(57)【要約】本発明は、ジンクフィンガー転写因子であるSALL4（アイソフォームSALL4A、SALL4BおよびSALL4Cを含む）の核酸、タンパク質、およびそれに対する抗体を開示する。さらに、SALL4の構成的発現がモデル動物系の細胞における白血病誘発の可能性を高めることを実証する方法も開示する。加えて、トランスジェニックマウスにおける選定アイソフォーム（例えば、SALL4B）の構成的発現は、これらの動物が、移植可能である後発性の急性骨髄性白血病（AML）を含む、骨髄異形成症候群（MDS）様の徴候および症状を生じることを実証する。本開示はまた、胚性幹細胞、成体幹細胞、白血病幹細胞を含むがん幹細胞を同定して精製するための方法、SALL4と結合する、および／またはSALL4を調節する物質を同定するための方法、対象におけるMDSを診断するための方法、ならびにMDS、AMLおよび他の形態の白血病を呈する対象を治療するための方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における始原細胞起源の障害を診断する方法であって、対象由来の組織試料におけるSALL4の発現を決定する段階を含む方法。
【請求項２】
障害が胚細胞腫瘍（GCT）に関連する、請求項1記載の方法。
【請求項３】
GCTが古典的セミノーム、精母細胞セミノーム、胎生期癌、卵黄嚢腫瘍または未熟型奇形種である、請求項2記載の方法。
【請求項４】
組織試料が精巣起源の細胞を含む、請求項1記載の方法。
【請求項５】
試料中に存在する実質的にすべての成熟精巣細胞型がSALL4を発現しない、請求項4記載の方法。
【請求項６】
組織試料が、GCTから転移した細胞を含む部位から得られる、請求項1記載の方法。
【請求項７】
以下の段階：
a）対象への移植の前に幹細胞におけるSALL4の発現レベルを決定する段階；
b）対象に段階（a）の細胞をグラフト（graft）する段階；
c）グラフトされた幹細胞におけるSALL4の発現レベルを移植後の期間で決定する段階
を含む、対象における移植された幹細胞の生着（engraftment）をモニタリングする方法であって、
前記期間にわたるSALL4発現の低下が幹細胞の分化と相関し、そのような分化が対象における細胞の生着が陽性であることを示す、モニタリング方法。
【請求項８】
前記期間にわたるSALL4発現の増大が分化の抑圧と相関し、そのような抑圧が対象における細胞の生着が陰性であることを示す、請求項7記載の方法。
【請求項９】
細胞が、外来性または内在性遺伝子産物をコードするベクターによって形質転換される、請求項7記載の方法。
【請求項１０】
以下の段階：
a）対象から臍帯細胞（UBC）を得る段階；
b）SALL4を発現する細胞をSALL4を発現しない細胞から選別する段階；および任意で、
c）SALL4を発現する選別された細胞から1つまたは複数のマーカーを用いて細胞を選択する段階
を含む、臍帯血から幹細胞を単離するための方法であって、
SALL4を発現するUBCが単離された幹細胞を示す、単離方法。
【請求項１１】
1つまたは複数のマーカーが、SSEA-1、SSEA-2、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、CD34+、CD59+、Thy1/CD90+、CD38lo/-、C-kit-/lo、lin-、SH2、ビメンチン、過ヨウ素酸シッフ活性（PAS）、FLK1、BAPおよび酸性ホスファターゼからなる群より選択される、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
選別の段階が、蛍光活性化細胞選別（FACS）による選別を含む、請求項10記載の方法。
【請求項１３】
選別の段階が、磁性ビーズ選別（MACS）による選別を含む、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
幹細胞または前駆細胞起源のがんを治療する方法であって、それを必要とする対象に対して、SALL4の発現レベルを低下させる作用物質を含む組成物を投与する段階を含む方法。
【請求項１５】
作用物質が、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31；SEQ ID NO：32；SEQ ID NO：33；またはSEQ ID NO：34から選択されるオリゴヌクレオチド配列である、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
組成物がメチル化阻害薬を含む、請求項14記載の方法。
【請求項１７】
メチラーゼ阻害薬が、5'アザシチジン、5'アザ-2-デオキシシチジン、1-B-D-アラビノフラノシル-5-アザシトシンまたはジヒドロキシ-5-アザシチジンから選択される、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
組成物がさらにプロテアソーム阻害薬を含む、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
プロテアソーム阻害薬が、MG 132、PSI、ラクタシスチン、エポキソミシンまたはボルテゾミブから選択される、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
幹細胞または前駆細胞が、白血病幹細胞、セミノーム、精母細胞セミノーム、胎生期癌、卵黄嚢腫瘍または未熟型奇形種から選択される、請求項14記載の方法。
【請求項２１】
SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31；SEQ ID NO：32；SEQ ID NO：33；またはSEQ ID NO：34から選択される、単離されたオリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は一般に、Wnt／β-カテニンシグナル伝達経路に関連する因子に関し、より具体的には、胚性幹細胞およびがん幹細胞の調節に関与する、その経路の、SALLタンパク質ファミリーおよびOCT4およびnanogを含む転写性構成要素間の相互作用に関し、そのような相互作用を標的化することによる増殖性障害の診断および治療のための方法を含む。さらに、SALL4シャットダウンはアポトーシスおよび細胞周期停止を起こすようにがん幹細胞を誘導し、それらの細胞はBmi-1を含むSALL4下流標的によってレスキューすることができる。
【背景技術】
【０００２】
背景情報
胚盤胞の内部細胞塊（ICM）に由来するES細胞は、自己複製細胞分裂を行いそれらの多分化能を不定の期間維持することが可能である。ES細胞はまた、体外培養される時に様々な異なる細胞型へ分化することも出来る。Wnt／βカテニンシグナル伝達経路は、正常なヒト幹細胞（HSC）および慢性骨髄性白血病（CML）の顆粒球-マクロファージ前駆細胞（GMP）の自己複製に関連している。さらに、転写因子OCT4は着床前発生においてICMの形成のための主要調節因子として同定される。さらには、OCT4タンパク質は多様な遺伝子を調整することによって胚性幹（ES）細胞の多分化能の維持において中心的な役割を行っているようである。
【０００３】
幹細胞の役割は、がんの病因において考えられてきた。腫瘍がそのようながん幹細胞、すなわち、腫瘍の成長の原因となるまれな細胞を含む可能性があるという証拠が増えつつある。これらの無限増殖能を伴うまれな細胞は、従来の治療方法に対応する、がん細胞に見られる抵抗力の原因である可能性がある。幹細胞が、そのような細胞が例えば造血性細胞等の特定の組織から生じる成体組織で同定されることは既知である。幹細胞自己複製特性は正常な器官形成で厳重に制御されるため、自己複製の脱制御は発がんをもたらす可能性がある。
【０００４】
例えば、骨髄異形成症候群（MDS）は、汎血球減少症、多分化機能障害、および骨髄アポトーシスを引き起こす、造血幹細胞（HSC）レベルでのゲノム異常の蓄積を特徴とする血液病である。
【０００５】
本疾病による死亡は、汎血球減少症または急性骨髄性白血病（AML）への変換を原因とする。AMLは、骨髄および末梢血においての未熟骨髄系前駆体の蓄積を特徴とする血液がんである。
【０００６】
AML患者からの骨髄試料での遺伝的転座の分析からは、造血にとって重要である転写因子が、白血病誘発において重要な役割を果たすことが明らかである。AMLの病因は多段階遺伝子変化に関与すると考えられる。HSCのみが自己複製の能力を有すると考えられるため、それらが多段階性、前白血病遺伝子変化の蓄積および、それらをいわゆる「白血病幹細胞」（LSC）へ変換させる最良候補である。
【０００７】
また、下流前駆細胞は自己複製能力を得て、白血病を引き起こす可能性がある。LSCは特に現在の化学療法レジメンでは標的とされないが、そのような細胞は薬物耐性および白血病再発の原因であることが発見されている。
【０００８】
SALL遺伝子ファミリーであるSALL1、SALL2、SALL3、およびSALL4は、本来、ショウジョウバエspalt（sal）に対してそれらのDNA配列相同性に基づいてクローニングされた。ショウジョウバエにおいて、spaltは、後頭部および前尾部の断片の発達に必要不可欠であるホメオティック遺伝子である。それは、気管の発生、光受容体の最終分化、および翅脈の配置において重要な役割を果たす。ヒトにおいて、SALL遺伝子ファミリーは腫瘍形成のみならず正常な発達にも関連する。SALLタンパク質は、全タンパク質に分布されたマルチフィンガー領域を特徴とするC2H2ジンクフィンガー転写因子の群に属する。ショウジョウバエの気管発生の間、spaltはウィングレスの活性下流標的、Wntオーソログである。SALL1は、コアクチベーターとして機能し、SALLとWnt／βカテニン経路間の相互作用は両方向性であることを示唆することにより、βカテニンと相互作用することが実証されてきた。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、発達に不可欠なジンクフィンガー型転写因子である、ショウジョウバエspaltに対するヒトホモログであるSALL4に関連する。SALL4およびそのアイソフォーム（SALL4A、SALL4B、およびSALL4C）は、クローニングされ配列決定される。本開示は、SALL4がヒト原発性AMLにおいて遮断（turn off）されることが出来なかったことを実証する。さらに、マウスモデルにおいて、SALL4の構成的発現の白血病誘発可能性が実証される。さらに、骨髄異形成症候群（MDS）様の兆候および症状ならびに続発性の可移植性AMLを発症するSALL4B-トランスジェニックマウスを開示する。
【００１０】
髄鞘形成に関連するアポトーシスの増加は、トランスジェニックマウスの骨髄、およびコロニー形成（CFU）分析において明らかである。両アイソフォームは、βカテニンに結合することが可能であり、相乗的にWnt／βカテニンシグナル伝達経路を強化することが可能である。これはSALL4の構成的発現がMDS／AMLを引き起こすこと、およびそのような発現がWnt／βカテニン経路に影響を与えることを実証する。関連する態様では、開示されるマウスモデルは、ヒトMDS／AML変換と白血病幹細胞の病因におけるWnt／βカテニン経路の役割を調査するプラットフォームを提供する。
【００１１】
一態様では、SEQ ID NO：13に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合される抗体または抗体フラグメントを開示する。
【００１２】
他の態様では、対象における骨髄異形成症候群（MDS）の治療の方法が開示され、該方法は、SEQ ID NO：13に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する抗体の治療的に有効な量を対象に投与する段階を含む。
【００１３】
他の態様では、対象における骨髄異形成症候群（MDS）の治療の方法が示され、該方法は、SEQ ID NO：1に示される配列、SEQ ID NO：3に示される配列、SEQ ID NO：5に示される配列、SEQ ID NO：1の相補体、SEQ ID NO：3の相補体、SEQ ID NO：5の相補体、およびそれらのフラグメントを有するポリヌクレオチドの組成物を対象へ投与する段階を含み、前記フラグメントは、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、またはSEQ ID NO：6に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む。
【００１４】
一態様では、対象における骨髄異形成症候群（MDS）の治療の方法が開示され、該方法は、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4および／またはSEQ ID NO：6に示される配列を有するポリペプチド組成物を対象へ投与する段階を含む。
【００１５】
関連する態様では、MDSは急性骨髄性白血病（AML）である。
【００１６】
一態様では、対象における骨髄異形成症候群（MDS）を診断する方法が開示され、該方法は、対象から生体試料を得る段階と、その生体試料に、ハイブリダイゼーション条件下で、SEQ ID NO：1に示される配列、SEQ ID NO：3に示される配列、SEQ ID NO：5に示される配列、SEQ ID NO：1の相補体、SEQ ID NO：3の相補体、またはSEQ ID NO：5の相補体を有するポリヌクレオチドの少なくとも15個の連続したヌクレオチドのフラグメントを含むプローブを接触させる段階と、プローブと生体試料のハイブリダイゼーションを検出する段階とを含み、ハイブリダイゼーションの検出はMDSに相関する。
【００１７】
他の態様では、対象における骨髄異形成症候群（MDS）を診断する方法が開示され、該方法は、対象から生体試料を得る段階と、生体試料をSEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、またはSEQ ID NO：6に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する抗体に接触させる段階と、試料への抗体の結合を検出する段階とを含み、検出結合はMDSに相関する。
【００１８】
一態様では、白血病幹細胞を単離する方法が示され、該方法は、対象から細胞試料を採取する段階と、SEQ ID NO：13に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現する細胞をそのアミノ酸配列を発現しない細胞から選別する段階と、SEQ ID NO：13に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現する細胞試料から、骨髄表面マーカーによって白血病幹細胞選び出す段階とを含む。
【００１９】
他の態様では、ヒトSALL4遺伝子を有するトランスジェニック動物が示され、該動物はSEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、またはSEQ ID NO：6に示されるアミノ酸をコードするヌクレオチドを含むヒトSALL4遺伝子の配列を発現するように改変される。関連する態様では、前記動物はその挿入されたSALL4遺伝子を構成的に発現する。
【００２０】
一態様では、ヒトSALL4遺伝子を含むトランスジェニック動物を作製する方法が開示され、該動物は、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、またはSEQ ID NO：6に示されるアミノ酸をコードするヌクレオチドを含むヒトSALL4遺伝子の配列を構成的に発現するように改変され、該方法は、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、またはSEQ ID NO：6に示されるアミノ酸をコードするヌクレオチドを含むヒトSALL4遺伝子構築物を含む核酸分子を胚細胞へ導入する段階と、構築物の導入の段階から生じる細胞からトランスジェニック動物を作製する段階と、トランスジェニック動物を交配させてヒトSALL4遺伝子のトランスジェニック動物の同型接合体を得る段階と、トランスジェニック動物由来の組織からヒトSALL4転写物を検出する段階とを含む。
【００２１】
一態様では、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、またはSEQ ID NO：6に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの細胞発現を調整する方法が開示され、該方法は、ポリヌクレオチドへハイブリッドする二本鎖RNA（dsRNA）、またはポリヌクレオチドへハイブリッドするアンチセンスRNA、またはそれらのフラグメントを細胞へ導入する段階を含む。
【００２２】
一態様では、内部細胞塊（ICM）、腫瘍性組織、または腫瘍から単離された細胞を、SALLファミリーメンバータンパク質の発現を検出する作用物質に接触させる段階と、SALLファミリーメンバータンパク質が、細胞において発現するかどうかを判定する段階とを含む、潜在的多能性を有する細胞を同定する方法が開示され、この方法では、SALLファミリーメンバータンパク質の発現の判定は、細胞における自己複製の誘発に正に相関し、それによって、そのような発現は、多分化能を示す。
【００２３】
一形態において、そのSALLファミリーメンバーはSALL1、SALL3、およびSALL4を含む。関連する態様では、SALL4はSALL4AまたはSALL4Bである。
【００２４】
他の態様では、作用物質はSALLファミリーメンバータンパク質またはSALLファミリーメンバータンパク質をコードするmRNAに相補的な核酸に対する抗体である。関連する態様では、SALLファミリーメンバータンパク質配列はSEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：22、およびSEQ ID NO：24を含む。その他の関連する態様では、核酸はSEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5；SEQ ID NO：21、およびSEQ ID NO：23を含む核酸配列のセンス鎖に相補的である。
【００２５】
一形態において、細胞は、胚性幹（ES）細胞、胎生期癌（EC）細胞、成体幹細胞、またはがん幹細胞である。関連する態様では、組織は対象由来の血漿試料または生検試料である。さらに関連する態様では、対象はヒトである。
【００２６】
一態様では、OCT4発現に対するSALLファミリーメンバータンパク質の影響を調整する作用物質を識別する方法が開示され、該方法は、機能的に連結されたOCT4プロモーターと遺伝子発現レポータータンパク質をコードする核酸とを含むプロモーター-レポーター構築物を含むベクターと、SALLファミリーメンバータンパク質をコードする核酸を含むベクターとを、細胞へコトランスフェクトする段階、細胞を作用物質に接触させる段階、ならびに作用物質の存在下および非存在下でプロモーター-レポーター構築物の活性を判定する段階を含み、プロモーター-レポーター構築物の活性を判定する段階はSALLファミリーメンバータンパク質／OCT4相互作用に対する作用物質の影響に相関する。
【００２７】
関連する態様では、プロモーター領域はSEQ ID NO：26に示される核酸配列を含み、発現レポータータンパク質はルシフェラーゼである。
【００２８】
他の態様では、対象の細胞を、SALLファミリーメンバータンパク質の発現を検出する作用物質に接触させる段階と、SALLファミリーメンバータンパク質が、細胞において発現されるかどうかを判定する段階とを含む、腫瘍性または増殖性の障害を診断する方法が開示され、この方法では、SALLファミリーメンバータンパク質の発現の判定は、細胞における自己複製の誘発に正に相関し、それによって、そのような発現は、腫瘍形成または増殖を示す。
【００２９】
一形態において、作用物質は標識され、判定する段階は、作用物質の位置を画像化する装置に対象をさらすことによる作用物質の検出を含む。関連する態様では、画像は磁気共鳴、X線、または放射性核種放出によって作製される。
【００３０】
一態様では、SALL4の発現を抑制する作用物質を含む医薬組成物を対象へ投与する段階を含む、腫瘍性または増殖性の障害の治療方法が開示され、ここで対象の細胞は、自己複製の脱制御を示す。
【００３１】
他の態様では、1つ以上のSALLファミリーメンバータンパク質を検出するための作用物質と、作用物質-細胞相互作用および作用物質の標識に十分な条件を提供するための試薬および緩衝剤と、検出試薬の標識および作用物質の細胞との接触についての説明書と、構成要素を含む容器とを含む、潜在的多能性を有する細胞を識別するためのキットが開示される。
【００３２】
細胞を、SALL4に対する抗体に接触させる段階と、抗体に結合した細胞を、流体および細胞の進入および放出のための少なくとも2つの開口部を備える表面境界キャビティへ適用する段階と、細胞および流体がキャビティを通過することを可能にする段階とを含む、増殖性疾患または腫瘍性細胞形成の進行に関連する細胞を検出する方法が開示され、この方法では、混合流体中の抗体結合細胞は光学検出器によって検出され、電圧が流体に加えられると、それによって、その電圧が1つ以上のコレクタにおいて結合細胞を類別する。
【００３３】
1つの態様においては、対象における始原細胞起源の障害を診断する方法であって、対象由来の組織試料におけるSALL4の発現を決定する段階を含む方法が開示される。1つの局面において、この障害は胚細胞腫瘍（GCT）に関連する。さらに、GCTには古典的セミノーム、精母細胞セミノーム、胎生期癌、卵黄嚢腫瘍または未熟型奇形種が含まれる。
【００３４】
もう1つの局面において、組織試料は精巣起源の細胞を含み、これには試料中に存在する実質的にすべての成熟精巣細胞型がSALL4を発現しないものが含まれる。さらに、組織試料は、GCTから転移した細胞を含む部位から得ることもできる。
【００３５】
もう1つの態様においては、対象への移植の前に幹細胞におけるSALL4の発現レベルを決定する段階、対象に細胞をグラフト（graft）する段階、およびグラフトされた幹細胞におけるSALL4の発現レベルを移植後の期間で決定する段階を含む、対象における移植された幹細胞の生着（engraftment）をモニタリングする方法であって、前記期間にわたるSALL4発現の低下が幹細胞の分化と相関し、そのような分化が対象における細胞の生着が陽性であることを示す、モニタリング方法が開示される。
【００３６】
1つの局面において、前記期間にわたるSALL4発現の増大は分化の抑圧と相関し、そのような抑圧は対象における細胞の生着が陰性であることを示す。
【００３７】
もう1つの局面において、移植された細胞は、外来性または内在性遺伝子産物をコードするベクターによって形質転換される。
【００３８】
1つの態様においては、対象から臍帯細胞（UBC）を得る段階、SALL4を発現する細胞をSALL4を発現しない細胞から選別する段階を含む、臍帯血から幹細胞を単離するための方法であって、SALL4を発現するUBCが単離された幹細胞を示す、単離方法が開示される。さらに、本方法は任意で、SALL4を発現する選別された細胞から1つまたは複数の追加のマーカーを用いて細胞を選択する段階を含みうる。
【００３９】
1つの局面において、1つまたは複数のマーカーは、SSEA-1、SSEA-2、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、CD34+、CD59+、Thy1/CD90+、CD38lo/-、C-kit-/lo、lin-、SH2、ビメンチン、過ヨウ素酸シッフ活性（PAS）、FLK1、BAPおよび酸性ホスファターゼからなる群より選択される。
【００４０】
もう1つの態様においては、幹細胞または前駆細胞起源のがんを治療する方法であって、それを必要とする対象に対して、SALL4の発現レベルを低下させる作用物質を含有する組成物を投与する段階を含む方法が開示される。
【００４１】
1つの局面において、作用物質は、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31；またはSEQ ID NO：32から選択されるオリゴヌクレオチド配列である。もう1つの局面において、組成物は、5'アザシチジン、5'アザ-2-デオキシシチジン、1-B-D-アラビノフラノシル-5-アザシトシンまたはジヒドロキシ-5-アザシチジンを非限定的に含むメチル化阻害薬を含む。1つの関連した局面において、組成物はさらに、以下のものを非限定的に含むプロテアソーム阻害薬を含む。
2010528620.tif 000002
2010528620.tif 000003
【００４２】
もう1つの態様においては、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31；SEQ ID NO：32；SEQ ID NO：33；またはSEQ ID NO：34から選択される、単離されたオリゴヌクレオチドが開示される。
【００４３】
本発明による例示的な方法および組成物を、以下にさらに詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
（図１）図1（a〜c）は、3つのSALL4アイソフォーム（SALL4A、SEQ ID NO：l［GenBankアクセッション番号：AYl72738］、SALL4B、SEQ ID NO：3［GenBankアクセッション番号：AY170621］、およびSALL4C、SEQ ID NO：5［GenBankアクセッション番号：AY170622］）の領域を示す。選択的スプライシングはSALL4mRNAの2つの異形を生じさせる。図1（a）SALL4AおよびSALL4Bはタンパク質の長さおよび異なる数の特徴的なsal様ジンクフィンガー領域の存在において異なる。SALL4A（1,067アミノ酸をコード）は、8つのジンクフィンガー領域を含み、一方SALL4B（623アミノ酸をコード）は、3つのジンクフィンガー領域を有する。SALL4Cは276アミノ酸を含み、アミノ酸43から820の完全長SALL4Aに一致する領域を欠く。両方の変異体は1、3、および4のエクソンを有し、SALL4Aは1から4のすべてのエクソンを含む。しかしながら、SALL4Bは、エクソン2の大きな3’の部分の欠失に繋がる選択的スプライス受容部位を使用する。図1（b）は、異なる組織におけるSALL4の変異のRT-PCR分析を示す。SALL4の4つのエクソンとそれらの潜在性コーディング構造が、SALL4転写物のPCR増幅に使用されるプライマーを示す矢印で示される（A）。RT-PCRによるSALL4転写物の組織依存的な発現（B）。プライマーA1（エクソン2）およびB1（エクソン4）を用いた、SALL4Aに対して特異的な315bpの期待産物は、様々な組織のcDNAで増幅される。プライマーD1（エクソン4）およびC1（エクソン1）が、SALL4Bの1,851bpの期待産物を増幅するために使用された。同等の量のcDNAがGAPDHによって測定された。図1（c）は、SALL4ペプチド抗体によって識別されたSALL4タンパク質産物、SALL4A、およびSALL4Bを示す。His-SALL4B（レーン1）、His-SALL4A（レーン2）、または対照ベクター（レーン8）を一過性に発現するCos-7細胞からの溶解液、または異なるヒト組織からの溶解液は10％SDS-PAGEゲルで分解され、ニトロセルロース膜へ移され、N末端SALL4ペプチド抗体で検査された。
（図２）ヒト原発性AMLおよび骨髄性白血病細胞株におけるSALL4の発現を示す。GAPDHに正規化されたSALL4AおよびSALL4BのリアルタイムPCR定量化は、SALL4AとSALL4Bの両方が精製CD34＋細胞において発現されたが、SALL4Aは急速にダウンレギュレーションされ、SALL4Bは正常な骨髄（N＝3）細胞および正常な末梢血（N＝3）細胞で遮断されたことを示した。その一方、15の原発性AML試料および3つの骨髄性白血病細胞株（Kasumi-1、THP-1、およびKG.1）において、SALL4AまたはSALL4B、あるいはその両方の発現は、ダウンレギュレーションされることが出来なかった。その結果は、精製CD34＋細胞におけるSALL4AまたはSALL4Bの発現に対し調整された。
