(57)【要約】  Ｎ末端の短縮化ＴＡＣＩ（膜貫通活性化因子およびＣＡＭＬ相互作用因子）の細胞外領域と、Ｆｃとを含む最適化された融合タンパク質、そのような融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列、そのようなＤＮＡ配列を含むベクターおよび宿主細胞、そのような融合タンパク質を含む医薬組成物が提供される。そのような融合タンパク質の調製方法、および、疾患を処置するための、そのような融合タンパク質の使用もまた提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
短縮化されたＴＡＣＩと、免疫グロブリンのＦｃとから構成される融合タンパク質であって、融合タンパク質のＴＡＣＩ部分が、ＴＡＣＩ由来の細胞外領域のアミノ末端領域の部分配列、ＴＡＣＩ由来のシステインリッチ領域の全配列、および、ＴＡＣＩ由来の柄領域の部分配列を含み、融合タンパク質の免疫グロブリンＦｃ部分が、ヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を含み、かつ、ＴＡＣＩ部分およびＦｃ部分が直接的またはリンカー配列を介してのどちらかで融合されることを特徴とする、融合タンパク質。
【請求項２】
前記ＴＡＣＩ部分が、ＴＡＣＩの１３位〜１０８位のアミノ酸および１３位〜１１８位のアミノ酸からなる群から選択され、前記リンカー配列が９Ｇｌｙであり、かつ、前記免疫グロブリンＦｃ部分が、それぞれのすべてのイソ型を含めて、ヒトまたは動物の免疫グロブリンＩｇＧ、免疫グロブリンＩｇＭ、免疫グロブリンＩｇＤおよび免疫グロブリンＩｇＡのＦｃに由来することを特徴とする、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記免疫グロブリンＦｃ部分がＩｇＧ１に由来することを特徴とする、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
融合タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号１〜配列番号３に示される配列から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
請求項１に記載される融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列。
【請求項６】
配列番号５〜配列番号７に示される配列であることを特徴とする、請求項５に記載のＤＮＡ配列。
【請求項７】
請求項５に記載されるＤＮＡ配列を含むベクター。
【請求項８】
請求項１に記載される対応する融合タンパク質の発現のために使用され、かつ、真核生物細胞または原核生物細胞から選択される、請求項７に記載されるベクターを含む細胞。
【請求項９】
ＢＬｙＳまたはＡＰＲＩＬを阻止するための医薬品の製造における、請求項１に記載される融合タンパク質の使用。
【請求項１０】
請求項１に記載される融合タンパク質を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子組換え技術を使用することによる最適化された融合タンパク質（具体的には、ＴＡＣＩ−Ｆｃ融合タンパク質）の調製、および、免疫学的疾患を処置するためのその適用に関連する。
【背景技術】
【０００２】
リンパ球の発達および分化のプロセスは様々なサイトカインによって厳しく制御される。Ｂリンパ球刺激因子（ＢＬｙＳ、または、いわゆるＢＡＦＦ、ＴＮＳＦ１３Ｂ、ＴＨＡＮＫ、ＴＡＬＬ−１、ｚＴＮＦ４）および増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）は、生体内での免疫応答を調節することにおいて重要な役割を果たすサイトカインである（非特許文献１：Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ、２００５、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１７：２８２〜２８９）（非特許文献２：Ｓｅｙｌｅｒ他、２００５、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、１１５：３０８３〜３０９２）。それらはＢリンパ球の発達および増殖を刺激して、血液中における様々な免疫グロブリンの発現を増大させる。ＢＬｙＳおよびＡＰＲＩＬはまた、Ｔリンパ球の成熟化に対して、従って、細胞性免疫に対して、不可欠な調節作用を有する（非特許文献３：Ｗａｎｇ他、２００１、Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２：６３２〜６３７）。
【０００３】
