(57)【要約】  本発明は、免疫刺激性ＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＯＲＮ）に関する。特に、ＯＲＮは、３’ポリＧモチーフ、および任意選択により５’ポリＧモチーフが直接的または間接的に隣接する免疫刺激性ＯＲＮモチーフを有する。本発明はまた、治療方法およびスクリーニング方法を含む方法およびＯＲＮを使用するための関連キットに関する。2010507386.tif 000011
2010507386.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＧ（Ｒ１）ｎ（Ｕ）４〜２０（Ｒ２）ｍＧＧＧＧ（配列番号２９）［式中、Ｒ１およびＲ２は、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド、スペーサーまたは非ヌクレオチドリンカーであり、Ｕは、ウリジンまたはその誘導体であり、Ｇは、グアノシンであり、ｎ＝０〜２０、ｍ＝０〜２０である］を含む、１０〜１００個のリボヌクレオチドの長さのＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＯＲＮ）。
【請求項２】
５’ＧＧＧＧＵＵＵＵＧＧＧＧＧ３’（配列番号３３）または５’ＧＧＧＧＵＵＵＵＧＧＧＧ３’（配列番号３４）でない、請求項１に記載のＯＲＮ。
【請求項３】
ＧＧ（Ｒ１）ｎ（Ｕ）５〜２０（Ｒ２）ｍＧＧＧＧ（配列番号３０）［式中、Ｒ１およびＲ２は、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド、スペーサーまたは非ヌクレオチドリンカーであり、Ｕは、ウリジンまたはその誘導体であり、Ｇは、グアノシンであり、ｎ＝０〜２０、ｍ＝０〜２０である］を含む、１０〜１００個のリボヌクレオチドの長さのＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＯＲＮ）。
【請求項４】
ＧＧ（Ｒ１）ｎ（Ｕ）４（Ｒ２）ｍＧＧＧＧ（配列番号３１）［式中、Ｒ１およびＲ２は、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド、スペーサーまたは非ヌクレオチドリンカーであり、Ｕは、ウリジンまたはその誘導体であり、Ｇは、グアノシンであり、ｎ＝０〜２０、ｍ＝０〜２０であり、ここで、（Ｒ１）ｎがＧＧである場合、（Ｒ２）ｍはＧではないか、ｍ＝０ではない］を含む、１０〜１００個のリボヌクレオチドの長さのＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＯＲＮ）。
【請求項５】
ＧＧ（Ｒ１）ｎ（Ｕ）４〜２０（Ｒ２）ｍＧＧＧＧ（配列番号２９）［式中、Ｒ１およびＲ２は、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド、スペーサーまたは非ヌクレオチドリンカーであり、Ｕは、ウリジンまたはその誘導体であり、Ｇは、グアノシンであり、ｎ＝０〜２０、ｍ＝０〜２０である］を含み
【化１】
2010507386.tif 000008
［式中、
Ｒ１は、水素（Ｈ）、ＣＯＯＲ、ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ６Ｈ５または（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｒ２であり、ここで、Ｒは、Ｈまたはメチル、ブチル、メトキシエチル、ピバロイルオキシメチル、ピバロイルオキシベンジルまたはＳ−ピバロイルチオエチルであり、Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルまたはＣ２〜Ｃ１８アシルであり、ｍは、１〜１７であり、
Ｘは、酸素（Ｏ）または硫黄（Ｓ）であり、
ＮｕおよびＮｕ’は各々独立に、ヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体であり、
ただし、Ｒ１がＨである場合、ＸはＳである］、
【化２】
2010507386.tif 000009
［式中、
Ｘは、ＯまたはＳであり、
Ｘ１は、ＯＨ、ＳＨ、ＢＨ３、ＯＲ３またはＮＨＲ３であり、ここで、Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルであり、
Ｘ２およびＸ３は各々独立に、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２またはＣＦ２であり、
ＮｕおよびＮｕ’は各々独立に、ヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体であり、
ただし、
（ａ）Ｘ、Ｘ２およびＸ３のうち少なくとも１つはＯではない、またはＸ１はＯＨではなく、
（ｂ）Ｘ１がＳＨである場合、Ｘ、Ｘ２およびＸ３のうち少なくとも１つはＯではなく、
（ｃ）ＸおよびＸ２がＯであり、Ｘ１がＯＨである場合、Ｘ３はＳではなく、Ｎｕは３’Ｎｕであり、Ｎｕ’は５’Ｎｕ’であり、
（ｄ）Ｘ１がＢＨ３である場合、Ｘ、Ｘ２またはＸ３のうち少なくとも１つはＳである］および
（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の任意の組合せ
からなる群から選択される修飾されたリン酸結合を含まず、
式ＩＩＩＡもしくは式ＩＩＩＢとして示される少なくとも１つのヌクレオチド類似体
【化３】
2010507386.tif 000010
［式中、
Ｒ４は、ＨまたはＯＲであり、ここで、Ｒは、ＨまたはＣ１〜Ｃ１８アシルであり、
Ｂは、核酸塩基、修飾された核酸塩基またはＨであり、
ＸおよびＸ５は各々独立に、ＯまたはＳであり、
Ｘ４は、ＯＨ、ＳＨ、メチルまたはＮＨＲ５であり、ここで、Ｒ５は、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルであり、
破線は各々独立に、隣接する単位、水素または有機基との任意選択の結合を表し、
ただし、ＸおよびＸ５の少なくとも一方はＯではない、またはＸ４はＯＨではない］
を含まない、１０〜１００個のリボヌクレオチドの長さのＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＯＲＮ）。
【請求項６】
５’ＧＧＧＵＵＵＵ３’モチーフを含まない、請求項１に記載のＯＲＮ。
【請求項７】
滅菌担体をさらに含む、請求項１に記載のＯＲＮ。
【請求項８】
脂質担体とともに製剤される、請求項１に記載のＯＲＮ。
【請求項９】
一本鎖である、請求項１に記載のＯＲＮ。
【請求項１０】
ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドではない、請求項１に記載のＯＲＮ。
【請求項１１】
少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含む、請求項１に記載のＯＲＮ。
【請求項１２】
ＯＲＮのすべてのヌクレオチド間結合が、ホスホロチオエート結合である、請求項１に記載のＯＲＮ。
【請求項１３】
少なくとも１つのホスホジエステル様結合を含む、請求項１に記載のＯＲＮ。
【請求項１４】
ホスホジエステル様結合が、ホスホジエステル結合である、請求項１３に記載のＯＲＮ。
【請求項１５】
少なくとも１つの５’−５’ヌクレオチド間結合をさらに含む、請求項１に記載のＯＲＮ。
【請求項１６】
５’−５’ヌクレオチド間結合が、リンカーを含む、請求項１５に記載のＯＲＮ。
【請求項１７】
少なくとも１つの３’−３’ヌクレオチド間結合をさらに含む、請求項１に記載のＯＲＮ。
【請求項１８】
３’−３’ヌクレオチド間結合が、リンカーを含む、請求項１７に記載のＯＲＮ。
【請求項１９】
２’−Ｏ−アルキル修飾、２−フルオロ−アラビノ修飾、またはＬＮＡ修飾された少なくとも１つのＧをさらに含む、請求項１に記載のＯＲＮ。
【請求項２０】
ＣＧジヌクレオチドを含まない、請求項１に記載のＯＲＮ。
【請求項２１】
少なくとも１つのメチル化されていないＣｐＧジヌクレオチドを含む、請求項１に記載のＯＲＮ。
【請求項２２】
少なくとも２つの隣接する水素結合した塩基対によって提供される、二次構造を形成できる、ヌクレオシド、ヌクレオシド類似体またはヌクレオシドとヌクレオシド類似体の組合せの配列を含む、請求項１に記載のＯＲＮ。
【請求項２３】
二次構造が、ステムループ二次構造である、請求項２２に記載のＯＲＮ。
【請求項２４】
（Ｒ１）ｎが、ＧＧである、請求項１に記載のＯＲＮ。
【請求項２５】
（Ｒ２）ｍが、ＧＧＧである、請求項１に記載のＯＲＮ。
【請求項２６】
（Ｕ）４〜２０が、ＵＵＵＵＵである、請求項１に記載のＯＲＮ。
【請求項２７】
（Ｕ）４〜２０が、ＵＵＵＵＵＵＵである、請求項１に記載のＯＲＮ。
【請求項２８】
（Ｕ）４〜２０が、ＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号３２）である、請求項１に記載のＯＲＮ。
【請求項２９】
ＧＧおよび（Ｒ１）ｎが、直接接続している、請求項１に記載のＯＲＮ。
【請求項３０】
ＧＧおよび（Ｒ１）ｎが、３’−３’結合を介して接続している、請求項１に記載のＯＲＮ。
【請求項３１】
ＧＧおよび（Ｒ１）ｎが、スペーサーによって接続している、請求項１に記載のＯＲＮ。
【請求項３２】
スペーサーが、非ヌクレオチドスペーサーである、請求項３１に記載のＯＲＮ。
【請求項３３】
非ヌクレオチドスペーサーが、Ｄ−スペーサーである、請求項３２に記載のＯＲＮ。
【請求項３４】
非ヌクレオチドスペーサーが、リンカーである、請求項３２に記載のＯＲＮ。
【請求項３５】
ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＵ＊ｒＵ＊ｒＵ＊ｒＵ＊ｒＵ＊ｒＵ＊ｒＵ＊ｒＵ＊ｒＵ＊ｒＵ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ（配列番号４）を含むＯＲＮ。
【請求項３６】
ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＵ＊ｒＵ＊ｒＧ＊ｒＵ＊ｒＵ＊ｒＧ＊ｒＵ＊ｒＵ＊ｒＧ＊ｒＵ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ（配列番号５）を含むＯＲＮ。
【請求項３７】
ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＵ＊ｒＵ＊ｒＡ＊ｒＵ＊ｒＵ＊ｒＡ＊ｒＵ＊ｒＵ＊ｒＡ＊ｒＵ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ（配列番号６）を含むＯＲＮ。
【請求項３８】
ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ−ｒＵ−ｒＵ−ｒＵ−ｒＵ−ｒＵ−ｒＵ−ｒＵ−ｒＵ−ｒＵ−ｒＵ−ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ（配列番号８）を含むＯＲＮ。
【請求項３９】
ｒＧ＊ｒＵ＊ｒＵ＊ｒＧ＊ｒＵ＊ｒＧ＊ｒＵ＊ｄＧ＊ｄＧ＊ｄＧ＊ｄＧ＊ｄＧ（配列番号１０）を含むＯＲＮ。
【請求項４０】
ポリＧモチーフと連結している免疫刺激性ＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＯＲＮ）モチーフを含み、ポリＧモチーフが、免疫刺激性ＯＲＮモチーフの３’側にあり、ポリＧモチーフが、少なくとも４個のＧを含み、Ｇがグアノシンである、８〜１００個のリボヌクレオチドの長さの免疫刺激性ＯＲＮ。
【請求項４１】
以下の５’ＧＧＧＧＵＵＵＵＧＧＧＧＧ３’（配列番号３３）、５’ＧＧＧＧＵＵＵＵＧＧＧＧ３’（配列番号３４）、ＧＵＵＵＵＵＧ（配列番号３５）、ＧＧＧＧＧＧＧＵＵＧＵＧＵＧＧＧＧＧ（配列番号３６）、ＣＣＣＣＵＵＵＵＧＧＧＧＧ（配列番号３７）、ＧＵＵＵＧＵＧＵＧＧＧＧ（配列番号３８）、ＧＵＵＧＵＧＵＧＧＧＧＧ（配列番号３９）、ＵＵＵＵＵＵＧＧＧＧＧ（配列番号４０）、ＵＵＵＵＵＧＧＧＧＧ（配列番号４１）、ＵＵＵＵＧＧＧＧＧ（配列番号１９）、またはＵＵＵＵＧＧＧＧ（配列番号１５）のうちの１つではない、請求項４０に記載のＯＲＮ。
【請求項４２】
免疫刺激性ＯＲＮモチーフが、ＴＬＲ８モチーフである、請求項４０に記載のＯＲＮ。
【請求項４３】
ＴＬＲ８モチーフが、Ｎ−Ｕ−Ｒ１−Ｒ２であり、Ｎが、リボヌクレオチドであり、ＮがＵを含まず、Ｕが、ウラシルまたはその誘導体であり、Ｒが、リボヌクレオチドであり、ここで、Ｒ１およびＲ２の少なくとも一方が、アデノシン（Ａ）またはシトシンまたはその誘導体であり、Ｎ−Ｕ−Ｒ１−Ｒ２が、少なくとも２個のＡを含まない限り、ＲがＵではない、請求項４２に記載のＯＲＮ。
【請求項４４】
Ｎが、アデノシンまたはシトシン（Ｃ）またはその誘導体である、請求項４３に記載のＯＲＮ。
【請求項４５】
第２のＮ−Ｕ−Ｒ１−Ｒ２モチーフをさらに含む、請求項４３に記載のＯＲＮ。
【請求項４６】
免疫刺激性ＯＲＮモチーフが、ＴＬＲ７／８モチーフである、請求項４０に記載のＯＲＮ。
【請求項４７】
ＴＬＲ７／８モチーフが、
（ｉ）５’−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−Ｕ−３’、
（ｉｉ）５’−Ｒ−Ｕ−Ｒ−Ｇ−Ｙ−３’、
（ｉｉｉ）５’−Ｇ−Ｕ−Ｕ−Ｇ−Ｂ−３’、
（ｉｖ）５’−Ｇ−Ｕ−Ｇ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−３’、および
（ｖ）５’−Ｇ／Ｃ−Ｕ−Ａ／Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｃ−３’
［式中、Ｃ／Ｕは、シトシン（Ｃ）またはウラシル（Ｕ）であり、Ｇ／Ｕは、グアニン（Ｇ）またはＵであり、Ｒは、プリンであり、Ｙは、ピリミジンであり、Ｂは、Ｕ、Ｇ、またはＣであり、Ｇ／Ｃは、ＧまたはＣであり、Ａ／Ｃは、アデニン（Ａ）またはＣである］
からなる群から選択されるリボヌクレオチド配列を含む、請求項４６に記載のＯＲＮ。
【請求項４８】
ポリＧモチーフが、６個のＧである、請求項４０に記載のＯＲＮ。
【請求項４９】
ポリＧモチーフが、７個のＧである、請求項４０に記載のＯＲＮ。
【請求項５０】
免疫刺激性ＯＲＮモチーフおよびポリＧモチーフが、直接連結している、請求項４０に記載のＯＲＮ。
【請求項５１】
免疫刺激性ＯＲＮモチーフおよびポリＧモチーフが、スペーサー、ヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカーであるリンカーを介して間接的に連結している、請求項４０に記載のＯＲＮ。
【請求項５２】
少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含む、請求項４０に記載のＯＲＮ。
【請求項５３】
ＯＲＮのすべてのヌクレオチド間結合が、ホスホロチオエート結合である、請求項４０に記載のＯＲＮ。
【請求項５４】
少なくとも１つのホスホジエステル様結合を含む、請求項５２に記載のＯＲＮ。
【請求項５５】
脂質、小分子、ペプチドまたはタンパク質からなる群から選択される分子とコンジュゲートしている、請求項１、３、４、５または３５から４０のいずれか一項に記載のＯＲＮ。
【請求項５６】
ＯＲＮおよび分子が、直接コンジュゲートしている、請求項５５に記載のＯＲＮ。
【請求項５７】
ＯＲＮおよび分子が、リンカーを介してコンジュゲートしている、請求項５５に記載のＯＲＮ。
【請求項５８】
ＩＦＮ−αの産生を刺激する方法であって、ＴＬＲ７発現細胞を、ＩＦＮ−α産生を刺激するのに有効な量の、ポリＧモチーフと連結している免疫刺激性ＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＯＲＮ）モチーフを含むＯＲＮと接触させることを含み、ポリＧモチーフは免疫刺激性ＯＲＮモチーフの３’側にあり、ポリＧモチーフは少なくとも４個のＧを含み、Ｇはグアノシンであるステップを含み、ＯＲＮに応じたＩＦＮ−γまたはＩＬ−１２産生はバックグラウンドと比較して大幅には誘導されない方法。
【請求項５９】
ＯＲＮが、ＧＧ（Ｒ１）ｎ（Ｕ）４〜２０（Ｒ２）ｍＧＧＧＧ［式中、Ｒ１およびＲ２は、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド、スペーサーまたは非ヌクレオチドリンカーであり、ｎ＝０〜２０であり、ｍ＝０〜２０であり、Ｕはウリジンまたはその誘導体であり、Ｇはグアノシンである］である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
ＴＬＲ７発現細胞がｍＤＣである、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
ＴＬＲ７発現細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏである、請求項５８に記載の方法。
【請求項６２】
ＴＬＲ７発現細胞がｉｎ  ｖｉｖｏである、請求項５８に記載の方法。
【請求項６３】
癌を治療する方法であって、それを必要とする対象に、癌を治療するのに有効な量の、請求項１から５７のいずれか一項に記載のＯＲＮを投与することを含む方法。
【請求項６４】
対象に化学療法薬を投与することをさらに含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
対象に放射線を施すことをさらに含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
喘息を治療する方法であって、それを必要とする対象に、喘息を治療するのに有効な量の、請求項１から５７のいずれか一項に記載のＯＲＮを投与することを含む方法。
【請求項６７】
アレルギーを治療する方法であって、それを必要とする対象に、アレルギーを治療するのに有効な量の、請求項１から５７のいずれか一項に記載のＯＲＮを投与することを含む方法。
【請求項６８】
対象がアレルギー性鼻炎である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
対象において免疫応答を調節する方法であって、それを必要とする対象に、免疫応答を調節するのに有効な量の、請求項１から５７のいずれか一項に記載のＯＲＮを投与することを含む方法。
【請求項７０】
対象において自己免疫疾患を治療するために、ＯＲＮが対象に送達される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
対象において気道リモデリングを治療するために、ＯＲＮが対象に送達される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
ＯＲＮが、抗原を伴わずに対象に投与される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７３】
ＯＲＮが、経口、鼻腔、舌下、静脈内、皮下、粘膜、呼吸器、直接注射および経皮的からなる群から選択される経路によって送達される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７４】
ＯＲＮが、ＩＦＮα発現を誘導するのに有効な量で対象に送達される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７５】
ウイルス感染によって悪化した喘息を治療する方法であって、それを必要とする対象に、ウイルス感染によって悪化した喘息を治療するのに有効な量の、請求項１から５４のいずれか一項に記載のＯＲＮを投与することを含む方法。
【請求項７６】
ウイルス感染がＲＳＶによる、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
感染性疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に、感染性疾患を治療するのに有効な量の、請求項１から５４のいずれか一項に記載のＯＲＮを投与することを含む方法。
【請求項７８】
対象がウイルス感染症である、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
ウイルス感染症が、Ｂ型肝炎である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
ウイルス感染症が、Ｃ型肝炎である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
対象に抗ウイルス薬を投与することをさらに含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項８２】
抗ウイルス薬が、ＯＲＮと連結している、請求項６８に記載の方法。
【請求項８３】
ＯＲＮが、経口、鼻腔、舌下、静脈内、皮下、粘膜、呼吸器、直接注射および経皮的からなる群から選択される経路によって送達される、請求項７７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫刺激性ＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＯＲＮ）に関する。特に、ＯＲＮは、３’ポリＧモチーフ、および任意選択により５’ポリＧモチーフが直接的または間接的に隣接する免疫刺激性ＯＲＮモチーフを有する。本発明はまた、治療方法およびスクリーニング方法を含む方法ならびにＯＲＮを使用するための関連キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を認識し、哺乳類における自然免疫において重要な役割を果たす、高度に保存されたパターン認識受容体（ＰＲＲ）ポリペプチドのファミリーである。現在、ＴＬＲ１〜ＴＬＲ１０と名づけられた少なくとも１０種のファミリーメンバーが同定されている。種々のＴＬＲの細胞質ドメインが、Ｔｏｌｌ−インターロイキン１受容体（ＴＩＲ）ドメインを特徴としている。Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ  Ｒら（１９９８年）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ２：２５３〜８頁。ＴＬＲによる微生物侵入の認識は、ショウジョウバエおよび哺乳類において進化的に保存されているシグナル伝達カスケードの活性化を引き起こす。ＴＩＲドメイン含有アダプタータンパク質ＭｙＤ８８は、ＴＬＲと結合し、インターロイキン１受容体関連キナーゼ（ＩＲＡＫ）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）をＴＬＲに補充すると報告されている。ＭｙＤ８８依存性シグナル伝達経路は、ＮＦ−κＢ転写因子およびｃ−Ｊｕｎ  ＮＨ２ターミナルキナーゼ（Ｊｎｋ）マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性化、免疫活性化および炎症性サイトカインの産生における重要な工程につながると考えられている。総説については、Ａｄｅｒｅｍ  Ａら（２０００年）Ｎａｔｕｒｅ４０６：７８２〜８７頁、およびＡｋｉｒａ  Ｓら（２００４年）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ４：４９９〜５１１頁参照のこと。
【０００３】
いくつかの特異的ＴＬＲリガンドが同定されている。ＴＬＲ２のリガンドとして、ペプチドグリカンおよびリポペプチドが挙げられる。Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ  Ａら（１９９９年）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ１６３：１〜５頁；Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ  Ａら（１９９９年）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ１６３：１〜５頁；Ａｌｉｐｒａｎｔｉｓ  ＡＯら（１９９９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２８５：７３６〜９頁。リポ多糖類（ＬＰＳ）は、ＴＬＲ４のリガンドである。Ｐｏｌｔｏｒａｋ  Ａら（１９９８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２８２：２０８５〜８頁；Ｈｏｓｈｉｎｏ  Ｋら（１９９９年）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ１６２：３７４９〜５２頁。細菌フラジェリンは、ＴＬＲ５のリガンドである。Ｈａｙａｓｈｉ  Ｆら（２００１年）Ｎａｔｕｒｅ４１０：１０９９〜１１０３頁。ペプチドグリカンは、ＴＬＲ２のリガンドであるだけでなくＴＬＲ６のリガンドでもあると報告されている。Ｏｚｉｎｓｋｙ  Ａら（２０００年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ９７：１３７６６〜７１頁；Ｔａｋｅｕｃｈｉ  Ｏら（２００１年）Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３：９３３〜４０頁。最近、特定の低分子量合成化合物、イミダゾキノリンイミキモド（Ｒ−８３７）およびレシキモド（Ｒ−８４８）は、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８のリガンドであると報告された。Ｈｅｍｍｉ  Ｈら（２００２年）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ３：１９６〜２００頁；Ｊｕｒｋ  Ｍら（２００２年）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ３：４９９頁。
【０００４】
メチル化されていない細菌ＤＮＡおよびその合成類似体（ＣｐＧ  ＤＮＡ）は、ＴＬＲ９のリガンドである（Ｈｅｍｍｉ  Ｈら（２０００年）Ｎａｔｕｒｅ４０８：７４０〜５頁；Ｂａｕｅｒ  Ｓら（２００１年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ９８、９２３７〜４２頁）という最近の発見を発端にして、特定のＴＬＲのリガンドは、特定の核酸分子を含むということが報告された。最近、特定の種類のＲＮＡは、配列独立的にまたは配列依存的に免疫刺激性であると報告された。さらに、これらの種々の免疫刺激性ＲＮＡは、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８を刺激すると報告された。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、概して、特定のＲＮＡモチーフを含有する免疫刺激性オリゴリボヌクレオチド（ＯＲＮ）、ならびにこのようなＯＲＮを含有する関連免疫刺激性組成物、ならびにこのようなＯＲＮおよび組成物を使用する方法に関する。本発明のＯＲＮは、免疫応答を刺激または増強するような任意の設定または適用において有用であり得る。以下に開示されるように、本発明のＯＲＮは、種々の状態、例えば、感染、癌、アレルギーおよび喘息の治療において使用するための、アジュバント、ワクチンおよび他の医薬をはじめとする医薬組成物の調製において特に役に立つ。したがって、特定の態様では、本発明は、本発明のＯＲＮを含む組成物ならびにその使用方法に関する。また、以下に開示されるように、本発明のＯＲＮおよび組成物は、免疫細胞を活性化する方法、対象にワクチン接種する方法、免疫系不全の対象を治療する方法、感染症の対象を治療する方法、自己免疫疾患の対象を治療する方法、癌の対象を治療する方法、アレルギー状態の対象を治療する方法、喘息、気道リモデリング、エピトープ拡散の促進および抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の対象を治療する方法において特に役に立つ。
【０００７】
以下に、より詳細に開示されるように、本発明の免疫刺激性ＯＲＮは、それらが少なくとも１つの配列依存性免疫刺激性ＲＮＡモチーフを含むことを特徴とする。配列依存性免疫刺激性ＲＮＡモチーフは、通常、短いＲＮＡ配列であるが、特定の実施形態では、モチーフはまた、１つまたは複数の修飾、例えば、修飾されたヌクレオチド間リン酸結合、修飾された核酸塩基、修飾された糖、ヌクレオチド類似体、デオキシリボヌクレオチド、スペーサー、非ヌクレオチドリンカーまたはそれらの任意の組合せを含み得る。一実施形態では、免疫刺激性ＲＮＡモチーフは、本発明の長い免疫刺激性ＯＲＮの状況で提供される。また、免疫刺激性ＲＮＡモチーフは、キメラＤＮＡ：ＲＮＡ核酸分子の状況で提供され得る。
【０００８】
配列依存性免疫刺激性ＲＮＡモチーフおよびこのようなモチーフを組み込むＯＲＮは、ＴＬＲ７のアゴニストであるが、ＴＬＲ８のアゴニストではないと開示されている。本発明のいくつかの態様によれば、８〜１００個のリボヌクレオチドの長さの免疫刺激性ＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＯＲＮ）が提供される。ＯＲＮは、ポリＧモチーフと連結している免疫刺激性ＯＲＮモチーフを含み、ポリＧモチーフは、免疫刺激性ＯＲＮモチーフの３’側にある。ポリＧモチーフは、少なくとも４個のＧを含む。他の実施形態では、ポリＧモチーフは、５、６、７、８、９または１０個のＧであり得る。Ｇは、グアノシンまたはその誘導体である。
【０００９】
いくつかの実施形態では、ＯＲＮは、以下の５’ＧＧＧＧＵＵＵＵＧＧＧＧＧ３’（配列番号３３）、５’ＧＧＧＵＵＵＵ３’，５’ＧＧＧＧＵＵＵＵＧＧＧＧ３’（配列番号３４）、ＧＵＵＵＵＵＧ（配列番号３５）、ＧＧＧＧＧＧＧＵＵＧＵＧＵＧＧＧＧＧ（配列番号３６）、ＣＣＣＣＵＵＵＵＧＧＧＧＧ（配列番号３７）、ＧＵＵＵＧＵＧＵＧＧＧＧ（配列番号３８）、ＧＵＵＧＵＧＵＧＧＧＧＧ（配列番号３９）、ＵＵＵＵＵＵＧＧＧＧＧ（配列番号４０）、ＵＵＵＵＵＧＧＧＧＧ（配列番号４１）、ＵＵＵＵＧＧＧＧＧ（配列番号１９）、またはＵＵＵＵＧＧＧＧ（配列番号１５）のうちの１つではない。
【００１０】
いくつかの実施形態では、免疫刺激性ＯＲＮモチーフは、ＴＬＲ８モチーフである。本発明のいくつかの態様のＴＬＲ８モチーフは、Ｎ−Ｕ−Ｒ１−Ｒ２である。
【００１１】
Ｎは、リボヌクレオチドであり、Ｎは、Ｕを含まない。いくつかの実施形態では、Ｎは、アデノシンまたはシトシン（Ｃ）またはそれらの誘導体である。
【００１２】
Ｕは、ウラシルまたはその誘導体である。
【００１３】
Ｒは、リボヌクレオチドであり、Ｒ１およびＲ２のうち少なくとも一方は、アデノシン（Ａ）またはシトシンまたはそれらの誘導体である。Ｒは、Ｎ−Ｕ−Ｒ１−Ｒ２が少なくとも２個のＡを含まない限り、Ｕではない。
【００１４】
本発明のＯＲＮは、少なくとも１つの、いくつかの実施形態では、２つ以上の（すなわち、２、３または４つの）免疫刺激性モチーフ、Ｎ−Ｕ−Ｒ１−Ｒ２を含む。ＴＬＲ８モチーフを含むＯＲＮは、ＴＬＲ７／８モチーフも任意選択により含み得る。
【００１５】
いくつかの実施形態では、Ｎ−Ｕ−Ｒ１−Ｒ２は、少なくとも３個のＡまたは少なくとも２個のＣを含み得る。任意選択により、Ｎ−Ｕ−Ｒ１−Ｒ２は、少なくとも１個のＧまたはＣを含む。
【００１６】
他の実施形態では、ＴＬＲ８モチーフは、非ヌクレオチドリンカーを介して５’リボヌクレオチドから離れている。さらに他の実施形態では、ＴＬＲ８モチーフは、非ヌクレオチドリンカーを介して３’リボヌクレオチドから離れている。任意選択により、ＴＬＲ８モチーフは、非ヌクレオチドリンカーを介して５’および３’リボヌクレオチドから離れている。
【００１７】
他の実施形態では、ＴＬＲ８モチーフは、少なくとも１個のＡＵを含む。さらに他の実施形態では、ＴＬＲ８モチーフは、少なくとも１個のＣＵを含む。
【００１８】
さらに他の実施形態では、免疫刺激性ＯＲＮモチーフは、ＴＬＲ７／８モチーフである。ＴＬＲ７／８モチーフは、例えば、（ｉ）５’−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−Ｕ−３’、（ｉｉ）５’−Ｒ−Ｕ−Ｒ−Ｇ−Ｙ−３’、（ｉｉｉ）５’−Ｇ−Ｕ−Ｕ−Ｇ−Ｂ−３’、（ｉｖ）５’−Ｇ−Ｕ−Ｇ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−３’および（ｖ）５’−Ｇ／Ｃ−Ｕ−Ａ／Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｃ−３’などのリボヌクレオチド配列を含む。Ｃ／Ｕは、シトシン（Ｃ）またはウラシル（Ｕ）である。Ｇ／Ｕは、グアニン（Ｇ）またはＵである。Ｒはプリンである。Ｙはピリミジンである。ＢはＵ、ＧまたはＣである。Ｇ／Ｃは、ＧまたはＣである。Ａ／Ｃは、アデニン（Ａ）またはＣである。
【００１９】
種々の実施形態では、５’−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−Ｕ−３’は、ＣＵＧＵ、ＣＵＵＵ、ＵＵＧＵまたはＵＵＵＵである。
【００２０】
種々の実施形態では、５’−Ｒ−Ｕ−Ｒ−Ｇ−Ｙ−３’は、ＧＵＡＧＵ、ＧＵＡＧＣ、ＧＵＧＧＵ、ＧＵＧＧＣ、ＡＵＡＧＵ、ＡＵＡＧＣ、ＡＵＧＧＵまたはＡＵＧＧＣである。一実施形態では、塩基配列は、ＧＵＡＧＵＧＵである。
【００２１】
種々の実施形態では、５’−Ｇ−Ｕ−Ｕ−Ｇ−Ｂ−３’は、ＧＵＵＧＵ、ＧＵＵＧＧまたはＧＵＵＧＣである。
【００２２】
種々の実施形態では、５’−Ｇ−Ｕ−Ｇ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−３’は、ＧＵＧＵＧまたはＧＵＧＵＵである。一実施形態では、塩基配列は、ＧＵＧＵＵＵＡＣである。
【００２３】
種々の実施形態では、５’−Ｇ／Ｃ−Ｕ−Ａ／Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｃ−３’は、ＧＵＡＧＧＣＡＣ、ＧＵＣＧＧＣＡＣ、ＣＵＡＧＧＣＡＣまたはＣＵＣＧＧＣＡＣである。
【００２４】
いくつかの態様では、本発明のＯＲＮは、ＧＧ（Ｒ１）ｎ（Ｕ）４〜２０（Ｒ２）ｍＧＧＧＧ（配列番号２９）、ＧＧ（Ｒ１）ｎ（Ｕ）５〜２０（Ｒ２）ｍＧＧＧＧ（配列番号３０）またはＧＧ（Ｒ１）ｎ（Ｕ）４（Ｒ２）ｍＧＧＧＧ（配列番号３１）を含む、１０〜１００個のリボヌクレオチドの長さのＯＲＮである。
【００２５】
Ｒ１およびＲ２は、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド、スペーサーまたは非ヌクレオチドリンカーである。Ｕは、ウリジンまたはその誘導体である。Ｇは、グアノシンまたはその誘導体である。ｎ＝０〜２０かつｍ＝０〜２０。いくつかの実施形態では、（Ｒ１）ｎがＧＧである場合、（Ｒ２）ｍはＧではないか、ｍ＝０ではない。
【００２６】
他の実施形態では、ＯＲＮは、本明細書に記載される式（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）の特定の修飾されたリン酸結合またはそれらの任意の組合せを含まない。
