(57)【要約】  本発明は、ω−６脂肪酸をω−３対応物に変換する能力（すなわちアラキドン酸［２０：４、ＡＲＡ］のエイコサペンタエン酸［２０：５、ＥＰＡ］への変換）を有するΔ１７デサチュラーゼに関する。Δ１７デサチュラーゼをコードする単離された核酸断片およびこのような断片を含んでなる組み換えコンストラクトが、油性酵母中でこれらのΔ１７デサチュラーゼを使用して長鎖多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を作成する方法と共に開示されている。
2010508019.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．）配列番号２および配列番号３からなる群から選択された、Δ１７デサチュラーゼ酵素をコードする単離されたヌクレオチド分子、
ｂ．）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、および２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳというハイブリダイゼーション条件下で（ａ）とハイブリダイズする単離されたヌクレオチド分子、または
（ａ）または（ｂ）と完全に相補的な単離されたヌクレオチド分子
からなる群から選択された単離された核酸分子。
【請求項２】
配列番号１および配列番号４からなる群から選択された、Δ１７デサチュラーゼ酵素をコードする単離された核酸分子。
【請求項３】
請求項１に記載の単離された核酸分子によってコードされた、Δ１７デサチュラーゼ酵素をコードするポリペプチド。
【請求項４】
配列番号２および配列番号３からなる群から選択された、Δ１７デサチュラーゼ酵素をコードするポリペプチド。
【請求項５】
少なくとも１７５個のコドンがヤロウィア中での発現のためにコドン最適化されている、配列番号２に記載のΔ１７デサチュラーゼ酵素をコードする単離された核酸分子。
【請求項６】
Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアルゴリズムに基づいて配列番号２に示される配列を有するポリペプチドと比較すると、少なくとも７５．３％の同一性を有する少なくとも３５９個のアミノ酸のΔ１７デサチュラーゼ酵素をコードする第１のヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子、
または第１のヌクレオチド配列の相補体を含んでなる第２のヌクレオチド配列。
【請求項７】
適切な制御配列と作動可能に連結する、請求項１に記載の単離された核酸分子を含んでなるキメラ遺伝子。
【請求項８】
請求項１に記載の単離された核酸分子を含んでなる形質転換宿主細胞。
【請求項９】
藻類、細菌、酵母、卵菌綱、および真菌からなる群から選択された、請求項８に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１０】
酵母が油性酵母である、請求項９に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１１】
油性酵母が、ヤロウィア、カンジダ、ロドトルラ、ロドスポリジウム、クリプトコッカス、トリコスポロン、およびリポマイセスからなる群から選択される、請求項１０に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１２】
ａ．）（ｉ）クラスタルダブル（Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ）を用いたアライメント法に基づいて配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると、少なくとも７５．３％の同一性を有する二機能性Δ１７／Δ１５デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子、および
（ｉｉ）アラキドン酸源
を含んでなる宿主細胞を提供する工程と、
ｂ．）二機能性Δ１７／Δ１５デサチュラーゼポリペプチドをコードする核酸分子が発現して、アラキドン酸がエイコサペンタエン酸に変換される条件下で、工程（ａ）の宿主細胞を成長させる工程と、
ｃ．）場合により工程（ｂ）のエイコサペンタエン酸を回収する工程と
を含んでなる、エイコサペンタエン酸を製造する方法。
【請求項１３】
ａ．）（ｉ）クラスタルダブル（Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ）を用いたアライメント法に基づいて配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると、少なくとも７５．３％の同一性を有する二機能性Δ１７／Δ１５デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子、および
（ｉｉ）ジホモ−γ−リノレン酸源
を含んでなる宿主細胞を提供する工程と、
ｂ．）二機能性Δ１７／Δ１５デサチュラーゼポリペプチドをコードする核酸分子が発現して、ジホモ−γ−リノレン酸がエイコサテトラエン酸に変換される条件下で、工程（ａ）の宿主細胞を成長させる工程と、
ｃ．）場合により工程（ｃ）のエイコサテトラエン酸を回収する工程と
を含んでなる、エイコサテトラエン酸を製造する方法。
【請求項１４】
ａ）ｉ）クラスタルダブル（Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ）を用いたアライメント法に基づいて配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると、少なくとも７５．３％の同一性を有する二機能性Δ１７／Δ１５デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子、および
ｉｉ）リノール酸およびエイコサジエン酸からなる群から選択された脂肪酸源
を含んでなる宿主細胞を提供する工程と、
ｂ）二機能性Δ１７／Δ１５デサチュラーゼポリペプチドをコードする核酸分子が発現して、リノール酸がα−リノレン酸に変換され、エイコサジエン酸がエイコサトリエン酸に変換される条件下で、工程（ａ）の宿主細胞を成長させる工程と、
ｃ）場合により工程（ｂ）の脂肪酸を回収する工程と
を含んでなる、多価不飽和脂肪酸を製造する方法。
【請求項１５】
単離された核酸分子が配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する二機能性Δ１７／Δ１５デサチュラーゼポリペプチドをコードし、少なくとも１７５個のコドンがヤロウィア中での発現のためにコドン最適化されている、請求項１２、１３または１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
単離された核酸分子が、配列番号２および配列番号３からなる群から選択されたアミノ酸配列を有する二機能性Δ１７／Δ１５デサチュラーゼポリペプチドをコードする、請求項１２、１３または１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ａ．）単離された核酸分子が配列番号１および配列番号４からなる群から選択された核酸配列を有し、
ｂ．）宿主細胞がヤロウィア・リポリティカである、
請求項１２、１３または１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
宿主細胞が、藻類、細菌、酵母、卵菌綱、および真菌からなる群から選択される、請求項１２、１３または１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
宿主細胞が、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種、およびモルティエラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）種からなる群から選択された真菌である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
酵母が油性酵母である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
油性酵母が、ヤロウィア、カンジダ、ロドトルラ、ロドスポリジウム、クリプトコッカス、トリコスポロン、およびリポマイセスからなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ａ）ＦＴＸＧＨＤＸＧＨ（配列番号９６）、
ｂ）ＨＲＨＨＨＫＮＴＧ（配列番号９７）、および
ｃ）ＩＧＴＨＱＸＨＨＬＦＰ（配列番号９８）
からなる群から選択された少なくとも１つのアミノ酸配列モチーフを含んでなるΔ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなり、
Ｘがあらゆるアミノ酸となることができ、
Δ１７デサチュラーゼポリペプチドが配列番号４３および９５に示されるアミノ酸配列を有さない、単離された核酸断片。
【請求項２３】
配列番号９６〜９８からなる群から選択された少なくとも１つのアミノ酸モチーフを含んでなる、Δ１７デサチュラーゼポリペプチド。
【請求項２４】
配列番号９６〜９８からなる群から選択されたアミノ酸モチーフをコードするΔ１７デサチュラーゼポリペプチドを同定するのに有用な単離された核酸分子コード化。
【請求項２５】
ａ）ｉ）配列番号９６〜９８からなる群から選択されたアミノ酸配列をコードする単離された核酸断片、または
ｉｉ）（ｉ）に相補的な単離された核酸断片
でゲノムライブラリをプローブする工程と、
ｂ）工程（ａ）の核酸断片とハイブリダイズするＤＮＡクローンを同定する工程と、
ｃ）工程（ｂ）で同定されたクローンを含んでなるゲノム断片を配列決定する工程と
を含んでなり、配列決定されたゲノム断片がΔ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする、Δ１７デサチュラーゼポリペプチドを同定および単離する方法。
【請求項２６】
ａ）配列番号９６〜９８からなる群から選択されたアミノ酸モチーフをコードする単離された核酸配列の一部に対応する、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを合成する工程と、
ｂ）工程（ａ）のオリゴヌクレオチドプライマーを使用してクローニングベクター中に存在する挿入断片を増幅する工程と
を含んでなり、増幅された挿入断片がΔ１７デサチュラーゼ酵素をコードするアミノ酸配列の一部をコードする、Δ１７デサチュラーゼポリペプチドを同定および単離する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００６年１０月３０日に出願された米国仮特許出願第６０／８５５１７７号明細書の優先権の利益を主張する。
【０００２】
本発明は生物工学の分野にある。より具体的には、本発明はΔ１７脂肪酸デサチュラーゼ酵素をコードする核酸断片の同定、および長鎖多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の作成におけるこのデサチュラーゼの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＰＵＦＡの重要性には議論の余地がない。例えば特定のＰＵＦＡは健康な細胞の重要な生物学的構成要素であり、哺乳類では新規（ｄｅ  ｎｏｖｏ）合成できず、その代わりに食餌中で得なくてはならず、またはリノール酸（ＬＡ、１８：２  ω−６）またはα−リノレン酸（ＡＬＡ、１８：３  ω−３）のさらなる不飽和化および延長によって送達されなくてはならない「必須」脂肪酸として、リン脂質またはトリアシルグリセロールなどの形態であってもよい細胞の原形質膜の構成物として、（特に発達中の幼児の脳における）適切な発達、組織形成および修復のために必要なものとして、哺乳類における重要ないくつかの生物学的に活性なエイコサノイド前駆物質（例えばプロスタサイクリン、エイコサノイド、ロイコトリエン、プロスタグランジン）として認識される。さらに長鎖ω−３ＰＵＦＡの大量摂取は、心臓血管保護効果をもたらす（非特許文献１〜４）。ならびに、その他の多数の研究が、ω−３および／またはω−６ＰＵＦＡの投与によって得られる、多様な症状および疾患（例えば喘息、乾癬、湿疹、糖尿病、癌）に対する多岐にわたる健康上の利点を実証している。
【０００４】
植物、藻類、真菌および酵母をはじめとする多様な異なる宿主が、商業的ＰＵＦＡ生産の手段として調査されている。遺伝子操作は、例えば高レベルのγ−リノレン酸（ＧＬＡ、１８：３ω−６）、ジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ、２０：３ω−６）、アラキドン酸（ＡＲＡ、２０：４ω−６）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、２０：５ω−３）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ、２２：５ω−３）、およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、２２：６ω−３）を生成するために、いくつかの宿主（天然ではＬＡおよびＡＬＡ脂肪酸生成に限定されるものでさえ）の自然の能力を実質的に改善できることを実証している。
【０００５】
ω−３／ω−６ＰＵＦＡ生成が天然能力または組み換え技術の結果であろうとなかろうと、どちらの戦略もω−６ＰＵＦＡのそれらのω−３対応物への変換を必要とするかもしれない。具体的にはΔ１５デサチュラーゼがＬＡからＡＬＡへの変換の役割を担うのに対し、（いくつかのΔ１７デサチュラーゼはまた、基質としてＤＧＬＡ）を使用してエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ；２０：４ω−３）も生成できるが）Δ１７デサチュラーゼはＡＲＡからＥＰＡへの変換の役割を担う。これらの酵素はどちらもΔ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路（主に藻類、コケ、真菌、線形動物、およびヒトに見られ、ＧＬＡおよび／またはステアリドン酸（ＳＴＡ；１８：４ω−３）の生成によって特徴づけられる）、およびΔ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路（鞭毛虫種などのいくつかの生物中で機能し、エイコサジエン酸（ＥＤＡ；２０：２ω−６）および／またはエイコサトリエン酸（ＥＴｒＡ；２０：３ω−３）の生成によって特徴づけられる）に関与する（図１）。
【０００６】
ω−３脂肪酸の合成可能化においてΔ１７デサチュラーゼが果たす役割のために、様々な起源からこれらの酵素を同定および特性決定するかなりの努力がなされている。しかしほんのわずかなΔ１７デサチュラーゼのみが目下知られており、これらは２つの異なる分類学的属のみから単離されている。具体的には特許文献１はサプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ）からのΔ１７デサチュラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＹ３７３８２３も参照されたい）について述べている。特許文献２がフィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）「ω３デサチュラーゼ」（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＪ３０８７０も参照されたい）について述べている一方、特許文献３はフィトフトラ・ソジャ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅ）「ω３デサチュラーゼ」について述べており、このどちらもΔ１７デサチュラーゼとして機能するようである。また特許文献４（２００７年４月１８日出願）の番号を有する同一譲受人同時係属出願は、フィトフトラ・ソジャ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅ）およびフィトフトラ・ラモルム（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｒａｍｏｒｕｍ）からのΔ１７デサチュラーゼのための核酸およびアミノ酸配列を開示する。したがってω−３脂肪酸の生成で使用するために、多様な宿主生物中での異種性発現に適した、Δ１７デサチュラーゼをコードする追加的遺伝子の同定および単離に対する必要性がある。
【０００７】
出願人らは、卵菌（ｏｏｍｙｃｅｔｅ）ピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）からΔ１７デサチュラーゼをコードする遺伝子を単離することにより、既述の問題を解決した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００３／０１９０７３３号明細書
【特許文献２】国際公開第２００５／０８３０５３号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００６／１００２４１号パンフレット
【特許文献４】米国特許出願第１１／７８７７７２号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｄｙｅｒｂｅｒｇ，Ｊ．ら、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ．２８：９５８〜９６６（１９７５年）
【非特許文献２】Ｄｙｅｒｂｅｒｇ，Ｊ．ら、Ｌａｎｃｅｔ  ２（８０８１）：１１７〜１１９（１９７８年７月１５日）
【非特許文献３】Ｓｈｉｍｏｋａｗａ，Ｈ．、Ｗｏｒｌｄ  Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．Ｄｉｅｔ、８８：１００〜１０８（２００１年）
【非特許文献４】ｖｏｎ  Ｓｃｈａｃｋｙ，Ｃ．およびＤｙｅｒｂｅｒｇ，Ｊ．、Ｗｏｒｌｄ  Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．Ｄｉｅｔ、８８：９０〜９９（２００１年）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、Δ１７デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする新しい遺伝子コンストラクト、およびＰＵＦＡおよび特にω−３脂肪酸を生成するための植物、細菌、藻類、真菌および酵母におけるそれらの使用に関する。
【００１１】
したがって本発明は、
ａ．）配列番号２および配列番号３からなる群から選択される、Δ１７デサチュラーゼをコードする単離されたヌクレオチド分子、または
ｂ．）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、および２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳというハイブリダイゼーション条件下で（ａ）とハイブリダイズする単離されたヌクレオチド分子、または
（ａ）または（ｂ）と完全に相補的な単離されたヌクレオチド分子
を提供する。
【００１２】
別の実施態様では本発明は、配列番号１および４からなる群から選択されるΔ１７デサチュラーゼをコードする単離された核酸分子、または配列番号２に記載のΔ１７デサチュラーゼをコードする単離された核酸分子を提供し、ここで少なくとも１７５個のコドンは、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中での発現のためにコドン最適化される。さらに本発明は、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアルゴリズムに基づいて配列番号２に記載の配列を有するポリペプチドと比較すると少なくとも７５．３％の同一性を有する、少なくとも３５９個のアミノ酸のΔ１７デサチュラーゼをコードする第１のヌクレオチド配列、
または第１のヌクレオチド配列の相補体を含んでなる第２のヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子を提供する。
【００１３】
他の実施態様では本発明は、本発明の単離された核酸分子を含んでなるキメラ遺伝子、および同遺伝子を含んでなる形質転換された宿主を提供する。
【００１４】
別の実施態様では本発明は、
ａ．）（ｉ）Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づいて配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると、少なくとも７５．３％の同一性を有する二機能性Δ１７／Δ１５デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子、および
（ｉｉ）アラキドン酸源
を含んでなる宿主細胞を提供する工程と、
ｂ．）二機能性Δ１７／Δ１５デサチュラーゼポリペプチドをコードする核酸分子が発現して、アラキドン酸がエイコサペンタエン酸に変換される条件下で、工程（ａ）の宿主細胞を成長させる工程と、
ｃ．）場合により工程（ｂ）のエイコサペンタエン酸を回収する工程と
を含んでなる、エイコサペンタエン酸を生成する方法を提供する。
【００１５】
同様に本発明は、
ａ．）（ｉ）Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づいて配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると、少なくとも７５．３％の同一性を有する二機能性Δ１７／Δ１５デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子、および
（ｉｉ）ジホモ−γ−リノレン酸源
を含んでなる宿主細胞を提供する工程と、
ｂ．）二機能性Δ１７／Δ１５デサチュラーゼポリペプチドをコードする核酸分子が発現して、ジホモ−γ−リノレン酸がエイコサテトラエン酸に変換される条件下で、工程（ａ）の宿主細胞を成長させる工程と、
ｃ．）場合により工程（ｃ）のエイコサテトラエン酸を回収する工程と
を含んでなる、エイコサテトラエン酸を生成する方法を提供する。
【００１６】
代案として本発明は、
ａ）ｉ）Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づいて配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると、少なくとも７５．３％の同一性を有する二機能性Δ１７／Δ１５デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子、および
ｉｉ）リノール酸およびエイコサジエン酸からなる群から選択される脂肪酸源
を含んでなる宿主細胞を提供する工程と、
ｂ）二機能性Δ１７／Δ１５デサチュラーゼポリペプチドをコードする核酸分子が発現して、リノール酸がα−リノレン酸に変換され、エイコサジエン酸がエイコサトリエン酸に変換される条件下で、工程（ａ）の宿主細胞を成長させる工程と、
ｃ）場合により工程（ｂ）の脂肪酸を回収する工程と
を含んでなる、多価不飽和脂肪酸を生成する方法を提供する。
【００１７】
別の実施態様では本発明は、
ａ）ＦＴＸＧＨＤＸＧＨ（配列番号９６）、
ｂ）ＨＲＨＨＨＫＮＴＧ（配列番号９７）、および
ｃ）ＩＧＴＨＱＸＨＨＬＦＰ（配列番号９８）
からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列モチーフを含んでなるΔ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなり、
Ｘがあらゆるアミノ酸であることができ、
Δ１７デサチュラーゼポリペプチドが配列番号４３および９５に記載のアミノ酸配列を有さない、単離された核酸断片を提供する。
【００１８】
代案として本発明は、配列番号９６〜９８からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸モチーフを含んでなるΔ１７デサチュラーゼポリペプチドを提供する。
【００１９】
他の実施態様では本発明は、
ａ）ｉ）配列番号９６〜９８からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする単離された核酸断片、または
ｉｉ）（ｉ）に相補的な単離された核酸断片
でゲノムライブラリをプローブする工程と、
ｂ）工程（ａ）の核酸断片とハイブリダイズするＤＮＡクローンを同定する工程と、
ｃ）工程（ｂ）で同定されたクローンを含んでなるゲノム断片を配列決定する工程と
を含んでなり、配列決定されたゲノム断片がΔ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする、
または代案としては、
ａ）配列番号９６〜９８からなる群から選択されるアミノ酸モチーフをコードする単離された核酸配列の一部に対応する、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを合成する工程と、
ｂ）工程（ａ）のオリゴヌクレオチドプライマーを使用してクローニングベクター中に存在する挿入断片を増幅する工程と
を含んでなり、増幅された挿入断片がΔ１７デサチュラーゼをコードするアミノ酸配列の一部をコードする、
Δ１７デサチュラーゼポリペプチドを同定および単離する方法を提供する。
【００２０】
生物学的寄託
以下の生体物質が１０８０１ユニバーシティ・ブールヴァード、マナッサス、ＶＡ２０１１０−２２０９の米国微生物系統保存機関（ＡＴＣＣ）に寄託され、以下の命名、登録番号、および寄託日を有する。
【００２１】
【表１】
2010508019.tif 000003
【００２２】
上に列挙した生体物質は、「特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約」の条項に従って寄託された。列挙した寄託物は、表示された国際受託機関に少なくとも３０年間保存され、それを開示する特許の付与時に一般に公開される。寄託株の利用可能性は、政府の行動によって付与された特許権を失墜させて主題発明を実施する認可とはみなされない。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路を図示する。
【図２】Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ（登録商標）’ｓ  ＡｌｉｇｎＸ  ｐｒｏｇｒａｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）のデフォルトパラメーターを使用して作り出したフィトフトラ・ソジャ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅ）Δ１７デサチュラーゼ（配列番号４５）およびフィトフトラ・ラモルム（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｒａｍｏｒｕｍ）Δ１７デサチュラーゼ（配列番号４７）のアミノ酸配列のペアワイズ配列比較を示す。
【図３】ＡはｐＫＵＮＦｍｋＦ２のプラスミドマップを提供する。ＢはｐＤＭＷ２８７Ｆのプラスミドマップを提供する。ＣはｐＤＭＷ２１４のプラスミドマップを提供する。ＤはｐＦｍＤ８Ｓのプラスミドマップを提供する。
【図４】Ａは総脂質画分中に１１％のＡＲＡを生成するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２０４７株の開発を図示する。ＢはｐＫＵＮＦ１２Ｔ６Ｅのプラスミドマップを提供する。ＣはｐＤＭＷ２７１のプラスミドマップを提供する。
【図５Ａ】ピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）Δ１７デサチュラーゼ遺伝子（「ＰａＤ１７」と称する、配列番号１）、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン−最適化された合成遺伝子（「ＰａＤ１７Ｓ」と称する、配列番号４）のＤＮＡ配列の比較を示す。
【図５Ｂ】ピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ））Δ１７デサチュラーゼ遺伝子（「ＰａＤ１７」と称する、配列番号１）、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された合成遺伝子（「ＰａＤ１７Ｓ」と称する、配列番号４）のＤＮＡ配列の比較を示す。
【図６】Ａは総脂質画分中に１２％のＡＲＡを生成するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４０７０株の開発を図示する。ＢはｐＺＫＬｅｕＮ−２９Ｅ３のプラスミドマップを提供する。ＣはｐＹ１１６のプラスミドマップを提供する。
【図７】ＡはｐＫＯ２ＵＦ８２８９のプラスミドマップを提供する。ＢはｐＺＫＳＬ−５５５Ｒのプラスミドマップを提供する。
【図８】ＡはｐＦＢＡＩＮ−ＭＯＤ−１のプラスミドマップを提供する。ＢはｐＹ６．ＧＰＤ．Ｌｅｕ２のプラスミドマップを提供する。
【図９】フィトフトラ・ソジャ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅ）Δ１７デサチュラーゼ遺伝子「ＰｓＤ１７」と称する、配列番号４４）およびＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された合成遺伝子（「ＰｓＤ１７Ｓ」と称する、配列番号８１）のＤＮＡ配列の比較を示す。
【図１０】フィトフトラ・ラモルム（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｒａｍｏｒｕｍ）Δ１７デサチュラーゼ遺伝子（「ＰｒＤ１７」と称される；配列番号４６）と、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された合成遺伝子（「ＰｒＤ１７Ｓ」と称される；配列番号８４）とのＤＮＡアラインメントを示す。
【図１１】ＡはｐＹ１３０のプラスミドマップを提供する。ＢはｐＹ１３８のプラスミドマップを提供する。ＣはｐＹ１３９のプラスミドマップを提供する。ＤはｐＹ１４０のプラスミドマップを提供する。
【図１２】ＡはｐＹ１３７のプラスミドマップを提供する。ＢはｐＹ１１７のプラスミドマップを提供する。
【図１３】次のω−３デサチュラーゼのω−６脂肪酸基質特異性を示すグラフである。フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１５デサチュラーゼ（ＦｍＤ１５、配列番号８６および８７）、フィトフトラ・ラモルム（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｒａｍｏｒｕｍ）に由来してヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された合成Δ１７デサチュラーゼ（ＰｒＤ１７Ｓ、配列番号８４および４７）フィトフトラ・ソジャ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅ）に由来してヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された合成Δ１７デサチュラーゼ（ＰｓＤ１７Ｓ、配列番号８１および８２）、およびピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）に由来してヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された合成Δ１７デサチュラーゼ（ＰａＤ１７Ｓ、配列番号４および２）。
【図１４】次のω−３デサチュラーゼの（デフォルトパラメーターでの）Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖ配列比較を示す。フィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）Δ１７デサチュラーゼ（ＰｉＤ１７、配列番号４３）、フィトフトラ・ラモルム（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｒａｍｏｒｕｍ）Δ１７デサチュラーゼ（ＰｒＤ１７、配列番号４７）、フィトフトラ・ソジャ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅ）に由来してヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された合成Δ１７デサチュラーゼ（ＰｓＤ１７Ｓ、配列番号８２）、サプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ）Δ１７デサチュラーゼ（ＳｄＤ１７、配列番号９５）、および本発明のピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）Δ１７デサチュラーゼ（ＰａＤ１７Ｓ、配列番号２）。枠内に示される配列領域は、それぞれΔ１７モチーフ＃１、＃２、および＃３に対応する。
