(57)【要約】【課題】現在のところ、予防的投薬がより適切であろう個体から、この高リスク群内でそれらを区別する情報はほとんどなく、ライフスタイル介入が疾患予防の最良の選択であろう。感受性遺伝子の同定は該疾患の病態生理学のより良い理解を可能にするであろうし、そして患者の直接的利点として、それは診断及び治療についてのより良いアプローチを容易にするであろう。２型糖尿病の予防のための療法剤も必要とされている。【解決手段】関連解析は、ある種の変異体が２型糖尿病についての感受性変異体であることを示した。本発明は、こうした感受性変異体の診断応用に関し、個体において２型糖尿病への増加した感受性を決定する方法、ならびに、２型糖尿病への減少した感受性を決定する方法を含む。本発明はさらに、本明細書に記載した該変異体に基づいた、２型糖尿病への感受性を決定するためのキットに関する。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト個体における２型糖尿病への感受性を決定する方法であって、該個体から得られた核酸サンプル中の少なくとも一つの多型マーカーの少なくとも一つのアレルの存在又は不存在を決定することを含んでなり、該少なくとも一つの多型マーカーは、表１０〜１２に示したマーカー及びそれらと連鎖不平衡にあるマーカーより選択され、及び該少なくとも一つのアレルの存在又は不存在は、２型糖尿病に対する感受性を示す、前記方法。
【請求項２】
該少なくとも一つの多型マーカーが、配列番号１、配列番号２又は配列番号３内に存在する、請求項１の方法。
【請求項３】
該少なくとも一つの多型マーカーが、ｒｓ２４９７３０４（配列番号１６）、ｒｓ９４７５９１（配列番号３０）、ｒｓ１０８８２０９１（配列番号４）、ｒｓ７９１４８１４（配列番号２４）、ｒｓ６５８３８３０（配列番号２０）、ｒｓ２４２１９４３（配列番号１５）、ｒｓ６５８３８２６（配列番号１９）、ｒｓ７７５２９０６（配列番号３２）、ｒｓ１５６９６９９（配列番号６）、ｒｓ７７５６９９２（配列番号２１）、ｒｓ９３５０２７１（配列番号３３）、ｒｓ９３５６７４４（配列番号３４）、ｒｓ９３６８２２２（配列番号３５）、ｒｓ１０４４０８３３（配列番号３６）、ｒｓ６９３１５１４（配列番号３７）、ｒｓ１８６０３１６（配列番号１０）、ｒｓ１９８１６４７（配列番号１１）、ｒｓ１８４３６２２（配列番号９）、ｒｓ２１９１１１３（配列番号１３）、ｒｓ９８９０８８９（配列番号３１）及びそれらと連鎖不平衡にあるマーカーより選択される少なくとも一つのマーカーを含んでなる、請求項１又は２の方法。
【請求項４】
該少なくとも一つの多型マーカーが、表２２、表２３及び表２４に示したマーカーから成る群より選択される一つ又はそれより多くのマーカーと、０．８より大きな｜Ｄ’｜の及び／又は０．２より大きなｒ２の数値により規定される強い連鎖不平衡にある、少なくとも一つのマーカーを含んでなる、前記請求項のいずれか一項の方法。
【請求項５】
該少なくとも一つの多型マーカーが、マーカーｒｓ７７５２９０６（配列番号３２）、ｒｓ１５６９６９９（配列番号６）、ｒｓ７７５６９９２（配列番号２１）、ｒｓ９３５０２７１（配列番号３３）、ｒｓ９３５６７４４（配列番号３４）、ｒｓ９３６８２２２（配列番号３５）、ｒｓ１０４４０８３３（配列番号３６）、ｒｓ６９３１５１４（配列番号３７）及びそれらと連鎖不平衡にあるマーカーより選択される、前記請求項のいずれか一項の方法。
【請求項６】
該少なくとも一つの多型マーカーが、マーカーｒｓ７７５２９０６（配列番号３２）、ｒｓ１５６９６９９（配列番号６）、ｒｓ７７５６９９２（配列番号２１）、ｒｓ９３５０２７１（配列番号３３）、ｒｓ９３５６７４４（配列番号３４）、ｒｓ９３６８２２２（配列番号３５）、ｒｓ１０４４０８３３（配列番号３６）及びｒｓ６９３１５１４（配列番号３７）から選択される、請求項５の方法。
【請求項７】
該少なくとも一つのマーカーが、マーカーｒｓ７７５６９９２（配列番号２１）及びそれらと連鎖不平衡にあるマーカーより選択される、請求項１の方法。
【請求項８】
該少なくとも一つのマーカーが、表２２に示したマーカーより選択される、請求項７の方法。
【請求項９】
該少なくとも一つのマーカーが、マーカーｒｓ１０８８２０９１（配列番号４）及びそれらと連鎖不平衡にあるマーカーより選択される、請求項１の方法。
【請求項１０】
該少なくとも一つのマーカーが、表２３に示したマーカーより選択される、請求項９の方法。
【請求項１１】
該少なくとも一つのマーカーが、ｒｓ２１９１１１３（配列番号１３）及びそれらと連鎖不平衡にあるマーカーより選択される、請求項１の方法。
【請求項１２】
該少なくとも一つのマーカーが、表２４に示したマーカーより選択される、請求項１１の方法。
【請求項１３】
さらに、該個体における少なくとも一つのハプロタイプの頻度を評価することを含んでなる、前記請求項のいずれか一項の方法。
【請求項１４】
該個体からの核酸サンプル中の少なくとも一つの多型マーカーの少なくとも一つのアットリスクアレルの存在が、増加した２型糖尿病への感受性を示す、前記請求項のいずれか一項の方法。
【請求項１５】
増加した感受性が、少なくとも１．１５の相対リスク（ＲＲ）又はオッズ比（ＯＲ）により特徴付けられる、請求項１４の方法。
【請求項１６】
増大した感受性が、少なくとも１．２０の相対リスク（ＲＲ）又はオッズ比（ＯＲ）により特徴付けられる、請求項１４又は１５の方法。
【請求項１７】
ｒｓ２４９７３０４アレルＡ、ｒｓ９４７５９１アレルＡ、ｒｓ１０８８２０９１アレルＣ、ｒｓ７９１４８１４アレルＴ、ｒｓ６５８３８３０アレルＡ、ｒｓ２４２１９４３アレルＧ、ｒｓ６５８３８２６アレルＧ、ｒｓ７７５２９０６アレルＡ、ｒｓ１５６９６９９アレルＣ、ｒｓ７７５６９９２アレルＧ、ｒｓ９３５０２７１アレルＡ、ｒｓ９３５６７４４アレルＣ、ｒｓ９３６８２２２アレルＡ、ｒｓ１０４４０８３３アレルＡ、ｒｓ６９３１５１４アレルＧ、ｒｓ１８６０３１６アレルＡ、ｒｓ１９８１６４７アレルＣ、ｒｓ１８４３６２２アレルＴ、ｒｓ２１９１１１３アレルＡ及び／又はｒｓ９８９０８８９アレルＡの存在が、２型糖尿病への増加した感受性を示す、請求項１４〜１６のいずれか一項の方法。
【請求項１８】
該個体からの核酸サンプルにおける少なくとも一つの保護アレルの存在が、２型糖尿病への減少した感受性を示す、請求項１〜１３のいずれか一項の方法。
【請求項１９】
該個体からの核酸サンプルにおいて少なくとも一つのアットリスクアレルも存在しないことが２型糖尿病の減少した感受性を示す、請求項１〜１３のいずれか一項の方法。
【請求項２０】
該少なくとも一つのマーカー又はハプロタイプが、該個体におけるインスリン応答及び／又はグルコース耐性不良にさらに関連する、前記請求項のいずれか一項の方法。
【請求項２１】
アットリスクマーカー中の少なくとも一つのアレル又はハプロタイプの存在の決定が、２型糖尿病への増加した感受性を示し、そして該少なくとも一つのアレル又はハプロタイプはさらに減少したインスリン応答及び／又はグルコース耐性不良を示す、請求項１４〜１７のいずれか一項の方法。
【請求項２２】
連鎖不平衡が、０．８より大きな｜Ｄ’｜及び／又は０．２より大きなｒ２の数値により特徴付けられる、前記請求項のいずれか一項の方法。
【請求項２３】
ヒト個体における２型糖尿病への感受性を評価する方法であって、該個体からの核酸を、ヒト集団において２型糖尿病の増加した発生と相関する、配列番号１、配列番号２又は配列番号３中の少なくとも一つの多型マーカー又はハプロタイプについてスクリーニングすることを含んでなり、
該核酸中の該少なくとも一つの多型又はアットリスクハプロタイプにおけるアットリスクマーカーアレルの存在が、該個体を糖尿病に対する上昇した感受性を有していると同定し、及び
該核酸中に該少なくとも一つのアットリスクマーカーアレル又はアットリスクハプロタイプが存在しないことが、該個体を糖尿病に対する上昇した感受性を有していないと同定する、前記方法。
【請求項２４】
該多型又はハプロタイプが、ｒｓ２４９７３０４（配列番号１６）、ｒｓ９４７５９１（配列番号３０）、ｒｓ１０８８２０９１（配列番号４）、ｒｓ７９１４８１４（配列番号２４）、ｒｓ６５８３８３０（配列番号２０）、ｒｓ２４２１９４３（配列番号１５）、ｒｓ６５８３８２６（配列番号１９）、ｒｓ７７５２９０６（配列番号３２）、ｒｓ１５６９６９９（配列番号６）、ｒｓ７７５６９９２（配列番号２１）、ｒｓ９３５０２７１（配列番号３３）、ｒｓ９３５６７４４（配列番号３４）、ｒｓ９３６８２２２（配列番号３５）、ｒｓ１０４４０８３３（配列番号３６）、ｒｓ６９３１５１４（配列番号３７）、ｒｓ１８６０３１６（配列番号１０）、ｒｓ１９８１６４７（配列番号１１）、ｒｓ１８４３６２２（配列番号９）、ｒｓ２１９１１１３（配列番号１３）、ｒｓ９８９０８８９（配列番号３１）及び、０．８より大きい｜Ｄ’｜及び／又は０．２より大きいｒ２の数値により特徴付けられる連鎖不平衡にあるマーカーから選択される、請求項２３の方法。
【請求項２５】
さらに、ＬＤブロックＣ０６（配列番号１）、ＬＤブロックＣ１０（配列番号２）及びＬＤブロックＣ１７（配列番号３）とは関連しない、２型糖尿病の少なくとも一つのアットリスク遺伝子変異体の存在について、該核酸をスクリーニングする工程を含んでなる、前記請求項のいずれか一項の方法。
【請求項２６】
ＴＣＦ７Ｌ２遺伝子中の、２型糖尿病についての少なくとも一つのアットリスク変異体の少なくとも一つのアットリスクアレルの存在又は不存在について、該核酸をスクリーニングすることを含んでなり、少なくとも一つのアットリスクアレルの存在の決定が、２型糖尿病への増加した感受性を示す、請求項２５の方法。
【請求項２７】
該マーカー又はハプロタイプの存在が、２型糖尿病のための特定の治療モダリティーへの対象の異なった応答率を示す、前記請求項のいずれか一項の方法。
【請求項２８】
該個体が、特異的ヒト祖先を有する、前記請求項のいずれか一項の方法。
【請求項２９】
該祖先が、ブラックアフリカ人祖先、コーカサス人祖先及び中国人祖先より選択される、請求項２８の方法。
【請求項３０】
該祖先が、ブラックアフリカ人祖先である、請求項２８又は２９の方法。
【請求項３１】
該祖先が、ヨーロッパ人祖先である、請求項２８の方法。
【請求項３２】
該祖先が、コーカサス人祖先である、請求項２８又は２９の方法。
【請求項３３】
該祖先が、自己申告である、請求項２８〜３２のいずれか一項の方法。
【請求項３４】
該祖先が、個体からの核酸サンプル中の少なくとも一つの多型マーカーの少なくとも一つのアレルを検出することを含んでなる遺伝子決定により決定され、ここで該アレルの存在又は不存在は該個体の祖先を示す、請求項２８〜３２のいずれか一項の方法。
【請求項３５】
該個体が肥満である、前記請求項のいずれか一項の方法。
【請求項３６】
該個体が非肥満である、請求項１〜３４のいずれか一項の方法。  
【請求項３７】
ヒト個体における２型糖尿病への感受性を評価することにおいて使用するマーカーの同定の方法であって：
ａ）配列番号１、配列番号２又は配列番号３内の少なくとも一つの多型マーカー、又はそれらと連鎖不平衡にある少なくとも一つの多型マーカーを同定すること；
ｂ）２型糖尿病と又は２型糖尿病への感受性を有すると診断された個体のサンプルの遺伝子型を決定すること；及び
ｃ）対照個体のサンプルの遺伝子型を決定すること；
を含んでなり、対照サンプル中の少なくとも一つのアレルの頻度と比較し、２型糖尿病と又は２型糖尿病への感受性を有すると診断された個体における少なくとも一つの多型中の少なくとも一つのアレルの頻度の有意な相違は、２型糖尿病への感受性を評価するために有用である少なくとも一つの多型を示す、前記方法。
【請求項３８】
連鎖不平衡が、０．２より大きなｒ２及び／又は０．８より大きな｜Ｄ’｜の数値により特徴付けられる、請求項３７の方法。
【請求項３９】
該少なくとも一つの多型マーカーが、マーカーｒｓ２４９７３０４（配列番号１６）、ｒｓ９４７５９１（配列番号３０）、ｒｓ１０８８２０９１（配列番号４）、ｒｓ７９１４８１４（配列番号２４）、ｒｓ６５８３８３０（配列番号２０）、ｒｓ２４２１９４３（配列番号１５）、ｒｓ６５８３８２６（配列番号１９）、ｒｓ７７５２９０６（配列番号３２）、ｒｓ１５６９６９９（配列番号６）、ｒｓ７７５６９９２（配列番号２１）、ｒｓ９３５０２７１（配列番号３３）、ｒｓ９３５６７４４（配列番号３４）、ｒｓ９３６８２２２（配列番号３５）、ｒｓ１０４４０８３３（配列番号３６）、ｒｓ６９３１５１４（配列番号３７）、ｒｓ１８６０３１６（配列番号１０）、ｒｓ１９８１６４７（配列番号１１）、ｒｓ１８４３６２２（配列番号９）、ｒｓ２１９１１１３（配列番号１３）、ｒｓ９８９０８８９（配列番号３１）から選択される少なくとも一つのマーカーと０．２より大きなｒ２及び／又は０．８より大きな｜Ｄ’｜の数値により特徴付けられる連鎖不平衡にある、請求項３７の方法。
【請求項４０】
対照サンプル中の少なくとも一つのアレルの頻度と比較し、２型糖尿病と又は２型糖尿病への感受性を有すると診断された個体における少なくとも一つの多型中の少なくとも一つのアレルの頻度の増加が、該少なくとも一つの多型が２型糖尿病への増加した感受性を評価するために有用であることを示す、請求項３７〜３９のいずれか一項の方法。
【請求項４１】
対照サンプル中の少なくとも一つのアレルの頻度と比較し、２型糖尿病と又は２型糖尿病への感受性を有すると診断された個体における少なくとも一つの多型中の少なくとも一つのアレルの頻度の減少が、２型糖尿病への減少した感受性、又は２型糖尿病に対する保護を示す、請求項３７〜３９のいずれか一項の方法。
【請求項４２】
ヒト個体から得られた核酸サンプルを遺伝子型同定する方法であって、該サンプル中の少なくとも一つの多型マーカーの少なくとも一つのアレルの存在又は不存在を決定することを含んでなり、該少なくとも一つのマーカーは、ｒｓ２４９７３０４（配列番号１６）、ｒｓ９４７５９１（配列番号３０）、ｒｓ１０８８２０９１（配列番号４）、ｒｓ７９１４８１４（配列番号２４）、ｒｓ６５８３８３０（配列番号２０）、ｒｓ２４２１９４３（配列番号１５）、ｒｓ６５８３８２６（配列番号１９）、ｒｓ７７５２９０６（配列番号３２）、ｒｓ１５６９６９９（配列番号６）、ｒｓ７７５６９９２（配列番号２１）、ｒｓ９３５０２７１（配列番号３３）、ｒｓ９３５６７４４（配列番号３４）、ｒｓ９３６８２２２（配列番号３５）、ｒｓ１０４４０８３３（配列番号３６）、ｒｓ６９３１５１４（配列番号３７）、ｒｓ１８６０３１６（配列番号１０）、ｒｓ１９８１６４７（配列番号１１）、ｒｓ１８４３６２２（配列番号９）、ｒｓ２１９１１１３（配列番号１３）、ｒｓ９８９０８８９（配列番号３１）及びそれらと連鎖不平衡にあるマーカーから選択され、及び該少なくとも一つの多型マーカーの該少なくとも一つのアレルの存在又は不存在の決定は、２型糖尿病への感受性を示す、前記方法。
【請求項４３】
連鎖不平衡が、０．２より大きなｒ２及び／又は０．８より大きな｜Ｄ’｜の数値により特徴付けられる、請求項４１又は４２の方法。
【請求項４４】
遺伝子型同定が、該少なくとも一つの多型マーカーに隣接するヌクレオチドプライマー対を使用し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により該少なくとも一つの多型マーカーを含んでなる核酸のセグメントを増幅することを含んでなる、請求項４１〜４３のいずれか一項の方法。
【請求項４５】
遺伝子型同定が、アレル特異的プローブハイブリダイゼーション、アレル特異的プライマー伸張、アレル特異的増幅、核酸シークエンシング、５’−エキソヌクレアーゼ消化、分子ビーコンアッセイ、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ、サイズ分析、及び一本鎖配座解析から選択されるプロセスを使用して実施される、請求項４１〜４４のいずれか一項の方法。
【請求項４６】
該プロセスがアレル特異的プローブハイブリダイゼーションを含んでなる、請求項４５の方法。
【請求項４７】
該プロセスがＤＮＡシークエンシングを含んでなる、請求項４５の方法。
【請求項４８】
該方法が：
１）該核酸のコピーと検出オリゴヌクレオチドプローブ及びエンハンサーオリゴヌクレオチドプローブを、該オリゴヌクレオチドプローブと該核酸の特異的ハイブリダイゼーションのための条件下で接触させること；ここで
ａ）該検出オリゴヌクレオチドプローブは５〜１００ヌクレオチド長であり、そのヌクレオチド配列が少なくとも一つの多型部位を含んでなる配列番号１、配列番号２又は配列番号３により与えられる核酸の第一のセグメントに特異的にハイブリダイズし；
ｂ）該検出オリゴヌクレオチドプローブは、その３’末端に検出可能標識を、及びその５’末端にクエンチング部分を含んでなり；
ｃ）該エンハンサーオリゴヌクレオチドは５〜１００ヌクレオチド長であり、両方のオリゴヌクレオチドが該核酸にハイブリダイズされた時、該エンハンサーオリゴヌクレオチドが該検出オリゴヌクレオチドプローブに関して３’に位置されるように、該オリゴヌクレオチドプローブに関して５’にある該ヌクレオチド配列の第二のセグメントに相補的であり；及び
ｄ）該オリゴヌクレオチドプローブ及びエンハンサーオリゴヌクレオチドプローブが両方とも該核酸にハイブリダイズされた時、該オリゴヌクレオチド間に単一塩基ギャップが存在するように、第一のセグメント及び第二のセグメント間に単一塩基ギャップが存在する；
２）検出プローブが該核酸にハイブリダイズされた時、該検出プローブの３’末端から検出可能標識を切断して遊離検出可能標識を放出するであろうエンドヌクレアーゼで該核酸を処理すること；及び
３）遊離検出可能標識を測定すること、ここで遊離検出可能標識の存在は、該検出プローブが該核酸の第一のセグメントへ特異的にハイブリダイズされたことを示し、及び検出プローブの補体としての多型部位の配列を示す；
を含んでなる、請求項４５〜４７のいずれか一項の方法。
【請求項４９】
該核酸のコピーが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅によって提供される、請求項４８の方法。
【請求項５０】
該感受性が、増加した感受性である、請求項３７〜４９のいずれか一項の方法。
【請求項５１】
該感受性が、減少した感受性である、請求項３７〜４９のいずれか一項の方法。
【請求項５２】
該個体が、特異的ヒト祖先を有する、請求項３７〜５０のいずれか一項の方法。
【請求項５３】
祖先が、ブラックアフリカ人祖先、コーカサス人祖先及び中国人祖先より選択される、請求項５２の方法。
【請求項５４】
該祖先が、ブラックアフリカ人祖先である、請求項５２又は５３の方法。
【請求項５５】
該祖先が、ヨーロッパ人祖先である、請求項５２の方法。
【請求項５６】
該祖先が、コーカサス人祖先である、請求項５２又は５３の方法。
【請求項５７】
該祖先が、自己申告である、請求項５２〜５６のいずれか一項の方法。
【請求項５８】
該祖先が、個体からの核酸サンプル中の少なくとも一つの多型マーカーの少なくとも一つのアレルを検出することを含んでなる遺伝子決定により決定され、ここで該アレルの存在又は不存在は該個体の祖先を示す、請求項５２〜５６のいずれか一項の方法。
【請求項５９】
ヒト個体が肥満である、請求項３７〜５８のいずれか一項の方法。
【請求項６０】
該個体が非肥満である、請求項３７〜５８のいずれか一項の方法。
【請求項６１】
２型糖尿病に関連する症状を予防する及び／又は寛解するための療法剤への応答の可能性について個体を評価する方法であって：該個体から得られた核酸サンプル中の、少なくとも一つの多型マーカーの少なくとも一つのアレルの存在又は不存在を決定することを含んでなり、該少なくとも一つの多型マーカーが、ｒｓ２４９７３０４（配列番号１６）、ｒｓ９４７５９１（配列番号３０）、ｒｓ１０８８２０９１（配列番号４）、ｒｓ７９１４８１４（配列番号２４）、ｒｓ６５８３８３０（配列番号２０）、ｒｓ２４２１９４３（配列番号１５）、ｒｓ６５８３８２６（配列番号１９）、ｒｓ７７５２９０６（配列番号３２）、ｒｓ１５６９６９９（配列番号６）、ｒｓ７７５６９９２（配列番号２１）、ｒｓ９３５０２７１（配列番号３３）、ｒｓ９３５６７４４（配列番号３４）、ｒｓ９３６８２２２（配列番号３５）、ｒｓ１０４４０８３３（配列番号３６）、ｒｓ６９３１５１４（配列番号３７）、ｒｓ１８６０３１６（配列番号１０）、ｒｓ１９８１６４７（配列番号１１）、ｒｓ１８４３６２２（配列番号９）、ｒｓ２１９１１１３（配列番号１３）、ｒｓ９８９０８８９（配列番号３１）及びそれらと連鎖不平衡にあるマーカーから選択され、該少なくとも一つのマーカーの少なくとも一つのアレルの存在の決定が、２型糖尿病療法剤への陽性応答の可能性を示す、前記方法。
【請求項６２】
該２型糖尿病治療薬が、剤表１及び剤表２に示した剤から選択される、請求項６１の方法。
【請求項６３】
２型糖尿病と診断された個体の予後を予測する方法であって、該個体から得られた核酸サンプル中の、少なくとも一つの多型マーカーの少なくとも一つのアレルの存在又は不存在を決定することを含んでなり、該少なくとも一つの多型マーカーが、ｒｓ２４９７３０４（配列番号１６）、ｒｓ９４７５９１（配列番号３０）、ｒｓ１０８８２０９１（配列番号４）、ｒｓ７９１４８１４（配列番号２４）、ｒｓ６５８３８３０（配列番号２０）、ｒｓ２４２１９４３（配列番号１５）、ｒｓ６５８３８２６（配列番号１９）、ｒｓ７７５２９０６（配列番号３２）、ｒｓ１５６９６９９（配列番号６）、ｒｓ７７５６９９２（配列番号２１）、ｒｓ９３５０２７１（配列番号３３）、ｒｓ９３５６７４４（配列番号３４）、ｒｓ９３６８２２２（配列番号３５）、ｒｓ１０４４０８３３（配列番号３６）、ｒｓ６９３１５１４（配列番号３７）、ｒｓ１８６０３１６（配列番号１０）、ｒｓ１９８１６４７（配列番号１１）、ｒｓ１８４３６２２（配列番号９）、ｒｓ２１９１１１３（配列番号１３）、ｒｓ９８９０８８９（配列番号３１）及びそれらと連鎖不平衡にあるマーカーから成る群より選択され、該少なくとも一つのアレルの存在の決定が、該個体における２型糖尿病のより悪い予後を示す、前記方法。
【請求項６４】
２型糖尿病の治療を受けている個体における治療の進行をモニタリングする方法であって、該個体から得られた核酸サンプル中の、少なくとも一つの多型マーカーの少なくとも一つのアレルの存在又は不存在を決定することを含んでなり、該少なくとも一つの多型マーカーが、ｒｓ２４９７３０４（配列番号１６）、ｒｓ９４７５９１（配列番号３０）、ｒｓ１０８８２０９１（配列番号４）、ｒｓ７９１４８１４（配列番号２４）、ｒｓ６５８３８３０（配列番号２０）、ｒｓ２４２１９４３（配列番号１５）、ｒｓ６５８３８２６（配列番号１９）、ｒｓ７７５２９０６（配列番号３２）、ｒｓ１５６９６９９（配列番号６）、ｒｓ７７５６９９２（配列番号２１）、ｒｓ９３５０２７１（配列番号３３）、ｒｓ９３５６７４４（配列番号３４）、ｒｓ９３６８２２２（配列番号３５）、  ＴＳ１０４４０８３３（配列番号３６）、ｒｓ６９３１５１４（配列番号３７）、ｒｓ１８６０３１６（配列番号１０）、ｒｓ１９８１６４７（配列番号１１）、ｒｓ１８４３６２２（配列番号９）、ｒｓ２１９１１１３（配列番号１３）、ｒｓ９８９０８８９（配列番号３１）及びそれらと連鎖不平衡にあるマーカーから成る群より選択され、該少なくとも一つのアレルの存在の決定が、該個体の治療結果を示す、前記方法。
【請求項６５】
連鎖不平衡が、０．２より大きなｒ２及び／又は０．８より大きな｜Ｄ’｜の数値により定義される、請求項６１〜６４のいずれか一項の方法。
【請求項６６】
さらに、該個体からのサンプル中の少なくとも一つのバイオマーカーを評価することを含んでなる、前記請求項のいずれか一項の方法。
【請求項６７】
さらに、個体のリスク評価、診断又は予後診断を行うため、非遺伝的情報を分析することを含んでなる、前記請求項のいずれか一項の方法。
【請求項６８】
該非遺伝的情報が、年齢、性別、民族性、社会経済的地位、既往症診断、対象の病歴、２型糖尿病の家族歴、生化学的測定及び臨床的測定から選択される、請求項６７の方法。
【請求項６９】
さらに全リスクを計算することを含んでなる、請求項６６〜６８のいずれか一項の方法。
【請求項７０】
ヒト個体の２型糖尿病への感受性を評価するためのキットであって、個体のゲノム中の少なくとも一つの多型マーカーの少なくとも一つのアレルを選択的に検出するための試薬を含んでなり、該多型マーカーは、その配列が配列番号１、配列番号２及び配列番号３に示されている核酸セグメント内の多型マーカー及びそれらと連鎖不平衡にあるマーカーから成る群より選択され、及び該少なくとも一つのアレルの存在は２型糖尿病への感受性を示す、前記キット。
【請求項７１】
該少なくとも一つの多型マーカーが、表１０〜１２に示したマーカー及びそれらと連鎖不平衡にあるマーカーの群より選択される、請求項７０のキット。
【請求項７２】
該少なくとも一つの多型マーカーが、ｒｓ２４９７３０４（配列番号１６）、ｒｓ９４７５９１（配列番号３０）、ｒｓ１０８８２０９１（配列番号４）、ｒｓ７９１４８１４（配列番号２４）、ｒｓ６５８３８３０（配列番号２０）、ｒｓ２４２１９４３（配列番号１５）、ｒｓ６５８３８２６（配列番号１９）、ｒｓ７７５２９０６（配列番号３２）、ｒｓ１５６９６９９（配列番号６）、ｒｓ７７５６９９２（配列番号２１）、ｒｓ９３５０２７１（配列番号３３）、ｒｓ９３５６７４４（配列番号３４）、ｒｓ９３６８２２２（配列番号３５）、ｒｓ１０４４０８３３（配列番号３６）、ｒｓ６９３１５１４（配列番号３７）、ｒｓ１８６０３１６（配列番号１０）、ｒｓ１９８１６４７（配列番号１１）、ｒｓ１８４３６２２（配列番号９）、ｒｓ２１９１１１３（配列番号１３）、ｒｓ９８９０８８９（配列番号３１）及びそれらと連鎖不平衡にあるマーカーから選択される、請求項７０又は７１のキット。
【請求項７３】
連鎖不平衡が、少なくとも０．２のｒ２の数値及び／又は少なくとも０．８の｜Ｄ’｜値により定義される、請求項６９〜７２のいずれかのキット。
【請求項７４】
該試薬が、該少なくとも一つの多型マーカーを含んでなる該個体のゲノムの断片へハイブリダイズする少なくとも一つの近接するオリゴヌクレオチド、緩衝液及び検出可能な標識を含んでなる、請求項７０〜７３のいずれかのキット。
【請求項７５】
該試薬が、対象から得られたゲノム核酸セグメントの反対鎖にハイブリダイズする少なくとも一つのオリゴヌクレオチド対を含んでなり、各オリゴヌクレオチドプライマー対は、一つの多型マーカーを含む該個体のゲノムの断片を選択的に増幅するように設計されており、及び該断片は少なくとも３０塩基対のサイズである、請求項７０〜７４のいずれかのキット。
【請求項７６】
該少なくとも一つのオリゴヌクレオチドは該個体のゲノムと完全に相補的である、請求項７４又は７５のキット。
【請求項７７】
該オリゴヌクレオチドは約１８〜約５０ヌクレオチド長である、請求項７４〜７６のいずれかのキット。
【請求項７８】
該オリゴヌクレオチドが２０〜３０ヌクレオチド長である、請求項７４〜７７のいずれかのキット。
【請求項７９】
該キットが：
ａ．５〜１００ヌクレオチド長である検出オリゴヌクレオチドプローブ；
ｂ．５〜１００ヌクレオチド長であるエンハンサーオリゴヌクレオチドプローブ；及び
ｃ．エンドヌクレアーゼ酵素；
を含んでなり；
該検出オリゴヌクレオチドプローブが、そのヌクレオチド配列が少なくとも一つの多型部位を含んでなる配列番号１、配列番号２及び配列番号３により与えられている核酸の第一のセグメントへ特異的にハイブリダイズし；及び
該検出オリゴヌクレオチドプローブが、その３’末端に検出可能な標識及びその５’末端にクエンチング部分を含んでなり；
該エンハンサーオリゴヌクレオチドが、５〜１００ヌクレオチド長であり、両方のオリゴヌクレオチドが該核酸にハイブリダイズされた時、該エンハンサーオリゴヌクレオチドが該検出オリゴヌクレオチドプローブに関して３’に位置されるように、該オリゴヌクレオチドプローブに関して５’にある該ヌクレオチド配列の第二のセグメントに相補的であり；
該オリゴヌクレオチドプローブ及びエンハンサーオリゴヌクレオチドプローブが両方とも該核酸にハイブリダイズされた時、該オリゴヌクレオチド間に単一塩基ギャップが存在するように、第一のセグメント及び第二のセグメント間に単一塩基ギャップが存在し；及び
該核酸をエンドヌクレアーゼで処理することが、該検出プローブが該核酸にハイブリダイズされた時、該検出プローブの３’末端から検出可能標識を切断して遊離検出可能標識を放出するであろう；
請求項７０〜７８のいずれかのキット。
【請求項８０】
ヒト個体において２型糖尿病を診断する及び／又は２型糖尿病への感受性を評価するための診断薬の製造におけるオリゴヌクレオチドプローブの使用であって、該プローブが、そのヌクレオチド配列が少なくとも一つの多型部位を含んでなる配列番号１、配列番号２及び配列番号３により与えられる核酸のセグメントにハイブリダイズし、該断片は１５〜５００長である、前記使用。
【請求項８１】
該多型部位が、多型マーカーｒｓ２４９７３０４（配列番号１６）、ｒｓ９４７５９１（配列番号３０）、ｒｓ１０８８２０９１（配列番号４）、ｒｓ７９１４８１４（配列番号２４）、ｒｓ６５８３８３０（配列番号２０）、ｒｓ２４２１９４３（配列番号１５）、ｒｓ６５８３８２６（配列番号１９）、ｒｓ７７５２９０６（配列番号３２）、ｒｓ１５６９６９９（配列番号６）、ｒｓ７７５６９９２（配列番号２１）、ｒｓ９３５０２７１（配列番号３３）、ｒｓ９３５６７４４（配列番号３４）、ｒｓ９３６８２２２（配列番号３５）、ｒｓ１０４４０８３３（配列番号３６）、ｒｓ６９３１５１４（配列番号３７）、ｒｓ１８６０３１６（配列番号１０）、ｒｓ１９８１６４７（配列番号１１）、ｒｓ１８４３６２２（配列番号９）、ｒｓ２１９１１１３（配列番号１３）、ｒｓ９８９０８８９（配列番号３１）及びそれらと連鎖不平衡にある多型マーカーから選択される、請求項８０に記載の使用。
【請求項８２】
コンピューター可読媒体であって、
ａ．少なくとも一つの多型マーカーのための識別子；
ｂ．２型糖尿病と診断された複数の個体における、前記少なくとも一つの多型マーカーの少なくとも一つのアレルの頻度の指標；及び
ｃ．複数の参照個体における、前記少なくとも一つの多型マーカーの少なくとも一つのアレルの頻度の指標；が保存され；
該少なくとも一つの多型マーカーは、多型マーカーｒｓ２４９７３０４（配列番号１６）、ｒｓ９４７５９１（配列番号３０）、ｒｓ１０８８２０９１（配列番号４）、ｒｓ７９１４８１４（配列番号２４）、ｒｓ６５８３８３０（配列番号２０）、ｒｓ２４２１９４３（配列番号１５）、ｒｓ６５８３８２６（配列番号１９）、ｒｓ７７５２９０６（配列番号３２）、ｒｓ１５６９６９９（配列番号６）、ｒｓ７７５６９９２（配列番号２１）、ｒｓ９３５０２７１（配列番号３３）、ｒｓ９３５６７４４（配列番号３４）、ｒｓ９３６８２２２（配列番号３５）、ｒｓ１０４４０８３３（配列番号３６）、ｒｓ６９３１５１４（配列番号３７）、ｒｓ１８６０３１６（配列番号１０）、ｒｓ１９８１６４７（配列番号１１）、ｒｓ１８４３６２２（配列番号９）、ｒｓ２１９１１１３（配列番号１３）、ｒｓ９８９０８８９（配列番号３１）及び少なくとも０．２のｒ２の数値及び／又は少なくとも０．８の｜Ｄ’｜の値により定義される、それらと連鎖不平衡にある多型から選択される、前記コンピューター可読媒体。
【請求項８３】
さらに複数の個体の祖先についての情報を含んでなる、請求項８２の媒体。
【請求項８４】
２型糖尿病と診断された複数の個体及び複数の参照個体が特定の祖先を有する、請求項８２又は８３の媒体。
【請求項８５】
ヒト個体における２型糖尿病についての遺伝的指標を決定するための装置であって：
コンピューター可読メモリー；及び
コンピューター可読メモリー上に保存されたルーチン；を含んでなり、
該ルーチンが、マーカーｒｓ２４９７３０４（配列番号１６）、ｒｓ９４７５９１（配列番号３０）、ｒｓ１０８８２０９１（配列番号４）、ｒｓ７９１４８１４（配列番号２４）、ｒｓ６５８３８３０（配列番号２０）、ｒｓ２４２１９４３（配列番号１５）、ｒｓ６５８３８２６（配列番号１９）、ｒｓ７７５２９０６（配列番号３２）、ｒｓ１５６９６９９（配列番号６）、ｒｓ７７５６９９２（配列番号２１）、ｒｓ９３５０２７１（配列番号３３）、ｒｓ９３５６７４４（配列番号３４）、ｒｓ９３６８２２２（配列番号３５）、ｒｓ１０４４０８３３（配列番号３６）、ｒｓ６９３１５１４（配列番号３７）、ｒｓ１８６０３１６（配列番号１０）、ｒｓ１９８１６４７（配列番号１１）、ｒｓ１８４３６２２（配列番号９）、ｒｓ２１９１１１３（配列番号１３）、ｒｓ９８９０８８９（配列番号３１）及びそれらと少なくとも０．２のｒ２の数値及び／又は少なくとも０．８の｜Ｄ’｜の値により定義される連鎖不平衡にあるマーカーから選択される少なくとも一つの多型マーカーに関して少なくとも一つのヒト個体についてのマーカー及び／又はハプロタイプ情報を分析するためにプロセッサーで実行されるのに適合しており、そしてマーカー及び／又はハプロタイプ情報に基づいたアウトプットを発生し、該アウトプットはヒト個体についての２型糖尿病の遺伝的指標としての該少なくとも一つのマーカー又はハプロタイプのリスク尺度を含んでなる、前記装置。
【請求項８６】
該ルーチンがさらに、２型糖尿病と診断された複数の個体における少なくとも一つの多型マーカーの少なくとも一つのアレル又は少なくとも一つのハプロタイプの頻度の指標、及び複数の参照個体における少なくとも一つの多型マーカーの少なくとも一つのアレル又は少なくとも一つのハプロタイプの頻度の指標をさらに含んでなり、そしてリスク尺度は、２型糖尿病と診断された複数の個体についての該少なくとも一つのマーカー及び／又はハプロタイプ情報の頻度の指標とヒト個体についての該少なくとも一つのマーカー及び／又はハプロタイプ状態の比較に基づいている、請求項８５の装置。
【請求項８７】
該リスク尺度が、オッズ比（ＯＲ）又は相対リスク（ＲＲ）により特徴付けられる、請求項８５又は８６の装置。
【請求項８８】
ヒト個体において２型糖尿病の感受性を決定する方法であって、少なくとも一つの多型マーカー中の少なくとも一つのアットリスクアレルが該個体に由来する遺伝子型データセット中に存在するかどうかを決定することを含んでなり、該少なくとも一つの多型マーカーは、表１０〜１２に示したマーカー及びそれらと連鎖不平衡にあるマーカーより選択され、及び該少なくとも一つのアットリスクアレルの存在の決定は該個体における２型糖尿病への増加した感受性を示す、前記方法。
【請求項８９】
該少なくとも一つの多型マーカーが、配列番号１、配列番号２又は配列番号３内に存在する、請求項８８の方法。
【請求項９０】
該少なくとも一つの多型マーカーが、ｒｓ２４９７３０４（配列番号１６）、ｒｓ９４７５９１（配列番号３０）、ｒｓ１０８８２０９１（配列番号４）、ｒｓ７９１４８１４（配列番号２４）、ｒｓ６５８３８３０（配列番号２０）、ｒｓ２４２１９４３（配列番号１５）、ｒｓ６５８３８２６（配列番号１９）、ｒｓ７７５２９０６（配列番号３２）、ｒｓ１５６９６９９（配列番号６）、ｒｓ７７５６９９２（配列番号２１）、ｒｓ９３５０２７１（配列番号３３）、ｒｓ９３５６７４４（配列番号３４）、ｒｓ９３６８２２２（配列番号３５）、ｒｓ１０４４０８３３（配列番号３６）、ｒｓ６９３１５１４（配列番号３７）、ｒｓ１８６０３１６（配列番号１０）、ｒｓ１９８１６４７（配列番号１１）、ｒｓ１８４３６２２（配列番号９）、ｒｓ２１９１１１３（配列番号１３）、ｒｓ９８９０８８９（配列番号３１）及びそれらと連鎖不平衡にあるマーカーより選択される少なくとも一つのマーカーを含んでなる、請求項８８又は８９の方法。
【請求項９１】
該少なくとも一つの多型マーカーが、表２２、表２３及び表２４に示したマーカーから成る群より選択される一つ又はそれより多くのマーカーと、０．８より大きな｜Ｄ’｜及び／又は０．２より大きなｒ２の数値により定義される強い連鎖不平衡にある少なくとも一つのマーカーを含んでなる、請求項８８〜９０のいずれか一項の方法。
【請求項９２】
該少なくとも一つの多型マーカーが、マーカーｒｓ７７５２９０６（配列番号３２）、ｒｓ１５６９６９９（配列番号６）、ｒｓ７７５６９９２（配列番号２１）、ｒｓ９３５０２７１（配列番号３３）、ｒｓ９３５６７４４（配列番号３４）、ｒｓ９３６８２２２（配列番号３５）、ｒｓ１０４４０８３３（配列番号３６）、ｒｓ６９３１５１４（配列番号３７）及びそれらと連鎖不平衡にあるマーカーより選択される、請求項８８〜９１のいずれか一項の方法。
【請求項９３】
該少なくとも一つの多型マーカーが、マーカーｒｓ７７５２９０６（配列番号３２）、ｒｓ１５６９６９９（配列番号６）、ｒｓ７７５６９９２（配列番号２１）、ｒｓ９３５０２７１（配列番号３３）、ｒｓ９３５６７４４（配列番号３４）、ｒｓ９３６８２２２（配列番号３５）、ｒｓ１０４４０８３３（配列番号３６）及びｒｓ６９３１５１４（配列番号３７）より選択される、請求項９２の方法。
【請求項９４】
該少なくとも一つの多型マーカーが、マーカーｒｓ７７５６９９２（配列番号２１）及びそれらと連鎖不平衡にあるマーカーより選択される、請求項８８の方法。
【請求項９５】
該少なくとも一つの多型マーカーが、表２２に示したマーカーより選択される、請求項９４の方法。
【請求項９６】
該少なくとも一つのマーカーが、マーカーｒｓ１０８８２０９１（配列番号４）及びそれらと連鎖不平衡にあるマーカーより選択される、請求項８８の方法。
【請求項９７】
該少なくとも一つのマーカーが、表２３に示したマーカーより選択される、請求項９６の方法。
【請求項９８】
該少なくとも一つのマーカーが、マーカーｒｓ２１９１１１３（配列番号１３）及びそれらと連鎖不平衡にあるマーカーより選択される、請求項８８の方法。
【請求項９９】
該少なくとも一つのマーカーが、表２４に示したマーカーより選択される、請求項９８の方法。
【請求項１００】
さらに、該個体において少なくとも一つのアットリスクハプロタイプの頻度を評価することを含んでなり、そしてアットリスクハプロタイプの存在の決定が、２型糖尿病の増加した感受性を示す、請求項８８〜９９のいずれか一項の方法。
【請求項１０１】
該増加した感受性が、少なくとも１．１５の相対リスク（ＲＲ）又はオッズ比（ＯＲ）により特徴付けられる、請求項８８〜１００のいずれか一項の方法。
【請求項１０２】
該増加した感受性が、少なくとも１．２０の相対リスク（ＲＲ）又はオッズ比（ＯＲ）により特徴付けられる、請求項８８〜１０１のいずれか一項の方法。
【請求項１０３】
ｒｓ２４９７３０４アレルＡ，ｒｓ９４７５９１アレルＡ、ｒｓ１０８８２０９１アレルＣ、ｒｓ７９１４８１４アレルＴ、ｒｓ６５８３８３０アレルＡ、ｒｓ２４２１９４３アレルＧ、ｒｓ６５８３８２６アレルＧ、ｒｓ７７５２９０６アレルＡ、ｒｓ１５６９６９９アレルＣ、ｒｓ７７５６９９２アレルＧ、ｒｓ９３５０２７１アレルＡ、ｒｓ９３５６７４４アレルＣ、ｒｓ９３６８２２２  アレルＡ、ｒｓ１０４４０８３３アレルＡ、ｒｓ６９３１５１４アレルＧ、ｒｓ１８６０３１６アレルＡ、ｒｓ１９８１６４７アレルＣ、ｒｓ１８４３６２２アレルＴ、ｒｓ２１９１１１３アレルＡ、及び／又はｒｓ９８９０８８９アレルＡの存在が、２型糖尿病の増加した感受性を示す、請求項８８〜１０２のいずれか一項の方法。
【請求項１０４】
