコードする、Ｓｏｘ１およびネスチン遺伝子等の初期マーカー遺伝子のそれらの発現によって選択することができる神経前駆細胞を含有する（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８：６７５−９，２０００）。
【００２８】
神経性幹細胞
内耳細胞または内耳細胞前駆体は、哺乳類幹細胞から生成することができる。本明細書に記載されているように、本発明の方法における使用に適切な幹細胞は、神経性潜在力を有する任意の幹細胞、つまり、神経細胞、グリア、星状膠細胞、網膜の光受容器、乏突起膠細胞、嗅細胞、有毛細胞、支持細胞等の神経細胞に分化する可能性を有する任意の幹細胞であることができる。骨髄間葉系幹細胞等のヒト成体幹細胞を含む神経性幹細胞は、有毛細胞および支持細胞を含む成熟内耳細胞を生じさせることが可能な内耳前駆細胞に分化するように誘発することができる。本明細書に記載した方法において有用な神経性幹細胞は、ネスチン、ｓｏｘ１、ｓｏｘ２、およびｍｕｓａｓｈｉ等の特定の神経性幹細胞マーカーの発現によって同定することができる。代替的にまたは付加的に、これらの細胞は、高レベルのヘリックスループヘリックス転写因子であるＮｅｕｒｏＤ、Ａｔｏｈ１、およびニューロゲニン１を発現する。
【００２９】
神経性幹細胞の例は、耳（例えば、内耳）、中枢神経系、血液、皮膚、眼または骨髄等の成熟（例えば、成体）組織に由来する胚幹細胞または幹細胞を含む。一部の実施形態においては、幹細胞は、間葉系幹細胞である。幹細胞を培養し、内耳細胞（例えば、有毛細胞または支持細胞）への分化を誘発するための本明細書に記載した方法のいずれをも使用することができる。
【００３０】
内耳の細胞を生成するのに有用な幹細胞は、ヒト、マウス、ラット、ブタ、ヒツジ、ヤギ、または非ヒト霊長類等の哺乳類から得ることができる。例えば、幹細胞は、マウス卵形嚢斑から同定および単離されている（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ９：１２９３−１２９９，２００３）。
【００３１】
神経前駆細胞の生成
増殖因子処理（例えば、本明細書に記載されているように、ＥＧＦ、ＦＧＦ、およびＩＧＦを用いる処理）およびニューロトロフィン（例えば、本明細書に記載されているように、ＮＴ３およびＢＤＮＦを用いる処理）を含む、神経性潜在力を有する幹細胞の、神経前駆細胞への分化を誘発するための、当技術分野において既知の多くの誘発プロトコルがある。他の分化プロトコルは、当技術分野において既知であり、例えば、Ｃｏｒｒａｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．６６（１３）：１４８９−５００（２００６）、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４１８，５０−６（２００２）、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １８，６７５−９（２０００）、およびＬｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２３，２１５−２１（２００５）を参照されたい。
【００３２】
誘発プロトコルの一例として、幹細胞は、前駆細胞への分化を誘発する補足的増殖因子の存在下において増殖する。これらの補足的増殖因子を、培養培地に添加する。補足的増殖因子の種類および濃度は、細胞の増殖特性を調節するように（例えば細胞が分化するように刺激または感作すること）、および神経細胞、グリア細胞、支持細胞または有毛細胞等の分化した細胞の生存を可能にするように調整される。
【００３３】
例示的な補足増殖因子は、下記に詳述され、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ：ｂＦＧＦ）、インスリン様の増殖因子（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ：ＩＧＦ）、および上皮増殖因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ：ＥＧＦ）を含むが、これらに限定されない。代替として、補足的増殖因子は、神経栄養因子ニューロトロフィン−３（ＮＴ３）および脳由来神経栄養因子（ｂｒａｉｎ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｆａｃｔｏｒ：ＢＤＮＦ）を含むことができる。増殖因子の濃度は、約１００ｎｇ／ｍＬから約０．５  ｎｇ／ｍＬ（例えば、約６０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、または約５ｎｇ／ｍＬ等の約８０ｎｇ／ｍＬから約３ｎｇ／ｍＬ）の範囲に及ぶことができる。
【００３４】
これらの方法によって産生される神経前駆細胞は、内耳前駆細胞、つまり、有毛細胞および支持細胞等の内耳細胞を生じさせることができる内耳前駆細胞を含む。内耳前駆細胞は、特定の内耳に特異的なマーカー遺伝子Ｂｒｎ３Ｃ、Ｐａｘ２、およびＡｔｏｈ１に加えて、ネスチン、ｓｏｘ２、およびｍｕｓａｓｈｉ等のマーカー遺伝子の発現によって同定することができる。本発明は、ネスチン、ｓｏｘ２、ｍｕｓａｓｈｉ、Ｂｒｎ３Ｃ、Ｐａｘ２、およびＡｔｏｈ１を発現する精製された内耳前駆細胞の集団を含む。これらの内耳前駆細胞は、系列拘束され、本明細書に記載した方法によって、有毛細胞および支持細胞にさらに分化するように誘発することができる。
本明細書に記載した方法によって調製された前駆細胞は、今後の使用のために任意で凍結することができる。
【００３５】
細胞培養方法
本明細書に記載した方法においては、概して、標準的な培養方法を使用する。適切な培養培地は、Ｌｉら（上記参照）等の当技術分野において記述されている。例えば、幹細胞は、血清を含まないＤＭＥＭ／高グルコースおよびＦ１２培地（１：１で混合）中で培養することができ、Ｎ２およびＢ２７溶液ならびに増殖因子を補充することができる。ＥＧＦ、ＩＧＦ−１、およびｂＦＧＦ等の増殖因子は、培養中の球形成を増大させることが実証されている。生体外で、幹細胞は、単一細胞の増殖によって球を形成する特有の可能性を示すことが多い。したがって、球の同定および単離は、内耳の分化した細胞を作るのに用いる成熟組織から幹細胞を単離する工程に役立つことができる。培養した幹細胞の増殖培地は、１つ以上の、または任意の組み合わせの増殖因子を含有することができる。これは、幹細胞が分化することを防ぐ血病抑制因子（ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆａｃｔｏｒ：ＬＩＦ）を含む。細胞（および球の細胞）が分化するように誘発するため、培地は、培地を欠いている増殖因子と交換することができる。例えば、培地は、Ｎ２およびＢ２７溶液を補充される無血清ＤＭＥＭ／高グルコースおよびＦ１２培地（１：１で混合）であることができる。また、同等の代替的な培地および栄養分も使用することができる。培養条件は、当技術分野において既知の方法を使用して最適化することができる。
【００３６】
Ａｔｏｈ１の発現による分化
本明細書に記載されているように、幹細胞由来の前駆細胞内でのＡｔｏｈ１の発現は、有毛細胞マーカーを採用するように、それらを駆動させるのに十分であった。耳内でのＡｔｏｈ１発現の研究は、このヘリックスループヘリックス転写因子が、有毛細胞の分化に対する内耳転写因子の階層において重要な位置を占めることを示している。
【００３７】
Ａｔｏｈ１核酸およびポリペプチドは、当技術分野において既知であり、例えば、米国特許第６，８３８，４４４号および第７，０５３，２００号、ならびに特許付与前公開第２００４／０２３７１２７号および第２００４／０２３１００９号に記載されており、参照することによってそれら全体が本願明細書に組み込まれる。一部の実施形態においては、Ａｔｏｈ１は、ヒトアトナール相同体１（ＡＴＯＨ１）、ＡＴＨ１、およびＨＡＴＨ１であるか、またはそれらと少なくとも８０％、８５％、９０％、９３％、または９５％同一である（さらなる情報は、Ｂｅｎ−Ａｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．５：１２０７−１２１６（１９９６）、Ｂｅｒｍｉｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４：１８３７−１８４１  （１９９９）、ＯＭＩＭ  ＊６０１４６１、ＵｎｉＧｅｎｅ  Ｈｓ．５３２６８０、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００５１７２．１（核酸）およびＮＰ＿００５１６３．１（ポリペプチド）を参照）。例えば、マウスＡｔｏｈ１（Ｍａｔｈ１としても知られている。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００７５００．２）、ニワトリＡｔｏｈ１（Ｃａｔｈ１としても知られている。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４６７２９２．１）等の他の種も使用することができる。
【００３８】
ヒトＡｔｏｈ１ｍＲＮＡ（ＣＤＳ＝−１０６５）およびポリペプチド配列は、以下の通りである。
１  ａｔｇｔｃｃｃｇｃｃ  ｔｇｃｔｇｃａｔｇｃ  ａｇａａｇａｇｔｇｇ  ｇｃｔｇａａｇｔｇａ  ａｇｇａｇｔｔｇｇｇ  ａｇａｃｃａｃｃａｔ
６１  ｃｇｃｃａｇｃｃｃｃ  ａｇｃｃｇｃａｔｃａ  ｔｃｔｃｃｃｇｃａａ  ｃｃｇｃｃｇｃｃｇｃ  ｃｇｃｃｇｃａｇｃｃ  ａｃｃｔｇｃａａｃｔ
１２１  ｔｔｇｃａｇｇｃｇａ  ｇａｇａｇｃａｔｃｃ  ｃｇｔｃｔａｃｃｃｇ  ｃｃｔｇａｇｃｔｇｔ  ｃｃｃｔｃｃｔｇｇａ  ｃａｇｃａｃｃｇａｃ
１８１  ｃｃａｃｇｃｇｃｃｔ  ｇｇｃｔｇｇｃｔｃｃ  ｃａｃｔｔｔｇｃａｇ  ｇｇｃａｔｃｔｇｃａ  ｃｇｇｃａｃｇｃｇｃ  ｃｇｃｃｃａｇｔａｔ
２４１  ｔｔｇｃｔａｃａｔｔ  ｃｃｃｃｇｇａｇｃｔ  ｇｇｇｔｇｃｃｔｃａ  ｇａｇｇｃｃｇｃｔｇ  ｃｇｃｃｃｃｇｇｇａ  ｃｇａｇｇｔｇｇａｃ
３０１  ｇｇｃｃｇｇｇｇｇｇ  ａｇｃｔｇｇｔａａｇ  ｇａｇｇａｇｃａｇｃ  ｇｇｃｇｇｔｇｃｃａ  ｇｃａｇｃａｇｃａａ  ｇａｇｃｃｃｃｇｇｇ
３６１  ｃｃｇｇｔｇａａａｇ  ｔｇｃｇｇｇａａｃａ  ｇｃｔｇｔｇｃａａｇ  ｃｔｇａａａｇｇｃｇ  ｇｇｇｔｇｇｔｇｇｔ  ａｇａｃｇａｇｃｔｇ
４２１  ｇｇｃｔｇｃａｇｃｃ  ｇｃｃａａｃｇｇｇｃ  ｃｃｃｔｔｃｃａｇｃ  ａａａｃａｇｇｔｇａ  ａｔｇｇｇｇｔｇｃａ  ｇａａｇｃａｇａｇａ
４８１  ｃｇｇｃｔａｇｃａｇ  ｃｃａａｃｇｃｃａｇ  ｇｇａｇｃｇｇｃｇｃ  ａｇｇａｔｇｃａｔｇ  ｇｇｃｔｇａａｃｃａ  ｃｇｃｃｔｔｃｇａｃ
５４１  ｃａｇｃｔｇｃｇｃａ  ａｔｇｔｔａｔｃｃｃ  ｇｔｃｇｔｔｃａａｃ  ａａｃｇａｃａａｇａ  ａｇｃｔｇｔｃｃａａ  ａｔａｔｇａｇａｃｃ
６０１  ｃｔｇｃａｇａｔｇｇ  ｃｃｃａａａｔｃｔａ  ｃａｔｃａａｃｇｃｃ  ｔｔｇｔｃｃｇａｇｃ  ｔｇｃｔａｃａａａｃ  ｇｃｃｃａｇｃｇｇａ
６６１  ｇｇｇｇａａｃａｇｃ  ｃａｃｃｇｃｃｇｃｃ  ｔｃｃａｇｃｃｔｃｃ  ｔｇｃａａａａｇｃｇ  ａｃｃａｃｃａｃｃａ  ｃｃｔｔｃｇｃａｃｃ
７２１  ｇｃｇｇｃｃｔｃｃｔ  ａｔｇａａｇｇｇｇｇ  ｃｇｃｇｇｇｃａａｃ  ｇｃｇａｃｃｇｃａｇ  ｃｔｇｇｇｇｃｔｃａ  ｇｃａｇｇｃｔｔｃｃ
７８１  ｇｇａｇｇｇａｇｃｃ  ａｇｃｇｇｃｃｇａｃ  ｃｃｃｇｃｃｃｇｇｇ  ａｇｔｔｇｃｃｇｇａ  ｃｔｃｇｃｔｔｃｔｃ  ａｇｃｃｃｃａｇｃｔ
８４１  ｔｃｔｇｃｇｇｇａｇ  ｇｇｔａｃｔｃｇｇｔ  ｇｃａｇｃｔｇｇａｃ  ｇｃｔｃｔｇｃａｃｔ  ｔｃｔｃｇａｃｔｔｔ  ｃｇａｇｇａｃａｇｃ
９０１  ｇｃｃｃｔｇａｃａｇ  ｃｇａｔｇａｔｇｇｃ  ｇｃａａａａｇａａｔ  ｔｔｇｔｃｔｃｃｔｔ  ｃｔｃｔｃｃｃｃｇｇ  ｇａｇｃａｔｃｔｔｇ
９６１  ｃａｇｃｃａｇｔｇｃ  ａｇｇａｇｇａａａａ  ｃａｇｃａａａａｃｔ  ｔｃｇｃｃｔｃｇｇｔ  ｃｃｃａｃａｇａａｇ  ｃｇａｃｇｇｇｇａａ
１０２１  ｔｔｔｔｃｃｃｃｃｃ  ａｔｔｃｃｃａｔｔａ  ｃａｇｔｇａｃｔｃｇ  ｇａｔｇａｇｇｃａａ  ｇｔｔａｇ（配列番号１）
