(57)【要約】  これまで知られていたフィブリン結合ペプチドと比較して高い結合親和性と優れた物理特性を有するフィブリン結合ペプチドを提供する。これら、フィブリン結合ペプチドは、検出可能な標識または治療剤とコンジュゲートし、血栓、血管新生および新生物の状態などのフィブリンの存在に関連する病的状態の検出および処置の促進のために用いることができる。これらのペプチドは、イメージング法（例えば、ＭＲＩ、超音波および核医学イメージング（例えばＰＥＴ、シンチグラフィーイメージングなど））に用いることができる。本ペプチドはまた、治療的に用いることができる。本発明はさらにそのようなペプチドおよびそのコンジュゲートの製造方法および使用方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓｅq005およびＳｅｑ０１４−０５７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる単離されたフィブリン結合ペプチド。
【請求項２】
Ｓｅq005−Ｐ、Ｓｅq005−Ｐ２およびＳｅq005−Ｐ３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる単離されたフィブリン結合ペプチド。
【請求項３】
請求項１記載のフィブリン結合ペプチドまたはその製薬的に許容し得る塩を含んでなる医薬組成物。
【請求項４】
製薬的に許容し得る成分、賦形剤、担体、アジュバントまたはビークルをさらに含んでなる請求項３記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記フィブリン結合ペプチドが、所望によりリンカーまたはスペーサーを介して、検出可能な標識に連結している、請求項１に記載の少なくとも１つのフィブリン結合ペプチドを含んでなる診断用造影剤。
【請求項６】
前記Ｔが、磁気共鳴映像法、放射性イメージング、超音波イメージング、Ｘ線イメージング、および光学イメージングからなる群から選択される手段における使用に適している、請求項５記載の診断用造影剤。
【請求項７】
前記造影剤が光学イメージングにおける使用に適している、請求項６記載の診断用造影剤。
【請求項８】
検出可能な標識が、色素分子、蛍光分子、リン光分子、紫外線スペクトルに吸収される分子、量子ドット、近赤外線または遠赤外線における吸収が可能な分子からなる群から選択される、請求項７記載の診断用造影剤。
【請求項９】
さらにリンカーを含んでなる請求項８記載の診断用造影剤。
【請求項１０】
検出可能なリンカーが、Ｃｙ５．５、ＩＲＤｙｅ８００、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）、テトラスルホン酸置換されたインドシアニングリーン（ＴＳ−ＩＣＧ）、およびそれらの組合せからなる群から選択される、近赤外線または遠赤外線における吸収が可能な分子である、請求項８記載の診断剤。
【請求項１１】
検出可能な標識が、拡張された非局在化環系および、４００−１５００ｎｍの範囲内に最大吸収または放出を有する有機発色団および蛍光からなる群から選択される色素分子である請求項８記載の診断剤。
【請求項１２】
検出可能な標識が蛍光分子である請求項８記載の診断用造影剤。
【請求項１３】
前記Ｔが、超音波イメージングにおける使用に適している請求項４記載の診断用造影剤。
【請求項１４】
ガス充填微小胞を含んでなる請求項４記載の診断用造影剤。
【請求項１５】
前記微小胞がガス充填マイクロバブルを含んでなる請求項５記載の診断用造影剤。
【請求項１６】
請求項１記載のフィブリン結合ペプチドおよびリン脂質を含んでなるペプチド−リン脂質コンジュゲート。
【請求項１７】
リン脂質がＤＳＰＥおよびＤＰＰＥからなる群から選択される請求項１６記載のペプチド−リン脂質コンジュゲート。
【請求項１８】
リン脂質がＰＥＧ化されている請求項１６記載のペプチド−リン脂質コンジュゲート。
【請求項１９】
ＰＥＧ化されたリン脂質がＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００およびＤＰＰＥ−ＰＥＧ２０００からなる群から選択される請求項１８記載のペプチド−リン脂質コンジュゲート。
【請求項２０】
ペプチドおよびリン脂質が連結基によって結合している請求項１６記載のペプチド−リン脂質コンジュゲート。
【請求項２１】
親水性ポリマーおよびアミノ酸鎖からなる群から選択される連結基が部分を含んでなる請求項１９記載のペプチド−リン脂質コンジュゲート。
【請求項２２】
親水性ポリマーがポリエチレングリコールである請求項２１記載のペプチド−リン脂質コンジュゲート。
【請求項２３】
アミノ酸鎖がプロリンを含んでなる請求項２１記載のペプチド−リン脂質コンジュゲート。
【請求項２４】
ペプチド−リン脂質コンジュゲートを含んでなる請求項１６記載の超音波造影剤。
【請求項２５】
造影剤がガス充填微小胞を含んでなる請求項２４記載の超音波造影剤。
【請求項２６】
ガス充填微小胞がリン脂質を含んでなる請求項２５記載の超音波造影剤。
【請求項２７】
リン脂質が、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＧ、ＤＰＰＥ、ＤＳＰＧ、およびＤＳＰＡからなる群から選択される請求項２５記載の超音波造影剤。
【請求項２８】
リン脂質がＤＳＰＣおよびＤＰＰＧを含んでなる、請求項２７記載の超音波造影剤。
【請求項２９】
リン脂質がＤＰＰＥおよびＤＰＰＧを含んでなる、請求項２７記載の超音波造影剤。
【請求項３０】
リン脂質がＤＳＰＣおよびＤＳＰＧを含んでなる、請求項２７記載の超音波造影剤。
【請求項３１】
リン脂質がＤＳＰＣおよびＤＳＰＡを含んでなる、請求項２７記載の超音波造影剤。
【請求項３２】
ガス充填微小胞が、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＧ、ＤＰＰＡ、ＤＳＰＡ、ＤＰＰＥ、ＤＳＰＧ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ１０００、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、パルミチン酸およびステアリン酸からなる群から選択される２またはそれ以上の成分を含んでなる請求項２５記載の超音波造影剤。
【請求項３３】
ガスが、空気、窒素、酸素、ＣＯ2、水素、亜酸化窒素、希ガスまたは不活性ガス、放射性ガス、過分極希ガス、フッ素化ガス、低分子量炭化水素、シクロアルカン、アルケン、アルキン、エーテル、ケトン、エステル、ハロゲン化ガスおよび／またはそれらの混合物からなる群から選択される、請求項２６記載の超音波造影剤。
【請求項３４】
ガスがフッ素化ガスを含んでなる、請求項３３記載の超音波造影剤。
【請求項３５】
ガスがＣ4Ｆ10と窒素の混合物である、請求項３４記載の超音波造影剤。
【請求項３６】
さらに治療薬剤を含んでなる、請求項２６記載の超音波造影剤。
【請求項３７】
請求項１記載の少なくとも１つのフィブリン結合ペプチドを含んでなる超音波造影剤。
【請求項３８】
造影剤がガス充填微小胞を含んでなる、請求項３７記載の超音波造影剤。
【請求項３９】
ガス充填微小胞がリン脂質を含んでなる、請求項３８記載の超音波造影剤。
【請求項４０】
リン脂質が以下からなる群から選択される請求項３９記載の超音波造影剤：ジラウリロイル−ホスファチジルコリン（“ＤＬＰＣ”）、ジミリストイルホスファチジルコリン（“ＤＭＰＣ”）、ジパルミトイル−ホスファチジルコリン（“ＤＰＰＣ”）、ジアラキドイルホスファチジルコリン（“ＤＡＰＣ”）、ジステアロイル−ホスファチジルコリン（“ＤＳＰＣ”）、１−ミリストイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン（“ＭＰＰＣ”）、１−パルミトイル−２−ミリストイルホスファチジルコリン（“ＰＭＰＣ”）、１−パルミトイル−２−ステアロイルホスファチジルコリン（“ＰＳＰＣ”）、１−ステアロイル−２−パルミトイル−ホスファチジルコリン（“ＳＰＰＣ”）、ジオレオイルホスファチジルｙコリン（“ＤＯＰＣ”）、１,２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（エチル−ＤＳＰＣ）、ジラウリロイル−ホスファチジルグリセリン（“ＤＬＰＧ”）およびそのアルカリ金属塩、ジアラキドイルホスファチジルグリセリン（“ＤＡＰＧ”）およびそのアルカリ金属塩、ジミリストイルホスファチジルグリセリン（“ＤＭＰＧ”）およびそのアルカリ金属塩、ジパルミトイル−ホスファチジルグリセリン（“ＤＰＰＧ”）およびそのアルカリ金属塩、ジステアロイルホスファチジルグリセリン（“ＤＳＰＧ”）およびそのアルカリ金属塩、ジオレオイルホスファチジルグリセリン（“ＤＯＰＧ”）およびそのアルカリ金属塩、ジミリストイルフォスファチジン酸（“ＤＭＰＡ”）およびそのアルカリ金属塩、ジパルミトイルフォスファチジン酸（“ＤＰＰＡ”）およびそのアルカリ金属塩、ジステアロイルフォスファチジン酸（“ＤＳＰＡ”）、ジアラキドイルフォスファチジン酸（“ＤＡＰＡ”）およびそのアルカリ金属塩、ジミリストイルホスファチジル−エタノールアミン（“ＤＭＰＥ”）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（“ＤＰＰＥ”）、ジステアロイルホスファチジル−エタノールアミン（“ＤＳＰＥ”）、ジミリストイルホスファチジルセリン（“ＤＭＰＳ”）、ジアラキドイルホスファチジルセリン（“ＤＡＰＳ”）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（“ＤＰＰＳ”）、ジステアロイルホスファチジルセリン（“ＤＳＰＳ”）、ジオレオイルホスファチジルセリン（“ＤＯＰＳ”）、ジパルミトイルスフィンゴミエリン（“ＤＰＳＰ”）、およびジステアロイルスフィンゴミエリン（“ＤＳＳＰ”）。
【請求項４１】
リン脂質がＤＳＰＣ、ＤＰＰＧ、ＤＰＰＥ、ＤＳＰＧ、およびＤＳＰＡからなる群から選択される、請求項３９記載の超音波造影剤。
【請求項４２】
ガス充填微小胞が、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＧ、ＤＰＰＡ、ＤＳＰＡ、ＤＰＰＥ、ＤＰＰＧ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ１０００、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、パルミチン酸およびステアリン酸からなる群から選択される２またはそれ以上の成分を含んでなる、請求項３８記載の超音波造影剤。
【請求項４３】
ガスが、空気、窒素、酸素、ＣＯ2、水素、亜酸化窒素、希ガスまたは不活性ガス、放射性ガス、過分極希ガス、フッ素化ガス、低分子量炭化水素、シクロアルカン、アルケン、アルキン、エーテル、ケトン、エステル、ハロゲン化ガスおよび／またはそれらの混合物からなる群から選択される、請求項３８記載の超音波造影剤。
【請求項４４】
ガスがフッ素化ガスを含んでなる請求項３８記載の超音波造影剤。
【請求項４５】
ガスがＣ4Ｆ10と窒素の混合物である、請求項４４記載の超音波造影剤。
【請求項４６】
さらに治療薬剤を含んでなる請求項３８記載の超音波造影剤。
【請求項４７】
請求項１に記載の少なくとも１つのフィブリン結合ペプチドおよび治療薬剤を含有する組成物。
【請求項４８】
請求項１記載の少なくとも１つのフィブリン結合ペプチドを含有する組成物を哺乳類に投与することを含んでなる、診断または治療方法。
【請求項４９】
組成物が、検出可能な標識または治療薬剤をさらに含有する請求項４８記載の診断または治療方法。
【請求項５０】
検出可能な標識が光学的造影剤を含んでなる、請求項４８記載の診断または治療方法。
【請求項５１】
検出可能な標識が超音波造影剤を含んでなる、請求項４８記載の診断または治療方法。
【請求項５２】
組成物が、凝血塊の溶解が可能な抗凝固−血栓溶解剤またはフィブリン溶解剤、抗血管形成剤、細胞毒性物質、化学療法剤、殺腫瘍剤、および放射線治療薬からなる群から選択される治療薬剤を含んでなる請求項４８記載の診断または治療方法。
【請求項５３】
請求項１に記載の少なくとも１つのフィブリン結合ペプチドを含有する組成物を哺乳類に投与することを含んでなる、フィブリン沈着に関連する病的状態を診断または治療するための方法。
【請求項５４】
前記病的状態が、血栓、血栓塞栓性疾患、炎症性疾患、腫瘍、および転移プロセスからなる群から選択される、請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
前記組成物が検出可能な標識または治療薬剤をさらに含んでなる、請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
検出可能な標識が光学的造影剤を含んでなる、請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
検出可能な標識が超音波造影剤を含んでなる、請求項５５記載の診断または治療方法。
【請求項５８】
組成物が、凝血塊の溶解が可能な抗凝固−血栓溶解剤またはフィブリン溶解剤、抗血管形成剤、細胞毒性物質、化学療法剤、殺腫瘍剤、および放射線治療薬からなる群から選択される治療薬剤を含んでなる、請求項５５記載の診断または治療方法。
【請求項５９】
有効量の請求項５、７、１４または２５のいずれかに記載の組成物を哺乳類に投与し、哺乳類のイメージングを行うことを含んでなる、フィブリン含有組織のイメージングを行うための方法。
【請求項６０】
有効量の請求項５、７、１４、２５、３６または４６のいずれかに記載の組成物を哺乳類に投与し、該哺乳類を超音波スキャニングに付して該フィブリン含有組織のイメージングおよび／または治療を行うことを含んでなる、哺乳類におけるフィブリン含有組織のイメージングおよび／または治療の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、米国仮出願第６０／８６９,４７２号（出願日２００６年１２月１１日）の優先権および利益を請求し、その全内容は本明細書の一部を構成する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、フィブリン沈着または蓄積に関連する病的状態（例えば、血管内血栓形成および血管新生プロセスに関連するような）の検出および／または処置のためのフィブリン結合ペプチド、ポリペプチドおよび組成物に関する。本発明は、フィブリン結合ペプチドを含有する診断および／または治療的適用のための化合物を包含する。また、本発明は、そのようなペプチド、化合物および組成物の製造方法および使用方法を包含する。
【背景技術】
【０００３】
疾患に伴う血栓症は、血餅の存在に起因して進行する血管の状態である。そのような疾患は、主な死亡原因であるため、血栓症に特異的な診断、処置および検出の方法論ならびに試薬の開発、臨床上極めて重要である。肺塞栓（ＰＥ）、深部静脈血栓症（ＤＶＴ）、卒中、およびアテローム性動脈硬化症は、血栓症に関連する疾患である。
【０００４】
ＤＶＴは、脚および鼠径部の深部の血管において血餅が形成される状態である。これらの血餅により、脚から心臓への血硫がブロックされ得る。時には、脱離した血餅のかけらが血流によって、心臓を介して血管へと運ばれ、そこで留まって、組織の血管への血流を減少またはブロックする。これは、塞栓症と呼ばれる。そのような血餅が肺の血管に留まれば、致命的になりうる。
【０００５】
米国だけでも、毎年６００,０００人の患者がＰＥに罹患している。このうちおよそ３７８,０００人は、ＰＥが検出されず、そして１１４,０００人はこの疾患に関連する合併症により後に死亡している。この高い死亡率は、部分的ではあるが、多くの場合において臨床的な症状が無いこと、そして検査および検出の現在利用可能な方法が非常に限られていることに起因している。
【０００６】
フィブリンはまた、様々な癌にも関連している。様々なタイプの腫瘍において、フィブリン／フィブリノーゲン沈着の外的な（hetergeneous）パターンの存在は、相関する実質的な身体によって裏付けられる概念であり、フィブリン／フィブリノーゲンは腫瘍ストーマ形成において重要であると示唆する間接的な証拠である（例えば、Costantini V, Zacharski LR. Fibrin and cancer.  Thromb Haemost. 1993;69:406; Dvorak HF.  Thrombosis and cancer.  Hum Pathol. 1987;18:275; Dvorak HF, Nagy JA, Berse B, et al.  Vascular permeability factor, fibrin, and the pathogenesis of tumor stroma formation, Ann N Y Acad Sci. 1992; 667:101; Cavanagh PG, Sloane BF,Honn KV.  Role of the coagulation system in tumor-cell-induced platelet aggregation and metastasis. Hemostasis. 1988; 18:37 and Bardos H, Molnar P, Csecsei G, Adany R. Fibrin deposition in primary and metastatic human brain tumours.  Blood Coagul Fibrinolysis. 1996;7:536を参照)。実際、癌を有する患者において、播種性血管内凝固症候群、出血事象および遊走性血栓性静脈炎を含む多くの有意の止血異常の記述がみられる。止血の合併症は、癌を有する患者の一般的な死亡原因である。多くの腫瘍細胞は、凝固システムの局地的な活性化を促進する強い凝固促進活性を有している。凝固カスケードの腫瘍介在の活性化は、腫瘍ストローマの形成および血行性転移の両方にかかわっている。フィブリンマトリックスは、さらに、形質転換細胞、マクロファージおよび線維芽細胞を含む、相当な数の異なるタイプの細胞の移動を促進することが知られている。特に、創傷治癒と非常に類似するように、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）へのフィブリン／フィブリノーゲンの沈着は、他の接着性糖タンパク質と共に、足場として成長因子の結合を支援し、癒着の細胞応答、増殖および血管形成および腫瘍細胞増殖の間の移動を促進することが示されている（例えば、Dvorak HF, Nagy JA, Berse B, et al.  Vascular permeability factor, fibrin, and the pathogenesis of tumor stroma formation, Ann N Y Acad Sci. 1992; 667:101;  Rickles FR, Patierno S, Fernandez PM. Tissue Factor, Thrombin, and Cancer.  Chest. 2003; 124:58S-68S; Brown HF, Van der Water L, Hervey VS, Dvorak HF.  Fibrinogen influx and accumulation of cross-linked fibrin in healing wounds and in tumor stroma.  Am J Pathol. 1988; 130:4559; Dvorak HF, Hervey  VS, Estrella P, Brown LF, Mc-Donagh J, Dvorak AM..  Fibrin containing gels induce angiogenesis: implication for tumor  stroma generation and wound healing.  Lab Invest. 1987; 57:673 and Rickles FR, Patierno S, Fernandez PM. Tissue Factor, Thrombin and Cancer. Cest. 2003; 124:58S-68Sを参照)。ヒトにおける大部分の充実性腫瘍は、かなりの量の架橋フィブリンを含んでおり、腫瘍ストローマ形成に重要であることを示唆している。研究は、フィブリノーゲンおよびフィブリンの両方とも、腫瘍-宿主細胞の界面に局在することを示している (例えば、Rickles FR, Patierno S, Fernandez PM. Tissue Factor, Thrombin and Cancer. Cest. 2003; 124:58S-68S; Costantini V, Zacharski LR, Memoli VA et al. Fibrinogen deposition without thrombin generation in primary human breast  cancer.  Cancer Res. 1991; 51: 349-353 and Simpson-Haidaris PJ and Rybarczyky B. Tumors and Fibrinogen: The Role of Fibrinogen as an Extracellular Matrix Protein. Ann. N.Y. Acad. Sci., 2001 936(1): 406-425を参照)。フィブリンマトリックスは、血管新生を促進し、フィブリンが創傷治癒に類似したメカニズムによって腫瘍ストローマ形成を促進しているという概念を支持している。