該個体に由来する遺伝子型データセットにおいて、多型マーカー中にアットリスクアレルが存在しないことの決定が、２型糖尿病の減少した感受性を示す、請求項８８の方法。
【請求項１０５】
連鎖不平衡が、０．８より大きな｜Ｄ’｜及び／又は０．２より大きなｒ２の数値により特徴付けられる、請求項８８〜１０４のいずれか一項の方法。
【請求項１０６】
さらに、リスク尺度として２型糖尿病の感受性を表現することを含んでなる、請求項８８〜１０５のいずれか一項の方法。
【請求項１０７】
該リスク尺度が、相対リスク（ＲＲ）又はオッズ比（ＯＲ）として計算される、請求項１０６の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
炭水化物の利用が減少し及び脂質及びタンパク質の利用が促進されているメタボリック疾患である糖尿病は、インシュリンの絶対的又は相対的欠乏により起こる。より重症例では、糖尿病は慢性高血糖、糖尿、水分及び電解液損失、ケトアシドーシス及び昏睡により特徴付けられる。長期合併症には、神経障害、網膜症、腎症、大血管及び微小血管における全般性変性変化、及び感染への増加した感受性の発生が含まれる。最も一般的な糖尿病の型は、インスリン分泌障害及び標的組織におけるインスリン耐性による高血糖により特徴付けられる２型インスリン非依存性糖尿病である。遺伝及び環境因子の両方が本疾患の原因となる。例えば、肥満は本疾患の発生に主要な役割を果たしている。２型糖尿病はしばしば、糖尿病の漸進的発症の軽症型である。
【０００２】
２型糖尿病の健康的意義は非常に大きい。１９９５年において、糖尿病を有する成人は世界中で１億３，５００万人であった。２０２５年中には３億人近くが糖尿病を有するであろうと見積もられている。(King H., et al, Diabetes Care, 21(9): 1414-1431 (1998)) 。アイスランドにおける成人人口の２型糖尿病有病率は２．５％であり(Vilbergsson, S., et al, Diabet. Med., 14（6): 491-498 (1997)) 、該疾患を有する３４歳以上のおよそ５，０００人が含まれる。
【０００３】
２型糖尿病は、インスリン分泌障害、末梢組織におけるインスリン耐性及び肝臓による増加したグルコース排出のような機構を介して生じることが可能である高血糖により特徴付けられる。ほとんどの２型糖尿病患者は、腎症、神経障害、網膜症及び心血管疾患の加速された発生を含む、慢性的高血糖の重篤な合併症に苦しんでいる。全世界の２型糖尿病の有病率は現在６％であるが、次の１０年で上昇すると予想されている（Amos, A. F., McCarty, D. J., Zimmet, P., Diabet Med 14 Suppl 5, Sl (1997)）。２型糖尿病の有病率におけるこの増加は、人口の高齢化及び肥満の増加によるものである。
【０００４】
種々の人種グループ間の有病率相違（Zimmet, P. et al., Am J Epidemiol 118, 673 (1983), Knowler, W. C, Pettitt, D.J., Saad, M. F., Bennett, P.H., Diabetes Metab Rev 6, 1 (1990)）、二卵性双生児よりも一卵性双生児間でのより高い一致率（Newman, B. et al., Diabetologia 30, 763（1987), Barnett, A. H., Eff, C, Leslie, R.D., Pyke, D. A., Diabetologia 20, 87(1981)）及び約３．５のヨーロッパ人集団における２型糖尿病についての同胞相対リスク（λｓ）（Gloyn, A. L., Ageing Res Rev 2, 111 (2003)）を含む、２型糖尿病に対するリスクの遺伝的成分についての証拠がある。
【０００５】
これまで二つのアプローチが、２型糖尿病に関連する遺伝子を探求するために使用されてきた。候補遺伝子内の一塩基変異多型（ＳＮＰ）が関連について試験され、一般に、２型糖尿病のリスクは再現されていないか又はわずかしか与えなかった−ペルオキシソーム増殖因子活性化レセプターガンマ遺伝子（ＰＰＡＲＧ２）中の保護的Ｐｒｏ１２ＡＩａ多型（Altshuler, D. et al., Nat Genet 26, 76(2000)）及びカリウム内向き整流性チャネル、サブファミリーＪ、メンバー１１遺伝子（ＫＩＲ６．２）中のアットリスク多型（Gloyn A. L. et al., Diabetes 52, 568 (2003)）が最も広範に報告されている。
【０００６】
２型糖尿病の共通形態を有するファミリーにおける全ゲノム連鎖スキャンでいくつかの座位が得られており、国際研究コンソーシアムの第一焦点は、多くの集団で観察された染色体１、１２及び２０に当てられている（Gloyn, A. L., Ageing Res Rev 2, 111 (2003)）。これらの座位上の遺伝子はいつか明らかにすべきである。しかしながら、メキシコ系アメリカ人において、染色体２ｑ上の座位の中からカルパイン１０（ＣＡＰＮ１０）遺伝子が単離されている（Horikawa, Y. et al., Nat Genet 26, 163(2000)）。２型糖尿病の希なメンデルの法則に従った形態、即ち若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）では、ポジショナルクローニングにより６つの遺伝子が得られた（Gloyn, A. L., Ageing Res Rev 2, 111 (2003)）。
【０００７】
アイスランド人集団における２型糖尿病について、染色体５ｑに対する全ゲノムでの有意な連鎖が報告されている（Reynisdottir, I. et al., Am J Hum Genet 73, 323（2003)）；同じ研究において、１０ｑ及び１２ｑへの示唆的連鎖も報告されている。１０ｑ領域への連鎖はメキシコ系アメリカ人においても観察されている（Duggirala, R. et al., Am J Hum Genet 64, 1127(1999)）。
【０００８】
転写因子７様２遺伝子（ＴＣＦ７Ｌ２；以前はＴＣＦ４）は２型糖尿病と関連していた（Ｐ＝２．１ｘ１０（−９））(Grant, S. F. et al., Nat Genet 38, 320（2006))。遺伝子のイントロン３内のマイクロサテライトマーカーＤＧ１０Ｓ４７８の関連性（Ｐ＝２．１ｘ１０（−９））についてのアイスランド人コホートにおける最初の発見は、デンマーク人コホート（Ｐ＝４．８ｘ１０（−３））及び米国人コホート（Ｐ＝３．３ｘ１０（−９））において再現された。非キャリアと比較して、アットリスクアレルのヘテロ接合性及びホモ接合性キャリア（それぞれ集団の３８％及び７％）は１．４５及び２．４１の相対リスクを有する。このことは２１％の集団寄与リスクに相当する。ＴＣＦ７Ｌ２変異体の関連性は現在、１０の独立した研究で再現され、類似の相対リスクが異なった研究集団において観察されている。ＴＣＦ７Ｌ２遺伝子産物は、以前に血中グルコースホメオスターシスで示唆されている高移動度群ボックス含有転写因子である。それは、Ｗｎｔシグナル伝達経路を介した腸内分泌細胞中のプログルカゴン遺伝子発現の調節を介して働いていると考えられている。
【０００９】
２型糖尿病遺伝子学の解明における進歩にも関わらず、該疾患の高い有病率及び罹患した集団の増加は、関連リスク因子をより正確に規定するために２型糖尿病に関与する追加の遺伝因子を規定するという、満たされていない医学的要求を示している。空腹時血中グルコース不良又はグルコース耐性不良を有する人々は無症候性ではあるが、２型糖尿病を発症する高いリスクにある。現在のところ、予防的投薬がより適切であろう個体から、この高リスク群内でそれらを区別する情報はほとんどなく、ライフスタイル介入が疾患予防の最良の選択であろう。感受性遺伝子の同定は該疾患の病態生理学のより良い理解を可能にするであろうし、そして患者の直接的利点として、それは診断及び治療についてのより良いアプローチを容易にするであろう。２型糖尿病の予防のための療法剤も必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許番号5,288,611
【特許文献２】米国特許番号4,851,330
【特許文献３】米国特許番号5,143,854
【特許文献４】米国特許番号5,143,854（公開ＰＣＴ出願番号WO90/15070）
【特許文献５】公開ＰＣＴ出願番号WO92/10092
【特許文献６】米国特許番号5,424,186
【特許文献７】米国特許番号5,384,261
【特許文献８】米国特許番号5,858,659
【特許文献９】米国特許番号5,837,832
【特許文献１０】米国特許番号5,288,644
【特許文献１１】米国特許番号4,376,110
【特許文献１２】米国特許番号5,223,409
【特許文献１３】ＰＣＴ公開番号WO92/18619
【特許文献１４】ＰＣＴ公開番号WO91/17271
【特許文献１５】ＰＣＴ公開番号WO92/20791
【特許文献１６】ＰＣＴ公開番号WO92/15679
【特許文献１７】ＰＣＴ公開番号WO93/01288
【特許文献１８】ＰＣＴ公開番号WO92/01047
【特許文献１９】ＰＣＴ公開番号WO92/09690
【特許文献２０】ＰＣＴ公開番号WO90/02809
【非特許文献】
【００１１】
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【非特許文献３】Amos, A. F., McCarty, D. J., Zimmet, P., Diabet Med 14 Suppl 5, Sl (1997)
【非特許文献４】Zimmet, P. et al., Am J Epidemiol 118, 673（1983)
【非特許文献５】Knowler, W. C, Pettitt, D.J., Saad, M. F., Bennett, P.H., Diabetes Metab Rev 6, 1 (1990)
【非特許文献６】Newman, B. et al., Diabetologia 30, 763 (1987)
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【発明の概要】
【００１２】
本発明は、２型糖尿病への増加した又は減少した感受性に関連することが発見されたある種のマーカー又はハプロタイプを評価することによる、２型糖尿病への増加した感受性を診断する方法、ならびに２型糖尿病に対する減少した感受性を診断する又は２型糖尿病に対する保護を診断する方法に関する。
【００１３】
第一の側面において、本発明はヒト個体における２型糖尿病への感受性を決定する方法に関し、該個体から得られた核酸サンプル中の少なくとも一つの多型マーカーの少なくとも一つのアレルの存在又は不存在を決定することを含んでなり、該少なくとも一つの多型マーカーは、表１０〜１２に示したマーカー及びそれらと連鎖不平衡にあるマーカーより選択され、及び該少なくとも一つのアレルの存在又は不存在は、２型糖尿病に対する感受性を示す。一つの態様において、該少なくとも一つの多型マーカーは、表１０〜１２及び１４に示したマーカーより選択される。代わりの側面において、２型糖尿病への感受性を決定する方法は、２型糖尿病への感受性を診断する方法である。
【００１４】
一つの態様において、該少なくとも一つの多型マーカーは、配列番号１、配列番号２又は配列番号３内に存在する。別の態様において、該少なくとも一つの多型マーカーは、ｒｓ２４９７３０４（配列番号１６）、ｒｓ９４７５９１（配列番号３０）、ｒｓ１０８８２０９１（配列番号４）、ｒｓ７９１４８１４（配列番号２４）、ｒｓ６５８３８３０（配列番号２０）、ｒｓ２４２１９４３（配列番号１５）、ｒｓ６５８３８２６（配列番号１９）、ｒｓ７７５２９０６（配列番号３２）、ｒｓ１５６９６９９（配列番号６）、ｒｓ７７５６９９２（配列番号２１）、ｒｓ９３５０２７１（配列番号３３）、ｒｓ９３５６７４４（配列番号３４）、ｒｓ９３６８２２２（配列番号３５）、ｒｓ１０４４０８３３（配列番号３６）、ｒｓ６９３１５１４（配列番号３７）、ｒｓ１８６０３１６（配列番号１０）、ｒｓ１９８１６４７（配列番号１１）、ｒｓ１８４３６２２（配列番号９）、ｒｓ２１９１１１３（配列番号１３）、ｒｓ９８９０８８９（配列番号３１）、及びそれらと連鎖不平衡にあるマーカーより選択される少なくとも一つのマーカーを含んでなる。別の態様において、該少なくとも一つの多型マーカーは、表２２、表２３及び表２４に示したマーカーから成る群より選択される一つ又はそれより多くのマーカーと、０．８より大きな｜Ｄ’｜の及び／又は０．２より大きなｒ２の数値により規定される強い連鎖不平衡にある、少なくとも一つのマーカーを含んでなる。一つの好ましい態様において、該少なくとも一つの多型マーカーは、ｒｓ７７５２９０６（配列番号３２）、ｒｓ１５６９６９９（配列番号６）、ｒｓ７７５６９９２（配列番号２１）、ｒｓ９３５０２７１（配列番号３３）、ｒｓ９３５６７４４（配列番号３４）、ｒｓ９３６８２２２（配列番号３５）、ｒｓ１０４４０８３３（配列番号３６）、ｒｓ６９３１５１４（配列番号３７）及びそれらと連鎖不平衡にあるマーカーより選択される。別の好ましい態様において、該少なくとも一つの多型マーカーは、マーカーｒｓ７７５２９０６（配列番号３２）、ｒｓ１５６９６９９（配列番号６）、ｒｓ７７５６９９２（配列番号２１）、ｒｓ９３５０２７１（配列番号３３）、ｒｓ９３５６７４４（配列番号３４）、ｒｓ９３６８２２２（配列番号３５）、ｒｓ１０４４０８３３（配列番号３６）及びｒｓ６９３１５１４（配列番号３７）より選択される。一つの態様において、該少なくとも一つのマーカーは、ｒｓ７７５６９９２（配列番号２１）及びそれらと連鎖不平衡にあるマーカーより選択される。別の態様において、該少なくとも一つのマーカーは、表２２に示したマーカーより選択される。別の態様において、該少なくとも一つのマーカーは、マーカーｒｓ１０８８２０９１（配列番号４）及びそれらと連鎖不平衡にあるマーカーより選択される。別の態様において、該少なくとも一つのマーカーは、表２３に示したマーカーより選択される。さらに別の態様において、該少なくとも一つのマーカーは、マーカーｒｓ２１９１１１３（配列番号１３）及びそれらと連鎖不平衡にあるマーカーより選択される。別の態様において、該少なくとも一つのマーカーは、表２４に示したマーカーより選択される。
【００１５】
一つの態様において、２型糖尿病への感受性を決定する、又は感受性を診断する方法はさらに、該個体における少なくとも一つのハプロタイプの頻度を評価することを含んでなる。一つのこうした態様において、該少なくとも一つのハプロタイプは、表１〜６に示した少なくとも一つの多型マーカー、及びそれらと連鎖不平衡にある多型マーカーを含んでなるハプロタイプから選択される。別の態様において、該少なくとも一つのハプロタイプは、ｒｓ２４９７３０４（配列番号１６）、ｒｓ９４７５９１（配列番号３０）、ｒｓ１０８８２０９１（配列番号４）、ｒｓ７９１４８１４（配列番号２４）、ｒｓ６５８３８３０（配列番号２０）、ｒｓ２４２１９４３（配列番号１５）、ｒｓ６５８３８２６（配列番号１９）、ｒｓ７７５２９０６（配列番号３２）、ｒｓ１５６９６９９（配列番号６）、ｒｓ７７５６９９２（配列番号２１）、ｒｓ９３５０２７１（配列番号３３）、ｒｓ９３５６７４４（配列番号３４）、ｒｓ９３６８２２２（配列番号３５）、ｒｓ１０４４０８３３（配列番号３６）、ｒｓ６９３１５１４（配列番号３７）、ｒｓ１８６０３１６（配列番号１０）、ｒｓ１９８１６４７（配列番号１１）、ｒｓ１８４３６２２（配列番号９）、ｒｓ２１９１１１３（配列番号１３）、ｒｓ９８９０８８９（配列番号３１）から選択される少なくとも一つのマーカー及びそれらと連鎖不平衡にあるマーカーより選択される少なくとも一つの多型マーカーを含んでなるハプロタイプから選択される。別の態様において、該少なくとも一つのハプロタイプは、表１〜６及び１４に示したハプロタイプから選択される。
【００１６】
第二の側面において、本発明はヒト個体における２型糖尿病への感受性を決定する方法に関し、少なくとも一つの多型マーカー中の少なくとも一つのアットリスクアレルが該個体に由来する遺伝子型データセット中に存在するかどうかを決定することを含んでなり、該少なくとも一つの多型マーカーは、表１０〜１２に示したマーカー及びそれらと連鎖不平衡にあるマーカーより選択され、及び該少なくとも一つのアットリスクアレルの存在の決定は該個体における２型糖尿病への増加した感受性を示す。該遺伝子型データセットは、一つの態様において、マーカー同一性についての情報及び該個体のアレル状態、即ち、該マーカーについて、個体により運ばれている二つのアレルの同一性についての情報を含んでなる。該遺伝子型データセットは、二つ又はそれ以上のマーカー、三つ又はそれ以上のマーカー、五つ又はそれ以上のマーカー、百又はそれ以上のマーカーその他を含む一つ又はそれ以上のマーカーについての遺伝子型情報を含んでなることができる。いくつかの態様において、該遺伝子型データセットは数十万のマーカー又は百万又はそれ以上のマーカーさえ含む、個体の全ゲノム評価からの遺伝子型情報を含んでなる。
【００１７】
一つの態様において、該少なくとも一つの多型マーカーは、配列番号１、配列番号２又は配列番号３内に存在する。別の態様において、該少なくとも一つの多型マーカーは、ｒｓ２４９７３０４（配列番号１６）、ｒｓ９４７５９１（配列番号３０）、ｒｓ１０８８２０９１（配列番号４）、ｒｓ７９１４８１４（配列番号２４）、ｒｓ６５８３８３０（配列番号２０）、ｒｓ２４２１９４３（配列番号１５）、ｒｓ６５８３８２６（配列番号１９）、ｒｓ７７５２９０６（配列番号３２）、ｒｓ１５６９６９９（配列番号６）、ｒｓ７７５６９９２（配列番号２１）、ｒｓ９３５０２７１（配列番号３３）、ｒｓ９３５６７４４（配列番号３４）、ｒｓ９３６８２２２（配列番号３５）、ｒｓ１０４４０８３３（配列番号３６）、ｒｓ６９３１５１４（配列番号３７）、ｒｓ１８６０３１６（配列番号１０）、ｒｓ１９８１６４７（配列番号１１）、ｒｓ１８４３６２２（配列番号９）、ｒｓ２１９１１１３（配列番号１３）、ｒｓ９８９０８８９（配列番号３１）及びそれらと連鎖不平衡にあるマーカーより選択される少なくとも一つのマーカーを含んでなる。別の態様において、該少なくとも一つの多型マーカーは、表２２、表２３及び表２４に示したマーカーから成る群より選択される、一つ又はそれ以上のマーカーと、０．８より大きい｜Ｄ’｜及び／又は０．２より大きいｒ２の数値により定義される強い連鎖不平衡にある少なくとも一つのマーカーを含んでなる。一つの好ましい態様において、該少なくとも一つの多型マーカーは、マーカーｒｓ７７５２９０６（配列番号３２）、ｒｓ１５６９６９９（配列番号６）、ｒｓ７７５６９９２（配列番号２１）、ｒｓ９３５０２７１（配列番号３３）、ｒｓ９３５６７４４（配列番号３４）、ｒｓ９３６８２２２（配列番号３５）、ｒｓ１０４４０８３３（配列番号３６）、ｒｓ６９３１５１４（配列番号３７）及びそれらと連鎖不平衡にあるマーカーより選択される。別の好ましい態様において、該少なくとも一つの多型マーカーは、マーカーｒｓ７７５２９０６（配列番号３２）、ｒｓ１５６９６９９（配列番号６）、ｒｓ７７５６９９２（配列番号２１）、ｒｓ９３５０２７１（配列番号３３）、ｒｓ９３５６７４４（配列番号３４）、ｒｓ９３６８２２２（配列番号３５）、ｒｓ１０４４０８３３（配列番号３６）及びｒｓ６９３１５１４（配列番号３７）から選択される。一つの態様において、該少なくとも一つのマーカーは、マーカーｒｓ７７５６９９２（配列番号２１）及びそれらと連鎖不平衡にあるマーカーより選択される。別の態様において、該少なくとも一つのマーカーは、表２２に示したマーカーより選択される。別の態様において、該少なくとも一つのマーカーは、マーカーｒｓ１０８８２０９１（配列番号４）及びそれらと連鎖不平衡にあるマーカーより選択される。別の態様において、該少なくとも一つのマーカーは、表２３に示したマーカーより選択される。さらに別の態様において、該少なくとも一つのマーカーは、マーカーｒｓ２１９１１１３（配列番号１３）及びそれらと連鎖不平衡にあるマーカーより選択される。別の態様において、該少なくとも一つのマーカーは、表２４に示したマーカーより選択される。さらに別の態様において、該少なくとも一つのマーカーは、１１８、０３２、３９８及び１１８、２５８、１３４位（Human genome assemblyのNCBI Build 36 ）間の８番染色体上のＳＬＣ３０Ａ遺伝子と連鎖不平衡にあるマーカーより選択される。一つのこうした態様において、該少なくとも一つのマーカーはＳＬＣ３０Ａ遺伝子内に位置している。
【００１８】
一つの態様において、２型糖尿病への感受性を決定する、又は感受性を診断する方法はさらに、該個体における少なくとも一つのハプロタイプの頻度を評価することを含んでなる。一つのこうした態様において、該少なくとも一つのハプロタイプは、表１〜６に示した少なくとも一つの多型マーカー及びそれらと連鎖不平衡にある多型マーカーを含んでなるハプロタイプから選択される。別の態様において、該少なくとも一つのハプロタイプは、ｒｓ２４９７３０４（配列番号１６）、ｒｓ９４７５９１（配列番号３０）、ｒｓ１０８８２０９１（配列番号４）、ｒｓ７９１４８１４（配列番号２４）、ｒｓ６５８３８３０（配列番号２０）、ｒｓ２４２１９４３（配列番号１５）、ｒｓ６５８３８２６（配列番号１９）、ｒｓ７７５２９０６（配列番号３２）、ｒｓ１５６９６９９（配列番号６）、ｒｓ７７５６９９２（配列番号２１）、ｒｓ９３５０２７１（配列番号３３）、ｒｓ９３５６７４４（配列番号３４）、ｒｓ９３６８２２２（配列番号３５）、ｒｓ１０４４０８３３（配列番号３６）、ｒｓ６９３１５１４（配列番号３７）、ｒｓ１８６０３１６（配列番号１０）、ｒｓ１９８１６４７（配列番号１１）、ｒｓ１８４３６２２（配列番号９）、ｒｓ２１９１１１３（配列番号１３）、ｒｓ９８９０８８９（配列番号３１）から選択される少なくとも一つのマーカー及びそれらと連鎖不平衡にあるマーカーより選択される少なくとも一つの多型マーカーを含んでなるハプロタイプから選択される。別の態様において、該少なくとも一つのハプロタイプは、表１〜６及び１４に示したハプロタイプから選択される。
【００１９】
本発明のある種の態様において、該個体からの核酸サンプル中の少なくとも一つの多型マーカーの少なくとも一つのアットリスクアレルの存在の決定は、２型糖尿病への増加した感受性を示す。一つの態様において、増加した感受性は、少なくとも１．１５の相対リスク（ＲＲ）又はオッズ比（ＯＲ）により特徴付けられる。別の態様において、増加した感受性は、少なくとも１．２０の相対リスク（ＲＲ）又はオッズ比（ＯＲ）により特徴付けられる。
【００２０】
いくつかの態様において、ｒｓ２４９７３０４アレルＡ、ｒｓ９４７５９１アレルＡ、ｒｓ１０８８２０９１アレルＣ、ｒｓ７９１４８１４アレルＴ、ｒｓ６５８３８３０アレルＡ、ｒｓ２４２１９４３アレルＧ、ｒｓ６５８３８２６アレルＧ、ｒｓ７７５２９０６アレルＡ、ｒｓ１５６９６９９アレルＣ、ｒｓ７７５６９９２アレルＧ、ｒｓ９３５０２７１アレルＡ、ｒｓ９３５６７４４アレルＣ、ｒｓ９３６８２２２アレルＡ、ｒｓ１０４４０８３３アレルＡ、ｒｓ６９３１５１４アレルＧ、ｒｓ１８６０３１６アレルＡ、ｒｓ１９８１６４７アレルＣ、ｒｓ１８４３６２２アレルＴ、ｒｓ２１９１１１３アレルＡ及び／又はｒｓ９８９０８８９アレルＡの存在は、２型糖尿病への増加した感受性を示す。
【００２１】
特定の態様において、該個体からの核酸サンプルにおける少なくとも一つの保護アレルの存在は、２型糖尿病への減少した感受性を示す。別の態様において、該個体からの核酸サンプルにおいて少なくとも一つのアットリスクアレルも存在しないことは２型糖尿病の減少した感受性を示す。
【００２２】
本発明の方法の特定の態様は、該個体におけるインスリン応答及び／又はグルコース耐性不良にさらに関連している少なくとも一つのマーカー又はハプロタイプに関する。
他の態様において、アットリスクマーカー中の少なくとも一つのアレル又はハプロタイプの存在の決定は、２型糖尿病への増加した感受性を示し、そして該少なくとも一つのアレル又はハプロタイプはさらに減少したインスリン応答及び／又はグルコース耐性不良を示す。
【００２３】
本発明のある種の態様において、連鎖不平衡は、０．８より大きな｜Ｄ’｜及び／又は０．２より大きなｒ２の数値により特徴付けられる。しかしながら、ｒ２及び｜Ｄ’｜測定についての他の値も、本明細書でさらに詳細に記載されるように請求された発明の範囲内である。
【００２４】
本発明の別の側面は、ヒト個体における２型糖尿病への感受性を評価する方法に関し、該個体からの核酸を、ヒト集団において２型糖尿病の増加した発生と相関する、配列番号１、配列番号２又は配列番号３中の少なくとも一つの多型マーカー又はハプロタイプについてスクリーニングすることを含んでなり、該核酸中の該少なくとも一つの多型又はアットリスクハプロタイプにおけるアットリスクマーカーアレルの存在は、該個体を糖尿病に対する上昇した感受性を有していると同定し、該核酸中に該少なくとも一つのアットリスクマーカーアレル又はアットリスクハプロタイプが存在しないことは、該個体を糖尿病に対する上昇した感受性を有していないと同定する。
【００２５】
一つの態様において、該多型又はハプロタイプは、ｒｓ２４９７３０４（配列番号１６）、ｒｓ９４７５９１（配列番号３０）、ｒｓ１０８８２０９１（配列番号４）、ｒｓ７９１４８１４（配列番号２４）、ｒｓ６５８３８３０（配列番号２０）、ｒｓ２４２１９４３（配列番号１５）、ｒｓ６５８３８２６（配列番号１９）、ｒｓ７７５２９０６（配列番号３２）、ｒｓ１５６９６９９（配列番号６）、ｒｓ７７５６９９２（配列番号２１）、ｒｓ９３５０２７１（配列番号３３）、ｒｓ９３５６７４４（配列番号３４）、ｒｓ９３６８２２２（配列番号３５）、ｒｓ１０４４０８３３（配列番号３６）、ｒｓ６９３１５１４（配列番号３７）、ｒｓ１８６０３１６（配列番号１０）、ｒｓ１９８１６４７（配列番号１１）、ｒｓ１８４３６２２（配列番号９）、ｒｓ２１９１１１３（配列番号１３）、ｒｓ９８９０８８９（配列番号３１）及び、０．８より大きい｜Ｄ’｜及び／又は０．２より大きいｒ２の数値により特徴付けられる連鎖不平衡にあるマーカーより選択される
本発明のある種の態様はさらに、ＬＤブロックＣ０６（配列番号１）、ＬＤブロックＣ１０（配列番号２）及びＬＤブロックＣ１７（配列番号３）とは関連しない、２型糖尿病の少なくとも一つのアットリスク遺伝子変異体の存在について、該核酸をスクリーニングする工程を含んでなる。こうした追加の遺伝子変異体は、具体的態様において、本明細書に記載された他の変異体を含んで、２型糖尿病についての感受性又はリスク変異体と同定されているいずれの変異体も含み得る。一つの態様において、該工程は、ＴＣＦ７Ｌ２遺伝子中の、２型糖尿病についての少なくとも一つのアットリスク変異体の少なくとも一つのアットリスクアレルの存在又は不存在について、該核酸をスクリーニングすることを含んでなり、少なくとも一つのアットリスクアレルの存在の決定は、２型糖尿病への増加した感受性を示す。別の態様において、ＴＣＦ７Ｌ２遺伝子中の該少なくとも一つのアットリスク変異体は、マーカーＤＧ１０Ｓ４７８、ｒｓ１２２５５３７２、ｒｓ７８９５３４０、ｒｓ１ｌｌ９６２０５、ｒｓ７９０１６９５、ｒｓ７９０３１４６、ｒｓ１２２４３３２６及びｒｓ４５０６５６５及びそれらと連鎖不平衡にあるマーカーより選択される。
【００２６】
本発明の別の態様において、２型糖尿病と関連していることが見いだされているマーカー又はハプロタイプの存在は、それ自体が２型糖尿病への感受性を決定するために有用であり、２型糖尿病のための特定の治療モダリティーへの対象の異なった応答率を示す。
【００２７】
別の態様において、本発明は、ヒト個体における２型糖尿病への感受性を評価することにおいて使用するマーカーの同定の方法に関し、該方法は：配列番号１、配列番号２又は配列番号３内の少なくとも一つの多型マーカー、又はそれらと連鎖不平衡にある少なくとも一つの多型マーカーを同定すること；
２型糖尿病と又は２型糖尿病への感受性を有すると診断された個体のサンプルの遺伝子型を決定すること；及び
対照個体のサンプルの遺伝子型を決定すること；
を含んでなり、対照サンプル中の少なくとも一つのアレルの頻度と比較し、２型糖尿病と又は２型糖尿病への感受性を有すると診断された個体における少なくとも一つの多型中の少なくとも一つのアレルの頻度の有意な相違は、２型糖尿病への感受性を評価するために有用である少なくとも一つの多型を示す。
【００２８】
一つの態様において、「有意な」は統計的手段により決定され、例えば、相違は統計的に有意である。一つのこうした態様において、統計的有意性は０．０５未満のＰ値により特徴付けられる。他の態様において、該統計的有意性は０．０１未満の、０．００１未満の、０．０００１未満の、０．００００１未満の、０．０００００１未満の、０．００００００１未満の、０．０００００００００１未満の、又は０．０００００００１未満のＰ値により特徴付けられる。
【００２９】
一つの態様において、該少なくとも一つの多型マーカーは、マーカーｒｓ２４９７３０４（配列番号１６）、ｒｓ９４７５９１（配列番号３０）、ｒｓ１０８８２０９１（配列番号４）、ｒｓ７９１４８１４（配列番号２４）、ｒｓ６５８３８３０（配列番号２０）、ｒｓ２４２１９４３（配列番号１５）、ｒｓ６５８３８２６（配列番号１９）、ｒｓ７７５２９０６（配列番号３２）、ｒｓ１５６９６９９（配列番号６）、ｒｓ７７５６９９２（配列番号２１）、ｒｓ９３５０２７１（配列番号３３）、ｒｓ９３５６７４４（配列番号３４）、ｒｓ９３６８２２２（配列番号３５）、ｒｓ１０４４０８３３（配列番号３６）、ｒｓ６９３１５１４（配列番号３７）、ｒｓ１８６０３１６（配列番号１０）、ｒｓ１９８１６４７（配列番号１１）、ｒｓ１８４３６２２（配列番号９）、ｒｓ２１９１１１３（配列番号１３）、ｒｓ９８９０８８９（配列番号３１）から選択される少なくとも一つのマーカーと０．２より大きなｒ２及び／又は０．８より大きな｜Ｄ’｜の数値により特徴付けられる連鎖不平衡にある。
【００３０】
一つの態様において、対照サンプル中の少なくとも一つのアレルの頻度と比較し、２型糖尿病と又は２型糖尿病への感受性を有すると診断された個体における少なくとも一つの多型中の少なくとも一つのアレルの頻度の増加は、該少なくとも一つの多型が２型糖尿病への増加した感受性を評価するために有用であることを示す。別の態様において、対照サンプル中の少なくとも一つのアレルの頻度と比較し、２型糖尿病と又は２型糖尿病への感受性を有すると診断された個体における少なくとも一つの多型中の少なくとも一つのアレルの頻度の減少は、２型糖尿病への減少した感受性、又は２型糖尿病に対する保護を示す。
【００３１】
本発明の別の側面は、ヒト個体から得られた核酸サンプルを遺伝子型同定する方法に関し、該サンプル中の少なくとも一つの多型マーカーの少なくとも一つのアレルの存在又は不存在を決定することを含んでなり、該少なくとも一つのマーカーは、ｒｓ２４９７３０４（配列番号１６）、ｒｓ９４７５９１（配列番号３０）、ｒｓ１０８８２０９１（配列番号４）、ｒｓ７９１４８１４（配列番号２４）、ｒｓ６５８３８３０（配列番号２０）、ｒｓ２４２１９４３（配列番号１５）、ｒｓ６５８３８２６（配列番号１９）、ｒｓ７７５２９０６（配列番号３２）、ｒｓ１５６９６９９（配列番号６）、ｒｓ７７５６９９２（配列番号２１）、ｒｓ９３５０２７１（配列番号３３）、ｒｓ９３５６７４４（配列番号３４）、ｒｓ９３６８２２２（配列番号３５）、ｒｓ１０４４０８３３（配列番号３６）、ｒｓ６９３１５１４（配列番号３７）、ｒｓ１８６０３１６（配列番号１０）、ｒｓ１９８１６４７（配列番号１１）、ｒｓ１８４３６２２（配列番号９）、ｒｓ２１９１１１３（配列番号１３）、ｒｓ９８９０８８９（配列番号３１）及びそれらと連鎖不平衡にあるマーカーより選択され、及び該少なくとも一つの多型マーカーの該少なくとも一つのアレルの存在又は不存在の決定は、２型糖尿病への感受性を示す。
【００３２】
一つの態様において、遺伝子型同定は、該少なくとも一つの多型マーカーに隣接するヌクレオチドプライマー対を使用し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により該少なくとも一つの多型マーカーを含んでなる核酸のセグメントを増幅することを含んでなる。別の態様において、遺伝子型同定は、アレル特異的プローブハイブリダイゼーション、アレル特異的プライマー伸張、アレル特異的増幅、核酸シークエンシング、５’−エキソヌクレアーゼ消化、分子ビーコン（beacon）アッセイ、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ、サイズ分析、及び一本鎖配座解析から選択されるプロセスを使用して実施される。一つ特定の態様において、該プロセスはアレル特異的プローブハイブリダイゼーションを含んでなる。別の態様において、該プロセスはＤＮＡシークエンシングを含んでなる。好ましい態様において、該方法は：
１）該核酸のコピーと検出オリゴヌクレオチドプローブ及びエンハンサーオリゴヌクレオチドプローブを、該オリゴヌクレオチドプローブと該核酸の特異的ハイブリダイゼーションのための条件下で接触させること；ここで
ａ）該検出オリゴヌクレオチドプローブは５〜１００ヌクレオチド長であり、そのヌクレオチド配列が少なくとも一つの多型部位を含んでなる配列番号１、配列番号２又は配列番号３により与えられる核酸の第一のセグメントに特異的にハイブリダイズし；
ｂ）該検出オリゴヌクレオチドプローブは、その３’末端に検出可能標識を、及びその５’末端にクエンチング部分を含んでなり；
ｃ）該エンハンサーオリゴヌクレオチドは５〜１００ヌクレオチド長であり、両方のオリゴヌクレオチドが該核酸にハイブリダイズされた時、該エンハンサーオリゴヌクレオチドが該検出オリゴヌクレオチドプローブに関して３’に位置されるように、該オリゴヌクレオチドプローブに関して５’にある該ヌクレオチド配列の第二のセグメントに相補的であり；及び
ｄ）該オリゴヌクレオチドプローブ及びエンハンサーオリゴヌクレオチドプローブが両方とも該核酸にハイブリダイズされた時、該オリゴヌクレオチド間に単一塩基ギャップが存在するように、第一のセグメント及び第二のセグメント間に単一塩基ギャップが存在する；
２）検出プローブが該核酸にハイブリダイズされた時、該検出プローブの３’末端から検出可能標識を切断して遊離検出可能標識を放出するであろうエンドヌクレアーゼで該核酸を処理すること；及び
３）遊離検出可能標識を測定すること、ここで遊離検出可能標識の存在は、該検出プローブが該核酸の第一のセグメントへ特異的にハイブリダイズされたことを示し、及び検出プローブの補体としての多型部位の配列を示す。
【００３３】
特定の態様において、該核酸のコピーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅によって提供される。別の態様において、該決定された感受性は増加した感受性である。別の態様において、該決定された感受性は減少した感受性である。
【００３４】
本発明の別の側面は、２型糖尿病に関連する症状を予防する及び／又は寛解するための療法剤への応答の可能性について個体を評価する方法に関し：該個体から得られた核酸サンプル中の、少なくとも一つの多型マーカーの少なくとも一つのアレルの存在又は不存在を決定することを含んでなり、該少なくとも一つの多型マーカーは、ｒｓ２４９７３０４（配列番号１６）、ｒｓ９４７５９１（配列番号３０）、ｒｓ１０８８２０９１（配列番号４）、ｒｓ７９１４８１４（配列番号２４）、ｒｓ６５８３８３０（配列番号２０）、ｒｓ２４２１９４３（配列番号１５）、ｒｓ６５８３８２６（配列番号１９）、ｒｓ７７５２９０６（配列番号３２）、ｒｓ１５６９６９９（配列番号６）、ｒｓ７７５６９９２（配列番号２１）、ｒｓ９３５０２７１（配列番号３３）、ｒｓ９３５６７４４（配列番号３４）、ｒｓ９３６８２２２（配列番号３５）、ｒｓ１０４４０８３３（配列番号３６）、ｒｓ６９３１５１４（配列番号３７）、ｒｓ１８６０３１６（配列番号１０）、ｒｓ１９８１６４７（配列番号１１）、ｒｓ１８４３６２２（配列番号９）、ｒｓ２１９１１１３（配列番号１３）、ｒｓ９８９０８８９（配列番号３１）及びそれらと連鎖不平衡にあるマーカーより選択され、該少なくとも一つのマーカーの少なくとも一つのアレルの存在の決定は、２型糖尿病療法剤への陽性応答の可能性を示す。一つの態様において、２型糖尿病療法剤は剤表１及び剤表２に示した剤から選択される。
【００３５】
本発明のさらに別の側面は、２型糖尿病と診断された個体の予後を予測する方法に関し、該方法は、該個体から得られた核酸サンプル中の、少なくとも一つの多型マーカーの少なくとも一つのアレルの存在又は不存在を決定することを含んでなり、該少なくとも一つの多型マーカーは、ｒｓ２４９７３０４（配列番号１６）、ｒｓ９４７５９１（配列番号３０）、ｒｓ１０８８２０９１（配列番号４）、ｒｓ７９１４８１４（配列番号２４）、ｒｓ６５８３８３０（配列番号２０）、ｒｓ２４２１９４３（配列番号１５）、ｒｓ６５８３８２６（配列番号１９）、ｒｓ７７５２９０６（配列番号３２）、ｒｓ１５６９６９９（配列番号６）、ｒｓ７７５６９９２（配列番号２１）、ｒｓ９３５０２７１（配列番号３３）、ｒｓ９３５６７４４（配列番号３４）、ｒｓ９３６８２２２（配列番号３５）、ｒｓ１０４４０８３３（配列番号３６）、ｒｓ６９３１５１４（配列番号３７）、ｒｓ１８６０３１６（配列番号１０）、ｒｓ１９８１６４７（配列番号１１）、ｒｓ１８４３６２２（配列番号９）、ｒｓ２１９１１１３（配列番号１３）、ｒｓ９８９０８８９（配列番号３１）及びそれらと連鎖不平衡にあるマーカーから成る群より選択され、該少なくとも一つのアレルの存在の決定は、該個体における２型糖尿病のより悪い予後を示す。
【００３６】
本発明のさらなる側面は、２型糖尿病の治療を受けている個体における治療の進行をモニタリングする方法に関し、該方法は、該個体から得られた核酸サンプル中の、少なくとも一つの多型マーカーの少なくとも一つのアレルの存在又は不存在を決定することを含んでなり、該少なくとも一つの多型マーカーは、ｒｓ２４９７３０４（配列番号１６）、ｒｓ９４７５９１（配列番号３０）、ｒｓ１０８８２０９１（配列番号４）、ｒｓ７９１４８１４（配列番号２４）、ｒｓ６５８３８３０（配列番号２０）、ｒｓ２４２１９４３（配列番号１５）、ｒｓ６５８３８２６（配列番号１９）、ｒｓ７７５２９０６（配列番号３２）、ｒｓ１５６９６９９（配列番号６）、ｒｓ７７５６９９２（配列番号２１）、ｒｓ９３５０２７１（配列番号３３）、ｒｓ９３５６７４４（配列番号３４）、ｒｓ９３６８２２２（配列番号３５）、  ＴＳ１０４４０８３３（配列番号３６）、ｒｓ６９３１５１４（配列番号３７）、ｒｓ１８６０３１６（配列番号１０）、ｒｓ１９８１６４７（配列番号１１）、ｒｓ１８４３６２２（配列番号９）、ｒｓ２１９１１１３（配列番号１３）、ｒｓ９８９０８８９（配列番号３１）及びそれらと連鎖不平衡にあるマーカーから成る群より選択され、該少なくとも一つのアレルの存在の決定は、該個体の治療結果を示す。
【００３７】