【００２７】
いくつかの実施形態では、ＯＲＮは、ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＵ＊ｒＵ＊ｒＵ＊ｒＵ＊ｒＵ＊ｒＵ＊ｒＵ＊ｒＵ＊ｒＵ＊ｒＵ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ（配列番号４）、ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ  ｒＵ＊ｒＵ＊ｒＧ＊ｒＵ＊ｒＵ＊ｒＧ＊ｒＵ＊ｒＵ＊ｒＧ＊ｒＵ  ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ（配列番号５）、ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＵ＊ｒＵ＊ｒＡ＊ｒＵ＊ｒＵ＊ｒＡ＊ｒＵ＊ｒＵ＊ｒＡ＊ｒＵ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ（配列番号６）、ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ−ｒＵ−ｒＵ−ｒＵ−ｒＵ−ｒＵ−ｒＵ−ｒＵ−ｒＵ−ｒＵ−ｒＵ−ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ（配列番号８）、ｒＧ＊ｒＵ＊ｒＵ＊ｒＧ＊ｒＵ＊ｒＧ＊ｒＵ＊ｄＧ＊ｄＧ＊ｄＧ＊ｄＧ＊ｄＧ（配列番号１０）、ｒＧ＊ｒＵ＊ｒＵ＊ｒＧ＊ｒＵ＊ｒＧ＊ｒＵ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ（配列番号２３）、ｒＧ＊ｒＵ＊ｒＵ＊ｒＧ＊ｒＵ＊ｒＧ＊ｒＵ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ（配列番号２４）、ｒＧ＊ｒＵ＊ｒＵ＊ｒＧ＊ｒＵ＊ｒＧ＊ｒＵ＊ｒＧ＊ｒＧ（配列番号２５）、ｒＵ＊ｒＵ＊ｒＧ＊ｒＵ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ（配列番号２６）、ｒＵ＊ｒＵ＊ｒＵ＊ｒＵ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ（配列番号２７）、またはｒＧ＊ｒＵ＊ｒＵ＊ｒＧ＊ｒＵ＊ｒＧ＊ｒＵ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ（配列番号２１）である。
【００２８】
任意選択により、式の成分は、以下のうちの１つまたは複数として定義される：（Ｒ１）ｎはＧＧであり、（Ｒ２）ｍはＧＧＧであり、（Ｕ）４〜２０はＵＵＵＵＵであり、（Ｕ）４〜２０はＵＵＵＵＵＵＵであり、（Ｕ）４〜２０はＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号３２）であり、ＧＧおよび（Ｒ１）ｎは、直接接続しており、ＧＧおよび（Ｒ１）ｎは、３’−３’結合を介して接続しており、またはＧＧおよび（Ｒ１）ｎは、スペーサーによって接続している。いくつかの実施形態では、スペーサーは、Ｄ−スペーサーまたはリンカーなどの非ヌクレオチドスペーサーである。
【００２９】
本組成物は、滅菌担体をさらに含み得る。
【００３０】
ＯＲＮは、一本鎖または二本鎖または部分二本鎖であり得る。いくつかの実施形態では、ＯＲＮは、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドではない。
【００３１】
ＯＲＮは、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含み得る。いくつかの実施形態では、ＯＲＮのすべてのヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート結合である。他の実施形態では、ＯＲＮは、少なくとも１つのホスホジエステル様結合を含む。任意選択により、ホスホジエステル様結合は、ホスホジエステル結合である。
【００３２】
一態様では、本発明は、本発明の免疫刺激性ＯＲＮおよびアジュバントを含む免疫刺激性組成物を提供する。種々の実施形態では、アジュバントは、デポー効果を生じるアジュバント、免疫刺激性アジュバントまたはデポー効果を生じ、かつ、免疫系を刺激するアジュバントである。一実施形態では、本発明のこの態様の免疫刺激性組成物は、免疫刺激性ＯＲＮおよびアジュバントのコンジュゲートである。本発明のこの態様の一実施形態では、免疫刺激性ＯＲＮは、アジュバントと共有結合によって連結している。他の実施形態では、それらはコンジュゲートしていない。
【００３３】
本発明の組成物は、抗原を任意選択により含み得る。したがって、一態様では、本発明は、本発明の免疫刺激性ＯＲＮおよび抗原を含む、ワクチンを提供する。一態様では、本発明は、本発明の免疫刺激性ＯＲＮおよび抗原のコンジュゲートを含むワクチンを提供する。一実施形態では、本発明のこの態様のコンジュゲートは、抗原と共有結合によって連結している免疫刺激性ＯＲＮを含む。他の実施形態では、それらはコンジュゲートしていない。種々の実施形態では、抗原は、それ自体抗原であり得る。抗原は、任意の抗原、例えば、癌抗原、微生物の抗原またはアレルゲンであり得る。
【００３４】
一態様では、本発明は、本発明の免疫刺激性ＯＲＮおよび親油性部分のコンジュゲートを含む免疫刺激性組成物を提供する。一実施形態では、免疫刺激性ＯＲＮは、親油性部分と共有結合によって連結している。一実施形態では、親油性部分は、コレステリル、パルミチルおよび脂肪酸アシルからなる群から選択される。一実施形態では、親油性部分は、コレステロールの誘導体、例えば、コレステリルである。
【００３５】
一実施形態では、免疫刺激性ＯＲＮは、少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドを含む。少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドは、通常、免疫刺激性ＲＮＡモチーフの外側のどこかに生じ得る。種々の実施形態では、少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４の連続するデオキシリボヌクレオチドである。非連続デオキシリボヌクレオチドを含有する免疫刺激性ＯＲＮもまた、本発明によって考慮される。種々の実施形態では、少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドは、免疫刺激性ＯＲＮの５’末端、３’末端または５’末端および３’末端の両方である。少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドはまた、キメラＤＮＡ：ＲＮＡ分子のＤＮＡ部分に相当する。一実施形態では、キメラＤＮＡ：ＲＮＡ分子のＤＮＡ成分は、ＣｐＧ核酸、すなわち、ＴＬＲ９アゴニストを含む。一実施形態では、キメラＤＮＡ：ＲＮＡ分子のＤＮＡおよびＲＮＡ部分は、ヌクレオチド間リン酸結合を介して共有結合によって連結している。別の実施形態では、キメラＤＮＡ：ＲＮＡ分子のＤＮＡおよびＲＮＡ部分は、リンカー、例えば、非ヌクレオチドリンカーを介して、共有結合によって連結している。
【００３６】
一態様では、本発明は、共有結合によって閉じた、部分的に一本鎖である、ダンベル型核酸分子を含む免疫刺激性組成物を提供し、これでは、分子の少なくとも１つの一本鎖部分が、本発明の免疫刺激性ＲＮＡモチーフを含む。
【００３７】
一態様では、本発明は、本発明の前記の態様のいずれかの組成物を、カチオン性脂質、リポソーム、コクリート（ｃｏｃｈｌｅａｔｅ）、ビロソーム、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）、微粒子、ミクロスフェア、ナノスフェア、単層ベシクル（ＬＵＶ）、多重膜ベシクル、水中油型エマルジョン、油中水型エマルジョン、エマルソーム（ｅｍｕｌｓｏｍｅ）およびポリカチオン性ペプチドなどの送達ビヒクルおよび任意選択により、薬学的に許容できる担体と関連させて含む医薬組成物を提供する。本発明のこの態様の一実施形態では、医薬組成物は、抗原を含む。送達ビヒクルのさらなる例は、以下に記載されている。
【００３８】
ＯＲＮは、噴霧器または吸入器、例えば、定量吸入器または粉末吸入器中に製剤され得る。いくつかの実施形態では、ＯＲＮは、化学療法薬、抗ウイルス薬または薬学的に許容できる担体などのさらなる組成物をさらに含む。薬学的に許容できる担体は、注射または粘膜投与用に製剤され得る。
【００３９】
さらに、本発明のこれらおよび他の態様によれば、種々の実施形態では、免疫刺激性ＯＲＮは、少なくとも１つの５’−５’ヌクレオチド間結合、少なくとも１つの３’−３’ヌクレオチド間結合、少なくとも１つの、リンカー部分を含む５’−５’ヌクレオチド間結合、少なくとも１つの、リンカー部分を含む３’−３’ヌクレオチド間結合またはそれらの任意の組合せを任意選択により含み得る。リンカー部分は、一実施形態では、非ヌクレオチドリンカー部分である。
【００４０】
さらに、本発明のこれらおよび他の態様によれば、種々の実施形態では、免疫刺激性ＯＲＮは、少なくとも１つの２’−２’ヌクレオチド間結合、少なくとも１つの２’−３’ヌクレオチド間結合、少なくとも２’−５’ヌクレオチド間結合、またはそれらの任意の組合せを任意選択により含み得る。好ましい実施形態では、少なくとも１つの２’−２’ヌクレオチド間結合、少なくとも１つの２’−３’ヌクレオチド間結合または少なくとも２’−５’ヌクレオチド間結合が、免疫刺激性ＲＮＡモチーフの外側に存在する。
【００４１】
また、本発明のこれらおよび他の態様によれば、一実施形態では、免疫刺激性ＯＲＮは、少なくとも１つの増倍単位を含む。したがって、特定の実施形態では、本発明の免疫刺激性ＯＲＮは、分岐構造を有し得る。分岐組成物は、３’−５’、５’−５’、３’−３’、２’−２’、２’−３’または２’−５’ヌクレオチド間結合を、任意の組合せで含み得る。一実施形態では、免疫刺激性ＯＲＮは、少なくとも２つの増倍単位を含み、いわゆる、デンドリマーが結果として生じる。さらに、特定の実施形態では、本発明の免疫刺激性ＯＲＮは、例えば、直鎖ＯＲＮに沿って直列に、分岐構造の異なるアーム上、または直鎖ＯＲＮに沿って直列に、かつ、分岐構造の異なるアーム上の両方で配列された、２つ以上の免疫刺激性ＲＮＡモチーフを含み得る。分岐構造、例えば、デンドリマーは、少なくとも１つの免疫刺激性ＣｐＧ核酸を、例えば、分岐構造の分離アームとして任意選択により含み得る。
【００４２】
さらに、本発明のこれらおよび他の態様によれば、一実施形態では、免疫刺激性ＯＲＮは、２’−Ｏ−アルキル修飾、２’−フルオロ−アラビノ修飾されたＧを少なくとも１個、またはＬＮＡ修飾されたＧを少なくとも１個含む。
【００４３】
さらに、本発明のこれらおよび他の態様によれば、一実施形態では、免疫刺激性ＯＲＮは、ＣＧ  ＤＮＡもＲＮＡジヌクレオチドも含まない。
【００４４】
別の態様では、本発明は、対象において免疫応答を調節する方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、対象に有効量の本発明の組成物を投与するステップを含む。いくつかの実施形態では、ＯＲＮは、対象において自己免疫疾患または気道リモデリングを治療するために、対象に送達され得る。ＯＲＮは、抗原とともに、または抗原を伴わずに対象に投与され得る。任意選択によりＯＲＮは、経口、鼻腔、舌下、静脈内、皮下、粘膜、呼吸器、直接注射および経皮的などの経路によって送達される。ＯＲＮは、ＩＦＮαなどのサイトカイン発現を誘導するのに有効な量で対象に送達され得る。
【００４５】
一態様では、本発明は、対象にワクチン接種する方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、対象に抗原および本発明の免疫刺激性ＯＲＮを投与するステップを含む。
【００４６】
一態様では、本発明は、感染性疾患である、またはそのリスクがある対象を治療する方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、対象に有効量の本発明の組成物を投与するステップを含む。一実施形態では、本方法は、対象に有効量の本発明の免疫刺激性ＯＲＮを投与するステップを含む。一実施形態では、対象は、ウイルス感染症である。ウイルス感染症は、例えば、Ｂ型肝炎またはＣ型肝炎であり得る。抗ウイルス薬もまた、対象に投与してよい。抗ウイルス薬は、ＯＲＮと、任意選択により連結されている。
【００４７】
一態様では、本発明は、癌である、またはそのリスクがある対象を治療する方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、対象に有効量の本発明の組成物を投与するステップを含む。一実施形態では、本方法は、対象に有効量の本発明の免疫刺激性ＯＲＮを投与するステップを含む。一実施形態では、対象にさらに、化学療法薬が投与される、または放射線が施される。
【００４８】
一態様では、本発明は、アレルギー状態である、またはそのリスクがある対象を治療する方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、対象に有効量の本発明の組成物を投与するステップを含む。一実施形態では、本方法は、対象に有効量の本発明の免疫刺激性ＯＲＮを投与するステップを含む。一実施形態では、対象は、アレルギー性鼻炎である。
【００４９】
一態様では、本発明は、喘息である、またはそのリスクがある対象を治療する方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、対象に有効量の本発明の組成物を投与するステップを含む。一実施形態では、本方法は、対象に有効量の本発明の免疫刺激性ＯＲＮを投与するステップを含む。一実施形態では、喘息は、ウイルス感染によって悪化した喘息である。ＯＲＮは、アレルゲンとともに、またはアレルゲンを伴わずに投与され得る。
【００５０】
別の態様では、本発明は、気道リモデリングの対象を治療する方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、対象に有効量の本発明の免疫刺激性ＯＲＮを投与するステップを含む。
【００５１】
一態様では、本発明は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を増大する方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、ＡＤＣＣの増大を必要とする対象に有効量の本発明の免疫刺激性ＯＲＮおよびＡＤＣＣを増大するための抗体を投与するステップを含む。一実施形態では、抗体は、癌細胞によって発現される癌抗原または他の抗原に特異的な抗体である。一実施形態では、抗体は、ＩｇＧ抗体である。
【００５２】
一態様では、本発明は、エピトープ拡散を促進する方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、免疫系の細胞を、抗原と接触させるステップと、続いて、この細胞を、少なくとも２用量の本発明の免疫刺激性ＯＲＮと接触させるステップの逐次ステップとを含む。一実施形態では、本方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏで実施される。一実施形態では、本方法は、対象に、抗原およびアジュバントを含むワクチンを投与するステップと、続いて、対象に少なくとも２用量の本発明の免疫刺激性ＯＲＮを、多重エピトープ特異的免疫応答を誘導するのに有効な量で投与するステップとを含む。一実施形態では、本方法は、対象における免疫系抗原曝露をもたらす治療プロトコールを適用することと、それに続いて、少なくとも２用量の本発明の免疫刺激性ＯＲＮを、多重エピトープ特異的免疫応答を誘導するのに有効な量で投与することとを伴う。種々の実施形態では、治療プロトコールとして、手術、放射線、化学療法、他の癌医薬、ワクチンまたは癌ワクチンがある。一実施形態では、少なくとも２用量の免疫刺激性ＯＲＮを、互いに少なくとも１日〜１週間空けて投与する。一実施形態では、少なくとも２用量の免疫刺激性ＯＲＮを、互いに少なくとも１週間〜１カ月空けて投与する。一実施形態では、少なくとも２用量の免疫刺激性ＯＲＮを、互いに少なくとも１カ月〜６カ月空けて投与する。
【００５３】
一態様では、本発明は、ＴＬＲ７発現細胞を、ＩＦＮ−αの産生を刺激するのに有効な量の本発明のＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＯＲＮ）と接触させることによって、ＩＦＮ−αの産生を刺激する方法であり、ＯＲＮに応じたＩＦＮ−γまたはＩＬ−１２産生は、バックグラウンドと比較して大幅には誘導されない。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ７発現細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏである。一実施形態では、ＯＲＮは、ポリＧモチーフと連結している免疫刺激性ＯＲＮモチーフであり、ポリＧモチーフは、免疫刺激性ＯＲＮモチーフの３’側にあり、ポリＧモチーフは、少なくとも４個のＧを含む。他の実施形態では、ＯＲＮは、ＧＧ（Ｒ１）ｎ（Ｕ）４〜２０（Ｒ２）ｍＧＧＧＧ（式中、Ｒ１およびＲ２は、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド、スペーサーまたは非ヌクレオチドリンカーであり、ｎ＝０〜２０であり、ｍ＝０〜２０であり、Ｕはウリジンまたはその誘導体であり、Ｇはグアノシンまたはその誘導体である）である。
【００５４】
本発明の制限の各々は、本発明の種々の実施形態を包含し得る。したがって、任意の１つの要素または要素の組合せを伴う本発明の制限の各々は、本発明の各態様に含まれ得ることが予想される。この発明は、以下の説明に示される、または図面において例示される成分の構成および配置の詳細には、その適用に制限されない。本発明は、他の実施形態であり得、種々の方法で実行または実施され得る。また、本明細書において用いられる表現および技術用語は、説明目的のものであって、制限と見なされるべきではない。「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「伴う（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」および本明細書におけるそれらの変形の使用は、以後列挙される項目およびその等価物ならびにさらなる項目を包含するものとする。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
図は単に例示であり、本明細書に開示される本発明の実施可能性に必要とされるわけではない。
【図１】細胞をオリゴリボヌクレオチド（ＯＲＮ）と接触させた後の、ヒトＰＢＭＣによるサイトカイン産生を示す２つのグラフである。ＯＲＮ（出発濃度：２μＭ＋５０μｇ／ｍｌ  ＤＯＴＡＰ）を、ヒトＰＢＭＣとともにインキュベートし、上清を、ＥＬＩＳＡによって、サイトカイン濃度について２４時間後にアッセイした。ＴＬＲ７／８免疫刺激性ＯＲＮ（配列番号１および２）および３種の試験配列（配列番号４、５および８、表１を参照のこと）が示されている。ｙ軸は、ｐｇ／ｍｌでのＩＦＮ−α（図１Ａ）またはＩＬ−１２ｐ４０（図１Ｂ）濃度であり、ｘ軸は、μＭでのｌｏｇ  ＯＲＮ濃度である。
【図２】細胞をオリゴリボヌクレオチド（ＯＲＮ）と接触させた後の、ヒトＰＢＭＣによるサイトカイン産生を示す２つのグラフである。ＯＲＮ（出発濃度：２μＭ＋５０μｇ／ｍｌ  ＤＯＴＡＰ）を、ヒトＰＢＭＣとともにインキュベートし、上清を、ＥＬＩＳＡによって、サイトカイン濃度について２４時間後にアッセイした。ＴＬＲ７／８免疫刺激性ＯＲＮ（配列番号１および２）および３種の試験配列（配列番号３、６および７、表１を参照のこと）が示されている。ｙ軸は、ｐｇ／ｍｌでのＩＦＮ−α（図２Ａ）またはＩＬ−１２ｐ４０（図２Ｂ）濃度であり、ｘ軸は、μＭでのｌｏｇ  ＯＲＮ濃度である。
【図３】細胞をオリゴリボヌクレオチド（ＯＲＮ）と接触させた後の、ヒトＰＢＭＣによるサイトカイン産生を示す２つのグラフである。ＯＲＮ（出発濃度：２μＭ＋５０μｇ／ｍｌ  ＤＯＴＡＰ）を、ヒトＰＢＭＣとともにインキュベートし、上清を、ＥＬＩＳＡによって、サイトカイン濃度について２４時間後にアッセイした。ＴＬＲ７／８免疫刺激性ＯＲＮ（配列番号１）および４種の試験配列（配列番号９〜１２）が示されている。ｙ軸は、ｐｇ／ｍｌでのＩＦＮ−α（図３Ａ）またはＩＦＮ−γ（図３Ｂ）濃度であり、ｘ軸は、μＭでのＯＲＮ濃度である。
【図４】細胞をオリゴリボヌクレオチド（ＯＲＮ）と接触させた後の、ヒトＰＢＭＣによるＩＦＮ−α産生を示すグラフである。ＯＲＮ（出発濃度：２μＭ＋５０μｇ／ｍｌ  ＤＯＴＡＰ）を、ヒトＰＢＭＣとともにインキュベートし、上清を、ＥＬＩＳＡによって、サイトカイン濃度について２４時間後にアッセイした。ＤＯＴＡＰ（ＤＯ）を伴う、および伴わない、配列番号１０および修飾されたＧ（７−デアザ−ｒＧ）を含む同等配列が示されている。ｙ軸は、ｐｇ／ｍｌでのＩＦＮ−α濃度であり、ｘ軸は、μＭでのＯＲＮ濃度である。
【図５】細胞を種々の３’修飾を含むオリゴリボヌクレオチド（ＯＲＮ）と接触させた後の、ヒトＰＢＭＣによるＩＦＮ−α産生を示すグラフである。ＯＲＮ（出発濃度：２μＭ＋５０μｇ／ｍｌ  ＤＯＴＡＰ）を、ヒトＰＢＭＣとともにインキュベートし、上清を、ＥＬＩＳＡによって、サイトカイン濃度について２４時間後にアッセイした。配列番号１２および１０種の試験配列が示されている。ｙ軸は、ｐｇ／ｍｌでのＩＦＮ−α濃度であり、ｘ軸は、μＭでのＯＲＮ濃度である。
【図６】細胞をオリゴリボヌクレオチド（ＯＲＮ）と接触させた後の、ヒトＰＢＭＣによるサイトカイン産生を示す２つのグラフである。ＯＲＮ（出発濃度：２μＭ＋５０μｇ／ｍｌ  ＤＯＴＡＰ）を、ヒトＰＢＭＣとともにインキュベートし、上清を、ＥＬＩＳＡによって、サイトカイン濃度について２４時間後にアッセイした。配列番号２１および５種の試験配列、ならびにＴＬＲ７／８免疫刺激性ＯＲＮ配列番号１が示されている。
【図７】細胞をオリゴリボヌクレオチド（ＯＲＮ）と接触させた後の、ヒトＰＢＭＣによるサイトカイン産生を示す３つのグラフである。ポリｒＧを含むＯＲＮは、ＴＬＲ８を欠くｐＤＣにおけるＴＬＲ７依存性ＩＦＮ−α産生を刺激するということを実証する。ヒトＰＢＭＣ（ｎ＝２）（図７Ａ）、単球（図７Ｂ）またはｐＤＣ（図７Ｃ）を、配列番号１４（４μＭ）、免疫刺激性ＣｐＧ  ＯＤＮ配列番号２８（０．５μＭ）または配列番号１２（０．５μＭ）を用い、ＤＯＴＡＰ（２０μｇ／ｍｌ）の存在下２４時間刺激し、ＩＦＮ−αを測定した。ｙ軸は、試験されたＯＲＮ、ＯＤＮまたは培地であり、ｘ軸は、ｐｇ／ｍｌでのＩＦＮ−α濃度である。
【図８】ネズミ樹状細胞におけるサイトカイン産生の刺激を示す４つのグラフである。ネズミＣＤ１１＋脾細胞を回収し、ＯＲＮを用いて２０時間処理した。上清を、ＩＦＮ−α（図８Ａ）、ＩＬ−６（図８Ｂ）、ＩＬ−１２ｐ４０（図８Ｃ）およびＩＰ−１０（図８Ｄ）濃度についてＥＬＩＳＡによって分析した。細胞を、ＤＯＴＡＰ（ＤＯ）を伴う、既知ＴＬＲ７／８刺激性ＯＲＮ（配列番号４８）、ＴＬＲ７／８を刺激する小分子Ｒ−８４８、配列番号１２のコレステロールタグを付け、３’Ｇストレッチで修飾されたＯＲＮ（ＤＯＴＡＰを伴う、および伴わないの両方、それぞれ、配列番号１１および１２）ならびにＤＯＴＡＰを伴う配列番号１２で処理した。ｙ軸は、ｐｇ／ｍｌでのサイトカイン濃度であり、ｘ軸は、ｎＭでの治療用量濃度である。
【図９】ｉｎ  ｖｉｖｏでのサイトカイン産生の刺激を示す４つのグラフである。ｓｖ１２９マウスに、未修飾ＯＲＮ（配列番号１２）、同配列のコレステロール修飾されたＯＲＮ（配列番号１１）、同配列および３’ポリＧストレッチを含むＯＲＮ（配列番号２１）またはＲ−８４８を用いて静脈内注射した。すべてのＯＲＮは、ＤＯＴＡＰを２：１の比（ｗ／ｗ）で用いて製剤した。マウスを出血させ、ＥＬＩＳＡによって、血清をＩＦＮ−α（図９Ａ）、ＩＬ−１２ｐ４０（図９Ｂ）、ＩＰ−１０（図９Ｃ）およびＴＮＦ−α（図９Ｄ）濃度について分析した。ｙ軸は、ｐｇ／ｍｌでのサイトカイン濃度であり、ｘ軸は、ｎＭでの治療用量濃度である。
【図１０】ｉｎ  ｖｉｖｏでのサイトカイン産生の刺激を示す２つのグラフである。ｓｖ１２９マウスに静脈内注射した。注射の３時間後、ＯＲＮで刺激した後のマウスにおいて、血清をサイトカイン産生について試験した。図１０Ａは、３０μｇの配列番号２１＋ＤＯＴＡＰ、３０μｇの配列番号２１単独、またはＤＯＴＡＰまたは水単独での刺激を示す。ｘ軸は、投与された用量であり、ｙ軸は、ｐｇ／ｍｌでのＩＰ−１０濃度である。図１０Ｂは、未修飾ＯＲＮ（配列番号１２）、同配列のコレステロール修飾されたＯＲＮ（配列番号１１）または同配列および３’ポリＧストレッチを含むＯＲＮ（配列番号２１）を用いて注射した後の、ＩＰ−１０濃度を示す。ｘ軸は、μｇでの治療用量であり、ｙ軸は、ｐｇ／ｍｌでのＩＰ−１０濃度である。
【図１１】細胞を、種々の３’修飾を含むオリゴリボヌクレオチド（ＯＲＮ）と接触させた後の、ヒトＰＢＭＣによるＩＦＮ−α産生を示すグラフである。ＯＲＮ（出発濃度：２μＭ＋５０μｇ／ｍｌ  ＤＯＴＡＰ）を、ヒトＰＢＭＣとともにインキュベートし、上清を、ＥＬＩＳＡによって、サイトカイン濃度について２４時間後にアッセイした。ＴＬＲ７／８刺激性ＯＲＮ配列番号４８（ＤＯＴＡＰを伴うおよび伴わない）および修飾された３’末端を有する６種の試験配列（ＤＯＴＡＰなし）が示されている。ｙ軸は、ｐｇ／ｍｌでのＩＦＮ−α濃度であり、ｘ軸は、ｌｏｇ  μＭでのＯＲＮ濃度である。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８依存性に、ヒト免疫系を刺激すると思われる、免疫刺激性オリゴリボヌクレオチド（ＯＲＮ）が記載されている。例えば、ＧＵリッチおよびＣＵリッチモチーフを含有し、ポリＧ末端を欠くＯＲＮは、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８に対して作用すると思われる。ＡＵリッチモチーフを含み、ポリＧ末端を欠くＯＲＮは、ＴＬＲ８のみに対して作用すると思われるが、これは、それらが、サイトカイン、例えば、ＴＬＲ９活性化と関連している、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γを刺激し、ＴＬＲ７活性化と関連しているＩＦＮ−αを刺激しないためである。例えば、単球の活性化は、直接ＴＬＲ８媒介性効果である可能性が最も高いが、これは、単球がＴＬＲ８を発現するが、ＴＬＲ７を発現せず、ｓｓＲＮＡ刺激時にＴＮＦ−αを分泌するのに対しＩＦＦＮ−α産生ｐＤＣは、ＴＬＲ７を発現し、ＴＬＲ８を発現しないとわかっているからである。最近、本発明者らは、異なる免疫プロフィールを有するＯＲＮを同定し、ＲＮＡ媒介性反応の活性化のためのモチーフを規定した。それらのＯＲＮの中には、ヒトＰＢＭＣによるＩＦＮ−α産生を誘導しないが、相当な量のＴＮＦ−α、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γを誘導し、ＴＬＲ７の大きな刺激は伴わず、主にＴＬＲ８の刺激を示すものもあった。これらのＯＲＮは、少なくとも米国特許出願番号第１１／６０３，９７８号に記載されている。
【００５７】
本発明は、特定のモチーフを有するＯＲＮが、実質的な量のＴＬＲ８媒介性（すなわち、ＴＬＲ８発現細胞によって産生されるサイトカインの産生、例えば、単球からのＴＮＦ−α）免疫活性化を誘導することなく、ＴＬＲ７媒介性と呼ばれる、ＲＮＡ媒介性ｐＤＣ免疫応答（例えば、ＩＦＮ−α産生）を誘導し得るという予期しない発見を伴う。本明細書において、「実質的な量」とは、誘導されるレベルが、上記のＧＵリッチおよびＣＵリッチモチーフを含有し、ポリＧ末端を欠くもの、またはＴＬＲ８を刺激すると思われる他のＯＲＮなどのＯＲＮによって誘導されるレベルと比較した場合に最小であることを意味するものとする。したがって、本発明のＯＲＮは、ＲＮＡ  ＴＬＲ８または７／８リガンドにとって典型的なサイトカイン、例えば、炎症性サイトカインＴＮＦ−α、ＩＬ−６をあまり誘導しない。
【００５８】
本明細書に記載されるＯＲＮのクラスは、３’ポリＧモチーフ、および任意選択により５’ポリＧモチーフが直接的または間接的に隣接する免疫刺激性ＯＲＮモチーフを含み、ほぼＴＬＲ７様免疫応答の活性化のみを特徴とする免疫プロフィールと関連している。例えば、図１に示されるように、本発明のＯＲＮ配列番号４、配列番号８および配列番号５は、ＤＯＴＡＰとともに製剤された場合に極めて多量のＩＦＮ−αを誘導し、ＩＦＮ−γまたはＩＬ−１２のような、他の応答の大幅な誘導はない。対照的に、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８関連サイトカインの両方を刺激することがわかっている陽性対照ＯＲＮ、配列番号１および２は、多量のＩＦＮ−αおよび多量のＩＬ−１２ｐ４０の両方を誘導した。非常に驚くべきことに、本発明によれば、ＴＬＲ７／８およびＴＬＲ８応答を媒介するものなどの免疫刺激性ＯＲＮモチーフは、ＯＲＮ中に１つまたは複数のポリＧモチーフが組み込まれている場合に、ＴＬＲ７免疫プロフィールを生じるということも発見された。
【００５９】
本発明のいくつかの態様による免疫刺激性ＲＮＡモチーフは、ポリＧモチーフと連結している免疫刺激性ＯＲＮモチーフであり、ポリＧモチーフは、免疫刺激性ＯＲＮモチーフの３’側にあり、ポリＧモチーフは、少なくとも４個のＧを含む。
【００６０】
すべてではないがいくつかの実施形態では、ＯＲＮは、具体的に、ＴＬＲ７／８および／またはＴＬＲ８モチーフを含む。ＴＬＲ７／８モチーフは、例えば、５’−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−Ｕ−３’、５’−Ｒ−Ｕ−Ｒ−Ｇ−Ｙ−３’、５’−Ｇ−Ｕ−Ｕ−Ｇ−Ｂ−３’、５’−Ｇ−Ｕ−Ｇ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−３’または５’−Ｇ／Ｃ−Ｕ−Ａ／Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｃ−３’などのリボヌクレオチド配列を含み得る。Ｃ／Ｕは、シトシン（Ｃ）またはウラシル（Ｕ）であり、Ｇ／Ｕは、グアニン（Ｇ）またはＵであり、Ｒはプリンであり、Ｙはピリミジンであり、Ｂは、Ｕ、ＧまたはＣであり、Ｇ／Ｃは、ＧまたはＣであり、Ａ／Ｃは、アデニン（Ａ）またはＣである。５’−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−Ｕ−３’は、ＣＵＧＵ、ＣＵＵＵ、ＵＵＧＵまたはＵＵＵＵであり得る。種々の実施形態では、５’−Ｒ−Ｕ−Ｒ−Ｇ−Ｙ−３’は、ＧＵＡＧＵ、ＧＵＡＧＣ、ＧＵＧＧＵ、ＧＵＧＧＣ、ＡＵＡＧＵ、ＡＵＡＧＣ、ＡＵＧＧＵまたはＡＵＧＧＣである。一実施形態では、塩基配列は、ＧＵＡＧＵＧＵである。種々の実施形態では、５’−Ｇ−Ｕ−Ｕ−Ｇ−Ｂ−３’は、ＧＵＵＧＵ、ＧＵＵＧＧまたはＧＵＵＧＣである。種々の実施形態では、５’−Ｇ−Ｕ−Ｇ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−３’は、ＧＵＧＵＧまたはＧＵＧＵＵである。一実施形態では、塩基配列は、ＧＵＧＵＵＵＡＣである。種々の他の実施形態では、５’−Ｇ／Ｃ−Ｕ−Ａ／Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｃ−３’は、ＧＵＡＧＧＣＡＣ、ＧＵＣＧＧＣＡＣ、ＣＵＡＧＧＣＡＣまたはＣＵＣＧＧＣＡＣである。
【００６１】
ＴＬＲ８モチーフは、例えば、Ｎ−Ｕ−Ｒ１−Ｒ２（式中、Ｎは、リボヌクレオチドであり、Ｎは、Ｕを含まず、Ｕは、ウラシルまたはその誘導体であり、Ｒは、リボヌクレオチドであり、ここで、Ｒ１およびＲ２の少なくとも一方はアデノシン（Ａ）またはシトシンまたはその誘導体である）である。Ｒは、Ｎ−Ｕ−Ｒ１−Ｒ２が少なくとも２個のＡを含まない限り、Ｕではない。いくつかの実施形態では、Ｎはアデノシンまたはシトシン（Ｃ）またはその誘導体である。ＯＲＮは、２つ以上のＮ−Ｕ−Ｒ１−Ｒ２モチーフを任意選択により含む。
【００６２】
他の実施形態では、ＯＲＮは、具体的に、ＴＬＲ７／８および／またはＴＬＲ８モチーフを排除する。
【００６３】
ＯＲＮは、以下の構造：ＧＧ（Ｒ１）ｎ（Ｕ）４〜２０（Ｒ２）ｍＧＧＧＧ（配列番号２９）を有し得る。他の態様では、ＲＮＡモチーフは、ＧＧ（Ｒ１）ｎ（Ｕ）５〜２０（Ｒ２）ｍＧＧＧＧ（配列番号３０）である。他の態様では、ＲＮＡモチーフは、ＧＧ（Ｒ１）ｎ（Ｕ）４（Ｒ２）ｍ、ＧＧＧＧ（配列番号３１）（式中、（Ｒ１）ｎがＧＧである場合、（Ｒ２）ｍはＧではないか、ｍ＝０ではない）である。
【００６４】
ポリＵとは、少なくとも４個のＵのストレッチを指す。ポリＧとは、少なくとも２個のＧのストレッチを指す。
【００６５】
Ｒ１およびＲ２は、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド、スペーサーまたは非ヌクレオチドリンカーである。いくつかの実施形態では、（Ｒ１）ｎはＧＧである。他の実施形態では、（Ｒ２）ｍはＧＧＧである。
【００６６】
Ｕはウリジンまたはその誘導体である。（Ｕ）４〜２０または（Ｕ）５〜２０は、例えば、ＵＵＵＵＵ、ＵＵＵＵＵＵＵまたはＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号３２）であり得る。
【００６７】
Ｇは、グアノシンまたはその誘導体である。ｎ＝０〜２０である。ｍ＝０〜２０である。
【００６８】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡモチーフは、配列番号４〜６および８〜１２のいずれか１つのＯＲＮである。
【００６９】
いくつかの実施形態では、ＯＲＮは、５’ＧＧＧＧＵＵＵＵＧＧＧＧＧ３’（配列番号３３）、５’ＧＧＧＧＵＵＵＵＧＧＧＧ３’（配列番号３４）、ＧＵＵＵＵＵＧ（配列番号３５）、ＧＧＧＧＧＧＧＵＵＧＵＧＵＧＧＧＧＧ（配列番号３６）、ＣＣＣＣＵＵＵＵＧＧＧＧＧ（配列番号３７）、ＧＵＵＵＧＵＧＵＧＧＧＧ（配列番号３８）、ＧＵＵＧＵＧＵＧＧＧＧＧ（配列番号３９）、ＵＵＵＵＵＵＧＧＧＧＧ（配列番号４０）、ＵＵＵＵＵＧＧＧＧＧ（配列番号４１）、ＵＵＵＵＧＧＧＧＧ（配列番号１９）、またはＵＵＵＵＧＧＧＧ（配列番号１５）ではない。
【００７０】
他の実施形態では、ＯＲＮは、
【００７１】
【化１】
2010507386.tif 000003
［式中、
Ｒ１は、水素（Ｈ）、ＣＯＯＲ、ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ６Ｈ５または（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｒ２、であり、ここで、Ｒは、Ｈまたはメチル、ブチル、メトキシエチル、ピバロイルオキシメチル、ピバロイルオキシベンジルまたはＳ−ピバロイルチオエチルであり、Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルまたはＣ２〜Ｃ１８アシルであり、ｍは、１〜１７であり、
