(57)【要約】本発明は、間葉幹細胞及びＣＤ２６阻害剤による、多臓器不全または急性腎不全などの腎機能障害の治療のための方法および組成物を提供する。この場合、ＣＤ２６を阻害することにより、標的組織への間葉幹細胞のホーミングが増加する。一局面において、本発明は、急性腎不全、急性腎臓損傷、多臓器不全、腎移植の早期の機能障害、移植片拒絶反応、慢性腎不全のような疾病および同様の疾病などの臓器機能障害および／または臓器不全を治療するための改善された方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における多臓器不全、急性腎不全、慢性腎不全、または腎臓機能障害を治療する方法であって、
対象に治療有効量のＣＤ２６阻害剤を投与する工程、及び
治療有効量の間葉幹細胞を該対象に共投与する工程
を含む方法。
【請求項２】
Ｄｉｐｒｏｔｉｎ  Ａ、Ｌ−Ｖａｌ−Ｌ−ｂｏｒｏＰｒｏ、スルフォスチン、Ｐ−ｅｐｉスルフォスチン、脱スルホン化スルフォスチン、Ｌｙｓ［Ｚ（ＮＯ２）］−チアゾリジド、Ｌｙｓ［Ｚ（ＮＯ２）］−ピロリジド、ＬＡＦ２３７、ＭＫ−０４３１、シタグリプチン、ビルダグリプチン、サクサグリプチン、アログリプチン、これらの塩もしくはエステル、およびこれらの組み合わせから成る群から選択されるＣＤ２６阻害剤を投与する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
治療有効量の前記ＣＤ２６阻害剤Ｄｉｐｒｏｔｉｎ  Ａまたはその化学的に修飾された類似物を投与する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記方法は、Ｄｉｐｒｏｔｉｎ  Ａの化学的に修飾された類似物を投与する工程を含み、該化学的修飾は、ペプチドのＮ末端および／またはＣ末端への修飾、アミノ酸の側鎖の変更、α炭素の修飾、１つ以上のＬ残基による１つ以上のＤ残基の置換、及びアミド結合置換の導入、から成る群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
治療有効量の前記ＣＤ２６阻害剤シタグリプチンまたはビルダグリプチンを投与する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
同種異系の間葉幹細胞を投与する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
自己由来の間葉幹細胞を投与する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
糖尿病に関連する腎不全を治療する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
心筋梗塞に関連する臓器不全を治療する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記対象における急性腎不全を治療する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記対象に化学向性薬剤を共投与する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記化学向性薬剤としてＳＤＦ−１またはＳＤＦ−１類似物を投与する工程を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＣＤ３４およびＣＸＣＲ４を発現する間葉幹細胞を共投与する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
対象における多臓器不全、急性腎不全、慢性腎不全、または腎機能障害を治療する方法であって、
有効量のＣＤ２６阻害剤によってインビトロにおいて間葉幹細胞を処理する工程、及び
治療有効量の該ＣＤ２６処理済み間葉幹細胞を対象に投与する工程
を含む方法。
【請求項１５】
Ｄｉｐｒｏｔｉｎ  Ａ、Ｌ−Ｖａｌ−Ｌ−ｂｏｒｏＰｒｏ、スルフォスチン、Ｐ−ｅｐｉスルフォスチン、脱スルホン化スルフォスチン、Ｌｙｓ［Ｚ（ＮＯ２）］−チアゾリジド、Ｌｙｓ［Ｚ（ＮＯ２）］−ピロリジド、ＬＡＦ２３７、ＭＫ−０４３１、シタグリプチン、ビルダグリプチン、サクサグリプチン、アログリプチン、これらの塩もしくはエステル、及びこれらの組み合わせから成る群から選択されるＣＤ２６阻害剤を投与する工程を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
Ｄｉｐｒｏｔｉｎ  Ａまたはその化学的に修飾された類似物を投与する工程を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
治療有効量の前記ＣＤ２６阻害剤シタグリプチンまたはビルダグリプチンを投与する工程を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
さらに、化学向性薬剤を前記対象に共投与する工程を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記化学向性薬剤としてＳＤＦ−１またはＳＤＦ−１類似物を投与する工程を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
腎臓疾患である急性腎不全、慢性腎不全の治療のための医薬品の製造における治療量のＣＤ２６阻害剤の使用。
【請求項２１】