（図３）図3（a〜e）は、SALL4BトランスジェニックマウスがMDSのような／AML表現型を有することを示す。図3（a）は、SALL4Bトランスジェニックマウスの作製を表し、CMV／SALL4Bトランスジェニック構築物およびトランスジェニック系統のPCR分析507を表す。（A）トランスジェニック構築物の系統図。約1.8-kbのSALL4BのcDNAがpCEP4ベクターへサブクローニングされ、CMV／SALL4構築物はSalIでの消化によって励起された。（B）トランスジェニックマウスにおけるSALL4Bの組織分布。RT-PCR増幅に使用されるプライマーの位置は、パートAの矢印によって示される。C末端でヒトSALL4Bに対して特異的なプライマーは5’プライマーとして使用され、様々な組織のRT-PCRのためのSV40-非コード配列特異的プライマーと組み合わされる。図3（b）は、SALL4BトランスジェニックマウスにおけるAMLのフローサイトメトリー分析を示す。AML細胞はCD45、c-kit、Gr-1、およびMac-1に対して陽性であり、B220、CD3、およびTer119に対して陰性であった。図3（c）は、SALL4Bトランスジェニックマウスと対照マウスの骨髄の比較を示す。SALL4Bトランスジェニックマウスの骨髄は、対照WTマウスに比べ、増加した細胞質、骨髄集団（Gr-1／Mac-1二重陽性）、未熟集団（c-kit陽性）、およびアポトーシス（アネキシンV陽性、PI陰性）を示した。図3（d）は、SALL4BトランスジェニックマウスからのCFUにおいて未熟細胞およびアポトーシスの増加があることを示す。培養の7日目に、対照CFUにおいてよりも、より多くの数の未熟細胞（B、C、およびD、赤矢印）とアポトーシスを起こした細胞（B、C、およびD、二重赤矢印）がトランスジェニックマウスCFUにおいて、認められた（A）。形態学的観察に一致し、アポトーシス（アネキシンV陽性、PI陰性、E）およびより多くのCD34＋未熟細胞の増加があった（F）。図3（e）は、SALL4Bトランスジェニックマウスと対照マウスの骨髄CFUの比較を示す。SALL4Bトランスジェニックマウスと対照マウスのCFU分析において発見された異なる種類のコロニーの割合（A）。SALL4BトランスジェニックマウスからのCFUは、対照マウスに比べ、統計的に、CFU-GMでの顕著な増大（B）（トランスジェニック：53.6±10.3、N＝13vs. WT：38.1±3.1、N＝8；P＝0.002）を示し、BFU-Eでの減少（トランスジェニック：7.8±3.8、N＝13vs. WT：14.1±2.7、N＝8；P＝0.001）を示した。
（図４）図4（a〜c）は、SALL4とWnt／βカテニンシグナル伝達経路の相互作用を実証する。図4（a）は、SALL4AとSALL4Bの両方がβカテニンと相互作用することを示す。Cos-7細胞から作られた核抽出物（溶解液）は、一過性にHA-SALL4AまたはHA-SALL4Bでトランスフェクトされた。（A）抗HA抗体SALL4A（165kDa）とSALL4B（95kDa）の両方を認識した。（B）βカテニンは溶解液で検出された。（C）免疫沈降がHA親和性樹脂を使用して実施され、抗βカテニン抗体で検出された。βカテニンはすぐにHA-SALL4AとHA-SALL4Bプルダウンの両方で検出された。図4（b）は、SALL4AとSALL4Bの両方によるWnt／βカテニンシグナル伝達経路の活性を示す。NIH3T3細胞は1.0μgのSALL4AプラスミドまたはSALL4Bプラスミドのいずれか、およびトップフラッシュレポータープラスミドでトランスフェクトされた（Upstate USA、Chicago、IL）。Wnt1またはmockでの24時間の刺激後、ルシフェラーゼ活性が測定された。図4（c）は、作業仮説を示す。SALL4はヒト幹細胞／前駆細胞に発現するが、正常な造血中、成熟造血性細胞においては発現しない。SALL4アイソフォームの構成的発現（SALL4遮断の不全）は、白血病性形質転換（＋、SALL4発現有り；−、SALL4発現無し）を引き起こす、幹細胞プールの異常拡大を伴う分化の阻害および構成的再生をもたらす。
（図５）SALL4BのOCT4プロモーターへの用量依存効果を示す。0.3μgのOCT4-Luc構築物（PMOct4）を、0.1μgのレニラプラスミドを用いてコトランスフェクトし、SALL4BまたはpcDNA3ベクター対照の量（0〜1.0μg）を増加した。
（図６）OCT4のSALL遺伝子ファミリーメンバープロモーターへの効果を示す。各（0.3μg）SALL-Lucプロモーター構築物（すなわち、pSALL1、pSALL3、およびpSALL4）は、0.9μgのOCT4またはpcDNA3ベクター対照を用いて、HEK-293細胞にコトランスフェクトされた。24時間のトランスフェクション後、ルシフェラーゼ活性を各群で評価した。
（図７）SALL4アイソフォームAおよびBの、SALL4プロモーター活性への効果を示す。0.3μgのSALL4-Lucが、異なるT細胞系統（HEK-293またはCOS-7）においてプラスミドを発現する、0.1μgのSALL4AまたはSALL4Bのいずれかを用いてコトランスフェクトされ、pcDNA3ベクターは対照として使用された。ルシフェラーゼ活性は、レニラレポーター活性に対して標準化された。値は、3つの実験の±s.e.平均値を表す。
（図８）SALL4プロモーター活性へのSALL4Aの用量依存効果を示す。HEK-293細胞に、0.3μgのSALL4-Lucを、0.1μgのレニラプラスミドを用いてコトランスフェクトし、SALL4A構築物および対照pcDNA3ベクターの割合を増加した。ルシフェラーゼ活性は、レニラレポーター活性に対して標準化された。
（図９）SALL4のSALL1およびSALL3プロモーター活性への効果を示す。各（0.3μg）SALL-Lucプロモーター構築物は、HEK-293細胞に、0.9μgのSALL4AプラスミドまたはpcDNA3ベクター（対照）を用いて一過性にコトランスフェクトされた。
（図１０）過剰SALL4Aの存在下での、OCT4のSALL4プロモーターへの効果を示す。0.25μgのSALL4-Luc構築物（pSALL4）を、HEK-293細胞に、同量（0.5μg）のSALL4AおよびOCT4プラスミドを用いて一過性にコトランスフェクトした。pcDNA3は対照として使用された。
（図１１）SALL4の存在下での他のSALLメンバープロモーターに対するOCT4の効果を示す。HEK-293細胞を24ウェルプレートに蒔き、異なるSALLメンバープロモーターレポーター（pSALL1またはpSALL3）ならびにOCT4プラスミドおよび／またはSALL4A構築物を一過性にコトランスフェクトした。pcDNA3は対照として使用した。
（図１２）その他のSALLタンパク質ファミリーメンバーについてのプロモーター活性に対する自己プロモーター相互作用の効果を示す。HEK-293細胞を24ウェルプレートに蒔き、以前にSALL1プロモーターを活性化させることが認められた、様々な量のSALL1プラスミド（0.45および0.9μg）SIX1を用いて、0.3μgのSALL1-Lucレポーター構築物を、一過性にトランスフェクトまたはコトランスフェクトし、陽性対照として使用した。ルシフェラーゼ活性は、レニラレポーター活性に対して標準化した。
（図１３）SALL4が、Oct4およびNanogならびにそれらのネットワークに対する遺伝子と結合することを示している。（A）公開データとの比較は、SALL4がOct4およびNanogの結合位置に共通する遺伝子と結合することを示している。（B）および（C）SALL4、Oct4およびNanogに関するウエスタンブロット。これらは、これらの3種のタンパク質が、ES細胞における多能性を維持するために共同して働くことを示唆する。
（図１４）SALL4が多能性を維持するように機能することを示している。（A）ChIP-チップ中に結合された4種の細胞系列のそれぞれに関する多能性マーカーとして同定された遺伝子。（B）リアルタイムPCRを用いて、本発明者らはSALL4シャットダウン後に多能性に関するさまざまなマーカーのmRNAレベルを分析した。mRNAのレベルは内胚葉、外胚葉および栄養外胚葉のマーカーに関して上昇し、このことはSALL4がこれらの細胞系列への分化を抑制することを指し示している。
（図１５）SALL4がPRC1およびPRC2の下流標的と結合することを示している。（A）PRC1およびPRC2の調節機構をより良く例証するために、本発明者らはSALL4、Rnf2およびSuz12によって結合される転写因子を比較した。例えば、Suz12は固有な転写因子を2つのみ有し、他のものをRnf2、SALL4、またはSALL4およびRnf2の両方と共有している。（B）SALL4によって結合される発生上重要な遺伝子の表示。これには、HOX（ホメオボックスタンパク質）、PAX（ペアードボックス）、DLX（distal-lessホメオボックス）、SIX（sine oculisホメオボックス相同体）、RBX（生殖性ホメオボックス）、H6（H6ホメオボックス）、OBX（卵母細胞特異的ホメオボックス）、LHX（LIMホメオボックス）、FBX（F-ボックス）、FOX（forkheadボックス）およびTBX（T-ボックス）ファミリーの複数のメンバーが、さまざまな他の発生遺伝子ともに含まれる。
（図１６）SALL4が、H3K4およびH3K27に関連するメチル化イベントを調節することを示している。
（図１７）SALL4が、細胞運命の決定のために極めて重要なシグナル伝達経路と結合することを示している。（A）SALL4はさまざまな経路に属する遺伝子プロモーターと結合し、本発明者らはそれがこれらの経路において調節的役割を果たすことを示唆する。（B）SALL4によって結合される経路の定量的表示。値は、経路において直接的に、または経路の下流標的として結合される遺伝子を反映している。（C）Wnt／β-カテニンシグナル伝達経路を用いて、本発明者らはカノニカル経路に対するSALL4シャットダウンの影響を示している（緑は発現のダウンレギュレーション、赤はアップレギュレーションである）。
（図１８）SALL4BトランスジェニックマウスにおけるHSCおよびHPCの増大（expansion）が疾患進行と相関したことを実証している。SALL4Bトランスジェニックマウスにおけるc-kit陽性HSC／HPCの増加は、c-kit陽性細胞が総骨髄細胞のおよそ6.5＋2.5％であったWT対照マウスとは対照的であった。この集団はプレ白血病（MDS）SALL4Bトランスジェニックマウスで増加しており、白血病性SALL4B骨髄ではさらにより顕著となった。
（図１９）SALL4BトランスジェニックマウスにおけるLSCを示している。SALL4Bトランスジェニックマウスからの全骨髄を、HSC、CMP（骨髄系共通前駆細胞）、GMP（顆粒球／マクロファージ前駆細胞）およびMEP（巨核球／赤血球前駆細胞）に選別し、続いて一次NOD-SCIDレシピエントに移植した。一次レシピエントが白血病を発症した後に、それらの骨髄細胞をHSC、CMP、GMPおよびMEPに選別して、二次NOD-SCIDレシピエントに移植した。WT NOD-SCIDマウス、一次白血病NOD-SCIDレシピエントおよび二次白血病NOD-SCIDマウスの骨髄由来のHSCおよびHPCの代表的なFACS染色プロフィールは、GMP細胞が白血病移植の過程で実質的に増加したことを示している。白血病SALL4Bトランスジェニックマウスおよび白血病NOD-SCIDレシピエントにおけるHSCの増加はさまざまであった。
（図２０）SALL4抑制性NB4におけるカスパーゼ-3活性、細胞周期および細胞DNA合成を示している。AおよびD、対照レトロウイルスが形質導入されたNB4。BおよびE、SALL4 siRNAレトロウイルスが形質導入されたNB4細胞；CおよびF、Bmi-1を異所性に発現させることによるBmi-1の復旧。SALL4のsiRNAシャットダウンがNB4細胞におけるアポトーシスを誘導することを示している証拠（AおよびB）。SALL4シャットダウンNB4細胞をアポトーシスからレスキューすることができる（C）。BrdU取り込みアッセイおよびFACS（3％のバックグラウンド残渣は除外）の両方によってNB4およびSALL4シャットダウンNB4細胞における細胞周期変化および細胞DNA合成をモニタリングする。SALL4ノックダウンは細胞周期停止を誘導し、DNA合成を増加させた（DおよびE）。Bmi-1を異所性に発現させることにより、SALL4シャットダウン細胞を細胞周期停止およびDNA合成からレスキューすることができる（F）。SALL4の異なる領域を標的とする2つのsiRNAレトロウイルス構築物を作り、それらがNB4細胞におけるSALL4 mRNAを減少させる能力をQ-RT-PCRによって確かめた。どちらのSALL4 siRNA構築物においても、SALL4のダウンレギュレーションはBmi-1レベルも有意に低下させた。
（図２１）5-アザシチジン（5AC）による処置が、SALL4およびその下流標的であるBmi-1を有意に抑制するが、腫瘍抑制遺伝子p16INK4aの発現は増加させることを実証している。5AC処置の48時間後に、Bmi-1およびSALL4の発現の、それぞれ約50〜95％および64〜98％という用量依存的な様式での顕著なノックダウンが観察された。その反対に、p16INK4A mRNA発現は非処置対照と比べて5〜6倍に有意に増加した。
（図２２）HEK293細胞におけるSALL4によるBmi-1プロモーターの用量依存的な活性化を示している。0.25μgのBmi-1-Luc構築物を、0.04μgのウミシイタケ（Renilla）ルシフェラーゼプラスミドおよび種々の割合のSALL4AまたはSALL4B発現構築物のいずれかとともにコトランスフェクトした；pcDNA3を対照として用いた。データは、3回の独立した実験の平均を表している。これらのトランスフェクション実験には32D細胞でもHL60細胞でもなくHEK-293細胞を用いたが、それはこれらの造血細胞が低いトランスフェクション効率を示したためである。
（図２３）ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイによるBmi-1プロモーター領域内部のSALL4機能部位のマッピングを示している。HEK-293細胞において、0.3μgの種々の長さのBmi-1-Luc構築物を、0.04μgのウミシイタケルシフェラーゼプラスミドおよび0.9μgのSALL4AまたはSALL4Bプラスミドのいずれかとともにコトランスフェクトした。ΔP1254およびΔP683は、-270〜-168配列が欠失したBmi-1突然変異体プロモーター構築物-1254または-683のことを指す。（A）Bmi-1プロモーターの欠失構築物、およびSALL4AまたはSALL4Bのいずれかによって刺激されたそれらの対応するプロモーター活性。（B）-1254および-683またはΔp1254およびΔP683 Bmi-1プロモーター構築物のSALL4AおよびSALL4Bによる刺激。
（図２４）SALL4が内在性マウスBmi-1プロモーター（-450〜1+）と特異的に結合することをChIPアッセイを用いて示している。（A）Bmi-1プロモーターに対して特異的なプライマーセットの略図。（B）チップアッセイを、HAに対する抗体（レーン+）または免疫前血清（レーン-）を用いることによって行った；富化（enriched）クロマチンを、Aに示したようなプライマーを用いるPCRによって分析した。（C）HAがタグ付加されたSALL4アイソフォームまたは対照pcDNA3をトランスフェクトした32D細胞におけるBmi-1プロモーター領域の相対的富化。チップアッセイはHA抗体を用いて行った。アンプリコンをQ-PCRによって定量した。内在性SALL4も、ヒトBmi-1プロモーターと、SALL4抗体を用いてヒトHEK-293細胞、白血病細胞系およびNB4で見られるのと同じ位置で結合した。
（図２５）内在性Bmi-1発現レベルの影響を示している。（A）白血病細胞におけるsiRNAを介したSALL4抑制：SALL4遺伝子の位置890、1682および1705をそれぞれ標的とする3つのsiRNAオリゴヌクレオチドを、pSUPERレトロウイルスベクター中にクローニングした；PT67パッケージング細胞をトランスフェクトし、HL-60細胞に感染48時間後に収集したウイルスを感染させた。安定な感染細胞をG418選択の下で収集した。全RNAをTrizolによって抽出し、RT PCRを行って、標的遺伝子mRNAの相対量を分析した。非感染細胞におけるSALL4／GAPDH比は1に設定した；値は2つずつの反応の平均である。バーはSDを指し示している。（B）SALL4+/-ヘテロ接合型骨髄細胞は、Bmi-1発現レベルの低下を示した。SALL4+/-およびSALL4+/+マウスから骨髄細胞を単離した。SALL4およびBmi-1の発現レベルを分析するためにQRT PCRを行った。値は2つずつの反応の平均である。（C）SALL4BトランスジェニックマウスにおけるBmi-1のアップレギュレーションは疾患進行と関連していた。RT-PCR分析を、（1）2匹のWT対照マウス（レーン1、2）および2匹のプレ白血病トランスジェニックマウス（レーン3、4）由来の総骨髄細胞、ならびに（2）2匹の白血病トランスジェニックSALL4Bマウス由来の白血病性骨髄細胞（レーン5、6）に対して行った。
（図２６）ヒトAML芽（AML blast）試料におけるBmi-1およびSALL4のmRNA発現が、Bmi-1およびSALL4の発現の間で強い相関を示したことを実証している。12個のランダムに選択した芽球性AML試料を、Bmi-1およびSALL4遺伝子の相対的mRNA発現を発現強化について定量するために、RT PCRを用いて分析した。12個のAML試料のうち10個が、平均した正常対照（正常）を基準として1.10倍〜22.32倍の範囲にわたる有意なBmi-1遺伝子増幅を示した。興味深いことに、12個のAML試料のうち同じ10個は、平均した正常対照を基準として3.93倍〜653.03倍の範囲にわたるSALL4遺伝子発現増幅の増加も示した。ログ10スケール（Log 10 scale）は、関心対象の遺伝子の相対的数量を表している。12個のAML試料に関するデータを用いて、本発明者らは統計分析を行い、相関係数が0.703でp値が0.0159であることを決定した。
（図２７）SALL4が内在性マウスBmi-1プロモーター（-450〜1+）と特異的に結合して、ヒストン3のリジン4およびリジン79のメチル化を結果的にもたらすことを、クロマチン免疫沈降（ChIP）アッセイを用いて示している。富化クロマチンを、図3Aに示したプライマーを用いるPCRによって分析した。図6Aおよび6Bは、HAをタグ付加したSALL4Aまたは対照DNAであるpcDNA3をトランスフェクトした32D細胞における、それぞれBmi-1プロモーター領域上のH3-K4およびH3-K79のヒストン3トリメチル化レベルの分布である。ChIPアッセイは、ヒストンH3-K4トリメチル化抗体（A）およびヒストンH3-K79メチル化抗体（B）を用いて行った。アンプリコンをQ-PCRによって定量した。実験を3回ずつ反復したところ、同様の結果が得られた。
（図２８）NTERA2細胞の分化の過程でSALL4発現が低下することを示している。（A）胎生期癌細胞系においてレチノイン酸を用いて分化を誘導した。これらの細胞の分化状態を決定するために、系列特異的な細胞分化を表すマーカーを分析するためのQ-RT-PCRを行った。NTERA2細胞のレチノイン酸誘導（5μM）は、一団の外胚葉マーカーのアップレギュレーションを結果的にもたらした。加えて、いくつかの内胚葉遺伝子、中胚葉遺伝子および栄養外胚葉遺伝子もアップレギュレートした。（B）レチノイン酸で誘導した分化の後に、種々の濃度のレチノイン酸で処置したNTRA2細胞におけるSALL4発現は非処置NTERA2細胞と比較して有意に低下する。
（図２９）SALL4ノックダウンによる内在性Bmi-1発現レベルおよび細胞分化の影響を示している。（A）SALL4ノックダウン後の相対的内在性Bmi-1およびSALL4発現レベルを示している。SALL4遺伝子の異なる領域を標的とする2つのsiRNAオリゴヌクレオチド（#7410、#7412）をPT67パッケージング細胞にトランスフェクトする。NTERA2細胞を、トランスフェクション48時間後に収集したウイルスに感染させる。全RNAを抽出し、標的遺伝子mRNAの相対量を分析するためにQ-RT-PCRを行う。非感染細胞におけるSALL4／GAPDH比を1に設定する。値は2つずつの平均であり、バーは標準偏差を指し示している。B、NTERA2細胞分化に対するSALL4ノックダウンの影響。SALL4 siRNA
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ウイルス感染後のNTERA2細胞における幹細胞マーカー遺伝子の定量的PCR分析は、原始胚葉マーカーが全く検出されなかったことを示している。
（図３０）NTERA2細胞およびSALL4が欠失したNTERA2細胞におけるカスパーゼ-3活性の代表的なFACSデータを示している。SALL4のsiRNAシャットダウンがNTERA2細胞におけるアポトーシスを誘導することを示している証拠（AおよびB）。Bmi-1を過剰発現させることにより、SALL4シャットダウン細胞をアポトーシスからレスキューすることができる（C）。しかし、Bmi-1の過剰発現はWT NTERA2細胞におけるカスパーゼ3活性に対してはほとんど影響を及ぼさなかった（D）。
（図３１）BrdU取り込みアッセイおよびFACSの両方による、SALL4が欠失したNTERA2細胞およびNTERA2細胞においてモニタリングした細胞周期変化および細胞DNA合成を示している。SALL4ノックダウンは細胞周期停止を誘導し、DNA合成を増加させた（AおよびB）。Bmi-1を異所性に発現させることによってSALL4シャットダウン細胞を細胞周期停止およびDNA合成からレスキューすることはできるが（C）、対照ベクターはそれをしなかった（非提示データ）。Bmi-1の過剰発現は野生型NTERA2細胞における細胞周期停止およびDNA合成増加に対してほとんど影響を及ぼさなかった（D）。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
発明の詳細な説明
本発明の組成、方法および培養方法の説明に先立って、本発明は特定の組成、方法、および実験方法に限定されず、そのような組成、方法および状態は変化してもよいことを理解されたい。また本願において使用される専門用語は、特定の態様のみを説明するためのものであり、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲でのみで限定されるため、限定することを意図しないということも理解されたい。
【００４６】
本願および添付の特許請求の範囲で使用される、単数形「1つの（a、an）」および「その（the）」は、その文脈が明記しない限り、複数照応的指示を含む。つまり、例えば、「核酸」の言及は、1つ以上の核酸、および／または本開示などを読む際に、当業者には明らかである、本願に記載の種類の組成物を含む。
【００４７】
別途定めのない限り、本願で使用される全ての技術用語および専門用語は、本発明の属する技術分野において通常の技術を有する者にはよく知られているような意味を有する。本願に説明されるものと類似のまたは同じである全ての方法および物質は、本発明の実施または試験において使用されるが、修正および変更が本開示の趣旨と範囲内に含まれるということが理解されるだろう。本願に記載されるすべての刊行物はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００４８】
SALL4は、C2H2ジンクフィンガー転写因子のファミリーのメンバーである。SALL4は最初に、ショウジョウバエsplatに対するその相同性に基づいてクローニングされた。ショウジョウバエでは、salはホメオティック遺伝子であり、後頭セグメントおよび前尾セグメントの発生に必須である。ヒトでは、常染色体優性突然変異が、複数の臓器系における欠陥を引き起こすオキヒロ症候群（Duaneラジアルレイ（radial ray）症候群とも呼ばれる）に関連している。SALL4遺伝子における突然変異は、多くの動物モデルにおける発生を著しく妨げる。
【００４９】
SALL4は、Oct4およびBmi-Iを含む主要な調節タンパク質との相互作用を通じて、胚性幹細胞（ESC）の多能性を調節するように思われる。
【００５０】
Bmi-1は、ホメオティック遺伝子のリプレッサーとしてショウジョウバエで最初に同定されたポリコーム群（PcG）タンパク質のメンバーである。ヒトでは、ポリコーム遺伝子Bmi-1は、成体の自己再生性の造血幹細胞（HSC）および白血病幹細胞（LSC）の調節において必須な役割を果たす。Bmi-1は精製HSCで高度に発現され、その発現は分化に伴って低下する。マウスにおけるBmi-1遺伝子のノックアウトは、すべての造血系列の進行性喪失を結果的にもたらす。この喪失は、Bmi-1（-/-）幹細胞が自己再生する能力を持たないことに起因する。加えて、Bmi-1（-/-）細胞は、細胞周期阻害遺伝子p16INK4aおよびp19ARFの発現の変化も呈する。Bmi-1の発現は白血病細胞の蓄積において重要であるように思われる。興味深いことに、Bmi-1を欠失させることによって腫瘍幹細胞における自己再生を阻害することで、白血病再発を予防することができる。最近、Bmi-1の発現は、MDSの発症およびAMLへの疾患進行を予測するための重要なマーカーとして用いられている。
【００５１】
短鎖干渉性RNAを用いたSALL4発現のノックダウンはESCを栄養芽細胞系列に分化させるが、このことは多能性を維持するためにはSALL4が発現されなければならないことを実証している。さらに、SALL4は初期胚発生の過程で内部細胞塊がエピブラストおよび原始内胚葉に分化するためにも必要であるように思われる。SALL4タンパク質の発現は、骨髄を含むさまざまな臓器系における幹細胞および前駆細胞集団とも相関づけることができる。ヒトのオキヒロ症候群は、遺伝的背景に依存する異なる幹細胞または前駆細胞プールの早期枯渇に起因する可能性がある。
【００５２】
胚性幹細胞は、それらの再生能力および疾患治療法における使用の可能性のために、科学研究の焦点となっている。幹細胞は、胚発生の過程で3つの胚葉（外胚葉、中胚葉および内胚葉）のすべてを生じさせることが示されており、これはそれらの多能性能力を強く示している。ES細胞を司る細胞機構は、それが適正な発生のために必要な分化シグナルおよび多能性維持シグナルを調節することから、それらの機能にとって極めて重要である。
【００５３】
ES細胞は、発生中の胚の内部細胞塊（ICM）に由来する。この決定的な時期の間に、ES細胞の多能性は、Oct4、Sox2およびNanogによって、さらには2種のポリコーム抑制複合体（PRC）：PRC1およびPRC2を通じて調節される。SALL4はES細胞の増殖および多能性を司る上で極めて重要な役割を果たす。例えば、胚性内胚葉ES細胞をSALL4の欠損した胚盤胞（blastocyts）から樹立することはできない。SALL4は初期胚の細胞および生殖細胞によって発現され、Oct4およびSox2の両方と類似した発現パターンを呈する。このことは、SALL4が、ES細胞の多能性の維持と関連づけられている遺伝子のネットワークの調節因子である可能性を示唆する。
【００５４】
ホメオボックスおよびホメオティック遺伝子は正常な発達において重要な役割を果たす。ホックスやパックスのような、一部のホメオボックス遺伝子は腫瘍遺伝子としてまたは腫瘍形成または白血病誘発における腫瘍抑制因子としても機能する。ヘテロ接合SALL4変異がデュアン放射線症候群を引き起こすことから、ヒトの発達における、ホメオティック遺伝子および転写因子であるSALL4の重要な役割が認められた。関連する態様では、白血病誘発におけるSALL4の発がん性の役割が本願で説明される。
【００５５】
一態様では、本開示は2つのSALL4アイソフォームであるSALL4AおよびSALL4Bを識別する。関連する態様では、本開示は、SALL4の核酸およびタンパク質の構成的発現に関連する血液悪性腫瘍およびその他の腫瘍等の増殖障害を有する患者を診断および治療するための手段としてのSALL4の核酸およびタンパク質の分析を提供する。関連する態様では、SALL4は、がんの診断および治療のための悪性幹細胞マーカーをして機能する。
【００５６】
