(57)【要約】  サンプル中の真菌の有無を試験するための方法およびキットについて開示されている。検出できる真菌の例には、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属およびニューモシスティス（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ）属に属する真菌が含まれるが、それらに限定されない。本方法は、真菌核酸の少なくとも１つの普遍的領域を含む真菌核酸を含有することが疑われるサンプルを入手するステップと、前記サンプル中の真菌核酸の少なくとも１つの普遍的領域の有無を試験するステップとを含む。サンプルは、生物学的又は非生物学的なものであってもよい。
2010523076.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の任意の真菌の有無について試験する方法であって、
真菌核酸の少なくとも１つの普遍的領域を含む真菌核酸を含有することが疑われるサンプルを入手するステップと、
前記サンプル中での真菌核酸の少なくとも１つの普遍的領域の有無を試験するステップと
を含み、
ここで、真菌核酸の前記少なくとも１つの普遍的領域は、配列番号１、５２もしくは５３、又は配列番号１、５２もしくは５３の相補体もしくは転写産物、又は配列番号１、５２もしくは５３との８０％以上の配列相同性を有する配列もしくはそれらの相補体もしくは転写産物を含む、方法。
【請求項２】
前記サンプルは、生物学的起源から入手される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記サンプルは、生体液、組織、又はそれらの組み合わせを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記サンプルは、非生物学的起源から入手される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記サンプルは、自動車、船、航空機、建造物、又は居住施設の一部を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記サンプルは、環境から入手される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記サンプルは、空気サンプル、水サンプル、土壌サンプル、又はそれらの組み合わせを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記試験するステップは、ストリンジェントな条件下で、前記サンプルを、真菌核酸の少なくとも１つの普遍的領域にハイブリダイズできる核酸を含むオリゴヌクレオチドプローブに接触させるステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記プローブは、検出可能な標識を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記プローブは、配列番号４、その相補体もしくは転写産物、又は配列番号４との９０％以上の配列相同性を有する配列もしくはそれらの相補体もしくは転写産物を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記プローブは、配列番号４４、その相補体、又は配列番号４４との９０％以上の配列相同性を有する配列もしくはその相補体を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記プローブは、配列番号４５、その相補体、又は配列番号４５との９０％以上の配列相同性を有する配列もしくはその相補体を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記サンプル中でのカンジダ属に特徴的な真菌核酸の少なくとも１つの領域の有無を試験するステップと、
ここで、カンジダ属に特徴的な真菌核酸の前記少なくとも１つの領域は、配列番号５、その相補体もしくは転写産物、又は配列番号５との８０％以上の配列相同性を有する配列、その相補体もしくは転写産物を含み、
前記サンプル中でのアスペルギルス属に特徴的な真菌核酸の少なくとも１つの領域の有無を試験するステップと、
ここで、前記アスペルギルス属に特徴的な真菌核酸の前記少なくとも１つの領域は配列番号１４、その相補体もしくは転写産物、又は配列番号５との８０％以上の配列相同性を有する配列、その相補体もしくは転写産物を含む、
をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記真菌核酸の領域を増幅するステップをさらに含む請求項１３に記載の方法であって、
ここで、前記試験するステップは、（Ａ）配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０および配列番号５１からなる群から選択される少なくとも２つの増幅プライマーと、（Ｂ）配列番号４４および配列番号４５からなる群から選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブとの使用を含む、方法。
【請求項１５】
配列番号６、配列番号７、配列番号４６および配列番号４７の配列を有する増幅プライマーと、配列番号８および配列番号１７の配列を有するオリゴヌクレオチドプローブとの使用をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
真菌核酸の少なくとも１つの普遍的領域を増幅するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記増幅ステップは、前記サンプルを１対のプライマーに接触させるステップを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記対のプライマーは、配列番号２および配列番号３を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記対のプライマーは、配列番号４８および配列番号４９を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記増幅ステップからのアンプリコンは、配列番号４４又は配列番号４５の標識オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせるステップによって検出される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記対のプライマーは、配列番号５０および配列番号５１を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記増幅ステップからのアンプリコンは、配列番号４４又は配列番号４５の標識オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせるステップによって検出される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
サンプル中のアスペルギルス属に属する真菌の有無について試験するための方法であって、
アスペルギルス属に特徴的な真菌核酸の少なくとも１つの領域を含む真菌核酸を含有すると疑われるサンプルを入手するステップと、
前記サンプル中の前記アスペルギルス属に特徴的な真菌核酸の少なくとも１つの領域の有無について試験するステップと
を含む方法。
【請求項２４】
アスペルギルス属に特徴的な真菌核酸の少なくとも１つの領域は、配列番号１４、その相補体もしくは転写産物、又は配列番号１４と８０％以上の配列相同性を有する配列、その相補体もしくは転写産物を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記試験するステップは、前記サンプルを、配列番号１７を含むプローブに接触させるステップを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記サンプルを、配列番号１５および配列番号１６を含む１対のプライマーに接触させることによって、アスペルギルス属に特徴的な真菌核酸の少なくとも１つの領域を増幅するステップをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記サンプルを、配列番号４６および配列番号４７を含む１対のプライマーに接触させることによって、アスペルギルス属に特徴的な真菌核酸の少なくとも１つの領域を増幅するステップをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記サンプル中におけるニューモシスティス・イロヴェツィイに特徴的な真菌核酸の少なくとも１つの領域の有無を試験するステップをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記試験するステップが、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１９および配列番号２０の配列を有する増幅プライマーならびに配列番号１７および配列番号２１の配列を有するオリゴヌクレオチドプローブの使用を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
サンプル中のカンジダ属に属する真菌の有無について試験するための方法であって、
カンジダ属に特徴的な真菌核酸の少なくとも１つの領域を含む真菌核酸を含有すると疑われるサンプルを入手するステップと、
前記サンプル中の真菌核酸の前記カンジダ属に特徴的な少なくとも１つの領域の有無について試験するステップと
を含む、方法。
【請求項３１】
カンジダ属に特徴的な真菌核酸の少なくとも１つの領域は、配列番号５、その相補体もしくは転写産物、又は配列番号５と８０％以上の配列相同性を有する配列、その相補体もしくは転写産物を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記試験するステップは、前記サンプルを、配列番号８を含むプローブに接触させるステップを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記サンプルを、配列番号６および配列番号７を含む１対のプライマーに接触させることによって、カンジダ属に特徴的な真菌核酸の少なくとも１つの領域を増幅するステップをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
サンプル中のニューモシスティス属に属する真菌の有無について試験するための方法であって、
ニューモシスティス属に特徴的な真菌核酸の少なくとも１つの領域を含む真菌核酸を含有すると疑われるサンプルを入手するステップと、
前記サンプル中の真菌核酸の前記ニューモシスティス属に特徴的な少なくとも１つの領域の有無について試験するステップと
を含む方法。
【請求項３５】
ニューモシスティス属に特徴的な真菌核酸の少なくとも１つの領域は、配列番号１８、その相補体もしくは転写産物、又は配列番号１８と８０％以上の配列相同性を有する配列、その相補体もしくは転写産物を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記試験するステップは、前記サンプルを、配列番号２１を含むプローブに接触させるステップを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記サンプルを、配列番号１９および配列番号２０を含む１対のプライマーに接触させることによってニューモシスティス属に特徴的な真菌核酸の少なくとも１つの領域を増幅するステップをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
サンプル中のカンジダ・トロピカリス種に属する真菌の有無について試験するための方法であって、
カンジダ・トロピカリス種に特徴的な真菌核酸の少なくとも１つの領域を含む真菌核酸を含有すると疑われるサンプルを入手するステップと、
前記サンプル中の真菌核酸の前記カンジダ・トロピカリス種に特徴的な少なくとも１つの領域の有無について試験するステップと
を含む方法。
【請求項３９】
カンジダ・トロピカリス種に特徴的な真菌核酸の少なくとも１つの領域は、配列番号３０、その相補体もしくは転写産物、又は配列番号３０と８０％以上の配列相同性を有する配列、その相補体もしくは転写産物を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記試験するステップは、前記サンプルを、配列番号３３を含むプローブに接触させるステップを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
サンプル中のカンジダ・パラプシローシス種に属する真菌の有無について試験するための方法であって、
カンジダ・パラプシローシス種に特徴的な真菌核酸の少なくとも１つの領域を含む真菌核酸を含有すると疑われるサンプルを入手するステップと、
前記サンプル中の真菌核酸の前記カンジダ・パラプシローシス種に特徴的な少なくとも１つの領域の有無について試験するステップと
を含む方法。
【請求項４２】
カンジダ・パラプシローシス種に特徴的な真菌核酸の少なくとも１つの領域は、配列番号３４、その相補体もしくは転写産物、又は配列番号３４と８０％以上の配列相同性を有する配列、その相補体もしくは転写産物を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記試験するステップは、前記サンプルを、配列番号３５を含むプローブに接触させるステップを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
サンプル中のカンジダ・アルビカンスに属する真菌の有無について試験するための方法であって、
カンジダ・アルビカンス種に特徴的な真菌核酸の少なくとも１つの領域を含む真菌核酸を含有すると疑われるサンプルを入手するステップと、
前記サンプル中の真菌核酸の前記カンジダ・アルビカンス種に特徴的な少なくとも１つの領域の有無について試験するステップと
を含む方法。
【請求項４５】
カンジダ・アルビカンス種に特徴的な真菌核酸の少なくとも１つの領域は、配列番号３６、その相補体もしくは転写産物、又は配列番号３６と８０％以上の配列相同性を有する配列、その相補体もしくは転写産物を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記試験するステップは、前記サンプルを、配列番号３７を含むプローブに接触させるステップを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
サンプル中のカンジダ・グラブラタに属する真菌の有無について試験するための方法であって、
カンジダ・グラブラタ種に特徴的な真菌核酸の少なくとも１つの領域を含む真菌核酸を含有すると疑われるサンプルを入手するステップと、
前記サンプル中の真菌核酸の前記カンジダ・グラブラタ種に特徴的な少なくとも１つの領域の有無について試験するステップと
を含む方法。
【請求項４８】
カンジダ・グラブラタ種に特徴的な真菌核酸の少なくとも１つの領域は、配列番号３８、その相補体もしくは転写産物、又は配列番号３８と８０％以上の配列相同性を有する配列、その相補体もしくは転写産物を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記試験するステップは、前記サンプルを、配列番号３９を含むプローブに接触させるステップを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
サンプル中のカンジダ・クルセイ種に属する真菌の有無について試験するための方法であって、
カンジダ・クルセイ種に特徴的な真菌核酸の少なくとも１つの領域を含む真菌核酸を含有すると疑われるサンプルを入手するステップと、
前記サンプル中の真菌核酸の前記カンジダ・クルセイ種に特徴的な少なくとも１つの領域の有無について試験するステップと
を含む方法。
【請求項５１】
カンジダ・クルセイ種に特徴的な真菌核酸の少なくとも１つの領域は、配列番号４０、その相補体もしくは転写産物、又は配列番号４０と８０％以上の配列相同性を有する配列、その相補体もしくは転写産物を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記試験するステップは、前記サンプルを、配列番号４３を含むプローブに接触させるステップを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記サンプルを、配列番号３１および配列番号３２を含む１対のプライマーと接触させることによって、カンジダ属に特徴的な真菌核酸の少なくとも１つの領域を増幅するステップをさらに含む、請求項３８、４１、４４、４７、又は５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記サンプルを、配列番号４１および配列番号４２を含む１対のプライマーに接触させるステップによって、カンジダ種に特徴的な真菌核酸の少なくとも１つの領域を増幅するステップをさらに含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５５】
前記増幅ステップは、前記サンプル中に存在する任意の真菌核酸の適切な増幅を保証するために、１つ又は複数の内部ＰＣＲ増幅対照の存在下で実施される、請求項１３に記載の方法。
【請求項５６】
前記１つ又は複数の内部ＰＣＲ増幅対照は、非真菌配列を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記増幅ステップは、阻害剤又はその他の欠陥のある増幅ステップの存在を排除するために規定量で増幅混合物に加えられる、クローニング又は合成されたｔＲＮＡ−ＬＥＵイントロン領域の存在下で実施される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記ｔＲＮＡ−ＬＥＵイントロン領域は、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）ｔＲＮＡ−ＬＥＵイントロン領域の一部分を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記トウモロコシｔＲＮＡ−ＬＥＵイントロン領域は、配列番号９を含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
配列番号１０を含む核酸の存在を検出するステップをさらに含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記検出ステップは、前記サンプルを、配列番号１１および１２を含む１対のオリゴヌクレオチドプライマーならびに配列番号１３を含むモレキュラービーコンプローブに接触させるステップを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記核酸は、ＤＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６３】
前記核酸は、ＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６４】
配列番号４を含むモレキュラービーコンプローブならびに配列番号２および配列番号３を含む１対のプライマーを含む総真菌核酸試験キット。
【請求項６５】
サンプル中のカンジダ属に特徴的な真菌核酸の少なくとも１つの領域の有無について試験するためのキットであって、配列番号８を含むモレキュラービーコンプローブならびに配列番号６および配列番号７を含む１対のプライマーを含むキット。
【請求項６６】
サンプル中のアスペルギルス属に特徴的な真菌核酸の少なくとも１つの領域の有無について試験するためのキットであって、配列番号１７を含むモレキュラービーコンプローブならびに配列番号１５および配列番号１６を含む１対のプライマーを含むキット。
【請求項６７】
サンプル中のニューモシスティス属に特徴的な真菌核酸の少なくとも１つの領域の有無について試験するためのキットであって、配列番号２１を含むモレキュラービーコンプローブならびに配列番号１９および配列番号２０を含む１対のプライマーを含むキット。
【請求項６８】
サンプル中のカンジダ種に特徴的な真菌核酸の少なくとも１つの領域の有無を試験するためのキットであって、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４３、又はそれらの組み合わせを含む１つ又は複数のモレキュラービーコンプローブならびに配列番号３１および配列番号３２、配列番号４１および配列番号４２、又は両方の対を含む１対のプライマーを含むキット。
【請求項６９】
１つ又は複数の内部ＰＣＲ増幅対照をさらに含む、請求項６４に記載のキット。
【請求項７０】
配列番号４４〜４５の配列を有する単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７１】
配列番号４６〜５１の配列を有する単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７２】
（Ａ）配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０および配列番号５１からなる群から選択される少なくとも２つの増幅プライマーと、（Ｂ）配列番号４４および配列番号４５からなる群から選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブとを含む、真菌検出キット。
【請求項７３】
配列番号６、配列番号７、配列番号４６および配列番号４７の増幅プライマーならびに配列番号８および配列番号１７のオリゴヌクレオチドプローブをさらに含む、請求項７２に記載の真菌検出キット。
【請求項７４】
（Ａ）配列番号１５、配列番号１６、配列番号１９および配列番号２０の配列を有する増幅プライマー、ならびに（Ｂ）配列番号１７および配列番号２１の配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを含む真菌検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願に関する情報］
本出願は、２００７年８月２８日に出願された米国仮特許出願第６０／９６８，４１３号明細書および２００６年１１月２日に出願された米国仮特許出願第６０／８６４，１４６号明細書、ならびに２００７年８月２８日に出願された英国特許出願第０７１６６８７．９号明細書および２００６年１１月２日に出願された英国特許出願第０６２１８６４．８号明細書に対する優先権を主張するものであり、上記特許出願の全ては全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
［発明の分野］
本発明は、サンプル中で真菌を検出することに関する。詳細には、本発明は、サンプル中での任意の真菌の迅速な検出およびサンプル中の特定の属もしくは種の真菌の迅速な検出に関する。本発明はさらに、一般に真菌の同定に関する。サンプル中の真菌の有無を試験するための方法およびキットもまた提供される。検出される真菌の例には、カンジダ属、アスペルギルス属およびニューモシスティス属に属する真菌が含まれるが、それらに限定されない。
【背景技術】
【０００３】
真菌感染症は、様々な重症患者における病的状態および死亡の重大な原因である。例えば、真菌は、免疫不全患者において表在性およびしばしば致死性の播種性感染症を引き起こすことがある。全身性真菌感染症は、白血病においてはおよそ２５％の感染関連死および肺、膵臓もしくは肝移植を受けた患者においては５〜１０％の死亡を引き起こす。後天性真菌性敗血症は、極小未熟児の１３％にまで発生することも知られている。
【０００４】
カンジダ属のメンバーは、ヒトにおける大多数の真菌感染症の原因となる。それらは、院内血流感染症の第４の原因である。しかし、他の真菌種もまたヒトにおける感染症の原因となる。アスペルギルス属のメンバーは、カンジダ属のメンバーに次いで真菌感染症の第２の原因である。しかし、マラセチア（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、フザリウム属、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、リゾープス属、ムコール属およびアブシディア（Ａｂｓｉｄｉａ）属を含む他の属は、ヒトにおける播種性感染症の原因となることがある。
【０００５】
真菌感染症が与える衝撃は、感染症を迅速に診断して効果的に治療することの失敗によってしばしば悪化する。数多くの研究は、適切な療法の遅延に病的状態および死亡の増加が結び付いていることを証明している。現在、患者における真菌の存在を検出する臨床的方法は信頼性が低く、時間がかかる。例えば、真菌感染症の検出は、通常は血液培養によって実施され、これは実施するために１〜２日間を要し、偽陰性の結果を生じさせることが多い。さらに、一部の真菌、例えばニューモシスティス属のメンバーは、容易に培養することができない。
【０００６】
