(57)【要約】本発明は、ポンペ病を治療するための新しく改良された方法を提供する。具体的には、本発明は、酸α−グルコシターゼ（ＧＡＡ）をリソソームにマンノース−６−リン酸に非依存的に標的化するための方法および組成物を提供する。その結果、本発明の方法は、より単純、効率的、強力、かつ費用効果がある。したがって、本発明は、ポンペ病のための酵素補充療法の進歩を大幅に発展させる。一態様では、本発明は、対象に治療上有効量の融合タンパク質を投与することによって、対象におけるポンペ病を治療するための方法を提供する。
2010509344.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象におけるポンペ病を治療するための方法であって、ヒト酸α−グルコシターゼ（ＧＡＡ）、またはそのフラグメントと、リソソーム標的化ドメインとを含有する、治療上有効量の融合タンパク質を前記対象に投与するステップを備え、前記リソソーム標的化ドメインは、ヒト陽イオン−非依存性マンノース−６−リン酸受容体をマンノース−６−リン酸に非依存的に結合する、方法。
【請求項２】
前記リソソーム標的化ドメインは、成熟ヒトインスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、あるいはそのフラグメントまたは配列変異体を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記リソソーム標的化ドメインは、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸１および８−６７を含有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記融合タンパク質は、ヒトＧＡＡのアミノ酸７０−９５２を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記融合タンパク質は、野生型ヒトＧＡＡと比較して、低下したマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）レベルをその上に有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記融合タンパク質は、機能的Ｍ６Ｐレベルをその上に有しない、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記治療上有効量は、前記対象の体重１キログラム当たり２．５〜２０ｍｇの範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記融合タンパク質は、静脈内に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記融合タンパク質は、隔月、毎月、３週間毎、隔週、毎週、毎日、または変動する間隔で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
対象におけるポンペ病を治療するための方法であって、成熟ヒトインスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）のアミノ酸１および８−６７と、ヒト酸α−グルコシターゼ（ＧＡＡ）のアミノ酸７０−９５２とを含有する、治療上有効量の融合タンパク質を前記対象に投与するステップを備える、方法。
【請求項１１】
前記融合タンパク質は、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩの前記アミノ酸と、ヒトＧＡＡの前記アミノ酸との間にスペーサ配列ＧＩｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏをさらに含有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記融合タンパク質は、野生型ヒトＧＡＡと比較して、低下したマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）レベルをその上に有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記融合タンパク質は、機能的Ｍ６Ｐレベルをその上に有しない、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
体内グリコーゲンレベルを低下させるための方法であって、ヒト酸α−グルコシターゼ（ＧＡＡ）、またはそのフラグメントと、リソソーム標的化ドメインとを含有する、有効量の融合タンパク質をポンペ病罹患対象に投与するステップを備え、前記リソソーム標的化ドメインは、ヒト陽イオン−非依存性マンノース−６−リン酸受容体をマンノース−６−リン酸に非依存的に結合する、方法。
【請求項１５】
前記リソソーム標的化ドメインは、成熟ヒトインスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、あるいはそのフラグメントまたは配列変異体を含有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記リソソーム標的化ドメインは、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸１および８−６７を含有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記融合タンパク質は、ヒトＧＡＡのアミノ酸７０−９５２を含有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記融合タンパク質は、野生型ヒトＧＡＡと比較して、低下したマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）レベルをその上に有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記融合タンパク質は、機能的Ｍ６Ｐレベルをその上に有しない、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記治療上有効量は、前記対象の体重１キログラム当たり２．５〜２０ｍｇの範囲である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記融合タンパク質は、静脈内に投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
前記融合タンパク質は、隔月、毎月、３週間毎、隔週、毎週、毎日、または変動する間隔で投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
哺乳類リソソーム内のグリコーゲンレベルを低下させるための方法であって、ヒト酸α−グルコシターゼ（ＧＡＡ）、またはそのフラグメントと、リソソーム標的化ドメインとを含有する、有効量の融合タンパク質を前記リソソームに標的化するステップを備え、前記リソソーム標的化ドメインは、前記ヒト陽イオン−非依存性マンノース−６−リン酸受容体をマンノース−６−リン酸に非依存的に結合する、方法。
【請求項２４】
前記リソソーム標的化ドメインは、成熟ヒトインスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、あるいはそのフラグメントまたは配列変異体を含有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記リソソーム標的化ドメインは、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸１および８−６７を含有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記融合タンパク質は、ヒトＧＡＡのアミノ酸７０−９５２を含有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
ポンペ病罹患対象の筋組織におけるグリコーゲンレベルを低下させるための方法であって、ヒト酸α−グルコシターゼ（ＧＡＡ）、またはそのフラグメントと、リソソーム標的化ドメインとを含有する、治療上有効量の融合タンパク質を前記筋組織に送達するステップを備え、前記リソソーム標的化ドメインは、前記ヒト陽イオン−非依存性マンノース−６−リン酸受容体をマンノース−６−リン酸に非依存的に結合する、方法。
【請求項２８】
前記筋組織は、骨格筋である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
対象におけるポンペ病に付随する心筋症を治療するための方法であって、ヒト酸α−グルコシターゼ（ＧＡＡ）、またはそのフラグメントと、リソソーム標的化ドメインとを含有する、治療上有効量の融合タンパク質を前記対象に投与するステップを備え、前記リソソーム標的化ドメインは、マンノース−６−リン酸に非依存的に前記ヒト陽イオン−非依存性マンノース−６−リン酸受容体を結合する、方法。
【請求項３０】
対象におけるポンペ病に付随する筋疾患を治療するための方法であって、ヒト酸α−グルコシターゼ（ＧＡＡ）、またはそのフラグメントと、リソソーム標的化ドメインとを含有する、治療上有効量の融合タンパク質を前記対象に投与するステップを備え、前記リソソーム標的化ドメインは、マンノース−６−リン酸に非依存的に前記ヒト陽イオン−非依存性マンノース−６−リン酸受容体を結合する、方法。
【請求項３１】
ポンペ病罹患対象における酸α−グルコシターゼ（ＧＡＡ）活性を増加させるための方法であって、ヒト酸α−グルコシターゼ（ＧＡＡ）、またはそのフラグメントと、リソソーム標的化ドメインとを含有する、融合タンパク質を前記対象に投与するステップを備え、前記リソソーム標的化ドメインは、前記ヒト陽イオン−非依存性マンノース−６−リン酸受容体をマンノース−６−リン酸に非依存的に結合する、方法。
【請求項３２】
ポンペ病の治療に好適な医薬組成物であって、ヒト酸α−グルコシターゼ（ＧＡＡ）、またはそのフラグメントと、リソソーム標的化ドメインとを含有する、治療上有効量の融合タンパク質を含有する、前記リソソーム標的化ドメインは、前記ヒト陽イオン−非依存性マンノース−６−リン酸受容体をマンノース−６−リン酸に非依存的に結合する、組成物。
【請求項３３】
前記リソソーム標的化ドメインは、成熟ヒトインスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）あるいは、そのフラグメントまたは配列変異体を含有する、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
前記リソソーム標的化ドメインは、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸１および８−６７を含有する、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
前記融合タンパク質は、ヒトＧＡＡのアミノ酸７０−９５２を含有する、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
前記融合タンパク質は、ヒトＧＡＡのアミノ酸７０−９５２と、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸１および８−６７とを含有する、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
前記融合タンパク質は、ヒトＧＡＡの前記アミノ酸と成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩの前記アミノ酸との間にスペーサ配列ＧＩｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏをさらに含有する、請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
前記融合タンパク質は、野生型ヒトＧＡＡと比較して、低下したマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）レベルをその上に有する、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
前記融合タンパク質は、機能的Ｍ６Ｐレベルをその上に有しない、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項４０】
前記医薬組成物は、医薬担体をさらに含有する、請求項３２に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００７年２月７日出願の米国仮特許出願第６０／９００，１８７号、２００７年１月５日出願の米国仮特許出願第６０／８７９，２５５号、２００６年１１月１３日出願の米国仮特許出願第６０／８５８，５１４号の利益を請求するものであって、それぞれの内容は、参照することによって、全体として本明細書に組み込まれる。また、本出願は、２００５年２月１０日出願の米国特許出願第１１／０５７，０５８号にも関し、その内容は、参照することによって、全体として本明細書に組み込まれる。
【０００２】
技術分野
本発明は、ポンペ病を治療するための方法および組成物に関する。特に、本発明は、酸α−グルコシターゼをリソソームにマンノース−６−リン酸に非依存的に標的化することによって、ポンペ病を治療するための療法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ポンペ病は、グリコーゲン−分解リソソーム酵素であるリソソームヒドロラーゼ酸α−グルコシターゼ（ＧＡＡ）の欠損または機能不全に生じる、常染色体性劣性遺伝病である。ＧＡＡの欠損は、ポンペ病患者の多くの組織内にリソソームグリコーゲン蓄積をもたらし、心筋組織および骨格筋組織が最も深刻な影響を受ける。あらゆる形態のポンペ病合計発生率は、１：４０，０００であると推定され、本疾患は、民族による偏好なく、全群に影響を及ぼす。ポンペ病患者のおよそ３分の１は、急速進行性の致死性乳児発症形態を有する一方、大部分の患者は、緩徐進行性の若年性以降発症形態を呈すると推定される。
【０００４】
薬物治療方針、食餌療法、および骨髄移植は、ポンペ病の治療のための手段として採用されているが、有意な成功が伴っていない。近年、酵素補充療法（ＥＲＴ）が、ポンペ病患者のための新しい希望として提供されている。例えば、組み換えＧＡＡタンパク質薬物であるＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）は、２００６年、米国およびヨーロッパ両国において、ポンペ病患者における使用の認可を得た。Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）は、リソソームへの送達のために、ＧＡＡタンパク質の表面上のマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）に依存する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、ポンペ病を治療するための新しく改良された方法を提供する。具体的には、本発明は、酸α−グルコシターゼ（ＧＡＡ）をリソソームにマンノース−６−リン酸に非依存的に標的化するための方法および組成物を提供する。その結果、本発明の方法は、より単純、効率的、強力、かつ費用効果がある。したがって、本発明は、ポンペ病のための酵素補充療法の進歩を大幅に発展させる。
