(57)【要約】  本発明は、IL-33特異的結合性ポリペプチドおよび、IL-33特異的結合性ポリペプチド、例えば、抗体および単量体/多量体ドメインポリペプチドを含む組成物を包含する。本発明はまた、喘息等の疾患および障害を治療するためにIL-33特異的結合性ポリペプチドを用いる方法を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症性障害の治療方法であって:
抗体、単量体ドメインポリペプチド、または多量体ドメインポリペプチドを含むIL-33特異的結合性組成物を被験体に投与するステップを含む、方法。
【請求項２】
炎症性障害が喘息である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
単量体ドメインがフィブロネクチン足場を含む、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
多量体ドメインポリペプチドの少なくとも1個の単量体ドメインがフィブロネクチン足場を含む、請求項１または２記載の方法。
【請求項５】
フィブロネクチン足場がフィブロネクチン3足場である、請求項３記載の方法。
【請求項６】
フィブロネクチン足場がフィブロネクチン3足場である、請求項４記載の方法。
【請求項７】
IL-33特異的結合性組成物が被験体の肺におけるIL-5レベルを減少させる、請求項２記載の方法。
【請求項８】
IL-33特異的結合性組成物が被験体の肺におけるIL-13レベルを減少させる、請求項２記載の方法。
【請求項９】
IL-33特異的結合性組成物が被験体の肺におけるロイコトリエンレベルを減少させる、請求項２記載の方法。
【請求項１０】
IL-33特異的結合性組成物が被験体の肺におけるマクロファージ活性化を減少させる、請求項２記載の方法。
【請求項１１】
IL-33特異的結合性組成物が被験体の血清におけるマクロファージ活性化を減少させる、請求項２記載の方法。
【請求項１２】
IL-33特異的結合性組成物が被験体の気道過敏性を減少させる、請求項２記載の方法。
【請求項１３】
被験体がヒトである、請求項２記載の方法。
【請求項１４】
IL-33特異的結合性組成物ではない治療物質を投与するステップをさらに含む、請求項１または請求項２記載の方法。
【請求項１５】
IL-33特異的ポリペプチドを含む組成物であって、IL-33特異的ポリペプチドが、抗体、単量体ドメインポリペプチド、または多量体ドメインポリペプチドである、組成物。
【請求項１６】
ポリペプチドが単量体ドメインポリペプチドである、請求項１５記載の組成物。
【請求項１７】
ポリペプチドが多量体ドメインポリペプチドである、請求項１５記載の組成物。
【請求項１８】
単量体ドメインがフィブロネクチン足場を含む、請求項１６記載の組成物。
【請求項１９】
多量体ドメインが、フィブロネクチン足場を含む少なくとも1つの単量体ドメインを含む、請求項１７記載の組成物。
【請求項２０】
フィブロネクチン足場がフィブロネクチン3足場である、請求項１８記載の組成物。
【請求項２１】
フィブロネクチン足場がフィブロネクチン3足場である、請求項１９記載の組成物。
【請求項２２】
滅菌されている、請求項１５記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の属する分野
本発明はIL-33および炎症性疾患に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
本発明は、IL-33特異的結合性ポリペプチドおよび、IL-33特異的結合性ポリペプチドを含む組成物を包含する。IL-33特異的結合性ポリペプチドは、抗体、単量体ドメインポリペプチド、または多量体ドメインポリペプチドであってよい。前記ポリペプチドおよび、前記ポリペプチドを含む組成物は炎症性疾患、例えば喘息の治療に有用である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
発明の要旨
本発明の一実施形態は炎症性障害を治療するための方法を包含する。IL-33特異的結合性組成物を被験体に投与する。IL-33特異的結合性組成物は、抗体、単量体ドメインポリペプチド、または多量体ドメインポリペプチドを含んでよい。
【０００４】
本発明の別の実施形態は、IL-33特異的ポリペプチドを含む組成物を包含する。IL-33特異的ポリペプチドは、抗体、単量体ドメインポリペプチド、または多量体ドメインポリペプチドである。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】図１Ａ〜Ｄ: IL-33は、IL-6産生によって測定された場合、マウスBMMCの強力なアクチベーターである。(Ａ) IL-33は、他の刺激、例えば、IgE受容体架橋またはLPSと比較して強力な応答を誘発する; (Ｂ) T1/ST2抗体はIL-33によって刺激された細胞によるIL-6産生を阻害する; (Ｃ) IL-33はIgE受容体架橋と相乗的に作用すると思われるが、TLRリガンドの存在下では明らかに効果を有さない; (Ｄ) IL-33によって誘発されるサイトカイン産生はMyD88依存的である; IL-33はMyD88欠損マウス由来のBMMCに対して効果を有さない。結果を平均±SEMとして表記する。
【図２】図２Ａ〜Ｂ: IL-33の活性化は、IL-6に加えて種々の炎症性メディエーターを誘導する。(Ａ) IL-33単独(赤色)により、またはIgE受容体架橋(青色)との相乗作用によって誘導されたサイトカインおよびケモカイン(↑は誘導を示し、←→は誘導なしを示す) (Ｂ) IL-33の活性化によるシステイニルロイコトリエンの時間依存的誘導。結果を平均±SEMとして表記する。
【図３】図３: IL-33は脱顆粒を誘発しないようである。結果を平均±SEMとして表記する。
【図４】図４Ａ〜Ｄ: IL-33はナイーブマウスにおいてAHRを誘発する。BALB/cマウスをIL-33 (赤線)、IL-13 (青線)、またはPBS (黒線)で鼻腔内(i.n.)処置した。4または24時間後にAHRを評価した。(Ａ) 4時間の時点でのPenhに関するメタコリン用量応答曲線; (Ｂ) 24時間の時点でのPenhに関するメタコリン用量応答曲線; (Ｃ) 気道抵抗; および(Ｄ) コンプライアンス。結果を平均±SEMとして表記する(PBS n=6, IL-13 & IL-33 n=8マウス/群)。それぞれのPBSとIL-33処置マウス間およびPBSとIL-13処置マウス間の有意差を*P<0.05 - P<0.01として示す。
【図５】図5Ａ〜Ｄ: IL-33はマウス肺において、IL-5、IL-13およびムチン遺伝子Gob-5およびMUC5ACのmRNA発現を誘導する。IL-33は、(Ａ) IL-5; (Ｂ) IL-13; (Ｃ) GOB5; および(Ｄ) MUC5ACの有意な発現を誘導する。IL-13は、ムチン遺伝子、(Ｃ) GOB5; および(Ｄ) MUC5ACを有意に上方制御する。結果を平均±SEMとして表記する(PBS n=6, IL-13 & IL-33 n=8マウス/群)。それぞれのPBSおよびIL-33処置マウス間ならびにPBSおよびIL-13処置マウス間の有意差を*P<0.05 - P<0.01として示す。
【図６】図６Ａ〜Ｂ: IL-33はmMCP-1の誘導によって示されるように肥満細胞を直接活性化する。IL-33は、(Ａ) 肺組織; および(Ｂ) 血清においてともにmMCP-1の有意な上方制御を誘導したが、IL-13はそのような効果を示さなかった。結果を平均±SEMとして表記する(PBS n=6, IL-13 & IL-33 n=8マウス/群)。それぞれのPBSとIL-33処置マウス間およびPBSとIL-13処置マウス間の有意差を*P<0.05 - P<0.01として示す。
【図７】図７Ａ〜Ｅ: IL-33はヒト臍帯血由来肥満細胞(HMC)を活性化する。無処置(白抜きバー)、IL-33刺激(赤色バー)、IgE受容体架橋(黒色バー)およびIL-33 + IgE受容体架橋(青色バー)由来のHMC上清を指定の時点で採取し、ELISAによってアッセイした。HMCをIL-33によって刺激すると、無処置細胞と比較して、(Ａ) IL-5および(Ｂ) IL-13産生が誘発された。興味深いことに、IL-33 + IgE受容体架橋は、これらの細胞からの(Ａ) IL-5、(Ｂ) IL-13、および(Ｃ) TNF-アルファの産生を顕著に増強した。IL-33はまた、(Ｄ) PGD2および(Ｅ) PGE2産生を誘発した。結果を平均±SEMとして表記する。
【図８ａ−ｄ】図８ａ〜８ｆ:  IL-33はマウスおよびヒト肥満細胞の強力なアクチベーターである。BMMCをIL-33 (.1- 100 ng/ml)の4点用量応答曲線で6および24時間刺激した。24時間の時点でIL-6 (ａ; 白抜きカラム)、IL-13 (ａ; 黒カラム)、CysLT (ｂ; 白抜きカラム)に関して、および6時間の時点でPGD2 (ｂ; 黒カラム)に関してBMMC上清を分析した。(ｃ) IL-33は、MyD88依存的であるがTRIF非依存的様式でIL-6産生を媒介する。野生型由来のBMMC、MyD88-/-、またはTRIF-/- BMMCを、IL-33 (10 ng/ml)またはIL-1b (10 ng/ml)によって、またはIgER架橋(CL)と組み合わせて刺激した。24時間の刺激後、IL-6のレベルをELISAによって評価した。(ｄ) IL-33 (.1- 100 ng/ml)またはIgER架橋での90分の刺激後にマウス肥満細胞プロテアーゼ-1 (mMCP-1)レベルに関してBMMC上清を評価した。(ｅ) IL-33はIgE受容体架橋と相乗的に作用するようである。BMMCは、IgER架橋と組み合わせたIL-33 (.1- 100 ng/ml)で相乗的に活性化された。IL-6 (白抜きカラム)、IL-13 (黒カラム)、およびCysLT (斜線カラム)に関して上清を分析した。(ｆ) HMCをIL-33 (10 ng/ml)で24時間刺激するか(白抜きカラム)、または刺激しなかった(黒カラム)。HMC上清をIL-5、IL-13、CysLT、およびPGD2に関して分析した。HMCの結果は、異なるバッチの細胞を用いて得られる2つの独立した実験を代表するものである。BMMCの結果は、異なるバッチの細胞を用いて得られる3つの独立した実験を代表するものである。すべてのデータを平均±SEMとして表記する。
【図８ｅ−ｆ】図８ａ〜８ｆ:  IL-33はマウスおよびヒト肥満細胞の強力なアクチベーターである。BMMCをIL-33 (.1- 100 ng/ml)の4点用量応答曲線で6および24時間刺激した。24時間の時点でIL-6 (ａ; 白抜きカラム)、IL-13 (ａ; 黒カラム)、CysLT (ｂ; 白抜きカラム)に関して、および6時間の時点でPGD2 (ｂ; 黒カラム)に関してBMMC上清を分析した。(ｃ) IL-33は、MyD88依存的であるがTRIF非依存的様式でIL-6産生を媒介する。野生型由来のBMMC、MyD88-/-、またはTRIF-/- BMMCを、IL-33 (10 ng/ml)またはIL-1b (10 ng/ml)によって、またはIgER架橋(CL)と組み合わせて刺激した。24時間の刺激後、IL-6のレベルをELISAによって評価した。(ｄ) IL-33 (.1- 100 ng/ml)またはIgER架橋での90分の刺激後にマウス肥満細胞プロテアーゼ-1 (mMCP-1)レベルに関してBMMC上清を評価した。(ｅ) IL-33はIgE受容体架橋と相乗的に作用するようである。BMMCは、IgER架橋と組み合わせたIL-33 (.1- 100 ng/ml)で相乗的に活性化された。IL-6 (白抜きカラム)、IL-13 (黒カラム)、およびCysLT (斜線カラム)に関して上清を分析した。(ｆ) HMCをIL-33 (10 ng/ml)で24時間刺激するか(白抜きカラム)、または刺激しなかった(黒カラム)。HMC上清をIL-5、IL-13、CysLT、およびPGD2に関して分析した。HMCの結果は、異なるバッチの細胞を用いて得られる2つの独立した実験を代表するものである。BMMCの結果は、異なるバッチの細胞を用いて得られる3つの独立した実験を代表するものである。すべてのデータを平均±SEMとして表記する。
【図９ａ−ｄ】図９ａ〜９ｅ:  IL-33の投与はナイーブマウスにおいてAHRを誘発した。1 (黒三角)または3用量(黒丸)の組換えIL-33またはPBS (黒四角)をナイーブBALB/cマウスに鼻腔内送達した。麻酔し、気管開口した(tracheostomised)マウスにおいて、flexivent系を使用して、1日後および3日後の、メタコリンの濃度の増加に応答した、肺抵抗(ａ)、エラスタンス(ｂ)、組織抵抗(G; ｃ)、組織エラスタンス(H; ｄ)および気道のニュートン抵抗(Rn, ｅ)の変化を測定することによってAHRを評価した。データを平均±SEMとして表記する(n=6-11マウス/群; PBS処置マウスと比較して*p<0.05 (二元配置ANOVA)である)。
【図９ｅ】図９ａ〜９ｅ:  IL-33の投与はナイーブマウスにおいてAHRを誘発した。1 (黒三角)または3用量(黒丸)の組換えIL-33またはPBS (黒四角)をナイーブBALB/cマウスに鼻腔内送達した。麻酔し、気管開口した(tracheostomised)マウスにおいて、flexivent系を使用して、1日後および3日後の、メタコリンの濃度の増加に応答した、肺抵抗(ａ)、エラスタンス(ｂ)、組織抵抗(G; ｃ)、組織エラスタンス(H; ｄ)および気道のニュートン抵抗(Rn, ｅ)の変化を測定することによってAHRを評価した。データを平均±SEMとして表記する(n=6-11マウス/群; PBS処置マウスと比較して*p<0.05 (二元配置ANOVA)である)。
【図１０ａ−ｄ】図１０ａ〜１０ｆ:  IL-33の投与はナイーブマウスにおいてTh2型炎症を誘発した。1 (ハッチングバー)、2 (ストライプバー)または3 (黒色バー)用量のIL-33またはPBS (白抜きバー)をナイーブマウスに鼻腔内送達し、投与後1、2および3日目に肺炎症を評価した。気道内腔(ａ; トータル、好中球(eo)、マクロファージ(mac)、好中球(neut):*p<0.0001; リンパ球(lymph):*p=0.0014)および肺組織(ｂ; トータル、eo、mac、neut:*p<0.0001; lymph:*p=0.0003)から白血球を単離し、表現型を決定した(phenotyped)。肺組織においてTaqmanによってムチン関連遺伝子MUC5acおよびGob-5 (ｃ)の発現を評価し、GAPDHと比較して表記した(MUC5ac 1用量:*p=0.003; 2および3用量:*p<0.0001; Gob-5:*p<0.0001)。CD4 T細胞(ｄ; 1用量:*p=0.0486; 2用量:*p=0.0006; 3用量:*p<0.0001)およびCD4/T1/ST2 T細胞(ｅ; 1用量:*p=0.006; 2用量:*p=0.0001; 3用量:*p<0.0001)の数をフローサイトメトリー分析によって定量した。血清中のmMCP-1レベルを定量することによって肥満細胞活性化(ｆ; 1用量:*p=0.0212; 2および3用量:*p<0.0001)を決定した。データを平均±SEMとして表記する(n=8-30マウス/群; PBS処置マウスと比較して*p<0.05 (マン・ホイットニーU検定)である)。
【図１０ｅ−ｆ】図１０ａ〜１０ｆ:  IL-33の投与はナイーブマウスにおいてTh2型炎症を誘発した。1 (ハッチングバー)、2 (ストライプバー)または3 (黒色バー)用量のIL-33またはPBS (白抜きバー)をナイーブマウスに鼻腔内送達し、投与後1、2および3日目に肺炎症を評価した。気道内腔(ａ; トータル、好中球(eo)、マクロファージ(mac)、好中球(neut):*p<0.0001; リンパ球(lymph):*p=0.0014)および肺組織(ｂ; トータル、eo、mac、neut:*p<0.0001; lymph:*p=0.0003)から白血球を単離し、表現型を決定した(phenotyped)。肺組織においてTaqmanによってムチン関連遺伝子MUC5acおよびGob-5 (ｃ)の発現を評価し、GAPDHと比較して表記した(MUC5ac 1用量:*p=0.003; 2および3用量:*p<0.0001; Gob-5:*p<0.0001)。CD4 T細胞(ｄ; 1用量:*p=0.0486; 2用量:*p=0.0006; 3用量:*p<0.0001)およびCD4/T1/ST2 T細胞(ｅ; 1用量:*p=0.006; 2用量:*p=0.0001; 3用量:*p<0.0001)の数をフローサイトメトリー分析によって定量した。血清中のmMCP-1レベルを定量することによって肥満細胞活性化(ｆ; 1用量:*p=0.0212; 2および3用量:*p<0.0001)を決定した。データを平均±SEMとして表記する(n=8-30マウス/群; PBS処置マウスと比較して*p<0.05 (マン・ホイットニーU検定)である)。
【図１１ａ−ｄ】図１１ａ〜１１ｆ:  AHRの誘発はCD4細胞依存的ではなかった。IL-33の投与前にCD4に対する枯渇抗体でマウスを処置し、3日後にAHRおよび炎症を評価した。トータルCD4枯渇をフローサイトメトリー分析によって確認した(ａ〜ｂ; CD4:*p=0.0043, マン・ホイットニーU検定; CD4/T1ST2:*p=0.0022, マン・ホイットニーU検定)。メタコリンの濃度の増加に応答した抵抗(ｃ; *p<0.05;#p<0.05, 二元配置ANOVA)およびエラスタンス(ｄ; p<0.05;#p<0.05, 二元配置ANOVA)の変化を測定することによってAHRを評価した。肺組織への白血球動員(ｅ; トータル:*p=0.0022, #p=0.0002; Eo:*p=0.0022, #p=0.0002; Mac:*p=0.0260, #p=0.0003; Lymph:*p=0.0649, #p=0.0002; Neut:*p=0.0022, #p=0.0003, マン・ホイットニーU検定)を、以前に記載されるように評価した。mMCP-1の血清レベルを定量することによって肥満細胞活性化(ｆ)を決定した(*p=0.0009, #p=0.0001, マン・ホイットニーU検定)。データを平均±SEMとして表記する(n=6-18マウス/群; PBS + Ig処置マウス(白色バー/黒四角)と比較されたIL-33 +Ig処置マウス(黒丸/黒色バー)は*p<0.05であり; PBS + 抗CD4処置マウス(灰色バー/白四角)と比較されたIL-33 + 抗CD4処置マウス(スラッシュバー/白丸)は#p<0.05である)。
【図１１ｅ−ｆ】図１１ａ〜１１ｆ:  AHRの誘発はCD4細胞依存的ではなかった。IL-33の投与前にCD4に対する枯渇抗体でマウスを処置し、3日後にAHRおよび炎症を評価した。トータルCD4枯渇をフローサイトメトリー分析によって確認した(ａ〜ｂ; CD4:*p=0.0043, マン・ホイットニーU検定; CD4/T1ST2:*p=0.0022, マン・ホイットニーU検定)。メタコリンの濃度の増加に応答した抵抗(ｃ; *p<0.05;#p<0.05, 二元配置ANOVA)およびエラスタンス(ｄ; p<0.05;#p<0.05, 二元配置ANOVA)の変化を測定することによってAHRを評価した。肺組織への白血球動員(ｅ; トータル:*p=0.0022, #p=0.0002; Eo:*p=0.0022, #p=0.0002; Mac:*p=0.0260, #p=0.0003; Lymph:*p=0.0649, #p=0.0002; Neut:*p=0.0022, #p=0.0003, マン・ホイットニーU検定)を、以前に記載されるように評価した。mMCP-1の血清レベルを定量することによって肥満細胞活性化(ｆ)を決定した(*p=0.0009, #p=0.0001, マン・ホイットニーU検定)。データを平均±SEMとして表記する(n=6-18マウス/群; PBS + Ig処置マウス(白色バー/黒四角)と比較されたIL-33 +Ig処置マウス(黒丸/黒色バー)は*p<0.05であり; PBS + 抗CD4処置マウス(灰色バー/白四角)と比較されたIL-33 + 抗CD4処置マウス(スラッシュバー/白丸)は#p<0.05である)。
【図１２ａ−ｄ】図１２ａ〜１２ｅ:  肥満細胞欠損マウスはIL-33誘導AHRから保護された。IL-33を野生型および肥満細胞欠損(KitW-sh/W-sh)マウスに鼻腔内送達し、3日後にAHRおよび炎症を評価した。メタコリンの濃度の増加に応答した、抵抗(ａ; *p<0.001, 二元配置ANOVA)およびエラスタンス(ｂ; *p<0.01, #p<0.01, 二元配置ANOVA)の変化を測定することによってAHRを評価した。IL-13 (ｃ; *p=0.0111, #p=0.0006, マン・ホイットニーU検定)、ならびにPGD2およびロイコトリエン(ｄ; PGD2:*p<0.0001, #p=0.0012; LTs:*p<0.0001, #p<0.0255, マン・ホイットニーU検定)の発現をBAL上清(supernatent)中でELISAによって決定した。血清mMCP-1レベルをELISAによって定量した(ｅ; *p<0.0001, マン・ホイットニーU検定)。データを平均±SEMとして表記する(2-3回の独立した実験由来のn=6-18マウス/群; PBS処置マウス(黒四角/白抜きバー)と比較されたWT IL-33処置マウス(黒丸/黒色バー)は*p<0.05であり; PBS処置マウス(白四角/スポットバー)と比較されたKitW-sh/W-sh IL-33処置マウス(白丸/スラッシュバー)は#p<0.05である)。
【図１２ｅ】図１２ａ〜１２ｅ:  肥満細胞欠損マウスはIL-33誘導AHRから保護された。IL-33を野生型および肥満細胞欠損(KitW-sh/W-sh)マウスに鼻腔内送達し、3日後にAHRおよび炎症を評価した。メタコリンの濃度の増加に応答した、抵抗(ａ; *p<0.001, 二元配置ANOVA)およびエラスタンス(ｂ; *p<0.01, #p<0.01, 二元配置ANOVA)の変化を測定することによってAHRを評価した。IL-13 (ｃ; *p=0.0111, #p=0.0006, マン・ホイットニーU検定)、ならびにPGD2およびロイコトリエン(ｄ; PGD2:*p<0.0001, #p=0.0012; LTs:*p<0.0001, #p<0.0255, マン・ホイットニーU検定)の発現をBAL上清(supernatent)中でELISAによって決定した。血清mMCP-1レベルをELISAによって定量した(ｅ; *p<0.0001, マン・ホイットニーU検定)。データを平均±SEMとして表記する(2-3回の独立した実験由来のn=6-18マウス/群; PBS処置マウス(黒四角/白抜きバー)と比較されたWT IL-33処置マウス(黒丸/黒色バー)は*p<0.05であり; PBS処置マウス(白四角/スポットバー)と比較されたKitW-sh/W-sh IL-33処置マウス(白丸/スラッシュバー)は#p<0.05である)。
【図１３ａ−ｅ】図１３ａ〜１３ｈ:  オボアルブミン(黒色バー)および偽(白抜きバー)感作およびチャレンジマウスにおいて最終チャレンジの1.5〜24時間後に、肺組織ホモジネート上清中のIL-33タンパク質レベルをELISAによって測定した(ａ; 1.5h, 3h, 6h:*p=0.0002; 24h:*p<0.0001, マン・ホイットニーU検定, 1-2回の独立した実験由来のn=14-17マウス/群)。(ｂ〜ｇ; 気道上皮におけるIL-33免疫反応性は細胞核に限定され、強く染色された基底細胞核と円柱上皮細胞のあまり強くない染色の間には明らかな区別がある。点在する染色されなかった上皮細胞(ｂの挿入図およびｃの上部に例示される)がよく観察された。上皮下組織には、厳密に核が染色されているIL-33+内皮細胞(ｃの矢尻)が、粒状の外観を有する細胞質の免疫反応性を示す点在する細胞(ｃおよびｄのアステリスク)とともに含まれた。これは、主要な抗体が除外されているコントロール切片には存在しない現象であった(ｅ)。二重免疫蛍光では、トリプターゼ陽性肥満細胞中に存在するIL-33+顆粒が示された(ｆ)。ｄに示されるように、概して肥満細胞中のいくらかのフラクションの顆粒のみがIL-33染色を示した(ｇ)。スケールバー: ｃ 40μm, ｄ〜ｇ 12μm。喘息肺切片の免疫染色によって肥満細胞がIL-33の潜在的供給源として関係付けられたので、マウスBMMCをそれに沿って刺激し、IL-33 mRNA発現に関してサンプルを分析した。IL-33はIgE受容体活性化BMMC中で検出されなかったが、IgE受容体活性化+ IL-33刺激細胞では、mRNA発現の、時間関連の増加が検出された。この増加は90分および4時間の時点で観察されたが、24時間までに消失していた。このことは肥満細胞におけるIL-33の新規合成を示唆する(ｈ)。
【図１３ｆ−ｈ】図１３ａ〜１３ｈ:  オボアルブミン(黒色バー)および偽(白抜きバー)感作およびチャレンジマウスにおいて最終チャレンジの1.5〜24時間後に、肺組織ホモジネート上清中のIL-33タンパク質レベルをELISAによって測定した(ａ; 1.5h, 3h, 6h:*p=0.0002; 24h:*p<0.0001, マン・ホイットニーU検定, 1-2回の独立した実験由来のn=14-17マウス/群)。(ｂ〜ｇ; 気道上皮におけるIL-33免疫反応性は細胞核に限定され、強く染色された基底細胞核と円柱上皮細胞のあまり強くない染色の間には明らかな区別がある。点在する染色されなかった上皮細胞(ｂの挿入図およびｃの上部に例示される)がよく観察された。上皮下組織には、厳密に核が染色されているIL-33+内皮細胞(ｃの矢尻)が、粒状の外観を有する細胞質の免疫反応性を示す点在する細胞(ｃおよびｄのアステリスク)とともに含まれた。これは、主要な抗体が除外されているコントロール切片には存在しない現象であった(ｅ)。二重免疫蛍光では、トリプターゼ陽性肥満細胞中に存在するIL-33+顆粒が示された(ｆ)。ｄに示されるように、概して肥満細胞中のいくらかのフラクションの顆粒のみがIL-33染色を示した(ｇ)。スケールバー: ｃ 40μm, ｄ〜ｇ 12μm。喘息肺切片の免疫染色によって肥満細胞がIL-33の潜在的供給源として関係付けられたので、マウスBMMCをそれに沿って刺激し、IL-33 mRNA発現に関してサンプルを分析した。IL-33はIgE受容体活性化BMMC中で検出されなかったが、IgE受容体活性化+ IL-33刺激細胞では、mRNA発現の、時間関連の増加が検出された。この増加は90分および4時間の時点で観察されたが、24時間までに消失していた。このことは肥満細胞におけるIL-33の新規合成を示唆する(ｈ)。
【図１４ａ−ｄ】図１４ａ〜１４ｅ:  (ａ) 24時間の時点のBMMCからのIL-6産生に関して、IL-33は、IgER CL (斜線カラム)、LPS (チェックカラム)、およびPam3CSK4刺激(シェードカラム)と比較して強力な応答(黒色カラム)を誘発する。(ｂ) T1/ST2抗体はIL-6およびIL-13の産生を阻害する。BMMCをT1/ST2抗体(1-10 ug/ml)と30分プレインキュベートした後、IL-33 (.01 ng/ml)を加えた。(ｃ) IL-33のみ(黒色カラム)またはIgER CL (チェックカラム)との組み合わせはヒスタミン産生を増強しなかった。(ｄ) BMMCにおけるmMCP-1の発現は、10 ng/mlのIL-33 (黒色カラム)で刺激されると、1.5時間で開始されて4時間で最大誘導に達する時間経過様式で上方制御された。(ｅ) IgER CLあり(チェックカラム)またはなし(黒色カラム)でIL-33への曝露の24時間後に、HMCの培養上清中のIL-5レベルおよびIL-13レベルをELISAによって測定した。IL-33なしでIgER CLによって24時間刺激されたHMC由来の上清を斜線カラムとして示す。HMCの結果は、異なるバッチの細胞を用いて得られる2つの独立した実験を代表するものである。BMMCの結果は、異なるバッチの細胞を用いて得られる2つの独立した実験を代表するものである。すべてのデータを平均±SEMとして表記する。
【図１４ｅ】図１４ａ〜１４ｅ:  (ａ) 24時間の時点のBMMCからのIL-6産生に関して、IL-33は、IgER CL (斜線カラム)、LPS (チェックカラム)、およびPam3CSK4刺激(シェードカラム)と比較して強力な応答(黒色カラム)を誘発する。(ｂ) T1/ST2抗体はIL-6およびIL-13の産生を阻害する。BMMCをT1/ST2抗体(1-10 ug/ml)と30分プレインキュベートした後、IL-33 (.01 ng/ml)を加えた。(ｃ) IL-33のみ(黒色カラム)またはIgER CL (チェックカラム)との組み合わせはヒスタミン産生を増強しなかった。(ｄ) BMMCにおけるmMCP-1の発現は、10 ng/mlのIL-33 (黒色カラム)で刺激されると、1.5時間で開始されて4時間で最大誘導に達する時間経過様式で上方制御された。(ｅ) IgER CLあり(チェックカラム)またはなし(黒色カラム)でIL-33への曝露の24時間後に、HMCの培養上清中のIL-5レベルおよびIL-13レベルをELISAによって測定した。IL-33なしでIgER CLによって24時間刺激されたHMC由来の上清を斜線カラムとして示す。HMCの結果は、異なるバッチの細胞を用いて得られる2つの独立した実験を代表するものである。BMMCの結果は、異なるバッチの細胞を用いて得られる2つの独立した実験を代表するものである。すべてのデータを平均±SEMとして表記する。
【図１５】図１５:  IL-33はBMMCによる種々のメディエーターの分泌を誘発する。BMMCをIL-33 (10 ng/ml)、IgER CL、または組み合わせで24時間刺激した。データを平均±SEMとして表記する。
【図１６】図１６ａ〜１６ｂ:  IL-33はTh2サイトカインの発現を誘発した。1 (ハッチングバー)、2 (ストライプバー)または3 (黒色バー)用量のIL-33またはPBS (白抜きバー)をナイーブマウスに鼻腔内送達し、投与後1、2および3日目に肺炎症を評価した。Th2サイトカインIL-5 (ａ; *p<0.0001)およびIL-13 (ｂ; *p<0.0001)の発現をTaqmanによって評価した。データをGAPDHと比較した平均相対発現±SEMとして表記する(n=8-17マウス/群, PBS処置マウスと比較して*p<0.05 (マン・ホイットニーU検定)である)。