例えば、正常な造血中に、SALL4アイソフォームはCD34＋HSC／HPC集団において発現され、正常なヒトの骨髄および末梢血において急速に遮断（SALL4B）またはダウンレギュレーションされる（SALL4A）。その一方、SALL4は検査されたすべてのAML試料（N＝81）においては構成的に発現され、ヒト原発性AMLおよび骨髄性白血病細胞株においては停止することが出来なかった。関連する態様では、体内でのSALL4の構成的発現の白血病誘発可能性がSALL4Bトランスジェニックマウスの作製を通じて直接検査された。そのようなトランスジェニックマウスは、ヒトMDSに酷似した、調節不全な造血を示し、移植可能なAMLを示した。これらのSALL4BトランスジェニックマウスにおけるMDSのような特性は、協同突然変異を必要とせず、早くて2ヶ月齢で見られる。これらのマウスで見られた無効造血は、ヒトMDSにおける無効造血のように、骨髄において顕著であるアポトーシスの増加に高い確率で続発する過形成骨髄および奇異性末梢血血球減少（好中球減少および貧血）および形成不全症を特徴とする。学説にとらわれないが、これらのトランスジェニックマウスにおける白血病発達の遅い発現の理由は?8ヶ月の複製ストレスの間の追加的な遺伝子損傷の蓄積でありうる。疾患の後期発症はSALL4導入ゲノム不安定性の結果でもありうる。
【００５７】
さらに、特定の、再発性の染色体転座は多くの白血病を特徴付け、それらは免疫グロブリンまたはT細胞受容体の遺伝子再配列の正常なプロセスにおける分解に起因するが、正常な染色体内再配列よりも染色体内転座を引き起こす。染色体転座切断点の遺伝子からタンパク質への遺伝子情報の流れは、治療剤が抑制することの出来るいくつかの点を有する。ジンクフィンガー結合タンパク質領域を有効利用する配列特異的結合因子は、異常遺伝子の融合産物の発現を停止させる染色体融合結合を標的化することの出来る遺伝子スイッチとして作用する、デノボ配列特異的結合因子を作り出すために使用されることが出来る。
【００５８】
一態様では、SALL4は、遺伝子融合産物の発現を調節する遺伝子スイッチとして染色体融合結合を標的とする融合タンパク質の構成要素として使用されることが出来る。組換え融合タンパク質の生成は当技術分野において既知である（例、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed. ；Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.（1989）を参照）。
【００５９】
一態様では、SALL4のタンパク質および／または核酸は、リンパ腫および白血病の亜集団またはその他のタイプのがんを診断するために検出される。他の態様では、SALL4のタンパク質および核酸の検出は、増殖性疾患を発病する／もたらす危険性のあるヒト対象を含むがそれらに限定されない対象を識別するために使用されることが出来る。
【００６０】
さらなる態様では、SALL4のタンパク質レベルおよび核酸レベルを変化させる化合物を識別する方法が開示される。関連する態様では、SALL4は、SALL4の阻害機能が、腫瘍の発達と進行を抑制する、治療標的として機能することが出来る。
【００６１】
他の態様では、白血病誘発へ関与するSALL4の潜在的機序の検査は、SALL4AとSALL4Bの両方が、HSCの自己複製を含む、Wntシグナル伝達経路に不可欠な構成要素であるβカテニンと相互作用することを示す。さらに、両方ともが、レポーター遺伝子アッセイにおいてWnt／βカテニン経路を活性化することができ、ショウジョウバエおよびヒトにおけるSALLファミリーの機能に一致する。さらには、βカテニンの状況と同様に、CMLにおけるSALL4発現は疾患の様々な段階で変化し、慢性期にないSALL4発現は未熟な芽球の加速期でのみ検出可能になり、芽球期において強く陽性である。
【００６２】
これらの研究に基づいて、作業仮説が開示される（例、図4d参照）。学説にとらわれないが、AMLにおけるSALL4の構成的発現は、白血病性芽球が自己複製および／または脱分化等の幹細胞特性を得ることを可能にする可能性があり、こうして、LSCになることが出来る。本仮説モデルはβカテニンの場合に見られるものに匹敵するであろう。例えば、正常な骨髄造血において、βカテニンは、自己複製特性を示すHSCにおいてのみ活性化される。CMLの芽球期において、βカテニンは、GMPにおいて活性化されることによって機能し、白血病性形質転換をもたらす。
【００６３】
他の態様では、がん遺伝子SALL4は、正常な造血および白血病誘発において重要な役割を果たす。SALL4Bトランスジェニックマウスは、移植可能な続発性のAML変換を伴う、MDS様表現型を示す。ヒトMDSの研究に利用可能な動物モデルは、現在ほとんどない。本願に説明される方法によって作製されたSALL4Bトランスジェニックマウスは、モデルヒトMDSおよびそのAMLへの続発性の変換の理解と治療のための適した動物を提供する。SALL4とWnt／βカテニンシグナル伝達経路との相互作用は、白血病誘発におけるSALL4の関与の説得力あるメカニズムを提供するのみだけでなく、CML芽球化転換におけるWnt／βカテニンシグナル伝達経路の活性化の理解を提供する。
【００６４】
本願に開示されるように、すべてのヒトAMLにおけるSALL4アイソフォームの識別とそれらの構成的発現が検査された。AMLにおけるSALL4発現の直接の影響が生体内で検査された。本開示は、マウスにおけるSALL4の構成的発現が、MDSのような症状や移植可能なAMLへの変換を誘発するのに十分であることを実証する。本開示はさらに、SALL4がβカテニンを結合してWnt／βカテニンシグナル伝達経路を活性化することが出来ることを実証する。SALL4およびβカテニンは、CMLの様々な段階において類似の発現パターンを共有する。
【００６５】
一態様では、SEQ ID NO：2（GenBankアクセッション番号AAO44950）、SEQ ID NO：4（GenBankアクセッション番号AAO16566）、またはSEQ ID NO：6（GenBankアクセッション番号AAO16567）に示されるアミノ酸配列をコードする配列を含む、単離ポリヌクレオチドが提供される。関連する態様では、そのような配列は、SEQ ID NO：1（GenBankアクセッション番号AYl72738）、SEQ ID NO：3（GenBankアクセッション番号AY170621）、SEQ ID NO：5（GenBankアクセッション番号AY170622）、またはそれらの補体に示される核酸配列を含む。もう1つの関連する態様においても、そのようなポリヌクレオチドを含むベクターが開示され、それらは、宿主細胞においてポリヌクレオチドの発現を導く調節配列に操作可能に関連する発現ベクターを含むが、それらに限定されるものではない。
【００６６】
他の態様では、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、またはSEQ ID NO：6に示されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドが開示される。一形態において、そのようなポリペプチドを投与する段階を含む、個々における骨髄異形成症候群（MDS）の治療の方法が提供される。他の態様では、そのようなポリペプチドに結合する抗体またはそれらの結合フラグメントも開示される。
【００６７】
開示される方法に使用される抗体は、SALL4または、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、またはSEQ ID NO：6に示されるそれらのアイソフォームを含むポリペプチドを特異的に結合する抗体を含む。一形態においては、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、またはSEQ ID NO：6のフラグメントが使用されそのような抗体を生成する。関連する態様では、そのようなフラグメントはSEQ ID NO：13から基本的に構成される。
【００６８】
一態様では、潜在的多能性を有する細胞を識別する方法が開示され、該方法は内部細胞塊（ICM）から単離された細胞、腫瘍性組織からの細胞、または腫瘍からの細胞を、SALLファミリーメンバータンパク質の発現を検出する作用物質に接触させる段階と、SALLファミリーメンバータンパク質が、細胞において発現するかどうかを判定する段階とを含み、SALLファミリーメンバータンパク質の発現を判定する段階は、細胞における自己複製の誘導に正に相関し、それによって、そのような発現は多分化能を示す。
【００６９】
一形態において、SALLファミリーメンバーはSALL1、SALL3、およびSALL4を含む。関連する態様では、SALL4はSALL4AまたはSALL4Bである。
【００７０】
他の態様では、作用物質はSALLファミリーメンバータンパク質に対するまたはSALLファミリーメンバータンパク質をコードするmRNAに相補的な核酸に対する抗体である。関連する態様では、そのSALLファミリーメンバータンパク質配列はSEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：22、およびSEQ ID NO：24を含む。もう1つの関連する態様において、核酸はSEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：21およびSEQ ID NO：23を含む核酸配列のセンス鎖に相補的である。
【００７１】
一形態において、細胞は、胚性幹（ES）細胞、または胎生期癌（EC）細胞、成体幹細胞、がん幹細胞である。関連する態様では、その組織は対象由来の血漿試料または生検試料である。さらなる関連する態様では、対象はヒトである。
【００７２】
本明細書で用いる場合、「始原細胞」とは、個体または臓器の成長において最初に、または最も早期に形成される細胞を意味する。
【００７３】
本明細書で用いる場合、「前駆細胞」とは、一連の細胞分裂によってある独特な細胞系列を生じる親細胞を意味する。
【００７４】
本願に使用される、「潜在的多能性」とは有糸分裂によって自己複製する細胞の能力を意味する。
【００７５】
本願に使用される「正に相関する」とは、認められた現象に肯定的に関連することを意味する。例えば、SALL4AまたはSALL4B導入は細胞の自己複製力の増大に関連する。
【００７６】
本願に使用される、「新生物」とは、その文法的な変化形を含み、良性またはがん性である可能性のある、組織の新しい異常な成長を意味する。
【００７７】
本願に使用される、「基本的に構成される」とは特異的な分子実体（例えば、特異的な配列識別子などを含むがそれらに限定されない）および、特異的な分子実体に関連する特性に物質的には影響しないその他の分子実体を含む。例えば、SEQ ID NO：13を含む融合タンパク質、およびアジュバントは、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、および／またはSEQ ID NO：6に対する免疫原性反応を生じるため、SEQ ID NO：13から基本的に構成される。
【００７８】
抗体は当技術分野において既知であり、例えば、米国特許第6,391,589号で論じられる。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体、一本鎖抗体、Fabフラグメント抗体、F（ab'）フラグメント抗体、Fab発現ライブラリによって作製されたフラグメント、抗イディオタイプ（anti-Id）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗イディオ抗体などを含む）、および上記すべてのエピトープ結合フラグメントを含むが、それらに限定されるものではない。本願に使用される「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、免疫特異的に抗原を結合する抗原結合部位を含む分子を示す。本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の全てのタイプ（例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、およびIgY）、またはクラス（例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2）、またはサブクラスであることが出来る。
【００７９】
本発明の抗体は、Fab、Fab'およびF（ab'）2、Fd、一本鎖Fvs（scFv）、一本鎖抗体、ジスルフィド架橋Fvs（sdFv）および、VLまたはVH領域のいずれかを含むフラグメントを含む、抗体フラグメントを含むが、それらに限定されるものではない。抗原結合抗体フラグメントは、一本鎖抗体を含むが、可変領域単独または以下のもの、ヒンジ領域、CHl領域、CH2領域、およびCH3領域の全体もしくは一部との組合せであることが出来る。また、本発明において、ヒンジ領域、CHl領域、CH2領域、およびCH3領域との可変領域の組合せを含む、抗原結合フラグメントが含まれる。本発明の抗体は、鳥類および哺乳類を含むいかなる動物起源であってもよい。一形態において、抗体はヒト抗体、マウス抗体（例えば、マウスおよびラットなど）、ロバ抗体、ヒツジ抗体、ウサギ抗体、ヤギ抗体、テンジクネズミ抗体、ラクダ抗体、ウマ、または鶏である。さらに、そのような抗体は、動物抗体のヒト化型である（例、米国特許第6,949,245号などを参照）。本発明の抗体は、単一特異性、二重特異性、三重特異性またはそれ以上の多特異性である。
【００８０】
本発明の抗体は、当技術分野において既知であるすべての適切な方法によって生成されることができる。関心の抗原に対するポリクローナル抗体は当技術分野において既知の様々な過程によって生成されることができる。例えば、本発明のポリペプチドは、ウサギ、マウス、ラットなどを含むが、それらに限定されず、様々な宿主動物に投与され、抗原に特異的なポリクローナル抗体を含む血清の生成させる。宿主動物種によって、免疫反応を高めるための様々なアジュバントが使用され、それらは、フロインド（完全または不完全）、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、リゾレシチンのような界面活性物質、プルロニックポリオール類、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、キーホールリンペットヘモシニアン、ジニトロフェノールならびに、BCG（カルメットゲラン桿菌）またはコリネバクテリウムパルブムのような潜在的に役立つヒトアジュバントを含むが、それらに限定されない。そのようなアジュバントも当技術分野において既知である。さらに、抗体およびタンパク質を結合する抗体のようなものはファージ提示法によって作られる（例、Smith and Petrenko、Chem Rev（1997）97（2）：391-410などを参照）。
【００８１】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、ならびにファージ提示技術、またはそれらの組合せを使用することを含む、当技術分野において既知の様々な技術を使用して、調合されることが出来る。例えば、モノクローナル抗体は、当技術分野において既知であり、例えば、Harlowら、Antibodies：A Laboratory Manual、（Cold Spring Harbor Laboratory Press、2nd ed. 1988）、Hammerlingら、Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681（Elsevier、N.Y.、1981）（参考文献は、参照によって全体が組み入れられる）に教示の方法を含む、ハイブリドーマ技術を用いて作製することが出来る。本願に使用される「モノクローナル抗体」という用語はハイブリドーマ技術を通じて作製される抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」は単一クローンから起因する抗体を示し、全ての真核性、原核生物、またはファージクローンを含み、それが作製される方法を含まない。
【００８２】
一態様では、そのような抗体を使用する、白血病幹細胞を単離する方法が提供され、該方法は、対象から細胞試料を得る段階と、SEQ ID NO：13に示されるアミノ酸配列を発現する細胞を、そのアミノ酸配列を発現しない細胞から選別する段階と、SEQ ID NO：13に示されるアミノ酸配列を発現する細胞の試料から、骨髄表面マーカーによって白血病幹細胞を選び出す段階とを含む。関連する態様では、選別の段階は、蛍光励起細胞選別および／または磁性粒子選別による選別を含む。
【００８３】
1つの局面において、マーカーはCD34、c-kit、Gr-1、Mac-1、MPOおよび／または非特異的エステラーゼである。もう1つの局面において、マーカーはSSEA-1、SSEA-2、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、CD34+、CD59+、Thy1/CD90+、CD38lo/-、C-kit-/lo、lin-、SH2、ビメンチン、過ヨウ素酸シッフ活性（PAS）、FLK1、BAPおよび酸性ホスファターゼである。1つのさらなる関連した局面において、白血病幹細胞はB細胞マーカー（B220およびCD19）、T細胞マーカー（CD4、CD8、CD3およびCD5）、巨核球マーカー（CD41）および赤血球（Ter119）マーカーに関して陰性である。または、マーカーは表1に示されたものを含みうる。
【００８４】
（表１）幹細胞を同定するため、および分化した細胞種を特徴づけるために一般的に用いられるマーカー
2010528620.tif 000005
2010528620.tif 000006
2010528620.tif 000007
2010528620.tif 000008
2010528620.tif 000009
2010528620.tif 000010
【００８５】
一態様では、潜在的多能性を有する細胞を識別するためのキットが開示され、そのキットは1つ以上のSALLファミリーメンバータンパク質マーカーを検出するための作用物質と、作用物質-細胞相互作用および作用物質の標識のための十分な条件を提供するための試薬および緩衝剤と、検出試薬の標識および作用物質の細胞との接触についての説明書と、構成要素を含む容器とを含む。
【００８６】
開示の方法により、SEQ ID NO：13を含むマーカーの発現に陽性である細胞をそうでない細胞から、まず選別することによって、幹細胞を細胞集団から識別する。その後、関心対象の幹細胞を陽性マーカーの細胞から選択し、これは既知の細胞マーカーの発現で細胞を選別することにより実行される。関心対象の幹細胞に関連することで知られる任意のマーカーを使用することが出来る（例えば、表1を参照）。
【００８７】
幹細胞が発見される疑いのあるすべての細胞集団は、開示される方法によって選別されることが出来る。一形態において、細胞は非胎児動物の骨髄から得られ、それらはヒト細胞を含むがそれらに限定されるものではない。胎児細胞も使用することができる。
【００８８】
細胞選別は、蛍光励起細胞選別（FACS）（例えば、Baumgarth and Roederer、J Immunol Methods（2000）243：77-97などを参照）および磁性粒子細胞選別（MACS）による選別を含む、当技術分野において既知の細胞を選別するためのいかなる方法によるものであることが出来る。従来のMACSの過程はMiltenyiら、「High Gradient Magnetic Cell Separation with MACS」、Cytometry11：231-238（1990）によって説明される。MACSによって細胞を選別するには、細胞を磁性粒子で標識し、その細胞を、常磁性分離カラムに通す。分離カラムには強力永久磁石が配置され、カラム内に磁場を作り出す。磁気的に標識された細胞は、カラムに捕捉され、そうでない細胞は、通過する。その後、捕捉細胞をカラムから溶離する。一態様では、SALL4に対して誘導される抗体が胚幹細胞、成体幹細胞および／またはがん幹細胞を単離する細胞選別において使用される。他の態様では、SALL4に対して誘導される抗体はフローサイトメトリー分析で使用され、SALL4を発現する細胞を検出し、そのような細胞は、増殖性疾患の進行または腫瘍性細胞形成に関連する。関連する態様では、SALL4はSALL4AまたはSALL4Bである。
【００８９】
骨髄異形成症候群（MDS）は未だに不治の造血幹細胞（HSC）悪性腫瘍であり続けており、その頻度は高齢者で最も高く、米国では新たな症例が毎年約14,000例存在する。MDS症例の約30〜40パーセントは急性骨髄性白血病（AML）に進行する。MDSの発生率は我々の集団個体の高齢化に伴って増加し続けている。MDSおよびAMLの研究には多大な労力が払われてきたが、今日までに満足のいく治療法は開発されておらず、MDSのAMLへの進行を誘導する正確な細胞的または分子的なイベントは依然としてほとんど解明されていない。ごく最近になるまで、MDSおよびそのAMLへの進行を研究するための適した細胞系も動物モデルも利用可能ではなかった。その結果として、この疾患の分子的基盤の理解に関してほとんど進展は得られておらず、それ故に見込みのある治療的処置の開発は極めて遅くかつ思わしくない。研究社会がMDSおよびAMLの生物学的機構の解明に成功しつつあり、多くの人命を奪っている難治性疾患に対する新たな治療法の開発に突破口を切り開きつつあるものの、革新的アプローチが至急求められている。
【００９０】
現在までのところ、MDSおよびAMLに対する治療法は白血病芽細胞を的に絞っており、その理由は、これらが非常に量が多く、かつ明らかに患者にとって最も緊急な問題であるためである。しかし、ある重要な事実から、ほとんどの他の白血病細胞（「芽」細胞）とは極めて異なる白血病幹細胞（LSC）が関心の的となる。これらのLSCは稀な部分集団を構成している。芽細胞を死滅させることはMDS患者に対して短期的な緩和をもたらしうるが、LSCが破壊されなければそれらは必ず再増殖して患者に再発を引き起こさせると考えられる。MDS疾患に対して永続きする治癒を達成するためには、LSCを破壊することが絶対に必要である。残念ながら、標準的な投薬レジメンはMDSまたはAMLのいずれのLSCに対しても有効でない。この不備に対処するために、本発明者らが提唱した研究における重大な要素は、LSCを特異的に標的とすることのできる新たな治療法の開発に的を絞っている。この目標に向けて、本発明者らは、SALL4幹細胞遺伝子の発現レベルの低下がLSCのアポトーシスを招き、かつ重要なことに正常幹細胞は残存させることを見いだした。
【００９１】
本明細書に開示するように、SALL4は幹細胞の多能性を調節する重要な幹細胞遺伝子（stem gene）である。例えば、SALL4ノックダウンは、Bmi-1の減少を伴う大規模なアポトーシスを結果的にもたらす。SALL4により誘導されるアポトーシスは、Bmi-1を正常レベルに復旧させることによって完全にレスキューすることができる。理論に拘束されるわけではないが、SALL4により誘導されるアポトーシスにはBmi-1の調節が関与しているように思われる。
【００９２】
さらに、本発明は、マウスにおけるSALL4の過剰発現が、Bmi-1のアップレギュレーションによりHSC／HPCをLSCに形質転換させることを実証する。その上、SALL4はBmi-1プロモーターと結合することもできる。1つの態様においては、新生物細胞をSALL4の発現を調節するおよび／またはBmi-1の発現を調節する作用物質と接触させる、アポトーシスおよび細胞周期停止を調節する方法が開示される。1つの局面において、そのような細胞はAML細胞である。もう1つの局面において、調節はSALL4および／またはBmi-1の発現レベルを低下させて、細胞周期停止および／またはアポトーシスを誘導する。1つの関連した局面において、そのような細胞はBmi-1レベルを実質的に正常に復旧させることによってレスキューすることができる。
【００９３】
1つの局面において、アポトーシスおよび細胞周期停止は、SALL4もしくはBmi-1を標的化することによって、またはそれらの組み合わせを標的化することによって達成することができる。もう1つの局面において、アポトーシスおよび／または細胞周期停止の誘導はSALL4下流標的を標的化することによって達成することができる。1つの態様においては、SALL4標的化を介したBmi-1の調節の方法が開示され、そのような調節はがん幹細胞および／または白血病幹細胞におけるアポトーシス／細胞周期停止を結果的にもたらし、それによってそれを必要とする対象におけるがんを治療する。
【００９４】
本明細書に開示するように、SALL4はNTERA2細胞にとって重要な生存増殖因子である。SALL4が他のがん幹細胞にも存在するという観察所見を考慮すれば、SALL4はがん幹細胞にアポトーシスを起こさせる誘導のための魅力ある標的である可能性がある。
【００９５】
1つの態様においては、LSCの増大に伴うMDS／AMLを呈するSALL4Bトランスジェニックマウスが開示される。1つの局面においては、5'アザシチジン（5AC）、またはプロテアソーム阻害薬の1つであるボルテゾミブとの組み合わせを、SALL4Bトランスジェニックマウスに投与して、HSCおよびHPC部分集団における変化をモニタリングする。1つの関連した局面においては、SALL4Bトランスジェニックマウスを種々の用量で処置することが考えられる。さらに、そのデータは、SALL4Bトランスジェニックマウスにおける治療応答に伴ってLSC増大の阻害を最大化する至適用量を同定するために用いられると考えられる。
【００９６】
もう1つの態様においては、5ACを単独でまたはボルテゾミブと組み合わせて投与して、インビトロでのLSCの長期的自己再生能力に対するそれらの影響を一連の再プレーティングアッセイを用いて評価する。1つの局面においては、LSCに対するアポトーシスの影響を、例えば非限定的ではあるがTUNELアッセイおよびカスパーゼ-3活性の測定によって調べることもできる。もう1つの局面において、本方法は、5ACまたはボルテゾミブの単独または併用による処置過程でのトランスジェニックマウスにおける、SALL4B；その下流標的であるBmi-1；ならびにHSCにおける細胞増殖および／または細胞死に関連するその経路、例えばp16およびp19などの発現レベルの変化を、例えばQ-RT-PCRおよびウエスタンブロット法によって決定する。末梢血試料を、5ACまたはボルテゾミブとの組み合わせにより処置したSALL4Bトランスジェニックマウスから、齢を合致させた非処置対照マウスとともに入手する。自動分類（automated differential）を用いた全血球数を毎週決定する。この分類は塗沫標本から確認することができる。さらに、AML形質転換の潜時を、5ACによる、またはボルテゾミブとの組み合わせによる処置を受けたSALL4Bマウスと非処置SALL4Bマウスで比較する。AMLの発病は末梢血液塗沫標本および骨髄生検標本の分析によってモニタリングすることができる。
【００９７】
1つの態様においては、幹細胞または前駆細胞起源のがんを治療する方法であって、それを必要とする対象に対して、SALL4の発現レベルを低下させる作用物質を含む組成物を投与する段階を含む方法が開示される。
【００９８】
1つの局面において、作用物質は、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31；またはSEQ ID NO：32から選択されるオリゴヌクレオチド配列である。もう1つの局面において、組成物は、5'アザシチジン、5'アザ-2-デオキシシチジン、1-B-D-アラビノフラノシル-5-アザシトシンまたはジヒドロキシ-5-アザシチジンを非限定的に含むメチル化阻害薬を含む。1つの関連した局面において、組成物はさらに、MG 132、PSI、ラクタシスチン、エポキソミシンまたはボルテゾミブを非限定的に含むプロテアソーム阻害薬を含む。
【００９９】
胚細胞腫瘍（GCT）とは、往々にして臨床診断において課題を呈し、標本の組織学的描写のみに基づいて診断されることが最も多い、多様な一群の新生物のことである。しかし、これは多くの症例において困難である恐れがある。往々にして生検標本は非常に少ないために混合型GCTの正確な診断が不十分となる。
【０１００】
SALL4抗体による免疫組織化学染色は特異的かつ高感度なシグナルを生じる。核染色されることはSALL4の転写因子としての役割と合致し、バックグラウンド染色がないことから陽性染色細胞におけるその発現の明確な証拠が得られる。本発明者らのデータは、SALL4が多能性能力を有する細胞のみにおいて発現されることを示している。
