(57)【要約】医学的状態（例えば、癌）の出現（例えば、再発）の予測のための予測モデルにおいて臨床情報、分子情報、およびコンピュータ生成された形態情報（ｃｏｍｐｕｔｅｒ−ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｉｃ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を使用する方法およびシステムを提供する。１つの実施形態では、フィーチャ（１つまたは複数（例えば、全て）の生検グリーソンスコア、精嚢浸潤、嚢外拡大、術前ＰＳＡ、優位前立腺摘除グリーソン分類（ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｐｒｏｓｔａｔｅｃｔｏｍｙ  Ｇｌｅａｓｏｎ  ｇｒａｄｅ）、ＡＲ＋上皮核の相対領域、上皮核の形態計測、および上皮細胞質の形態計測が含まれる）に基づいた前立腺癌再発を予測するモデルを提供する。
2010523979.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の前立腺癌の再発リスクを評価するための装置であって、前記装置が、
患者のデータセットを評価し、それによって前記患者の前立腺癌の再発リスクを評価するように構成された前立腺癌再発予想モデルを含み、前記モデルが、以下のフィーチャの群：
生検グリーソンスコア；
精嚢浸潤；
嚢外拡大；
術前ＰＳＡ；
優位前立腺摘除グリーソン分類；
ＡＲ＋上皮核の相対領域；
組織画像由来の上皮核の形態計測；および
組織画像由来の上皮細胞質の形態計測
から選択される１つまたは複数のフィーチャに基づく、装置。
【請求項２】
前記上皮核の形態計測が腫瘍上皮核のテクスチャの測定を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記上皮細胞質の形態計測が腫瘍上皮細胞質のテクスチャの測定を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
前記モデルが前記群由来の２つのフィーチャに基づく、請求項１に記載の装置。
【請求項５】
前記モデルが前記群由来の３つのフィーチャに基づく、請求項１に記載の装置。
【請求項６】
前記モデルが前記群由来の４つのフィーチャに基づく、請求項１に記載の装置。
【請求項７】
前記モデルが前記群由来の５つのフィーチャに基づく、請求項１に記載の装置。
【請求項８】
前記モデルが前記群由来の６つのフィーチャに基づく、請求項１に記載の装置。
【請求項９】
前記モデルが前記群由来の７つのフィーチャに基づく、請求項１に記載の装置。
【請求項１０】
前記モデルが前記群由来の全８つのフィーチャに基づく、請求項１に記載の装置。
【請求項１１】
前記モデルが前記患者の医学的状態の出現リスクを示す値が得られるように構成されている、請求項１に記載の装置。
【請求項１２】
前記モデルがＡＲ＋上皮核の相対領域のフィーチャに基づき、前記フィーチャが免疫蛍光を示す組織画像のコンピュータ分析に基づく、請求項１に記載の装置。
【請求項１３】
患者の前立腺癌の再発リスクを評価する方法であって、前記方法が、
前立腺癌再発を予測するモデルを使用して前記患者のデータセットを評価する工程であって、前記モデルが、以下のフィーチャの群：生検グリーソンスコア、精嚢浸潤、嚢外拡大、術前ＰＳＡ、優位前立腺摘除グリーソン分類、ＡＲ＋上皮核の相対領域、組織画像由来の上皮核の形態計測、および組織画像由来の上皮細胞質の形態計測から選択される１つまたは複数のフィーチャに基づき、それにより、前記患者の前立腺癌の再発リスクを評価する工程
を含む、方法。
【請求項１４】
前記上皮核の形態計測が腫瘍上皮核のテクスチャの測定を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記上皮細胞質の形態計測が腫瘍上皮細胞質のテクスチャの測定を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記患者の前立腺癌の再発リスクを示す値を出力する工程をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
免疫蛍光を示す組織画像のコンピュータ分析に基づいてＡＲ＋上皮核の相対領域のフィーチャを生成する工程をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
コンピュータ読み取り可能な媒体であって、
前立腺癌再発を予測するモデルを使用して患者のデータセットを評価し、それにより、前記患者の前立腺癌の再発リスクを評価する工程であって、前記モデルが、以下のフィーチャの群：生検グリーソンスコア、精嚢浸潤、嚢外拡大、術前ＰＳＡ、優位前立腺摘除グリーソン分類、ＡＲ＋上皮核の相対領域、組織画像由来の上皮核の形態計測、および組織画像由来の上皮細胞質の形態計測から選択される１つまたは複数のフィーチャに基づく、評価工程
を含む方法を実行するための前記コンピュータ読み取り可能な媒体上に記録したコンピュータ実行可能命令を含むコンピュータ読み取り可能な媒体。
【請求項１９】
根治的前立腺摘除受けた後の患者の臨床的な失敗リスクを評価するための装置であって、前記装置は、以下：
患者のデータセットを評価し、それによって前記患者の臨床的な失敗リスクを評価するように構成された臨床的な失敗を予想するモデルを含み、前記モデルが、以下のフィーチャの群：
優位前立腺摘除グリーソン分類；
リンパ節の浸潤状態；
組織画像由来の管腔の形態測定；
組織画像由来の細胞質の形態計測；および
ＡＲ＋／ＡＭＡＣＲ−上皮核中のＡＲの平均強度
から選択される１つまたは複数のフィーチャに基づく、装置。
【請求項２０】
前記管腔の形態計測が平均管腔周囲長を含む、請求項１９に記載の装置。
【請求項２１】
前記管腔の形態計測が相対管腔領域を含む、請求項１９に記載の装置。
【請求項２２】
前記モデルが平均管腔周囲長および相対管腔領域を含む少なくとも２つの管腔の形態測定に基づく、請求項１９に記載の装置。
【請求項２３】
前記モデルがＡＲ＋／ＡＭＡＣＲ−上皮核中のＡＲの平均強度のフィーチャに基づき、前記フィーチャが免疫蛍光を示す組織画像のコンピュータ分析に基づく、請求項１９に記載の装置。
【請求項２４】
前記モデルが前記群由来の２つのフィーチャに基づく、請求項１９に記載の装置。
【請求項２５】
前記モデルが前記群由来の３つのフィーチャに基づく、請求項１９に記載の装置。
【請求項２６】
前記モデルが前記群由来の４つのフィーチャに基づく、請求項１９に記載の装置。
【請求項２７】
前記モデルが前記群由来の５つのフィーチャに基づく、請求項１９に記載の装置。
【請求項２８】
前記モデルが、患者の臨床的な失敗リスクを示す値を生成するように構成されている、請求項１９に記載の装置。
【請求項２９】
根治的前立腺摘除を受けた後の患者の臨床的な失敗リスクを評価する方法であって、前記方法は、以下：
前立腺摘除後の臨床的失敗を予測するモデルを使用して前記患者のデータセットを評価する工程であって、前記モデルが、以下のフィーチャの群：優位前立腺摘除グリーソン分類、リンパ節の浸潤状態、組織画像由来の管腔の形態測定、組織画像由来の細胞質の形態計測、およびＡＲ＋／ＡＭＡＣＲ−上皮核中のＡＲの平均強度から選択される１つまたは複数のフィーチャに基づき、
それにより、患者の臨床的な失敗リスクを評価する工程
を含む、方法。
【請求項３０】
前記管腔の形態計測が平均管腔周囲長を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記管腔の形態計測が相対管腔領域を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記モデルが平均管腔周囲長および相対管腔領域を含む少なくとも２つの管腔の形態測定に基づく、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記患者の臨床的な失敗リスクを示す値を出力する工程をさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
免疫蛍光を示す組織画像のコンピュータ分析に基づいてＡＲ＋／ＡＭＡＣＲ−上皮核中のＡＲの平均強度のフィーチャを生成する工程をさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
コンピュータ読み取り可能な媒体であって、前立腺摘除後の臨床的失敗を予測するモデルを使用して患者のデータセットを評価し、それにより、前記患者の臨床的な失敗リスクを評価する工程であって、前記モデルが、以下のフィーチャの群：優位前立腺摘除グリーソン分類、リンパ節の浸潤状態、組織画像由来の管腔の形態測定、組織画像由来の細胞質の形態計測、およびＡＲ＋／ＡＭＡＣＲ−上皮核中のＡＲの平均強度から選択される１つまたは複数のフィーチャに基づく、評価工程
を含む方法を実行するために前記コンピュータ読み取り可能な媒体上に記録したコンピュータ実行可能命令を含むコンピュータ読み取り可能な媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００６年１０月１３日に出願された米国特許出願第１１／５８１，０５２号（これは２００５年１０月１３日に出願された米国仮特許出願第６０／７２６，８０９号からの優先権を主張し、２００５年３月１４日に出願された米国特許出願第１１／０８０，３６０号の一部継続出願であり、米国特許出願第１１／０８０，３６０号は２００５年２月２５日に出願された米国特許出願第１１／９６７，０６６号（現在では２００８年１月２２発行の米国特許第７，３２１，８８１号）の一部継続出願であり、米国特許出願第１１／９６７，０６６号は２００４年２月２７日に出願された米国仮特許出願第６０／５４８，３２２号および２００４年６月４日に出願された米国特許第６０／５７７，０５１号からの優先権を主張する）の一部継続出願であり、２００３年１１月１７日に出願された米国仮特許出願第６０／５２０，８１５号からの優先権を主張する２００４年１１月１７日に出願された米国特許出願第１０／９９１，８９７号の一部継続出願であり、２００３年７月２１日に出願された米国仮特許出願第１０／６２４，２３３号（現在では２００６年２月７日発行の米国特許第６，９９５，０２０号）の一部継続出願であり、２００３年１１月１８日に出願された米国仮特許出願第６０／５２０，９３９号からの優先権を主張する２００４年１１月１７日に出願された米国仮特許出願第１０／９９１，２４０号の一部継続出願であり、そして２００４年３月１２日に出願された米国仮特許出願第６０／５５２，４９７号、２００４年６月４日に出願された米国仮特許出願第６０／５７７，０５１号、２００４年８月１１日に出願された米国仮特許出願第６０／６００，７６４号、２００４年１０月２０日に出願された米国仮特許出願第６０／６２０，５１４号、２００５年１月１８日に出願された米国仮特許出願第６０／６４５，１５８号、２００５年２月９日に出願された米国仮特許出願第６０／６５１，７７９号からの優先権を主張する。本出願はまた、２００７年４月５日に出願された米国仮特許出願第６０／９２２，１６３号、２００７年４月５日に出願された米国仮特許出願第６０／９２２，１４９号、２００７年４月１３日に出願された米国仮特許出願第６０／９２３，４４７号、および２００８年１月９日に出願された米国仮特許出願第６１／０１０，５９８号による優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明の実施形態は、医学的状態（例えば、疾患または治療に対する応答性もしくは非応答性）の出現を予測するための予測モデルにおける臨床情報、分子情報、およびコンピュータ生成された形態情報（ｃｏｍｐｕｔｅｒ−ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｉｃ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を使用する方法およびシステムに関する。例えば、１つの実施形態では、本発明は、前立腺癌の再発を治療、診断、および予測するために臨床情報、分子情報、および形態情報を使用する方法およびシステムを含む。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
医師は、例えば、患者が医学的状態を経験する可能性が高いかどうかおよびそれはいつかといった問題や、一旦患者が疾患と診断されるとどのようにして患者を治療すべきかといった問題にまで亘って、多数の医学的判断を行う必要がある。患者に対する一連の治療を適切に決定すれば、例えば、患者が生存および／または回復する機会が増大し得る。同様に、事象の出現の予想により、個体の事象の治療を有利に計画することが可能である。例えば、患者が疾患の出現（例えば、再発）を経験する可能性が高いかどうかが予想されると、医師はこの患者に適切な一連の治療を推奨することが可能である。
【０００４】
伝統的には、医師は、医学的状態の出現の治療、診断、および予測のために医師の専門知識および訓練に大いに依存する。例えば、病理学者は、前立腺癌の進行および侵襲レベルを評価するためにグリーソンスコアリングシステム（Ｇｌｅａｓｏｎ  ｓｃｏｒｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）を使用し、このシステムでは、医師によって把握される顕微鏡下での前立腺組織の外観に基づいて癌が分類される。未分化型がより多数である前立腺組織サンプルに、より高いグリーソンスコアが与えられる（１）。グリーソン分類は病理学者によって信頼できると広く見なされているが、グリーソン分類は主観的なスコアリングシステムである。特に、同一組織サンプルを観察する病理学者が異なれば、解釈も異なる。
【０００５】
医学的診断において医師を補助するための従来のツールは、範囲および適用が制限される。例えば、患者が根治的前立腺摘除を受けた後に前立腺癌治療に関する医師の決定を補助するためのツールは、血清ベースのＰＳＡスクリーニング試験および一般化ノモグラム（ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ  ｎｏｍｏｇｒａｍ）に制限される。Ｋａｔｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．の特許文献１によって開発された１つの術後ノモグラムは、泌尿器科医によって広く使用されており、根治的前立腺摘除治療を受けた患者の７年疾患再発率を予測可能である。このノモグラムは、生化学的不全（すなわち、ＰＳＡレベルの増加）の可能性についての情報しか得られず、臨床的失敗（死亡）を予測しない。さらに、このノモグラムは、患者の容態が７年以内に再発する可能性が高いかどうかのみを予測し、７年間のうち患者の容態が再発し得る時期を予想しない。このノモグラムで使用される予後変数には、処置前血清ＰＳＡレベル、グリーソンスコア、および病理学者による前立腺被膜浸潤、切除縁、精嚢浸潤、およびリンパ節の状態微視的評価が含まれる。処置の失敗は、疾患の再発の臨床的証拠が存在するか、血清ＰＳＡが上昇するか、または補助療法を開始する場合に記録される。しかし、これらのノモグラムにはいくつかの制限が存在する。最も重要な制限は、最良のこれらのノモグラムでさえ、完全に区別されるモデル（一致指数（ｃｏｎｃｏｒｄａｎｃｅ  ｉｎｄｅｘ）＝１．０）と区別できないモデル（一致指数＝０．５）との間の中間よりもわずかに良好にしか実施されないという点である。さらに、予測がコイントスほどの精度に過ぎないので、中間領域のノモグラム予測（７年無増悪生存率３０〜７０％）を有する患者の約３０％の転帰が不明確である。
【０００６】
コンピュータの処理能力が有意に増大した、コンピュータ実行画像処理および画像分析の技術が出現している。多数の応用面において、単一画像から大量の定量的連続値フィーチャを自動的に抽出することが現実的にできるようになっている。フィーチャＸは、あるＡがＢ未満の場合において、フィーチャの値セットがＡとＢとの間の全ての数ｘを含む場合に、連続値であるといわれる。癌画像分析システムは、細胞学的検体の撮影画像について開発されている（２）（３）。しかし、かかるシステムは、細胞のみを取り込んでいるので、組織レベルで観察可能な構造情報の全てを利用せず、まして臨床情報および分子情報がその情報と組み合わされない。組織レベルで異なる病理学的要素の構造を分析するための癌画像分析システムは提供されていないが、組織レベルの構造は、しばしば、各細胞の外観よりも診断（例えば、グリーソン分析）で重要な役割を果たす。したがって、病理学者は、前立腺の形状およびサイズを分析するために手作業の技術を用いて、癌の病理学的悪性度を決定している（４）。組織画像が典型的には細胞画像より複雑であり、理解するために専門分野の幅広い知識が必要であるという事実が、従来の癌画像分析システムの欠点をより深刻にしている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第６，４０９，６６４号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記を考慮して、予測力が改善された医学的状態、応答、および他の医学的現象の出現を治療、診断、および予測するためのシステムおよび方法を提供することが望ましいであろう。医学的状態の治療、診断、およびその出現の予測のために組織レベルの情報を使用するコンピュータ実行システムおよび方法を提供することも望ましいであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の概要）
本発明の実施形態は、医学的状態の出現を予測するための自動化システムおよび方法を提供する。本明細書中で使用する場合、医学的状態の出現の予測には、例えば、患者が癌などの疾患の出現（例えば、再発）を経験するかどうかの予測および／またはその経験する時期の予測、患者が１つまたは複数の療法（例えば、新規の医薬品）に応答する可能性が高いかどうかの予測、および任意の他の適切な医学的状態の出現の予測が含まれ得る。本発明の実施形態による予測を、例えば、患者のための適切な一連の治療を選択し、および／または患者の医学的状態を診断するために、医師または他の個人によって使用することができる。
【００１０】
本発明の１つの態様では、医学的状態の出現を予測するモデルを生成するためのシステムおよび方法を提供する。予測モデルの生成は、その転帰が少なくとも部分的に知られている患者のコホートについてのデータを使用してサポートベクトルマシン（ＳＶＭ）または神経回路網を訓練するための分析ツールの使用を含み得る。１つの実施形態では、トレーニングデータには、臨床データ、分子データ、およびコンピュータ生成された形態計測データが含まれる。本明細書中で使用する場合、特定の型の「データ」（例えば、臨床データ、分子データ、または形態計測データ）には、その型の１つまたは複数のフィーチャが含まれ得る。さらに、形態計測データを、組織の電子（デジタル）画像に関連するかこれに由来する任意のコンピュータ生成されたデータ（組織またはその一部の構造特性（例えば、領域、長さ、幅、稠密度、および密度）、組織またはその一部のスペクトル特性（例えば、赤色、緑色、青色（ＲＧＢ）色成分値（ｃｏｌｏｒ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｖａｌｕｅｓ）、輝度、およびチャネルヒストグラム（ｃｈａｎｎｅｌ  ｈｉｓｔｏｇｒａｍ））、組織画像および／または同定された組織成分（例えば、上皮内接触面、内腔輪郭のフラクタル次元）のフラクタル特性、ウェーブレット分解係数の統計的特性、ならびに／または他の画像データ変換に関するデータが含まれるが、これらに限定されない）が含まれると定義する。他の実施形態では、トレーニングデータには、コンピュータ生成された形態計測データのみまたは臨床データとコンピュータ生成された形態計測データとの組み合わせが含まれる。
【００１１】
１つの実施形態では、間質、細胞質、上皮核、間質核、管腔、赤血球、組織人工物（ｔｉｓｓｕｅ  ａｒｔｉｆａｃｔ）、組織バックグラウンド（ｔｉｓｓｕｅ  ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）、またはその組み合わせに関連する１つまたは複数のコンピュータ生成された形態計測的フィーチャに基づいた予測モデルを生成するためのシステムおよび方法を提供する。コンピュータ生成された形態計測的フィーチャのみまたは表４に列挙した１つまたは複数の臨床的フィーチャおよび／または表６に列挙した１つまたは複数の分子的フィーチャとの組み合わせに基づいて予測モデルを生成することができる。例えば、１つまたは複数のフィーチャを、関連するモデルが医学的状態を予測する能力に及ぼすフィーチャの影響を決定する分析ツールに入力することができる。モデルの予測力を増加させるフィーチャを最終モデルに含めることができるのに対して、予測力を増加させない（または減少させる）フィーチャを、検討事項から除去することができる。予測モデル開発の根拠として、上記形態計測的フィーチャを単独または表４および／または表６に列挙した臨床的フィーチャおよび／または形態計測的フィーチャとそれぞれ組み合わせて使用することにより、医師、他の個人、および／または自動化処理装置（例えば、組織画像分析システム）のリソースを、転帰と相関する可能性がより高く、したがって、最終予測モデルで有用な患者のフィーチャについてのデータの取得に向けることができる。
【００１２】
本発明の別の態様では、コンピュータ生成された形態計測的データのみまたは臨床データおよび／または分子データとの組み合わせに基づく、患者に於ける医学的状態の出現リスクを評価するために患者のデータセットを評価する予測モデルを提供する。例えば、予測モデルは、入力として患者のデータセットを受信し、患者が医学的状態に関連する１つまたは複数の転帰を経験する可能性を示す「スコア」を出力することができる。
【００１３】
１つの特定の実施形態では、１つまたは複数（例えば、全て）の以下：生検グリーソンスコア、精嚢浸潤、嚢外拡大、術前ＰＳＡ、優位前立腺摘除グリーソン分類（ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｐｒｏｓｔａｔｅｃｔｏｍｙ  Ｇｌｅａｓｏｎ  ｇｒａｄｅ）、ＡＲ＋上皮核の相対領域（例えば、免疫蛍光を示す組織画像のコンピュータ分析に基づいて生成）、上皮核の形態計測、および上皮細胞質の形態計測が含まれるフィーチャに基づく、患者の前立腺癌の再発リスクを予測する予測モデルを提供する。
【００１４】
別の実施形態では、１つまたは複数の以下：精嚢の関与、切除縁の関与、リンパ節の状態、腫瘍のアンドロゲン受容体（ＡＲ）染色指数、組織画像由来の上皮核の形態計測（例えば、総組織領域で除した上皮核によって占められる領域）、および／または組織画像由来の間質の形態計測（例えば、総組織領域で除した間質によって占められる領域）が含まれるフィーチャに基づく、患者の前立腺癌の再発リスクを予測する予測モデルを提供する。いくつかの実施形態では、モデルは、生検グリーソンスコアのフィーチャおよび／または組織画像に由来する間質内のテクスチャの測定にさらに基づき得る。モデルは、患者のデータセットを評価し、それにより、患者の前立腺癌の再発リスクを評価することができる。
【００１５】
別の実施形態では、間質、細胞質、上皮核、間質核、管腔、赤血球、組織人工物、組織バックグラウンド、またはその組み合わせに関連する１つまたは複数のコンピュータ生成された形態計測的フィーチャに基づく、疾患の出現または再発を予測するための予測モデルを提供する。予測モデルは、コンピュータ生成された形態計測的フィーチャのみまたは表４に列挙した１つまたは複数の臨床的フィーチャおよび／または表６に列挙した１つまたは複数の分子的フィーチャとの組み合わせに基づくことができる。
【００１６】
別の実施形態では、図６に示す１つまたは複数の臨床的フィーチャおよび／または分子的フィーチャならびに１つまたは複数の以下の病理学的オブジェクト：赤血球、上皮核、間質、管腔、細胞質、および組織バックグラウンドについての１つまたは複数の形態計測的フィーチャに基づく、前立腺癌の再発を予測するための予測モデルを提供する。
【００１７】
さらに別の実施形態では、図９に示す１つまたは複数の臨床的フィーチャおよび／または分子的フィーチャならびに１つまたは複数の以下の病理学的オブジェクト：赤血球、上皮核、間質、管腔、および細胞質についての１つまたは複数の形態計測的フィーチャに基づく、前立腺癌の再発を予測するための予測モデルを提供する。
【００１８】
別の実施形態では、図１１に示す１つまたは複数の臨床的フィーチャおよび／または分子的フィーチャならびに１つまたは複数の以下の病理学的オブジェクト：赤血球、上皮核、および間質についての１つまたは複数の形態計測的フィーチャに基づく、前立腺癌の生存性を予測するための予測モデルを提供する。
【００１９】
他の実施形態では、予測モデルにより、組織サンプルが正常または異常であるかどうか決定することができるか、あるいは、患者が前立腺摘除後の臨床的な失敗を経験する可能性が高いかどうかを予測することができる。１つの特定の実施形態では、１つまたは複数（例えば、全て、１つ、２つ、３つ、４つなど）の以下：優位前立腺摘除グリーソン分類、リンパ節の浸潤状態、少なくとも１つの管腔の形態計測、細胞質の形態計測、およびＡＲ＋／ＡＭＡＣＲ−上皮核におけるＡＲチャネルの平均強度（例えば、免疫蛍光を示す組織画像のコンピュータ分析に基づいて生成）が含まれるフィーチャに基づく、前立腺摘除後の臨床的な失敗リスクを予測する予測モデルを提供する。モデルは、患者のデータセットを評価し、それにより、患者の臨床的な失敗リスクを評価することができる。
【００２０】
別の実施形態では、１つまたは複数（例えば、全て、１つ、２つ、３つ、４つなど）の以下：生検グリーソンスコア、リンパ節の関与、前立腺摘除グリーソンスコア、組織画像由来の上皮細胞質の形態計測（例えば、上皮細胞質の平均強度）、組織画像由来の上皮核の形態計測（例えば、上皮核中のテクスチャの変動）、組織画像由来の間質の形態計測（例えば、間質内のテクスチャの変動）、および／またはラセマーゼ（ＡＭＡＣＲ）−陽性上皮細胞中のアンドロゲン受容体（ＡＲ）の強度（例えば、免疫蛍光を示す組織画像のコンピュータ分析に基づいて生成）が含まれるフィーチャに基づく、前立腺摘除後の臨床的な失敗リスクを予測する予測モデルを提供する。モデルは、患者のデータセットを評価し、それにより、患者の臨床的な失敗リスクを評価することができる。
【００２１】
別の実施形態では、複数の各時点での患者のデータを測定し、本発明の予測モデルによって評価するシステムおよび方法を提供する。患者の診断または治療は、各評価由来の結果の比較に基づき得る。かかる比較を、例えば、医師または他の個人による使用のためにコンピュータによるレポート出力にまとめることができる。例えば、医学的状態のインヒビター化合物についてのスクリーニングのためのシステムおよび方法を提供することができる。患者のための第１のデータセットを、臨床データ、分子データ、およびコンピュータ生成された形態計測データに基づく予測モデルによって評価することができる。試験化合物を患者に投与することができる。試験化合物の投与後、第２のデータセットを患者から得て、予測モデルによって評価することができる。第１のデータセットの評価の結果を、第２のデータセット由来の評価の結果と比較することができる。第１のデータセットに関する第２のデータセットの結果の変化により、試験化合物がインヒビター化合物であることを示すことができる。
【００２２】
本発明のさらに別の態様では、医学的状態の出現を治療、診断、および／または予測するための試験キットを提供する。かかる試験キットを、病院、他の医療施設、任意の他の適切な場所に配置することができる。試験キットは、患者のデータ（例えば、臨床データ、分子データ、および／またはコンピュータ生成された形態計測データが含まれる）を受信し、患者のデータを予測モデル（例えば、試験キットのメモリ中にプログラミングする）と比較し、比較結果を出力することができる。いくつかの実施形態では、分子データおよび／またはコンピュータ生成された形態計測データを、試験キットによって少なくとも部分的に生成することができる。例えば、分子データを、患者の組織サンプルを受けた後に分析アプローチによって生成することができる。組織サンプルの電子画像の１つまたは複数のオブジェクトへのセグメント化、１つまたは複数のオブジェクトの１つまたは複数のオブジェクトクラス（例えば、間質、管腔、赤血球など）への分類、および１つまたは複数のオブジェクトクラスについての１つまたは複数の測定による形態計測データの決定を行うことによって形態計測データを生成することができる。いくつかの実施形態では、試験キットは、例えば、予測モデルへのアップデートを受信するための入力を含むことができる。いくつかの実施形態では、試験キットは、例えば、患者への請求および／または用途の追跡に有用なデータなどのように、データの別のデバイスまたは場所への転送のための出力を含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
本発明の実施形態のより深い理解のために、添付の図面と共に以下の説明の後にリファレンスを示す。この図面中の引用符合は、明細書全体の符合に対応する。
【図１Ａ】図１Ａおよび１Ｂは、医学的状態の出現を治療、診断、または予測するために予測モデルを使用するシステムのブロック図である。図１Ｃは、予測モデルを生成するためのシステムのブロック図である。
【図１Ｂ】図１Ａおよび１Ｂは、医学的状態の出現を治療、診断、または予測するために予測モデルを使用するシステムのブロック図である。図１Ｃは、予測モデルを生成するためのシステムのブロック図である。