【図１７】図１７ａ〜１７ｃ:  3用量のIL-33によって誘発されたAHRはCD4細胞依存的ではなかった。IL-33の投与前にCD4に対する枯渇抗体でマウスを処置し、3日後にAHRを評価した。メタコリンの濃度の増加に応答した、組織抵抗(G; ａ)、組織エラスタンス(H; ｂ)、および気道のニュートン抵抗(Rn; ｃ)の変化を測定することによってAHRを評価した。データを平均±SEMとして表記する(n=6-18マウス/群; PBS + Ig処置マウス(黒四角)と比較されたIL-33 +Ig処置マウス(黒丸)は*p<0.05であり; PBS + 抗CD4処置マウス(白四角)と比較されたIL-33 + 抗CD4処置マウス(白丸)は#p<0.05である(二元配置ANOVA))。
【図１８ａ−ｄ】図１８ａ〜１８ｅ:  1用量のIL-33によって誘発されたAHRはCD4細胞依存的ではなかった。IL-33の投与前にCD4に対する枯渇抗体でマウスを処置し、1日後にAHRを評価した。メタコリンの濃度の増加に応答した、抵抗(ａ)、エラスタンス(ｂ)、組織抵抗(G; ｃ)、組織エラスタンス(H; ｄ)、および気道のニュートン抵抗(ｅ Rn)の変化を測定することによってAHRを評価した。データを平均±SEMとして表記する(n=6-18マウス/群; PBS + Ig処置マウス(黒四角)と比較されたIL-33 +Ig処置マウス(黒三角)は*p<0.05であり; PBS + 抗CD4処置マウス(白四角)と比較されたIL-33 + 抗CD4処置マウス(白三角)は#p<0.05である(二元配置ANOVA))。
【図１８ｅ】図１８ａ〜１８ｅ:  1用量のIL-33によって誘発されたAHRはCD4細胞依存的ではなかった。IL-33の投与前にCD4に対する枯渇抗体でマウスを処置し、1日後にAHRを評価した。メタコリンの濃度の増加に応答した、抵抗(ａ)、エラスタンス(ｂ)、組織抵抗(G; ｃ)、組織エラスタンス(H; ｄ)、および気道のニュートン抵抗(ｅ Rn)の変化を測定することによってAHRを評価した。データを平均±SEMとして表記する(n=6-18マウス/群; PBS + Ig処置マウス(黒四角)と比較されたIL-33 +Ig処置マウス(黒三角)は*p<0.05であり; PBS + 抗CD4処置マウス(白四角)と比較されたIL-33 + 抗CD4処置マウス(白三角)は#p<0.05である(二元配置ANOVA))。
【図１９ａ−ｃ】図１９ａ〜１９ｅ:  IL-33によって誘発された炎症はCD4細胞依存的ではなかった。IL-33の投与前にCD4に対する枯渇抗体でマウスを処置し、IL-33の最終投与の1日後に炎症を評価した。気道内腔から白血球を単離し、表現型を決定した(ａ; トータル:*p=0.0087, #p=0.0012; Eo:*p=0.026, #p=0.0037; Mac:*p=0.026, #p=0.0037; Lymph:*p=0.0260; Neut:*p=0.0152, #p=0.0003)。ムチン関連遺伝子(ｂ; MUC5ac:*p=0.0009, #p=0.0001; Gob-5:*p=0.0009, #p=0.0001)およびIL-13 (ｃ; *p=0.0009, #p=0.0001)発現をTaqmanによって評価した。IL-13タンパク質レベルをBAL上清(ｄ; *p=0.0009, #p=0.0002)および肺組織ホモジネート上清(ｅ; *p=0.0011, #p=0.0001)中で決定した。データを平均±SEMとして表記する(n=6-18マウス/群; PBS + Ig処置マウス(白抜きバー)と比較されたIL-33 +Ig処置マウス(黒色バー)は*p<0.05であり; PBS + 抗CD4処置マウス(灰色バー)と比較されたIL-33 + 抗CD4処置マウス(スラッシュバー)は#p<0.05である(マン・ホイットニーU検定))。
【図１９ｄ−ｅ】図１９ａ〜１９ｅ:  IL-33によって誘発された炎症はCD4細胞依存的ではなかった。IL-33の投与前にCD4に対する枯渇抗体でマウスを処置し、IL-33の最終投与の1日後に炎症を評価した。気道内腔から白血球を単離し、表現型を決定した(ａ; トータル:*p=0.0087, #p=0.0012; Eo:*p=0.026, #p=0.0037; Mac:*p=0.026, #p=0.0037; Lymph:*p=0.0260; Neut:*p=0.0152, #p=0.0003)。ムチン関連遺伝子(ｂ; MUC5ac:*p=0.0009, #p=0.0001; Gob-5:*p=0.0009, #p=0.0001)およびIL-13 (ｃ; *p=0.0009, #p=0.0001)発現をTaqmanによって評価した。IL-13タンパク質レベルをBAL上清(ｄ; *p=0.0009, #p=0.0002)および肺組織ホモジネート上清(ｅ; *p=0.0011, #p=0.0001)中で決定した。データを平均±SEMとして表記する(n=6-18マウス/群; PBS + Ig処置マウス(白抜きバー)と比較されたIL-33 +Ig処置マウス(黒色バー)は*p<0.05であり; PBS + 抗CD4処置マウス(灰色バー)と比較されたIL-33 + 抗CD4処置マウス(スラッシュバー)は#p<0.05である(マン・ホイットニーU検定))。
【図２０】図２０ａ〜２０ｃ。3用量のIL-33によって誘発されるAHRは肥満細胞欠損マウスにおいて大きく減少した。WTおよびKitW-sh/W-shマウスを3鼻腔内用量のIL-33で処置し、最終投与の1日後にAHRを評価した。メタコリンの濃度の増加に応答した、組織抵抗(G; ａ)、組織エラスタンス(H; ｂ)、および気道のニュートン抵抗(ｃ; Rn)の変化を測定することによってAHRを評価した。データを平均±SEMとして表記する(3回の独立した実験由来のn=16-22マウス/群; PBS処置マウス(黒四角)と比較されたWT IL-33処置マウス(黒丸)は*p<0.05であり; PBS処置マウス(白四角)と比較されたKitW-sh/W-sh IL-33処置マウス(白丸)は#p<0.05である(二元配置ANOVA))。
【図２１ａ−ｄ】図２１ａ〜２１ｅ:  肥満細胞欠損マウスは1用量のIL-33によって誘発されるAHRから保護された。WT (IL-33:黒三角; PBS:黒四角)およびKitW-sh/W-sh (IL-33:白三角; PBS:白四角)マウスを1鼻腔内用量のIL-33で処置し、1日後にAHRを評価した。メタコリンの濃度の増加に応答した、抵抗(ａ)、エラスタンス(ｂ)、組織抵抗(G; ｃ)、組織エラスタンス(H; ｄ)、および気道のニュートン抵抗(Rn; ｅ)の変化を測定することによってAHRを評価した。データを平均±SEMとして表記する(3回の独立した実験由来のn=16-22マウス/群; PBS処置マウスと比較されたIL-33処置マウスは*p<0.05である(マン・ホイットニーU検定))。
【図２１ｅ】図２１ａ〜２１ｅ:  肥満細胞欠損マウスは1用量のIL-33によって誘発されるAHRから保護された。WT (IL-33:黒三角; PBS:黒四角)およびKitW-sh/W-sh (IL-33:白三角; PBS:白四角)マウスを1鼻腔内用量のIL-33で処置し、1日後にAHRを評価した。メタコリンの濃度の増加に応答した、抵抗(ａ)、エラスタンス(ｂ)、組織抵抗(G; ｃ)、組織エラスタンス(H; ｄ)、および気道のニュートン抵抗(Rn; ｅ)の変化を測定することによってAHRを評価した。データを平均±SEMとして表記する(3回の独立した実験由来のn=16-22マウス/群; PBS処置マウスと比較されたIL-33処置マウスは*p<0.05である(マン・ホイットニーU検定))。
【図２２ａ−ｄ】図２２ａ〜２２ｆ:  IL-33は肥満細胞欠損マウスにおいて炎症を誘発した。WTおよびKitW-sh/W-shマウスを3鼻腔内用量のIL-33で処置し、最終投与の1日後に炎症を評価した。気道内腔(ａ; トータル:*p=0.0003, #p=0.002; Eo:*p=0.0002, #p=0.0007; Mac:*p=0.0112, #p=0.0481; Lymph:*p=0.0074, #p=0.0278; Neut:*p=0.0137, #p=0.002)および肺組織(ｂ; トータル:*p=0.0003, #p=0.002; Eo:*p=0.0002, #p=0.0007; Mac:*p=0.0112, #p=0.0481; Lymph:*p=0.0074, #p=0.0278; Neut:*p=0.0137, #p=0.0020)から白血球を単離した。肺組織におけるCD4応答(ｃ; CD4:*p=0.0016, #p=0.0051; CD4/T1/ST2:*p=0.0016, #p=0.0051)を、以前に記載されるように測定した。ムチン関連(ｄ; MUC5ac:*p=0.0061, #p=0.0167; Gob-5:*p=0.0061, #p=0.0167)およびIL-13 (ｅ; *p=0.0061, #p=0.0167)遺伝子発現をtaqman解析によって評価した。IL-13タンパク質レベル(ｆ; *p=0.0006, #p=0.0006)を肺ホモジネート上清中でELISAによって決定した。データを平均±SEMとして表記する(1-3回の独立した実験由来のn=4-22マウス/群; PBS処置マウス(白抜きバー)と比較されたWT IL-33処置マウス(黒色バー)は*p<0.05であり、PBS処置マウス(スポットバー)と比較されたKitW-sh/W-sh IL-33処置マウス(スラッシュバー)は#p<0.05である)。
【図２２ｅ−ｆ】図２２ａ〜２２ｆ:  IL-33は肥満細胞欠損マウスにおいて炎症を誘発した。WTおよびKitW-sh/W-shマウスを3鼻腔内用量のIL-33で処置し、最終投与の1日後に炎症を評価した。気道内腔(ａ; トータル:*p=0.0003, #p=0.002; Eo:*p=0.0002, #p=0.0007; Mac:*p=0.0112, #p=0.0481; Lymph:*p=0.0074, #p=0.0278; Neut:*p=0.0137, #p=0.002)および肺組織(ｂ; トータル:*p=0.0003, #p=0.002; Eo:*p=0.0002, #p=0.0007; Mac:*p=0.0112, #p=0.0481; Lymph:*p=0.0074, #p=0.0278; Neut:*p=0.0137, #p=0.0020)から白血球を単離した。肺組織におけるCD4応答(ｃ; CD4:*p=0.0016, #p=0.0051; CD4/T1/ST2:*p=0.0016, #p=0.0051)を、以前に記載されるように測定した。ムチン関連(ｄ; MUC5ac:*p=0.0061, #p=0.0167; Gob-5:*p=0.0061, #p=0.0167)およびIL-13 (ｅ; *p=0.0061, #p=0.0167)遺伝子発現をtaqman解析によって評価した。IL-13タンパク質レベル(ｆ; *p=0.0006, #p=0.0006)を肺ホモジネート上清中でELISAによって決定した。データを平均±SEMとして表記する(1-3回の独立した実験由来のn=4-22マウス/群; PBS処置マウス(白抜きバー)と比較されたWT IL-33処置マウス(黒色バー)は*p<0.05であり、PBS処置マウス(スポットバー)と比較されたKitW-sh/W-sh IL-33処置マウス(スラッシュバー)は#p<0.05である)。
【図２３ａ】図２３ａ〜２３ｄ:  アレルゲンチャレンジはin vivoでIL-13およびIL-33産生を誘発する。BALB/cマウスを免疫(オボアルブミン、OVA)し、気道を通じてOVAでチャレンジし、種々の時点でIL-13タンパク質に関して肺を分析した(ａ)。さらにヒト喘息性肺生検におけるIL-33の発現を検査した。最も強い染色は、主に上皮細胞(ｂ)中の、および内皮細胞(ｃおよびｄ)においても、構造細胞の核中に存在した。均一であるが弱い核染色が円柱上皮細胞(すなわち繊毛細胞および杯状細胞)内で観察されたが、上皮染色は生検間で均一であり、かつ主に基底細胞に局在した。さらにまた、気管支の血管の内皮細胞はIL-33免疫反応性を示すことが多かった(ｃおよびｄ)。
【図２３ｂ−ｄ】図２３ａ〜２３ｄ:  アレルゲンチャレンジはin vivoでIL-13およびIL-33産生を誘発する。BALB/cマウスを免疫(オボアルブミン、OVA)し、気道を通じてOVAでチャレンジし、種々の時点でIL-13タンパク質に関して肺を分析した(ａ)。さらにヒト喘息性肺生検におけるIL-33の発現を検査した。最も強い染色は、主に上皮細胞(ｂ)中の、および内皮細胞(ｃおよびｄ)においても、構造細胞の核中に存在した。均一であるが弱い核染色が円柱上皮細胞(すなわち繊毛細胞および杯状細胞)内で観察されたが、上皮染色は生検間で均一であり、かつ主に基底細胞に局在した。さらにまた、気管支の血管の内皮細胞はIL-33免疫反応性を示すことが多かった(ｃおよびｄ)。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
詳細な説明
本発明は、IL-33特異的結合性ポリペプチドおよび組成物および、IL-33特異的ポリペプチドを含む組成物を包含する。前記IL-33特異的結合性ポリペプチドは、抗体、単量体ドメインポリペプチド、または多量体ドメインポリペプチドを含んでよい。IL-33特異的結合性ポリペプチドを使用して、自己免疫性障害および炎症性障害、例えば喘息を含む障害を治療することができる。
【０００７】
障害/疾患
IL-33特異的結合性ポリペプチドを使用して、任意の炎症性障害、例えば慢性炎症性障害を治療することができる。慢性炎症性障害には、関節リウマチ、乾癬、アレルギー、喘息、COPD、炎症性腸疾患(例えばクローン病および潰瘍性大腸炎)、および自己免疫性甲状腺炎(例えばグレーブス病および橋本甲状腺炎)が含まれる。障害のレビューはGirard and Springer, (1995) Immunology Today 16(9): 449-457に提供されている。
【０００８】
また、IL-33特異的結合性ポリペプチドを使用して、リンパ系外(extralymphoid)の部位の慢性炎症によって特徴付けられる障害を治療することができる。例えば、IL-33インヒビターは糖尿病の治療または予防に有用である。IL- 33特異的結合性ポリペプチドを移植片拒絶の治療または予防に使用してよい。
【０００９】
炎症性疾患または障害はまた、病状が、例えば免疫系の細胞の、数の変化、遊走の割合の変化、または活性化の変化に、全体的または部分的に、起因する任意の障害または病的状態を包含する。免疫系の細胞には、例えば、T細胞、B細胞、単球またはマクロファージ、抗原提示細胞(APC)、樹状細胞、ミクログリア、NK細胞、NKT細胞、好中球、好酸球、肥満細胞、または免疫学と特に関連している任意の他の細胞、例えばサイトカイン産生内皮または上皮細胞が含まれる。
【００１０】
被験体
疾患または障害の治療方法では、被験体または患者にIL-33特異的結合性ポリペプチドを投与する。被験体または患者は、動物、例えば、非霊長類(例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラット、およびマウス)または霊長類(例えば、サル、例えばカニクイザル(cynomolgous monkey)、チンパンジー、およびヒト)を含む哺乳類であってよい。被験体または患者は哺乳類、例えば疾患または障害を有するヒトであってよい。被験体または患者は、障害を有する家畜(例えば、ウマ、ブタ、またはウシ)またはペット(例えばイヌまたはネコ)であってよい。被験体は、障害を発症するリスクにさらされているかまたは障害の1以上の症状を有する哺乳類(例えば免疫無防備状態のまたは免疫抑制された哺乳類)であってよい。
【００１１】
IL-33結合性ポリペプチド
結合性ポリペプチドを投与することによって被験体を治療することができる。結合性ポリペプチドは、IL-33またはIL-33Rに結合可能な任意の分子ポリペプチド、小分子、高分子、抗体、その断片またはアナログ、単量体/多量体ドメインポリペプチド、または可溶性受容体であってよい。また、結合性ポリペプチドは、IL-33またはIL-33Rに結合可能な、分子の複合体、例えば非共有結合性複合体、イオン化分子、および共有結合または非共有結合によって改変された分子、例えば、リン酸化、アシル化、架橋、環化、または限定切断(limited cleavage)によって改変された分子を表す。結合性ポリペプチドはまた、安定剤、賦形剤、塩、バッファー、溶媒、または添加物と組み合わされた、標的に結合可能な分子を表してもよい。
【００１２】
抗体
IL-33特異的結合性ポリペプチドはIL-33特異的抗体であってよい。IL-33特異的結合性ポリペプチドを含む組成物はIL-33特異的抗体を含んでよい。IL-33特異的抗体を含む組成物は、細胞材料または異種混入タンパク質を実質的に含まないIL-33特異的抗体を含んでよい。例えば、IL-33特異的抗体は単離された形式であってよい。例えば、そのような組成物は、約30%、20%、10%、5% (乾燥重量%)未満の、IL-33特異的抗体以外の化学前駆体、細胞成分、または異種混入タンパク質を有してよい。そのような組成物を別の治療物質と組み合わせることができる。
【００１３】
抗体には、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわちIL-33に特異的に結合する(IL-33と免疫反応する)抗原結合部位を含有する分子が含まれる。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の例には、ペプシン等の酵素で抗体を処理することによって作製することができるF(ab)およびF(ab')2断片が含まれる。本発明はIL-33に結合するポリクローナルおよびモノクローナル抗体を包含する。モノクローナル抗体またはモノクローナル抗体組成物は、IL-33の特定のエピトープと免疫反応可能な抗体を含有する抗体分子集団を包含する。ゆえにモノクローナル抗体組成物は、その免疫反応の対象である特定のIL-33タンパク質に関する単一結合親和性を示す。
【００１４】
IL-33抗体は、ポリクローナルであれモノクローナルであれ、IL-33ポリペプチドまたは突然変異IL-33ポリペプチドの配列中の少なくとも6アミノ酸、好ましくは少なくとも8〜10アミノ酸、より好ましくは少なくとも12、15、20、25、30、40、50、100、または100を超えるアミノ酸の連続区間を含むエピトープ含有ポリペプチドに選択的に結合可能であるか、または選択的に結合する。
【００１５】
好適な被験体をIL-33免疫原で免疫することによってポリクローナル抗IL-33抗体を作製することができる。免疫化被験体中の抗IL-33抗体力価を標準的技術によって、例えば固定されたIL-33を使用する酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)で経時的にモニターすることができる。所望であれば、IL-33を標的にする抗体分子を哺乳類から(例えば血液から)単離し、周知の技術、例えばプロテインAクロマトグラフィーによってさらに精製して、IgGフラクションを得ることができる。免疫後の適切な時点で、例えば抗IL-33抗体力価が最高であるときに、被験体から抗体産生細胞を取得し、それを使用して、以下の参考文献に記載の技術: Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495-497)によって最初に報告されたハイブリドーマ技術(Brown et al. (1981) J. Immunol. 127:539-46; Brown et al. (1980) J. Biol. Chem. 255:4980-83; Yeh et al. (1976) PNAS 76:2927-31; およびYeh et al. (1982) Int. J. Cancer 29:269-75も参照のこと)、より最近のヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor et al. (1983) Immunol Today 4:72)、EBV-ハイブリドーマ技術(Cole et al. (1985), Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)またはトリオーマ技術等の標準的技術によってモノクローナル抗体を製造することができる。モノクローナル抗体ハイブリドーマを製造するための技術は周知である(一般にR. H. Kenneth, in Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, N.Y. (1980); E. A. Lerner (1981) Yale J. Biol. Med., 54:387-402; M. L. Gefter et al. (1977) Somatic Cell Genet. 3:231-36を参照のこと)。簡潔に言えば、不死セルライン(典型的に骨髄腫)を、上記のようにIL-33免疫原で免疫された哺乳類由来のリンパ球(典型的に脾細胞)に融合させ、得られたハイブリドーマ細胞の培養上清をスクリーニングして、IL-33に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを特定する。
【００１６】
リンパ球と不死化セルラインの融合のために使用される多数の周知のプロトコルのいずれかを抗IL-33モノクローナル抗体を作製する目的に適用することができる(例えばG. Galfre et al. (1977) Nature 266:55052; Gefter et al. Somatic Cell Genet. (上記); Lerner, Yale J. Biol. Med (上記); Kenneth, Monoclonal Antibodies (上記)を参照のこと)。さらに、同様に有用な、そのような方法の多数のバリエーションが存在することを当業者は認識する。典型的に、不死セルライン(例えば骨髄腫セルライン)はリンパ球と同一の哺乳類種由来である。例えば、本発明の免疫原性調製物で免疫されたマウス由来のリンパ球を不死化マウスセルラインと融合させることによってマウスハイブリドーマを作製することができる。好ましい不死セルラインは、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有する培養培地("HAT培地")に感受性のマウス骨髄腫セルラインである。多数の骨髄腫セルラインのいずれか、例えばP3-NS1/1-Ag4-1、P3-x63-Ag8.653またはSp2/O-Ag14骨髄腫セルラインを、標準的技術に基づく融合パートナーとして使用することができる。前記骨髄腫セルラインはAmerican Type Culture Collection (ATCC)から入手可能である。典型的に、ポリエチレングリコール("PEG")を使用してHAT-感受性マウス骨髄腫細胞をマウス脾細胞に融合させる。融合から得られたハイブリドーマ細胞をHAT培地を使用して選択する。該培地は未融合および非生産的に融合した骨髄腫細胞を死滅させる(未融合脾細胞は形質転換されていないために数日後に死滅する)。例えば標準ELISAアッセイを使用して、IL-33に結合する抗体に関してハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることによって、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を検出する。
【００１７】
モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマを製造する代わりに、組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー(例えば抗体ファージディスプレイライブラリー)をIL-33でスクリーニングし、それによってIL-33に結合する免疫グロブリンライブラリーメンバーを単離することによって、モノクローナル抗IL-33抗体を特定および単離することができる。ファージディスプレイライブラリーを作製およびスクリーニングするためのキットは市販されている(例えばPharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catalog No. 27-9400-01; およびStratagene SurfzAP.TM.. Phage Display Kit, Catalog No. 240612)。さらに、抗体ディスプレイライブラリーの作製およびスクリーニングにおける使用に特に適する方法および試薬の例は、例えば、以下の文献中に見出せる: Ladner et al. U.S. Pat. No. 5,223,409; Kang et al. PCT国際公開No. WO 92/18619; Dower et al. PCT国際公開No. WO 91/17271; Winter et al. PCT国際公開WO 92/20791; Markland et al. PCT国際公開No. WO 92/15679; Breitling et al. PCT国際公開WO 93/01288; McCafferty et al. PCT国際公開No. WO 92/01047; Garrard et al. PCT国際公開No. WO 92/09690; Ladner et al. PCT国際公開No. WO 90/02809; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226:889-896; Clarkson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc. Acid Res. 19:4133-4137; Barbas et al. (1991) PNAS 88:7978-7982; およびMcCafferty et al. Nature (1990) 348:552-554。
【００１８】
さらに、標準組換えDNA技術を使用して作製することができるヒトおよび非ヒト部分をともに含む組換え抗IL-33抗体、例えばキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は本発明の範囲内である。当技術分野において公知の組換えDNA技術によって、例えば以下の文献に記載の方法を使用して、そのようなキメラおよびヒト化モノクローナル抗体を製造することができる: Robinson et al. 国際出願No. PCT/US86/02269; Akira, et al. 欧州特許出願184,187; Taniguchi, M., 欧州特許出願171,496; Morrison et al. 欧州特許出願173,494; Neuberger et al. PCT国際公開No. WO 86/01533; Cabilly et al. U.S. Pat. No. 4,816,567; Cabilly et al. 欧州特許出願125,023; Better et al. (1988) Science 240:1041-1043; Liu et al. (1987) PNAS 84:3439-3443; Liu et al. (1987) J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al. (1987) PNAS 84:214-218; Nishimura et al. (1987) Canc. Res. 47:999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446-449; およびShaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559); Morrison, S. L. (1985) Science 229:1202-1207; Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214; Winter U.S. Pat. No. 5,225,539; Jones et al. (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534; およびBeidler et al. (1988) J. Immunol. 141:4053-4060。
【００１９】
抗体および可溶性受容体の突然変異タンパク質および変異体が想定され、例えばペグ化または脱アミド性Asn残基(deamidating Asn residues)を除去または置換するための突然変異誘発が想定される。
【００２０】
抗IL-33抗体(例えばモノクローナル抗体)を使用して、標準的技術、例えばアフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降によってIL-33を単離することができる。抗IL-33抗体は、細胞からの天然IL-33の精製および宿主細胞中で発現された組換え生産されたIL-33の精製を容易にする。さらに、IL-33タンパク質の存在量および発現パターンを評価するために、抗IL-33抗体を使用して(例えば細胞ライセートまたは細胞上清中の)IL-33タンパク質を検出することができる。例えば所定の治療方式の効力を決定するために臨床検査手順の部分として抗IL-33抗体を診断的に使用して組織中のタンパク質レベルをモニターすることができる。抗体を検出可能な物質にカップリング(すなわち物理的に連結)することによって検出を容易にすることができる。検出可能な物質の例には、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、および放射性物質が含まれる。好適な酵素の例には、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、-ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが含まれ; 好適な補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジン/ビオチンおよびアビジン/ビオチンが含まれ; 好適な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロライドまたはフィコエリトリンが含まれ; 発光物質の例には、ルミノールが含まれ; 生物発光物質の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが含まれ、好適な放射性物質の例には、125I、131I、35Sまたは3Hが含まれる。
【００２１】
単量体/多量体ドメインポリペプチド
IL-33特異的結合性ポリペプチドはIL-33特異的単量体/多量体ドメインポリペプチドであってよい。組成物はIL-33特異的単量体/多量体ドメインポリペプチドを含んでよい。IL-33単量体/多量体ドメインポリペプチドを含む組成物は、細胞材料または異種混入タンパク質を実質的に含まないIL-33特異的抗体を含んでよい。例えば、IL-33特異的抗体は単離された形式であってよい。例えば、そのような組成物は、約30%、20%、10%、5% (乾燥重量%)未満の、IL-33特異的抗体以外の化学前駆体、細胞成分、または異種混入タンパク質を有してよい。そのような組成物を別の治療物質と組み合わせることができる。
