(57)【要約】  本発明は、オリゴリボヌクレオチド合成中でシリル保護基を除去するために、テトラアルキルアンモニウムフルオリド誘導体又はピリジンフッ化水素複合体を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
保護されたＲＮＡ分子の２’−ヒドロキシルを脱保護する組成物であって、テトラアルキルアンモニウムフルオリド又はピリジンフッ化水素を含むことを特徴とする組成物。
【請求項２】
前記テトラアルキルアンモニウムフルオリドが、テトラエチルアンモニウムフルオリドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記テトラエチルアンモニウムフルオリドが、ジメチルスルホキシド含有混合物中にある、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
オラー試薬含有混合物中にピリジンフッ化水素を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記テトラアルキルアンモニウムフルオリド又はピリジンフッ化水素が、シリル保護基を除去する、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記シリル保護基が、tert−ブチル−ジメチルシリル又は２’−Ｏ−トリイソプロピルシリルオキシメチルである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記テトラアルキルアンモニウムフルオリド又はピリジンフッ化水素が、２’−Ｏ−ビス（２−アセトキシエトキシ）メチルオルトエステル保護基を除去する、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
保護されたＲＮＡ分子の２’−ヒドロキシルを脱保護する方法であって、
ａ）保護されたＲＮＡと請求項１に記載の組成物とを混合する工程、
ｂ）前記ＲＮＡ及び請求項１に記載の組成物に約３０〜１８０分間、熱又は超音波をかける工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項９】
前記熱又は超音波が、約３０〜１２０分間かけられる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の組成物が、ジメチルスルホキシド中のテトラエチルアンモニウムフルオリドである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
合成したオリゴヌクレオチドを固体担体から回収する方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする方法。
（１）合成したオリゴヌクレオチドが結合した固体合成担体を提供する工程、
（２）前記オリゴヌクレオチドを切り離し、脱保護するのに適した条件下で、アミン試薬とともに前記固体担体をインキュベートする工程、
（３）切り離した保護基の遊離残基を実質的に除去し、かつ切り離し脱保護した前記オリゴヌクレオチドが前記担体上に優先的に保持されることを可能とする方法で、前記アミン試薬を除去する工程、及び
（４）脱シリル化試薬とともに前記固体担体をインキュベートする工程であって、前記脱シリル化試薬が、ピリジンフッ化水素及びオラー試薬を含み、前記オリゴヌクレオチドを前記担体上に残したまま、シリル保護基を除去するのに適した条件下でインキュベートする工程。
【請求項１２】
前記アミン試薬が、ニートのアミン試薬である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ニートのアミン試薬が、ニートのプロピルアミン試薬である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
担体に結合したオリゴヌクレオチドの塩基保護基及び２’保護基の位置を除去する方法であって、
ａ）ニートのプロピルアミン試薬を前記担体に結合した前記オリゴヌクレオチドに導入して、前記オリゴヌクレオチドから塩基保護基を切り離す工程、
ｂ）ピリジンフッ化水素及びオラー試薬を含む試薬を前記担体に結合した前記オリゴヌクレオチドに導入して、２’保護基を除去する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
