(57)【要約】  表面、例えば、タンパク質がコーティングされたバイオセンサー表面での非特異的タンパク質結合をブロッキングする方法。
2010508520.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面での非特異的結合を低減する方法であって、ここで、表面は、アルデヒド官能基が付与されているか、アミン官能基が付与されているか、または、それらの組み合わせであり、該方法は、表面を糖分子で処理し、それによって、表面での非特異的結合が低減されることを含んでなる方法。
【請求項２】
糖分子が、二糖を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
二糖が、トレハロース分子であるか、またはトレハロース分子を含んでなる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
糖分子が、硫酸デキストランであるか、または硫酸デキストランを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
表面が、バイオセンサー表面である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
バイオセンサーが、比色分析共鳴反射率バイオセンサーである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
糖分子が、単糖、二糖、多糖、三糖、四糖、五糖またはそれらの組み合わせを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
表面が、アミン官能基が付与された表面である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
糖分子が、ラクトース、グリセルアルデヒド、またはそれらの組み合わせを含んでなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
糖分子が、トレハロースおよびラクトースを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
糖分子が、トレハロースおよびグリセルアルデヒドを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
表面に付着しているアルデヒド基と結合している複数の特異的結合物質、および表面に付着しているアルデヒド基と結合している複数の糖分子を含んでなるバイオセンサー。
【請求項１３】
糖分子が、二糖を含んでなる、請求項１２に記載のバイオセンサー。
【請求項１４】
二糖が、トレハロース分子である、請求項１３に記載のバイオセンサー。
【請求項１５】
糖分子が二糖である、請求項１５に記載のバイオセンサー。
【請求項１６】
二糖がトレハロース分子である、請求項１３に記載のバイオセンサー。
【請求項１７】
糖分子がデキストランを含んでなる、請求項１２に記載のバイオセンサー。
【請求項１８】
糖分子がデキストランである、請求項１２に記載のバイオセンサー。
【請求項１９】
特異的結合物質がタンパク質である、請求項１２に記載のバイオセンサー。
【請求項２０】
タンパク質がストレプトアビジンを含んでなる、請求項１９に記載のバイオセンサー。
【請求項２１】
表面に付着しているアルデヒド基と結合している特異的結合物質を含むバイオセンサーと、糖分子を含んでなる保存溶液とを含有するパッケージ。
【請求項２２】
糖分子が二糖を含んでなる、請求項２１に記載のパッケージ。
【請求項２３】
二糖がトレハロースを含んでなる、請求項２２に記載のパッケージ。
【請求項２４】
糖分子がデキストランを含んでなる、請求項２１に記載のパッケージ。
【請求項２５】
糖分子がデキストランである、請求項２１に記載のパッケージ。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本発明は、表面上の非特異的タンパク質結合をブロッキングする方法に関する。本発明はまた、非特異的タンパク質結合を防ぐために、単糖、二糖（例えば、トレハロース）、多糖（例えば、デキストラン）またはオリゴ糖によってブロッキングされているバイオセンサー表面に関する。
【０００２】
ヒトゲノムの配列決定の完了に伴って、分子生物学の次の大きな課題の１つは、ＤＮＡによってコードされる多数のタンパク質標的が、どのように別のタンパク質、小分子医薬品候補化合物、および多数の酵素および阻害剤と相互作用するかを理解することであろう（例えば、非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。この目的を達成するために、多数の異なる生体分子の相互作用を、高感度で、同時に同定および／または定量できる能力を有するツールは、医薬品発見、プロテオミクスおよび診断に応用されるであろう。さらに、これらのツールが広範に使用されるためには、それらは使用が簡単であり、所持および操作が安価であり、例えば、ポリヌクレオチド、ペプチド、小さなタンパク質、抗体および細胞全体でさえも含み得る広範な分析物に適用可能でなくてはならない。
【０００３】
支持体表面上への標的分子の固定化は、生物学的アッセイの開発において重要な側面となっている。一般に、生物学的アッセイは、マイクロウェルプレート、顕微鏡用スライド、チューブ、シリコンウエハまたはメンブランの表面上で実施される。標的分子は、表面上の官能基と分子の官能基の間のカップリング反応を用いて、表面上に共有結合によって固定化される。ガラス表面での一般的な表面官能基付与技術の１つとして、官能性シランを用いるシリル化がある（非特許文献６、Ｇｅｌｅｓｔ  Ｉｎｃ．、Ｔｕｌｌｙｔｏｗｎ、ＰＡ（２０００年））。Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）によって製造されたＧＡＰＳ  ＩＩでコーティングされたスライド、ＴｅｌｅＣｈｅｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）によって供給されるＡｒｒｙｉｔ（商標）ＳｕｐｅｒＡｍｉｎｅスライド、Ｓｉｇｍａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）によって提供されるＳＩＬＡＮＥ−ＰＲＥＰ（商標）アミン官能基が付与されたスライドおよびその他のものが、顕微鏡用スライドのフォーマットの利用可能な生物学的アッセイ表面の例である。ＳｕｐｅｒＡｍｉｎｅスライドは、１ｍｍ２あたり５×１０１２個のアミン基を提供すると主張されている。別の例として、ナイロン支持体上のアミジンとして誘導体化されているアミド基が、特定のポリヌクレオチド配列を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイにおいて、ＤＮＡおよびＲＮＡプローブを固定化するために用いられる。特許文献１を参照のこと。マイクロウェルプレートおよびチューブ形式の製品、例えば、Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）によって提供されるＮｕｃｌｅｏＬｉｎｋ（商標）およびＣｏｖａＬｉｎｋ（商標）は、ポリマー支持体表面でのみ利用可能である。ＣｏｖａＬｉｎｋ（商標）製品は、表面積１ｍｍ２あたり約１０１２個の基をもつ第二級アミン表面を提供する。第二級アミンは、多くのコンジュゲーション反応において第一級アミンよりも低い反応性を示す（非特許文献７）。
【０００４】
例えば、シリコン、ガラスまたは金などの材料の表面に化学的に官能基を付与するための多数の公知の方法がある。表面官能基付与は、しばしば表面の適用の拡大につながり、それによって、化学的に官能基付与されていない表面を有する表面と比較して、表面に対する種々の分子の結合および分析をの増強しうるので、重要である。表面上の化学的官能基付与コーティングの種類、量および質によって、共有結合の強度および特定の分析物と結合する表面の能力が決まる。コーティング自体が容易に洗浄除去されたり複数回の使用の後に分解されないことが非常に望ましい。
【０００５】
表面上にコーティングされたアルデヒド官能基およびアミン官能基は、生体分子を検出するための多用途のプラットフォームを提供することがわかっている。これらの基は、例えば、電気的相互作用などの物理的引力または化学的結合によって生体分子を捕獲し得る。このような化学的結合は、直接的にまたは間接的に（すなわち、化学リンカーを介して）達成され得る。当技術分野では多数のホモ二官能性またはヘテロ二官能性リンカーが知られている。アミンを用いて表面をコーティングするための簡単な方法は、洗浄された表面をポリリジンに直接曝露することである。一例として、マイクロアレイプリンティングに用いられるガラススライド面がある。アミンを用いて表面をコーティングする代わりに、共有結合によって、アミンコーティング分子を表面に付着させる方法、例えば、シランをガラス上に、またはチオールを金上に付着させる方法があり、両方ともよく知られている。
【０００６】
種々のアミノアルキルシラン試薬が、アミン基を用いてシリコンまたはガラスベースの表面をコーティングするために用いられてきた。このような表面のコーティングに用いられる方法として、種々のシラン試薬、溶媒および種々の物理的処理手順の使用が挙げられる。さらに、表面上の化学基の存在を調べるために、放射性、比色分析、蛍光、ＸＰＳ、ＦＴＩＲ、ＡＦＭおよびその他の方法が用いられてきた。感度は、表面を試験するための適当な方法を選択する場合の重要な問題である。概して、バイオセンサーのセンサー表面を化学的にコーティングするための標準的な工業的手順も、このようなバイオセンサー上の特定の化学成分の存在または量を検出するための標準化された試験法もない。
【０００７】
アルデヒド結合部位を用いて表面をコーティングする一方法として、アミン基を用いて表面に官能基を付与し、アミン官能基が付与された表面に、シアノ水酸化ホウ素を含んでなるアルデヒド溶液を添加する方法がある。得られるバイオセンサーは、タンパク質およびその他のアミン含有分子を結合するために使用できる。アレイをプリンティングするための、いくつかのアルデヒド修飾されたスライドも市販されている（例えば、ＣＥＬ  ＡｓｓｏｃｉａｔｅｓおよびＮｏＡｂ  ＢｉｏＤｉｓｃｏｖｅｒｉｅｓ）。
【０００８】
例えば、オリゴヌクレオチド、抗体−抗原相互作用、ホルモン−受容体相互作用および酵素−基質相互作用をはじめとする種々の生体分子複合体を検出するためのバイオセンサーが開発されている。一般に、バイオセンサーは、２種の成分、すなわち、高度に特異的な認識エレメントと、分子認識事象を定量可能なシグナルに変換するトランスデューサーとから構成される。シグナル変換は、蛍光、干渉法（非特許文献８；非特許文献９）および重量分析（非特許文献１０）をはじめ、多数の方法によって達成されている。
【０００９】
光学系の変換法のうち、分析物を蛍光化合物で標識する必要がない直接法は、アッセイが比較的単純であり、小分子と容易に標識できないタンパク質との相互作用を調べることができるため、注目されている。直接光学法として、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（非特許文献１１）、格子カプラー（非特許文献１２）、偏光解析法（非特許文献１３）、エバネセント波装置（非特許文献１４）および反射率測定法（非特許文献１５）が挙げられる。これらの検出法の理論的に予測される検出限界は調べられており、診断上関連する濃度範囲で実用可能であることが実験的に確認されている。
【００１０】
アルデヒド官能基が付与された表面は、マイクロアレイ、マイクロウェルプレートおよびウェルスライドをはじめ、いくつかの装置フォーマットの表面上に標的分子を固定化または捕獲するために用いられてきた。標的分子が、表面上に固定化された後、標的分子は、サンプルを分析するために、特異的な分子相互作用によって未知サンプル中の分析物分子と結合できる。しかし、未反応のアルデヒド基は、反応性のままであり、標的分子−分析物相互作用によって表面上に分析物分子を化学的に付着させる能力を有し、それによって、非特異的な結合が生ずる。多数の化学分子および生体分子および細胞は、表面上に生物学的受容体などの標的分子が全くない場合でも、疎水性相互作用および／または電荷相互作用によってほとんどの表面に吸着する傾向がある。この吸着もまた、不要な非特異的結合を引き起こす。非特異的結合は、特異的生体分子相互作用に基づく生体分子検出において、シグナル対ノイズ比を低下させる。ＢＩＮＤ（商標）センサー等のバイオセンサーのアルデヒド密度は劇的に高まっている。アルデヒド密度が高まるにつれ、非特異的結合は相当なレベルに達し、検出シグナルが分析物に由来するものか、偽読み取りに由来するものかどうかを調べることを困難にしている。したがって、非特異的結合を低減させることは重要である。アミン官能基が付与された表面への非特異的結合を低減することも重要である。
【００１１】