【図１Ｃ】図１Ａおよび１Ｂは、医学的状態の出現を治療、診断、または予測するために予測モデルを使用するシステムのブロック図である。図１Ｃは、予測モデルを生成するためのシステムのブロック図である。
【図２】図２は、予測モデルによって出力することができる患者の例示的結果を示す。
【図３】図３は、組織画像の処理に関与する例示的ステージの流れ図である。
【図４】図４は、医学的状態のインヒビター化合物のスクリーニングに関与する例示的ステージの流れ図である。
【図５】図５ａおよび５ｂは、それぞれ画像のセグメント化および分類後の健康および異常な前立腺組織検体のグレースケールデジタル画像を示す。
【図６】図６は、前立腺癌再発を予測するためのモデルによって使用される種々の臨床的フィーチャ、分子的フィーチャ、およびコンピュータ生成された形態計測的フィーチャを示す。
【図７】図７ａおよび７ｂは、２つの分子的フィーチャ、特に、アンドロゲン受容体（ＡＲ）およびＣＤ３４の存在を証明する染色組織検体を示す。
【図８】図８は、図６のフィーチャに基づいて予想される前立腺癌再発の経験について低リスク、中程度のリスク、または高リスクの患者の分類を示すカプラン・マイヤー曲線のグラフである。
【図９】図９は、前立腺癌再発を予測するためのモデルによって使用される種々の臨床的フィーチャ、分子的フィーチャ、およびコンピュータ生成された形態計測的フィーチャを示す。
【図１０】図１０は、図９のフィーチャに基づいて予想される前立腺癌再発の経験について低リスク、中程度のリスク、または高リスクの患者の分類を示すカプラン・マイヤー曲線のグラフである。
【図１１】図１１は、前立腺癌の全生存性を予測するためのモデルによって使用される種々の臨床的フィーチャ、分子的フィーチャ、およびコンピュータ生成された形態計測的フィーチャを示す。
【図１２】図１２は、図１１のフィーチャに基づいて予想されるモデルによって予測される任意の原因に起因する死の低リスク、中程度のリスク、または高リスクの患者の分類を示すカプラン・マイヤー曲線のグラフである。
【図１３】図１３は、前立腺摘除した患者の後の浸潤性疾患を予測するためのモデルによって使用される種々の臨床的フィーチャおよびコンピュータ生成された形態計測的フィーチャを示す。
【図１４】図１４は、前立腺癌再発を予測するためのモデルによって使用される種々の臨床的フィーチャ、分子的フィーチャ、およびコンピュータ生成された形態計測的フィーチャを示す。
【図１５】図１５は、前立腺癌再発を予測するためのモデルによって使用される種々の臨床的フィーチャ、分子的フィーチャ、およびコンピュータ生成された形態計測的フィーチャを示す。
【図１６】図１６は、根治的前立腺摘除後の患者の臨床的な失敗を予測するためのモデルによって使用される種々の臨床的なフィーチャおよびコンピュータ生成された組織画像のフィーチャを示す。
【図１７】図１７は、前立腺癌再発を予測するためのモデルによって使用される種々の臨床的フィーチャおよびコンピュータ生成された組織画像のフィーチャを示す。
【図１８】図１８ａ〜ｅは、前立腺組織中の核ＡＲの分類のための複数の画像セグメント化を示す。
【図１９】図１９は、根治的前立腺摘除後の患者における臨床的な失敗を予測するための別のモデルによって使用される種々の臨床的フィーチャおよびコンピュータ生成された組織画像のフィーチャを示す。
【図２０】図２０は、カットポイント３９を超えるかそれ未満のモデルスコア（３９．５以上のスコアは総生存期間が短いと予測される）によって２群に分類されゲフィチニブで処置された非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を有する個体の生存を予測するためのモデルにおける患者５１人についての生存曲線を示す線グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明の実施形態は、医学的状態の出現の予想のための予測モデルにおいてコンピュータ生成された形態情報のみまたは臨床情報および／または分子情報との組み合わせを使用する方法およびシステムに関する。例えば、本発明の１つの実施形態では、臨床情報、分子情報、およびコンピュータ生成された形態情報を使用して、前立腺癌の再発を予測する。他の実施形態では、本明細書中に提供された教示を使用して、他の医学的状態（例えば、他の疾患型（例えば、上皮新生物および混合新生物（乳房、結腸、肺、膀胱、肝臓、膵臓、腎臓の細胞、および軟組織が含まれる）など）の出現および１つまたは複数の療法（例えば、調合薬（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｄｒｕｇ））に対する患者の応答性または非応答性を予測する。これらの予測を、医師または他の個人が使用して、例えば、患者に適切な一連の治療を選択し、および／または患者の医学的状態を診断することができる。
【００２５】
本発明の１つの態様では、臨床的フィーチャ、分子のフィーチャ、およびコンピュータ生成された形態計測的フィーチャと医学的状態との間の相関を決定する分析ツール（サポートベクトルマシン（ＳＶＭ）および／または神経回路網が含まれる）を提供することができる。相関するフィーチャは、容態の出現または再発を予測するために使用することができるモデルを形成することができる。例えば、分析ツールを使用して、医学的状態に関連するその転帰（例えば、癌再発までの期間）が少なくとも部分的に既知の患者のコホートについてのデータに基づいた予測モデルを生成することができる。次いで、モデルを使用して新規の患者のデータを評価し、新規の患者の医学的状態の出現を予測することができる。いくつかの実施形態では、３つのデータ型のうちのサブセットのみ（例えば、臨床データおよび形態計測データのみ）を分析ツールによって使用して、予測モデルを生成することができる。
【００２６】
本発明の実施形態によって使用される臨床データ、分子データ、および／または形態計測データには、医学的状態の診断、治療、および／または予測に関連する任意の臨床データ、分子データ、および／または形態計測データが含まれ得る。予測モデルを生成するための前立腺癌の再発および生存との相関について分析したフィーチャは、例えば、表１、２、４および／または６に関連して以下に記載されている。少なくともいくつかのこれらのフィーチャ（例えば、上皮新生物および混合新生物）によって他の医学的状態（例えば、乳房、結腸、肺、膀胱、肝臓、膵臓、腎臓の細胞、および軟組織）の予測モデルの開発の基礎を得ることができると理解されるであろう。例えば、表１、２、４および／または６中の１つまたは複数のフィーチャを、いくつかの他の医学的状態を有する患者について評価し、次いで、分析ツールに入力して、フィーチャが医学的状態と相関するかどうかを決定することができる。モデルの医学的状態発生予測力を増加させるフィーチャを最終モデルに含めることができるのに対して、予測力を増加させない（または減少させる）フィーチャを、検討事項から除去することもできる。予測モデル開発の基礎としての表１、２、４および／または６中のフィーチャの使用により、医師、他の個人、および／または自動化処理装置（例えば、組織画像分析システム）のリソースを、転帰と相関する可能性がより高く、したがって、最終予測モデルで有用な患者のデータの取得に向けることができる。さらに、前立腺癌の再発および生存と相関すると判断されるフィーチャを、図６、９、および１１に示す。これらのフィーチャを、前立腺癌の再発および／または生存を予測する最終モデルに直接含め、および／または他の医学的状態のための予測モデルの開発のために使用することができると理解されるであろう。
【００２７】
形態計測データには、種々の構造および／またはスペクトル特性（例えば、組織検体）を示すコンピュータ生成されたデータが含まれ得る。１つの実施形態では、形態計測データには、間質、細胞質、上皮核、間質核、管腔、赤血球、組織人工物、組織バックグラウンド、またはその組み合わせの形態計測的フィーチャについてデータが含まれ得る。本発明の１つの実施形態では、組織画像から形態計測的フィーチャを測定するための組織画像分析システムを提供する。かかるシステムは、Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ  Ｃｅｌｌｅｎｇｅｒソフトウェアを使用するＭＡＧＩＣ（商標）システムであり得る。かかるシステムは、入力としてＨ＆Ｅ染色画像を受信し、画像中の病理学的オブジェクトについて種々の形態計測的フィーチャの測定値を出力することができる。画像から形態計測的フィーチャを得るためのシステムおよび方法に関するさらなる詳細は、図３に関して以下に記載されている。
【００２８】
臨床的フィーチャは、年齢、人種、体重、身長、病歴、遺伝子型、および病状などの１つまたは複数の患者のデータを含むかこれらに基づき得る。ここで、病状は、臨床的および病理学的な病期のフィーチャおよび特に手作業で疾患過程について収集した任意の他の臨床的フィーチャをいう。一般に、臨床データは、医師によって患者および／または患者の組織または細胞の一連の試験中に収集される。臨床データには、特定の医学的状況により特異的であり得る臨床データも含まれ得る。例えば、前立腺癌の文脈では、臨床データには、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の血中濃度、直腸の指診の結果、グリーソンスコア、および／または前立腺癌に対してより特異的であり得る他の臨床データを示すデータが含まれ得る。一般に、表１、２、４および／または６および／または図６、９および／または１１中の任意のフィーチャ（すなわち、臨床的、形態計測的、および／または分子的なフィーチャ）を前立腺以外の医学的状況に適用する場合、前立腺に対してより特異的な表および／または図由来のフィーチャを考慮しないかもしれない。任意選択的に、問題の医学的状況に対してより特異的なフィーチャを、前立腺に特異的なフィーチャに代えることができる。例えば、他の組織学的に疾患特異的なフィーチャ／顕在化には、壊死領域（例えば、ｉｎ  ｓｉｔｕでの乳房の管癌）、サイズ、形状、および上皮細胞（例えば、乳房、肺）の領域パターン／分布、分化度（例えば、非小細胞肺癌を伴う扁平細胞分化（ＮＳＣＬＣ、乳房および結腸の両方で認められる種々の腺癌に伴って認められるムチン産生））、細胞の形態計測的／微視的分布（例えば、乳癌の管裏層、ＮＳＣＬＣ中の細気管支裏層）、ならびに炎症の程度および型（例えば、前立腺と比較して乳房およびＮＳＣＬＣが異なるフィーチャを有する）が含まれ得る。
【００２９】
分子的フィーチャには、生体分子（核酸、ポリペプチド、サッカリド、ステロイド、および他の小分子または上記の組み合わせ（例えば、糖タンパク質およびタンパク質−ＲＮＡ複合体）が含まれる）の存在、非存在、相対的な増加または減少、または相対的位置を示すデータを含むか、これらに基づき得る。これらの分子が測定される位置には、腺、腫瘍、間質、および／または他の位置が含まれ得、この位置は、特定の医学的状況に依存し得る。一般に、分子データを、一般的な分子生物学的技術および生化学的技術（サザンブロット、ウェスタンブロット、およびノーザンブロット、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、免疫組織化学、および免疫蛍光）を使用して収集する。さらに、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成を使用して、分子生物学的フィーチャの相対存在量および位置の両方を示すことができる。組織のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成のための例示的方法およびシステムは、２００３年７月２１日に出願され、発明の名称が「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｆｉｘｅｄ−ｔｒｅａｔｅｄ  ｃｅｌｌ−ｌｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」である上記援用の米国特許出願第１０／６２４，２３３号（現在、米国特許第６，９９５，０２０号）に記載されている。
【００３０】
図１Ａおよび１Ｂは、患者の医学的状態の出現を予測するために予測モデルを使用する例示的システムを示す。例えば、ｍｅｄｉｃａｌ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ｌａｂがリモートアクセスデバイスに関連した医師または他の個人の医学的決定を補助する場合、図１Ａ中の配置を使用することができる。例えば、病院、他の医療施設、または他の適切な場所などの施設で用いる予測モデルを含む試験キットが提供される場合、図１Ｂ中の配置を使用することができる。
【００３１】
図１Ａに関して、予測モデル１０２を診断施設１０４に配置する。予測モデル１０２は、患者のデータを受信し、これを評価して患者の医学的状態の出現（例えば、再発）を予測し、評価の結果を出力するための任意の適切なハードウェア、ソフトウェア、またはその組み合わせを含むことができる。別の実施形態では、モデル１０２を使用して、特定の１つまたは複数の療法に対する患者の応答性を予測することができる。診断施設１０４は、インターネットサービスプロバイダー（ＩＳＰ）１０８ならびに通信ネットワーク１１０および１１２を介してリモートアクセスデバイス１０６から患者のデータを受信し、評価のために予測モデル１０２にデータを入力することができる。遠隔地からの患者のデータの受信および評価のための他の配置も勿論可能である（例えば、電話線などの別の接続または通常郵便による）。遠隔地に存在する医師または個人は、任意の適切な様式で患者のデータを取得し、リモートアクセスデバイス１０６を使用してデータを診断施設１０４に転送することができる。いくつかの実施形態では、患者のデータを、診断施設１０４または他の施設によって少なくとも部分的に生成することができる。例えば、診断施設１０４は、リモートアクセスデバイス１０６または他のデバイスからデジタルバージョンのＨ＆Ｅ染色画像を受信し、画像に基づいて患者の形態計測データを生成することができる。別の例では、実際の組織サンプルを診断施設１０４によって受信および処理して、形態計測データを生成することができる。他の例では、第三者が新規の患者の画像または組織を受信し、画像または組織に基づいて形態計測データを生成し、診断施設１０４に形態計測データを提供することができる。組織の画像および／またはサンプルから形態計測データを生成するための適切な画像処理ツールは、図３に関して以下に記載されている。
【００３２】
診断施設１０４は、ＩＳＰ１０８ならびに通信ネットワーク１１０および１１２または普通郵便または電話などの別の様式を介したリモートアクセスデバイス１０６への転送によってリモートアクセスデバイス１０６に関連する医師または個人に評価の結果を提供することができる。結果には、診断「スコア」（例えば、事象の再発までの予測時間などの医学的状態に関連する１つまたは複数の転帰を患者が経験する可能性の表示）、医学的状態と相関する予測モデル１０２によって分析された１つまたは複数のフィーチャを示す情報、予測モデルの感受性および／または特異性を示す情報、他の適切な診断情報、またはその組み合わせが含まれる。例えば、図２は、予測モデルによって出力することができる架空の患者についてのレポートの例を示す。図に示すように、レポートは、時間（月）（ｘ軸）に対する患者の転帰の確率（例えば、前立腺癌の再発；すなわち、ｙ軸）をマッピングしている。この例では、患者は、患者が高リスクカテゴリーに置かれた場合、スコア「５２０」を有する。医師または他の個人は、かかるレポートを使用して、より洗練された臨床診断腫瘍分類の決定を補助し、患者の再分類に有効な手段を開発し、最後に、各患者に対してより正確な（且つ適切な）治療オプションを生成することができる。レポートはまた、医師または個人が患者のリスクを患者に説明するのを補助することができるという点で有用であり得る。
【００３３】
リモートアクセスデバイス１０６は、診断施設１０４（例えば、パーソナルコンピュータ、ワイヤレスデバイス（ラップトップコンピュータ、携帯電話、または携帯情報端末（ＰＤＡ）など）、または任意の他の適切なリモートアクセスデバイスなど）からデータを転送および／または受信することができる任意のリモートデバイスであり得る。複数のリモートアクセスデバイス１０６を、図１Ａのシステムに含めることができるが（例えば、対応する複数の遠隔地の複数の医師または他の個人がデータを診断施設１０４と通信するため）、描画が過剰に複雑になるのを回避するために、たった１つのリモートアクセスデバイス１０６を図１Ａに含めた。診断施設１０４は、リモートアクセスデバイス１０６への、および／またはリモートアクセスデバイス１０６からの、伝達を受信および処理することができるサーバを含むことができる。かかるサーバは、コンピューティングハードウェアおよび／または記憶装置の異なる構成要素を含むことができるが、ソフトウェアアプリケーションまたはハードウェアとソフトウェアとの組み合わせであり得る。１つまたは複数のコンピュータを使用してサーバを構成することができる。
【００３４】
各通信リンク１１０および１１２は、任意の適切な有線または無線の通信経路（例えば、ローカルエリアネットワーク、広域ネットワーク、電話回線網、ケーブルテレビネットワーク、イントラネット、またはインターネットなど）であり得る。いくつかの適切な無線通信ネットワークは、移動通信（ＧＳＭ）ネットワーク、時分割多元接続（ＴＤＭＡ）ネットワーク、符合分割多元接続（ＣＤＭＡ）ネットワーク、ブルートゥースネットワーク、または任意の他の適切な無線ネットワークのためのグローバルシステムであり得る。
【００３５】
図１Ｂは、施設１２４で使用する本発明の予測モデルを含む試験キット１２２を提供するシステムを示す。施設１２４は、病院、医師のオフィス、または他の適切な場所であり得る。試験キット１２２は、患者のデータ（例えば、少なくとも１つの臨床データ、形態計測データ、および分子データ）を受信し、予測モデル（例えば、試験キットのメモリ中でプログラミングされた）を使用して患者のデータを評価し、評価の結果を出力するように構成された任意の適切なハードウェア、ソフトウェア、またはその組み合わせ（例えば、パーソナルコンピュータ）を含むことができる。例えば、試験キット１２２は、予測モデルの機能実施のためのコンピュータ実行可能命令を使用してコード化されたコンピュータ読み取り可能な媒体を含むことができる。予測モデルは、（例えば、図１Ｃ中のシステムなどの別のシステムまたはアプリケーションによって）事前に生成された所定のモデルであり得る。いくつかの実施形態では、試験キット１２２は、任意選択的に、例えば、組織サンプルまたは画像から形態計測的フィーチャに対応するデータを生成することができる画像処理ツールを含むことができる。適切な画像処理ツールは、図３に関して以下に記載されている。他の実施形態では、試験キット１２２は、例えば、入力デバイス（例えば、キーボード）または別のデバイスもしくは場所からの入力としてプレパッケージングされた形態計測的フィーチャのデータを受信することができる。試験キット１２２は、任意選択的に、例えば、予測モデルに対するアップデートを受信するための入力を含むことができる。試験キットはまた、任意選択的に、データ（患者への請求および／または用途の追跡に有用なデータなど）の主施設または他の適切なデバイスもしくは場所に転送するための出力を含むことができる。請求データは、例えば、試験キットによって評価された患者の医療保険情報（例えば、名称、保険会社、およびアカウント番号）を含むことができる。かかる情報は、例えば、試験キットの提供者が使用毎にキットに課金する場合、および／または提供者が保険会社に請求書を提出するために患者の保険情報が必要である場合に有用であり得る。
【００３６】
図１Ｃは、例示的な予測モデル生成システムを示す。システムは、分析ツール１３２（例えば、サポートベクトルマシン（ＳＶＭ）および／または神経回路網が含まれる）およびその転帰が少なくとも部分的に知られた患者のデータベース１３４を含む。分析ツール１３２は、データベース１３４由来のデータと医学的状態との間の相関を決定するための任意の適切なハードウェア、ソフトウェア、またはその組み合わせを含むことができる。図１Ｃ中のシステムはまた、例えば、デジタル化バージョンのＨ＆Ｅ染色組織画像、実際の組織サンプル、またはその両方に基づいて形態計測データを生成することができる画像処理ツール１３６を含むことができる。ツール１３６は、例えば、そのデータがデータベース１３４に含まれる既知の患者の形態計測データを生成することができる。適切な画像処理ツール１３６は、図３に関して以下に記載されている。
【００３７】
データベース１３４は、臨床的フィーチャ、形態計測的フィーチャ、分子的フィーチャ、またはその組み合わせのデータなどの任意の適切な患者データを含むことができる。データベース１３４はまた、患者が疾患再発を経験したかどうかおよび経験した時期などの患者の転帰を示すデータを含むことができる。例えば、データベース１３４は、医学的状態の再発を経験した患者のデータなどの患者の打ち切りなしのデータ（ｕｎｃｅｎｓｏｒｅｄ  ｄａｔａ）（すなわち、その転帰が完全に知られている患者のデータ）を含むことができる。データベース１３４は、選択的またはさらに、１回または複数回の医師への追跡調査来院において疾患再発の兆候が認められなかった患者のデータなどの患者の打ち切りデータ（すなわち、その転帰が完全に知られていない患者のデータ）を含むことができる。分析ツール１３２による打ち切りデータの使用は、予測モデルの生成に利用可能なデータ量を増大させることができ、したがって、モデルの信頼性および予測力を有利に改善することができる。打ち切りデータおよび打ち切りなしのデータの両方を使用することができるサポートベクトルマシン（ＳＶＭ）および神経回路網（ＮＮｃｉ）の例を、以下に記載する。
【００３８】
１つの実施形態では、分析ツール１３２は、サポートベクトルマシン（ＳＶＭ）を含むことができる。かかる実施形態では、ツール１３２は、好ましくは、打ち切りデータ上のサポートベクトル回帰（ＳＶＲｃ）を実施することができるＳＶＭを含む。同時係属米国特許出願第１０／９９１，２４０号に記載のように、ＳＶＭが打ち切りデータを使用することができるＳＶＭ内で使用するための新規の修正損失関数／ペナルティ関数をＳＶＲｃ中に提供する。データベース１３４由来の既知の患者の臨床的フィーチャ、分子的フィーチャ、および／または形態計測的フィーチャを含むデータをＳＶＭに入力して、予測モデルのパラメータを決定することができる。パラメータは、入力フィーチャの相対的重要性を示すことができ、ＳＶＭが既知の患者の転帰を予測する能力を最大にするように調整することができる。フィーチャの医学的状態との相関を決定するためのＳＶＭの使用に関するさらなる詳細を、（５）および（６）に記載する。
【００３９】
分析ツール１３２によるＳＶＲｃの使用は、患者の状態を示す情報の多次元非線形ベクトルをデータベース１３４から取得することを含むことができる。ここで、少なくとも１つのこのベクトルは対応する患者に関する事象の出現時間の表示を欠く。次いで、分析ツール１３２は、ベクトルを使用して回帰を行ってカーネルベースのモデルを生成し、それにより、情報のベクトル中に含まれる少なくともいくつかの情報に基づいて事象までの時間の予測に関連する出力値を得る。分析ツール１３２は、打ち切りなしのデータを含むベクトルについてツール１３２によって使用される損失関数と異なる打ち切りデータを含む各ベクトルの損失関数を使用することができる。打ち切りデータサンプルを差分的に操作することができる。これは、打ち切りデータサンプルが「片方の情報」のみしか提供できないからである。例えば、生存期間の予測では、打ち切りデータサンプルは、典型的には、所与の時間内に事象が起こらなかったことのみを示し、たとえ起こったとしても、所与の時間後に起こる場合を示さない。
【００４０】
打ち切りデータのために分析ツール１３２によって使用された損失関数は、以下であり得る。
【００４１】
【数１】
2010523979.tif 000003
ここで、ｅ＝ｆ（ｘ）−ｙ；およびｆ（ｘ）＝ＷＴΦ（ｘ）＋ｂは、フィーチャ空間Ｆにおける線形回帰関数である。ここで、Ｗは、Ｆのベクトルであり、Φ（ｘ）はＦのベクトルに対する入力ｘをマッピングする。
【００４２】
対照的に、打ち切りなしのデータのためにツール１３２によって使用される損失関数は、以下であり得る。
【００４３】
【数２】
2010523979.tif 000004
ここで、ｅ＝ｆ（ｘ）−ｙ
および
εｎ＊≦εｎおよびＣ＊ｎ≧Ｃｎである。
【００４４】
上記説明では、Ｗおよびｂは、最適化問題を解決することによって得られる。その一般式は以下である。
【００４５】
【数３】
2010523979.tif 000005
しかし、この方程式は、凸最適化問題が常に実現可能であると仮定しており、これは、真ではないかもしれない。さらに、回帰推定中の小さな誤差を許容することが望ましい。これらが損失関数をＳＶＲｃのために使用する理由である。損失により、回帰推定をおこなう余地がいくらかできる。理想的には、構築されたモデルは全ての結果を正確に計算するが、これは実行不可能である。損失関数は、理想からの一定範囲の誤差が可能であり、この範囲はスラック変数ξおよびξ＊ならびにペナルティＣによって制御される。理想から逸脱しているが、ξおよびξ＊によって定義される範囲内である誤差を計数するが、その寄与をＣによって軽減する。インスタンスの誤差が多いほど、ペナルティが高くなる。インスタンスの誤差がより少ないほど（理想に近い）、ペナルティが少ない。誤差と共にペナルティが増加するこの概念によって勾配が生じ、Ｃはこの勾配を制御する。種々の損失関数をε無視（ｅｐｓｉｌｏｎ−ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）損失関数のために使用することができる一方で、一般方程式を、以下のように変形する。
【００４６】
【数４】
2010523979.tif 000006
本発明のε無視損失関数について（打ち切りデータおよび打ち切りなしのデータに適用した異なる損失関数を使用）、この方程式は、以下のようになる。
【００４７】
【数５】
2010523979.tif 000007
最適化基準は、そのｙ値がεを超えることによってｆ（ｘ）と異なるデータポイントにペナルティを科す。スラック変数ξおよびξ＊は、それぞれ正の偏差および負の偏差についての過剰な偏差サイズに対応する。このペナルティ機構は、２つの成分（一方は打ち切りなしのデータ（すなわち、右打ち切りでない）および他方は打ち切りデータ）を有する。両成分を、ここに、ε−無視損失関数と呼ばれる損失関数形態で示す。
【００４８】
打ち切りデータにおけるサポートベクトル回帰（ＳＶＲｃ）を実施するためのシステムおよび方法に関するさらなる詳細は、２００４年１１月１７に出願された上記で援用された米国特許出願第１０／９９１，２４０号および２００３年１１月１８日に出願された米国特許仮出願第６０／５２０，９３９号に記載されている。
【００４９】
別の実施形態では、分析ツール１３２は、神経回路網を含むことができる。かかる実施形態では、ツール１３２は、好ましくは、打ち切りデータを使用することができる神経回路網を含む。さらに、神経回路網は、好ましくは、関連モデル（ＮＮｃｉ）を訓練するために、一致指数（ＣＩ）の近似（例えば、微分）に実質的にしたがって目的関数を使用する。生存率分析の成績指標としてＣＩが長く使用されているが（７）、神経回路網を訓練するためのＣＩの使用は以前に提案されていなかった。これまで、目的関数の訓練としてＣＩを使用することは、ＣＩが微分不可能であり、勾配ベースの方法によって最適化できないという点で困難である。２００５年２月２５日に出願された同時係属米国特許出願第１１／０６７，０６６号（現在、米国特許第７，３２１，８８１号）に記載のように、この障害を、目的関数としてＣＩの近似値を使用することによって克服することができる。
【００５０】
例えば、分析ツール１３２が前立腺癌再発を予測するために使用される神経回路網を含む場合、神経回路網は、前立腺癌再発に関するその転帰が出力を得るために少なくとも部分的に既知である患者のコホートについての入力データを処理することができる。神経回路網への入力のために選択された特定のフィーチャを、上記ＳＶＲｃ（例えば、分析ツール１３２のサポートベクトルマシンを使用して実行される）の使用または別の適切なフィーチャ選択過程の使用によって選択することができる。ツール１３２の誤差モジュールは、出力と入力データに対応する所望の出力との間の誤差（例えば、予測される転帰と患者の既知の転帰との間の差異）を決定することができる。次いで、分析ツール１３２は、神経回路網の成績を評価するためにＣＩの近似に実質的にしたがって目的関数を使用することができる。分析ツール１３２は、目的関数の結果に基づいて神経回路網の重み付きコネクション（ｗｅｉｇｈｔｅｄ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ）（例えば、フィーチャの相対的重要性）に適応することができる。フィーチャと予測された転帰との相関を調整するための神経回路網の重み付きコネクションの適応に関するさらなる詳細は、（８）および（９）に記載されている。
【００５１】
一致指数を、以下の形態：
【００５２】
【数６−１】
2010523979.tif 000008
で示すことができ、これは、それぞれ、患者ｉおよびｊについての予後評価
【００５３】
【数６−２】
2010523979.tif 000009
と
【００５４】
【数６−３】
2010523979.tif 000010
