(57)【要約】本開示はリンカーにより相互に連結されたＴＧＦ−βＩＩ型受容体のＴＧＦ−β結合ドメイン２つを含有する融合タンパク質を提供する。例えば、第１のＴＧＦ−β結合ドメインの第１のＣ末端は第２のＴＧＦ−β結合ドメインのＮ末端に短鎖ペプチドリンカー（例えば９グリシンリンカー）により連結される。第１のドメインのＣ末端が第２のドメインのＮ末端に近接しているにもかかわらず、そのような融合タンパク質は、抗ＴＧＦ−β抗体と同様に一部の例においてはＴＧＦ−βを効果的に中和する。2010529859.tif 000014
2010529859.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＧＦ−β受容体ＩＩのＴＧＦ−β結合ドメイン２つを含む融合タンパク質であって、該結合ドメインがペプチドリンカーにより相互に連結されている、融合タンパク質。
【請求項２】
第１のＴＧＦ−β結合ドメインのＣ末端がリンカーにより第２のＴＧＦ−β結合ドメインのＮ末端に連結されている、請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項３】
２つのドメインが同一である、請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項４】
リンカーが５０以下のアミノ酸からなる、請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項５】
リンカーの最大計算長が６５Åである、請求項４記載の融合タンパク質。
【請求項６】
リンカーが１つ以上のグリシンを含む、請求項５記載の融合タンパク質。  
【請求項７】
リンカーが９つのグリシン残基を含む、請求項５記載の融合タンパク質。
【請求項８】
ＴＧＦ−β結合ドメインの一方または両方が配列番号：３１のアミノ酸２８〜１３６と少なくとも６０％同一である配列を含む、請求項５記載の融合タンパク質。
【請求項９】
ＴＧＦ−β結合ドメインの一方または両方が配列番号：８に示す配列を含む、請求項５記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
ＴＧＦ−β結合ドメインの一方または両方が配列番号：３１のアミノ酸２８〜１２９を含む、請求項９記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
１００ｋＤａ未満の分子量を有する、請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
融合タンパク質が可溶性である、請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
ｉ）配列番号：３１に示す配列を各々有するＴＧＦ−β結合ドメイン２つ、ｉｉ）該２つのドメインを連結する９Ｇｌｙリンカー、および任意でｉｉｉ）１つ以上のアダプターアミノ酸、を含む、請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
配列番号：９のアミノ酸２４〜アミノ酸３１０に示すアミノ酸配列を含む請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
配列番号：９に示すアミノ酸配列を含む、請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
請求項１記載の融合タンパク質を含む医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１記載の融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項１８】
配列番号：１０に記載する配列を含む、請求項１７記載の核酸。
【請求項１９】
請求項１７記載の核酸を含むベクター。
【請求項２０】
請求項１７記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項２１】
哺乳類細胞である、請求項２０記載の宿主細胞。
【請求項２２】
ＣＨＯまたはＨＥＫ２９３細胞である、請求項２１記載の宿主細胞。
【請求項２３】
請求項２０記載の宿主細胞を培養する段階、および細胞培養物から融合タンパク質を回収する段階を含む、融合タンパク質の製造方法。
【請求項２４】
請求項１記載の融合タンパク質または請求項１７記載の核酸を哺乳類に投与する段階を含む、哺乳類におけるＴＧＦ−β発現に関連する疾患または状態を治療する方法。
【請求項２５】
疾患または状態が腎臓の疾患または状態である、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
腎臓の疾患または障害が糖尿病性腎症、放射線腎症、閉塞性腎症、多嚢胞性腎臓疾患、髄質海綿腎、馬蹄腎、腎炎、糸球体腎炎、腎硬化症、腎石灰症、バージャー病（ＩｇＡ腎症）、全身性高血圧、糸球体高血圧、尿細管間質性腎症、尿細管性アシドーシス、腎結核、および腎梗塞からなる群より選択される、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
疾患または状態が癌である、請求項２４記載の方法。
【請求項２８】
癌が胃癌、腸癌、皮膚癌、乳癌、および甲状腺癌からなる群より選択される、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
癌が黒色腫である、請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
癌が骨癌である、請求項２７記載の方法。
【請求項３１】
癌が肺癌である、請求項２７記載の方法。
【請求項３２】
疾患または状態が線維性または硬化性の疾患または障害である、請求項２４記載の方法。
【請求項３３】
線維性または硬化性の疾患または障害が硬皮症、アテローム性動脈硬化症、肝線維症（ｌｉｖｅｒ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、びまん性全身硬化症、肺線維症（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、糸球体腎炎、神経瘢痕形成、皮膚瘢痕形成、肺線維症（ｌｕｎｇ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、放射線誘導線維症、肝線維症（ｈｅｐａｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、および骨髄線維症からなる群より選択される、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
疾患または障害が気管支肺異形成である、請求項２４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は参照により全体が本明細書に組み込まれる２００７年６月１５日出願の米国特許出願第６０／９４４，４０３号の優先権を主張する。
【０００２】
本発明はＴＧＦ−β拮抗剤および例えば疾患の治療を包含するそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
形質転換成長因子（ＴＧＦ）−βは細胞成長、細胞分化、アポトーシス、細胞ホメオスタシスおよび他の細胞機能を包含する多くの細胞プロセスに関与している。ＴＧＦ−βの過剰発現は、例えば線維症および癌を包含する多くの病理学的プロセスに関連している。ＴＧＦ−βファミリーは哺乳類において観察される３種の高度に保存されたアイソフォーム（ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、およびＴＧＦ−β３）を包含する。ＴＧＦ−β、並びにＴＧＦ−βスーパーファミリーの他のメンバーは約２５ｋＤａのジスルフィド結合ホモ２量体を形成する。ＴＧＦ−βはセリン／スレオニンキナーゼである２量体ＩＩ型受容体に結合する。次に後者がＩ型受容体をリクルートし、リン酸化する。Ｉ型受容体は、受容体制御型ＳＭＡＤをリン酸化し、これがｃｏＳＭＡＤに結合して核に進入し、転写プロモーターに結合する。これにより、多数の遺伝子の発現を調節する。ＴＧＦ−βＩＩ型受容体は独立してリガンドに結合できるが、シグナル伝達のためにはＩ型受容体の存在を必要とする。ＩＩＩ型ＴＧＦ−β受容体（βグリカンとしても知られている）はＴβＲＩＩへのリガンド結合を増大させる共受容体として機能する。ＴＧＦ−βおよびその受容体の構造的および機能的な特徴に関する詳細な考察は、例えばＯｐｐｅｎｈｅｉｍら（編）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ、２００１（非特許文献１）の例えばｐｐ．７１９〜７４６およびｐｐ．１８７１〜１８８８に記載されている。
【０００４】
ヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体（ＴβＲＩＩ、ＡＡＴ３、ＦＡＡ３、ＨＮＰＣＣ６、ＭＦＳ２、ＲＩＩＣおよびＴＡＡＤ２としても知られている）は５６０アミノ酸を含有し（Ｌｉｎら、Ｃｅｌｌ、６８（４）：７７５〜８５（１９９２）（非特許文献２）；アクセッション番号：ＮＰ＿００１０２００１８）、１３６アミノ酸のＮ末端細胞外ドメイン（ＥＣＤ；配列番号：３１で表される）と、それに続く単一の２０アミノ酸の膜貫通ドメインを包含する。残余は細胞内（細胞質）ドメインである。野生型のヒトＴβＲＩＩは高い親和性でＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β３に結合するが、ＴＧＦ−β２とは低い親和性で結合する。いくつかの種に由来するＴβＲＩＩのＥＣＤに関する配列アライメントを図１に示す。さらに、ＴβＲＩＩの代替的スプライシングアイソフォーム、即ち「ＩＩ−Ｂ型」受容体（ＴβＲＩＩ−Ｂ）と称されるものも発見されている（Ｓｕｚｕｋｉら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、３３５：１９−２２（１９９４）（非特許文献３）；アクセッション番号：ＧＩ：４５６７０８）。このアイソフォームは配列番号：３１中のバリン９の代わりに２６アミノ酸の挿入を含有している（配列番号：３２で表されるＴＧＦβＲＩＩＢのＥＣＤ）。
【０００５】
ＴＧＦ−βに結合して不活性化することができる多くのＴＧＦ−β拮抗剤が作成されている。既知のＴＧＦ−β拮抗剤は抗ＴＧＦ−β抗体、例えば、ＴＧＦ−βに対するマウスモノクローナル抗体である１Ｄ１１（米国特許第５，７７２，９９８号（特許文献１）参照）等を包含する。他の報告されているＴＧＦ−β拮抗剤は可溶性ＴＧＦ−β受容体および受容体−Ｆｃ融合タンパク質、例えばＫｏｔｅｌｉａｎｓｋｙ  （米国特許出願第２００２／００４０３７号（特許文献２））；Ｌｉｎら（米国特許第６，００１，９６９号（特許文献３））、Ｂｒｕｎｋｏｗら（米国特許第６，３９５，５１１号（特許文献４））；Ｒｅｅｄ（米国特許第５，７３０，９７６号（特許文献５））；Ｇｏｔｗａｌｓ（米国特許出願第２００５／０２０３０２２号（特許文献６））；およびＳｅｇａｒｉｎｉ（米国特許第５，６９３，６０７号（特許文献７））に記載されているものを包含する。
【０００６】
ＴβＲＩＩへのＴＧＦ−βの結合に関して提案されている化学量論的特徴（１つの２量体リガンド対２つの受容体）によれば、受容体−Ｆｃ融合タンパク質またはＴβＲＩＩ  ＥＣＤのコイルドコイル２量体のような２量体拮抗剤のアビディティが２量体拮抗剤の高い親和性に寄与しており、そしてこれにより、ＴＧＦ−βのより効果的な中和が可能となることが示唆されている（例えば、Ｃｒｅｓｃｅｎｚｏら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３２８：１１７３〜１１８３（２００３）（非特許文献４）を参照）。ＴＧＦ−β−ＴβＲＩＩ複合体の予測された構造は約６５Å離れている受容体２量体上の２つの対称的に位置するＴＧＦ−β−結合部位を明らかにしている（Ｈａｒｔら、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、９（３）：２０３〜８（２００２）（非特許文献５）、例えば、その図３を参照）。したがって、結合部位の十分遠隔である分離および結合部位の対称的な位置の保存といった２量体拮抗剤に関わる特定の構造上の必要条件が存在している可能性がある。
【０００７】
それ故に適切なアビディティおよび親和性を有し、そしてＴＧＦ−β拮抗剤として有用である可溶性ＴＧＦ−β受容体は、例えばＴＧＦ−β活性の低減が望ましい疾患を治療または予防するための使用を目的として、今なお提供を必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第５，７７２，９９８号
【特許文献２】米国特許出願第２００２／００４０３７号
【特許文献３】米国特許第６，００１，９６９号
【特許文献４】米国特許第６，３９５，５１１号
【特許文献５】米国特許第５，７３０，９７６号
【特許文献６】米国特許出願第２００５／０２０３０２２号
【特許文献７】米国特許第５，６９３，６０７号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍら（編）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ、２００１