特定の真菌種についての迅速な診断試験の欠如は、感染患者をうまく管理するための主要な障害の１つである。様々な種の真菌は、同一属内でさえ、共通の抗真菌剤に対する感受性が相違する。一部の種は、一部の物質に対する耐性さえ示めす。感染を引き起こす特定の真菌種についての同定は、真菌の存在を単純に検出するステップより一層長い時間がかかり、これは感染の効果的な治療をしばしばさらに遅延させる可能性がある。
【０００７】
様々な非生物学的サンプル、例えば手術液および飲料水が真菌非含有であることを確認することもまた重要である。しかし、現在は、非生物学的サンプル中の真菌又は特定の属もしくは種の真菌についての迅速な試験が欠如している。
【発明の概要】
【０００８】
本発明者らは、サンプル中の任意の真菌の有無は、ＤＮＡ分析を使用すると迅速かつ確実に決定できることを証明した。これを本明細書では総真菌検出（ｐａｎｆｕｎｇａｌ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）と呼ぶ。詳細には、本発明者らは初めて、非生物学的サンプルを対象に総真菌検出を実施できることを証明した。本発明者らは、総真菌検出のために使用できる真菌ＤＮＡの新規領域をさらに同定した。
【０００９】
本発明者らは、カンジダ属、アスペルギルス属およびニューモシスティス属に属する真菌に特異的なＤＮＡの新規領域をも同定したので、それゆえこれらの属の各々に属する真菌を検出するために使用できる。本発明者らは、マルチプレックス反応において個別又は同時のいずれかでこれらの領域を検出するために使用できる新規なプローブおよびプライマーをさらに開発した。
【００１０】
本発明者らは、カンジダ・トロピカリス種、カンジダ・パラプシローシス種、カンジダ・アルビカンス種、カンジダ・グラブラタ種およびカンジダ・クルセイ種に属する真菌を迅速に検出するための新規なプライマーおよびプローブもまた開発した。これは、多重反応において１対だけのプライマーを使用してこれら種の全部を同時に同定することを可能にする。本発明者らは、新規の内部ＰＣＲ増幅対照もまた開発した。
【００１１】
このため本発明者らは、サンプル中の任意の真菌の迅速な検出に関する。本発明は、サンプル中でのカンジダ属、アスペルギルス属又はニューモシスティス属の真菌の迅速な検出にさらに関する。本発明は、サンプル中のカンジダ・トロピカリス種、カンジダ・パラプシローシス種、カンジダ・アルビカンス種、カンジダ・グラブラタ種もしくはカンジダ・クルセイ種の真菌の迅速な検出にさらに関する。本発明は、ＤＮＡ分析を使用すると、サンプル中の真菌の存在又は属もしくは種を迅速かつ確実に決定できることを意味している。したがって、本発明は、サンプル中の任意の真菌の有無を迅速に検出するための方法であって、該サンプル中の真菌ＤＮＡの少なくとも１つの普遍的（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）領域の有無を検出するステップを含む方法を提供する。本発明は、さらに、以下を提供する。
サンプル中のカンジダ属に属する真菌の有無を迅速に検出するための方法であって、該サンプル中で配列番号５との少なくとも８０％の相同性を共有する真菌ＤＮＡの領域の有無を検出するステップを含む方法。
サンプル中のアスペルギルス属に属する真菌の有無を迅速に検出するための方法であって、該サンプル中で配列番号１４との少なくとも８０％の相同性を共有する真菌ＤＮＡの領域の有無を検出するステップを含む方法。
ヒトから入手したサンプル中のニューモシスティス属に属する真菌の有無を迅速に検出するための方法であって、該サンプル中で配列番号１８との少なくとも８０％の相同性を共有する真菌ＤＮＡの領域の有無を検出するステップを含む方法。
サンプル中のカンジダ・トロピカリス種に属する真菌の有無を迅速に検出するための方法であって、配列番号３３に示したモレキュラービーコンプローブを用いて該サンプル中で配列番号３０に示した真菌ＤＮＡの領域の有無を検出するステップを含む方法。
サンプル中のカンジダ・パラプシローシス種に属する真菌の有無を迅速に検出するための方法であって、配列番号３５に示したモレキュラービーコンプローブを用いて該サンプル中で配列番号３４に示した真菌ＤＮＡの領域の有無を検出するステップを含む方法。
サンプル中のカンジダ・アルビカンス種に属する真菌の有無を迅速に検出するための方法であって、配列番号３７に示したモレキュラービーコンプローブを用いて該サンプル中で配列番号３６に示した真菌ＤＮＡの領域の有無を検出するステップを含む方法。
サンプル中のカンジダ・グラブラタ種に属する真菌の有無を迅速に検出するための方法であって、配列番号３９に示したモレキュラービーコンプローブを用いて該サンプル中で配列番号３８に示した真菌ＤＮＡの領域の有無を検出するステップを含む方法。
サンプル中のカンジダ・クルセイ種に属する真菌の有無を迅速に検出するための方法であって、配列番号４３に示したモレキュラービーコンプローブを用いて該サンプル中で配列番号４０に示した真菌ＤＮＡの領域の有無を検出するステップを含む方法。
サンプル中の任意の真菌の有無を迅速に検出するためのキットであって、配列番号４に示したモレキュラービーコンプローブならびに配列番号２および３に示したプライマーを含むキット。
サンプル中の任意の真菌の有無を迅速に検出するためのキットであって、（ａ）配列番号４４に示したモレキュラービーコンプローブ、（ｂ）配列番号４８および５０に示したセンスプライマーの一方もしくは両方、ならびに配列番号４９および５１に示したアンチセンスプライマーの一方もしくは両方を含むキット。
サンプル中の任意の真菌の有無を迅速に検出するためのキットであって、（ａ）配列番号４５に示したモレキュラービーコンプローブ、（ｂ）配列番号４８および５０に示したセンスプライマーの一方もしくは両方、ならびに配列番号４９および５１に示したアンチセンスプライマーの一方もしくは両方を含むキットと、
サンプル中のカンジダ属に属する真菌の有無を迅速に検出するためのキットであって、配列番号８に示したモレキュラービーコンプローブならびに配列番号６および７に示したプライマーを含むキットと、
サンプル中のアスペルギルス属に属する真菌の有無を迅速に検出するためのキットであって、配列番号１７に示したモレキュラービーコンプローブならびに（ａ）配列番号１５および１６又は（ｂ）配列番号４６および４７に示したプライマーを含むキットと、
ヒトから入手したサンプル中のニューモシスティス属に属する真菌の有無を迅速に検出するためのキットであって、配列番号２１に示したモレキュラービーコンプローブならびに配列番号１９および２０に示したプライマーを含むキットと、
サンプル中のカンジダの特定種に属する真菌の有無を迅速に検出するためのキットであって、配列番号３１および３２もしくは４１および４２に示したプライマーならびに配列番号３３、３５、３７、３９および４３に示したモレキュラービーコンプローブの１つ又は複数を含むキット。
【００１２】
１つの態様では、サンプル中の任意の真菌の有無を試験するための方法であって、真菌核酸の少なくとも１つの普遍的領域を含む真菌核酸を含有すると疑われるサンプルを入手するステップと、該サンプル中の真菌核酸の該少なくとも１つの普遍的領域の有無について試験するステップとを含む方法が提供される。ある実施形態では、核酸はＤＮＡを含み、他の実施形態では、核酸はＲＮＡを含む。サンプルは、広範囲の生物学的および／又は非生物学的起源から入手されてもよい。
【００１３】
ある態様では、試験するステップは、サンプルを、ストリンジェントな条件下で真菌核酸の少なくとも１つの普遍的領域にハイブリダイズできる核酸を含むオリゴヌクレオチドプローブと接触させるステップを含む。試験するステップは、サンプルを、非ストリンジェントな条件下で真菌核酸の少なくとも１つの普遍的領域にハイブリダイズできる核酸を含むオリゴヌクレオチドプローブと接触させるステップをさらに含んでもよい。ある実施形態では、本方法は、真菌核酸の少なくとも１つの普遍的領域を増幅するステップをさらに含む。真菌核酸の普遍的領域を増幅する方法では、増幅ステップは、サンプル中に存在する任意の真菌核酸の適切な増幅を保証するために、１つ又は複数の内部ＰＣＲ増幅対照の存在下で実施されてもよい。そのような方法では、１つ又は複数の内部ＰＣＲ増幅対照は、非真菌配列を含んでもよい。
【００１４】
また別の態様では、サンプル中のカンジダ属、アスペルギルス属、もしくはニューモシスティス属などに属する真菌の有無を試験する方法が提供される。そのような方法は、当該の属に特徴的な真菌核酸の少なくとも１つの領域を含む真菌核酸を含有することが疑われるサンプルを入手するステップと、該サンプル中のその属に特徴的な真菌核酸の少なくとも１つの領域の有無を試験するステップとをさらに含んでもよい。試験するステップは、該サンプルをプローブと接触させるステップをさらに含んでもよい。そのような方法は、該サンプルを１対のプライマーと接触させるステップによってその属に特徴的な真菌核酸の少なくとも１つの領域を増幅するステップをさらに含んでもよい。
【００１５】
さらにまた別の態様では、サンプル中の例えばカンジダ・トロピカリス種、カンジダ・パラプシローシス種、カンジダ・アルビカンス種、カンジダ・グラブラタ種、および／又はカンジダ・クルセイ種などに属する真菌の有無を試験する方法が提供される。そのような方法は、当該の種に特徴的な真菌核酸の少なくとも１つの領域を含む真菌核酸を含有することが疑われるサンプルを入手するステップと、および該サンプル中のその種に特徴的な真菌核酸の少なくとも１つの領域の有無を試験するステップとをさらに含んでもよい。真菌がカンジダ種に属する上記の具現方法では、本方法は、該サンプルを１対のプライマーと接触させるステップによって該カンジダ種に特徴的な真菌核酸の少なくとも１つの領域を増幅するステップをさらに含んでもよい。
【００１６】
また別の態様では、多数の真菌核酸のための試験キットが提供される。一部の実施形態では、総真菌核酸試験キットが提供される。他の実施形態では、サンプル中のアスペルギルス属、ニューモシスティス属、もしくはカンジダの１つの種に特徴的な真菌核酸の少なくとも１つの領域の有無を試験するためのキットが提供される。また別の例では、総真菌、汎カンジダおよび総アスペルギルス標的を同時に検出するためのキットが提供される。その他のキットは、総アスペルギルス標的およびＰｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｊｉｒｏｖｅｃｉｉを検出するための試薬を含む。そのようなキットは、１つ又は複数の内部ＰＣＲ増幅対照もまた含んでよい。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】標的の存在下もしくは非存在下で、温度が上昇するにつれて総真菌のモレキュラービーコン（表１、Ｉｂ；配列番号４）から放出される蛍光のプロットを示す図である（融解曲線）。点線は、標的が存在する場合の結果を示している。実線は、標的が存在しない場合の結果を示している。
【図２】多重反応において内部対照（ＩＣ）と一緒に、カンジダ（ＰａｎＣａｎ）、アスペルギルス（ＰａｎＡｓｐ）および真菌（ＰａｎＦｕｎ）ＤＮＡの検出を示す図である。
【図３】多重反応において内部対照（ＩＣ）と一緒に、ニューモシスティス（ＰＣＰ）、アスペルギルス（ＰａｎＡｓｐ）および任意の真菌（ＰａｎＦｕｎ）ＤＮＡの検出を示す図である。
【図４】病院からの様々な水サンプル中の真菌ＤＮＡの検出を示す図である。
【図５Ａ−Ｃ】カンジダ属の様々なメンバーの１８Ｓ領域間の配列アラインメントを示す図である。Ｃｔｒｏｐは、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）である。Ｃｐａｒは、カンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）である。Ｃｄｕｂは、カンジダ・ドゥブリニエンシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ）である。Ｃａｌｂは、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）である。Ｃｇｕｉｌは、カンジダ・ギリエルモンジイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）である。Ｃｌｕｓは、カンジダ・ルシタニアエ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）である。Ｃｇｌａは、カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）である。Ｃｋｒｕは、カンジダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ）である。全８配列に及ぶ影付き囲みは、これらの全８種のカンジダ種の１８Ｓ領域の部分を増幅するプライマーを設計するために実施例において使用された領域を示している。これらの領域に対応するプライマーは、表１に配列番号３１（フォワード）および３２（リバース）として示されている。カンジダ・クルセイについての配列上の影なし囲みは、この種についての１８Ｓ領域の部分を増幅するプライマーを設計するために使用できる相違する領域に対応する。これらの領域に対応するプライマーは、表１に配列番号４１（フォワード）および４２（リバース）として示されている。１つの種の配列にしか及んでいない影付き囲みは、カンジダの特定の種について特異的である領域を示している。これらの領域（配列番号３０、３４、３６、３８および４０）は、種特異的プローブを設計するために使用できる。相違する種特異的領域を検出するために使用するモレキュラービーコンプローブは、表１に、配列番号３３、３５、３７、３９および４３に示されている。
【図６】多重反応におけるカンジダ・トロピカリスＤＮＡ（矢印を参照）の特異的検出を示す図である。
【図７】多重反応におけるカンジダ・パラプシローシスＤＮＡ（矢印を参照）の特異的検出を示す図である。
【図８】多重反応におけるカンジダ・アルビカンスＤＮＡ（矢印を参照）の特異的検出を示す図である。
【図９】多重反応におけるカンジダ・グラブラタＤＮＡ（矢印を参照）の特異的検出を示す図である。
【図１０】多重反応におけるカンジダ・クルセイＤＮＡ（矢印を参照）の特異的検出を示す図である。
【図１１】Ｃｙ（登録商標）５モノＮＨＳエステルの構造を示す図である。
【図１２】Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）の構造を示す図である。
【図１３Ａ−Ｎ】マルチプレックスパネル実験からのリアルタイムＰＣＲの結果のグラフ表示である（実施例７を参照）。
【図１４】アスペルギルス属、ニューモシスティス・イロヴェツィイ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ）および内部対照を検出するために設計された多重アッセイのためのアスペルギルスの検出限界を示す図である。
【図１５】アスペルギルス属、ニューモシスティス・イロヴェツィイ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ）および内部対照を検出するために設計されたマルチプレックスアッセイのためのニューモシスティスの検出限界を示す図である。
【００１８】
［配列の説明］
配列番号１は、実施例１〜４において検出される総真菌配列を示している。
配列番号２および３は、実施例１〜４において使用される総真菌のオリゴヌクレオチドプライマーを示している。
配列番号４は、実施例１〜４において使用される総真菌のモレキュラービーコンプローブを示している。
配列番号５は、実施例３において検出されるカンジダ特異的配列を示している。
配列番号６および７は、実施例３において使用されるカンジダのオリゴヌクレオチドプライマーを示している。
配列番号８は、実施例３において使用されるカンジダのモレキュラービーコンプローブを示している。
配列番号９は、実施例において内部対照として使用されるトウモロコシｔＲＮＡ−ＬＥＵイントロン領域の部分の配列を示している。
配列番号１０は、実施例において内部対照の一部として検出される配列番号９内の配列を示している。
配列番号１１および１２は、実施例において内部対照の一部として使用されるオリゴヌクレオチドプライマーを示している。
配列番号１３は、実施例において内部対照の一部としての配列番号１０を検出するために使用するモレキュラービーコンプローブを示している。
配列番号１４は、実施例３および４において検出されるアスペルギルス特異的配列を示している。
配列番号１５および１６は、実施例３および４において使用されるアスペルギルスのオリゴヌクレオチドプライマーを示している。
配列番号１７は、実施例３〜４において使用されるアスペルギルスのモレキュラービーコンプローブを示している。
配列番号１８は、実施例４において検出されるニューモシスティス特異的配列を示している。
配列番号１９および２０は、実施例４において使用されるニューモシスティスのオリゴヌクレオチドプライマーを示している。
配列番号２１は、実施例４において使用されるニューモシスティスのモレキュラービーコンプローブを示している。
配列番号２２は、カンジダ・トロピカリスにおける１８Ｓの配列を示している。
配列番号２３は、カンジダ・パラプシローシスにおける１８Ｓの配列を示している。
配列番号２４は、カンジダ・ドゥブリニエンシスにおける１８Ｓの配列を示している。
配列番号２５は、カンジダ・アルビカンスにおける１８Ｓの配列を示している。
配列番号２６は、カンジダ・ギリエルモンジイにおける１８Ｓの配列を示している。
配列番号２７は、カンジダ・ルシタニアエにおける１８Ｓの配列を示している。
配列番号２８は、カンジダ・グラブラタにおける１８Ｓの配列を示している。
配列番号２９は、カンジダ・クルセイにおける１８Ｓの配列を示している。
配列番号３０は、実施例６において検出されるカンジダ・トロピカリス特異的配列を示している。
配列番号３１は、全５種のカンジダ種について１８Ｓ領域の一部を増幅するために実施例６において使用されるフォワードプライマーの配列を示している。
配列番号３２は、全５種のカンジダ種について１８Ｓ領域の一部を増幅するために実施例６において使用されるリバースプライマーの配列を示している。
配列番号３３は、カンジダ・トロピカリスを特異的に検出するために実施例６において使用されるモレキュラービーコンプローブの配列を示している。
配列番号３４は、実施例６において検出されるカンジダ・パラプシローシス特異的配列を示している。
配列番号３５は、カンジダ・パラプシローシスを特異的に検出するために実施例６において使用されるモレキュラービーコンプローブの配列を示している。
配列番号３６は、実施例６において検出されるカンジダ・アルビカンス特異的配列を示している。
配列番号３７は、カンジダ・アルビカンスを特異的に検出するために実施例６において使用されるモレキュラービーコンプローブの配列を示している。
配列番号３８は、実施例６において検出されるカンジダ・グラブラタ特異的配列を示している。
配列番号３９は、カンジダ・グラブラタを特異的に検出するために実施例６において使用されるモレキュラービーコンプローブの配列を示している。
配列番号４０は、実施例６において検出されるカンジダ・クルセイ特異的配列を示している。
配列番号４１は、カンジダの全５種について１８Ｓ領域の一部を増幅するために使用できるフォワードプライマーの配列を示している。
配列番号４２は、カンジダの全５種について１８Ｓ領域の一部を増幅するために使用できるリバースプライマーの配列を示している。
配列番号４３は、カンジダ・クルセイを特異的に検出するために実施例６において使用されるモレキュラービーコンプローブの配列を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本明細書に開示した方法の様々な用途は、当分野における特定の必要に合わせて調整できることを理解されたい。さらに、本明細書で使用する用語は、本発明の特定の実施形態を記載することだけを目的としているもので、限定することは意図されていないことを理解されたい。
【００２０】
さらに、本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される単数形「１つの」および「その」には、その内容が他のことを明確に指示しない限り複数対象が含まれる。そこで例えば、「１つの方法」との言及には「複数の方法」が含まれ、「１つのプローブ」との言及には２つ以上のそのようなプローブが含まれ、「１つの標識」には２つ以上のそのような標識が含まれ、「真菌」との言及には２つ以上の真菌が含まれる。
【００２１】
本明細書で言及した全刊行物、特許および特許出願は、上記のものもと下記のものも、参照することにより全体が本明細書に組み込まれる。
【００２２】
本発明は、一般に、サンプル中での１つの真菌もしくは２つ以上の真菌の迅速な検出および同定に関する。本発明は、サンプル中の任意の真菌の迅速な検出（総真菌検出）を可能にする。本発明は、好ましい実施形態において、カンジダ属、アスペルギルス属もしくはニューモシスティス属に属する真菌の迅速な検出および同定を可能にする。本発明のさらにまた好ましい実施形態では、カンジダ・トロピカリス種、カンジダ・パラプシローシス種、カンジダ・アルビカンス種、カンジダ・グラブラタ種およびカンジダ・クルセイ種に属する真菌を迅速に検出および同定するための方法が提供される。
【００２３】
［本発明の選択された実施形態の説明］
１つの態様では、サンプル中の任意の真菌の有無について試験する方法であって、真菌核酸の少なくとも１つの普遍的領域を含む真菌核酸を含有すると疑われるサンプルを入手するステップと、および該サンプル中の真菌核酸の該少なくとも１つの普遍的領域の有無について試験するステップとを含む方法が提供される。ある実施形態では、核酸はＤＮＡを含み、他の実施形態では、核酸はＲＮＡを含む。
【００２４】
サンプルは、生物学的もしくは非生物学的起源から入手できる。例えば、生物学的起源サンプルは、生体液、組織、又はそれらの任意の２つ以上の組み合わせを含んでもよい。非生物学的起源は、環境から入手されるサンプルを含んでよいが、それらに限定されない。例えば、一部の非生物学的起源は、空気サンプル、水サンプル、土壌サンプル、又はそれらの組み合わせを含んでよい。非生物学的起源は、自動車、船、航空機、建造物、もしくは居住施設の一部をさらに含んでもよい。
【００２５】
ある実施態様による方法では、真菌核酸の少なくとも１つの普遍的領域は、配列番号１、その相補体もしくは転写産物、又は配列番号１と８０％以上の配列相同性を有する配列、その相補体もしくは転写産物を含む。他の実施形態では、真菌核酸の少なくとも１つの普遍的領域は、配列番号１、その相補体もしくは転写産物、又は配列番号１と９０％以上の配列相同性を有する配列、その相補体もしくは転写産物を含む。
【００２６】
ある実施態様による方法では、試験するステップは、サンプルを、ストリンジェントな条件下で真菌核酸の少なくとも１つの普遍的領域にハイブリダイズできる核酸を含むオリゴヌクレオチドプローブと接触させるステップを含む。試験するステップは、サンプルを、非ストリンジェントな条件下で真菌核酸の少なくとも１つの普遍的領域にハイブリダイズできる核酸を含むオリゴヌクレオチドプローブと接触させるステップをさらに含んでもよい。そのような方法では、オリゴヌクレオチドプローブは、検出可能な標識をさらに含んでよい。他のそのような方法では、プローブは、配列番号４、その相補体もしくは転写産物、又は配列番号４との９０％以上の配列相同性を有する配列、その相補体もしくは転写産物を含む。
【００２７】
本明細書の実施態様による方法は、真菌核酸の少なくとも１つの普遍的領域を増幅するステップをさらに含んでもよい。例えば、増幅ステップは、サンプルを、配列番号２および配列番号３などであるがそれらに限定されない１対のプライマーと接触させるステップを含んでもよい。
【００２８】
真菌核酸の普遍的領域を増幅する方法では、増幅ステップは、サンプル中に存在する任意の真菌核酸の適切な増幅を保証するために１つ又は複数の内部ＰＣＲ増幅対照の存在下で実施されてもよい。そのような方法では、１つ又は複数の内部ＰＣＲ増幅対照は、非真菌配列を含んでよい。他のそのような方法では、増幅ステップは、阻害剤もしくはその他の欠陥のある増幅ステップの存在を排除するために、規定量で増幅混合物に加えられる、クローニングもしくは合成されたｔＲＮＡ−ＬＥＵイントロン領域の存在下で実施できる。その実施態様による方法において使用されるｔＲＮＡ−ＬＥＵイントロン領域は、例えば、配列番号９を含むがそれには限定されないトウモロコシｔＲＮＡ−ＬＥＵイントロン領域の一部分を含んでもよい。一部のそのような実施態様による方法では、本方法は、配列番号１０を含む核酸の存在を検出するステップをさらに含む。他のそのような実施態様による方法では、検出ステップは、サンプルを、配列番号１１および１２を含む１対のオリゴヌクレオチドプライマーならびに配列番号１３を含むモレキュラービーコンプローブと接触させるステップを含む。
【００２９】