【００２２】
IL-33特異的単量体/多量体ドメインポリペプチドはIL-33に結合する単量体ドメインを含んでよく、該単量体は任意のサイズであってよい。単量体ドメインは、約25〜約500、約30〜約200、約30〜約100、約35〜約50、約35〜約100、約90〜約200、約30〜約250、約30〜約60、約9〜約150、約100〜約150、約25〜約50、または約30〜約150アミノ酸を有してよい。単量体ドメインは、例えば、約30〜約200アミノ酸残基; 約25〜約180アミノ酸; 約40〜約150アミノ酸; 約50〜約130アミノ酸; または約75〜約125アミノ酸を含んでよい。
【００２３】
単量体ドメインポリペプチドおよびモザイクポリペプチドを記載する刊行物およびその引用文献には、以下のものが含まれる: Hegyi, H and Bork, P., On the classification and evolution of protein modules, (1997) J. Protein Chem., 16(5):545-551; Baron et al., Protein modules (1991) Trends Biochem. Sci. 16(1):13-7; Ponting et al., Evolution of domain families, (2000), Adv. Protein Chem., 54:185-244; Doolittle, The multiplicity of domains in proteins, (1995) Annu. Rev. Biochem 64:287-314; Doolitte and Bork, Evolutionarily mobile modules in proteins (1993) Scientific American, 269 (4):50-6; およびBork, Shuffled domains in extracellular proteins (1991), FEBS letters 286(1-2):47-54。本発明の単量体ドメインはまた、PfamデータベースおよびSMARTデータベースに見出されるドメインを含む。Schultz, et al., SMART: a web-based tool for the study of genetically mobile domains, (2000) Nucleic Acid Res. 28(1):231-34を参照のこと。例示的な単量体ドメインには、例えば、EGF-様ドメイン、クリングル-ドメイン、フィブロネクチンI型ドメイン、フィブロネクチンII型ドメイン、フィブロネクチンIII型ドメイン、PANドメイン、G1aドメイン、SRCRドメイン、クニッツ/ウシ膵臓トリプシンインヒビタードメイン、Kaza1型セリンプロテアーゼインヒビタードメイン、トレフォイル(P-型)ドメイン、フォンウィルブランド因子C型ドメイン、アナフィラトキシン-様ドメイン、CUBドメイン、チログロブリンI型リピート、LDL-受容体クラスAドメイン、スシ(Sushi)ドメイン、リンク(Link)ドメイン、トロンボスポンジンI型ドメイン、免疫グロブリン様ドメイン、C-型レクチンドメイン、MAMドメイン、フォンウィルブランド因子A型ドメイン、ソマトメジンBドメイン、WAP型4ジスルフィドコアドメイン、F5/8 C型ドメイン、ヘモペキシンドメイン、SH2ドメイン、SH3ドメイン、ラミニン-型EGF様ドメイン、C2ドメイン、および当業者に公知の他のそのようなドメイン、ならびにその誘導体および/または変異体が含まれる。
【００２４】
単量体ドメインポリペプチドは、(1) βサンドイッチドメイン; (2) β-バレルドメイン; または(3) ジスルフィド結合を含むシステインリッチドメインを含んでよい。本発明の実施に用いられるシステインリッチドメインは典型的にαヘリックス、βシート、またはβ-バレル構造を形成しない。ジスルフィド結合は3次元構造へのドメインのフォールディングを促す。システインリッチドメインは少なくとも2個のジスルフィド結合を有し、より典型的には少なくとも3個のジスルフィド結合を有する。
【００２５】
単量体または多量体ドメインポリペプチドに含まれるドメインは任意の数の特性を有することができる。例えば、ドメインは動物(例えばヒト)において低い免疫原性しか有さないか、またはまったく免疫原性を有さなくてよい。ドメインは小さいサイズを有してよい。ドメインは皮膚または他の組織に浸透するために十分に小さくてよい。ドメインはある範囲のin vivo半減期または安定性を有してよい。
【００２６】
単量体ドメインの特性には、独立してフォールディングする能力および安定な構造を形成する能力が含まれる。ゆえに、単量体をコードするポリヌクレオチド配列は保存される必要はないが、単量体ドメインの構造は保存されることが多い。例えば、A-ドメイン構造はA-ドメインファミリーのメンバー間で保存されるが、A-ドメイン核酸配列は保存されない。ゆえに、例えば、単量体ドメインを、必ずしもその核酸配列によってではなく、そのシステイン残基および、カルシウムに対するその親和性によってA-ドメインとして分類してよい。
【００２７】
本明細書中で記載されるように、単量体ドメインはIL-33に結合する能力に関して選択され、IL-33は、相同な天然に存在するドメインが結合する標的であってもなくてもよい。
【００２８】
IL-33に特異的に結合する単量体ドメインは、A-ドメインを含有するヒトA-ドメインタンパク質であってよく、それには、例えば、補体成分(例えば、C6、C7、C8、C9、および因子I)、セリンプロテアーゼ(例えば、エンテロペプチダーゼ、マトリプターゼ、およびコリン(corin))、膜貫通タンパク質(例えば、ST7、LRP3、LRP5およびLRP6)およびエンドサイトーシス受容体(例えば、ソルチリン-関連受容体、LDL-受容体、VLDLR、LRP1、LRP2、およびApoER2)が含まれる。AドメインおよびAドメイン変異体は、本発明の実施において、単量体ドメインおよびその変異体として容易に用いることができる。Aドメインについての追加の説明は以下の刊行物およびその引用文献に見出せる: Howell and Hertz, The LDL receptor gene family: signaling functions during development, (2001) Current Opinion in Neurobiology 11:74-81; Herz (2001) (上記); Krieger, The "best " of cholesterols, the "worst" of cholesterols: A tale of two receptors, (1998) PNAS 95: 4077-4080; Goldstein and Brown, The Cholesterol Quartet, (2001) Science, 292: 1310-1312; および, Moestrup and Verroust, Megalin-and Cubilin-Mediated Endocytosis of Protein-Bound Vitamins, Lipids, and Hormones in Polarized Epithelia, (2001) Ann. Rev. Nutr. 21:407-28。
【００２９】
IL-33に特異的に結合する単量体はC2ドメイン由来であってよい。C2単量体ドメインは、2個の4ストランドのβ-シートからなるコンパクトなβ-サンドイッチを含有するポリペプチドであり、ドメインの「上部」のループおよびドメインの「底部」のループは8個のβ-ストランドを連結する。C2単量体ドメインは、2つのサブクラス、すなわち、それぞれトポロジーI (シナプトタグミン-様トポロジー)およびトポロジーII (サイトゾルホスホリパーゼA2-様トポロジー)を有するC2単量体ドメインに分けることができる。トポロジーIを有するC2単量体ドメインは分子の「上部」に3個のループ(そのすべてがCa2+結合ループである)を含有し、トポロジーIIを有するC2単量体ドメインは分子の「上部」に4個のループ(そのうち3個のみがCa2+結合ループである)を含有する。C2単量体ドメインの構造は、Rizo and Sudhof, J. Biol. Chem. 273;15879-15882 (1998) およびCho, J. Biol. Chem. 276;32407-32410 (2001)によってレビューされている。用語「ループ領域1」、「ループ領域2」および「ループ領域3」とは、分子の「上部」に位置するCa2+結合ループ領域を表す。分子の「上部」に位置する3個のCa2+結合ループを非Ca2+結合ループ(分子の「底部」に主に位置する)と区別するために使用されるこの命名法は、文献で広く使用され、認識されている。Rizo and Sudhof, J. Biol. Chem. 273;15879-15882 (1998)を参照のこと。ループ領域1、2、および3は標的結合領域であり、ゆえに結合特異性および親和性をモジュレートするように変化させることができる。C2ドメインの残りの部分は、所望であれば改変させずに維持することができる。
【００３０】
IL-33に特異的に結合するかまたはIL-33に特異的に結合するように改変することができる単量体ドメインの他の例はタンパク質キュビリンにおいて見出せる。キュビリンはEGF-タイプのリピートおよびCUBドメインを含有する。CUBドメインはリガンド結合に関与し、例えば、いくつかのリガンドには、内因子(IF)-ビタミンB12、受容体関連タンパク質(RAP)、Apo A-I、トランスフェリン、アルブミン、Ig軽鎖およびカルシウムが含まれる。Moestrup and Verroust (上記)を参照のこと。
【００３１】
IL-33に特異的であるかまたはIL-33に特異的であるように改変することができる単量体ドメインの追加の例は、以下の文献に記載の単量体ドメインである: Yamazaki et al., Elements of Neural Adhesion Molecules and a Yeast Vacuolar Protein Sorting Receptor are Present in a Novel Mammalian Low Density Lipoprotein Receptor Family Member, (1996) Journal of Biological Chemistry 271(40) 24761-24768; Nakayama et al., Identification of High-Molecular-Weight Proteins with Multiple EGF-like Motifs by Motif-Trap Screening, (1998) Genomics 51:27-34; Liu et al, Genomic Organization of New Candidate Tumor Suppressor Gene, LRP1B, (2000) Genomics 69:271-274; Liu et al., The Putative Tumor Suppressor LRP1B, a Novel Member of the Low Density Lipoprotein (LDL) Receptor Family, Exhibits Both Overlapping and Distinct Properties with the LDL Receptor-related Protein, (2001) Journal of Biological Chemistry 276(31):28889-28896; Ishii et al, cDNA of a New Low-Density Lipoprotein Receptor-Related Protein and Mapping of its Gene (LRP3) to Chromosome Bands 19q12-q13.2, (1998) Genomics 51:132-135; Orlando et al, Identification of the second cluster of ligand-binding repeats in megalin as a site for receptor-ligand interactions, (1997) PNAS USA 94:2368-2373; Jeon and Shipley, Vesicle-reconstituted Low Density Lipoprotein Receptor, (2000) Journal of Biological Chemistry 275(39):30458-30464; Simmons et al., Human Low Density Lipoprotein Receptor Fragment, (1997) Journal of Biological Chemistry 272(41):25531-25536; Fass et al., Molecular Basis of familial hypercholesterolaemia from structure of LDL receptor module, (1997) Nature 388:691-93; Daly et al., Three-dimensional structure of a cysteine-rich repeat from the low-density lipoprotein receptor, (1995) PNAS USA 92:6334-6338; North and Blacklow, Structural Independence of Ligand-Binding Modules Five and Six of the LDL Receptor, (1999) Biochemistry 38:3926-3935; North and Blacklow, Solution Structure of the Sixth LDL-A module of the LDL Receptor, (2000) Biochemistry 39:25640-2571; North and Blacklow, Evidence that Familial Hypercholesterolemia Mutations of the LDL Receptor Cause Limited Local Misfolding in an LDL-A Module Pair, (2000) Biochemistry 39:13127-13135; Beglova et al., Backbone Dynamics of a Module Pair from the Ligand-Binding Domain of the LDL Receptor, (2001) Biochemistry 40:2808-2815; Bieri et al., Folding, Calcium binding, and Structural Characterization of a Concatemer of the First and Second Ligand-Binding Modules of the Low-Density Lipoprotein Receptor, (1998) Biochemistry 37:10994-11002; Jeon et al., Implications for familial hypercholesterolemia from the structure of the LDL receptor YWTD-EGF domain pair, (2001) Nature Structural Biology 8(6):499-504; Kurniawan et al., NMR structure of a concatemer of the first and second ligand-binding modules of the human low-density lipoprotein receptor, (2000) Protein Science 9: 1282-1293; Esser et al., Mutational Analysis of the Ligand Binding Domain of the Low Density Lipoprotein Receptor, (1988) Journal of Biological Chemistry 263(26): 13282-13290; Russell et al., Different Combinations of Cysteine-rich Repeats Mediate Binding of Low Density Lipoprotein Receptor to Two Different Proteins, (1989) Journal of Biological Chemistry 264(36):21682-21688; Davis et al., Acid-dependent ligand dissociation and recycling of LDL receptor mediated by growth factor homology region, (1987) Nature 326:760-765; Rong et al., Conversion of a human low-density lipoprotein receptor ligand-binding repeat to a virus receptor: Identification of residues important for ligand specificity, (1998) PNAS USA 95:8467-8472; Agnello et al., Hepatitis C virus and other Flaviviridae viruses enter cells via low density lipoprotein receptor; (1999) PNAS 96(22):12766-12771; Esser and Russell, Transport-deficient Mutations in the Low Density lipoprotein receptor, (1988) Journal of Biological Chemistry 263(26):13276-13281; Davis et al., The Low Density Lipoprotein Receptor, (1987) Journal of Biological Chemistry 262(9):4075-4082; お���び, Peacock et al., Human Low Density Lipoprotein Receptor Expressed in Xenopus Oocytes, (1988) Journal of Biological Chemistry 263(16):7838-7845。
【００３２】
IL-33に特異的であるかまたはIL-33に特異的であるように改変することができる単量体ドメイン(例えば、VLDLR、ApoER2およびLRP1タンパク質およびそれらの単量体ドメイン)の追加の例は、以下の文献に記載の単量体ドメインである: Savonen et al., The Carboxyl-terminal Domain of Receptor-associated Protein Facilitates Proper Folding and Trafficking of the Very Low Density Lipoprotein Receptor by Interaction with the Three Amino-terminal Ligand-binding Repeats of the Receptor, (1999) Journal of Biological Chemistry 274(36):25877-25882; Hewat et al., The cellular receptor to human rhinovirus 2 binds around the 5-fold axis and not in the canyon: a structural view, (2000) EMBO Journal 19(23):6317-6325; Okun et al., VLDL Receptor Fragments of Different Lengths Bind to Human Rhinovirus HR V2 with Different Stoichiometry, (2001) Journal of Biological Chemistry 276(2):1057-1062; Rettenberger et al., Ligand Binding Properties of the Very Low Density Lipoprotein Receptor, (1999) Journal of Biological Chemistry 274(13):8973-8980; Mikhailenko et al., Functional Domains of the very low density lipoprotein receptor: molecular analysis of ligand binding and acid-dependent ligand dissociation mechanisms, (1999) Journal of Cell Science 112:3269-3281; Brandes et al., Alternative Splicing in the Ligand Binding Domain of Mouse ApoE Receptor-2 Produces Receptor Variants Binding Reelin but not alpa2-macroglobulin, (2001) Journal of Biological Chemistry 276(25):22160-22169; Kim et al., Exon/Intron Organization, Chromosome Localization, Alternative Splicing, and Transcription Units of the Human Apolipoprotein E Receptor 2 Gene, (1997) Journal of Biological Chemistry 272(13):8498-8504; Obermoeller-McCormick et al., Dissection of receptor folding and ligand-binding property with functional minireceptors of LDL receptor-related protein, (2001) Journal of Cell Science 114(5):899-908; Horn et al., Molecular Analysis of Ligand Binding of the Second Cluster of Complement-type Repeats of the Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein, (1997) Journal of Biological Chemistry 272(21):13608-13613; Neels et al., The Second and Fourth Cluster of Class A Cysteine-rich Repeats of the Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein Share Ligand-binding Properties, (1999) Journal of Biological Chemistry 274(44):31305-31311; Obermoeller et al., Differential Functions of the Triplicated Repeats Suggest Two Independent Roles for the Receptor-Associated Protein as a Molecular Chaperone, (1997) Journal of Biological Chemistry 272(16):10761-10768; Andersen et al., Identification of the Minimal Functional Unit in the Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein for Binding the Receptor-associated Protein (RAP), (2000) Journal of Biological Chemistry 275(28):21017-21024; Andersen et al., Specific Binding of alpha-Macroglobulin to Complement-Type Repeat CR4 of the Low-Density Lipoprotein Receptor-Related Protein, (2000) Biochemistry 39:10627-10633; Vash et al., Three Complement-Type Repeats of the Low-Density Lipoprotein Receptor-Related Protein Define a Common Binding Site for RAP, PAI-1, and Lactoferrin, (1998) Blood 92(9):3277-3285; Dolmer et al., NMR Solution Structure of Complement-like Repeat CR3 from the Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein, (2000) Journal of Biological Chemistry 275(5):3264-3269; Huang et al., NMR Solution Structure of Complement-like Repeat CR8 from the Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein, (1999) Journal of Biological Chemistry 274(20): 14130-14136; およびLiu et al., Uptake of HIV-1 Tat protein mediated by low-density lipoprotein receptor-related protein disrupts the neuronal metabolic balance of the receptor ligands, (2000) Nature Medicine 6(12):1380-1387。
【００３３】
IL-33に特異的であるかまたはIL-33に特異的であるように改変することができる単量体ドメインの追加の例は、以下の文献に記載の単量体ドメインである: FitzGerald et al, Pseudomonas Exotoxin-mediated Selection Yields Cells with Altered Expression of Low-Density Lipoprotein Receptor-related Protein, (1995) Journal of Cell Biology, 129: 1533-41; Willnow and Herz, Genetic deficiency in low density lipoprotein receptor-related protein confers cellular resistance to Pseudomonas exotoxin A, (1994) Journal of Cell Science, 107:719-726; Trommsdorf et al., Interaction of Cytosolic Adaptor Proteins with Neuronal Apolipoprotein E Receptors and the Amyloid Precursor Protein, (1998) Journal of Biological Chemistry, 273(5): 33556-33560; Stockinger et al., The Low Density Lipoprotein Receptor Gene Family, (1998) Journal of Biological Chemistry, 273(48): 32213-32221; Obermoeller et al., Ca+2 and Receptor-associated Protein are independently required for proper folding and disulfide bond formation of the low density lipoprotein receptor-related protein, (1998) Journal of Biological Chemistry, 273(35):22374-22381; Sato et al., 39-kDa receptor-associated protein (RAP) facilitates secretion and ligand binding of extracellular region of very-low-density-lipoprotein receptor: implications for a distinct pathway from low-density-lipoprotein receptor, (1999) Biochem. J., 341:377-383; Avromoglu et al, Functional Expression of the Chicken Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein in a mutant Chinese Hamster Ovary Cell Line Restores Toxicity of Pseudomonas Exotoxin A and Degradation of alpha2-Macroglobulin, (1998) Journal of Biological Chemistry, 273(11) 6057-6065; Kingsley and Krieger, Receptor-mediated endocytosis of low density lipoprotein: Somatic cell mutants define multiple genes required for expression of surface-receptor activity, (1984) PNAS USA, 81:5454-5458; Li et al, Differential Functions of Members of the Low Density Lipoprotein Receptor Family Suggests by their distinct endocystosis rates, (2001) Journal of Biological Chemistry 276(21):18000-18006; および, Springer, An Extracellular beta-Propeller Module Predicted in Lipoprotein and Scavenger Receptors, Tyrosine Kinases, Epidermal Growth Factor Precursor, and Extracellular Matrix Components, (1998) J. Mol. Biol. 283:837-862。