【０１０１】
セミノームおよび胎生期癌は、多くの他の細胞系に分化する可能性を有する明らかな原始細胞である。未熟奇形種および卵黄嚢腫瘍は組織幹細胞と呼ばれるが、これはそれらが多能性を有するものの、さらに特定組織の細胞のみに分化しうるためである。成熟奇形種はSALL4を発現しないが、このことはそれらがそれ以上分化する能力を有しないという事実に合致する。
【０１０２】
開示しているように、精子形成におけるSALL4の染色は、SALL4が生殖細胞では強く発現されるが、精細管内の他のいかなる細胞でもそうではないことを示している。同様に、SALL4は未分化胎生期癌細胞系では発現されるが、誘導分化後にはその発現はダウンレギュレートされる。SALL4はまた、がん性上皮組織の正常なものに由来するかなりの数の細胞内では発現されない。例えば、組織アレイ中に提示される組織型は、SALL4に関して陽性染色される細胞を細胞の2％未満しか含まない可能性がある。したがって、アレイ中のSALL4に関して陽性染色される細胞は組織幹細胞を示す。
【０１０３】
さらに、SALL4抗体による精細管の染色は、管の生殖細胞のみがSALL4に関して陽性染色されるという点で固有である。その上、細精管の生殖細胞およびさまざまな原始悪性GCTのそれらはいずれもSALL4に関して陽性染色される。
【０１０４】
1つの態様においては、対象における始原細胞起源の障害を診断する方法であって、対象由来の組織試料におけるSALL4の発現を決定する段階を含む方法が開示される。1つの局面において、この障害は胚細胞腫瘍（GCT）に関連する。さらに、GCTには、古典的セミノーム、精母細胞セミノーム、胎生期癌、卵黄嚢腫瘍または未熟型奇形種が含まれる。
【０１０５】
もう1つの局面において、組織試料は精巣起源の細胞を含み、これには試料中に存在する実質的にすべての成熟精巣細胞型がSALL4を発現しないものが含まれる。さらに、組織試料は、GCTから転移した細胞を含む部位から得ることもできる。
【０１０６】
もう1つの態様においては、対象への移植の前に幹細胞におけるSALL4の発現レベルを決定する段階、対象に細胞をグラフトする段階、およびグラフトされた幹細胞におけるSALL4の発現レベルを移植後の期間で決定する段階を含む、対象における移植された幹細胞の生着をモニタリングする方法であって、前記期間にわたるSALL4発現の低下が幹細胞の分化と相関し、そのような分化が対象における細胞の生着が陽性であることを示す、モニタリング方法が開示される。
【０１０７】
1つの局面において、前記期間にわたるSALL4発現の増大は分化の抑圧と相関し、そのような抑圧は対象における細胞の生着が陰性であることを示す。
【０１０８】
そのような期間は、約1〜4時間、約4〜12時間、約12〜24時間、約24〜48時間、約48〜72時間、約3〜7日、約7日〜2週間、約2週間〜1カ月、約1〜6カ月、および／または約6カ月〜1年間であってよい。
【０１０９】
もう1つの局面において、細胞は外来性または内在性遺伝子産物をコードするベクターによって形質転換される。
【０１１０】
1つの態様においては、対象から臍帯細胞（UBC）を得る段階、SALL4を発現する細胞をSALL4を発現しない細胞から選別する段階を含む、臍帯血から幹細胞を単離するための方法であって、SALL4を発現するUBCが単離された幹細胞を示す、単離方法が開示される。さらに、本方法は任意で、SALL4を発現する選別された細胞から1つまたは複数の追加のマーカーを用いて細胞を選択する段階を含みうる。
【０１１１】
1つの局面において、1つまたは複数のマーカーは、SSEA-1、SSEA-2、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、CD34+、CD59+、Thy1/CD90+、CD38lo/-、C-kit-/lo、lin-、SH2、ビメンチン、過ヨウ素酸シッフ活性（PAS）、FLK1、BAPおよび酸性ホスファターゼからなる群より選択される。
【０１１２】
一態様では、生体試料においてSEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、またはSEQ ID NO：6をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドの有無を検出する方法が開示され、該方法は、ハイブリダイゼーション条件下で、生体試料にSEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、もしくはSEQ ID NO：5に示される配列、またはSEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、もしくはSEQ ID NO：5の相補体を有するポリヌクレオチドの少なくとも15個の連続したヌクレオチドのフラグメントを含むプローブを接触させる段階と、ハイブリダイゼーションがポリヌクレオチドの存在を示す、プローブと試料のハイブリダイゼーションを検出する段階とを含むがそれらに限定されるものではない。
【０１１３】
他の態様では、生体試料に存在する、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、またはSEQ ID NO：6に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを検出する方法が開示され、該方法は、ポリペプチドに結合する抗体を提供する段階と、生体試料を抗体に接触させる段階と、結合がポリペプチドの存在を示す、抗体の生体試料への結合を判定する段階とを含むが、それらに限定されるものではない。
【０１１４】
一態様では、対象における骨髄異形成症候群（MDS）の治療方法が説明され、該方法は、SEQ ID NO：1に示される核酸配列、SEQ ID NO：3に示される核酸配列、SEQ ID NO：5に示される核酸配列、SEQ ID NO：1の相補体、SEQ ID NO：3の相補体、SEQ ID NO：5の相補体、またはそれらのフラグメントを有するポリヌクレオチドを、対象へ投与する段階を含み、前記フラグメントは、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、またはSEQ ID NO：6に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む。関連する態様では、該方法はSEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、またはSEQ ID NO：5に示されるポリヌクレオチドを投与する段階を含む。一形態において、MDSは急性骨髄性白血病（AML）である。
【０１１５】
一態様では、機能的に連結されたOCT4プロモーターと遺伝子発現レポータータンパク質をコードする核酸とを含むプロモーター-レポーター構築物を含むベクターと、SALLファミリーメンバータンパク質コードする核酸を含むベクターとを、細胞にコトランスフェクトする段階と、細胞に作用物質を接触させる段階と、作用物質の存在下および非存在下におけるプロモーター-レポーター構築物の活性を判定する段階とを含む、OCT4発現に対するSALLファミリーメンバータンパク質の影響を調節する作用物質を識別する方法が開示され、この方法において、プロモーター-レポーター構築物の活性を判定する段階は、SALLファミリーメンバータンパク質／OCT4相互作用に対する作用物質の影響に相関する。
【０１１６】
関連する態様では、プロモーター領域は、SEQ ID NO：26を含む核酸配列を含むが、それらに限定されず、発現レポータータンパク質はルシフェラーゼである。
【０１１７】
他の態様では、SALL4の発現を抑制する作用物質を含む医薬組成物を、対象へ投与する段階を含む、腫瘍性または増殖性の障害を治療する方法が開示され、対象の細胞は自己複製の脱制御を示す。
【０１１８】
他の態様では、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、またはSEQ ID NO：6に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する物質を識別する方法が提供され、該方法は、ポリペプチドを候補物質に接触させる段階とポリペプチドに対する該物質の結合を検出する段階とを含む。
【０１１９】
一態様では、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、またはSEQ ID NO：6に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの機能を調節する物質を識別する方法が開示され、該方法は、ポリペプチドを候補物質に接触させる段階とポリペプチドの活性を判定する段階とを含み、その候補物質の存在下での活性における変化は、その物質がポリペプチドの機能を調節していることを示す。
【０１２０】
他の態様では、対象から生体試料を得る段階と、生体試料をハイブリダイゼーション条件下でSEQ ID NO：1に示されるポリヌクレオチド配列、SEQ ID NO：3に示されるポリヌクレオチド配列、SEQ ID NO：5に示されるポリヌクレオチド配列、SEQ ID NO：1の相補体、SEQ ID NO：3の相補体、またはSEQ ID NO：5の相補体のうちの少なくとも15個の連続したヌクレオチドのフラグメントを有するプローブに接触させる段階と、プローブと生体試料との間のハイブリダイゼーションを検出する段階とを含むが、それらに限定されない、対象における骨髄異形成症候群（MDS）を治療する方法が開示され、この方法では、ハイブリダイゼーションを検出する段階は、MDSと相関する。一形態において、MDSは急性骨髄性白血病（AML）である。
【０１２１】
他の態様では、対象における骨髄異形成症候群（MDS）を診断する方法が開示され、該方法は、対象から生体試料を得る段階と、生体試料をSEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、またはSEQ ID NO：6に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する抗体に接触させる段階と、検出結合がMDSに相関する、試料への抗体の結合を検出する段階とを含むが、それらに限定されない。一形態において、MDSは急性骨髄性白血病（AML）である。
【０１２２】
一態様では、対象の細胞を、SALLファミリーメンバータンパク質の発現を検出する作用物質へ接触させる段階と、SALLファミリーメンバータンパク質が、細胞において発現されるかどうかを判定する段階とを含む、腫瘍性または増殖性の障害を診断する方法が開示され、SALLファミリーメンバータンパク質の発現の判定は、細胞においての自己複製の誘発と正に相関し、それによって、そのような発現が腫瘍の形成または増殖を示す。
【０１２３】
一形態において、作用物質は標識され、判定する段階は、作用物質の位置を画像化する装置に対象を供することによる検出を含む。関連する態様では、画像は磁気共鳴、またはX線、または放射性核種放出によって生成される。
【０１２４】
一態様では、急性原発性骨髄性白血病細胞に構成的に発現されるジンクフィンガー型転写因子をコードするポリヌクレオチドの細胞発現を調節する方法を含み、該方法は、ポリヌクレオチドにハイブリダイズする二本鎖RNA（dsRNA）、またはポリヌクレオチドにハイブリダイズするアンチセンスRNA、またはそれらのフラグメントを細胞へ導入する段階を含む。関連する態様では、調節はダウンレギュレーションである。
【０１２５】
乳児血管腫は新生児および若齢小児において非常によくみられる。白人集団のほぼ10％が血管腫を有する。血管腫の60パーセントは頭頸部に起こり、血管腫のほとんどは増殖性の成長期を経て出生後に急速に広がり、小児が年齢を重ねるにつれて退行する。これらの血管腫の中には頭頸部の構造を破壊するほどに大きくなるものもある。多くは外観を大きく変形させ、正常な成熟を妨げる恐れのある社会心理学的な徴候を小児が有するようにさせる可能性もある。
【０１２６】
1つの態様においては、ヒトSALL4を対象とする抗体が、血管腫における幹細胞のサブセットを特徴づけるために用いられ、ここでそのような抗体は多能性幹細胞と推定される細胞であるSALL4発現細胞と結合する。1つの関連した局面において、血管腫を構成する細胞の5〜10％は、そのようなSALL4を対象とする抗体と結合する。さらに、血管腫の退行の診断およびモニタリングを、そのような抗体によるSALL4結合の低下によって判定することもできる。1つの局面において、モニタリングには、フローサイトメトリーおよび／または抗SALL4により免疫組織化学的に染色された組織切片の細胞の検査が非限定的に含まれる。
【０１２７】
もう1つの態様においては、SALL4発現を低下させる作用物質を、それを必要とする対象に対して、対象における血管腫の退行の誘導を引き起こすのに十分な量で投与する、乳児血管腫に対する非外科的治療が開示される。
【０１２８】
他の態様では、トランスジェニック動物が開示される。一般的な態様において、トランスジェニック動物は、その導入遺伝子の発現を可能にする方法で外来遺伝子を導入することにより作製される。トランスジェニック動物の作製方法は、概して、WagnerとHoppe（参照により本願に取り込まれる米国特許第4,873,191号）、全体が参照により本願に組み入れられる、Brinsterら（1985）、および全体が参照により本願に組み入れられる「Manipulating the Mouse Embryo；A Laboratory Manual」2nd edition、（eds.,  Hogan、Beddington、Costantimi and Long、Cold Spring Harbor Laboratory Press（1994））で説明される。
【０１２９】
一般的に、遺伝子はマイクロインジェクションによって受精卵へ移入される。微量注入された卵は、宿主の雌へ移植され、その子孫は、導入遺伝子の発現を検査される。トランスジェニック動物は、爬虫類、両生類、鳥類、哺乳類、魚類を含むが、それらに限定されない多くの動物からの受精卵から作製されてもよい。
【０１３０】
マイクロインジェクションのためのDNAクローンは当技術分野で既知のすべての方法によって作製することが出来る。例えば、マイクロインジェクションのためのDNAクローンは細菌プラスミドの配列を除去するのに適した酵素、およびTBE緩衝剤で1％アガロースゲルで電気泳動させられたDNAのフラグメントで、標準技術を用いて分割することができる。DNAバンドはエチジウムブロマイドで染色することによって可視化され、発現配列を含むバンドが除去される。除去されたバンドは、その後0.3M酢酸ナトリウム、pH7.0を有する透析袋に置かれる。DNAは透析袋へ電気溶出され、1：1のフェノール：クロロフォルム溶液で抽出され、2ボリュームのエタノールによって沈殿される。DNAは1mlの低塩緩衝液（0.2M NaCl、20mMトリス、pH7.4、および1mM EDTA）で再び溶かされ、Elutip-D（商標）カラムで精製される。カラムは、最初に3mlの高塩緩衝液（1M NaCl、20mMトリス、pH7.4、および1mM EDTA）で刺激され、続いて5mlの低塩緩衝液で洗浄される。DNA溶液はカラムを3回通過し、DNAをカラムマトリックスへ結合させる。3mlの低塩緩衝液で1回洗浄した後、DNAは0.4mlの高塩緩衝液で溶出され、2ボリュームのエタノールによって沈殿される。DNA濃度は紫外分光光度計において260nmでの吸収によって測定される。
【０１３１】
本発明はさらに、少なくとも1つの、その有効量で障害を治療することの出来る化合物と、薬学的に許容される賦形剤または希釈剤とを含む医薬組成物を提供する。本発明の組成物は、記載されるようにその他の治療薬を含むことができ、例えば、従来の固体または液体の賦形剤もしくは希釈剤を採用することにより、製剤処方の技術において既知である技術に従って、望ましい投与様式に適した種類の医薬品添加物（例えば、添加剤、結合剤、保存料、安定剤、香料など）に加えて、採用することにより処方されてもよい。
【０１３２】
本発明の製造品の構成要素として採用される医薬組成物は、固体、溶液、乳剤、分散、ミセル、リポソームおよび同様のものなどの形態で使用されることができ、結果として生じる組成物は、腸内または非経口の使用に適した有機または無機の担体もしくは添加剤との混合物の状態で、活性成分として上記の化合物の1つまたは複数含む。本発明の製造品の構成要素として使用されるために採用される化合物は、例えば、通常の非毒性で、薬学的に許容される、タブレット、ペレット、カプセル、坐薬、溶液、乳剤、懸濁液、およびその他の使用に適した形態のための担体と組み合わせられてもよい。使用される担体は、グルコース、ラクトース、アカシアガム、ゼラチン、マンニトール、デンプンのり、三ケイ酸マグネシウム、タルク、コーンスターチ、ケラチン、コロイド状シリカ、ポテトスターチ、尿素、中鎖長トリグリセリド、デキストラン、および製造調合剤の使用に適したその他の担体を固体、半固体、または液体の形態で含む。さらに、補助剤、安定剤、濃化剤、および着色剤ならびに香料が使用されてもよい。
【０１３３】
本発明の医薬組成物は、例えば、タブレット、カプセル、顆粒または粉末などの形態での経口投与；舌下投与；口腔投与；皮下、静脈、筋肉内、槽内への注射もしくは注入技術などによる非経口投与（例えば、無菌の注射可能な水性または非水性の溶液もしくは懸濁液として）；吸入噴霧などによる経鼻投与；クリームまたは軟膏などの形態での局所的投与；または坐薬などの形態での経直腸的投与などの任意の適切な方法によって；非毒性の、薬学的に許容される賦形剤または希釈剤を含む投与量単位の形態で、投与されることが出来る。本発明の化合物は、例えば、短時間作用型または持続放出型に適した形態で投与されることが出来る。短時間作用型または持続放出型は、本発明の化合物を含む適した医薬組成物の使用によって、または、特に持続放出型の場合は、皮下インプラントまたは浸透圧ポンプなどの装置を使用することにより、達成されることが出来る。本発明の化合物はリポソームで投与されることも出来る。
【０１３４】
霊長類に加えて、ヒトなど、様々なその他の哺乳類を本発明の方法によって治療することができる。例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、テンジクネズミ、ラットまたはその他のウシ亜科の動物、ヒツジ科動物、ウマ科動物、イヌ科動物、ネコ科動物、齧歯動物またはネズミ科に属する種を含むが、それらに限定されない哺乳類を治療することが出来る。しかし、該方法は、鳥類のような（例えば、鶏など）、他の種においても実践されることが出来る。
【０１３５】
細胞が調整のため標的化されることが望ましい、上述の方法で治療された対象はウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、テンジクネズミ、ラットまたはその他のウシ亜科の動物、ヒツジ科動物、ウマ科動物、イヌ科動物、ネコ科動物、齧歯動物またはネズミ科に属する種を含むが、それらに限定されない哺乳類であり、好ましくは、ヒトで、男性または女性である。
【０１３６】
「治療的有効量」という用語は、研究者、獣医、医師あるいはその他の臨床医によって求められている組織、系、動物、またはヒトの生物学的または医学的な反応を引き起こすであろう対象となる化合物の量を意味する。
【０１３７】
本明細書に使用される、「組成物」という用語は、特定の量で特定の材料を含む製品、ならびに特定の量で特定の材料の組合せから直接的にまたは間接的に出来る任意の製品を包含することを意図する。「薬学的に許容される」は、担体、希釈剤または添加剤が、処方のその他の材料と適合しなくてはならず、かつそれらの受容体に対して有害ではないことを意味する。
【０１３８】
化合物「の投与」および／または化合物「を投与する」という用語は、本発明の化合物を治療が必要な個体に提供することを意味すると理解されるべきである。
【０１３９】
本発明の化合物の投与のための医薬組成物は、好都合に投与量単位形態で存在することができ、かつ製薬の技術分野において公知である任意の方法によって調合されることが出来る。すべての方法は、活性成分を1つ以上の副成分を構成する担体に結合させる段階を含む。一般的に、医薬組成物は、均一に、密接に、活性成分を液体担体または微紛化された固体担体またはその両方と結合させ、その後、必要に応じて、製品を望ましい形態に成形することによって調合される。医薬組成物において、対象となる活性化合物は疾患の進行または状態に対して望ましい効果を作り出すのに十分な量で含まれる。
【０１４０】
活性成分を含む医薬組成物は、例えば、タブレット、トローチ、ロゼンジ、水性または油性の懸濁液、分散剤もしくは顆粒、乳剤、硬性または軟性のカプセル、またはシロップもしくはエリキシル剤などの、経口使用に適した形態であることが出来る。
【０１４１】
経口使用を目的とした組成物は、医薬組成物製造の技術分野で知られている任意の方法によって調合されることができ、そのような組成物は、薬学上の優れた、口に合う調合を提供するために、甘味剤、香料剤、着色剤および保存剤からなる群より選択される剤を1つ以上含むことができる。タブレットは、タブレットの製造に適した非毒性の、薬学的に許容される添加剤との混合物の状態で活性成分を含むことが出来る。これらの添加剤は、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ソーダ、ラクトース、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウムのような、不活性希釈剤、例えば、コーンスターチ、またはアルギン酸などの造粒剤および崩壊剤、例えばスターチ、ゼラチンまたはアカシアなどの結合剤、そして例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸もしくはタルクなどの潤滑剤であることが出来る。タブレットはコーティングされなくてもよく、または胃腸管での分解および吸収を遅らせ、それにより、より長い期間の持続作用を提供することの出来る既知の技術によってコーティングされても良い。例えば、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリルのような時間遅延材料が採用されてもよい。また、それらは放出を制御するための浸透性治療タブレットを形成するようコーティングされてもよい。
【０１４２】
経口使用のための処方は、活性成分が、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリンなどの不活性固体希釈剤と混合される硬性ゼラチンカプセルとして、または、活性成分が、水もしくは、例えばピーナッツ油、流動パラフィン、あるいはオリーブ油などの油媒体と混合される軟性ゼラチンカプセルとして存在してもよい。
【０１４３】
水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に適した添加剤との混合物の状態で活性物質を含む。そのような添加剤は、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシ-プロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガムおよびアカシアガムなどの懸濁化剤であり、分散剤または湿潤剤は、例えばレシチンなどの天然フォスファチド、または例えばステアリン酸ポリオキシエチレンなどのアルキレンオキシドの脂肪酸との縮合物、または例えばへプタデカエチレンオキセタノールなどのエチレンオキシドの長鎖脂肪族アルコールとの縮合物、またはエチレンオキシドのポリオキシエチレンソルビトールモノオレエートのような脂肪酸およびへキシトール由来の部分エステルとの縮合物、または例えばポリエチレンソルビタンモノオレエートなどの、エチレンオキシドの脂肪酸およびへキシトール無水物由来の部分エステルとの縮合物であってもよい。水性懸濁液は、さらに例えばエチル、またはn-プロピル、p-ヒドロキシ安息香酸などの1つ以上の保存料、1つ以上の着色剤、1つ以上の香料剤、さらにスクロースまたはサッカリンなどの1つ以上の甘味剤を含んでもよい。
【０１４４】
油性懸濁液は活性成分を例えばラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油またはココナッツ油などの植物油、または流動パラフィンなどの鉱油で懸濁することにより処方されることができる。油性懸濁液は例えば蜜ろう、固形パラフィンまたはセチルアルコールなどの濃厚剤を含んでもよい。上述のような甘味剤、および香料剤が口当たりのいい経口剤を提供するために加えられてもよい。これらの組成物は、アスコルビン酸のような抗酸化物質の追加によって保存されてもよい。
【０１４５】
水の追加による水性懸濁液の調合に適した分散パウダーおよび顆粒は、分散剤または湿潤剤、懸濁化剤および1種以上の保存料との混合物の状態で活性成分を提供する。適した分散剤または湿潤剤および懸濁化剤は上述によって例示される。例えば、甘味剤、香料剤および着色剤などの追加の添加剤が存在してもよい。
【０１４６】
シロップおよびエリキシル剤は、例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトールまたはスクロースなどの甘味剤と共に処方されることが出来る。そのような処方は、鎮痛薬、保存料および香料剤と着色剤を含むことが出来る。
【０１４７】
医薬組成物は無菌注射剤の水性または油性の懸濁液の形態であることができる。本懸濁液は、既知の技術に従い、上述の適した分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を用いて調合されることができる。無菌注射剤の調合は、例えば1,3-ブタンジオールの溶液として、非毒性の薬学的に許容される希釈剤もしくは溶剤における無菌注射剤の溶液または懸濁液であることができる。許容される賦形剤および溶剤において、水、リンガー溶液および等張食塩水溶液が採用される。さらに、滅菌した固定油は、溶剤または懸濁溶媒として通常に採用される。本目的のため、合成のモノグリセリドまたはジグリセリドを含む、任意の無菌性の固定油が採用されてもよい。さらに、オレイン酸などの脂肪酸は注入剤の調合において使用される。
【０１４８】
本発明の化合物は、薬物の直腸投与のための坐薬の形態で投与されてもよい。これらの組成物はその薬物を、通常の温度では固体であり直腸温では液体になり、それゆえ直腸で解けて薬物を放出する、適した非刺激性の添加剤と混合することにより調合されることが出来る。そのような物質はココアバターおよびポリエチレングリコールである。
【０１４９】
局所使用には、本発明の化合物を含有するクリーム、軟膏、ゼリー、溶液または懸濁液などが採用される（本使用の目的のため、局所使用は洗口剤およびうがい薬を含む）。
【０１５０】
本開示に基づく、SALL4を抑制するポリペプチドまたはペプチドをコードする核酸は、例えば、がんなどの腫瘍、または細胞周期および／または細胞成長の適切な調節の損失を含む障害、または特異的細胞死が望ましいその他の障害の予防または治療（全体的または部分的）を目的とする個々の治療において遺伝子治療法に使用されることができる。
【０１５１】
ウィルスベクターなどのベクターが、当技術分野において、核酸を様々な種類の標的細胞に導入するために使用されてきた。一般的に、ベクターは標的細胞にさらされ、トランスフェクションが細胞の十分な部分で行われることができ、望ましいポリペプチドの発現からの有用な治療効果または予防的効果を提供する。トランスフェクションされた核酸は標的化された腫瘍細胞それぞれのゲノムへ永続的に組みこまれて長期持続効果を提供してもよく、あるいは、治療が定期的に繰り返される必要があってもよい。
【０１５２】
ウィルスベクターとプラスミドベクターの両方である様々なベクターが、当技術分野において既知である。米国特許第5,252,479号およびWO93／07282を参照されたい。具体的には、SV40のようなパポバウィルス、ワクシニアウイルス、HSVおよびEBVを含むヘルペスウイルス、ならびにレトロウイルスを含む多くのウィルスが、遺伝子移入ベクターとして使用されてきた。当技術分野における多くの遺伝子治療プロトコルが、無能にしたマウスレトロウイルスを使用してきた。
【０１５３】
