(57)【要約】  本発明は血管内皮成長因子受容体を中和するヒトモノクローナル抗体及びその用途に係り、さらに詳しくは、血管内皮成長因子受容体を中和するヒトＳｃＦｖ分子及びこれを含有する血管新生抑制、並びに癌治療用組成物に関する。本発明に係る血管内皮成長因子受容体を中和するモノクローナル抗体は、生存細胞内において市販される血管内皮成長因子受容体の抗体よりも優れた中和能を示し、ヒトだけではなく、マウスとラットの血管内皮成長因子受容体においても中和能を示すことから、抗癌研究に役立ち、しかも、癌治療に極めて有効である。
2010529853.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜１９のうちいずれかのアミノ酸配列で表わされる軽鎖可変領域を含有し、血管内皮成長因子受容体を中和する一本鎖可変領域断片（ＳｃＦｖ）分子。
【請求項２】
配列番号２０のアミノ酸配列で表わされる重鎖可変領域を有することを特徴とする請求項１に記載の一本鎖可変領域断片（ＳｃＦｖ）分子。
【請求項３】
請求項１又は請求項２に記載の一本鎖可変領域断片（ＳｃＦｖ）分子をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
請求項３に記載のＤＮＡを含有するベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターで形質転換された細胞。
【請求項６】
細胞はバクテリア又は動物細胞であることを特徴とする請求項５に記載の細胞。
【請求項７】
請求項１又は請求項２に記載のＳｃＦｖ分子を含有する血管新生抑制用組成物。
【請求項８】
請求項１又は請求項２に記載のＳｃＦｖ分子を含有する癌治療用組成物。
【請求項９】
配列番号１〜１９のうちいずれかのアミノ酸配列で表わされる軽鎖可変領域を含有し、血管内皮成長因子受容体を中和するＩｇＧ。
【請求項１０】
配列番号２０のアミノ酸配列で表わされる重鎖可変領域を有することを特徴とする請求項９に記載のＩｇＧ。
【請求項１１】
請求項９又は請求項１０に記載のＩｇＧを含有する血管新生抑制用組成物。
【請求項１２】
請求項９又は請求項１０に記載のＩｇＧを含有する癌治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は血管内皮成長因子受容体を中和するヒトモノクローナル抗体及びその用途に係り、さらに詳しくは、血管内皮成長因子受容体を中和するヒト一本鎖可変領域断片（ＳｃＦｖ；Single Chain Fragment Variable）分子及びこれを含有する血管新生抑制、並びに癌治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
新生血管形成とは、内皮細胞の成長、分熱、遊走などによって既存の血管から新たな血管が生成されることを意味し、成人の場合、創傷治療、女性の性周期などの特別な場合を除いては発生しない。しかしながら、腫瘍の成長と転移、年齢関連黄班変性、リウマチ性関節炎、糖尿病性網膜症、乾癬及び慢性炎症などの疾病における過剰な新生血管の形成が報告されており（Cameliet and Jain, Nature, 407:249, 2000）、この理由から、新生血管抑制剤を用いて疾病治療、特に腫瘍の治療をするための幾多の努力が注がれている。
【０００３】
新生血管形成に関与する因子としては、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦｂ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）などがあり、これらの中で、内皮細胞成長因子は、内皮細胞の成長、分化、遊走に直接的に関与する内皮細胞特異的因子であって、４種の相異なるイソ型（ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１８９、ＶＥＧＦ２０６）が存在し、胎盤を除く全てのヒト組織においてＶＥＧＦ１６５が最も豊富なイソ型である（Tisher et al., J. Biol. Chem., 266:11947, 1991）。
【０００４】
内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）はイン・サイチュにて内皮前駆体（血管芽細胞）の分化からの新たな血管形成を調節し、胚芽組織（Breier et al., Development (Camb), 114:521, 1992）、大食細胞、傷治癒中の増殖上皮角化細胞（Brown et al., J. Exp. Med., 176:1375, 1992）において発現され、炎症関連組織浮腫の原因であることができる（Ferrara et al., Endocr. Rev., 13:18, 1992）。インサイチュ・ハイブリダイゼーション研究によれば、神経膠芽腫多形、血管芽腫、中枢神経系新形成及びエイズ関連カポジ肉腫（Plate et al., Nature, 359:845, 1992; Plate et al., Cancer Res., 53: 5822, 1993; Berkman et al., J. Clin. Invest., 91:153, 1993; Nakamura et al., AIDS Weekly, 13(1), 1992）をはじめとして多数のヒト腫瘍株においてＶＥＧＦが高度に発現されるということが証明された。高レベルのＶＥＧＦは低酸素症誘導血管新生においても観察された（Shweiki et al., Nature, 359:843, 1992）。
【０００５】
ＶＥＧＦの生物学的機能は、ＶＥＧＦに対して高アフィニティーを有するＶＥＧＦ受容体を通じて仲介されるが、前記受容体は胚芽形成（Millauer et al., Cell, 72:835, 1993）及び腫瘍形成中に内皮細胞において選択的に発現される。一般的に、ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）は、そのアミノ末端細胞外受容体リガンド−結合ドメインに多数個、一般的に５個又は７個のイムノグロブリン様ループを有することを特徴とするクラスIII受容体型チロシン・キナーゼである（Kaipainen et al., J. Exp. Med., 178:2027, 1993）。他の２つの領域は、キナーゼ挿入ドメインと呼ばれる可変長の親水性インターキナーゼ配列の挿入により中断されているカルボキシ末端細胞内触媒ドメイン及びトランスメンブラン領域を含む（Terman et al., Oncogene, 6:1677, 1991）。ＶＥＧＦＲはニューロピリン−１及びニューロピリン−２などの他の受容体もＶＥＧＦに結合することはできるとはいえ、ｆｍｓ様チロシン・キナーゼ受容体（ｆｌｔ−１）、又はＶＥＧＦＲ−１（Shibuya et al., Oncogene, 5:519, 1990; WO 92/14248; Terman et al., Oncogene, 6:1677, 1991）及びキナーゼ挿入ドメイン含有受容体／胎児肝キナーゼ（ＫＤＲ／ｆｌｋ−１）、又はＶＥＧＦＲ−２（Matthews et al., PNAS, 88:9026, 1991）を含む。他のチロシン・キナーゼ受容体であるＶＥＧＦＲ−３（ｆｌｔ−４）はＶＥＧＦホモログであるＶＥＧＦ−Ｃ及びＶＥＧＦ−Ｄに結合し、リンパ管の発達において重要な役割を果たす。
【０００６】
高レベルのＦｌｋ−１は神経膠腫を浸潤する内皮細胞により発現される（Plate et al., Nature, 359:845, 1992）。Ｆｌｋ−１レベルはヒト膠芽腫により生成されるＶＥＧＦにより特異的に上方調節される（Plate et al., Cancer Res., 53:5822, 1993）。膠芽腫関連内皮細胞（ＧＡＥＣ）においてＦｌｋ−１が高レベルで発現されるということは、Ｆｌｋ−１転写体が正常脳内皮細胞においてはほとんど検出されないため、受容体活性が恐らく腫瘍形成中に導かれるということを示す。このような上方調節は腫瘍に極めて近接した血管内皮細胞においてしか発生しない。中和抗−ＶＥＧＦモノクローナル抗体（ｍＡｂ）をもってＶＥＧＦ活性を遮断すれば、ヌードマウスにおいてヒト腫瘍移植片の成長が抑制されるが（Kim, K. et al., Nature, 362:841-844, 1993）、これは、腫瘍関連血管新生におけるＶＥＧＦが直接的な役割を果たすということを示すものである。
【０００７】
ＶＥＧＦリガンドが腫瘍細胞において上方調節され、その受容体が腫瘍浸潤管内皮細胞において上方調節されるとはいえ、血管新生未関連正常細胞においてはＶＥＧＦリガンド及びその受容体の発現は低い。このため、このような正常細胞はＶＥＧＦとその受容体との間の相互作用を遮断して血管新生が抑制されることになり、これにより、腫瘍成長が起こらない。
【０００８】
高レベルのＶＥＧＦＲ−２は神経膠腫に浸潤する内皮細胞により発現され、ヒト膠芽腫により生成されたＶＥＧＦにより特異的に上方調節される（Plate et al., Nature, 359:845, 1992; Plate et al., Cancer Res., 53:5822, 1993）。ＶＥＧＦＲ−２転写体は正常脳内皮細胞においてはほとんど検出されないため、膠芽腫関連内皮細胞（ＧＡＥＣ）において高レベルのＶＥＧＦＲ−２が発現されることは腫瘍形成中に受容体活性が誘導されるということを示す。
【０００９】
このため、腫瘍成長部位において発現されるＶＥＧＦの活性を抑制して血管新生を抑制することにより、腫瘍成長を抑制して癌治療に利用しようとする研究が盛んになされている。その代表的な方法として、癌細胞の細胞膜に存在するＶＥＧＦ受容体を遮断してＶＥＧＦの細胞内流入を遮断する方法が開発されている。その例として、ラット抗マウスＶＥＧＦＲ−２モノクローナル抗体（ＤＣ１０１；ＡＴＣＣ ＨＢ １１５３４）を生成するハイブリドーマ細胞株、マウス抗マウスＶＥＧＦＲ−２モノクローナル抗体ｍＡｂ ２５を生成するハイブリドーマ細胞株（Ｍ２５，１８Ａ１；ＡＴＣＣ ＨＢ １２１５２）、マウス抗マウスＶＥＧＦＲ−２モノクローナル抗体ｍＡｂ ７３を生成するハイブリドーマ細胞株（Ｍ７３，２４；ＡＴＣＣ ＨＢ １２１５３）、ＫＭ１７３０（ＦＥＲＭ ＢＰ−５６９７；ＷＯ ９８／２２６１６；ＷＯ ９９／５９６３６）、ＫＭ１７３１（ＦＥＲＭ ＢＰ−５７１８）、ＫＭ１７３２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５６９８）、ＫＭ１７４８（ＦＥＲＭ ＢＰ−５６９９）、ＫＭ１７５０（ＦＥＲＭ ＢＰ−５７００）などがある。
【００１０】
ＶＥＧＦ受容体に対するヒト化抗体に対する開発が絶えずなされているが、これまで開発されたこれらのＶＥＧＦ受容体のヒト化抗体はインビトロにおいてはＶＥＧＦと高い競合効率を示すものの、細胞内においてはＶＥＧＦ受容体中和率が低下したり、マウスやラットにおける交差反応が起こらないため、動物実験を行うことができないといった欠点があった。
【００１１】
そこで、本発明者らは、完全ヒト抗体ライブラリーを構築し、ＶＥＧＦ受容体（ＫＤＲ）に対する一本鎖可変領域断片（ＳｃＦｖ）をスクリーニングし、前記抗体がインビトロだけではなく、細胞内及び生体内においても優れたＫＤＲ中和効果を示し、マウス及びラットにおいても交差反応を示すということを見出し、本発明を完成するに至った。
【発明の概要】
【００１２】
本発明の目的は、細胞内及び生体内においても優れたＶＥＧＦ受容体中和能を有する完全ヒト化一本鎖可変領域断片（ＳｃＦｖ）抗体６Ａ６−ＳｃＦｖ及び６Ａ６−ＩｇＧを提供するところにある。
【００１３】
本発明の他の目的は、６Ａ６−ＳｃＦｖよりも一層優れたＶＥＧＦ受容体中和能を示す６Ａ６の軽鎖変異体である完全ヒト化ＳｃＦｖを提供するところにある。
【００１４】
本発明のさらに他の目的は、前記ＶＥＧＦ受容体中和能を有する完全ヒト化ＳｃＦｖ又はＩｇＧを含有する血管新生抑制用組成物を提供するところにある。
【００１５】
本発明のさらに他の目的は、前記ＶＥＧＦ受容体中和能を有する完全ヒト化ＳｃＦｖ又はＩｇＧを含有する癌治療用組成物を提供するところにある。
【００１６】
上記の目的を達成するために、本発明は、配列番号１〜１９のうちいずれかのアミノ酸配列で表わされる軽鎖可変領域を含有し、血管内皮成長因子受容体を中和する一本鎖可変領域断片（ＳｃＦｖ）分子を提供する。本発明において、一本鎖可変領域断片（ＳｃＦｖ）分子及びこの作製物は、配列番号２０のアミノ酸配列で表わされる重鎖可変領域を有することを特徴とすることができる。
【００１７】
また、本発明は、前記ＳｃＦｖ分子をコードするＤＮＡ、前記ＤＮＡを含有するベクター及び前記ベクターで形質転換された細胞を提供する。本発明において、細胞はバクテリア又は動物細胞であることを特徴とすることができる。
【００１８】
さらに、本発明は、前記ＳｃＦｖ分子を含有する血管新生抑制用組成物及び前記ＳｃＦｖ分子を含有する癌治療用組成物を提供する。
【００１９】
さらに、本発明は、配列番号１〜１９のうちいずれかのアミノ酸配列で表わされる軽鎖可変領域を含有し、血管内皮成長因子受容体を中和するＩｇＧを提供する。本発明において、前記ＩｇＧは配列番号２０のアミノ酸配列で表わされる重鎖可変領域を有することを特徴とすることができる。
【００２０】
さらに、本発明は、前記ＩｇＧを含有する血管新生抑制用組成物及び前記ＩｇＧを含有する癌治療用組成物を提供する。
【００２１】
本発明の他の特徴および具現例は、下記の詳細な説明及び特許請求の範囲からなお一層明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ｐＣＤＮＡ３−ＫＤＲ Ｄ１２３ｔＦｃｍベクターに挿入された遺伝子のアミノ酸配列及び機能を示すものである。
【図２】本発明に係るエピトープ・マッピングのためのＫＤＲ（ＥＣＤ１−２）及びＫＤＲ（ＥＣＤ２−３）−Ｆｃの模式図を示すものである。
【図３】本発明において精製されたＫＤＲ（ＥＣＤ１−３）−ＦｃのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示すものである。
【図４】本発明に係る抗ＫＤＲファージ及び抗ＫＤＲ−ＳｖＦｃのＶＥＧＦ競合アッセイ結果を示すものである。
【図５】本発明に係る６Ａ６ ＳｃＦｖファージの核酸配列、アミノ酸配列及びＣＤＲ配列を示すものである。
【図６】精製された６Ａ６ ＳｃＦｖに対するＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示すものである。
【図７】抗ＫＤＲ−ＳｃＦｖを用いたＶＥＧＦ競合アッセイ結果を示すものである。
【図８】本発明に係る抗ＫＤＲ−ＳｃＦｖのエピトープ・マッピング結果を示すものである。
【図９】６Ａ６ ＩｇＧの不変領域と重鎖領域を含むベクターであるｐＩＧＨＤ−６Ａ６Ｈｖｙの開裂マップを示すものである。
【図１０】ＩｇＧの不変領域と軽鎖領域を含むベクターであるｐＩｇＧＬＤ−６Ａ６Ｌｇｔの開裂マップを示すものである。
【図１１】精製された６Ａ６ ＩｇＧのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示すものである。
【図１２】抗ＫＤＲ ６Ａ６ ＩｇＧを用いたＶＥＧＦ競合アッセイ結果を示すものである。
【図１３】抗ＫＤＲ ６Ａ６ ＩｇＧを用いたＶＥＧＦファミリとの競合アッセイ結果を示すものである。
【図１４】本発明に係る抗ＫＤＲ ＩｇＧ抗体のＨＵＶＥＣ細胞に対する結合能をＦＡＣＳにより分析した結果を示すものである。
【図１５】ＨＵＶＥＣ細胞における本発明に係る抗ＫＤＲ ＩｇＧ抗体とＶＥＧＦ１６５との競合によるＦＡＣＳアッセイ結果を示すものである。
【図１６】Ｋ５６２（ＡＴＣＣＣＣＬ−２４３）細胞におけるＫＤＲ発現をウェスタン・ブロットにより確認した結果を示すものである。
【図１７】本発明に係る抗ＫＤＲ ＩｇＧ抗体のＫ５６２細胞株に対する結合能を示すものである。
【図１８】本発明に係る抗ＫＤＲ ＩｇＧ抗体のＫ５６２細胞株に対するＶＥＧＦとの競合を介してのＦＡＣＳアッセイ結果を示すものである。
【図１９】グリーベック耐性Ｋ５６２細胞株に対する抗ＫＤＲ抗体の結合能をＦＡＣＳにより分析した結果を示すものである。
【図２０】本発明に係る抗ＫＤＲ−ＩｇＧの細胞成長阻害の度合いを確認した結果を示すものである。
【図２１】抗ＫＤＲ抗体のＶＥＧＦによるＫＤＲリン酸化及びＥＲＫリン酸化抑制能に対するウェスタン・ブロット結果を示すものである。
【図２２】ＩｇＧ型ＫＤＲ抗体のＶＥＧＦによる内皮細胞の遊走阻害を示すものである。
【図２３】ＩｇＧ型ＫＤＲ抗体のＶＥＧＦによる内皮細胞のチューブ形成阻害を示すものである。
【図２４】ＩｇＧ型ＫＤＲ抗体−細胞表面のＫＤＲ間の結合を介してのＶＥＧＦ−ＫＤＲ内在化阻害を示すものである。
【図２５】ＩｇＧ型ＫＤＲ抗体のＶＥＧＦにより誘導されるラットの大動脈輪発芽阻害効果を示すものである。
【図２６】ＩｇＧ型ＫＤＲ抗体のＶＥＧＦによる新生血管形成抑制能に対する結果を示すものである。
【図２７】ＨＣＴ１１６細胞株を用いた大腸癌マウス異種移植モデルにおける６Ａ６抗体による腫瘍成長抑制効能の結果を示すものである。
【図２８】大腸癌マウス異種移植モデルにおける６Ａ６抗体処理後の切除腫瘍に対する写真である。
【図２９】Ａ５４９肺癌マウス異種移植モデルにおける６Ａ６抗体による腫瘍成長抑制効能の結果を示すものである。
【図３０】ＩｇＧ型６Ａ６抗体の放射性同位元素であるヨードを標識した結果を示すものである。
【図３１】慢性骨髄性白血病腫瘍モデルマウスにおいてヨード−１２３により標識されたＩｇＧ型６Ａ６抗体の生体映像に対する結果である。
【図３２】軽鎖シャッフルを製造するための模式図を示すものである。