【００２４】
本発明は、本明細書の一部を形成する以下の詳細な説明および添付の配列説明からより完全に理解できる。
【００２５】
次の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．§８２１〜１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列開示を含む特許出願の要件−配列規則」）を満たし、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８年）、およびＥＰＯおよびＰＣＴの配列表要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、および実施細則第２０８号および附属書Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データのために使用される記号および型式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２で述べられる規則に従う。
【００２６】
配列番号１〜８、４２〜５３、５６〜９５および１０２は、表１で同定される遺伝子、タンパク質またはプラスミドをコードするＯＲＦである。
【００２７】
【表２】
2010508019.tif 000004
【００２８】
【表３】
2010508019.tif 000005
【００２９】
【表４】
2010508019.tif 000006
【００３０】
【表５】
2010508019.tif 000007
【００３１】
配列番号９〜１１は、ピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）ｃＤＮＡ合成のために使用されるＳＭＡＲＴ（商標）ＩＶオリゴヌクレオチドプライマー、ＣＤＳＩＩＩ／３’ＰＣＲプライマー、および５’−ＰＣＲプライマーにそれぞれ対応する。
【００３２】
配列番号１２は、配列番号１３に記載のペプチドをコードする、縮重オリゴヌクレオチプライマーＰＤ１７−Ｆ１に対応する。
【００３３】
配列番号１４および１５は、どちらも配列番号１６に記載のペプチドをコードする、縮重オリゴヌクレオチプライマーＰＤ１７−Ｆ２およびＰＤ１７−Ｆ３にそれぞれ対応する。
【００３４】
配列番号１７および１８は、どちらも配列番号１９に記載のペプチドをコードする、縮重オリゴヌクレオチプライマーＰＤ１７−Ｆ４およびＰＤ１７−Ｆ５にそれぞれ対応する。
【００３５】
配列番号２０および２１は、どちらも配列番号２２に記載のペプチドをコードする、縮重オリゴヌクレオチプライマーＰＤ１７−Ｆ６およびＰＤ１７−Ｆ７にそれぞれ対応する。
【００３６】
配列番号２３および２４は、どちらも配列番号２５に記載のペプチドをコードする、縮重オリゴヌクレオチプライマーＰＤ１７−Ｒ１およびＰＤ１７−Ｒ２にそれぞれ対応する。
【００３７】
配列番号２６および２７は、どちらも配列番号２８に記載のペプチドをコードする、縮重オリゴヌクレオチプライマーＰＤ１７−Ｒ３およびＰＤ１７−Ｒ４にそれぞれ対応する。
【００３８】
配列番号２９および３０は、どちらも配列番号３１に記載のペプチドをコードする、縮重オリゴヌクレオチプライマーＰＤ１７−Ｒ５およびＰＤ１７−Ｒ６にそれぞれ対応する。
【００３９】
配列番号３２は、配列番号３３に記載のペプチドをコードする縮重オリゴヌクレオチプライマーＰＤ１７−Ｒ７に対応する。
【００４０】
配列番号３４および３５は、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ（商標）アダプターに対応する。
【００４１】
配列番号３６、３７、３８および３９は、ピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）Δ１７デサチュラーゼをコードするゲノムＤＮＡの５’末端のＰＣＲ増幅のために使用される、プライマーＰＵＤ１７−５−１、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ（商標）プライマーＡＰ１、ＰＵＤ１７−５−３、およびＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ（商標）プライマーＡＰ２にそれぞれ対応する。
【００４２】
配列番号４０および４１は、ピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）Δ１７デサチュラーゼをコードするｃＤＮＡの３’末端のＰＣＲ増幅のために使用される、プライマーＰＵＤ１７−３−１およびＰＵＤ１７−３−２にそれぞれ対応する。
【００４３】
配列番号５４および５５は、ピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）Δ１７デサチュラーゼをコードする完全長ｃＤＮＡの増幅のために使用される、プライマーＰＵＤ１７−ＦおよびＰＵＤ１７−Ｒにそれぞれ対応する。
【００４４】
配列番号９６〜９８は、Δ１７デサチュラーゼモチーフ＃１、Δ１７デサチュラーゼモチーフ＃２、およびΔ１７デサチュラーゼモチーフ＃３にそれぞれ対応する。
【００４５】
配列番号９９〜１０１は、膜二鉄タンパク質のスーパーファミリーに属する膜結合脂肪酸デサチュラーゼにおいて特徴とされるＨｉｓに富むモチーフに対応する。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本明細書に引用する全ての特許、特許出願、および公報は、その全体を参照によって援用する。これは具体的には、次の出願人らの譲受人の同時係属出願を含む。米国特許第７，１２５，６７２号明細書、米国特許第７，１８９，５５９号明細書、米国特許第７，１９２，７６２号明細書、米国特許第７，１９８，９３７号明細書、米国特許第７，２０２，３５６号明細書、米国特許出願第１０／８４０５７９号明細書および米国特許出願第１０／８４０３２５号明細書（２００４年５月６日出願）、米国特許出願第１０／８６９６３０号明細書（２００４年６月１６日出願）、米国特許出願第１０／８８２７６０号明細書（２００４年７月１日出願）、米国特許出願第１０／９８５２５４号明細書および米国特許出願第１０／９８５６９１号明細書（２００４年１１月１０日出願）、米国特許出願第１１／０２４５４４号明細書（２００４年１２月２９日出願）、米国特許出願第１１／１６６９９３号明細書（２００５年６月２４日出願）、米国特許出願第１１／１８３６６４号明細書（２００５年７月１８日出願）、米国特許出願第１１／１８５３０１号明細書（２００５年７月２０日出願）、米国特許出願第１１／１９０７５０号明細書（２００５年７月２７日出願）、米国特許出願第１１／１９８９７５号明細書（２００５年８月８日出願）、米国特許出願第１１／２２５３５４号明細書（２００５年９月１３日出願）、米国特許出願第１１／２５３８８２号明細書（２００５年１０月１９日出願）、米国特許出願第１１／２６４７８４号明細書および米国特許出願第１１／２６４７３７号明細書（２００５年１１月１日出願）、米国特許出願第１１／２６５７６１号明細書（２００５年１１月２日出願）、米国仮特許出願第６０／８５３５６３号明細書（２００６年１０月２３日出願）、米国仮特許出願第６０／８５５１７７号明細書（２００６年１０月３０日出願）、米国特許出願第１１／６０１５６３号明細書および米国特許出願第１１／６０１５６４号明細書（２００６年１１月１６日出願）、米国特許出願第１１／６３５２５８号明細書（２００６年１２月７日出願）、米国特許出願第１１／６１３４２０号明細書（２００６年１２月２０日出願）、米国仮特許出願第６０／９０９７９０号明細書（２００７年４月３日出願）、米国仮特許出願第６０／９１０８３１号明細書（２００７年４月１０日出願）、米国仮特許出願第６０／９１１９２５号明細書（２００７年４月１６日出願）、米国特許出願第１１／７８７７７２号明細書（２００７年４月１８日出願）、米国特許出願第１１／７３７７７２号明細書（２００７年４月２０日出願）、米国特許出願第１１／７４０２９８号明細書（２００７年４月２６日出願）、米国仮特許出願第６０／９１５７３３号明細書（２００７年５月３日出願）、および米国特許出願第１１／７４８６２９号明細書および米国特許出願第１１／７４８６３７号明細書（２００７年５月１５日出願）。
【００４７】
本発明は、健康に良いＰＵＦＡを生成するために生化学的経路を操作するために使用してもよい、新しい卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）Δ１７デサチュラーゼ、および同酵素をコードする遺伝子を提供する。
【００４８】
本明細書で開示される方法によって作られるＰＵＦＡ、またはその誘導体は、食事代用物、または栄養補給剤、特に乳児用調製粉乳として、静脈内栄養補給を受ける患者のために、または栄養失調を予防しまたは治療するために使用できる。代案としては、通常の使用において受容者が所望量の食事補給を受け入れるように調合された、料理用油、脂肪またはマーガリン中に、純化されたＰＵＦＡ（またはその誘導体）を組み込んでもよい。ＰＵＦＡはまた、乳児用調製粉乳、栄養補給剤またはその他の食品中に組み込んでもよく、抗炎症薬またはコレステロール低下剤としての用途があるかもしれない。場合により組成物は、製薬用途（ヒトまたは獣医）のために使用してもよい。
【００４９】
組み換え手段によって生成されるＰＵＦＡをヒトまたは動物に補給することは、添加ＰＵＦＡ、ならびにそれらの代謝子孫のレベル増大をもたらすことができる。例えばＥＰＡによる処置は、ＥＰＡのみでなく、エイコサノイドなどのＥＰＡの下流生成物（すなわちプロスタグランジン、ロイコトリエン、トロンボキサン）のレベル増大もまたもたらす。複雑な調節機序は、このような機序を防止、調節または克服して、個体において特定ＰＵＦＡの所望のレベルを達成するために、様々なＰＵＦＡを組み合わせ、または異なるＰＵＦＡ抱合体を添加することを望ましくする。
【００５０】
定義
本開示では、いくつかの用語および略語を使用する。以下の定義が提供される。
【００５１】
「読み取り枠」はＯＲＦと略記される。
【００５２】
「ポリメラーゼ連鎖反応」はＰＣＲと略記される。
【００５３】
「米国微生物系統保存機関」はＡＴＣＣと略記される。
【００５４】
「多価不飽和脂肪酸」はＰＵＦＡと略記される。
【００５５】
「トリアシルグリセロール」はＴＡＧと略記される。
【００５６】
ここでの用法では「発明」または「本発明」と言う用語は、本特許請求の範囲および本明細書で述べられる本発明の全ての態様および実施態様を指すことが意図され、いかなる特定の実施態様または態様にも限定されない。
【００５７】
「脂肪酸」という用語は、（より長い、およびより短い鎖長の酸の双方も知られているが）約Ｃ１２〜Ｃ２２の様々な鎖長の長鎖脂肪族酸（アルカン酸）を指す。優勢な鎖長は
Ｃ１６〜Ｃ２２の間である。脂肪酸の構造は単純な表記体系「Ｘ：Ｙ」で表され、式中、Ｘは特定の脂肪酸中の炭素（Ｃ）原子総数であり、Ｙは二重結合数である。「飽和脂肪酸」対「不飽和脂肪酸」、「一価不飽和脂肪酸」対「多価不飽和脂肪酸」（または「ＰＵＦＡ」）、および「オメガ−６脂肪酸」（ω−６またはｎ−６）」対「オメガ−３脂肪酸」（ω−３またはｎ−３）の違いについて、さらに詳しくは国際公開第２００４／１０１７５７号パンフレットで規定される。
【００５８】
本開示においてＰＵＦＡを既述するのに使用される命名法を下の表２に示す。「略記法」と題された欄では、オメガ−参照システムが使用されて炭素数、二重結合数、およびオメガ炭素（この目的では番号１）から数えて、オメガ炭素に最も近い二重結合の位置を示唆する。表の残りは、ω−３およびω−６脂肪酸およびそれらの前駆物質の一般名、本明細書全体で使用される略語、および各化合物の化学名を要約する。
【００５９】
【表６】
2010508019.tif 000008
【００６０】
「トリアシルグリセロール」、「油」、および「ＴＡＧ」という用語は、グリセロール分子とエステル化する３個の脂肪酸アシル残基から構成される中性脂質を指す（そしてこのような用語は、本開示の全体を通して区別なく使用される）。このような油は、長鎖ＰＵＦＡ、ならびにより短い飽和および不飽和脂肪酸、および鎖長のより長い飽和脂肪酸を含有できる。したがって「油生合成」は、一般に細胞中でのＴＡＧ合成を指す。「微生物油」または「単細胞油」とは、微生物がそれらの生涯において天然に産生する油である。
【００６１】
「総脂質および油画分中のパーセント（％）ＰＵＦＡ」とは、これらの画分中の全脂肪酸に対するＰＵＦＡのパーセントを指す。「全脂質画分」または「脂質画分」という用語は、どちらも油性生物中の全脂質（すなわち中性および極性）の合計を指すので、ホスファチジルコリン（ＰＣ）画分、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）画分、およびトリアシルグリセロール（ＴＡＧまたは油）画分内に位置する脂質を含む。しかし「脂質」および「油」という用語は、本明細書全体で同義的に使用される。
【００６２】
代謝経路または生合成経路は、生化学的意味において、細胞内で起きて酵素によって触媒され、細胞によって使用されまたは保存される代謝産物の形成、または別の代謝経路の開始（流束発生工程と称される）のどちらかを達成する一連の化学反応と見なすことができる。これらの経路の多くは複雑であり、開始物質を所望の正確な化学構造を有する生成物に成形する段階を追った改変を伴う。
【００６３】
「ＰＵＦＡ生合成経路」という用語は、オレイン酸をＬＡ、ＥＤＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＡＬＡ、ＳＴＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡに転換する代謝過程を指す。この過程は、文献で詳しく述べられる（例えば国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレットを参照されたい）。簡単に述べると、この過程は、小胞体膜中に存在する一連の特別な不飽和化酵素および延長酵素（すなわち「ＰＵＦＡ生合成経路酵素」）による、炭素原子の添加を通じた炭素鎖延長、および二重結合付加を通じた分子不飽和化を伴う。より具体的には、「ＰＵＦＡ生合成経路酵素」は、Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ９エロンガーゼ、Ｃ１４／１６エロンガーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼおよび／またはＣ２０／２２エロンガーゼをはじめとする、ＰＵＦＡ生合成に関与するいずれかの酵素（および前記酵素をコードする遺伝子）を指す。
【００６４】
「ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路」という用語は、適切な条件下で発現すると、ω−３およびω−６脂肪酸の片方または双方の生成を触媒する酵素をコードする一組の遺伝子を指す。典型的にω−３／ω−６脂肪酸生合成経路に関与する遺伝子は、ＰＵＦＡ生合成経路酵素をコードする。代表的な経路を図１に示し、様々な中間体を経由するミリスチン酸のＤＨＡへの変換を提供して、ω−３およびω−６脂肪酸の双方が共通の原料からどのように生成できるかを実証する。経路は自然に２つの部分に別れ、１つの部分はω−３脂肪酸、別の部分はω−６脂肪酸のみを発生させる。ω−３脂肪酸のみを発生させる部分をここでω−３脂肪酸生合成経路と称する一方、ω−６脂肪酸のみを発生させる部分はここでω−６脂肪酸生合成経路と称する。
【００６５】
「機能性」という用語は、ここでω−３／ω−６脂肪酸生合成経路に関する文脈で、経路中の遺伝子のいくつか（または全て）が、活性酵素を発現し、生体内触媒作用または基質変換をもたらすことを意味する。いくつかの脂肪酸生成物は、この経路の遺伝子のサブセットの発現のみを必要とするので、「ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路」または「機能性ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路」は、上の段落の全ての遺伝子が必要とされることを暗示しないものとする。
【００６６】
「デサチュラーゼ」と言う用語は、不飽和化できる、すなわち１個もしくはそれ以上の脂肪酸に二重結合を導入して、対象とする脂肪酸または前駆物質を生じさせるポリペプチドを指す。特定の脂肪酸を指すために、本明細書全体を通じたω参照システムの使用にもかかわらず、デルタシステムを使用して基質のカルボキシル末端から数えることで、デサチュラーゼの活性を示す方が都合よい。ここで興味深いのは、１．）ＥＤＡからＤＧＬＡへのおよび／またはＥＴｒＡからＥＴＡへの変換を触媒するΔ８デサチュラーゼ、２．）ＤＧＬＡからＡＲＡへのおよび／またはＥＴＡからＥＰＡへの変換を触媒するΔ５デサチュラーゼ、３．）ＬＡからＧＬＡへのおよび／またはＡＬＡからＳＴＡへの変換を触媒するΔ６デサチュラーゼ、４．）ＤＰＡからＤＨＡへの変換を触媒するΔ４デサチュラーゼ、５．）オレイン酸からＬＡへの変換を触媒するΔ１２デサチュラーゼ、６．）ＬＡからＡＬＡへのおよび／またはＧＬＡからＳＴＡへの変換を触媒するΔ１５デサチュラーゼ、および７．）パルミチン酸からパルミトレイン酸（１６：１）および／またはステアリン酸からオレイン酸（１８：１）への変換を触媒するΔ９デサチュラーゼである。
【００６７】
ここで特に興味深いのは、分子のカルボキシル−末端から数えて１７番目と１８番目の炭素原子間で脂肪酸を不飽和化する、Δ１７デサチュラーゼであり、それは例えばＡＲＡからＥＰＡ（そして場合によりＤＧＬＡからＥＴＡ）への変換を触媒する。当該技術分野で、Δ１７デサチュラーゼ（そしてまたΔ１５デサチュラーゼ）は、また時としてω−６脂肪酸をそれらのω−３対応物に変換する能力（例えばそれぞれＬＡからＡＬＡへのまたはＤＧＬＡからＥＴＡへのおよびＡＲＡからＥＰＡへの変換）に基づいて「オメガ−３デサチュラーゼ」、「ｗ−３デサチュラーゼ」、および／または「ω−３デサチュラーゼ」と称される。
【００６８】
いくつかのデサチュラーゼは、２つ以上の基質に対する活性を有する。この能力に基づいて、これらの酵素は、それらのデサチュラーゼ活性について「単機能性」または「二機能性」のどちらかとしてさらに分類できる。いくつかの実施態様では、適切な宿主を脂肪酸デサチュラーゼの遺伝子で形質転換して、宿主の脂肪酸プロフィールに対するその効果を判定することで、脂肪酸デサチュラーゼの特異性を経験的に判定することが最も望ましい。
【００６９】
より具体的には、Δ１７デサチュラーゼは、ここで単機能性または二機能性Δ１７デサチュラーゼ活性を有する脂肪酸デサチュラーゼと定義され、Δ１７デサチュラーゼ活性はＡＲＡからＥＰＡへのおよび／またはＤＧＬＡからＥＴＡへの変換である。「単機能性Δ１７デサチュラーゼ」、「単機能性Δ１７デサチュラーゼ活性」または「排他的Δ１７デサチュラーゼ活性」という用語は、ＡＲＡからＥＰＡにおよび／またはＤＧＬＡからＥＴＡに変換できるが、ＬＡからＡＬＡには変換できないΔ１７デサチュラーゼを指す。対照的に「二機能性Δ１７デサチュラーゼ」、「二機能性Δ１７デサチュラーゼ活性」または「一次Δ１７デサチュラーゼ活性」は、ＡＲＡからＥＰＡおよび／またはＤＧＬＡからＥＴＡを優先的に変換するが、さらにＬＡからＡＬＡに変換する限られた能力を有するΔ１７デサチュラーゼを指す（したがって主としてΔ１７デサチュラーゼ活性、および限られたΔ１５デサチュラーゼ活性を示す）。
【００７０】
Δ１７デサチュラーゼは、Δ１７およびΔ１５不飽和化以外の、この分類には関連性がない特異性を有することができることに留意すべきである。
【００７１】
ここでの目的では、「ＰａＤ１７」という用語は、配列番号１によってコードされるピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）から単離されたΔ１７デサチュラーゼ酵素（配列番号２）を指す。同様に、「ＰａＤ１７＊」という用語は、配列番号２に関して２個までの（およびそれを含む）保存的アミノ酸変異（すなわち１５５ＳからＰへおよび３５１ＡからＴへ）を含んでなるΔ１７デサチュラーゼ酵素（配列番号３）を指す。対照的に「ＰａＤ１７Ｓ」という用語は、ピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）に由来してヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された合成Δ１７デサチュラーゼを指す（すなわち配列番号４および２）。ここで述べられている分析に基づいて、ＰａＤ１７およびＰａＤ１７Ｓは二機能性Δ１７デサチュラーゼにさらに分類される。
【００７２】
ここでの目的で、「ＰｓＤ１７」という用語は、配列番号４４によってコードされる、フィトフトラ・ソジャ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅ）から単離されたΔ１７デサチュラーゼ（配列番号４５）を指す。対照的に「ＰｓＤ１７Ｓ」という用語は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された、フィトフトラ・ソジャ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅ）由来の合成Δ１７デサチュラーゼを指す（すなわち配列番号８１および８２）。ここで述べられる分析に基づいて、ＰｓＤ１７およびＰｓＤ１７Ｓはさらに二機能性Δ１７デサチュラーゼに分類される。
【００７３】
同様に「ＰｒＤ１７」という用語は、配列番号４６によってコードされるフィトフトラ・ラモルム（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｒａｍｏｒｕｍ）から単離されたΔ１７デサチュラーゼ酵素（配列番号４７）を指す。対照的に「ＰｒＤ１７Ｓ」という用語は、フィトフトラ・ラモルム（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｒａｍｏｒｕｍ）に由来してヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された合成Δ１７デサチュラーゼを指す（すなわち配列番号８４および４７）。米国特許出願第１１／７８７７７２号明細書で述べられている以前の分析は、ＰｒＤ１７およびＰｒＤ１７Ｓを単機能性Δ１７デサチュラーゼとして分類したが、ここで述べられている分析に基づいて、ＰｒＤ１７およびＰｒＤ１７Ｓは今や二機能性Δ１７デサチュラーゼと同定された。
【００７４】
それに関連して「ＰｉＤ１７」という用語は、配列番号４２によってコードされる、フィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）から単離されたΔ１７デサチュラーゼ（配列番号４３）を指す。
【００７５】
「変換効率」および「％基質変換」という用語は、それによって特定の酵素（例えばデサチュラーゼ）が基質を生成物に変換できる効率を指す。変換効率は以下の式に従って評価される。（［生成物］／［基質＋生成物］）×１００。式中、「生成物」には、直接生成物およびそれに由来する経路中の全生成物が含まれる。
【００７６】
「エロンガーゼ」という用語は、脂肪酸炭素鎖を延長して、エロンガーゼが作用する脂肪酸基質よりも炭素２個分長い酸を生成できるポリペプチドを指す。この延長過程は、国際公開第２００４／１０１７５７号パンフレットで述べられているように、脂肪酸シンターゼと関連している多段階機序で起きる。エロンガーゼ系によって触媒される反応の例は、ＧＬＡからＤＧＬＡ、ＳＴＡからＥＴＡ、およびＥＰＡからＤＰＡへの変換である。一般にエロンガーゼの基質選択性はいくぶん広いが、鎖長および不飽和の程度とタイプの双方によって区別される。例えばＣ１４／１６エロンガーゼはＣ１４基質（例えばミリスチン酸）を利用し、Ｃ１６／１８エロンガーゼはＣ１６基質（例えばパルミチン酸）を利用し、Ｃ１８／２０エロンガーゼ（同義的に使用できる用語としてΔ６エロンガーゼとしてもまた知られている）はＣ１８基質（例えばＧＬＡ、ＳＴＡ）を利用し、Ｃ２０／２２エロンガーゼはＣ２０基質（例えばＥＰＡ）を利用する。同様にしてΔ９エロンガーゼはまた、それぞれＬＡおよびＡＬＡからＥＤＡおよびＥＴｒＡへの変換も触媒できる。いくつかのエロンガーゼは幅広い特異性を有し、したがって単一酵素がいくつかのエロンガーゼ反応を触媒できてもよいことに留意することが重要である（例えばＣ１６／１８エロンガーゼおよびａＣ１８／２０エロンガーゼの双方として作用する）。
【００７７】
「卵菌綱（ｏｏｍｙｃｅｔｅｓ）」という用語は、水生菌類およびべと病として一般に知られている一群の従属栄養生物を指す。それらは繊維状原生生物であり、周囲の水や土壌からそれらの食物を吸収しなくてはならず、または食べるために別の生物の身体に侵入するかもしれない。したがって卵菌綱は、腐敗物の分解と再循環に重要な役割を果たす。卵菌綱は収束進化を通じて真菌との類似性を有するが、それらは（以前考えられていたように）真菌でない。そうではなく卵菌綱はストラメノパイル（Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ）界の一部であり、その結果、植物、真菌、および動物とは異なる。珪藻および黄藻類および褐藻類（例えば昆布）もまた、ストラメノパイル（Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ）界に含まれる。
【００７８】
ピシウム（Ｐｙｔｈｉｕｍ）は卵菌綱の属であり、約８５種を含んでなる。ピシウム（Ｐｙｔｈｉｕｍ）種は、植物および魚において病害を引き起こす一般的な病原体である。この属の種は最も破壊的な植物病原体であり、種子、貯蔵器官、根、およびその他の植物組織を破壊することで農作物に重篤な経済的損失を与える。ピシウム（Ｐｙｔｈｉｕｍ）属の構成員は、「水生菌類」といわれてきた。
【００７９】
「油性」と言う用語は、それらのエネルギー源を脂質の形態で保存する傾向がある生物を指す（Ｗｅｅｔｅ、「Ｆｕｎｇａｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、第２版、Ｐｌｅｎｕｍ、１９８０年）。「油性酵母菌」と言う用語は、油を生成できる酵母菌として分類される微生物を指す。一般に油性微生物の細胞油またはＴＡＧ含量はＳ字形曲線に従い、対数増殖後期または定常増殖初期において脂質濃度が最大に達するまで増大し、次に定常増殖後期および死滅期において徐々に減少する（ＹｏｎｇｍａｎｉｔｃｈａｉおよびＷａｒｄ、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５７：４１９〜２５（１９９１年））。油性微生物が約２５％を超えるその乾燥細胞重量を油として蓄積するのは珍しくない。油性酵母菌の例としては、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）属が挙げられるが、決してこれに限定されるものではない。
【００８０】
「アミノ酸」という用語は、タンパク質またはポリペプチドの基本的化学構造単位を指す。アミノ酸は、参照によって本明細書に援用するＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１３：３０２１〜３０３０（１９８５年）およびＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ、２１９（２）：３４５〜３７３（１９８４年）で述べられているＩＵＰＡＣ−ＩＹＵＢ基準に準拠して、アミノ酸のための１文字コードまたは３文字コードのどちらかによって同定される。
【００８１】
「保存的アミノ酸置換」という用語は、タンパク質の化学的または機能的性質を変化させることなしに、特定のタンパク質中のアミノ酸残基を別のアミノ酸で置換することを指す。例えば特定の部位において化学的に等価なアミノ酸の生成をもたらす（しかしをコードされた折り畳みタンパク質の構造および機能特性に影響しない）遺伝子中の変更が一般的であることは、当該技術分野でよく知られている。本発明の目的で、「保存的アミノ酸置換」は次の５群の１つ内の交換として定義される。
１．小型脂肪族の非極性またはわずかに極性の残基：Ａｌａ［Ａ］、Ｓｅｒ［Ｓ］、Ｔｈｒ［Ｔ］（Ｐｒｏ［Ｐ］、Ｇｌｙ［Ｇ］）
２．極性の負に帯電した残基およびそれらのアミド：Ａｓｐ［Ｄ］、Ａｓｎ［Ｎ］、Ｇｌｕ［Ｅ］、Ｇｌｎ［Ｑ］
３．極性の正に帯電した残基：Ｈｉｓ［Ｈ］、Ａｒｇ［Ｒ］、Ｌｙｓ［Ｋ］
４．大型脂肪族非極性残基：Ｍｅｔ［Ｍ］、Ｌｅｕ［Ｌ］、Ｉｌｅ［Ｉ］、Ｖａｌ［Ｖ］（Ｃｙｓ［Ｃ］）および
５．大型芳香族残基：Ｐｈｅ［Ｆ］、Ｔｙｒ［Ｙ］、Ｔｒｐ［Ｗ］
【００８２】
保存的アミノ酸置換は、一般に、１．）置換領域内のポリペプチド主鎖の構造、２．）標的部位における分子の電荷または疎水性、または３．）側鎖の大半を維持する。さらに多くの場合、タンパク質分子のＮ末端およびＣ末端部分の変更もまた、タンパク質の活性を変更することは予期されない。
【００８３】
「非保存的アミノ酸置換」という用語は、タンパク質特性に最大変化を生じることが一般に予期されるアミノ酸置換を指す。したがって例えば非保存的アミノ酸置換は、次の１つである。１．）親水性残基が疎水性残基を置換し、またはそれによって置換される（例えばＳｅｒまたはＴｈｒがＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌを置換し、またはそれによって置換される）、２．）ＣｙｓまたはＰｒｏがあらゆるその他の残基を置換し、またはそれによって置換される、３．）電気陽性側鎖を有する残基が電気陰性残基を置換し、またはそれによって置換される（例えばＬｙｓ、ＡｒｇまたはＨｉｓがＡｓｐまたはＧｌｕを置換し、またはそれによって置換される）、または４．）かさ高い側鎖を有する残基が側鎖を有さないものを置換し、またはそれによって置換される（例えばＰｈｅがＧｌｙを置換し、またはそれによって置換される）。時として５群中の２群間の非保存的アミノ酸置換は、コードされるタンパク質の活性に影響しない。
【００８４】
ここでの用法では「単離された核酸断片」または「単離された核酸分子」は同義的に使用されて、一本鎖または二本鎖で、場合により合成、非天然または改変ヌクレオチド塩基を含有するＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーを指す。ＤＮＡポリマーの形態の単離された核酸断片は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つ以上のセグメントを含んでなってもよい。
【００８５】
核酸断片は、適切な温度および溶液イオン強度条件下で、核酸断片の一本鎖形態がその他の核酸断片とアニールできる場合、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡなどの別の核酸断片と「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件については良く知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第二版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９年）の特に第１１章およびその表１１．１で例証される（参照によってその内容全体を本明細書に援用する）。温度およびイオン強度条件が、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を定める。ストリンジェントな条件は、（遠縁の生物からの相同的配列などの）中程度に類似の断片をスクリーニングするため、そして（近縁の生物からの機能性酵素を複製する遺伝子などの）高度に類似した断片をスクリーニングするために調節できる。ハイブリダイゼーション後の洗浄が、ストリンジェンシー条件を決定する。１つの好ましい条件のセットは、室温において６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで１５分間に始まり、次に４５℃において２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで３０分間を反復し、次に５０℃において０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを３０分間を２回反復する、一連の洗浄を使用する。より好ましいストリンジェントな条件のセットはより高い温度を使用し、そこでは洗浄は、最後の０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中での２回の３０分間の洗浄の温度を６０℃に増大させること以外は上述したのと同一である。別の好ましい高度にストリンジェントな条件のセットは、６５℃において０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での２回の最終洗浄を使用する。さらに別のストリンジェントな条件のセットは、例えば０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、そして２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでのハイブリダイゼーションを含む。
【００８６】
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー次第で塩基間のミスマッチは可能であるが、ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補的配列を含有することを必要とする。核酸がハイブリダイゼーションする適切なストリンジェンシーは、技術分野で良く知られた変数である核酸の長さおよび相補性の程度に左右される。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が高い程、これらの配列を有する核酸ハイブリッドのＴｍ値は大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対安定性（より高いＴｍに対応する）は、次の順で低下する。ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さがヌクレオチド１００個を超えるハイブリッドでは、Ｔｍを計算する式が導かれている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出９．５０〜９．５１参照）。より短かい核酸、すなわちオリゴヌクレオチドによるハイブリダイゼーションのためにはミスマッチの配置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出１１．７〜１１．８参照）。一実施態様では、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは少なくともヌクレオチド約１０個である。ハイブリダイズ可能な核酸の好ましい最小の長さは少なくともヌクレオチド約１５個、より好ましくは少なくともヌクレオチド約２０個、そして最も好ましくは長さが少なくともヌクレオチド約３０個である。さらに当業者は、プローブの長さなどの要因次第で、温度および洗浄液の塩濃度を必要に応じて調節してもよいことを認識する。
【００８７】
アミノ酸またはヌクレオチド配列の「かなりの部分」とは、当業者による配列の手動評価によって、あるいはＢＬＡＳＴ（「基礎的局在性配列検索ツール（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ」、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９３年））などのアルゴリズムを使用したコンピュータ自動化アラインメントおよび同定によって、遺伝子またはポリペプチドの推定上の同定を得るのに十分なポリペプチドまたは遺伝子のヌクレオチド配列のアミノ酸配列を含んでなる部分である。一般に推定的にポリペプチドまたは核酸配列が既知のタンパク質または遺伝子に相同的であると同定するためには、１０個以上の隣接するアミノ酸または３０個以上のヌクレオチド配列が必要である。さらにヌクレオチド配列に関して、配列依存遺伝子同定法（例えばサザンハイブリダイゼーション）および単離（例えば細菌コロニーまたはバクテリオファージプラークの原位置ハイブリダイゼーション）において、２０〜３０個の隣接するヌクレオチドを含んでなる遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを使用しても良い。さらにプライマーを含んでなる特定の核酸断片を得るために、塩基１２〜１５個の短いオリゴヌクレオチドを増幅プライマーとしてＰＣＲで使用しても良い。したがってヌクレオチド配列の「かなりの部分」は、配列を含んでなる核酸断片を特異的に同定、および／または単離できるようにする十分な配列を含んでなる。本明細書は、特定の卵菌タンパク質をコードする完全なアミノ酸およびヌクレオチド配列を教示する。当業者はここで報告される配列の恩恵を被り、当業者に既知の目的のために、今や開示された配列の全てまたはかなりの部分を使用できる。したがって本発明は、添付の配列表で報告される完全な配列、ならびに上で定義される配列のかなりの部分を含んでなる。
【００８８】
「相補的」と言う用語は、互いにハイブリダイズできるヌクレオチド塩基間の関係について述べるために使用される。例えばＤＮＡについて、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって本発明は添付の配列表で報告される完全な配列、ならびに実質的に類似した核酸配列に相補的な単離された核酸断片も含む。
【００８９】
「相同性」、および「相同的」という用語は、区別なく使用され、その中において１個もしくはそれ以上のヌクレオチド塩基の変化が、遺伝子発現を仲介するまたは特定の表現型を生成する核酸断片の能力に影響しない核酸断片を指す。これらの用語はまた、最初の未変性断片と比べて、得られる核酸断片の機能特性を実質的に変化させない、１個もしくはそれ以上のヌクレオチドの欠失または挿入などの本発明の核酸断片の変更も指す。したがって当業者によって理解されるように、本発明は具体的な例示的配列を超えるものを包含する。
【００９０】
さらに当業者は、本発明によって包含される相同的な核酸配列が、中程度にストリンジェントな条件下（例えば０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃）において、ここで例示される配列と、またはここで開示される核酸配列のいずれかの機能的同等物である本ヌクレオチド配列のあらゆる部分とハイブリダイズする、それらの能力によってもまた定義されることを認識する。
【００９１】
「コドン縮重」とは、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響しないヌクレオチド配列の変動を可能にする遺伝子コードの性質を指す。当業者は、特定のアミノ酸を特定化するヌクレオチドコドンの使用における、特定の宿主細胞によって示される「コドンバイアス」についてよく知っている。したがって宿主細胞中の改善された発現のために遺伝子を合成する場合、そのコドン使用頻度が、宿主細胞の好むコドン使用頻度に近くなるように遺伝子をデザインすることが望ましい。
【００９２】
ＤＮＡ配列に関連して「化学的に合成された」とは、構成要素ヌクレオチドが、生体外で構築されたことを意味する。ＤＮＡの手動化学合成は確立された手順を使用して達成されてもよく、あるいはいくつかの市販の機器の１つを使用して自動化学合成を実施できる。「合成遺伝子」は、当業者に公知の手順を使用して化学的に合成されるオリゴヌクレオチド構成単位からアセンブルできる。これらの構成単位をライゲーションしアニールして遺伝子セグメントを形成し、次にそれを酵素的にアセンブルして遺伝子全体を構築する。したがって遺伝子をヌクレオチド配列の最適化に基づいて、最適な遺伝子発現のために個別に調整し、宿主細胞のコドンバイアスを反映させることができる。当業者は、コドン利用が宿主によって好まれるコドンに偏っている場合の遺伝子発現成功の可能性を理解する。好ましいコドンの判定は、配列情報が利用できる宿主細胞由来の遺伝子の調査に基づくことができる。
【００９３】
「遺伝子」とは特定のタンパク質を発現する核酸断片を指し、それはコード領域のみを指してもよく、またはコード配列に先行する（５’非コード配列）およびそれに続く（３’非コード配列）制御配列を含んでもよい。「天然遺伝子」とは、自然界にそれ自体の制御配列と共に見られる遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」とは、自然界に共に見られない制御およびコード配列を含んでなる天然遺伝子でないあらゆる遺伝子を指す。したがってキメラ遺伝子は、異なる起源由来の制御配列およびコード配列、あるいは同一起源由来であるが、自然界に見られるのとは異なる様式で配列される制御配列およびコード配列を含んでなってもよい。「内在性遺伝子」とは、生物ゲノム中のその天然位置にある天然遺伝子を指す。「外来性」遺伝子とは、遺伝子移入によって宿主生物に導入された遺伝子を指す。外来性遺伝子は、非天然生物中に挿入された天然遺伝子、天然宿主内の新しい位置に導入された天然遺伝子、あるいはキメラ遺伝子を含んでなることができる。「導入遺伝子」とは、形質転換によってゲノム中に導入された遺伝子である。「コドン最適化遺伝子」とは、そのコドン使用頻度が宿主細胞の好むコドン使用頻度を模倣するようにデザインされた遺伝子である。
【００９４】
「コード配列」とは、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「適した制御配列」とは、コード配列の上流（５’非コード配列）、配列内、または下流（３’非コード配列）に位置して、転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または関連コード配列の翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。制御配列は次を含んでも良い。プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセッシング部位、エフェクター結合部位、およびステム−ループ構造。
【００９５】
「プロモーター」とは、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を調節できるＤＮＡ配列を指す。一般にコード配列はプロモーター配列に対して３’に位置する。プロモーターはその全体が天然遺伝子に由来しても良く、あるいは自然界に見られる異なるプロモーター由来の異なる要素からなっても良く、あるいは合成ＤＮＡセグメントを含んでなってさえ良い。異なるプロモーターが、異なる組織または細胞タイプ中で、あるいは異なる発育段階で、あるいは異なる環境または生理学的条件に呼応して、遺伝子の発現を導いても良いことが当業者には理解される。ほとんどの場合にほとんどの細胞タイプ中で遺伝子の発現を引き起こすプロモーターは、一般に「構造プロモーター」と称される。ほとんどの場合、制御配列の正確な境界は完全に画定されていないので、異なる長さのＤＮＡ断片が、同一プロモーター活性を有してもよいこともさらに認識される。
【００９６】
「３’非翻訳配列」および「転写ターミネーター」と言う用語は、コード配列下流に位置するＤＮＡ配列を指す。これには、ｍＲＮＡプロセッシングまたは遺伝子発現に影響できる調節シグナルをコードするポリアデニル化認識配列、およびその他の配列が含まれる。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆物質の３’末端へのポリアデニル酸トラクトの付加に影響することで特徴づけられる。３’領域は、関連したコード配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または翻訳に影響できる。
【００９７】
「ＲＮＡ転写物」とは、ＲＮＡポリメラーゼが触媒するＤＮＡ配列転写から得られる生成物を指す。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーである場合、それは一次転写物と称され、あるいはそれは一次転写物の転写後プロセッシング由来のＲＮＡ配列であってもよく、成熟ＲＮＡと称される。「メッセンジャーＲＮＡ」または「ｍＲＮＡ」とは、イントロンがなく、細胞によってタンパク質に翻訳されることができるＲＮＡを指す。「ｃＤＮＡ」とは、ｍＲＮＡに対して相補的であり、それに由来する二重鎖ＤＮＡを指す。「センスＲＮＡ」とは、ｍＲＮＡを含み、細胞によってタンパク質に翻訳されることができるＲＮＡ転写物を指す。「アンチセンスＲＮＡ」とは、標的一次転写物またはｍＲＮＡの全部または一部に相補的であり、標的遺伝子の発現をブロックするＲＮＡ転写物を指す（米国特許第５０，１７０，０６５号明細書、国際公開第９９／２８５０８号パンフレット）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特定の遺伝子転写物のあらゆる部分、すなわち５’非コード配列、３’非コード配列、またはコード配列にあっても良い。「機能性ＲＮＡ」とは、翻訳されないがそれでもなお細胞プロセスに影響するアンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、またはその他のＲＮＡを指す。
【００９８】
「作動的に結合した」と言う用語は、１つの機能が他方の機能による影響を受けるような、単一核酸断片上の核酸配列のつながりを指す。例えばプロモーターがコード配列の発現に影響を及ぼすことができる（すなわちコード配列がプロモーターの転写調節下にある）場合、それはそのコード配列と作動的に結合する。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向で制御配列に作動的に結合できる。
【００９９】
「発現」という用語は、ここでの用法では、本発明の核酸断片由来のセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写と安定した蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳も指す。
【０１００】
「成熟」タンパク質とは、翻訳後処理されたポリペプチド、すなわち一次翻訳生成物中に存在するあらゆるプレまたはプロペプチドがそれから除去されたものを指す。「前駆」タンパク質とは、ｍＲＮＡの翻訳の一次生成物、すなわちプレまたはプロペプチドが依然として存在するものを指す。プレまたはプロペプチドは、細胞内局在化シグナルであってもよい（が、これに限定されるものではない）。
【０１０１】
「形質転換」とは、遺伝的に安定した遺伝形質をもたらす核酸分子の宿主生物中への転移を指す。核酸分子は、例えば自律的に複製するプラスミドであってもよく、またはそれは宿主生物のゲノムに組み込まれてもよい。形質転換された核酸断片を含有する宿主生物は、「遺伝子導入」または「組み換え」または「形質転換」生物と称される。
【０１０２】
「プラスミド」、「ベクター」、および「カセット」と言う用語は、細胞の中心的代謝の一部ではない遺伝子を運ぶことが多く、通常環状二本鎖ＤＮＡ断片の形態である染色体外要素を指す。このような要素は、あらゆる供給源に由来する一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの配列、ゲノム一体化配列、直鎖または環状のファージまたはヌクレオチド配列を自律的に複製するかもしれず、そこではいくつかのヌクレオチド配列が独自の構成に結合または組み換えされ、それは選択された遺伝子産物のために、適切な３’非翻訳配列と共にプロモーター断片およびＤＮＡ配列を細胞中に導入することができる。「発現カセット」とは、外来性遺伝子を含有し、外来性遺伝子に加えて外来性宿主におけるその遺伝子の促進された発現を可能にする要素を有する特定のベクターを指す。
【０１０３】
当該技術分野で知られている「％同一性」と言う用語は、配列を比較して判定される２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列の関係である。当該技術分野で「同一性」は、場合によってはこのような配列ストリング間の整合によって判定される、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度も意味する。「同一性」および「類似性」は、１．）「計算分子生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＮＹ（１９８８年）、２．）「Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ」（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編）Ａｃａｄｅｍｉｃ、ＮＹ（１９９３年）、３．）「Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ」、第一部、（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．、およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編）Ｈｕｍａｎｉａ、ＮＪ（１９９４年）、４．）「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ、ＮＹ（１９８７年）、５．）「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ」（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ、ＮＹ（１９９１年）で述べられているものをはじめとするが、これに限定されるものではない公知の方法によって容易に計算できる。
【０１０４】
同一性を判定する好ましい方法は、試験される配列間に最良の整合を与えるようにデザインされる。同一性および類似性を判定する方法は、一般に入手できるコンピュータプログラムで体系化されている。アラインメントおよび同一性百分率の計算は、ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）からのＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス計算スイートのＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラムを使用して実施してもよい。配列の多重アラインメントは「Ｃｌｕｓｔａｌ法のアラインメント」を使用して実施され、これは「Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖ法のアラインメント」をはじめとするアルゴリズムのいくつかの変種を包含して、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖとラベルされたアラインメント法に相当し（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１〜１５３（１９８９年）；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ら、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．８：１８９〜１９１（１９９２年）で述べられている）、ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．からのＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス計算スイートのＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラムにある。多重アラインメントでは、デフォルト値はＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に相当する。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖ法を使用した、タンパク質配列のペアワイズアラインメントおよび％同一性計算のデフォルトパラメーターは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５である。核酸ではこれらのパラメーターは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝４である。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖプログラムを使用したアラインメント後、同プログラムの「配列距離」表を見ることで「％同一性」を得ることが可能である。さらに「クラスタルダブル（Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ）を用いたアライメント法のアラインメント」を利用でき、これはＣｌｕｓｔａｌ  Ｗとラベルされたアラインメント法に相当し（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１〜１５３（１９８９年）；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ら、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．８：１８９〜１９１（１９９２年）で述べられている）、ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．からのＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス計算スイートのＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）ｖ６．１プログラムにある。多重アラインメントのデフォルトパラメーターは、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．２、Ｄｅｌａｙ  Ｄｉｖｅｒｇｅｎ  Ｓｅｑｓ（％）＝３０、ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  Ｗｅｉｇｈｔ＝０．５、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝Ｇｏｎｎｅｔ  ＳｅｒｉｅｓおよびＤＮＡ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝ＩＵＢに対応する。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗプログラムを使用したアラインメント後、同プログラムの「配列距離」表を見ることで「％同一性」を得ることが可能である。
【０１０５】
「ＢＬＡＳＴＮ法のアラインメント」は、デフォルトパラメーターを使用してヌクレオチド配列を比較する、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）が提供するアルゴリズムである。
【０１０６】
その他の種から同一または同様の機能または活性を有するポリペプチドを同定する上で、多くのレベルの配列同一性が有用であることを当業者はよく理解している。適切な核酸断片（本発明の単離されたポリヌクレオチド）は、ここで報告されるアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一、好ましくは少なくとも約７５％同一、より好ましくは少なくとも約８０％同一のポリペプチドをコードする。好ましい核酸断片は、ここで報告するアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一のアミノ酸配列をコードする。より好ましい核酸断片は、ここで報告するアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列をコードする。最も好ましいのは、ここで報告するアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一のアミノ酸配列をコードする核酸断片である。確かに本発明について述べるのに、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％などの７０％〜１００％のあらゆる整数のアミノ酸同一性が有用かもしれない。適切な核酸断片は上の相同性を有するだけでなく、典型的に少なくとも５０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも１００個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも１５０個のアミノ酸、なおもより好ましくは少なくとも２００個のアミノ酸、最も好ましくは少なくとも２５０個のアミノ酸を有するポリペプチドをコードする。
【０１０７】
「配列分析ソフトウェア」と言う用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析のために有用なあらゆるコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを指す。「配列分析ソフトウェア」は、市販のものでも、あるいは独立して開発されても良い。典型的な配列分析ソフトウェアとしては、１．）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）からのＧＣＧプログラム一式（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０）、２．）ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９０年））、および３．）ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）からのＤＮＡＳＴＡＲ、４．）Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）からのＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ、および５．）スミス−ウォーターマン・アルゴリズムを組み入れたＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４年）、１９９２年会議、１１１〜２０、編集者：Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ、Ｐｌｅｎｕｍ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。本明細書の文脈では、配列分析ソフトウェアを分析のために使用する場合、分析結果は特に断りのない限り、言及されるプログラムの「デフォルト値」に基づくものと理解される。ここでの用法では、「デフォルト値」とは、最初に初期化されるときにソフトウェアに元からロードされる、あらゆる値またはパラメータの組を意味する。
【０１０８】
「保存ドメイン」または「モチーフ」という用語は、進化的に関連したタンパク質の整合配列に沿った特定位置で保存されたアミノ酸のセットを意味する。別の位置のアミノ酸が相同的なタンパク質間で変動できる一方、特定位置で高度に保存されたアミノ酸は、タンパク質の構造、安定性、または活性に必須のアミノ酸を示唆する。それらはタンパク質相同体ファミリーの整合配列におけるそれらの高度の保存によって同定されるので、それらを識別子または「シグネチャー」として使用して、新たに判定された配列があるタンパク質が以前同定されたタンパク質ファミリーに属するかどうかを判定できる。ここでの目的で、次の表はΔ１７デサチュラーゼ活性を有するタンパク質の徴候である本発明のモチーフを示す。
【０１０９】
【表７】
2010508019.tif 000009
【０１１０】
「Ｈｉｓ  Ｂｏｘ」という用語は、Ｈ（Ｘ）３Ｈ（配列番号９９）、Ｈ（Ｘ）２ＨＨ（配列番号１００）、およびＨ／Ｑ（Ｘ）２ＨＨ（配列番号１０１）からなる群から選択されるモチーフを有するヒスチジンボックスを指す。
【０１１１】
ここで使用される標準リコンビナントＤＮＡおよび分子クローニング技術については技術分野で良く知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．、およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」第二版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９年）（下文においてＭａｎｉａｔｉｓ）；Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．、Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．およびＥｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．、「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８４年）；およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪによる出版（１９８７年）で述べられている。
【０１１２】
概説：脂肪酸およびトリアシルグリセロールの微生物生合成
一般に、油性微生物中の脂質蓄積は、増殖培地中に存在する全体的な炭素対窒素比に応えて誘発される。油性微生物中に遊離パルミチン酸（１６：０）の新規（ｄｅ  ｎｏｖｏ）合成をもたらすこのプロセスについては、国際公開第２００４／１０１７５７号パンフレットで詳細に述べられる。パルミチン酸は、エロンガーゼおよびデサチュラーゼの作用を通じて形成される、より長鎖の飽和および不飽和脂肪酸誘導体の前駆物質である（図１）。
【０１１３】
ＴＡＧ（脂肪酸の主要な貯蔵単位）は、以下が関与する一連の反応によって形成される。１．）アシルトランスフェラーゼによる１分子のアシル−ＣｏＡのグリセロール−３−リン酸塩へのエステル化がリゾホスファチジン酸を生じ、２．）アシルトランスフェラーゼによる第２のアシル−ＣｏＡ分子のエステル化が１，２−ジアシルグリセロールリン酸塩（一般にホスファチジン酸として同定される）を生じ、３．）ホスファチジン酸ホスファターゼによるリン酸塩の除去が１，２−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）を生じ、４．）アシルトランスフェラーゼの作用による第３の脂肪酸の付加がＴＡＧを形成する。飽和および不飽和脂肪酸および短鎖および長鎖脂肪酸をはじめとする、幅広い脂肪酸をＴＡＧに組み込むことができる。
【０１１４】
オメガ脂肪酸の生合成
オレイン酸がω−３／ω−６脂肪酸に変換される代謝プロセスは、炭素原子付加を通じた炭素鎖の延長、および二重結合添加を通じた分子の不飽和化を伴う。これは、小胞体膜内に存在する一連の特別な不飽和化酵素および延長酵素を必要とする。しかし図１に示され下で述べられるように、特定ω−３／ω−６脂肪酸生成のための複数の代案の経路があることが多い。
【０１１５】
具体的には全ての経路は、Δ１２デサチュラーゼによる、オレイン酸から第１のω−６脂肪酸であるＬＡへの最初の変換を必要とする。次に「Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路」を使用して、ω−６脂肪酸が次のようにして形成される。（１）Δ６デサチュラーゼによってＬＡがＧＬＡに転換され、（２）Ｃ１８／２０エロンガーゼによってＧＬＡがＤＧＬＡに転換され、３）Δ５デサチュラーゼによってＤＧＬＡがＡＲＡに転換される。代案としては次のようにして、ω−３脂肪酸形成のために「Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路」を利用することができる。（１）Δ１５デサチュラーゼによってＬＡが第１のω−３脂肪酸であるＡＬＡに転換され、（２）Δ６デサチュラーゼによってＡＬＡがＳＴＡに転換され、（３）Ｃ１８／２０エロンガーゼによってＳＴＡがＥＴＡに転換され、（４）Δ５デサチュラーゼによってＥＴＡがＥＰＡに転換され、（５）Ｃ２０／２２エロンガーゼによってＥＰＡがＤＰＡに転換され、（６）Δ４デサチュラーゼによってＤＰＡがＤＨＡに転換される。場合により、ω−６脂肪酸がω−３脂肪酸に転換されてもよい。例えばΔ１７デサチュラーゼ活性によって、ＥＴＡおよびＥＰＡがそれぞれＤＧＬＡおよびＡＲＡから生成される。
【０１１６】
ω−３／ω−６脂肪酸生合成のための代案の経路は、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ生合成経路を利用する。より具体的には、ＬＡおよびＡＬＡは、Δ９エロンガーゼによってそれぞれＥＤＡおよびＥＴｒＡに変換されもよく、次にΔ８デサチュラーゼがＥＤＡをＤＧＬＡに、および／またはＥＴｒＡをＥＴＡに変換する。
【０１１７】
ω−３／ω−６脂肪酸の生成のために特定の宿主生物中に発現することが必要とされる特定の機能性は、宿主細胞（およびその天然ＰＵＦＡプロフィールおよび／またはデサチュラーゼ／エロンガーゼプロフィール）、基質の可用性、および所望の最終産物に左右されることが考察される。当業者は、ω−３／ω−６脂肪酸生合成のために所望される各酵素をコードする、様々な候補遺伝子を同定できるであろう。有用なデサチュラーゼおよびエロンガーゼ配列はあらゆる供給源に由来してもよく、例えば天然供給源（細菌、藻類、真菌、卵菌綱、植物、動物など）から単離され、半合成経路によって生成され、または新規（ｄｅ  ｎｏｖｏ）合成される。宿主中に導入されるデサチュラーゼおよびエロンガーゼ遺伝子の特定の供給源は重大でないが、デサチュラーゼまたはエロンガーゼ活性を有する特異的ポリペプチド選択のための考慮事項としては以下が挙げられる。１．）ポリペプチドの基質特異性、２．）ポリペプチドまたはその構成要素が律速酵素であるかどうか、３．）デサチュラーゼまたはエロンガーゼが所望のＰＵＦＡ合成に必須であるかどうか、４．）ポリペプチドが必要とする補助因子、および／または、５．）ポリペプチドが、その生成後に修飾されたかどうか（例えば、キナーゼによって）。発現したポリペプチドは、好ましくは宿主細胞中のその位置の生化学的環境に適合したパラメーターを有する（より詳しくは国際公開第２００４／１０１７５７号パンフレットを参照されたい）。