一例として、ストレプトアビジンなどの標的分子を、バイオセンサー表面上に固定化することができる。バイオセンサーは、リガンドとしても知られる他のタンパク質または小分子の標的分子との結合を、このような結合事象によって生じるシグナルの変化を測定することによって測定できる。このシグナルは、例えば、光学的、電気的または視覚的なものであり得る。しかし、標的分子を含有するバイオセンサー表面は、タンパク質または小分子の、表面との非特異的結合が低減され、標的分子との特異的相互作用のみが許されるよう、ブロッキングされている必要がある。このような特異的相互作用の一例として、ストレプトアビジンとストレプトアビジンの特異的リガンドであるビオチンとの間の相互作用がある。ブロッキングは、通常、利用可能な市販のブロッカーのいずれか、例えば、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（登録商標）ブロッキングバッファー、Ｓｅａ  Ｂｌｏｃｋ  ブロッキングバッファー、Ｂｌｏｃｋｅｒｉｔ、Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ｃａｓｉｎ、魚皮膚ゼラチンおよびＢＳＡ、例えば、１％  ＢＳＡ＋ＴＷＥＥＮ（登録商標）を用いることによって達成されている。これらのブロッカーは、両親媒性であり、単にある不要な付着を別のものと交換することができるだけである。先に、ストレプトアビジンでコーティングされたバイオセンサー、例えば、ＢＩＮＤ（商標）センサープレートをブロッキングすることが試みられたが、ビオチンのストレプトアビジンとの結合の減少を測定して、このような市販のブロッカーによる干渉によってストレプトアビジンの活性が低下した。この干渉は、一部は、市販のブロッカー中に存在するタンパク質（またはペプチド）などの生体物質の存在によるものであり得る。したがって、当技術分野では、この問題への対応が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第４，８０６，５４６号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｐａｎｄｅｙ＆Ｍａｎｎ、「Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｔｏ  ｓｔｕｄｙ  ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ｇｅｎｏｍｅｓ」、Ｎａｔｕｒｅ、４０５、８３７〜８４６頁、２０００年
【非特許文献２】Ｌｅｉｇｈ  Ａｎｄｅｒｓｏｎら、「Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１１、４０８〜４１２頁、２０００年
【非特許文献３】Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ、「Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：ｔｈｅ  ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１１、４１３〜４１８頁、２０００年
【非特許文献４】ＭａｃＢｅａｔｈ＆Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ、「Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｓ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ｆｏｒ  Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８９、１７６０〜１７６３頁、２０００年
【非特許文献５】Ｄｅ  Ｗｉｌｄｔら、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｒｒａｙｓ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１８、９８９〜９９４頁、２０００年
【非特許文献６】Ｓｉｌａｎｅ、Ｓｉｌｉｃｏｎｅｓ、ａｎｄ  Ｍｅｔａｌ−Ｏｒｇａｎｉｃｓ、８８頁
【非特許文献７】Ｌｏｕｄｏｎ，Ｇ．Ｍａｒｃ，Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３版、Ｔｈｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｒｅｄｗｏｏｄ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ（１９９５年）
【非特許文献８】Ｊｅｎｉｓｏｎら、「Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｏｎ  ｏｐｔｉｃａｌｌｙ  ｃｏａｔｅｄ  ｓｉｌｉｃｏｎ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９、６２〜６５頁
【非特許文献９】Ｌｉｎら、「Ａ  ｐｏｒｏｕｓ  ｓｉｌｉｃｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７８、８４０〜８４３頁、（１９９７年）
【非特許文献１０】Ａ．  Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ、Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｅｎｓｏｒｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９９８年）
【非特許文献１１】Ｊｏｒｄａｎ＆Ｃｏｒｎ、「Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ  Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｏｎｔｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｇｏｌｄ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ」、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、６９：１４４９〜１４５６頁、（１９９７年）
【非特許文献１２】Ｍｏｒｈａｒｄら、「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｐａｔｔｅｒｎｓ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ」、Ｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ｂ、７０、２３２〜２４２頁、（２０００年）
【非特許文献１３】Ｊｉｎら、「Ａ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ｃｏｎｃｅｐｔ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｅｌｌｉｐｓｏｍｅｔｒｙ  ｆｏｒ  ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２３２、６９〜７２頁、（１９９５年）
【非特許文献１４】Ｈｕｂｅｒら、「Ｄｉｒｅｃｔ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｉｎｇ  （ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ）」、Ｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ｂ、６、１２２〜１２６頁、（１９９２年）
【非特許文献１５】Ｂｒｅｃｈｔ＆Ｇａｕｇｌｉｔｚ、「Ｏｐｔｉｃａｌ  ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒｓ」、Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、１０、９２３〜９３６頁、（１９９５年）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の一実施形態は、アルデヒド官能基が付与されているか、アミン官能基が付与されているか、またはそれらの組み合わせの表面上での非特異的結合を低減する方法を提供する。本方法は、表面を、糖分子で処理し、それによって表面上の非特異的結合が低減されることを含んでなる。糖分子は、二糖を含むことができる。二糖は、トレハロース分子であり得る、またはトレハロース分子を含むことができる。糖分子はまた、硫酸デキストランであり得るか、または硫酸デキストランを含むことができる。表面は、バイオセンサー表面、例えば、比色分析共鳴反射率バイオセンサー表面であり得る。糖分子は、単糖、二糖、多糖、三糖、四糖、五糖またはそれらの組み合わせを含むことができる。表面は、アミン官能基が付与された表面であってもよい。糖分子は、ラクトース、グリセルアルデヒドまたはそれらの組み合わせを含むことができる。糖分子は、トレハロースおよびラクトースを含んでなる。糖分子は、トレハロースおよびグリセルアルデヒドを含むことができる。
【００１５】
本発明の別の実施形態は、表面に付着しているアルデヒド基と結合している複数の特異的結合物質および表面に付着しているアルデヒド基と結合している複数の糖分子を含んでなるバイオセンサーを提供する。糖分子は二糖であり得るか、または二糖を含むことができる。二糖類は、トレハロース分子であり得る。あるいは、糖分子は、デキストランであり得るか、またはデキストランを含むことができる。特異的結合物質は、タンパク質であり得る。タンパク質は、ストレプトアビジンを含むことができる。
【００１６】
本発明のさらに別の実施形態は、表面に付着しているアルデヒド基と結合している特異的結合物質を含むバイオセンサーと、糖分子を含んでなる保存溶液とを含有するパッケージを提供する。
【００１７】
したがって、本発明は、両親媒性のブロッカーのように不要な付着を与えない、高親水性の、非帯電性の特徴を有する小分子を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】比色分析共鳴反射率バイオセンサーに用いられる光回折格子構造の種々の実施形態の模式図である。ｎｓｕｂｓｔｒａｔｅは、基板材料を表し、ｎ１は、カバー層の屈折率を表す。ｎ２は、一次元または二次元回折格子の屈折率を表す。ｎｂｉｏは、１種以上の特異的結合物質の屈折率を表す。ｔ１は、カバー層の厚みを表す。ｔ２は、回折格子の厚みを表す。ｔｂｉｏは、１種以上の特異的結合物質の層の厚みを表す。
【図２】ストレプトアビジン（ＳＡ）が固定化されたウェルまたは５％トレハロース溶液のみを含有する対照ウェルのいずれかに５％トレハロース溶液を加えたときのシフトをｎｍで表す。固定化の際のＳＡ濃度は、０．０５ｍｇ／ｍｌまたは０．２ｍｇ／ｍｌのいずれかとした。
【図３】ストレプトアビジン（ＳＡ）が固定化されたウェルのいずれかに５％トレハロース溶液を加え、続いて１０％または１００％のＦＢＳを加えたときのシフトをｎｍで表す。結果は、トレハロースを含まないウェルとの比較で示す。固定化の際のＳＡ濃度は、０．０５ｍｇ／ｍｌまたは０．２ｍｇ／ｍｌのいずれかとした。
【図４】５％トレハロースでブロッキングした後のワルファリンのＨＳＡとの結合から生ずる、標準化されたピーク波長値（ＰＷＶ）を表す図である。
【図５】５％トレハロースでブロッキングした後のＣＢＳの炭酸脱水酵素との結合から生ずる、標準化されたピーク波長値（ＰＷＶ）を表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
官能基が付与されてコーティングされたバイオセンサーの表面は、化学分子または生体分子、例えば、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、小分子、小さな有機分子、ビオチン、細胞、分画された細胞、細胞抽出物、細胞画分、細胞の一部および例えば、プロテオミクス、ゲノミクス、医薬品、創薬および診断検査の領域において注目されるその他の化学分子または生体分子を結合するのに有用である。例えば、バイオセンサーは、目的とする化学分子または生体分子を結合するよう、アルデヒドコーティングまたはアミンコーティングされ得る。
【００２０】
本明細書において、「アルデヒド」とは、式−ＣＨＯを有する分子を指し、「アミン」とは、式−ＮＨ２を有する第一級アミンおよび第二級アミンの両方を指す。アルデヒドおよびアミンは、表面、例えば、バイオセンサーの表面に直接付着させてもよく、連結分子を介して付着させてもよい。アミンコーティングされた表面またはアミン官能基が付与された表面とは、化学修飾、例えば、特異的結合物質の直接的または間接的付着に利用可能なアミン基を提供する表面を指す。アルデヒドコーティングされた表面またはアルデヒド官能基が付与された表面とは、化学修飾、例えば、特異的結合物質の直接的または間接的付着に利用可能なアルデヒド基を提供する表面を指す。間接的付着とは、当技術分野で周知のように、化学リンカーを介した化学分子または生体分子の付着を指す。
【００２１】
本明細書において、「表面」とは、特異的結合物質を直接的または間接的に結合することができる任意の表面を指す。例えば、表面は、表面に直接的に付着している官能性アミンまたは官能性アルデヒド基を含んでもよく、または官能基は、リンカー分子によって表面に付着されていてもよい。表面は官能基が付与されていてもよいし、付与されていなくてもよい。表面は、限定されないが、プラスチック、ガラスまたは金であり得る。このような表面として、限定されないが、センサー表面、例えば、バイオセンサー表面が挙げられる。
