(57)【要約】  本発明は輸送タンパク質の輸送活性を決定するための方法及び前記輸送活性を調節することができる化合物を同定するためのその使用に関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
輸送タンパク質の輸送活性を測定するための方法であって、以下を含むことを特徴とする前記方法：
（ｉ）輸送タンパク質の最Ｃ末端が小胞の外側にあるような方法で少なくとも１つの輸送タンパク質を隠す小胞と、
（ii）輸送タンパク質の最Ｃ末端と直接的又は間接的に結合するのに適したSPAビーズと、
（iii）輸送タンパク質の最Ｃ末端とのSPAビーズの間接的な結合の場合にのみ、輸送タンパク質の最Ｃ末端とのSPAビーズの結合を媒介することができる少なくとも１つの分子と、
（iv）放射活性物質で標識した基質であって、基質の輸送を可能にする条件下で輸送タンパク質によって輸送できる基質とを混合し、
SPAビーズとの小胞の直接的又は間接的な結合を可能にし、かつ、小胞内への基質の輸送を可能にするのに十分長い時間混合物をインキュベートし、及び
ビーズの発光剤によって放射される光を測定する。
【請求項２】
小胞がインサイドアウトの小胞である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
輸送タンパク質がABC輸送タンパク質である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
輸送タンパク質がMRP1 (ABCC1)、MRP2 (ABCC2)、MRP3 (ABCC3)、MRP4 (ABCC4)、MRP5 (ABCC5)、MRP6 (ABCC6)、MRP7 (ABCC10)、MRP8 (ABCC11)、SUR1 (ABCC8)、SUR2 (ABCC9)、CFTR (ABCC7)、ABCA1、ABCA3、ABCA4、ABCG5、ABCG8、MDR1 (ABCB1) 、MDR3 (ABCB4)、BSEP (ABCB11)、BCRP (ABCG2)、TAP1 (ABCB2)及びTAP2 (ABCB3)からなる群より選ばれる、請求項３記載の方法。
【請求項５】
基質がADP、BQ-123、コレステロール、シメチジン、コルヒチン、環状AMP、環状GMP、デヒドロエピアンドロステロンサルファート、ダウノマイシン、ジゴキシン、エストラジオールグルクロニド、エストロン3-スルファート、エトポシド、葉酸、グルコシルセラミド、グリコケノデオキシコラート、グリココラート、ロイコトリエンC4、ロイコトリエンD4、ロイコトリエンE4、メトトレキサート、ミトキサントン、スルホブロモフタレイン、パクリタクセル、血小板活性化因子、プロスタグランジンE1、プロスタグランジンE2、プロスタグランジンF2アルファ、リトナビル、サキナビルトロンボキサンB2、ベラパミール、シトステロール、タウロケノデオキシコラート、タウロコラート、タウロウルソデオキシコラート、プラゾシン、ビンクリスチン及びビンブラスチンからなる群より選ばれる、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
輸送タンパク質及び基質として、以下の組合せの１つを使用する、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
2010501837.tif 000005
【請求項７】
インキュベーション期間が30秒以上30時間以下持続する、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
インキュベーション期間が１時間以上24時間以下持続する、請求項７記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項記載の方法を実施することを特徴とするハイスループット（HTS）形式で輸送タンパク質の輸送活性を測定する方法。
【請求項１０】
96ウエル以上を有するプレートを使用する請求項９記載の方法。
【請求項１１】
384ウエルプレート又は1536ウエルプレートを使用する請求項９記載の方法。
【請求項１２】
反応及び/又は読出しプラットフォームとしてチップを使用する請求項９記載の方法。
【請求項１３】
輸送タンパク質としてMRP4を使用する請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
請求項１記載の方法の（iii）において配列が配列番号１又は配列番号２で表されるペプチドに結合することができる抗体を使用する請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
請求項１記載の方法の（ii）においてプロテインＡでコートされたSPAビーズを使用する請求項１３又は１４記載の方法。
【請求項１６】
請求項１記載の方法の（ii）において請求項１４の抗体に結合することができる別の抗体でコートされたSPAビーズを使用する請求項１３又は１４記載の方法。
【請求項１７】
輸送タンパク質として、ヒスチジン標識がＣ末端で融合されたMRP4を使用する請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
輸送タンパク質として、６個以上のヒスチジン残基からなるヒスチジン標識のMRP4を使用する請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
請求項１記載の方法の（ii）において銅キレートでコートされたSPAビーズを使用する請求項１７又は１８記載の方法。
【請求項２０】
化合物が輸送タンパク質の輸送活性のモジュレーターであるかどうかを決定するための方法であって、以下を含むことを特徴とする前記方法：
（Ａ）（ｉ）輸送タンパク質の最Ｃ末端が小胞の外側にあるような方法で少なくとも１つの輸送タンパク質を隠す小胞と、
（ii）輸送タンパク質の最Ｃ末端と直接的又は間接的に結合するのに適したSPAビーズと、
（iii）輸送タンパク質の最Ｃ末端とのSPAビーズの間接的な結合の場合にのみ、輸送タンパク質の最Ｃ末端とのSPAビーズの結合を媒介することができる少なくとも１つの分子と、
（iv）放射活性物質で標識した基質であって、基質の輸送を可能にする条件下で輸送タンパク質によって輸送できる基質と
（ｖ）試験化合物とを混合し、
（Ｂ）（ｉ）輸送タンパク質の最Ｃ末端が小胞の外側にあるような方法で少なくとも１つの輸送タンパク質を隠す小胞と、
（ii）輸送タンパク質の最Ｃ末端と直接的又は間接的に結合するのに適したSPAビーズと、
（iii）輸送タンパク質の最Ｃ末端とのSPAビーズの間接的な結合の場合にのみ、輸送タンパク質の最Ｃ末端とのSPAビーズの結合を媒介することができる少なくとも１つの分子と、
（iv）放射活性物質で標識した基質であって、基質の輸送を可能にする条件下で輸送タンパク質によって輸送できる基質とを混合し、
SPAビーズとの小胞の直接的又は間接的な結合を可能にし、かつ、小胞内への基質の輸送を可能にするのに十分長い同じ時間混合物（Ａ）及び（Ｂ）をインキュベートし、及び
ビーズの発光剤によって放射される光を測定し、ここで（Ｂ）と比較したときに（Ａ）で得られた値が大きいことは、試験した輸送タンパク質のアクチベーターである化合物と同定され、（Ｂ）と比較したときに（Ａ）で得られた値が小さいことは、試験した輸送タンパク質のインヒビターである化合物と同定される。
【請求項２１】
小胞がインサイドアウトの小胞である、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
輸送タンパク質がABC輸送タンパク質である、請求項２０又は２１記載の方法。
【請求項２３】