前記ＣＤ２６阻害剤が、Ｄｉｐｒｏｔｉｎ  Ａ、Ｌ−Ｖａｌ−Ｌ−ｂｏｒｏＰｒｏ、スルフォスチン、Ｐ−ｅｐｉスルフォスチン、脱スルホン化スルフォスチン、Ｌｙｓ［Ｚ（ＮＯ２）］−チアゾリジド、Ｌｙｓ［Ｚ（ＮＯ２）］−ピロリジド、ＬＡＦ２３７，ＭＫ−０４３１，シタグリプチン、ビルダグリプチン、サクサグリプチン、アログリプチン、これらの塩もしくはエステル、およびこれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
前記ＣＤ２６阻害剤がＤｉｐｒｏｔｉｎ  Ａまたはその化学的に修飾された類似物である、請求項２０に記載の使用。
【請求項２３】
前記ＣＤ２６阻害剤がシタグリプチンまたはビルダグリプチンである、請求項２０に記載の使用。
【請求項２４】
前記医薬品がさらに間葉幹細胞を含む、請求項２０に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互に関連した出願の記述
この出願は、２００７年２月１日に出願された、米国仮特許出願第６０／８９８，８０３号（この全体は、参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、概して、臓器機能障害および／または臓器不全の治療のための間葉幹細胞およびその誘導体の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
幹細胞治療法は、様々な疾病に対する新しい治療の開発において大変有望視されている。幹細胞は、自己複製能および他の細胞種への分化能を有する未分化細胞であり、細胞表面マーカー、転写因子の有無、および／またはサイトカインの産生において特徴付けることができる。骨髄由来の幹細胞としては、造血幹細胞（ＨＳＣ：ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）および間葉幹細胞もしくは髄間質細胞（ＭＳＣ：ｍａｒｒｏｗ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ）などがある。ＭＳＣは、高い自己複製能、ならびに軟骨細胞、骨細胞、筋細胞、内皮細胞、神経細胞、β−すい臓島細胞、および脂肪細胞などの細胞種への分化能を有する。
【０００４】
移植した同種異系ＭＳＣは、移植者の免疫系を調整することがわかっている。例えば、ＡｇｇａｒｗａｌおよびＰｉｔｔｅｎｇｅｒは、免疫細胞の部分細胞群と一緒に共培養したヒトＭＳＣ（ｈＭＳＣ：ｈｕｍａｎ  ＭＳＣ）が、樹枝状細胞（ＤＣ：ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ）、Ｔ細胞（ＴＨ１およびＴＨ２）、およびナチュラルキラー細胞のサイトカイン分泌特性を変え、炎症反応を抑えることを実証した（非特許文献１）。さらに、ＭＳＣの投与が、臓器機能障害および臓器不全（例えば、急性腎不全（ＡＲＦ：ａｃｕｔｅ  ｒｅｎａｌ  ｆａｉｌｕｒｅ）および多臓器不全などが挙げられるが、これに限定されるものではない）の治療において有益であることがわかっている（特許文献１および特許文献２を参照のこと。なお、両方とも、その全体が参照により本明細書中に援用されるものとする）。これは、ＭＳＣが腎臓内の損傷した部位に到達し、臓器に対して有益なパラクリン効果（例えば、腎臓での炎症反応を抑えるなど）を及ぼす能力を有するためと考えられている。腎臓におけるＡＲＦの主な影響の１つは、腎臓の尿細管細胞と血管細胞との破壊である。腎臓機能の回復および患者の生存は、主に、破壊され損傷した細胞の保護および再生にかかっている。
【０００５】
ＭＳＣは、炎症反応を抑制して患者のＡＲＦからの回復または生存を支援することできるが、ＭＳＣの標的を腎臓にすることができれば、当技術分野における有意義な改良となるであろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００４／０９０１１２号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００６／１２１４４５号パンフレット
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｓｕｄｅｅｐｔａ  ＡｇｇａｒｗａｌおよびＭａｒｋ  Ｆ．Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ、「Ｈｕｍａｎ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｍｏｄｕｌａｔｅ  Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ」，Ｂｌｏｏｄ（２００５）１０５：１８１５−１８２２
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、投与されたＭＳＣのホーミング効率を高める方法、およびＭＳＣの腎臓保護効果を増加させる方法に関する。
【０００９】
さらに、本発明は、対象の臓器機能障害および／または臓器不全の治療のための間葉幹細胞（同種同系（自己由来を含む）または同種異系（非自己由来）であってもよい）の使用に関する。典型的な実施形態において、本発明は、多臓器不全または急性腎不全などの腎機能障害の治療のための、ＣＤ２６阻害剤と組み合わせてのＭＳＣの使用に関する。別の典型的な実施形態において、本発明は、ＭＳＣと組み合わせての化学向性薬剤（ｃｈｅｍｏｔｒｏｐｉｃ  ａｇｅｎｔ）の使用に関する。さらに別の典型的な実施形態において、本発明は、ＣＤ２６阻害剤および／または化学向性薬剤（例えば、ＳＤＦ−１またはＳＤＦ−１類似物）と組み合わせてのＭＳＣの使用に関する。