前記アミン試薬が、脱シリル化試薬を導入する前に、前記担体に結合した前記オリゴヌクレオチドから除去される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記アミン試薬が、減圧、重力圧、又はテトラヒドロフラン洗浄工程に通すことにより除去される、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国特許法１１９条（ｅ）の下、２００６年１１月２０日に出願された米国仮特許出願番号６０／８６６，４６９の優先権を請求する。上述の出願の全教示を、ここで参考として取り入れる。
本発明は、リボ核酸（ＲＮＡ）を合成する方法に関連し、具体的には、オリゴリボヌクレオチドの合成中に２’−ＯＨ保護基を除去する新規な方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡ又はＲＮＡ断片は、現在の科学的な応用において不可欠な道具である。ＲＮＡは、細胞プロセスを研究するため、又は遺伝子発現を抑制するために使用され得る。オリゴリボヌクレオチドを合成する方法は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を合成する方法と平行してきたが、ＲＮＡ合成は従来から、ＲＮＡに２’ヒドロキシル基が存在するためより厄介なものである。５’ヒドロキシル基及び２’位は合成中に保護される必要があるが、各位置の保護基は異なる時に除去される必要がある。これは、ＲＮＡ合成方法をより複雑にする。ＲＮＡ合成の一例は、オジルビー(Ogilvie)らにより説明される（Proc. Natl. Acad. ScL, Vol. 85, pp. 5764-5768, August 1988）。
【０００３】
オジルビーらの方法では、２’−ヒドロキシル基はtert−ブチル−ジメチルシリル(TBDMS)保護基により保護される。典型的に、合成ＲＮＡは、テトラヒドロフラン中でテトラブチルアンモニウムフルオリド(TBAF)を使用してカップリングした後に、脱保護（シリル保護基が除去）される（Glen Research Report, Vol. 4, No. 1, March 1991, RNA Synthesis - Problems in Deprotectionを参照）。この脱保護方法は数時間かかる可能性があり、特に、より長いオリゴリボヌクレオチドでは、完全には機能しないだろう。そして、結果として生じるＲＮＡの有用性を抑制するかもしれない保護基が残るだろう。
【０００４】
別の代替方法では、従来のジメトキシトリチル(DMT)基の代わりに別の５’保護基を使用する（Scaringeなど、米国特許第5,889,136号明細書を参照）。スカリンジ(Scaringe)らの方法では、シリルエーテル基が５’位で使用され、２’保護基は２’−Ｏ−ビス−（２−アセトキシエトキシ）メチル(ACE)オルトエステルである。この方法は広大な循環、及び合成の複雑性を増大させる試薬交換を必要とする。
【０００５】
更に別の代替方法では、２’TBDMS基を２’−Ｏ−トリイソプロピルシリルオキシメチル(TOM)と置換する。TOMの構造は立体的に好ましく、結果として、穏やかな条件下でより良いカップリング収率をもたらす。それは塩基性又は弱酸性条件で安定である。しかしながら、TOMは、特定の条件下、例えば加熱下では好ましくなく、結果として、通常中性である副生成物をもたらす。
【０００６】
ドゥプラー(Duplaa)らの方法では（米国特許第5,552,539号明細書）、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩(triethylamine trihydrofluoride)（TEA/3HF）が、典型的には、有機溶媒、例えばアセトニトリル中で、保護基、特にTBDMSを除去するために使用される。TEA/3HFはより時間をかけずに（約２〜２０時間）、より長いオリゴヌクレオチドで使用され得、より完全な脱保護を提供し得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
TEA/3HFは、従前の脱保護試薬を超える改良であるけれども、代わりの脱保護試薬、特に、穏やかな条件下でより速い脱保護時間をもたらすことができる試薬を提供する必要がある。加えて、オリゴヌクレオチドが担体(support)に留まったまま、塩基脱保護及び脱シリル化を起こし得る試薬が必要とされる。
【０００８】
提案方法は、テトラアルキルアンモニウムフルオリド誘導体及びピリジンフッ化水素(pyridine hydro fluoride)を含む代替試薬を提供する。これは、穏やかな条件下、２時間足らずでシリル保護基を除去する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の簡単な概要）