【００３４】
IL-33に対する結合親和性に関して特定または選択される単量体ドメインに多量体を形成させてよい。IL-33に対する特異的結合を伴うドメインの選択を導く任意の方法を使用することができる。例えば、該方法は、それぞれが単量体ドメインをコードする多数の異なる核酸を提供するステップ; 多数の異なる核酸を翻訳して多数の異なる単量体ドメインを提供するステップ; 多数の異なる単量体ドメインをIL-33の結合に関してスクリーニングするステップ; および、IL-33に結合する、多数の異なる単量体ドメインのメンバーを特定するステップを含むことができる。
【００３５】
天然に存在する単量体ドメインをIL-33に特異的であるように改変することが必要である場合、単量体ドメインは、先祖ドメイン(ancestral domain)、キメラドメイン、ランダム化ドメイン、突然変異ドメイン、等由来であってよい。例えば、先祖ドメインは系統発生解析に基づいてよい。キメラドメインは1個以上の領域が同一ファミリーの他のドメイン由来の対応する領域によって置換されているドメインであってよい。例えば、同一ファミリーの複数の関連ドメイン由来のループ配列を組み合わせて潜在的に低下した免疫原性を有する新規ドメインを形成させることによってキメラドメインを構築することができる。当業者は、ランダムなアミノ酸配列を創出するよりも、同一ファミリーの種々の関連ドメイン由来のループ領域を組み合わせることによって、改変された結合ドメイン単量体を構築する免疫学的利益を認識する。例えば、ヒトLDL受容体クラスA-ドメイン中に天然に存在するループ配列またはそれどころか複数のループ配列を組み合わせることにより変異体ドメインを構築することによって、得られたドメインはIL-33結合特性を含有するが、すべての露出ループがヒト起源であるため、いかなる免疫原性タンパク質配列をも含有しない。内因性関連のループアミノ酸配列の組み合わせはすべてのまたは任意の単量体構築物に適用することができる。ゆえに、ヒトタンパク質由来のキメラ単量体ドメインのライブラリーを作製するための方法は、ヒトタンパク質の少なくとも2種の異なる天然に存在する各変異体由来の少なくとも1個のループに対応するループ配列(ループ配列はポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列である)を提供するステップ; およびループ配列を共有結合によって組み合わせて少なくとも2種の異なるキメラ配列(各キメラ配列は少なくとも2個のループを有するキメラ単量体ドメインをコードする)のライブラリーを作製するステップを含む。キメラドメインは少なくとも4個のループ、または少なくとも6個のループを有してよい。IL-33単量体/多量体ドメインポリペプチドは、ジスルフィド結合の可能性、二次タンパク質構造間の架橋、および分子動力学(すなわち可動性)等の固有の特徴によって特定される少なくとも3タイプのループを有してよい。3タイプのループ配列は、システインによって規定されるループ配列、構造によって規定されるループ配列、およびB-因子によって規定されるループ配列であってよい。
【００３６】
ランダム化ドメインは1以上の領域がランダム化されているドメインである。ランダム化は、完全ランダム化に基づいてよく、または場合により、配列多様性の天然分布に基づく部分的ランダム化に基づいてよい。そのようなドメインはIL-33特異的単量体/多量体ドメインポリペプチドを生じさせることができる。
【００３７】
非天然の単量体ドメインまたは改変された単量体ドメインはいくつかの方法によって製造することができる。突然変異誘発、例えば部位特異的突然変異誘発およびランダム突然変異誘発(例えば化学的突然変異誘発)の任意の方法を使用して変異体を製造することができる。いくつかの実施形態では、エラープローン(error-prone)PCRを用いて変異体を創出する。追加の方法には、多数の天然に存在する単量体ドメイン中の保存アミノ酸をアライメントすることによる多数の天然に存在する単量体ドメインのアライメント; および、保存アミノ酸を維持しかつ保存アミノ酸の周りのアミノ酸を挿入するか、欠失させるか、または改変して天然に存在しない単量体ドメインを作製することによる天然に存在しない単量体ドメインの設計が含まれる。一実施形態では、保存アミノ酸はシステインを含む。別の実施形態では、挿入ステップでランダムアミノ酸を使用し、または場合により、挿入ステップで天然に存在する単量体ドメインの部分を使用する。該部分は、理想的には、同一ファミリー由来のドメイン由来のループをコードしうる。合成オリゴヌクレオチドを使用して、またはシャフリングによって、または制限酵素ベースの組換えによってアミノ酸を挿入または交換する。本発明のヒトキメラドメインは、最小限の免疫原性が所望である治療上の適用に有用である。本発明は、ヒトキメラドメインのライブラリーを作製するための方法を提供する。ヒトキメラ単量体ドメインライブラリーは、上記のように、ヒト単量体ドメインの異なる変異体由来のループ配列を組み合わせることによって構築することができる。組み合わせられるループ配列は、配列によって規定されるループ、構造によって規定されるループ、B-因子によって規定されるループ、またはその任意の2つ以上の組み合わせであってよい。
【００３８】
あるいは、天然に存在するヒト単量体ドメインを、ループレベルと比較して、アミノ酸レベルで改変することによってヒトキメラドメインライブラリーを作製することができる。免疫原性に関する可能性を最小化するために、同一ファミリーのヒト単量体ドメイン由来のタンパク質配列中に天然に存在する残基のみを利用してキメラ配列を創出する。このことは、同一ファミリーの単量体ドメイン由来の少なくとも2種のヒト単量体ドメインの配列アライメントを提供し、ヒト単量体ドメイン間で異なる、ヒト単量体ドメイン配列中の対応する位置のアミノ酸残基を特定し、各ヒトキメラ単量体ドメイン配列が、同一ファミリーの単量体ドメイン由来の2種以上のヒト単量体ドメイン由来の残基に種類および位置が対応するアミノ酸残基からなる2種以上のヒトキメラ単量体ドメインを作製することによって達成することができる。ヒトキメラ単量体ドメインのライブラリーを用いて、IL-33の結合に関してヒトキメラ単量体ドメインのライブラリーをスクリーニングしかつIL-33に結合するヒトキメラ単量体ドメインを特定することによってIL-33に結合するヒトキメラ単量体ドメインを特定することができる。最初の配列アライメントステップで用いられる好適な天然に存在するヒト単量体ドメイン配列には、本明細書中に記載の天然に存在する単量体ドメインのいずれかに対応する配列が含まれる。
【００３９】
本発明のヒトキメラドメインライブラリー(ループの変化によって作製されるかまたは単一アミノ酸残基の変化によって作製されるかにかかわらない)は、当業者に公知の方法によって調製することができる。これらのライブラリーの作製に特に好適な方法は、WO01/23401に記載のスプリット-プール形式およびトリヌクレオチド合成形式である。
【００４０】
本発明では、同一ファミリーのタンパク質由来のタンパク質に対応するヒトタンパク質配列をデータベースから同定し; 同一ファミリーのタンパク質由来のヒトタンパク質配列をリファレンスタンパク質配列に対してアライメントし; 同一ファミリーの異なるヒトタンパク質配列由来のサブシークエンスのセットを特定し、各サブシークエンスは、異なる天然に存在するヒトタンパク質配列由来の少なくとも1つの他のサブシークエンスと同一な領域を共有し; 第一、第二、および第三のサブシークエンス由来のキメラ連結部(chimeric junction)を特定し、各サブシークエンスは異なる天然に存在するヒトタンパク質配列由来であり、かつキメラ連結部は2個の連続したアミノ酸残基位置を含み、該位置では、第一のアミノ酸位置が、第三の天然に存在するヒトタンパク質配列ではなく第一および第二の天然に存在するヒトタンパク質配列に共通のアミノ酸残基によって占有され、かつ第二のアミノ酸位置が、第二および第三の天然に存在するヒトタンパク質配列に共通のアミノ酸残基によって占有され、かつ、それぞれ配列がサブシークエンスのセット由来の2種以上のサブシークエンスに対応しかつそれぞれ1個以上の特定されたキメラ連結部を含むヒト様キメラタンパク質分子を作製することによって、ヒト様キメラタンパク質のライブラリーを作製する。
【００４１】
改変された単量体ドメインは、単量体ドメインをコードするポリヌクレオチド中のあらかじめ決められた部位にライゲーションによって挿入される予定のペプチド配列の、保存された、ランダムの、疑似ランダムの、または限定された配列をコードする合成オリゴヌクレオチド(例えばオーバーラップオリゴヌクレオチド)のコレクションを提供することによって作製することもできる。同様に、部位特異的突然変異誘発、ランダム突然変異、疑似ランダム突然変異、限定カーネル(defined kernal)突然変異、コドンベースの突然変異、等で単量体ドメイン(群)を突然変異させることによって、1種以上の単量体ドメインの配列多様性を拡大することができる。得られた核酸分子をクローニングおよび増幅のために宿主中で増殖させることができる。いくつかの実施形態では、核酸を組換える。
【００４２】
単量体ドメインをコードする多数の核酸を組換えおよびスクリーニングして、IL-33に結合する単量体ドメインのライブラリーを作製することができる。選択された単量体ドメイン核酸を、中性配列(すなわち、結合に対する、実質的でない機能的影響しか有さない配列)をコードするポリヌクレオチド配列と組換えることによって戻し交配(back-crossed)することもでき、例えば、選択配列に実質的に同一の野生型または天然に存在する配列と戻し交配することによってネイティブ様機能的単量体ドメインを得る。一般に、戻し交配中に、特性、例えばリガンドに対する結合性を保持するための、その後の選択を適用する。
【００４３】
ドメインのライブラリー由来のIL-33に特異的に結合する単量体ドメインおよび/または免疫ドメイン(immuno-domains)の選択は、種々の手順によって達成することができる。例えば、所望の特性を有する単量体ドメインおよび/または免疫ドメインを特定する一方法は、それぞれが単量体ドメインおよび/または免疫ドメインをコードする多数の核酸を翻訳するステップ、多数の核酸によってコードされるポリペプチドをスクリーニングするステップ、およびIL-33に結合する単量体ドメインおよび/または免疫ドメインを特定して選択単量体ドメインおよび/または免疫ドメインを得るステップを含む。各核酸によって発現された単量体ドメインおよび/または免疫ドメインを、当技術分野において公知の方法(すなわち、パニング、アフィニティークロマトグラフィー、FACS解析)によってIL-33に結合するその能力に関して検査することができる。
【００４４】
上述のように、単量体ドメインおよび/または免疫ドメインの選択はIL-33に対する結合に基づくことができる。単量体ドメインおよび/または免疫ドメインの他の選択は、例えば、IL-33の特定の機能の阻害または増強に基づくことができる。IL-33活性には、例えば、肥満細胞によるケモカイン分泌の誘発の減少が含まれうる。選択は高処理アッセイを使用するステップを含むこともできる。
【００４５】
単量体ドメインおよび/または免疫ドメインが、IL-33に結合するその能力に基づいて選択される場合、選択の基礎には、通常高親和性を予測させる緩徐な解離速度に基づく選択が含まれうる。リガンドの結合価を変化させて、選択単量体ドメインおよび/または免疫ドメインの平均結合親和性をコントロールすることもできる。例えば競合化合物を加えることによって、希釈によって、または当業者に公知の他の方法によって、IL-33を種々の密度で表面または基質に結合させることができる。
【００４６】
他のディスプレイ系の例には、リボソームディスプレイ、ヌクレオチド結合ディスプレイ(例えば、U.S. Pat. Nos. 6,281,344; 6,194,550, 6,207,446, 6,214,553, および6,258,558を参照のこと)、ポリソームディスプレイ、細胞表面ディスプレイ等が含まれる。細胞表面ディスプレイには、種々の細胞、例えば、大腸菌(E. coli)、酵母および/または哺乳類細胞が含まれる。細胞をディスプレイとして使用する場合、核酸、例えばPCR増幅およびその後の消化によって得られた核酸を細胞に導入し、翻訳する。場合により、本発明の単量体ドメインまたは多量体をコードするポリペプチドを、例えばインジェクションによって細胞に導入することができる。
【００４７】
いくつかの実施形態では、同一ファミリーの単量体ドメインおよび/または免疫ドメイン(例えばLDL受容体クラスAドメイン)由来の2種以上の異なる配列を組換えることによって変異体を作製する。あるいは、異なるファミリー由来の2種以上の異なる単量体ドメインおよび/または免疫ドメインを組み合わせて多量体を形成させることができる。いくつかの実施形態では、以下のファミリークラス: EGF様ドメイン、クリングル-ドメイン、フィブロネクチンI型ドメイン、フィブロネクチンII型ドメイン、フィブロネクチンIII型ドメイン、PANドメイン、G1aドメイン、SRCRドメイン、クニッツ/ウシ膵臓トリプシンインヒビタードメイン、Kaza1型セリンプロテアーゼインヒビタードメイン、トレフォイル(P-型)ドメイン、フォンウィルブランド因子C型ドメイン、アナフィラトキシン-様ドメイン、CUBドメイン、チログロブリンI型リピート、LDL受容体クラスAドメイン、スシドメイン、リンクドメイン、トロンボスポンジンI型ドメイン、免疫グロブリン様ドメイン、C型レクチンドメイン、MAMドメイン、フォンウィルブランド因子A型ドメイン、ソマトメジンBドメイン、WAP型4ジスルフィドコアドメイン、F5/8 C型ドメイン、ヘモペキシンドメイン、SH2ドメイン、SH3ドメイン、ラミニン型EGF様ドメイン、C2ドメイン、およびその誘導体の少なくとも1つの単量体または単量体変異体から多量体を形成させる。別の実施形態では、単量体ドメインおよび異なる単量体ドメインには、Pfamデータベースおよび/またはSMARTデータベースに見出せる1種以上のドメインが含まれうる。上記方法によって作製されるライブラリー、該ライブラリーの1種以上のメンバーを含む1種以上の細胞(群)、および該ライブラリーの1種以上のメンバーを含む1種以上のディスプレイもまた、本発明に含まれる。
【００４８】
多量体は、IL-33に結合する少なくとも2個の単量体ドメインおよび/または免疫ドメインを含む。例えば、多量体は、2〜約10個の単量体ドメインおよび/または免疫ドメイン、2〜約8個の単量体ドメインおよび/または免疫ドメイン、約3〜約10個の単量体ドメインおよび/または免疫ドメイン、約7個の単量体ドメインおよび/または免疫ドメイン、約6個の単量体ドメインおよび/または免疫ドメイン、約5個の単量体ドメインおよび/または免疫ドメイン、または約4個の単量体ドメインおよび/または免疫ドメインを含むことができる。いくつかの実施形態では、多量体は少なくとも3個の単量体ドメインおよび/または免疫ドメインを含む。単量体ドメインサイズの可能な範囲を考慮すると、本発明の多量体は、例えば、100 kD、90 kD、80 kD、70 kD、60 kD、50 kd、40 kD、30 kD、25 kD、20 kD、15 kD、10 kDまたはそれ以下またはそれ以上であってよい。典型的に、単量体ドメインはIL-33に対する結合に関してあらかじめ選択されている。
【００４９】
いくつかの実施形態では、各単量体ドメインはIL-33に特異的に結合する。いくつかの前記実施形態では、各単量体はIL-33上の異なる位置(エピトープに類似の位置)に結合する。IL-33に結合する複数の単量体ドメインおよび/または免疫ドメインはアビディティー効果を導くことができ、アビディティー効果により、個々の各単量体と比較して、IL-33に対する多量体のアビディティーが向上する。いくつかの実施形態では、多量体は、単量体ドメインのみのアビディティーの少なくとも約1.5、2、3、4、5、10、20、50または100倍のアビディティーを有する。
【００５０】
多量体は単量体ドメインの種々の組み合わせを含むことができる。例えば、単一の多量体中で、選択した単量体ドメインは同じであるかまたは同一であるか、場合により、異なるかまたは非同一であってよい。さらに、選択した単量体ドメインは、同一単量体ドメインファミリー由来の種々の異なる単量体ドメインを含むか、または異なるドメインファミリー由来の種々の単量体ドメインを含むか、または場合により、両者の組み合わせを含むことができる。
【００５１】
選択した単量体ドメインをリンカーによって結合させて単鎖多量体を形成させることができる。例えば、多量体中の分離した個別の各単量体ドメイン間にリンカーを配置する。典型的には、免疫ドメインも、リンカー部分を介して互いにまたは単量体ドメインに連結する。免疫ドメイン変異体をともに連結するために容易に用いることができるリンカー部分は、単量体ドメイン変異体の多量体に関して記載されるリンカー部分と同一である。免疫ドメイン変異体を他のドメインに結合して多量体にするために好適なリンカー部分は本明細書中に記載される。
【００５２】
リンカーを介する選択した単量体ドメインの結合は、当技術分野において公知の種々の技術を使用して達成することができる。例えば、制限消化および再連結によって、PCRベースの、セルフプライミングオーバーラップ反応(self-priming overlap reactions)、または他の組換え法によって、選択した単量体ドメインをコードするポリヌクレオチドのコンビナトリアルアセンブリを達成することができる。IL-33に結合する能力に関して単量体を特定する前に、またはIL-33に結合する能力に関して単量体を選択した後にリンカーを単量体に取り付けることができる。
【００５３】
リンカーは、天然に存在するリンカー、合成リンカーまたは両者の組み合わせであってよい。例えば、合成リンカーは、例えば配列およびサイズがともにランダム化されたリンカーであってよい。一態様では、ランダム化リンカーは完全にランダム化された配列を含むことができ、または場合により、ランダム化リンカーは天然リンカー配列に基づくリンカーであってよい。リンカーは、例えば、非ポリペプチド部分、ポリヌクレオチド、ポリペプチド等を含むことができる。
【００５４】
リンカーは、堅固なリンカー、または代わりに、フレキシブルリンカー、または両者の組み合わせであってよい。リンカーの可動性は、リンカーおよび、リンカーが相互作用する単量体ドメインの両者の組成の関数でありうる。リンカーは2個の選択単量体ドメインを結合し、単量体ドメインを、分離した個別の単量体ドメインとして維持する。リンカーによって、分離した個別の単量体ドメインが協同するが、分離した特性、例えば多量体(multime)中の複数の分離したIL-33結合部位を維持することが可能になる。時には、2つの連結された単量体ドメイン間またはリンカーと単量体ドメインの間にジスルフィド架橋が存在する。いくつかの実施形態では、単量体ドメインおよび/またはリンカーは金属-結合中心を含む。
【００５５】
2個以上の単量体ドメイン(すなわちポリペプチド鎖)を連結しようとする特定の場合に好適なリンカーの選択は、例えば単量体ドメインの性質、および/またはタンパク質分解および酸化に関するペプチドリンカーの安定性を含む種々のパラメータに依存する。
【００５６】
リンカーポリペプチドは、Gly、Ser、AlaおよびThrからなる群から選択されるアミノ酸残基を主に含んでよい。例えば、ペプチドリンカーは、少なくとも75% (ペプチドリンカー中に存在する残基の総数に基づいて算出される)、例えば少なくとも80%、例えば少なくとも85%または少なくとも90%の、Gly、Ser、AlaおよびThrからなる群から選択されるアミノ酸残基を含有してよい。ペプチドリンカーはGly、Ser、Alaおよび/またはThr残基のみから構成されていてもよい。リンカーポリペプチドは、2個の単量体ドメインを、それらが所望の活性を保持するように互いに対して正しいコンフォメーションをとるように連結するために適切な長さを有するべきであろう。
【００５７】
この目的のために好適な長さは、少なくとも1個でかつ典型的に約50アミノ酸残基未満、例えば2〜25アミノ酸残基、5〜20アミノ酸残基、5〜15アミノ酸残基、8〜12アミノ酸残基または11残基の長さである。同様に、リンカーをコードするポリペプチドは、サイズが、例えば約2〜約15アミノ酸、約3〜約15、約4〜約12、約10、約8、または約6アミノ酸の範囲であってよい。核酸、例えばDNA、RNA、または両者の組み合わせを含む方法および組成物では、リンカー配列を含有するポリヌクレオチドは、例えば約6ヌクレオチド〜約45ヌクレオチドの範囲、約9ヌクレオチド〜約45ヌクレオチドの範囲、約12ヌクレオチド〜約36ヌクレオチドの範囲、約30ヌクレオチド、約24ヌクレオチド、または約18ヌクレオチドであってよい。同様に、リンカーポリペプチドに含めるために選択されたアミノ酸残基は、ポリペプチド多量体の活性または機能を大きく妨害しない特性を示すべきであろう。ゆえに、ペプチドリンカーは総合的に考えて電荷を示さないべきであろう。電荷があると、ポリペプチド多量体の活性または機能と調和しないか、または内部フォールディングを妨害するか、または1個以上の単量体ドメインのアミノ酸残基と結合または他の相互作用を形成し、それによりIL-33に対するポリペプチド多量体の結合が大きく妨害される。
【００５８】
特定のポリペプチド多量体中の特定のセットの単量体ドメインに関してペプチドリンカー中のアミノ酸残基がランダム化されたライブラリーからペプチドリンカーを選択してもよい。フレキシブルリンカーを使用して、単量体ドメインの好適な組み合わせを見出すことができ、次いでそれを、可変リンカーの前記ランダムライブラリーを使用して最適化して、最適な長さおよび形状を有するリンカーを得ることができる。最適なリンカーは、標的に対する結合に関与しかつIL-33に結合していないときにポリペプチド多量体中の単量体ドメインの、互いに対する移動を制限する適切なタイプの最小数のアミノ酸残基を含有してよい。
【００５９】
ポリペプチドを連結して新規連結融合ポリペプチドにするための天然に存在するペプチドリンカーならびに人工ペプチドリンカーの使用は文献において周知である(Hallewell et al. (1989), J. Biol. Chem. 264, 5260-5268; Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8, 725-731; Robinson & Sauer (1996), Biochemistry 35, 109-116; Khandekar et al. (1997), J. Biol. Chem. 272, 32190-32197; Fares et al. (1998), Endocrinology 139, 2459-2464; Smallshaw et al. (1999), Protein Eng. 12, 623-630; U.S. Pat. No. 5,856,456)。
【００６０】
上述のように、概して、ペプチドリンカーは少なくともいくらかの可動性を有することが好ましい。したがって、いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、1-25グリシン残基、5-20グリシン残基、5-15グリシン残基または8-12グリシン残基を含有する。ペプチドリンカーは、典型的に、少なくとも50%のグリシン残基、例えば少なくとも75%のグリシン残基を含有する。本発明のいくつかの実施形態では、ペプチドリンカーはグリシン残基のみを含む。
【００６１】
時には、ペプチドリンカーにいくらかの堅さをもたらすことが望ましいかまたは必要である。これは、ペプチドリンカーのアミノ酸配列にプロリン残基を含ませるによって達成することができる。ゆえに、本発明の別の実施形態では、ペプチドリンカーはペプチドリンカーのアミノ酸配列中に少なくとも1個のプロリン残基を含んでよい。例えば、ペプチドリンカーは、少なくとも25%、例えば少なくとも50%、例えば少なくとも75%、のアミノ酸残基がプロリン残基であるアミノ酸配列を有する。本発明の特定の一実施形態では、ペプチドリンカーはプロリン残基のみを含む。
【００６２】
本発明のいくつかの実施形態では、非ポリペプチド部分を取り付けるための基を含むアミノ酸残基が導入されるようにペプチドリンカーを改変する。そのようなアミノ酸残基の例はシステイン残基(後に非ポリペプチド部分を取り付ける対象である)であるか、またはアミノ酸配列はin vivo N-グリコシル化部位(それにより糖部分(in vivo)がペプチドリンカーに取り付けられる)を含んでよい。追加の選択肢は、進化させた(evolved) tRNAおよびtRNAシンセターゼ(例えば米国特許出願公開第2003/0082575号を参照のこと)を使用して単量体ドメインまたはリンカーに非天然アミノ酸を遺伝的に組み入れることである。例えば、ケト-チロシンの挿入により、発現された単量体ドメインまたは多量体に対する部位特異的カップリングが可能になる。
【００６３】
時には、ポリペプチド多量体中に存在するすべてのペプチドリンカーのアミノ酸配列は同一である。あるいは、ポリペプチド多量体中に存在するすべてのペプチドリンカーのアミノ酸配列は異なってよい。
【００６４】
延長された血清半減期等の所望の効果を達成するために、ほんの少数の、典型的には1個のみの非ポリペプチド部分群/部分(例えばmPEG、糖部分または非ポリペプチド治療物質)をポリペプチド多量体に取り付けることが望ましいかまたは必要であることがかなり多い。明らかに、2個のペプチドリンカーを含有するポリペプチド三量体の場合、一方のペプチドリンカーのみを例えばシステイン残基の導入によって改変することが典型的に必要とされるが、他方のペプチドリンカーの改変は典型的に必要ではない。この場合、ポリペプチド多量体(三量体)のすべての(両)ペプチドリンカーは異なってよい。
【００６５】
単量体または多量体を進化させるための方法は、例えば、以下のステップ: それぞれが単量体ドメインをコードする多数の異なる核酸を提供するステップ; 多数の異なる核酸を翻訳して多数の異なる単量体ドメインを得るステップ; 多数の異なる単量体ドメインをIL-33の結合に関してスクリーニングするステップ; IL-33に結合する、多数の異なる単量体ドメインのメンバーを特定して選択単量体ドメインを得るステップ; 選択単量体ドメインを少なくとも1個のリンカーと結合させて、少なくとも2個の選択単量体ドメインおよび少なくとも1個のリンカーを含む少なくとも1個の多量体を作製するステップ; および、少なくとも1個の多量体を、選択単量体ドメインと比較して、IL-33に関する向上した親和性またはアビディティーまたは改変された特異性に関してスクリーニングするステップのいずれかまたはすべてを含むことができる。
【００６６】
単量体または多量体に変異を導入することができる。改良された単量体の例には、ドメイン内組換えが含まれ、ドメイン内組換えでは、得られる増幅産物中に変異を(例えばシャフリングまたは他の組換え法によって)導入するための条件下で単量体の2個以上(例えば、3、4、5、またはそれ以上)の部分を別々に増幅して、単量体の異なる部分に関する変異体のライブラリーを合成する。両PCR断片が共通に有する「ミドル(middle)」または「オーバーラップ」配列中にミドルプライマーの5'末端を配置することによって、得られる「左」側および「右」側ライブラリーをオーバラップPCRによって組み合わせて元の単量体プールの新規変異体を作製することができる。これらの新規変異体を所望の特性に関してスクリーニングすることができ、例えば、標的に対してパニングするか、または機能的効果に関してスクリーニングする。「ミドル」プライマー(群)は、単量体の任意のセグメントに対応するように選択してよく、典型的に、足場または単量体内の1個以上のコンセンサスアミノ酸(例えばAドメインに見出されるようなシステイン)に基づく。
【００６７】
同様に、単量体レベルで変異を導入し、次いで単量体変異体ライブラリーを組換えることによって多量体を創出することができる。大規模に、所望の特性を有する多量体(単一またはプール)を組換えて、長い多量体を形成させてよい。時には、単量体またはリンカーに変異を(典型的に合成によって)導入してライブラリーを形成させる。
【００６８】
異なる長さおよび組成のリンカーをドメイン間に挿入することによって追加の変異を導入することができる。これにより、ドメイン間の最適なリンカーの選択が可能になる。いくつかの実施形態では、リンカーの最適な長さおよび組成により、ドメインの最適な結合が可能になる。いくつかの実施形態では、特定の結合親和性(群)を有するドメインを異なるリンカーを介して連結し、結合アッセイにおいて最適なリンカーを選択する。例えば、ドメインを所望の結合特性に関して選択し、次いで種々のリンカーを含むライブラリーに形成させる。次いで該ライブラリーをスクリーニングして最適なリンカーを特定することができる。あるいは、IL-33結合に対するドメインまたはリンカーの影響が未知である多量体ライブラリーを形成させることができる。
【００６９】