【００１０】
さらなる典型的な実施形態において、本発明は、臓器機能障害または臓器不全（例えば、腎不全または腎臓損傷など）を患っていると考えられる対象に、１種以上のＣＤ２６阻害剤を投与することによって当該対象を治療する方法に関する。別の典型的な実施形態において、ＣＤ２６阻害剤は、ＭＳＣと組み合わせて、例えばＭＳＣと同時に、あるいはＭＳＣの投与の後に対象に投与される。さらに別の典型的な実施形態では、ＭＳＣを対象に投与する前に、ＣＤ２６阻害剤によってＭＳＣを前処理する。
【００１１】
別の典型的な実施形態において、ＣＤ２６阻害剤は、天然ＣＤ２６阻害剤の化学的修飾によって設計されたペプチド類似物を包含する。この場合、この化学的修飾は、ペプチドのＮ末端および／またはＣ末端への修飾（例えば、Ｎ末端アセチル化もしくは脱アミノ化および／またはアミドもしくはアルコールによるＣ末端カルボキシル基の置換など）、アミノ酸置換を含み得る側鎖に対する変更、メチル化、アルキル化、および脱水素化などのα炭素の修飾、１つ以上のＬ残基による１つ以上のＤ残基の置換、並びにアミド結合置換の導入（すなわち、ペプチド（またはアミド）結合に関与する原子の変更）を包含し得る。
【００１２】
別の典型的な実施形態において、本発明は、同種同系のＭＳＣを所望する場合に、時間節約のため、培養する必要のある細胞が少なくて済むように、ＭＳＣの投与と組み合わせてのＣＤ２６阻害剤の使用に関する。別の典型的な実施形態において、本発明は、対象に投与されるＭＳＣの数を減らすための、ＭＳＣの投与と組み合わせてのＣＤ２６阻害剤の使用に関する。
【００１３】
また、本発明は、急性腎不全、急性腎臓損傷、多臓器不全、腎移植の早期の機能障害、移植片拒絶反応、慢性腎不全のような疾病および同様の疾病などの臓器機能障害および／または臓器不全を治療するための改善された方法に関する。別の典型的な実施形態において、本発明は、損傷を受けた臓器がＳＤＦ−１の産生を増加する疾病症状を治療する方法に関する。
【００１４】
また、本発明は、臓器機能障害および／または臓器不全に関連する疾病の治療のための、ＣＤ２６阻害剤を含む医薬品の製造に関する。任意選択により、この医薬品は、さらにＭＳＣ、化学向性薬剤、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１Ａは、腎臓、血漿、および骨髄におけるＳＤＦ−１タンパク質の濃度に関する急性腎不全の影響を示す。図１Ｂは、腎臓、血漿、および骨髄におけるＳＤＦ−１タンパク質の濃度に関する急性腎不全の影響を示す。
【図２】ＣＸＣＲ４＋／ＣＤ３４＋ＭＳＣの移動に関するＣＸＣＲ４ブロッキング抗体の効果を示す。
【図３】ＭＳＣが急性腎不全（ＡＲＦ）を治療する能力を有することを示す。
【図４】ＣＤ２６の阻害が血液循環から骨へのＨＳＣのホーミングを増加させ得ることを示す。
【図５】ヒトＭＳＣがＣＤ２６、ＳＤＦ−１、およびＣＸＣＲ４を発現することを示す。
【図６】ＭＳＣが機能性ＣＤ２６を発現することを示す。
【図７】ＣＤ２６の阻害がＭＳＣの移動を著しく増加させることを示す。
【図８】典型的実験の概要を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書および添付の請求項の中で使用される場合、単数形、例えば「一つの（”ａ”、”ａｎ”）」および「前記（”ｔｈｅ”）」は、文脈から明確に他の意味が規定されない限り、複数形も包含する。例えば、「ＣＤ２６阻害剤」についての言及は、複数のこのような阻害剤、例えば、２種以上のＣＤ２６阻害剤の混合物およびその同等物などを包含する。
【００１７】
本明細書中で使用される場合、化合物（すなわち、ＣＤ２６阻害剤または化学向性薬剤）およびＭＳＣについて言及した「共投与（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒ）」、「との組み合わせにおいて」、「の組み合わせ」なる句または同様の句は、化合物およびＭＳＣの効果が、治療される対象において両方とも存在することを意味する。この化合物および／またはＭＳＣは、同時に、または連続して、任意の順序にて異なる時点において投与してもよい。しかしながら、この化合物およびＭＳＣは、治療効果において所望する増進が得られるように、時間的に十分に接近して投与されるべきである。この化合物およびＭＳＣは、同じ投与経路で投与してもよいし、異なる投与経路で投与してもよい。この場合、このような化合物およびＭＳＣの好適な投与間隔、投与経路、および投与順序は、本開示の観点から当業者には明らかであろう。
【００１８】