【０００６】
一態様では、本発明は、対象に治療上有効量の融合タンパク質を投与することによって、対象におけるポンペ病を治療するための方法を提供する。融合タンパク質は、ヒト酸α−グルコシターゼ（ＧＡＡ）（または、ヒトＧＡＡのフラグメント）と、リソソーム標的化ドメインとを含む。リソソーム標的化ドメインは、ヒト陽イオン−非依存性マンノース−６−リン酸受容体をマンノース−６−リン酸に非依存的に結合する。
【０００７】
一実施形態では、リソソーム標的化ドメインは、成熟ヒトインスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、あるいは成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩのフラグメントまたは配列変異体を含む。一実施形態では、リソソーム標的化ドメインは、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸８−６７を含む。好ましくは、リソソーム標的化ドメインは、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸１および８−６７（すなわち、成熟ヒトＧＡＡのΔ２−７）を含む。別の実施形態では、融合タンパク質は、ヒトＧＡＡのアミノ酸７０−９５２を含む。
【０００８】
一実施形態では、本発明に好適な融合タンパク質は、野生型ヒトＧＡＡと比較して、低下したマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）レベルをタンパク質の表面上に有する。さらに別の実施形態では、本発明に好適な融合タンパク質は、機能的Ｍ６Ｐレベルをタンパク質の表面上に有しない。
【０００９】
別の実施形態では、治療上有効量は、対象の体重１キログラム当たり約２．５〜２０ミリグラムの範囲である（ｍｇ／ｋｇ）。
【００１０】
一実施形態では、融合タンパク質は、静脈内に投与される。他の実施形態では、融合タンパク質は、隔月、毎月、３週間毎、隔週、毎週、毎日、または変動する間隔で投与される。本明細書で使用される「隔月」という用語は、２ヶ月に１回の投与（すなわち、２ヶ月毎に１回）を意味し、「毎月」という用語は、１ヶ月に１回の投与を意味し、「３週間毎」という用語は、３週間に１回の投与を意味し（すなわち、３週間毎に１回）、「隔週」という用語は、２週間に１回の投与を意味し（すなわち、２週間毎に１回）、「毎週」という用語は、１週間に１回の投与を意味し、「毎日」という用語は、１日に１回の投与を意味する。
【００１１】
さらなる実施形態では、融合タンパク質は、免疫抑制剤と併用して投与される。免疫抑制剤は、融合タンパク質の任意の投与に先立って、投与可能である。いくつかの実施形態では、ポンペ病を治療するための方法は、対象を耐性化する追加ステップをさらに含む。
【００１２】
本発明の別の態様は、対象に治療上有効量の融合タンパク質を投与することによって、対象におけるポンペ病を治療するための方法を提供する。融合タンパク質は、成熟ヒトインスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）のアミノ酸１および８−６７（すなわち、成熟ヒトＧＡＡのΔ２−７）と、ヒト酸α−グルコシターゼ（ＧＡＡ）のアミノ酸７０−９５２とを含む。好ましい実施形態では、融合タンパク質は、ヒトＧＡＡのアミノ酸と成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸との間にスペーサ配列ＧＩｙ−Ａｌａ−Ｐｒoを含む。
【００１３】
一実施形態では、本発明の本態様に好適な融合タンパク質は、野生型ヒトＧＡＡと比較して、低下したマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）レベルをタンパク質の表面上に有する。さらに別の実施形態では、本発明の本態様に好適な融合タンパク質は、機能的Ｍ６Ｐレベルをタンパク質の表面上に有しない。
【００１４】
本発明のさらなる態様は、ポンペ病罹患対象に有効量の融合タンパク質を投与することによって、体内グリコーゲンレベルを低下させるための方法を提供する。融合タンパク質は、ヒト酸α−グルコシターゼ（ＧＡＡ）（または、ヒトＧＡＡのフラグメント）と、リソソーム標的化ドメインとを含む。リソソーム標的化ドメインは、ヒト陽イオン−非依存性マンノース−６−リン酸受容体をマンノース−６−リン酸に非依存的に結合する。
【００１５】
一実施形態では、リソソーム標的化ドメインは、成熟ヒトインスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、あるいは成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩのフラグメントまたは配列変異体を含む。一実施形態では、リソソーム標的化ドメインは、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸８−６７を含む。好ましくは、リソソーム標的化ドメインは、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸１および８−６７（すなわち、成熟ヒトＧＡＡのΔ２−７）を含む。別の好ましい実施形態では、融合タンパク質は、ヒトＧＡＡのアミノ酸７０−９５２を含む。
【００１６】
一実施形態では、本発明の本態様に好適な融合タンパク質は、野生型ヒトＧＡＡと比較して、低下したマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）レベルをタンパク質の表面上に有する。さらに別の実施形態では、本発明の本態様に好適な融合タンパク質は、機能的Ｍ６Ｐレベルをタンパク質の表面上に有しない。
【００１７】
別の実施形態では、有効量は、対象の体重１キログラム当たり約２．５〜２０ミリグラムの範囲である（ｍｇ／ｋｇ）。
【００１８】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、静脈内に投与される。他の実施形態では、融合タンパク質は、隔月、毎月、３週間毎、隔週、毎週、毎日、または変動する間隔で投与される。
【００１９】
別の態様では、本発明は、リソソームに有効量の融合タンパク質を標的化することによって、哺乳類リソソーム内のグリコーゲンレベルを低下させるための方法を提供する。融合タンパク質は、ヒト酸α−グルコシターゼ（ＧＡＡ）（または、ヒトＧＡＡのフラグメント）と、リソソーム標的化ドメインとを含む。リソソーム標的化ドメインは、ヒト陽イオン−非依存性マンノース−６−リン酸受容体をマンノース−６−リン酸に非依存的に結合する。
【００２０】
一実施形態では、リソソーム標的化ドメインは、ヒトインスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、あるいはヒトＩＧＦ−ＩＩのフラグメントまたは配列変異体を含む。一実施形態では、リソソーム標的化ドメインは、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸８−６７を含む。好ましくは、リソソーム標的化ドメインは、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸１および８−６７（すなわち、成熟ヒトＧＡＡのΔ２−７）を含む。別の好ましい実施形態では、融合タンパク質は、ヒトＧＡＡのアミノ酸７０−９５２を含む。
【００２１】
別の態様では、本発明は、筋組織に治療上有効量の融合タンパク質を送達することによって、ポンペ病罹患対象の筋組織におけるグリコーゲンレベルを低下させるための方法を提供する。融合タンパク質は、ヒト酸α−グルコシターゼ（ＧＡＡ）（または、ヒトＧＡＡのフラグメント）と、リソソーム標的化ドメインとを含む。リソソーム標的化ドメインは、ヒト陽イオン−非依存性マンノース−６−リン酸受容体をマンノース−６−リン酸に非依存的に結合する。一実施形態では、筋組織は、骨格筋である。
【００２２】
本発明の別の態様は、対象に融合タンパク質の治療上有効量を投与することによって、対象におけるポンペ病に付随する心筋症を治療するための方法を提供する。融合タンパク質は、ヒト酸α−グルコシターゼ（ＧＡＡ）（または、ヒトＧＡＡのフラグメント）と、リソソーム標的化ドメインとを含む。リソソーム標的化ドメインは、ヒト陽イオン−非依存性マンノース−６−リン酸受容体をマンノース−６−リン酸に非依存的に結合する。
【００２３】
さらに別の態様では、本発明は、対象に治療上有効量の融合タンパク質を投与することによって、対象におけるポンペ病に付随する筋疾患を治療するための方法を提供する。融合タンパク質は、ヒト酸α−グルコシターゼ（ＧＡＡ）（または、ヒトＧＡＡのフラグメント）と、リソソーム標的化ドメインとを含む。リソソーム標的化ドメインは、ヒト陽イオン−非依存性マンノース−６−リン酸受容体をマンノース−６−リン酸に非依存的に結合する。
【００２４】
本発明の別の態様は、ヒト酸α−グルコシターゼ（ＧＡＡ）（または、ヒトＧＡＡのフラグメント）と、リソソーム標的化ドメインとを含む、融合タンパク質を対象に投与することによって、ポンペ病罹患対象における酸α−グルコシターゼ活性を増加させるための方法を提供する。リソソーム標的化ドメインは、マンノース−６−リン酸に非依存的にヒト陽イオン−非依存性マンノース−６−リン酸受容体を結合する。
【００２５】
本発明のさらなる態様は、ポンペ病の治療に好適な医薬組成物を提供する。医薬組成物は、ヒト酸α−グルコシターゼ（ＧＡＡ）（または、ヒトＧＡＡのフラグメント）と、リソソーム標的化ドメインとを含む、治療上有効量の融合タンパク質を含む。リソソーム標的化ドメインは、ヒト陽イオン−非依存性マンノース−６−リン酸受容体をマンノース−６−リン酸に非依存的に結合する。
【００２６】
一実施形態では、リソソーム標的化ドメインは、成熟ヒトインスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、あるいは成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩのフラグメントまたは配列変異体を含む。一実施形態では、リソソーム標的化ドメインは、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸８−６７を含む。好ましくは、リソソーム標的化ドメインは、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸１および８−６７（すなわち、成熟ヒトＧＡＡのΔ２−７）を含む。別の好ましい実施形態では、融合タンパク質は、ヒトＧＡＡのアミノ酸７０−９５２を含む。
【００２７】
別の実施形態では、融合タンパク質は、ヒトＧＡＡのアミノ酸７０−９５２と、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸１および８−６７（すなわち、成熟ヒトＧＡＡのΔ２−７）とを含む。さらなる実施形態では、融合タンパク質は、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩ（アミノ酸１および８−６７）のフラグメントとヒトＧＡＡのフラグメント（アミノ酸７０−９５２）との間にスペーサ配列ＧＩｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏをさらに含む。
【００２８】
一実施形態では、本発明の本態様に好適な融合タンパク質は、野生型ヒトＧＡＡと比較して、低下したマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）レベルをタンパク質の表面上に有する。さらに別の実施形態では、本発明の本態様に好適な融合タンパク質は、機能的Ｍ６Ｐレベルをタンパク質の表面上に有しない。
【００２９】
さらに別の実施形態では、医薬組成物は、医薬担体を含む。
【００３０】
本出願で使用される「ヒト酸α−グルコシターゼ（ＧＡＡ）」は、哺乳類リソソーム内のグリコーゲンレベルを低下可能な、あるいは１つ以上のポンペ病症状を救済または改善可能である、前駆体野生型形態のヒトＧＡＡまたは機能的変異体を示す。
【００３１】
本出願で使用される「約」および「およそ」という用語は、同等物として使用される。約／およその有無を問わず、本出願で使用される任意の数字は、当業者によって理解される任意の正常変動を網羅することを意味する。
【００３２】
本発明の他の特徴、目的、および利点は、後述の発明を実施するための最良の形態において明白である。しかしながら、発明を実施するための最良の形態は、本発明の実施形態を示すが、例示のみとして提供され、制限ではないことを理解されたい。本発明の範囲内の種々の変更および修正は、発明を実施するための最良の形態から、当業者に明白となるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
図面は、例示目的のみであって、本発明を制限するためのものではない。
【図１】ＧＩＬＴ標識ＧＡＡＺＣ−７０１の略図を示す図である。
【図２】図２Ａは、野生型非標識ＧＡＡとＧＩＬＴ標識ＧＡＡＺＣ−７０１とのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットを示す図である。図２Ａは、銀染色を受けたＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。図２Ｂは、抗ＧＡＡ抗体を使用したウエスタンブロットを示す図である。図２Ｃは、抗ＩＧＦ−ＩＩ抗体を使用したウエスタンブロットを示す図である。
【図３Ａ】ビオチン化され、Ｈｉｓで標識された２つの組み換えタンパク質であるｐ１２８８およびｐ１３５５の略図を示す図であるであり、それぞれ、野生型ＣＩ−ＭＰＲドメイン１０−１３および点突然変異体を含有する。
【図３Ｂ】銀染色による１２８８および１３５５の発現を示す図である。
【図４Ａ】ＣＩ−ＭＰＲとのＧＩＬＴ標識ＧＡＡＺＣ−７０１相互作用のＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）分析の例示的な結果を示す図である。図４Ａは、ＩＧＦ−ＩＩの例示的な結合曲線を示す図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＧＩＬＴ標識ＧＡＡＺＣ−７０１の例示的な結合曲線を示す図である。
【図５】ラットＬ６筋芽細胞内へのＧＩＬＴ標識ＧＡＡＺＣ−７０１の標識依存性取り込みの例示的な結果を示す図である。
【図６】ラットＬ６筋芽細胞内への精製されたＧＩＬＴ標識ＧＡＡＺＣ−７０１および野生型非標識ＧＡＡの取り込みの例示的な飽和曲線を示す図である。
【図７】ラットＬ６筋芽細胞内のＧＩＬＴ標識ＧＡＡＺＣ−７０１および野生型非標識ＧＡＡ（ＺＣ−６３５）の半減期を反映する、例示的な結果を示す図である。
【図８Ａ】ラットＬ６筋芽細胞内への取り込み後のＧＩＬＴ標識ＧＡＡＺＣ−７０１のタンパク質分解処理を表す、例示的なウエスタンブロットを示す図である。図８Ａは、取り込み後のＧＩＬＴ標識の損失を表す、例示的なウエスタンブロットを示す図である。