また別の態様では、サンプル中のカンジダ属に属する真菌の有無を試験するための方法が提供される。そのような方法は、カンジダ属に特徴的な真菌核酸の少なくとも１つの領域を含む真菌核酸を含有することが疑われるサンプルを入手するステップと、該サンプル中のカンジダ属に特徴的な真菌核酸の少なくとも１つの領域の有無を試験するステップとをさらに含む。一部の実施形態では、カンジダ属に特徴的な真菌核酸の少なくとも１つの領域は、配列番号５、その相補体もしくは転写産物、又は配列番号５と８０％以上の配列相同性を有する配列、その相補体もしくは転写産物を含む。
【００３０】
他の実施形態では、試験するステップは、サンプルを、配列番号８を含むプローブと接触させるステップを含む。一部のそのような実施形態では、本方法は、サンプルを、配列番号６および配列番号７を含む１対のプライマーと接触させるステップによってカンジダ属に特徴的な真菌核酸の少なくとも１つの領域を増幅するステップをさらに含む。
【００３１】
また別の態様では、サンプル中のアスペルギルス属に属する真菌の有無について試験するための方法であって、アスペルギルス属に特徴的な真菌核酸の少なくとも１つの領域を含む真菌核酸を含有すると疑われるサンプルを入手するステップと、該サンプル中の真菌核酸の該アスペルギルス属に特徴的な少なくとも１つの領域の有無について試験するステップとを含む方法が提供される。
【００３２】
ある実施形態では、アスペルギルス属に特徴的な真菌核酸の少なくとも１つの領域は、配列番号１４、その相補体もしくは転写産物、又は配列番号１４と８０％以上の配列相同性を有する配列、その相補体もしくは転写産物を含む。一部のそのような方法では、試験するステップは、サンプルを、配列番号１７を含むプローブと接触させるステップを含む。そのような方法は、該サンプルを、配列番号１５および配列番号１６を含む１対のプライマーと接触させるステップによってアスペルギルス属に特徴的な真菌核酸の少なくとも１つの領域を増幅するステップをさらに含んでもよい。
【００３３】
さらにまた別の態様では、サンプル中のニューモシスティス属に属する真菌の有無について試験するための方法であって、ニューモシスティス属に特徴的な真菌核酸の少なくとも１つの領域を含む真菌核酸を含有すると疑われるサンプルを入手するステップと、該サンプル中の真菌核酸の該ニューモシスティス属に特徴的な少なくとも１つの領域の有無について試験するステップとを含む方法が提供される。
【００３４】
ある実施態様による方法では、ニューモシスティス属に特徴的な真菌核酸の少なくとも１つの領域は、配列番号１８、その相補体もしくは転写産物、又は配列番号１８と８０％以上の配列相同性を有する配列、その相補体もしくは転写産物を含む。一部のそのような方法では、試験するステップは、サンプルを、配列番号２１を含むプローブと接触させるステップを含む。一部のそのような方法は、該サンプルを、配列番号１９および配列番号２０を含む１対のプライマーと接触させるステップによってニューモシスティス属に特徴的な真菌核酸の少なくとも１つの領域を増幅するステップをさらに含んでよい。
【００３５】
さらにまた別の態様では、サンプル中のカンジダ・トロピカリス種に属する真菌の有無について試験するための方法であって、カンジダ・トロピカリス種に特徴的な真菌核酸の少なくとも１つの領域を含む真菌核酸を含有すると疑われるサンプルを入手するステップと、該サンプル中の真菌核酸の該カンジダ・トロピカリス種に特徴的な少なくとも１つの領域の有無について試験するステップとを含む方法が提供される。ある実施態様による方法では、カンジダ・トロピカリス種に特徴的な真菌核酸の少なくとも１つの領域は、配列番号３０、その相補体もしくは転写産物、又は配列番号３０と８０％以上の配列相同性を有する配列、その相補体もしくは転写産物を含む。試験するステップは、該サンプルを、配列番号３３を含むプローブと接触させるステップを含んでもよい。
【００３６】
さらにまた別の態様では、サンプル中のカンジダ・パラプシローシス種に属する真菌の有無について試験するための方法であって、カンジダ・パラプシローシス種に特徴的な真菌核酸の少なくとも１つの領域を含む真菌核酸を含有すると疑われるサンプルを入手するステップと、該サンプル中の真菌核酸の該カンジダ・パラプシローシス種に特徴的な少なくとも１つの領域の有無について試験するステップとを含む方法が提供される。ある実施態様による方法では、カンジダ・パラプシローシス種に特徴的な真菌核酸の少なくとも１つの領域は、配列番号３４、その相補体もしくは転写産物、又は配列番号３４と８０％以上の配列相同性を有する配列、その相補体もしくは転写産物を含む。一部のそのような方法では、試験するステップは、サンプルを、配列番号３５を含むプローブと接触させるステップを含んでもよい。
【００３７】
さらにまた別の態様では、サンプル中のカンジダ・アルビカンス種に属する真菌の有無について試験するための方法であって、カンジダ・アルビカンス種に特徴的な真菌核酸の少なくとも１つの領域を含む真菌核酸を含有すると疑われるサンプルを入手するステップと、該サンプル中の真菌核酸の該カンジダ・アルビカンス種に特徴的な少なくとも１つの領域の有無について試験するステップとを含む方法が提供される。ある実施態様による方法では、カンジダ・アルビカンス種に特徴的な真菌核酸の少なくとも１つの領域は、配列番号３６、その相補体もしくは転写産物、又は配列番号３６と８０％以上の配列相同性を有する配列、その相補体もしくは転写産物を含む。一部のそのような方法では、試験するステップは、サンプルを、配列番号３７を含むプローブと接触させるステップを含んでもよい。
【００３８】
また別の態様では、サンプル中のカンジダ・グラブラタ種に属する真菌の有無について試験するための方法であって、カンジダ・グラブラタ種に特徴的な真菌核酸の少なくとも１つの領域を含む真菌核酸を含有すると疑われるサンプルを入手するステップと、該サンプル中の真菌核酸の該カンジダ・グラブラタ種に特徴的な少なくとも１つの領域の有無について試験するステップとを含む方法が提供される。一部の具現方法では、カンジダ・グラブラタ種に特徴的な真菌核酸の少なくとも１つの領域は、配列番号３８、その相補体もしくは転写産物、又は配列番号３８と８０％以上の配列相同性を有する配列、その相補体もしくは転写産物を含む。一部のそのような方法では、試験するステップは、サンプルを、配列番号３９を含むプローブと接触させるステップを含んでよい。
【００３９】
さらにまた別の態様では、サンプル中のカンジダ・クルセイ種に属する真菌の有無について試験するための方法であって、カンジダ・クルセイ種に特徴的な真菌核酸の少なくとも１つの領域を含む真菌核酸を含有すると疑われるサンプルを入手するステップと、該サンプル中の真菌核酸の該カンジダ・クルセイ種に特徴的な少なくとも１つの領域の有無について試験するステップとを含む方法が提供される。ある実施態様による方法では、カンジダ・クルセイ種に特徴的な真菌核酸の少なくとも１つの領域は、配列番号４０、その相補体もしくは転写産物、又は配列番号４０と８０％以上の配列相同性を有する配列、その相補体もしくは転写産物を含む。そのような方法では、試験するステップは、サンプルを、配列番号４３を含むプローブと接触させるステップを含んでもよい。
【００４０】
真菌がカンジダ種に属する上記の具現方法では、本方法は、該サンプルを、配列番号３１、配列番号３２、配列番号４１、および配列番号４２を含む１対のプライマーと接触させるステップによって該カンジダ種に特徴的な真菌核酸の少なくとも１つの領域を増幅するステップをさらに含んでもよい。
【００４１】
他の態様では、本方法は、様々な真菌の有無について同時に試験するための多重反応において使用できる。以下に記載する１つ又は複数の総真菌検出法は、以下に記載する１つ又は複数の属検出法および／又は以下に記載する種検出法を用いて多重反応において同時に実施できる。同様に、以下に記載する１つ又は複数の属検出法は、以下に記載する１つ又は複数の種検出法を用いて多重反応において同時に実施できる。例えば、本方法は、真菌、一般にはニューモシスティス、アスペルギルス、ならびに内部対照の存在についてサンプルを同時に評価するために使用できる。また別の実施例では、本方法は、サンプル中でアスペルギルス属、ニューモシスティス・イロヴェツィイおよび内部対照を同時に検出するために使用できる。
【００４２】
多数の真菌核酸を使用するための試験キットもまた提供される。一部の実施形態では、配列番号４を含むモレキュラービーコンプローブならびに配列番号２および配列番号３を含む１対のプライマーを含む総真菌核酸試験キットが提供される。他の実施形態では、サンプル中のカンジダ属に特徴的な真菌核酸の少なくとも１つの領域の有無について試験するためのキットであって、配列番号８を含むモレキュラービーコンプローブならびに配列番号６および配列番号７を含む１対のプライマーを含むキットが提供される。
【００４３】
さらに他の実施形態では、サンプル中のアスペルギルス属に特徴的な真菌核酸の少なくとも１つの領域の有無について試験するためのキットであって、配列番号１７を含むモレキュラービーコンプローブならびに配列番号１５および配列番号１６を含む１対のプライマーを含むキットが提供される。
【００４４】
さらに他の実施形態では、サンプル中のニューモシスティス属に特徴的な真菌核酸の少なくとも１つの領域の有無について試験するためのキットであって、配列番号２１を含むモレキュラービーコンプローブならびに配列番号１９および配列番号２０を含む１対のプライマーを含むキットが提供される。
【００４５】
さらに他の実施形態では、サンプル中のカンジダ種に特徴的な真菌核酸の少なくとも１つの領域の有無を試験するためのキットであって、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４３、もしくはそれらの組み合わせを含む１つ又は複数のモレキュラービーコンプローブならびに配列番号３１および配列番号３２、配列番号４１および配列番号４２、又は両方の対を含む１対のプライマーを含むキットが提供される。そのようなキットは、１つ又は複数の内部ＰＣＲ増幅対照もまた含んでもよい。
【００４６】
＜総真菌検出法＞
本発明は、サンプル中の任意の真菌の有無を迅速に検出するための方法を提供する。本明細書ではこれを総真菌検出法と呼ぶ。総真菌検出法は、サンプルが任意の真菌を含むか否かを決定するステップを含む。このため本方法は、任意の真菌門、任意の真菌属又は任意の真菌種に属する真菌を含むか否かを決定するステップを含む。本方法は、任意の真菌と関連付けて使用できる。真菌は、５つの真菌門である、ツボカビ門、接合菌門、グロムス菌門、子嚢菌門又は担子菌門のいずれかに属する可能性がある。真菌は、糸状菌、酵母菌、黒穂菌又は茸であってもよい。真菌は、好ましくはヒト又は動物を感染させることのできる真菌である。真菌は、任意の真菌属に属する可能性がある。真菌は、好ましくはカンジダ属、アスペルギルス属、ニューモシスティス属、クリプトコッカス属、ブラストミセス属、コクシジオイデス属、パラコクシジオイデス属、ペニシリウム属、ムコール属、セドポリウム属、サッカロミセス属、ヒストプラズマ属、フザリウム属、ペシロミセス属、トリコスポロン属、アクレモニウム属、リゾープス属、リゾムコール属、ムコール属、クニンガメラ属、Ｍａｌｅｚｚｅｓｉａ属、ブラストシゾミセス（Ｂｌａｓｔｏｓｃｈｉｚｏｍｙｃｅｓ）属、セドスポリウム属、ゲオトリクム属、白癬菌属、エクソフィアラ属、エキセロヒラム属、フォンセセア属、クラドスポリウム属、クルブラリア属、バシジオボーラス（Ｂａｓｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）属、アウレオバシジウム属、スエヒロタケ属、スポロトリクス属、スコプラリオプシス属もしくはアブシディア属に属する。真菌は、任意の真菌種に属する可能性がある。真菌は、以下に例示する種のいずれかに属する可能性がある。
【００４７】
総真菌検出法は、サンプルの真菌含有状態の指標を提供する。本方法は、サンプル中に存在する１つ又は複数の真菌が存在すること、又はサンプル中に真菌が全く存在しないことのいずれかを示す。本方法は、特定の真菌属又は特定の真菌種について試験する必要を伴わずに、サンプル中の真菌の検出を可能にする。
【００４８】
総真菌検出法は、任意のサンプルを対象に実施できる。１つの実施形態では、サンプルは、非生物学的サンプルである。以下では、特定タイプのサンプルについてより詳細に考察する。総真菌検出法は、典型的には、その真菌含有状態が既知ではないサンプルを対象に実施される。これを言い換えると、総真菌検出法は、典型的にはサンプルが真菌を含有するか否かが不明である場合に実施される。総真菌検出法は、好ましくは、真菌を含有することが疑われるサンプルを対象に実施される。本方法は、真菌の存在を確証するために、真菌を含有することが既知であるサンプルを対象に実施することができる。
【００４９】
本総真菌検出法は、サンプル中の真菌ＤＮＡの少なくとも１つの普遍的領域の有無を検出するステップを含む。サンプル中の普遍的領域の存在は、サンプル中の真菌の存在の指標である。サンプルからの普遍的領域の非存在は、そのサンプル中の真菌の非存在の指標である。本方法は、１、２、３、４、５、１０、１５、２０以上の普遍的領域を検出するステップを含んでよい。真菌ＤＮＡの普遍的領域（以下では「普遍的領域」）は、全真菌のゲノム内に存在するＤＮＡの領域である。普遍的領域は、任意の他の有機体、詳細には例えば細菌もしくはウイルスなどの微生物中には存在しない。例えば、普遍的領域は、全ての真菌中には存在するが、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）および黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）中には存在しないＤＮＡの領域である。真菌ＤＮＡの領域は、真菌のゲノム内のＤＮＡ配列である。その領域は、遺伝子の一部、例えばイントロン、エクソンもしくはその一部であってもよい。又は、その領域は１つ又は複数の遺伝子の一部を組み込むことができる。
【００５０】
普遍的領域は、典型的には長さが少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも７５又は少なくとも１００ヌクレオチドである。例えば、普遍的領域は、長さが５〜２００、７〜１００又は１０〜５０ヌクレオチドであってもよい。この領域は、好ましくは、長さが５、１０、１５、２０、２５、３０、３５又は４０ヌクレオチドである。
【００５１】
ある実施形態では、普遍的領域だけが検出される。また別の実施形態では、普遍的配列がより大きな配列の一部として検出される。例えば、普遍的領域は、普遍的領域の５’末端、３’末端もしくは５’および３’末端の両方でフランキング配列を有する配列の一部として検出できる。フランキング配列は、長さが少なくとも１、少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも７５又は少なくとも１００ヌクレオチドであってもよい。例えば、フランキング領域は、長さが１〜１００、５〜５０又は１０〜２０ヌクレオチドであってもよい。
【００５２】
普遍的領域は、好ましくは１８Ｓ領域の一部である。
【００５３】
普遍的領域は、好ましくは、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％の相同性もしくは配列同一性を共有する配列である。普遍的領域は、一層より好ましくは配列番号１と同一の配列である。
【００５４】
また別の実施形態では、本総真菌検出法は、サンプル中の少なくとも以下の真菌：Ｇｙｍｎｏｐｕｓ  ｓｐｐ．、Ｒｈｏｄｏｃｏｌｌｙｂｉａ  ｂｕｔｙｒａｃｅａ、ニガクリタケ（Ｈｙｐｈｏｌｏｍａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｅ）、サッカロミセス・セレビジエ、塊茎種（Ｔｕｂｅｒ  ｓｐｐ．）、Ｂｏｔｈｉａ  ｃａｓｔａｎｅｌｌａ、根圏種（Ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ  ｓｐｐ．）、Ｈｅｒｐｏｔｒｉｃｈｉｅｌｌａｃｅａｅ  ｓｐｐ．、アナイボゴケ種（Ｖｅｒｒｕｃａｒｉａｃｅａｅ  ｓｐｐ．）、Ｍａｒｃｈａｎｄｉｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．、Ｍｉｎｉｍｅｄｕｓａ  ｓｐｐ．、Ｍａｒｃｈａｎｄｉｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ、Ｍａｒｃｈａｎｄｉｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｒａｌｌｉｎｕｓ、Ｍａｒｃｈａｎｄｉｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｇｎｉｃｏｌａ、Ｂｕｒｇｏａ  ｓｐｐ．、Ａｔｈｅｌｉａ  ａｒａｃｈｎｏｉｄｅａ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ａｌｔｅｒｎａｔａ、アルテルナリア種（Ａｌａｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｐｐ．）、ヤマドリタケ（Ｂｏｌｅｔｕｓ  ｅｄｕｌｉｓ）、アカエノキンチャヤマイグチ（Ｌｅｃｃｉｎｕｍ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ）、カワラタケ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、ホウロクタケ種（Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｓｐｐ．）、Ｓｙｍｐｏｄｉｏｍｙｃｏｐｓｉｓ  ｓｐｐ．）、コガネエイランタイ（Ｆｌａｖｏｃｅｔｒａｖｉａ  ｎｉｖａｌｉｓ）、アムペロミセス種（Ａｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）、Ｇｙｍｎｏｐｕｓ  ｂｉｆｏｒｍｉｓ、Ｇｙｍｎｏｐｕｓ  ｓｐｐ．、Ｇｙｍｎｏｐｕｓ  ｃｏｎｆｌｕｅｎｓ、Ｇｙｍｎｏｐｕｓ  ｓｐｏｎｇｉｏｓｕｓ、Ｃｏｌｌｙｂｉａ  ｒｅａｄｉｉ、Ｍａｒａｓｍｉｅｌｌｕｓ  ｓｔｅｎｏｐｈｙｌｌｕｓ、Ｍａｒａｓｍｉｅｌｌｕｓ  ｒａｍｅａｌｉｓ、Ｍａｒａｓｍｉｕｓ  ｓｃｏｒｏｄｏｎｉｕｓ、Ｃｏｌｌｙｂｉａ  ｍａｒａｓｍｉｏｉｄｅｓ、Ｍｉｃｒｏｍｐｈａｌｅ  ｂｒａｓｓｉｃｏｌｅｎｓ、Ｃａｒｉｐｉａ  ｍｏｎｔａｇｎｅｉ、Ｒｈｏｄｏｃｏｌｌｙｂｉａ  ｓｐｐ．、Ａｎｔｈｒａｃｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｌａｔｅｒｉｔｉｕｍ、Ａｎｔｈｒａｃｏｐｈｙｌｌｕｍ  ａｒｃｈｅｒｉ、Ａｎｔｈｒａｃｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｓｐｐ．、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｓｐｐ．、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、アスペルギルス・フミガータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、アカゲシメジ（Ｔｒｉｃｈｏｌｏｍａ  ｉｍｂｒｉｃａｔｕｍ）、キシメジ（Ｔｒｉｃｈｏｌｏｍａ  ｆｌａｖｏｖｉｒｅｎｓ）、Ｔｏｍｅｎｔｅｌｌａ  ｓｕｂｌｉｌａｃｉｎａ、ショウロ種（Ｒｈｉｚｏｐｏｇｏｎ  ｓｐｐ．）、キツネタケ種（Ｌａｃｃａｒｉａ  ｓｐｐ．）、アセタケ種（Ｉｎｏｃｙｂｅ  ｓｐｐ．）、ワカフサタケ種（Ｈｅｂｅｌｏｍａ  ｓｐｐ．）、フウセンタケ種（Ｃｏｒｔｉｎａｒｉｕｓ  ｓｐｐ．）、カレエダタケ種（Ｃｌａｖｕｌｉｎａ  ｓｐｐ．）、アワタケ種（Ｘｅｒｏｃｏｍｕｓ  ｓｐｐ．）、テングタケ種（Ａｍａｎｉｔａ  ｓｐｐ．）、ユーロチウム・ヘルバリオラム（Ｅｕｒｏｔｉｕｍ  ｈｅｒｂａｒｉｏｒｕｍ）、Ｅｄｙｕｉｌｌｉａ  ａｔｈｅｃｉａ、Ｗａｒｃｕｐｉｅｌｌａ  ｓｐｉｎｕｌｏｓａ、Ｈｅｍｉｃａｒｐｅｎｔｅｌｅｓ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ、Ｈｅｍｉｃａｒｐｅｎｔｅｌｅｓ  ａｃａｎｔｈｏｓｐｏｒｕｓ、Ｈｅｍｉｃａｒｐｅｎｔｅｌｅｓ  ｓｐｐ．、Ｃｈａｅｔｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｃｒｅｍｅａ、ペテロミセス種（Ｐｅｔｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）、Ｇｒａｐｈｉｕｍ  ｔｅｃｔｏｎａｅ、Ｄｉｐｌｏｌａｉｍｅｌｌｏｉｄｅｓ  ｓｐｐ．、ラブドライムス種（Ｒｈａｂｄｏｌａｉｍｕｓ  ｓｐｐ．）、Ｈｏｈｅｎｂｕｅｈｅｌｉａ  ｐｅｔａｌｏｄｅｓ、イネ科炭疽病菌（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｒｂｏｒｉｆｏｒｍｉｓ、クリプトコッカス・ネルフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、クリプトコッカス種（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、Ｇａｍｓｙｌｅｌｌａ  ｐａｒｖｉｃｏｌｌｉｓ、Ｍｏｎａｃｒｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｈａｐｔｏｔｙｌｕｍ、Ｍｏｎａｃｒｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｉｃｈｕａｎｅｎｓｅ、モナクロスポリウム種（Ｍｏｎａｃｒｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、Ｍｏｎａｃｒｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｇｅｐｈｙｒｏｐａｇｕｍ、モナクロスポリウム種（Ｍｏｎａｃｒｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒｅｌｌａ  ｃｏｅｌｏｂｒｏｃｈａ、Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒｅｌｌａ  ｄａｃｔｙｌｏｉｄｅｓ、Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ  ｍｕｓｉｆｏｒｍｉｓ、アルスロボトリス・フラグランス（Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ  ｆｌａｇｒａｎｓ）、Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ  ｈｅｒｔｚｉａｎａ、アルスロボトリス・オリゴスポラ（Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ  ｏｌｉｇｏｓｐｏｒａ）、アルスロボトリス・ベルミコラ（Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ  ｖｅｒｍｉｃｏｌａ）、アルスロボトリス種（Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ  ｓｐｐ．）、Ｍｏｎａｃｒｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｄｒｅｃｈｓｌｅｒｉ、Ｖｅｒｍｉｓｐｏｒａ  ｓｐｐ．）、Ｐｓｅｕｄｏｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ  ｂｏｙｄｉｉ（Ｓｃｅｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ａｐｉｏｓｐｅｒｍｕｍ）、Ｓｃｅｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｉｎｆｌａｔｕｍ、ゲオスミチア種（Ｇｅｏｓｍｉｔｈｉａ  ｓｐｐ．）、イチゴ炭疽病菌（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ  ｃｉｎｇｕｌａｔａ）、ロフォデルミウム・ピセアエ（Ｌｏｐｈｏｄｅｒｍｉｕｍ  ｐｉｃｅａｅ）、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ａｓｉａｔｉｃｕｍ、フザリウム種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｅｒｙｎｇｉｉ、Ｃｉｎｔｒａｃｔｉａ  ｓｏｒｇｈｉ−ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｃａｎｔｈａｒｏｃｙｂｅ  ｇｒｕｂｅｒｉ種、Ｂｏｕｒｄｏｔｉａ  ｓｐｐ．、Ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａ  ｓｐｐ．、Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｂａｒｔｈｏｌｏｍａｅｉ、プクキニア種（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｓｐｐ．）、Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ  ｐｈａｓｅｏｌｏｒｕｍ、Ｍｅｌａｎｃｏｎｉｓ  ｓｔｉｌｂｏｓｔｏｍａ、Ｘｙｌａｒｉａ  ｓｐｐ．、トリコフィトン・エクイヌム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｅｑｕｉｎｕｍ）、トリコフィトン・トンスランス（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｔｏｎｓｕｒａｎ��）、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｕｍ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｕｍ  ｒｕｂｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｕｍ  ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｕｍ  ｓｃｈｏｅｎｌｅｉｎｉｉ、トリコフィトン種（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｓｐｐ．）、Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌｕｍ  ａｇａｒｉｃｏｉｄｅｓ、Ｃｅｎｏｃｏｃｃｕｍ  ｇｅｏｐｈｉｌｕｍ、ヒョウタケ種（Ｈｅｌｏｔｉａｌｅｓ  ｓｐｐ．）、Ｒｈｉｚｏｓｃｙｐｈｕｓ  ｅｒｉｃａｅ、Ｌａｃｔａｒｉｕｓ  ｐｕｂｅｓｃｅｎｓ、Ｌａｃｔａｒｉｕｓ  ｓｐｐ．、Ｐｉｌｏｄｅｒｍａ  ｆａｌｌａｘ、ヌメリイグチ（Ｓｕｉｌｌｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）、ベニテンダケ（Ａｍａｎｉｔａ  ｍｕｓｃａｒｉａ）、キシメジ種（Ｔｒｉｃｈｏｌｏｍａ  ｓｐｐ．）、Ｌａｃｃａｒｉａ  ｃｆ．  ｂｉｃｏｌｏｕｒ、カワムラフウセンタケ（Ｃｏｒｔｉｎａｒｉｕｓ  ｐｕｒｐｕｒａｓｃｅｎｓ）、セイリディウム種（Ｓｅｉｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．）、Ａｐｉｏｓｐｏｒａ  ｍｏｎｔａｇｎｅｉ、ムラサキウロコタケ（Ｃｈｏｎｄｒｏｓｔｅｒｅｕｍ  ｐｕｂｅｓｃｅｎｓ）、Ｂｏｔｒｙｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｓｕｂｃｏｒｏｎａｔｕｍ、トゲミノヒメイグチ（Ｂｏｌｅｔｅｌｌｕｓ  ｓｃｈｉｃｈｉａｎｕｓ）、キクバナイグチ種（Ｂｏｌｅｔｅｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｆａｒｉｎｏｓｅ、ヒポクレア種（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｓｐｐ．）、Ｓａｒｃｏｓｔｒｏｍａ  ｒｅｓｔｉｏｎｉｓ、Ｓａｒｃｏｓｔｒｏｍａ  ｓｐｐ．、Ｔｒｕｎｃａｔｅｌｌａ  ｂｅｔｕｌａｅ、クビキレガイ種（Ｔｒｕｎｃａｔｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ  ｍａｔｉｌｄａｅ、Ｐａｒａｃｏｎｉｏｔｈｙｒｉｕｍ  ｓｐｐ．、フォーマ種（Ｐｈｏｍａ  ｓｐｐ．）、クニンガメラ・バイニエリ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ  ｂａｉｎｉｅｒｉ）、クニンガメラ・ベルトレチアエ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ  ｂｅｒｔｈｏｌｌｅｔｉａｅ）、アンズダケ（Ｃａｎｔｈａｒｅｌｌｕｓ  ｃｉｂａｒｉｕｓ）、アピオスポラ・バンブサエ（Ａｐｉｏｓｐｏｒａ  ｂａｍｂｕｓａｅ）、アピオスポラ種（Ａｐｉｏｓｐｏｒａ  ｓｐｐ．）、Ｄｉｓｃｏｓｔｒｏｍａ  ｂｏｔａｎ、Ｃｅｒｃｏｐｈｏｒａ  ｃａｕｄａｔｅ、Ｇｎｏｍｏｎｉａ  ｒｉｂｉｃｏｌａ、Ｆａｕｒｅｌｉｎａ  ｅｌｏｎｇａｔｅ、Ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａ  ｆｕｎｇｉ、Ｇｅｏｍｙｃｅｓ  ｐａｎｎｏｒｕｍ、ヒトヨタケ種（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ｓｐｐ．）、アクレモニウム種（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｓｐｐ．）、Ｃｌｏｎｅｓｔａｃｈｙｓ  ｓｐｐ．、株枯病菌（Ｐｈｏｍａ  ｅｕｐｙｒｅｎａ）、Ｔｅｔｒａｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐｐ．、モルティエラ種（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、Ｔｕｌａｓｎｅｌｌａ  ｃａｌｏｓｐｏｒａ、Ｅｐｕｌｏｒｈｉｚａ  ｓｐｐ．、Ｔｕｌａｓｎｅｌｌａ  ｃａｌｏｓｐｏｒａ、Ａｎｔａｒｃｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｓｙｃｈｒｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ａｍｐｈｉｓｐｈａｅｒｉａｃｅａｅ  ｓｐｐ．、ホモプシス種（Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ  ｓｐｐ．）、トリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐｐ．）、肺斑病菌種（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ  ｓｐｐ．）、ペスタロティオプシス種（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ  ｓｐｐ���）、マユハキタケ種（Ｔｒｉｃｈｏｃｏｍａｃｅａｅ  ｓｐｐ．）、コニオケータ種（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａｌｅｓ  ｓｐｐ．）、シロキクラゲ種（Ｔｒｅｍｅｌｌａｌｅｓ  ｓｐｐ．）、クロイボタケ種（Ｄｏｔｈｉｄｅａｌｅｓ  ｓｐｐ．）、クロカワキン種（Ｐｈｙｌｌａｃｈｏｒａｃｅａｅ  ｓｐｐ．）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ  ｓｐｐ．、ヘルポトリキエラ種（Ｈｅｒｐｏｔｒｉｃｈｉｅｌｌａｃｅａｅ  ｓｐｐ．）、Ｌｉｌｉｏｐｓｉｄａ  ｓｐｐ．、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎａｌｅｓ  ｓｐｐ．、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｍｙｃｏｔｏｘｉｎｉｖｏｒａｎｓ、トリコスポロン種（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｓｐｐ．）、ドチオラ種（Ｄｏｔｈｉｏｒａｃｅａｅ  ｓｐｐ．）、ボタンタケ種（Ｈｙｐｏｃｒｅａｌｅｓ  ｓｐｐ．）、コタマカビ種（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａｃｅａｅ  ｓｐｐ．）、Ｓｐｏｒｉｄｉｏｈｏｌａｌｅｓ  ｓｐｐ．、バッカクキン種（Ｃｌａｖｉｃｉｐｉｔａｃｅａｅ  ｓｐｐ．）、プレオスポラ種（Ｐｌｅｏｓｐｏｒａｌｅｓ  ｓｐｐ．）、クロボ菌種（Ｕｓｔｉｌａｇｉｎａｃｅａｅ  ｓｐｐ．）、クロカワキン種（Ｐｈｙｌｌａｃｈｏｒａｃｅａｅ  ｓｐｐ．）、ケカビ種（Ｍｕｃｏｒａｃｅａｅ  ｓｐｐ．）、フンタマカビ種（Ｓｏｒｄａｒｉａｌｅｓ  ｓｐｐ．）、フィロバシディウム種（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉａｌｅｓ  ｓｐｐ．）、カロスフェリア種（Ｃａｌｏｓｐｈａｅｒｉａｃｅａｅ  ｓｐｐ．）、バッカクキン種（Ｃｌａｖｉｃｉｐｉｔａｃｅａｅ  ｓｐｐ．）、ケカビ種（Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ  ｓｐｐ．）、ヘルポトリキエラ種（Ｈｅｒｐｏｔｒｉｃｈｉｅｌｌａｃｅａｅ  ｓｐｐ．）、ミクロドチウム種（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ  ｓｐｐ．）、クロカワキン種（Ｐｈｙｌｌａｃｈｏｒａｃｅａｅ  ｓｐｐ．）、ゾフィア種（Ｚｏｐｆｉａｃｅａｅ  ｓｐｐ．）、ボトリオスフェリア種（Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｉａｃｅａｅ  ｓｐｐ．）、ビョウタケ種（Ｈｅｌｏｔｉａｃｅａｅ  ｓｐｐ．）、肉座菌種（Ｂｉｏｎｅｃｔｒｉａｃｅａｅ  ｓｐｐ．）、ラクノクラジウム種（Ｌａｃｈｎｏｃｌａｄｉａｃｅａｅ  ｓｐｐ．）、ディポドアスクス種（Ｄｉｐｏｄａｓｃａｃｅａｅ  ｓｐｐ．）、イワヅタ種（Ｃａｕｌｅｒｐａｃｅａｅ  ｓｐｐ．）
、ミクロストロマ種（Ｍｉｃｒｏｓｔｒｏｍａｔａｌｅｓ  ｓｐｐ．）、ヒダナシタケ種（Ａｐｈｙｌｌｏｐｈｏｒａｌｅｓ  ｓｐｐ．）、Ｍｏｎｔａｇｎｕｌａｃｅａｅ  ｓｐｐ．、ギムノアスクス種（Ｇｙｍｎｏａｓｃａｃｅａｅ  ｓｐｐ．）、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａｃｅａｅ  ｓｐｐ．、クロサイワイタケ種（Ｘｙｌａｒｉａｌｅｓ  ｓｐｐ．）、Ｍｏｎｔａｇｎｕｌａｃｅａｅ  ｓｐｐ．、ケダマカビ種（Ｃｈａｅｔｏｍｉａｃｅａｅ  ｓｐｐ．）、アカサビゴケ（Ｘａｎｔｈｏｒｉａ  ｅｌｅｇａｎｓ）、クモノスカビ種（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｐｐ．）、ペニシリウム種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐｐ．）、Ｃｅｔｒａｒｉａ  ａｃｕｌｅａｔｅ、Ｎｅｐｈｒｏｍｏｐｓｉｓ  ｌａｕｒｅｒｉ、Ｔｕｃｋｅｒｍａｎｎｏｐｓｉｓ  ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌａ、マキバエイランタイ（Ｃｅｔｒａｒｉａ  ｅｒｉｃｅｔｏｒｕｍ）、セトラリア種（Ｃｅｔｒａｒｉａ  ｓｐｐ．）、コガネエイランタイ（Ｆｌａｖｏｃｅｔｒａｒｉａ  ｃｕｃｕｌｌａｔａ）、Ｋａｅｒｎｅｆｅｌｔｉａ  ｍｅｒｒｉｌｌｉｉ、Ａｍｏｒｏｓｉａ  ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ、Ｑｕａｍｂａｌａｒｉａ  ｃｙａｎｅｓｃｅｎｓ、ボクトウガオオハリタケ（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ  ｒｏｓｅｏｓｔｒｏｍａｔａ）、冬虫夏草菌種（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ  ｓｐｐ．）、ベニタケ種（Ｒｕｓｓｕｌａ  ｓｐｐ．）、カレエダケ種（Ｃｌａｖｕｌｉｎａ  ｓｐｐ．）、Ｔｕｂｅｒ  ｑｕｅｒｃｉｃｏｌａ、Ｇｙｍｎｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．、Ｔｅｔｒａｃｈａｅｔｕｍ  ｅｌｅｇａｎｓ、Ａｎｇｕｉｌｌｏｓｐｏｒａ  ｌｏｎｇｉｓｓｉｍａ、ボタンタケ種（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｓｐｐ．）、Ｓｉｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｎｉｇｅｎｕｓ、外生菌根菌ショウロ（Ｒｈｉｚｏｓｃｙｐｈｕｍ  ｅｒｉｃａｅ）、Ｒｈｉｚｏｐｏｇｏｎ  ｏｌｉｖａｃｅｏｔｉｎｃｔｕｓ、ショウロ種（Ｒｈｉｚｏｐｏｇｏｎ  ｓｐｐ．）、Ｐｉｓｏｌｉｔｈｕｓ  ｍｉｃｒｏｃａｒｐｕｓ、Ｒｈｉｚｏｓｃｙｐｈｕｓ  ｅｒｉｃａｅ、Ｃｏｒｔｉｎａｒｉｕｓ  ｇｌａｕｃｏｐｕｓ、ヒダハタケ種（Ｐａｘｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、ヤマイグチ（Ｓｕｉｌｌｕｓ  ｖａｒｉｅｇａｔｅｓ）、クレン古細菌（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）、トゥラスネラ種（Ｔｕｌａｓｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、ヒメムキタケ種（Ｈｏｈｅｎｂｕｅｈｅｌｉａ  ｓｐｐ．）、コクリオボラス・ルナータス（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｌｕｎａｔｕｓ）、チヂレタケ（Ｐｌｉｃａｔｕｒｏｐｓｉｓ  ｃｒｉｓｐａ）、Ｂｏｎｄａｒｃｅｖｏｍｙｃｅｓ  ｔａｘｉ、Ｔａｐｉｎｅｌｌａ  ｐａｎｕｏｉｄｅｓ、Ｔａｐｉｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．、アウストロパキルス種（Ａｕｓｔｒｏｐａｘｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、オウギダケ（Ｇｏｍｐｈｉｄｉｕｓ  ｒｏｓｅｕｓ）、ハンノキイグチ（Ｇｙｒｏｄｏｎ  ｌｉｖｉｄｕｓ）、Ｐｈｙｌｌｏｐｏｒｕｓ  ｐｅｌｌｅｔｉｅｒｉ、Ｃｈａｍｏｎｉｘｉａ  ｃａｅｓｐｉｔｏｓｅ、Ｐｏｒｐｈｙｒｅｌｌｕｓ  ｐｏｒｐｈｙｒｏｓｐｏｒｕｓ、トルンココルメラ・キトリナ（Ｔｒｕｎｃｏｃｏｌｕｍｅｌｌａ  ｃｉｔｒｉａｎａ）、ニワタケ（Ｔａｐｉｎｅｌｌａ  ａｔｒｏｔｏｍｅｎｔｏｓａ）、Ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ  ｌｅａｖｅ、ヌメリイグチ（Ｓｕｉｌ���ｕｓ  ｖａｒｉｅｇａｔｅｓ）、スイルス種（Ｓｕｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、Ｐｏｒｐｈｙｒｅｌｌｕｓ  ｐｏｒｐｈｙｒｏｓｐｏｒｕｓ、コツブタケ（Ｐｉｓｏｌｉｔｈｕｓ  ａｒｒｈｉｚｕｓ）、Ｐｈａｅｏｇｙｒｏｐｏｒｕｓ  ｐｏｒｔｅｎｔｏｓｕｓ、Ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  ｖａｒｉｅｇａｔｅｓ、ヒメノシワタケ（Ｌｅｕｃｏｇｙｒｏｐｈａｎａ  ｍｏｌｌｕｓｃａ）、Ｈｙｄｎｏｍｅｒｕｌｉｕｓ  ｐｉｎａｓｔｒｉ、オウギタケ（Ｇｏｍｐｈｉｄｉｕｓ  ｒｏｓｅｕｓ）、ハンノキイグチ（Ｇｙｒｏｄｏｎ  ｌｉｖｉｄｕｓ）、アイゾメイグチ（Ｇｙｒｏｐｏｒｕｓ  ｃｙａｎｅｓｃｅｎｓ）、コショウイグチ（Ｃｈａｌｃｉｐｏｒｕｓ  ｐｉｐｅｒａｔｕｓ）、Ｃｈａｍｏｎｉｘｉａ  ｃａｅｓｐｉｔｏｓｅ、Ｂｏｎｄａｒｃｅｖｏｍｙｃｅｓ  ｔａｘｉ、Ｄｅｎｄｒｙｐｈｉｅｌｌａ  ｔｒｉｔｉｃｉｃｏｌａ、Ｇｕｉｇｎａｒｄｉａ  ｓｐｐ．、Ｓｈｉｒａｉａ  ｓｐｐ．、クラドスポリウム種（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、ホモプシス種（Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ  ｓｐｐ．）、ディアポルテ種（Ｄｉａｐｏｒｔｈａｌｅｓ  ｓｐｐ．）、ペスタロティオプシス種（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ  ｓｐｐ．）、ロフィオストマ種（Ｌｏｐｈｉｏｓｔｏｍａ  ｓｐｐ．）、線虫卵寄生性糸状菌（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｌａｍｙｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）、ペシロミセス・ライラキナス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｌａｃｉｎｕｓ）、ペシロミセス・ヴァリオティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ  ｖａｒｉｏｔｉ）、ペシロミセス種（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）、Ｃｅｒａｔｏｒｈｉｚａ  ｏｒｙｚａｅ−ｓａｔｉｖａｅ、Ｇｅｏｓｍｉｔｈｉａ  ｐａｌｌｉｄａ、ゲオスミチア種（Ｇｅｏｓｍｉｔｈｉａ  ｓｐｐ．）、ゲオシフォン・ピリフォルミス（Ｇｅｏｓｉｐｈｏｎ  ｐｙｒｉｆｏｒｍｉｓ）、Ａｇｏｎｉｍｉａ  ｓｐｐ．、オガサワラピルギルス（Ｐｙｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｖａｎｉｃｕｓ）、エクソフィアラ  デルマティティヂス（Ｅｘｏｐｈｉａｌａ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、エクソフィアラ・ピシフィラ（Ｅｘｏｐｈｉａｌａ  ｐｉｓｃｉｐｈｉｌａ）、エクソフィアラ種（Ｅｘｏｐｈｉａｌａ  ｓｐｐ．）、Ｒａｍｉｃｈｌｏｒｉｄｉｕｍ  ａｎｃｅｐｓ、ラミクロリジウム種（Ｒａｍｉｃｈｌｏｒｉｄｉｕｍ  ａｎｃｅｐｓ）、Ｃａｐｒｏｎｉａ  ｐｉｌｏｓｅｌｌａ、Ｉｓａｒｉａ  ｆａｒｉｎｏｓｅ、Ｐｏｃｈｏｎｉａ  ｓｕｃｈｌａｓｐｏｒｉａ、Ｌｅｃａｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｓａｌｌｉｏｔａｅ、Ｄｏｔｈｉｄｅｏｍｙｃｅｔｅ  ｓｐｐ．、Ｌｅｏｔｉｏｍｙｃｅｔｅ  ｓｐｐ．、稲コウジ病菌（Ｕｓｔｉｌａｇｉｎｏｉｄｅａ  ｖｉｒｅｎｓ）、Ｈｙｐｈｏｚｙｍａ  ｌｉｇｎｉｃｏｌａ、Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ  ｍａｌａｃｏｔｒｉｃｈａ、Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ  ｓｐｐ．、Ｔｏｒｒｕｂｉｅｌｌａ  ｃｏｎｆｒａｇｏｓａ、ハナサナキダケ（Ｉｓａｒｉａ  ｔｅｎｕｉｐｅｓ）、ミクロスポルム・カニス（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｃａｎｉｓ）、ミクロスポルム・オーズアニー（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ａｕｄｏｕｉｎｉｉ）、ミクロスポルム種（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｓｐｐ．）、エピコッカム・フロコッサム（Ｅｐｉｃｏｃｃｕｍ  ｆｌｏｃ���ｏｓｕｍ）、ギガスポラ・ローゼア（Ｇｉｇａｓｐｏｒａ  ｒｏｓｅａ）、ギガスポラ種（Ｇｉｇａｓｐｏｒａ  ｓｐｐ．）、霊芝種（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ  ｓｐｐ．）、キュウリベト病菌（Ｐｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｃｕｂｅｎｓｉｓ）、Ｈｙａｌｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｐａｒａｓｉｔｉｃａ、Ｐｌｅｃｔｏｐｈｏｍｅｌｌａ  ｓｐｐ．、黒酵母（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）、キカイガラタケ（Ｇｌｏｅｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｓｅｐｉａｒｉｕｍ）、カワラタケ種（Ｇｌｏｅｐｈｙｌｌｕｍ  ｓｐｐ．）、ドンキオポリア・エクスパンサ（Ｄｏｎｋｉｏｐｏｒｉａ  ｅｘｐａｎｓａ）、ワタグサレタケ（Ａｎｔｒｏｄｉａ  ｓｉｎｕｏｓａ）、Ｐｈａｅｏａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｒｕｂｒｉｇｅｎｕｍ、フェオアクレモニウム種（Ｐｈａｅｏａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｓｐｐ．）、Ａｌｂｅｒｔｉｎｉｅｌｌａ  ｐｏｌｙｐｏｒｉｃｏｌａ、Ｃｅｐｈａｌｏｔｈｅｃａ  ｓｕｌｆｕｒｅａ、Ｆｒａｇｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｆｒａｇｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｓｐｐ．、Ｐｈｉａｌｅｍｏｎｉｕｍ  ｄｉｍｏｒｐｈｏｓｐｏｒｕｍ、フィアレモニウム種（Ｐｈｉａｌｅｍｏｎｉｕｍ  ｓｐｐ．）、ピチア・ノルベゲンシス（Ｐｉｃｈｉａ  ｎｏｒｖｅｇｅｎｓｉｓ）、ピチア種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌａｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、カンジダ種（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．）、Ｇｏｎｄｗａｎａｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．、グラフィウム種（Ｇｒａｐｈｉｕｍ  ｓｐｐ．）、Ａｍｂｒｏｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．、シャモジタケ種（Ｍｉｃｒｏｇｌｏｓｓｕｍ  ｓｐｐ．）、ニカワチャワンタケ（Ｎｅｏｂｕｌｇａｒｉａ  ｐｕｒａ）、ナガミノクロサラタケ（Ｈｏｌｗａｙａ  ｍｕｃｉｄａ）、Ｃｈｌｏｒｏｖｉｂｒｉｓｓｅａ  ｓｐｐ．、Ｃｈｌｏｒｏｃｉｂｏｒｉａ  ｓｐｐ．、Ｔｈａｘｔｅｒｏｇａｓｔｅｒ  ｓｐｐ．、フウセンタケ種（Ｃｏｒｔｉｎａｒｉｕｓ  ｓｐｐ．）、Ｓｅｔｃｈｅｌｌｉｏｇａｓｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ｔｉｍｇｒｏｖｅａ  ｓｐｐ．、Ｄｅｓｃｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．、マメツブタケ（Ｈｙｍｅｎｏｇａｓｔｅｒ  ｓｐｐ．）、Ｑｕａｄｒｉｓｐｏｒａ  ｔｕｂｅｒｃｕｌａｒｉｓ、Ｑｕａｄｒｉｓｐｏｒａ  ｓｐｐ．、Ｐｒｏｔｏｇｌｏｓｓｕｍ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍ、Ｃｅｒａｔｏｓｔｏｍｅｌｌａ  ｐｙｒｅｎａｉｃａ、Ｃｅｒａｔｏｓｐｈａｅｒｉａ、Ｃｅｒａｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｌａｍｐａｄｏｐｈｏｒａ、フォンセカヤ・ペドロソイ（Ｆｏｎｓｅｃａｅａ  ｐｅｄｒｏｓｏｉ）、Ｐｈｌｅｂｉａ  ａｃｅｒｉｎａ、シワウロコタケ種（Ｐｈｌｅｂｉａ  ｓｐｐ．）、Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ  ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔａ、パラコクシジオイデス症病原菌（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、Ｒａｃｏｓｐｅｒｍｙｃｅｓ  ｋｏａｅ、Ｅｎｄｏｒａｅｃｉｕｍ  ａｃａｃｉａｅ、Ｕｒｏｍｙｃｌａｄｉｕｍ  ｔｅｐｐｅｒｉａｎｕｍ、Ｕｒｏｍｙｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐ���．、アガリクス・ビスポラス（Ａｇａｒｉｃｕｓ  ｂｉｓｐｏｒｕｓ）、アガリクス種（Ａｇａｒｉｃｕｓ  ｓｐｐ．）、Ｐｓｉｌｏｃｙｂｅ  ｑｕｅｂｅｃｅｎｓｉｓ、カワリコシワツバタケ（Ｐｓｉｌｏｃｙｂｅ  ｍｅｒｄａｒｉａ）、Ｐｓｉｌｏｃｙｂｅ  ｓｐｐ．、ムウラサキスギダケ（Ｇｙｍｎｏｐｉｌｕｓ  ｌｕｔｅｏｆｏｌｉｕｓ）、チャツムタケ（Ｇｙｍｎｏｐｉｌｕｓ  ｌｉｑｕｉｒｉｔｉａｅ）、チャツムタケ種（Ｇｙｍｎｏｐｉｌｕｓ  ｓｐｐ．）、タマムクエタケ（Ｈｙｐｈｏｌｏｍａ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、Ｍｅｌａｎｏｔｕｓ  ｈａｒｔｉｉ、Ｐａｎａｅｏｌｕｓ  ｕｌｉｇｉｎｏｓｕｓ、Ｓｔｒｏｐｈａｒｉａ  ｒｕｇｏｓｏａｎｎｕｌａｔａ、アカヒダササタケ（Ｄｅｒｍｏｃｙｂｅ  ｓｅｍｉｓａｎｇｕｉｎｅａ）、ササタケ種（Ｄｅｒｍｏｃｙｂｅ  ｓｐｐ．）、Ｈｅｌｉｃｏｍａ  ｍｏｎｉｌｉｐｅｓ、ヘリコマ種（Ｈｅｌｉｃｏｍａ  ｓｐｐ．）、Ｔｕｂｅｕｆｉａ  ｈｅｌｉｃｏｍｙｃｅｓ、Ｔｕｂｅｕｆｉａ  ｓｐｐ．、Ｌｅｏｈｕｍｉｃｏｌａ  ｖｅｒｒｕｃｏｓａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｕｌｉｎａ  ｃｈａｒｔａｒｕｍ、Ｍａｃｒｏｐｈｏｍａ  ｓｐｐ．、Ｍａｒｓｓｏｎｉｎａ  ｒｏｓａｅ、Ｂｏｔｒｙｏｔｉｎｉａ  ｆｕｃｋｅｌｉａｎａ、ペスタロティオプシス種（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ  ｓｐｐ．）、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｃａｒｍｉｃｈａｅｌｉｉ、クリソスポリウム種（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、Ｄａｃｔｙｌｅｌｌａ  ｏｘｙｓｐｏｒａ、Ｄａｃｔｙｌｅｌｌｉｎａ  ｌｏｂａｔｕｍ、ウリ種（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ  ｓｐｐ．）、Ｃｈｒｙｓｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｓｐａｒｓｉｆｌｏｒｕｍ、クリソフィルム種（Ｃｈｒｙｓｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｓｐｐ．）、オオムギウドンコ病菌（Ｂｌｕｍｅｒｉａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）、Ｓａｗａｄａｅａ  ｐｏｌｙｆｉｄａ、Ｓａｗａｄａｅａ  ｓｐｐ．、Ｐａｒａｕｎｃｉｎｕｌａ  ｓｅｐｔａｔａ、Ｅｒｙｓｉｐｈｅ  ｍｏｒｉ、Ｅｒｙｓｉｐｈｅ  ｓｐｐ．、Ｔｙｐｈｕｌｏｃｈａｅｔａ  ｊａｐｏｎｉｃａ、Ｇｏｌｏｖｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｏｒｏｎｔｉｉ、Ｇｏｌｏｖｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．、キュウリウドンコ病菌（Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ  ｘａｎｔｈｉｉ）、ポドスフェラ種（Ｐｏｄ