【図３３】軽鎖シャッフルにより確保された抗ＫＤＲ抗体のＶＥＧＦ競合アッセイ結果を示すものである。
【図３４】軽鎖シャッフルにより確保された抗ＫＤＲ抗体のＶＥＧＦ競合アッセイ結果を示すものである。
【図３５】軽鎖シャッフルにより確保された抗ＫＤＲ抗体のＶＥＧＦ競合アッセイ結果を示すものである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、一観点において、血管内皮成長因子受容体を中和する完全ヒト化一本鎖可変領域断片（ＳｃＦｖ）抗体６Ａ６（ＴＴＡＣ−０００１）−ＳｃＦｖに関するものである。
【００２４】
前記６Ａ６−ＳｃＦｖは、下記の方法によりスクリーニングした。先ず、完全ヒト抗体ライブラリーを構築し、ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ−２）の細胞外ドメインのうちＩｇＧ両ドメイン１〜３をＦｃ部位と融合させたタンパク質を発現する細胞株を製作し、前記細胞株において精製された組換えＫＤＲ Ｄ１〜Ｄ３−Ｆｃ融合タンパク質を用いて、完全ヒト抗体ライブラリーにおいてＫＤＲを中和する抗ＫＤＲ−ＳｃＦｖ抗体をスクリーニングした。
【００２５】
前記スクリーニングされたＳｃＦｖ抗体はＶ５タギングとともにバクテリアにおいて発現／精製して、ヒトＫＤＲＤ１〜Ｄ３−Ｆｃ結合アッセイとＶＥＧＦ競合アッセイを通じて、ＳｃＦｖ−ファージ・パーティクルにおける結果を再確認し、ＢＩＡコア分析を通じて、ＳｃＦｖ−抗体のアフィニティーを測定して、そのアフィニティーが絶えず維持される６Ａ６−ＳｃＦｖを確保し、ＩｇＧ転換を行った。
【００２６】
また、本発明においては、初代培養したＨＵＶＥＣ細胞において６Ａ６−ＳｃＦｖが血管新生シグナル伝達因子であるＥＲＫのリン酸化を抑制するということをウェスタン・ブロットを通じて確認し、また、このような抑制は６Ａ６−ＳｃＦｖの濃度に依存して阻害されるということを確認した。
【００２７】
本発明は、他の観点において、血管内皮成長因子受容体を中和する完全ヒト化抗体６Ａ６−ＩｇＧに関するものである。
【００２８】
前記６Ａ６−ＩｇＧは、ＦＡＣＳ分析を通じて確認した結果、生存ＨＵＶＥＣ細胞（ＡＴＣＣ，USA）の表面において発現される内因性ヒトＫＤＲに市販されるＩＭＣ−１Ｃ１１ ＩｇＧキメラ抗体（Imclone，USA）よりも良好に結合し、競合的に結合するヒトＶＥＧＦ１６５を同時に処理した場合にも、ＩＭＣ−１Ｃ１１ ＩｇＧキメラ抗体よりも６Ａ６−ＩｇＧの方が生存ＨＵＶＥＣ細胞の表面に発現されるＫＤＲをさらに良好に中和することを示した。
【００２９】
これは、ＥＬＩＳＡにおいてＶＥＧＦ競合アッセイを行った結果が、６Ａ６−ＩｇＧとＩＭＣ−１Ｃ１１ ＩｇＧキメラ抗体がほとんど同様にＫＤＲを中和した結果とは違いがあるものであり、インビトロ結果とインビボ結果は異なる場合があり、インビトロアッセイ結果により高効率の抗体をスクリーニングするには限界があることを示すものである。
【００３０】
さらに、本発明においては、ヒト急性骨髄性白血病細胞株であるＫ５６２細胞株（ＡＴＣＣ，ＵＳＡ）において発現されるＫＤＲにはＩＭＣ−１Ｃ１１ ＩｇＧよりも、６Ａ６−ＩｇＧの方が遥かに良好に結合することを確認することができた。
【００３１】
また、本発明においては、初代培養したＨＵＶＥＣ細胞において６Ａ６−ＩｇＧが血管新生シグナル伝達因子であるＥＲＫのリン酸化を抑制するということをウェスタン・ブロットを通じて確認し、また、このような抑制は６Ａ６−ＩｇＧの濃度に依存して阻害されるということを確認した。
【００３２】
さらに、本発明に係る６Ａ６−ＩｇＧは、ＨＵＶＥＣ細胞がＶＥＧＦの存在する環境に遊走するＨＵＶＥＣ走化性を阻害することを確認し、直接的な血管新生作用であるＨＵＶＥＣ細胞のチューブ形成も抑制するということを確認した。
【００３３】
さらに、本発明においては、このような６Ａ６−ＩｇＧのＨＵＶＥＣ細胞に対するＶＥＧＦ効果の抑制機能がＨＵＶＥＣ細胞内部へのＶＥＧＦ受容体の流入を遮断するためであるということを確認するために、ＦＩＴＣにより標識されたＫＤＲ抗体を用いた実験において共焦点顕微鏡により観察した結果、６Ａ６−ＩｇＧ処理時にＶＥＧＦ受容体（ＫＤＲ）が流入できないということを確認した。
【００３４】
また、体外におけるラット大動脈輪アッセイを通じて、６Ａ６−ＩｇＧ処理したラットの大動脈輪は血管発芽が起こらないことを確認し、マウスの皮下にマトリゲルを注入したマトリゲルプラグアッセイを通じて血管新生能を分析した結果、ＶＥＧＦを処理した群の場合にはプラグ内において血管新生が観察されたのに対し、ＶＥＧＦと６Ａ６−ＩｇＧを一緒に処理した群においては血管新生が観察されず、インビボにおける血管新生抑制効果を確認した。
【００３５】
本発明は、他の観点において、６Ａ６−ＳｃＦｖの軽鎖配列を軽鎖シャッフル方法により変異させた変異体に関するものである。
【００３６】
前記軽鎖シャッフル方法を通じて１８個の６Ａ６−ＳｃＦｖの軽鎖変異体を確保し、前記軽鎖シャッフルは下記の方法により行われた。
（１）６Ａ６がバイオパニング過程中に再選択されることを防ぐために６Ａ６軽鎖シャッフルライブラリーのＤＮＡに６Ａ６のＣＤＲ３部位に認識部位が存在する制限酵素であるＳｐｅＩを処理した。前記ＤＮＡをさらにＥＴＢ細胞に形質転換させた後、サブライブラリーを構築し、ＥＬＩＳＡ上においてＫＤＲアフィニティー及びＶＥＧＦ競合アッセイを実施してＫＤＲ中和能に優れたクローンを選択した。
（２）バイオパニング過程中の洗浄段階において可溶性ＫＤＲと競合させて、ＫＤＲ中和能に優れたクローンを選択した。
（３）バイオパニング過程中のファージと抗原であるＫＤＲを結合させる過程においてＩＭＣ−１１２１Ｂ ＩｇＧ（ImClone，USA）を一緒に添加して、１１２１Ｂ ＩｇＧよりも優れているか、あるいは、それに類似するＫＤＲ中和能を有するクローンを選択した。
【００３７】
本発明は、さらに他の観点において、前記ＳｃＦｖ又は前記ＩｇＧを含有する血管新生抑制用組成物及び癌治療用組成物に関するものである。
【００３８】
本発明において、前記血管新生は、腫瘍の成長と転移、年齢関連黄斑変性、リウマチ性関節炎、糖尿病性網膜症、乾癬及び慢性炎症に随伴する血管新生を含むが、本発明がこれらに限定されるものではない。
【００３９】
本発明において、前記癌は、大腸癌、膵臓癌、直腸癌、大腸直腸癌、前立腺癌、腎臓癌、メラノーマ、前立腺癌の骨転移癌、卵巣癌及び血液癌を含むが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４０】
本発明の組成物は、特定の分子に適した任意の経路により投与することができる。本発明の組成物は、任意の好適な手段を用いてヒトをはじめとする動物に直接的に（例えば、注射、皮下注入又は組織位置への局所的投与のように局所的に）又は全身的に（例えば、非経口又は経口的に）提供されうる。本発明に係る組成物が非経口、例えば、静脈、皮下、目、腹腔、筋肉内、口腔、直腸、膣内、眼窩内、大脳内、脊髄内、心室内、鞘内、嚢内、関節包内、鼻腔内、又は煙霧質投与により提供される場合、組成物は、水性又は生理的和合性である流体懸濁液又は溶液部分を含むことが好ましい。このため、担体又は賦形剤は生理的に許容されうるものであって、所望の組成物を患者に伝達する他にも、患者の電解質及び／又は体積バランスに悪影響を及ぼさないことが求められる。このため、このような製剤用流体媒質は標準生理塩水を含みうる。
【００４１】
本発明のＳｃＦｖ又はＩｇＧタンパク質は、癌患者に治療的処置のために腫瘍の進行、例えば、腫瘍の成長、侵入、転移及び（又は）再発を防止、抑制又は減少させるのに十分な量にて投与されうる。前記目的を達成するために好適な量を治療有効容量と定義する。前記用途に効果的な量は、当該疾患の重度及び患者自身の免疫系の一般的な状態によるであろう。
【００４２】
本発明の好ましい容量は０.０１〜１００ｍｇ／ｋｇであり、０.１〜１０ｍｇ／ｍ２であることがさらに好ましい。
【００４３】
しかしながら、最適投与量は、治療の対象となる疾患と副作用の存否によって異なってくる。ところが、最適投与量は、通常の実験により決定することができる。抗体の投与は、周期的な丸剤注入、又は外部貯蔵器（例えば、静脈袋）又は内部貯蔵器（例えば、生体分解性インプラント）からの連続した静脈又は腹腔注射により行うことができる。また、本発明の抗体タンパク質は、多数の相異なる生物学的活性分子とともに目的受容体に投与することができる。しかしながら、抗体タンパク質及びその他の分子の最適な組合せ、投与方式及び投与量は、当業者の技術レベルに属する通常の実験により決定することができる。
【００４４】
本発明に係る組成物は、当該疾患と関連する他の治療剤と併用することができる。
【００４５】
ヒト腫瘍を含む腫瘍を、ＶＥＧＦ受容体抗体と化学療法剤、放射線、又は追加の受容体拮抗剤又はそれらの組合せとを併用して治療する場合、相乗作用が存在する。換言すると、ＶＥＧＦ受容体抗体による腫瘍成長の抑制は、化学療法剤、放射線、又は追加の受容体拮抗剤又はそれらの組合せと併用する場合に期待以上に増強される。相乗作用は、例えば、ＶＥＧＦ受容体抗体及び化学療法剤、放射線、又は追加の受容体拮抗剤による治療の上記の効果から期待されるものよりも、併用治療法の利用によるさらに大きな腫瘍成長抑制のものにより例示されうる。好ましくは、相乗作用は、ＶＥＧＦ受容体抗体及び化学療法剤の組合せ物、放射線、又は追加の受容体拮抗剤を用いた治療からは緩和が期待されない癌の緩和により証明される。
【００４６】
ＶＥＧＦ受容体抗体は化学療法又は放射線療法の着手前、これらの療法の着手後、及びそれらの組合せ、すなわち、化学療法及び／又は放射線療法の着手前及び着手中、これらの療法の着手前及び着手後、これらの療法の着手中及び着手後、又はこれらの療法の着手前、着手中、及び着手後に投与される。例えば、ＶＥＧＦ受容体抗体が抗体である場合、一般的に、抗体は、放射線療法及び／又は化学療法の着手１日から３０日前、好ましくは、３日から２０日前、さらに好ましくは、５日から１２日前に投与される。
【００４７】
ＶＥＧＦ受容体抗体
一実施形態において、ＶＥＧＦ受容体抗体はＶＥＧＦ受容体の細胞外ドメイン上のエピトープに特異的に結合する。ＶＥＧＦ受容体の細胞外ドメインはリガンド結合ドメインである。前記リガンド結合ドメインは受容体のある末端において発見されうるが、正常的にはアミノ末端において発見される。
【００４８】
ＶＥＧＦ受容体のいくつかの例は、文献において、Ｆｌｔ−１（ＶＥＧＦＲ−１）、ＫＤＲ及びＦｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）で表わされるタンパク質チロシン・キナーゼ受容体を含む。特にことわらない限り、又は、文脈により別に明確に提案されない限り、又は、文脈により別に明確に提案されない限り、この明細書は、ＶＥＧＦ受容体の慣習的な文献命名法に準拠する。ＫＤＲ（ＶＥＧＲ−２）はＭＷ １８０ｋＤのヒト型のＶＥＧＦ受容体である（Terman et al., Oncogene, 6:1677, 1991）。Ｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）はネズミ科のＫＤＲホモログである（Matthews et al., PNAS, 88:9026, 1991）。Ｆｌｔ−１（ＶＥＧＦＲ−１）はＫＤＲ／Ｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）受容体とは異なるが、それと関連するＶＥＧＦ受容体型で表わされる（Shibuya et al., Oncogene, 5:519, 1990）。
【００４９】
その他のＶＥＧＦ受容体はＶＥＧＦにより交差−結合標識されうるか、あるいは、ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ−２）により共同−免疫沈澱されうるものを含む。いくつかの公知の形態の前記ＶＥＧＦ受容体は、概ね１７０ＫＤ、１５０ＫＤ、１３０−１３５ＫＤ、１２０−１２５ＫＤ及び８５ＫＤの分子量を有する（Quinn et al., PNAS, 90:7533, 1993; Scher et al., J. Biol. Chem., 271:5761, 1996）。
【００５０】
ＶＥＧＦ受容体は、一般的に内皮細胞などの細胞に結合する。ＶＥＧＦ受容体は、非内皮細胞、例えば、腫瘍細胞にも結合することができる。これとは異なり、ＶＥＧＦ受容体は細胞から自由になりうるが、好ましくは、可溶型であることができる。
【００５１】
本発明に係る拮抗剤はＶＥＧＦ受容体を中和する。この明細書において、受容体を中和するということは、受容体の内因性キナーゼ活性を不活性化させて信号を伝達するということを意味する。信頼性あるＶＥＧＦ受容体の中和分析は受容体リン酸化の抑制である。
【００５２】
本発明は、ＶＥＧＦ受容体中和の特定のメカニズムにより限定されない。ある拮抗剤により起こるメカニズムが他の拮抗剤により起こるメカニズムと同一である必要はない。いくつかの採用されうるメカニズムは、ＶＥＧＦ受容体の細胞外結合ドメインにＶＥＧＦリガンドが結合することを防止して、受容体の二量体化又はオリゴマー化を防止することを含む。しかしながら、その他のメカニズムを除外することはできない。
【００５３】
本発明の文脈において、ＶＥＧＦ受容体（又はＶＥＧＦＲ）抗体はＶＥＧＦＲサブファミリの受容体の活性化を抑制し、ＶＥＧＦＲサブファミリの受容体の活性化を抑制するということはＶＥＧＦＲの活性化を減少させるということを意味する。すなわち、活性化の防止はＶＥＧＦＲの活性化を完全に中止する必要はない。また、本発明により定義されるように、ＶＥＧＦＲ活性化の抑制はＶＥＧＦＲ抗体とＶＥＧＦＲとの相互作用によるＶＥＧＦＲの抑制を意味する。関連は、ＶＥＧＦＲ受容体のチロシン・キナーゼ活性化を抑制するＶＥＧＦＲ抗体とＶＥＧＦＲとの間の十分な物理的又は化学的相互作用を意味する。当業界の熟練者であれば、関連又は結合を含むこのような化学的相互作用の例が当業界に知られており、共有結合、イオン結合、水素結合などを含むということが理解できるであろう。このため、本発明のＶＥＧＦＲ拮抗剤は前記受容体のチロシン・キナーゼ活性化を抑制するが、これはＶＥＧＦＲシグナル伝達経路に関連する様々なその他のタンパク質のリン酸化及び前記受容体の自己リン酸化を防止する。血管形成及び血管新生の調節に関連するこのような経路は、ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）経路又はホスファチジルイノシトール３’キナーゼ（ＰＩ３−Ｋ）Ａｋｔ及びマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）経路のうち任意のものを含む（Larrivee et al., Int. J. Med., 5:447, 2000）。
【００５４】
ＶＥＧＦＲサブファミリの受容体は細胞外ドメインに７個のイムノグロブリン様ループ、単一トランスメンブラン領域及び細胞内領域にスプリットチロシン・キナーゼ・ドメインが存在することをその特徴とする（クラスiii受容体チロシン・キナーゼ）。種々の公知のＶＥＧＦＲサブファミリの受容体メンバーが存在するが、その例としては、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２及びＶＥＧＦＲ−３を挙げることができる。
【００５５】
一般的に、ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ−２）が内皮細胞増殖、遊走、分化、管形成、血管透過性増加、及び血管整合性の維持につながる主なＶＥＧＦシグナル伝達体であると考えられている。ＶＥＧＦＲ−１は遥かに弱いキナーゼ活性を保有し、ＶＥＧＦＲ−１がＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ−２）よりも略１０倍ほどさらに高いアフィニティーをもってＶＥＧＦに結合するとしても、ＶＥＧＦにより刺激する場合に有糸分熱誘発応答（マイトジェン応答）を生成することはできない。ＶＥＧＦＲ−１はＶＥＧＦ及び胎盤成長因子（ＰＩＧＦ）誘導性の単核球及び大食細胞の遊走及び組織因子の生成にも関与する。
【００５６】
前記ＥＧＦＲの場合と同様に、ＶＥＧＦＲの活性化増加は高レベルのリガンド、ＶＥＧＦＲ遺伝子増幅、受容体の転写増加又は未調節受容体シグナリングを引き起こす突然変異に起因しうる。
【００５７】
本発明の一実施形態において、ＶＥＧＦＲ抗体は、ＶＥＧＦＲがそのリガンドに結合することを抑制する。リガンドがＶＥＧＦＲの外部の細胞外ドメインに結合すれば、受容体の二量体化、ＶＥＧＦＲの自己リン酸化、受容体の内部の細胞質チロシン・キナーゼ・ドメインの活性化、及び血管形成及び血管新生の調節に関連する多数のシグナル伝達経路の開始が刺激される。
【００５８】
ＶＥＧＦＲのリガンドはＶＥＧＦ及びそのホモログであるＰＩＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ及びＶＥＧＦ−Ｅを含む。例えば、二量体で分泌される因子であって、単にＶＥＧＦＲ−１にのみ結合するＰＩＧＦは、細胞性栄養膜細胞、合胞体栄養膜細胞及び絨毛外栄養膜細胞により多量生成され、ＶＥＧＦに対して近いアミノ酸相同性を有する。ヒトにおいては、３種のイソ型であるＰＩＧＦ−１、ＰＩＧＦ−２、及びＰＩＧＦ−３が存在する。ＰＩＧＦを欠くマウスを用いた研究によれば、前記成長因子は血管新生そのものには関連しておらず、むしろ病的な状況中にＶＥＧＦの血管新生及び透過性効果を特異的に調整する。また、ＶＥＧＦ−Ｄは他のＶＥＧＦファミリメンバーにおいては発見されないＮ−末端及びＣ−末端延長が存在してＶＥＧＦ−Ｃに密接に連関している。成人組織において、ＶＥＧＦ−Ｄ ｍＲＮＡは心臓、肺、骨格筋肉、結腸及び小腸において最も豊富である。ＶＥＧＦ−Ｄ受容体特異性の分析によれば、ＶＥＧＦ-ＤはＶＥＧＦＲ−２（Ｆｌｋ１）及びＶＥＧＦＲ−３（Ｆｌｔ４）の両方のリガンドであり、前記受容体を活性化させることができるが、ＶＥＧＦ−ＤはＶＥＧＦＲ−１には結合しないことが判明された。また、ＶＥＧＦ−Ｄは内皮細胞のマイトジェンである。
