(57)【要約】本発明は、種々の状態によって引き起こされる急性腎不全に罹患している被験体を予防および／または処置するための方法を提供する。この方法は、プロテインＣを活性化しない可溶性トロンボモジュリンを被験体に投与する工程を含む。標準的なケアと併せて、プロテインＣを活性化しない可溶性トロンボモジュリンは、急性腎損傷ならびにその後の罹患率および死亡率を予防または減少させる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテインＣを活性化しない有効量の可溶性トロンボモジュリン変異体を、それを必要とする患者に投与する工程を含む、急性腎不全を処置する方法。
【請求項２】
プロテインＣを活性化しない有効量の可溶性トロンボモジュリン変異体を、それを必要とする患者に投与する工程を含む、急性腎不全を予防する方法。
【請求項３】
治療のための、プロテインＣを活性化しない可溶性トロンボモジュリンの使用。
【請求項４】
患者における急性腎不全を処置するための医薬の製造のための、プロテインＣを活性化しない可溶性トロンボモジュリン変異体の使用。
【請求項５】
患者における急性腎不全を予防するための医薬の製造のための、プロテインＣを活性化しない可溶性トロンボモジュリン変異体の使用。
【請求項６】
該可溶性トロンボモジュリン変異体が、配列番号４の配列を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法または使用。
【請求項７】
該可溶性トロンボモジュリン変異体が、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３からなる群より選択される配列を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法または使用。
【請求項８】
該可溶性トロンボモジュリン変異体が、配列番号６、配列番号９、配列番号１０および配列番号１３からなる群より選択される配列を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法または使用。
【請求項９】
配列番号４の配列を有する、可溶性トロンボモジュリン変異体。
【請求項１０】
該可溶性トロンボモジュリン変異体が、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３からなる群より選択される配列を有する、請求項９に記載の可溶性トロンボモジュリン変異体。
【請求項１１】
該可溶性トロンボモジュリン変異体が、配列番号６、配列番号９、配列番号１０および配列番号１３からなる群より選択される配列を有する、請求項９または１０に記載の可溶性トロンボモジュリン変異体。
【請求項１２】
請求項９〜１１のいずれか１項に記載の可溶性トロンボモジュリン変異体を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学、特に、可溶性トロンボモジュリンを用いる急性腎不全の予防および処置に関する。
【背景技術】
【０００２】
急性腎不全（ＡＲＦ）は、腎臓の微小血管系の急性損傷によって生じる状態をいう一般用語である。急性損傷の正確な性質は様々であるが、ＡＲＦは、一般に、糸球体濾過率の突然の減少、窒素老廃物の蓄積、電解質と水とのバランスを調節する腎臓の不能によって特徴付けられる。
【０００３】
ＡＲＦに罹患している患者のケアにおける技術の進歩および疾患の進行の病態生理学の理解の向上にもかかわらず、この状態に関連する高い死亡率が依然として存在する。このことは、ＡＲＦが５０〜９０％の死亡率に関連するＩＣＵ（集中治療室）設定において特に当てはまる。多数の実験モデルは、ドーパミン、浸透圧性薬剤、心房性ナトリウム利尿ペプチド、インスリン様成長因子および内皮受容体拮抗薬を含む、様々な薬剤が、動物モデルにおいて有効であると示しているが、これらの薬剤は、ＡＲＦの臨床研究において効果がない。
【０００４】
トロンボモジュリン（ＴＭ）は、肺、肝臓および腎臓を含む、多くの器官における内皮細胞の膜表面に結合される糖タンパク質であり、炎症、線維素溶解、アポトーシス、細胞接着および細胞増殖において周知の確立された役割を有すると示されている。ＴＭは、トロンビンの凝血促進活性を阻害するために、トロンビンと複合体を形成することができ、一度、複合体が形成されると、ＴＭ／トロンビン複合体は、プロテインＣ（ＰＣ）の活性化を１０００倍高めることができる。活性化したＰＣ（ＡＰＣ）はまた、抗炎症性特性を有することに加えて、凝血カスケードを調節する。
【０００５】
ＴＭは、５つのドメイン：Ｎ末端レクチン様結合ドメイン、６つのＥＧＦ様リピートからなる上皮成長因子（ＥＧＦ）ドメイン、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−リッチ領域、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインから構成される。可溶性ＴＭ変異体は、細胞質および膜貫通ドメインを欠失させることによって構築されている。ＴＭの機能を理解しようとする試みのために、さらなるＴＭ変異体が生成されている。ＴＭ欠失変異体は、トロンビン結合およびＰＣ活性化を保持する最も小さいＴＭフラグメント（ＥＧＦ様リピート４−６）を決定するために用いられている。Ｎａｇａｓｈｉｍａおよびその共同研究者は、トロンボモジュリン活性に重要である残基を決定するために、このＴＭ領域のアラニンスキャニングを使用した。ＥＧＦ４−６からなるポリペプチド内の特定の残基のアラニンへの変更により、非常に減少したレベルのＰＣ活性化を有するｓＴＭ変異体が生じた。しかしながら、急性腎不全の処置におけるｓＴＭまたは任意のｓＴＭ変異体の使用は、開示されていなかった（非特許文献１）。
【０００６】