【０００７】
さらに、血漿フィブリノーゲンレベルと腫瘍サイズ、腫瘍侵襲の深さと転移との間に相関がみられる。（たとえば、Lee JH, Ryu KW, Kim S, Bae JM. Preoperative plasma fibrinogen levels in gastric cancer patients correlate with extent of tumor.  Hepatogastroenterology 2004;51:1860-3を参照)。さらに、フィブリン／血小板が、ヒト免疫系からもたらされる循環血中のナチュラルキラー単位の作用から腫瘍細胞を保護し、循環血中の腫瘍の生存が改善されているということが知られている（例えば、Palumbo JS, et al. platelets and fibrin(ogen) increase metastatic potential by impeding natural killer cell-mediated elimination of tumor cells.  Blood, 2005; 105:178を参照)。このことは、例えば、これらの腫瘍がフィブリンによって保護されているので、腫瘍を標的とする抗体を用いる従来の腫瘍治療が、フィブリンを含む腫瘍を効果的には処置し得ないということを示している。
【０００８】
このように、フィブリン沈着の可視化および確立された欠陥構造および凝固したフィブリンの標的化された阻害／破壊は、悪性の疾患進行に対する重要なツールであると考えられる。従って、フィブリン沈着、および特に充実性腫瘍、に関連する歯陽的状態の感受性の高い診断および特異的那智量において使用するための改善されたフィブリン結合化合物が必要とされている。
【０００９】
フィブリンはまた、血管新生プロセスにも関与している。胚の発生において、血管ネットワークは、脈管形成と呼ばれるプロセスにおいて、中胚葉性細胞の in situ 分化によって確立される。胚での血管形成の後、胚または成人における新しい血管の形成はすべて、血管形成と呼ばれるプロセスにおいて、既に存在する脈管構造からの新しい血管の発芽または分裂によって支配される(Pepper, M. et al., 1996. Enzyme Protein, 49:138-162; Risau, W., 1997. Nature, 386:671-674)。血管形成は、胚発生および正常な組織の成長と修復において関与するだけでなく、女性の生殖サイクル、妊娠の確立および維持、ならびに創傷および骨折の修復にも関与している。
【００１０】
通常の血管新生プロセスに加え、血管形成の事象はまた、数多くの重要な病理学的プロセス、特に、腫瘍成長および転移、および血管増殖が増加する他の状態（糖尿病性網膜症、乾癬、関節症および慢性関節リウマチ等）において関与している。実際、血管形成は、増殖性から新生物増殖への腫瘍の移行において非常に重要であり、血管形成の阻害は癌治療を裏付けるものとして示されている(Kim, K. et al., 1993. Nature, 362:841-844)。これらの病理学的プロセスにおいて、フィブリンは新しい血管の形成に必要なメッシュ構造を提供する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、フィブリンおよびフィブリン関連疾患の存在を検出する感受性の高い有効なアッセイが求められている。より具体的には、フィブリンに特異的に結合することが可能で、病的な血栓状態ならびに病的な血管新生プロセスに関連する状態を検出するために使用することができる、非侵襲性の試薬が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の概要
フィブリン塊およびフィブリンに関連する病的状態を検出、測定および処置するための、改善された材料および方法の必要に応えるため、我々は、驚くべきことに、予想外に高いフィブリン特異的結合を示す非天然のポリペプチドを発見した。これらのポリペプチドは、従来知られているペプチドに比べ、優れたフィブリン特異的結合が可能であり、溶解度等の改善された物理的特性を有する。
【００１３】
本発明の更なる態様は、検出可能な標識とのコンジュゲーションによってフィブリン特異的な造影剤を提供するための、前記のペプチドの修飾に関する。例えば、フィブリン結合ペプチドが放射性標識、酵素標識、ＭＲ常磁性キレートまたは微粒子等の核磁気共鳴（ＭＲＩ）によって検出可能な標識とコンジュゲートを形成する、ガス充填微小胞等の超音波造影剤とコンジュゲートを形成するまたは取り込まれる（例えばマイクロバブル、微粒子、ミクロスフェア、エマルジョン、またはリポソーム）、または光学色素を含む光学的造影剤とコンジュゲートを形成する化合物。本発明の結合部分は、フィブリン又はその断片の結合、検出または単離が有利な任意の適用において有用である。
【００１４】
本発明はさらに、治療薬剤とコンジュゲートを形成することによりフィブリン特異的な治療をもたらすための前記ペプチドの修飾に関する。そのような薬剤としては、例えば、化学療法剤、細胞毒性物質、放射線治療薬、殺腫瘍剤または血栓溶解剤が挙げられる。好ましい態様では、ペプチドは、治療用放射性核種を含んでなる放射線治療薬とコンジュゲートを形成することによって修飾される。
【００１５】
本明細書に開示した結合部分の特に有用な使用は、血栓およびフィブリンに関連する病理学的プロセスをインビボでイメージングする方法における使用である。そのようなプロセスとしては、例えば、肺塞栓（ＰＥ）、深部静脈血栓症（ＤＶＴ）、卒中、アテローム性動脈硬化症、および癌、特に充実性腫瘍が挙げられる。本方法は、血栓またはフィブリン関連の病理学的プロセスを検出するための、本発明のフィブリン特異的な結合部分の使用を必要とし、その結合部分は造影剤（磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）造影剤、Ｘ線造影剤、放射性医薬品造影剤、超音波造影剤、および光学的造影剤が挙げられる）として使用するために検出可能に標識されている。
【００１６】
さらに、新たに開示されたフィブリン結合剤はまた、フィブリンが役割を担っている他の数多くの病態生理学的状態を検出するために有利に用いることができる。これらの場合には、フィブリンイメージングは、診断または治療のモニタリングのための直接のまたは代理マーカーとして有用である。例えば、腹膜癒着は外科手術または炎症プロセスの後しばしば起こり、フィブリンネットワーク、線維芽細胞、マクロファージおよび新しい血管からなる。慢性関節リウマチ、狼瘡、または敗血症性関節炎の患者は、米粒体とよばれるフィブリン含有組織のかけらが関節内の滑液中に存在することが多い。貧血症の一種である、血栓症の血小板減少性紫斑病では、細動脈におけるフィブリン沈着が血流の乱れを引き起こし、赤血球細胞のストレスと破壊をもたらす。本発明のフィブリン結合部分は、そのようなフィブリン関連疾患の検出および診断において使用することができる。
【００１７】
フィブリン特異的な薬剤はまた、低酸素症または心臓、腎臓、肝臓、肺、脳または他の臓器の虚血、ならびに腫瘍、糖尿病性網膜症、初期または危険度の高いアテローム性動脈硬化症および他の自己免疫疾患および炎症性疾患が挙げられるがこれに限定されない他の状態の検出に用いることができる。フィブリン特異的な薬剤はまた、低酸素症および血管形成が役割を担っていると予想される疾患モデルの直接または代理マーカーの両方を提供することができる。低酸素状態においては、例えば、フィブリン（フィブリノーゲン）は、低酸素誘導因子１（ＨＩＦ−１）の制御下で発現する。
【００１８】
本発明のフィブリン結合ペプチドはまた、フィブリン塊、腫瘍、低酸素症または様々な臓器の虚血、血管形成に関連する病理学的プロセス、腹膜癒着、慢性関節リウマチ、狼瘡、敗血症性関節炎、および血栓症の血小板減少性紫斑病が挙げられるがこれらに限定されない、フィブリンが役割を担っている病態生理学的状態を処置するために治療的に用いることができる。例えば、フィブリン結合ペプチドは、適当な治療用放射性核種とコンジュゲートを形成して放射線治療（特に腫瘍を処置するための）に用いることができる。さらに、フィブリン結合ペプチドは適当な治療薬剤とコンジュゲートを形成することができる。
【００１９】
本発明のこれらのおよびその他の態様は、以下の詳細な記載から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の代表的なリンカー官能化ペプチドの調製方法を示す。
【００２１】
【図２】代表的な５−カルボキシフルオレセイン 標識化ペプチドの調製方法を示す。
【００２２】
【図３】本発明の代表的なDSPE-PEG200ペプチドコンジュゲートの調製方法を示す。
【００２３】
【図４】本発明の代表的なDSPE-PG4-Glutペプチドコンジュゲートの調製方法を示す。
【００２４】
【図５】本発明の代表的なDPPE-Glut-PG2-JJペプチドコンジュゲートの調製方法を示す。
【００２５】
【図６】いずれかの111Ｉｎおよびランタニド（常磁性Ｇｄ3+）または放射性ランタニド（177Ｌｕ、90Ｙ、153Ｓｍ、および166Ｈｏ等）のための好ましいキレート化剤の例を示す。
【００２６】
【図７】放射性金属イオン（90mＴｃ、186Ｒｅおよび188Ｒｅ）の好ましいキレート化剤の例を示す。
【００２７】
【図８】実施例２６に記載のキレート錯体１（下段）および参照化合物２（上段）の注射（錯体  ２５μｍｏｌ／ｋｇ）４時間後に得られたＴ１強調ＭＲＩ像（一連のスライス）。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
定義
特に明記しないかぎり、本明細書において用いる用語「ポリペプチド」は、ペプチドアミド結合［−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−］により主鎖（側鎖に対して）を通して結合する２以上のアミノ酸の化合物を意味するために用いる。本明細書にて用いる「ポリペプチド」と同義で用いられる用語「ペプチド」は一般に、２５より少ないアミノ酸を有するポリペプチドを意味するために用いられる。
【００２９】
用語「フィブリン由来ポリペプチド」は、フィブリンと免疫学的に交差反応性である、タンパク質の免疫学的に反応性のフラグメントなどのフィブリンの任意のサブコンポーネントまたはフィブリンのフラグメントを意味する。
【００３０】
用語「結合」は、結合するポリペプチドが与えられた標的を認識し可逆的に結合することの本明細書に記載のものを含む標準アッセイによる測定を意味する。そのような標準アッセイとしては、結合をもたらす平衡透析, ゲルろ過および分光学的変化のモニターが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
用語「特異性」は、一の標的について別のものよりもより高い結合親和性を有する結合ポリペプチドを意味する。用語「フィブリン特異性」は、フィブリンについて不適切な標的よりもより高い親和性を有するフィブリン結合部分を意味する。結合特異性は二の試験標的物質についての解離平衡定数（KD）または会合平衡定数（Ka）により特徴付けることができるか、または相対的な結合の強さの任意の測定基準であってよい。
【００３２】
本明細書にて用語「結合部分」は、別の分子と結合錯体を形成することができる任意の分子を意味する。「フィブリン結合部分」は凝血塊、可溶性もしくは不溶性フィブリン、またはフィブリノゲンではなくフィブリンにより示される構造もしくは特徴を有するフィブリンの可溶性もしくは不溶性フラグメントと錯体を形成する結合部分である。フィブリンのそのような可溶性または不溶性フラグメントには、「フィブリン誘導体化」ポリペプチドとして定義されるフラグメントが含まれる。フィブリン誘導体化ポリペプチドは、本発明においては、本明細書に記載したＤＤ、ＤＤ−ダイマーおよびＤＤ（Ｅ）ポリペプチドについての総称として用いられる。このようなフィブリン誘導体化ポリペプチドは、典型的に架橋フィブリンのタンパク質分解治療により生成されるが、フィブリン特有の構造的特徴を保持する
【００３３】
具体的なフィブリン結合ペプチドは、本明細書に記載のもの（例えば、Table １および２に示したもの）およびそのようなペプチドを含んでいるハイブリッドおよびキメラペプチドである。
【００３４】
本明細書においてさらに記載する検出可能な標識に加えて、結合ポリペプチドは、放射線治療薬、細胞毒性物質、殺腫瘍剤または酵素、血栓溶解剤または酵素（例えば、ｔＰＡ、プラスミン、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、ヒルジン）、リポソーム（例えば、治療薬剤（例えば、血栓溶解剤、超音波に適当なガス、またはその両者）を充填した）を含む治療薬剤に連結するかまたはコンジュゲートすることができる。さらに、本発明の結合ポリペプチドは、固体の支持体、ウェル、プレート、ビーズ、チューブ、スライド、フィルター、またはディッシュに結合または連結させることができる。そのような修飾されたフィブリン結合部分はいずれも、それらがフィブリンまたはフィブリン由来ポリペプチドに結合する能力を保持している限り、フィブリン結合部分であるとされる。
【００３５】
本明細書において用いられる「標識基」または「検出可能な標識」は、検出可能なシグナルを生じることが可能な基である。具体的には、標識基または診断用標識は、診断イメージング（例えば、 磁気共鳴映像法, 放射性イメージング, 超音波イメージング,Ｘ線イメージング, 光イメージング）のためのシグナルを生じるか、または放射線治療もしくは他の治療形態において用いることができる部分（放射性金属またはその他の物質など）を有し得る。
【００３６】
本明細書において用語「治療薬剤」または「治療的に」は、インビボにて有益な治療効果または細胞毒性効果を有する化合物または作用物質を意味する。治療薬剤としては、例えば生物活性剤、細胞毒性薬、薬物、化学療法剤、放射線治療薬、遺伝物質などと称される成分が挙げられる。
【００３７】
本明細書において用いられる用語「患者」は、任意の哺乳動物、特にヒトを意味する。
【００３８】
本明細書において用いられる用語「医薬的に許容し得る」担体または賦形剤は、その生物学的または薬理学的活性を破壊しないように、本発明化合物と一緒に患者に投与することができる無毒の担体または賦形剤を意味する。
【００３９】
本明細書において以下の共通の略号を用いる：Ａｃ2Ｏ−無水酢酸、ＣＡＮ−アセトニトリル、Ａｃ−アセチル、ＡＰＩ−ＥＳ−常圧イオン化電子スプレー、ＢＯＰ−ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス（ジメチルアミノ）−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、Ｂｎ−ベンジル、Ｃｂｚ−ベンジルオキシカルボキシル、ＣＦ５−ＮＨＳ−５カルボキシフルオレセイン、スクシンイミジルエステル（単一の異性体）、Ｃｈａ−２−シクロヘキシル−Ｌ−アラニン、ＤＣＣ−ジシクロヘキシルカルボジイミド、ＤＣＭ−ジクロロメタン、Ｄｄｈｈ−１２,２６−ジアミノ−１,１１−ジオキソ−３,６,９,１６,１９,２２−ヘキサオキサヘキサコサノイル、Ｄｇａ−ジグリコリル、３−オキサペンタン−１,５−ジ−オイル−ジＣ−Ｎ,Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミドDIEAＡ−Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、ＤＭＡ−ジメチルアセトアミド、ＤＭＦ−ジメチルホルムアミド、ＤＭＳＯ−ジメチルスルホキシド、ＤＰＰＥ−１,２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（一般的にジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンとして同定される）、ＤＰＰＧ−１,２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホル−ｒａｃ−（１−グリセリン）］ナトリウム塩（一般的にジパルミトイルホスファチジルグリセリンとしても同定される）、ＤＰＰＳ−１,２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホ−Ｌ−セリン（一般的にジパルミトイルホスファチジルセリンとしても同定される）、ＤＳＰＡ−１,２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−リン酸塩ナトリウム塩（一般的にジステアロイルホスファチジン酸としても同定される）、ＤＳＰＥ−１,２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセリン−３−ホスホエタノールアミン（一般的にジステアロイルホスファチジルエタノールアミンとしても同定される）、ＤＳＰＥ−ＰＧ４−ＮＨ2−｛１、２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［アミノ（ポリエチレングリコール）２０００］｝、ＤＰＰＥ−ＰＧ４−ＮＨ2−｛１、２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［アミノ（ポリエチレングリコール）２０００］｝、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ１０００−ジステアロイル−グリセロ−ホスホエタノールアミン−Ｎ−メトキシ（ポリエチレングリコール）１０００、ＤＳＰＳ−１,２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−（ホスホル−Ｌ−セリン）（一般的にジステアロイルホスファチジルセリンとしても同定される）、ＤＳＧ−ジスクシンイミジルグルタレート、ＥＤＡＣ、１−エチル３−（３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドＨＣｌ、ＥｔＯＨ−エタノール、Ｅｔ2Ｏ−ジエチルエーテル、ＥｔＯＡｃ−酢酸エチル、Ｆｍｏｃ−９−フルオレニルメトキシルオキシカルボニル、Ｆｆｅ４−Ｌ−４−フルオロフェニルアラニン、Ｆ３４ｆｅ−Ｌ−３,４−ジフルオロフェニルアラニン、Ｇｌｕｔ−グルタリル、ペンタン−１,５−ジ−オイル、ＨＯＡｃ−酢酸、ＨＯＡｔ−１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール、ＨＰＬＣ−高速液体クロマトグラフィー、Ｈｙｐｔ４−トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン、Ｆｍｏｃ−ＪまたはＦｍｏｃ−Ａｄｏａ−Ｆｍｏｃ−８−アミノ−３,６−ジオキサオクタン酸,ＨＡＴＵ−ｎ−｛（ジメチルアミノ）−１Ｈ−１,２,３−トリアゾロ（４,５−ｂ）ピリジン−１−イルメチレン］−Ｎ−メチレンメタンアミニウムヘキサフルオロホスフェート−Ｎ−オキシド,ＨＢＴＵ−２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１,１,３,３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート、ＨＯＢｔ−ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール、ｉｖＤｄｅ−（４，４−ジメチル−２,６−ジオキソシクロヘキサン−１−イリデン）−３−メチルブチル、ＭＡＬＤＩ−マトリックス支援レーザー脱離イオン化、Ｎｅｇ．イオン−陰イオン、ＭｅＯＨ−メタノール、ＭＳ−マススペクトル、ＮＨＳ−ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ＮＭＭ−ｎ−メチルモルホリン、ＮＭＰ−ｎ−メチルピロリドン、ＰＥＧ−ポリエチレングリコール（番号を付記する場合（例えばＰＥＧ４０００）、多分散ＰＥＧポリマーのおおよその平均分子量を示す（即ち、この例では、約４０００ダルトン）、ＰＦＥ−ペルフルオロエタノール、Ｐｉｐ−ピペリジン、Ｐｄ／Ｃ−パラジウム炭素触媒、Ｐｄ（ＰＰｈ3）4−テトラキス（トリフェニル−ホスフィン）パラジウム（０）、Ｐｏｓ．Ｉｏｎ−陽イオン、ＰｙＢＯＰ−ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、Ｐｙｒ−ピリジン、ｔR−保持時間（分）、試薬Ｂ（ＴＦＡ：Ｈ2Ｏ：フェノール：トリイソプロピルシラン、８８：５：５：２）、ＳＡＴＡ−Ｓ−アセチルチオールアセチル、Ｓ（Ｇａｌｎａｃ）−Ｏ−（２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−Ｌ−セリン、ＳＰＰＳ−固相ペプチド合成、ステアリン酸−ナトリウムステアリン酸ｕ−スクシンイミジル、ＳｕＯ−スクシンイミジルオキシ、ｔ−Ｂｕ−ｔｅｒｔ−ブチル、ＴＥＡ−トリエチルアミン、Ｔｈｆ２ｃａ−テトラヒドロフラン−２−カルボン酸、ＴＦＡ−トリフルオロ酢酸、ＴＩＰＳ−トリイソプロピルシラン、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（ｆｍｏｃまたはＦｍｏｃ）、Ｔｔｄａ−４,７,１０−トリオキサトリデカン−１,１３−ジアミノ、Ｔｕｄａ−３,６,９−トリオキサウンデカン−１,１１−ジ−オイル、Ａｌｏｃ−アリルオキシカルボニル、Ｂｏｃ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、ＤＳＧ−ジ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−グルタレート、ＰＥＧ３４００−ＮＨＳ−ポリエチレングリコール３４００ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、Ｐｍｃ−２,２,５,７,８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル、Ｔｒｔ−トリチル、ＤＭＡＣ−ジメチルアセトアミド。