【００５９】
本発明の他の実施形態において、ＶＥＧＦＲ抗体はＶＥＧＦＲに結合する。ＶＥＧＦＲ抗体は、チロシン・キナーゼ・ドメインに内部的に結合可能であるか、あるいは、ＶＥＧＦＲの細胞外部分に外部的に結合可能であるが、このような外部的結合はリガンドの結合を抑制したり抑制することができない。好ましくは、本発明のＶＥＧＦＲ拮抗剤はＶＥＧＦＲに特異的な抗体、又はその機能的な等価物であるが、これらの詳細については後述する。
【００６０】
一つの好ましい実施形態において、ＶＥＧＦ受容体抗体はＫＤＲに特異的に結合する。特に好ましいのは、ＫＤＲの細胞外ドメインに結合してそのリガンドであるＶＥＧＦ及びＰＩＧＦの一方又はこれらの両方による結合を遮断し／遮断したり、ＫＤＲのＶＥＧＦ−誘導性又はＰＩＧＦ−誘導性活性化を中和する抗原−結合タンパク質である。
【００６１】
また、ＶＥＧＦＲ−２抗体を生成する様々なハイブリドーマが存在する。例えば、ラット抗マウスＶＥＧＦＲ−２モノクローナル抗体（ＤＣ１０１）を生成するハイブリドーマ細胞株はＡＴＣＣ ＨＢ １１５３４として寄託され、マウス抗マウスＶＥＧＦＲ−２モノクローナル抗体ｍＡｂ ２５を生成するハイブリドーマ細胞株（Ｍ２５、１８Ａ１）はＡＴＣＣ ＨＢ １２１５２として寄託され、マウス抗マウスＶＥＧＦＲ−２モノクローナル抗体ｍＡｂ ７３を生成するハイブリドーマ細胞株（Ｍ７３、２４）はＡＴＣＣ ＨＢ １２１５３として寄託された。
【００６２】
また、ＷＯ９８／２２６１６、ＷＯ９９／５９６３６、ＡＵ５０６６６９８ Ｂ２及びＣＡ ２３２８８９３に開示されているハイブリドーマＫＭ１７３０（ＦＥＲＭ ＢＰ−５６９７として寄託される）、ＫＭ１７３１（ＦＥＲＭ ＢＰ−５７１８として寄託される）、ＫＭ１７３２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５６９８として寄託される）、ＫＭ１７４８（ＦＥＲＭ ＢＰ−５６９９として寄託される）、ＫＭ１７５０（ＦＥＲＭ ＢＰ−５７００として寄託される）をはじめとして抗−ＶＥＧＦＲ−１抗体を生成する多くのハイブリドーマが存在し、これらに制限されない。
【００６３】
多くの他のＶＥＧＦＲ拮抗剤が当業界に公知されている。ＶＥＧＦＲ拮抗剤の一部の例は，米国特許第５，１８５，４３８号公報；第５，６２１，０９０号公報；第５，２８３，３５４号公報；第５，２７０，４５８号公報；第５，３６７，０５７号公報；第５，５４８，０６５号公報；第５，７４７，６５１号公報；第５，９１２，１３３号公報；第６，６７７，４３４号公報；第６，９６０，４４６号公報；第５，８４０，３０１号公報；第５，８６１，４９９号公報；第６，３６５，１５７号公報；第５，９５５，３１１号公報；第６，３６５，１５７号公報；第６，８１１，７７９号公報；及びＷＯ２００１／６６０６３号公報に記載されている。米国特許第５，８６１，３０１号公報、Terman et al., Oncogene, 6:1677, 1991、ＷＯ９４／１０２０２号公報；及びＷＯ９５／２１８６５号公報にはＶＥＧＦＲ拮抗剤、特に抗−ＶＥＧＦＲ−２抗体が記載されている。また、ＷＯ９５／２１８６８号公報には抗−ＶＥＧＦＲ−２抗体が記載されている。抗−ＶＥＧＦＲ抗体は米国特許第６，１７７，４０１号公報；第５，７１２，３９５号公報に記載されており，米国特許第５，９８１，５６９号公報には有機分子であるＶＥＧＦＲ拮抗剤が記載されている。また、ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ−２）及びＶＥＧＦＲ−１に働く２つの異なる抗原結合特異性又は部位を有する抗体である２特異性抗体（ＢｓＡｂｓ）がHennequin et al., J. Med. Chem., 42:5369, 1999にＶＥＧＦ受容体抗体として有用な特定のキナゾリン、キノリン及びシンノリンが開示されている（Annie et al., J. Acqu. Immune Defic. Syn. and Hum. Retrovirol., 17: A41, 1998）。
【００６４】
また、ＶＥＧＦＲ抗体決定のための分析は当業界に公知されており、本発明のＶＥＧＦＲ抗体はリン酸化を一般的に随伴するＶＥＧＦＲのチロシン・キナーゼ活性を抑制する。このため、リン酸化分析は本発明におけるＶＥＧＦＲ拮抗剤の決定に有用である。チロシン・キナーゼ活性の分析はPanek et al., J. Pharmacol. Exp. Thera., 283:1433, 1997及びBatley et al., Life Sci., 62:143, 1998に記載されている。また、ＶＥＧＦＲ発現検出に特異的な方法を使用することができる。
【００６５】
抗体
本発明の抗体は当業界に公知の方法により製造することができる（Kohler and Milstein, Nature, 256:495, 1975; Campbell, Monoclonal Antibody Technology, The Production and Characterization of Rodent and Human Hybridomas; Burdon et al., Eds., Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 13, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985; Huse et al., Science, 246:1275, 1989）。本発明の抗体はモノクローナル又は多クローン又は全体抗体と同一又は類似の結合特性を有する抗体の他の任意の好ましい形態、例えば、抗体の断片又は誘導体、一本鎖抗体（ＳｃＦｖ）又は抗体の合成ホモログであることができる。本発明において使用されたように、特にことわらない限り、又は、文脈により別に明確に提案されない限り、抗体ドメイン、領域及び断片は当業界に公知の標準定義に準拠し（Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology, W.B. Saunders Company, Philadelphia, PA, 1991）、好ましくは、本発明の抗体はモノクローナル抗体である。
【００６６】
抗体断片は全体抗体の切断又は前記断片をコードするＤＮＡを発現させて製造することができる。抗体断片は公知の文献に記載の方法により製造することができる（Lamoyi et al., J. Immunol. Methods, 56:235, 1983; Parham, J. Immunol., 131:2895, 1983）。前記断片はＦａｂ（Fragment, antigen binding）断片又はＦ（ａｂ’）２断片の一方又は両方を含みうる。また、前記断片は一本鎖可変領域断片抗体、すなわち、ＳｃＦｖ、ダイアボディー又は他の抗体断片を含みうる。前記機能的等価物の製造方法は、ＷＯ９３／２１３１９号公報、ヨーロッパ特許第２３９，４００号公報；ＷＯ８９／０９６２２号公報；ヨーロッパ特許第３３８，７４５号公報及びヨーロッパ特許第３３２，４２４号公報に記載されている。
一本鎖抗体（ＳｃＦｖ）は相互連結リンカーを使用したり使用せずに軽鎖の可変領域に連結される抗体の重鎖の可変領域からなるポリペプチドである。このため、ＳｃＦｖは全体抗体結合部位を含む。前記鎖は細菌又は真核細胞において生成することができる。本発明における代表的なＳｃＦｖの例は、６Ａ６−ＳｃＦｖ（ＴＴＡＣ−０００１）である。６Ａ６−ＳｃＦｖはＶＥＧＦとＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ−２）との相互作用を遮断し、ＨＵＶＥＣ細胞及びＫ５６２細胞のＶＥＧＦ−刺激された受容体リン酸化を抑制することが判明された。前記６Ａ６−ＳｃＦｖはＨＵＶＥＣ細胞及びＫ５６２細胞上において可溶性ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ−２）及び細胞表面−発現されたＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ−２）の両方ともに結合する。６Ａ６−ＳｃＦｖは配列番号３６の軽鎖配列を有し、配列番号３５の重鎖配列を有する。６Ａ６−ＳｃＦｖ抗体は完全ヒト抗体であり、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、二価ＳｃＦｖ、二価組み換え型ＳｃＦｖ、ヒトＩｇＧ抗体から製作されうる。
【００６７】
好ましくは、抗体断片は全体抗体の６個の相補性決定領域をいずれも含有するが、前記全ての領域をより少なく含有する断片、例えば、３、４又は５個のＣＤＲがまた機能的であることができる。抗体断片が免疫原性になるのに短過ぎると、キャリア分子にコンジュゲートすることができる。一部の好ましいキャリア分子はキーホール・リンペット・ヘモシアニン及び牛血清アルブミンを含む。結合（コンジュゲーション）は当業界に公知の方法により行うことができる。
【００６８】
また、本発明の抗体は、それに対する結合特性が定方向突然変異、アフィニティー成熟、ファージ・ディスプレイ又は鎖シャッフルの方法により改良されているところの抗体を含む。アフィニティー及び特異性はＣＤＲを突然変異させ、所望の特徴を有する抗原結合部位についてスクリーニングすることにより、修飾又は改善されうる（Yang et al., J. Mol. Biol., 254:392, 1995）。ＣＤＲは種々の方式により突然変異される。１の方法は、同一抗原結合部位をもつ集団において、２０アミノ酸の全てが特別の位置に存在するように、個々の開発残基又は残基の組合せを無作為化させることである。あるいは、突然変異を引き起こす変異性ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）方法により一定範囲のＣＤＲ残基に亘って突然変異を誘発させる（Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226:889, 1992）。重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子を含有するファージ・ディスプレイ・ベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉの突然変異菌株において繁殖される（Low et al., J. Mol. Biol., 250:359, 1996）。これらの突然変異誘発方法は当業者が通常的に使用する方法である。
【００６９】
抗体、特に、モノクローナル抗体は当業界に公知の方法により製造することができる。抗体製法の例は、ハイブリドーマ細胞における製造及び受容体拮抗剤をコードするＤＮＡを使用する哺乳類細胞の形質転換を含むが、これに制限されない。これらの方法は、各種の文献に記載されている（Kohler and Milstein, Nature, 256:495, 1975; Campbell in “Monoclonal Antibody Technology, The Production and Chracterization of Rodent and Human Hybridomas” in Burdon et al, Eds., Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol.13, Elservier Science Publishers, Amsterdam, 1985; Huse et al., Science, 246:1275, 1989）。
【００７０】
また、抗体の等価物は当業界に公知の方法により製造される。例えば、抗体の断片は全体抗体から酵素的に製造することができる。好ましくは、抗体の等価物は前記等価物をコードするＤＮＡから製造することができる。抗体の断片をコードするＤＮＡは完全長抗体をコードするＤＮＡの目的とする部分を除く全部を欠失することにより製造することができる。キメラ抗体をコードするＤＮＡは対応するヒト抗体領域から実質的に又は排他的に由来したヒト不変領域をコードするＤＮＡ及びヒト以外の哺乳類の可変領域の配列から実質的に又は排他的に由来した可変領域をコードするＤＮＡを組み換えることにより製造することができる。ヒト化抗体をコードするＤＮＡは対応するヒト抗体領域から実質的に又は排他的に由来した、相補性決定領域（ＣＤＲ）以外の不変領域及び可変領域をコードするＤＮＡ及びヒト以外の哺乳類から実質的に又は排他的に由来したＣＤＲをコードするＤＮＡを組み換えることにより製造することができる。
【００７１】
抗体の断片をコードするＤＮＡ分子の好適な供給源は完全長抗体を発現するハイブリドーマなどの細胞を含む。断片は抗体等価物としてそれ自体使用されることができ、あるいは、上述したように、等価物に組み換えられることができる。この節に記載されるＤＮＡ欠失及び組換えは、「抗体の機能的等価物」と題する節において先に列挙した公開特許に掲載された如き公知の方法及び（又は）後述する他の標準組換えＤＮＡ技術により行うことができる。
【００７２】
本発明の抗体のベクターの形質転換及び発現のための好ましい宿株細胞は、哺乳類細胞、例えば、ＣＯＳ−７細胞、チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞及びリンパ性起源の細胞株、例えば、リンパ腫、骨髄腫又はハイブリッド細胞である。酵母などの他の真核宿株が代案的に使用されうる。例えば、胎マウス肝基質細胞株２０１８はＡＰタグ−ｆｌｋ１及びＡＰタグ−ｆｌｋ−２融合タンパク質に結合し、すなわち、ＶＥＧＦＲ−２及びｆｌｋ−２のリガンド（ＡＴＣＣ，Manassas，ＶＡ，ＣＲＬ １０９０７）を含有し、ヒト胎脾臓細胞株Ｆｓｐ ６２８９１はｆｌｋ−２リガンド（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０９３５）を含有し、ヒト基質胎胸腺Ｆ.ｔｈｙ６２８９１はＶＥＧＦＲ−２リガンド（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０９３６）を含有する。
【００７３】
本発明において使用される「ベクター」という用語は、宿株細胞に挿入されて宿株細胞ゲノムと組み換えられ、ここに挿入されるか、又はエピゾームとして自発的に複製する競争ヌクレオチド配列を含む任意の核酸を意味する。このようなベクターとしては、線形核酸、プラスミド、ファージミド、コスミド、ＲＮＡベクター、ウィルス・ベクターなどがある。ウィルス・ベクターの例としては、レトロウィルス、アデノウィルス及びアデノ関連ウィルスがあり、本発明はこれらに制限されるものではない。
【００７４】
本発明において使用される「遺伝子発現」又は標的タンパク質の「発現」という用語は、ＤＮＡ配列の転写、ｍＲＮＡ転写体の翻訳及びＦｃ融合タンパク質生成物の分泌を意味するものである。
【００７５】
好適な宿株細胞を本発明がＤＮＡ配列で形質転換又は形質感染させ、これを標的タンパク質を発現及び／又は分泌させるのに用いることができる。本発明に使用して好適な宿株細胞としては、不滅化されたハイブリドーマ細胞、ＮＳ／Ｏ骨髄腫細胞、２９３細胞、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＨＥＬＡ細胞及びＣＯＳ細胞がある。
【００７６】
形質転換された宿株細胞は当業界に公知の方法により同化されうる炭素源（グルコース又はラクトースなどの炭水化物）、窒素源（アミノ酸、ペプチド、タンパク質又はこれらの分解産物、例えば、ペプトン、アンモニウム塩など）及び無機塩（ナトリウム、カリウム、マグネシウム及びカルシウムの硫酸塩、リン酸塩及び（又は）炭酸塩）を含有する液体培地中において培養される。培地は、例えば、微量元素、例えば、鉄、亜鉛、マンガンなどの成長−促進物質をさらに含有する。
【００７７】
遺伝子構造物を酵母において発現させることが望まれる場合に、酵母において使用して好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹｒｐ７に存在するｔｒｐｌ遺伝子である（Stinchcomb et al., Nature, 282:39, 1979; Kingsman et al., Gene, 7:141, 1979）。Ｔｒｐｌ遺伝子はトリプトファン内において成長する能力を欠く酵母の突然変異菌株、例えば、ＡＴＣＣ Ｎｏ.４４０７６又はＰＥＰ４−１に対する選択マーカーを提供する（Jones, Genetics, 85:12, 1977）。このため、酵母宿株細胞ゲノム内におけるｔｒｐｌ損傷の存在はトリプトファンの不在下に成長による形質転換を検出するための効果的な環境を提供する。類似に、ｌｅｕ２−欠陥酵母菌株（ＡＴＣＣ ２０，６２２又は３８，６２６）はＬｅｕ２遺伝子を含有する公知のプラスミドにより補完される。
【００７８】
他の方法として、受容体拮抗剤をコードするＤＮＡはウィルス、例えば、アデノウィルス、アデノ関連ウィルス、ヘルペスウィルス、レトロウィルス又はレンチウィルスから由来したベクター内にクローニングされうる。遺伝子発現は誘導されうる又は誘導され得ない調節配列により制御される。
【００７９】