【図８Ｂ】図８Ｂは、取り込み後の種々のペプチド種内への野生型およびＧＩＬＴ標識ＧＡＡの処理を表す、例示的なウエスタンブロットを示す図である。
【図９】３つの異なる組織培養培地において産出されたＧＩＬＴ標識ＧＡＡＺＣ−７０１の野生型マウス１２９匹における血清半減期を反映する、例示的な結果を示す図である。赤線は、ＰＦ−ＣＨＯ培地、ｔｌ／２＝４３分に対応し、橙線は、ＣＤＭ４培地、ｔｌ／２＝３８分に対応し、緑線は、ＣＤ１７培地、ｔｌ／２＝５２分に対応する。
【図１０Ａ】野生型非標識ＧＡＡ（ＺＣ−６３５）、ＧＩＬＴ標識ＧＡＡＺＣ−７０１、およびＧＩＬＴ標識ＧＡＡＺＣ−１０２６に対するポンペ病マウスの種々の組織における例示的な減衰曲線を示す図である。図１０Ａは、大腿四頭筋組織における例示的な減衰曲線を示す図である。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、心組織における例示的な減衰曲線を示す図である。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、隔膜組織における例示的な減衰曲線を示す図である。
【図１０Ｄ】図１０Ｄは、肝組織における例示的な減衰曲線を示す図である。
【図１１】ＧＩＬＴ標識ＧＡＡおよびリソソームマーカーＬＡＭＰ１の共局在化を示す図である。
【図１２】ＧＩＬＴ標識ＧＡＡタンパク質、ＺＣ−７０１、または非標識ＧＡＡのうちのいずれかを一回注射することによって処理されたポンペ病マウスから採取された心組織試料におけるグリコーゲンのクライアントを表す、例示的な結果を示す図である。
【図１３Ａ】野生型非標識ＧＡＡまたはＧＩＬＴ標識ＧＡＡＺＣ−７０１の注射後のポンペ病マウスの種々の筋組織におけるグリコーゲンのクリアランスを表す、例示的なグラフを示す図である。
【図１３Ｂ】野生型非標識ＧＡＡまたはＧＩＬＴ標識ＧＡＡＺＣ−７０１の注射後のポンペ病マウスの種々の筋組織におけるグリコーゲンのクリアランスを表す、例示的なグラフを示す図である。
【図１３Ｃ】野生型非標識ＧＡＡまたはＧＩＬＴ標識ＧＡＡＺＣ−７０１の注射後のポンペ病マウスの種々の筋組織におけるグリコーゲンのクリアランスを表す、例示的なグラフを示す図である。
【図１３Ｄ】野生型非標識ＧＡＡまたはＧＩＬＴ標識ＧＡＡＺＣ−７０１の注射後のポンペ病マウスの種々の筋組織におけるグリコーゲンのクリアランスを表す、例示的なグラフを示す図である。
【図１３Ｅ】野生型非標識ＧＡＡまたはＧＩＬＴ標識ＧＡＡＺＣ−７０１の注射後のポンペ病マウスの種々の筋組織におけるグリコーゲンのクリアランスを表す、例示的なグラフを示す図である。
【図１３Ｆ】野生型非標識ＧＡＡまたはＧＩＬＴ標識ＧＡＡＺＣ−７０１の注射後のポンペ病マウスの種々の筋組織におけるグリコーゲンのクリアランスを表す、例示的なグラフを示す図である。
【図１３Ｇ】野生型非標識ＧＡＡまたはＧＩＬＴ標識ＧＡＡＺＣ−７０１の注射後のポンペ病マウスの種々の筋組織におけるグリコーゲンのクリアランスを表す、例示的なグラフを示す図である。
【図１３Ｈ】野生型非標識ＧＡＡまたはＧＩＬＴ標識ＧＡＡＺＣ−７０１の注射後のポンペ病マウスの種々の筋組織におけるグリコーゲンのクリアランスを表す、例示的なグラフを示す図である。
【図１４】臨床研究手順の詳細な工程図である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明は、グリコシル化−非依存性リソソーム標的化技術（ＧＩＬＴ）に基づいて、ポンペ病を治療するための方法および組成物を提供する。特に、本発明は、酸α−グルコシターゼをリソソームにマンノース−６−リン酸に非依存的に標的化することによって、ポンペ病を治療するための方法および組成物を提供する。
【００３５】
本発明の種々の態様は、以下の項で詳述される。項の使用は、本発明を制限することを意味していない。各項は、本発明の任意の態様に適用可能である。本出願では、「または」の使用は、別途記載がない限り、「および／または」を意味する。
【００３６】
ポンペ病
ポンペ病は、エネルギーのために使用される蓄積形態の糖類であるグリコーゲンを破壊するために必要とされる酵素である、酸α−グルコシターゼ（ＧＡＡ）の欠損によって生じる稀な遺伝性疾患である。また、ポンペ病は、グリコーゲン蓄積症ＩＩ型、ＧＳＤＩＩ、ＩＩ型グリコーゲン蓄積症、糖原病ＩＩ型、酸性マルターゼ欠損症、α−１，４−グルコシターゼ欠損症、びまん性心肥大グリコーゲン病、および全身性糖原病の心臓性病態としても知られる。グリコーゲンの蓄積は、全身の進行性筋衰弱（筋疾患）を生じさせ、特に、心臓、骨格筋、肝臓、呼吸器、および神経系における種々の体内組織に影響を及ぼす。
【００３７】
ポンペ病の現れる臨床症状は、疾患発症年齢および残留ＧＡＡ活性に応じて、大きく異なり得る。残留ＧＡＡ活性は、グリコーゲン蓄積量および組織分布の両方、ならびに疾患の重症度と相関する。小児発症ポンペ病（正常ＧＡＡ活性の１％未満）は、最も深刻な形態であって、低血圧、全身性筋衰弱、および肥大型心筋症、ならびに心組織および他の筋組織における大量のグリコーゲン蓄積によって特徴付けられる。通常、心肺不全によって、生後１年以内に死に至る。Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）”Ｇｌｙｃｏｇｅｎ  Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｔｙｐｅ  ＩＩ：Ａｃｉｄ  Ａｌｐｈａ−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ（Ａｃｉｄ  Ｍａｌｔａｓｅ）Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ，”ｉｎ  Ｓｃｒｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｔｈｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａr  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ．８ｔｈ  Ｅｄ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，３３８９−３４２０．若年性発症（正常ＧＡＡ活性の１−１０％）および成人発症（正常ＧＡＡ活性の１０−４０％）ポンペ病は、さらに臨床的に異種であって、発症年齢、臨床症状、および疾患進行度がより大きく異なる。若年性および成人発症ポンペ病は、概して、重度の心臓障害の欠如、晩年期の発症、および緩徐な疾患進行度によって特徴付けられるが、最終的呼吸器または四肢筋肉障害は、有意な罹患率および死亡率をもたらす。平均寿命は異なり得るが、概して、呼吸器不全によって、死に至る。Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）”Ｇｌｙｃｏｇｅｎ  Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｔｙｐｅ  ＩＩ：Ａｃｉｄ  Ａｌｐｈａ−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ（Ａｃｉｄ  Ｍａｌｔａｓｅ）Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ，”ｉｎ  Ｓｃｒｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｔｈｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ．８ｔｈ  Ｅｄ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，３３８９−３４２０．
酵素補充療法
酵素補充療法（ＥＲＴ）は、欠落酵素を血流中に注入することによって、酵素欠損を補正するための治療方針である。血液が患者組織をかん流すると、酵素は、細胞によって吸収されて、リソソームに輸送され、酵素は、酵素欠損症によってリソソーム内に蓄積した物質を排除するように作用する。有効なリソソーム酵素補充療法のためには、治療酵素は、蓄積欠陥が発現する組織内の適切な細胞のリソソームに送達されなければならない。従来のリソソーム酵素補充療法は、タンパク質に天然付着する炭水化物を使用して送達され、標的細胞の表面上の特異的受容体に係合する。ある受容体、陽イオン−非依存性Ｍ６Ｐ受容体（ＣＩ−ＭＰＲ）は、ＣＩ−ＭＰＲが、ほとんどの細胞型の表面上に存在するため、置換リソソーム酵素を標的化するために特に有用である。
【００３８】
「陽イオン−非依存性マンノース−６−リン酸受容体（ＣＩ−ＭＰＲ）」、「Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩ受容体」、および「ＣＩ−ＭＰＲ／ＩＧＦ−ＩＩ受容体」という用語は、本明細書において同義的に使用され、Ｍ６ＰおよびＩＧＦ−ＩＩの両方を結合する細胞受容体を示す。
【００３９】
グリコシル化非依存性リソソーム標的化
本発明は、治療酵素をリソソームに標的化するためのグリコシル化非依存性リソソーム標的化（ＧＩＬＴ）技術を開発した。具体的には、本発明は、Ｍ６Ｐの代わりに、ペプチド標識を使用して、リソソーム標的化のためにＣＩ−ＭＰＲに係合させる。典型的には、ＧＩＬＴ標識は、タンパク質、ペプチド、またはＣＩ−ＭＰＲをマンノース−６−リン酸に非依存的に結合する他の部分である。有利なことには、本技術は、リソソーム酵素の取り込みのために、正常な生物学的機構を模倣し、さらに、マンノース−６−リン酸非依存的に行う。
【００４０】
好ましいＧＩＬＴ標識は、ヒトインスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）に由来する。ヒトＩＧＦ−ＩＩは、ＣＩ−ＭＰＲの高親和性配位子であって、また、ＩＧＦ−ＩＩ受容体とも称される。ＧＩＬＴ標識治療酵素のＭ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩ受容体への結合は、エンドサイトーシス経路を介して、タンパク質をリソソームに標的化する。本方法は、タンパク質が分離されると、さらなる修飾が必要ないため、グリコシル化を伴う方法と比べ、簡素化および費用効果を含む、多数の利点を有する。
【００４１】
ＧＩＬＴ技術およびＧＩＬＴ標識の詳細な説明は、米国特許公開第２００３００８２１７６号、第２００４０００６００８号、第２００４０００５３０９号、および第２００５０２８１８０５号において見られ、そのすべての教示は、参照することによって、全体として本明細書に組み込まれる。
【００４２】
ＧＩＬＴ標識ＧＡＡ
適切なＧＩＬＴ標識をコードするカセットをＧＡＡ−コード化配列に融合することによって、本発明は、タンパク質上でＣＩ−ＭＰＲを高親和性のＭ６Ｐ非依存性含有量と結合可能な、ＧＩＬＴ標識ＧＡＡを提供する。さらに、本発明は、各酵素分子がＣＩ−ＭＰＲの高親和性配位子を保有する、ＧＡＡ製剤を提供する。実施例の項で説明されるように、ＧＩＬＴ標識ＧＡＡは、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）分析によるＣＩ−ＭＰＲに対し高親和性を有し、従来のリソソーム酵素補充療法よりも体内において治療上より効果的である。
【００４３】
ＧＩＬＴ標識ＧＡＡの優れた効力は、いくつかの臨床効果を提供する。効力の増加は、単に、同様またはより低用量でより有益な臨床予後をもたらすであろう。ＧＩＬＴ標識ＧＡＡは、より効率的に疾患に罹患した複数の組織に送達可能である。例えば、ＧＩＬＴ標識ＧＡＡは、特に、より低用量で骨格筋への送達を増加させることが可能である。また、効力の増加は、患者がしばしば被る有害事象を最小限にし、患者内の薬物に対する抗体の産出を軽減するために十分な低用量を可能にし得る。また、効力の増加によって、注入間の間隔を増加させた治療計画を可能にし得る。
【００４４】
好ましい実施形態では、ＧＩＬＴ標識ＧＡＡは、ヒトＧＡＡ、あるいは直鎖オリゴ糖内のαｌ−４結合を開裂する能力を保持するそのフラグメントまたは配列変異体と、ヒトＣＩ−ＭＰＲをマンノース−６−リン酸に非依存的に結合するリソソーム標的化ドメインとを含む。好適なリソソーム標的化ドメインは、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩ、あるいは、そのフラグメントまたは配列変異体を含む。
【００４５】
ＩＧＦ−ＩＩは、好ましくは、ＣＩ−ＭＰＲに特異的に標的化される。特に有用なのは、高親和性を有するＣＩ−ＭＰＲを結合するが、評価可能な親和性を有する他のＩＧＦ−ＩＩ受容体の結合は行わない、タンパク質をもたらすＩＧＦ−ＩＩポリペプチド内の変異体である。また、ＩＧＦ−ＩＩは、血清ＩＧＦ−結合タンパク質への結合を最小限にするように修飾され（Ｂａｘｔｅｒ（２０００）Ａｍ．Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．２７８（６）：９６７−７６）、ＩＧＦ−ＩＩ／ＧＩＬＴ構築物の隔離を回避可能である。いくつかの研究は、ＩＧＦ−結合タンパク質への結合のために必要なＩＧＦ−ＩＩ内の残留物を特定している。これらの残留物において変異体を有する構築物は、Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩ受容体に結合する高親和性の保持と、ＩＧＦ−結合タンパク質の低下した親和性とに対して検査可能である。例えば、ＩＧＦ−ＩＩのＰｈｅ  ２６とＳｅｒの置換は、ＩＧＦＢＰ−１および−６のＩＧＦ−ＩＩの親和性を低下させ、Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩ受容体への結合に作用しないと報告されている（Ｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（１３）：９２４６−５４）。また、ＧＩｕ  ９のＬｙｓ等の他の置換も有利である可能性がある。ＩＧＦ−ＩＩによって高度に保存されるＩＧＦ−Ｉの領域内の類似変異体は、個別にまたは組み合わせて、ＩＧＦ−ＢＰ結合の大幅な減少をもたらす（Ｍａｇｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８（４８）：１５８６３−７０）。
【００４６】
代替アプローチは、高親和性によって、Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩ受容体に結合可能なＩＧＦ−ＩＩの最小領域を同定することである。Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩ受容体に結合するＩＧＦ−ＩＩに関与する残留物は、ほとんどがＩＧＦ−ＩＩの一面上に凝集する（Ｔｅｒａｓａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）ＥＭＢＯ  Ｊ．１３（２３）：５５９０−７）。ＩＧＦ−ＩＩ三次構造は、通常、３つの分子内ジスルフィド結合によって維持されるが、ＩＧＦ−ＩＩのＭ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩ受容体結合表面上のアミノ酸配列を組み込むペプチドは、適切に折り畳まれ、結合活性を有するように設計可能である。そのような最小結合ペプチドは、非常に好ましいリソソーム標的化ドメインである。例えば、好ましいリソソーム標的化ドメインは、ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸８−６７である。またＭ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩ受容体に結合するアミノ酸４８−５５周囲の領域に基づいて設計されたペプチドも、望ましいリソソーム標的化ドメインである。別様に、ペプチドのランダムライブラリは、酵母２ハイブリッドアッセイ、またはファージディスプレイ型アッセイのいずれかを介して、Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩ受容体を結合する能力に対し検査可能である。