ウィルスベクターの使用の代わりとしての、核酸を細胞へ導入するためのその他の既知の方法には、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム同時沈殿法、マイクロインジェクション法や、弾道法、リポソームで媒介される導入法、および直接DNA取り込み法などの機械的技術法、ならびに受容体介在DNA導入法が挙げられる。
【０１５４】
核酸がタンパク質リガンドにポリリシンを介して連結され、リガンドが標的細胞の界面に存在する受容体に対して特異的である、受容体介在遺伝子導入は、特定の細胞を特異的に核酸の標的とする技術の例である。
【０１５５】
細胞が調整のため標的化される対象の治療において、適切な投与レベルは、一般的に、1日当たりの患者の体重1kg当たりの約0.01mgから500mgであり、これは単回投与または反復投与で投与される。好ましくは、投与レベルは1日当たり約0.1mg／kgから約250mg／kgであり、さらに好ましくは1日当たり約0.5mg／kgから約100mg／kgである。適した投与レベルは、1日当たり約0.01mg／kgから250mg／kg、1日当たり約0.05mg／kgから約100mg／kg、または1日当たり約0.1mg／kgから約50mg／kgであることができる。この範囲内で投与量は、1日当たり、約0.05から0.5、0.5から5または5から50mg／kgであることができる。経口投与には、組成物は、治療される患者への投与量の症候性調節のため、好ましくは1.0から1000ミリグラムの活性成分、具体的には、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、50.0、75.0、100.0、150.0、200.0、250.0、300.0、400.0、500.0、600.0、750.0、800.0、900.0、および1000.0ミリグラムの活性成分を含む、タブレットの形態で提供される。化合物は1日当たり1回から4回のレジメンで投与されることができ、好ましくは1日当たり1回または2回である。
【０１５６】
しかしながら、任意の特定の患者に対する特定の投与レベルならびに投与の頻度は変動する可能性があり、かつ採用される特定の化合物の活性、この化合物の代謝的安定性および作用の長さ、年齢、体重、通常の健康状態、性別、食事、投与の方法と時間、排せつの割合、薬物の組合せ、特定の状態の重症度、および治療中の宿主などを含む様々な要因に左右されることが理解されるだろう。
【０１５７】
以下の実施例は発明を説明することを目的とするが、それを限定するものではない。
【０１５８】
実施例
方法
分子クローニング
プラスミドコンストラクションおよびDNAシークエンシングが標準の方法に従って実施された。SALL4アイソフォームのクローニングのため、PCRプライマーが、ゲノムクローンRP5-1112Fl9（SEQ ID NO：25）（GenBankアクセッション番号AL034420）に基づき、設計された。SALL4アイソフォームは、ヒトの胎児の腎臓に由来するマラソン-レディcDNAライブラリ（BD Biosciences Clontech、Palo Alto、CA）を使用して、サプライヤープロトコルに従いクローニングされた。増幅されたPCR産物はTAクローニングベクター（Invitrogen Corp.、Carlsbad、CA）へクローニングされ、ヌクレオチド配列はDNAシークエンシングにより決定された。GAL4-SALL4B構築物は、PCRにより、各端部に制限酵素部位、BamHIを有する5’プライマーおよび3’プライマーを使用し、作製された。
2010528620.tif 000011
【０１５９】
GAL4-SALL4B構築物は、最初のアミノ酸であるメチオニンを除く、最小GAL4 DNA結合ドメインおよび完全長のSALL4Bの93アミノ酸をコードすることを企図した。
【０１６０】
異なる組織における選択的スプライシングパターンの決定
逆転写（RT）-PCRが使用され、成人組織におけるSALL4のmRNA発現パターンを評価した。8つの標準化第1ストランドcDNA調合液のパネルは、異なる成人組織に由来し、BD Biosciences Clontechから購入された。PCR増幅が、5μlのcDNA、10mMトリスHCl（pH8.3）、50mMのKCl、2mMのMgCl2、0.2mMのdNTPs、1.25UのTaqDNAポリメラーゼ（PerkinElmer Life Sciences、Boston、MA）を含む50-μl反応体積で実施された。94℃で10分間の初期変性の後、増幅が30サイクルで以下の条件の下実施された：94℃で30秒間の変性、55℃で30秒間のアニーリング、72℃で30秒間の伸長。続いて最後のサイクルは、72℃での最終の7分間の伸長であった。
【０１６１】
グリセロアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）mRNAの増幅は鋳型濃度ローディングの対照に使用された。SALL4アイソフォームに対して特異的に選択されたプライマーのペアは以下である。
【０１６２】
SALL4Aプライマー（センスプライマー：
2010528620.tif 000012
；アンチセンスプライマー：
2010528620.tif 000013
）、および
2）SALL4Bプライマー（センスプライマー：
2010528620.tif 000014
；アンチセンスプライマー：
2010528620.tif 000015
）。
【０１６３】
PCR産物は電気泳動により1％アガロースゲルで分離された。さらにDNAシークエンシングが増幅産物を確認するために使用された。
【０１６４】
抗体作製
ヒトSALL4のペプチド
2010528620.tif 000016
は、その潜在的抗原性（アミノ酸1〜13）によって選択され、抗ペプチド抗体を作製するために使用された。本領域はマウスSALL4の領域とも同一であり、作製された抗体がマウスSALL4と交差反応することを可能にする。SALL4抗ペプチド抗体はウサギにおいて、Lampire Biological Laboratories Inc.（Pipersville、PA）との協力において作製された。
【０１６５】
ゲル電気泳動ならびにウエスタンブロット分析
ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）が、ラエムリ法に従いSDS10％w／vポリアクリルアミドスラブゲルにおいて実施され、タンパク質はその後、ニトロセルロース膜へ移された。SALL4抗ペプチド抗体（1：100）を伴うウサギ免疫血清の免疫ブロット法は、説明されるように、電気化学発光検出システムで製造会社（Amersham Biosciences、Piscataway、NJ）によって実施された。
【０１６６】
白血病と正常組織
パラフィンブロックまたはジメチルスルホキシド（DMSO）での凍結のいずれかである白血病試料と正常な試料は、認可されたInstitutional Review Boardのプロトコルの下、1998から2004年の間、テキサス州立大学M.D. Anderson Cancer Center、Houston、TX、およびDana-Farber Cancer Institute、Boston、MAのファイルから採取された。すべての腫瘍の診断は、造血形新生物のFAB分類に従い、形態学的および免疫表現型的基準に基づく。CD34＋新鮮細胞がCambrexから購入された。
【０１６７】
リアルタイム定量的RT-PCR法
TaqMan5’ヌクレアーゼ分析が（Applied Biosystems、Foster City、CA）これらの研究で使用された。正常骨髄および末梢血からの精製CD34＋HSC／HPCからの全RNA、15のAML試料、および3つの白血病細胞株がRNeasy Mini Kitで単離され、DNase I（Qiagen）で消化された。RNA（1μg）が20μLでSuperscript II逆転写酵素およびポリ（dT）12〜18プライマー（Invitrogen）を使用して逆転写された。80μLの水および混合液を追加した後、5μLのアリコートが各TaqMan反応に使用された。TaqManプライマーおよびプローブは、Primer Expressソフトウェアバーション1.5（Applied Biosystems）の使用するように設定されている。SALL4およびGAPDHのリアルタイムPCRがTaqMan PCR core reagent kit （Applied Biosystems）およびABI Prism7700Sequence Detection System（PE Applied Biosystems）で実行された。PCR反応混合液は3.5mMのMgCl2；各0.2mMのデオキシアデノシン三リン酸（dATP）、デオキシシチジン三リン酸（dCTP）、デオキシグアノシン三リン酸（dGTP）；0.4mMのデオキシウリジン三リン酸（dUTP）；0.5μMフォワードプライマー；0.5μMリバースプライマー；0.1μM TaqManプローブ；0.25UウラシルDNAグリコシラーゼ；および0.625U AmpliTaq Goldポリメラーゼを、1×TaqManPCR緩衝液に含んだ。cDNA（5μL）がPCR混合液に加えられ、PCR反応の最終体積は25μLであった。すべてのサンプルは二重で実行された。GAPDHは内在性対照として使用された。サーマルサイクラーの状態は50℃で2分間、95℃で10分間であり、および95℃で30秒間、そして60℃で1分間の45サイクルであった。データはSequence Detection Systemソフトウェアバージョン1.6.3（Applied Biosystems）を用いて分析された。結果はサイクル閾値（Ct）の値である。ソフトウェアは、基準蛍光信号に基づき閾値ラインを測定し、閾値に合うデータポイントはCt値として与えられる。Ct値は鋳型の複製の最初の数に反比例する。すべての測定は二重に実施された。TaqMan配列は以下を含む。
GAPDHフォワードプライマー：
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およびリバースプライマー：
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、TaqManプローブ：
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、およびSALL4フォワードプライマー：
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およびリバースプライマー：
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。
【０１６８】
組織アレイの設計および構成
白血病標本からの三つ組の腫瘍コアを含んだ組織アレイの切片を作製した（厚さ5μm）。手動組織アレイヤー（Beecher Instruments、Silver Spring、MD）を使用して、組織アレイを構成した。
【０１６９】
免疫組織化学
免疫組織化学的染色を標準技術によって実施した。手短に言えば、ホルマリン固定し、パラフィン包埋した厚さ4μmの組織切片を脱パラフィン化して水和した。加熱誘導（heat-induced）エピトープをトリス緩衝液（pH9.9；Dako Corp.、Carpinteria、CA）および高速マイクロ波ヒストプロセッサで回収した。100度での10分間のインキュベーションの後、スライドを水道の流水で5分間、そしてリン酸緩衝生理食塩水（PBS；pH7.2）で5分間洗浄した。そして組織切片は、室温の加湿室内で5時間、抗SALL4抗体（1：200）によりインキュベートした。PBSによる3回の洗浄後、組織切片は室温で30分間、抗マウス免疫グロブリンGおよびペルオキシダーゼによりインキュベートした。
【０１７０】
PBSによる3回の洗浄後、組織切片は着色のために3,3’-ジアノベンジジン／H2O2（Dako）によりインキュベートし、ヘマトキシリンを使用して切片を対比染色した。腫瘍性細胞は、明確な核染色を示した時にSALL4に対して陽性であると考えられた。
【０１７１】
トランスジェニックマウスの作製
コーディング領域全体に対応するSALL4B cDNAは、pCEP4ベクター（IntroGene；now Crucell、Leiden、The Netherlands）にサブクローニングし、遺伝子導入実験のためのCMV／SALL4B構築物を作製した。SALL4B cDNA内を切断しないSalIによる後の消化は、CMVプロモーター、SALL4 cDNAコーディング領域、SV40イントロン、およびポリアデニル化シグナルのみを含む、追加ベクター配列のない直鎖状断片を放出した。
【０１７２】
トランスジェニックマウスは、エール大学のトランスジェニックマウス施設で、前核注入を介して作製した。SALL4B初代（founder）マウスの識別および導入遺伝子の伝達はPCR分析によって判定した。遺伝子型解析に使用されるPCRプライマーは、CMVプロモーターへの5’SALL4B cDNAの接合部に及ぶ（センスプライマー：
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、アンチセンスプライマー：
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）。
【０１７３】
血液学的分析
自動分類による全血球数は、Mascot Hemavet細胞カウンタ（CDC Technologies、Oxford、CT）により判定した。前駆細胞アッセイのために、1.5×104骨髄細胞を、組換えマウスインターロイキン-3（IL-3）（10ng／ml）、IL-6（10ng／ml）、幹細胞因子（SCF）（50ng／ml）、およびエリスロポエチン（3U／ml）（M3434、StemCell Technologies、Vancouver、British Columbia、Canada）を補充した二つ組の1.25mlメチルセルロース培養に入れた。コロニーは7から14日の間に記録した（CFU-G、CFU-GM、CFU-M、CFU-GEMM、およびBFU-E）。末梢血、骨髄塗抹標本、およびプールCFU細胞からのサイトスピンは、ライトギムザ染色で染色した。
【０１７４】
フローサイトメトリー分析
細胞は、Gr-1、Mac-1、B220、Ter119、c-kit、CD34、CD45、CD41、CD19、CD5、CD3、CD4、CD8、プロピジウムヨウ化物（PI）またはAnnexin V（BD Biosciences Pharmingen、San Diego、CA）に対する結合抗体により直接染色した。1万個の散乱光ゲーティングした赤血球は、FACScan上で獲得し、CellQuestソフトウェア（BD Biosciences Clontech）で分析した。
【０１７５】
増殖中の細胞をまずIS3 295の存在下または非存在下で最長48時間にわたり処理した。細胞の一部分を採取して、製造元の指示に従ってブロモデオキシウリジン（BrdU）（Pharmingen）を取り込ませ、フローサイトメトリーによって分析した。採取した細胞を、Roche Applied Science社のアポトーシス検出システム（フルオロセイン）を製造元の指示に従って用いたTUNELアッセイによる検出を介して、アポトーシスについても分析した。
【０１７６】
統計分析
すべての統計分析に関して、両側性正規分布および不等分散を仮定した上でStudentのt検定を用いた。さらに、SALL4B HSCおよびHPCに影響を及ぼすと考えられる5ACまたはボルテゾミブとの組み合わせによる処置を、さまざまな用量にわたって判定することが考えられる。加えて、至適用量の同定を行うことが考えられる。この種の検討の主要エンドポイントは、動物を殺処理した後のこれらの集団内の、正常HSC／HPCと比較した、SALL4B HSC／HPCおよびアポトーシス細胞の処置後パーセンテージである。他のエンドポイントには、5ACおよび5ACとボルテゾミブとの組み合わせに対する曝露後の、LSCのインビトロでの長期的自己再生能力、およびBmi-1の発現を決定することが含まれる。
【０１７７】
細胞培養およびトランスフェクション
すべての細胞培養物は5％ CO2の存在下にて37℃で維持した。HEK-293（ATCC：CRL-11268）細胞を、10％熱失活FBS（ウシ胎仔血清）およびペニシリン／ストレプトマイシン（P／S）を加えたダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）中で培養した。HL60細胞系は、10％ FBSおよびP／Sを加えたRPMI 1640培地中で培養した。マウスの複能性造血細胞系である32D（ATCC：CRL-1821）は、10％ FBS、P／Sおよびマウス白血病阻害因子（mLIF；1×103U／ml、Chemicon, Pittsburgh, PA）を加えたRPMI 1640中で維持した。HEK293、マウス32D細胞およびHL60細胞へのプラスミドのトランスフェクションは、Lipofectamine 2000（Invitrogen, Carlsbad, CA）を製造元の推奨に従って用いて行った。細胞を24ウェルプレートにほぼ1×105個／ウェルの密度でプレーティングした。細胞をトランスフェクションから24時間後に採取した。一過性トランスフェクションのためのプラスミドDNAはQiagen Plasmid Midi Kit（Valencia, CA）により調製した。
【０１７８】
β-ガラクトシダーゼおよびルシフェラーゼアッセイ
細胞は、トランスフェクションの24時間後に、100μlのルシフェラーゼ細胞培養溶解試薬（Promega Corp.、Madison Wi）で抽出した。10μlの細胞抽出物により実施したβガラクトシダーゼアッセイは、β-Galactosidase Enzyme Assay System（Promega）およびメーカー提供の標準アッセイプロトコル（炭酸ソーダの代わりに、停止緩衝液として1Mトリス基剤を使用したことを除く）を使用した。ルシフェラーゼアッセイ（Promega）に対しては、5μlの抽出物をメーカーの指示に従って使用した。バックグラウンドの減算後、ルシフェラーゼ活性（任意の単位）を、各試料に対してβ-ガラクトシダーゼ活性（任意の単位）に対して標準化した。
【０１７９】
プロモーターレポーター検定
一般的に、OCT4プロモーター（SEQ ID NO：26）を含む0.25〜0.3μgのOCT4-Luc構築物（PMOct4）、またはSALLファミリータンパク質（つまり、SALL1、SALL3、SALL4A、またはSALL4B）プロモーター（つまり、それぞれSEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、およびSEQ ID NO：29であり、SALL4AおよびSALL4Bはプロモーターを共有する）を含むSALL-Luc構築物は、0.1μgから0.12μgのレニラプラスミドおよび／または、HEK-293またはCOS-7細胞中でSALLファミリータンパク質またはOCT4タンパク質を発現する様々な量（0〜1.0μg）のプラスミドにコトランスフェクトされる。典型的に、pcDNA3ベクターは対照として使用した。そしてトランスフェクト細胞は、トランスフェクション後の24時間のルシフェラーゼ活性についてモニタリングした。
【０１８０】
ヒト試料
古典的セミノーム、胎生期癌、卵黄嚢腫瘍、成熟型奇形種、未熟型奇形種および絨毛癌は、パラフィン包埋切片として入手して、免疫組織化学染色に用いた。非GCTの組織マイクロアレイは、National Institutes of Health（NIH）から購入した。
【０１８１】
細胞培養
ヒトEC細胞系NTERA2.cl.D1（ATCC#CRL-1973）は、10％ FBS（ウシ胎仔血清）を加えたダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）中で維持した。種々の量のレチノイン酸（Sigma）による処置によって、細胞を分化するように誘導した。Phoenixパッケージング細胞（ATCC：#SD-3443）は、当技術分野で周知の手段によって培養する。
【０１８２】
ウイルス作製およびSALL4ノックダウン
SALL4遺伝子の異なる領域を標的とする2種のsiRNAオリゴヌクレオチド（#7410、#7412；Origen, Rockville, MD）を、Lipofectamin 2000を用いて、Phoenixパッケージング細胞にトランスフェクション導入した。流出したウイルスを採取した。NTERA2細胞を、トランスフェクションから48時間後に収集したウイルスに感染させた。ピューロマイシン（1.2ug／ml）選択下で7日後に安定なSALL4ノックダウンNTERA2クローンが得られた。Bmi-1を発現するpcDNA構築物を、NTERA2細胞系へのトランスフェクションのために用いた。
【０１８３】
Bmi-1プロモーター構築物および部位指定突然変異誘発
Bmi-1の5'隣接領域をプライマー
2010528620.tif 000024
を用いて増幅して、各末端にそれぞれXhoI部位およびBglII部位を有する、開始コドンATGの上流のヌクレオチド（Nt）-1からNt-2102までのフラグメントを作製した。ESCから単離したマウスゲノムDNAをテンプレートとして用いた。増幅されたPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）フラグメントを、プロモーターを欠くpGL3-基本ルシフェラーゼレポータープラスミド（Promega, Madison, WI）中にクローニングして、プラスミドBmi-1（P2102）（すなわち、Nt-1〜-2102、図1参照）を作製した。Nt-1から-1254、-683、-270および-168までのプロモーター融合レポーターフラグメント（P1254、P683、P270およびP168）を、Bmi-1と同じ様式で作り出した。-168-270配列を欠くBmi-1-Lucプロモーター構築物P683およびP1254の欠失突然変異体を、QuikChange II突然変異誘発キット（Stratagene, La Jolla, CA）を製造元のプロトコールに従って用いて作製した。
【０１８４】
siRNA構築物
SALL4のダウンレギュレーションのために、ヒトSALL4配列の異なる領域を標的とする60bpオリゴヌクレオチドの3種類のセットを合成した。これらのフラグメントを、pSuper-retro-puro（OligoEngine, Seattle, WA）のHindIII部位およびBglII部位にクローニングして、以下のように命名したpSuper-retro／SALL4-1 siRNA構築物を作製した。
2010528620.tif 000025
【０１８５】
レトロウイルスの作製
Phoenixパッケージング細胞（ATCC：SD-3443）を、10％ FBSを有するDMEM中で、5％ CO2下にて37℃で増殖させた。組換えレトロウイルスは、対照RNAi配列またはSALL4を対象とする配列を含むpSuper構築物をトランスフェクトしたPhoenixパッケージング細胞系を用いて産生させた。ウイルス上清をトランスフェクションから48時間後に収集し、0.45μmフィルターを通して濾過した。
【０１８６】
Bmi-1プロモーターアッセイ
Bmi-1プロモータールシフェラーゼアッセイは、Dual-Luciferase Reporter Assay System（Promega, Madison WI）を用いて行った。トランスフェクションから24時間後に、受動的溶解（passive lysis）緩衝液の使用によってHEK293細胞の抽出を行った；20μlのアリコートをルミノメーターによる蛍光測定のために用いた。データは、ホタルとウミシイタケのルシフェラーゼ活性の比（Fluc／Rluc）として表される。これらの実験は2回ずつ行った。
【０１８７】
ChIPアッセイ
HEK-293 32D細胞（6ウェルプレート中に1×106個／ウェル）を、一過性トランスフェクションの存在下または非存在下で、ChIP Assay Kit（Upstate, Charlottesville, VA）を製造元のプロトコールに従って用いて処理した。手短に述べると、ホルムアルデヒド（37％ホルムアルデヒド／mlを27μl）を添加することによって細胞を架橋させ、10分間インキュベートした。続いて、クロマチンを超音波処理して平均サイズをおよそ500bpとし、SALL4抗体、免疫前血清または抗HA（血球凝集）抗体を用いて免疫沈降させた。ヒストン修飾物であるヒストンH3トリメチルK4およびヒストンH3ジメチルK79に対する抗体は、Abcam（Cambridge, MA）から購入した。ヒストン-DNA架橋は、65℃で加熱した後にプロテイナーゼK（Invitrogen, Carlsbad, CA）による消化を行うことによって逆行させた。PCR精製キット（Qiagen, Valencia, CA）を用いることによってDNAを回収し、続いてPCRまたはQRT-PCR（定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応）のために用いた。
【０１８８】
ヒト白血病試料およびSALL4ノックアウト
ジメチルスルホキシド（DMSO）中にて凍結させた白血病試料および正常試料を、The University of Texas M.D. Anderson Cancer Center, Houston, TXのファイルから、承認された施設内審査委員会（Institutional Review Board）のプロトコールの下で収集した。すべての腫瘍の診断は、造血器新生物に関するFAB分類に準拠した形態的および免疫表現型的な基準に基づいて行った。SALL4ノックアウトマウスの作製は記載されている（8）。
【０１８９】
細胞培養
W4マウスESC（Gene Targeting Core Facility, University of Iowaにより寄贈）を、フィーダー上の条件またはフィーダー無しの条件で、以前に記載した通りに培養した。Sall4+/-欠損ESCに対しては、G418を培地に125ug／mlの濃度で添加した。
【０１９０】
ChIP-チップアッセイ
全プロトコールがNimbleGen Systems Inc（Madison, WI）により提供された。手短に述べると、細胞を増殖させ、ホルムアルデヒドを用いて架橋させて、超音波処理により剪断した。抗SALL4抗体およびウサギ血清（参考文献）をクロマチン免疫沈降（CHIP）のために用いた。CHIP精製したDNAを平滑末端化し、リンカーと連結させて、低サイクルのPCR増幅に供した。プロモータータイリングアレイ（RefSeqアレイ）は、NimbleGenにより製造された。RefSeqマウスプロモーターアレイのデザインは、各プロモーター領域の2.7kbを含む単一のアレイである（ビルドMM5による）。プロモーター領域は、その領域の配列組成に応じて、概ね100bp間隔の50〜75merプローブでカバーされる。アレイのハイブリダイゼーションおよびデータの抽出はNimbleGenの標準的な手順に従って行った。
【０１９１】
予測した結合部位の確認は、アレイに対して適用したアンプリコンの定量的リアルタイムPCR分析を用いて行った。
【０１９２】
マイクロアレイのデザインおよび分析
受注生産のマイクロアレイを、NimbleGgen（Madison, WI）によりマスクレス（maskless）アレイ合成を用いて製造させた。このデザイン上のマウス遺伝子（n＝42558）は、RefSeq収集物中のマウス（Mus musculus）エントリーから選択した。重複を除去するために、BLASTプログラムを用いて各遺伝子を他のすべてのものと比較した。各標的について、各標的の3' 1kbから10個のプローブ対を選択した。プローブは標的領域の全長にわたって均等な間隔で配置し（≦1kb）、このため正確な間隔は標的配列の長さに依存した。各プローブの長さは24ヌクレオチドとした。完全マッチプローブのそれぞれに対して、単一のヌクレオチドに違いのあるミスマッチプローブも存在させた。
【０１９３】
