(57)【要約】本明細書において提供されるのは、活性薬剤に連結された、ヌクレオシド輸送経路の基質を含んだ抱合体分子であり、この抱合体は細胞のヌクレオシド輸送経路を介して細胞にまたは細胞の核に輸送されることができる。さらに提供されるのは、ヌクレオシド輸送経路を発現する標的細胞に抱合体分子を送達する方法であり、この抱合体は活性薬剤に連結された、ヌクレオシド輸送経路の基質を含む。同様に提供されるのは、ヌクレオシド輸送経路によって輸送される抱合体をスクリーニングするための方法である。さらに提供されるのは、障害を処置するうえで有効な薬剤を含んだ抱合体が患者に投与される、ヌクレオシド輸送経路を発現する組織に影響を及ぼす疾患または障害を抱える患者を処置する方法である。同様に提供されるのは、ヌクレオシド輸送経路を阻害する化合物を患者に投与する段階を含む、自己免疫障害を抱える患者を処置する方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
基質が抗体である場合、モノクローナル抗体3E10またはその断片ではないという条件で、ヌクレオシド輸送経路によって輸送されることができる基質と該基質に連結された活性薬剤とを含む抱合体であって、
ヌクレオシド輸送経路によって輸送される前記抱合体。
【請求項２】
ヌクレオシド輸送経路が拡散型ヌクレオシド輸送体または濃縮型ヌクレオシド輸送体を含む、請求項1記載の抱合体。
【請求項３】
拡散型ヌクレオシド輸送体が低濃度のニトロベンジルメルカプトプリンリボシド(NBMBR)に対して非感受性である、請求項2記載の抱合体。
【請求項４】
拡散型ヌクレオシド輸送体が、ENT1、ENT2、ENT3およびENT4からなる群より選択される、請求項2記載の抱合体。
【請求項５】
基質が、ヌクレオシド、核酸塩基、ヌクレオチド、ヌクレオシド類似体、オリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、抗体、抗体断片からなる群より選択される、請求項1記載の抱合体。
【請求項６】
基質が抗体またはその断片である、請求項1記載の抱合体。
【請求項７】
抗体またはその断片が核酸に結合する、請求項4記載の抱合体。
【請求項８】
活性薬剤が、核酸、無機分子、有機分子、有機小分子、薬物化合物、ペプチド、ポリペプチド、抗体、抗体断片、ペプチド模倣薬、DNA、RNA、リボザイム、ヘアピンRNA、siRNA、miRNA、アンタゴmir、PNA、LNAからなる群より選択される、請求項1記載の抱合体。
【請求項９】
薬物化合物が、α-グルコシダーゼ、α-L-イズロニダーゼ、α-ガラクトシダーゼA、アリールスルファターゼ、N-アセチルガラクトサミン-6-スルファターゼもしくはβ-ガラクトシダーゼ、イズロン酸2-スルファターゼ、セラミダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、ヘパランN-スルファターゼ、N-アセチル-α-グルコサミニダーゼ、アセチルCoA-α-グルコサミニドN-アセチルトランスフェラーゼ、N-アセチル-グルコサミン-6スルファターゼ、ガラクトース6-スルファターゼ、アリールスルファターゼA、BもしくはC、アリールスルファターゼAセレブロシド、ガングリオシド、酸性β-ガラクトシダーゼGMIガングリシオド(Gaiglioside)、酸性β-ガラクトシダーゼ、ヘキソサミニダーゼA、ヘキソサミニダーゼB、α-フコシダーゼ、α-N-アセチルガラクトサミニダーゼ、糖タンパク質ノイラミニダーゼ、アスパルチルグルコサミンアミダーゼ、酸性リパーゼ、酸性セラミダーゼ、リソソームスフィンゴミエリナーゼ、他のスフィンゴミエリナーゼ、ジストロフィン、ジストロフィン-糖タンパク質複合体の成分、ラミニンα2鎖、フクチン関連タンパク質、LARGE、フクチン、EMD、LMNA、DMPK、ZNF9およびPABPN1、グリコーゲンシンターゼ、グルコース-6-ホスファターゼ、脱分岐酵素、トランスグルコシダーゼ、筋ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、酸性マルターゼ欠損、カルニチンパルミチルトランスフェラーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、またはホスホグリセリン酸ムターゼからなる群より選択される、請求項8記載の抱合体。
【請求項１０】
ヌクレオシド輸送経路を発現する標的細胞を、
基質が抗体である場合、モノクローナル抗体3E10またはその断片ではないという条件で、ヌクレオシド輸送経路によって輸送されることができる基質と、該基質に連結された活性薬剤とを含む、ヌクレオシド輸送経路によって輸送される抱合体に接触させ、
それにより標的細胞へ抱合体を輸送する段階を含む、
ヌクレオシド輸送経路を発現する標的細胞に抱合体を送達する方法。
【請求項１１】
ヌクレオシド輸送経路が拡散型ヌクレオシド輸送体または濃縮型ヌクレオシド輸送体を含む、請求項9記載の方法。
【請求項１２】
拡散型ヌクレオシド輸送体が低濃度のニトロベンジルメルカプトプリンリボシド(NBMBR)による阻害に対して非感受性である、請求項10記載の方法。
【請求項１３】
拡散型ヌクレオシド輸送体が、ENT1、ENT2、ENT3およびENT4からなる群より選択される、請求項10記載の方法。
【請求項１４】
基質が、クレオシド、核酸塩基、ヌクレオチド、ヌクレオシド類似体、オリゴヌクレオチド、ペプチド、抗体、および抗体断片からなる群より選択される、請求項10記載の方法。
【請求項１５】
基質が抗体またはその断片である、請求項10記載の方法。
【請求項１６】
抗体またはその断片が核酸に結合する、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
活性薬剤が、核酸、無機分子、有機分子、有機小分子、薬物化合物、ペプチド、ポリペプチド、抗体、抗体断片、ペプチド模倣薬、脂質、DNA、RNA、リボザイム、ヘアピンRNA、siRNA、miRNA、アンタゴmir、PNA、LNAからなる群より選択される、請求項10記載の方法。
【請求項１８】
薬物化合物が、α-グルコシダーゼ、α-L-イズロニダーゼ、α-ガラクトシダーゼA、アリールスルファターゼ、N-アセチルガラクトサミン-6-スルファターゼもしくはβ-ガラクトシダーゼ、イズロン酸2-スルファターゼ、セラミダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、ヘパランN-スルファターゼ、N-アセチル-α-グルコサミニダーゼ、アセチルCoA-α-グルコサミニドN-アセチルトランスフェラーゼ、N-アセチル-グルコサミン-6スルファターゼ、ガラクトース6-スルファターゼ、アリールスルファターゼA、BもしくはC、アリールスルファターゼAセレブロシド、ガングリオシド、酸性β-ガラクトシダーゼGMIガングリシオド(Gaiglioside)、酸性β-ガラクトシダーゼ、ヘキソサミニダーゼA、ヘキソサミニダーゼB、α-フコシダーゼ、α-N-アセチルガラクトサミニダーゼ、糖タンパク質ノイラミニダーゼ、アスパルチルグルコサミンアミダーゼ、酸性リパーゼ、酸性セラミダーゼ、リソソームスフィンゴミエリナーゼ、他のスフィンゴミエリナーゼ、ジストロフィン、ジストロフィン-糖タンパク質複合体の成分、ラミニンα2鎖、フクチン関連タンパク質、LARGE、フクチン、EMD、LMNA、DMPK、ZNF9およびPABPN1、グリコーゲンシンターゼ、グルコース-6-ホスファターゼ、脱分岐酵素、トランスグルコシダーゼ、筋ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、酸性マルターゼ欠損、カルニチンパルミチルトランスフェラーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、またはホスホグリセリン酸ムターゼからなる群より選択される、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
標的細胞が、筋肉、骨格筋、心筋、血管内皮、心臓、脳、胎盤、胸腺、膵臓、前立腺、腎臓、血液、皮膚、およびENT2発現がん細胞からなる群より選択される組織由来である、請求項10記載の方法。
【請求項２０】
ヌクレオシド輸送経路を発現する細胞を、抱合体と、輸送が行われるのに適した条件の下で接触させる段階; および
該抱合体がヌクレオシド輸送経路により該細胞に輸送されるかどうかを判定する段階
を含む、ヌクレオシド輸送経路による輸送について抱合体をスクリーニングする方法。
【請求項２１】
ヌクレオシド輸送経路が拡散型ヌクレオシド輸送体または濃縮型ヌクレオシド輸送体を含む、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
拡散型ヌクレオシド輸送体が低濃度のニトロベンジルメルカプトプリンリボシド(NBMBR)に対して非感受性である、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
拡散型ヌクレオシド輸送体が、ENT1、ENT2、ENT3およびENT4からなる群より選択される、請求項21記載の方法。
【請求項２４】
拡散型ヌクレオシド輸送体がENT2輸送体である、請求項21記載の方法。
【請求項２５】
細胞が、ENT2輸送体をコードするDNAでトランスフェクトされる、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
判定する段階が、ENT2をコードするDNAでトランスフェクトされた細胞に輸送される抱合体の量を、ENT2でトランスフェクトされていない対照細胞に輸送される抱合体の量と比較する段階を含み、該対照細胞と比べてトランスフェクトされた細胞の抱合体輸送の増大が、輸送がENT2輸送体によるものであることを示す、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
抱合体の輸送が低濃度のNBMPRの存在下において行われる、請求項20記載の方法。
【請求項２８】
抱合体が検出可能な標識を含む、請求項20記載の方法。
【請求項２９】
拡散型ヌクレオシド輸送体によって輸送されることができる基質と骨格筋障害を処置するための活性薬剤とを含む抱合体を、骨格筋障害を抱える患者に投与する段階を含む、骨格筋障害を処置する方法であって、
該活性薬剤が基質に連結され、かつさらに該抱合体が拡散型ヌクレオシド輸送体によって輸送され、それにより該抱合体が骨格筋細胞に輸送され、その結果、該活性薬剤が送達される、前記方法。
【請求項３０】
骨格筋障害が、ベッカー型筋ジストロフィー(BMD)、先天型筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)、遠位型筋ジストロフィー、エメリ・ドレフュス型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕筋ジストロフィー(FSHD)、肢帯筋ジストロフィー(LGMD)、筋緊張性筋ジストロフィー、眼球咽頭型筋ジストロフィー、ポンペ病、フルラー症候群、ファブリー病、マロトー・ラミー症候群、モルキオ症候群、ハンター症候群、ファーバー病、クラッベ病、スライ症候群、サンフィリポ症候群(A、B、およびD型を含む)、モルキオA、多発性スルファターゼ欠損症、異染性白質萎縮症、ムコ脂質症IV型、G.sub.MIガングリオシドーシス、ガラクトシアリドーシス、テイサックス病およびテイサックス病の変種、サンドホフ病、フコシドーシス(Fucsidosis)、シンドラー病、シアリドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、ウォルマン病、ファーバー脂肪性肉芽腫症、ニーマン・ピック病、ホスホリラーゼ欠損、酸性マルターゼ欠損、ミトコンドリア性筋障害、カルニチンパルミチルトランスフェラーゼ欠損、ホスホグリセリン酸キナーゼ欠損、ならびにホスホグリセリン酸ムターゼ欠損からなる群より選択される、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
拡散型ヌクレオシド輸送体によって輸送されることができる基質と、遺伝的障害を処置するための活性薬剤とを含む抱合体を、遺伝的障害を抱える患者に投与する段階を含む、遺伝的障害を処置する方法であって、
該活性薬剤が該基質に連結され、かつさらに該抱合体が該拡散型ヌクレオシド輸送体によって輸送され、それにより該抱合体が細胞に輸送され、その結果該活性薬剤が送達される、前記方法。
【請求項３２】
活性薬剤が、遺伝的疾患を抱える患者において欠損している遺伝子またはタンパク質である、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
拡散型ヌクレオシド輸送体によって輸送されることができる基質と、がんを処置するための活性薬剤とを含む抱合体を、がんを抱える患者に投与する段階を含む、がんを処置する方法であって、
該活性薬剤が該基質に連結され、かつさらに該抱合体が拡散型ヌクレオシド輸送体によって輸送され、それにより該抱合体ががん性細胞に輸送され、その結果、該活性薬剤が送達される、前記方法。
【請求項３４】
活性薬剤が腫瘍抑制遺伝子または腫瘍抑制タンパク質である、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
基質が、ヌクレオシド、核酸塩基、ヌクレオチド、ヌクレオシド類似体、オリゴヌクレオチド、ペプチド、抗体、および抗体断片からなる群より選択される、請求項29、31、または33記載の方法。
【請求項３６】
基質が抗体またはその断片である、請求項29、31、または33記載の方法。
【請求項３７】
抗体またはその断片が核酸に結合する、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
抗体またはその断片が、ATCCアクセッション番号PTA 2439を有するハイブリドーマによって産生される抗体の結合特異性を有する抗体、その変種、またはその機能断片である、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
活性薬剤が、α-グルコシダーゼ、α-L-イズロニダーゼ、α-ガラクトシダーゼA、アリールスルファターゼ、N-アセチルガラクトサミン-6-スルファターゼもしくはβ-ガラクトシダーゼ、イズロン酸2-スルファターゼ、セラミダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、ヘパランN-スルファターゼ、N-アセチル-α-グルコサミニダーゼ、アセチルCoA-α-グルコサミニドN-アセチルトランスフェラーゼ、N-アセチル-グルコサミン-6スルファターゼ、ガラクトース6-スルファターゼ、アリールスルファターゼA、BもしくはC、アリールスルファターゼAセレブロシド、ガングリオシド、酸性β-ガラクトシダーゼGMIガングリシオド(Gaiglioside)、酸性β-ガラクトシダーゼ、ヘキソサミニダーゼA、ヘキソサミニダーゼB、α-フコシダーゼ、α-N-アセチルガラクトサミニダーゼ、糖タンパク質ノイラミニダーゼ、アスパルチルグルコサミンアミダーゼ、酸性リパーゼ、酸性セラミダーゼ、リソソームスフィンゴミエリナーゼ、他のスフィンゴミエリナーゼ、ジストロフィン、ジストロフィン-糖タンパク質複合体の成分、ラミニンα2鎖、フクチン関連タンパク質、LARGE、フクチン、EMD、LMNA、DMPK、ZNF9およびPABPN1、グリコーゲンシンターゼ、グルコース-6-ホスファターゼ、脱分岐酵素、トランスグルコシダーゼ、筋ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、酸性マルターゼ欠損、カルニチンパルミチルトランスフェラーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、またはホスホグリセリン酸ムターゼからなる群より選択される、請求項29、31、または33記載の方法。
【請求項４０】
ENT2輸送体による輸送を阻害する化合物を、自己免疫障害を抱える患者に投与する段階を含む、自己免疫障害を処置する方法。
【請求項４１】
請求項1記載の抱合体および組織中のENT2発現を促進する薬剤を含む薬学的組成物。
【請求項４２】
組織中のENT2発現を促進する薬剤が、低酸素症を処置もしくは抑制する薬剤またはHIF-1αを阻害する薬剤である、請求項41記載の薬学的組成物。
【請求項４３】
組織が低酸素状態である、請求項41記載の薬学的組成物。
【請求項４４】
低酸素状態である組織が低酸素腫瘍、不十分な血管系を有する組織、潰瘍、脳卒中による虚血領域、または心血管疾患による虚血領域である、請求項44記載の薬学的組成物。
【請求項４５】
HIF-1αを処理するまたは阻害する薬剤がトポテカン、NSC644221、PX-478、YC-1、17-AAG、ベバシズマブ、またはHIF-1α発現を低減するsiRNA、RNAi構築体、ヘアピンRNA、もしくはmiRNAである、請求項42記載の薬学的組成物。
【請求項４６】
低酸素症を処置または抑制する薬剤が、腫瘍血管系を正常化する薬剤、または組織の酸化還元状態を変える薬剤である、請求項42記載の薬学的組成物。
【請求項４７】
低酸素症を処置または抑制する薬剤が、過剰酸素、TSC、アルミトリン、ATP、またはATP生成系である、請求項42記載の薬学的組成物。
【請求項４８】
a) ENT2発現および/または活性を促進する薬剤を投与する段階、ならびに
b) 請求項1記載の抱合体を投与する段階
を含む、ENT-2欠損組織を処置する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は全体として抱合体分子に関し、より具体的には、内因性細胞輸送経路を用いた細胞への活性薬剤の送達における抱合体分子およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
輸送体タンパク質は、細胞中へのおよび/または細胞を通る、種々の分子の細胞取り込みに関与している。担体により媒介される輸送系では、典型的には複数の膜貫通ドメインにより細胞膜に固定され、かつ、その基質を能動機構または受動機構を介して輸送することにより機能する、タンパク質が使用される。担体により媒介される輸送系は、ビタミン、糖、およびアミノ酸などの多くの重要な栄養分の能動的促進輸送または非能動的促進輸送に関与している。担体により媒介される輸送体はまた、肝臓および腎臓などの臓器にも存在し、ここでタンパク質は循環化合物の排泄または再吸収に関与している。極性化合物または親水性化合物は、典型的には、細胞膜を構成する脂質二重層を横断して拡散されにくい。多くの低分子(例えば、アミノ酸、ジペプチドおよびトリペプチド、単糖類、ヌクレオシドならびに水溶性ビタミン)の場合、生体膜を横断する溶質分子の能動輸送のための特異的担体により媒介される輸送体が存在している。
【０００３】
哺乳類細胞による生理学的ヌクレオシドおよびその合成類似体の多くの取り込みまたは放出は、ヌクレオシド輸送体として公知の、特異的担体により媒介される輸送体によって主に行われる。ヌクレオシド輸送体は二つの部類: (i) 拡散(促進拡散)型および(ii) 濃縮(二次性能動)型ナトリウム依存性に分類されている。類似の広い基質特異性を有する二つの拡散型輸送系が同定されており、ニトロベンジルチオイノシン(NBMPR, 1)による阻害に対するその感受性または非感受性に基づいて、それぞれ、es (拡散型感受性)およびei (拡散型非感受性)輸送体と指定されている。cif/N1、cit/N2、cib/N3、cit/N4、cs/N5およびcsg/N6と指定された6つもの数のナトリウムイオン共役(濃縮型)ヌクレオシド輸送系も哺乳類組織において機能的に同定されている。
【０００４】
抗DNA抗体断片3E10 Fvは、特異的な核局在性での生細胞へのその透過、毒性の欠如、ならびにインビトロおよびインビボでの治療用積荷タンパク質の成功裏の送達により、新規の分子送達媒体であることが実証されている。3E10 Fvが細胞膜を横断することを可能にする経路の解明は、高分子の核内伝達による遺伝子発現の調節に依存した新しい分子治療の開発にとって極めて重要である。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、細胞内に透過し、核内に局在化しうるDNA結合抗体がヌクレオシド輸送経路によって輸送されるという発見に基づいている。
【０００６】
本発明の一つの態様によれば、ヌクレオシド輸送経路によって輸送されることができる基質、および基質に連結された活性薬剤を含む抱合体であって、ヌクレオシド輸送経路によって輸送される該抱合体が提供される。基質が抗体である特定の態様において、抗体はモノクローナル抗体3E10またはその断片ではない。ある種の態様において、ヌクレオシド輸送経路は拡散型ヌクレオシド輸送体または濃縮型ヌクレオシド輸送体を含む。ヌクレオシド輸送経路が拡散型ヌクレオシド輸送体を伴う態様において、このような輸送体は低濃度のニトロベンジルメルカプトプリンリボシド(NBMBR)による阻害に対して非感受性でありうる。
【０００７】
本発明の別の態様によれば、ヌクレオシド輸送経路を発現する標的細胞に抱合体を送達するための方法が提供される。そのような方法は、ヌクレオシド輸送経路を発現する標的細胞と、ヌクレオシド輸送経路によって輸送されることができる基質、および基質に連結された活性薬剤を含む抱合体であって、ヌクレオシド輸送経路によって輸送される該抱合体とを接触させる段階を伴う。基質が抗体である特定の態様において、抗体はモノクローナル抗体3E10またはその断片ではない。ある種の態様において、ヌクレオシド輸送経路は拡散型ヌクレオシド輸送体または濃縮型ヌクレオシド輸送体を含む。ヌクレオシド輸送経路が拡散型ヌクレオシド輸送体を伴う態様において、このような輸送体は低濃度のニトロベンジルメルカプトプリンリボシド(NBMBR)による阻害に対して非感受性でありうる。
【０００８】
本発明のさらなる態様によれば、ヌクレオシド輸送経路による輸送について抱合体をスクリーニングする方法が提供される。そのような方法は、ヌクレオシド輸送経路を発現する細胞と抱合体とを、輸送が行われるのに適した条件の下で接触させる段階; および抱合体がヌクレオシド輸送経路により細胞に輸送されるかどうかを判定する段階を含む。ある種の態様において、判定する段階は、ヌクレオシド輸送系を発現する細胞に輸送される抱合体の量を、ヌクレオシド輸送系を発現しない対照細胞に輸送される抱合体の量と比較する段階を含む。これらの態様において、対照細胞と比べてヌクレオシド輸送経路を発現する細胞の抱合体輸送の増大は、輸送がそのヌクレオシド輸送経路によるものであることを示す。
【０００９】
本発明の別の態様によれば、ヌクレオシド輸送経路を発現する細胞または組織における疾患または障害を処置するための方法が提供される。この方法は、病的細胞または組織において発現されるヌクレオシド輸送経路によって輸送されることができる基質、および疾患または障害を処置するための活性薬剤を含む抱合体であって、ヌクレオシド輸送経路によって同様に輸送される該抱合体を、疾患または障害を抱える患者に投与する段階を含む。このように、抱合体は病的細胞または組織に輸送され、それによって活性薬剤を送達する。ある種の態様において、疾患または障害は骨格筋に関わり、抱合体は骨格筋細胞に輸送され、それによって活性薬剤を送達する。