【００４７】
ＧＩＬＴ標識は、ＧＡＡポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端に融合可能である。ＧＩＬＴ標識は、ＧＡＡポリペプチドに直接融合可能であるか、あるいはリンカまたはスペーサによって、ＧＡＡポリペプチドから分離可能である。アミノ酸リンカは、天然タンパク質内のその位置に生じるもの以外のアミノ酸配列を組み込み、概して、柔軟であるように、または２つのタンパク質部分間にα−ヘリックス等の構造を介入するように設計される。リンカは、配列Ｇｌｙ−Ａｌａ−ＰｒｏまたはＧＩｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ等のように長さが比較的短い、あるいは、例えば、１０−２５アミノ酸等のように長い可能性がある。融合接合部位は、両融合パートナの適切な折り畳みおよび活性を促進し、ＧＡＡポリペプチドからのペプチド標識の未成熟分離を防止するように、慎重に選択されるべきである。好ましい実施形態では、リンカ配列は、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏである。
【００４８】
本発明の方法および組成物において使用可能なＧＩＬＴ標識ＧＡＡタンパク質の追加構築物は、米国特許公開第２００５０２４４４００号に詳細に説明されており、その全体の開示は、参照することによって本明細書に組み込まれる。
【００４９】
ＧＩＬＴ標識ＧＡＡは、種々の哺乳類細胞株に発現可能であって、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、サル腎臓（ＣＯＳ）、ＨＴ１０８０、Ｃｌ０、ＨｅＬａ、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）、３Ｔ３、Ｃ１２７、ＣＶ−Ｉ、ＨａＫ、ＮＳ／Ｏ、およびＬ−９２９細胞を含むが、これらに限定されない。また、ＧＩＬＴ標識ＧＡＡは、種々の非哺乳類宿主細胞内に発現可能であって、例えば、昆虫（例えば、Ｓｆ−９、Ｓｆ−２１、Ｈｉ５）、植物（例えば、マメ科、穀草類、またはタバコ）、酵母（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、原核生物（例えば、Ｅ．ＣｏＩｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、および他のＢａｃｉｌｌｕｓ類、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ類、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ類）、あるいは菌類が挙げられる。
【００５０】
いくつかの実施形態では、ＧＩＬＴ標識ＧＡＡは、分泌シグナルペプチドを使用して産出され、融合タンパク質の分泌を促進可能である。例えば、ＧＩＬＴ標識ＧＡＡは、ＩＧＦ−ＩＩシグナルペプチドを使用して産出可能である。一般に、ＩＧＦ−ＩＩシグナルペプチドを使用して産出されるＧＩＬＴ標識ＧＡＡは、野生型ヒトＧＡＡと比較して、低下したマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）レベルをタンパク質の表面上に有する。実施例の項に示されるように、検出可能Ｍ６Ｐは、本発明の例示的な治療的融合タンパク質上に存在しないことが、Ｎ−連鎖オリゴ糖分析および機能的取り込みアッセイの両方によって確認されている。
【００５１】
本発明のＧＩＬＴ−ＧＡＡは、典型的には、約１５０，０００−６００，０００ｎｍｏｌ／時間／ｍｇタンパク質、好ましくは、約２５０，０００−５００，０００ｎｍｏｌ／時間／ｍｇタンパク質の範囲の特異的酵素活性を有する。一実施形態では、ＧＡＡは、少なくとも約１５０，０００ｎｍｏｌ／時間／ｍｇタンパク質の特異的酵素活性、好ましくは、少なくとも約３００，０００ｎｍｏｌ／時間／ｍｇタンパク質の特異的酵素活性、より好ましくは、少なくとも約４００，０００ｎｍｏｌ／時間／ｍｇの特異的酵素活性、さらにより好ましくは、少なくとも約６００，０００ｎｍｏｌ／時間／ｍｇタンパク質の特異的酵素活性を有する。ＧＡＡ活性は、ＧＡＡ４ＭＵ単位によって定義される。
【００５２】
ポンペ病の治療
本発明の方法は、小児、若年性、または成人発症ポンペ病に罹患する個体を治療する際に等しく有効である。典型的には、本明細書に記載の療法および組成物は、より高いレベルの残留ＧＡＡ活性（それぞれ、１〜１０％または１０−４０％）を有し、したがって、投与されたＧＩＬＴ標識ＧＡＡが免疫学的により耐性となる可能性があるため、若年性または成人発症ポンペ病を有する個体を治療する際により有効である場合がある。理論に制約されることを所望するものではないが、これらの患者は、概して、内因性ＧＡＡに対し交差反応性免疫物質（Ｃｒｏｓｓ−Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  Ｍａｔｅｒｉａｌ；ＣＲＩＭ）陽性である。したがって、彼らの免疫系は、「異質」タンパク質として、ＧＩＬＴ標識ＧＡＡのＧＡＡ部分を知覚せず、ＧＩＬＴ標識ＧＡＡのＧＡＡ部分に対する抗体を作る可能性が低い。
【００５３】
本明細書で使用される「治療する／処理する」または「治療／処理」という用語は、疾患に付随する１つ以上の症状の改善、疾患の１つ以上の症状の発症の防止または遅延、および／または疾患の１つ以上の症状の重症度または頻度を軽減することを示す。例えば、治療は、心臓状態（例えば、拡張終期および／または収縮末期容量の増加、あるいはポンペ病に典型的に見られる進行性心筋症の低減、改善、または防止）、あるいは肺機能（例えば、基準容量を上回る啼泣時肺活量の増加、および／または啼泣時の酸素飽和度低下の正常化）の改善、神経発達および／または運動技能の改善（例えば、ＡＩＭＳスコアの上昇）、疾患に罹患する個体の組織内のグリコーゲンレベルの低下、あるいはこれらの効果の任意の組み合わせを示す可能性がある。好ましい一実施形態では、治療は、特に、ポンペ病付随心筋症の低減または防止におけるグリコーゲンクリアランスの改善を含む。本明細書で使用される「改善する」、「増加する」、または「低下する」という用語は、本明細書に記載の治療開始前の同一個体における測定値、あるいは本明細書に記載の治療を受けていない対照個体（または複数の対照個体）における測定値等、基準測定に相対する値を示す。「対照個体」は、治療を受ける個体と同一形態のポンペ病（小児、若年性、または成人発症のいずれか）に罹患する個体であって、治療を受ける個体とほぼ同年齢である（治療を受ける個体および対照個体における疾患の段階は同程度であることを保証するため）。
【００５４】
治療を受ける個体（また、「患者」または「対象」とも称される）は、ポンペ病（すなわち、小児、若年性、または成人発症ポンペ病のいずれか）を有する、あるいはポンペ病を発症する可能性を有する個体（胎児、幼児、小児、青年、または成人のヒト）である。個体は、残留内因性ＧＡＡ活性を有する、または測定可能活性を有しない可能性がある。例えば、ポンペ病を有する個体は、約１％未満の正常ＧＡＡ活性（すなわち、通常、小児発症ポンペ病に付随するＧＡＡ活性）であるＧＡＡ活性、約１〜１０％の正常ＧＡＡ活性（すなわち、通常、若年性発症ポンペ病に付随するＧＡＡ活性）であるＧＡＡ活性、または約１０〜４０％の正常ＧＡＡ活性（すなわち、通常、成人発症ポンペ病に付随するＧＡＡ活性）であるＧＡＡ活性を有する可能性がある。個体は、内因性ＧＡＡに対しＣＲＩＭ−陽性またはＣＲＩＭ−陰性である可能性がある。一実施形態では、個体は、内因性ＧＡＡに対しＣＲＩＭ−陽性である。別の実施形態では、個体は、最近、疾患を有していると診断された個体である。早期治療（診断後可能な限り迅速な治療の開始）は、疾患の影響を最小限にし、治療の効果を最大限にするために重要である。
【００５５】
ＧＩＬＴ標識ＧＡＡの投与
本発明の方法では、ＧＩＬＴ標識ＧＡＡは、典型的には、単独で、あるいは、本明細書に記載のように、ＧＩＬＴ標識ＧＡＡを含有する（例えば、疾患の治療のための薬剤の製造において）組成物または薬剤中で、個体に投与される。組成物は、生理的に受容可能な担体または賦形剤によって調合された、医薬組成物を調製可能である。担体および組成物は、無菌にすることが可能である。調合は、投与形態に適合させるべきである。
【００５６】
好適な医薬的に受容可能な担体は、水、食塩水（例えば、ＮａＣｌ）、生理食塩水、緩衝食塩水、アルコール、グリセロール、エタノール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、炭水化物（ラクトース、アミロース、または澱粉等）、糖類（マンニトール、スクロース、またはその他等）、デキストロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、流動パラフィン、香油、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等、ならびにこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。医薬製剤は、所望に応じて、活性化合物と有害に反応しない、あるいはそれらの活性に干渉しない、助剤（例えば、潤滑剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳剤、浸透圧に作用する塩、緩衝液、着色剤、香味料および／または芳香剤等）と混合可能である。好ましい実施形態では、静脈内投与に好適な水溶性担体が使用される。
【００５７】
また、組成物または薬剤は、所望に応じて、小量の湿潤または乳化剤、あるいはｐＨ緩衝液を含有可能である。組成物は、液体溶液、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸薬、カプセル剤、徐放性調合剤、または散剤であることが可能である。また、組成物は、従来の結合剤およびトリグリセリド等の担体によって、坐薬として調合可能である。経口調合剤は、製薬等級のマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等の標準的担体を含むことが可能である。
【００５８】
組成物または薬剤は、ヒトに投与するために適合される医薬組成物として、常法に従って、調合可能である。例えば、好ましい実施形態では、静脈内投与のための組成物は、典型的には、無菌等張水性緩衝液内の溶液である。また、必要に応じて、組成物は、溶解補助剤および局所麻酔薬を含み、注射部位の疼痛を緩和してもよい。概して、成分は、例えば、密封容器内の凍結乾燥粉末、あるいは活性剤の量を示すアンプルまたはサシェ等の密閉容器内の水非含有濃縮物等の単位投与量形態で、個別に、もしくは混合して供給される。組成物が注入によって投与されるべきである場合、無菌医薬等級の水、生理食塩水、またはデキストロース／水を含有する注入瓶によって分注可能である。組成物が注射によって投与される場合、成分が投与前に混合され得るように、注射のための無菌水または生理食塩水のアンプルを提供可能である。
【００５９】
ＧＩＬＴ標識ＧＡＡは、中性または塩形態で調合可能である。医薬的に受容可能な塩は、遊離アミノ基（塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等に由来）、および遊離カルボキシル基（ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、二価カチオン、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等に由来）によって形成されるものを含む。
【００６０】
ＧＩＬＴ標識ＧＡＡ（または、ＧＩＬＴ標識ＧＡＡ含有組成物または薬剤）は、任意の適切な経路によって投与される。好ましい実施形態では、ＧＩＬＴ標識ＧＡＡは、静脈内に投与される。他の実施形態では、ＧＩＬＴ標識ＧＡＡは、心臓または筋肉（例えば、筋肉内）、あるいは神経系（例えば、脳に直接注射、脳室内に、髄腔内に）等の標的組織への直接投与によって投与される。別様に、ＧＩＬＴ標識ＧＡＡ（または、ＧＩＬＴ標識ＧＡＡ含有組成物または薬剤）は、非経口的に、経皮的に、あるいは経粘膜的に（例えば、経口的にまたは経鼻的に）投与可能である。所望に応じて、２つ以上の経路を並行して、使用することができる。
【００６１】
ＧＩＬＴ標識ＧＡＡ（あるいは、ＧＩＬＴ標識ＧＡＡを含有する組成物または薬剤）は、単独で、もしくは抗ヒスタミン剤（例えば、ジフェンヒドラミン）または免疫抑制剤等の他の薬剤、あるいは抗ＧＩＬＴ標識ＧＡＡ抗体に拮抗する他の免疫治療剤と併用して、投与可能である。「併用して」という用語は、薬剤が、ＧＩＬＴ標識ＧＡＡ（または、ＧＩＬＴ標識ＧＡＡ含有組成物）の前、ほぼ同時に、あるいはその後に投与されることを示す。例えば、薬剤は、ＧＩＬＴ標識ＧＡＡ含有組成物内に混合され、それによって、ＧＩＬＴ標識ＧＡＡと同時に投与可能である。別様に、薬剤は、混合せずに（例えば、同様にＧＩＬＴ標識ＧＡＡが投与される、静脈ライン上の薬剤の「ピギーバッキング」送達によって、またはその逆によって）、同時に投与可能である。別の実施例では、薬剤は、個別に（例えば、混合せずに）であるが、ＧＩＬＴ標識ＧＡＡの投与の短時間フレーム内（例えば、２４時間以内）で投与可能である。好ましい一実施形態では、個体が、内因性ＧＡＡに対しＣＲＩＭ−陰性である場合、ＧＩＬＴ標識ＧＡＡ（または、ＧＩＬＴ標識ＧＡＡ含有組成物）は、抗ＧＩＬＴ標識ＧＡＡ抗体の量を低減する、あるいはその産出を防止するように設計された免疫抑制または免疫治療計画と併用して投与される。例えば、血友病患者において使用されるものと類似のプロトコル（Ｎｉｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ（１９８８）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１８：９４７−５０）を使用して、抗ＧＩＬＴ標識ＧＡＡ抗体を減少させることが可能である。また、そのような計画は、内因性ＧＡＡに対しＣＲＩＭ−陽性であるが、抗ＧＩＬＴ標識ＧＡＡ抗体を有する、またはその危険性を有する個体において使用可能である。特に好ましい実施形態では、免疫抑制または免疫治療計画は、抗ＧＩＬＴ標識ＧＡＡ抗体の産出の可能性を最小限にするために、ＧＩＬＴ標識ＧＡＡの最初の投与前に開始される。
【００６２】
ＧＩＬＴ標識ＧＡＡ（または、ＧＩＬＴ標識ＧＡＡを含有する組成物または薬剤）は、治療上有効量（すなわち、規則的間隔で投与されると、上述のように、疾患に付随する症状を改善する、疾患の発症を防止あるいは遅延させる、および／または疾患の症状の重症度もしくは頻度も同様に軽減する等、疾患を治療するために十分な投与量）で投与される。