【００２２】
また本明細書において、糖分子とは、単糖、二糖、多糖およびオリゴ糖を指す。二糖、多糖またはオリゴサッカライドは、限定されないが、トレハロース、ラクトース、マルトース、マルトトリオース、パラチノース、ラクツロース、スクロース、デキストラン、ラフィノース、スタキオース、ベルバスコースであり得る。トレハロースは、α−１，１結合によって結合している２つのグルコース分子からなる二糖である。Ｈｉｇａｓｈｉｙａｍａ、Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．、７４（７）：１２６３〜１２６９頁（２００２年）参照のこと。
【００２３】
バイオセンサー回折格子は、高い屈折率を有する材料、例えば、酸化タンタル、またはその他の適した材料でコーティングしてもよく、場合により、その上に酸化シリコンのオーバーコートをしてもよい。プラスチックで大きな表面積上に高感度バイオセンサーを製造する能力によって、大きな面積の、ディスポーザブルアッセイフォーマット、例えば、マイクロタイタープレートおよびマイクロアレイスライドにバイオセンサーを組み込むことが可能となる。バイオセンサーを、底のないマイクロタイタープレート、マイクロアレイまたはマイクロ流体装置の底に組み込むことができ、これらのバイオセンサープレートを用いて、例えば、複数のタンパク質−タンパク質または標的分子−リガンド結合アッセイを並行して実施できることが好ましい。底のないマイクロタイタープレートは、例えば、６、８、１２、２４、４８、９６、３８４、１５３６または３４５６ウェルを有し得る。プラスチック基板バイオセンサーの検出感度は、これまでに報告されたガラス基板バイオセンサーよりも優れているか、同等であることが見いだされている。例えば、プラスチックベースのバイオセンサーは、大量生産でき、例えば、９６ウェルまたは３８４ウェルのバイオセンサーアレイは、アップスケールし、大量生産できる。
【００２４】
プラスチックベースのバイオセンサーまたはプラスチックバイオセンサーとは、プラスチック回折格子またはセンサー表面、基板とも呼ばれる回折格子のためのプラスチック支持体、および／またはその他のプラスチック構成要素を含むバイオセンサーを指す。このようなバイオセンサーは、バイオセンサーの表面に官能基を付与するために用いられる反応条件の結果として、分解の影響を受けやすいものであり得る。光学的品質を有するプラスチックが好ましい。プラスチックは、微粒子を全く含まない澄んだ、透明なものであることができ、滑らかな、平らな仕上がりを提供できる。一例として、バイオセンサーは、アクリルポリマー−回折格子層を支えるポリエステル基板を含み得る。さらなる例として、バイオセンサーは、エポキシ回折格子層を支えるポリカーボネート基板を含み得る。プラスチックの他の非限定的例として、ポリエステルおよびポリウレタンが挙げられる。しかし、バイオセンサーにおいて使用するための光学的品質を提供する任意のプラスチックを使用することができる。別の例では、回折格子表面がプラスチックであり、その結果、プラスチックは、基板および回折格子の両方として働く。このようなバイオセンサーは、このようなバイオセンサーの表面に官能基を付与するために当技術分野において通常用いられる反応条件の結果として分解の影響を受けやすかった。しかし、プラスチックベースのバイオセンサーの分解を引き起こさない官能基付与法がある。例えば、参照によりその全文が組み込まれる、２００４年１１月１１日に出願された米国特許出願第１０／９８３，５１１号参照のこと。当業者ならば、本発明の方法はまた、ガラスベースのバイオセンサーに使用してもよいということは認識されよう。
【００２５】
一例として、バイオセンサーは、ＢＩＮＤ（商標）センサープレートであり得る。ＢＩＮＤ（商標）システムは、化学分子および生体分子相互作用の標識なしでの検出を可能とする。ＢＩＮＤ（商標）システムは、ＢＩＮＤ（商標）リーダーおよび９６または３８４ウェルマイクロプレートバイオセンサーを含み得る。ＢＩＮＤ（商標）システムは、光学的効果を用いて、バイオセンサー表面上の結合を高い感度で測定する。バイオセンサーは、業界標準フォーマットのマイクロウェルプレート中に組み込まれている、構造化されていない光回折格子であり得る。ＢＩＮＤ（商標）システムは、とりわけ、タンパク質、ペプチドおよび細胞を用いる化学分子および生体分子相互作用の測定を可能にする。ＢＩＮＤ（商標）システムは、抗原を用いるアフィニティーランキングおよび細胞を用いる機能的スクリーニング、ペプチドエピトープマッピングおよび免疫原性スクリーニングに使用できる。
【００２６】
アルデヒド官能基が付与された表面またはアミン官能基が付与された表面とは、それを介して特異的結合物質が付着され得るコーティングを有する表面を指す。例えば、アルデヒド官能基が付与された表面とは、限定されないが、それを介して特異的結合物質が付着され得る高屈折率材料のコーティングを有するバイオセンサーの回折格子表面を指す。このような高屈折率材料として、例えば、窒化ケイ素、硫化亜鉛、二酸化チタンまたは酸化タンタルが挙げられる。
【００２７】
場合により、表面官能基付与に先立って、酸化ケイ素層を高屈折率材料上にコーティングしてもよい。化学分子および生体分子の付着のために、高屈折率材料または酸化ケイ素のいずれかに、アルデヒド官能基またはアミン官能基を用いて官能基を付与してもよい。高屈折率材料でコーティングされた回折格子表面にアルデヒド官能基付与またはアミン官能基付与するために用いられる試薬は、プラスチックまたはエポキシであるかにかかわらず、回折格子材料および基板材料と適合することが好ましい。回折格子は、表面にアルデヒド官能基付与またはアミン官能基付与するために用いられる試薬から回折格子材料をある程度保護する高屈折率材料でコーティングするが、回折格子の反対側は、官能基付与工程の間、曝露されたままであってもよい。同様に、回折格子が基板と結合している場合には、基板の反対側は、官能基付与試薬に曝露されていてもよい。また、回折格子表面上の高屈折率材料のコーティング中の欠陥のため、回折格子表面の上側の領域が曝露される場合もある。したがって、種々の層の材料および層間の接着は、官能基付与およびその後のアッセイ手順の間、元のままでなくてはならない。
【００２８】
バイオセンサーのアルデヒド官能基が付与された表面またはアミン官能基が付与された表面とは、プラスチックベースのバイオセンサー、ならびにプラスチックベースではないバイオセンサーを指す。例えば、バイオセンサーとは、酸化チタンでコーティングされたセンサー、または最上層および基材構築用の、高屈折率低吸収率のコーティングまたは被膜を有する別のセンサーを含む。さらに、種々の物理的形状のすべての二酸化ケイ素、または低吸収率および低屈折率を有するその他の材料が企図される。これらのバイオセンサーは例示を意味しており、アルデヒド官能基が付与された表面またはアミン官能基が付与された表面を有するバイオセンサーに限定されない。
【００２９】
サブ波長構造表面（ＳＷＳ）バイオセンサー
本発明の一実施形態では、サブ波長構造表面（ＳＷＳ）を用いて、特定の波長で鋭い光学的共鳴反射を生成し、これは、化学物質または生体物質、例えば、特異的結合物質または結合パートナーまたはその両方の相互作用を高感度で追跡するために使用できる。比色分析共鳴反射率バイオセンサー表面は、特異的結合物質の表面結合プラットフォームとして作用する。
【００３０】
サブ波長構造表面は、薄膜コーティングの効果を模倣できる非従来型の回折光学素子である（Ｐｅｎｇ＆Ｍｏｒｒｉｓ、「Ｒｅｓｏｎａｎｔ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｇｒａｔｉｎｇｓ」、Ｊ．Ｏｐｔ．Ｓｏｃ．Ａｍ．Ａ、第１３巻、第５号、９９３頁、５月；Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ，＆Ｗａｎｇ、「Ｎｅｗ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ｆｏｒ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｆｉｌｔｅｒｓ」、Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．、６１、第９号、１０２２頁、１９９２年８月；Ｐｅｎｇ＆Ｍｏｒｒｉｓ、「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｏｎａｎｔ  ａｎｏｍａｌｉｅｓ  ｉｎ  ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｇｒａｔｉｎｇｓ」、Ｏｐｔｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、第２１巻、第８号、５４９頁、１９９６年４月）。ＳＷＳ構造は、表面レリーフ、一次元または二次元回折格子を含み、ここで、回折格子周期は入射光の波長と比較して小さく、その結果、反射されたおよび透過されたゼロ次数以外の回折次数は伝播することができない。参照によりその全文が組み込まれる、米国特許出願第１０／０５９，０６０号および同１０／０５８，６２６号参照のこと。ＳＷＳ表面狭帯域フィルタは、基板層と、回折格子溝を埋めるカバー層との間にサンドイッチされている、一次元または二次元回折格子を含み得る。場合により、カバー層は用いられない。回折格子領域の有効屈折率が、基板またはカバー層よりも高い場合は、導波モード共鳴効果が生じる。フィルタが適切に設計されている場合には、一次元または二次元回折格子構造は、狭帯域波長で選択的に光をカップリングする。光は散乱し、前方および後方伝播ゼロ次数の光とカップリングする。導波モード共鳴効果は、任意の光子が構造に入る点から約３ミクロンの非常に局在した領域上に生じる。横方向の導波モード伝播が支持されないので、導波は作り出されない。
【００３１】
この構造の反射される色または透過される色は、カバー層の上面または一次元もしくは二次元回折格子表面に、特異的結合物質または結合パートナーまたは両方などの分子を添加することによって調節できる。添加された分子は、その構造を介して入射放射線の光路長を増大し、従って、最大反射率または透過率が生じる波長を改変する。
【００３２】
一実施形態では、バイオセンサーは、白色光を当てられると、単一波長のみを反射するよう設計される。特異的結合物質または標的分子、例えば、化学分子および生体分子がバイオセンサーの表面に付着すると、反射される波長（色）は、回折格子中にカップリングされる光の光路の変化のためにシフトする。特異的結合物質をバイオセンサー表面に連結することによって、いかなる種類の蛍光プローブまたは粒子標識も使用することなく相補的結合パートナー分子を検出できる。この検出技術は、例えば、約０．１ｎｍ厚のタンパク質結合の変化を検出でき、バイオセンサー表面が液体中に浸漬されていても、乾燥していても実施できる。
【００３３】
検出システムは、例えば光ファイバープローブによって垂直入射でバイオセンサーの小さな点を照射する光源、および例えば同様に垂直入射の第２の光ファイバープローブによって反射光を集める分光計から構成される。励起／検出システムとバイオセンサー表面の間には物理的接触が生じないので、特定のカップリングプリズムは必要でなく、バイオセンサーは、例えば、マイクロタイタープレートおよびマイクロアレイスライドをはじめとする、任意のよく用いられるアッセイプラットフォームに容易に適応させることができる。単一の分光計読み取りは数ミリ秒で実施でき、したがって、バイオセンサー表面上で並行して起こる多数の分子間相互作用を迅速に測定し、反応速度論をリアルタイムでモニターすることが可能である。
【００３４】
この技術は、多数の生体分子間相互作用が並行して測定される用途に、特に、分子を標識すると試験中の分子の機能が変更または阻害される場合に有用である。タンパク質標的を用いる医薬品ライブラリーのハイスループットスクリーニング、プロテオミクスのためのタンパク質間相互作用のマイクロアレイスクリーニングは、本発明の組成物および方法によって与えられる感度および処理能力を必要とする用途の例である。
【００３５】
ＳＷＳ構造の一例の模式図が、図１に示されている。図１では、ｎｓｕｂｓｔｒａｔｅは、基板材料を表す。ｎ１は、任意選択のカバー層の屈折率を表す。ｎ２は、一次元または二次元回折格子の屈折率を表す。ｎｂｉｏは、１種以上の特異的結合物質の屈折率を表す。ｔ１は、一次元または二次元回折格子構造の上のカバー層の厚みを表す。ｔ２は、回折格子の厚みを表す。ｔｂｉｏは、１種以上の特異的結合物質の層の厚みを表す。一実施形態では、ｎ２＞ｎ１である（図１参照のこと）。層厚（すなわち、カバー層、１種以上の特異的結合物質または回折格子）は、最上面上のさらなる分子に対する共鳴波長感受性を達成するよう選択される。回折格子周期は、所望の波長で共鳴を達成するよう選択される。この構造は、ガラスおよび窒化ケイ素誘電性材料から作ることができる。あるいは、構造は、適当な誘電性カバー層を有するエンボス加工プラスチックから形成してもよい。
【００３６】
本発明の一実施形態は、ＳＷＳバイオセンサーを提供する。ＳＷＳバイオセンサーは、一次元または二次元回折格子、回折格子を支える基板層、および基板層の反対側の回折格子の表面上に固定化されている１種以上の特異的結合物質を含んでなる。