多量体を特定するための一方法は多量体をディスプレイすることによって達成することができる。単量体ドメインの場合のように、多量体を場合により発現させるか、または上記のように種々のディスプレイ系、例えば、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、ポリソームディスプレイ、ヌクレオチド結合ディスプレイ(例えば、U.S. Pat. Nos. 6,281,344; 6,194,550, 6,207,446, 6,214,553, および6,258,558を参照のこと)および/または細胞表面ディスプレイ上でディスプレイする。細胞表面ディスプレイには、非限定的に、大腸菌、酵母または哺乳類細胞が含まれうる。さらに、複数の結合部位を有する多量体のディスプレイライブラリーをIL-33に関するアビディティーまたは親和性または改変された特異性に関してパニングすることができる。
【００７０】
いくつかの実施形態では、単量体または多量体ドメインを、医薬品として有用な分子(例えば、タンパク質、核酸、有機小分子、等)に連結する。典型的な医薬用タンパク質には、例えば、サイトカイン、抗体、ケモカイン、成長因子、インターロイキン、細胞表面タンパク質、細胞外ドメイン、細胞表面受容体、細胞毒、等が含まれる。典型的な小分子医薬品には、小分子毒素または治療物質が含まれる。
【００７１】
当技術分野において公知の任意の方法にしたがって本発明の多量体または単量体ドメインを製造することができる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドをコードするpET由来プラスミドを含む大腸菌を誘導してタンパク質を発現させる。細菌の回収後、それらを溶解し、遠心分離によって浄化する。Ni--NTAアガロース溶出を使用してポリペプチドを精製し、透析によってリフォールディングさせる。ミスフォールディングしたタンパク質を、ヨード酢酸を伴うキャッピングフリースルフヒドリル(capping free sulfhydrils)によって中和することができる。Qセファロース溶出、ブチルセファロースFT、SPセファロース溶出、Qセファロース溶出、および/またはSPセファロース溶出を使用してポリペプチドを精製することができる。
【００７２】
単量体/多量体ドメインポリペプチドは、米国特許6,673,901, 7,153,661, および米国特許出願公開2005-0048512および2006-0223114にさらに記載される。
【００７３】
フィブロネクチンドメイン/足場を含むIL-33特異的単量体
IL-3に特異的に結合する単量体はフィブロネクチンドメインに基づいてよく、フィブロネクチンまたはフィブロネクチン様足場を含んでよい。これらの単量体は、抗体における構造および機能の喪失を通常生じさせる条件下で、最適なフォールディング、安定性、および溶解性を示す抗体模擬体(mimics)のように作用する。
【００７４】
フィブロネクチンドメイン/足場を含むIL-33特異的単量体は、抗体可変領域の相補性決定領域(CDR)に類似の3つのフィブロネクチンループを含む。これらのループを、IL-33結合を向上させるように設計された定方向進化(directed evolution)に付しても付さなくてもよい。そのような定方向進化アプローチにより、目的の抗原に対する高親和性を有する抗体様分子が生産される。さらに、フィブロネクチンドメイン/足場を使用して規定の曝露されたループ(例えば、あらかじめランダム化および抗原結合に基づいて選択されたループ)をディスプレイして、そのような導入ループに結合する分子の進化を方向付けることができる。このタイプの選択を実行して、任意の個々のCDR様ループに関する認識分子を特定するか、または、その代わりに、非線形エピトープに組み合わされた2つまたは全3つのCDR様ループの認識に関する認識分子を特定することができる。
【００７５】
フィブロネクチンドメイン/足場はフィブロネクチンIII型ドメイン(Fn3)であってよい。Fn3ドメインは、2つのベータシート間に分配されている7または8ベータストランドを有し(該ベータシート自体は互いに反対にパッキングしてタンパク質のコアを形成する)、かつ該ベータストランドを互いに連結しかつ溶媒に曝露されているループをさらに含有するドメインであってよい。ベータシートサンドイッチの各エッジに少なくとも3つのそのようなループが存在し、該エッジはベータストランドの向きに対して垂直なタンパク質の境界である。Fn3ドメインは、通常、哺乳類の血液および構造タンパク質中に見出せる。Fn3ドメインは任意のポリペプチド由来であってよく; そのようなポリペプチドには、フィブロネクチン、テネイシン、細胞内細胞骨格タンパク質、および原核生物の酵素が含まれることが知られている(Bork and Doolittle, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:8990, 1992; Bork et al., Nature Biotech. 15:553, 1997; Meinke et al., J. Bacteriol. 175:1910, 1993; Watanabe et al., J. Biol. Chem. 265:15659, 1990)。
【００７６】
フィブロネクチンドメインがFn3ドメインである場合、Fn3ドメインは1Fn3-9Fn3および11Fn3-17Fn3のいずれか1つのモジュール、ならびに非ヒト動物および原核生物由来の関連Fn3モジュールであってよい。さらに、テネイシンおよびウンジュリン(undulins)等の、10Fn3に対して配列相同性を有する、他のタンパク質由来のFn3モジュールを使用してもよい。異なる生物および親タンパク質由来のモジュールが種々の適用に最も適切であるかもしれない; 例えば、抗体模擬体を設計する場合、治療用または診断用分子の対象である生物に対してネイティブのフィブロネクチンまたはフィブロネクチン様分子由来の該タンパク質を作製することが最も望ましい。
【００７７】
10Fn3モジュールは、Protein Data Baseから入手可能な「1ttg」(ID=「1ttg」(one ttg))と称される10Fn3ドメインの構造をコードする配列に対して、少なくとも30%のアミノ酸同一性、または少なくとも50%のアミノ酸同一性を示す配列を有してよい。この定義で言及される配列同一性は、Molecular Simulation (San Diego, Calif.)から入手可能なHomologyプログラムによって決定される。10Fn3モジュールは、10Fn3-関連モジュールのポリマーであってもよく、それは、ポリタンパク質のサブユニットの配列が同一であるか異なるかにかかわらず、単量体構造の使用の拡張であってよい。10Fn3モジュールは典型的に94アミノ酸残基を含む。このドメインの全体のフォールディングは最小の機能的抗体断片である重鎖の可変領域のフォールディングに密接に関連している。ラクダおよびラマIgGにおいて重鎖の可変領域は抗原認識単位全体を含む。ラクダおよびラマドメインと10Fn3ドメインの間の主な差異は、(i) 10Fn3の方が少ないベータストランドしか有さない(7 vs. 9)こと、および(ii) 互いに反対にパッキングされた2つのベータシートが、ラクダおよびラマドメインではジスルフィド架橋によって連結されているが、10Fn3ではそうではないことである。
【００７８】
IgG重鎖の抗原結合ループに対応する10Fn3の3つのループは、およそアミノ酸残基21〜31、51〜56、および76〜88間にわたる。第一および第三ループの長さ、それぞれ11および12残基は、抗体重鎖中に見出される対応する抗原認識ループの範囲、すなわちそれぞれ10〜12および3〜25残基内に入る。したがって、ランダム化および高い抗原親和性に関する選択後、これらの2つのループは、抗体中の対応するループの接触と同等にIL-33と接触する。
【００７９】
対照的に、10Fn3の第二ループはほんの6残基長であるが、抗体重鎖中の対応するループは16〜19残基の範囲である。したがって、抗原結合を最適化するために、10Fn3の第二ループを(ランダム化に加えて) 10〜13残基延長して、最大の可動可能性およびIL-33結合における親和性を得ることができる。実際、一般に、IL-33抗体模擬体のCDR様ループの長さならびに配列をin vitroまたはin vivo親和性成熟中にランダム化することができる。
【００８０】
ヒト10Fn3配列では、最低でも、アミノ酸1-9、44-50、61-54、82-94 (ベータシートのエッジ); 19、21、30-46 (even)、79-65 (odd) (両ベータシートの溶媒接近可能表面); 21-31、51-56、76-88 (CDR様溶媒接近可能ループ); および14-16および36-45 (他の溶媒接近可能ループおよびベータターン)をランダム化して新規または改良IL-33-結合タンパク質を進化させることができることが解析によって示される。さらに、1つ以上の溶媒曝露ループの長さの改変をそのような定方向進化法に含ませてもよい。あるいは、ベータシート配列の変化を使用して新規タンパク質を進化させてもよい。これらの突然変異は骨格を変化させ、それによってループ構造(群)を間接的に改変する。このアプローチが採用される場合、突然変異が配列を飽和させるべきではなく、むしろ少ない突然変異しか導入されないべきであろう。このアプローチによって、わずか10、9、8、7、6、、5、4 3、2、または1アミノ酸の変化をベータシート配列に導入してよい。本発明のフィブロネクチンIII型ドメイン含有タンパク質はジスルフィド結合を欠いてよい。
【００８１】
フィブロネクチンドメイン/足場を含むIL-33特異的単量体を他のタンパク質ドメインに融合させてよい。例えば、フィブロネクチンドメイン/足場を含むIL-33特異的単量体を、IgGの定常領域(Fc)を10Fn3モジュールと、場合により10Fn3のC末端を介して融合させることによって、ヒト免疫応答と融和させてよい。そのような10Fn3-Fc融合分子中のFcは免疫応答の補体成分を活性化させ、抗体模擬体の治療価値を増加させることができる。同様に、10Fn3とClq等の補体タンパク質間の融合を使用してよく、10Fn3と毒素間の融合も有用である。さらに、任意の形式の10Fn3をアルブミンと融合させて、血流中のその半減期およびその組織浸透を増加させてよい。任意のこれらの融合は、標準的技術によって、例えば公的に入手可能な遺伝子配列を使用して構築された組換え融合遺伝子からの融合タンパク質の発現によって作製することができる。
【００８２】
フィブロネクチン単量体に加えて、結合価およびゆえにIL-33結合のアビディティーを増加させるための手段としての10Fn3-ベースの抗体模擬体の二量体または多量体として任意のフィブロネクチン構築物を作製することができる。そのような多量体は、個々の10Fn3モジュール間の共有結合によって、例えば天然8Fn3-9Fn3-10Fn3 C-to-N-末端結合を模倣するかまたは定常領域によってつなぎ合わされている抗体二量体を模倣することによって作製することができる。10Fn3-Fc構築物を利用して一般式: 10Fn3-Fc::Fc-10Fn3の二量体を設計してよい。Fc::Fc界面になるように設計される結合は共有結合または非共有結合であってよい。さらに、Fc以外の二量体化または多量体化パートナーを10Fn3ハイブリッド中で使用してそのような高次構造を創出することができる。
【００８３】
特定の例では、多量体をコードする融合遺伝子を構築するか、または代わりに、システイン残基のコドンを操作して単量体配列中に入れて発現産物間でジスルフィド結合の形成が生じることを可能にすることよって、共有結合によって結合されたフィブロネクチン多量体を作製する。非共有結合によって結合された多量体を種々の技術によって作製してもよい。これらには、単量体配列内への、正および/または負に帯電した残基に対応しかつ発現産物中でこれらの残基間(したがって単量体間)の相互作用が生じることを可能にするコドンの導入が含まれる。このアプローチは、単量体サブユニット中に天然に存在する荷電残基、例えばフィブロネクチンの負に帯電した残基を利用して単純化してよい。非共有結合によって結合された抗体模擬体を作製するための別の手段は、相互作用することが知られているタンパク質またはタンパク質ドメインのコード配列を単量体遺伝子に(例えばアミノ-またはカルボキシ-末端で)導入することである。そのようなタンパク質またはタンパク質ドメインには、コイル-コイルモチーフ、ロイシンジッパーモチーフ、および二量体または高次多量体の形成を導くことが知られている任意の多数のタンパク質サブユニット(またはその断片)が含まれる。
【００８４】
フィブロネクチンドメイン/足場を含むIL-33特異的単量体を、バイオパニングプロトコル(Smith & Scott, 1993)を使用してIL-33特異的結合に関してスクリーニングすることができる; IL-33をビオチン化し、強いビオチンストレプトアビジン相互作用を使用して、ストレプトアビジンでコーティングされた皿上にIL-33を固定する。実験は室温で実施する(22℃)。ライブラリーからのファージの最初の回収では、10μgのビオチン化IL-33をストレプトアビジンコーティングポリスチレン皿(35 mm, Falcon 1008)上に固定し、次いでファージ溶液(約1011 pfu (プラーク形成単位)を含有)を加える。適切なバッファー(典型的にTBST, Tris-HCl (50 mM, pH 7.5), NaCl (150 mM)およびTween 20 (0.5%))で皿を洗浄した後、以下の条件: 低pH、遊離IL-33の添加、尿素(6 Mまで)および、トロンビンによるIL-33-ビオチンリンカーの切断の1つまたは組み合わせによって結合ファージを溶出させる。回収されたファージをK91kanを宿主として使用する標準プロトコルを使用して増幅する(Sambrook et al., 1989)。選択プロセスを3-5回反復して陽性クローンを濃縮する。第二ラウンドを開始してから、IL-33の量を次第に(約1μgに)減少させ、ビオチン化IL-33をファージ溶液と混合した後に皿を移す。最終ラウンドの後、10 20クローンを採取し、そのDNA配列を決定する。クローンのIL-33親和性をファージ-ELISA法によって最初に測定する。
【００８５】
IL-33に対するFn3フレームワークの潜在的結合(バックグラウンド結合)を抑制するために、野生型Fn3をバッファー中に競合因子として加えてよい。さらに、無関係のタンパク質(例えば、ウシ血清アルブミン、シトクロムcおよびRNアーゼA)を競合者として使用して、非常にIL-33特異的なFn抗体模擬体を選択してよい。
【００８６】
ファージ表面上のフィブロネクチンドメイン/足場を含むIL-33特異的単量体の結合親和性は、ファージELISA技術(Li et al., 1995)を使用して半定量的に特徴付けられる。マイクロタイタープレート(Nunc)のウェルをIL-33でコーティングし(またはストレプトアビジンでコーティングし、次いでビオチン化IL-33を結合させ)、BLOTTO溶液(Pierce)でブロックする。単一プラーク(M13)/コロニー(fUSE5)由来の精製ファージ(約1010 pfu)を各ウェルに加えて4℃で一晩インキュベートする。適切なバッファー(上記参照のこと)でウェルを洗浄した後、抗-M13 Ab (ウサギ, Sigma)および抗-ウサギIg-ペルオキシダーゼコンジュゲート(Pierce)を使用するかまたは抗-M13 Ab-ペルオキシダーゼコンジュゲート(Pharmacia)を使用する標準ELISAプロトコルによって結合ファージを検出する。TMB (3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン, Pierce)を使用して比色(Colormetric)アッセイを実施する。抗IL-33 Abを使用してフィブロネクチンドメイン/足場を含むIL-33特異的単量体を検出する。
【００８７】
ファージELISAを使用してフィブロネクチンドメイン/足場を含むIL-33特異的単量体を予備的に特徴付けした後、遺伝子を発現ベクターpEW1にサブクローニングする。フィブロネクチンドメイン/足場を含む単量体をHis-タグ融合タンパク質として製造し、精製し、およびそのコンフォメーション、安定性およびIL-33親和性を特徴付けする。
【００８８】
IL-33特異的抗体または単量体/多量体ドメインポリペプチドのIL-33結合特性
IL-33特異的抗体および単量体/多量体ドメインポリペプチドはIL-33ポリペプチドに関する高い結合親和性を有することができる。IL-33特異的抗体および単量体/多量体ドメインポリペプチドは、少なくとも105 M-1s-1、少なくとも1.5x105 M-1s-1、少なくとも2x105 M-1s-1、少なくとも2.5x105 M-1s-1、少なくとも5x105 M-1s-1、少なくとも106 M-1s-1、少なくとも5x106 M-1s-1、少なくとも107 M-1s-1、少なくとも5x107 M-1s-1、または少なくとも108 M-1s-1、または105-108 M-1s-1、1.5x105 M-1s-1-1x107 M-1s-1、2x105-1x106 M-1s-1、または4.5x105〜5x 107 M-1s-1の会合速度定数またはkon速度(抗体(Ab)+抗原(Ag)(kon→Ab-Ag)を有してよい。IL-33特異的抗体および単量体/多量体ドメインポリペプチドは、BIAcoreアッセイによって測定された場合、少なくとも2x105 M-1s-1、少なくとも2.5x105 M-1s-1、少なくとも5x105 M-1s-1、少なくとも106 M-1s-1、少なくとも5x106 M-1s-1、少なくとも107 M-1s-1、少なくとも5x107 M-1s-1、または少なくとも108 M-1s-1のkonを有し、IL-33特異的抗体および単量体/多量体ドメインポリペプチドはマイクロ中和アッセイにおいてヒトIL-33を中和することができる。IL-33特異的抗体および単量体/多量体ドメインポリペプチドは、BIAcoreアッセイによって測定された場合、多くとも108 M-1s-1、多くとも109 M-1s-1、多くとも1010 M-1s-1、多くとも1011 M-1s-1、または多くとも1012 M-1s-1のkonを有し、マイクロ中和アッセイにおいてヒトIL-33を中和することができる。
【００８９】
IL-33特異的抗体および単量体/多量体ドメインポリペプチドは、10-3 s-1未満、5x10-3 s-1未満、10-4 s-1未満、2x10-4 s-1未満、5x10-4 s-1未満、10-5 s-1未満、5x10-5 s-1未満、10-6 s-1未満、5x10-6 s-1未満、10-7 s-1未満、5x10-7 s-1未満、10-8 s-1未満、5x10-8 s-1未満、10-9 s-1未満、5x10-9 s-1未満、または10-10 s-1未満、または10-3-10-10 s-1、10-4-10-8 s-1、または10-5-10-8 s-1のkoff速度(抗体(Ab)+抗原(Ag koff←→Ab-Ag)を有してよい。IL-33特異的抗体および単量体/多量体ドメインポリペプチドは、BIAcoreアッセイによって測定された場合、10-5 s-1、5x10-5 s-1未満、10-6 s-1未満、5x10-6 s-1未満、10-7 s-1未満、5x10-7 s-1未満、10-8 s-1未満、5x10-8 s-1未満、10-9 s-1未満、5x10-9 s-1未満または10-10 s-1未満のkoffを有し、IL-33特異的抗体および単量体/多量体ドメインポリペプチドはマイクロ中和アッセイにおいてヒトIL-33を中和することができる。IL-33特異的抗体および単量体/多量体ドメインポリペプチドは、10-13 s-1より大きいか、10-12 s-1より大きいか、10-11 s-1より大きいか、10-10 s-1より大きいか、10-9 s-1より大きいか、または10-8 s-1より大きいkoffを有してよい。
【００９０】
IL-33特異的抗体および単量体/多量体ドメインポリペプチドは、少なくとも102 M-1、少なくとも5x102 M-1、少なくとも103 M-1、少なくとも5x103 M-1、少なくとも104 M-1、少なくとも5x104 M-1、少なくとも105 M-1、少なくとも5x105 M-1、少なくとも106 M-1、少なくとも5x106 M-1、少なくとも107 M-1、少なくとも5x107 M-1、少なくとも108 M-1、少なくとも5x108 M-1、少なくとも109 M-1、少なくとも5x109 M-1、少なくとも1010 M-1、少なくとも5x1010 M-1、少なくとも1011 M-1、少なくとも5x1011 M-1、少なくとも1012 M-1、少なくとも5x1012 M-1、少なくとも1013 M-1、少なくとも5x1013 M-1、少なくとも1014 M-1、少なくとも5x1014 M-1、少なくとも1015 M-1、または少なくとも5x1015 M-1、または102-5x105 M-1、104-1x1010 M-1、または105-1x108 M-1の親和性定数またはKa (kon/koff)を有してよい。IL-33特異的抗体および単量体/多量体ドメインポリペプチドは、多くとも1011 M-1、多くとも5x1011 M-1、多くとも1012 M-1、多くとも5x1012 M-1、多くとも1013 M-1、多くとも5x1013 M-1、多くとも1014 M-1、または多くとも5x1014 M-1のKaを有してよい。IL-33特異的抗体および単量体/多量体ドメインポリペプチドは、10-5 M未満、5x10-5 M未満、10-6 M未満、5x10-6 M未満、10-7 M未満、5x10-7未満、10-8 M未満、5x10-8 M未満、10-9 M未満、5x10-9 M未満、10-10 M未満、5x10-10 M未満、10-11 M未満、5x10-11 M未満、10-12 M未満、5x10-12 M未満、10-13 M未満、5x10-13 M未満、10-14 M未満、5x10-14 M未満、10-15 M未満、または5x10-15 M未満または10-2 M-5x10-5 M、10-6-10-15 M、または10-8-10-14 Mの解離定数またはKd (kon/koff)を有してよい。IL-33特異的抗体および単量体/多量体ドメインポリペプチドは、BIAcoreアッセイによって測定された場合、10-9 M未満、5x10-9 M未満、10-10 M未満、5x10-10 M未満、1x10-11 M未満、5x10-11 M未満、1x10-12 M未満、5x10-12 M未満、10-13 M未満、5x10-13 M未満または1x10-14 M未満、または10-9 M-10-14 MのKdを有し、IL-33特異的抗体および単量体/多量体ドメインポリペプチドはマイクロ中和アッセイにおいてヒトIL-33を中和することができる。IL-33特異的抗体および単量体/多量体ドメインポリペプチドは、10-9 Mより大きいか、5x10-9 Mより大きいか、10-10 Mより大きいか、5x10-10 Mより大きいか、10-11 Mより大きいか、5x10-11 Mより大きいか、10-12 Mより大きいか、5x10-12 Mより大きいか、6x10-12 Mより大きいか、10-13 Mより大きいか、5x10-13 Mより大きいか、10-14 Mより大きいか、5x10-14 Mより大きいかまたは10-9 M-10-14 Mより大きいKdを有してよい。
【００９１】
治療薬
疾患または障害(例えば、IL-33ポリペプチドの異常な発現および/または活性によって特徴付けられる疾患または障害、IL-33受容体またはその1個以上のサブユニットの異常な発現および/または活性によって特徴付けられる疾患または障害、自己免疫疾患(例えば、ループス、関節リウマチ、および多発性硬化症)、炎症性疾患(例えば、喘息、アレルギー性障害、および関節炎)、または感染の進行、重症度、および/または持続期間の低減または改善、または1種以上のその症状の改善のための、治療薬として、または治療としてIL-33結合性ポリペプチドを使用して治療することができる。特定の実施形態では、該用語は、器官または組織の腫脹の低減、または呼吸器症状に伴う疼痛の低減を表す。他の実施形態では、該用語は、喘息に伴う気道(群)の炎症または狭窄の低減を表す。他の実施形態では、該用語は、感染物質の複製の低減、または被験体の他の器官もしくは組織または他の被験体への感染物質の伝播の低減を表す。他の実施形態では、該用語は、肥満細胞による炎症性物質の放出の低減、またはそのような炎症性物質の生物学的影響の低減を表す。
【００９２】
治療用IL-33抗体または単量体/多量体ドメインポリペプチドは、本明細書中に記載のまたは当業者に周知のin vivoおよび/またはin vitroアッセイ(例えばELISA等のイムノアッセイ)において、PBS等のコントロールと比較して、IL-33ポリペプチドとIL-33受容体(「IL-33R」)またはそのサブユニット間の相互作用を、約25%、好ましくは約30%、約35%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、または約98%阻害し、かつ/または減少させることができる。
【００９３】
治療用IL-33抗体または単量体/多量体ドメインポリペプチドは、当業者に周知のin vivoおよび/またはin vitroアッセイにおいて、リン酸緩衝食塩水(「PBS」)等のコントロールと比較して、IL-33ポリペプチドとIL-33受容体(「IL-33R」)またはその1個以上のサブユニット間の相互作用を、少なくとも25%、好ましくは、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%阻害するかまたは減少させることができる。代替の実施形態では、IL-33ポリペプチドに特異的に結合する抗体または単量体/多量体ドメインポリペプチドは、PBS等のコントロールと比較して、IL-33ポリペプチドとIL-33Rまたはその1個以上のサブユニット間の相互作用を阻害しない。別の実施形態では、IL-33ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体またはIL-32特異的単量体/多量体ドメインポリペプチドは、当業者に周知のin vivoおよび/またはin vitroアッセイにおいて、PBS等のコントロールと比較して、IL-33ポリペプチドとIL-33Rまたはその1個以上のサブユニット間の相互作用を、20%未満、15%未満、10%未満、または5%未満しか阻害しない。
【００９４】
治療用IL-33抗体または単量体/多量体ドメインポリペプチドは、本明細書中に記載のまたは当業者に周知のin vivoおよび/またはin vitroアッセイ(例えばトリパンブルーアッセイまたは3H-チミジンアッセイ)において、PBS等のコントロールと比較して、炎症性細胞(例えば、肥満細胞、T細胞、B細胞、マクロファージ、好中球、好塩基球、および/または好酸球)の増殖を、少なくとも25%、好ましくは少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%減少させ、かつ/または阻害することができる。
【００９５】
別の実施形態では、IL-33ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体または単量体/多量体ドメインポリペプチドは、本明細書中に記載のまたは当業者に周知のin vivoおよび/またはin vitroアッセイにおいて、PBS等のコントロールと比較して、上および/または下気道への炎症性細胞の浸潤を、少なくとも少なくとも25%、好ましくは少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%減少させ、かつ/または阻害する。
【００９６】
治療用IL-33抗体または単量体/多量体ドメインポリペプチドは、当技術分野において周知のin vivoおよび/またはin vitroアッセイにおいて、PBS等のコントロールと比較して、上気道および/または気道への炎症性細胞の増殖を、少なくとも25%、好ましくは少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%減少させ、かつ/または阻害することができる。
【００９７】
治療用IL-33抗体または単量体/多量体ドメインポリペプチドは、当業者に周知のin vivoおよび/またはin vitroアッセイにおいて、PBS等のコントロールと比較して、肥満細胞プロテアーゼ、例えばキマーゼおよびトリプターゼの発現、活性、血清濃度、および/または放出を、少なくとも25%、好ましくは少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%阻害し、かつ/または減少させることができる。肥満細胞活性は、原発性肥満細胞または肥満細胞セルラインをin vitroで10 ng/mlのIL-33の存在下で培養することによって測定することができる。上清中のプロテアーゼ(例えばキマーゼおよびトリプターゼ)およびロイコトリエンのベースラインレベルを市販ELISAキットによって決定する。IL-33-反応性抗体または単量体/多量体ドメインポリペプチドを1μg/mlの濃度で細胞培養物に直接加えることによって、抗体または単量体/多量体ドメインポリペプチドがプロテアーゼまたはロイコトリエンレベルをモジュレートする能力を評価する。24および36時間の時点でプロテアーゼおよびロイコトリエンレベルを評価する。
【００９８】
別の実施形態では、IL-33ポリペプチドに特異的に結合する抗体または単量体/多量体ドメインポリペプチドは、当業者に周知のin vivoおよび/またはin vitroアッセイにおいて、PBS等のコントロールまたはコントロールIgG抗体と比較して、C4、D4、およびE4等の肥満細胞ロイコトリエンの発現、活性、血清濃度、および/または放出を、少なくとも25%、好ましくは少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%阻害し、かつ/または減少させる。
【００９９】
さらにまた、IL-33ポリペプチドに特異的に結合する抗体または単量体/多量体ドメインポリペプチドは、当業者に周知のin vivoおよび/またはin vitroアッセイ(例えばELISAまたはウエスタンブロットアッセイ)において、PBS等のコントロールと比較して、TNF-α、IL-4、IL-5、IL-6またはIL-13等の肥満細胞サイトカインの発現、活性、血清濃度、および/または放出を、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%阻害し、かつ/または減少させる。
【０１００】