【００６３】
疾患の治療のために治療上有効となる投与量は、疾患の影響の特性および範囲に依存し、標準的臨床技術によって判定可能である。さらに、体外または体内アッセイは、随意に、以下に例示されるように、最適用量の範囲の同定を補助するために採用されてもよい。また、採用される正確な用量は、投与の経路および疾患の重篤度に依存し、施術者の判定および各患者の状況に従って、決定されるべきである。有効用量は、体外または動物モデル試験系に由来する用量応答曲線から推定されてもよい。治療上有効投与量は、例えば、約０．１〜１ｍｇ／ｋｇ、約１〜５ｍｇ／ｋｇ、約５〜２０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜５０ｍｇ／ｋｇ、または２０〜１００ｍｇ／ｋｇであることが可能である。特定の個体のための有効投与量は、個体の必要性に応じて、経時的に変化可能である（例えば、増加または減少）。例えば、物理的疾病またはストレスの時、あるいは抗ＧＩＬＴ標識ＧＡＡ抗体が存在または増加する場合、もしくは疾患症状が悪化する場合、投与量は増大可能である。
【００６４】
治療上有効量のＧＩＬＴ標識ＧＡＡ（または、ＧＩＬＴ標識ＧＡＡを含有する組成物または薬剤）は、疾患の影響の特性および範囲に応じて規則的間隔で、かつ継続的に投与される。本明細書で使用される、ある「間隔」での投与は、治療上有効量が、定期的に投与される（１回量とは区別されるように）ことを示す。間隔は、標準的臨床技術によって判定可能である。好ましい実施形態では、ＧＩＬＴ標識ＧＡＡは、隔月、毎月、毎月２回、３週間毎、隔週、毎週、毎週２回、毎週３回、または毎日投与される。単一個体のための投与間隔は、固定間隔である必要はないが、個体の必要性に応じて、経時的に変化可能である。例えば、物理的疾病またはストレスの時、あるいは抗ＧＩＬＴ標識ＧＡＡ抗体が存在または増加する場合、もしくは疾患症状が悪化する場合、投与間の間隔は減少可能である。
【００６５】
本明細書で使用される「隔月」という用語は、２ヶ月に１回（すなわち、２ヶ月毎に１回）の投与を意味し、「毎月」という用語は、１ヶ月に１回の投与を意味し、「３週間毎」という用語は、３週間に１回（すなわち、３週間毎に１回）の投与を意味し、「隔週」という用語は、２週間に１回（すなわち、２週間毎に１回）の投与を意味し、「毎週」という用語は、１週間に１回の投与を意味し、「毎日」という用語は、投与１日に１回の投与を意味する。
【００６６】
さらに、本発明は、本明細書に記載のように、本明細書に記載の方法等による、ポンペ病の治療用の組成物の投与のための指示を含むラベル付き容器（例えば、バイアル、瓶、静脈内投与用の袋、注射器等）内のヒトＧＩＬＴ標識ＧＡＡを含む医薬組成物に関する。
【００６７】
本発明は、以下の実施例によって、さらに、かつより具体的に説明される。しかしながら、実施例は、例証目的のために含まれるものであって、制限のためのものではない。
【実施例】
【００６８】
実施例１  組み換え野生型ＧＡＡおよびＧＩＬＴ標識ＧＡＡの産出
プラスミド
全長野生型ヒトＧＡＡをコードするＤＮＡは、分離され、組み換えヒトＧＡＡの産出のために、発現ベクター内に挿入される。完全ヒトＧＡＡアミノ酸１−９５２をコードするＤＮＡカセット（以下、「カセット６３５」）は、以下のＰＣＲプライマーを使用して、ＩＭＡＧＥクローン４３７４２３８（Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から派生した。
ＧＡＡ１３：５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＡＣＣＡＴＧＧＧＡＧＴＧＡＧＧＣＡＣＣＣＧＣＣＣ（配列番号１）
および
ＧＡＡ２７：５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＴＡＡＣＡＣＣＡＧＣＴＧＡＣＧＡＧＡＡＡＣＴＧＣ（配列番号２）。
カセット６３５は、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩによって消化され、Ｋｌｅｎｏｗ  ＤＮＡポリメラーゼによる処理によって鈍化され、次いで、発現ベクターｐＣＥＰ４のＫｌｅｎｏｗ処理されたＨｉｎｄＩＩＩ部位（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内に結紮され、プラスミドｐ６３５を生成する。以下、ＺＣ−６３５は、野生型非標識ＧＡＡタンパク質と称する。
【００６９】
組み換えＧＩＬＴ標識ＧＡＡＺＣ−７０１の産出のためのＤＮＡカセット（以下、「カセット７０１」）は、アミノ酸Ａ７０に対応するＧＡＡ配列の上流に結合された以下のＮ−末端配列を除き、カセット６３５と同様に調製した。
ＧＡＡＴＴＣＡＣＡＣＣＡＡＴＧＧＧＡＡＴＣＣＣＡＡＴＧＧＧＧＡＡＧＴＣＧＡＴＧＣＴＧＧＴＧＣＴＴＣＴ
ＣＡＣＣＴＴＣＴＴＧＧＣＣＴＴＣＧＣＣＴＣＧＴＧＣＴＧＣＡＴＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＴＧＣＧＧＣＧＧＧＧＡ
ＧＣＴＧＧＴＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＣＡＧＴＴＣＧＴＣＴＧＴＧＧＧＧＡＣＣＧＣＧＧＣＴＴＣＴＡＣＴＴＣＡＧ
ＣＡＧＧＣＣＣＧＣＡＡＧＣＣＧＴＧＴＧＡＧＣＣＧＴＣＧＣＡＧＣＣＧＴＧＧＣＡＴＣＧＴＴＧＡＧＧＡＧＴ
ＧＣＴＧＴＴＴＣＣＧＣＡＧＣＴＧＴＧＡＣＣＴＧＧＣＣＣＴＣＣＴＧＧＡＧＡＣＧＴＡＣＴＧＴＧＣＴＡＣＣＣ
ＣＣＧＣＣＡＡＧＴＣＣＧＡＧＧＧＣＧＣＧＣＣＧ（配列番号３）。
【００７０】
カセット７０１は、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩによって消化され、Ｋｌｅｎｏｗ  ＤＮＡポリメラーゼによる処理によって鈍化され、次いで、発現ベクターｐＣＥＰ４のＫｌｅｎｏｗ処理されたＨｉｎｄＩＩＩ部位内に結紮され、プラスミドｐ７０１を生成する。以下、ＺＣ−７０１は、ｐ７０１プラスミドによってコードされるＧＩＬＴ標識ＧＡＡタンパク質と称する。図１は、ＧＩＬＴ標識ＧＡＡＺＣ−７０１の略図を示し、分泌によって損失するＩＧＦ−ＩＩシグナルペプチドを表す。したがって、分泌形態（すなわち、対象に投与されるように）では、ＺＣ−７０１は、ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸１および８−６７（すなわち、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩのΔ２−７）と、スペーサ配列ＧＩｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏと、ヒトＧＡＡのアミノ酸７０−９５２とを含む。全長アミノ酸配列は、以下に示される。スペーサ配列は、下線が引かれている。スペーサ配列に対する配列Ｎ−末端は、ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸１および８−６７（アミノ酸１を指す矢印）を反映し、スペーサ配列に対する配列Ｃ−末端は、ヒトＧＡＡのアミノ酸７０−９５２を反映する。
↓
ＭＧＩＰＭＧＫＳＭＬＶＬＬＴＦＬＡＦＡＳＣＣＩＡＡＬＣＧＧＥＬＶＤＴＬＱＦＶＣＧＤＲＧＦＹＦＳＲＰＡＳＲＶＳＲＲＳ
ＲＧＩＶＥＥＣＣＦＲＳＣＤＬＡＬＬＥＴＹＣＡＴＰＡＫＳＥＧＡＰＡＨＰＧＲＰＲＡＶＰＴＱＣＤＶＰＰＮＳＲＦＤＣＡＰＤＫ
ＡＩＴＱＥＱＣＥＡＲＧＣＣＹＩＰＡＫＱＧＬＱＧＡＱＭＧＱＰＷＣＦＦＰＰＳＹＰＳＹＫＬＥＮＬＳＳＳＥＭＧＹＴＡＴＬＴ
ＲＴＴＰＴＦＦＰＫＤＩＬＴＬＲＬＤＶＭＭＥＴＥＮＲＬＨＦＴＩＫＤＰＡＮＲＲＹＥＶＰＬＥＴＰＲＶＨＳＲＡＰＳＰＬＹＳＶＥ
ＦＳＥＥＰＦＧＶＩＶＨＲＱＬＤＧＲＶＬＬＮＴＴＶＡＰＬＦＦＡＤＱＦＬＱＬＳＴＳＬＰＳＱＹＩＴＧＬＡＥＨＬＳＰＬＭＬＳＴ
ＳＷＴＲＩＴＬＷＮＲＤＬＡＰＴＰＧＡＮＬＹＧＳＨＰＦＹＬＡＬＥＤＧＧＳＡＨＧＶＦＬＬＮＳＮＡＭＤＶＶＬＱＰＳＰＡ
ＬＳＷＲＳＴＧＧＩＬＤＶＹＩＦＬＧＰＥＰＫＳＶＶＱＱ  ＹＬＤＶＶＧＹＰＦＭＰＰＹＷＧＬＧＦＨＬＣＲＷＧＹＳＳＴＡＩＴ
ＲＱＶＶＥＮＭＴＲＡＨＦＰＬＤＶＱＷＮＤＬＤＹＭＤＳＲＲＤＦＴＦＮＫＤＧＦＲＤＦＰＡＭＶＱＥＬＨＱＧＧＲＲＹ
ＭＭＩＶＤＰＡＩＳＳＳＧＰＡＧＳＹＲＰＹＤＥＧＬＲＲＧＶＦＩＴＮＥＴＧＱＰＬＩＧＫＶＷＰＧＳＴＡＦＰＤＦＴＮＰＴＡＬ
ＡＷＷＥＤＭＶＡＥＦＨＤＱＶＰＦＤＧＭＷＩＤＭＮＥＰＳＮＦＩＲＧＳＥＤＧＣＰＮＮＥＬＥＮＰＰＹＶＰＧＶＶＧＧＴ
ＬＱＡＡＴＩＣＡＳＳＨＱＦＬＳＴＨＹＮＬＨＮＬＹＧＬＴＥＡＩＡＳＨＲＡＬＶＫＡＲＧＴＲＰＦＶＩＳＲＳＴＦＡＧＨＧＲＹ
ＡＧＨＷＴＧＤＶＷＳＳＷＥＱＬＡＳＳＶＰＥＩＬＱＦＮＬＬＧＶＰＬＶＧＡＤＶＣＧＦＬＧＮＴＳＥＥＬＣＶＲＷＴＱＬＧ
ＡＦＹＰＦＭＲＮＨＮＳＬＬＳＬＰＱＥＰＹＳＦＳＥＰＡＱＱＡＭＲＫＡＬＴＬＲＹＡＬＬＰＨＬＹＴＬＦＨＱＡＨＶＡＧＥＴ
ＶＡＲＰＬＦＬＥＦＰＫＤＳＳＴＷＴＶＤＨＱＬＬＷＧＥＡＬＬＩＴＰＶＬＱＡＧＫＡＥＶＴＧＹＦＰＬＧＴＷＹＤＬＱＴＶ
ＰＩＥＡＬＧＳＬＰＰＰＰＡＡＰＲＥＰＡＩＨＳＥＧＱＷＶＴＬＰＡＰＬＤＴＩＮＶＨＬＲＡＧＹＩＩＰＬＱＧＰＧＬＴＴＴＥＳＲＱ
ＱＰＭＡＬＡＶＡＬＴＫＧＧＥＡＲＧＥＬＦＷＤＤＧＥＳＬＥＶＬＥＲＧＡＹＴＱＶＩＦＬＡＲＮＮＴＩＶＮＥＬＶＲＶＴＳ
ＥＧＡＧＬＱＬＱＫＶＴＶＬＧＶＡＴＡＰＱＱＶＬＳＮＧＶＰＶＳＮＦＴＹＳＰＤＴＫＶＬＤＩＣＶＳＬＬＭＧＥＱＦＬＶＳ
ＷＣ（配列番号４）。
【００７１】
第２のＧＩＬＴ標識ＧＡＡカセットＺＣ−１０２６は、同様に構築された。ＺＣ−１０２６は、ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸１および８−６７と、スペーサ配列Ｔｈｒ−Ｇｌｙと、ヒトＧＡＡのアミノ酸７０−９５２とを含む。
【００７２】
これらのプラスミドを使用して、組み換えタンパク質の産出のための懸濁ＨＥＫ２９３細胞を一過性にトランスフェクトした。プラスミドは、製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって記載されるように、懸濁ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（登録商標）２９３−Ｆ細胞内にトランスフェクトされた。要するに、細胞は、旋回式振盪機上のポリカーボネート振盪フラスコ内のＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において、３７℃および８％ＣＯ２で成長させた。細胞は、製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって記載されるように、濃度１×１０６細胞／ｍｌに調節され、次いで、１：１：１の比率のｍｌ細胞：μｇ  ＤＮＡ：μｌ  ２９３ｆｅｃｔｉｎ（登録商標）でトランスフェクトされた。培養物は、トランスフェクション後５〜１０日で採取され、細胞は、遠心分離と、０．２μｍボトルトップフィルタを通した濾過とによって、除去された。上清は、−８０℃で保存した。
【００７３】
別様に、カセット７０１は、ＧＰＥｘ（登録商標）レトロベクター発現系（Ｃａｒｄｉｎａｌ  Ｈｅａｌｔｈ）内に組み込まれた。プロセスは、米国特許第６，８５２，５１０号に記載されており、その開示は、参照することによって本明細書に組み込まれる。カセット７０１を含有するＧＰＥｘ（登録商標）レトロベクター発現系を使用して、組み換えＧＩＬＴ標識ＧＡＡの産出のために、安定したＣＨＯ細胞株を生成した。また、カセット７０１は、ＧＰＥｘ（登録商標）レトロベクター発現系内に組み込み、組み換えＧＩＬＴ標識ＧＡＡの産出のために、安定したＨＥＫ２９３細胞株を生成するために使用可能である。
【００７４】
ＧＩＬＴ標識ＧＡＡの精製
出発物質は、上述のように、−８０℃の保存から解凍させた哺乳類細胞培養上清であった。酢酸ナトリウム（ｐＨ４．６）を添加し、最終濃度１００ｍＭを達成し、硫酸アンモニウムを添加し、最終濃度０．７５Ｍを達成した。物質を遠心分離して、沈殿物を除去し、０．８／０．２μｍ  ＡｃｒｏＰａｋ（登録商標）５００カプセル（Ｐａｌｌ、カタログ＃１２９９１）で濾過した。
【００７５】
濾過された物質は、ＨＩＣ  Ｌｏａｄ  Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  ＮａＡｃ  ｐＨ４．６、０．７５Ｍ  ＡｍＳＯ４）によって調製されたＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）６Ｌｏｗ−Ｓｕｂ  Ｆａｓｔ−Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラム上に装填した。カラムは、１０カラム体積のＨＩＣ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  ＮａＡｃ  ｐＨ５．３、０．７５Ｍ  ＡｍＳＯ４）で洗浄し、５カラム体積のＨＩＣ  Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  ＮａＡｃ  ｐＨ５．３、２０ｍＭ  ＡｍＳＯ４）で溶出した。
【００７６】
貯留された留分は、ＱＸＬ  Ｌｏａｄ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  ｐＨ６．５、５０ｍＭ  ＮａＣｌ）内に広く透析され、次いで、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＸＬカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に装填した。カラムは、１０カラム体積のＱＸＬ  Ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒによって洗浄し、１０カラム体積のＱＸＬ  Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  ｐＨ６．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）で溶出した。ある場合には、ＱＸＬカラムから貯留された留分は、３０から４０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度に濃縮され、次いで、ＰＢＳ  ｐＨ６．２に平衡された２．６×９０ｃｍ  Ｕｌｔｒｏｇｅｌ  ＡｃＡ  ４４カラム上に装填した。装填体積は、５から７．５ｍｌ（カラム体積の１〜１．５％）とした。カラムは、ＰＢＳ  ｐＨ６．２中で０．４ｍｌ／分で作動させ、４ｍｌの留分を回収した。
【００７７】
精製された非標識ＧＡＡおよびＧＩＬＴ標識ＧＡＡは、図２Ａ−図２Ｃに示される。図２Ａは、銀染色後のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。図２Ｂは、抗ＧＡＡ抗体を使用したウエスタンブロットを示す。図２Ｃは、抗ＩＧＦ−ＩＩ抗体を使用したウエスタンブロットを示す。
【００７８】
（実施例２）ＣＩ−ＭＰＲに対するＧＩＬＴ標識ＧＡＡの親和性