【表１】
2010512400.tif 000002
【００４０】
本発明の詳細な記載
本発明は、フィブリンの新規な結合部分を提供する。そのような結合部分は、フィブリンまたはフィブリン誘導体化ペプチドを含有する溶液または系における、フィブリンまたはフィブリン誘導体化ペプチドの効果的な検出、イメージングおよび局在化を可能にする。特に、本発明の結合部分は、適当に標識化された場合、フィブリン含有血栓または他のフィブリン特異的な病態生理学的状態の検出、イメージングおよび局在化に有用であり、例えば、血管形成、血栓および癌（特に充実性腫瘍）に関連する病理学的状態の診断および処置のための様々な診断薬および治療薬を形成するのに用いることができる。本発明の好ましい結合部分は、フィブリンおよび／またはフィブリン誘導体化ポリペプチドと高い親和性で結合する、即ち、公知の抗フィブリン抗体および他のフィブリン結合タンパク質と比較して、低い生理学的に適当な濃度で作用し、これまで知られていたフィブリン結合部分に対して改善を示す。
【００４１】
以下に記載する技術を用いて（実施例の項に記載の技術を含む）、Table 1およびTable 2に示すポリペプチドは、予想外にも、これまで知られているペプチドと比較して優れた物理的特性と共に、優れたフィブリン特異的結合を有することが分かった。特に、これまで知られていたペプチドＡｃ−ＷＱＰＣ*ＰＷＥＳＷＴＦＣ*ＷＤＰＧＧＧＫ−ＮＨ2（配列番号１２２）の６番目のＴｒｐのＡｌａへの置換により、効力の改善がもたらされ、ＨＰＬＣにより示されるとおりより親水性のペプチドとなる。この置換による改善された特性は、このペプチドにおいて他のＴｒｐ残基のいずれかを置換すればフィブリン結合の喪失または減少につながるので、予想し得ないものである。
【００４２】
ペプチドＡｃ−ＷＱＰＣ*ＰＷＥＳＷＴＦ*ＣＷＤＰＧＧＧＫ−ＮＨ2（配列番号１２２）の修飾に用いた他の方法は、Ｎ末端またはＣ末端でのアミノ酸の付加である。一般にＣ末端でのアミノ酸の付加では、そのペプチドの効力は劇的には変化しなかった。しかしながら、極性のアミノ酸（Ａｒｇ等）をＮ末端へ付加した場合、結合の改善が観察された。１番目のＴｒｐの重要性を考慮すると、有益な効果を伴った極性の導入は、予想し得ないものであった。
【００４３】
効力の改善につながる別の修飾は、１１番目のＰｈｅに対する異常アミノ酸シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）の導入であった。置換されたフェニルアラニン誘導体が弱い結合につながったことを考慮すると、より嵩高い、より芳香性の低い残基への変更によって効力が改善することは予想し得ないものである。これら３つの修飾の組み合わせによってさらに改善された効力につながった。
【００４４】
以下のＴａｂｌｅ１に、本発明の各フィブリン結合ペプチド、その配列、調製および試験したフィブリン−結合部分の配列、これらペプチドの解析データ（ＨＰＬＣデータおよびマススペクトルデータを含む）および、大部分のペプチドについて、Ａｃ−ＷＱＰＣ*ＰＷＥＳＷＴＦＣ*ＷＤＰＧＧＧＫ−ＮＨ2の配列を有するこれまで知られていたフィブリン結合ペプチドと比較した結合活性の測定値（相対値ＩＣ50＝１）を示す。１よりも低い相対ＩＣ50は、比較対象のペプチドよりも良好な結合を示す。
【００４５】
調製および試験したフィブリン結合部位はリンカーＧＧＧＫをＣ末端に含み、いくつかの場合ではＮ末端にＡｃ基を含んでいた。本発明は、ＧＧＧＫリンカーおよび／またはＡｃ−基を有するまたは有しないフィブリン結合部分、ならびにそのような部分は本明細書に記載する異なるまたはさらなるリンカーを有する。Seq005のペプチドは、さらなるリンカー：Ａｃ−ＷＱＰＣＰＡＥＳＷＴＦＣＷＤＰＧＳＡＧＳＫ−ＮＨ2（Seq005−Ｐ２）とともに調製した［ＨＰＬＣデータ： System D, tR 3.53; マススペクトルデータ:  Neg. ion:[M-H]:2377.8, [M-2H]/2:1188.4]
（リンカーＧＳＡＧＳＫおよびＡｃ−ＷＱＰＣ*ＰＡＥＳＷＴＦＣ*ＷＤＰＧＡＧＳＧＫ−ＮＨ2、（Seq005−Ｐ３）[HPLCデータ:SystemD、tR3.54;マススペクトルデータ:Neg. ion:[M-H]:2348.1, [M-2H]/2:1173.4]（リンカーＧＡＧＳＧＫを含む）を含む）実施例２１に示すように、別のリンカーは、Seq005を有する標的化された微小胞をフィブリンに結合させる能力は有しなかった。
【表２】
2010512400.tif 000003
【表３】
2010512400.tif 000004
【表４】
2010512400.tif 000005
【表５】
2010512400.tif 000006
【表６】
2010512400.tif 000007
【表７】
2010512400.tif 000008
【００４６】
使用したＨＰＬＣシステムの詳細については、実施例の項に記載する。フィブリン結合アッセイについての詳細も実施例の項に記載する。
【００４７】
公知のペプチドＡｃ−ＷＱＰＣ*ＰＷＥＳＷＴＦＣ*ＷＤＰＧＧＧＫ−ＮＨ2（本明細書のSeq000としても参照される）からの変化は下線で表示し、この配列からの削除（例えば最初のＡｃなど）は強調していない。従って、例えば、Seq005で示される本発明のペプチドにおいて、「Ａ」として定義されるその配列のアミノ酸は、同じ位置において、従来技術のペプチドSeq000における対応するアミノ酸「Ｗ」を置換したものである。
【００４８】
Table 1および本明細書に用いられる「Ｃ*」は、ジスルフィド結合に寄与するシステイン残基を示す。
【００４９】
Table 1に示されるように、本明細書に記載したペプチドはいずれも、比較対象のペプチドと比較して同等またはさらに優れた結合を有する。
【００５０】
以下のTable 2に、各５−カルボキシフルオレセイン標識化フィブリン結合ペプチド、その配列、ＨＰＬＣデータ、マススペクトルデータおよび、大部分のペプチドについて、これまでに知られているＡｃ−ＷＱＰＣ*ＰＷＥＳＷＴＦＣ*ＷＤＰＧＧＧＫ−ＮＨ2の配列（Seq000）を有するフィブリン結合ペプチドと比較して結合親和性の測定値を示す。
【表８】
2010512400.tif 000009
【表９】
2010512400.tif 000010
【表１０】
2010512400.tif 000011
【表１１】
2010512400.tif 000012
【００５１】
ＨＰＬＣシステムの詳細については実施例の項に記載する。フィブリン結合アッセイの詳細についても実施例の項に記載する。
【００５２】
Table 2に示されるように、本明細書に記載の５−カルボキシフルオレセイン標識フィブリン結合ペプチドはいずれも、比較対象のフィブリン結合ペプチドと比較して同等または優れた結合を有する。
【００５３】
以下のTable 3に、上記のTable 1およびTable 2で参照した残基に共通して用いられる残基の略号と対応する構造を示す。
【表１２】
2010512400.tif 000013
【００５４】
本発明のフィブリン結合ペプチドの直接の合成は、固相ペプチド合成、液相合成等を含む慣用技術を用いることにより行うことができる。固相合成が好ましい。本明細書の一部を構成する、Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis (W. H. Freeman Co., San Francisco, 1989); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963); Bodanszky and Bodanszky, The Practice of Peptide Synthesis (Springer-Verlag, New York, 1984)を参照。
【００５５】
本発明のフィブリン結合ペプチドを単離または合成したら、好ましくは精製する。精製手順については、Ｃ4−、Ｃ8−またはＣ18−シリカ等のアルキル化シリカカラムを用いる逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を含む、使用することができる多くの標準的方法がある。有機物量が増加するグラジェント移動相は精製を行うのに一般的に用いられ、例えば、水性バッファー中のアセトニトリルは、通常少量のトリフルオロ酢酸を含有する。イオン交換クロマトグラフィーもまた、ペプチドをその電荷に基づいて分離するのに用いられる。ポリペプチドの純度の程度は、ＨＰＬＣでの主要な大きなピークを同定することを含む様々な方法によって測定することができる。ＨＰＬＣカラム上で投入物が少なくとも９５％である単一のピークを生じるポリペプチドが好ましい。さらに好ましくは、ＨＰＬＣカラムで、投入物の少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはさらには９９．５％またはそれ以上である単一のピークを生じるポリペプチドである。
【００５６】
得られたフィブリン結合ペプチドが本発明の組成物において使用するための望ましいペプチドであることを確かめるために、ペプチド組成物の解析を行うことができる。そのような組成物の解析は、高分解能質量分析分光法を用いてそのペプチドの分子量を測定することができる。あるいは、そのペプチドのアミノ酸含量を、水性の酸中でのそのペプチドの加水分解し、ＨＰＬＣまたはアミノ酸解析装置を用いてその混合物の成分を分離、同定および定量することによって確認することができる。ペプチドを切断し、順次アミノ酸を同定するタンパク質の配列決定もまた、ペプチドの配列を明確に決定するために用いることができる。
【００５７】
本発明のフィブリン結合ポリペプチドは、その配列における２つのシステイン残基の間のジスルフィド結合によって構造的に拘束される。この構造的な拘束によって、そのペプチドが、フィブリンに対する親和性、およびフィブリノーゲンと比較してフィブリンに対する特異性に寄与する結合構造を有することが保証される。そのペプチドについて、類似の立体配座とフィブリン特異性を保持するようペプチドを拘束するための他の方法については、当分野において記載されており、本発明において用いることができる。
【００５８】
結合ポリペプチドの修飾および最適化
フィブリン結合ポリペプチドの修飾または最適化は、本発明の範囲内である。
具体的には、本発明のポリペプチド配列はさらに修飾してその効力、薬物動態の挙動、安定性および／または他の生物学的、物理的および化学的特性を最適化することができる。
【００５９】
アミノ酸残基の置換
同クラス内でのアミノ酸の置換（例えば、ある塩基性アミノ酸を他のものに置換する）は当分野において周知である。例えば、当業者は、生じたポリペプチドが上記の特性の同様または改善したプロファイルを有することを除いて、元のポリペプチド配列において、以下の等比体積のおよび／または保存的アミノ酸変化を行うことが可能である。
【００６０】
アルキル−置換された疎水性アミノ酸の置換：分岐鎖の、環状および直鎖状のアルキル、アルケニルまたはアルキニル置換基を含む１〜１０炭素の脂肪族側鎖によって置換された、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、ノルロイシン、Ｓ−２−アミノ酪酸−シクロヘキシルアラニンまたは他の単純アルファ−アミノ酸が挙げられる。
【００６１】
芳香族−置換された疎水性アミノ酸の置換：フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、ビフェニルアラニン、１−ナフチルアラニン、２−ナフチルアラニン、２−ベンゾチエニルアラニン、３−ベンゾチエニルアラニン、ヒスチジン、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アザ、ハロゲン化（フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨード）またはアルコキシ（Ｃ1−Ｃ4）−置換された上記芳香族アミノ酸の形態が挙げられる。例示としては：２−、３−、または４−アミノフェニルアラニン、２−、３−、または４−クロロフェニルアラニン、２−、３−、または４−メチルフェニルアラニン、２−、３−、または４−メトキシフェニルアラニン、５−アミノ−、５−クロロ−、５−メチル−または５−メトキシトリプトファン、２’−、３’−、または４’−アミノ−、２’−、３’−、または４’−クロロ−、２、３、または４−ビフェニルアラニン、２’−、３’−、または４’−メチル−２−、３−または４−ビフェニルアラニン、および２−または３−ピリジルアラニン。
【００６２】
アミノ酸含有塩基性官能基の置換：アルギニン、リジン、ヒスチジン、オルチニン、２,３−ジアミノプロパン酸、ホモアルギニン、前記アミノ酸のアルキル、アルケニル、またはアリール−置換された（Ｃ1−Ｃ10の分岐鎖、直鎖状、または環状）誘導体が挙げられ、置換基はヘテロ原子上（アルファ窒素、または末端の窒素または窒素、またはアルファ炭素上、例えばプロＲ位の）に存在してもしなくてもよい。例示として以下の化合物が挙げられる：ｎ−イプシロン−イソプロピル−リジン、３−（４−テトラヒドロピリジル）−グリシン、３−（４−テトラヒドロピリジル）−アラニン、Ｎ,Ｎ−ガンマ,ガンマ’−ジエチル−ホモアルギニン。さらに、アルファメチルアルギニン、 アルファメチル２,３−ジアミノプロパン酸、アルファメチルヒスチジン、アルファメチルオルチニン（アルキル基がアルファ炭素のプロＲ位に位置する）等の化合物も挙げられる。また、アルキル、芳香族、ヘテロ芳香族（ヘテロ芳香族基が１以上の窒素、酸素または硫黄原子を単独でまたは一緒になって有する）カルボン酸から形成したアミド形態、または酸クロリド、活性なエステル、活性なアゾリド、および関連誘導体等の数多くの周知の活性化誘導体、およびリジン、オルチニン、または２,３−ジアミノプロパン酸が挙げられる。
【００６３】
酸性アミノ酸の置換：アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、チロシン、２,３−ジアミノプロパン酸、オルチニンまたはリジンのアルキル、アリール、アラルキル、およびヘテロアリールスルホンアミド、およびテトラゾール−置換されたアルキルアミノ酸が挙げられる。
【００６４】
側鎖アミド残基の置換：アスパラギン、グルタミン、およびアスパラギンまたはグルタミンのアルキルまたは芳香族置換された誘導体が挙げられる。
【００６５】
ヒドロキシル含有アミノ酸の置換：セリン、トレオニン、ホモセリン、２,３−ジアミノプロパン酸、およびセリンまたはトレオニンのアルキルまたは芳香族置換された誘導体が挙げられる。
【００６６】
さらに、上記のカテゴリーのそれぞれのアミノ酸は、同じグループの別の基で置換されていてもよい。
【００６７】
アミド結合の置換
本発明の範囲に含まれる別ノタイプの修飾は、結合ポリペプチドの骨格内に存在するアミド結合の置換である。例えば、血清安定性を損なう、生物活性の減少または消失をもたらす、望ましくないタンパク質分解または他の分解経路を減少または排除するために、またはコンフォメーションの自由度を制限若しくは増大するために、ペプチドの骨格内のアミド結合を、望ましい方式で存在するコンフォメーションを模擬するもしくはコンフォメーションを変更する官能基で置換することは一般的であると理解される。そのような修飾は、増大した結合親和性または改善した薬物動態挙動を生じ得る。ペプチド合成の分野におけるこれらの知見によって、得られるペプチドが同じかまたは改善された活性を有するという予測のもとに、２つのアミノ酸を連結する任意のアミド結合について以下のアミド結合の変更を行うことができることは理解されている：アルファ−Ｎ−メチルアミドまたはペプチドアミド骨格チオアミドの挿入、同族の第二級のアミンを生じるカルボニルの脱離、セミカルバゾン誘導体を生じる１つのアミノ酸のアザ−アミノ酸の置換、アミド結合代理としてのおよびＥ−オレフィンおよび置換されたＥ−オレフィンの使用。
【００６８】
Ｄ−アミノ酸の導入
本発明の範囲におけるべつのアプローチは、不安定なペプチド結合に、遠位または近位でＤ−アラニン、他のＤ−アミノ酸を導入することである。この場合、当業者は、そのようなＤ−アミノ酸置換は、その際、側鎖が置換されるＬ−アミノ酸について保存的置換でないＤ−アミノ酸によって行わなければならないことを理解している。これは、キラリティーの相違のため、および側鎖の配向で、置換されるＬ−アミノ酸の側鎖によって供されるものと比較して、異なる電荷、疎水性、立体的条件の部分を有する標的の結合部位のこれまで暴露されていない領域に接近するようにし得る。
【００６９】
改善された薬物動態または薬物動力学的特性の修飾
さらに、具体的な適用において本発明の結合部分の使用は、薬物動態または薬物動力学の挙動を改善するためにペプチドまたはペプチドの製剤の修飾を必要とすることがあることは理解される。ペプチドの特性が、所望の物理的または化学的特性を有すると予想される部分を付加することにより変化しうることは予想される。薬物動態および薬物動力学の挙動に影響を与えるそのような部分は、それぞれ、酸またはアミンを用いアミド結合または尿素結合を介して、ペプチドのＮ末端またはＣ末端、または適切に位置するリジンまたはリジン誘導体、ジアミノプロパン酸、オルチニン、または末端のアミン基または末端のアルコキシアミノまたはヒドラジン基を有するペプチドにおける他のアミノ酸の末端のアミノ基に結合させることができる。導入した部分は、目的のペプチドおよびその特性の修飾について存在する必要条件に依存して、親水性、塩基性または非極性のアルキルまたは芳香族基である基であってよい。
【００７０】
アミノ酸残基のグリコシレーション
本発明の範囲における更なる修飾は、グリコシル化アミノ酸残基（例えばセリン、トレオニンまたはアスパラギン残基）を、単独でまたは結合部分もしくはリンカー部分のいずれかとあるいは両方を組み合わせて採用することである。グリコシレーションは、標準的な条件を用いて行うことができ、溶解度を増大させるため、薬物動態および薬物動力学を変化させるため、またはグリコシド部分を伴う特異的または非特異的相互作用を介する結合を増大させるために用いることができる。別のアプローチでは、グリコシル化アミノ酸（Ｏ−（２−アセトアミド−２−デオキシ−３,４,６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）セリンまたはトレオニン誘導体アナログ（Ｄ−またはＬ−アミノ酸）等）は、マニュアルまたは自動化された固相ペプチド合成またはマニュアルまたは自動化された液相ペプチド合成によってペプチドに導入することができる。同様に、Ｄ−またはＬ−Ｎγ−（２−アセトアミド−２−デオキシ−３,４,６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−アスパラギンを用いることができる。グリコシレーションに用いることのできる適切に官能化されたおよび活性化された炭化水素部分の作用による末端の酸素、窒素または硫黄官能基においてグリコシル化されたアミノ酸の使用は企図される。そのような炭化水素官能基はモノサッカライド、ジサッカライドまたはさらに大きな構造のオリゴサッカライドであり得る(Kihlberg, Jan. (2000) Glycopeptide synthesis.  In: Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis - A Practical Approach (Chan, W.C. and White, P.D. Eds) Oxford University Press, New York, NY Chap. 8, pp195-213)。