ＢＬｙＳおよびＡＰＲＩＬは、リンパ球の免疫応答を、リンパ球の細胞表面の受容体を介して調節する。ＢＬｙＳおよびＡＰＲＩＬは細胞膜受容体のＴＡＣＩ（膜貫通活性化因子およびＣＡＭＬ相互作用因子）およびＢＣＭＡ（Ｂ細胞成熟化抗原）に結合する。加えて、ＢＬｙＳはまた、別の受容体（ＢＡＦＦ−Ｒ）にも結合することができる。Ｂリンパ球は、ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡおよびＢＡＦＦ−Ｒを発現する。成熟Ｔリンパ球はＴＡＣＩを発現する。ＢＬｙＳおよびＡＰＲＩＬは、これらの受容体によって媒介されるシグナル伝達を介してリンパ球の活性化、増殖および発達を調節し、従って、免疫応答を高める。加えて、リンパ球由来の腫瘍において、ＢＬｙＳおよびＡＰＲＩＬはまた、腫瘍細胞の増殖を促進させ、アポトーシスを抑制し、それらにより、腫瘍の進行を加速させる。
【０００４】
ＢＬｙＳおよびＡＰＲＩＬの過剰な発現が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、リウマチ様関節炎（ＲＡ）、シェーグレン症候群など（これらに限定されない）を含む多くの自己免疫疾患についての病原因子の１つである。ＢＬｙＳの濃度が多くの場合、自己免疫疾患の重篤度に対して正に相関することが臨床研究において示される。従って、ＢＬｙＳおよびＡＰＲＩＬの阻害がこれまで、関連した自己免疫疾患を処置するための潜在的に効果的な手段となっている。一方で、ＢＬｙＳおよびＡＰＲＩＬはＢリンパ球腫瘍の進行を加速し得るので、ＢＬｙＳおよびＡＰＲＩＬの阻害はまた、Ｂリンパ球の腫瘍（例えば、慢性リンパ球白血球、多発性骨髄腫、Ｂリンパ球リンパ腫など）を処置するために使用することができる。
【０００５】
ＴＡＣＩは、ＢＬｙＳおよびＡＰＲＩＬのそれぞれに対して高い親和性を有するので、ＢＬｙＳまたはＡＰＲＩＬと、それらの膜受容体（ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ、ＢＡＦＦ−Ｒ）との相互作用を妨げ、それにより、ＢＬｙＳまたはＡＰＲＩＬの生物学的活性を阻止するために、および、自己免疫疾患または腫瘍を処置するために、可溶性ＴＡＣＩ（ＴＡＣＩの細胞外部分）を使用することが可能である。
【０００６】
ＴＡＣＩの細胞外部分と、ＩｇＧのＦｃフラグメントとの融合タンパク質（ＴＡＣＩ−Ｆｃ）が、ＢＬｙＳによって引き起こされる疾患進行を効果的に阻害し得ることが研究において示される（非特許文献４：Ｇｒｏｓｓ他、２００１、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１５：２８９〜３０２）。しかしながら、天然型ＴＡＣＩの細胞外部分を使用することによって構築されるＴＡＣＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、細胞で発現されたとき、分解されやすいこともまた研究において明らかにされ、また、それによって得られる生成物は多くの場合、異種である。従って、天然型ＴＡＣＩの、ＦｃフラグメントとのＴＡＣＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、工業的製造のためには適していない。本発明は、ＴＡＣＩ−Ｆｃ融合タンパク質を、工業的製造のために適用可能である医薬組成物を開発するように遺伝子工学技術によって改善することを目的とする。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ、２００５、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１７：２８２〜２８９）
【非特許文献２】Ｓｅｙｌｅｒ他、２００５、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、１１５：３０８３〜３０９２
【非特許文献３】Ｗａｎｇ他、２００１、Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２：６３２〜６３７
【非特許文献４】Ｇｒｏｓｓ他、２００１、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１５：２８９〜３０２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ＢＬｙＳおよびＡＰＲＩＬを阻止するタンパク質薬物を構築および製造するための方法、そのようなタンパク質薬物の調製方法、ならびに、疾患を処置するための、そのようなタンパク質薬物の使用に関連する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、ＴＡＣＩフラグメントを免疫グロブリンのＦｃフラグメントと融合することによって得られ、かつ、Ｂリンパ球の増殖を阻止することができるいくつかの融合タンパク質を提供し、本発明の融合タンパク質の構造は下記の点を特徴とする：