Ｘは、酸素（Ｏ）または硫黄（Ｓ）であり、
ＮｕおよびＮｕ’は各々独立に、ヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体である
ただし、Ｒ１がＨである場合、ＸはＳである］、
【００７２】
【化２】
2010507386.tif 000004
［式中、
Ｘは、ＯまたはＳであり、
Ｘ１は、ＯＨ、ＳＨ、ＢＨ３、ＯＲ３またはＮＨＲ３であり、ここで、Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルであり、
Ｘ２およびＸ３は各々独立に、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２またはＣＦ２であり、
ＮｕおよびＮｕ’は各々独立に、ヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体である
ただし、
（ａ）Ｘ、Ｘ２およびＸ３のうち少なくとも１つはＯではない、またはＸ１はＯＨではなく、
（ｂ）Ｘ１がＳＨである場合、Ｘ、Ｘ２およびＸ３のうち少なくとも１つはＯではなく、
（ｃ）ＸおよびＸ２がＯであり、Ｘ１がＯＨである場合、Ｘ３はＳではなく、Ｎｕは３’Ｎｕであり、Ｎｕ’は５’Ｎｕ’であり、
（ｄ）Ｘ１がＢＨ３である場合、Ｘ、Ｘ２またはＸ３のうち少なくとも１つはＳである］および
（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の任意の組合せ
からなる群から選択される修飾されたリン酸結合を含まず、
式ＩＩＩＡもしくは式ＩＩＩＢとして示される少なくとも１つのヌクレオチド類似体
【００７３】
【化３】
2010507386.tif 000005
［式中、
Ｒ４は、ＨまたはＯＲであり、ここで、Ｒは、ＨまたはＣ１〜Ｃ１８アシルであり、
Ｂは、核酸塩基、修飾された核酸塩基またはＨであり、
ＸおよびＸ５は各々独立に、ＯまたはＳであり、
Ｘ４は、ＯＨ、ＳＨ、メチルまたはＮＨＲ５であり、ここで、Ｒ５は、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルであり、
破線は各々独立に、隣接する単位、水素または有機基との任意選択の結合を表し、
ただし、ＸおよびＸ５の少なくとも一方はＯではない、またはＸ４はＯＨではない］
を含まない。
【００７４】
ＯＲＮは、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。本発明の方法によれば、修飾されたＯＲＮは、ヒト細胞中のコード配列のものと相補的である配列を含むようには設計されず、したがって、アンチセンスＯＲＮまたはサイレンシングＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）であるとは考えられない。「相補的でない」ＯＲＮとは、標的細胞中の１つの特定のコーディング領域と強力にハイブリダイズできる配列を含むものではないものである。したがって、本明細書において用いる場合、相補的でないＯＲＮの投与は、特に、本発明に記載されるＯＲＮが一本鎖である場合、サイレンシングＲＮＡとして用いられる二本鎖分子と比較して、遺伝子サイレンシングをもたらさない。
【００７５】
いくつかの実施形態では、本発明のＯＲＮは、１０〜３０ヌクレオチドの間の長さである。いくつかの実施形態では、ＯＲＮは、１０〜５０ヌクレオチドの間の長さである。いくつかの実施形態では、本発明のＯＲＮは、１０〜１００ヌクレオチドの間の長さである。
【００７６】
いくつかの実施形態では、ＯＲＮは、安定化され得る主鎖を有する。一実施形態では、主鎖は、少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、糖リン酸主鎖である。一実施形態では、主鎖は、完全にホスホロチオエートである。ＯＲＮは、少なくとも１つのホスホジエステル様結合を含み得る。いくつかの例では、ホスホジエステル様結合は、ホスホジエステル結合である。
【００７７】
本発明のＯＲＮと、ＴＬＲ７／８モチーフ、すなわちＧＵ含有反復配列、またはＬＴＲ８モチーフ、すなわちＡＵ含有反復配列を有するＯＲＮについて、ＩＦＮ−αと、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１２などの他の炎症性サイトカインの産生の間の明確な相違が観察された。ポリＧ−ポリＵ−ポリＧモチーフ、例えば、配列番号４〜６および８〜１２を有する本発明のＯＲＮは、ＰＢＭＣおよびｐＤＣ刺激時にＩＦＮ−αサイトカイン産生を示したが、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１２産生は示さなかった。
【００７８】
したがって、本発明のＯＲＮは、バックグラウンドと比較して、有意な量のＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−α関連分子を誘導する免疫応答を誘導する能力を有する。バックグラウンドと比較して、有意な量のＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−α関連分子とは、バックグラウンドと比較して、ＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−α関連分子のレベルの２０％を超える変化であることが好ましい。いくつかの実施形態では、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％を超えるものである。他の実施形態では、本発明のＯＲＮによって誘導されるＩＦＮ−αの量は、ＴＬＲ７／８ＯＲＮまたはＴＬＲ８ＯＲＮによって誘導されるＩＦＮ−αの２０％以上である。本発明のＯＲＮによって誘導されるＩＦＮ−αの量は、任意選択により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて３００ｐｇ／ｍｌを超えるものであり得、または１．５μＭを超えるＥＣ５０を有し得る。
【００７９】
ＩＦＮ−α関連分子とは、本明細書において用いる場合、ＩＦＮ−αの発現と関連するサイトカインまたは因子である。これらの分子として、それだけには限らないが、ＭＩＰ１−β、ＩＰ−１０およびＭＩＰ１−αが挙げられる。
【００８０】
本発明は、概して、１つまたは複数の免疫刺激性ＲＮＡモチーフを含む免疫刺激性オリゴリボヌクレオチド、本発明の１つまたは複数の免疫刺激性ＯＲＮを含有する免疫刺激性組成物ならびに本発明の免疫刺激性ＯＲＮおよび免疫刺激性組成物の使用方法に関する。
【００８１】
本明細書において用いる場合、用語「ＲＮＡ」とは、３’−５’ホスホジエステル結合（複数可）により共有結合によって連結している２つ以上のリボヌクレオチド（すなわち、リン酸基、およびプリンまたはピリミジン核酸塩基（例えば、グアニン、アデニン、シトシンまたはウラシル）と連結しているリボース糖を各々含む分子）を指すものとする。
【００８２】
異なる実施形態では、免疫刺激性ＲＮＡモチーフを含む免疫刺激性ＯＲＮは、単一のモチーフまたは２つ以上の免疫刺激性ＲＮＡモチーフを含み得る。単一の免疫刺激性ＯＲＮ中に２つ以上の免疫刺激性ＲＮＡモチーフを有すること、例えば、免疫刺激性ＯＲＮが２つ以上のＴＬＲと結合し得るようモチーフが配置される場合が有利であり得ると考えられている。例えば、免疫刺激性ＯＲＮは、２つ以上のＴＬＲ７受容体と結合し、それによって、得られる免疫刺激性効果を増幅または改変し得る。
【００８３】
免疫刺激性ＯＲＮ中に２つ以上の免疫刺激性ＲＮＡモチーフがある、モチーフは通常、免疫刺激性ＯＲＮの中の任意の位置に生じ得る。例えば、２つのモチーフがある場合、各々、免疫刺激性ＯＲＮの末端に存在し得る。あるいは、１つのモチーフが末端に存在し、１つのモチーフの両末端に、免疫刺激性ＯＲＮの少なくとも１つのさらなるヌクレオチドが隣接する場合もある。さらに別の実施形態では、各モチーフの両末端に、免疫刺激性ＯＲＮの少なくとも１つのさらなるヌクレオチドが隣接する場合もある。
【００８４】
免疫刺激性ＯＲＮとして、それだけには限らないが、左から右に５’から３’方向で示される以下の配列が挙げられる：
ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ  ｒＵ＊ｒＵ＊ｒＵ＊ｒＵ＊ｒＵ＊ｒＵ＊ｒＵ＊ｒＵ＊ｒＵ＊ｒＵ  ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ（配列番号４）、
ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ  ｒＵ＊ｒＵ＊ｒＧ＊ｒＵ＊ｒＵ＊ｒＧ＊ｒＵ＊ｒＵ＊ｒＧ＊ｒＵ  ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ（配列番号５）、
ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ  ｒＵ＊ｒＵ＊ｒＡ＊ｒＵ＊ｒＵ＊ｒＡ＊ｒＵ＊ｒＵ＊ｒＡ＊ｒＵ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ（配列番号６）、
ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ−ｒＵ−ｒＵ−ｒＵ−ｒＵ−ｒＵ−ｒＵ−ｒＵ−ｒＵ−ｒＵ−ｒＵ−ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ（配列番号８）、
ｒＧ＊ｒＵ＊ｒＵ＊ｒＧ＊ｒＵ＊ｒＧ＊ｒＵ＊ｄＧ＊ｄＧ＊ｄＧ＊ｄＧ＊ｄＧ（配列番号１０）、
ｒＧ＊ｒＵ＊ｒＵ＊ｒＧ＊ｒＵ＊ｒＧ＊ｒＵ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ＊ｒＧ（配列番号２１）、
ｒＵ＊ｒＵ＊ｒＧ＊ｒＵ＊ｒＵ＊ｒＧ＊ｒＵ＊ｒＵ＊ｒＧ＊ｒＵ＊ｒＵ＊ｒＧ＊ｒＵ＊ｒＵ＊ｒＧ＊ｒＵ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｇ（配列番号４２）。
【００８５】
他の免疫刺激性ＯＲＮ配列ならびに制御配列は、以下の表１に示す。
【００８６】
上記のように、ＲＮＡは、３’−５’ホスホジエステル結合によってつながっているリボヌクレオチドのポリマーである。特定の実施形態では、本発明の免疫刺激性ＯＲＮは、ＲＮＡである。しかし、本発明の免疫刺激性ＯＲＮは、以下に記載するように、ＲＮＡに限定されない。
【００８７】
本発明の免疫刺激性ＯＲＮは、一実施形態では、１個以上の修飾された核酸塩基、すなわち、Ａ、Ｃ、ＧおよびＵの誘導体を含み得る。これらの修飾された核酸塩基の具体的な実施形態として、それだけには限らないが、５−置換シトシン（例えば、５−メチル−シトシン、５−フルオロ−シトシン、５−クロロ−シトシン、５−ブロモ−シトシン、５−ヨード−シトシン、５−ヒドロキシ−シトシン、５−ヒドロキシメチル−シトシン、５−ジフルオロメチル−シトシンおよび非置換または置換５−アルキニル−シトシン）、６−置換シトシン、Ｎ４−置換シトシン（例えば、Ｎ４−エチル−シトシン）、５−アザ−シトシン、２−メルカプト−シトシン、イソシトシン、シュード−イソシトシン、縮合環系を有するシトシン類似体（例えば、Ｎ，Ｎ’−プロピレンシトシンまたはフェノキサジン）ならびにウラシルおよびその誘導体（例えば、５−フルオロ−ウラシル、５−ブロモ−ウラシル、５−ブロモビニル−ウラシル、４−チオ−ウラシル、５−ヒドロキシ−ウラシル、５−プロピニル−ウラシル）、チミン誘導体（例えば、２−チオチミン、４−チオチミン、６−置換チミン）、グアノシン誘導体（７−デアザグアニン、７−デアザ−７−置換グアニン（例えば、７−デアザ−７−（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニルグアニン）、７−デアザ−８−置換グアニン、ヒポキサンチン、Ｎ２−置換グアニン（例えば、Ｎ２−メチル−グアニン）、８−置換グアニン（例えば、８−ヒドロキシグアニンおよび８−ブロモグアニン）および６−チオグアニン）またはアデノシン誘導体（５−アミノ−３−メチル−３Ｈ，６Ｈ−チアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン−２，７−ジオン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノプリン、プリン、インドール、アデニン、置換アデニン（例えば、Ｎ６−メチル−アデニン、８−オキソ−アデニン））が挙げられる。塩基はまた、ユニバーサル塩基（例えば、４−メチル−インドール、５−ニトロ−インドール、３−ニトロピロール、Ｐ−塩基およびＫ−塩基）、芳香環系（例えば、ベンゾイミダゾールまたはジクロロ−ベンゾイミダゾール、１−メチル−１Ｈ−［１，２，４］トリアゾール−３−カルボン酸アミド）芳香環系（例えば、フルオロベンゼンまたはジフルオロベンゼン）または水素原子（ｄＳｐａｃｅｒ）によって置換され得る。好ましい塩基修飾として、ウラシルおよび７−デアザ−グアニンがある。これらの修飾されたＵ核酸塩基およびその対応するリボヌクレオシドは、民間の供給業者から入手可能である。
【００８８】
修飾されたＧ核酸塩基の具体的な実施形態として、Ｎ２−ジメチルグアニン、７−デアザグアニン、８−アザグアニン、７−デアザ−７−置換グアニン、７−デアザ−７−（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニルグアニン、７−デアザ−８−置換グアニン、８−ヒドロキシグアニンおよび６−チオグアニンが挙げられる。一実施形態では、修飾されたＧ核酸塩基は、８−ヒドロキシグアニンである。これらの修飾されたＧ核酸塩基およびその対応するリボヌクレオシドは、民間の供給業者から入手可能である。
【００８９】
特定の実施形態では、少なくとも１つのβ−リボース単位が、β−Ｄ−デオキシリボースまたは修飾された糖単位によって置換されてもよく、ここで、修飾された糖単位は、例えば、β−Ｄ−リボース、α−Ｄ−リボース、β−Ｌ−リボース（「スピーゲルマー（Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒｓ）」におけるような）、α−Ｌ−リボース、２’−アミノ−２’−デオキシリボース、２’−フルオロ−２’−デオキシリボース、２’−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−リボースから選択され、好ましくは、２’−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−リボースは、２’−Ｏ−メチルリボース、２’−Ｏ−（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル−リボース、２’−［Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル］−リボース、ＬＮＡおよびα−ＬＮＡ（Ｎｉｅｌｓｅｎ  Ｐら（２００２年）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−Ａ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ８：７１２〜２２頁）、β−Ｄ−キシロ−フラノース、α−アラビノフラノース、２’−フルオロアラビノフラノースおよび炭素環式および／または鎖式糖類似体（例えば、Ｖａｎｄｅｎｄｒｉｅｓｓｃｈｅら（１９９３年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ４９：７２２３頁に記載される）および／またはビシクロ糖類似体（例えば、Ｔａｒｋｏｖ  Ｍら（１９９３年）Ｈｅｌｖ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ７６：４８１頁に記載される）から選択される。
【００９０】
本発明の免疫刺激性ＯＲＮの個々のリボヌクレオチドおよびリボヌクレオシドは、あるいは、非ヌクレオチドリンカー、特に、脱塩基リンカー（ｄＳｐａｃｅｒｓ）、トリエチレングリコール単位またはヘキサエチレングリコール単位によって連結されていてもよい。さらなるリンカーとして、Ｃ３、Ｃ６およびＣ１２アミノリンカーなどのアルキルアミノリンカーおよびまた、Ｃ３またはＣ６チオールリンカーなどのアルキルチオールリンカーがある。本発明の免疫刺激性ＯＲＮの個々のヌクレオチドおよびリボヌクレオシドは、あるいは、アルキルまたは置換アルキル基によってさらに置換されていてもよい芳香族残基によって連結されていてもよい。
【００９１】
ＲＮＡは、３’−５’ホスホジエステル結合によってつながっているリボヌクレオチドのポリマーである。本発明の免疫刺激性ＯＲＮのヌクレオチドは、３’−５’ホスホジエステル結合によってつながっている場合もある。しかし、本発明はまた、普通でないヌクレオチド間結合、例えば、具体的に、５’−５’、３’−３’、２’−２’、２’−３’および２’−５’ヌクレオチド間結合を有する免疫刺激性ＯＲＮも包含する。一実施形態では、このような普通でない結合は、免疫刺激性ＯＲＮ内のどこかに１つまたは複数のこのような結合が生じ得るとしても、免疫刺激性ＲＮＡモチーフから排除される。遊離端を有する免疫刺激性ＯＲＮについては、１つの３’−３’ヌクレオチド間結合を含むことは、結果として、２つの遊離５’末端を有する免疫刺激性ＯＲＮとなり得る。逆に、遊離端を有する免疫刺激性ＯＲＮについては、１つの５’−５’ヌクレオチド間結合を含むことは、結果として、２つの遊離３’末端を有する免疫刺激性ＯＲＮとなり得る。
【００９２】
本発明の免疫刺激性組成物は、２つ以上の、分岐単位によって連結され得る免疫刺激性ＲＮＡモチーフを含有し得る。ヌクレオチド間結合は、３’−５’、５’−５’、３’−３’、２’−２’、２’−３’または２’−５’結合であり得る。したがって、用語２’−５’は、リボースの炭素原子に従って選択される。普通でないヌクレオチド間結合は、ホスホジエステル結合であり得るが、あるいは、ホスホロチオエートまたは本明細書に記載される任意の他の修飾された結合のように修飾され得る。以下の式は、本発明の、ヌクレオチドの分岐単位によって分岐している免疫刺激性ＯＲＮの一般構造を示す。したがって、Ｎｕ１、Ｎｕ２およびＮｕ３は、３’−５’、５’−５’、３’−３’、２’−２’、２’−３’または２’−５’結合によって連結され得る。免疫刺激性ＯＲＮの分岐はまた、非ヌクレオチドリンカーおよび脱塩基スペーサーの使用と関わり得る。一実施形態では、Ｎｕ１、Ｎｕ２およびＮｕ３は、同一または異なる免疫刺激性ＲＮＡモチーフを表す。別の実施形態では、Ｎｕ１、Ｎｕ２およびＮｕ３は、少なくとも１つの免疫刺激性ＲＮＡモチーフおよび少なくとも１つの免疫刺激性ＣｐＧ  ＤＮＡモチーフを含む。
【００９３】
【化４】
2010507386.tif 000006
【００９４】
免疫刺激性ＯＲＮは、ダブラー（ｄｏｕｂｌｅｒ）またはトレブラー（ｔｒｅｂｌｅｒ）単位（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ）、特に、３’−３’結合を含む免疫刺激性ＯＲＮを含有し得る。ダブラー（ｄｏｕｂｌｅｒ）単位は、一実施形態では、１，３−ビス−［５−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）ペンチルアミド］プロピル−２−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホルアミダイトに基づいたものであり得る。トレブラー（ｔｒｅｂｌｅｒ）単位は、一実施形態では、Ｔｒｉｓ−２，２，２−［３−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）プロピルオキシメチル］エチル−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホルアミダイトの組み込みに基づいたものであり得る。複数のダブラー（ｄｏｕｂｌｅｒ）、トレブラー（ｔｒｅｂｌｅｒ）または他の増倍単位による免疫刺激性ＯＲＮの分岐は、本発明のさらなる実施形態であるデンドリマーにつながる。分岐した免疫刺激性ＯＲＮは、免疫刺激性ＯＲＮの分岐していない形と比較して異なる免疫効果を有する、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８などの免疫刺激性ＲＮＡの受容体の架橋につながり得る。さらに、分岐した、またはそうでなければ多量体の免疫刺激性ＯＲＮの合成によって、ＲＮＡを分解に対して安定化することができ、弱い、または部分的に有効なＲＮＡ配列が治療上有用なレベルの免疫活性を発揮するのを可能にし得る。免疫刺激性ＯＲＮはまた、ペプチド修飾試薬またはオリゴヌクレオチド修飾試薬（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）に起因するリンカー単位を含有し得る。さらに、免疫刺激性ＯＲＮは、ペプチド（アミド）結合によってポリマーと接続している、１個以上の天然または非天然アミノ酸残基を含有し得る。
【００９５】
本発明の組成物は、二次以上の構造を含む、また含まないポリマーを包含する。例えば、ポリマーは、一実施形態では、少なくとも２つの隣接する水素結合した塩基対によって提供される二次構造を形成できる、ヌクレオシド、ヌクレオシド類似体またはヌクレオシドおよびヌクレオシド類似体の組合せの配列を含む。一実施形態では、少なくとも２つの隣接する水素結合した塩基対は、２セットの少なくとも３個の連続する塩基を伴う。関連する塩基の連続する性質は、いわゆるクランプを形成するのに熱力学的に有利である。しかし、連続する塩基は、特に、高ＧＣ含量および／または延長された配列がある場合、必要でない場合もある。通常、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６個の塩基対がある。水素結合した塩基対は、一実施形態では、従来のワトソン−クリック塩基対、すなわちＧ−Ｃ、Ａ−ＵまたはＡ−Ｔであり得る。他の実施形態では、水素結合した塩基対は、非従来型塩基対、例えば、Ｇ−Ｕ、Ｇ−Ｇ、Ｇ−ＡまたはＵ−Ｕであり得る。さらに他の実施形態では、水素結合した塩基対は、フーグスティーンまたは他の塩基対であり得る。
【００９６】
一実施形態では、二次構造は、ステムループ二次構造である。ステムループまたはヘアピン二次構造は、相補的な、または少なくとも部分的に相補的な配列間の分子内水素結合塩基対形成によって生じ得る。相補的または少なくとも部分的に相補的な配列とは、それぞれ、完全なまたは中断された逆方向反復配列を表す。例えば、５’−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３…Ｘ３’−Ｘ２’−Ｘ１’−３’（ここで、Ｘ１およびＸ１’、Ｘ２およびＸ２’ならびにＸ３およびＸ３’は各々、水素結合した塩基対を形成し得る）によって提供される塩基配列を有するポリマーは、完全なまたは中断された逆方向反復を含む場合があり、折り畳まれ、ステムループ二次構造を形成する可能性を有する。５’−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３…Ｘ３’−Ｘ２’−Ｘ１’−３’（ここで、Ｘ１およびＸ１’、Ｘ２およびＸ２’ならびにＸ３およびＸ３’は各々、水素結合した塩基対を形成し得る）によって提供される塩基配列を有するポリマーはまた、分子間の水素結合した塩基対によって分子間複合体を形成する可能性を有することが認められよう。２つ以上の逆方向反復がある場合、個々のポリマーはまた、相互作用して、二量体の分子間複合体だけでなく高次の分子間複合体または構造を形成する可能性がある。当業者ならば、条件および／または配列は、別のものを上回って二次構造の１種の形成に有利に働くように選択できるということは認識するであろう。
【００９７】
３’−５’、５’−５’、３’−３’、２’−２’、２’−３’および２’−５’ヌクレオチド間結合は、直接または間接であり得る。さらに、ポリＵモチーフは、ポリＧモチーフと直接的または間接的に連結され得る。さらに、ＯＲＮ式のいずれのヌクレオチドも、互いに直接的または間接的に連結され得る。例えば、ＧＧおよび（Ｒ１）ｎは、直接接続され得る。直接結合は、３’−３’結合であり得る。あるいは、ＧＧおよび（Ｒ１）ｎは、間接的に、すなわち、スペーサーまたは非ヌクレオチドリンカーを介して接続されて連結され得る。
【００９８】
これに関連して「直接結合」とは、介在するリンカー部分のない、本明細書に開示されるリン酸結合または修飾されたリン酸結合を指す。介在するリンカー部分は、本明細書に開示されるリン酸結合または修飾されたリン酸結合とは異なる有機部分であり、例えば、ポリエチレングリコール、トリエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール、ｄＳｐａｃｅｒ（すなわち、脱塩基デオキシヌクレオチド）、ダブラー（ｄｏｕｂｌｅｒ）単位またはトレブラー（ｔｒｅｂｌｅｒ）単位を挙げることができる。間接結合は、ヌクレオチド性および非ヌクレオチド性のリンカーおよびスペーサーを含む。
【００９９】
特定の実施形態では、免疫刺激性ＯＲＮは、別の実体とコンジュゲートして、コンジュゲートを提供する。例えば、免疫刺激性ＯＲＮは、ペプチド、タンパク質、低分子量リガンド、脂質部分または核酸とコンジュゲートされ得る。本明細書において用いる場合、コンジュゲートとは、任意の物理化学的手段、例えば、疎水性相互作用および共有結合カップリングによって互いに結合している任意の２つ以上の実体の組合せを指す。
【０１００】
別の実施形態では、免疫刺激性ＯＲＮは、免疫調節性受容体によって認識される低分子量リガンドとコンジュゲートされ得る。この受容体は、ＴＬＲファミリーのメンバー、例えば、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８またはＴＬＲ９であることが好ましい。低分子量リガンドは、これらの受容体の天然リガンドの模倣体である。例として、それだけには限らないが、ＴＬＲ７またはＴＬＲ８のいずれかを刺激する、Ｒ−８４８（レシキモド）、Ｒ−８３７（イミキモド；ＡＬＤＡＲＡ（商標）、３Ｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、７−デアザ−グアノシン、７−チア−８−オキソ−グアノシンおよび７−アリル−８−オキソ−グアノシン（Ｌｏｘｏｒｉｂｉｎｅ）が挙げられる。Ｄ−グルコピラノース誘導体、例えば、３Ｄ−ＭＰＬ（ＴＬＲ４リガンド）もまた、免疫刺激性ＯＲＮとコンジュゲートされ得る。Ｐａｍ３−Ｃｙｓは、免疫刺激性ＯＲＮとコンジュゲートさせることのできるＴＬＲ２リガンドの一例である。ＣｐＧモチーフを含有するオリゴデオキシヌクレオチドとして、ＴＬＲ９リガンドがあり、これらもまた、本発明の免疫刺激性ＯＲＮとコンジュゲートさせることができる。一実施形態では、ＴＬＲ９シグナル伝達を刺激するのに有効なＣｐＧモチーフを含む少なくとも１つのオリゴデオキシヌクレオチドが、本発明の免疫刺激性ＯＲＮとコンジュゲートされている。種々のＴＬＲのリガンドの１分子へのコンジュゲーションは、受容体の多量体化につながり、これが、免疫刺激の増強または任意の単一のこのようなリガンドに起因するものとは異なる免疫刺激性プロフィールをもたらし得る。他の実施形態では、ＣｐＧ  ＯＤＮは、治療法において、コンジュゲートされずに混合されるか、または同時投与される。
【０１０１】
一態様では、本発明は、本発明の免疫刺激性ＯＲＮと親油性部分とのコンジュゲートを提供する。特定の実施形態では、免疫刺激性ＯＲＮは、親油性部分と共有結合によって連結している。親油性部分は、通常、遊離端を有する免疫刺激性ＯＲＮの１つまたは複数の末端に生じるが、特定の実施形態では、親油性部分は、免疫刺激性ＯＲＮに沿ってどこにでも生じ得、したがって、免疫刺激性ＯＲＮが遊離端を有することを必要としない。一実施形態では、免疫刺激性ＯＲＮは、３’末端を有し、親油性部分が３’末端と共有結合によって連結している。親油性基は、通常、コレステリル、修飾されたコレステリル、コレステロール誘導体、還元コレステロール、置換コレステロール、コレスタン、Ｃ１６アルキル鎖、胆汁酸、コール酸、タウロコール酸、デオキシコレート、オレイルリトコール酸、オレオイルコレン酸（ｃｈｏｌｅｎｉｃ  ａｃｉｄ）、糖脂質、リン脂質、スフィンゴ脂質、ステロイドなどのイソプレノイド、ビタミンＥなどのビタミン、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、トリグリセリドなどの脂肪酸エステル、ピレン、ポルフィリン、テキサフィリン（Ｔｅｘａｐｈｙｒｉｎｅ）、アダマンタン、アクリジン、ビオチン、クマリン、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、ジゴキシゲニン（ｄｉｇｏｘｙｇｅｎｉｎ）、ジメトキシトリチル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、シアニン色素（例えば、Ｃｙ３またはＣｙ５）、ヘキスト３３２５８色素、ソラレンまたはイブプロフェンであり得る。特定の実施形態では、親油性部分は、コレステリル、パルミチルおよび脂肪酸アシルから選択される。一実施形態では、親油性部分は、コレステリルである。本発明の免疫刺激性ＯＲＮ中に１つまたは複数のこのような親油性部分を含むことは、それらに、ヌクレアーゼによる分解に対して、なおさらなる安定性を付与すると考えられている。本発明の単一の免疫刺激性ＯＲＮ中に２つ以上の親油性部分がある場合、各親油性部分は、他のものとは独立に選択され得る。
【０１０２】
一実施形態では、親油性基は、免疫刺激性ＯＲＮのヌクレオチドの２’位と結合している。親油性基は、あるいはまたはさらに、免疫刺激性ＯＲＮのヌクレオチドの複素環式核酸塩基と連結され得る。親油性部分は、任意の適した直接または間接結合によって、免疫刺激性ＯＲＮと共有結合によって連結され得る。一実施形態では、結合は直接であり、エステルまたはアミドである。一実施形態では、結合は間接であり、スペーサー部分、例えば、１つまたは複数の脱塩基ヌクレオチド残基、トリエチレングリコール（スペーサー９）またはヘキサエチレングリコール（スペーサー１８）などのオリゴエチレングリコールまたはブタンジオールなどのアルカン−ジオールを含む。
【０１０３】
一実施形態では、本発明の免疫刺激性ＯＲＮは、カチオン性脂質と組み合わされる。カチオン性脂質は、免疫刺激性ＯＲＮの、エンドソーム区画への輸送を補助すると考えられており、エンドソーム区画ではＴＬＲ７が見られる。一実施形態では、カチオン性脂質は、ＤＯＴＡＰ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチル−スルフェート）である。ＤＯＴＡＰは、ポリマーを、細胞中に輸送する、具体的には、エンドソーム区画に輸送し、そこでポリマーをｐＨ依存性に放出し得ると考えられている。ポリマーは、エンドソーム区画にあると、特定の細胞内ＴＬＲと相互作用し、免疫応答の発生に関与するＴＬＲ媒介性シグナル変換経路を誘発し得る。エンドソーム区画への輸送を含む同様の特性を有する他の物質を、ＤＯＴＡＰの代わりに、またはＤＯＴＡＰに加えて用いてもよい。他の脂質製剤として、例えば、ＥＦＦＥＣＴＥＮＥ（登録商標）（特定のＤＮＡ濃縮エンハンサーを含む非リポソーム脂質）およびＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（登録商標）（新規作用性デンドリマー技術）、ＳＭＡＲＴＩＣＬＥＳ（登録商標）（細胞膜を通過すると、正の電荷を有するようになる電荷可逆性粒子）および脂質二重層を使用する安定核酸脂質粒子（Ｓｔａｂｌｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｐｉｄ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（ＳＮＡＬＰｓ））が挙げられる。リポソームは、例えば、Ｎ−［１−（２，３ジオレイルオキシ）−プロピル］−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム（ＤＯＴＭＡ）およびジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）などのカチオン性脂質から形成される、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）およびＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ（商標）として、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬから市販されている。リポソームを作製する方法は、当技術分野で周知であり、多数の刊行物に記載されている。リポソームはまた、Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ  Ｇ（１９８５年）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ３：２３５〜２４１頁に概説されている。他の実施形態では、本発明の免疫刺激性ポリマーは、微粒子、シクロデキストリン、ナノ粒子、ニオソーム、デンドリマー、ポリカチオン性ペプチド、ビロソームおよびウイルス様粒子またはＩＳＣＯＭＳ（登録商標）と組み合わされる。他の実施形態では、ＯＲＮは、カチオン性脂質担体を含まない。本発明のＯＲＮの１つの利点は、このような担体を必要としないことである。
【０１０４】
一実施形態では、本発明の免疫刺激性ＯＲＮは、共有結合によって閉じた、ダンベル型分子の形であり、一次および二次構造の両方を有する。以下に記載されるように、一実施形態では、このような環状オリゴリボヌクレオチドは、介在する二本鎖セグメントによって接続されている２つの一本鎖ループを含む。一実施形態では、少なくとも１つの一本鎖ループは、本発明の免疫刺激性ＲＮＡモチーフを含む。本発明の、他の共有結合によって閉じたダンベル型分子は、キメラＤＮＡ：ＲＮＡ分子を含み、例えば、二本鎖セグメントは、少なくとも部分的にＤＮＡ（例えば、ホモ二量体ｄｓＤＮＡまたはヘテロ二量体ＤＮＡ：ＲＮＡのいずれか）であり、少なくとも１つの一本鎖ループは、本発明の免疫刺激性ＲＮＡモチーフを含む。あるいは、キメラ分子の二本鎖セグメントはＲＮＡである。
【０１０５】
特定の実施形態では、免疫刺激性ＯＲＮは、単離されている。単離された分子とは、実質的に純粋であり、通常、天然では、またはｉｎ  ｖｉｖｏ系において見られる他の物質を、意図される使用にとって実用的かつ適当な程度まで含まない分子である。特に、免疫刺激性ＯＲＮは、例えば、医薬品の製造において有用であるよう、十分に純粋であり、細胞の他の生物学的成分を十分に含まない。本発明の単離された免疫刺激性ＯＲＮは、医薬品において薬学的に許容できる担体と混合され得るので、免疫刺激性ＯＲＮは、医薬品のわずかな重量比率のみを含む場合がある。それにもかかわらず、免疫刺激性ＯＲＮは、生物系において関連している可能性のある物質から実質的に分離されているという点で実質的に純粋である。