【００７１】
さらに、アノマー炭素の脱離基の活性化によるグリコシレーション以外の手段による炭化水素官能基のアミノ酸への付加も企図される。アミノ酸のグリコシドへの連結は炭化水素官能基のアノマー炭素への結合の形成に限定されない。それに代わり、炭化水素部分のアミノ酸への結合は、当分野において知られているＣ−ヘテロ原子、Ｃ−Ｃまたはヘテロ原子−ヘテロ原子結合（例：Ｓ−、Ｏ−Ｎ、ｎ−Ｎ、Ｐ−Ｏ、Ｐ−Ｎ）の形成に採用される方法によって、適切で十分に反応性の酸素原子、窒素原子、炭素原子または炭化水素官能基の他の末端の原子によって行うことができる。
【００７２】
塩の形成
水溶解度を増大させるまたはこれらペプチド製剤化を容易にする、種々の塩を形成することも本発明の範囲に含まれる。これらには、ｎ−メチルグルカミン（メグルミン）、酢酸塩、シュウ酸塩、アスコルビン酸塩などが挙げられるがこれに限定されない。
【００７３】
構造上の特徴を保持する構造修飾
さらに、本発明の範囲に含まれる修飾は環状ポリペプチドの切断である。本発明の多くのポリペプチドの環状の性質は、ペプチド配列に利用可能な立体的空間、特に環内、を制限する。従って、Ｎ末端またはＣ末端領域でペプチドを環の遠位またはさらには近位の１以上の残基で切断することにより、同様または改善された生物活性を有する末端が切断されたペプチドが得られる。アミノ酸の独特な配列（結合活性に関与する３アミノ酸でさえ）ＲＧＤペプチドとして有名な同定され得る。例えば、本明細書の一部を構成するE.F. Plow et al., Blood (1987), 70(1), 110-5; A. Oldberg et al., Journal of Biological Chemistry (1988), 263(36), 19433-19436; R. Taub et al., Journal of Biological Chemistry (1989 Jan. 5), 264(1), 259-65; A. Andrieux et al., Journal of Biological Chemistry (1989 Jun. 5), 264(16), 9258-65；および米国特許第５,７７３,４１２および５,７５９,９９６号を参照。
【００７４】
文献には、大きなペプチド環を実質的に短くし、無関係なアミノ酸を除去するものの、重要な結合残基を実質的に含むことを示している。本明細書の一部を構成する米国特許第５,５５６,９３９号を参照。短くなった環状ペプチドは、ジスルフィド結合または適当に位置するカルボン酸基とアミノ基のアミド結合を用いて形成することができる。
【００７５】
さらに、Ｄ−アミノ酸をペプチド配列に付加してターン特性（turn features）を安定化することができる（特にグリシンの場合）。別のアプローチでは、以下の構造１、２および３に示すような、アルファ、ベータ、ガンマまたはデルタジペプチドまたはターン模擬体（α、β、γ、またはδターン模擬体）を用いてペプチドにおける構造モチーフやターン特性を模擬すると同時にタンパク質分解に対する安定性や他の特性（例えば、コンフォメーション安定性および溶解度）の増大をもたらすことができる（構造１： Hart et al., J. Org. Chem., 64, 2998-2999(1999); 構造２: Hanessian et al., "Synthesis of a Versatile Peptidomimetic Scaffold" in Methods in Molecular Medicine, Vol. 23: Peptidomimetics Protocols, W.M. Kazmierski Ed. (Humana Press Inc.  Totowa N.J. 1999), Chapter 10, pp. 161-174; 構造３:ＷＯ０１／１６１３５。
【化１】
2010512400.tif 000014
【００７６】
ジスルフィド模擬体の置換
さらに、本発明の結合ポリペプチド内のジスルフィド結合のジスルフィド模擬体への置換も本発明の範囲に含まれる。本発明のジスルフィド含有ペプチドについて、ジスルフィド結合は、ジスルフィド結合の存在によって時にもたらされる特定の問題を回避するために置換する必要があることもある。例えば、99mＴｃ（または他の放射性核種）ベースの−放射性医薬品または本発明のペプチドとの特定の他の構造体を製造する場合、ジスルフィド結合の存在は、有意の問題となり得る。過テクネチウム酸イオンの還元およびその後の還元されたＴｃのＴｃ適合のキレート化基を有する物質への取込に依存する経路を介して99mＴｃを取り込ませるよう設計された手法においては、ジスルフィド結合の完全性を保持することが困難である。これは、ジスルフィド結合が放射性医薬品のワンステップ調製のために考案されたキットにおいて一般に用いられる還元剤によって、かえって容易に還元されるからである。したがって、Ｔｃキレート化の間にジスルフィド結合が還元されやすいため、このジスルフィド結合の模擬体で置換することが必要となりうる。したがって、本発明の範囲にふくまれる更なる修飾は、ジスルフィド部分を、本発明において用いられる結合ポリペプチドの活性および所望の特性を保持しつつ、本明細書において開示したまたは当業者に知られた方法を用いて模擬体で修飾することである。
【００７７】
オキシムリンカー
オキシム部分は、数多くの研究によってリンカーとして用いることができる。最も興味深いのは、Wahl, F and Mutter, M, Tetrahedron Lett.  (1996) 37, 6861-6864による仕事である。アミノアルコール官能基を含むアミノ酸（４）およびアルコキシアミノ官能基を含むアミノ酸（５）をペプチド鎖に導入することができるが、ペプチド鎖の末端に導入する必要はない。ペプチドの形成後、側鎖の保護基を脱離する。アルデヒド基はマスクせずオキシム結合を形成させる。
【化２】
2010512400.tif 000015
【００７８】
ランチオニンリンカー
ランチオニンは、ジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ）が（Ｃ−Ｓ）結合で置換された環状硫化物である。このように、還元され易さがかなり低減され、この結合は塩化スズに対して安定である。ランチオニンは数多くの方法によって調製することができる。
【００７９】
ブロモアセチル化ペプチドを用いたランチオニンの調製
ランチオニンは、公知の方法を用いて容易に調製される。例えば、当分野において、(Robey, F.A. and Fields, R.L.  Anal. Biochem.  (1989) 177, 373-377) and Inman, et al. (Inman, J.K.; Highet, P.F.; Kolodny, N.; and Robey, F.A. Bioconjugate Chem. (1991) 2, 458-463; Ploinsky, A. Cooney, M.C. Toy-Palmer, A. Osapay, G. and Goodman, M. J. Med. Chem.  (1992) 35, 4185-4194; Mayer, J.P.; Zhang, J.; and Liu, C.F. in :  Tam, J.P. and Kaumaya, P.T.P. (eds), "Peptides, Frontiers of Peptide Science, " Proceedings of the 15th American Peptide Symposium, June 14-19 Nashville, Tenn. Klumer Academic Pub. Boston.  pp 291-292;. Wakao, Norihiro; Hino, Yoichi; Ishikawa, Ryuichi. Jpn. Kokai Tokkyo Koho  (1995), 7 pp. JP  07300452  A2  19951114  Heisei; JP  95-49692  19950309; JP  94-41458  19940311が公開されている。Ｂｏｃ自動化ペプチド合成、次いでペプチド末端とブロモ酢酸のカップリングを用いたペプチドの調製により、ブロモアセチル化ペプチドが高収率で得られる。ペプチドの切断と脱保護は、ＨＦ／アニソールを用いて行うことができる。ペプチドがシステイン基を含んでいる場合、その反応性は低いｐＨにより制御することができる。媒質のｐＨが６〜７に上昇した場合は、ペプチドのポリマー化または環化が起きる。ポリマー化は高濃度（１００ｍｇ／ｍＬ）濃度で起こり易く、環化は低濃度（１ｍｇ／ｍＬ）で起こり易い。例えば、以下の反応式１（６から７への環化）を参照。
【化３】
2010512400.tif 000016
【００８０】
Inman et al.は、Ｂｏｃペプチド合成において用いることができ、配列におけるブロモアセチルを有する部分の置換を可能にする、ブロモアセチルのキャリヤーとしてのＮα−（Ｂｏｃ）−Ｎε−［Ｎ−（ブロモアセチル）−β−アラニル］−Ｌ−リジンの使用を記載している
予備実験において、彼らは、環化する傾向のあるシステインからブロモアセチル−リジン誘導体を隔てる４〜６アミノ酸を有するペプチドを見出し、この方法の有用性の可能性を示している
【００８１】
アクリルアミドに対するシステインチオール付加によるランチオニンの調製
この方法のいくつかの変法を実施することができる。樹脂結合セリンを用いて、ボロモ化−脱臭化水素化−チオール付加配列を用いるまたはジスクシンイミジル炭酸塩による脱水反応、次いでチオール付加によって、樹脂においてランチオニン環を調製することができる。Ploinsky et al., M. J. Med. Chem., 35:4185-4194 (1992); Mayer et al., "Peptides, Frontiers of Peptide Science", in Proceedings of the 15th American Peptide Symposium, Tam & Kaumaya (eds), June 14-19, 1995, Nashville, Tenn. (Klumer Academic Pub. Boston) pp. 291-292. チオールのアクリルアミドへのコンジュゲート付加についても、十分に記載されており、２−メルカプトエタノールのアクリルアミドへの付加についても言及されている。Wakao et al., Jpn. Kokai Tokkyo Koho, JP  07300452 A2 (1995)。
【００８２】
ジアリールエーテルまたはジアリールアミン結合
アリールボロン酸およびチロシンの分子内環化からのジアリールエーテル結合
酢酸銅の存在下、空気中、常温にて、塩基としてピリジンまたはトリエチルアミンを用いるジクロロメタン中での、アリールボロン酸とフェノールアミンおよび複素環アミンの反応により、非対称のジアリールエーテルおよび関連のアミンが好収率（およそ９８％）で得られることが報告されている。Evans et al., Tetrahedron Lett., 39:2937-2940 (1998); Chan et al., Tetrahedron Lett., 39:2933-2936 (1998); Lam et al., Tetrahedron Lett.,  39:2941-2944 (1998)を参照。フェノール成分としてｎ−保護チロシン誘導体の場合も、収率は９８％と高かった。このことから、アミノ酸アミド（ペプチド）がトランスフォーメーションに対して安定であり、収率が高いことが期待される。容易なペプチドのラクタムへの分子内環化、ＳNＡｒ反応に基づく分子内ビアリールーテル形成および高希釈条件下でのまたは偽希釈効果が高い希釈条件を模擬する樹脂における分子内環化反応の普遍性に鑑み分子内反応の先例が存在する。
【００８３】
分子内ネイティブケミカルライゲーションを介したラクタム結合による環状ペプチドの形成
【化４】
2010512400.tif 000017
【００８４】
用いることができる別のアプローチは、適切に位置するアミノメルカプタン官能基(例えば、通常は直鎖状の配列の末端またはリジンの側鎖の窒素を解する側鎖に結合したシステインの配置から生じる）およびアルデヒド官能基の分子内環化が関与し、その一方の環は主鎖の残基によって形成されるものであり、他方の環がチアゾール環である、二環式のペプチドの形成をもたらすチアゾリジンを生じる。上記反応式２に例を示す。必要となるアルデヒド官能基は適切に位置する近接のアミノアルコール官能基のメタ過ヨウ素酸ナトリウム開裂によって作製することができ、これはリジン部分の側鎖アミノ基への付加により鎖へ結合した非保護のセリンとして存在する。いくつかの場合には、必要となるアルデヒド官能基は、鎖のＣ末端またはＮ末端での保護されたアルデヒト誘導体の脱マスキングによって作製する。この方法の例は Botti, P.; Pallin, T.D.およびTam, J.P.  J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 10018-10034に記載されている。
【００８５】
樹脂における末端のアミノ基のカルボキシル基による分子内環化に基づくラクタム
大環状ペプチドは、頭−尾結合または末端の基の環化によりラクタム形成によって調製することができる。この基本となる方法は、選択的にアミン保護基およびカルボキシ保護基を脱離することが可能である完全に保護されたポリペプチドを調製するためのものである。オルソゴナル・プロテクション反応が開発されている。そのうち、アリル, トリチルおよびＤｄｅ方法が最も採用されている。Mellor et al., “Synthesis of Modified Peptides,” in Fmoc Solid Phase Synthesis: A Practical Approach, White and Chan (eds) ([Oxford University Press,, New York, 2000]), Chapt. 6, pp. 169-178を参照。Ｄｄｅ法は、カルボン酸官能基（Ｄｍａｂエステル）およびアミノ基（Ｄｄｅ基）について同様の保護基を利用するので興味深い。両者とも、ＤＭＦ中常温で２〜１０％のヒドラジンで脱離する。あるいは、アミノ基にはＤｄｅを、カルボキシルにはアリル基を用いることができる。
【００８６】
標準的なペプチドカップリング剤によって分子内カップリングにより利用可能な、ラクタム官能基（ＨＡＴＵ、ＰｙＢＯＰ等）は、ジスルフィド結合の代理として作用し得る。Ｄｄｅ／Ｄｍａｂ法を以下の反応式３ａに示す。
【化５】
2010512400.tif 000018
【００８７】
このように、Ｄｄｅ保護リジンおよびＤｍａｂエステルを含む直鎖状配列は、低ロードのＴｅｎｔａｇｅｌベースのＲｉｎｋアミド樹脂上で調製することができる（約０．１〜０．２ｍｍｏｌ／ｇ）。次いで、両方の官能基のヒドラジンによる脱保護、次いで樹脂上での環化により所望の生成物が得られる。
【化６】
2010512400.tif 000019
【００８８】
反応式３ｂに示すアリル法では、環化を受ける末端のカルボキシル基をアリルエステルとして保護し、末端のアミノ基をａｌｌｏｃ基として保護する。樹脂において、ＤＭＦ中Ｎ−メチルモルホリンおよび酢酸の存在下でパラジウムトリス−トリフェニルホスフィンにより両方を選択的に脱マスクする。残存したパラジウム塩を、ＤＭＦ中ＤＩＥＡの存在下でジエチルジチオカルバミン酸ナトリウムを用いて脱離した後、ＤＭＦで洗浄する。次いで、Ｎ−メチルモルホリンの存在下でＨＡＴＵ／ＨＯＡｔを用いてラクタム環を形成する。上記の他のカップリング剤を用いることができる。次いで、ペプチドの処理を上記のとおり行い、所望のペプチドラクタムを得る。
【００８９】
次いで、樹脂から開裂させて、精製を行うこともできる。ペプチドのＮ末端の官能化するために、トランス−４−（ｉＶ−Ｄｄｅ）メチルアミノシクロヘキサンカルボン酸、トランス−４−（ｉＶ−Ｄｄｅ）メチルアミノ安息香酸またはそれらのａｌｌｏｃ同族体等のアミノ酸を用いることができる。さらに別の方法は、樹脂からの開裂の間の分子内ラクタム形成にセイフティーキャッチ法を用いるとうものである。
【００９０】
オレフィンメタセシスに基づく環状ペプチド
Grubbs反応（以下の反応式4)は、オレフィン結合のメタセシス/環化によるものであり、以下に示すとおり説明される。Schuster et al., Angewandte. Chem. Int. Edn Engl., 36:2036-2056 (1997); Miller et al.,  J. Am. Chem. Soc., 118:9606-9614 (1996)を参照。
【化７】
2010512400.tif 000020
【００９１】
出発物質がジオレフィン（１６）である場合、得られる生成物が環状化合物１７であることが容易にわかる。この反応は、実際、オレフィン−官能化ペプチドから環を作製するために用いられている。例えば、Pernerstorfer et al., Chem. Commun., 20:1949-50 (1997); Covalent capture and stabilization of cylindrical β-sheet peptide assemblies, Clark et al., Chem.Eur. J., 5(2):782-792 (1999); Highly efficient synthesis of covalently cross-linked peptide helices by ring-closing metathesis, Blackwell et al., Angew. Chem., Int. Ed., 37(23):3281-3284 (1998); Synthesis of novel cyclic protease inhibitors using Grubbs olefin metathesis, Ripka et al., Med. Chem. Lett., 8(4):357-360 (1998); Application of Ring-Closing Metathesis to the Synthesis of Rigidified Amino Acids and Peptides, Miller et al.,  J. Am. Chem. Soc., 118(40):9606-9614 (1996); Supramolecular Design by Covalent Capture, Design of a Peptide Cylinder via Hydrogen-Bond- Promoted Intermolecular Olefin Metathesis, Clark et al., J. Am. Chem. Soc., 117(49):12364-12365 (1995); Synthesis of Conformationally Restricted Amino Acids and Peptides Employing Olefin Metathesis, Miller et al., J. Am. Chem. Soc., 117(21):5855-5856 (1995)を参照。Ｃ−アリル化アミノ酸または所望によりｎ−アリル化アミノ酸を調製し、ジスルフィド結合を含有するペプチドの代理としてｃａｒｂａ−架橋環状ペプチドを調製するために、これらをこの反応に用いることができる。
【００９２】
また、オレフィン基を有する新規化合物を調製することもできる。オレフィンを含有するテザーによるチロシンヒドロキシルの官能化は、１つの選択肢である。リジンε−アミノ基は、例えば、アシル化部分の一部としてのオレフィン含有単位の付加によるもうひとつの選択肢である。代わりに、リジン側鎖のアミノ基をオレフィン含有テザーによりアルキル化する場合は、それは依然としてレポーターに対する結合部位としても機能する。リジン、オルチニンまたはジアミノプロピオン酸側鎖アミノ基に対する５−ペンテン酸のアシル化剤としての使用もまた可能である。オレフィン含有テザーの長さは、構造と活性の相関関係を調べるために変更することもできる。
【００９３】
ペプチド配列の操作
本発明の範囲に含まれる他の修飾としては、同様のまたは改善された生物学的特性を有するペプチドが得られると考えられるペプチド配列の操作が挙げられる。これらには、アミノ酸転位（配列内でのアミノ酸の交換）、元の配列または修飾された元の配列に代わるretro-inversoペプチドの使用、ペプトイド、retro-inversoペプトイド配列、および合成ペプチドが挙げられる。具体的な残基がペプチドの代わりにハイブリット分子を生じるペプトイドであって、完全にペプチド性でも完全にペプトイドでもない構造も同様に包含される。
【００９４】