【００１０】
別の態様によれば、拡散型ヌクレオシド輸送体によって輸送されることができる基質、および遺伝的障害を処置するための活性薬剤を含む抱合体を、遺伝的障害を抱える患者に投与する段階を含み、この活性薬剤が基質に連結され、かつさらにこの抱合体が拡散型ヌクレオシド輸送体によって輸送され、それによりこの抱合体が細胞に輸送され、その結果この活性薬剤を送達する、遺伝的障害を処置するための方法が提供される。ある種の態様において、活性薬剤は、遺伝的疾患を抱える患者において欠損している遺伝子またはタンパク質である。
【００１１】
他の局面において、本開示は、拡散型ヌクレオシド輸送体によって輸送されることができる基質、およびがんを処置するための活性薬剤を含む抱合体を、がんを抱える患者に投与する段階を含み、この活性薬剤が基質に連結され、かつさらにこの抱合体が拡散型ヌクレオシド輸送体によって輸送され、それによりこの抱合体ががん性細胞に輸送され、その結果この活性薬剤を送達する、がんを処置する方法を提供する。ある種の態様において、活性薬剤は腫瘍抑制遺伝子または腫瘍抑制タンパク質である。
【００１２】
本発明の別の態様によれば、ヌクレオシド輸送経路による輸送を阻害する化合物を、自己免疫障害を抱える患者に投与する段階を含む、自己免疫障害を処置する方法が提供される。
【００１３】
本開示は同様に、本明細書において記述される抱合体および組織中のENT2発現を促進する薬剤を含む薬学的組成物を提供する。いくつかの局面において、組織中のENT2発現を促進する薬剤は、低酸素症を処置もしくは抑制する薬剤またはHIF-1を阻害する薬剤である。組織は低酸素腫瘍、不十分な血管系を有する組織、潰瘍、糖尿病性潰瘍、治癒が不十分な創傷、虚血領域、脳卒中による虚血領域、または心血管疾患による虚血領域などの、低酸素組織でありうる。ある種の態様において、HIF-1αを阻害する薬剤は、HIF-1α発現を低減するsiRNA、RNAi構築体、ヘアピンRNA、またはmiRNAである。いくつかの態様において、HIF-1α阻害剤は化学療法薬、トポテカン、NSC 644221、PX-478、YC-1、17-AAG、またはベバシズマブである。ある種の態様において、低酸素症を処置または抑制する薬剤は、腫瘍血管系を正常化する薬剤、または組織の酸化還元状態を変える薬剤である。低酸素症を処置または抑制する薬剤は、過剰酸素、TSC、またはアルミトリンでありうる。
【００１４】
さらに、本明細書において、a) ENT2発現および/または活性を促進する薬剤を投与する段階、ならびにb) 本明細書において開示される抱合体の一つを投与する段階を含む、ENT-2欠損組織を処置する方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】A、BはヒトENT1のヌクレオチド配列(SEQ ID NO:1; GenBankアクセッション番号U81375)およびアミノ酸配列(SEQ ID NO:2; GenBankアクセッション番号AAC51103.1)を、それぞれ示す。
【図２】A、BはヒトENT2のヌクレオチド配列(SEQ ID NO:3; GenBankアクセッション番号AF029358)およびアミノ酸配列(SEQ ID NO:4; GenBankアクセッション番号AAC39526.1)を、それぞれ示す。
【図３】mAb 3E10 VHのヌクレオチド配列(SEQ ID NO:5; GenBankアクセッション番号L16982)およびアミノ酸配列(SEQ ID NO:6)を示す。
【図４】mAb 3E10 Vk軽鎖3E10VkIII (GenBankアクセッション番号L34051; ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ、SEQ ID NO:7および8)ならびに3E10VkSER (GenBankアクセッション番号L16981; ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ、SEQ ID NO:9および10)のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明の方法について記述する前に、本発明は記述した特定の組成物、方法、および実験条件に限定されず、したがって組成物、方法、および条件は変更可能であることが理解されるべきである。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲においてのみ限定されるので、本明細書において使用される専門用語は特定の態様について記述するためだけにあり、限定することを意図するものではないことも理解されるべきである。
【００１７】
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる場合、単数形「一つの(a)」、「一つの(an)」、および「その(the)」とは、文脈上明らかに他の意味に解すべき場合を除き、複数の対応物を含む。したがって、例えば、「その方法」への言及は、本開示を読めば当業者に明らかとなるであろう本明細書において記述される種類などの一つまたは複数の方法、および/または段階を含む。
【００１８】
他に定義されていない限り、本明細書において用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【００１９】
本発明によれば、ヌクレオシド輸送経路によって輸送されることができる基質、および基質に連結された活性薬剤を含む抱合体であって、ヌクレオシド輸送経路によって輸送される該抱合体が提供される。このように、抱合体、かくして、活性薬剤は標的細胞に輸送される。基質が抗体である特定の態様において、抗体はモノクローナル抗体3E10またはその断片ではない。ある種の態様において、ヌクレオシド輸送経路は拡散型ヌクレオシド輸送体または濃縮型ヌクレオシド輸送体を含む。ヌクレオシド輸送経路が拡散型ヌクレオシド輸送体を伴う態様において、このような輸送体は低濃度のニトロベンジルメルカプトプリンリボシド(NBMBR)による阻害に対して非感受性でありうる。
【００２０】
「ヌクレオシド輸送経路」とは、一つまたは複数の生体膜を横断する基質の輸送をもたらす一つまたは複数の輸送タンパク質の系をいう。例えば、ヌクレオシド輸送経路は、原形質膜を横断する基質の段階的輸送の後、細胞内小器官の膜を横断する基質の輸送を媒介しうる。二つの生体膜を横断する基質のそのような段階的移動に関与する輸送タンパク質またはヌクレオシド輸送体は、同じ種類のヌクレオシド輸送体であることもあり、または異なる種類のものであることもある。ある種の態様において、ヌクレオシド輸送体は、拡散型ヌクレオシド輸送体でありうる。他の態様において、ヌクレオシド輸送体は、濃縮型ヌクレオシド輸送体でありうる。
【００２１】
「輸送タンパク質」または「輸送体」とは、膜を横断して分子を輸送するうえで直接的または間接的な役割を果たすタンパク質である。この用語には、例えば、基質を認識して、担体により媒介される輸送体によってまたは受容体により媒介される輸送によって、基質の細胞への進入または細胞からの排出をもたらす膜結合タンパク質が含まれる。輸送体は原形質膜または細胞内小器官の膜上に存在することができる。したがって、輸送体は細胞質へのまたは細胞内小器官への分子の輸送を促進する。
【００２２】
二つの異なるファミリーのヌクレオシド輸送体(NT): 拡散型ヌクレオシド輸送体および濃縮型ヌクレオシド輸送体が特徴付けられている。「拡散型ヌクレオシド輸送体」または「ENT」とは、受動輸送または促進拡散によって基質の濃度勾配の下方へ基質を移動させる輸送体をいう。ENT活性はナトリウムイオン(または他のイオン)勾配を必要とせず、それゆえ「Na+-依存性」輸送体と呼ばれる。ENTはニトロベンジルメルカプトプリンリボシド(NBMBR)による阻害に対する感受性に基づき二つのサブタイプのうちの一つに分類される。ENTのうちの一つのサブタイプ(拡散型、感受性または「es」)は、<1 nM NBMPRによって阻害されるのに対し、もう一つのサブタイプ(拡散型、非感受性または「ei」)は、低濃度(例えば、<1 μM)のNBMPRによって影響されない。
【００２３】
ENTファミリーの4つの成員がクローニングされており、ENT1、ENT2、ENT3およびENT4と呼ばれている。4つ全てがアデノシンを輸送するが、他のヌクレオシドまたは核酸塩基を輸送するその能力に関して互いに異なる。ENT1はesサブタイプの輸送体である。ヒトENT1をコードする例示的なポリヌクレオチド配列は、GenBankアクセッション番号U81375を含み、GenBankアクセッション番号AAC51103.1は、対応するアミノ酸配列に当たる。ENT1はヒトおよびげっ歯類組織において普遍的に発現されるが、発現レベルは組織間で異なる。ENT1は広範囲のプリンおよびピリミジンヌクレオシドを輸送することが公知である。
【００２４】
ENT2はeiサブタイプの輸送体である。ヒトENT2をコードする例示的なポリヌクレオチド配列は、GenBankアクセッション番号AF029358を含み、GenBankアクセッション番号AAC39526は、対応するアミノ酸配列に当たる。ENT2は、血管内皮、心臓、脳、胎盤、胸腺、膵臓、前立腺、腎臓、および筋肉、骨格筋、心筋、血液、皮膚、ならびにENT2発現がん細胞を含め、広範囲のヒトおよびげっ歯類組織において発現される。ENT2発現がん細胞は、例えば、ある種の腎腫瘍細胞、乳房腫瘍細胞、前立腺がん細胞、結腸がん細胞、胃がん細胞、白血病細胞、肺がん細胞および卵巣がん細胞を含む。他の種類のENT-2発現がん細胞は当技術分野において公知である; 例えばLu X et al., Journal of Experimental Therapeutics and Oncology 2:200-212, 2002、およびPennycooke M et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 208, 951-959, 2001を参照されたい。ENT2は骨格筋において高い発現レベルを示す。ENT2は核などの細胞小器官の膜においても発現される。ENT2は広範囲のプリンおよびピリミジンヌクレオシドおよび核酸塩基を輸送することが公知である。
【００２５】
ENT3はeiサブタイプの輸送体である。ヒトENT3をコードする例示的なポリヌクレオチド配列は、GenBankアクセッション番号NM_018344を含み、GenBankアクセッション番号NP_060814は、対応するアミノ酸配列に当たる。ENT3は異なる組織において幅広く発現され、胎盤において豊富である。ENT3は主に細胞内タンパク質であるように思われ、培養細胞においてリソソームマーカーと共局在する。ENT3は広範囲のプリンおよびピリミジンヌクレオシドを輸送することが公知である。
【００２６】
ENT4はNBMPRによって弱く阻害される。ヒトENT4をコードする例示的なポリヌクレオチド配列は、GenBankアクセッション番号BC047592を含み、GenBankアクセッション番号AAH47592は、対応するアミノ酸配列に当たる。ENT4は脳、骨格筋、および心臓においてかなり普遍的に発現され、豊富に含まれる。ENT4は腸、膵臓、腎臓、肝臓、骨髄、およびリンパ節においてもかなり発現される。ENT4は広範囲のプリンおよびピリミジンヌクレオシドならびにセロトニンを輸送することが公知である。
【００２７】
「濃縮型ヌクレオシド輸送体」または「CNT」とは、能動輸送によりヌクレオシドおよびヌクレオシド類似体を輸送するヌクレオシド輸送体の群をいう。CNTは、細胞内 vs 細胞外のナトリウム濃度の相違から生じるナトリウム勾配を利用する。この濃度勾配によって生体膜を横断する基質の上り坂輸送または濃縮輸送が可能になる。一般に、哺乳類細胞膜を横断するナトリウム濃度勾配は、ナトリウムおよびヌクレオシドの細胞への移動に有利に働く。CNTは、それゆえ「Na+-依存性」輸送体と考えられる。現在、CNTファミリーの成員が三つクローニングされており、それらは基質選択性および基質対ナトリウム比に関して互いに異なる。
【００２８】
CNT1はピリミジンヌクレオシドおよびアデノシンを、後者は高親和性・低容量の形で輸送することが公知である。CNT1を介した輸送は、ナトリウム対ヌクレオシド比1:1の比率で行われる。ヒトCNT1をコードする例示的なポリヌクレオチド配列は、GenBankアクセッション番号U62968を含み、GenBankアクセッション番号AAB53839.1は、対応するアミノ酸配列に当たる。CNT1は小腸、腎臓、および肝臓などの、組織の上皮細胞において、ならびに脳の多くの領域において主に発現される。
【００２９】
CNT2はプリンヌクレオシドおよびウリジンを輸送することが公知である。CNT2を介した輸送は、ナトリウム対ヌクレオシド比1:1の比率で行われる。ヒトCNT2をコードする例示的なポリヌクレオチド配列は、GenBankアクセッション番号AF036109を含み、GenBankアクセッション番号AAB88539は、対応するアミノ酸配列に当たる。CNT2は心臓、肝臓、腎臓、脳、胎盤、膵臓、骨格筋、結腸、および小腸などの広範囲のヒト組織において発現される。
【００３０】
CNT3は広範に選択的な、輸送プリンおよびピリミジンヌクレオシド、ならびに種々のヌクレオシド類似体であることが公知である。CNT3を介した輸送は、ナトリウム対ヌクレオシド比2:1の比率で行われる。ヒトCNT3をコードする例示的なポリヌクレオチド配列は、GenBankアクセッション番号AF305210を含み、GenBankアクセッション番号AAG22551は、対応するアミノ酸配列に当たる。CNT3は気管、膵臓、骨髄、および乳腺などの組織において発現されるほかに、腸、肺、胎盤、前立腺、精巣、および肝臓においても低レベルで発現される。
【００３１】
本明細書において用いられる「抱合体」とは、活性薬剤に連結された、ヌクレオシド輸送経路によって輸送されることができる基質を含んだ分子を一般的にいう。抱合体はヌクレオシド輸送体によって輸送されることもできる。
【００３２】
本明細書において一般的に用いられる、輸送タンパク質の「基質」とは、細胞または細胞小器官への取り込みが輸送タンパク質によって促進されるような化合物である。基質は特定の輸送体に対して特徴的な反応速度パラメータ(例えばVmaxおよびKm)を有する。Vmaxとは、基質の飽和濃度で単位時間あたりに輸送される基質の分子数をいう。Kmとは、基質がVmaxの半分で輸送される、基質の濃度を指す。一般に、輸送体の基質には高いVmax値が望ましい。低濃度の化合物の輸送には低いKm値が望ましく、高濃度の化合物の輸送には高いKm値が望ましい。Vmaxは輸送体(分子/輸送体タンパク質)に固有の代謝回転速度にも、発現レベルに依る原形質膜中の輸送体密度にも影響を受ける。これらの理由から、特定の輸送体によって輸送される化合物に固有の容量は、通常、化合物のVmax/輸送体の基質であることが公知の対照化合物のVmax比として表現される。
【００３３】
「ヌクレオシド輸送経路によって輸送されることができる基質」とは、細胞または細胞小器官への取り込みがヌクレオシド輸送タンパク質またはヌクレオシド輸送体によって促進される分子化合物をいう。本発明の抱合体において使用される基質は、ヌクレオシド輸送体の公知の基質であってもよく、または当技術分野において知られるおよび本明細書において提供される方法を用いて同定されてもよい。基質はヌクレオシド、核酸塩基、ヌクレオチド、ヌクレオシド類似体、オリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、抗体、抗体断片を含むことができる。
【００３４】
「核酸塩基」という用語はプリンまたはピリミジン塩基をいう。例としてはアデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、およびチミンが挙げられる。核酸塩基はプソイドウリジン、ジヒドロウリジン、イノシン、リボチミジン、7-メチルグアノシン(m7G)、ヒポキサンチン、およびキサンチンなどの、修飾塩基を含む。
【００３５】
「ヌクレオシド」という用語は、5-炭糖(すなわち、ペントース)に共有結合的に連結されているプリンまたはピリミジン塩基をいう。糖がリボースである場合、ヌクレオシドはリボヌクレオシドであり、糖が2-デオキシリボースである場合、ヌクレオシドはデオキシリボヌクレオシドである。例示的なヌクレオシドとしてはシチジン、ウリジン、アデノシン、グアノシン、およびチミジン、ならびにDNAおよびRNAを形成するヌクレオチドの基礎を形成する、対応するデオキシリボヌクレオシドが挙げられる。
【００３６】
本明細書において用いられる「ヌクレオシド類似体」という用語は、塩基部分、糖部分またはその両方が修飾されているヌクレオシドをいう。そのような類似体は、細胞機能においてヌクレオシドの代わりをしうるように、一般的に合成され、天然ヌクレオシドを模倣する。例えば、ヌクレオシドは対応する天然ヌクレオシドの代わりにDNAまたはRNAに組み入れられうる。そのように組み入れられるある種のヌクレオシド類似体は、例えば、合成中の核酸鎖のさらなる伸長を阻止することができる。多くのヌクレオシド類似体は、抗ウイルス特性または抗がん特性を有する。ヌクレオシド類似体の例としてはイノシン、デオキシアデノシン類似体、例えばジダノシン(2',3'-ジデオキシイノシン、ddI)およびビダラビン(9-β-D-リボフラノシルアデニン)、デオキシシチジン類似体、例えばシタラビン(シトシンアラビノシド、エムトリシタビン、ラミブジン(2',3'-ジデオキシ-3'-チアシチジン、3TC)およびザルシタビン(2'-3'-ジデオキシシチジン、ddC)、デオキシグアノシン類似体、例えばアバカビル、(デオキシ-)チミジン類似体、例えばスタブジン(2'-3'-ジデヒドロ-2'-3'-ジデオキシチミジン、d4T)およびジドブジン(アジドチミジン、またはAZT)、ならびにデオキシウリジン類似体、例えばイドクスウリジンおよびトリフルウリジンが挙げられる。
【００３７】
本明細書において用いられる場合、「活性薬剤」という語句は、細胞において生物学的効果を有する分子をいう。ある種の態様において、活性薬剤は核酸、無機分子、有機分子、有機小分子、薬物化合物、ペプチド、ポリペプチド、抗体、抗体断片、ペプチド模倣薬、脂質、DNA、RNA、リボザイム、ヘアピンRNA、種々の化学的性質のsiRNA (低分子干渉RNA)、miRNA、アンタゴmir、PNA (ペプチド核酸)、LNA (ロックされた核酸)、またはモルホリノでありうる。ある種の態様において、活性薬剤はポリペプチドである。
【００３８】
他の態様において、活性薬剤は、α-グルコシダーゼ、α-L-イズロニダーゼ、α-ガラクトシダーゼA、アリールスルファターゼ、N-アセチルガラクトサミン-6-スルファターゼもしくはβ-ガラクトシダーゼ、イズロン酸2-スルファターゼ、セラミダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、ヘパランN-スルファターゼ、N-アセチル-α-グルコサミニダーゼ、アセチルCoA-α-グルコサミニドN-アセチルトランスフェラーゼ、N-アセチル-グルコサミン-6スルファターゼ、ガラクトース6-スルファターゼ、アリールスルファターゼA、BもしくはC、アリールスルファターゼAセレブロシド、ガングリオシド、酸性β-ガラクトシダーゼGMIガングリシオド(Gaiglioside)、酸性β-ガラクトシダーゼ、ヘキソサミニダーゼA、ヘキソサミニダーゼB、α-フコシダーゼ、α-N-アセチルガラクトサミニダーゼ、糖タンパク質ノイラミニダーゼ、アスパルチルグルコサミンアミダーゼ、酸性リパーゼ、酸性セラミダーゼ、リソソームスフィンゴミエリナーゼおよび他のスフィンゴミエリナーゼからなる群より選択される。ある種の態様において、活性薬剤は、ジストロフィン、ジストロフィン-糖タンパク質複合体の成分、ラミニンα2鎖、フクチン関連タンパク質、LARGE、フクチン、EMD、LMNA、DMPK、ZNF9およびPABPN1、グリコーゲンシンターゼ、グルコース-6-ホスファターゼ、脱分岐酵素、トランスグルコシダーゼ、筋ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、酸性マルターゼ欠損、カルニチンパルミチルトランスフェラーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、もしくはホスホグリセリン酸ムターゼ、または該タンパク質のいずれかをコードする核酸である。
【００３９】
ある種の態様において、基質は抗体またはその断片である。例えば、抗体またはその断片はヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸塩基、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、または核酸に結合することができる。基質が抗体である場合のある種の態様において、それは3E10抗体またはATCCアクセッション番号PTA 2439を有するハイブリドーマによって産生される抗体ではない。
【００４０】
ある種の態様において、抱合体の基質部分はDNA結合自己抗体でありうる。そのようなDNA結合自己抗体の例としては、ATCCアクセッション番号PTA 2439を有するハイブリドーマによって産生される抗体の結合特異性を有する抗体、抗体mAb 3E10、ならびにそれらの変種および/または機能断片が挙げられる。mAb 3E10の重鎖の可変領域に対するヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、図3に示されている。mAb 3E10の軽鎖の可変領域に対するヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、図4に示されている。具体的には、VkIIIと指定された軽鎖は、mAb 3E10のDNA結合能を含む。したがって、VkIIIは本発明の方法において使用される3E10に好ましい軽鎖である。
【００４１】
生細胞を透過する抗体は毒性または傷害性であることが多く、それらが見出される自己免疫疾患の病理学的徴候のいくつかを説明できるが、抗体mAb 3E10は、対照的に、それが組織培養において透過する細胞に対して害を示すことはない。さらに、インビトロでの研究から、mAb 3E10およびmAb 3E10のscFv断片がカタラーゼなどの、比較的大きなタンパク質を、組織培養中の細胞の核に輸送できることも示された。さらに、mAb 3E10またはその断片(例えば、Fv)は、それに接合された生物学的に活性な分子の治療効果を妨げる可能性のある顕著な炎症をインビボで生み出さないはずである。モノクローナル抗体3E10は、2000年8月31日に、ブダペスト条約の条件により、ATCCアクセッション番号PTA-2439の下でAmerican Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, USAに寄託され永久的に保管され、かくしてブダペスト条約の条件により維持され利用可能とされるハイブリドーマ3E10によって産生される。そのような菌株の利用可能性はいずれかの政府の権限の下で、その特許法にしたがって承認された権利に違反して本発明を実践するための許可と解釈されるべきではない。