との間の一対比較に基づき得る。この例では、Ωは、以下の条件を満たす全患者対｛ｉ，ｊ｝からなる。
【００５５】
・両患者ｉおよびｊは再発を経験し、患者ｉの再発時間ｔｉは、患者ｊの再発時間ｔｊよりも短いか、
・患者ｉのみが再発を経験し、ｔｉは患者ｊの追跡調査来院時間ｔｊよりも短い。
ＣＩの分子は、神経回路網によってより早く再発すると予測される患者が実際により早く再発する時間数を示す。分母は、所定の条件を満たす患者対の総数である。
【００５６】
一般に、ＣＩが増加する場合（好ましくは、最大になる場合）、モデルはより正確である。したがって、好ましくはＣＩを実質的に最大にするかＣＩの近似により、モデルの成績は改善される。本発明の１つの実施形態は、以下に示すＣＩの近似を提供する。
【００５７】
【数７−１】
2010523979.tif 000011
（式中、０＜γ≦１およびｎ＞１）。
【００５８】
【数７−２】
2010523979.tif 000012
を、
【００５９】
【数７−３】
2010523979.tif 000013
の近似と見なすことができる。
【００６０】
結果を改善するために経験的に示した本発明によって提供されるＣＩの別の近似を以下に示す。
【００６１】
【数８−１】
2010523979.tif 000014
ここで、
【００６２】
【数８−２】
2010523979.tif 000015
は、規格化因子である。ここで、各
【００６３】
【数８−３】
2010523979.tif 000016
を、
【００６４】
【数８−４】
2010523979.tif 000017
と
【００６５】
【数８−５】
2010523979.tif 000018
との間の差異によって重みを付ける。Ｃω（またはＣ）の最小化は、Ω中の各サンプル対を、
【００６６】
【数８−６】
2010523979.tif 000019
を満たし、それによって
【００６７】
【数８−７】
2010523979.tif 000020
が得られるように模索する。
【００６８】
Ω中の対の出力間の差異が縁γより大きい場合、このサンプル対は目的関数への寄与を停止するであろう。この機構は、モデルの訓練中のデータの過剰適合を有効に克服し、好ましくは、Ω中により多くのサンプル対を移動させて
【００６９】
【数８−８】
2010523979.tif 000021
を満たすことのみに注目する。訓練サンプルの影響を、訓練中の一対比較にしたがって適応的に調整する。Ｒ中の切除縁陽性γが汎化性能の改良に好ましいことに留意のこと。言い換えれば、神経回路網のパラメータを、全患者データを入力した後にＣＩを計算することによって訓練中に調整する。次いで、神経回路網は、目的関数を最小化するためにパラメータを調整し、それにより、ＣＩが最大化する。上記で使用するように、過剰適合は、一般に、神経回路網の複雑さをいう。具体的には、ネットワークが非常に複雑な場合、ネットワークは「ノイズの多い」データに反応するであろう。過剰適合は、データの訓練範囲をはるかに超えて容易に予測することができるという点で危険である。
【００７０】
神経回路網を訓練するためのＣＩの近似に実質的にしたがって目的関数を使用するためのシステムおよび方法に関するさらなる詳細は、２００５年２月２５日に出願された米国特許出願第１１／０６７，０６６号（現在、米国特許第７，３２１，８８１号）、２００４年２月２７日に出願された米国特許仮出願第６０／５４８，３２２号および２００４年６月４日に出願された同第６０／５７７，０５１号に記載されている。
【００７１】
図３は、適切な画像処理ツールの例示的機能の流れ図である。図３中の機能は、主に、画像中の病理学的オブジェクトの分類（例えば、細胞質、管腔、核、間質、バックグラウンド、人工物、および赤血球のようなオブジェクトの分類）のための組織画像のセグメント化に関する。１つの例では、画像処理ツールは、ＳＰＯＴ  Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＱＥカラーデジタルカメラ（ＫＡＩ２０００）を使用して２０倍の組織画像を取り込み、１６００×１２００ピクセルの画像を生成する光学顕微鏡を含むことができる。画像を、Ｔｉｆｆ形式で２４ビット／ピクセルの画像として保存することができる。かかる装置は例示のみを目的とし、本発明の範囲を逸脱することなく任意の他の適切な画像取り込み装置を使用することができる。画像処理ツールはまた、取り込まれた画像をセグメント化および分類し、次いで、オブジェクトの形態計測的フィーチャを測定するための任意の適切なハードウェア、ソフトウェア、またはその組み合わせを含むことができる。１つの実施形態では、画像処理ツールは、例えば、上記の種々の病理学的オブジェクトのセグメント化および分類を行い、これらのオブジェクトの種々の形態計測的フィーチャを測定するのに適応した市販のＤｅｆｉｎｉｅｎｓ  Ｃｅｌｌｅｎｇｅｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ  Ｓｔｕｄｉｏ（ｖ．４．０）を含むことができる。Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ  Ｃｅｌｌｅｎｇｅｒ製品に関するさらなる詳細は、（１０）に記載されている。画像処理ツールは、オブジェクトの種々の形態計測的フィーチャ（スペクトルベースのフィーチャ（赤色、緑色、青色（ＲＧＢ）チャネル特性（平均値、標準偏差など））、位置、サイズ、周囲長、形状（非対称性、稠密度、楕円適合度（ｅｌｌｉｐｔｉｃ  ｆｉｔ）など）が含まれる）、隣接するオブジェクトに対する空間的関係および強度の関係（明暗差）を測定することができる。画像処理ツールは、画像中のあらゆる同定された病理学的オブジェクトのあらゆるインスタンスについてこれらのフィーチャを測定し、例えば、予測モデル１０２（図１Ａ）、試験キット１２２（図１Ｂ）、または分析ツール１３２（図１Ｃ）による評価のためにこれらのフィーチャを出力することができる。任意選択的に、画像処理ツールはまた、測定した各フィーチャの画像についての全統計的概要を出力することができる。分類された病理学的オブジェクトの形態計測的フィーチャの測定に関するさらなる詳細は、表１および２に関して以下に記載されている。以下は、図３に示す画像処理ツールの機能の説明である。
【００７２】
最初のセグメント化。第１ステージでは、画像処理ツールは、画像（例えば、Ｈ＆Ｅ染色組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）画像または全組織切片のＨ＆Ｅ）をオブジェクトとして公知の小さな連続的ピクセル群にセグメント化することができる。これらのオブジェクトを、色類似性および形状規則性に基づいて連続領域を見出す領域拡張法によって得ることができる。オブジェクトのサイズを、いくつかのパラメータの調整によって変化させることができる（１１）。このシステムでは、ピクセルよりもむしろオブジェクトが、典型的には、最も小さな処理単位である。したがって、全ての形態計測的フィーチャの計算および操作を、オブジェクトに関して行うことができる。例えば、画像に閾値を適用する場合、オブジェクトのフィーチャ量（ｆｅａｔｕｒｅ  ｖａｌｕｅｓ）を閾値に供する。結果として、オブジェクト内の全てのピクセルを同一クラスに割り当てる。１つの実施形態では、オブジェクトのサイズを、最高詳細レベルで１０〜２０ピクセルであるように制御することができる。このレベルに基づいて、より低いレベルでのより小さなオブジェクトからのより大きなオブジェクトの形成によってその後のより高く且つより粗いレベルを構築する。
【００７３】
バックグラウンド抽出。最初のセグメント化後、画像処理ツールは、強度閾値および凸包を使用してバックグラウンド（スライドの透明領域）から画像組織コアをセグメント化することができる。強度閾値は、画像ピクセルを２つのクラス「組織コア」および「バックグラウンド」に分類する強度値である。閾値以上の強度値を有する任意のピクセルを、「組織コア」ピクセルとして分類し、そうでなければ、ピクセルを「バックグラウンド」ピクセルと分類する。幾何学的オブジェクトの凸包は、このオブジェクトを含む最も小さな凸集合（多角形）である。セットＳは、凸面であり、いつでも２つのポイントＰおよびＱがＳの内側に存在する場合、ラインセグメントＰＱもＳ中に存在する。
粗セグメント化。次のステージでは、画像処理ツールは、フォアグラウンド（例えば、ＴＭＡコア）を核および余白に対応するラフ領域（ｒｏｕｇｈ  ｒｅｇｉｏｎ）に再セグメント化することができる。例えば、Ｈ＆Ｅ染色画像中の核のフィーチャの主な特性は、残りの病理学的オブジェクトと比較して青色に染色されることである。したがって、赤色チャネルと青色チャネル（Ｒ−Ｂ）の強度値の差異を、識別されるフィーチャとして使用することができる。特に、最初のセグメント化工程で得たあらゆる画像オブジェクトについて、平均の赤色ピクセル強度値と青色ピクセル強度値との間の差異を決定することができる。長さ／幅比を使用して、オブジェクトが核領域として分類すべきかどうかを決定することもできる。例えば、（Ｒ−Ｂ）フィーチャ閾値および長さ／幅閾値を下回るオブジェクトを、核領域と分類することができる。同様に、緑色チャネル閾値を使用して、余白として組織コア中にオブジェクトを分類することができる。組織間質は、赤色で占められる。強度差異ｄ、「赤色比」ｒ＝Ｒ／（Ｒ＋Ｇ＋Ｂ）、および画像オブジェクトの赤色チャネル標準偏差σＲを使用して、間質オブジェクトを分類することができる。
【００７４】
余白の分類。粗セグメント化ステージでは、余白領域は、画像中の管腔（病理学的オブジェクト）および人工物（破壊組織領域）の両方に対応し得る。より小さな余白オブジェクト（１００ピクセル未満の領域）は、通常、人工物である。したがって、画像処理ツールは、これらを人工物として分類するための領域フィルタ（ａｒｅａ  ｆｉｌｔｅｒ）を適用する。
【００７５】
核の脱融合および分類。粗セグメント化ステージでは、核領域は、しばしば、いくつかの実際の核を含む連続的な融合領域として得られる。さらに、核領域は、周辺の誤分類された細胞質も含み得る。したがって、これらの融合核領域は、各核を得るために脱融合される必要があり得る。
【００７６】
画像処理ツールは、核を脱融合するために２つの異なるアプローチを使用することができる。第１のアプローチは、形状拘束（円形）下で核領域を構成する画像オブジェクトを融合する領域拡張法に基づき得る。このアプローチは、融合が深刻でない場合にうまく行くように決定されている。
【００７７】
深刻な融合の場合、画像処理ツールは、管理学習（ｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ  ｌｅａｒｎｉｎｇ）に基づいた異なるアプローチを使用することができる。このアプローチは、専門家（病理学者）による核領域の手作業のラベリングを含む。ラベリングした核に属する画像オブジェクトのフィーチャを使用して、統計分類子（ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ）をデザインすることができる。
【００７８】
１つの実施形態では、フィーチャ空間の次元数を減少させるために、以下の２つの分類子を使用して、訓練組に対してフィーチャ選択を行うことができる：Ｂａｙｅｓｉａｎ分類子およびｋ最近傍分類子（１２）。１つ取って置き法（ｌｅａｖｅ−ｏｎｅ−ｏｕｔ  ｍｅｔｈｏｄ）（１３）をクロスバリデーションのために使用することができ、逐次前方探索法（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒｗａｒｄ  ｓｅａｒｃｈ  ｍｅｔｈｏｄ）を使用して、最高のフィーチャを選択することができる。最後に、２つのＢａｙｅｓｉａｎ分類子を、それぞれ、１および５に等しいフィーチャ数を使用してデザインすることができる。クラス条件付き分布は、対角共分散行列を有するガウス分布であると推測することができる。
【００７９】
いくつかの実施形態では、入力画像は、以下の異なる種の核を含むことができる：上皮核、線維芽細胞、基底核、内皮核、アポトーシス核、および赤血球。上皮核数が典型的には腫瘍範囲の分類における重要なフィーチャと見なされるので、上皮核数は上皮核を他と区別するのに重要であり得る。画像処理ツールは、検出された核の以下の２つのクラスへの分類によってこれを行うことができる：形状（偏心度（ｅｃｃｅｎｔｒｉｃｉｔｙ））およびサイズ（領域）のフィーチャに基づいた上皮核および「残り」。
【００８０】
本発明の画像のセグメント化および分類に関するさらなる詳細は、２００４年１１月１７日に出願された上記で援用された米国特許出願第１０／９９１，８９７号および２００３年１１月１７日に出願された米国特許仮出願第６０／５２０，８１５号および２００４年３月１２日に出願された同第６０／５５２，４９７号に記載されている。
【００８１】
上記のように、画像処理ツールは、ツールによる画像中のオブジェクトのセグメント化および分類後に種々の形態計測的フィーチャを測定することができる。これらの形態計測的フィーチャは、１つまたは複数の特性および／または統計を示すことができる。オブジェクトの特性には、スペクトル特性（例えば、カラーチャネルの平均値、標準偏差、および輝度）および構造／形状特性（例えば、領域、長さ、幅、稠密度、密度）の両方が含まれ得る。統計値には、最大値、最小値、平均値、および標準偏差が含まれ得、画像オブジェクトの各特性を計算することができる。表１および表２（本明細書中に添付）は、本発明にしたがって測定することができる形態計測的フィーチャの種々の例を示す。これらの表中の形態計測的フィーチャを、これらのフィーチャによって測定された種々の特性および／または統計値を示す従来法を使用して命名する。表１および表２に示す特定の命名規則を、上記の市販のＤｅｆｉｎｉｅｎｓソフトウェア製品から取り入れる。したがって、当業者に理解されるであろう。
【００８２】
表１および表２中に示したコンピュータ生成された形態計測的フィーチャは例示のみを目的とし、任意のコンピュータ生成された形態計測的フィーチャを本発明の範囲を逸脱することなく使用することができると理解されるであろう。例えば、表１および表２は、異なる形態計測的フィーチャセットを含む。表２中のフィーチャセットの減少および修正（すなわち、表１のフィーチャと比較した減少および修正）は、表１を含む研究を行った時間からの前立腺癌の再発および生存の分野におけるさらなる実験に起因した。特に、さらなる実験により、転帰と相関する可能性がより高いかもしれないフィーチャ型に関するさらなる洞察が得られた。発明者は、実験の継続および／または他の適切なハードウェア、ソフトウェア、またはその組み合わせの使用によってこれらおよび他の医学的状態と相関し得る種々の他のコンピュータ生成されたフィーチャセット（例えば、表１中のフィーチャのサブセット（表１０および表１１を参照のこと）または表２中のフィーチャのサブセット）が得られると予想する。
【００８３】
表１および表２に関して、フィーチャ「Ｌｕｍｅｎ．ＳｔｄＤｅｖＡｒｅａＰｘｌ」、「管腔」は、画像オブジェクトの型を示し、「ＳｔｄＤｅｖ」は同定された管腔の全てのインスタンスを使用して計算されるべき統計値（標準偏差）を示し、「ＡｒｅａＰｘｌ」は統計値によって評価されるべきオブジェクトインスタンス（ピクセル数としての領域）のフィーチャを示す。画像処理ツールは、画像中で事前にセグメント化および分類された全オブジェクトについての形態計測的フィーチャを測定することができる。例えば、画像処理ツールは、オブジェクトの形態計測的フィーチャ（「バックグラウンド」、「細胞質」、「上皮核」、「管腔」、「間質」、「間質核」、および「赤血球」が含まれる）を測定することができる。「バックグラウンド」は、組織で占められていないデジタル画像の部分を含む。「細胞質」は細胞の細胞質をいい、無定形領域（例えば、例えば、Ｈ＆Ｅ染色組織の画像中の上皮核を囲む桃色領域）であり得る。「上皮核」は、腺単位（ｇｌａｎｄｕｌａｒ  ｕｎｉｔ）の上皮細胞／管腔細胞および基底細胞内に存在する核をいい、細胞質に囲まれた「円形」オブジェクトとして出現する。「管腔」は、上皮細胞によって分泌物が堆積する中心の腺状空間をいい、上皮細胞に囲まれた閉ざされた白色領域として出現する。時折、管腔は、前立腺液（典型的には、Ｈ＆Ｅ染色組織中に桃色で出現する）または他の「破片」（例えば、マクロファージ、死細胞など）で満たされ得る。管腔、上皮細胞質、および核を合わせて、腺単位を形成する。「間質」は、前立腺組織の構造を維持する異なる密度を有する結合組織の一形態をいう。間質組織は、腺単位の間に存在し、Ｈ＆Ｅ染色組織中で赤色から桃色として出現する。「間質核」は、細胞質（線維芽細胞）を含まないか最少量で含む細長い細胞である。このカテゴリーには、内皮細胞および炎症細胞も含まれ得、癌が存在する場合、間質内に上皮核を見出すこともできる。「赤血球」は、通常、血管（動脈または静脈）内に存在する小さな赤色の円形の物体であるが、組織全体の分散状態でも見出され得る。
【００８４】
以下の表中の「Ｃ２ＥＮ」は、細胞質に対する核領域の比である。上皮細胞がより未分化／悪性になれば、より多くの領域を核が占め、比率がより大きくなる。「ＥＮ２ＳＮ」は、デジタル組織画像中に存在する間質細胞に対する上皮細胞の比率または相対量である。「Ｌ２Ｃｏｒｅ」は、組織内に存在する管腔の数または領域である。グリーソン分類がより高ければ、癌がより高い侵襲性を示し、したがって、管腔存在量がより少なくなる。一般に、これは、癌が生じる場合に無制御の方法で上皮細胞が複製され、管腔が上皮細胞で満たされるようになるからである。
【００８５】
本発明の１つの態様では、医学的状態（例えば、疾患）のインヒビター化合物をスクリーニングするためのシステムおよび方法を提供する。図４は、本発明の１つの実施形態のインヒビター化合物のスクリーニングに関与する例示的ステージの流れ図である。ステージ４０２では、患者の第１のデータセット（１つまたは複数の臨床データ、形態計測データ、および分子データが含まれる）を得ることができる。試験化合物を、ステージ４０４で患者に投与することができる。ステージ４０４後、ステージ４０６で第２のデータセットを患者から得ることができる。第２のデータセットは、第１のデータセット中に含まれる同一のデータ型（すなわち、フィーチャ）を含んでも、含まなくてもよい。ステージ４０８では、第２のデータセットを、第１のデータセットと比較することができ、ここで試験化合物の投与後の第２のデータセットの変化は、試験化合物がインヒビター化合物であることを示す。データセット比較のステージ４０８は、第１のデータセットの入力に応答する本発明の予測モデルによって生成された出力を第２のデータセットの入力に応答する予測モデルによって生成された出力と比較することを含むことができる。例えば、インヒビター化合物は所与の薬物であってよく、本発明は、薬物が医学的状態の医学的処置として有効であるかどうかを決定することができる。
【００８６】
医学的状態の予測に対する本発明の実施形態の種々の例示的適用をここに記載するであろう。第１の例では、本発明の１つの実施形態は、前立腺癌の再発を予測するために臨床データおよび形態計測データを使用した。第２の例では、本発明の１つの実施形態は、前立腺癌の再発および全生存性を予測するために臨床データ、形態計測データ、および分子データを使用した。第３の例では、本発明の１つの実施形態を使用して、患者の前立腺摘除後の浸潤性疾患の出現を予測することができる。第４の例では、本発明の１つの実施形態を使用して、肝臓毒物学を予測した。第５、第６、および第８の例では、本発明の実施形態を使用して、前立腺癌の再発を予測した。第７および第９の例では、本発明の実施形態を使用して、前立腺摘除後の臨床的な失敗を予測した。第１０の例では、本発明の１つの実施形態を使用して、ゲフィチニブで処置した非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の個体の生存率を予測した。
【００８７】
前立腺癌の概要
前立腺癌は、米国男性の主な死亡原因であり、２００４年に新規に診断された症例は２３０，０００と予想され、約３０，０００人が死亡している。ＰＳＡを使用した血清ベースのスクリーニングの使用の拡大により、医師は、前立腺に局在している初期段階（すなわち、Ｔ１ａ−ｃ、Ｔ２）または領域に拡大しているが検出される比率が小さい転移期に前立腺癌を検出することができる。初期検出および初期診断の報告された利点は、一連の処置の選択において患者および泌尿器科医の両方に非常に大きな重荷を課した。腫瘍の大部分が無痛であり、最少の介入（すなわち、「静観」）が必要である一方で、他の腫瘍はより浸潤性が高く、早期介入（すなわち、放射線療法／ホルモン療法／全身補助療法／臨床試験の配置）が推奨されるので、最初の治療介入を選択する場合、正確な診断は重要である。さらに、静観と根治的前立腺摘除とを比較する無作為化試験では、手術がわずかに有利であり（前立腺摘除後の死亡率が６．６％減少）、個人に合わせた患者のケアをガイドするためにより良好な患者の層別化が必要であることが示唆される（１４）。
【００８８】
ＰＣａの自然史は、診断時に患者が直面する困難を再度強調する（１５）。早期前立腺癌が局所療法を使用して治癒可能である場合でさえ、約２５〜４０％の男性がＰＳＡ／生化学的再発（ＢＣＲ）を起こすであろう。さらにより厄介なことには、前立腺癌が再発した男性は、ＰＳＡ／ＢＣＲの約８年後（ＢＣＲ後平均８年；中央値５年）に依然として転移し得る。これにより、この患者群の治療レジメン（そのＢＣＲまでの時間および転移傾向の予測の両方）における早期のこの患者群の同定がその全生存に最重要であることが示唆される。不運なことに、既存の予測モデルはその正確性が制限され、その腫瘍病理に関して特定の患者のために個別化されていない。種々の遺伝的変化、環境的変化、および生活様式の変化がＰＣａの病理発生に関与しているにもかかわらず、現在、所与の患者の転帰を予測することができる単一の生物学的経路、遺伝子変異、または臨床的バイオマーカーは存在しない。根治的前立腺摘除が再度一般的になってから２１年後およびＰＳＡ使用が広まってから１５年後、泌尿器科医は、局所性疾患の治療によって最良に臨床疾患がなくなるか、全生存する患者を依然として区別できない。
【００８９】
臨床的フィーチャデータにのみ基づいた予後ノモグラムは、実際、臨床状態および転帰を有用に予測するが、精度および普遍性の両方を改良する必要がある（１６）。本発明の実施形態は、ＰＳＡ／ＢＣＲ前立腺摘除後の予後モデルの正確性を首尾よく改良するための「システム病理学（ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）」アプローチを提供する。これは、高度に正確且つ統合的な予測モデルを作製するための患者自身の腫瘍サンプルの「個別化した」表示（細胞および微小解剖学的形態計測特性、臨床プロフィール、および分子マーカーが含まれる）を示す。専門分野の使用により、ＰＳＡ再発の予想のための高度に正確な予測モデルが開発されている。これらの試みにより、予測モデルおよび予後モデルの生成におけるシステム病理学の有用性が立証された。さらに、分析により、制限された臨床的変数、分子バイオマーカー、および組織形態計測的フィーチャの組を誘導することができ、これを、指定された臨床結果に基づいて最適な患者の処置プランを構築するために泌尿器科医／病理学者によって使用される予測試験に含めることができることが示されている。ＰＳＡの再発に関連した選択された分子的フィーチャにより、成長因子シグナル伝達（下記のアンドロゲン受容体（以後、「ＡＲ」）による）および細胞結合脈管形成（ＣＤ３４による）の機構についての収束性の役割が示唆される。ＣＤ３４は、上皮細胞上に存在し、身体の脈管を裏打ちしている膜貫通糖タンパク質である。これらの所見および前立腺癌の進行の予測に及ぼす潜在的影響をより深く理解するためのさらなる研究は進行中である。モデルの開発および精度において重要ないくつかの新規の組織記述子（ｄｅｓｃｒｉｐｔｏｒ）に加えて、高度に正確で非主観的な定量的グリーソンスコアを一部示す選択された画像のセグメント化および形態計測的特性にも留意した。グリーソンスコアリングシステムに関する定義された形態計測的フィーチャには、腺構造の全外観の一部、上皮細胞の形状およびサイズ（細胞質成分）、上皮細胞核、および間質中で混合された単一上皮細胞の証明が一部含まれる。
【００９０】
アンドロゲン受容体タンパク質（ＡＲ）は、これらのホルモンが精巣のライディッヒ細胞によって合成された後に天然に存在する男性ホルモン（テストステロンおよびその５α還元代謝産物であるジヒドロテストステロン）を受け取る。特に、合成後、これらのホルモンは体内を循環し、ＡＲに結合する。受容体ＡＲを介して作用するアンドロゲンは、胎児中の男性生殖器および副生殖腺の発達、思春期男性における男性化および成長、ならびに成人における男性生殖力および生殖機能の維持を刺激する。アンドロゲン受容体は、他のステロイドホルモン受容体と共に、特異的遺伝子配列との相互作用を介して遺伝子転写を調節するトランス作動性転写調節タンパク質ファミリーを構成する。
【００９１】
前立腺癌に関するＡＲの研究により、癌細胞中のアンドロゲン受容体の存在と成長のための男性ホルモン刺激の依存との間に正相関が存在し得ることが示唆されている。例えば、Ｓｏｖａｋ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第６，４７２，４１５号は、早期における前立腺癌の成長はアンドロゲン駆動であり、少なくとも一過性にアンドロゲン枯渇によって停止することができることを提案している。Ｆｒｅｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第６，８２１，７６７号は、医師による前立腺癌の診断的評価におけるアンドロゲン受容体アッセイの使用が可能なＡＲの種々の測定方法を提案している。しかし、これらの研究は、本明細書中に開示の前立腺癌の出現を予測する自動化モデルと併せたＡＲ測定の使用を提案していなかった。
【実施例】
【００９２】
（実施例１）前立腺癌再発の予測
臨床データおよび形態計測データ
最初に５００ほどの多数の生形態計測的フィーチャを、Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ  Ｃｅｌｌｅｎｇｅｒソフトウェアに基づくＭＡＧＩＣ組織画像分析システムを使用して、各前立腺組織から抽出した。潜在的に有用なフィーチャが無視されるのを回避するために、生フィーチャの全セットを不可知的に選択した。しかし、これらの全形態計測的フィーチャは、平等に有益でありそうになく、全フィーチャセットに基づいて構築された予測モデルは、「次元の呪い（ｃｕｒｓｅ  ｏｆ  ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｉｔｙ）」によって予測成績が不十分である可能性が高いであろう（１３）。それにより、次元削減手順を適用し、８つの形態計測的フィーチャセットを最終的に選択した。
【００９３】
根治的前立腺摘除を受けた前立腺癌患者コホートから患者１５３人のサブセットに基づいて研究を行った。術後の測定可能な前立腺特異抗原（ＰＳＡ）を使用して、前立腺癌の再発（生化学的再発（ＢＣＲ）ともいう）を定義した。術後に患者を追跡した。最後の来院におけるその再発状態およびその追跡期間を記録し、右打ち切りデータセットを生成した。グリーソンスコアを、術前に生検検体から測定し、術後の切除した前立腺を使用して測定した。以下の４つの特異的な臨床的測定（すなわち、フィーチャ）を本研究で考慮した：（１）生検グリーソン分類、（２）生検グリーソンスコア、（３）術後グリーソン分類、および（４）術後グリーソンスコア。
【００９４】
臨床的に導かれたグリーソンスコアフィーチャ由来の形態計測的フィーチャを個別に分析して、ＰＳＡ／ＢＣＲ再発の確率およびＰＳＡ／ＢＣＲ再発までの期間を予測した。次いで、画像およびグリーソンスコア（フィーチャ）を組み合わせて、再発を確立し、再発までの期間を予測した。この共同のフィーチャセットによって達成された予測精度の改善は、画像フィーチャが実際にさらなる情報を提供し、それにより、再発予測率および全予測モデルを強化したことを示した。
【００９５】
この患者コホートが右打ち切り転帰データを有していたので、生存分析モデルは、再発予測のために構築されなければならない。異なるデータ型における潜在的バイアスを回避するために、以下の２つの生存分析法を使用した：１）コックス回帰モデル（１７）および２）上に記載されており、サポートベクトルマシンに適用されるＳＶＲｃ。５倍クロスバリデーションを使用して評価した一致指数を使用して、モデルの予測精度を測定した（１３）（１８）。
【００９６】
両方法を、以下の３つのデータセットに適用した：（１）グリーソンスコア臨床的フィーチャのみ；（２）選択された形態計測的フィーチャのみ；および（３）形態計測的フィーチャとグリーソンスコア臨床的フィーチャとの組み合わせ。実験結果を、表３に列挙する。
【００９７】