【０１１８】
追加的実施態様では、特定の各デサチュラーゼおよび／またはエロンガーゼの変換効率を考慮することもまた有用であろう。より具体的には、各酵素が基質を生成物に変換するのに１００％の効率で機能することは稀なので、宿主細胞中に生成される未精製油の最終脂質プロフィールは、典型的に所望のω−３／ω−６脂肪酸、ならびに様々な上流中間ＰＵＦＡからなる様々なＰＵＦＡの混合物である。したがって所望の脂肪酸生合成を最適化するのに際し、各酵素の変換効率の考慮もまた有益である。
【０１１９】
上のそれぞれの考慮を念頭に、公的に入手可能な文献（例えばＧｅｎＢａｎｋ）、特許文献、およびＰＵＦＡ生成能力を有する生物の実験的分析に従って、適切なデサチュラーゼおよびエロンガーゼ活性（例えばΔ６デサチュラーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Ｃ１４／１６エロンガーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、Δ９エロンガーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ４デサチュラーゼ、およびＣ２０／２２エロンガーゼ）を有する候補遺伝子を同定できる。これらの遺伝子は、特定宿主生物に導入して、生物のＰＵＦＡ合成を可能にしまたは増強するのに適する。
【０１２０】
新しいΔ１７デサチュラーゼの同定
本発明では、ピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）からΔ１７デサチュラーゼをコードするヌクレオチド配列が単離され、ここで「ＰａＤ１７」と称される。
【０１２１】
ＰａＤ１７ヌクレオチド塩基および推定アミノ酸配列の公共データベースとの比較は、最も類似した既知の配列が、配列比較アルゴリズムのクラスタルダブル（Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ）を用いたアライメント法を使用して、３５９個のアミノ酸の長さにわたってここで報告されるＰａＤ１７のアミノ酸配列と約７５．３％同一であることを明らかにする。より好ましいアミノ酸断片はここでの配列と少なくとも約７０％〜８５％同一であり、少なくとも約８５％〜９０％同一の配列が特に適切であり、少なくとも約９０％〜９５％同一の配列が最も好ましい。同様に本Δ１７デサチュラーゼＯＲＦに対応する好ましいＰａＤ１７をコードする核酸配列は、活性タンパク質をコードして、ここで報告されるＰａＤ１７の核酸配列と少なくとも約７０％〜８５％と同一のものであり、少なくとも約８５％〜９０％同一の配列が特に適切であり、少なくとも約９０％〜９５％同一の配列が最も好ましい。
【０１２２】
代案の実施態様では、本ＰａＤ１７配列は、特定の宿主生物中での発現のためにコドン最適化できる。当該技術分野でよく知られているように、宿主が好むコドンの使用はポリペプチドをコードする外来遺伝子の発現を実質的に増強できるので、これは代案宿主中での酵素の発現をさらに最適化する有用な手段であり得る。一般に宿主が好むコドンは、対象とする特定の宿主種中で、タンパク質（好ましくは最大量で発現するもの）中のコドン使用頻度を調べ、どのコドンが最高頻度で使用されるかを判定することで判定できる。次に宿主種中で好まれるコドンを使用して、例えばデサチュラーゼ活性を有する対象とするポリペプチドのコード配列が、全体的にまたは部分的に合成できる。
【０１２３】
好ましい本発明の一実施態様では、ＰａＤ１７をヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化した。これはＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）コドン使用頻度プロフィール（国際公開第０４／１０１７５７号パンフレット、米国特許第７，１２５，６７２号明細書を参照されたい）を最初に判定して、好ましいコドンを同定することで可能であった。Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中の遺伝子発現のさらなる最適化は、「ＡＴＧ」開始コドン周辺の共通配列を判定することで達成された。この最適化は１０８０ｂｐコード領域の１８８ｂｐ（１７．４％）の修正、および１７５コドン（４８．６％）の最適化をもたらした。コドン最適化された遺伝子（「ＰａＤ１７Ｓ」、配列番号４）中の修正のいずれも、コードされたタンパク質（配列番号２）のアミノ酸配列を変化させなかった。実施例１０で述べられているように、コドン最適化された遺伝子は、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中で発現すると、ＡＲＡをＥＰＡに不飽和化させるのに野生型遺伝子よりも効率的であった。
【０１２４】
当業者は、ここでの教示を使用して、野生型ＰａＤ１７配列（すなわち配列番号２）または配列番号３に記載のその変異型に基づいて、代案の宿主（すなわちヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）以外）中での最適発現に適した様々なその他のコドン最適化されたΔ１７デサチュラーゼタンパク質を作り出すことができるであろう。したがって本発明は、配列番号２または配列番号３のどちらかに由来するあらゆるコドン最適化されたΔ１７デサチュラーゼタンパク質に関する。これとしては、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された合成Δ１７デサチュラーゼタンパク質をコードする配列番号４に記載のヌクレオチド配列（すなわちＰａＤ１７Ｓ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１２５】
上述の卵菌ポリペプチドの同定に際して、野生型およびコドン最適化された脂肪酸デサチュラーゼの活性は、適切な宿主（すなわちヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））中への形質転換、および宿主の脂肪酸プロフィールに対するその影響の判定により判定された（実施例７、１０、および１７）。予期されたようにＰａＤ１７およびＰａＤ１７ＳはどちらもΔ１７デサチュラーゼ活性を有し、酵素はＡＲＡからＥＰＡへの変換を触媒できた。具体的にはＰａＤ１７のＡＲＡからＥＰＡへの変換効率が１８．４〜１９．５％の範囲であるのに対し、ＰａＤ１７ＳのＡＲＡからＥＰＡへの変換効率は５４．１〜５５．８％の範囲であった（２つの異なるＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株における、および異なる成長条件下での判定を基準にして）。変換効率は（［生成物］／［基質＋生成物］）＊１００の式に従って測定され、「生成物」は即時の生成物および経路中のそれに由来する全ての生成物を含む。
【０１２６】
しかし意外にも、ＰａＤ１７Ｓは限られたΔ１５デサチュラーゼ活性をさらに有した（すなわちＬＡからＡＬＡへの変換効率が３４．６％であった）（実施例１７）。したがってピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）デサチュラーゼは、ここで二機能性Δ１７デサチュラーゼと定義される。
【０１２７】
ＰａＤ１７Ｓのさらなる分析は、ω−６脂肪酸基質ＥＤＡおよびＤＧＬＡを使用しての２５％を超える変換効率に基づいて、酵素が広範な触媒無差別性を示すことを明らかにした（実施例１７）。したがってＰａＤ１７Ｓのω−６脂肪酸基質特異性は、フィトフトラ・ソジャ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅ）に由来してヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された合成Δ１７デサチュラーゼ（すなわちＰｓＤ１７Ｓ、米国特許出願第１１／７８７７７２号明細書、および本明細書の実施例１７）、およびフィトフトラ・ラモルム（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｒａｍｏｒｕｍ）に由来してヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された合成Δ１７デサチュラーゼ（すなわちＰｒＤ１７Ｓ、米国特許出願第１１／７８７７７２号明細書、および本明細書の実施例１７）と類似している。これらの結果は、単機能性Δ１７デサチュラーゼとしてＣ２０ω−６脂肪酸基質に排他的に機能することが報告されている近縁のサプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ）のω−３デサチュラーゼについて実証されたものとは対照的である（Ｐｅｒｅｉｒａ，Ｓ．Ｌ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３７８：６６５（２００４年））。
【０１２８】
別の態様では本発明は、配列番号４３（すなわち「ＰｉＤ１７」、フィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）からのω−３デサチュラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＪ３０８７０））、および配列番号９５（すなわち「ＳｄＤ１７」、サプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ）からのΔ１７デサチュラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＲ２０４４４））を除く、Δ１７デサチュラーゼをコードする核酸配列を含んでなる単離された核酸断片に関し、前記Δ１７デサチュラーゼを含んでなるアミノ酸配列は、
ａ）ＦＴＸＧＨＤＸＧＨ（Δ１７デサチュラーゼモチーフ＃１、配列番号９６）、
ｂ）ＨＲＨＨＨＫＮＴＧ（Δ１７デサチュラーゼモチーフ＃２、配列番号９７）、および
ｃ）ＩＧＴＨＱＸＨＨＬＦＰ（Δ１７デサチュラーゼモチーフ＃３、配列番号９８）
からなる群から選択されるアミノ酸配列モチーフの少なくとも１つを含有し、Ｘはあらゆるアミノ酸であることができる。
【０１２９】
下線付きアミノ酸は、デサチュラーゼＨｉｓ  Ｂｏｘモチーフの一部であるヒスチジン残基を表す。Ｈｉｓ  Ｂｏｘモチーフは、Ｈ（Ｘ）３Ｈ（配列番号９９）、Ｈ（Ｘ）２ＨＨ（配列番号１００）、およびＨ／Ｑ（Ｘ）２ＨＨ（配列番号１０１）として述べられている。図１４は、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖ配列比較（デフォルトパラメーター）を使用した、本発明のΔ１７デサチュラーゼとその他の公共的に開示されているΔ１７デサチュラーゼとの比較を記載する。具体的には配列番号２（ＰａＤ１７）、配列番号４３（ＰｉＤ１７）、配列番号４７（ＰｒＤ１７）、配列番号８２（ＰｓＤ１７Ｓ）、および配列番号９５（ＳｄＤ１７）を比較した。本発明のモチーフを含んでなる領域（すなわちそれぞれΔ１７デサチュラーゼモチーフ＃１、Δ１７デサチュラーゼモチーフ＃２、およびΔ１７デサチュラーゼモチーフ＃３）を枠内に示す。
【０１３０】
相同体の同定および単離
配列分析ソフトウェアを使用して、本デサチュラーゼ配列（すなわちＰａＤ１７、ＰａＤ１７＊、ＰａＤ１７Ｓ）またはその部分（すなわちΔ１７デサチュラーゼモチーフ＃１、Δ１７デサチュラーゼモチーフ＃２、および／またはΔ１７デサチュラーゼモチーフ＃３）のいずれかを使用して、同一または別の細菌、藻類、真菌、卵菌綱または植物種中で、Δ１７デサチュラーゼ相同体を検索してよい。一般には、このようなコンピューターソフトウェアは、様々な置換、欠失、およびその他の改変に相同性の程度を割り当てて同様の配列をマッチする。
【０１３１】
代案としてはΔ１７デサチュラーゼ相同体の同定のために、本デサチュラーゼ配列またはその部分のいずれかをハイブリダイゼーション試薬として用いてもよい。核酸ハイブリダイゼーション試験の基本的構成要素には、プローブ、対象とする遺伝子または遺伝子断片を含有することが疑われるサンプル、および特定のハイブリダイゼーション法が含まれる。本発明のプローブは、典型的に、検出される核酸配列に相補的な一本鎖核酸配列である。プローブは、検出される核酸配列と「ハイブリダイズ可能」である。プローブの長さは、５個の塩基から数万個の塩基の間で変動してもよいが、典型的に約１５個の塩基から約３０個の塩基のプローブ長が適切である。プローブ分子の一部のみが、検出される核酸配列に相補的であればよい。さらにプローブと標的配列との間の相補性は完璧でなくてもよい。ハイブリダイゼーションは不完全に相補的な分子間でも生じ、その結果、ハイブリダイズした領域の特定塩基の一部は、適切な相補的塩基と対合形成しない。
【０１３２】
ハイブリダイゼーション法については、良く定義されている。典型的には、プローブおよびサンプルは、核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で混合されなくてはならない。これは適切な濃度および温度条件下において、無機または有機塩存在下で、プローブとサンプルを接触させることを伴う。プローブとサンプル核酸の間であらゆる可能なハイブリダイゼーションが起きるように、プローブおよびサンプル核酸は、十分長い時間接触しなくてはならない。混合物中のプローブまたは標的濃度が、ハイブリダイゼーションが生じるのに必要な時間を決定する。プローブまたは標的濃度が高いほど、必要なハイブリダイゼーションインキュベーション時間は短くなる。場合により、カオトロピック剤を添加してもよい（塩化グアニジニウム、グアニジニウムチオシアネート、ナトリウムチオシアネート、テトラクロロ酢酸リチウム、過塩素酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸ルビジウム、ヨウ化カリウム、およびトリフルオロ酢酸セシウム）。所望するならば、ハイブリダイゼーション混合物にホルムアミドを典型的に３０〜５０％（ｖ／ｖ）添加できる。
【０１３３】
様々なハイブリダイゼーション溶液を用いることができる。それらは典型的に約２０〜６０容量％、好ましくは３０容量％の極性有機溶剤からなる。一般的なハイブリダイゼーション溶液は、約３０〜５０％ｖ／ｖのホルムアミドと、約０．１５〜１Ｍの塩化ナトリウムと、（例えばクエン酸ナトリウム、トリス−ＨＣｌ、ＰＩＰＥＳまたはＨＥＰＥＳ（ｐＨ範囲約６〜９）などの）約０．０５〜０．１Ｍの緩衝液と、（例えばドデシル硫酸ナトリウムなどの）約０．０５〜０．２％の洗剤、または０．５〜２０ｍＭのＥＤＴＡ、ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｉｎｃ．）からのＦＩＣＯＬＬ（約３００〜５００ｋｄａｌ）、ポリビニルピロリドン（約２５０〜５００ｋｄａｌ）、および血清アルブミンを用いる。また典型的なハイブリダイゼーション溶液には、約０．１〜５ｍｇ／ｍＬの非標識の担体核酸、（例えば仔ウシ胸腺またはサケ精子ＤＮＡ、または酵母菌ＲＮＡなどの）核酸ＤＮＡ断片、および場合により約０．５〜２％重量／体積のグリシンも含まれる。様々な（例えばポリエチレングリコールなどの）極性水溶性または水性膨張剤、（例えばポリアクリレートまたはポリメチルアクリレートなどの）陰イオンポリマー、（例えば硫酸デキストランなどの）陰イオン糖類ポリマーをはじめとする体積排除剤などのその他の添加剤を含めてもよい。
【０１３４】
核酸ハイブリダイゼーションは多様なアッセイ型式に適合できる。最も適切なもの１つは、サンドイッチアッセイ型式である。サンドイッチアッセイは、特に非変性条件下でのハイブリダイゼーションに適合できる。サンドイッチタイプのアッセイの主要構成要素は、固体担体である。固体担体は、未標識で配列の一部と相補的である固定化核酸プローブをそれに吸着し、またはそれと共有結合する。
【０１３５】
さらに別の実施態様では、ここで述べられるΔ１７デサチュラーゼ核酸断片（または同定されたそのあらゆる相同体）のいずれかを使用して、同一または別の細菌、藻類、真菌、卵菌綱または植物種から、相同的なタンパク質をコードする遺伝子を単離してもよい。配列依存プロトコルを使用した相同的遺伝子の単離は、当該技術分野で周知である。配列依存プロトコルの例としては以下が挙げられるが、これに限定されるものではない。１．）核酸ハイブリダイゼーション法、２．）核酸増幅技術の様々な使用で例示されるようなＤＮＡおよびＲＮＡ増幅法［例えばＭｕｌｌｉｓらに付与された米国特許第４，６８３，２０２号明細書のポリメラーゼ連鎖反）（ＰＣＲ）；Ｔａｂｏｒ，Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８２、１０７４（１９８５年）のリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）；または（Ｗａｌｋｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８９、３９２（１９９２年）の連鎖置換増幅（ＳＤＡ）］、および３．）相補性によるライブラリー構築およびスクリーニング法。
【０１３６】
例えば本明細書で述べられるΔ１７デサチュラーゼに類似したタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子は、当業者によく知られている方法を使用して、本核酸断片の全てまたは一部をＤＮＡハイブリダイゼーションプローブとして使用して、あらゆる所望の酵母菌または卵菌からライブラリーをスクリーニングして直接単離できる（ＥＰＡ［またはその誘導体］を産生する酵母または真菌が好ましい）。本核酸配列に基づく特異的オリゴヌクレオチドプローブは、技術分野で既知の方法によってデザインおよび合成できる（Ｍａｎｉａｔｉｓ、前出）。さらに当業者に既知の方法（例えばランダムプライマーＤＮＡ標識、ニック翻訳または末端標識技術）によって、配列全体を直接使用してＤＮＡプローブを合成でき、または利用できる生体外転写システムを使用してＲＮＡプローブを合成できる。さらに特異的プライマーをデザインして使用し、本配列の一部（または全長）を増幅できる。得られた増幅生成物を増幅反応中に直接標識し、または増幅反応後に標識して、適切なストリンジェンシー条件下でプローブとして使用し、完全長ＤＮＡ断片を単離できる。
【０１３７】
典型的にＰＣＲ−タイプ増幅技術では、プライマーは異なる配列を有し、互いに相補的でない。所望の試験条件次第で、プライマーの配列は、標的核酸の効率的かつ忠実な複製を提供するようにデザインされるべきである。ＰＣＲプライマーデザインの方法は当該技術分野で一般的であり、よく知られている。（Ｋ．Ｅ．Ｄａｖｉｓ編、「Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」よりＴｈｅｉｎおよびＷａｌｌａｃｅ、「Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」（１９８６年）３３〜５０、ＩＲＬ：Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ；およびＷｈｉｔｅ，Ｂ．Ａ．編、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」よりＲｙｃｈｌｉｋ，Ｗ．、「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」（１９９３年）第１５巻、３１〜３９、Ｈｕｍａｎａ：Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）。
【０１３８】
一般に本デサチュラーゼ配列の２本の短い断片をＰＣＲプロトコルで使用して、ＤＮＡまたはＲＮＡからの相同遺伝子をコードするより長い核酸断片を増幅してもよい。またクローンされた核酸断片ライブラリーに対して、１つのプライマーの配列が本核酸断片に由来し、別のプライマーの配列が真核生物の遺伝子をコードするｍＲＮＡ前駆物質の３’末端のポリアデニル酸トラクトの存在を利用する、ＰＣＲを実施してもよい。
【０１３９】
代案としては第２のプライマー配列は、クローニングベクターに由来する配列に基づいてもよい。例えば当業者は、ＲＡＣＥプロトコル（Ｆｒｏｈｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８５：８９９８（１９８８年））に従って、ＰＣＲを使用して転写物の一点と３’または５’末端との間の領域のコピーを増幅し、ｃＤＮＡを作り出すことができる。３’および５’方向を向いたプライマーは、本配列からデザインできる。Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）から市販される３’ＲＡＣＥまたは５’ＲＡＣＥシステムを使用して、特定の３’または５’ｃＤＮＡ断片を単離できる（Ｏｈａｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８６：５６７３（１９８９年）；Ｌｏｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：２１７（１９８９年））。
【０１４０】
別の実施態様では、新しい改善された脂肪酸デサチュラーゼを作り出すために、ここで述べられるいずれのΔ１７デサチュラーゼ核酸断片（または同定されるそのいずれの相同体）を使用してもよい。当該技術分野でよく知られているように、生体外変異誘発および選択、化学的突然変異誘発、「遺伝子シャフリング」法またはその他の手段を使用して、天然のデサチュラーゼ遺伝子の突然変異を得ることができる。代案としては改善された脂肪酸がドメイン交換によって合成されてもよく、そこではここで述べられるΔ１７デサチュラーゼ核酸断片のいずれかからの機能性ドメインが代案のデサチュラーゼ遺伝子中の機能性ドメインと交換され、それによって新しいタンパク質がもたらされる。
【０１４１】
様々なω−３および／またはω−６脂肪酸の生成方法
ここで述べられるΔ１７デサチュラーゼをコードするキメラ遺伝子（すなわちＰａＤ１７、ＰａＤ１７＊、ＰａＤ１７Ｓまたはその他の突然変異酵素、コドン最適化酵素またはその相同体）の導入は、適切なプロモーター制御下において、形質転換された宿主生物体中でそれぞれＥＰＡの生成増大をもたらすことが期待される。したがって本発明は、基質が所望の脂肪酸生成物（すなわちＥＰＡ）に転換されるように、脂肪酸基質（すなわちＡＲＡ）をここで述べられるデサチュラーゼ（例えばＰａＤ１７、ＰａＤ１７＊、ＰａＤ１７Ｓ）に曝す工程を含んでなる、ＰＵＦＡの直接的生成方法を包含する。
【０１４２】
より具体的には、本発明の目的は、以下をを含んでなる宿主細胞（例えば油性酵母）中でＥＰＡを製造する方法を提供することである。
ａ．）クラスタルダブル（Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ）を用いたアライメント法に基づいて配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると、少なくとも７５．３％の同一性を有するΔ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子、および
ｂ）ＡＲＡ源、
ｃ．）Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする核酸分子が発現してＡＲＡがＥＰＡに変換される条件下で、工程（ａ）の宿主細胞を成長させる工程と、
ｄ．）場合により工程（ｃ）のＥＰＡを回収する工程。
【０１４３】
当業者は、Δ１７デサチュラーゼの広範な基質範囲が、ＤＧＬＡからＥＴＡへの変換のための酵素の使用を可能にすることを認識するであろう。したがって本発明は、以下を含んでなる宿主細胞中でＥＴＡを生成する方法を提供する。
ａ．）クラスタルダブル（Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ）を用いたアライメント法に基づいて配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると、少なくとも７５．３％の同一性を有するΔ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子、および
ｂ．）ＤＧＬＡ源、
ｃ．）Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする核酸分子が発現して、ＤＧＬＡがＥＴＡに変換される条件下で、工程（ａ）の宿主細胞を成長させる工程と、
ｄ．）場合により工程（ｃ）のＥＴＡを回収する工程。
【０１４４】
代案の実施態様では、ピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）Δ１７デサチュラーゼの二機能性に基づいて、
ａ．）クラスタルダブル（Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ）を用いたアライメント法に基づいて配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると、少なくとも７５．３％の同一性を有する二機能性Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子、および
ｂ．）リノール酸およびエイコサジエン酸からなる群から選択される脂肪酸起源
を含んでなる宿主細胞（例えば油性酵母）中で多価不飽和脂肪酸を生成する方法を提供することが本発明の目的であり、
二機能性Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする核酸分子が発現して、リノール酸がα−リノレン酸に変換されてエイコサジエン酸がエイコサトリエン酸に変換される条件下で宿主細胞を成長させ、次に場合により前記脂肪酸が回収される。
【０１４５】
上述の方法のいずれかで、基質供給が必要とされるかもしれない。
【０１４６】
代案としては、ここで述べられるΔ１７デサチュラーゼ遺伝子およびその対応する酵素生成物を、ω−３脂肪酸を生成するために間接的に使用できる（国際公開第２００４／１０１７５７号パンフレットおよび国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレット参照）。ω−３／ω−６ＰＵＦＡの間接的生成は、中間工程または経路中間体の手段を通じて、脂肪酸基質が所望の脂肪酸生成物に間接的に転換する場合に起きる。したがってここで述べられるΔ１７デサチュラーゼ（例えばＰａＤ１７、ＰａＤ１７＊、ＰａＤ１７Ｓまたはその他の突然変異酵素、コドン最適化酵素またはそれらの相同体）をＰＵＦＡ生合成経路の酵素（例えばΔ６デサチュラーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Ｃ１４／１６エロンガーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、Δ９エロンガーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ４デサチュラーゼ、Ｃ２０／２２エロンガーゼ）をコードする追加的遺伝子と併せて発現して、より高いレベルのより鎖長の長いω−３脂肪酸（例えばＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡ）の生成をもたらしてもよいことが考察された。特定発現カセット内に含まれる特定遺伝子は、宿主細胞（およびそのＰＵＦＡプロフィールおよび／またはデサチュラーゼ／エロンガーゼプロフィール）、基質可用性、および所望最終産物に左右される。
【０１４７】
代案の実施態様では、ここで述べられる完全な配列、これらの完全な配列の相補体、これらの配列のかなりの部分、それに由来するコドン最適化デサチュラーゼ、およびそれらと実質的に相同的な配列に基づいて、宿主生物の天然Δ１７デサチュラーゼを中断することが有用かもしれない。例えば宿主生物における標的を定めたΔ１７デサチュラーゼ（そして場合によりΔ１５デサチュラーゼ）の中断は、ω−３脂肪酸を合成する能力低下を有する突然変異株を生じる。この突然変異株は、「純粋な」ω−６脂肪酸（ω−３脂肪酸の同時合成なし）を生成するために有用であるかもしれない。
【０１４８】
発現システム、カセット、およびベクター
本明細書で述べられる本配列の遺伝子および遺伝子生成物は、異種の宿主細胞の細胞中で発現されてもよい。組み換え宿主中での発現は、様々なＰＵＦＡ経路中間体を生成するために、または宿主を使用して従来可能でなかった新しい生成物を合成するのに宿主に既存のＰＵＦＡ経路を調節するために有用かもしれない。
【０１４９】
外来タンパク質の高レベル発現を導く制御配列を含有する、発現システムおよび発現ベクターは、当業者によく知られている。これらのいずれも本配列の遺伝子生成物のいずれかを生成するためのキメラ遺伝子を構築するのに使用できる。次に形質転換を通じてこれらのキメラ遺伝子を適切な宿主細胞に導入して、コードされた酵素の高レベル発現を提供できる。
【０１５０】
適切な宿主細胞の形質転換に有用なベクターまたはＤＮＡカセットは、当該技術分野でよく知られている。コンストラクト中に存在する配列の特定の選択は、所望の発現生成物（上述）、宿主細胞の性質、および提案される形質転換細胞と非形質転換細胞とを分離する手段に左右される。しかし典型的にベクターまたはカセットは、関連遺伝子の転写および翻訳を導く配列、選択性標識、および自律性複製または染色体組み込みを可能にする配列を含有する。適切なベクターは、転写開始を制御する遺伝子の５’領域（例えばプロモーター）、および転写終結を制御するＤＮＡ断片の３’領域（すなわちターミネーター）を含んでなる。双方の制御領域が形質転換された宿主細胞の遺伝子由来であることが最も好ましいが、このような制御領域は、必ずしも生成宿主として選択された特定種に天然の遺伝子に由来しなくてよいものと理解される。
【０１５１】
所望の宿主細胞中で、本Δ１７デサチュラーゼＯＲＦの発現を推進するのに有用な開始制御領域またはプロモーターは多数あり、当業者にはなじみが深い。選択された宿主細胞中でこれらの遺伝子の発現を導くことができる、実質的にあらゆるプロモーターが本発明に適する。宿主細胞中での発現は、一時的または安定様式で達成できる。一時的発現は、対象とする遺伝子に作動的に結合された、調節可能プロモーターの活性を誘導することで達成できる。安定発現は、対象とする遺伝子に作動的に結合された構成的プロモーターの使用によって達成できる。一例として宿主細胞が酵母菌の場合、酵母菌細胞中で機能する転写および翻訳領域は、特に宿主種から提供される（例えばヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中で使用するための好ましい転写開始調節領域については、国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレット［米国特許出願公開第２００６−０１１５８８１−Ａ１号明細書］を参照されたい）。構成的または誘導的転写が所望されるかどうか、対象とするＯＲＦを発現する上でのプロモーター効率、構築の容易さなど次第で、いくつかの調節配列のいずれか１つを使用できる。
【０１５２】
終結領域は、それから開始領域が得られた遺伝子の３’領域に、または異なる遺伝子に由来することができる。多数の終結領域が知られており、（それらが由来するのと同一および異なる属および種の双方で使用した際に）多様な宿主において満足に機能する。終結領域は、通常特定の特性のためと言うよりも便宜的に選択される。終結制御領域もまた、好ましい宿主に天然の様々な遺伝子に由来してもよい。場合により終結部位は不必要かもしれないが、含まれることが最も好ましい。
【０１５３】
当業者は認識しているように、遺伝子をクローニングベクターに単に挿入するだけでは、それが必要なレベルで成功裏に発現することは確証されない。高発現率の必要性に答えて、転写、翻訳、タンパク質安定性、酸素限界、および宿主細胞からの分泌の側面を制御するいくつかの異なる遺伝的要素を操作することで、多くの特殊化した発現ベクターが作り出されている。より具体的には、遺伝子発現を制御するように操作される分子の特徴のいくつかとして以下が挙げられる。１．）関連転写プロモーターおよびターミネーター配列の性質、２．）クローンされる遺伝子のコピー数、および遺伝子がプラスミド上にあるかまたは宿主細胞のゲノム内に組み込まれるかどうか、３．）合成された外来タンパク質の最終的細胞内位置、４．）宿主生物体中の翻訳効率およびタンパク質の正しい折りたたみ、５．）宿主細胞内のｍＲＮＡおよびクローン遺伝子タンパク質の本質的な安定性、および６．）頻度が宿主細胞の好むコドン使用頻度に近づくようなクローン遺伝子内のコドン使用。これらの各タイプの改変は、ここで述べられるΔ１７デサチュラーゼの発現をさらに最適化する手段として、本発明中に包含される。
【０１５４】
宿主細胞の形質転換