【非特許文献２】Ｌｉｎら、Ｃｅｌｌ、６８（４）：７７５〜８５（１９９２）
【非特許文献３】Ｓｕｚｕｋｉら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、３３５：１９−２２（１９９４）
【非特許文献４】Ｃｒｅｓｃｅｎｚｏら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３２８：１１７３〜１１８３（２００３）
【非特許文献５】Ｈａｒｔら、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、９（３）：２０３〜８（２００２）
【発明の概要】
【００１０】
したがって、本発明の１つの特徴は、ＴβＲＩＩのＴＧＦ−β結合ドメイン２つを含む融合タンパク質であって、その結合ドメインがリンカー（例えば、短鎖ペプチドリンカー）により相互に連結されているものを提供する。一部の実施形態においては、第１のＴＧＦ−β結合ドメインのＣ末端は短鎖ペプチドリンカーにより第２のＴＧＦ−β結合ドメインのＮ末端に連結されている。意外にも、第１のＴＧＦ−β結合ドメインのＣ末端がもう１つのドメインのＮ末端に近接しているにも関わらず、そのような融合タンパク質は確かに、一部の例において、抗ＴＧＦ−β抗体およびＴβＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質と同様の程度にまでＴＧＦ−βを効果的に中和する。
【００１１】
一部の実施形態においては、リンカーは５０以下のアミノ酸からなり、各ＴＧＦ−β結合ドメインは配列番号：３１のアミノ酸２８〜１２９と少なくとも６０％同一である配列を含む。一部の実施形態においては、結合ドメインの一方または両方は、例えば配列番号：３１のアミノ酸２８〜１２９に示すように、配列番号：８を含む。例示的な実施形態において、リンカーはＧｌｙ９リンカーであり、各ＴＧＦ−β結合ドメインは、例えば配列番号：９に示すように配列番号：３１のアミノ酸１〜１３６を含有する。本発明の融合タンパク質はＴＧＦ−β１、−β２、および−β３のうちの１つ、２つまたは全てに結合してよい。実施例に記載するような非限定的な例示的な実施形態において、融合タンパク質はＴＧＦ−β１および−β３に結合する。
【００１２】
本発明はさらに、本発明の融合タンパク質をコードする核酸（例えば配列番号：１０に示すもの）、そのような核酸を含むベクター、およびそのような核酸を含む宿主細胞を提供する。
【００１３】
別の態様において、本発明は、本発明の融合タンパク質または融合タンパク質をコードする核酸を含む医薬組成物を提供する。
【００１４】
さらに別の態様において、本発明は、本発明の融合タンパク質、核酸、宿主細胞、および医薬組成物を製造する方法を提供する。
【００１５】
本発明はさらにまた、本発明のＴβＲＩＩ  ＴＧＦ−β結合ドメイン融合タンパク質によるＴＧＦ−β中和を必要としている哺乳類を治療する方法を提供する。哺乳類は例えば腎疾患を有してよい。ある特定の実施形態において、ＴＧＦ−β中和を要する哺乳類は糖尿病性腎症、放射線腎症、閉塞性腎症、多嚢胞性腎臓疾患、髄質海綿腎、馬蹄腎、腎炎、糸球体腎炎、腎硬化症、腎石灰症、バージャー病（ＩｇＡ腎症）、全身性高血圧、糸球体高血圧、尿細管間質性腎症、尿細管性アシドーシス、腎結核、または腎梗塞を有してよい。
【００１６】
本発明の方法の別の態様において、ＴＧＦ−βの中和を必要とする哺乳類は、例えば癌を有する。特定の実施形態においては、治療すべき癌は胃癌、腸癌、皮膚癌、乳癌、または甲状腺癌であってよい。他の実施形態において、癌は黒色腫、骨癌または肺癌である。
【００１７】
本発明の方法のさらに別の態様において、ＴＧＦ−βの中和を必要とする哺乳類は線維性または硬化性の疾患または状態を有してよい。特定の実施形態においては、治療すべき線維性または硬化性の疾患または障害は硬皮症、アテローム性動脈硬化症、肝線維症（ｌｉｖｅｒ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、びまん性全身硬化症、肺線維症（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、糸球体腎炎、神経瘢痕形成、皮膚瘢痕形成、肺線維症（ｌｕｎｇ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、放射線誘導線維症、肝線維症（ｈｅｐａｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、または骨髄線維症であってよい。本発明の方法の別の態様においては、ＴＧＦ−βの中和を必要とする哺乳類は気管支肺異形成（ＢＰＤ）を有してよい。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】幾つかの種に由来するＴβＲＩＩの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に関する配列アライメントを示す（ヒト（Ｈｕｍ）：配列番号：３１；チンパンジー（Ｃｈｍ）：配列番号：２；ラット：配列番号：３；イヌ：配列番号：４；ブタ：配列番号：５；マウス（Ｍｕｓ）：配列番号：６；ミンク（Ｍｎｋ）：配列番号：７；および一般配列  （Ｇｅｎ）：配列番号：８）。アスタリスクは保存されたアミノ酸を指す。下線付き太字のアミノ酸はＴＧＦ−β結合に必須ではないと報告されているアミノ酸を例示している（例えば欠失分析により明らかにされている、例えばＧｕｉｍｏｎｄら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、８４（４５６）：７９〜８４（１９９９）参照）。一般配列はＴＧＦ−β結合に必須ではないことが以前よりわかっているアミノ酸を除き、ＴＧＦ−β結合ドメインの保存されたアミノ酸を含有している。
【図２】実施例において使用されたｓＲＩＩ−９Ｇｌｙ融合タンパク質のアミノ酸（配列番号：９）およびヌクレオチド配列（配列番号：１０）を示す。
【図３】実施例において使用されたｓＲＩＩ−９Ｇｌｙ融合タンパク質の構造の模式図である。
【図４】記載した２週間投与過程中の片側尿管閉塞（ＵＵＯ）ラットモデルにおける循環系中ＴＧＦ−β拮抗剤（ｓＲＩＩ−９Ｇｌｙおよび１Ｄ１１）のレベルを示すグラフである。
【図５】２週間投与過程の後のＵＵＯラットモデルにおける特定のＴＧＦ−β拮抗剤（ｓＲＩＩ−９Ｇｌｙまたは１Ｄ１１）、ＰＢＳまたは対照抗体（１３Ｃ４）を投与した動物の組織学的評価の結果の散布図である。
【図６】図６Ａ〜６Ｃは特定のＴＧＦ−β拮抗剤（１Ｄ１１またはｓＲＩＩ−９Ｇｌｙ）の２週間投与の後のＵＵＯラット腎試料、および対照動物（偽手術（ｓｈａｍ）、ＰＢＳ、および１３Ｃ４）における、コラーゲン含有量（図６Ａ）、ピクロシリウスレッド染色による線維症（図６Ｂ）およびＤＡＢ染色によるコラーゲンＩＩＩ（図６Ｃ）のレベルを示すグラフである。
【図７】図７Ａおよび７Ｂは以下の遺伝子：コラーゲンＩＩＩ（図７Ａ）；ＴＧＦ−β１、−β２、および−β３（図７Ｂ）に関する、特定のＴＧＦ−β拮抗剤（１Ｄ１１またはｓＲＩＩ−９Ｇｌｙ）の２週間投与の後のＵＵＯラット腎試料、および対照動物（偽手術、ＰＢＳ、および１３Ｃ４）における、転写物分析の結果を示すグラフである。
【図８】図８Ａは２週間投与過程の後の、ＴＧＦ−β拮抗剤ｓＲＩＩ−９Ｇｌｙの多数回毎日投薬により、または１Ｄ１１、ＰＢＳまたは対照抗体（１３Ｃ４）の毎週３回投薬により治療したＵＵＯラットの組織学的評価の結果のグラフである。図８Ｂは２週間投与過程における、ＴＧＦ−β拮抗剤ｓＲＩＩ−９Ｇｌｙの多数回毎日投薬の後の、または１Ｄ１１、ＰＢＳまたは対照抗体（１３Ｃ４）の毎週３回投薬による、ＵＵＯラット腎試料におけるヒドロキシプロリン試験により検出されたコラーゲンのレベルを示すグラフである。
【図９】図９Ａは、２週間投与過程の後の、７．５ｍｇ／ｋｇにおけるＴＧＦ−β拮抗剤ｓＲＩＩ−９Ｇｌｙの毎日投薬によるか、５または１０ｍｇ／ｋｇの１Ｄ１１の毎週３回の投薬によるか、ＰＢＳ、または記載された通りの対照抗体（１３Ｃ４）の毎週３回の投薬により治療したＵＵＯマウスの組織学的評価の結果のグラフである。図９Ｂは、２週間投与過程の後の、７．５ｍｇ／ｋｇにおけるＴＧＦ−β拮抗剤ｓＲＩＩ−９Ｇｌｙの毎日投薬によるか、５または１０ｍｇ／ｋｇの１Ｄ１１の毎週３回の投薬によるか、ＰＢＳ、または記載された通りの対照抗体（１３Ｃ４）の毎週３回の投薬により治療したＵＵＯマウスにおけるヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）試験により検出されたコラーゲンのレベルを示すグラフである。図９Ｃは、２週間投与過程の後の、７．５ｍｇ／ｋｇにおけるＴＧＦ−β拮抗剤ｓＲＩＩ−９Ｇｌｙの毎日投薬によるか、５または１０ｍｇ／ｋｇの１Ｄ１１の毎週３回の投薬によるか、ＰＢＳ、または記載された通りの対照抗体（１３Ｃ４）の毎週３回の投薬により治療したＵＵＯマウスにおけるＲＴ−ＰＣＲにより検出されたコラーゲンＩＩＩｍＲＮＡのレベルを示すグラフである。図９Ｄは、２週間投与過程の後の、７．５ｍｇ／ｋｇにおけるＴＧＦ−β拮抗剤ｓＲＩＩ−９Ｇｌｙの毎日投薬によるか、５または１０ｍｇ／ｋｇの１Ｄ１１の毎週３回の投薬によるか、ＰＢＳ、または記載された通りの対照抗体（１３Ｃ４）の毎週３回の投薬により治療したＵＵＯマウスにおけるＲＴ−ＰＣＲにより検出されたＰＡＩ−１ｍＲＮＡのレベルを示すグラフである。
【図１０】１２５Ｉ標識ヒトｓＲＩＩ−Ｇｌｙを注射したマウスの一連の放射線ＳＰＥＣＴ／ＣＴ画像であり、上側パネルは標準的な感受性、下側パネルは上昇した感受性を示す。
【図１１】図１１Ａおよび１１Ｂは肝臓、心臓、腎臓、肺、脾臓、舌、胃、小腸、大腸、直腸、脳、皮膚（耳）、筋肉（足）、血液、および陰嚢における、注射用量のパーセントとして表示した、またはそれぞれ組織重量のグラム数に関して標準化した、種々の組織における１２５Ｉ標識ヒトｓＲＩＩ−Ｇｌｙの放射線定量を示すグラフである。各バーは個々の動物を示す（ｎ＝６）。
【配列表フリーテキスト】
【００１９】
配列表の簡単な説明
配列番号：１〜７は以下の種：ヒト、チンパンジー、ラット、イヌ、ブタ、マウス、およびミンクにそれぞれ由来するＴβＲＩＩのＥＣＤのアミノ酸配列を示す（図１）。ヒト配列（配列番号：１）はバリン９における変異により反映される通り、両方のアイソフォーム、ＴβＲＩＩおよびＴβＲＩＩＢを包含している。
【００２０】
配列番号：８はＴβＲＩＩの最小ＴＧＦ−β結合ドメインの例示される一般化されたアミノ酸配列を示す（図１）。
【００２１】
配列番号：９〜１０は実施例において使用したｓＲＩＩ−９Ｇｌｙ融合タンパク質のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す（図２）。
【００２２】
配列番号：１１はグリシン−セリンリンカーのアミノ酸配列を示す。
【００２３】
配列番号：１２〜１５は各実施例に相当するＳＲＩＩ−９Ｇｌｙを作成するために使用したプライマー配列を示す。
【００２４】
配列番号：１６〜３０は実施例に記載した転写物分析のために使用したプライマーおよびプローブの配列を示す。
【００２５】
配列番号：３１はヒトＴβＲＩＩのＥＣＤのアミノ酸配列を示し、配列番号：３２はそのＴβＲＩＩＢアイソフォームのＥＣＤのアミノ酸配列を示す。
【００２６】
配列番号：３３は図２に示したシグナル配列のアミノ酸配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
融合タンパク質
本発明は、例えばペプチドリンカーのようなリンカーにより相互に連結されたＴβＲＩＩの２つのＴＧＦ−β結合ドメインを含む融合タンパク質を提供する。本発明は部分的には、短鎖ペプチドリンカー（Ｇｌｙ９）で２つのＥＣＤを連結することにより構築されるＴβＲＩＩの可溶性形態であるｓＲＩＩ−９Ｇｌｙが、細胞に基づく試験においてＴＧＦ−βを効果的に中和したという観察事例に基づいている。さらに腎臓疾患のラットＵＵＯモデルにおけるインビボ試験において、ｓＲＩＩ−９Ｇｌｙの投与は腎線維症の軽減および腎形態の良好な保存をもたらした。データはｓＲＩＩ−９ＧｌｙのようなＴＧＦ−β拮抗剤がＴＧＦ−βを効果的に中和する場合があることを示している。一部の実施形態においては、抗体およびＦｃ融合タンパク質と比較して相対的に小型であるため、本発明の融合タンパク質は、より大型の分子では容易に到達できない身体の領域に到達することが可能である場合がある。例えば、それらは糸球体係蹄の管腔から尿路に、そしてその後、尿細管上皮細胞に通じる場合があり、これにより、より大型の分子よりもより効率的なインサイチューでのＴＧＦ−βの中和を達成する。即ち、一部の実施形態においては、本発明の融合タンパク質の計算された分子量は翻訳後修飾を含まない場合、１００ｋＤａ、８０ｋＤａ、５０ｋＤａ、４０ｋＤａ、または３５ｋＤａ未満である。例示的な実施形態において、ｓＲＩＩ−９Ｇｌｙの計算された分子量は３２ｋＤａである。
【００２８】