ＭＳＲＬＬＨＡＥＥＷＡＥＶＫＥＬＧＤＨＨＲＱＰＱＰＨＨＬＰＱＰＰＰＰＰＱＰＰＡＴＬＱＡＲＥＨＰＶＹＰＰＥＬＳＬＬＤＳＴＤＰＲＡＷＬＡＰＴＬＱＧＩＣＴＡＲＡＡＱＹＬＬＨＳＰＥＬＧＡＳＥＡＡＡＰＲＤＥＶＤＧＲＧＥＬＶＲＲＳＳＧＧＡＳＳＳＫＳＰＧＰＶＫＶＲＥＱＬＣＫＬＫＧＧＶＶＶＤＥＬＧＣＳＲＱＲＡＰＳＳＫＱＶＮＧＶＱＫＱＲＲＬＡＡＮＡＲＥＲＲＲＭＨＧＬＮＨＡＦＤＱＬＲＮＶＩＰＳＦＮＮＤＫＫＬＳＫＹＥＴＬＱＭＡＱＩＹＩＮＡＬＳＥＬＬＱＴＰＳＧＧＥＱＰＰＰＰＰＡＳＣＫＳＤＨＨＨＬＲＴＡＡＳＹＥＧＧＡＧＮＡＴＡＡＧＡＱＱＡＳＧＧＳＱＲＰＴＰＰＧＳＣＲＴＲＦＳＡＰＡＳＡＧＧＹＳＶＱＬＤＡＬＨＦＳＴＦＥＤＳＡＬＴＡＭＭＡＱＫＮＬＳＰＳＬＰＧＳＩＬＱＰＶＱＥＥＮＳＫＴＳＰＲＳＨＲＳＤＧＥＦＳＰＨＳＨＹＳＤＳ
ＤＥＡＳ（配列番号２）
【００３９】
マウスＡｔｏｈ１ｍＲＮＡ（ＣＤＳ＝１９６−１２５１）およびポリペプチド配列、以下の通りである。
１  ｔｃｇａｃｃｃａｃｇ  ｃｇｔｃｃｇｃｃｃａ  ｃｇｃｇｔｃｃｇｇａ  ｔｃｔｃｃｇａｇｔｇ  ａｇａｇｇｇｇｇａｇ  ｇｇｔｃａｇａｇｇａ
６１  ｇｇａａｇｇａａａａ  ａａａａａｔｃａｇａ  ｃｃｔｔｇｃａｇａａ  ｇａｇａｃｔａｇｇａ  ａｇｇｔｔｔｔｔｇｔ  ｔｇｔｔｇｔｔｇｔｔ
１２１  ｃｇｇｇｇｃｔｔａｔ  ｃｃｃｃｔｔｃｇｔｔ  ｇａａｃｔｇｇｇｔｔ  ｇｃｃａｇｃａｃｃｔ  ｃｃｔｃｔａａｃａｃ  ｇｇｃａｃｃｔｃｃｇ
１８１  ａｇｃｃａｔｔｇｃａ  ｇｔｇｃｇａｔｇｔｃ  ｃｃｇｃｃｔｇｃｔｇ  ｃａｔｇｃａｇａａｇ  ａｇｔｇｇｇｃｔｇａ  ｇｇｔａａａａｇａｇ
２４１  ｔｔｇｇｇｇｇａｃｃ  ａｃｃａｔｃｇｃｃａ  ｔｃｃｃｃａｇｃｃｇ  ｃａｃｃａｃｇｔｃｃ  ｃｇｃｃｇｃｔｇａｃ  ｇｃｃａｃａｇｃｃａ
３０１  ｃｃｔｇｃｔａｃｃｃ  ｔｇｃａｇｇｃｇａｇ  ａｇａｃｃｔｔｃｃｃ  ｇｔｃｔａｃｃｃｇｇ  ｃａｇａａｃｔｇｔｃ  ｃｃｔｃｃｔｇｇａｔ
３６１  ａｇｃａｃｃｇａｃｃ  ｃａｃｇｃｇｃｃｔｇ  ｇｃｔｇａｃｔｃｃｃ  ａｃｔｔｔｇｃａｇｇ  ｇｃｃｔｃｔｇｃａｃ  ｇｇｃａｃｇｃｇｃｃ
４２１  ｇｃｃｃａｇｔａｔｃ  ｔｇｃｔｇｃａｔｔｃ  ｔｃｃｃｇａｇｃｔｇ  ｇｇｔｇｃｃｔｃｃｇ  ａｇｇｃｃｇｃｇｇｃ  ｇｃｃｃｃｇｇｇａｃ
４８１  ｇａｇｇｃｔｇａｃａ  ｇｃｃａｇｇｇｔｇａ  ｇｃｔｇｇｔａａｇｇ  ａｇａａｇｃｇｇｃｔ  ｇｔｇｇｃｇｇｃｃｔ  ｃａｇｃａａｇａｇｃ
５４１  ｃｃｃｇｇｇｃｃｃｇ  ｔｃａａａｇｔａｃｇ  ｇｇａａｃａｇｃｔｇ  ｔｇｃａａｇｃｔｇａ  ａｇｇｇｔｇｇｇｇｔ  ｔｇｔａｇｔｇｇａｃ
６０１  ｇａｇｃｔｔｇｇｃｔ  ｇｃａｇｃｃｇｃｃａ  ｇｃｇａｇｃｃｃｃｔ  ｔｃｃａｇｃａａａｃ  ａｇｇｔｇａａｔｇｇ  ｇｇｔａｃａｇａａｇ
６６１  ｃａａａｇｇａｇｇｃ  ｔｇｇｃａｇｃａａａ  ｃｇｃａａｇｇｇａａ  ｃｇｇｃｇｃａｇｇａ  ｔｇｃａｃｇｇｇｃｔ  ｇａａｃｃａｃｇｃｃ
７２１  ｔｔｃｇａｃｃａｇｃ  ｔｇｃｇｃａａｃｇｔ  ｔａｔｃｃｃｇｔｃｃ  ｔｔｃａａｃａａｃｇ  ａｃａａｇａａｇｃｔ  ｇｔｃｃａａａｔａｔ
７８１  ｇａｇａｃｃｃｔａｃ  ａｇａｔｇｇｃｃｃａ  ｇａｔｃｔａｃａｔｃ  ａａｃｇｃｔｃｔｇｔ  ｃｇｇａｇｔｔｇｃｔ  ｇｃａｇａｃｔｃｃｃ
８４１  ａａｔｇｔｃｇｇａｇ  ａｇｃａａｃｃｇｃｃ  ｇｃｃｇｃｃｃａｃａ  ｇｃｔｔｃｃｔｇｃａ  ａａａａｔｇａｃｃａ  ｃｃａｔｃａｃｃｔｔ
９０１  ｃｇｃａｃｃｇｃｃｔ  ｃｃｔｃｃｔａｔｇａ  ａｇｇａｇｇｔｇｃｇ  ｇｇｃｇｃｃｔｃｔｇ  ｃｇｇｔａｇｃｔｇｇ  ｇｇｃｔｃａｇｃｃａ
９６１  ｇｃｃｃｃｇｇｇａｇ  ｇｇｇｇｃｃｃｇａｇ  ａｃｃｔａｃｃｃｃｇ  ｃｃｃｇｇｇｃｃｔｔ  ｇｃｃｇｇａｃｔｃｇ  ｃｔｔｃｔｃａｇｇｃ
１０２１  ｃｃａｇｃｔｔｃｃｔ  ｃｔｇｇｇｇｇｔｔａ  ｃｔｃｇｇｔｇｃａｇ  ｃｔｇｇａｃｇｃｔｔ  ｔｇｃａｃｔｔｃｃｃ  ａｇｃｃｔｔｃｇａｇ
１０８１  ｇａｃａｇｇｇｃｃｃ  ｔａａｃａｇｃｇａｔ  ｇａｔｇｇｃａｃａｇ  ａａｇｇａｃｃｔｇｔ  ｃｇｃｃｔｔｃｇｃｔ  ｇｃｃｃｇｇｇｇｇｃ
１１４１  ａｔｃｃｔｇｃａｇｃ  ｃｔｇｔａｃａｇｇａ  ｇｇａｃａａｃａｇｃ  ａａａａｃａｔｃｔｃ  ｃｃａｇａｔｃｃｃａ  ｃａｇａａｇｔｇａｃ
１２０１  ｇｇａｇａｇｔｔｔｔ  ｃｃｃｃｃｃａｃｔｃ  ｔｃａｔｔａｃａｇｔ  ｇａｃｔｃｔｇａｔｇ  ａｇｇｃｃａｇｔｔａ  ｇｇａａｇｇｃａａｃ
１２６１  ａｇｃｔｃｃｃｔｇａ  ａａａｃｔｇａｇａｃ  ａａｃｃａａａｔｇｃ  ｃｃｔｔｃｃｔａｇｃ  ｇｃｇｃｇｇｇａａｇ  ｃｃｃｃｇｔｇａｃａ
１３２１  ａａｔａｔｃｃｃｔｇ  ｃａｃｃｃｔｔｔａａ  ｔｔｔｔｔｇｇｔｃｔ  ｇｔｇｇｔｇａｔｃｇ  ｔｔｇｔｔａｇｃａａ  ｃｇａｃｔｔｇａｃｔ
１３８１  ｔｃｇｇａｃｇｇｃｔ  ｇｃａｇｃｔｃｔｔｃ  ｃａａｔｃｃｃｃｔｔ  ｃｃｔｃｃｔａｃｃｔ  ｔｃｔｃｃｔｔｃｃｔ  ｃｔｇｔａｔｇｔａｇ
１４４１  ａｔａｃｔｇｔａｔｃ  ａｔｔａｔａｔｇｔａ  ｃｃｔｔｔａｃｇｔｇ  ｇｃａｔｃｇｔｔｔｃ  ａｔｇｇｔｃｃａｔｇ  ｃｔｇｃｃａａｔａｔ
１５０１  ｇｃｔｇｃｔａａａａ  ｔｇｔｃｇｔａｔｃｔ  ｃｔｇｃｃｔｃｔｇｇ  ｔｃｔｇｇｇｔｔｔｃ  ａｃｔｔａｔｔｔｔａ  ｔａｃｃｔｔｇｇｇａ
１５６１  ｇｔｔｃａｔｃｃｔｔ  ｇｃｇｔｇｔｔｇｃｇ  ｃｔｃａｃｔｃａｃａ  ａａｔａａｇｇｇａｇ  ｔｔａｇｔｃａａｔｇ  ａａｇｔｔｇｔｔｔｃ
１６２１  ｃｃｃａａｃｔｇｃｔ  ｔｇａｇａｃｃｃｇｃ  ａｔｔｇｇｇｔａｃｔ  ｔｔａｃｔｇａａｃａ  ｃｇｇａｃｔａｔｔｇ  ｔｇｔｔｇｔｔａａａ
１６８１  ａｔｇｃａｇｇｇｇｃ  ａｇａｔａａｇａｇｔ  ａｔｃｔｇｔａｇａｇ  ｃｔｔａｇａｃａｃｃ  ａａｇｔｇｔｇｔｃｃ  ａｇｃａｇｔｇｔｇｔ
１７４１  ｃｔａｇｃｇｇａｃｃ  ｃａｇａａｔａｃａｃ  ｇｃａｃｔｔｃａｔｃ  ａｃｔｇｇｃｃｇｃｔ  ｇｃｇｃｃｇｃｃｔｔ  ｇａａｇａａａｃｔｃ
１８０１  ａａｃｔｇｃｃａａｔ  ｇｃａｇａｇｃａａｃ  ｔｔｔｔｇａｔｔｔｔ  ａａａａａｃａｇｃｃ  ａｃｔｃａｔａａｔｃ  ａｔｔａａａｃｔｃｔ
１８６１  ｔｔｇｃａａａｔｇｔ  ｔｔｇｔｔｔｔｔｇｃ  ａａａｔｇａａａａｔ  ｔａａａａａａａａａ  ｃａｔｇｔａｇｔｇｔ  ｃａａａｇｇｃａｔｔ
１９２１  ｔｇｇｔｃａａｔｔｔ  ｔａｔｔｔｔｇｃｔｔ  ｔｇｔｔａａｃａｔｔ  ａｇａａａａｇｔｔａ  ｔｔｔａｔｔａｔｔｇ  ｃｇｔａｔｔｔｇｇａ
１９８１  ｃｃｃａｔｔｔｃｔａ  ｃｔｔａａｔｔｇｃｃ  ｔｔｔｔｔｔｔｔａｃ  ａｔｔｔｔｃｔａｃｔ  ｃｇａｇａｔｃｇｔｔ  ｔｔａｔｔｔｔｇａｔ
２０４１  ｔｔａｇｃａａａｔｃ  ｃａｇｔｔｇｃｃａｔ  ｔｇｃｔｔｔａｔｇｔ  ａｔｇｔａｔｇｃｔｃ  ｔｔｔｔａｃａａａｔ  ｇａｔａａａａｔａａ
２１０１  ａｃｔｃｇｇａａａａ  ａａａａａａａａａａ  ａａａａａａａａａａ  ａａａａａａａａａａ  ａａａａ（配列番号３）
ＭＳＲＬＬＨＡＥＥＷＡＥＶＫＥＬＧＤＨＨＲＨＰＱＰＨＨＶＰＰＬＴＰＱＰＰＡＴＬＱＡＲＤＬＬＶＲＲＳＧＣＧＧＬＳＫＳＰＧＰＶＫＶＲＥＱＬＣＫＬＫＧＧＶＶＶＤＥＬＧＣＳＲＱＲＡＰＳＳＫＱＶＮＧＶＱＫＱＲＲＬＡＡＮＡＲＥＲＲＲＭＨＧＬＮＨＡＦＤＱＬＲＮＶＩＰＳＦＮＮＤＫＫＬＳＫＹＥＴＬＱＭＡＱＩＹＩＮＡＬＳＥＬＬＱＴＰＮＶＧＡＳＳＧＧＹＳＶＱＬＤＡＬＨＦＰＡＦＥＤＲＡＬＴＡＭＭＡＱＫＤＬＳＰＳＬＰＧＧＩＬＱＰＶＱＥＤＮＳＫＴＳＰＲＳＨＲＳＤＧＥＦＳＰＨＳＨＹＳＤＳＤＥＡＳ（配列番号４）
【００４０】
ニワトリＣａｔｈ１ｍＲＮＡ（ＣＤＳ＝１−７１７）およびポリペプチド配列は、以下の通りである。
１  ａｔｇｇｃｃｃｃａｇ  ｇａｇｇｔａｇｃｇａ  ｇｔｇｔｔｇｔｔｇｃ  ａｇｔｇａｔｇｃｃｇ  ｃｇｃａｃａｔｃａｃ  ｔｔｇｇａｇｇｃａｇ
６１  ｔｇｇｇａｇｔａｃａ  ｃｇｃａｃｇａｇａａ  ｃｃａａｃｔｇｔｇｃ  ｇｔｇｇｃａｇｇａａ  ｃｔｇｔｃａｇｃａｇ  ｇａｔｇａｇｇｃｃｃ
１２１  ａｇｇａｃｇｔｇｇｇ  ｔｃｔｇｃａｃｃｇｇ  ａｔｃｔｔｔｇｔｇｇ  ｇａｃｃａｇｇａａｇ  ｃｇｇｇａａｔｔａｃ  ｔｔｔｇａｔｇｇｇｃ
１８１  ｃｃｃｃａａａｔａｃ  ｃｃａａａｇｔｇｇａ  ｔｇａｇｇｃａｇｇａ  ｇｔｇａｔｇａｃｃｃ  ａｃｃｃｇｇｃａａｇ  ｇｔｃｇｃｔｔｔｇｃ
２４１  ａｇｃａｃｔｇｇｇｇ  ｃａｃａｔｃｃｇｔｇ  ｔｃｃｃｇｇｇｇｔｇ  ｇｔｃｇｔｇｃｔｇｃ  ｃｃａｃｇｇｇｔｇｇ  ｇａｔａｇｇｇｃａｇ
３０１  ｃｃｔｔｃａａａｇａ  ａｇｃｔｃｔｃｃａａ  ｇｔａｃｇａｇａｃｇ  ｃｔｇｃａｇａｔｇｇ  ｃｇｃａａａｔｃｔａ  ｃａｔｃａｇｃｇｃｃ
３６１  ｃｔｃｇｃｃｇａｇｃ  ｔｔｃｔｇｃａｃｇｇ  ｇｃｃｇｃｃｃｇｃｇ  ｃｃｃｃｃｃｇａｇｃ  ｃｇｃｃｃｇｃｃａａ  ｇｇｃｃｇａｇｃｔｃ
４２１  ｃｇｃｇｇｇｇｃｃｃ  ｃｃｔｔｃｇａｇｃｃ  ｔｃｃｃｃｃｇｃｃｇ  ｃｃｃｃｃｔｃｃｔｃ  ｃｇｃｃｇｃｃｃｃｇ  ｃｇｃｃｔｃｇｃｃｃ
４８１  ｃｃｃｇｃｇｃｃｃｇ  ｃｃａｇｇａｃｔｃｇ  ｃｔｔｃｃｃｃｃｃｇ  ｇｃｇｇｃｇｇｃｃｇ  ｃｇｇｇｃｇｇｔｔｔ  ｃｇｃｇｇｃｇｃｔｔ
５４１  ｃｔｃｇａｇｃｃｇｃ  ｔｇｃｇｃｔｔｃｃｃ  ｔｔｃｔｔｔｃｃｃｇ  ｇｃｇｃａｇａａａｇ  ｃｇｃｃｔｔｃｔｃｃ  ｃｇｃｇｃｔｇｃｔｃ
６０１  ｃｔｇｇｇｇｃｃｇｃ  ｃｃｇｃｇｃｃｇｃａ  ｇｃａｇｃｃｃｇａｇ  ａｇｇａｇｃａａａｇ  ｃｇｔｃｇｃｃｇｃｇ  ｃｔｃｔｃａｃｃｇｃ
６６１  ａｇｃｇａｃｇｇｇｇ  ａｇｔｔｃｔｃｇｃｃ  ｇｃｇｃｔｃｃｃａｃ  ｔａｃａｇｔｇａｃｔ  ｃｇｇａｃｇａｇｇｃ  ｃａｇｃｔａｇ
（配列番号５）
ＭＡＰＧＧＳＥＣＣＣＳＤＡＡＨＩＴＷＲＱＷＥＹＴＨＥＮＱＬＣＶＡＧＴＶＳＲＭＲＰＲＴＷＶＣＴＧＳＬＷＤＱＥＡＧＩＴＬＭＧＰＱＩＰＫＶＤＥＡＧＶＭＴＨＰＡＲＳＬＣＳＴＧＡＨＰＣＰＧＶＶＶＬＰＴＧＧＩＧＱＰＳＫＫＬＳＫＹＥＴＬＱＭＡＱＩＹＩＳＡＬＡＥＬＬＨＧＰＰＡＰＰＥＰＰＡＫＡＥＬＲＧＡＰＦＥＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＲＡＳＰＰＡＰＡＲＴＲＦＰＰＡＡＡＡＧＧＦＡＡＬＬＥＰＬＲＦＰＳＦＰＡＱＫＡＰＳＰＡＬＬＬＧＰＰＡＰＱＱＰＥＲＳＫＡＳＰＲＳＨＲＳＤＧＥＦＳＰＲＳＨＹＳＤＳＤＥＡＳ（配列番号６）
【００４１】
２つのアミノ酸配列、または２つの核酸配列のパーセント同一性を決定するため、配列は、最適に比較できるように整列される（例えば、ギャップは、最適な整列のために、第１および第２のアミノ酸または核酸配列の一方または両方に導入することができ、非相同配列は、比較目的のために無視することができる）。比較目的で整列された参照配列の長さは、参照配列の少なくとも８０％の長さであり、一部の実施形態においては、少なくとも９０％または１００％である。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置で、アミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められるなら、分子は、その位置で同一である（本明細書で使用するアミノ酸または核酸の「同一性」は、アミノ酸または核酸の「相同性」と同等である）。２つの配列間の同一率（％）は、２つの配列の最適な整列のために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮した上での、配列によって共有される同一の位置の数の関数である。
【００４２】
本発明の目的のために、配列の比較および２つの配列間同一率の決定は、１２のギャップペナルティ、４のギャップ拡張ペナルティ、および５のフレームシフトギャップペナルティを適用するＢｌｏｓｓｕｍ６２スコアリングマトリックスを使用して達成することができる。
【００４３】
一部の実施形態においては、該方法は、ストリンジェントな条件下で、ヒトＡｔｏｈ１ｍＲＮＡとハイブリダイズする核酸によってコードされるＡｔｏｈ１ポリペプチドを細胞内で発現するステップを含む。本明細書で使用する「ストリンジェントな条件」という用語は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄に関する条件を表す。本明細書で使用されるストリンジェントな条件は、６５℃での０．５Ｍリン酸ナトリウム、７％ＳＤＳ、続いて、６５℃での０．２ＸＳＳＣ、１％ＳＤＳでの１回以上の洗浄のことである。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（２００６）を参照されたい。