提案方法は、テトラアルキルアンモニウムフルオリド誘導体及びピリジンフッ化水素を含む代替試薬を提供する。これは、穏やかな条件下、２時間足らずでシリル保護基を除去する。一群の態様では、オリゴヌクレオチドが担体から除去される少し前に、試薬を使用し得る。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】脱保護試薬としてテトラエチルアンモニウムフルオリドを使用して合成した配列番号１(SEQ ID NO.1)のＥＳＩ質量分析記録である。
【図２】脱保護試薬としてテトラエチルアンモニウムフルオリドを使用して合成した配列番号２(SEQ ID NO.2)のＥＳＩ質量分析記録である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（発明の詳細な説明）
提案方法は、テトラアルキルアンモニウムフルオリド誘導体及びピリジンフッ化水素を含む代替試薬を提供する。これは、穏やかな条件下、２時間足らずでシリル保護基を除去する。一態様では、脱シリル化は、オリゴヌクレオチドが担体から動かずに付着されたまま起こり得る。提案脱保護試薬は、技術的によく知られているＲＮＡ合成方法、例えば、ドゥプラーらに説明された方法とともに使用され得る。一態様では、テトラエチルアンモニウムフルオリドのジメチルスルホキシド(DMSO)溶液が、シリル保護基を除去するために使用される。別の態様では、DMSO／ピリジン／フッ化水素ピリジン(hydrogen fluoride pyridine)溶液が、他の従来のＲＮＡ合成条件で、シリル基を除去するために使用される。更に別の態様では、提案脱保護試薬は、２時間足らずでシリル基を除去するために使用され得る。今一つ別の態様では、提案脱保護試薬は、超音波処理を使用して室温で除去され得る。
【００１２】
用語「オリゴヌクレオチド」は、合成ＲＮＡ又はＤＮＡポリマーについて言及する。用語「オリゴリボヌクレオチド」は、少なくとも１つのリボヌクレオチドモノマーを含む「オリゴヌクレオチド」のサブセットである。１以上のＤＮＡ及びＲＮＡモノマーは、標識若しくは連結基で変更され得、又は技術的に知られている他の変更をされ得る。
【００１３】
以下の実施例は、本発明を更に説明するが、もちろん、発明の範囲を制限するものと決して解釈されるべきでない。
【実施例１】
【００１４】
この実施例は、テトラエチルアンモニウムフルオリドを使用する、オリゴヌクレオチド合成及び脱シリル化を明示する。
【００１５】
2'-TBDMS保護された標準的なＲＮＡホスホラミダイト化学(phosphoramidite chemistry)を使用して、Applied Biosystems Model Expedite 8909 ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置で、２つのオリゴヌクレオチドを合成した。反応を１ｕｍｏｌｅスケールで行った。
配列番号１: 5' aTTTTTTTTTTTTTTT 3'
配列番号２: 5' gaacuucaggcuccugggcT 3'
T=デオキシチミジン（ＤＮＡ）、u=ウリジン、a=アデノシン、g=グアニン、c=シトシン、（ＲＮＡ）。
【００１６】
以下の合成では、調整された多孔性ガラス(controlled pore glass)（ＣＰＧ）固体担体を２ｍｌマイクロチューブに移した。オリゴヌクレオチドをＣＰＧから切り離し、４０％メチルアミン水溶液１ｍｌ中、６５℃で３０分間インキュベーションすることにより脱保護した。浮遊物を除去し、プールし、乾燥させた。t−ブチル−ジメチルシリル保護基を、超音波浴中、室温で３０分間、１５％テトラエチルアンモニウムフルオリドのDMSO溶液５００μＬで処理することにより、ＲＮＡ残基から除去した。オリゴヌクレオチドを、n−ブタノール１．５ｍｌにより沈殿させた。試料を−７０℃で１時間冷却し、次いで、１０，０００ｇで１０分間遠心分離した。浮遊物をデカントし、沈殿物をn−ブタノールでもう一度洗浄した。
【００１７】
合成及び精製後に、ESI質量分析により化合物の同一性を確認した。質量分析記録を図１に示す。基質配列番号１の測定質量は、4830.8であった（計算質量4830.2）。基質配列番号２の測定質量は、6357.0であった（計算質量6356.9）。
【実施例２】
【００１８】
以下の実施例は、脱シリル化試薬としてピリジンフッ化水素(pyridine hydrofluoride)を使用する、オリゴヌクレオチドの合成を明示する。
【００１９】