本発明のペプチドまたはコンジュゲートは、任意の適当なアミノまたはカルボキシル基においてまたは他の適当な官能基において１以上の保護基を含み得る。特に記載しないかぎり、用語「保護基」は、それが結合している官能基の化学的官能性を保存する保護基を意味する。例えば、保護基は、アミノまたはカルボキシル基の官能性を保存するために用いることができ、例えば、Ｆｍｏｃ、ベンジル、ベンジルオキシカルボニルまたはアルキルエステルまたはそのような官能基の保護に一般的に意図される他の基が挙げられる。さらなる保護基は例えば、T.W. グリーン, Protective Groups in Organic Synthesis (Wiley, NY 1981)に開示されている。
【００９５】
適当な状況では、本発明のペプチドまたはコンジュゲートはまた「脱活性化基」を含んでいてもよく、これはペプチド単位のＮ末端（−ＮＨ2）またはＣ末端（−ＣＯＯＨ）の基と化学的に反応することが可能であり、化学反応を介して、フィブリンに対して対応するペプチド部分の特異性を維持する適当なその誘導体に変換するが、異なる部分におけるカルボキシル基またはアミノ基とそれぞれ化学的に反応することはできず、従ってカルボキサミド反応には関与しない基を意味する。そのような基としては、アセチル（ＣＨ3（ＣＯ）−またはＡｃとも称される）、アミノ基およびその誘導体、例えば、−ＮＨ2、−ＮＨ（ＣＨ3）、Ｈ２ＮＯＣ−ＣＨ2−ＮＨ−が挙げられる。
【００９６】
本発明のフィブリン結合ペプチドを含むマルチマー構造は、公知のリンカーおよび方法（例えば、本明細書の一部を構成する米国特許出願第２００５／０１４７５５５号）を用いて調製することができる。好ましい態様では、フィブリン結合ペプチドを含むホモダイマーを製造してもよい。そのような二量体化合物は増大した親和性を有し、フィブリンに対してより良好な結合を示す。
【００９７】
本発明の実施において、フィブリノーゲンに相対的な、フィブリンに対するフィブリン結合部分の親和性の測定は有用な評価基準であり、フィブリンに対する特異性を意味するものである。結合を定量化し親和性を測定する標準的なアッセイとしては、平衡透析法、平衡結合法、ゲル濾過または結合部分とその標的の相互作用から生じる数多くの分光学的変化のモニタリング（蛍光偏光の変化等）が挙げられる。これらの技術により、リガンド（またはタンパク質）濃度の関数として結合したリガンドとフリーのリガンドの濃度を測定する。結合したポリペプチドの濃度([Bound])、フリーのポリペプチドの濃度([Free])およびポリペプチドに対する結合部位（即ち、フィブリン上）（Ｎ）の関係は以下の式のとおりである：
[Bound]=N x [Free]/((1/Ka)+[Free])
【００９８】
この式のデータの解として、結合親和性の定量的測定値である会合定数（Ｋa）が求められる。会合定数Ｋaは、解離定数ＫDの逆数である。ＫDは、親和性の測定値として最も頻繁に報告されているものである。フィブリンよりもフィブリノーゲンに対して１．５倍高いＫDを有するペプチドは特異性の低いフィブリン結合物質である。フィブリンよりもフィブリノーゲンに対して１０倍高いＫDを有するペプチドは、中程度の特異性を有するフィブリン結合剤であり、フィブリンよりもフィブリノーゲンに対して１００倍高いＫDを有するペプチドは、特異性が高いフィブリン結合剤である。好ましくは本発明のペプチドおよび剤は、フィブリンよりもフィブリノーゲンに対して少なくとも１．５倍、より好ましくは少なくとも１０倍、さらにより好ましくは少なくとも１００倍、および最も好ましくは少なくとも１０００倍のＫDを有する。好ましいフィブリン結合ポリペプチドは、フィブリンに対するＫDが、１ナノモル濃度（ｎＭ）〜１００マイクロモル濃度（μＭ）の範囲であり、ＫDとしては、少なくとも１０ｎＭ、少なくとも２０ｎＭ、少なくとも４０ｎＭ、少なくとも６０ｎＭ、少なくとも８０ｎＭ、少なくとも１μＭ、少なくとも５μＭ、少なくとも１０μＭ、少なくとも２０μＭ、少なくとも４０μＭ、少なくとも６０μＭ、および少なくとも８０μＭが挙げられる。
【００９９】
フィブリン結合部分を造影剤として用いる場合、結合特異性以外の側面がより重要になりうる：造影剤は、造影剤の標的への結合がイメージング手順の間にわたって安定な平衡状態ではないという点において、動的システムで働く。例えば、造影剤を最初に注入すると、造影剤および造影剤−標的錯体の濃度は急速に増加する。しかし、注入後まもなくして、循環（フリーの）造影剤の腎臓または肝臓からの排出がはじまり、造影剤の血漿濃度は減少し始める。このフリーの造影剤の濃度の減少は、ひいては造影剤−標的錯体の解離を引き起こす。造影剤の有用性は、造影剤の排出速度に対する造影剤−標的錯体の解離の速度の差に依存する。解離速度は排出速度と比較して遅く、その間血漿中で造影剤−標的錯体の濃度が高く、フリーの造影剤の濃度（バックグラウンドシグナル）が低い、長時間のイメージング時間を生じるのが理想的である。錯体の解離速度は、解離速度定数ｋoｆｆによりコントロールされる。なぜなら、高いｋoｆｆ値は速い解離速度に相当し、造影剤として使用するためには低いｋoｆｆ値を有する結合ペプチドを得ることが望ましいからである。
【０１００】
本発明のフィブリン−結合部分は、インビトロまたはインビボでのフィブリンの検出および／またはイメージング、特にフィブリン塊および病的な血管新生プロセスの検出および／またはイメージングに極めて有用である。フィブリンのアッセイまたはイメージングのための任意の方法を用いることができる。
【０１０１】
溶液中でのフィブリンまたはフィブリン由来のポリペプチドの検出には、本発明の結合部分を検出可能な標識、例えば、蛍光標識、放射性標識または酵素標識により標識した後、その溶液と接触させた後、結合部分とフィブリン標的との錯体を検出する。
例えば、蛍光標識したフィブリン結合ペプチドを、結合が起きるような条件下でペプチドをフィブリンについて試験する溶液に加える、インビトロフィブリン検出に用いることができる。蛍光標識したフィブリン結合ペプチドとフィブリンの錯体は、フリーのペプチドに対し、相対的なフィブリン結合ペプチドから生じる増大した蛍光偏光を測定することにより、検出・測定することができる。
【０１０２】
あるいは、サンドウィッチタイプのＥＬＩＳＡアッセイを用いることができ、フィブリン結合部分をプラスチックチューブまたはウェル等の固相の支持体に固定化した後、フィブリンまたはフィブリン由来のポリペプチドを含有すると思われる溶液をその固定化された結合部分と接触させ、結合しなかった物質を洗い流し、錯体を形成したポリペプチドを、フィブリンを認識するモノクローナル抗体等の適当な検出試薬により検出することができる。モノクローナル抗体は、検出可能に標識された、例えば、放射性標識、西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素とコンジュゲートを形成させた、または蛍光標識させたものなど、当分野で公知の慣用的な手段により検出可能である。
【０１０３】
溶液中または溶液からの可溶性のフィブリンまたはフィブリン由来ポリペプチドの検出または精製に関して、本発明の結合部分を、クロマトグラフィー支持体または他の多孔質材料等の固体の担体上に固定化した後、固定化された結合剤を結合部分／フィブリン錯体の形成に適当な条件下でロードするか溶液と接触させることができる。結合しなかった溶液の一部を除去し、例えば、抗フィブリンまたは抗結合部分抗体を用いて錯体を検出することができる、またはフィブリン標的を適当な溶離条件で結合部分から放出させることができる。
【０１０４】
本発明のポリペプチドについての特に好ましい使用は、血栓症および病的な血管新生プロセスの、そのような疾患の診断、モニタリングおよび治療を支援するための、視覚的に解読可能な画像を作製するための使用である。本明細書に開示したフィブリン結合ポリペプチドは、診断検出に適当な標識によりポリペプチドとコンジュゲートを形成させることにより血栓症の検出のための造影剤に変換することができる。そのような標識は、例えば、検出可能な標識または診断に有効な部分として、イメージング手段によって検出可能な任意の部分、即ち、例えば磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）、放射性イメージング、Ｘ線イメージング、光イメージング、超音波イメージングが挙げられる診断的イメージング法によって、検出されたシグナルを任意の方法で改善するまたは有利に修飾し、当該イメージング法に伴って用いたときに、表示を診断上有用なものに、好ましくはコントラストをつけるように、するために提供することが可能な任意の部分を意味する。本発明の検出可能な標識または診断に有効な部分の例としては、例えば、キレート化ガンマ線または陽電子放出核種；キレート化またはポリキレート化錯体の形態の常磁性金属イオン、原子番号２０を超える原子を含むＸ線吸収剤；超音波造影剤、例えばガス充填微小胞、色素分子；蛍光分子；リン光分子；紫外線スペクトルに吸収する分子；量子ドット；近赤外線または遠赤外線内での吸収が可能な分子および、一般的に検出可能な物質を生じるすべての部分が挙げられる。
【０１０５】
好ましくは、フィブリンに対する高い結合能力を示す本発明のペプチドは、採用される検出方法に適当な標識とコンジュゲートを形成するかまたは連結させる（直接またはリンカーを介して）。例えば、フィブリン結合剤を、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）に適当な常磁性キレート、Ｘ線イメージングに適当な放射性標識、超音波検出に適当な超音波ミクロスフェアまたはリポソームまたは光学的イメージング色素とコンジュゲートを形成させることができる。
【０１０６】
あるいは、フィブリンに対する高い結合能力を示す本発明のペプチドを、治療薬剤とコンジュゲートを形成させるか連結させる（直接またはリンカーを介して）。そのような化合物は、フィブリンに関連する疾患の治療または軽減に有用である。
【０１０７】
本発明の範囲に含まれるさらなる修飾には、フィブリン結合ペプチドの標的配列と検出可能な標識または治療薬剤との間にリンカーまたはスペーサーを導入させることが含まれる。そのようなリンカー／スペーサーの使用によって、結合ペプチドの目的とする特性を改善することができる（例えば結合能力を改善する、血清安定性を増大させる、疎水性または親水性を適応させる、薬物動態および薬物動力学的特性を改善する、など）。実際、適当なリンカーおよび／またはスペーサーの使用によって、フィブリン結合ペプチドと検出可能な標識または治療薬剤との間の最適な距離がもたらされ、本発明の化合物のターゲッティング能力を改善することができる。これらのリンカーとしては、以下のものが挙げられるがこれに限定されない、置換されたまたは置換されていない、飽和または不飽和の、直鎖または分岐鎖のアルキル鎖、誘導体化されたまたは誘導体化されていないポリエチレングリコール、ポリオキシエチレンまたはポリビニルピリジン鎖、１以上のアミノ酸（および好ましくは３またはそれ以上のアミノ酸および最も好ましくは少なくとも４または６アミノ酸）、直鎖、枝分かれしているまたは環状アミノ酸からのペプチド、糖、または当分野で一般的な脂肪族または芳香族スペーサー、置換されたまたは置換されていないポリアミド鎖；誘導体化されたまたは誘導体化されていないポリアミン、ポリエステル、ポリエチレンイミン、ポリアクリル酸塩、ポリ（ビニル  アルコール）、ポリグリセリンまたはオリゴ糖（例えば、デキストラン）鎖；グリコシル化アミノ酸残基、オルタネーティングブロックコポリマー；マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸およびピメリン酸；カプロン酸；単純ジアミンおよびジアルコール；本明細書に開示した他の任意のリンカーならびに当分野において公知の他のいずれかの単純ポリマー性リンカー（例えば、ＷＯ９８／１８４９７およびＷＯ９８／１８４９６）。
【０１０８】
さらに、ペプチドの特性に特別な利点を与えるために、上記の部分の組み合わせであるリンカーもまた用いることができる。リンカーは、直鎖状でも枝分かれしていてもよく、好ましくは少なくとも２価の連結部分である。「２価の連結部分」は、一方でペプチドとのコンジュゲーション、もう一方で検出可能な標識または治療薬剤とのコンジュゲーションが可能な２つの官能基を含む鎖である。好ましくは、２価の連結部分は、ペプチドの末端のアミノまたはカルボキシル基および検出可能な標識または治療薬剤とのコンジュゲーションを可能にする。「官能基」は、これら分子または部分の特徴的な化学反応に関与する分子または部分内の原子の具体的集団を意味し、例えば、ペプチドの−ＮＨ2または−ＣＯＯＨ基、ならびに検出可能な標識または治療薬剤の他の活性な基（例えば、アミノ、チオールまたはカルボキシル基）が挙げられる。
【０１０９】
リンカーはまた、多官能性連結部分または多官能性リンカーであってよく、これは、少なくとも３個の官能基を含み、１つはペプチドとの連結部分であり、残りは少なくとも２つの検出可能な標識および／または治療薬剤との連結部分である、直鎖または分岐鎖を意味する。そのような多官能性連結部分としては、例えば以下のものが挙げられる：ｎ−分岐リジン系(f. i., Veprek, P et al., J. Pept. Sci. 5, 5 (1999); 5, 203 (1999)を参照）,ポリカルボキシル化合物およびカルボキシル基が適当に活性化されているまたは保護された形態である適当なその誘導体、ポリアミノ化化合物およびアミノ基が適当に活性化されているまたは保護された形態である適当なその誘導体、およびアミノ酸およびポリアミノ酸（例えば、ポリオルチニン、ポリアルギニン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸）。
【０１１０】
リンカーを有する脂質分子を付加して超音波バブル、リポソームまたは他の凝集構造を形成させることができる。そのような構造を診断レポーター、治療薬剤（例えば、治療のために化学的に「洗浄された」）またはそれらの組合せ、のターゲティングおよびデリバリーのための試薬として用いることができる。
【０１１１】
本発明において特に好ましいリンカーはＧＧＧＫである。さらに、リンカーＧＳＡＧＳＫおよびＧＡＧＳＧＫもまた好ましい。
【０１１２】
一般に、検出可能に標識されたフィブリン結合部分の使用技術は、標識によって患者の他以外で検出可能なシグナルが発生するという前提に基づく。検出可能に標識されたフィブリン結合部分をフィブリン関連疾患（例えば、血栓症または病的な血管新生プロセス）を有すると思われる患者に投与する場合、フィブリンに対するフィブリン結合部分の高い親和性によって、フィブリンに対する結合をもたらし、目的とする部位で標識を蓄積させる。標識されたペプチドによって発生したシグナルは、使用する標識のタイプによって異なるスキャンイング装置により検出され、シグナルを領域の画像に変換される。
【０１１３】
磁気共鳴映像法
本発明のフィブリン結合部分は、ＭＲＩにおいて使用する造影剤を形成させるために、ＭＲＩ検出可能な部分（例えば、常磁性金属キレート剤または鉄粒子（例えば、超常磁性ＦｅＯ粒子））と有利にコンジュゲートを形成させることができる。好ましい常磁性金属イオンは原子番号２１−３１、３９、４２、４３、４４、４９または５７−８３のものである。これには、遷移金属のイオンまたは１およびより好ましくは５またはそれ以上の、不対電子と少なくとも１．７ボーア磁子の磁気モーメントを有する一連のランタニドが含まれる。好ましい常磁性金属は以下からなる群から選択される：Ｆｅ（２＋）、Ｆｅ（３＋）、Ｃｕ（２＋）、Ｎｉ（２＋）、Ｒｈ（２＋）、Ｃｏ（２＋）、Ｃｒ（３＋）、Ｇｄ（３＋）、Ｅｕ（３＋）、Ｄｙ（３＋）、Ｔｂ（３＋）、Ｐｍ（３＋）、Ｎｄ（３＋）、Ｔｍ（３＋）、Ｃｅ（３＋）、Ｙ（３＋）、Ｈｏ（３＋）、Ｅｒ（３＋）、Ｌａ（３＋）、Ｙｂ（３＋）、Ｍｎ（３＋）、Ｍｎ（２＋）。Ｇｄ（３＋）（Ｇｄ（ＩＩＩ）とも称する）は、高い緩和能と低い毒性および唯一生物学的に可能な酸化状態で利用可能であることから、ＭＲＩに特に好ましい。Ｇｄ（ＩＩＩ）キレートは、１９８８年以降、臨床および放射能ＭＲでの適用に関して用いられており、現在、およそ３０％のＭＲ試験がガドリニウムベースの造影剤を採用している。さらに、本発明のフィブリン−結合部分は、他のＭＲＩ検出可能な部分（例えば、１以上の超常磁性粒子）とコンジュゲートを形成することもできる。
【０１１４】
当業者は、血栓症の検出に必要な用量と他の因子（例えば、患者にたいする金属の毒性）を考慮して金属を選択する。Tweedle et al., Magnetic Resonance Imaging (2nd ed.), vol. 1, Partain et al., eds. (W. B. Saunders Co. 1988), pp. 796-7を参照。一般的に、個々の金属にとって望ましい用量は、その緩和能に比例し、生体内分布, 薬物動態および代謝により変更する。３価の陽イオンＧｄ3+は、緩和能が高く、毒性が低く、さらに患者による金属の望ましくない代謝を最小限にする唯一生物学的に可能な酸化状態において存在するという利点を有するので、ＭＲＩ造影剤として特に好ましい。他の有用な金属は、Ｃｒ3+であり、比較的安価である。
【０１１５】
キレート化剤（キレート化リガンドまたはキレート化剤とも称する）は、常磁性金属に対するリガンドとして作用し、常磁性金属と錯体を形成する１以上の極性基を有する化学的部分、作用剤、化合物または分子である。適当なキレート化剤は当分野において公知であり、以下のものが挙げられる：メチレンホスホン酸基を有する酸、メチレンカルボヒドロキサミン酸基、カルボキシエチリデン基、またはカルボキシメチレン基。好ましい態様では、キレート化剤は、環状または直鎖状のポリアミノポリカルボキシルまたはポリホスホン酸を含み、少なくとも１つのアミノ、チオールまたはカルボキシル基を含む。キレート化剤の例としては、例えば、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）およびそれらの誘導体を含んでなるポリアミノポリカルボン酸およびそれらの誘導体、例えば、以下のものが挙げられるが、これに限定されない：ベンゾＤＴＰＡ、ジベンゾＤＴＰＡ、フェニルＤＴＰＡ、ジフェニルＤＴＰＡ、ベンジルＤＴＰＡ、ジベンジルＤＴＰＡ；Ｎ,Ｎ−ｂｉｓ［２−［（カルボキシメチル）［（メチルカルバモイル）メチル］アミノ］エチル］−グリシン（ＤＴＰＡ−ＢＭＡ）；ｎ−［２−［ビス（カルボキシメチル）アミノ］−３−（４−エトキシフェニル）プロピル）］−Ｎ−［２−［ビス（カルボキシメチル）アミノ］エチルグリシン（ＥＯＢ−ＤＴＰＡ）；４−カルボキシ−５,８,１１−トリス（カルボキシメチル）−１−フェニル−２−オキサ−５,８,１１−トリアザトリデカン−１３−酸（ＢＯＰＴＡ）；Ｎ,Ｎ−Ｂｉｓ［２−［ｂｉｓ［２−（１,１−ジメチルエトキシ）−２−オキソエチル］アミノ］エチル］−Ｌ−グルタミン酸１−（１,１−ジメチルエチル）エステルＮ,Ｎ−ｂｉｓ［２−［ビス（カルボキシメチル）アミノ］エチル］Ｌ−グルタミン酸（ＤＴＰＡ−ＧＬＵ）；Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ−Ｌｙｓ）とコンジュゲートを形成するＤＴＰＡ；エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）；１,４,７,１０−テトラアザシクロドデカン１,４,７−三酢酸（ＤＯ３Ａ）およびそれらの誘導体（例えば、［１０−（２−ヒドロキシプロピル）−１,４,７,１０−テトラアザシクロドデカン１,４,７−三酢酸（ＨＰＤＯ３Ａ）；１,４,７−トリアザシクロノナンＮ,Ｎ’,Ｎ”−三酢酸（ＮＯＴＡ）；２−メチル−１,４,７,１０テトラアザシクロテトラデカン１,４,７,１０−テトラ酢酸（ＭＣＴＡ）；６−［ビス（カルボキシメチル）アミノ］テトラヒドロ−６−メチル−１Ｈ−１,４−ジアゼピン−１,４（５Ｈ）−二酢酸（ＡＡＺＴＡ）（ＷＯ０３００８３９０に記載）およびそれらの誘導体；１,４,７,１０テトラアザシクロテトラデカン１,４,７,１０−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）およびそれらの誘導体（例えば、ベンゾ−ＤＯＴＡ,ジベンゾ−ＤＯＴＡ,（α,α’,α’’,α’’’）−テトラメチル−１,４,７,１０テトラアザシクロテトラデカン１,４,７,１０−テトラ酢酸（ＤＯＴＭＡ））；または１,４,８,１１−テトラアザシクロテトラデカン−Ｎ,Ｎ’,Ｎ’’,Ｎ’’’−テトラ酢酸（ＴＥＴＡ）；または１以上のカルボキシル基がホスホン酸および／またはホスフィン酸基で置換されている対応する化合物（例えば、Ｎ,Ｎ’−ビス−（ピリドオキサル−５−リン酸塩）エチレンジアミン−Ｎ,Ｎ’−二酢酸（Ｄ��ＤＰ）；エチレンジニトリロテトラキス（メチルホスホン）酸（ＥＤＴＰ）、１,４,７,１０テトラアザシクロテトラデカン１,４,７,１０テトラ（メチレンホスホン）酸（ＤＯＴＰ）、ホスホノアルキル−ポリアザ大環状化合物（例えば、ＵＳ５３６２４７６およびＵＳ５,４０９,６８９に開示）および直鎖状ホスホノアルキル誘導体（ＵＳ６５０９３２４に開示）；または大環状キレート（例えば、テキサフィリン、 ポルフィリン、 フタロシアニン）。
【０１１６】