本発明の融合タンパク質はＴＧＦ−β１、−β２、および−β３のうち少なくとも１つ、２つまたは全てに結合してよい。例えば、一部の実施形態においては、融合タンパク質はＴＧＦ−β１および−β３に結合する。特に記載が無い限り、本明細書においては、「ＴＧＦ−β」という用語は少なくとも１つの種に由来する少なくとも１つのＴＧＦ−βアイソフォームを指すものであって、必ずしも全てのＴＧＦ−βアイソフォームを指さない。ＴＧＦ−βは種間で高度に保存されている。例えば、ブタ、サル、およびヒトの成熟ＴＧＦ−β１タンパク質（１１２アミノ酸）は同一であり、そしてマウスおよびラットのＴＧＦ−β１タンパク質は僅か１アミノ酸のみヒトと異なっている。よって、１つの種に由来するＴＧＦ−βに結合する融合タンパク質は別の種に由来する同じアイソフォームに結合することが期待される。したがって、本発明の融合タンパク質は１０μＭ、１μＭ、５００ｎＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、またはそれより低値のＫＤでＴＧＦ−βアイソフォーム（例えばＴＧＦ−β１または−β３）に結合する場合がある。例示的な実施形態においては、本発明の融合タンパク質のＫＤ値は２〜１０ｎＭの範囲にある。結合親和性は例えば酵素結合免疫吸着試験（ＥＬＩＳＡ）またはプラズモン共鳴（例えば実施例に記載するようなＢｉａｃｏｒｅ（商標））を用いて計測できる。
【００２９】
本発明の融合タンパク質はまたＴＧＦ−β受容体へのＴＧＦ−βの結合を抑制し、これによりＴＧＦ−βの生物学的活性を中和する場合がある。一部の実施形態においては、ＴＧＦ−βアイソフォームの１つ（例えばＴＧＦ−β１または−β３）に対する本発明の融合タンパク質のＩＣ５０は１μＭ、５００ｎＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、０．１ｎＭまたはそれより低値である。例示的な実施形態においては、本発明の融合タンパク質のＩＣ５０は０．０１〜０．０８ｎＭの範囲内である。ＴＧＦ−βは多様な生物学的活性を示すため、ＴＧＦ−β中和活性を検出および定量するためには種々の試験を使用できる。一部の頻繁に使用されているインビトロの生物学的試験の例は、実施例に記載する通り、（１）ＥＧＦの存在下での軟寒天中のＮＲＫ細胞のコロニー形成の誘導（Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７８：５３３９〜５３４３（１９８１））；（２）軟骨表現型を発現するための原始間葉細胞の分化の誘導（Ｓｅｙｅｄｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：２２６７〜２２７１（１９８５））；（３）Ｍｖ１Ｌｕミンク肺上皮細胞（Ｄａｎｉｅｌｐｏｕｒら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１３８：７９〜８６（１９８９））またはＢＢＣ−１サル腎細胞（Ｈｏｌｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：５９８９〜５９９２（１９８０））の成長の抑制；（４）Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス胸腺細胞の有糸分裂誘発の抑制（Ｗｒａｎｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、６：１６３３〜１６３６（１９８７））；（５）ラットＬ６筋芽細胞の分化の抑制（Ｆｌｏｒｉｎｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２６１：１６５０９〜１６５１３（１９８６））；（６）フィブロネクチン生産の計測（Ｗｒａｎａら、Ｃｅｌｌ、７１：１００３〜１０１４（１９９２））；（７）ルシフェラーゼレポーター遺伝子に融合したプラスミノーゲン活性化物質抑制物質Ｉ（ＰＡＩ−１）プロモーターの誘導（Ａｂｅら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ、２１６：２７６〜２８４（１９９４））；（８）サンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｄａｎｉｅｌｐｏｕｒら、Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ、２：６１〜７１（１９８９））；および（９）Ａ５４９／ＩＬ−１１細胞に基づく試験を包含する。
【００３０】
ＴＧＦ−β結合ドメイン
本発明はＴβＲＩＩのＴＧＦ−β結合ドメインを少なくとも２つ含有する融合タンパク質を提供する。
【００３１】
多くの哺乳類の種に由来するＴβＲＩＩがクローニングされている（例えばヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ、ＧＩ：１１６２４２８１８）、チンパンジー（Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｙｄｙｔｅｓ、ＧＩ：１１４５８５８２２）、イヌ（Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ、ＧＩ：７３９９０４０６）、ラット（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、ＧＩ：２０７２９０）；ブタ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ、ＧＩ：５８６０８７）、マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｃｕｌｕｓ、ＧＩ：２４９９６５６）、およびミンク（Ｍｕｓｔｅｌａ  ｓｐ．、ＧＩ：２６１６１６））。特に記載が無い限り、本明細書においては、「ＴβＲＩＩ」という用語およびその同義語は、哺乳類種少なくとも１つに由来するＴβＲＩＩを指す。図１に示す通り、７つの種に由来するＴβＲＩＩのＥＣＤに関する配列アライメントは高い程度の相同性を示している。保存されたアミノ酸は図１においてアスタリスクにより示される。最小ＴＧＦ−β結合ドメインは配列番号：１〜７の何れか１つに由来するアミノ酸２８〜１２９である（Ｐｅｐｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２２０：２８９〜２９３（１９９６）参照）。この領域において、配列は約７０％の相同性を示す。欠失分析によりさらに、保存および非保存のアミノ酸の少なくとも一部分がＴＧＦ−β結合のために必須ではないことが明らかになり（例えばＧｕｉｍｏｎｄら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、８４（４５６）：７９〜８４（１９９９）参照）；これらのアミノ酸は図１において下線および太字で示されている。ＴＧＦ−β結合ドメインの一般配列は配列番号：８に示す通りであり、既知の必須でないアミノ酸を除いた保存されたアミノ酸のみを含有している。この一般化された配列は７配列の何れかと少なくとも６４％同一である。ＴＧＦ−β結合を消失させることなく可変並びに非可変のアミノ酸位置において配列番号：８をさらに修飾することができることが理解される。ＴＧＦ−βＩＩ型受容体のそのような変異体は、本発明の目的のためには「ＴＧＦ−β結合ドメイン」という用語の意味に包含される。そのような変異体は機能的に等価な分子をもたらす置換、付加、および／または欠失／トランケーションによりアミノ酸配列を改変することにより行ってよい。一般的に、ＴＧＦ−βと相互作用する表面から遠隔である分子の領域に位置するアミノ酸を置換または欠失させることが好ましい場合がある。以下の参考文献はＴβＲＩＩの細胞外ドメインにおけるアミノ酸残基を突然変異または欠失させるためのさらなる指針を示している：Ｌｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５６（２０）：４５９５〜９８（１９９６）；Ｏｇａｓａら、Ｇｅｎｅ、１８１（１〜２）：１８５〜９０（１９９６）；Ｈａｒｔら、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、９（３）：２０３〜８（２００２）；Ｂｏｅｓｅｎら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、１０（７）：９１３〜１９（２００２）；Ｄｅｅｐら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４２（３４）：１０１２６〜３９（２００３）；Ｇｕｉｍｏｎｄら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、８４（４５６）：７９〜８４（１９９９）；Ｔａｎａｋａら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、８２（９）：１５５７〜６０（２０００）；Ｌｕｃｋｅら、Ｃａｎｃ���ｒ  Ｒｅｓ．６１（２）：４８２〜５（２００１）；Ｐａｎｎｕら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１１２（４）：５１３〜２０（２００５）；Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ、３６（８）：８５５〜６０（２００４）；Ｐｅｐｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２２０：２８９〜２９３（１９９６）；Ｌｏｅｙｓら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、３７（３）：２７５〜８１（２００５）。典型的には、アミノ酸は同様のアミノ酸で置換されてよく、即ち、機能の多大な損失を伴わない保存的置換であってよい。アミノ酸に関する置換は、例えば表１に示す通り、アミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択してよい。非極性アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンを包含する。極性の中性アミノ酸はグリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンを包含する。正荷電（塩基性）アミノ酸はアルギニン、リジン、およびヒスチジンを包含する。負荷電（酸性）アミノ酸はアスパラギン酸およびグルタミン酸を包含する。さらにまた、多くのネイティブの残基がアラニンまたはグリシンで置換されてよい。
【００３２】
（表１）例示的なアミノ酸置換
2010529859.tif 000003
【００３３】
従って、一部の実施形態においては、ＴＧＦ−β結合ドメインの各々は以下の配列、即ち：ａ）配列番号：１；ｂ）配列番号：２；ｃ）配列番号：３；ｄ）配列番号：４；ｅ）配列番号：５；ｆ）配列番号：６；ｇ）配列番号：７；およびｈ）配列番号：３１の何れか１つ以上のアミノ酸２８〜１２９と、または配列番号：３２のアミノ酸５３〜１５４と、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、またはそれより高値で同一である配列を含む。一部の実施形態においては、ＴＧＦ−β結合ドメインの各々は、以下の配列、即ち：ａ）配列番号：１；ｂ）配列番号：２；ｃ）配列番号：３；ｄ）配列番号：４；ｅ）配列番号：５；ｆ）配列番号：６；ｇ）配列番号：７；ｈ）配列番号：３１；およびｉ）配列番号：３２の何れか１つのフラグメントを含むが、ただしこのフラグメントはＴＧＦ−βに結合しなければならない。一部の実施形態においては、ＴＧＦ−β結合ドメインの各々はａ）配列番号：１；ｂ）配列番号：２；ｃ）配列番号：３；ｄ）配列番号：４；ｅ）配列番号：５；ｆ）配列番号：６；ｇ）配列番号：７；ｈ）配列番号：３１に示されるアミノ酸配列の何れか１つのアミノ酸２８〜１２９；またはａ）〜ｉ）の完全長配列を包含するこれらの配列の何れか１つに由来するアミノ酸２８〜１２９を包含するそれらのフラグメントを含む。アミノ酸２８〜１２９を含むフラグメントは、例えば、アミノ酸残基１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、２７、２８で開始するＮ末端、および、アミノ酸残基１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、および１３６で終止するＣ末端を有するフラグメントを包含する。
【００３４】
２つのアミノ酸配列の間のパーセント同一性は標準的なアライメントアルゴリズム、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３〜４１０（１９９０）に記載のＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｔｏｏｌ  （ＢＬＡＳＴ）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４８：４４４〜４５３（１９７０）のアルゴリズム、またはＭｅｙｅｒｓら、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．、４：１１〜１７（１９８８）のアルゴリズムにより決定してよい。そのようなアルゴリズムはＢＬＡＳＴＰおよび「ＢＬＡＳＴ  ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」プログラムに組み込まれる（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ参照）。そのようなプログラムを使用する場合、デフォルトパラメーターを使用できる。アミノ酸配列に関しては、以下の設定、即ち：プログラムＢＬＡＳＴＰ、マトリックスＢＬＯＳＵＭ６２、オープンギャップおよびエクステンションギャップペナルティーそれぞれ１１および１、ギャップｘ＿ドロップオフ５０、エクスペクト１０、ワードサイズ３、フィルターＯＮを「ＢＬＡＳＴ  ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」プログラムのために使用できる。