【００３７】
一次元または二次元回折格子は、例えば、硫化亜鉛、二酸化チタン、酸化タンタルおよび窒化ケイ素をはじめとする材料からなるものであり得る。回折格子の断面プロフィールは、任意の周期的に繰り返す機能、例えば、「方形波」であることができる。回折格子は、連続平行線の四角、円、楕円、三角形、台形、正弦波、卵形、長方形および六角形からなる群から選択される形の反復パターンからなるものであり得る。正弦断面プロフィールは、プラスチックなどの軟質材料に回折格子の形をエンボス加工すること、またはエポキシなどの材料に回折格子表面を複製することを必要とする製造用途用に好ましい。本発明の一実施形態では、回折格子の深さは、約０．０１ミクロン〜約１ミクロンであり、回折格子の周期は、約０．０１ミクロン〜約１ミクロンである。
【００３８】
ＳＷＳバイオセンサーはまた、一次元線形回折格子表面構造、すなわち、一連の平行線または溝を含むことができる。一次元線形回折格子は、導波モード共鳴フィルタ効果を生じさせるのに十分である。二次元回折格子は、センサー表面の面全域に２つの横方向に、両方ともサブ波長である特徴を有するのに対し、一次元回折格子の断面は、１つの横方向でのみサブ波長であるが、長さは、共鳴回折格子効果の波長より長くてもよい。一次元回折格子バイオセンサーは、一次元回折格子の表面構造を有する低屈折率材料の層上の薄膜としてコーティングされている高屈折率材料を含んでいてもよい。あるいは、一次元回折格子バイオセンサーは、上に、高屈折率薄膜材料が一次元回折格子の表面構造にパターン化されている、低屈折率材料基板を含んでいてもよい。低屈折率材料は、ガラス、プラスチック、ポリマーまたは硬化エポキシであり得る。高屈折率材料は、低屈折率材料よりも高い屈折率を有さなくてはならない。高屈折率材料は、例えば、硫化亜鉛窒化ケイ素、酸化タンタル、二酸化チタンまたはインジウムスズ酸化物であり得る。
【００３９】
ＳＷＳ構造は、例えば、標準顕微鏡用スライドと同じ大きさである回折格子表面を構築すること、および回折格子表面上のｘ−ｙ格子の位置上に高親和性化学受容体試薬の微液滴を置くことによって、マイクロアレイプラットフォームとして用いることができる。あるいは、ＳＷＳ構造は、標準マイクロタイタープレートと同じ大きさであり、プレート全体の底表面に組み込まれるよう構築することができる。化学的に官能基が付与された表面、例えば、マイクロアレイ／マイクロタイタープレートが、分析物などの分子に曝露されると、分子は高親和性を有する位置に優先的に付着する。結果として、一部の表面位置がさらなる材料を集め、他の表面位置は集めない。さらなる材料が付着した表面位置は、各個々の表面位置、例えば、各個々のマイクロアレイ／マイクロタイター表面位置内の共鳴波長のシフトを測定することによって決定することができる。したがって、例えば、サンプル中の分析物等の結合した分子の量、および受容体試薬と分子との間の化学親和性は、共鳴波長のシフトの程度を測定することによって求めることができる。
【００４０】
本発明の一実施形態では、第１の分子と第２の試験分子との相互作用を検出できる。上記のＳＷＳバイオセンサーが用いられる。したがって、バイオセンサーは、一次元または二次元回折格子と、一次元または二次元回折格子を支える基板層と、場合により、カバー層とを含んでなる。上記のように、バイオセンサーが照射されると、反射された放射線スペクトルで共鳴回折格子効果が生じ、回折格子の深さおよび周期は、共鳴回折格子効果の波長より小さい。
【００４１】
第１の分子と第２の試験分子との相互作用を検出するために、第１の分子と第２の分子の混合物を、バイオセンサー上の別個の位置に適用する。別個の位置は、バイオセンサー上の１スポットまたはウェルであってもよいし、バイオセンサー上の大きな領域であってもよい。第１の分子と第３の対照分子との混合物も、バイオセンサー上の別個の位置に適用する。バイオセンサーは、上記と同一のバイオセンサーであってもよいし、または第２のバイオセンサーであってもよい。バイオセンサーが同一のバイオセンサーである場合は、第２の別個の位置を、第１の分子および第３の対照分子の混合物のために使用してもよい。あるいは、第１および第２の分子がバイオセンサーから洗浄された後に、バイオセンサーの同一の別個の位置を用いてもよい。第３の対照分子は、第１の分子と相互作用せず、第１の分子とほぼ同じ大きさである。バイオセンサーまたは複数のバイオセンサーの別個の位置からの光の反射波長のシフトを測定する。第１の分子および第２の試験分子を有する別個の位置からの光の反射波長のシフトが、第１の分子および第３の対照分子を有する別個の位置からの反射波長のシフトよりも大きい場合には、第１の分子および第２の試験分子は相互作用する。相互作用は、例えば、核酸分子のハイブリダイゼーション、抗体または抗体フラグメントの抗原との特異的結合およびポリペプチドの結合であり得る。第１の分子、第２の試験分子または第３の対照分子は、例えば、核酸、ポリペプチド、抗原、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ）フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、小さな有機分子、細胞、ウイルスおよび細菌であり得る。
【００４２】
アミン官能基が付与されたバイオセンサー
高屈折率材料、例えば、窒化ケイ素の層を、表面、例えば、プラスチック表面上にコーティングした後、高屈折率材料の表面上にアミン官能基を付着させることにより、装置をセンサーとして使用するために準備する。プラスチックベースのバイオセンサーは、その表面上にアミン官能基を提供する化学修飾の間に分解される場合がある（すなわち、センサー上での構造または組成変化）。このような分解を避けるために、バイオセンサーのアミン表面官能基付与の工程は、バイオセンサーのプラスチックと適合する試薬を用いることができる。高屈折率材料をプラスチックバイオセンサーの回折格子表面に被着させた後、センサーを保存してもよいし、官能基付与に直接使用してもよい。センサーを、湿潤法（例えば、溶媒などの液体を用いる洗浄）または乾燥法（例えば、ＵＶオゾンまたはプラズマ）を用いる洗浄工程に付し、その後、アミン官能基付与手順に付してもよい。一実施形態では、アミン官能基付与手順は、（ａ）プラスチック比色分析共鳴バイオセンサーをアルコール性シラン溶液に曝露し、次いで（ｂ）曝露されたプラスチック比色分析共鳴バイオセンサーをアルコールですすぐことを含む。バイオセンサーを乾燥させると、回折格子表面は、アミン官能基、すなわち、−ＮＨ２基を含む。
【００４３】
一実施形態では、シラン溶液は、３−アミノプロピルトリエトキシシランおよびアルコール、例えば、エタノールまたはその他の適した低分子量アルコールを含む。同様に、任意の適した低分子量アルコールを用いて、バイオセンサーをすすいでもよい。プラスチックバイオセンサーのアミンによるコーティングの一例では、まず、センサーを、３−アミノプロピルトリエトキシシランおよびエタノールを含有する溶液に曝露し、次いで、センサーをエタノール中で手短にすすぎ、最後にセンサーを乾燥させる。エタノール中、３−アミノプロピルシランの濃度は、３−アミノプロピルシランの濃度が、エタノール中、約１％〜約１５％であるよう調節できる。さらに、エタノールは、約９０％〜１００％（容量／容量、水で調節する）であり得る。乾燥工程は、例えば、約７０℃のオーブン中で１０分間、実施することができる。乾燥は、センサーの分解が生じないよう温度を選択する限り、高温で実施してもよい。
【００４４】
多数の適した溶媒、濃度、反応時間および硬化／インキュベーション時間を使用することができる。変形として、表面の種類、シラン試薬（その他のシラン、例えば、３−アミノプロピルトリメトキシシランなど）、シラン濃度、コーティング溶媒または溶媒の組合せ（例えば、エタノールおよび水）、コーティング反応時間、すすぎ溶媒または溶媒の組合せ（例えば、エタノールおよび水）、硬化時間および硬化温度が挙げられる。
【００４５】
表面処理
本発明の一実施形態では、センサー表面は、化学処理によって修飾され得る。例えば、表面は、表面を溶液中に浸漬することによって溶液で処理してもよい。あるいは、ガス相処理、例えば、化学蒸着または噴霧被着も、表面のコーティングのために用いてよい。ガス相処理は、幾何学的に平坦でない表面の絶縁保護コーティングを確実にするために用いることができる。このようなコーティングは、表面をシリル化する工程において、または表面にその他の有機材料を付加するために、使用できる。表面を処理できるその他の方法は、当業者には認識されよう。
【００４６】
プラズマによる処理は、一般にガス相コーティング工程の前に行うことができる。プラズマ処理は、表面上のほとんどの汚染を除去し、表面の一部を活性化してその後のガス相コーティング工程の接着を改善することができる。
【００４７】
ガス相コーティング工程を用いて、化学的官能基を付与し、ポリマーフィルムの表面上に吸着される水分、有機汚染物質および低分子量材料を最小にすることができる。ガス相コーティングは、限定されないが、表面の均一処理、ポリマーフィルムが処理される場合に裏面処理がないこと、多孔質材料を処理する場合にピンホールがないという利点を有する。本発明において有用な、このようなコーティングサービスとして、限定されないが、Ｓｉｇｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ）、４ｔｈ  Ｓｔａｔｅ（Ｂｅｌｍｏｎｔ、ＣＡ）、Ｙｉｅｌｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）、Ｅｒｉｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ、ＮＨ）およびＡＳＴ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（先端表面技術）（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）によって提供されるサービスが挙げられる。
【００４８】
音響バイオセンサー
本発明の別の実施形態では、音響バイオセンサーが用いられる。音響バイオセンサーは、分子および／または分析物の結合の結果として被着した量の変化によって引き起こされるバイオセンサー表面上の共鳴振動周波数の変化を検出することによって、分析物などの分子と、表面と共有結合によって結合している化学分子または生体分子または標的分子との結合を測定する。共鳴振動周波数は、例えば、ピエゾ抵抗装置、微小カンチレバー、メンブランもしくは音叉などの機械的振動子または表面音波オシレーターを用いることによって測定できる。
【００４９】
エレクトロニックバイオセンサー
本発明の別実施形態では、エレクトロニックバイオセンサーが用いられる。エレクトロニックバイオセンサーは、例えば、分子および／または分析物の結合の結果として被着した量の変化によって引き起こされる、バイオセンサー表面上の、抵抗（例えば、ＤＣまたはＡＣ）、低または高周波、キャパシタンスまたはインダクタンスの変化を検出することによって、分析物などの分子と、表面と共有結合によって結合している化学的または生物学的標的分子との結合を測定する。
【００５０】
特異的結合物質および結合パートナー
１種以上の特異的結合物質または標的分子を、例えば、物理吸着によって、または化学結合によって、表面、例えば、センサー表面上に固定化してもよい。特異的結合物質は、例えば、センサーの表面上に加えられている結合パートナーと特異的に結合し得る。特異的結合物質は、その結合パートナーと特異的に結合するが、バイオセンサーの表面に加えられている他の結合パートナーとは実質的に結合しない。例えば、特異的結合物質が抗体であり、およびその結合パートナーが特定の抗原である場合には、抗体は、その特定の抗原と特異的に結合するが、他の抗原とは実質的に結合しない。特異的結合物質は、例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗原、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ）フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、小分子、小さな有機分子、ビオチン、細胞、細胞抽出物、細胞の一部、ウイルス、細菌、ポリマー、ペプチド溶液、一本鎖または二本鎖ＤＮＡ溶液、ＲＮＡ溶液、コンビナトリアル化学ライブラリーに由来する化合物を含有する溶液または生体サンプルであり得る。生体サンプルは、例えば、血液、血漿、血清、消化管分泌物、組織または腫瘍のホモジネート、滑液、糞便、唾液、痰、嚢胞液、羊水、脳脊髄液、腹水、肺洗浄液、精液、リンパ液、涙または前立腺液であり得る。
【００５１】