ｏｓｐｈａｅｒａ  ｓｐｐ．）、Ａｒｔｈｒｏｃｌａｄｉｅｌｌａ  ｍｏｕｇｅｏｔｉｉ、Ｎｅｏｅｒｙｓｉｐｈｅ  ｇａｌｅｏｐｓｉｄｉｓ、Ｐｈｙｌｌａｃｔｉｎｉａ  ｋａｋｉｃｏｌａ、Ｐｈｙｌｌａｃｔｉｎｉａ  ｓｐｐ．、Ｃｙｐｈｅｌｌｏｐｈｏｒａ  ｌａｃｉｎｉａｔａ、Ｓｐｈａｅｒｏｇｒａｐｈｉｕｍ  ｔｅｎｕｉｒｏｓｔｒｕｍ、Ｍｉｃｒｏｓｐｈａｅｒａ  ｔｒｉｆｏｌｉｉ、Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ  ｓｐｉｒａｅａｅ、Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ  ｓｐｐ．、Ｕｎｃｉｎｕｌｉｅｌｌａ  ａｕｓｔｒａｌｉａｎａ、アブシディア・コリンビフェラ（Ａｂｓｉｄｉａ  ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒａ）、アブシディア種（Ａｂｓｉｄｉａ  ｓｐｐ．）、ゲオトリクム種（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｓｐｐ．）、Ｎｅｃｔｒｉａ  ｃｕｒｔａ、Ａｎａｍｉｋａ  ｌａｃｔａｒｉｏｌｅｎｓ、エノキタケ（Ｈｅｂｅｌｏｍａ  ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）、Ｓｔｒｏｐｈａｒｉａ  ａｍｂｉｇｕａ、フミヅキタケ（Ａｇｒｏｃｙｂｇｅ  ｐｒａｅｃｏｘ）、イタチハリタケ（Ｈｙｄｎｕｍ  ｒｕｆｅｓｃｅｎｓ）、ハリタケ種（Ｈｙｄｎｕｍ  ｓｐｐ．）、エンドファイト（Ｍｅｌｉｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）、Ｒｈｉｚｏｓｃｙｐｈｕｓ  ｅｒｉｃａｅ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｅｒｉｃａｅ、ヒアロデンドロン種（Ｈｙａｌｏｄｅｎｄｒｏｎ  ｓｐｐ．）、レプトグラフィウム・レンドベルギ（Ｌｅｐｔｏｇｒａｐｈｉｕｍ  ｌｕｎｄｂｅｒｇｉｉ）、レプトグラフィウム種（Ｌｅｐｔｏｇｒａｐｈｉｕｍ  ｓｐｐ．）、オオシロアリタケ種（Ｔｅｒｍｉｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）、コクシジオイデス・ポサダシ（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｐｏｓａｄａｓｉｉ）、コクシジオイデス・イミティス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ）、菌核病菌（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）、ホモプシス種（Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ  ｓｐｐ．）、メタリジウム・アニソプリエ（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ  ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）、冬虫夏草種（Ｃｏｙｄｙｃｅｐｓ  ｓｐｐ．）、Ｔｉｌｌｅｔｉｏｐｓｉｓ  ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎｅｎｓｉｓ、ミダレアミタケ種（Ｃｅｒｒｅｎａ  ｕｎｉｃｏｌｏｒ）、繊維汚染菌（Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ  ｃｈａｒｔａｒｕｍ）、フェオコッコミセス・ニグリカンス（Ｐｈａｅｏｃｏｃｃｏｍｙｃｅｓ  ｎｉｇｒｉｃａｎｓ）、Ｇａｎｏｄｅｒｍａ  ｐｈｉｌｉｐｐｉｉ、マンネンタケ種（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ  ｓｐｐ．）、キカイガラタケ（Ｇｌｏｅｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｓｅｐｉａｒｉｕｍ）、Ｃｙｓｔｏｔｈｅｃａ  ｌａｎｅｓｉｒｉｓ、ピーマンウドンコ病菌（Ｌｅｖｅｉｌｌｕｌａ  ｔａｕｒｉｃａ）、Ｐｈｙｌｌａｃｔｉｎｉａ  ｆｒａｘｉｎｉ、Ｖａｒｉｃｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｅｌｏｄｅａｅ、Ｒｈｉｎｏｃｌａｄｉｅｌｌａ  ｂａｓｉｔｏｎｕｍ、Ｍｅｌａｎｃｈｌｅｎｕｓ  ｏｌｉｇｏｓｐｅｒｍｕｓ、クラビスポラ・ルシタニエ（Ｃｌａｖｉｓｐｏｒａ  ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）、クモノスカビ種（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｐｐ．）、リゾムコール種（Ｐｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｓｐｐ．）、ムコール種（Ｍｕｃｏｒ  ｓｐｐ．）、コニディオボラス・コロナトゥス（Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓ  ｃｏｒｏｎａｔｕｓ）、Ｃｏｎｉｄｏｂｏｌｕｓ  ｓｐｐ．、バシディオボラス・ラナルム（Ｂａｓｉｄｉｏｂｏｌｕｓ  ｒａｎａｒｕｍ）、バシジオボーラス種（Ｂａｓｉｄｉｏｂｏｌｕｓ  ｓｐｐ．）、Ｏｃｈｒｏｎｉｓ  ｓｐｐ．、ヒストプラスマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、ヒストプラスマ種（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｓｐｐ．、ウィルコクシナ・ミコラエ（Ｗｉｌｃｏｘｉｎａ  ｍｉｋｏｌａｅ）、ラシオディプロディア種（Ｌａｓｉｏｄｉｐｌｏｄｉａ  ｓｐｐ．）、コフキシロムカデゴケ（Ｐｈｙｓｃｉａ  ｃａｅｓｉａ）、フィスキア種（Ｐｈｙｓｃｉａ  ｓｐｐ．）、Ｂｒａｃｈｙｃｏｎｉｄｉｅｌｌｏｐｓｉｓ  ｓｐｐ．、キコガサケ（Ｃｏｎｏｃｙｂｅ  ｌａｃｔｅａｌ）、Ｇａｓｔｒｏｃｙｂｅ  ｌａｔｅｒｉｔｉａ、Ｇａｓｔｒｏｃｙｂｅ  ｓｐｐ．、Ａｇｒｏｃｙｂｅ  ｓｅｍｉｏｒｂｉｃｕｌａｒｉｓ、スモモフクロミ病菌（Ｔａｐｈｒｉｎａ  ｐｒｕｎｉ）、タフリナ種（Ｔａｐｈｒｉｎａ  ｓｐｐ．）、ナガエノヤグラタケ（Ａｓｔｅｒｏｐｈｏｒａ  ｐａｒａｓｉｔｉｃａ）、ヤグラタケ種（Ａｓｔｅｒｏｐｈｏｒａ  ｓｐｐ．）、エレモテシウム・アシュビイ（Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ  ａｓｈｂｙｉ）、トリクラディウム・スペレンデンス（Ｔｒｉｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐｌｅｎｄｅｎｓ）、キホウキタケ（Ｒａｍａｒｉａ  ｆｌａｖａ）、ホウキタケ種（Ｒａｍａｒｉａ  ｓｐｐ．）、Ｌａｃｃａｒｉａ  ｆｒａｔｅｒｎａｌ、スクテロスポーラ種（Ｓｃｕｔｅｌｌｏｓｐｏｒａ  ｓｐｐ．）、Ｉｌｌｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｃａｒｎｅｕｍ、Ｈｏｂｓｏｎｉａ  ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎｉｉ、Ｍａｒｃｈａｎｄｉｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｒａｌｌｉｎｕｓ、Ｆｕｓｉｃｏｃｃｕｍ  ｌｕｔｅｕｍ、Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｒｉｂｉｓ、シュードザイマ・アフィディス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ  ａｐｈｉｄｉｓ）、シュードザイマ種（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ  ｓｐｐ．）、Ｐｅｓｏｔｕｍ  ｅｒｕｂｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｔｔａｒｒｅａ  ｓｔｅｖｅｎｉｉ、コウボウフデ種（Ｂａｔｔａｒｒｅａ  ｓｐｐ．）、Ｈａｒｐｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｊａｎｕｓ、Ｈａｒｐｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐｐ．、ヒルステラ・ロッシリエンシス（Ｈｉｒｓｕｔｅｌｌａ  ｒｈｏｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、Ａｒｔｈｒｏｄｅｒｍａ  ｃｉｆｅｒｒｉｉ、アースロデルマ種（Ａｒｔｈｒｏｄｅｒｍａ  ｓｐｐ．）、Ｐｕｃｃｉｎｉａｓｔｒｕｍ  ｇｏｅｐｐｅｒｔｉａｎｕｍ、Ｃｒｏｎａｒｔｉｕｍ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ、Ｃｒｏｎａｒｔｉｕｍ  ａｒｉｚｏｎｉｃｕｍ、クロナルチウム種（Ｃｒｏｎａｒｔｉｕｍ  ｓｐｐ．）、Ｐｅｒｉｄｅｒｍｉｕｍ  ｈａｒｋｎｅｓｓｉｉ、Ｐｅｒｉｄｅｒｍｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｃｈｒｙｓｏｍｙｘａ  ａｒｃｔｏｓｔａｐｈｙｌｉ、Ｈｏｌｌｅｙａ  ｓｉｎｅｃａｕｄａ、Ｈｏｌｌｅｙａ  ｓｐｐ．、ズープトラ・ラディカンス（Ｚｏｏｐｈｔｈｏｒａ  ｒａｄｉｃａｎｓ）、Ｓｍｉｔｔｉｕｍ  ｃｕｌｉｓｅｔａｅ、オウキサルスロン・ズフィアナム（Ａｕｘａｒｔｈｒｏｎ  ｚｕｆｆｉａｎｕｍ）、Ｒｅｎｉｓｐｏｒａ  ｆｌａｖｉｓｓｉｍａ、テノマイセス・セルラタス（Ｃｔｅｎｏｍｙｃｅｓ  ｓｅｒｒａｔｕｓ）、およびスポロトリックス・シェンキイ（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｃｈｅｎｃｋ��ｉ）中に存在する真菌ＤＮＡの少なくとも１つの普遍的領域の有無を検出するステップを含む。
【００５５】
当分野における標準方法を使用すると、相同性を決定できる。例えば、ＵＷＧＣＧパッケージは、例えばそのデフォルト設定で使用される、相同性を計算するために使用できるＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９８４；１２：３８７−３９５）。ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用すると、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌ  Ｊ  ＭｏＩ  Ｅｖｏｌ，１９９３；３６：２９０−３００；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ，１９９０；２１５：４０３−１０）に記載されているように、相同性を計算でき、又は配列を整列させる（例えば同等の残基もしくは対応する配列を（典型的にはそれらのデフォルト設定で）同定する）ことができる。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウエアは、全米バイオテクノロジー情報センター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して公的に入手できる。
【００５６】
ある実施形態では、普遍的領域自体が検出される。また別の実施形態では、普遍的領域から転写されたＲＮＡが検出される。サンプル中の普遍的領域から転写されたＲＮＡの存在は、それ自体がサンプル中の半量域の存在の指標である。以下では、普遍的領域もしくはそれから転写された任意のＲＮＡが検出される方法についてより詳細に考察する。
【００５７】
普遍的領域もしくはそれから転写されたＲＮＡは、典型的にはそれが検出される前にサンプル中に存在する心筋細胞から抽出される。普遍的領域は、当分野において公知のルーチン方法を用いて抽出できる。例えば、真菌ＤＮＡを抽出するための適切な方法は、Ｆｒｅｄｒｉｃｋｓ  ｅｔ  ａ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００５；４３（１）：５１２２−５１２８、米国特許出願第２００２／０１１５０７７号明細書、および米国特許第６，６０５，４３９号明細書の中に開示されている。真菌ＲＮＡを抽出する適切な方法は、当分野において、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓにおいて開示された塩化リチウム精製法などに開示されている。真菌ＲＮＡを抽出するためのキット、例えばＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ社）もまた市販で入手できる。
【００５８】
普遍的領域は、当分野において公知の任意の方法を用いて検出できる。普遍的領域は、好ましくは普遍的領域に特異的にハイブリダイズするプローブを用いて検出される。典型的には、検出ステップは、プローブをサンプルと、該プローブが、存在する場合にはその領域へ特異的にハイブリダイズする条件下で接触させるステップと、ハイブリダイゼーション生成物の有無を決定するステップとを含む。ハイブリダイゼーション生成物の存在は、普遍的領域の存在を指示する。これとは逆に、ハイブリダイゼーション生成物の非存在は、普遍的領域の非存在を指示する。
【００５９】
プローブは、典型的には核酸、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、又は合成核酸である。プローブは、それが普遍的領域に優先的もしくは選択的にハイブリダイズする場合には普遍的領域へ特異的にハイブリダイズするが、任意の他のＤＮＡもしくはＲＮＡ配列にはハイブリダイズしない。
【００６０】
プローブは、好ましくはストリンジェントな条件下で普遍的領域へ特異的にハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションを許容する条件は、当分野において周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−ｌｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９５）を参照されたい）。検出は、ストリンジェンシーの低い条件下、例えば３７℃での３０〜３５％のホルムアルデヒド、１ＭのＮａＣｌおよび１％  ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の存在下で、そしてその後に５０℃で１×（０．１６５０ＭのＮａ＋）〜２×（０．３３ＭのＮａ＋）のＳＳＣ（標準クエン酸ナトリウム）中での洗浄を行う条件下で実施できる。検出は、中程度のストリンジェンシー条件下、例えば３７℃での４０〜４５％のホルムアルデヒド、１ＭのＮａＣｌおよび１％  ＳＤＳの存在下で、そしてその後に５５℃で０．５×（０．０８２５ＭのＮａ＋）〜１×（０．１６５０ＭのＮａ＋）のＳＳＣ中での洗浄を行う条件下で実施できる。検出は、高いストリンジェンシー条件下、例えば３７℃での５０％のホルムアルデヒド、１ＭのＮａＣｌおよび１％  ＳＤＳの存在下で、そしてその後に６０℃で１×（０．０１６５ＭのＮａ＋）のＳＳＣ中での洗浄を行う条件下で実施できる。
【００６１】
プローブは、普遍的領域と同一の長さであっても、普遍的領域より短くても、又は長くてもよい。プローブは、典型的には長さが少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも７５又は少なくとも１００ヌクレオチドである。例えば、プローブは、長さが５〜２００、７〜１００又は１０〜５０ヌクレオチドであってもよい。プローブは、好ましくは、長さが５、１０、１５、２０、２５、３０、３５又は４０ヌクレオチドである。プローブは、好ましくは、普遍的領域との配列同一性に基づいて少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の相同性を共有する配列を含む。相同性は、上記で考察したように決定できる。
【００６２】
プローブは、検出可能に標識される。検出可能な標識は、プローブと普遍的領域との間の特異的ハイブリダイゼーションによって形成されるハイブリダイゼーション生成物の有無（およびそれにより普遍的領域の有無）を決定することを可能にする。任意の標識を使用できる。適切な標識には、蛍光分子、放射性同位元素、例えば、１２５Ｉ、３５Ｓ、酵素、抗体およびビオチンなどのリンカーが含まれるが、それらに限定されない。
【００６３】
プローブは、プライマーに連結したプローブであるスコーピオンプローブであってもよい。このプローブのプライマー部分は、検出対象の真菌ＤＮＡの領域を増幅するように設計することができ、プローブ部分は増幅領域を検出するように設計できる。スコーピオンプローブは、当分野において周知である。それらは、例えば、Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９４；１１７：８０４−８０７）に記載されている。
【００６４】
プローブは、モレキュラービーコンプローブであってもよい。モレキュラービーコンプローブは、一方の端では蛍光標識を、そして他方の端では消光分子を含む。検出すべき領域が非存在である場合は、プローブはヘアピンループを形成し、消光分子は蛍光標識と近接近させられるので、結果としてシグナルを検出することはできない。プローブが検出対象の領域にハイブリダイズすると、ループが開き、蛍光分子がクエンチャーから分離されるので、シグナルを検出できる。モレキュラービーコンにおいて使用するための適切な蛍光分子およびクエンチャーの組み合わせは、当分野において公知である。そのような組み合わせには、カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）およびダブシル（ｄａｂｃｙｌ）が含まれるが、それらに限定されない。プローブは、好ましくは配列番号４、配列番号４４又は配列番号４５に示したモレキュラービーコンである。
【００６５】
真菌ＤＮＡの領域は、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲを用いて検出できる。この技術は、当分野において周知である。
【００６６】
プローブは、当分野において公知である任意の技術を用いて支持体上に不動化できる。適切な固体支持体は当分野において周知であり、例えばマルチウェルプレートなどのプレート、フィルター、膜、ビーズ、チップ、ピン、計深棒および多孔性担体が含まれる。ナノ粒子は、当分野において公知である任意の技術を用いて支持体上に不動化できる。
【００６７】
普遍的領域を検出するステップは、好ましくは、普遍的領域もしくはそれから転写されたＲＮＡを増幅するステップを含む。１つの実施形態では、この領域は、その存在が決定される前に増幅される。また別の実施形態では、この領域は、その存在が決定されるときにリアルタイムで検出される。リアルタイム法は、実施例に開示するが、当分野においてすでに記載されている。そのような方法は、例えば、米国特許第５，４８７，９７２号明細書およびＡｆｏｎｉａ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２００２；３２：９４６−９）に記載されている。
【００６８】
ある実施形態では、検出対象の普遍的領域だけが増幅される。他の実施形態では、検出対象の領域は、真菌ＤＮＡもしくはＲＮＡのはるかに長い長さの一部として増幅される。少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも４００もしくは少なくとも５００ヌクレオチドを有し、検出対象の領域を含むＤＮＡもしくはＲＮＡの配列を増幅することができる。例えば、１０〜２，０００、２０〜１，５００、５０〜１，０００又は１００〜５００ヌクレオチドを有する配列を増幅することができる。
【００６９】
ＤＮＡもしくはＲＮＡを、当分野において公知であるルーチン方法を用いて増幅することができる。真菌ＤＮＡの増幅は、好ましくは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）もしくは核酸配列対応増幅法（ＮＡＳＢＡ）を用いて実施される。ＰＣＲのための適切な方法は、例えば、米国特許第６，６０５，４３９号、欧州特許第０９７９３１２ＢおよびＢｕｃｈｈｅｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２００２；１１６：８０３０８１１）に開示されている。
【００７０】
ＮＡＳＢＡにより真菌ＤＮＡを増幅するための適切な方法は、Ｗｉｄｊｏｊｏａｔｍｏｄｊｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９９；３８（１−２）：８１−９０に記載されている。
【００７１】
真菌ＲＮＡは、例えば逆転写ＰＣＲなどの、当分野におけるルーチン方法を用いて増幅することができる。
【００７２】
当業者であれば、普遍的領域を増幅する特異的プライマーを設計することができる。プライマーは、通常は増幅される配列のいずれかの端で配列に相補的であるが、任意の他の配列に対しては相補的ではないように設計される。プライマーの設計については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．２００１（上記）で考察されている。
【００７３】
１８Ｓ領域を増幅するプライマーは、例えば、Ｂｕｃｈｈｅｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２００２；１１６：８０３０８１１）およびＭａｋｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．、（Ｊａｐａｎ  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ｂｉｏｌ．，１９９４；４７：１４４−１５６）に開示されている。
【００７４】
普遍的領域は、好ましくは（ａ）配列番号２および３に示したプライマー；又は（ｂ）配列番号４８および５０に示したセンスプライマーの１つならびに配列番号４９および５１に示したアンチセンスプライマーの１つを用いて増幅される。
【００７５】