【００３５】
一部の実施形態においては、第１および第２のＴＧＦ−β結合ドメインの１つまたは両方が配列番号：８を含む。他の実施形態において、第１および第２のＴＧＦ−β結合ドメインの１つまたは両方が配列番号：１またはそのフラグメントを含む。一部の実施形態においては、ＴＧＦ−β結合ドメインのアミノ酸配列は同一であるが、他の実施形態においてはアミノ酸配列は異なっている。
【００３６】
一部の実施形態において、特に融合タンパク質を薬学的調製物において投与する場合、融合タンパク質の可溶性形態が望ましい。そのような可溶性形態は一般的に、ａ）膜貫通ドメインのかなりの部分または全て、およびｂ）細胞質ドメインの全てまたはかなりの部分、の非存在により特徴づけられる。
【００３７】
例示的な実施形態において、ＴＧＦ−β結合ドメインは例えば配列番号：９のアミノ酸２４〜３１０(最終産物としてのシグナルペプチドを含まない)に示す通り、配列番号：１のアミノ酸１〜１３６を含有する。より特定される実施形態においては、融合タンパク質は配列番号：９に示される配列を有する。その多くが当該分野で知られている任意の適当なシグナル配列を使用できる。
【００３８】
リンカー
一部の実施形態においては、本発明は例えば短鎖ペプチドリンカーのようなリンカーにより相互に連結されているＴＧＦ−β結合ドメイン２つを含む融合タンパク質を提供する。一部の実施形態においては、第１のＴＧＦ−β結合ドメインのＣ末端は短鎖ペプチドリンカーにより第２のＴＧＦ−β結合ドメインのＮ末端に連結される。リンカーは５０以下のアミノ酸を含有する場合に短鎖とみなされる。一部の実施形態においては、リンカーは計算される最大の長さが６５、６０、５０、４０Å以下となるようなものである。アミノ酸当たりの未構造化ペプチド単位の長さを約３．８Åと仮定すれば、３、４、５および６グリシン残基はそれぞれ１１．４、１５．２、１９．０および２２．８Åの最大長を有するリンカーに相当する。当業者の知る通り、二次構造の存在により実際の単位長は最大計算長よりもはるかに短鎖となる場合がある。
【００３９】
最も典型的には、リンカーは５０以下のアミノ酸、例えば４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、３、４、２、または１アミノ酸を含有するペプチドリンカーである。一般的にペプチドリンカーの配列はＴＧＦ−βＩＩ型受容体の天然のアミノ酸配列中には存在しない。種々の実施形態においてリンカーは天然の受容体配列に由来する任意の２０、または任意の１０、または任意の５隣接アミノ酸より多くを含有しない。典型的には、リンカーは可撓性となり、そして連結されたドメインの適切な折り畳みを可能にすることとなる。嵩高の側鎖基および荷電した基を有さないアミノ酸が一般的に好ましい（例えばグリシン、セリン、アラニン、およびスレオニン）。場合により、リンカータンパク質は１つ以上のアダプターアミノ酸、例えば制限部位の挿入の結果として生成されるものをさらに含有してよい。一般的にリンカー中には４アダプターアミノ酸は１０、８、６、５より多くは存在しない。
【００４０】
一部の実施形態においては、リンカーは１つ以上のグリシン、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１５、１８、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５，またはそれより多いグリシンを含む。例えば、リンカーは（ＧＧＧ）ｎ［式中、ｎ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９等］および任意のアダプターアミノ酸からなるものであってよい。例示的な実施形態においては、リンカーは例えば配列番号：９のアミノ酸１６１〜１７３に示すもののような、９個のグリシンおよび４個のアダプターアミノ酸を含むグリシンリンカーである（図２中下線および太字で示す）。他の実施形態において、リンカーは（ＧＧＧＳ）ｎ［式中、ｎ＝１、２、３、４、５等］を含むグリシン−セリンリンカーである（配列番号：１１）。本明細書に開示した結果を鑑みれば、例えばＡｌｆｔｈａｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．、８：７２５〜７３１（１９９５）；Ａｒｇｏｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１１：９４３〜９５８（１９９０）；Ｃｒａｓｔｏら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．、１３：３０９-３１２（２０００）；およびＲｏｂｉｎｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５：５９２９〜５９３４（１９９８）に記載される通り、任意の他の適当なペプチドリンカーを本発明の融合タンパク質中で使用することができることは当業者の知る通りである。
【００４１】
核酸、ベクター、宿主細胞
本発明はさらに本発明の融合タンパク質の何れかをコードする核酸、そのような核酸を含むベクター、およびそのような核酸を含む宿主細胞を提供する。例えば、例示的な実施形態においては、本発明の核酸は配列番号：１０において示されるヌクレオチド７０〜ヌクレオチド９３０（即ち特定のシグナル配列を有さない）または配列番号：１０のヌクレオチド１〜９３０（即ち特定のシグナル配列を包含する）の配列を含む。
【００４２】
本発明の核酸は例えば実施例に記載する通り、標準的な手法を用いてベクター、例えば発現ベクター中に組み込むことができる。次に発現ベクターを種々の標準的手法、例えばリポソーム媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降法、またはエレクトロポレーションを用いて宿主細胞に導入してよい。本発明による宿主細胞は哺乳類細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ヒト胚性腎細胞（例えばＨＥＫ２９３）、ＨｅＬａ  Ｓ３細胞、ネズミ胚細胞、またはＮＳ０細胞であることができる。しかしながら、例えば細菌、酵母、昆虫、および植物の細胞を包含する非哺乳類細胞も使用できる。適当な宿主細胞はまたインビボにあっても、或いはインビボに移植してもよく、その場合、核酸はインビボまたはエクスビボの遺伝子療法の状況において使用される。
【００４３】
製造方法
本発明はまたａ）融合タンパク質、ｂ）これをコードする核酸、およびｃ）融合タンパク質または核酸の何れかを含む宿主細胞および医薬組成物を製造する方法を提供する。例えば、本発明の融合タンパク質を製造する方法は、本発明の融合タンパク質をコードする核酸を含有する宿主細胞を融合タンパク質の発現をもたらす条件下で培養すること、およびその後の融合タンパク質の回収を含む。例示的な実施形態においては、融合タンパク質はＣＨＯまたはＨＥＫ２９３細胞中に発現させ、そして実施例に記載する方法を用いて培地から精製する。一部の実施形態においては、融合タンパク質は中性以上のｐＨにおいて、例えばｐＨ７．５以上、ｐＨ８．０以上、ｐＨ８．５以上、またはｐＨ９．０以上においてカラムから溶離させる。
【００４４】
変異体を包含する融合タンパク質、並びにそれをコードする核酸は、例えば以下の参考文献、即ち：Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９９０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹおよびＢｏｄａｎｓｋｙら（１９９５）  Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版、Ｓｐｒｉｎｇ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に記載される通り、または実施例に記載される通り、標準的な分子生物学の手法および合成方法を包含する任意の適当な方法を用いて製造できる。医薬組成物はまた、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、Ｇｅｎｎａｄｏら編、第２１版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、２００５）に記載のものを包含する任意の適当な方法を用いて製造できる。
【００４５】
医薬組成物および投与方法
本発明は本発明の融合タンパク質または融合タンパク質をコードする核酸を含む医薬組成物を提供する。
【００４６】
融合タンパク質は遺伝子療法の手段により細胞または生物に対して送達してよく、その場合、融合タンパク質をコードする核酸配列を発現ベクター内に挿入し、これをインビボで投与するか、エクスビボの細胞に投与した後にそれをインビボに投与し、融合タンパク質をそれから発現させる。ＴＧＦ−β拮抗剤を送達するための遺伝子療法に関する方法は公知である（例えばＦａｋｈｒａｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：２９０９〜２９１４（１９９６）および米国特許第５，８２４，６５５号参照）。
【００４７】
融合タンパク質は活性成分として融合タンパク質を含む医薬組成物中で細胞または生物に投与してよい。医薬組成物は実施する治療および投与経路に応じて製剤できる。例えば、本発明の医薬組成物は経口、局所、経皮、非経腸、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内に、点鼻により、腔内または嚢内の滴注により、眼内、動脈内、病巣内に、または例えば鼻、喉、および気管支管の粘膜への適用により、投与することができる。医薬組成物は典型的には生物学的に不活性な成分、例えば希釈剤、賦形剤、塩類、緩衝物質、保存料等を含み得る。標準的な薬学的調製手法および賦形剤は当該分野で良く知られている（例えばＰｈｙｓｉｃｉａｎｓ’  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ＰＤＲ）２００５、第５９版、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ、２００４；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、Ｇｅｎｎａｄｏら編、第２１版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、２００５参照）。
【００４８】
一般的に、本発明の融合タンパク質は症状の重症度および疾患の進行に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇの用量として投与してよい。拮抗剤の適切な治療有効用量は担当医により選択され、そして概ね、１μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇ、１００μｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、および５００μｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇの範囲となる。ある動物において達成される有効投薬量は、当該分野で知られる変換係数を用いてヒトを包含する別の動物における使用に変換してよい（例えばＦｒｅｉｒｅｉｃｈら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｒｅｐｏｒｔｓ、５０（４）：２１９〜２４４（１９９６）参照）。
【００４９】
本発明の融合タンパク質は国際特許出願ＷＯ０４／０９８６３７に記載されている通り、例えばＡＣＥ阻害剤のような他の治療薬と同時投与してよい。
【００５０】
治療上および非治療上の使用
本発明の融合タンパク質はＴＧＦ−βを捕捉または中和することにより、天然に存在するＴＧＦ−β受容体へのＴＧＦ−βの結合を低減または防止するために使用してよい。
【００５１】
本発明は本発明の融合タンパク質または融合タンパク質をコードする核酸、または融合タンパク質をコードする核酸を含有する細胞を哺乳類に投与することにより、哺乳類を治療する方法を包含する。哺乳類は例えば霊長類（例えばヒト）、げっ歯類（例えばマウス、モルモット、ラット）、またはその他（例えばイヌ、ブタ、ウサギ）であることができる。
【００５２】
治療される哺乳類はＴＧＦ−βレベルの低減が望ましい場合があるＴＧＦ−βの過剰に関連する状態１つ以上を有するか、その危険性を有していてよい。そのような状態は限定しないが例えば線維性の疾患（例えば糸球体腎炎、神経瘢痕形成、皮膚瘢痕形成、肺線維症（例えば特発性肺線維症、肺線維症、放射線誘導線維症、肝線維症、骨髄線維症）、腹膜癒着、増殖亢進性の疾患（例えば癌）、熱傷、免疫媒介疾患、炎症性疾患（関節リウマチを包含）、移植片拒絶、デュプュイトラン拘縮、および胃潰瘍を包含する。
【００５３】