１種以上の特異的結合物質が、バイオセンサー上の別個の位置のマイクロアレイに配置されていることが好ましい。特異的結合物質のマイクロアレイは、表面が、各々異なる特異的結合物質を含む、または異なる量の特異的結合物質を含む、多数の別個の位置を含むように、本発明のバイオセンサーの表面上に１種以上の特異的結合物質を含んでなる。例えば、アレイは、１、１０、１００、１，０００、１０，０００または１００，０００の別個の位置を含むことができる。このようなバイオセンサー表面は、通常、１種以上の特異的結合物質がｘ−ｙ座標の規則的な格子パターンに広げられているためにマイクロアレイと呼ばれる。しかし、本発明のマイクロアレイは、任意の種類の規則的または不規則的なパターンに広げられた１種以上の特異的結合物質を含むことができる。例えば、別個の位置は、１種以上の特異的結合物質のマイクロアレイのスポットを規定できる。マイクロアレイスポットは、直径約５０〜約５００ミクロンであり得る。マイクロアレイスポットはまた、直径約１５０〜約２００ミクロンであり得る。１種以上の特異的結合物質は、その特異的結合パートナーに結合することができる。
【００５２】
本発明のバイオセンサー上のマイクロアレイは、１種以上の特異的結合物質の微液滴を、例えば、一次元または二次元回折格子またはカバー層表面上のｘ−ｙ格子の位置に置くことによって作製できる。バイオセンサーを１個以上の結合パートナーを含んでなる試験サンプルに曝すと、結合パートナーは、結合パートナーに対して高親和性を有する特異的結合物質を含んでなるマイクロアレイ上の別個の位置に優先的に付着する。一部の別個の位置が、その表面上に結合パートナーを集め、他の位置は集めない。
【００５３】
本発明のマイクロアレイの一例として、アレイ内の各々の別個の位置が異なる核酸分子を含む核酸マイクロアレイがある。この実施形態では、核酸マイクロアレイ内のスポットは、試験サンプル中の核酸の反対鎖との相補的化学結合を検出する。
【００５４】
マイクロタイタープレートは、生化学アッセイに用いられる最もよくあるフォーマットであるが、マイクロアレイは、貴重な試薬の容量を最小にしながら、１度に測定できる生化学的相互作用の数を最大にする手段としてますます注目されている。本発明のバイオセンサー上にマイクロアレイスポッターを用いて特異的結合物質を適用することによって、１０，０００個の特異的結合物質／ｉｎ２の特異的結合物質密度を得ることができる。照射ビームを、単一のマイクロアレイ位置を調べるよう焦点を合わせることによって、バイオセンサーを、標識を含まないマイクロアレイ読み取りシステムとして用いることができる。
【００５５】
１種以上の特異的結合物質の固定化
バイオセンサー上への１種以上の結合物質の固定化は、特異的結合物質がすすぎ手順によって洗浄除去されないように、試験サンプル中の結合パートナーとの結合がバイオセンサー表面によって妨げられないように、実施される。種々の種類のマイクロアレイおよびバイオセンサーにおいて使用するために、特異的結合物質を、例えばガラスと共有結合させるために、いくつかの異なる種類の表面化学戦略が実施されている。これらの同様の方法は、本発明のバイオセンサーに容易に適応させることができる。１種以上の特異的結合物質を結合するための正しい官能基を含むようバイオセンサーの表面を調製することは、バイオセンサー製造工程の欠くことのできない部分である。
【００５６】
本明細書において、用語「標的分子」または「化学分子または生体分子」または「特異的結合物質」とは、官能基が付与された表面に付着され得る任意の特異的結合物質を指す。化学分子または生体分子は、例えば、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、小分子、ビオチン、細胞、分画された細胞、細胞抽出物、細胞画分および細胞の一部からなる群から選択され得る。
【００５７】
本明細書において、タンパク質、ペプチドおよびポリペプチドとの用語は、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語はまた、１個以上のアミノ酸が、対応する天然に存在するアミノ酸の化学類似体、例えば、翻訳後プロセシング（例えば、グリコシル化およびリン酸化）によって修飾されているアミノ酸である、アミノ酸ポリマーにも適用される。本明細書において、用語「タンパク質」とは、任意のタンパク質、例えば、限定されないが、ペプチド、酵素、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、増殖因子などを意味する。
【００５８】
用語「ポリペプチド」とは、ポリマーの長さに関わらずアミノ酸のポリマーを指し、したがって、ポリペプチドの定義の中には、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質が含まれる。この用語は、天然に存在するポリペプチドおよび合成ポリペプチドを指す。この用語は、ポリペプチドの化学修飾または発現後修飾を含み得る。したがって、例えば、グリコシル基、アセチル基、リン酸基、脂質基などの共有結合を含むポリペプチドの修飾は、明らかにポリペプチドとの用語によって包含される。化学的に修飾されたポリペプチドは、同定または捕獲タグがポリペプチド中に組み込まれているポリペプチドを含む。上記の例において列挙されるものなどの天然またはその他の化学修飾は、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端をはじめポリペプチド中のどこに生じてもよい。当然のことながら、同じ種類の修飾が、所与のポリペプチド中のいくつかの部位に、同程度に、または種々の程度に存在し得る。また、所与のポリペプチドは、多数の種類の修飾を含み得る。ポリペプチドは、例えば、ユビキチン化の結果として分岐していてもよく、分岐を含むか含まない環状であってもよい。修飾として、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸化、水素化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解性プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレニル化、硫酸化、アルギニル化などのタンパク質へのアミノ酸のトランスファーＲＮＡ媒介性添加およびユビキチン化が挙げられる（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、第２版、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３年）；Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１〜１２頁（１９８３年）；Ｓｅｉｆｔｅｒら、Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ１８２：６２６〜６４６頁（１９９０年）；Ｒａｔｔａｎら、Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ６６３：４８〜６２頁（１９９２年）参照のこと）。また、１個以上のアミノ酸の類似体（例えば、天然に存在しないアミノ酸、無関係の生物系においてのみ天然に生じるアミノ酸、哺乳類系由来の修飾されたアミノ酸などを含む）を含むポリペプチド、置換された結合、ならびに天然に存在する、および天然に存在しない、当技術分野で公知の他の修飾を含むポリペプチドも定義内に含まれる。ポリペプチドは、天然に存在するものであってもよいし、合成のものであってもよい。
【００５９】
本明細書において、「小分子」とは、約２，５００ダルトン未満である分子を指す。これらの分子として、例えば、小さな有機分子、例えば、ビオチンが挙げられるが、小ペプチド、例えば、ペプチドミメティック、ならびに、ヌクレオチド、例えば、抗ウイルススクリーニングライブラリー中によく見られるものも含む。小分子は、多様性志向の、小さいサイズのものであり得る合成分子、および大きな分子量を有する傾向がある天然化合物の両方を指すことができる。小分子はまた、約５００ダルトンの上部サイズ範囲を有する、経口的に作用する薬物を含む。２３６（「Ｌｉｐｉｎｓｋｉ」）の、Ｌｉｐｉｎｓｋｉ、ＣＡ．「Ｄｒｕｇ−ｌｉｋｅ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｃａｕｓｅｓ  ｏｆ  Ｐｏｏｒ  Ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｐｏｏｒ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ」Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ａｎｄ  Ｔｏｘ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．４４：２３５（２０００年）参照のこと。
【００６０】
１種以上の特異的結合物質は、物理吸着によって（すなわち、化学リンカーを使用せず）または化学結合によって（すなわち、化学リンカーの使用を伴って）、バイオセンサー表面に付着され得る。化学結合は、バイオセンサー表面上に特異的結合物質の、より強力な結合を生じさせ、表面に結合している分子の規定の配向およびコンホメーションを提供し得る。
【００６１】
化学結合の種類の例として、例えば、アミン官能基付与、アルデヒド官能基付与、カルボキシル官能基付与およびビオチン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）およびニッケル活性化が挙げられる。これらの表面を用いて、特異的結合物質を、バイオセンサー表面に直接、または表１に示されるようないくつかの異なる種類の化学リンカーの使用によって、結合できる。また、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、１９９６年も参照のこと。
【００６２】
【表１】
2010508520.tif 000003
【００６３】
アミン官能基が付与された表面を用いて、いくつかの種類のリンカー分子を付着することができ、一方、アルデヒド官能基が付与された表面を用いて、さらなるリンカーを用いずにタンパク質と直接結合できる。例えば、表面のアルデヒド官能基コーティングは、約５０オングストローム未満の厚さである。また、表面は平坦であってもよいし、平坦でなくてもよい。「平坦でない」表面は、例えば、本明細書に記載される回折格子を含んでなる表面であり得る。「平坦な」表面は、例えば、２００１年８月１５日に出願された米国特許出願第０９／９３０，３５２号、および２００２年１月２９日に出願された米国特許出願第１０／０５９，０６０号（これらは参照により組み込まれる）に記載される、酸化ケイ素またはスピンオングラス（ＳＯＧ）などの保護膜とともに、回折格子を含んでなる表面であり得る。ニッケル表面を用いて、組み込まれたヒスチジン（「ｈｉｓ」）タグを有する分子と結合できる。ニッケル活性化表面を用いる「ｈｉｓタグを付けた」分子の検出は、当技術分野で公知である（Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ、６８、４９０、（１９９６年））。
【００６４】
特異的結合物質の、例えば、酸化物であり得るプラスチックセンサーの表面への固定化は、本質的に、ガラスへの固定化のために記載されるように実施できる。しかし、特異的結合物質を固定化する材料に損傷を与えるような洗浄およびコーティング処理工程は、排除されなければならない。
【００６５】
約０．１ｎｇ／ｍｌ未満の濃度の結合パートナーの検出には、バイオセンサーと結合している結合パートナーを、バイオセンサー表面上のさらなる層に増幅し、変換することが好ましい。バイオセンサー上に被着された質量の増加は、光路長の増加の結果として容易に検出できる。バイオセンサー表面上により多くの質量を組み込むことによって、表面上の結合パートナーの光学濃度も増加し、したがって、付加質量がない場合よりも多くの共鳴波長シフトが与えられる。質量の付加は、例えば、「サンドイッチ」アッセイによって酵素的に、または適当にコンジュゲートされたビーズまたは種々の大きさのポリマーおよび組成物の形で、質量をバイオセンサー表面に直接適用することによって達成できる。この原理は、別の種類の光学バイオセンサーに利用されており、質量増幅なしで達成される感度限界を１５００×越える感度増大が実証されてきた。例えば、Ｊｅｎｉｓｏｎら、「Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｏｎ  ｏｐｔｉｃａｌｌｙ  ｃｏａｔｅｄ  ｓｉｌｉｃｏｎ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９：６２〜６５頁、２００１年参照のこと。
【００６６】
一例として、アミン官能基が付与されたセンサー表面は、表面に固定化されている一本鎖ＤＮＡ捕捉プローブを含んでなる特異的結合物質を有し得る。捕捉プローブは、その相補的結合パートナーと選択的に相互作用する。結合パートナーは、次いで、「検出器」分子を結合する配列またはタグを含むよう設計できる。検出器分子は、例えば、正しい酵素に曝露されると、バイオセンサー上の検出器分子が存在する位置のみで、さらなる材料を選択的に被着させる、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とのリンカーを含み得る。このような手順は、例えば、３００オングストロームの検出可能な生体材料をバイオセンサーに数分以内に付加し得る。
【００６７】