適切な宿主細胞中での発現に適したポリペプチドをコードするＤＮＡがひとたび得られたら、それを宿主細胞中で自律複製できるプラスミドベクターに入れ、またはそれを宿主細胞のゲノムに直接組み込む。発現カセットの組み込みは、宿主ゲノム中で無作為に起きることができ、または宿主遺伝子座での遺伝子組み換えを標的とするのに十分な宿主ゲノムとの相同性領域を含有するコンストラクトの使用を通じて、標的を定めることができる。コンストラクトが内在性遺伝子座に標的を定めれば、全てまたはいくつかの転写および翻訳調節領域を内在性遺伝子座によって提供できる。
【０１５５】
別々の複製ベクターから２つ以上の遺伝子が発現する場合、各ベクターは異なる選択手段を有することが望ましく、他のコンストラクトに対する相同性を欠いて、安定した発現を維持し、コンストラクト中の要素の再集合を防止すべきである。調節領域、選択手段、および導入コンストラクト増殖方法の思慮深い選択は、全ての導入された遺伝子が必要なレベルで発現して、所望の生成物の合成を提供するように実験的に判定できる。
【０１５６】
対象とする遺伝子を含んでなるコンストラクトは、あらゆる標準的技術によって宿主細胞に導入してもよい。これらの技術としては、形質転換（例えば酢酸リチウム形質転換［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９４：１８６〜１８７（１９９１年）］）、プロトプラスト融合、微粒子銃衝撃、電気穿孔、マイクロインジェクション、または宿主細胞中に対象とする遺伝子を導入するその他のあらゆる方法が挙げられる。
【０１５７】
便宜上、ＤＮＡ配列（例えば発現カセット）を取り込むように、あらゆる方法によって操作されている宿主細胞を「形質転換された」または「組み換え」とここで称する。形質転換された宿主は、遺伝子がゲノム中に組み込まれるか、増幅されるか、または複数のコピー数を有する染色体外要素上に存在するかどうか次第で、発現コンストラクトの少なくとも１つのコピーを有し、２つ以上を有してもよい。形質転換宿主細胞は、国際公開第２００４／１０１７５７号パンフレット、国際公開第２００５／００３３１０号パンフレットおよび国際公開第２００６／０５２７８０号パンフレットで述べられるようにして、様々な選択技術によって同定できる。
【０１５８】
形質転換に続いて、本Δ１７デサチュラーゼ（そして場合により、宿主細胞内で同時発現するその他のＰＵＦＡ酵素）に適した基質が、宿主によって自然にまたは遺伝子導入的に生成されてもよく、またはそれらは外来性に提供されてもよい。
【０１５９】
ω−３および／またはω−６脂肪酸生合成の代謝エンジニアリング
本Δ１７デサチュラーゼの配列の知識は、様々な宿主細胞中でのω−３および／またはω−６脂肪酸生合成を操作するために有用であろう。これは直接にＰＵＦＡ生合成経路内での代謝エンジニアリング、または炭素をＰＵＦＡ生合成経路に与える経路の追加的操作を必要とするかもしれない。望ましい生化学的経路をアップレギュレートし、望ましくない生化学的経路をダウンレギュレートするのに有用な方法は、当業者にはよく知られている。例えばエネルギーまたは炭素についてω−３および／またはω−６脂肪酸生合成経路と競合する生化学的経路、または特定のＰＵＦＡ最終産物の生成を妨げる天然ＰＵＦＡ生合成経路酵素を遺伝子中断によって排除し、またはその他の手段（例えばアンチセンスｍＲＮＡおよびジンクフィンガー標的技術）によってダウンレギュレートしてもよい。
【０１６０】
ＡＲＡ、ＥＰＡまたはＤＨＡを増大させる手段としてのＰＵＦＡ生合成経路内の操作の詳細な考察（およびその関連技術）は、国際公開第２００６／０５５３２２号パンフレット［米国特許出願公開第２００６−００９４０９２−Ａ１号明細書］、国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレット［米国特許出願公開第２００６−０１１５８８１−Ａ１号明細書］、および国際公開第２００６／０５２８７１号パンフレット［米国特許出願公開第２００６−０１１０８０６−Ａ１号明細書］でそれぞれ示され、ＴＡＧ生合成経路およびＴＡＧ分解経路中の望ましい操作（およびその関連技術）についても同様である。
【０１６１】
Δ１７デサチュラーゼの組み換え発現のための好ましい宿主
本遺伝子および核酸断片の発現のための宿主細胞としては、広範な温度およびｐＨで、単純または複合糖質、脂肪酸，有機酸、油、およびアルコール、および／または炭化水素をはじめとする多様な原材料上で生育する宿主が挙げられる。出願人らの譲受人のニーズに基づいて、本発明で述べられる遺伝子は、油性酵母菌（および特にヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））中での発現のために単離された。しかし転写、翻訳、およびタンパク質生合成器官は高度に保存されているので、あらゆる植物、細菌、酵母菌、藻類、卵菌および／または糸状菌が、本核酸断片の発現のための適切な宿主になることが考察される。
【０１６２】
好ましい宿主は、油性酵母菌などの油性生物体である。これらの油性生物体は自然に油の合成および蓄積ができ、油は細胞乾燥重量の約２５％を超え、より好ましくは細胞乾燥重量の約３０％を超え、最も好ましくは細胞乾燥重量の約４０％を超える量を構成できる。油性酵母菌として典型的に同定されている属としては、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。より具体的には、例証的な油合成酵母菌としては、ロドスポリジウム・トルイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、リポマイセス・スターケイ（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｔａｒｋｅｙｉｉ）、Ｌ．リポフェラス（Ｌ．ｌｉｐｏｆｅｒｕｓ）、カンジダ・レブカウフィ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｅｖｋａｕｆｉ）、Ｃ．プルケリマ（Ｃ．ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、Ｃ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、Ｃ．ユチリス（Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ）、トリコスポロン・プランス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｐｕｌｌａｎｓ）、Ｔ．クタネウム（Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ）、ロドトルラ・グルティナス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｕｓ）、Ｒ．グラミニス（Ｒ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（以前はカンジダ・リポリティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）として分類されていた）が挙げられる。
【０１６３】
最も好ましいのは油性酵母菌ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）であり、さらなる実施態様で最も好ましいのは、ＡＴＣＣ＃７６９８２、ＡＴＣＣ＃２０３６２、ＡＴＣＣ＃８８６２、ＡＴＣＣ＃１８９４４、および／またはＬＧＡＭＳ（７）１と称されるＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株である（Ｐａｐａｎｉｋｏｌａｏｕ  Ｓ．、およびＡｇｇｅｌｉｓ  Ｇ．、Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．８２（１）：４３〜９（２００２年））。
【０１６４】
Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるＥＰＡおよびＤＨＡのエンジニアリングのために適用できる特定の教示は、それぞれ米国特許出願第１１／２６５７６１号明細書（国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレット、米国特許出願公開第２００６−０１１５８８１−Ａ１号明細書）および米国特許出願第１１／２６４７３７号明細書（国際公開第２００６／０５２８７１号パンフレット、米国特許出願公開第２００６−０１１０８０６−Ａ１号明細書）で提供される。油性酵母（すなわちヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））中でのΔ１７デサチュラーゼを含んでなる発現ベクターの合成および形質転換のための詳細な手段は、国際公開第２００４／１０１７５７号パンフレットおよび国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレットで提供される。この酵母中で遺伝子を発現する好ましい方法は、宿主のゲノム中への線状ＤＮＡの組み込みによる。ゲノム中の複数位置への組み込みは、遺伝子の高レベル発現が所望される場合に特に有用であることができる［例えばＵｒａ３遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ３０６４２１）、Ｌｅｕ２遺伝子遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ２６０２３０）、Ｌｙｓ５遺伝子遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ３４９２９）、Ａｃｏ２遺伝子遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ００１３００）、Ｐｏｘ３遺伝子遺伝子座（Ｐｏｘ３：ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＰ＿５０３２４４；またはＡｃｏ３：ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ００１３０１）、Δ１２デサチュラーゼ遺伝子遺伝子座（国際公開第２００４／１０４１６７号パンフレット）、Ｌｉｐ１遺伝子遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｚ５００２０）および／またはＬｉｐ２遺伝子遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ０１２６３２）中への］。
【０１６５】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）において使用される好ましい選択方法は、カナマイシン、ハイグロマイシン、およびアミノグリコシドＧ４１８に対する抵抗性、ならびにウラシル、ロイシン、リジン、トリプトファンまたはヒスチジンを欠く培地に生育する能力である。代案の実施態様では、５−フルオロオロト酸（５−フルオロウラシル−６−カルボン酸一水和物、「５−ＦＯＡ」）が、酵母Ｕｒａ−突然変異体の選択のために使用される。化合物はオロチジン５’−一リン酸デカルボキシラーゼ（ＯＭＰデカルボキシラーゼ）をコードする機能性ＵＲＡ３遺伝子を有する酵母細胞に対して有毒である。したがってこの毒性に基づいて、５−ＦＯＡはＵｒａ−突然変異酵母株の選択および同定のために特に有用である（Ｂａｒｔｅｌ，Ｐ．Ｌ．およびＦｉｅｌｄｓ，Ｓ．、「Ｙｅａｓｔ  ２−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ」、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、第７巻、１０９〜１４７、１９９７年）。
【０１６６】
その他の好ましい微生物宿主としては、油性の細菌、藻類、卵菌綱、およびその他の真菌が挙げられ、この幅広い微生物宿主郡中で特に興味深いのはω−３／ω−６脂肪酸（または、この目的のために遺伝子操作可能なもの［例えば、サッカロミセス・セレヴィシエ(Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの他の酵母］）を合成する微生物である。したがって例えば誘導性プロモーターまたは調節プロモーター制御下にある本Δ１７デサチュラーゼ遺伝子のいずれかによる、（商業的にＡＲＡの生成のために使用される）モルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）の形質転換は、さらに多量のＥＰＡを合成できる形質転換生物を生じるかもしれない。Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）の形質転換法については、Ｍａｃｋｅｎｚｉｅら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６６：４６５５（２０００年）で述べられている。同様にヤブレツボカビ目（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）微生物の形質転換法について米国特許第７，００１，７７２号明細書で開示されている。
【０１６７】
ここで述べられるΔ１７デサチュラーゼの発現のために、どの特定の宿主が選択されようとも、所望の発現レベルおよびパターンを示す株を得るためには、複数の形質転換体をスクリーンするのが望ましい。このようなスクリーニングは、ＤＮＡブロットのサザン分析（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、９８：５０３（１９７５年））、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析（Ｋｒｏｃｚｅｋ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｐｐｌ．、６１８（１〜２）：１３３〜１４５（１９９３年））、タンパク質発現のウエスタンおよび／またはエライサ分析、ＰＵＦＡ生成物の表現型分析またはＧＣ分析を伴ってもよい。
【０１６８】
ω脂肪酸生成のための発酵過程
形質転換された宿主細胞は、キメラデサチュラーゼ遺伝子の発現を最適化する条件下で生育させて、最大かつ最も経済的な所望のＰＵＦＡ収率を生じさせる。一般に、最適化されてもよい培地条件としては、炭素源のタイプおよび量、窒素源のタイプおよび量、炭素−対−窒素比、異なる無機イオンの量、酸素レベル、生育温度、ｐＨ、バイオマス生成相の長さ、油蓄積相の長さ、および細胞収穫時間および方法が挙げられる。ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）は、一般に複合培地（例えば酵母菌抽出物−ペプトン−デキストロース液体培地（ＹＰＤ））で、または生育に必要な構成要素が欠如することで所望の発現カセットの選択を強要する合成最少培地（例えばＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）からの酵母菌窒素ベース）上で生育させる。
【０１６９】
本発明における発酵培地は適切な炭素源を含有しなくてはならない。適切な炭素源については、国際公開第２００４／１０１７５７号パンフレットで教示されている。本発明で利用される炭素源は多種多様な炭素含有源を包含してもよいことが考察されるが、好ましい炭素源は糖、グリセロール、および／または脂肪酸である。最も好ましいのはグルコースおよび／または１０〜２２個の炭素を含有する脂肪酸である。
【０１７０】
窒素は、無機（例えば（ＮＨ４）２ＳＯ４）または有機（例えば尿素またはグルタミン酸）源から供給されてもよい。適切な炭素および窒素源に加えて、発酵培地はまた、適切なミネラル、塩、補助因子、緩衝液、ビタミン、および油性宿主の生育と、ＰＵＦＡ生成に必須の酵素的経路の促進とに適した、当業者に既知であるその他の構成要素を含有しなくてはならない。脂質およびＰＵＦＡの合成を促進するいくつかの金属イオン（例えばＦｅ＋２、Ｃｕ＋２、Ｍｎ＋２、Ｃｏ＋２、Ｚｎ＋２、Ｍｇ＋２）が注目されている（Ｄ．Ｊ．ＫｙｌｅおよびＲ．Ｃｏｌｉｎ編、「Ｉｎｄ．Ａｐｐｌ．Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｏｉｌ」より、Ｎａｋａｈａｒａ，Ｔ．ら、６１〜９７（１９９２年）。
【０１７１】
本発明における好ましい増殖培地は、ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）からの酵母菌窒素ベースなどの一般的な市販の調製培地である。その他の合成または人工増殖培地もまた使用されてもよく、形質転換宿主細胞の生育に適する培地は、微生物学または発酵科学の当業者に知られている。発酵に適したｐＨ範囲は、典型的に約ｐＨ４．０〜ｐＨ８．０の間であり、ｐＨ５．５〜ｐＨ７．５が初期生育条件の範囲として好ましい。発酵は好気性または好気性条件下で実施されてもよく、微好気条件が好ましい。
【０１７２】
典型的に油性酵母菌細胞中のＰＵＦＡの高レベルの蓄積は、代謝状態が生育と脂肪合成／貯蔵との間で「平衡状態」でなくてはならないので、二段階過程を必要とする。したがって最も好ましくは、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるＰＵＦＡ生成には、二段階発酵過程が必要である。このアプローチについては国際公開第２００４／１０１７５７号パンフレットで述べられ、様々な適切な発酵過程デザイン（すなわちバッチ、供給バッチ、および連続）および成育中の考察事項についても同様に述べられる。
【０１７３】
食材、健康食品、医薬品、および動物飼料で使用するための油
市場は目下ω−３および／またはω−６脂肪酸（特にＡＬＡ、ＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡ）を組み込んだ多岐にわたる食物および飼料製品をサポートする。長鎖ＰＵＦＡを含んでなる本発明の油は、食物および飼料製品中で機能して本調合物の健康上の利点を与えることが考察される。より具体的にはω−３および／またはω−６脂肪酸を含有する本発明の油は、類似食品、飲料、肉製品、穀物製品、ベークド食品、スナック食品、および乳製品をはじめとするが、これに限定されるものではない多様な食物および飼料製品中で使用するのに適する（詳細については米国特許出願公開第２００６／００９４０９２号明細書を参照されたい）。
【０１７４】
さらに本油を調合物中で使用して、医療栄養物、栄養補助食品、乳児用調製粉乳ならびに医薬品をはじめとするメディカルフードに健康上の利点を与えてもよい。食物加工および食物調合の当業者は、どのように食物または飼料製品に本油の量および組成物を添加してもよいかを理解するであろう。このような量はここで「効果的」量と称され、食物または飼料製品、製品が栄養補給することが意図される食餌またはメディカルフード、または医療栄養物が矯正または治療することが意図される疾患に左右される。
【実施例】
【０１７５】
以下の実施例で、本発明をさらに定義する。これらの実施例は、発明の好ましい実施態様を示しながら、あくまで例示のために提供されるものとする。上の考察およびこれらの実施例から、当業者は本発明の必須特性を把握でき、その趣旨と範囲を逸脱することなく、本発明の様々な変更および改変を行って、それを様々な使用法および条件に適合できる。
【０１７６】
一般方法
実施例で使用する標準組み換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当該技術分野でよく知られており、１．）Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９年）（Ｍａｎｉａｔｉｓ）；２．）Ｔ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ、Ｍ．Ｌ．Ｂｅｎｎａｎ、およびＬ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ、「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４年）；および３．）Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅによる出版、Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ（１９８７年）で述べられる。
【０１７７】
微生物培養の維持および生育に適した材料および方法は、技術分野でよく知られている。以下の実施例で使用するのに適した技術については、次で述べられている。Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ、Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ、Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ、Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ、Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ、Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ、およびＧ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ編、「Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９４年）、またはＴｈｏｍａｓ，Ｄ．Ｂｒｏｃｋ、「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」、第２版、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ：Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（１９８９年）。微生物細胞の生育および維持のために使用される全ての試薬制限酵素および材料は、特に断りのない限り、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、またはＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得た。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ）コンピテント細胞は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は、典型的にルリア・ベルターニ（Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ）（ＬＢ）プレート上で３７℃で生育させた。
【０１７８】
一般分子クローニングは、標準法に従って実施した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）。ＤＮＡ配列は、ベクターとインサート特異的プライマーとの組み合わせを使用して、染料ターミネーター技術（米国特許第５，３６６，８６０号明細書、欧州特許第２７２，００７号明細書）を使用して、ＡＢＩ自動シーケンサー上で生成した。遺伝的配列の比較は、ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．からのＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアを使用して達成された。
【０１７９】
特に断りのない限り、ＢＬＡＳＴ（「基礎的局在性配列検索ツール（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）」Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９３年）およびＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２（１９９７年））を検索を実施して、ＢＬＡＳＴ「ｎｒ」データベース（全ての非冗長ＧｅｎＢａｎｋＣＤＳ翻訳、３次元構造ブルックヘブンタンパク質データバンク由来配列、スイスＰＲＯＴタンパク質配列データベース、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪデータベースを含んでなる）に含まれる配列に対する類似性を有する単離配列を同定した。国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）によって提供されるＢＬＡＳＴＮアルゴリズムを使用して、「ｎｒ」データベース中に含まれる公的に入手可能なＤＮＡ配列との類似性についてクエリー配列を分析した。配列を全ての読み枠で翻訳し、ＮＣＢＩによって提供されるＢＬＡＳＴＸアルゴリズム（Ｇｉｓｈ，Ｗ．およびＳｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３：２６６〜２７２（１９９３年））を使用して、「ｎｒ」データベースに含まれる全ての公的に入手できるタンパク質配列との類似性について比較した。クエリー配列がそれに対して最も高い類似性を有する配列を要約するＢＬＡＳＴ比較の結果を％同一性、％類似性、および期待値に従って報告する。「％同一性」は、２つのタンパク質間で同一のアミノ酸の百分率として定義される。「％類似性」は、２つのタンパク質間で同一のまたは保存されたアミノ酸の百分率として定義される。「期待値」は、この大きさのデータベース検索で期待される、絶対的に偶然の特定スコアでのマッチ数を明記して、マッチの統計学的有意さを推定する。
【０１８０】
略語の意味は以下の通り。「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ｄ」は日を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「μＭ」はマイクロモル濃度を意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌｅ」はマイクロモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「Ｕ」は単位を意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｋＢ」はキロベースを意味する。
【０１８１】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の形質転換および培養
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株ＡＴＣＣ登録番号＃２０３６２は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）から購入した。Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株は、通常ＹＰＤ寒天（１％酵母菌抽出物、２％バクトペプトン、２％グルコース、２％寒天）上で２８℃で生育させた。
【０１８２】
Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の形質転換は、特に断りのない限りＣｈｅｎ，Ｄ．Ｃ．ら、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４８（２）：２３２〜２３５（１９９７年）の方法に従って実施した。簡単に述べると、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）をＹＰＤプレート上に画線培養し、３０℃でおよそ１８時間生育させた。いくつかの大型白金耳を満たす細胞をプレートからこすり取り、平均分子量３３５０の２．２５ｍＬの５０％ＰＥＧ、ｐＨ６．０の０．１２５ｍＬの２Ｍ酢酸Ｌｉ、および０．１２５ｍＬの２Ｍ  ＤＴＴを含有する１ｍＬの形質転換緩衝液に再懸濁した。次に約５００ｎｇの直線化プラスミドＤＮＡを１００μＬの再懸濁細胞内でインキュベートし、１５分間隔でボルテックス混合しながら３９℃に１時間保った。細胞を選択培地プレートに蒔いて、３０℃に２〜３日間保った。
【０１８３】
形質転換体の選択のためには、一般に最少培地（「ＭＭ」）を使用した。ＭＭの組成は以下のとおり。ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）からの硫酸アンモニウムまたはアミノ酸を含まない０．１７％酵母菌窒素ベース、２％グルコース、０．１％プロリン、ｐＨ６．１。必要に応じてロイシン、リジンおよび／またはウラシルのサプリメントを最終濃度０．０１％に添加した（それによってそれぞれ２０ｇ／Ｌの寒天で調製される「ＭＭＬｅｕ」、「ＭＭＬｙｓ」、および「ＭＭＵ」選択培地を生成した）。
【０１８４】
代案としては、次を含んでなる５−フルオロオロチン酸（「ＦＯＡ」、また５−フルオロウラシル−６−カルボン酸一水和物とも）選択培地上で形質転換体を選択した。ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからの硫酸アンモニウムまたはアミノ酸を含まない０．１７％酵母窒素ベース、２％グルコース、０．１％プロリン、７５ｍｇ／Ｌのウラシル、７５ｍｇ／Ｌのウリジン、Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．（Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ）からの９００ｍｇ／Ｌ  ＦＯＡ、および２０ｇ／Ｌの寒天。
【０１８５】
最終的に、高グルコース培地（「ＨＧＭ」）を、油性の状態を促進する手段として、次のように調製した。６．３ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、２７ｇ／Ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４、および８０ｇ／Ｌ  グルコース（ｐＨ７．５）。
【０１８６】
ここでＹ４００１Ｕ１、Ｙ４０３６Ｕ、およびＬ３８と同定された株を作り出すのに使用された方法は、部位特異的リコンビナーゼ系に依存する。簡単に述べると、部位特異的組み換え系は、（１）特徴的なＤＮＡ配列［例えば、ＬｏｘＰ］を有する組み換え部位、および（２）２つ以上の組み換え部位が同一ＤＮＡ分子上の特定の間隔で同一方向を向く場合に、ＤＮＡ配列と特異的に結合してＤＮＡ配列間の組み換え（すなわち切除）を触媒するリコンビナーゼ酵素［例えばＣｒｅ］、の２つの要素からなる。ここでの目的で、組み換え部位で挟まれた、宿主ゲノムに挿入することが望ましい標的遺伝子（すなわち第１の選択マーカー［すなわちＵｒａ３またはＬｅｕ２］）を含んでなる組み込みコンストラクトを作り出した。形質転換、および形質転換体の選択に続いて、第２の選択マーカー（すなわちＬｅｕ２またはスルホニル尿素抵抗性［ＡＨＡＳ］）、およびゲノムに導入された部位特異的組み換え部位認識するのに適したリコンビナーゼ（すなわちＣｒｅ）を持つ複製型プラスミドを導入して、第１の選択マーカーを染色体から切除した。第２のマーカーを持つ形質転換体を選択したら、次に複製型プラスミドを選択の不在下で宿主からキュアリングして、キュアリング株の宿主ゲノムからの第１の選択マーカーの切除をＵｒａまたはＬｅｕ原栄養性の喪失によって確認した。これによって第１または第２の選択マーカーのどちらも持たない形質転換体が生成し、したがって第１の選択マーカーを使用した次回の形質転換のためのキュアリング株が入手できた。ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）で使用するための部位特異的リコンビナーゼベースの方法に関する追加的な詳細については、国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレットで述べられている。
【０１８７】
ｐＹ１１７（実施例１６）で利用された第２の選択マーカー遺伝子は、スルホニル尿素除草剤抵抗性（ＳＵＲ、国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレットで述べられている）を与える単一アミノ酸変化（Ｗ４９７Ｌ）を含有する、天然ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳまたはアセト乳酸シンターゼ、Ｅ．Ｃ．４．１．３．１８、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＭ_５０１２７７）であった。ＡＨＡＳは分枝−鎖アミノ酸の生合成のための経路内の第１の共通の酵素であり、それはスルホニル尿素およびイミダゾリノン除草剤の標的である。
【０１８８】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の脂肪酸分析