普遍的領域もしくはそれから転写されたＲＮＡは、真菌細胞から抽出されるので、増幅および／又は検出ステップを妨害する１つ又は複数の因子で汚染される可能性がある。この理由から、普遍的領域は、典型的には内部ＰＣＲ増幅対照の存在下で検出される。これは、サンプル中に存在する任意のＤＮＡが正しく増幅されることを保証する。内部ＰＣＲ増幅対照は、好ましくは、非真菌配列を含む。普遍的領域は、好ましくは阻害剤もしくはその他の欠陥のある増幅ステップの存在を排除するために、規定量で増幅混合物に加えられる、クローニングもしくは合成されたｔＲＮＡ−ＬＥＵイントロン領域の存在下で検出される。ｔＲＮＡ−ＬＥＵイントロン領域は、好ましくは配列番号９に示したトウモロコシｔＲＮＡ−ＬＥＵイントロン領域の一部分を含む。トウモロコシｔＲＮＡ−ＬＥＵイントロン領域の配列には、ヒトもしくは病原性真菌種に存在する任意の配列との相同性が欠如する。内部ＰＣＲ増幅対照は、好ましくは配列番号１０に示した配列番号９の特定部分を検出するステップを含む。配列番号１０は、上述したように配列番号１０へ特異的にハイブリダイズする検出可能に標識されたプローブを用いると検出できる。プローブは、好ましくは、配列番号１０との配列同一性に基づいて少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の相同性を共有する配列を含む。プローブは、一層より好ましくは配列番号１０と同一の配列を含む。配列番号１０の検出は、最も好ましくは図１１および１２に示したオリゴヌクレオチドプライマーの対ならびに配列番号１３に示したモレキュラービーコンを用いて実施される。これらのプライマーは、表１に示した配列番号１０を含有するトウモロコシｔＲＮＡ−ＬＥＵイントロン領域内の配列を増幅させることができ、そして分子ビーコンは、配列番号１０を特異的に検出することができる。
【００７６】
＜属検出法＞
本発明は、サンプル中におけるカンジダ属、アスペルギルス属もしくはニューモシスティス属に属する真菌の有無を迅速に検出するための方法をさらに提供する。本方法は、サンプル内にカンジダ属、アスペルギルス属もしくはニューモシスティス属に属する真菌が含有されているか否かの迅速な指示を提供する。本方法は、サンプル中でカンジダ属、アスペルギルス属もしくはニューモシスティス属に対して特異的な真菌ＤＮＡの領域を検出するステップを含む。サンプル中の特定属に対して特異的である真菌ＤＮＡの領域の存在は、そのサンプル中でのその属に属する真菌が存在する指標である。サンプルからの特定属に対して特異的である真菌ＤＮＡの領域の非存在は、そのサンプル中でのその属に属する真菌が非存在である指標である。１つの属に対して特異的であるＤＮＡの領域は、その真菌の属にのみ存在するＤＮＡの領域である。そこで、１つの属に対して特異的である真菌ＤＮＡの領域は、その属の全種のゲノム内に存在するが、他の真菌属の種のゲノム内には存在しない。１つの属に対して特異的である真菌ＤＮＡの領域は、任意の他の生物、詳細には微生物、例えば細菌もしくはウイルスのゲノム内には存在しない。
【００７７】
カンジダ属およびアスペルギルス属に属する真菌の有無を検出するための方法は、任意のサンプルを対象に実施することができる。ニューモシスティス属に属する真菌の有無を検出するための方法は、ヒトから入手したサンプル上で実施される。以下では、特定タイプのサンプルについてより詳細に考察する。ある実施形態では、真菌を含有することが公知であるサンプルを対象に実施される。例えば、本方法は、上記に記載した総真菌検出法を既に受け、陽性結果が得られたサンプルを対象に実施できる。本方法は、サンプル中の存在が既知である１つ又は複数の真菌の同一性を確証するためにサンプルを対象に実施することができる。また別の実施形態では、本方法は、その真菌含有状態が不明であるサンプルを対象に実施される。本方法は、典型的には、カンジダ属、アスペルギルス属もしくはニューモシスティス属に属する真菌が疑われるサンプルを対象に実施される。
【００７８】
配列番号５は、カンジダ属に特異的な真菌ＤＮＡの領域を示している。サンプル中のカンジダ属に属する真菌の有無を検出するための方法は、該サンプル中で配列番号５との少なくとも８０％の相同性もしくは配列同一性を共有する真菌ＤＮＡの領域の有無を検出するステップを含む。この領域は、好ましくは、配列番号５との少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の相同性もしくは配列同一性を共有する。この配列は、より好ましくは配列番号５と同一である。相同性は、上述したように決定できる。
【００７９】
本方法を使用すると、カンジダ属に属する任意の真菌種の有無を検出することができる。これらの真菌は、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・ドゥブリニエンシス、カンジダ・ファマータ、カンジダ・グラブラタ、カンジダ・ギリエルモンジイ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｈａｅｍｕｌｏｎｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｅｙｆｙｒ、カンジダ・クルセイ、カンジダ・ルシタニアエ、カンジダ・リポリチカ、カンジダ・ノルベンシス、カンジダ・パラプシローシス、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・ビスワナチー、カンジダ・インコンスピクア（Ｃａｎｄｉｄａ  ｉｎｃｏｎｓｐｉｃｕａ）、カンジダ・カテヌラタ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｒｕｍｐｔｉｉおよびカンジダ・ラバウティーとしても知られている）、カンジダ・シュードトロピカリス、カンジダ・パラプシローシス、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍｅｔａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｏｒｔｈｏｐｓｉｌｏｓｉｓ、カンジダ・シフェリィ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｃｉｆｅｒｒｉｉ）、カンジダ・ファマータ、カンジダ・リポリチカ、カンジダ・ノルベンシス、カンジダ・ルゴーサ、カンジダ・ビスワナチーもしくはカンジダ・ゼイラノイデスであってもよい。
【００８０】
配列番号１４は、アスペルギルス属に特異的な真菌ＤＮＡの領域を示している。サンプル中のアスペルギルス属に属する真菌の有無を検出するための方法は、該サンプル中で配列番号１４との少なくとも８０％の相同性もしくは配列同一性を共有する真菌ＤＮＡの領域の有無を検出するステップを含む。この領域は、好ましくは、配列番号１４との少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の相同性もしくは配列同一性を共有する。この配列は、より好ましくは配列番号１４と同一である。相同性は、上述したように決定できる。
【００８１】
本方法を使用すると、アスペルギルス属に属する任意の真菌種の有無を検出することができる。これらの真菌は、アスペルギルス・アリアセウス、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｌｕｔａｃｅｕｓ、アスペルギルス・アトロビオラセウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｔｒｏｖｉｏｌａｃｅｕｓ）、アスペルギルス・セシエラス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃａｅｓｉｅｌｌｕｓ）、アスペルギルス・カンジダス、アスペルギルス・カルネウスＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃａｒｎｅｕｓ、アスペルギルス・シバリエリ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃｌａｖａｔｏ−ｎａｎｉｃｕｓ、アスペルギルス・クラバタス、アスペルギルス・コニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・デフレクタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｄｅｆｌｅｃｔｕｓ）、アスペルギウス・フィスケリアヌス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｉｓｃｈｅｒｉａｎｕｓ）、アルペルギウス・フラビペス、黄色アスペルギルス、アスペルギルス・フミガータス、アスペルギルス・グラウカス、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｈｏｌｌａｎｄｉｃｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｎｕｓ、アスペルギルス・ジャポニクス、アスペルギルス・ニデュランス、黒色アスペルギルス、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ｖａｒ．  ａｗａｍｏｒｉｉ、アスペルギルス・ニベウス、アスペルギルス・オクラセウス、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ペニシロイデス、アスペルギルス・レプタンス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｒｅｐｔａｎｓ）、アスペルギルス・レストリクタス、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｒｕｂｒｏｂｒｕｎｎｅｕｓ、アスペルギルス・スピノサス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｉｎｏｓｕｓ）、アスペルギルス・シドウィ、アスペルギルス・タマリイ、アスペルギルス・テレウス、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｔｒａｚｏｎｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｕｎｇｕｉｓ、アスペルギルス・ウスタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｕｓｔｕｓ）又はアスペルギルス・バージカラー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）であってもよい。
【００８２】
配列番号１８は、ニューモシスティス属に特異的な真菌ＤＮＡの領域を示している。サンプル中のニューモシスティス属に属する真菌の有無を検出するための方法は、該サンプル中で配列番号１８との少なくとも８０％の相同性を共有する真菌ＤＮＡの領域の有無を検出するステップを含む。この領域は、好ましくは、配列番号１８との少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の相同性もしくは配列同一性を共有する。この配列は、より好ましくは配列番号１８と同一である。相同性は、上述したように決定できる。
【００８３】
本方法を使用すると、ニューモシスティス属に属する任意の真菌種の有無を検出することができる。これらの真菌は、ニューモシスティス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ）又はニューモシスティス・イロヴェツィイ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ）でもよい。
【００８４】
ある実施形態では、カンジダ属、アスペルギルス属もしくはニューモシスティス属に対して特異的（すなわち、配列番号５、１４および１８と相同）である真菌ＤＮＡの領域自体が検出される。また別の実施形態では、その領域から転写された任意のＲＮＡが検出される。
【００８５】
ある実施形態では、真菌ＤＮＡの領域だけが検出される。また別の実施形態では、真菌ＤＮＡの領域がより大きな配列の一部として検出される。例えば、この領域は、総真菌検出法を参照して上述したようなフランキング配列を有する配列の一部として検出できる。
【００８６】
真菌ＤＮＡもしくはそれから転写された任意のＲＮＡの領域は、総真菌検出法を参照して上述したように抽出できる。
【００８７】
真菌ＤＮＡもしくはそれから転写された任意のＲＮＡの領域は、総真菌検出法を参照して上述したように任意の方法を使用して検出できる。真菌ＤＮＡの領域を検出するステップは、好ましくは、総真菌検出法を参照して上述したように  真菌ＤＮＡもしくはそれから転写された任意のＲＮＡを増幅するステップを含む。
【００８８】
カンジダに対して特異的である真菌ＤＮＡの領域（すなわち、配列番号５と相同である領域）は、好ましくは配列番号８に示したモレキュラービーコンプローブを用いて検出される。カンジダ属に対して特異的である真菌ＤＮＡの領域は、配列番号６および７に示したプライマーを用いて増幅される。
【００８９】
アスペルギルス属に対して特異的である真菌ＤＮＡの領域（すなわち、配列番号１４と相同である領域））は、好ましくは配列番号１７に示したモレキュラービーコンプローブを用いて検出される。アスペルギルス属に対して特異的である真菌ＤＮＡの領域は、（ａ）配列番号１５および１６に示したプライマー、又は（ｂ）配列番号４６および４７に示したプライマーを用いて増幅される。
【００９０】
ニューモシスティス属に対して特異的である真菌ＤＮＡの領域（すなわち、配列番号１８と相同である領域）は、好ましくは配列番号２１に示したモレキュラービーコンプローブを用いて検出される。ニューモシスティス属に対して特異的である真菌ＤＮＡの領域は、配列番号１９および２０に示したプライマーを用いて増幅される。
【００９１】
上記の属検出法のいずれかで使用したモレキュラービーコンプローブは、検出可能に標識される。モレキュラービーコンプローブは、総真菌検出法を参照して上述した任意の方法で標識できる。
【００９２】
真菌ＤＮＡの領域は、典型的には、総真菌検出法を参照して上述した内部ＰＣＲ増幅対照の存在下でこれらの方法において検出される。
【００９３】
上記の方法の２つ又は３つは、同時に実施できる。したがって、（ｉ）カンジダ属およびアスペルギルス属、（ｉｉ）カンジダ属およびニューモシスティス属、又は（ｉｉｉ）アスペルギルス属およびニューモシスティス属に属する真菌の有無は、サンプル中で同時に検出できる。同様に、カンジダ属、アスペルギルス属およびニューモシスティス属に属する真菌の有無は、サンプル中で同時に検出できる。同時検出は、２つ以上の属に属する真菌が同時に検出されることを意味する。２つ以上の属は、典型的には同量のサンプル中で検出される。これを言い換えると、２つ以上の属は、典型的にはサンプルの相違するアリコート中では検出されない。カンジダ属、アスペルギルス属およびニューモシスティス属に属する真菌の有無を検出するための上記の方法の１つ、２つもしくは３つは、上述した総真菌検出法の１つ又は複数および／又は以下に記載する種検出法の１つ又は複数を用いる多重反応において同時に実施することができる。例えば、（ｉ）任意の真菌（すなわち総真菌）およびカンジダ属に属する真菌、（ｉｉ）任意の新規およびアスペルギルス属に属する真菌、（ｉｉｉ）任意の真菌およびニューモシスティス属に属する真菌、（ｉｖ）任意の真菌、カンジダ属に属する真菌およびアスペルギルス属に属する真菌、（ｖ）任意の真菌、カンジダ属に属する真菌およびニューモシスティス属に属する真菌、又は（ｖｉ）任意の真菌、アスペルギルス属に属する真菌およびニューモシスティス属に属する真菌の、有無をサンプル中で同時に検出することができる。実施形態（ｉ）〜（ｖｉ）のいずれかは、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・パラプシローシス、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラタもしくはカンジダ・クルセイのうちの１つ又は複数、例えば２つ、３つ、４つもしくは５つの有無の同時検出をさらに含むことができる。又は、カンジダ属、アスペルギルス属およびニューモシスティス属の１つ、２つもしくは３つに属する真菌ならびにカンジダ・トロピカリス、カンジダ・パラプシローシス、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラタおよびカンジダ・クルセイのうちの１つ又は複数、例えば、２つ、３つ、４つもしくは５つの有無は、サンプル中で同時に検出することができる。本方法は、典型的には同量のサンプル中で同時に実施されるが、すなわちそれらは典型的にはサンプルの相違するアリコート中では実施されない。
【００９４】
２つ以上の方法が同時に実施される場合は、相違する真菌ＤＮＡの領域を検出するために使用する相違するプローブ（真菌又は相違する属もしくは種の有無を指示する）は、典型的には相違する標識で標識される。相違する標識を有するプローブは、相違する真菌ＤＮＡの領域が同量のサンプル中で同時に検出される場合には好ましい。２つ以上の真菌が同量のサンプル中で検出される場合は、相違する標識管を識別し、そこで相違する領域の真菌ＤＮＡを検出することが可能でなければならない。例えば、相違する波長の光線を発光する蛍光分子を使用できる。その各々を同時に検出できる適切な蛍光標識の群は、ＨＥＸフルオレセインホスホルアミダイト（ＨＥＸ）、カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、Ｃｙ（登録商標）５およびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）である。その他の適切な群の標識は、当分野において公知である。
【００９５】
＜種検出法＞
本発明は、サンプル中におけるカンジダ・トロピカリス種、カンジダ・パラプシローシス種、カンジダ・アルビカンス種、カンジダ・グラブラタ種又はカンジダ・クルセイ種に属する真菌の有無を迅速に検出するための方法をさらに提供する。カンジダ・パラプシローシス種に属する真菌は、第Ｉ群（カンジダ・パラプシローシスとしても知られている）、第ＩＩ群（Ｃａｎｄｉｄａ  ｏｒｔｈｏｐｓｉｌｏｓｉｓとしても知られている）又は第ＩＩＩ群（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍｅｔａｐｓｉｌｏｓｉｓとしても知られている）に属していてもよい。本方法は、サンプル内に特定の種に属する真菌が含有されているか否かの迅速な指示を提供する。本方法は、特異的モレキュラービーコンプローブを使用してサンプル中で真菌ＤＮＡの領域を検出するステップを含む。特異的モレキュラービーコンプローブは、各種に対して特異的な真菌ＤＮＡの領域を検出する。これらの領域は、図５における１つの種の配列だけに及ぶ影付き囲みの中に示されている（配列番号３０、３４、３６、３８および４０）。１つの種に対して特異的であるＤＮＡの領域は、その真菌の種にのみ存在するＤＮＡの領域である。そこで、１つの種に対して特異的な真菌ＤＮＡの領域は、同一属のゲノム内でさえ、他の種のゲノム内には存在していない。１つの属に対して特異的であるＤＮＡの領域は、任意の他の生物、詳細には微生物、例えば細菌もしくはウイルスのゲノム内には存在しない。サンプル中の特定種に対して特異的である真菌ＤＮＡの領域の存在は、そのサンプル中でのその種に属する真菌が存在する指標である。サンプルからの特定種に対して特異的である真菌ＤＮＡの領域の非存在は、そのサンプル中でのその種に属する真菌が非存在である指標である。
【００９６】
本方法は、任意のサンプルを対象に実施できる。以下では、特定タイプのサンプルについてより詳細に考察する。１つの実施形態では、総真菌検出法を参照して上述したように真菌を含有することが既知であるサンプルを対象に実施される。また別の実施形態では、本方法は、その真菌含有状態が既知ではないサンプルを対象に実施される。本方法は、典型的には、カンジダ・トロピカリス種、カンジダ・パラプシローシス種、カンジダ・アルビカンス種、カンジダ・グラブラタ種又はカンジダ・クルセイ種に属する真菌が疑われるサンプルを対象に実施される。
【００９７】
１つの実施形態では、真菌ＤＮＡの領域自体が検出される。また別の実施形態では、その領域から転写された任意のＲＮＡが検出される。
【００９８】
１つの実施形態では、真菌ＤＮＡの領域だけが検出される。また別の実施形態では、真菌ＤＮＡの領域がより大きな配列の一部として検出される。例えば、この領域は、総真菌検出法を参照して上記で考察したようなフランキング配列を有する配列の一部として検出できる。
【００９９】
真菌ＤＮＡもしくはそれから転写された任意のＲＮＡの領域は、総真菌検出法を参照して上述したように抽出できる。
【０１００】
カンジダ・トロピカリスに対して特異的である真菌ＤＮＡの領域の有無は、配列番号３３に示したモレキュラービーコンプローブを用いて検出される。カンジダ・パラプシローシスに対して特異的である真菌ＤＮＡの領域の有無は、配列番号３５に示したモレキュラービーコンプローブを用いて検出される。カンジダ・アルビカンスに対して特異的である真菌ＤＮＡの領域の有無は、配列番号３７に示したモレキュラービーコンプローブを用いて検出される。カンジダ・グラブラタに対して特異的である真菌ＤＮＡの領域の有無は、配列番号３９に示したモレキュラービーコンプローブを用いて検出される。カンジダ・クルセイに対して特異的である真菌ＤＮＡの領域の有無は、配列番号４３に示したモレキュラービーコンプローブを用いて検出される。モレキュラービーコンプローブは、検出可能に標識される。モレキュラービーコンプローブは、総真菌検出法を参照して上述した任意の方法によって標識できる。
【０１０１】
真菌ＤＮＡの領域を検出するステップは、好ましくは、総真菌検出法を参照して上述したように真菌ＤＮＡもしくはそれから転写された任意のＲＮＡを増幅するステップを含む。５つの種のうちのいずれか１つにおける真菌ＤＮＡの領域は、好ましくは配列番号３１および３２に示したプライマーを用いて増幅される。カンジダ・クルセイにおける真菌ＤＮＡの領域は、配列番号４１および４２に示したプライマーを用いて検出される。
【０１０２】
真菌ＤＮＡの領域は、典型的には、総真菌検出法を参照して上述した内部ＰＣＲ増幅対照の存在下でこれらの方法において検出される。
【０１０３】
２つ以上の上記の種検出法は、同時に実施できる。詳細には、２つ、３つ、４つもしくは５つの方法は、任意の組み合わせで同時に実施できる。そこで、２つ、３つ、４つもしくは５つの特定種に属する真菌の有無は、サンプル中で同時に検出することができる。同時検出は、２つ以上の種に属する真菌が同時に検出されることを意味する。２つ以上の種は、典型的には同量のサンプル中で検出される。これを言い換えると、２つ以上の種は、典型的にはサンプルの相違するアリコート中では検出されない。特定のカンジダ種の有無を検出するための１つ以上、例えば２つ、３つ、４つもしくは５つの上記方法は、上述した総真菌検出法の１つ又は複数および／又は上述した属検出法の１つ又は複数、例えば２つもしくは３つを用いて同時に実施することができる。例えば、上記に記載した組み合わせに加えて、任意の真菌（すなわち、総真菌）およびカンジダ・トロピカリス、カンジダ・パラプシローシス、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラタおよびカンジダ・クルセイの１つ又は複数、例えば２つ、３つ、４つもしくは５つの有無をサンプル中で同時に検出することができる。本方法は、典型的には同量のサンプル中で同時に実施される、すなわちそれらは典型的にはサンプルの相違するアリコート中では実施されない。
【０１０４】
２つ以上の特定種が同時に検出される場合は、相違する真菌ＤＮＡの領域（相違する種を指示する）は、好ましくは配列番号３１および３２に示したプライマーを用いて増幅される。これらのプライマーは、５つの特定真菌種の各々における適切な領域を増幅する。
【０１０５】
２つ又は３つの方法が同時に実施される場合は、相違する真菌ＤＮＡの領域を検出するために使用する相違するプローブ（真菌又は相違する属もしくは種の有無を指示する）は、典型的には属検出法を参照して上記で考察したように相違する標識で標識される。
【０１０６】
＜サンプル＞
本発明において使用するサンプルは、任意の適切なサンプルであってもよい。本発明は、典型的には生物学的サンプルを対象に実施される。本発明は、好ましくは生物学的サンプルを対象にインビトロで実施される。生物学的サンプルは、任意の生物から入手又は抽出できる。生物は、典型的には真核生物であり、植物界又は動物界に属していてもよい。サンプルは、真菌のコロニーであってもよい。
【０１０７】
サンプルは、好ましくは液状サンプルである。サンプルは、典型的には体液を含む。サンプルは、尿、リンパ液、唾液、脳脊髄液、腹水、心嚢液、硝子体液もしくは他の眼サンプル、胸膜水、膣液、粘液、膿もしくは羊水であってもよいが、好ましくは血液、血漿もしくは血清である。サンプルは、例えば肺、脳、肝臓、皮膚もしくは爪などの細胞もしくは組織サンプルであってもよい。
【０１０８】
典型的には、サンプルはヒト起源であるが、その代わりに、サンプルは非ヒトであってもよい。例えば、サンプルは、例えばウマ、ウシ、ヒツジもしくはブタなどの商業的農耕動物などの動物由来であってもよく、又はネコもしくはイヌなどのペットであってもよい。サンプルは、さらにまた例えば昆虫などの他の生物由来であってもよい。サンプルは、抗真菌剤による治療を受けているヒト又は非ヒト動物由来であってもよい。
【０１０９】