本明細書中で使用される場合、「ＣＤ２６阻害剤」は、ＣＤ２６プロテアーゼ活性を阻害することのできる任意の化合物、ペプチド、およびペプチド類似物を意味する。ＣＤ２６阻害剤の例としては、これに限定されるものではないが、Ｄｉｐｒｏｔｉｎ  Ａ（Ｈ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−ＯＨ）、Ｌ−Ｖａｌ−Ｌ−ｂｏｒｏＰｒｏ、スルフォスチン（ｓｕｌｐｈｏｓｔｉｎ）、Ｐ−ｅｐｉスルフォスチン、脱スルホン化スルフォスチン（ｓｕｌｐｈｏｓｔｉｎ  ｄｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、Ｌｙｓ［Ｚ（ＮＯ２）］−チアゾリジド、Ｌｙｓ［Ｚ（ＮＯ２）］−ピロリジド、ＬＡＦ２３７、ＭＫ−０４３１、シタグリプチン（Ｓｉｔａｇｌｉｐｔｉｎ）（Ｊａｎｕｖｉａ（商標））、ビルダグリプチン（ｖｉｌｄａｇｌｉｐｔｉｎ）、サクサグリプチン（Ｓａｘａｇｌｉｐｔｉｎ）、アログリプチン（Ａｌｌｏｇｌｉｐｔｉｎ）、および／またはこれらの塩もしくはエステルが挙げられる（また、米国特許第６，１００，２３４号、国際公開第２００７／０４１３６８号、およびそれらの中で引用された文献を参照のこと）。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、「ＭＳＣ」または「間葉幹細胞」は、細胞群の大部分の細胞が、自己複製能および脂肪細胞種または骨細胞腫への分化能を有する細胞群である。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、「対象」は、ヒトを含む任意の動物を意味する。
【００２１】
本明細書中で使用される場合、「治療」は、疾病の少なくとも１つの症状を改善することを意味する。
【００２２】
ＭＳＣ（髄間質細胞、骨髄間質細胞、間質前駆細胞、コロニー形成単位−線維芽細胞、多能性成体前駆細胞（ＭＡＰＣ：ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ａｄｕｌｔ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ）としても知られている）は、成体幹細胞であり、この成体幹細胞は、古くから骨髄から得られていたが、他の組織（例えば、これらに限定されるものではないが、末梢血液、皮膚、毛根、筋肉、脂肪組織、臍帯組織、および様々な組織の一次培養物など）からも得ることができる。ＭＳＣは、多くの公知の手順（例えば、国際公開第２００６／１２１４４５号、同第２００４／０９０１１２号、およびＴｏｅｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｐｒｏｔｅｃｔ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｉｓｃｈｅｍｉｃ  Ａｃｕｔｅ  Ｒｅｎａｌ  Ｆａｉｌｕｒｅ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２８９：Ｆ３１−Ｆ４２に記載の方法など）により、入手、精製、および／または同定することができる。
【００２３】
ＳＤＦ−１（また、ＣＸＣＬ１２としても知られている）は、ＣＸＣＲ４受容体（システイン−Ｘ−システイン受容体４）との相互作用による、造血幹細胞（ＨＳＣ：ｈｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）に対する走化活性を有するα−ケモカイン（化学向性薬剤）である（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｓｏｎ  ＩＩ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ＣＤ２６／ＤＰＰＩＶ  Ｍｅｄｉａｔｅｓ  Ｇ−ＣＳＦ  Ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｕｓｅ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌｓ，  Ｂｌｏｏｄ  １０１（１２）：４６８０−４６８６）。さらに、ＳＤＦ−１は、炎症、骨髄への幹細胞の移動、および損傷臓器（例えば、脳、心臓、肝臓、および腎臓など）において、発生神経生物学上重要な役割を果たす。ＳＤＦ−１は、内皮に対するＨＳＣの結合、マトリックス・メタロプロティナーゼ（ＭＭＰ：ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）の発現、並びにＨＳＣのホーミングおよび移植に関係する他の過程を調整する。近年、尿細管細胞の発現およびＳＤＦ−１の血漿中濃度が著しくアップレギュレートされた後に、それに続いて急性の虚血／再潅流腎損傷（ＡＫＩ）が誘発されることがマウスにおいて実証された。これは、特にＣＤ３４およびＣＸＣＲ４共発現骨髄幹細胞の腎臓へのホーミングを促進するＳＤＦ−１を増加させる（Ｔｏｅｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）  Ｒｅｎａｌ  ＳＤＦ−１  ｓｉｇｎａｌｓ  ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｈｏｍｉｎｇ  ｏｆ  ＣＸＣＲ４−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｋｉｄｎｅｙ  ａｆｔｅｒ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｉｎｊｕｒｙ，  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．  ６７：１７７２−１７８４およびＳｏｎ  ｅｔ  ａｔ．（２００７）  Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  ａｎｄ  Ｃｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｉｓ  Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ＳＤＦ−１−ＣＸＣＲ４  ａｎｄ  ＨＧＦ−ｃ−ｍｅｔ  Ａｘｅｓ  ａｎｄ  Ｉｎｖｏｌｖｅｓ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ，  ＤＯＩ：１０．１６３４／ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．２００５−０２７１）。