「サンドイッチ」アプローチはまた、検出感度を増強するためにも使用できる。このアプローチでは、高分子量分子を用いて低分子量分子の存在を増幅できる。例えば、約０．１ｋＤａ〜約２０ｋＤａの分子量を有する結合パートナーに、例えば、スクシンイミジル−６−［ａ−メチル−ａ−（２−ピリジル−ジチオ）トルアミド］ヘキサノエート（ＳＭＰＴ）またはジメチルピメリミデート（ＤＭＰ）、ヒスチジンまたはビオチン分子を用いてタグを付けることができる。タグがビオチンである場合には、ビオチン分子は、ストレプトアビジンと強力に結合し、ストレプトアビジンは６０ｋＤａの分子量を有する。ビオチン／ストレプトアビジン相互作用が高度に特異的であるので、ストレプトアビジンは、小さな結合パートナーのみによって引き起こされるシグナルを６０倍増幅する。
【００６８】
検出感度は、化学的に誘導体化された小粒子の使用によってさらに増強できる。直径約３〜３００ｎｍの、コロイド金、種々のプラスチックまたはガラス製の「ナノ粒子」を、結合パートナーと共有結合によって選択的に結合することを可能にする分子種でコーティングしてもよい。例えば、ストレプトアビジンを用いて共有結合によってコーティングされているナノ粒子を用いて、バイオセンサー表面上のビオチンタグが付けられた結合パートナーの可視性を増強できる。ストレプトアビジン分子自体は６０ｋＤａの分子量を有するが、誘導体化されたビーズは、例えば、６０ＫＤａを含めた任意の大きさの分子量を有し得る。大きなビーズの結合は、バイオセンサー表面上の光学濃度の大きな変化、および容易に測定可能なシグナルをもたらす。この方法は、感度分解能の約１０００×の増強をもたらし得る。
【００６９】
センサーを用いる方法
本発明のセンサーを用いて、１種のまたは数種の特異的結合物質／結合パートナー相互作用を並行して調べることができる。１種以上の特異的結合物質の、そのそれぞれの結合パートナーとの結合を、その表面上に固定化されている１種以上の特異的結合物質を有するバイオセンサーに１種以上の結合パートナーを適用することによって、標識を用いずに検出できる。例えば、ＳＷＳバイオセンサーに光を当て、バイオセンサーから、光の最大の反射波長または最小の透過波長を検出する。１種以上の特異的結合物質が、それぞれの結合パートナーと結合している場合には、光の反射波長は、１種以上の特異的結合物質がそのそれぞれの結合パートナーと結合していない場合と比較してシフトする。ＳＷＳバイオセンサーが、１種以上の特異的結合物質を含有する、別個の位置のアレイでコーティングされている場合は、光の最大の反射波長または最小の透過波長を、バイオセンサーの別個の位置の各々から検出する。
【００７０】
種々の特異的結合物質、例えば、抗体をバイオセンサー上にアレイフォーマットで固定化できる。次いで、バイオセンサーを、タンパク質などの結合パートナーを含む、目的とする試験サンプルと接触させる。バイオセンサー上に固定化されている抗体と特異的に結合するタンパク質のみが、バイオセンサーと結合されたままである。このようなアプローチは、本質的に、酵素結合免疫吸着測定法の大規模版であるが、酵素または蛍光標識の使用は必要ではない。
【００７１】
酵素の活性は、１種以上の酵素を、１種以上の特異的結合物質が固定化されているバイオセンサーに適用することによって検出できる。例えば、バイオセンサーを洗浄し、光を当てる。バイオセンサーから光の反射波長を検出する。１種以上の酵素が酵素活性によってバイオセンサーの１種以上の特異的結合物質を変化させると、光の反射波長がシフトする。
【００７２】
さらに、試験サンプル、例えば、結合パートナーを含有する細胞溶解物を、バイオセンサーに適用し、続いて洗浄して、結合していない材料を除去してもよい。バイオセンサーと結合した結合パートナーは、バイオセンサーから溶出し、例えば、質量分析によって同定することができる。場合により、ファージＤＮＡディスプレイライブラリーを、本発明のバイオセンサーに適用し、続いて洗浄し、結合していない材料を除去することができる。バイオセンサーと結合した個々のファージ粒子を単離し、次いで、これらのファージ粒子中の挿入物を配列決定して、結合パートナーの同一性を調べることができる。
【００７３】
上記の用途では、および特定のプロテオミクス用途では、試験サンプルに由来する材料、例えば結合パートナーが、本発明のバイオセンサー上で選択的に結合しうること、続いてさらなる分析のために、結合した材料をバイオセンサーの別個の位置から選択的に回収しうることは、有利である。本発明のバイオセンサーはまた、光の反射波長のシフトを測定することによって、バイオセンサーアレイの別個の位置に結合したサンプルに由来する結合パートナーの量を検出および定量することができる。例えば、１つの別個のバイオセンサー位置での波長シフトを、他の別個のバイオセンサー位置の陽性及び陰性対照と比較して、バイオセンサーアレイの別個の位置と結合している結合パートナーの量を調べることができる。
【００７４】
バイオセンサー表面上の非特異的結合のブロッキング
例えば、トレハロースおよびデキストラン等の糖を用いて、バイオセンサー表面上に固定化されている特異的結合物質と、溶液中の他の小分子およびタンパク質との間の非特異的相互作用を低減することができる。本発明において有用な糖として、例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、五糖および他の多糖およびデキストランなどのオリゴ糖が挙げられる。非タンパク質性物質である糖を用いて、分子と、とりわけＢＩＮＤ（商標）センサープレートのようなタンパク質でコーティングされたバイオセンサー表面との非特異的結合をブロックまたは低減することができる。糖は、特異的タンパク質−リガンド相互作用（例えば、ストレプトアビジン−ビオチン相互作用）を干渉しない。本明細書において、「オリゴ糖」とは、約３〜１０個の間の単糖単位を有する糖を指し、「多糖」とは、約１０個を越える単糖単位を有する糖を指すが、３０００個を超える単糖単位を有していてもよい。デキストランは、種々の長さの鎖に結合している多数のグルコース分子から作られた、複雑な分岐多糖の一例である。糖を用いて、例えば、アミン官能基が付与された表面、アルデヒド官能基が付与された表面、およびカルボキシル官能基が付与された表面をブロッキングできる。非特異的結合の減少は、例えば、実施例３および４に記載される方法によって測定できる。
【００７５】
これらの糖ブロッカー、例えば、二糖ブロッカーはまた、タンパク質でコーティングされたプレートを輸送するための保存溶液として使用できる。例えば、所望のタンパク質をアルデヒド官能基が付与されたバイオセンサー表面上に、例えば、ストレプトアビジンをセンサープレート上に固定化した後、プレートにトレハロースの溶液を加え、その後、包装する。トレハロースはアルデヒド表面と結合し、任意の残存するアルデヒド基をブロッキングする。受取人がバイオセンサーを受け取る時には、表面は二糖分子で予めブロッキングされている。糖は、プレートを湿潤にしておき、またはプレートを有用でないものにする可能性がある化学反応をさせることなく安定にしておくための不活性な方法を提供する。この実施形態では、糖は、一時的な保護基として作用する。糖は、アルデヒドとヘミアセタールを形成し、その結果、簡単な酸化還元化学によって、容易に除去／逆転され得る短命の「共有」結合が生じると考えられる。タンパク質が表面に加えられ、その後、糖が加えられると、糖は、水分子を固定化されたタンパク質とごく接近して保つ重要な構造の層を維持することによって、タンパク質を安定化するよう働く。糖は、その分子の大きさおよび均一な高い疎水性のために、特定のタンパク質−リガンド相互作用（例えば、ストレプトアビジン−ビオチン相互作用）を妨害しない。糖はまた、タンパク質が変性しないようにする機能を供する。糖の添加によって、固定化されたタンパク質を含む表面は、より安定に、おそらくは、半乾燥状態で輸送することができる。
【００７６】
本発明において有用である糖として、還元糖および非還元糖が挙げられる。還元糖は、アルデヒド基を含み、フルクトース、グルコース、グリセルアルデヒド、ラクトースおよびマルトースなどのメンバーを含む。還元糖はアミンと反応し得るので、アミン官能基が付与された表面は、還元糖、例えば、グリセルアルデヒドでブロッキングされ得る。単糖もまた、アミン官能基が付与された表面に付着し得る。アルデヒド官能基が付与された表面は、アルデヒド基を含有しヒドロキシル基も含む糖でブロッキングできる。還元糖および非還元糖は両方とも、センサーのアルデヒド官能基が付与された表面上のアルデヒド基と反応するヒドロキシル基を含み、それによって表面をブロッキングする。トレハロースおよびスクロースは、アルデヒド基を含まないので非還元糖のカテゴリー内に含まれる。
【００７７】
アルデヒド官能基が付与された表面は、タンパク質付着のために使用できる。糖は、アルデヒドと反応し、それらをブロッキングすることができ、それによってタンパク質が、特異的結合物質と結合していない表面上のアルデヒド基と反応するのを防ぐことができる。本発明の表面はまた、いくつかのアミン基を含み得る。例えば、アルデヒド含有表面に変換される高密度アミン表面は、そのアミン基のすべてが変換されず、したがって表面に残る場合がある。したがって、還元糖および非還元糖の両方とも、表面上のアミン基およびアルデヒド基をブロッキングし、その結果、アッセイの間に分析物として添加されるタンパク質が、固定化されたタンパク質とのみ結合し、アミン基およびアルデヒド基を含む表面のその他の部分とは結合しないよう使用できる。
【００７８】
トレハロースおよび他の二糖分子は、標的タンパク質が表面上に固定化された後に反応していないままであるアルデヒド官能基と、おそらくはヘミアセタールを介して結合すると考えられている。結合は、簡単な酸化還元化学を用いて可逆性であり、わずか約２、３時間という通常のアッセイの時間の間、安定とすることができる。したがって、トレハロースは、アルデヒド表面と安定な様式で結合すると思われる。
【００７９】
本発明の一実施形態は、表面に付着しているアルデヒド基と結合している複数の特異的結合物質および表面に付着しているアルデヒド基と結合している複数の糖分子を含んでなるバイオセンサーを提供する。すなわち、バイオセンサーに、アルデヒド官能基を付与し、特異的結合物質および糖がバイオセンサー表面に付着しているアルデヒド基と結合するよう、糖および特異的結合物質をバイオセンサーに加えた。
【００８０】
本発明の別の実施形態は、表面に付着しているアルデヒド基と結合している特異的結合物質を含むバイオセンサーと糖分子を含んでなる保存溶液とを含むパッケージを提供する。表面に付着しているアルデヒド基は、表面をアルデヒド官能基が付与された表面にするよう、表面に付加されたアミン基である。
【００８１】
本明細書に例示的に記載される本発明は、本明細書に具体的に開示されていない、任意の要素または複数の要素、制限または複数の制限の不在下で適当に実施され得る。したがって、例えば、本明細書における各例では、いずれかの用語「含んでなる」、「本質的にからなる」および「からなる」は、その元の意味を変更することなく、他の２つの用語のいずれかと置き換えることができる。用いられているこれらの用語および表面は、説明の用語として用いられ、限定ではない。このような用語および表現の使用において、示され、説明される特徴またはその一部の任意の等価物を排除する意図はなく、種々の改変が、特許請求される本発明の範囲内で可能であることが認識される。したがって、本発明を好ましい実施形態によって具体的に説明したが、当業者によって、本明細書に開示される概念の任意選択の特徴、改変および変法を用いることができるということ、およびこのような改変および変法は、説明および添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲内にあると考えられることは理解されよう。
【００８２】
さらに、本発明の特徴または態様が、マーカッシュ群または代替物のその他のグループ分けの観点から記載される場合には、それによって、当業者ならば、本発明はまた、任意のマーカッシュ群またはその他の群の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループの観点から記載されることは認識されよう。
【００８３】
以下は、単に例示目的で提供されるものであって、上記の広義で記載される本発明の範囲を制限しようとするものではない。この開示内容に引用されるすべての参照文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例１】
【００８４】
ＳＷＳバイオセンサーの製造
ＳＷＳバイオセンサーの詳細な製造方法は、先に記載されている。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、Ｓｅｎｓｏｒ  ａｎｄ  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ｂ  ６７７９、１〜６頁（２００２年）参照のこと。具体的には、光学等級ポリマーフィルムを、ＳＷＳセンサーの支持体として用いた。ＵＶ硬化性アクリルベースポリマーコーティングを、フィルム上にコーティングし、９６ウェルマイクロタイタープレートの標準フォーマットに対応する９６個の円を有するシリコンマスクを用いて複製した。この円が、ＳＷＳ構造を形成する。Ｘｅｎｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）によって提供されるＵＶランプＲＣ６００を用いて、複製後にコーティングを硬化した。続いて、二酸化チタン層および二酸化ケイ素層を表面の最上部に被着させた。