【００４４】
一部の実施形態においては、該方法は、幹細胞内で外因性Ａｔｏｈ１を発現するステップを含む。これは、例えば、細胞内に発現ベクターを導入することによって達成することができる。本明細書で使用する「ベクター」という用語は、それに連結され、プラスミド、コスミドまたはウイルスベクターを含むことができる別の核酸を運搬することが可能な核酸分子を指す。ベクターは、自己複製が可能であり得るか、または宿主ＤＮＡに統合することができる。ウイルスベクターは、例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスを含む。
【００４５】
ベクターは、宿主細胞内の核酸の発現に適切な形でＡｔｏｈ１核酸を含むことができる。概して、発現ベクターは、発現される核酸配列に操作可能なように連結される１つ以上の調節配列を含む。「調節配列」という用語は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含む。調節配列は、ヌクレオチド配列、ならびに組織特異的な調節および／または誘導性配列の恒常的発現を方向付けるものを含む。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望されるタンパク質の発現レベル等の因子に依存し得る。発現ベクターは、リン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介の形質移入、リポフェクション、または電気穿孔を含む、当技術分野において既知の方法を使用して、宿主細胞に導入することができる。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（２００６）を参照されたい。
【００４６】
本発明の方法において、幹細胞内に発現されたＡｔｏｈ１ポリペプチドは、本明細書に記載されているように、有毛細胞および／または支持細胞への間葉系幹細胞の分化を誘発する能力を有するであろう。
【００４７】
ニワトリ耳胞での培養による分化
また、本明細書に記載されているように、幹細胞由来の前駆細胞は、外因性Ａｔｏｈ１を必要とすることなく、感覚上皮細胞に分化させることによって、ニワトリ胚からの発生中の耳胞細胞との物理的接触にも応答した。これは、本明細書に記載されているように、同時培養および分化後の、Ａｔｏｈ１エンハンサー−ＧＦＰレポーター構築からのｎＧＦＰ発現およびミオシンＶＩＩａの同時発現から明らかであった。胎生期マウスからの耳胞および後脳条件培地でのインキュベーションによる先行研究（Ｋｏｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ１０２，４７８９−４７９４（２００５））において、感覚細胞のマーカーを発現する神経細胞は、骨髄ＭＳＣから誘発された。
【００４８】
したがって、本明細書に記載した方法は、例えば、本明細書に記載されているように、Ｅ３胎生期ニワトリから単離された細胞等の耳胞細胞と、前駆細胞を接触させるステップを含むことができる。
【００４９】
一部の実施形態においては、方法は、耳胞細胞の融合層当たり約５０，０００細胞の割合で、または無傷耳胞（下記の実施例を参照）内に１００，０００細胞を注入することによって、耳胞細胞とともに前駆細胞を培養するステップを含む。代替として、幹細胞は、当技術分野において既知の方法を使用して、例えば、約４日間ニワトリ耳胞の培養と接触した培地を使用して産生することができるニワトリ耳胞条件培地の存在下において、培養することができる。
【００５０】
Ｎｏｔｃｈシグナルの阻害による分化
Ｎｏｔｃｈは、原形質膜受容体であり、Ｎｏｔｃｈ経路は、Ｎｏｔｃｈおよびそのリガンド、ならびにＮｏｔｃｈシグナルを核に伝達する細胞内タンパク質から成る。Ｎｏｔｃｈ経路内には、経路のエフェクター機能を有する転写因子が含まれる。
Ｎｏｔｃｈシグナルは、１つの細胞が所与の運命の間、（例えば、有毛細胞への分化）細胞クラスターから選抜される側方抑制に関与する。分化は、分化するように選択されなかったそれらの細胞内で阻害され、その結果、細胞のクラスターの多くの部分への特定の運命拘束が予防される。側方抑制は、発生時に繰り返し生じる。この過程の中心となるのは、Ｄｅｌｔａ、ＳｃａｂｒｏｕｓおよびＳｅｒｒａｔｅを含む、幾つかのリガンドのうちの１つのＮｏｔｃｈ受容体への結合である。Ｎｏｔｃｈリガンドへのリガンド結合は、側方抑制をもたらす一連の細胞内事象を引き起こす。Ｎｏｔｃｈ経路に関するレビューは、Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：２２５−２３２（１９９５）に記載されている。本明細書に記載されているように、本明細書に記載した内耳前駆細胞におけるＮｏｔｃｈの阻害は、有毛細胞および支持細胞への細胞の分化をもたらす。
【００５１】
したがって、本明細書に記載した方法の一部の実施形態においては、前駆細胞は、Ｎｏｔｃｈシグナル経路阻害剤の存在下において増殖する。例示的なＮｏｔｃｈ経路阻害剤は、γセクレターゼ阻害剤を含み、その多くは当技術分野において既知である（例えば、アリールスルホンアミド（ＡＳ）、ジベンザゼピン（ＤＢＺ）、ベンゾジアゼピン（ＢＺ）、Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェナセチル）−Ｌ−アラニル］−（Ｓ）−フェニルグリシンｔ−ブチルエステル（ＤＡＰＴ）、Ｌ−６８５，４５８（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、およびＭＫ０７５２（Ｍｅｒｃｋ）。有用な濃度は、選択した阻害剤に依存する。
【００５２】
他のＮｏｔｃｈ阻害剤は、阻害性核酸（例えば、低分子干渉ＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびモルホリノオリゴであり、例えば、阻害配列を選択および最適化するための遺伝子ウォーク方法等のそれらを設計する、作る、および使用するための方法は、当技術分野において既知であり、例えば、Ｅｎｇｅｌｋｅ，ＲＮＡ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＮＡｉ）：Ｔｈｅ  Ｎｕｔｓ＆Ｂｏｌｔｓ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（ＤＮＡ  Ｐｒｅｓｓ，２００４）、Ｍｏｌ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，（ＣＲＣ，１９９４）、Ｓｉｏｕｄ，Ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｓｉｒｎａ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  ２００４）、およびＰｈｉｌｉｐｓ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  （Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  ２００４）を参照）を含み、Ｎｏｔｃｈ（例えば、Ｐｒｅｓｅｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０１（６）：１７６４−１７６８（２００４）、Ｉｖａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０１（４６）：１６２１６−１６２２１（２００４）を参照）またはそのリガンド、つまり、ＤｅｌｔａもしくはＪａｇｇｅｄ（例えば、Ｐａｔｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３，１４４０−１４４４（２００５）、Ｐｕｒｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６５：２３５３−２３６３（２００５）、またはＳｔａｌｌｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７７：８８５−８９５（２００６）を参照）を標的にする。代替として、細胞は、ｍ−Ｎｕｍｂ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１００５７４３．１）を発現するように修飾することができ、または乱すことができる（Ｄｖｌ；ヒト相同体は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００４４２１．２（変異体１）、ＮＭ＿００４４２２．２（変異体２）、およびＮＭ＿００４４２３．３（変異体３）にあり、両方ともＮｏｔｃｈシグナリングの内因性阻害剤である。
【００５３】
分化をアッセイ
幹細胞が、前駆細胞に、または例えば有毛細胞もしくは支持細胞等の内耳の細胞に分化されたことを判定するために、様々な方法を利用することができる。例えば、細胞は、細胞マーカー遺伝子の発現に対して検査することができる。有毛細胞マーカー遺伝子は、ミオシンＶＩＩａ（ｍｙｏＶＩＩａ）、Ａｔｏｈ１、α９アセチルコリン受容体、エスピン、パルブアルブミン３、およびＢｒｎ３ｃを含む。支持細胞マーカーは、クローディン１４、コネキシン２６、ｐ７５Ｔｒｋ、Ｎｏｔｃｈ１およびＳ１００Ａを含む。多能性幹細胞は、概して、これらの遺伝子を発現しない。これらの遺伝子の１つ以上を発現する細胞を伝播および産生する幹細胞は、有毛細胞を産生しており、つまり、幹細胞は、少なくとも部分的に有毛細胞に分化した。内耳前駆細胞（有毛細胞の前駆物質）に分化した幹細胞は、ネスチン、ｓｏｘ２、ｍｕｓａｓｈｉ、Ｂｒｎ３Ｃ、Ｐａｘ２、およびＡｔｏｈ１等の初期耳マーカー遺伝子を発現する。前駆細胞は、これらの遺伝子の１つ以上を発現することができる。前駆細胞は、増殖因子の存在下において、無血清培地中で伝播することができる。増殖因子の除去およびＡｔｏｈ１の発現、またはニワトリ耳胞での同時培養は、細胞が、さらに有毛細胞および支持細胞等に分化するように誘発するであろう。
【００５４】
有毛細胞または有毛細胞前駆体（例えば、幹細胞から分化した有毛細胞、支持細胞、または前駆細胞）の同定は、本明細書に記載されているように、マーカー遺伝子の発現を検出することによって容易にすることができる。遺伝子発現の産物の検出は、免疫細胞化学によって行うことができる。免疫細胞化学技術は、適切な抗原に対する抗体を使用した細胞または組織の染色を伴う。この場合、適切な抗原は、組織特異的な遺伝子発現のタンパク質産物である。原理上は、第１の抗体（つまり、抗原を結合する抗体）は標識することができるが、第１の抗体に対して作られた第２の抗体（例えば、抗ＩｇＧ）を使用することがより一般的である（および可視化を改善させる）。この第２の抗体は、１次抗体の位置、したがって抗原を認識できるように、蛍光色素、または比色反応のために適切な酵素、またはゴールドビーズ（電子顕微鏡法のため）、あるいはオチン−アビジン系に抱合される。タンパク質マーカーは、これらの抗原に対する抗体を使用するフローサイトメトリーによって、または細胞抽出物のウエスタンブロット分析によって検出することもできる。
【００５５】
代替的にまたは付加的に、遺伝子発現は、直接的に分析することができ、例えば、発現レベルを検出および比較するために使用することができる定量的ＲＴ−ＰＣＲ等の定量的ＰＣＲを含む、当技術分野において既知のＰＣＲ方法を使用して分析することができる。
【００５６】
治療方法
本明細書に記載した方法は、治療上の使用のために、細胞を生成するために使用することができる。治療方法は、それを必要としているヒトの耳に移植するための本明細書に記載した方法を使用して、幹細胞から、内耳の細胞（例えば、有毛細胞または支持細胞）を生成するステップを含む。対象の内耳への細胞の移植は、対象の聴力を回復もしくは改善するために、または前庭機能不全の症状を減少させるために有用であり得る。本明細書に記載した方法によれば、幹細胞に由来する内耳細胞は、治療上有用となるように完全に分化する必要はない。対象における聴覚障害の任意の症状を改善させる部分的に分化した細胞は、治療的組成物および本明細書に記載した方法にとって有用である。
【００５７】