最近の結果は、ＡＰＣが、ラットにおいて虚血／再潅流により誘発される腎損傷を予防するのに効果的であることを示す（非特許文献２）。この研究は、ＡＰＣが、白血球活性化を阻害することによって、および凝血を軽減することによって、この腎損傷を予防することができることを示す。ＡＰＣの使用が有望のように思われるが、急性腎臓の状況において抗凝血環境を誘発する危険性は、知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｎａｇａｓｈｉｍａら、「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，１９９３年，２６８（４），ｐ．２８８８−２８９２
【非特許文献２】Ｍｉｚｕｔａｎｉら、「Ｂｌｏｏｄ」，２０００年，９５（１２），ｐ．３７８１−３７８７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
安全でありかつ効果的である急性腎不全を処置するための代替の選択肢の必要性が依然として存在している。従って、本出願人らは、プロテインＣを活性化しない可溶性トロンボモジュリン変異体が、ＡＲＦのインビボでの実験モデルにおいて予期しない効果があることを発見した。それ故、凝血カスケードを調節できない可溶性トロンボモジュリン変異体を用いることは、ＡＲＦの予防および処置のための、潜在的に重要な代替アプローチを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、プロテインＣを活性化しない可溶性トロンボモジュリン（ｓＴＭ）変異体を提供する。好ましい実施形態において、ｓＴＭ変異体は、配列番号４の配列を有する。
【００１０】
本発明は、有効量のｓＴＭ変異体を、それを必要とする患者に投与する工程であって、前記ｓＴＭ変異体がプロテインＣを活性化しない工程を含む、急性腎不全を処置する方法を提供する。好ましい実施形態において、本発明は、有効量のｓＴＭ変異体を、それを必要とする患者に投与する工程であって、前記ｓＴＭ変異体が配列番号４のポリペプチド配列を有する工程を含む、急性腎不全を処置する方法を提供する。
【００１１】
別の実施形態において、本発明は、有効量のｓＴＭ変異体を、それを必要とする患者に投与する工程であって、前記ｓＴＭ分子がプロテインＣを活性化しない工程によって、急性腎不全を予防する方法を提供する。本発明はまた、プロテインＣを活性化しない有効量のｓＴＭ変異体を、それを必要とする患者に投与する工程であって、前記ｓＴＭ変異体は配列番号４の配列を有する工程を含む、急性腎不全を予防する方法を提供する。
【００１２】
さらに別の実施形態において、本発明は、患者における急性腎不全を処置するための、ＰＣを活性化しないｓＴＭ変異体の使用を提供する。より好ましい実施形態において、本発明は、患者における急性腎不全を処置するための、プロテインＣを活性化しないｓＴＭ変異体の使用であって、前記ｓＴＭが配列番号４の配列を有する使用を提供する。別の実施形態において、本発明は、患者における急性腎不全を処置するための医薬の製造のための、ＰＣを活性化しないｓＴＭ変異体の使用を提供する。より好ましい実施形態において、本発明は、患者における急性腎不全を処置するための医薬の製造のための、プロテインＣを活性化しないｓＴＭ変異体の使用であって、前記ｓＴＭが配列番号４の配列を有する使用を提供する。
【００１３】
本発明はまた、患者における急性腎不全を予防するための、ＰＣを活性化しないｓＴＭ変異体の使用を提供する。より好ましい実施形態において、本発明は、患者における急性腎不全を予防するための、プロテインＣを活性化しないｓＴＭ変異体の使用であって、前記ｓＴＭが配列番号４の配列を有する使用を提供する。本発明はまた、患者における急性腎不全を予防するための医薬の製造のための、ＰＣを活性化しないｓＴＭ変異体の使用を提供する。より好ましい実施形態において、本発明は、患者における急性腎不全を予防するための医薬の製造のための、プロテインＣを活性化しないｓＴＭ変異体の使用であって、前記ｓＴＭが配列番号４の配列を有する使用を提供する。
【００１４】
本発明はまた、配列番号４のｓＴＭ変異体を含む医薬組成物を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（定義）
本明細書に開示され特許請求される本発明の目的のために、以下の用語を以下のように定義する。
【００１６】
「ＡＲＦ」とは、窒素老廃物の滞留に関連する糸球体濾過率の急激な低下を１つの症状として有する急性腎不全をいう。この低下は、例えば、急性尿細管壊死または急性間質性腎炎のような急性腎損傷に起因する場合がある。あるいは、急性腎不全は、急性腎機能障害と呼ばれる場合がある。
【００１７】
「ｓＴＭ」とは、配列番号３の可溶性トロンボモジュリンをいう。
【００１８】
「ｓＴＭ変異体」とは、配列番号３と比較した場合、１つ以上の置換を有するｓＴＭをいう。
【００１９】
「有効量」とは、治療的に有効なｓＴＭ変異体の量をいう。本発明に従って投与されるｓＴＭ変異体の特定の用量は、もちろん、投与される化合物、処置される特定の状態、患者の特性および同様の考慮すべき事項など、症例に関連する特定の状況を評価する主治医によって決定される。
【００２０】
「処置」または「処置する」とは、疾患、状態または障害を除去、減少、または制御するための患者の管理およびケアをいう。
【００２１】
「予防」または「予防する」とは、疾患、状態または障害の症状または合併症の発症を遅らせるための患者の管理およびケアをいう。
【００２２】