【０１０６】
本発明における使用のために、本発明の免疫刺激性ＯＲＮは、当技術分野で公知のいくつかの手順のいずれかを使用して、または適合させて、ｄｅ  ｎｏｖｏ合成できる。例えば、β−シアノエチルホスホルアミダイト法（Ｂｅａｕｃａｇｅ  ＳＬら（１９８１年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ２２：１８５９頁）；ヌクレオシドＨ−ホスホネート法（Ｇａｒｅｇｇ  Ｐら（１９８６年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ２７：４０５１〜４頁；Ｆｒｏｅｈｌｅｒ  ＢＣら（１９８６年）Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １４：５３９９〜４０７頁；Ｇａｒｅｇｇ  Ｐら（１９８６年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ２７：４０５５〜８頁；Ｇａｆｆｎｅｙ  ＢＬら（１９８８年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ２９：２６１９〜２２頁）。これらの化学は、市販されているさまざまな自動化核酸シンセサイザーによって実施できる。本発明に従って有用な、さらなる合成法は、Ｕｈｌｍａｎｎ  Ｅら（１９９０年）Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ９０：５４４〜８４頁およびＧｏｏｄｃｈｉｌｄ  Ｊ（１９９０年）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ１：１６５頁に開示されている。
【０１０７】
オリゴリボヌクレオチド合成は、溶液中または固相支持体上で実施できる。溶液中では、ブロックカップリング反応（二量体、三量体、四量体など）が好ましいが、固相合成は、単量体のビルディングブロックを用いて段階法で実施されることが好ましい。ホスホトリエステル法、Ｈ−ホスホネート法およびホスホルアミダイト法などの種々の化学が記載されている（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ  Ｆ（１９９１年）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ）。ホスホトリエステル法では、反応性リン基が、酸化状態＋Ｖにあるが、ホスホルアミダイトおよびＨ−ホスホネートアプローチのカップリング反応では、より反応性のホスホル＋ＩＩＩ誘導体を用いる。後者の２つのアプローチでは、リンは、カップリングステップ後に酸化されて安定なＰ（Ｖ）誘導体が生じる。酸化剤が、ヨウ素／水／塩基である場合、ホスホジエステルは脱保護後に得られる。対照的に、酸化剤がＢｅａｕｃａｇｅ試薬などの硫化剤である場合、脱保護後にホスホロチオエートが得られる。
【０１０８】
オリゴリボヌクレオチド合成のための効率的な方法として、ＭａｔｔｅｕｃｃｉおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓによる、オリゴデオキシヌクレオチドについて最初に記載されたようなホスホルアミダイト化学を用いる固体支持体合成の組合せがある。Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ  ＭＤら（１９８１年）Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １０３：３１８５頁。
【０１０９】
オリゴリボヌクレオチドの合成は、オリゴデオキシヌクレオチドと類似しているが、オリゴリボヌクレオチド中に存在する２’−ヒドロキシ基は、適したヒドロキシ保護基によって保護されなくてはならないという相違がある。単量体は、例えば、ＲＮＡ単量体ビルディングブロック中の２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基によって保護され得る。しかし、２’−Ｏ−トリイソプロピルシリルオキシメチル（ＴＯＭ）基（ＴＯＭ−Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ−Ｇｒｏｕｐ（商標））を含有する単量体を用いるＲＮＡ合成が、より高いカップリング効率を生じると報告されているが、これは、ＴＯＭ−Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ−Ｇｒｏｕｐは、ＴＢＤＭＳ基よりも低い立体障害を示すためである。ＴＢＤＭＳ保護基はフッ化物を用いて除去されるのに対し、ＴＯＭ基については、室温で、エタノール／水中、メチルアミンを用いて迅速な脱保護が達成される。オリゴ（リボ）ヌクレオチド合成では、３’から５’末端への鎖伸長が好ましく、これは、３’−ホスホル（ＩＩＩ）基またはその活性化された誘導体を有するリボヌクレオチド単位の、別のヌクレオチド単位の遊離５’−ヒドロキシ基とのカップリングによって達成される。
【０１１０】
合成は、好都合なことに、自動化ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを用いて実施できる。したがって、シンセサイザーの供給者によって推奨される合成サイクルを使用してよい。リボヌクレオシドホスホルアミダイト単量体については、カップリング時間は、デオキシヌクレオシド単量体と比較して長い（例えば、４００秒）。固相支持体として、５００〜１０００Å制御孔ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）（ＣＰＧ）支持体または有機ポリマー支持体、例えば、プライマー支持体ＰＳ２００（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用してよい。固相支持体は、通常、最初のヌクレオシド、例えば、その３’末端を介して結合される、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ−６−ベンゾイルアデノシンを含有する。５’−Ｏ−ジメトキシトリチル基をトリクロロ酢酸で切断した後、例えば、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ−保護された２’−Ｏ−ｔブチルジメチルシリル−ヌクレオシド−３’−Ｏ−ホスホルアミダイトを用いて鎖伸長を達成する。連続反復サイクルの後、完成したオリゴリボヌクレオチドを支持体から切断し、濃アンモニア／エタノール（３：１、ｖ：ｖ）を用いて３０℃で２４時間処理によって脱保護する。ＴＢＤＭＳ保護基を、トリエチルアミン／ＨＦを用いて最後に切断する。粗オリゴリボヌクレオチドは、イオン交換高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、イオン対逆相ＨＰＬＣまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって精製し、質量分析によって特性決定できる。
【０１１１】
５’−コンジュゲートの合成は、分子のホスホルアミダイトを、固相合成における末端ヌクレオチドの５’−ヒドロキシ基と連結されるようカップリングすることによって容易である。このようなリガンド、例えば、コレステロール、アクリジン、ビオチン、ソラレン、エチレングリコールまたはアミノアルキル残基の種々のホスホルアミダイト誘導体は、市販されている。あるいは、アミノアルキル基を、固相合成の間に導入することもでき、これによって、活性エステル、イソチオシネート（ｉｓｏｔｈｉｏｃｙｎａｔｅ）またはヨードアセトアミドなどの活性化されたコンジュゲート分子による合成後誘導体化が可能となる。
【０１１２】
３’末端コンジュゲートの合成は、通常、対応して修飾された固相支持体、例えば、市販のコレステロールで誘導体化された固相支持体などを用いて達成される。しかし、コンジュゲーションは、ヌクレオチド間結合、核酸塩基で、またはリボース残基で、例えば、リボースの２’位でも行われ得る。
【０１１３】
環状オリゴリボヌクレオチドについては、オリゴヌクレオチド鎖の伸長は、ヌクレオチドＰＳ固相支持体（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）上で、標準ホスホルアミダイト化学を用いて実施できる。次いで、環化反応を、固相支持体上で、ホスホトリエステルカップリング手順を用いて実施する（Ａｌａｚｚｏｕｚｉら（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ１６：１５１３〜１４頁）。水酸化アンモニウムを用いる最終脱保護では、事実上、溶液になる生成物のみが所望の環状オリゴヌクレオチドである。
【０１１４】
本発明の環状オリゴリボヌクレオチドは、閉じた円形のＲＮＡを含み、二本鎖ＲＮＡを伴うか伴わない一本鎖ＲＮＡを含み得る。例えば、一実施形態では、環状オリゴリボヌクレオチドは、二本鎖ＲＮＡを含み、介在する二本鎖セグメントによって接続されている２つの一本鎖ループを含むダンベルコンホメーションを呈する。共有結合によって閉じた、ダンベル型ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドは、米国特許第６，８４９，７２５号に記載されている。別の実施形態では、環状オリゴリボヌクレオチドは、二本鎖ＲＮＡを含み、介在する二本鎖セグメントによって接続されている３つ以上の一本鎖ループを含むコンホメーションを呈する。一実施形態では、免疫刺激性ＲＮＡモチーフは、１つまたは複数の一本鎖セグメント中に位置する。
【０１１５】
本発明の免疫刺激性ＯＲＮは、単独で、またはアジュバントなどの他の薬剤と組み合わせて有用である。アジュバントとは、本明細書において用いる場合、抗原に応じた免疫細胞活性化、例えば、体液性および／または細胞性免疫応答を増強する抗原以外の物質を指す。アジュバントは、補助細胞の蓄積および／または活性化を促進して、抗原特異的免疫応答を増強する。アジュバントは、抗原に対する防御免疫を誘導するために用いられるワクチン、すなわち、抗原含有組成物の有効性を増強するために用いられる。
【０１１６】
アジュバントは、２つの一般的な機序によって作用することができ、所与のアジュバントまたはアジュバント製剤は、一方または両方の機序によって作用し得る。
【０１１７】
第１の機序は、抗原特異的免疫応答が発生する細胞または部位への抗原の分布に物理的に影響を及ぼすことであり、これは、特異的領域または細胞種をターゲッティングすることを含む抗原の体内分布を変更し、または抗原が身体中にゆっくりと放出され、その結果、抗原に対する免疫細胞の曝露を延長するようなデポー効果を生じさせる送達ビヒクルであり得る。
【０１１８】
このクラスのアジュバントとして、それだけには限らないが、ミョウバン（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム）；鉱油または非鉱油のいずれかから製造された油中水または水中油型エマルジョンを含むエマルジョンベースの製剤が挙げられる。これらは、モンタニド  ＩＳＡ  ７２０（Ｓｅｐｐｉｃ、ＡｉｒＬｉｑｕｉｄｅ、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）、ＭＦ−５９（Ｓｐａｎ８５およびＴｗｅｅｎ８０で安定化された、水中スクアレンエマルジョン；Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、Ｃａｌｉｆ．）、およびＰＲＯＶＡＸ（安定化界面活性剤およびミセル形成剤；ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）などの水中油型エマルジョンであり得る。これらはまた、モンタニド  ＩＳＡ  ５０（オレイン酸マンニドおよび鉱油の油性組成物、Ｓｅｐｐｉｃ）またはモンタニド  ＩＳＡ  ２０６（オレイン酸マンニドおよび鉱油の油性組成物、Ｓｅｐｐｉｃ）などの油中水エマルジョンであり得る。
【０１１９】
第２のアジュバント機序は、免疫応答モディファイヤーまたは免疫刺激性物質としてである。これらは、抗原に対してより良好に提示、認識または応答する免疫細胞の活性化をもたらし、このようにして、抗原特異的応答が、動力学、大きさ、表現型または記憶について増強される。免疫応答モディファイヤーは、通常、Ｔｏｌｌ様受容体などの特異的受容体またはいくつかの他の非ＴＬＲ経路のうちの１つ（例えば、ＲＩＧ−Ｉ）を介して作用するが、いくつかについては経路はまだわかっていない。このクラスのアジュバントとして、それだけには限らないが、Ｑ．サポナリア（ｓａｐｏｎａｒｉａ）樹木の樹皮から精製されたサポニン、例えば、ＱＳ２１（ＨＰＬＣ分画を用いて２１番目のピーク中に溶出する糖脂質；Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ、Ｉｎｃ．、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、Ｍａｓｓ．）；ポリ［ジ（カルボキシラトフェノキシ）ホスファゼン（ＰＣＰＰポリマー；Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＵＳＡ）、Ｆｌｔ３リガンドおよびリーシュマニア伸長因子（精製リーシュマニアタンパク質；Ｃｏｒｉｘａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｅａｔｔｌｅ、Ｗａｓｈ．）が挙げられる。ＴＬＲを介して作用する多数のアジュバントがある。ＴＬＲ４を介して作用するアジュバントとして、リポ多糖の誘導体、例えば、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ；Ｒｉｂｉ  ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｎｃ．、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｍｏｎｔ．）およびムラミルジペプチド（ＭＤＰ；Ｒｉｂｉ）およびトレオニルムラミルジペプチド（ｔ−ＭＤＰ；Ｒｉｂｉ）、ＯＭ−１７４（脂質Ａと関連しているグルコサミンジサッカライド；ＯＭ  Ｐｈａｒｍａ  ＳＡ、Ｍｅｙｒｉｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）が挙げられる。フラジェリンは、ＴＬＲ５を介して作用するアジュバントである。二本鎖ＲＮＡは、ＴＬＲ３を介して作用する。ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８を介して作用するアジュバントとして、ＴＬＲを認識および活性化する、一本鎖ＲＮＡまたはオリゴリボヌクレオチド（ＯＲＮ）および合成低分子量化合物、例えば、イミダゾキノリンアミン（例えば、イミキモド、レシキモド；３Ｍ）が挙げられる。ＴＬＲ９を介して作用するアジュバントとして、ウイルスもしくは細菌起源のＤＮＡまたは合成オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、例えば、ＣｐＧ  ＯＤＮが挙げられる。
【０１２０】
物理的効果および免疫刺激性効果の両方を有するアジュバントは、上記で同定された機能の両方を有する化合物である。このクラスのアジュバントとして、それだけには限らないが、ＩＳＣＯＭＳ（混合サポニン、脂質を含有し、ウイルスの大きさの、抗原を入れることができる孔を有する粒子を形成する免疫刺激性複合体；ＣＳＬ、Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、ＳＢ−ＡＳ２（ＭＰＬおよびＱＳ２１を含有する水中油型エマルジョンであるＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ  アジュバントシステム番号２：ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ［ＳＢＢ］、Ｒｉｘｅｎｓａｒｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）、ＳＢ−ＡＳ４（ミョウバンおよびＭＰＬを含有するＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ  アジュバントシステム番号４；ＳＢＢ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）、ＣＲＬ１００５などのミセルを形成する非イオン性ブロックコポリマー（これらは、ポリオキシエチレンの鎖が隣接する直鎖の疎水性ポリオキシプロピレンを含有する、Ｖａｘｃｅｌ、Ｉｎｃ．、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、Ｇａ．）およびＳｙｎｔｅｘ  アジュバント製剤（ＳＡＦ、Ｔｗｅｅｎ８０および非イオン性ブロックコポリマーを含有する水中油型エマルジョン；Ｓｙｎｔｅｘ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｏｕｌｄｅｒ、Ｃｏｌｏ．）、モンタニドＩＭＳ（例えば、ＩＭＳ１３１２、可溶性免疫賦活薬と組み合わせた水ベースのナノ粒子、Ｓｅｐｐｉｃ）ならびに以下に記載される多数の送達ビヒクルが挙げられる。
【０１２１】
また、本発明の免疫刺激性ポリマーおよび別のアジュバントを含み、他のアジュバントが、キトサンなどのカチオン性多糖またはプロタミンなどのカチオン性ペプチド、ポリエステル、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）または上記の１つまたは複数の共重合体である、組成物が提供される。
【０１２２】
また、本発明の免疫刺激性ＯＲＮおよび別のアジュバントを含み、他のアジュバントがサイトカインである組成物が提供される。一実施形態では、本組成物は、本発明の免疫刺激性ＯＲＮおよびサイトカインのコンジュゲートである。
【０１２３】
サイトカインとは、炎症および免疫応答を媒介する多数の種類の細胞によって産生される、可溶性タンパク質および糖タンパク質である。サイトカインは、免疫系の細胞間の情報交換を媒介し、局所的ならびに全身性に作用して細胞を補充し、その機能および増殖を調節する。サイトカインのカテゴリーは、自然免疫のメディエーターおよび調節因子、適応免疫のメディエーターおよび調節因子ならびに造血の刺激因子を含む。サイトカインの中には、インターロイキン（例えば、中でも、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８およびインターロイキン１９〜３２（ＩＬ−１９〜ＩＬ−３２））、ケモカイン（例えば、中でも、ＩＰ−１０、ランテス、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−３α、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、エオタキシン、Ｉ−ＴＡＣおよびＢＣＡ−１）ならびに１型インターフェロン（例えば、ＩＮＦ−αおよびＩＦＮ−β）、２型インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）をはじめとする他のサイトカインならびにＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦおよびＭ−ＣＳＦをはじめとする種々のコロニー刺激因子（ＣＳＦ）が含まれる。
【０１２４】
また、本発明の免疫刺激性ＯＲＮおよび免疫刺激性ＣｐＧ核酸を含む組成物が提供される。一実施形態では、組成物は、本発明の免疫刺激性ＯＲＮおよびＣｐＧ核酸のコンジュゲート、例えば、ＲＮＡ：ＤＮＡコンジュゲートである。
【０１２５】
免疫刺激性ＣｐＧ核酸とは、本明細書において用いる場合、ＣｐＧモチーフを含み、免疫系の細胞の活性化または増殖を刺激する天然または合成ＤＮＡ配列を指す。免疫刺激性ＣｐＧ核酸は、いくつかの交付済み特許、公開特許出願および他の刊行物、例えば、米国特許第６，１９４，３８８号；同６，２０７，６４６号；同６，２１４，８０６号；同６，２１８，３７１号；同６，２３９，１１６号；および同６，３３９，０６８号に記載されている。一実施形態では、免疫刺激性ＣｐＧ核酸は、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）６〜１００ヌクレオチドの長さである。一実施形態では、免疫刺激性ＣｐＧ核酸は、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）８〜４０ヌクレオチドの長さである。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、ＯＲＮは、ＣＧジヌクレオチドを含む。他の実施形態では、ＯＲＮは、ＣＧジヌクレオチドを含まない。
【０１２７】
免疫刺激性ＣｐＧ核酸は、異なるクラスのＣｐＧ核酸を含む。あるクラスは、Ｂ細胞を活性化するのに強力であるが、ＩＦＮ−αの誘導およびＮＫ細胞活性化においては比較的弱く、このクラスはＢクラスと呼ばれている。ＢクラスＣｐＧ核酸は、通常、十分に安定化されており、特定の好ましい塩基構成内にメチル化されていないＣｐＧジヌクレオチドを含む。例えば、米国特許第６，１９４，３８８号；同６，２０７，６４６号；同６，２１４，８０６号；同６，２１８，３７１号；同６，２３９，１１６号；および同６，３３９，０６８号参照のこと。別のクラスは、ＩＦＮ−αの誘導およびＮＫ細胞活性化に対して強力であるが、Ｂ細胞の刺激では比較的弱く、このクラスはＡクラスと呼ばれている。ＡクラスＣｐＧ核酸は、通常、少なくとも６ヌクレオチドの、回帰性ホスホジエステルＣｐＧジヌクレオチド含有配列および安定化されたポリＧ配列を、５’および３’末端のいずれかまたは両方に有する。例えば、公開された国際特許出願ＷＯ０１／２２９９０参照のこと。さらに別のクラスのＣｐＧ核酸は、Ｂ細胞およびＮＫ細胞を活性化し、ＩＦＮ−αを誘導し、このクラスは、Ｃクラスと呼ばれる。最初に特性決定されたように、ＣクラスＣｐＧ核酸は、通常、十分に安定化されており、Ｂクラス型配列およびＧＣリッチパリンドロームまたはほぼパリンドロームを含む。このクラスは、その全開示内容が参照により本明細書に組み込まれる、公開された米国特許出願第２００３／０１４８９７６号に記載されている。
【０１２８】
免疫刺激性ＣｐＧ核酸はまた、その全開示内容が参照により本明細書に組み込まれる、公開された米国特許出願第２００３／０１４８９７６号に開示されるような、いわゆるソフトおよびセミソフトＣｐＧ核酸を含む。このようなソフトおよびセミソフト免疫刺激性ＣｐＧ核酸は、ヌクレアーゼ耐性およびヌクレアーゼ感受性ヌクレオチド間結合の組合せを組み込み、ここでは、異なる種類の結合が一定の基準に従って配置されている。
【０１２９】
本発明は、一態様では、本発明の免疫刺激性ＯＲＮおよび抗原を含むワクチンを提供する。「抗原」とは、本明細書において用いる場合、Ｔ細胞抗原受容体またはＢ細胞抗原受容体によって認識され得る任意の分子を指す。この用語は、宿主免疫系によって外来性であるとして認識される、いずれの種類の分子も広く含む。抗原とは、通常、それだけには限らないが、細胞、細胞抽出物、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、多糖、多糖コンジュゲート、多糖および他の分子のペプチドおよび非ペプチド模倣体、小分子、脂質、糖脂質、多糖、炭水化物、ウイルスおよびウイルス抽出物および寄生生物などの多細胞生物およびアレルゲンを含む。タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドである抗原に関しては、このような抗原は、このような抗原をコードする核酸分子を含み得る。抗原として、さらに詳しくは、それだけには限らないが、癌細胞および癌細胞中または癌細胞上に発現される分子を含む癌抗原；微生物および微生物中または微生物上に発現される分子を含む微生物抗原；アレルゲンならびに自己反応性Ｔ細胞などの他の疾患関連分子が挙げられる。したがって、本発明は、特定の実施形態では、癌、感染性疾患、アレルギー、耽溺、異常に折り畳まれたタンパク質によって引き起こされる疾患、自己免疫疾患およびコレステロール管理のためのワクチンを提供する。
【０１３０】
感染性疾患に対するワクチンは、予防的なものである場合も、治療的なものである場合もある。ワクチン中の抗原は、完全な生存している（弱毒化された）もの、完全な死滅している／不活化されているもの、組換え型の生存している弱毒化されたもの、精製されたサブユニット、組換え型のサブユニットまたはペプチドであり得る。ワクチンは、さらなるアジュバントまたはアジュバントの組合せをさらに含む場合がある。さらなるアジュバントは、デポー効果を有するもの（例えば、ミョウバン）および、免疫モディファイヤー（例えば、別のＴＬＲアゴニストまたは非ＴＬＲ経路によって作用するもののいずれか）またはこれらの効果の両方を有するアジュバント、例えば、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ（登録商標））であり得る。アジュバントは、以下により詳細に記載される。
【０１３１】
癌に対するワクチンもまた、予防的である場合も、治療的である場合もある。癌抗原は、完全細胞（個々のＤＣワクチン）または１つまたは複数のポリペプチドまたはペプチドであり得る。これらは、通常、担体分子と結合している。ワクチンは、上記のものなどのさらなるアジュバントまたはアジュバントの組合せをさらに含む場合がある。癌抗原は、以下により詳細に論じられる。
【０１３２】
アレルギーを治療するためのワクチンについては、抗原は、アレルゲンまたはアレルゲンの一部である。アレルゲンは、送達ビヒクル内に含有されているか、送達ビヒクルと結合しているかのいずれかであり得る。アレルゲンは、免疫刺激性ＯＲＮと連結させてもよい。アレルゲンは、以下により詳細に論じられる。
【０１３３】
耽溺を治療するためのワクチンは、例えば、ニコチン耽溺、コカイン耽溺、メタンフェタミンまたはヘロイン耽溺を治療するのに有用であり得る。これらの場合における耽溺性分子は、天然分子またはハプテンである。耽溺に対するワクチンに含めるための「抗原」は、通常、小分子であり、担体タンパク質または他の担体粒子とコンジュゲートされる場合もあり、ウイルス様粒子中に組み込まれる場合もある。
【０１３４】
異常に折り畳まれたタンパク質によって引き起こされた疾患を治療するためのワクチンは、伝染性海綿状脳症（クロイツフェルト・ヤコブ病の異型）などの疾患を治療するのに有用であり得る。この場合において「抗原」は、スクレイピープリオンであり、担体タンパク質または生存弱毒化ベクターと結合させることができる。アルツハイマー病に対するワクチンの一例として、例えば、β−アミロイドペプチドまたはタンパク質を標的とするワクチンがある。
【０１３５】
自己免疫疾患を治療するためのワクチンも提供される。これらのワクチンは、自己免疫細胞が認識する分子が同定されている自己免疫疾患を治療するのに有用であり得る。例えば、ミエリンと反応する自己反応性Ｔ細胞に対するワクチンは、多発性硬化症を治療するのに使用される。
【０１３６】
心血管疾患および状態を治療するのに有用なワクチンも提供される。このワクチンは、この疾患の病因論の一因となっているとわかっている分子、例えば、リポタンパク質、コレステロールおよびコレステロール代謝に関与する分子を標的とし得る。コレステロールを管理するためのワクチンは、例えば、抗原としてコレステロールエステル輸送タンパク質（ＣＥＴＰ）を含む。ＣＥＴＰは、アテローム産生抑制性アポＡ−Ｉ含有ＨＤＬ粒子からアテローム生成的アポＢ含有ＶＬＤＬおよびＬＤＬへのコレステロールの交換を促進する。このようなワクチンは高コレステロールを治療するため、またはアテローム性動脈硬化症の進行を遅延するために使用できる。このワクチンは、標的分子がわかっている他の心血管疾患および状態を治療するために使用できる。
【０１３７】
本発明は、一態様では、対象にワクチン接種するための医薬の調製のための本発明の免疫刺激性ＯＲＮの使用を提供する。
【０１３８】
本発明は、一態様では、ワクチンを調製する方法を提供する。本方法は、本発明の免疫刺激性ＯＲＮを、抗原と、および任意選択により、薬学的に許容できる担体と密接な関係に置くステップを含む。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、免疫刺激性ＯＲＮおよび抗原またはアレルゲンはコンジュゲートされている。抗原および免疫刺激性ＯＲＮは、直接コンジュゲートされていてもよく、またはそれらはリンカーを介して間接的にコンジュゲートされていてもよい。
【０１４０】
種々の実施形態では、抗原は、微生物抗原、癌抗原またはアレルゲンである。「微生物抗原」とは、本明細書において用いる場合、微生物の抗原であり、それだけには限らないが、ウイルス、細菌、寄生生物および真菌を含む。このような抗原は、無傷の微生物ならびにその自然分離体および断片または誘導体ならびにまた、天然微生物抗原と同一または類似であり、その微生物に特異的な免疫応答を誘導する合成化合物を含む。化合物は、天然微生物抗原に対する免疫応答（体液性および／または細胞性）を誘導する場合に天然微生物抗原と類似である。このような抗原は、当技術分野では日常的に用いられ、当業者には周知である。
【０１４１】
ウイルスは、小さな感染性病原体であり、通常、核酸コアおよびタンパク質コートを含有するが、生物から独立していない。ウイルスはまた、タンパク質を欠く感染性核酸の形をとり得る。ウイルスは、その中で複製できる生細胞の不在下では生存できない。ウイルスは、エンドサイトーシスまたはＤＮＡ（ファージ）の直接注射のいずれかによって特定の生細胞に侵入し、増殖し、疾患を引き起こす。次いで、増殖したウイルスが放出され、さらなる細胞に感染し得る。一部のウイルスは、ＤＮＡ含有ウイルスであるが、他のものは、ＲＮＡ含有ウイルスである。いくつかの態様では、本発明はまた、プリオンが疾患進行に関係している疾患、例えば、ウシ海綿状脳症（すなわち狂牛病、ＢＳＥ）または動物におけるスクレイピー感染またはヒトにおけるクロイツフェルト・ヤコブ病などを治療することを意図する。
【０１４２】
ウイルスとして、それだけには限らないが、エンテロウイルス（それだけには限らないが、ピコナウイルス科のウイルス、例えば、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルスを含む）、ロタウイルス、アデノウイルスおよびＡ型、Ｂ型、Ｃ型Ｄ型およびＥ型肝炎などの肝炎ウイルスが挙げられる。ヒトにおいて見られたウイルスの特定の例として、それだけには限らないが、以下が挙げられる：レトロウイルス科（例えば、ヒト免疫不全ウイルス、例えば、ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩとも呼ばれる、ＬＡＶまたはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶまたはＨＩＶ−ＩＩＩ；および他の分離株、例えば、ＨＩＶ−ＬＰ；ピコナウイルス科（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）；カリシウイルス科（例えば、胃腸炎を引き起こす株）；トガウイルス科（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；フラビウイルス科（例えば、デングウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；コロナウイルス科（例えば、コロナウイルス）；ラブドウイルス科（例えば、水泡性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科（例えば、エボラウイルス）；パラミクソウイルス科（例えば、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス）；オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルス）；ブニヤウイルス科（例えば、ハンタンウイルス、ブニヤウイルス、フレボウイルスおよびナイロウイルス）；アレナウイルス科（出血熱ウイルス）；レオウイルス科（例えば、レオウイルス、オルビウイルスおよびロタウイルス）；ビルナウイルス科；ヘパドナウイルス科（Ｂ型肝炎ウイルス）；パルボウイルス科（パルボウイルス）；パポバウイルス科（Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ）（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；アデノウイルス科（ほとんどのアデノウイルス）；ヘルペスウイルス科（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１および２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ））；ポックスウイルス科（痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；イリドウイルス科（例えば、アフリカブタ熱ウイルス）；および他のウイルス急性咽頭気管支炎ウイルス、アルファウイルス、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ニパーウイルス、ノーウォークウイルス、パピローマウイルス、パラインフルエンザウイルス、鳥インフルエンザ、ＳＡＲｓウイルス、ウエストナイルウイルス。
【０１４３】
細菌は、二分裂によって無性生殖的に増殖する単細胞生物である。それらは、形態学、染色反応、栄養および代謝性要求、抗原構造、化学組成および遺伝的相同性に基づいて分類され、名づけられている。細菌は、その形態学的な形、球状（球菌）、直鎖状の桿状体（桿菌）および曲がったまたはらせん状の桿状体（ビブリオ、カンピロバクター、スピリルムおよびスピロヘータ）に基づいて３つの群に分類され得る。細菌はまた、より通常は、その染色反応に基づいて、２つのクラスの生物、グラム陽性およびグラム陰性に特性決定される。グラムとは、微生物学実験室において、よく実施される染色法を指す。グラム陽性生物は、染色手順後に染色剤を保持し、濃い紫色に見える。グラム陰性生物は、染色剤を保持しないが、対比染色剤を取り込み、ピンク色に見える。
【０１４４】