簡単に、抗体、抗体等価物又はＶＥＧＦ受容体などの目的とするＤＮＡを発現する核酸分子を含有する好適な細胞源を選択する。全体ＲＮＡは好適な起源から標準手順により製造する。全体ＲＮＡがｃＤＮＡ合成を指導するために用いられる。ＲＮＡを単離してｃＤＮＡを合成するための標準方法は、例えば、上述した如き分子生物学の標準マニュアルに提供されている。
【００８０】
ｃＤＮＡは公知の技術により増幅することができる。例えば、ｃＤＮＡはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅のためのテンプレートとして使用されうる（Saiki et al., Science, 239:487, 1988; US 4,683,195; 米国特許第４，６８３，１９５号公報；米国特許第４，６８３，１９５号公報）。ＰＣＲ増幅用オリゴヌクレオチド・プライマーの配列は増幅されるべき公知配列から由来する。オリゴヌクレオチドは公知の方法により合成される（Caruthers, Science, 230:281, 1985）。
【００８１】
上流及び下流オリゴヌクレオチドの混合物がＰＣＲ増幅に使用される。条件は標準方法によってそれぞれの特定のプライマー対に対して最適化される。ＰＣＲ生成物は、例えば、プライマー間の配列に対応する正確なサイズを有するｃＤＮＡに対する電気泳動により分析する。あるいは、コード領域は２以上の重複断片に増幅されうる。重複断片は断片から完全なｃＤＮＡの会合を可能にする制限部位を含むように講じられる。
【００８２】
ＶＥＧＦ受容体のための全体タンパク質コード領域を単離するために、例えば、上流ＰＣＲオリゴヌクレオチド・プライマーは、好ましくは、ＡＴＧ開始コドン及び開始コドン上流の少なくとも５−１０ヌクレオチドを含む５’末端の配列に相補的である。下流ＰＣＲオリゴヌクレオチド・プライマーは目的とするＤＮＡ配列の３’末端の配列に相補的である。目的とするＤＮＡ配列はＶＥＧＦ受容体の全体細胞外部分をコードすることが好ましく、任意にトランスメンブラン領域の全部又は一部及び（又は）停止コドンをはじめとして細胞内領域の全部又は一部をコードする。
【００８３】
増幅されるＤＮＡ、例えば、抗体、抗体等価物又はＶＥＧＦ受容体をコードするＤＮＡは極めて広範な宿株細胞において極めて広範なクローニング・ベクターにおいて複製されうる。宿株細胞は原核又は真核細胞であることができる。
【００８４】
ＤＮＡがその内部にスプライスされるベクターは、染色体、非染色体及び合成ＤＮＡ配列のセグメントを含みうる。好適な原核クローニング・ベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のプラスミド、例えば、ｃｏｌＥＩ、ｐＣＲＩ、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ｐＫＳＭ及びＲＰ４を含む。また、原核ベクターはファージＤＮＡ、例えば、Ｍ１３及び他の繊維状単一筋ＤＮＡファージの誘導体を含む。ＶＥＧＦ受容体をコードする核酸クローニングに適したベクターはバキュロウィルス・ベクターである。
【００８５】
発現されるＤＮＡを含むベクターは好適な宿株細胞にトランスファクションされる。宿株細胞は好適な培地に維持され、細胞及びベクターが複製される条件に適用される。ベクターは細胞から回収することができる。発現されるＤＮＡはベクターから回収することができる。
【００８６】
発現されるＤＮＡ、例えば、抗体、抗体等価物又は受容体をコードするＤＮＡは好適な発現ベクターに挿入されて好適な原核又は真核宿株細胞において発現されうる。
【００８７】
例えば、宿株細胞に挿入されるＤＮＡはＶＥＧＦ受容体の全体細胞外部分又はＶＥＧＦ受容体の細胞外部分の可溶性断片をコードすることができる。ＤＮＡによりコードされるＶＥＧＦ受容体の細胞外部分は任意に５’末端又は３’末端の一方又は両方において追加のアミノ酸配列に付着される。追加のアミノ酸配列はＶＥＧＦ受容体細胞外領域、例えば、リーダー配列、トランスメンブラン領域及び（又は）ＶＥＧＦ受容体の細胞内領域に付着されうる。また、追加のアミノ酸配列は天然ＶＥＧＦ受容体に付着されない配列であることができる。好ましくは、前記追加のアミノ酸配列は、特定の目的、例えば、発現レベル、分泌、溶解度又は免疫原性を改善させる機能を行う。
【００８８】
細菌、特に大腸菌においてタンパク質を発現するためのベクターは公知されている（Dieckmann and Tzagoloff, J. Biol. Chem., 260:1513, 1985）。前記ベクターはアントラニル酸塩合成酵素（ＴｒｐＥ）及びカルボキシ末端のポリリンカーをコードするＤＮＡ配列を含む。他の発現ベクター・システムはβ−ガラクトシダーゼ（ｐＥＸ）；ラムダＰＬマルトース結合タンパク質（ｐＭＡＬ）；及びグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ｐＧＳＴ）に基づく（Gene, 67:31, 1988; Peptide Research, 3:167, 1990）。
【００８９】
哺乳類細胞における発現に適したベクターも公知されている。前記ベクターはＳＶ−４０、アデノウィルス、レトロウィルス由来ＤＮＡ配列の公知された誘導体及び上述した如き機能性哺乳類ベクターと機能性プラスミド及びファージＤＮＡの組合せ物から由来したシャトルベクターを含む。
【００９０】
追加の真核細胞発現ベクターは当業界に公知されている（Southern, P. J. and Berg, P., J. Mol. Appl. Genet., 1:327, 1982; Subramani et al, Mol. Cell. Biol., 1:854, 1981; Kaufinann and Sharp, J. Mol. Biol., 159:601, 1982; Kaufinann and Sharp, Mol. Cell. Biol., 1982; Scahill et al., PNAS, 80:4654, 1983; Urlaub and Chasin, PNAS, 77:4216, 1980）。本発明に有用な発現ベクターは発現されるＤＮＡ配列又は断片に作動可能な状態で連結された１以上の発現調節配列を含む。調節配列はクローニングされるＤＮＡ配列の発現を制御又は調節するためにベクターに挿入される。有用な発現調節配列の例は、ｌａｃシステム、ｔｒｐシステム、ｔａｃシステム、ｔｒｃ−システム、ファージラムダの主なオペレータ及びプロモータ領域、ｆｄコートタンパク質の調節領域、酵母の糖分解プロモータ、例えば、３−ホスホグリセレート・キナーゼのプロモータ、酵母酸ホスファターゼのプロモータ、例えば、Ｐｈｏ５、酵母アルファ交配因子のプロモータ及びポリオーマ、アデノウィルス、レトロウィルス及びシミアン・ウィルス由来のプロモータ、例えば、ＳＶ４０の初期及び後期プロモータ、及び原核又は真核細胞及びこれらのウィルスの遺伝子発現を調節するものと知られている他の配列及びこれらの組合せ物を含む。
【００９１】
調節シグナル及び発現されるＤＮＡ、例えば、抗体、抗体等価物又はＶＥＧＦ受容体をコードするＤＮＡを含むベクターは発現用宿株細胞に挿入される。一部の有用な発現宿株細胞は公知の原核及び真核細胞を含む。一部の好適な原核宿株細胞は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ種（ＳＧ−９３６、ＨＢ−１０１、Ｗ３１１０、Ｘ１７７６、Ｘ２２８２、ＤＨＩ、及びＭＲＣ１）、シュードモナス菌（Pseudomonas）、バチルス（Bacillus）、例えば、バシラス・サチリス（Bacillus subtilis）及びストレプトマイセス（Streptomyces）を含む。好適な真核細胞は酵母及び他の真菌、昆虫、動物細胞、例えば、ＣＯＳ細胞及びＣＨＯ細胞、組織培養時のヒト細胞及び植物細胞を含む。
【００９２】
好適な培地において維持された宿株細胞において発現された後に、発現されるポリペプチド又はペプチド、例えば、抗体、抗体等価物又はＶＥＧＦ受容体は培地から単離されて当業界に公知された方法により精製することができる。ポリペプチド又はペプチドが培地に分泌されない場合、宿株細胞は単離及び精製前に溶解される。
【００９３】
また、本発明の抗体は可溶性受容体により哺乳類を免疫処理して製造することができる。可溶性受容体そのものは免疫源として使用されうるか、又は、キャリアタンパク質又は他の物質、例えば、ビーズ、すなわち、セファロース・ビーズに付着されうる。哺乳類が抗体を生成した後に、抗体生成細胞、すなわち、例えば、脾臓細胞の混合物を単離する。モノクローナル抗体は混合物から個別抗体生成細胞を単離し、細胞を例えば、腫瘍細胞、例えば、骨髄腫細胞と融合させて不死の状態にして製造することができる。生成されるハイブリドーマは培養時に保存され、モノクローナル抗体を発現し、これを培地から回収する。
【００９４】
さらに、抗体は目的とする特定の受容体を発現する細胞の表面に結合された受容体から製造することができる。受容体が結合される細胞は本来の受容体を発現する細胞、例えば、ＶＥＧＦＲの血管内皮細胞であることができる。あるいは、受容体が結合する細胞は受容体をコードするＤＮＡによりトランスファクションされた細胞、例えば、ＶＥＧＦＲによりトランスファクションされた３Ｔ３細胞であることができる。
【００９５】
受容体は本発明の抗体を発生させる免疫源として使用されうる。受容体ペプチドは天然供給源、例えば、受容体を発現する細胞から得ることができる。例えば、ＶＥＧＦ受容体ペプチドは血管内皮細胞から得ることができる。あるいは、合成受容体ペプチドは市販される機械を用いて製造することができる。上記の例において、ＶＥＧＦ受容体アミノ酸配列は公知文献を通じて提供されうる（Shibuya et al., Oncogene, 5:519, 1990; PCT/US92/01300; Terman et al., Oncogene, 6:1677, 1991; Matthews et al., PNAS, 88:9026, 1991）。
【００９６】
あるいは、受容体をコードするＤＮＡ、例えば、ｃＤＮＡ又はその断片をクローニングして発現させ、生成ポリペプチドを回収して、本発明の抗体を生成する免疫源として使用することができる。例えば、それに対する抗体が製造されるＶＥＧＦ受容体を製造するために、本発明のＶＥＧＦ受容体をコードする核酸分子又はその一部、特に、その細胞外部分を後述するような標準組換えＤＮＡ技術を用いて宿株細胞において発現するための公知のベクターに挿入することができる。前記核酸分子の好適な供給源は、ＶＥＧＦ受容体、すなわち、血管内皮細胞を発現する細胞をいう。
【００９７】
抗体は任意の哺乳類において製造することができ、ヒト以外の他の好適な哺乳類は、例えば、ウサギ、ネズミ、マウス、馬、羊又は霊長類を含む。単一クローン抗体を製造するために、マウスが多用されている。抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、又はＩｇＥのイムノグロブリン・クラス、及びそのサブクラスの一つ、好ましくは、ＩｇＧ１抗体であることができる。本発明の抗体及びその機能的等価物は任意のイムノグロブリン・クラスであるか、あるいは、これらのメンバーの組合せ物であることができる。
【００９８】
ＶＥＧＦ受容体のＶＥＧＦ活性化の中和
内皮又は非内皮細胞、例えば、腫瘍細胞の試料におけるＶＥＧＦ受容体の活性化の中和は試験管内又は生体内において行うことができる。ＶＥＧＦ−受容体発現細胞の試料におけるＶＥＧＦ受容体のＶＥＧＦ活性化の中和は前記細胞を本発明の抗体と接触させることを含む。細胞は細胞試料にＶＥＧＦを添加する前に、同時に又はその後に試験管内において抗体と接触される。
生体内において、本発明の抗体は哺乳類に投与することによりＶＥＧＦ受容体と接触される。哺乳類に対する投与方法は、例えば、経口、静脈内、腹腔内、皮下又は筋肉内投与を含む。
【００９９】
前記生体内中和方法は哺乳類において血管新生を抑制するために有用である。血管新生抑制は、腫瘍成長などの病理学的状態と関連する血管新生を防止又は抑制するためのもののように有用な治療方法である。このため、本発明の抗体は抗−血管新生剤及び抗−腫瘍免疫治療剤である。
【０１００】
哺乳類は任意の哺乳類を意味する。哺乳類の例は、愛玩動物（例えば、犬と猫）、農場動物（例えば、豚、牛、羊及びヤギ）、実験室動物（例えば、猿及びチンパンジー ）及びヒトを含む。
【０１０１】
ＶＥＧＦ受容体はいくつかの非内皮細胞、例えば、腫瘍細胞において発見され、これはこれらの細胞において自己分泌及び（又は）傍分泌ループの予期しない存在を示す。本発明に係る拮抗剤、例えば、抗体は前記細胞上においてＶＥＧＦ受容体の活性を中和することにより、自己分泌及び（又は）傍分泌ループを遮断し、腫瘍成長を抑制するために有用である。血管新生を抑制し、哺乳類において腫瘍成長などの病理学的状態を抑制する方法はその任意の機能的等価物を含む本発明の任意の拮抗剤、例えば、抗体有効量を哺乳類において全身に又は哺乳類内の腫瘍に直接的に投与することを含む。哺乳類は、好ましくは、ヒトである。前記方法は固形腫瘍、好ましくは、高度血管性腫瘍と非固形腫瘍の患者を治療するために有効である。
【０１０２】
腫瘍成長の抑制又は減少は癌性及び非癌性腫瘍を含む腫瘍の進行の予防又は抑制を含む。腫瘍の進行は腫瘍の侵入、転移、再発及びサイズ増加を含む。また、腫瘍成長の抑制又は減少は腫瘍の破壊を含む。
【０１０３】
本発明の方法によりあらゆる種類の腫瘍を治療することができる。腫瘍は固形又は非固形であることができる。
【０１０４】
本発明に係る拮抗剤を用いて治療されうる固形腫瘍のいくつかの例は、癌腫、肉腫、芽腫又は神経膠腫を含む。前記腫瘍のいくつかの例は、類表皮腫瘍、扁平上皮腫瘍、例えば、頭部及び首部腫瘍、結腸直腸腫瘍、前立腺腫瘍、乳腫瘍、肺腫瘍（小細胞性肺腫瘍と非小細胞性肺腫瘍を含む）、膵臓腫瘍、甲状腺腫瘍、卵巣腫瘍、及び肝腫瘍を含む。他の例は、カポシ肉腫、ＣＮＳ新形成、神経芽腫、毛細管血管芽腫、髄膜腫及び脳転移、メラノーマ、胃腸及び腎臓癌及び肉腫、横紋筋肉腫、神経膠芽腫、好ましくは、神経膠芽腫多形及び平滑筋肉腫を含む。本発明に係る拮抗剤がそれにとって有効であるところの血管形成される皮膚癌の例は、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌及び悪性ケラチノサイト、例えば、ヒト悪性ケラチノサイトの成長を抑制することにより治療されうる皮膚癌を含む。
【０１０５】
非固形腫瘍のいくつかの例は、白血病、多形骨髄腫及びリンパ腫を含む。白血病のいくつかの例は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、赤血球性白血病又は単核球性白血病を含む。リンパ腫のいくつかの例は、ホッジキン性及び非ホッジキン性リンパ腫を含む。
【０１０６】
さらに、血管新生を防止または抑制することは、過剰な血管新生を特徴とする非新形成性病理学的状態、例えば、新血管性緑内障、増殖性糖尿病網膜症をはじめとする増殖性網膜症、関節炎、黄斑変性、血管腫、血管繊維腫及び乾癬を治療するために有効である。
【０１０７】
ＶＥＧＦ受容体を単離して精製するための本発明の抗体の使用
本発明に係る拮抗剤は、親和クロマトグラフィなどの通常の方法を用いてＶＥＧＦ受容体を単離して精製するために使用されうる（Dean et al., アフィニティー Chromatography: A Practical Approach, IRL Press, Arlington, VA, 1985）。当業界に周知の他の方法は、抗体−コートされた磁気ビーズを使用する磁気分離、固体マトリックスに付着された抗体を使用する「パニング」及び流動細胞測定（ＦＡＣＳ）を含む。
【０１０８】
ＶＥＧＦ受容体の起源は、普通、ＶＥＧＦ受容体を発現する血管細胞、特に、血管内皮細胞である。血管内皮細胞の好適な起源は、臍帯血管細胞、特に臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）などの血管細胞である。
【０１０９】
ＶＥＧＦ受容体はＶＥＧＦ受容体を認識して結合する付加的なモノクローナル及び多クローン抗体を製造するための抗原又はＶＥＧＦ発現細胞の表面上の他の抗原などの他の物質を製造するために出発物質として使用されうる。
【０１１０】
ＫＤＲ陽性腫瘍細胞を単離して精製するための本発明の抗体の使用
本発明の抗体は親和クロマトグラフィなどの通常の方法を用いてｆｌｋ−１ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ−２）陽性腫瘍細胞、ＫＤＲを発現する腫瘍細胞を単離して精製するために使用されうる（Dean, P.D.G. et al., アフィニティー Chromatography: A Practical Approach, IRL Press, Arlington, VA, 1985）。当業界に周知の他の方法は、抗体コートされた磁気ビーズを使用する磁気分離、抗体にコンジュゲートされた補体などの細胞毒性剤、固体マトリックスに付着された抗体を使用する「パニング」及び流動細胞測定（ＦＡＣＳ）を含む。
【０１１１】
インビトロ又はインビボにおけるＶＥＧＦ及びＶＥＧＦ受容体モニターリング
本発明の抗体は当業界に公知された標準分析及び方法を用いて生物学的試料内においてＶＥＧＦ又はＶＥＧＦ受容体のレベルを試験管内又は生体内モニターリングするために使用されうる。生物学的試料のいくつかの例は、体液、例えば、血液を含む。標準分析は、例えば、当業界に周知のように、抗体を標識し、標準免疫分析、例えば、放射線免疫分析を行うことを含む。
【０１１２】