可溶性トロンボモジュリン（ｓＴＭ）は、可溶性であり、全長のトロンボモジュリン膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを欠く分泌されたトロンボモジュリンの変異体である。ヒトトロンボモジュリン（配列番号１）のアミノ酸の一次構造は、欧州特許第０４１２８４１  Ａ１号に記載されるように、当該分野において公知である。ヒトＴＭは、長さが１６、１８、または２１残基であると報告されているシグナルペプチド部分を含む、５７５アミノ酸タンパク質として合成される。シグナルペプチド部分に続いて、ヒトＴＭは、アミノ末端から順に、以下のドメインまたは領域を含む、１）約２２２−２２６アミノ酸のアミノ末端ドメイン、２）約２３６−２４０アミノ酸の６つのＥＧＦ（「上皮成長因子」）様構造（ＥＧＦドメイン）、３）約３４−３７アミノ酸のセリン／トレオニンリッチドメイン（ＳＴドメイン）で、数個のＯ−グリコシル化部位を有する可能性があるドメイン、４）約２３−２４アミノ酸の膜貫通領域、および５）約３６−３８アミノ酸の細胞質ドメイン。本明細書で使用される場合、「アミノ末端ドメイン」、「ＥＧＦドメイン」、「ＳＴドメイン」、「膜貫通領域またはドメイン」および「細胞質領域またはドメイン」とは、各領域またはドメインについて上記されたアミノ酸残基のおおよその範囲をいう。さらに、インビボでの処理が、発現している形質転換宿主細胞、特に、真核宿主細胞と比較して原核宿主細胞に依存して変わると予想されるため、用語「アミノ末端領域またはドメイン」は、必要に応じて、トロンボモジュリンシグナルペプチドまたはその部分を含んでもよい。
【００２３】
当業者は、シグナルペプチドの開裂のバリエーションが、異なるサイズのタンパク質を生成し、アミノ酸位置についての異なる番号付けを生じることを理解するであろう。例示の目的のために、アミノ酸位置の番号付けは、配列番号３に基づく。配列番号３の最初のアラニンは、アミノ酸の番号付けのために１位と指定される。
【００２４】
さらに、本発明のｓＴＭ変異体は、置換されたアミノ酸についての一文字表記、アミノ酸位置の番号、置換アミノ酸残基の順で命名される。例えば、ｓＴＭ  Ｙ３７６は、３７６位のチロシンを指定する。さらに、Ｙ３７６Ｅとは、３７６位のチロシンがグルタミン酸に変更されているｓＴＭ変異体をいう。
【００２５】
本発明のｓＴＭ変異体は、プロテインＣを活性化しない。好ましい実施形態において、ｓＴＭ変異体は、配列番号４：
【化１】
2010512411.tif 000002
【化２】
2010512411.tif 000003
（配列中、３５８位のＸａａは、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、またはＧｌｎであり、３７６位のＸａａは、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＶａｌであり、あるいは、４１０位のＸａａは、ＰｒｏまたはＬｅｕである（配列番号４））の配列を有する。
【００２６】
より好ましい実施形態において、本発明は、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３からなる群より選択される配列を有する可溶性トロンボモジュリン変異体を提供する。より好ましい実施形態において、本発明は、配列番号６、配列番号９、配列番号１０および配列番号１３からなる群より選択される配列を有する可溶性トロンボモジュリン変異体を提供する。本発明の好ましい実施形態は、３５８、３７６または４１０位のアミノ酸において置換を有するｓＴＭ変異体である。好ましい実施形態において、ｓＴＭ変異体は、Ｙ３５８Ｄ（配列番号５）、Ｙ３５８Ｅ（配列番号６）、Ｙ３５８Ｎ（配列番号７）、およびＹ３５８Ｑ（配列番号８）からなる群より選択される配列を有する。より好ましい実施形態において、ｓＴＭ変異体は、Ｙ３５８Ｅの配列を有する。別の実施形態において、ｓＴＭ変異体は、Ｆ３７６Ｉ（配列番号９）、Ｆ３７６Ｌ（配列番号１０）、Ｆ３７６Ｖ（配列番号１１）、およびＦ３７６Ｇ（配列番号１２）からなる群より選択される配列を有する。より好ましい実施形態において、ｓＴＭ変異体は、Ｆ３７６ＩおよびＦ３７６Ｌからなる群より選択される配列を有する。さらにより好ましい実施形態において、ｓＴＭ変異体は、Ｆ３７６Ｌの配列を有する。好ましい実施形態において、ｓＴＭ変異体は、Ｆ３６７Ｉの配列を有する。本発明の別の実施形態は、４１０位にプロリンのアミノ酸置換を有するｓＴＭ変異体である。より好ましい実施形態において、ｓＴＭ変異体は、Ｐ４１０Ｌ（配列番号１３）の配列を有する。
【００２７】
ヒト組み換え可溶性トロンボモジュリンを生成するための方法は、以前に記載されている（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎら、１９９０Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１２６０２−１２６１０）。この発明は、当該分野において公知の種々の方法において達成することができる分子遺伝子操作を含む。本発明の組み換え細胞、プラスミド、およびＤＮＡ配列は、薬学的に有用な化合物（この化合物は、組み換え細胞から分泌される、可溶性トロンボモジュリン変異体である）を生成するための手段を提供する。
【００２８】
概して、本出願において使用される命名の定義および一般的な実験手順の説明は、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．に見出され得る。そのマニュアルは、本明細書の以下において、Ｓａｍｂｒｏｏｋと呼ばれる。さらに、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（１９８７および定期的に更新される）Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋは、本出願にとって有用な方法を開示している。
【００２９】