感染性細菌は、それだけには限らないが、グラム陰性菌およびグラム陽性菌を含む。グラム陽性菌として、それだけには限らないが、パスツレラ種、スタフィロコッカス種およびストレプトコッカス種が挙げられる。グラム陰性菌として、それだけには限らないが、大腸菌、シュードモナス種およびサルモネラ種が挙げられる。感染性細菌の特定の例として、それだけには限らないが、以下が挙げられる：ピロリ菌、ボレリア・ブルグドルフェリ、レジオネラ・ニューモフィリア（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ）、マイコバクテリア種（例えば、結核菌、鳥結核菌、Ｍ．イントラセルラーレ、Ｍ．カンサシ、Ｍ．ゴルドネ）、黄色ブドウ球菌、淋菌、髄膜炎菌、リステリア菌、化膿性連鎖球菌（グループＡストレプトコッカス）、ストレプトコッカス・アガラクチア（グループＢストレプトコッカス）、ストレプトコッカス（ビリダンス群）、ストレプトコッカス・フェカリス、ストレプトコッカス・ボビス、ストレプトコッカス（嫌気性種）、肺炎連鎖球菌、病原性カンピロバクター種、エンテロコッカス種、インフルエンザ菌、炭疽菌、コリネバクテリウム・ジフテリエ、コリネバクテリウム種、ブタ丹毒菌、クロストリジウム・パーフリンジェンス、クロストリジウム・テタニ、エンテロバクター・アエロゲネス、肺炎桿菌、パスツレラ・マルトシダ、バクテロイド種、フソバクテリウム・ヌクレアタム、ストレプトバチルス・モニリフォルミス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、梅毒トレポネーマ、トレポネーマ・ペルテニュー（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐｅｒｔｅｎｕｅ）、レプトスピラ、リケッチアおよびアクチノミセス・イスラエリ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｓｒａｅｌｌｉ）。
【０１４５】
寄生生物とは、生存するために他の生物に依存しており、したがって、その生活環を継続するために別の生物に侵入または感染してなくてはならない生物である。感染した生物、すなわち、宿主は、寄生生物に栄養および生育地の両方を提供する。広い意味では、この用語、寄生生物は、すべての感染性病原体（すなわち、細菌、ウイルス、真菌、原虫および蠕虫）を含み得るが、一般的に言えば、この用語は、もっぱら原虫、蠕虫および外寄生生物性節足動物（例えば、マダニ、ダニなど）を指すよう用いられる。原虫とは、細胞内および細胞外の両方で、特に、血液、腸管または組織の細胞外マトリックスにおいて増殖できる単細胞生物である。蠕虫とは、ほとんど細胞外である多細胞生物である（トリキネラ種は例外である）。蠕虫は、普通、増殖するには、一次宿主から出て、二次宿主に伝染する必要がある。これらの上記のクラスとは対照的に、外寄生生物性節足動物は、宿主身体の外表面と寄生関係を形成する。
【０１４６】
寄生生物は、細胞内寄生生物および偏性細胞内寄生生物を含む。寄生生物の例として、それだけには限らないが、熱帯熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、二日熱マラリア原虫、ネズミバベシア、バベシア・ディバージェンス（Ｂａｂｅｓｉａ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ）、トリパノソーマ・クルージ、トキソプラズマ原虫、トリキナ、森林型熱帯リーシュマニア、ドノバンリーシュマニア、ブラジルリーシュマニア、熱帯リーシュマニア、ガンビアトリパノソーマ、ローデシアトリパノソーマおよびマンソン住血吸虫が挙げられる。
【０１４７】
真菌は、真核生物であり、そのうちほんのわずかなものだけが、脊椎動物哺乳類に感染を引き起こす。真菌は真核生物であるので、原核生物の細菌とは大きさ、構造的構成、生活環および増殖の機序が大きく異なる。真菌は、通常、形態学的特徴、生殖様式および培養特徴に基づいて分類される。真菌は、対象において種々の種類の疾患、例えば、真菌抗原の吸入後の呼吸器アレルギー、毒性物質、例えば、タマゴテングダケ毒素および毒キノコによって産生されるファロトキシンおよびアスペルギルス種によって産生されるアフラトキシンの経口摂取による真菌中毒を引き起こし得るが、すべての真菌が感染性疾患を引き起こすわけではない。
【０１４８】
感染性真菌は、全身性感染症または表在性感染症を引き起こし得る。一次全身性感染症は、正常な健常な対象において起こり得、日和見感染症は、免疫低下対象において最も高い頻度で見られる。一次全身性感染症を引き起こす最も一般的な真菌病原体として、ブラストミセス属、コクシジオイデス属およびヒストプラズマ属がある。免疫低下または免疫抑制対象において日和見感染症を引き起こす一般的な真菌として、それだけには限らないが、カンジダ・アルビカンス、クリプトコッカス・ネオフォルマンスおよび種々のアスペルギルス種が挙げられる。全身性真菌感染症は、内部臓器の侵襲的感染である。これらの生物は、通常、肺、消化管または静脈内カテーテルを通って身体に侵入する。こういった種類の感染は、一次病原性真菌または日和見感染真菌によって引き起こされ得る。
【０１４９】
表在性真菌感染は、内部組織への侵入を伴わない外表面での真菌の増殖を伴う。典型的表在性真菌感染として、皮膚、毛髪または爪が関与する皮膚真菌感染症が挙げられる。
【０１５０】
真菌感染と関連している疾患として、アスペルギルス症、ブラストミセス症、カンジダ症、黒色分芽菌症、コクシジオイデス症、クリプトコッカス症、真菌性眼感染症、真菌性毛髪、爪および皮膚感染症、ヒストプラスマ症、ロボ真菌症、菌腫、外耳道真菌症、パラコクシジオイデス症、播種性ペニシリウム・マルネフェイ、フェオフィオ真菌症、リノスポリジウム症、スポロトリクム症および接合菌症が挙げられる。
【０１５１】
他の医学的に関連のある微生物は、文献に広く記載されている。例えば、その全開示内容が参照により本明細書に組み込まれるＣ．Ｇ．Ａ  Ｔｈｏｍａｓ、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｂａｉｌｌｉｅｒｅ  Ｔｉｎｄａｌｌ、Ｇｒｅａｔ  Ｂｒｉｔａｉｎ  １９８３年参照のこと。上記で列挙された各々は、例示であり、限定しようとするものではない。
【０１５２】
本明細書において用いる場合、用語「癌抗原」および「腫瘍抗原」は、腫瘍または癌細胞と関係しており、主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）分子との関連で、抗原提示細胞の表面に発現されると免疫応答を誘発できる化合物、例えば、ペプチド、タンパク質または糖タンパク質を指すよう同義的に用いられる。癌細胞によって差次的に発現される癌抗原は、そのために、癌細胞を標的とするために利用できる。癌抗原は、明らかに腫瘍特異的な免疫応答を刺激できる可能性がある抗原である。これらの抗原の中にはコードされているものもあるが、必ずしも、正常な細胞によって発現されるわけではない。これらの抗原は、正常細胞では、通常、サイレントである（すなわち、発現されない）もの、特定の分化ステージでのみ発現されるものおよび胚抗原および胎児抗原などの一時的に発現されるものと特徴付けることができる。他の癌抗原は、突然変異細胞遺伝子、例えば、癌遺伝子（例えば、活性化ｒａｓ癌遺伝子）、サプレッサー遺伝子（例えば、突然変異ｐ５３）、内部欠失または染色体転位置に起因する融合タンパク質によってコードされる。さらに他の癌抗原は、ＲＮＡおよびＤＮＡ腫瘍ウイルスで運ばれるものなど、ウイルス遺伝子によってコードされる場合もある。
【０１５３】
癌抗原は、例えば、Ｃｏｈｅｎ  ＰＡら（１９９４年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５４：１０５５〜８頁に記載されるように、癌細胞の粗抽出物を調製することによって、抗原を部分精製することによって、組換え技術によってまたは既知抗原のｄｅ  ｎｏｖｏ合成によってのいずれかで癌細胞から調製できる。癌抗原は、それだけには限らないが、組換え発現される抗原、腫瘍または癌またはその細胞の免疫原性部分または全体を含む。このような抗原は、単離、または組換えによって、もしくは当技術分野で公知の任意の他の手段によって調製できる。
【０１５４】
腫瘍抗原の例として、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）、アデノシンデアミナーゼ結合タンパク質（ＡＤＡｂｐ）、シクロフィリンｂ、結腸直腸関連抗原（ＣＲＣ）−−Ｃ０１７−１Ａ／ＧＡ７３３、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）およびその免疫原性エピトープＣＡＰ−１およびＣＡＰ−２、ｅｔｖ６、ａｍｌ１、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）およびその免疫原性エピトープＰＳＡ−１、ＰＳＡ−２およびＰＳＡ−３、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、Ｔ細胞受容体／ＣＤ３−ζ鎖、ＭＡＧＥファミリーの腫瘍抗原（例えば、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ７、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１１、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−Ｘｐ２（ＭＡＧＥ−Ｂ２）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ３（ＭＡＧＥ−Ｂ３）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ４（ＭＡＧＥ−Ｂ４）、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、ＭＡＧＥ−Ｃ３、ＭＡＧＥ−Ｃ４、ＭＡＧＥ−Ｃ５）、ＧＡＧＥファミリーの腫瘍抗原（例えば、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７、ＧＡＧＥ−８、ＧＡＧＥ−９）、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ−１、ＮＡＧ、ＧｎＴ−Ｖ、ＭＵＭ−１、ＣＤＫ４、チロシナーゼ、ｐ５３、ＭＵＣファミリー、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｐ２１ｒａｓ、ＲＣＡＳ１、α−フェトプロテイン、Ｅ−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニンおよびγ−カテニン、ｐ１２０ｃｔｎ、ｇｐ１００Ｐｍｅｌ１１７、ＰＲＡＭＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｃｄｃ２７、大腸腺腫症タンパク質（ＡＰＣ）、フォドリン、コネキシン３７、Ｉｇ−イディオタイプ、ｐ１５、ｇｐ７５、ＧＭ２およびＧＤ２  ガングリオシド、ヒトパピローマウイルスタンパク質などのウイルス産物、Ｓｍａｄファミリーの腫瘍抗原、ｌｍｐ−１、Ｐ１Ａ、ＥＢＶによってコードされる核抗原（ＥＢＮＡ）−１、脳グリコーゲンホスホリラーゼ、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−２（ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０）、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−４、ＳＳＸ−５、ＳＣＰ−１およびＣＴ−７およびｃ−ｅｒｂＢ−２が挙げられる。この羅列は限定しようとするものではない。
【０１５５】
「アレルゲン」とは、本明細書において用いる場合、ＩｇＥの生成を特徴とする免疫応答を誘発できる分子である。アレルゲンはまた、感受性対象においてアレルギー反応または喘息症状を誘導し得る物質である。したがって、この発明との関連では、用語「アレルゲン」とは、ＩｇＥ抗体によって媒介されるアレルギー反応の誘引となり得る特定の種類の抗原を意味する。
【０１５６】
アレルゲンの羅列は、膨大なものであり、花粉、昆虫毒液、動物のフケ粉塵、真菌胞子および薬物（例えば、ペニシリン）を含み得る。天然の動物および植物アレルゲンの例として、以下の属に特異的なタンパク質が挙げられる：イヌ属（Ｃａｎｉｓ）（ケイネス・ファミリアリス（Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ））；ヒョウヒダニ属（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ）（例えば、コナヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｆａｒｉｎａｅ））；ネコ属（ｆｅｌｉｓ）（フェリス・ドメスティカス（Ｆｅｌｉｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ））；ブタクサ属（Ａｍｂｒｏｓｉａ）（ブタクサ（Ａｍｂｒｏｓｉａ  ａｒｔｅｍｉｓｉｉｆｏｌｉａ））；ドクムギ属（Ｌｏｌｉｕｍ）（例えば、ホソムギ（Ｌｏｌｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅ）およびイタリアンライグラス（Ｌｏｌｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ））；スギ属（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ）（スギ（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ））；アルテルナリア属（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）（アルテルナリア・アルテナータ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ａｌｔｅｒｎａｔａ））；アルダー（Ａｌｄｅｒ）；ハンノキ属（Ａｌｎｕｓ）（アルヌス・グルティノサ（Ａｌｎｕｓ  ｇｕｌｔｉｎｏｓａ））；カバノキ属（Ｂｅｔｕｌａ）（ビーチ（Ｂｅｔｕｌａ  ｖｅｒｒｕｃｏｓａ））；カシ属（Ｑｕｅｒｃｕｓ）（ホワイトオーク（Ｑｕｅｒｃｕｓ  ａｌｂａ））；オリーブ属（Ｏｌｅａ）（オレア・ユーロパ（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａ））；ヨモギ属（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ）（オウシュウヨモギ（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ））；オオバコ属（Ｐｌａｎｔａｇｏ）（例えば、ヘラオオバコ（Ｐｌａｎｔａｇｏ  ｌａｎｃｅｏｌａｔａ））；ヒカゲミズ属（Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ）（例えばパリエタリア・オフィチナリス（Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）およびパリエタリア・ユダイカ（Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ  ｊｕｄａｉｃａ））；チャバネゴキブリ属（Ｂｌａｔｔｅｌｌａ）（例えば、チャバネゴキブリ（Ｂｌａｔｔｅｌｌａ  ｇｅｒｍａｎｉｃａ））；ミツバチ属（Ａｐｉｓ）（例えば、アピス・ムルティフロルム（Ａｐｉｓ  ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ））；イトスギ属（Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ）（例えば、クプレッサス・センペルビレンス（Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ  ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ）、クプレッサス・アリゾニカ（Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ  ａｒｉｚｏｎｉｃａ）およびモントレーイトスギ（Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ  ｍａｃｒｏｃａｒｐａ））；ビャクシン属（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ）（例えば、ジュニペラス・サビノイデス（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ  ｓａｂｉｎｏｉｄｅｓ）、ジュニペラス・ビルギニアナ（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ  ｖｉｒｇｉｎｉａｎａ）、ジュニペラス・コムニス（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）およびジュニペラス・アシェイ（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ  ａｓｈｅｉ））；クロベ属（Ｔｈｕｙａ）（例えばツヤ・オリエンタリス（Ｔｈｕｙａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ））；ヒノキ属（Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ）（例えば、ヒノキ（Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ  ｏｂｔｕｓａ））；ゴキブリ属（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ）（例えば、ワモンゴキブリ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ））；���モジグサ属（Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ）（例えば、シバムギ（Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ  ｒｅｐｅｎｓ））；ライムギ属（Ｓｅｃａｌｅ）（例えば、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ））；コムギ属（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）（例えば、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ））；カモガヤ属（Ｄａｃｔｙｌｉｓ）（例えば、オーチャードグラス（Ｄａｃｔｙｌｉｓ  ｇｌｏｍｅｒａｔａ））；ウシノケグサ属（Ｆｅｓｔｕｃａ）（例えば、ヒロハノウシノケグサ（Ｆｅｓｔｕｃａ  ｅｌａｔｉｏｒ））；イチゴツナギ属（Ｐｏａ）（例えば、ナガハグサ（Ｐｏａ  ｐｒａｔｅｎｓｉｓ）およびコイチゴツナギ（Ｐｏａ  ｃｏｍｐｒｅｓｓａ））；カラスムギ属（Ａｖｅｎａ）（例えば、マカラスムギ（Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ））；シラゲガヤ属（Ｈｏｌｃｕｓ）（例えば、シラゲガヤ（Ｈｏｌｃｕｓ  ｌａｎａｔｕｓ））；ハルガヤ属（Ａｎｔｈｏｘａｎｔｈｕｍ）（例えば、ハルガヤ（Ａｎｔｈｏｘａｎｔｈｕｍ  ｏｄｏｒａｔｕｍ））；オオカニツリ属（Ａｒｒｈｅｎａｔｈｅｒｕｍ）（例えば、オオカニツリ（Ａｒｒｈｅｎａｔｈｅｒｕｍ  ｅｌａｔｉｕｓ））；コヌカグサ属（Ａｇｒｏｓｔｉｓ）（例えば、コヌカグサ（Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ａｌｂａ））；アワガエリ属（Ｐｈｌｅｕｍ）（例えば、オオアワガエリ（Ｐｈｌｅｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ））；クサヨシ属（Ｐｈａｌａｒｉｓ）（例えば、クサヨシ（Ｐｈａｌａｒｉｓ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ））；スズメノヒエ属（Ｐａｓｐａｌｕｍ）（例えば、アメリカスズメノヒエ（Ｐａｓｐａｌｕｍ  ｎｏｔａｔｕｍ））；モロコシ属（Ｓｏｒｇｈｕｍ）（例えば、セイバンモロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｈａｌｅｐｅｎｓｉｓ））；およびスズメノチャヒキ属（Ｂｒｏｍｕｓ）（例えば、コスズメノチャヒキ（Ｂｒｏｍｕｓ  ｉｎｅｒｍｉｓ））。
【０１５７】
本発明は、一態様では、本発明の免疫刺激性ＯＲＮおよび抗原のコンジュゲートを提供する。一実施形態では、本発明の免疫刺激性ＯＲＮは、抗原と共有結合によって連結している。免疫刺激性ＯＲＮと抗原との間の共有結合は、免疫刺激性ＯＲＮおよび抗原が、そのようにつながる場合に、各々個々の成分の測定可能な機能活性を保持するという条件で、任意の適した種類の共有結合であり得る。一実施形態では、共有結合は直接である。別の実施形態では、共有結合は、例えば、リンカー部分を介して間接である。共有結合によって連結している免疫刺激性ＯＲＮおよび抗原は、一方が他方から放出されるよう細胞内で処理され得る。このようにして、いずれかの成分の細胞への送達は、別個の調製物または別個の成分として投与される場合のその送達と比較して増強され得る。一実施形態では、抗原は、それ自体抗原である、すなわち、前もって作られた抗原である。
【０１５８】
一態様では、本発明は、本発明の組成物を、送達ビヒクルと関連して含む医薬組成物を提供する。種々の実施形態では、送達ビヒクルは、カチオン性脂質、リポソーム、コクリート（ｃｏｃｈｌｅａｔｅ）、ビロソーム、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ（登録商標））、微粒子、ミクロスフェア、ナノスフェア、単層リポソーム（ＬＵＶ）、多重膜ベシクル、エマルソーム（ｅｍｕｌｓｏｍｅ）およびポリカチオン性ペプチド、リポプレックス、ポリプレックス、リポポリプレックス、油中水型（Ｗ／Ｏ）エマルジョン、水中油型（Ｏ／Ｗ）エマルジョン、水中油中水型（Ｗ／Ｏ／Ｗ）マルチプルエマルジョン、マイクロエマルジョン、ナノエマルジョン、ミセル、デンドリマー、ビロソーム、ウイルス様粒子、ポリマーナノ粒子（例えば、ナノスフェアまたはナノカプセル）、ポリマー微粒子（例えば、ミクロスフェアまたはマイクロカプセル）、キトサン、シクロデキストリン、ニオソームまたはＩＳＣＯＭ（登録商標）および任意選択により、薬学的に許容できる担体から選択され得る。
【０１５９】
薬学的に許容できる担体は、以下に論じられている。本発明の医薬組成物は、抗原を、任意選択によりさらに含み得る。本発明の組成物を、任意の適した方法を用いて、存在する場合抗原とともに、送達ビヒクルと物理的に関連させる。免疫刺激性組成物は、送達ビヒクル内に含有されてもよく、または、送達ビヒクルの溶媒にさらされる表面上に、もしくは表面と結合して存在してもよい。一実施形態では、免疫刺激性ＯＲＮは、送達ビヒクルの溶媒にさらされる表面上に存在するか、表面と結合しており、抗原は、存在する場合、送達ビヒクル内に含有される。別の実施形態では、免疫刺激性ＯＲＮおよび抗原は両方とも、送達ビヒクルの溶媒にさらされる表面上に存在するか、表面と結合している。さらに別の実施形態では、抗原は、送達ビヒクルの溶媒にさらされる表面上に存在するか、表面と結合しており、免疫刺激性ＯＲＮは、送達ビヒクル内に含有されている。さらに別の実施形態では、抗原が含まれる場合、免疫刺激性ＯＲＮおよび抗原の両方とも、送達ビヒクル内に含有される。
【０１６０】
本発明はまた、本発明の免疫刺激性組成物を使用する方法を提供する。一態様では、本発明は、免疫細胞を活性化する方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、免疫細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで有効量の本発明の組成物と接触させて、免疫細胞を活性化するステップを含む。本発明の組成物は、抗原を任意選択により含み得る。「免疫細胞」とは、本明細書において用いる場合、自然または獲得免疫応答に関与し得る任意の骨髄由来細胞を指す。免疫系の細胞として、限定されるものではないが、樹状細胞（ＤＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、マクロファージ、顆粒球、Ｂリンパ球、血漿細胞、Ｔリンパ球およびその前駆体細胞が挙げられる。いくつかの実施形態では、免疫細胞はＴＬＲ７発現細胞である。
【０１６１】
本明細書において用いる場合、用語「有効量」とは、所望の生物学的効果を引き起こすのに必要であるか、十分である物質の量を指す。有効量は、単回投与で投与される量であり得るが、これに限定される必要はない。
【０１６２】
本明細書において用いる場合、用語「免疫細胞を活性化する」とは、免疫細胞が、免疫応答と関連している活性化された状態に入るのを誘導することを指す。用語「免疫細胞を活性化する」とは、免疫応答を誘導および増強することの両方を指す。本明細書において用いる場合、用語「免疫応答」とは、増殖し、エフェクター免疫機能を発揮し、または免疫応答に関与する遺伝子産物を産生するための免疫細胞の活性化を反映する、自然または獲得免疫応答の任意の側面を指す。免疫応答に関与する遺伝子産物として、免疫機能に特有の、分泌産物（例えば、抗体、サイトカインおよびケモカイン）ならびに細胞内および細胞表面分子（例えば、特定の表面抗原分類（ＣＤ）抗原、転写因子および遺伝子転写物）が挙げられる。用語「免疫応答」は、単細胞に、または細胞の集団に当てはまり得る。
【０１６３】
サイトカインの産生は、当技術分野で周知のいくつかの方法、例えば、生物学的応答アッセイ、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、細胞内蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析および逆転写酵素／ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）のいずれかによって評価できる。一実施形態では、免疫応答は、ＩＦＮ−αの産生を伴う。
【０１６４】
一実施形態では、免疫応答は、免疫細胞活性化の細胞表面マーカー、例えば、ＣＤ２５、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ１５４のアップレギュレーションを伴う。このようなマーカーの細胞表面発現を測定する方法は、当技術分野で周知であり、ＦＡＣＳ分析が挙げられる。
【０１６５】
細胞または細胞集団における免疫応答の測定のために、一実施形態では、細胞または細胞集団はＴＬＲ７を発現する。細胞が、ＴＬＲを天然に発現する場合もあり、またはＴＬＲの適した発現ベクターを細胞に導入することによってＴＬＲを発現するよう操作してもよい。一実施形態では、細胞または細胞集団は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）として得られる。一実施形態では、細胞または細胞集団は、ＴＬＲを発現する細胞株として得られる。一実施形態では、細胞または細胞集団は、ＴＬＲを発現する一時的な形質転換体として得られる。一実施形態では、細胞または細胞集団は、ＴＬＲを発現する安定な形質転換体として得られる。
【０１６６】
また、細胞または細胞集団における免疫応答の測定において使用するには、細胞または細胞集団に、ＴＬＲによる細胞内シグナル伝達に反応性であるリポーター構築物を導入することが好都合であり得る。一実施形態では、このようなリポーターは、ＮＦ−κＢプロモーターの制御下に置かれた遺伝子である。一実施形態では、プロモーターの制御下に置かれた遺伝子はルシフェラーゼである。活性化の適した条件下では、ルシフェラーゼリポーター構築物が発現され、検出可能な光シグナルを放射し、これはルミノメーターを用いて定量的に測定できる。このようなリポーター構築物および他の適したリポーター構築物は、市販されている。
【０１６７】
本発明はまた、細胞を含まないＴＬＲ活性化を検出する方法の使用を考慮する。
【０１６８】
本発明は、特定の態様では、治療において使用するための組成物および方法に関する。本発明の免疫刺激性組成物は、単独で使用してもよく、他の治療薬と組み合わせて使用してもよい。免疫刺激性組成物および他の治療薬は、同時に投与してもよく、逐次投与してもよい。本発明の免疫刺激性組成物および他の治療薬を同時に投与する場合、それらは同一の製剤で投与してもよく、別個の製剤で投与してもよいが、それらは同時に投与される。さらに、本発明の免疫刺激性組成物および他の治療薬が同時に投与される場合、それらは同一の投与経路によって投与されてもよく、別個の投与経路によって投与されてもよいが、それらは同時に投与される。本発明の免疫刺激性組成物および別の治療薬は、本発明の免疫刺激性組成物の投与が、他の治療薬の投与と時間的に離れている場合逐次投与される。これらの化合物の投与間の時間の分離は、ほんの数分である場合もあるし、より長い場合もある。一実施形態では、本発明の免疫刺激性組成物は、他の治療薬の投与の前に投与される。一実施形態では、本発明の免疫刺激性組成物は、他の治療薬の投与の後に投与される。さらに、本発明の免疫刺激性組成物および他の治療薬が逐次投与される場合、それらは、同一の投与経路によって投与されてもよく、別個の投与経路によって投与されてもよい。他の治療薬として、それだけには限らないが、アジュバント、抗原、ワクチンならびに感染、癌、アレルギーおよび喘息の治療に有用な医薬が挙げられる。
【０１６９】
一態様では、本発明は、対象にワクチン接種する方法を提供する。本発明のこの態様の方法は、対象に、抗原および本発明の組成物を投与するステップを含む。一実施形態では、抗原を投与することは、抗原をコードする核酸を投与することを含む。
【０１７０】
「対象」とは、本明細書において用いる場合、脊椎動物を指す。種々の実施形態では、対象は、ヒト、非ヒト霊長類または他の哺乳類である。特定の実施形態では、対象は、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシまたはウマである。
【０１７１】
対象にワクチン接種する方法において使用するには、本発明の組成物は、一実施形態では、抗原を含む。抗原は、本発明のＯＲＮと分離していてもよく、共有結合によって連結していてもよい。一実施形態では、本発明の組成物は、それ自体抗原を含まない。この実施形態では、抗原は対象に、本発明の組成物と別個に投与してもよく、本発明の組成物と一緒に投与してもよい。別個である投与として、時間において別個である、投与位置または経路において別個である、または時間において、および、投与位置または経路においての両方で別個であることを含む。本発明の組成物および抗原が、時間において別個で投与される場合、抗原は本発明の組成物の前に投与してもよく、後に投与してもよい。一実施形態では、抗原は、本発明の組成物の投与の４８時間〜４週間後に投与される。本方法はまた、抗原および組成物の最初の投与後の、抗原単独、組成物単独または抗原および組成物の１つまたは複数のブースター用量の投与を考慮する。
【０１７２】
また、対象に、抗原を含まない本発明の組成物を投与することによって、対象に、未知抗原との将来の遭遇に対して準備させることができるということも本発明によって考慮される。この実施形態によれば、対象の免疫系は、例えば、環境性曝露または職業性曝露によって対象によって後で遭遇される抗原に対してより活発な反応を開始するよう準備される。このような方法は、例えば、微生物因子に対して曝露される可能性のある旅行者、医療労働者および兵士に対して使用できる。
【０１７３】
一態様では、本発明は、免疫系不全の対象を治療する方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、対象に有効量の本発明の組成物を投与して対象を治療するステップを含む。「免疫系不全」とは、本明細書において用いる場合、抗原に対する免疫応答を開始するための免疫系の異常に低下した能力を指す。一実施形態では、免疫系不全とは、対象の免疫系が正常な能力で機能していないか、例えば、対象において腫瘍または癌または感染症を排除するのに、対象の免疫応答をブーストすることが有用である疾患または障害である。「免疫不全症の対象」とは、本明細書において用いる場合、抗原に対する免疫応答を開始するための対象の免疫系の能力の低下がある対象を指す。免疫不全症の対象として、後天性免疫不全症の対象ならびに先天性免疫系不全の対象が挙げられる。後天性免疫不全症の対象として、限定されるものではないが、慢性炎症状態の対象、慢性腎機能不全または腎不全の対象、感染症の対象、癌の対象、免疫抑制薬を摂取している対象、他の免疫抑制治療を受けている対象および栄養障害の対象が挙げられる。一実施形態では、対象は、抑制されたＣＤ４＋Ｔ細胞集団を有する。一実施形態では、対象は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）による感染症であるか、または後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）である。したがって、本発明のこの態様による方法は、より活発な免疫応答を必要とする対象において免疫応答をブーストする、または免疫応答を開始する能力をブーストする方法を提供する。
【０１７４】
本発明の組成物および方法は単独で使用してもよく、感染症の治療に有用な他の薬剤および方法とともに使用してもよい。一態様では、本発明は、感染症の対象を治療する方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、感染症の対象に有効量の本発明の組成物を投与して対象を治療するステップを含む。
【０１７５】
一態様では、本発明は、感染症の対象を治療する方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、感染症の対象に有効量の本発明の組成物および感染症医薬を投与して対象を治療するステップを含む。
【０１７６】
一態様では、本発明は、対象において感染症を治療するための医薬の調製のための本発明の免疫刺激性ＯＲＮの使用を提供する。
【０１７７】
一態様では、本発明は、感染症の治療に有用な組成物を提供する。この態様による組成物は、本発明の免疫刺激性ＯＲＮおよび感染症医薬を含む。
【０１７８】
本明細書において用いる場合、用語「治療する」とは、疾患または状態の対象に対して用いられる場合、対象において疾患または状態の少なくとも１つの徴候または症状を予防、寛解または排除することを意味するものとする。
【０１７９】
「感染症の対象」とは、感染性微生物による、表在的な、局所的な、または全身的な対象の侵入に起因する障害の対象である。感染性微生物は、上記のように、ウイルス、細菌、真菌または寄生生物であり得る。
【０１８０】