【００４２】
本明細書において用いられる場合、「特異的結合」とは、所定の抗原との抗体の結合をいう。典型的には、抗体は約10-8 Mまたはそれ以下のKDに相当する親和性で結合し、所定の抗原に対しては、所定の抗原または近縁の抗原以外の非特異的な抗原(例えばBSA、カゼイン)に対するその結合親和性よりも(KDで表して)少なくとも10倍小さい、および好ましくは少なくとも100倍小さい親和性で結合する。あるいは、抗体は約106 M-1、もしくは約107 M-1、もしくは約108 M-1、もしくは約109 M-1またはそれ以上のKAに相当する親和性で結合することができ、所定の抗原に対しては、所定の抗原または近縁の抗原以外の非特異的な抗原(例えばBSA、カゼイン)に対するその結合親和性よりも(KAで表して)少なくとも10倍高い、および好ましくは少なくとも100倍高い親和性で結合する。いくつかの態様において、抗体変種または機能断片は、ATCCアクセッション番号PTA 2439を有するハイブリドーマによって産生される抗体と同じKAまたはKDを有するであろう。ある種の態様において、抗体変種または機能断片は、mAb 3E10と同じKAまたはKDを有するであろう。
【００４３】
本明細書において用いられる「kd」(秒-1)という用語は、特定の抗体-抗原相互作用の解離速度定数をいうよう意図される。この値はkoff値ともいわれる。
【００４４】
本明細書において用いられる「ka」(M-1秒-1)という用語は、特定の抗体-抗原相互作用の結合速度定数をいうよう意図される。本明細書において用いられる「KA」(M)という用語は、特定の抗体-抗原相互作用の結合平衡定数をいうよう意図される。
【００４５】
本明細書において用いられる「KD」(M-1)という用語は、特定の抗体-抗原相互作用の解離平衡定数をいうよう意図される。
【００４６】
天然に存在する抗体は一般に、二本の軽鎖および二本の重鎖を含んだ四量体である。実験的に、抗体は、重鎖の各々を切断させ、三つの別個のサブユニットを生成させるタンパク質分解酵素パパインで切断されうる。軽鎖および軽鎖と質量のほぼ等しい重鎖の断片からなる二つのユニットは、Fab断片(すなわち「抗原結合」断片)と呼ばれる。重鎖の二つの等しいセグメントからなる、第三のユニットは、Fc断片と呼ばれる。Fc断片は、典型的には、抗原-抗体結合に関与しないが、抗原本体の除去に関わる以後の過程において重要である。
【００４７】
本明細書において用いられる場合、「ATCCアクセッション番号PTA 2439を有するハイブリドーマによって産生される抗体の結合特異性を有する抗体の機能断片」という語句は、mAb 3E10と同じ細胞透過性および結合特異性を保持する断片をいう。したがって、ある種の態様において、ATCCアクセッション番号PTA 2439を有するハイブリドーマによって産生される抗体の結合特異性を有する抗体の機能断片または抗体mAb 3E10が抱合体に使用される。いくつかの態様において、抱合体に使用される機能断片は、Fab、F(ab')2、Fvおよび一本鎖Fv (scFv)断片からなる群より選択される。ある種の態様において、機能断片はFv断片またはscFv断片である。一つの例を挙げれば、機能断片はmAb 3E10の少なくとも抗原結合部分を含む。別の例を挙げれば、機能断片は、mAb 3E10の重鎖の可変領域(VH)およびκ軽鎖の可変領域(Vκ)を含むscFv断片である。scFvが発現されるポリヌクレオチドの発現増大のため、mAb E310の鎖をコードする核酸は、Vκ cDNAがVHの5'側に配置されるのと逆の順番で配置される。さらに、当技術分野において公知の一つまたは複数のタグ、好ましくはペプチド(例えば、mycまたはHis6)を抱合体に組み入れて、抱合体のインビトロ精製または組織学的局在を容易にすることもできる。いくつかの態様において、mycタグおよびHis6タグがVHのC末端に付加される。
【００４８】
当業者には容易に認識されるように、改変された抗体(例えば、キメラ、ヒト化、CDRグラフト化、二官能性、抗体ポリペプチド二量体(すなわち、抗体の二本のポリペプチド鎖成分の会合、例えば、重鎖および軽鎖、またはVL、VH、CLおよびCH1抗体ドメインを含むFab断片、またはVLドメインおよびVHドメインを含むFv断片を含んだ抗体の一本のアーム)、一本鎖抗体(例えば、リンカーによってVHドメインに連結されたVLドメインを含むscFv (すなわち、一本鎖Fv; single chain Fv)断片など)を当技術分野において周知の方法により産生することもできる。そのような抗体は、例えば、(参照により本明細書に組み入れられるSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2d Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989)および参照により本明細書に組み入れられるHarlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory 1988))に記述されているハイブリドーマ法、化学的合成法、または組み換え法により産生することもできる。抗ペプチド抗体も抗抱合体抗体もともに使用することができる(例えば、参照により本明細書に組み入れられるBahouth et al., Trends Pharmacol. Sci. 12:338 (1991); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, NY 1989)を参照のこと)。mAb 3E10と指定された本発明の例示的抗体の具体的なヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、特に図2および3を参照されたい。
【００４９】
例えば、抗原結合に直接関与していないFv可変領域の配列を、ヒトFv可変領域由来の等価な配列と置き換えることにより、抗体をヒト化することができる。ヒト化キメラ抗体の総説はMorrisonら(Science 229:1202-1207, 1985)によりおよびOiら(BioTechniques 4:214, 1986)により提供されている。それらの方法は、重鎖または軽鎖の少なくとも一つからの免疫グロブリンFv可変領域の全部または一部をコードする核酸配列を単離する段階、操作する段階、および発現させる段階を含む。そのような核酸の供給源は当業者に周知であり、例えば、抗体産生ハイブリドーマから得ることができる。ヒト化抗体もしくはキメラ抗体、またはそれらの断片をコードする組み換えDNAを次いで、適切な発現ベクターにクローニングすることができる。ヒト化抗体は、あるいは、CDR置換によって産生することもできる。米国特許第5,225,539号; Jones (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. 1988 Science 239:1534; およびBeidler (1988) J. Immunol. 141:4053-4060。したがって、ある種の態様において、抱合体において使用される抗体は、ATCCアクセッション番号PTA 2439を有するハイブリドーマによって産生される抗体のヒト化型またはCDRグラフト化型である。他の態様において、抗体は抗体mAb 3E10のヒト化型またはCDRグラフト化型である。例えば、図2および3に示されるように、本発明の例示的抗体のCDR領域は、図中に示されるものとは1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のアミノ酸の相違などのアミノ酸の置換を含むことができる。場合によっては、1〜5個のアミノ酸相違がどこかに存在する。
【００５０】
本明細書において用いられる場合、「ATCCアクセッション番号PTA 2439を有するハイブリドーマによって産生される抗体の結合特異性を有する抗体の変種」への言及は、mAb 3E10と同じ細胞透過性および結合特異性を保持している変種、ならびにその有用性の改善(例えば、特異的な細胞種を標的化する能力の改善、細胞膜を透過する能力の改善、細胞DNAに局在化する能力の改善など)を行うように突然変異によって改変された変種を含む。そのような変種は、一つまたは複数の保存的置換が抗体の重鎖、軽鎖および/または定常領域に導入されているものを含む。いくつかの態様において、変種は、SEQ ID NO:8に記載のアミノ酸配列に対し少なくとも80%または少なくとも90%または少なくとも95%同一のアミノ酸配列を有する軽鎖を持つ。他の態様において、変種は、SEQ ID NO:6に記載のアミノ酸配列に対し少なくとも80%または少なくとも90%または少なくとも95%同一のアミノ酸配列を有する重鎖を持つ。さらに、本発明は、ストリンジェントな条件の下で3E10可変領域コード配列(例えば、SEQ ID NO:5および/もしくはSEQ ID NO:7)にハイブリダイズする、またはSEQ ID NO:6もしくはSEQ ID NO:8に記載のアミノ酸配列に対し少なくとも80%もしくは少なくとも90%もしくは少なくとも95%同一のアミノ酸配列をコードする核酸配列によってコードされる抗体を含む。
【００５１】
そのような変種は、一つまたは複数の置換が抗体の重鎖ヌクレオチド配列、軽鎖ヌクレオチド配列および/または定常領域に導入されているものを含む。いくつかの態様において、変種は、SEQ ID NO:7に記載のヌクレオチド配列に対し少なくとも80%または少なくとも90%または少なくとも95%同一のヌクレオチド配列を有する軽鎖を持つ。他の態様において、変種は、SEQ ID NO:5に記載のヌクレオチド配列に対し少なくとも80%または少なくとも90%または少なくとも95%同一のヌクレオチド配列を有する重鎖を持つ。
【００５２】
本発明の実践用に企図される一つの例示的な変種は、31位のアスパラギン酸のアスパラギンへの単一変化を伴うmAb 3E10 VH変種(すなわち、mAb 3E10-31)である。この変種およびさらなる変種の調製ならびにその細胞透過能の実証が米国特許第7,189,396号に記述されている。この特定のmAb 3E10変種は、とりわけ、腎臓および脳細胞への生体分子の送達によく適している。他の3E10変種および/またはその機能断片を用いて、生物学的に活性な分子の標的化をもたらすことができる。広範囲の変種および/またはその機能断片は、選択された生物学的に活性な分子への接合後にmAb 3E10またはmAb 3E10-31と実質的に同じ細胞透過性を示すという条件で可能である。
【００５３】
他の態様において、一つまたは複数の特異的なヌクレオシド輸送体を標的化する新規の基質を作出することができる。そのような新規の基質は、例えば公知の基質の構造に基づき分子モデリングおよびタンパク質模倣の方法論を用いて作出することができよう。
【００５４】
基質および活性薬剤がポリペプチドである抱合体(すなわち、タンパク質抱合体)は、周知の組み換えDNA法を用いて、基質のアミノまたはカルボキシ末端に活性薬剤を配置するようにデザインすることができる。そのような抱合体は融合タンパク質として宿主細胞中で発現させることができる。あるいは、基質および活性薬剤をペプチド結合により、または当技術分野において周知のタイプの化学リンカーもしくはペプチドリンカー分子により化学的に連結することもできる。リンカーは一つもしくは複数のタグ(例えば、mycもしくはHis6 (SEQ ID NO:12))であってよく、または公知のリンカー配列GGGGS (SEQ ID NO:11)の一つもしくは複数の繰り返しであってよい。さらなるペプチドリンカーが当技術分野において公知である。リンカー配列は、抗体に連結されるポリペプチドに応じて変化しうることを当業者は認識するであろう。
【００５５】
タンパク質抱合体の調製で用いるのに適したベクターは、バキュロウイルス、ファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、フォスミド、細菌人工染色体、ウイルスDNA、P1に基づく人工染色体、酵母プラスミド、および酵母人工染色体から選択されるものを含む。例えば、ウイルスDNAベクターはワクシニアウイルス、アデノウイルス、ファウルポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびSV40の誘導体から選択することができる。本発明の方法の実践で用いるのに適した細菌ベクターはpQE70、pQE60、pQE-9、pBLUESCRIPT SK、pBLUESCRIPT KS、pTRC99a、pKK223-3、pDR540、PACおよびpRIT2Tを含む。本発明の方法の実践で用いるのに適した真核生物ベクターはpWLNEO、pXTI、pSG5、pSVK3、pBPV、pMSGおよびpSVLSV40を含む。本発明の方法の実践で用いるのに適した真核生物ベクターはpWLNEO、pXTI、pSG5、pSVK3、pBPV、pMSGおよびpSVLSV40を含む。
【００５６】
当業者は、そのようなベクターに含まれる適当な調節領域を、例えばlacI、lacZ、T3、T7、apt、λPR、PL、trp、CMV前初期、HSVチミジンキナーゼ、初期および後期SV40、レトロウイルスLTR、ならびにマウスメタロチオネイン-I調節領域から選択することができる。
【００５７】
タンパク質抱合体をコードするポリヌクレオチドを含んだベクターを発現できる宿主細胞は、細菌細胞、真核細胞、酵母細胞、昆虫細胞または植物細胞を含む。例えば、大腸菌(E. coli)、桿菌(Bacillus)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、サルモネラ・ティフィムリウム(Salmonella typhimurium)、ショウジョウバエ(Drosophila) S2、スポドプテラ(Spodoptera) SJ9、CHO、COS (例えばCOS-7)またはボウズ(Bowes)黒色腫細胞は全て、本発明の方法の実践で用いるのに適した宿主細胞である。
【００５８】
基質がポリペプチドであり、活性薬剤が低分子または薬物化合物である抱合体は、当技術分野において公知の方法を用いて作出することができる。例えば、薬物または他の低分子薬をタンパク質に付着させるための方法には、N-スクシンイミジル(4-ヨードアセチル)-アミノ安息香酸; スルホスクシンイミジル(4-ヨードアセチル)-アミノ安息香酸; 4-スクシンイミジル-オキシカルボニル-α-(2-ピリジルジチオ)トルエン; スルホスクシンイミジル-6-[α-メチル-α-(ピリジルジチオ)-トルアミド]ヘキサン酸; N-スクシンイミジル-3-(-2-ピリジルジチオ)-プロピオネート(proprionate); スクシンイミジル-6-[3(-(-2-ピリジルジチオ)-プロピオンアミド(proprionamido)]ヘキサン酸; スルホスクシンイミジル-6-[3(-(-2-ピリジルジチオ)-プロピオンアミド]ヘキサン酸; 3-(2-ピリジルジチオ)-プロピオニルヒドラジド、エルマン試薬、ジクロロトリアジン酸、S-(2-チオピリジル)-L-システインなどのような二官能性化学リンカーが含まれる。さらなる二官能性連結分子は米国特許第5,349,066号; 同第5,618,528号; 同第4,569,789号; 同第4,952,394号; および同第5,137,877号に開示されており、これらの各々はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００５９】
本発明のさらなる態様によれば、ヌクレオシド輸送経路を発現する細胞と抱合体とを、輸送が行われるのに適した条件の下で接触させる段階; および抱合体がヌクレオシド輸送経路により細胞に輸送されるかどうかを判定する段階を含む、ヌクレオシド輸送経路による輸送について抱合体をスクリーニングする方法が提供される。ある種の態様において、判定する段階は、ヌクレオシド輸送系を発現する細胞に輸送される抱合体の量を、ヌクレオシド輸送系を発現しない対照細胞に輸送される抱合体の量と比較する段階を含み、対照細胞と比べてヌクレオシド輸送経路を発現する細胞の抱合体輸送の増大は、輸送がそのヌクレオシド輸送経路によるものであることを示す。
【００６０】
上記のスクリーニング方法の特定の態様において、ヌクレオシド輸送経路は拡散型ヌクレオシド輸送体または濃縮型ヌクレオシド輸送体を含む。いくつかの態様において、拡散型ヌクレオシド輸送体は、ENT1、ENT2、ENT3およびENT4からなる群より選択される。ある種の態様において、拡散型ヌクレオシド輸送体は、低濃度のニトロベンジルメルカプトプリンリボシド(NBMBR)に対して非感受性である。特定の態様において、ヌクレオシド輸送体をコードするDNAを細胞にトランスフェクトする。そのような態様は、ヌクレオシド輸送体をコードするDNAをトランスフェクトした細胞に輸送される抱合体の量を、ヌクレオシド輸送体をトランスフェクトしていない対照細胞に輸送される抱合体の量と比較する段階をさらに含むことができ、対照細胞と比べてトランスフェクト細胞の抱合体輸送の増大は、輸送がヌクレオシド輸送体によるものであることを示す。
【００６１】
スクリーニング方法は、ヌクレオシド輸送活性を阻害する化合物をさらに含むことができる。例えば、NBMPR、ジラゼプ、ジピリダモール、およびドラフラジンは、ある種のesヌクレオシド輸送体(例えば、ENT1)の阻害剤である。したがって、ある種の態様において低濃度のNBMPRを含めることができる。
【００６２】
ある種の態様において、抱合体は検出可能な標識をさらに含むことができる。そのような標識は当技術分野において公知であり、放射性同位体および蛍光標識を含む。
【００６３】
抱合体は、ヌクレオシド輸送経路により輸送されるその能力について直接スクリーニングすることができる。スクリーニングは、典型的には、ヌクレオシド輸送経路を発現する細胞にて行われる。いくつかの方法では、特定のヌクレオシド輸送体(NT)をコードするDNAを細胞にトランスフェクトする。他の方法では、内因性NTを発現する細胞を使用する。細胞は内因性CNTおよび/またはENTを発現することができる。いくつかの方法では、ENTは、発現される唯一のNTである。他の方法では、ENT1もENT2もともに発現する細胞を使用する。
【００６４】
輸送体による通過を立証する化合物の内部移行は、種々のレポーターのいずれかに由来する細胞内からのシグナルの検出により検出することができる。レポーターはフルオロフォア、クロモフォア、放射性同位体などの標識のように単純であってよい。共焦点画像法も、細胞表面上の蛍光と細胞内の蛍光を識別するのに十分な空間的分離を提供するので、標識の内部移行を検出するために使用することができ、あるいは、共焦点画像法を、化合物の移動を経時的に追跡するために使用することもできる。別のアプローチでは、化合物の内部移行は、細胞内で発現される酵素の基質であるレポーターを用いて検出される。複合体が内部移行したら、基質は酵素により代謝されて、取り込みの指標となる光学的シグナルまたは放射性崩壊を生じる。発光は、市販のPMTに基づく装置によりまたはCCDに基づく画像系によりモニタリングすることができる。さらに、輸送活性の指標となる輸送化合物または電気生理学的シグナルのLCMSによる検出を用いたアッセイ法も利用される。
【００６５】
いくつかの方法では、複数の抱合体を同時にスクリーニングし、各薬剤または抱合体部分の実体を、抱合体に連結されたタグを用いて追跡する。いくつかの方法では、スクリーニングは、被試験抱合体およびヌクレオシド輸送体の公知の基質が同一細胞に適用される競合形式で行うことができる。典型的には、抱合体および公知の基質は、このようなアッセイでは個別的に標識される。あるいは、公知の基質を標識し、試験抱合体の存在下および非存在下での標識基質の取り込みの同時測定値を比較してもよい。
【００６６】
そのような比較アッセイにおいて、抱合体のVmaxを公知の基質のそれと比較することができる。抱合体が輸送体に対する公知の基質の少なくとも1%、好ましくは少なくとも5%、より好ましくは少なくとも10%、さらにより好ましくは少なくとも20%、および最も好ましくは少なくとも50%のVmaxを有するなら、抱合体はそのNTに対する基質であると考えることができる。
【００６７】
核酸治療薬
ある種の態様において、本明細書における組成物は核酸またはその類似体を、標的組織または細胞種に送達するために使用することができる。例えば、タンパク質発現は、例えば、アンチセンス、ロックされた核酸(LNA)、ペプチド核酸(PNA)、モルホリノ核酸(Morpholino)および種々の化学的性質の低分子干渉RNA (siRNA)などのオリゴヌクレオチドを用いて特異的に下方制御することができる。あるいは、発現構築体を細胞に送達して、所望の遺伝子産物の発現を誘導することもできる。
【００６８】
ある種の遺伝子または遺伝子産物の発現を調節する核酸を、投与することができる。本明細書において用いられる場合、「...の発現を調節する核酸」とは、所与の遺伝子または遺伝子産物の発現を上方制御および下方制御する核酸を包含する。例えば、発現構築体は関心対象の遺伝子を発現させ、上方制御を引き起こすことができる。あるいは、下方制御を引き起こす核酸は、例えば、siRNA、アンチセンスRNA (低分子ヘアピンRNAなどの)を発現する構築体、またはリボザイムであってもよい。
【００６９】
細胞内標的(mRNAまたはタンパク質)に対して作製されたオリゴヌクレオチドなどの、核酸治療薬は強力な治療剤である。オリゴヌクレオチド治療剤の例としては、相補mRNAに結合しかつ翻訳を阻害するかまたはRNaseHを介した転写産物の分解を誘導する短い、一本鎖DNAおよびRNAである、アンチセンスオリゴヌクレオチド; mRNA分解につながるRNA干渉(RNAi)経路を活性化する短い、二本鎖RNAである、siRNAオリゴヌクレオチド; 特異的なmRNA転写産物を切断するようにデザインされるオリゴヌクレオチドに基づくエンドヌクレアーゼである、リボザイム; ならびに低分子薬と類似した方法でタンパク質標的に結合し、タンパク質標的を遮断する非天然オリゴヌクレオチドである、核酸アプタマーおよびデコイが挙げられる。
【００７０】