標識cDNAをマイクロアレイ上のオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせた。洗浄の後に、アレイをストレプトアビジン-Cy3結合物（Amersham Biosciences, Piscataway, New Jersey）で染色し、続いて洗浄および吹き付け乾燥（blow dry）段階を行った。スライドをGenePix 4000Bマイクロアレイスキャナー（Axon Instruments, Union City, California, USA）を用いてスキャンし、TIFファイルから抽出されたフィーチャー（feature）強度を、NimbleGen（Madison, Wisconsin, USA）によって開発された特許権のあるアプリケーションを用いるスキャナーソフトウエアによって計算した。このアプリケーションは、各フィーチャーを既定するピクセル（3×3グリッドのピクセル）に関して平均シグナル強度を計算する。各遺伝子に関する強度は、各標的に対して特異的な完全マッチプローブに関する強度の平均から、ミスマッチプローブの強度の平均を差し引くことによって計算される。そのセットに関する平均との差が3SDを上回るプローブをそのセットから除去して、平均を再計算した。平均差（再計算された平均）を以降の分析のために用いた。データ分析はPANTHERおよびIngenuity Pathway Analysisを用いて行った。
【０１９４】
免疫共沈およびウエスタンブロット法
Oct4／SALL4とNanog／SALL4の相互作用については、プラスミドpcDNA3／SALL4-HAをW4 ES細胞にトランスフェクション導入して、SALL4-HA融合タンパク質を発現させた。Lipofectamine 2000試薬（Invitrogen）を、提供された説明書に基づいて用いた。36時間後に、細胞を収集してCelLytic M Cell Lysis Reagent（Sigma）で処置した。免疫共沈はCatch and Release v2.0 Kit（Upstate）の推奨に従って行った。最初に、W4溶解物を抗HA抗体（Bethyl Laboratories Inc.）またはIgGとともに25℃で40分間インキュベートし、続いてビーズに結合したタンパク質を洗浄して、0.5％ β-メルカプトエタノールを含む変性溶出緩衝液によって溶出させた。ウエスタンブロットは記載された通りに行った（参考文献）。その膜を、1：300希釈したOct-3／4抗体（H-134）、Nanog抗体（M-149）（いずれもSanta Cruzによる）またはSALL4抗体とともに4℃で一晩インキュベートした。検出はSuperSignal West Pico溶液（Pierce）を用いることによって行った。
【０１９５】
SALL4 loxP導入（floxed）アレルおよびSALL4+/-欠損ES細胞の作製
SALL4-floxベクターは、5' NotI-SalI 2kbフラグメント、3' BamHI／loxp-PacI-KpnI 3.2kbフラグメントおよびPacI／KpnI 3.4kbフラグメントを、FRT配列およびloxP配列によって挟まれたpGK-Neoを含むベクター中に組み入れることによって構築した。LoxP配列は、Cre処置するとエクソン2が切り出され、6つのジンクフィンガーモチーフの破壊が結果としてもたらされるように配置した。これらのES細胞を、Ad-CMV-CreまたはAd-CMV-GFP（#1045および#1060 Vector BioLabs）に、製造元の手順に従って感染させた。従来のSALL4欠損ES細胞は、当技術分野で公知の方法によって樹立した。
【０１９６】
実施例1：SALL4の分子解析
ヒトSALL4の2つの選択的スプライシングアイソフォームの分子クローニング
SALL4の2つの全長転写物は、ヒト胎児腎臓Marathon-Ready cDNA（BD Biosciences Clontech）をテンプレートとして使用し、5’および3’RACE-PCR（5’および3’cDNA端ポリメラーゼ連鎖反応の高速増幅）によって単離した。
【０１９７】
単離されたより大きいcDNAフラグメントの配列分析は、強いコンセンサスインターフェロン配列から始まり、1,053のアミノ酸をコードすることが予期された、SALL4Aと指定される単一の大型オープンリーディングフレームを明らかにした。SALL4Bに指定されるSALL4の他のスプライシング変異体は、全長SALL4Aのアミノ酸385〜820に対応する領域が欠けていた（図1a）。SALL4B cDNAによってコードされる推定タンパク質は、617のアミノ酸から成ることが予期された。
【０１９８】
これら2つの明白なスプライシング変異体が人工物に起因するかもしれないという可能性を除外するため、ヒトゲノムの対応配列を含む両方の変異型mRNA配列を比較した。SALL4Aは全エクソン（1〜4）を含んだが（図1a）、SALL4Bはエクソン2の3’の広い部分が欠けていた。両方のエクソン-イントロンスプライス部位は、G-T-A-G規則を満たした。両方のスプライシング変異体には同じ翻訳リーディングフレームがあったが、SALL4B mRNAは内部欠損のあるタンパク質をコードした。SALL4Aは8つのジンクフィンガー領域を含んだ一方で、SALL4Bには3つのジンクフィンガー領域があった。
【０１９９】
ヒト組織におけるSALL4アイソフォームの発現パターン
SALL4の選択的スプライシングパターンは、種々のヒト組織における逆転写（RT）-PCRによって描かれた。遍在GAPDH遺伝子cDNAのフラグメントは、対照として増幅した（図1b）。より長いスプライス変異体を表す315bpのフラグメントであるSALL4Aは、一部組織中で増幅し、様々な発現レベルを達成した。SALL4B変異体は、発現の様々なレベルにおいてあらゆる組織中に存在した。造血組織におけるSALL4発現についての詳細な研究は、次の結果で説明される。
【０２００】
SALL4抗体の作製ならびにSALL4タンパク質産物の識別
SALL4遺伝子産物を識別し、SALL4変異体の存在を確認するため、SALL4の合成ペプチド（アミノ酸1〜13）に対するポリクローナル抗体を開発した。両方のSALL4変異体に共通であるため、本領域を選んだ。アフィニティ精製したSALL4ペプチド抗体は、ヒト腎臓全溶解液中の2つの内在性タンパク質を特異的に認識した。2つのタンパク質は約165kDaと95kDaであり、それぞれCos-7細胞において過剰発現されたSALL4AおよびSALL4Bの分子量と同一であった（図1c）。本抗体によるウエスタンブロット法は、SALL4アイソフォームにはmRNAレベルで認められるものと同様であった異なる組織分布があったことを確認した（図1b-B）。
【０２０１】
ヒト原発性AMLおよび骨髄性白血病細胞株におけるSALL4遮断の不全
SALL4が位置する染色体領域20q13は、腫瘍に頻繁に関与するため、AMLにおけるSALL4のmRNA発現を調べた。SALL4の発現は、AML試料由来の骨髄細胞（N＝15）、骨髄性白血病細胞株（N＝3）においてリアルタイムRT-PCRによって定量的に調査し、精製CD34＋幹細胞／前駆細胞プール（Cambrexより購入したHSC／HPC）からの非腫瘍性造血性細胞、正常骨髄（N＝3）、および正常末梢血（N＝3）と比較した。アイソフォーム特異的プライマー（図2a参照）を使用すると、SALL4Bおよび／またはSALL4Aのいずれかまたは両方は、AML試料または骨髄性白血病細胞株中で遮断（SALL4B）またはダウンレギュレーション（SALL4A）されなかった。データは、GAPDHの内在性発現に対して標準化し、精製CD34＋細胞中のSALL4AまたはSALL4B発現のレベルに対して調整した。正常骨髄におけるSALL4Bの完全な欠損とは対照的に、原発性AMLにおけるその発現は、15のAML試料中13で、かつ3つ全ての骨髄性白血病細胞株で遮断されなかった。原発性AML試料におけるSALL4Aの中央標準化レベルは正常骨髄よりも40倍高かった。骨髄性白血病細胞株KG.1、Kasumi-1およびTHP-1におけるSALL4A発現は、正常骨髄よりもそれぞれ、8倍、25倍、および240倍高かった。興味深いことに、SALL4AおよびSALL4B発現レベルは両方とも、正常骨髄と比べて、AML試料の60％および3つ全ての細胞株において増加した。AML試料の残りの40％では、SALL4AまたはSALL4Bのいずれかがダウンレギュレーションしなかった。
【０２０２】
ヒト原発性AMLにおけるSALL4タンパク質の構成的発現
認められた異常SALL4発現がタンパク質レベルでも存在するかどうかを調査するため、AMLクラスM1からM5（FAB分類）に及ぶ81のAML試料を調べた：Ml（N＝20）、M2（N＝27）、M3（N＝8）、M4（N＝16）、M5（N＝3）、およびAML非特定（N＝7）で、正常骨髄、胸腺および脾臓の一部の試料、ならびに正常CD34＋HSC／HPCであった。
【０２０３】
正常骨髄、脾臓および胸腺は、検出可能なSALL4タンパク質発現を示さず、正常CD34＋HSC／HPCは、陽性であるがより弱いSALL4タンパク質染色を呈したが、より強いSALL4発現が白血病細胞の核において検出された（図2b-F）。全81のAML試料は異常SALL4発現を示し、最も強い染色はAML-M1および-M2で見られた。これらの所見は、リアルタイムRT-PCRによって実証されたSALL4のmRNA発現レベルと一致した（図2a）。データは、SALL4がCD34＋HSC／HPCにおいて存在し、成熟顆粒球およびリンパ球においてダウンレギュレーションされたことを示唆した。結果として、白血病におけるSALL4の構成的発現は、白血病性芽球が分化および／または通常HSCで見られる特性を獲得することを防いだ可能性がある。
【０２０４】
全長ヒトSALL4Bを構成的に発現するトランスジェニックマウスの作製
SALL4の構成的発現がAMLを誘発するのに十分であるかを直接的に試験するため、SALL4トランスジェニックマウスモデルを作製した。CMVプロモーターはヒトSALL4Bの617のアミノ酸をコードするcDNAに融合し（図3a-A）それは以前に調べたあらゆる組織中で発現されたため選ばれた（図1b-B）。CMVプロモーターは、ほとんどのネズミ臓器においてヒト遺伝子を異所的に発現させるために以前に使用した。RT-PCR増幅を行い、トランスジェニックマウスにおける野生型（WT）全長SALL4Bの過剰発現を調べた。
【０２０５】
SALL4B転写物は、脳、腎臓、肝臓、脾臓、末梢血、リンパ節、および骨髄を含む、トランスジェニックマウスからの種々の組織において検出された（図3a-B）。生後3週間の異常歩行および関連水頭症が、複数系統からのトランスジェニックマウスの20％において認められ、60％に多嚢胞腎臓が認められた。これらの所見は、SALL4Bが神経および腎臓発生において重要な役割を果たすことを示唆する。
【０２０６】
SALL4BトランスジェニックマウスにおけるMDS様症状およびAML
6つ全ての系統からの14匹のトランスジェニックマウスのコホートにおける血液学的異常のモニタリングは、6〜8月齢で全マウスに明白なMDS様特徴があったことを明らかにした。過分葉好中球および偽ペルゲル・フェット様細胞を含む、増加した数の未熟芽球および多くの異型および異形成白血球が、末梢血塗抹標本上で見られた（図3b）。有核赤血球および巨大血小板、ならびに二核赤血球前駆体および低分葉巨核球などの赤血球および巨核球異形成の特徴も存在した。
【０２０７】
これら14匹のマウスのうち6匹（43％）が最終的に急性白血病に進んだ（表1）。
【０２０８】
（表１）SALL4BトランスジェニックマウスにおけるMDS様／AMLの概要
2010528620.tif 000026
【０２０９】
肺、腎臓、肝臓、脾臓、およびリンパ節を含む、多くの臓器の白血病の浸潤は、疾患の悪性度を強調した（図3c）。白血病芽細胞は、CD34、c-kit、Gr-1、Mac-1、MPO、および非特異的エステラーゼが陽性であったため、元来は骨髄性と考えられ、B細胞（B220およびCD19）、T細胞（CD4、CD8、CD3、およびCD5）、巨核球（CD41）、および赤血球（Ter119）マーカーで陰性であった（図3d）。
【０２１０】
SALL4B誘発性AMLは移植可能であった
約6週間目の発症を伴う進行性致命的AMLが、皮下注射によるSALL4B誘発性AML細胞の連続移植後に、免疫不全NOD／SCIDマウスに発生した。移植された疾患は、多臓器への転移によって特徴付けられ、顕著な脾腫および肝腫脹を伴った（図3e）。
【０２１１】
SALL4Bトランスジェニックマウスにおける無効造血および過剰アポトーシス
若年SALL4Bトランスジェニックマウス（2〜6月齢）における血液学的異常の調査は、それらの末梢血が、骨髄異形成の特徴は最小だが、統計学的有意な白血球減少および好中球減少、ならびに軽度の貧血を示したことを明らかにした（表2）。
【０２１２】
（表２）SALL4Bトランスジェニックマウスおよび野生型対照からのCBC
2010528620.tif 000027
【０２１３】
これらのトランスジェニックマウスにおける血球減少の原因が産生上の問題に関連したかどうかを判定するため、それらの骨髄を検討した。骨髄試料は、WT対照と比較して、細胞充実度の増加および骨髄性細胞集団の増加を示した（図3f）（SALL4BトランスジェニックマウスにおけるGr-1／Mac-1二重陽性集団：67±16％、N＝10に対して、WT：55.3±4％、N＝11；P＝0.048）。
【０２１４】
過剰アポトーシスがヒトMDSにおける無効造血で中心的役割を果たすため、インビボおよびインビトロのSALL4トランスジェニックマウスにおけるアポトーシスを次に調べた。アポトーシスの増加が、一次骨髄（トランスジェニックマウスにおけるAnnexin V陽性、PI陰性集団：4.4±2.4％、N＝10に対して、WT：1.86±1.55％、N＝7；P＝0.03）および7日CFU（トランスジェニックマウスにおけるAnnexin V陽性、PI陰性集団：20.1±6％、N＝10に対して、WT：10.9±4％、N＝7；P＝0.002）の両方でSALL4Bトランスジェニックマウスにおいて認められた（図3fおよびg）。これらの所見は、骨髄中の骨髄系集団の増加にもかかわらず、これらのトランスジェニックマウスは、その骨髄において進行中の無効骨髄造血の後に、末梢血において統計学的に有意な低い好中球数を有するという事実を説明しうる。未熟細胞の集団の増加も、一次骨髄（SALL4Bトランスジェニックマウスにおけるc-kit陽性集団：10.2±1.3％、N＝14に対して、WT：6.5±2.5％、N＝10；P＝0.008）（図3f）および7日CFU（SALL4BトランスジェニックマウスにおけるCD34陽性集団：11±2.2％、N＝8に対して、WT：6.3±2.4％、N＝7；P＝0.002）の両方でSALL4Bトランスジェニックマウスにおいて認められた（図3g）。同様数の総コロニーがSALL4Bトランスジェニックマウス（平均＝51、N＝10）およびWT対照（平均＝40、N＝6）において認められた。しかし、ヒトMDS患者およびその他のMDSマウスモデルで報告されているように、増加した骨髄系コロニーおよび減少した赤血球系コロニーの集団（図3h）が、WT対照と比較してSALL4BトランスジェニックマウスCFUにおいて見られた。これらの結果は、SALL4Bトランスジェニックマウスにおける欠陥は、造血分化に影響する幹細胞／前駆細胞レベルにあることを示唆する。
【０２１５】
インビトロでのβ-カテニンへのSALL4AおよびSALL4Bの結合
SALL4が白血病誘発において影響を及ぼす場合のある潜在的シグナル伝達経路を次に探索した。ショウジョウバエにおいて、spalt（sal）は、Wntシグナル伝達の下流ターゲットである。SALL遺伝子ファミリーのもう1つのメンバーであるALL1は、β-カテニンと相互作用することが可能である。本相互作用に対する高親和性部位は、C末端二重ジンクフィンガー領域に位置する。SALL1のこの領域は、SALL4の領域とほぼ同一であることが分かった。本所見は、SALL4もβ-12カテニンに結合できたかどうかの調査を促進した。血球凝集素（HA）に付いたSALL4AおよびSALL4Bの発現構築物が生成された。図4aに示されるように、内在性β-カテニンは、HA単独ではなく、HA-SALL4AおよびHA-SALL4Bによってプルダウンされた。
【０２１６】
SALL4AおよびSALL4B両方によるWnt／β-カテニンシグナル伝達経路の活性化
β-カテニンとのSALL4アイソフォームの相互作用の機能的効果を調査するため、例示的なWntシグナル伝達経路を活性化するSALL4AおよびSALL4Bの潜在能力を判定するためのWnt応答要素の複数のコピーを含むルシフェラーゼレポーター（TOPflash；Upstate USA）を使用した。本レポーター構築物は、種々の細胞系においてWnt1によって能率的に刺激されることが示されている。TOPflashレポータープラスミドは、WntおよびそのWnt／β-カテニンシグナル経路の両方が存在したHEK-293細胞系に一過性に遺伝子導入した。TOPflashレポータープラスミドは、SALL4AまたはSALL4Bにもコトランスフェクトした。SALL4AおよびSALL4Bの両方によるWnt／β-カテニンシグナル伝達経路の有意な活性化は、ルシフェラーゼ活性の増加によって示された（図4b）。
【０２１７】
CMLの異なる段階におけるβ-カテニンおよびSALL4の同様な発現パターン
調節不全なWnt／β-カテニンシグナル伝達は、LSCの発生に関与することが知られている。LSC自己複製へのβ-カテニンの関与の最もよい証拠は、CML芽球化転換の研究によってもたらされる。Wntシグナル伝達は慢性期ではなく、CMLの芽球期に活性化されたことが実証されており、β-カテニンの活性化などの調節不全なWntシグナル伝達がCMLのGMPに自己複製の特性を与えて、これらに芽球化転換をもたらした可能性があることが結論づけられた。
【０２１８】
SALL4とβ-カテニンとの間の潜在的な相互作用、およびショウジョウバエにおけるWntシグナル伝達の下流ターゲットとしてのspaltの位置を所与として、異なる段階でのCMLにおけるSALL4タンパク質発現を調べた。SALL4発現は、芽球期CMLに存在したが（N＝12,75％）、慢性期には存在しなかった（N＝11,100％）（図4c）。芽球が増加する加速期（N＝6,10％）では、SALL4を発現する未熟芽球が、好中球などの非染色性成熟骨髄性細胞のバックグラウンド上に認められた。
【０２１９】
OCT4プロモーターに対するSALL4の効果
OCT4に対するSALL4の効果を識別するため、細胞、OCT4-Luc構築物をレニラプラスミドおよび増加する濃度のSALL4Bにコトランスフェクトした（図5）。図が示すように、増加するSALL4Bは、OCT4プロモーター活性を8倍以上増加させた。
【０２２０】
OCT4がSALL遺伝子メンバープロモーターの活性を刺激するかどうかを判定するため、プロモーター構築物（pSALL1、pSALL3、およびpSALL4）をHEK-293細胞中のOCT4にコトランスフェクトした。データ（図6）に図示されるように、24時間のトランスフェクション後のあと、OCT4の過剰発現は、pcDNA3ベクター対照と比較すると、SALL遺伝子メンバーであるSALL1、SALL3、およびSALL4のプロモーター活性を際立って刺激した。また、この活性化は少量の過剰SALL4の存在により完全に阻止された（図10）。
【０２２１】
SALLファミリーメンバータンパク質によるSALLプロモーターの自己調整があったかどうかを判定するため、SALL4-Lucをレニラレポーターと共にコトランスフェクトし、SALL4AまたはSALL4B発現プラスミドのいずれかはHEK-293およびCOS-7細胞である（図7）。図に示されるように、SALL4（AおよびBアイソフォームの両方）は、異なる細胞系においてそれ自身のプロモーター活性を抑制する。さらに、本自己抑制は用量依存性である（図8参照）。SALL4プロモーターとのSALL4の比率が6：1に達した時、プロモーター活性は、基礎レベルと比較して約3.5倍低下した。本データは、SALL4が自己抑制機能を持つことを示す。このことは全てのSALLメンバーに該当するわけではなく、例えば、SALL1はそのプロモーターの自己抑制を明示しない（図12）。
【０２２２】
データは、SALL1およびSALL3プロモーターが外から加えられたSALL4によって際立って活性されたことも示し（図9参照）、SALL4が胚幹細胞機能を伴うSALL遺伝子ファミリーの他のメンバーを調整することができることを示す。
【０２２３】
SALL4プロモーターに対するOCT4の刺激はSALL4によって完全に阻止することが可能であるため（図10）、SALL4を調べて、その他のSALLメンバープロモーターに対するOCT4の活性化を抑えるかどうかを判定した。図11に示されるように、SALL4は、その他のSALLメンバープロモーターのOCT4活性化も阻止した。
【０２２４】
成体幹細胞および胎生期癌におけるSALL4
幹細胞とその分化子孫との間で区別することが可能であるマーカーの欠如のため、組織幹細胞集団の特徴は困難なままである。多くの組織にとって、分子マーカーの一団は、幹細胞コンパートメントを画定するように開発されている。
【０２２５】
本データは、SALL4が多分化能および自己複製における胚幹細胞の主要調節因子であることを示す。例えば、胎生期癌は、初期胚幹細胞の表現型を示し、潜在的多能性を持つ。したがって、免疫組織化学による、この種類の腫瘍におけるSALL4タンパク質の発現を調べた。免疫組織化学データは、胎生期癌の全腫瘍細胞が核染色を示したが、全ての非腫瘍細胞が陰性だったことを決定的に示した。これらの結果は、SALL4は、正常および悪性の胚生殖細胞および胚幹細胞に対する特異的マーカーとして使用することが可能であることを示唆する。
【０２２６】
SALL4がきわめて初期の胚幹細胞において発現され、胎生期癌がこれらの細胞の変換より生じることが報告されていることを考えると、免疫組織化学は、a）正常乳腺小葉中のSALL4陽性細胞が上皮の2％未満を占め、b）乳がん試料において、細胞の集団または散在性細胞におけるSALL4タンパク質発現が認められたことも示す。さらに、SALL4タンパク質は、正常乳房上皮細胞および乳がん細胞の核において発現された。また、この多能性の遺伝子発現は、前立腺および肺などのその他の正常成人組織、およびSALL4抗体を伴うこれらの組織から生じる癌において認められた。気管支上皮および前立腺房、およびそれらの間質細胞における少数のSALL4発現細胞の存在が認められ、かつ、SALL4が、胸の小葉性上皮細胞と同様の頻度で正常前立腺および肺において発現したという所見が認められた。また、前立腺がんにおける散在性腫瘍細胞は、SALL4抗体による免疫組織化学研究によってSALL4タンパク質を発現した。
【０２２７】
上記の実施例は、（1）抗SALL4抗体による免疫染色は、胎生期癌の識別において有用な診断ツールである、（2）SALL4の発現は、一部のヒト幹細胞およびがん細胞において見られる、（3）ヒト組織中のSALL4発現細胞の識別は、幹細胞、その前悪性クローン、および悪性細胞を識別するために使用することが可能である、（4）SALL4は、胚幹細胞、成体幹細胞およびがん幹細胞に対する理想的なマーカーの代表例である、ということを明らかにする。
【０２２８】
実施例2：SALL4はES細胞における主要なマスター調節因子である
増加しつつある証拠により、Sall4がES細胞の運命の決定を司る上で極めて重要な役割を果たすことが示されてきている。SALL4は胚発生の初期に発現され、Oct4のそれと同様の発現パターンを呈する。SALL4-ヌルES細胞は有意に低下した増殖を呈し、SALL4短鎖干渉性RNAのマウス接合体へのマイクロインジェクションは、着床前にSALL4およびOct4 mRNAの減少を結果的にもたらした。これらの所見により、胚細胞におけるSALL4の包括的下流標的の研究が促された。ChIP-チップアッセイを用いて、マウス胚性幹細胞系W4においてSALL4結合遺伝子のゲノムスケールでのマッピングが行われた。NimbleGen Systems Incによって供給されたRefSeqプロモータータイリングアレイを用いて、各プロモーター領域の2.7kb領域（転写開始部位から上流の2kbおよび下流の500bp）をプロービングした。W4細胞由来のSALL4クロマチン免疫沈降DNAを有するこれらのアレイに対するハイブリダイゼーションによって大量の遺伝子結合が明らかとなり、合計5,256種の遺伝子の結合がみられた。PANTHER分類体系に基づくこれらのSall4結合遺伝子の分析により、分類された遺伝子の約73％が、増殖および自己再生、または分化および発生のいずれかに関与することが示された。
【０２２９】
最近の公開データに基づき、SALL4による幹細胞遺伝子結合パターンをゲートキーパー遺伝子Oct4およびNanogのそれと比較した。
【０２３０】
同様のChip-PETアッセイから得られたデータは、Oct4が1083種の遺伝子のみと結合し、Nanogが3006種の遺伝子と結合することを示している。CHIP-PET方法はかなり高いプローブ分解能を有するにもかかわらず、これらの結合数はSall4のそれよりも著しく少ない。
【０２３１】
発生の過程で、SALL4およびOct4はいずれも胚発生の極めて初期に発現される。SALL4発現はすでに2細胞期にOct4とともに認められるが、一方、Nanogは発生が胚盤胞期に達してから発現される。より早期の発現および広範囲にわたる遺伝子結合は、SALL4がES細胞の特徴の調節においてより広範かつより強力な役割を果たすことを示唆する可能性がある。
【０２３２】
次に、ES細胞におけるOct4、NanogおよびSALL4結合性の遺伝子の分布を決定することを目指した。この3つの遺伝子群の比較により、SALL4がOct4の標的でもある合計229種の遺伝子と結合することが示され、本発明者らはこれらの遺伝子を共結合性（co-bound）または共占有性（co-occupied）と呼ぶことにする。これはOct4が結合した遺伝子全体の21％に相当する。同様に、SALL4は535種のNanog標的遺伝子と共結合し、これはNanogの結合部位全体の18％に相当する（図13）。Oct4、SALL4およびNanogのすべてによって共占有される遺伝子は合計118種ある。PANTHER分類により、これらの共占有性遺伝子の79％が自己再生／増殖プロセスまたは発生／分化プロセスのいずれかに属することが示されている。これらの所見は、多くの多能性維持遺伝子が、少なくともOct4、Sall4およびNanogからなる複雑なネットワークによって調整される可能性を提起するものである。
【０２３３】
ES細胞におけるSALL4とOct4およびNanogとの相互作用
Sall4-Oct4とSALL4-Nanogとの間で遺伝子プロモーターの共占有および遺伝子発現パターンが類似していることから、Oct4-SALL4-Nanog複合体が存在すると考えた。この目的に向けて、一過性にSALL4-HAをトランスフェクトしたES細胞の抽出物を用いて、Sall4およびOct4に関する免疫共沈実験を行った。ウエスタンブロットの結果に見られるように（図13bおよび13c）、SALL4-HA融合タンパク質の過剰発現が抗HA抗体および抗SALL4抗体の両方によって検出された（後者は提示せず）。HA抗体で処置した細胞溶解物では、固有のほぼ45kdのバンドが首尾良く検出された；そのサイズは内在性Oct4対照と合致する。対照的に、IgG陰性対照は同じ抽出物中にOct4バンドを生じることができず、このことは直接的なSall4-Oct4相互作用を指し示している（図13bおよび13c）。同じ方法を用いて、同じ抗HAでプルダウンした細胞溶解物中でSall4／Nanog相互作用も確かめられた（図13bおよび13c）。これらの結果に基づくと、Oct4、SALL4、Nanogおよびおそらくは他のものが、内部相互作用を通じてESCの特徴の調節に寄与する複合体を形成するとしても驚くには当たらない。このことはSall4、Oct4およびNanog標的遺伝子間での著しい共占有によっても補強される。Oct4-SALL4-Nanog複合体に関する知見を広げるためには、さらなる研究が依然として必要である。
【０２３４】
分化および多能性に関係する遺伝子
このデータに基づくと、SALL4は分化を招く遺伝子を抑圧し、多能性のために必要な遺伝子を活性化すると思われる。これに関して、そのいくつかが異なる発生系列で特異的に発現される、細胞分化のために必要なものとして同定されたSALL4結合性遺伝子の217種を分析した。図14に見るように、SALL4は外胚葉、内胚葉、中胚葉および栄養外胚葉を含む系列のすべてからの複数のマーカーと結合し、このことは細胞分化および多能性の調節における直接の関与を示唆する。本発明者らの条件的Sall4ノックアウトES細胞系を用いて、本発明者らは内在性SALL4ノックダウン後のこれらのマーカー発現レベルの変化を検証することができた。1コピーのSALL4アレルにloxPが導入されたW4クローンEC 228を、Creを発現するアデノウイルスで9時間にわたり処置し、遺伝子発現をqPCRによって評価した。分化分析のために、本発明者らは各細胞系列に対して4つの候補マーカーを選んだ。