更なるキレート化リガンドはエチレンビス−（２−ヒドロキシ−フェニルグリシン）（ＥＨＰＧ）、およびそれらの誘導体であり、以下のものが挙げられる：５−Ｃｌ−ＥＨＰＧ、５Ｂｒ−ＥＨＰＧ、５−Ｍｅ−ＥＨＰＧ、５ｔ−Ｂｕ−ＥＨＰＧ、および５ｓｅｃ−Ｂｕ−ＥＨＰＧ；ビス−２（ヒドロキシベンジル）−エチレン−ジアミン二酢酸（ＨＢＥＤ）およびそれらの誘導体、１,３−プルピレンジアミンテトラ酢酸（ＰＤＴＡ）およびトリエチレンテトラアミンヘキサ酢酸（ＴＴＨＡ）の誘導体；１,５,１０−Ｎ,Ｎ’,Ｎ”−トリス（２,３−ジヒドロキシベンゾイル）−トリカテコレート（ＬＩＣＡＭ）および１,３,５−Ｎ,Ｎ’,Ｎ”−トリス（２,３−ジヒドロキシベンゾイル) アミノメチルベンゼン （ＭＥＣＡＭ）の誘導体。本発明に含まれるキレート化剤およびキレート化基の代表例は、例えば、ＷＯ９８／１８４９６、ＷＯ８６／０６６０５、ＷＯ９１／０３２００、ＷＯ９５／２８１７９、ＷＯ９６／２３５２６、ＷＯ９７／３６６１９、ＰＣＴ／ＵＳ９８／０１４７３、ＰＣＴ／ＵＳ９８／２０１８２、およびＵ．Ｓ．４,８９９,７５５に記載されている。
【０１１７】
本発明の好ましいリガンドは、これら調製に関する適当な書誌参照とともに図６ａ〜６ｃに記載されている。
【０１１８】
特に好ましいものは：ＤＴＰＡ、ＤＴＰＡ−ＧＬＵ、ＤＴＰＡ−Ｌｙｓ、ＤＯＴＡ、ＡＡＺＴＡ、および以下のＡＡＺＴＡ誘導体:
【化８】
2010512400.tif 000021
である。
【０１１９】
本発明によれば、ＭＲＩ造影剤のキレート化剤は、フィブリン結合部分に直接かまたはリンカーを介してカップリングさせる。キレート化剤の位置は、フィブリン結合部分の結合親和性または特異性と緩衝しないように選択しなければならない。好ましくは、キレート化剤をＮ末端またはＣ末端のいずれかに付加するが、配列内であればキレート化剤をどこで結合させてもよい。好ましい態様では、フリーの中心のカルボン酸基を有するキレート化剤（例えば、ＤＴＰＡ−Ａｓｐ（β．−ＣＯＯＨ）−ＯｔＢｕ）は、アミド結合の形成によってペプチドのＮ末端への結合が容易である。リンカーの助けをかりてキレートをＣ末端に結合させることもできる。或いは、ＤＴＰＡを有する適当なイソチオシアナト基をペプチド配列の任意の位置でフリーのアミノ基に連結する手段として、イソチオシアネートコンジュゲーション反応を用いることができる。
【０１２０】
一般に、フィブリン結合部分は、金属キレート剤（またはその他の検出可能な標識）に直接または共有結合により結合させることができるか、または以下のものが挙げられるがこれに限定されないリンカーを用いて金属キレート剤とカップリングまたはコンジュゲーションすることができる：
アミド、尿素、アセタール、ケタール、二重エステル、カルボニル、カルバメート、チオ尿素、スルホン、チオエステル、エステル、エーテル、ジスルフィド、ラクトン、イミン、ホスホリルまたはホスホジエステル結合；置換されたまたは置換されていない、飽和または不飽和のアルキル鎖；単一のまたは異なるアミノ酸の、直鎖状、分岐鎖または環状のアミノ酸鎖（例えば、フィブリン結合部分のＮ末端またはＣ末端の延長）；誘導体化または非誘導体化ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレンまたはポリビニルピリジン鎖；置換または非置換ポリアミド鎖；誘導体化または非誘導体化ポリアミン、ポリエステル、ポリエチレンイミン、ポリアクリレート、ポリ（ビニルアルコール）、ポリグリセロールまたはオリゴ糖（例えばデキストラン）鎖；交互ブロックコポリマー；マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸およびピメリン酸；カプロン酸；単独ジアミンおよびジアルコール；および当分野で知られる他の任意の単独ポリマー性リンカー（例えばＷＯ９８／１８４９７およびＷＯ９８／１８４９６）または本明細書に記載した他のリンカー。好ましくはリンカーの分子量は、厳密にコントロールする。分子量は、１００未満〜１０００以上の範囲である。好ましくはリンカーの分子量は１００未満である。さらに、インビボで生物分解性のリンカーを用いて、本発明の造影剤の排出の効果的な経路を提供することが望ましい場合もある。リンカーにおけるそれらの位置にもよるが、そのような生物分解性の官能基としては、エステル、二重エステル、アミド、ホスホエステル、エーテル、アセタール、およびケタール官能基が挙げられる。
【０１２１】
一般に、そのようなリンカーを用いて、公知の方法により、金属キレートとフィブリン結合部分をカップリングすることができる。例えば、ＷＯ９５／２８９６７、ＷＯ９８／１８４９６、ＷＯ９８／１８４９７および本明細書における考察を参照のこと。フィブリン結合部分を、アミド結合を介してＮ末端またはＣ末端を介して、例えば金属キレートの金属配位している骨格の窒素または金属キレート自身の酢酸アーム（acetate arm）に連結することができる。本発明は、任意の位置でのキレートの連結を企図するが、但し、金属キレートは毒性を最小限にするために金属を強固に結合する能力を保持する。同様にフィブリン結合部分は、金属キレート剤への結合のための場所を生成するために改変され、または伸長してもよく、但し、そのような改変または伸長は標的を結合させる能力を除去しない。
【０１２２】
本明細書の開示に従って製造されるＭＲＩ造影剤は、従来のＭＲＩ造影剤と同じ方法で使用することができる。血栓をイメージングする場合、特定のＭＲ法およびパルス系列が、バックグラウンドの血液および組織に対して血栓のコントラストを増強するのに好ましいことがある。これらの技術としては、例えば、高速スピンエコー系列（fast spin echo sequence）など）（例えば、Alexanderら, Magnetic Resonance in Medicine, 40(2): 298-310 (1998)を参照のこと）およびフロー・スポイルド・グラディエントエコー系列（flow-spoiled gradient echo sequence）（例えばEdelmanら, Radiology, 177(1): 45-50 (1990)を参照のこと）などの血液を暗くさせようとするブラック・ブラッド（black blood）血管イメージング系列が挙げられる（が、これらに限定されない）。これらの方法はまた、血栓とバックグラウンド組織間のコントラストを増大する反転回復プリペアード系列（inversion-recovery prepared）または飽和回復プリペアード系列（saturation-recovery prepared sequence）などの、コントラストを増大した血栓と血液および組織とのＴ1の差に起因してコントラストの差を増強するフロー（flow）インデペンデント法が含まれる。さらに、本発明はＴ2が有意に変わらないため、Ｔ2調製の方法も有用と分かるかもしれない例えば、Gronas et al., Journal of Magnetic Resonance Imaging, 7(4): 637-643 (1997参照)。最終的に、マグネタイゼーション・トランスファ・プリパレーション（magnetization transfer preparation）はまた、これらの薬剤でのイメージングを改善することができる（例えばGoodrichら, Investigative Radiology, 31(6): 323-32 (1996)を参照のこと）。
【０１２３】
標識された試薬は、注射用組成物の形態にて患者に投与される。ＭＲＩ造影剤の投与方法は、好ましくは非経口、すなわち静脈内、動脈内、髄腔内、間質内または腔内である。血栓をイメージングするため、静脈内または動脈内投与が好ましい。
ＭＲＩについて、標的（例えば血管形成部位）におけるＭＲシグナルを少なくとも１０％増強するのに十分な投与量の造影剤を対象が投与されることが意図される。フィブリン結合部分を含有するＭＲＩ試薬による注射後、患者をＭＲＩ設備内でスキャンし、血栓の位置を測定する。治療設備において、血栓の位置を決定した後、必要ならば血栓溶解剤をすぐに投与し、次いで患者をスキャンして治療効果を視覚化することができる。
【０１２４】
超音波イメージング 
超音波が物質を透過するとき、その物質の音響特性は透過速度および物質の密度に依存するだろう。音響特性における変化は、異なる物質（固体、液体、気体）の接合部分においてもっとも顕著であろう。超音波造影剤は、溶液（例えば血液）と、その溶液中に溶解しているガス含有微小胞（例えばマイクロバブルまたはマイクロバルーン）、リポソーム、またはミクロスフェアとの間の音響上の相違のため、強烈な音波反射体である。マイクロバブル（microbubble）、マイクロバルーン（microballoon）などを含む超音波造影剤は、その大きさのため、他の検出可能部分よりも注射後、血流中に長時間とどまることができ、従って標的化されたフィブリン特異的超音波薬剤は、血栓および血管新生の部位の優れたイメージングを明らかにすることができる。
【０１２５】
本発明のこの態様において、フィブリン結合部分は、超音波イメージングに有用である物質に連結することができる。この物質は検出可能な標識（例えば音波を発生する気体または音波を発生する気体を生成することが可能な物質）として機能する液体もしくは気体を含む微小胞（例えば、リポソーム、マイクロバブル、ミクロスフェア、またはエマルジョン）を形成するために用いられる。そのような微小胞の製造のための物質としては、両親媒性化合物（例えば、界面活性剤、脂質、スフィンゴ脂質、オリゴ脂質、リン脂質、タンパク質、ポリペプチド、炭化水素）および合成または天然高分子材料が挙げられる。例えば本明細書にそのまま引用されるＷＯ９８／５３８５７、ＷＯ９８／１８４９８、ＷＯ９８／１８４９５、ＷＯ９８／１８４９７、ＷＯ９８／１８４９６およびＷＯ９８／１８５０１を参照のこと。
【０１２６】
安定化されたマイクロバブルの懸濁液を含む造影剤（好ましい態様）について、両親媒性の成分が好ましい。適当な両親媒性の成分としては、リン脂質、リゾリン脂質、脂質（例えば、パルチミン酸、ステアリン酸、アラキドン酸またはオレイン酸）；ポリマーを有する脂質（例えば、キチン、ヒアルロン酸、ポリビニルピロリドンまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（「ＰＲＧ化脂質」とも称される））；硫酸化モノ−、ジ−、オリゴ−またはポリサッカライドを有する脂質；コレステロール、コレステロール硫酸エステルまたはコレステロールヘミコハク酸エステル；トコフェロールヘミコハク酸エステル；エーテルまたはエステル様脂肪酸を有する脂質；重合化した脂質；ジアセチルリン酸エステル；ジアセチルリン酸エステル；セラミド；ポリオキシエチレン脂肪酸エステル（（例えば、ポリオキシエチレン脂肪酸ステアリン酸）、ポリオキシエチレン脂肪アルコール、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル、ポリオキシエチル化ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリンポリエチレングリコールリシノール酸エステル、エトキシル化大豆ステロール、エトキシル化ヒマシ油またはエチレンオキシド（ＥＯ）およびプロピレンオキシド（ＰＯ）ブロックコポリマー；ステロール脂肪族酸エステル（コレステロール酪酸エステル、コレステロールイソ酪酸エステル、コレステロールパルミチン酸エステル、コレステロールステアリン酸、ラノステロールアセテート、エルゴステロールパルミチン酸エステル、または植物ステロールｎ−酪酸エステル）；コレステロールグルクロニドを含む糖酸のステロールエステル、ラノステロールグルクロニド、７−デヒドロコレステロールグルクロニド、エルゴステロールグルクロニド、コレステロールグルコン酸エステル、ラノステロールグルコン酸エステル、またはエルゴステロールグルコン酸エステル；糖酸とアルコールのエステル（ラウリルグルクロニド、ステアロイルグルクロニド、ミリストイルグルクロニド、ラウリルグルコン酸エステル、ミリストイルグルコン酸エステル、またはステアロイルグルコン酸エステル）；糖と脂肪酸とのエステル（ショ糖ラウリン酸エステル、フルクトースラウリン酸エステル、ショ糖パルミチン酸エステル、ショ糖ステアリン酸、グルクロン酸、グルコン酸またはポリウロン酸）；サポニン（サルササポゲニン、スミラゲニン、ヘデラゲニン、オレアノール酸、またはジギトキシゲニン）；グリセリンまたはグリセリンエステル（グリセリントリパルミチン酸エステル、グリセリンジステアリン酸、グリセリントリステアリン酸、グリセリン−ジミリスチン酸エステル、グリセリントリミリスチン酸エステル、グリセリン−ジラウリン酸エステル、グリセリントリラウリン酸エステル、グリセリンジパルミチン酸エステル）；長鎖アルコール（ｎ−デシルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、セチルアルコール、またはｎ−オクタデシルアルコール）；６−（５−コレステン−３β−イルオキシ）−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド；−ジガラクトシルジグリセリド；６−（５−コレステン−３β−イルオキシ）ヘキシル−６−アミノ−６−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド；６−（５���コレステン−３β−イルオキシ）ヘキシル−６−アミノ−６−デオキシｌ−１−チオ−β−Ｄ−マンノピラノシド；１２−（（（７’−ジエチルアミノクマリン−３−イル）カルボニル）メチルアミノ）オクタデカン酸；ｎ−［１２−（（（７’−ジエチルアミノクマリン−３−イル）カルボニル）メチルアミノ）オクタデカノイル］−２−アミノパルチミン酸；ｎ−スクシニルジオレイルホスファチジルエタノールアミン；１、２−ジオレイル−ｓｎ−グリセリン；１,２−ジパルミトイル−ｓｎ−３−スクシニルグリセリン；１,３−ジパルミトイル−２−スクシニルグリセリン；１−ヘキサデシル−２−パルミトイルグリセロホスホエタノールアミンまたはパルミトイルホモシステイン；少なくとも１つの（Ｃ10−Ｃ20）、好ましくは（Ｃ14−Ｃ18）アルキル鎖を含むアルキルアミンまたはアルキルアンモニウム塩（例えば、ｎ−ステアリルアミン、Ｎ,Ｎ’−ジステアリルアミン、ｎ−ヘキサデシルアミン、Ｎ,Ｎ’−ジヘキサデシルアミン、ｎ−ステアリル塩化アンモニウム、Ｎ,Ｎ’−ジステアリル塩化アンモニウム、ｎ−ヘキサデシル塩化アンモニウム、Ｎ,Ｎ’−ジヘキサデシル塩化アンモニウム,ジメチルジオクタデシルアンモニウム臭化物（ＤＤＡＢ）、ヘキサデシルトリメチルアンモニウム臭化物（ＣＴＡＢ）；（Ｃ3−Ｃ6）アルキレン架橋を介して窒素原子に連結した１または好ましくは２つの（Ｃ10−Ｃ20）、好ましくは（Ｃ14−Ｃ18）アシル鎖を含んでなる第三級または第四級アンモニウム塩（例えば、１,２−ジステアロイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＳＴＡＰ）、１,２−ジパルミトイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＰＴＡＰ）、１,２−オレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）、１,２−ジステアロイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＳＤＡＰ））；およびそれらの混合物または組合せ。
【０１２７】
好ましい態様によれば、マイクロバブルのエンベロープを形成する化合物の少なくとも１つは、所望により他の上記の材料と混合された、リン脂質である。本明細書の記載において、用語「リン脂質」は、最終のマイクロバブル懸濁液における気体−水界面において
、その分子が物質の安定化フィルム（典型的には単分子層の）を形成することが可能な任意の両親媒性のリン脂質化合物を包含することを意図する。したがって、これらの物質はまた、当分野において「フィルム形成リン脂質」とも称される。
【０１２８】
両親媒性リン脂質化合物は、典型的には、少なくとも１つの リン酸基および少なくとも１つの、好ましくは２つの、親油性の長鎖炭化水素基を含む。
【０１２９】
適当なリン脂質の例としては、グリセリンの１または好ましくは２（同一または異なる）の脂肪酸残基とリン酸のエステルであって、リン酸残基が親水性の基と結合しているもの（例えば、コリン（ホスファチジルコリン−ＰＣ）、セリン（ホスファチジルセリン−ＰＳ）、イノシトール（ホスファチジルイノシトール）、グリセリン（ホスファチジルグリセリン−ＰＧ）、エタノールアミン（ホスファチジルエタノールアミン−ＰＥ）等）が挙げられる。脂肪酸の１つの残基のみとのリン脂質とエステルは、一般に当分野において、リン脂質の「リゾ」型またはリゾリン脂質と称される。リン脂質に存在する脂肪酸は、一般に、典型的に１２〜２４個の炭素原子、好ましくは１４〜２２個の炭素原子を含む長鎖脂肪酸であり、脂肪族鎖は１以上不飽和を含んでいてもよいが好ましくは完全に飽和である。リン脂質に含まれる適当な脂肪酸の例としては、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルチミン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、オレイン酸、リノール酸およびリノレン酸が挙げられる。好ましくは、飽和脂肪酸（例えば、ミリスチン酸、パルチミン酸、ステアリン酸およびアラキジン酸）を用いる。
【０１３０】
リン脂質のさらなる例は、ホスファチジン酸、すなわちグリセロール−リン酸の脂肪酸とのジエステル、スフィンゴミエリン、すなわち脂肪酸とのグリセロールジエステルの残渣がセラミド鎖で置き換わっているホスファチジルコリン類似体、カルジオリピン、すなわち１，３−ジホスファチジルグリセロールの脂肪酸とのエステル、ガングリオシド、セレブロシド、糖脂質、 スルファチドおよびスフィンゴ糖脂質などである。本明細書において用語「リン脂質」は、単独でまたは混合物としてのいずれかで用いることができる、天然由来、半合成または合成的に製造される生成物のいずれかを含む。天然リン脂質の例は、典型的に大豆レシチンまたは卵黄レシチンのような天然レシチン（ホスファチジルコリン（ＰＣ）誘導体）である。
【０１３１】
半合成リン脂質の例は、天然由来レシチンの部分的にまたは完全に水素化された誘導体である。
【０１３２】
好ましい態様である、合成リン脂質の例は、例えばジラウリロイル−ホスファチジルコリン（「ＤＬＰＣ」）、ジミリストイルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（「ＤＰＰＣ」）、ジアラキドイルホスファチジルコリン（ジアラキドイルホスファチジルコリン）（「ＤＡＰＣ」）、ジステアロイル−ホスファチジルコリン（「ＤＳＰＣ」）、１−ミリストイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン（「ＭＰＰＣ」）、１−パルミトイル−２−ミリストイルホスファチジルコリン（「ＰＭＰＣ」）、１−パルミトイル−２−ステアロイルホスファチジルコリン（「ＰＳＰＣ」）、１−ステアロイル−２−パルミトイル−ホスファチジルコリン（「ＳＰＰＣ」）、ジオレオイルホスファチジルコリン（「ＤＯＰＣ」）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（エチル−ＤＳＰＣ）、ジラウリロイル−ホスファチジルグリセロール（「ＤＬＰＧ」）およびそのアルカリ金属塩、ジアラキドイルホスファチジルグリセロール（「ＤＡＰＧ」）およびそのアルカリ金属塩、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）およびそのアルカリ金属塩、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（「ＤＰＰＧ」）およびそのアルカリ金属塩、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（「ＤＳＰＧ」）およびそのアルカリ金属塩、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（「ＤＯＰＧ」）およびそのアルカリ金属塩、ジミリストイルホスファチジン酸（「ＤＭＰＡ」）およびそのアルカリ金属塩、ジパルミトイルホスファチジン酸（「ＤＰＰＡ」）およびそのアルカリ金属塩、ジステアロイルホスファチジン酸（「ＤＳＰＡ」）、ジアラキドイルホスファチジン酸（「ＤＡＰＡ」）およびそのアルカリ金属塩、ジミリストイルホスファチジル−エタノールアミン（「ＤＭＰＥ」）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（「ＤＰＰＥ」）、ジステアロイルホスファチジル−エタノールアミン（「ＤＳＰＥ」）、ジミリストイルホスファチジルセリン（「ＤＭＰＳ」）、ジアラキドイルホスファチジルセリン（「ＤＡＰＳ」）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（「ＤＰＰＳ」）、ジステアロイルホスファチジルセリン（「ＤＳＰＳ」）、ジオレオイルホスファチジルセリン（「ＤＯＰＳ」）、ジパルミトイルスフィンゴミエリン（「ＤＰＳＰ」）およびジステアロイルスフィンゴミエリン（「ＤＳＳＰ」）である。