治療用IL-33抗体または単量体/多量体ドメインポリペプチドは、当技術分野において周知のin vivoおよび/またはin vitroアッセイにおいて、PBS等のコントロールと比較して、肥満細胞浸潤を、少なくとも25%、好ましくは少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%阻害し、かつ/または減少させることができる。
【０１０１】
治療用IL-33抗体または単量体/多量体ドメインポリペプチドは、当技術分野において周知のin vivoおよび/またはin vitroアッセイにおいて、PBS等のコントロールと比較して、上気道および/または下気道への肥満細胞前駆体の浸潤を、少なくとも25%、好ましくは少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%阻害し、かつ/または減少させることができる。他の実施形態では、IL-33ポリペプチドに特異的に結合する抗体または単量体/多量体ドメインポリペプチドは、当業者に周知のin vivoおよび/またはin vitroアッセイ(例えば、トリパンブルーアッセイ、FACSまたは3Hチミジンアッセイ)において、PBS等のコントロールと比較して、肥満細胞前駆体の増殖を、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%阻害し、かつ/または減少させる。
【０１０２】
さらに他の実施形態では、IL-33ポリペプチドに特異的に結合する抗体または単量体/多量体ドメインポリペプチドは、当技術分野において周知のアッセイにおいて、PBS等のコントロールと比較して、気道過敏性を、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%阻害し、かつ/または減少させる。
【０１０３】
治療用IL-33抗体または単量体/多量体ドメインポリペプチドはケモカインのレベルを減少させることができる。ケモカインには、非限定的に、XCL1、XCL2、CCL1、CCL2、CCL3、CCL3L1、SCYA3L2、CCL4、CCL4L、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、SCYA9、SCYA10、CCL11、SCYA12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、クローン391、CARP CC-1、CCL1、CK-1、レガカイン-1 (regakine-1)、K203、CXCL1、CXCL1P、CXCL2、CXCL3、PF4、PF4V1、CXCL5、CXCL6、PPBP、SPBPBP、IL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL14、CXCL15、CXCL16、NAP-4、LFCA-1、Scyba、JSC、VHSV-誘導タンパク質、CX3CL1およびfCL1が含まれうる。いくつかの実施形態では、IL-33ポリペプチドまたはその生物活性断片のレベルまたは活性のモジュレーションはケモカインの生理的効果をモジュレートする。そのような生理的効果は、例えば、ケモカインをコードする核酸の転写をモジュレートすること、またはケモカインの、その受容体または、転写因子等の別の分子との相互作用をモジュレートすることに起因しうる。ケモカイン受容体には、非限定的に、CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10, CCR11, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4およびCXCR5が含まれうる。
【０１０４】
治療上の組み合わせ
IL-33特異的結合性組成物は、非限定的に、IL-33の異常な発現および/または活性によって特徴付けられる障害、IL-33Rまたはその1個以上のサブユニットの異常な発現および/または活性によって特徴付けられる障害、炎症性障害、自己免疫性障害、増殖性障害、または感染を含む疾患および障害の予防、管理、治療、および/または改善であって、それを必要としている被験体に、有効量の、IL-33ポリペプチドに免疫特異的に結合する1種以上の抗体または単量体/多量体ドメインポリペプチドおよび1種以上の追加の治療薬(例えば予防または治療物質)を投与するステップを含む、予防、管理、治療、および/または改善のために使用してよい。追加の治療または予防物質には、非限定的に、小分子、合成薬物、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸(例えば、非限定的にアンチセンスヌクレオチド配列、三重ヘリックス、RNAi、および生物活性タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むDNAおよびRNAヌクレオチド) 抗体、合成または天然無機分子、模擬物質、および合成または天然有機分子が含まれる。追加の治療薬および治療物質は、例えば、Gilman et al., Goodman and Gilman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Tenth Ed., McGraw-Hill, New York, 2001; The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, Berkow, M. D. et al. (eds.), 17th Ed., Merck Sharp & Dohme Research Laboratories, Rahway, N.J., 1999; およびCecil Textbook of Medicine, 20th Ed., Bennett and Plum (eds.), W.B. Saunders, Philadelphia, 1996に見出すことができる。予防および治療物質の例には、非限定的に、免疫調節剤、抗炎症剤(例えば、アドレノコルチコイド(adrenocorticoids)、コルチコステロイド(例えば、ベクロメタゾン、ブデソニド、フルニソリド、フルチカゾン、トリアムシノロン、メチルプレドニゾロン(methlyprednisolone)、プレドニゾロン、プレドニゾン、ヒドロコルチゾン)、糖質コルチコイド、ステロイド、非ステロイド性抗炎症剤(例えば、アスピリン、イブプロフェン、ジクロフェナク、およびCOX-2インヒビター)、およびロイコトリエン(leukotreine)アンタゴニスト(例えば、モンテルカスト、メチルキサンチン、ザフィルルカスト、およびジロイトン)、ベータ2-アゴニスト(例えば、アルブテロール、ビテロール(biterol)、フェノテロール、イソエタリエ(isoetharie)、メタプロテレノール、ピルブテロール、サルブタモール、テルブタリンフォルモテロール、サルメテロール、およびサルブタモールテルブタリン)、抗コリン物質(例えば、臭化イプラトロピウムおよび臭化オキシトロピウム)、スルファサラジン、ペニシラミン、ダプソン、抗ヒスタミン剤、抗マラリア物質(例えばヒドロキシクロロキン)、抗ウイルス剤、および抗生物質(例えばダクチノマイシン(以前のアクチノマイシン)、ブレオマイシン、エリトマイシン(erythomycin)、ペニシリン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン(AMC))が含まれる。
【０１０５】
当業者に周知の任意の免疫調節剤を追加の治療物質として使用してよい。免疫調節剤は、被験体における免疫応答の1つ以上のまたはすべての態様に影響しうる。免疫応答の態様には、非限定的に、炎症反応、補体カスケード、白血球およびリンパ球分化、増殖、および/またはエフェクター機能、単球および/または好塩基球カウント、および免疫系の細胞間の細胞情報交換が含まれる。本発明のいくつかの実施形態では、免疫調節剤は免疫応答の1態様をモジュレートする。他の実施形態では、免疫調節剤は免疫応答の2以上の態様をモジュレートする。免疫調節剤を被験体に投与すると、被験体の免疫応答能の1つ以上の態様が阻害されるか、または減少する。本発明のいくつかの実施形態では、免疫調節剤は被験体の免疫応答を阻害または抑制する。
【０１０６】
免疫調節剤の例には、非限定的に、タンパク質性物質、例えばサイトカイン、ペプチド模擬体(例えば単量体/多量体ドメインポリペプチド)、および抗体(例えば、ヒト、ヒト化、キメラ、モノクローナル、ポリクローナル、Fv、ScFv、FabまたはF(ab)2断片またはエピトープ結合断片)、核酸分子(例えばアンチセンス核酸分子および三重ヘリックス)、小分子、有機化合物、および無機化合物が含まれる。特に、免疫調節剤には、非限定的に、メトトレキセート、レフルノミド、シクロホスファミド、シトキサン、イムラン(Immuran)、シクロスポリンA、ミノサイクリン、アザチオプリン、抗生物質(例えばFK506 (タクロリムス))、メチルプレドニゾロン(MP)、コルチコステロイド、ステロイド、ミコフェノール酸モフェチル、ラパマイシン(シロリムス)、ミゾリビン、デオキシスペルグアリン(deoxyspergualin)、ブレキナール(brequinar)、マロノニトリロアミンド(malononitriloamindes) (例えばレフルナミド(leflunamide))、T細胞受容体モジュレーター、サイトカイン受容体モジュレーター、およびモジュレーター肥満細胞モジュレーターが含まれる。
【０１０７】
T細胞受容体モジュレーターの例には、非限定的に、抗T細胞受容体抗体(例えば、抗-CD4抗体(例えば、cM-T412 (Boeringer)、IDEC-CE9.1.RTM. (IDEC and SKB)、mAB 4162W94、OrthocloneおよびOKTcdr4a (Janssen-Cilag))、抗-CD3抗体(例えばNuvion (Product Design Labs)、OKT3 (Johnson & Johnson)、またはRituxan (IDEC))、抗-CD5抗体(例えば抗-CD5リシン結合免疫複合体)、抗-CD7抗体(例えばCHH-380 (Novartis))、抗-CD8抗体、抗-CD40リガンドモノクローナル抗体(例えばIDEC-131 (IDEC))、抗-CD52抗体(例えばCAMPATH 1H (Ilex))、抗-CD2抗体(例えばシプリズマブ(MedImmune, Inc., 国際公開Nos. WO 02/098370およびWO 02/069904))、抗-CD11a抗体(例えばXanelim (Genentech))、および抗-B7抗体(例えばIDEC-114) (IDEC)))、CTLA4-免疫グロブリン、およびLFA-3TIP (Biogen, 国際公開No. WO 93/08656およびU.S. Pat. No. 6,162,432)が含まれる。
【０１０８】
サイトカイン受容体モジュレーターの例には、非限定的に、可溶性サイトカイン受容体(例えば、TNF-α受容体の細胞外ドメインまたはその断片、IL-1β受容体の細胞外ドメインまたはその断片、およびIL-6受容体の細胞外ドメインまたはその断片)、サイトカインまたはその断片(例えば、インターロイキンIL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-23、TNF-α、TNF-β、インターフェロン(IFN)-α、IFN-β、IFN-γ、およびGM-CSF)、抗サイトカイン受容体抗体(例えば、抗IFN受容体抗体、抗IL-2受容体抗体(例えばZenapax (Protein Design Labs))、抗IL-3受容体抗体、抗IL-4受容体抗体、抗IL-6受容体抗体、抗IL-10受容体抗体、抗IL-12受容体抗体、抗IL-13受容体抗体、抗IL-15受容体抗体、および抗IL-23受容体抗体)、抗サイトカイン抗体(例えば、抗IFN抗体、抗TNF-α抗体、抗IL-10抗体、抗IL-3抗体、抗IL-6抗体、抗IL-8抗体(例えばABX-IL-8 (Abgenix))、抗IL-12抗体、抗IL-13抗体、抗IL-15抗体、および抗IL-23抗体)が含まれる。
【０１０９】
サイトカイン受容体モジュレーターは、IL-3、IL-4、IL-10、またはその断片であってよい。サイトカイン受容体モジュレーターは、抗IL-1β抗体、抗IL-6抗体、抗IL-12受容体抗体、または抗TNF-α抗体であってよい。サイトカイン受容体モジュレーターはTNF-α受容体の細胞外ドメインまたはその断片であってよい。
【０１１０】
当業者に周知の炎症性障害の治療に有用な物質を含む任意の抗炎症剤を本発明の組成物および方法において使用することができる。抗炎症剤の非限定的な例には、非ステロイド性抗炎症剤(NSAID)、ステロイド性抗炎症剤、抗コリン薬(例えば、硫酸アトロピン、硝酸メチルアトロピン、および臭化イプラトロピウム(ATROVENTTM))、ベータ2-アゴニスト(例えば、アブテロール(abuterol) (VENTOLINMおよびPROVENTILTM)、ビトルテロール(TORNALATETM)、レバルブテロール(XOPONEXTM)、メタプロテレノール(ALUPENTTM)、ピルブテロール(MAXAIRTM)、テルブトライン(terbutlaine) (BRETHAIRETMおよびBRETHINETM)、アルブテロール(PROVENTILTM、REPETABSTM、およびVOLMAXTM)、フォルモテロール(FORADIL AEROLIZERTM)、およびサルメテロール(SEREVENTTMおよびSEREVENT DISKUSTM))、およびメチルキサンチン(例えば、テオフィリン(UNIPHYLTM、THEO-DURTM、SLO-BIDTM、AND TEHO-42TM))が含まれる。NSAIDの例には、非限定的に、アスピリン、イブプロフェン、セレコキシブ(CELEBREXTM)、ジクロフェナク(VOLTARENTM)、エトドラク(LODINETM)、フェノプロフェン(NALFONTM)、インドメタシン(INDOCINTM)、ケトララク(ketoralac) (TORADOLTM)、オキサプロジン(DAYPROTM)、ナブメントン(nabumentone) (RELAFENTM)、スリンダク(CLINORILTM)、トルメンチン(tolmentin) (TOLECTINTM)、ロフェコキシブ(VIOXXTM)、ナプロキセン(ALLEVETM、NAPROSYNTM)、ケトプロフェン(ACTRONTM)およびナブメトン(RELAFENTM)が含まれる。そのようなNSAIDはシクロオキシゲナーゼ(cyclooxgenase)酵素(例えばCOX-1および/またはCOX-2)を阻害することによって機能する。ステロイド性抗炎症剤の例には、非限定的に、糖質コルチコイド、デキサメタゾン(DECADRONTM)、コルチコステロイド(例えばメチルプレドニゾロン(MEDROLTM))、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン(PREDNISONETMおよびDELTASONETM)、プレドニゾロン(PRELONETMおよびPEDIAPREDTM)、トリアムシノロン、アザルフィジン、およびエイコサノイド(例えば、プロスタグランジン、トロンボキサン、およびロイコトリエン)のインヒビターが含まれる。
【０１１１】
特定の実施形態では、抗炎症剤は、喘息またはその1つ以上の症状の予防、管理、治療、および/または改善に有用な物質であってよい。そのような物質の非限定的な例には、以下の物質が含まれる: アドレナリン作動性刺激薬(例えば、カテコールアミン(例えば、エピネフリン、イソプロテレノール、およびイソエタリン)、レゾルシノール(例えば、メタプロテレノール、テルブタリン、およびフェノテロール)、およびサリゲニン(例えばサルブタモール))、アドレノコルチコイド(adrenocorticoids)、ブルココルチコイド(blucocorticoids)、コルチコステロイド(例えば、ベクロメタドンス(beclomethadonse)、ブデソニド、フルニソリド、フルチカゾン、トリアムシノロン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、およびプレドニゾン)、他のステロイド、ベータ2-アゴニスト(例えば、アルブツエロール(albtuerol)、ビトルテロール、フェノテロール、イソエタリン、メタプロテレノール、ピルブテロール、サルブタモール、テルブタリン、フォルモテロール、サルメテロール、およびアルブタモール(albutamol) テルブタリン)、抗コリン薬(例えば、臭化イプラトロピウムおよび臭化オキシトロピウム)、IL-4アンタゴニスト(抗体を含む)、IL-5アンタゴニスト(抗体を含む)、IL-13アンタゴニスト(抗体を含む)、PDE4-インヒビター、NF-kBインヒビター、VLA-4インヒビター、CpG、抗-CD23、セレクチンアンタゴニスト(TBC 1269)、肥満細胞プロテアーゼインヒビター(例えば、トリプターゼキナーゼインヒビター(例えば、GW-45、GW-58、およびゲニステイン)、ホスファチジルイノシチド-3' (PI3)-キナーゼインヒビター(例えばカルフォスチンC)、および他のキナーゼインヒビター(例えばスタウロスポリン) (Temkin et al., 2002 J Immunol 169(5):2662-2669; Vosseller et al., 1997 Mol. Biol. Cell 8(5):909-922; およびNagai et al., 1995 Biochem Biophys Res Commun 208(2):576-581を参照のこと))、C3受容体アンタゴニスト(抗体を含む)、免疫抑制物質(例えばメトトレキセートおよび金塩)、肥満細胞モジュレーター(例えばクロモリンナトリウム(INTALTM)およびネドクロミルナトリウム(TILADETM))、および粘液溶解物質(例えばアセチルシステイン))。抗炎症剤は、ロイコトリエンインヒビター(例えば、モンテルカスト(SINGULAIRTM)、ザフィルルカスト(ACCOLATETM)、プランルカスト(ONONTM)、またはジロイトン(ZYFLOTM)であってよい。
【０１１２】
特定の実施形態では、抗炎症剤は、アレルギーまたはその1つ以上の症状の予防、治療、管理、および/または改善に有用な物質であってよい。そのような物質の非限定的な例には、抗メディエーター薬(antimediator drugs) (例えば、抗ヒスタミン薬、コルチコステロイド、充血除去薬、交感神経興奮薬(例えばα-アドレナリン作動薬およびβ-アドレナリン作動薬)、TNX901 (Leung et al., 2003, N Engl J Med 348(11):986-993)、IgEアンタゴニスト(例えば抗体rhuMAb-E25オマリズマブ(Finn et al., 2003 J Allergy Clin Immuno 111(2):278-284; Corren et al., 2003 J Allergy Clin Immuno 111(1):87-90; Busse and Neaville, 2001 Curr Opin Allergy Clin Immuno 1(1):105-108; およびTang and Powell, 2001, Eur J Pediatr 160(12): 696-704を参照のこと)、K-12および6HD5 (Miyajima et al., 2202 Int Arch Allergy Immuno 128(1):24-32を参照のこと)、およびmAB Hu-901 (van Neerven et al., 2001 Int Arch Allergy Immuno 124(1-3):400を参照のこと)、テオフィリンおよびその誘導体、糖質コルチコイド、および免疫療法(例えば、アレルゲンの長期反復注射、短期間の脱感作、および蛇毒免疫療法)が含まれる。
【０１１３】
抗炎症治療およびその用量、投与経路、および推奨される使用は当技術分野において公知であり、Physician's Desk Reference (57th ed., 2003)等の文献に記載されている。
【０１１４】
IL-33特異的抗体および/または単量体/多量体ドメインポリペプチドを使用して、喘息を患っていることが予測されるかまたは喘息を発症するリスクにさらされている患者(patent)における喘息の発症を予防することができる。該患者は、例えば、喘息の遺伝的素因を有する患者、1種以上の呼吸器感染を有するかまたは有していた患者、乳児、未熟児、子供、高齢者、または毒性化学物質を用いて作業している(すなわち職業性喘息を発症するリスクにさらされている)患者である。いくつかの実施形態では、被験体は、喘息を発症するリスクにさらされている子供、例えば呼吸器感染、特に、PIV、RSV、およびhMPVを有するかまたは有していた子供、高いIgEレベル、喘息の家族歴を有する子供、喘息誘発因子および/またはアレルゲン(例えば、動物、ゴキブリアレルゲン、およびタバコの煙)でチャレンジされている子供、または喘鳴もしくは気管支過敏性を経験している子供であってよい。喘息の危険因子の考察に関しては、例えば、Klinnert et al., 2001, Pediatrics 108(4):E69; London et al., 2001, Epidemiology, 12(5):577-83; Melen et al., 2001, Allergy, 56(7): 464-52; Mochizuki et al., 2001, J Asthma 38(1):1-21; Arruda et al., 2001, Curr Opin Pulm Med, 7(1):14-19; Castro-Rodriguez et al., 2000, Am J Respir Crit Care Med 162: 1403-6; Gold, 2000, Environ Health Perspect 108: 643-51; およびCsonka et al., 2000, Pediatr Allergy Immuno, 11(4): 225-9を参照のこと。
【０１１５】
IL-33特異的抗体および/または単量体/多量体ドメインポリペプチドを、COPDまたはその1つ以上の症状を予防、治療、管理、および/または改善するための有効量の1種以上の他の治療と組み合わせて使用してよい。そのような他の治療の非限定的な例には、物質、例えば気管支拡張剤(例えば、短期作用β2-アドレナリン作動性アゴニスト(例えば、アルブテロール、ピルブテロール、テルブタリン、およびメタプロテレノール)、長期作用β2-アドレナリン作動性アゴニスト(例えば経口持続放出性アルブテロールおよび吸入サルメテロール)、抗コリン薬(例えば臭化イプラトロピウム)、およびテオフィリンおよびその誘導体(テオフィリンの治療範囲は好ましくは10〜201g/mLである))、糖質コルチコイド、外因性α1AT (例えば、60 mg/kgの週用量で静脈内投与される、プールされたヒト血漿由来のα1AT)、酸素、肺移植、肺容積減少手術、気管内挿管、換気支持、年一度のインフルエンザワクチンおよび23価多糖を有する肺炎球菌ワクチン接種、運動、および禁煙が含まれる。
【０１１６】
IL-33特異的抗体および/または単量体/多量体ドメインポリペプチドを、肺線維症またはその1つ以上の症状を予防、治療、管理、および/または改善するための有効量の1種以上の他の治療と組み合わせて使用してよい。そのような治療の非限定的な例には、酸素、コルチコステロイド(例えば、1〜1.5 mg/kg/d (100 mg/dまで)で6週間の投与で開始され、3〜6か月にわたって0.25 mg/kg/dの最小維持量に次第に減少するプレドニゾンの毎日の投与)、細胞傷害性薬物(例えば、1日1回経口で100〜120 mgで投与されるシクロホスファミドおよび1日1回経口で3 mg/kg〜200 mgまでで投与されるアザチオプリン)、気管支拡張剤(例えば短期および長期作用β2-アドレナリン作動性アゴニスト、抗コリン薬、およびテオフィリンおよびその誘導体)、および抗ヒスタミン剤(例えばジフェンヒドラミンおよびドキシラミン)が含まれる。
【０１１７】
IL-33特異的抗体および/または単量体/多量体ドメインポリペプチドを使用して、自己免疫性障害またはその1つ以上の症状を予防、治療、管理、および/または改善することができる。有効量の1種以上の本発明の抗体または単量体/多量体ドメインポリペプチドを有効量の別の治療と組み合わせて被験体に投与して、自己免疫性障害またはその1つ以上の症状を予防、管理、治療、および/または改善してもよい。
【０１１８】
IL-33特異的抗体または単量体/多量体ドメインポリペプチドで治療することができる自己免疫性障害は、1器官または組織タイプのみに影響するか、または複数の器官および組織に影響してよい。自己免疫性障害に一般に罹患する器官および組織には、赤血球、血管、結合組織、内分泌腺(例えば甲状腺または膵臓)、筋肉、関節、および皮膚が含まれる。本発明の方法によって予防、治療、管理、および/または改善できる自己免疫性障害の例には、非限定的に、アドレナリン作動薬耐性、円形脱毛症(alopecia greata)、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性アジソン病、副腎の自己免疫疾患、アレルギー性脳脊髄炎、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性炎症性眼疾患、自己免疫性新生児血小板減少症、自己免疫性好中球減少、自己免疫性卵巣炎および睾丸炎、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性甲状腺炎、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、心臓切開症候群(cardiotomy syndrome)、セリアックスプルー-皮膚炎、慢性活動性肝炎、慢性疲労免疫機能障害症候群(CFIDS)、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、CREST症候群、寒冷凝集素病、クローン病、デンスデポジット病、円板状狼蒼、本態性混合クリオグロブリン血症、線維筋痛-線維筋炎、糸球体腎炎(例えばIgA腎症(nephrophathy))、グルテン感受性腸疾患、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー、甲状腺機能亢進症(すなわち橋本甲状腺炎)、特発性肺線維症、特発性アジソン病、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、IgA神経障害、若年性関節炎、扁平苔癬、エリテマトーデス(lupus erthematosus)、メニエール病、混合結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋炎、1型または免疫介在性糖尿病、重症筋無力症、心筋炎、神経炎、他の内分泌腺不全、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎(polychrondritis)、多腺性内分泌障害、多腺症候群、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎および皮膚筋炎、ポスト心筋梗塞(post-MI)、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、再発性多発性軟骨炎、ライター症候群、リウマチ性心疾患、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、全身性エリテマトーデス、エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎(temporal arteristis)/巨細胞動脈炎、潰瘍性大腸炎、じんま疹、ブドウ膜炎、ブドウ膜炎眼炎(Uveitis Opthalmia)、血管炎(vasculitides)、例えば疱疹性皮膚炎血管炎、白斑、およびウェゲナー肉芽腫症が含まれる。
【０１１９】
IL-33特異的抗体および/または単量体/多量体ドメインポリペプチドは、自己免疫性障害またはその1つ以上の症状を予防、管理、治療、および/または改善するための第1、第2、第3、第4、または第5の治療であってよい。自己免疫治療およびその用量、投与経路、および推奨される使用は当技術分野において公知であり、Physician's Desk Reference (57th ed., 2003)等の文献に記載されている。
【０１２０】
医薬組成物//投与
IL-33結合物質を含む医薬組成物または滅菌組成物を調製するために、製薬的に許容される担体または賦形剤とIL-33結合試薬を混合する。治療物質および診断物質の製剤は、例えば、凍結乾燥粉末、スラリー、水性溶液、ローション、または懸濁液の形式で、生理的に許容される担体、賦形剤、または安定剤と混合することによって調製することができる(例えば、Hardman, et al. (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N.Y.; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, N.Y.; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.を参照のこと)。
【０１２１】
治療薬の投与方式の選択は、物質の血清または組織代謝回転率、症状のレベル、物質の免疫原性、および生物学的マトリックス中の標的細胞の到達性を含むいくつかの要因に依存する。好ましくは、投与方式は、許容可能なレベルの副作用と調和して患者に送達される治療薬の量を最大にする。したがって、送達される生物学的物質の量は、具体的な物質および治療対象の症状の重症度に部分的に依存する。抗体、サイトカイン、および小分子の適切な用量の選択に関する指針が入手可能である(例えば、Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK; Kresina (ed.) (1991) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, N.Y.; Bach (ed.) (1993) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, N.Y.; Baert, et al. (2003) New Engl. J. Med. 348:601-608; Milgrom, et al. (1999) New Engl. J. Med. 341:1966-1973; Slamon, et al. (2001) New Engl. J. Med. 344:783-792; Beniaminovitz, et al. (2000) New Engl. J. Med. 342:613-619; Ghosh, et al. (2003) New Engl. J. Med. 348:24-32; Lipsky, et al. (2000) New Engl. J. Med. 343:1594-1602を参照のこと)。