本発明の実施形態は、しばしば、インビトロでの突然変異生成による新規のｓＴＭ変異体およびｓＴＭ変異体をコードする遺伝子の作製に関する。作製された遺伝子は、中間体ベクターにおいて単離され、Ｅ．ｃｏｌｉのような原核生物において増幅するためにクローニングされる。Ｅ．ｃｏｌｉは、生物体が培養し易く、他の種の原核生物よりも十分に理解されているため、好ましい。Ｓａｍｂｒｏｏｋのマニュアルは、後に記載されるＥ．ｃｏｌｉにおけるクローニングを完全に実施するのに十分な方法論を含む。代表的なベクターは、商業的な供給源から利用可能なｐＢＲ３２２およびｐＵＣシリーズを含む。
【００３０】
ｓＴＭ変異体は、ヒトｓＴＭのアミノ酸配列（配列番号３）を変えることによって生成される。アミノ酸が、タンパク質の配列において除去または置換され得る方法は、周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出；Ａｕｓｕｂｅｌら、前出；米国特許第４，７３７，４６２号；米国特許第４，５８８，５８５号；欧州特許第０２８５１２３号；および本明細書に引用される参考文献を参照のこと。変更されたアミノ酸配列を有するペプチドをコードする遺伝子は、例えば、合成的に作製され得る。好ましい方法は、インビトロでの部位特異的突然変異生成の使用である。部位特異的突然変異生成の連続ラウンドは、複数の置換を有する類似体を生成するのに用いることができる。
【００３１】
当業者は、所望のｓＴＭ変異体の発現のために選択される発現系に精通していると予想される。つまり、ポリヌクレオチドは、配列が、発現制御配列に操作可能に連結された（すなわち、発現制御配列の機能を確実にするために位置付けされた）後、宿主において発現される。これらの発現ベクターは、典型的に、エピソームまたは宿主染色体ＤＮＡの一体部分のいずれかとして宿主生物において複製可能である。通常、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列で形質転換されたこれらの細胞の検出を可能にするために、選択マーカー、例えば、テトラサイクリン、ネオマイシン、ジヒドロ葉酸還元酵素などを含む。目的のポリヌクレオチド配列（例えば、可溶性トロンボモジュリン変異体をコードする配列および発現制御配列）を含むベクターは、細胞の宿主によって異なる周知の方法によって宿主細胞に移入される。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションは、通常、原核細胞のために利用されるが、リン酸カルシウム処理またはエレクトロポレーションを他の細胞の宿主に使用してもよい。
【００３２】
Ｅ．ｃｏｌｉは、本発明のポリヌクレオチドをクローニングするために特に有用な原核細胞の宿主である。使用に適した他の微生物宿主としては、桿菌、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｕｓ、および他の腸内細菌、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、および種々のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種が挙げられる。これらの原核生物の宿主において、発現ベクターを作製することもでき、その発現ベクターは、典型的に、宿主細胞（例えば、複製起点）と適合する発現制御配列を含む。さらに、任意の多くの周知のプロモーター、例えば、ラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、βラクタマーゼプロモーター系、またはラムダファージ由来のプロモーター系が、存在してもよい。プロモーターは、典型的に、必要に応じて、オペレーター配列で発現を制御し、転写および翻訳を開始および終了するためのリボソーム結合部位配列などを有する。
【００３３】
真核細胞もまた、本発明のｓＴＭ変異体を発現および生成するために用いることができる。例えば、酵母を発現用に用いることができる。Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓは、必要に応じて、発現制御配列、例えば、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の糖分解酵素を含むプロモーター、および複製起点、終止配列などを有する適切なベクターを含む、好ましい宿主である。さらに、哺乳動物の組織細胞培養物もまた、本発明のポリペプチドを発現および生成するために使用することができる。実際には、哺乳動物の組織培養物が好ましい。なぜなら、インタクトな組み換えタンパク質を分泌できる多くの適切な宿主細胞株が、当該分野において開発されているからであり、それには、ＣＨＯ細胞株、種々のＣＯＳ細胞株、ヒーラー細胞、骨髄腫細胞株、形質転換されたＢ細胞、ヒト胚腎臓細胞株、またはハイブリドーマなどが含まれる。好ましい細胞株は、ＣＨＯおよび骨髄腫細胞株、例えば、ＳＰ２／０およびＮＳ０である。
【００３４】
これらの細胞の発現ベクターは、発現制御配列、例えば、複製起点、プロモーター、エンハンサー、必要な処理情報部位、例えば、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終了配列などを含むことができる。好ましい発現制御配列は、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、サイトメガロウイルスなどのようなプロモーターである。好ましいポリアデニル化部位は、ＳＶ４０およびウシ成長ホルモン由来の配列を含む。
【００３５】