感染症医薬として、それだけには限らないが、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤および駆虫剤が挙げられる。「抗感染剤」、「抗生物質」、「抗菌剤」、「抗ウイルス剤」、「抗真菌剤」、「駆虫剤」および「寄生虫駆除剤」などの語句は、当業者にとって十分に確立された意味を有し、標準的な医療テキストに定義されている。手短には、抗菌剤は、細菌を死滅させる、または阻害し、抗生物質ならびに同様の機能を有する他の合成または天然化合物を含む。抗ウイルス剤は、天然供給源から単離でき、または合成でき、ウイルスを死滅させる、または阻害するのに有用である。抗真菌剤は、表在性真菌感染症ならびに日和見性および一次全身性真菌感染症を治療するために用いられる。駆虫剤は、寄生生物を死滅させる、または阻害する。多数の抗生物質は、微生物などの細胞によって二次代謝産物として生成される低分子量分子である。通常、抗生物質は、微生物に特異的であり、宿主細胞には存在しない１つまたは複数の機能または構造を干渉する。
【０１８１】
抗感染薬治療に伴う問題の１つとして、抗感染薬で治療されている宿主に生じる副作用がある。例えば、多数の抗感染剤は、広範囲の微生物を死滅させる、または阻害することができ、特定の種類の種に特異的ではない。これらの種類の抗感染剤を用いる治療は、宿主中で生存している正常な微生物叢ならびに感染性微生物の死滅をもたらす。微生物叢は感染性病原体と競合し、障壁として機能するために、その喪失は、疾患合併症につながり、宿主を他の病原体による感染症にさせ得る。他の副作用が、これらの化学物質の微生物でない、宿主の細胞または組織に対する特異的または非特異的効果の結果として起こり得る。
【０１８２】
抗感染物質の広範な使用に伴うもう１つの問題として、微生物の抗生物質耐性株の発生がある。すでに、バンコマイシン耐性腸球菌、ペニシリン耐性肺炎球菌、多剤耐性黄色ブドウ球菌および多剤耐性結核株が発生しており、大変な臨床的問題となっている。抗感染物質の広範な使用は、多数の抗生物質耐性株の細菌を生じさせる可能性がある。結果として、これらの微生物と闘うために、新規抗感染症戦略が必要となる。
【０１８３】
広範な細菌を死滅させる、または阻害するのに有効である抗菌抗生物質は、広域スペクトル抗生物質と呼ばれる。他の種類の抗菌抗生物質は、グラム陽性またはグラム陰性クラスの細菌に対して主に有効である。これらの種類の抗生物質は、狭域スペクトル抗生物質と呼ばれる。単一の生物または疾患に対して有効であり、他の種類の細菌に対しては有効でない他の抗生物質は、限定スペクトルの抗生物質と呼ばれる。
【０１８４】
抗菌剤は、その主な作用様式に基づいて分類されることがある。通常、抗菌剤は、細胞壁合成阻害剤、細胞膜阻害剤、タンパク質合成阻害剤、核酸合成または機能阻害剤および競合阻害剤である。細胞壁合成阻害剤は、細胞壁合成のプロセスにおける、通常、細菌ペプチドグリカンの合成における一段階を阻害する。細胞壁合成阻害剤として、β−ラクタム抗生物質、天然ペニシリン、半合成ペニシリン、アンピシリン、クラブラン酸、セファロスポリンおよびバシトラシンが挙げられる。
【０１８５】
β−ラクタムは、ペプチドグリカン合成の最後の段階を阻害する４員のβ−ラクタム環を含有する抗生物質である。β−ラクタム抗生物質は、合成してもよく、天然であってもよい。アオカビ属によって産生されるβ−ラクタム抗生物質は、天然ペニシリン、例えば、ペニシリンＧまたはペニシリンＶである。これらは、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）の発酵によって産生される。天然ペニシリンは、狭域スペクトルの活性を有し、通常、ストレプトコッカス、淋菌およびブドウ状球菌に対して有効である。グラム陽性菌に対しても有効である、他の種類の天然ペニシリンとして、ペニシリンＦ、Ｘ、ＫおよびＯが挙げられる。
【０１８６】
半合成ペニシリンは、通常、カビによって産生された分子６−アミノペニシラン酸の修飾物である。６−アミノペニシラン酸は、側鎖の付加によって修飾でき、これによって、天然ペニシリンよりも広いスペクトルの活性または種々の他の有利な特性を有するペニシリンが得られる。いくつかの種類の半合成ペニシリンは、グラム陽性およびグラム陰性菌に対して広域スペクトルを有するが、ペニシリナーゼによって不活化される。これらの半合成ペニシリンとして、アンピシリン、カルベニシリン、オキサシリン、アズロシリン、メズロシリンおよびピペラシリンが挙げられる。他の種類の半合成ペニシリンは、グラム陽性菌に対してより狭い活性を有するが、ペニシリナーゼによって不活化されないような発展した特性を有する。これらとして、例えば、メチシリン、ジクロキサシリンおよびナフシリンが挙げられる。いくつかの広域スペクトル半合成ペニシリンはβ−ラクタマーゼ阻害剤、例えば、クラブラン酸およびスルバクタムと組み合わせて使用できる。β−ラクタマーゼ阻害剤は、抗微生物作用を有さないが、それらはペニシリナーゼを阻害するよう機能し、したがって、半合成ペニシリンを分解から保護する。
【０１８７】
別の種類のβ−ラクタム抗生物質として、セファロスポリンがある。それらは、細菌β−ラクタマーゼによる分解に対して感受性であり、したがって、単独では常に有効ではない。しかし、セファロスポリンは、ペニシリナーゼに対しては耐性である。それらは種々のグラム陽性およびグラム陰性菌に対して有効である。セファロスポリンとして、それだけには限らないが、セファロチン、セファピリン、セファレキシン、セファマンドール、セファクロル、セファゾリン、セフロキシン（ｃｅｆｕｒｏｘｉｎｅ）、セフォキシチン、セフォタキシム、セフスロジン、セファタメト、セフィキシム、セフトリアキソン、セフォペラゾン、セフタジジンおよびモキサラクタムが挙げられる。
【０１８８】
バシトラシンは、サブユニットを膜の外側に送達する分子からのムロペプチドサブユニットまたはペプチドグリカンの放出を阻害することによって細胞壁合成を阻害する、もう１つのクラスの抗生物質である。バシトラシンは、グラム陽性菌に対して有効であるが、その使用は、その高い毒性のために、通常、局所投与に限定される。
【０１８９】
カルバペネムは、細胞壁合成を阻害できる、もう１つの広域スペクトルβ−ラクタム抗生物質である。カルバペネムの例として、それだけには限らないが、イミペネムが挙げられる。モノバクタムもまた、広域スペクトルβ−ラクタム抗生物質であり、ユーズトレオナム（ｅｕｚｔｒｅｏｎａｍ）を含む。ストレプトマイセスによって産生される抗生物質、バンコマイシンもまた、細胞膜合成を阻害することによってグラム陽性菌に対して有効である。
【０１９０】
別のクラスの抗菌剤として、細胞膜阻害剤である抗菌剤がある。これらの化合物は、細菌膜の構造を壊す、またはその機能を阻害する。細胞膜阻害剤である抗菌剤に伴う１つの問題として、細菌および真核細胞の膜におけるリン脂質の類似性のために、真核細胞ならびに細菌において効果を生じ得るということがある。したがって、これらの化合物が、これらの化合物を全身に使用できるほど十分に特異的であることは稀であり、局所投与のための高用量の使用もなされない。
【０１９１】
１種の臨床上有用な細胞膜阻害剤としてポリミキシンがある。ポリミキシンは、膜リン脂質と結合することによって膜機能を干渉する。ポリミキシンは、主にグラム陰性菌に対して有効であり、通常、重篤なシュードモナス感染症または毒性の低い抗生物質に対して耐性であるシュードモナス感染症において用いられる。この化合物の全身投与と関連する重い副作用として、腎臓および他の臓器の損傷が挙げられる。
【０１９２】
他の細胞膜阻害剤として、全身性真菌感染症およびカンジダ酵母感染症の治療において主に用いられる抗真菌剤である、アムホテリシンＢおよびナイスタチンが挙げられる。イミダゾールは、細胞膜阻害剤である別のクラスの抗生物質である。イミダゾールは、抗菌剤ならびに抗真菌剤として用いられ、例えば、酵母感染症、皮膚糸状菌感染症および全身性真菌感染症の治療のために用いられる。イミダゾールとして、それだけには限らないが、クロトリマゾール、ミコナゾール、ケトコナゾール、イトラコナゾールおよびフルコナゾールが挙げられる。
【０１９３】
多数の抗菌剤は、タンパク質合成阻害剤である。これらの化合物は、細菌が構造タンパク質および酵素を合成するのを妨げ、このようにして、細菌細胞増殖もしくは機能の阻害または細胞死を引き起こす。一般に、これらの化合物は、転写または翻訳のプロセスを干渉する。転写を遮断する抗菌剤として、それだけには限らないが、リファンピンおよびエタンブトールが挙げられる。酵素ＲＮＡポリメラーゼを阻害するリファンピンは、広域スペクトルの活性を有し、グラム陽性およびグラム陰性菌ならびに結核菌に対して有効である。エタンブトールは、結核菌に対して有効である。
【０１９４】
翻訳を遮断する抗菌剤は、細菌リボソームを干渉して、ｍＲＮＡがタンパク質に翻訳されるのを妨げる。一般に、このクラスの化合物として、それだけには限らないが、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、マクロライド（例えば、エリスロマイシン）およびアミノグリコシド（例えば、ストレプトマイシン）が挙げられる。
【０１９５】
アミノグリコシドは、細菌ストレプトマイセスによって産生される抗生物質のクラスであり、例えば、ストレプトマイシン、カナマイシン、トブラマイシン、アミカシンおよびゲンタマイシンなどがある。アミノグリコシドは、グラム陽性およびグラム陰性菌によって引き起こされるさまざまな細菌感染症に対して用いられている。ストレプトマイシンは、結核の治療において第一次薬として広く用いられている。ゲンタマイシンは、グラム陽性およびグラム陰性菌の多数の株、例えば、シュードモナス感染に対して、特に、トブラマイシンと組み合わせて用いられる。カナマイシンは、多数のグラム陽性菌、例えば、ペニシリン耐性ブドウ球菌に対して用いられる。アミノグリコシドの臨床的な使用を制限している１つの副作用として、有効性にとって必須である投与量では、長期使用が腎臓機能を損ない、聴神経に損傷を引き起こし聴覚消失につながることがわかっている。
【０１９６】
別の種類の翻訳阻害剤抗菌剤として、テトラサイクリンがある。テトラサイクリンは、広域スペクトルであり、種々のグラム陽性およびグラム陰性菌に対して有効である抗生物質の一クラスである。テトラサイクリンの例として、テトラサイクリン、ミノサイクリン、ドキシサイクリンおよびクロルテトラサイクリンが挙げられる。それらは、多数の種類の細菌の治療にとって重要であるが、特に、ライム病の治療において重要である。テトラサイクリンは、それらの毒性が低いことおよび直接的な副作用が最小であることの結果として、医学界によって過剰使用および誤用され、これが問題につながっている。例えば、その過剰使用が、耐性の広い発生をもたらした。
【０１９７】
マクロライドなどの抗菌剤は、５０Ｓリボソームサブユニットと可逆的に結合し、ペプチジルトランスフェラーゼによるタンパク質の伸長を阻害する、もしくは細菌リボソームからの無電荷のｔＲＮＡの放出を妨げるか、その両方である。これらの化合物として、エリスロマイシン、ロキシスロマイシン、クラリスロマイシン、オレアンドマイシンおよびアジスロマイシンが挙げられる。エリスロマイシンは、ほとんどのグラム陽性菌、ナイセリア、レジオネラおよびヘモフィルスに対して活性であるが、腸内細菌科に対しては活性でない。リンコマイシンおよびクリンダマイシンは、タンパク質合成の際にペプチド結合形成を遮断し、グラム陽性菌に対して用いられる。
【０１９８】
別の種類の翻訳阻害剤として、クロラムフェニコールがある。クロラムフェニコールは、７０Ｓリボソームと結合して細菌酵素ペプチジルトランスフェラーゼを阻害し、それによってタンパク質合成の際のポリペプチド鎖の伸長を妨げる。クロラムフェニコールに伴われる１つの重大な副作用として、再生不良性貧血がある。再生不良性貧血は、小集団（１／５０，０００）の患者では、細菌を治療するのに有効であるクロラムフェニコールの用量で発生する。クロラムフェニコールは、以前はよく処方された抗生物質であったが、貧血に起因する死亡の結果として今ではめったに使用されない。その有効性のために、命にかかわる状況（例えば、腸チフス）ではまだ使用されている。
【０１９９】
いくつかの抗菌剤は、核酸合成または機能を混乱させる。例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡと結合し、その結果、そのメッセージが読み取られなくなる。これらとして、それだけには限らないが、キノロンおよびコトリモキサゾール（両方とも合成化学物質）およびリファマイシン（天然または半合成化学物質）が挙げられる。キノロンは、ＤＮＡジャイレース、細菌によって、その環状ＤＮＡを生成するために必要とされる酵素を阻害することによって細菌ＤＮＡ複製を遮断する。それらは、広域スペクトルであり、例として、ノルフロキサシン、シプロフロキサシン、エノキサシン、ナリジクス酸およびテマフロキサシンが挙げられる。ナリジクス酸は、殺菌剤であり、これはＤＮＡ複製に必須であり、スーパーコイルが解かれ、再編成されるのを可能にするＤＮＡジャイレース酵素（トポイソメラーゼ）と結合し、ＤＮＡジャイレース活性を阻害する。ナリジクス酸の主な用途は、下部尿路感染症（ＵＴＩ）の治療においてであるが、これは、ＵＴＩのよくある原因である、大腸菌、エンテロバクター・アエロゲネス、肺炎桿菌およびプロテウス種などのいくつかの種類のグラム陰性菌に対して有効であるためである。コトリモキサゾールは、スルファメトキサゾールおよびトリメトプリムの組合せであり、ＤＮＡヌクレオチドを作製するのに必要である葉酸の細菌による合成を遮断する。リファンピシンは、グラム陽性菌（例えば、結核菌および髄膜炎菌によって引き起こされる髄膜炎）およびいくつかのグラム陰性菌に対して活性であるリファマイシンの誘導体である。リファンピシンは、ポリメラーゼのβサブユニットと結合し、ポリメラーゼを活性化するのに必要な第１のヌクレオチドの付加を遮断し、それによって、ｍＲＮＡ合成を遮断する。
【０２００】
別のクラスの抗菌剤として、細菌酵素の競合阻害剤として機能する化合物がある。競合阻害剤は、細菌増殖因子とほとんどすべて構造的に類似しており、結合について競合するが、細胞において代謝機能を発揮しない。これらの化合物として、スルホンアミドおよびさらに高い、広い抗菌活性を有するスルファニルアミドの化学修飾された形が挙げられる。スルホンアミド（例えば、ガントリシンおよびトリメトプリム）は、肺炎連鎖球菌、β−溶血性連鎖球菌および大腸菌の治療にとって有用であり、大腸菌によって引き起こされた無併発性ＵＴＩの治療において、および髄膜炎菌性髄膜炎の治療において使用されている。
【０２０１】
抗ウイルス剤は、ウイルスによる細胞の感染または細胞内でのウイルスの複製を防ぐ化合物である。抗ウイルス薬は抗菌薬よりもずっと少ないが、これは、ウイルス複製のプロセスが、宿主細胞内のＤＮＡ複製と密接に関連しており、非特異的抗ウイルス剤が宿主にとって毒性であることが多いためである。ウイルス感染のプロセス内には、抗ウイルス剤によって遮断または阻害できるいくつかの段階がある。これらの段階として、ウイルスの宿主細胞との結合（免疫グロブリンまたは結合性ペプチド）、ウイルスの脱外被（例えば、アマンタジン）、ウイルスｍＲＮＡの合成または翻訳（例えば、インターフェロン）、ウイルスＲＮＡまたはＤＮＡの複製（例えば、ヌクレオシド類似体）、新規ウイルスタンパク質の成熟（例えば、プロテアーゼ阻害剤）ならびにウイルスの出芽および放出が挙げられる。
【０２０２】
別のカテゴリーの抗ウイルス剤として、ヌクレオシド類似体がある。ヌクレオシド類似体は、ヌクレオシドと類似しているが、不完全または異常なデオキシリボースまたはリボース基を有する合成化合物である。ヌクレオシド類似体は細胞中にあると、リン酸化され、三リン酸の形を生じ、これが、ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡ中への組み込みについて正常なヌクレオチドと競合する。三リン酸の形のヌクレオシド類似体が、伸長している核酸鎖中に組み込まれると、ウイルスポリメラーゼと不可逆的な結合を引き起こし、このようにして鎖が停止する。ヌクレオシド類似体として、それだけには限らないが、アシクロビル（単純ヘルペスウイルスおよび水痘帯状疱疹ウイルスの治療に用いられる）、ガンシクロビル（サイトメガロウイルスの治療にとって有用）、イドクスウリジン、リバビリン（呼吸器多核体ウイルスの治療にとって有用）、ジデオキシイノシン、ジデオキシシチジンおよびジドブジン（アジドチミジン）が挙げられる。
【０２０３】
別のクラスの抗ウイルス剤として、インターフェロンなどのサイトカインが挙げられる。インターフェロンは、ウイルスに感染した細胞ならびに免疫細胞によって分泌されるサイトカインである。インターフェロンは、感染細胞に隣接する細胞上の特異的受容体と結合し、その細胞において、ウイルスによる感染から保護する変化を引き起こすことによって機能する。αおよびβ−インターフェロンはまた、感染細胞の表面上でクラスＩおよびクラスＩＩ  ＭＨＣ分子の発現を誘導し、宿主免疫細胞認識のための抗原提示の増大をもたらす。αおよびβ−インターフェロンは、組換え型として入手可能であり、慢性Ｂ型およびＣ型肝炎感染症の治療のために用いられている。インターフェロンは、抗ウイルス治療にとって有効である投与量で、発熱、倦怠および体重減少などの重大な副作用を有する。
【０２０４】
免疫グロブリン療法は、ウイルス感染の予防のために用いられる。ウイルス感に対する免疫グロブリン療法は、細菌感染とは異なっているが、これは、むしろ抗原特異的であるためであり、免疫グロブリン療法は、細胞外ウイルス粒子と結合し、それらが、ウイルス感染に感受性である細胞と結合し、侵入することを妨げることによって機能する。この療法は、宿主中に抗体が存在する期間のウイルス感染の予防にとって有用である。概して、２種類の免疫グロブリン療法、標準免疫グロブリン療法および高度免疫グロブリン療法がある。標準免疫グロブリン療法は、正常血液ドナーの血清から調製され、プールされている抗体製剤を使用する。このプールされた製剤は、Ａ型肝炎、パルボウイルス、エンテロウイルス（特に、新生児において）などの広範なヒトウイルスに対する低力価の抗体を含有する。高度免疫グロブリン療法は、特定のウイルスに対する高力価の抗体を有する個体の血清から調製されている抗体を使用する。そのようにして、それらの抗体を特定のウイルスに対して用いる。高度免疫グロブリンの例として、帯状疱疹免疫グロブリン（免疫無防備状態の小児および新生児における水痘の予防にとって有用な）、ヒト狂犬病免疫グロブリン（狂犬病の動物によって噛まれた対象の曝露後予防において有用な）、Ｂ型肝炎免疫グロブリン（特に、ウイルスにさらされた対象における、Ｂ型肝炎ウイルスの予防において有用な）およびＲＳＶ免疫グロブリン（呼吸器多核体ウイルス感染症の治療において有用な）が挙げられる。
【０２０５】
抗真菌剤は、感染性真菌の治療および予防にとって有用である。抗真菌剤は、その作用機序によって分類されることがある。抗真菌剤の中には、グルコースシンターゼを阻害することによって細胞壁阻害剤として機能するものがある。これらとして、それだけには限らないが、バシウリジン（ｂａｓｉｕｎｇｉｎ）／ＥＣＢが挙げられる。他の抗真菌剤は、膜完全性を不安定にすることによって機能する。これらとして、それだけには限らないが、イミダゾール類、例えば、クロトリマゾール、セルタコンゾール（ｓｅｒｔａｃｏｎｚｏｌｅ）、フルコナゾール、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ミコナゾールおよびボリコナコール（ｖｏｒｉｃｏｎａｃｏｌｅ）ならびにＦＫ４６３、アムホテリシンＢ、ＢＡＹ３８−９５０２、ＭＫ９９１、プラディマイシン、ＵＫ２９２、ブテナフィンおよびテルビナフィンが挙げられる。他の抗真菌剤は、キチンを分解することによって（例えば、キチナーゼ）または免疫抑制によって（５０１クリーム）機能する。
【０２０６】
寄生虫駆除剤は、寄生生物を直接死滅させる薬剤である。このような化合物は、当技術分野では公知であり、通常、市販されている。ヒト投与にとって有用な寄生虫駆除剤の例としてそれだけには限らないが、アルベンダゾール、アムホテリシンＢ、ベンズニダゾール、ビチオノール、塩酸クロロキン、リン酸クロロキン、クリンダマイシン、デヒドロエメチン、ジエチルカルバマジン、フロ酸ジロキサニド、エフロールニチン、フラゾリダオン（ｆｕｒａｚｏｌｉｄａｏｎｅ）、グルココルチコイド、ハロファントリン、ヨードキノール、イベルメクチン、メベンダゾール、メフロキン、アンチモン酸メグルミン、メラルソプロール、メトリホネート、メトロニダゾール、ニクロサミド、ニフルチモックス、オキサムニキン、パロモマイシン、イセチオン酸ペンタミジン、ピペラジン、プラジカンテル、リン酸プリマキン、プログアニル、パモ酸ピランテル、ピリメタンミン（ｐｙｒｉｍｅｔｈａｎｍｉｎｅ）−スルホンアミド、ピリメタンミン（ｐｙｒｉｍｅｔｈａｎｍｉｎｅ）−スルファドキシン、塩酸キナクリン、硫酸キニーネ、グルコン酸キニジン、スピラマイシン、スチボグルコネートナトリウム（グルコン酸アンチモンナトリウム）、スラミン、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、チアベンダゾール、チニダゾール、トリメトロプリム（ｔｒｉｍｅｔｈｒｏｐｒｉｍ）−スルファメトキサゾールおよびトリパルサミドが挙げられる。
【０２０７】
ＯＲＮはまた、自己免疫疾患を治療および予防するのに有用である。自己免疫疾患は、対象自身の抗体が宿主組織と反応する、または免疫エフェクターＴ細胞が内因性自己ペプチドに対して自己反応性であり、組織の破壊を引き起こす疾患の一クラスである。したがって、免疫応答が、自己抗原と呼ばれる対象自身の抗原に対して開始される。自己免疫疾患として、それだけには限らないが、関節リウマチ、クローン病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、自己免疫脳脊髄炎、重症筋無力症（ＭＧ）、橋本甲状腺炎、グッドパスチャー症候群、天然痘（例えば、尋常性天疱瘡）、グレーブス病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫血小板減少性紫斑病、抗コラーゲン抗体を有する強皮症、混合性結合組織疾患、多発性筋炎、悪性貧血、特発性アジソン病、自己免疫関連不妊症、糸球体腎炎（例えば、半月体形成性糸球体腎炎、増殖性糸球体腎炎）、水疱性類天疱瘡、シェーグレン症候群、インスリン抵抗性および自己免疫糖尿病が挙げられる。
【０２０８】
「自己抗原」とは、本明細書において用いる場合、正常な宿主組織の抗原を指す。正常な宿主組織は、癌細胞を含まない。したがって、自己抗原に対して開始される免疫応答は、自己免疫疾患との関連で、望ましくない免疫応答であり、正常組織の破壊および損傷の一因となっているのに対し、癌抗原に対して開始される免疫応答は、望ましい免疫応答であり、腫瘍または癌の破壊の一因となっている。したがって、自己免疫障害を治療することを目的とする本発明のいくつかの態様では、ＯＲＮが、自己抗原、特に、自己免疫障害の標的であるものとともに投与されることは推奨されない。
【０２０９】
他の例では、ＯＲＮは、低用量の自己抗原とともに送達されてもよい。いくつかの動物研究によって、低用量の抗原の粘膜投与が、免疫反応低下または「耐性」という状態をもたらし得ることが実証された。活性機構は、Ｔｈ１から主にＴｈ２およびＴｈ３反応（すなわち、ＴＧＦ−β支配された）への、サイトカイン媒介性免疫偏向であると思われる。低用量抗原送達を用いる活性抑制はまた、無関係な、免疫応答を抑制する場合があり（傍観者抑制）、これは自己免疫疾患、例えば、関節リウマチおよびＳＬＥの治療においてかなり注目される。傍観者抑制は、炎症誘発性およびＴｈ１サイトカインが、抗原特異的または抗原非特異的のいずれかで放出される局所環境におけるＴｈ１−対抗制御的サプレッサー、サプレッサーサイトカインの分泌を伴う。「耐性」とは、本明細書において用いる場合、この現象を指すよう用いられる。実際、経口耐性は、動物におけるいくつかの自己免疫疾患、例えば、実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）、実験的自己免疫重症筋無力症、コラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）およびインスリン依存性糖尿病の治療において有効であった。これらのモデルでは、自己免疫疾患の予防および抑制は、Ｔｈ１からＴｈ２／Ｔｈ３反応への抗原特異的体液性および細胞性反応のシフトと関連している。
【０２１０】
本発明の組成物および方法は、単独で使用してもよく、癌の治療にとって有用である他の薬剤および方法とともに使用してもよい。一態様では、本発明は、癌の対象を治療する方法を提供する。本発明のこの態様の方法は、癌の対象に有効量の本発明の組成物を投与して対象を治療するステップを含む。
【０２１１】
一態様では、本発明は、癌の対象を治療する方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、癌の対象に有効量の本発明の組成物および抗癌療法を投与して対象を治療するステップを含む。
【０２１２】
一態様では、本発明は、対象において癌を治療する医薬を調製するための、本発明の免疫刺激性ＯＲＮの使用を提供する。
【０２１３】
一態様では、本発明は、癌の治療にとって有用な組成物を提供する。この態様の組成物は、本発明の免疫刺激性ＯＲＮおよび癌医薬を含む。
【０２１４】
癌の対象とは、検出可能な癌性細胞の対象である。癌は、悪性である場合も、非悪性癌である場合もある。「癌」とは、本明細書において用いる場合、身体の臓器および系が正常に機能することを干渉する、細胞の制御されない増殖を指す。その本来の位置から移動し、重要臓器に播種する癌は、罹患した臓器の機能低下によって、最終的に対象の死亡を導き得る。白血病などの造血系癌は、対象中の正常な造血区画を打ち負かすことができ、それによって、造血不全（貧血、血小板減少症および好中球減少症の形）をもたらし、最終的に、死亡を引き起こす。
【０２１５】
転移は、原発腫瘍から身体の他の部分への癌細胞の播種に起因する、原発腫瘍位置とは別個の癌細胞の領域である。原発腫瘍量の診断時に、対象は、転移の存在についてモニターされ得る。転移は、核磁気共鳴画像（ＭＲＩ）スキャン、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）スキャン、血液および血小板カウント、肝臓機能検査、胸部Ｘ線および骨スキャンならびに特定の症状のモニタリングの単独または併用使用で最も多く検出される。
【０２１６】
癌として、それだけには限らないが、基底細胞癌、胆道癌；膀胱癌；骨癌；脳および中枢神経系（ＣＮＳ）癌；乳癌；子宮頸癌；絨毛癌；結腸および直腸癌；結合組織癌；消化系の癌；子宮内膜癌；食道癌；眼の癌；頭頸部の癌；上皮内新生物；腎臓癌；喉頭癌；白血病；肝臓癌；肺癌（例えば、小細胞および非小細胞）；リンパ腫、例えば、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫；黒色腫；骨髄腫；神経芽細胞腫；口腔癌（例えば、口唇、舌、口腔および咽頭）；卵巣癌；膵臓癌；前立腺癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；直腸癌；呼吸器系の癌；肉腫；皮膚癌；胃癌；精巣癌；甲状腺癌；子宮癌；尿路系の癌ならびに他の癌腫、腺癌および肉腫が挙げられる。
【０２１７】
本発明の免疫刺激性組成物はまた、抗癌療法とともに投与してもよい。抗癌療法として、癌医薬、放射線および外科手術が挙げられる。本明細書において用いる場合、「癌医薬」とは、癌を治療する目的で対象に投与される薬剤を指す。本明細書において用いる場合、「癌を治療する」とは、癌の発生を予防すること、癌の症状を低減すること、および／または確立した癌の成長を阻害することを含む。他の態様では、癌医薬は、癌を発症するリスクがある対象に、癌を発症するリスクを低減する目的で投与される。癌の治療のための種々の種類の医薬が本明細書に記載されている。この明細書の目的上、癌医薬は、化学療法薬、免疫治療薬、癌ワクチン、ホルモン療法および生物反応修飾物質として分類される。
【０２１８】
化学療法薬は、メトトレキサート、ビンクリスチン、アドリアマイシン、シスプラチン、糖を含有しないクロロエチルニトロソウレア、５−フルオロウラシル、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダカルバジン、タキソール、フラジリン（ｆｒａｇｙｌｉｎｅ）、メグラミン（Ｍｅｇｌａｍｉｎｅ）ＧＬＡ、バルルビシン、カルムスタイン（ｃａｒｍｕｓｔａｉｎｅ）およびポリフェルポサン（ｐｏｌｉｆｅｒｐｏｓａｎ）、ＭＭＩ２７０、ＢＡＹ１２−９５６６、ＲＡＳファメシル（ｆａｍｅｓｙｌ）トランスフェラーゼ阻害剤、ファメシル（ｆａｍｅｓｙｌ）トランスフェラーゼ阻害剤、ＭＭＰ、ＭＴＡ／ＬＹ２３１５１４、ＬＹ２６４６１８／ロメテキソール（Ｌｏｍｅｔｅｘｏｌ）、グラモレック（Ｇｌａｍｏｌｅｃ）、ＣＩ−９９４、ＴＮＰ−４７０、ハイカムチン／トポテカン、ＰＫＣ４１２、バルスポダール（Ｖａｌｓｐｏｄａｒ）／ＰＳＣ８３３、ノバントロン（Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）／ミトロキサントロン（Ｍｉｔｒｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、メタレット（Ｍｅｔａｒｅｔ）／スラミン、バチマスタット、Ｅ７０７０、ＢＣＨ−４５５６、ＣＳ−６８２、９−ＡＣ、ＡＧ３３４０、ＡＧ３４３３、インセル（Ｉｎｃｅｌ）／ＶＸ−７１０、ＶＸ−８５３、ＺＤ０１０１、ＩＳＩ６４１、ＯＤＮ６９８、ＴＡ２５１６／マルミスタット（Ｍａｒｍｉｓｔａｔ）、ＢＢ２５１６／マルミスタット（Ｍａｒｍｉｓｔａｔ）、ＣＤＰ８４５、Ｄ２１６３、ＰＤ１８３８０５、ＤＸ８９５１ｆ、レモナール（Ｌｅｍｏｎａｌ）ＤＰ２２０２、ＦＫ３１７、ピシバニール／ＯＫ−４３２、ＡＤ３２／バルルビシン、メタストロン（Ｍｅｔａｓｔｒｏｎ）／ストロンチウム誘導体、テモダール（Ｔｅｍｏｄａｌ）／テモゾロミド、エバセット（Ｅｖａｃｅｔ）／リポソームドキソルビシン、ユータキサン（Ｙｅｗｔａｘａｎ）／パクリタキセル、タキソール／パクリタキセル、キセロード（Ｘｅｌｏａｄ）／カペシタビン、フルツロン／ドキシフルリジン、シクロパックス（Ｃｙｃｌｏｐａｘ）／経口パクリタキセル、経口タキソイド、ＳＰＵ−０７７／シスプラチン、ＨＭＲ１２７５／フラボピリドール、ＣＰ−３５８（７７４）／ＥＧＦＲ、ＣＰ−６０９（７５４）／ＲＡＳ癌遺伝子阻害剤、ＢＭＳ−１８２７５１／経口白金、ＵＦＴ（テガフール／ウラシル）、エルガミゾール（Ｅｒｇａｍｉｓｏｌ）／レバミソール、エニルウラシル／７７６Ｃ８５／５ＦＵエンハンサー、カンプト（ｃａｍｐｔｏ）／レバミソール、カンプトサル（ｃａｍｐｔｏｓａｒ）／イリノテカン、ツモデックス（Ｔｕｍｏｄｅｘ）／ラリトレキセド（Ｒａｌｉｔｒｅｘｅｄ）、ロイスタチン／クラドリビン、パキセックス（Ｐａｘｅｘ）／パクリタキセル、ドキシル／リポソームドキソルビシン、カエリクス（Ｃａｅｌｙｘ）／リポソームドキソルビシン、フルダラ／フルダラビン、ファルマルビシン（Ｐｈａｒｍａｒｕｂｉｃｉｎ）／エピルビシン、デポサイト、ＺＤ１８３９、ＬＵ７９５５３／ビス−ナフタリミド（Ｎａｐｈｔａｌｉｍｉｄｅ）、ＬＵ１０３７９３／ドラスタイン（Ｄｏｌａｓｔａｉｎ）、カエチクス（Ｃａｅｔｙｘ）／リポソームドキソルビシン、ジェムザール／ゲムシタビン、ＺＤ０４７３／アノルメド（Ａｎｏｒｍｅｄ）、ＹＭ１１６、ヨウ素シード、ＣＤＫ４およびＣＤＫ２阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、Ｄ４８０９／デキシフォサミド（Ｄｅｘｉｆｏｓａｍｉｄｅ）、イフェス（Ｉｆｅｓ）／メスネックス（Ｍｅｓｎｅｘ）／イフォサミド（Ｉｆｏｓａｍｉｄｅ）、ブモン（Ｖｕｍｏｎ）／テニポシド、パラプラチン／カルボプラチン、プランチノール（Ｐｌａｎｔｉｎｏｌ）／シスプラチン、ベプシド／エトポシド、ＺＤ９３３１、タキソテール／ドセタキセル、グアニンアラビノシドのプロドラッグ、タキサン類似体、ニトロソウレア、メルフェラン（ｍｅｌｐｈｅｌａｎ）およびシクロホスファミドなどのアルキル化剤、アミノグルテチミド、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クロロムブシル（Ｃｈｌｏｒｏｍｂｕｃｉｌ）、塩酸シタラビン、ダクチノマイシン、塩酸ダウノルビシン、リン酸エストラムスチンナトリウム、エトポシド（ＶＰ１６−２１３）、フロクスウリジン、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フルタミド、ヒドロキシ尿素（ヒドロキシカルバミド）、イホスファミド、インターフェロンα−２ａ、α−２ｂ、酢酸ロイプロリド（ＬＨＲＨ放出因子類似体）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、塩酸メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、メルカプトプリン、メスナ、ミトタン（ｏ．ｐ’−ＤＤＤ）、塩酸ミトキサントロン、オクトレオチド、プリカマイシン、塩酸プロカルバジン、ストレプトゾシン、クエン酸タモキシフェン、チオグアニン、チオテパ、硫酸ビンブラスチン、アムサクリン（ｍ−ＡＭＳＡ）、アザシチジン、エルスロポエチン（Ｅｒｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）、インターロイキン２、ミトグアゾン（メチル−ＧＡＧ；メチルグリオキサールビス−グアニルヒドラゾン；ＭＧＢＧ）、ペントスタチン（２’デオキシコホルマイシン）、セムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）、テニポシド（ＶＭ−２６）および硫酸ビンデシンからなる群から選択され得るが、そのように限定されるものではない。
【０２１９】
免疫治療薬は、３６２２Ｗ９４、４Ｂ５、ＡＮＡ  Ａｂ、抗ＦＬＫ−２、抗ＶＥＧＦ、ＡＴＲＡＧＥＮ、ＡＶＡＳＴＩＮ（ベバシズマブ；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＢＡＢＳ、ＢＥＣ２、ＢＥＸＸＡＲ（トシツモマブ；ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、Ｃ２２５、ＣＡＭＰＡＴＨ（アレムツズマブ；Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｒｐ．）、ＣＥＡＣＩＤＥ、ＣＭＡ６７６、ＥＭＤ−７２０００、アービタックス（セツキシマブ；ＩｍＣｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．）、グリオマブ（Ｇｌｉｏｍａｂ）−Ｈ、ＧＮＩ−２５０、ヘルセプチン（トラスツズマブ；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＩＤＥＣ−Ｙ２Ｂ８、ＩｍｍｕＲＡＩＴ−ＣＥＡ、ｉｏｒ  ｃ５、ｉｏｒ  ｅｇｆ．ｒ３、ｉｏｒ  ｔ６、ＬＤＰ−０３、リンホシド（ＬｙｍｐｈｏＣｉｄｅ）、ＭＤＸ−１１、ＭＤＸ−２２、ＭＤＸ−２１０、ＭＤＸ−２２０、ＭＤＸ−２６０、ＭＤＸ−４４７、ＭＥＬＩＭＭＵＮＥ−１、ＭＥＬＩＭＭＵＮＥ−２、モノファーム（Ｍｏｎｏｐｈａｒｍ）−Ｃ、ＮｏｖｏＭＡｂ−Ｇ２、オンコリム（Ｏｎｃｏｌｙｍ）、ＯＶ１０３、オバレックス（Ｏｖａｒｅｘ）、パノレックス（Ｐａｎｏｒｅｘ）、プレターゲット（Ｐｒｅｔａｒｇｅｔ）、クアドラメット、リブタキシン（Ｒｉｂｕｔａｘｉｎ）、リツキサン（リツキシマブ；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＳＭＡＲＴ  １Ｄ１０  Ａｂ、ＳＭＡＲＴ  ＡＢＬ  ３６４  Ａｂ、ＳＭＡＲＴ  Ｍ１９５、ＴＮＴおよびＺＥＮＡＰＡＸ（ダクリズマブ；Ｒｏｃｈｅ）からなる群から選択され得るが、そのように限定されるものではない。