本明細書において用いられる場合、「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸(DNA)、および、適切な場合、リボ核酸(RNA)などのポリヌクレオチドをいう。この用語はまた、文脈に適切な場合または記述されている態様に適用可能な場合、一本鎖ポリヌクレオチド(アンチセンスなどの)も二本鎖ポリヌクレオチド(siRNAなどの)もともに含むものと理解されるべきである。「核酸」という用語は、例えば、DNA分子、RNA分子、RNAi分子およびsiRNA分子、マイクロRNA分子、天然RNA分子、リボザイムRNA分子、アプタマー、プラスミド、cDNA分子、アンチセンスDNA鎖、ならびにオリゴヌクレオチドを包含する。それはDNA分子(プラスミド、cDNA、線状DNA、オリゴまたはアンチセンスDNA鎖の形での)、RNA分子(siRNA、mRNA、shRNA、リボザイム、RNAiの形での)、アプタマー、タンパク質(抗体、ポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質の断片)、他の化合物(蛍光色素、特異的タンパク質の低分子阻害剤)に接合された核酸をさらに包含する。現時点で開発の各段階にある核酸に基づく治療剤がいくつか存在する。それらの中にはアンチセンス剤、アプタマー、リボザイム、および低分子干渉RNA (siRNA)がある。M. Faria, H. Ulrich, Curr. Cancer Drug Targets 2002, 2:355-368。
【００７１】
アンチセンス剤はこれらの薬剤のうち最も進んだ部類でありえ、CMV網膜炎の処置向けに一製品(ホミビルセン)が上市されており、別の製品(アリカホルセン)はクローン病の処置向けに臨床試験が進行しており、ならびにGenasense(商標) (オブリメルセンナトリウム)、Affinitac(商標)およびOncomyc-NG(商標)はがんの処置向けに臨床試験中である。アンチセンス剤は、典型的には、標的mRNAの特異的な相補領域にハイブリダイズする短い、化学的に修飾されたオリゴヌクレオチド鎖である。生じたmRNA二重鎖はRNAse Hにより認識され分解され、それによってmRNAを破壊する。mRNAの命令はリボソームに到達できないので、標的mRNAによりコードされるタンパク質の産生が阻止される。疾患に関与するタンパク質の産生を阻害することにより、アンチセンス薬は治療的有用性を生み出すことができる。
【００７２】
アプタマーは、標的分子に結合するその能力に基づき、オリゴ核酸の無作為の、または偏ったプールから選択されたDNAまたはRNA分子である。核酸、タンパク質、有機小化合物および特異的な細胞表面に結合するアプタマーを選択することができ、疾患状態に関連するタンパク質に結合するいくつかのものが開発されている。アプタマーは、概して、抗体よりも容易に製造され、化学的修飾を受けやすく、それらを無作為修飾および親和性に基づく選択の反復過程により、標的とのより緊密な結合へと「進化させる」ことができる。進化したアプタマーは抗体様の特異性を有することが多く、それゆえ、抗体が役に立つと既に証明されているような、治療ならびにインビトロおよびインビボ診断などの、用途において有用性があると期待される。少なくとも一つの製品Macugen(商標) (ペガタニブ(pegaptanib)ナトリウム: VEGFに高い親和性を有するPEG化アプタマー)は、加齢黄斑変性症の処置向けに臨床試験が進行している。
【００７３】
リボザイム、またはRNA酵素は、化学反応を触媒できるRNA分子である。これまで天然に見出されたリボザイムは全て、RNAの切断を触媒する。それらはサイズが大型の「ハンマーヘッド」リボザイムから、活性のために必要とされる最小構造を含んだ合成構築体である、いわゆる「ミニザイム」までの範囲にわたる。類似の特性を有する、DNAに基づく酵素(デオキシリボザイム、またはDNAzyme)も調製されている。リボザイムは特異的なmRNA分子を認識かつ切断できるので、それらは治療剤としてのかなりの可能性がある。特異的なmRNAの切断を触媒するようデザインされたリボザイムは、相補的アンチセンス核酸と同じように、治療剤として有用であろうが、単一のリボザイム分子で多コピーのmRNAを破壊できるという利点を有する。VEGF受容体サブタイプをコードするmRNAを切断する合成リボザイム(Angiozyme(商標))が、現在、がんの処置向けに臨床試験中である。
【００７４】
RNA干渉(RNAi)は、二本鎖RNAオリゴマーによる遺伝子特異的な転写後スプライシングの現象である(Elbashir et al. Nature 2001, 411: 494-498; Caplen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2001, 98: 9742-9747)。低分子阻害性RNA (siRNA)は、アンチセンスオリゴ核酸およびリボザイムと同様に、有害なタンパク質の発現を低減することにより治療剤として役立つ可能性がある。二本鎖siRNAはタンパク質複合体(RNA誘導サイレンシング複合体)によって認識されるが、これは鎖の一方を引き離し、残りの鎖と標的mRNAとのハイブリダイゼーションを促進し、次いで標的鎖を切断する。細胞内でsiRNAを作出できる、DNAに基づくベクターも、効率的にプロセッシングされて細胞内でsiRNAを形成する低分子ヘアピンRNAと同様に、同じ理由から対象となる。内因的および外因的に発現された遺伝子を特異的に標的化できるsiRNAが記述されており; 例えばPaddison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2002, 99: 1443-1448; Paddison et al., Genes & Dev. 2002, 16: 948-958; Sui et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2002, 8: 5515-5520; およびBrummelkamp et al., Science 2002, 296: 550-553を参照されたい。
【００７５】
本明細書において用いられる「核酸に基づく治療剤」という用語は、三つの部類の化合物をいう。この用語は、該化合物の薬学的に許容される塩、エステル、プロドラッグ、コドラッグおよび保護された形態、以下に記述される類似体および誘導体も含む。第一の部類は、本明細書において「アンチセンス核酸」と総称されるが、標的化一本鎖RNAまたはDNA分子に配列特異的にハイブリダイズする能力を有する、核酸、好ましくは約50単量体単位またはそれ以下のオリゴマーを含む。この部類の成員は、通常のDNAおよびRNAオリゴマー、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネートおよびペプチド核酸を含むがこれらに限定されない、修飾された骨格を有するDNAおよびRNA、2'-デオキシ誘導体、ならびに化学的に修飾されたプリンおよびピリミジン塩基を特徴とするか、または親油改質されおよび/もしくはPEG化されてその薬力学を改変した核酸オリゴマーを含む。そのような薬剤の前駆体として役立つオリゴマー、例えば細胞内でsiRNAに変換されるヘアピンRNAも、この部類の範囲内であると考えられる。
【００７６】
核酸に基づく治療剤の第二の部類はアプタマーである。アプタマーは、構造特異性によって非オリゴヌクレオチド標的分子に、または配列特異的なハイブリダイゼーションによる以外の形でオリゴヌクレオチドに結合する能力を有する、核酸、好ましくは約50単量体単位またはそれ以下のオリゴマーを含む。この部類の成員は、DNAおよびRNAアプタマー、ならびに鏡像DNAおよびRNA (「スピーゲルマー(Spiegelmer)」)、ペプチド核酸、および上記したのと別の形で化学的に修飾された核酸オリゴマーを含むがこれらに限定されない、それらの修飾体を含む。やはり、これらの種のいずれも、化学的に修飾されたプリンおよびピリミジンを特徴とするか、または親油的に改変されおよび/もしくはPEG化されていてもよい。アプタマー技術の最近の概説はM. Rimmele, Chembiochem. 2003, 4: 963-71およびA. Vater and S. Klussmann, Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 2003, 6: 253-61を参照されたい。この第二の部類の多くの成員は、標的分子に対するその構造特異的な親和性に加えて、推定されるDNAまたはRNA配列に対する配列特異的な親和性を有することが理解されよう。
【００７７】
核酸に基づく治療剤の第三の部類は、本明細書において「核酸酵素」といわれるが、標的RNA分子の切断を、配列特異的な形で認識かつ触媒できる核酸を含む。この部類には、ハンマーヘッドリボザイム、最小化ハンマーヘッド(「ミニザイム」)、'10-23'デオキシリボザイム(「DNAzyme」)などが含まれる。アンチセンスおよびアプタマー分子のように、この部類には、化学的に修飾された触媒種が含まれる。
【００７８】
「薬学的に許容される塩」という用語は、本発明の化合物の生理学的および薬学的に許容される塩、例えば、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、かつ望ましくない毒物学的影響をそれに与えない塩をいう。
【００７９】
「タンパク質コード配列」または特定のポリペプチドもしくはペプチドを「コードする」配列は、適切な調節配列の制御下に配置される場合にインビトロまたはインビボで転写され(DNAの場合)およびポリペプチドに翻訳される(mRNAの場合)核酸配列である。コード配列の境界は、5'(アミノ)末端の開始コドンおよび3'(カルボキシル)末端の翻訳終止コドンによって決定される。コード配列は、以下に限定されないが、原核生物または真核生物mRNAからのcDNA、原核生物または真核生物DNAからのゲノムDNA配列、および合成DNA配列さえも含むことができる。転写終結配列は、通常、コード配列の3'側に位置するであろう。
【００８０】
本明細書において用いられる場合、「RNAi構築体」という用語は、siRNA、ヘアピンRNA、およびインビボで切断されてsiRNAを形成できる他のRNA種を含む、総称である。RNAi構築体は本明細書において、細胞中でdsRNAもしくはヘアピンRNAを形成する転写産物、および/またはインビボでsiRNAに変換されうる転写産物をもたらしうる発現ベクター(RNAi発現ベクターともいわれる)も含む。
【００８１】
本明細書において用いられる場合、「ベクター」という用語は、それに連結された別の核酸を輸送できる核酸分子をいう。ベクターの一種は、宿主細胞の染色体DNAに統合されるようになりうる、ゲノム統合ベクターまたは「統合ベクター」である。ベクターの別種はエピソームベクター、例えば、染色体外複製ができる核酸である。機能的に連結されている遺伝子の発現を指令できるベクターは、本明細書において「発現ベクター」といわれる。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、文脈から別であることが明らかでない限り、互換的に使用される。発現ベクターにおいて、転写を制御する調節要素は一般的に、哺乳類、微生物、ウイルスまたは昆虫の遺伝子に由来することができる。通常は複製起点によって与えられる、宿主中で複製する能力、および形質転換体の認識を促進するための選択遺伝子を、さらに組み入れることもできる。レトロウイルス、アデノウイルスなどのような、ウイルスに由来するベクターを利用してもよい。
【００８２】
一つの態様において、本開示は、標的とされる疾患関連タンパク質の発現を低下させるためのアンチセンス核酸の使用に関する。そのようなアンチセンス核酸は、例えば、細胞中で転写される場合に、標的とされる疾患関連タンパク質をコードする細胞mRNAの少なくとも独自の部分に相補的であるRNAを産生する、発現プラスミドとして送達されることができる。あるいは、この構築体は、エクスビボで生成され、細胞中に導入される場合に、標的とされる疾患関連タンパク質をコードするmRNAおよび/またはゲノム配列とハイブリダイズすることによって発現の阻害を引き起こす、オリゴヌクレオチドである。そのようなオリゴヌクレオチドは、任意で、内因性エキソヌクレアーゼおよび/またはエンドヌクレアーゼに耐性であるように修飾されてもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドとして用いるための例示的な核酸分子は、DNAのホスホロアミデート、ホスホチオエートおよびメチルホスホネート類似体である(例えば米国特許第5,176,996号; 同第5,264,564号; および同第5,256,775号を参照のこと)。核酸療法において有用なオリゴマーを構築するための一般的アプローチは、例えば、van der Krol et al., (1988) Biotechniques 6: 958-976; およびStein et al., (1988) Cancer Res 48: 2659-2668により概説されている。
【００８３】
他の態様において、本出願は、標的遺伝子のノックダウンをもたらすためのRNA干渉(RNAi)の使用に関する。RNAi構築体は、標的遺伝子の発現を特異的に遮断できる二本鎖RNAを含む。RNAi構築体は、標的核酸配列と同一もしくは実質的に同一の長いdsRNAストレッチか、または標的核酸配列の一領域のみと同一もしくは実質的に同一の短いdsRNAストレッチのいずれかを含むことができる。
【００８４】
任意で、RNAi構築体は、阻害される遺伝子(「標的」遺伝子)のmRNA転写産物の少なくとも一部分のヌクレオチド配列と、細胞の生理的条件の下でハイブリダイズする、ヌクレオチド配列を含んでもよい。二本鎖RNAは、RNAiを誘導する能力を持つよう天然RNAに十分類似していることが必要なだけである。したがって、本発明は、標的配列における遺伝子突然変異、多型部位、または進化的多様性のために予想されうる、配列変異を許容する態様を企図する。標的配列とRNAi構築体配列との間の許容されるヌクレオチドミスマッチの数は、5塩基対中1塩基対と同じくらいに高いが、10塩基対中1塩基対を超えないことが好ましい。siRNA二重鎖の中心におけるミスマッチは最も重要な意味を持ち、標的RNAの切断を本質的になくすことがある。対照的に、標的RNAに相補的であるsiRNA鎖の3'末端のヌクレオチドは、標的認識の特異性に有意には寄与しない。配列同一性は、当技術分野において公知の配列比較および整列アルゴリズム(Gribskov and Devereux, Sequence Analysis Primer, Stockton Press, 1991およびその中で引用されている参考文献を参照のこと)ならびにヌクレオチド配列間の相違の割合を、例えば、BESTFITソフトウェアプログラム(例えば、University of Wisconsin Genetic Computing Group)でデフォルトパラメータを用いて実行されるようなスミス・ウォーターマン(Smith-Waterman)アルゴリズムにより算出することによって最適化されうる。阻害性RNAと標的遺伝子の部分との間の90%〜100%の配列同一性が好ましい。あるいは、RNAの二重鎖領域は、400 mM NaCl、40 mM PIPES pH 6.4、および1.0 mM EDTA中50℃〜70℃で12〜16時間のハイブリダイゼーション、次いで洗浄後の標的遺伝子転写産物と検出可能にハイブリダイズできるヌクレオチド配列と機能的に規定されてもよい。
【００８５】
二本鎖構造は、一本の自己相補的RNA鎖または二本の相補的RNA鎖によって形成されうる。dsRNAの形成は細胞の内部または外部で開始されうる。このRNAは、少なくとも1細胞あたり1コピーの送達を可能にする量で導入されうる。より多くの用量(例えば、少なくとも1細胞あたり5、10、100、500または1000コピー)の二本鎖材料はより効果的な阻害をもたらしうるが、より少ない用量でも特定の用途に有用なことがある。
【００８６】
本RNAi構築体は「低分子干渉RNA」または「siRNA」であることができる。これらの核酸は、長さが約50ヌクレオチド未満、好ましくは19〜30ヌクレオチド前後、より好ましくは長さが21〜23ヌクレオチドである。siRNAは、ヌクレアーゼ複合体を動員し、特異的配列と対合することによってこの複合体を標的mRNAにガイドすると考えられる。その結果、標的mRNAはタンパク質複合体中のヌクレアーゼによって分解される。特定の態様において、21〜23ヌクレオチドのsiRNA分子は3'ヒドロキシル基を含む。ある種の態様において、siRNA構築体は、例えば、酵素DICERの存在下での、より長い二本鎖RNAのプロセッシングによって作出されうる。一つの態様において、ショウジョウバエのインビトロ系が用いられる。この態様において、dsRNAをショウジョウバエ胚由来の可溶性抽出物と組み合せ、それによって組み合せを作出する。この組み合せを、dsRNAが約21〜約23ヌクレオチドのRNA分子へとプロセッシングされる条件の下で維持する。siRNA分子はゲル電気泳動などの、当業者には公知の数多くの技術を用いて精製することができる。あるいは、カラムクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、グリセロール勾配遠心分離および親和性精製などの、非変性法を用いてsiRNAを精製することもできる。
【００８７】
RNAi構築体の産生は化学的合成法によりまたは組み換え核酸技術により行うことができる。処理細胞の内因性RNAポリメラーゼはインビボで転写を媒介することができ、またはクローニングされたRNAポリメラーゼをインビトロでの転写に用いることもできる。RNAi構築体はリン酸-糖の骨格またはヌクレオシドのいずれかに対する修飾、例えば、細胞ヌクレアーゼに対する感受性を低下させ、生体利用能を向上させ、処方特性を向上させ、かつ/または他の薬物速度論的特性を変化させるための修飾を含むことができる。例えば、天然RNAのホスホジエステル結合を、少なくとも一つの窒素または硫黄ヘテロ原子を含むように修飾することができる。RNA構造の修飾は、dsRNAに対する一般的な応答を避けながら、特定の遺伝的阻害を可能とするように調整することができる。同様に、アデノシンデアミナーゼの活性を遮断するように、塩基を修飾することもできる。RNAi構築体は酵素によって、または部分的/全体的な有機合成によって作出することができ、任意の修飾リボヌクレオチドをインビトロでの酵素合成または有機合成によって導入することができる。RNA分子を化学的に修飾する方法は、RNAi構築体を修飾するのに適合させることができる(例えば、Heidenreich et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 776-780; Wilson et al. (1994) J. Mol. Recog. 7: 89-98; Chen et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23: 2661-2668; Hirschbein et al. (1997) Antisense Nucleic Acid Drug, Dev. 7: 55-61を参照のこと)。例えば、RNAi構築体の骨格を、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、ホスホジチオエート、キメラのメチルホスホネート-ホスホジエステル、ペプチド核酸、5-プロピニルピリミジン含有オリゴマーまたは糖修飾(例えば、2'-置換または2'-デオキシリボヌクレオシド、α-立体配置など)で修飾することができる。
【００８８】
いくつかの態様において、siRNA分子の少なくとも一方の鎖は、長さが約1〜約6ヌクレオチドの3'突出部を有することができる。好ましくは、3'突出部は、長さが1〜3ヌクレオチドである。ある種の態様において、一方の鎖は3'突出部を有し、もう一方の鎖は平滑末端であるか、または同様に突出部を有する。突出部の長さは、各鎖について同じでもまたは異なってもよい。siRNAの安定性をさらに増強するために、3'突出部を分解に対して安定化することができる。一つの態様において、アデノシンまたはグアノシンヌクレオチドなどの、プリンヌクレオチドを含めることにより、RNAを安定化する。あるいは、修飾された類似体によるピリミジンヌクレオチドの置換、例えば、2'-デオキシチミジンによるウリジンヌクレオチドの3'突出部の置換はRNAiの有効性を低下させることなく許容されうる。2'ヒドロキシルがないことは、組織培地中での突出部のヌクレアーゼ耐性を有意に増強し、インビボでも有益でありうる。
【００８９】
RNAi構築体は、細胞内消化されて、細胞内でsiRNA配列を生じる、長い二本鎖RNAの形態であってもよい。あるいは、RNAi構築体はヘアピンRNAの形態であってもよい。siRNAは、ヘアピンRNAを細胞中でプロセッシングすることによって作出されうることが当技術分野において公知である。ヘアピンRNAは外因的に合成されうるか、またはインビボでRNAポリメラーゼIIIプロモーターから転写することによって形成されうる。哺乳類細胞中でヘアピンRNAを作出し、遺伝子抑制のためにそれを用いる例は、例えば、Paddison et al., Genes Dev, 2002, 16: 948-58; McCaffrey et al., Nature, 2002, 418: 38-9; McManus et al., RNA, 2002, 8: 842-50; Yu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002, 99: 6047-52に記述されている。そのようなヘアピンRNAは細胞中または動物中で操作されて、所望の遺伝子の連続的かつ安定的な抑制を確実にすることが好ましい。
【００９０】
PCT出願WO 01/77350では、真核細胞において同じ導入遺伝子のセンスRNA転写産物もアンチセンスRNA転写産物もともにもたらす、導入遺伝子の双方向性転写のための例示的なベクターについて記述している。したがって、ある種の態様において、本発明は、以下のユニークな特徴を有する組み換えベクターを提供する。そのベクターは、反対方向に整列された二つの重複する転写単位を有しかつ関心対象のRNAi構築体の導入遺伝子に隣接した、ウイルスレプリコンを含み、この二つの重複する転写単位は宿主細胞中で同じ導入遺伝子断片からセンスRNA転写産物もアンチセンスRNA転写産物もともにもたらす。
【００９１】
別の態様において、本開示は、mRNAの翻訳を阻止するためにmRNA転写産物を触媒的に切断するようデザインされた、リボザイム分子の使用に関する(例えば、1990年10月4日付で公開されたPCT国際公開WO90/11364; Sarver et al., 1990, Science 247: 1222-1225; および米国特許第5,093,246号を参照のこと)。標的mRNAを部位特異的認識配列で切断する、どのリボザイムを用いてその特定のmRNAを破壊することもできるが、ハンマーヘッドリボザイムの使用が好ましい。ハンマーヘッドリボザイムは、標的mRNAと相補的な塩基対を形成する隣接領域によって指令される位置で、mRNAを切断する。唯一の要件は、標的mRNAが以下の二塩基配列: 5'-UG-3'を有することである。ハンマーヘッドリボザイムの構築および作出は、当技術分野において周知であり、Haseloff and Gerlach, 1988, Nature, 334: 585-591にさらに十分に記述されている。本発明のリボザイムは、テトラヒメナ・テルモフィラ(Tetrahymena thermophila)において天然に存在し(IVSまたはL-19 IVS RNAとして公知)、かつ広く記述されているもの(例えば、Zaug, et al., 1984, Science, 224: 574-578; Zaug and Cech, 1986, Science, 231: 470-475; Zaug, et al., 1986, Nature, 324: 429-433; University Patents Inc.により公開された国際特許出願第WO88/04300号; Been and Cech, 1986, Cell, 47: 207-216を参照のこと)などのRNAエンドリボヌクレアーゼ(「Cech型リボザイム」)も含む。