プロテインＣを活性化するためのヒトトロンボモジュリンの能力を測定する方法は、当該分野において公知である。例えば、ＧｒｉｎｎｅｌｌおよびＢｅｒｇ．１９９６．Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７０：Ｈ６０３−６０９に記載されるような細胞培養ベースのアッセイは、プロテインＣ活性化を測定するために用いることができる。さらに、このアッセイは、ヒトｓＴＭが、異なる因子の存在下においてラットＰＣを活性化できるかどうかを測定するために用いることができる。つまり、内因性ＴＭを与えるヒト大動脈内皮細胞は、ヒトまたはラットプロテインＣと、ヒトまたはラットトロンビンとの組み合わせとともにインキュベートされ、プロテインＣ活性化の量は、発色基質の開裂率によって測定される。その結果は、１００％ＰＣ活性化としてヒトトロンビンと、ヒトプロテインＣとの反応において得られた率を確立し、他の条件下で得られた率と、この１００％とを比較することによって報告される。このアッセイにおいて、内因性ヒトＴＭは、ラットトロンビンの存在下においてラットプロテインＣを活性化できず（０％活性化）、ヒトトロンビンの存在下においてラットプロテインＣの活性化が不十分（１２．８３％）である。
【００３６】
上述のＧｒｉｎｎｅｌｌおよびＢｅｒｇはまた、プロテインＣ活性化を測定するための無細胞ベースのアッセイを記載している。つまり、ラットｓＴＭ、ヒトｓＴＭまたはｓＴＭ変異体を、ラットプロテインＣおよびラットトロンビンと組み合わせる。ラットプロテインＣを活性化するためのｓＴＭの能力は、発色基質のプロテインＣ依存性開裂率によって測定される。実施例１に例示されるように、ラットトロンビンおよびラットｓＴＭは、ラットＰＣを活性化する。しかしながら、ラットＰＣ活性化は、ヒトｓＴＭの存在下において１０倍超減少し、ｓＴＭ変異体Ｙ３５８Ｌによって全く検出できない程度まで不活性化される。
【００３７】
本発明は、ＰＣを活性化しないｓＴＭ変異体の投与を含む、急性腎不全の処置および予防を提供する。本発明は、プロテインＣを活性化しない有効量のｓＴＭ変異体の投与を含む、急性腎不全を処置または予防する方法を提供する。本発明の方法の好ましい実施形態において、ｓＴＭ変異体は、配列番号４の配列を有する。本発明の方法のより好ましい実施形態において、ｓＴＭ変異体は、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３からなる群より選択される。本発明の方法のより好ましい実施形態において、ｓＴＭ変異体は、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、および配列番号１３からなる群より選択される。
【００３８】
別の実施形態において、本発明は、治療のためのプロテインＣを活性化しないｓＴＭ変異体の使用を提供する。好ましい実施形態において、プロテインＣを活性化しないｓＴＭ変異体は、急性腎不全を処置するための医薬の製造において使用される。別の好ましい実施形態において、本発明は、急性腎不全を予防するための医薬の製造のための、プロテインＣを活性化しないｓＴＭ変異体の使用を提供する。好ましい実施形態において、ｓＴＭ変異体は、配列番号４の配列を有する。別の好ましい実施形態において、ｓＴＭは、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、および配列番号１３からなる群より選択される。より好ましい実施形態において、ｓＴＭ変異体は、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、および配列番号１３からなる群より選択される。
【００３９】
急性腎不全のインビボでのモデルが記載されている。例えば、実施例２は、当業者に公知のＬＰＳによって誘発される急性腎不全のラットモデルを記載している（Ｋｉｋｅｒｉら、（１９８６）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２５０：Ｆ１０９８−１１０６）。ＬＰＳによって誘発されるモデルは、一般に、Ｅ．ｃｏｌｉＬＰＳのボーラス注入を用いる誘発性急性腎不全からなる。ＬＰＳのボーラス注入により、ＧＲＦの減少および血中尿素窒素（ＢＵＮ）レベルの増加を生じる内毒素血が引き起こされる。ｓＴＭ変異体は、内毒素血の誘発前に、ヒトｓＴＭ変異体でラットを処置することによって、この急性腎損傷を減少または予防するための能力を試験してもよい。つまり、ヒトまたはラットｓＴＭは、ＬＰＳの腹腔内投与によって、内毒素血の誘発の１２時間前に投与されるが、コントロールのラットは、誘発の１２時間前にビヒクルを与えられる。ＬＰＳまたはビヒクル投与後、２４時間で、動物は犠牲にされ、血液サンプルが、血中尿素窒素分析のために採取される。実施例２に示すように、ヒトまたはラットｓＴＭの投与は、ＢＵＮレベルの減少の測定で示されるように、急性腎損傷を減少させることができる。
【００４０】
さらに、本発明のｓＴＭ変異体はまた、実施例３に示されるように、ＡＲＦの虚血性ラットモデル試験してもよい。つまり、ｓＴＭまたはｓＴＭ変異体は、腎虚血の誘発の２４時間前に投与される。腎虚血は、腎動脈の直下の腹部大動脈の部分的な締め付けによって誘発され、血流を９０％減少させる。締め付けは１時間維持され、次いで、取り除かれる。次いで、急性腎損傷は、血清クレアチニンレベルの増加として測定される。表３に示すように、ヒトｓＴＭまたはｓＴＭ変異体の投与は、生理食塩水で処置されたラットと比較して、血清クレアチニンレベルを顕著に減少させた。
【００４１】