本発明を行うために有用な標準組換えＤＮＡ技術は、文献（Sambrook et al., “Molecular Cloning, “Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1987; Ausubel et al, (Eds) “Current Protocols in Molecular Biology, “Green Publishing Associates/Wiley-Interscience, New York, 1990）に記載されている。
【０１１３】
投与
本発明に係る受容体抗体は癌患者に治療的処置のために、腫瘍の進行、例えば、腫瘍の成長、侵入、転移及び（又は）再発を防止し、抑制し、又は減少させるために十分な量で投与されうる。前記目的を達成するために有効な量を治療有効容量と定義する。前記用途に有効な量は、当該疾患の重度及び患者自身の免疫系の一般状態に依存するであろう。投薬スケジュールも、患者の病的状態及び状況に伴って変化するであろうし、そして典型的には、１回のボーラス投与又は連続輸注から、１日当り多数回投与まで（例えば、４〜６時間毎）に亘るであろうし、又は処置内科医及び患者の状態により指示されるであろう。しかしながら、本発明は特定の投与量に限定されることはないことに留意すべきである。
【０１１４】
本発明は、例えば、乳、心臓、肺、小腸、結腸、脾臓、腎臓、膀胱、頭と首、卵巣、前立腺、脳、膵臓、皮膚、骨、骨髄、血液、胸腺、子宮、睾丸、子宮頸部又は肝の腫瘍を含む任意の好適な腫瘍を治療するために使用されうる。好ましくは、本発明の方法は、腫瘍が結腸の腫瘍である場合又は腫瘍が非小細胞性肺癌（ＮＳＣＬＣ）である場合に使用される。
【０１１５】
また、本発明の腫瘍は、好ましくは、ＶＥＧＦＲの非正常的発現又はシグナリングを有する。ＶＥＧＦＲによる増進されたシグナリングは多くの異なるヒト癌において観察される。高レベルのＶＥＧＦＲ−２は神経膠腫に浸潤する内皮細胞により発現される（Plate et al., Nature, 359:845, 1992）。ＶＥＧＦＲ−２レベルはヒト膠芽腫により生成されたＶＥＧＦにより特異的に上方調節される（Plate et al., Cancer Res., 53:5822, 1993）。膠芽腫関連内皮細胞（ＧＡＥＣ）における高レベルのＶＥＧＦＲ−２発現の発見はＶＥＧＦＲ−２転写体が正常脳内皮細胞においてはほとんど検出されないため、腫瘍形成中に受容体活性が恐らく誘導されるということを示す。前記上方調節は腫瘍に極めて近接した血管内皮細胞に限定される。
【０１１６】
本発明は腫瘍成長の抑制又は減少に有用である。腫瘍成長の抑制又は減少は腫瘍の進行、例えば、腫瘍の成長、侵入、転移及び（又は）再発の予防、抑制又は減少を意味する。因みに、本発明はまた、動脈硬化症、関節炎、筋肉変性及び乾癬などの血管新生疾患を治療するために有用であることができる。本発明が有用な疾患を有する患者の確認は当業界の熟練者の能力と知識内にある。
【０１１７】
本発明において、ＶＥＧＦＲの抗体を投与するために任意の好適な方法又は経路、例えば、経口、静脈内、腹腔内、皮下又は筋肉内投与が利用されうる。投与される拮抗剤の容量は、例えば、拮抗剤の種類、治療すべき腫瘍の種類と深刻度及び拮抗剤の投与経路をはじめとする多くの因子に依存する。しかしながら、本発明は任意の特定の投与方法又は経路に制限されないことに留意すべきである。
【０１１８】
別の一実施態様において、ＶＥＧＦＲ拮抗剤は１種以上の抗腫瘍剤と組み合わせて投与されうる（米国特許第６，２１７，８６６号公報）。化学療法剤又は放射線などの任意の好適な抗腫瘍剤を使用することができる。化学療法剤の例としては、シスプラチン、ドキソルビシン、パクリタキセル、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、トポテカン又はこれらの組合せ物を含むが、これらに制限されるものではない。抗腫瘍剤が放射線である場合、放射線源は治療の対象となる患者に対して外部的（外部ビーム放射線療法−ＥＢＲＴ）又は内部的（近接治療−ＢＴ）であることができる。投与される抗腫瘍剤の容量は、例えば、薬物の種類、治療すべき腫瘍の種類と深刻度及び薬物の投与経路をはじめとする多くの因子に依存する。しかしながら、本発明は任意の特定の容量に制限されないことに留意すべきである。
【０１１９】
さらに別の実施態様において、ＶＥＧＦＲ抗体は、例えば、サイトカイン（例、ＩＬ−１０及びＩＬ−１３）又は他の免疫刺激剤などの１種以上の好適なアジュバントと組み合わせて投与されうる。例えば、Larrivee et al., supraを参照されたい。しかしながら、ＥＧＦＲ拮抗剤及びＶＥＧＦＲ拮抗剤だけを投与した方が、治療学的に有効な方式により腫瘍の進行を予防したり、抑制したり、又は減少させるのに十分であるということを理解すべきである。
【０１２０】
さらに、ＶＥＧＦＲ抗体は受容体に特異的に結合してリガンド−トキシン内面化に続いて、毒性致死有効量を伝達するリガンド・コンジュゲートとして投与されうる。トキシンと受容体との間のコンジュゲートは非特異的毒性を極力抑えながら、ＥＧＦＲ−又はＶＥＧＦＲ−と発現腫瘍細胞に特異的な毒性剤を開発するための目的で設計された。例えば、ＥＧＦ及びシュードモナス・エンドトキシン（ＰＥ）からなるコンジュゲートは試験管内においてＥＧＦＲ−発現ＨｅＬａ細胞について毒性であることが判明された。チオリダジン及びアデノウィルスを含む様々な薬物がコンジュゲートの細胞取り込みを増進させるだけではなく、コンジュゲートの細胞毒性を増加させることができる。
【０１２１】
本発明のＶＥＧＦＲ抗体は予防又は治療の目的で哺乳類に使用される場合、付加的に製薬学的に許容されるキャリアを含む組成物の形態で投与されるものであることが理解される。好適な製薬学的に許容されるキャリアは、例えば、１種以上の水、塩水、リン酸塩緩衝塩水、デキストロースグリセロール、エタノールなどとこれらの組合を含む。製薬学的に許容されるキャリアは結合タンパク質の貯蔵寿命又は有効性を増進させる湿潤剤又は乳化剤、防腐剤又は緩衝剤などの少量の補助成分をさらに含みうる。当業界に周知の如く、注入組成物は哺乳類に投与された後に活性成分の迅速又は遅延放出を提供するように剤形化されうる。
【０１２２】
本発明のＶＥＧＦＲ抗体は様々な形態で存在することができる。これらは、例えば、固形、半固形及び液状投与型、例えば、精製、丸剤、粉末剤、液剤溶液、分散液又は懸濁液、リポソーム、坐薬、注射及び注入溶液を含む。好ましい形態は意図された投与様式と治療用途による。
【０１２３】
前記抗体は製薬業界に周知の方式により製造することができる。組成物を製造するに当たって、活性成分を普通キャリアと混合したり、キャリアで希釈し（希釈したり）例えば、カプセル、小袋、紙又は他の容器形態であってもよいキャリア内に含めるであろう。キャリアは、希釈剤として働くときに活性成分のためのビヒクル、賦形剤又は媒体として働く固形、半固形又は液状物質であることができる。このため、組成物は、錠剤、トローチ剤、小袋剤、カプセル、エリキシル剤、懸濁剤、エアロゾル（固体として又は液体媒質中に）、例えば、１０重量％以下の活性化合物を含有する軟膏剤、軟質及び硬質ゼラチンカプセル剤、坐薬、注入溶液、懸濁液剤、滅菌包装粉末剤形態及び外用貼付剤として存在することができる。
【０１２４】
放射線
ＶＥＧＦ受容体抗体と併用される放射線は治療の対象となる患者に対して外部的又は内部的であることができる。放射線が患者に対して外部的である場合、この療法は外部ビーム照射療法（ＥＢＲＴ）として知られている。放射線源が患者に対して内部的である場合、この治療法は近接治療（ＢＴ）と呼ばれる。
【０１２５】
放射線は、前記目的で製造された標準装備、例えば、ＡＥＣＬ Theratron及びVarian Clinacを用いて周知の標準技術により照射される。放射線量は、当業界に周知の如く、多数の因子によって異なる。これらの因子は、治療する機関、偶然に悪影響を受けられる放射線経路中の健康な機関、放射線療法に対する患者の耐性、及び治療が必要とされる身体部位を含む。放射線量は１〜１００Ｇｙ、特に、２〜８０Ｇｙである。報告されたいくつかの放射線量は、脊髄に対して３５Ｇｙ、腎臓に対して１５Ｇｙ、肝に対して２０Ｇｙ、及び前立腺に対して６５−８０Ｇｙを含む。しかしながら、本発明は特定の放射線量に限定されるものではないことに留意すべきである。放射線量は、与えられた状況において前記因子を含んで特定の因子によって治療医者により決定される。
【０１２６】
外部放射性源と患者内へのエントリ地点との間の距離は標的細胞の死滅と副作用の最小化との間の容認されうる均衡を代表する任意の距離であることができる。一般的に、外部放射線源は患者内へのエントリ地点から７０〜１００ｃｍに存在する。
【０１２７】
一般的に近接治療は患者内に放射線減をおくことにより実施される。一般的に、放射線源は治療する組織から概ね０〜３ｃｍにおく。公知の技術は、組織内、腔内及び表面近接治療を含む。放射性シードは永久的に又は一時的に移植されうる。永久移植体に使用されてきた典型的ないくつかの放射能原子はヨード−１２５及びラドンを含む。一時的移植物に使用されてきた典型的ないくつかの放射能原子は、ラジウム、セシウム−１３７、及びイリジウム−１９２を含む。近接治療に使用されてきた追加のいくつかの放射能原子は、アメリシウム−２４１及び金−１９８を含む。
【０１２８】
近接治療のための放射線量は外部ビーム照射療法に対して上述したのと同様であることができる。近接治療の線量の決定に当たっては、外部ビーム照射療法の線量の決定における前記因子の他にも、使用される放射能原子の性質も考慮されるべきである。
【０１２９】
化学療法
化学療法剤は腫瘍成長の抑制に効果的なあらゆる化学的化合物を含む。
【０１３０】
化学療法剤の投与は非経口及び腸経路による全身的方法を含んで様々な方法により達成されうる。一実施形態において、ＶＥＧＦ受容体抗体及び化学療法剤を個別分子として投与する。他の実施形態において、ＶＥＧＦ受容体抗体は、例えば、結合（コンジュゲーション）により化学療法剤に付着させる。
【０１３１】
化学療法剤の例としては、アルキル化剤、例えば、窒素マスタード、エチレン・イミン化合物及びアルキル・スルフォネート；代謝拮抗物質、例えば、葉酸、フリン又はピリミジン拮抗剤、有糸分熱抑制剤、例えば、ビンカ・アルカロイド及びポドフィロトキシンの誘導体、細胞毒性抗体、ＤＮＡ発現を損傷又は妨害する化合物を挙げることができる。
【０１３２】
さらに、化合療法剤は、本願に記述されたように、抗体、生物学的分子及び小分子を含む。化学療法剤又は化学療法の具体例としては、シスプラチン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、メクロレタミン（窒素マスタード）、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ダウノルビシン、プロカルバジン、マイトマイシン、シタラビン、エトポシド、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、 ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、パクリタキセル(タクソール)、ドセタキセル(タキソテール)、アルデスロイキン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クラドリビン、ダカルバジン、フロキシウリジン、フルダラビン、ヒドロキシウレア、イホスファミド、インターフェロン・アルファ、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、プリカマイシン、ミトタン、ペグアスパルガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシル・マスタード、酒石酸ビノレルビン、クロラムブシル、タクソール及びそれらの組合せを挙げることができる。
【０１３３】
また、本発明は、治療有効量のＥＧＦＲ拮抗剤と治療有効量のＶＥＧＦＲ拮抗剤を含む腫瘍成長抑制用キットを含みうる。本発明のキットのＥＧＦＲ又はＶＥＧＦＲ拮抗剤はその例を上述した任意の好適な拮抗剤であることができる。好ましくは、キットのＥＧＦＲ拮抗剤はＥＧＦＲに特異的な抗体又はその機能的等価物を含む。あるいは、好ましくは、キットのＥＧＦＲ拮抗剤はＥＧＦＲに特異的な小分子を含む。キットのＶＥＧＦＲ拮抗剤は、好ましくは、ＶＥＧＦＲに特異的な抗体又はその機能的等価物を含む。あるいは、キットのＶＥＧＦＲ拮抗剤は、好ましくは、ＶＥＧＦＲに特異的な小分子を含む。また、本発明のキットは抗腫瘍学をさらに含みうる。本発明の文脈において好適な抗腫瘍薬の例を本願に記載した。また、本発明のキットは、その例を上述したアジュバントをさらに含みうる。
【０１３４】
このため、本発明に係る受容体抗体は当業界に周知の研究、予防又は治療方法のために生体内及び試験管内において使用されうる。もちろん、当業界の熟練者がこの明細書に開示された本発明の原理を変更することができ、そのような変形は本発明の範囲内に含まれることは自明である。
【実施例】
【０１３５】
以下、本発明を実施例により詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業界において通常の知識を持った者にとって自明である。
【０１３６】
実施例１：ＫＤＲ−Ｆｃ分泌細胞株の確立
遺伝子銀行に公知されたヒトＫＤＲ遺伝子塩基配列（accession #: AF063658）を基に合成されたプライマーを用いて、ヒト胎児ｃＤＮＡライブラリー（human placental cDNA library）（Clonetech，USA）からＫＤＲ遺伝子の細胞外ドメイン１−３を増幅した。ヒトＫＤＲ遺伝子塩基配列のアミノ酸配列１−３２７に相当する部位をＢａｍＨＩとＮｈｅＩ切断部位を有するプライマーＫＤＲ １Ｆ（配列番号２１）とＫＤＲ３Ｒ（配列番号２２）を用いて増幅した。
配列番号:２１：  ５’−ＣＧＣ  ＧＧＡＴＣＣ  ＡＴＧＧＡＧ  ＡＧＣＡＡ−３’
配列番号：２２：  ５’−ＣＣＧＣＴＡＧＣ  ＴＴＴＴＴＣＡＴＧＧＡＣＣＣＴＧＡＣＡ−３’
ＫＤＲ（ＥＣＤ１−３）−Ｆｃキメラ・タンパク質を産生するために、ｐＣＤＮＡ３ベクター（Invitrogen，USA）にＢＡＣＥ−Ｆｃタンパク質遺伝子が挿入された組換えベクターであるｐＣＤＮＡ３−ＢＡＣＥ−Ｆｃ（韓国特許公開：１０−２００５−００３２１７７）ベクターをＢａｍＨＩとＮｈｅＩを用いて切断した後、前記同じ制限酵素を用いて切断した前記ＰＣＲ断片と接合した。Ｆｃ部位はトロンビン切断部位とｍｙｃタグを有するようにプライマーＴｈＦｃ−Ｆ（配列番号２３）とＭｙｃＦｃ−Ｒ（配列番号２４）によりＰＣＲを行い、ＮｈｅＩとＸｈｏＩ部位を用いて接合、ｐＣＤＮＡ３−ＫＤＲ Ｄ１２３ｔＦｃｍを製作した。
配列番号２３：５’−ＣＣＧＣＴＡＧＣＡＧＣＧＧＣＣＴＧＧＴＧＣＣＧＣＧＣＧＧＣＡＧＣＧ
ＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣ−３’：
配列番号２４：５’−ＧＧＣＴＣＧＡＧＴＣＡＣＡＧＧＴＣＴＴＣＣＴＣＡＧＡＧＡＴＣＡ
ＧＣ  ＴＴＣＴＧＣＴＣＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣ−３’
前記ｐＣＤＮＡ３−ＫＤＲ Ｄ１２３ｔＦｃｍはヒトＫＤＲの分泌信号配列及び細胞外ドメインを含むアミノ酸１−３２７をコードする塩基配列、トロンビン認識部位をコード（ＳＳＧＬＶＰＲＧＳ）する塩基配列及びヒトイムノグロブリンＧ（ｈＩｇＧ）のＦｃ部位に相当する２２７個のアミノ酸をコードする塩基配列及びｍｙｃタグをコードする塩基配列（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）から構成される（図１）。
【０１３７】
抗体のエピトープ・マッピングのためにＫＤＲ（ＥＣＤ１−２）−Ｆｃ（アミノ酸配列１−２２２）、ＫＤＲ（ＥＣＤ２−３）−Ｆｃ（アミノ酸配列１−５３２７（Δ２４−１１６））を製造した。ＫＤＲ（ＥＣＤ１−２）をクローニングするためにプライマーＫＤＲ １Ｆ（５’−ＣＧＣ  ＧＧＡＴＣＣ  ＡＴＧＧＡＧ  ＡＧＣＡＡ：配列番号２５）とプライマーＫＤＲ １２Ｒ（５’−ＣＴＡ  ＧＣＴＡＧＣ  ＣＣＴＡＴ  ＡＣＣＣＴ  ＡＣＡＡＣ  ＧＡＣＡ−３’：配列番号２６）を用いてＰＣＲを行った後、ＢａｍＨＩとＮｈｅＩを用いて同じ酵素を用いて切断されたｐＣＤＮＡ３−ＫＤＲ Ｄ１２３ｔＦｃｍに挿入してｐＣＤＮＡ３−ＫＤＲ Ｄ１２ｔＦｃｍを製造した。ＫＤＲ（ＥＣＤ２−３）をクローニングするためにプライマーＫＤＲ １ＦとプライマーＫＤＲ ２３ＳＲ（配列番号２６）のＰＣＲ断片とプライマーＫＤＲ ２３ＳＦ（配列番号２７）とプライマーＫＤＲ ２３Ｒ（配列番号２８）のＰＣＲ断片を重複ＰＣＲして得たＰＣＲ断片をＢａｍＨＩとＮｈｅＩ部位を用いて挿入してｐＣＤＮＡ３−ＫＤＲ Ｄ２３ｔＦｃｍを製造した（図２）。
配列番号２６：５’−ＡＣＡ  ＴＡＡＣＣＣ  ＡＣＡＧ  ＡＧＧＣＧ  ＧＣＣＣＧＧＧ  ＴＣＴＣＣＡ−３’
配列番号２７：５’−ＧＡＣＣＣＧＧＧＣＣＧＣＣＴＣＴＧＴＧＧＧＴＴＡＴＧＴＴＣＡＡＧＡＴＴＡＣＡＧＡ−３’
配列番号２８：５’−ＣＴＡ  ＧＣＴＡＧＣ  ＴＴＴＴＴＣＡ  ＴＧＧＡＣＣＣＴＧＡＣＡ−３’
ＫＤＲ（ＥＣＤ）−Ｆｃキメラ・タンパク質を産生するために、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞（Aprogen, Korea）に前記製造されたｐＣＤＮＡ３−ＫＤＲ Ｄ１２３ｔＦｃｍベクターをトランスファクションさせ、細胞は日常的に１０％ｄＦＢＳ（Gibco，USA）、５００μｇ／ｍｌのＧ４１８（geneticin）；シグマ、米国）を添加したα−ＭＥＭ（GibCo，USA）において培養した。ＫＤＲ（ＥＣＤ）−Ｆｃキメラ・タンパク質の発現量を最適化させるためにＭＴＸ（methotrexate, sigma）の存在下でＣＨＯ−ＳＦＭ２（Gibco）培地において培養しながらＭＴＸ濃度を増加させた結果、ＭＴＸ ７００ｎＭにおいて最適に発現することを確認し、この後、ＭＴＸを７００ｎＭ濃度で添加して使用した。