脂肪酸分析のために、Ｂｌｉｇｈ，Ｅ．Ｇ．およびＤｙｅｒ，Ｗ．Ｊ．、Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７：９１１〜９１７（１９５９年）で述べられるように、細胞を遠心分離して収集し、脂質を抽出した。ナトリウムメトキシドでの脂質抽出物のエステル交換反応によって、脂肪酸メチルエステルを調製し（Ｒｏｕｇｈａｎ，Ｇ．およびＮｉｓｈｉｄａ，Ｉ．、Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．２７６（１）：３８〜４６（１９９０年））、引き続きＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄからの３０ｍ×０．２５ｍｍ（内径）ＨＰ−ＩＮＮＯＷＡＸカラムを装着したＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ６８９０  ＧＣで分析した。オーブン温度は３．５℃／分で、１７０℃（２５分間保持）から１８５℃であった。
【０１８９】
直接塩基エステル交換のために、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）培養物（３ｍＬ）を収集し、蒸留水で１回洗浄し、スピードバック（Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ）内で真空下において５〜１０分乾燥させた。ナトリウムメトキシド（１００μＬの１％）をサンプルに添加して、次にサンプルをボルテックスし２０分間振盪した。３滴の１Ｍ  ＮａＣｌおよび４００μＬのヘキサンを添加した後、サンプルをボルテックスして遠心分離した。上層を除去して上述のようにＧＣで分析した。
【０１９０】
実施例１
ピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）脂質プロフィール、総ＲＮＡ単離、およびゲノムＤＮＡ単離
Ｌｉｓａ  Ｈｏｆｆｍａｎ（Ｅ．Ｉ．ｄｕＰｏｎｔ  ｄｅ  Ｎｅｍｏｕｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｌｉｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）からピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）株を得た。
【０１９１】
麦芽エキス寒天培地（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）上で室温で３日間株を成長させた。細胞をプレートから掻き取って、メタノールに溶解した６００μｌのナトリウムメトキシドに再懸濁した。サンプルを２０分間振盪して、５０μｌの１Ｍ  ＮａＣｌを添加した。混合後、６００μｌのヘプタンを添加した。サンプルをボルテックスして、エッペンドルフ微量遠心管内で１分間遠心分離した。上層を下層から注意深く分離して、ＧＣ分析のためにガラスバイアルに入れた。分析結果を下の表４に示す。脂肪酸は１６：０（パルミチン酸）、１６：１（パルミトレイン酸）、１８：０、１８：１（オレイン酸）、１８：２、ＧＬＡ、２０：１、２０：２、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＰＡ、およびＤＨＡと同定され、それぞれの組成は総脂肪酸の％で表される。
【０１９２】
【表８】
2010508019.tif 000010
【０１９３】
ＡＲＡおよびＥＰＡの存在に基づいて、Ｐ．アファニデルマタム（ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）株は、恐らくΔ５デサチュラーゼ（ＤＧＬＡをＡＲＡに変換できる）およびΔ１７デサチュラーゼ（ＡＲＡをＥＰＡに変換できる）の双方を有したと結論された。
【０１９４】
総ＲＮＡおよびゲノムＤＮＡは、トリゾール試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、麦芽エキス寒天プレートから掻き取った細胞から単離された。具体的には掻き取った細胞を１ｍＬの水に再懸濁して、エッペンドルフ微量遠心管内で３０秒間遠心分離した。細胞ペレットを０．７５ｍＬのトリゾール試薬に再懸濁し、０．７５ｍＬの０．５ｍｍガラスビーズと混合して、Ｂｉｏｓｐｅｃ  ｍｉｎｉ  ｂｅａｄｂｅａｔｅｒ（Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ，ＯＫ）内で最強設定で３分間均質化した。混合物をエッペンドルフ遠心機内で１４，０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離して、残骸片およびガラスビーズを除去した。上清を１５０μｌの２４：１のクロロホルム：イソアミルアルコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で抽出した。上部水相をＲＮＡ単離のために、下部有機相をＤＮＡ単離のために使用した。
【０１９５】
ＲＮＡ単離のために、水相を０．３７５ｍＬのイソプロピルアルコールと混合し、室温で５分間インキュベートした。沈殿したＲＮＡを８０００ｒｐｍおよび４℃で５分間の遠心分離によって収集した。ペレットを０．７ｍＬの８０％エタノールで１回洗浄し、風乾した。総ＲＮＡ（５９μｇ）が得られた（すなわち２９．５μｇ／μｌで２００μｌのサンプル）。
【０１９６】
ゲノムＤＮＡ単離のために、サンプルの下部有機相を２２５μｌのエタノールと混合して、室温で５分間インキュベートした。次にサンプルをエッペンドルフ遠心機内で５０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。ペレットを０．７５ｍＬの０．１Ｍクエン酸ナトリウム／１０％エタノールで２回洗浄した。毎回サンプルを洗浄液中で室温で１５分間インキュベートして、エッペンドルフ遠心機内での５０００ｒｐｍおよび４℃で５分間の遠心分離がそれに続いた。ペレットを風乾して、３００μｌの８ｍＭ  ＮａＯＨに再溶解した。サンプルのｐＨを１Ｍ  ＨＥＰＥＳで７．５に調節して、次にＱｉａｇｅｎ  ＰＣＲ精製キットを用いて、厳密に製造業者のプロトコールで述べられているようにしてさらに精製した。合計７．２μｇのＰ．アファニデルマタム（ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）ゲノムＤＮＡが得られた。
【０１９７】
実施例２
ピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）ｃＤＮＡの合成
ＢＤ−ＣｌｏｎｔｅｃｈＣｒｅａｔｏｒ（商標）Ｓｍａｒｔ（商標）ｃＤＮＡライブラリーキット（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）を使用して、ピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）総ＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを直接に合成した。具体的には、３μｌの総ＲＮＡサンプル（０．９μｇ）を１μｌのＳＭＡＲＴ（商標）ＩＶオリゴヌクレオチド（配列番号９）および１μｌのＣＤＳＩＩＩ／３’ＰＣＲプライマー（配列番号１０）と混合した。混合物を７５℃で５分間加熱して、氷上で５分間冷却した。２μｌの５×第１ストランド緩衝液、１μｌの２０ｍＭ  ＤＴＴ、１μｌのｄＮＴＰミックス（各１０ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ）、および１μｌのＰｏｗｅｒＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素を混合物に添加した。サンプルを４２℃で１時間インキュベートした。
【０１９８】
次に得られた第１ストランドｃＤＮＡ合成混合物をＰＣＲ増幅のためのテンプレートとして使用した。反応混合物は、２μｌの上記第１ストランドｃＤＮＡサンプル、８０μｌの水、１０μｌの１０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ２ＰＣＲ緩衝液、２μｌの５０×ｄＮＴＰミックス（各１０ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ）、２μｌの５’ＰＣＲプライマー（配列番号１１）、２μｌのＣＤＳＩＩＩ／３’ＰＣＲプライマー（配列番号１０）および２μｌの５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ２ポリメラーゼミックスを含有した。サーモサイクラー条件を９５℃で１分間、次に９５℃で１０秒間および６８℃で６分間を２０サイクルに設定した。
【０１９９】
Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲ精製キットを用いて製造業者のプロトコールに厳格に従って、増幅生成物を精製した。精製されたｃＤＮＡ生成物を５０μｌの水で溶出した。
【０２００】
実施例３
ピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）Δ１７デサチュラーゼ遺伝子のコード領域の一部の単離
本実施例は、その他の既知のΔ１７デサチュラーゼ配列の保存領域に由来するプライマーの使用による、Δ１７デサチュラーゼをコードするピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）遺伝子（ここで「ＰａＤ１７」と称する（配列番号１および２））の一部の同定について述べる。
【０２０１】
フィトフトラ・ソジャ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅ）（配列番号４５、２００７年４月１８日出願の米国特許出願第１１／７８７７７２号明細書、下の実施例１１も参照されたい）およびフィトフトラ・ラモルム（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｒａｍｏｒｕｍ）（配列番号４７、２００７年４月１８日出願の米国特許出願第１１／７８７７７２号明細書、下の実施例１３も参照されたい）のΔ１７脂肪酸デサチュラーゼ配列に基づいて、有望なΔ１７デサチュラーゼ遺伝子の一部を増幅するようにデザインされた縮重プライマーを使用したＰＣＲのためのテンプレートとして、実施例２からのＰ．アファニデルマタム（ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）ｃＤＮＡサンプルを使用した。ここで図２として提供される配列比較に基づいて、縮重プライマーを表５に示すように命名した（配列番号４５および４７に対するプライマーの位置は、図２に点線枠として示す）。
【０２０２】
【表９】
2010508019.tif 000011
【０２０３】
７つの順方向および７つの逆方向プライマーの全ての可能な組み合わせを使用して、合計４９の異なるＰＣＲ増幅反応を実施した。各反応混合物は、１μｌの１：１０希釈Ｐ．アファニデルマタム（ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）ｃＤＮＡ、各５μｌの順方向および逆方向プライマー（２０μＭ）、１４μｌの水、および２５μｌのＴａＫａＲａ  ＥｘＴａｑ  ２×プレミックス（ＴａＫａＲａ  Ｂｉｏ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を含有した。サーモサイクラー条件を９４℃で１分間、次に９４℃で２０秒間、５５℃で２０秒間、および７２℃で１分間を３０サイクルと、それに続く７２℃で７分間の最終延長に設定した。ＰＣＲ産物を標準アガロースゲル上での電気泳動法によって分析し、推定上のΔ１７デサチュラーゼ断片が下の表６に示すように検出された。
【０２０４】
【表１０】
2010508019.tif 000012
【０２０５】
上の表６で述べられる各断片は、Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲ精製キット（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングして配列決定した。
【０２０６】
ＢＬＡＳＴ配列分析は、各断片が、その他の生物からの既知のΔ１７デサチュラーゼと大きな相同性を示す単一遺伝子からのものであることを示した。Ｐ．アファニデルマタム（ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）からの推定上のΔ１７デサチュラーゼをコードすると想定される６１４ｂｐコンティグ（配列番号５）中に配列をアセンブルした。
【０２０７】
実施例４
ピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）からの全長Δ１７デサチュラーゼの単離
配列番号５に記載のおよび実施例３で述べられている部分的配列に基づいて、Ｐ．アファニデルマタム（ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）のｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡサンプルから推定上のΔ１７デサチュラーゼ遺伝子の５’および３’末端を単離するように、プライマーがデザインされた。
【０２０８】
Ｐ．アファニデルマタム（ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）からの推定上のΔ１７デサチュラーゼの５’領域は、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ（商標）キット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して、製造業者のプロトコールに従ってゲノム歩行によって単離した。最初にＰ．アファニデルマタム（ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）からのゲノムＤＮＡ（消化あたり１μｇ）をＤｒａＩ、ＥｃｏＲＶ、ＰｖｕＩＩ、およびＳｔｕＩで別々に消化した。消化されたＤＮＡサンプルをＱｉａｇｅｎ酵素反応クリーンアップキットを用いて製造業者のプロトコールに従って精製し、各サンプルを２０μｌの水で溶出した。
【０２０９】
消化されたゲノムＤＮＡサンプルを下図のようにＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ（商標）アダプター（配列番号３４［上側ストランド］および３５［下側ストランド］）とライゲートした。
5'-GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGGT-3’
3'-H2N-CCCGACCA-5’
【０２１０】
具体的には、各４μｌの消化されたＤＮＡを１．９μｌの２５μＭ  ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅ（商標）アダプター、１．６μｌの１０×ライゲーション緩衝液、および０．５μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼと混合した。反応を１６℃で一晩実施した。７０℃で５分間の加熱後、７２μｌの１０ｍＭトリス、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４緩衝液を各反応混合物に添加した。次にこれらの反応混合物をＰＣＲ増幅のためのテンプレートとして使用した。
【０２１１】
第１回目のＰＣＲのために、プライマーＰＵＤ１７−５−１（配列番号３６）およびキットからのＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ（商標）プライマーＡＰ１（配列番号３７）を使用した。反応混合物は、各１μｌの１０μＭ  プライマー、テンプレートとしての２μｌの精製されたライゲーション生成物、２１μｌの水、および２５μｌのＴａＫａＲａ  ＥｘＴａｑ  ２×プレミックスを含有した。サーモサイクラー条件を９４℃で９０秒間、次に９４℃で２０秒間、５５℃で２０秒間、および７２℃で２分間を３０サイクルと、それに続く７２℃で５分間の最終延長に設定した。
【０２１２】
ＰＣＲ産物を１：２０に希釈して、１μｌの希釈されたＰＣＲ産物をプライマーＰＵＤ１７−５−３（配列番号３８）およびＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ（商標）プライマーＡＰ２（配列番号３９）を使用した第２回目のＰＣＲのためのテンプレートとして使用した。ＰＣＲ構成要素および増幅条件は上述のとおりであった。
【０２１３】
第２回目のＰＣＲから約７５０ｂｐのＤＮＡ断片が作り出された。この断片をＱｉａｇｅｎ  ＰＣＲ精製キットを用いて精製し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングして配列決定した。引き続く配列分析は、この断片が翻訳開始コドンおよび３８７ｂｐの追加的非翻訳５’配列を含む、推定上のΔ１７デサチュラーゼ遺伝子の５’末端を含有することを示した。５’断片（配列番号６）は、サプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ）Δ１７デサチュラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＲ２０４４４、配列番号９５）と顕著な相同性を有した。
【０２１４】
Ｐ．アファニデルマタム（ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）ｃＤＮＡをテンプレートとして使用し、ＰＣＲ増幅によって推定上のΔ１７デサチュラーゼの３’領域を単離した。プライマーＰＵＤ１７−３−１（配列番号４０）およびＣＤＳＩＩＩ／３’ＰＣＲプライマー（配列番号１０、ＢＤ−Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｃｒｅａｔｏｒ（商標）Ｓｍａｒｔ（商標）ｃＤＮＡライブラリー構築キットから、実施例１参照）を第１回目の増幅のために使用した。反応混合物は、各１μｌのプライマー（１０μＭ）、１μｌのＰ．アファニデルマタム（ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）ｃＤＮＡ、２２μｌの水、および２５μｌのＴａＫａＲａ  ＥｘＴａｑ２×プレミックスを含有した。サーモサイクラー条件を９４℃で９０秒間、次に９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、および７２℃で３０秒間を３０サイクルと、それに続く７２℃で５分間の最終延長に設定した。
【０２１５】
ＰＣＲ産物を１：２０に希釈し、上述のような構成要素および増幅条件を使用して、１μｌの希釈生成物をＰＵＤ１７−３−２（配列番号４１）およびＣＤＳＩＩＩ／３’ＰＣＲプライマー（配列番号１０）を使用した第２回目のＰＣＲのためのテンプレートとして使用した。第２回目のＰＣＲからは約５５０ｂｐのＤＮＡ断片が作り出された。これをＱｉａｇｅｎ  ＰＣＲ精製キット用いて精製し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ中にクローニングして配列決定した。配列分析はこの断片が、ポリＡテイルを含む推定上のΔ１７デサチュラーゼｃＤＮＡの３’−領域を含有したことを示した。３’断片（配列番号７）は、サプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ）Δ１７デサチュラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＲ２０４４４、配列番号９５）と顕著な相同性を有した。
【０２１６】
５’ゲノムの領域（配列番号６）、オリジナルの部分的ｃＤＮＡ配列（配列番号５）、および３’ｃＤＮＡ配列（配列番号７）のアセンブリーは、Ｐ．アファニデルマタム（ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）からの推定上のΔ１７デサチュラーゼの完全な配列、および追加的な非翻訳５’および３’末端を含んでなる１５３３ｂｐのコンティグ（配列番号８）をもたらした。配列番号１として記載される配列番号８のコード領域は、１０８０ｂｐの長さであり（配列番号８の塩基３８８〜１４６７に対応する）、３５９個のアミノ酸のペプチド（配列番号２）をコードする。ピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）のコード配列は、ここで「ＰａＤ１７」と称された。
【０２１７】
全長ＰａＤ１７遺伝子（すなわち配列番号１）をクエリー配列として使用したＢＬＡＳＴ検索の結果は、それがサプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ）のΔ１７デサチュラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＲ２０４４４）のアミノ酸配列と、期待値ｅ−１２１で５８％の同一性および７１％類似性を有し、さらにそれがその他のω−３デサチュラーゼとの同一性および類似性を有したことを示した。
【０２１８】
同様に、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ分析（ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアのＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラム）を使用した、フィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）（「ＰｉＤ１７」、配列番号４３）、フィトフトラ・ソジャ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅ）（「ＰｓＤ１７」、配列番号４５）、フィトフトラ・ラモルム（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｒａｍｏｒｕｍ）（「ＰｒＤ１７」、配列番号４７）、およびピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）（「ＰａＤ１７」、配列番号２）からのΔ１７デサチュラーゼタンパク質の間のペアワイズ比較は、ＰｉＤ１７およびＰａＤ１７の間で７４．５％、ＰｒＤ１７およびＰａＤ１７の間で７５．０％、およびＰｓＤ１７およびＰａＤ１７の間で７５．３％の％類似性をもたらした。
【０２１９】
実施例５
ピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）Δ１７デサチュラーゼ（「ＰａＤ１７」）を含んでなるヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）発現ベクターの産生
本実施例は、それぞれキメラＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７＊：：ＸＰＲ遺伝子を含んでなるプラスミドｐＦｍＤ１７−１、ｐＦｍＤ１７−２、ｐＦｍＤ１７−３ｍ、およびｐＦｍＤ１７−４の構築について述べ、ＰａＤ１７＊（配列番号３）は配列番号２に関して２個までの（およびそれを含む）アミノ酸変異を含んでなる。プラスミドｐＦｍＤ１７−１、ｐＦｍＤ１７−２、ｐＦｍＤ１７−３、およびｐＦｍＤ１７−４は、下の実施例７で述べられているようにＰａＤ１７＊の機能発現を試験するために利用された。
【０２２０】
プラスミドｐＦｍＤ１７−１、ｐＦｍＤ１７−２、ｐＦｍＤ１７−３、およびｐＦｍＤ１７−４は、プラスミドｐＦｍＤ８Ｓ、ＰａＤ１７の５’部分、およびＰａＤ１７の３’部分からの断片を使用して、三元ライゲーションによって構築された。プラスミドｐＦｍＤ８Ｓ（配列番号５１、図３Ｄ）は、プラスミドｐＫＵＮＦｍｋＦ２、ｐＤＭＷ２８７Ｆ、およびｐＤＭＷ２１４からの断片を使用して、三元ライゲーションによって構築された。
【０２２１】
プラスミドｐＫＵＮＦｍｋＦ２
ｐＫＵＮＦｍｋＦ２（配列番号４８、図３Ａ、国際公開第２００６／０１２３２６号パンフレット）は、キメラＦＢＡＩＮｍ：：Ｆ．Ｄ１２：：Ｌｉｐ２遺伝子（「ＦＢＡＩＮｍＫ」はヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＦＢＡＩＮｍプロモーター［国際公開第２００５／０４９８０５号パンフレット、米国特許第７，２０２，３５６号明細書］であり、「Ｆ．Ｄ１２」はフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１２デサチュラーゼ［国際公開第２００５／０４７４８５号パンフレット］であり、「Ｌｉｐ２」はヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｌｉｐ２ターミネーター配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ０１２６３２）である）を含んでなるコンストラクトである。
【０２２２】
プラスミドｐＤＭＷ２８７Ｆ
ｐＤＭＷ２８７Ｆ（配列番号４９、図３Ｂ、国際公開第２００６／０１２３２６号パンフレット）は、野生型ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）に由来してヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された合成Δ８デサチュラーゼ（「ＥｇＤ８Ｓ」、ここでの配列番号５２）を含んでなるコンストラクトである（図中でＥｇＤ８Ｓは「Ｄ８ＳＦ」と同定される）。デサチュラーゼ遺伝子は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＦＢＡＩＮプロモーター（国際公開第２００５／０４９８０５号パンフレット、米国特許第７，２０２，３５６号明細書、図中では「ＦＢＡ１＋イントロン」と同定される）およびヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Ｐｅｘ１６遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ７５４３３）のＰｅｘ１６ターミネーター配列で挟まれる。
【０２２３】
プラスミドｐＤＭＷ２１４
ｐＤＭＷ２１４（配列番号５０、図３Ｃ、国際公開第２００５／０４９８０５号パンフレット、米国特許第７，２０２，３５６号明細書）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）双方の中で複製するシャトルプラスミドである。それは次の構成要素を含有した。
【０２２４】
【表１１】
2010508019.tif 000013
【０２２５】
プラスミドｐＦｍＤ８Ｓ
プラスミドｐＫＵＮＦｍｋＦ２のＰｍｅＩ／ＮｃｏＩ断片（図３Ａ、ＦＢＡＩＮｍプロモーターを含んでなる）およびプラスミドｐＤＭＷ２８７ＦのＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ断片（図３Ｂ、合成Δ８デサチュラーゼ遺伝子「ＥｇＤ８Ｓ」を含んでなる）を一方向性に使用して、ｐＤＭＷ２１４（図３Ｃ）のＰｍｅＩ／ＮｏｔＩ断片を置換した。これはキメラＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｓ：：ＸＰＲ遺伝子を含んでなるｐＦｍＤ８Ｓ（配列番号５１、図３Ｄ）の産生をもたらした。したがってｐＦｍＤ８Ｓの構成要素は下の表８で述べられているようである。
【０２２６】
【表１２】
2010508019.tif 000014
【０２２７】
プラスミドｐＦｍＤ１７−１、ｐＦｍＤ１７−２、ｐＦｍＤ１７−３、およびｐＦｍＤ１７−４の産生
Ｐ．アファニデルマタム（ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）Δ１７デサチュラーゼを次を含有する反応混合物によってｃＤＮＡから増幅した。１μｌの２０μＭ順方向プライマーＰＵＤ１７−Ｆ（配列番号５４）、１μｌの２０μＭ逆方向プライマーＰＵＤ１７−Ｒ（配列番号５５）、１μｌのＰ．アファニデルマタム（ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）ｃＤＮＡ、１０μｌの５×ＰＣＲ緩衝液、１μｌのｄＮＴＰミックス（各１０μＭ）、３５μｌの水、および１μｌのＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）。サーモサイクラー条件を９８℃で１分間、次に９８℃で１０秒間、５５℃で１０秒間、および７２℃で３０秒間を３０サイクルと、それに続く７２℃で５分間の最終延長に設定した。
【０２２８】
ＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングして、８つの個々のクローンを配列決定した。配列結果に基づいて、２つのクローン（すなわちクローン２およびクローン４）を使用して、最終発現プラスミドを構築した。クローン２が配列番号２に関して３５１ＡからＴへの変異を含有したのに対して、クローン４は配列番号２に関して１５５ＳからＰへの変異を含有した。したがってそれらは２個の保存的アミノ酸置換について互いに異なり、それらは１個の保存的アミノ酸置換について、配列番号２に記載の野生型ｃＤＮＡＰａＤ１７配列とそれぞれ異なった。
【０２２９】
各クローンをＮｃｏＩおよびＢｇｌＩＩで消化して、Δ１７デサチュラーゼｃＤＮＡの５’領域を含有する約３７０ｂｐの断片を作り出した。各クローンをＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩでも消化して、ｃＤＮＡの３’領域を含有する７１０ｂｐの断片を作り出した。Δ１７デサチュラーゼの５’領域を含んでなる約３７０ｂｐの断片、およびΔ１７デサチュラーゼの３’領域を含んでなる７１０ｂｐの断片を三元ライゲーション反応において、（コドン最適化されたΔ８デサチュラーゼ遺伝子［「ＥｇＤ８Ｓ」］がプラスミドから切除されるように）ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで前消化されたｐＦｍＤ８Ｓ中にライゲートした。反応混合物は、１０μｌの２×ライゲーション緩衝液および１μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒω）、各４μｌの５’および３’Δ１７デサチュラーゼ断片（各約３００ｎｇ）、および１μｌのｐＦｍＤ８Ｓ（約１５０ｎｇ）を含有した。
【０２３０】
上の方法を使用して、新たに作り出された発現プラスミドｐＦｍＤ１７−１、ｐＦｍＤ１７−２、ｐＦｍＤ１７−３、およびｐＦｍＤ１７−４の構成要素は、ｐＦｍＤ１７ベクターがｐＦｍＤ８Ｓ中でキメラＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｓ：：ＸＰＲ遺伝子の代わりにキメラＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７＊：：ＸＰＲ遺伝子を有したことを除いて、ｐＦｍＤ８Ｓ（配列番号５１）について表８で述べられているものと同一である。「ＰａＤ１７＊」の表記法は、配列番号２に関する下の変異に対応する（すなわち実施例４で述べられているようなＰａＤ１７のアミノ酸）。ｎｕｌｌ変異、１５５ＳからＰへの変異、３５１ＡからＴへの変異、および１５５ＳからＰへのおよび３５１ＡからＴへの変異はそれぞれ配列番号３に包含され、下文においてＰａＤ１７＊と称される。下の表９に示すように、４つの変異型発現プラスミドは、２つのクローンの組み合わせに基づいて次の変異を含有した。
【０２３１】
【表１３】
2010508019.tif 000015
【０２３２】
各反応混合物を室温で２時間インキュベートして、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ１０コンピテント細胞を形質転換するのに使用した。形質転換体からのプラスミドＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを用いて回収した。
【０２３３】
実施例６
Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路を通じて総脂質の約１１％ＡＲＡを生成するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２０４７株の産生
本実施例は、Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路の発現を通じて、総脂質に対して１１％のＡＲＡを生成できる、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２に由来するＹ２０４７株の構築について述べる（図４Ａ）。この株を利用して、下の実施例７のＰａＤ１７＊の機能発現を試験した。