実施例１で上述されたように、オリゴヌクレオチド配列番号１及び配列番号２を合成し、ＣＰＧから切り離しておく。t−ブチル−ジメチルシリル保護基を、超音波浴中、室温で３０分間、ピリジンフッ化水素（ＨＦ）／ピリジン（Ｐｙｒ）の１：２（ｖ／ｖ）溶液５００μＬで処理することにより、ＲＮＡ残基から除去した。実施例１で説明されたように、最終生成物を単離し、解析した。オラー(Olah)試薬中のＨＦとＰｙｒの比は９：１（７０％ＨＦ、３０％Ｐｙｒ）であるが、ＨＦ／Ｐｙｒ比６：１〜１：１を使用して、保護基を成功裏に除去した。一態様では、比は３：１であり、これはＯｌａｈ／Ｐｙｒ比１：２に相当する。
【実施例３】
【００２０】
以下の実施例は、ポリスチレン固体担体上で、ピリジンフッ化水素を使用する合成及び脱シリル化を明示する。
【００２１】
2'-TBDMS保護された標準的なＲＮＡホスホラミダイト化学を使用して、Applied Biosystems Model Expedite 8909 ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置で、配列番号２のオリゴヌクレオチドを合成した。反応を１ｕｍｏｌｅスケールで行った。
【００２２】
以下の合成では、ポリスチレン（ＰＳ）固体担体を２ｍｌマイクロユーブに移した。ニートのプロピルアミン１ｍｌ中、５５℃で６０分間インキュベーションすることにより、固定担体から引き離すことなく、オリゴヌクレオチドを切り離し、脱保護した。過剰のプロピルアミンを除去し、固体担体をＴＨＦ１ｍＬで洗浄した。
【００２３】
t−ブチル−ジメチルシリル保護基を、４０℃で３０分間、ピリジンフッ化水素／ピリジン／ＴＨＦの１：２：３（ｖ／ｖ）溶液５００μＬで処理することにより、ＲＮＡ残基から除去した。固体担体を２×１回分ブタノール１ｍＬで洗浄した。オリゴヌクレオチドを、メタノール２０％含有脱イオン水溶液１．５ｍＬで溶出した。
【００２４】
合成及び精製後に、ESI質量分析により化合物の同一性を確認した。基質配列番号２の測定質量は、6357.0であった（計算質量6356.9）。
【００２５】
出版物、特許出願、及び特許を含む、ここで引用される全ての参考文献を、まるで各文献を個別にかつ具体的に参考として取り込むように示し、ここで完全に説明したのと同じ程度にまで、これにより参考として取り入れる。
【００２６】
本発明を説明する文中（特に、特許請求の範囲の文中）での、語“a”、“an”及び“the”並びに同様の指示物の使用は、明細書中別に指し示したり、文脈からはっきりと矛盾したりしない限り、単数と複数の両方を含むものと解釈されるべきである。語句「含む(comprising)」、「有する(having)」、「含む(including)」、及び「含有する(containing)」は、別に言及されない限り、制限のない語として解釈されるべきである（すなわち、「含むが、制限されない」という意味である）。本明細書中、別に指し示されない限り、数値範囲の記載は、その範囲内に入るそれぞれ異なる数値に個別に言及する簡略表記方法として役立つことが意図されるに過ぎず、まるで本明細書中に個別に記載されるかのように、それぞれの異なる数値を本明細書に取り込む。本明細書中で説明される全ての方法は、本明細書中別に指し示したり、文脈から別にはっきりと矛盾したりしない限り、どんな適した順序においても行い得る。本明細書中で提供される、いずれかの及び全ての例、又は例示的な言葉の使用（例えば、「例えば(such as)」）は、本発明をより明らかにすることが意図されるに過ぎず、別に主張されない限り、本発明の範囲の制限を持ち出すものではない。本明細書中の言葉は、本発明の実施に不可欠なものとして何ら主張されていない要素を指し示すように解釈されるべきでない。
【００２７】
本発明の好ましい態様は、本明細書で説明され、これは、発明者に知られている、本発明を実施するための最良の形態を含む。それらの好ましい態様の変更は、前述の記載を読むとすぐに、当業者にとって明らかとなるかもしれない。発明者は、そのような変更を適するように用いる当業者を予期する。本発明は、具体的に本明細書で説明されるのとは別の方法で実施され得るということを、発明者は意図する。従って、本発明は、適用法により許されるように、明細書に添付される特許請求の範囲に記載される主題の全ての変更及び同等物を含む。さらに、本明細書中別に指し示したり、文脈から別にはっきりと矛盾したりしない限り、その全ての可能な変更における上述の要素のどんな組み合わせも本発明により包含される。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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