【０１３８】
産生されたタンパク質はプロテインＡ親和性クロマトグラフィ（プロテインＡ-セファロース、ＧＥ healthcare）とサイズ・エキスクージョン・クロマトグラフィ（Hiload superdex 200, ＧＥ healthcare ）を用いて精製し、１５０ｍＭのＮａＣｌが添加された１０ｍＭリン酸塩バッファ（ｐＨ７.０）において保管した。図３は、前記方法により精製されたＫＤＲ（ＥＣＤ１−３）−ＦｃのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示すものである。
【０１３９】
実施例２：完全ヒト非免疫一本鎖抗体（ＳｃＦｖ）ファージ・ディスプレイライブラリーの製造
健常な５名の骨髄寄贈者の骨髄からＴＲＩ試薬（sigma）を用いて全体ＲＮＡを確保し、これを基にｍＲＮＡ精製キット（oligotex mRNA preparation kit, Qiagen, USA）を用いてｍＲＮＡを精製した。前記ｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲシステム（ThermoScript RT-PCR system, Gibco-BRL, USA）を用いてｃＤＮＡを得た。ＶＨ遺伝子を確保するためにＶ遺伝子断片とＤＪ断片をそれぞれ下記表１のプライマーを用いて増幅し、増幅されたＤＮＡ断片をそれぞれ５’末端と３’末端にＳｆｉＩ制限酵素サイトがあるプライマー（配列番号２９〜６１）を用いて２次ＰＣＲを行った。
【０１４０】
【表１】
2010529853.tif 000003
【０１４１】
ＶＬ遺伝子を確保するためにｌａｍｂｄａ遺伝子増幅のためのプライマー（表２）とＫａｐｐａ遺伝子増幅のためのプライマー（表３）を用いて、それぞれ１次ＰＣＲを行い、増幅された断片を５’末端と３’末端にＢｓｔＸＩ切断部位が付着されたプライマー（ｌａｍｂｄａ：配列番号７６〜８１、Ｋａｐｐａ：配列番号１０６〜１０８）を用いて２次ＰＣＲを行った。
【０１４２】
【表２】
2010529853.tif 000004
【０１４３】
【表３】
2010529853.tif 000005
【０１４４】
ＶＨ遺伝子断片とＶＬ遺伝子断片をファージミド・ベクターに導入するためにｐＡＫ１００ベクター（Krebber, A. et al., J. Immunol. Method., 201:35, 1997）を使用した。ＶＬ遺伝子断片を導入するためにｐＡＫ１００ベクターのｌａｃリプレッサー（ｌａｃＩ）遺伝子に存在する３個のＢｓｔＸＩ部位（２３６、３６５、４８８）をQuikchange site-specific mutagenesis kit（Stratagene，USA）を用いて突然変異させた。修飾されたｐＡＫ１００ベクターを用いてＳｃＦｖライブラリー製作のための骨格ベクターを製造するために、Ｈ０５（配列番号２９）とＨ２３０プライマー（配列番号４９）を用いて増幅された重鎖Ｖ遺伝子とＣＤＲ３−３（配列番号５４）とＪＨ−Ｕ１（配列番号５７）プライマーを用いて増幅されたＤＪ遺伝子断片をＨ４８ＳｆｉＩ（配列番号５８）／Ｈ４７ＳｆｉＩ（配列番号６１）で２次ＰＣＲを行った重鎖可変領域をＳｆｉＩを用いて切断し、同じ制限酵素を用いて切断した修飾ｐＡＫ１００ベクターと接合させた。軽鎖とリンカーを導入するために重鎖領域をプライマー（順方向：配列番号１０９；逆方向：配列番号１１０）を用いて増幅し、ヒト４−１ＢＢの抗体（ＬＢ５０６）の軽鎖配列（大韓民国特許公開２０００−００３４８４７）をそれぞれプライマー（順方向：配列番号１１１；逆方向：配列番号１１２）で増幅した後、ＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩを用いて、重鎖可変領域が導入された修飾ｐＡＫ１００ベクターに挿入して抗体ライブラリー骨格ベクターを製造した。
配列番号：１０９：５’−ＣＧＡＡＴＴＴＣＴＡＧＡＴＡＡＣＧＡ−３’
配列番号：１１０：５’−ＣＣＴＣＣＧＣＣＡＣＴＡＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＧＡＧＧＣＣＣＣＣＧＡＧＧＣＣＴＧＡ−３’
配列番号：１１１：５’−ＧＧＴＡＧＴＧＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＣＴＣＣＧＧＴＧＧＡ  ＴＣＣＡＧＣＧＧＴＧＴＧＧＧＴＴＣＣＧＡＴＡＴＴＧＴＧ−３’
配列番号：１１２：５’−ＣＴＣＧＡＡＴＴＣＣＣＡＣＧＡＧＧＣＴＧＧＣＴＣＣＴＣＣＡＣＧＴＴＴＧＡＴＴＴＣ−３’
軽鎖可変領域を導入するために増幅されたそれぞれの軽鎖（κ、λ）可変領域をＢｓｔＸＩで切断して前記抗体ライブラリー骨格ベクターに挿入させた。得られたプラスミドをＳｆｉＩ制限酵素で切断し、予めＳｆｉＩで切断された重鎖可変領域が増幅されたＰＣＲ断片と混ぜた後に結紮し、Electro Ten-Blue competent cells （Stratagene、米国）を用いて形質転換した。その結果、コロニーから約１０１１のダイバーシティを有するＳｃＦｖファージライブラリーを確保した。
【０１４５】
実施例３：バイオパニング
実施例２において製作されたライブラリー原液を代数期まで成長させ、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージ（ＧＥ healthcare，USA）で球剤し、３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールと７０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する２ｘＹＴ培地（２ｘＹＴ／Ｃ／Ｋ）において１ｍＭ ＩＰＴＧを添加して３０℃の温度条件下で一晩中増幅させた。
【０１４６】
ヒトＦｃを用いて抗−ヒトＦｃＳｃＦｖを示すファージを除去し、他の非特異的結合を遮断するためにファージ製剤を４％ＰＥＧ６０００／０.５ＭＮａＣｌ中において沈殿させ、５００μｇ／ｍｌのヒトＦｃタンパク質を含有する２％脱脂乳／ＰＢＳ内に再懸濁させ、３７℃の温度条件下で１時間培養した。
【０１４７】
抗原として使用されるＫＤＲ（ヒトＶＥＧＦＲ−２）タンパク質はＫＤＲの細胞外ドメイン中にＩｇＧ様ドメイン１、２及び３を含むＫＤＲ（ＥＣＤ１−３）−Ｆｃとして、実施例１に従い製造されたＫＤＲ（ＥＣＤ１−３）−Ｆｃステーブル細胞株を培養して、ＫＤＲ（ＥＣＤ１−３）−Ｆｃを精製して使用した。
【０１４８】
ＫＤＲ（ＥＣＤ１−３）−Ｆｃ（１０μｇ／Ｍｌ）でコートされたMaxisorb Starチューブ（Nunc, Denmark）を、先ず、室温において２時間２％脱脂乳／ＰＢＳにより遮断させた後、室温において１時間５.４Ｘ１０１２ｐｆｕのファージ製剤を接種した。前記チューブを４１ＰＢＳＴにより１０回洗浄した後、ＰＢＳ（０.１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳ）により１０回洗浄した。結合型ファージを室温において１０分間１ｍｌの新たに製造した１００ｍＭトリエチルアミンの溶液を用いて溶出させた。溶出されたファージを１０ｍｌのミッドログ器ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞とともに３７℃の温度条件下で３０分間静置させた後、３０分間振とう培養した。次いで、感染されたＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞を１％グルコースが含有された２ｘＹＴ／Ｃプレートにおいて３０℃の温度条件下で一晩中培養した。１次パニング後、２次、３次のパニングはＫＤＲ（ＥＣＤ１−３）−Ｆｃをmaxisorpチューブの代わりに９６ウェルプレート（Nunc，USA）にコートして実施した。３次パニングを実施した後、確保されたファージのＫＤＲ中和能力をＶＥＧＦ競合アッセイを通じて再確認した。
【０１４９】
ＶＥＧＦ競合アッセイのために２００ｎｇのＶＥＧＦ１６５（Ｒ＆Ｄ system）を一晩中コートしたマイクロプレートに２％脱脂乳／ＰＢＳにより３７℃の温度条件下で２時間反応させた。前記マイクロプレートをＰＢＳにより洗浄した後、１０ｎｇのＫＤＲ（ＥＣＤ１−３）−Ｆｃと様々な量のファージを室温において１時間予め反応させた混合液をそれぞれのウェルに入れ、室温において２時間反応させた。前記反応液をＰＢＳにより洗浄後、ウサギ抗−ＫＤＲ抗体（Reliatech, Germany）を３７℃の温度条件下で１時間反応させ、ＨＲＰ（horse radish peroxidase）−conjugated goat anti−rabbit antibody (Abcam, UK）を３７℃の温度条件下で１時間反応させた。反応が終わったウェルをＴＭＢ溶液（Sigma）を用いて発色させた後、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した（図４）。
【０１５０】
その結果、６Ａ６、６Ｈ１、６Ｇ１、６Ｃ１がいずれもＫＤＲに対するＶＥＧＦの結合を抑制することができるということを確認し、これらの中で、６Ａ６、６Ｈ１が最も中和能力に優れていた。また、６Ａ６及び６Ｈ１は実施例４において確保された再構成された１Ｃ１１（以下、１Ｃ１１）ファージと類似する結合能力を有していることが確認された。これらの中で、６Ａ６（ＴＴＡＣ−０００１）ＳｃＦｖのＤＮＡ配列、アミノ酸配列及びＣＤＲ配列を図５に示す。
【０１５１】
また、６Ａ６（ＴＴＡＣ−０００１）ＳｃＦｖの塩基配列及びアミノ酸配列を重鎖ＣＤＲ １（配列番号１１３、配列番号１１４）、重鎖ＣＤＲ ２（配列番号１１５、配列番号１１６）、重鎖ＣＤＲ ３（配列番号１１７、配列番号１１８）、軽鎖ＣＤＲ １（配列番号１１９、配列番号１２０）、軽鎖ＣＤＲ ２（配列番号１２１、配列番号１２２）、軽鎖ＣＤＲ ３（配列番号１２３、配列番号１２４）、重鎖可変領域（配列番号１２５、配列番号２０）、軽鎖可変領域（配列番号１２６、配列番号１）、ＩｇＧ重鎖領域（配列番号１２７、配列番号１２８）、ＩｇＧ軽鎖領域（配列番号１２９、配列番号１３０）として示す。
【０１５２】
実施例４：再構成されたＩＭＣ−１１２１（ｒＩＭＣ−１１２１）、ＩＭＣ−１Ｃ１１（ｒＩＭＣ−１Ｃ１１）ファージ・ベクター製作
陽性対照群として使用するImclone社のＩＭＣ−１Ｃ１１ＳｃＦｖ（ＰＣＴ／ＵＳ２００１／１０５０４）及びＩＭＣ−１１２１ ＳｃＦｖ（ＰＣＴ／ＵＳ２００２／００６７６２）ファージ・パーティクルを確保するためにｐＡＫベクターにそれぞれの抗体のＳｃＦｖ領域をクローニングした。
【０１５３】
ＩＭＣ−１Ｃ１１の場合、マウスナイブ抗体ライブラリー（ＬＧ生命科学）から確保されたｐＴＡ−ｄ９−０７クローン（ＬＧ生命科学）を鋳型として軽鎖可変領域遺伝子をクローニングした。表４に示すＬＲとＬＦプライマーを用いてＰＣＲを行った後、ＢｓｔＸＩで切断し、ＢｓｔＸＩを予め処理したライブラリー骨格ベクターに軽鎖可変領域遺伝子を接合させた。重鎖可変領域遺伝子はｐＴＡ−Ａ５Ｎ２−１０クローン（ＬＧ生命科学）を鋳型とし、表４に記載されたプライマーを用いてＰＣＲを行った。プライマー対ＨＦ１−ＲＩ（Ａ）、ＨＦ２−ＨＲ２（Ｂ）、ＨＦ３−ＨＲ３（Ｃ）及びＨＦ４−ＨＲ４（Ｄ）を用いてそれぞれＰＣＲを行った後、Ａ−Ｂ（ＨＦ１−ＨＲ２プライマーセット）及びＣ−Ｄ（ＨＦ３−ＨＲ４プライマー対）を用いて、重複ＰＣＲを行い、Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ（ＨＦ１−ＨＲ４プライマー対）重複ＰＣＲを行った後ＳｆｉＩにより処理し、ＳｆｉＩにより処理した１Ｃ１１軽鎖遺伝子を含有するライブラリー骨格ベクターと結合させた。表４には、ファージ・ベクター（ｐＡＫ−ｒ１ｃ１１）のＰｅｌＢ信号配列とａｍｂｅｒ（ＴＧＡ）コドンまでのＤＮＡ配列をまとめる。
【０１５４】
【表４】
2010529853.tif 000006
【０１５５】
ＩＭＣ−１１２１を確保する目的で軽鎖可変領域をクローニングするために６Ｇ１を鋳型として、プライマー対ＬＦ−ＫＲ１（Ａ）、ＬＦ１−ＬＲ２（Ｂ）、ＬＦ２−ＬＲ３（Ｃ）及びＬＦ３−ＬＲ４（Ｄ）を用いてそれぞれＰＣＲを行い、Ａ−Ｂ（ＬＦ−ＬＲ２プライマーセット）及びＣ−Ｄ（ＬＦ２−ＬＲプライマー対）の重複ＰＣＲを行い、さらにＡ−Ｂ−Ｃ−Ｄ（ＬＦ−ＬＲプライマー対）の重複ＰＣＲを行った。確保されたＰＣＲ断片をＢｓｔＸＩ処理して、ライブラリー骨格ベクターに挿入した（再構成されたＩＭＣ−１１２１、以下、ＩＭＣ−１１２１と称する）。このときに使用されたプライマーは表５にまとめる。
【０１５６】
重鎖可変領域の場合、ヒトナイブｓｃＦｖライブラリー（実施例２）において確保されたクローン配列のうち、ＩＭＣ−１１２１と最も配列が近いＹＧＫＬ−１３６クローンを鋳型とし、プライマー対ＨＦ−ＨＲ１（Ａ）、ＨＦ１−ＨＲ２（Ｂ）及びＨＦ２−ＨＲ（Ｃ）を用いてそれぞれＰＣＲを行った後、Ａ＋Ｂ重複ＰＣＲ（ＨＦ−ＨＲ２プライマー対）を行い、その後、Ａ＋ＢとＣの重複ＰＣＲ（ＨＦ−ＨＲプライマー対）を行い、生成されたＰＣＲ断片をＳｆｉＩにより処理して、軽鎖を含むライブラリー骨格ベクターに結紮した。
【０１５７】
【表５】
2010529853.tif 000007
【０１５８】
実施例５：可溶性ＳｃＦｖの産生及び精製
可溶性６Ａ６ ＳｃＦｖを製造するために、ｐｅｌＢ配列とＳｃＦｖ配列を有するｐＡＫ−６Ａ６をＥｃｏＲＩとＸｂａＩを用いて切断してｐｅｌＢ配列とＳｃＦｖ配列を有する断片を確保し、前記断片を同じ制限酵素を用いてｐＥＴ２１ｂベクター（Novagen，USA）に挿入した。前記ｐｅｌＢ配列とＳｃＦｖ配列を有する断片が挿入されたベクターにｍｙｃタグを添加するためにプライマー（ｍｙｃＦｏｒ：配列番号１６０、ｍｙｃＲｅｖ：配列番号１６１）により前記ｐｅｌＢ配列とＳｃＦｖ配列が挿入されたｐＥＴ２１ｂベクターを鋳型としてＰＣＲを行った後、ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩを前記ｐｅｌＢ配列とＳｃＦｖ配列を有する断片が挿入されたベクターに結紮して、ｐＥＴ２１ｂ−ＫＤＲ ６Ａ６を製作した。
配列番号１６０：５’−ＧＡＧＣＣＡＧＣＣＴＣＧＴＧＧＡＡＴＴＣＧＡＡＣＡＡＡＡＡ−３’
配列番号１６１：５’−ＴＧＣＴＣＧＡＧＡＴ  ＴＣＡＧＡＴＣＣＴＣ  ＴＴＣＴＧＡＧＡＴＧＡＧＴＴＴＴＴＧＴＴ  ＧＡＡＴＴＣＣＡＣＧ  ＡＧＧＣＴ−３’
動態測定のためにはＶ５タグ配列（ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ）をｍｙｃタグ後方のＸｈｏＩ部位に次の方法により挿入した。前記ｐＥＴ２１ｂ−ＫＤＲ ６Ａ６のＥｃｏＲＩとＶ５タグ配列が含まれているＸｈｏＩ切断部位を増幅させるプライマー（Ｖ５−Ｆｏｒ：配列番号１６２、Ｖ５−Ｒｅｖ：配列番号１６３）で増幅した後、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩを用いて切断し、同じ制限酵素により切断されたｐＥＴ２１ｂ−ＫＤＲ ６Ａ６に結紮して、ｐＥＴＶ−ＫＤＲ ６Ａ６を製作し、前記製作されたｐＥＴＶ１５ＫＤＲ ６Ａ６をＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させた。
配列番号１６２：５’−ＣＣＡＧＣＣＴＣＧＴＧＧＡＡＴＴＣ  ＧＡＡＣ−３’
配列番号１６３：５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧ  ＧＧＴＧＧＡＧＴＣ  ＣＡＧＡＣＣＴＡＡＴＡＧ  ＡＧＧＧＴＴ  ＴＧＧＧＡＴＣＧＧ  ＣＴＴＴＣＣＡＴＴＣＡＧＡＴＣ  ＣＴＣＴＴＣＴＧＡ−３’
前記ｐＥＴＶ−ＫＤＲ ６Ａ６で形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を培養して可溶性ＳｃＦｖタンパク質を発現させた後、細胞を遠心分離して、２０％スクロースと２００ｕｇ／ｍｌのリソザイム及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche、スイス）が含有された５０ｍＭ Tris（ｐＨ８.０）溶液を用いて細胞のペリプラスム分画を確保した。確保された分画をＮｉ−ＮＴＩ親和性クロマトグラフィ（Hisprep, ＧＥhealthcare, USA）とイオン交換クロマトグラフィ（Ｑ−セファロース、ＳＰ−セファロース、ＧＥ healthcare，USA）を用いてＳｃＦｖタンパク質を精製した。
【０１５９】
６Ａ６の場合、２０ｍＭイミダゾール、０.４Ｍ ＮａＣｌ及び１ｘＰＢＳから構成された溶液を用いてHisprepカラムを平衡化した後、ペリプラスム分画をカラムに入れ、３００ｍＭイミダゾールが含まれている溶液（３００ｍＭイミダゾール、０.４Ｍ ＮａＣｌ／１ｘＰＢＳ）により溶出した。溶出されたタンパク質は５０ｍＭイミダゾール（ｐＨ６.７）溶液により透析した後、陽イオン交換クロマトグラフィを用いてＮａＣｌの濃度を０.５Ｍまで高めながら溶出した。溶出されたタンパク質は濃縮（centriprep YM10, milipore, USA）した後、ＰＢＳ溶液において透析保管した。図６は、精製された６Ａ６ ＳｃＦｖに対するＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示すものである。
【０１６０】