【００８５】
１種以上の特異的結合物質の固定化
比色分析共鳴反射バイオセンサーで以下のプロトコールを用い、アミン官能基を用いて表面に官能基付与した。アミン基は、その後のいくつかの種類のリンカー分子の共有結合のための多目的表面として用いることができる。
【００８６】
ガラス版のバイオセンサーは、ピラニアエッチ（７０／３０％（ｖ／ｖ）濃硫酸／３０％過酸化水素）に１２時間浸漬することによって洗浄する。このバイオセンサーを水で十分に洗浄した。バイオセンサーを、無水アセトン中３％の３−アミノプロピルトリエトキシシラン溶液に１分間浸し、次いで、無水アセトンですすぎ、風乾した。次いで、バイオセンサーを水で洗浄した。
【００８７】
半定量的方法を用いて、バイオセンサー表面上のアミノ基の存在を確認した。アミノ官能基が付与されたバイオセンサーの各バッチに由来する１つのバイオセンサーを、５ｍＬの５０ｍＭ  炭酸水素ナトリウム、ｐＨ８．５で短時間洗浄する。次いで、バイオセンサーを、５ｍＬの、０．１ｍＭスルホ−スクシンイミジル−４−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−ブチレート（ｓ−ＳＤＴＢ、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を含有する５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム、ｐＨ８．５に浸し、３０分間激しく振盪した。ｓ−ＳＤＴＢ溶液は、１ｍＬのＤＭＦに３．０ｍｇのｓ−ＳＤＴＢを溶解し、５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム、ｐＨ８．５を用いて５０ｍＬに希釈することによって調製する。３０分インキュベートした後、バイオセンサーを、２０ｍＬのｄｄＨ２Ｏで３回洗浄し、続いて、５ｍＬの３０％過塩素酸で処理する。橙色の溶液の発生は、バイオセンサーがアミンを用いて上手く官能基付与されたことを示し、未処理ガラスバイオセンサーについては色の変化は観察されない。
【００８８】
上記の手順に続く、過塩素酸処理後の溶液の４９５ｎｍの吸光度を、表面上のアミン基の量の指標として用いることができる。あるセットの実験では、Ｓｉｇｍａスライド、Ｃｅｌ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅスライドおよび自家バイオセンサースライドそれぞれの吸光度は、０．６２７、０．６４７および０．７２８であった。これは、バイオセンサー表面のＮＨ２官能基付与のレベルが、官能基付与された市販のマイクロアレイガラススライドと同程度であることを示す。
【００８９】
バイオセンサーをアミンを用いて官能基付与するための上記のプロトコールを行った後に、リンカー分子をバイオセンサーに付着させることができる。架橋試薬を選択する場合には、反応基の選択性、スペーサーアーム長、溶解度および切断性などの問題を考慮するべきである。リンカー分子は、次いで、結合パートナーの特異的認識に用いられる特異的結合物質と結合する。一例として、ビオチンリンカー分子をアミン官能基が付与されたバイオセンサーと結合させるために、以下のプロトコールを用いた。
【００９０】
アミンコーティングされたバイオセンサーを、ビオチンを用いて官能基付与するためのプロトコール
アミンコーティングされたバイオセンサーをＰＢＳ（ｐＨ８．０）で３回洗浄する。０．５ｍｇ／ｍｌ濃度の、ＰＢＳバッファー（ｐＨ８）中、スルホ−スクシンイミジル−６−（ビオチンアミド）ヘキサノエート（スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）溶液を調製する。各アミンコーティングされたバイオセンサーに、２ｍｌのスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン溶液を加え、室温で３０分間インキュベートする。バイオセンサーをＰＢＳ（ｐＨ８．０）で３回洗浄する。スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンリンカーは、５５６．５８の分子量および２２．４Åの長さを有する。得られたバイオセンサーは、アビジンまたはストレプトアビジン分子を捕獲するために使用できる。
【００９１】
アミンコーティングされたバイオセンサーをアルデヒドを用いて官能基付与するためのプロトコール
０．１Ｍリン酸ナトリウム中、２．５％のグルタルアルデヒド溶液、０．１％水素化シアノホウ素ナトリウム、ｐＨ７．０を調製する。各アミンコーティングされたバイオセンサーに２ｍｌのグルタルアルデヒド溶液を加え、室温で３０分間インキュベートする。バイオセンサーをＰＢＳ（ｐＨ７．０）で３回洗浄する。グルタルアルデヒドリンカーは、１００．１１の分子量を有する。得られたバイオセンサーを、タンパク質およびその他のアミン含有分子を結合するために使用できる。反応は、シッフ塩基の形成によって進行し、続く還元的アミノ化によって安定な第二級アミン結合が生じる。１つの実験では、コーティングされたアルデヒドスライドを、市販のアルデヒドスライド（Ｃｅｌ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅ）と比較した場合に、上記の方法によって作製されたスライド上のストレプトアビジンおよび抗ウサギＩｇＧの１０倍高い結合が観察された。
【００９２】
アミンコーティングされたバイオセンサーを、ＮＨＳを用いて官能基付与するためのプロトコール
炭酸ナトリウムバッファー（ｐＨ８．５）中、２５ｍＭのＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート（ＤＳＣ、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）を調製した。各アミンコーティングされたバイオセンサーに２ｍｌのＤＳＣ溶液を加え、室温で２時間インキュベートした。バイオセンサーをＰＢＳ（ｐＨ８．５）で３回洗浄した。ＤＳＣリンカーは２５６．１７の分子量を有する。得られたバイオセンサーを、ヒドロキシルまたはアミン含有分子との結合に用いる。このリンカーは、利用可能な最小のホモ二官能性ＮＨＳエステル架橋試薬の１種である。
【００９３】
上記で定義されるプロトコールに加え、種々の種類の生体分子のアッセイ性能を最適化する、多数のさらなる表面官能基付与及び分子リンカー技術が報告されている。これらのうち最も一般的なものは、アミン表面、アルデヒド表面およびニッケル表面である。次いで、表２に示されるように、官能基が付与された表面を用いて、バイオセンサー表面にいくつかの異なる種類の化学リンカーを付着できる。アミン表面はいくつかの種類のリンカー分子を付着するために用いられるが、アルデヒド表面は、さらなるリンカーを含まずにタンパク質を直接結合するために用いられる。ニッケル表面は、もっぱら、組み込まれたヒスチジン（「ｈｉｓ」）タグを有する分子を結合するために用いられる。ニッケル活性化表面を用いる、「ｈｉｓタグが付けられた」分子の検出はよく知られている（Ｓｉｇａｌら（１９９６年）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、第６８巻、４９０頁）。
【００９４】
表１は、バイオセンサーを調製し、使用するために用いられる一連の工程および表面官能基付与化学、化学リンカー分子、特異的結合物質および結合パートナー分子に利用可能である種々の選択肢の一例を示す。ＨＲＰまたはストレプトアビジンなどの大きな分子を用いる増幅および分子結合に利用可能な表面積を増大するためのデキストランまたはＴＳＰＳなどのポリマー材料使用によって検出されるシグナルを増強するための機会も存在する。
【００９５】
【表２】
2010508520.tif 000004
【実施例２】
【００９６】
アルデヒド表面官能基付与および試験
以下の実施例は、タンパク質、ペプチド、核酸、細胞、小分子、小さな有機分子、その他の化学分子および／または生体分子などを結合するための比色分析共鳴バイオセンサーの表面上の化学官能基を提供する。このような化学官能基は、プロテオミック、ゲノミック、医薬品、創薬、診断法、環境、化学および類似の研究領域および／または産業において興味深いものである。この例は、バイオセンサー構造を変更または分解しない化学試薬を用いて高密度の官能基アルデヒド結合部位を提供するコーティング方法の開発に対応する。この実施例で取り組む別の問題は、比色分析共鳴バイオセンサーの官能基付与された表面上のアルデヒド結合部位の存在を確認する試験法の開発である。
【００９７】
前のセンサー表面を、表面アミン基でコーティングした。センサー表面をアミンを用いてコーティングするための簡単な方法は、洗浄した表面をポリリジンに直接曝露することである。一例として、マイクロアレイプリンティングに用いられるガラススライド表面がある。アミンを用いて表面をコーティングするための代替法は、表面にアミンコーティング分子を共有結合によって付着すること、例えば、ガラスにシランを、または金にチオールを付着することであり、その両方とも周知である。いくつかのアルデヒド修飾スライドはまた、アレイをプリンティングするために市販されている（例えば、ＣＥＬ  ＡｓｓｏｃｉａｔｅｓおよびＮｏＡｂ  ＢｉｏＤｉｓｃｏｖｅｒｉｅｓ、下記）。
【００９８】
この実施例は、比色分析共鳴バイオセンサーの表面に高密度の官能基アルデヒド結合部位を、バイオセンサー構造の変更または分解を伴わずに提供する方法を説明する。
【００９９】
アルデヒド基の存在を確認するために、現在の比色分析および蛍光法は、通常、溶液のサンプルを使用し、この方法では、検出は、乾燥表面でのサンプルよりもより感度が高い可能性がある。また、乾燥した、起伏のある（すなわち、完全に平坦ではない）表面上の約５０Å未満の厚さの化学基の表面特性決定を実施することも、難しい問題であるとわかっている。
【０１００】
比色分析共鳴バイオセンサー表面は、アミン基を用いて官能基を付与でき、ここで、表面は、プラスチック、ガラス、エポキシまたは本明細書に記載されるポリマー基板を含んでなるバイオセンサーであることができる。アミン官能基が付与された表面は、カップリングバッファーですすぐことができる。カップリングバッファーは、約７．４のｐＨのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に作成できる。シアノ水酸化ホウ素を含むアルデヒド溶液を、バイオセンサー表面に加えることができる。アルデヒド溶液は、約１００ｍＭのシアノ水酸化ホウ素を含有する約１０％のグルタルアルデヒドを含むことができる。表面は、例えば、約４時間、ほぼ室温で静置することができる。バイオセンサー表面は、例えば、カップリングバッファーで洗浄することができる。
【０１０１】
バイオセンサーの表面上のアルデヒド基の存在について調べるために、限定されないが、放射性、比色分析、蛍光、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）などをはじめ、多数の方法を用いてもよい。
【０１０２】
アルデヒド表面官能基付与についての蛍光試験は、例えば、アルデヒド処理された、および未処理バイオセンサーを約２×２ｃｍ２の小片に切断することを含んでいてもよい。アルデヒドコーティングされた表面を、可視光で励起され得る蛍光色素に曝露することができる。例えば、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液中の、ＡＬＥＸＡ  ６４７−ヒドラジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＯＲ）のような蛍光ヒドラジン誘導体を約１００μｇ／ｍＬの色素の最終濃度で調製して使用する。約１００μＬの色素溶液を１片のカバースリップ上に分配し、バイオセンサー片を色素溶液上に裏向きに置く。このバイオセンサーを色素とともに、ほぼ室温で約１時間インキュベートする。カバースリップおよび色素溶液を廃棄し、バイオセンサー表面を、例えば、蒸留、脱イオン水で３回すすいでよい。このバイオセンサー片を、例えば、２０ｍＬの蒸留、脱イオン水とともにペトリ皿に入れ、ロッキングプラットフォーム上で約１時間洗浄する。このバイオセンサー片をＮ２を用いて乾燥する。例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）４２８（商標）スキャナーを用いるスキャニングのために、水滴を用いて、バイオセンサー片をガラススライド上に固定することができる。各バイオセンサー片の蛍光を読み取り、アルデヒド結合部位の量を調べる。
【０１０３】
比色分析共鳴バイオセンサーは、例えば、本明細書に記載される低屈折率材料を含む回折格子上に被着された高屈折率材料を含む。高屈折率材料は、例えば、硫化亜鉛、二酸化チタン、インジウムスズ酸化物、酸化タンタルまたは窒化ケイ素であることができ、低屈折率材料は、例えば、ガラス、プラスチック、ポリマーまたはエポキシであることができる。一実施形態では、バイオセンサーの高屈折率材料は、場合により、ＳｉＯ２でコーティングされる。用いられる比色分析バイオセンサーの表面上のアルデヒドコーティングは、約５０Å未満の厚さ等の任意の厚さであり得る。さらに、バイオセンサー表面は、起伏のある（すなわち、平坦でない）ものであり得る。バイオセンサー表面は、アルデヒド表面活性化の検出に先立って乾燥させてもよい。