ＣＩ−ＭＰＲに対するＧＩＬＴ標識ＧＡＡＺＣ−７０１の結合親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）表面プラズモン共鳴アッセイを使用して判定した。それぞれ、野生型ＣＩ−ＭＰＲドメイン１０−１３および点突然変異体を含有する２つのビオチン化およびＨｉｓで標識された組み換えタンパク質は、標準的分子技術に従って作製した。２つの組み換えタンパク質の略図は、図３Ａに示される。プラスミドｐｌ２８８は、ＩＧＦ−ＩＩシグナルペプチドに続き、ポリ−Ｈｉｓ標識、Ｂｉｏｔｉｎ  ＡＳドメイン、野生型ＣＩ−ＭＰＲドメイン１０−１３をコードする配列を含有する。プラスミドｐ１３５５は、ＩＧＦ−ＩＩシグナルペプチドに続き、ポリ−Ｈｉｓ標識、Ｂｉｏｔｉｎ  ＡＳドメイン、受容体ＩＧＦ−ＩＩに対する受容体の親和性を効果的に低下させる点変異体Ｉ１５７２Ｔを有するＣＩ−ＭＰＲドメイン１０−１３をコードする配列を含有する。２つの組み換えタンパク質に関する特異的ＤＮＡおよびアミノ酸配列は、以下に示される。
【００７９】
ＨＩＳ−ＢＩＯＴＩＮ−ＣＩ−ＭＰＲ  ＤＯＭＡＩＮＳ  １０−１３
【００８０】
【数１】
2010509344.tif 000003
ＨＩＳ−ＢＩＯＴＩＮ−ＣＩ−ＭＰＲ  ＤＯＭＡＩＮＳ  １０−１３ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ
【００８１】
【数２】
2010509344.tif 000004
ＨＩＳ−ＢＩＯＴＩＮ−ＣＩ−ＭＰＲ  ＤＯＭＡＩＮＳ  １０−１３  Ｉｌ  ５７２Ｔ（下線の配列変化は、点変異体Ｉ１５７２Ｔと、診断ＳｐｅＩ部位を生成するサイレント変異体Ｓ  １５７３をもたらす）
【００８２】
【数３】
2010509344.tif 000005
ＨＩＳ−ＢＩＯＴＩＮ−ＣＩ−ＭＰＲ  ＤＯＭＡＩＮＳ  １０−１３  Ｉ１５７２Ｔ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ（Ｉ１５７２Ｔ変異体は下線部）
【００８３】
【数４】
2010509344.tif 000006
組み換えタンパク質は、懸濁ＨＥＫ２９３細胞（図３Ｂ参照）内に一時的に発現した。タンパク質は、培養上清から回収し、ニッケルアガロースによって精製し、次いで、ビオチン化した。具体的には、プラスミドｐ１２８８およびｐ１３５５によってトランスフェクトされた細胞からの上清は、Ｈｉｓ６で標識された受容体ドメインタンパク質の精製のために、製造業者によって指示されるように、１ｍｌ  Ｈｉｓ  Ｇｒａｖｉｔｒａｐ（登録商標）カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した。溶出液を濃縮し、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８および２５ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液に交換し、次いで、タンパク質は、製造業者（Ａｖｉｄｉｔｙ）によって記載されるように、２５μｌ  ＢｉｏｍｉｘＡ、２５μｌ  ＢｉｏｍｉｘＢ、および４μｌ  ＢｉｒＡ酵素を有する２０５μｌ総体積中７０μｇ受容体を含有する反応において、ＢｉｒＡ酵素によってビオチン化された。ＢｉｒＡ酵素処理は、３０℃で１．５時間行った。反応液は、次いで、２０倍でＨｉｓ  Ｇｒａｖｉｔｒａｐ結合緩衝液（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中に希釈し、ＢｉｒＡ酵素および遊離ビオチンの除去のために、Ｈｉｓ  Ｇｒａｖｉｔｒａｐ（登録商標）カラムに再適用した。溶出液は、４℃で保存した。
【００８４】
表面プラズモン共鳴分析
表面プラズモン共鳴測定はすべて、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）  ３０００機器を使用して、２５℃で行った。ＳＡセンサチップおよび界面活性剤Ｐ２０は、Ｂｉａｃｏｒｅ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）から取得した。緩衝液はすべて、Ｎａｌｇｅｎｅ（登録商標）濾過ユニット（０．２μｍ）を使用して濾過し、室温に平衡化し、使用直前に脱気した。タンパク質試料は、１３，０００ｘｇで１５分間遠心分離し、試料内に存在し得るあらゆる微粒子を除去した。
【００８５】
精製され、ビオチン化された野生型（１２８８ＦＳ）または変異体（１３５５ＦＳ）組み換えＣＩ−ＭＰＲ  ＤＯＭＡＩＮＳ  １０−１３（Ｄｏｍ１０−１３）タンパク質は、ストレプトアビジンが共有結合しているデキストランマトリクスを含有するＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）ストレプトアビジン（ＳＡ）チップ上に固定した。ＳＡセンサチップのドッキング後、ＳＡチップを脱イオン水で２回洗浄した。カップリングされるべき流動細胞は、５０ｍＭ  ＮａＯＨ／１  Ｍ  ＮａＣｌを含有する緩衝液６０ｍｌを流速２０ｍｌ／分で注入することによって、調整した。チップは、上述のように、Ｈ２Ｏで洗浄した。チップは、次いで、上述のように、カップリング緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４／１００ｍＭ  ＮａＣｌ）で洗浄した。ビオチン化されたＤｏｍ１０−１３タンパク質１３５５ＦＳおよび１２８８ＦＳは、カップリング緩衝液中で２０ｎｇ／ｍｌおよび４ｎｇ／ｍｌに希釈した。流動細胞（ＦＣ）１＆２は、ＦＣ３＆４よりも高密度でカップリングした。ＦＣ１およびＦＣ３は、変異体Ｄｏｍ１０−１３構築物によって固定し、基準表面（すなわち、ＦＣ１からの反応は、ＦＣ２からサブトラクトし、ＦＣ３からの反応は、ＦＣ４からサブトラクトした）として使用した。ＦＣ２およびＦＣ４は、野生型Ｄｏｍ１０−１３構築物によって固定した。ＦＣ１は、流速１０ｍｌ／分で１３５５ＦＳ（２０ｎｇ／ｍｌ）を５０ｍｌ注入することによってカップリングし、ＦＣ２は、流速１０ｍｌ／分で１２８８ＦＳ（２０ｎｇ／ｍｌ）５０ｍｌを注入することによってカップリングし、最終カップリングレベルおよそ５，０００共鳴単位（ＲＵ）を達成した。ＦＣ３は、流速１０ｍｌ／分で１３５５ＦＳ（４ｎｇ／ｍｌ）５０ｍｌを注入することによってカップリングし、ＦＣ２は、流速１０ｍｌ／分で１２８８ＦＳ（４ｎｇ／ｍｌ）を５０ｍｌを注入することによってカップリングし、最終カップリングレベルおよそ１，０００ＲＵを達成した。これらのカップリングレベルは、８００ＲＵ（ＦＣ２−１）または１６０ＲＵ（ＦＣ４−３）のＩＧＦ−ＩＩのための理論Ｒｍａｘと、１０，０００ＲＵ（ＦＣ２−１）または２，０００ＲＵ（ＦＣ４−３）のＧＡＡ−ＧＩＬＴのための理論Ｒｍａｘとを提供する。Ｄｏｍ１０−１３構築物を含有するカップリング緩衝液を５０ｍｌ注射後、チップは、カップリング緩衝液のみで洗浄した（流速１０ｍｌ／分の１０ｍｌ注射）。非結合ストレプトアビジン結合部位の保持は、流速１０μｌ／分でのビオチン（１０ｍＭ）の２つの連続した１０ｍｌ注射によって、ビオチンで飽和した。
【００８６】
カップリング後、流動細胞は、泳動緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および０．００５％（ｖ／ｖ）界面活性剤Ｐ２０）中で平衡化した。固定されたＤｏｍ１０−１３構築物の活性は、ＩＧＦ−ＩＩ単独に対する受容体の新和性を測定することによって判定した。ＩＧＦ−ＩＩ（１３４ｍＭ）は、最初に、泳動緩衝液中の最終濃度１、５、１０、２５、５０、７５、１００、２５０、および５００ｎＭに希釈した。各ＩＧＦ−ＩＩ濃度は、流速４０ｍｌ／分で２分間チップ上に注入し（すなわち、会合相）、その後、泳動緩衝液単独で２分間の注射（流速＝４０ｍｌ／分）を行った（すなわち、解離相）。表面は、流速１０ｍｌ／分で、１０ｍＭ  ＨＣｌの１０ｍｌ注射によって再生した。再生後、流速を４０ｍｌ／分に上昇させ、チップを次の注射の開始前に１分間平衡化させた。
【００８７】
同様に、ＧＩＬＴ標識ＧＡＡ構築物７０１は、Ｄｏｍ１０−１３組み換え受容体に対するその結合親和性のためにアッセイした。構築物は、泳動緩衝液中の最終濃度１、５、１０、２５、５０、７５、１００、２５０、および５００ｎＭに希釈し、ＩＧＦ−ＩＩに対し上述のように注入した。ＩＧＦ−ＩＩ濃度曲線を、ＧＩＬＴ標識ＧＡＡを構築後に、固定されたＤｏｍ１０−１３表面の完全性を試験するために、描いた。
【００８８】
平衡状態での反応の平均は、各検体濃度に対し判定し、結果として生じる平衡共鳴単位は、濃度に対しプロット化した。データは、ＢＩＡ評価（登録商標）ソフトウェア（バージョン４．１）を使用して、定常状態親和性モデルに適合させた。また、解離定数は、１：１結合等温モデルを使用して判定した。反応データはすべて、Ｍｙｓｚｋａ（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２３：３２５−３４０に記載されるように、二重参照され、バルク屈折率変化の寄与に対する対照（すなわち、泳動緩衝液の単独注射）を変異体Ｄｏｍ１０−１３によって固定された流動細胞と並行して行い、すべての結合センサグラムからサブトラクトした。図４Ａ−図４Ｂは、例示的な濃度曲線であって、ＣＩ−ＭＰＲに結合するＩＧＦ−ＩＩおよびＧＩＬＴ標識ＧＡＡＺＣ−７０１のＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）分析を示す。図４Ａは、ＩＧＦ−ＩＩの結合曲線を示す。図４Ｂは、ＧＩＬＴ標識ＧＡＡＺＣ−７０１の結合曲線を示す。両流動細胞対の結果（すなわち、ＦＣ２−１およびＦＣ４−３）を比較した（図４Ｂ）。
【００８９】
これらの実験結果は、ＧＩＬＴ標識ＧＡＡＺＣ−７０１が、ＣＩ−ＭＰＲに対し親和性を有し、ＩＧＦ−ＩＩの親和性の約０．８であることを示す（表１）。これらのデータは、ＧＩＬＴ標識ＧＡＡが、ＩＧＦ−ＩＩの親和性と比較して、ＣＩ−ＭＰＲに対し高親和性を有することを示す。ＣＩ−ＭＰＲに対するＩＧＦ−ＩＩの測定された親和性の絶対値は、２７ｎＭであったが、ＩＧＦ−ＩＩは、天然受容体よりも約１０倍低い親和性を有する受容体のドメイン１０−１３に結合することが、以前に文献に報告されていた。Ｌｉｎｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．Ｊｕｎ  ２９；２７６（２６）：２３９８６−９１。したがって、天然受容体に対するＧＩＬＴ標識ＧＡＡの結合親和性もまた、１０倍高いと予測される。
【００９０】
表１．
【００９１】
【表１】
2010509344.tif 000007
（実施例３）Ｎ−結合型オリゴ糖分析は、ＺＣ−７０１のＭ６Ｐ欠落を示唆
Ｎ−結合型オリゴ糖分析を行い、脱グリコシル化に続き、蛍光検出によるＨＰＬＣ分析の組み合わせを使用して、ＺＣ−７０１に対するオリゴ糖プロファイルを判定した（Ｂｌｕｅ  Ｓｔｒｅａｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。
【００９２】
糖タンパク質試料からのＮ−結合型炭水化物の開裂は、各試料に対しおよそ１００μｇのタンパク質を使用して、１：１００（酵素対基質）の比率でＮ−グリカナーゼによって行った。一旦放出させ、冷エタノールを使用してグリカンを抽出し、遠心分離によって乾燥させた。回収されたオリゴ糖は、シアノホウ水素化ナトリウムの存在下、かつ酸性条件下、２−アミノベンズアミド（２−ＡＢ）によって標識した。誘導体化ステップに続き、試料中に残った過剰染料および他の反応試薬は、Ｇｌｙｃｏｃｌｅａｎ（Ｒ）Ｓ試料濾過カートリッジ（Ｐｒｏｚｙｍｅ）によって除去した。
【００９３】
以下の条件を使用してＨＰＬＣ−ＦＬＤによるＮ結合型オリゴ糖の分析を行なった：移動相Ａ：６５％アセトニトリル／３５％移動Ｂ；移動相Ｂ：２５０ｍＭギ酸アンモニウム、ｐＨ４．４；検出：蛍光（Ｅｘ：３３０ｎｍ、Ｅｍ：４２０ｎｍ）；ＨＰＬＣ勾配。
【００９４】
クロマトグラフのピークを積分し、ピーク保持時間に基づいて、比較した。結果は、総ピーク面積当たりの各糖型の％面積として報告した。本分析から、ＺＣ−７０１上に存在する優勢オリゴ糖構造は、高マンノース構造であって、一部は複合鎖構造であることが判定された。しかしながら、マンノース−６−リン酸構造は検出されなかった。
【００９５】
（実施例４）取り込みアッセイは、ＺＣ−７０１表面上のＭ６Ｐの機能的欠如を実証
哺乳類細胞内への組み換えＧＡＡの取り込みは、ほとんどの哺乳類細胞型の表面上に存在するＣＩ−ＭＰＲとの相互作用によって媒介される。取り込みは、タンパク質表面のオリゴ糖上のＭ６Ｐの存在に依存する。
【００９６】
対照的に、ＺＣ−７０１は、タンパク質のＮ−末端におけるＩＧＦ−ＩＩ由来標識の存在によって、ＣＩ−ＭＰＲに対し高親和性を有する。種々の実験では、ＺＣ−７０１は、哺乳類細胞内への評価可能なＭ６Ｐ−依存性取り込みを示さず、ＺＣ−７０１表面上のＭ６Ｐの機能的欠如を実証することを示した。
【００９７】
細胞ベースの取り込みアッセイを行い、標的細胞に侵入するＧＩＬＴ標識または非標識ＧＡＡの能力を実証した。ラットＬ６筋芽細胞は、取り込み２４時間前に、２４−ウェルプレート内にウェル当たり密度１×１０５細胞で載置した。実験開始時、培地を細胞から除去し、２〜５００ｎＭの濃度の標識または非標識ＧＡＡを含有する０．５ｍｌの取り込み培地と交換した。取り込みの特異性を実証するために、いくつかのウェルは、さらに、競合剤Ｍ６Ｐ（５ｍＭ最終濃度）および／またはＩＧＦ−ＩＩ（１８μｇ／ｍｌ最終濃度）を含有した。１８時間後、培地を細胞から吸引し、細胞をＰＢＳで４回洗浄した。次いで、細胞は、２００μｌ  ＣｅｌＬｙｔｉｃ  Ｍ（登録商標）溶菌緩衝液によって溶解した。４ＭＵ基質を使用して、後述のように、ＧＡＡ活性に対し溶解物をアッセイした。タンパク質は、Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ（登録商標）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔを使用して判定した。
【００９８】
ＣＨＯ細胞中に産生したＺＣ−７０１の典型的取り込み実験結果は、図５に示される。図から分かるように、ラットＬ６筋芽細胞内へのＺＣ−７０１の取り込みは、事実上、Ｍ６Ｐの大量のモル過剰の添加によって影響を受けなかった一方、取り込みは、過剰ＩＧＦ−ＩＩによって、完全に抑制された。対照的に、ｗｔＧＡＡ（ＺＣ−６３５）の取り込みは、過剰Ｍ６Ｐの添加によって、完全に抑制されたが、事実上、ＩＧＦ−ＩＩとの競合によって影響を受けなかった。過剰Ｍ６Ｐによる抑制に対する哺乳類細胞内へのＣＨＯ−細胞産出ＺＣ−７０１取り込みの鈍感性は、ＣＨＯ細胞内に産出されたＺＣ−７０１表面上のＭ６Ｐの機能的欠如を示す。
【００９９】
（実施例５）ＧＩＬＴ標識ＧＡＡは、非標識ＧＡＡよりも効率的取り込みを示唆
図６は、精製されたＧＩＬＴ標識ＧＡＡ（ＺＣ−７０１）および野生型非標識ＧＡＡ（ＺＣ−６３５）のＬ６筋芽細胞内への取り込みの飽和曲線を示す。図示される実験では、ＧＩＬＴ標識ＧＡＡは、Ｋｕｐｔａｋｅ＝７ｎＭを有する一方、ｗｔ  ＧＡＡは、Ｋｕｐｔａｋｅ＝３５４ｎＭを有する。これは、ＧＩＬＴ標識ＧＡＡの有意に低いレベルは、非標識ＧＡＡと比較して、ＣＩ−ＭＰＲを介しての筋芽細胞内への最大取り込みを達成することが必要とされるため、ＧＩＬＴ標識ＧＡＡが非標識ＧＡＡよりも効率的取り込みを示すことを示唆する。
【０１００】
また、ＧＩＬＴ標識は、ＧＡＡの酵素活性に干渉しないことが示された。
【０１０１】
ＧＡＡＰＮＰアッセイ