【００２４】
ＣＤ２６（ジペプチジルペプチダーゼＩＶ；ＥＣ  ３．４．１４．５）は、プロリン残基またはアラニン残基の後でポリペプチド鎖のＮ−末端からジペプチドを切断する膜結合性細胞外性ペプチダーゼである。ＣＤ２６は、間質細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１：ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  １）（ＣＸＣリガンド１２としても知られている）をその２番目の位置のプロリンで切断し、その結果として、ＳＤＦ−１を不活性化する能力を有する。
【００２５】
さらに、ＭＳＣの投与は、複雑なパラクリン機構（抗炎症剤、抗アポトーシスおよび分裂促進細胞応答など）を通じて、急性腎臓障害（ＡＫＩ：ａｃｕｔｅ  ｋｉｄｎｅｙ  ｉｎｊｕｒｙ）を防ぐ（Ｔｏｅｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２８９：Ｆ３１−４２，２００５を参照のこと）。ここで、ジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶ（ＣＤ２６）を阻害することで、ＳＤＦ−１の不活性化が減少し、それによって、ＣＸＣＲ４発現ＭＳＣのＳＤＦ−１信号へのＳＤＦ−１媒介性ホーミングが増加することが示されている。特に、これは、腎臓障害に応答してのＭＳＣの腎臓へのホーミングを可能にするが、それは、傷害を受けた腎臓においてＳＤＦ−１信号が増加するためである。したがって、本発明は、傷害を受けた腎臓またはＳＤＦ−１を発現する他の組織へＭＳＣをターゲッティングし、それにより、ＭＳＣによる腎臓の保護と回復を増強させるための改善された方法を提供する。さらに、本発明は、ケモカイン療法に基づいてＳＤＦ−１を改良する方法を提供する。
【００２６】
本発明では、インビトロにおいて、ＣＤ２６の阻害がＳＤＦ−１−ＣＸＣＲ４によって媒介されるＭＳＣの走化活性を高めることを実証する。対照的に、ＣＸＣＲ４の阻害は、ＳＤＦ−１−ＣＸＣＲ４によって媒介されるＭＳＣの走化活性を低下させる。したがって、インビボにおいてＤｉｐｒｏｔｉｎ  ＡなどのＣＤ２６阻害剤によりラットを予備治療すれば、実験による急性腎臓障害（ＡＫＩ）において、投与されたＭＳＣの腎臓保護機能が増強し得る。その結果、本発明は、修飾されたＣＤ２６阻害プロトコルの使用と、その結果として、ＡＫＩにおける堅牢な腎保護を達成するために必要なＭＳＣの数の減少とを提供する。
【００２７】
ＣＤ２６阻害剤による対象の治療は、腎臓内でのＳＤＦ−１濃度をさらに増加および／または持続させ、それによってＭＳＣのホーミングまたは動員を増加させる方法を提供する。１種以上のＣＤ２６阻害剤の投与は、特にＭＳＣの投与と組み合わせて、内生のＭＳＣおよび／または投与されたＭＳＣの損傷を受けた臓器へのホーミングまたは動員を増加させ、その結果、有益な治療につながると考えられている。
【００２８】
治療のための投与量は、通常、投与経路、治療される対象の年齢、体重、および症状に応じて変わる。本明細書に提示された情報に基づいて、ＣＤ２６阻害剤、化学向性薬剤（例えば、ＳＤＦ−１など）、および／またはＭＳＣの有効量の決定は、ベテラン医師によって最適に決定される（国際公開第２００６／１２１４４５号、米国特許出願公開第２００４／０２４７５７４号、並びに米国特許第６，２５８，５９７、同第６，３００，３１４号、および同第６，３５５，６１４号を参照のこと）。本発明のＣＤ２６阻害剤、化学向性薬剤、および／またはＭＳＣは、一般的に、任意の望ましい担体、希釈剤、または賦形剤を含み得る医薬組成物において有用である。
【００２９】
本発明のＣＤ２６阻害剤は、約１〜約１００μＭ／ｋｇ（全体重）、または約１〜５０μＭ／ｋｇ（全体重）、または約１〜３０μＭ／ｋｇ（全体重）、または約１〜１０μＭ／ｋｇ（全体重）の投与量において、対象に投与してもよい。本発明のＭＳＣは、約０．０１〜約１×１０６細胞／ｋｇ（全体重）の量において対象に投与してもよい。
【００３０】
当業者は、保存または投与のために、所望の純度を有する本発明の化合物（例えば、ＣＤ２６阻害剤、化学向性薬剤、およびそれらの組み合わせなど）および／またはＭＳＣを、薬学的に許容される担体、賦形剤、安定化剤などと混合することによって、本発明の化合物および／またはＭＳＣの製剤を調製することができる。治療用途のための許容可能な担体、賦形剤、安定化剤、または希釈剤は、製剤業界において既知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ  ｅｄｉｔ．  １９８５）に記載されている。