一つの態様において、該方法はさらに、該個体からのサンプル中の少なくとも一つのバイオマーカーを評価することを含んでなる。別の態様において、該方法はさらに、個体のリスク評価、診断又は予後診断を行うため、非遺伝的情報を分析することを含んでなる。該非遺伝的情報は、一つの態様において、年齢、性別、民族性、社会経済的地位、既往症診断、対象の病歴、２型糖尿病の家族歴、生化学的測定及び臨床的測定から選択される。特定の好ましい態様において、全リスクを計算することを含んでなるさらなる工程が用いられる。
【００３８】
本発明の別の側面は、ヒト個体の２型糖尿病への感受性を評価するためのキットに関し、該キットは、個体のゲノム中の少なくとも一つの多型マーカーの少なくとも一つのアレルを選択的に検出するための試薬を含んでなり、該多型マーカーは、その配列が配列番号１、配列番号２及び配列番号３に示されている核酸セグメント内の多型マーカー及びそれらと連鎖不平衡にあるマーカーから成る群より選択され、及び該少なくとも一つのアレルの存在は２型糖尿病への感受性を示す。
【００３９】
一つの態様において、該少なくとも一つの多型マーカーは、表１０〜１２に示したマーカー及びそれらと連鎖不平衡にあるマーカーの群より選択される。別の態様において、該少なくとも一つの多型マーカーは、表１０〜１２及び表１４に示したマーカー及びそれらと連鎖不平衡にあるマーカーの群より選択される。別の態様において、該少なくとも一つの多型マーカーは、ｒｓ２４９７３０４（配列番号１６）、ｒｓ９４７５９１（配列番号３０）、ｒｓ１０８８２０９１（配列番号４）、ｒｓ７９１４８１４（配列番号２４）、ｒｓ６５８３８３０（配列番号２０）、ｒｓ２４２１９４３（配列番号１５）、ｒｓ６５８３８２６（配列番号１９）、ｒｓ７７５２９０６（配列番号３２）、ｒｓ１５６９６９９（配列番号６）、ｒｓ７７５６９９２（配列番号２１）、ｒｓ９３５０２７１（配列番号３３）、ｒｓ９３５６７４４（配列番号３４）、ｒｓ９３６８２２２（配列番号３５）、ｒｓ１０４４０８３３（配列番号３６）、ｒｓ６９３１５１４（配列番号３７）、ｒｓ１８６０３１６（配列番号１０）、ｒｓ１９８１６４７（配列番号１１）、ｒｓ１８４３６２２（配列番号９）、ｒｓ２１９１１１３（配列番号１３）、ｒｓ９８９０８８９（配列番号３１）及びそれらと連鎖不平衡にあるマーカーより選択される。別の態様において、該少なくとも一つの多型マーカーは、ｒｓ２４９７３０４（配列番号１６）、ｒｓ９４７５９１（配列番号３０）、ｒｓ１０８８２０９１（配列番号４）、ｒｓ７９１４８１４（配列番号２４）、ｒｓ６５８３８３０（配列番号２０）、ｒｓ２４２１９４３（配列番号１５）、ｒｓ６５８３８２６（配列番号１９）、ｒｓ７７５２９０６（配列番号３２）、ｒｓ１５６９６９９（配列番号６）、ｒｓ７７５６９９２（配列番号２１）、ｒｓ９３５０２７１（配列番号３３）、ｒｓ９３５６７４４（配列番号３４）、ｒｓ９３６８２２２（配列番号３５）、ｒｓ１０４４０８３３（配列番号３６）、ｒｓ６９３１５１４（配列番号３７）、ｒｓ１８６０３１６（配列番号１０）、ｒｓ１９８１６４７（配列番号１１）、ｒｓ１８４３６２２（配列番号９）、ｒｓ２１９１１１３（配列番号１３）及びｒｓ９８９０８８９（配列番号３１）から選択される。
【００４０】
一つの態様において、該試薬は、該少なくとも一つの多型マーカーを含んでなる該個体のゲノムの断片へハイブリダイズする少なくとも一つの近接するオリゴヌクレオチド、緩衝液及び検出可能な標識を含んでなる。一つの態様において、該試薬は、対象から得られたゲノム核酸セグメントの反対鎖にハイブリダイズする少なくとも一つのオリゴヌクレオチド対を含んでなり、各オリゴヌクレオチドプライマー対は、一つの多型マーカーを含む該個体のゲノムの断片を選択的に増幅するように設計されており、及び該断片は少なくとも３０塩基対のサイズである。特定の態様において、該少なくとも一つのオリゴヌクレオチドは該個体のゲノムと完全に相補的である。別の態様において、該少なくとも一つのオリゴヌクレオチドは、該個体のゲノムと少なくとも一つのミスマッチを含み得る。一つの態様において、該オリゴヌクレオチドは約１８〜約５０ヌクレオチド長である。別の態様において、該オリゴヌクレオチドは２０〜３０ヌクレオチド長である。
【００４１】
一つの好ましい態様において、該キットは：
５〜１００ヌクレオチド長である検出オリゴヌクレオチドプローブ；５〜１００ヌクレオチド長であるエンハンサーオリゴヌクレオチドプローブ；及びエンドヌクレアーゼ酵素；
該検出オリゴヌクレオチドプローブは、そのヌクレオチド配列が少なくとも一つの多型部位を含んでなる配列番号１、配列番号２及び配列番号３により与えられている核酸の第一のセグメントへ特異的にハイブリダイズし；及び該検出オリゴヌクレオチドプローブは、その３’末端に検出可能な標識及びその５’末端にクエンチング部分を含んでなり；該エンハンサーオリゴヌクレオチドは、５〜１００ヌクレオチド長であり、両方のオリゴヌクレオチドが該核酸にハイブリダイズされた時、該エンハンサーオリゴヌクレオチドが該検出オリゴヌクレオチドプローブに関して３’に位置されるように、該オリゴヌクレオチドプローブに関して５’にある該ヌクレオチド配列の第二のセグメントに相補的であり；該オリゴヌクレオチドプローブ及びエンハンサーオリゴヌクレオチドプローブが両方とも該核酸にハイブリダイズされた時、該オリゴヌクレオチド間に単一塩基ギャップが存在するように、第一のセグメント及び第二のセグメント間に単一塩基ギャップが存在し；及び該核酸をエンドヌクレアーゼで処理することは、該検出プローブが該核酸にハイブリダイズされた時、該検出プローブの３’末端から検出可能標識を切断して遊離検出可能標識を放出するであろう。
【００４２】
本発明のさらなる側面は、ヒト個体において２型糖尿病を診断する及び／又は２型糖尿病への感受性を評価するための診断薬の製造におけるオリゴヌクレオチドプローブの使用に関し、該プローブは、そのヌクレオチド配列が少なくとも一つの多型部位を含んでなる配列番号１、配列番号２及び配列番号３により与えられる核酸のセグメントにハイブリダイズし、該断片は１５〜５００長である。一つの態様において、該多型部位は多型マーカーｒｓ２４９７３０４（配列番号１６）、ｒｓ９４７５９１（配列番号３０）、ｒｓ１０８８２０９１（配列番号４）、ｒｓ７９１４８１４（配列番号２４）、ｒｓ６５８３８３０（配列番号２０）、ｒｓ２４２１９４３（配列番号１５）、ｒｓ６５８３８２６（配列番号１９）、ｒｓ７７５２９０６（配列番号３２）、ｒｓ１５６９６９９（配列番号６）、ｒｓ７７５６９９２（配列番号２１）、ｒｓ９３５０２７１（配列番号３３）、ｒｓ９３５６７４４（配列番号３４）、ｒｓ９３６８２２２（配列番号３５）、ｒｓ１０４４０８３３（配列番号３６）、ｒｓ６９３１５１４（配列番号３７）、ｒｓ１８６０３１６（配列番号１０）、ｒｓ１９８１６４７（配列番号１１）、ｒｓ１８４３６２２（配列番号９）、ｒｓ２１９１１１３（配列番号１３）、ｒｓ９８９０８８９（配列番号３１）及びそれらと連鎖不平衡にある多型マーカーより選択される。
【００４３】
本発明のさらに別の側面は：少なくとも一つの多型マーカーのための識別子；２型糖尿病と診断された複数の個体における、前記少なくとも一つの多型マーカーの少なくとも一つのアレルの頻度の指標；及び、複数の参照個体における、前記少なくとも一つの多型マーカーの少なくとも一つのアレルの頻度の指標；が保存されるコンピューター可読媒体に関し、該少なくとも一つの多型マーカーは、多型マーカーｒｓ２４９７３０４（配列番号１６）、ｒｓ９４７５９１（配列番号３０）、ｒｓ１０８８２０９１（配列番号４）、ｒｓ７９１４８１４（配列番号２４）、ｒｓ６５８３８３０（配列番号２０）、ｒｓ２４２１９４３（配列番号１５）、ｒｓ６５８３８２６（配列番号１９）、ｒｓ７７５２９０６（配列番号３２）、ｒｓ１５６９６９９（配列番号６）、ｒｓ７７５６９９２（配列番号２１）、ｒｓ９３５０２７１（配列番号３３）、ｒｓ９３５６７４４（配列番号３４）、ｒｓ９３６８２２２（配列番号３５）、ｒｓ１０４４０８３３（配列番号３６）、ｒｓ６９３１５１４（配列番号３７）、ｒｓ１８６０３１６（配列番号１０）、ｒｓ１９８１６４７（配列番号１１）、ｒｓ１８４３６２２（配列番号９）、ｒｓ２１９１１１３（配列番号１３）、ｒｓ９８９０８８９（配列番号３１）及びそれらと連鎖不平衡にある多型から選択される。一つの態様において、連鎖不平衡は、少なくとも０．２のｒ２の数値及び／又は少なくとも０．８の｜Ｄ’｜の値により定義されると定義できる。
【００４４】
一つの態様において、複数の個体の祖先についての情報が含まれている。別の態様において、２型糖尿病と診断された複数の個体及び複数の参照個体は特定の祖先を有する。
別の側面は、ヒト個体における２型糖尿病についての遺伝的指標を決定するための装置に関し、コンピューター可読メモリー；及びコンピューター可読メモリー上に保存されたルーチン（routine）；を含んでなり、該ルーチンは、マーカーｒｓ２４９７３０４（配列番号１６）、ｒｓ９４７５９１（配列番号３０）、ｒｓ１０８８２０９１（配列番号４）、ｒｓ７９１４８１４（配列番号２４）、ｒｓ６５８３８３０（配列番号２０）、ｒｓ２４２１９４３（配列番号１５）、ｒｓ６５８３８２６（配列番号１９）、ｒｓ７７５２９０６（配列番号３２）、ｒｓ１５６９６９９（配列番号６）、ｒｓ７７５６９９２（配列番号２１）、ｒｓ９３５０２７１（配列番号３３）、ｒｓ９３５６７４４（配列番号３４）、ｒｓ９３６８２２２（配列番号３５）、ｒｓ１０４４０８３３（配列番号３６）、ｒｓ６９３１５１４（配列番号３７）、ｒｓ１８６０３１６（配列番号１０）、ｒｓ１９８１６４７（配列番号１１）、ｒｓ１８４３６２２（配列番号９）、ｒｓ２１９１１１３（配列番号１３）、ｒｓ９８９０８８９（配列番号３１）及びそれらと少なくとも０．２のｒ２の数値及び／又は少なくとも０．８の｜Ｄ’｜の値により定義される連鎖不平衡にあるマーカーより選択される少なくとも一つの多型マーカーに関して少なくとも一つのヒト個体についてのマーカー及び／又はハプロタイプ情報を分析するためにプロセッサーで実行されるのに適合しており、そしてマーカー及び／又はハプロタイプ情報に基づいたアウトプットを発生し、該アウトプットはヒト個体についての２型糖尿病の遺伝的指標としての該少なくとも一つのマーカー又はハプロタイプのリスク尺度を含んでなる。
【００４５】
一つの態様において、該ルーチンは、２型糖尿病と診断された複数の個体における少なくとも一つの多型マーカーの少なくとも一つのアレル又は少なくとも一つのハプロタイプの頻度の指標、及び複数の参照個体における少なくとも一つの多型マーカーの少なくとも一つのアレル又は少なくとも一つのハプロタイプの頻度の指標をさらに含んでなり、そしてリスク尺度は、２型糖尿病と診断された複数の個体についての該少なくとも一つのマーカー及び／又はハプロタイプ情報の頻度の指標とヒト個体についての該少なくとも一つのマーカー及び／又はハプロタイプ状態の比較に基づいている。
【００４６】
本発明の方法、使用、装置又はキットのある種の態様において、連鎖不平衡は０．８より大きな｜Ｄ’｜及び／又は０．２より大きなｒ２の数値により特徴付けられる。しかしながら、ｒ２及び｜Ｄ’｜尺度についての他の値も他の態様において可能であり、そしてこうした態様も本明細書でさらに詳細に記載するように本発明の範囲内である。
【００４７】
本発明の方法、使用、装置又はキットのある種の態様において、該個体は特定の祖先を有する。一つの態様において、該祖先は、ブラックアフリカ人祖先、コーカサス人祖先及び中国人祖先から選択される。別の態様において、該祖先はブラックアフリカ人祖先である。別の態様において、該祖先はヨーロッパ人祖先である。別の態様において、該祖先はコーカサス人祖先である。該祖先は、ある種の態様において、遺伝子分析又は遺伝子型同定が行われている個体による自己申告である。他の態様において、該祖先は個体からの核酸サンプル中の少なくとも一つの多型マーカーの少なくとも一つのアレルを検出することを含んでなる遺伝子決定により決定され、ここで該アレルの存在又は不存在は該個体の祖先を示す。
【００４８】
本発明の方法、使用、装置又はキットの特定の他の態様において、該個体は肥満である。他の態様において、該個体は非肥満である。肥満は、一つの態様において、２５より大きなＢＭＩ（肥満度指数（Body Mass Index））の値により決定される。別の態様において、肥満は３０より大きなＢＭＩの値により定義される。限定されるわけではないが、２３、２４、２５．５、２６、２６．５、２７、２７．５などより大きいＢＭＩを含む、他のＢＭＩのカットオフ整数又は小数値も可能であり、本発明の範囲内である。非肥満個体は、一つの態様において、ＢＭＩによる肥満の基準を満たしていないすべての個体として定義される。他の態様において、非肥満個体は、２５未満の、２４未満の、２３未満の、２２未満の、２１未満の又は２０未満のＢＭＩようなＢＭＩの特定のカットオフを有する個体である。ＢＭＩ値の非整数カットオフ値も非肥満個体を定義するために有用である。一般に、肥満及び非肥満群は、それらのＢＭＩ値に関して重複することはない。ある態様において、群を定義するために用いられるカットオフは同一であり、例えば、２５のＢＭＩより大きいか又はより小さい。他の態様においては、異なったカットオフが使用され、例えば、肥満個体については２７より大きく、そして非肥満個体については２３より小さい。肥満及び非肥満個体を定義するために適しているすべてのＢＭＩの関連範囲が可能であり、本発明の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】図１は、２型糖尿病に関連するマーカーを含有する染色体６ｐ２２．３の領域中のプロット連鎖不平衡パターンを示す。（ａ）ｘ軸はＮＣＢＩ  Ｂｕｉｌｄ  ３５ゲノムアセンブリーに関する位置を示しており（Ｂｕｉｌｄ  ３６と同一）、及びｙ軸は領域中の連鎖不平衡の尺度を示している。ＣＤＫＡＬ１遺伝子のスパンは矢印で示されており、黒いバーによるエクソンの位置は対角線に垂直である。ＳＮＰマーカーはそれらの物理的位置に従うよりむしろ等距離でプロットされている。本図は連鎖不平衡のｒ２を示し、陰影はマーカー間のｒ２のペアワイズ値に比例している。（ｂ）ＣＤＫＡＬ遺伝子の５’末端の拡大図、ＬＤブロックＣ０６領域（配列番号１）を示しており、その中に２型糖尿病に関連することが見いだされたいくつかのマーカーが存在する。関連ＳＮＰマーカーのいくつかの位置は図に示されている。
【図２】図２は、２型糖尿病に関連するマーカーを含有する染色体１０ｑ２３．３３の領域中の連鎖不平衡パターンを示す。ｘ軸はＮＣＢＩ  Ｂｕｉｌｄ  ３５ゲノムアセンブリーに関する位置を示しており、ｙ軸は領域中の連鎖不平衡の尺度を示している。４つの関連ＳＮＰマーカーｒｓ２４９７３０４、ｒｓ９４７５９１、ｒｓ１０８８２０９１及びｒｓ７９１４８１４の位置、ならびにＬＤブロック内の３つの遺伝子、ＩＤＥ、ＫＩＦ１１及びＨＨＥＸのスパン及びエクソンが示されている。本図は連鎖不平衡のｒ２を示し、陰影はマーカー間のｒ２のペアワイズ値に比例している。
【図３】図３は、非肥満及び全患者において糖尿病に関連するマーカーを含有する染色体１７ｑ２４．３の領域中の連鎖不平衡パターンを示す。５つのＳＮＰマーカーｒｓ１８６０３１６、ｒｓ１９８１６４７、ｒｓ１８４３６２２、ｒｓ２１９１１１３及びｒｓ９８９０８８９が示されている。本図は連鎖不平衡のｒ２を示し、陰影はマーカー間のｒ２のペアワイズ値に比例している。
【図４】図４は、単一ＳＮＰ及び２マーカーハプロタイプの解析からの６５３，０２５補正カイ２−統計値（丸）のＱ−Ｑプロットを示す。等角線（黒線）は参照目的のためのプロットに含まれている。点線の水平線は、試験された６５３，０２５ＳＮＰ／ハプロタイプ及び３つの表現型についてのボンフェローニの調整を仮定している全ゲノム有意性についての閾値を示している。
【図５】図５は、６ｐ２２．３へのＴ２Ｄの関連の模式図を表している。ａ）６番染色体上の１Ｍｂインターバル（２０．５〜２１．５Ｍｂ、ＮＣＢＩ  Ｂｕｉｌｄ  ３４）でのペアワイズ相関構造。上部プロットはＣＥＵ集団のＨａｐＭａｐレリース１９からの１０４７の共通ＳＮＰ（ＭＡＦ＞５％）についてのペアワイズＤ’を含み、一方、下段のプロットはＳＮＰの同一セットのペアワイズｒ２値を含む。ｂ）ＨａｐＭａｐデータセット（Nature 437, 1299-1320(2005年10月27日)）に基づいたこの間隔における組換えホットスポットの位置。ｃ）地図に位置づけられた２つの遺伝子、Ｅ２Ｆ３及びＣＤＫＡＬ１１のエクソンの位置（縦バー）。ｄ）すべてのＴ２Ｄ症例（黒丸）、非肥満Ｔ２Ｄ症例（白丸）及び肥満Ｔ２Ｄ症例（白三角）それぞれについてのインターバル中の全ゲノム関連性結果の概略図。プロットされているのは、マーカーの染色体位置に対する−ｌｏｇＰであり、Ｐは補正Ｐ値である。４つすべてのパネルは、同一の水平Ｍｂスケールを使用し、パネルｄの下部に示されている。
【図６】図６は、ＩＮＳ−Ｉ細胞からのＣＤＫＡＬ１  ｃＤＮＡを示す。レーン１及び２は、エクソン２〜８及びエクソン７〜１３から増幅されたＣＤＫＡＬ１  ｃＤＮＡを含み、それぞれ５９６ｂｐ及び７３８ｂｐのバンドサイズを与えている。βアクチン（８３７ｂｐ）は、レーン３において陽性対照として働いており、レーン４はプライマーなしの陰性対照反応である。サイズ標準は左に与えられている。
【図７】図７は、インスリン分泌とｒｓ７７５６９９２及びｒｓ１３２６６６３４との関連を示す。平均ｌｏｇ転換インスリン分泌レベルは、２つのＳＮＰ、ｒｓ７７５６９９２及びｒｓ１３２６６６３４の３つの異なった遺伝子型についての、補正インスリン応答（方法の項を参照されたい）により推定した。結果は、経口グルコース耐性試験を行っているデンマーク人Inter99 研究からの３９３８個体（２３１Ｔ２Ｄ症例及び３７５１対照）について示されている。個体の数が各カラムの下に含まれており、標準偏差（ｓ．ｅ．ｍ．）は水平バーとして示されている。含まれているＰ値は、年齢、性、及び罹患状態について補正し、加法モデル（Ｐａｄｄ）又は劣性モデル（Ｐｒｅｃ）の両方を仮定した、遺伝子型状態に対してｌｏｇ転換インスリン分泌レベルの回帰からのものである。
【図８】図８は、ｒｓ７７５６９９２及びｒｓ１３２６６６３４とインスリン分泌の関連のさらなる分析を示す。ａ）平均ｌｏｇ転換インスリン分泌レベルは、ＳＮＰ  ｒｓ７７５６９９２の３つの異なった遺伝子型についての、補正インスリン応答（ＣＩＲ）により推定した。インスリン分泌レベルはＯＧＴＴを行っているデンマーク人Inter99 コホート（２２３Ｔ２Ｄ症例及び３７１５対照）からの３９３８個体の群から推定した。結果は、すべての個体（最も左のバー）及び男性（中央バー）及び女性（最も右のバー）について別々に示されている。各推定値の個体数は、カラムの下に、対応する遺伝子型とともに括弧内に示されている。平均の標準偏差は各カラムの上部にバーで示されている。ｂ）３９２６個体（２２８Ｔ２Ｄ症例及び３６９８対照）のＳＮＰ  ｒｓ１３２６６６３４の異なった遺伝子型についての対応する推定値。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
発明の詳細な説明
本発明の好ましい態様の説明は以下の通りである。
本発明は２型糖尿病に関連することが見いだされている多型マーカー及びハプロタイプを開示する。こうしたアレルを含んでなる、ある多型ＳＮＰマーカー及びハプロタイプの特定のアレルは２型糖尿病に関連することが見いだされている。こうしたマーカー及びハプロタイプは、本明細書でさらに詳細に記述されているように、２型糖尿病への感受性を評価するために有用である。本発明のさらなる応用には、本発明の多型マーカーを利用している２型糖尿病療法剤への応答を評価するための方法、ならびに２型糖尿病への個体の感受性を評価するためのキットが含まれる。
【００５１】
定義
以下の用語は、本文脈において示されている意味を有する：
本明細書に記載した「多型マーカー」（「マーカー」と呼ばれることもある）とは、ゲノム多型部位を指す。各多型マーカーは、多型部位の特定のアレルに特徴的な少なくとも二つの配列変異を有する。それ故、多型マーカーへの遺伝的関連は、その特定の多型マーカーの少なくとも一つの特異的アレルとの関連があることを暗示する。該マーカーは、一塩基変異多型（ＳＮＰｓ）、マイクロサテライト、挿入、欠失、重複及び転座を含む、ゲノムで観察されるいずれかの変異体タイプのいずれかのアレルを含み得る。
【００５２】
「アレル」とは、染色体上の所与の座位（位置）のヌクレオチド配列を指す。多型マーカーアレルはそれ故、染色体上の該マーカーの組成（即ち、配列）を指す。個体からのゲノムＤＮＡは、いずれかの所与の多型マーカーについての二つのアレルを含有し、各染色体上の各コピーを代表する。本明細書で使用されたヌクレオチドについての配列コードは：Ａ＝１、Ｃ＝２、Ｇ＝３、Ｔ＝４、である。
【００５３】
本明細書に記載した配列ヌクレオチド多義性は、IUPAC-IUBにより提唱されている通りである。これらのコードはEMBL、GenBank及びPIRデータベースで使用されているコードと一致している。
【００５４】
【表１】
2010510804.tif 000002
【００５５】
集団（天然集団又は合成的集団、例えば、合成分子のライブラリー）中で一つより多くの配列が可能であるヌクレオチド位置が、本明細書中で「多型部位」と称される。
「単一ヌクレオチド多型」又は「ＳＮＰ」は、種のメンバー間で又は個体中の対となった染色体間で、ゲノム中の特異的位置で単一ヌクレオチドが異なっている場合に生じるＤＮＡ配列変異である。ほとんどのＳＮＰ多型は二つのアレルを有する。各個体は、この場合、多型の一つのアレルについてホモ接合性であるか（即ち、個体の両方の染色体コピーはＳＮＰ位置で同一のヌクレオチドを有する）、又は該個体はヘテロ接合性である（即ち、該個体の二つの姉妹染色体は異ったヌクレオチドを含有する）。本明細書で報告されているＳＮＰ命名法はNational Center for Biotechnology Information (NCBI)により、それぞれ特有ＳＮＰと指定された公式Reference SNP(rs) ID 同定法を指す。
【００５６】
本明細書に記載した「変異体」とは、参照ＤＮＡとは異なっているＤＮＡのセグメントを指す。本明細書に記載した「マーカー」又は「多型マーカー」は変異体である。参照と異なっているアレルは「変異体」アレルと称される。
【００５７】
「マイクロサテライト」は、特定の部位に、２〜８ヌクレオチド長である多数の小さな塩基のリピートを有する（ＣＡリピートのような）多型マーカーであり、母集団中でリピート長の数は変化する。「インデル」は、典型的には数ヌクレオチド長である小さな挿入又は欠失を含んでなる多型の共通形態である。
【００５８】
本明細書に記載した「ハプロタイプ」とは、セグメントに沿って配置されたアレルの特異的組み合わせにより特徴付けされる、ＤＮＡの一つの鎖内のゲノムＤＮＡのセグメントを指す。ヒトのような二倍体生物については、ハプロタイプは各多型マーカー又は座位について一対のアレルの一つのメンバーを含んでなる。ある態様において、該ハプロタイプは二つ又はそれ以上のアレル、三つ又はそれ以上のアレル、四つ又はそれ以上のアレル、又は五つ又はれ以上のアレルを含み得る。ハプロタイプは、そのハプロタイプ中のマーカー名及びマーカーのアレルとの関連で記述されており、例えば、「３  ｒｓ７７５８８５１」とは、ハプロタイプ中にあるマーカーｒｓ７７５８８５１の３アレルを指し、「ｒｓ７７５８８５１アレル３」と等しい。さらに、ハプロタイプ中のアレルコードは、個々のマーカーについてのものである、即ち、１＝Ａ、２＝Ｃ、３＝Ｇ及び４＝Ｔ。
【００５９】
本明細書に記載した用語「感受性」とは、増加した感受性及び減少した感受性の両方を包含する。それ故、本発明の多型マーカー及び／又はハプロタイプでの特定アレルは、特定のアレル又はハプロタイプについて１より大きな相対リスク（ＲＲ）又はオッズ比（ＯＲ）により特徴付けられるような、２型糖尿病への増加した感受性（即ち、増加したリスク）により特徴付けることができる。もしくは、本発明のマーカー及び／又はハプロタイプは、１未満の相対リスクにより特徴付けられるような、２型糖尿病への減少した感受性（即ち、減少したリスク）を特徴とする。
【００６０】
「核酸サンプル」は、核酸を含有する、個体から得られたサンプルである。ある態様において（即ち、特異的多型マーカー及び／又はハプロタイプの検出）、該核酸サンプルはゲノムＤＮＡを含んでなる。こうした核酸サンプルは、こうした核酸サンプルは、血液サンプル、羊水のサンプル、脳脊髄液のサンプル、又は皮膚、筋肉、頬側又は結膜粘膜、胎盤、消化管又は他の器官からの組織サンプルを含む、ゲノムＤＮＡを含有するいずれの起源のものでもあり得る。
【００６１】
用語「２型糖尿病療法剤」は、２型糖尿病に関連する症状を寛解する又は予防するために使用し得る剤を指す。
本明細書に記載された用語「２型糖尿病関連核酸」とは、２型糖尿病に関連していることが見出されている核酸を指す。これには、限定されるわけではないが、本明細書に記載したマーカー及びハプロタイプ、及びそれらと強い連鎖不平衡（ＬＤ）にあるマーカー及びハプロタイプが含まれる。一つの態様において、２型糖尿病関連核酸は、ＬＤブロック内に位置する少なくとも一つの多型マーカーを介して２型糖尿病に関連していることが見出されたＬＤブロックを指す。
【００６２】
本明細書に記載された用語「非肥満」とは、３０又はそれ以下のような前もって決定された閾値以下の肥満度指数（ＢＭＩ）と計算された個体を指す。本明細書でより詳細に記載されているように、該用語を定義するために有用な他の閾値も可能である。ＢＭＩを計算するための式は、［体重（ｋｇ）］／［身長（ｍ）］２により与えられる。用語「肥満」は、３０の閾値のようなある前もって決定された閾値より上のＢＭＩを有する個体である。
【００６３】
本明細書に記載された用語「ＬＤブロックＣ０６」とは、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）Ｂｕｉｌｄ  ３５の２０，６３４，９９６〜２０，８３６，７１０位（配列番号１）に相当する、マーカーｒｓ４４２９９３６及びｒｓ６９０８４２５間の、６番染色体上の連鎖不平衡（ＬＤ）ブロックを指す。
【００６４】
本明細書に記載された用語「ＬＤブロックＣ１０」とは、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）Ｂｕｉｌｄ  ３５の９４，１９２，８８５〜９４，４９０，０９１位（配列番号２）に相当する、マーカーｒｓ２７９８２５３及びｒｓｌ１１８７１５２間の、１０番染色体上の連鎖不平衡（ＬＤ）ブロックを指す。
【００６５】
本明細書に記載された用語「ＬＤブロックＣ１７」とは、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）Ｂｕｉｌｄ  ３５の６６，０３７，６５６−６６，１６３，０７６位（配列番号３）に相当する、マーカーｒｓｌ１０７７５０１及びｒｓ４７９３４９７間の、１７番染色体上の連鎖不平衡（ＬＤ）ブロックを指す。
【００６６】
本明細書に記載された用語「ＣＤＫＡＬ１」とは、ヒトゲノムのＮＣＢＩ  Ｂｕｉｌｄ  ３５中の２０，６４２，７３６〜２１，３４０，６１１位にまたがるＣＤＫ５調節サブユニット関連タンパク質１様１遺伝子を指す。
【００６７】
本明細書に記載された用語「ＳＬＣ３０Ａ８」とは、溶質輸送体ファミリー３０、メンバー８、遺伝子を指す。この遺伝子は８番染色体上に位置し、その最も長いアイソフォームは、ＮＣＢＩ  Ｂｕｉｌｄ  ３４中のそれぞれ１１７，９１９，８０５及び１１８，１４５，５４１位に相当する、ヒトゲノムアセンブリーのＮＣＢＩ  Ｂｕｉｌｄ  ３６中の１１８，０３２，３９８及び１１８，２５８，１３４位間の２２５ｋｂほどにまたがっている。両方のＢｕｉｌｄにおいて、該遺伝子はゲノム配列の２２５，７３６ｂｐにまたがる。
【００６８】
ゲノム中の３００，０００を超えるＳＮＰｓを同時に測定するために使用し得るIllumina 330K チップを使用する、アイスランド人２型糖尿病患者及び集団対照個体の遺伝子型同定を介して、２型糖尿病に関連する多数の変異体が本発明により同定された。広範囲の連鎖不平衡の領域（ＬＤブロック）内の単一ＳＮＰｓ、２マーカーハプロタイプ及び拡張ハプロタイプを使用する関連解析を、該ゲノム全域で実施した。関連性についてｐ値を補正後、２１座位で５ｘｌ０−５未満のｐ値を有する４９の単一マーカー及び二つのマーカーハプロタイプが最初に同定された（即ち、該ゲノム中の遺伝子感受性位置）（表１）。加えて、８の追加の座位で１０の拡張ハプロタイプが、同一の基準で選択された（表２）。患者群内で７００個体は非肥満（ＢＭＩ＜３０）であり、関連について別々に試験された。関連性についてｐ値を補正後、２０座位で３６の単一マーカー及び二つのマーカーハプロタイプが５ｘｌ０−５未満のｐ値を有していた（表３）。全群が解析された場合、これらの座位の３つも同定された。加えて、４の追加の座位で６の拡張ハプロタイプが、同一の基準で選択された（表４）。５３１人の患者の肥満群（ＢＭＩ＞３０）も、関連について別々に試験された。関連性についてｐ値を補正後、１６座位で３８の単一マーカー及び２つのマーカーハプロタイプが５ｘｌ０−５未満のｐ値を有していた（表５）。全群が解析された場合、これらの座位の一つも同定されたが、この基準を使用すると非肥満及び肥満群間での重複は観察されなかった。加えて、７の追加の座位で１０の拡張ハプロタイプが、肥満糖尿病患者の関連解析において５ｘｌ０−５未満のｐ値を有していた（表６）。
【００６９】
これらの単一マーカー連関及び２マーカー及び拡張ハプロタイプ連関結果は、２型糖尿病に対する多感受性変異体についての証拠を示している。本明細書で示した単一マーカーＳＮＰ解析について、感受性変異体は増加したリスクにより表し得ることに注意すべきであり、一つのアレルは対照と比較して患者群において過剰提示されている（overrepresented）。もしくは、感受性変異体は、問題とするＳＮＰの他のアレルにより表すことが可能であり−そのようなアレルについては、対照と比較して、患者における過小提示（under-representation）が期待される。このことは、二つのアレルを含んでなる遺伝子要素の関連解析の当然の結果である。多マーカーハプロタイプについては、又は一つより多くのマーカーを含んでなる多型マーカーについては、アットリスク関連性が一つ（又はそれ以上の）アットリスクアレル又はハプロタイプで観察することができる。問題とする遺伝子領域中の遺伝子組成又はハプロタイプ構造に依存して、一つの（又はそれ以上の）保護的変異体又はハプロタイプへの関連性（１未満のＲＲ値）の形で保護的変異体も観察することができる。
【００７０】
最も有意な関連シグナルが、染色体６ｐ２２．３に位置する二つの単一マーカー（ｒｓｌ５６９６９９及びｒｓ７７５６９９２）及び三つの２マーカーハプロタイプ（３  ｒｓ７７５８８５１  ２  ｒｓｌ５６９６９９、１  ｒｓ４７１２５２７  ３  ｒｓ７７５６９９２，１  ｒｓ７７５６９９２  ３  ｒｓ９２９５４７８；表３参照）により同定された。これらのマーカーはマーカーｒｓ４４２９９３６及びｒｓ６９０８４２５間、染色体上の２０６３４９９６及び２０８３６７１０位間（ＮＣＢＩ  Ｂｕｉｌｄ  ３５；配列番号１）の拡張ＬＤ（ＬＤブロック）の領域内に位置する（図１）。この領域は、遺伝子ＣＤＫ５調節サブユニット関連タンパク質１様１（ＣＤＫＡＬ１）（ＮＭ＿０１７７７４）のエクソン１〜５を含む５’末端を含有する。これらのマーカーの関連性は、二つの追加の２型糖尿病コホートにおいて確認された（表７を参照されたい）。
【００７１】
ｒｓ７７５６９９２アレルＧと２型糖尿病の増加したリスクとの関連性の引き続いての研究は、ヨーロッパ人祖先の個体（アレル特異的オッズ比（ＯＲ）＝１．１６；Ｐ＝３．９ｘ１０−１０）における、ハン族中国人祖先の香港からの個体（ＯＲ＝１．２５；Ｐ＝０．０００１８）における、２型糖尿病と該マーカーの関連性を確立した（表１４、１５及び１７を参照されたい）。ヨーロッパ人及び中国人集団において２型糖尿病と関連していることも示されている、ｒｓ７７５６９９２を有するＬＤ中のＬＤブロックＣ０６（配列番号１）内の追加の変異体には、ｒｓｌ５６９６９９、ｒｓ７７５２９０６、ｒｓ９３５０２７１、ｒｓ９３５６７４４、ｒｓ９３６８２２２、ｒｓ１０４４０８３３及びｒｓ６９３１５１４が含まれる（表１８）。ｒｓ７７５６６９９２アレルＧ変異体の遺伝子型オッズ比（ＯＲ）は、ほとんど劣勢遺伝型式であることを指示している（表２０）。特に、ホモ接合体についてのＯＲは、ヨーロッパ人及び香港群においてそれぞれ１．４５及び１．５５である。ｒｓ７７５６６９９２アレルＧアットリスク変異体は、キャリアにおける減少したインスリン応答と相関することが見いだされている（表２１、図７及び８）。該変異体のホモ接合体キャリアは、ヘテロ接合体又は非キャリアよりも推定２４％未満のインスリン応答を有していることが観察されており、この変異体は減少したインスリン分泌を介してＴ２Ｄのリスクを与えることを示唆している。ｒｓ７７５６９９２マーカー及びそれらと連鎖不平衡にあるマーカー（限定されるわけではないが、ｒｓｌ５６９６９９、ｒｓ７７５２９０６、ｒｓ９３５０２７１、ｒｓ９３５６７４４、ｒｓ９３６８２２２、ｒｓ１０４４０８３３及びｒｓ６９３１５１４を含んで）はそれ故、個体における２型糖尿病への増加した感受性を評価するために使用し得る。
【００７２】
ＣＤＫＡＬ１の遺伝子産物の機能は知られていない。しかしながら、遺伝子名から暗示されるように、該遺伝子産物も別のタンパク質、ＣＤＫ５調節サブユニット関連タンパク質１（ＣＤＫ５ＲＡＰ１）と同様である。ＣＤＫ５ＲＡＰ１は神経組織中で発現され、ＣＤＫ５調節サブユニットｐ３５へ結合することにより、サイクリン依存性キナーゼ５（ＣＤＫ５）活性を阻害する（Ching, Y.P., Pang, A.S., Lam, W. H., Qi, R.Z. & Wang, J. H. J Biol Chem 277, 15237-40 (2002) ）。膵臓ベータ細胞において、ＣＤＫ５は糖毒性状態下でのベータ細胞機能の喪失において役割を果たすことが示されている（Wei, F. Y. et al. Nat Med 11, 1104-8 (2005)）。さらに、ＣＤＫ５／ｐ３５複合体の阻害は、糖毒性により生じるインスリン遺伝子発現の減少を防止する（Ubeda, M., Rukstalis, J. M. & Habener, J. F. J Biol Chem 281, 28858-64(2006) ）。ＣＤＫＡＬ１は、神経組織中のＣＤＫ５ＲＡＰ１役割と同様に、膵臓ベータ細胞のＣＤＫ５／ｐ３５の阻害において役割を果たすに違いない。ＣＤＫＡＬ１の減少した発現又は減少した阻害機能は、糖毒性に対して損なわれた応答を導き得る。本データは、ＣＤＫＡＬ１がラット膵臓ベータ細胞株ＩＮＳ−１において発現されていることを示している（図６）。
【００７３】
ＣＤＫＡＬ１の予測される機能及びＳＬＣ３０Ａ８の既知の機能に基づいて、ｒｓ７７５６９９２及びｒｓｌ３２６６６３４の両方がインスリン分泌に影響することを期待する。インスリン分泌に対する二つのＳＮＰの効果を評価するため、経口グルコース耐性試験（ＯＧＴＴ）を行っているInter99 研究（デンマークＢの一部）からの一組の個体において、補正インスリン応答（ＣＩＲ）に対する遺伝子型状態の影響を分析した。ｒｓ７７５６９９２について、リスクアレルのホモ接合体キャリアは、ヘテロ接合体キャリア又は非キャリアより推定２４％未満のＣＩＲを有していたことを我々は示した（Ｐ＜０．００００１、図７）。この観察は、疾患リスクに関して変異体はほとんど劣勢遺伝型式であることと一致した。さらに、ＣＩＲについて観察された効果は、男性及び女性の両方（図８）、及びＴ２Ｄ患者ならびに対照に存在しており、ＢＭＩ状態を調整することは結果に影響しなかった（表２１）。インスリン応答に対するｒｓｌ３２６６６３４の効果はより小さかったが有意であり、このリスク変異体について、ＣＩＲの減少は相加作用と合致した。いずれの変異体についてもインスリン感受性に対する影響は観察されなかった（表２１）。
【００７４】
Ｔ２Ｄについての感受性遺伝子としてのＣＤＫＡＬ１の同定は、どのように遺伝的因子がＴ２Ｄの素因となることができるかどうかのパズルに一つのピースを加える。この遺伝子の機能は未だ不明であるが、それが膵臓ベータ細胞中で発現されること、及び本遺伝子はインスリン分泌と相関していることを我々は示した。ＣＤＫ５ＲＡＰ１との類似性はさらに、ＣＤＫＡＬ１がＣＤＫ５との相互作用を介して、糖毒性条件下でのインスリン産生を容易にすることができることを示している。結論として、ほとんど劣性様式でインスリン応答を鈍らせ、そしてＴ２Ｄの素因となる、ＣＤＫＡＬ１遺伝子中の変異体を我々は同定した。
【００７５】
本発明は２型糖尿病に関連するとして７つの単一マーカー及び７つの２マーカーハプロタイプを１０番染色体ｑ２３．３３上の領域で同定した。肥満患者を別に分析した場合、これらのマーカーのほとんどは上昇したＲＲ値を有し、糖尿病にも関連していた（表５）。これらのマーカーは、９４１９２８８５及び９４４９００９１位（ＮＣＢＩ  Ｂｕｉｌｄ  ３５）間の一つのＬＤブロック内に位置し、マーカーｒｓ２７９８２５３及びｒｓｌｌｌ８７１５２により架橋されているゲノムセグメントに対応している。このＬＤブロックは三つの遺伝子、インスリン分解酵素（ＩＤＥ）（ＮＭ＿００４９６９）、キネシンファミリーメンバー１１（ＫＩＦ１１）（ＮＭ＿００４５２３）及び造血的に発現されるホメオボックス（ＨＨＥＸ）（ＮＭ＿００２７２９）を含む。
【００７６】
ＩＤＥは、細胞間ペプチドシグナル伝達の原因であるプロテアーゼファミリーに帰属させることができる。インスリンの細胞プロセシングにおけるその役割は未だ定義されていないが、インスリン分解酵素はインスリン応答の終結に関与すると考えられている（Fakhrai-Rad et al, Human Molecular Genetics 9:2149-2158, 2000）。糖尿病ＧＫラットの遺伝子解析は、ＧＫアレル中のＩＤＥ遺伝子の二つのアミノ酸置換（Ｈ１８Ｒ及びＡ８９０Ｖ）を明らかにし、それはトランスフェクト細胞においてインスリン分解活性を３１％減少させた。しかしながら、Ｈ１８Ｒ及びＡ８９０Ｖ変異体を別々に研究した場合、何の影響も観察されず、インスリン分解に対する２変異体の相乗効果を示唆している。細胞溶解液ではインスリン分解に対して何の影響も観察されず、前記影響はインスリンのレセプター仲介内部移行と共役しているようである。ＩＤＥ  ＧＫアレルを有するコンジェニック（congenic）ラットは食後高血糖、脂肪細胞における減少した脂質生合成、鈍ったインスリン刺激グルコース膜貫通取り込み、及び単離された筋肉における減少したインスリン分解を示した。追加のラット株分析は、機能障害性ＩＤＥアレルがＧＫラットに特有であったことを示した。筆者は、ＩＤＥがＧＫラットにおける糖尿病表現型に重要な役割を果たしていることを結論した。ＩＤＥはヒトにおける２型糖尿病についての候補遺伝子として研究されてきたが、矛盾する結果しか得られていない。二つの大規模な研究は、該遺伝子全域にわたってタグ付けしたＳＮＰを使用する突然変異スクリーニング及びハプロタイプ分析により２型糖尿病とＩＤＥの関連を最近分析した（Groves et al, Diabetes 52: 1300-1305, 2003; Florez et al, Diabetes 55:128-135, 2006）。両研究は、ＩＤＥにおける共通の変異が２型糖尿病の有意なリスクを与えていないようであると結論している。しかしながら、これらの研究は、図２に定義した全ＬＤブロックを含んでおらず、及び我々の研究で２型糖尿病に関連すると同定されたマーカーの少なくともいくつかは、以前の研究で分析された領域の領域外にある。ここに報告された結果に基づくと、ＩＤＥを含むＬＤ中のマーカーは２型糖尿病に関連しており、２型糖尿病の病因におけるＩＤＥの役割についての遺伝的証拠を提供している。