【００９２】
さらなる態様において、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害するためのDNA酵素の使用に関する。DNA酵素は、アンチセンス技術とリボザイム技術の両方の機構的特徴のいくつかを組み入れている。DNA酵素は、アンチセンスオリゴヌクレオチドのように、特定の標的核酸配列を認識するように、しかしながら、リボザイムのように、標的核酸を触媒的かつ特異的に切断するようにデザインされる。手短に言えば、標的核酸を特異的に認識かつ切断する理想的なDNA酵素をデザインするには、当業者はまず、ユニークな(またはほぼユニークな)標的配列を同定しなければならない。好ましくは、この配列は、ほぼ18〜22ヌクレオチドのG/Cリッチなストレッチである。高いG/C含量は、DNA酵素と標的配列との間のより強い相互作用を確実にする手助けになる。DNA酵素を合成する場合、酵素を伝達暗号に標的化しうる特異的なアンチセンス認識配列を、それがDNA酵素の2本の腕を含み、かつDNA酵素のループが特異的な2本の腕の間に位置するように分割する。DNA酵素を作出かつ投与する方法は、例えば、米国特許第6,110,462号において見出すことができる。
【００９３】
本明細書において記述される方法は、低分子(最適な細胞透過性を持たない低分子を含む)、脂質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、抗体、毒素、負に帯電した重合体および他の重合体、例えばタンパク質、ペプチド、ホルモン、糖質、またはポリアミンを含むがこれらに限定されない、種々の分子を細胞膜を越えて送達するために使用することができる。本発明の化合物および方法を用いて細胞膜を越えて送達できるポリヌクレオチドの非限定的な例としては、低分子干渉核酸(siNA)、アンチセンス、酵素的核酸分子、2',5'-オリゴアデニル酸、三重鎖形成性オリゴヌクレオチド、アプタマー、およびデコイが挙げられる。被験体または生物におけるような、関連する細胞および/または組織に、送達できる生物学的に活性な分子は、抗体(例えば、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体など)、コレステロール、ホルモン、抗ウイルス剤、ペプチド、タンパク質、化学療法薬、低分子、ビタミン、補因子、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、酵素的核酸、アンチセンス核酸、三重鎖形成性オリゴヌクレオチド、2,5-Aキメラ、アロザイム、アプタマー、デコイおよびその類似体、ならびに低分子干渉核酸(siNA)、低分子干渉RNA (siRNA)、二本鎖RNA (dsRNA)、マイクロRNA (miRNA)、アンタゴmirおよび低分子ヘアピンRNA (shRNA)分子などの、小核酸分子を含む。
【００９４】
本発明の化合物、組成物および方法は、細胞または組織に対する生物活性分子(例えば、siNA、siRNA、miRNA、siRNAおよびmiRNA阻害剤、核酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ホルモン、抗体、ならびに低分子)の送達または利用能を、本発明の化合物、組成物および方法がない場合の分子の送達と比べて増大することができる。したがって、細胞、組織または生物内の生物活性分子のレベルは、本発明の化合物および組成物がない場合と比べて、本発明の化合物および組成物がある場合に増大する。
【００９５】
「リガンド」という用語は、受容体などの別の化合物と、直接的にまたは間接的に相互作用できる薬物、ペプチド、ホルモンまたは神経伝達物質などの、任意の化合物または分子をいう。リガンドと相互作用する受容体は、細胞の表面に存在することがあり、またあるいは細胞間受容体でもあり得る。リガンドと受容体との相互作用は、生化学的反応を引き起こすこともあり、または単純に物理的な相互作用または結合ともなり得る。リガンドの非限定的な例としては、ガラクトース、ガラクトサミン、およびN-アセチルガラクトサミンなどの糖および糖質; エストロゲン、テストステロン、プロゲステロン、グルココルチゾン(glucocortisone)、アドレナリン、インスリン、グルカゴン、コルチゾール、ビタミンD、甲状腺ホルモン、レチノイン酸、および成長ホルモンなどのホルモン; VEGF、EGF、NGF、およびPDGFなどの増殖因子; コレステロール; 胆汁酸; GABA、グルタミン酸、アセチルコリンなどの神経伝達物質; NOGO; イノシトール三リン酸; ジアシルグリセロール; エピネフリン; ノルエピネフリン; 酸化窒素、ペプチド、葉酸およびピリドキシンなどのビタミン、薬物、抗体ならびに受容体とインビボまたはインビトロで相互作用できるその他任意の分子が挙げられる。リガンドはアミド(amide)、アミド(amido)、カルボニル、エステル、ペプチド、ジスルフィド酸、シランヌクレオシド、脱塩基ヌクレオシド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、糖質、脂質、ポリ炭化水素、リン酸エステル、ホスホロアミデート、チオホスフェート、アルキルホスフェートまたは感光性リンカーなどの、リンカー分子を用いて本発明の化合物に付着させることができる。一つの態様において、リンカーは生分解性リンカーである。
【００９６】
リンカー
種々のリンカーを用いて、輸送されうる基質を活性薬剤に連結させることができる。例えば、分解性および切断性リンカーを用いることができる。
【００９７】
本明細書において用いられる「分解性リンカー」という用語は、さまざまな条件の下で切断されうるリンカー部分をいう。切断に適した条件は、pH、UV照射、酵素活性、温度、加水分解、脱離および置換反応、ならびに結合の熱力学特性を含むことができるが、これらに限定されることはない。本明細書において用いられる「感光性リンカー」という用語は、特定のUV波長の下で選択的に切断される、当技術分野において公知であるようなリンカー部分をいう。感光性リンカーを含んだ本発明の化合物は、関心対象の標的細胞または組織に化合物を送達するために使用され、その後、UV光源の存在下において放出されることができる。
【００９８】
本明細書において用いられる「リンカー」という用語は、基質および活性薬剤が同じ領域、組織または細胞に標的化されることを可能にする任意の結合、低分子または他の媒体である。ある種の態様において、リンカーは切断可能である。
【００９９】
一つの態様において、リンカーは一つまたは複数の基質と一つまたは複数の治療成分との間の化学結合である。したがって、結合は共有結合性またはイオン性でありうる。リンカーが化学結合である治療的複合体の一例は、融合タンパク質である。一つの態様において、化学結合は酸感受性であり、pH感受性結合が血流(pH 7.5)から経細胞輸送性媒体または細胞の内部(pH 約6.0)への移行時に切断される。あるいは、結合は酸感受性ではないこともあるが、引き続いて添加されるまたは標的部位の微小環境において天然に見出される、特異的な酵素または化学物質により切断可能であることもある。あるいは、結合は、還元条件の下で切断される結合、例えば、ジスルフィド結合でありうる。
【０１００】
あるいは、結合は切断可能でなくてもよい。
【０１０１】
いかなる種の酸切断性または酸感受性リンカーを用いることもできる。酸切断性結合の例としては、シス-ポリカルボン酸アルケンとして公知の部類の有機酸が挙げられるが、これらに限定されることはない。この部類の分子は、少なくとも一つの二重結合を含んだ炭素鎖に付着された少なくとも三つのカルボン酸基(COOH)を含む。これらの分子ならびにそれらをどのように作出かつ使用するかは、Shenらの米国特許第4,631,190号に開示されている。
【０１０２】
あるいは、穏和な酸性条件の下で切断可能な、アミノ-スルフヒドリル架橋試薬などの、分子を用いてもよい。これらの分子はBlattlerら米国特許第4,569,789号に開示されている。
【０１０３】
あるいは、酸切断性リンカーは生分解性、加水分解性結合などの、徐放性結合であってもよい。典型的な生分解性担体結合にはエステル、アミドまたはウレタン結合があり、したがって典型的な担体は、ポリエステル、ポリアミド、ポリウレタン、および約5,000〜1,000,000の分子量を有する他の縮合重合体である。これらの担体/結合の例は、Petersonら米国特許第4,356,166号に示されている。他の酸切断性リンカーは、米国特許第4,569,789号および同第4,631,190号またはBlattner et al. in Biochemistry 24: 1517-1524 (1984)において見出すことができる。リンカーは天然の酸性条件により切断され、またあるいは、Abramsら米国特許第4,171,563号に説明されているように標的部位にて酸性条件が誘導されてもよい。
【０１０４】
切断可能なジスルフィド結合(還元性結合)を含んだ連結試薬の例としては、全てPierce Chemicals (Rockford, Illinois)から入手可能な、「DPDPB」、1,4-ジ-[3'-(2'-ピリジルジチオ)プロピオンアミド]ブタン; 「SADP」(N-スクシンイミジル(4-アジドフェニル)1,3'-ジチオプロピオネート); 「スルホ-SADP」(スルホスクシンイミジル(4-アジドフェニルジチオ)プロピオネート); 「DSP」-ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート); 「DTSSP」-3,3'-ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート); 「DTBP」-ジメチル3,3ジチオビスプロピオンイミデート-2HClが挙げられるが、これらに限定されることはない。
【０１０５】
酸化によって切断可能な連結試薬の例は「DST」-ジスクシンイミジルタルタレート; および「スルホ-DST」-ジスクシンイミジルタルタレートである。これらのリンカーもまた、Pierce Chemicalsから入手可能である。
【０１０６】
非切断性リンカーの例は「スルホ-LC-SMPT」-（スルホスクシンイミジル6-[αメチル-α-(2-ピリジルチオ)トルアミド}ヘキサノエート); 「SMPT」; 「ABH」-アジドベンゾイルヒドラジド; 「NHS-ASA」-N-ヒドロキシスクシンイミジル-4-アジドサリチル酸; 「SASD」-スルホスクシンイミジル2-(pアジドサリチルアミド)エチル-1,3-ジチオプロピオネート; 「APDP」-N-{4-(p-アジドサリチルアミド)ブチル}-3'(2'-ピリジルジチオ)プロピオンアミド; 「BASED」-ビス-[β-(4-アジドサリチルアミド)エチル]ジスルフィド; 「HSAB」-N-ヒドロキシスクシンイミジル-4アジドベンゾエート; 「APG」-p-アジドフェニルグリオキサル一水和物; 「SANPAH」-N-スクシンイミジル-6(4'-アジド-2'-ニトロ(mitro)フェニル-アミノ)ヘキサノエート; 「スルホ-SANPAH」-スルホスクシンイミジル6-(4'-アジド-2'-ニトロフェニルアミノ)ヘキサノエート; 「ANB-NOS」N-5-アジド-2-ニトロベンジオイル(bezyoyl)オキシスクシンイミド; 「SAND」-スルホスクシンイミジル-2-(m-アジド-o-ニトロ(mitro)ベンズアミド)-エチル-1,3'-ジチオプロピオネート; 「PNP-DTP」-p-ニトロフェニル-2-ジアゾ-3,3,3トリフルオロプロピオネート; 「SMCC」-スクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート; 「スルホ-SMCC」-スルホスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート; 「MBS」m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル; 「スルホ-MBS」-m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル; 「SIAB」-N-スクシンイミジル(4-ヨードアセチル)アミノベンゾエート; 「スルホ-SIAB」-N-スルホスクシンイミジル(4-ヨードアセチル)アミノベンゾエート; 「SMPB」-スクシンイミジル4-(pマレイミド(malenimido)フェニル)ブチレート; 「スルホ-SMPB」-スルホスクシンイミジル4-(p-マレイミド(malenimido)フェニル)ブチレート; 「DSS」-ジスクシンイミジルスベレート; 「BSSS」-ビス(スルホスクシンイミジル)スベレート; 「BMH」-ビスマレイミドヘキサン; 「DFDNB」-1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン; 「DMA」-ジメチルアジピミデート2HCl; 「DMP」-ジメチルピメルイミデート-2HCl; 「DMS」-ジメチルスベルイミデート-2-HCl; 「SPDP」-N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルチオ)プロピオネート; 「スルホ-HSAB」-スルホスクシンイミジル4-(p-アジドフェニル)ブチレート; 「スルホ-SAPB」-スルホスクシンイミジル4-(p-アジドフェニルブチレート); 「ASIB」-1-9p-アジドサリチルアミド)-4-(ヨードアセトアミド)ブタン; 「ASBA」-4-(p-アジドサリチルアミド)ブチルアミンである。これらのリンカーは全てPierce Chemicalsから入手可能である。
【０１０７】
別の態様において、リンカーはペプチドリンカーなどの低分子である。一つの態様において、ペプチドリンカーは切断可能でない。さらなる態様において、ペプチドリンカーは、還元条件の下で塩基により、または特定の酵素により切断可能である。一つの態様において、酵素は常在性である。あるいは、低分子ペプチドは、治療的複合体の後にまたは治療的複合体に加えて投与される非常在性酵素によって切断可能であってもよい。あるいは、低分子ペプチドは、例えば、ジスルフィド結合を含む場合には還元条件の下で切断されることができる。あるいは、低分子ペプチドはpH感受性であってもよい。ペプチドリンカーの例としては、ポリ(L-Gly)、(ポリL-グリシンリンカー); ポリ(L-Glu)、(ポリL-グルタミンリンカー); ポリ(L-Lys)、(ポリL-リシンリンカー)が挙げられる。一つの態様において、ペプチドリンカーは式(アミノ酸)nを有し、式中nは2〜100の整数であり、好ましくは、このペプチドは一つまたは複数のアミノ酸の重合体を含む。さらなる態様において、配列
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を有するものなどの、ペプチドリンカーはプロテイナーゼによって切断可能である(Suzuki, et al. 1998, J. Biomed. Mater. Res. Oct; 42(1): 112-6)。この態様は、細菌感染症、特に緑膿菌(Pseudomonasaeruginosa)感染症の処置に有利であることが示されている。ゲンタマイシンまたは別の抗生物質は、創傷が緑膿菌に感染している場合にだけ切断される。これは、非感染組織ではトロンビン様のプロテイナーゼ酵素の顕著に高い活性が認められるからである。
【０１０８】
さらなる態様において、リンカーは、ポリ(エチレングリコール) (PEG)およびジペプチドのL-アラニル-L-バリン(Ala-Val)を含む、酵素サーモリシンによって切断可能な、切断性リンカーである。サーモリシン様酵素は多くの腫瘍の部位で発現されることが報告されているので、このリンカーは有利である。あるいは、プロテアーゼ・フリンの認識部位を含んだ12残基のスペーサー
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を用いることもできる(Goyal, et al. Biochem. J. 2000 Jan 15; 345 Pt 2: 247-254)。
【０１０９】
化学リンカーおよびペプチドリンカーは、抱合体合成のための当技術分野において公知の技術により、すなわち、遺伝子操作を用いまたは化学的に、基質と活性薬剤との間に結合させることができる。抱合体の合成は、適切な官能基での他の部分へのタンパク質の古典的カップリング反応により適切な抗体を介して化学的に達成することができる。
【０１１０】
タンパク質に存在し、化学的カップリング反応に通常用いられる官能基の例を以下に概説する。糖質構造をアルデヒド基に酸化し、これを、H2NNH-R基を含有する化合物(式中Rは当該化合物である)と反応させて、C=NH-NH-R基を形成してもよい。チオール基(タンパク質中のシステイン)を、チオール反応性基を含有する化合物と反応させて、チオエーテル基またはジスルフィド基を形成してもよい。アミノ酸残基中(タンパク質のアミノ末端またはリシン上)の遊離アミノ基を、活性化カルボキシ基などの、求電子基を含有する化合物と反応させて、アミド基を形成してもよい。アミノ酸残基中の遊離カルボキシ基を反応性カルボキシ基に変換し、次いで、アミノ基を含有する化合物と反応させてアミド基を形成してもよい。
【０１１１】
リンカーは、あるいは、リポソームであってもよい。リポソームの調製のための多くの方法は、当技術分野において周知である。例えば、逆相蒸発法、凍結融解法、押出法および脱水和・再水和法(Storm, et al. PSTT 1: 19-31 (1998)を参照のこと)。
【０１１２】
リポソームは、重合の間に物質が被包化されるように活性薬剤を含有する溶液中で作出することができる。あるいは、リポソームを最初に重合化し、重合化したリポソームを生物学的に活性な物質の溶液中に再懸濁し超音波処理して活性薬剤の被包化に影響を与えることにより、生物学的に活性な物質を後で添加することもできる。リポソームを、基質がリン脂質二重層の一部となるように、基質の存在下で重合化することができる。一つの態様において、リポソームは活性薬剤を内側におよび基質を外側に含有する。
【０１１３】
本発明において企図されるリポソームは種々の構造を含むことができる。例えば、リポソームは多層小胞(MLV)、オリゴラメラ小胞(OLV)、単層小胞(UV)、小型単層小胞(SUV)、中型単層小胞(MUV)、大型単層小胞(LUV)、巨大単層小胞(GUV)、または多胞性小胞(MVV)でありうる。これらのリポソーム構造の各々は当技術分野において周知である(Storm, et al. PSTT 1: 19-31 (1998)を参照のこと)。
【０１１４】
一つの態様において、リポソームは、例えば特定の高周波の適用によって医薬を引き抜く「微小機械」である。別の態様において、リポソームは標的細胞において活性薬剤を放出するように分解されることができ、例えば、リポソームは酸もしくはアルカリ感受性であっても、または低pHもしくは高pHの存在下において分解されてもよく、その結果、活性薬剤が細胞内に放出される。あるいは、リポソームは、標的細胞によって取り込まれるように非荷電性であってもよい。リポソームはpH感受性であっても還元条件に感受性であってもよい。
【０１１５】
本発明において有利に用いられうるリポソームの一種は、1999年12月21日付で発行されたLangerら、米国特許第6,004,534号において特定されているものである。この出願には、二重結合および三重結合を含有する単量体(monomelic)リン脂質の重合によって調製される改変リポソームの作出方法が開示されている。これらのリポソームは消化管の過酷な環境に対して予想外に増強された安定性を有する。したがって、それらは活性薬剤の経口および/または粘膜送達に有用性がある。リポソームは全身循環およびリンパ循環へ吸収されうることも示されている。リポソームは一般に、二重結合および三重結合を含有する単量体リン脂質の重合(すなわち、ラジカル開始または照射)によって調製される。
【０１１６】
本発明の他の態様において、リンカーは、長い血液循環時間を有するリポソームでありうる。そのようなリポソームは、当技術分野において周知である(米国特許第5,013,556号; 同第5,225,212号; 同第5,213,804号; 同第5,356,633号; および同第5,843,473号を参照のこと)。長い血液循環時間を有するリポソームは、ポリエチレングリコール(PEG)または他の類似の重合体で誘導体化されたそのリン脂質部分を有することによって特徴付けられる。いくつかの態様において、リン脂質に遠位のPEG分子末端は化学的に反応性であるように活性化されていてよい。そのような反応性PEG分子は、基質をリポソームに連結するために用いることができる。反応性PEG分子の一例は、米国特許第5,527,528号に記述されているPEGのマレイミド誘導体である。
【０１１７】
あるいは、リンカーは、収納構造(container)上または収納構造中に親油性活性薬剤を有し、その収納構造が治療的複合体におけるリンカーとして機能する、マイクロカプセル、ナノ粒子、磁性粒子などであってもよい(Kumar, J. Pharm. Sci., May-Aug 3(2) 234-258, 2000; およびGill et al, Trends Biotechnol. Nov; 18(11): 469-79, 2000)。
【０１１８】
あるいは、リンカーは光切断性リンカーであってもよい。例えば、1-2-(ニトロフェニル)エチル部分は300〜360 nmの光によって切断することができる(Pierceカタログ番号21332ZZを参照のこと)。光切断性リンカーがより特異的な領域、例えば臓器の特定の部分での薬物の活性化および作用を可能にすることも想定されうる。脈管内へのカテーテルを用いて、光を局在化させることができる。あるいは、光は処置を消化管の特定の部分に局限するために用いられてもよく、光はその領域に対する天然の開口部を通して操作されてもよい。
【０１１９】
あるいは、光はその領域に外科的に操作されてもよい。
【０１２０】
あるいは、リンカーは切断可能でないが、活性薬剤または基質が切断可能であってもよい。活性薬剤がプロドラッグであり、このプロドラッグを切断する酵素が治療的複合体とともに投与される場合がこの例である。あるいは、酵素が治療的複合体の一部または常在性であり、プロドラッグが別個に投与される。好ましくは、別個に投与される酵素またはプロドラッグは、最初の投与から約48時間以内に投与される。あるいは、別個に投与されるプロドラッグまたは酵素は、約1分〜24時間の間に投与されてもよく、あるいは約2分〜8時間の間に投与されてもよい。