内耳の障害を有する、またはそのような障害を発症する危険性があるヒトは、本明細書に記載する方法を使用して幹細胞から生成された内耳細胞（有毛細胞または支持細胞）で治療することができる。成功した生着において、少なくとも一部の移植された有毛細胞は、例えば、らせん神経節細胞とのシナプス接合を形成し、内耳の感覚上皮に統合されるであろう。細胞が生着する能力を改善するため、幹細胞を、分化に先立って修飾することができる。例えば、細胞は、前駆体または分化した細胞内で１つ以上の抗アポトーシス遺伝子を過剰発現させるように操作することができる。ＦａｋチロシンキナーゼまたはＡｋｔ遺伝子は、この目的に有用であり得る候補抗アポトーシス遺伝子であり、ＦＡＫまたはＡｋｔの過剰発現は、らせん神経節細胞内における細胞死を防止して、外植したコルチ器官（例えば、Ｍａｎｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１１９５−２０１（２００３）を参照）等の別の組織に移植される時に、生着を促進することができる。αｖβ３インテグリンを過剰発現させる神経前駆細胞は、インテグリンが、ラミニン基質（Ａｌｅｔｓｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｕｄｉｏｌ．Ｎｅｕｒｏｏｔｏｌ．６：５７−６５（２００１））上のらせん神経節神経細胞からの神経突起伸長を媒介することが証明されているため、神経突起を組織外植片内に伸長させる増強された能力を有し得る。別の実施例において、エフリンＢ２およびエフリンＢ３の発現は、ＥｐｈＡ４シグナル伝達事象を修飾するために、ＲＮＡｉでのサイレンシングまたは外因的に発現されたｃＤＮＡでの過剰発現等によって変化させることができる。らせん神経節神経細胞は、エフリン−Ｂ２および−Ｂ３（Ｂｒｏｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．４６２：９０−１００（２００３））の細胞表面発現によって媒介されるＥｐｈＡ４からのシグナルによって誘導されることが証明されている。この誘導シグナルの不活性化は、成体内耳におけるそれらの標的に到達する神経細胞の数を増強し得る。ニューロトロフィンＢＤＮＦおよびＮＴ３、ならびにＬＩＦ等の外因性因子は、神経突起の伸長ならびに生体内の標的組織および生体外組織培養に向けたそれらの増殖を増強させるために、組織移植片に添加することができる。感覚神経細胞の神経突起伸長は、ニューロトロフィン（ＢＤＮＦ、ＮＴ３）およびＬＩＦの添加によって増強することができる（Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ  １２：２７５−２７９（２００１））。またソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）ポリペプチドまたはポリペプチド断片（例えば、ＳＨＨ−Ｎ）も、神経突起伸長を増強させるために、内因性因子として有用であり得る。Ｓｈｈは、内耳に対する発生的修飾因子であり、軸索（Ｃｈａｒｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，細胞１１３：１１  ２３（２００３））に対する化学誘引物質である。
【００５８】
難聴を経験しているまたは発症する危険性があるいなかるヒトも、本明細書に記載する治療方法の候補者である。例えば、そのようなヒトは、本明細書に記載した方法によって生成された内耳有毛細胞または支持細胞の移植片を受け取ることができる。難聴である、または難聴を発症する危険性があるヒトは、平均的ヒトほど良好に聞こえず、または難聴を経験する前のヒトほど良好に聞こえない。例えば、聴覚は、少なくとも５、１０、３０、５０％以上減少し得る。ヒトは、耳の感覚部分（蝸牛）もしくは神経部分（聴神経）の損傷もしくは機能不全に起因する感音難聴、または外耳および／または中耳内の妨害もしくは損傷によって生じる伝音難聴である可能性があり、あるいはヒトは、伝音経路（外耳または中耳内）および神経経路（内耳）の両方における問題によって生じる混合性難聴である可能性がある。混合性難聴の実施例は、加齢に付随する損傷に起因する感音障害と同時に発生する中耳感染症に起因する伝音障害である。
【００５９】
対象は、任意の理由で、または任意の種類の事象の結果として、聾または難聴である可能性がある。例えば、ヒトは、遺伝子または先天性欠損のために聾である可能性があり、例えば、ヒトは、生まれつき聾である可能性があるか、または遺伝子または先天性欠損に起因して聴覚が徐々に失われた結果として、聾または聴力低下である可能性がある。別の例において、ヒトは、耳の身体的外傷、または突然の大きな騒音、あるいは大きな騒音への長時間暴露等の外傷性の事象の結果として聾または聴力低下である可能性がある。例えば、コンサート会場、空港の滑走路、および建設地域への長時間暴露は、内耳損傷およびその後の難聴を引き起こし得る。ヒトは、化学的に誘発された聴器毒性を経験する可能性があり、聴器毒性薬物は、抗悪性腫瘍薬、サリチル酸、キニーネ、およびアミノグリコシド系抗菌薬を含む治療薬、食物または医薬品中の混合物、ならびに環境または産業性汚染物質を含む。ヒトは、加齢によって生じる聴覚障害であり得るか、またはヒトは、耳鳴（耳の中で鳴り響く音に特徴付けられる）を有し得る。
【００６０】
細胞は、任意の適切な方法で投与することができる。例えば、聴覚を回復するため、本明細書に記載する方法によって生成された内耳細胞は、細胞懸濁液等の形で、注入によって蝸牛の管腔等の耳に移植することができる。例えば、Ｃｏｒｒａｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．６６（１３）：１４８９−５００（２００６）およびＨｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３０２：４０−４７（２００５）に記載された方法を参照。例えば、耳の正円窓を通じて、または蝸牛周囲の骨嚢を通じて注入することができる。細胞は、正円窓を通じて、内耳道内の聴神経幹に、または鼓室階に注入することができる。好適な実施形態において、細胞は、対象の感覚上皮に、またはその付近に、例えば、感覚上皮の上または下の液体（外リンパ）で充填された空間、つまり中心階、鼓室階、または前庭階に投与される。
【００６１】
代替として、治療的組成物および本明細書に記載する方法に適切なヒトは、両側性および片側性前庭機能不全を含む、前庭機能不全を有するヒトを含む。前庭機能不全は、浮動性眩暈、不均衡、眩暈、悪心、および不鮮明な視覚を含む症状に特徴付けられる内耳機能不全であり、聴覚問題、疲労、認知機能の変化を伴う場合がある。前庭機能不全は、遺伝子もしくは先天性欠損、ウイルスもしくは細菌感染症等の感染症、または外傷性もしくは非外傷性障害等の障害の結果であり得る。前庭機能不全は、障害の個々の症状（例えば、眩暈、悪心、および不鮮明な視覚）を測定することによって検査することが最も多い。これらの実施形態においては、本明細書に記載した方法によって生成された内耳細胞は、例えば注入によって、細胞懸濁液等の形で、前庭系の器官に、例えば、卵形嚢、膨大部および球形嚢に移植することができる。細胞は、概して、これらの器官の外リンパ内に、または前庭（３器官を連結させる）内に注入されるであろう。
【００６２】
本明細書に記載する内耳細胞または内耳細胞前駆体での治療後に、ヒトを、聴覚または内耳障害に関連する他の症状の改善に関して検査することができる。聴覚を測定するための方法は既知であり、純音聴力検査、気導、および骨伝導テストを含む。これらの検査は、ヒトが聞くことができる音量（強度）および音階（周波数）の限界を測定する。ヒトにおける聴覚試験は、一般行動聴力検査（７ヶ月までの乳児に対して）、視覚強化詮索聴力検査（７ヶ月から３歳の子供に対して）および３歳より上の子供に対する遊戯聴力検査を含む。耳音響放射検査は、蝸牛の有毛細胞の機能をテストするために使用することができ、蝸電図法は、蝸牛の機能および脳への神経経路の基部に関する情報を提供する。
【００６３】
治療的組成物および本明細書に記載した方法は、難聴、聴覚消失、または内耳機能の損失に付随する他の聴力障害を予防できるように、予防的に使用することができる。例えば、分化剤を含有する組成物は、聴覚障害に影響を及ぼし得る治療等の第２の治療とともに投与することができる。そのような耳毒性薬物は、抗生物質ネオマイシン、カナマイシン、アミカシン、バイオマイシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、エリスロマイシン、バンコマイシン、およびストレプトマイシン、シスプラチン等の化学療法剤、トサルチル酸コリンマグネシウム、ジクロフェナク、ジフルニサル、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、メクロフェナム酸、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、サルサラート、スリンダク、およびトルメチン等の非ステロイド性抗炎症薬（ｎｏｎｓｔｅｒｏｉｄａｌ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｒｕｇ：ＮＳＡＩＤ）、利尿薬、アスピリン等のサリチル酸、ならびにキニーネおよびクロロキン等の特定のマラリア治療を含む。
【００６４】
また、例えば、化学療法中のヒトは、本明細書に記載した方法によって、本明細書に記載される内耳細胞または内耳細胞前駆体を投与することができる。例えば、化学療法剤シスプラチンは、難聴を生じさせることが既知である。したがって、分化剤を含有する組成物は、シスプラチン副作用の重度を予防する、または和らげるために、シスプラチン療法とともに投与することができる。本明細書に記載される内耳細胞または内耳細胞前駆体は、第２の治療剤の前、その後および／またはそれと同時に投与することができる。２つの治療は、概して、異なる投与経路によって投与される。
本発明において特徴とされる組成物および方法は、感音有毛細胞損失または聴覚性神経障害によって生じる聴覚障害の治療に適している。例えば、感音有毛細胞損失のある患者は、蝸牛の有毛細胞の変性を経験し、これは、有毛細胞損失の領域におけるらせん神経節神経細胞の損失に繋がることが多く、また、コルチ器官における支持細胞の損失、ならびに側頭骨材料における角膜縁、らせん靱帯、および血管条の変性も経験し得る。そのような患者は、内耳への支持細胞および／または有毛細胞の投与から特に恩恵を受け得る。
【００６５】
実施例
本発明を、以下の実施例においてさらに説明するが、これらは、特許請求の範囲において記載される本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００６６】
実施例１：間葉系幹細胞からの感覚前駆体
間葉系幹細胞は、高血清条件下において、髄からの接着細胞を培養することによって、マウス骨髄から取得した。
簡潔に述べると、細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｃａｍｂｒｅｘ，ＮＹ）および１ｍＭグルタミン（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を含有するＭＥＭ−α（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）で、骨髄を洗い流すことによって、４週齢Ｃ５７ＢＬ／６またはＡｔｏｈ１−ｎＧＦＰマウス（Ｈｅｌｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２７，１１８５−１１９６（２０００））の両側性大腿骨および脛骨から取得した。ペレット細胞は再懸濁し、ＲＢＣ溶解緩衝液（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）と混合した。約５×１０６細胞は、５％ＣＯ２大気中３７℃で、９％ウマ血清、９％ＦＢＳ、１％Ｇｌｕｔａ−Ｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ならびに１００単位／ｍｌペニシリンおよびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）を有するＭＥＭ−αにおいて、一晩１０ｃｍディッシュ上で培養した。非接着造血幹細胞を除去して、接着骨髄間質細胞を残した。細胞が集密的になった時に、トリプシン処理を行い、細胞を培養して３から５回継代し、培地は３〜４日ごとに交換した。これらの細胞を間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ：ＭＳＣ）と称する。
【００６７】