【０２２０】
癌ワクチンは、ＥＧＦ、抗イディオタイプ癌ワクチン、Ｇｐ７５抗原、ＧＭＫ黒色腫ワクチン、ＭＧＶガングリオシドコンジュゲートワクチン、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、Ｏｖａｒｅｘ、Ｍ−Ｖａｘ、Ｏ−Ｖａｘ、Ｌ−Ｖａｘ、ＳＴｎ−ＫＨＬセラトープ（ｔｈｅｒａｔｏｐｅ）、ＢＬＰ２５（ＭＵＣ−１）、リポソームイディオタイプワクチン、メラシン（Ｍｅｌａｃｉｎｅ）、ペプチド抗原ワクチン、毒素／抗原ワクチン、ＭＶＡベースのワクチン、ＰＡＣＩＳ、ＢＣＧワクチン、ＴＡ−ＨＰＶ、ＴＡ−ＣＩＮ、ＤＩＳＣウイルスおよびイムシスト／テラシス（ＴｈｅｒａＣｙｓ）からなる群から選択され得るが、そのように限定されるものではない。
【０２２１】
本発明の組成物および方法は、単独で使用してもよく、アレルギーの治療にとって有用な他の薬剤および方法とともに使用してもよい。一態様では、本発明は、アレルギー状態の対象を治療する方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、アレルギー状態の対象に有効量の本発明の組成物を投与して対象を治療するステップを含む。
【０２２２】
一態様では、本発明は、アレルギー状態の対象を治療する方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、アレルギー状態の対象に有効量の本発明の組成物および抗アレルギー療法を投与して対象を治療するステップを含む。
【０２２３】
一態様では、本発明は、対象においてアレルギー状態を治療する医薬を調製するための、本発明の免疫刺激性ＯＲＮの使用を提供する。
【０２２４】
一態様では、本発明は、アレルギー状態の治療にとって有用な組成物を提供する。この態様の組成物は、本発明の免疫刺激性ＯＲＮおよびアレルギー医薬を含む。
【０２２５】
「アレルギー状態の対象」とは、アレルゲンに応じてアレルギー反応を現在起こしている、またはかつて起こした対象を指すものとする。「アレルギー状態」または「アレルギー」とは、物質（アレルゲン）に対する後天性の過敏症を指す。アレルギー状態として、それだけには限らないが、湿疹、アレルギー性鼻炎または鼻感冒、枯草熱、アレルギー性結膜炎、気管支喘息、じんま疹（ｕｒｔｉｃａｒｉａ）（じんま疹（ｈｉｖｅｓ））および食物アレルギー、他のアトピー状態、例えば、アトピー性皮膚炎、アナフィラキシー、薬物アレルギーおよび血管性浮腫が挙げられる。
【０２２６】
アレルギーは、通常、アレルゲンに対する、特定のクラスの免疫グロブリン、ＩｇＥからの抗体の産生を伴う一時的な状態である。一般的な空気アレルゲンに対するＩｇＥ媒介性応答の発生もまた、喘息の発生に向けての素因を示す因子である。アレルゲンが、好塩基球（血液中を循環している）または肥満細胞（固体組織中に分散している）の表面上のＩｇＥ  Ｆｃ受容体（ＦｃεＲ）と結合している特異的ＩｇＥと遭遇すると、この細胞は活性化となり、ヒスタミン、セロトニンおよび脂質性メディエーターなどのメディエーターの産生および放出をもたらす。
【０２２７】
アレルギー反応は、組織を感作するＩｇＥ型の免疫グロブリンが、外来アレルゲンと反応すると起こる。ＩｇＥ抗体は、肥満細胞および／または好塩基球と結合しており、これらの特殊化した細胞は、アレルゲンが抗体分子の末端を架橋することによって放出するよう刺激されると、アレルギー反応のケミカルメディエーター（血管作動性アミン）を放出する。ヒスタミン、血小板活性化因子、アラキドン酸代謝産物およびセロトニンは、中でも、ヒトにおけるアレルギー反応の最も知られたメディエーターである。ヒスタミンおよび他の血管作動性アミンは、通常、肥満細胞および好塩基球白血球に貯蔵されている。肥満細胞は、動物組織中に分散しており、好塩基球は脈管系内を循環している。これらの細胞はヒスタミンを製造し、ＩｇＥ結合を伴う特定化された一連の事象が生じて、その放出を引き起こさない限り細胞内に貯蔵する。
【０２２８】
アレルギー反応の症状は、ＩｇＥが抗原と反応する身体内の位置に応じて変わる。反応が、呼吸器上皮に沿って起こる場合、症状は、通常、くしゃみ、咳および喘息性反応である。食物アレルギーの場合におけるように、消化管において相互作用が起こる場合、腹痛および下痢が一般的である。例えば、蜂刺傷またはアレルギー性対象へのペニシリンの投与後の全身性アレルギー反応は、重篤である場合があり、命にかかわることも多い。
【０２２９】
アレルギーは、少なくとも幾分かは、Ｔｈ２サイトカインＩＬ−４およびＩＬ−５ならびにＩｇＥへの抗体アイソタイプ転換を特徴とするＴｈ２型の免疫応答と関連している。Ｔｈ１およびＴｈ２免疫応答は、相互に対抗制御的であり、その結果、Ｔｈ１型の免疫応答に向けた免疫応答の歪みは、アレルギーを含むＴｈ２型免疫応答を予防または寛解し得る。したがって、本発明の免疫刺激性ＯＲＮは、アレルギー状態の対象を治療するのにそれ自体で有用であるが、これは、免疫刺激性ＯＲＮが、免疫応答を、Ｔｈ１型の免疫応答に向けて歪めることができるからである。あるいは、またはさらに、本発明の免疫刺激性ＯＲＮは、アレルギー状態の対象を治療するために、アレルゲンと組み合わせて使用してもよい。
【０２３０】
本発明の免疫刺激性組成物はまた、抗アレルギー療法とともに投与してもよい。アレルギーを治療または予防するための従来法は、アレルギー医薬の使用または脱感作療法を伴うものであった。アレルギーを治療または予防するための発展的療法の中には、抗ＩｇＥ抗体の中和の使用が含まれる。抗ヒスタミン剤およびアレルギー反応のケミカルメディエーターの効果を遮断する他の薬物は、アレルギー症状の重篤度を調節するのに役立つが、アレルギー反応を予防することはなく、その後のアレルギー反応に対して効果がない。脱感作療法は、アレルゲンに対するＩｇＧ型反応を誘導するために、小用量のアレルゲンを、通常、注射によって皮膚下に投与することによって実施される。ＩｇＧ抗体の存在は、ＩｇＥ抗体の誘導に起因するメディエーターの産生を中和するのに役立つと考えられている。最初に、対象は、重篤な反応を誘導することを避けるために極めて低用量のアレルゲンで治療され、この用量をゆっくりと増大させる。この種の治療は、対象が、アレルギー反応を引き起こす化合物を実際に投与され、重大なアレルギー反応が結果として起こり得るので危険である。
【０２３１】
アレルギー医薬として、それだけには限らないが、抗ヒスタミン剤、コルチコステロイドおよびプロスタグランジン誘導因子が挙げられる。抗ヒスタミン剤は、肥満細胞または好塩基球によって放出されるヒスタミンに対抗する化合物である。これらの化合物は、当技術分野で周知であり、アレルギーの治療のためによく用いられる。抗ヒスタミン剤として、それだけには限らないが、アクリバスチン、アステミゾール、アザタジン、アゼラスチン、ベタタスチン（ｂｅｔａｔａｓｔｉｎｅ）、ブロムフェニラミン、ブクリジン、セチリジン、セチリジン類似体、クロルフェニラミン、クレマスチン、ＣＳ５６０、シプロヘプタジン、デスロラタジン、デクスクロルフェニラミン、エバスチン、エピナスチン、フェキソフェナジン、ＨＳＲ６０９、ヒドロキシジン、レボカバスチン、ロラチジン（ｌｏｒａｔｉｄｉｎｅ）、メトスコポラミン、ミゾラスチン、ノラステミゾール（ｎｏｒａｓｔｅｍｉｚｏｌｅ）、フェニンダミン、プロメタジン、ピリラミン、テルフェナジンおよびトラニラストが挙げられる。
【０２３２】
コルチコステロイドとして、それだけには限らないが、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、ベクロメタゾン、ブデソニド、デキサメタゾン、フルニソリド、プロピオン酸フルチカゾンおよびトリアムシノロンが挙げられる。デキサメタゾンは、抗炎症作用を有するコルチコステロイドであるが、通常は、吸入型ではアレルギーまたは喘息の治療に用いられないが、これは、高度に吸収され、有効用量で長期の抑制性副作用を有するためである。しかし、デキサメタゾンは、アレルギーまたは喘息を治療するために本発明に従って使用してよいが、これは、本発明の組成物と組み合わせて投与される場合に、副作用を低減するために低用量で投与できるからである。コルチコステロイド使用に伴う副作用の中には、咳、発声障害、経口口腔カンジダ症（カンジダ症）、および高用量では、副腎抑制、グルコース不耐性、骨粗しょう症、骨の無菌性壊死、白内障形成、成長抑制、高血圧症、筋力低下、皮膚菲薄化およびあざができやすいことなどの全身性効果がある。Ｂａｒｎｅｓ＆Ｐｅｔｅｒｓｏｎ（１９９３年）Ａｍ  Ｒｅｖ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｄｉｓ１４８：Ｓ１〜Ｓ２６；およびＫａｍａｄａ  ＡＫら（１９９６年）Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １５３：１７３９〜４８頁。
【０２３３】
本発明の組成物および方法は単独で使用してもよく、喘息の治療にとって有用である他の薬剤および方法とともに使用してもよい。一態様では、本発明は、喘息の対象を治療する方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、喘息の対象に有効量の本発明の組成物を投与して対象を治療するステップを含む。
【０２３４】
一態様では、本発明は、喘息の対象を治療する方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、喘息の対象に有効量の本発明の組成物および抗喘息療法を投与して対象を治療するステップを含む。
【０２３５】
一態様では、本発明は、対象において喘息を治療する医薬を調製するための、本発明の免疫刺激性ＯＲＮの使用を提供する。
【０２３６】
一態様では、本発明は、喘息の治療にとって有用な組成物を提供する。この態様による組成物は、本発明の免疫刺激性ＯＲＮおよび喘息医薬を含む。
【０２３７】
「喘息」とは、本明細書において用いる場合、気道の炎症および狭小化、および吸入物質に対する気道の反応性の増大を特徴とする、呼吸器系の障害を指す。喘息は、アトピーまたはアレルギー状態と関連していることが多いが、それに限らない。喘息の症状として、気流閉塞に起因する、喘鳴音の再発性エピソード、息切れ、胸部絞扼感および咳が挙げられる。喘息と関連する気道炎症は、気道上皮の裸出、基底膜の真下のコラーゲン沈着、浮腫、肥満細胞活性化、好中球、好酸球およびリンパ球を含む炎症細胞浸潤などのいくつかの生理学的変化の観察によって検出できる。気道炎症の結果として、喘息患者は、気道応答性亢進、気流制限、呼吸器症状および疾患慢性化を起こすことが多い。気流制限は、急性気管支収縮、気道浮腫、粘液栓形成および気道リモデリング、気管支閉塞につながることが多い特徴を含む。喘息の症例の中には、基底膜下繊維症が起こり、肺機能の持続性の異常につながる場合がある。
【０２３８】
過去数年にわたる研究によって、喘息は、炎症細胞、メディエーターならびに気道中に常在する他の細胞および組織間の複雑な相互作用に起因する可能性があるということが示された。肥満細胞、好酸球、上皮細胞、マクロファージおよび活性化されたＴ細胞はすべて、喘息と関連する炎症プロセスにおいて重要な役割を果たす。Ｄｊｕｋａｎｏｖｉｃ  Ｒら（１９９０年）Ａｍ  Ｒｅｖ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｄｉｓ１４２：４３４〜４５７頁。これらの細胞は、局所組織に直接または間接的に作用し得る、前もって作られた、および新規に合成されたメディエーターの分泌によって気道機能に影響を及ぼし得ると考えられている。また、Ｔリンパ球の部分集団（Ｔｈ２）が、選択的サイトカインを放出することによる気道におけるアレルギー性炎症の調節および疾患慢性化の確立において重要な役割を果たしていることが認識されている。Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ＤＳら（１９９２年）Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ３２６：２９８〜３０４頁。
【０２３９】
喘息は、発達の種々の段階で生じる複合障害であり、症状の程度に基づいて、急性、亜急性または慢性として分類できる。急性炎症反応は、気道への細胞の初期動員と関連している。亜急性炎症反応は、より持続的な炎症パターンを引き起こす、細胞の動員ならびに常在する細胞の活性化を伴う。慢性炎症反応は、持続レベルの細胞損傷と進行中の修復プロセスを特徴とし、これは気道に永続的な異常をもたらし得る。
【０２４０】
「喘息の対象」とは、炎症および気道の狭小化および吸入物質に対する気道の反応性の増大を特徴とする呼吸器系の障害の対象である。喘息の開始と関連する因子として、それだけには限らないが、アレルゲン、低温、運動、ウイルス感染およびＳＯ２が挙げられる。
【０２４１】
上記のように、喘息は、少なくとも幾分かは、Ｔｈ２サイトカインＩＬ−４およびＩＬ−５ならびにＩｇＥへの抗体アイソタイプ転換を特徴とする、Ｔｈ２型の免疫応答と関連している可能性がある。Ｔｈ１およびＴｈ２免疫応答は、相互に対抗制御的であり、その結果、Ｔｈ１型の免疫応答に向けた免疫応答の歪みは、アレルギーを含むＴｈ２型の免疫応答を予防または寛解し得る。したがって、本発明の修飾されたオリゴリボヌクレオチド類似体は、喘息の対象を治療するのにそれ自体で有用であるが、これは、類似体が、免疫応答を、Ｔｈ１型の免疫応答に向けて歪めることができるからである。あるいは、またはさらに、本発明の修飾されたオリゴリボヌクレオチド類似体は、喘息の対象を治療するために、アレルゲンと組み合わせて使用してもよい。
【０２４２】
本発明の免疫刺激性組成物はまた、喘息治療とともに投与してもよい。喘息を治療または予防するための従来法は、抗アレルギー療法（上記）およびいくつかの他の薬剤、例えば、吸入物質の使用を伴うものであった。
【０２４３】
喘息の治療のための薬物は、通常、２つのカテゴリー、急速解放薬物および長期制御薬物に分けられる。喘息患者は、長期制御薬物を毎日のように服用して、持続的喘息の制御を達成および維持する。長期制御薬物として、コルチコステロイド、クロモリン（ｃｈｒｏｍｏｌｙｎ）ナトリウムおよびネドクロミルなどの抗炎症薬、長期作用性β２−アゴニストおよびメチルキサンチンなどの長期作用性気管支拡張薬およびロイコトリエンモディファイヤーが挙げられる。急速救援薬物として、短期作用性β２−アゴニスト、抗コリン作動薬および全身性コルチコステロイドが挙げられる。これらの薬物の各々に伴う多数の副作用があり、単独または組み合わせたこれらの薬物のうち、喘息を予防または完全に治療できるものはない。
【０２４４】
喘息医薬として、それだけには限らないが、ＰＤＥ−４阻害剤、気管支拡張薬／β−２アゴニスト、Ｋ＋チャネルオープナー、ＶＬＡ−４アンタゴニスト、ニューロキンアンタゴニスト、トロンボキサンＡ２（ＴＸＡ２）合成阻害剤、キサンチン、アラキドン酸アンタゴニスト、５リポキシゲナーゼ阻害剤、ＴＸＡ２受容体アンタゴニスト、ＴＸＡ２アンタゴニスト、５−リポックス（ｌｉｐｏｘ）活性化タンパク質の阻害剤およびプロテアーゼ阻害剤が挙げられる。
【０２４５】
気管支拡張薬／β２アゴニストは、気管支拡張または平滑筋弛緩を引き起こす化合物の一クラスである。気管支拡張薬／β２アゴニストとして、それだけには限らないが、サルメテロール、サルブタモール、アルブテロール、テルブタリン、Ｄ２５２２／フォルモテロール、フェノテロール、ビトルテロール、ピルブエロール（ｐｉｒｂｕｅｒｏｌ）メチルキサンチンおよびオルシプレナリンが挙げられる。長期作用性β２アゴニストおよび気管支拡張薬は、抗炎症治療に加えて症状の長期予防のために用いられる化合物である。長期作用性β２アゴニストとして、それだけには限らないが、サルメテロールおよびアルブテロールが挙げられる。これらの化合物は、通常、コルチコステロイドと組み合わせて用いられ、一般に、炎症治療を全く伴わずには用いられない。それらは、頻脈、骨格筋振戦、低カリウム血症および過剰摂取におけるＱＴｃ間隔の延長などの副作用を伴うことがあった。
【０２４６】
例えば、テオフィリンをはじめとするメチルキサンチンは、症状の長期制御および予防のために用いられてきた。これらの化合物は、ホスホジエステラーゼ阻害およびおそらくはアデノシン拮抗作用に起因する気管支拡張を引き起こす。用量関連性急性毒性は、これらの種類の化合物に伴う個々の問題である。結果として、日常的な血清濃度をモニターして、毒性および代謝クリアランスにおける個々の相違から生じる狭い治療範囲を明らかにしなくてはならない。副作用として、頻脈、頻脈性不整脈、悪心および嘔吐、中枢神経系刺激、頭痛、発作、吐血、高血糖症および低カリウム血症が挙げられる。短期作用性β２アゴニストとして、それだけには限らないが、アルブテロール、ビトルテロール、ピルブテロールおよびテルブタリンが挙げられる。短期作用性β２アゴニストの投与と関連する有害作用の中には、頻脈、骨格筋振戦、低カリウム血症、乳酸増加、頭痛および高血糖症が含まれる。
【０２４７】
クロモリン（Ｃｈｒｏｍｏｌｙｎ）ナトリウムおよびネドクロミルは、主として、運動から生じる喘息症状またはアレルゲンから生じるアレルギー症状を予防するために長期制御薬物として用いられる。これらの化合物は、クロライドチャネル機能を干渉することによって、アレルゲンに対する初期および後期反応を遮断すると考えられている。それらはまた、肥満細胞膜を安定化し、イノシネオフィル（ｉｎｏｓｉｎｅｏｐｈｉｌｓ）および上皮細胞の活性化およびそれらからのメディエーターの放出を阻害する。通常、最大の利益を達成するのに４〜６週の投与期間が必要である。
【０２４８】
抗コリン作動薬は、通常、急性気管支痙攣の解放のために用いられる。これらの化合物は、ムスカリン性コリン受容体の競合阻害によって機能すると考えられている。抗コリン作動薬として、それだけには限らないが、臭化イプラトロピウムが挙げられる。これらの化合物は、コリン作動性に媒介される気管支痙攣のみを逆転させるが、抗原に対する反応は全く改変しない。副作用として、口腔および呼吸器分泌物の乾燥、個体によっては喘鳴音の増大および眼に噴霧された場合のかすみ目が挙げられる。
【０２４９】
本発明の免疫刺激性ＯＲＮはまた、気道リモデリングを治療するのに有用であり得る。気道リモデリングは、平滑筋細胞増殖および／または気道における粘膜下肥厚に起因し、最終的に、気道の狭小化を引き起こし、気流の制限につながる。本発明の免疫刺激性ＯＲＮは、さらなるリモデリングを防ぐことができ、リモデリングプロセスに起因する組織発達をさらに低減する可能性がある。
【０２５０】
本発明の免疫刺激性ＯＲＮはまた、樹状細胞の生存、分化、活性化および成熟を改善するのに有用である。免疫刺激性オリゴリボヌクレオチドは、樹状細胞の細胞生存、分化、活性化および成熟を促進する独特の能力を有する。
【０２５１】
本発明の免疫刺激性ＯＲＮはまた、ナチュラルキラー細胞溶解活性および抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を増加させる。ＡＤＣＣは、免疫刺激性ＯＲＮを、細胞標的、例えば、癌細胞に対して特異的な抗体と組み合わせて用いて実施できる。免疫刺激性ＯＲＮが対象に抗体とともに投与される場合、対象の免疫系は、腫瘍細胞を死滅させるよう誘導される。ＡＤＣＣ手順において有用な抗体として、身体中の細胞と相互作用する抗体が挙げられる。細胞標的に対して特異的な多数のこのような抗体は、当技術分野では記載されており、多くが市販されている。一実施形態では、抗体は、ＩｇＧ抗体である。
【０２５２】
特定の態様では、本発明は、エピトープ拡散を増強する方法を提供する。「エピトープ拡散」とは、本明細書において用いる場合、自己または外来タンパク質に対して向けられた、最初に焦点が当てられたドミナントエピトープ特異的免疫応答から、サブドミナントおよび／またはそのタンパク質上の（分子内拡散）または他のタンパク質上の（分子間拡散）潜在性エピトープへのエピトープ特異性の多様化を指す。エピトープ拡散は、多重エピトープ特異的免疫応答をもたらす。
【０２５３】
免疫応答は、自己免疫疾患におけるように有害であり得る、または、ワクチン接種におけるように有益であり得る最初の拡大相と、免疫系をホメオスタシスに戻し、記憶を作製する後のダウンレギュレート相とからなる。エピトープ拡散は、両相の重要な成分であり得る。腫瘍の環境におけるエピトープ拡散の増強によって、対象の免疫系が、元の治療プロトコールに応じてでは、免疫系によって最初に認識されていない、さらなる標的エピトープを決定することが可能となり、腫瘍集団中のエスケープ変異体の可能性を低減し、このようにして疾患の進行に影響を及ぼす。
【０２５４】
本発明のオリゴリボヌクレオチドは、治療上有益な適応症、例えば、癌、ウイルスおよび細菌感染症ならびにアレルギーにおいてエピトープ拡散を促進するのに有用であり得る。本方法は、一実施形態では、対象に、抗原およびアジュバントを含むワクチンを投与し、続いて、対象に、少なくとも２用量の、多重エピトープ特異的免疫応答を誘導するのに有効な量の本発明の免疫刺激性ＯＲＮを投与するステップを含む。本方法は、一実施形態では、対象に、腫瘍抗原およびアジュバントを含むワクチンを投与し、続いて、対象に、少なくとも２用量の、多重エピトープ特異的免疫応答を誘導するのに有効な量の本発明の免疫刺激性ＯＲＮを投与するステップを含む。本方法は、一実施形態では、対象における免疫系抗原曝露と、それに続く、本発明の免疫刺激性オリゴリボヌクレオチドの少なくとも２回の投与をもたらし、多重エピトープ特異的免疫応答を誘導する、すなわち、エピトープ拡散を促進する治療プロトコールを適用することを伴う。種々の実施形態では、治療プロトコールは、手術、放射線、化学療法、他の癌医薬、ワクチンまたは癌ワクチンである。
【０２５５】
治療プロトコールは、免疫賦活薬、さらにその後の免疫賦活薬治療とともに実施され得る。例えば、治療プロトコールがワクチンである場合、アジュバントとともに投与してもよい。ワクチンとアジュバントの組合せは、混合物であってもよく、別個の投与、すなわち、注射（すなわち、同一のドレナージ領域）であってもよい。投与は、必ずしも同時でなくてもよい。非同時注射を用いる場合、タイミングは、アジュバントのプレ注射と、それに続くワクチン製剤の注射を伴い得る。
【０２５６】
治療プロトコールが実施された後に、免疫賦活薬単剤療法が始まる。投与の最適化された頻度、期間および部位は、標的および他の因子に応じて変わるが、例えば、６カ月から２年の間の、１カ月に一度から２カ月に一度の投与であり得る。あるいは、投与は１日１回、週１回または２週間に１回であってもよく、または投与は、１日、１週または１カ月に複数回であってもよい。いくつかの例では、投与期間は、治療の長さに応じて変わる場合があり、例えば、１週間後、１カ月後、１年後、または複数年後に終了する場合がある。他の例では、単剤療法は、静脈内点滴を用いた場合のように連続であり得る。免疫賦活薬は、標的と共通するドレナージ領域に投与してもよい。
【０２５７】
治療において使用するには、化合物の活性、投与方法、免疫化の目的（すなわち、予防または治療）、障害の性質および重篤度、対象の年齢および体重に応じて、対象の治療のために種々の用量が必要であり得る。所与の用量の投与は、個々の用量単位、あるいは数回の、より少ない用量単位の形での単独投与の両方によって実施できる。数週間または数カ月離れた指定の間隔での用量の複数回投与は、抗原特異的免疫応答をブーストするために、よくあることである。
【０２５８】
種々の活性化合物の中から選択することおよび効力、相対バイオアベイラビリティ、患者の体重、有害な副作用の重篤度−効果および好ましい投与様式などの因子を検討することによって、本明細書に提供される教示を組み合わせると、実質的な毒性を引き起こさないが、特定の対象を治療するのに完全に有効である、有効な予防的または治療的治療計画を計画できる。任意の特定の適用にとって有効な量は、治療されている疾患もしくは状態、投与されている特定の治療薬、対象の大きさまたは疾患もしくは状態の重篤度のような因子に応じて変わり得る。当業者ならば、過度の実験を必要とすることなく、特定の核酸および／または他の治療薬の有効量を経験的に決定することができる。
【０２５９】
本明細書に記載される化合物の対象用量は、通常、約０．１μｇ〜１０，０００ｍｇ、より通常は、約１μｇ／日〜８０００ｍｇ、最も通常は、約１０ｍｇ〜１００ｍｇの範囲である。対象の体重でいうと、通常の投与量は、約０．１μｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ／週（投与は、普通、週１回与えられてもよく、数日離れて与えられる２つ以上の用量に分割されてもよい）、より通常は、約０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ／週、最も通常は、約１〜５ｍｇ／ｋｇ／週の範囲である。
【０２６０】
核酸および／または他の化合物を含有する医薬組成物は、薬物を投与するための任意の適した投与経路によって投与してよい。種々の投与経路が利用可能である。選択される特定の様式は、もちろん、選択された特定の薬剤または複数の薬剤、治療されている特定の状態および治療効力に必要な投与量に応じて変わる。本発明の方法は、一般的に言えば、臨床上許容されない有害作用を引き起こさずに有効なレベルの免疫応答を生じさせる任意の様式を意味する、医学的に許容される任意の投与様式を用いて実施できる。好ましい投与様式は、本明細書に開示されている。治療において使用するために、薬剤を所望の表面、例えば、粘膜、全身に送達する任意の様式によって、核酸および／または他の治療薬の有効量を対象に投与できる。
【０２６１】
本発明の医薬組成物の投与は、当業者に公知の任意の手段によって達成してよい。投与経路として、それだけには限らないが経口、非経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、舌下、気管内、吸入、皮下、眼、経膣および直腸が挙げられる。喘息またはアレルギーの治療または予防には、このような化合物は全身経路によって吸入、経口摂取または投与されることが好ましい。全身経路として、経口および非経口が挙げられる。いくつかの実施形態では、肺、主として喘息患者における炎症部位への直接送達のために吸入薬物が好ましい。吸入による投与には、いくつかの種類の装置が普通は使用される。こういった種類の装置として、定量吸入器（ＭＤＩ）、呼吸作動性（ｂｒｅａｔｈ−ａｃｔｕａｔｅｄ）ＭＤＩ、乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）、ＭＤＩと組み合わせたスペーサー／ホールディングチャンバーおよび噴霧器が挙げられる。
【０２６２】
本発明の治療薬は、ベクターを頼りに、特定の組織、細胞種に、または免疫系に、またはその両方に送達できる。広い意味では、ベクターは、組成物の標的細胞への輸送を促進することが可能な任意のビヒクルである。ベクターは、一般に、免疫刺激性核酸、抗体、抗原、および／または障害特異的医薬を、ベクターの不在下でもたらす分解の程度と比較して少ない分解で標的細胞に輸送する。
【０２６３】
一般に、本発明において有用なベクターは、２つのクラス：生物学的ベクターおよび化学的／物理的ベクターに分けられる。生物学的ベクターおよび化学的／物理的ベクターは、本発明の治療薬の送達および／または取り込みにおいて有用である。
【０２６４】
ほとんどの生物学的ベクターは、核酸の送達のために用いられ、これは、免疫刺激性核酸である、または免疫刺激性核酸を含む治療薬の送達において最も適当である。
【０２６５】
本明細書に論じられる生物学的ベクターに加え、化学的／物理的ベクターを使用して、免疫刺激性核酸、抗体、抗原および障害特異的医薬をはじめとする治療薬を送達できる。本明細書において用いる場合、化学的／物理的ベクターは、細菌学的またはウイルス供給源に由来するもの以外の、核酸および／または他の医薬を送達できる天然または合成分子を指す。
【０２６６】
本発明の好ましい化学的／物理的ベクターは、コロイド分散系である。コロイド分散系として、脂質ベースの系、例えば、水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセルおよびリポソームが挙げられる。本発明の好ましいコロイド系として、リポソームがある。リポソームは、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて送達ベクターとして有用である人工膜容器である。大きさが０．２〜４．０μｍの範囲である大きな単層リポソーム（ＬＵＶ）は、大きな高分子を被包できることがわかっている。ＲＮＡ、ＤＮＡおよび無傷のウイルス粒子は、水性内部に被包され、生物学的に活性な形で細胞に送達され得る。Ｆｒａｌｅｙら（１９８１年）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ６：７７頁。
【０２６７】
リポソームをモノクローナル抗体、糖、糖脂質またはタンパク質などの特異的リガンドとカップリングすることによって、リポソームを特定の組織にターゲッティングできる。リポソームを免疫細胞にターゲッティングするのに有用であり得るリガンドとして、それだけには限らないが以下が挙げられる：免疫細胞特異的受容体と相互作用する無傷の分子または分子の断片および免疫細胞の細胞表面マーカーと相互作用する抗体などの分子。このようなリガンドは、当業者に周知の結合アッセイによって容易に同定できる。さらに他の実施形態では、リポソームは、上記で論じたリポソームを免疫治療用抗体の１種とカップリングすることによって癌をターゲッティングできる。さらに、ベクターは、核ターゲッティングペプチドとカップリングさせてもよく、これによってベクターは宿主細胞の核に向かう。
【０２６８】
トランスフェクションのための脂質製剤は、例えば、ＥＦＦＥＣＴＥＮＥ（商標）（特定のＤＮＡ濃縮エンハンサーを含む非リポソーム脂質）およびＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（商標）（新規作用性デンドリマー技術）としてＱＩＡＧＥＮから市販されている。
【０２６９】
リポソームは、例えば、Ｎ−［１−（２，３ジオレイルオキシ）−プロピル］−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム（ＤＯＴＭＡ）およびジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）などのカチオン性脂質から形成される、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）およびＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ（商標）としてＧｉｂｃｏ  ＢＲＬから市販されている。リポソームを作製する方法は、当技術分野で周知であり、多数の刊行物に記載されている。リポソームはまた、Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ  Ｇ（１９８５年）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ３：２３５〜２４１頁に概説されている。
【０２７０】
特定のカチオン性脂質、例えば、特に、Ｎ−［１−（２，３ジオレオイルオキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチル−硫酸塩（ＤＯＴＡＰ）は、本発明の修飾されたオリゴリボヌクレオチド類似体と組み合わせた場合に、特に有利であると思われる。
【０２７１】
一実施形態では、ビヒクルは、哺乳類レシピエントへの移植または投与に適している生体適合性微粒子またはインプラントである。この方法に一致して有用である例示的生体内分解性インプラントが、ＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ／０３３０７（「Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ」と題された公開番号ＷＯ９５／２４９２９、に記載されている。ＰＣＴ／ＵＳ／０３０７には、外因性遺伝子を適当なプロモーターの制御下に含有するための、生体適合性、好ましくは、生分解性ポリマーマトリックスが記載されている。ポリマーマトリックスを使用して、対象において、治療薬の持続放出を達成できる。
【０２７２】
ポリマーマトリックスは、ミクロスフェア（これでは、核酸および／または他の治療薬は固体ポリマーマトリックス中に分散されている）またはマイクロカプセル（これでは、核酸および／または他の治療薬が、ポリマーシェルのコア中に保存されている）などの微粒子の形であることが好ましい。治療薬を含有するためのポリマーマトリックスの他の形として、フィルム、コーティング、ゲル、インプラントおよびステントが挙げられる。ポリマーマトリックス装置の大きさおよび組成は、マトリックスが導入される組織において好都合な放出速度論をもたらすよう選択される。ポリマーマトリックスの大きさは、用いられる予定の送達の方法、通常、組織への注射または鼻腔および／または肺領域へのエアゾールによる懸濁液の投与に従ってさらに選択される。エアゾール経路が用いられる場合、ポリマーマトリックスならびに核酸および／または他の治療薬は界面活性剤ビヒクル中に包含されることが好ましい。ポリマーマトリックス組成物は、損傷を受けた鼻腔および／または肺表面にマトリックスが投与された場合に輸送の有効性をさらに増大するために、好都合な分解速度を有し、また生体接着性である材料から形成されるよう選択できる。マトリックス組成物はまた、分解せず、むしろ、長期間にわたる拡散によって放出するよう選択してもよい。いくつかの好ましい実施形態では、核酸は、インプラントによって対象に投与され、他方、他の治療薬は急性に投与される。経口または粘膜送達などの送達に適している生体適合性ミクロスフェアは、Ｃｈｉｃｋｅｒｉｎｇら（１９９６年）Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｂｉｏｅｎｇ  ５２：９６〜１０１頁およびＭａｔｈｉｏｗｉｔｚ  Ｅら（１９９７年）Ｎａｔｕｒｅ  ３８６：４１０〜４１４頁およびＰＣＴ特許出願ＷＯ９７／０３７０２に開示されている。
【０２７３】