本発明は、さらにまた非生物学的サンプルを対象に実施することができる。非生物学的サンプルは、流体もしくは固体であってもよい。非生物学的サンプルの例には、手術液体、空気、飲料水などの水、臨床検査のための試薬および家庭用容器が含まれる。サンプルは、空気、水、その他の液体もしくは物質を含有する粒子捕集装置であってもよい。
【０１１０】
サンプルは、典型的には本発明において使用する前に、例えば遠心分離によって、又は例えば赤血球などの望ましくない分子もしくは細胞を濾過して除去する膜に通しての通過によって処理される。サンプルは、本発明において使用する前にポリメラーゼ連鎖反応を受けていてもよい。サンプルは、採取後直ちに測定できる。サンプルはさらに、アッセイ前に、好ましくは−７０℃未満で保存することもできる。
【０１１１】
＜キット＞
本発明は、本発明の方法を実施するための様々なキットをさらに提供する。詳細には、本発明は、以下のキットを提供する。
サンプル中の任意の真菌の有無を迅速に検出するためのキットであって、
（ａ）配列番号４に示したモレキュラービーコンプローブならびに配列番号２および３に示したプライマー、
（ｂ）配列番号４４に示したモレキュラービーコンプローブ、配列番号４８および５０に示したセンスプライマーの一方もしくは両方ならびに配列番号４９および５１に示したアンチセンスプライマーの一方もしくは両方、又は
（ｃ）配列番号４５に示したモレキュラービーコンプローブ、配列番号４８および５０に示したセンスプライマーの一方もしくは両方ならびに配列番号４９および５１に示したアンチセンスプライマーの一方もしくは両方を含むキット。
サンプル中のカンジダ属に属する真菌の有無を迅速に検出するためのキットであって、配列番号８に示したモレキュラービーコンプローブ及び配列番号６および７に示したプライマーを含むキット。
サンプル中のアスペルギルス属に属する真菌の有無を迅速に検出するためのキットであって、配列番号１７に示したモレキュラービーコンプローブならびに
（ａ）配列番号１５および１６、又は
（ｂ）配列番号４６もしくは４７に示したプライマー
を含むキット。
サンプル中のニューモシスティス属に属する真菌の有無を迅速に検出するためのキットであって、配列番号２１に示したモレキュラービーコンプローブならびに配列番号１９および２０に示したプライマーを含むキット。
サンプル中のカンジダ属の特定種に属する真菌の有無を迅速に検出するためのキットであって、配列番号３１および３２もしくは４１および４２に示したプライマーならびに配列番号３３、３５、３７、３９および４３に示したモレキュラービーコンプローブの１つ又は複数を含むキット。
【０１１２】
サンプル中のカンジダ属の特定種に属する真菌の有無を迅速に検出するためのキットは、配列番号３３、３５、３７、３９および４３に示したモレキュラービーコンプローブの１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つ全てを含んでよい。
【０１１３】
本キットは、好ましくはサンプルから真菌ＤＮＡ又はＲＮＡを抽出するための試薬および／又は真菌ＤＮＡの領域を増幅するために使用できるプライマーおよび／又は増幅段階および検出段階のための内部対照をさらに含む。内部対照は、好ましくは配列番号９に示したトウモロコシｔＲＮＡ−ＬＥＵイントロン領域の部分、配列番号１１および１２に示したオリゴヌクレオチドプライマーの対ならびに配列番号１３に示したモレキュラービーコンプローブを含む。本キットは、上記に記載したように本発明の方法を実施することを可能にする１つ又は複数の他の試薬もしくは機器をさらに含んでよい。そのような試薬もしくは機器には、適切なバッファー（水溶液）、被験者からサンプルを入手するための手段（例えば容器、又は針を含む器具）又はその上で反応を実施できるウェルを含む支持体のうちの１つ又は複数が含まれる。試薬は、液体サンプルが試薬を再懸濁させるように乾燥状態でキット内に存在してもよい。キットは、任意選択により、本キットを本発明の方法において使用することを可能にする取扱説明書を含んでもよい。
【０１１４】
＜発明の使用＞
本発明は、サンプル中の真菌の検出および同定に関する。このため本発明は、患者における真菌感染症を診断するために使用できる。本発明は、任意の非生物学的生成物中又はその上の真菌の存在およびそこでその生成物が真菌感染症を引き起こす可能性を決定するためにも使用できる。非生物学的サンプルが真菌を含有していないことを保証することが重要な多数の状況がある。例には、飲料水および検査室で使用される液体が含まれる。詳細には、本発明は、構成成分に真菌核酸が全く含まれていないことを保証するために真菌診断キットにおける成分を予備試験する（すなわち、品質管理ステップ）ために使用できる。本発明のその他の使用は、当業者には明白である。
【０１１５】
［実施例］
表１−実施例において使用されるプライマーおよびプローブの配列。
【表１Ａ】
2010523076.tif 000003
【０１１６】
太字で強調した配列（配列番号１０）は、以下に示すモレキュラービーコンプローブ（配列番号１３）を用いて検出した。下線を付した配列は、以下に示したプライマー（配列番号１１および１２）が結合する配列を示している。
【表１Ｂ】
2010523076.tif 000004
【表１Ｃ】
2010523076.tif 000005
【実施例１】
【０１１７】
＜総真菌のモレキュラービーコンプローブについての融解曲線＞
プライマーおよびモレキュラービーコンプローブを設計するために報告された配列を使用した。モレキュラービーコンプローブおよびＤＮＡプライマー（表１、Ｉ）は、Ｂｅａｃｏｎ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ  ３．０ソフトウエア（ＰＲＥＭＩＥＲ  Ｂｉｏｓｏｆｔ社、カリフォルニア州パロアルト）を用いて設計した。すべてのモレキュラービーコンプローブおよびプライマー構築のためにデフォルトソフトウエアパラメーターを適用した。モレキュラービーコンプローブは、５’末端では蛍光体の５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）および３’末端ではダブシルを用いて標識した。モレキュラービーコンプローブおよびプライマーは、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（カリフォルニア州ノヴァト）から購入した。モレキュラービーコンプローブのハイブリダイゼーション特性は、一本鎖標的オリゴヌクレオチドを用いて２５℃〜９５℃の全温度範囲について試験した。モレキュラービーコンプローブ−標的ハイブリダイゼーションは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＭＸ４０００  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ定量的ＰＣＲシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、カリフォルニア州ラ・ホーヤ）を用いて実施した。データ監視および分析のためにＭＸ４０００ソフトウエア内で、「モレキュラービーコンプローブ融解曲線」実験のタイプを選択した。
【０１１８】
各５０μＬのハイブリダイゼーション反応混合物は、１×のＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｏｒｅ  ＰＣＲバッファー、４ｍＭのＭｇＣｌ２、１００ｐｍｏｌの個別標的オリゴヌクレオチドおよび５ｐｍｏｌのモレキュラービーコンプローブを含有していた。実験の温熱条件は、９５℃で３分間にわたる加熱および８０℃への冷却、その後の−０．５℃の温度勾配を用いる３０秒間ずつの１１２ステップを用いた２５℃への冷却を含んだ。各個別反応についての蛍光出力を冷却ステップの終了時に測定した。各モレキュラービーコンプローブ対についての融解温度（Ｔｍ）は、蛍光出力Ｒ’（Ｔ）の一次導関数の最大値に対応する温度点としてＭＸ４０００ソフトウエアによって決定した。
【実施例２】
【０１１９】
＜任意の真菌の検出（総真菌検出）＞
リアルタイム増幅アッセイは、表Ｉに記載したプライマーおよびプローブ（配列番号２〜４）を用いて実施された。本アッセイは、モレキュラービーコンプローブを用いたリアルタイム検出を使用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ増幅を含んだ。複数の真菌種からのＤＮＡは、グラム陽性およびグラム陰性菌から抽出したＤＮＡからなる陰性対照を一緒に用いて試験した。試験した種は、アスペルギルス・フラブス、アスペルギルス・フミガータス、アスペルギルス・ジャポニクス、アスペルギルス・ニデュランス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・テレウス、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・ドゥブリニエンシス、カンジダ・グラブラタ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｅｙｆｒ、カンジダ・クルセイ、カンジダ・ルシタニアエ、カンジダ・リポリチカ、カンジダ・パラプシローシス、カンジダ・ルゴーサ、カンジダ・トロピカリス、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、サッカロミセス・セレビジエ、ニューモシスティス・カリニ、ニューモシスティス・イロヴェツィイ、大腸菌および黄色ブドウ球菌であった。臨床サンプルから入手したニューモシスティス属のサンプルを除いて、使用したＤＮＡは、ＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ、米国バージニア州マナッサス）から入手した菌株由来であった。
【０１２０】
手順は次のとおりであった。リアルタイムＰＣＲ実験は、「定量的ＰＣＲ（複数標準物質）」設定を用いてＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｍｘ４０００多重定量的ＰＣＲシステム上で実施した。Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ社（ベルギー国リエージュ）からの試薬を全反応のために使用した。各５０μＬのＰＣＲ反応液は、１×のＥｕｒｏｇｅｎｔｅｃ反応バッファー、０．２μＭのモレキュラービーコンプローブ（Ｉｂ、配列番号３）、０．２５μＭの表１に示したＩａのプライマー各々（配列番号１および２）、１．２５ＵのＨｏｔＧｏｌｄＳｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ社、ベルギー国リエージュ）、０．４ｍＭのｄＮＴＰｓ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｐｇ〜１００ｎｇの真菌染色体ＤＮＡを含有していた。リアルタイムＰＣＲサーマルサイクラーのパラメーターは、９５℃で１０分間の１サイクル、９５℃で３０秒間、５０℃で３０秒間および７２℃で３０秒間の４５サイクルであった。Ｍｘ４０００システムのフィルタ・ゲインセットはＦＡＭ−９６０に変更した。蛍光は、アニーリングステップ中に３回測定された。
【０１２１】
ＰＣＲ増幅中にＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｍｘ４０００システムから生じる蛍光シグナルは、Ｍｘ４０００ソフトウエアを用いてリアルタイムで監視した。各ランの終了時に、増幅プロットデータをグラフフォーマットへ変換し、イメージファイルとして保存した、又はＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｏｆｆｉｃｅ  Ｅｘｃｅｌにエクスポートし、スプレッドシートファイルとして保存した。個々の蛍光体についての蛍光における全変化（Ｒｐｏｓｔ−Ｒｐｒｅ）は、分析のための数値として収集した。結果は、グラフもしくは数的フォーマットへ変換し、イメージファイルもしくはスプレッドシートファイルとして保存した。結果の要約は、表２に示した。
【０１２２】
【表２】
2010523076.tif 000006
【実施例３】
【０１２３】
＜アスペルギルスおよびカンジダＤＮＡのマルチプレックス検出＞
アスペルギルス、カンジダおよび総真菌（任意の真菌の存在）ＤＮＡを検出するためのリアルタイム増幅アッセイは、表１、ＩＩＩ（配列番号１１〜１３）に記載したプライマーおよびプローブを用いる内部対照ＤＮＡの存在についてのアッセイと一緒に、表１、Ｉ（配列番号２〜４）、ＩＩ（配列番号６〜７）およびＩＶ（配列番号１５〜１７）に記載したプライマーおよびプローブを用いて実施した。検出を可能にするために、蛍光体をビーコンプローブへコンジュゲートした。使用した蛍光体は、表３に示した。
【０１２４】
【表３】
2010523076.tif 000007
【０１２５】
本アッセイは、モレキュラービーコンプローブを用いたリアルタイム検出を使用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ増幅を含んだ。複数の真菌種由来のＤＮＡは、ＤＮＡ鋳型を含まない陰性対照を一緒に用いて試験した。
【０１２６】
リアルタイムＰＣＲ実験は、「定量的ＰＣＲ（複数標準物質）」設定を用いてＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｍｘ４０００多重定量的ＰＣＲシステム上で実施した。全反応のためにＥｕｒｏｇｅｎｔｅｃ  ｑＰＣＲ  ＭａｓｔｅｒＭｉｘ  Ｎｏ  ＲＯＸキットを使用した。各５０μＬのＰＣＲ反応液は、１×ｐＰＣＲ  ＭａｓｔｅｒＭｉｘを４ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｐｍｏｌの各モレキュラービーコン、１０〜２０ｐｍｏｌの各プライマーおよび１００ｎｇの各ＤＮＡ又は鋳型を含まない対照のための水を含有していた。ＰＣＲ反応は、９５℃で１０分間の１サイクル、９５℃で３０秒間、５０℃で３０秒間および７２℃で３０秒間の４５サイクルのパラメーターを用いて実施した。蛍光は、アニーリングステップ中に３０回測定した。
【０１２７】
ＰＣＲ増幅中にＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｍｘ４０００システムから生じる蛍光シグナルは、Ｍｘ４０００ソフトウエアを用いてリアルタイムで監視した。各ランの終了時に、増幅プロットデータをグラフフォーマットへ変換し、イメージファイルとして保存した、又はＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｏｆｆｉｃｅ  Ｅｘｃｅｌにエクスポートし、スプレッドシートファイルとして保存した。個々の蛍光体についての蛍光における全変化（Ｒｐｏｓｔ−Ｒｐｒｅ）は、分析のための数値として収集した。結果は、グラフもしくは数的フォーマットへ変換し、イメージファイルもしくはスプレッドシートファイルとして保存した。結果の要約は、図２に示した。
【実施例４】
【０１２８】
＜アスペルギルスおよびニューモシスティスＤＮＡのマルチプレックス検出＞
アスペルギルス、ニューモシスティス（ＰＣＰ）および総真菌（任意の真菌の存在）ＤＮＡを検出するためのリアルタイム増幅アッセイは、表１、ＩＩＩ（配列番号１１〜１３）に記載したプライマーおよびプローブを用いる内部対照ＤＮＡの存在についてのアッセイと一緒に、表１、Ｉ（配列番号２〜４）、ＩＩ（配列番号１５〜１７）およびＩＶ（配列番号１９〜２１）に記載したプライマーおよびプローブを用いて実施された。
【０１２９】
検出を可能にするために、蛍光体をビーコンプローブへコンジュゲートした。使用した蛍光体は、表４に示した。
【０１３０】
【表４】
2010523076.tif 000008
【０１３１】
本アッセイは、モレキュラービーコンプローブを用いたリアルタイム検出を使用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ増幅を含んだ。複数の真菌種由来のＤＮＡは、ＤＮＡ鋳型を含まない陰性対照を一緒に用いて試験した。
【０１３２】
リアルタイムＰＣＲ実験は、「定量的ＰＣＲ（複数標準物質）」設定を用いてＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｍｘ４０００多重定量的ＰＣＲシステム上で実施した。全反応のためにＥｕｒｏｇｅｎｔｅｃ  ｑＰＣＲ  ＭａｓｔｅｒＭｉｘ  Ｎｏ  ＲＯＸキットを使用した。各５０μＬのＰＣＲ反応液は、１×ｐＰＣＲ  ＭａｓｔｅｒＭｉｘを４ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｐｍｏｌの各モレキュラービーコン、１０〜２０ｐｍｏｌの各プライマーおよび１００ｎｇまでの各ＤＮＡ又は鋳型を含まない対照のための水を含有していた。ＰＣＲ反応は、９５℃で１０分間の１サイクル、９５℃で３０秒間、５０℃で３０秒間および７２℃で３０秒間の４５サイクルのパラメーターを用いて実施した。蛍光は、アニーリングステップ中に３０回測定した。
【０１３３】
ＰＣＲ増幅中にＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｍｘ４０００システムから生じる蛍光シグナルは、Ｍｘ４０００ソフトウエアを用いてリアルタイムで監視した。各ランの終了時に、増幅プロットデータをグラフフォーマットへ変換し、イメージファイルとして保存した、又はＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｏｆｆｉｃｅ  Ｅｘｃｅｌにエクスポートし、スプレッドシートファイルとして保存した。個々の蛍光体についての蛍光における全変化（Ｒｐｏｓｔ−Ｒｐｒｅ）は、分析のための数値として収集した。結果は、グラフもしくは数的フォーマットへ変換し、イメージファイルもしくはスプレッドシートファイルとして保存した。結果の要約は、図３に示した。
【実施例５】
【０１３４】
＜非生物学的サンプル中の真菌の検出＞
リアルタイム増幅アッセイは、総真菌（任意の真菌の存在）ＤＮＡを検出するために、表１、Ｉ（配列番号２〜４）に記載したプライマーおよびプローブ（配列番号２〜４）を用いて実施した。９つの水のサンプルは、病院中の様々な部屋から採取し、滅菌検査室用水、陽性（抽出したアスペルギルス属ゲノムＤＮＡ）および陰性（無菌ＰＢＳ）対照と一緒に試験した。
【０１３５】
手順は次のとおりであった。リアルタイムＰＣＲ実験は、「定量的ＰＣＲ（複数標準物質）」設定を用いてＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｍｘ４０００多重定量的ＰＣＲシステム上で実施した。Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ社（ベルギー国リエージュ）からの試薬を全反応のために使用した。各５０μＬのＰＣＲ反応液は、１×Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ反応バッファー、０．２μＭのモレキュラービーコンプローブ（Ｉｂ、配列番号３）、０．２５μＭの表１に示したＩａのプライマー各々（配列番号１および２）、１．２５ＵのＨｏｔＧｏｌｄＳｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ社、ベルギー国リエージュ）、０．４ｍＭのｄＮＴＰｓ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｐｇ〜１００ｎｇの真菌染色体ＤＮＡを含有していた。リアルタイムＰＣＲサーマルサイクラーのパラメーターは、９５℃で１０分間の１サイクル、９５℃で３０秒間、５０℃で３０秒間および７２℃で３０秒間の４５サイクルであった。Ｍｘ４０００システムのフィルタ・ゲインセットはＦＡＭ−９６０に変更した。蛍光は、アニーリングステップ中に３回測定した。
【０１３６】
ＰＣＲ増幅中にＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｍｘ４０００システムから生じる蛍光シグナルは、Ｍｘ４０００ソフトウエアを用いてリアルタイムで監視した。各ランの終了時に、増幅プロットデータをグラフフォーマットへ変換し、イメージファイルとして保存した、又はＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｏｆｆｉｃｅ  Ｅｘｃｅｌにエクスポートし、スプレッドシートファイルとして保存した。個々の蛍光体についての蛍光における全変化（Ｒｐｏｓｔ−Ｒｐｒｅ）は、分析のための数値として収集した。結果は、グラフもしくは数的フォーマットへ変換し、イメージファイルもしくはスプレッドシートファイルとして保存した。結果の要約は、表５および図４に示した。
【０１３７】
【表５】
2010523076.tif 000009
【実施例６】
【０１３８】
＜特定のカンジダ種の検出＞
実験は、実施例２〜５について上記で考察したように実施した。
【０１３９】
リアルタイム増幅アッセイは、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）を検出するために、表Ｉに記載したプライマーおよびプローブ（配列番号３１〜３３）を用いて実施した。多重反応において同時に試験したその他のサンプルは、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ）、カンジダ・ネオフォルマンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、カンジダ・ドゥブリニエンシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ）、カンジダ・ルシタニアエ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）、スタフィロコッカス・セレビジエ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、アスペルギルス・フミガータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、カンジダ・ギリエルモンジイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）およびカンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）ならびに水から抽出したＤＮＡであった。結果の要約は、図６に示した。
【０１４０】
リアルタイム増幅アッセイは、カンジダ・パラプシローシスを検出するために、表Ｉ、ＶＩＩに記載したプライマーおよびプローブ（配列番号３１、３２および３５）を用いて実施した。試験したサンプルは、カンジダ・トロピカリスについて試験したサンプルと同一であった。結果の要約は、図７に示した。
【０１４１】
リアルタイム増幅アッセイは、カンジダ・アルビカンスを検出するために、表Ｉ、ＶＩＩＩに記載したプライマーおよびプローブ（配列番号３１、３２および３７）を用いて実施した。試験したサンプルは、カンジダ・トロピカリスについて試験したサンプルと同一であった。結果の要約は、図８に示した。
【０１４２】
リアルタイム増幅アッセイは、カンジダ・グラブラタを検出するために、表Ｉ、ＩＸに記載したプライマーおよびプローブ（配列番号３１、３２および３９）を用いて実施した。試験したサンプルは、カンジダ・トロピカリスについて試験したサンプルと同一であった。結果の要約は、図９に示した。
【０１４３】
リアルタイム増幅アッセイは、カンジダ・クルセイを検出するために、表Ｉ、Ｘに記載したプライマーおよびプローブ（配列番号３１、３２および４３）を用いて実施した。試験したサンプルは、カンジダ・トロピカリスについて試験したサンプルと同一であった。結果の要約は、図１０に示した。
【０１４４】
本発明は、当業者には本発明の所定の態様を具体的に説明するためにのみ役立ち、本明細書に提示した好ましい実施形態および実施例に限定されないことを理解されたい。本発明のその他の実施形態は、当業者には明白であるが、本発明の範囲および精神の範囲内に含まれると見なされる。
【実施例７】
【０１４５】
＜総真菌病原体および内部対照を検出するための４色多重モレキュラービーコンプローブの使用＞
病原性真菌および内部対照を検出するための４色多重アプローチは、モレキュラービーコンプローブを用いるリアルタイム定量的ＰＣＲのために開発された。マルチプレックスパネルは、全真菌（総真菌）、全カンジダ種（総カンジダ）、全アスペルギルス種（総アスペルギルス）および新規な非ヒトおよび非真菌内部対照ＤＮＡ配列（内部対照）を含んだ。
【０１４６】
総アスペルギルスプローブに対する検出感受性を強化するために、２つの新規プライマー（配列番号４６および４７）を設計し、さらに広汎な総真菌範囲を有する１８Ｓリボソーム遺伝子内の新規な標的領域もまた同定した。これらの領域を使用して、「ｖ．２」および「ｖ．３」と表示したプライマーならびに「ｖ．２．３」および「ｖ．３．３」と表示したモレキュラービーコンを設計した。以下の表６および７を参照されたい。
【０１４７】
２パネルの４色多重プローブは、総真菌ｖ．２．３もしくはｖ．３．３に内部対照、汎カンジダおよび総アスペルギルスのいずれかを加えたものを用いて使用した。各パネルは、多重特異性を評価するために、様々な標的ゲノムＤＮＡを用いて評価した。