融合タンパク質のＴＡＣＩ部分が、ＴＡＣＩ由来の細胞外領域のアミノ末端領域の部分配列、ＴＡＣＩ由来のシステインリッチ領域の全配列、および、ＴＡＣＩ由来の柄領域の部分配列を含み、一方、融合タンパク質における免疫グロブリンＦｃが、ヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を含み、ＴＡＣＩ配列およびＦｃ配列が直接に融合されるか、または、リンカー配列を介して融合される；
ただし、ＴＡＣＩフラグメントは、ＴＡＣＩのアミノ酸配列において、１３位〜１０８位の位置、または、１３位〜１１８位の位置からなる群から選択することができ、かつ、前記リンカー配列は９Ｇｌｙである場合があり、かつ、
免疫グロブリンＦｃフラグメントはヒトまたは動物の免疫グロブリンのＦｃに由来することができ、かつ、全長Ｆｃまたはその部分配列である場合がある；かつ、さらに、Ｆｃは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＡに由来することができ、この場合、これらのそれぞれがすべてのイソ型をそれぞれ含む（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４など、好ましくはＩｇＧ１）；および
前記ＴＡＣＩフラグメントは、ヒトおよび動物に由来するＴＡＣＩ配列からなる群から選択することができる。
【００１０】
具体的には、本発明の好ましい融合タンパク質として、
ａ．融合タンパク質Ｔ１：これは、ＴＡＣＩの１３位〜１０８位のアミノ酸と、免疫グロブリンＩｇＧ１のＦｃとを融合することによって作製される（配列番号１）；
ｂ．融合タンパク質Ｔ２：これは、ＴＡＣＩの１３位〜１１８位のアミノ酸と、免疫グロブリンＩｇＧ１のＦｃとを融合することによって作製される（配列番号２）；および
ｃ．融合タンパク質Ｔ３：これは、ＴＡＣＩの１３位〜１１８位のアミノ酸と、９Ｇｌｙのリンカー配列と、免疫グロブリンＩｇＧ１のＦｃとを融合することによって作製される（配列番号３）
を挙げることができ、
ただし、ＴＡＣＩは、ヒトおよび動物に由来するＴＡＣＩ（膜貫通活性化因子およびＣＡＭＬ相互作用因子）についての細胞外領域の配列からなる群から選択される。
【００１１】
本発明はまた、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ配列に関連する。
【００１２】
前記ＤＮＡ配列が配列番号５〜配列番号７において例示される。
【００１３】
天然型ＴＡＣＩ配列を有するＴＡＣＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、容易なタンパク質分解のため、工業的製造のためには適用することができない。ＰＣＴ／ＵＳ２００２／０１５９１０は、アミノ末端領域全体および柄領域の部分配列が欠失されるＴＡＣＩフラグメントをＦｃフラグメントと融合することにより、融合タンパク質のタンパク質分解が妨げられ得ることを記載する。しかしながら、アミノ末端領域の除去はＴＡＣＩの生物学的活性を著しく低下させることが報告された（Ｗｕ他、２０００、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７５：３５４７８〜３５４８５）。
【００１４】
本発明の手がかりは、プロタンパク質転換酵素（ＰＣ）人工ニューラルネットワークのコンピューター・ソフトウエア・システムが、ＴＡＣＩの細胞外領域のアミノ酸配列を分析するために利用されることにある。その分析結果は、ＴＡＣＩの細胞外領域の配列は２つのＰＣ切断部位（９位および１３５位のアミノ酸）を含むこと、および、２つのさらなる部位（１２位および１２０位のアミノ酸）が、ＰＣ切断部位についての閾値に近いスコアを有することを示した。これらのＰＣ切断部位は、発現過程において、ＴＡＣＩの分解に本質的に関わっているかもしれないことが推定される。この発見に基づいて、本発明者らは、これらのＰＣ切断部位をＴＡＣＩ分子の最適化において除き、ＰＣ切断部位を含まないＴＡＣＩフラグメントをＦｃに融合した。本発明者らの実験は、新しい融合タンパク質が発現期間中においてＴＡＣＩの分解を効果的に妨げることを証明した。短縮化されたＴＡＣＩ配列、ならびに、他の方法を、これらのＰＣ切断部位を妨げるために使用することができる。例えば、ＤＮＡ部位特異的変異誘発を、これらのＰＣ切断部位を除くために使用することができる。従って、様々な最適化方法を、同じ目的を達成するために選ぶことができる。本発明の最適化されたＴＡＣＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、アミノ末端領域におけるほとんどの残基と、ＴＡＣＩ分子の柄領域における長いアミノ酸配列とを保持する。最適化されたＴＡＣＩ−Ｆｃ融合タンパク質により、タンパク質分解の問題が克服される。Ｎ末端領域全体が除かれているＴＡＣＩ−Ｆｃ融合と比較した場合、本発明の最適化されたＴＡＣＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、より大きい生物学的活性およびタンパク質発現レベルを示した。