そのような材料は、採用された投与量および濃度において、受容側に対して無毒であり、緩衝剤（例えば、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、および他の有機酸塩など）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸など）、低分子量（約１０残基未満）ペプチド（例えば、ポリアルギニンなど）、タンパク質（例えば、血漿アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなど）、親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドンなど）、アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはアルギニンなど）、単糖類、二糖類、および他の炭水化物（例えば、セルロースもしくはその誘導体、グルコース、マンノースまたはデキストリンなど）、キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡなど）、糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビートルなど）、対イオン（例えば、ナトリウムなど）、および／または非イオン性界面活性剤（例えば、トゥイーン、プルロニクス、またはポリエチレングリコールなど）を含んでいてもよい。注入のための無菌の化合物および／または細胞は、従来の薬務に従って製剤化することができる。例えば、賦形剤（例えば、リン酸緩衝食塩水など）中における化合物（単数または複数）および／または細胞の溶液もしくは懸濁液などが挙げられる。また、緩衝液、保存料、抗酸化剤などを、許容される薬務に従って添加することができる。
【００３１】
ＳＤＦ−１は、感染症、骨髄への幹細胞の移動、および損傷臓器（例えば、脳、心臓、肝臓、および腎臓など）において、発生神経生物学上重要な役割を果たすβ−β−β−αトポロジーの典型的なケモカインであり、ＣＸＣＲ４は、多くの細胞上で発現するＳＤＦ−１のＧタンパク質共役細胞表面受容体であり、ＣＤ２６は、ＳＤＦ−１を不活性化するジペプチジルペプチダーゼＩＶである。さらに、ＣＸＣＲ４は、ＣＤ４（分化抗原群４）の共受容体として、ＨＩＶ−１ウィルスによって使用され、Ｔリンパ球への結合を容易にし、Ｔリンパ球を破壊する。ＳＤＦ−１は、ＨＩＶ糖タンパク質１２０と競合し、ＨＩＶ感染を防ぐために役に立ち得る。また、ＣＸＣＲ４は、癌細胞株（膵、食道、乳房）、腎臓細胞、骨髄、および神経細胞においても発現する。
【００３２】
図１Ａおよび１Ｂは、ＳＤＦ−１タンパク質の濃度に関する急性腎不全の影響を示している。腎臓皮質中のＳＤＦ−１タンパク質の濃度は、正常な腎臓での濃度に比べ、ＡＲＦ後２４時間で著しく増加した（図２Ａ）。血漿中のＳＤＦ−１タンパク質は、ＡＲＦ後１日でベースラインよりかなり上昇した（図２Ｂ）。対照的に、骨髄（ＢＭ：ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ）中のＳＤＦ−１のレベルは、ベースラインより低下し、その結果、正常な骨髄−血液の勾配は逆になった（Ｔｏｅｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００５））。
【００３３】
ＡＲＦ前（Ｎ＝３）およびＡＲＦの１日後（Ｎ＝３）の腎臓、骨髄、および末梢血液中のＳＤＦ−１タンパク質の定量は、ＥＬＩＳＡによって実施した。被膜を剥離した腎組織は、細胞および組織を溶解するため、切り刻んで超音波処理し、ＲＩＰＡ緩衝液で溶解し、ＢＣＡタンパク質定量試薬アッセイによってタンパク質を定量した。マウスの大腿骨の骨髄（Ｎ＝３）をＰＢＳで洗い、細胞を遠心分離した。ＳＤＦ−１のために細胞分画および上澄みを分析した。また、ＳＤＦ−１のために等量のタンパク質を検査した。すなわち、９６ウェルプレートをＳＤＦ−１抗体でコーティングし、終夜インキュベートした。ウェルを緩衝液で洗浄して、ブロッキング用緩衝液により室温で１時間インキュベートした。１００マイクロリットルの試料を供給し、室温で２時間インキュベートした。３回洗浄した後、抗ＳＤＦ−１抗体を適用し、試料を室温で２時間インキュベートした。洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体を反応混合物に加え、室温で２０分間インキュベートした。反応が停止したら、４５０ｎｍに設定したマイクロプレートリーダーによって光学濃度を測定した。波長補正は５７０ナノメートルに設定した。試料結果は、既知の量の組換えＳＤＦ−１タンパク質を希釈して作成した標準曲線から計算した。
【００３４】
図２は、ＣＸＣＲ４＋／ＣＤ３４＋ＭＳＣの移動に関するＣＸＣＲ４ブロッキング抗体の効果を示している。この実験は、損傷した腎臓へのＭＳＣのホーミングにＣＸＣＲ４が必要であることを示している。正常なＦＶＢ（フレンド白血病ウィルスのＢ株に対する感応性）のマウスの１００万個の骨髄細胞をＣＦＤＡ（カルボキシフルオレセインジアセテート（ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｄｉａｃｅｔａｔｅ））で染色し、腎茎を６０分間クランプした後、尾静脈に注入した。２４時間後に動物を殺し、さらなる分析のために腎臓を採取した。各腎臓の四分の一を、コラゲナーゼにより３７℃で６０分間消化分解した。遠心分離処理しＰＢＳで洗浄した後、腎臓細胞を再懸濁させ、ノイバウエル盤にてカウントした。注入されホーミングした細胞は、明緑色のＣＦＤＡ染色により明確に認識することができた。総細胞数と同様に、ＣＦＤＡ−陽性細胞を同じ腎臓の少なくとも２つの試料でカウントし、平均を取った。