好ましい実施形態において、本発明のｓＴＭ変異体は、ヒトへの種々の投与方法に適した医薬組成物として慣用の手順に従って処方される。本発明のｓＴＭ変異体は、薬理学的に許容できる希釈剤または賦形剤に懸濁された本発明のｓＴＭ変異体を含む組成物の形態であってもよい。これらの医薬組成物は、急性腎不全の処置に必要な一般的に意図される目的を達成する、当該分野において公知の任意の手段によって投与されてもよい。好ましい投与経路は、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下、および関節内の注射および注入を含む、投与方法として本明細書で定義される、非経口である。より好ましくは、ｓＴＭ変異体は、ＩＶボーラスおよび／または皮下注射のいずれかによって投与される。好ましい暴露時間は、１〜２４時間またはそれ以上の範囲であり、４８、７２、９６または更に１２０時間を含むが、それらに限定されない。投与される用量は、受容者の年齢、健康状態および体重、併用療法があればその種類、処置の頻度、ならびに所望される効果の性質に依存する。
【００４２】
本発明の範囲内の組成物は、急性腎不全の処置にとって望ましい医療効果を達成するのに効果的な量のｓＴＭ変異体が存在する、全ての組成物を含む。投与のための医薬組成物は、選択される投与方法に適切であるように設計され、そして薬学的に許容できる賦形剤（例えば、緩衝液、界面活性剤、防腐剤、可溶化剤、等張性剤、安定剤、担体など）が、適宜使用される。参照として本明細書に援用されるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，イーストン  ペンシルバニア州、最新版は、一般に、医師に公知の処方技術の概要を提供する。
【００４３】
処方物におけるｓＴＭ変異体の濃度は、わずか約０．１重量％から１５重量％または２０重量％もの濃度であってもよく、選択される特定の投与方法に従って、液量、粘性、安定性などに基づいて主に選択される。ｓＴＭ変異体の好ましい濃度は、一般に、１〜約１００ｍｇ／ｍＬの範囲である。
【００４４】
典型的な用量レベルは、標準的な臨床技術を用いて最適化でき、投与方法および患者の状態に依存する。一般に、用量は、１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。
【００４５】
以下の実施例は、例示目的であり、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００４６】
（実施例１  ｓＴＭ変異体によるラットプロテインＣ活性化）
種々のヒトｓＴＭ変異体によるラットＰＣの活性化率を測定するために、動的解析を行う。各ｓＴＭ変異体について、反応を、以下のように定める。１００μＬの最終反応体積において、最終濃度１５０ｎＭのラットプロテインＣを加え、最終濃度２ｎＭのラットトロンビンを加える。ＡＢ／ＢＳＡ緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５；３ｍＭ  ＣａＣｌ２；１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）中のｓＴＭまたはｓＴＭ変異体を、０．５ｎＭ〜３０ｎＭの最終濃度で反応に加える。反応混合物を、３７℃で３０分、インキュベートする。各反応の２５μＬを、１５０μＬのトロンビン停止緩衝液（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  Ｓｔｏｐ  Ｂｕｆｆｅｒ）（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中の１ユニット／ｍｌヒルジン；２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５；３ｍＭ  ＣａＣｌ２）を含む９６ウェルプレートに移し、室温で５分、インキュベートする。Ｓ２３６６発色基質（Ｌ−ピログルタミル−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリン塩酸塩、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）の４μＭ原液２５μＬを加えて、簡単に混合する。４０５ｎｍでの吸光度（ＯＤ４０５）を、６秒の読み取り間隔で、５分の動的読み取りにおいてマイクロプレート分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ）で読み取る。ミカエリスメンテン（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ  Ｍｅｎｔｏｎ）速度定数を、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  Ｍｏｄｕｌｅ１．１を有するＳｉｇｍａＰｌｏｔソフトウェアを用いて動的データから計算した。「ＴＬＤ」は、非常に低くて検出できないことを示す。
【００４７】
動的アッセイの結果が示すように、ヒトｓＴＭ（配列番号３）は、ラットＰＣを活性化できるが、しかしながら、その活性化率は、ラットｓＴＭ（配列番号１４）により得られたものより１０倍超低かった。試験したｓＴＭ変異体（配列番号１０）で得られたラットＰＣ活性化率は、非常に低くて検出できず、ｓＴＭ変異体がラットＰＣを活性化できなかったことを示す。
【００４８】
【表１】
2010512411.tif 000004
【００４９】
（実施例２  ラットにおけるＬＰＳ誘発急性腎不全へのヒトおよびラットｓＴＭの効力）
重量２００−２５０ｇの雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｈａｒｌａｎ，インディアナ州，ＵＳＡ）を、この研究に使用する。当該動物を、外科手術の時に２つの群：１）偽処置および２）ＬＰＳ処置した動物に無作為に分ける。ＬＰＳ処置した群の動物をさらに、ビヒクル、ヒトｓＴＭ（ｈｓＴＭ−配列番号３）、またはラットｓＴＭ（ｒｓＴＭ−配列番号１４）のサブグループに分ける。内毒素血は、Ｅ．ｃｏｌｉＬＰＳ（２０ｍｇ／ｋｇ；リポ多糖ＷＥ．ｃｏｌｉ０１１１：Ｂ４，Ｓｉｇａｍａ，デトロイト、ミシガン州）の腹腔内投与によって誘発する。コントロールの群に、ピロゲンを含まない生理食塩水を与える。ＨｓＴＭ（２．５ｍｇ／ｋｇ）またはｒｓＴＭ（２．５ｍｇ／ｋｇ）を、内毒素血の誘発の１２時間前に、皮下投与する。動物を、ＬＰＳ投与後、２４時間で犠牲にし、血液サンプルをＢＵＮ解析のために採取する。以下の結果は、１つの群につき、４匹のラットの平均である。