本実施例で選択された臨床的フィーチャは、ＢＸＧＧＴＯＴ、ＢＸＧＧ１、ＧＧＴＯＴ、およびＧＧ１であり、形態計測的フィーチャを、以下に関して選択した：上皮核（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ．Ｎｕｃｌｅｉ．ＭａｘＣｏｍｐａｃｔｎｅｓｓ）、バックグラウンド（Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ．ＳｔｄＤｅｖＡｒｅａＰｘｌ）、および管腔（Ｌｕｍｅｎ．ＭａｘＢｏｒｄｅｒＬｅｎｇｔｈＰｘｌ、Ｌｕｍｅｎ．ＭｉｎＲａｄｉｕｓｏｆｓｍａｌｌｅｓｔｅｎｃｌｏｓｉｎｇｅ、Ｌｕｍｅｎ．ＳｔｄＤｅｖＢｏｒｄｅｒＬｅｎｇｔｈＰｘｌ、Ｌｕｍｅｎ．ＳｕｍＢｏｒｄｅｒｌｅｎｇｔｈＰｘｌ、Ｌｕｍｅｎ．ＳｔｄＤｅｖＡｒｅａＰｘｌ、およびＬｕｍｅｎ．ＭｉｎＣｏｍｐａｃｔｎｅｓｓ）。より具体的には、本実施例では、管腔の領域、境界長、および形状（稠密度）に関連する形態計測的フィーチャを、疾患の進行に相関させるように決定した。管腔がより小さく、且つより稠密度が高いほど、癌が進行する可能性が高い。実際、より浸潤性の高い癌（グリーソン分類４および５）では、管腔が組織からほとんどまたは完全に消失すると予想され得る。上皮核領域に対する上皮核の長さおよび幅の比としてＤｅｆｉｎｉｅｎｓ  Ｃｅｌｌｅｎｇｅｒソフトウェアによって稠密度を計算した場合、上皮核の稠密度の形態計測的フィーチャは癌の進行と相関するとも判断された。これは、間質への上皮核の浸潤が癌進行につれて増加する（すなわち、進行癌を有する組織は、典型的には、多数の上皮核を含む）からであり得る。本実施例の転帰と相関すると判断されたバックグラウンドベースの形態計測的フィーチャにより、本分析で使用した実際の組織コアサイズを測定した。
【００９８】
【表３】
2010523979.tif 000022
表３によれば、形態計測的フィーチャの予測性能はグリーソンスコアに匹敵し、形態計測的フィーチャとグリーソンスコアとの組み合わせによってより高い予測率が達成される。この高い予測率により、組織画像分析システムによって抽出された形態計測的フィーチャが実際にグリーソンスコアを超えるさらなる情報を提供することが確認される。したがって、形態計測の使用により、全再発予測を強化することができる。
【００９９】
（実施例２）
前立腺癌再発および全生存の予測
臨床データ、形態計測データ、および分子データ
前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の再発をそれぞれ８８％および８７％の予測精度で首尾よく予測する２つの研究を行った。臨床的フィーチャ、分子的フィーチャ、および形態計測的フィーチャと機械学習との組み合わせにより、ロバストプラットフォームを作製した。このプラットフォームは、患者の診断、治療管理、および予後診断で広く適用されている。注目の転帰が任意の原因による死亡であった前立腺癌患者の全生存を予測するために第３の研究を行った。
【０１００】
根治的前立腺摘除を受けた５３９患者のコホートの研究を、前立腺摘除検体から構築した高密度組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を組み込みつつ行った。ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色組織切片を使用して形態計測研究を行い、分子生物学的決定因子を、免疫組織化学（ＩＨＣ）を使用して評価した。ＰＳＡの再発および全生存の両方のための予測モデルは、管理された多変量学習によって選択されたフィーチャセットから導いた。各ドメイン中の完全な非欠測データ（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｎｏｎ−ｍｉｓｓｉｎｇ  ｄａｔａ）を有する患者を、打ち切りデータを操作するために開発した回帰のためのサポートベクトルマシン（ＳＶＲｃ）を使用して評価した。モデルの予測性能を、リスク群を定義するために使用した生成スコアを伴う一致指数（ＣＩ）を使用して評価した。
【０１０１】
１３２患者のコホートを使用して、ＰＳＡ再発を精度８８％で予測した４１個のフィーチャ（１７個の臨床的フィーチャ、１４個の分子的フィーチャ、および１０個の形態計測的フィーチャを含む）を選択した。２６８患者のコホートでは、１０個のフィーチャ（３臨床的フィーチャ、１個の分子的フィーチャ、および６個の形態計測的フィーチャ）により、ＰＳＡ再発を精度８７％で予想可能なことが見出され、さらに、１４個のフィーチャ（２個の臨床的フィーチャ、１個の分子的フィーチャ、および１１個の形態計測的フィーチャ）により、全生存を精度８０％で予測可能なことが見出された。ログランク検定を使用して、リスク群の間で腫瘍再発および死亡の有意差が認められた（ｐ＜０．０００１）。
【０１０２】
本研究により、機械学習で分析される臨床的変数、分子マーカー、および組織学を組み合わせた新規のシステムアプローチの使用によって前立腺癌の再発傾向の予測が前進的に改善されることが明らかとなる。
【０１０３】
患者の臨床的フィーチャ。根治的前立腺摘除を受けた５３９患者のコホートを研究した。１７個の臨床的フィーチャ（以下の表４に示す）を、患者の年齢、術前ＰＳＡ、およびグリーソン分類が含まれる非特定の（ｄｅ−ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ）患者情報を使用して遡及的に収集した。
【０１０４】
【表４】
2010523979.tif 000023
組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を、前立腺摘除検体の選択されたブロックから構築した。各検体由来の直径０．６ｍｍの組織コアを、各レシピエントパラフィンブロックについて三連で無作為に整列させた（Ｂｅｅｃｈｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇ，ＭＤ）。切片（５μｍ）のこれらのＴＭＡブロックを、形態計測分析および免疫組織化学（ＩＨＣ）分析のために使用される荷電ポリリジンコーティングスライド上に置いた（以下を参照のこと）。
【０１０５】
臨床的フィーチャの欠測値を、全フィーチャを含む柔軟なさらなる回帰モデルを使用して帰属させて転帰と無関係にフィーチャの欠測値を評価し、完全な臨床データ（帰属後）、形態計測データ、および分子データならびに非欠測転帰の情報を有する患者のみをさらに研究した。研究１（概念実証）に有効なサンプルサイズは、患者１３２人からなる。目的の一次分類は、患者が前立腺癌手術後に再発するかどうかについてであった。ＰＳＡ＞０．２ｎｇ／ｍＬで２つの連続した評価を行った患者を、前立腺癌が再発したと見なした。患者がその最後の来院以後に再発しなかったか患者の転帰が最近の来院以後に未知である場合（すなわち、追跡失敗）、患者の転帰を打ち切りデータと見なした。再発までの期間を、根治的前立腺摘除からＰＳＡ（生化学的）再発までの期間（月）と定義した。
【０１０６】
研究１由来の患者１３２人のうちの１２９人を含む最初の患者５３９人のコホート由来の患者２６８人を使用して研究２を行った。ＴＭＡコア由来のＨ＆Ｅ画像を使用する代わりに、根治的前立腺摘除由来の全切片を分析した。研究３は、同一の患者２６８人のコホートを試験したが、全生存を予測するために使用し、注目の転帰は任意の原因による死亡であった。
【０１０７】
画像分析および形態計測研究。各患者の組織コアまたは全切片から回収された元の腫瘍組織の代表的領域をデジタル化し、Ｈ＆Ｅ染色スライドを使用して分析した。２０倍の光学顕微鏡によってＳＰＯＴ  Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＱＥカラーデジタルカメラ（ＫＡＩ２０００）を使用して画像を取り込んだ。８０％超が腫瘍を含む領域のみを、最適な画像セグメント化および定量分析のために選択した。
【０１０８】
分子分析。１２のバイオマーカー（サイトケラチン１８（管腔細胞）、サイトケラチン１４（基底細胞）、ＣＤ４５（リンパ球）、ＣＤ３４（内皮細胞）、ＣＤ６８（マクロファージ）、Ｋｉ６７（増殖）、ＰＳＡ（ｈＫ−３、カリクレイン）、ＰＳＭＡ（成長受容体）、サイクリンＤ１（細胞周期）、ｐ２７（細胞周期）、アンドロゲン受容体（内分泌）、およびＨｅｒ−２／ｎｅｕ（シグナル伝達）が含まれる）のパネルを、標準的な発色免疫組織化学を使用して全部で７つのＴＭＡブロックに適用した。全抗原についてプレッシャークッカー中で０．０１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６）を３０分間使用して抗原回復を行った。かかる過程に関する例示的方法およびシステムは、上記で援用され、発明の名称が「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｆｉｘｅｄ−ｔｒｅａｔｅｄ  ｃｅｌｌ−ｌｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」である２００３年７月２１日に出願された米国特許出願第１０／６２４，２３３号（現在、米国特許第６，９９５，０２０号）に記載されている。一次抗体（表５に示す）を、０．１％Ｔｗｅｅｎを含むＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水中で希釈し、４℃で１６時間アプライし、その後に１０００倍希釈の二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ）でビオチン化した。
【０１０９】
【表５】
2010523979.tif 000024
ネガティブコントロールスライドに、一次抗体として正常マウス血清（ＤＡＫＯ）を投与した。スライドをＨａｒｒｉｓヘマトキシリンで対比染色し、２人の独立した病理学者によって観察し、全ての矛盾を第３の病理学者によって解決した。５３９人の全患者およびその各三連のコア由来の記録したＩＨＣデータは、調査中の特定の抗原について染色した細胞の比率および強度（０〜３＋）を含んでいた。適用可能な場合、これらの２つの測定を組み合わせて、特定のバイオマーカーについての染色指数を作製した（以下の表６は分子的フィーチャの例示的リストを示す）。ＡＲ（アンドロゲン受容体）、ＣＫ１４（サイトケラチン１４）、サイクリンＤ１、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、ｐ２７、およびＨｅｒ２／ｎｅｕの染色指数を計算する一方で、残りのマーカー（すなわち、Ｋｉ６７、ＣＫ１８（サイトケラチン１８）、ＣＤ４５、ＣＤ６８）を、所与の強度を有する陽性細胞の比率に基づいて評価した。これらのバイオマーカーを、以下にさらに記載する。染色指数は０〜３００の範囲であり、以下のように計算した：１＊（バイオマーカーについて強度１＋の細胞染色陽性の比率）＋２＊（バイオマーカーについて強度２＋の細胞染色陽性の比率）＋３＊（バイオマーカーについて強度３＋の細胞染色陽性の比率）（式中、細胞染色陽性の比率は、計算した１００個の細胞あたり同定された陽性細胞数をいう）。この染色指数に関するさらなる詳細は、（１９）に記載されている。かかる染色指数は例示のみを目的とし、本発明の範囲を逸脱することなく、分子的フィーチャの任意の他の測定方法を使用することができる。
【０１１０】
上記のバイオマーカーの考察では、ｐ２７は、サイクリン−ＣＤＫ複合体に結合して細胞周期をＧ１期で停止させるサイクリン依存性キナーゼインヒビターと呼ばれる細胞周期レギュレーターファミリーに属する。バイオマーカーｐ２７は、アポトーシスを促進し、いくつかの組織の最終分化で役割を果たすと改訂されている。免疫組織化学により、核ｐ２７発現の喪失は、より悪性の表現型に関連する。Ｈｅｒ２／ｎｅｕは受容体チロシンキナーゼのＥＧＦＲファミリーのメンバーであり、一定のヒト癌の病理発生において重要な役割を果たす。細胞膜における免疫組織化学によるＨｅｒ２／ｎｅｕの過剰発現は、より悪性の乳癌型に関連している。Ｋｉ６７は、種々の強度で核を染色し、問題の腫瘍サンプルの増殖指数（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｉｎｄｅｘ）を評価するか細胞活性を測定するために使用される多数の増殖マーカーの１つである。ＣＤ４５は、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞など）などの免疫細胞になる運命にある細胞を同定するために使用される細胞表面抗原である。強度は、その分布／存在および他の組織要素との関連ほど重要でないと考えられる。ＣＤ６８は、リソソームと密接に関連する細胞質抗原である。これは単球分化カスケードを介して発現されるが、通常、単球よりマクロファージで強度が高い。
【０１１１】
【表６】
2010523979.tif 000025
分析的および統計的研究。以下の３つの研究を行った：患者１３２人を使用した最初の概念実証分析（研究１）および患者２６８人を使用した長期調査（研究２および研究３）。研究１および研究２の両方では、分析は、以下の２つの工程からなる：将来の根治的前立腺摘除患者における生化学的（ＰＳＡ）再発を予測するためのモデル使用を最終目的とする、ＰＳＡ再発を予測するフィーチャの同定およびこれらのフィーチャに基づいたモデルの構築。研究３の目的は、フィーチャを同定し、前立腺摘除後の全生存を予測するためのモデルを構築することである。上記型の打ち切りデータについてのサポートベクトル回帰（ＳＶＲｃ）を使用して、これらの各研究で得られたモデルを構築した。
【０１１２】
モデルの予測精度を、一致指数（ＣＩ）を使用して評価した。打ち切りデータの転帰の取り扱いにおいて、これは、最適の測定法である。一致指数は、以下の基準のいずれか１つを満たす２人の無作為に選択した患者の予後スコアの間の一対比較に基づく：両患者において第１の患者の事象および事象時間が第２の患者より短いことを経験したか、第１の患者のみにおいて事象および第１の患者の事象時間が第２の患者の追跡時間よりも短いことを経験した。ＣＩは、モデル由来のより高い予後スコアを有する患者がより低いスコアを有する患者より短い時間内に事象を経験し、ＲＯＣ曲線下の領域（ＡＵＣ）と強く関連する確率を評価する。他の測定基準を使用して、予測モデルの能力を測定することもできる。例えば、診断の評価で感度および特異性を使用することができる。別の例として、機会のみが、例えば、層間の認められた差異を担う確率を示す「ｐ値」を使用することができる（例えば、図８、１０、および１２を参照のこと）。したがって、ｐ値がより低いと転帰に対して真の統計的関連がある可能性がより高くなる。典型的には、標準は、０．０５以下の任意のｐ値が統計的に有意であることである。
【０１１３】
研究１。本分析では、上記ＳＶＲｃモデルを、臨床データ、分子データ、および形態計測データに連側的に適用した。ここで、臨床的フィーチャは、分子データにつながるＳＶＲｃを介した「グリーディ・フォワード（ｇｒｅｅｄｙ−ｆｏｒｗａｒｄ）」  フィーチャ選択（「ＦＳ」）法のためのアンカーとしての役割を果たす。この工程後、アンカーとして臨床データと選択された分子的フィーチャとの組み合わせを使用して、形態計測データに対する第２のＳＶＲｃグリーディ・フォワードフィーチャ選択法を行った。最後の工程は、最終モデルを誘導するための臨床的フィーチャ、選択された分子的フィーチャ、および選択された形態計測的フィーチャとの組み合わせにおけるグリーディ・バックワード選択法の実施を含んでいた。フィーチャ選択中、フィーチャをモデル中に入力（または保持）するかどうかを決定するための基準は、そのフィーチャの存在（または非存在）によって一致指数が増加する（予測情報が増加する）かどうかに基づいた。
【０１１４】
内部検証および外部検証の両方を使用して予測精度についてモデルを評価した。５倍クロスバリデーションを使用して内部検証を行った。外部検証を行うために、患者コホートから一連の患者試験組を作製し、予測された転帰を、一致指数を介してこれらの患者の実際の転帰と比較した。この２レベルの検証デザインの適用では、患者のサブセットを患者レコードのフルセットから無作為に選択し、残りの患者のみを使用し、前述の手順を使用して予測モデルを構築した。次いで、非公開のレコードを使用して訓練されたモデルに適用し、予想精度を得た。これら２つの工程をＢ回繰り返し、予測率Ｂを得た。ここで、最終予測率は平均であった。最終モデルのために選択されたフィーチャは、作製された異なるモデルＢで十分な時間のようであるフィーチャであった。
【０１１５】
選択されたフィーチャセットを使用して、一致指数の直接的最大化によって神経回路網モデルを構築した。特に、上記型の神経回路網（ＮＮｃｉ）を使用した。そのネットワークを、実質的に一致指数の近似にしたがって目的関数を使用して訓練した。最終モデルの出力を使用して、ＰＳＡ再発についての各患者の将来のリスクを評価した。
【０１１６】
研究２。本研究の目的は、研究１と同一であった。しかし、異なるフィーチャの選択および検証手順を使用した。アンカーアプローチの代わりに、全フィーチャをＰＳＡ再発（一致指数によって測定）までの時間とのその関連によって格付けし、一定の所定の閾値（ＣＩ＞０．６０）をパスしたフィーチャを選択した。フィーチャの画像化数を本発明者らの専門家によって減少した後にこれを行い、次いで、これらのフィーチャを一連のｎ−フィーチャモデル（例えば、１−フィーチャ、２−フィーチャ、３−フィーチャなど）で評価した。フィーチャ前進選択手順を使用して、各ｎ−フィーチャモデルの一致指数を最大化するフィーチャを、次のｎ＋１−フィーチャモデルで使用した。ＣＩが所定の閾値によって改善することができないと、この過程を終了した。次いで、バックワードフィーチャ選択過程を使用して、ＣＩを増加させる目的でフィーチャを除去した。任意のフィーチャの除去によってＣＩが改善されなかった場合、この過程を終了した。
【０１１７】
簡潔なブーストラップ技術を、フィーチャ選択のために使用した。このアプローチでは、患者を復元抽出して訓練組として使用した一方で、モデルを選択していない患者に関して評価した。比較として、このフィーチャ選択法を、Ｋａｔｔａｎ  ｅｔ  ａｌに付与された米国特許第６，４０９，６６４号（その全体が本明細書中で参考として援用される）に記載のＫａｔｔａｎ術後ノモグラムで見出されたフィーチャのみを使用して行った。最終モデルの出力を使用して、それぞれの未来の患者のＰＳＡ再発リスクを評価した。
【０１１８】
研究３。本研究の目的は、研究２で分析した同一のコホートおよびフィーチャならびに同一のフィーチャ選択法を使用して全生存を予測するフィーチャを同定することであった。最終モデルの出力を使用して、任意の原因によるそれぞれの未来の患者の死亡リスクを評価した。
【０１１９】
結果
一般的なアプローチは、システム病理学（形態計測的分析と、分子署名と、患者の臨床プロフィールとの組み合わせ）を適用して、前立腺摘除後の前立腺癌患者の状態のコホートにおいてＰＳＡ再発および全生存のための予測モデルを構築することであった。研究１由来の臨床病理学的フィーチャのみを標準的なＣｏｘモデル分析で使用した場合、ＰＳＡ再発の予測精度は５９％でしかなかったことに留意することは重要である。形態計測的フィーチャおよび分子的フィーチャのＳＶＲｃとの統合後に予測精度のレベルが８８％に増加した。以下の項は、どのようにしてこの改良が達成されたかを記載する。
【０１２０】
研究１。このコホート中の患者１３２人について、診断における年齢の中央値は６３歳（最年少：４０歳、最年長８１歳）であり、術前ＰＳＡの中央値は８．２ｎｇ／ｄｌ（最小値：１．１、最大値：８１．９）であった。前立腺摘除サンプルに基づいて、３２％がグリーソンスコア７未満であり、６０％がグリーソン７であり、残りの８％が７超であった。患者６９人（５２％）がｐＴ２Ｎ０Ｍ０であり、患者４０人（３０％）がｐＴ３ａＮ０Ｍ０であり、残りの患者２３人（１８％）がｐＴ３ｂＮ０Ｍ０またはｐＴｌ−３Ｎ＋であった（表７は、３つの研究についての臨床的特徴のまとめリストを含む）。
【０１２１】
【表７−１】
2010523979.tif 000026
【０１２２】
【表７−２】
2010523979.tif 000027
【０１２３】
【表７−３】
2010523979.tif 000028
２５人（１５％）の患者がＰＳＡ再発を経験した一方で、残りの患者（８５％）は打ちきられた。打ち切られた患者について、追跡期間の中央値は６０．８ヶ月（すなわち、５年を少し超過する）であった。ＰＳＡ再発までの全時間の中央値に届かなかった。ＰＳＡ再発が予測される全１７の臨床的フィーチャを選択し、そのうちで最も有益なフィーチャを以下に注釈する（モデルによって選択された臨床病理学的フィーチャおよび時間数）：生検グリーソン分類（１１２）、人種（１１２）、ＵＩＣＣ  臨床病期（１１０）、倍数性（１１０）、およびＤＲＥの結果（１０９）。
【０１２４】
画像分析および形態計測研究。図５ａおよび図５ｂは、本発明にしたがってセグメント化および分類した後に得たそれぞれ健康および異常な前立腺組織のデジタル化画像を示す。例示のために、組織中の種々の病理学的オブジェクトをラベリングした。画像分析ソフトウェアによって全部で４９６個の形態計測的フィーチャ（表１に示す）を得た。
【０１２５】
４９６個の形態計測的フィーチャのうち、図６に示すＰＳＡ再発を予測する１０個の形態計測的フィーチャを選択した。以下の病理学的オブジェクト（赤血球、上皮核、管腔、間質、細胞質、および組織バックグラウンド）に関連して以下の形態計測的フィーチャ（フィーチャの隣の括弧内の数字は、最終モデルの生成中に転帰と相関するフィーチャが何回選択されたかを示す）を選択した：赤血球の最小長（ピクセル）（２０）、上皮核の最大稠密度（１７）、最小包囲（ｅｎｃｌｏｓｕｒｅ）の管腔最小半径（１４）、上皮核最小幅（ピクセル）（１１）、間質最大密度（１０）、管腔最小境界長（ピクセル）（１０）、上皮核最小標準偏差チャネル２（１０）、最小包囲の上皮核最大半径（１０）、境界長の細胞質標準偏差（ピクセル）（１０）、および領域のバックグラウンド標準偏差（ピクセル）（１０）。より詳細には、本実施例では、赤血球の長さ、管腔の最小包囲の半径および境界長、細胞質の境界長、間質の密度（例えば、間質によって覆われた領域の平方根をその半径で除した値）、およびバックグラウンド領域の形態計測的フィーチャを、転帰と相関するように決定した。稠密度、幅、グリーンチャネル値、および上皮核の最小包囲の半径の形態計測的フィーチャ（例えば、オブジェクトと同一領域を有する楕円を作製し、次いで、この楕円が上皮核を完全に囲むまで拡大し、元の楕円の半径に対する最も小さな包囲楕円の比を計算する）も、転帰と相関するように決定した。
【０１２６】
これらの相関のうちの少なくともいくつかについての種々の可能な理由は、実施例１と併せて上に記載されている。例えば、上皮核の稠密度の形態計測的フィーチャは、円周パターンの上皮細胞の「背中合わせの」性質を反映し得る。それにより、腺および管腔の形成／分化の喪失が示唆され、したがって、より高いグリーソン分類（すなわち、より高い疾患の進行）と一致するであろう。また、管腔の最小包囲の半径の形態計測的フィーチャは、管腔の全サイズに関連し、グリーソン分類が増加するにつれて劇的に減少および縮小する。
【０１２７】
さらに、本研究で決定した相関は、上皮核が間質に浸潤するにつれて、上皮核が、典型的には、形状（例えば、変動の少ないさらなる円形）およびサイズ（例えば、領域および境界長）の変動がより小さくなるようになり、色の変動がより小さくなるという仮説によって少なくとも一部を説明することができる。この間質の浸潤はまた、なぜ間質の形態計測的フィーチャが疾患の進行と相関するように決定されたのかを説明することができる。特に、癌画像は、典型的には、少量の間質によって特徴づけられる。これは、癌が進行するにつれて間質領域が上皮細胞の細胞質に置換されるからである。これにより、間質の密度値がより高くなる。これは、間質稠密度が減少し、形状がよりフラクタルになるからである（オブジェクトが変形し、より薄くなるにつれて、オブジェクト半径が領域を超えて増加する）。本研究で決定された相関についてのさらなる根拠は、組織全体を移動する豊富な赤血球が、細胞が前立腺から遊離して外部に播種されるための手段として疾患の進行に関連し得る血管形成または新規の血管形成のいくつかの測定値を反映し得、それにより、ＰＳＡ／ＢＣＲ再発の臨床結果に影響を及ぼすことであり得る。
【０１２８】
上記のように、転帰と相関するように本明細書中に提供した教示によって決定された少なくともいつくかの特定の形態計測的フィーチャが、例えば、形態計測的フィーチャを計算するために本発明によって使用される特定のハードウェア、ソフトウェア、またはその組み合わせに依存し得ると理解されるであろう。Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ  Ｃｅｌｌｅｎｇｅｒソフトウェアおよび本明細書中に記載のソフトウェアによって測定された特定の形態計測的フィーチャは例示のみを目的とし、本発明の範囲を逸脱することなく任意の他のハードウェア、ソフトウェア、またはその組み合わせを使用することができる。
【０１２９】
分子分析。ＩＨＣによって評価された１２のバイオマーカーのうち、全部で４３個の固有のフィーチャを記録した（以下の表８ａ、８ｂ、および８ｃは、認められたバイオマーカー−分子的フィーチャのまとめを示す）。
【０１３０】
【表８−１】
2010523979.tif 000029
【０１３１】
【表８−２】
2010523979.tif 000030
これらの１２種の抗体から、ＰＳＡ再発と相関する１４個の分子的フィーチャを含む８つのバイオマーカーを選択した。より高度に選択された分子的フィーチャのいくつかの例を、以下のように注釈づけし（バイオマーカー−モデルによって選択された回数）、これらのフィーチャには、以下が含まれる：ＡＲ染色指数−腫瘍（９３）、ＡＲ染色指数−萎縮性腺（５４）、ＣＤ３４−関連腫瘍／ＰＩＮ（２２）、Ｋｉ−６７−腫瘍（１８）、およびＣＤ４５−ＰＩＮに関連（１７）（ＰＩＮは前立腺上皮内新生物である）。図７ａおよび７ｂは、それぞれＡＲおよびＣＤ３４の発現プロフィールを証明する代表的な視野を示す。バイオマーカー発現のプロフィールは、高度に選択された、いくらか異種のＡＲおよびＣＤ３４の発現パターンに関して注目に値した。これらのマーカーならびに腫瘍、萎縮性腺（ＡＲについて）、および腫瘍／ＰＩＮ（ＣＤ３４について）とのその関係により、ＰＳＡ再発の臨床転帰に及ぼす生物学的および機能的な有意性が示唆される。選択されたマーカーの第２の群はＫｉ−６７およびＣＤ４５を含み、その両方がＡＲおよびＣＤ３４と比較した場合に顕著であるが選択頻度が全体的に低かった。
【０１３２】
分析および統計研究。モデルの訓練（Ｎ＝１００）および試験（Ｎ＝３２）のために１２０個のランダムスプリットを作製した上記の専門知識およびドメイン特異的フィーチャ選択手順の両方を使用して、最終フィーチャセットを全部で４１個のフィーチャに削減させた。そのうちの１７個は臨床的フィーチャであり、１０個は形態計測的フィーチャであり、１４個は分子的フィーチャであった。図５は、選択されたフィーチャの完全なリストを示す。１０個の形態計測的フィーチャは上記である。臨床的フィーチャおよび分子的フィーチャを、以下にさらに記載する。
【０１３３】
臨床的フィーチャ
１．生検グリーソンスコア：病理学者によって行われた複数の針生検組織サンプルに割り当てるグリーソン分類（優位および二次的）のまとめ。各悪性度の生成によって組織学によって標準化されたいくらか主観的な前立腺癌の構造を示す手段を作製するために、グリーソンスコアリングシステムを構築した。悪性度は、腺単位および上皮細胞の分化度に基づいて１から５までの範囲である。優位（一次）および準優位（二次）パターンを共に加えて、グリーソンサマリー（Ｇｌｅａｓｏｎ  Ｓｕｍｍａｒｙ）を作成した。さらに、全間質稠密度のフィーチャ、上皮細胞サイズ、および核フィーチャを、時折、全分類システム中で考慮する。
２．人種（例えば、アフリカ系アメリカ人、コーカサスなど）
３．ＵＩＣＣ期：Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ＣａｎｃｅｒのＴＮＭ病期分類システムを、癌の臨床病期分類を定義するために使用する。ここで、「Ｔ」は腫瘍サイズを示し、「Ｎ」はリンパ節の関与を示し、「Ｍ」は遠位部位への転移を示す。
４．倍数性の結果：前立腺癌上皮細胞内の全ＤＮＡ含量を反映するＤＮＡ含量。良性細胞および挙動が良好な（ｗｅｌｌ−ｂｅｈａｖｅｄ）腫瘍細胞は成長し、規則正しく分裂する。静止期では、これらの細胞は１つの完全な染色体組を含む（これは、二倍体条件である）。この完全な染色体組は、Ｍａ由来の２３個（すなわちＮ）の染色体およびＰａ由来の２３個（この場合もＮ）の染色体（合計で２Ｎに等しい）からなる。細胞はその染色体数を倍加しなければならず、それにより分裂して２つの完全な染色体組（これは４Ｎ、すなわち、四倍体状態である）を作製することができる。分裂の完了後、新規の各細胞は遺伝子材料の半分を受け、再度二倍体（２Ｎ）になる。ＤＮＡ倍数性分析がこれらの細胞群に対して行われる場合、ほとんどの細胞が二倍体であり、その小画分（分裂する準備を進めている細胞）が四倍体であろう。さらに、各細胞中の遺伝子材料の量の測定およびグラフの作成では、主な二倍体ピークおよび小さな四倍体ピークが認められるであろう。細胞中のＤＮＡ量を、遺伝子材料に結合する色素でのＤＮＡの染色によって測定することができる。この色素（Ｆｕｅｌｇｅｎ  ｓｔａｉｎ）の濃度および分布を、画像分析マイクロアレイによって測定することができる。
【０１３４】
腫瘍が悪化した場合、腫瘍は、かつて分裂していたように規則的には分裂しない傾向がある。完全な染色体組を有する静止状態の代わりに、静止期は１つの組または半分のみを有し得る。かかる細胞は、二倍体および四倍体のいずれでもなく、その中間であるＤＮＡ含量を有するであろう。上記グラフ上のこれらの細胞のプロットにより、他の２つのピークの中間の異数性ピークが得られるであろう。研究により、有意な異数性ピークを有する腫瘍は、ピークを持たない腫瘍と同様に、挙動しないことが示された。倍数性状態と核グレードとの間に強い相関が存在するので、これは驚くべきことではない。核グレードを、十分な前立腺癌の経験を有する任意の病理学者によって評価することができる。ＤＮＡ倍数性分析が付加される価値は、標準化された技術を使用して研究所間で比較することができ、グリーソンスコアリングの近似精度を迅速にチェックするために使用することができる客観的測定であることである。例えば、異数性ピークを有する任意のグリーソンスコア２＋２＝４または２＋３＝５個の腫瘍を、スコアの予想される調整のために、スコアを潜在的に再評価すべきである。