【００１５】
本発明における融合タンパク質の構築は従来の分子クローニング技術に基づいており、具体的な実験プロトコルは様々な実験室マニュアルを参照することができ、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌの第２版および第３版などを参照することができる。
【００１６】
ＰＣＲ合成法を、上記の融合タンパク質をコードするＤＮＡをベクターにクローン化するために使用した。融合タンパク質を発現させるためのベクターは、分子生物学において一般に使用されるプラスミドであり得る。シグナルペプチド配列が、細胞からのタンパク質の分泌を確実にするように、融合タンパク質のアミノ末端の前方に含まれる。ベクター配列は、遺伝子発現を行わせるためのプロモーター、タンパク質翻訳のための開始シグナルおよび停止シグナル、ならびに、ポリアデニル化（ポリＡ）配列を含む。ベクターは、細菌におけるプラスミド複製を容易にするために、抗生物質抵抗性遺伝子を含むことができる。加えて、ベクターはまた、安定なトランスフェクションされた細胞系統を選抜するための真核生物細胞選抜遺伝子を含むことができる。
【００１７】
プラスミドを構築した後、融合タンパク質のＤＮＡ配列が配列決定によって確認される。その後、対応するタンパク質を、プラスミドＤＮＡを細胞にトランスフェクションすることによって発現させることができる。多くの発現システムが、そのような融合タンパク質を発現させるために利用可能であり、それらには、哺乳動物細胞、細菌、酵母、昆虫細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【００１８】
哺乳動物細胞において発現されるタンパク質は翻訳後修飾プロセスにおいてグリコシル化される。本発明のＴＡＣＩ−Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列は、グリコシル化されたアミノ酸を含有する；従って、哺乳動物細胞が、これらのタンパク質を発現させるために最も好ましい。様々な哺乳動物細胞が大規模なタンパク質発現のために好適である（例えば、ＣＨＯ細胞、ＳＰ２０細胞、ＮＳ０細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞およびＰｅｒＣ６細胞など）。多くの他の細胞もまた、これらのタンパク質の発現および製造のために使用することができ、従って、本発明において意図される。ポリペプチドをコードするプラスミドは、トランスフェクションによって細胞に入れることができる。細胞のトランスフェクションのための多くの方法があり、これらには、エレクトロポレーション、および、リポソーム媒介またはカルシウム媒介のトランスフェクションなどが含まれる（しかし、これらに限定されない）。
【００１９】
哺乳動物細胞に加えて、他の発現システムもまた、これらの融合タンパク質の発現のために使用することができ（例えば、細菌、酵母および昆虫細胞など）、これらもまた本発明において意図される。これらの発現システムにおけるタンパク質収率は、哺乳動物細胞におけるタンパク質収率よりも大きくなる場合があり、しかし、これらのシステムにおいて産生されるタンパク質は一般に、グリコシル化を欠いているか、または、哺乳動物細胞における形態とは異なる形態の糖コンジュゲートを有する。
【００２０】
タンパク質発現の後、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）または他の方法を、細胞培養上清における融合タンパク質の濃度を求めるために使用することができる。これらの融合タンパク質は免疫グロブリンのＦｃフラグメントを含有するので、プロテインＡまたはプロテインＧのアフィニティークロマトグラフィーを、これらの融合タンパク質を単離するための最初の精製工程として使用することができる。
【００２１】
本発明のＴＡＣＩ−Ｆｃ融合タンパク質の基本的機能は、ＢＬｙＳおよびＡＰＲＩＬを阻止することであり、一方、ＢＬｙＳおよびＡＰＲＩＬは、Ｂリンパ球の発達およびＴリンパ球の成熟化を刺激するための重要な因子である。従って、ＴＡＣＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、異常な免疫学的機能に関連する疾患、および、Ｂリンパ球の異常な増殖によって引き起こされる疾患において使用することができる。これらの疾患には、リウマチ様関節炎、全身性エリテマトーデスおよびＢリンパ球腫瘍が含まれる（しかし、これらに限定されない）。ＴＡＣＩ−Ｆｃ融合タンパク質を、精製された組換えタンパク質としてヒト身体に注入することができる。あるいは、融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、融合タンパク質を遺伝子治療または細胞治療によって患者の身体において発現させるための適切なベクターに挿入することができる。従って、本発明の融合タンパク質を使用するための多くの方法が存在する。そのような方法では、タンパク質の単独での使用だけでなく、融合タンパク質をコードするＤＮＡの使用もまた含まれる。