輸送タンパク質がMRP1 (ABCC1)、MRP2 (ABCC2)、MRP3 (ABCC3)、MRP4 (ABCC4)、MRP5 (ABCC5)、MRP6 (ABCC6)、MRP7 (ABCC10)、MRP8 (ABCC11)、SUR1 (ABCC8)、SUR2 (ABCC9)、CFTR (ABCC7)、ABCA1、ABCA3、ABCA4、ABCG5、ABCG8、MDR1 (ABCB1) 、MDR3 (ABCB4)、BSEP (ABCB11)、BCRP (ABCG2)、TAP1 (ABCB2)及びTAP2 (ABCB3)からなる群より選ばれる、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
基質がADP、BQ-123、コレステロール、シメチジン、コルヒチン、環状AMP、環状GMP、デヒドロエピアンドロステロンサルファート、ダウノマイシン、ジゴキシン、エストラジオールグルクロニド、エストロン3-スルファート、エトポシド、葉酸、グルコシルセラミド、グリコケノデオキシコラート、グリココラート、ロイコトリエンC4、ロイコトリエンD4、ロイコトリエンE4、メトトレキサート、ミトキサントン、スルホブロモフタレイン、パクリタクセル、血小板活性化因子、プロスタグランジンE1、プロスタグランジンE2、プロスタグランジンF2アルファ、リトナビル、サキナビルトロンボキサンB2、ベラパミール、シトステロール、タウロケノデオキシコラート、タウロコラート、タウロウルソデオキシコラート、プラゾシン、ビンクリスチン及びビンブラスチンからなる群より選ばれる、請求項２０〜２３のいずれか１項記載の方法。
【請求項２５】
輸送タンパク質及び基質として、以下の組合せの１つを使用する、請求項２０〜２３のいずれか１項記載の方法。
2010501837.tif 000006
【請求項２６】
インキュベーション期間が30秒以上30時間以下持続する、請求項２０〜２５のいずれか１項記載の方法。
【請求項２７】
インキュベーション期間が１時間以上24時間以下持続する、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
請求項２０〜２７のいずれか１項記載の方法を実施することを特徴とするハイスループット（HTS）形式で輸送タンパク質の輸送活性を測定する方法。
【請求項２９】
96ウエル以上を有するプレートを使用する請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
384ウエルプレート又は1536ウエルプレートを使用する請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
反応及び/又は読出しプラットフォームとしてチップを使用する請求項２８記載の方法。
【請求項３２】
輸送タンパク質としてMRP4を使用する請求項２０〜３１のいずれか１項記載の方法。
【請求項３３】
請求項２０記載の方法の（iii）において配列が配列番号１又は配列番号２で表されるペプチドに結合することができる抗体を使用する請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
請求項２０記載の方法の（ii）においてプロテインＡでコートされたSPAビーズを使用する請求項３２又は３３記載の方法。
【請求項３５】
請求項２０記載の方法の（ii）において請求項３３の抗体に結合することができる別の抗体でコートされたSPAビーズを使用する請求項３２又は３３記載の方法。
【請求項３６】
輸送タンパク質として、ヒスチジン標識がＣ末端で融合されたMRP4を使用する請求項２０〜３１のいずれか１項記載の方法。
【請求項３７】
輸送タンパク質として、６個以上のヒスチジン残基からなるヒスチジン標識のMRP4を使用する請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
請求項２０記載の方法の（ii）において銅キレートでコートされたSPAビーズを使用する請求項３６又は３７記載の方法。
【請求項３９】
ハイスループットスクリーニング又は超ハイスループットスクリーニングでの請求項１〜３８のいずれか１項記載の方法の使用。
【請求項４０】
輸送タンパク質の輸送活性を決定するためのキットであって、以下を含むキット：
（ａ）輸送タンパク質の最Ｃ末端が小胞の外側にあるような方法で少なくとも１つの輸送タンパク質を隠す小胞、及び
（ｂ）輸送タンパク質の最Ｃ末端と直接的又は間接的に結合するのに適したSPAビーズ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（緒言）
輸送タンパク質は膜タンパク質であり、細胞膜又はオルガネラ膜のような生体膜の選択的透過性を調節する。輸送タンパク質は、膜の反対側に電気化学的勾配を下って溶質が受動運動することを可能にするか（受動トランスポーター）、又はATPの加水分解によって与えられるエネルギーを直接的又は間接的に消費することによって濃度勾配に逆らって溶質が蓄積することを媒介する（能動トランスポーター）。能動トランスポーターの最も大きなファミリーの１つはATP結合カセットトランスポーター（ABCトランスポーター）である（Higgins, 1992;Holland and Holland, 2005）。ヒトにおいて、ABCトランスポーターは多種多様の生理学的及び病態生理学的プロセスにおいて重要な役割を果たす。ABCトランスポーターをコードする遺伝子における変異は嚢胞性線維症（Riordan et al., 1989）、タンジアー病（Bodzioch et al., 1999;Brooks-Wilson et al., 1999;Young and Fielding, 1999）、デュービン・ジョンソン症候群（Kartenbeck et al., 1996;Mayer et al., 1995）、弾性線維性仮性黄色腫（Ringpfeil et al., 2000）及びスタルガルト病（Allikmets, 1997）などの種々の遺伝的疾患を生じる。生理学的機能以外に、ABCトランスポーターは、薬剤の吸収、処分及び排出のプロセスにおいても重要な役割を果たす（Ayrton and Morgan, 2001;Borst and Elferink, 2002）。腫瘍細胞におけるABCトランスポーターの過剰発現は化学療法剤に対する抵抗性の主なメカニズムである（Gottesman et al., 2002）。したがって、薬剤とABCトランスポーターとの間の相互作用の研究は薬剤候補の開発の成功に必須である。
【背景技術】
【０００２】
輸送タンパク質の重要な機能のために、輸送タンパク質の活性を調節できる物質が必要とされている。前記物質を同定するために、例えばある物質が輸送タンパク質の活性を調節できるかどうかを決定するのに十分な感度を有するハイスループット又は超ハイスループットの適合性のあるアッセイが必要とされている。
現在、コスト及び時間がかかる複数の工程を含む方法のみが、輸送タンパク質の輸送活性を決定するために技術的に知られている（ある物質が輸送タンパク質の活性を調節できるかどうかを決定するための基礎となる方法）。
技術的に知られている輸送タンパク質の活性を決定するための前記方法は、例えば輸送タンパク質の輸送活性が以下のようにして測定される急速ろ過方法である：
−組織、培養細胞又は組換え輸送タンパク質を発現する細胞から調製された膜小胞を用意し、
−前記小胞を所定時間放射標識物質とともにその物質の輸送を可能にする条件下でインキュベートし、
−膜小胞を小胞外（extra-vesicular）物質から、例えばニトロセルロース又は繊維ガラス膜によるろ過によって分離し、そして
−例えば、放射能の量が輸送タンパク質の輸送活性と直接相関する分離した小胞の放射能の増加を測定する（Keppler et al., 1998）。
前記方法の時間のかかる分離工程以外に、前記方法の別の欠点はハイスループットスクリーニング（HTS）対策（campaign）、特に超ハイスループットスクリーニング（uHTS）対策に適していないことである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