【０１２１】
別個に投与されるプロドラッグまたは酵素は、後日に投与されてもよく、薬物の効果がもはや必要でなくなるまで投与され続けてもよい。
【０１２２】
本発明の別の態様によれば、ヌクレオシド輸送経路を発現する細胞または組織において疾患または障害を処置するための方法が提供される。この方法は、病的細胞または組織において発現されるヌクレオシド輸送経路によって輸送されることができる基質、および疾患または障害を処置するための活性薬剤を含む抱合体であって、ヌクレオシド輸送経路によって同様に輸送される該抱合体を、疾患または障害を抱える患者に投与する段階を含む。このように、抱合体は病的細胞または組織に輸送され、それによって活性薬剤を送達する。
【０１２３】
本発明の抱合体を用いて処置できる疾患または障害は、筋肉(骨格筋および心筋を含む)、グリコーゲン貯蔵細胞、血管内皮、心臓、脳、胎盤、胸腺、膵臓、前立腺、腎臓、血液、皮膚、ならびにENT2発現がん細胞などの、組織に関わる疾患または障害を含む。
【０１２４】
ある種の態様において、疾患または障害は骨格筋または心筋などの筋肉に関わり、抱合体は筋肉細胞(骨格筋細胞または心筋細胞などの)に輸送され、それにより活性薬剤を送達する。ある種の態様において、筋障害は、悪液質、筋ジストロフィー、リソソーム筋障害(lysosomal muscle disorder)、骨格筋障害、平滑筋障害、および心筋障害からなる群より選択される。ある種の態様において、これらの指定は重複することがある。筋ジストロフィーは、ベッカー型筋ジストロフィー(BMD)、先天型筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)、遠位型筋ジストロフィー、エメリ・ドレフュス型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕筋ジストロフィー(FSHD)、肢帯筋ジストロフィー(LGMD)、筋緊張性筋ジストロフィー、および眼球咽頭型筋ジストロフィーを含む。ある種の態様において、リソソーム障害はポンペ病、フルラー症候群、ファブリー病、マロトー・ラミー症候群、モルキオ症候群、ハンター症候群、ファーバー病、クラッベ病、スライ症候群、サンフィリポ症候群(A、B、およびD型を含む)、モルキオA、多発性スルファターゼ欠損症、異染性白質萎縮症、ムコ脂質症IV型、G.sub.MIガングリオシドーシス、ガラクトシアリドーシス、テイサックス病およびテイサックス病の変種、サンドホフ病、フコシドーシス(Fucsidosis)、シンドラー病、シアリドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、ウォルマン病、ファーバー脂肪性肉芽腫症、ならびにニーマン・ピック病である。ある種の態様において、心筋障害は心筋症、心虚血、うっ血性心不全、虚血再灌流障害、冠動脈性心疾患、心血管疾患、虚血性心疾患、心不全、高血圧性心疾患、炎症性心疾患、および弁膜心疾患である。筋障害はサルコペニアでありうる。いくつかの態様において、筋障害はAIDSまたはがんなどの、別の疾患により引き起こされる筋肉疲労である。他の筋障害は、重症筋無力症、ランバート・イートン症候群および先天性筋無力症症候群などの、神経筋接合部の疾患、運動ニューロン疾患(ALS、脊髄性筋萎縮症、シャルコー・マリー・トゥース病(Charcot-Maria-Tooth disease)およびフリードライヒ失調症(Freidrich's Ataxia)などの)、炎症性筋疾患(皮膚筋炎、多発性筋炎および封入体筋炎などの)、内分泌異常(甲状腺機能高進症性ミオパチーなどの)、筋緊張症、ネマリンミオパチー、ならびにミオチューブラーミオパチーを含む。筋肉の酵素欠損症はホスホリラーゼ欠損症、酸性マルターゼ欠損症、ミトコンドリア性筋障害、カルニチンパルミチルトランスフェラーゼ欠損症、ホスホグリセリン酸キナーゼ欠損症、およびホスホグリセリン酸ムターゼ欠損症を含む。
【０１２５】
特定の態様において、骨格筋障害の処置において有効な活性薬剤は、例えば、筋障害を抱える患者において欠けている酵素でありうる。例えば、以下の骨格筋疾患および障害を本明細書における方法にしたがい、以下の酵素、または該酵素の発現を調節する核酸で処置することができる: α-グルコシダーゼ(ポンペ病)、α-L-イズロニダーゼ(フルラー症候群)、α-ガラクトシダーゼA (ファブリー病)、アリールスルファターゼ(マロトー・ラミー症候群)、N-アセチルガラクトサミン-6-スルファターゼまたはβ-ガラクトシダーゼ(モルキオ症候群)、イズロン酸2-スルファターゼ(ハンター症候群)、セラミダーゼ(ファーバー病)、ガラクトセレブロシダーゼ(クラッベ病)、β-グルクロニダーゼ(スライ症候群)、ヘパランN-スルファターゼ(サンフィリポA型)、N-アセチル-α-グルコサミニダーゼ(サンフィリポB型)、アセチルCoA-α-グルコサミニドN-アセチルトランスフェラーゼ、N-アセチル-グルコサミン-6スルファターゼ(サンフィリポD型)、ガラクトース6-スルファターゼ(モルキオA)、アリールスルファターゼA、B、およびC (多発性スルファターゼ欠損症)、アリールスルファターゼAセレブロシド(異染性白質萎縮症)、ガングリオシド(ムコ脂質症IV型)、酸性β-ガラクトシダーゼG.sub.MIガングリシオド(Gaiglioside) (G.sub.MIガングリオシドーシス)、酸性β-ガラクトシダーゼ(ガラクトシアリドーシス)、ヘキソサミニダーゼA (テイサックス病およびその変種)、ヘキソサミニダーゼB (サンドホフ病)、α-フコシダーゼ(フコシドーシス(Fucsidosis))、α-N-アセチルガラクトサミニダーゼ(シンドラー病)、糖タンパク質ノイラミニダーゼ(シアリドーシス)、アスパルチルグルコサミンアミダーゼ(アスパルチルグルコサミン尿症)、酸性リパーゼ(ウォルマン病)、酸性セラミダーゼ(ファーバー脂肪性肉芽腫症)、リソソームスフィンゴミエリナーゼおよび他のスフィンゴミエリナーゼ(ニーマン・ピック病)。ある種の態様において、活性薬剤はジストロフィン、ジストロフィン-糖タンパク質複合体の成分、ラミニンα2鎖、フクチン関連タンパク質、LARGE、フクチン、EMD、LMNA、DMPK、ZNF9、およびPABPN1、または該タンパク質の発現を調節する核酸である。
【０１２６】
ある種の態様において、疾患または障害はグリコーゲン貯蔵細胞に関わり、抱合体はグリコーゲン貯蔵細胞に輸送され、それにより活性薬剤を送達する。グリコーゲン貯蔵細胞は筋細胞、肝細胞、ならびに同様に腎細胞および腸細胞を含む。ある種の態様において、グリコーゲン貯蔵障害は、グリコーゲンシンターゼ欠損症、グルコース-6-ホスファターゼ欠損症(フォン・ギールケ病)、脱分岐酵素欠損症(フォーブス・コリ病)、トランスグルコシダーゼ欠損症、(アンダーソン病、アミロペクチン症)、筋ホスホリラーゼ欠損症(マッカードル病)、ホスホリラーゼ欠損症(ハース病)、およびホスホフルクトキナーゼ欠損症(タウリ病(Tauri disease))からなる群より選択される。特定の態様において、グリコーゲン貯蔵障害の処置において有効な活性薬剤は、グリコーゲンシンターゼ、グルコース-6-ホスファターゼ、脱分岐酵素、トランスグルコシダーゼ、筋ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、酸性マルターゼ欠損、カルニチンパルミチルトランスフェラーゼ欠損、ホスホグリセリン酸キナーゼ、もしくはホスホグリセリン酸ムターゼ、または欠損タンパク質の発現を上方制御する核酸である。
【０１２７】
ある種の態様において、疾患または障害は血管内皮に関わり、抱合体は血管内皮に輸送され、それにより活性薬剤を送達する。ある種の態様において、血管内皮障害は、不適切な血管形成(例えば、腫瘍周辺の)、不十分な血管形成(例えば、ゆっくり治癒する創傷または潰瘍での)、再狭窄、アテローム性動脈硬化症、外科手術または負傷後の瘢痕化、および脈管炎からなる群より選択される。本明細書における組成物および方法で処置できる制御不能な血管形成に関連する疾患の例としては、網膜/脈絡膜血管新生および角膜血管新生が挙げられるが、これらに限定されることはない。網膜/脈絡膜血管新生の例としては、ベスト病、近視、視窩、スタルガルト病(Stargarts diseases)、パジェット病、静脈閉塞、動脈閉塞、鎌状赤血球貧血、サルコイド、梅毒、弾性線維仮黄色腫(pseudoxanthoma elasticum)頚動脈閉塞性疾患(carotid apo structive disease)、慢性ブドウ膜炎/硝子体炎、マイコバクテリア感染、ライム病、全身性エリテマトーデス、網膜症未熟児網膜症、イールズ病、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、ベーチェット病、網膜炎または脈絡膜炎(chroiditis)を起こす感染、推定眼ヒストプラスマ症、扁平部炎、慢性網膜剥離、過粘稠度症候群、トキソプラズマ症、外傷およびレーザー照射後合併症、ルベオーシス(rubesis)に関連する疾患(隅角血管新生)、ならびに増殖性硝子体網膜症の全形態を含め線維血管性組織または線維性組織の異常増殖によって引き起こされる疾患が挙げられるが、これらに限定されることはない。角膜血管新生の例としては、流行性角結膜炎、ビタミンA欠乏症、コンタクトレンズの使い古し(contact lens overwear)、アトピー性角膜炎、上輪部角膜炎、翼状片乾燥角膜炎、シェーグレン症候群、酒さ性痊瘡、フリクテン症、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、角膜移植拒絶反応、モーレン潰瘍、テリエン周辺角膜変性、辺縁表皮剥離、多発性動脈炎、ウェゲナー肉芽腫、強膜炎、ペリフィゴイド放射状角膜切開(periphigoid radial keratotomy)、血管新生緑内障および後水晶体繊維増殖症、梅毒、マイコバクテリア感染、脂質変性、化学火傷、細菌性潰瘍、真菌性潰瘍、単純ヘルペス感染、帯状疱疹感染、原虫感染症ならびにカポジ肉腫が挙げられるが、これらに限定されることはない。不十分な血管形成の例としては、皮膚潰瘍および糖尿病性潰瘍などの潰瘍が挙げられる。一つの態様において、血管内皮の疾患の処置において有効な活性薬剤は、血清アミロイドP (SAP)、またはSAP発現を増大する核酸である。SAPは線維芽細胞が瘢痕病変を引き起こすことを阻害する。別の態様において、血管内皮の疾患はアテローム性動脈硬化症であり、これはスタチン、ナイアシン、腸コレステロール吸収を阻害する栄養補助食品、例えばエゼチミブおよびフィブレート、アスピリン、アポ-A1ミラノHDL、またはアポ-A1ミラノHDL発現を増大する核酸を用いて処置することができる。コレステロール合成酵素の発現を低減するようにデザインされたsiRNA構築体などの、コレステロールの合成を低減する核酸を投与することもできる。コレステロール合成酵素はHMG-CoAシンターゼ、HMG-CoAレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、およびラノステロールシンターゼを含む。
【０１２８】
ある種の態様において、疾患または障害は脳に関わり、抱合体は脳細胞に輸送され、それにより活性薬剤を送達する。ある種の態様において、脳障害は、神経変性病(アルツハイマー病、パーキンソン病、運動ニューロン病、およびハンチントン病などの)、臨床的鬱病、統合失調症、双極性障害、および心的外傷後ストレス障害などの精神病; 髄膜炎、ウイルス性疾患、細菌性疾患、およびプリオン病を含む感染性疾患、テイサックス病、脆弱性X症候群、ダウン症候群、およびリソソーム貯蔵障害などの遺伝性障害からなる群より選択される。特定の態様において、脳の疾患の処置において有効な活性薬剤は、リソソーム貯蔵障害を抱える患者に存在しない(または低減したレベルで存在する)酵素であり、リソソーム障害の例、およびそれらを処置するための組成物は、上記に掲載されている。
【０１２９】
ある種の態様において、疾患または障害は胎盤に関わり、抱合体は胎盤細胞に輸送され、それにより活性薬剤を送達する。ある種の態様において、胎盤障害は、癒着胎盤、前置胎盤、および胎盤早期剥離からなる群より選択される。
【０１３０】
ある種の態様において、疾患または障害は胸腺に関わり、抱合体は胸腺の細胞に輸送され、それにより活性薬剤を送達する。ある種の態様において、胸腺障害は、自己免疫疾患、T細胞の誤陽性(faulty positive)選択または誤陰性(faulty negative)選択から生じる疾患、および胸腺のがんからなる群より選択される。自己免疫疾患のいくつかの例としては、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、ベーチェット病、水胞性類天疱瘡、心筋症、セリアックスプルー皮膚炎、慢性疲労免疫機能障害症候群(CFIDS)、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、クレスト症候群、寒冷凝集素病、クローン病、円板状ループス、必須混合クリオグロブリン血症、線維筋肉痛・線維筋炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、甲状腺機能低下症、特発性肺線維症、特発性血小板減少紫斑病(ITP)、IgA腎症、インスリン依存性糖尿病、若年性関節炎、扁平苔癬、狼瘡、メニエレ病、混合性結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、多腺症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎および皮膚筋炎、一次無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティフマン症候群、高安動脈炎、側頭動脈炎/巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、血管炎、白斑症、ウェゲナー肉芽腫症、ならびに重症筋無力症が挙げられる。特定の態様において、胸腺の疾患の処置において有効な活性薬剤は免疫抑制性または抗炎症性である。この薬剤は、例えば、ムロモナブ、バシリキシマブおよびダクリズマブを含む抗体、またはそれらの抗体の一つをコードする核酸でありうる。活性薬剤として使用できる免疫抑制薬および抗炎症薬の例としては、コルチコステロイド、ロリプラム、カルホスチン、CSAID; インターロイキン10、グルココルチコイド、サリチル酸塩、酸化窒素; デオキシスパガリン(DSG)などの、核移行阻害剤; イブプロフェン、セレコキシブおよびロフェコキシブなどの非ステロイド系抗炎症薬(NSAID); プレドニゾンまたはデキサメタゾンなどのステロイド; アバカビルなどの抗ウイルス剤; メトトレキサート、レフルノミド、FK506 (タクロリムス、プログラフ)などの抗増殖剤; アザチオプリンおよびシクロホスファミドなどの細胞毒性薬; テニダップ、抗TNF抗体または可溶性TNF受容体などのTNFα阻害剤、ならびにラパマイシン(シロリムスもしくはラパミューン)またはそれらの誘導体が挙げられる。疾患が胸腺のがんである場合、活性薬剤は化学療法薬または他の種類の抗がん治療薬でありうる。
【０１３１】
ある種の態様において、疾患または障害は膵臓に関わり、抱合体は膵臓の細胞に輸送され、それにより活性薬剤を送達する。ある種の態様において、膵臓障害は、膵炎、糖尿病、膵外分泌機能不全、嚢胞性線維症の合併症、偽性嚢胞、または膵臓がんからなる群より選択される。特定の態様において、膵臓の疾患の処置において有効な活性薬剤は、インスリン、パンクレリパーゼなどの膵酵素製品(PEP)、またはそれらの発現を上方制御する核酸である。
【０１３２】
ある種の態様において、疾患または障害は前立腺に関わり、抱合体は前立腺の細胞に輸送され、それにより活性薬剤を送達する。ある種の態様において、前立腺障害は、前立腺炎、良性前立腺過形成、または前立腺がんからなる群より選択される。特定の態様において、前立腺の疾患の処置において有効な活性薬剤は、抗がん剤であり、このような薬剤の例は本出願の他の箇所に掲載されている。
【０１３３】
ある種の態様において、疾患または障害は腎臓に関わり、抱合体は腎臓の細胞に輸送され、それにより活性薬剤を送達する。ある種の態様において、腎臓障害は、糖尿病性腎症、糸球体腎炎、水腎症、腎臓結石、腎腫瘍(ウイルムス腫瘍および腎細胞がんなどの)、ループス腎炎、微小変化型疾患、腎盂腎炎、ネフローゼ症候群、ならびに腎不全(急性腎不全および第5病期の慢性腎臓病などの)からなる群より選択される。特定の態様において、腎臓の疾患の処置において有効な活性薬剤は、自己免疫疾患を処置する薬剤、または抗がん治療薬であり、これらのどちらも本出願の他の箇所に掲載されている。
【０１３４】
ある種の態様において、疾患または障害は血液に関わり、抱合体は血液の細胞に輸送され、それにより活性薬剤を送達する。ある種の態様において、血液障害は、原発性免疫不全(SCID、血友病A、および血友病Bを含む)、造血機能低下、免疫機能低下、好中球数低下、好中球移動の低下、末梢血前駆細胞の移動、敗血症、重症慢性好中球減少症、骨髄移植、感染性疾患、白血球減少症、血小板減少症、貧血、放射線によって引き起こされる骨髄障害、化学物質または化学療法薬によって誘発される骨髄形成不全症または骨髄抑制、後天性免疫不全症候群、ならびに真性赤血球増加症からなる群より選択される。特定の態様において、血液の疾患の処置において有効な活性薬剤は、コルチコステロイド、抗白血病薬、増殖因子、および凝固因子からなる群より選択される。ある種の態様において、凝固因子は、第VIII因子または第IX因子である。ある種の局面において、SCIDは、劣性突然変異によって引き起こされ、不足タンパク質(またはそのタンパク質をコードする核酸)の野生型コピーを投与することによって処置することができる。例えば、X連鎖性SCIDはIL2RGで処置することができ、Jak3遺伝子突然変異はJAK3で処置することができ、ADA遺伝子突然変異はADAで処置することができ、IL-7Rα鎖突然変異はIL7Rαで処置することができ、CD3δまたはε突然変異はCD3δまたはεで処置することができ、RAG1/RAG2突然変異はRAG1/RAG2で処置することができ、Artemis遺伝子突然変異はARTEMISで処置することができ、およびCD45遺伝子突然変異はCD45で処置することができる。他の種類の原発性免疫不全は以下のタンパク質: DNAリガーゼI型、CD40リガンド、CD40、プリン・ヌクレオシド・ホスホリラーゼ(PNP)、MHCクラスII、CD3γ、CD8、ZAP-70、TAP-1/2、ウイングドヘリックスタンパク質、CD19、TACI、BAFF受容体、AICDA、ウラシルDNAグリコシラーゼ、パーフォリン、MUNC13D、シンタキシン11、CD95、Fasリガンド、CASP8、およびCASP10の欠損症である。これらの欠損症は欠損タンパク質またはそれをコードする核酸の投与によって処置することができる。
【０１３５】
ある種の態様において、疾患または障害は皮膚に関わり、抱合体は皮膚の細胞に輸送され、それにより活性薬剤を送達する。ある種の態様において、皮膚障害は、皮膚筋炎、丘疹落屑性皮膚疾患、細菌性皮膚疾患、ウイルス性皮膚疾患、真菌性(mycolic)皮膚感染症、肉芽腫性皮膚疾患、寄生虫性皮膚疾患、剥脱性皮膚疾患、水疱性皮膚疾患、色素性皮膚疾患、感光性皮膚疾患、膠原病によって引き起こされる皮膚疾患、内臓疾患による皮膚疾患、乾燥症、じんましん、アトピー性皮膚炎、湿疹(eczyma)、慢性単純性苔癬、乾癬、疥癬、創傷、日焼け、単純疱疹、座瘡、虫刺され、放射線療法または化学療法によって誘発される皮膚炎、腫瘍随伴症候群、悪性腫瘍、黒色腫、原発性皮膚がん、および転移性皮膚がんからなる群より選択される。特定の態様において、皮膚の疾患の処置において有効な活性薬剤は、アントラリン、シポトリエン(calpotriene)、コールタール、ジクロフェナク、T4エンドヌクレアーゼ、イソトレチノイン、アシトレチン、シドフォビル(cidofoir)、コルチコステロイド、抗生物質、鎮痛剤、タクロリムスおよびピメクロリムスなどの経口免疫調節薬、ならびに局所免疫調節薬を含む、免疫調節薬; 免疫抑制剤、抗VEGF、抗FGF、抗EGFおよび抗HGFを含む、抗血管新生剤; ロイコトリエン修飾薬、アミノサリチル酸、麻酔薬、非ステロイド性抗炎症薬、可溶性インターロイキン受容体の修飾薬、チロシンキナーゼ受容体の阻害剤、プロテインキナーゼC阻害剤、メトトレキサート、シクロスポリン、および酢酸メチルプレドニゾロンである。
【０１３６】
ある種の態様において、疾患または障害はがんの一種であり、抱合体はがん細胞に輸送され、それにより活性薬剤を送達する。ある種の態様において、がんの種類は、横紋筋肉腫、卵巣がん、結腸がん、および乳がんからなる群より選択される。他の態様において、がんは白血病、リンパ腫、黒色腫、扁平上皮がん、乳がん、前立腺(prostrate)がん、膀胱がん、非小細胞肺がんおよび小細胞肺がんを含む肺がん、卵巣がん、結腸がん、扁平上皮がん、星状細胞腫、カポジ肉腫、神経膠芽腫、膀胱がん、頭頸部がん、神経膠腫、結腸直腸がん、泌尿生殖器がんならびに消化管がんより選択される。ある種の態様において、活性薬剤は化学療法薬である。化学療法薬は当技術分野において周知であり、シスプラチンなどのアルキル化剤、メルカプトプリンなどの代謝拮抗薬、パクリタキセルなどのタキサン、トポテカンなどのトポイソメラーゼ阻害剤、およびドキソルビシンなどの抗腫瘍抗生物質を含む。抗腫瘍活性薬剤もハーセプチンなどの抗体を含む。特定の態様において、がんの処置において有効な活性薬剤は、Pax-FKHR融合タンパク質に結合する二重特異性抗体または腫瘍抑制因子、例えばp53、pRb、PTEN、APC、およびCD95、BRCA1、BRCA2、DNA修復酵素、プロアポトーシス遺伝子、p16INK4a、WT1、NF1 (ニューロフィブロミン1)、NF2 (メルリンまたはニューロフィブロミン2)、TSC1 (ハマルチン)、TSC2 (ツベリン)、DPC4、SMAD4、DCC、LKB1、STK11、MSH2、MLH1、CDH1 (Eカドヘリン)、VHL、PTCH、(patched)、MEN1、BLM、NBS1、MRE11A、ATM、hRad50、NER酵素(XPA、XPB、XPC、XPD、DDB2、ERCC4、RAD2、およびPOLHなどの)、ERCC6、ERCC8、RECQL2、FANCA、FANCC、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、FANCI、FANCJ、FANCL、FANCM、MLH1、MSH2、MSH6、PMS、ならびにPMS2より選択されるタンパク質(またはそれをコードする核酸)である。
【０１３７】