【００２２】
本発明はまた、医薬的に許容されるキャリアを含むことができる、融合タンパク質の医薬組成物に関連する。医薬組成物は、液体形態および凍結乾燥された形態を含めて、医薬配合物（好ましくは、注射用の配合物）の任意の形態であり得る。医薬組成物は従来の製薬方法論に従って調製することができる。そのような方法論は、製薬技術に基づいて、所望される投薬形態物を調製するために、有効成分（すなわち、本発明の融合タンパク質）を医薬的に許容されるキャリアと混合することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】プロタンパク質転換酵素（ＰＣ）人工ニューラルネットワークによるＴＡＣＩアミノ酸配列の分析を示す。ＴＡＣＩの細胞外領域における９位および１３５位のアミノ酸残基がＰＣ切断部位として示される。１２位および１２０位のアミノ酸残基もまた、ＰＣ切断部位についての閾値に対する近い値を有する。
【図２】天然型全長ＴＡＣＩタンパク質および４つのＴＡＣＩ−Ｆｃ融合タンパク質の構造を示す。
【図３】ＣＨＯ細胞からのタンパク質発現の比較を４つのＴＡＣＩ−Ｆｃ融合タンパク質について示す。
【図４】ＢＬｙｓに対する４つのＴＡＣＩ−Ｆｃ融合タンパク質の結合についてのアッセイを示す。結果は、融合タンパク質のすべてがＢＬｙＳに結合することができ、この場合、Ｔ３がＢＬｙＳに対する最も大きい親和性を有することを示す。
【図５】精製されたＴ３融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。高性能なＣＨＯ発現システムで発現させたＴ３融合タンパク質はゲルにおいて１本のタンパク質バンドとして現れた。このＴ３融合タンパク質は見かけの分子量が約４２ｋＤであり、これは、グリコシル化されたＴ３融合タンパク質の分子量予想と一致している。
【図６】コラーゲン誘導によるマウスの関節炎モデルにおけるＴ３融合タンパク質の顕著な自己免疫疾患抑制効果を示す。マウスの関節炎の進行ｔを関節炎の臨床スコアによって測定した。結果は、ＴＡＣＩ−Ｆｃ融合タンパク質Ｔ３により処置されたマウスが、コントロール群の臨床スコアよりも有意に低い臨床スコアを有することを示す（ｐ＜０．０１）。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、下記の実施例を、ＴＡＣＩ−Ｆｃ融合タンパク質の設計、構築および評価を詳細に例示するために提供する。しかしながら、本発明の内容および使用は実施例の範囲に限定されない。
【００２５】
実施例１：ＴＡＣＩの配列分析
プロタンパク質転換酵素（ＰＣ）はポリペプチドを細胞において特異的に切断することができる。多くのタンパク質について、ＰＣによる切断が、タンパク質の翻訳後修飾の期間中における重要な工程である。ＰＣファミリーは、特定のアミノ酸配列を認識および切断する数多くの酵素からなる。ＰＣ人工ニューラルネットワークは、タンパク質配列に存在するＰＣ切断部位を予測するために、知られているＰＣ切断部位についてのデータベースを利用するコンピューター・ソフトウエア・システムである。このシステムを、タンパク質における可能性のある何らかのＰＣ切断部位を分析するために利用することができる。本発明では、ＴＡＣＩのアミノ酸配列が、ＰＣ人工ニューラルネットワークを使用することによって分析された。２つのＰＣ切断部位（９位および１３５位のアミノ酸）がＴＡＣＩの細胞外領域に存在することが見出される。加えて、２つのさらなる部位（１２位および１２０位のアミノ酸）が、ＰＣ切断部位についての閾値に近いスコアを有する（図１）。従って、最適化されたＴＡＣＩ−Ｆｃ融合タンパク質を、これらのＰＣ切断部位を除き、可能性のあるＰＣ切断部位を含まないＴＡＣＩ配列をＦｃに融合し、その結果、タンパク質の切断を妨げるようにすることによって設計することが可能である。これらの知見に基づいて、本発明者らは、ＴＡＣＩ配列が、１２位のアミノ酸と、１２０位のアミノ酸との間において天然型ＴＡＣＩ配列に由来したいくつかのＴＡＣＩ−Ｆｃ融合タンパク質を構築している（図２）。これらの新規なＴＡＣＩ−Ｆｃ融合タンパク質によって共有される共通する特徴は、１）ＴＡＣＩのアミノ末端領域の大半の配列が含まれること、２）システインリッチ領域の配列全体が含まれること、および、３）柄領域の部分配列が含まれることである。
【００２６】
実施例２：融合タンパク質の構築および融合タンパク質をコードするプラスミド
総ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ総ＲＮＡ精製キットを使用することによってヒト末梢血単核細胞から単離および精製した。ｃＤＮＡを逆転写酵素により総ＲＮＡから合成した。その後、所望されるＴＡＣＩフラグメントを、適切なプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によって得た。免疫グロブリンのＦｃフラグメントを、クローン化されたＩｇＧ１  ＦｃプラスミドからＰＣＲ増幅によって得た。最後に、ＴＡＣＩ配列およびＦｃ配列をＰＣＲによって融合し、その結果として、ＴＡＣＩ−Ｆｃ融合タンパク質のＤＮＡ配列を首尾良く構築した。
【００２７】
ＰＣＲ反応は、９５℃での３０秒間の変性、５６℃での４５秒間のアニーリング、および、７２℃での２分間の伸長からなる３０サイクルを含む。ＴＡＣＩおよびＦｃのＰＣＲ生成物を、ＴＡクローニングキットを使用することによってｐＣＲ２．１プラスミドにそれぞれクローン化した。プラスミドを大腸菌に形質転換した。白色の大腸菌コロニーを選択し、ＬＢ培地において一晩成長させた。その後、プラスミドを、Ｑｉａｇｅｎプラスミドキットを使用することによって単離した。ＴＡＣＩ配列およびＦｃ配列を制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定によって確認した。最後に、ＴＡＣＩおよびＩｇＧ１  ＦｃのｃＤＮＡを、重複ＰＣＲ法を使用することによって融合した。ＴＡＣＩ−Ｆｃ融合フラグメントを哺乳動物発現プラスミドに挿入し、組換えプラスミドを大腸菌に形質転換し、陽性コロニーを選択し、標的配列を制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定による分析によって確認した。最後に、得られたプラスミドを使用して、ＣＨＯ細胞を、融合タンパク質を発現させるためにトランスフェクションした。
Ｔ１タンパク質  ＴＡＣＩの１３位〜１０８位のアミノ酸＋Ｆｃ  配列番号１および配列番号５
Ｔ２タンパク質  ＴＡＣＩの１３位〜１１８位のアミノ酸＋Ｆｃ  配列番号２および配列番号６
Ｔ３タンパク質  ＴＡＣＩの１３位〜１１８位のアミノ酸＋リンカー配列の９Ｇｌｙ＋Ｆｃ  配列番号３および配列番号７
【００２８】
加えて、この研究ではまた、融合タンパク質Ｔ４が比較のために含まれた。
Ｔ４タンパク質の、他の３つの融合タンパク質との違いは、ＴＡＣＩのＮ末端領域がＴ４において存在しないことである。実際、Ｔ４は、ＴＡＣＩの３０位〜１１０位のアミノ酸残基と、Ｆｃ配列との間における融合タンパク質である（配列番号４および配列番号８を参照のこと）。
Ｔ１融合タンパク質のためのプライマー配列：
フォワードプライマー：ＡＧＣＣＧＴＧＴＧＧＡＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧ
リバースプライマー：ＧＡＧＣＴＴＧＴＴＣＴＣＡＣＡＧＡＡＧＴＡＴＧ
Ｔ２融合タンパク質のためのプライマー配列：
フォワードプライマー：ＡＧＣＣＧＴＧＴＧＧＡＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧ
リバースプライマー：ＧＡＧＣＴＣＴＧＧＴＧＧＡＡＧＧＴＴＣＡＣＴＧ
Ｔ３融合タンパク質のためのプライマー配列：
フォワードプライマー：ＡＧＣＣＧＴＧＴＧＧＡＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧ
リバースプライマー：ＡＣＣＴＣＣＡＣＣＴＣＣＡＣＣＴＣＣＡＣＣＴＣＣＡＣＣＧＡＧＣＴＣＴＧＧＴＧＧＡＡＧＧＴＴＣＡＣＴＧＧＧＣＴＣＣＴ
Ｔ４融合タンパク質のためのプライマー配列：
フォワードプライマー：ＧＣＴＡＴＧＡＧＡＴＣＣＴＧＣＣＣＣＧＡＡＧ
リバースプライマー：ＴＧＡＡＧＡＴＴＴＧＧＧＣＴＣＧＣＴＣＣ
【００２９】
実施例３：細胞におけるＴＡＣＩ−Ｆｃ融合タンパク質の発現
本発明により、例えば、哺乳動物細胞におけるＴＡＣＩ−Ｆｃ融合タンパク質の発現が例示された。４つの融合タンパク質（Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３およびＴ４）をｐｃＤＮＡ３．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した。。Ｆｌｔ−１のシグナルペプチド配列をそれぞれの融合タンパク質の５’末端において付加した。４つのＴＡＣＩ−Ｆｃプラスミドを、高純度プラスミドＤＮＡ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して精製した。その後、プラスミドＤＮＡをＦＵＧＥＮ６トランスフェクションキット（ＲＯＣＨＥ）によりＣＨＯ細胞にそれぞれ導入した。一過性トランスフェクション方法を使用して、４つのＴＡＣＩ−Ｆｃ融合タンパク質の発現レベルを比較した。ＣＨＯ細胞を、１０％のウシ胎児血清を含む完全ＤＭＥＭ培地において細胞培養プレートで培養した。細胞が特定の密度に達したとき、ＦＵＧＥＮ６試薬（Ｒｏｃｈｅ）とのプラスミドＤＮＡの複合体を培養物に加えた。３日間培養した後、発現した融合タンパク質を含有する上清を集めた。融合タンパク質の濃度をＥＬＩＳＡ法により求めた。タンパク質濃度の結果を図３に示した。Ｔ３がとりわけ、最も大きい発現を有し、次いでＴ２が続く。Ｔ４が最も低い発現レベルを有する。従って、タンパク質の発現を考慮すると、融合タンパク質Ｔ３が最も良好な分子組成物である。