特定の実施形態においては、本発明の融合タンパク質、核酸および細胞を用いて細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の接着に関連する疾患および状態を治療する。そのような疾患および状態は限定しないが例えば、全身硬化症、術後の癒着、ケロイドおよび肥厚性瘢痕形成、増殖性硝子体網膜症、緑内障ドレナージ手術、角膜傷害、白内障、ペーロニー病、成人呼吸窮迫症候群、肝硬変、心筋梗塞後の瘢痕形成、再狭窄（例えば血管形成後の再狭窄）、くも膜下出血後の瘢痕形成、多発性硬化症、椎弓切除後の線維症、腱および他の修復後の線維症、刺青除去に起因する瘢痕形成、胆汁性肝硬変（硬化性胆管炎を包含）、心外膜炎、胸膜炎、気管切開、貫通性ＣＮＳ傷害、好酸性筋肉痛症候群、血管再狭窄、静脈閉塞性疾患、膵臓炎および乾癬性関節症を包含する。特に本発明の融合タンパク質および関連する態様は、腹膜の線維症／癒着の治療のために特に有用である。特に、如何なる特定の理論にも制約されないが、げっ歯類モデルにおける動物試験は、腹腔内投与後の血流中における融合タンパク質の全身生体利用性が乏しいことを明らかにしている。これとは対照的に、抗体は腹腔から循環系中に容易に移行することがよく知られている。従って、融合タンパク質の腹腔内送達は、罹患した腹膜内の融合タンパク質の好都合な濃度のため、並びに、全身送達に伴う合併症の危険性が低減されるという付随的利点のために、腹膜の線維症および癒着のような腹膜障害の高度に限局的な治療形態を可能にする。
【００５４】
本発明の融合タンパク質、核酸および細胞はまた、再上皮化の促進が有利である状態を治療するために有用である。そのような状態は限定しないが例えば、皮膚の疾患、例えば静脈潰瘍、虚血性潰瘍（褥瘡）、糖尿病性の潰瘍、移植片部位、移植片ドナー部位、擦過症および熱傷；気管支上皮の疾患、例えば喘息およびＡＲＤＳ；腸上皮の疾患、例えば細胞毒性剤投与に関連する粘膜炎、食道潰瘍（反射疾患）、胃潰瘍、および小腸および大腸の疾患（炎症性腸疾患）を包含する。
【００５５】
本発明の融合タンパク質、核酸および細胞のさらに別の用途は、内皮細胞増殖が望ましい状態、例えばアテローム性動脈硬化プラークの安定化、血管吻合部の治癒の促進を行う場合、または平滑筋細胞増殖の抑制が望ましい状態、例えば動脈疾患、再狭窄および喘息の場合である。
【００５６】
本発明の融合タンパク質、核酸および細胞はさらに、増殖亢進性疾患、例えば癌、限定しないが例えば、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、胃癌、腎臓癌（例えば腎細胞癌）、膵臓癌、結腸直腸癌、皮膚癌、肺癌、甲状腺癌、子宮癌および膀胱癌、グリオーマ、神経膠芽細胞腫、中皮腫、黒色腫、並びに種々の白血病および肉腫、例えばカポジ肉腫の治療においても有用であり、そしてとくにそのような腫瘍の再発または転移を治療または予防するために有用である。特定の実施形態においては、本発明の融合タンパク質、核酸および細胞はシクロスポリン媒介転移を予防する方法において有用である。当然ながら、癌療法の関連においては、「治療」とは腫瘍成長の緩徐化または腫瘍転移の低減、並びに患者の余命を延長するための癌の部分的沈静化をもたらす任意の医学的介入を包含する。１つの実施形態において、本発明は、本発明の融合タンパク質、核酸または細胞を投与することを含む癌の治療方法である。特定の実施形態においては、状態は腎臓癌、前立腺癌または黒色腫である。
【００５７】
本発明の融合タンパク質、核酸および細胞はまた腎不全、例えば限定しないが、糖尿病性（Ｉ型およびＩＩ型）腎症、放射線腎症、閉塞性腎症、びまん性全身硬化症、肺線維症、同種移植片拒絶、遺伝性の腎疾患（例えば多嚢胞性腎臓病、髄質海綿腎、馬蹄腎）、腎炎、糸球体腎炎、腎硬化症、腎石灰症、全身エリテマトーデス、シェーグレン症候群、バージャー病、全身性または糸球体高血圧、尿細管間質性腎症、尿細管性アシドーシス、腎結核、および腎梗塞の治療、予防および発生の危険性の低減のために有用である。特定の実施形態においては、本発明の融合タンパク質、核酸および細胞は、限定しないが例えばレニン阻害剤、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、ＡｎｇＩＩ受容体拮抗剤（「ＡｎｇＩＩ受容体ブロッカー」としても知られている）、およびアルドステロン拮抗剤（例えばＷＯ２００４／０９８６３７参照）を包含するレニン−アンジオテンシン−アルドステロン系の拮抗剤と組み合わせる。
【００５８】
本発明の融合タンパク質、核酸および細胞はまた、マクロファージ媒介感染症、例えばリーシュマニア属（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｓｐｐ．）、トリパノソーマ・クルージ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｒｎａ  ｃｒｕｚｉ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）およびらい菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ）、並びに原生動物であるトキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）、カビであるヒストプラズマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、およびクリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、およびリケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、例えば発疹チフスリケッチア（Ｒ．ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）、リケッチア・コノリイ（Ｒ．ｃｏｒｏｎｉｉ）、およびツツガムシ病リケッチア（Ｒ．ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ）により誘発されるものに対する免疫応答を増強するために有用である。それらはまた例えば腫瘍、エイズまたは肉芽腫性の疾患により誘発される免疫抑制を低減する場合に有用である。
【００５９】
特定の実施形態においては、本発明の融合タンパク質、核酸および細胞は、他のＴＧＦ−β拮抗剤と相対比較して小型でありかつ／または短い半減期を有するＴＧＦ−β拮抗剤が、治療薬としてより効果的であるような、疾患および状態を治療するために、使用される。本明細書に記載する通り、本発明の融合タンパク質は他のＴＧＦ−β拮抗剤（例えばＴＧＦ−β抗体、ＴＧＦ−β受容体−Ｆｃ融合タンパク質）よりも小型であり、そしてより短い循環系中半減期を有している。従って、そのような融合タンパク質はそのような特性が望ましい疾患または状態を治療する場合に増大した効果を示す場合がある。例えば、如何なる特定の理論にも制約されないが、本発明の融合タンパク質は、他のＴＧＦ−β拮抗剤と相対比較した場合に小型であるため、作用部位へのターゲティングが向上していると考えられる（例えば、腫瘍貫通性の増大、組織（例えば、線維性組織）貫通性の増大）。
【００６０】
さらにまた、如何なる特定の理論にも制約されないが、本発明の融合タンパク質は、それらが（ＴＧＦ−β抗体およびＴＧＦ−β受容体−Ｆｃ融合タンパク質とは異なり）免疫グロブリンドメインを欠いているため、免疫系による作用部位からのクリアランスに対してそれほど感受性ではないと考えられる（例えば肺の状態または疾患の場合）。
【００６１】
本明細書に記載する通り、そして当該分野で知られる通り、ＴＧＦ−βは多くの細胞プロセス、例えば細胞成長、細胞分化、アポトーシス、細胞ホメオスタシスおよび他の細胞機能に関与している。ＴＧＦ−βが細胞プロセスにおいて有している重要な役割を考慮すれば、より長時間作用性のＴＧＦ−β拮抗剤（例えばＴＧＦ−β抗体、ＴＧＦ−β受容体−Ｆｃ融合タンパク質）よりも少ない負の付随作用を相応に有することになるより短時間作用性のＴＧＦ−β拮抗剤を投与することが好ましい状態または疾患が存在する場合がある。従って、如何なる特定の理論にも制約されないが、本発明の融合タンパク質は、それらのより短い循環系中の半減期のために、より少ない負のＴＧＦ−β拮抗剤関連作用を呈すると考えられる。例えば、出生前の乳児において一般的に診断される肺の疾患である気管支肺異形成（ＢＰＤ）は、本発明の融合タンパク質のようなより短時間作用性のＴＧＦ−β拮抗剤は正常な発達においてＴＧＦ−βが有している重要な役割に対する干渉がより低値であることから、そのようなより短時間作用性のＴＧＦ−β拮抗剤の投与が有利となる状態である場合がある。
【００６２】
一部の例示的な実施形態においては、本発明の融合タンパク質の投与は腎線維症の低減および／または腎臓の形態の良好な保存をもたらす場合がある。
【００６３】
以下の実施例は説明目的で提示しており、限定する意図はない。
【００６４】
実施例
実施例１：ｓＲＩＩ−９Ｇｌｙの製造および精製
ヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体ｃＤＮＡを使用して、図３に模式的に示す通り、９Ｇｌｙリンカーにより連結されたＴβＲＩＩのＥＣＤ２つを含有する可溶性ＴＧＦ−β拮抗剤のコンストラクトを作成した（ｓＲＩＩ−９Ｇｌｙ）。プライマーは制限酵素の切断部位、そして必要に応じて９グリシン残基のオーバーラップ配列を含有した（Ｏｉｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７３（１８）：１１１７３−６（１９９８））。第１のＥＣＤは表２に示すプライマーＡおよびリバースプライマーＢを用いて作成し；第２のＥＣＤはプライマーＣおよびリバースプライマーＤを用いて作成した。
【００６５】
（表２）ｓＲＩＩ−９Ｇｌｙコンストラクトを作成するために使用したプライマー
2010529859.tif 000004
＊  ＸｈｏＩ部位は太字、開始コドンは下線、Ｋｏｚａｋ配列は斜体。
＊＊  ＮｄｅＩ部位は太字。
＊＊＊  ＮｄｅＩおよびＣｌａＩ部位は太字，  Ｇｌｙリンカーは下線。
＊＊＊＊  ＢａｍＨＩは太字；終止コドンは下線。
【００６６】
増幅されたＰＣＲ産物をそれぞれの制限酵素で消化し、そして精製されたフラグメントを標準的なクローニング手法を用いてｐｃＤＮＡ３．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）内にライゲーションした。
【００６７】
最終ｓＲＩＩ−９Ｇｌｙコンストラクトのヌクレオチド配列および相当するアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：９および配列番号：１０に示す。次にこのコンストラクトをＣＨＯ細胞中での発現のためにＣＨＯ発現ベクター内にサブクローニングした。可溶性ＩＩ型受容体を発現するＣＨＯ細胞系統を使用して可溶性受容体を作成した。ＣＨＯ生産細胞系統を解凍し、ローラボトル中に播種した。培養物が９０％コンフルエントに達した時点で生産培地を供給することにより生産を開始した。細胞培地から一定の間隔で３〜５採取物をその採取回に収集し、そして採取時には新しい培地を補給した。一部の実験においては、ｓＲＩＩ−９ＧｌｙをＨＥＫ２９３細胞において標準的なプロトコルを使用して調製した。ｓＲＩＩ−９Ｇｌｙに関する精製スキームは３カラム工程を含むものとした。第１の工程は主にアニオン交換樹脂（予め２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．００１％Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ９．０で平衡化させておいたＰａｌｌＱセラミックハイパーＤカラム）を用いた濃縮工程とした。画分は、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．００１％  Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ９．０を用いて終了時を２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、０．００１％  Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ９．０として溶離させた。疎水性相互作用カラムを最初の精製工程に後続して使用した。アニオン交換工程により得られた選択された画分を１．５Ｍ硫酸アンモニウムで滴定し、濾過し、ＢｉｏＲａｄのＭａｃｒｏＰｒｅｐメチルカラム上にローディングした。画分は１２．５ｍＭ  ＮａＰＯ４、０．００１％  Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ８．０で溶離させた。選択されたピーク画分をプールし、次に１２．５ｍＭ  ＮａＰＯ４、０．００１％  Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ８．０内への接線流濾過を用いて透析濾過することにより、残存する可能性のあるいかなる硫酸アンモニウム痕跡量も除去した。最後のカラム工程はＣＨＴ（セラミックヒドロキシアパタイト；ＢｉｏＲａｄ  ＣＨＴカラム）を用いて実施し、そしてフロースルーモードにおいて実施することにより不純物を除去した。選択されたフロースルー画分を１２ｍＭ  ＮａＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ７．２に調整した。