５．ＤＲＥの結果：触診による前立腺内および前立腺外の拡大の範囲を決定するために使用される直腸の指診の結果（例えば、陰性または陽性）。
６．リンパ節の関与：臨床的／外科的検査または前立腺摘除時のいずれかによって評価することができるリンパ節が腫瘍細胞（例えば、前立腺癌上皮細胞）を含む範囲の測定。
７．優位生検グリーソン分類：上記の生検グリーソンスコアの説明を参照のこと。これは、生検または前立腺摘除検体で認められた優位グリーソン分類パターンを反映する。
８．Ｓ期の倍数性率：細胞周期の増殖期またはＳ期にあり、且つ腫瘍の潜在的成長を反映する細胞内容物の割合を示す。
９．術後グリーソンスコア：前立腺切除術サンプルの種々の領域由来の術後に採取した組織のスコアリング。
１０．ＴＮＭ期：前立腺摘除後のＵＩＣＣおよび組織サンプルの病理学的試験に基づいた腫瘍、結節、および転移。
１１．優位術後グリーソン分類：前立腺摘除検体中に存在する最も支配的な組織学的フィーチャを示す優位グリーソン分類。
１２．年齢
１３．精嚢の関与：腫瘍による精嚢の浸潤。
１４．術前ＰＳＡ：手術前に認められるＰＳＡレベル。
１５．倍数性画分比率：上記の倍数性の結果を参照のこと。
１６．切除縁の関与：腫瘍／前立腺が手術時に除去された床が腫瘍細胞を含む範囲を反映する腫瘍による切除縁の関与。
１７．嚢外の関与：前立腺被膜を超えた腫瘍の拡大。
【０１３５】
分子的フィーチャ
１．ＡＲ−腫瘍：腫瘍についてのアンドロゲン受容体（ＡＲ）染色指数。これは、ＡＲについて陽性染色された細胞の比率および強度の基準である。前立腺癌に関して、染色指数は、評価した前立腺サンプル中の上皮細胞の核中で検出される褐色の反応生成物の程度を示すことができる。
２．ＡＲ−腺：腺構造内に存在する腫瘍についてのＡＲ染色指数。
３．ＣＤ３４−腫瘍／ＰＩＮ：腫瘍およびＰＩＮに関連する血管の内皮細胞へのＣＤ３４の局在化。
４．Ｋｉ６７−腫瘍２：腫瘍上皮細胞核内のｋｉ６７陽性核の同定。
５．ＣＤ４５−ＰＩＮ３：ＰＩＮに関連するｆＣＤ４５陽性リンパ球の同定。
６．ＣＤ３４−腫瘍／間質：腫瘍に関連する血管へのＣＤ３４の局在化。
７．Ｋｉ−６７−腫瘍３：上記を参照のこと。
８．ｐ２７−腫瘍：腫瘍上皮細胞の核内のｐ２７の同定。
９．Ｃ１４−ＰＩＮ：腺単位の（上皮）基底細胞中のサイトケラチン１４の同定。
１０．ＣＤ３４−腫瘍：腫瘍に関連する血管に対するＣＤ３４の局在化。
１１．ＰＳＡ−腺：腺単位の管腔上皮細胞に対するＰＳＡの同定。
１２．ＰＳＭＡ−ＰＩＮ：ＰＩＮとして同定された領域の腺／管腔組織に対するＰＳＭＡの同定。
１３．ＣＤ３４−ＰＩＮ／間質：ＰＩＮに関連する血管へのＣＤ３４の局在化。
１４．ＣＤ４５−腫瘍３：腫瘍に関連するＣＤ４５陽性リンパ球の同定。
【０１３６】
ＳＶＲｃを使用してこの過程中にデータの各ドメインを分析した場合、モデルの予測精度が増加した。臨床データのみを調査する場合、内部検証を使用して、一致指数は０．７９であった。分子ドメイン由来のフィーチャの付加により、一致指数は０．８１に増加した。形態計測的フィーチャの付加によって形成された最終モデルの一致指数は、０．８４に到達した。これらの内部検証された各モデルも外部検証し（上の材料と方法に記載のように）、同一の傾向が認められた。最終的に選択されたフィーチャセットに対してＮＮｃｉを使用して、一致指数は０．８８に到達した。
【０１３７】
ＮＮｃｉおよびＳＶＲｃモデルの得られた出力を、各患者についてのＰＳＡ再発の相対リスクの評価と解釈することができる。このスコアの四分位値（≦２５％、＞２５％〜７５％、＞７５％）を使用して、患者のリスク群を作製した；ＮＮｃｉモデルに従った各リスクについての再発のカプラン・マイヤー評価を図８に示す。群は、ＰＳＡ再発までの期間に統計的有意差を示した（ログランク検定、ｐ値＜０．０００１）。ｐ値は、機会のみが、層（これらの実施例中のリスク群）の間の認められた差異を担う確率を示す。したがって、ｐ値がより低いと真の統計的関連がある可能性がより高くなる。一般に、０．０５以下の任意のｐ値は統計的に有意である。
【０１３８】
研究２。本コホート中の患者２６８人（研究１で分析した患者１３２人のうちの１２９人を含む）について、診断時の年齢の中央値は６３歳（最年少：３８歳、最年長８１歳）であり、根治的前立腺摘除前ＰＳＡの中央値は７．８ｎｇ／ｄｌ（最小値：０．９、最大値：８１．９）であった。前立腺摘除サンプルに基づいて、腫瘍の４０％はグリーソンスコアが７未満である一方で、前立腺摘除術の５５％がグリーソン７であった。前立腺摘除術の残りの５％は、グリーソンスコアが７超であった。患者１５７人（５９％）は、ｐＴ２Ｎ０Ｍ０疾患と診断され、患者７２人（２７％）はｐＴ３ａＮ０Ｍ０と診断され、残りの患者３９人（１４％）はｐＴ３ｂＮ０Ｍ０またはｐＴｌ−３Ｎ＋と診断された（このコホートについての分析された全臨床病理学的フィーチャの詳細については、前出の表５を参照のこと）。３８人（１４％）の患者はＰＳＡ再発を経験した一方で、残りの患者（８６％）は打ち切った。打ち切られた患者について、追跡期間の中央値は５８．７ヶ月（すなわち、５年を少し下回る）であった。ＰＳＡ再発までの全時間の中央値に届かなかった。ＰＳＡ再発が予測される以下の３つの臨床的フィーチャを選択した：ＴＮＭ  臨床病期、切除縁、およびリンパ節。
【０１３９】
画像分析および形態計測研究。画像分析ソフトウェアのアップデートバージョンを使用するが同一のＨ＆Ｅ染色スライドを分析して、全部で３５０個の形態計測的フィーチャを生成した（上記の表２に示す）。
【０１４０】
図９は、３５０個のフィーチャのうちのＰＳＡ再発が予測される６個の形態計測的フィーチャを選択したことを示し、これらの形態計測的フィーチャは、上皮核、間質、細胞質、赤血球、および管腔の病理学的オブジェクトに関連した（すなわち、ＥｐｉｔｈｅｌｉａｌＮｕｃｌｅｉＭｉｎＣｏｍｐａｃｔｎｅ０２１５、ＳｔｒｏｍａＭａｘＳｔｄｄｅｖＣｈａｎｎｅｌ３０５６９、ＣｙｔｏｐｌａｓｍＳｔｄｄｅｖＭａｘＤｉｆｆ０１４８、ＲｅｄＢｌｏｏｄＣｅｌｌＭｅａｎＡｒｅａＰｘｌ０３８６、ＲｅｄＢｌｏｏｄＣｅｌｌＳｔｄｄｅｖＡｒｅａＰｘｌ０３８８、およびＬｕｍｅｎＭｉｎＡｓｙｍｍｅｔｒｙ０２９５）。より詳細には、本研究では、転帰と相関する上皮核の稠密度、間質の青色チャネル値、細胞質の最大差（例えば、細胞質の全色チャネルにわたるその最大値から引いた細胞質に属する最小平均値。結果をオブジェクト輝度で除する）、赤血球領域、および管腔の非対象性の形態計測的フィーチャを選択した。
【０１４１】
これらの相関のうちの少なくともいくつかについての種々の可能な理由を、上記の実施例１および／または研究１と併せて記載する。例えば、形態計測的フィーチャ（上皮細胞の稠密度、浸潤上皮細胞による間質の変動および破壊、および管腔サイズ減少の証拠が含まれる）は全て、より高いグリーソン分類（すなわち、より高い疾患の進行）の組織学的証拠を提供するであろう。より高いグリーソン分類により、より浸潤性の高い前立腺腫瘍が示唆され、これは、術後ＰＳＡ再発を支持する腫瘍の転移および／または拡大を支持するであろう。さらに、種々の形式の赤血球の同定により、多数の血管が示唆されるであろう。さらなる血管の証拠により、上皮細胞が前立腺から抜け出し、ＰＳＡを産生する外部に分布することができる可能な経路が作製されるであろう。
【０１４２】
研究２で選択された臨床的フィーチャおよび分子的フィーチャを図９に示し、以下に列挙する。これらの臨床的フィーチャおよび分子的フィーチャは、上記で説明されている。
【０１４３】
臨床的フィーチャ
１．ＴＮＭ期
２．切除縁の関与
３．リンパ節の関与
分子的フィーチャ
１．ＡＲ  染色指数（腫瘍）
図９中の各数字は、対応するフィーチャに基づいた予測モデルの一致指数を示し、図９中の全ての他のフィーチャは、より小さな数字を有する。例えば、０．８４８３は、フィーチャ（ＴＮＭ臨床病期、切除縁、ＥｐｉｔｈｅｌｉａｌＮｕｃｌｅｉＭｉｎＣｏｍｐａｃｔｎｅ０２１５、リンパ節、およびＳｔｒｏｍａＭａｘＳｔｄｄｅｖＣｈａｎｎｅｌ３０５６９）に基づいたモデルのＣＩである。同一の５個のフィーチャ＋ＡＲ染色指数（腫瘍）に基づいたモデルのＣＩは０．８５２８である。言い換えれば、モデルへのＡＲ染色指数分子的フィーチャの付加により、モデルの予測力が増加する。
【０１４４】
分子分析。さらなる免疫組織化学研究は必要なかった。最初に収集したデータを、材料と方法に記載のように使用した（分子的フィーチャの完全なまとめに付いては、表９ａ、９ｂ、および９ｃを参照のこと）。
【０１４５】
【表９−１】
2010523979.tif 000031
【０１４６】
【表９−２】
2010523979.tif 000032
ＰＳＡ再発が予測される以下の１つの分子的フィーチャを選択した：ＡＲ  染色指数−腫瘍。
【０１４７】
分析および統計研究。専門知識および簡潔なブーストラッピングを使用して、方法は、一致指数（ＣＩ）０．８７の１０個のフィーチャ（３つの臨床病理学的フィーチャ、６つの形態計測的フィーチャ、および１つの分子的フィーチャ）のサブセットを見出した（図９は、選択されたフィーチャの完全なリストを示す）。得られたＳＶＲｃモデルの出力も、各患者についてのＰＳＡ再発の相対リスクの評価と解釈することができる。このスコアの四分位値（＜２５％、＞２５％〜７５％、＞７５％）を使用して、患者のリスク群を作製した；ＳＶＲｃモデルによって予想される各リスク群についての再発のカプラン・マイヤー評価を図１０に示す。群は、ＰＳＡ再発までの期間に統計的有意差を示した（ログランク検定、ｐ値＜０．０００１）。
【０１４８】
研究３。本研究は、患者の臨床病理学的特徴が同一であるように、研究２と同一のコホートを使用した。転帰に関して、１９人（７％）の患者が任意の理由によって死亡した一方で、残りの患者（９３％）はその最後の来院で生存しており、データ収集を打ち切った。打ち切られた患者について、追跡期間の中央値は６４．８ヶ月（すなわち、５年を少し超過する）であった。死亡までの全時間の中央値に届かなかった。任意の原因による死亡が予測される以下の２つの臨床的フィーチャを選択した：ＴＮＭ臨床病期および患者の年齢。
【０１４９】
画像分析および形態計測研究。研究２由来の同一の３５０個の形態計測的フィーチャセットを、本研究で使用した。図１１は、３５０個のフィーチャのうち、任意の原因による死亡が予測される１１個の形態計測的フィーチャを選択し、ここで、これらのフィーチャは、間質、赤血球、および上皮核の病理学的オブジェクト（すなわち、ＳｔｒｏｍａＭｉｎＭｅａｎＣｈａｎｎｅｌ１０５３５、ＲｅｄＢｌｏｏｄＣｅｌｌＭｅａｎＳｔｄｄｅｖＣｈａｎｎ３０４７４、ＳｔｒｏｍａＭｉｎＭｅａｎＣｈａｎｎｅｌ２０５３９、ＲｅｄＢｌｏｏｄＣｅｌｌＭｉｎＭｅａｎＣｈａｎｎｅｌ２０４４３、ＲｅｄＢｌｏｏｄＣｅｌｌＳｔｄｄｅＳｔｄｄｅＣｈａｎｎ２０４７２、ＳｔｒｏｍａＭａｘＭａｘＤｉｆｆ０５２９、ＥｐｉｔｈｅＮｕｃｌｅＭｅａｎＢｏｒｄｅＬｅｎｇｔＰｘｌ０２０６、ＥｐｉｔｈｅｌｉａｌＮｕｃｌｅｉＭｅａｎＡｒｅａＰｘｌ０１９４、ＥｐｉｔｈｅｌＮｕｃｌｅｉＳｔｄｄｅｖＥｌｌｉｐｔＦｉｔ０２２８、ＲｅｄＢｌｏｏｄＣｅｌｌＳｔｄｄｅＳｔｄｄｅＣｈａｎｎ３０４７６、およびＲｅｄＢｌｏｏｄＣｅｌｌＳｔｄｄｅｖＥｌｌｉｐｔｉＦｉｔ０４２０、ここで、「チャネル」は、赤色（Ｒ）、緑色（Ｇ）、および青色（Ｂ）の画像色チャネルをいう）に関連したことを示す。より詳細には、本研究では、赤色チャネルの平均値、青色チャネルの平均値、および間質の最大差の形態計測的フィーチャを、転帰と相関するように決定した。赤色チャネルの平均および標準偏差、緑色チャネルの平均および標準偏差、および赤血球の楕円適合度の形態計測的フィーチャを、転帰と相関するように決定した。楕円適合度の形態計測的フィーチャを決定するために、赤血球と同一領域を有する楕円を作製し、楕円の外側の赤血球の領域を、赤血球で満たされていない楕円の内側の領域と比較し、適合しなかった場所に値０を割り当てたのに対して、完全に適合したオブジェクトに値１を割り当てた。上皮核の境界長、領域、および楕円適合度の形態計測的フィーチャを、転帰と相関するように決定した。
【０１５０】
これらの相関のうちの少なくともいくつかについての種々の可能な理由は、実施例１および／または研究１と併せて上に記載されている。例えば、上皮核の全形状は、より高いグリーソン分類の組織学的外観を反映する。さらに、本研究では、間質に関連する相関を、癌がその上皮細胞の妨害によって進行するにつれて間質のコントラストが減少する（最大に異なる形態計測的フィーチャによって測定）という理解によって説明することができる。
【０１５１】
分子分析。研究２由来の同一の分子的フィーチャセットを、本研究で使用した。任意の原因による死亡が予想される以下の１つのフィーチャを選択した：ＰＳＡ  染色指数−萎縮性腺。
【０１５２】
分析および統計研究。本コホートでは、全部で１４個のフィーチャ（２個の臨床病理学的フィーチャ、１１個の形態計測的フィーチャ、および１個の分子的フィーチャ）を選択した。最終モデルの一致指数（ＣＩ）は０．８０であった。選択されたフィーチャの完全なリストを、図１１に示し、以下に列挙する。選択された臨床的フィーチャおよび分子的フィーチャを以下に列挙する。臨床的フィーチャを上記で説明する。
【０１５３】
臨床的フィーチャ
１．ＴＮＭ期
２．年齢
分子的フィーチャ
１．ｐｓａｐｓｉ：前立腺上皮内新生物（ＰＩＮ）中の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の染色指数をいう。
【０１５４】
図１１中の各数字は、対応するフィーチャに基づいた予測モデルの一致指数を示し、図１１中の全ての他のフィーチャは、より小さな数字を有する。例えば、０．６８０４は、ＳｔｒｏｍａＭｉｎＭｅａｎＣｈａｎｎｅｌ１０５３５に基づいたモデルのＣＩであり、０．７３６２は、モデルがＳｔｒｏｍａＭｉｎＭｅａｎＣｈａｎｎｅｌ１０５３５およびＴＮＭの両方に基づいた場合のＣＩである。
【０１５５】
得られたＳＶＲｃモデルの出力も、各患者の死亡の相対リスクの評価と解釈することができる。このスコアの四分位値（＜２５％、＞２５％〜７５％、＞７５％）を使用して、患者のリスク群を作製した。ＳＶＲｃモデルによって予想される各リスク群についての再発のカプラン・マイヤー評価を図１２に示す。ログランク検定を使用して、リスク群間で生存の有意差が認められた（ｐ＜０．０００１）。
【０１５６】
結果の考察（実施例２）
モデルの予測精度を保持しながら研究１（４１）から研究２（１０）までの選択されたフィーチャ（複合）の減少が認められたことにより、異なる機械学習法によって達成された精度およびフィルタリング属性を強調された。患者２６８人のコホートで構築されたモデルの一致指数は０．８７であった。比較すると、Ｋａｔｔａｎノモグラム（２０）をこのコホートに適用した場合、一致指数０．７８が達成された。おそらく、研究２で考察された上記モデルが感度８０％で早期ＰＳＡ再発（５年以内）する患者を正確に分類する能力がより顕著である。比較すると、Ｋａｔｔａｎノモグラムは、たった５４％の感度で同一の予測を行うことができる。これは、かかる予測試験が早期介入の決定で機能を果たすという役割をさらに強調した。最後に、示したモデルの出力を使用して、時間枠内に関して任意の表示を行わずに所与の年数内で患者が再発する確率を１度評価するのと対照的に、長期にわたって患者が再発する可能性を評価することができる。
【０１５７】
研究３では、研究２由来の既存の専門知識を使用し、全生存のための予測モデルを構築することが目的であった。首尾の良い最終結果は、全部で１４個の組み合わせたドメインフィーチャを使用して、精度８０％で個体の全生存および死亡までの期間を予測することができることであった。少数の事象（任意の原因による７％の死亡）および比較可能な公開されたノモグラムによって制限されるにもかかわらず、結果は、これらの予測試験型の構築のためのシステムアプローチの使用をさらに支持する。
【０１５８】
独立した外部検証研究を用いる遡及的多施設集団を使用した不良転帰（すなわち、前立腺癌に起因する転移および／または死亡）の臨床的測定を含めるための全患者の分析の拡大に関してさらに努力されている最中である。さらに、手術前の治療上の問題点に影響を及ぼすために診断的針生検を調査するための「システム病理学」アプローチが最近開始されている。
【０１５９】
上記実施例は、臨床的フィーチャ、腫瘍組織形態計測、および分子分析を組み合わせる「システム病理学」プラットフォームが首尾よく構築されたことを証明している。専門知識および打ち切りデータのサポートベクトル回帰（ＳＶＲｃ）の使用により、フィーチャを３つのドメインから選択し、これを使用して、ＰＳＡ再発および全生存の予測モデルを構築した。腫瘍診断、患者の予後診断、および特定の療法に対する反応の予測ツールに関連するので、この新規の「システム病理学」アプローチが個別化医療分野で広く適用されていると理解されるであろう。
【０１６０】
（実施例３）
前立腺摘除後の浸潤性疾患の予測
臨床データおよび形態計測データ
前立腺摘除した患者がその後に起こす浸潤性疾患（すなわち、前立腺癌の骨への転移を示す陽性骨スキャンによって証明される臨床的な失敗）を予測するために、本研究に着手した。本発明の前に、かかる予測を行うための正確な分析ツールは存在しなかった。上記のように、本発明のシステム病理学アプローチは、ＰＳＡ再発を正確に予測することを示した。本研究は、本発明を使用して前立腺摘除後の遠位骨転移を正確に予想することもできることを証明する。
【０１６１】
根治的前立腺摘除を受けた患者１１９人のコホートに、前立腺摘除検体から構築した組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を組み込んだ研究を行った。ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色組織切片を使用して形態計測（すなわち、画像分析）研究を行い、生物学的決定要因を前立腺癌の進行についてのその潜在的な生物学的関連性について選択した一連のバイオマーカーを使用した免疫組織化学（ＩＨＣ）を使用して評価した。臨床的な失敗（すなわち、陽性骨スキャン）のための予測モデルは、管理された多変量学習を介して選択されたフィーチャセットに由来した。各ドメイン中に完全な非欠測データを有する患者（ｎ＝ｌ１６）を、打ち切りデータ（ＳＶＲｃ）を取り扱うために開発された回帰のためのサポートベクトルマシンを使用して評価した。モデルの予測性能を、リスク群を定義するために使用した生成スコアを用いた一致指数（ＣＩ）を使用して評価した。
【０１６２】
患者１１６人から、患者６１人のサブセットを、その臨床的フィーチャに基づいて選択し、このサブセットは、骨転移によって同定された臨床的に失敗した２０人の個体を含む。このコホートを使用して、前立腺摘除から５年以内に陽性骨スキャンの可能性を予測するためのモデルを作製した。精度８９％ならびに感度および特異性がそれぞれ８６％および８５％で臨床的な失敗を予測した図１３中に示した７個のフィーチャ（４個の臨床的フィーチャおよび３個の形態計測的フィーチャが含まれる）を選択した。選択された形態計測的フィーチャは、細胞質および管腔の病理学的オブジェクトと関連していた。より詳細には、選択された形態計測的フィーチャは、総組織領域で除した細胞質領域、総組織領域で除した管腔領域、および平均赤色チャネルの細胞質標準偏差であった。臨床的フィーチャを、以下に列挙する。
【０１６３】
臨床的フィーチャ
１．嚢外拡大（ＥＣＥ）
２．精嚢浸潤（ＳＶＩ）
３．優位前立腺摘除グリーソン分類（ＰＧＧｌ）
４．リンパ節浸潤（ＬＮＩ）
考察
臨床的フィーチャの形態計測的フィーチャとの組み合わせにより、前立腺摘除後５年以内の臨床的な失敗を予測するための第１の正確な予後試験が得られた。記載のように、この試験は、患者が前立腺摘除後５年以内に臨床的な失敗をする可能性が最も高いこと（および時期）を精度８９％で予測することができる。モデルの臨床的フィーチャおよび形態計測的フィーチャへの分子的フィーチャの付加の結果は、現在、調査中である。
【０１６４】
（実施例４）
肝臓毒物学
形態計測データ
毒物学分野において画像分析および統計的モデル化能力を証明するために、本研究に着手した。具体的には、研究は、ラット肝臓切片の獲得および分析を必要とし、全ての目的は、切片を正常または異常に分類することである。この過程を自動化すると同時に高レベルの分類精度を達成することができることにより、予測研究において毒性を客観的にスクリーニングするための高処理プラットフォームを作製することができる。
【０１６５】
研究を以下の２つの段階に分けた。初期に、訓練組として１００個のラット肝臓切片組（８０個の正常肝臓切片および２０個の異常な肝臓切片）を使用した。この切片組を使用し、上記組織画像分析システムを使用して画像分析アプリケーションを開発し、フィーチャおよびモデルを選択して切片を分類した。次いで、確立された画像分析過程を、第２期で１００個の非標識ラット肝臓切片組に適用し、訓練期でデザインされた統計的モデルを試験した。
【０１６６】
セグメント化精度
病理学者の評価によって測定された全オブジェクトの総セグメント化精度は、８０％〜９０％であった。
【０１６７】
統計
研究の統計成分（ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）は、２つの工程を含んでいた。第１の工程は、切片の画像分析によって生成された画像化データからのフィーチャの選択を含んでいた。分類のためのフィーチャの使用数の減少により、切片分類のロバスト性および信頼性を改善することができる。第２の工程は、各切片（異常、正常）のために選択されたフィーチャセットおよび標識を使用したモデルの訓練および標識が未知である独立したラット肝臓切片組の分類の予測による試験の両方を含んでいた。
【０１６８】
フィーチャの選択
上記の各オブジェクトのために生成した統計的測定は以下であった。
【０１６９】
−オブジェクト数
−相対領域（総画像領域に対する比率）
−最小サイズ（ピクセル）
−最大サイズ（ピクセル）
−平均サイズ（ピクセル）
−サイズの標準偏差
切片あたり複数の画像を分析したので、これらの測定自体を、各ラット肝臓切片の全画像から平均した。元のフィーチャの総数は３７８であった。
【０１７０】
フィーチャ選択も２つの工程を含んでいた。第１の工程は、専門知識を使用した。病理学者は、切片の画像分析によって生成された元のフィーチャリストからフィーチャを選択した。フィーチャを含めるか排除するかどうかの決定は、肝臓病理学の理解および遭遇し得る潜在的な異常性／毒性に基づいた。専門知識を使用して、３７８個の元のフィーチャセットから、９０個のフィーチャを選択した。
【０１７１】
次いで、これらのフィーチャを段階的判別分析を使用して試験して、分析のためのフィーチャ数をさらに減少させた。各クラスを作り上げたフィーチャセットは、一般的な共分散行列を使用した多変量正規であると考えられる。共分散分析からＦ検定の有意レベルにしたがってモデルを出入りさせるようにフィーチャを選択した。ここで、すでに選択したフィーチャは共変量として作用し、検討中のフィーチャは従属変数である。有意レベル０．１５を使用した。
【０１７２】
−モデル中でフィーチャから段階的選択を開始しなかった。各工程では、モデルを試験した。
【０１７３】
−ウィルクスのΛ（尤度基準）によって測定されたモデルの識別力への寄与が最小であるモデル中のフィーチャがとどまるための基準を満たすことができなかった場合、そのフィーチャを除去した。
【０１７４】
−そうでなければ、モデルの識別力に最も寄与したモデル中にないフィーチャを入れた。
【０１７５】
−モデル中の全フィーチャがとどまるための基準を満たし、他のフィーチャが入るための基準を満たさなかった場合、段階的選択過程を停止した。
【０１７６】
分類／モデルの訓練
次いで、選択されたフィーチャを線形判別分析（ＬＤＡ）に入力し、肝臓切片を異常または正常に分類した。モデルの出力を、クロスバリデーションによって潜在的バイアスに対して補正した。
【０１７７】
神経回路網も分類子として調査した。選択されたフィーチャを、神経回路網モデルへの入力として使用した。このモデルは、ゼロ隠れユニット（ｚｅｒｏ  ｈｉｄｄｅｎ  ｕｎｉｔ）および入力層と出力層との間の直接接続を有する標準的な多層パーセプトロン（ＭＬＰ）構造である。モデルを、以下に説明するＲＯＣ曲線下領域への近似を直接最大化するように試みることによって訓練した。この基準によって訓練されたＭＬＰモデルは、典型的な基準（例えば、平均平方誤差およびクロスエントロピー）によって訓練されたＭＬＰよりも高い精度が達成されることが見出された。
【０１７８】
両モデル由来の出力を使用して、モデル出力の異なる値を切点として選択し、各切点について感度および特性を計算し、これらを二次元プロット（ｙ軸に沿った感度およびｘ軸に沿った特異性）中にプロットすることによって受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を作製した。ＲＯＣ曲線下領域（ＡＵＣ）は、各モデルの精度を評価するために両方の基準を使用し、モデルが肝臓切片を異常または正常と正確に分類する能力と解釈することができる。典型的には、感度および特異性を、それぞれ、真の陽性率および陰性率に関して記載する。したがって、本研究の文脈において、異常クラスを「陽性」結果と見なした一方で、正常クラスを「陰性」クラスと見なした。したがって、感度は、真の陽性率（すなわち、正確に異常に分類された肝臓切片の比率）であり、他方では、特異性は、真の陰性率（すなわち、正確に正常に分類された肝臓切片の比率）である。
【０１７９】
ＲＯＣ曲線から、訓練組由来の選択された感度および特異性を、以下の結果の項に示す。
【０１８０】
モデル試験
一旦開発されると、線形判別関数および神経回路網の両方のパラメータをロックした。ラット肝臓画像の試験組からの統計学的測定値の受信の際、各モデル出力のクロスバリデーションの結果をそれぞれ使用して評価した各切点を使用して、両分類子を適用した。切点は共に将来の産業規模の適用のための感度１００％および特異性９０％（共にクロスバリデーションに基づく）に対応した。肝臓のこの外部検証組の最初の評価のために、モデルの精度の評価を、肝臓切片の真の分類に対して非盲検の第三者によって行った。次いで、この第三者により、結果を検証するための試験キー（ｔｅｓｔ  ｋｅｙ）が提供される。
【０１８１】
結果
両モデルについてのＲＯＣ曲線下領域は１に非常に近く、異常および正常な肝臓切片のほぼ完全な区別を示す。ＬＤＡを使用して導いた関数のＡＵＣは０．９９であり、神経回路網を使用して導いた関数のＡＵＣは０．９８である。
【０１８２】
ＲＯＣ曲線において、各モデルの感度および特異性も認められ、これは、肝臓切片を異常または正常に分類するためのモデル出力に適用した切片に依存した。表１０は、感度−特異性対の選択をまとめている。
【０１８３】
【表１０】
2010523979.tif 000033
試験
試験キー標識を、線形判別関数および神経回路網の予測される分類と比較した。キーに基づいて、以下のように結果を図１１ａおよび図１１ｂにまとめる。
【０１８４】
【表１１−１】
2010523979.tif 000034
【０１８５】
【表１１−２】
2010523979.tif 000035
ＬＤＡ分類子のために使用した切点は０．００３１であった。ＮＮ分類子のために使用した切点は０．０００２であった。共に感度１００％および特異性９０％のシステム要件に対応している。
【０１８６】
考察
試験セットへの適用後の各分類子の感度および特異性に基づいて、ＬＤＡはＮＮより優れていた。ＬＤＡ分類子は、感度８６％を達成した。これは、感度７３％の神経回路網分類子とは対照的に、この分類子が異常なラット肝臓切片をその時に８６％の異常として正確に標識したことを意味する。両分類子の特異性は６３％であった。各モデルの感度および特異性の両方は、以前に認められた値より低いが、任意の分類子の外部セットに対する一般化によってしばしばその精度が低下するので、これは驚くべきことではない。本研究は、画像化技術および統計的モデル化技術の首尾の良い適用を証明した。
【０１８７】
（実施例５）
前立腺癌再発の予測
臨床データ、形態計測データ、および分子データ
別の研究を行い、根治的前立腺摘除を受けた患者の前立腺癌の再発までの期間を予測するモデルを生成した。実施例２と同様に、再発までの期間を、根治的前立腺摘除からＰＳＡ（生化学的）再発までの期間（月）と定義した。本研究で使用した前立腺組織の切片は、主に腫瘍から構成されるが、良性エレメントも含んでいた。
【０１８８】
本研究は、実施例２で評価した同一の１７個の臨床的フィーチャ（表４）および４３個の分子的フィーチャ（表６）についての情報に基づいた。４９６個の形態計測的フィーチャセット（表１）を、例えば、前立腺癌再発分野の専門知識およびさらなる実験に基づいて、表１７（本明細書に添付）中に示す３８個のフィーチャに減少させた。実施例２と併せた上記の患者５３９人のコホート由来の患者２６２人についての臨床情報、分子情報、および形態情報を、本研究で評価した。形態計測的フィーチャ数が４９６個から３８個に減少したフィルタリング以外に、本研究と実施例２との間の主な相違は、本研究がフィーチャ選択のためのＳＶＲｃフィーチャ減少法を使用したことである。ＳＶＲｃフィーチャ減少は、２００６年５月２２日に出願された共同所有の米国特許出願第１１／４３８，７８９号（その全体が本明細書中で参考として援用される）に記載されている。
【０１８９】
結果