免疫組織化学は、以下の通りに行った。細胞を、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定した。免疫染色は、１％ＢＳＡおよび５％ヤギ血清（ＰＢＴ１）を補充したＰＢＳ中０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で、１時間切片を再水和し、遮断することによって開始した。固定および透過処理された細胞または再水和された切片を、ＰＢＴ１中で一晩インキュベートした。１：４０に希釈したＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ４５、Ｓｃａ−１抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、抽出した骨髄細胞の特徴付けのために使用した。有毛細胞および骨髄前駆体は、１：５００に希釈したニワトリ有毛細胞特異的抗原に対するモノクローナル抗体（Ｇｕｙ  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎからのギフト（Ｂａｒｔｏｌａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｏｍｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  ３１４，７７７−７８８（１９９１））、ミオシンＶＩＩａに対するポリクローナル抗体、１：５００（Ｏｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｓｓｏｃ  Ｒｅｓ  Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ．８（１）：１８−３１（２００７））、ネスチンに対するモノクローナル抗体、１，０００（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ，Ｉｏｗａ  Ｃｉｔｙ，ＩＡ）、パルブアルブミン３に対するポリクローナル抗体、１：２，０００（Ｈｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｓｓｏｃ  Ｒｅｓ  Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ  ３，４８８−４９８  （２００２））、Ａｔｏｈ１に対するモノクローナル抗体、１：１００（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ）、神経フィラメントＭに対するモノクローナル抗体、１：２００（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、ＩＩ型コラーゲンに対するポリクローナル抗体、１：４０（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、Ｂｒｎ３ｃに対するポリクローナル抗体（Ｃｏｖａｎｃｅ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ）、Ｃｙ−５抱合型Ｆアクチン１：１０００（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅ）を使用して特徴付けした。試料は、２０分３回それぞれＰＢＳで洗浄した。ＦＩＴＣ−、ＴＲＩＴＣ−、およびＣｙ−５−（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）に抱合された抗ウサギ、抗モルモットおよび抗マウス２次抗体を、１次抗体を検出するために使用した。試料は、１０分間ＤＡＰＩで対比染色し（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、射蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏｓｋｏｐ  ２  Ｍｏｔ  Ａｘｉｏｃａｍ，Ｚｅｉｓｓ）または共焦点顕微鏡（ＴＣＳ，Ｌｅｉｃａ）で観察した。免疫陽性細胞の計数は、２０の無作為に選択された顕微鏡視野中３００の細胞を計数することによって行い、有意性をスチューデントｔ−検定で計算した。
【００６８】
また、フローサイトメトリー分析も行った。ＭＳＣは、ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ４５またはＳｃａ−１（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に対する抗体でインキュベートし、ＴＲＩＴＣと抱合された２次抗マウス抗体でさらにインキュベートした。データを取得し、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒシステムおよびフローサイトメトリーチップ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して分析した。２次抗体単独からの蛍光が２％未満となるように参照窓を設定した。
【００６９】
ＭＳＣは、骨髄中の造血幹細胞に対するマーカーであるＣＤ３４およびＣＤ４５に陰性であり（Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４１８，４１−４９（２００２）；Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４，１４３−１４７（１９９９））、ＭＳＣに対するマーカーであるＣＤ４４およびＳｃａ−１に陽性であった（Ｄｅｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１３，１７０１−１７１０（２００４））。免疫組織化学に基づくと、Ｓｃａ−１は５．２％の細胞上に存在し、ＣＤ４４は１１．５％の細胞上に存在し、フローサイトメトリーで決定した割合は同様であった（図１Ａおよび１Ｄならびに表１）。ＣＤ４４およびネスチンの同時発現ならびに少ない割合の細胞上にＳｃａ−１およびネスチンを検出した（図１Ｂおよび１Ｃ）。
【００７０】
【表１】
2010509919.tif 000002
【００７１】
陽性細胞は、ＤＡＰＩによって染色した合計核との関連で計数した。データは、１０回の別々の実験についての平均±標準誤差である。ネスチンでの細胞染色の増加は有意であり（ｐ＜０．００１）、ネスチンおよびＣＤ４４（ｐ＜０．００１）ならびにネスチンおよびＳｃａ−１（ｐ＜０．０５）の両方に対する細胞染色が増加も同様であった。
【００７２】
ＭＳＣの、以前に報告されている、軟骨細胞（Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４，１４３−１４７（１９９９））および神経細胞（Ｄｅｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１３，１７０１−１７１０（２００４））に転換される能力を確認した。軟骨細胞分化のために、ＭＳＣをミクロペレット内に形成し、１０ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦｂｅｔａ１、６．２５ｕｇ／ｍｌトランスフェリンおよび６．２５ｕｇ／ｍｌインスリンで２週間培養した。軟骨細胞に分化するそれらの可能性を図１Ｅに示す。神経分化のために、ＭＳＣを、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を補充したＮ２／Ｂ２７を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２  １：１中で、１４日間およびＦＧＦなしで７日間培養した。これは、神経マーカー（図１Ｆ）によって示すように、神経細胞への分化をもたらした（Ｄｅｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１３，１７０１−１７１０（２００４））。
【００７３】
内耳前駆細胞の初期発生において重要な耳胞増殖因子が、ＭＳＣへの効果と同様の効果を有し得るかどうかを判定するために、３〜５代継代後にＭＳＣから血清を除去し、ＩＧＦ−１、ＥＧＦおよびｂＦＧＦを含有する無血清培地中で細胞を培養した。
【００７４】
前駆細胞の誘発のために、３〜５代継代ＭＳＣをトリプシン処理し、５×１０４細胞／ｍｌでポリ−Ｌ−オルニチンおよびゼラチンまたはフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ）で被覆した６−ウェルプレートまたは４ウェルプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に移動した。細胞を５〜７日間培養し、次いで、Ｎ２／Ｂ２７  補充剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２  １：１で構成される無血清培地中で培養した。前駆細胞誘発のために、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）の組み合わせを２週間、続いて、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）に加えて他の増殖因子の添加をさらに２週間、またはＮＴ３（３０ｎｇ／ｍｌ）およびｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）の組み合わせを４〜５日間、続いてＮＴ３（３０ｎｇ／ｍｌ）およびＢＤＮＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を７日間使用した。
【００７５】
半定量的ＲＴ−ＰＣＲを以下の通りに行った。総ＲＮＡは、製造業者の使用説明書に従って、ＲＮＡｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて抽出した。逆転写のために、６μｇの総ＲＮＡをＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびオリゴ−ｄＴプライマーとともに使用した。ＰＣＲサイクリング条件は、パイロット実験において最適化した。特定のサイクリングパラメータは、初回変性ステップを９４℃で２分間、変性を９４℃で３０秒、５６〜６０℃間で最適化されたアニーリング温度で３０秒、７２℃６０秒間の伸長、７２℃６０秒間の伸長、および続いて、最後のサイクル後に７２℃で末端伸長を７分間であった。サイクル数は、３０から３５で最適化し、条件は、各プライマーに対して一定を保った。これらの提示されるデータは、少なくとも５回繰り返された実験からのものである。逆転写酵素を有さない対照ＰＣＲは、特異的なバンドを産生しなかった。プライマー対およびｃＤＮＡ産物の長さは以下の通りであった。
【００７６】
【表２】
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【００７７】
結果として生じた培養物における神経前駆細胞マーカーの発現を評価した際、Ｏｔｘ２、ネスチン、Ｓｏｘ２、およびＭｕｓａｓｈｉは、ＲＴ−ＰＣＲ（図２Ａ）に基づくＭＳＣと比べて、本明細書においてその後前駆細胞と称されるこれらの細胞において増加量で発現された。Ｐａｘ６は、前駆細胞内で発見されたが、ＭＳＣ内では発見されなかった（図２Ａ）。Ｐａｘ２は発現されなかった。低レベルのＰａｘ５が検出されたが、Ｐａｘ８は発現されなかった（データは図示せず）。同様のパターンの発現は、前駆細胞内で発現された幹細胞マーカーＯｃｔ４に対して見られが、興味深いことに、幹細胞の多能性を維持する役割を考慮すると、ＭＳＣ内では発見されなかった。ＭＳＣ（図２Ａ）と比較した前駆細胞内のネスチンの発現の増加は、免疫組織化学（図２Ｂおよび図２Ｃならびに表１）で確認され、有意（ｐ＜０．００１）であった。有毛細胞および神経系列（Ａｔｏｈ１、Ｂｒｎ３ｃ、ＧＡＴＡ３）の付加的なマーカーならびに神経マーカー（ＴｒｋＢおよびＴｒｋＣ）もまた前駆体内で発現された（図２Ａ）。
【００７８】