【０２３４】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２０４７株はブダペスト条約の条項に従って寄託され、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−７１８６を有する。さらにＹ２０４７の構築については、参照によって本明細書に援用する、同時係属米国特許出願第１１／２６５７６１号明細書（米国特許出願公開第２００６−０１１５８８１  Ａ１号明細書および国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレット）で述べられている。
【０２３５】
Ｙ２０４７株の発生には、最初にＭ４株（８％のＤＧＬＡを生成する）の構築を必要とする。
【０２３６】
総脂質の約８％のＤＧＬＡを生成するためのＭ４株の発生
コンストラクトｐＫＵＮＦ１２Ｔ６Ｅ（図４Ｂ；配列番号５６）を発生させて４個のキメラ遺伝子（Δ１２デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、および２個のＣ１８／２０エロンガーゼを含んでなる）を野性型ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２株のＵｒａ３遺伝子座に組み込み、それによってＤＧＬＡの生成を可能にした。ｐＫＵＮＦ１２Ｔ６Ｅプラスミドは、以下の構成要素を含有した。
【０２３７】
【表１４】
2010508019.tif 000016
【０２３８】
一般方法に従ってｐＫＵＮＦ１２Ｔ６ＥプラスミドをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次に野性型Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２の形質転換のために使用した。形質転換体細胞をＦＯＡ選択培地プレート上に播種し、３０℃に２〜３日間保った。ＦＯＡ抵抗性コロニーを拾って、ＭＭおよびＭＭＵ選択プレート上に画線培養した。ＭＭＵプレート上に生育できたが、ＭＭプレート上には生育できなかったコロニーをＵｒａ−株として選択した。次にＵｒａ−株の単一コロニーを３０℃の液体ＭＭＵに接種して、２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。遠心分離によって細胞を収集し、脂質を抽出してエステル交換により脂肪酸メチルエステルを調製して、引き続いてＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ６８９０  ＧＣで分析した。
【０２３９】
ＧＣ分析は、ｐＫＵＮＦ１２Ｔ６Ｅの４個のキメラ遺伝子を含有する形質転換体中にＤＧＬＡの存在を示したが、野性型ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）対照株では示されなかった。選択された３２個のＵｒａ−株のほとんどが総脂質の約６％のＤＧＬＡを生成した。総脂質の約８％のＤＧＬＡを生成した２株（すなわちＭ４株および１３−８）があった。
【０２４０】
総脂質の約１１％ＡＲＡを生成するＹ２０４７株の発生
コンストラクトｐＤＭＷ２７１（図４Ｃ；配列番号５９）を発生させて、３個のΔ５キメラ遺伝をヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Ｍ４株のＬｅｕ２遺伝子に組み込んだ。表１１で述べられるように、プラスミドｐＤＭＷ２７１は以下の構成要素を含有した。
【０２４１】
【表１５】
2010508019.tif 000017
【０２４２】
一般方法に従ってプラスミドｐＤＭＷ２７１をＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次にＭ４株に形質転換した。形質転換に続いて、細胞をＭＭＬｅｕプレート上に播種し、３０℃に２〜３日間保った。ＭＭＬｅｕプレートの上で生育した個々のコロニーを拾って、ＭＭおよびＭＭＬｅｕプレート上に画線培養した。ＭＭＬｅｕプレート上では生育できたが、ＭＭプレート上では生育できなかったコロニーをＬｅｕ２−株として選択した。次にＬｅｕ２−株の単一コロニーを３０℃の液体ＭＭＬｅｕ培地に接種して、２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。遠心分離によって細胞を収集し、脂質を抽出してエステル交換により脂肪酸メチルエステルを調製して、引き続いてＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ６８９０  ＧＣで分析した。
【０２４３】
ＧＣ分析はｐＤＭＷ２７１形質転換体中のＡＲＡの存在を示したが、親Ｍ４株中には示されなかった。具体的には、ｐＤＭＷ２７１がある４８個の選択されたＬｅｕ２−形質転換体中に、改変されたヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中の総脂質の５％未満のＡＲＡを生成した３５株、６〜８％のＡＲＡを生成した１２株、および総脂質の約１１％のＡＲＡを生成した１株があった。１１％のＡＲＡを生成した株を「Ｙ２０４７」と命名した。
【０２４４】
実施例７
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２０４７株中のピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）Δ１７デサチュラーゼ（「ＰａＤ１７＊」）の機能解析
本実施例は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２０４７株中のＰａＤ１７＊の機能解析について述べる（実施例６）。したがってＰａＤ１７＊を含んでなる変異型ｐＦｍＤ１７プラスミド（実施例５から）の形質転換に続いて、形質転換生物中の脂質プロフィールを比較した。
【０２４５】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の形質転換
一般方法で述べられているようにして、プラスミドｐＦｍＤ１７−１、ｐＦｍＤ１７−２、ｐＦｍ１７−３、およびｐＦｍＤ１７−４（キメラＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７＊：：ＸＰＲ遺伝子を含んでなる）をヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２０４７株中に形質転換した。形質転換細胞をウラシルを欠くＭＭプレート上に播種して、３０℃に２〜３日間保った。次に形質転換ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の単一コロニーをウラシルを欠く新鮮なＭＭプレート上にパッチして、３０℃で１日間成長させた。次にパッチを使用して３ｍＬのＭＭ液状媒体に接種した。細胞をＭＭ培地中で２日間、次にＨＧＭ培地中で４日間成長させた。細胞を遠心分離によって収集し、脂質を抽出してエステル交換により脂肪酸メチルエステルを調製し、引き続いて一般方法で述べられているようにＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ６８９０ＧＣを用いて分析した。
【０２４６】
表１２に示すように、ＧＣ分析は、ｐＦｍＤ１７−１、ｐＦｍＤ１７−２、ｐＦｍＤ１７−３、およびｐＦｍＤ１７−４をそれぞれ含んでなる各クローン中でのＡＲＡからＥＰＡへの変換を実証した。ＡＲＡおよびＥＰＡの組成は、総脂肪酸の％として表す。変換効率（「Ｃｏｎｖ．Ｅｆｆｉｃ．」）は（［生成物］／［基質＋生成物］）＊１００の式に従って測定され、「生成物」は即時の生成物および経路中のそれに由来する全ての生成物を含む。
【０２４７】
【表１６】
2010508019.tif 000018
【０２４８】
ＰａＤ１７＊がＡＲＡをＥＰＡに変換する変換効率は１８．４〜２４．６％の範囲であった。より具体的には実験的データは、ベクターｐＦｍＤ１７−３中に存在したＰ．アファニデルマタム（ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）からのクローニングｃＤＮＡ（配列番号２、ＰａＤ１７）がΔ１７デサチュラーゼとして機能し、ＡＲＡをＰＡに効率的に不飽和化することを実証した（変換効率は１８．４％〜１９．５２％の範囲）。しかし配列番号２のアミノ酸位置１５５のＳｅｒまたは配列番号２のアミノ酸位置３５１のＡｌａのどちらも酵素活性のためには必要でなかった。１５５ＳからＰへの変異、３５１ＡからＴへの変異、または双方の変異（それぞれｐＦｍＤ１７−２、ｐＦｍＤ１７−１、およびｐＦｍＤ１７−４で表される）を含んでなる、配列番号３によってコードされるＰａＤ１７＊変異型は全て、ｐＦｍＤ１７−３中のＰａＤ１７（配列番号２）よりも大きな変換効率を有した。最も高いΔ１７デサチュラーゼ変換効率を示した形質転換細胞は、Ｓ１５５からＰおよびＡ３５１からＴへの変異があるＰａＤ１７＊変異型（配列番号３）を含んでなるベクターｐＦｍＤ１７−４を発現したものであった。
【０２４９】
実施例８
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のためにコドン最適化されたピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）のΔ１７デサチュラーゼ遺伝子（「ＰａＤ１７Ｓ」）の合成
国際公開第２００４／１０１７５３号パンフレットおよび米国特許第７，１２５，６７２号明細書で述べられているのと同様の方法で、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）のΔ１７デサチュラーゼ遺伝子（配列番号１および２）のコドン使用頻度を最適化した。具体的にはヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）コドン使用頻度パターン（国際公開第２００４／１０１７５３号パンフレット）、「ＡＴＧ」翻訳開始コドン周辺の共通配列、およびＲＮＡ安定性の原則（Ｇｕｈａｎｉｙｏｇｉ，Ｇ．およびＪ．Ｂｒｅｗｅｒ、Ｇｅｎｅ、２６５（１〜２）：１１〜２３（２００１年））に従って、ＰａＤ１７のコード配列に基づいて、ピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）のコドン最適化されたΔ１７デサチュラーゼ遺伝子（「ＰａＤ１７Ｓ」と称される、配列番号４）をデザインした。翻訳開始部位の修正に加えて、１８８ｂｐの１０８０ｂｐコード領域（停止コドンを含む）を改変し（１７．４％、図５Ａおよび５Ｂ）、１７５コドンを最適化した（４８．６％）。ＧＣ含量を野性型遺伝子（すなわちＰａＤ１７）中の６１．８％から合成遺伝子（すなわちＰａＤ１７Ｓ）中の５４．５％に低下させた。ＮｃｏＩ部位およびＮｏｔＩ部位をそれぞれＰａＤ１７Ｓの翻訳開始コドン周辺および停止コドンの後に組み込んだ。コドン最適化された遺伝子中のいずれの修正もコードされたタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）を変化させなかった。デザインされたＰａＤ１７Ｓ遺伝子（配列番号４）はＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって合成され、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｙ１４８３７）にクローニングされてｐＰａＤ１７Ｓ（配列番号６２）が作り出された。
【０２５０】
実施例９
Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路を通じて総脂質の約１２％のＡＲＡを生成するためのヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４０７０株の発生
本実施例は、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路（図６Ａ）の発現を通じて、総脂質に対して約１２％のＡＲＡを生成できるヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２由来のヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４０７０株について述べる。Ｙ４０７０株を利用して、下記の実施例１０のＰａＤ１７Ｓの機能性発現を試験した。
【０２５１】
Ｙ４０７０株の発生には、Ｙ２２２４株（野生型ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２株のＵｒａ３遺伝子の自律性変異からのＦＯＡ抵抗性突然変異体）、Ｙ４００１株（Ｌｅｕ−フェノタイプで１７％のＥＤＡを生成する）、Ｙ４００１Ｕ株（Ｌｅｕ−およびＵｒａ−フェノタイプで１７％のＥＤＡを生成する）、Ｙ４０３６株（Ｌｅｕ−フェノタイプで１８％のＤＧＬＡを生成する）、およびＹ４０３６Ｕ株（Ｌｅｕ−およびＵｒａ−フェノタイプで１８％のＤＧＬＡを生成する）の構築が必要であった。
【０２５２】
Ｙ２２２４株の発生
Ｙ２２２４株を次の様式で単離した。ＹＰＤ寒天プレート（１％酵母抽出物、２％バクトペプトン、２％グルコース、２％寒天）からのヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２細胞を２５０ｍｇ／Ｌの５−ＦＯＡ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を含有するＭＭプレート（各７５ｍｇ／Ｌのウラシルおよびウリジン、６．７ｇ／Ｌ硫酸アンモニア添加ＹＮＢ、アミノ酸無添加、および２０ｇ／Ｌグルコース）上に画線培養した。プレートを２８℃でインキュベートし、得られたコロニーの内４つを２００ｍｇ／ｍＬ  ５−ＦＯＡ含有ＭＭプレート上、およびウラシルおよびウリジンを欠くＭＭプレート上に別々にパッチして、ウラシルＵｒａ３栄養要求性を確認した。
【０２５３】
総脂質の約１７％のＥＤＡを生成するＹ４００１株の発生
コンストラクトｐＺＫＬｅｕＮ−２９Ｅ３（図６Ｂ）の組み込みを通じて、Ｙ４００１株を作り出した。４個のキメラ遺伝子（すなわちΔ１２デサチュラーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、および２個のΔ９エロンガーゼ）を含んでなるこのコンストラクトをＹ２２２４株のＬｅｕ２遺伝子座に組み込み、それによってＥＤＡの生成を可能にした。
【０２５４】
コンストラクトｐＺＫＬｅｕＮ−２９Ｅ３は、表１３に示す構成要素を含有した。
【０２５５】
【表１７】
2010508019.tif 000019
【０２５６】
一般方法に従って、プラスミドｐＺＫＬｅｕＮ−２９Ｅ３をＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次にＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２２２４株（すなわちＡＴＣＣ＃２０３６２Ｕｒａ３−）の形質転換のために使用した。形質転換体細胞をＭＭＬｅｕ培地プレート上に播種して３０℃に２〜３日間保った。コロニーを拾って、ＭＭおよびＭＭＬｅｕ選択プレート上に画線培養した。ＭＭＬｅｕプレート上では生育できたが、ＭＭプレートでは生育できなかったコロニーをＬｅｕ−株として選択した。次にＬｅｕ−株の単一コロニーを３０℃の液体ＭＭＬｅｕに接種して、２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。遠心分離によって細胞を収集し、脂質を抽出してエステル交換により脂肪酸メチルエステルを調製して、引き続いてＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ６８９０  ＧＣで分析した。
【０２５７】
ＧＣ分析は、ｐＺＫＬｅｕＮ−２９Ｅ３の４個のキメラ遺伝子を含有する形質転換体中のＥＤＡの存在を示したが、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Ｙ２２２４対照株中には示されなかった。選択された３６個のＬｅｕ−株のほとんどは総脂質の約１２〜１６．９％のＥＤＡを生成した。総脂質の約１７．４％、１７％、および１７．５％のＥＤＡを生成した３株（すなわち株＃１１、＃３０、および＃３４）があり、それらをそれぞれＹ４００１、Ｙ４００２、およびＹ４００３株と称した。
【０２５８】
総脂質の約１７％ＥＤＡを生成するためのＹ４００１Ｕ株（Ｌｅｕ−、Ｕｒａ−）の発生
Ｙ４００１株において、プラスミドｐＹ１１６中でのＣｒｅリコンビナーゼ酵素の一時的な発現を通じてＹ４００１Ｕ株を作り出し（図６Ｃ）、Ｌｅｕ−およびＵｒａ−フェノタイプを生成した。コンストラクトｐＹ１１６は次の構成要素を含有した。
【０２５９】
【表１８】
2010508019.tif 000020
【０２６０】
一般方法に従って、新鮮に生育させたＹ４００１細胞の形質転換のためにプラスミドｐＹ１１６を使用した。形質転換体を２８０μｇ／ｍＬスルホニル尿素を含有するＭＭＬｅｕ＋Ｕｒａプレート（ロイシン添加ＭＭＵ）上に播種して、３０℃に３〜４日間保った。４個のコロニーを拾って３０℃の３ｍＬの液体ＹＰＤ培地に接種し、２５０ｒｐｍ／分で１日間振盪した。培養を液体ＭＭＬｅｕ＋Ｕｒａ培地で１：５０，０００に希釈し、１００μＬを新しいＹＰＤプレート上に播種して３０℃に２日間保った。コロニーを拾ってＭＭＬｅｕおよびＭＭＬｅｕ＋Ｕｒａ選択プレート上に画線培養した。ＭＭＬｅｕ＋Ｕｒａプレート上では生育できたが、ＭＭＬｅｕプレートでは生育できなかったコロニーを選択し、ＧＣによって分析してＣ２０：２（ＥＤＡ）の存在を確認した。Ｌｅｕ−およびＵｒａ−フェノタイプを有する１株は総脂質の約１７％のＥＤＡを生成し、Ｙ４００１Ｕと称された。
【０２６１】
総脂質の約１８％のＤＧＬＡを生成するためのＹ４０３６株の発生
コンストラクトｐＫＯ２ＵＦ８２８９（図７Ａ；配列番号７０）を発生させて、４個のキメラ遺伝子（１個のΔ１２デサチュラーゼ、１個のΔ９エロンガーゼ、および２個の突然変異Δ８デサチュラーゼを含んでなる）をＹ４００１Ｕ１株のΔ１２遺伝子座に組み込み、それによってＤＧＬＡの生成を可能にした。コンストラクトｐＫＯ２ＵＦ８２８９は以下の構成要素を含有した。
【０２６２】
【表１９】
2010508019.tif 000021
【０２６３】
一般方法に従って、ｐＫＯ２ＵＦ８２８９プラスミドをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次にＹ４００１Ｕ１株の形質転換のために使用した。形質転換体をＭＭＬｅｕプレート上に播種し、３０℃に２〜３日間保った。コロニーを拾ってＭＭＬｅｕ選択プレート上において３０℃で２日間画線培養した。次にこれらの細胞を３０℃の液体ＭＭＬｅｕに接種して、２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。遠心分離によって細胞を収集し、脂質を抽出してエステル交換により脂肪酸メチルエステルを調製して、引き続いてＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ６８９０  ＧＣで分析した。
【０２６４】
ＧＣ分析は、ｐＫＯ２ＵＦ８２８９の４キメラ遺伝子を含有する形質転換体中のＤＧＬＡの存在を示したが、親Ｙ４００１Ｕ１株中には示さなかった。選択された９６株のほとんどは、総脂質の７〜１３％のＤＧＬＡを生成した。総脂質の約１５％、１３．８％、１８．２％、１３．１％、１５．６％、および１３．９％のＤＧＬＡを生成した６株（すなわち＃３２、＃４２、＃６０、＃６８、＃７２、および＃９４）があった。これらの６株をそれぞれＹ４０３４、Ｙ４０３５、Ｙ４０３６、Ｙ４０３７、Ｙ４０３８、およびＹ４０３９と称した。
【０２６５】
総脂質の約１８％のＤＧＬＡを生成するためのＹ４０３６Ｕ株（Ｌｅｕ−、Ｕｒａ３−）の発生
コンストラクトｐＹ１１６（図６Ｃ；配列番号６９）を利用して、Ｙ４０３６株中で一時的にＣｒｅリコンビナーゼ酵素を発現した。これはゲノムからＬｏｘＰに挟まれたＵｒａ３遺伝子を放出した。
【０２６６】
一般方法に従って、プラスミドｐＹ１１６を使用してＹ４０３６株を形質転換した。形質転換に続いて細胞をＭＭＬｅｕ＋Ｕｒａプレート（ロイシン添加ＭＭＵ）上に播種し、３０℃に２〜３日間保った。ＭＬｅｕ＋Ｕｒａプレート上で生育した個々のコロニーを拾ってＹＰＤ液体培地に画線培養し、３０℃および２５０ｒｐｍ／分で１日間振盪してｐＹ１１６プラスミドをキュアリングした。生育した培養物をＭＭＬｅｕ＋Ｕｒａ  ｕプレート上に画線培養した。３０℃で２日後、個々のコロニーをＭＭＬｅｕ＋Ｕｒａ、ＭＭＵ、およびＭＭＬｅｕプレート上に再度画線培養した。ＭＭＬｅｕ＋Ｕｒａ上では生育できたがＭＭＵまたはＭＭＬｅｕプレート上では生育できなかったコロニーを選択した。Ｌｅｕ−およびＵｒａ−フェノタイプがあるこれらの株の１つをＹ４０３６Ｕ（Ｕｒａ−、Ｌｅｕ−）と称した。
【０２６７】
総脂質の約１２％のＡＲＡを生成するためのＹ４０７０株の発生
コンストラクトｐＺＫＳＬ−５５５Ｒ（図７Ｂ；配列番号７４）を発生させ、３個のΔ５デサチュラーゼ遺伝子をＹ４０３６Ｕ株のＬｙｓ遺伝子座に組み込み、それによってＡＲＡの生成を可能にした。ｐＺＫＳＬ−５５５Ｒプラスミドは次の構成要素を含有した。
【０２６８】
【表２０】
2010508019.tif 000022
【０２６９】
一般方法に従って、ｐＺＫＳＬ−５５５ＲプラスミドをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次にＹ４０３６Ｕ株の形質転換のために使用した。形質転換体細胞をＭＭＬｅｕＬｙｓプレート（リジン添加ＭＭＬｅｕ）上に播種して、３０℃に２〜３日間保った。次に単一コロニーをＭＭＬｅｕＬｙｓプレート上に再度画線培養し、次に３０℃の液体ＭＭＬｅｕＬｙｓに接種して２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。遠心分離によって細胞を収集し、脂質を抽出してエステル交換により脂肪酸メチルエステルを調製して、引き続いてＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ６８９０  ＧＣで分析した。
【０２７０】
ＧＣ分析はｐＺＫＳＬ−５５５Ｒの３個のキメラ遺伝子を含有する形質転換体中のＡＲＡの存在を示したが、親Ｙ４０３６Ｕ株中には示されなかった。選択された９６株のほとんどは総脂質の約１０％のＡＲＡを生成した。総脂質の約１１．７％、１１．８％、１１．９％、および１１．７％のＡＲＡを生成した４株（すなわち＃５７、＃５８、＃６９、および＃７５）があった。これらの４株をそれぞれＹ４０６８、Ｙ４０６９、Ｙ４０７０、およびＹ４０７１と称する。さらなる分析は、ｐＺＫＳＬ−５５５Ｒの３個のキメラ遺伝子が、Ｙ４０６８、Ｙ４０６９、Ｙ４０７０、およびＹ４０７１株のＬｙｓ５部位に組み込まれなかったことを示した。全ての株はＬｙｓ＋フェノタイプを有した。
【０２７１】
野生型ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２に関してＹ４０７０株の最終遺伝子型は、Ｕｒａ３−、Ｌｅｕ＋、Ｌｙｓ＋、ＧＰＤ：：Ｆ．Ｄ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ：：Ｆ．Ｄ１２：：ＯＣＴ、ＹＡＴ：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、Ｅｘｐ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＷＴ：：Ａｃｏ、ＥＸＰ：：ＥｇＤ５Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ：：ＲＤ５Ｓ：：ＯＣＴであった。
【０２７２】
実施例１０
（コドン最適化されたΔ１７デサチュラーゼ遺伝子「ＰａＤ１７Ｓ」を含んでなる）コンストラクトｐＦＢＡＩＮＰａＤ１７Ｓの産生およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現
本実施例は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）４０７０株中のＰａＤ１７Ｓの機能解析について述べる（実施例９）。したがってキメラＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｐｅｘ２０遺伝子を含んでなるプラスミドｐＦＢＡＩＮＰａＤ１７Ｓ（配列番号１０２）の構築および形質転換に続いて、形質転換生物中の脂質プロフィールを比較した。
【０２７３】
具体的にはプラスミドｐＦＢＡＩＮＰａＤ１７Ｓは、プラスミドｐＰａＤ１７Ｓからの５’ＰａＤ１７Ｓおよび３’ＰａＤ１７Ｓ断片（実施例８の５’ＰａＤ１７Ｓ断片はＮｃｏＩおよびＢｇｌＩＩ消化によって作り出され、３’ＰａＤ１７Ｓ断片は実施例５で述べられているようにＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩ消化によって作り出された）と、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで前消化されたプラスミドｐＦＢＡＩＮ−ＭＯＤ−１（配列番号８０、図８Ａ）を使用して、三元ライゲーションによって構築された。したがってＰａＤ１７Ｓは、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＦＢＡＩＮｍプロモーター（国際公開第２００５／０４９８０５号パンフレット、米国特許第７，２０２，３５６号明細書）およびヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Ｐｅｘ２０遺伝子のＰＥＸ２０−３’ターミネーター領域（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０５４６１３）と作動的に連結する。
【０２７４】
プラスミドｐＦＢＡＩＮＰａＤ１７Ｓ（配列番号１０２）をヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）４０７０株中に形質転換し、形質転換体をＳＤ−Ｕｒａプレート（２０ｇ／Ｌの寒天；アミノ酸を含まないが硫酸アンモニウムを含む６．７ｇ／ＬのＹＮＢ；２０ｇ／Ｌのグルコース；各２０ｍｇ／Ｌの硫酸アデニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−ヒスチジン−ＨＣｌ、Ｌ−アルギニン−ＨＣｌ、Ｌ−メチオニン；各３０ｍｇ／ＬのＬ−チロシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−リジン−ＨＣｌ；５０ｍｇ／ＬのＬ−フェニルアラニン；各１００ｍｇ／ｍＬのＬ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸；１５０ｍｇ／ＬのＬ−バリン；２００ｍｇ／ＬのＬ−スレオニン；および４００ｍｇ／ＬのＬ−セリンを含んでなる）上で選択した。
【０２７５】
実施例７で述べられているようにして４つの形質転換体の脂肪酸プロフィールおよび変換効率を判定した。ＧＣ分析の結果を表１７に示す。ＡＲＡおよびＥＰＡの組成は総脂肪酸の％で表される。
【０２７６】
【表２１】
2010508019.tif 000023
【０２７７】
ＧＣ結果はｐＦＢＡＩＮＰａＤ１７Ｓを持つ形質転換体中ではＡＲＡおよびＥＰＡが生成するが、対照プラスミドｐＦＢＡＩＮ−ＭＯＤ−１（図８Ａ、ベクターのみ）を持つ形質転換体中ではＡＲＡのみが生成することを実証する。コドン最適化されたＰ．アファニデルマタム（ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）Δ１７デサチュラーゼ（ＰａＤ１７Ｓ、配列番号４）の変換効率は、野生型ＰａＤ１７（配列番号２）の１８．４〜１９．５％の変換効率と比較して、５４．１％〜５５．６％の範囲であった。
【０２７８】
実施例１１
Δ１７デサチュラーゼをコードするフィトフトラ・ソジャ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅ）遺伝子の同定
米国特許出願第１１／７８７７７２号明細書で開示されている本実施例は、フィトフトラ・ソジャ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅ）からのΔ１７デサチュラーゼ（配列番号４４および４５）の同定について述べる。
【０２７９】
米国エネルギー省の共同ゲノム研究所（「ＪＧＩ」、ＷａｌｎｕｔＣｒｅｅｋ，ＣＡ）は、バージョン１．０のフィトフトラ・ソジャ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅ）ゲノム（推定ゲノムサイズ９５Ｍｂｐ）を作り出した。このゲノム配列は全ゲノムショットガンストラテジーを使用して作り出され、合計１９，２７６個の遺伝子モデルを含んでなる。
【０２８０】
フィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）のΔ１７デサチュラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＪ３０８７０、ここで「ＰｉＤ１７」と称され配列番号４３に対応する）のアミノ酸配列をクエリー配列として使用して、ＪＧＩのフィトフトラ・ソジャ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅ）データベースに対して、（ＪＧＩから入手できるデフォルトパラメーターを使用して）ＴＢＬＡＳＴＮ（ＢＬＡＳＴタンパク質対翻訳ヌクレオチド）検索を行った。ｓｃａｆｆｏｌｄ  １７：３３８１４８〜３３９１６７に位置する１個のＰ．ソジャ（ｓｏｊａｅ）ＯＲＦは、ＰｉＤ１７と広範な相同性（すなわち期待値０で９１．８％の同一性および９５．６％の類似性）を有することが分かった。この相同性に基づいて、Ｐ．ソジャ（ｓｏｊａｅ）ＯＲＦはΔ１７デサチュラーゼとして仮に同定され、「ＰｓＤ１７」と称された。データベースからＰｓＤ１７（配列番号４４）の１０９２ｂｐのＤＮＡ配列を検索すると、それは長さ３６３個のアミノ酸のポリペプチド（配列番号４５）をコードすることが分かった。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ分析（ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアのＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラム）を使用したアミノ酸配列アラインメントは、ＰｉＤ１７およびＰｓＤ１７の間に９０．９％の同一性があったのに対し、ヌクレオチド配列は８６．６％の同一性のみを有した
ことを示した。
【０２８１】
ＰｓＤ１７（配列番号４５）をクエリー配列として使用して、タンパク質−タンパク質ＢＬＡＳＴ検索を行い、ＰｓＤ１７と「ｎｒ」データベース（一般方法参照）中に含まれる全ての公的に入手可能なタンパク質配列との配列相同性もまた判定した。この分析に基づいて、ＰｓＤ１７はサプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ）のω−３脂肪酸デサチュラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＲ２０４４４）と最高の相同性を有することが分かった。具体的にはＰｓＤ１７は、期待値７Ｅ−１１７でＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＲ２０４４４のアミノ酸配列と６０％の同一性および７４％の類似性を有した。さらにＰｓＤ１７は、期待値４Ｅ−５７でアナベナ・バリアビリス（Ａｎａｂａｅｎａ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ＃２９４１３の脂肪酸デサチュラーゼのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＢＡ２３８０９）と３９％の同一性および５７％の類似性を有した。
【０２８２】
実施例１２
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のためにコドン最適化されたΔ１７デサチュラーゼ遺伝子（「ＰｓＤ１７Ｓ」）の合成
米国特許出願第１１／７８７７７２号明細書で開示されている本実施例は、フィトフトラ・ソジャ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅ）に由来し（配列番号８１および８２）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された合成Δ１７デサチュラーゼ（配列番号４４および４５）の作成について述べる。
【０２８３】