上記で概略されたように、医薬用原料の開発における物質探索（profiling）のための輸送タンパク質の使用はますます重要となってきている。したがって、HTS対策における使用にも適した輸送タンパク質の輸送活性を決定するための新しい迅速な方法を提供することが強く求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（発明の説明）
輸送タンパク質及び目的（putative）物質を探索するためのその応用並びにそれを用いてそれぞれの輸送タンパク質の活性を決定するための方法の必要性は長年知られていたが、今まで輸送タンパク質の輸送活性を決定するための方法として知られていたのは、それぞれの読出し情報を評価する前に標識された物質を反応混合物から分離しなければならない反応チューブの外側でのろ過工程を含む複数の工程を必要とする手間のかかる方法のみである。
しかしながら、本発明は、HTS及びuHTS対策にも適した輸送タンパク質の輸送活性を決定するための迅速で無駄のない方法を可能にする「インワンチューブ方法」を初めて提供する。
本発明の基礎は、輸送タンパク質の最（very）Ｃ末端、すなわち１〜25個のアミノ酸が、例えばヒスチジン標識で標識でき（Hagmann et al., 1999）及び/又は例えば抗体又は抗体断片でその輸送活性を与えることなく標識できることを発見したことである。それらによって最Ｃ末端は、前記輸送タンパク質の活性を決定するためのアッセイにおけるアンカーとして使用できる。
別の基礎は、例えば1979年（Hart及びGreenwald, 1979 Mol. Immunology. Vol. 16, 265-267）までさかのぼるシンチレーション近接アッセイ（SPA）技術と呼ばれる、よく知られた均一な一般的なアッセイ技術である。SPAを使用すると、放射能が標準シンチレーションカウンターで検出できる光を放出するように誘導された発光剤（scintillant）に近づくことによって放射能を測定できる。放射性原子が崩壊したときに、それは電子のような原子より小さい粒子を放出する。これらの粒子が水を通る距離は限られており、粒子のエネルギーに依存する（SPAはこの制限に基づいている）。例えば、トリチウム[3H]原子が崩壊したときには、それはβ-粒子を放出する。[3H]原子は適した発光剤分子の1.5μmの範囲内である場合には、β-粒子のエネルギーは発光剤に届くのに十分であり、それを励起して光を放射する。発光剤と[3H]原子との距離が1.5μmよりも大きい場合には、β-粒子は必要な距離を移動するのに十分なエネルギーを持っていない。水溶液中で、水分子との衝突はβ-粒子のエネルギーを消費し、したがって発光剤を励起することはできない。
【０００５】
好ましくは、発光剤は、技術的によく知られている小さいフルオミクロスフェア（fluomicrosphere）（ビーズ）に組み込まれる。それらは特定の分子を結合するように構成される（例えば、免疫グロブリンと結合するプロテインＡでコートされる）。放射性分子がビーズに結合されている場合、それは、TopCount（パーキンエルマー）又はLEADSeeker（GE）のような標準シンチレーションカウンターで決定できる光（350〜650nmの波長）を放射する発光剤を励起することができるように十分に極めて接近させられる。
本発明は、輸送タンパク質の最Ｃ末端をSPAビーズに接近させるためのブリッジとして使用する、輸送タンパク質の活性を決定するためのSPAアッセイを初めて提供する。
【０００６】
輸送タンパク質の輸送活性を決定するための本発明の方法は、以下を含むことを特徴とする：
（ｉ）輸送タンパク質の最Ｃ末端が小胞の外側にあるような方法で少なくとも１つの輸送タンパク質を隠す小胞、好ましくはインサイドアウトの小胞と、
（ii）輸送タンパク質の最Ｃ末端と直接的又は間接的に結合するのに適したSPAビーズと、
（iii）輸送タンパク質の最Ｃ末端とのSPAビーズの間接的な結合の場合にのみ、輸送タンパク質の最Ｃ末端とのSPAビーズの結合を媒介することができる少なくとも１つの分子と、
（iv）放射活性物質で標識した基質であって、基質の輸送を可能にする条件下で輸送タンパク質によって輸送できる本発明の基質とを混合し、
SPAビーズとの小胞の直接的又は間接的な結合を可能にし、かつ、小胞内への基質の輸送を可能にするのに十分長い時間混合物をインキュベートし、及び
ビーズの発光剤によって放射される光を測定する。
【０００７】
本発明の別の方法は、化合物が輸送タンパク質の輸送活性のモジュレーターであるかどうかを決定するための方法であって、以下を含むことを特徴とする：
（Ａ）（ｉ）輸送タンパク質の最Ｃ末端が小胞の外側にあるような方法で少なくとも１つの輸送タンパク質を隠す小胞、好ましくはインサイドアウトの小胞と、
（ii）輸送タンパク質の最Ｃ末端と直接的又は間接的に結合するのに適したSPAビーズと、
（iii）輸送タンパク質の最Ｃ末端とのSPAビーズの間接的な結合の場合にのみ、輸送タンパク質の最Ｃ末端とのSPAビーズの結合を媒介することができる少なくとも１つの分子と、
（iv）放射活性物質で標識した基質であって、基質の輸送を可能にする条件下で輸送タンパク質によって輸送できる本発明の基質と、
（ｖ）試験化合物とを混合し、
（Ｂ）（ｉ）輸送タンパク質の最Ｃ末端が小胞の外側にあるような方法で少なくとも１つの輸送タンパク質を隠す小胞、好ましくはインサイドアウトの小胞と、
（ii）輸送タンパク質の最Ｃ末端と直接的又は間接的に結合するのに適したSPAビーズと、
（iii）輸送タンパク質の最Ｃ末端とのSPAビーズの間接的な結合の場合にのみ、輸送タンパク質の最Ｃ末端とのSPAビーズの結合を媒介することができる少なくとも１つの分子と、
（iv）放射活性物質で標識した基質であって、基質の輸送を可能にする条件下で輸送タンパク質によって輸送できる本発明の基質とを混合し、
SPAビーズとの小胞の直接的又は間接的な結合を可能にし、かつ、小胞内への基質の輸送を可能にするのに十分長い同じ時間混合物（Ａ）及び（Ｂ）をインキュベートし、及び
ビーズの発光剤によって放射される光を測定し、ここで（Ｂ）と比較したときに（Ａ）で得られた値が大きいことは、試験した輸送タンパク質のアクチベーターである化合物と同定され、（Ｂ）と比較したときに（Ａ）で得られた値が小さいことは、試験した輸送タンパク質のインヒビターである化合物と同定される。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明のすべての方法はハイスループットスクリーニング（HTS）対策及び超ハイスループットスクリーニング（uHTS）対策において使用できる。前記方法は、96ウエル以上を有するプレートを使用することによって実行でき、より好ましくは384ウエルプレート又は1536ウエルプレートの使用である。さらに好ましくは、反応及び/又は読出しプラットフォームとしてのチップの使用である。
本発明は、また輸送タンパク質の輸送活性を決定するための、及び基質が本発明の輸送タンパク質のモジュレーターであるかどうか（すなわち、アクチベーター又はインヒビター）を決定するためのキットを提供する。
輸送タンパク質の輸送活性を決定するための本発明のキットは、
（ａ）輸送タンパク質の最Ｃ末端が小胞の外側にあるような方法で少なくとも１つの輸送タンパク質を隠す小胞、好ましくはインサイドアウトの小胞、及び
（ｂ）輸送タンパク質の最Ｃ末端と直接的又は間接的に結合するのに適したSPAビーズを含む。
【０００９】
本発明の方法に従って、用語「混合する」は、記載された成分の少なくとも任意の添加として理解されるべきである。しかしながら、本発明との関連で、用語「混合する」は、また前記成分の更なる分布をもたらすことができる任意の運動又は攪拌を含むことができる。