【００５０】
ヒトｓＴＭおよびラットｓＴＭは、同程度でＢＵＮレベルを減少させることができる。ヒトｓＴＭはラットＰＣを活性化するための能力を非常に欠いているが、ヒトｓＴＭによるＢＵＮレベルの減少は、ＬＰＳによって誘発された急性腎損傷の減少が、ＰＣの活性化に依存しないことを示す。
【００５１】
【表２】
2010512411.tif 000005
【００５２】
（実施例３  齧歯動物の部分的大動脈締め付け（ＰＡＣ）モデルにおけるｓＴＭ変異体の効力）
ｓＴＭ変異体による前処置が虚血性ＡＲＦに及ぼす効果を評価するため、ラット（２００−２５０ｇ、Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、インディアナポリス、インディアナ州）を、２つの群に分ける。ｓＴＭ（５ｍｇ／ｋｇ）を、１つの群（処置群）に、外科手術の２４時間前に皮下投与し、一方、等体積の生理食塩水を、他の群（未処置群）に、外科手術の２４時間前に投与する。外科手術前の晩、ラットに食物を与えず、水のみを与える。麻酔を５％ハロタンで誘発し、フェイスマスクを介して酸素が豊富な空気中の１−１．５％ハロタンで維持する。ラットの腹部を剃毛した後、皮膚および筋肉組織を通して正中切開を施し、腹腔を露出させる。次に、腎動脈の直下の腹大動脈を、下大静脈から鈍的切開により摘出し、腎臓下の大動脈血流量の測定のために超音波プローブ（２．０ｍｍ直径、Ｔｒａｎｓｉｔ  Ｔｉｍｅ  Ｐｅｒｉｖａｓｃｕｌａｒ  Ｆｌｏｗｍｅｔｅｒ  ＴＳ４２０（Ｔｒａｎｓｏｎｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ，Ｉｔｈｉｃａ，ＮＹ））を配置し、固定する。次に、上部の腹大動脈を鈍的切開により摘出し、腹腔動脈と上腸間膜動脈との間に大動脈を露出させるために、周囲の組織から解放させる。
【００５３】
大動脈締め付け自体は、２つの４ｍｍ長のポリエチレンチューブ（ＰＥ−１００、０．８６ｍｍの直径、Ｃｌａｙ  Ａｄａｍｓ  Ｃｏ、パーシッパニー、ニュージャージー州）および１０インチ（約２５．４ｃｍ）の標準的な絹の３．０縫合糸で構成する。絹の縫合糸を、まず、上記部位において大動脈の下部から通過させる。次に、チューブの１本目を糸の両端部にわたるように通過させ、腹腔とＳＭＡとの間の大動脈に最終的に配置させる。次に、絹の糸をループ状にし、ゆるく結ぶ。次に、チューブの２本目をループ内に、１本目の上に垂直に配置する。次に、絹の糸を結さつし、糸の２つの端部の張力を、超音波プローブリーダーで測定して最初の大動脈血流量が９０％減少するまで増加させる。この最初の大動脈血流量を、チューブを配置する前に記録する。１０％のベースライン血流量を６０分間維持する。処置の間中、ラットを加温毛布で包み続け、体温を３７℃に維持する。
【００５４】
一旦、外科手術が完了すると、全てのラットに２ｍｌの温かい生理食塩水を腹腔内に与えて、麻酔および外科手術の間に被った血液量の損失を回復させる。血清クレアチニンレベルを、外科手術後２４時間で測定する。
【００５５】
インビボでの２光子顕微鏡検査を、以前に記載されるように実施する（Ｄｕｎｎら、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２８３：Ｃ９０５−９１６，２００２；Ｓｕｔｔｏｎら、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ  ６２：１５３９−１５４９，２００２）。Ｓｐｒａｇｕｅ−ＤａｗｌｅｙラットをＰＡＣモデルにし、生きた腎臓のイメージングを２４時間にて、６０Ｘ  ＮＡ  １．４レンズを利用してＮｉｋｏｎ  Ｄｉａｐｈｏｔ倒立顕微鏡を通し、８００ｎｍの励起波長でＢｉｏ−Ｒａｄ  ＭＲＣ−１０２４ＭＰ  Ｌａｓｅｒ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｃｏｎｆｏｃａｌ／Ｍｕｌｔｉｐｈｏｔｏｎスキャナ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いて実施する。大腿部静脈カテーテルを挿入し、イメージング前に染料を注入するために血管へアクセスする手段を得る。血管透過性欠損、ならびに尿および血流量の乱れによる腎臓機能損傷の評価を、核染色（Ｈｏｅｃｈｓｔ−３３３４２、４００μｌ、０．９％生理食塩水中１．５ｍｇ／ｍｌ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、ユージン、オレゴン州）、通常の条件下で糸球体により濾過されない高分子量デキストラン（ＨＭＷＤ）（５００，０００Ｄａ、０．９％生理食塩水中７．５ｍｇ／ｍｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、ユージン、オレゴン州）、および制限されずに濾過可能である低分子量デキストラン（ＬＭＷＤ）（３，０００Ｄａ、０．９％生理食塩水中２０ｍｇ／ｍｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、ユージン、オレゴン州）を用いて行う。２つのデキストランを識別するため、ＨＭＷＤデキストランをフルオレセイン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、ユージン、オレゴン州）で標識し、一方、ＬＭＷＤをＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、ユージン、オレゴン州）で標識する。