ある種の態様において、本明細書における組成物および方法は、核受容体の機能不全に関わる疾患または障害を処置するために使用することができ、抱合体は核受容体機能の改変が望まれる細胞に輸送される。ある種の態様において、核受容体はステロイド受容体、チロイド受容体、レチノイド受容体、またはオーファン核受容体である。ある種の態様において、オーファン核受容体はSAR (選択的アンドロゲン受容体)、PPAR、PPARβ、PPAR、NUC1、FAAR、PPAR、RevErbA、EAR-1、RVR、RevErbAβ、BD73、HZF2、ROR、RZR、RORβ、RZRβ、ROR、TOR、LXR、RLD1、LXRβ、UR、NER、RIP15、OR1、FXR、RIP14、HRR1、PXR.1、PXR.2、SXR、ONR1、xOR6、BXR、hCAR1、MB67、mCAR1、HNF4、HNF4β、HNF4、RXR、RXRβ、H2RIIBP、RXR、TR2、TR2-11、xDOR2、aDOR1、TR4、TAK1、TR2R1、T1x、TLL、xTLL、COUP-TFI、COUPTFA、EAR3、SVP44、COUP-TFII、COUPTFB ARP1、SVP40、xCOUP-TFIII、COUP-TF、SVP46、EAR2、ERR、ERR1、ERRβ、ERR2、ERR、NGFI-B、NUR77、N10、TR3、NAK1、TIS1、NURR1、NOT、RNR1、HZF-3、TINUR、TR3β、NOR-1、MINOR、TEC、CHN、FTZ-F1、SF1、ELP、AD4BP、FTF、LRH1、PHR1、CPF、FFLR、FF1rA、GCNF、RTR、DAX1、AHCH、またはSHPである。処置される疾患に応じて、核受容体のレベルを高くすることによりまたは核受容体のレベルもしくは活性を低くすることにより疾患を処置すべきであるかを当業者は認識するであろう。核受容体のレベルは、例えば、核受容体をコードする核酸を投与することによって高くすることができる。核受容体の活性は、例えば、阻害抗体を投与することによって低くすることができる。核受容体、およびそれらにおける突然変異によって引き起こされる疾患は、次の通りである: アンドロゲン受容体(CAIS/PAIS、完全型/部分型アンドロゲン不応症候群; 女性化乳房; 不妊症(interfility); SBMA; ケネディ病; 前立腺がん; 会陰尿道下裂(perineal hypospadias))、DAX-1 (先天性副腎低形成症、副腎不全、遅発性および低ゴナドトロピン性性腺機能低下症)、ビタミン3D受容体(ビタミンD抵抗性くる病IIA型); HNF4α(若年成人発症型糖尿病); ミネラルコルチコイド(Mineralocoricoid)受容体(偽性低アルドステロン症、1型; 常染色体優性; 高血圧、早発型、常染色体優性、妊娠での増悪を伴う)、甲状腺ホルモンβ-1 (甲状腺ホルモン耐性)、グルココルチコイド受容体(一次性コルチゾール耐性 家族性グルココルチコイド耐性)、PPARγ(糖尿病、インスリン抵抗性、黒色表皮症および高血圧を伴う; 結腸がん; 炎症性腸疾患)、HNF4α(II型糖尿病)、ならびにERa (骨粗しょう症、乳がん)。特定の態様において、核受容体を介した障害の処置において有効な活性薬剤は、上記の疾患において欠損しているタンパク質、またはその発現を上方制御する核酸である。変異体遺伝子の不適切に高い発現によって引き起こされる上記の疾患の患者は、その発現を下方制御する核酸を投与することによって処置することができる。
【０１３８】
いくつかの局面において、骨格筋障害は、オーファン核受容体の活性および/またはレベルを変化させることによって処置することができる。オーファン核受容体およびそれらに関連する疾患は当技術分野において、例えばSmithら「Orphan Nuclear Receptor: therapeutic opportunities in skeletal muscle」Am J Physiol Cell Physiol 291: 203-217, 2006において公知である。例えば、LXR-α、LXR-β、ファルネソイドX受容体(FXR)、PPAR-α、-β/δ、および-γ、肝受容体相同体-1、ならびに低分子ヘテロ二量体パートナーの機能不全は、脂質異常症、糖尿病、肥満、炎症、および心血管疾患を引き起こしうる。さらに、ERR-α、ROR-α、Rev-erb-αおよび-β、ならびにNur77は、脂質吸収(lipid absorpotion)、脂肪分解、炎症、およびミオカイン発現を含むいくつかの過程を制御する。具体的には、PPAR-δは骨格筋でのおよび脂肪組織での耐糖能、脂肪酸酸化、およびエネルギー消費を調整する。PPAR-αは脂肪酸酸化を調節し、筋肉でのミトコンドリアβ酸化および熱産生を刺激する。さらに、LXR-αおよび-βは骨格筋での脂質代謝を調節する。ERR-α、-β、および-γは肥満(ovesity)、脂質代謝、および酸化的リン酸化、ならびに骨格筋および心筋(cardiac mucsle)でのミトコンドリア呼吸に関与する。同様に、核内受容体ROR (ROR-α1、-α2、α3、および-ααを含む)は、運動失調などの筋機能不全、ならびに脂質異常症、アテローム性動脈硬化症、および過敏性免疫反応に関与する。Rev-erb (Rev-erbαおよびRev-erbβを含む)も脂質異常症に関与している。さらに、NR4Aファミリー(Nurr1、Nur11、およびNOR-1を含む)は、肥満、エネルギー・バランス、ホメオスタシス、脂質利用、ならびに脂質および糖質ホメオスタシスに関与すると考えられている。当技術分野の状況とともに本明細書における開示に基づいて、オーファン核受容体を介した疾患を効果的に処置するために、本明細書における方法および組成物とともにどのオーファン核受容体タンパク質、オーファン核受容体調節核酸、またはオーファン核受容体アゴニストもしくはアンタゴニストを投与できるかを当業者は認識するであろう。
【０１３９】
ある種の態様において、本明細書における組成物および方法は、クロマチン修飾を制御する因子の機能不全に関わる疾患または障害を処置するために使用することができ、抱合体はクロマチン修飾状態の改変が望まれる細胞に輸送される。ある種の態様において、クロマチン修飾因子はヒストンデアセチラーゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンキナーゼ、ヒストンホスファターゼ、ヒストンユビキチニル化酵素、またはヒストンポリ-ADP-リボシラーゼである。同様に、クロマチン集合因子およびヌクレオソーム再構築因子(ならびにそれらの発現を調節する核酸)を投与することもできる。ある種の態様において、DNAメチルトランスフェラーゼ(DNMT1、DNMT2、DNMT3などの)またはそれらの発現を調節する核酸を、ICF症候群などの、DNAメチルトランスフェラーゼ機能の改変に関連する疾患を処置するために投与することができる。
【０１４０】
ある種の態様において、疾患または障害は不適用なホルモンレベルに関わる。ホルモンレベルは不適切に高いまたは低いこともある。疾患が低いホルモンレベルに関連するなら、そのホルモンの合成経路における遺伝子(または遺伝子産物)を投与することができる。例えば、低いテストステロンレベルを処置するために、17βヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、3βヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、または17,20リアーゼの遺伝子または遺伝子産物を投与することができる。あるいは、疾患がホルモンレベルの上昇に関連するなら、ホルモン合成経路の成分のレベルを低減するためにデザインされた核酸(siRNAなどの)を投与することもできる。ホルモンはテストステロン、エストロゲン、エストラジオール、およびプロゲステロンを含む。
【０１４１】
ある種の態様において、本明細書における方法を特定の標的細胞に絞って、治療用抗体またはそれらをコードする核酸を標的化するために使用することができる。抗体は、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、一本鎖抗体、または二重特異性抗体でありうる。適当な治療用抗体は、抗EGFr抗体(例えば、パニツムマブ(panitumamab)、エルビタックス(セツキシマブ)、マツズマブ、IMC-I IF8、TheraCIM hR3)、デノスマブ、アバスチン(ベバシズマブ)、抗HGF抗体、ヒュミラ(アダリムマブ)、抗-Ang-2抗体、ハーセプチン(トラスツズマブ)、レミケード(インフリキシマブ)、抗CD20抗体、リツキシマブ、シナジス(パリビズマブ)、マイロターグ(ゲムツズマブ・オゾガマイシン(oxogamicin))、ラプティバ(エファリズマブ)、タイサブリ(ナタリズマブ)、ゼナパックス(ダクリキシマブ)、ニュートロスペック(NeutroSpec) (テクネチウム(99mTc)ファノレソマブ)、トシリズマブ、ロスタシント(インジウム-Ill標識カプロマブペンデチド)、ベキサール(トシツモマブ)、ゼバリン(イットリウム90に接合されたイブリツモマブ・チウキセタン(IDEC-Y2B8))、ゾレア(オマリズマブ)、マブセラ(リツキシマブ)、レオプロ(アブシキシマブ)、マブキャンパス(アレムツズマブ)、シムレクト(バシリキシマブ)、ロイコスキャン(LeukoScan) (スレソマブ)、CEA-Scan (アルシツモマブ)、ベルルーマ(ノフェツモマブ)、パノレックス(エドレコロマブ)、アレムツズマブ、CDP 870、およびナタリズマブを含むが、これらに限定されることはない。
【０１４２】
ある種の態様において、治療剤はプロテアソーム阻害剤である。プロテアソーム阻害剤は、例えば、HIV/AIDSおよびC型肝炎のような感染症の処置において、およびがん治療に使用することができる。ある種の態様において、プロテアソーム阻害剤は、プロテアーゼに結合する抗体である。
【０１４３】
ある種の態様において、本抱合体は治療用タンパク質をコードする発現構築体を、筋細胞などの、細胞に送達するために使用することができる。例えば、発現構築体は、形質導入細胞によって分泌される治療用タンパク質をコードすることができる。例えば、発現構築体核酸はVEGFなどの血管新生増殖因子、塩基性FGFもしくはFGF-4などの線維芽細胞増殖因子、胎盤増殖因子、肝細胞増殖因子、アンギオジェニン、アンギオポイエチン1、プレイオトロフィン、形質転換増殖因子(αもしくはβ)、または腫瘍壊死因子αをコードすることができる。発現構築体は心房性ナトリウム利尿(natiuretic)ペプチド(ANP)もしくは脳性ナトリウム利尿ペプチド(BNP)などのナトリウム利尿ペプチド、プロスタサイクリンシンターゼ、酸化窒素シンターゼ、アンギオスタチン、エンドスタチン、エリスロポエチン(EPO)、血液因子(第I因子、第II因子、第III因子、第IV因子、第V因子、第VII因子、第VIII因子、第IV因子、第X因子、第XI因子、第XII因子、および第XIII因子のような凝固因子などの)、GM-CSF、またはIL-1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、もしくは18などのインターロイキンをコードすることもできる。発現構築体はセレクチン(例えば、E、L、もしくはPセレクチン)などの接着分子、細胞外基質タンパク質(例えば、コラーゲンI型、III型、もしくはIV型; フィブロネクチン; ラミニン; またはビトロネクチン)、インテグリン(例えば、α5β1)、またはICAMもしくは血管細胞接着分子(VCAM)などの細胞内接着分子をコードすることができる。
【０１４４】
いずれにしても、送達される発現構築体は、典型的には、プロモーターなどの調節要素が関心対象の核酸に機能的に連結されているベクターの一部である。プロモーターは構成的でも誘導的でもよい。構成的プロモーターの非限定的な例としては、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターおよびラウス肉腫ウイルスプロモーターが挙げられる。本明細書において用いられる場合「誘導的」とは、上方制御も下方制御もいう。誘導的プロモーターは、誘導因子に応じて一つまたは複数のDNA配列または遺伝子の転写を直接的または間接的に活性化できるプロモーターである。誘導因子が存在しない場合、DNA配列または遺伝子は転写されないであろう。誘導因子はタンパク質、代謝産物、増殖調節因子、フェノール化合物などの化学物質、あるいは例えば熱によって直接的に、またはウイルスなどの病原体もしくは病因物質の作用を通じて間接的に課せられる生理的ストレスでありうる。誘導因子は、波長、強度、蛍光、方向、および持続時間を含め、光および光のさまざまな局面などの照射因子であってもよい。
【０１４５】
誘導プロモーターの一例は、核酸の転写を調節するために使用できるテトラサイクリン(tet)-オン・プロモーター系である。この系では、変異Tet抑制因子(TetR)が単純ヘルペスVP16 (転写活性化タンパク質)の活性化ドメインに融合されて、tetまたはドキシサイクリン(dox)により調節される、テトラサイクリン制御転写活性化因子(tTA)を作出している。抗生物質が存在しない場合には、転写が最小限であるのに対し、tetまたはdoxが存在する場合には、転写が誘導される。別の誘導系はエクダイソンまたはラパマイシン系を含む。エクダイソンは、エクダイソン受容体およびウルトラスピラクル遺伝子産物(USP)のヘテロ二量体によって発現が制御される昆虫脱皮ホルモンである。その発現はエクダイソンまたはムリステロンAなどのエクダイソン類似体での処理によって誘導される。
【０１４６】
ベクターにおいて有用でありうるさらなる調節要素は、ポリアデニル化配列、翻訳制御配列(例えば、内部リボソーム進入部位、IRES)、エンハンサー、またはイントロンを含むが、これらに限定されることはない。そのような要素は必要ないかもしれないが、それらは、転写、mRNAの安定性、翻訳効率などに影響を及ぼすことにより発現を増大することができる。そのような要素を必要に応じ核酸構築体に含めて、細胞における核酸の最適な発現を得ることができる。しかしながら、場合によっては、そのようなさらなる要素がなくとも十分な発現を得ることもできる。
【０１４７】
ベクターは他の要素を含むこともできる。例えば、ベクターは、コードされるポリペプチドが特定の細胞部位に向けられるようなシグナルペプチド(例えば、タンパク質を細胞によって分泌させるシグナル分泌配列)をコードする核酸または選択可能なマーカーをコードする核酸を含むことができる。選択可能なマーカーの非限定的な例としては、ピューロマイシン、アデノシンデアミナーゼ(ADA)、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ(neo、G418、APH)、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)、ハイグロマイシン-B-ホスホトランスフェラーゼ、チミジンキナーゼ(TK)、およびキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(XGPRT)が挙げられる。そのようなマーカーは培養下で、安定な形質転換体を選択するのに有用である。
【０１４８】
ウイルスベクターは、抱合体を形成させるために使用することができ、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス(AAV) ベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、麻疹ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、およびウシ乳頭腫ウイルスベクターを含む。ウイルスベクターおよび非ウイルスベクターの概説は、Kay et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12744-12746を参照されたい。ウイルスベクターは、ウイルスの天然の指向性および病原性が改変または除去されているように修飾される。ウイルスのゲノムを修飾して、その感染性を高めることも、関心対象のポリペプチドをコードする核酸のパッケージングに合わせることもできる。
【０１４９】
非ウイルスベクターを本抱合体において使用することもできる。
【０１５０】
さらに説明するために、一つの態様において、ベクターによりコードされる哺乳類血清タンパク質は、組織型プラスミノーゲン活性化因子、組織型プラスミノーゲン活性化因子の受容体、ストレプトキナーゼ、スタフィロキナーゼ、ウロキナーゼ、および凝固因子からなる群より選択される。本発明は同様に、そのような哺乳類血清タンパク質の治療上有効量の、形質導入筋細胞からなどの、組み換え発現および血液への分泌を引き起こす抱合体を哺乳類に投与する段階を含む、その血液循環中での血塊の形成に関連するものを処置するための方法を提供する。
【０１５１】
別の態様において、哺乳類血清タンパク質はグルコセレブロシダーゼである。本発明は同様に、グルコセレブロシダーゼの治療上有効量の、形質導入筋細胞からなどの、組み換え発現および血液への分泌を引き起こす抱合体を患者に投与する段階を含む、ゴーシェ病を抱える患者を処置する方法を提供する。
【０１５２】
別の態様において、哺乳類血清タンパク質はα-ガラクトシダーゼAである。本発明は同様に、α-ガラクトシダーゼAの治療上有効量の、形質導入筋細胞からなどの、組み換え発現および血液への分泌を引き起こす抱合体を患者に投与する段階を含む、ファブリー病を有する哺乳類を処置する方法を提供する。
【０１５３】
別の態様において、哺乳類血清タンパク質はサイトカインである。サイトカインは、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12およびIL-15からなる群より選択することができる。本発明は同様に、そのようなサイトカインの治療上有効量の、形質導入筋細胞からなどの、組み換え発現および血液への分泌を引き起こす抱合体を哺乳類に投与する段階を含む、がんまたは細菌感染もしくはウイルス感染を有する哺乳類を処置する方法を提供する。
【０１５４】
別の態様において、哺乳類血清タンパク質はペプチドホルモンである。ペプチドホルモンは、抗ミュラー管ホルモン(AMH)、アディポネクチン、副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)、アンギオテンシノーゲンおよびアンギオテンシン、抗利尿ホルモン(ADH)、心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)、カルシトニン、コレシストキニン(CCK)、コルチコトロピン放出ホルモン(CRH)、エリスロポエチン(EPO)、卵胞刺激ホルモン(FSH)、ガストリン、グルカゴン、ゴナドトロピン放出ホルモン(GnRH)、成長ホルモン放出ホルモン(GHRH)、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)、成長ホルモン(GH)、インスリン、インスリン様増殖因子(IGF)、レプチン、黄体形成ホルモン(LH)、メラニン細胞刺激ホルモン(MSHまたはα-MSH)、神経ペプチドY、オキシトシン、副甲状腺ホルモン(PTH)、プロラクチン(PRL)、レラキシン、レニン、セクレチン、ソマトスタチン、トロンボポエチン、甲状腺刺激ホルモン(TSH)、ならびに甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン(TRH)からなる群より選択することができる。本発明は同様に、そのようなペプチドホルモンの治療上有効量の、形質導入筋細胞からなどの、組み換え発現および血液への分泌を引き起こす抱合体を哺乳類に投与する段階を含む、哺乳類でのホルモン補充療法のための方法を提供する。
【０１５５】
他の態様において、本抱合体は、L-アスパラギン、L-グルタミナーゼ-L-アスパラギナーゼ、L-メチオニナーゼ、L-フェニルアラニン、アンモニアリアーゼ、L-アルギナーゼ、L-チロシナーゼ、L-セリンデヒドラターゼ、L-トレオニンデアミナーゼ、インドリル-3-アルカンヒドロキシラーゼ、ノイラミニダーゼ、リボヌクレアーゼ、プロテアーゼ、ペプシン、およびカルボキシペプチダーゼからなる群より選択される酵素の、形質導入筋細胞からなどの、組み換え発現および血液への分泌を引き起こす発現ベクターを含むように選択することができる。そのような構築体をがんの処置計画の一部として使用することができる。
【０１５６】
別の態様において、本抱合体は、リソスタフィンの組み換え発現および血液への分泌を引き起こす発現ベクターを含むように選択することができる。本発明は同様に、そのような抱合体を投与する段階を含む、細菌感染を有する哺乳類を処置する方法を提供する。
【０１５７】
ある種の態様において、本方法および組成物は、本明細書において掲載される薬物のいずれかのプロドラッグを送達するために使用される。
【０１５８】
開示の抱合体を含む薬学的組成物を、本明細書に記述の方法において使用することができる。したがって、一つの態様において、被験体においてヌクレオシド輸送経路を発現する組織に影響を及ぼす疾患または障害を処置するのに有効な量で存在する抱合体を含む薬学的組成物を、本明細書に記述の方法において使用する。別の態様において、被験体において骨格筋の疾患または障害を処置するのに有効な量で存在する抱合体を含む薬学的組成物を、本明細書に記述の方法において使用する。抱合体に加えて、薬学的組成物は、他の治療剤を含有することもでき、例えば、薬学的処方の技術分野において公知の技術にしたがって所望の投与方法に適した種類の薬学的添加物(例えば、賦形剤、防腐剤など)や、従来の媒体または希釈剤を利用することにより処方することができる。
【０１５９】
ある種の態様において、本明細書において開示される組成物は、所望の細胞または組織への進入を促進するさらなる薬剤とともに処方される。そのようなさらなる薬剤はミセル、リポソーム、およびデンドリマーを含む。
【０１６０】
活性薬剤の「有効な量」という用語は、被験体または大多数もしくは正常の細胞にとって無害である量をいうが、所望の効果(例えば、骨格筋障害、代謝障害、血液障害、またはがんの処置)を与えるのに十分な活性薬剤の量である。この量は、被験体の種、年齢および体調、処置されている疾患の重症度、特定の抱合体、またはより具体的には、使用される特定の活性薬剤、その投与方法などに依り、被験体によって異なることがある。それゆえ、的確な「有効量」を一般化するのは困難であるが、当業者は適当な有効量を判定することができる。
【０１６１】
「薬学的に許容される」という用語は、担体、希釈剤または賦形剤が、処方物の他の成分に適合しなければならず、その受容者に有害であってはならないという事実をいう。例えば、担体、希釈剤もしくは賦形剤またはその組成物を、どのような望ましくない生物学的作用も引き起こさずにまたはそれが含有される薬学的組成物の他の成分のいずれとも望ましくない形で相互作用せずに、本発明の抱合体とともに被験体に投与することができる。
【０１６２】
抱合体を含む薬学的組成物は、無毒な、薬学的に許容される媒体または希釈剤を含有する投与量処方物で、任意の適当な手段により、例えば、非経口的に、例えば皮下の、静脈内の、筋肉内の、くも膜下腔内のまたは嚢内の注射または注入技術により(例えば、無菌の注射可能な水性または非水性の溶液または懸濁液として)投与することができる。ある種の態様において、抱合体は非経口的に、またはより好ましくは、静脈内に投与される。
【０１６３】