ＧＡＡ酵素は、１００ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．２および１０ｍＭ  Ｐａｒａ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ（ＰＮＰ）α−グルコシド基質（Ｓｉｇｍａ  Ｎ１  ３７７）を含有する５０μｌ反応混合物中でインキュベートした。反応物は、３７℃で２０分間インキュベートし、３００μｌの１００ｍＭ炭酸ナトリウムで停止した。４０５ｎｍでの吸収度は、９６−ウェルマイクロタイタープレート内で測定し、ｐ−ニトロフェノール（Ｓｉｇｍａ  Ｎ７６６０）から派生した標準的曲線と比較した。１  ＧＡＡＰＮＰ単位は、１ｎモルＰＮＰ加水分解／時間として定義した。
【０１０２】
ＧＡＡ４ＭＵアッセイ
ＧＡＡ酵素は、１０ｍＭ  ４−メチルウンベリフェリルα−Ｄ−グルコシターゼ基質（Ｓｉｇｍａ、カタログ＃Ｍ−９７６６）を有する１２３ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ  ４．０を含有する２０μｌ反応混合物内でインキュベートした。反応物は、３７℃で１時間インキュベートし、２６７ｍＭ炭酸ナトリウム、４２７ｍＭグリシン、ｐＨ１０．７を含有する２００μｌの緩衝液で停止した。蛍光度は、９６−ウェルマイクロタイタープレート内で３５５ｎｍ励振および４６０ｎｍ濾過によって測定し、４−メチルウンベリフェロン（Ｓｉｇｍａ、カタログ＃Ｍ１３８１）から派生した標準的曲線と比較した。１  ＧＡＡ４ＭＵ単位は、１ｎモル４−メチルウンベリフェロン加水分解／時間として定義した。
【０１０３】
例示的なＧＩＬＴ標識ＧＡＡおよび野生型非標識ＧＡＡの特異的活性は、表２に示される。ＧＩＬＴ標識ＧＡＡの酵素活性は、非標識ＧＡＡと比較可能である。
【０１０４】
表２．ＧＩＬＴ標識ＧＡＡＺＣ−７０１および野生型非標識ＧＡＡに対する特異的活性およびＫｍ
【０１０５】
【表２】
2010509344.tif 000008
＊３製剤の判定の平均
＊＊２製剤の判定の平均
（実施例６）ラットＬ６筋芽細胞内のＧＡＡの半減期
取り込み実験は、上述のように（実施例４参照）、ラットＬ６筋芽細胞内のＧＩＬＴ標識ＧＡＡおよび非標識ＧＡＡによって行った。１８時間後、酵素を含有する培地を細胞から吸引し、細胞をＰＢＳで４回洗浄した。この時、複製ウェルを溶解し（時間０）、溶解物を−８０で凍結した。その後毎日、複製ウェルを溶解し、分析のために保存した。１４日後、すべての溶解物をＧＡＡ活性に対しアッセイした。データは、一次減衰式：Ｉｎ  Ｃｔ＝−ｋｔ＋ＩｎＣ0（式中、Ｃは化合物の濃度、ｔは１時間単位による時間、およびｋは一次速度定数）に従って、プロット化した。図７は、例示的なグラフであって、ラットＬ６筋芽細胞内のＧＩＬＴ標識ＧＡＡＺＣ−７０１および野生型非標識ＧＡＡ（ＺＣ−６３５）の半減期を示す。図７に示される結果は、標識および非標識タンパク質が、それぞれ、６．５および６．７日に非常に類似した半減期を有することを示す。これは、細胞内に入ると、ＧＩＬＴ標識酵素が、非標識ＧＡＡに対し類似動態に固執することを示唆する。
【０１０６】
（実施例７）取り込み後のＧＡＡの処理
哺乳類ＧＡＡは、典型的には、Ｍｏｒｅｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，２８０：６７８０−６７９１およびその中に含まれる参照文献に記載されるように、リソソーム内で連続的タンパク質分解処理を受ける。処理されたタンパク質は、７０ｋＤａ、２０ｋＤａ、１０ｋＤａ、およびいくつかの小ペプチドのペプチドパターンを生じさせる。ＧＩＬＴ標識ＧＡＡが、非標識ＧＡＡと同様に処理されるかどうかを判定するために、前述の取り込み実験からの溶解物のアリコートをウエスタンブロットによって分析した。図８Ａ−Ｂは、ラットＬ６筋芽細胞内への取り込み後のＧＩＬＴ標識ＧＡＡのタンパク質分解処理を示す、ウエスタンブロットである。図８Ａは、ＩＧＦ−ＩＩ標識によって７０ｋＤａ  ＩＧＦ−ＩＩペプチドおよびより大きな中間体を認識する、モノクローナル抗体によって同定されるペプチドのパターンを示す、ウエスタンブロットである。図８Ａに示される結果は、取り込み直後のＧＩＬＴ標識の損失を示す。図８Ｂは、７０ｋＤａペプチドおよびより大きな中間体を認識する、モノクローナル抗体によって同定された取り込み後の７６ｋＤａおよび７０ｋＤａ種内への野生型およびＧＩＬＴ標識ＧＡＡの処理を示す、ウエスタンブロットである。本実験において同定されるポリペプチドのプロファイルは、事実上、標識および非標識酵素の両方と同等であった。これは、細胞内に侵入すると、ＧＩＬＴ標識は失われ、ＧＩＬＴ標識ＧＡＡは、非標識ＧＡＡと同様に処理されることを示唆する。したがって、ＧＩＬＴ標識は、細胞内に入ると、ＧＡＡの挙動に影響をほとんど及ぼさない、または全く及ぼさない可能性がある。
【０１０７】
（実施例８）薬物動態
異なる培養条件の下産出されるＧＩＬＴ標識ＧＡＡの薬物動態は、野生型１２９マウスにおいて測定した。ＧＩＬＴ標識ＧＡＡＺＣ−７０１は、３つの異なる培養条件下で産出した。３つの群の１２９匹のマウスに、３つの代替培地で成長させた細胞の培養上清から精製された１０ｍｇ／ｋｇ  ＺＣ−７０１の一回の投与によって、頸静脈に注射した。血清試料は、注射前、注射後１５分、３０分、４５分、６０分、９０分、１２０分、４時間、および８時間に採取した。その後、動物を屠殺した。血清試料は、定量的ウエスタンブロットによってアッセイした。データは、一次減衰式：Ｉｎ  Ｃｔ＝−ｋｔ＋ＩｎＣ0（式中、Ｃは化合物の濃度、ｔは１時間単位の時間、およびｋは一次速度定数）に従って、プロット化した。半減期は、図９に示されるログプロットの線形部分から求めた。ＧＩＬＴ標識ＧＡＡタンパク質の半減期：赤線、ＰＦ−ＣＨＯ、ｔｌ／２＝４３分；橙線、ＣＤＭ４、ｔｌ／２＝３８分；緑線、ＣＤ１７、ｔｌ／２＝５２分。これらの結果に基づくと、ＣＤ１７培地内で産出されるタンパク質は、最も有益な半減期を有する。これらの結果は、ＧＩＬＴ標識ＧＡＡが、循環から過度に急速に消失しないことを示唆する。
【０１０８】
（実施例９）ＧＡＡの組織半減期
本実験の目的は、酵素がその標的組織に達すると、ＧＩＬＴ標識ＧＡＡ活性が損失される比率を判定することであった。ポンペ病マウスモデルでは、Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）は、種々の筋組織において、約６−７日の組織半減期を有すると考えられる（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓの出願番号第１２５１４１／０）。
【０１０９】
ポンペ病マウス（Ｒａｂｅｎ（１９９８）ＪＢＣ．  ２７３：１９０８６−１９０９２に記載され、その開示は、参照することによって本明細書に組み込まれる、ポンペ病マウスモデル６ｎｅｏ／６ｎｅｏ）は、非標識ＧＡＡ（ＺＣ−６３５）、またはＧＩＬＴ標識ＧＡＡＺＣ−７０１、あるいはＧＩＬＴ標識ＧＡＡＺＣ−１０２６のいずれか１０ｍｇ／ｋｇを頸静脈に注射された。その後、注射後１、５、１０、および１５日に、マウスは屠殺された。組織試料を均質化し、標準的手順に従って、ＧＡＡ活性を測定した。ＧＩＬＴ標識ＧＡＡＺＣ−７０１およびＺＣ−１０２６、ならびに非標識ＧＡＡＺＣ−６３５の組織半減期を異なる組織における減衰曲線から計算した（図１０Ａ、大腿四頭筋組織、図１０Ｂ、心組織、図１０Ｃ、隔膜組織、図１０Ｄ、肝組織）。計算された半減期値は、表３に要約される。
【０１１０】
非標識タンパク質（ＺＣ−６３５）の組織半減期は、異なる組織において９．１から３．９日の範囲であった一方、ＧＩＬＴ標識ＧＡＡＺＣ−７０１の半減期は、異なる組織において８．５から７．４日の範囲であった（表３）。これらの範囲は、有意差よりも、比較的小試料サイズ（点当たり３匹の動物）による統計的変動を反映している可能性がある。
【０１１１】
比較のため、図９に示される減衰曲線から計算したＺＣ−７０１および非標識野生型ＧＡＡ（ＺＣ−６３５）に対するラットＬ６筋芽細胞における半減期は、それぞれ、６．５および６．７日であった。
【０１１２】
表３．種々の組織における標識および非標識ＧＡＡの組織半減期
【０１１３】
【表３】
2010509344.tif 000009
これらのデータは、ポンペ病マウス内の細胞内に入ると、ＧＩＬＴ標識ＧＡＡは、非標識ＧＡＡと類似の動態に固執すると考えられることを示唆する。さらに、ＧＩＬＴ標識ＧＡＡの減衰動態の知識は、適切な投与間隔のデザインに役立ち得る。
【０１１４】
（実施例１０）Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞のリソソーム内へのＧＩＬＴ標識ＧＡＡの取り込み
Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞をポリ−リジンでコーティングされた細胞（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上に成長させ、５％  ＣＯ２中３７℃で、１００ｎＭ  ＧＩＬＴ標識ＧＡＡの存在（パネルＡ）または非存在（パネルＢ）下、１８時間インキュベートした。次いで、細胞を成長培地内で１時間インキュベートし、その後、室温で１５分間、メタノールで凝固させる前に、Ｄ−ＰＢＳで４回洗浄した。以降のインキュベーションはすべて、室温で行い、それぞれ、Ｄ−ＰＢＳ内での３回の洗浄によって分離した。インキュベーションは、記載がない限り、１時間とした。スライドは、１５分間、０．１％トリトンＸ−１００によって透過性化し、次いで、阻止緩衝液（Ｄ−ＰＢＳ中１０％加熱不活性化ウマ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））で阻止した。スライドは、一次マウスモノクローナル抗ＧＡＡ抗体３Ａ６−１Ｆ２（阻止緩衝液中１：５，０００）によって、次いで、二次ウサギ抗マウスＩｇＧ  ＡＦ５９４共役抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ａｌ１０３２、阻止緩衝液中１：２００）によって、インキュベートした。次いで、ＦＩＴＣ−共役ラット抗マウスＬＡＭＰ−Ｉ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  ５５３７９３、阻止緩衝液中１：５０）をインキュベートした。スライドは、ＤＡＰＩ−含有装填液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で装填し、フルオレセインイソチオシアネート、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、およびＤＡＰＩフィルタ（Ｃｈｒｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を備えたＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ８０ｉ顕微鏡で観察した。画像は、ＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウェア（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ）によって制御される光度Ｃａｓｃａｄｅカメラで撮影した。画像は、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェア（Ａｄｏｂｅ）を使用して、統合した。図１１は、リソソームマーカーＬＡＭＰｌに対し誘導される抗体によって検出されたシグナルを有する、抗ＧＡＡ抗体によって検出されるシグナルの共局在化を示す。したがって、本結果は、ＧＩＬＴ標識ＧＡＡがリソソームに送達されることを実証する。
【０１１５】
（実施例１１）体内グリコーゲンのクリアランス
本実験の目的は、グリコーゲンが、ポンペ病マウス内へのＧＩＬＴ標識ＧＡＡまたはｗｔ  ＧＡＡの一回のＩＶ注射後、心組織から消失する比率を判定することであった。
【０１１６】
ポンペ病マウス（Ｒａｂｅｎ（１９９８）ＪＢＣ，２７３：１９０８６−１９０９２に記載され、その開示は、参照することによって本明細書に組み込まれる、ポンペ病マウスモデル６ｎｅｏ／６ｎｅｏ）に、非標識ＧＡＡ（ＺＣ−６３５）、またはＧＩＬＴ標識ＧＡＡ（ＺＣ−７０１）のいずれか１０ｍｇ／ｋｇを頸静脈に注射した。その後、マウスは、注射後１、５、１０、および１５日に屠殺された。各データ点は、３匹のマウスの平均を表す。心組織試料を標準的手順に従って均質化し、グリコーゲン含有量を分析した。これらの組織ホモジネート内のグリコーゲン含有量は、本質的に、Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．，３８９：６１９−６２８に記載のように、Ａ．ｎｉｇｅｒアミログルコシダーゼおよびＡｍｐｌｅｘ（登録商標）  Ｒｅｄ  Ｇｌｕｃｏｓｅアッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して測定した。図１２に示される結果は、ＺＣ−７０１で処理されたマウスからの心組織は、グリコーゲンのほぼ完全なクリアランスを示した一方、ｗｔ  ＧＡＡで処理されたマウスは、グリコーゲン含有量の小量の変化のみを示したことを示唆する。
【０１１７】
（実施例１２）ポンペ病病理の反転
本発明の治療的融合タンパク質は、体内ｗｔ  ＧＡＡよりも治療上より有効であることが示された。ポンペ病マウス内の骨格筋組織からグリコーゲンを消失させるＺＣ−７０１およびｗｔ  ＧＡＡの能力を比較するため、研究が行われた。ポンペ病マウスモデル６ｎｅｏ／６ｎｅｏ動物を使用した（Ｒａｂｅｎ（１９９８）ＪＢＣ  ２７３：１９０８６−１９０９２）。ポンペ病マウス群（５／群）は、２用量のｗｔ  ＧＡＡあるいはＺＣ−７０１（５ｍｇ／ｋｇまたは２０ｍｇ／ｋｇ）、もしくは媒介物のうちの１つのＩＶ注射を週４回受けた。５匹の未処理動物を対照として使用し、生理食塩水溶液の注射を週４回受けた。動物は、２、３、および４回目の注射１時間前に、経口ジフェンヒドラミン５ｍｇ／ｋｇを受けた。本研究におけるポンペ病ノックアウトマウスは、耐性化させるために、動物が生後４８時間未満である場合、２５μｇのＺＣ−７０１を首筋に皮下注射された。マウスは、４回目の注射から１週間後に屠殺され、組織（横隔膜、心臓、肺、肝臓、ヒラメ筋、大腿四頭筋、腓腹筋、ＴＡ、ＥＤＬ、舌）を組織学的および生化学的分析のために採取した。組織ホモジネート内のグリコーゲン含有量は、Ａ．  ｎｉｇｅｒアミログルコシダーゼおよびＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ  Ｇｌｕｃｏｓｅアッセイキットを使用して測定した。研究デザインは、表４に要約される。
表４
【０１１８】
【表４】
2010509344.tif 000010
異なる組織ホモジネート内のＧＡＡ酵素レベルは、標準的手順を使用して測定し、結果は、表５に要約される。
【０１１９】
表５．組織内のＧＡＡレベル
【０１２０】
【表５−１】
2010509344.tif 000011
【０１２１】
【表５−２】