【０１３３】
好ましいリン脂質は、ホスファチジルコリン、エチルホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトールまたはスフィンゴミエリンの脂肪酸ジエステルである。特に好ましいリン脂質は、ＤＡＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＡ、ＤＳＰＡ、ＤＭＰ、ＤＰＰ、ＤＳＰＳおよびエチル−ＤＳＰＣである。最も好ましいのは、ＤＰＰＳまたはＤＳＰＣである。リン脂質の混合物もまた用いることができる（例えばＤＳＰＥ、ＤＰＰＥ、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣおよび／またはＤＡＰＣと、ＤＳＰ、ＤＰＰ、ＤＳＰＡ、ＤＰＰＡ、ＤＳＰＧ、ＤＰＰＧ、エチル−ＤＳＰＣおよび／またはエチル−ＤＰＰＣとの混合物）。
【０１３４】
適当なリン脂質としてはさらに、親水性ポリマー（例えば、 PEGまたはポリプロピレングリコール (PPG)）の連結により修飾されたリン脂質が挙げられる。PEGを連結することにより修飾されたリン脂質は、本明細書においてはＰＥＧ化リン脂質と称する。修飾リン脂質の例は、ポリエチレングリコール (PEG)で修飾されたホスファチジルエタノールアミン (PE)、「PE-PEGs」、即ち親水性エタノールアミン部分が種々の分子量(例えば300〜5000 ダルトン)のＰＥＧ分子に連結しているホスファチジルエタノールアミン（例えば、 DPPE-PEG, DSPE-PEG, DMPE-PEGまたはDAPE-PEG (ここで、DAPEは1,2−ジアラキドイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミンである) である。組成物はさらに、その他の両親媒性化合物を含んでいてもよい：例えば脂肪酸（例えば、パルチミン酸、ステアリン酸、アラキドン酸ｏｒオレイン酸）；ステロール（例えば、コレステロール、またはステロールと脂肪酸または糖とのエステル）；グリセリンまたはグリセリンエステル（トリパルミチン酸グリセリル、ジステアリン酸グリセリル、トリステアリン酸グリセリル、グリセリン−ジミリスチン酸エステル、グリセリントリミリスチン酸エステル、ジラウリン酸グリセリル、トリラウリン酸グリセリル、ジパルミチン酸グリセリル）；第三級または第四級アルキル−アンモニウム塩（例えば、１,２−ジステアロイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＳＴＡＰ）、１,２−ジパルミトイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＰＴＡＰ）、およびそれらの組合せ。
【０１３５】
好ましくは、製剤（および好ましくはマイクロバブルエンベロープ）は、全体の正味荷電を有する少なくとも１つの成分（例えば、荷電両親媒性物質、好ましくは脂質またはリン脂質）を含む。全体の正味荷電を有するリン脂質の例は誘導体、特に、ホスファチジルセリン（例えば、ＤＭＰ、ＤＰＰ、ＤＳＰＳ）、ホスファチジン酸（例えば、ＤＭＰＡ、ＤＰＰＡ、ＤＳＰＡ）；ホスファチジルグリセリン（例えば、ＤＭＰＧ、ＤＰＰＧおよびＤＳＰＧ）またはホスファチジルイノシトール（例えば、ＤＭＰＩ、ＤＰＰＩまたはＤＰＰＩ）の脂肪酸ジエステル誘導体である。さらに、修飾リン脂質、特にＰＥＧ−修飾ホスファチジルエタノールアミン（例えば、ＤＰＰＥ−ＰＥＧまたはＤＳＰＥ−ＰＥＧ）を、負に荷電した分子として用いることができる。また、上記のリン脂質のリゾ型（例えば、リゾホスファチジルセリン誘導体（例えばｌｙｓｏ−ＤＭＰ、−ＤＰＰＳまたは−ＤＳＰＳ）、リゾホスファチジン酸誘導体（例えばｌｙｓｏ−ＤＭＰＡ、−ＤＰＰＡまたは−ＤＳＰＡ）およびリゾホスファチジルグリセリン誘導体（例えばｌｙｓｏ−ＤＭＰＧ、−ＤＰＰＧまたは−ＤＳＰＧ）を負に荷電した化合物として有利に用いることができる。負に荷電した化合物の他の例は、胆汁酸塩（例えば、コール酸塩、デオキシコール酸塩またはグリココール酸塩）；および（Ｃ12−Ｃ24）、好ましくは（Ｃ14−Ｃ22）脂肪酸塩（例えばパルミチン酸塩、ステアリン酸塩、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−３−スクシニルグリセリン塩または１，３−ジパルミトイル−２−スクシニルグリセリン塩）である。
【０１３６】
好ましくは、負に荷電した化合物は、ＤＰＰＡ、ＤＰＰ、ＤＳＰＧ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００またはそれらの混合物から選択される。
【０１３７】
負に荷電した成分は、典型的には、１価（例えばアルカリ金属またはアンモニウム）、２価（例えばアルカリ土類金属）または３価（例えばアルミニウム）であり得る、正の対応する対イオンを伴う。好ましくは、対イオンは、アルカリ金属陽イオン（例えば、Ｌｉ+、Ｎａ+、またはＫ+、より好ましくはＮａ+）から選択される。
【０１３８】
全体として正の電荷を有するリン脂質の例は、エチルホスファチジルコリンの誘導体、特に、エチルホスファチジルコリンと脂肪酸とのジエステル（例えば、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（エチル−ＤＳＰＣまたはＤＳＥＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（エチル−ＤＰＰＣまたはＤＰＥＰＣ）である。負の対イオンは好ましくは、ハロゲン化イオン、特に塩化物イオンまたは臭化物イオンである。マイクロバブルのエンベロープ内に取り込むことができる正に荷電した化合物の例は、少なくとも１つの（Ｃ10−Ｃ20）、好ましくは（Ｃ14−Ｃ18）、アルキル鎖を含んでなる、ハロゲン化対イオン（例えばクロリドまたはブロミド）とのモノ−、ジ−トリ−、またはテトラ−アルキルアンモニウム塩（例えば、モノ−またはジ−ステアリル塩化アンモニウム、モノまたはジ−ヘキサデシル塩化アンモニウム、ジメチルジオクタデシルアンモニウム臭化物（ＤＤＡＢ）またはヘキサデシルトリメチルアンモニウム臭化物（ＣＴＡＢ））である。マイクロバブルのエンベロープに取り込むことができる正に荷電した化合物の更なる例は、(C3-C6) アルキレン架橋を介して窒素原子に連結した、１または好ましくは２個の（Ｃ10−Ｃ20）、好ましくは（Ｃ14−Ｃ18）アシル鎖を含んでなる、ハロゲン化対イオン（例えばクロリドまたはブロミド）との第三級または第四級アンモニウム塩（例えば、１、２−ジステアロイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＳＴＡＰ）、１，２−ジパルミトイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＰＴＡＰ）、１，２−オレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）または１，２−ジステアロイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＳＤＡＰ））である。
【０１３９】
ＤＳＥＰＣ、ＤＰＥＰＣおよび／またはＤＳＴＡＰは、マイクロバブルエンベロープにおいて正に荷電した化合物として好ましく用いられる。
【０１４０】
正に荷電する成分は、典型的に、１価（例えばハライド）、２価（例えば硫酸）または３価（例えばリン酸塩）であってよい対応する負の対イオンに関連する。好ましくは、対イオンは、ハロゲン化イオン、（例えば、Ｆ-（フッ素）、Ｃｌ-（塩素）またはＢｒ-（臭素））から選択される。
【０１４１】
天然の荷電した化合物の混合物、特に、リン脂質および／または脂質、はマイクロバブルエンベロープの形成に十分用いることができる。荷電した脂質またはリン脂質の量は、脂質およびリン脂質の総量に対して、約９５ｍｏｌ％〜約１ｍｏｌ％、好ましくは８０ｍｏｌ％〜２０ｍｏｌ％の間で変更することができる。
【０１４２】
天然のリン脂質および荷電したリン脂質の好ましい混合物は、例えば、ＤＰＰＧ／ＤＳＰＣ、ＤＳＴＡＰ／ＤＡＰＣ、ＤＰＰＳ／ＤＳＰＣ、ＤＰＰＳ／ＤＡＰＣ、ＤＰＰＥ／ＤＰＰＧ、ＤＳＰＡ／ＤＡＰＣ、ＤＳＰＡ／ＤＳＰＣおよびＤＳＰＧ／ＤＳＰＣである。
【０１４３】
好ましい態様では、リン脂質はマイクロバブルの安定化エンベロープの主成分であり、その量は少なくとも、ガス充填マイクロバブルのエンベロープを形成する成分の総量の少なくとも５０％（ｗ／ｗ）である。いくつかのこのましい態様では、エンベロープの実質的に全体（重量で少なくとも９０％〜１００％）がリン脂質で構成され得る。
【０１４４】
本明細書に開示したまたは当業者に公知の任意のガスを用いることができるが、不活性ガス（例えば、ＳＦ6またはＣＦ4、Ｃ3Ｆ8およびＣ4Ｆ10等のペルフルオロ炭素）が好ましく、所望により他のガス（例えば、空気、窒素、酸素または二酸化炭素）と混合してもよい。
【０１４５】
本発明の好ましい微小胞懸濁物は、粗製のリン脂質の適切な溶媒中の溶液の凍結乾燥もしくは吹きつけ乾燥のような知られている工程またはEP 554213, US 5,413,774, US 5,578,292, EP 744962, EP 682530, US 5,556,610, US 5,846,518, US 6,183,725, EP 474833, US 5,271,928, US 5,380,519, US 5,531,980, US 5,567,414, US 5,658,551, US 5,643,553, US 5,911,972, US 6,110,443, US 6,136,293, EP 619743, US 5,445,813, US 5,597,549, US 5,686,060, US 6,187,288およびUS 5,908,610に記載の工程を用いて、リン脂質から製造することができ、これらはそれぞれ本明細書にそのまま引用される。もっとも好ましくは、リン脂質は有機溶媒に溶解し、溶液はリポソーム形成段階を経ずに乾燥する。これは、適切な有機溶媒中に、親水性安定物質、もしくは有機溶媒と水の両方に溶解する化合物と一緒にリン脂質を溶解させ、溶液を凍結乾燥または吹きつけ乾燥することにより行うことができる。この具体的態様にて、親水性安定剤の選択に使用される基準は、選択された有機溶媒中における可溶性である。水および有機溶媒に可溶な親水性安定化合物の例は、例えばポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのようなポリマー、リンゴ酸、グリコール酸、マルトールなどである。そのような親水性化合物はまた、マイクロバブルのサイズ分布を均質化するのを助け、保存下において安定性を増強させる。続く乾燥を促進するために、その沸点が十分に低く、その融点が十分に高い限り、いずれの適切な有機溶媒をも使用することができる。典型的な有機溶媒としては、例えばジオキサン、シクロヘキサノール、ターシャリーブタノール、テトラクロロジフルオロエチレン（Ｃ2Ｃｌ4Ｆ2）または２−メチル−２−ブタノールが挙げられるが、２−メチル−２−ブタノールおよびＣ2Ｃｌ4Ｆ2が好ましい。
【０１４６】
水性キャリア中での分散による微小胞の懸濁物の形成前に、凍結乾燥または吹きつけ乾燥したリン脂質散剤を、空気または別の気体と接触させる。水性キャリアと接触させた場合、その構造が崩壊している粉末リン脂質は、そこに分散している気体のマイクロバブルを安定化させる層状（lamellarized）または薄層（laminarized）セグメントを形成するだろう。この方法により、長期間保存しても安定であり、振盪せずに、または激しく撹拌せずに乾燥薄層リン脂質（所望の気体雰囲気下にて保存されている）の単純な溶解により得られるマイクロバブルの懸濁物の生成が可能となる。
【０１４７】
あるいは微小胞は、特にマイクロバブルは、例えばＷＯ９７／２９７８３に開示のように、高撹拌速度にて気体を水溶液中にて懸濁化させることにより製造することができる。好ましくは、国際特許出願ＷＯ０４／０６９２８４に開示されているように、リン脂質（例えば、ＤＳＰＣおよび／またはＤＳＰＡ）を、液性保護剤（lyoprotecting agent）（例えば以下に詳細に示すような、炭化水素, 糖 アルコール,ポリグリコールおよびそれらの混合物）、および所望により他の両親媒性物質（例えばステアリン酸）と混合して、水および水に混和しない有機溶媒のエマルジョンに分散させた、マイクロエマルジョンを調製することができる。好ましい有機の溶媒は、水における溶解度が１．０ｇ／ｌまたはそれ以下、好ましくは約０．０１ｇ／ｌより低い、ものであり、例えば、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、デカン、１−ペンテン、２−ペンテン、１−オクテン、シクロペンタン、シクロヘキサン、シクロオクタン、１−メチル−シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、エチルベンゼン、１,２−ジメチルベンゼン、１,３−ジメチルベンゼン、ジ−ブチルエーテルおよびジ−イソプロピルケトン、クロロホルム、炭素四塩化、２−クロロ−１−（ジフルオロメトキシ）−１,１,２−トリフルオロエタン（エンフルラン）、２−クロロ−２−（ジフルオロメトキシ）−１,１,１−トリフルオロエタン（イソフルラン）、テトラクロロ−１,１−ジフルオルエタン、ペルフルオロペンタン、ペルフルオロヘキサン、ペルフルオロヘプタン、ペルフルオロノナン、ペルフルオロベンゼン、ペルフルオロデカリン、メチルペルフルオロブチルエーテル、メチルペルフルオロイソブチルエーテル、エチルペルフルオロブチルエーテル、エチルペルフルオロイソブチルエーテルおよびそれらの混合物が挙げられる。
【０１４８】
リン脂質(例えば本明細書に開示したリポペプチド) にコンジュゲートした本発明のフィブリン結合ペプチドをマイクロエマルジョンにおいて微小胞のエンベロープを形成するエーテルと混合することができる。好ましくは、フィブリン結合ペプチド−リン脂質コンジュゲートおよびＰＥ−ＰＥＧ（例えばＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）の水性懸濁液を最初に調製した後、リン脂質と液正保護剤を含んでなる水性の有機エマルジョンと混合することができる。好ましくはこの混合は加熱下（例えば４０℃〜８０℃）で行う。
【０１４９】
その他の賦形剤または添加剤は、マイクロバブルの安定化エンベロープの形成を伴う（または単に部分的に伴う）必要なく、マイクロバブルの乾燥製剤に存在させるか、またはその再構成のために用いる水性担体とともに加えることができる。これらには、ｐＨ調整剤、浸透圧調整剤、増粘剤、乳化剤、充填剤などが挙げられ、慣用的な量で用いることができる。例えば、ポリオキシプロピレングリコールおよびポリオキシエチレングリコールならびにそれらのコポリマー等の化合物を用いることができる。増粘剤または安定化剤の例としては、直鎖状および架橋ポリ−およびオリゴ−サッカライド、糖類および親水性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）から選択される化合物である。
【０１５０】
ガス充填マイクロバブルの製造には凍結乾燥工程またはスプレー乾燥工程を伴うことがあるので、製剤に、凍結乾燥添加物（例えば、凍結保護（cryoprotective）および／または液性保護（lyoprotective）効果を有する物質および／または充填剤、例えばアミノ酸（例えば、グリシン）;炭化水素、例えば糖類（例えば、スクロース、マンニトール、マルトース、トレハロース、グルコース、ラクトースまたはシクロデキストリン）、または多糖類（例えば、デキストラン）;またはポリオキシアルキレングリコール（例えば、ポリエチレングリコール））を添加することが有利であるかもしれない。
【０１５１】
超音波適用にて、リン脂質安定化マイクロバブルにより形成される造影剤は、例えば注射されるリン脂質の量が０．１〜２００μｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．１〜３０μｇ／ｋｇの範囲であるような用量にて投与することができる。
【０１５２】
その他の気体を含む懸濁液は、例えば本明細書にそのまま引用される、US 5,798,091、WO 97/29783およびEP 881 915に開示のものが挙げられる。これらの薬剤は、US 5,798,091またはWO97/29783に記載のように製造することができる。
【０１５３】
別の好ましい超音波造影剤は、「マイクロカプセル」の「マイクロバルーン」の形態の超音波造影剤が挙げられる。用語「マイクロバルーン」または「マイクロカプセル」（ここでは相互に互換的に用いられる）は、物質境界線またはエンベロープを有する気体充填体を意味する。マイクロバルーン形成についての詳細および製造方法は、EP-A-0 324 938(U.S. Pat. No. 4,844,882); US 5,711,933; US 5,840,275; US 5,863,520; US 6,123,922; US 6,200,548; US 4,900,540; US 5,123,414; US 5,230,882; 5,469,854; 5,585,112; US 4,718,433; US 4774,958; WO 9501187; US 5,529,766; US 5,536,490およびUS 5,990,263に記載されており、これらはそれぞれ本明細書にそのまま引用される。
【０１５４】
好ましいマイクロバルーンは、生分解性の生理学的に両立できるポリマーまたは生分解性固体脂質を含む膜を有する。本発明のマイクロバルーンの製造に有用なポリマーは、次のいずれかの特許：EP 458745, US 5,711,933, US 5,840,275, EP 554213, US 5,413,774およびUS 5,578,292のいずれかに記載のような生分解性の生理学的に両立できるポリマーから選択することができ、これらの全内容は本明細書に引用される。特にポリマーは、水難溶性の多糖類、ポリラクチドおよびポリグリコリドおよびそれらの共重合体、ラクチドおよびε−カプロラクトン、γ−バレロラクトンのようなラクトンの共重合体およびポリペプチドのような生分解性の生理学的に両立できるポリマーから選択することができる。他の適切なポリマーとしては、ポリ（オルト）エステル類（例えばUS 4,093,709; US 4,131,648; US 4,138,344; US 4,180,646を参照のこと）；  ポリ乳酸およびポリグリコール酸およびそれらの共重合体、例えばＤＥＸＯＮ（J. Heller, Biomaterials 1 (1980), 51を参照のこと）；  ポリ（ＤＬ−ラクチド−ｃｏ−ε−カプロラクトン）、ポリ（ＤＬ−ラクチド−ｃｏ−γ−バレロラクトン）、ポリ（ＤＬ−ラクチド−ｃｏ−γ−ブチロラクトン）、ポリアルキルシアノアクリレート；  ポリアミド、ポリヒドロキシブチラート；  ポリジオキサノン；  ポリ−β−アミノケトン（A. S. Angeloni, P. Ferruti, M. Tramontini and M. Casolaro, The Mannich bases in polymer synthesis: 3. Reduction of poly(beta-aminoketone)s to poly(gamma-aminoalcohol)s and their N-alkylation to poly(gamma-hydroxyquaternary ammonium salt)s, Polymer 23, pp 1693-1697, 1982.)；  ポリホスファゼン（Allcock, Harry R.  Polyphosphazenes:  new polymers with inorganic backbone atoms (Science 193(4259), 1214-19 (1976)）およびポリ無水物（polyanhydride）が挙げられる。本発明のマイクロバルーンはまた、本明細書に引用されるWO-A-96/15815の方法に従って製造することができ、該マイクロバルーンは、好ましくはモノ−、ジ−、トリ−グリセリド、脂肪酸、ステロール、蝋およびそれらの混合物から選択される生分解性脂質を含む生分解性膜から製造する。好ましい脂質は、ジ−またはトリ−グリセリド、例えばジ−またはトリ−ミリスチン、−パルミチンまたは−ステアリン、特にトリパルミチンまたはトリステアリンである。マイクロバルーンは、本明細書に開示されているか、または当業者に知られているいずれかの気体を用いることができる；しかしフッ素化ガスのような不活性気体が好ましい。マイクロバルーンは、当業者に知られている任意の添加物および安定剤とともに、製薬的に許容される液体キャリア中にて懸濁化することができる。
【０１５５】