【０１２２】
適切な用量の決定は、例えば、治療に影響することが当技術分野において知られているかまたは疑われるかまたは治療に影響すると予測されるパラメータもしくは因子を使用して、臨床家によって行われる。一般に、用量は、適量よりいくらか少ない量で開始され、その後、任意の負の副作用と比べて所望のまたは最適な効果が達成されるまで少しずつ増量される。重要な診断測定には、例えば、炎症の症状または産生される炎症性サイトカインのレベルの測定が含まれる。
【０１２３】
IL-33抗体、抗体断片、および単量体/多量体ドメインポリペプチドを、持続注入によって、または、例えば、1日、1週間の間隔で、または週1〜7回の用量によって投与することができる。用量は、静脈内、皮下、局所、経口、経鼻、経直腸、筋肉内、脳内で、または吸入によって投与してよい。好ましい用量プロトコルは、顕著な望ましくない副作用を回避する極量または用量頻度を含むものである。トータルの週用量は、少なくとも0.05μg/体重kg、少なくとも0.2μg/kg、少なくとも0.5μg/kg、少なくとも1μg/kg、少なくとも10μg/kg、少なくとも100μg/kg、少なくとも0.2 mg/kg、少なくとも1.0 mg/kg、少なくとも2.0 mg/kg、少なくとも10 mg/kg、少なくとも25 mg/kg、または少なくとも50 mg/kgであってよい(例えば、Yang, et al. (2003) New Engl. J. Med. 349:427-434; Herold, et al. (2002) New Engl. J. Med. 346:1692-1698; Liu, et al. (1999) J. Neurol. Neurosurg. Psych. 67:451-456; Portielji, et al. (20003) Cancer Immunol. Immunother. 52:133-144を参照のこと)。小分子治療薬、例えば、ペプチド模擬体、天然物、または有機化合物の所望の用量は、モル/体重kgに基づいて、抗体またはポリペプチドに関する用量とほぼ同じである。小分子治療薬の所望の血漿濃度は、モル/体重kgに基づいて、抗体に関する血漿濃度とほぼ同じである。用量は、少なくとも15μg、少なくとも20μg、少なくとも25μg、少なくとも30μg、少なくとも35μg、少なくとも40μg、少なくとも45μg、少なくとも50μg、少なくとも55μg、少なくとも60μg、少なくとも65μg、少なくとも70μg、少なくとも75μg、少なくとも80μg、少なくとも85μg、少なくとも90μg、少なくとも95μg、または少なくとも100μgであってよい。被験体に投与される用量は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12、またはそれ以上を数えてよい。
【０１２４】
IL-33に特異的な抗体、単量体/多量体ドメインポリペプチド、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドおよび融合タンパク質に関して、患者に投与される用量は、0.0001 mg/患者の体重kg〜100 mg/患者の体重kgであってよい。該用量は、患者の体重を基準にして、0.0001 mg/kg〜20 mg/kg、0.0001 mg/kg〜10 mg/kg、0.0001 mg/kg〜5 mg/kg、0.0001〜2 mg/kg、0.0001〜1 mg/kg、0.0001 mg/kg〜0.75 mg/kg、0.0001 mg/kg〜0.5 mg/kg、0.0001 mg/kg〜0.25 mg/kg、0.0001〜0.15 mg/kg、0.0001〜0.10 mg/kg、0.001〜0.5 mg/kg、0.01〜0.25 mg/kgまたは0.01〜0.10 mg/kgの範囲であってよい。
【０１２５】
IL-33に特異的な抗体、単量体/多量体ドメインポリペプチド、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドおよび融合タンパク質の用量は、mg/kg単位で処方される用量と乗算したキログラム(kg)単位の患者の体重を使用して算出することができる。IL-33に特異的な抗体、単量体/多量体ドメインポリペプチド、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドおよび融合タンパク質の用量は、患者の体重を基準にして、150μg/kg以下、好ましくは125μg/kg以下、100μg/kg以下、95μg/kg以下、90μg/kg以下、85μg/kg以下、80μg/kg以下、75μg/kg以下、70μg/kg以下、65μg/kg以下、60μg/kg以下、55μg/kg以下、50μg/kg以下、45μg/kg以下、40μg/kg以下、35μg/kg以下、30μg/kg以下、25μg/kg以下、20μg/kg以下、15μg/kg以下、10μg/kg以下、5μg/kg以下、2.5μg/kg以下、2μg/kg以下、1.5μg/kg以下、1μg/kg以下、0.5μg/kg以下、または0.5μg/kg以下であってよい。
【０１２６】
IL-33に特異的な抗体、単量体/多量体ドメインポリペプチド、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドおよび融合タンパク質の単位用量は、0.1 mg〜20 mg、0.1 mg〜15 mg、0.1 mg〜12 mg、0.1 mg〜10 mg、0.1 mg〜8 mg、0.1 mg〜7 mg、0.1 mg〜5 mg、0.1〜2.5 mg、0.25 mg〜20 mg、0.25〜15 mg、0.25〜12 mg、0.25〜10 mg、0.25〜8 mg、0.25 mg〜7 m g、0.25 mg〜5 mg、0.5 mg〜2.5 mg、1 mg〜20 mg、1 mg〜15 mg、1 mg〜12 mg、1 mg〜10 mg、1 mg〜8 mg、1 mg〜7 mg、1 mg〜5 mg、または1 mg〜2.5 mgであってよい。
【０１２７】
IL-33に特異的な抗体、単量体/多量体ドメインポリペプチド、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドおよび融合タンパク質の用量は、被験体において、少なくとも0.1μg/ml、少なくとも0.5μg/ml、少なくとも1μg/ml、少なくとも2μg/ml、少なくとも5μg/ml、少なくとも6μg/ml、少なくとも10μg/ml、少なくとも15μg/ml、少なくとも20μg/ml、少なくとも25μg/ml、少なくとも50μg/ml、少なくとも100μg/ml、少なくとも125μg/ml、少なくとも150μg/ml、少なくとも175μg/ml、少なくとも200μg/ml、少なくとも225μg/ml、少なくとも250μg/ml、少なくとも275μg/ml、少なくとも300μg/ml、少なくとも325μg/ml、少なくとも350μg/ml、少なくとも375μg/ml、または少なくとも400μg/mlの血清力価を達成することができる。あるいは、IL-33に特異的な抗体、単量体/多量体ドメインポリペプチド、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドおよび融合タンパク質の用量は、被験体において、少なくとも0.1μg/ml、少なくとも0.5μg/ml、少なくとも1μg/ml、少なくとも、2μg/ml、少なくとも5μg/ml、少なくとも6μg/ml、少なくとも10μg/ml、少なくとも15μg/ml、少なくとも20μg/ml、少なくとも25μg/ml、少なくとも50μg/ml、少なくとも100μg/ml、少なくとも125μg/ml、少なくとも150μg/ml、少なくとも175μg/ml、少なくとも200μg/ml、少なくとも225μg/ml、少なくとも250μg/ml、少なくとも275μg/ml、少なくとも300μg/ml、少なくとも325μg/ml、少なくとも350μg/ml、少なくとも375μg/ml、または少なくとも400μg/mlの血清力価を達成することができる。
【０１２８】
IL-33に特異的な抗体、単量体/多量体ドメインポリペプチド、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドおよび融合タンパク質の用量を反復してよく、投与は、少なくとも1日、2日、3日、5日、10日、15日、30日、45日、2か月、75日、3か月、または少なくとも6か月間隔であってよい。
【０１２９】
具体的な患者に関する有効量は、治療対象の症状、患者の全般的健康、投与の方法経路および用量および副作用(side affects)の重症度等の要因に応じて変動する(例えば、Maynard, et al. (1996) A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Boca Raton, Fla.; Dent (2001) Good Laboratory and Good Clinical Practice, Urch Publ., London, UKを参照のこと)。
【０１３０】
投与の経路は、例えば、局所または皮膚適用、静脈内、腹腔内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内、脳脊髄内(intracerebrospinal)、病巣内による注射または注入、または徐放系もしくはインプラントによる経路であってよい(例えば、Sidman et al. (1983) Biopolymers 22:547-556; Langer, et al. (1981) J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277; Langer (1982) Chem. Tech. 12:98-105; Epstein, et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692; Hwang, et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030-4034; U.S. Pat. Nos. 6,350466および6,316,024を参照のこと)。必要であれば、組成物に、可溶化剤および、注射部位の疼痛を和らげるためのリドカイン等の局所麻酔薬を含ませてもよい。さらに、例えば、吸入器または噴霧器、およびエアロゾル化剤を伴う製剤の使用によって、肺投与を用いることもできる。例えば、U.S. Pat. Nos. 6,019,968, 5,985, 320, 5,985,309, 5,934,272, 5,874,064, 5,855,913, 5,290,540, および4,880,078; およびPCT公開Nos. WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346, およびWO 99/66903 (各文献は参照によりその全体がここに組み入れられる)を参照のこと。一実施形態では、Alkermes AIRTM肺薬物送達技術(Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.)を使用して本発明の抗体(anitbody)、併用療法、または組成物を投与する。
【０１３１】
IL-33特異的抗体または単量体/多量体ドメインポリペプチドを制御放出または徐放系で投与する場合、ポンプを使用して制御放出または徐放を達成してよい(Langer (上記); Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574を参照のこと)。ポリマー材料を使用して本発明の治療薬の制御放出または徐放を達成することができる(例えば、Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61を参照のこと; さらにLevy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 7 1:105); U.S. Pat. No. 5,679,377; U.S. Pat. No. 5,916,597; U.S. Pat. No. 5,912,015; U.S. Pat. No. 5,989,463; U.S. Pat. No. 5,128,326; PCT公開No. WO 99/15154; およびPCT公開No. WO 99/20253を参照のこと。徐放性製剤において使用されるポリマーの例には、非限定的に、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリラート)、ポリ(メタクリル酸メチル)、ポリ(アクリル酸)、ポリ(エチレン-co-酢酸ビニル)、ポリ(メタクリル酸)、ポリグリコリド(PLG)、ポリアンヒドリド、ポリ(N-ビニルピロリドン)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリアクリルアミド、ポリ(エチレングリコール)、ポリラクチド(PLA)、ポリ(ラクチド-co-グリコリド) (PLGA)、およびポリオルトエステルが含まれる。好ましい実施形態では、徐放性製剤において使用されるポリマーは不活性であり、浸出性(leachable)不純物を含まず、保存時に安定であり、滅菌されていて、生分解性である。制御放出または徐放系は予防または治療標的に近接して配置することができ、ゆえに全身性用量の一部分しか必要とされない(例えばGoodson, in Medical Applications of Controlled Release (上記) vol. 2, pp. 115-138 (1984)を参照のこと)。
【０１３２】
制御放出系はLangerによるレビュー(1990, Science 249:1527-1533)で考察されている。当業者に公知の任意の技術を使用して、本発明の1種以上の治療物質を含む徐放性製剤を製造することができる。例えば、U.S. Pat. No. 4,526,938, PCT公開 WO 91/05548, PCT公開 WO 96/20698, Ning et al., 1996, "Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel," Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al., 1995, "Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397, Cleek et al., 1997, "Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application," Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854, およびLam et al., 1997, "Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760 (各文献は参照によりその全体がここに組み入れられる)を参照のこと。
【０１３３】
IL-33特異的抗体または単量体/多量体ドメインポリペプチドを局所投与する場合、軟膏、クリーム、経皮パッチ、ローション、ゲル、シャンプー、スプレー、エアロゾル、溶液、エマルジョン、または当業者に周知の他の形式で製剤化することができる。例えばRemington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19th ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa. (1995)を参照のこと。スプレー可能でない局所投与剤形では、局所適用に適合する担体または1種以上の賦形剤を含みかつ好ましくは水より高い動的粘性を有する半固形または固形の粘性が典型的に用いられる。好適な製剤には、非限定的に、溶液、懸濁液、エマルジョン、クリーム、軟膏(ointments)、粉末、リニメント、軟膏(salves)、等が含まれ、所望であれば、それを滅菌するか、または種々の特性、例えば浸透圧に影響するための補助物質(例えば、保存剤、安定剤、湿潤剤、バッファー、または塩)と混合する。他の好適な局所投与剤形には、スプレー可能エアロゾル調製物が含まれ、該調製物では、活性成分を、好ましくは固体または液体不活性担体と組み合わせて、加圧された揮発性物質(例えばフレオン等の噴射剤ガス)との混合物またはスクイーズボトル中にパッケージする。所望であれば、保湿剤または湿潤剤を医薬組成物および投与剤形に加えることもできる。そのような追加の成分の例は当技術分野において周知である。
【０１３４】
IL-33特異的抗体または単量体/多量体ドメインポリペプチドを鼻内投与する場合、エアロゾル形式、スプレー、ミストまたは点鼻薬の形式で製剤化することができる。特に、本発明にしたがって使用するための予防または治療物質を、好適な噴射剤(例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の好適なガス)を使用して加圧パックまたは噴霧器からのエアロゾルスプレー提示の形式で好都合に送達することができる。加圧エアロゾルの場合、定量を送達するための弁を装備することによって投与単位を決定することができる。吸入器または空気吸入器中で使用するためのカプセルおよびカートリッジ(例えばゼラチン製)を、該化合物および好適な粉末基剤、例えばラクトースまたはデンプンの粉末混合物を含有するように製剤化してよい。
【０１３５】
第2の治療物質、例えば、サイトカイン、ステロイド、化学療法剤、抗生物質、または放射線との同時の投与または治療のための方法は当技術分野において周知である(例えば、Hardman, et al. (eds.) (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10.sup.th ed., McGraw-Hill, New York, N.Y.; Poole and Peterson (eds.) (2001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice:A Practical Approach, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., Pa.; Chabner and Longo (eds.) (2001) Cancer Chemotherapy and Biotherapy, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., Pa.を参照のこと)。治療薬の有効量は、少なくとも10%; 少なくとも20%; 少なくとも約30%; 少なくとも40%、または少なくとも50%症状を減少させることができる。
【０１３６】
IL-33特異的抗体または単量体/多量体ドメインポリペプチドと組み合わせて投与することができる、IL-33特異的抗体または単量体/多量体ドメインポリペプチド以外の治療(例えば予防または治療物質)は、IL-33特異的抗体または単量体/多量体ドメインポリペプチドから、5分未満の間隔、30分未満の間隔、1時間間隔、約1時間間隔で、約1〜約2時間間隔で、約2時間〜約3時間間隔で、約3時間〜約4時間間隔で、約4時間〜約5時間間隔で、約5時間〜約6時間間隔で、約6時間〜約7時間間隔で、約7時間〜約8時間間隔で、約8時間〜約9時間間隔で、約9時間〜約10時間間隔で、約10時間〜約11時間間隔で、約11時間〜約12時間間隔で、約12時間〜18時間間隔で、18時間〜24時間間隔、24時間〜36時間間隔、36時間〜48時間間隔、48時間〜52時間間隔、52時間〜60時間間隔、60時間〜72時間間隔、72時間〜84時間間隔、84時間〜96時間間隔、または96時間〜120時間間隔で投与してよい。患者(patent)の1回の診察中に同時に2以上の治療を施してよい。
【０１３７】
抗体IL-33特異的抗体または単量体/多量体ドメインポリペプチドおよび他の治療薬を循環的に投与してよい。循環治療は、治療の1つに対する耐性の発生を低減させ、治療の1つの副作用を回避するかまたは低減させ、かつ/または治療の効力を向上させるために、第1の治療薬(例えば第1の予防または治療物質)の一定期間の投与、次いで第2の治療薬(例えば第2の予防または治療物質)の一定期間の投与、場合により、次いで第3の治療薬(例えば予防または治療物質)の一定期間の投与等、およびこの連続投与を反復するステップ、すなわち循環を含む。
【０１３８】
本明細書に記載のすべての刊行物、特許および特許出願は、ここに、個々の各刊行物、特許または特許出願が具体的かつ個別に参照によりここに組み入れられると指定されているのと同程度に、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１３９】
本出願は、2007年5月18日提出の出願番号第60/924,542号および2008年2月20日提出の第61/064,167号の優先権を主張し、かつそれらを参照により組み入れる。
【０１４０】
以下の一連の実施例は単に説明のために提供されるものであり、本発明はいかなる意味においてもこれらの実施例に限定されると解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１４１】
実施例
実施例1:  IL-33はマウスBMMCからのサイトカインおよびロイコトリエン産生を誘導する。
マウス肥満細胞:  以前に記載されるようにSCFおよびIL-3の存在下でマウス骨髄由来肥満細胞(BMMC)を分化させた。5週の時点で、IgE受容体およびcKitに対するFACs二重染色によって肥満細胞成熟度が95%であると決定した。
【０１４２】
マウス肥満細胞の刺激:  BMMCをIL-33 (1-100 ng/ml)とともにインキュベートして、サイトカインおよびロイコトリエン産生を誘導した。IgE受容体架橋のため、BMMCを抗DNP IgE (Sigma)とともに37℃で4時間インキュベートし、次いで30 ng/ml DNP-BSAで24時間刺激した。TLR4およびTLR2活性化のため、BMMCを超高純度の大腸菌LPSおよびPam3CSK4 (Invivogen)で刺激した。
【０１４３】
ELISA:  R&D ELISAキットを使用して培養上清中のマウスIL-6、ヒトIL-5、ヒトIL-13、およびヒトTNFアルファ濃度を測定した。Cayman Chemicalキットを使用して、PGD2、PGE2、およびシステイニルロイコトリエンレベルを決定した。追加のサイトカインおよびケモカインの濃度をPerbio Searchlightサービスによって決定した。すべてのサンプルを3回重複してアッセイした。
【０１４４】
結果:  IL-33はマウスBMMCによる多数のサイトカインおよびロイコトリエンの産生を誘導する。IL-33によるマウスBMMCからのIL-6産生の誘導を示す図１Ａ〜Ｃを参照のこと。留意すべきは、他の刺激、例えばIgE受容体架橋、ならびにLPSおよびPAMcys (TLRアゴニスト)がIL-33ほど大きなIL-6発現の応答を誘発しなかったことである。さらに、IL-33が、とりわけ、IL-4およびGM-CSF産生を誘導することを示す図２Ａを参照のこと。マウスBMMCからのIL-6産生は、明確に、IL-33に起因するものであった; マウスBMMCによるIL-6の産生はT1/ST2 (IL-33受容体)抗体によって無効化された。
【０１４５】
IL-33はマウスBMMCにおける種々の他の炎症メディエーターの産生を誘導した。IL-33が、マウスBMMCによるケモカイン、例えば、MIP-1α、MIP-1β、MIP2の産生を誘導したことを示す図２Ａを参照のこと。IL-33活性化によるシステイニルロイコトリエンの時間依存的誘導を図示する図２Ｂを参照のこと。
【０１４６】
さらにまた、IL-33は3倍を超えるメディエーター放出を促すことによって肥満細胞のIgE受容体架橋と相乗的に作用するようであった。マウスBMMCによるIL-6産生の相乗的誘導を定量的に示す(IL-33 + IgE受容体架橋によるIL-6誘導を単独のIL-33またはIgE受容体架橋と比較する)図１Ｃを参照のこと。さらに、IL-33がマウスBMMCからのIL-4、IL-5、MIP-1α、MIP-1β、TNF-α、VEGF、GM-CSF、KC、およびJEの放出の刺激においてIgE受容体と相乗的に作用することを示す図２Ａを参照のこと。
【０１４７】
さらに、IL-33シグナル伝達はMyD88 (MyD88はTLRシグナル伝達アダプタタンパク質である)依存的である。図１Ｄを参照のこと。
【０１４８】
実施例2:  IL-33はマウスBMMCにおける脱顆粒を誘発しないようである。
IL-33がマウスBMMCにおける脱顆粒を誘発するかどうかを決定するために、マウスBMMCをIL-33で30分刺激し、培養上清をヒスタミン放出に関してアッセイした。単独のIL-33 (10 -1000 ng/ml)はBMMCからのヒスタミン産生を誘発しなかった。10、100、および1000 ng/mlの濃度のIL-33がヒスタミン放出を誘発しなかったことを示す図３を参照のこと。さらにまた、IL-33およびIgE受容体架橋の組み合わせはヒスタミン産生を誘発しないようであった。さらに、単独のIgE受容体架橋と比較して、IL-33 + IgE受容体架橋によって刺激された細胞におけるほぼ同等のヒスタミン放出を示す図３を参照のこと。
【０１４９】
実施例3:  IL-33はナイーブマウスにおいてAHRを誘発する。
AHR誘発:  BALB/cマウスをIL-33、IL-13またはPBSで鼻内(i.n.)で処置してAHRを誘発した。
【０１５０】
AHRの評価:  処置の4または24時間後にAHRを評価した。吸入メタコリン(3-300 mg/mlで1分)に対するPenh応答(Buxco Electronics, CT)を測定(5分の記録/用量にわたってPenh値を平均)することによって自発呼吸下の動物においてAHRを決定した。Buxco全身プレチスモグラフィシステムを使用して、吸入メタコリン(3-100 mg/ml)に応答した、麻酔され機械的人工呼吸器を付けたマウスにおける気道抵抗性およびコンプライアンスを測定(3分の記録/用量にわたって結果を平均)することによってPenhの結果を確認した。
【０１５１】
結果:  IL-33はナイーブマウスにおいてAHRを誘発する。図４に示されるように、IL-33で処置されたマウスでは投与の4時間後(図４Ａ)および24時間後(図４Ｂ)のPenh応答が上昇した。IL-33で処置されたマウスはまた、増加した抵抗性(図４Ｃ)および減少したコンプライアンス(図４Ｄ)を有する。
【０１５２】
実施例4:  IL-33はナイーブマウスの肺においてサイトカインおよびムチン発現を誘導する。
方法:  BALB/cマウスをIL-33、IL-13、またはPBSでi.n.で処置し、24時間後に肺組織を採取した。肺組織中のmRNAレベルを定量的RT-PCRによって決定した。
【０１５３】
結果:  IL-33で処置されたマウスの肺は、IL-13またはPBSで処置されたマウスの肺よりずっと高いIL-5 (図５Ａ)およびIL-13 (図５Ｂ) mRNA発現レベルを示した。実際、IL-13およびPBSコントロールで処置されたマウスの肺は類似したレベルのIL-5 (図５Ａ)およびIL-13 (図５Ｂ)誘導を示した。さらにまた、ムチン遺伝子発現レベルが、IL-13およびPBSで処置されたマウスと比べてIL-33で処置されたマウスの肺においてより高い程度で誘導された。マウスの肺におけるGob 5およびMuc5ACの発現レベルをそれぞれ示す図５Ｃおよび５Ｄを参照のこと。
【０１５４】
実施例5:  IL-33はマウス肺組織および血清においてマクロファージを直接活性化する。
BALB/cマウスを、IL-33、IL-13、またはPBSでi.n.で処置した。肺組織におけるmRNAレベルおよび血清におけるELISAを用いてmMCP-1レベルを24時間後に決定した。図６で観察されるように、肺(図６Ａ)および血清(図６Ｂ)におけるmMCP-1レベルは投与後に上昇した。PBSまたはIL-13で処置されたマウスにおいてこれらのレベルの上昇は観察されなかった。実際、IL-13で処置されたマウスは、PBSで処置されたコントロールと比較して、肺(図６Ａ)および血清(図６Ｂ)において類似したまたはより低いレベルのmMCP-1発現を示した。
【０１５５】
実施例6:  IL-33はヒト肥満細胞を活性化する。
ヒト肥満細胞:  以前に記載したようにヒト臍帯血由来肥満細胞を取得した。>95%がトルイジンブルーで陽性染色された時点で細胞を回収し、幹細胞因子(SCF, 100 ng/ml, R & D Systems)およびIL-4 (10 ng/ml, R & D Systems)とともに37℃および5% CO2で4日間さらに培養した。4日目に、細胞をIgE (10 ug/ml; Chemicon)と一晩インキュベートし、洗浄し、プレートにまいた。そして、種々の時点で、ウサギ抗ヒトIgE抗体(1 ug/ml; ICN biomedicals)、rhIL-33 (10 ng/ml; Axxora, LLC)または組み合わせで細胞を刺激した。
【０１５６】
HMCのIL-33刺激は、無処理細胞と比較して、サイトカインIL-5 (図５Ａ)およびIL-13 (図５Ｂ)の産生を誘発した。興味深いことに、IL-33 + IgE受容体架橋は、これらの細胞からのIL-5 (図５Ａ)、IL-13 (図５Ｂ)、およびTNF-アルファ(図５Ｃ)の産生を大幅に増強した。IL-33はまた、他の炎症メディエーターPGD2 (図５Ｄ)およびPGE2 (図５Ｅ)の産生を誘発した。ゆえに、IL-33はヒト臍帯血由来肥満細胞を活性化する。これらの知見は、アレルギー疾患に関与する肥満細胞の活性化におけるIL-33の潜在的役割を説明する。
【０１５７】
実施例7:  IL-33はマウス骨髄由来肥満細胞の強力なアクチベーターである。