【０２３５】
3つの別々の実験からのデータは、Sall4発現レベルが一貫して約50％シャットダウンされたことを示しており、このことはEC228が首尾の良い安定な遺伝子標的化システムであることを裏づける。興味深いことに、外胚葉、内胚葉および栄養外胚葉に関する被験マーカーはすべてSALL4によって抑制されたが、3つの中胚葉マーカーのうち2つは活性化される。換言すれば、これはSALL4が外胚葉、内胚葉および栄養外胚葉の分化を抑制する役割を有する一方で、中胚葉系列への分化を活性化することを示す（図14b）。
【０２３６】
本発明者らはまた、多能性を維持することが知られている遺伝子に対するSALL4の結合についても評価した。本発明者らがSALL4標的遺伝子に共通するものとして同定したのは15種の多能性遺伝子（Assou et al, Stem Cells）のみであり、このことはSALL4が多能性の維持にはほとんど役割を果たさず、その反対に分化を阻害するように機能することを示唆する。
【０２３７】
ES細胞の多能性および増殖はSALL4発現に依存する
以前に記載した通り、胚性内胚葉ES細胞をSALL4の欠損した胚盤胞（blastocyts）から樹立することはできない。W4-EC228クローンをフィーダー無しのT25フラスコで培養し、Ade-Creで処置した。処置から9時間以内に形態変化が観察された。ESCのアルカリホスファターゼ染色が実証された。層マーカーの分析はqPCRによって行った。
【０２３８】
Sall4はPRC1およびPRC2の標的遺伝子と結合する
ポリコーム抑制複合体（PRC）が最近報告されており、これは2つの別個の群からなる。PRC1はBmi-1、Rnf2、PhcIおよびHPCタンパク質を含む10個を上回るサブユニットからなり、一方、PRC2はEzh2、Eed、Suz12およびRbAp48を含む。PRCは、ヒストン3上のリジン27（H3K27）のメチル化といった後成的（epigenic）イベントを通じてES細胞の多能性を維持し、それ故に分化に関係するアクチベーターを抑制する。SALL結合遺伝子がどのようにPRCと関係するかをより良く理解するために、SALL4によるゲノム結合パターンを、以前に発表されているポリコーム遺伝子のそれと比較した。4種の遺伝子Rnf2、Phc1（PRC1から）、Suz12およびEed（PRC2から）がマウスES細胞における512種の共通遺伝子を共占有し、その多くが発生において重要な役割を有する転写因子をコードすることは当技術分野で公知である。これらのデータとの直接比較により、Suz12標的遺伝子の28.3％（360／1271）およびRnf2標的の27.8％（339／1219）がSALL4によって共結合されることが示されている。これらの2つの群の共通遺伝子の分析により、それらの75％超が増殖／自己再生または分化／発生に関与することが示されている。このことは、PRC1、PRC2およびSall4がESCの特徴を司る遺伝子の大規模なブロックと共結合性であることを示す（図15a）。
【０２３９】
2種のPRC遺伝子（Suz12、Rnf2）により結合される転写因子を選択し、SALL4により結合されるものと比較した。Suz12は固有の転写因子Lrch4およびLhmx2と結合するが、それはSALL4またはRnf2のいずれかと重複する部位を多く共有している。同じことがRnf2についても言える（図15b）。Rnf2、Suz12およびSall4により結合される遺伝子には、複数のホメオボックス遺伝子、Zic1、Gata4およびLef1が含まれる。SALL4は、その多くが発生に関与する339種の転写因子とそれが結合するという点で例外的である。実際に、本発明者らは、SALL4が、ポリコーム結合性とは関係なく、HOX、FOX、F-ボックスおよびT-ボックスファミリーのメンバーを含む、ホメオボックス遺伝子の大規模な群およびその他の発生上重要な遺伝子と結合することを見いだした（図15bおよび表4）。
【０２４０】
（表４）Sall4により結合される枢要な発生遺伝子
2010528620.tif 000028
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【０２４１】
K4K27二価ドメインはSALL4により結合される
最近、二価ドメインの存在が、H3K4遺伝子の活性化とH3K27遺伝子の抑圧とのバランスを通じて多能性を調節していることが報告されている。本発明者らのデータを以前に発表された二価ドメインと比較することにより、本発明者らは、Sall4が、本検討で同定された非重複性の二価ドメインの40％超（54／122）と結合することを示す。興味深いことに、SALL4は、二価ドメインによってカバーされる遺伝子を別とすれば、3種のK27結合性遺伝子および27種のK4遺伝子のみと結合する。このことはSall4が、メチル化の活性化と抑圧のバランスを通じて発生上重要な遺伝子の選ばれた領域を制御している可能性を示す。しかし、SALL4はある種の遺伝子の活性化においてより大きな役割を果たしているかのように思われる。
【０２４２】
遺伝子が二価ドメインを伴う場合には、それらは、K4メチル化を活性化することよりも発現に対して顕著な影響を及ぼすK27でのメチル化に起因して、低い発現レベルを有することが示されている。このため、本発明者らは、この検討で同定された54種の遺伝子がSALL4発現細胞では低い発現レベルを有すると予想しうると考えられるが、SALL4シャットダウンの影響を予測することはできない。
【０２４３】
SALL4はESの分化および系列特異化を制御する重要なシグナルを標的とする
胚発生の過程における多能性を維持する上で重要な役割を果たす枢要なシグナル伝達経路には、STAT3、Notch、Nodal、TGFβおよびWntシグナル伝達経路が含まれる。実際に、SALL4はこれらの経路のそれぞれにかかわる遺伝子に対して結合性である（図16）。Wntシグナル伝達経路は胚発生およびがんにおいて重要な役割を有し、一方、STAT3経路は、LIF／gp130受容体複合体に対するLIF結合後のマウスESC自己再生のために必要な枢要なシグナルである。骨形成タンパク質（BMP、TGFβ）シグナル伝達は、中胚葉の誘導、造血および表皮形成を含む多様な胚イベントにおいて重要な役割を果たす。Nodal経路はTGF-βスーパーファミリーに属し、主として幹細胞に限局しており、軸パターン形成（axial pattering）の前にマウスエピブラスト内の多能性細胞を持続させる。Notchシグナル伝達経路は、細胞分化、増殖、形態形成および臓器形成を制御する多様な範囲の発生プロセスに影響する。85種を上回るSALL4結合遺伝子は、Wnt経路の内部に、または下流標的としてかかわるため、本発明者らはこの経路を以降の分析のための例として用いることにする（下記参照）。
【０２４４】
ChIP-チップおよび遺伝子発現の比較
ゲノムワイドの発現プロフィールに基づき、Kimら（Nature 2005）は、標的遺伝子の発現を解明するために、富化している結合遺伝子を4つのカテゴリーに分類した。本明細書では、どのSALL4結合遺伝子が真にSALL4レベルによって調節されるかを確かめるために、同様の戦略を内在性Sall4ノックダウンと組み合わせた。この目的に向けて、本発明者らの条件的ノックアウトW4-EC228クローンを発現マイクロアレイに対して用いた。定量的PCR検証により、RNAiまたは本発明者らが検討した他の従来のノックアウトに比べて、Creにより誘導されるSALL4ノックダウンがはるかに効率が高く、かつ一貫していることが指し示されている。Sall4ノックダウン後の発現プロフィールの比較により、結合遺伝子の46％が発現レベルの劇的な変化を有することが示されている。
【０２４５】
発現プロフィールから、SALL4をノックダウンした場合に多能性遺伝子の発現にはほとんど変化がなく、2種の結合性遺伝子のみがアップレギュレートされることが示され、このことはSALL4が多能性の維持にはほとんど役割を果たさず、その反対に分化を阻害するように機能することを示唆する。このことはSALL4が分化リプレッサーを有することを裏づける一方で、Sall4は多能性に対してほとんど影響を及ぼさないことを指し示している。
【０２４６】
SALL4がカノニカルWntシグナル伝達経路に及ぼす可能性のある影響を明らかにするために、本発明者らはCre処置後のEC228細胞における遺伝子発現の値を比較した。興味深いことに、発現プロファイリングにより、SALL4シャットダウンはその経路のメンバーのほぼすべてに影響を及ぼすことが示されている（図17）。SALL4のダウンレギュレーションは、より高レベルのβ-カテニン（β-cantenin）を結果的にもたらし、他のタンパク質との組み合わせで転写調節を変化させる。注目されることに、本発明者らは、SALL4がその経路内のダウンレギュレートされる遺伝子のいずれとも直接には結合しないことを示している。各経路において、SALL4は選ばれた遺伝子と結合し、他のものは介在機構を通じて調節する。
【０２４７】
本発明者らのデータは、他のデータとともに提示された場合、SALL4が（1）Oct4と同様の発現パターンを有し、Nanogよりも発生においてより初期に発現される、（2）Oct4またはNanogのいずれよりも多くの遺伝子のプロモーター領域と結合する、（3）欠損が存在する場合に分化を引き起こす、（4）Oct4およびNanogよりも多くの二価ドメインと結合する、ならびに（5）Oct4およびNanogと同じく致死性ノックアウトである、という系の概要を浮かび上がらせる。このことは、SALL4がESCの多能性の維持において中心的な役割を果たすことを示唆する。
【０２４８】
本発明者らは、SALL4がマウスESC内部の5,000種を上回るプロモーター領域と結合することを示している。Oct4およびNanogが結合するプロモーター領域を調べるために類似のChiIP-PETアッセイをマウスESCに対して行ったところ、このアッセイによる結果から、Oct4は約1,000種の遺伝子プロモーターと結合し、Nanogは約3,000種と結合することが示されている。SALL4がNanogよりもほぼ2,000種多い遺伝子と結合し、発生においてより初期に発現されることは興味深い。プロモーター結合は遺伝子の発現を示すわけではないため、これは意味がある可能性もあればそうでない可能性もある。本発明者らのデータに関して、本発明者らが言うことができるのは、SALL4が5256種のプロモーター領域と結合して、これらの遺伝子のX％の有意な転写物レベルの変化を引き起こすということである。
【０２４９】
Sall4ノックダウン細胞は自発的に分化する。以前の研究は、この分化が栄養外胚葉系列へのものであることを述べている。本明細書では、リアルタイムPCRに基づけば、ノックダウンは内胚葉、外胚葉および栄養外胚葉系列への分化を結果的にもたらすように思われる。これらの所見が異なるのは、トランスフェクションの方法が異なることが原因である可能性がある。本発明者らの実験では、発現レベルを内在性SALL4シャットダウンの直後に測定した。この点は、安定なトランスフェクションを用い、他の遺伝子がSall4シャットダウンを代償することを可能としている、以前に発表されたデータとは対照的である。
【０２５０】
二価ドメインは最近、後成的調節を通じて細胞分化および多能性に不可欠な役割を果たすことが報告されている。これらのドメインは、より小さなH3K4メチル化部位を保有するH3K27メチル化部位の大規模な領域からなり、それらは発生上重要な遺伝子に集中していることがしばしばである。興味深いことに、SALL4は報告されている二価ドメインの約40％と結合する。対照的に、Oct4は10％と結合し、Nanogは20％と結合する。二価ドメインの調節におけるこれらのタンパク質の役割は不明であるが、Sall4または別の調節遺伝子が、これらの二価ドメインでの後成的イベントの活性化と抑圧のバランスに役割を果たしているとの仮説を立てることはできる。Bernsteinらは、Oct4、NanogおよびSox2が、彼らが報告した二価ドメインのほぼ50％と結合することを最初に報告したが、この情報はヒトESCに基づいていた。このため、マウスESCにおける本発明者らの比較とは幾分異なる。
【０２５１】
ポリコーム群タンパク質は、ESCにおいて抑圧されている遺伝子を占有する。それらは、これらの遺伝子のかなり多くの部分をOct4およびNanogと共占有することが示されている。本明細書で、本発明者らは、それらがSALL4ともその多くの部分を共占有することを示す。興味深いことに、SALL4の結合は、それが各群からの全遺伝子の約30％と結合するため、PRC1またはPRC2を上回る選好性は示さない。しかし、Sall4は主として発生／自己再生プロセスと結合するため、これは直感的には意味がある。Suz12、Rnf2およびSALL4のそれぞれにより結合される転写因子を比較することにより、本発明者らは、SALL4によって調節される可能性のある遺伝子を同定することができる。これらには、ホメオボックス遺伝子の大規模な群、ならびに発生遺伝子Zic1、Gata4およびLef1が含まれた。
【０２５２】
これらの知見は、多くの興味深い疑問を最前面に押し出した。最近報告された二価ドメインに対するSall4の結合は極めて興味深く、さらなる検討の対象になると考えられる。同様に、遺伝子発現およびESCの多能性を調節するOct4-SALL4-Nanog複合体についての証拠に関しては多くの疑問が未回答のままである。このことは、複合的な標的遺伝子の発現レベルが安定的に維持される1つの機序を与える。
【０２５３】
実施例3：ES細胞およびLSCにおけるSALL4
SALL4は、LSCと正常HSCおよびES細胞の自己再生性との間の結び付きを生んでいる少数の遺伝子の1つである可能性がある。興味深いことに、骨髄を含むさまざまな臓器系において、SALL4タンパク質の発現は幹細胞および前駆細胞集団の存在と常に相関している。
【０２５４】
原発性ヒトAMLにおけるSALL4タンパク質の構成的発現およびMDSにおけるSALL4の発現は高悪性度（high-grade）形態に関連する
SALL4遺伝子の増幅は、デジタル式核型分類または定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Q-PCR）を通じての分析によって実証されているように、ヒトAML症例のおよそ75パーセントに認められる。観察された異常なSALL4発現がタンパク質レベルでも存在するか否かを明らかにするために、AMLサブタイプM1〜M5（FAB分類）の81個のAML試料を調べた。81個のAML試料すべてが異常なSALL4発現を示し、それはリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）増幅によって実証されたSALL4 mRNA発現レベルと一致した。正常な造血において、SALL4はCD34+ HSC／HPCに存在し、成熟顆粒球およびリンパ球ではダウンレギュレートされる。その結果として、白血病におけるSALL4の構成的発現は、白血病性芽球が分化すること、および／または自己再生性を獲得することを防止している可能性がある。
【０２５５】
悪性度の異なるMDSを含むヒト試料におけるSALL4タンパク質の発現についても、アフィニティー精製したSALL4抗体を用いる免疫組織化学を用いて調べた。SALL4陽性細胞が＞5パーセントというカットオフ値を用いたところ、低悪性度MDS群（RA、不応性貧血、およびRARS、環状鉄芽球を伴う不応性貧血）はすべて、SALL4に関して陰性であった。SALL4陽性‐免疫標識細胞が5パーセント超と定義される‐は、11件の高悪性度MDS群のうち10件で検出された。高悪性度MDS群をSALL4陽性細胞のパーセンテージに関してさらに対比した。RAEB-2（芽球増加を伴う不応性貧血-2）およびAML転換（AML transformation）は、比較的高いパーセンテージ（＞10パーセント）を示した。SALL4陽性細胞の最も高いパーセンテージが見られたのはAML転換であった（＞20パーセント）。このことは、SALL4発現細胞の高いパーセンテージがMDSにおける高悪性度形態と相関することを指し示している。
【０２５６】
SALL4BトランスジェニックマウスはヒトMDSの理想的なマウスモデルである
6匹のファウンダーすべてからの17匹のトランスジェニックマウスのコホートにおける血液学的異常のモニタリングにより、すべてのマウスが2カ月齢の時点で見かけ上MDS様の特徴を呈することが判明した。未熟芽球の数の増加、ならびに過分葉好中球および偽ペルゲル-ヒュエット様細胞を含む多くの異型および形成異常の白血球が、末梢血液塗沫標本で見られた。有核赤血球および巨大血小板、ならびに赤血球および巨核球の形成異常的な特徴、例えば二核赤血球前駆体および低分葉（hypolobulated）巨核球なども存在した。17匹のマウスのうち9匹（53パーセント）が、7〜15カ月齢となった後に最終的にAMLへと進行した。肺、腎臓、肝臓、脾臓およびリンパ節を含む多くの臓器の白血病浸潤は、この疾患の侵襲性を強く示している。SALL4Bにより誘導されたAMLは免疫能欠損マウスにも移植可能であった。これらの結果は、以下の証拠により、挿入的な影響の帰結として説明することはできない。第1に、SALL4Bトランスジェニックマウスに関する6匹のファウンダーすべてを分析したところ、それらはすべて同様の表現型を呈した。第2に、SALL4の短縮型N末端356アミノ酸を発現するマウスを作製した。6匹のファウンダーのすべてで、MDSもAMLも認められなかった。
【０２５７】
本発明者らのマウスの様式においてMDSの進行は自己再生性原始幹細胞のサブセットの増大によって主導される
白血病表現型に寄与する細胞の欠陥が幹細胞レベルまたは前駆細胞レベルのいずれにあるかを明らかにするために、HSCおよびHPCの部分集団を、SALL4Bトランスジェニックマウスにおける疾患進行との相関によって分析した。骨髄細胞の総数は、野生型（WT）、プレ白血病および白血病のSALL4Bトランスジェニック群の間で同程度であった。HSC集団およびHPC集団のパーセンテージはいずれも、SALL4Bトランスジェニックマウスにおけるプレ白血病または白血病期で、WT対照同腹仔と比較して有意に高かった（図18）。LSCの源を同定するために、NOD-SCIDを用いて連続的な白血病移植を行った。第1に、一次白血病SALL4BトランスジェニックドナーマウスからHSCおよびHPCの部分集団を選別した。この選別に続いて、NOD-SCIDマウスへの移植を行った。白血病表現型がこれらのレシピエントで認められた。本発明者らは、移植された白血病において顆粒球／マクロファージ前駆細胞（GMP）細胞が増大し続け（図19）、第2の移植後には唯一のHPC集団となったことを観察した。同様に、HSC集団は白血病ドナーおよびその連続レシピエントマウスにおいてさまざまな程度で増加した。HSCおよびGMP細胞はいずれもレシピエントにおいて白血病表現型を生じさせることができ、このためこの両方の集団がLSCであったことを指し示している。その上、LSCの自己再生において重要な役割を果たす遺伝子であるBmi-1も、SALL4Bにより誘導されるLSCと関連づけられた。
【０２５８】
以上をまとめると、SALL4Bトランスジェニックマウスは過剰な芽球、有効でない造血、およびHSCにおける異形成を呈し、これらはすべてヒトMDSの顕著な特徴である。本発明者らのモデルは、以下の新規な理論を提示する：MDSの進行は自己再生性の原始幹細胞のサブセットの増大によって主導される。
【０２５９】
LSC自己再生性の調節におけるSALL4およびBmi-1の生化学的経路
ポリコーム遺伝子Bmi-1は、LSC自己再生性の調節に関して現在までに最も研究されている遺伝子である。マウスにおけるBmi-1のノックアウトは、すべての造血系列の進行性喪失を結果的にもたらす。この喪失は、Bmi-1-/幹細胞が自己再生する能力を持たないことに起因する。Bmi-1-/-細胞は細胞周期阻害遺伝子p16INK4aおよびp19ARFの発現の変化を呈し、結果として、主としてpRb経路およびp53経路の活性化を通じて細胞周期停止およびアポトーシスの促進をもたらす。AMLを生じさせることが知られた遺伝子をBmi-1-/- HSCに導入すると、通常の動態を有するAMLが誘導される。重要なことに、一次レシピエントからのBmi-1-/- LSCは、Bmi-1-/- LSCの消耗が原因で二次レシピエントにおいてAMLを生じさせることができない。Bmi-1と同様に、SALL4BはHSCにおいて高度に発現され、分化が進行するに伴ってダウンレギュレートされる。SALL4Bマウスモデルにおける幹細胞区分（stem compartment）の増大は、MDS、およびBmi-1の発現のアップレギュレーションを伴うMDSのAMLへの進行に随伴する。加えて、本発明者らのデータは、SALL4B遺伝子がBmi-1をトランス活性化しうることを示している。クロマチン免疫沈降（ChIP）によって、本発明者らは、SALL4が、SALL4刺激にかかわる領域でBmi-1プロモーターと直接結合しうることを実証しており、このことはさらにBmi-1がLSC自己再生を媒介するSALL4B下流標的であることを指し示している。
【０２６０】
がん特異的細胞においてSALL4発現を低下させることによって大量のアポトーシスおよび有意な増殖停止が誘導される
白血病細胞におけるSALL4の機能を解明するために、本発明者らは、AML細胞系の1つであるNB4におけるSALL4ノックダウンの影響を調べた。本発明者らは、NB4細胞系におけるSALL4発現を抑制するためにsiRNAを適用した。SALL4 mRNAの異なる領域を標的とする2種のsiRNAレトロウイルス構築物を作り、それらがNB4細胞におけるSALL4 mRNAを減少させる能力をQ-RT-PCRによって確かめた。どちらのSALL4 siRNA構築物においても、SALL4のダウンレギュレーションはBmi-1レベルも有意に低下させた。図20に示されているように、SALL4のmRNAをWTレベルのおよそ50パーセントに低下させたNB4細胞のWT細胞では、カスパーゼ-3活性の21倍の上昇‐4.6パーセントから98.3パーセントに‐が認められた（図20AおよびB）。カスパーゼ-3はアポトーシス経路の枢要なタンパク質マーカーの1つである。同様の結果は、胎生期癌（EC）細胞系および慢性骨髄性白血病細胞系KBM5といった他のがん細胞系でも観察された（非提示データ）。加えて、SALL4により誘導されるカスパーゼ-3活性は、Bmi-1の過剰発現によってほぼ正常レベルに復旧した（図20C）。細胞増殖におけるSALL4幹細胞遺伝子の役割についてさらに検討するために、SALL4が抑制されたNB4細胞およびNB4細胞における細胞周期の変化および細胞DNA合成を、BrdU取り込みアッセイおよびFACS（蛍光活性化細胞選別）によってモニタリングした。SALL4発現を最大50パーセント低下させたNB4細胞は、S期細胞のほぼ4分の1への低下、ならびにG1期およびG2期の有意な増加（それぞれ6倍および50倍）を示し、これはBrdU取り込みレベルから判断したDNA合成の低下と並行していた（図20Dおよび20E）。同様の結果が、胚性がん細胞系の1つであるNTERA2などの他のがん細胞系でも観察された。対照的に、NB4細胞に対照ウイルスを形質導入した場合には細胞周期プロフィールの有意な変化は観察されなかった。Bmi-1のみの復旧が、SALL4ノックダウンによって誘導される細胞増殖低下および細胞周期停止を無効化するのに十分であるか否かを明らかにするために、Bmi-1を異所性に発現させることにより、SALL4が抑制されたNB4細胞におけるBmi-1を復旧させた。Bmi-1の復旧は、SALL4の低下によって誘導される細胞増殖低下および細胞周期停止をレスキューするのに十分であった（図20F）。これらの結果は、SALL4ノックダウンNB4細胞における細胞周期停止および細胞増殖低下が、Bmi-1の発現低下によって説明されうると考えられることを示唆する。この結果はまた、SALL4の標的遺伝子としてのBmi-1とも合致する。
【０２６１】
SALL4の抑制ががん幹細胞のみの生存に影響し、正常ES細胞には影響しないか否かを明らかにするために、悪性多能性幹細胞であるEC細胞、NTERA2に対するSALL4低下の影響を、正常（ES）細胞に対する影響と比較した。SALL4のおよそ50パーセントの低下は、カスパーゼ-3活性の測定および形態によっての細胞死による評価では、有意なEC細胞アポトーシス（10倍の増加）を招き、一方、SALL4-/+ ES細胞では有意な細胞死もカスパーゼ-3活性の上昇も観察されなかった。
【０２６２】
骨髄幹細胞に対するSALL4低下の影響を検討するために、マウスSALL4+/-を相同組換えによって作製した。およそ50パーセントのヘテロ接合型SALL4ノックアウトマウス（SALL4+/-）は、ES細胞レベルでの欠陥にもかかわらず生存した。しかし、ホモ接合型SALL4突然変異胚は妊娠の極めて初期に死亡した。生存しているSALL4+/-マウスおよびWT対照マウスに対して血液学的分析を行った。その結果により、これらのヘテロ接合型マウスが末梢血中に軽度の白血球減少を呈することが示された。SALL4+/-骨髄は、WT対照で見られるものと類似していた。SALL4+/-マウスにおける未熟HSC／HPCは、WT対照におけるものと比較して軽度減少していた（WTマウスにおけるc-kit陽性集団：17±1.8パーセント、N＝5に対して、SALL4+/-：13.9±0.9パーセント、N＝3）。HSC／HPCホモ接合型SALL4マウスに対する影響を明らかにするために、条件的SALL4アレル（loxPが導入された）を含むマウスを相同組換えによって作製した。
【０２６３】
以上をまとめると、SALL4の低下はEC細胞の生存に対しては劇的な影響を及ぼすが正常ES細胞に対してはそうでないことから、理論に拘束されることはないものの、SALL4はがん幹細胞の増殖および生存を維持するための生存因子としての役を果たすように思われる。これらの知見は、SALL4を標的とするLSC特異的治療法を開発するための基礎を与える。
【０２６４】
LSCは白血病性芽球細胞とは大きく異なり、LSCは標準的な化学療法薬によって効果的には死滅しない。その結果として、寛解に達した患者であってもLSCは一般に破壊されておらず、これは疾患がその後に再燃する原因とみなされている。SALL4はESC遺伝子であり、マウスにおけるこの遺伝子の過剰発現は、HSC／HPCを、Bmi-1のアップレギュレーションを伴うLSCへと転換させる。SALL4の低下は、Bmi-1の低下を伴う、AML細胞における大量のアポトーシスおよび細胞周期停止を誘発する。これらの現象的応答は、Bmi-1を比較的正常なレベルに復旧させることによってレスキューすることができる（上記参照）。
【０２６５】
条件的SALL4ノックアウトを用いて、SALL4の喪失または低下がLSCにアポトーシスを起こさせることができるか否か、および白血病クローン内部のSALL4 LSC区画の排除がこの疾患を治癒させるのに十分であるか否かを明らかにすることができる。
【０２６６】
これを達成するためには、SALL4flox/floxマウスおよびSALL4flox/+マウスを、ポリI：C（インターフェロン）誘導性Mx1Creマウスと交配させる。Mx1Creマウスは、幹細胞または極めて初期の前駆細胞を含む、骨髄内のほとんどすべての細胞種において高レベルのCreリコンビナーゼを誘導することが示されている。このCreシステムにおいて、Creリコンビナーゼ導入遺伝子は、Cre発現の誘導‐ポリI：Cを注入することによって達成される‐が標的遺伝子からの重要なエクソンの切り出しを引き起こすような様式で、インターフェロンで調節されるプロモーターの制御下に置かれている。5-FU（フルオロウラシル）で処置したSALL4flox/flox/CreマウスおよびSALL4flox/+/Creマウスからの骨髄細胞にHoxa9-Meis1融合遺伝子をレトロウイルス性に形質導入し、致死性照射を受けたレシピエントに移植してAMLマウスモデルを作製する。AMLにおけるLSCは白血病性芽球の増加を伴う点でMDS進行におけるLSCと類似しており、しかもMDS進行に関して利用しうるマウスモデルがないことから、本発明者らはAMLマウスモデルに的を絞ることにする。