前駆細胞集団におけるＴｒｋＢおよびＴｒｋＣの発現のために、これらの受容体に結合するニューロトロフィンであるＮＴ−３およＢＤＮＦとのインキュベーションが、前駆細胞の産出を増加させるか、または有毛細胞への遺伝子の発現もしくは神経運命を変化させるどうかを試験した。これらの条件下において、Ｏｔｘ２、Ｓｏｘ２、ネスチン、およびＭｕｓａｓｈｉの発現の増加ならびにＯｃｔ４発現の増加を見出し（図３Ａ）、これは、細胞が、神経前駆細胞運命を採用し得ることが示唆される。ニューロトロフィン媒介の前駆細胞への転換は、ＥＧＦ、ＩＧＦ−１およびｂＦＧＦ単独に対して発見したものより早急な時間的経過を有した。前神経転写因子であるＮｅｕｒｏＤおよびＮｇｎ１、ならびに神経および有毛細胞系列マーカーＧＡＴＡ３、Ａｔｏｈ１、およびＢｒｎ３ｃの発現もまた増加し、内耳内の有毛細胞運命にわたる神経を選択する（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２８，４１７−４２６（２００１）；Ｍａｔｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ  Ｄｙｎ．２３４（３）：６３３−５０（２００５））Ｎｇｎ１およびＮｅｕｒｏＤの発現は、ＮＴ−３およびＢＤＮＦが分化培地に含まれた時により高かった。発生時に耳前駆物質内に発現される他の転写因子Ｚｉｃ２およびＰａｘ６は、ＭＳＣと比べて前駆細胞において上昇し、Ｚｉｃ１発現は観察されなかった。これにより、ＮＴ−３およびＢＤＮＦが、神経細胞および有毛細胞の両方になるように潜在的に運命付けられた神経系列の細胞の形成を誘発したことが示唆される。しかしながら、これらの細胞に対するマーカーが発見されなかった（図３Ａ、有毛細胞マーカーミオシンＶＩＩａおよびエスピン）ために、細胞は、有毛細胞または神経細胞に転換しなかった。また、有毛細胞に対する前駆体が、これらの細胞を含むか、または生じさせることができ、前駆体が、Ｓ１００Ａ、ｐ７５ｔｒｋ、クローディン１４、コネキシン２６、およびＮｏｔｃｈ１を発現させたことが分かったため、支持細胞等の内の他の上皮細胞の特徴を示す遺伝子の発現に関しても検査した。
【００７９】
増殖因子誘発後のＭＳＣ由来の前駆細胞からの支持細胞マーカーの観察は、生体内発生時に、共通前駆体からのそれらの起源と相関し得る（Ｍａｔｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ  Ｄｙｎ．２３４（３）：６３３−５０（２００５）；Ｓａｔｏｈ  ａｎｄ  Ｆｅｋｅｔｅ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３２，１６８７−１６９７（２００５））。有毛細胞は、Ａｔｏｈ１遺伝子の導入後に支持細胞から発生するように誘発することができるので（Ｉｚｕｍｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １１，２７１−２７６（２００５）；Ｚｈｅｎｇ  ａｎｄ  Ｇａｏ，Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ３，５８０−５８６（２０００））、分化転換を介した有毛細胞に対する潜在的な前駆体としての支持細胞の役割が検討されている（Ｉｚｕｍｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １１，２７１−２７６（２００５））。支持細胞遺伝子の発現は、有毛細胞となる途中の中間体または付随する段階を反映している可能性があり、Ａｔｏｈ１ノックアウトマウスにおいて、支持細胞のマーカーを有する未分化細胞は、Ａｔｏｈ１遺伝子を活性化させることが観察されている（Ｆｒｉｔｚｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ  Ｄｙｎ  ２３３，５７０−５８３（２００５）；Ｗｏｏｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ７，１３１０−１３１８（２００４））。代替として、支持細胞は、発生中の有毛細胞によって誘発される可能性があり、より大きな上皮隆線内の異所性有毛細胞は、細胞周囲の支持細胞マーカーを誘発した（Ｗｏｏｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ７，１３１０−１３１８（２００４））。ＭＳＣは、ｂＦＧＦ、ＥＧＦおよびＩＧＦ−１によって有毛細胞前駆体となるように誘発される可能性があり、ｂＦＧＦ、ＥＧＦおよびＩＧＦ−１は、これらの前駆体の生体内形成を潜在的に刺激する因子であり（Ｌｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３６，３４９４−３５０３（１９９５）、Ｐａｕｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ  Ｄｙｎ  ２２７，２０３−２１５（２００３）、Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １７，２１６−２２６（１９９７））、これらの前駆体は、Ａｔｏｈ１の過剰発現後に有毛細胞を生じさせることができた。神経前駆体マーカーの発現の増加は、これらのマーカーを発現する細胞の増殖によって、または神経前駆体表現型へのＭＳＣの分化によってもたらされる可能性がある。
【００８０】
本明細書に記載されているように、ＭＳＣ由来の前駆細胞は、ニューロトロフィン受容体を発現した。ＢＤＮＦおよびＮＴ−３は、内耳神経細胞の成熟（Ｆｒｉｔｚｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １７，６２１３−６２２５  （１９９７）；Ｐｉｒｖｏｌａ  ａｎｄ  Ｙｌｉｋｏｓｋｉ，Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ５７，２０７−２２３（２００３））、および神経細胞への神経幹細胞の分化（Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ  ７１，６４８−６５８（２００３））において重要な役割を担い、したがって、前駆体の運命が、ニューロトロフィンによって調節され得るかどうかを試験した。これらの因子のインキュベーションが、その後のＡｔｏｈ１過剰発現（Ｉｚｕｍｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １１，２７１−２７６（２００５）、Ｚｈｅｎｇ  ａｎｄ  Ｇａｏ，Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ３，５８０−５８６（２０００））またはニワトリ耳胞細胞との同時培養によって、有毛細胞に転換され得る前駆体の濃縮をもたらした。ＮＴ−３およびＢＤＮＦが、神経幹細胞においてＡｔｏｈ１発現および分化の両方を増加させることが分かったため（Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ  ７１，６４８−６５８（２００３））、ニューロトロフィンは、ＭＳＣの分化を直接的に増加させる可能性があるか、または過剰発現されたＡｔｏｈ１に応答するように、それらの応答能を増加させる可能性がある。
【００８１】
ＭＳＣから取得した前駆細胞の分析は、内耳感覚上皮の自然発生との類似点を明らかにした。ＭＳＣ由来の前駆体は、発生中の耳胞において、その後の有毛細胞分化のために存在していなければならないＳｏｘ２を発現した（Ｋｉｅｒｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４３４，１０３１−１０３５（２００５））。ミオシンＶＩＩａを有さなかった細胞内のＡｔｏｈ１の発現および後の時点でのミオシンＶＩＩａの出現は、免疫組織化学に基づいた発生時のそれらの発現順序と一致する（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２９，２４９５−２５０５（２００２））。ペアードボックス転写因子が、耳胞内に遍在性に発現されたため、Ｐａｘ２発現の欠乏は驚くべきことであった（Ｂｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２７２，１６１−１７５（２００４）；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  ６０，６１−７０（２００４））。これは、有毛細胞へのＭＳＣの転換のために、Ｐａｘ２が必要とされないこと、または別の因子で置換することができることを示唆し得る。Ｐａｘ５が検出され、これは、それらの機能等価に基づいてＰａｘ２の代わりをし得る（Ｂｏｕｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．１２７（５）：１０１７−２８（２０００））。これは、Ｐａｘ２ヌルマウスの分析と一致しており（Ｂｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２７２，１６１−１７５（２００４））、蝸牛の正常形態の重度の破損にかかわらず、有毛細胞を発生させるように考えられる。また、Ｚｉｃ２に対するＺｉｃ１発現の欠乏は、耳胞内の感覚神経細胞と比較すると、有毛細胞表現型の発生時に発見されており（Ｗａｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ  Ｄｙｎ  ２２６，７０２−７１２（２００３））、したがって、有毛細胞表現型の発生と一致する。条件培地中に存在しないニワトリ耳胞細胞上の誘導的分子の同定は、有毛細胞分化に関するさらなる洞察を提供する。
【００８２】
内耳内で観察される、起源の組織を生じさせることができる前駆細胞の単離は（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  １０，３０９−３１５（２００４）；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９，１２９３−１２９９（２００３ａ））、予測可能な場合があるが、しかし、恐らく、誕生後に内耳幹細胞の数が減少するために、細胞は障害後に再生しない（Ｏｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｓｓｏｃ  Ｒｅｓ  Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ．８（１）：１８−３１（２００７））。したがって、これらの感覚細胞の置換を提供するための細胞源が非常に望ましい。骨髄が、殆ど前駆体を有さずに、器官内の新しい細胞の源としての機能を果たし得るとはいえ、再生におけるＭＳＣの生体外の役割は、概して不透明なままである。骨髄からの細胞が、成体の脳および心臓に移動し（Ｍｅｚｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １００，１３６４−１３６９（２００３）；Ｗｅｉｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １００，２０８８−２０９３（２００３））、脳内で神経細胞に分化するという実証にもかかわらず、骨髄からの造血幹細胞は、注入後に心筋細胞に転換されず（Ｍｕｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４２８，６６４−６６８（２００４））、および神経細胞への転換は、極めてまれであった（Ｗａｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２９７，２２５６−２２５９（２００２）；Ｗｅｉｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １００，２０８８−２０９３（２００３））。成体幹細胞による他の組織からの再生への試みで最も成功したものは、破壊後に得られており、Ｄｏｙｏｎｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０１，１３５０７−１３５１２（２００４）；Ｅｄｇｅ，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ  ３２，１１６９−１１７１（２０００）；Ｈｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２１，７６３−７７０（２００３）；Ｐａｇａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ４１，８７９−８８８（２００３））および組織障害は、骨髄由来の細胞による細胞置換を目視するために必要であり得る。骨髄由来の細胞が、生体内の障害に自発的に応じて、感覚または末梢神経系において任意の再生役割を担うかどうかは未解決の問題であるが、しかし、生体内の骨髄細胞による有毛細胞の低レベルの置換が除外できないとはいえ、感覚細胞の自発的置換は、成体蝸牛および前庭系に見られる有毛細胞再生の欠乏を考慮すると、可能性があるとは考えられない（Ｈａｗｋｉｎｓ  ａｎｄ  Ｌｏｖｅｔｔ，Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  １３（Ｓｐｅｃ  Ｎｏ  ２）：Ｒ２８９−２９６（２００４）；Ｗｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４４１，９８４−９８７（２００６））。