実施例６：ＳｃＦｖを用いたＶＥＧＦ競合アッセイ
分離されたＳｃＦｖがＶＥＧＦに対するＫＤＲの結合を抑制することができるかどうかを確認するために競合アッセイを実施した。このために２０ｎｇのＶＥＧＦ１６５を９６−ウェル・マイクロタイター・プレートにおいて室温において一晩中コートした後、２％脱脂乳／１０ＰＢＳを用いて３７℃の温度条件下で２時間反応させた。反応が終わったプレートをＰＢＳにより洗浄した後、１００ｎｇのＦｃが切断されたＫＤＲ（ＥＣＤ１−３）と様々な量のＳｃＦｖを混ぜて１時間室温において反応させた混合液をマイクロプレートに入れた後、室温において２時間反応させた。反応が終わったプレートをＰＢＳを用いて洗浄した後、抗−ＫＤＲマウス抗体（５ｕｇ／ｍｌ、Reliatech、ドイツ）を添加して３７℃の温度条件下で１時間反応させた後、１：５０００で希釈したＨＲＰコンジュゲーテッドヤギ抗−マウス抗体（abcam、英国）を添加して１時間反応させた後、ＴＭＢ溶液により反応させ、その後、４５０ｎｍと６５０ｎｍにおける吸光度を測定した。図７は、実施例５において精製された抗ＫＤＲ−ＳｃＦｖを用いたＶＥＧＦ競合アッセイ結果を示すものであり、６Ａ６−ＳｃＦｖだけが強力なＫＤＲ中和能を示すことを確認することができる。
【０１６１】
実施例７：抗ＫＤＲ ＳｃＦｖ抗体を用いたエピトープ・マッピング
抗ＫＤＲ ＳｃＦｖ抗体がＫＤＲの細胞外１−３ドメインのうちどのドメインに結合するかを調べるために実施例１の方法に従い製造されたＫＤＲ（ＥＣＤ１−２）、ＫＤＲ（ＥＣＤ２−３）及びＫＤＲ（ＥＣＤ１−３）−Ｆｃを３μｇ／ｍｌ濃度でそれぞれ９６−プレートに３７℃の温度条件下で２時間反応させてコートした。反応が終わったプレートをＰＢＳにより洗浄した後、２％脱脂乳／ＰＢＳによりＫＤＲタンパク質未コート部分を閉塞した後、さらにＰＢＳにより洗浄し、その後、３３０ｎＭの抗ＫＤＲ ＳｃＦｖ抗体をプレートに添加して３７℃の温度条件下で１時間３０分間反応させた。反応が終わったプレートをさらにＰＢＳにより洗浄した後、１：５００で希釈されたＨＲＰコンジュゲーテッドウサギ抗−６ｘＨｉｓ抗体（abcam、英国）を３７℃の温度条件下でさらに１時間反応し、次いで、ＴＭＢ溶液により発色させ、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【０１６２】
その結果、６Ａ６は、ＩＭＣ−１１２１と同様に、ＫＤＲの細胞外ドメイン３に結合することが分かった（図８）。これに対し、６Ｇ１、６Ｃ１の場合、吸光度が低いとはいえ、ドメイン１により強く結合することを確認した。
【０１６３】
実施例８：ＩｇＧ発現及び精製
全体ＩｇＧの形態で発現させるために全体不変領域を含む重鎖及び軽鎖発現ベクターを製造した。重鎖の場合にはヒト４−１ｂｂの重鎖骨格を有しているｐＩｇＧＨＤベクター（Aprogen、韓国）をＳｆｉＩにより処理した後、ｐＡＫ−ＳｃＦｖの重鎖可変領域をＳｆｉＩにより処理した断片と結紮して全体不変領域と重鎖領域を含む発現ベクターであるｐＩｇＧＨＤ−６Ａ６Ｈｖｙを製作した（図９）。
【０１６４】
軽鎖の場合にはヒト４−１ｂｂの軽鎖骨格を有しているｐＩｇＧＬＤベクター（Aprogen、韓国）をＢｓｔＸＩにより処理した後、ｐＡＫ−ＳｃＦｖの軽鎖可変領域をＢｓｔＸＩにより処理した断片と結紮して全体不変領域と軽鎖領域を含む発現ベクターであるｐＩｇＧＬＤ−６Ａ６Ｌｇｔを製作した（図１０）。ＩＭＣ−１Ｃ１１及び１１２１の場合にも上記の方法と同様にしてＩｇＧ発現用ベクターを製作した。
【０１６５】
ＩｇＧ発現のために同量の軽鎖発現ベクター（６Ａ６クローンの場合にはｐＩｇＧＨＤ−６Ａ６Ｈｖｙ）と重鎖発現ベクター（６Ａ６クローンの場合にはｐＩｇＧＬＤ−６Ａ６Ｌｇｔ）をＣＨＯＤＧ４４細胞（Aprogen, Korea）に共同トランスフェクションさせた。トランスフェクションさせた細胞を１０％ ｄＦＢＳ及び５００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８が添加されたα−ＭＥＭ培地において培養した後、ＭＴＸを１０ｎＭ〜７００ｎＭの範囲内において添加しながら、最もタンパク質発現量が多いクローンを選択した。
【０１６６】
抗体の発現のためにＭＴＸ７００ｎＭが含まれているＣＨＯ−ＳＦ２培地に３７℃の温度条件下で培養した後、培地を収集した。製造者により記述されたプロトコルに従いプロテインＡカラム（ＧＥ healthcare，USA）を用いて親和クロマトグラフィにより合わせた上澄液から６Ａ６−ＩｇＧを精製した。上澄液を２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７.０）と１００ｍＭ ＮａＣｌ溶液により平衡化させたプロテインＡカラムに注入し、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７.０）と１ｍＭ ＥＤＴＡ、５００ｍＭ ＮａＣｌが含有された溶液により洗浄した後、１００ｍＭ ＮａＣｌが含有された０.１Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ３.３）溶液により溶出した。溶出されたタンパク質は１Ｍ Ｔｒｉｓにより中和した。溶出されたタンパク質を５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６.０）バッファと１：１で混ぜた後、５０ｍＭ ＮａＣｌが含有された５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６.０）により平衡化させたプレパックドＳＰ−セファロース（ＧＥ healthcare）カラムに注入した。カラムに結合されたタンパク質は５０ｍＭ ＮａＣｌが含有されたリン酸ナトリウム（ｐＨ７.０）バッファにより溶出し、溶出バッファにより平衡化させたプレパックドＱ−セファロース（ＧＥ healthcare）に注入して未結合タンパク質を得た。得られたタンパク質は３０Ｋｄ vivaspin 20(Sartorius)により濃縮し、ＰＢＳにより透析した。図１１は、前記方法により精製された６Ａ６ ＩｇＧタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示すものである。
【０１６７】
実施例９：抗ＫＤＲ ＩｇＧの様々なＶＥＧＦに対する競合アッセイ
実施例６において実施した抗ＫＤＲ ＳｃＦｖのＶＥＧＦ競合アッセイ（ＶＥＧＦ１６５使用）の方法と同様にして抗ＫＤＲ ＩｇＧのＶＥＧＦに対する競合アッセイを実施した。ＳｃＦｖをもって行った競合アッセイ結果と同様に、抗ＩｇＧの場合にも、６Ａ６ ＩｇＧが最もＫＤＲ中和能力に優れており、アミノ酸配列を基に再構成されたＩＭＣ−１１２１抗ＫＤＲ ＩｇＧとほとんど同様な中和能力を示した（図１２）。
【０１６８】
また、ＶＥＧＦ１６５以外の他のイソ型とＶＥＧＦファミリに対する６Ａ６ ＩｇＧの結合及び競合の度合いを調べるためにＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ及びＶＥＧＦ−Ｅをそれぞれ２００ｎｇの９６−ウェルプレートにコートした後、実施例６における実施方法と同様にして競合アッセイを実施した。その結果、ＶＥＧＦ−Ａに属するＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１６５及びＶＥＧＦ−Ｅには結合してＶＥＧＦ中和能を示し、ＶＥＧＦ−Ｃ、Ｄには結合しなかった（図１３）。
【０１６９】
実施例１０：抗ＫＤＲＳｃＦｖ及びＩｇＧの結合力分析
ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ−２）に対する抗体の結合力を分析するためにＢＩＡコア（ＧＥ healthcare）を用いて測定した。ＳｃＦｖの場合、製造者のマニュアルに従いＣＭ５チップ（ＧＥ healthcare、スウェデン）の上にＫＤＲ（ＥＣＤ１−３）−Ｆｃを固定したり、Ｖ５タグを有しているＳｃＦｖの場合、Ｖ５抗体（abchem、英国）を固定した。Ｖ５抗体が固定されたＣＭ５チップにＶ５−タグされたＳｃＦｖを結合させた後、Ｆｃ部位がないＫＤＲ（ＥＣＤ１−３）を流してセンサーグラムを得た。ＩｇＧの場合、Ｖ５配列を有していないＳｃＦｖと同様にＫＤＲ（ＥＣＤ１−３）−ＦｃをＣＭ５チップに固定した後、様々な量の抗体を流すことによりセンサーグラムを確保した。それぞれの濃度において確保されたセンサーグラムを基に速度定数ｋｏｎ及びｋｏｆｆを測定し、速度定数の比ｋｏｆｆ／ｋｏｎからＫｄを計算した（表６）。
【０１７０】
その結果、種々のＳｃＦｖの中でＫＤＲと高い結合アフィニティーを有するＳｃＦｖは６Ａ６であることを確認した。また、６Ａ６をＩｇＧの形態に転換させた場合、Ｋｄ値がＩＭＣ−１１２１よりも約２倍ほど低かった。これは、６Ａ６ ＩｇＧがＩＭＣ−１１２１よりもＫＤＲにより強く結合するということを意味する。
【０１７１】
【表６】
2010529853.tif 000008
【０１７２】
実施例１１：ＦＡＣＳ分析を用いたＨＵＶＥＣ細胞における抗ＫＤＲ−ＩｇＧのＫＤＲ中和能分析
初期継代培養ＨＵＶＥＣ細胞を、無血清培地において一晩中培養してＫＤＲの過発現を誘導した後、細胞を収穫してＰＢＳにより３回洗浄し、４℃の温度条件下で１時間６Ａ６又はＩＭＣ−１Ｃ１１ ＩｇＧ（１０μｇ／ｍｌ）とともに反応させ、次いで、さらに６０分間ＦＩＴＣ標識されたウサギ抗−ヒトＩｇＧ抗体（Abchem、英国）とともに反応させた。反応が終わった細胞を洗浄し、流細胞測定器（ＦＡＣＳ；モデルＥＰＩＣＳ９，Coulter Corp., USA）により分析した。
【０１７３】
その結果、図１４に示すように、ＨＵＶＥＣ細胞のＫＤＲをＩＭＣ−１Ｃ１１と６Ａ６が同じレベルで感知することを確認した。
【０１７４】
また、ＶＥＧＦとの競合的阻害能を確認するために、ＨＵＶＥＣ細胞を無血清の状態で一晩中培養してＫＤＲの発現を誘導した後、細胞を収穫してＰＢＳにより３回洗浄し、室温において２０ng／ｍｌ濃度のＶＥＧＦを３０分間反応させた。反応後、６Ａ６−ＩｇＧ及びＩＭＣ−１Ｃ１１ ＩｇＧを４℃の温度条件下で１時間反応させた後、４℃の温度条件下で３０分間ＦＩＴＣ標識されたウサギ抗−ヒトＩｇＧ抗体と反応させた。
【０１７５】
その結果、図１５に示すように、ＶＥＧＦ１６５を同時に処理するとき、両抗体ともにその結合信号が減少することが判明され、６Ａ６−ＩｇＧがＶＥＧＦと競合的に結合することを確認した。また、ＶＥＧＦ競合アッセイにおいては、６Ａ６−ＩｇＧ及びＩＭＣ−１Ｃ１１ ＩｇＧが同じレベルのＫＤＲ中和能力を示したが、実際に生細胞におけるＫＤＲ中和能力は６Ａ６−ＩｇＧの方がＩＭＣ−１Ｃ１１ ＩｇＧよりも２倍ほど高く現れた。
【０１７６】
実施例１２：Ｋ５６２細胞における抗ＫＤＲ−ＩｇＧのＫＤＲ中和能分析
ＨＵＶＥＣ細胞以外のＫＤＲを発現する細胞株を用いて抗体のＫＤＲ結合能力を確認するために白血病細胞株であるＫ５６２（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４３）細胞におけるＫＤＲ発現を確認した。図１６は、Ｋ５６２（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４３）細胞におけるＫＤＲ発現をウェスタン・ブロットにより確認した結果を示すものであり、Ｋ５６２とＨＵＶＥＣ細胞は血清の有無とは無関係にＫＤＲを発現することを確認した。このため、Ｋ５６２細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４３）を実施例１１のＨＵＶＥＣ細胞と同様に処理して、ＦＡＣＳを介しての抗ＫＤＲ−ＩｇＧがＫ５６２細胞と結合することができるかどうかを確認した。
【０１７７】
その結果、図１７に示すように、Ｋ５６２細胞においては、ＨＵＶＥＣ細胞とは異なり、６Ａ６−ＩｇＧだけが有意なレベルで結合することを確認した。ＶＥＧＦ競合を介してのＦＡＣＳアッセイ結果、図１８に示すように、Ｋ５６２細胞においては、ＨＵＶＥＣとは異なり、陽性である細胞の割合があまり変わらないことを確認した。正確な理由は不明であるが、これは、Ｋ５６２細胞の表面に発現されるＫＤＲに対して６Ａ６抗体が強く結合したり、ＶＥＧＦ／ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ−２）自己分泌ループメカニズムを用いて細胞の生長を調節するため、外部においてＶＥＧＦを処理すれば、Ｋ５６２細胞のＫＤＲ発現が誘導されて、より多くのＫＤＲタンパク質が細胞表面に発現されるため、６Ａ６−ＩｇＧシグナルがＶＥＧＦを外部において処理する前よりも高くなるものと考えられる。また、図１９に示すように、６Ａ６−ＩｇＧはグリーベック耐性Ｋ５６２（カトリック医科大学）細胞のＫＤＲも中和することができるということを確認した。
【０１７８】
実施例１３：６Ａ６抗体のＨＵＶＥＣ細胞成長阻害分析
抗ＫＤＲ−ＩｇＧのＨＵＶＥＣ細胞の成長の阻害の度合いをＷＳＴ−１（Roche、スイス）試薬を用いて確認した。ＨＵＶＥＣ細胞をゼラチンがコートされた２４ウェル−培養プレートに２ｘ１０４／ウェルにて分注し、１８時間培養後、無血清Ｍ１９９培地（Sigma-aldrich、米国）において４時間さらに培養した。その後、２０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦと様々な濃度の６Ａ６を添加した後、ＷＳＴ−１試薬を製造者のマニュアルに従い添加し、１時間後及び４時間後に４５０ｎｍと６９０ｎｍにおける吸光度を測定した（図２０）。
【０１７９】
その結果、ＶＥＧＦを処理すれば、ＨＵＶＥＣ細胞の成長が３倍ほど増加したが、６Ａ６抗体を添加すれば、濃度依存的にＨＵＶＥＣ細胞の成長が減少することを確認した。
【０１８０】
実施例１４：６Ａ６抗体によるＫＤＲ及びＥＲＫリン酸化抑制効果確認
十分に生長したＨＵＶＥＣ細胞を１％ＦＢＳ入りＭ１９９培地において６時間培養した後、ＶＥＧＦ及び６Ａ６、ＩＭＣ−１１２１、６Ｃ１抗体を様々な濃度で１０分間処理した。その後、細胞を１ｍｌの溶解バッファ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８.０、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１０％グリセロール、１％ Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）により溶解させ、遠心分離して上澄液を１μｇ／ｍｌの抗−ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１抗体（Santacruz Biotechnology，USA）により４℃の温度条件下で３時間処理した。プロテイン−Ａアガロースビーズ（Sigma-aldrich、米国）を入れて１時間反応させた後、免疫沈殿されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより電気泳動し、その後、ウェスタン・ブロットを実施した（図２１のＡ）。
【０１８１】
その結果、ＶＥＧＦを処理すれば、予想通りにＫＤＲのリン酸化が増加されるが、６Ａ６、ＩＭＣ−１１２１を処理すれば、ＶＥＧＦによるＫＤＲのリン酸化が抑制されることを確認した。また、６Ｃ１抗体はＶＥＧＦ中和効果がなかった。
【０１８２】
上記の方法と同様にしてＫＤＲの信号を受け取ると知られているリン酸化酵素であるＥＲＫのリン酸化が６Ａ６により抑制されるかどうかを確認した。その結果、６Ａ６、ＩＭＣ−１１２１はＥＲＫのリン酸化を抑制するものの、６Ｃ１は予想通りにＥＲＫのリン酸化をほとんど抑制することができないということを確認した（図２１のＢ）。
【０１８３】
実施例１５：ＶＥＧＦによる内皮細胞の走化性に対する抗ＫＤＲ−６Ａ６ ＩｇＧの阻害効果分析
ＶＥＧＦによるＨＵＶＥＣの遊走に対する６Ａ６−ＩｇＧの阻害効果を調べるために、６.５ｍｍの直径のポリカーボネート・フィルター（８μＭ気孔）を持ったトランスウェル（Corning costar，USA）を利用した。前記フィルターの下層表面に１０μｇのゼラチンをコートし、下層ウェルに新鮮なＭ１９９培地（１％ＦＢＳ入り）とＶＥＧＦを注入した。ＨＵＶＥＣ細胞をＭ１９９培地（１％ＦＢＳ入り）に１ｘ１０６／ｍｌで希釈し、様々な濃度の抗−ＫＤＲ抗体を添加した後、３０分間室温において反応させた。１００μｌの反応液を上層ウェルに置き、３７℃の温度条件下で４時間反応させた後、ヘマトキシリン・エオジン染色法により細胞を染色した。未遊走細胞は綿棒により除去した後、下層ウェルに遊走した細胞は顕微鏡により観察し、遊走した細胞数を測定した。その結果、ＶＥＧＦにより誘導されたＨＵＶＥＣ細胞の遊走が濃度依存的に６Ａ６により抑制されることを確認した（図２２）。
【０１８４】
実施例１６：ＶＥＧＦによる内皮細胞チューブ形成に対する抗ＫＤＲ−６Ａ６ ＩｇＧの阻害効果分析
ＶＥＧＦによるＨＵＶＥＣのチューブ形成を６Ａ６抗体が阻害するかどうかを調べるために、２５０μｌの成長因子減少マトリゲル（Collaborative biomedical products, USA）を１６ｍｍ直径の組織培養容器のウェルに注入し、３７℃の温度条件下で３０分間ポリマー化した。ＨＵＶＥＣ細胞をＭ１９９培地（１％ＦＢＳ入り）で懸濁させ、様々な量の抗体を細胞と混ぜて反応させ、３０分後にマトリゲル上に２ｘ１０５／ウェルの濃度でプレーティングし、１０ng／ｍｌのＶＥＧＦを添加し、２０時間培養した。培養された細胞を顕微鏡により観察し、Image-Pro plus（Media cybernetics, USA）を用いてイメージを得た。その結果、ＶＥＧＦにより誘導されたＨＵＶＥＣのチューブ形成が６Ａ６−ＩｇＧにより抑制されることを確認した（図２３）。