本発明の小胞、好ましくはインサイドアウトの小胞は、脂質二重膜からなる小胞である。インサイドアウトの小胞は、小胞の外側に面しているその旧細胞内の表面及び小胞の内側に面しているその旧細胞外の表面を有する小胞である。前記小胞は、細胞膜の調製の際に自然に形成される。膜小胞の側面（ライトサイドアウト又はインサイドアウト）は技術的によく知られた方法、例えばヌクレオチドピロホスファターゼ（EC3.6.1.9）のようなエクトエンザイムの活性をTriton X-100の存在下又は非存在下で測定することによって決定できる（Keppler et al., 1998;Meier and Boyer, 1990）。
【００１０】
本発明の輸送タンパク質は細胞内小胞、細胞膜又は小胞膜を横切って基質を輸送することができる細胞内の細胞膜における組み換え型発現により生じる又は自然に生じる任意のタンパク質及び別の分子がＣ末端の与えられた部分（例えば、Ｃ末端に融合されているヒスチジン標識）に特異的に結合できる方法でＣ末端で与えられる任意の前記輸送タンパク質である。好ましい輸送タンパク質は、ABC輸送タンパク質である（Holland and Holland, 2005）。より好ましい輸送タンパク質は、技術的によく知られているMRP1、MRP2、MRP3、MRP4、MRP5、MRP6、MRP7、MRP8、SUR1、SUR2、CFTR、ABCA1、ABCA3、ABCA4、ABCG5、ABCG8、MDR1、MDR3、BSEP、BCRP、TAP1及びTAP2からなる群より選ばれる。しかしながら、以下に、その参考文献及び受入番号を記載する。
タンパク質ID/遺伝子記号; 参考文献; 受入番号
MRP1 / ABCC1; (Cole et al., 1992); NP_004987
MRP2 / ABCC2; (Buchler et al., 1996); NP_000383
MRP3 / ABCC3; (Kiuchi et al., 1998); NP_003777
MRP4 / ABCC4; (Lee et al., 1998); NP_005836
MRP5 / ABCC5; (Belinsky et al., 1998); NP_005679
MRP6 / ABCC6; (Kool et al., 1999); NP_001162
CFTR / ABCC7; (Riordan et al., 1989); NP_000483
SUR1 / ABCC8; (Aguilar-Bryan et al., 1995); NP_000343
SUR2 / ABCC9; (Inagaki et al., 1996); NP_005682; NP_064693; NP_064694
MRP7 / ABCC10; (Hopper et al., 2001); NP_258261
MRP8 / ABCC11; (Tammur et al., 2001); NP_115972; NP_149163; NP_660187
MDR1 / ABCB1; (Gros et al., 1986); NP_000918
TAP1 / ABCB2; (Trowsdale et al., 1990); NP_000584
TAP2 / ABCB3; (Trowsdale et al., 1990); NP_000535; NP_061313
MDR3 / ABCB4; (Van der Bliek et al., 1987); NP_000434; NP_061337; NP_061338
BSEP / ABCB11; (Strautnieks et al., 1998); NP_003733
ABCA1; (Luciani et al., 1994); NP_005493
ABCA3; (Klugbauer and Hofmann, 1996); NP_001080
ABCA4; (Allikmets, 1997); NP_000341
BCRP  / ABCG2; (Allikmets et al., 1998); NP_004818
ABCG5; (Berge et al., 2000); NP_071881
ABCG8; (Berge et al., 2000); NP_071882
【００１１】
好ましい輸送タンパク質は本発明の基質を外側から本発明の小胞に輸送することができるタンパク質である。
本発明の輸送タンパク質の最Ｃ末端は本発明の輸送タンパク質の最末端であり、好ましくは本発明の輸送タンパク質の最Ｃ末端の６個以上25個以下のアミノ酸の範囲を含む。前記範囲のアミノ酸からなる前記ペプチドは、前記ペプチドに結合でき、それによって本発明の輸送タンパク質の最Ｃ末端に結合でき、本発明の最Ｃ末端との本発明のSPAビーズの間接的な結合を媒介するために使用できる抗体又は抗体断片を生成するために本発明に従って使用できる。例として、MRP4の15〜25個のアミノ酸の範囲のアミノ酸からなる２つのペプチドは、それぞれ配列番号１及び２で与えられる。
本発明の輸送タンパク質の活性は、本発明の基質の空間的な変化を生じる、好ましくは本発明の基質の本発明の小胞への移動を生じる本発明の輸送タンパク質のすべての活性である。前記活性は、本発明の方法によって決定できる。
【００１２】
本発明のSPAビーズは本発明の輸送タンパク質の最Ｃ末端に直接的又は間接的に結合できるすべてのSPAビーズである。本発明の間接的な結合は、一方で本発明の輸送タンパク質の最Ｃ末端に結合でき、他方でSPAビーズに結合できる抗体（第１抗体）となることができる別の可溶性分子、例えばプロテインＡ（プロテインＡは細菌スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）の多くの菌株の細胞壁から単離されるタンパク質であり、たいていの哺乳類種のIgGに結合するその能力によって特徴付けられる。）又はSPAビーズに結合し、第１抗体に結合できる別の抗体（例えば、それぞれウサギ、ヤギ、ラット又はマウス由来の免疫グロブリンと結合できる抗ウサギ抗体、抗ヤギ抗体、抗ラット抗体又は抗マウス抗体）によって媒介される結合である。そのような場合において、SPAビーズは、好ましくはプロテインＡ又はそれぞれの第２抗体でコートされる。
本発明の直接的な結合は可溶性分子が必要ない結合であり、例えばそのような結合は本発明の輸送タンパク質の、最Ｃ末端又は与えられた最Ｃ末端との結合が可能である方法でコートされたSPAビーズへの結合となることができる（例えば、ヒスチジン標識が融合したＣ末端が銅キレートによってコートされたSPAビーズと直接的に結合する本発明の輸送タンパク質）。
SPAビーズの適した量は技術的に一般に知られた方法によって容易に決定できる。しかしながら、20〜250μg/ウエルの384ウエルプレートが好ましい。
【００１３】
本発明の輸送タンパク質のＣ末端と結合できる抗体は、ポリクローナル血清、例えばウサギ血清の任意の抗体（Ab）、又は本発明の輸送タンパク質のＣ末端と結合できる任意のモノクローナル抗体（mAb）である。本発明の前記抗体は、技術的に知られている方法、すなわち本発明の輸送タンパク質の少なくともＣ末端の投与によってそれぞれの非ヒト動物の免疫処置によって容易に得ることができる。ポリクローナル血清の前記Ab又はmAbが本発明の方法で使用できるか否かは、mAb又はポリクローナル血清のAbが本発明の輸送タンパク質の最Ｃ末端の15〜25個のアミノ酸の範囲と結合できる（好ましくは、選択的に結合できる）か否かを決定することを可能にする技術的によく知られた方法によって容易に試験することができる。本発明によれば、当然のことながら、本発明の適したAb又はmAbは、（ｉ）小胞の膜に組み込まれる場合に小胞の外側に位置し、（ii）本発明の輸送タンパク質のＣ末端の前記25個のアミノ酸の上流である異なるアミノ酸の領域には結合しない。