米国特許第７，１２５，６７２号明細書で述べられているのと同様の方法で、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにフィトフトラ・ソジャ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅ）のΔ１７デサチュラーゼ遺伝子のコドン使用頻度を最適化した。具体的にはヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）コドン使用頻度パターン（国際公開第２００４／１０１７５３号パンフレット）、「ＡＴＧ」翻訳開始コドン周辺の共通配列、およびＲＮＡ安定性の原則（Ｇｕｈａｎｉｙｏｇｉ，Ｇ．およびＪ．Ｂｒｅｗｅｒ、Ｇｅｎｅ、２６５（１〜２）：１１〜２３（２００１年））に従って、ＰｓＤ１７（配列番号４４および４５）のコード配列に基づいて、コドン最適化されたΔ１７デサチュラーゼ遺伝子（「ＰｓＤ１７Ｓ」と命名される、配列番号８１および８２）をデザインした。翻訳開始部位修の正に加えて、１７５ｂｐの１０９２ｂｐコード領域を改変し（１６．０％）、１６８個のコドンを最適化した（４６．２％）。ＧＣ含量を野性型遺伝子（すなわちＰｓＤ１７）中の６５．１％から合成遺伝子（すなわちＰｓＤ１７Ｓ）中の５４．５％に低下させた。ＮｃｏＩ部位およびＮｏｔＩ部位をそれぞれ、ＰｓＤ１７Ｓ（配列番号８１）の翻訳開始コドン周辺および停止コドンの後に組み込んだ。図９はＰｓＤ１７およびＰｓＤ１７Ｓのヌクレオチド配列の比較を示す。アミノ酸レベルでは、ＰｓＤ１７Ｓは野性型ＰｓＤ１７と比較して３番目および４番目のアミノ酸を欠いており、したがってＰｓＤ１７Ｓ（配列番号８２）の全長はアミノ酸３６１個である。デザインされたＰｓＤ１７Ｓ遺伝子はＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって合成され、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｙ１４８３７）にクローニングされてＰｓＤ１７Ｓ（配列番号８３）が作り出された。
【０２８４】
実施例１３
Δ１７デサチュラーゼをコードするフィトフトラ・ラモルム（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｒａｍｏｒｕｍ）遺伝子の同定
米国特許出願第１１／７８７７７２号明細書で開示されている本実施例は、フィトフトラ・ラモルム（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｒａｍｏｒｕｍ）Δ１７デサチュラーゼ（配列番号４６および４７）の同定について述べる。
【０２８５】
Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｅｎｅｒｇｙ’ｓ  Ｊｏｉｎｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＪＧＩ）（Ｗａｌｎｕｔ  Ｃｒｅｅｋ，ＣＡ）はフィトフトラ・ラモルム（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｒａｍｏｒｕｍ）ゲノム（推定ゲノムサイズ６５Ｍｂｐ）のバージョン１．０を作り出した。このゲノム配列は、全ゲノムショットガンストラテジーを使用して生成され、全部で１６，０６６個の遺伝子モデルを含んでなる。
【０２８６】
実施例１１で述べられるのと類似した様式で、ＰｉＤ１７（配列番号４３）のアミノ酸配列をクエリー配列として使用し、ＪＧＩのＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｒａｍｏｒｕｍデータベースに対してＴＢＬＡＳＴＮ検索を実施した（ＪＧＩから入手できるデフォルトパラメーターを使用）。
【０２８７】
２個のＯＲＦが、フィトフトラ・ラモルム（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｒａｍｏｒｕｍ）のゲノム配列中のＰｉＤ１７と高度な相同性を有することが分かった。具体的にはＯＲＦ８０２２２は、期待値０で配列番号４３と８９％の同一性および９４％の類似性を有する。同様にＯＲＦ４８７９０は、期待値６Ｅ−４４で配列番号４３と４０％までの同一性および６１％の類似性を有する。これらの結果に基づいて、ＯＲＦ８０２２２をΔ１７デサチュラーゼと仮に同定し、「ＰｒＤ１７」と称した。
【０２８８】
ＰｒＤ１７（配列番号４６）の１０８６ｂｐのＤＮＡ配列をデータベースから検索すると、それは長さが３６１個のアミノ酸のポリペプチド（配列番号４７）をコードすることが分かった。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ分析（ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアからのＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラム）を使用したアミノ酸のアラインメントは、ＰｉＤ１７とＰｒＤ１７の間に８９．５％の同一性があったことを示し、対照的にヌクレオチド配列は８５．７％の同一性のみを有した。
【０２８９】
次にＰｒＤ１７（配列番号４７）をクエリー配列として使用してタンパク質−タンパク質ＢＬＡＳＴ検索を行うことで、「ｎｒ」データベース（一般方法参照）中に含まれる全ての公的に入手可能なタンパク質配列とＰｒＤ１７の配列相同性を比較した。最高度の類似性を示した配列はサプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ）のω−３脂肪酸デサチュラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＲ２０４４４）であり、期待値Ｅ−１２４で５９％の同一性および７４％の類似性を有した。さらにＰｒＤ１７はアナベナ・バリアビリス（Ａｎａｂａｅｎａ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ＃２９４１３の脂肪酸デサチュラーゼのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＢＡ２３８０９）と、期待値６Ｅ−６１で３８％の同一性および５７％の類似性を有した。
【０２９０】
実施例１４
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のためにコドン最適化されたΔ１７デサチュラーゼ遺伝子（「ＰｒＤ１７Ｓ」）の合成
米国特許出願第１１／７８７７７２号明細書で開示されている本実施例は、フィトフトラ・ラモルム（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｒａｍｏｒｕｍ）に由来し（配列番号４６および４７）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された合成Δ１７デサチュラーゼ（配列番号８４および４７）の作成について述べる。
【０２９１】
米国特許第７，１２５，６７２号明細書で述べられたのと類似の様式で、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のために、フィトフトラ・ラモルム（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｒａｍｏｒｕｍ）のΔ１７デサチュラーゼ遺伝子のコドン使用頻度を最適化した。具体的には、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）のコドン使用頻度パターン（国際公開第２００４／１０１７５３号パンフレット）、「ＡＴＧ」翻訳開始コドン周辺の共通配列、およびＲＮＡの安定法則（Ｇｕｈａｎｉｙｏｇｉ，Ｇ．およびＪ．Ｂｒｅｗｅｒ、Ｇｅｎｅ  ２６５（１〜２）：１１〜２３（２００１年））に従って、ＰｒＤ１７のコード配列（配列番号４６および４７）に基づいて、コドン最適化Δ１７デサチュラーゼ遺伝子（「ＰｒＤ１７Ｓ」と称する、配列番号８４）をデザインした。翻訳開始部位の修正に加えて、１０８６ｂｐのコード領域の１６８ｂｐ（１５．５％）を修正し、１６０個のコドン（４４．２％）を最適化した。ＧＣ含量は、野性型遺伝子（すなわちＰｒＤ１７）内の６４．４％から、合成遺伝子（すなわちＰｒＤ１７Ｓ）内の５４．５％に低下した。ＮｃｏＩ部位およびＮｏｔＩ部位をＰｒＤ１７Ｓ（配列番号８４）の翻訳開始コドン周辺、および停止コドン後にそれぞれ組み込んだ。図１０は、ＰｒＤ１７およびＰｒＤ１７Ｓのヌクレオチド配列の比較を示す。コドン最適化遺伝子内の改変は、いずれもタンパク質（配列番号４７）をコードするアミノ酸配列を変化させなかった。デザインされたＰｒＤ１７Ｓ遺伝子はＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって合成され、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｙ１４８３７）中にクローンされて、ｐＰｒＤ１７Ｓ（配列番号８５）を生じた。
【０２９２】
実施例１５
ω−６脂肪酸基質特異性の比較のための（フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１５デサチュラーゼ、ＰｒＤ１７Ｓ、ＰｓＤ１７Ｓ、およびＰａＤ１７Ｓを含んでなる）コンストラクトｐＹ１３０、ｐＹ１３８、ｐＹ１３９、およびｐＹ１４０の産生
本実施例、および関連実施例１６および１７（下述）は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中のフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１５デサチュラーゼ（ＦｍＤ１５、配列番号８６および８７）と、ＰａＤ１７Ｓ（配列番号４および２）、ＰｒＤ１７Ｓ（配列番号８４および４７）、およびＰｓＤ１７Ｓ（配列番号８１および８２）との基質特異性の比較について述べる。
【０２９３】
この研究は、次の工程を含む。（１）実施例１５で述べられているようなヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）発現ベクターｐＹ１３０（ＦｍＤ１５を含んでなる）、ｐＹ１３８（ＰｒＤ１７Ｓを含んでなる）、ｐＹ１３９（ＰｓＤ１７Ｓを含んでなる）、およびｐＹ１４０（ＰａＤ１７Ｓを含んでなる）の構築、（２）実施例１６で述べられているようなＬ３８株と同定されたヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃７６９８２のΔ１２デサチュラーゼ−中断株の構築、３．）実施例１７で述べられているようなｐＹ１３０、ｐＹ１３８、ｐＹ１３９および、ｐＹ１４０の野生型ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）およびヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Ｌ３８株中への形質転換、４．）実施例１７で述べられているような、脂肪酸基質供給後のｐＹ１３０、ｐＹ１３８、ｐＹ１３９、またはｐＹ１４０を含んでなる形質転換生物中の脂質プロフィールの比較。
【０２９４】
実験の基礎
Ｃ１８脂肪酸基質に作用するΔ１５デサチュラーゼおよびＣ２０脂肪酸基質に作用するΔ１７デサチュラーゼの双方を含むω−３デサチュラーゼは、ω−６脂肪酸をそれらのω−３対応物に変換することにより、長鎖ＰＵＦＡの生合成において重要な役割を果たす（図１）。いくつかの真菌ω−３デサチュラーゼは、広範な触媒無差別性を示すことがよく知られている。例えばフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＤＱ２７２５１６．１）およびマグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＰ_３６２９６３）のΔ１５デサチュラーゼは、どちらも限られたΔ１７デサチュラーゼ活性をさらに有する（国際公開第２００５／０４７４８５号パンフレットおよび国際公開第２００５／０４７４８０号パンフレット、米国特許出願第１１／７４０２９８号明細書）。
【０２９５】
同様に、フィトフトラ・ソジャ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅ）に由来してヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された合成Δ１７デサチュラーゼ（すなわちＰｓＤ１７Ｓ）は、以前、米国特許出願第１１／７８７７７２号明細書でΔ１７およびΔ１５デサチュラーゼ活性のどちらも有することが実証された。より具体的にはＰｓＤ１７Ｓは「二機能性Δ１７デサチュラーゼ活性」または「一次Δ１７デサチュラーゼ活性」を示し、デサチュラーゼはＡＲＡをＥＰＡにおよび／またはＤＧＬＡをＥＴＡに優先的に変換するが、さらにＬＡをＡＬＡに変換する限られた能力を有する（したがって主としてΔ１７デサチュラーゼ活性および限られたΔ１５デサチュラーゼ活性を示す）。
【０２９６】
上述の広範な触媒無差別性にもかかわらず、全てのω−３デサチュラーゼが二機能性を有するわけではない。例えばサプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ）Δ１７デサチュラーゼは、Ｃ２０ω６脂肪酸基質に排他的に機能する（Ｐｅｒｅｉｒａ，Ｓ．Ｌ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３７８：６６５（２００４年））。
【０２９７】
以下の実施例目的は、フィトフトラ・ソジャ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅ）（ＰｓＤ１７Ｓ、配列番号８１および８２）、フィトフトラ・ラモルム（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｒａｍｏｒｕｍ）（ＰｒＤ１７Ｓ、配列番号８４および４７）およびピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）（ＰａＤ１７Ｓ、配列番号４および２）からのΔ１７デサチュラーゼと、以前に特性決定されたフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１５デサチュラーゼ（ＦｍＤ１５、配列番号８６および８７）との相対ω−６脂肪酸基質特異性を比較することである。ＬＡからＥＰＡへの変換に関与するデサチュラーゼおよびエロンガーゼの存在は長鎖ＰＵＦＡ生合成の代案の経路を可能にするので、米国特許出願第１１／７８７７７２号明細書でＰｓＤ１７ＳおよびＰｒＤ１７Ｓについて以前実施された研究とは対照的に、ω−３デサチュラーゼはここではそれらを欠くヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株中で発現された（図１）。その結果、ＰｒＤ１７Ｓ、ＰｓＤ１７Ｓ、およびＰａＤ１７Ｓ中のω−６基質特異性に関する解釈は、以前の研究におけるよりも遙かに明瞭である。
【０２９８】
ＦｍＤ１５を含んでなるヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）発現ベクターｐＹ１３０の構築
プラスミドｐＹ６．ＧＰＤ．Ｌｅｕ２（配列番号８８）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のどちらの中でも複製できるシャトルプラスミドであり、次を含有する。ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）自律複製配列（ＡＲＳ１８、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ９１６００）、ＣｏｌＥ１プラスミド複製起点、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｆ１複製起点、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での選択のためのアンピシリン−抵抗性遺伝子（ＡｍｐＲ）、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中での選択のためのヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Ｌｅｕ２遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ２６０２３０）、およびキメラＧＰＤ：：ＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ：：ＸＰＲカセット。ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）「ＧＰＤプロモーター」は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）遺伝子によってコードされ、発現に必要なタンパク質の「ＡＴＧ」翻訳開始コドン前の５’上流非翻訳領域を指す（国際公開第２００５／００３３１０号パンフレット）。「ＸＰＲ」は、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Ｘｐｒ遺伝子の約１００ｂｐの３’領域を指す（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ１７７４１）。プラスミドｐＹ６．ＧＰＤ．Ｌｅｕ２の構築については本明細書では詳細に述べられていないが、それはｐＹ２８ＧＰＤ．ＹｌＤ１２ｄに由来した（２００７年４月２６日出願の米国特許出願第１１／７４０２９８号明細書で以前述べられており、キメラＧＰＤ：：ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼ（Ｙｌｄ１２ｄ）：：Ｌｉｐ１遺伝子カセットを含んでなる）。
【０２９９】
フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１５デサチュラーゼは、以前、（その内容を参照によって本明細書に援用する）国際公開第２００５／０４７４８５号パンフレットで述べられているプラスミドｐＹ３４に由来し、最初にＦｍＤ１５デサチュラーゼＯＲＦの位置１８０を単一ｂｐ置換した。このＣ１８０Ｔ「サイレント」変異は、クローニング利便性のためにＯＲＦのＮｃｏＩ部位の損失をもたらした。次にＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ制限部位がある５’および３’ＰＣＲプライマーを使用してＯＲＦをＰＣＲするために改変配列を使用し、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ部位を使用して上述のプラスミドｐＹ２８中のＹｌｄ１２ｄ  ＯＲＦを置き換えるために、ＦｍＤ１５デサチュラーゼＯＲＦ（配列番号８６）を含有する得られたＮｃｏＩ−ＮｏｔＩ断片を使用して、ｐＹ１３０（配列番号８９、図１１Ａ［そこでは「ｐＹ１３０．ＧＰＤ．Ｆｍｄ１５」と標識される］）を生成した。
【０３００】
キメラＧＰＤ：：ＦｍＤ１５：：Ｌｉｐ１遺伝子を含有する発現ベクターｐＹ１３０の９０４８ｂｐの配列は配列番号８９で開示され、下の表で述べられている。
【０３０１】
【表２２】
2010508019.tif 000024
【０３０２】
ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）発現ベクターｐＹ１３８（ＰｒＤ１７Ｓを含んでなる）、ｐＹ１３９（ＰｓＤ１７Ｓを含んでなる）、およびｐＹ１４０（ＰａＤ１７Ｓを含んでなる）の構築
起源プラスミドｐＰｒＤ１７Ｓ（配列番号８５、前出の実施例１４）およびｐＰｓＤ１７Ｓ（配列番号８３、前出の実施例１２）からのヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中での発現のためにコドン最適化されたフィトフトラ・ラモルム（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｒａｍｏｒｕｍ）およびフィトフトラ・ソジャ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅ）の合成Δ１７デサチュラーゼＯＲＦ（すなわちそれぞれＰｒＤ１７ＳおよびＰｓＤ１７Ｓ）を含んでなる同様に消化された断片によって、ｐＹ１３０中のＦｍＤ１５を含んでなるＮｃｏＩ−ＮｏｔＩ断片を置換した。これによってプラスミドｐＹ１３８（配列番号９０、図１１Ｂ［そこでは「ｐＹ１３８  ＧＰＤ−ＰｒＤ１７」と標識される］）およびｐＹ１３９（配列番号９１、図１１Ｃ［そこでは「ｐＹ１３９  ＧＰＤ  ＰｓＤ１７」と標識される］）がそれぞれ生成した。
【０３０３】
同様のストラテジーを使用して、起源プラスミドｐＰａＤ１７Ｓ（配列番号６２、前出の実施例８）からのピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）の合成Δ１７デサチュラーゼＯＲＦで、ｐＹ１３０中のＦｍＤ１５ＯＲＦを置き換えた。しかしＰａＤ１７Ｓは内部ＮｃｏＩ部位を含有したため、これはＰａＤ１７ＳのＮｃｏＩ−ＢｇｌＩＩおよびＢｇｌＩＩ−ＮｏｔＩ断片のｐＹ１３０ベクター主鎖への三元ライゲーションによって達成された。これは図１１Ｄに示すようなプラスミドｐＹ１４０（配列番号９２）の形成をもたらした（ここでは「ｐＹ１４０ＧＰＤ−ＰａＤ１７」と標識される）。
【０３０４】
実施例１６
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２ノックアウトＬ３８株の産生
米国特許出願第１１／７４０２９８号明細書で開示されている本実施例は、Ｌ３８株と同定され、「ｄ１２ＫＯ株」と総称的に称される、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃７６９８２のΔ１２デサチュラーゼ−中断［Δ１２ノックアウト（ＫＯ）］株の作成について述べる。この株の唯一の天然Δ１２デサチュラーゼ遺伝子は、相同的組換えを通じて中断バージョンでの置換によって中断された。
【０３０５】
ここでＬ３８と同定されたｄ１２ＫＯ株を作り出すのに使用された方法は、一般方法で述べられているように部位特異的リコンビナーゼ系に依存した。
【０３０６】
実験的方法
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃７６９８２をＳｐｈＩおよびＡｓｃＩ直線化プラスミドｐＹ１３７で形質転換した。プラスミドｐＹ１３７（図１２ＡではｐＹ１３７．ＹｌＤ１２ｋｏ．Ｌｅｕ２と標識される）の配列は配列番号９３として開示されており、ｐＹ１３７については下の表で述べられている。
【０３０７】
【表２３】
2010508019.tif 000025
【０３０８】
１１のＬＥＵ原栄養株ｐＹ１３７形質転換体をＧＣによって分析し、４つはＧＣ分析時の検出可能な１８：２（ＬＡ）の不在によってΔ１２ノックアウト（ｄ１２ＫＯ）株と同定された。これらの１つをＬ３７株と命名した。
【０３０９】
ｄ１２ＫＯＬ３７株中のＬＥＵ２遺伝子は、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素（ＧＰＡＴ）プロモーターの制御下にあるＣｒｅリコンビナーゼの一過性発現によって切除された。具体的にはＬ３７株をプラスミドｐＹ１１７で形質転換した。変異プラスミドｐＹ１１７中のヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＡＨＡＳ酵素は、正のスクリーニングマーカーとして使用されるＳＵＲを与えた。
【０３１０】
プラスミドｐＹ１１７は、ＰａｃＩ−ＳｗａＩ部位で挟まれた変異ＡＨＡＳ遺伝子をＰａｃＩ−ＳｗａＩ消化されたｐＹ１１６に挿入し、それによってＬＥＵ選択可能なマーカーをスルホニル尿素マーカーで置き換えて、プラスミドｐＹ１１６（表１４、および米国特許出願第１１／６３５２５８号明細書で述べられている）から誘導された。プラスミドｐＹ１１７（配列番号９４）は図１２Ｂ（そこではｐＹ１１７．Ｃｒｅ．ＡＨＡＳｗ４９７Ｌと標識される）に示され、下の表２０で述べられている。
【０３１１】
【表２４】
2010508019.tif 000026
【０３１２】
Ｌｅｕおよび２８０μｇ／ｍＬスルホニル尿素（クロリムロンエチル、Ｅ．Ｉ．ｄｕＰｏｎｔ  ｄｅ  Ｎｅｍｏｕｒｓ  ＆  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）を含有する最小プレート上に、ｐＹ１１７によって形質転換されたＬ３７を播種した。ｐＹ１１７の株をキュアリングするために、２個のＳＵＲコロニーを使用して３ｍＬのＹＰＤに接種した。３０℃で一晩成長させた後、１００μｌの１：２５０，０００希釈培養物をＹＰＤプレート上に播種した。３０℃で一晩成長させた後、６個の単一コロニーをＹＰＤおよびＭＭプレートの双方の上に画線培養した。全てＹＰＤ上には成長したが、ＭＭプレート上には成長せず、それらのＬｅｕ栄養要求性が確認された。これらの１つをＬ３８株と称する。
【０３１３】
実施例１７
ω−６脂肪酸基質特異性の比較のためのヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株中でのコンストラクトｐＹ１３０、ｐＹ１３８、ｐＹ１３９、およびｐＹ１４０（ＦｍＤ１５、ＰｒＤ１７Ｓ、ＰｓＤ１７ＳおよびＰａＤ１７Ｓを含んでなる）の発現
本実施例は、発現プラスミドｐＹ１３０、ｐＹ１３８、ｐＹ１３９、およびｐＹ１４０のヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃７６９８２中への形質転換と、それに続く形質転換生物中の脂質プロフィールの比較について述べる。
【０３１４】
形質転換
一般方法で述べられているように、次の発現プラスミドを野性型（ＷＴ）ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃７６９８２およびそのΔ１２デサチュラーゼ−中断誘導体（Δ１２ＫＯ）Ｌ３８株（実施例１６）中に形質転換した。１．）プラスミドｐＹ１３０（ＦｍＤ１５を含んでなる）、２．）プラスミドｐＹ１３８（ＰｒＤ１７Ｓを含んでなる）、３．）プラスミドｐＹ１３９（ＰｓＤ１７Ｓを含んでなる）、４．）プラスミドｐＹ１４０（ＰａＤ１７Ｓを含んでなる）、および５．）プラスミドｐＹ６．ＧＰＤ．Ｌｅｕ２（あらゆる飽和化酵素ＯＲＦを欠く空ベクター対照、プラスミド「ｐＹ６」とも称される）。
【０３１５】
基質供給なしの脂質プロフィールの比較
各形質転換からの３つの独立した形質転換体をＭＭプレート上に画線培養した。新鮮な培養物を使用して、３ｍＬのＭＭに三連で別々に接種した。３０℃で２日間振盪機内で成長させた後、それぞれの２ｍＬアリコートからの細胞を遠心分離によって収集し、脂質を抽出して脂肪酸メチルエステルをエステル交換により調製し、引き続いてＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ６８９０  ＧＣで分析した。
【０３１６】
ｐＹ６（配列番号８８）、ｐＹ１３０（配列番号８９）、ｐＹ１３８（配列番号９０）、ｐＹ１３９（配列番号９１）、およびｐＹ１４０（配列番号９２）を発現するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の脂肪酸プロフィールを下の表２１に示す。表２１では、脂肪酸は１６：０（パルミチン酸）、１６：１、１８：０（ステアリン酸）、１８：１（オレイン酸）、１８：２（ＬＡ）、およびＡＬＡと同定される。脂肪酸組成は総脂肪酸の重量％として表される。変換効率は（「ＣＥ」）（［生成物］／［基質＋生成物］）＊１００の式に従って測定され、「生成物」は即時の生成物および経路中のそれに由来する全ての生成物を含む。したがってΔ１２活性（すなわち「ｄ１２ｄ  ＣＥ」）は（［ＬＡ］／［オレイン酸＋ＬＡ］）＊１００に従って計算され、ＬＡへの％基質変換を表す。「Δ１５活性」（すなわち「ｄ１５ｄ  ＣＥ」）は式（［ＡＬＡ］／［ＬＡ＋ＡＬＡ］）＊１００に従って計算され、ＡＬＡへの％基質変換を表す。標準偏差は「ＳＤ」と略記され、「ｎｄ」は不検出である。
【０３１７】
【表２５】
2010508019.tif 000027
【０３１８】
基質供給ありの脂質プロフィールの比較
ＬＡ以外のω６基質に対する異なるω−３デサチュラーゼの相対基質特異性を研究するために、異なるプラスミド（すなわちｐＹ６、ｐＹ１３０、ｐＹ１３８、ｐＹ１３９、およびｐＹ１４０）で形質転換された１２  ＫＯ株に、異なるＦＡの混合物を供給した。このために株をＭＭプレート上に画線培養し、新鮮な培養物を使用して３ｍＬのＭＭに接種した。３０℃で一晩成長させた後、全ての培養物をＯＤ６００＝０．５に希釈してから、それらを３つの３ｍＬ培養物に等分した。さらに６時間成長させた後、培養物を収集して１％タージトールおよび各０．５ｍＭのＧＬＡ、ＥＤＡ、およびＡＲＡを含有する３ｍＬＭＭに再懸濁して２４時間成長させ、その時点でそれらを収集し、１２ｍＬの０．５％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００で１回、１２ｍＬの蒸留水で１回洗浄した。ペレットを脂肪酸組成について上述のように分析した。
【０３１９】
ｐＹ６（配列番号８８）、ｐＹ１３０（配列番号８９）、ｐＹ１３８（配列番号９０）、ｐＹ１３９（配列番号９１）、およびｐＹ１４０（配列番号９２）を発現するｄ１２  ＫＯヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の脂肪酸プロフィールを下の表２２に示す。表中、脂肪酸は、ＧＬＡ（ω−６）、ＥＤＡ（ω−６）、ＤＧＬＡ（ω−６）、ＡＲＡ（ω−６）、ＡＬＡ（ω−３）、ＳＴＡ（ω−３）、ＥＴｒＡ（ω−３）、ＥＴＡ（ω−３）、およびＥＰＡ（ω−３）と同定される。脂肪酸組成は総脂肪酸の重量％として表される。ω−６基質ＧＬＡ、ＥＤＡ、ＤＧＬＡ、およびＡＲＡからそれらのω−３生成物ＳＴＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、およびＥＰＡへのω−３デサチュラーゼの変換効率（「Ｃｏｎｖ．Ｅｆｆｉｃ．」）は、それぞれ式［生成物／（基質＋生成物）］＊１００に従って計算される。標準偏差は「ＳＤ」と略記され、「ｎｄ」は不検出である。
【０３２０】
【表２６】
2010508019.tif 000028
【０３２１】
ＦｍＤ１５、ＰｓＤ１７Ｓ、ＰｒＤ１７Ｓ、およびＰａＤ１７Ｓのω−６脂肪酸基質特異性に関する結果を図１３に視覚的に要約した。具体的にはＬＡに関するデータは、表２１に示すような野性型Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）形質転換体からのものである。その他の全データは、表２２に示すような異なるω−６脂肪酸基質を供給されたΔ１２−デサチュラーゼ中断（ｄ１２ＫＯ）ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株からのものである。脂肪酸ＤＧＬＡは図中で「ＨＧＬＡ」と略記される。
【０３２２】
ここで示すデータに基づいて、ＦｍＤ１５はＰｓＤ１７Ｓ、ＰｒＤ１７Ｓ、およびＰａＤ１７Ｓと比較して、最も高いΔ１５デサチュラーゼ活性を有した（表２１、図１３）。しかしＦｍＤ１５（二機能性Δ１２／Δ１５デサチュラーゼ活性を有する）とは異なり、試験された３つのΔ１７デサチュラーゼのいずれもオレイン酸に対するいかなる検出可能なΔ１２デサチュラーゼ活性も有さなかった（表２１）。ω−６脂肪酸基質存在下での成長は、全てのΔ１７デサチュラーゼが、ＡＲＡに対する最高の優先度、ＥＤＡおよびＤＧＬＡに対する比較的低い活性、およびＧＬＡに対する最小の活性を有したことを示した。ＰａＤ１７ＳはＡＲＡに対して最も高い活性を有した。Δ１７デサチュラーゼはＣ１８基質ＬＡに対して顕著なΔ１５デサチュラーゼ活性を有し、活性はＣ２０基質ＥＤＡおよびＤＧＬＡに対するΔ１７デサチュラーゼ活性と匹敵した（ＰｓＤ１７ＳおよびＰｒＤ１７Ｓは、Ｃ２０基質に対するΔ１７デサチュラーゼ活性と比較して活性はわずかに低下しているが、ＬＡに対してもまた顕著なΔ１５デサチュラーゼ活性を示した）。３つのΔ１７デサチュラーゼの広範な触媒無差別性は、Ｃ２０ω−６脂肪酸基質に排他的に作用するサプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ）Δ１７デサチュラーゼからそれらを区別した。
【図１】
2010508019.tif 000029
【図２】
2010508019.tif 000030
【図３】
2010508019.tif 000031
【図４】
2010508019.tif 000032
【図５Ａ】
2010508019.tif 000033
【図５Ｂ】
2010508019.tif 000034
【図６】
2010508019.tif 000035
【図７】
2010508019.tif 000036
【図８】
2010508019.tif 000037
【図９】
2010508019.tif 000038
【図１０】
2010508019.tif 000039
【図１１】
2010508019.tif 000040
【図１２】
2010508019.tif 000041
【図１３】
2010508019.tif 000042
【図１４】
2010508019.tif 000043
【配列表】
2010508019000001.app
【国際調査報告】
2010508019.tif 000044
2010508019.tif 000045
2010508019.tif 000046
2010508019.tif 000047