【０１０４】
上記のアルデヒド官能基付与プロトコールおよび蛍光試験法を用いて、アルデヒドコーティングされ染色されたバイオセンサーは、通常、アルデヒド表面官能基付与されていないバイオセンサーに対して、少なくとも１０倍高い蛍光を示す。表２は、すべて、蛍光試験手順に付された、アルデヒド官能基付与のない（ブランク）プラスチックバイオセンサーとアルデヒド官能基が付与されたバイオセンサーの比較を示す。上記のプロトコールおよび方法は、コーティングされたアルデヒドの表面密度が、商業的供給元（例えば、ＣＥＬ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｐｅａｒｌａｎｄ，ＴＸおよびＮｏＡｂ  ＢｉｏＤｉｓｃｏｖｅｒｉｅｓ、（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、ＯＮ、Ｃａｎａｄａ）によって用いられる方法によって得られたものよりも高いことを示した。表３は、すべて蛍光試験手順に付された、アルデヒド官能基付与のないガラススライド（ブランク、４サンプルの平均が示される）と、本発明の方法および商業的供給元（Ｃｅｌ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅ  による、およびＮｏＡｂによる）によって得られた、アルデヒド官能基が付与されたスライドとの比較を示す。
【０１０５】
【表３】
2010508520.tif 000005
【０１０６】
【表４】
2010508520.tif 000006
【０１０７】
アルデヒド表面官能基付与はまた、タンパク質結合試験を用いて試験できる。例えば、約７．４のｐＨで、ＰＢＳ中、プロテインＡの約１００μｇ／ｍＬの溶液を調製し、アルデヒドコーティングされたおよび未処理のバイオセンサー片に加え、ほぼ室温で約１時間インキュベートする。バイオセンサーを、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含んでなるＰＢＳ溶液で約３回洗浄する。バイオセンサー片を洗浄溶液に入れ、ほぼ室温で約１５分間洗浄する。バイオセンサー片を、ほぼ室温で約ｐＨ７．４のＰＢＳバッファーですすいでよい。バイオセンサーの表面に適した抗体の標識された溶液を加え、インキュベートする。例えば、約２０μｇ／ｍＬのウサギ抗ヤギＩｇＧ−ＡＬＥＸＡ６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）の溶液を用い、バイオセンサーを暗所で約３０分間インキュベートすることができる。バイオセンサーを、約ｐＨ７．４（ＰＢＳＴ溶液）の約０．０５％のＴｗｅｅｎ（商標）２０を含んでなるＰＢＳバッファーで約３回洗浄する。このバイオセンサーを、脱イオン水で洗浄し、Ｎ２で乾燥させる。検出は、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）４２８（商標）スキャナーを用いてバイオセンサーをスキャンして蛍光読み取りを得ることを含む。
【０１０８】
アルデヒドコーティング法およびタンパク質結合試験法を用いて、アルデヒドコーティングされたバイオセンサーは、プロテインＡ／ＩｇＧと、同一のプロテインＡ／ＩｇＧ処理に付されたコーティングされていないバイオセンサーよりも約５倍良好に結合することが示された（表４参照のこと）。
【０１０９】
【表５】
2010508520.tif 000007
【０１１０】
表５は、アルデヒド官能基が付与された、プラスチックベースの、比色分析共鳴バイオセンサーアレイが、ＰＢＳ、ＢＳＡおよび抗ＢＳＡに逐次曝露された場合にどのように応答したかを示す。６個のバイオセンサーを同時にモニターした。工程１で、すべてのバイオセンサーをＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液に曝露して、バイオセンサーのベースラインを得た。次いで、工程２で、センサー３〜６を０．５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（ＰＢＳで作製）に曝露したのに対し、バイオセンサー１および２（参照として用いた）はＰＢＳのみに対して曝露した。ＢＳＡが結合しているバイオセンサーで約０．３８ｎｍの平均シグナルが得られたのに対し、参照バイオセンサーはベースラインのままであった。最後に、工程３で、バイオセンサー３および４を、０．５ｍｇ／ｍＬの抗ＢＳＡに曝露したのに対し、バイオセンサー１および２は再度、ＰＢＳのみに対して曝露した。ＢＳＡ上での抗ＢＳＡの結合（バイオセンサー３および４）が、ベースラインを上回るさらなる約１．４ｎｍのシグナルを与えることがわかった。対照として、この工程で、バイオセンサー５および６はそれぞれ、ＰＢＳおよび０．５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡに対して曝露し、それでは、それらの応答は工程２のレベルのままであった。
【０１１１】
【表６】
2010508520.tif 000008
【０１１２】
本明細書に記載される工程、方法および結果は、アルデヒドコーティングされた表面を用いて実施できる広範な検出用途、例えば、限定されないが、タンパク質、ペプチド、核酸、細胞、小分子、小さな有機分子、その他の化学分子および／または生体分子などの結合のために、一般に適用できる。このような用途は、限定されないが、プロテオミック、ゲノミック、医薬品、創薬、診断法、環境、化学などをはじめとする多数の分野において興味深いものである。
【実施例３】
【０１１３】
ストレプトアビジン（ＳＡ）表面の、５％トレハロースでのブロッキング
ＳＡを固定化したウェル（０．０５ｍｇ／ｍｌ  ＳＡおよび０．２ｍｇ／ｍｌ  ＳＡ）および対照ウェル（トレハロース単独）に、４０μｌの５％トレハロース溶液を加え、２時間結合させた。これらのプレートを洗浄し、ピーク波長値（ＰＷＶ）シフトを測定した（表６および図２参照のこと）。ＳＡシフトは、アルデヒド表面とのＳＡ結合のＰＷＶであり、ブロッカーシフトは、ブロッカーをＳＡ固定化アルデヒド表面上の未反応アルデヒド官能基と結合させた後に得られたＰＷＶシフトである。未反応アルデヒドは、大きなＳＡ分子よりも小さなブロッカー分子によって、より容易に接近される。ブロッカーシフトは、ＳＡ濃度が高いほど低いが、これは、おそらくは、これらのウェル中にブロッカーを結合するために利用可能なアルデヒドが少ないためである。
【０１１４】
【表７】
2010508520.tif 000009
【実施例４】
【０１１５】
非特異的結合を低減するためのトレハロースの有効性
非特異的結合を低減するためのトレハロースの有効性を調べるために、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）のＳＡ表面との結合を低減するトレハロースの能力を測定した。１０％および１００％の市販のＦＢＳを、２ｎｍのＰＷＶシフトまたは５．８ｎｍのＰＷＶシフトを有するＳＡ表面のいずれかと反応させ、得られたシフトを測定した（表７および図３参照のこと）。表面をブロッキングした後に得られたシグナルをゼロまたはベースラインとすることによって、シフトをトレハロースシフトに対して標準化した。次いで、ＦＢＳ中に存在するタンパク質による結合の変化を測定し、これを非特異的結合とする。
【０１１６】
【表８】
2010508520.tif 000010
【０１１７】
これらの結果は、ＦＢＳが、表面上の未反応アルデヒドと結合していることを示す。さらに、これらの結果は、表面上で、より多くの未反応アルデヒド基が依然として利用可能である低固定化密度のＳＡでさえ、トレハロースでのブロッキングが、非特異的結合を低減したことを実証する。
【０１１８】
トレハロースは、ＦＢＳに由来するタンパク質の、ＳＡ表面との非特異的結合を低減した。最高のシフト低減は、５．８ｎｍのＳＡ表面で見られ、このことは、ブロッカーの最適な選択は、固定化標的タンパク質の表面密度に応じて変わるということを示唆する。言い換えれば、表面がまばらにしか覆われていない低い表面密度には、小分子ブロッカーまたは不活性タンパク質のような高分子ブロッカーのいずれかを使用できる。しかし、高い表面密度では、表面のタンパク質被覆度が高い場合、ブロッカーはタンパク質層を透過して、未反応のアルデヒドと結合できるよう十分に小さくなくてはならない。
【０１１９】
ブロッカーを選択するための別の考慮すべき事項として、意図される表面の用途がある。タンパク質間相互作用、例えば、抗体のスクリーニングなどの用途に使用される表面は、通常、低密度の標的タンパク質を有するのに対し、高い固定化密度表面は、例えば、小分子結合の検出において、例えば、薬物スクリーニングにおいて用いられる。
【実施例５】
【０１２０】
トレハロースは、特異的タンパク質間相互作用に対して影響を及ぼす
特異的タンパク質間相互作用に対するトレハロースの影響を試験するために、トレハロースがＳＡ表面と結合するビオチンの能力を妨害する能力を測定した。１０％または１００％ＦＢＳのいずれかにおいて、ビオチンを５．８ｎｍのＰＷＶシフトを有するＳＡ表面と反応させ、得られたシフトを測定した（表８参照のこと）。括弧内に示される、ビオチン結合に起因する理論的シフトは、以下の式から算出した：（ビオチンの分子量／ＳＡの分子量）×ビオチンに対するＳＡ上の結合部位数×ＳＡシフトすなわち（２４４／５５０００）×４（結合部位）×５．８ｎｍ（ＳＡシフト）。明確なビオチン結合シグナルが、すべての場合において見られた。したがって、トレハロースは、その他のブロッカーについて見られるように、ビオチン結合を妨害しないと思われる。
【０１２１】
【表９】
2010508520.tif 000011
【実施例６】
【０１２２】
トレハロースは、ＨＳＡ−ワルファリンタンパク質−小分子系に影響を及ぼす
トレハロースを用いて、別のタンパク質−小分子系での非特異的結合を低減できる。例えば、トレハロースは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）とワルファリンとの相互作用に伴う非特異的結合をブロッキングできる。アッセイは、１％ＤＭＳＯ中で実施した。ＨＳＡを５％トレハロースでブロッキングした。結果は、表８および図４に示される。ワルファリンと表面との非特異的相互作用をブロッキングするトレハロースによって、１μＭ未満のＨＳＡとの特異的結合の検出が可能となった。トレハロースを加えない場合は、このような低濃度で結合を検出することは困難である。
【０１２３】
【表１０】
2010508520.tif 000012
【実施例７】
【０１２４】
トレハロースは、炭酸脱水酵素（ＣＡ）−カルボキシスルホンアミド（ＣＢＳ）タンパク質−小分子系に対して影響を及ぼす
トレハロースを用いて、別のタンパク質−小分子系で非特異的結合を低減することができる。例えば、トレハロースは、ＣＢＳと炭酸脱水酵素との相互作用に伴う非特異的結合をブロッキングできる。ＣＡ表面を５％トレハロースでブロッキングした。結果は、表９および図５に示される。ＣＢＳと表面との非特異的相互作用をブロッキングするトレハロースによって、１μＭ未満のＣＡとの特異的結合の検出が可能となった。トレハロースを加えない場合は、このような低濃度で結合を検出することは困難である。
【０１２５】
【表１１】
2010508520.tif 000013
【実施例８】
【０１２６】
バイオセンサー表面上の非特異的タンパク質結合のブロッキング
二糖分子、例えば、トレハロースを用いて、タンパク質またはその他の分子と、例えば、タンパク質がコーティングされたバイオセンサー表面、例えば、ＢＩＮＤ（商標）センサープレートとの非特異的結合をブロッキングできる。
【０１２７】
二糖分子はまた、タンパク質がコーティングされたプレートを輸送するための保存溶液としても使用できる。所望のタンパク質をバイオセンサー表面に、例えば、ストレプトアビジンをＢＩＮＤ（商標）センサープレート上に固定化する。プレート中のウェルに、二糖分子、例えば、トレハロースの溶液を加え、包装する。したがって、使用者がバイオセンサーを受け取るときには、表面は二糖分子で予めブロッキングされている。
【実施例９】
【０１２８】
アミン表面と結合する糖
アミン官能基を用いて官能基が付与されたＢＩＮＤ（商標）センサープレートに、それぞれ５％および２．５％のラクトースおよびグリセルアルデヒド水溶液を２時間加えた。次いで、プレートを水で十分に洗浄し、水中で一晩保存した。次いで、プレートを水で再度洗浄し、糖の結合を測定した。以下の表は、一晩インキュベーションの前とインキュベーション後のシフトの相違を示す。シフトは一晩で有意には変化しておらず、このことは、糖ブロッカーと表面上のアミン官能基間の安定な結合を示すということに留意すべきである。
【０１２９】
【表１２】
2010508520.tif 000014
【図１】
2010508520.tif 000015
【図２】
2010508520.tif 000016
【図３】
2010508520.tif 000017
【図４】
2010508520.tif 000018
【図５】
2010508520.tif 000019
【国際調査報告】
2010508520.tif 000020
2010508520.tif 000021
2010508520.tif 000022