【０１８５】
実施例１７：６Ａ６抗体と細胞表面のＫＤＲとの結合によるＶＥＧＦＫＤＲの細胞内在化阻害効果分析
ＨＵＶＥＣ細胞を２ｘ１０４／ウェルの濃度でゼラチンがコートされたカバースリップの上に載せ、２４時間後にＭ１９９培地で２回洗浄し、Ｍ１９９培地（１％ＦＢＳ入り）において６時間培養した。ＨＵＶＥＣ細胞を様々な濃度の抗体を用いて３０分間反応させ、１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦを処理して１０分間反応させた。反応が終わった後、細胞をメタノールや２％ホルムアルデヒドにより１０分間固定化及び浸透化させ、ＰＢＳを用いて洗浄した。その後、０.１％ Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２％ ＢＳＡ／ＰＢＳにより３０分間ブロックし、マウスＫＤＲ抗体を１時間反応させた後、ＦＩＴＣが標識された抗−マウス抗体と４５分間室温において反応させた。カバースリップはSloFade（分子プローブ）によりマウントし、４８８ｎｍ（励起波長）において共焦点顕微鏡（Zeiss、ドイツ）により観察した。
【０１８６】
その結果、図２４に示すように、６Ａ６抗体はＫＤＲの細胞内への流入を阻害し、６Ｇ１はＫＤＲの細胞内への流入をほとんど阻害することができないことを確認した。
【０１８７】
実施例１８：抗ＫＤＲ−ＩｇＧの体外血管新生阻害効果分析
６Ａ６−ＩｇＧのＶＥＧＦによる大動脈輪ベッセル発芽が阻害されるかどうかを調べるために、ラット大動脈輪アッセイを行った。まず、６週齢ラット（スプロージ・ドーリー）から動脈を分離し、約０.５ｍｍのサイズに切断して１２０μｌのマトリゲルがコートされた４８ウェルプレートに切断された動脈を載せた後、さらに５０μｌのマトリゲルにより動脈を覆い、ＶＥＧＦ（１０ng／ｍｌ）と６Ａ６−ＩｇＧ、６Ｃ１−ＩｇＧ、１１２１−ＩｇＧをヒト内皮無血清培地（invitrogen）と混ぜて最終的に２００μｌになるようにしてウェルに注入した。６日経過後に細胞を固定させ、Diff-Quick (Baxter Diagnostics)により染色した。各データは０（最低点）から５点（最高点）としてそれぞれ付与し、６回の独立した実験を行った。図２５のＡはベッセル発芽イメージであり、Ｂはベッセルの発芽の度合いに対するスコア統計結果を示すものである。６Ａ６の場合にはＶＥＧＦによるベッセル発芽を阻害したものの、６Ｃ１は阻害能力を示さなかった。上記の如き体外ラット大動脈輪アッセイ結果は、単純なＶＥＧＦによる血管形成を６Ａ６が阻害するという側面の他にも極めて重要な意味があるが、それは、６Ａ６がヒトのＫＤＲを中和するための目的で製造されたが、ラットに発現されるヒトＫＤＲの類似体であるｆｌｋ−１と結合してｆｌｋ−１を中和することができるということを確認したことである。すなわち、６Ａ６抗体はヒト−ラット間の種間交差反応を有しているということが分かる。
【０１８８】
実施例１９：６Ａ６によるＶＥＧＦにより誘導された生体内新生血管形成阻害（インビボマウスマトリゲルプラグアッセイ）
ラット大動脈輪アッセイに続き、マウスの生体内においてＶＥＧＦにより誘導された血管新生形成をヒトＫＤＲ中和抗体である６Ａ６が抑制することができるかどうかを調べるために、マウスマトリゲルプラグアッセイを行った。６−８週齢のＣ５７／ＢＬ６マウスの皮下に２００μｇの抗体と１００ｎｇのＶＥＧＦおよび１０ｕｎｉｔのヘパリンが含有された０.６ｍｌのマトリゲルを注入し、７日後にマトリゲルプラグを手術して取り出した後、イメージを撮影した（図２６のＡ）。その後、速やかに最適切断温度（ＯＣＴ；optimum cutting temperature）化合物存在下に液体窒素で冷凍し、８−１２μｍの厚さに切断した。切断されたプラグは４％の中性バッファ化されたパラホルムアルデヒドにより固定し、抗ＣＤ３１抗体によりマイクロ血管の密度を測定した（図２６のＢ）。６Ａ６抗体はマウス生体内においてＶＥＧＦにより誘導される血管の形成を抑制することができるということを確認した。ラット体外実験と同様に、６Ａ６抗体はマウスのＫＤＲ類似体であるｆｌｋ−１を中和することができるということを再確認し、６Ａ６抗体はヒト−マウス間の種間交差反応を有することを確認した。これまで、治療用ヒト抗体のうちヒト−マウス間種間交差反応を持ったＫＤＲ抗体は報告されていない。このような６Ａ６抗体の種間交差反応を利用すれば、抗体の生体内効果をマウスやラットを用いて確認することができるであろう。
【０１８９】
実施例２０：大腸癌異種移植動物モデルにおける６Ａ６抗体の抗癌効果
ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスと比較時、ヒト癌細胞を一層良好に受け入れるというメリットがあると知られているＴ細胞、Ｂ細胞及びＮＫ細胞が欠失されたＮＯＤ／ＳＣＩＤＩＬ−２Ｒ欠損マウス（雌性、１１週齢、体重２５ｇ、The Jackson Laboratories、米国）を用いて、大腸癌異種移植マウスモデルにおける６Ａ６抗体の抗癌効果を確認した。
【０１９０】
ヒト癌細胞はＨＣＴ１１６（ＡＴＣＣ、米国）としてよく知られているヒト大腸癌細胞株を使用し、腫瘍細胞注入は（ｄａｙ０）２ｘ１０５細胞（無血清ＤＭＥＭ）／１０μｌの細胞濃度でマウスの左側脇に皮下注射した。
【０１９１】
６Ａ６抗体は静脈注射し、腫瘍細胞を注射した「ｄａｙ０」から２４時間後の「ｄａｙ１」から抗体を注射し始めて、１週当たりに３回のスケジュールで行った。マウス５匹を１グループとして、３つのグループに分けて実験を実施した。グループ１はＰＢＳ注射グループ（対照群）を注射し、グループ２は１００μｇ／ｅａ（＝４ｍｇ／ｋｇ）で６Ａ６抗体を注射し、グループ３は２００μｇ／ｅａ（＝８ｍｇ／ｋｇ）で６Ａ６抗体を注射した。マウスに現れた腫瘍のサイズは１日置きに下記の如き公式によりｄａｙ２６まで測定した。
腫瘍体積＝１／２ｘ（長さｘ広さｘ高さ）
Ｄａｙ３０にマウスを致死に至らして、腫瘍重量を測定した。その結果、腫瘍のサイズは、ＰＢＳを注射した対照群と比較して、６Ａ６抗体の投与したグループにおいて容量に比例して減少することを確認した（図２７及び図２８）。
【０１９２】
実施例２１：肺癌異種移植動物モデルにおける６Ａ６抗体の抗癌効果
ヒト肺癌細胞株Ａ５４９（ＡＴＣＣ、米国）を用いて、ヌードマウス（Japan ＳＬＣ、日本）に７ｘ１０７細胞を皮下注射して腫瘍を形成させ、癌細胞を注射し、１０日後に腫瘍が目視観察できるようになってから、６Ａ６抗体を腹腔注射方式により１週当たりに３回のスケジュールで注射した。
【０１９３】
マウス５匹を１グループとして、３つのグループに分けて実験を実施した。グループ１はＰＢＳ注射グループ（対照群）を注射し、グループ２は１ｍｇ／ｋｇで６Ａ６抗体を注射し、グループ３はAvastin(Genentech，USA）を１ｍｇ／ｋｇで注射した。その結果、図２９に示すように、ＰＢＳを注射した対照グループに比べて、６Ａ６抗体を注射したグループと陽性対照群であるAvastinを注射したグループにおいて腫瘍の成長が抑制されることを確認した。
【０１９４】
実施例２２：放射性ヨード標識された６Ａ６抗体の生体内腫瘍標的化
６Ａ６抗体のＣＭＬ（chronic myelogenous leukemia：慢性骨髄性白血病）細胞株であるＫ５６２細胞の結合性質を用いて腫瘍への標的化を確認した。放射性ヨードであるヨード−１２５をヨードビード（iodobead）法を用いて抗体に標識して９０％以上の抗体をヨードにより標識し（図３０のＡ）、９８％以上の純度を有する放射性ヨード標識抗−ＫＤＲ（６Ａ６）抗体を製造した（図３０のＢ）。ＣＭＬ腫瘍モデルはＫ５６２細胞をＢａｌｂ／ｃヌードマウスに皮下接種して腫瘍モデルを製造し、Ｋ５６２細胞注射後２１−２８日後に腫瘍のサイズが１ｃｍとなった場合にヨード−１２５が標識された抗体（１００μｇ）をＫ５６２腫瘍モデルヌードマウスの尻尾静脈に注射し、注射後２時間及び２４時間でそれぞれ腫瘍形成動物のガンマカメラ映像を獲得した。抗体の腫瘍への摂取は２時間と２４時間で同じ様相を示し、２４時間後には背後放射能が減少することを確認することができた。抗体は腫瘍への局所的な集積が確認されてＫ５６２腫瘍にＫＤＲが発現することを再確認した。このため、局所的な集積による抗体自体の治療効果と併せて、放射性同位元素から放出されるβ線による治療効果の増大により抗体の放射免疫治療剤としての可能性を確認することができた（図３１）。
【０１９５】
実施例２３：軽鎖シャッフルを用いた６Ａ６−ＩｇＧのアフィニティー変異
６Ａ６よりもアフィニティーが高い抗体を同定するために、実施例２において製造した完全ヒト抗体ライブラリーのＤＮＡから制限酵素ＳｆｉＩを用いて重鎖を除去し、その位置にＳｆｉＩ制限酵素処理して得たｐＡＫ−６Ａ６の重鎖を挿入して、ＥＴＢ（Electro Ten blue）細胞（Stratagene，USA）に形質転換させた後、ＳＯＢ培地において１時間培養した。その後、２ｘＹＴ（Ｃｍ）スクエアプレートにスプレッドして、翌日にコロニーを得て−７０℃の温度条件下で保管した。その結果、４ｘ１０６個の多様性を有する６Ａ６軽鎖シャッフルライブラリーを製作した（図３２）。
【０１９６】
ライブラリーの軽鎖シャッフルが成功的になされたかどうかを確認するために、４８個のクローンを無作為に選択して軽鎖配列分析を行った結果、４８個のクローンの軽鎖配列において１つの重複も現れなかった。
【０１９７】
前記ライブラリーを用いて、実施例３の方法と同様にしてファージ・ディスプレイを用いたバイオパニング過程を通じて６Ａ６よりも抗体結合アフィニティーに優れたクローンをスクリーニングした。
【０１９８】
下記の過程を経て１８個の候補を最終的に確保した。
（１）６Ａ６がバイオパニング過程中に再選択されることを防ぐために６Ａ６軽鎖シャッフルライブラリーのＤＮＡに６Ａ６のＣＤＲ３部位に認識部位が存在する制限酵素であるＳｐｅＩを処理した。前記ＤＮＡをさらにＥＴＢ細胞に形質転換させた後サブ−ライブラリーを構築し、ＥＬＩＳＡ上においてＫＤＲ親和性を確認した。４次パニングを通じて選別された候補のうち９４個を選択して、実施例５の方法と同様にしてＫＤＲ結合アッセイを行い、陽性であると判定された候補のうち無作為に４個を選択してＤＮＡ配列を決定し、それぞれのファージを用いてＶＥＧＦ競合アッセイを実施した（図３３）。その結果、これらのうち４ＳＢ２Ｓと４ＳＦ１０は陽性対照群である６Ａ６と同様又は同等のＫＤＲ中和能を有する４ＳＤ５、４ＳＣ３及び４ＳＣ５を選択した。
（２）バイオパニング過程中の洗浄段階において可溶性ＫＤＲと競合させて、ＫＥ３、ＫＥ６、２ＫＧ８、３ＫＥ１１、３ＫＦ１１、３ＫＧ３及びＫ３Ｆ１を選択した。使用したバイオパニング方法は下記の通りである。
【０１９９】
ＫＤＲ（５μｇ／ｍｌ）４ｍｌによりMaxisorp Starチューブ（Nunc, Denmark）をコートし、先ず、３７℃の温度条件下で２時間２％スキムミルク／ＰＢＳにより遮断した後、２％スキムミルクに懸濁させた６Ａ６軽鎖シャッフルライブラリーファージ５００μｌを１時間結合させた。その後、０.１％ＰＢＳ−Ｔ（tween 20）において１時間反応させた後、０.１％ＰＢＳＴにより１０回洗浄し、ＰＢＳバッファにより１０回洗浄した。その後、可溶性ＫＤＲ（２５μｇ／ｍｌ／ＰＢＳ）４ｍｌを添加して３０分間結合させた後、１００ｍＭトリエチルアミンにより１０分間処理してファージを溶出し、１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７.５）５００μｌにより中和した後、Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅに５０分間形質転換させた後に培養した。
【０２００】
パニングは３次までそれぞれの段階において選択された抗体によりＳｃＦｖ−ファージ・パーティクル状態でＶＥＧＦ競合アッセイを実施した。１次パニング結果として得られた４個の候補抗体のうち、他の候補抗体に比べてＶＥＧＦ競合力が良好なＫＥ３、ＫＥ６が選択され、ＫＣ７、ＫＱ１１は脱落させた（図３４のＡ）。２次パニング結果として得られた３個の候補抗体のうち、ＶＥＧＦ競合能に劣る２ＫＥ５を脱落させ、残りの６Ａ６と類似するＶＥＧＦ競合能を有する２ＫＧ４及び２ＫＧ８を選択した。２ＫＧ４は、ＤＮＡ配列の確認結果、後で選択された抗体である３ＫＧ３と同じ配列を示して３ＫＧ３に置き換えた（図３４のＢ）。
【０２０１】
３次パニングを通じて得られた５個の候補抗体のうち、ＶＥＧＦ競合能に劣る３ＫＧ２、３ＫＦ７は脱落させ、３ＫＥ１１、３ＫＦ１１及び３ＫＧ３だけを選択した（図３４のＣ）。同様に、３次パニングを通じて得られたＫ３Ｆ１が選択され、Ｋ３Ｆ１は６Ａ６に比べて遥かに優れたＶＥＧＦ競合能を示した（図３４のＤ）。
（３）バイオパニング過程中のファージと抗原であるＫＤＲを結合させる過程において実施例８において確保されたＩＭＣ−１１２１ ＩｇＧを一緒に添加してＩＭＣ−１１２１ ＩｇＧと競合させて、ＩＥ４、３ＩＧ１１、３ＩＧ１２、３ＩＥ１、３ＩＨ２、Ｉ２Ｆ２、Ｉ３Ａ１２及びＩ３Ｆ２クローンを選択し、使用したバイオパニング方法は下記の通りである。
【０２０２】
ＫＤＲ（５μｇ／ｍｌ）４ｍｌによりMaxisorp Starチューブ（Nunc, Denmark）をコートし、先ず、３７℃の温度条件下で２時間２％スキムミルク／ＰＢＳにより遮断した後、２１μｇ／ｍｌのＩＭＣ−１１２１ ＩｇＧ（０.１４μＭ）を含む２％スキムミルクに懸濁させた６Ａ６軽鎖シャッフルライブラリーファージ５００μｌを１時間結合させた。次いで、０.１％ＰＢＳＴにおいて１時間反応させた後、０.１％ＰＢＳＴにより１０回洗浄し、ＰＢＳバッファにより１０回洗浄した。その後、可溶性ＫＤＲ（２５μｇ／ｍｌ／ＰＢＳ）４ｍｌを添加して３０分間結合させた後、１００ｍＭトリエチルアミンにより１０分間処理してファージを溶出し、１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７.５）５００μｌにより中和した。その後、Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅに５０分間形質転換させた後に培養した。
【０２０３】
パニングは３次までそれぞれの段階において選択された抗体によりＳｃＦｖ−ファージ・パーティクル状態でＶＥＧＦ競合アッセイを実施した。１次パニング結果として得られた３個の候補抗体のうち６Ａ６と類似するＶＥＧＦ競合力を有するＩＥ４だけを選択した（図３５のＡ）。ＩＥ４は、ＤＮＡ配列の確認結果、２８個のアミノ酸が６Ａ６と異なる結果を示し、６Ａ６は１０８個の軽鎖アミノ酸を有しているのに対し、ＩＥ４は１０７個のアミノ酸を有していて、ＣＤＲ３部位から一つのアミノ酸が欠失されたことが判明された。
【０２０４】
図３５のＢは、３次パニング結果として得られた３個の候補抗体のＶＥＧＦ競合アッセイ結果であり、これらのうち３ＩＧ８はＤＮＡ配列分析結果６Ａ６とは全く異なる軽鎖配列を有しており、後続するＦＡＣＳ結果によれば、生存細胞においては全く結合をしないことが確認されてＩｇＧ形態に転換されなかった。３ＩＧ１１、３ＩＧ１２、３ＩＥ１及び３ＩＨ２を選択し、３ＩＡ７は軽鎖内部に中止コドンがあるため脱落させた。図３５のＣは、２次及び３次パニングを通じて得られた候補抗体のＶＥＧＦ競合アッセイ結果であり、３ＩＡ１２、Ｉ３Ｆ２及びＩ２Ｆ２をいずれも選択した。
【０２０５】
選択された１８個のクローンの軽鎖ＤＮＡ配列を配列番号１６４〜配列番号１８１に示し、ＤＮＡ配列から類推されたアミノ酸配列を配列番号２〜配列番号１９に示す。６Ａ６（ＴＴＡＣ−０００１）の軽鎖アミノ酸配列と比較して置換された部分を表７にまとめる。また、それぞれのクローンはＴＴＡＣ−０００２〜ＴＴＡＣ−００１９と再命名した（表８）。
【０２０６】
【表７】
2010529853.tif 000009
【０２０７】
【表８】
2010529853.tif 000010
【産業上の利用可能性】
【０２０８】
以上詳述したように、本発明は、細胞内及び生体内においても優れたＶＥＧＦ受容体中和能を有する完全ヒト化抗体及び前記抗体を含有する血管新生抑制用組成物及び癌治療用組成物を提供する効果がある。本発明に係る血管内皮成長因子受容体を中和する６Ａ６抗体は、生存細胞内において市販される血管内皮成長因子受容体の抗体よりも優れた中和能を示し、ヒトだけではなく、マウスとラットの血管内皮成長因子受容体においても中和能を示して、抗癌研究に役立ち、癌治療に極めて有効である。
【０２０９】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界の通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好ましい実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されるわけではないということは明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物によって定義されると言えるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３４Ｃ】
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【図３４Ｄ】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３５Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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