側面切開により、後腹膜窓を通して露出させた後、麻酔したラットの左の腎臓を撮像する。Ｍｅｔａｍｏｒｐｈ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ、ウェストチェスター、ペンシルバニア州）ソフトウェアを用いて画像を解析する。検査した動物の各々について、３分毎に約１０〜１２の画像を取得する。微小血管系における白血球を評価する研究のために、得られた画像を４×４のグリッドにおいて解析する。白血球を、Ｈｏｅｃｈｓｔ核染色を取り込む特徴によって同定する。これは微小血管系と相関しており、微小血管系自体に存在する白血球のみを計数する。微小血管系内の白血球は以下の３つのサブタイプ、すなわち、（ｉ）遊離型−２フレーム以下の間グリッドでリアルタイムイメージングの間に急速に出現し、消失、（ｉｉ）安定又は担持型−移動せずに微小血管内皮に結合、そして（ｉｉｉ）ローリング型−グリッドの３フレーム以上の間、内皮面上に沿って出現、に分類される。
【００５６】
血漿サンプルの全ての統計的解析は、有意性に関する２サンプル、非対比両側スチューデントｔ−検定、および必要に応じて線形回帰を用いて行った。データは、平均値±平均値の２標準偏差である。解析を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＯｆｆｉｃｅのＥｘｃｅｌ８．０統計ソフトウェア、およびＥＰＩＩＮＦＯ  ｖ６．０（ＣＤＣ、アトランタ、ジョージア州）を使用して行う。
【００５７】
ＰＡＣの２４時間後に、一連のラットに組織病理学的分析を実施する。摘出前に、腎臓を、加温したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で腹大動脈を通して短時間潅流し、その後４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）溶液でインビボで潅流して保存する。各ラットから両方の腎臓を摘出し、矢状スライスに切り、４℃で一晩ＰＦＡに浸漬させる。次に、切片をパラフィンに封埋し、ヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）または過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）で組織染色を行う。組織学的グレーディングを、管状細胞の腐肉の程度、近位側の尿細管刷子縁の損失、円柱形成、尿細管の膨張および閉塞の評価による組織傷害の重症度について、盲検試験により腎臓病理学者（Ｃ．Ｌ．Ｐ．）に行わせる。以前に記載されている（Ｊａｂｌｏｎｓｋｉら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ３５：１９８−２０４，１９８３）ように、皮質近位側の尿細管の損傷および（Ｋｅｌｌｙら、Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９７：１０５６−１０６３，１９９６）髄質外側の尿細管の損傷について、尿細管壊死の記録も評価する。
【００５８】
表３に示すように、ＰＡＣ虚血性障害の２４時間前に与えられたヒトｓＴＭ（５ｍｇ／ｋｇ）（配列番号３）またはｓＴＭ変異体（配列番号１０）の単一量の皮下投与は、生理食塩水で処置したラットと比べて、クレアチニンの血清レベルに有意な減少（Ｐ値＜０．０５）を引き起こした。減少した血清クレアチニンレベルは、ヒトｓＴＭおよびｓＴＭ変異体が、急性腎障害を減少させることを示す。
【００５９】
【表３】
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【配列表】
2010512411000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年6月3日(2009.6.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2010512411000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年6月15日(2009.6.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療のための、プロテインＣを活性化しない可溶性トロンボモジュリン変異体の使用。
【請求項２】
患者における急性腎不全を処置するための医薬の製造のための、プロテインＣを活性化しない可溶性トロンボモジュリン変異体の使用。
【請求項３】
患者における急性腎不全を予防するための医薬の製造のための、プロテインＣを活性化しない可溶性トロンボモジュリン変異体の使用。
【請求項４】
該可溶性トロンボモジュリン変異体が、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３からなる群より選択される配列を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
該可溶性トロンボモジュリン変異体が、配列番号６、配列番号９、配列番号１０および配列番号１３からなる群より選択される配列を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３からなる群より選択される配列を有する、可溶性トロンボモジュリン変異体。
【請求項７】
該可溶性トロンボモジュリン変異体が、配列番号６、配列番号９、配列番号１０および配列番号１３からなる群より選択される配列を有する、請求項６に記載の可溶性トロンボモジュリン変異体。
【請求項８】
請求項６または７に記載の可溶性トロンボモジュリン変異体を含む、医薬組成物。
【国際調査報告】
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