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これらの組織ホモジネート内のグリコーゲン含有量は、本質的に、Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．，３８９：６１９−６２８に記載されるように、Ａ．  ｎｉｇｅｒ  アミログルコシダーゼおよびＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ  Ｇｌｕｃｏｓｅアッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して測定した。グリコーゲンデータは、図１３Ａ−Ｈに記載される。図１３Ａ−Ｈで使用されるように、ＧＡＡ５は、用量５ｍｇ／ｋｇにおける非標識ＧＡＡを示し、ＧＡＡ２０は、用量２０ｍｇ／ｋｇにおける非標識ＧＡＡを示し、７０１  ５は、用量５ｍｇ／ｋｇにおけるＧＩＬＴ標識ＧＡＡＺＣ−７０１を示し、７０１  ２０は、用量２０ｍｇ／ｋｇにおけるＧＩＬＴ標識ＧＡＡＺＣ−７０１を示す。ＰＢＳは、対照として使用した。これらの結果は、種々の筋組織からグリコーゲンを消失させるその能力において、非標識ＧＡＡ（ＺＣ−６３５）と比較して、ＧＩＬＴ標識ＧＡＡ（ＺＣ−７０１）の消失優位性を示唆する。具体的には、ＺＣ−７０１は、複数の骨格筋組織からグリコーゲンンを消失させるその能力において、ｗｔ  ＧＡＡよりも有意に有効であった。いずれかの用量でｗｔ  ＧＡＡを受けたポンペ病マウスは、ＰＢＳ処理動物におけるグリコーゲンレベルと異なるグリコーゲンレベルを有していた。対照的に、ＺＣ−７０１を受けた動物は、有意に低いレベルのグリコーゲンを示した。
【０１２２】
（実施例１３）対象の投与量、投与間隔、および年齢の最適化
投与量
前述の実験では、用量５ｍｇ／ｋｇは、いくつかの組織において、グリコーゲン消失の際、用量２０ｍｇ／ｋｇとほぼ同程度に有効であった。用量漸増実験を使用して、ヒト患者を治療する際に、治療上十分となり得る最小有効用量を判定する。群当たり５から７匹の耐性化されたポンペ病ノックアウトマウスに、異なる用量のＧＩＬＴ標識ＧＡＡを毎週注射する。例えば、耐性化されたポンペ病マウスは、１．０、１．５、２、２．５、５、１０、２０ｍｇ／ｋｇで注射する。
【０１２３】
ポンペ病ノックアウトマウスに、８週間注射し、その後、屠殺する。試料は、異なる組織から採取し、実施例１１および１２に記載されるように、グリコーゲンレベルを判定する。また、グリコーゲンおよび酵素分布の組織化学を標準的手順に従って判定する。さらに、気圧全身プレチスモグラフィを使用した、筋力測定および高炭酸ガスに対する喚起等の生理学的測定値は、Ｍａｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ（オンライン刊行物）によって記載されるように、マウスにおいて判定可能である。
【０１２４】
間隔
さらに、治療間隔が評価され、依然として臨床的有益性をもたらす所与の用量の最大間隔が判定される。用量漸増は、上述のように、異なる治療間隔、例えば、２、３、または４週間毎の注射によって行われる。例えば、ヒラメ筋または大腿四頭筋等の骨格筋組織内のグリコーゲンクリアランスは、典型的には、マウスモデルにおける用量と治療間隔との間の最適均衡を判定するための指標として使用される。上述のような他の臨床的関連測定値も、同様に使用可能である。
【０１２５】
例えば、一実験は、ポンペ病マウスモデルにおけるその有効性について、ＧＩＬＴ標識ＧＡＡの可変投与間隔の効果を検査するように設計される。２−３ヶ月齢のポンペ病マウス（Ｒａｂｅｎ  ＪＢＣ  １９９８  ２７３：１９０８６−１９０９２）は、８匹の動物群に分割される。ある群は、ＰＢＳの注射を毎週受け（対照群）、ある群は、５ｍｇ／ｋｇ  ＧＩＬＴ標識ＧＡＡの注射を毎週受け、ある群は、１０ｍｇ／ｋｇ  ＧＩＬＴ標識ＧＡＡの注射を隔週受け、ある群は、１５ｍｇ／ｋｇ  ＧＩＬＴ−標識ＧＡＡの注射を３週間毎に受け、ある群は、２０ｍｇ／ｋｇ  ＧＩＬＴ標識ＧＡＡの注射を４週間毎に受ける。１２週目の注射から１週間後、すべての動物は屠殺される。分析のために採取された組織試料は、心臓、ヒラメ筋、腓腹筋、ＥＤＬ、ＴＡ、大腿四頭筋、腰筋、横隔膜、脳、舌を含む。
【０１２６】
分析は、生化学的グリコーゲン分析、グリコーゲンのための組織化学的染色、選択組織のＥＭ、選択組織の免疫染色、ＥＬＩＳＡによる抗体のための血清試料の分析、ヒラメ筋の体外力−収縮頻度測定、研究の生存部分期間における尿中グルコース四糖類分析、治療計画前後のグリコーゲン含有量の１３Ｃ  ＮＭＲ分光判定を含む。
【０１２７】
用量および間隔が変動する条件のマトリクスは、これらのパラメータ間の関係の理解を深めるために生成され得る。
【０１２８】
より高用量での投与の間隔がより長い程、有効であることが証明され、それによって、ポンペ病に罹患する人々のために、より負担の少ない治療計画のための理論的根拠を提供され得ることが予測される。例えば、図１３Ａ〜Ｈに示されるグリコーゲンデータに基づくと、用量５ｍｇ／ｋｇの毎週の投与は、１０ｍｇ／ｋｇの隔週投与または２０ｍｇ／ｋｇの３週間毎の投与と同様の結果をもたらすことが予測される。したがって、２週間毎に１回の代わりに、３週間または４週間毎に１回のＧＩＬＴ標識ＧＡＡの注入は、ヒトポンペ病患者における治療的効果を達成するために十分であることが予測される。より長い治療間隔は、少なくとも、患者の負担および不便さを軽減するため、非常に有利である。
【０１２９】
対象の年齢
治療開始時のマウスの年齢が、治療的転帰に及ぼす影響を判定する。ポンペ病マウスＩＩ型筋線維において、外因性酵素のリソソームへの送達を含み、正常な輸送経路に干渉する自食胞が、経時的に形成されることが報告されている。Ｆｕｋｕｄａ  ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒａｐｙ，１４（６）：８３１−８３９；Ｆｕｋｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，５９（４）：７００−７０８；Ｆｕｋｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ａｕｔｏｐｈａｇｙ．２（４）：３１８−３２０を参照されたい。科学者らは、それぞれ２つのＭ６Ｐを含有する最大６つの化学的にカップリングされた合成オリゴ糖を有する組み換えＧＡＡであるネオ−ｒｈＧＡＡが、１３ヶ月齢のポンペ病ノックアウトマウスからグリコーゲンを完全に消失可能であることを示した。Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ，（２００５）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．，３８９：６１９−６２８。これは、ＣＩ−ＭＰＲに対する高親和性を有する酵素が使用される場合、Ｆｕｋｕｄａらによって報告された細胞病理が、反転し得ることを示唆する。ＣＩ−ＭＰＲに対するＧＩＬＴ標識ＧＡＡの高親和性と、非標識ＧＡＡよりも効率的筋肉細胞への送達とを仮定すると、十分なＧＩＬＴ標識ＧＡＡ酵素がリソソームに送達され、グリコーゲンを消失させ、続いて、自食胞構築を反転し得ることが想定される。これは、１２−１３ヶ月齢のポンペ病マウスにおいて直接試験される。これらのマウスは、２０または４０ｍｇ／ｋｇ  ＧＩＬＴ標識ＧＡＡの注射を毎週４回受け、最終注射から１週間後に屠殺される。グリコーゲン含有量は、本質的に、Ｚｈｕら（２００５）に記載されるＡ．ｎｉｇｅｒアミログルコシダーゼおよびＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ  Ｇｌｕｃｏｓｅアッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して査定される。また、グリコーゲンは、Ｌｙｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ，（２００５）Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．，５３：６３−７３によって記載される組織化学的染色によって査定される。
【０１３０】
さらに、アッセイが行われ、自食胞構築を有する動物から分離された無傷筋線維内へのＧＩＬＴ標識ＧＡＡの取り込みを分析し、非標識ＧＡＡと比較して、Ｆｕｋｕｄａらによって記載されるそのような条件下、リソソームを標的化するＧＩＬＴ標識ＧＡＡの能力を直接比較する。ＧＩＬＴ標識ＧＡＡは、非標識酵素より効率的に自食胞構築を有する筋線維を標的化することが予測される。
【０１３１】
実験１４：ヒト臨床研究
動物治療の成功に基づき、小児ポンペ病患者における６ヶ月の第１相／第２相ＧＩＬＴ標識ＧＡＡ投与量決定研究をデザインする。本臨床研究は、非盲検実証ヒト研究であって、小児発症ポンペ病患者におけるＧＩＬＴ標識ＧＡＡの安全性、耐性、有効性、および薬物動態を評価するために行われる。本研究では、一般的治療間隔は、２週間毎に１回（隔週）である。特定用量において、治療間隔が３または４週間毎に１回である追加治療群が追加されることが、予測される。
【０１３２】
臨床研究の主要目的は、小児発症ポンペ病患者を治療する際に、２週間毎に静脈内注入によって投与される４つの用量レベル、すなわち、２．５、５、１０、および２０ｍｇ／ｋｇのＧＩＬＴ標識ＧＡＡの有効性を判定することを含む。副次的目的は、（１）小児発症ポンペ病患者を治療する際に、２週間毎に静脈内注入によって投与される４つの異なる用量レベルのＧＩＬＴ標識ＧＡＡの安全性および薬物動態を評価すること、（２）小児発症ポンペ病患者を治療する際に、２週間毎に静脈内注入によって投与される４つの用量レベルのＧＩＬＴ−ＧＡＡの薬物動態を判定すること、（３）２週間毎に静脈内注入によって投与される４つの用量レベルのＧＩＬＴ−ＧＡＡのそれぞれの小児発症ポンペ病患者における筋肉グリコーゲンの存在に及ぼす影響を判定することを含む。本臨床研究の詳細なプロトコル概要は、表６に示される。
【０１３３】
表６．ヒト臨床研究
【０１３４】
【表６−１】
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【０１３５】
【表６−２】
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【０１３６】
【表６−３】
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図１４は、臨床研究手順の詳細な工程図を示す。
【０１３７】
さらに、患者を耐性化または免疫学的に抑制するステップを含むことが望ましい。他のリソソーム酵素補充療法の臨床研究では、多くの患者が、ＧＡＡに対する抗体の高力価を産出することが観察された。例えば、本現象は、Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）を摂取しているゴーシェ病患者に認められる。その場合、大部分の患者は、治療計画に応じて、自然に耐性化され、抗体の産出を停止する。理論に制約されることを所望するものではないが、抗ＧＡＡ抗体は、ＣＩ−ＭＰＲに対する酵素の標的化に干渉し、それによって、酵素の生体内分布を変化させると考えられる。耐性化計画の１つは、ＧＩＬＴ標識ＧＡＡ治療の前またはその間に、ＣＤ２０に対するモノクローナル抗体であるＲｉｔｕｘｉｍａｂ（登録商標）によって、ポンペ病患者を治療することである。ポンペ病患者に使用されるＲｉｔｕｘｉｍａｂ（登録商標）の用量は、Ｓｐｅｒｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ．Ｊａｎ；９２（１）：６６−７１において教示され、参照することによって本明細書に組み込まれるように、いくつかの自己免疫疾患を治療する際に使用されるものと同様である。また、本化合物は、ステロイド等の他の免疫抑制薬剤と併用しても使用可能である。
【０１３８】
ＧＩＬＴ標識ＧＡＡによって治療されるポンペ病患者は、生検物質の組織化学的染色に基づいて、１０〜１２週間後のグリコーゲンの有意なクリアランスを実証することが予測される。Ｔｈｕｒｂｅｒｇらは、一連の微細構造の損傷に基づいて、ポンペ病を５段階の細胞病理に分類することを発明した。Ｔｈｕｒｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８６：１２０８−１２２０。例えば、早期疾患段階１細胞は、無傷筋細線維間に小グリコーゲン充填リソソームを含有する。段階３細胞は、リソソーム膜の破裂によって、細胞質に漏出する多量のグリコーゲンとともに、多数のグリコーゲン充填リソソームを含有する。これらの段階は、Ｆｕｋａｄａらに記載される自食胞蓄積と相関すると考えられる。治療の開始時の研究における患者の細胞病理の分析は、臨床的転帰を示すと予測される。概して、応答患者は、より重度の形態の細胞病理とともに、低率の筋細胞を有する。特に、５０％を上回る段階２の筋細胞を有する患者は、より優れた臨床転帰を有する。また、より若年の患者は、概して、より優れた臨床転帰を有し、より高率のＩ型筋線維を有する患者もまた、より優れた臨床転帰を有すると想定される。
【０１３９】
細胞病理の重症度を変化させる要因は、患者のＧＡＡ対立遺伝子の性質、治療開始時の患者の年齢、および患者の免疫反応による、患者内の残留ＧＡＡ活性の存在を含む。例えば、ＧＩＬＴ標識ＧＡＡに対する抗体反応は、ＣＲＩＭ−陰性患者において、より重症である。
【０１４０】
初期の動物実験の結果に基づいて、ＧＩＬＴ標識ＧＡＡは、ヒト患者の治療における非標識ＧＡＡよりも有効であると予測される。同様の用量を仮定する場合、酵素補充療法の開始時に、所与のレベル細胞病理を有する患者のより高い留分は、ＧＩＬＴ標識ＧＡＡ療法に対し有利に反応することが予測される。例えば、Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）の中枢となる臨床試験では、１８名中１２名の患者が、５２週目時点で、２０％を上回る筋肉グリコーゲンの低下を示した。しかしながら、１８名中わずか３名の患者は、５０％以上のグリコーゲン含有量の低下を経験した。Ｋｉｓｈｎａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．６８：９９−１０９。動物データおよびＺｈｕらの報告に基づくと、ＧＩＬＴ標識ＧＡＡは、ほとんどの患者において、８０％のグリコーゲン含有量の低下をもたらすと予測される。ＧＩＬＴ標識ＧＡＡによって治療された患者のより多い留分は、運動機能、呼吸等の生理学的パラメータにおいて改善を示すことが予測され、より多くの患者が、療法開始後１、２、および５年生存することが予測される。
【０１４１】
また、筋細胞のより進行した細胞病理を有する、酵素補充療法を開始した患者、例えば、療法開始時、６ヶ月を上回る年齢の患者は、筋肉グリコーゲンの有意な減少、呼吸器能、運動機能の改善、およびＧＩＬＴ標識ＧＡＡ酵素補充療法に基づくより優れた、かつ長期の転帰を有することが予測される。
【０１４２】
参照文献の援用
本出願に引用されるすべての刊行物および特許文書は、各個別の刊行物および特許文書が本明細書に組み込まれる場合と同様に、参照することによって、全体として本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１３Ｇ】
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【図１３Ｈ】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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