本発明のヒスチジン標識は、ヒスチジン残基、好ましくは少なくとも6個のヒスチジン残基からなるペプチドである。それは、例えば輸送タンパク質の全長cDNAの終止コドンの前にあるヒスチジン残基をコードするDNA配列を挿入することによって本発明の輸送タンパク質の最末端に対して遺伝子操作される。前記標識を達成するための別の方法は技術的によく知られている。
【００１４】
本発明の基質は、本発明の輸送タンパク質によって輸送できる任意の内在性分子又は化合物又はオリゴペプチド又は核酸又はヌクレオチド又は環状ヌクレオチドである。本発明の前記輸送は、通常脂質二重層に組み込まれる輸送タンパク質によって生じる本発明の基質の任意の特別な変化である。
好ましい基質は、ADP、BQ-123、コレステロール、シメチジン、コルヒチン、環状AMP、環状GMP、デヒドロエピアンドロステロンサルファート、ダウノマイシン、ジゴキシン、エストラジオールグルクロニド、エストロン3-スルファート、エトポシド、葉酸、グルコシルセラミド、グリコケノデオキシコラート、グリココラート、ロイコトリエンC4、ロイコトリエンD4、ロイコトリエンE4、メトトレキサート、ミトキサントン、スルホブロモフタレイン、パクリタクセル、血小板活性化因子、プロスタグランジンE1、プロスタグランジンE2、プロスタグランジンF2アルファ、リトナビル、サキナビルトロンボキサンB2、ベラパミール、シトステロール、タウロケノデオキシコラート、タウロコラート、タウロウルソデオキシコラート、プラゾシン、ビンクリスチン及びビンブラスチンからなる群より選ばれる。輸送タンパク質及び基質のより好ましい組合せは以下の通りである。
【００１５】
2010501837.tif 000002
2010501837.tif 000003
【００１６】
本発明の基質は放射活性物質で標識される。適した同位体はH3、S35、P32又は33、J125である（前記リストは適した同位体を開示するのみで、限定されるものと理解されるべきではない）。放射活性物質で標識した基質の適した濃度は、技術的に一般に知られた方法によって容易に決定できる。しかしながら、１〜1000μmの濃度はより適切である。
本発明のインキュベーション時間は30秒以上である。好ましくは、インキュベーション時間は30秒以上続け、30時間を超えない。より好ましいインキュベーション時間は１時間以上続け、24時間を超えない。好ましくは、ルミネッセンスシグナルはインキュベーション時間の終了後すぐに測定され、0.5、１、２、４、６又は最大24時間後に容易に測定できる。本発明の各輸送タンパク質の適したインキュベーション時間は、異なる時点でのルミネッセンスシグナルの測定及びその後の得られたデータの比較により当業者によって容易に同定できる。好ましいインキュベーション時間は、例えば最も短い時間で重要なデータを与えるものである。
本発明の輸送タンパク質のモジュレーターである本発明の試験される化合物は、任意の小分子、ペプチド又は抗体である。
本発明の輸送タンパク質のモジュレーターは、本発明の輸送タンパク質の輸送活性に影響を与える。前記モジュレーターは、本発明の輸送タンパク質のインヒビターであるか、又は本発明の輸送タンパク質のアクチベーターである。前記インヒビターは本発明の輸送タンパク質の輸送活性を低下させるか、阻害する。一方、前記アクチベーターは本発明の輸送タンパク質の輸送活性を増強する。
本発明は、また本発明の方法を用いてインヒビターとして決定された本発明の輸送タンパク質のモジュレーターを開示する（例えば、MRP4/のインヒビターであるMK571又はジピリダモールのような（van Aubel et al., 2002））。
以下の実施例は本発明を説明することを意図され、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。しかしながら、実施例は本発明の最も好ましい実施態様を記載する。
【実施例】
【００１７】
（実施例１）
１）MRP4をコードする全長cDNAを含むバキュロウイルス構成物に感染させた昆虫細胞（Hi5又はSf9）由来の膜小胞をvan Aubel et al.（van Aubel et al., 2002）によって記載されるよう（いくつかの変更を加えて）に調製した：Hi5細胞を、昆虫細胞培養液を含まないInsect-Xpress血清中1×106細胞/mlの細胞密度に懸濁液中で培養し、MRP4をコードする全長cDNAを含むバキュロウイルス構成物に感染させた。感染三日後、細胞を3000rpmで10分間遠心分離により回収した。細胞ペレットを、プロテアーゼインヒビター（例えば、Complete, Roche Diagnostics, 商品番号 04693132001）の混合物を含む低張緩衝液（0.1 mM EDTA, 1 mM Tris, 1 mM HEPES, pH=7.4）中に再懸濁し、氷浴上で90分間攪拌した。崩壊させた細胞を４℃及び1000000ｇで30分間遠心分離により沈殿させた。粗製の膜フラクションからなるペレットをTris/スクロース緩衝液（10mMのTris, 250mMのスクロース, pH=7.4）に再懸濁し、ぴったり合った乳棒を有するガラスダンス（dounce）中で30回（strike）ホモジナイズした。膜画分のタンパク質濃度を、標準的な方法（例えば、BCAタンパク質アッセイ（Pierce, 製品番号 23250））を用いて決定した。
【００１８】
２）MRP4の輸送活性の決定：１）で調製された膜小胞を3.3μgタンパク質/μlの濃度までTris/スクロース緩衝液で希釈した。５μl希釈した膜小胞を384ウエルの白色の不透明なマイクロプレート（PerkinElmer, 製品番号 6007299）の各ウエルに加えた。５μlの試験化合物（Tris/スクロース緩衝液で異なる濃度に希釈）を膜小胞に加えた。Tris/スクロース緩衝液中で、12mMのATP、30mMのMgCl2、30mMのホスホクレアチン及び22.5mMのK2CO3、0.375mg/mlのクレアチンキナーゼ（（Leier et al., 1994）, Roche diagnostics, 商品番号 10127566001)、90μMの葉酸、0.1μCiの3H-葉酸（Movarek Biochemicals, MT783）、120μgのプロテインＡ SPA イメージングビーズ又はプロテインＡ SPA シンチレーションビーズ（Matsumura et al., 1992）及び0.075 μl 抗-MRP4ウサギ抗血清（配列番号１で与えられるMRP4のＣ末端の15個のアミノ酸に対して向けられる）を含む反応混合物を調製した。輸送は、５μlの反応混合物を膜小胞に加えることによって開始される。30分後、１時間後、２時間後、４時間後又は最大24時間後に、ルミネッセンスシグナルをLEADSeeker又はTopCountシステムで測定した。
【００１９】
３）試験化合物の抑制効果の計算：試験化合物の存在下で決定されたMRP4の相対的な輸送活性は、試験化合物の非存在下で決定されたルミネッセンスと比較して試験化合物の存在下で決定されたルミネッセンスの割合として計算される。MRP4のインヒビターは100％未満の値を生じるが、MRP4のアクチベーターは100％よりも大きい値を生じる。
【００２０】
表１に、上述のアッセイを利用し、公知のMRP4インヒビターを試験することによって得られた結果をまとめる。
【表１】
2010501837.tif 000004
【００２１】
文献
1. Aguilar-Bryan,L., Nichols,C.G., Wechsler,S.W., Clement,J.P., Boyd,A.E., III, Gonzalez,G., Herrera-Sosa,H., Nguy,K., Bryan,J., and Nelson,D.A. (1995). Cloning of the beta cell high-affinity sulfonylurea receptor: a regulator of insulin secretion. Science 268, 423-426.