【００６８】
実施例２：ｓＲＩＩ−９Ｇｌｙの結合親和性
ＣＨＯおよびＨＥＫ２９３細胞において生産したｓＲＩＩ−９Ｇｌｙの結合親和性をＢｉａｃｏｒｅ（商標）を用いて試験した。センサーチップをＴＧＦ−β１、−２、または−３でコーティングした。ｓＲＩＩ−９ＧｌｙをＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中１．２、３．３、１０、３０、および９０ｎＭの濃度で調製した。タンパク質を二つ組で注入し、５分間会合の後、５分間解離に供した。得られた結合曲線を１：１結合モデルにフィットさせた。ＣＨＯおよびＨＥＫ２９３が生産したｓＲＩＩ−９Ｇｌｙは両方とも、表３に示す通り、低いｎＭ範囲においてＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β３に結合した。
【００６９】
（表３）ＣＨＯおよびＨＥＫ２９３により生産されたｓＲＩＩ−９ＧｌｙのＴＧＦ−β結合親和性
2010529859.tif 000005
【００７０】
実施例３：ｓＲＩＩ−９Ｇｌｙの効果測定
ＨＥＫ２９３生産ｓＲＩＩ−９Ｇｌｙの効果をＲａｐｏｚａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、３１６（１−２）：１８〜２６（２００６）に記載のＡ５４９／ＩＬ−１１細胞バイオアッセイを用いて分析した。ｓＲＩＩ−９Ｇｌｙを連続希釈し、固定濃度のＴＧＦ−β（０．３ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦ−β１または０．７ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦ−β３）とともに１時間インキュベートし、その後試料を１８〜２４時間、Ａ５４９細胞上に移行させた。その後Ａ５４９細胞上澄み中のｈＩＬ−１１レベルをＥＬＩＳＡにより定量した。
【００７１】
ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β３に関する標準曲線はシグモイド型のロジスティック曲線を生じ、ＥＤ５０値はそれぞれ２５１および２８１ｐｇ／ｍｌであった（本アッセイに典型的な範囲）。本実施例において得られたＩＣ５０値を表４および５に総括する。
【００７２】
（表４）Ａ５４９／ＩＬ−１１バイオアッセイにおけるｓＲＩＩ−９ＧｌｙのＩＣ５０値
2010529859.tif 000006
【００７３】
（表５）Ａ５４９／ＩＬ−１１バイオアッセイにおけるｓＲＩＩ−９ＧｌｙのＩＣ５０値
2010529859.tif 000007
【００７４】
試験したｓＲＩＩ−９Ｇｌｙの４ロットのうち、全てがＴＧＦ−β１に対してほぼ同一の効果（２倍以内）を示し、そしてＴＧＦ−β３に対して同様の効果を保有していた（４倍以内）。このデータは、ＨＥＫ２９３細胞系統から作成され、そして同じ方法を用いて精製された拮抗剤のロットが、Ａ５４９バイオアッセイにおいて同様の効果プロファイルを有するタンパク質を生じさせたことを示している。中性のｐＨより高値で溶離させた（収率を向上するため）ｓＲＩＩ−９Ｇｌｙの一部の試料をＡ５４９力価アッセイにおいて試験することにより、ｐＨがそれらの力価に影響したかどうかを調べた。アッセイは本質的に上記した通り実施し、そして結果は表６に示す。
【００７５】
（表６）Ａ５４９／ＩＬ−１１細胞バイオアッセイにおけるｓＲＩＩ−９ＧｌｙのＩＣ５０値
2010529859.tif 000008
【００７６】
試験したｓＲＩＩ−９Ｇｌｙの５試料のうち、全てがＴＧＦ−β１に対してほとんど同一の効果（ｐＭ範囲において）を示し、ＩＣ５０値の変動は２倍未満であった（試験の変動内）。同様のＩＣ５０値が上記した通りｓＲＩＩ−９Ｇｌｙのロット１〜４に関して以前に得られている。考えあわせると、これらの結果は、同じ細胞系統から形成され、そして同様の方法を用いて精製された拮抗剤のロットは、Ａ５４９バイオアッセイにおいて同様の効果プロファイルを有するタンパク質を形成することを示している。７．０〜９．０のｐＨ範囲内のｓＲＩＩ−９Ｇｌｙの精製は、Ａ５４９バイオアッセイにおいてＴＧＦ−β１を中和するその能力に対して有意に影響しない。
【００７７】
ＣＨＯ生産ｓＲＩＩ−９Ｇｌｙの効果をＡ５４９／ＩＬ−１１細胞バイオアッセイの同様の方法を用いて分析した。結果を表７に示す。
【００７８】
（表７）Ａ５４９／ＩＬ−１１細胞バイオアッセイにおけるＣＨＯ生産ｓＲＩＩ−９ＧｌｙのＩＣ５０（ｎＭ）    
2010529859.tif 000009
【００７９】
実施例４：ｓＲＩＩ−９Ｇｌｙのインビボ効果（２週間ラット試験）
体重２５０ｇの成体雄性スプラーグドーリーラット（７〜８週齢；Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＮＹ）をＭｉｙａｊｉｍａら、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．、５８（６）：２３０１−１３（２０００）の片側尿管閉塞（ＵＵＯ）モデルに使用した。全動物を空調、温度調節、および照明調節された環境下で飼育した。小さな腹側正中切開を行うことにより左側腎臓および上部尿管を露出させ、その後永久尿管結紮を行った。偽手術されたラットには尿管結紮を行わなかった以外は同じ外科的プロトコルを施した。ラットには表８に記載する通り投薬した。１Ｄ１１は上述のＭｉｙａｊｉｍａらまたは米国特許５，７７２，９９８に記載されている通りネズミＩｇＧ１モノクローナル抗ＴＧＦ−β抗体であり、そして１３Ｃ４は１Ｄ１１の陰性対照となる。第３，７，１５および２１日に０．１０５Ｍのクエン酸ナトリウムの１０分の１の量まで後方眼窩洞部から採血した。結紮の二週間後に動物を屠殺し、左側腎臓を５分間ＰＢＳで灌流し、そして組織学的評価（腎線維症）および転写物分析用に採取した。
【００８０】
（表８）処置群（２週間試験）
2010529859.tif 000010
【００８１】
拮抗剤レベルの定量−血漿試料および血清試料中のｓＲＩＩ−９Ｇｌｙレベルを定量するためのＥＬＩＳＡ試験を行った。ｓＲＩＩ−９Ｇｌｙ定量のために、９６ウェルプレートをコーティング緩衝液（０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３）中１μｇ／ｍｌのＴＧＦ−β１（Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｒｐ．）１００μｌでコーティングし、そして４℃で一晩インキュベートした。ウェルを１時間ブロッキング緩衝液（０．５％  ＢＳＡ／ＰＢＳ）１５０μｌでブロッキングした。被験試料を添加し、１時間インキュベートした。ヤギ抗ヒトＴＧＦ−βＲＩＩ（カタログ番号：ＡＦ−２４１−ＮＡ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を１時間２５０ｎｇ／ｍｌで添加した。二次抗体、ウサギ抗ヤギＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲート（ＫＰＬカタログ番号：１４−１３−０６）を１時間１００ｎｇ／ｍｌで添加した。ＯＰＤ基質（カタログ番号：Ｐ９１８７、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を暗所で１５分間インキュベートした後、４．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４  ５０μｌを添加した。発色反応はレファレンス６５０ｎｍとして４９０ｎｍでプレートを読み取ることにより定量した。標準物質としては精製されたｓＲＩＩ−９Ｇｌｙ（Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｒｐ．）を使用した。１Ｄ１１の定量のためにはプレートを１μｇ／ｍｌの精製ＴＧＦ−β２（Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｒｐ．、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ）１００μｌでコーティングした。ブロッキングは３７℃で３０分間行った。試料を添加し、３７℃で２時間インキュベートした後、ＨＲＰにコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧ（カタログ番号：Ｐ／Ｎ  Ａ−０１６、Ｓｉｇｍａ）を添加した。シグナルは上記した通り３０分間ＳｉｇｍａＯＰＤ基質を用いて検出した。
【００８２】
全ラットがＥＬＩＳＡ試験において、被験化合物の検出可能なレベルを有しており、動物間の変動はほとんどなかった（図４参照）。１Ｄ１１レベル（半減期５〜６日）は平均で１００μｇ／ｍｌであった。これとは対照的に、ｓＲＩＩ−９Ｇｌｙは毎日の静脈内注射にも関わらず１０μｇ／ｍｌ未満で検出された（短い循環系中半減期（１８〜２０時間）のため）。
【００８３】
組織病理学的分析−腎臓切片（５μｍ）を４％のパラホルムアルデヒドで固定し、そしてパラフィン包埋した。組織切片をヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色し、盲検方式において組織病理学的に採点した。盲検方式において実施した組織学的評価によれば、１Ｄ１１投与動物は図５に示す通り、１３Ｃ４／ＰＢＳ投与動物と比較して有意に良好な腎臓の形態学的特徴を有していたことがわかった（ｐ＜０．０５）。ｓＲＩＩ−９Ｇｌｙ群の１匹は試験において最高の評点（１）を有していたが、平均では、この群は１３Ｃ４／ＰＢＳ投与動物と比較して有意差はなかった。
【００８４】
腎線維症の定量−線維症はヒドロキシプロリンアッセイおよびピクロシリウスレッド染色およびコラーゲンＩＩＩ免疫組織化学的染色の定量的評価により定量した。ヒドロキシプロリン含有量はＫｉｖｉｒｉｋｋｏら、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、３４８（１１）：１３４１〜４（１９６７）およびＲｅｄｄｙらＣｌｉｎｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２９：２２５〜２２９（１９９６）において以前に記載されている通り計測した（９６ウェルフォーマットに変更）。第１に、腎組織を真空凍結乾燥機中で凍結乾燥し、乾燥した組織を２Ｎ  ＮａＯＨ中で加水分解した（１００μｇ乾燥組織／μｌ）。試料１０μｌを９６ウェルプレートに添加し、クロラミン−Ｔ（Ｓｉｇｍａ）９０μｌを室温で２５分間加水分解試料に添加した。次にエールリッヒ・アルデヒド（Ｓｉｇｍａ）１００μｌを添加し、試料を２０分間６５℃でインキュベートした後、５５０ｎｍにおける吸光度を計測した。ヒドロキシプロリン含有量は乾燥組織ｍｇ当たりのヒドロキシプロリンのμｇとして表示した。図６Ａに示す通り、ｓＲＩＩ−９Ｇｌｙおよび１Ｄ１１投与動物の両方において腎ヒドロキシプロリン含有量の有意な低減が観察された（１３Ｃ４と比較してｓＲＩＩ−９Ｇｌｙでｐ＜０．０１、１Ｄ１１でｐ＜０．０５）。
【００８５】
腎切片は標準的な手法を用いてピクロシリウスレッドで染色した。Ｃｈｒｏｍａｖｉｓｉｏｎ自動ソフトウエアを用いて画像を採取し、染色物はＭｅｔａＭｏｒｐｈ分析ソフトウエア（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．、Ｄｏｗｎｉｎｇｔｏｗｎ、ＰＡ）を用いた画像分析により定量した。図６Ｂに示す通り、ピクロシリウスレッド染色コラーゲンはＭｅｔａｍｏｒｐｈ分析により定量した。ＵＵＯ群のいずれもＰＢＳ投与と比較して有意差はなかった（動物間で大きな変動）。しかしながら、ｓＲＩＩ−９Ｇｌｙ投与群を１３Ｃ４と比較した場合には有意差があった（ｐ＜０．０５）。
【００８６】
コラーゲンＩＩＩの免疫組織化学的検出のために、腎組織切片を１０分間３％過酸化水素でブロックし、７分間１％脱マスキング溶液（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）とともに圧力鍋中で加熱し、その後、３０分間タンパク質をブロックした。切片を４℃で一晩、抗体希釈液（Ｄａｋｏ）中のヤギ抗コラーゲンＩＩＩ抗体（１：１００）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で処理し、５分間ＰＢＳ／０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、その後３７℃で３０分間、抗体希釈液（Ｄａｋｏ）中のＨＲＰにコンジュゲートしたウサギ抗ヤギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（１：１００；Ｚｙｍｅｄ）で処理した。５分間ＰＢＳ／０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した後、切片を室温で９分間安定なジアミノベンジン（ＫＰＬ）中で発色させ、３０秒間ヘマトキシリンで対比染色した。図６Ｃに示す通り、投与群のいずれも、個体動物間の大きな変動のためにＰＢＳ群と比較して有意差を示していなかった。しかしながら、ｓＲＩＩ−９Ｇｌｙおよび１Ｄ１１投与群の両方とも、１３Ｃ４投与群とは有意差があった（ｐ＜０．０５）。