【００７７】
ＫＩＦ１１はキネシン様タンパク質ファミリーに属する運動タンパク質をコードする。このタンパク質ファミリーのメンバーは、いろいろな紡錘体動力学に関与することが知られている。この遺伝子産物の機能には、染色体転座、染色体分離、及び細胞有糸分裂間の双極紡錘体の確立が含まれる。この遺伝子は、糖尿病についての優れた機能的候補ではないが、関連するＬＤブロック内のその位置のため、位置的候補と考えるべきである。
【００７８】
ＨＨＥＸは転写因子のホメオボックスファミリーのメンバーをコードし、その多くは発生プロセスに関与している。特定の造血分化系列における発現は、このタンパク質が血球分化に役割を果たすことができることを示唆している。ＨＨＥＸは膵臓発生に必須である；ＨＨＥＸ陰性マウス胎児においては、腹側膵臓特異化が完全に失敗する（Bort et al, Development 131, 797- 806, 2004）。膵臓発生に関与する他の転写因子には、ＭＯＤＹ遺伝子、ならびに後期発症糖尿病に関係付けられている他の因子が含まれる。ＨＨＥＸは、心臓誘導のためのＷｎｔアンタゴニストの必須エフェクターでもある（Foley and Mercola, GENES & DEVELOPMENT 19:387-396, 2005）。このことは、ＨＨＥＸを最近確立された２型糖尿病遺伝子ＴＣＦ７Ｌ２と同一の経路におくことになり、これらのデータを一緒にすると、ＨＨＥＸは２型糖尿病についての機能的ならびに位置的候補になる。
【００７９】
２型糖尿病に対するｒｓ２４９７３０４、ｒｓ９４７５９１、ｒｓｌ０８８２０９１及びｒｓ７９１４８１４の関連性はデンマーク人２型糖尿病症例−対照コホートにおいて、及びＰＥＮＮ  ＣＡＴＨ研究からの米国コーカサス人コホート２型糖尿病コホートにおいても確認された（表８）。二つのコホートを合併させた場合、ｒｓ９４７５９１の関連性は、合併コホートにおいて１．１のリスクを有し、０．０５レベルで有意性に達する。すべてのコホートを合併した場合、ｒｓ９４７５９１マーカーについてリスクは１．１５である。これらの結果は、ＩＤＥ及びＨＨＥＸを含有する１０番染色体上のＬＤブロック内の変異体は、２型糖尿病についての感受性変異体であることを示唆する。
【００８０】
染色体１７ｑ２４．３の領域中の五つの単一マーカー及び２マーカーハプロタイプはさらに、非肥満患者において２型糖尿病に関連していることが見いだされた（表３）。これらのマーカーのいくつかは、表３に報告されている強い関連性を示し、この領域への関連性は、全糖尿病患者が解析された場合にも観察された（表１）。これらのマーカーは、マーカーｒｓｌｌ０７７５０１及びｒｓ４７９３４９７間、１７番染色体上の６６０３７６５６及び６６１６３０７６（ＮＣＢＩ  Ｂｕｉｌｄ  ３５）位間に位置する二つの隣接ＬＤブロック内に位置している（図３）。関連性は全ゲノムレベルで有意である。これらのＬＤブロック内には既知の遺伝子は位置していない。しかしながら、この領域中の変異体は、ＫＣＮＪ２及びＫＣＮＪ１６を含む隣の領域中の遺伝子に影響することは可能である。もしくは、これらの変異体は、これらのＬＤブロック内の未知の遺伝子に影響してもよい。
【００８１】
ｒｓ７７５６９９２、及び染色体６ｐ２２．３上のＣＤＫＡＬ１遺伝子（ＮＭ＿０１７７７４）のエクソン１〜５を含んでいる５’末端を含有するＬＤブロックＣ０６内の相関マーカーと２型糖尿病との関連性についてのさらなる証拠は、追加の関連性研究から得られた。ｒｓ７７５６９９２と強く相関する（ｒ２  ０，６８；Ｄ’  ０，９５）二つの均等なマーカーｒｓ７７５４８４０及びｒｓｌ０９４６３９８は、三つの大規模な研究において２型糖尿病と有意に関連していることが示されている（Saxena, R et al. Science 2007;316: 1331-6; Zeggini, E et al. Science 2007;316: 1336-41; Scott, U et al. Science 2007;316: 1341-5）。これらの研究はそれ故、２型糖尿病におけるＣＤＫＡＬ遺伝子の関与をさらに支持している。
【００８２】
ｒｓｌ０８８２０９１及び染色体１０ｑ２３．３３上の相関マーカーと２型糖尿病との関連性も、最近の文献により支持される。強く相関したマーカー、ｒｓ１１１１８７５（ｒ２  ０，５１；Ｄ’＝１）は、四つの大規模な研究において２型糖尿病と有意に関連していることが見いだされた（Sladek, R et al. Nature. 2007;445:828-30; Saxena, R et al. Science 2007;316: 1331-6; Zeggini, E et al. Science 2007;316: 1336-41; Scott, U et al. Science 2007;316: 1341-5）。それ故、最近の研究は、本明細書に記載したＬＤブロックＣ１０領域中のマーカーは２型糖尿病のリスク因子であるという、本発明者による発見への追加の支持を提供する。
【００８３】
個体が比較された場合、集団内のゲノム配列は同一ではない。むしろ、ゲノム中の多くの位置で、個体間の配列可変性を示す。配列中のこうした変異は多型と称され、各ゲノム内に多くのこうした部位がある。例えば、ヒトゲノムは、平均５００塩基対毎に生じる配列変異を示す。最も普通の配列変異体は、ゲノム中の単一塩基位置での塩基変異から成り、こうした配列変異体、又は多型は一般に単一ヌクレオチド多型（「ＳＮＰ」）と称される。これらのＳＮＰは、単一突然変異事象で生じると信じられており、それ故、各ＳＮＰ部位で可能な二つの可能なアレルがある；本来のアレル及び突然変異したアレル。自然の遺伝的浮動及び場合により選択圧のため、本来の突然変異は、いずれか所与の集団中の、そのアレルの特定の頻度により特徴付けられる多型を生じる。マイクロサテライト、挿入、欠失、逆位及びコピー数変異体を含む、配列変異体の多くの他のタイプがヒトゲノム中で観察されている。多型マイクロサテライトは、特定の部位に塩基の多数の小さなリピート（ＣＡリピート、相補鎖上のＴＧのような）を有し、そこではリピート長の数は母集団中で変化する。一般論として、多型部位に関する配列の各バージョンは、多型部位の特異的アレルを表している。これらの配列変異体は、問題とする配列変異体に特徴的な特異的多型部位で生じている多型とすべて呼ぶことができる。一般論として、多型は任意の数の特異的アレルを含むことができる。それ故、本発明の一つの態様において、該多型はいずれの所与の集団においても二つ又はそれ以上のアレルの存在により特徴付けられる。別の態様において、該多型は三つ又はそれ以上のアレルの存在により特徴付けられる。他の態様において、該多型は四つ又はそれ以上のアレル、五つ又はそれ以上のアレル、六つ又はそれ以上のアレル、七つ又はそれ以上のアレル、九つ又はそれ以上のアレル、又は十又はそれ以上のアレルにより特徴付けられる。すべてのこうした多型が、本発明の方法及びキットにおいて利用することが可能であり、そしてそれ故、本発明の範囲内である。
【００８４】
いくつかの例において、基準アレルを選ぶことなく多型部位での異なったアレルに対して参照が行われる。もしくは、基準配列が特定の多型部位について参照される。基準アレルは時には「野生型」アレルと称され、それは通常第一の配列決定されたアレルと、又は「非罹患」個体（例えば、形質又は疾患表現型を示さない個体）からのアレルと通常選ばれる。
【００８５】
本明細書に記述したＳＮＰマーカーについてのアレルは、用いられたＳＮＰアッセイにおける多型部位で生じる場合、塩基Ａ、Ｃ、Ｇ又はＴを指す。本明細書で使用したＳＮＰｓについてのアレルコードは以下の通りである：１＝Ａ、２＝Ｃ、３＝Ｇ、４＝Ｔ。しかしながら、当業者は反対のＤＮＡ鎖をアッセイすること又は読み取ることにより、相補的アレルを各ケースで測定し得ることを理解するであろう。それ故、Ａ／Ｇ多型により特徴付けられる多型部位（多型マーカー）に対して、用いられるアッセイは、可能な二つの塩基（即ち、Ａ及びＧ）の一つ又は両方の存在を特異的に検出するように設計される。もしくは、ＤＮＡ鋳型の反対の鎖を検出するように設計されているアッセイを設計することにより、相補的塩基Ｔ及びＣの存在を測定し得る。定量的には（例えば、相対リスクの点から）、同一の結果が両ＤＮＡ鎖（＋鎖／又は−鎖）の測定から得られるであろう。
【００８６】
典型的には、基準配列が特定の配列について参照される。基準から異なるアレルは「変異体」アレルと称される。本明細書で使用する変異体配列とは、基準配列とは異なっているが、それ以外は実質的に類似している配列を指す。本明細書に記載した多型遺伝子マーカーでのアレルは変異体である。追加の変異体は、ポリペプチドに影響する変化を含み得る。基準ヌクレオチド配列と比較した場合のこれらの配列相違は、本明細書に詳細に記載されている、フレームシフトを生じる単一又は一つより多くのヌクレオチドの欠失；コードされたアミノ酸に変化を生じる少なくとも一つのヌクレオチド変化；早発性の終止コドンの発生を生じる少なくとも一つのヌクレオチド変化；ヌクレオチドによりコードされた一つまたはそれより多くのアミノ酸の欠失を生じるいくつかのヌクレオチドの欠失；読み取り枠のコード配列の中断を生じる、非等価組換え又は遺伝子変換によるような一つ又はいくつかのヌクレオチドの挿入；配列のすべて又は一部の重複；転座；又はヌクレオチド配列の再編成を含み得る。こうした配列変化は、核酸によりコードされているポリペプチドを変化させる。例えば、もしヌクレオチド配列中の変化がフレームシフトを起こすとすれば、該フレームシフトはコードされたアミノ酸の変化を生じ得、及び／又は早発性の終止コドンを生じ得、端が切断されたポリペプチドの発生を起こす。もしくは、疾患又は形質に関連する多型は、一つまたはそれより多くのヌクレオチドの同義の変化であり得る（即ち、変化はアミノ酸配列の変化を生じさせない）。こうした多型は、例えば、スプライシング部位を変化し、ｍＲＮＡの安定性又は輸送に影響し、又はさもなくばコードされたポリペプチドの転写又は翻訳に影響し得る。それは、増幅又は欠失のような構造変化が腫瘍の体細胞レベルで生じる可能性を増加させるようにＤＮＡを変化させることもできる。基準ヌクレオチド配列によりコードされているポリペプチドは、特定の基準アミノ酸配列を有する「基準」ポリペプチドであり、及び変異体アレルによりコードされているポリペプチドは、変異体アミノ酸配列を有する「変異体」ポリペプチドと称される。
【００８７】
ハプロタイプとは、セグメントに沿って配置されたアレルの特異的組み合わせにより特徴付けられるＤＮＡのセグメントを指す。ヒトのような二倍体生物では、ハプロタイプは各多型マーカー又は座位について対のアレルを有する一つのメンバーを含んでなる。ある態様において、該ハプロタイプは、各アレルがセグメントに沿った特異的多型マーカーに対応する二つ又はそれ以上のアレル、三つ又はそれ以上のアレル、四つ又はそれ以上のアレル、又は五つ又はれ以上のアレルを含んでなることが可能である。ハプロタイプは、多型部位に特定のアレルを有する多様な多型マーカー、例えば、ＳＮＰ及びマイクロサテライトの組み合わせを含んでなることが可能である。該ハプロタイプは、それ故、種々の遺伝子マーカーでのアレルの組み合わせを含んでなる。
【００８８】
特異的多型マーカー及び／又はハプロタイプの検出は、多型部位の配列を検出するための当該技術分野では公知の方法により達成し得る。例えば、核酸増幅のためにＰＣＲ、ＬＣＲ、ネステッドＰＣＲ及び他の技術を利用する蛍光に基づいた技術（Chen, X. et al., Genome Res. 9(5): 492-98 (1999))のような、ＳＮＰ及び／又はマイクロサテライトマーカーの存在について遺伝子型同定する標準技術を使用し得る。ＳＮＰ遺伝子型同定に利用可能な具体的方法論には、限定されるわけではないが、TaqMan遺伝子型同定アッセイ及びSNPIex プラットフォーム（Applied Biosystems）、質量分析（例えば、Sequenom からのMassARRAY システム）、ミニシークエンシング法、リアルタイムＰＣＲ、Bio-Plex システム（BioRad）、CEQ及びSNPstream システム（Beckman）、Molecular Inversion Probe アレイ技術（例えば、Affymetrix GeneChip）、BeadArray Technologies（例えば、Illumina GoldenGate and lnfinium アッセイ）及びCentaurus アッセイ（Nanogen）が挙げられる。これら又は当業者には利用可能な他の方法により、マイクロサテライト、ＳＮＰ又は他のタイプの多型マーカーを含む、多型マーカーでの一つ又はそれ以上のアレルを同定し得る。
【００８９】
本明細書に記載したある方法において、２型糖尿病について増加した感受性（即ち、増加したリスク）を有する個体は、２型糖尿病への増加した感受性を与える一つまたはそれより多くの多型マーカーで少なくとも一つの特異的アレルが同定されている（即ち、アットリスクマーカーアレル又はハプロタイプ）個体である。一つの側面において、該アットリスクマーカー又はハプロタイプは、２型糖尿病への有意に増加したリスク（又は感受性）を与えるものである。一つの態様において、マーカー又はハプロタイプに関連する有意性は相対リスク（ＲＲ）により測定される。別の態様において、マーカー又はハプロタイプに関連する有意性はオッズ比（ＯＲ）により測定される。さらなる態様において、有意性はパーセンテージにより測定される。一つの態様において、有意に増加したリスクは、限定されるわけではないが、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２．０、少なくとも２．５、少なくとも３．０、少なくとも４．０及び少なくとも５．０を含む、少なくとも１．２のリスク（相対リスク及び／又はオッズ比）として測定される。特定の態様において、少なくとも１．２のリスク（相対リスク及び／又はオッズ比）が有意である。別の特定の態様において、少なくとも１．３のリスクが有意である。さらに別の態様において、少なくとも１．４のリスクが有意である。さらなる態様において、少なくとも約１．５の相対リスクが有意である。別のさらなる態様において、少なくとも約１．７であるリスクの有意な増加が有意である。しかしながら、他のカットオフ、例えば、少なくとも１．１５、１．２５、１．３５なども企図され、こうしたカットオフも本発明の範囲内である。他の態様において、リスクの有意な増加は、限定されるわけではないが、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１５０％、２００％、３００％及び５００％を含む、少なくとも約２０％である。一つの特定の態様において、リスクの有意な増加は少なくとも約２０％である。他の態様において、リスクの有意な増加は少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％及び少なくとも１００％である。しかしながら、本発明を特徴付けるため、当業者により適していると考えられた他のカットオフ又は範囲も企図され、それらも本発明の範囲内である。
【００９０】
本発明のアットリスク多型マーカー又はハプロタイプは、比較群（対照）におけるその存在の頻度と比較して、該疾患又は形質（罹患した）についてアットリスクである個体において、少なくとも一つのマーカー又はハプロタイプの少なくとも一つのアレルがより頻繁に存在しているものであり、該マーカー又はハプロタイプの存在は、該疾患又は形質への感受性を示す。一つの態様において、対照群は集団サンプル、即ち、母集団からのランダムサンプルであることができる。別の態様において、対照群は疾患を有していない個体の群により表される。こうした疾患を有していない対照は、一つの態様において、一つまたはそれより多くの特異的疾患関連症状が存在しないことにより特徴付けることができる。別の態様において、疾患を有していない対照は、一つ又はそれ以上の疾患特異的リスク因子が存在しないことにより特徴付けられる。一つの態様において、こうしたリスク因子は少なくとも一つの環境リスク因子である。代表的な環境要因は、特異的疾患又は形質に影響することが知られている、又は影響するように企図された天然産物、鉱物又は他の化学物質である。他の環境リスク因子は、限定されるわけではないが、食物及び飲酒習慣、主な生育地の地理的な位置、及び職業的リスク因子を含む、ライフスタイルに関連するリスク因子である。別の態様において、リスク因子は、少なくとも一つの遺伝的リスク因子である。
【００９１】
相関のための単純な検定の例は、２ｘ２分割表でのフィッシャーの直接確率検定であろう。染色体のコホートを考えると、２ｘ２分割表は、マーカー又はハプロタイプの両方を含む、マーカー又はハプロタイプの一つを含む（他方は含まない）及びマーカー又はハプロタイプを含まない染色体の数から構成される。
【００９２】
本発明の他の態様において、２型糖尿病について減少した感受性（即ち、減少したリスク）にある個体は、２型糖尿病について減少した感受性を与える一つまたはそれより多くの多型マーカーで少なくとも一つの特異的アレルが同定されている個体である。減少したリスクを与えるマーカーアレル及び／又はハプロタイプは保護的であるとも言われている。一つの側面において、該保護的マーカー又はハプロタイプは、疾患又は形質への有意に減少したリスク（又は感受性）を与えるものである。別の態様において、個体からの核酸サンプル中にアットリスクアレルが存在しないことも、アットリスクアレルが存在しないという理由により疾患に対する保護を示す。一つの態様において、有意に減少したリスクは、限定されるわけではないが、０．９未満、０．８未満、０．７未満、０．６未満、０．５未満、０．４未満、０．３未満、０．２未満及び０．１未満を含む、０．９未満の相対リスクとして測定される。一つの特定の態様において、有意に減少したリスクは０．７未満である。別の態様において、有意に減少したリスクは０．５未満である。さらに別の態様において、有意に減少したリスクは０．３未満である。別の態様において、リスクの減少（又は感受性）は、限定されるわけではないが、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％及び少なくとも９８％を含む、少なくとも２０％である。一つの特定の態様において、リスクの有意な減少は少なくとも約３０％である。別の態様において、リスクの有意な減少は少なくとも約５０％である。別の態様において、リスクの減少は少なくとも約７０％である。しかしながら、本発明を特徴付けるため、当業者により適していると考えられた他のカットオフ又は範囲も企図され、それらも本発明の範囲内である。
【００９３】
当業者は、集団中に存在する二つのアレルを有するマーカーについて研究されていることを理解するであろうし（ＳＮＰのような）、ここで一つのアレルは、対照と比較して、集団中の形質又は疾患を有する個体の群において増加した頻度で観察され、該マーカーの他のアレルは、対照と比較して、集団中の形質又は疾患を有する個体の群において減少した頻度で観察されるであろう。こうしたケースにおいて、マーカーの一つのアレル（形質又は疾患を有する個体において増加した頻度で観察された方）がアットリスクアレルであろうし、一方、他のアレルは保護的アレルであろう。
【００９４】
連鎖不平衡
各減数分裂事象間に、各染色体対について平均一回起こる組換えの自然現象は、自然が配列（及び結果により生物学的機能）に変異を提供する一つの様式を代表している。ゲノム中では組換えがランダムに起こらないことが発見されており；組換え率の頻度には大きな変動があり、高組換え頻度の小さな領域（組換えホットスポットとも称される）及び低組換え頻度のより大きな領域が生じており、それは一般に連鎖不平衡（ＬＤ）ブロックと称されている（Myers, S. et al., Biochem Soc Trans 34:526-530（2006); Jeffreys, A.J., et al.,Nature Genet 29:217-222 (2001); May, C.A., et al., Nature Genet 31:272-275(2002)）。
【００９５】
連鎖不平衡（ＬＤ）とは二つの遺伝的要素の非ランダム分類を指す。例えば、もし一つの特定の遺伝的要素（例えば、多型マーカー又はハプロタイプのアレル）が集団中で０．５０（５０％）の頻度で生じ、及び別の要素が０．５０（５０％）の頻度で生じたとすれば、両方の要素を有するヒトでの予期される発生率は、要素のランダム分布を仮定すれば０．２５（２５％）である。しかしながら、もし二つの要素が０．２５よりも高い頻度で一緒に生じるならば、それらは発生の独立した頻度（例えば、アレル又はハプロタイプ頻度）が予測されるであろうよりも高い比率で一緒に遺伝される傾向があるので、該要素は連鎖不平衡にあると言われている。大まかに言うと、ＬＤは、二つの要素間の組換え事象の頻度に一般的に相関している。集団中の個体の遺伝子型を決定し、及び集団中の各アレルの出現率を決定することにより、集団中のアレル頻度を決定し得る。二倍体の集団（例えば、ヒト集団）では、個体は典型的には各遺伝的要素（例えば、マーカー、ハプロタイプ又は遺伝子）について二つのアレルを有しているであろう。
【００９６】
連鎖不平衡（ＬＤ）の強度を評価するため、多くの異なった尺度が提案されてきた。ほとんどは両アレル部位の対間の関連の強さを捕捉する。二つの重要なＬＤの対尺度はｒ２（しばしばΔ２で表示される）及び｜Ｄ’｜である。両方の尺度とも０（不平衡なし）から１（「完全」不平衡）の範囲であるが、それらの解釈はわずかに異なっている。｜Ｄ’｜は、もし二つ又は三つの可能なハプロタイプが存在するならば、それは１に等しく、及び四つの可能なハプロタイプが存在するならば、それは＜１であるとように定義される。従って、＜１である｜Ｄ’｜の値は、二つの部位で歴史的組換えが起こってもよいことを示している（反復性変異も＜１である｜Ｄ’｜を生じ得るが、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）についてこのことは組換えよりも起こりにくいと通常考えられている）。尺度ｒ２は、二つの部位間の統計的相関を表しており、もし二つのみのハプロタイプが存在すれば１の値をとる。  
【００９７】
ｒ２尺度は、ｒ２間の単純な逆関係であり、及び感受性座位及びＳＮＰ間の関連を検出するために少量の試料しか必要とされないので、関連マッピングについての間違いなく最もよい関連尺度である。これらの尺度は対の部位について定義されているが、いくつかの適用については、多くの多型部位を含有する全領域にわたり、ＬＤがどれくらい強いかを決定することが望まれるであろう（例えば、ＬＤの強度が座位間で又は集団にわたって有意に異なっているかどうか、又は特定のモデル下で予測されるよりも領域中でＬＤが大きいか又は小さいかどうかを試験すること）。領域にわたってＬＤを測定することは容易ではないが、一つのアプローチは集団遺伝学で開発された尺度ｒを使用するものである。大まかに言うと、ｒは、データに見られるＬＤを発生させるため、特定の集団モデル下でどのくらいの組換えが必要とされるであろうかを測定する。このタイプの方法は、ＬＤデータが組換えホットスポットの存在についての証拠を提供するかどうかを決定することへの統計的に厳密なアプローチも提供できる可能性がある。本明細書で記載されている方法、キット、手順、媒体及び装置について、有意なｒ２値は、少なくとも、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０９〜１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、０．９９又は１．０のように、少なくとも０．０５であり得る。一つの好ましい態様において、有意なｒ２値は少なくとも、０．２であり得る。もしくは、本明細書に記載した連鎖不平衡は、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．８５、０．９、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、０．９９のような、少なくとも、０．２の｜Ｄ’｜の値により特徴付けられる連鎖不平衡を指す。それ故、連鎖不平衡は特有なマーカーのアレル間の相関を表す。それは相関係数又は｜Ｄ’｜（１．０までのｒ２及び１．０までの｜Ｄ’｜）により測定される。ある態様において、連鎖不平衡はｒ２及び｜Ｄ’｜尺度の両方についての値に関して定義される。一つのこうした態様において、有意な連鎖不平衡は、ｒ２＞０．１及び｜Ｄ’｜＞０．８と定義される。別の態様において、有意な連鎖不平衡は、ｒ２＞０．２及び｜Ｄ’｜＞０．９と定義される。連鎖不平衡を決定するためのｒ２及び｜Ｄ’｜の値についての他の組み合わせ及び順列も可能であり、本発明の範囲内である。連鎖不平衡は本明細書で定義した単一ヒト集団において決定することもできるし、又は一つより多くのヒト集団からの個体を含んでなるサンプルの集合においても決定し得る。本発明の一つの態様において、ＬＤは、定義されているような（http://www.hapmap.org）、一つ又はそれ以上のＨａｐＭａｐ集団（コーカサス人、アフリカ人、日本人、中国人）からのサンプルにおいても決定される。一つのこうした態様において、ＨａｐＭａｐサンプルのＣＥＵ集団においてＬＤが決定される。別の態様において、ＹＲＩ集団においてＬＤが決定される。さらに別の態様において、アイスランド集団からのサンプルにおいてＬＤが決定される。
【００９８】
もしゲノム中のすべての多型が集団レベルで同一であれば、次ぎに、それらのことごとくが関連性研究で調査されるべきであろう。しかしながら、多型の連鎖不平衡のため、強固に連結した多型は強く相関し、それは有意な関連を観察するための関連性研究で調査されることを必要とする多型の数を減少させる。ＬＤの別の結果は、これらの多型が強く相関性があるという事実のため、多くの多型が関連性シグナルを与えることができるということである。
【００９９】
ゲノムＬＤ地図は、ゲノムの全域で作製されており、こうしたＬＤ地図は疾患−遺伝子地図作製のための骨組みとして働くことが提案されてきた（Risch, N. & Merkiangas, K, Science 273:1516-1517（1996); Maniatis, N., et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:2228-2233 (2002); Reich, DE et al, Nature 411:199-204（2001)）。
【０１００】
ヒトゲノムの多くの部分が、少数の共通ハプロタイプを含有する、一連の分離したハプロタイプブロックに分解され得ることが確立されており；これらのブロックについて、連鎖不平衡データは組換えを示す証拠を提供しなかった（例えば、Wall., J. D. and Pritchard, J. K., Nature Reviews Genetics 4:587-597 (2003); Daly, M. et al., Nature Genet. 29:229-232 (2001); Gabriel, S.B. et al., Science 296:2225-2229 (2002); Patil, N. et al., Science 294:1719-1723 (2001); Dawson, E. et al., Nature 418:544-548 (2002); Phillips, M.S. et al., Nature Genet. 33:382-387 (2003) を参照されたい）。
【０１０１】
これらのハプロタイプブロックを画定するための二つの主な方法がある：ブロックは、限定されたハプロタイプ多様性を有するＤＮＡの領域として（例えば、Daly, M. et al., Nature Genet. 29:229- 232 (2001); Patil, N. et al., Science 294:1719-1723 (2001); Dawson, E. et al., Nature 418:544-548 (2002); Zhang, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:7335-7339 (2002) を参照されたい）、又は連鎖不平衡を使用して同定された、広範囲の歴史的組換えを有する遷移域間の領域として（例えば、Gabriel, S.B. et al., Science 296:2225-2229 (2002); Phillips, M.S. et al., Nature Genet. 33:382-387 (2003); Wang, N. et al., Am. J. Hum. Genet. 71:1227-1234 (2002); Stumpf, M.P., and Goldstein, D.B., Curr. Biol. 73:1-8 (2003) を参照されたい）画定し得る。さらに最近、組換え率の高精度地図及びヒトゲノム全域にわたった対応するホットスポットが作製された（Myers, S., et al., Science 310:321 -32324 (2005); Myers, S. et al., Biochem Soc Trans 34:526530 (2006)）。該地図は、該ゲノム全域にわたった組換えでの膨大な変異を明らかにし、ホットスポット中では１０〜６０ｃＭ／Ｍｂほど高い組換え率を有し、一方、介在領域では０に近く、それ故、それは限定されたハプロタイプ多様性及び高ＬＤの領域を表している。該地図はそれ故、組換えホットスポットが隣接した領域としてのハプロタイプブロックｓ／ＬＤブロックを画定するために使用し得る。本明細書で使用される用語「ハプロタイプブロック」又は「ＬＤブロック」は、上記の特徴のいずれかにより、又はこうした領域を画定するために当業者により使用される代替法により画定されたブロックを含む。
【０１０２】
ハプロタイプブロックは、単一マーカー又は複数のマーカーを含んでなるハプロタイプを使用し、表現型とハプロタイプ状態間の関連の地図作製に使用し得る。主ハプロタイプが各ハプロタイプブロックで同定でき、次ぎに「タグ付けされた」ＳＮＰ又はマーカーの組（ＳＮＰ又はマーカーの最も小さな組がハプロタイプ間を区別するために必要とされる）を同定し得る。これらのタグ付けされたＳＮＰ又はマーカーを次ぎに、表現型とハプロタイプ間との関連を同定するため、個体の群からのサンプルの評価に使用し得る。望むなら、隣接したハプロタイプブロックは、ハプロタイプブロック間の連鎖不平衡でも存在することができるので、同時に評価し得る。
【０１０３】
ゲノム中の多型マーカーへのいずれかの所与の観察された関連について、ゲノム中の追加のマーカーも関連を示すようであることが明らかにされた。このことは、組換え率の大きな変動により観察されたように、ゲノム全域にわたるＬＤの一様でない分布の自然の結果である。関連を検出するために使用されたマーカーは、それ故、ある意味で、所与の疾患又は形質に関連するゲノム領域（即ち、ハプロタイプブロック又はＬＤブロック）のための「タグ」を表し、そのようであるので、本発明の方法及びキットでの使用に有用である。一つ又はそれ以上の原因となる（機能的）変異体又は突然変異は、該疾患又は形質へ関連していることが見いだされた領域内に属することができる。こうした変異体は、関連性を検出するために使用されたタグ付けマーカーで観察されたよりも高い相対リスク（ＲＲ）又はオッズ比（ＯＲ）を与えることができる。本発明はそれ故、本明細書に記載した該疾患への関連性を検出するために使用したマーカー、ならびに該マーカーと連鎖不平衡にあるマーカーについて言及する。それ故、本発明のある態様において、本明細書に記載した本発明のマーカー及び／又はハプロタイプとＬＤにあるマーカーを、代替マーカーとして使用することができる。該代替マーカーは、一つの態様において、本明細書に記載した、該疾患と関連していると最初に見いだされたマーカー又はハプロタイプよりも小さな相対リスク（ＲＲ）及び／又はオッズ比（ＯＲ）値を有する。他の態様において、該代替マーカーは、本明細書に記載した、該疾患と関連していると最初に見いだされたマーカーについて決定されたＲＲ又はＯＲ値よりも大きな値を有する。こうした態様の例は、本明細書に記載した変異体のような、該疾患に関連していると最初に発見された、より共通の変異体（＞１０％の集団頻度）を伴ったＬＤ中の、希な又は相対的に希な変異体（＜１０％の集団頻度）であろう。本明細書に記載した、本発明者により発見された関連を検出するためにこうしたマーカーを同定すること及び使用することは、当業者には公知のルーチン法により実施することができ、そしてそれ故、本発明の範囲内である。
【０１０４】
２型糖尿病に関連していると本明細書で示されたマーカーと連鎖不平衡にあるある種のマーカーは、画定されたＬＤブロックの物理的境界の外側に位置することが可能である。このことは、問題とする領域中の歴史的組換え率の結果であり、該ブロック内のマーカーとＬＤにある、該ブロックの外側の残余マーカーを有する、強いＬＤの領域（該ＬＤブロック）を導くことができる。こうしたマーカーも、２型糖尿病と関係していることが本明細書で示されたマーカーとのそれらの遺伝的関係によって、本発明を実施するために等しく有用である限り、本発明の範囲内である。例が、表２２（ｒｓｌ７２３４３７８；配列番号４４）、表２３（ｒｓ７０８６２８５；配列番号４３）及び表２４（ｒｓ９８９０８８９；配列番号３１；ｒｓ２００９８０２；配列番号３８；ｒｓｌ７７１８９３８；配列番号３９；、ｒｓ２１０９０５０；配列番号４１；ｒｓｌ９６２８０１；配列番号４２、に示されている。
【０１０５】
ハプロタイプ頻度の決定
患者及び対照群中のハプロタイプの頻度は期待値最大化（expectation-maximization）アルゴリズム(Dempster A. et al., J. R. Stat. Soc. B, 39:1-38 (1977)) を使用して見積もることが可能である。失われた遺伝子型及びフェーズの不確かさを取り扱うことが可能なこのアルゴリズムの実行を使用し得る。帰無仮説下、患者及び対照は同一の頻度を有すると仮定した。尤度アプローチを使用し、対立仮説を試験し、そこでは、本明細書に記載したマーカーを含むことができる候補アットリスクハプロタイプは対照よりも患者でより高い頻度にし、一方、他のハプロタイプの頻度は両群で同一とした。両方の仮説下で尤度を別々に最大化し、対応する１−ｄｆ尤度比統計を、統計的有意性を評価するために使用した。
【０１０６】
問題とする領域内のアットリスク及び保護的マーカー及び／ハプロタイプを探すため、例えば、これらのマーカーが実行領域に広がっていると仮定して、遺伝子型決定したマーカーのすべての可能な組み合わせの関連を研究した。合併した患者及び対照群を、患者及び対照の本来の群に等しいサイズで、二つの組にランダムに分割することができる。マーカー及び／ハプロタイプ分析を次ぎに繰り返し、登録された最も有意なＰ値を決定した。このランダム化スキームを例えば、１００回以上繰り返すことができ、Ｐ値の実験的分布を構築した。好ましい態様において、＜０．０５のＰ値が有意なマーカー及び／又はハプロタイプの関連を示す。
【０１０７】
ハプロタイプ分析
ハプロタイプ分析の一つの一般的アプローチはネステッドモデル（ＮＥＭＯ）(Gretarsdottir S., et al., Nat. Genet.35:131-38 (2003))に応用した尤度に基づいた推論を使用することを含んでいる。該方法は、多くの多型マーカー、ＳＮＰｓ及びマイクロサテライトを許容するプログラムＮＥＭＯで実行される。方法及びソフトウェアーは、患者対照研究について具体的に設計され、異なったリスクを与えるハプロタイプ群を同定することが目的である。それはＬＤ構造を研究するためのツールでもある。ＮＥＭＯにおいて、最大尤度見積もり、尤度比及びＰ値は、観察されたデータについてそれを失われたデータ問題として取り扱う、ＥＭアルゴリズムの助けを借りて、直接的に計算される。
【０１０８】
フェーズの不確かさ及び失われた遺伝子型による情報損失を取り込んだ観察データを直接計算される尤度に基づいた尤度比試験は信頼できて、有効なＰ値を与えるが、不完全である情報のため、どのくらいの情報が失われていたかを知ることはそれでも興味あることであろう。ハプロタイプ分析についての情報量は、連鎖分析について定義された情報量の自然な流れとしてNicolae and Kong (Technical Report 537, Department of Statistics, University of Statistics, University of Chicago ; Biometrics, 60(2):368-75 (2004)) により記載されており、ＮＥＭＯで実行された。
【０１０９】
疾患又は形質（例えば、２型糖尿病）との単一マーカー関連について、フィッシャーの直接確率検定を使用することができ、各個体アレルの両側Ｐ値を計算した。通常、すべてのＰ値は特別に示されていない限り、複数比較のために調整されずに示されている。示された頻度（マイクロサテライト、ＳＮＰｓ及びハプロタイプについて）は、キャリアー頻度に対立するものとしてのアレル頻度である。連鎖分析のための家族として動員された患者の同系性による偏向を最小化するため、一等親及び二等親血縁者類は患者リストから除去し得る。さらに、Risch, N. & Teng, J.(Genome Res., 8: 1273-1288 (1998)) に記載されている分散調節法を拡大することにより、一般的家族関連性に適用できるように、及び比較のため調整及び未調整Ｐ値の両方に提示できるように同胞群についてＤＮＡをプール化することにより（前記文献）、患者間に残った同系性を補正して関連について試験を繰り返し得る。相違は、予測されたごとく一般的に非常に小さかった。多重試験のために補正された単一マーカー関連の有意性を評価するため、同一の遺伝子型データを使用してランダム化試験を実施し得る。患者及び対照のコホートをランダム化でき、関連分析を複数回（例えば、５００,０００回まで)やり直し、及びＰ値は、本来の患者及び対照のコホートを使用して観察されたＰ値より低いか又は等しい、いくつかのマーカーアレルについてのＰ値を生み出す反復の一部である。
【０１１０】