【実施例２】
【００８３】
実施例２：Ａｔｏｈ１発現プラスミドでの形質移入が、前駆体を有毛細胞に転換させる
前駆細胞が内耳前駆体細胞として機能し得るかどうかを試験するため、コンピテント前駆体を有毛細胞運命（Ｉｚｕｍｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １１，２７１−２７６（２００５）；Ｚｈｅｎｇ  ａｎｄ  Ｇａｏ，Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ３，５８０−５８６（２０００））へと進ませることが知られる転写因子Ａｔｏｈ１の過剰発現が、有毛細胞マーカーの発現を増加させるかどうかを評価した。
Ａｔｏｈ１形質移入の効率は、Ａｔｏｈ１に加えてＧＦＰ発現をコード化するベクターを形質移入した後、緑色蛍光細胞を計数することによって試験した。ＣＭＶプロモーターの下でＧＦＰ−Ｚｅｏｃｉｎ融合配列を有するｐＴｒａｃｅｒ−ＥＦベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内のＥＦ１αプロモーター制御下で配列をコード化するＡｔｏｈ１を含有するベクターを構成した。遺伝子形質移入は、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）形質移入試薬（Ｓｉｇｍａ）を使用し、前駆細胞状態で、またはＭＳＣとして行った。細胞は、Ｚｅｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養して、安定な形質移入体を取得した。形質移入されたＭＳＣは、増殖因子を併用した無血清条件において培養した。
【００８４】
ＭＳＣが形質移入された後、２％もの細胞が２４時間でＧＦＰ陽性であった（図４Ａ）。１４日目のＲＴ−ＰＣＲは、形質移入された細胞集団が、ｐ２７Ｋｉｐ、Ｂｒｎ３ｃおよびｊａｇｇｅｄ２、ならびに成熟有毛細胞マーカーであるミオシンＶＩＩａおよびエスピン等の発生中の感覚上皮のマーカーを発現し（図４Ｂ）、Ｎｇｎ１およびＮｅｕｒｏＤの発現を増加させたことを示した。また、支持細胞マーカー、Ｓ１００Ａ、ｐ７５Ｔｒｋ、クローディン１４、コネキシン２６、およびＮｏｔｃｈ１の発現も検出し、これは前駆細胞が有毛細胞および支持細胞を生じさせ得ることを示唆する（図４Ｃ）。安定したＡｔｏｈ１発現を伴うＭＳＣ形質移入体の選択は、ＧＦＰ陽性の割合を増加させた（図４Ｄ）。上記の増殖因子におけるこれらの細胞のインキュベーションと、それに続く免疫組織化学は、Ａｔｏｈ１およびミオシンＶＩＩａの発現が、総細胞のそれぞれ７．７％および７．１％の細胞を産出した（図４Ｅ）。増殖因子刺激下での分化は、核内にＢｒｎ３および細胞質内にミオシンＶＩＩａを有する細胞を生じさせた。これらの細胞は、同じ細胞内において、両方のマーカーに陽性であり、９２％のＡｔｏｈ１陽性細胞はミオシンＶＩＩａに対する染色を示し、および７７％のＢｒｎ３ｃ陽性細胞はミオシンＶＩＩａに対する染色を示した。Ｆアクチンに対するミオシンＶＩＩａ陽性細胞の検査（図４ＧおよびＨ）は、一部の細胞（４．９％のミオシンＶＩＩａ陽性細胞）が、それらの頂極で突出を発生したことを示した。これらの突出は、不動毛束の極性化した出現を有し、エスピンに陽性であった（図４Ｇ）。
【００８５】
Ａｔｏｈ１発現は、ヘリックスループヘリックス転写因子であるＮｇｎ１およびＮｅｕｒｏＤの強発現を導いた。以前の幾つかの研究は、Ａｔｏｈ１発現が、これらの転写因子を増加させることができることを示している。マウス小脳において、Ａｔｏｈ１発現は、ＮｅｕｒｏＤの過剰発現を導く（Ｈｅｌｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １７，６７１−６８２（２００１））。ゼブラフィッシュにおいて、ＮｅｕｒｏＤは、Ａｔｏｈ１の非存在下で発現されず（Ｓａｒｒａｚｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２９５，５３４−５４５（２００６））、有毛細胞形成が必要である。関連するマウスａｃｈａｅｔｅ−ｓｃｕｔｅ（Ｍａｓｈ１）はＮｇｎ１を上方制御する（Ｃａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２４，１６１１−１６２１（１９９７））。しかしながら、Ｎｇｎ１は、ニワトリ神経管においてＡｔｏｈ１の過剰発現によって下方制御された（Ｇｏｗａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  ３１，２１９−２３２（２００１））。
これらのデータは、増殖因子によって誘発された前駆細胞におけるＡｔｏｈ１の過剰発現が、有毛細胞への一定の割合のそれらの細胞の分化を誘発することを示す。
【実施例３】
【００８６】
実施例３：前駆体の有毛細胞への転換は、発生中の耳胞細胞によって刺激される
発生中の耳胞が、有毛細胞へのＭＳＣの分化を増加させる因子を産生したかどうかを試験するために、ＭＳＣとのＥ３ニワトリ耳胞細胞の同時培養実験を行った。
白色レグホン系統（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）の胚は、受精卵を、３８℃で維持した加湿した恒温器の固定プラットフォームに置いた後７２時間で採取した。抽出した胚からの耳胞の解離は、内耳周囲の間葉組織を除去した後、ｐＨ７．２の冷却ＰＢＳ中で行った。耳胞は、トリプシン処理し、プレーティングするために単一細胞に解離し、２×１０４細胞を、１０％ＦＢＳ中４つのウェルプレートで一晩培養した。プレーティングの１日後、耳胞細胞を４％パラホルムアルデヒドで２０分間固定するか、またはマイトマイシンＣ（１０μｇ／ｍｌ）で３時間不活性化し、次いで、ＰＢＳで４回洗浄した。培養した細胞からの馴化培地を収集し、前駆体細胞に使用する前に凍結した。無血清培地中で増殖因子によって誘発された前駆細胞（５×１０４細胞／ｍｌ）で、ニワトリ耳胞細胞を覆い、ＥＧＦ／ＩＧＦで５〜７日間、続いてＥＧＦ／ＩＧＦ／ＦＧＦで１０日間培養して、さらに５〜１０日間増殖因子を取り除いた。細胞は、本明細書に記載されるように、ＲＴ−ＰＣＲまたは免疫組織化学で分析した。
ニワトリ耳胞細胞の存在下で２１日間培養した後、ＲＴ−ＰＣＲによるミオシンＶＩＩａ、ｊａｇｇｅｄ２、ｐ２７Ｋｉｐ、Ｂｒｎ３ｃおよびＡｔｏｈ１の発現の増加が発見された（図５Ａ）。細胞の固定は、１４日間の曝露後に、分化を促進する能力を減少させず、一方で、条件培地が１４日の間に効果がなくなったために、因子は、分泌された分子ではないようであった（図５Ａ）。幹細胞の有毛細胞への転換の後に、Ａｔｏｈ１エンハンサー要素が活性化された時に、増強したＧＦＰの核バージョンを発現するトランスジェニックＡｔｏｈ１−ｎＧＦＰマウスに由来するＭＳＣを使用した、培養物における緑色蛍光の出現が起こり得る（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２９，２４９５−２５０５（２００２）；Ｌｕｍｐｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒ  Ｐａｔｔｅｒｎｓ  ３，３８９−３９５（２００３））。これらの緑色細胞は、ニワトリ耳胞細胞との同時培養で観察され（図５Ｂ）、細胞は、ミオシンＶＩＩａに対する抗体で同時標識した。
【００８７】
Ｅ３ニワトリ胚からの耳胞を、前駆細胞の注入に使用した。解離した耳胞を、ゼラチン被覆の組織培養ディッシュ上で、Ｎ２およびＢ２７を含有する７ｍｌの無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２１：１に移した。無傷耳胞の付着後、ＭＳＣ（５×１０７細胞／ｍｌ）からの前駆細胞を、２μｌの培地においてマイクロピペットで耳胞に注入した。左耳小胞は、細胞移植片を受け取らず、対照として機能を果たした。耳胞は、１０〜１４日後に採取し、パラホルムアルデヒド（ＰＢＳ中４％）中で３０分間固定し、ショ糖（ＰＢＳ中３０％）中で一晩凍結保護し、ＴｉｓｓｕｅＴｅｋ（ＥＭＳ）に包埋して、クリオスタット（ＣＭ３０５０，Ｌｅｉｃａ，Ｎｕｓｓｌｏｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で連続的に区分化した。
【００８８】
前駆細胞が、Ｅ３で取得したニワトリ耳胞に注入された時に、有毛細胞特性（５％のミオシンＶＩＩａ−陽性細胞は、ｎＧＦＰに陽性であった）を有する細胞への前駆体の転換が観察された（図６Ａ）。マウスの有毛細胞は、ＧＦＰの発現によって検出されるように、発生中のニワトリ耳胞の上皮を有する有毛細胞に取り込まれると見なされた（図６Ｂ）。同時培養中のＭＳＣ由来の細胞による有毛細胞遺伝子の発現に関する１つの可能な説明は、ニワトリ細胞との融合である。これを排除するために、ニワトリ有毛細胞抗原に対する抗体を有する細胞を標識した（Ｂａｒｔｏｌａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｏｍｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  ３１４，７７７−７８８（１９９１））。天然ニワトリ有毛細胞は、耳胞の内部空洞を裏打ちすることを検出することができ（ミオシンＶＩＩａに対して染色した１５の耳胞注入による、５１％の１，３５２細胞が、ニワトリ有毛細胞抗原に陽性であった）、ｎＧＦＰおよび有毛細胞マーカーを発現した細胞は、ニワトリ有毛細胞抗原を同時発現せず（図６Ｃ）、したがって、マウス起源であったが、細胞融合の産物ではなかった。
【００８９】
発生中の耳胞細胞とのＭＳＣの接触が、有毛細胞へのそれらの分化を誘発するシグナルを、どうように提供したかを理解しようとするために行われたこれらの実験は、誘導的効果が、分泌因子ではなく、細胞表面分子を介したことを示した。生体外の発生中の耳胞へのＭＳＣの注入は、幹細胞から分化した有毛細胞が、ニワトリ耳胞上皮に統合されたことを示唆し、発生中のニワトリ耳胞細胞によって提供された環境が、分化および適切な前駆細胞の統合を誘導し得ることを示した。また、有益な影響が、内耳由来の幹細胞およびマウスのＥＳ細胞由来の前駆細胞でも以前に見られている（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  １０，３０９−３１５（２００４）、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９，１２９３−１２９９（２００３）、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １００，１３４９５−１３５００（２００３）。
【００９０】
耳胞細胞との同時インキュベーションの効果は、Ａｔｏｈ１発現を単純に活性化することであり得、およびＭＳＣが低レベルのＡｔｏｈ１は有するが、検出可能な感覚上皮細胞マーカーを有さなかったので、十分な量のＡｔｏｈ１が、有毛細胞分化を可能にするために必要であり得る。このタイプの高レベルの発現が、Ａｔｏｈ１タンパク質と相互作用する既存の内因性阻害剤のレベルを克服するために、Ａｔｏｈ１のために必要であり得る。マウスの細胞は、ｎＧＦＰのそれらの発現によって、および種特異的な抗体を用いたニワトリ有毛細胞の免疫標識によって同時に分化したニワトリ有毛細胞と明確に区別され得る。その細胞は、決して共染色されず（１，３５２の細胞の検査に基づく）、マウス有毛細胞が幹細胞から分化し、細胞融合から生じなかったことが示唆される。
【実施例４】
【００９１】
実施例４：Ｎｏｔｃｈシグナルの阻害は、有毛細胞の分化を誘発する
Ｎｏｔｃｈ経路は、支持細胞からの有毛細胞の分化を抑止することによって、生体内の有毛細胞および支持細胞の交互のパターンを維持し、胚におけるＮｏｔｃｈの活性化は、前駆体からの有毛細胞の発生を遮断するように思われる。