ヒト患者または哺乳類動物などの、被験体への本発明による抱合体の投与のために選択される送達方法は、主に、抱合体に存在する特定の活性薬剤および標的細胞に依存するであろう。一般に、活性薬剤のみを投与するために用いられるのと同一の投与量および投与経路が抱合体にもその出発点として用いられるであろう。しかしながら、活性薬剤の細胞透過の増大が期待されるので、小用量を最初に用いることが好ましい。所与の投与経路のための実際の最終投与量は、日常の実験によって容易に決定される。一般に、抗体に基づく他の標的化抱合体でこれまでに用いられたのと同一の手順およびプロトコル(例えば、非経口的に、静脈内、くも膜下腔など)が本発明の抱合体にも適している。
【０１６４】
抱合体の薬学的組成物は、単独でまたは他の治療剤との組み合わせで投与されることができ、単位用量形態で好都合に与えられてもよく、薬学の技術分野において周知の方法のいずれかによって調製されてもよい。どの方法も抱合体を、一つまたは複数の補助成分を構成する担体と会合させる段階を含む。一般に、薬学的組成物は、活性成分を液体担体と均一かつ密接に会合させることによって調製される。薬学的組成物において、抱合体は、疾患の過程または状態によって所望の効果をもたらすのに十分な量で含まれる。
【０１６５】
処置されている状態に応じて、これらの薬学的組成物を処方し、全身にまたは局所に投与してもよい。処方および投与の技術は「Remington's Pharmaceutical Sciences」(Mack Publishing Co, Easton Pa.)の最新版のなかで見出すことができる。適当な経路は、例えば、筋肉内の、皮下の、髄内の、髄腔内の、心室内の、静脈内の、または腹腔内の送達を含め、非経口の送達でありうる。注射の場合、本発明の薬学的組成物を水溶液中で、好ましくはハンクス液、リンゲル液、または生理緩衝食塩水などの生理的に適合する緩衝液中で処方することができる。
【０１６６】
本開示は同様に、本明細書において記述される抱合体および組織中のENT2発現を促進する薬剤を含む薬学的組成物を提供する。いくつかの局面において、組織中のENT2発現を促進する薬剤は、低酸素症を抑制する薬剤またはHIF-1を阻害する薬剤である。組織は低酸素腫瘍、不十分な血管系を有する組織、潰瘍、糖尿病性潰瘍、治癒が不十分な創傷、虚血領域、脳卒中による虚血領域、または心血管疾患による虚血領域などの、低酸素組織でありうる。ある種の態様において、HIF-1αを阻害する薬剤は、HIF-1α発現を低減するsiRNA、RNAi構築体、ヘアピンRNA、またはmiRNAである。いくつかの態様において、HIF-1α阻害剤は化学療法薬、トポテカン、NSC 644221、PX-478、YC-1、17-AAG、またはベバシズマブである。ある種の態様において、低酸素症を抑制する薬剤は、腫瘍血管系を正常化する薬剤、または組織の酸化還元状態を変える薬剤である。低酸素症を抑制する薬剤は、過剰酸素、TSC、またはアルミトリンでありうる。過剰酸素は、例えば、挿管、酸素マスク、または高圧室によって送達することができる。ある種の態様において、ENT2発現を促進する薬剤は、HIF-1αなどの、ENT2を下方制御する遺伝子の阻害剤である。他の態様において、ENT2発現を促進する薬剤は、ENT2をコードする核酸、例えばENT2の発現を推進する発現構築体または完全長ENT2と本質的に同じ治療的輸送活性を有するその任意の断片である。
【０１６７】
さらに、本明細書において、a) ENT2発現および/または活性を促進する薬剤を投与する段階、ならびにb) 本明細書において開示される抱合体の一つを投与する段階を含む、ENT-2欠損組織を処置する方法が提供される。
【０１６８】
ある種の局面において、本明細書に記述の抱合体は、ATPまたはATP生成剤とともに投与することができる。これらの薬剤は、低酸素症および/または虚血を抑制するために使用することができる。ある種の局面において、ATPは、例えば、リポソームを用いて標的組織に特異的に送達される。ATPを虚血組織に送達する方法は、当技術分野において公知であり、米国特許第7,056,529号およびVerma D et al.,「ATP-loaded Liposomes Effectively Protect Mechanical Functions of the Myocardium from Global Ischemia in an Isolated Rat Heart Model」, J Control Release. 2005 November 28; 108(2-3):460-471に記述されている。
【０１６９】
ある種の態様において、外科手術によって引き起こされる虚血の予防的処置として、外科手術の前に低酸素症抑制剤および本明細書における抱合体により、患者を処置する。
【０１７０】
いくつかの薬物は腫瘍血管系に影響を及ぼす。そのような薬物の機構は十分には理解されていないが、大きく三つの部類の血管標的薬剤があるように思われる。第一に、薬剤は抗血管新生性でありうる。そのような薬剤は新しい血管の成長を抑制し、腫瘍内の血液および酸素を欠乏させる。そのような薬剤は腫瘍をより低酸素状態にさせる。第二に、薬剤は既存の腫瘍血管系を崩壊させ、腫瘍の低酸素状態を増大させることもできる。第三に、血管系正常化剤は腫瘍血管系の異常を低減する。例えば、それらは腫瘍血管系における過剰な上皮細胞の数を低減することができる。これらの薬剤は腫瘍への血流を改善し、低酸素状態を低減する。逆説的に、血管系正常化剤は、腫瘍への他の治療用分子(化学療法薬などの)の接近をよくさせることにより、腫瘍増殖を妨げるために使用することができる。
【０１７１】
抗血管新生性であるとこれまでに考えられている治療のなかには、それよりもむしろ、血管系の正常化をもたらすものもある。例えば、血管内皮増殖因子(VEGF)またはその受容体(VEGFR2)を遮断し、内皮細胞のアポトーシスを引き起こすものもある。その結果、血管の直径、密度および透過性が減少する。間質液圧および、少なくともある場合には、酸素圧の上昇も減少する(Jain R et al., Nature Medicine 7, 987-989 (2001)に概説されている)。PDGFR、HER1およびHER2シグナル伝達を遮断する、それぞれ、STI571、C225およびハーセプチンを含め、その他各種の治療薬も血管系の正常化に寄与する。
【０１７２】
治療用抗体を用いて腫瘍血管系を正常化することができる。例えば、VEGF/VPFに対する中和抗体(A4.6.1)がYuan F et al. (Proc Natl Acad Sci U S A. 1996 Dec 10; 93 (25):14765-70.)に記述されている。腫瘍血管系の透過処理が注射から数時間後に認められ、約5日間続いた。同様に、(VEGFR)-2中和抗体DC101を用いて、Kadambi et al., (Cancer Res. 2001 Mar 15; 61 (6):2404-8)に記述されているように腫瘍血管系を正常化することもできる。これらの抗体のヒト化型、および一本鎖抗体などの抗体変種を、本明細書において開示される方法にしたがい使用することができる。
【０１７３】
本発明をこれから、以下の非限定的な例を参照することにより、さらに詳細に記述する。
【０１７４】
実施例1
抗DNA抗体断片3E10 Fvは、特異的な核局在性での生細胞へのその透過、毒性の欠如、ならびにインビトロおよびインビボでの治療用積荷タンパク質の成功裏の送達により、新規の分子送達媒体として注目を集めている。本研究において、3E10 Fvが細胞膜を通過することを可能にする経路を解明した。具体的には、本研究は、3E10 Fvがヌクレオシドサルベージ輸送体を通じて細胞を透過することを実証する。これらの結果から、3E10 Fvは拡散型ヌクレオシド輸送体ENT2欠損細胞に透過することができず、ENT2欠損細胞へのENT2の再構成が細胞核への3E10 Fvの輸送を回復させることが示された。これらの結果は、ヌクレオシドサルベージ輸送経路を通じたタンパク質輸送の最初の実証となった。
【０１７５】
細胞株
COS-7、K562、およびCEM/ENT1細胞はAmerican Type Culture Collection (Rockville, MD)から購入した。既報(Ward et al., J. Biol. Chem. 275:8375-81, 2000)のように、ヌクレオシド輸送欠損ブタ腎尿細管上皮細胞(PKNTD)を作出し、hENT1またはhENT2をコードする核酸を含有するプラスミドでトランスフェクトして、それぞれ、PKNTD/ENT1およびPKNTD/ENT2細胞を形成させた。
【０１７６】
プラスミド
ピキア・パストリスのX-33株での3E10 Fvの発現用構築体pPICZαA-Fvは、既報(Weisbart et al., Cancer Lett. 195:211-9, 2003; およびWeisbart et al., Int J Oncol 2004;25:1113-8)のように、mAb 3E10の一本鎖Fv断片をコードするcDNAを、pPICZαAに連結することによって作出された。
【０１７７】
3E10 Fvの精製。3E10 Fvは既報(Weisbart et al., Cancer Lett. 195:211-9, 2003)のようにpPICZαA-FvをトランスフェクトしたP.パストリスの上清から精製された。
【０１７８】
細胞透過アッセイ法
精製3E10 Fvを細胞への適用前にPBSに交換透析した。透析後、3E10 Fvを含有する緩衝液に10%ウシ胎仔血清を加えた。対照緩衝液は、10%ウシ胎仔血清を含むPBSとした。接着細胞株(COS-7、PKNTD/ENT1、およびPKNTD/ENT2)の場合、1時間96ウェルプレート上の細胞に、対照緩衝液またはPBS + 10%ウシ胎仔血清中の3E10 Fv 50 μLを加えた。3E10 Fvとのインキュベーション後、既報(Weisbart et al., Cancer Lett. 195:211-9, 2003)のように抗体断片を除去し、細胞を洗浄し、冷却された100%エタノール中で固定し、9E10α-myc抗体で染色した。非接着細胞(K562およびCEM/ENT1)の場合、およそ細胞200,000個からなる細胞ペレットを対照緩衝液または10 μM 3E10 Fv 100 μLに再懸濁し、1時間 37℃で断続的に振盪しながらインキュベートした。次に細胞を2分間100 gで遠心分離し、PBSで3回洗浄した。次に、細胞をスライドガラス上に拡げ、オーバーナイトで乾燥させた。次いで細胞を10分間、冷却された100%エタノール中で固定し、PBS中で3回洗浄し、9E10α-myc抗体で染色した。
【０１７９】
ヌクレオシド輸送体阻害アッセイ法
ニトロベンジルメルカプトプリンリボシド(NBMPR)はSigma (St. Louis, MO)から購入し、DMSO中100 mMのNBMPRのストック液を調製した。細胞培養でのDMSOの影響を制御するため、NBMPRを含有していない対照緩衝液にDMSOを加えた。全ての対照緩衝液および実験緩衝液中のDMSO濃度を0.1%とした。COS-7細胞を対照緩衝液(PBS + 10%ウシ胎仔血清)または10 μMもしくは100 μM NBMPRを含有する緩衝液で30分間前処理した。次いで、緩衝液を1時間10 μMまたは100 μM NBMPRの存在下または非存在下での対照緩衝液または10 μM 3E10 Fvと交換した。次いで細胞を洗浄し、固定し、9E10α-myc抗体で染色した。
【０１８０】
顕微鏡画像
細胞の画像は既報(Weisbart et al., J Immunol 164:6020-6, 2000)のように、RC反射光・蛍光灯取付具およびMagnaFire SPデジタル画像系(Olympus, Melville, NY)を備えたOlympus IX70倒立顕微鏡で獲得した。細胞画像中のスケールバー = 5 μm。
【０１８１】
3E10抗DNA自己抗体の一本鎖Fv断片(3E10 Fv)は、最近になって、その特異的な核局在性および見掛け上の毒性の欠如により、新規の分子送達媒体として利用されている(Weisbart et al., J. Autoimmun. 11(5), 539-46, 1998)。3E10 FvおよびFv融合タンパク質は細胞膜を越えて容易に伝達され、細胞核に透過するので、3E10 FvはインビトロでHsp70 (Hansen et al., Brain Res. 1088(1), 187-96, 2006)およびp53 (Weisbart et al., Int. J. Oncol. 25(6), 1867-1873, 2004)などの生物学的に活性なタンパク質を生細胞に成功裏に送達した。さらに、3E10 Fvはインビボでの完全長p53タンパク質療法も媒介している(Hansen et al., Cancer Res. 67(4), 1769-74, 2007)。しかしながら、3E10 Fvが細胞膜を越えて、かつ細胞核へ運ばれる経路は、これまでに同定されていない。
【０１８２】
過去の研究から、DNA結合が細胞核への3E10 Fvの伝達において重要であると見なされている。具体的には、抗体によるDNA結合をなくす突然変異によって、抗体は細胞透過ができなくなる(Zack et al., J Immunol. 157(5), 2082-8, 1996)。細胞透過とDNA結合との間の関連性が3E10 Fvと他のタンパク質伝達ドメインとを区別し、3E10 Fv輸送におけるヌクレオシドサルベージ経路の潜在的な関与を示唆している。濃縮型ヌクレオシド輸送体(CNT)も拡散型ヌクレオシド輸送体(ENT)もともに、哺乳類細胞によるヌクレオシドおよび核酸塩基の取り込みを媒介する(Kong et al., Curr. Drug Metab. 5(1):63-84, 2004)。内因性CNTを欠いたCOS-7細胞への3E10 Fvの透過を示す他の研究から、CNTが3E10 Fvの輸送において主要な役割を果たしていないことが示唆されている(Hansen et al., Brain Res. 1088(1), 187-96, 2006; およびToan et al., Pflugers Arch. 447(2), 195-204, 2003)。したがって、3E10 Fvの輸送におけるENTの役割を本研究のなかで調べた。
【０１８３】
ENT1およびENT2は、哺乳類細胞において拡散型ヌクレオシド輸送をそれぞれ媒介するが、高濃度のNBMPRによって阻害される(Ward et al., J. Biol. Chem. 275(12):8375-81, 2000)。NBMPRを3E10 Fv輸送の阻害について試験した。精製3E10 Fv (精製の場合His6タグおよび同定の場合mycタグとともに構築された)は、SDS-PAGEにて単一のおよそ30 kDaのタンパク質として移動した。COS-7細胞への3E10 Fvの伝達を、37℃で1時間10 μM 3E10 Fvとともに細胞をインキュベートした後に、細胞溶解物のウエスタンブロット分析または細胞の免疫細胞化学的染色を行うことにより確認した(図1C、上パネル)。細胞溶解物のウエスタンブロット分析から、3E10 Fvで処理された細胞内でのおよそ30 kDaのmycタグ付タンパク質の存在が示され、このことは完全長抗体の断片の透過を示すものであった。さらに、免疫細胞化学的染色から、その抗体に関する過去の共焦点顕微鏡検査および免疫細胞化学的研究(Hansen et al., Brain Res. 1088(1), 187-96, 2006; およびWeisbart et al., J. Immunol. 164(11), 6020-6, 2000)と一致して、3E10 Fvによる核局在性(図1C、右上パネル)が確認された。次に、COS-7細胞をNBMPRの存在下または非存在下での10 μM 3E10 Fvとの1時間のインキュベーションの前に対照緩衝液または100 μM NBMPRを含有する緩衝液で30分間前処理した。引き続く細胞の免疫細胞化学的染色は、100 μM NBMPRが3E10 Fvによる核透過を抑制する(図1C、左下パネル)ことを実証し、このことから、ENT1またはENT2が3E10 Fv輸送に関与することが示唆された。
【０１８４】
ENTのうちのどれが3E10 Fv輸送に関連しているかを解決するため、COS-7細胞核への3E10 Fvの透過を低用量のNBMPRの存在下で試験して、ENT1およびENT2に対するNBMPRの異なるKi (それぞれ、0.4 nM vs 2.8 μM) (Ward et al., J. Biol. Chem. 275(12):8375-81, 2000)をうまく利用した。すなわち、10 μM NBMPRで、ENT1活性は完全に阻害されるのに対し、ENT2は適度な活性を保持する。100 μM NBMPRによって与えられる3E10 Fv輸送の明らかな阻害(図1C、左下パネル)とは対照的に、3E10 Fvは10 μM NBMPRの存在下においてCOS-7細胞核を成功裏に透過した(図1C、右下パネル)。この結果から、ENT1ではなく、ENT2が3E10 Fvの輸送を媒介することが示唆された。3E10 Fvのみで処理した細胞と比べて3E10 Fv + 10 μM NBMPRで処理した細胞での核染色強度の減少は、10 μM NBMPRによって予測されるENT2活性の>50%の抑制に起因した3E10 Fv輸送の部分的阻害を反映している可能性が高い。
【０１８５】
3E10 Fvの伝達に関わる拡散型ヌクレオシド輸送体を特定するためのさらなるアプローチとして、ENT1を発現するが、しかしENT2を欠くCEM/ENT1細胞株(Crawford et al., J. Biol. Chem. 273(9), 5288-93, 1998)への3E10 Fvの伝達を調べた。ENT1もENT2も発現するK562白血病細胞(Huang et al., Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 23(8-9), 1445-50, 2004)を陽性対照として用いた。CEM/ENT1細胞(これはENT1を発現するが、ENT2を発現しない)およびK562細胞を対照緩衝液または10 μM 3E10 Fvとともに1時間インキュベートした。次いで細胞を洗浄し、固定し、α-myc抗体で染色した。対照K562細胞およびCEM/ENT1細胞は染色を示さなかった。COS-7細胞での研究と一致して、3E10 Fv処理K562細胞の免疫細胞化学的染色から、およそ100%の細胞への抗体断片の透過が実証された。しかしながら、3E10 Fvで処理したCEM/ENT1細胞は染色を示さなかった。この結果から、ENT2がないことで、3E10 Fvによる細胞への伝達は著しく損なわれることが実証された。総合すれば、高濃度のNBMPRによる3E10 Fv輸送の阻害および3E10 FvがENT2欠損細胞株を透過できないことは、3E10 Fv輸送におけるENT2の役割を強く支持するものである。
【０１８６】
ENT2が3E10 Fv核内タンパク質伝達を促進することを検証するため、ENT1またはENT2 cDNAの安定なトランスフェクションおよび発現を通じて再構成されたENT1またはENT2のいずれかを用いヌクレオシド輸送体欠損PK15細胞(PKNTD) (Ward et al., J. Biol. Chem. 275(12):8375-81, 2000)に関して実験を行った。PKNTD/ENT1およびPKNTD/ENT2細胞を対照緩衝液(すなわち、対照細胞)または10 μM 3E10 Fvで1時間処理した。次いで細胞を洗浄し、固定し、α-myc抗体で染色した。対照PKNTD/ENT1およびPKNTD/ENT2細胞は染色の欠如を示した。同様に、10 μM 3E10 Fvで1時間処理したPKNTD/ENT1細胞は染色の欠如を示し、核透過の証拠を示さず、抗体断片がENT2欠損細胞を透過できないことが示唆された。この結果は、CEM/ENT1細胞で得られた結果と一致していた。対照的に、3E10 Fv処理PKNTD/ENT2細胞は明らかな核染色を示し、ヌクレオシド輸送体欠損細胞に対するENT2の回復が3E10 Fvによる核透過を著しく増大させることが示唆された。この結果により、ENT2の存在が3E10 Fvによる核透過を促進することが確認され、ENT2媒介性のヌクレオシドサルベージ経路を通じた抗体断片のタンパク質伝達が立証された。
【０１８７】
ヌクレオシドサルベージ経路は詳細に研究されてきたが、ヌクレオシドサルベージを通じたまたはヌクレオシドサルベージに関連したタンパク質輸送は、これまでに報告されていない。任意の特定の理論によって束縛することを望むわけではないが、3E10 Fvは、ENT2により細胞へその後輸送されるヌクレオシドまたは核酸塩基とのその結合によって、細胞へ運搬されうる。あるいは、3E10 Fvは、ENT2により認識され細胞に輸送されるヌクレオシドまたは核酸塩基の構造を模倣することもできる。ENT2が3E10 Fv輸送を促進する特異的機構の解明は、タンパク質伝達およびヌクレオシドサルベージ経路の双方へのさらなる洞察をもたらすはずである。さらに、ENT2は原形質膜にも核膜にもともに位置しているので、ENT2が細胞膜および核膜の双方を越えた3E10 Fvの輸送を促進するかどうかまたは別の経路が核透過に関与しているかを突き止めることが重要であろう(Mani et al., J. Biol. Chem. 273(46), 30818-325, 1998)。
【０１８８】
分子治療に関して、本明細書において報告される3E10 Fvによる核透過とENT2との間の関連性は、既報の他のタンパク質伝達ドメインとは異なる新規の分子送達媒体としての3E10 Fvをさらに確立するものである。細胞透過性ペプチドによるエンドソーム局在性は、分子治療でのその役割を限定してしまう(Jones et al., Br. J. Pharmacol. 145(8), 1093-102, 2005; およびKaplan et al., J. Control Release 102(1):247-53, 2005)が、ENT2を通じた3E10 Fv輸送の特定はsiRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、および転写因子などの分子を細胞核に送達するうえでの3E10 Fvの使用に関する将来の研究の理論的根拠となる。
【０１８９】
さらに、有害な細胞透過性抗体は細胞透過においてヌクレオシドサルベージ経路を利用することが可能である。したがって、ヌクレオシド輸送体の阻害は、ある種の自己免疫疾患における細胞毒性自己抗体による組織損傷を制限する手段となりうる。ENT2媒介性のヌクレオシドサルベージ経路を通じた3E10 Fvによる核内タンパク質伝達の発見は、細胞生物学、薬理学および医学に対して深遠な意味を持つ。
【０１９０】
本発明を上記の例に関して記述してきたが、変更および変形は本発明の趣旨および範囲のなかに包含されることが理解されよう。したがって、本発明は以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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