【００８７】
腎転写物の定量−トリゾール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の腎組織をＺｉｒｃｏｄｉａビーズ（ＢｉｏＳｐｅｃ）およびビーズビーターを用いてホモゲナイズし、クロロホルムで抽出し、そしてＲＮＡをＲＮＡｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて製造元の説明書に従って単離した。ＲＮＡをＤＮＡｓｅＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で処理し、そしてｃＤＮＡをＰｏｗｅｒＳｃｒｉｐｔプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて作成した。ＴａｑＭａｎ（商標）ユニバーサルＰＣＲマスターミックスおよび遺伝子特異的プライマー（表９）を用いてＲＴ−ＰＣＲをセットアップし、そしてＡＢＩＰｒｉｓｍ７７００配列検出器（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）上で反応を実施した。
【００８８】
（表９）腎転写物定量のために使用したプライマーおよびプローブ
2010529859.tif 000011
【００８９】
図７ＡはＲＴ−ＰＣＲにより試験したコラーゲンＩＩＩに関する転写物レベルを示す。１Ｄ１１（ｐ＜０．０５）およびｓＲＩＩ−９Ｇｌｙ（ｐ＜０．０１）投与の両方ともがＰＢＳ投与動物と比較してコラーゲンＩＩＩメッセージレベルを有意に低減した。このデータはＩＨＣ／ＭｅｔａｍｏｒｐｈによるコラーゲンＩＩＩタンパク質レベルに関する結果と相関していた。コラーゲンＩＩＩ  ｍＲＮＡレベルが１３Ｃ４投与によっても低下した理由は不明である。
【００９０】
ＴＧＦ−βアイソフォームの各々に関するメッセージレベルを偽手術された動物と比較した場合のコピー数（図７Ｂ）における倍差として表示した。偽手術された動物と比較した場合に閉塞腎においてはＴＧＦ−β１およびβ２のｍＲＮＡレベルにはそれぞれ６倍および２倍の増大が観察されたのに対し、ＴＧＦ−β３  ｍＲＮＡの変化は観察されなかった。図７Ｂに示す通り、投与群の間では、ｓＲＩＩ−９Ｇｌｙおよび１Ｄ１１投与群におけるＴＧＦ−β１  ｍＲＮＡレベルが、１３Ｃ４投与と比較してそれぞれ３０および４０％低下していた（ｐ＜０．０１）。拮抗剤投与群の何れにおいてもＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３  ｍＲＮＡレベルの変化は観察されなかった。偽手術された動物においてＴＧＦ−β２  ｍＲＮＡはＴＧＦ−β１よりも有意に高値であり、ＴＧＦ−β２が正常腎臓において役割を果たしていることを示唆していた（ＴＧＦ−βアイソフォームに関するＩＨＣ分析においても観察）。
【００９１】
ＴＧＦ−β中和抗体、１Ｄ１１は週当たり３回の投薬スケジュールの後、循環系中に残存していた。これとは対照的に、ｓＲＩＩ−９Ｇｌｙレベルはその短い血漿中半減期のために１０倍低値であった。本試験においては、１Ｄ１１およびｓＲＩＩ−９Ｇｌｙの両方とも、種々のエンドポイントにより評価した同様の程度にまで腎線維症を低減した。両方の拮抗剤は腎臓の形態学的特徴を僅かに向上させ、そして、低下したヒドロキシプロリン含有量、コラーゲンＩＩＩタンパク質レベルおよびピクロシリウスレッド染色により明らかにされる通り、線維症の重症度を低下させた。さらにまた、ｓＲＩＩ−９Ｇｌｙおよび１Ｄ１１は両方ともＴＧＦ−β１およびコラーゲンＩＩＩ転写物のレベルを低下させた（ＴＧＦ−β２またはＴＧＦ−β３のレベルに対しては無作用）。試験した拮抗剤の何れも、閉塞腎臓における内因性ＴＧＦ−β受容体（ＲＩＩ、ＲＩＩＩ）レベルには影響しなかった。１Ｄ１１と比較して循環系中のｓＲＩＩ−９Ｇｌｙの１０倍低値のレベルにもかかわらず、１Ｄ１１およびｓＲＩＩ−９Ｇｌｙによる同様の効果が得られた。このことは、ｓＲＩＩ−９Ｇｌｙが１Ｄ１１よりも強力であるか、またはそれが腎臓において異なって局在化していることを示唆している。ｓＲＩＩ−９Ｇｌｙの分子量（グリコシル化を伴って５５〜６０ｋＤａ）は１Ｄ１１（１５０ｋＤａ）よりも小さく、この相違は、腎臓尿路空間へのｓＲＩＩ−９Ｇｌｙのより良好な到達性および／または尿細管間質空間内への良好な組織貫通をもたらしていると考えられる。実施例４に記載したものと同様の試験を３週間（ｖｓ２週間）の期間を用いて同じモデルにおいて実施した。その延長された試験においてはｓＲＩＩ−９Ｇｌｙの低い効果が観察されたが、大部分はヒト可溶性受容体タンパク質に対するラットにおける潜在的な免疫応答に起因すると考えられる。
【００９２】
実施例５：ラットＵＵＯモデルにおけるｓＲＩＩ−９Ｇｌｙのインビボ効果（多数回毎日投薬）
ｓＲＩＩ−９Ｇｌｙ投与群には以下に総括する通り毎日３回投薬を行った以外は実施例４において上述したものと同様の２週間試験において、成体雄性スプラーグドーリーラットを片側尿管閉塞（ＵＵＯ）モデルに使用した。
【００９３】
（表１０）処置群（多数回毎日投薬ラット試験）
2010529859.tif 000012
【００９４】
投与ラットの血流中の種々の形態のＴＧＦ−β拮抗剤のレベルを以下の通り試験した。血中のｓＲＩＩ−９Ｇｌｙレベルは一日当たり投薬の最終回（採血後）の１５分後に、そして再度、一晩経過後の翌日、ただし一日当たり投薬の初回前（即ち採血前）に試験することにより、ピークおよび定常状態のレベルを観察した。ｓＲＩＩ−９Ｇｌｙのレベルは投薬直後は１Ｄ１１と同等（１５０〜３００μｇ／ｍｌ）であったが；定常状態のレベルは１４〜６０ｕｇ／ｍｌの低値であった。
【００９５】
効果エンドポイント−拮抗剤の効果は、実施例４における分析と同様の組織病理学的採点および腎線維症の定量により評価した。組織切片をＨ＆Ｅ染色し、そして盲検方式において組織病理学的特徴に関して採点した。Ｈ＆Ｅ染色腎切片は１３Ｃ４投与群と比較してｓＲＩＩ−９Ｇｌｙ（ｐ＜０．０１）および１Ｄ１１（ｐ＜０．０５）投与群において腎臓の形態学的特徴の有意な保存を示していた（図８Ａ）。ヒドロキシプロリンアッセイによるコラーゲンレベルの定量は、１Ｄ１１投与動物におけるコラーゲンの有意に低値のレベル（ｐ＜０．０１）およびｓＲＩＩ−９Ｇｌｙ投与群における同様の傾向を示していた（図８Ｂ）。
【００９６】
総括すれば、ラットＵＵＯモデルにおいて観察されたｓＲＩＩ−９Ｇｌｙの一日当たり多数回投薬の効果は、腎臓の形態学的特徴および腎線維症の定量により評価した場合、１Ｄ１１抗ＴＧＦ−β抗体で達成されたものに匹敵していた。
【００９７】
実施例６：マウスＵＵＯモデルにおけるインビボ効果
体重２５〜３０ｇの成体雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１０〜１２週齢；Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用し、そして上記したラットモデルと同様に外科的処置を行った。マウスには表１１に示す通り投薬した。尿管結紮２週間後に動物を屠殺し、そして灌流した腎臓を採取して分析に供した。
【００９８】
（表１１）処置群（毎日投薬マウス試験）
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【００９９】
血流中の検出可能なｓＲＩＩ−９Ｇｌｙのレベルを定量したところ、第７および１５日にはそれぞれ８および２ｕｇ／ｍｌであることがわかった。ｓＲＩＩ−９Ｇｌｙ投与動物の大部分が毎日の静脈内投薬にも関わらず検出可能な血中ｓＲＩＩ−９Ｇｌｙレベルの低下を有していた。この低下は、ＥＬＩＳＡプレート上のＴＧＦ−β１へのｓＲＩＩ−９Ｇｌｙの結合を妨害した可能性のあるヒトｓＲＩＩ−９Ｇｌｙタンパク質に対する中和抗体の形成に起因すると考えられる。
【０１００】
ヒトｓＲＩＩ−９Ｇｌｙに対する潜在的抗体形成を第１５日の血漿試料中で評価した。ＥＬＩＳＡプレートをＣＨＯ生産ヒトｓＲＩＩ−９Ｇｌｙでコーティングし、その後第１５日の血漿試料を添加した。ＨＲＰにコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を添加し、その後ＯＤＰ基質を添加した。発色反応はレファレンス６５０ｎｍとして４９０ｎｍでプレートを読み取ることにより定量した。抗体力価はＯＤ＞０．１００（試験のバックグラウンドは＜０．０５であった）をもたらす希釈度の逆数として定義した。結果によれば、マウス全９匹ともｓＲＩＩ−９Ｇｌｙ可溶性ヒトＴＧＦ−β受容体コンストラクトに対する抗体を有していたが、この試験はＴＧＦ−β結合に干渉しない非中和抗体とＴＧＦ−β結合に干渉する中和抗体とを区別しなかった。
【０１０１】
ヒトｓＲＩＩ−９Ｇｌｙタンパク質への抗体の応答はげっ歯類では予測されたが、抗体の発生は、特に形成された抗体がＴＧＦ−βを中和するｓＲＩＩ−９Ｇｌｙの能力を相殺した場合に、ｓＲＩＩ−９Ｇｌｙコンストラクトの効果に影響する可能性がある。第７日と比較した場合に第１５日にマウスの大半の循環系中のＥＬＩＳＡにより検出されたｓＲＩＩ−９Ｇｌｙレベルが低値であったことは、これらの抗体が実際にＴＧＦ−βへのｓＲＩＩ−９Ｇｌｙの結合を低減したことを示唆しており、従ってＵＵＯ動物モデルは治療用ＴＧＦ−β拮抗剤としてのヒトｓＲＩＩ−９Ｇｌｙの効果を大きく過小評価していると考えられる。
【０１０２】
マウスＵＵＯモデルにおけるｓＲＩＩ−９Ｇｌｙの効果を、実施例４において上記実施した分析と同様の組織病理学的採点、腎線維症の定量および転写分析により評価した。Ｈ＆Ｅ染色腎切片を盲検方式において採点したところ、１３Ｃ４投与群と比較して１Ｄ１１（５ｍｇ／ｋｇ）およびｓＲＩＩ−９Ｇｌｙ投与動物の両方において腎臓の形態学的特徴が有意に保存されていた（ｐ＜０．０５）（図９Ａ）。さらにまた、ヒドロキシプロリンアッセイによるコラーゲンレベルの定量によれば、１Ｄ１１投与動物におけるコラーゲンの有意に低値のレベル（ｐ＜０．０１）およびｓＲＩＩ−９Ｇｌｙ投与群における同様の傾向が示されていた（図９Ｂ）。
【０１０３】
コラーゲンＩＩＩおよびプラスミノーゲン活性化物質阻害剤−１（ＰＡＩ−１）の腎転写物レベルをＲＴ−ＰＣＲにより試験した。１Ｄ１１およびｓＲＩＩ−９Ｇｌｙの両方とも、ＰＢＳおよび１３Ｃ４投与動物と比較してコラーゲンＩＩＩ（１Ｄ１１でｐ＜０．００１およびｓＲＩＩ−９Ｇｌｙでｐ＜０．０１）（図９Ｃ）およびＰＡＩ−１  ｍＲＮＡレベル（１Ｄ１１およびｓＲＩＩ−９Ｇｌｙの両方でｐ＜０．００１）（図９Ｄ）を有意に低減した。
【０１０４】
総括すれば、ｓＲＩＩ−９Ｇｌｙおよび対照抗体１Ｄ１１は腎臓の形態学的特徴を保存し、そして線維症関連の遺伝子の転写およびその後の線維症を低減することにより、マウスＵＵＯモデルにおいて効果を示した。
【０１０５】
実施例７：単回投与後の正常マウスにおけるｓＲＩＩ−９Ｇｌｙの生体分布
ヒトｓＲＩＩ−ＧｌｙをＩＯＤＯ−ＧＥＮ法（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて１２５Ｉで標識し、そしてＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて精製した。６匹の雄性Ｂａｌｂ／ｃマウスにｓＲＩＩ−９Ｇｌｙ  １０ｍｇ／ｋｇを静脈内投与した（マウス当たり約６８０μＣｉの総放射能を有する１２５Ｉ標識ｓＲＩＩ−９Ｇｌｙ  ２２μｇを包含するｓＲＩＩ−９Ｇｌｙ２００μｇ）。選択された臓器（心臓、左右の腎臓、肺、胃、甲状腺、脳、筋肉、陰嚢および全身）をＳＰＥＣＴ／ＣＴを用いて投与後３０分、２〜３、８および２４時間にスキャンし、そして対象領域（ＲＯＩ）の計数値を算出した。最終画像の後、マウスを屠殺し、そして選択された臓器を切開し、そして放射能を集計した（肝臓、心臓、腎臓、肺、脾臓、舌、胃、食道、小腸および大腸、結腸、直腸、脳、大腿骨、皮膚［耳］および筋肉）。切除した臓器に関する数値を組織重量により標準化した。
【０１０６】
ＳＰＥＣＴ／ＣＴ画像は心臓、頸動脈、左右腎臓、胃および膀胱中の３０分におけるｓＲＩＩ−９Ｇｌｙを示している（図１０）。時間とともに活性の低下が観察され、ｓＲＩＩ−９Ｇｌｙの急速なクリアランスが示された。膀胱における強力なｓＲＩＩ−９Ｇｌｙシグナルおよび肝臓および脾臓で検出された低いレベルは、ｓＲＩＩ−９Ｇｌｙのクリアランスが主に腎臓を経由して起こったことを示していた。８および２４時間において、それぞれ総計数値の１０〜４７％および８０〜８５％が除去された。甲状腺を除き２４時間には放射能は殆ど観察されなかった。より後期の時点に関してＳＰＥＣＴ／ＣＴ画像の尺度を増大させたところ、時間経過の全体にわたって同じ臓器におけるｓＲＩＩ−９Ｇｌｙの局在化が示された（心臓、胃、および膀胱）。
【０１０７】
２４時間におけるｓＲＩＩ−９Ｇｌｙの生体分布もまた摘出した臓器の放射能を集計することにより調べた。これは１）投与された際の活性と比較した場合の摘出組織における総放射能（ｃｐｍ）のパーセント（図１１Ａ）、および２）組織重量により標準化した組織計数値のパーセント（図１１Ｂ）として表示した。
【０１０８】
摘出した臓器における放射能は血液、胃、肝臓、腎臓および小腸において最高値であった（＞０．２％）。組織重量に関して標準化したところ、ｓＲＩＩ−９Ｇｌｙの最高量は、血液、皮膚および胃（１．５〜１．８％）において、そして次いで腎臓および肺（０．７〜０．８％）、そして心臓および舌（０．５％）において観察された。分析した臓器の残余は、僅か０．０４％のみ含有していた脳を除き、０．２〜０．３％であった。