マウス骨髄由来肥満細胞(BMMC)に対するIL-33刺激の効果を評価した。MedImmune, Incの実験動物研究施設で飼育され、かつMedimmune, Inc.で、IACUCによって確立および承認された動物飼育のプロトコルにしたがって処置されたBalb/c (Harlan)、C57/BL6-野生型およびC57/BL6J KitW-sh/W-shマウス(Grimbaldeston, M.A. et al. Mast Cell-Deficient W-sash c-kit Mutant KitW-sh/W-sh Mice as a Model for Investigating Mast Cell Biology in Vivo. Am J Pathol 167, 835-848 (2005))からBMMCを取得した。MyD88 (Adachi,O. et al. Targeted Disruption of the MyD88 Gene Results in Loss of IL-1- and IL-18-Mediated Function. Immunity 9, 143-150 (1998))およびTRIF (Yamamoto,M. et al. Role of Adaptor TRIF in the MyD88-Independent Toll-Like Receptor Signaling Pathway. Science 301, 640-643 (2003))ノックアウトマウスをS. Akira博士(Osaka University, Osaka, Japan)から入手し、C57BL/6マウスに少なくとも6世代戻し交配した。マサチューセッツ大学ウースター校(University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA)で特定病原体を含まない条件下でMyD88ノックアウトマウスおよびTRIFノックアウトマウスを維持した。
【０１５８】
以前に報告されるようにしてマウスBMMCを分化させた(Mekori,Y.A., Oh,C.K., & Metcalfe,D.D. IL-3-dependent murine mast cells undergo apoptosis on removal of IL-3. Prevention of apoptosis by c-kit ligand. J Immunol 151, 3775-3784 (1993))。簡単に説明すると、安楽死させたBalb/c、C57BL/6マウス(野生型(WT)コントロール)、MyD88ノックアウトマウス、またはTRIFノックアウトマウスの大腿骨からRPMI培地で骨髄を洗い出した。10% FBS、1%ペニシリンストレプトマイシン、25 ng/ml幹細胞因子(SCF)(R&D Systems)および10 ng/ml IL-3 (R&D)を補充したRPMI培地中で5 x 105細胞/mlの密度で骨髄細胞培養を確立した。細胞を37℃で維持し、非接着細胞を3〜4日毎に継代して、肥満細胞の発達について選択した。5週の時点で、フローサイトメトリー解析によって、BMMC培養物が95%純度(c-kit+FcERI+)であることがわかった。以前に報告されるようにしてフローサイトメトリー解析を使用して細胞の表現型を決定した(Kearley, J., Barker, J.E., Robinson, D.S., & Lloyd, C.M. Resolution of airway inflammation and hyperreactivity after in vivo transfer of CD4+CD25+ regulatory T cells is interleukin 10 dependent. J. Exp. Med. 202, 1539-1547 (2005))。簡潔に言えば、冷FACSバッファー(1%FCS、0.1%アジ化ナトリウムを含有するPBS)中で細胞を染色した。Fc Block (BD Biosciences)で非特異的結合をブロックした後、抗体染色した。使用された抗体は、抗マウスCD4 (BD Biosciences)、c-kit (BD Biosciences)、FcERI (eBiosciences)、およびT1/ST2 (MD Biosciences)およびその対応アイソタイプコントロールであった。LSRIIフローサイトメーターおよびFACS DIVAソフトウェア(BD Biosciences)を使用してサンプルを解析した。FlowJo (TreeStar Corp.)を使用して結果をさらに解析した。
【０１５９】
IL-33活性化のために、細胞を指定濃度の組換えIL-33 (Axxora, LLC)とともに24時間インキュベートした。IgER架橋のため、BMMCを抗DNP IgE (Sigma)とともに37℃で4時間インキュベートし、次いで30 ng/ml DNP-BSAで24時間刺激した。TLR4およびTLR2活性化のため、BMMCを、それぞれ、超高純度の大腸菌LPSおよびPam3CSK4 (Invivogen)で24時間刺激した。特定の研究では、T1/ST2抗体(MD Biosciences)をBMMCとともに30分インキュベートした後、IL-33を加えた。
【０１６０】
ELISAキット(R&D systems)を製造元のプロトコルにしたがって使用してマウスIL-6を測定した。Cayman Chemical製のキットを製造元のプロトコルにしたがって使用して、BAL上清中のPGD2、PGE2、およびシステイニルロイコトリエンを測定した。Moredun Scientific ELISAキットを使用して、血清中のマウス肥満細胞プロテアーゼ-1濃度を決定した。追加のサイトカインおよびケモカインの濃度をPerbio Searchlightサービスによって決定した。すべてのサンプルを3回重複してアッセイした。
【０１６１】
IL-33が、一連のサイトカインおよび炎症促進性メディエーターを誘導するBMMCの強力なアクチベーターであることがわかった(図８および図１５)。詳細に試験したもののうち、IL-33は、IL-6 (図８ａ)、Th2サイトカインIL-4、IL-5 (図１５)およびIL-13 (図８ａ)およびエイコサノイド、PGD2およびシステイニルロイコトリエン(図８ｂ)の用量依存的増加を誘導した。実際、IL-33は、他の刺激、すなわち高親和性IgE受容体架橋、LPS (TLR4活性化)または合成リガンドPam3CSK4 (TLR2活性化, 図１４ａ)と比較して高レベルのこれらのサイトカインを誘導した。さらに、これらの効果はT1/ST2依存的であったが、これはこの受容体に対する中和抗体がサイトカイン産生を阻止したためである(図１４ｂ)。T1/ST2はTIR受容体ファミリーに属し、そのメンバーはアダプタ分子MyD88およびTRIFを介してシグナル伝達する。
【０１６２】
どのアダプタ分子を通じてIL-33がシグナル伝達するかを調べるために、MyD88欠損、TRIF欠損およびC57BL/6野生型マウス由来のBMMCを分化させ、しかるべく刺激した。C57BL/6およびTRIF欠損BMMCでは、増加レベルおよび同等レベルのIL-6およびIL-13が検出されたが、MyD88 -/- 動物由来の細胞ではそうではなかった。これは、IL-33のシグナル伝達がMyD88依存的であることを示唆する(図８ｃ)。実施例1も参照のこと。
【０１６３】
実施例8:  IL-33はヒスタミン放出を誘発しないようであるが、IgE受容体活性化と相乗的に作用してサイトカイン産生を増強する
IL-33がサイトカイン産生を刺激することを前提として、それが肥満細胞の脱顆粒を誘発するかどうかを決定した。BMMCを30分刺激し、上清をヒスタミンに関して分析した。これらの実験的条件では、IL-33 (10 - 100 ng/ml)はIgE受容体架橋と比較してヒスタミン放出を誘発しなかった(図１４ｃ)。しかし、IL-33は、mRNA発現(図１４ｄ)およびタンパク質(図８ｄ)の両レベルで、マウス肥満細胞プロテアーゼ1、(mMCP-1)、肥満細胞顆粒関連プロテアーゼを誘導した。
【０１６４】
以前のin vitro研究では、IL-1ファミリーメンバーが、IgE受容体によって媒介される活性化を増強できることが示されている。ここでは、IL-33が、IgE受容体活性化BMMCからのサイトカインおよびエイコサノイド産生を著しく増強する相乗効果(単独のIL-33またはIgE受容体活性化と比較して約4〜8倍)を示すことを実証した(図８ｅ(IL-5、IL-13、システイニルロイコトリエン(Cys LT)およびPGD2が示される)および図１５)。実施例2も参照のこと。
【０１６５】
実施例9:  IL-33はヒト肥満細胞において類似の炎症促進性プロファイルを誘発する
また、ヒト臍帯血由来肥満細胞(HMC)に対するIL-33の効果を決定した。以前に報告されるようにしてヒト臍帯血由来肥満細胞を取得した(Ochi, H. et al. T Helper Cell Type 2 Cytokine mediated Co-mitogenic Responses and CCR3 Expression During Differentiation of Human Mast Cells In Vitro. J. Exp. Med. 190, 267-280 (1999))。簡単に、通常の帝王切開分娩後に胎盤からヘパリン処理臍帯血を得た。血液のデキストラン沈降後、Ficoll-Hypaque(登録商標) (1.77 g/ml; Pharmacia)のクッションを通してバフィーコートを遠心分離することによって単核細胞を取得した。残留赤血球を低張溶解によって除去し、10%ウシ胎児血清(Sigma)、2 mM L-グルタミン、0.1 mM非必須アミノ酸、0.2μM 2-ME、100 U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、および2μg/mlゲンタマイシン(gentamycin)を補充したRPMI 1640 (Invitrogen)に単核細胞を懸濁した。細胞懸濁液を106細胞/mlの密度で播種し、100 ng/ml SCF、50 ng/ml IL-6、および10 ng/ml IL-10の存在下で培養した。>95%がトルイジンブルーで陽性染色された時点で細胞を回収し、幹細胞因子(SCF, 100 ng/ml, R & D Systems)およびIL-4 (10 ng/ml, R & D Systems)とともに37℃および5% CO2で4日間さらに培養した。4日目に、細胞をIgE (10 ug/ml; Chemicon)とともに一晩インキュベートし、洗浄し、プレートにまいた。そして、種々の時点で、ウサギ抗ヒトIgE抗体(1 ug/ml; ICN biomedicals)、rhIL-33 (10 ng/ml; Axxora, LLC)またはそれらの組み合わせで細胞を刺激した。ELISAキット(R&D systems)を製造元のプロトコルにしたがって使用してヒトIL-5、ヒトIL-13、およびヒトTNFαを測定した。
【０１６６】
マウスBMMCとほとんど同一のサイトカインプロファイルが得られた。すなわち、TH2サイトカイン、IL-5およびIL-13、および特にエイコサノイド、PGD2およびCys LTの増加(図８ｆ)が観察された。さらに、エイコサノイド産生ではなくIL-33誘導性サイトカインが、IgE受容体活性化によって増強された(図１４ｅ)。同様に、IL-33はHMCの脱顆粒を誘発しなかった。実施例6も参照のこと。
【０１６７】
実施例11:  IL-33はナイーブマウスにおいてAHRおよび炎症を誘発する
IL-33はin vitroで肥満細胞を活性化し、かつTH2サイトカインプロファイルを誘導する(図８)ので、ナイーブマウスの気道におけるIL-33の効果を調べた。IL-33 (1用量あたり5μg)を1〜3日目にBALB/cマウスに鼻内投与し、24時間後(2日目および4日目)に吸入メタコリンに対する気道応答を測定した。吸入イソフルオラン(isofluorane)を使用してマウスを麻酔し、組換えIL-33 5ugまたは同等の容量のPBSを鼻内投与した。各投薬間に24時間の間隔を空けてマウスに1、2または3回投薬した。最終IL-33投薬の24時間後にAHRおよび肺炎症を評価した。いくつかの研究では、CD4に対する枯渇抗体(GK1.5 (Gavett,S.H., Chen,X., Finkelman,F., & Wills-Karp,M. Depletion of murine CD4+ T lymphocytes prevents antigen-induced airway hyperreactivity and pulmonary eosinophilia. Am J Respir Cell Mol Biol 10, 587-593 (1994)))またはコントロールIgの0.5mgでマウスを処置し、24時間後にIL-33の最初の投薬を行った。
【０１６８】
以前に報告されている方法の適合変法によって過敏性を判定した(Wagers,S.S. et al. Intrinsic and antigen-induced airway hyperresponsiveness are the result of diverse physiological mechanisms. J Appl Physiol 102, 221-230 (2007))。簡潔に言えば、マウスをペントバルビタールナトリウムで麻酔し、小動物人工呼吸器(FlexiVent, Scireq, Montreal, CA)に連結した。ベースライン機械的人工呼吸を、呼気終末陽圧3 cmH2Oに対して0.25 mlの一回呼吸量で180呼吸/分で適用した。実験の開始時に、1 mlの2回の深肺膨張(deep lung inflations)およびその後の2分の通常の人工呼吸を送達することによって標準肺気量歴を確立した。次にすべてのパラメータ(SnapshotおよびQuick-Prime)のベースラインの記録を取得した。そして、超音波ネブライザーを通じて人工呼吸器からの吸気流を導くことによって達成されるPBSのエアロゾル(40 s)を用いてマウスをチャレンジした。すべてのパラメータの記録を、シグナル間で交互に、10秒毎に3分間行った(SnapshotおよびQuick-Prime, 後者の測定は1秒の受動呼気およびその後の2秒の広帯域(1-19.625 Hz)の容積摂動(volume pertubation)に関して人工呼吸を中断することによって行う。これらの摂動(pertubation)の送達中の人工呼吸器ピストンのピーク・トゥ・ピーク可動域(excusion)は機能的残気量を0.17 ml上回り、人工呼吸器シリンダーおよび連結チューブ中のガス圧縮を計上した後に0.14 mlの送達容積が得られた)。最後にさらに2回の深肺膨張を施し、3.125、12.5および50 mg/mlの連続的に増加する濃度でメタコリン(Sigma)を含有するエアロゾルを用いて上記プロトコルをさらに3回反復した。
【０１６９】
シングルコンパートメント線形モデルを使用した場合に得られるパラメータ: Snapshot  シグナル
P(t) = RV (t) + EV (t) + Po
R = 動的抵抗(すなわち肺の狭窄のレベル)
E = 動的エラスタンス(すなわち肺の弾性剛性)
C = コンプライアンス= 1/E (すなわち肺の拡張のしやすさ)
COD: 測定係数(品質管理パラメータ、モデル適合度)
定位相(constant phase)モデルから得られるパラメータ: Quick-Primeシグナル
Zin(f) = R + i2πfI + Gt - iHt
(2πf)α
R = ニュートン抵抗, Rn (すなわち中枢気道の抵抗である)
I  = 不活性度(中枢気道におけるガスの不活性(inertive)特性, >20 Hzでマウスにおいて無視できる(neglible)
G = 組織ダンペニング(Tissue dampening)または、組織抵抗に密接に関連
H = 組織エラスタンス。
【０１７０】
驚くべきことに、IL-33の単回投与はナイーブマウスにおいて有意なAHRを誘発し、これはPBS単独と比較して3回のチャレンジ後にさらに増強された(図９)。興味深いことに、IL-33は検査されたすべての肺機能パラメータの有意な変化を誘発した。flexivent肺機能システムを使用して、全肺抵抗(図９ａ)およびエラスタンス(図９ｂ)ならびに組織パラメータG (組織抵抗, 図９ｃ)およびH (組織エラスタンス, 図９ｄ)の増加が観察された。また、中枢気道の抵抗を反映しかつ気道平滑筋収縮に関連するパラメータであるニュートン抵抗(Rn, 図９ｅ)のさらに顕著な増加が観察された。特に、一用量のIL-33はナイーブマウスにおけるAHR誘発時に同量のTH2サイトカインIL-13(AHRの周知の誘導物質である)よりも著しく有効であった(データは示していない)。
【０１７１】
さらなる調査では、IL-33がマウスの気道において用量・時間依存的炎症を誘発することがわかった。マウスの気道内腔および肺組織を評価することによって気道炎症を検査した。(i) 気道内腔。肺機能測定を行った後、心臓穿刺によってマウスを出血させた。気管カニューレを通じて10 mM HEPESおよびEDTAを含有するHBSSの3 x 0.6 mlアリコートでBALを実施した。BAL液を遠心分離(400 g, 4℃)し、細胞を除去した。コールターZ2粒子カウンター(Beckman Coulter Corporation)を使用して総細胞数を決定し、エオシンおよびメチレンブルー(Diff-Quik, Dade Diagnostics)で染色されたサイトスピン調製物に対して(スライドあたり少なくとも500細胞の)示差細胞カウントを実施した。(ii) 肺組織。肺組織から細胞を分散させるために、肺の一葉(約100 mg)を、RPMI/10%FCS中の消化試薬(1.8mg/ml リベラーゼ(Blenzyme 2; Roche), 25μg/ml DNアーゼ(1型; Roche))中で37℃で1時間インキュベートした。回収された細胞を、70μmナイロンシーブ(Falcon)に通してろ過し、2回洗浄し、RPMI/10%FCSに再懸濁し、Coulter Z2粒子カウンターを使用してカウントした。集細胞遠心機(Cytocentrifuge)調製物を調製し、染色し、BALに関して示差カウントを実施した。
【０１７２】
IL-33の1回の投与は、ムチン遺伝子Gob-5およびMUC5AC (図１０ｃ)およびTh2サイトカイン、IL-5およびIL-13 (それぞれ図１６ａ, ｂ)のmRNA発現の有意な増加を誘導したが、肺切片中にこの時点で観察される炎症または粘液生産は存在しなかった。しかし、3回のIL-33投薬の後、タンパク質レベルでの顕著な炎症およびBALにおける細胞動員が存在した。またマクロファージ、リンパ球、好酸球および好中球の増加が観察された(図１０ａ)。さらに、Gob-5およびMUC5ac mRNAレベル(図１０ｃ)は増加し続け、肺組織中で顕著な粘液生産が観察され(図１０ｃ)、これらのレベルはIL-13によって誘導されるレベルと類似であった(データは示していない)。RNAeasy Plus miniキット(Qiagen)でmRNAを精製し、Sprint Power Script Double Preprimed 96キット(Clontech)を使用してcDNAを合成した。TaqMan(登録商標)リアルタイムPCR (Applied Biosystems)によって製造元のプロトコルにしたがって遺伝子発現を測定した。プローブセットは、Applied BiosystemsからTaqMan(登録商標) Gene Expression Assaysとして入手した。Taqman反応は、リファレンス遺伝子GAPDHまたは目的の遺伝子のいずれか、IL-5、IL-13、Muc5ac、Gob-5、または肥満細胞プロテアーゼ-1を含有した。
【０１７３】
TH2リンパ球およびマクロファージ上のT1/ST2の発現、およびIL-33の反復が脾臓においてTH2応答を誘発したことを前提として、複数回のIL-33投与後に肺組織中の細胞、特にリンパ球のサブタイプを検査した。BALに関して示された結果(図１０ａ)と類似の、合計肺細胞の有意な用量・時間依存的増加が観察された(図１０ｂ)。肺リンパ球集団のうち、CD4 (図１０ｄ)、およびCD4/T1/ST2陽性TH2細胞(図１０ｅ)の用量依存的増加が認められた。さらに、肺組織中のマクロファージ、好酸球および好中球の増加(図１０ｂ)が確認された。
【０１７４】
IL-33は肥満細胞の強力なアクチベーターとして説明されるが、現在までの研究はin vitroで実施されてきた(図８)。in vivoの局所活性化に対するIL-33の効果を研究した。この目的を達成するために、血清中のマウス肥満細胞プロテアーゼ-1 (mMCP-1)レベルを測定した。すなわち、血清mMCP-1の増加は粘膜の肥満細胞活性化と相関することが示されている。同様に、IL-33は血清mMCP-1の有意な用量依存的増加を誘導することがわかり(図１０ｆ)、in vivoでの繰り返される肥満細胞活性化が示唆されたが、これはIL-13では観察されなかった。
【０１７５】
実施例12:  IL-33によって誘発されるAHRはCD4依存的ではない。
IL-33によって誘発されるAHRおよび炎症の基礎となる機構を研究した。IL-33の後の、CD4およびCD4/T1ST2 TH2細胞の肺への有意な動員はAHRに寄与することが仮定された。したがって、CD4枯渇動物における単回および複数回のIL-33チャレンジの効果を研究した。抗CD4枯渇抗体で前処理すると、マウスの肺からCD4およびCD4/T1ST2 TH2細胞が効果的に除去された(図１１ａ, ｂ)が、驚くべきことにIL-33によって誘発されるAHRに対しては効果を有さなかった(3x IL-33: 図１１ｃ, ｄおよび図１７ａ〜ｃ; 1x IL-33: 図１８ａ〜ｅ)。さらに、野生型およびCD4枯渇マウスはともに、IL-33投与後に、同等程度の炎症(図１１ｅ、図１９ａ)、粘液生産(図１９ｂ)およびTH2サイトカイン、IL-4、IL-5 (示していない)およびIL-13 (Balおよび肺、それぞれ図１９ｃ, ｄ)を示した。
【０１７６】
実施例13:  IL-33は肥満細胞依存的機構を介してAHRを誘発する。
IL-33は、有意かつ反復した肥満細胞活性化をin vivoで誘導した(図１０ｆ)ので、該効果が肥満細胞によって媒介されるかどうかを調べた。そこで、肥満細胞欠損マウス(KitW-sh/KitW-sh)におけるIL-33 (1および3x)の応答を調べた。BALB/c動物で観察されるように、IL-33はC57BL/6野生型コントロールにおいて用量依存的AHRを誘発した(図１２ａ、ｂおよび図２０、２１)。しかし、KitW-sh/KitW-sh肥満細胞欠損マウスは、複数回(図１２ａ、ｂおよび図２０ａ〜ｃ)および一回(図２１)のIL-33のいずれの投与後にも、ほとんど完全にAHRから保護された。興味深いことに、肥満細胞欠損は炎症に対して影響を有さなかった。すなわち、CD4およびCD4/T1ST2 T細胞を含む細胞動員、またはムチン遺伝子GOB-5およびMUC5AC(図２２)における差異は観察されなかった。mMCP-1レベルを測定することによってKitW-sh/KitW-shマウスにおける肥満細胞活性化の不在を確認した。IL-33はC57BL/6野生型においてmMCP-1の有意な上昇を誘導したが、KitW-sh/KitW-shマウスではそうではなかった(図１２ｅ)。
【０１７７】
どの肥満細胞メディエーターが、IL-33によって誘発されるAHRに寄与するかを研究した。サイトカインIL-13はTH2細胞および肥満細胞の両者によって産生され、ナイーブマウスにおいてAHRを直接誘発することができる。そこで、IL-33処置マウスにおいてこのサイトカインのレベルを測定した。IL-33処置野生型マウスおよびKitW-sh/KitW-sh肥満細胞欠損マウスのBAL液(図１２ｃ)および肺組織(図２２ｅ, ｆ)の両方において有意でかつ同等レベルのIL-13が検出された。これは、IL-13がAHRに関与しないことを示す。
【０１７８】
気管支平滑筋収縮を誘発することが知られている他の肥満細胞メディエーターはエイコサノイド、PGD2およびシステイニルロイコトリエン(cysLT)である。発明者らのマウスにおけるこれらのエイコサノイドのレベルを調べた。IL-33は野生型マウスのBAL液においてPGD2およびCys-LTの両者の有意な増加を誘発したが、しかし、これらの増加はKitW-sh/KitW-sh肥満細胞欠損マウスでは検出されなかった(図１２ｄ)。したがってこれらのデータは、IL-33によって誘発されるAHRが肥満細胞によるPGD2およびcys LTの産生を介することを示唆する。
【０１７９】
実施例14:  アレルギー疾患におけるIL-33の役割
現在の結果は、IL-33がin vivoにおける肥満細胞の強力なアクチベーターであり、顕著な気管支収縮、TH2サイトカイン産生および炎症を誘導することを実証する。したがってこれらのデータは喘息におけるIL-33の潜在的役割を裏付ける。アレルゲンのチャレンジがin vivoにおけるIL-33産生を誘導するかどうかが問題となった。BALB/cマウスを免疫(オボアルブミン、OVA)し、気道を介してOVAでチャレンジし、種々の時点でIL-33タンパク質について肺を分析した。
【０１８０】
Balb/cマウスを0日目および10日目にミョウバン(Sigma; 325μg)中のオボアルブミン(OVA; Sigma; 10μg)を用いて腹腔内経路で感作させた。19〜21日目に、マウスに1% OVAのエアロゾルチャレンジを30分間受けさせた。偽マウスは、ミョウバンのみで感作させ、気道経由でPBSでチャレンジした。最終OVAチャレンジの1.5、3、6または24時間後にマウスを犠牲にし、上記のようにしてELISAによるサイトカイン解析のために肺を取り出した。
【０１８１】
IL-33のほとんど即時(90分)で有意な誘導が観察され、該誘導はチャレンジの24時間後に依然として維持されていた(図１３ａ)。特に、これらのレベルはアレルゲンチャレンジ後のTh2サイトカインIL-13のレベルと類似していた(図２３ａ)。
【０１８２】
ヒト喘息性肺生検におけるIL-33の発現を研究した。生検中の最も強い染色は上皮細胞の先端の構造細胞の核に存在したが(図１３ｂおよび図２３ｂ)、内皮細胞にも存在した(図１３ｃの矢じり印および図２３ｃ, ｄ)。円柱上皮細胞(すなわち繊毛細胞および杯状細胞)内に均一であるが弱い核染色が観察されたが、上皮染色は生検間で均一であり、かつ主に基底細胞に局在した。さらにまた、気管支の血管の内皮細胞はIL-33免疫反応性を示すことが多かった(図１３ｃおよび図２３ｃ, ｄ)。これはIL-33に関する内皮細胞供給源についての以前の報告と一致する。肥満細胞様形態を有する顆粒細胞の小集団がIL-33陽性染色顆粒を含有するという新規観察がかなり興味深かった(図１３ｃ(挿入図), ｄ)。重要なことに、この顆粒染色はコントロール染色切片には存在しなかった(図１３ｅ)。IL-33および肥満細胞トリプターゼに対する二重免疫蛍光染色(図１３ｆ)では、トータルの気管支肥満細胞数の10〜15%にIL-33免疫反応性顆粒の存在が確認された(図１３ｇ)。増加したIL-33発現は区域アレルゲンチャレンジ後に回収された喘息患者の肺洗浄液中でも検出されている(データは示していない)。
【０１８３】
肥満細胞が喘息肺におけるIL-33の潜在的供給源であるという考えをさらに調査した。これに取り組むために、マウスBMMCを適宜刺激し、サンプルをIL-33 mRNA発現に関して解析した。IL-33はIgE受容体活性化BMMC中で検出されなかったが、IgE受容体活性化+ IL-33刺激細胞では、mRNA発現の時間依存的増加が検出された。この増加は90分および4時間の時点で観察されたが、24時間までに消失していた。このことは、肥満細胞におけるIL-33の新規(de novo)合成を示唆する(図１３ｈ)。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８ａ−ｄ】
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【図８ｅ−ｆ】
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【図９ａ−ｄ】
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【図９ｅ】
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【図１０ａ−ｄ】
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【図１０ｅ−ｆ】
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【図１１ａ−ｄ】
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【図１１ｅ−ｆ】
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【図１２ａ−ｄ】
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【図１２ｅ】
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【図１３ａ−ｅ】
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【図１３ｆ−ｈ】
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【図１４ａ−ｄ】
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【図１４ｅ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８ａ−ｄ】
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【図１８ｅ】
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【図１９ａ−ｃ】
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【図１９ｄ−ｅ】
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【図２０】
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【図２１ａ−ｄ】
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【図２１ｅ】
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【図２２ａ−ｄ】
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【図２２ｅ−ｆ】
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【図２３ａ】
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【図２３ｂ−ｄ】
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【国際調査報告】
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