単一マーカー及び／ハプロタイプ両分析について、相対リスク（ＲＲ）及び集団寄与リスク（ＰＡＲ）を乗法（multiplicative）モデル（ハプロタイプ相対リスクモデル）(Terwilliger, J.D. & Ott, J., Hum. Hered. 42:337-46 (1992) 及び Falk, CT. & Rubinstein, P, Ann. Hum. Genet. 51 (Pt 3):227-33 (1987)) 、即ち、二つのアレル／人が多数重なって運んでいるハプロタイプのリスク、を仮定して計算し得る。例えば、もしＲＲがａに対するＡの相対リスクであるとしたら、ホモ接合体ＡＡの人のリスクはヘテロ接合体ＡａのリスクのＲＲ倍であり、ホモ接合体ａａのそれのＲＲ２倍であろう。乗法モデルは、分析及び計算を単純化する素晴らしい特性を有する−罹患した集団内ならびに対照集団内でハプロタイプは独立している（即ち、Hardy-Weinberg平衡で）。その結果、罹患者及び対照のハプロタイプ計算は各々多項分布を有するが、対立仮説下では異なったハプロタイプ頻度を有する。具体的には、二つのハプロタイプ、ｈｉ及びｈｊについて、リスク（ｈｉ）／リスク（ｈｊ）＝（ｆｉ/ｐｉ）/（ｆｊ/ｐｊ）、式中、ｆ及びｐは、それぞれ患者集団及び対照集団中の頻度を表す。もし真のモデルが乗法的でないとしたら、いくらかのパワーの損失があるが、該損失は極端なケースを除いて軽度である傾向がある。最も重要なことは、Ｐ値は帰無仮説に関して計算されるので、常に有効である。
【０１１１】
リスク評価及び診断
本明細書に記載したように、こうしたマーカーを含有するある種の多型マーカー及びハプロタイプは、２型糖尿病のリスク評価に有用であることが見いだされた。リスク評価は、２型糖尿病への感受性を診断するためのマーカーの使用を含み得る。多型マーカーの特定のアレルが、２型糖尿病と診断されていない個体よりも、２型糖尿病を有する個体でより頻度高く観察された。従って、これらのマーカーアレルは、個体において２型糖尿病の検出又は２型糖尿病への感受性を予測することに役に立つ。本発明のマーカーのようなアットリスクマーカーを含んでなるハプロタイプブロック又はＬＤブロック内のタグ付けマーカーは、該ハプロタイプブロック又はＬＤブロック内の他のマーカー及び／又はハプロタイプの代替物として使用し得る。１に等しいｒ２の値を有するマーカーは該アットリスク変異体の完全な代替物である；即ち、一つのマーカーについての遺伝子型は、他についての遺伝子型を完全に予測する。１より小さなｒ２の値を有するマーカーも該アットリスク変異体の代替物であることができ、もしくは、アットリスク変異体と同じ高さの又はもしかするとさらにより高い相対リスク値を有する変異体を示す
同定されたアットリスク変異体は、それ自身が機能性変異体ではなくてもよいが、この例においては真の機能性変異体と連鎖不平衡にある。本発明は、本明細書に記載したマーカーのこうした代替マーカーの評価を包含する。こうしたマーカーは、当業者には公知であるように、注釈が付けられ、地図作製され、及び公開データベースに（例えば、ｄｂＳＮＰ）収載されるか、もしくは、個体のグループ中で本発明のマーカーにより同定された領域又は領域の一部を配列決定することにより容易に同定することができ、そして生じた配列群中の多型を同定する。その結果、当業者は容易に及び実験することなく、本明細書に記載したマーカー及び／又はハプロタイプと連鎖不平衡にある代替マーカーを遺伝子型同定し得る。検出されたアットリスク変異体とＬＤにあるタグ付け又は代替マーカーも、個体における２型糖尿病への関連又は２型糖尿病への感受性を検出することを予測することに役に立つ。
【０１１２】
本明細書に記載したマーカー及びハプロタイプ（例えば、表１〜２４に示したマーカー）は、単独で又は組み合わせて、リスク評価及び診断目的に有用である。該マーカー及びハプロタイプは２型糖尿病について増加したリスクを与える他のマーカーと組み合わせることもできる。個々のマーカーによるリスクの増加が比較的軽微（即ち、１０〜３０％程度）の場合においても、該関連性は有意な意味を有する。それ故、比較的共通の変異体が全リスクに対して有意に寄与し（集団寄与危険度（人口寄与危険度 ）が高い）、マーカーの統合リスクに基づいて、疾患を発生する有意な統合リスクを有する個体の群を規定するために、マーカーの組み合わせを使用し得る。２型糖尿病に関連していると本明細書に記載されたマーカーは、それ故、複数の遺伝子マーカーに基づいた疾患の全リスクを得るため、２型糖尿病に関連していると報告された、又は観察された他の多型マーカー又はハプロタイプと組み合わせ得る。
【０１１３】
一つのこうした態様において、本明細書に記載された多型マーカー又はハプロタイプは、ＴＣＦ７Ｌ２遺伝子内のマーカーについての情報と共に評価される。この遺伝子内の変異体の関連性はよく確立されており（Grant S. F., et al., Nat Genet. 38 : 320-3 (2006)）、多数の集団で再現されている（Florez, J. C, Curr Opin Clin Nutr Metabol Care 10:391-396（2007)）。ＴＣＦ７Ｌ２遺伝子内のマーカーｒｓ７９０３１４６、又は該マーカーとＬＤにある他のマーカー（例えば、ｒｓ１２２５５３７２）は、該遺伝子中のアットリスク変異体により与えられる遺伝子リスクを決定するために使用し得る（ＯＲ  約１．４４）。
【０１１４】
ＰＰＡＲＧ（ｒｓ１８０１２８２）、ＫＣＮＪ１１（ｒｓ５２１５）、ＴＣＦ２（ｒｓ４４３０７９６）、ＷＦＳ１（ｒｓ１００１０１３１）、ＣＤＫＮ２Ａ−２Ｂ（ｒｓ１０８１１６１）、ＩＧＦ２ＢＰ２（ｒｓ４４０２９６０）及びＦＴＯ（ｒｓ８０５１３６）を含む、他の遺伝子中のマーカーがリスク因子として２型糖尿病の病因に最近意味づけられた（Frayling, T.M. Nature Reviews Genetics 8:657-662(2007)）。これらのマーカー又はそれらと連鎖不平衡マーカーも同様に、２型糖尿病の全リスク評価を得るため、本明細書に報告した変異体と、２型糖尿病についてのアットリスク変異体の存在又は不存在の決定を組み合わせる方法に使用し得る。
【０１１５】
本発明の一つの態様において、複数の変異体（遺伝子マーカー及び／又はバイオマーカー及び／又はハプロタイプ）が全リスク評価のために使用される。これらの変異体は、一つの態様において、本明細書に開示した変異体から選択される。他の態様には、２型糖尿病への感受性を診断するために有用であることが知られている他の変異体と組み合わされた本発明の変異体の使用が含まれる。こうした態様において、複数のマーカー及び／又はハプロタイプの遺伝子型状態が個体において決定され、個体の状態を、関連変異体の集団頻度、又は年齢が一致した及び性が一致した対象のような臨床的に健康な対象における変異体の頻度と比較する。多変量分析又は結合リスク（joint risk）分析のような当該技術分野で公知である方法を、多座位での遺伝子型状態に基づいて、与えられた全リスクを決定するために引き続いて使用することができる。こうした分析に基づいたリスクの評価は、本明細書に記載した本発明の方法及びキットで引き続いて使用することができる。
【０１１６】
上記のように、ヒトゲノムのハプロタイプブロック構造は、疾患又は形質と本来関連する変異体と連鎖不平衡にある多数の変異体（マーカー及び／又はハプロタイプ）が、該疾患又は形質との関連を評価するための代替マーカーとして使用することができる効果を有する。こうした代替マーカーの数は、領域中の歴史的組換え率、領域中の突然変異頻度（即ち、領域中の多型部位又はマーカーの数）、及び領域中のＬＤの程度（ＬＤブロックのサイズ）のような因子に依存するであろう。これらのマーカーは、本明細書に記載した方法を使用して、又は当業者には公知の他の方法により画定された、問題とするＬＤブロック又はハプロタイプブロックの物理的境界内に通常位置する。しかしながら、時にはマーカー及びハプロタイプ関連性は、画定されたハプロタイプブロックの物理的境界を超えて拡大していることが観察される。こうしたマーカー及び／又はハプロタイプは、これらのケースにおいて、画定されたハプロタイプブロック内に物理的に属する該マーカー及び／又はハプロタイプの代替マーカー及び／又はハプロタイプとしても使用することができる。その結果、本発明のマーカー及びハプロタイプとＬＤにある（典型的には、０．３より大きなｒ２を含む、０．４より大きなｒ２も含んだ０．２より大きなｒ２のような、０．１より大きなｒ２により特徴付けられる）マーカー及びハプロタイプは、たとえそれらが画定されたハプロタイプブロックの境界を超えて位置してしても、本発明の範囲内である。これには、本明細書に記載されているマーカー（例えば、表２２、２３及び２４にリストされているマーカー）にみでなく、表２２、２３及び２４にリストされている一つ又はそれより多くのマーカーと連鎖不平衡にある（例えば、０．２より大きなｒ２及び／又は｜Ｄ’｜＞０．８により特徴付けられる）他のマーカーも含まれる。
【０１１７】
本明細書に記載したＳＮＰマーカーについては、患者で発現していることが観察されたアレル（アットリスクアレル）と逆のアレルは、２型糖尿病において減少した頻度で観察された。ＬＤにある及び／又はこうしたマーカーを含んでなるこれらのマーカー及びハプロタイプは、それ故２型糖尿病に対して保護的であり、即ち、それらは２型糖尿病を発生するマーカー及び／又はハプロタイプを運んでいる個体に減少したリスク又は感受性を与える。言い換えれば、アットリスク変異体のアットリスクアレルが存在しないことは、ＳＮＰのような２アレルマーカーの代替マーカーの存在を暗示する。それ故、本明細書に記載したアットリスク変異体が存在しないことは、２型糖尿病に対する保護を示す。
【０１１８】
本明細書に記載したように、遺伝子マーカーの組み合わせ（例えば、ＳＮＰ及びマイクロサテライト）を含んでなるハプロタイプはリスク評価のために有用であり得る。ハプロタイプを検出することは、当該技術分野で知られている及び／又は多型部位の配列を検出するために本明細書に記載した方法により達成し得る。さらに、ある種のハプロタイプ又はマーカーの組と疾病表現型間の相関は、標準技術を使用して確認し得る。相関のための単純な検定の例は、２ｘ２分割表でのフィッシャーの直接確率検定であろう。
【０１１９】
具体的態様において、２型糖尿病と関連することが観察されたマーカー又はハプロタイプは、健常な個体（対照）又は該集団からランダムに選択された個体（集団対照）におけるその存在の頻度と比較し、２型糖尿病のリスクがある個体（罹患者）においてより高頻度で存在するマーカー又はハプロタイプであり、該アレル又はハプロタイプマーカーの存在は２型糖尿病又は２型糖尿病への感受性を示す。他の態様において、２型糖尿病と関連することが観察された一つ又はそれ以上のマーカーと連鎖不平衡にあるアットリスクマーカーは、対照におけるそれらの存在の頻度と比較して、２型糖尿病のリスクがある個体（罹患者）により高頻度で存在するタグ付けマーカーであり、該タグ付けマーカーの存在は２型糖尿病への増加した感受性を示す。さらなる態様において、２型糖尿病と関連することが観察された一つ又はそれ以上のマーカーと連鎖不平衡にあるアットリスクマーカーアレル（即ち、増加した感受性を与える）は、対照におけるそれらの存在の頻度と比較して、２型糖尿病のリスクがある個体により高頻度で存在する一つ又はそれ以上のアレルを含んでなるマーカーであり、該マーカーの存在は２型糖尿病への増加した感受性を示す。
【０１２０】
研究集団
一般的な意味において、本発明の方法及びキットは、いずれの起源（即ち、いずれの個体）からのゲノムＤＮＡ含有サンプルにも利用し得る。好ましい態様において、該個体はヒト個体である。該個体は、大人、子供、又は胎児であり得る。本発明は、標的集団のメンバーである個体中のマーカー及び／又はハプロタイプを評価するためにも提供される。こうした標的集団は、一つの態様において、他の遺伝因子、バイオマーカー、生物物理的パラメーター（例えば、体重、ＢＭＤ、血圧）又は一般健康及び／又はライフスタイルパラメーター（例えば、疾患又は関連疾患の病歴、疾患の診断歴、疾患の家族歴）に基づいて疾患を発生するリスクを有する個体の集団又は群である。
【０１２１】
本発明は、４０歳以上、４５歳以上、又は５０歳、５５歳、６０歳、６５歳、７０歳、７５歳、８０歳又は８５歳以上のような特異的年齢副群からの個体を含む態様を提供する。本発明の他の態様は、８０歳未満、７５歳未満、又は７０歳、６５歳、６０歳、５５歳、５０歳、４５歳、４０歳、３５歳、又は３０歳未満のような、８５歳未満の年齢の個体のような他の年齢群に関する。他の態様は、いずれかの上記の年齢範囲に疾患の発症年齢を有する個体に関する。４５歳より上で６０歳未満での発症年齢のような年齢範囲がある種の態様で関連することができることも企図される。しかしながら、上にリストした年齢値によりひとくくりにされたすべての年齢範囲を含む、他の年齢範囲も企図される。本発明はさらに両方の性（男性又は女性）の個体に関する。
【０１２２】
アイスランド人集団は、北ヨーロッパ祖先のコーカサス人集団である。アイスランド人集団における遺伝子連鎖及び関連性の結果を報告している多数の研究が、ここ数年公開されてきた。これらの研究の多くは、他の集団において、特定の疾患に関連しているとして元々アイスランド人集団で同定された変異体の再現性を示した（Stacey, S. N., et al., Nat Genet. May 27 2007 (Epub ahead of print; Helgadottir, A., et al., Science 316:1491-93 (2007); Steinthorsdottir, V., et al., Nat Genet. 39:770-75 (2007); Gudmundsson, J., et al., Nat Genet. 39:631-37 (2007); Amundadottir, L.T., et al., Nat Genet. 38:652-58 (2006); Grant, S.F., et al., Nat Genet. 38:320-23 (2006)）。それ故、アイスランド人集団における遺伝的発見は、アフリカ及びアジアからの集団を含む他の集団においても一般に再現されてきた。ＣＤＫＡＬ遺伝子、特にＬＤブロックＣ０６（配列番号１）に関連していると本明細書で記載された変異体は、ヨーロッパ人、アメリカ人及び中国人（香港）起源のいくつかの集団で再現された。このことは、これらの変異体（ｒｓ７７５６９９２及びそれらと連鎖不平衡にあるマーカー）はほとんどの集団において２型糖尿病についてのアットリスク変異体であるという考えを支持している。
【０１２３】
個々のヒト集団を含んでなる特定の態様もそれ故企図され、本発明の範囲内である。こうした態様は、限定されるわけではないが、コーカサス人、ヨーロッパ人集団、アメリカ人集団、ユーラシア人集団、アジア人集団、中央／南アジア人集団、東アジア人集団、中東人集団、アフリカ人集団、ラテンアメリカ人系集団及びオセアニア人集団を含む、一つ又はそれ以上のヒト集団であるヒト対象に関する。ヨーロッパ人集団には、限定されるわけではないが、スウェーデン人、ノルウェー人、フィンランド人、ロシア人、デンマーク人、アイスランド人、アイルランド人、ケルト人、イギリス人、スコットランド人、オランダ人、ベルギー人、フランス人、ドイツ人、スペイン人、ポルトガル人、イタリア人、ポーランド人、ブルガリア人、スラブ人、セルビア人、ボスニア人、チェチェン人、ギリシア人及びトルコ人集団が含まれる。他の態様において、本発明はさらに、バンツー、マンデンカ、ヨルバ、サン、ムブティピグミー、オルカディアン、エディゲル、ロシア、サルジニア、トスカナ、ムザブ、ベドウィン、ドルーズ、パレスティナ、バローチ、ブラフイ、マクラーニー、シンド、パターン、ブルーショー、ハザラ、ウィグル、カラーシュ、ハン、ダイ、ダフール、ホジェン、ラフ、ミャオ、オロチョン、シ、エ、トゥチャ、トウ、シボ、イー、モンゴル、ナシ、カンボジア、ジャパニーズ、ヤクート、メラネシア、パプア、カリティアナ、スルイ、コロンビア、マヤ及びピマを含む特異的ヒト集団においても実施し得る。
【０１２４】
一つの好ましい態様において、本発明は、アフリカ系家系又は血統の人々を含んでなる集団のようなブラックアフリカ人祖先を含む集団に関する。ブラックアフリカ人祖先は自己申告により、ブラック人種のメンバーである又はネグロ人種のメンバーである、アフリカンアメリカ人、アフロアメリカ人、ブラックアメリカ人として決定することができる。例えば、アフリカンアメリカ人又はブラックアメリカ人は北アメリカに住み、そしてアフリカのブラック人種群のいずれかに起源を有する人々である。別の例において、ブラックアフリカ人祖先の自己申告をした人々は、少なくとも一人のブラックアフリカ人祖先の親又は少なくとも一人のブラックアフリカ人祖先の祖父母を有している。
【０１２５】
個々の対象における人種的寄与も遺伝子解析により決定することができる。祖先の遺伝子解析は、Smith et al. （Am J Hum Genet 74, 1001 -13 (2004)）により示されているような非連鎖マイクロサテライトマーカーを使用して実施することができる。
【０１２６】
ある態様において、本発明は上記の特異的集団で同定されたマーカー及び／又はハプロタイプに関する。当業者は、連鎖不平衡（ＬＤ）の尺度は、異なった集団に適応された場合に異なった結果を与えることを認識するであろう。このことは、異なったヒト集団の異なった集団歴史、ならびに特異的ゲノム領域中のＬＤの相違を導くことができる異なった選択圧による。ある種のマーカー（例えば、ＳＮＰマーカー）は、異なった集団中で異なった集団頻度を有し、又は一つの集団では多型であるが、別の集団ではそうではないことも、当業者には公知である。しかしながら、当業者はいずれの所与のヒト集団においても本発明を実施するため、利用可能な及び本明細書で考えられた方法を適用するであろう。このことは、特異的集団内で最も強い関連性を与えるマーカーを同定するための、本発明のＬＤ領域中の多型マーカーの評価が含まれる。それ故、本発明のアットリスク変異体は、多様なヒト集団において異なったハプロタイプバックグラウンド上に、及び異なった頻度で存在することができる。しかしながら、当該技術分野で公知である方法及び本発明のマーカーを利用し、本発明はいずれの所与のヒト集団においても実行し得る。
【０１２７】
遺伝子検査の有用性
２型糖尿病を発生するリスクを与える遺伝子変異体についての知識は、疾患を発生する増加したリスクを有する個体（即ち、アットリスク変異体のキャリア）及び疾患を発生する減少したリスクを有する個体（即ち、保護的変異体のキャリア）間を区別するための遺伝子検査を適用する機会を与える。上記の群の両方に属する個体についての遺伝子検査の中核的意義は、早期段階で疾患を診断することができる可能性であり、最も適切な治療を適用することが可能であるように疾患の予後／攻撃性について、臨床医に情報を提供することである。
【０１２８】
例えば、２型糖尿病に対する遺伝子検査の適用は、空腹時血中グルコース不良（ＩＦＧ）又はグルコース耐性不良（ＩＧＴ）を有する人々の間の高リスク個体を同定し得る。ＩＦＧ／ＩＧＴを有することが観察された人々の約３分の１が２型糖尿病を発症することはかなり確立されており、等しい比率の個体についてはグルコースレベルが正常に戻る。遺伝的リスク変異体を運んでいるこの群内の個体の同定は、予防策によるこれらの個体の標的化を可能にするであろう。例えば、これらの個体は、早期診断を助けるため、血中グルコースレベルの綿密なモニタリングにより恩恵を受けることができる。ある種の遺伝的リスク因子を有する個体は、それらの因子を有していない個体よりも低いＢＭＩで２型糖尿病を発症するので、より厳密なライフスタイル介入も必要とするであろう。
【０１２９】
２型糖尿病の家族歴及びアットリスク変異体のキャリアを有する個体は、遺伝的リスク因子の存在の知識、又は一つ又はそれ以上のリスク因子のキャリアであるという増加したリスクの証拠は、より健康的なライフスタイルを実行するための増加した意欲を提供するので、遺伝子を検査することにより恩恵を受けることができる。さらに、グルコースレベルの綿密なモニタリングがこうした個体にアドバイスされるべきであり、早期診断及び／又は予防的治療を容易にしている。
【０１３０】
２型糖尿病患者の遺伝子検査はさらに、該疾患の主原因についての有用な情報を与えることができ、そして各個体に最良の治療オプション及び投薬の選択することにおいて臨床医を助け得る。例えば、減少したインスリン分泌についての遺伝的リスク因子を有する患者は、インスリン分泌を増加させる投薬により恩恵を受けることができるが、これらの個体においてインスリン感受性を増加させることはほとんど効果がないであろう。
【０１３１】
本発明の方法
２型糖尿病のリスク評価のための方法が本明細書に記載されており、本発明に包含される。本発明は、２型糖尿病のための療法剤への応答の可能性を評価する方法、ならびに、２型糖尿病のための療法剤の有効性を予測する方法も包含する。２型糖尿病への感受性えお検出するため、対象からのサンプルをアッセイするためのキットも本発明に包含されている。
【０１３２】
本発明の診断的及びスクリーニングアッセイ
ある態様において、本発明は、２型糖尿病対象又は２型糖尿病への感受性がある対象において、より頻繁に現れる遺伝子マーカーの特定のアレルを検出することにより、２型糖尿病又は２型糖尿病への感受性のリスクを評価する又は診断する、又はリスク評価又は診断を助ける方法に関する。特定の態様において、本発明は、少なくとも一つの多型マーカー（例えば、本明細書に記載したマーカー）の少なくとも一つのアレルを検出することにより２型糖尿病への感受性を評価する方法である。本発明は、特定のマーカー又はハプロタイプの特定のアレルの検出が２型糖尿病への感受性を示す方法を記載している。こうした予後又は予測アッセイは、２型糖尿病の症状の開始に先立って対象の予防的治療を決定するためにも使用し得る。
【０１３３】
本発明は、いくつかの態様において、遺伝的リスク変異体の評価又は決定を含むことができる診断、例えば、医学専門家により実施される診断の臨床的応用の方法に関する。他の態様において、本発明は素人により実施されるリスク評価（又は診断）の方法に関する。Molecular Inversion Probeアレイ技術（例えば、Affymetrix GeneChip）及びBeadArray Technologies （例えば、Illumina GoldenGate and Infinium アッセイ）のようなＳＮＰマーカーの高スループット遺伝子型同定を含む、遺伝子型同定技術における最近の技術的進歩は、個体が１００万までのＳＮＰについて評価された自身のゲノムを有することを可能にした。得られた遺伝子型情報は、個体に利用可能にされており、種々のＳＮＰに関連する疾患又は形質についての公開文献からの情報と比較し得る。本明細書に記載した疾患関連アレルの診断的応用は、臨床試験の結果に基づいて医療従事者により、又はＳＮＰの全ゲノム評価を実施するためのサービスを提供している個人を含む素人により実施し得る。別の言葉では、遺伝的リスクに基づいた感受性の評価は、彼の／彼女の遺伝子型についての情報及び種々のリスク因子についての論文に基づいて、医療従事者、遺伝子カウンセラー、遺伝子型サービスプロバイダー又は素人により行い得る。本文脈において、用語「診断する」及び「感受性を診断する」とは、上記の方法を含むいずれかの利用可能な診断法を指すことを意味する。
【０１３４】
加えて、ある他の態様において、本発明は、２型糖尿病と診断されていない個体又は母集団中よりも、２型糖尿病患者において低い頻度で出現する特定の遺伝子マーカーアレル又はハプロタイプを検出することによる、２型糖尿病への減少した感受性を診断する、又は診断を助ける方法に関する。
【０１３５】
本明細書に記載した及び例示したごとく、特定のマーカー又はハプロタイプ（例えば、表１〜２４にリストしたマーカー及びハプロタイプ、例えば、表１〜６及び表９〜１２にリストしたマーカー及びハプロタイプ、及びそれらと連鎖不平衡にあるマーカー）は２型糖尿病に関連する。一つの態様において、該マーカーアレル又はハプロタイプは、２型糖尿病への有意なリスク又は感受性を与えるものである。別の態様において、本発明は、ヒト個体における２型糖尿病への感受性を診断する方法に関し、該方法は、該個体から得られた核酸サンプル中の少なくとも一つの多型マーカーの少なくとも一つのアレルの存在又は不存在を決定することを含んでなり、該少なくとも一つの多型マーカーは表９、表１０、表１１及び表１２にリストした多型マーカー及びそれらと連鎖不平衡（ｒ２＞０．２で規定される）にあるマーカーから成る群より選択される。別の態様において、本発明は、表１〜６及び９〜１２にリストした少なくとも一つのマーカーアレル又はハプロタイプ又はそれらと連鎖不平衡にあるマーカーについてのスクリーニングにより、ヒト個体における２型糖尿病への感受性を診断する又は評価する方法に関する。別の態様において、該マーカーアレル又はハプロタイプは、健常対象（対照、集団対照のような）における存在の頻度と比較して、２型糖尿病を有している又は２型糖尿病に罹りやすい対象（患者）においてより高頻度に存在する。ある態様において、該少なくとも一つのマーカーアレル又はハプロタイプの関連の有意性は、ｐ値＜０．０５により特徴付けられる。他の態様において、該関連の有意性は、＜０．０１、＜０．００１、＜０．０００１、＜０．００００１、＜０．０００００１、＜０．００００００１、＜０．０００００００１又は＜０．００００００００１のような、より小さなｐ値により特徴付けられる。
【０１３６】
これらの態様において、該少なくとも一つのマーカーアレル又はハプロタイプの存在は、２型糖尿病への感受性を示す。これらの診断法は、２型糖尿病に関連している少なくとも一つのマーカーアレル又はハプロタイプの存在又は不存在を検出することを含む。本明細書に記載したハプロタイプは、多様な遺伝子マーカー（例えば、ＳＮＰ、マイクロサテライト）でのアレルの組み合わせを含む。特定のハプロタイプを作り上げる特定の遺伝子マーカーアレルの検出は、本明細書に記載した及び／又は当該技術分野で既知の多様な方法により実行し得る。例えば、遺伝子マーカーは、核酸レベルで（例えば、直接ヌクレオチドシークエンシング又は当業者には公知の他の手段により）又は、もし遺伝子マーカーが、２型糖尿病関連核酸によりコードされたタンパク質のコード配列に影響するならばアミノ酸レベルで（例えば、タンパク質シークエンシングにより、又はこうしたタンパク質を認識する抗体を使用するイムノアッセイにより）検出し得る。本発明のマーカーアレル又はハプロタイプは、２型糖尿病に関連するゲノムＤＮＡ配列の断片に相当する。こうした断片は、問題とする多型マーカー又はハプロタイプのＤＮＡ配列を包含するが、該マーカー又はハプロタイプと強いＬＤ（連鎖不平衡）にある（例えば、０．２より大きなｒ２及び／又は｜Ｄ’｜＞０．８により決定された）ＤＮＡセグメントも含むことができる。
【０１３７】
一つの態様において、２型糖尿病への感受性の診断又は評価は、サザン分析、ノーザン分析及び／又はインサイツハイブリダイゼーションのようなハイブリダイゼーション法(Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. et al, eds., John Wiley & Sons 、すべての補足を含んで、を参照されたい）を使用して達成し得る。特異的マーカーアレルの存在は、該特定のアレルに特異的である核酸プローブの配列特異的ハイブリダイゼーションにより示し得る。特異的マーカーアレル又は特異的ハプロタイプ以外の存在は、それぞれが特定のアレルに特異的である、いくつかの配列特異的核酸プローブを使用することにより示し得る。一つの態様において、ハプロタイプは、特定のハプロタイプに特異的である（即ち、該ハプロタイプに特徴的な特異的マーカーアレルを含んでなるＤＮＡ鎖に特異的にハイブリダイズする）単一核酸プローブにより示し得る。配列特異的プローブは、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ又はｃＤＮＡへハイブリダイズするように方向付け得る。本明細書で使用される「核酸プローブ」は、相補的配列にハイブリダイズするＤＮＡプローブ又はＲＮＡプローブであり得る。当業者は、特定のアレルが試験サンプルからのゲノムＤＮＡ中に存在する場合にのみ配列特異的ハイブリダイゼーションが起こるように、こうしたプローブをどのように設計するのかを承知しているであろう。
【０１３８】
２型糖尿病への感受性を診断するため、２型糖尿病関連核酸を含有する試験サンプル（ゲノムＤＮＡサンプルのような）と少なくとも一つの核酸プローブを接触させることによりハイブリダイゼーションサンプルを形成させる。ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡを検出するためのプローブの非制限例は、本明細書に記載したｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡ配列にハイブリダイズすることができる標識核酸プローブである。該核酸プローブは完全長核酸分子、又は例えば、ストリンジェント条件下で適切なｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズするのに十分である、少なくとも１５、３０、５０、１００、２５０又は５００ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドのようなそれらの一部であり得る。例えば、該核酸プローブは、本明細書に記載したＬＤブロックＣ０６（配列番号１）、ＬＤブロックＣ１０（配列番号２）（例えば、本明細書に記載したＩＤＥ、ＫＩＦ１１及び／又はＨＨＥＸ遺伝子をコードするヌクレオチド配列）、ＬＤブロックＣ１７（配列番号３）又はＣＤＫＡＬ１遺伝子又はＳＬＣ３０Ａ８遺伝子のヌクレオチド配列のすべて又は一部を含んでなることができ、本明細書に記載したハプロタイプ中に含まれる少なくとも一つのアレルを含んでいてもよく、又は該プローブはこうした配列の相補配列であり得る。特定の態様において、該核酸プローブは、本明細書に記載したＬＤブロックＣ０６（配列番号１）、ＬＤブロックＣ１０（配列番号２）（例えば、本明細書に記載したＩＤＥ、ＫＩＦ１１及び／又はＨＨＥＸ遺伝子をコードするヌクレオチド配列）、ＬＤブロックＣ１７（配列番号３）又はＣＤＫＡＬ１遺伝子又はＳＬＣ３０Ａ８遺伝子のヌクレオチド配列の一部であり、本明細書に記載した該マーカーの少なくとも一つのアレル又は本明細書に記載した該ハプロタイプ中に含有される少なくとも一つのアレルを含んでいてもよく、又は該プローブはこうした配列の相補配列であり得る。本発明の診断アッセイに使用するための他の適したプローブは本明細書に記載されている。ハイブリダイゼーションは当業者には公知の方法により実施し得る（例えば、Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel、 F. et al.、 eds., John Wiley & Sons、 including all supplements、すべての補足を含んで、を参照されたい）。一つの態様において、ハイブリダイゼーションは特異的ハイブリダイゼーション、即ち、ミスマッチのないハイブリダイゼーション（正確なハイブリダイゼーション）を指す。一つの態様において、特異的ハイブリダイゼーションのためのハイブリダイゼーション条件は高ストリンジェンシーである。
【０１３９】
特異的ハイブリダイゼーションは、もし存在するならば、標準法を使用して検出される。もし特異的ハイブリダイゼーションが、該核酸プローブと試験サンプル中の核酸との間で起こったら、該サンプルは、該核酸プローブ中に存在するヌクレオチドに相補的であるアレルを含有する。該プロセスは、本発明のいずれのマーカー、本発明のハプロタイプを作り上げるマーカーについても繰り返すことができ、一つまたはそれより多くのマーカーアレルを検出するために複数のプローブを同時に使用し得る。特定のハプロタイプの一つより多くのマーカーアレルを含有する単一プローブ（例えば、特定のハプロタイプを作り上げる２、３、４、５又はすべてのマーカーに相補的なアレルを含有するプローブ）を設計することが可能である。該サンプル中のハプロタイプ特定のマーカーの検出は、サンプルの起源が特定のハプロタイプ（例えば、一つのハプロタイプ）を有し、それ故、２型糖尿病へ感受性であることを示す。
【０１４０】
一つの好ましい態様において、一つの方法は、Kutyavin et al.,(Nucleic Acids Res. 34:e128 (2006)）により記載されているように、蛍光部分を３’末端に、及びクエンチャーを５’末端に、及びエンハンサーオリゴヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチドプローブの検出を利用する。該蛍光成分はGig Harbor Green又はYakima Yellow 又は他の適した蛍光成分であり得る。該検出プローブは、検出されるべきＳＮＰ多型を含む短い核酸配列へハイブリダイズするように設計されている。好ましくは、該ＳＮＰは末端残基から検出プローブの３’末端から６残基の間のいずれかにある。該エンハンサーは、検出プローブに関して３’のＤＮＡ鋳型へハイブリダイズする短いオリゴヌクレオチドプローブである。該プローブは、検出プローブ及びエンハンサーヌクレオチドプローブの両方が鋳型に結合された場合、両者間に単一ヌクレオチドギャップが存在するように設計されている。該ギャップは、エンドヌクレアーゼＩＶのようなエンドヌクレアーゼにより認識される合成塩基脱落部位を創造する。該酵素は、完全に相補的な検出プローブの染料を切断するが、ミスマッチを含有する検出プローブを切断できない。それ故、放出された蛍光部分の蛍光を測定することにより、検出プローブの核酸配列により規定された特定のアレルの存在の評価を実施し得る。
【０１４１】
検出プローブはどのようなサイズでもよいが、好ましくは、該プローブは比較的短い。一つの態様において、該プローブは５〜１００ヌクレオチド長である。別の態様において、該プローブは１０〜５０ヌクレオチド長である。別の態様において、該プローブは１２〜３０ヌクレオチド長である。該プローブの他の長さも可能であり、当業者の範囲内である。好ましい態様において、ＳＮＰ多型を含有する該ＤＮＡ鋳型は、検出に先立ってポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅される。こうした態様において、該増幅されたＤＮＡは、該検出プローブ及び該エンハンサープローブのための鋳型として働く。
【０１４２】
該検出プローブ、該エンハンサープローブ及び／又はＰＣＲによる鋳型の増幅に使用されたプライマーのある種の態様は、修飾Ａ及び修飾Ｇを含む修飾塩基の使用を含む。修飾塩基の使用は、鋳型ＤＮＡに対するヌクレオチド分子（プローブ及び／又はプライマー）の融点を調節するために、例えば、低パーセンテージのＧ又はＣを含有する領域の融点を上昇させるために（その相補的Ｔと三つの水素結合を形成する能力を有する修飾Ａを使用し得る）、又は高パーセンテージのＧ又はＣを含有する領域の融点を低下させるために（例えば、二本鎖ＤＮＡ分子中で、その相補的Ｃと二つの水素結合しか形成しない修飾Ｇ塩基を使用することにより）、有用であり得る。好ましい態様において、修飾塩基は、検出ヌクレオチドプローブの設計に使用される。当業者には既知のいずれの修飾塩基もこれらの方法において選択することができ、適した塩基の選択は、本明細書の教示に基づくと当業者の範囲内であり、及び当業者には公知のように既知の塩基が商業的供給源から入手可能である。
【０１４３】
別のハイブリダイゼーション法において、ノーザン分析(Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel、F. et al., eds., John Wiley & Sons 、上記文献、を参照されたい) を、２型糖尿病に関連する多型の存在を同定するために使用する。ノーザン分析のためには、適切な手段により対象からＲＮＡの試験サンプルを得る。本明細書に記載したごとく、対象からのＲＮＡへの核酸プローブの特異的ハイブリダイゼーションは、プローブに相補的な特定のアレルを示す。核酸プローブの使用の代表的な例は、例えば、米国特許番号5,288,611及び4,851,330を参照されたい。
【０１４４】
さらに、又はもしくは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブを、本明細書に記載したハイブリダイゼーション法の核酸プローブに加えて、又は代わりに使用し得る。ＰＮＡは、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシンユニットのような、ペプチド様無機主鎖を有し、メチレンカルボニルリンカーを介して該グリシン窒素に有機塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ又はＵ）が結合されているＤＮＡ模倣物である(例えば、Nielsen, P., et al, Bioconjug. Chem. 5:3-7(1994) を参照されたい) 。ＰＮＡプローブは、２型糖尿病に関連する一つまたはそれより多くのマーカーアレル又はハプロタイプを含有すると疑われるサンプル中の分子に特異的にハイブリダイズするように設計し得る。ＰＮＡプローブのハイブリダイゼーションは、２型糖尿病又は２型糖尿病への感受性を診断するものである。
【０１４５】
本発明の方法の一つの態様において、２型糖尿病又は２型糖尿病への感受性の診断は、該対象からの核酸の酵素的増幅を介して達成される。例えば、ゲノムＤＮＡを含有する試験サンプルは該対象から得ることができ、そして２型糖尿病に関連していることが観察された本発明の一つ又はそれ以上のマーカー又はハプロタイプを含んでなる断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用し得る。本明細書に記載したように、２型糖尿病に関連する特定のマーカーアレル又はハプロタイプの同定は種々の方法（例えば、配列分析、制限消化による分析、特異的ハイブリダイゼーション、一本鎖コンホメーション多型アッセイ（ＳＳＣＰ）、電気泳動分析など）により達成し得る。別の態様において、診断は定量的ＰＣＲ（動力学的熱サイクリング）を使用する発現分析により達成される。この技術は、例えば、TaqMan（登録商標）(Applied Biosystems、 Foster City、 CA) のような商業的に入手可能な技術を利用することができ、多型及びハプロタイプの同定を可能にする。該技術は、２型糖尿病関連核酸によりコードされているポリペプチド又はスプライシング変異体（単数又は複数）の発現又は組成の変化の存在を評価し得る。さらに、変異体（単数又は複数）の発現を物理的に又は機能的に異なったものとして定量し得る。
【０１４６】