【００３５】
骨髄は、両方の大腿骨をＰＢＳで洗い流して得た。骨髄細胞については、ノイバウエル盤にてＣＦＤＡ−陽性細胞をカウントし、ホーミングした細胞の定量を行った。損傷した腎臓へのＣＸＣＲ４発現細胞のホーミングにおけるＣＸＣＲ４の役割を調べるため、骨髄細胞を１０μｇの抗ＣＸＣＲ４ブロッキング抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）によって３０分間プレインキュベートし、細胞を洗浄および遠心分離した後で注入した。上で説明したように、ＣＦＤＡ−陽性細胞について、腎臓および骨髄を調べた。
【００３６】
図３は、対照培地、ＭＳＣ、または線維芽細胞による、重症の急性腎不全（ＡＲＦ）の治療を示す。図４Ａでは、ＭＳＣは、ＡＲＦを有するネズミへの血流再開直後に投与されたものであり、クランプ後２４時間で腎機能の著しい改善がみられた。対照処置動物対ＭＳＣ処置動物はＰ＝０．００２であり、線維芽細胞処置動物対ＭＳＣ処置動物はＰ＝０．０４である。賦形剤処置動物対線維芽細胞処置動物はＰ＞０．０５であった。図４Ｂでは、ＭＳＧ投与により、腎臓損傷スコアが著しく低下している。クレアチニンは、筋肉の重要な構成要素であるクレアチンの崩壊産物であり、腎臓によって完全に体内から排出される。正常な腎臓の排泄機能により、血中クレアチニン濃度は、一定で正常な値に維持されるはずである。したがって、クレアチニン濃度は、腎臓機能の指標として頻繁に使用される。
【００３７】
図４は、ＣＤ２６の阻害が、血液循環から骨へのＨＳＣのホーミングを増加させ得ることを示している（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｓｏｎ  ＩＩ  ｅｔ  ａｌ．（２００４））。ただし、ＭＳＣにおいてＣＤ２６を阻害する効果については、突き止められていなかった。対照、Ｄｉｐｒｏｔｉｎ  Ａ処置済みまたはＣＤ２６−／−選別Ｓｃａ−１＋ｌｉｎ−ドナー細胞（受容体マウス当たり１〜２×１０４個の細胞）を、致死的放射線照射した雌の受容体マウスに尾静脈注射によって移植した。ＣＤ２６阻害剤で処置される細胞は、移植前に、５ｍＭのＤｉｐｒｏｔｉｎ  Ａ（Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹ））で１５分間処置し洗浄した。ホーミング効率の割合は、受容体のＢＭ（２つの大腿骨）中のＳｃａ−１＋ｌｉｎ−細胞の数を、注入されたＳｃａ−１＋ｌｉｎ−ドナー細胞の数で割ることによって計算する。
【００３８】
図５は、ヒトＭＳＣが、ＣＤ２６、ＳＤＦ−１、およびＣＸＣＲ４を発現することを示している。ヒトＭＳＣ（継代１〜７、ＣＤ３４−、ＣＤ４５−、およびＳＨ２モノクロナール抗体に結合）において、ＣＸＣＲ４  ｍＲＮＡレベルは、低すぎて通常のＲＴ−ＰＣＲでは容易に検出できなかった（Ｗｙｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２００４  Ａ  Ｓｍａｌｌ  Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｓｔｒｏｎｇｌｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ  Ａｃｔｉｖｅ  ＣＸＣＲ４  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ，  Ｂｌｏｏｄ，  １０４（９）：２６４３−２６４５）。
【００３９】
図６は、ＭＳＣが機能性ＣＤ２６を発現することを示している。ＣＤ２６によって切断されＧｌｙ−Ｐｒｏ＋４−ニトロアニリンを生成するＧｌｙ−Ｐｒｏ−４−ニトロアニリド＋Ｈ２Ｏを用いてアッセイを実施した。分光光度計を使用して、４０５ｎｍでニトロアニリンの吸光度を測定し、ニトロアニリンの基準吸光量曲線に対してプロットした。１単位のＣＤ２６は、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−４−ニトロアニリドから、１分間当たり１．０ｍモルの４−ニトロアニリンを生成する。
【００４０】
図７は、ＣＤ２６の阻害がＭＳＣの移動を著しく増加させることを示している。ＡＭＤ  ３１００は、ＣＸＣＲ４の非ペプチドアンタゴニストであり、Ｄｉｐｒｏｔｉｎ  Ａ（Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹ）は、一般的に使用されるＣＤ２６阻害剤の例である。この図は、ＣＤ２６阻害剤の投与によりＭＳＣの移動が一貫して増加することを示している。したがって、本発明は、腎臓の臓器機能障害（すなわち、障害または損傷）の治療のためのＣＤ２６阻害剤の使用、特にＭＳＣの使用と組み合わせてのＣＤ２６阻害剤の使用を提供する。例えば、ＳＤＦ−１不活性化の阻害は、損傷した腎臓への投与されたＭＳＣのホーミングを増加させ、腎臓の回復を増強すると考えられる。
【実施例】
【００４１】
（実施例１）