【０１０９】
総括すると、１２５Ｉ標識ｓＲＩＩ−９Ｇｌｙの生体分布をＳＰＥＣＴ／ＣＴスキャンにより正常マウスにおいて試験した。摘出した臓器のＳＰＥＣＴ／ＣＴ撮影および放射能の定量の両方とも、全動物で同等および同様であった。予測された通り、被験物の大部分は腎臓により２４時間以内に除去され、物質の残余は大部分が血液、皮膚および胃において検出可能であった。これらの結果はｓＲＩＩ−９Ｇｌｙは皮膚および胃、並びに腎臓および肺に効率的に保持され得ることを示唆している。従ってｓＲＩＩ−９Ｇｌｙは、ｓＲＩＩ−９Ｇｌｙが効率的に保持されるこれらの組織および臓器が罹患している疾患および障害、例えば皮膚の硬化性および線維性の疾患および障害（例えば硬皮症）、皮膚癌（例えば黒色腫）、腎臓の疾患および障害（例えば糖尿病性腎症）、および肺の疾患および障害（例えば肺癌および気管支肺異形成）の治療において特に有用であるといえる。
【０１１０】
本明細書は参照により全体が本明細書に組み込まれる本明細書中で引用した参考文献の教示内容に鑑みて最もよく理解される。本明細書中の実施形態は本発明の実施形態の例示であり、本発明の範囲を限定すると考えてはならない。多くの他の実施形態が本発明に包含されることは当業者のよく知る通りである。本開示内で引用した全ての刊行物および特許は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書における任意の参考文献の引用はその参考文献が本発明の先行技術であることを許容するものではない。分子メカニズムおよび経路の表示は本発明の理解を容易にするためにのみ提示しており、これに拘束されると考えてはならない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年2月16日(2010.2.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＧＦ−β受容体ＩＩのＴＧＦ−β結合ドメイン２つを含む融合タンパク質であって、該結合ドメインがペプチドリンカーにより相互に連結されている、融合タンパク質。
【請求項２】
第１のＴＧＦ−β結合ドメインのＣ末端がリンカーにより第２のＴＧＦ−β結合ドメインのＮ末端に連結されている、請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項３】
２つのドメインが同一である、請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項４】
リンカーが５０以下のアミノ酸からなる、請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項５】
リンカーの最大計算長が６５Åである、請求項４記載の融合タンパク質。
【請求項６】
リンカーが１つ以上のグリシンを含む、請求項５記載の融合タンパク質。  
【請求項７】
リンカーが９つのグリシン残基を含む、請求項５記載の融合タンパク質。
【請求項８】
ＴＧＦ−β結合ドメインの一方または両方が配列番号：３１のアミノ酸２８〜１３６と少なくとも６０％同一である配列を含む、請求項５記載の融合タンパク質。
【請求項９】
ＴＧＦ−β結合ドメインの一方または両方が配列番号：８に示す配列を含む、請求項５記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
ＴＧＦ−β結合ドメインの一方または両方が配列番号：３１のアミノ酸２８〜１２９を含む、請求項９記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
１００ｋＤａ未満の分子量を有する、請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
融合タンパク質が可溶性である、請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
ｉ）配列番号：３１に示す配列を各々有するＴＧＦ−β結合ドメイン２つ、ｉｉ）該２つのドメインを連結する９Ｇｌｙリンカー、および任意でｉｉｉ）１つ以上のアダプターアミノ酸、を含む、請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
配列番号：９のアミノ酸２４〜アミノ酸３１０に示すアミノ酸配列を含む請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
配列番号：９に示すアミノ酸配列を含む、請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
請求項１記載の融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項１７】
配列番号：１０に記載する配列を含む、請求項１６記載の核酸。
【請求項１８】
請求項１６記載の核酸を含むベクター。
【請求項１９】
請求項１６記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項２０】
哺乳類細胞である、請求項１９記載の宿主細胞。
【請求項２１】
ＣＨＯまたはＨＥＫ２９３細胞である、請求項２０記載の宿主細胞。
【請求項２２】
請求項１９記載の宿主細胞を培養する段階、および細胞培養物から融合タンパク質を回収する段階を含む、融合タンパク質の製造方法。
【請求項２３】
請求項１記載の融合タンパク質を含む医薬組成物。
【請求項２４】
哺乳類におけるＴＧＦ−β発現に関連する疾患または状態を治療するために使用する、請求項２３記載の組成物。
【請求項２５】
疾患または状態が腎臓の疾患または状態である、請求項２４記載の組成物。
【請求項２６】
腎臓の疾患または障害が糖尿病性腎症、放射線腎症、閉塞性腎症、多嚢胞性腎臓疾患、髄質海綿腎、馬蹄腎、腎炎、糸球体腎炎、腎硬化症、腎石灰症、バージャー病（ＩｇＡ腎症）、全身性高血圧、糸球体高血圧、尿細管間質性腎症、尿細管性アシドーシス、腎結核、および腎梗塞からなる群より選択される、請求項２５記載の組成物。
【請求項２７】
疾患または状態が癌である、請求項２４記載の組成物。
【請求項２８】
癌が胃癌、腸癌、皮膚癌、乳癌、甲状腺癌、黒色腫、骨癌、および肺癌からなる群より選択される、請求項２７記載の組成物。
【請求項２９】
疾患または状態が線維性または硬化性の疾患または障害である、請求項２４記載の組成物。
【請求項３０】
線維性または硬化性の疾患または障害が硬皮症、アテローム性動脈硬化症、肝線維症（ｌｉｖｅｒ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、びまん性全身硬化症、肺線維症（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、糸球体腎炎、神経瘢痕形成、皮膚瘢痕形成、肺線維症（ｌｕｎｇ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、放射線誘導線維症、肝線維症（ｈｅｐａｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、および骨髄線維症からなる群より選択される、請求項２９記載の組成物。
【請求項３１】
疾患または状態が気管支肺異形成である、請求項２４記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
本発明の方法のさらに別の態様において、ＴＧＦ−βの中和を必要とする哺乳類は線維性または硬化性の疾患または状態を有してよい。特定の実施形態においては、治療すべき線維性または硬化性の疾患または障害は硬皮症、アテローム性動脈硬化症、肝線維症（ｌｉｖｅｒ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、びまん性全身硬化症、肺線維症（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、糸球体腎炎、神経瘢痕形成、皮膚瘢痕形成、肺線維症（ｌｕｎｇ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、放射線誘導線維症、肝線維症（ｈｅｐａｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、または骨髄線維症であってよい。本発明の方法の別の態様においては、ＴＧＦ−βの中和を必要とする哺乳類は気管支肺異形成（ＢＰＤ）を有してよい。
[請求項101]
TGF-β受容体IIのTGF-β結合ドメイン2つを含む融合タンパク質であって、該結合ドメインがペプチドリンカーにより相互に連結されている、融合タンパク質。
[請求項102]
第1のTGF-β結合ドメインのC末端がリンカーにより第2のTGF-β結合ドメインのN末端に連結されている、請求項101記載の融合タンパク質。
[請求項103]
2つのドメインが同一である、請求項101記載の融合タンパク質。
[請求項104]
リンカーが50以下のアミノ酸からなる、請求項101記載の融合タンパク質。
[請求項105]
リンカーの最大計算長が65Åである、請求項104記載の融合タンパク質。
[請求項106]
リンカーが1つ以上のグリシンを含む、請求項105記載の融合タンパク質。 
[請求項107]
リンカーが9つのグリシン残基を含む、請求項105記載の融合タンパク質。
[請求項108]
TGF-β結合ドメインの一方または両方が配列番号:31のアミノ酸28〜136と少なくとも60%同一である配列を含む、請求項105記載の融合タンパク質。
[請求項109]
TGF-β結合ドメインの一方または両方が配列番号:8に示す配列を含む、請求項105記載の融合タンパク質。
[請求項110]
TGF-β結合ドメインの一方または両方が配列番号:31のアミノ酸28〜129を含む、請求項109記載の融合タンパク質。
[請求項111]
100kDa未満の分子量を有する、請求項101記載の融合タンパク質。
[請求項112]
融合タンパク質が可溶性である、請求項101記載の融合タンパク質。
[請求項113]
i)配列番号:31に示す配列を各々有するTGF-β結合ドメイン2つ、ii)該2つのドメインを連結する9Glyリンカー、および任意でiii)1つ以上のアダプターアミノ酸、を含む、請求項101記載の融合タンパク質。
[請求項114]
配列番号:9のアミノ酸24〜アミノ酸310に示すアミノ酸配列を含む請求項101記載の融合タンパク質。
[請求項115]
配列番号:9に示すアミノ酸配列を含む、請求項101記載の融合タンパク質。
[請求項116]
請求項101記載の融合タンパク質を含む医薬組成物。
[請求項117]
請求項101記載の融合タンパク質をコードする核酸。
[請求項118]
配列番号:10に記載する配列を含む、請求項117記載の核酸。
[請求項119]
請求項117記載の核酸を含むベクター。
[請求項120]
請求項117記載の核酸を含む宿主細胞。
[請求項121]
哺乳類細胞である、請求項120記載の宿主細胞。
[請求項122]
CHOまたはHEK293細胞である、請求項121記載の宿主細胞。
[請求項123]
請求項120記載の宿主細胞を培養する段階、および細胞培養物から融合タンパク質を回収する段階を含む、融合タンパク質の製造方法。
[請求項124]
請求項101記載の融合タンパク質または請求項117記載の核酸を哺乳類に投与する段階を含む、哺乳類におけるTGF-β発現に関連する疾患または状態を治療する方法。
[請求項125]
疾患または状態が腎臓の疾患または状態である、請求項124記載の方法。
[請求項126]
腎臓の疾患または障害が糖尿病性腎症、放射線腎症、閉塞性腎症、多嚢胞性腎臓疾患、髄質海綿腎、馬蹄腎、腎炎、糸球体腎炎、腎硬化症、腎石灰症、バージャー病(IgA腎症)、全身性高血圧、糸球体高血圧、尿細管間質性腎症、尿細管性アシドーシス、腎結核、および腎梗塞からなる群より選択される、請求項125記載の方法。
[請求項127]
疾患または状態が癌である、請求項124記載の方法。
[請求項128]
癌が胃癌、腸癌、皮膚癌、乳癌、および甲状腺癌からなる群より選択される、請求項127記載の方法。
[請求項129]
癌が黒色腫である、請求項127記載の方法。
[請求項130]
癌が骨癌である、請求項127記載の方法。
[請求項131]
癌が肺癌である、請求項127記載の方法。
[請求項132]
疾患または状態が線維性または硬化性の疾患または障害である、請求項124記載の方法。
[請求項133]
線維性または硬化性の疾患または障害が硬皮症、アテローム性動脈硬化症、肝線維症(liver fibrosis)、びまん性全身硬化症、肺線維症(pulmonary fibrosis)、糸球体腎炎、神経瘢痕形成、皮膚瘢痕形成、肺線維症(lung fibrosis)、放射線誘導線維症、肝線維症(hepatic fibrosis)、および骨髄線維症からなる群より選択される、請求項132記載の方法。
[請求項134]
疾患または障害が気管支肺異形成である、請求項124記載の方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2010529859000001.app
【国際調査報告】
2010529859.tif 000048
2010529859.tif 000049
2010529859.tif 000050