【００３０】
実施例４：ＢＬｙＳに対する融合タンパク質の結合活性の評価
それぞれの融合タンパク質を発現させた後、本発明者らは、ＢＬｙＳ結合アッセイにおいてＢＬｙＳに対するそれらの結合活性を求めた。このアッセイでは、組換えＢＬｙＳタンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を最初に９６ウエルＥＬＩＳＡプレートに被覆した。非特異的なタンパク質結合部位を２％のＢＳＡブロッキング溶液によりブロッキング処理した。その後、様々な濃度でのＴＡＣＩ融合タンパク質をそれぞれのウエルに加えた。プレートを３７℃で２時間インキュベーションし、その後、ウサギ抗ヒトＩｇ抗体−ＨＲＰコンジュゲートを添加する前に洗浄した。最後に、ペルオキシダーゼ基質を発色のために使用した。ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して、ＯＤ値を９６ウエルプレートのそれぞれのウエルについて測定した。この場合、増大したＯＤ値により、ＢＬｙＳに対する融合タンパク質の結合が示される。本発明者らは、Ｔ３が、ＢｌｙＳに対する最も良好な結合を有すること、Ｔ１およびＴ２が中程度の結合を有すること、Ｔ４が最も低い結合を有することを見出した（図４）。従って、タンパク質発現およびＢＬｙＳに対する結合活性の両方を考慮すると、融合タンパク質Ｔ３が最も良好な分子組成物である。
【００３１】
実施例５：高発現細胞株の確立
融合タンパク質Ｔ３が最も良好な分子組成物であることを明らかにした後、本発明者らは、安定的トランスフェクションおよび遺伝子増幅を使用することによってＣＨＯ細胞の安定な高発現株を確立した。融合タンパク質Ｔ３をコードする遺伝子を、ＤＨＦＲ遺伝子を含有するプラスミドにクローン化した。高純度のプラスミドＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮプラスミド精製キットを使用することによって精製し、ＣＨＯ細胞を、エレクトロポーレションを使用してプラスミドによりトランスフェクションした。トランスフェクションされた細胞を選抜培地において培養して、抵抗性クローンを得た。メトトレキサート（ＭＴＸ）を加えて、Ｔ３遺伝子を増幅し、高発現の細胞クローンを得た。最後に、選択されたクローンのＣＨＯ細胞を培養で拡大し、融合タンパク質をバイオリアクターにおいて大規模で産生させた。融合タンパク質の濃度をＥＬＩＳＡによって求めた。この方法を使用して、本発明者らは融合タンパク質Ｔ３を大規模で首尾良く産生させている。融合タンパク質の収量が２０ｐｇ／細胞／日よりも大きくし得る。融合タンパク質Ｔ３を、プロテインＡまたはプロテインＧのアフィニティークロマトグラフィーを使用することによって精製することができる。
【００３２】
実施例７：ＴＡＣＩ−Ｆｃ融合タンパク質の電気泳動による同定
本発明により、融合タンパク質の分解が、最適化された融合タンパク質の発現の期間中に生じないことが実験的に明らかにされた。融合タンパク質Ｔ３を高発現させるためのＣＨＯ細胞の系統を細胞培養フラスコで培養した。細胞が高密度に達した後、細胞培養上清を集め、融合タンパク質を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用することによって精製した。精製された融合タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ負荷緩衝液と混合し、３分間煮沸した。融合タンパク質をポリアクリルアミドゲルで分離し、クーマシーブリリアントブルーにより染色した。タンパク質バンドを、ゲルをメタノールにより脱染色した後で可視化した。Ｔ３タンパク質が、グリコシル化されたＴ３融合タンパク質の分子量予想と一致している約４２ｋＤの見かけの分子量を伴って、ゲルにおいて１本のバンドとして現れたことが示された（図５）。４２ｋＤよりも小さい分子量でのタンパク質バンドが全く観測されなかったことは重要である。この結果から、本発明の最適化されたＴＡＣＩ−Ｆｃ融合タンパク質は発現過程におけるタンパク質の切断および分解を効果的に妨げることができ、従って、大規模な工業的製造のために使用することができることが明らかにされた。
【００３３】