非生分解性および生分解性ポリマーマトリックスの両方とも、対象に核酸および／または他の治療薬を送達するために使用できる。生分解性マトリックスが好ましい。このようなポリマーは、天然ポリマーであってもよく、合成ポリマーであってもよい。ポリマーは、放出が望まれる期間、通常、数時間から１年以上という程度に基づいて選択される。通常、特に、核酸物質については、数時間と３〜１２カ月の間の範囲の期間にかけての放出が最も望ましい。ポリマーは、任意選択により、水中で最大その重量の約９０％を吸収し得るヒドロゲルの形であってもよく、さらに、任意選択により、多価イオンまたは他のポリマーと架橋していてもよい。
【０２７４】
特に注目される生体接着性ポリマーとして、Ｈ．Ｓ．Ｓａｗｈｎｅｙ、Ｃ．Ｐ．ＰａｔｈａｋおよびＪ．Ａ．Ｈｕｂｅｌｌの、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、（１９９３年）２６：５８１〜５８７頁に記載される、生体内分解性ヒドロゲルが挙げられ、その教示は本明細書に組み込まれる。これらは、ポリヒアルロン酸、カゼイン、ゼラチン、グルチン、ポリ酸無水物、ポリアクリル酸、アルギン酸塩、キトサン、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）およびポリ（オクタデシルアクリレート）を含む。
【０２７５】
治療薬が核酸である場合、凝縮剤の使用が望ましい場合もある。凝縮剤はまた、単独で使用してもよく、生物学的または化学的／物理的ベクターと組み合わせて使用してもよい。「凝縮剤」とは、本明細書において用いる場合、核酸上の負の電荷を中和し、それによって、核酸の細粒への凝縮を可能にするヒストンなどの物質を指す。核酸の凝縮によって、標的細胞による核酸の取り込みが容易になる。凝縮剤は単独で、すなわち、核酸を、細胞によってより効率的に取り込まれる形で送達するために使用してもよく、より好ましくは、１つまたは複数の上記のベクターと組み合わせて使用してもよい。
【０２７６】
核酸の取り込みを容易にするために使用できる他の例示的組成物として、リン酸カルシウムおよび細胞内輸送の他のケミカルメディエーター、マイクロインジェクション組成物、エレクトロポレーションおよび相同組換え組成物（例えば、核酸を予め選択された標的細胞染色体内の位置に組み込むための）が挙げられる。
【０２７７】
本化合物は、単独で（例えば、生理食塩水またはバッファー中）投与してよく、または当技術分野で公知の任意の送達ビヒクルを用いて投与してもよい。例えば、以下の送達ビヒクルが記載されている：コクリート（ｃｏｃｈｌｅａｔｅ）；Ｅｍｕｌｓｏｍｅ（登録商標）；ＩＳＣＯＭ（登録商標）；生細菌ベクター（例えば、サルモネラ菌、大腸菌、バチルスカルメット−ゲラン（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）、赤痢菌、乳酸桿菌）；生ウイルスベクター（例えば、ワクシニア、アデノウイルス、単純ヘルペス）；ミクロスフェア；核酸ワクチン；ポリマー（例えば、カルボキシメチルセルロース、キトサン）；ポリマー環；プロテオソーム；フッ化ナトリウム；トランスジェニック植物。本発明のいくつかの実施形態では、送達ビヒクルはリポソーム、ｐＨ感受性リポソーム（例えば、ＯｃｔｏＰｌｕｓ（登録商標））、融合性リポソーム、ニオソーム、リポプレックス、ポリプレックス、リポポリプレックス、油中水型（Ｗ／Ｏ）エマルジョン、水中油型（Ｏ／Ｗ）エマルジョン、水中油中水型（Ｗ／Ｏ／Ｗ）マルチプルエマルジョン、マイクロエマルジョン、ナノエマルジョン、ミセル、デンドリマー、ビロソーム、ウイルス様粒子、ナノスフェアまたはナノカプセルのようなポリマーナノ粒子、ミクロスフェアまたはマイクロカプセルのようなポリマー微粒子。本発明の製剤は、薬学的に許容できる溶液中で投与され、この溶液は薬学的に許容できる濃度の塩、緩衝剤、保存料、適合性担体、アジュバント、および任意選択により、他の治療成分を日常的に含有し得る。いくつかの実施形態では、組成物は無菌である。
【０２７８】
用語薬学的に許容できる担体とは、ヒトまたは他の脊椎動物への投与に適している、１つまたは複数の適合性固体または液体増量剤、希釈剤または封入物質を意味する。用語担体は、天然または合成の有機または無機成分を表し、それと有効成分が組み合わされ、適用を容易にする。医薬組成物の成分はまた、本発明の化合物と、互いに、所望の薬学的効率性を実質的に損なう相互作用がないような方法で混合され得る。
【０２７９】
経口投与には、化合物（すなわち、核酸、抗原、抗体および他の治療薬）は、活性化合物（類）を、当技術分野で周知の薬学的に許容できる担体と組み合わせることによって容易に製剤できる。このような担体は、本発明の化合物が、治療されるべき対象による経口摂取のための、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液体剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁液剤などとして製剤されるのを可能にする。経口使用のための医薬品は、錠剤または糖衣錠コアを得るために、必要に応じて、任意選択により、得られた混合物を粉砕し、顆粒の混合物を処理し、適した助剤を加え、固体賦形剤として得ることができる。適した賦形剤として、特に、糖類、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールなどの増量剤；例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロースおよび／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などのセルロース調製物がある。必要に応じて、崩壊剤、例えば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天またはアルギン酸またはアルギン酸ナトリウムなどのその塩を加えてもよい。任意選択により、経口製剤はまた、内部酸性条件を中和するために生理食塩水またはバッファー中に製剤してもよく、または担体を全く伴わずに投与してもよい。
【０２８０】
糖衣錠コアは、適したコーティングとともに提供される。この目的上、濃縮糖溶液を用いてもよく、これは任意選択により、アラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポール（ｃａｒｂｏｐｏｌ）ゲル、ポリエチレングリコールおよび／または二酸化チタン、ラッカー溶液および適した有機溶媒または溶媒混合物を含有してもよい。識別のため、または活性化合物用量の種々の組合せを特徴付けるために染料または色素も錠剤または糖衣錠コーティングに添加してよい。
【０２８１】
経口によって使用できる医薬品として、ゼラチンで作製された押し込み型のカプセル剤ならびにゼラチンとグリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤とで作製されたソフト密閉カプセル剤が挙げられる。押し込み型カプセル剤は、有効成分を、ラクトースなどの増量剤、デンプンなどの結合剤および／またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、および任意選択により安定化剤との混合物中に含有し得る。ソフトカプセル剤では、活性化合物は、脂肪オイル、液体パラフィンまたは液体ポリエチレングリコールなどの適した液体に溶解または懸濁してよい。さらに、安定化剤を添加してもよい。経口投与用に製剤されたミクロスフェアも使用してよい。このようなミクロスフェアは、当技術分野で十分に規定されている。すべての経口投与用製剤は、このような投与に適した投与量でなくてはならない。
【０２８２】
口内投与には、組成物は、従来法で製剤された錠剤またはトローチ剤の形をとり得る。
【０２８３】
吸入による投与には、本発明による使用のための化合物は、適した加圧パックまたはネブライザーから、噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適したガスの使用によって、エアゾールスプレー調製物の形で送達され得ることが好都合である。加圧エアゾールの場合、定量を送達するためのバルブを提供することによって投与量単位を決定できる。吸入器（ｉｎｈａｅｒ）または吸入器（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｏｒ）において使用するために、例えば、ゼラチンのカプセル剤およびカートリッジは、本化合物の粉末混合物およびラクトースまたはデンプンなどの適した粉末基剤を含めて製剤され得る。
【０２８４】
本化合物は、全身に送達するよう望まれる場合、注射による、例えば、ボーラス注射または持続注入による非経口投与用に製剤できる。注射用製剤は、例えば、保存料が添加された、アンプル中または複数回用量容器中の単位投与形で提示され得る。本組成物は、油性または水性ビヒクル中の溶液またはエマルジョンような形をとることができ、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの製薬物質を含有し得る。
【０２８５】
非経口投与用の医薬製剤として、水溶性の形の活性化合物の水溶液が挙げられる。さらに、活性化合物の懸濁液剤は、適当な油性注射用懸濁液として調製できる。適した親油性溶媒またはビヒクルとして、ゴマ油などの脂肪オイルまたはオレイン酸エチルなどの合成脂肪酸エステルまたはトリグリセリドまたはリポソームが挙げられる。水性注射用懸濁液剤は、懸濁液剤の粘度を増大させる物質、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランを含有し得る。任意選択により、懸濁液はまた、適した安定化剤または化合物の溶解度を増大させて、高度に濃縮された溶液の調製を可能にする物質を含有し得る。
【０２８６】
あるいは、活性化合物は、使用前に、適したビヒクル、例えば、無菌発熱物質不含水を用いて構成する散剤の形であり得る。
【０２８７】
本化合物はまた、例えば、ココアバターまたは他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を含有する坐剤または保留浣腸などの直腸用または膣用組成物に製剤できる。
【０２８８】
本化合物はまた、先に記載した製剤に加え、デポー製剤として製剤できる。このような長期作用性製剤は、適したポリマーまたは疎水性材料（例えば、許容されるオイル中のエマルジョンのような）またはイオン交換樹脂を用いて、または難溶性誘導体として、例えば、難溶性塩として製剤できる。
【０２８９】
本医薬組成物はまた、適した固体またはゲル相担体または賦形剤を含み得る。このような担体または賦形剤の例として、それだけには限らないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖類、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチンおよびポリエチレングリコールなどのポリマーが挙げられる。
【０２９０】
適した液体または固体医薬品の形として、例えば、吸入のための水溶液または生理食塩水、マイクロカプセル化されたもの、コクリート化（ｅｎｃｏｃｈｌｅａｔｅｄ）されたもの、微視的金粒子上にコーティングされたもの、リポソーム中に含有されたもの、噴霧されたもの、エアゾール、皮膚中に移植するためのペレットまたは皮膚を引っかくための尖ったもの上の乾燥されたものがある。本医薬組成物はまた、顆粒剤、散剤、錠剤、コーティング錠、（マイクロ）カプセル剤、坐剤、シロップ剤、エマルジョン、懸濁液剤、クリーム剤、ドロップ剤または活性化合物を長期間放出する調製物を含み、その調製では、賦形剤および添加剤および／または助剤、例えば、崩壊剤、結合剤、コーティング剤、膨張剤、滑沢剤、矯味剤、甘味料または可溶化剤が、上記と同様、習慣的に用いられる。本医薬組成物は、種々の薬物送達システムにおける使用に適している。薬物送達の方法の簡潔な概説については、参照により本明細書に組み込まれる、Ｌａｎｇｅｒ  Ｒ（１９９０年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７〜１５３３頁参照のこと。
【０２９１】
核酸、および任意選択により、他の治療薬および／または抗原は、それ自体で（ニート）投与してもよく、または薬学的に許容できる塩の形で投与してもよい。医薬中に用いられる場合、塩は薬学的に許容されなくてはならないが、その薬学的に許容できる塩を調製するために薬学的に許容できない塩も使用できることが好都合である。このような塩として、それだけには限らないが、以下の酸から調製されるものが挙げられる：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、ナフタレン−２−スルホン酸およびベンゼンスルホン酸。また、このような塩は、アルカリ金属塩またはアルカリ土類塩、例えば、カルボン酸基のナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩として調製できる。
【０２９２】
適した緩衝剤として以下が挙げられる：酢酸および塩（１〜２％ｗ／ｖ）；クエン酸および塩（１〜３％ｗ／ｖ）；ホウ酸および塩（０．５〜２．５％ｗ／ｖ）；ならびにリン酸および塩（０．８〜２％ｗ／ｖ）。適した保存料として、塩化ベンズアルコニウム（０．００３〜０．０３％ｗ／ｖ）；クロロブタノール（０．３〜０．９％ｗ／ｖ）；パラベン（０．０１〜０．２５％ｗ／ｖ）およびチメロサール（０．００４〜０．０２％ｗ／ｖ）が挙げられる。
【０２９３】
本組成物は、単位投与形で提示でき、薬学の技術分野で周知の任意の方法によって調製できることが好都合である。すべての方法は、化合物を、１つまたは複数の副成分を構成する担体と関係させるステップを含む。一般に、組成物は、化合物を液体担体、微粉化した固体担体または両方と、均一に、密接に関係させること、次いで、必要に応じて製剤を成形することによって調製される。液体用量単位は、バイアルまたはアンプルである。固体用量単位は、錠剤、カプセル剤および坐剤である。
【０２９４】
他の送達システムとして、持続放出型、遅延放出型または徐放性送達システムを挙げることができる。このようなシステムは、化合物の反復投与を避けることができ、対象および医師にとって利便性が増す。多数の種類の放出送達システムが入手可能であり、当業者には公知である。それらとして、ポリマー塩基システム、例えば、ポリ（ラクチド−グリコリド）、コポリオキサレート、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸およびポリ酸無水物が挙げられる。薬物を含有する上記のポリマーのマイクロカプセル剤は、例えば、米国特許第５，０７５，１０９号に記載されている。送達システムとしてまた、コレステロール、コレステロールエステルなどのステロールおよび脂肪酸またはモノ、ジ、トリグリセリドなどの中性脂肪をはじめとする脂質；ヒドロゲル放出システム；シラスティックシステム；ペプチドベースのシステム；ワックスコーティング；従来の結合剤および賦形剤を用いる圧縮錠；部分融合インプラントなどである非ポリマーシステムが挙げられる。具体的な例として、それだけには限らないが以下が挙げられる：（ａ）米国特許第４，４５２，７７５号、同４，６７５，１８９号および同５，７３６，１５２号に記載されるものなどの本発明の薬剤がマトリックス内の形で含有される浸食システムおよび（ｂ）米国特許第３，８５４，４８０号、同５，１３３，９７４号および同５，４０７，６８６号に記載されるものなどの、活性成分が制御された速度でポリマーから浸透する拡散システム。さらに、ポンプベースのハードウェア送達システムを使用でき、そのいくつかは移植に適している。
【０２９５】
本発明は、以下の実施例によってさらに例示されるが、決してさらなる制限と解釈されるべきではない。本出願を通じて引用された参照文献（参照文献、交付済み特許、公開特許出願および同時係属特許出願を含む）のすべての全内容は、参照により本明細書に明確に組み込まれる。
【実施例】
【０２９６】
材料および方法：
オリゴリボヌクレオチド
すべてのＯＲＮは、Ｂｉｏｓｐｒｉｎｇ（Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入するか、Ｃｏｌｅｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ＧｍｂＨ（Ｄｕｅｓｓｅｌｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって提供され、Ｃｏｌｅｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ＧｍｂＨによって同一性および純度について管理され、検出不能なエンドトキシンレベル（＜０．１ＥＵ／ｍｌ）しか有していないとリムルスアッセイ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｖｅｒｖｉｅｒｓ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）によって測定された。ＯＲＮを、滅菌ＤＮアーゼおよびＲＮアーゼ不含ｄＨ２Ｏ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｅｇｇｅｎｓｔｅｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に懸濁し、保存し、微生物およびエンドトキシン混入の両方を防ぐために無菌状態下で取り扱った。すべての希釈は、エンドトキシン不含Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡまたはＤＮアーゼおよびＲＮアーゼ不含ｄＨ２Ｏを用いて実施した。ＯＲＮ配列は、以下の表１に提供されている。
【０２９７】
細胞精製
実施例１〜７および１０：健常なヒトドナーから得た末梢血軟膜調製物を、デュッセルドルフ大学（ドイツ）の血液銀行から入手し、フィコール−ハイパック（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）（Ｓｉｇｍａ）上で遠心分離することによってＰＢＭＣを精製した。細胞を、３７℃の加湿したインキュベーター中、５％（ｖ／ｖ）熱不活化ヒトＡＢ血清（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）または１０％（ｖ／ｖ）熱不活化ＦＣＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（すべてＳｉｇｍａ製）を補給したＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。ＰＤＣおよび単球を、ＢＤＣＡ−４  ｐＤＣまたはＣＤ１４単球単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いて単離した。
【０２９８】
実施例８：脾臓を未処理のｓｖ１２９マウスから採取した。樹状細胞（ＤＣ）を、Ｍｙｌｔｅｎｙｉ製の磁性ビーズ（ＣＤ１１ｃ＋）を用いて精製した。細胞を３７℃の加湿したインキュベーター中で２０時間培養した。
【０２９９】
サイトカイン検出
実施例１〜６および１０：ＰＢＭＣを、約５×１０６個細胞／ｍｌの濃度で再懸濁し、９６ウェル丸底プレートに加えた（２５０μｌ／ウェル）。ＰＢＭＣを、種々のＯＲＮ濃度とともにインキュベートし（ＤＯＴＡＰの存在下：２μＭのＯＲＮを含む５０ｍｇ／ｍｌ）、２４時間後に培養上清（ＳＮ）を回収した。すぐに用いない場合、ＳＮを必要とされるまで−２０℃で保存した。
【０３００】
実施例７：ヒトＰＢＭＣ（ｎ＝２）、単球またはｐＤＣを、ＤＯＴＡＰ（２０μｇ／ｍｌ］の存在下、配列番号１４（４μＭ）、配列番号２８（０．５μＭ）または配列番号１２（０．５μＭ）を用いて２４時間刺激し、ＩＦＮ−αを測定した。
【０３０１】
実施例８：９６ウェルプレートに、精製したＤＣを、３×１０５個細胞／ウェルで播種し、２００μＬの容積中、ＤＯＴＡＰとともに製剤した５μＭ、１μＭ、２００ｎＭ、４０ｎＭ、８ｎＭまたは１．６ｎＭの指定の試薬を用いて活性化した。細胞を、３７℃の加湿したインキュベーター中で２０時間インキュベートし、ＳＮを回収した。
【０３０２】
ＳＮ中のサイトカイン（ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ＿またはＩＬ−１２ｐ４０）の量を、ＩＬ−１２ｐ４０のための（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ製）、ＩＦＮ−γのための（Ｄｉａｃｌｏｎｅ、Ｂｅｓａｎｃｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ製）市販のＥＬＩＳＡキット、または市販の抗体（ＰＢＬ、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ＮＪ、ＵＳＡ）を用いて開発したＩＦＮ−αのための自家ＥＬＩＳＡを用いて評価した。広範なセットのサイトカインおよびケモカインの分析のために、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）製のｌｕｍｉｎｅｘシステムおよびＢｉｏｓｏｕｒｃｅ（Ｓｏｌｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）製のマルチプレックスキットを用いるマルチプレックス分析を実施した。
【０３０３】
Ｉｎ  ｖｉｖｏサイトカイン誘導
ｓｖ１２９マウス（群あたり３匹）に、２：１（ｗ／ｗ）比でＤＯＴＡＰとともに製剤した、ＯＲＮまたは小分子を静脈内に注射した。血漿を注射の３時間後に回収し、ＥＬＩＳＡアッセイを実施した。
【０３０４】
誘導
本発明は、いくつかの態様では、特定の配列特異的ＲＮＡモチーフが免疫刺激性であり、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８に対して（ポリＧ末端を欠くＧＵリッチおよびＣＵリッチモチーフ）またはＴＬＲ８のみに対して（ポリＧ末端を欠くＡＵリッチモチーフ）作用する他のモチーフとは対照的に、ＴＬＲ７を介して作用するという発見を伴う。ポリＧモチーフ（複数可）が直接的または間接的に隣接する免疫刺激性ＯＲＮモチーフを含有することが好ましいＯＲＮは、ＴＬＲ７を介して免疫応答を刺激し、ＴＬＲ８を介さない。これらの別個のクラスのＯＲＮ、例えば、ＡＵおよびＧＵ含有反復配列を含有するが、ポリＧ末端を欠くＯＲＮならびに本発明のＯＲＮにおいて、ＩＦＮ−α、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１２産生間の相違を観察した。興味深いことに、本発明の免疫刺激性ＯＲＮは、強力なＩＦＮ−α応答を生じさせるが、他の通常のサイトカイン、例えば、ＴＬＲ８刺激に応じて誘導されるものは刺激しないことがわかった。全く驚くべきことに、本発明によれば、ＴＬＲ７／８およびＴＬＲ８応答を媒介するものなどの免疫刺激性ＯＲＮモチーフが、ＯＲＮ中に１つまたは複数のポリＧモチーフが組み込まれている場合にＴＬＲ７免疫プロフィールを生じさせるということも発見された。
【０３０５】
（実施例１）
本発明のＯＲＮは、多量のＩＦＮ−αを誘導するが、ＩＬ−１２ｐ４０は誘導しない
本発明のＯＲＮの免疫刺激能力を調べるために、ＰＢＭＣを、ＤＯＴＡＰの存在下、ＯＲＮとともにインキュベートした。２４時間後、上清を、ＩＦＮ−α（図１Ａ）またはＩＬ−１２ｐ４０（図１Ｂ）の存在についてアッセイした。本発明のＯＲＮ、配列番号４、配列番号８および配列番号５（表１）は、極めて多量のＴＬＲ７関連サイトカインＩＦＮ−αを誘導したが、ＴＬＲ８関連サイトカインＩＬ−１２−ｐ４０は実質的に誘導しなかった。対照的に、対照配列番号１および２、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８関連応答の既知アクチベーターは、多量のＩＦＮ−αおよび多量のＩＬ−１２ｐ４０を誘導した。
【０３０６】
（実施例２）
Ｕ−リッチ配列は、サイトカイン産生に必要である
ポリＧ領域が隣接するＯＲＮの領域の配列必要条件を調べるために、５’および３’末端でオリゴ（ｒＧ）ストレッチ内に組み込まれているＵ−リッチ配列（ホスホジエステル（ＰＯ）またはホスホロチオエート（ＰＳ）主鎖のいずれかを含む）を含有するＯＲＮを、サイトカイン産生を誘導するその能力について調べた（図２）。Ｇストレッチが隣接するＵリッチ配列を含むＯＲＮ、配列番号６は、多量のＩＦＮ−αを誘導したが（図２Ａ）、実質的な量のＩＬ−１２ｐ４０を誘導しなかった（図２Ｂ）。その配列内にＵを含まないＯＲＮ、配列番号３および７は、サイトカイン産生を誘導しなかった。
【０３０７】
（実施例３）
３’末端にオリゴ（ｄＧ）ストレッチを含むＯＲＮは、ＴＬＲ−７関連サイトカインを誘導する
ＴＬＲ７様免疫応答を誘導するのに５’オリゴ（ｒＧ）ストレッチが必要であるかどうかを決定するために、オリゴ（ｒＡ）３’末端（配列番号９）、オリゴ（ｄＧ）３’末端（配列番号１０）、３’コレステロールタグ（配列番号１１）を含むＯＲＮおよびテールのないＯＲＮ（配列番号１２）を、ＴＬＲ７様およびＴＬＲ８様サイトカイン応答を誘導するその能力について試験した。図３に示されるように、３’オリゴ（ｄＧ）（配列番号１０）ストレッチのみを含有するＯＲＮは、ＴＬＲ７様免疫応答を誘導した。配列番号１０は、多量のＩＦＮ−αを誘導したが（図３Ａ）、ＩＦＮ−γは誘導しなかった（図３Ｂ）。陽性対照（配列番号１）および配列番号９は、ＴＬＲ７／８様免疫応答を誘導したのに対し、配列番号１１および１２はＴＬＲ８様免疫応答を誘導した。
【０３０８】
（実施例４）
効率的なＩＦＮ−α誘導は、三次構造の形成と相関している
オリゴヌクレオチド中の（Ｇ）ｎストレッチ（ここで、ｎ≧４）は分子間凝集体形成につながることがわかっている。（Ｇ）ｎストレッチを含むオリゴヌクレオチドの取り込みは、非凝集オリゴヌクレオチドよりも約２０〜４０倍高く、細胞内局在性も異なると思われる。これらの知見が生物活性とどのように相関するかは理解されてない。凝集体形成が、ＯＲＮによるＴＬＲ７様免疫応答の活性化において役割を果たしたかどうかを調べるために、ヒトＰＢＭＣを、ＤＯＴＡＰの不在下または存在下で、配列番号１０および１３とともにインキュベートし、ＩＦＮ−αを測定した。配列番号１３は、１つの７−デアザ−ｒＧ介在ポリｄＧストレッチを含む以外は配列番号１０と同一配列である。取り込みエンハンサーの存在下および不在下の両方で、修飾されたＯＲＮはサイトカイン産生の低下をもたらした。配列番号１０によるＩＦＮ−αの誘導は、修飾された配列番号１３よりもかなり強力であり、このことは、凝集体形成は、ＴＬＲ７誘導性ＩＦＮ−α産生の活性化において役割を果たすということを示唆する。
【０３０９】
（実施例５）
３’末端のオリゴ（ｒＧ）およびオリゴ（ｄＧ）は、ＴＬＲ７様免疫応答を誘導するのに十分である
種々の３’タグで修飾された場合の、ＯＲＮのＩＦＮ−αを誘導する能力を比較するために、配列番号１２の活性を、３’ポリｒＡストレッチ（配列番号９）、３’ポリｄＧストレッチ（配列番号１０）、３’コレステロールタグ（配列番号１１）、３’トリエチレングリコール（配列番号１４）、３’アクリジンタグ（配列番号１６）、３’フルオレセインタグ（配列番号１７）、３’ビオチンタグ（配列番号１８）、３’ヘキサデシルグリセロールタグ（配列番号２０）および３’ポリｒＧストレッチ（配列番号２１）を含む同一配列のものと比較した。ヒトＰＢＭＣを、ＤＯＴＡＰの不在下で、示したＯＲＮとともに２４時間インキュベートし、ＩＦＮ−αを測定した。用いた３’修飾のうち、オリゴ（ｒＧ）およびオリゴ（ｄＧ）を含むＯＲＮのみが、ポリｒＡはある程度まで、ＤＯＴＡＰの不在下でのＩＦＮ−α産生に至った。
【０３１０】
（実施例６）
Ｇ残基の数が、ＩＦＮ−αの増加対ＴＮＦ−αおよび他のサイトカイン産生の減少を決定する
種々の数の３’Ｇ残基を含むＯＲＮの、ＩＦＮ−αおよびＴＮＦ−αを誘導する能力を比較するために、配列番号２１の活性を、１つの３’ｒＧを付加した同配列（配列番号２３）、１つの３’ｒＧを欠失した同配列（配列番号２４）および３個の３’ｒＧが欠失した同配列（配列番号２５）のものと比較した（図６）。３’ポリｒＧストレッチを含む免疫刺激性モチーフ（ＵＵＧＵ）を含むＯＲＮ（配列番号２６）および３’ポリｒＧストレッチを含むＵＵＵＵモチーフを含むＯＲＮ（配列番号２７）も試験した。
【０３１１】
３’Ｇの減少は、ＩＦＮ−αレベルの、未修飾ＯＲＮ配列番号１と比較して、わずかに増強されただけのレベルへの低下につながる。さらに、ポリＧテールの減少はまた、ＴＬＲ８関連サイトカインＴＮＦ−αの発現にもつながり、この効果は、ポリｒＧの数に応じて異なった。ＩＦＮ−αを増大し、他の効果を低下させるには、最小２個のＧで十分であると思われる。
【０３１２】
（実施例７）
ポリｒＧを含むＯＲＮは、ＴＬＲ８を欠くｐＤＣにおいてＴＬＲ７依存性ＩＦＮ−α産生を刺激する
３’ポリｒＧストレッチを含むＯＲＮが、ＴＬＲ７を介して作用していることを実証するために、ヒトＰＢＭＣ、単球またはｐＤＣを、ＤＯＴＡＰ（２０μｇ／ｍｌ）の存在下、配列番号１４（４μＭ）、配列番号２８（０．５μＭ）または配列番号１２（０．５μＭ）を用いて２４時間刺激し、ＩＦＮ−αを測定した。ＯＲＮおよびＣｐＧ  ＯＤＮは、ＰＢＭＣからのＩＦＮ−αを刺激することがわかった。この応答は、あったとしても最小のレベルのＴＬＲ７を発現する単球では、大幅に低減された。しかし、ＴＬＲ７発現ｐＤＣからの強力なＩＦＮ−α産生が、レベルは、ＣｐＧ  ＯＤＮよりも幾分か低いものの観察された。しかし、それにもかかわらず、レベルはＰＢＭＣにおいて観察されたものの約５倍高かった。
【０３１３】
（実施例８）
ネズミ樹状細胞におけるサイトカイン産生の刺激
本発明のＯＲＮを、ネズミ樹状細胞（ＤＣ）において、サイトカイン産生を誘導するその能力について試験した。ネズミＣＤ１１＋脾細胞を回収し、ＯＲＮで２０時間処理した。上清をＥＬＩＳＡによってＩＦＮ−α（図８Ａ）、ＩＬ−６（図８Ｂ）、ＩＬ−１２ｐ４０（図８Ｃ）およびＩＰ−１０（図８Ｄ）濃度について分析した。細胞を、ＤＯＴＡＰ（ＤＯ）を伴う既知ＴＬＲ７／８刺激性ＯＲＮ（配列番号４８）、ＴＬＲ７／８を刺激する小分子Ｒ−８４８、配列番号１２のコレステロールタグを付け、３’Ｇストレッチで修飾されたＯＲＮ（ＤＯＴＡＰを伴うおよび伴わないの両方で、それぞれ、配列番号１１および１２）、およびＤＯＴＡＰを伴う配列番号１２で処理した。配列番号２１および４８（両方ともＤＯＴＡＰを伴って製剤された）は、多量のＩＦＮ−αを誘導した。製剤されていない配列番号２１は、多量のＩＦＮ−αを、わずかに多い用量で誘導した。ＤＯＴＡＰとともに製剤した場合、配列番号２１および配列番号４８は両方とも、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−６およびＩＰ−１０を誘導した。これは、マウスが、ヒトＴＬＲ８の既知機能的ＴＬＲ８等価物を有していないので予測されたことであり、マウスＴＬＲ７単独によって誘導されたサイトカインプロフィールは、ヒトにおいてＴＬＲ７／８アクチベーターによって誘導されるものと類似している。
【０３１４】
（実施例９）
Ｉｎ  ｖｉｖｏサイトカイン誘導
本発明のＯＲＮを、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてサイトカイン産生を誘導するその能力について試験した（図９）。ｓｖ１２９マウスに、未修飾ＯＲＮ（配列番号１２）、同配列のコレステロール修飾されたＯＲＮ（配列番号１１）、同配列および３’ポリＧストレッチを含むＯＲＮ（配列番号２１）またはＲ−８４８を用いて静脈内に注射した。すべてのＯＲＮは、２：１（ｗ／ｗ）比でＤＯＴＡＰとともに製剤した。マウスを出血させ、血清を、ＥＬＩＳＡによって、ＩＦＮ−α（図９Ａ）、ＩＬ−１２ｐ４０（図９Ｂ）、ＩＰ−１０（図９Ｃ）およびＴＮＦ−α（図９Ｄ）濃度について分析した。配列番号２１は、コレステロール−修飾されたＯＲＮまたは未修飾ＯＲＮよりも高い程度にＩＦＮ−αを誘導した。配列番号２１は、より高い用量で、ＩＰ−１０を誘導し、ＩＦＮ−αをＲ−８４８よりも高い程度に誘導した（単独またはＤＯＴＡＰとともにいずれか）。配列番号２１は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの応答はｉｎ  ｖｉｔｒｏでの応答よりもわずかに弱かったので、このアッセイでは、実質的な量のＩＬ−１２ｐ４０またはＴＮＦ−αを誘導しなかった（図１０）。血清は、注射の３時間後に、ＩＰ−１０濃度について試験した。図１０Ａに示されるように、ＤＯＴＡＰとともに製剤された配列番号２１は、ＩＰ−１０を、配列番号２１単独よりも高い程度に誘導した。しかし、図１０Ｂに示されるように、配列番号２１は、コレステロールで修飾されたＯＲＮ配列番号１１よりもわずかに少ない量のＩＰ−１０を誘導した。
【０３１５】
（実施例１０）
３’ポリＧ修飾されたＯＲＮは、製剤の不在下でＴＬＲ７を刺激する
３’ポリＧ修飾されたＯＲＮが、製剤の不在下でＴＬＲ７を刺激することを実証するために、配列番号４８の塩基配列の３’変異体を作製した（これでは、３’末端から５個の塩基を除去し、５個のｄＧ残基（配列番号４２）、４個のｄＧ残基および３−メチル−ｄＧ（配列番号４３）、５個のｄＧ残基およびｄＴ（配列番号４４）、５個のｄＧ残基および逆方向ｄＴ（配列番号４５）、４個のｄＧ残基およびホスホロチオエート結合と置き換えてホスホジエステルヌクレオチド間結合を含む３−メチル−ｄＧ（配列番号４６）または４個のｄＧ残基およびｒＧ残渣（配列番号４７）で置換した）。図１１に示されるように、すべての製剤されていない修飾されたポリＧ  ＯＲＮは、ＩＦＮ−αを配列番号４８よりも多い程度に誘導したが、配列番号４８＋ＤＯＴＡＰの程度までではなかった。
【０３１６】
【表１】
2010507386.tif 000007
【０３１７】
本発明の少なくとも１つの実施形態のいくつかの態様をこのように説明したが、種々の変更、改変および改良は、当業者にとって容易に想到されることは理解されよう。このような変更、改変および改良は、本開示内容の一部であるものとし、本発明の趣旨および範囲内であるものとする。したがって、上記の説明および図面は、ほんの一例にすぎない。
【図１】
2010507386.tif 000012
【図２】
2010507386.tif 000013
【図３】
2010507386.tif 000014
【図５】
2010507386.tif 000015
【図７】
2010507386.tif 000016
【図８】
2010507386.tif 000017
【図９】
2010507386.tif 000018
【図１０】
2010507386.tif 000019
【図１１】
2010507386.tif 000020
【図４】
2010507386.tif 000021
【図６】
2010507386.tif 000022
【配列表】
2010507386000001.app
【国際調査報告】
2010507386.tif 000023
2010507386.tif 000024
2010507386.tif 000025
2010507386.tif 000026