６個のフィーチャ（３個の臨床的−病理学的フィーチャ、１個の分子的フィーチャ、および２個の形態計測学的フィーチャ）に基づき、一致指数（ＣＩ）０．８３の最終モデルを、研究結果として生成した。モデルに含まれる６個のフィーチャを、最終モデルに対するその各フィーチャの寄与と共に図１４に示す。ＰＳＡ再発が予測されるように選択された３個の臨床的フィーチャは、精嚢の関与（フィーチャ寄与＝−５．２１０３）、切除縁の関与（−７．３１５９）、およびリンパ節の関与（−９．３７４２）であった。選択された１つの分子的フィーチャは、腫瘍中に存在するアンドロゲン受容体（ＡＲ）染色指数（−３．５４０４）であった。これらの臨床的フィーチャおよび分子的フィーチャは、実施例２と共に上に記載されている。選択された２個の形態計測的フィーチャは、総組織領域で除した上皮細胞によって占められる領域（３．２９７５）および総組織領域で除した間質によって占められる領域（−．３４２２５）であった。例えば、総組織領域は、細胞質、上皮核、管腔、赤血球、間質核、間質、および人工物の領域の合計（１９２００００ピクセルが最大であり、ここで、画像サイズは１２００×１６００ピクセルである）を含むことができる。上皮核および間質細胞に関連する形態計測的フィーチャの選択についての可能な理由も、検証研究と併せて以下に記載している。
【０１９０】
５年前の前立腺癌再発を正確に予測するたに、最終訓練モデルは、感度８２％および特異性８１％であった。得られたＳＶＲｃモデルの出力を、各患者についてのＰＳＡ再発の相対リスク評価と解釈することもできる。このスコアの四分位値（＜２５％、＞２５％〜７５％、＞７５％）を使用して患者のリスク群を作製し、各リスク群について再発のカプラン・マイヤー評価を行った。群は、ＰＳＡ再発までの期間において統計的有意差を示した（ログランク検定、ｐ値＜０．０００１）。
【０１９１】
検証研究
患者６１人からなる外部コホートを使用して最終モデルを検証した。最初の５年以内に前立腺癌再発を経験するリスクのある患者の同定を検証するために、最終モデルは、ＣＩ  ０．８０、感度９１％、および特異性７０％であった。
【０１９２】
最終モデルで選択された２つの形態計測的フィーチャの有意性をさらに理解するために、各形態計測的フィーチャについてのカプラン・マイヤー曲線を作成した。漸増量の間質（ｐ＝０．００４）および上皮核（しかし、統計的に有意でない、ｐ＝０．２８）が好ましい結果と独立して関連することが認められた。これにより、これらの画像パターン由来の定量的測定がグリーソン分類システムのより客観的な決定要因を示すことができる可能性が高まった。
【０１９３】
本研究は、臨床的に有用な予測試験を作製するのに、限られた臨床的フィーチャ、分子的フィーチャ、および形態計測的フィーチャの組しか必要ないことを表明した。モデルの予測精度も保持しながらこのフィーチャを減少させた。
【０１９４】
（実施例６）
前立腺癌再発の予測
臨床データ、形態計測データ、および分子データ
さらに別の研究を行って、根治的前立腺摘除を受けた患者における前立腺癌再発までの期間を予測するモデルを生成した。実施例２および５の場合、再発までの期間を、根治的前立腺摘除からＰＳＡ（生化学的）再発までの期間（月）と定義した。本研究で使用した前立腺組織の切片は、主に腫瘍から構成されるが、良性エレメントも含んでいた。
【０１９５】
本研究は、実施例２および５で評価した同一の１７個の臨床的フィーチャ（表４）および４３個の分子的フィーチャ（表６）についての情報に基づいた。４９６個の形態計測的フィーチャセット（表１）を、表１８（本明細書中に添付）に示す３３個のフィーチャに減少させた。実施例５由来の同一の患者２６２人についての臨床情報、分子情報、および形態情報を、本研究で評価した。本研究は、上記の実施例５で参照した同一のＳＶＲｃフィーチャ減少法を使用した。
【０１９６】
結果
８個のフィーチャ（実施例５で選択された同一の６個のフィーチャおよび１個のさらなる臨床的−病理学的フィーチャおよび１個のさらなる形態計測的フィーチャ）に基づき、一致指数（ＣＩ）０．８６の最終モデルを、研究結果として生成した。モデルに含まれる８個のフィーチャを、最終モデルに対するその各フィーチャの寄与と共に図１５に示す。本研究で選択したさらなる臨床的フィーチャは、実施例２と併せて上記の生検グリーソンスコア（−１０．６０）であった。本研究で選択したさらなる形態計測的フィーチャは、赤色チャネル（−１１．２６）で示した間質内のテクスチャの変動であった。このフィーチャは、その選択特性に基づいた間質テクスチャの変動を示し、良性エレメントと対照的に腫瘍に関連した間質の生化学的特質を反映する可能性が最も高い。
【０１９７】
検証研究
患者３６６人からなる外部コホートを使用して最終モデルを検証した。最初の５年以内に前立腺癌再発を経験するリスクのある患者の同定を検証するために、ＣＩ  ０．８２、感度９６％、および特異性７２％の最終モデルを生成した。以下の表１２は、訓練および検証コホートについて認められた臨床的フィーチャを示す。表１３ａ〜ｃは、訓練コホート由来の認められたバイオマーカー−分子的フィーチャを示す。
【０１９８】
【表１２−１】
2010523979.tif 000036
【０１９９】
【表１２−２】
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【０２００】
【表１２−３】
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【０２０１】
【表１３−１】
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【０２０２】
【表１３−２】
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（実施例７）根治的前立腺摘除後の臨床的な失敗の予測
臨床データ、形態計測データ、および分子データ
本研究は、根治的前立腺摘除を受けた前立腺癌患者の臨床的な失敗を予測するためのモデルを生成した。本研究では、臨床的な失敗を、転移性疾患および／またはアンドロゲン非依存性疾患の発症（例えば、術後のＡＤＴの際に転移またはＰＳＡが陽性の骨スキャンが上昇する）と定義した。これは、臨床的な失敗を任意の原因による死亡と定義した実施例２に記載の臨床的な失敗の研究と対照的である。
【０２０３】
患者３４５人についての臨床情報および形態情報を、本研究で評価した。表４および６に示す臨床的フィーチャおよび形態計測的フィーチャに類似の１０（１０）個の臨床的フィーチャおよび２７個の形態計測的フィーチャを評価した。１１（１１）個の分子的フィーチャも評価した。しかし、これらの分子的フィーチャを、コンピュータによって免疫蛍光（ＩＦ）検出に供した組織の画像から生成し、実施例２に記載の分子的フィーチャと同様にＩＨＣに基づかなかった。
【０２０４】
より詳細には、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、ラセマーゼ（ＡＭＡＣＲ）、サイトケラチン１８（ＣＫｌ８）、ＴＰ７３Ｌ（ｐ６３）、および高分子量ケラチンのＡｌｅｘａ蛍光色素標識抗体を、ＤＡＰＩと共に「ｑｕｉｎｔ−ｐｌｅｘ」アッセイで使用した。蛍光色素の特有のスペクトルプロフィールに基づいて、抗原特異的グレースケール画像を取得した。Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ  Ｃｅｌｌｅｎｇｅｒ製品のためのスクリプトを生成して、各抗原を局在化した。抗原の分布および強度から、スクリプトは、細胞型および細胞区画（例えば、管腔上皮細胞、上皮／間質核）を同定し、前立腺腫瘍、良性の腺、および間質中のＡＲおよびＡＭＡＣＲを定量した。すなわち、ＤＡＰＩおよびＣＫ１８画像をそれぞれ有効な核および細胞質のオブジェクトにセグメント化したＤｅｆｉｎｉｅｎｓ  Ｃｅｌｌｅｎｇｅｒ製品のスクリプトが生成された。これらのスクリプトは、強度閾値に基づいて画像オブジェクトを核または細胞質に分類した。この強度閾値は、バイオマーカーのグレースケール画像の特徴（例えば、平均強度、標準偏差、変位値）の一次関数であった。各スクリプト／一次関数は、所与のバイオマーカーに特異的であり、管理学習（エキスパートによる閾値設定）およびエキスパート閾値と画像特性との間の線形回帰を使用してデザインした。同定した細胞質オブジェクトは、上皮および間質オブジェクトへの核の分割のためのアンカーオブジェクトとしての機能を果たした。ＡＲおよびＡＭＡＣＲバイオマーカーも、空間的および強度の共局在化（ｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）を使用してセグメント化した。空間的局在化により、以下の特定の区画内のバイオマーカーが同定された：ＡＲについての上皮核および間質核およびＡＭＡＣＲについての上皮細胞（細胞質）。ＤＡＰＩおよびＣＫ１８のために使用した閾値関数に類似の閾値関数により、区画内のバイオマーカーシグナルを有効またはノイズにさらに分類することができた。患者のコアがアレイから欠測された場合、またはサンプルが間質のみを含んでいた場合にその患者を排除した。
【０２０５】
大部分の患者がＩＦフィーチャを抽出した複数のコアを有していたので、複数のコアを通した各患者およびフィーチャについてのフィーチャ量の集計のための手順が考案された。４つの候補関数（ｍｉｎ、ｍａｘ、ｍｅｄｉａｎ、およびｍｅａｎ）を検討した（例えば、患者が３つのコアを有する場合、ｍｉｎ関数は３コア間の最も低い値を返す）。所与のフィーチャについて、これらの各関数を適用して、訓練組中の各患者のコア値を集計し、次いで、各ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ関数についての一致指数を計算して、臨床的な失敗の予測因子として評価した。フィーチャについての最良のａｇｇｒｅｇａｔｉｎｇ関数を、その一致指数がランダム（０．５）から最も遠いものであると見なした。以下の表１４は１１個のＩＦフィーチャおよび対応する選択されたａｇｇｒｅｇａｔｉｎｇ関数を列挙し、表１５はフィーチャを記載する。次いで、選択されたａｇｇｒｅｇａｔｉｎｇ関数を使用して、各患者の各ＩＦフィーチャについての１つの値を生成した。複数の免疫蛍光に関するさらなる詳細は、２００６年１０月１３日に出願され、発明の名称が「Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」である共同所有された米国特許出願第１１／５８１，０４３号（米国特許出願公開第２００７／０１５４９５８号）（その全体が本明細書中で参考として援用される）に記載されている。
【０２０６】
【表１４】
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【０２０７】
【表１５−１】
2010523979.tif 000042
【０２０８】
【表１５−２】
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【０２０９】
【表１５−３】
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「ＡＭＡＣＲ陰性である上皮細胞内に存在する核ＡＲ」を除く全ＩＦフィーチャは、一致指数（ＣＩ≦０．４またはＣＩ≧０．６）に基づいた単変量分析における臨床的な失敗との関連を示した。
【０２１０】
結果
本研究に由来するモデルは、７個のフィーチャ（３個の臨床的フィーチャ、１個の分子的フィーチャ、および３個の形態計測的フィーチャ）に基づき、訓練コホートに関して一致指数（ＣＩ）０．９１、感度９５％、および特異性８０％を有していた。モデル中に含まれる７個のフィーチャを、図１６に示す。前立腺摘除後の臨床的失敗が予測される３個の臨床的フィーチャは、生検グリーソンスコア、リンパ節の関与、および検体（前立腺摘除）グリーソンスコアであった。３個の形態計測的フィーチャは、青色チャネル中に示された上皮細胞質の平均強度（ＣｙｔｏｐｌａｓｍＭｅａｎＭｅａｎＣｈａｎｎｅｌ６００６０）、赤色チャネル中に示された間質内のテクスチャの変動（ＳｔｒｏｍａＭｅａｎＳｔｄｄｅｖＣｈａｎｎｅｌ４０３１０）、および赤色チャネル中に示された上皮核間のテクスチャの変動（ＥｐｉｔｈｅＮｕｃｌｅｉＳｔｄｄｅｖＭｅａｎＣｈａｎｎ４０１５７）であった。上記のように、間質テクスチャに関連するフィーチャは、その染色特性に基づき、良性エレメントと対照的に、腫瘍に関連した間質の生物学的特質を反映する可能性が最も高い。さらに、典型的には、細胞質の色が薄青色から濃青色に変化する場合、これは、癌の発症（すなわち、間質領域への上皮細胞浸潤）に起因する組織の変化を反映する。上皮核内側のテクスチャの変動に関して（折り畳み／非折り畳みクロマチンテクスチャおよび核小体）、癌の発症は、典型的には、非折り畳みクロマチンテクスチャを有する上皮核数の増加および核小体数の増加によって特徴づけられ、癌の発症によってこのフィーチャの値がより高くなる。選択された１個の分子的フィーチャは、ＡＭＡＣＲ陽性であった上皮細胞内のＡＲ強度であった。
【０２１１】
検証
患者３１９人からなる独立したコホートを使用して最終モデルを検証した。検証のために、前立腺摘除後の臨床的な失敗を予測するためのＣＩ  ０．８５、感度８９％、および特異性７７％の最終モデルを生成した。以下の表１６は、訓練および検証コホートについての認められた臨床的フィーチャを示す。
【０２１２】
【表１６−１】
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【０２１３】
【表１６−２】
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別の態様では、前立腺摘除後にＡＤＴで処置した患者のサブセットの評価に基づいて、漸増レベルのＡＲがＡＤＴ処置後の臨床的な失敗までの期間の短縮に関連し得ると判断された。したがって、前立腺摘除検体中のＡＲ含有量の測定を使用して、療法のアンドロゲン抑制型に対する応答を予測することができる。まとめると、前立腺摘除検体時および任意の治療形態の前のＡＲ含有量を使用して、疾患の進行だけでなく、治療に対する潜在的な応答も予測することができる。
【０２１４】
（実施例８）前立腺癌再発の予測
臨床データ、形態計測データ、および分子データ
別の研究を行って、根治的前立腺摘除を受けた患者における前立腺癌再発までの期間を予測するモデルを生成した。実施例２、５、および６で、再発までの期間を、根治的前立腺摘除からＰＳＡ（生化学的）再発までの期間（月）と定義した。
【０２１５】
６８２人の拡大したコホートを評価した。本研究は、実施例６で使用した臨床的フィーチャに匹敵する臨床的フィーチャを使用した（表１９を参照のこと）。患者１０１人（１４．８％）は、０．２ｎｇ／ｍＬ超の２つの連続するＰＳＡ測定値として定義されるＰＳＡ再発を経験した。認められた再発なしの患者の追跡の中央値は７４ヶ月であった。再発までの全時間の中央値に届かなかった。表１８に示した同一の形態計測的フィーチャを評価したが、本研究では、Ａｄｏｂｅ  Ｉｍａｇｅｒｅａｄｙ  ７．０を使用して、デジタル処理で輪郭を描き、その後の画像セグメント化のための各コア内の浸潤性腫瘍のみの領域をカラーマスキングした。定量的多重（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）免疫蛍光（ＩＦ）によって分子的フィーチャを生成した。これは、実施例７と併せて上に一般的に記載されている。ＩＦ定量に関するさらなる詳細を、以下に示す。
【０２１６】
モデルのＰＳＡ再発を高精度でさらに予測し、一致指数は０．７７、感度７２％、および特異性７４％であった。図１７に示すように、ＡＲ＋上皮核の相対領域に対応する１つの分子的フィーチャを選択した。５個の臨床的フィーチャ（精嚢浸潤、生検グリーソンスコア、嚢外拡大、術前ＰＳＡ、および優位前立腺摘除グリーソン分類が含まれる）、ならびに腫瘍のみの領域中の２つの形態計測的フィーチャ、上皮核のテクスチャ、および細胞質のテクスチャも選択した。図１７では、負の加重（ｗｅｉｇｈｔ）は各フィーチャの存在（または連続的フィーチャのより高い値）がより短いＰＳＡ再発までの時間に関連することを示す一方で、正の加重はその逆を示す。これらの加重は、完全なモデル中の各フィーチャの各寄与を示す。
【０２１７】
モデル中に包含するために選択された形態計測的フィーチャは、色のバリエーション（強度の標準偏差）を使用した上皮核領域および細胞質領域のテクスチャ特性を記載する。非折り畳みクロマチンテクスチャおよび上皮核中の核小体外観などの癌進行に関連する生物学的過程により、核画像オブジェクトのテクスチャが変化する。後者により、色標準偏差の値が増加する。細胞質領域のテクスチャ特性は、組織の構造変化および組織が良性期から悪性期に進行した場合の間質への上皮細胞の浸潤に起因する。
【０２１８】
定量的免疫蛍光（ＩＦ）
本研究における免疫蛍光画像分析によって定量されたフィーチャを、表１４および１５に示し、説明している（実施例７を参照のこと）。注目すべきは、ＡＲの強度などのフィーチャが抗原濃度に関連し、（０−２５５）の８ビット（ＲＧＢ−（赤色、緑色、青色）値の制限）とは対照的に１２ビットを使用して表示されたことである。したがって、ダイナミックレンジの拡大が可能である。ＡＲの測定のうち、１つのフィーチャ（全上皮核の全ＤＡＰＩ領域に対する上皮細胞核（腫瘍および非腫瘍エレメントが含まれる）中のＡＲ量）は、腫瘍中のＡＲについてのＩＨＣ染色指数と高度に調和していた（スピアマンの順位相関係数＝０．４４；ｐ＝０．００１１）。このフィーチャはまた、一変量で分析した場合にＰＳＡ再発と独立して関連した。したがって、定量的免疫蛍光データは、ＡＲ  ＩＨＣバイオマーカーの結果を支持し、細胞区画中のＡＲ発現への値のより客観的な割り当て手段を提供する。
【０２１９】
高解像度グレースケールｔｉｆｆ画像（１２８０×１０２４ピクセル）を、ＴＭＡコア中の上皮核および間質核内のＡＲについての強度レベルを同定したオブジェクト指向の方法を使用して個別に処理した。腫瘍エレメントは、正常なエレメントと区別されなかった。むしろ、間質細胞および皮細胞のみが区別された。ＣＫ１８発現は、全前立腺上皮細胞のための組織分布マーカーとしての機能を果たした。各「形態学的」層を覆い（すなわち、核についてはＤＡＰＩ、上皮細胞およびＡＲについてはＣＫ１８、および、個別のＡｌｅｘａ蛍光色素、ならびに、バックグラウンドおよび非特異的結合を除去するための予め確立した閾値の使用による）、ＡＲ強度を正確に定義した。多重蛍光画像化によるタンパク質マルチプレックスの自動化局在化および定量のための閾値の確立に関するさらなる説明を以下に示す。この分析により、絶対陽性ピクセル数（ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｐｉｘｅｌ  ｃｏｕｎｔ）に対するタンパク質濃度が、一連の形態学的相関を反映する各フィーチャ（ＡＲで占められた核（ＤＡＰＩ染色）領域ならびに上皮核および間質核内に存在するＡＲタンパク質の相対量が含まれる）と同等と見なされた。ＡＭＡＣＲ陽性上皮細胞を、ＡＲ含有量についてのさらなる記述子として使用し、誘導されたフィーチャを、全モデル開発の一部として評価した。
【０２２０】
図１８ａ〜ｅは、前立腺組織中の核ＡＲを定量するための多重画像セグメント化を示す。図１８ａは、個別の形態学的（すなわち、ＤＡＰＩ、ＣＫ１８）およびＡＲマップを示す３つのグレースケール画像（図１８ｂ〜ｄ）を生成するために分解された標準的な多蛍光色素画像である。図１８ｅは、スクリプトによって定量された上皮細胞内の核ＡＲを示すセグメント化画像である。これらの全ての図を、再現性のために白黒で示す。より詳細には、図１８ａは、核についてＤＡＰＩで染色した前立腺組織（示さず）、上皮細胞についてＡｌｅｘａ  ４８８で標識したＣＫ１８（典型的には、緑色で示す）、ならびに間質細胞および上皮細胞中でＡｌｅｘａ  ５６８で標識したＡＲ（典型的には、赤色で示す）の多重免疫蛍光画像である。各蛍光色素を分離するためのｓｐｅｃｔｒａｌ  ｏｐｔｉｃｓの適用により、核（図１８ｂ）、上皮細胞（図１８ｃ）、およびＡＲ（図１８ｄ）についての各グレースケール画像を作製した。ピクセルおよびオブジェクト分類に基づいた方法を使用して、カラー合成画像をレンダーリングした（図１８ｅ；ここでは白黒で示す）。これは、ＣＫ１８陽性上皮細胞内に存在するＤＡＰＩ染色核内に存在するＡＲおよびＣＫ１８陰性である核（間質）内に存在するＡＲをセグメント化する。セグメント化した画像は、上皮核中のＡＲおよび間質内のＡＲの定量の基礎であった。計算されたパラメータには、ＡＲに関与する全核領域、平均強度および最大強度、ならびに分布（陽性細胞の比率）が含まれていた。
【０２２１】
フィーチャの選択
実施例８の拡大した研究では、ＳＶＲｃ  Ｂｏｏｔｓｔｒａｐフィーチャ選択法を使用した。最初のフィルタリング工程で、目的の転帰と一変量的に相関しなかったフィーチャを除去した。次に、訓練データからＮ個の異なるスプリット（本研究では、Ｎ＝２５）を作成した。各スプリットでは、全訓練インスタンスの約２／３を訓練サブセットに無作為に割り当て、全訓練インスタンスの約１／３を試験サブセットに無作為に割り当てた。
【０２２２】
最初のフィルタを通過した全フィーチャから開始する「グリーディ・フォワード」フィーチャ選択過程から方法を開始した。各フィーチャについて、全スプリットにわたる訓練サブセットに対してＮ個のモデルを構築し、Ｎ個の各試験サブセットに対して検証した。Ｎ回の実行にわたる各フィーチャについての総合的パフォーマンスを平均した。最良の総合的パフォーマンスを有するフィーチャを選択した。次の工程では、各フィーチャを事前に選択したフィーチャに付加し、再度Ｎ個のモデルを構築し、スプリットにわたって試験した。その付加によって最良の総合的パフォーマンスが得られたフィーチャを選択した。パフォーマンスが改善されるフィーチャがそれ以上存在しなくなるまで、本方法をこの様式で続けた。
【０２２３】
その後、「グリーディ・バックワード」フィーチャ選択アプローチを使用した。各フィーチャを除去し、スプリットにわたるそのフィーチャを含まないＮ個のモデルを構築し、試験した。その除去によって最良の総合的パフォーマンスが得られたフィーチャを除去し、フィーチャの除去によってモデルパフォーマンスが停止して改善されるまで手順を繰り返した。この工程によってモデルの複雑さが軽減され、最初に有意であったかもしれないフィーチャを除去したが、その情報寄与をその後に付加したフィーチャ内にカプセル化した。
【０２２４】
最後に、完全なＳＶＲｃモデルを、完全な訓練データに対して全ての選択したフィーチャを使用して訓練した。
【０２２５】
他の実施形態では、診断的針生検時または根治的前立腺摘除後のいずれかでのアンドロゲン除去療法に前立腺癌が骨転移および／またはＰＳＡに進行する確率を予想するモデルを提供することができる。
【０２２６】
（実施例９）根治的前立腺摘除後の臨床的な失敗の予測
臨床データ、形態計測データ、および分子データ
別の研究を行って、根治的前立腺摘除を受けた前立腺癌患者における臨床的な失敗（ＣＦ）を予測するためのモデルを生成した。実施例７と同様に、臨床的な失敗を、転移性疾患および／またはアンドロゲン非依存性疾患の発症と定義した。
【０２２７】
３２個の臨床的な失敗事象を有する患者３７３人の訓練組を評価して、管理された多変量機械学習（ｂｏｏｔｓｔｒａｐフィーチャ選択を使用したＳＶＲｃ）によってモデルを生成した。前立腺摘除後５年以内の臨床的な失敗を予測するために、モデルは、ＣＩ    ０．９２、感度９０％、および特異性９１％を有していた。モデルを、２９個の臨床的な失敗事象を有する患者３８５人の独立したコホートに対して検証し、ＣＩ  ０．８４、感度８４％、および特異性８５％を得た。高レベルのアンドロゲン受容体により、アンドロゲン除去療法後の去勢ＰＳＡの上昇までの期間がより短くなることが予測された。
【０２２８】
図１９に示すように、モデルは、優位前立腺摘除グリーソン分類およびリンパ節の浸潤状態の臨床的フィーチャならびに管腔周囲の平均長、管腔の相対領域、および緑色チャネル中の細胞質内のテクスチャの変動の形態計測的フィーチャを含む。モデルはまた、定量的多重ＩＦによって生成されたＡＲ＋／ＡＭＡＣＲ−上皮核中のＡＲチャネルの平均強度の分子的フィーチャを含む。図１９では、負の加重は各フィーチャの存在（または連続的フィーチャのより高い値）がより短い臨床的な失敗までの時間に関連することを示す一方で、正の加重はその逆を示す。これらの加重は、完全なモデル中の各変数の各寄与を示す。
【０２２９】
本研究では、前立腺摘除前または生物学的再発前であるが前立腺摘除直後のいずれかで治療を受けた患者を排除し、全コホート中に患者８８１人が残った。コホートを無作為化し、臨床的な失敗事象と類似の数を有する訓練および検証組に均等に分けた。臨床的な失敗を、転移（骨疾患またはリンパ節または実質臓器における軟組織疾患が含まれる）、去勢状態でのＰＳＡの上昇、または前立腺癌に帰する死亡の明確なＸ線または病理学的な証拠として事前に特定した。ＣＦまでの期間を、根治的前立腺摘除から第１のこれらの事象までの期間と定義した。患者が最後の来院以後にＣＦを経験しなかった場合、または最後の来院時の患者の転帰が未知の場合、患者の転帰を打ち切った。
【０２３０】
完全な臨床データ、形態計測データ、および分子データ、ならびに非欠測転帰情報を有する患者のみをさらに研究した。結果として、評価可能患者数は、訓練組で３７３人、検証組で３８５人であった（表２０および２１を参照のこと）。これらの患者７５８人の特徴は、患者８８１人の全コホートの特徴と類似していた。実施例８（例えば、定量のために腫瘍エレメントのみを含むように標識化ツール（Ａｄｏｂｅ  ７．０）を使用したコアのデジタル処理によるマスキング）に関連して一般に記載のように、形態計測的フィーチャを患者コアから撮影した画像から抽出した。同様に、実施例８に関連して一般に記載のように、多重定量的ＩＦを使用して分子的フィーチャを生成した。
【０２３１】
患者３７３人の訓練組では、３３人（８％）が前立腺摘除後にＣＦを有し、２４人が可能な補助療法前に骨スキャンが陽性であり、９人の去勢ＰＳＡが上昇した。１人のＣＦ患者を除く全てがホルモン療法を受けていた。ホルモン療法を受けなかった１人の患者は、救済放射線療法を受けていた。さらに、放射線療法およびホルモン療法の両方を受けた患者が１人存在していた。これらの患者３７３人を、前立腺摘除から７６ヶ月後の中央値について追跡し、ＣＦまでの全時間の中央値に届かなかった。モデルよる選択のための変数として９個の臨床的フィーチャを含めた（表２０）。７２ヶ月の追跡中央値を有する患者３８５人からなるコホートの検証では、２９人（７．５％）の患者がＣＦを有し、２２人が可能な補助療法前に骨スキャンが陽性であり、７人の去勢ＰＳＡが上昇した。全ＣＦ患者がホルモン療法を受けており、７人が救済放射線療法も受けていた。ブラインドした転帰データと共に６個のフィーチャモデルを適用した。
【０２３２】
各患者のＨ＆Ｅ染色腫瘍コアの腫瘍マスキングしたデジタル化画像から、２７個の形態計測的フィーチャを生成し（表２２）、これは染色の色およびテクスチャならびに前立腺組織サンプル中の上皮細胞および間質細胞の全領域を反映していた。単変量分析では、１２個のフィーチャは、各フィーチャの一致指数（ＣＩ≦０．４またはＣＩ≧Ｏ．６）に基づいたＣＦとの関連を示した（表２０）。
【０２３３】
特異的細胞型（上皮腫瘍細胞）中のＡＲおよびＡＭＡＣＲを定量して、同時多重抗原評価および画像分析を組み合わせたスペクトル画像分析の使用によって分子的フィーチャを生成した。ＡＲおよびＡＭＡＣＲレベルに関連する免疫蛍光フィーチャのうち、１１個の免疫蛍光フィーチャは、単変量分析におけるＣＦとの関連を示し（ＣＩ≦０．４またはＣＩ≧０．６）、これらを選択のためにモデル中に含めた（表２０）。
【０２３４】
最終モデルに関して、前立腺癌進行の予測における腫瘍分化のために同定された役割（すなわち、グリーソン分類）および転移の証拠（すなわち、リンパ節の関与）に注目する。モデルの３個の形態計測的フィーチャは、グリーソン分類に関連する異なる細胞型および全組織構造内の生化学的性質および代謝的性質の代替物としての組織化学的染色の重要性を示す。病理学者は、良性細胞型と反応性または悪性細胞型とを区別する場合の色の重要性を伝統的に承認しているが、色を標準化し、客観的に定量することができなかった。本モデルを使用して、上皮細胞質のテクスチャ色特性は前立腺摘除グリーソン分類よりもＣＦに強く関連し、疾患進行における細胞の生化学的性質の重要性が示唆される。３個の画像化フィーチャについての各カプラン・マイヤー曲線は、患者を正確に階層化する能力を示した。分子的フィーチャに関して、ＡＭＡＣＲ陰性上皮細胞内のＡＲの正規化した輝度／強度のみを、モデルに含めるために選択した。このフィーチャについての負の加重（図１９）は、ＡＲ量の増加がＣＦまでのより短い時間に関連したことを示す。注目すべきは、術前ＰＳＡおよびＧｌｅａｓｏｎの和の情報がモデルを含めるために選択されなかったことである。ＳＶＲｃ分析にもかかわらず、これらの変数を、前立腺癌の生化学的性質に関連する分化および色の特徴を反映する画像分析フィーチャと置換した。
【０２３５】
ＣＦモデルの高精度の予測によってより情報量が多くて適切な治療計画が開発可能であると考えられる。これには、再発リスクが高い場合のより早い、ＡＤＴの投与（進行性前立腺癌に対して現在において最初に行われる全身療法である）、放射線療法、および／または化学療法の可能性が含まれるであろう。さらに、高リスクの患者の早期同定により、進行を調査する機会が増大する。モデル予測はまた、生化学的再発後の治療決定の誘導で有用であり得る。生化学的再発と臨床的に有意な事象との間の間隔が典型的には数年であり、非常に変動もするので、生化学的に再発した患者によっては迅速な介入が必要ないかもしれない。さらに、生化学的再発と診断された男性は、今日、一連の無痛性疾患を有する可能性が高い。浸潤性疾患（例えば、術後５年以内にＣＦに進行する疾患）の確率の知識は、患者および患者の主治医による、生化学的再発が積極的療法を誘発するかどうかの決定に役立ち得る。