本発明の方法の別の態様において、もしアレルが基準配列と比べて制限部位の創造又は除去を生じていたら、制限消化による分析を、特定のアレルを検出するために使用し得る。ゲノムＤＮＡを含有する試験サンプルは対象から得られる。試験対象からの試験サンプル中核酸の２型糖尿病に関連する特定の領域（例えば、表１〜２１の多型マーカー及びハプロタイプ、例えば、表１〜６及び表９〜１２の多型マーカー及びハプロタイプ、及びそれらと連鎖不平衡にあるマーカー）を増幅するためにＰＣＲを使用し得る。例えば、Current Protocols in Molecular Biology、上記文献、に記載されている、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）分析を実行し得る。関連ＤＮＡ断片の消化パターンは、サンプル中の特定のアレルの存在又は不存在を示す。
【０１４７】
２型糖尿病に関連する多型部位の特定のアレル（例えば、表１〜２１の多型マーカー及びハプロタイプ、例えば、表１〜６及び表９〜１２の多型マーカー及びハプロタイプ、及びそれらと連鎖不平衡にあるマーカー、例えば、表２２、２３及び２４に示したマーカー）を検出するため、配列分析も使用することができる。それ故、一つの態様において、特定のマーカーアレル又はハプロタイプの存在又は不存在の決定は配列分析を含んでなる。例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡの試験サンプルは試験対象から得ることができる。ＰＣＲ又は他の適切な方法を２型糖尿病関連核酸の一部を増幅するために使用することができ、そして特異的アレルの存在を、サンプル中のゲノムＤＮＡの多型部位（又は、もしくはハプロタイプ中の多くの多型部位）を配列決定することにより直接的に検出し得る。
【０１４８】
アレル特異的オリゴヌクレオチドも、増幅されたオリゴヌクレオチドとアレル特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブのドット−ブロットハイブリダイゼーションの使用を介して、２型糖尿病関連核酸での特定のアレル（例えば、表１〜２１の多型マーカー及びハプロタイプ、例えば、表１〜６及び表９〜１２の多型マーカー及びハプロタイプ、及びそれらと連鎖不平衡にあるマーカー）の存在を検出するために使用し得る(例えば、Saiki、 R. et al、 Nature、 324:163-166 (1986)を参照されたい) 。「アレル特異的オリゴヌクレオチド」（「アレル特異的オリゴヌクレオチドプローブ」とも称される）は、２型糖尿病関連核酸に特異的にハイブリダイズし、多型部位（例えば、本明細書に記載した多型）に特異的アレルを含む、およそ１０〜５０塩基対又はおよそ１５〜３０塩基対のオリゴヌクレオチドである。一つまたはそれより多くの特定の２型糖尿病関連核酸に特異的であるアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブは、標準法を使用して製造し得る(例えば、Current Protocols in Molecular Biology、 上記文献、を参照されたい) 。ＰＣＲを、２型糖尿病関連核酸の所望の領域を増幅するために使用し得る。増幅された領域を含有するＤＮＡは、標準法を使用してドット−ブロットすることができ(例えば、Current Protocols in Molecular Biology、 上記文献、を参照されたい) 、該ブロットを該オリゴヌクレオチドと接触させ得る。増幅された領域への該プローブの特異的ハイブリダイゼーションの存在を次ぎに検出し得る。対象からのＤＮＡへのアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブの特異的ハイブリダイゼーションは、２型糖尿病に関連する多型部位での特異的アレルを示す（例えば、Gibbs, R. et al., Nucleic Acids Res., 17:2437-2448 (1989)及びWO93/22456 を参照されたい）。
【０１４９】
別の態様において、対象からの標的核酸配列セグメントに相補的であるオリゴヌクレオチドプローブのアレイを、２型糖尿病関連核酸（例えば、表１〜２１の多型マーカー及びハプロタイプ、例えば、表１〜６及び表９〜１２の多型マーカー及びハプロタイプ、及びそれらと連鎖不平衡にあるマーカー）中の多型を同定するために使用し得る。例えば、オリゴヌクレオチドアレイを使用し得る。オリゴヌクレオチドアレイは典型的には、異なった既知の位置で基質の表面に結合する複数の異なったオリゴヌクレオチドプローブを含んでなる。「Genechips（商標）」とも記述されているこれらのオリゴヌクレオチドアレイは、当該技術分野で一般的に記載されている（例えば、米国特許番号5,143,854、ＰＣＴ特許出願番号WO90/15070及び92/10092を参照されたい）。これらのアレイは一般的には、機械的合成法又は光リソグラフ法及び固相オリゴヌクレオチド合成を取り込んだ光指向（light directed）合成法を使用して製造される（Fodor,S. et al., Science,251:767-773 (1991)；Pirrung et al., 米国特許番号5,143,854（公開ＰＣＴ出願番号WO90/15070も参照されたい);及びFodor. S. et al., 公開ＰＣＴ出願番号WO92/10092 及び米国特許番号5,424,186 、これらの各々の全教示が本明細書において援用される) 。機械的合成法を使用したこれらのアレイの合成のための技術については、例えば、米国特許番号5,384,261 （その全教示が本明細書において援用される）に記載されている。別の例においては、リニアアレイを利用し得る。
【０１５０】
多型の検出のためのオリゴヌクレオチドアレイの使用の追加の記述は、例えば、米国特許番号5,858,659 及び5,837,832 （両方の全教示が本明細書において援用される）に見ることができる。核酸分析の他の方法が２型糖尿病に関連する多型部位（例えば、表１〜２１の多型マーカー及びハプロタイプ、例えば、表１〜６及び表９〜１２の多型マーカー及びハプロタイプ、及びそれらと連鎖不平衡にあるマーカー）での特定のアレルを検出するために使用し得る。代表的な方法には、例えば、直接マニュアルシークエンシング(Church and Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1991-1995 (1988);Sanger, F.,et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,74:5463-5467(1977)；Beavis、 et al.,米国特許番号5,288,644)；自動化蛍光シークエンシング；一本鎖コンホメーション多型アッセイ（ＳＳＣＰ）；クランプト変性ゲル電気泳動（ＣＤＧＥ）；変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）(Sheffield, V., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:232-236 (1989))、移動度シフト分析 (Orita, M., et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 86:2766- 2770 (1989))、制限酵素分析 (Flavell, R., et al, Cell, 15:25-41 (1978); Geever, R., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:5081-5085 (1981))；ヘテロ二重鎖分析；化学ミスマッチ切断（ＣＭＣ） (Cotton, R., et al, Proc. Natl Acad. Sci USA, 85:4397-4401 (1985))；ＲＮａｓｅ保護アッセイ (Myers, R., et al, Science, 230:1242-1246 (1985)) ；大腸菌ｍｕｔＳタンパク質のようなヌクレオチドミスマッチを認識するポリペプチドの使用；及びアレル特異的ＰＣＲが含まれる。
【０１５１】
本発明の別の態様において、２型糖尿病又は２型糖尿病への感受性の診断は、２型糖尿病関連核酸によりコードされたポリペプチドの発現及び／又は組成を試験することによって行うことができ、これらの例において、本明細書に記載した遺伝子マーカー（単数又は複数）又はハプロタイプはポリペプチドの組成又は発現に変化をもたらす。それ故、２型糖尿病への感受性の診断は、これらのポリペプチドの一つ、又は２型糖尿病関連核酸によりコードされた別のポリペプチドの発現及び／又は組成を試験することにより行うことができ、これらの例において、本明細書に記載した遺伝子マーカー又はハプロタイプはポリペプチドは、ポリペプチドの組成又は発現に変化をもたらす。２型糖尿病への関連を示す本明細書に記載したハプロタイプ又はマーカーは、これらの近隣の遺伝子の一つまたはそれより多くに、その効果を介して関与することができる。これらの遺伝子に影響することが可能な機構には、例えば、転写への影響、ＲＮＡスプライシングへの影響、ｍＲＮＡの別のスプライス形の相対量の変化、ＲＮＡ安定性への影響、核から細胞質への輸送に対する影響、及び翻訳の効率及び正確さに対する影響が含まれる。
【０１５２】
酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降及び免疫蛍光を含む多様な方法をこうした検出を行うために使用し得る。対象からの試験サンプルは、２型糖尿病関連核酸によりコードされたポリペプチドの発現の変化及び／又は組成の変化の存在について評価される。２型糖尿病関連核酸によりコードされたポリペプチドの発現における変化は、例えば、定量的ポリペプチド発現（即ち、産生されたポリペプチドの量）であろう。２型糖尿病関連核酸によりコードされたポリペプチドの組成における変化は、定量的ポリペプチド発現（突然変異体ポリペプチドの又は異なったスプライシング変異体の発現）である。一つの態様において、２型糖尿病への感受性の診断は、本明細書に記載した２型糖尿病関連核酸によりコードされた特定のスプライシング変異体、又はスプライシング変異体の特定のパターンを検出することにより行われる。
【０１５３】
こうした変化の両方（定量的及び定性的）が存在し得る。本明細書で使用されるポリペプチド発現又は組成における「変化」とは、対照サンプル中の２型糖尿病関連核酸によりコードされたポリペプチドの発現又は組成と比較して、試験サンプル中のポリペプチドの発現又は組成の変化を指す。対照サンプルは、試験サンプルに対応するサンプル（例えば、同一タイプの細胞から）であり、及び２型糖尿病に罹患していない及び／又は２型糖尿病への感受性を有していない対象（例えば、本明細書に記載したマーカーアレル又はハプロタイプを有していない対象）からのものである。同様に、対照サンプルと比較して、試験サンプル中の一つ又はそれ以上の異ったスプライシング変異体の存在、又は試験サンプル中の異なったスプライシング変異体の有意に異なった量での存在は、２型糖尿病への感受性を示し得る。対照サンプルと比較して、試験サンプル中のポリペプチドの発現又は組成における変化は、アレルが対照サンプル中の基準に関連したスプライス部位を変化させている例においては、特異的アレルを示す。２型糖尿病関連核酸によりコードされたポリペプチドの発現又は組成を試験する多様な手段を使用することができ、分光法、比色分析法、電気泳動法、等電点電気泳動及びイムノブロッティングのような免疫アッセイ（例えば、David et al., 米国特許番号4,376,110）が含まれる（例えば、Current Protocols in Molecular Biology, 特に１０章 、上記文献、を参照されたい）。
【０１５４】
例えば、一つの態様において、２型糖尿病関連核酸によりコードされたポリペプチドに結合することが可能である抗体（例えば、検出可能な標識を有する抗体）を使用し得る。抗体はポリクローナルでもモノクローナルでもよい。無傷の抗体、又はそれらの断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’,Ｆ（ａｂ’）２）を使用し得る。プローブ又は抗体に関する用語「標識された」とは、プローブ又は抗体へ検出可能物質をカップリング（即ち、物理的連結）させることによるプローブ又は抗体の直接標識化、ならびに直接的に標識された別の試薬との反応性によるプローブ又は抗体の間接標識を包含することが意図される。間接標識の例には、標識二次抗体（例えば、蛍光標識二次抗体)を使用する一次抗体の検出、及び蛍光性標識ストレプトアビジンで検出できるような、ビオチンによるＤＮＡプローブの末端標識が含まれる。
【０１５５】
この方法の一つの態様において、試験サンプル中の２型糖尿病関連核酸によりコードされたポリペプチドのレベル又は量が、対照サンプル中の２型糖尿病関連核酸によりコードされたポリペプチドのレベル又は量と比較される。対照サンプル中のポリペプチドのレベル又は量よりも高い又は低い試験サンプル中のポリペプチドのレベル又は量（相違が統計的に有意であるような）は、２型糖尿病関連核酸によりコードされたポリペプチドの発現における変化を示し、発現に相違を起こすことの原因となる特定のアレル又はハプロタイプについての診断である。もしくは、試験サンプル中の２型糖尿病関連核酸によりコードされたポリペプチドの組成が対照サンプル中の２型糖尿病関連核酸によりコードされたポリペプチドの組成と比較される。別の態様において、該ポリペプチドのレベル及び量の両方を試験サンプル中及び対照サンプル中で評価し得る。
【０１５６】
別の態様において、２型糖尿病への感受性の診断は、追加のタンパク質に基づいた、ＲＮＡに基づいた、又はＤＮＡに基づいたアッセイと組み合わされた、少なくとも一つの２型糖尿病関連マーカーアレル又はハプロタイプ（例えば、表１〜６及び表９〜１２のような表１〜２１にリストされたマーカーの関連アレル又はハプロタイプ）を検出することにより行われる。本発明の方法は、対象の家族歴及びリスク因子（例えば、環境リスク因子、ライフスタイルリスク因子）の分析と組み合わせても使用し得る。
【０１５７】
キット
本発明の方法に有用なキットは、例えば、核酸増幅のためのプライマー、ハイブリダイゼーションプローブ、制限酵素（例えば、ＲＦＬＰ分析）、特異的アレルオリゴヌクレオチド、本明細書に記載した核酸（例えば、本発明の少なくとも一つの多型マーカー及び／又はハプロタイプを含んでなるゲノムセグメント）によりコードされた変化したポリペプチド、又は本明細書に記載した本発明の核酸によりコードされた変化していない（天然の）ポリペプチドに結合する抗体、を含む本明細書に記載したいずれかの方法、２型糖尿病と関連する核酸の増幅のための手段、２型糖尿病と関連する核酸の核酸配列を分析するための手段、２型糖尿病と関連する核酸によりコードされたポリペプチドのアミノ酸配列（例えば、２型糖尿病遺伝子によりコードされた２型糖尿病タンパク質）を分析するための手段などに有用な成分を含んでなる。該キットは、例えば、必要な緩衝液、本発明の核酸（例えば、本明細書に記載した一つ又はそれ以上の多型マーカーを含んでなる核酸セグメント）を増幅するための核酸プライマー、及びこうしたプライマー及び必要な酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）を使用して増幅された断片のアレル特異的検出のための試薬を含んでいる。加えて、キットは、本発明の方法と組み合わせて使用されるべき、アッセイのための試薬、例えば、他の２型糖尿病診断アッセイで使用するための試薬を提供し得る。
【０１５８】
一つの態様において、本発明は、対象における２型糖尿病の存在、２型糖尿病に関連した症状、又は２型糖尿病への感受性を検出するため、対象からのサンプルをアッセイするキットであり、該キットは、個体のゲノム中の、本発明の少なくとも一つの多型の少なくとも一つのアレルを選択的に検出するために必要な試薬を含んでなる。特定の態様において、該試薬は、少なくとも一つの本発明の多型を含んでなる個体のゲノムの断片にハイブリダイズする、少なくとも一つの近接するオリゴヌクレオチドを含んでなる。別の態様において、該試薬は、対象から得られたゲノムセグメントの反対鎖にハイブリダイズする少なくとも一つの対のオリゴヌクレオチドを含んでなり、各オリゴヌクレオチドプライマー対は、少なくとも一つの多型を含む個体のゲノムの断片を選択的に増幅するように設計されており、該多型は、表１〜６及び９〜１２にリストした多型及びそれらと連鎖不平衡にある多型マーカーから成る群より選択される。さらに別の態様において、該断片は少なくとも２０塩基対のサイズである。こうしたオリゴヌクレオチド又は核酸（例えば、オリゴヌクレオチドプライマー）は、２型糖尿病を示す多型（例えば、ＳＮＰ又はマイクロサテライト）に隣接する核酸配列の一部を使用して設計し得る。別の態様において、該キットは、２型糖尿病に関連する一つ又はそれ以上の特異的多型マーカー又はハプロタイプのアレル特異的検出が可能な一つ又はそれ以上の標識核酸、及び標識を検出するための試薬を含んでなる。適した標識には、例えば、放射性同位元素、蛍光標識、酵素標識、酵素補因子標識、磁気標識、スピン標識、エピトープラベルが含まれる。
【０１５９】
特定の態様において、本キットの試薬により検出されるべき多型マーカー又はハプロタイプは、表９〜１２に示されたマーカーから成る群より選択される一つ又はそれ以上のマーカー、二つ又はそれ以上のマーカー、三つ又はそれ以上のマーカー、四つ又はそれ以上のマーカー、五つ又はそれ以上のマーカーを含んでなる。別の態様において、検出されるべきマーカー又はハプロタイプは、表２２〜２４に示されたマーカーを含んでなる。別の態様において、検出されるべき多型マーカー又はハプロタイプは、マーカーｒｓ２４９７３０４（配列番号１６）、ｒｓ９４７５９１（配列番号３０）、ｒｓ１０８８２０９１（配列番号４）、ｒｓ７９１４８１４（配列番号２４）、ｒｓ６５８３８３０（配列番号２０）、ｒｓ２４２１９４３（配列番号１５）、ｒｓ６５８３８２６（配列番号１９）、ｒｓ７７５２９０６（配列番号３２）、ｒｓ１５６９６９９（配列番号６）、ｒｓ７７５６９９２（配列番号２１）、ｒｓ９３５０２７１（配列番号３３）、ｒｓ９３５６７４４（配列番号３４）、ｒｓ９３６８２２２（配列番号３５）、ｒｓ１０４４０８３３（配列番号３６）、ｒｓ６９３１５１４（配列番号３７）、ｒｓ１８６０３１６（配列番号１０）、ｒｓ１９８１６４７（配列番号１１）、ｒｓ１８４３６２２（配列番号９）、ｒｓ２１９１１１３（配列番号１３）及びｒｓ９８９０８８９（配列番号３１）及びそれらと連鎖不平衡にあるマーカーを含んでなる。一つのこうした態様において、連鎖不平衡は０．２より大きなｒ２により定義される。
【０１６０】
一つの好ましい態様において、本発明のマーカーを検出するためのキットは、検出されるべきＳＮＰ多型を鋳型ＤＮＡのセグメントにハイブリダイズする検出オリゴヌクレオチドプローブ、エンハンサーオリゴヌクレオチドプローブ及びエンドヌクレアーゼを含んでなる。上で説明したように、該検出オリゴヌクレオチドプローブは、蛍光成分又は基を３’末端に、及びクエンチャーをその５’末端に含んでなり、及びKutyavin et al. （Nucleic Acids Res. 34:e128 (2006)）に記載されているエンハンサーオリゴヌクレオチドが用いられている。該蛍光成分はGig Harbor Green又はYakima Yellow 又は他の適した蛍光成分であり得る。該検出プローブは、検出されるべきＳＮＰ多型を含む短い核酸配列へハイブリダイズするように設計されている。好ましくは、該ＳＮＰは末端残基から検出プローブの３’末端から６残基の間のいずれかにある。該エンハンサーは、検出プローブに関して３’のＤＮＡ鋳型へハイブリダイズする短いオリゴヌクレオチドプローブである。該プローブは、検出プローブ及びエンハンサーヌクレオチドプローブの両方が鋳型に結合された場合、両者間に単一ヌクレオチドギャップが存在するように設計されている。該ギャップは、エンドヌクレアーゼＩＶのようなエンドヌクレアーゼにより認識される合成塩基脱落部位を創造する。該酵素は、完全に相補的な検出プローブの染料を切断するが、ミスマッチを含有する検出プローブを切断できない。それ故、放出された蛍光部分の蛍光を測定することにより、検出プローブの核酸配列により規定された特定のアレルの存在の評価を実施し得る。
【０１６１】
検出プローブはどのようなサイズでもよいが、好ましくは、該プローブは比較的短い。一つの態様において、該プローブは５〜１００ヌクレオチド長である。別の態様において、該プローブは１０〜５０ヌクレオチド長である。別の態様において、該プローブは１２〜３０ヌクレオチド長である。該プローブの他の長さも可能であり、当業者の範囲内である。
【０１６２】
好ましい態様において、ＳＮＰ多型を含有する該ＤＮＡ鋳型は、検出に先立ってポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅され、そしてこうした増幅のためのプライマーは、該試薬キットに含まれている。こうした態様において、該増幅されたＤＮＡは、該検出プローブ及び該エンハンサープローブのための鋳型として働く。
【０１６３】
好ましい態様において、ＳＮＰ多型を含有する該ＤＮＡ鋳型は、検出に先立ってポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅される。こうした態様において、該増幅されたＤＮＡは、該検出プローブ及び該エンハンサープローブのための鋳型として働く。
【０１６４】
該検出プローブ、該エンハンサープローブ及び／又はＰＣＲによる鋳型の増幅に使用されたプライマーのある種の態様は、修飾Ａ及び修飾Ｇを含む修飾塩基の使用を含む。修飾塩基の使用は、鋳型ＤＮＡに対するヌクレオチド分子（プローブ及び／又はプライマー）の融点を調節するために、例えば、低パーセンテージのＧ又はＣを含有する領域の融点を上昇させるために（その相補的Ｔと三つの水素結合を形成する能力を有する修飾Ａを使用し得る）、又は高パーセンテージのＧ又はＣを含有する領域の融点を低下させるために（例えば、二本鎖ＤＮＡ分子中で、その相補的Ｃと二つの水素結合しか形成しない修飾Ｇ塩基を使用することにより）、有用であり得る。好ましい態様において、修飾塩基は、検出ヌクレオチドプローブの設計に使用される。当業者には既知のいずれの修飾塩基もこれらの方法において選択することができ、適した塩基の選択は、本明細書の教示に基づくと当業者の範囲内であり、及び当業者には公知のように既知の塩基が商業的供給源から入手可能である。
【０１６５】
こうした態様の一つにおいて、該マーカー又はハプロタイプの存在は、２型糖尿病への感受性（増加した感受性又は減少した感受性）を示す。別の態様において、該マーカー又はハプロタイプの存在は、２型糖尿病療法剤への応答を示す。別の態様において、該マーカー又はハプロタイプの存在は、個体における２型糖尿病の予後を示す。さらに別の態様において、該マーカー又はハプロタイプの存在は、２型糖尿病の治療の進行を示す。こうした治療は、手術による、投薬又は他の手段（例えば、ライフスタイル変更）による介入を含むことができる。
【０１６６】
２型糖尿病のための療法剤
現在利用可能な２型糖尿病薬物（インスリンは別として）は、６つの主なクラスの薬剤に分類される：スルホニル尿素、メグリチニド、ビグアナイド、チアゾリジンジオン、アルファ−グルコシダーゼ阻害剤及びＤＰＰ−４阻害剤と称される新規のクラスの薬剤。これらのクラスの薬剤は異なった様式で働いて血中グルコースレベルを低下させる。
１．スルホニル尿素。スルホニル尿素は膵臓のベータ細胞を刺激して、より多くのインスリンを放出させる。
２．メグリチニド。メグリチニドも膵臓のベータ細胞を刺激して、インスリンを放出させる。
３．ビグアナイド。ビグアナイドは、主として、肝臓により産生されるグルコースを減少させることにより血中グルコースレベルを低下させる。メトホルミンもグルコースを吸収できるように、インスリンにより感受性の筋肉組織を作り出すことにより、血中グルコースレベルの低下を助ける。
４．チアゾリジンジオン。これらの薬剤は、筋肉及び死亡においてインスリンがより良く働くことを助け、及び肝臓におけるグルコース産生も減少させる。
５．アルファ−グルコシダーゼ阻害剤。これらの薬剤は、腸におけるパン、ジャガイモ及びパスタのようなデンプンの分解を阻止することにより、体が血中グルコースレベルを低下させるのを助ける。これらは、テーブルシュガーのようないくつかの糖の分解も遅延させる。これらの作用は、食後の血中グルコースレベルの上昇を遅延させる。これらは食事の最初の一口の時に摂取すべきである。
６：ＤＰＰ−４阻害剤。ＤＰＰ−４阻害剤と称される新規クラスの薬物は、低血糖を起こすことなくＡＩＣを改善するのを助ける。これらは、体内に天然に存在する化合物、ＧＬＰ−１の分解を妨げることにより働く。ＧＬＰ−１は体内で血中グルコースレベルを減少させるが、非常に急速に分解され、薬剤それ自身として注射された場合、うまく働かない。ＧＬＰ−１を分解するプロセスを妨害することにより、ＤＰＰ−４阻害剤は体内でより長く活性を残存させることが可能になり、それらが上昇した場合のみ血中グルコースレベルを低下させる。
【０１６７】
これらのクラスの利用可能な薬剤は剤表１にリストされている。
【０１６８】
【表２】
2010510804.tif 000003
【０１６９】
加えて、ビグアナイド及びスルホニル尿素の併用療法が、２型糖尿病の治療に使用されてきた。
追加の２型糖尿病薬剤が剤表２にリストされている。
【０１７０】
【表３】
2010510804.tif 000004
【０１７１】
【表４】
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【０１７２】
本発明の療法剤
本発明の変異体（例えば、本明細書に記載したマーカー及び／又はハプロタイプ）は、２型糖尿病の新規療法的標的を同定するために使用し得る。例えば、２型糖尿病に関連する変異体（マーカー及び／又はハプロタイプ）、又は連鎖不平衡にある変異体を含有する遺伝子、又はそれらの産物、ならびにこれらの変異体遺伝子又はそれらの産物により直接的に又は間接的に調節されている、又はそれらと相互作用する遺伝子又はそれらの産物は、２型糖尿病を治療する、又は２型糖尿病に関連する症状の発症を予防する又は遅延するための、療法剤の開発の標的であり得る。療法剤は、一つ又はそれ以上の、例えば、小さな非タンパク質及び非核酸分子、タンパク質、ペプチド、タンパク質断片、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、ＰＮＡ（ペプチド核酸）又は標的遺伝子又はそれらの遺伝子産物の機能及び／又はレベルを変調し得るそれらの誘導体又は模倣物を含んでなることができる。
【０１７３】
本発明の核酸及び／又は変異体、又はそれらの相補的配列を含んでなる核酸は、アンチセンス構築物として使用することができ、細胞、組織又は器官中の遺伝子発現を制御する。アンチセンス技術に関連する方法論は当業者には公知であり、Antisense Drug Technology: Principles, Strategies, and Applications, Crooke, ed., Marcel Dekker Inc., New York (2001) 、に記述及び概説されている。一般に、アンチセンス分子がｍＲＮＡにハイブリダイズし、タンパク質へのｍＲＮＡの翻訳を阻止するように、アンチセンス核酸分子は、遺伝子により発現されるｍＲＮＡの領域と相補的であるように設計される。切断剤及び阻止剤を含むいくつかのクラスのアンチセンスオリゴヌクレオチドが当業者において公知である。前者は標的ＲＮＡ部位に結合し、標的ＲＮＡを切断する細胞内ヌクレアーゼ（例えば、ＲｎａｓｅＨ又はＲｎａｓｅＬ）を活性化する。阻止剤は標的ＲＮＡに結合し、リボソームの立体障害によりタンパク質翻訳を阻害する。阻止剤の例には、核酸、モルホリノ化合物、ロックト核酸及びメチルホスホン酸が含まれる（Thompson, Drug Discovery Today, 7:912-917 (2002)）。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、直接的に療法剤として有用であり、遺伝子機能を決定する及び検証するためにも（例えば、遺伝子ノックアウト又は遺伝子ノックダウン実験により）有用である。アンチセンス技術はさらに、Lavery et al., Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 6:561-569 (2003), Stephens et al., Curr. Opin. Mol. Ther. 5:118-122 (2003), Kurreck, Eur. J. Biochem. 270:1628-44 (2003), Dias et al., Mol. Cancer Ter. 1:347-55 (2002), Chen, Methods Mol. Med. 75:621-636 (2003), Wang et al., Curr. Cancer Drug Targets 1:177-96 (2001) 及びBennett, Antisense Nucleic Acid Drug.Dev. 12:215-24 (2002) 、に記述されている。
【０１７４】
本明細書に記載した変異体は、特定の変異体に特異的であるアンチセンス試薬の選択及び設計に使用し得る。本明細書に記載した変異体についての情報を使用し、本発明の一つ又は以上の変異体を含有するｍＲＮＡ分子を特異的に標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド又は他のアンチセンス分子を設計し得る。この様式において、一つ又はそれ以上の本発明の変異体（マーカー及び／又はハプロタイプ）を含有するｍＲＮＡ分子の発現を、阻害又は阻止することができる。一つの態様において、該アンチセンス分子は標的核酸の特定のアレル形（即ち、一つ又は数個の変異体（マーカー及び／又はハプロタイプ））に特異的に結合するように設計され、それによりこの特異的アレル又はハプロタイプに由来する産物の翻訳を阻害するが、標的核酸分子の特異的多型部位で他の又は代わりの変異体へは結合しない。
【０１７５】
アンチセンス分子は、遺伝子発現を阻害するために、ｍＲＮＡを不活性化するように使用することができるので、該分子は、２型糖尿病のような疾患を治療するために使用し得る。方法論は、翻訳されるべきｍＲＮＡの能力を弱める、ｍＲＮＡ中の一つ又はそれ以上の領域に相補的なヌクレオチド配列を含有するリボザイムによる切断を含み得る。こうしたｍＲＮＡ領域には、例えば、タンパク質コード領域、特に触媒活性に対応するタンパク質コード領域、基質及び／又はリガンド結合部位、又はタンパク質の他の機能性領域が含まれる。
【０１７６】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の現象は、Ｃ．エレガンスでのその最初の発見（Fire et al., Nature 391 :806-11 (1998)）以来、ここ十年間活発に研究されてきており、ヒト疾患の治療における使用可能性が活発に追求されている（Kim & Rossi,Nature Rev. Genet. 8:173-204 (2007) に概説されている）。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は遺伝子サイレンシングとも称され、特異的遺伝子をオフにするための二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）を使用することに基づいている。細胞内で、細胞性二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）は細胞性複合体により小さな干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）にプロセッシングされる。ｓｉＲＮＡは、タンパク質−ＲＮＡ複合体の標的を標的ｍＲＮＡ上の特異的部位へと導く（Thompson, Drug Discovery Today, 7:912-917 (2002)）。ｓｉＲＮＡ分子は典型的には、約２０、２１、２２又は２３ヌクレオチド長である。それ故、本発明の一つの側面は、単離された核酸分子、及びＲＮＡ干渉へのこれらの分子の使用（即ち、小さな干渉ＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）としての）に関する。一つの態様において、該単離された核酸分子は１８〜２６ヌクレオチド長、好ましくは１９〜２５ヌクレオチド長、より好ましくは２０〜２４ヌクレオチド長、及びより好ましくは２１、２２又は２３ヌクレオチド長である。
【０１７７】
ＲＮＡｉ仲介遺伝子サイレンシングの別の経路は、細胞中でプロセッシングされて前駆体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）を発生し、内因的にコードされている一次マイクロＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）転写体に由来する。これらのｍｉＲＮＡ分子は、核から細胞質へ輸送され、プロセッシングを受けて成熟ｍｉＲＮＡ分子（ｍｉＲＮＡ）を発生し、それはｍＲＮＡの３’非翻訳領域中の標的部位を認識することによる翻訳阻害及びＰボディーをプロセッシングすることによる続いてのｍＲＮＡ分解を指示する（Kim & Rossi, Nature Rev. Genet. 8:173-204 (2007) により概説されている）。
【０１７８】
ＲＮＡｉの臨床応用には、およそ２０〜２３ヌクレオチドのサイズであり、そして好ましくは２ヌクレオチドの３’オーバーラップを有する合成ｓｉＲＮＡ二重鎖の取り込みが含まれる。遺伝子発現のノックダウンは、標的ｍＲＮＡのための配列特異的設計により確立されている。こうした分子の最適化設計及び合成についてのいくつかの商業的サイトが当業者には知られている。
【０１７９】
他の応用は、より長いｓｉＲＮＡ分子（典型的には、２５〜３０ヌクレオチド長、好ましくは約２７ヌクレオチド）、ならびに小さなヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ； 典型的には約２９ヌクレオチド長）を提供する。後者は、Amarzguioui et al., (FEBS Lett. 579:5974-81 (2005)）により記載されているように、天然に発現される。化学合成ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡは、インビボプロセッシングの基質であり、いくつかの場合、より短い設計よりも強力な遺伝子サイレンシングを提供する（Kim et al., Nature Biotechnol. 23:222-226 (2005); Siolas et al., Nature Biotechnol. 23:227-231 (2005)）。一般に、ｓｉＲＮＡは、それらの細胞内濃度が続いての細胞分裂により希釈されるので、遺伝子発現の一時的サイレンシングしか提供しない。対照的に、発現されたｓｈＲＮＡは、ｓｈＲＮＡの転写が起こる限り、標的転写体の長期、安定なノックダウンを仲介する（Marques et al., Nature Biotechnol. 23:559-565 (2006); Brummelkamp et al., Science 296: 550-553 (2002)）。
【０１８０】
ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡを含むＲＮＡｉ分子は配列依存性様式で働くので、本発明の変異体（例えば、表５Ａ、５Ｂ及び５Ｃに示したマーカー、及びそれらの連鎖不平衡にあるマーカー、例えば、表４Ａ及び４Ｂに示したマーカーのヌクレオチド配列）は、特異的アレル及び／又はハプロタイプ（例えば、本発明のアレル及び／又はハプロタイプ）を含んでなる特異的核酸分子を認識するが、一方、他のアレル又はハプロタイプを含んでなる核酸分子は認識しないＲＮＡｉ試薬を設計するために使用し得る。これらのＲＮＡｉ試薬は、それ故、標的核酸分子を認識し及び破壊できる。アンチセンス試薬と同様に、ＲＮＡｉ試薬は療法剤として有用であり得るが（即ち、疾患関連遺伝子又は疾患関連遺伝子変異体をオフにする）、遺伝子機能を特徴付ける及び検証するためにも有用であることができる（例えば、遺伝子ノックアウト又は遺伝子ノックダウン実験により）。
【０１８１】
ＲＮＡｉの送達は、当業者には公知のさまざまな方法論により実行することができる。非ウイルス送達を利用する方法には、コレステロール、安定核酸−リピッド粒子（ＳＮＡＬＰ）、重鎖抗体断片（Ｆａｂ）、アプタマー及びナノ粒子が含まれる。ウイルス送達法には、レンチウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスの使用が含まれる。ｓｉＲＮＡ分子はいくつかの態様において、それらの安定性を増加させるため、化学的に修飾される。このことには、ＲＮＡｓｅ活性への耐性を提供する、２’−Ｏ−メチルプリン及び２’−フルオロピリミジンを含むリボースの２’での修飾が含まれる。他の化学的修飾が可能であり、当業者には公知である。
【０１８２】
以下の参照文献はＲＮＡｉのさらなる要約であり、ＲＮＡｉを使用する特異的遺伝子標的化の可能性である：Kim & Rossi, Nat. Rev. Genet. 8:173-184 (2007), Chen & Rajewsky, Nat. Rev. Genet. 8:93-103 (2007), Reynolds, et al., Nat. Biotechnol. 22:326-330 (2004), Chi et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 100:6343-6346 (2003), Vickers et al., J. Biol. Chem. 278:7108-7118 (2003), Agami, Curr. Opin. Chem. Biol. 6:829-834 (2002), Lavery, et al., Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 6:561- 569 (2003), Shi, Trends Genet. 19:9-12 (2003), Shuey et al., Drug Discov. Today 7:1040-46 (2002), McManus et al., Nat. Rev. Genet. 3:737-747 (2002), Xia et al., Nat. Biotechnol. 20:1006-10 (2002), Plasterk et al., Curr. Opin. Genet. Dev. 10:562-7 (2000), Bosher et al., Nat. Cell Biol. 2:E31-6 (2000), 及びHunter, Curr. Biol. 9:R440-442 (1999).