有毛細胞の分化へのＮｏｔｃｈ経路の効果を検討するため、ＮＴ３／ＢＤＮＦ処置の前駆体を、γセクレターゼ阻害剤とともにインキュベートした。ＮＴ３、ＢＤＮＦ、ＦＧＦとのインキュベーションによって生成され、その後γセクレターゼ阻害剤で処理された前駆体における遺伝子発現の分析は、ノッチシグナルの損失が、Ａｔｏｈ１発現を増加させたことを示した。Ａｔｏｈ１レベルは、阻害剤を１μＭで使用した時に、ＲＴ−ＰＣＲに基づく増殖因子単独での処理と比べて上昇した（図７）。阻害剤添加のタイミングは、後の段階（生体外分化の３日後）での阻害で非常に重要であり、０日目に開始し、１０日間継続する阻害ほど、有毛細胞マーカーを誘発しない。低濃度で、γセクレターゼ阻害剤は、ｎｇｎ１およびＮｅｕｒｏＤを活性化し、Ａｔｏｈ１または有毛細胞マーカーを増加させない。γセクレターゼ阻害剤は、高濃度で、Ａｔｏｈ１およびＢｒｎ３ｃ発現を増加させる。増加したＡｔｏｈ１は、細胞が、ミオシン７ａ、ｐ２７Ｋｉｐ等の有毛細胞に対するマーカーを発現させるにつれて、有毛細胞を産生できるように見えた。ＨＬＨ転写因子が、Ｎｏｔｃｈ経路の効果を媒介するため、この結果は、Ｎｏｔｃｈの役割と一致し、通常の条件下で有毛細胞分化を予防する機構を示唆する。
【実施例５】
【００９２】
実施例５：ヒト幹細胞における有毛細胞分化の阻害
ヒト間葉系幹細胞（ｈｕｍａｎ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ：ｈＭＳＣ）が、有毛細胞または感覚神経細胞を含む内耳細胞型に分化することができるかどうかを判定するため、健常成人からのヒト骨髄細胞を評価した。
ヒト骨髄細胞を採取し、１６時間組織培養プラスチック上にプレートして培養し、非接着造血幹細胞を吸引した。
【００９３】
まず、接着細胞は、９％ウマ血清および９％ウシ胎仔血清を含有するαＭＥＭ中で培養し、造血細胞マーカー、ＣＤ３４およびＣＤ４５に陰性であった。これらの細胞は、ＴＧＦβ、トランスフェリンおよびインスリンの存在下での培養後に、ＩＩ型およびＩＶ型コラーゲンを発現する軟骨細胞を生じさせた。
【００９４】
１０日間ＮＴ−３、ＢＤＮＦ、ソニックヘッジホッグおよびレチノイン酸の存在下で、Ｎ２およびＢ２７を含有し、血清の無いＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中のｈＭＳＣの培養は、Ｍｕｓａｓｈｉ、ネスチン、Ｐａｘ６、Ｂｒｎ３ａ、ＮｅｕｒｏＤ、Ｎｇｎ１、およびＧＡＴＡ３、ならびに感覚神経マーカー、ペリフェリンおよびＴｒｋＣ等のＲＴ−ＰＣＲによって検出される感覚神経前駆体マーカーを発現した細胞を生じさせた。これらの分化したｈＭＳＣは、β−ＩＩＩチューブリンに陽性であり（総細胞の２．１％は、免疫組織化学に基づいて陽性であった）、これらの細胞のうち、２８％がペリフェリンに対して共染色され、３１％がＢｒｎ３ａに対して共染色された。
【００９５】
有毛細胞への分化のために、ｈＭＳＣは、真核生物細胞に対する選択可能なマーカーを用いて、発現ベクターにおいてヒトＡｔｏｈ１を形質移入された。選択された前駆細胞は、ＲＴ−ＰＣＲに基づき、Ａｔｏｈ１を発現し、ならびに１０日間のＮＴ−３およびＢＤＮＦでのＮ２およびＢ２７を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中の分化後、有毛細胞マーカー、Ａｔｏｈ１、ミオシンＶＩＩａ、ｐ２７Ｋｉｐ、Ｊａｇ２およびエスピンを発現した。
【００９６】
コルチ器官内に生着するこれらの細胞の能力、Ａｔｏｈ１を形質移入された細胞は、マウスからの生体外のコルチ器官とともに同時培養した。これは、免疫染色によって検出されたミオシンＶＩＩａおよびエスピンを発現する細胞、つまり、分化した有毛細胞を生じさせた。生体外のマウスコルチ器官が毒素で処理されて、有毛細胞変性を誘発した時に、同時培養された骨髄由来の細胞は、マウス感覚上皮内に生着することが観察され、したがって、取得した細胞の能力が示される。
【００９７】
したがって、ヒトＭＳＣは、有毛細胞または感覚神経細胞を含む内耳細胞型に分化することができ、内耳の構造に上手く移植することができるため、難聴の細胞ベースの治療への潜在的な代替物である。
【実施例６】
【００９８】
実施例６：Ｍａｔｈ１−エストロゲン受容体（ＥＲ）融合コンストラクト
Ｍａｔｈ１の恒常的発現の１つの代替案は、細胞培地または蝸牛環境に添加される誘導因子を用いてＭａｔｈ１を上方制御するために、遺伝子発現の条件的または誘導系を使用することである。誘導モデルは、遺伝子発現の一時的効果を検討する時に、特に有用である。
【００９９】
この実施例は、合成エストロゲンアゴニストであるタモキシフェンの投与が、Ｍａｔｈ１の発現を誘発する系に関して記述する。Ｍａｔｈ１−エストロゲン受容体（ＥＲ）融合タンパク質（そこでは、ＥＲが、エストロゲンではなくタモキシフェンに選択可能に結合するように変異されている）が恒常的に発現される。タモキシフェンの非存在下において、Ｍａｔｈ１−ＥＲコンストラクトは、サイトゾル内で静止状態のままであり、熱ショックタンパク質によって不活性化されている。形質移入した細胞へのタモキシフェンの添加は、核へのＭａｔｈ１−ＥＲコンストラクトの用量依存的な局在性をもたらし、Ｍａｔｈ１の発現増加に繋がるように転写される。Ｍａｔｈ１の配列は上に記載される。
【０１００】
使用したＥＲの配は、以下の通りである（配列番号５９）。
ＡＴＧＴＣＣＡＡＴＴＴＡＣＴＧＡＣＣＧＴＡＣＡＣＣＡＡＡＡＴＴＴＧＣＣＴＧＣＡＴＴＡＣＣＧＧＴＣＧＡＴＧＣＡＡＣＧＡＧＴＧＡＴＧＡＧＧＴＴＣＧＣＡＡＧＡＡＣＣＴＧＡＴＧＧＡＣＡＴＧＴＴＣＡＧＧＧＡＴＣＧＣＣＡＧＧＣＧＴＴＴＴＣＴＧＡＧＣＡＴＡＣＣＴＧＧＡＡＡＡＴＧＣＴＴＣＴＧＴＣＣＧＴＴＴＧＣＣＧＧＴＣＧＴＧＧＧＣＧＧＣＡＴＧＧＴＧＣＡＡＧＴＴＧＡＡＴＡＡＣＣＧＧＡＡＡＴＧＧＴＴＴＣＣＣＧＣＡＧＡＡＣＣＴＧＡＡＧＡＴＧＴＴＣＧＣＧＡＴＴＡＴＣＴＴＣＴＡＴＡＴＣＴＴＣＡＧＧＣＧＣＧＣＧＧＴＣＴＧＧＣＡＧＴＡＡＡＡＡＣＴＡＴＣＣＡＧＣＡＡＣＡＴＴＴＧＧＧＣＣＡＧＣＴＡＡＡＣＡＴＧＣＴＴＣＡＴＣＧＴＣＧＧＴＣＣＧＧＧＣＴＧＣＣＡＣＧＡＣＣＡＡＧＴＧＡＣＡＧＣＡＡＴＧＣＴＧＴＴＴＣＡＣＴＧＧＴＴＡＴＧＣＧＧＣＧＧＡＴＣＣＧＡＡＡＡＧＡＡＡＡＣＧＴＴＧＡＴＧＣＣＧＧＴＧＡＡＣＧＴＧＣＡＡＡＡＣＡＧＧＣＴＣＴＡＧＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＣＡＣＴＧＡＴＴＴＣＧＡＣＣＡＧＧＴＴＣＧＴＴＣＡＣＴＣＡＴＧＧＡＡＡＡＴＡＧＣＧＡＴＣＧＣＴＧＣＣＡＧＧＡＴＡＴＡＣＧＴＡＡＴＣＴＧＧＣＡＴＴＴＣＴＧＧＧＧＡＴＴＧＣＴＴＡＴＡＡＣＡＣＣＣＴＧＴＴＡＣＧＴＡＴＡＧＣＣＧＡＡＡＴＴＧＣＣＡＧＧＡＴＣＡＧＧＧＴＴＡＡＡＧＡＴＡＴＣＴＣＡＣＧＴＡＣＴＧＡＣＧＧＴＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＴＡＡＴＣＣＡＴＡＴＴＧＧＣＡＧＡＡＣＧＡＡＡＡＣＧＣＴＧＧＴＴＡＧＣＡＣＣＧＣＡＧＧＴＧＴＡＧＡＧＡＡＧＧＣＡＣＴＴＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＴＡＡＣＴＡＡＡＣＴＧＧＴＣＧＡＧＣＧＡＴＧＧＡＴＴＴＣＣＧＴＣＴＣＴＧＧＴＧＴＡＧＣＴＧＡＴＧＡＴＣＣＧＡＡＴＡＡＣＴＡＣＣＴＧＴＴＴＴＧＣＣＧＧＧＴＣＡＧＡＡＡＡＡＡＴＧＧＴＧＴＴＧＣＣＧＣＧＣＣＡＴＣＴＧＣＣＡＣＣＡＧＣＣＡＧＣＴＡＴＣＡＡＣＴＣＧＣＧＣＣＣＴＧＧＡＡＧＧＧＡＴＴＴＴＴＧＡＡＧＣＡＡＣＴＣＡＴＣＧＡＴＴＧＡＴＴＴＡＣＧＧＣＧＣＴＡＡＧＧＡＴＧＡＣＴＣＴＧＧＴＣＡＧＡＧＡＴＡＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＴＣＴＧＧＡＣＡＣＡＧＴＧＣＣＣＧＴＧＴＣＧＧＡＧＣＣＧＣＧＣＧＡＧＡＴＡＴＧＧＣＣＣＧＣＧＣＴＧＧＡＧＴＴＴＣＡＡＴＡＣＣＧＧＡＧＡＴＣＡＴＧＣＡＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＴＧＧＡＣＣＡＡＴＧＴＡＡＡＴＡＴＴＧＴＣＡＴＧＡＡＣＴＡＴＡＴＣＣＧＴＡＡＣＣＴＧＧＡＴＡＧＴＧＡＡＡＣＡＧＧＧＧＣＡＡＴＧＧＴＧＣＧＣＣＴＧＣＴＧＧＡＡＧＡＴＧＧＧＧＡＴＣＡＧＧＣＴＧＧＴＧＣＣＡＴＧＧＧＣＧＡＴＣＣＡＣＧＡＡＡＴＧＡＡＡＴＧＧＧＴＧＣＴＴＣＡＧＧＡＧＡＣＡＴＧＡＧＧＧＣＴＧＣＣＡＡＣＣＴＴＴＧＧＣＣＡＡＧＣＣＣＴＣＴＴＧＴＧＡＴＴＡＡＧＣＡＣＡＣＴＡＡＧＡＡＧＡＡＴＡＧＣＣＣＴＧＣＣＴＴＧＴＣＣＴＴＧＡＣＡＧＣＴＧＡＣＣＡＧＡＴＧＧＴＣＡＧＴＧＣＣＴＴＧＴＴＧＧＡＴＧＣＴＧＡＡＣＣＧＣＣＣＡＴＧＡＴＣＴＡＴＴＣＴＧＡＡＴＡＴＧＡＴＣＣＴＴＣＴＡＧＡＣＣＣＴＴＣＡＧＴＧＡＡＧＣＣＴＣＡＡＴＧＡＴＧＧＧＣＴＴＡＴＴＧＡＣＣＡＡＣＣＴＡＧＣＡＧＡＴＡＧＧＧＡＧＣＴＧＧＴＴＣＡＴＡＴＧＡＴＣＡＡＣＴＧＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＧＴＧＣＣＡＧＧＣＴＴＴＧＧＧＧＡＣＴＴＧＡＡＴＣＴＣＣＡＴＧＡＴＣＡＧＧＴＣＣＡＣＣＴＴＣＴＣＧＡＧＴＧＴＧＣＣＴＧＧＣＴＧＧＡＧＡＴＴＣＴＧＡＴＧＡＴＴＧＧＴＣＴＣＧＴＣＴＧＧＣＧＣＴＣＣＡＴＧＧＡＡＣＡＣＣＣＧＧＧＧＡＡＧＣＴＣＣＴＧＴＴＴＧＣＴＣＣＴＡＡＣＴＴＧＣＴＣＣＴＧＧＡＣＡＧＧＡＡＴＣＡＡＧＧＴＡＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＧＧＣＡＴＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＴＴＴＧＡＣＡＴＧＴＴＧＣＴＴＧＣＴＡＣＧＴＣＡＡＧＴＣＧＧＴＴＣＣＧＣＡＴＧＡＴＧＡＡＣＣＴＧＣＡＧＧＧＴＧＡＡＧＡＧＴＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＣＡＡＡＴＣＣＡＴＣＡＴＴＴＴＧＣＴＴＡＡＴＴＣＣＧＧＡＧＴＧＴＡＣＡＣＧＴＴＴＣＴＧＴＣＣＡＧＣＡＣＣＴＴＧＡＡＧＴＣＴＣＴＧＧＡＡＧＡＧＡＡＧＧＡＣＣＡＣＡＴＣＣＡＣＣＧＴＧＴＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＡＴＣＡＣＡＧＡＣＡＣＴＴＴＧＡＴＣＣＡＣＣＴＧＡＴＧＧＣＣＡＡＡＧＣＴＧＧＣＣＴＧＡＣＴＣＴＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＴＣＧＣＣＧＣＣＴＡＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＴＣＴＣＡＴＴＣＴＴＴＣＣＣＡＴＡＴＣＣＧＧＣＡＣＡＴＧＡＧＴＡＡＣＡＡＡＣＧＣＡＴＧＧＡＧＣＡＴＣＴＣＴＡＣＡＡＣＡＴＧＡＡＡＴＧＣＡＡＧＡＡＣＧＴＧＧＴＡＣＣＣＣＴＣＴＡＴＧＡＣＣＴＧＣＴＣＣＴＧＧＡＧＡＴＧＴＴＧＧＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＣＣＴＴＣＡＴＧＣＣＣＣＡＧＣＣＡＧＴＣＧＣＡＴＧＧＧＡＧＴＧＣＣＣＣＣＡＧＡＧＧＡＧＣＣＣＡＧＣＣＡＧＡＣＣＣＡＧＣＴＧＧＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＡＣＴＴＣＡＧＣＡＣＡＴＴＣＣＴＴＡＣＡＡＡＣＣＴＡＣＴＡＣＡＴＡＣＣＣＣＣＧＧＡＡＧＣＡＧＡＧＧＧＣＴＴＣＣＣＣＡＡＣＡＣＧＡＴＣＴＧＡ
【０１０１】
追加の参考文献
Ｋｉｃｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２３，７７４２−７７４９（２００３）．
Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｓｓｏｃ  Ｒｅｓ  Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ  １，１２９−１４３  （２０００）．
Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４２２，８９７−９０１（２００３）．
【０１０２】
別の実施形態
本発明を、その発明を実施するための形態とともに説明したが、前述の説明は、例証であり、本発明の範囲を限定することを意図せず、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義されると理解されたい。他の態様、利点、および変更は、以下の特許請求の範囲内にある。
【図１】
2010509919.tif 000007
【図２】
2010509919.tif 000008
【図３】
2010509919.tif 000009
【図４】
2010509919.tif 000010
【図５】
2010509919.tif 000011
【図６】
2010509919.tif 000012
【図７】
2010509919.tif 000013
【国際調査報告】
2010509919.tif 000014
2010509919.tif 000015