【０２３６】
この臨床的進行モデルにおけるＡＲの重要性を考慮すると、前立腺摘除検体中のＡＲ含有量を使用してアンドロゲン除去療法（ＡＤＴ）後の去勢ＰＳＡの上昇までの期間を予測することができるかどうかを決定するための研究を行った。患者８８１人のうちの６３人は事前にＣＦがなくＡＤＴを受けた。これらの患者のうちの３２人（５１％）がその後にＣＦを示した。患者６３人の転帰データを使用して、ＣＦに関連する任意の免疫蛍光フィーチャもＡＤＴに対する応答に関するかどうかを調査した。以下の４個のフィーチャは、去勢ＰＳＡの上昇までの期間の減少に有意に（ｐ＜０．０５  カイ２乗検定）関連し、その全てが腫瘍上皮細胞中のＡＲ核レベルの増加に関連する。
【０２３７】
【化１】
2010523979.tif 000047
腫瘍サンプルのＡＲ含有量の使用により、泌尿器科医はＡＤＴの有用性を予測することができ、これは各患者でさえも可能であり、したがって、治療レジメンを調整することができる。現在のＣＦモデルで高スコアを有し、高レベルのＡＲを有する患者は、以下の特定のジレンマに直面する：ＡＤＴおよびおそらく救済放射線療法に対する永続的応答の見込みの減少に伴う臨床的進行の確率の上昇。これらの患者は、ＡＲまたはその補因子をターゲティングするヒストンデアセチラーゼインヒビターなどの療法の良好な候補であり得る。したがって、アンドロゲン受容体の正確な定量が治療決定の誘導を補助すると考えられる。かかるアプローチは、臨床試験の選択をさらに改善し、特にＡＲまたはＡＲ補因子をターゲティングするヒストンデアセチラーゼインヒビターなどの療法のための治療効果の基準としての役割を潜在的に果たすことができる。
【０２３８】
マルチスペクトル蛍光画像化によるタンパク質マルチプレックスの自動化局在化および定量
免疫蛍光（ＩＦ）顕微鏡画像中のタンパク質バイオマーカーの発現の自動化局在化および定量のためのシステムおよび方法を開発した。システムおよび方法は、バイオマーカーシグナルとバックグラウンドとを区別し、ここで、シグナルはＩＦで使用した任意の多数のバイオマーカーまたは対比染色の発現であり得る。システムおよび方法は、管理学習に基づき、画像バックグラウンド特性の関数としてバイオマーカー強度閾値を示す。前立腺摘除を受けた患者における前立腺癌再発の予測におけるシステムおよび方法の有用性を証明する。具体的には、アンドロゲン受容体（ＡＲ）発現を示すフィーチャは、単変量分析における転帰不良と統計的に有意に関連することを示す。ＡＲフィーチャはまた、多変量再発予測に有益であることを示す。
【０２３９】
緒言
タンパク質バイオマーカーは、癌診断、予後診断、および治療応答の予測のために組織病理学で広く使用されている。これらは、細胞中のタンパク質の発現レベルに関する情報を提供し、それにより、病状に関連する特定の細胞活性が検出可能である。
【０２４０】
１つのタンパク質発現の定量方法はＩＦであり、これは、蛍光色素で標識した抗体を標的タンパク質に結合する組織に導入することによってタンパク質を局在化する（２１）。特定の波長を有する光源を使用した蛍光顕微鏡下で染色されたスライドを照射する。この励起光は蛍光色素によって吸収されて、より長い波長の光を発する。放射光の強度は、標的タンパク質濃度の基準である。多重化では、組織をいくつかの抗体で同時に標識する。抗体を、異なるスペクトル特性を有する蛍光色素で標識する。複数のバイオマーカーの分離を、組織のマルチスペクトル画像分析およびその後の各抗体の発現を示す画像を得るためのスペクトル分解（ｓｐｅｃｔｒａｌ  ｕｎｍｉｘｉｎｇ）によって行う。
【０２４１】
伝統的には、組織中の目的のオブジェクト（例えば、核）のその認識された強度レベルに基づいて、ＩＦ画像を病理学者によって解釈する。この実務は骨が折れ、観察者内および観察者間の変動に悩まされる。自動化システムの開発により、ＩＦ画像の視覚的スコアリングの低コストで客観的な代替法が可能である。
【０２４２】
バイオマーカーの定量を２段階で行う。第１に、バイオマーカーに関連する区画を検出する。次いで、シグナルを区画内のバックグラウンドから分離する。これらのタスクをしばしば強度閾値化によって行う。対話型閾値（２２）〜（２４）の後、バイオマーカー発現を定量するためのコンピュータ測定をしばしば行う。Ｇｏｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２３）は、バックグラウンド由来の３つの標準偏差が閾値を超える連続ピクセル組として単細胞画像中のタンパク質を同定した。画像ヒストグラム様式を対話型閾値化と共にＡＱＵＡシステム中のバックグラウンドピクセルの同定のために使用する（２４）。Ｒａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２５）は、定量のために目的の区画をマーキングするためにマニュアル上皮核描写を使用する。低シグナル／バックグラウンド比の画像における対話型の方法の制限された再現性およびヒストグラム閾値化の不十分な性能は、既存技術の主な欠点である。
【０２４３】
上記制限に取り組むバイオマーカーの局在化および定量のためのシステムおよび方法が提案される。システムおよび方法は、完全に自動化され、それにより再現可能である。システムおよび方法は、その関連する細胞内区画内のバイオマーカーシグナルを定量し、それにより、システムおよび方法が低シグナル／バックグラウンド比に対してロバストになる。
【０２４４】
システムおよび方法は、バイオマーカーシグナルのバックグラウンドとの識別のためのアプローチに基づく。管理学習を使用して、画像バックグラウンド特性の関数としてのシグナル識別のための強度閾値をモデリングする。前立腺癌の予後診断における提案されたシステムおよび方法の有用性を証明するが、システムおよび方法が多数のさらなる用途を有し得ると理解されるであろう。
【０２４５】
多重画像分析
提案されたシステムおよび方法を、上記のＩＦ多重アッセイと合わせて記載する。ＩＦ多重アッセイは、サイトケラチン１８（ＣＫ１８）、α−メチルアシル−ＣｏＡ−ラセマーゼ（ＡＭＡＣＲ）、およびアンドロゲン受容体（ＡＲ）と共に核対比染色４’−６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を含む。
【０２４６】
画像分析プラットフォーム
Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ  Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ  Ｉｍａｇｅ  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ  Ｓｕｉｔｅ（商標）を使用して定量化システムをデザインした（２６）。有益な生物学的オブジェクト（例えば、核）への画像分割は、オブジェクト指向の画像分割に基づく多段階過程である。このパラダイムでは、オブジェクトは、ピクセルよりもむしろ画像処理操作およびフィーチャ計算が好ましい最小単位である。例えば、強度閾値を画像に適用する場合、オブジェクト強度を閾値に供する。オブジェクトの強度は、オブジェクトに属する全ピクセルの平均強度である。
【０２４７】
２つの方法を使用して、プリミティブを得る（２６）。多重解像度分割法により、ピクセルとオブジェクトの形状規則性との間の色類似性に基づいてプリミティブが見出される。四部木分割法は、色類似性のみを使用する。スケールパラメータは、両方法においてオブジェクトのサイズを調節する。
【０２４８】
バイオマーカーの局在化および定量
発展したアプローチでは、第１の工程は、対応する細胞内区画内のバイオマーカーの空間的共局在化である。例えば、上皮核および細胞質は、それぞれ、ＡＲおよびＡＭＡＣＲの細胞内区画である。次の工程は、対応する区画プリミティブ中の真のバイオマーカーシグナルとバックグラウンドとを識別することである。バックグラウンドは、自己蛍光および蛍光色素の組織への非特異的結合からなる。細胞内区画のオブジェクトは、オブジェクトが一定量の真のシグナルを含む場合、バイオマーカーに関して陽性に分類される。バイオマーカーの定量化は、分類したオブジェクトの性質（例えば、領域）を測定する分析の最終工程である。
【０２４９】
バイオマーカー閾値モデル
画像分析の次の段階は、強度閾値を使用した真のバイオマーカーシグナルとバックグラウンドとの識別である。閾値Ｔを、バイオマーカーのバックグラウンド特性の関数と見なす。この関数を見出すために、オブジェクトＢを以下の２つの非重複クラスに分割する：区画Ｂｃおよび区画の外側のオブジェクトＢｂ中の共局在化。オブジェクトＢｂは、以下のフィーチャによって説明されるバックグラウンドと見なす：平均μｂ、標準偏差σｂ  、およびオブジェクト強度のα−ｔｈパーセンタイルｑｂ，α（式中、α＝５、１０、．．．、９５）。閾値Ｔとバックグラウンド特性との間の線形関係を推測する場合、
Ｔ＝βＴＸ      （１）
（式中、β＝［β０、β１、．．．、βｐ］Ｔβはモデルパラメータであり、Ｘ＝［１、Ｘ１、．．．、Ｘｐ］Ｔはバックグラウンドフィーチャである）。（１）では、Ｔは各画像の性質にしたがって変化することに留意のこと。
【０２５０】
多変量線形回帰を使用して、βを決定する。モデル訓練のために画像組を選択する。各画像について、ａ）オブジェクトＢｃおよびＢｂを同定し、ｂ）バックグラウンドフィーチャを抽出し、ｃ）病理学者がエキスパート強度閾値ｅｘｐＴを決定する。訓練組を使用してモデルを訓練し、エキスパート閾値（ｅｘｐｅｒｔ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）を予測する。
【０２５１】
モデル過剰適合を回避するために、冗長且つ統計的に有意でないフィーチャを訓練から排除した。２個のフィーチャのうちの１個は、対応のある相関関数ｒがｒ≧０．８５を満たす場合に冗長である。エキスパート閾値とのより強い一変量相関を有するフィーチャを、多変量回帰のために使用する。回帰係数のための信頼区間を計算し、その信頼区間がゼロを含む係数を統計的に有意でないと見なして消去する。パラメータβを、残存するフィーチャを使用して算定する。
【０２５２】
共局在化のための細胞内区画
基本細胞内組織区画は、標的ＡＲおよびＡＭＡＣＲ抗原を起源とする真のシグナルを含む。上皮核および細胞質は、上記基本区画を構成する。これらは、それぞれＤＡＰＩ画像およびＣＫ１８画像からセグメント化された陽性オブジェクトである。次の工程は、細胞質との重複によって核オブジェクトを上皮細胞および間質細胞に分割することである。
【０２５３】
癌再発予測では、浸潤性癌領域中に存在する上皮核を識別することが重要である。後者は、ＡＭＡＣＲ発現を含む細胞質領域として認識される。ＡＭＡＣＲ−と対照的に、これらの上皮核をＡＭＡＣＲ＋と呼ぶ。
【０２５４】
最初のプリミティブオブジェクトを、ＣＫ１８およびＡＭＡＣＲ画像のカラー四部木分割によって得る。これらのオブジェクトを、多重解像度分割を使用してより粗いオブジェクトに再セグメント化する。次いで、表２３由来の閾値（３）を適用して、最初の細胞質またはＣＫ１８＋オブジェクトを同定する。全ての最初のＣＫ１８オブジェクトにわたって（３）中の強度標準偏差ｂσを算定することに留意のこと。一旦最初のＣＫ１８＋オブジェクトが同定されると、近傍分析を使用して、クラスラベルをリファインする。その全境界長に対する細胞質の境界長が０．６以上である小さなバックグラウンドオブジェクトを、細胞質に再分類する。小さな単離細胞質オブジェクトを、バックグラウンドとして標識する。
【０２５５】
プリミティブオブジェクトを、ＤＡＰＩ画像でオーバーレイする。表２３由来の閾値（２）を使用して、ＤＡＰＩ＋オブジェクトおよびバックグラウンドオブジェクト中のプリミティブを分類する。この分類を、上記に類似の近傍分析によってさらにリファインする。ＤＡＰＩ＋オブジェクトは、ＤＡＰＩ画像中に示された実際の核の小フラグメントである。
【０２５６】
領域拡張およびオブジェクト分類からなる対話型方法を使用して、ＤＡＰＩ＋プリミティブを核にマージする。最後に、ＣＫ１８＋オブジェクトとの共局在化に基づいて、核オブジェクトを、上皮核および間質核に分類する。
【０２５７】
陽性および陰性バイオマーカー発現
ＡＭＡＣＲ＋細胞質領域は、以下の２つの工程で見出される：ａ）ＡＭＡＣＲ画像上のプリミティブオブジェクトのＣＫ１８＋領域でのオーバーレイ；ｂ）表２３中の閾値（５）の共局在化オブジェクトへの適用。その強度が（５）を超える細胞質オブジェクトを、ＡＭＡＣＲ＋に分類する。それぞれ陽性および陰性細胞質とのその関連に応じて、上皮核を、ＡＭＡＣＲ＋およびＡＭＡＣＲ−と標識する。
【０２５８】
上皮細胞は、ＡＲ発現の基本的細胞内区画である。表２３中の閾値モデル（４）を、上皮核中に共局在化したＡＲオブジェクトに適用する。そのＡＲ＋オブジェクト領域がその全領域の０．１％を超える場合、上皮核をＡＲ陽性（ＡＲ＋）に分類する。そうでなければ、ＡＲ陰性（ＡＲ−）に分類する。
【０２５９】
バイオマーカー定量化
一旦バイオマーカーが共局在化および分類されると、オブジェクトベースの強度および領域特性を示す定量的フィーチャを、共局在化バイオマーカーから生成する。代表的な強度フィーチャには、画像中で認識されたＡＭＡＣＲ陽性／陰性上皮細胞内の平均ＡＲ強度および総ＡＲ強度が含まれる。代表的な領域フィーチャには、全上皮細胞領域と比較したＡＲ＋上皮細胞領域および全ＡＲ＋細胞間のＡＭＡＣＲ＋上皮細胞画分が含まれる。
【０２６０】
結果
ＩＦ画像分析のために提案されたシステムの有用性を、前立腺摘除を受けた患者の前立腺癌再発の予測で証明した。予測のために２つの有害転帰型を考慮した。一方の転帰は、患者の血清ＰＳＡレベルの有意な上昇に対応する前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）再発（ＰＳＡＲ）であった。他方の転帰は、遠隔転移などの基準によって測定した有意な疾患の進行に対応する臨床的な失敗（ＣＦ）であった。
【０２６１】
それぞれＰＳＡＲおよびＣＦ予測タスクにおける患者６８２人および７５８人について、組織領域の少なくとも８０％が腫瘍で覆われた組織マイクロアレイコアを得た。コアをＤＡＰＩ対比染色で標識し、ＣＫ１８、ＡＲ、およびＡＭＡＣＲバイオマーカーをＣＲＩ  Ｎｕａｎｃｅ（商標）マルチスペクトル画像分析システムを使用して画像化した（２７）。各コアについて、ＤＡＰＩ対比染色の発光ピーク波長での１つの１２ビット１２８０×１０２４ピクセルのグレースケール画像を取得した。ＣＫ１８、ＡＲ、およびＡＭＡＣＲバイオマーカーのそれぞれについて、対応する蛍光色素の発光スペクトルを含む一定範囲の波長についての画像スタックを取得した。得られた画像スタックをＮｕａｎｃｅ（商標）システムを使用して分解し、それぞれバイオマーカーの１つに対応する３つの画像を得た。
【０２６２】
訓練組由来の６０個の多重画像組に関して、ＤＡＰＩ対比染色のエキスパート閾値、ならびにＣＫ１８、ＡＲ、およびＡＭＡＣＲバイオマーカーを認定された病理学者が選択し、閾値モデルを上記および表２３に示すように訓練した。モデルを、そのエキスパートと予測される閾値との間の最大の矛盾を有する画像の目視検査によって検証した。画像上のＡＲおよびＡＭＡＣＲバイオマーカーを定量し、全上皮核領域と比較したＡＲ＋上皮核領域ならびにＡＲ＋上皮核の強度を示すフィーチャを得た。ＡＲ＋ＡＭＡＣＲ＋およびＡＲ＋ＡＭＡＣＲ−上皮核についての類似のフィーチャも算定した。
【０２６３】
利用可能な患者を、ＰＳＡＲ予測のために患者３４２人および３４０人の訓練および検証組にグループ分けし、ＣＦ予測のために患者３７３人および３８５人の訓練および検証組にグループ分けした。ＰＳＡＲ予測では、ＡＲ＋上皮核の相対領域は、訓練組において最も高い（全ＡＲフィーチャの間で）一変量一致指数（ＣＩ）０．３７を示した（ｐ値＜０．００１）。ＣＦ予測では、ＡＲ＋ＡＭＡＣＲ＋上皮核の強度は、最も高い一変量ＣＩ  ０．３０を達成した（ｐ値＜０．００１）。
【０２６４】
さらに、多変量モデルを、システム病理学パラダイムに照らして２つの予測タスクのために訓練した。このパラダイムでは、患者の臨床的プロフィール（例えば、年齢）、組織学的プロフィール（ヘマトキシリンおよびエオシン染色組織検体から抽出した画像フィーチャによる（２８））、および分子的プロフィール（タンパク質バイオマーカーの発現を測定するフィーチャによる）由来の異種情報を管理学習フレームワーク中で組み合わせて、癌再発を予測した。得られたＰＳＡＲモデルは、上の実施例８に記載されている。得られたＣＦモデルは、上の実施例９に記載されている。
【０２６５】
したがって、ＩＦ多重化顕微鏡画像中の任意のタンパク質バイオマーカー発現の自動化局在化および定量化のためのシステムおよび方法を本明細書中に提供する。管理学習問題としてのバイオマーカー画像の閾値アプローチ、画像バックグラウンド特性の関数としての閾値のモデル化によって真のバイオマーカーシグナルをバックグラウンドと識別する。例えば、前立腺癌予後診断アッセイのＩＦ多重成分へのこのシステムの適用を証明する。ＡＲ発現の領域および強度を示すフィーチャは、有意な一変量相関を有することが示された。さらに、多変量環境での他の予測因子と競合して有益である新規、再生可能、およびロバストなフィーチャを選択し、それにより、実際の適用におけるシステムの有用性が検証される。
【０２６６】
【表２３−１】
2010523979.tif 000048
【０２６７】
【表２３−２】
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（実施例１０）ゲフィチニブで処置した非小細胞肺癌患者の生存の予測；臨床データ、形態計測データ、および分子データ
別の研究を行って、ゲフィチニブで処置した非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を有する個体の生存を予測するモデルを生成した。本発明の前に、かかる予測を行うための正確な分析ツールは存在しなかった。上記のように、本発明のシステム病理学アプローチは、ＰＳＡ再発および前立腺摘除後の臨床的な失敗を正確に予測することが示された。本研究は、本発明を使用して、ゲフィチニブ処置後の生存を正確に予測することもできることを証明する。
【０２６８】
種々の固形腫瘍（非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）が含まれる）中の上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の発現の豊富さが、ＥＧＦＲを選択的分子治療薬（詳細には、ゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ）などのチロシンキナーゼインヒビター）の魅力的な標的にしている。予め処置した患者におけるゲフィチニブについての最初の結果が有望であるにもかかわらず、２つの他の薬剤と組み合わせたゲフィチニブの２つの極めて重要な第ＩＩＩ相試験では、ゲフィチニブで処置したＮＳＣＬＣ患者は、プラセボ群と比較して、有意により良好な全生存率や無増悪生存率を示さなかった。さらに、第ＩＩＩ相（肺癌（ＩＳＥＬ）試験におけるプラセボ対照ＩＲＥＳＳＡ生存評価）では、ゲフィチニブ単剤療法は、全生存におけるいくつかの改善と関連した。しかし、データは統計的有意性に到達しなかった。人種（アジア）、性（女性）、喫煙歴（非喫煙）、良好なパフォーマンスステータス、および腫瘍病理学（腺癌−気管支肺胞バリアント）などの臨床−人工統計学フィーチャを有するので、ゲフィチニブに対する正の反応は、ＥＧＦＲのＡＴＰポケット変異の活性化に関連した。これらの結果により、ＮＳＣＬＣ患者の特定の下位集団がゲフィチニブに応答する可能性が最も高いことが示唆された。しかし、データは、低ＥＧＦＲ変異頻度（具体的には、コーカサス集団；米国に約１０〜１５％）によって複雑になっており、（制限された研究における）ゲフィチニブで処置した患者の約４５〜５０％が幾らかの臨床的利点を経験していたという所見と対照的である。別の課題は、ゲフィチニブ対未処置および種々の化学療法に無作為化した患者の間のＥＧＦＲ変異に関する比較データの欠如である。さらに、応答率は、研究した群の人口統計（例えば、性比、民族性、および詳細な喫煙歴）に非常に依存するようである。それにより、応答基準が以前に考慮していたよりも複雑であることが示唆される。重要なことに、プラセボ対照ＩＳＥＬ試験由来の最近の証拠により、高ＥＧＦＲ遺伝子コピー数によって臨床的利点および生存が予測されることが示唆される。これらの所見は、応答基準を理解するために認められたいくつかの複雑さを示す。
【０２６９】
患者１０９人のコホートを評価した。具体的には、ゲフィチニブで処置した進行性難治性ＮＳＣＬＣ由来の診断腫瘍サンプルを評価した。腫瘍サンプルを、ＥＧＦＲ  ＤＮＡ変異分析、ＥＧＦＲ免疫組織化学、組織学的形態計測、および１５種のマーカーについての定量的免疫蛍光によって評価した。サポートベクトル回帰数学モデルを使用して、６個の臨床的フィーチャ（性、喫煙歴、診断時の年齢、腫瘍病歴、およびＥＣＯＧパフォーマンスステータス）を組織学的および定量的バイオマーカー多重化と統合した。
【０２７０】
患者および組織
第１のコホートは、２８４人のゲフィチニブ２５０ｍｇで毎日経口にて処置した進行性難治性ＮＳＣＬＣを有する米国人患者からなる。以下の５個の臨床的フィーチャを分析した：性、喫煙歴、診断時の年齢、病歴、ＥＣＯＧパフォーマンスステータス（スケールは、０（健康）から５（病死）までの範囲である）（表２４）。非染色スライド（細針吸引、細胞ペレット、およびサイトスピンが含まれる）および／または診断検体由来のパラフィンブロックを、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）を使用して腫瘍含有量について評価した。全バイオマーカーを、臨床転帰の知識を用いずに分析した。
【０２７１】
ＥＧＦＲチロシンキナーゼドメイン変異分析
各パラフィンブロック由来の２つの連続的な厚さ２０μｍの切片またはパラフィンスライド由来の最小の８個の非染色切片を分析した。プロテイナーゼＫとのインキュベーション後に脱パラフィン組織サンプルからゲノムＤＮＡを得て、その後にクロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行う。ＥＧＦＲ変異を、最初のエクソン１９、２０、および２１のＤＮＡ配列決定ならびにエクソン２１のＬ８５８Ｒ点変異および最も一般的なエクソン１９欠失（ｄｅｌ  Ｇ２２３５−Ａ２２４９）を検出するための第２の増幅困難な変異系（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）（ＡＲＭＳ）、具体的には、対立遺伝子特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用によって分析した。腫瘍ＤＮＡ由来の少なくとも２つの独立したＰＣＲ産物におけるＡＲＭＳまたは順方向および逆方法の両方での遺伝子配列決定のいずれかによってチロシンキナーゼドメインの変異が検出された場合、患者を変異陽性と見なした。
【０２７２】
組織学的形態計測
Ｈ＆Ｅ染色スライドを、元のブロックまたは非染色切片から調製した。代表的な腫瘍領域由来の１〜６つの画像を、２０倍のＯｌｙｍｐｕｓ明視野顕微鏡と共にＳＰＯＴ  Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＱＥカラーデジタルカメラ（ＫＡＩ２０００）を使用して取得した。画像分析ソフトウェアにより、画像オブジェクトを赤色、緑色、および青色チャネル値を示す組織病理学的細胞エレメント、一般的形状フィーチャ（例えば、領域、長さ）、および空間的関係の性質（例えば、全組織に関する管腔の相対量）に分類し、これらから統計を行った。サンプル調製（すなわち、サイトスピン、針生検、および組織切除）、固定、染色、および組織の質の相違により、画像セグメント化のためのいくつかの異なるスクリプトが開発された。
【０２７３】
ＥＧＦＲ免疫組織化学
ＥＧＦＲタンパク質を、ＥＧＦＲ  ｐｈａｒｍＤＸキット（ＤＡＫＯ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用した免疫組織化学によって分析した。１０％超の腫瘍細胞が染色された場合にサンプルを陽性と見なした。各強度レベル（０〜３）をその強度レベルでの細胞の比率と乗じることによって各サンプルの染色指数を計算した。したがって、この指数は、０から３００までの範囲である。
【０２７４】
（多重（Ｍ−Ｐｌｅｘ（商標））バイオマーカー評価）
サイトケラチン１８、Ｋｉ６７、カスパーゼ−３活性化、ＣＤ３４、リン酸化ＥＧＦＲ、リン酸化ＥＲＫ、リン酸化ＡＫＴ、ＰＴＥＮ、サイクリンＤ１、リン酸化ｍＴＯＲ、ＰＩ３−Ｋ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ−２、およびリン酸化ＶＥＧＦＲ−２が含まれる１５種の抗体を選択し、６つの多重形式にグループ化した。各抗体により、形態学的成分（例えば、サイトケラチン１８（ＣＫ１８）、ＣＤ３４）、シグナル伝達経路、または増殖、アポトーシス、および血管形成の生体過程を評価した。
【０２７５】
各抗体を、免疫組織化学（ＩＨＣ）によって一連の細胞株および／またはコントロール肺癌組織サンプルについて評価した。各抗体を、免疫組織化学および免疫蛍光の標準的な操作手順の両方を使用して滴定した。次いで、単一および多重の免疫蛍光形式に抗体を進めた。１５種の抗体を、生物学的適用に関して抗原回復系、アイソタイプ、および優先順位づけに基づいて６個の多重形式にまとめた。これらのｍ−ｐｌｅｘ形式を、表２７に列挙する。
【０２７６】
【表２７】
2010523979.tif 000050
組織サンプルの脱パラフィンおよび再水和を、標準的な操作手順によって行った。電子レンジ中の１×Ｒｅｖｅａｌ溶液（ＢｉｏＣａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ）中でのスライドの７．５分間のボイルによって抗原回復を行った。スライドを室温で２０分間冷却し、次いで、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中にて３分間の洗浄を２回行った。
【０２７７】
組織サンプルに対して以下のプレハイブリッド形成処置工程を行った。組織の細胞構造の浸透を補助するために、サンプルを、ＰＢＴ（ＰＢＳ＋０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）中にて室温で３０分間インキュベートし、その後にＰＢＳ中にてそれぞれ３分間で３回のリンスを行った。組織自己蛍光の減少を補助するために、サンプルを、酸アルコール（１％ＨＣｌを含む７０％エタノール）中にて室温で２０分間インキュベートし、その後にＰＢＳ中にてそれぞれ３分間で３回のリンスを行った。スライドのＩＦブロッキング試薬（０．５ｍｇ／ｍｌＢＳＡを含むＰＢＳ）中での室温で２０分間のインキュベーションによって非特異的結合部位をブロッキングした。ブロッキング工程とその後のハイブリッド形成工程との間に洗浄を行わなかった。
【０２７８】
予め決定した力価を使用して、１つのマウスＩｇＧ１抗体および１つのウサギＩｇＧ抗体のカクテルをＩＦブロッキング試薬中で作製した。約１００μｌのこの抗体カクテルを組織サンプルに適用し、抗体および組織サンプルを、湿室中にて室温で１時間ハイブリッド形成させた。ハイブリッド形成後、それぞれＰＢＳ中で５分間のリンスを２回行い、その後にそれぞれＰＢＳ中で３分間のリンスを２回行った。
【０２７９】
標識工程のために、上記ハイブリッド形成抗体のための適切なＺｅｎｏｎ  Ａｌｅｘａ  ＦｌｕｏｒウサギＩｇＧ標識および適切なＺｅｎｏｎ  Ａｌｅｘａ  ＦｌｕｏｒマウスＩｇＧ１標識（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）のカクテルを、製造者が推奨する濃度（各Ｆａｂフラグメントについて５０倍希釈）にてＩＦブロッキング試薬中で作製した。約１００μｌのこの標識カクテルを組織サンプルに適用し、組織サンプルを湿室中にて室温で３０分間インキュベートした。標識反応後、２回リンスした。上記のハイブリッド形成および標識工程を、マルチプレックス中に含まれる次の各抗体群にて繰り返した。２回までのさらなる抗体ハイブリッド形成および標識ラウンドが可能である。異なる抗体を識別するために、ウサギまたはマウスのいずれかに特異的なＺｅｎｏｎ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ標識を１回を超えて使用しなかったことに留意すべきである。
【０２８０】
１０％ホルマリン中での室温で１０分間のサンプルのインキュベーションおよびその後のＰＢＳ中で３分間の各リンスを２回行うことによって固定工程を行った。ＤＡＰＩマウンティング溶液を含む約２５．０μｌのＳｌｏｗＦａｄｅ  Ｇｏｌｄ  ａｎｔｉｆａｄｅ試薬をサンプルに適用し、その後にカバーガラスをかけた。サンプルを、分析を行うことができるまで、−２０℃で保存した。
【０２８１】