２型糖尿病を含む疾患の発生について増加した素因又はリスクを導く遺伝的欠陥、又は該疾患を起こす欠陥は、該遺伝的欠陥の部位で正常／野生型ヌクレオチド（単数又は複数）を供給する、修復配列を組み入れる核酸断片を欠陥を運んでいる対象に投与することにより永久に修正することができる。こうした部位特異的修復配列は、対象のゲノムＤＮＡの内因性修復を促進するように作用するＲＮＡ／ＤＮＡオリゴヌクレオチドを包含することができる。配列修復の投与は、ポリエチレンイミンとの複合体、陰イオン性リポソームでのカプセル化、アデノウイルスベクターのようなウイルスベクター、又は投与された核酸の細胞内取り込みを促進するために適した他の医薬組成物のような適切なビヒクルにより実施することができる。キメラオリゴヌクレオチドが対象のゲノム内への正常配列の組み入れを誘導し、正常／野生型遺伝子産物の発現を導くので、遺伝的欠陥を克服することができる。置き換えが伝搬され、それ故、恒久的修復及び疾患又は状態に関連する症状の緩和を与える。
【０１８３】
本発明は、２型糖尿病を治療するために使用できる化合物又は剤を同定する方法を提供する。それ故、本発明の変異体は療法剤の同定及び／又は開発のための標的として有用である。こうした方法は、本発明の少なくとも一つの変異体（マーカー及び／又はハプロタイプ）を含む核酸、又は核酸がコードする産物の活性及び／又は発現を変調する剤又は化合物の能力をアッセイすることを含むことができる。このことは順に、コードされた核酸産物の望まれない活性又は発現を阻害する又は改変する剤又は化合物を同定するために使用し得る。こうした実験を実施するためのアッセイは、当業者には公知のように、細胞に基づいたシステム又は無細胞システムで実施し得る。細胞に基づいたシステムには、問題とする核酸分子を天然に発現している細胞、又はある種の所望の核酸分子を発現するように遺伝子修飾されている組換え細胞が含まれる。
【０１８４】
患者における変異体遺伝子発現は、変異体含有核酸配列（例えば、少なくとも一つの本発明の変異体を含有する遺伝子、それは少なくとも一つの変異体を含有するＲＮＡに転写することができ、順にタンパク質に翻訳される）の発現により、又は正常転写体の発現のレベル又はパターンに影響する変異体（例えば、遺伝子の調節又は制御領域中の変異体）のため、正常／野生型核酸配列の発現の変化により評価し得る。遺伝子発現についてのアッセイには、直接核酸アッセイ（ｍＲＮＡ）、発現されたタンパク質レベルについてのアッセイ、又は経路、例えば、シグナル経路に関与する傍系化合物のアッセイが含まれる。さらに、シグナル経路に応答して上方又は下方制御される遺伝子の発現もアッセイし得る。一つの態様は、問題とする遺伝子（単数又は複数）の調節領域に動作可能なように連結された、ルシフェラーゼのようなレポーター遺伝子を含む。
【０１８５】
遺伝子発現の変調剤は、一つの態様において、細胞を候補化合物又は剤と接触させ、そしてｍＲＮＡの発現が決定された時に同定し得る。候補化合物又は剤の存在下でのｍＲＮＡの発現レベルが、該化合物又は剤の不存在下での発現レベルと比較される。この比較に基づき、２型糖尿病を治療するための候補化合物又は剤を、該変異体遺伝子の遺伝子発現を変調するものとして同定し得る。ｍＲＮＡ又はコードされたタンパク質の発現が、候補化合物又は剤の存在下でその不存在下よりも統計的に有意に高い場合、該候補化合物又は剤は該核酸の発現の刺激剤又は上方調節剤として同定される。核酸発現又はタンパク質レベルが、候補化合物又は剤の存在下でその不存在下よりも統計的に有意に低い場合、該候補化合物は該核酸発現の抑制剤又は下方調節剤として同定される。
【０１８６】
本発明はさらに、遺伝子変調剤（即ち、遺伝子発現の刺激剤及び／又は抑制剤）の薬剤（化合物又は剤）スクリーニングを介して同定された化合物を使用する治療の方法も提供する。
【０１８７】
本発明のさらなる側面において、医薬パック（キット）が提供され、該パックは療法剤、及び本明細書に記載した本発明の一つ又はそれ以上の変異体について診断的に試験されるヒトへの療法剤の投与に関する説明書のセットを含んでなる。該療法剤は、低分子薬剤、抗体、ペプチド、アンチセンス又はＲＮＡｉ分子、又は他の療法的分子であり得る。一つの態様において、本発明の少なくとも一つの変異体のキャリアと同定された個体は、該療法剤の処方された用量を服用するように指示される。一つのこうした態様において、本発明の少なくとも一つの変異体のホモ接合性キャリアと同定された個体は、該療法剤の処方された用量を服用するように指示される。別の態様において、本発明の少なくとも一つの変異体の非キャリアと同定された個体は、該療法剤の処方された用量を服用するように指示される。
【０１８８】
療法剤への応答の可能性を評価する方法、治療の進行をモニタリングする方法、及び治療の方法
当該技術分野で既知であるように、個体は特定の療法（例えば、療法剤又は治療法）に対して異なった応答を有し得る。薬理ゲノミクスは、薬剤の体内動態の変化及び／又は異常な又は変化した薬剤の作用のため、どのように遺伝子変異体（例えば、本発明の変異体（マーカー及び／又はハプロタイプ））が薬剤応答に影響するかの問題について取り組んだ。そのため、異なった応答の基礎が一部遺伝学的に決定された。薬剤応答に影響する遺伝子変異体による臨床的結果は、ある種の個体（例えば、遺伝子変異体のキャリア又は非キャリア）において薬剤の毒性、又は薬剤の治療不全を生じてもよい。それ故、本発明の変異体は、療法剤及び／又は方法が体に作用する様式、又は体が療法剤を代謝する経路を決定することができる。
【０１８９】
従って、一つの態様において、多型部位又はハプロタイプでの特定のアレルの存在は、特定の治療モダリティー（modality）に対して異なった応答、例えば、異なった奏功率を示す。このことは、２型糖尿病と診断され、及び本発明の多型又はハプロタイプにある種のアレル（例えば、アットリスク及び保護的アレル及び／又は発明のハプロタイプ）を運んでいる患者は、２型糖尿病を治療するために使用された特定の療法、薬剤及び／又は他の療法により良好に、又はより悪く応答するであろう。それ故、該アレル又はハプロタイプマーカーの存在又は不存在は、該患者に対してどのような治療を使用すべきかの決定において助けとなることができる。例えば、新規に診断された患者に対して、本発明のマーカー又はハプロタイプの存在を評価することができる（例えば、本明細書に記載したように、血液サンプルに由来するＤＮＡを試験することを介して）。もし患者がマーカーアレル又はハプロタイプについて陽性であれば（即ち、マーカーの少なくとも一つの特異的アレル又はハプロタイプが存在）、医者は一つの特定の療法を推奨し、一方、もし患者がマーカーの少なくとも一つのアレルについて陰性であれば、療法の異なったコースが推奨される（疾患の進行について連続的にモニターすること以外は、即時の療法を実施することは推奨しないことを含むことができる）。それ故、患者のキャリア状態を、特定の治療モダリティーを与えるべきかどうかを決定するのを助けるために使用できる。最も適切な治療を選択するために早期段階で疾患を診断することが可能であること、及び最も適切な治療を適用することが可能なように疾患の予後／進行性度について臨床医に情報を提供する可能性にも意義がある。
【０１９０】
いくつかの態様において、該治療モダリティーは、剤表１及び剤表２に示した療法剤の少なくとも一つを投与することを含んでなる。一つの態様において、療法剤はビグアナイド、チアゾリジンジオン、スルホニル尿素、メグリチニド、アルファ−グルコシダーゼ阻害剤及びＤＰＰ−４阻害剤から選択される。一つの態様において、ビグアナイドはメトホルミン又はメトホルミン＋グリブニドである。チアゾリジンジオンとの組み合わせを含む、メトホルミンを含んでなる他の併用療法も、本発明の範囲内で企図される。別の態様において、スルホニル尿素はアセトヘキサミド、クロロプロパミド、グリクラジド、ジアマイクロン、グリメプリド、グリピジド、グリブリド、トラザミド及びトルブタミドから選択される。別の態様において、チアゾリジンジオンはピオグリタゾン、ロシグリタゾン及びミトグリタゾン又は他のチアゾリジンジオン誘導体から選択される。別の態様において、療法剤は剤表２に示した剤から選択される。
【０１９１】
本発明は、２型糖尿病についての治療の進行又は有効性をモニタリングする方法にも関する。このことは本発明のマーカー及び／ハプロタイプの遺伝子型及び／又はハプロタイプ状態に基づいて、即ち、本明細書に記載した少なくとも一つの多型マーカーの少なくとも一つのアレルの存在又は不存在を評価することにより、又は本発明の変異体（マーカー及び／ハプロタイプ）に関連している遺伝子の発現をモニタリングすることにより行い得る。リスク遺伝子ｍＲＮＡ又はコードされたポリペプチドは、組織サンプル（例えば、末梢血液サンプル又は生検サンプル）で測定し得る。発現レベル及び／又はｍＲＮＡレベルは、それ故、その有効性をモニターするため、治療前及び治療間に決定される。もしくは、又は同時に 、本明細書で示された、２型糖尿病についての少なくとも一つのリスク変異体の遺伝子型及び／又はハプロタイプ状態が、その有効性をモニターするため、治療前及び治療間に決定される。もしくは、本発明のマーカー及び／ハプロタイプに関連する生物学的ネットワーク又は代謝経路を、ｍＲＮＡ及び／又はポリペプチドを決定することによりモニターし得る。このことは、例えば、治療前及び治療間に採取されたサンプル中の、該ネットワーク又は経路に属しているいくつかの遺伝子の発現レベル又はポリペプチドをモニターすることにより行い得る。もしくは、治療前及び治療間に、生物学的ネットワーク又は代謝経路に属している代謝産物を決定し得る。治療の有効性は、治療の間に観察された発現レベル／代謝レベルの変化を、健常対象からの対応するデータと比較することにより決定される。
【０１９２】
２型糖尿病の増加した感受性又はリスクに関連していることが観察された少なくとも一つのマーカーの少なくとも一つのアットリスクアレルを運んでいる個体における療法の進行は、それ故、該個体の遺伝子型状態に基づいてモニターされる。本明細書に記載したアットリスク変異体を運んでいる個体は、非キャリアよりも療法進行のより綿密な又はより高頻度なモニタリングにより、又は上記のような、特定の治療モダリティー又は投与されている療法剤と組み合わせることにより恩恵を受けることができる。
【０１９３】
さらなる側面において、本発明のマーカーは、臨床試行の能力及び有効性を増加させるために使用し得る。それ故、本発明の少なくとも一つのアットリスク変異体のキャリアである個体、即ち、２型糖尿病を発生する増加したリスクを与える少なくとも一つの多型マーカーの少なくとも一つのアレルのキャリアである個体は、特定の治療モダリティーにより応答し易いようである。一つの態様において、特定の治療（例えば、低分子薬剤）が標的としている、経路及び／又は代謝ネットワーク中の遺伝子（単数又は複数）のアットリスク変異体を運んでいる個体は、該治療のレスポンダーである可能性が高い。別の態様において、一つの遺伝子のアットリスク変異体を運んでいる個体（発現及び機能がアットリスク変異体により変化している）は、該遺伝子、その発現又はその遺伝子産物を標的とする治療モダリティーのレスポンダーである可能性が高い。この応用は、臨床試行の安全性を改善し得るが、臨床試行が統計的に有意な効力を示すであろう機会を高めることもでき、それはある種の集団の副群（例えば、本明細書に記載したアットリスク変異体のキャリアか又は非キャリアである個体）に限定されるであろう。それ故、こうした試行の起こり得る結果は、ある種の遺伝子変異体（例えば、本発明のマーカー及び／ハプロタイプ）のキャリアは、該療法剤に正の応答を統計的に有意に示し易い、即ち、処方された療法剤又は薬剤を服用した場合、２型糖尿病に関連する症状の緩和を経験することである。
【０１９４】
さらなる側面において、本発明のマーカー及び／ハプロタイプは、特定の個体のための医薬品の選択を目標に使用し得る。治療モダリティーの個別化選択、ライフスタイル変化又は二つの組み合わせは、本発明のアットリスク変異体の利用により実現し得る。それ故、本発明の特定のマーカーについての個体の状態は、本発明のアットリスク変異体により影響される標的遺伝子又は遺伝子産物を標的とする治療オプションの選択に有用であり得る。変異体のある種の組み合わせは、治療オプションの一つの選択に適していることができ、一方、他の遺伝子変異体の組み合わせは、他の治療オプションを目的とすることができる。こうした変異体の組み合わせは、臨床的に信頼できる正確さで治療モジュールの選択を決定するのに必要とされる場合、一つの変異体、二つの変異体、三つの変異体、又は  四つ又はそれ以上の変異体を含むことができる。
【０１９５】
本発明の変異体の診断的及び療法的使用に加えて、該変異体（マーカー及び／ハプロタイプ）は人物同定に有用なマーカーでもあり、そのため法医学、親子鑑定及びバイオメトリクスにおいても有用である。法医学目的のためのＳＮＰの具体的使用は、Gill (Int. J. Legal Med. 114:204-10 (2001) ）により概説されている。個体間のゲノムＤＮＡ中の遺伝子変異は、個体を同定するため及び生物学的サンプルと個体を結びつけるための遺伝子マーカーとして使用し得る。ＳＮＰ及びマイクロサテライトを含む遺伝子マーカーは、個体を識別するために有用であり得る。より多くのマーカーが分析されると、いずれかの所与の個体中のマーカーのアレル組み合わせが無関連個体と同一である可能性を低くする（マーカーは相関していないこと、即ち、該マーカーは完全連鎖平衡にあることを仮定して）。それ故、好ましいマーカーは、本発明のマーカーのような利用可能なマーカーより選択することができ、選択されたマーカーは、異なった染色体上のマーカーを含む、ヒトゲノム中の異なった領域からのマーカーを含んでなることができる。
【０１９６】
ある種の応用において、法医学試験に有用なＳＮＰは縮重コドン位置からのものである（即ち、ＳＮＰの変異がコドンによりコードされているアミノ酸に影響しないように、ある種のコドンの三番目の位置）。人種、祖先又は物理的特色を含む表現型特徴を予想するための応用のような他の応用において、コードされたタンパク質のアミノ酸配列に影響するＳＮＰを利用するのがより有用であり及び望ましいであろう。他のこうした態様において、該変異体（ＳＮＰ又は他の多型マーカー）は近隣の遺伝子の発現レベルに影響し、それ故、変化したタンパク質発現を導く。
【０１９７】
本発明は、２型糖尿病に関連すると本明細書に記載された多型マーカー及びハプロタイプのコンピューター実行応用にも関する。こうした応用は、本発明の方法に有用な遺伝子型データを保存する、操作する又はさもなくば解析するために有用であり得る。一つの例は、第三者（例えば、個人）に遺伝子型情報を提供することが可能なように、又は、例えば、２型糖尿病への増加した感受性に寄与する遺伝的リスク因子についての情報と遺伝子型データを比較することにより遺伝子型データから情報を引き出すため、及びこうした比較に基づいた結果を報告するために、可読媒体上に個体に由来する遺伝子型情報を保存することに関する。
【０１９８】
一つのこうした側面はコンピューター可読媒体である。一般用語において、こうした媒体は、（ｉ）少なくとも一つの多型マーカーのための識別子；（ｉｉ）２型糖尿病と診断された個体における、前記少なくとも一つのマーカーの少なくとも一つのアレルの頻度又はアレルの頻度の指標；及び、参照集団における、前記少なくとも一つのマーカーの少なくとも一つのアレルの頻度又はハプロタイプの頻度の指標；を保存する容量を有する。該参照集団は母集団からのランダムサンプルである。もしくは、該参照集団は一般集団からのランダムサンプルであり、それ故、全体の集団を代表する。頻度指標は、計算された頻度、アレル及び／又はハプロタイプコピーの総数、又は特定の媒体に適している実際の頻度の規格化された又はさもなくば操作された値であることができる。
【０１９９】
祖先情報、性、身体属性又は特性（身長及び体重を含む）、生化学的測定値（血圧、血中脂質レベル、空腹時グルコースレベル、インスリン応答測定のような）についての情報、又は特定の個体の遺伝子型状態に関係する保存する又は操作することが望まれるその他の有用な情報のような、個体についての追加の情報は該媒体に保存し得る、
本発明はさらに、ヒト個体における２型糖尿病への感受性を決定するために有用な遺伝子型データの決定又は操作に適している装置に関する。こうした装置は、コンピューター可読メモリー、コンピューター可読メモリーに保存されたデータを操作するためのルーチン、遺伝子データの尺度を含むアウトプットを発生するためのルーチンを含み得る。こうした尺度は、アレル又はハプロタイプ頻度、遺伝子型数、性、年齢、表現型情報、オッズ比（ＯＲ）又は相対リスク（ＲＲ）についての値、集団寄与リスク（ＰＡＲ）、本来の遺伝子型データの直接統計値、又は遺伝子データに基づいた計算に基づいているその他の有用な情報のような値を含み得る。
【０２００】
上記の応用は２型糖尿病への感受性を評価する方法に関してより詳細に記述されてきた本発明のマーカー及びハプロタイプですべて実施し得る。それ故、これらの応用は一般に、表１〜６にリストしたマーカー、及びそれらと連鎖不平衡にあるマーカー、例えば、表２２、２３及び２４に示したマーカーを使用して実施に移し得る。一つの態様において、該マーカー又はハプロタイプは、その配列が配列番号１、配列番号２又は配列番号３に示されているゲノムセグメント内に存在する。別の態様において、該マーカー及びハプロタイプは、ｒｓ２４９７３０４（配列番号１６）、ｒｓ９４７５９１（配列番号３０）、ｒｓ１０８８２０９１（配列番号４）、ｒｓ７９１４８１４（配列番号２４）、ｒｓ６５８３８３０（配列番号２０）、ｒｓ２４２１９４３（配列番号１５）、ｒｓ６５８３８２６（配列番号１９）、ｒｓ７７５２９０６（配列番号３２）、ｒｓ１５６９６９９（配列番号６）、ｒｓ７７５６９９２（配列番号２１）、ｒｓ９３５０２７１（配列番号３３）、ｒｓ９３５６７４４（配列番号３４）、ｒｓ９３６８２２２（配列番号３５）、ｒｓ１０４４０８３３（配列番号３６）、ｒｓ６９３１５１４（配列番号３７）、ｒｓ１８６０３１６（配列番号１０）、ｒｓ１９８１６４７（配列番号１１）、ｒｓ１８４３６２２（配列番号９）、ｒｓ２１９１１１３（配列番号１３）及びｒｓ９８９０８８９（配列番号３１）から選択される少なくとも一つのマーカーを含んでなり、それらと連鎖不平衡にあるマーカーを含んでもよく、連鎖不平衡は０．２より大きなｒ２の数値により定義される。別の態様において、該マーカー又はハプロタイプは、ｒｓ２４９７３０４アレルＡ、ｒｓ９４７５９１アレルＡ、ｒｓ１０８８２０９１アレルＣ、ｒｓ７９１４８１４アレルＴ、ｒｓ６５８３８３０アレルＡ、ｒｓ２４２１９４３アレルＧ、ｒｓ６５８３８２６アレルＧ、ｒｓ７７５２９０６アレルＡ、ｒｓ１５６９６９９アレルＣ、ｒｓ７７５６９９２アレルＧ、ｒｓ９３５０２７１アレルＡ、ｒｓ９３５６７４４アレルＣ、ｒｓ９３６８２２２  アレルＡ、ｒｓ１０４４０８３３アレルＡ、ｒｓ６９３１５１４アレルＧ、ｒｓ１８６０３１６アレルＡ、ｒｓ１９８１６４７アレルＣ、ｒｓ１８４３６２２アレルＴ、ｒｓ２１９１１１３アレルＡ及びｒｓ９８９０８８９アレルＡから選択される少なくとも一つのマーカーを含んでなる。さらに別の態様において、該少なくとも一つのマーカー又はハプロタイプは、表２２、２３及び２４に示したマーカーより選択される少なくとも一つのマーカーを含んでなる。
【０２０１】
核酸及びポリペプチド
本明細書に記載した核酸及びポリペプチドは、２型糖尿病への感受性の診断法、ならびにこうした診断に有用なキットで使用し得る。
【０２０２】
本明細書で使用される「単離された」核酸分子とは、通常は遺伝子又はヌクレオチド配列が隣接する核酸（ゲノム配列のように）から分離された及び／又は他の転写された配列から完全に又は部分的に精製された（例えば、ＲＮＡライブラリー中のように）ものである。例えば、本発明の単離された核酸は、それが自然に生じる複雑な細胞環境、又は組換え技術により産生された場合の培養培地、又は化学的に合成された場合の化学前駆体又は他の化学薬品に関して実質的に単離し得る。いくつかの例において、単離された物質は組成物（例えば、他の物質を含む粗抽出物）、緩衝液系又は試薬混合物の一部を形成するであろう。他の状況下では、該物質は、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）又はカラムクロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ）により決定されるように、本質的に均一にまで精製し得る。本発明の単離された核酸分子は、存在するすべての巨大分子の少なくとも約５０％、少なくとも約８０％又は少なくとも約９０％（モルに基づいて）含まれている。ゲノムＤＮＡに関しては、用語「単離された」は、ゲノムＤＮＡが天然に付随していた染色体から分離された核酸分子を指す。例えば、単離された核酸分子は、該核酸分子が由来した細胞のゲノムＤＮＡ中の該核酸分子に隣接する、約２５０ｋｂ、２００ｋｂ、１５０ｋｂ、１００ｋｂ、７５ｋｂ、５０ｋｂ、２５ｋｂ、１０ｋｂ、５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ又は０．１ｋｂ未満のヌクレオチドを含み得る。
【０２０３】
該核酸分子は、他のコード又は調節配列と融合することが可能であり、それでも単離されたと考えられる。それ故、ベクター中に含まれている組換えＤＮＡは、本明細書で使用した「単離された」の定義に含まれる。また、単離された核酸分子には、異種宿主細胞又は異種生物体中の組換えＤＮＡ分子、ならびに溶液中の部分的に又は実質的に精製されたＤＮＡ分子も含まれる。「単離された」核酸分子は本発明のＤＮＡ分子のインビボ又はインビトロＲＮＡ転写体も包含する。単離された核酸分子又はヌクレオチド配列は、化学的に合成された又は組換え手段による核酸分子又はヌクレオチド配列を含み得る。こうした単離されたヌクレオチド配列は、例えば、コードされたポリペプチドの製造における、相同的配列（例えば、他の哺乳類種からの）を単離するためのプローブとして、遺伝子地図作製のために（例えば、染色体とのインサイツハイブリダイゼーションによる）、又はノーザンブロット分析又は他のハイブリダイゼーション技術によるような組織中の（例えば、ヒト組織）遺伝子発現を検出するために有用である。
【０２０４】
本発明は、本明細書に記載したヌクレオチド配列に、選択的ハイブリダイゼーションのためのような高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸分子にも関する（例えば、本明細書に記載したハプロタイプに関連する多型を含有するヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする核酸分子）。一つの態様において、本発明はＬＤブロックＣ０６（配列番号１）、ＬＤブロックＣ１０（配列番号２；例えば、ＩＤＥ、ＫＩＦ１１及び／又はＨＨＥＸ遺伝子をコードするヌクレオチド配列）及びＬＤブロックＣ１７（配列番号３）又はＣＤＫＡＬ１遺伝子又はそれらの断片（又はＬＤブロックＣ０６（配列番号１）、ＬＤブロックＣ１０（配列番号２；ＩＤＥ、ＫＩＦ１１及び／又はＨＨＥＸ遺伝子をコードするヌクレオチド配列）及びＬＤブロックＣ１７（配列番号３）又はＣＤＫＡＬ１遺伝子又はそれらの断片のヌクレオチド配列の相補体を含んでなるヌクレオチド配列）、該ヌクレオチド配列はハプロタイプ（例えば、本明細書に記載したハプロタイプ）中に含有される少なくとも一つの多型アレルを含んでなる、のヌクレオチド配列を含んでなるヌクレオチド配列に高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション及び洗浄条件下（例えば、選択的ハイブリダイゼーション）でハイブリダイズする変異体を含む。
【０２０５】
こうした核酸分子はアレル又は配列特異的ハイブリダイゼーションにより検出及び／又は単離し得る（例えば、高ストリンジェンシー条件下）。核酸ハイブリダイゼーションのためのストリンジェンシー条件及び方法は、その全教示が本明細書において援用される、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. et al, John Wiley & Sons, (1998)、及びKraus, M. and Aaronson, S., Methods Enzymol., 200:546-556 (1991)のページ2.10.1-2.10.16 及びページ6.3.1-6.3.6 に説明されている。
【０２０６】
二つのヌクレオチド又はアミノ酸配列のパーセント同一性は、最適比較目的のために配列をアラインすることにより決定し得る（例えば、ギャップを第一の配列中に導入し得る）。対応する位置でのヌクレオチド又はアミノ酸を次ぎに比較し、二つの配列間のパーセント同一性は、配列により共有されている同一位置の数の関数である（即ち、％同一性＝同一位置の数／位置の総数ｘ１００）。ある態様において、比較目的のためにアラインされた配列の長さは、基準配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％である。二つの配列の正確な比較は、例えば、数学的アルゴリズムを使用する公知の方法により達成し得る。こうした数学的アルゴリズムの非制限例は、Karlin, S. and Altschul, S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877 (1993) に記載されている。Altschul, S. et al, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1997) に記載されているように、こうしたアルゴリズムはＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを使用し得る。ncbi.nlm.nih.gov. のワ−ルドワイドウェブ上のウェブサイトを参照されたい。一つの態様において、配列比較のためのパラメーターは、スコア＝１００、ワードレングス＝１２に設定することができるが、あるいは変化させることも可能である（例えば、Ｗ＝５又はＷ＝２０）。
【０２０７】
他の例には、Myers and Miller, CABIOS (1989)、のアルゴリズム、Torellis, A. and Robotti, C1 Comput. Appl. Biosci. 10:3-5 (1994) に記載されているＡＤＶＡＮＣＥ及びＡＤＡＭ；及びPearson, W. and Lipman, D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444-48 (1988) に記載されているＦＡＳＴＡが含まれる。別の態様において、二つのアミノ酸配列間のパーセント同一性はＧＣＧソフトウェアパッケージ（Accelrys, Cambridge, UK）中のＧＡＰプログラムを使用して達成し得る。
【０２０８】
本発明は、ＬＤブロックＣ０６（配列番号１）、ＬＤブロックＣ１０（配列番号２；例えば、ＩＤＥ、ＫＩＦ１１及び／又はＨＨＥＸ遺伝子をコードするヌクレオチド配列）及びＬＤブロックＣ１７（配列番号３）又はＣＤＫＡＬ１遺伝子又はそれらの断片（又はＬＤブロックＣ０６（配列番号１）、ＬＤブロックＣ１０（配列番号２；例えば、ＩＤＥ、ＫＩＦ１１及び／又はＨＨＥＸ遺伝子をコードするヌクレオチド配列）及びＬＤブロックＣ１７（配列番号３）又はＣＤＫＡＬ１遺伝子、又はそれらの断片のヌクレオチド配列の相補体を含んでなる、から成るヌクレオチド配列）、ここで該ヌクレオチド配列はハプロタイプ（例えば、本明細書に記載したハプロタイプ）中に含有される少なくとも一つの多型アレルを含んでなる、を含んでなる、又はから成る核酸に、高ストリンジェント条件下、ハイブリダイズする断片又は一部を含有する、単離された核酸分子も提供する。本発明の核酸断片は、少なくとも約１５、少なくとも約１８、２０、２３又は２５ヌクレオチドであり、３０、４０、５０、１００、２００、５００、１０００、１０,０００又はそれ以上のヌクレオチド長でもあり得る。
【０２０９】
本発明の核酸断片は、本明細書に記載したアッセイにおいてプローブ又はプライマーとして使用される。「プローブ」又は「プライマー」は、核酸分子の相補鎖に塩基特異的様式でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。ＤＮＡ及びＲＮＡに加え、こうしたプローブ及びプライマーには、Nielsen, P. et al, Science 254:1497-1500(1991) に記載されているポリペプチド核酸（ＰＮＡ）が含まれる。プローブ又はプライマーは、核酸分子の少なくとも約１５、典型的には約２０〜２５、及びある態様において約４０、５０又は７５の連続したヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含んでなる。一つの態様において、該プローブ又はプライマーは、本明細書に記載した少なくとも一つの多型マーカーの少なくとも一つのアレル又は少なくとも一つのハプロタイプ、又はそれらの相補体を含んでなる。特定の態様において、プローブ又はプライマーは、１００又はより少ないヌクレオチド；例えば、ある態様において６〜５０ヌクレオチド、又は、例えば、１２〜３０ヌクレオチドを含み得る。他の態様において、該プローブ又はプライマーは、該連続したヌクレオチド配列と、又は該連続したヌクレオチド配列の相補体と少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一又は少なくとも９５％同一である。別の態様において、該プローブ又はプライマーは、該連続したヌクレオチド配列に、又は該連続したヌクレオチド配列の相補体に選択的にハイブリダイズすることが可能である。しばしば、該プローブ又はプライマーはさらに、標識、例えば、ラジオアイソトープ、蛍光標識、酵素標識、酵素補因子標識、磁気標識、スピン標識、エピトープ標識を含んでなる。
【０２１０】
上記の本発明の核酸分子は、当業者には公知の標準分子生物学技術を使用して同定する及び単離することができる。増幅されたＤＮＡは標識することができ（例えば、放射性標識）、ヒト細胞から誘導されるｃＤＮＡをスクリーニングするためのプローブとして使用する。ｃＤＮＡはｍＲＮＡから誘導することができ、適したベクターに含ませることができる。対応するクローンを単離することが可能であり、ＤＮＡはインビボ切り出しに続いて得ることが可能であり、そしてクローン化した挿入物は当該技術分野で認識されている方法で片方又は両方の向きで配列決定できて、適切な分子量のポリペプチドをコードする正しい読み取り枠を同定する。これら又は類似の方法を使用し、ポリペプチド及びポリペプチドをコードするＤＮＡを単離する、配列決定する及びさらに特徴付け得る。
【０２１１】
一般に、本発明の単離された核酸配列は、サザンゲル上の分子量マーカーとして、及び関連する遺伝子位置を地図作製するために標識された染色体マーカーとして使用し得る。該核酸配列は２型糖尿病又は２型糖尿病への感受性を同定するため、患者の内在性ＤＮＡ配列と比較するため、及び関連ＤＮＡ配列をハイブリダイズする及び発見するための、又はサンプルから既知の配列を差し引くための（例えば、サブトラクティブハイブリダイゼーション）プローブとしても使用し得る。該核酸配列はさらに、遺伝子フィンガープリンティングのためにプライマーを誘導するため、免疫化技術を使用する抗ポリペプチド抗体を上昇させるため、及び／又は抗ＤＮＡ抗体を上昇させる又は免疫応答を惹起するために使用し得る。
【０２１２】
抗体
遺伝子産物の一つの形態に特異的に結合するが、遺伝子産物の他の形態には結合しないポリクローナル抗体及び／又はモノクローナル抗体も提供される。変異体又は多型部位（単数又は複数）を含有する基準遺伝子産物の一部を結合する抗体も提供される。本明細書で使用する用語「抗体」は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、即ち、抗原を特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子を指す。本発明のポリペプチドに特異的に結合する分子は、そのポリペプチド又はそれらの断片に結合するが、サンプル、例えば、天然に該ポリペプチドを含有する生物学的サンプル中の他の分子には実質的に結合しない分子である。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の例には、該抗体をペプシンのような酵素で処理することにより発生し得る、Ｆ（ａｂ）及びＦ（ａｂ’）２断片が含まれる。本発明は、本発明のポリペプチドに結合するポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を提供する。本明細書で使用する用語「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」は、本発明のポリペプチドの特定のエピトープと免疫反応することが可能である抗原結合部位のただ一つの種を含有する、抗体分子の集団を指す。モノクローナル抗体組成物は、それ故典型的には、それが免疫反応する本発明の特定のポリペプチドに対する単一の結合親和性を示す。
【０２１３】
ポリクローナル抗体は、所望の免疫原、例えば、本発明のポリペプチド又はそれらの断片で、適した対象を免疫化することにより、上記のように調製し得る。免疫化対象中の抗体力価は、固定化ポリペプチドを使用する、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）のような標準技術により、時間を通してモニターし得る。もし望むなら、該ポリペプチドに対して方向付けられた抗体分子を、哺乳動物から（例えば、血液から）単離することが可能であり、そしてプロテインＡクロマトグラフィーのような公知の技術によりさらに精製できて、ＩｇＧ分画を得る。免疫化後の適切な時点で（例えば、抗体力価が最も高い時）、対象から抗体産生細胞を得ることが可能であり、Kohler and Milstein, Nature 256:495-497 (1975) により最初に記載されたハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor et al, Immunol. Today 4: 72 (1983))、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術 (Cole et al., Monoclonal Antibodys and Cancer Therapy, Alan R. Liss,1985, Inc., pp. 77-96) 及びトリオーマ技術のような標準的技術によりモノクローナル抗体を調製するために使用する。ハイブリドーマを産生するテクノロジーは公知である（一般的には、Current Protocols in Immunology (1994) Coligan et al (eds.) John Wiley & Sons, Inc., New York, NY を参照されたい）。簡潔には、不死細胞株（典型的には骨髄腫）を、上記のように免疫原で免疫した哺乳動物からのリンパ球（典型的には脾細胞）と融合させ、生じたハイブリドーマ細胞の培養上清を、本発明のポリペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定するためにスクリーニングする。
【０２１４】
リンパ球及び不死細胞株を融合させるために使用される多くの公知のプロトコールのいずれもが、本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体を発生させる目的に応用し得る（例えば、Current Protocols in Immunology, 上記文献; Galfre et al., Nature 266:55052 (1977); R.H. Kenneth, Monoclonal Antibodies : A New Dimension In Biological Analyses 中, Plenum Publishing Corp., New York, New York (1980); 及び Lerner, YaIe J. Biol. Med. 54:387-402 (1981) を参照されたい）。さらに、当業者は、有用であろう、こうした方法の多くの変形があることを理解するであろう。
【０２１５】
モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマを調製する代案として、本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体は、該ポリペプチドを結合する免疫グロブリンライブラリーメンバーを単離するために該ポリペプチドで組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー（例えば、抗体ファージディスプレイライブラリー）をスクリーニングすることにより同定する又は単離することが可能である。ファージディスプレイライブラリーを発生する及びスクリーニングするためのキットは商業的に入手可能である（例えば、Pharmacia Recombinant Phage  Antibody System, カタログ番号27-9400-01 ；及びStratagene SurfZAP（商標） Phage Display Kit, カタログ番号240612 ）。加えて、抗体ファージディスプレイライブラリーを発生する及びスクリーニングするために特に受け入れられる方法及び試薬の例は、例えば、米国特許第5,223,409号；ＰＣＴ公開番号WO92/18619；ＰＣＴ公開番号WO91/17271；ＰＣＴ公開番号WO92/20791；ＰＣＴ公開番号WO92/15679；ＰＣＴ公開番号WO93/01288；ＰＣＴ公開番号WO92/01047；ＰＣＴ公開番号WO92/09690；ＰＣＴ公開番号WO90/02809; Fuchs et al., Bio/Technology 9:1370-1372 (1991); Hay et al., Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85 (1992); Huse et al., Science 246: 1275-1281 (1989); 及び Griffiths et al, EMBO J. 12:725-734 (1993) に見ることができる。
【０２１６】
加えて、キメラ及びヒト化モノクローナル抗体のような組換え抗体は、ヒト及び非ヒト部分を含んでなり、標準組換えＤＮＡ技術を使用して作製でき、本発明の範囲内である。こうしたキメラ及びヒト化モノクローナル抗体は、当該技術分野では既知の組換えＤＮＡ技術により製造し得る。
【０２１７】
一般に、抗体（例えば、モノクローナル抗体）は、アフィニティークロマトグラフィー又は免疫沈降のような標準技術による本発明のポリペプチドの単離に使用し得る。ポリペプチド特異的抗体は、細胞からの天然のポリペプチドの、又は宿主細胞中で発現された組換え的に産生されたポリペプチドの精製を容易にすることができる。さらに、本発明のポリペプチドに特異的な抗体は、該ポリペプチドの発現の存在量及びパターンを評価するため、該ポリペプチド（例えば、細胞溶解物、細胞上清又は組織サンプル中の）を検出することに使用し得る。抗体は、臨床試験法の一部として、例えば、所与の治療計画の効力を決定するために組織中のタンパク質レベルをモニターするように、診断的に使用し得る。該抗体はその検出を容易にするため、検出可能な物質に結合させることができる。検出可能な物質の例には、多様な酵素、補欠分子族、蛍光物質、化学発光物質、生物化学発光物質及び放射性物質が含まれる。適した酵素の例には、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ又はアセチルコリンエステラーゼが含まれ、適した補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンが含まれ；適した蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル又はフィコエリトリン；適した化学発光物質の例にはルミノールが含まれ；生物化学発光物質の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリンが含まれ、及び適した放射性物質の例には１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ又は３Ｈが含まれる。
【０２１８】
抗体は、薬理ゲノミクスの解析においても有用であることができる。こうした態様において、本発明の少なくとも一つの多型マーカーを含有する核酸によりコードされている変異体タンパク質のような、本明細書に記載した核酸によりコードされている変異体タンパク質に対する抗体は、修飾治療モダリティーを必要とする個体を同定するために使用し得る。
【０２１９】
抗体はさらに、２型糖尿病の活性段階のような疾患状態における、又はタンパク質の機能に関係する２型糖尿病の素因を有する個体における変異体タンパク質の発現を評価するために有用であり得る。本明細書に記載した少なくとも一つの多型マーカー又はハプロタイプを含んでなる核酸によりコードされている本発明の変異体タンパク質に特異的な抗体は、該変異体タンパク質の存在をスクリーニングするために、例えば、該変異体タンパク質の存在により示される２型糖尿病の素因についてスクリーニングするために使用することができる。
【０２２０】
抗体は他の方法においても使用し得る。それ故、電気泳動移動度、等電点、トリプシン又は他のプロテアーゼ消化による分析と併用して、又は当業者には既知の他の物理的アッセイで使用するため、本発明の変異体タンパク質のようなタンパク質を評価する診断ツールとして抗体は有用である。抗体は組織分類にも使用することができる。一つのこうした態様において、特異的変異体タンパク質は特定の組織タイプでの発現と相関しており、変異体タンパク質に特異的な抗体は、特定の組織タイプを同定するために使用し得る。
【０２２１】
変異体タンパク質を含むタンパク質の細胞内局在性も抗体を使用して決定することができ、そして多様な組織中の細胞における該タンパク質の異常な細胞内局在性を評価するために応用し得る。こうした使用は遺伝子試験におけるのみではなく、特定の治療モダリティーのモニタリングにおいても応用し得る。治療が、該変異体タンパク質の発現レベル又は存在を、又は該変異体タンパク質の異常な組織分布又は発生過程での発現を是正することを目的とする場合、該変異体タンパク質又はそれらの断片に特異的な抗体は、治療効率をモニターするために使用し得る。
【０２２２】
抗体はさらに、例えば、結合分子又は相手への変異体タンパク質の結合を阻止することにより変異体タンパク質機能を阻害するために有用である。こうした使用は、治療が変異体タンパク質の機能を阻害することを含む療法状況にも応用し得る。抗体は、例えば、結合を阻止する又は競合的に阻害するために使用でき、それにより該タンパク質の活性を変調する（即ち、刺激する又は拮抗する）。抗体は、特異的機能に必要な部位を含有する特定のタンパク質断片に対して、又は細胞又は細胞膜に関連している無傷のタンパク質に対して調製し得る。インビボでの投与のため、抗体を放射性核種、酵素、免疫原性エピトープ、又は細菌毒素（リシンのようなジフテリア又は植物毒素）を含む細胞毒のような追加の療法的ペイロード（payload）と連結させることができる。抗体又はそれらの断片のインビボ半減期は、ポリエチレングリコールへのコンジュゲーションを経たペグ化により増加させることができる。
【０２２３】
本発明はここで、以下の非制限的実施例により例示されるであろう。
【実施例】
【０２２４】
実施例１
以下には、ＳＮＰマーカーの単一点及びハプロタイプ解析を介し、２型糖尿病に関連していることが観察された感受性因子同定の記述が含まれる。
【０２２５】
方法
アイスランドコホート
アイスランドのData Protection Authority及びアイスランドのNational Bioethics Committeeは本研究を承認した。本研究の全ての関与者にはインフォームドコンセントを与えた。血液サンプル、医療情報及び系統学に関連するすべての個人情報は、サードパーティー暗号化システムを使用して、Data Protection Authorityにより最初に暗号化された。
【０２２６】
この研究のため、過去３０年間にわたってIcelandic  Heart Association で行われた長期疫学調査により、又は過去１２年間にわたってレイキャビックの２つの主要な病院の１つで診断された、２４００人の２型糖尿病患者を同定した。これらの患者の３分の２は生存しており、現在のアイスランドにおける既知の２型糖尿病患者の集団の約半分を代表している。これらの患者の大多数とこの研究のために接触をはかり、８０％の割合を超える協力率であった。この研究の全ての関与者はIcelandic Heart Association を訪れ、そこで彼らは質問表に回答し、血液を採取され、及び空腹時血漿グルコース測定が行われた。診断時での薬物療法及び年齢についての質問が含まれていた。この研究における２型糖尿病患者は、我々の公開した連鎖研究（Reynisdottir et al., Am J Hum Genet 73, 323(2003) ）に記載されているように診断された。手短に言えば、２型糖尿病の診断は、以前の医学記録、病歴及び／又は新規検査室測定を介して、研究医師により確認された。以前に診断された２型糖尿病患者については、経口血糖降下薬の使用を報告することで２型糖尿病を確認した。現在インシュリンで治療されている個体は、もし以前に使用した経口血糖降下薬も使用していれば又はいたら、２型糖尿病を有していると分類された。このコホートにおいて、薬物療法している患者の大多数が経口血糖降下薬を服用しており、一部のみが（９％）インシュリンを必要とする。これまで診断されていない個体については、２型糖尿病及び空腹時血糖異常（ＩＦＧ）の診断は、American Diabetes  Association (Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus 1997) により示された基準に基づいていた。この研究における２型糖尿病患者の平均年齢は６９．７歳であった。
【０２２７】
追試コホート
デンマーク研究群はコペンハーゲンのSteno Diabetes Center （Ｎ＝１，０１８）から、及び大コペンハーゲン地域に住み、Research Centre for Prevention and Health28 で試料採取された（Ｎ＝３５９）３０〜６０歳のInter99 集団に基づいたサンプルからの２型糖尿病患者の組であった。糖尿病及び前糖尿病カテゴリーは、1999 World Health Organization (WHO)基準に従って診断された。ＢＭＩ測定を有するデンマーク人対照の有効なランダム副群（Ｎ＝２，４００）はInter99 コレクションから得られた。参加前に、すべての対象からインフォームドコンセント書類を得た。本研究はEthical Committee of Copenhagen County により承認され、ヘルシンキ宣言の行動指針に従った。
【０２２８】
米国におけるPENN CATH研究は、１９９８年７月から２００３年３月の間、University of Pennsylvania Medical Centerで心臓カテーテル法を受けた患者の連続コホートにおける、冠動脈硬化と生化学的及び遺伝的因子の関連の横断研究である。２型糖尿病は、空腹時血糖＞１２６ｍｇ／ｄｌ、食後２時間グルコース＞２００ｍｇ／ｄｌ、年齢４０歳より高齢な対象での経口血糖降下薬又はインシュリン及び経口血糖降下薬の使用の履歴として定義された。University of Pennsylvania Institutional Review Board は研究プロトコルを承認し、すべての対象者に書類によるインフォームドコンセントを与えた。民族性は自己報告を介して決定された。総計で４６８人のコーカサス人２型糖尿病症例はこのコホートに由来する。加えて、１０２４人の非罹患（２型糖尿病及び心筋梗塞に関して）コーカサス人対照は同一の研究から無作為に選ばれた。
【０２２９】
遺伝子型同定のために使用したＤＮＡは、デンマーク及び米国の２型糖尿病患者及び対照の末梢血から単離されたＤＮＡのGenomiPhi増幅キット（Amersham）の使用による、全ゲノム増幅の生成物であった。
【０２３０】
遺伝子型同定
１３９９のアイスランド人糖尿病患者の全ゲノムスキャンは、単一チップ上でおよそ３１７，０００の単一塩基多型（ＳＮＰ）をアッセイするための、Illumina（Illumina, San Diego, CA, USA）からのInfinium HumanHap300  ＳＮＰチップを使用して実施した。他の症例−対照コホートにおける追試のためのＳＮＰ遺伝子型同定は、Centaurusプラットフォーム（Nanogen）を使用して実施した。
【０２３１】
関連解析のための統計法
２型糖尿病への単一マーカー関連について、各アレルの両側ｐ値を計算するために尤度比検定を使用した。乗法（multiplicative）モデルを仮定し、相対リスク（ＲＲ）及び集団寄与リスク（ＰＡＲ）を計算した（C. T. FaIk, P. Rubinstein, Ann Hum Genet 51 (Pt 3), 227(1987); J. D. Terwilliger, J. Ott, Hum Hered 42, 337(1992)）。ＣＥＰＨコーカサス人ＨａｐＭａｐデータについて、Ｄ’（R. C. Lewontin, Genetics 50, 757(1964) ）及びＲ２（W. G. Hill, A. Robertson, Genetics 60, 615 (Nov, 1968) ）の標準定義を使用し、ＳＮＰの対間のＬＤを計算した。特定の領域中のＬＤ構造を解明するためにすべてのＳＮＰ組み合わせをプロッティングする場合、Ｄ’を上部左隅に及びｐ値を下部右隅にプロットした。示したＬＤプロットにおいて、マーカーはそれらの物理的位置に従うよりむしろ等距離的にプロットした。