【０１４８】
リアルタイムＰＣＲ実験は、「定量的ＰＣＲ（複数標準物質）」設定を用いてＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｍｘ４０００多重定量的ＰＣＲシステム上で実施した。全反応のためにＥｕｒｏｇｅｎｔｅｃ  ｑＰＣＲ  ＭａｓｔｅｒＭｉｘ  Ｎｏ  ＲＯＸキットを使用した。各５０μＬのＰＣＲ反応液は、１×のｐＰＣＲ  ＭａｓｔｅｒＭｉｘを４ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｐｍｏｌの各モレキュラービーコン、１０〜２０ｐｍｏｌの各プライマーおよび１００ｎｇまでの各ＤＮＡ又は鋳型を含まない対照のための水を含有していた。ＰＣＲ反応は、９５℃で１０分間の１サイクル、９５℃で３０秒間、５０℃で３０秒間および７２℃で３０秒間の４５サイクルで実施した。蛍光は、アニーリングステップ中に３０回測定した。
【０１４９】
リアルタイムＰＣＲは、各パネルの特異性を評価するために単一鋳型を使用して２枚のマルチプレックスパネルを用いて実施した。このアッセイのための鋳型として、Ａ．フミガータス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．Ａｌｂｉｃａｎｓ）、Ｃ．ネオフォルマンス（Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、Ｒ．オリザエ（Ｒ．ｏｒｙｚａｅ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）およびトウモロコシ（Ｚ．ｍａｙｓ）ゲノムＤＮＡを使用した。
【０１５０】
【表６】
2010523076.tif 000010
【０１５１】
【表７】
2010523076.tif 000011
【０１５２】
図１３は、マルチプレックスパネル実験からのリアルタイムＰＣＲの結果のグラフ表示である。
【０１５３】
リアルタイムＰＣＲ実験は、「定量的ＰＣＲ（複数標準物質）」設定を用いてＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｍｘ４０００多重定量的ＰＣＲシステム上で実施した。全反応のためにＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ＱＰＣＲ  ＭａｓｔｅｒＭｉｘを使用した。各２５μＬのＰＣＲ反応液は、１×のＱＰＣＲ  ＭａｓｔｅｒＭｉｘを５．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｐｍｏｌの各モレキュラービーコン、１０ｐｍｏｌの各プライマーおよび１００ｎｇまでの各ＤＮＡ又は鋳型を含まない対照のための水を含有していた。ＰＣＲ反応は、９５℃で１０分間の１サイクル、９５℃で３０秒間、５０℃で３０秒間および７２℃で３０秒間の４５サイクルで実施した。蛍光は、アニーリングステップ中に３回測定した。
【０１５４】
単純反応においてアッセイした２つの総真菌プローブは、Ｚｙｏｇｍｙｃｅｔｅｓを含む１パネルの様々な真菌ＤＮＡ（ｎ＝２１）を同定した。どちらのプローブもＯｃｈｒｏｎｉｓ  ｇａｌｌｏｐａｖｕｍを含有する水および患者由来の呼吸サンプルから様々なヒト病原性真菌を増殖させなかったというシグナルを検出したが、これは検出感受性が増加したことを示唆していた。総アスペルギルスプライマーは、総アスペルギルスビーコンを含有していた多重プライマーアッセイにおける初期プライマーおよび多重反応における全プライマーと比較して、検出感受性を少なくとも１０倍増加させた。総カンジダプローブは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ機器のＨＥＸ検出チャネル上での不正確なゲイン設定の結果として他のビーコンより低い蛍光を生成した。一般に、両方のマルチプレックスパネルにおける特異的アッセイは、それらの各分析物を効率的に検出し、各マルチプレックスパネルの機能性を確証した。
【実施例８】
【０１５５】
＜アスペルギルスおよびＰｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｊｉｒｏｖｅｃｉｉのマルチプレックス検出＞
リアルタイム増幅アッセイは、極めて多数のアスペルギルス種、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｊｉｒｏｖｅｃｉｉおよび内部対照を同時に検出するために設計された。本アッセイは、モレキュラービーコンプローブを用いたリアルタイム検出を使用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ増幅を含んだ。詳細には、表８〜９に記載したプライマーおよびプローブは、これらの増幅および検出条件を用いて使用した。このセットアップは２５μＬの総量を必要としたが、そのうち５μＬは臨床サンプル、陽性又は陰性対照であった。陽性対照分子は、アスペルギルスおよびニューモシスティス標的配列を抱いている組換えプラスミドであった。マイクロタイタートレイはＰＣＲフード内で調製し、下記のラン条件を用いてＡＢ７５００サーモサイクラー上でランした。すなわち、９５℃で１０分間の１サイクル、次に９５℃で３０秒間、６０℃で１分間および７２℃で３０秒間の４０サイクル。閾値設定は、アスペルギルスに対しては０．２、ニューモシスティスおよびＩＡＣに対しては０．１に設定した。
【０１５６】
アスペルギルスＤＮＡ鋳型は、１ゲノムに付き３５〜９０コピーを有する、１８Ｓ領域内にある。この鋳型は全アスペルギルス属に共通であり、他の真菌病原体との重複はほとんど有していない。Ｐ．イロヴェツィイＤＮＡ鋳型は、ミトコンドリア大サブユニット内にある。
【０１５７】
【表８】
2010523076.tif 000012
【０１５８】
【表９】
2010523076.tif 000013
【０１５９】
＜サンプルの処理＞
臨床的呼吸（および一部の場合にはその他の）サンプル由来の真菌ＤＮＡは、臨床試験協力者から入手された。サンプルは、大多数の場合に数年間にわたり、臨床標本又はＤＮＡとして保存されていた。少数のサンプルは、予め収集された。ＤＮＡがサンプルから抽出されていなかった場合は、これは樹脂ビーズを含有するＭｙｃＸｔｒａ（商標）真菌ＤＮＡ抽出キット（Ｍｙｃｏｎｏｓｔｉｃａ社、英国マンチェスター）を用いて達成した。
【０１６０】
顕微鏡検査およびＢＡＬの培養に関する各センターで使用した方法は、以下の表に要約した。マンチェスターからのサンプルは、インフォームドコンセントを得る臨床試験の一部として採取されたが、標準微生物学検査手順によって処理した。
【０１６１】
【表１０】
2010523076.tif 000014
【０１６２】
図から明らかなように、サンプルの取扱い方法は、施設毎に相違した。標準物質ならびにニューモシスティス顕微鏡検査および真菌培養のために使用したＢＡＬの量もまた同様に変動した。例えば、インスブルック、ローザンヌおよびマンチェスターは真菌培養に先行して遠心ステップを使用したが、ルーバンでは使用しなかった。これらの差は、観察された収率における差の一部を説明する可能性がある。ルーバンの施設では、ＭｙｃＸｔｒａ（商標）キットを用いたＤＮＡ抽出のためには８００μＬのサンプルを使用し、真菌細胞を収集かつ濃縮するための初期遠心ステップは含まれていなかった。抽出すると、各サンプルからの核酸は輸送され、試験前は−８０℃で保存された。
【０１６３】
＜特異性＞
表１１は、様々な真菌を用いた交差反応性試験の結果を提供している。
【０１６４】
【表１１】
2010523076.tif 000015
【０１６５】
＜感受性＞
アスペルギルスに対する分析感受性は、Ａ．フミガータスＡ２９３から抽出した定量ＤＮＡを用いて決定した。図１４は、ゲノムコピーの検出限界が、標準方法（ＣＬＳＩ  ＥＰ１７−Ａ−「検出限界および定量限界を決定するためのプロトコール」）を用いて入手できることを証明している。
【０１６６】
ニューモシスティスに対する分析感受性は、定量組換えプラスミドＤＮＡを用いて決定した。図１５は、６つの標的コピーの検出限界が、標準方法（ＣＬＳＩ  ＥＰ１７−Ａ−「検出限界および定量限界を決定するためのプロトコール」）を用いて入手できることを証明している。標的はマルチコピー遺伝子であり、ゲノム内のコピー数が多く、このため１微生物当たりの検出限界は不明である。
【０１６７】
表１２は、これらのプライマーおよびプローブについての感受性および検出限界を提供している。
【０１６８】
【表１２】
2010523076.tif 000016
【０１６９】
アスペルギルス標的についての数値は、それに由来するゲノムが完全に塩基配列決定されているアスペルギルス・フミガータスのＡ２９３菌株を用いて決定した。このゲノム内には光学マッピングによって決定された標的の３７コピーが存在することが知られており、このため３４の標的コピーはほぼ１ゲノムコピーを表している。
【０１７０】
ニューモシスティス標的についての数値は、標的配列を抱えている組換えＤＮＡプラスミドを用いて決定した。ニューモシスティス標的配列はミトコンドリア標的であるので、１細胞に付き極めて多数のコピーが存在するが、それが幾つであるかは不明である。比較のために、１つのＡ．フミガータス核ゲノム（ＡＦ２９３中）当たり１３のミトコンドリアゲノムおよびＰｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ中の１ミトコンドリア当たり不明の数のサブユニット反復配列が存在する。
【０１７１】
＜内部増幅対照＞
抽出プロセスから反応液中への低レベル阻害剤が導入されたという予備証拠が得られた。これは、ＦＸＧアッセイにおけるより小量の溶出液量によって克服された。このため、反応液中に含まれるサンプルの量を変化させる作用を評価するために、サンプルの内部増幅対照値を試験かつ比較した。内部増幅対照の再現性は、６回の実験において実施された１３２回のアッセイにおいて決定した（以下の表を参照）。カットオフ値は、平均値からの±３標準偏差として取り出した（Ｃｔ＝３２〜３６．２）。
【０１７２】
【表１３】
2010523076.tif 000017
【０１７３】
反応液に５μＬのサンプルが加えられた臨床サンプルの試験では、３９９例中２６例（５．８％）のサンプルだけが範囲外であり、２例は低Ｃｔ値および２４例は高Ｃｔ値を示し、これはＰＣＲ阻害を指示していた。これらのうち１３例はＰＣＲの完全阻害を示した（本分析のためには４１のＣｔとして記録された）。アッセイした３９９例のサンプルについての平均Ｃｔ値は、３４．６８±１．４２であった。
【０１７４】
２μＬのサンプルが反応液に加えられた試験では、２例の内部増幅対照の結果だけが許容範囲外であった。どちらの場合にも、Ｃｔ値はその範囲より低かった（すなわち、阻害に起因しなかった）。２μＬ試験を用いて、阻害を示すサンプルは同定されなかった。
【０１７５】
低Ｃｔ値を示した両方のサンプルは、加速ＰＣＲ反応と一致して、ローザンヌからであり、この結果は２μＬおよび５μＬ反応の両方において見られた。この加速反応の性質は、決定されなかった。
【０１７６】
これらをまとめると、臨床サンプルにおける阻害の証明ならびに臨床試験の結果の精査およびそれらと培養および顕微鏡検査との相関に基づいて、その後の分析のために５μＬの量を選択した。
【０１７７】
＜ニューモシスティスの試験結果＞
結果は、次のように分析された。（ｉ）範囲外の内部増幅対照（ＩＡＣ）を有していたサンプルは強調表示して取り除かれた。（ｉｉ）Ｐ．イロヴェツィイの検出のために適切であった顕微鏡検査結果および／又はニューモシスティス肺炎菌  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）の臨床診断が下されたサンプルだけが選択された。（ｉｉｉ）ＰＣＲ陽性結果は、陽性についての適切な最低カットオフ値を評価するためにＣｔ値によって分類された。そして、（ｉｖ）結果の２×２表は、感受性、特異性、陽性（ＰＰＶ）および陰性予測（ＮＰＶ）値を決定するために顕微鏡検査（＋２例の臨床的に診断された症例）を用いて作表された。ＨＩＶ／ＡＩＤＳ患者についての二次分析もまた、これらの相違する集団におけるカットオフ値を評価するために実施された。
【０１７８】
計１９０例の結果が分析された。すなわち、ＡＩＤＳもしくはＨＩＶ感染症を有する患者からの４２例およびその他の患者からの１４８例である。陽性についての適切なカットオフ値は、アッセイの検出限界とするために、すなわち３８．５のＣｔ値を決定した。このカットオフ値を用いた結果は、以下の表に示した。
【０１７９】
【表１４】
2010523076.tif 000018
【０１８０】
Ｃｔ値は２３．５５〜検出限界（３８．５）までの範囲にわたり、これは広範囲の微生物負荷を示していた。９７．１％の感受性が良好な結果であることは明らかであり、顕微鏡検査によって２例の陽性サンプルしか検出されなかった。ＮＰＶは極めて高く（９８．１３）、高感受性試験と一致している。特異性は高くなかったが、これは１６例のサンプルが陽性結果を示したが、顕微鏡検査では陰性であり、ニューモシスティス肺炎の臨床診断は下されなかったからである。このことは、顕微鏡検査と比較してＰＣＲアッセイの方が感受性が高いことを指示している公表された文献と、そして見逃された臨床診断と一致している。陰性であった２例のサンプル中１例は非ＡＩＤＳ患者由来であり、ＢＡＬは遠心されていなかった。
【０１８１】
データをＡＩＤＳ／ＨＩＶ結果およびその他全部を詳細分析用に分離した。
【０１８２】
【表１５】
2010523076.tif 000019
【０１８３】
ＡＩＤＳ患者における試験の性能は極めて優れ、この群ではより高いＣｔ値が得られた（２４．５７〜３４．９３）。特異性およびＮＰＶについての計算は、試験のための４例の陰性サンプルを有することによってのみ制限される。
【０１８４】
【表１６】
2010523076.tif 000020
【０１８５】
非ＡＩＤＳ患者において、極めて多数の真の陰性サンプルが得られ、陽性結果のＣｔ範囲はより広かった（２３．５５〜３７．５５）。感受性は９６．８８と高く、ＮＰＶもまた９９．０２と高い。
【０１８６】
ＩＦＵにおいて提案された解釈基準は、たとえ阻害が検出された場合でさえ、ＩＦＵが陽性結果を報告することを可能にする（すなわち、上昇したＩＡＣ  Ｃｔ値）。これらの結果は、上記の表から除外した。６例のＰ．ｊｉｒｏｖｅｃｉｉの結果はこのカテゴリー内に含まれ、５例の顕微鏡検査は陽性であった（２１．０６、２２．２４、２５．１８、２５．２６、３３．５３および３５．９１のＣｔ値）。阻害剤を含有するこれらのサンプル中のＣｔ値は概して低く、最高値（３５．９１）だけが顕微鏡検査陰性であった。
【０１８７】
＜アスペルギルスの結果＞
分析ステップは、以下のとおりであった。（ｉ）範囲外の内部増幅対照（ＩＡＣ）を有していた結果が強調表示して取り除かれた。（ｉｉ）サンプルのタイプをＢＡＬ遠心するか否か、その他の呼吸標本（痰を含む）および組織／生検サンプルに分類された。（ｉｉｉ）陽性培養検査結果（呼吸サンプル）又は組織に対して陽性の培養もしくは組織学検査の結果だけが選択された。（ｉｖ）ＰＣＲ陽性結果は適切な最低カットオフ値を評価するためにＣｔ値によって分類された。（ｖ）結果の２×２表は、感受性、特異性、陽性（ＰＰＶ）および陰性予測（ＮＰＶ）値を決定するために培養検査の結果もしくは組織学検査陽性サンプルを用いて構築された。そして（ｖｉ）感受性に関する事前抗真菌療法が及ぼす可能性のある影響を決定するために結果が調査された。
【０１８８】
陽性に対するカットオフ値は、データの精査によって決定し、検出限界であると決定した（Ｃｔ  ３８．６）。このカットオフ値は、２例が３８．８２および３８．４のＣｔ値を有している正常対照由来のマンチェスターからのサンプル１５例の試験によって補強された。極めて低レベルのアスペルギルス種は正常肺中で見いだされたので、このレベルのカットオフ値は、重症患者においてさえ小量で見いだされる病原体を検出するために適切である。実際に、３８．４のＣｔ値を備えるサンプルはペニシリウム種を増殖させ、他のサンプルはＡ．フミガータスを増殖させたが、試験アッセイによっては陰性であった。これらのデータは、正常な人の肺中での極めて低レベルの真菌と一致し、本アッセイがこのレベルの検出で機能することを示している。
【０１８９】
ＩＡＣカットオフ値に基づくと、１０例のＢＡＬサンプル（５例は遠心、５例は非遠心）、５例の他の呼吸サンプルは、ＩＡＣが範囲外であったので分析から排除したが、組織／生検サンプルは除外しなかった。
【０１９０】
遠心および非遠心のＢＡＬサンプルの結果は、下記に示した。非遠心群では極めて少数のサンプルおよび少数の陽性サンプルしかないが、抽出における予備ステップとして遠心が及ぼす影響は、これらのデータから明白であると思われる。感受性は７３％〜２９％の範囲内に含まれるが、特異性は本質的に変化しない。この分析に基づいて、遠心ＢＡＬサンプルだけを全分析に含めた。遠心はこの差を説明できる可能性があるが、患者集団（大きな比率のＩＣＵ患者）、処理の相違および貯蔵因子を含む他の因子が関連する可能性がある。
【０１９１】
【表１７】
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【０１９２】
【表１８】
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【０１９３】
試験した他の呼吸サンプルは、痰、気管支吸引物、気管内吸引物、肺吸引物、１例の肺創傷ドレナージおよび１例の鼻汁を含んだ。痰サンプルの大多数は、嚢胞性線維症患者由来であった。処理した量は変動し、これらの通常は小量のサンプルの処理には遠心ステップは含まれない。これらの７５例のサンプルについての結果は以下に示した。
【０１９４】
【表１９】
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【０１９５】
遠心ＢＡＬサンプルと比較して、感受性は７３％に対して７９％で類似である。これに比例して、ＢＡＬを用いた場合より他の呼吸サンプルを用いた場合は、わずかにより多いアッセイ陽性、培養陰性結果を示し、これは９６％に対してわずかに低い特異性８８％、およびより低いＰＰＶ（６８％対８３％）をもたらした。これらの差は、おそらく、サンプル量および抗真菌処置などの多数の因子を反映している。
【０１９６】
【表２０】
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【０１９７】
分析した１９８例の呼吸サンプル中、３４例は陽性培養およびアッセイ陽性の両方であり、１４２例は真陰性であり、１１例はＦＸＧ  ＰＣＲ擬陽性および１２例はＦＸＧ  ＰＣＲ擬陰性であった。これは各々７３．９％および７５．６％の感受性およびＰＰＶ値を生じさせ、各々９２．８％および９２．２％の特異性およびＮＰＶ値を生じる。注目すべきことに、３例のＢＡＬサンプルはペニシリウム種に対して培養陽性であったが、これは本アッセイによってはアスペルギルス種から識別されない。これらが真陽性として記録されると、感受性は７５．５％に上昇し、特異性は９４．６％へ、そしてＰＰＶおよびＮＰＶは各々８２．２％および９２．２％へ上昇する。さらに注目すべきことに、リゾープス種によって惹起される接合菌症を有する２例の患者は本アッセイによって検出されず、さらにカンジダ・アルビカンスが増殖した患者由来の８例のサンプルもペシロミセスの３つの種およびカンジダ・トロピカリスによって増殖したサンプルも検出されなかった。無隔菌糸についての６例の顕微鏡検査陽性（しかし培養陰性）サンプルは、本アッセイでは陰性であった。
【０１９８】
１５例のサンプルは、ＩＡＣが範囲外であったために分析から除外した。ＩＦＵにおいて提案された解釈基準は、たとえ阻害が検出された場合でさえ、ＩＦＵが陽性結果を報告することを可能にする（すなわち、上昇したＩＡＣ  Ｃｔ値）。これらのサンプル１５例中、１３例は培養およびアッセイの両方が陰性であり、２例は培養陽性およびアッセイ陰性であった。このため、この解釈が正確であることをこのデータセットを用いて確証することは不可能であり、将来の試験における確証を必要とする。
【０１９９】
インスブルックからのＭｙｃＸｔｒａ（商標）抽出法（プロテイナーゼＫ消化が先行した）により処理した３１例の新鮮肺組織サンプルが存在した。これらは、概してリスク患者由来の陽性サンプルであるために選択したが、対照もしくは陰性は並行して処理しなかった。２つの分析を実施した。１つは、ＦＸＧ  ＰＣＲの結果を有隔菌糸（組織侵襲性疾患を誘発する全アスペルギルス種は、他のスケドスポリウム種、フザリウム種、ペニシリウム種その他などの余り一般的ではない侵襲性真菌と同様に無隔菌糸を有している）と比較し、もう１つはアスペルギルス種の培養と比較した。どちらの表も以下に示した。培養は、Ａ．フミガータスおよびＡ．テレウスに対して陽性であった。
【０２００】
【表２１】
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【０２０１】
【表２２】
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【０２０２】
データは、培養検査の性能が組織学検査の性能より優れていることを証明し、これは主として組織学検査よりむしろ培養検査では６例多いアッセイ陽性結果があるためである。これは、所見された一部の有隔菌糸がアスペルギルスではないことを示唆しているが、確認はしていない。これらをまとめると、組織学検査と比較して本アッセイについての１００％  ＰＰＶは、培養検査結果と結び付けると臨床的に有用であり、そして培養検査と比較した高感受性（８０％）は許容できる。
【０２０３】
陽性培養の大多数はＡ．フミガータスであり、これより少数がＡ．テレウス陽性であり、１例は黄色ブドウ球菌陽性であった。本アッセイは、最も一般的な病原性種であるこれらの３つの種を検出した（＞９８％）。１例のアスペルギルス・ニガーおよび１例のＡ．グラウクス（Ａ．  ｇｌａｕｃｕｓ）がサンプルから培養されたが、どちらも本アッセイでは陰性であった。どちらの場合にも、それらは混合陽性培養（Ｃ．アルビカンスおよびリゾープス・オリザエ）であった。いずれも疾患には関係しなかった。
【０２０４】
リアルタイム検出アッセイは、大規模レトロスペクティブ多施設共同試験においてＰｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｊｉｒｏｖｅｃｉｉおよびアスペルギルス種を迅速に検出するために良好に機能した。データは、真菌属および＜１０真菌細胞の検出限界両方の高効率抽出と一致している。ニューモシスティスは肺胞病原菌であり、このため気管支および末梢気道における疾患において大量に存在している。アスペルギルスは、通常は気道内には少数の真菌細胞が存在するが、極めて多数の真菌細胞が存在する太い気道においてもコロニー増殖して感染させる可能性がある実質性疾患（侵襲性アスペルギルス症）を引き起こす。臨床性能データは、アスペルギルスよりＰ．ｊｉｒｏｖｅｃｉｉに対して証明可能な高い感受性を伴って、これらの相違する病理と一致している。アッセイのアスペルギルス成分の特異性は絶対的ではないが、追加の真菌が検出される。これらは主として、エキノカンジンもしくはイトラコナゾールに対しては感受性ではないフザリウム種だけを除いて、アスペルギルスに対する類似の抗真菌感受性プロファイルを備える真菌である。ＰＣＲ阻害に起因する試験の失敗は頻回ではなく、原因不明であったが、それはＭｙｃＸｔｒａ（商標）キットが吸入薬を含む多数の潜在的阻害剤を排除するからである。ニューモシスティス（およびアスペルギルスへの拡張によって）に対しては、陽性結果は、阻害剤が存在する場合でさえ安全な可能性があるが、他方陰性結果は安全ではない。少数の肺生検標本についての追加のデータは、特に培養と比較した場合の良好な性能を証明している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１３Ｇ】
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【図１３Ｈ】
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【図１３Ｉ】
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【図１３Ｊ】
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【図１３Ｋ】
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【図１３Ｌ】
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【図１３Ｍ】
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【図１３Ｎ】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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