フィッシャー３４４ラットの骨髄由来のＭＳＣをインビトロ実験に使用した。最初に、ＦＡＣＳを使用して、約３５％のＭＳＣがそれらの表面にＣＤ２６およびＣＸＣＲ４タンパク質の両方を発現することを実証した。さらに、培養したＭＳＣは、機能性ＣＤ２６を発現し、効率的にＳＤＦ−１を不活性化し得る。最後に、トランスウェル培養システムでのＳＤＦ−１へのＭＳＣ移動は、Ｄｉｐｒｏｔｉｎ  Ａ（ＣＤ２６阻害剤）によるＭＳＣのプレインキュベートによって著しく増加し得、ＡＭＤ３１００（ＣＸＣＲ４阻害剤）によるプレインキュベートにより減少し得る。インビトロのデータの結果から、ＣＤ２６を阻害することが、インビボでのＭＳＣのＳＤＦ−１−ＣＸＣＲ４媒介走化活性を増加させると推論される。したがって、本発明は、臓器不全または臓器機能障害を伴う疾病の治療のために対象に投与されたＭＳＣのホーミングおよび腎臓の防御機能を増大させるためのＣＤ２６阻害剤による事前処理またはＭＳＣとの共投与に関する。
【００４２】
（実施例２）
動物に関するすべての手順は、それぞれ、ユタ大学、退役軍人医療センター（Ｓａｌｔ  Ｌａｋｅ  Ｃｉｔｙ，ＵＴ）、インディアナ大学（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、およびハンブルク大学（Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の動物管理使用委員会によって承認されている。動物は、一定の温度および湿度で、１２時間：１２時間の明暗サイクルにて飼育し、標準的な食物と水道水を自由に摂取できるようにした。体重２００〜３００ｇの雄成体のスプラーグドーリー（ＳＤ：Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラットおよびフィッシャー３４４（Ｆ３４４）ラットを用いることが好ましい（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ社（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ））。
【００４３】
イソフルラン麻酔動物において、Ｉ／Ｒ  ＡＲＦを誘起させ、直腸温度を３７℃に維持する。中腹部を開腹した後、腎臓を露出させ、腎茎を非外傷性の血管クランプで約４０分間クランプする。クランプを行う際、血流再開後直ちに大動脈内細胞を送り込むために、ＰＥ−５０のチューブを用いて左の頚動脈にカニューレ挿入する。Ｄｉｐｒｏｔｉｎ  ＡなどのＣＤ２６阻害剤、または賦形剤のみ（対照培地）は、血流再開の３０分前に投与する。細胞の投与は、血流再開または手術後、直ちに、または３０分後、または２４時間後のいずれかにおいて実施する。血流再開を目視により確認した後、適切な時期に、０．２ｍｌＳＦＭ中≒１０６個の標識ＭＳＣ／動物を左の頚動脈を通じて投与する。また、さらなる対照ＡＲＦ動物を使用してもよく、この場合、対照動物に対して同様に処置を行うが、ただし、細胞の代わりに０．２ｍｌのＳＦＭを注入する。代替として、または組み合わせにおいて、ＡＲＦを有するＦ３４４ラットの対照群に、同じプロトコルを用いて０．２ｍｌＳＦＭ中≒１０６個の同系線維芽細胞を注入してもよい。遅延注入（０．２ｍｌＳＦＭ中≒１０６個の標識ＭＳＣ）は、好ましくは、イソフルラン麻酔動物において、左の頸動脈による血流再開の３０分後に実施する。切開部は４−０絹糸で閉じ、動物が回復できるようにする。
【００４４】
細胞数の定量。ＣＦＤＡ−標識化した緑色蛍光細胞について調べ、ＡＲＦおよび細胞注入の２、２４、３６、４８、６０、および／または７２時間後に腎臓において定量した。Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２またはヨウ化プロピジウムにより細胞核を染色し、較正された共焦点マイクロメーター測定バーに基づいて、１切片あたり少なくとも３箇所の高倍率視野（ＨＰＦ）において細胞核をカウントする。この後、切片の核の数と切片の表面積に基づいて、研究に用いた組織切片の総細胞数を計算する。
【００４５】
インビトロでの研究に基づき、ＣＤ２６阻害剤であるＤｉｐｒｏｔｉｎ  Ａの投与に続くＭＳＣの投与、または１種以上のＣＤ２６阻害剤およびＭＳＣの共投与により、腎臓へのＭＳＣの移動が増加し、ＭＳＣのみで処置した試験動物に比べて、少なくとも２日および／または３日のうちに試験動物において腎機能が著しく改善されると考えられる。腎臓機能は、血清中クレアチニンおよび／または血中尿素態窒素の濃度によって評価することができる。虚血後３０分で、すべての投与群において、同様に、またはほぼ同様に、腎機能が低下することが予想される。ただし、ＣＤ２６阻害剤およびＭＳＣ処置動物では、ＭＳＣ処置のみ（対照培地）の動物に比べ、ＭＳＣ投与後に腎機能が著しく改善されることが予想される。
【００４６】
刊行物、特許、および特許出願を含む、本明細書中に列記されたすべての参考文献は、各参考文献を本明細書中において個別に特に示してその全体を説明したのと同程度において、参照により本明細書に援用されるものとする。
【００４７】
本発明はある特定の実施形態において記載されているが、本発明は、この開示の精神と範囲内においてさらなる変更を行うことが可能である。したがって、この出願は、その一般原理を用いた本発明の変法、用途、または適用も含むものとする。さらに、本出願は、本発明に関連し、かつ添付の特許請求の範囲内に含まれる当技術分野において既知または通常の実施において行われるような本開示からの逸脱を包含するものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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2010518004.tif 000011
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