実施例８：自己免疫疾患に対する、最適化されたＴＡＣＩ−Ｆｃ融合タンパク質の治療効果
最適化されたＴＡＣＩ−Ｆｃ融合タンパク質が抗自己免疫的な生物学的活性を有することが、コラーゲン誘導によるマウスの関節炎モデルにおいて明らかにされた。８週齢のＤＢＡ／１マウスを、それぞれの群が１０匹の動物を含む２つの群に分けた。マウスにはそれぞれ、完全フロイントアジュバントと混合された、２００μｇのウシＩＩ型コラーゲンを皮内に注射した。２１日後、マウスにはそれぞれ、不完全フロイントアジュバントと混合された、ウシのＩＩ型コラーゲンタンパク質を皮内に注射した。２４日目から、試験群におけるマウスには、１００μｇのＴ３融合タンパク質をそれぞれ、１週間に３回、皮下に注射し。コントロール群におけるマウスには、正常なヒトＩｇＧを同じ投薬量で注射した。関節炎の進行を、関節炎の臨床スコアを使用して測定した。Ｔ３により処置されたマウスにおける関節炎の重篤度がコントロールマウスにおける重篤度よりも著しく小さいこと、および、臨床スコアにおける有意な違い（Ｐ＜０．０１）がこれら２つの群の間において認められたこと（図６）が示された。
【００３４】
まとめると、本発明の最適化されたＴＡＣＩ−Ｆｃ融合タンパク質は発現過程におけるタンパク質の分解を妨げ、より強力な生物学的活性を有し、かつ、高いタンパク質発現レベルを示し、従って、本発明の最適化されたＴＡＣＩ−Ｆｃ融合タンパク質は大規模な工業的製造において使用することができる。
【図１】
2010529967.tif 000002
【図２】
2010529967.tif 000003
【図３】
2010529967.tif 000004
【図４】
2010529967.tif 000005
【図５】
2010529967.tif 000006
【図６】
2010529967.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成21年3月2日(2009.3.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
短縮化されたＴＡＣＩと、免疫グロブリンのＦｃとから構成される融合タンパク質であって、融合タンパク質のＴＡＣＩ部分が、ＴＡＣＩ由来の13位のアミノ酸残基から始まる細胞外領域のアミノ末端領域の配列、ＴＡＣＩ由来のシステインリッチ領域の全配列、および、ＴＡＣＩ由来の柄領域の部分配列を含み、融合タンパク質の免疫グロブリンＦｃ部分が、ヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を含み、かつ、ＴＡＣＩ部分およびＦｃ部分が直接的またはリンカー配列を介してのどちらかで融合されることを特徴とする、融合タンパク質。
【請求項２】
前記ＴＡＣＩ部分が、ＴＡＣＩの１３位〜１０８位のアミノ酸および１３位〜１１８位のアミノ酸からなる群から選択され、前記リンカー配列が９Ｇｌｙであり、かつ、前記免疫グロブリンＦｃ部分が、それぞれのすべてのイソ型を含めて、ヒトまたは動物の免疫グロブリンＩｇＧ、免疫グロブリンＩｇＭ、免疫グロブリンＩｇＤおよび免疫グロブリンＩｇＡのＦｃに由来することを特徴とする、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記免疫グロブリンＦｃ部分がＩｇＧ１に由来することを特徴とする、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
融合タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号１〜配列番号３に示される配列から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
請求項１に記載される融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列。
【請求項６】
配列番号５〜配列番号７に示される配列であることを特徴とする、請求項５に記載のＤＮＡ配列。
【請求項７】
請求項５に記載されるＤＮＡ配列を含むベクター。
【請求項８】
請求項１に記載される対応する融合タンパク質の発現のために使用され、かつ、真核生物細胞または原核生物細胞から選択される、請求項７に記載されるベクターを含む細胞。
【請求項９】
ＢＬｙＳまたはＡＰＲＩＬを阻止するための医薬品の製造における、請求項１に記載される融合タンパク質の使用。
【請求項１０】
請求項１に記載される融合タンパク質を含む医薬組成物。
【国際調査報告】
2010529967.tif 000008
2010529967.tif 000009
2010529967.tif 000010
2010529967.tif 000011
2010529967.tif 000012
2010529967.tif 000013
2010529967.tif 000014
2010529967.tif 000015