2. Allikmets,R. (1997). A photoreceptor cell-specific ATP-binding transporter gene (ABCR) is mutated in recessive Stargardt macular dystrophy. Nat. Genet. 17, 122.
3. Allikmets,R., Schriml,L.M., Hutchinson,A., Romano-Spica,V., and Dean,M. (1998). A human placenta-specific ATP-binding cassette gene (ABCP) on chromosome 4q22 that is involved in multidrug resistance. Cancer Res. 58, 5337-5339.
4. Ayrton,A., and Morgan,P. (2001). Role of transport proteins in drug absorption, distribution and excretion. Xenobiotica 31, 469-497.
5. Bakos,E., Evers,R., Sinko,E., Varadi,A., Borst,P., and Sarkadi,B. (2000). Interactions of the human multidrug resistance proteins MRP1 and MRP2 with organic anions. Mol. Pharmacol. 57, 760-768.
6. Belinsky,M.G., Bain,L.J., Balsara,B.B., Testa,J.R., and Kruh,G.D. (1998). Characterization of MOAT-C and MOAT-D, new members of the MRP/cMOAT subfamily of transporter proteins. J. Natl. Cancer Inst. 90, 1735-1741.
7. Berge,K.E., Tian,H., Graf,G.A., Yu,L., Grishin,N.V., Schultz,J., Kwiterovich,P., Shan,B., Barnes,R., and Hobbs,H.H. (2000). Accumulation of dietary cholesterol in sitosterolemia caused by mutations in adjacent ABC transporters. Science 290, 1771-1775.
8. Berger,H.A., Anderson,M.P., Gregory,R.J., Thompson,S., Howard,P.W., Maurer,R.A., Mulligan,R., Smith,A.E., and Welsh,M.J. (1991). Identification and regulation of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator-generated chloride channel. J. Clin. Invest 88, 1422-1431.
9. Bodzioch,M., Orso,E., Klucken,J., Langmann,T., Bottcher,A., Diederich,W., Drobnik,W., Barlage,S., Buchler,C., Porsch-Ozcurumez,M., Kaminski,W.E., Hahmann,H.W., Oette,K., Rothe,G., Aslanidis,C., Lackner,K.J., and Schmitz,G. (1999). The gene encoding ATP-binding cassette transporter 1 is mutated in Tangier disease. Nat. Genet. 22, 347-351.
10. Borst,P., and Elferink,R.O. (2002). Mammalian ABC transporters in health and disease. Annu. Rev. Biochem. 71, 537-592.
11. Bortfeld,M., Rius,M., Konig,J., Herold-Mende,C., Nies,A.T., and Keppler,D. (2006). Human multidrug resistance protein 8 (MRP8/ABCC11), an apical efflux pump for steroid sulfates, is an axonal protein of the CNS and peripheral nervous system. Neuroscience 137, 1247-1257.
12. Brooks-Wilson,A., Marcil,M., Clee,S.M., Zhang,L.H., Roomp,K., van Dam,M., Yu,L., Brewer,C., Collins,J.A., Molhuizen,H.O., Loubser,O., Ouelette,B.F., Fichter,K., Ashbourne-Excoffon,K.J., Sensen,C.W., Scherer,S., Mott,S., Denis,M., Martindale,D., Frohlich,J., Morgan,K., Koop,B., Pimstone,S., Kastelein,J.J., Genest,J., Jr., and Hayden,M.R. (1999). Mutations in ABC1 in Tangier disease and familial high-density lipoprotein deficiency. Nat. Genet. 22, 336-345.
13. Buchler,M., Konig,J., Brom,M., Kartenbeck,J., Spring,H., Horie,T., and Keppler,D. (1996). cDNA cloning of the hepatocyte canalicular isoform of the multidrug resistance protein, cMrp, reveals a novel conjugate export pump deficient in hyperbilirubinemic mutant rats. J. Biol. Chem. 271, 15091-15098.
14. Byrne,J.A., Strautnieks,S.S., Mieli-Vergani,G., Higgins,C.F., Linton,K.J., and Thompson,R.J. (2002). The human bile salt export pump: characterization of substrate specificity and identification of inhibitors. Gastroenterology 123, 1649-1658.
15. Chen,Z.S., Guo,Y., Belinsky,M.G., Kotova,E., and Kruh,G.D. (2005). Transport of bile acids, sulfated steroids, estradiol 17-beta-D-glucuronide, and leukotriene C4 by human multidrug resistance protein 8 (ABCC11). Mol. Pharmacol. 67, 545-557.
16. Chen,Z.S., Hopper-Borge,E., Belinsky,M.G., Shchaveleva,I., Kotova,E., and Kruh,G.D. (2003a). Characterization of the transport properties of human multidrug resistance protein 7 (MRP7, ABCC10). Mol. Pharmacol. 63, 351-358.
17. Chen,Z.S., Lee,K., and Kruh,G.D. (2001). Transport of cyclic nucleotides and estradiol 17-beta-D-glucuronide by multidrug resistance protein 4. Resistance to 6-mercaptopurine and 6-thioguanine. J Biol. Chem. 276, 33747-33754.
18. Chen,Z.S., Lee,K., Walther,S., Raftogianis,R.B., Kuwano,M., Zeng,H., and Kruh,G.D. (2002). Analysis of methotrexate and folate transport by multidrug resistance protein 4 (ABCC4): MRP4 is a component of the methotrexate efflux system. Cancer Res. 62, 3144-3150.
19. Chen,Z.S., Robey,R.W., Belinsky,M.G., Shchaveleva,I., Ren,X.Q., Sugimoto,Y., Ross,D.D., Bates,S.E., and Kruh,G.D. (2003b). Transport of methotrexate, methotrexate polyglutamates, and 17beta-estradiol 17-(beta-D-glucuronide) by ABCG2: effects of acquired mutations at R482 on methotrexate transport. Cancer Res. 63, 4048-4054.
20. Cole,S.P., Bhardwaj,G., Gerlach,J.H., Mackie,J.E., Grant,C.E., Almquist,K.C., Stewart,A.J., Kurz,E.U., Duncan,A.M., and Deeley,R.G. (1992). Overexpression of a transporter gene in a multidrug-resistant human lung cancer cell line. Science 258, 1650-1654.
21. Cui,Y., Konig,J., Buchholz,J.K., Spring,H., Leier,I., and Keppler,D. (1999). Drug resistance and ATP-dependent conjugate transport mediated by the apical multidrug resistance protein, MRP2, permanently expressed in human and canine cells. Mol. Pharmacol. 55, 929-937.
22. Cui,Y., Konig,J., and Keppler,D. (2001). Vectorial transport by double-transfected cells expressing the human uptake transporter SLC21A8 and the apical export pump ABCC2. Mol. Pharmacol. 60, 934-943.