【０２６７】
AMLを末梢血液塗沫標本によって実証した上で、AMLを保有するマウスに対して、SALL4遺伝子を切り出すためにインターフェロン誘導因子であるポリイノシン-ポリシチジン（pIpC）を腹腔内注射する。SALL4の欠失を白血病進行の緩徐化および表現型または臨床像の変化に関してモニタリングする。白血病性芽球は末梢血液塗沫標本によって算定する。末梢血中または骨髄内の白血病性芽球数が少ないことは、SALL4-/-またはSALL4-/+ LSCの消耗を指し示している可能性があると考えられる。白血病性芽球の分析にはFACSを用いることが考えられる。SALL4-/-およびSALL4-/+ LSCの両方を分析する主な理由は、本発明者らがLSCに対するSALL4欠失の用量反応効果を予期しているためである。SALL4-/-またはSALL4-/+ LSCの消耗の可能性についてさらに評価するためには、移植アッセイを行う。SALL4-/-またはSALL4-/+マウスの骨髄に由来するAML細胞を同系（synergistic）マウスに移植する。続いてレシピエントマウスをAMLの発症について経時的にモニタリングする。SALL4-/-またはSALL4-/+マウス由来のAML細胞をアポトーシスおよび細胞周期進行に関して分析する。さらに、SALL4-/-またはSALL4-/+由来のAML細胞の生存特性および増殖特性を長期的なインビトロ培養を通じてモニタリングする。
【０２６８】
本発明者らのインビボおよびインビトロでのAML細胞に対する予備的な検討を相関づけること、ならびにSALL4-/-またはSALL4-/+LSCのAML誘導能力がBmi-1の過剰発現によってインビボでレスキューされれてWTと類似した正常な機能が復旧されうるか否かの判定を行うことができる。
【０２６９】
Bmi-1を発現するレンチウイルスを調製する。レトロウイルス上清を用いて、AML SALL4-/-またはSALL4-/+マウスの髄から選別したSALL4-/-およびSALL4-/+ AML HSC／HPC細胞の形質導入を行う。GFP+（緑色蛍光タンパク質）細胞およびGFP-細胞をFACS精製する。Bmi-1発現はRT-PCRアッセイによって評価する。SALL4-/- AML HSC／HPCのGFP+およびGFP-細胞を、以前に記載された通りに骨髄移植およびコロニー形成に関してアッセイする。Bmi-1の増加がSALL4-/- AML HSC／HPCの自己再生能力を復旧させるならば、そのGFP+細胞は移植可能であって長期培養下で再プレーティング性を示すと考えられる。
【０２７０】
SALL4遺伝子の特異的な標的化を取り扱うために、生物体全体のLSC集団におけるアポトーシスを選好的に誘導することが可能であり、TVAを発現するLSCへのsiRNAの送達を促すRCASウイルスを用いる。サブグループAトリ白血病ウイルス（ATV）に対する受容体を発現するマウスを、特にSALL4BマウスにおけるHSCおよびHPCに関して作出する。これは、このウイルス受容体（TVA）をコードする遺伝子を、HSCおよびHPCのみにおいて活性を有するプロモーターsclの制御下に置くことによって達成されると考えられる。SALL4Bマウスをscl-TVAマウスと交配させてSALL4B／scl-TVAマウスを作製する。したがって、SALL4B／scl-TVAマウスのすべてのHSCおよびHPCは、この受容体を発現し、かつATVによる感染に対する感受性を有すると考えられるが、他の組織はそれらがTVA受容体を欠くために感染することはありえない。SALL4／scl MDSマウスのLSCは、LSCがHSCおよびHPCから転換するためにATV受容体を発現すると考えられる。TVAを基にしたレトロウイルスベクターは、マウスを用いたがんモデルの開発において成功裏に用いられている。
【０２７１】
MDSの進行を、SALL4 siRNA配列（SALL4の発現をサイレンシングさせる）を保有するさまざまな力価のRCANBPウイルスの静脈内注射および髄内注射の後に特徴づける。
【０２７２】
オリゴヌクレオチド配列をRCANBP（A）H1ベクター中に挿入し、そのウイルスをDF-1細胞において産生させる。陰性対照として、スクランブルsiRNA配列を含むベクターを用いる。このウイルスを、白血病細胞系におけるSALL4発現の低下に関して検討する。低下の程度を、Q-PCRを用いてRNAレベルで、ウエスタン分析によってタンパク質レベルで評価する。細胞死に対する影響は細胞数によって決定する。SALL4／scl-TVA MDSマウスの血液中および髄内への送達後に、SALL4低下の効力および持続時間、ならびに誘導された細胞死の程度を決定する。SALL4B／scl-TVAマウスが末梢血液塗沫標本による実証でAMLまたは初期疾患に進行する場合には、SALL4発現を抑制するために、SALL4 siRNAを保有するRCANBP H1ウイルスをマウスに投与する。AMLの潜時、浸透度、免疫表現型および転換を、マウスの3群間で比較する：（a）対照レトロウイルスを用いたSALL4B／scl-TVAマウス、（b）SALL4 siRNAを保有するRCANBP H1ウイルスを用いたSALL4B／scl-TVAマウス、および（c）scl-TVA正常マウス。加えて、アポトーシス、細胞周期進行、長期培養および骨髄再増殖のアッセイを通じて、SALL4の低下をLSCと正常HSC／HPCとの対比においてその機能と関連づけて比較する。
【０２７３】
MDS治療における最近の進展が、MDS疾患のすべての型において進行を遅延させる目的でFDAによって承認されている唯一の薬物である5-アザシチジン（5AC）に関して報告されている。しかし、5ACに対する反応の持続時間の中央値は18カ月未満に過ぎない。白血病細胞系の1つであるNB4の5ACによる処置は、SALL4およびその下流標的であるBmi-1を抑制した（図21）。このため、理論によって拘束されることはないものの、5ACはSALL4B発現の阻害を通じてLSCの自己再生および増殖に影響して、それ故にMDSの進行を遅延させるように思われる。最近の研究では、プロテアソーム阻害薬が、MDS進行と密接な関係のある疾患であるAMLにおいて幹細胞を効果的に破壊することも実証されている。しかし、プロテアソーム阻害薬は極度の毒性を生じ、それは多くの患者にとって耐えられない。5ACおよびプロテアソーム阻害薬の両方を用いることには利点がある可能性がある。
【０２７４】
実施例4：SALL4アイソフォームによるBmi-1プロモーターの用量依存的活性化
SALL4アイソフォームの1つであるヒトSALL4Bを構成的に過剰発現するトランスジェニックマウスは、正常期から前白血病期（MDS）を経て急性骨髄性白血病（AML）へと進行する。白血病発症におけるSALL4の具体的な遺伝子標的を探索するために、SALL4B前白血病性骨髄mRNAのAffymetrixマイクロアレイハイブリダイゼーション（U133チップを使用）を行い、そのデータを対照骨髄のそれと比較した。Bmi-1は、その発現が有意に増加した遺伝子の1つとして同定された。
【０２７５】
Bmi-1発現とSALL4発現との相関について調べるために、マウスBmi-1プロモーター活性の分析を行った。翻訳開始部位の上流のほぼ2.1kbの配列を、プロモーターを欠くpGL3-基本ルシフェラーゼレポータープラスミドの5'末端にサブクローニングした。続いて、Bmi-1プロモーターのSALL4反応性を、0.25μgのBmi-1プロモーター構築物および0.04μgのウミシイタケルシフェラーゼプラスミドと、Bmi-1プロモーター構築物を基準として種々の比でのSALL4AまたはSALL4B発現構築物（0〜2の比）とのコトランスフェクションによって評価した。SALL4AまたはSALL4B構築物のモル過剰量を増加させるに伴って、Bmi-1プロモーターが用量依存的な様式で活性化された（図22）。
【０２７６】
ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイによるBmi-1プロモーター領域内のSALL4機能的部位のマッピング
SALL4によってBmi-1を活性化するために必要な最小プロモーター配列を明確にするために、SALL4と、ルシフェラーゼレポーター遺伝子と融合したBmi-1プロモーターを包含する一連の欠失DNAフラグメントとの一過性コトランスフェクションを行った。トランスフェクションに用いた一連の欠失プロモーターフラグメントは図23Aに描写されている。Bmi-1の各プロモーターレポーター構築物を、SALL4アイソフォームとともにHEK-293細胞に一過性にコトランスフェクトさせた。両方のSALL4アイソフォームの高レベルの活性化が、0から-2102まで、0から-1254まで、0から-683まで、および0から-270までのプロモーター配列を含む構築物で認められた。-270〜-168の間の上流領域の除去はSALL4アイソフォームがBmi-1プロモーターを活性化することをできなくし、このことはこの領域における強いSALL4活性化部位の存在を指し示している。続いてSALL4結合領域（-270〜-168）を0〜-1254および0〜-683プロモーターフラグメントから欠失させて、2つの新たなBmi-1プロモーター構築物を作り出した。この結果得られた構築物（P1254およびP683）のルシフェラーゼ活性を、HEK-293細胞におけるSALL4AまたはSALL4Bのコトランスフェクションの存在下または非存在下におけるWTプロモーター構築物の活性と比較した。SALL4の非存在下では、HEK-293細胞におけるBmi-1プロモーター突然変異体P1254およびP683とWTプロモーター構築物との間にルシフェラーゼ活性に関して有意差はみられなかった。しかし、-270〜-168領域の欠失は、WTプロモーター構築物と比較して、SALL4によるBmi-1の活性化を消失させた（図23B）。これらの結果は、-270〜-168領域が、SALL4がん遺伝子によって活性化されるBmi-1プロモーター内部の機能的部位を含むことを指し示している。
【０２７７】
インビボでのSALL4タンパク質とBmi-1プロモーターとの結合
骨髄系幹細胞系32DはBmi-1を発現するが、内在性SALL4は極めて低レベルである。32D細胞におけるSALL4タンパク質とBmi-1プロモーターとの結合を、ChiPアッセイを用いて分析した。32D細胞に対して、ヘマグルチニン（haemagluttin）（HA）をタグ付加したSALL4AおよびSALL4B cDNA構築物をトランスフェクトした。続いてクロマチンを抽出し、超音波処理して、HA抗体に対するウサギポリクローナル抗体を用いて免疫沈降させた。順方向および逆方向プライマーのセット（7+8および9+10）は、投入試料（図24B、投入レーン）および免疫沈降物（図24B、+レーン）から強い225bpアンプリコンを増幅した。免疫前血清を用いた免疫沈降反応では、免疫沈降DNA中のBmi-1プロモーター構築物はほとんど増幅されなかった（図24B、-レーン）。すべてのChIP試料を、シス調節エレメントと結合したSALL4の特異性を確認するためにアンプリコンDNAをシークエンシングすることにより、偽陽性PCR増幅に関して検討した。各PCRアンプリコンの強度も、Bmi-1プロモーター構築物と結合したSALL4Aの相対的存在量を示すために、定量的リアルタイムPCR（QRT-PCR）により、ChIP投入バンドに対して標準化した（図24C）。エンプティベクター（pcDNA3）によってトランスフェクトした細胞を用いた並行したChIP実験では本質的に全くシグナルが観察されなかったため、観察された結合は特異的であった。この検討では、Bmi-1プロモーターの-450〜-1の間の領域がSALL4Aの結合部位と考えられることが指し示され、これは以前のルシフェラーゼプロモーター欠失実験と合致する。予想された通り、SALL4BについてもBmi-1プロモーター上で同様の結合分布が実証された。これらの検討は、Bmi-1プロモーターの-450〜-1領域が、両方のSALL4アイソフォームによる活性化に関する機能的部位であることを指し示している（図24C）。SALL4は胚性幹細胞、HEK 293細胞、急性白血病細胞系の1つ（NB4）、ならびにM0（FAB分類）およびCML（慢性骨髄系白血病）から転換したAMLを含む2個のAMLヒト試料におけるBmi-1のシス調節エレメントとも結合しうることが、ChIPアッセイ上でのChIPを用いて実証された。
【０２７８】
SALL4は内在性Bmi-1発現のレベルに影響を及ぼしうる
SALL4によるBmi-1の調節を検証するために、siRNAを介したノックダウンを用いて白血病細胞系HL60におけるSALL4発現を減弱させた。SALL4 mRNAの異なる領域を標的とする3種のsiRNAレトロウイルス構築物を作り、それらがHL60細胞におけるSALL4 mRNAをノックダウンする能力をQRT-PCRによって確かめた。HL-60白血病細胞系からの細胞を、形質導入から48時間後に収集したウイルスに感染させた。安定な感染細胞をG418選択下で同定した。3種のSALL4 siRNA構築物のいずれにおいても、SALL4のダウンレギュレーションはBmi-1レベルを有意に低下させた（図25A）。SALL4 mRNAレベルは90％超ノックダウンされ、Bmi-1発現は75〜85％低下した。
【０２７９】
SALL4によるBmi-1調節に関してさらなる裏づけとなる証拠を得るために、本発明者らはSall4+/-マウスを分析した。ホモ接合型Sall4突然変異胚は妊娠の極めて初期に死亡した。およそ50パーセントのヘテロ接合型SAll4ノックアウトマウス（SAll4+/-）は、胚性幹細胞レベルでの欠陥にもかかわらず生存した。突然変異型Sall4+/-および野生型Sall4+/+マウスから骨髄細胞を単離した。Sall4およびBmi-1の発現レベルを比較するために定量的リアルタイムPCR（QRT-PCR）を行った。ヘテロ接合型Sall4+/-骨髄細胞は、予想された通り、SALL4の発現が低下していた。加えて、これらのヘテロ接合型細胞ではBmi-1の発現レベルも正常マウス骨髄細胞と比較して有意に低下していた（図25B）。
【０２８０】
SALL4BトランスジェニックマウスにおけるBmi-1の発現増加は疾患進行に関連する
SALL4アイソフォームの1つであるSALL4Bを過剰発現するトランスジェニックマウスはMDS様の特徴を呈し、その後にAML転換も呈した。WT対照マウスとは対照的に、SALL4Bトランスジェニックマウスからの前白血病性骨髄および白血病性芽球ではBmi-1に関するmRNA発現が有意にアップレギュレートされていた（図25C）。SALL4BトランスジェニックマウスにおけるMDSの進行およびMDS転換に関連するイベントは、Bmi-1のアップレギュレーションに関連していた。造血（hemotopoetic）幹細胞（HSC）および顆粒球マクロファージ前駆細胞（GMP）を、3匹の白血病性SALL4トランスジェニックマウスおよび3匹の非白血病性SALL4トランスジェニックマウスから単離した。白血病性HSCおよびGMPではいずれも、QRT-PCRによって観察されたBmi-1発現が正常HSCおよびGMPよりもはるかに高レベルであった。これらの値は2倍〜20倍の増加の範囲にわたる。異なるファウンダーマウスではさまざまなSALL4B発現レベルが観察されたが、それぞれの場合で、HSCおよびGMP細胞集団におけるBmi-1の発現レベルはSALL4B発現レベルと相関していた。加えて、SALL4発現レベルは、白血病が進行するに伴って、HSCおよびHPCの増大のために一貫して上昇した。
【０２８１】
ヒトAMLにおけるSALL4発現の高レベルでの発現は高レベルのBmi-1の発現に関連する
骨髄由来の12個のランダムな臨床的AML試料を、SALL4およびBmi-1の相対的mRNA発現を定量化するためにQRT-PCRを用いて分析した（図26）。12個のAML試料のうち10個が、平均した正常対照を基準として3.93倍〜653倍の範囲にわたる有意なSALL4発現の増加を示した。これらの結果は、SALL4抗体を用いた免疫染色によって実証されたSALL4タンパク質発現と合致した。興味深いことに、12個のAML試料のうち同じ10個は、平均した正常対照を基準として1.10倍〜22倍の範囲にわたる高レベルのBmi-1発現も示した。調べたAML試料におけるSALL4発現とBmi-1発現との間には強い相関がみられた。
【０２８２】
SALL4タンパク質によって誘導されるBmi-1遺伝子プロモーターでの後成的改変
以上に示したように、SALL4はBmi-1プロモーターと結合し、SALL4によるBmi-1の調節はSALL4のインビトロおよびインビボの両方のモデルで認められた。H3-K4トリメチル化およびH3-K79メチル化は転写活性化と直接的なつながりがあることが報告されている。異常なH3-K4トリメチル化およびH3-K79は白血病発症とも関連する。SALL4がBmi-1プロモーターと結合する前にクロマチン上に存在するヒストン標識を分析するために、検出可能な内在性SALL4を発現しない32D細胞に対してChIP分析を行った。続いて、ChIP分析を、HAをタグ付加したSALL4A構築物または対照ベクターをトランスフェクトした32D細胞に対しても行い、続いてヒストンH3-K4トリメチル化およびH3-K79ジメチル化に対して特異的な抗体を用いるChIPによって免疫沈降させた。これらのChIP実験から回収されたDNAを、Bmi-1プロモーターの1.5kbをカバーするプライマーを用いるQ-PCRによって増幅した。SALL4AまたはSALL4B構築物をトランスフェクトした32D細胞におけるBmi-1プロモーター部位に対するSALL4の結合と合致して、H3-K4トリメチル化が検出され、これはベクター対照と比較して概ね2〜3倍であった（図27）。H3-K79メチル化についての同様の分析により、SALL4結合部位での強固なメチル化が判明し、これはSALL4の存在下でのH3-K4トリメチル化のパターンと密接に並行していた。
【０２８３】
実施例5：SALL4は精巣の精原細胞のみで発現される
SALL4は、初期胚発生の制御においてゲートキーパーとして作用する幹細胞遺伝子である。SALL4の発現はESCが分化するように誘発されるとダウンレギュレートされ、分化した組織の正常な体細胞では完全に抑制される。SALL4に対する抗体を用いた精巣における免疫組織化学によって、SALL4の存在について検討した。精巣の始原生殖細胞である精原細胞で強い核染色が見いだされ、一方、精細管における精子の後期発生段階では陰性であった。加えて、セルトリ細胞、ライディッヒ細胞および他の支持細胞もSALL4陰性であった。
【０２８４】
SALL4はGCTのバイオマーカーである
抗SALL4抗体を用いて、さまざまなGCTの免疫組織化学染色を行った。結果は表5にまとめられている。
【０２８５】
（表４）さまざまな組織試料からの免疫組織化学染色
すべての悪性GCTにおいて核の90％超がSALL4に関して陽性染色された。陰性染色試料は散在性の陽性染色細胞を有していたが、それらは全細胞の1％未満の量に過ぎなかった。
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【０２８６】
古典的および精母細胞セミノーム（n＝5）は両方ともSALL4に関して陽性染色された。胎生期癌（n＝5）、卵黄嚢腫瘍（n＝5）および未熟型奇形種（n＝5）を含む、多くの非セミノームもSALL4に関して陽性染色された。陽性試料はすべてSALL4抗体による強い染色を示し、これは細胞の核に特異的に局在した。SALL4に関して陽性染色されるのが細胞の2％未満である組織として定義される陰性染色は、成熟奇形種（n＝5）のみで生じた。いずれの場合にも、腫瘍細胞核の90％超はバックグラウンド染色をほとんどまたは全く伴うことなしに陽性であった。
【０２８７】
精母細胞セミノームにおけるSALL4発現についてさらに調べた。精母細胞セミノームにおける染色の強度は、正常精巣組織における精原細胞の染色と同程度であるように思われた。この分析により、SALL4はGCTを同定する上で最も情報的価値の高い免疫組織化学マーカーの1つであることが示された。このデータはまた、精巣幹細胞である精原細胞が精巣GCTの起源であることも指し示している。
【０２８８】
多腫瘍組織アレイ上でのSALL4免疫組織化学の分析
SALL4は極めて初期のESCにおいて発現され、GCTはこれらの細胞の転換によって生じることが報告されている。SALL4タンパク質がGCT以外の腫瘍で検出されうるか否かを明らかにするために、SALL4に関する免疫組織化学を、種々の上皮腫瘍組織を載せた組織アレイを用いて行った。比較のために正常組織の試料をアレイ上に配置した。肺がん（n＝10）、結腸がん（n＝10）、乳がん（n＝10）および卵巣がん（n＝10）の試料はすべて、SALL4に関して染色が陰性であった。しかし、これらの組織のそれぞれは、細胞の2％未満に陽性SALL4核シグナルを有する間欠的（intermittent）細胞を示した。正常な成体対照組織試料（肺、心臓、乳房）はすべてSALL4に関して染色が陰性であり、この場合も約2％は陽性の核染色を示した。乳がんの試料では、SALL4タンパク質の発現が細胞の小さな塊の中、および散在性の個々の細胞の両方で観察された。非造血組織において少数のSALL4発現細胞の存在が観察されたことは、SALL4が骨髄の正常造血幹細胞においても同様の低い頻度で発現されるという、本発明者らの以前の知見と合致する。
【０２８９】
NTERA2細胞分化の過程でのSALL4発現の低下
SALL4はESCにおける自己再生の枢要な調節因子であるため、胎生期癌細胞系の1つであるNTERA2細胞におけるSALL4の発現を、胎生期癌細胞における分化の公知の誘導因子であるレチノイン酸による処置の前および後に分析した。レチノイン酸処置は、SALL4発現（図28）ならびにその下流標的であるBmi-1の有意な低下を結果的にもたらした。これらの細胞の分化状態を決定するために、本発明者らは系列特異的な細胞分化を表すマーカーの発現に関してQ-RT-PCR（定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応）によるアッセイを行った。NTERA2細胞を5umのレチノイン酸で24〜48時間処置したところ、主として一団の外胚葉マーカーのアップレギュレーションが観察された（図28A）。加えて、いくつかの内胚葉遺伝子、中胚葉遺伝子および栄養外胚葉遺伝子もアップレギュレートされた。レチノイン酸処置から48時間後に、SALL4発現およびその下流標的であるBmi-1は非処置NTREA2細胞と比較して有意に低下した（図28B）。
【０２９０】
NTERA2細胞におけるSALL4発現の低下によるカスパーゼ-3活性の誘導
造血幹細胞または造血前駆細胞におけるSALL4の異常な発現は、これらの細胞の増大を結果的にもたらしてAML転換を招く。GCTにおけるSALL4の機能を解明するために、SALL4 siRNA（短鎖干渉性リボ核酸）レトロウイルスを形質導入したNTERA2細胞におけるSALL4ノックダウンの影響を調べた。SALL4 mRNAの異なる領域を標的とする2種のsiRNAレトロウイルス構築物を作り、それらがNTERA2細胞におけるSALL4 mRNAを低下させる能力をQ-RT-PCRによって確かめた。どちらのSALL4 siRNA構築物においても、SALL4のダウンレギュレーションはBmi-1レベルも有意に低下させた（図29A）。SALL4 mRNAおよびBmi-1 mRNAのレベルは90％を上回って低下した。加えて、これらのSALL4 siRNAで処置したNTERA2細胞は緩徐に増殖するように思われ、それ以上は分化することができなかった（図29B）。NTERA2細胞におけるSALL4発現の低下がアポトーシスを招くか否かを明らかにするために、本発明者らは、アポトーシス経路に関する枢要なタンパク質マーカーの1つであるカスパーゼ-3のレベルを測定した。SALL4ノックダウンによって誘導されるカスパーゼ-3のレベルをフローサイトメトリーによって測定した。SALL4の野生型（WT）レベルの10％を保っているNTERA2細胞では、カスパーゼ-3活性の、WT細胞における4.1％から64.5％への12倍の上昇がみられた（図30Aおよび30B）。同様の結果は、AML細胞系の1つであるNB4などの他のがん細胞系でも観察された。
【０２９１】
SALL4の減少によって引き起こされるカスパーゼ-3活性の上昇はBmi-1の過剰発現によって完全にレスキューされる
Bmi-1の過剰発現がSALL4により誘導されるカスパーゼ-3活性をレスキューしうるか否かを明らかにするために、SALL4 siRNAで処置したNTERA2細胞に対して、BMI-1を含む発現ベクターをトランスフェクトした。続いて、カスパーゼ-3活性のレベルをフローサイトメトリーによって測定した。図3cに示されているように、SALL4により誘導されるカスパーゼ-3活性は、BMI-1の過剰発現によってほぼ正常なレベルに復旧した。しかし、Bmi-1の過剰発現はWT NTERA2細胞におけるカスパーゼ-3活性に対してはほとんど影響を及ぼさなかった（図30D）。
【０２９２】
SALL4ノックダウンは有意に低下した細胞増殖および細胞周期停止を招く
細胞増殖におけるSALL4幹細胞遺伝子の役割についてさらに検討するために、SALL4を低下させたNTERA2細胞およびNTERA2細胞における細胞周期変化および細胞DNA合成を、（BrdU）取り込みアッセイおよび蛍光活性化細胞選別（FACS）を通じてモニタリングした。NTERA2細胞におけるSALL4ノックダウンは、G0／G1期（27％）およびG2期（37.9％）での停止を結果的にもたらした（図31B）。S期細胞の約2分の1への減少も観察され、これはBrdU取り込みのレベルから判断したDNA合成の低下と並行していた。同様の結果が、AML細胞系の1つであるNB4などの他のがん細胞系でも観察された。対照的に、WT-NTERA2細胞（顕著な量のSALL4を発現する）に対照ウイルスを形質導入した場合には細胞周期プロフィールの有意な変化は観察され無かった（図31A）。
【０２９３】
Bmi-1の復旧は、SALL4の低下によって誘導される細胞増殖低下および細胞周期停止をレスキューするのに十分である
Bmi-1のみの復旧が、SALL4ノックダウンによって誘導される細胞増殖低下および細胞周期停止を無効化するのに十分であるか否かを明らかにするために、Bmi-1を異所性に発現させることにより、SALL4が欠失したNTERA2細胞におけるBmi-1を復旧させた。SALL4が欠失したNTERA2細胞におけるBmi-1の再発現は、FACS分析による判定で、S期集団の増加ならびにG1期およびG2期の減少を結果としてもたらした（図31C）。加えて、BrdU標識アッセイに示されているように、Bmi-1が正常レベルに復旧したSALL4欠失細胞は、WT NTERA2細胞と同様の様式でBrdUを有意に取り込んだ（図31C）。これらの結果は、SALL4が欠失したNTERA2細胞における細胞周期停止および細胞増殖低下が、Bmi-1の発現低下によって説明されうると考えられることを示唆する。しかし、Bmi-1の過剰発現はWT NTERA2細胞における細胞周期および増殖に対してはほとんど影響を及ぼさず（図31D）、これはWT NTERA2細胞がすでに高レベルのBmi-1を保有するという事実に起因する可能性がある。
【０２９４】
参考文献
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【０２９５】
本発明を上記の実施例を参照しながら説明してきたが、改変物および変形物が本発明の精神および範囲内に包含されることは理解されるであろう。したがって、本発明は、以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2010528620.tif 000041
【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
2010528620.tif 000045
【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2010528620.tif 000053
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2010528620.tif 000084
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