Ｎｉｋｏｎ  ９０ｉ自動化蛍光顕微鏡をマウントし、ＭｅｔａＭｏｒｐｈオンラインソフトウェアによって制御されるＣＲＩ  Ｎｕａｎｃｅマルチスペクトルカメラ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．）を使用して多重蛍光画像を取得した。得られた画像を定量的グレースケールＴＩＦＦ画像（１２８０×１０２４ピクセル）として保存した。目的の選択領域について、ＤＡＰＩ核対比染色を、帯域通過ＤＡＰＩフィルタ（Ｃｈｒｏｍａ）を使用して、波長４８０ｎｍで記録した。Ａｌｅｘａ４８８を、ＦＩＴＣフィルタ（Ｃｈｒｏｍａ）を使用して、１０ｎｍ間隔にて５２０ｎｍと５６０ｎｍとの間で取得した。Ａｌｅｘａ５５５、５６８、および５９４を特注のロングパスフィルタ（Ｃｈｒｏｍａ）を使用して１０ｎｍ間隔にて５７０ｎｍと６７０ｎｍとの間で記録する一方で、Ａｌｅｘａ６４７を第２の特注のロングパスフィルタ（Ｃｈｒｏｍａ）を使用して１０ｎｍ間隔にて６４０ｎｍと７２０ｎｍとの間で記録した。各色素の代表的な領域を配分して、スペクトル分離過程のためのスペクトルライブラリを作製した。
【０２８２】
画像分析スクリプトを形態学的特質（すなわち、核についてはＤＡＰＩ、上皮細胞についてはＣＫ１８）にオーバーレイし、Ａｌｅｘａ蛍光色素サインを使用して各抗体を区別しながら、バックグラウンドを除去して信号対ノイズ比を最適にする。強度プロフィールによってフィーチャ（各標識抗体についての平均、最大、および標準偏差が含まれる）を生成する。その活性化形態を有する各マーカーの特異的関係（例えば、ｐＫＤＲ：ＫＤＲ、ｐＥＧＦＲ：ＥＧＦＲ）および別のマーカーを発現する細胞中の特異的マーカーの強度（例えば、ｐＥＲＫ陽性上皮細胞におけるリン酸化ｍＴＯＲ）を、スクリプトフィーチャ分析ソフトウェアによって生成する。
【０２８３】
抗体の品質管理
ｐＥＧＦＲ（Ｙ１０６８）抗体およびｐＥＲＫ抗体の特異性を確認するために、Ａ４３１  ＮＳＣＬＣ細胞株を上皮成長因子（ＥＧＦ）で処置した。細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、次いで、フェニルメチルスルホニルフルオリド（１ｍｍｏｌ／Ｌ）、ロイペプチン（２５μｇ／ｍＬ）、アプロチニン（２５μｇ／ｍＬ）、およびペプスタチンＡ（３．５μｇ／ｍＬ）を含む溶解緩衝液（０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）、３００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、２ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｎａ３ＶＯ４）にて４℃で２５分間溶解した。免疫沈降についての標準的なプロトコール後、ＩＰ  ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ化学発光ウェスタンブロットを、ＥＧＦ活性化細胞株および非活性化細胞株を使用して行った。ＶＥＧＦで活性化したＨＵＶＥＣ細胞株においてｐＫＤＲを使用して類似の試験を行った。さらに、ＥＧＦおよびＶＥＧＦの両方のために、処置細胞および非処置細胞を、日常的なＩＨＣのために処理した。
【０２８４】
免疫蛍光フィーチャの生成
各抗体の免疫蛍光スクリプト：コントロール肺癌組織サンプルを使用して抗原対を構築した。各タンパク質の予想される細胞分布にしたがってスクリプトをデザインし、取得したグレースケール画像を使用して各マーカーについての領域およびその後の蛍光強度の両方を同定する。予備スクリプトによって４００個超のフィーチャ（その多くが冗長）を生成し、それにより、モデル中のエントリーのためのフィーチャが８４個に減少した。
【０２８５】
統計分析
死亡までの期間を、ゲフィチニブでの処置の開始から死亡日または最後の追跡日までの期間と定義し、これを週で報告した。最後の追跡日に死亡が記録されなかった患者を打ち切った。フィーチャ減少した打ち切りデータについてのサポートベクトル回帰（ＳＶＲｃ−ＦＲ）を、Ｍ−Ｐｌｅｘ（商標）、組織学的形態計測、およびＥＧＦＲ免疫組織化学によって生成された臨床的変数およびフィーチャに適用した。ＳＶＲｃは、打ち切りデータ対応のための伝統的ＳＶＲの適応である。これを達成するために、右打ち切りデータおよび非打ち切りデータを処理可能な修正損失／ペナルティ関数を定義した。ＳＶＲｃ−ＦＲアルゴリズムは、一致指数（ＣＩ）に基づいて目的の転帰と一変量的に相関しないフィーチャを除去するための最初のフィルタリング工程を有する。ＣＩは、２人の無作為に選択した患者の時間（両方が死亡した場合）または打ち切られた患者の最後の追跡前に死亡した患者の時間を、正確な様式で予測する確率である。ＣＩは０から１までの範囲であり、０．５は無作為な関連（ｒａｎｄｏｍ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）を示す。したがって、ＣＩが０．５から離れるほど転帰とのより強い関連を示す。ＣＩ＜０．４または＞０．６のフィーチャのみを保持した。Ｃｏｘモデルを、複数のフィーチャ（ＳＶＲｃ−ＦＲによって選択されるフィーチャが含まれる）のコンパレータとして使用した。段階的アプローチを使用するとき、フィーチャの組み入れ基準はｐ値≦０．１５であった。モデル中にとどめるために、フィーチャのｐ値は≦０．０５でなければならなかった。
【０２８６】
結果
２８４人の患者のうち、１０９人（３８％）由来の組織サンプルは、さらなる分析に十分な腫瘍（＞５０％）を有していた。１０９人の患者サンプルのうち、８７人からＥＧＦＲ変異の結果を得た一方で５１人の患者は最終モデルに含めるための完全なデータ（すなわち、臨床的、免疫組織化学、および免疫蛍光）を有していた。全コホート（患者２８４人）および最終モデル（患者５１人）についての人口統計学を表２４に含む。
【０２８７】
【表２４】
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ＥＧＦＲ変異状態
エクソン１９〜２１、４、１０中の変異についての公開された配列に基づいたＥＧＦＲ変異分析を、臨床的転帰データおよびＤＮＡ分析に十分な材料を有する患者８７について行った。患者４人（５％）は、エクソン１９、２０、または２１中にＥＧＦＲチロシンキナーゼドメインの変異を有していた。これらの患者のうちの２人はエクソン１９にインフレーム欠損（ｄｅｌＬ７４７−Ｓ７５２ｉｎｓＶおよびｄｅｌＬ７４７Ｐ７５３ｉｎｓＳ）を有し、１人はエクソン２０に体細胞変異（Ｔ７９０Ｍ）を有し、１／４はエクソン２１にＬ８５８Ｒ変異を有していた。ＥＧＦＲ変異を有する患者４人全員が女性であり、腺癌と診断された。これらの患者のうちの２人が部分的に応答し、２人が進行した（表２５）。短命（４週間）の患者に存在するＴ７９０Ｍ変異は、薬物耐性と関連すると以前に示されていた。変異について分析した全患者についての全生存率の中央値は２４週間であり、１年間の全生存率は２６％であった。低頻度のＥＧＦＲ変異のために、変異状態を、その後のモデル開発における変数として使用しなかった。
【０２８８】
【表２５】
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ＥＧＦＲ免疫組織化学
腫瘍が５０％を超えて存在する患者６０人のサンプルに対して免疫組織化学を行った。簡潔に述べれば、腫瘍のみの領域におけるＥＧＦＲタンパク質の不均質を評価し、１４サンプル（２３％）が染色指数２００以上を示す一方で（発現の増加が示唆される）、２０サンプル（３０％）の染色指数が０であった。腫瘍染色指数は、予測モデル中に含まれる唯一の変数であった。ＥＧＦＲタンパク質の免疫組織化学を陽性細胞率×強度（０〜３＋）を使用して分析し、分析のために利用可能なサンプルを使用して患者についての染色指数（Ｈスコア）を作製した（表２８）。
【０２８９】
【表２８−１】
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【０２９０】
【表２８−２】
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【０２９１】
【表２８−３】
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Ｈ＆Ｅ  画像分析
１０９人のＨ＆Ｅ染色患者サンプル由来の選択されたデジタル化画像を、画像ソフトウェアを使用して処理した。本ソフトウェアは、各組織（細胞要素、分離上皮核、上皮細胞質、間質、および肺胞内腔）をセグメント化および分類する。エレメントを、スペクトルの「色」特性、形状、および組織オブジェクト間の空間的関係を使用して分類する。管腔を、例えば、肺胞「腫瘍」上皮細胞に囲まれた余白の全関連から分類する。３９個の画像化フィーチャを生成し、予測モデルに入れた。
【０２９２】
表２９は、各患者サンプル（全切片、針生検、および針吸引が含まれる）から抽出した３９個のＨ＆Ｅフィーチャを列挙する。
【０２９３】
【表２９−１】
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【０２９４】
【表２９−２】
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定量的Ｍ−Ｐｌｅｘ（商標）免疫蛍光
コントロール組織サンプルを使用して評価した場合、示した予想される細胞の局在および分布において１５種の全抗体を使用した。患者５９人由来の腫瘍検体を、方法の項に列挙した１５種の抗体を使用して評価した。各抗体についての目的の代表的領域を、サンプル内の腫瘍の量および質に基づいて選択し、壊死領域および細胞残屑を回避した。各多重分析において患者サンプルあたり最少で３つの視野を取得し、全画像を免疫蛍光ソフトウェアを使用して処理して８４個の定量的フィーチャを生成した。活性化カスパーゼ−３およびリン酸化ｍＴＯＲは、浸潤リンパ球および腫瘍上皮細胞内に局所的に見出された。対照的に、サイクリンＤ１は、腫瘍上皮細胞の核内に支配的に存在した。興味深いことに、ｐＫＤＲは腫瘍上皮細胞および腫瘍内皮細胞の島内に散在的に見出された。
【０２９５】
８４個のフィーチャ（表３０）は、見出される区画（すなわち、ＤＡＰＩ＝核；サイクリンＤ１、Ｋｉ６７、ＰＴＥＮ、およびリン酸化ＥＲＫ（ｐＥＲＫ）については核；ＣＫ１８、カスパーゼ−３ａ、およびＶＥＧＦについては細胞質；リン酸化ＡＫＴについては核／細胞質；ＥＧＦＲおよびＫＤＲについては膜；ならびにリン酸化ＫＤＲ（ｐＫＤＲ）、リン酸化ｍＴＯＲ、ＰＩ３Ｋ、およびリン酸化ＥＧＦＲについては細胞質／膜）、シグナルの分布（すなわち、核、細胞質などのオブジェクト内の幾何学的ドットとしてのピクセル対ピクセル）、および相互の関係（例えば、ＥＧＦＲ−ｐＥＧＦＲ；ｐ−ｍＴＯＲ−ｐＥＲＫ）に関する各バイオマーカーからのアルゴリズム出力（強度および領域の両方に関連する平均、最大、および標準偏差）を示す。
【０２９６】
【表３０−１】
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【０２９７】
【表３０−２】
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予測モデルの開発
統合的「システム病理学」アプローチを使用して、全生存の８つのモデルを、臨床的変数とともに以下のフィーチャの異なる組み合わせに基づいて開発した：ＥＧＦＲ免疫組織化学（分子）、組織学的形態計測（形態計測）、および免疫蛍光（分子）。患者によってはいくつかのフィーチャドメインについて欠測データが存在していたので、さらなるドメインを付加した場合、含まれる患者数が最大２８４人から５１人の最少組に減少することに留意のこと。６個の臨床的フィーチャのうちでＣＩフィルタを通過したものはなかったので、ＳＶＲｃ−ＦＲは、臨床的フィーチャのみを有するデータセットに適用できなかった（患者２８４人のコホート）。
【０２９８】
【表３１−１】
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【０２９９】
【表３１−２】
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システム病理学アプローチの有用性を評価するために、上記の８つのモデルを、全フィーチャドメインの完全な情報を有する患者のサブセット（ｎ＝５１）由来のデータを使用して訓練した。ＩＨＣがＣＩフィルタを通過しなかったので、このフィーチャの排除によってモデルは変化しなかった（例えば、臨床的＋＋ＩＨＣモデルは臨床モデルに等しい）。表３２は、患者５１人のコホートに対するＳＶＲｃ−ＦＲの結果を示す。パフォーマンスステータスは、ＣＩフィルタを通過した唯一の臨床的変数であった。選択された唯一のＨ＆Ｅフィーチャは、管腔の相対領域であった。臨床的フィーチャへのＩＦフィーチャの付加により、ＣＩが改善された。臨床データへのＨ＆ＥフィーチャによってもＣＩが改善されたが、ＩＦよりわずかに低かった。
【０３００】
【表３２−１】
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【０３０１】
【表３２−２】
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異なるモデルについてのＣｏｘの結果を、表３３に示す。これらは、変数の段階的選択を使用したＣｏｘモデルに基づいた多変数分析である。ｐ値≦０．１５であった全フィーチャをＣｏｘモデルの入力として入れた。モデル中に留まらせるために、フィーチャはｐ値≦０．０５を必要とした。
【０３０２】
１を超えるハザード比は生存に及ぼす負の影響を示し（フィーチャの値が高いほどより短い寿命が予測される）、１未満のハザード比はフィーチャが保護効果を有することを示す（フィーチャの値が高いほどより長い寿命が予測される）。これらの結果に基づいて、パフォーマンスステータスは、生存の有意に臨床的な予測因子であることが見出された。ＩＦフィーチャのうち、Ｃｏｘの結果およびＳＶＲｃモデル中でしばしば同一の抗体を選択した。しかし、選択したフィーチャは、ＳＶＲｃ−ＦＲを使用して選択した特質と異なる特質を捕捉した。Ｈ＆Ｅフィーチャのうち、Ｃｏｘモデルにより、上皮核の平均領域および細胞質の相対領域で生存が予測されることが見出された。
【０３０３】
【表３３−１】
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【０３０４】
【表３３−２】
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４個の全フィーチャドメインに基づいたモデルの詳細な説明を、以下に記載する。各入力ドメインについての完全なデータは、患者５１人に利用可能である。その人口統計学的特徴は、全コホートと類似していた（表２４）。
【０３０５】
最終モデル中で選択されたフィーチャを、モデルにおいて重要な順に表２６に列挙する。フィーチャに対する正の寄与は値が高いほど良好な転帰（より長い寿命）が予想されることを意味し、負の寄与は値が高いほど悪い転帰が予想されることを意味する。その寄与がゼロから最もかけ離れているフィーチャを、最も重要と見なす。
【０３０６】
ＣＩ０．７４で最終モデルを実行した。比較すると、臨床データのみを使用したモデルのＣＩは０．６２であった。パフォーマンスステータスは、選択された唯一の臨床的フィーチャであった。したがって、免疫蛍光およびＨ＆Ｅフィーチャの付加により、生存予測能力は１２％増加した。
【０３０７】
モデルスコアを、ログランク検定に基づいたカイ２乗統計量によって分析した。この分析により、切点３９．５は、その実際の生存経験に関して患者を最も強く分離する（カイ２乗、２１．３９；調整ｐ値０．０００２）ことが証明された。３９．５を超えるスコアは、ハザード比５．２６を有していた（９５％信頼区間：２．６０、１０．６２）。すなわち、３９．５を超えるスコアを有する患者について、より低いスコアを有する患者と比較して、研究期間にわたる死亡リスクは５倍であった。死亡リスクについてのこのハザード比を、遡及的な独立したコホートで確認する必要があるであろう。切点を超える患者および切点未満の患者についてのカプラン・マイヤー曲線を、図２０に示すように生成した。
【０３０８】
各フィーチャの予測値を、Ｃｏｘ分析によってさらに試験した。この分析により、パフォーマンスステータス（ハザード比：４．４、９５％信頼区間１．９６〜９．９２）が全モデルにわたって生存の有意な予測因子であることが確認された。パフォーマンスステータスよりもあまり確実に実行されないＩＦフィーチャについて、しばしば同一のマーカーを選択したが（すなわち、サイクリンＤ１、ｐＫＤＲ、カスパーゼ−３）、マーカーの異なる特質を反映する起源の異なるフィーチャを、異なるモデルの間または異なるモデル内で選択した。
【０３０９】
【表２６】
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考察
画像化研究で客観的応答が認められていない場合でさえ、ゲフィチニブから恩恵を受けることができるＮＳＣＬＣ患者の同定が決定的に重要性であることが医学界で同意されている。この理由のために、本発明者らは、終点として全生存を使用してゲフィチニブに対する応答を調査した。ゲフィチニブで処置した患者の全生存のための予測モデルが患者の腫瘍サンプル中の情報の付加によって改善されることが証明された。定量的バイオマーカー特性および組織学的形態計測の臨床データとの統合により、かかる予測モデルの精度（ＣＩ）が６２％（臨床的フィーチャのみ）から７４％（全ドメイン）まで増加した。
【０３１０】
多数の変数が、ゲフィチニブ感受性に影響を及ぼすと報告されており、変数には、性、腫瘍病歴（例えば、腺癌／気管支肺胞癌）、喫煙歴、民族性、ＥＧＦＲ遺伝子コピー数、ＥＧＦＲキナーゼドメイン変異、およびＥＧＦＲ変異型が含まれる。最近、ＥＧＦＲエクソン１９欠失患者がＬ８５８Ｒ変異を有する患者よりも長い生存期間の中央値を有することが報告された。さらに、ＥＧＦＲプロモーターにおける生殖系列多形は、チロシンキナーゼドメイン変異を持たない患者におけるゲフィチニブ応答に潜在的に関連する因子として提案されている。さらに、ゲフィチニブに対する応答は、腫瘍病歴または患者の人口統計学的と無関係にＮＳＣＬＣ患者で認められている。
【０３１１】
本ＥＡＰコホートでは、患者８７人のうちの４人にエクソン１９〜２１中にＥＧＦＲ変異が同定された。変異頻度が低すぎて予測モデルにこれらの変異を含められなかったにも関わらず、変異頻度は主に西洋人の患者を含む以前の研究と一致した。このコホートでは、以前の研究の場合、ＥＧＦＲ変異頻度は、ゲフィチニブ由来の臨床的利点の推定頻度よりもはるかに低かった。本ＥＡＰコホート由来の患者１２４人の分析では、４５％の患者が第１の再評価で進行の証拠がなく、２９％がゲフィチニブの投与中に肺癌関連症状の改善が報告された。
【０３１２】
生存に関連すると一貫して同定された唯一の臨床的変数はパフォーマンスステータスであった。これは、良好なパフォーマンスステータス（ＥＣＯＧステータス０〜２）がより長い生存と関連することを証明した以前の研究と一致する。良好な臨床転帰と関連していた気管支肺胞病歴を本発明者らの予測モデルで選択しなかったが、選択した組織学的画像化フィーチャである「総組織領域で除した管腔領域」を、この腺癌サブタイプの代理形態学的フィーチャと解釈することができる。
【０３１３】
進行性ＮＳＣＬＣ患者の下位個体群の異なるゲフィチニブ感受性の基本とする分子機構の理解は不完全なままである。ＥＧＦＲ変異およびＥＧＦＲ遺伝子コピー数に加えて、試験された他の分子変数には、インタクトなＥＧＦＲ、リン酸化ＥＧＦＲ、および下流分子（ＰＩ３Ｋ、ｐＡｋｔ、およびｐＥＲＫなど）が含まれる３１、５２〜５４。不運なことに、幾らかでもある場合にこれらの各因子がゲフィチニブ感受性で果たす役割と一致せず、全生存についてのその重要性とあまり一致しない。免疫組織化学によって評価されたＥＧＦＲでさえ、ゲフィチニブ応答とのその関連についての矛盾する報告の主題であった。
【０３１４】
本分析では、全生存に関連した定量的免疫蛍光によっていくつかのマーカーを同定した。有意には、増加量がより短い全生存と関連した２つのサイクリンＤ１フィーチャを、最終モデルによって選択した。
【０３１５】
モデルによって選択された残存バイオマーカー（活性化カスパーゼ−３およびリン酸化ＫＤＲが含まれる）を、肺癌臨床検体において広く調査しなかった。カスパーゼ−３は、生存期間の中央値を有する過剰発現に関連する矛盾する報告の主題であった。しかし、ｐＫＤＲについて、臨床ＮＳＣＬＣサンプルにおける免疫組織化学または免疫蛍光に関する研究は最近発表されていない。Ｃｏｘモデルにより、（選択されたフィーチャに基づいた）ＶＥＧＦの過剰発現が生存の減少と関連することが確認され、これは、微小管密度および腫瘍浸潤と併せてＶＥＧＦを試験する以前の研究と一致する。サイクリンＤ１、カスパーゼ−３、ｐＫＤＲ、およびＶＥＧＦを種々のサブモデルで繰り返し選択したという事実により、腫瘍の成長、転移、および生存のための細胞周期の調節および血管形成の重要性が示唆される。
【０３１６】
したがって、ゲフィチニブで処置した進行性ＮＳＣＬＣ患者において全生存が首尾よく予測された一連の統合的なシステムベースのモデルを構築した。選択したバイオマーカーは、これらが細胞周期の調節、アポトーシス、および血管形成の兆候を示すという点で誘発的である。
【０３１７】
さらなる実施形態
したがって、医学的状態の発生の予測のための方法およびシステムを提供することが分かる。特定の実施形態を本明細書中で詳細に開示しているが、これは、説明のみを目的として一例として開示しており、以下の添付の特許請求の範囲を制限することを意図しない。特に、本発明者らは、特許請求の範囲によって定義された本発明の精神および範囲を逸脱することなく種々の置換、変更、および修正を行うことができることを意図する。他の態様、利点、および修正形態が以下の特許請求の範囲の範囲内であると見なされる。示した特許請求の範囲は、本明細書中に開示の本発明を代表する。他の特許請求の範囲に記載されていない発明も意図される。出願人は、以下の特許請求の範囲中にかかる発明を追求する権利を留保する。
【０３１８】
コンピュータシステムの少なくとも一部を使用して上記の本発明の実施形態を実行可能な範囲で、記載の方法および／または記載のシステムの少なくとも一部の実行のためのコンピュータプログラムが本発明の態様の一部として予測されることが認識されるであろう。コンピュータシステムは、任意の適切な装置、システム、またはデバイスであり得る。例えば、コンピュータシステムは、プログラミング可能なデータ処理装置、汎用コンピュータ、デジタルシグナルプロセッサ、またはマイクロプロセッサであり得る。コンピュータプログラムをソースコードとして具体化してコンピュータ上での実行のためにコンパイルすることができるか、例えば、オブジェクトコードとして具体化することができる。
【０３１９】
前述のコンピュータプログラムまたはコンピュータシステムに帰するいくつかまたは全ての機能性を、例えば、１つまたは複数の特定用途向け集積回路によってハードウェア中で実行することができることも考えら得る。
【０３２０】
適切には、コンピュータプログラムを、コンピュータ使用可能形態のキャリア媒体に保存することができる。この媒体も本発明の１つの態様として想定される。例えば、キャリア媒体は、固体メモリ、光メモリ、または光磁気記憶装置（読み出し可能なおよび／または書き込み可能なディスク（例えば、コンパクトディスク（ＣＤ）またはデジタル多用途ディスク（ＤＶＤ））など）、または磁気メモリ（ディスクまたはテープなど）であり得る。コンピュータシステムは、システムを操作するためのプログラムを使用することもできる。コンピュータプログラムを、電気信号（高周波搬送波または光搬送波が含まれる）などのキャリア媒体中で具体化される遠隔光源から供給することもできる。
【０３２１】
(参考文献)
以下の参考文献（このうちのいくつかは上で引用されたものである）は全て、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０３２２】
【化２】
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【０３２３】
【化３】
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【０３２４】
【化４】
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【０３２５】
【化５】
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【０３２６】
【化６】
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【０３２７】
【化７】
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【０３２８】
【表１−１】
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【０３２９】
【表１−２】
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【０３３０】
【表１−３】
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【０３３１】
【表１−４】
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【０３３２】
【表１−５】
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【０３３３】
【表１−６】
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【０３３４】
【表１−７】
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【０３３５】
【表１−８】
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【０３３６】
【表１−９】
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【０３３７】
【表１−１０】
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【０３３８】
【表１−１１】
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【０３３９】
【表１−１２】
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【０３４０】
【表１−１３】
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【０３４１】
【表２−１】
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【０３４２】
【表２−２】
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【０３４３】
【表２−３】
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【０３４４】
【表２−４】
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【０３４５】
【表２−５】
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【０３４６】
【表２−６】
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【０３４７】
【表２−７】
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【０３４８】
【表２−８】
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【０３４９】
【表１７】
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【０３５０】
【表１８−１】
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【０３５１】
【表１８−２】
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【０３５２】
【表１９−１】
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【０３５３】
【表１９−２】
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【０３５４】
【表２０−１】
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【０３５５】
【表２０−２】
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【０３５６】
【表２１−１】
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【０３５７】
【表２１−２】
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【０３５８】
【表２２】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１９】
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【図２０】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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