23. Gottesman,M.M., Fojo,T., and Bates,S.E. (2002). Multidrug resistance in cancer: role of ATP-dependent transporters. Nat. Rev. Cancer 2, 48-58.
24. Gros,P., Ben Neriah,Y.B., Croop,J.M., and Housman,D.E. (1986). Isolation and expression of a complementary DNA that confers multidrug resistance. Nature 323, 728-731.
25. Hagmann,W., Nies,A.T., Konig,J., Frey,M., Zentgraf,H., and Keppler,D. (1999). Purification of the human apical conjugate export pump MRP2 reconstitution and functional characterization as substrate-stimulated ATPase. Eur. J. Biochem. 265, 281-289.
26. Higgins,C.F. (1992). ABC transporters: from microorganisms to man. Annu. Rev. Cell Biol. 8, 67-113.
27. Holland,K.A., and Holland,I.B. (2005). Adventures with ABC-proteins: highly conserved ATP-dependent transporters. Acta Microbiol. Immunol. Hung. 52, 309-322.
28. Hooijberg,J.H., Broxterman,H.J., Kool,M., Assaraf,Y.G., Peters,G.J., Noordhuis,P., Scheper,R.J., Borst,P., Pinedo,H.M., and Jansen,G. (1999). Antifolate resistance mediated by the multidrug resistance proteins MRP1 and MRP2. Cancer Res. 59, 2532-2535.
29. Hooijberg,J.H., Peters,G.J., Assaraf,Y.G., Kathmann,I., Priest,D.G., Bunni,M.A., Veerman,A.J., Scheffer,G.L., Kaspers,G.J., and Jansen,G. (2003). The role of multidrug resistance proteins MRP1, MRP2 and MRP3 in cellular folate homeostasis. Biochem. Pharmacol. 65, 765-771.
【００２２】
30. Hopper,E., Belinsky,M.G., Zeng,H., Tosolini,A., Testa,J.R., and Kruh,G.D. (2001). Analysis of the structure and expression pattern of MRP7 (ABCC10), a new member of the MRP subfamily. Cancer Lett. 162, 181-191.
31. Ilias,A., Urban,Z., Seidl,T.L., Le Saux,O., Sinko,E., Boyd,C.D., Sarkadi,B., and Varadi,A. (2002). Loss of ATP-dependent transport activity in pseudoxanthoma elasticum-associated mutants of human ABCC6 (MRP6). J. Biol. Chem. 277, 16860-16867.
32. Imai,Y., Asada,S., Tsukahara,S., Ishikawa,E., Tsuruo,T., and Sugimoto,Y. (2003). Breast cancer resistance protein exports sulfated estrogens but not free estrogens. Mol. Pharmacol. 64, 610-618.
33. Inagaki,N., Gonoi,T., Clement,J.P., Wang,C.Z., Aguilar-Bryan,L., Bryan,J., and Seino,S. (1996). A family of sulfonylurea receptors determines the pharmacological properties of ATP-sensitive K+ channels. Neuron 16, 1011-1017.
34. Jedlitschky,G., Leier,I., Buchholz,U., Barnouin,K., Kurz,G., and Keppler,D. (1996). Transport of glutathione, glucuronate, and sulfate conjugates by the MRP gene-encoded conjugate export pump. Cancer Res. 56, 988-994.
35. Jedlitschky,G., Tirschmann,K., Lubenow,L.E., Nieuwenhuis,H.K., Akkerman,J.W., Greinacher,A., and Kroemer,H.K. (2004). The nucleotide transporter MRP4 (ABCC4) is highly expressed in human platelets and present in dense granules, indicating a role in mediator storage. Blood 104, 3603-3610.
36. Kartenbeck,J., Leuschner,U., Mayer,R., and Keppler,D. (1996). Absence of the canalicular isoform of the MRP gene-encoded conjugate export pump from the hepatocytes in Dubin-Johnson syndrome. Hepatology 23, 1061-1066.
37. Keppler,D., Jedlitschky,G., and Leier,I. (1998). Transport function and substrate specificity of multidrug resistance protein. Methods Enzymol. 292, 607-616.
38. Kiuchi,Y., Suzuki,H., Hirohashi,T., Tyson,C.A., and Sugiyama,Y. (1998). cDNA cloning and inducible expression of human multidrug resistance associated protein 3 (MRP3). FEBS Lett. 433, 149-152.
39. Klugbauer,N., and Hofmann,F. (1996). Primary structure of a novel ABC transporter with a chromosomal localization on the band encoding the multidrug resistance-associated protein. FEBS Lett. 391, 61-65.
40. Kool,M., van der,L.M., de Haas,M., Baas,F., and Borst,P. (1999). Expression of human MRP6, a homologue of the multidrug resistance protein gene MRP1, in tissues and cancer cells. Cancer Res. 59, 175-182.
41. Lee,K., Belinsky,M.G., Bell,D.W., Testa,J.R., and Kruh,G.D. (1998). Isolation of MOAT-B, a widely expressed multidrug resistance-associated protein/canalicular multispecific organic anion transporter-related transporter. Cancer Res. 58, 2741-2747.
42. Leier,I., Jedlitschky,G., Buchholz,U., Cole,S.P., Deeley,R.G., and Keppler,D. (1994). The MRP gene encodes an ATP-dependent export pump for leukotriene C4 and structurally related conjugates. J. Biol. Chem. 269, 27807-27810.
43. Luciani,M.F., Denizot,F., Savary,S., Mattei,M.G., and Chimini,G. (1994). Cloning of two novel ABC transporters mapping on human chromosome 9. Genomics 21, 150-159.
44. Madon,J., Hagenbuch,B., Landmann,L., Meier,P.J., and Stieger,B. (2000). Transport function and hepatocellular localization of mrp6 in rat liver. Mol. Pharmacol. 57, 634-641.
45. Matsumura,Y., Umekawa,T., Kawamura,H., Takaoka,M., Robinson,P.S., Cook,N.D., and Morimoto,S. (1992). A simple method for measurement of phosphoramidon-sensitive endothelin converting enzyme activity. Life Sci. 51, 1603-1611.
46. Mayer,R., Kartenbeck,J., Buchler,M., Jedlitschky,G., Leier,I., and Keppler,D. (1995). Expression of the MRP gene-encoded conjugate export pump in liver and its selective absence from the canalicular membrane in transport-deficient mutant hepatocytes. J. Cell Biol. 131, 137-150.
47. Meier,P.J., and Boyer,J.L. (1990). Preparation of basolateral (sinusoidal) and canalicular plasma membrane vesicles for the study of hepatic transport processes. Methods Enzymol. 192, 534-545.
48. Noe,J., Stieger,B., and Meier,P.J. (2002). Functional expression of the canalicular bile salt export pump of human liver. Gastroenterology 123, 1659-1666.
49. Pavek,P., Merino,G., Wagenaar,E., Bolscher,E., Novotna,M., Jonker,J.W., and Schinkel,A.H. (2005). Human breast cancer resistance protein: interactions with steroid drugs, hormones, the dietary carcinogen 2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo(4,5-b)pyridine, and transport of cimetidine. J. Pharmacol. Exp. Ther. 312, 144-152.