【０２３２】
結果
全ゲノム関連研究
我々はIllumina 330Kチップを使用し、１３９９人のアイスランド人２型糖尿病患者及び５２７５人の集団対照個体の遺伝子型同定に成功した。関連解析は、ＬＤブロック内の単一ＳＮＰ、２マーカーハプロタイプ及び拡張ハプロタイプを使用して実施した。関連性についてｐ値を補正した後、２１座位（即ち、ゲノム中の遺伝的感受性位置）で、５ｘｌ０−５未満のｐ値を有していた４９の単一マーカー及び２マーカーハプロタイプを同定した（表１）。加えて、８の追加の座位で１０の拡張ハプロタイプが同一基準で選択された（表２）。患者群内で、７００個体は非肥満（ＢＭＩ＜３０）であり、これらは関連について別に試験した。関連性についてｐ値を補正した後、２０座位で３６の単一マーカー及び２マーカーハプロタイプが５ｘｌ０−５未満のｐ値を有していた（表３）。これらの座位の３つは、全群が解析された場合にも同定された。加えて、４の追加の座位で６の拡張ハプロタイプが同一基準で選択された（表４）。５３１患者の肥満群（ＢＭＩ＞３０）も関連について別に解析した。関連性についてｐ値を補正した後、１６座位で３８の単一マーカー及び２マーカーハプロタイプが５ｘｌ０−５未満のｐ値を有していた（表５）。これらの座位の１つは、全群が解析された場合にも同定されたが、この基準を使用すると非肥満及び肥満群間で重複は観察されなかった。加えて、７の追加の座位で１０の拡張ハプロタイプが、肥満糖尿病患者の関連解析で５ｘｌ０−５未満のｐ値を有していた（表６）。
【０２３３】
表１〜６に示されている単一マーカー関連及び２マーカー及び拡張ハプロタイプ関連解析は、それ故、２型糖尿病についての多感受性変異体の証拠を示している。本明細書に示した単一マーカーＳＮＰ解析については、感受性変異体は増加したリスクにより表し得ることに注意すべきであり、一つのアレルは対照と比較して患者群において過剰提示されている。もしくは、感受性変異体は、問題とするＳＮＰの他のアレルにより表すことが可能であり−そのようなアレルについては、対照と比較して、患者における過小提示が期待される。このことは、二つのアレルを含んでなる遺伝子要素の関連解析の当然の結果である。多マーカーハプロタイプについては、又は一つより多くのマーカーを含んでなる多型マーカーについては、アットリスク関連性が一つ（又はそれ以上の）アットリスクアレル又はハプロタイプで観察することができる。問題とする遺伝子領域中の遺伝子組成又はハプロタイプ構造に依存して、一つの（又はそれ以上の）保護的変異体又はハプロタイプへの関連性（１未満のＲＲ値）の形で保護的変異体も観察することができる。
【０２３４】
【表５】
2010510804.tif 000006
【０２３５】
【表６】
2010510804.tif 000007
【０２３６】
【表７】
2010510804.tif 000008
【０２３７】
【表８】
2010510804.tif 000009
【０２３８】
【表９】
2010510804.tif 000010
【０２３９】
【表１０】
2010510804.tif 000011
【０２４０】
【表１１】
2010510804.tif 000012
【０２４１】
染色体６ｐ２２．３座位
非肥満糖尿病患者について最も顕著な関連シグナルの一つが、染色体６ｐ２２．３に位置する二つの単一マーカー（ｒｓ１５６９６９９及びｒｓ７７５６９９２）２マーカーハプロタイプにより同定された（表３）。これらのマーカーはマーカーｒｓ４４２９９３６及びｒｓ６９０８４２５（配列番号１；図１）間の２０６３４９９６〜２０８３６７１０位塩基（ＮＣＢＩ  Ｂｕｉｌｄ  ３５）の一つのＬＤブロック内に位置していた。このＬＤブロックは、遺伝子ＣＤＫ５調節サブユニット関連タンパク質１様１（ＣＤＫＡＬ１）（ＮＭ＿０１７７７４）のエクソン１〜５を含んでいる５’末端を含有する。ＣＤＫＡＬ１タンパク質は触媒活性ならびに鉄イオン結合活性を有するが、インビボ機能は知られていない。それは膵臓での発現を含み、広範に発現されている。
【０２４２】
２型糖尿病へのｒｓ１５６９６９９及びｒｓ７７５６９９２の関連を確認するため、デンマーク人２型糖尿病症例−対照コホート及びＰＥＮＮ  ＣＡＴＨ研究からの米国コーカサス人コホート２型糖尿病コホートにおいて二つのマーカーを遺伝子型同定した（表７）。その結果は、二つのマーカーがデンマーク人コホートにおいて２型糖尿病と有意に関連していること、及び米国ＵＰｅｎｎコホートにおいて同様のリスクを与えるが統計的有意性には達しなかったことを示した。二つの追試コホートを合併した場合、約１．２のリスクで結果は有意である。すべてのコホートを合併した場合、ほぼ３０００人の２型糖尿病患者（ＢＭＩは明らかにされていない）及び８０００人を超える対照の群を比較すると、各マーカーのリスクは１．２を超えている。これらの結果は全ゲノムにわたって有意である。
【０２４３】
【表１２】
2010510804.tif 000013
【０２４４】
これらの結果は、マーカーｒｓ４４２９９３６及びｒｓ６９０８４２５間の、６番染色体上の２０６３４９９６〜２０８３６７１０ｂｐ領域（Ｂｕｉｌｄ３４）への２型糖尿病における有意な関連を示した。相対リスク（ＲＲ）の値は３つすべてのコホートで匹敵しており；ＵＰｅｎｎコホートにおける０．０５レベルでの有意な相関の欠如は、主として他のコホートと比較してパワー（power）の不足によるものであるけれども、アイスランドと比較してこのコホートにおけるＲＲ値はわずかに低い（ｒｓ１５６９６９９については、１．２２４と比較して１．１８５のＲＲ）。さらに、アイスランドにおける非肥満２型糖尿病患者のＲＲ値はもっと高い（ｒｓ１５６９６９９についてＲＲ＝１．３３）。
【０２４５】
染色体１０ｑ２３．３３座位
染色体１０ｑ２３．３３上の領域中で、７つの単一マーカー及び７つの２マーカーハプロタイプが２型糖尿病と関連していることが観察された（表１）。これらのマーカーのほとんどは、肥満患者が別に分析された場合にも上昇したＲＲ値で糖尿病と関連している（表５）。これらのマーカーは、マーカーｒｓ２７９８２５３及びｒｓ１ｌｌ８７１５２によりにより架橋されているゲノムセグメントに対応する９４１９２８８５及び９４４９００９１位（ＮＣＢＩ  Ｂｕｉｌｄ  ３５）間の一つのＬＤブロック内に位置している。このＬＤブロックは三つの遺伝子、インスリン分解酵素（ＩＤＥ）（ＮＭ＿００４９６９）、キネシンファミリーメンバー１１（ＫＩＦ１１）（ＮＭ＿００４５２３）及び造血的に発現されるホメオボックス（ＨＨＥＸ）（ＮＭ＿００２７２９）を含む。
【０２４６】
ＩＤＥは、細胞間ペプチドシグナル伝達の原因であるプロテアーゼファミリーに帰属させることができる。インスリンの細胞プロセシングにおけるその役割は未だ定義されていないが、インスリン分解酵素はインスリン応答の終結に関与すると考えられている（Fakhrai-Rad et al, Human Molecular Genetics 9:2149-2158, 2000）。糖尿病ＧＫラットの遺伝子解析は、ＧＫアレル中のＩＤＥ遺伝子の二つのアミノ酸置換（Ｈ１８Ｒ及びＡ８９０Ｖ）を明らかにし、それはトランスフェクト細胞においてインスリン分解活性を３１％減少させた。しかしながら、Ｈ１８Ｒ及びＡ８９０Ｖ変異体を別々に研究した場合、何の影響も観察されず、インスリン分解に対する２変異体の相乗効果を示唆している。細胞溶解液ではインスリン分解に対して何の影響も観察されず、前記影響はインスリンのレセプター仲介内部移行と共役しているようである。ＩＤＥ  ＧＫアレルを有するコンジェニック（congenic）ラットは食後高血糖、脂肪細胞における減少した脂質生合成、鈍ったインスリン刺激グルコース膜貫通取り込み、及び単離された筋肉における減少したインスリン分解を示した。追加のラット株分析は、機能障害性ＩＤＥアレルがＧＫラットに特有であったことを示した。筆者は、ＩＤＥがＧＫラットにおける糖尿病表現型に重要な役割を果たしていることを結論した。ＩＤＥはヒトにおける２型糖尿病についての候補遺伝子として研究されてきたが、矛盾する結果しか得られていない。二つの大規模な研究は、該遺伝子全域にわたってタグ付けしたＳＮＰを使用する突然変異スクリーニング及びハプロタイプ分析により２型糖尿病とＩＤＥの関連を最近分析した（Groves et al, Diabetes 52: 1300-1305, 2003; Florez et al, Diabetes 55:128-135, 2006）。両研究は、ＩＤＥにおける共通の変異が２型糖尿病の有意なリスクを与えていないようであると結論している。しかしながら、これらの研究は、図２に定義した全ＬＤブロックを含んでおらず、及び我々の研究で２型糖尿病に関連すると同定されたマーカーの少なくともいくつかは、以前の研究で分析された領域の領域外にある。ここに報告された結果に基づくと、ＩＤＥを含むＬＤ中のマーカーは２型糖尿病に関連しており、２型糖尿病の病因におけるＩＤＥの役割についての遺伝的証拠を提供している。
【０２４７】
ＫＩＦ１１はキネシン様タンパク質ファミリーに属する運動タンパク質をコードする。このタンパク質ファミリーのメンバーは、いろいろな紡錘体動力学に関与することが知られている。この遺伝子産物の機能には、染色体転座、染色体分離、及び細胞有糸分裂間の双極紡錘体の確立が含まれる。この遺伝子は、糖尿病についての優れた機能的候補ではないが、関連するＬＤブロック内のその位置のため、位置的候補と考えるべきである。
【０２４８】
ＨＨＥＸは転写因子のホメオボックスファミリーのメンバーをコードし、その多くは発生プロセスに関与している。特定の造血分化系列における発現は、このタンパク質が血球分化に役割を果たすことができることを示唆している。ＨＨＥＸは膵臓発生に必須である；ＨＨＥＸ陰性マウス胎児においては、腹側膵臓特異化が完全に失敗する（Bort et al, Development 131, 797- 806, 2004）。膵臓発生に関与する他の転写因子には、ＭＯＤＹ遺伝子、ならびに後期発症糖尿病に関係付けられている他の因子が含まれる。ＨＨＥＸは、心臓誘導のためのＷｎｔアンタゴニストの必須エフェクターでもある（Foley and Mercola, GENES & DEVELOPMENT 19:387-396, 2005）。このことは、ＨＨＥＸを最近確立された２型糖尿病遺伝子ＴＣＦ７Ｌ２と同一の経路におくことになり、これらのデータを一緒にすると、ＨＨＥＸは２型糖尿病についての機能的ならびに位置的候補になる。
【０２４９】
２型糖尿病に対するｒｓ２４９７３０４、ｒｓ９４７５９１、ｒｓ１０８８２０９１及びｒｓ７９１４８１４の関連を確認するため、該マーカーをデンマーク人２型糖尿病症例−対照コホート及びＰＥＮＮ  ＣＡＴＨ研究からの米国コーカサス人コホート２型糖尿病コホートにおいて遺伝子型同定した（表８）。結果は、それぞれのコホートにおいて独立して関連が再現されなかったことを示した。しかしながら、二つのコホートを合併した場合、ｒｓ９４７５９１の関連は０．０５レベルでの有意性に達し、合併コホートでのリスクは１．１である。すべてのコホートが合併された場合、ｒｓ９４７５９１マーカーについてのリスクは１．１５である。
【０２５０】
これらの結果は、ＩＤＥ及びＨＨＥＸを含む、１０番染色体上のＬＤブロック内の変異体は２型糖尿病についての感受性変異体であることを示している。
【０２５１】
【表１３】
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【０２５２】
染色体１７ｑ２４．３座位
染色体１７ｑ２４．３の領域中の、５つの単一マーカー及び２つの２マーカーハプロタイプが、非肥満患者において２型糖尿病に関連することが見いだされた（表３）。これらのマーカーのいくつかは、表３に報告されているように最も強い関連を示し、この領域への関連は、すべての糖尿病患者が分析された場合にも観察された（表１）。これらのマーカーはマーカーｒｓ１ｌ０７７５０１及びｒｓ４７９３４９７間の、１７番染色体上の６６０３７６５６及び６６１６３０７６位（ＮＣＢＩ  Ｂｕｉｌｄ  ３５）間に位置する２つの隣接ＬＤブロック内に位置している（図３）。該関連は、単一マーカー関連解析で実施された試験の数で補正した後でも有意であり；即ち、該関連は全ゲノムレベルで有意である。これらのＬＤブロック内に既知の遺伝子は位置していない。しかしながら、この領域の変異体が、ＫＣＮＪ２及びＫＣＮＪ１６を含む近隣領域中の遺伝子に影響することは可能である。もしくは、これらの変異体は、これらのＬＤブロック領域内の未知の遺伝子に影響してもよい。
【０２５３】
【表１４】
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【０２５４】
【表１５】
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【０２５５】
【表１６】
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【０２５６】
【表１７】
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【０２５７】
【表１８】
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【０２５８】
【表１９】
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【０２５９】
【表２０】
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【０２６０】
【表２１】
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【０２６１】
【表２２】
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【０２６２】
【表２３】
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【０２６３】
【表２４】
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【０２６４】
【表２５】
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【０２６５】
【表２６】
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【０２６６】
【表２７】
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【０２６７】
【表２８】
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【０２６８】
【表２９】
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【０２６９】
【表３０】
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【０２７０】
【表３１】
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【０２７１】
【表３２】
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【０２７２】
【表３３】
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【０２７３】
【表３４】
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【０２７４】
【表３５】
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【０２７５】
【表３６】
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【０２７６】
【表３７】
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【０２７７】
【表３８】
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【０２７８】
【表３９】
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【０２７９】
【表４０】
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【０２８０】
【表４１】
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【０２８１】
【表４２】
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【０２８２】
【表４３】
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【０２８３】
【表４４】
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【０２８４】
【表４５】
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【０２８５】
【表４６】
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【０２８６】
【表４７】
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【０２８７】
【表４８】
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【０２８８】
【表４９】
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【０２８９】
【表５０】
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【０２９０】
【表５１】
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【０２９１】
【表５２】
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【０２９２】
【表５３】
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【０２９３】
【表５４】
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【０２９４】
【表５５】
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【０２９５】
実施例２
ＣＤＫＡＬ１遺伝子中の変異体はインスリン応答及び２型糖尿病のリスクに影響する
我々は最近、Ｔ２Ｄに関連するＴＣＦ７Ｌ２中の変異体について記述した（Grant, S. F. et al. Nat Genet 38, 320-3(2006); Helgason, A. et al. Nat Genet (2007)）。以下において、Illumina Hap300チップを使用し、アイスランド人Ｔ２Ｄ患者についての全ゲノム関連性研究を記述する。我々は１３９９人のＴ２Ｄ患者及び５２７５人の対照のサンプルにおけるＴ２Ｄへの関連について３１３，１７９ＳＮＰを個々に試験した。我々はさらに、Hap300チップには含まれていないが、HapMapプロジェクトで型分けされたＳＮＰのセット（Pe’er, I. et al. Nat Genet 38, 663-7(2006)）についての有効な代替物（ｒ２＞０．８）として同定された３３９，８４６の２マーカーハプロタイプを試験した。Ｔ２Ｄ患者の全群を分析することに加え、７００人の非肥満Ｔ２Ｄ患者及び５３１人の肥満Ｔ２Ｄ患者を関連について別に試験した。全体で、総計１，９５９，０７５（６５３，０２５変異体ｘ３表現型）の試験を実施した。結果は、個体間の関連性及びゲノム対照による集団層別化可能性について補正した（Devlin, B. & Roeder, K. Biometrics 55, 997-1004(1999)）（方法を参照されたい）。具体的には、（未補正）カイ２乗検定を、すべて、非肥満及び肥満Ｔ２Ｄ症例についてそれぞれ１．２８７、１．２０４及び１．１８４で割り算した。以前に同定されたＴＣＦ７Ｌ２遺伝子中のＳＮＰ  ｒｓ７９０３１４６は、すべてのＴ２Ｄ患者において、ＯＲ＝１．３８及びＰ＝１．８２ｘｌ０-１０の最も有意な結果を与えた。他のＳＮＰ又はハプロタイプは、実施された試験の数について補正した後は有意ではなかったけれども、偶然と思われるより多くのボーダーラインにある有意なシグナルが観察された（図４）。それ故、トップのシグナルをさらに追跡することを決定した。
【０２９６】
方法
アイスランド人研究集団
アイスランド人Ｔ２Ｄ群は以前に記述されている（Reynisdottir, I. et al. Am J Hum Genet 73, 323-35 (2003)）。総計で１５００人のＴ２Ｄ患者を、Infinium II アッセイ法及びSentrix HumanHap300 BeadChip （Illumina, San Diego, CA, USA）を使用する、この全ゲノム関連研究に採用した。それらの内、１３９９人は、我々の質管理基準（補足の方法を参照されたい）に従った遺伝子型同定が成功し、本症例対照分析で使用した；遺伝子型同定された症例の５３１が肥満（ＢＭＩ＞３０）であった。この研究に使用された対照は、アイスランド人系図データベースからランダムに選択された５９９人の対照及びdeCODEで進行している他の全ゲノム研究からの４６７６個体から成っていた。本研究は、Data Protection Commission of Iceland 及びNational Bioethics Committeeof Icelandにより承認された。すべての症例及び対照からインフォームドコンセント書類を得た。
【０２９７】
他の研究集団
２８２症例及び６２９対照のデンマーク人女性研究群、デンマークＡと称される、はデンマークにおけるProspective Epidemiological Risk Factor（ＰＥＲＦ）研究（Tanko, L.B., et al. Bone 32, 8-14(2003)）から選択された。これは、Center for Clinical and Basic Researchで実施された、種々のスクリーニングプラセボ対照臨床試験及び疫学的研究を受けた閉経後の女性の群である。２０００〜２００１年の５８４７人の女性のフォローアップ検査時に、１型及び２型糖尿病を含む病歴、家族歴、現在及び過去の薬剤の長期服用が、前もって作られた質問を使用した個人面接の間に集められた。もし対象が１型か又は２型の糖尿病と診断されていたら、診断又は治療の時期もまとめられた。本研究はEthical Committee of Copenhagen Countyにより承認され、ヘルシンキ宣言の行動指針に従った。
【０２９８】
１３５９人のＴ２Ｄ症例及び正常糖負荷を有する４８５８人の対照個体の第二のデンマーク人研究集団は、コペンハーゲンのSteno Diabetes Center から、及び大コペンハーゲン地域に住み、Research Centre for Prevention and Health28 で試料採取された３０〜６０歳のInter99 集団に基づいたサンプルからである。このデータベースは文中でデンマークＢと称される。糖尿病及び前糖尿病カテゴリーは、1999 World Health Organization (WHO)基準に従って診断された。経口糖負荷試験は前記のInter99研究の参加者に対して実施された（Jorgensen, T. et al. Eur J Cardiovasc Prev Rehabil 10, 377-86(2003)）。参加前に、すべての対象からインフォームドコンセント書類を得た。本研究はEthical Committee of Copenhagen County により承認され、ヘルシンキ宣言の行動指針に従った。
【０２９９】
フィラデルフィア研究集団は４６８人のＴ２Ｄ症例及び１０２４対照個体から成っていた。本研究集団はUniversity of Pennsylvania Medical Centerで心臓カテーテル法を受けた継続的患者の研究集団における、冠動脈硬化と生化学的及び遺伝的因子の関連の横断研究であるＰＥＮＮ  ＣＡＴＨ研究から選択された。Ｔ２Ｄは、＞１２６ｍｇｄｌ−１の空腹時血中グルコース、＞２００ｍｇｄｌ−１の食後２時間後のグルコース、経口血糖降下薬の使用、又は４０歳以上の対象におけるインスリン及び経口血糖降下薬の使用の病例として定義された。University of Pennsylvania Institutional Review Boardは研究プロトコールを承認し、すべての対象にインフォームドコンセントが与えられた。すべての症例及び対照はヨーロッパ人祖先を有していた。民族性は自己申告により決定された。
【０３００】
Dutch Breda 研究集団は、３７０人のＴ２Ｄ症例及び９１６人の対照個体から成っていた。症例は１９９８〜１９９９年に、Diabetes Service Breda及びBreda周辺領域の８０の一般開業医の協力でリクルートされた。すべての患者はＷＨＯ基準（血漿グルコースレベル＞１１．１ｍｍｏｌ／ｌ又は空腹時血漿グルコースレベル＞７．０ｍｍｏｌ／ｌ）に従って診断され、３カ月ごとにそれらの糖尿病についての臨床的及び実験室的評価を受けた。ユトレヒトのMedical Ethics Committee of the University Medical Centreは研究プロトコールを承認した。すべてのプロバンド（proband）はインフォームドコンセント、糖尿病関連投薬、現在及び２０歳時の身長及び体重を含む臨床データの質問票に記入した。対照は、４８の平均年齢を有するオランダ血液銀行ドナーである。
【０３０１】
スコットランド人研究集団は、Diabetes Audit and Research Tayside（ＤＡＲＴＳ）のサブ研究であるWellcome Trust UK T2D症例−対照コレクション（Ｇｏ−ＤＡＲＴＳ２）からの２型糖尿病症例及び非糖尿病対照から成っていた（Morris, A. D. et al. BMJ 315, 524-8 (1997)）。すべてのＴ２Ｄ患者は、一次又は二次ケア糖尿病クリニックでリクルートされた、又は一次ケア登録に参加するように招待された臨床医診断Ｔ２Ｄ症例であり、ＧＡＤ抗体又はＭＯＤＹ遺伝子突然変異については特徴付けされていない。対照は一次ケア臨床医を介して、又は職場労働衛生部門を介して参加するように招待された。対照は以前に糖尿病と診断されていないが、対照のグルコース耐性状態は未知である。この進行している研究におけるすべての個体は２００４年１０月及び２００６年７月の間にTaysideでリクルートされた。この研究は、Tayside Medical Ethics Committeeにより承認され、インフォームドコンセントはすべての対象から得られた。
【０３０２】
香港研究集団のすべての対象は、南ハン族中国人祖先を有し、香港に居住している。症例はPrince of Wales Hospital Diabetes Registryから選択されたＴ２Ｄの１５００個体である。これらの内、６８２人の患者は、陽性家族歴を有する若年発症糖尿病（診断時の年齢≦４０歳）であった。追加の８１８の症例は、同じ登録からランダムに選択された。対照は、正常グルコース耐性（空腹時血漿グルコース＜６．１ｍｍｏｌ／ｌ）の１０００人の対象から成っていた。これらの内、６１７人は、地域密着型心臓血管リスクスクリーニングプログラムならびに病院スタッフに関係した一般住民からリクルートされた。加えて、３８３人の対象が若者のための心臓血管リスクスクリーニングプログラムでリクルートされた。インフォームドコンセントは各参加対象について得られた。この研究は、Chinese University of Hong Kong のClinical Research Ethics Committeeにより承認された。
【０３０３】
アフリカ人研究集団は、Africa America Diabetes Mellitus研究に由来し、それは本来、対照として利用可能な配偶者の登録を有する、罹患同胞対研究として設計された。その後、罹患対の他の家族メンバー及び集団対照を含むように拡大された。この報告に登録されたファミリーについての補充戦略及び適任性基準は以前に記載されている（Rotimi, CN. et al. Ann Epidemiol 11, 51-8 (2001)）。この西アフリカ人症例−対照シリーズは、ナイジェリアからのＹｏｒｕｂａ（２３３罹患個体、４３２対照）及びＩｇｂｏ（２３７罹患個体、２７６対照）群、及びガーナからのＡｋａｎ（２５７罹患個体、２４８対照）、Ｅｗｅ（２２罹患個体、３０対照）及びＧａａ−Ａｄａｎｇｂｅ（１２３罹患個体、１４１対照）群からの個体から成っていた。
【０３０４】
スコットランド人Ｇｏ−ＤＡＲＴＳ研究集団を除いて、すべての追試研究集団に遺伝子型同定に使用されたＤＮＡは、末梢血から単離されたＤＮＡの全ゲノム増幅の生成物であった（GenomiPhi Amplification kit, Amersham）。
【０３０５】
統計解析
Illumina全ゲノム遺伝子型同定。すべてのアイスランド人症例及び対照サンプルを、International HapMapプロジェクトのフェーズＩに由来する３１７，５０３ハプロタイプタグ付けＳＮＰを含有するInfinium HumanHap300 SNPチップ（Illumina, SanDiego, CA, USA）でアッセイした。チップ上でアッセイされたＳＮＰの内、４，３２４のＳＮＰは（ａ）症例又は対照で９５％より低い収率；（ｂ）集団中に１％の未満の副アレル頻度；又は（ｃ）対照においてハーディ・ワインベルグ平衡からの有意なゆがみを示した（Ｐ値＜０．００１）；ので除外した。９８％以下のコールレート（call rate）のサンプルは分析から除外した。それ故、文中で示された最終分析は、３１３，１７９ＳＮＰを利用した。
【０３０６】
単一ＳＮＰ遺伝子型同定。スコットランド人Ｇｏ−ＤＡＲＴＳ集団を除き、研究されたすべての集団の単一ＳＮＰ遺伝子型同定はレイキャビック、アイスランドのdeCODE Genetics で、Centaurus（Nanogen）プラットホーム（Kutyavin, I. V. et al. Nucleic acid s Res 34, el28 (2006)）により実施した。各Centaurus ＳＮＰアッセイの質は、ＣＥＵ及び／又はＹＲＩ  ＨａｐＭａｐサンプル中の各アッセイを遺伝子型同定することにより評価し、ＨａｐＭａｐデータと結果を比較した。＞１．５％ミスマッチ率を有するアッセイは使用せず、連鎖不平衡（ＬＤ）試験はＬＤにあることが知られているマーカーについて使用した。スコットランド人集団の単一ＳＮＰ遺伝子型同定は、Biomedical Research Centre, Ninewells Hospital and Medical School, Dundee，スコットランド、でTaqMan（商標）法により実施した。
【０３０７】
関連解析。関連解析については、ＮＥＭＯソフトウェア（Gretarsdottir, S. et al. Nat Genet 35, 131-8 (2003)）で実行される標準尤度比統計を利用して、両側ｐ値及び各個々のアレルについてのアレル特異的ＯＲを計算し、リスクについての乗法モデルを仮定し、即ち、ヒトが運んでいる２つのアレルのリスクのかけ算をした。キャリア頻度よりむしろアレル頻度がマーカーについて示されており、ｐ値は、対象の関連性について補正した後に与えられた。遺伝子型特異的ＯＲを推定する場合（表１９）、集団における遺伝子型頻度は、ＨＷＥを仮定して推定した。
【０３０８】
一般に、アレル／ハプロタイプ頻度は、最大尤度により推定し、症例及び対照間の相違の検定は、一般化尤度比検定を使用して実施した(Wadsworth Inc., Belmont, CA, 1995)）。この方法は、問題とするマーカーについていくつかの失われた遺伝子型がある状況において特に有用であり、問題とするマーカーと強いＬＤにある別のマーカーの遺伝子型が使用され、いくらかの部分情報を提供する。これは表１７に示されている関連検定で使用され、高度に相関したマーカーの比較は同じ数の個体を使用して行われたことを確実にした。フェーズ及び失われた遺伝子型による不確定性を取り扱うため、最大尤度推定、尤度比及びｐ値は観察されたデータについて直接計算し、フェーズ及び失われた遺伝子型による不確定性による情報の損失は尤度比により自動的に捕捉した。
【０３０９】
複数の症例−対照群からの結果は、マンテル・ヘンツェルモデル（Mantel, N. & Haenszel, W. J Natl Cancer Inst 22, 719-48 (1959)）を使用して合併し、そこで群はアレル及び遺伝子型について異なった集団頻度を有してもよいが、共通の相対リスクを有すると思われる。
【０３１０】
対象及びゲノム対照の関連性についての相関。アイスランド人患者及び対照群の両方における個体のいくつかは互いに関連しており、カイ２乗検定が平均＞１及び中央値＞０．６７５２を有することを起こしている。我々は、拡大要因（inflation factor）を、６５３，０２５カイ２乗統計値を計算することにより推定し、それはゲノム対照を関連性及び集団層別化可能性の両方について補正する方法である。拡大要因は、すべて、非肥満及び肥満Ｔ２Ｄ症例の解析について、各々１．２８７、１．２０４及び１．１８４と推定された。示された結果は、各項目を対応する拡大要因で割ることによりカイ２乗統計値を補正することに基づいている。
【０３１１】
定量的分析。デンマーク人Inter99研究からの個体についての経口グルコース耐性のデータを以下の式を使用し、補正インスリン応答（ＣＩＲ）としてインスリン分泌を計算した：（１００ｘ３０分でのインスリン）÷［３０分でのグルコースｘ（３０〜３８分でのグルコース−３．８９ｍｍｏｌ）］。インスリン感受性は、ホメオスタシスモデル評価（ＨＯＭＡ）に従ったインスリン耐性の逆数として推定した：２２．５／［空腹時インスリンｘ空腹時グルコース］（Matthews, D. R. et al. Diabetologia 28, 412-9(1985)）。ＣＩＲ（ＨＯＭＡ）及び遺伝子型状態間の関連は、重回帰を使用して検定し、ｌｏｇ転換ＣＩＲ（ＨＯＭＡ）を応答変数とし、及び説明変数は個体が運んでいるリスクアレルのコピー数（加法モデル）であるか又はリスクアレルのホモ接合性キャリアについての指標変数（劣性モデル）である。性、年齢及び罹患状態についての補正は、説明変数として適切な項目を含ませることにより行った。比較のため、インスリン分泌も、（３０分でのインスリン−０分でのインスリン）÷（３０分でのグルコース−０分でのグルコース）として計算され、比較できる結果を得ている。
【０３１２】
細胞株。ＩＮＳｌ細胞は、Hoffmann-LaRocheにより提供された。それらは、１０％ウシ胎仔血清（Invitrogen）、５０μｇ／ｍｌペニシリン−ストレプトマイシン（Invitrogen）、５０μＭ  ２−メルカプトエタノール（ＳＩＧＭＡ）、１ｍＭ  ＭＥＭピルビン酸ナトリウム（Invitrogen）及び１０ｍＭヘペス緩衝液（Invitrogen）を補給したＲＰＭＩ１６４０（Invitrogen）中で増殖させた。それらは、１Ｘハンクス平衡化塩溶液（Invitrogen）で１回洗浄し、次ぎにトリプシン（トリプシン−ＥＤＴＡ；Invitrogen）処理することにより、一週間に２回、１：２に分割した。
【０３１３】
ＲＮＡの調製及びｃＤＮＡ増幅。
ＩＮＳｌ細胞を、１０ｍＭグルコースを含む正常増殖培地中で４８時間インキュベートした。採取時に２ｘ１０７細胞であり、それを全ＲＮＡの調製に使用した。ＲＮＡはRNeasy Midi Kit（Quiagen）を使用して抽出した。ｃＤＮＡは、High-Capacity cDNA Archive Kit（Applied Biosystems）を使用して調製した。ＣＤＫＡＬ１  ｃＤＮＡは、エクソン２及び８間（フォワード：5’-GGGGCTGCTCACATAATAATTCA-3’；リバース：5’-TGTGCCAATGTCTCTGCCATA-3’）及びエクソン７及び１３間（フォワード：5’-ACCTGGCCAGCTATCCCATT-3’；リバース：5’−CCATTTTTCCCATGAATGCAG−3’）の２つの異なったプライマー対を使用して増幅した。ベータ−アクチンからのプライマーが陽性対照として働いた（フォワード5’- ATCTGGCACCACACCTCCTACAATGAGCTGC-3’；リバース：5’- CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC-3’）。
【０３１４】
結果及び考察
試験された各表現型について、Ｐ＜０．００００５のすべての単一ＳＮＰ及び２マーカーハプロタイプをデンマーク（デンマークＢ）からの症例−対照サンプルにおける追試のために選択した。重複性マーカーの除去後、総計で４６のＳＮＰをさらなる追試での試みのために使用した（表１４）。加えて、Illumina Hap300チップ上に存在する５つの最も有意な非同義ＳＮＰを含ませた。それら５１SNPの内、１１１０人のデンマーク人Ｔ２Ｄ症例及び２２７２人の対照において、遺伝子型同定を成功した。デンマーク人群において、ＳＮＰ  ｒｓ７７５６９９２及びｒｓ１３２６６６３４が卓越しており、全Ｔ２Ｄ患者のデンマーク人群において、それぞれＰ＝０．０００１３及びＯＲ＝１．２４及びＰ＝０．００１２及びＯＲ＝１．２０で有意に再現された（表１５）。このことは、最初のアイスランド人研究における、それぞれＰ＝０．０００２１及びＯＲ＝１．２３及びＰ＝０．００００６１及びＯＲは＝１．１９と比較される。他のすべての遺伝子型同定されたＳＮＰはデンマーク人群においてＰ＞０．０１を有しており、さらには追跡されなかった。第一のＳＮＰ、ｒｓ７７５６９９２は、６ｐ２２．３上のＣＤＫ５調節サブユニット関連タンパク質１−様１（ＣＤＫＡＬ１）遺伝子のイントロン５中に位置している。それは、ＣＤＫＡＬ１遺伝子のエクソン１〜５ならびに最小プロモーター領域を含む２０１．７ｋｂの大きなＬＤブロックに存在するが、他に既知の遺伝子は知られていない（図５）。第二のＳＮＰ、ｒｓ１３２６６６３４は、８ｑ２４上の溶質輸送体ファミリー３０（亜鉛輸送体）、メンバー８（ＳＬＣ３０Ａ８）遺伝子の最後のエクソン中のアルギニン３２５からトリプトファン変化を起こす、非同義ＳＮＰである。ＳＬＣ３０Ａ８の遺伝子産物は、膵臓に特異的であり、それはベータ細胞中で発現され、細胞質から細胞内ベシクル内への亜鉛の蓄積を容易にする（Chimienti, F., et al. Diabetes 53, 2330-7(2004)）。８ｑ２４上のｒｓ１３２６６６３４のリスクアレルは、フランス人Ｔ２Ｄ症例及び対照の全ゲノム関連性研究でＴ２Ｄのリスクを与えることが最近発見された（Sladek, R. et al. Nature 445, 881-5 (2007)）。その研究において他の有意に関連したＳＮＰでは（われわれも最初のアイスランド人サンプルで追試した）、２つのＳＮＰがＨＨＥＸ遺伝子に密接に関連していた（表１６）。しかしながら、その研究でまた記載されているＬＯＣ３８７７６１及びＥＸＴ２遺伝子中のマーカーへの報告されている関連性は、我々は再現できなかった。
【０３１５】
我々はＳＮＰ  ｒｓ７７５６９９２及びｒｓ１３２６６６３４を、デンマーク（デンマークＡ）、スコットランド、オランダ及びフィラデルフィア、米国からのヨーロッパ人祖先４つの他のＴ２Ｄ症例−対照群、ならびに香港及び西アフリカからの症例−対照群で遺伝子型同定した。さらに、デンマークＢ研究群のサイズを主に拡大し、遺伝子型同定された対照数を増加させた。ｒｓ７７５６９９２のＧアレルの関連は、スコットランド人（ＯＲ＝１．１１；Ｐ＝０．００４２）及び香港（ＯＲ＝１．２５；Ｐ＝０．０００１８）症例−対照群で有意に再現された（表１７）。他の研究群での関連は個々には有意ではなかったが、すべて同じ方向ではあった。８つすべての症例−対照群の合併で観察された関連性は、１．１５のＯＲを与え、対応するＰは９．０ｘＩ０−１２であった（表１７）。２百万の試験が最初のゲノムスキャンで実行されたことを考えると、この関連はボンフェローニの調整（Bonferonni adjustment）により高度に有意なまま残っていた（Ｐａｄｊ＝１．８ｘｌ０−５）（Skol, A. D., et al. Nat Genet 38, 20９-１3(2006)）。ＨａｐＭａｐ  ＣＥＰＨ（ＣＥＵ）データセット中の元々のシグナルと相関する追加のマーカーを遺伝子型同定することによりｒｓ７７５６９９２で観察された関連を精微化する試みは、より有意な結果を与えなかった（表１８）。予測されたように、西アフリカ人集団で観察された連鎖不平衡は、アイスランド人及び香港群で観察されたよりもかなり低かった（表１９）。ｒｓ７７５６９９２について観察されたよりも高いＯＲで関連変異体が西アフリカ人群において同定できるかどうかを決定するにはさらなる研究が必要である。同様に、非同義ＳＮＰ  ｒｓ１３２６６６３４のアレルＣについて、Ｔ２Ｄへの関連は、６つの追加の群の３つ（スコットランド、フィラデルフィア及び香港から）において有意性を持って再現された（表１７）。デンマークＢのＯＲはサンプルサイズを大きくすると減少するが、推定される効果はデンマークＡについては反対の方向であり（わずかのみ、又は有意ではない）、すべての研究群からの合併された結果は全ゲノムで有意であった、２．５ｘｌ０ｎのＰ及び１．１６のＯＲ（表１７）。
【０３１６】
アイスランド人研究において、ｒｓ７７５６９９２への関連は、全患者の群（ＯＲ＝１．２３；Ｐ＝０．０００２１）よりも非肥満Ｔ２Ｄ患者（ＯＲ＝１．３７；Ｐ＝９．０ｘＩＯ−６）でより有意であった（表１４及び表１７）。肥満Ｔ２Ｄ患者におけるよりも非肥満におけるより高いＯＲは、この変異体について他の研究された集団でも観察された。ヨーロッパ人起源の合併集団について、肥満群でのＯＲ＝１．１２；Ｐ＝０．０００１７と比較し、非肥満Ｔ２Ｄ患者ではＯＲ＝１．１９；Ｐ＝７．２９ｘｌ０−９。香港肥満群（ＯＲ＝１．１３；Ｐ＝０．０９４）と比較すると、さらにより強い効果が香港非肥満Ｔ２Ｄ群で観察され（ＯＲ＝１．３６；Ｐ＝７．４８ｘ２９ｘｌ０−６）、ここで肥満はＢＭＩ≧２５と定義されている。全群についての結果が合併された場合、対照と比較し、非肥満及び肥満Ｔ２Ｄ患者群について、それぞれＯＲ＝１．１９；Ｐ＝１．９３ｘ１０−ｎ及びＯＲ＝１．１３；Ｐ＝２．６８ｘｌ０−５が得られた。これらの結果は、この変異体は増加したＢＭＩを介してＴ２Ｄの増加したリスクを与えないことを示している。
【０３１７】
遺伝子型オッズ比（ＯＲ）は、二つの座位のそれぞれについて推定された（表２０）。合併コーカサス人研究集団の結果に基づくと、ｒｓ７７５６９９２は乗法モデルからかなり逸脱しており、ホモ接合体についてのＯＲ＝１．４５と比較してヘテロ接合体についてのＯＲ＝１．０９であり、ほぼ遺伝の劣性様式を支持している。有意ではないが、同じ傾向が、ヘテロ接合体がＯＲ＝１．１３及びホモ接合体がＯＲ＝１．５５を有する香港サンプルについても観察された。逆に、遺伝子型相対リスクについての乗法モデルは、ｒｓ１３２６６６３４に適切な一致を提供する。
【０３１８】
ＣＤＫＡＬ１の遺伝子産物の機能は未知である。しかしながら、遺伝子名に暗示されているように、該タンパク質産物は別のタンパク質、ＣＤＫ５調節サブユニット関連タンパク質１（ＣＤＫ５ＲＡＰ１）と類似している。ＣＤＫ５ＲＡＰ１は神経組織中で発現され、そこでＣＤＫ５調節サブユニットｐ３５へ結合することによりサイクリン依存性キナーゼ５（ＣＤＫ５）活性を阻害する（Ching, Y. P., et al. J Biol Chem 277, 15237-40(2002)）。膵臓ベータ細胞において、ＣＤＫ５は、糖毒性条件下、ベータ細胞機能の損失において役割を果たしていることが示されている（Wei, F.Y. ef al. Nat Med 11, 1104-8 (2005)）。さらに、ＣＤＫ５／ｐ３５複合体の阻害は、糖毒性から生じるインスリン遺伝子発現の減少を防止する（Ubeda, M., et al. J Biol Chem 281, 28858-64(2006)）。神経組織中のＣＤＫ５ＲＡＰ１の役割と同様に、ＣＤＫＡＬ１は膵臓ベータ細胞中、ＣＤＫ５／ｐ３５の阻害において役割果たしているであろうことを推測したくなる。ＣＤＫＡＬ１の減少した発現又は減少した阻害機能は、それ故、糖毒性への損なわれた応答を導きうる。この研究において、我々は、ＣＤＫＡＬ１がラット膵臓ベータ細胞株ＩＮＳ−１中で発現されていることを示した（図６）。Ｔ２Ｄのリスクを増加させることに対するＣＤＫＡＬ１効果が、この経路を介して果たされているかどうかを決定するにはさらなる研究が必要とされる。
【０３１９】
ＣＤＫＡＬ１の予測される機能及びＳＬＣ３０Ａ８の基地の機能に基づいて、ｒｓ７７５６９９２及びｒｓ１３２６６６３４の両方がインスリン分泌に影響することを期待する。インスリン分泌に対する２つのＳＮＰの効果を評価するため、経口グルコース耐性試験（ＯＧＴＴ）を行っているInter99 研究（デンマークＢの一部）からの個体のセットにおける補正インスリン応答（ＣＩＲ）に対する遺伝子型状態の効果を分析した。ｒｓ７７５６９９２について、リスクアレルホモ接合体キャリアは、ヘテロ接合体キャリア又は非キャリアよりも２４％低いと推定されたＣＩＲを有していた（Ｐ＜０．００００１、図７）ことを示した。この観察は、疾患リスクに関する変異体のほぼ遺伝の劣性様式と一致する。さらに、ＣＩＲに対して観察された効果は男性及び女性の両方（図８）、及びＴ２Ｄ患者ならびに対照において存在し、ＢＭＩ状態は結果に影響しなかった（表２１）。ｒｓ１３２６６６３４のインスリン応答に対する効果はより小さいが有意であり、このリスク変異体について、ＣＩＲの減少は相加効果と一致した。どちらの変異体にしても、インスリン感受性に対する効果は観察されなかった（表２１）。
【０３２０】
Ｔ２Ｄについての感受性遺伝子としてのＣＤＫＡＬ１の同定は、どのように遺伝的因子がＴ２Ｄの素因となることができるかどうかのパズルに一つのピースを加える。この遺伝子の機能は未だ不明であるが、それが膵臓ベータ細胞中で発現されること、及び本遺伝子はインスリン分泌と相関していることを我々は示した。ＣＤＫ５ＲＡＰ１との類似性はさらに、ＣＤＫＡＬ１がＣＤＫ５との相互作用を介して、糖毒性条件下でのインスリン産生を容易にすることができることを示している。結論として、ほとんど劣性様式でインスリン応答を鈍らせ、そしてＴ２Ｄの素因となる、ＣＤＫＡＬ１遺伝子中の変異体を我々は同定した。
【０３２１】
【表５６】
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【０３２２】
【表５７】
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【０３２３】
【表５８】
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【０３２４】
【表５９】
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【０３２５】
【表６０】
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【０３２６】
【表６１】
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【０３２７】
【表６２】
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【０３２８】
【表６３】
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【０３２９】
【表６４】
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【０３３０】
【表６５】
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【０３３１】
【表６６】
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【０３３２】
【表６７】
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【０３３３】
【表６８】
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【０３３４】
【表６９】
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【０３３５】
【表７０】
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【０３３６】
【表７１】
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【０３３７】
【表７２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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