50. Pratt,S., Shepard,R.L., Kandasamy,R.A., Johnston,P.A., Perry,W., III, and Dantzig,A.H. (2005). The multidrug resistance protein 5 (ABCC5) confers resistance to 5-fluorouracil and transports its monophosphorylated metabolites. Mol. Cancer Ther. 4, 855-863.
51. Raggers,R.J., van,H.A., Evers,R., and van,M.G. (1999). The human multidrug resistance protein MRP1 translocates sphingolipid analogs across the plasma membrane. J. Cell Sci. 112 ( Pt 3), 415-422.
52. Raggers,R.J., Vogels,I., and van,M.G. (2001). Multidrug-resistance P-glycoprotein (MDR1) secretes platelet-activating factor. Biochem. J. 357, 859-865.
53. Reid,G., Wielinga,P., Zelcer,N., van,d.H., I, Kuil,A., de Haas,M., Wijnholds,J., and Borst,P. (2003). The human multidrug resistance protein MRP4 functions as a prostaglandin efflux transporter and is inhibited by nonsteroidal antiinflammatory drugs. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 100, 9244-9249.
54. Ringpfeil,F., Lebwohl,M.G., Christiano,A.M., and Uitto,J. (2000). Pseudoxanthoma elasticum: mutations in the MRP6 gene encoding a transmembrane ATP-binding cassette (ABC) transporter. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 97, 6001-6006.
55. Riordan,J.R., Rommens,J.M., Kerem,B., Alon,N., Rozmahel,R., Grzelczak,Z., Zielenski,J., Lok,S., Plavsic,N., Chou,J.L., and . (1989). Identification of the cystic fibrosis gene: cloning and characterization of complementary DNA. Science 245, 1066-1073.
56. Rius,M., Nies,A.T., Hummel-Eisenbeiss,J., Jedlitschky,G., and Keppler,D. (2003). Cotransport of reduced glutathione with bile salts by MRP4 (ABCC4) localized to the basolateral hepatocyte membrane. Hepatology 38, 374-384.
57. Rius,M., Thon,W.F., Keppler,D., and Nies,A.T. (2005). Prostanoid transport by multidrug resistance protein 4 (MRP4/ABCC4) localized in tissues of the human urogenital tract. J. Urol. 174, 2409-2414.
58. Sarkadi,B., Price,E.M., Boucher,R.C., Germann,U.A., and Scarborough,G.A. (1992). Expression of the human multidrug resistance cDNA in insect cells generates a high activity drug-stimulated membrane ATPase. J. Biol. Chem. 267, 4854-4858.
59. Strautnieks,S.S., Bull,L.N., Knisely,A.S., Kocoshis,S.A., Dahl,N., Arnell,H., Sokal,E., Dahan,K., Childs,S., Ling,V., Tanner,M.S., Kagalwalla,A.F., Nemeth,A., Pawlowska,J., Baker,A., Mieli-Vergani,G., Freimer,N.B., Gardiner,R.M., and Thompson,R.J. (1998). A gene encoding a liver-specific ABC transporter is mutated in progressive familial intrahepatic cholestasis. Nat. Genet. 20, 233-238.
60. Sun,H., Molday,R.S., and Nathans,J. (1999). Retinal stimulates ATP hydrolysis by purified and reconstituted ABCR, the photoreceptor-specific ATP-binding cassette transporter responsible for Stargardt disease. J. Biol. Chem. 274, 8269-8281.
61. Takeuchi,T., Yoshitomi,S., Higuchi,T., Ikemoto,K., Niwa,S., Ebihara,T., Katoh,M., Yokoi,T., and Asahi,S. (2006). Establishment and characterization of the transformants stably-expressing MDR1 derived from various animal species in LLC-PK1. Pharm. Res. 23, 1460-1472.
62. Tammur,J., Prades,C., Arnould,I., Rzhetsky,A., Hutchinson,A., Adachi,M., Schuetz,J.D., Swoboda,K.J., Ptacek,L.J., Rosier,M., Dean,M., and Allikmets,R. (2001). Two new genes from the human ATP-binding cassette transporter superfamily, ABCC11 and ABCC12, tandemly duplicated on chromosome 16q12. Gene 273, 89-96.
63. Tanigawara,Y., Okamura,N., Hirai,M., Yasuhara,M., Ueda,K., Kioka,N., Komano,T., and Hori,R. (1992). Transport of digoxin by human P-glycoprotein expressed in a porcine kidney epithelial cell line (LLC-PK1). J. Pharmacol. Exp. Ther. 263, 840-845.
64. Trowsdale,J., Hanson,I., Mockridge,I., Beck,S., Townsend,A., and Kelly,A. (1990). Sequences encoded in the class II region of the MHC related to the 'ABC' superfamily of transporters. Nature 348, 741-744.
65. van Aubel,R.A., Smeets,P.H., Peters,J.G., Bindels,R.J., and Russel,F.G. (2002). The MRP4/ABCC4 gene encodes a novel apical organic anion transporter in human kidney proximal tubules: putative efflux pump for urinary cAMP and cGMP. J Am. Soc. Nephrol. 13, 595-603.
66. Van der Bliek,A.M., Baas,F., Ten Houte,d.L., Kooiman,P.M., Van,d., V, and Borst,P. (1987). The human mdr3 gene encodes a novel P-glycoprotein homologue and gives rise to alternatively spliced mRNAs in liver. EMBO J. 6, 3325-3331.
67. Volk,E.L., and Schneider,E. (2003). Wild-type breast cancer resistance protein (BCRP/ABCG2) is a methotrexate polyglutamate transporter. Cancer Res. 63, 5538-5543.
68. Wang,J., Sun,F., Zhang,D.W., Ma,Y., Xu,F., Belani,J.D., Cohen,J.C., Hobbs,H.H., and Xie,X.S. (2006). Sterol transfer by ABCG5 and ABCG8: In vitro assay and reconstitution. J. Biol. Chem.
69. Wielinga,P., Hooijberg,J.H., Gunnarsdottir,S., Kathmann,I., Reid,G., Zelcer,N., van der,B.K., de,H.M., van,d.H., I, Kaspers,G., Wijnholds,J., Jansen,G., Peters,G., and Borst,P. (2005). The human multidrug resistance protein MRP5 transports folates and can mediate cellular resistance against antifolates. Cancer Res. 65, 4425-4430.
70. Young,S.G., and Fielding,C.J. (1999). The ABCs of cholesterol efflux. Nat. Genet. 22, 316-318.
71. Zelcer,N., Reid,G., Wielinga,P., Kuil,A., van,d.H., I, Schuetz,J.D., and Borst,P. (2003). Steroid and bile acid conjugates are substrates of human multidrug-resistance protein (MRP) 4 (ATP-binding cassette C4). Biochem. J 371, 361-367.
72. Zeng,H., Liu,G., Rea,P.A., and Kruh,G.D. (2000). Transport of amphipathic anions by human multidrug resistance protein 3. Cancer Res. 60, 4779-4784.
【配列表】
2010501837000001.app
【国際調査報告】
2010501837.tif 000007
2010501837.tif 000008
2010501837.tif 000009