他の気体含有造影剤製剤は、その中に含まれる気体を有するか、またはそうでなければそれと結合している（例えばその表面に吸着されるか、および／または表面にある空間、空洞または孔に含まれる）微粒子（特に微粒子の凝集体）を含む。これらの薬剤の製造方法は、EP 0122624, EP 0123235, EP 0365467, US 5,558,857, US 5,607,661, US 5,637,289, US 5,558,856, US 5,137,928, WO 9521631およびWO 9313809に記載されており、これらはそれぞれ本明細書にそのまま引用される。
【０１５６】
これら任意の超音波組成物はまた、できるだけ血液と等張とする。従って注射前、上記超音波造影剤懸濁剤のいずれかに少量の等張な薬剤を加えることができる。等張な薬剤は、一般に医薬に使用される生理溶液であり、それは生理食塩水溶液（０．９％ＮａＣｌ）、２．６％グリセロール溶液、５％デキストロース溶液などを含む。さらに超音波組成物は、例えば乳化剤、粘度調整剤、抗凍結剤、溶解保護剤（lyoprotectant）、充填剤などを含む標準的な製薬的に許容される添加物を含むことができる。
【０１５７】
任意の生体適合性気体は、本発明に有用な超音波造影剤に使用することができる。本明細書において用語「気体」は、実質的に正常なヒト体温における気体形態における任意の物質（混合物を含む）を含む。従って気体としては、例えば空気；窒素, 酸素, 二酸化炭素, 水素, 酸化窒素, 希ガスまたは不活性ガス（例えば、 ヘリウム, アルゴン, キセノンまたはクリプトン,放射性ガス（例えば、 Xe133またはKr81）, 過分極 希ガス （例えば、 過分極 ヘリウム, キセノンまたはネオン）, フッ素化ガス (例えば、 ペルフルオロ炭素、 SF6, SeF6)、低分子量の炭化水素(例えば、1〜7の炭素原子を含むもの）、例えば、アルカン（例えば、メタン、エタン、プロパン、ブタン、イソブテン、イソペンタンまたはペンタン）、シクロアルカン（例えば、シクロブタンまたはシクロペンタン）、アルケン（例えば、プロペン、プロパジエンまたはブテン）、またはアルキン（例えば、アセチレン）、エーテル、ケトン、エステル、ハロゲン化ガス（例えば、ハロゲン化、フッ素化またはペルフルオロ低分子量炭化水素（例えば７までの炭素原子を含むもの）および／またはそれらの混合物が挙げられる。
【０１５８】
フッ素化ガス、特にペルフルオロガス、は好ましい。フッ素化ガスとしては、少なくとも１つのフッ素原子を含む物質、例えばＳＦ6、フロン（１つ以上の炭素原子およびフッ素を含む有機化合物、すなわちＣＦ4、Ｃ2Ｆ6、Ｃ3Ｆ8、Ｃ4Ｆ8、Ｃ4Ｆ10、ＣＢｒＦ3、ＣＣｌ2Ｆ2、Ｃ2ＣｌＦ5およびＣＢｒＣｌＦ2）、フッ素化炭化水素、フッ素化ケトン（例えば、ペルフルオロアセトン）、フッ素化エーテル（例えば、ペルフルオロジエチルエーテル）およびペルフルオロカーボンが挙げられる。用語ペルフルオロカーボンは、炭素およびフッ素原子のみを含む化合物を意味し、特に飽和、不飽和および環状のペルフルオロカーボンを含む。飽和ペルフルオロカーボンは、通常好ましく、式ＣnＦn+2を有し、ここに、ｎは１〜１２、好ましくは２〜１０、もっとも好ましくは３〜８およびさらに好ましくは３〜６である。生物適合性の、生理学的に許容し得るペルフルオロカーボンの例は、以下のとおりである：ペルフルオロアルカン（例えば、ペルフルオロメタン、ペルフルオロエタン、ペルフルオロプロパン、ペルフルオロブタン（例えばペルフルオロ−ｎ−ブタン（所望によりその他の異性体（例えば、ペルフルオロ−イソブタン）と混合していてもよい）、ペルフルオロペンタン、ペルフルオロヘキサンまたはペルフルオロヘプタン）；ペルフルオロアルケン（例えば、ペルフルオロプロペン、ペルフルオロブテン（例えばペルフルオロブタン−２エン）またはペルフルオロブタジエン）；ペルフルオロアルキン（例えばペルフルオロブタン−２−イン）；およびペルフルオロシクロアルカン（例えばペルフルオロシクロブタン、ペルフルオロメチルシクロブタン、ペルフルオロジメチルシクロブタン、ペルフルオロトリメチルシクロブタン、ペルフルオロシクロペンタン、ペルフルオロメチルシクロペンタン、ペルフルオロジメチルシクロペンタン、ペルフルオロシクロヘキサン、ペルフルオロメチルシクロヘキサンおよびペルフルオロシクロヘプタン）。好ましい飽和ペルフルオロ炭素としては、例えば、ＣＦ４、Ｃ２Ｆ６、Ｃ３Ｆ８、Ｃ４Ｆ８、Ｃ４Ｆ１０、Ｃ５Ｆ１２およびＣ６Ｆ１２が挙げられる。最も好ましくはガスまたは混合ガスは、ＳＦ６またはＣ３Ｆ８Ｃ４Ｆ８、Ｃ４Ｆ１０、Ｃ５Ｆ２、Ｃ６Ｆ１２、Ｃ７Ｆ１４、Ｃ８Ｆ１８からなる群から選択される（Ｃ４Ｆ１０が特に好ましい）ペルフルオロ炭素を含んでなる。ＷＯ９７／２９７８３、ＷＯ９８／５３８５７、ＷＯ９８／１８４９８、ＷＯ９８／１８４９５、ＷＯ９８／１８４９６、ＷＯ９８／１８４９７、ＷＯ９８／１８５０１、ＷＯ９８／０５３６４、ＷＯ９８／１７３２４もまた参照のこと。
【０１５９】
特定の状況では、ガス状物質の前駆体（例えばインビボにて気体に変換することが可能な物質、「ガス前駆体」と言及することが多い）を含むことが望ましいことがある。好ましくは、ガス前駆体およびその前駆体が生成するガスは、生理学的に許容される。ガス前駆体は、ｐＨ活性化、光活性化、温度活性化であるものである。例えば特定のペルフルオロカーボンは、温度活性化ガス前駆体として使用することができる。ペルフルオロペンタンのようなこれらのペルフルオロカーボンは、室温（またはその物質が製造および／または保存される温度）よりも高いが、体温を超えない液体／気体相遷移温度を有する；従ってこれら相シフトを受けてヒトの体内で気体に変換される。
【０１６０】
上記で述べたように、ガスは、混合ガスを含んでなることができる。混合物は上記ガスの任意のものを任意の比率で含んでなることができる。好ましい態様では、混合物は慣用のガス（例えば、窒素、空気または二酸化炭素およびフッ素化ガス）を含んでいてもよい。適当な混合ガスの例としては、本明細書の一部を構成するＷＯ９４／０９８２９に記載されているものが挙げられる。以下の組み合わせが混合ガスとして特に好ましい：ガス（Ａ）および（Ｂ）の混合物（ここに、ガスのうち（Ｂ）の少なくとも１つは容積で０．５〜４１％の量にて存在し、８０ダルトンよりも大きな分子量を有し、フッ素化ガスであり、そして（Ａ）は、空気、酸素、窒素、二酸化炭素およびその混合物からなる群から選択され、混合物の平衡を保つ。
【０１６１】
ＭＲＩにおける使用について、微小胞は、好ましくは、過分極希ガス（例えば、過分極ネオン、過分極ヘリウム、過分極キセノンまたはそれらの混合物）を、所望により空気、ＣＯ2、酸素、窒素、ヘリウム、キセノン、または前記の任意のハロゲン化炭化水素と混合して、含んでいる。
【０１６２】
シンチグラフィーにおける使用について、微小胞は、好ましくは、放射性ガス（例えば、Ｘｅ133またはＫｒ81）またはそれらの混合物を、所望により空気、ＣＯ2、酸素、窒素、ヘリウム、クリプトンまたは前記の任意のハロゲン化炭化水素と混合して、含んでいる。
【０１６３】
超音波微小胞は、本明細書に記載の他の検出可能な標識よりも大きいことがあるため、１つの好ましい態様では、造影剤のターゲティング効率を増大するために、それらを多数のフィブリン結合ポリペプチドに連結またはコンジュゲートすることができる。上記の（または当業者に知られている）超音波造影剤への結合は、フィブリン−結合ポリペプチドと微小胞を製造するために使用する物質との間の共有結合を介するか、またはこれまで記載されたリンカーを介することができる。例えば、WO 98/53857を参照。二官能性PEGリンカーへのペプチドの結合させた後これをリポソーム 組成物と反応させることが一般的に記載されている。また、Lanza et al., Ultrasound in Med. & Bio., 23(6):863-870 (1997)も参照のこと。
【０１６４】
フィブリン−結合 ポリペプチドにコンジュゲートした微小胞の懸濁液を製造するために、多くの方法を使用することができる。例えば、５％（ｗ／ｗ）のＮ−ＭＰＢ−ＰＥ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−４−（ｐ−マレイミド−フェニルブチルアミド）（Avanti Polar-Lipids, Inc）をリン脂質形成に組み込むことにより、マレイミド誘導体化マイクロバブルを製造することができる。次いで、脱アセチル化溶液（50 mM リン酸ナトリウム, 25 mM EDTA, 0.5 M ヒドロキシルアミン HCl, pH 7.5）中にてインキュベーションした、メルカプトアセチル化フィブリン結合ペプチドの溶液（ＤＭＦ中１０ｍｇ／ｍＬ）を、マレイミド活性化マイクロバブル懸濁液に加える。暗所で穏やかな撹拌下でインキュベーション後、マイクロバブルとコンジュゲートしたペプチドを遠心分離により精製することができる。
【０１６５】
微小胞、特にマイクロバブル、の誘導体化に使用することができる化合物は、典型的に次の成分を含む：（ａ）  マイクロバブルまたはマイクロバルーンの膜を形成する物質に適合する、微小胞の膜内への化合物の有効な取込を可能にするための疎水性部；該部分は典型的に脂質部分（ジパルミチン、ジステアロイル）により提示される；および（ｂ）スペーサー（典型的に種々の分子量のＰＥＧ、アミノ酸鎖など）であり、これはある場合（該スペーサーが長すぎる場合マイクロバブルは例えば凍結乾燥が困難な場合がある）には任意であるか、または他の場合（例えば短いスペーサーでマイクロバルーンにコンジュゲートする場合、ペプチドの活性がより低くなることがある）が好ましいことがある；および（ｃ）コンジュゲートされるペプチド上の対応する反応部分と反応することが可能な反応性基（例えばシステインの−ＳＨ基とマレイミド）。
【０１６６】
あるいは、マイクロバブルにコンジュゲートするフィブリン−結合ポリペプチドは、ビオチン／アビジンを用いて製造することができる。例えば、アビジン−コンジュゲートマイクロバブルは、メルカプトアセチル化アビジン（脱アセチル化溶液でインキュベーションされる）に加えられる、上記のように製造されるマレイミド活性化リン脂質マイクロバブル懸濁液を用いて製造することができる。次いでビオチニル化されたフィブリン結合ペプチドを、アビジン−コンジュゲートマイクロバブルの懸濁液に加え、フィブリン結合ペプチドにコンジュゲートしたマイクロバブルの懸濁液が得られる。
【０１６７】
さらに、フィブリン結合ペプチドは、リン脂質とコンジュゲートを形成させることができ、これらのリポペプチドを、ガス充填微小胞超音波造影剤を調製するために用いることができる。好ましくは、リン脂質は以下からなる群から選択される：ホスファチジルエタノールアミンおよび修飾されたホスファチジルエタノールアミン。ペプチドおよびリン脂質は、直接またはリンカー（例えば親水性ポリマー、アミノ酸鎖など）を介してコンジュゲートすることができる。特に好ましいリン脂質としては、親水性ポリマーが連結することにより修飾されたホスファチジルエタノールアミンが挙げられる。修飾されたホスファチジルエタノールアミンの例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で修飾されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）（「ＰＥ−ＰＥＧ」）、即ち、親水性エタノールアミン部分が種々の分子量（例えばｆｒｏｍ３００ｔｏ５０００ダルトン）のＰＥＧ分子に連結しているホスファチジルエタノールアミンが挙げられ、例えば、ＤＰＰＥ−ＰＥＧ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ、ＤＭＰＥ−ＰＥＧまたはＤＡＰＥ−ＰＥＧ．ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ３４００、ＤＰＰＥ−ＰＥＧ２０００およびＤＰＰＥ−ＰＥＧ３４００が好ましく、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００が特に好ましい。例えば、トリメチルアンモニウム塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリエチルアンモニウム塩、ナトリウム塩などの、リン脂質の塩の形態もまた用いることができる。そのようなリポペプチドの調製方法は実施例に記載する。
【０１６８】
リン脂質にコンジュゲートしたフィブリン結合ポリペプチドを有する標的化微小胞の好ましい製造方法もまた実施例に記載する。
【０１６９】
特別な保存条件を必要とすると知られている過分極化ガスを含まなければ、凍結乾燥残渣は、その環境の温度制御の必要なく保存し、運搬することができ、特に使用者が特別な保存設備を必要とせず、すぐに使用できる投与可能な懸濁物にその場で製剤化するために病院および医師に供給することができる。好ましくはそのような場合、２つの構成成分キットの形態にて供給することができ、それは２つの分離容器またはデュアルチャンバー容器を含むことができる。先の場合、好ましい容器は従来のセプタム封されたバイアルであり、ここに、工程ｂ）の凍結乾燥された残渣を含むバイアルは、キャリア液体を適宜予め充填したシリンジを用いて注入することができるセプタムで封印されている。次いでそのような場合、第二の構成成分の容器として用いられるシリンジはまた、造影剤を注入するために用いる。後の場合には、好ましいデュアルチャンバー容器は、デュアルチャンバーシリンジであり、凍結乾燥物が再構成された後、適切に混合するか、または穏やかに撹拌するとすぐに、容器は造影剤を注入するために直接用いることができる。両方の場合にて、容器の内容物に十分な気泡生成エネルギーの適用を導き、可能にする方法を提供する。しかし上記のように、本発明に従い安定化された造影剤にて、ガスマイクロバブルの大きさは実質的に、再構成された乾燥生成物に適用される撹拌エネルギーの量に依存しない。従って手による穏やかな振盪のみが一般に、一致したマイクロバブルサイズで再生される生成物を得るために必要である。
【０１７０】
乾燥した粉末を無菌で水溶液と混合することが可能な他の２つのチャンバー再構成系もまた、本発明の範囲内にあることは、当業者により十分認識することができる。そのような系にて、水相が水不溶性ガスとその環境の間に割り込むことができる場合、生成物の保存寿命を増大することは特に有利である。造影剤を形成するために必要な物質がすでに容器内に存在していない場合（例えば標的リガンドが再構成の間リン脂質に連結している）、キットの他の構成成分と、好ましくはキットの他の構成成分との組合せを予め容易にするために適合される形態または容器に詰めることができる。
【０１７１】
特殊でない容器、バイアルまたは連結系が必要である；  本発明は従来の容器、バイアルおよびアダプターを用いることができる。唯一の必要物は、ストッパーと容器の間の良い封である。それゆえ封の質は、一番関心のある問題となる；  封の完全性の劣化により望ましくない物質がバイアルに入り得る。無菌の保証に加えて、真空保持は安全で適切な再構成を保証するために常圧または減圧にて栓をされる生成物に不可欠である。ストッパーに関して、それはポリ（イソブチレン）またはブチルラバーのようなエラストマーベースの化合物または多成分製剤であることができる。
【０１７２】
本発明に従って用いることができる超音波イメージング法は、カラードップラー法、パワードップラー法、ドップラー振幅（Doppler amplitude）、刺激性音響イメージング（stimulated acoustic imaging）および二次元または三次元イメージング法のような既知の技術を含む。イメージングはハーモニック（harmonic）（共鳴周波数）または基本モードにて行うことができ、第二ハーモニックが好ましい。
【０１７３】
超音波適用にて、リン脂質安定化マイクロバブルにより形成される造影剤は、例えば注射されるリン脂質の量が０．１〜２００μｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．１〜３０μｇ／ｋｇの範囲であるような用量にて投与することができる。含マイクロバルーン造影剤は、典型的に壁形成ポリマーまたは脂質の量が約１０μｇ／ｋｇ体重〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重であるような用量にて投与される。
【０１７４】
好ましい具体的態様にて、本明細書に記載の超音波造影剤は、１以上のフィブリン- 結合部分にコンジュゲートしている。実施例二示すように、これらの標的化された超音波造影剤は、フィブリンを含む血餅、フィブリンを含む組織または血管新生の部位に局在化させ、血餅、癌または血管新生組織をイメージングするために用いることができる。
【０１７５】
本発明の超音波造影剤はさらに様々な治療的イメージング法において用いることができる。治療的イメージングなる語の意味には、造影剤の使用を含んでなる（例えば、治療剤の選択したレセプターまたは組織への送達のための）、およびインビトロおよび／またはインビボでの生物学的効果を示すまたはその原因となることが可能な、患者における疾患の治療のための任意の方法が含まれる。治療的イメージングは、有利には、ガス充填微小胞の制御された局在化した分布（例えば高い音圧（典型的には非破壊診断イメージング法に一般的に用いられるものよりも高い）での音波破裂によって）を伴うものであり得る。
この今後ロールされた分布は、例えば、血餅の治療（音響血栓溶解法としても知られる技術）のために、所望により適当な治療剤の局在化した放出と組み合わせて、用いることができる。あるいは、この治療的イメージングには、微小胞の局在化した破裂によって誘導される細胞レベルでの膜貫通浸透性の結果として、治療薬剤の細胞へのデリバリーを含んでいてもよい。この技術を、例えば、遺伝物質の細胞への効果的な送達に用いることができ、所望により、薬剤を遺伝物質と組み合わせて局地的に送達し、患者の複合的な医薬／遺伝子治療を可能にすることができる（例えば、癌治療の場合）。
【０１７６】
用語「治療薬剤」の意味には、任意の治療的適用において（例えば患者における疾患の処置のための方法において）、用いることができる任意の物質、組成物または粒子、ならびにインビトロおよび／またはインビボで生物学的効果を示すまたはその原因となることができる任意の物質が含まれる。従って、治療薬剤には、処置（診断、予防、軽減、または鎮痛治癒を含む）において用いることが可能な任意の化合物または材料が含まれる。治療薬剤の例としては、例えば、医薬物（drug）、医薬（pharmaceuticals）、生物活性剤、細胞毒性物質、化学療法剤、放射線治療薬、タンパク質、天然または合成ペプチド（オリゴペプチドおよびポリペプチドを含む）、ビタミン類、ステロイドおよび遺伝物質（ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドおよびプラスミド等の本明細書において記載したものが挙げられる。好ましい態様では、治療薬剤は、癌、血栓性の疾患または血管新生疾患の治療に有用な薬物である。
【０１７７】
光学イメージング、音ルミネセンスまたは光音響イメージング
さらなる態様では、本発明のフィブリン−結合部分は、光学的、音発光性（sonolumiscent）または光音響標識とコンジュゲート（直接またはリンカーを介して）することができる。好ましい態様では、本発明のフィブリン結合部分は、光学的に活性なイメージング部分とコンジュゲート（直接またはリンカーを介して）する。光学活性なイメージング部分の適切な例としては、例えば有機発色団またはフルオロフォアなどの拡張された非局在化環系を有し、４００−１５００ｎｍの範囲内に最大吸収または放出を有する光学色素；例えばフルオレセインなどの蛍光分子；リン光分子；ＵＶスペクトルに吸収される分子；量子ドット；または近もしくは遠赤外線を吸収可能な分子が挙げられる。好ましい光学活性な部分は５−カルボキシフルオレセイン（ＣＦ５）である。
【０１７８】
本発明によれば、数多くの光学的パラメーターを用いて、光学的に標識されたフィブリン結合部分で患者の注射後のインビボ光イメージングによるフィブリンの局在を測定することができる。イメージの製造において検出されるべき光学的パラメータとしては、例えば透過電磁波、吸収、蛍光またはリン光放射、光反射、振幅または最大吸光度の変化および弾性散乱放射線を挙げることができる。例えば生物学的組織は、６５０−１０００ｎｍの範囲の近赤外（ＮＩＲ）波長における光に比較的半透明である。ＮＩＲ放射は数センチメートルまで組織を貫通することができ、インビボでフィブリンの光学的イメージングのために本発明のフィブリン結合部分の使用が可能になる。
【０１７９】
近赤外色素としては、例えばＣｙ５．５、ＩＲＤｙｅ８００、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）、テトラスルホン酸置換インドシアニングリーン（ＴＳ−ＩＣＧ）などのインドシアニングリーン誘導体およびその組合せなどを挙げることができる。
【０１８０】
フィブリン 結合部分を光標識（例えば、有機発色団または蛍光を含み、拡張された非局在化環系および、４００−１５００ｎｍの範囲内に最大吸収または放出を有する光学色素）とコンジュゲーションすることができる。あるいは、フィブリン結合部分を生物発光分子で誘導体化することができる。光標識の最大吸収の好ましい範囲は６００〜１０００ｎｍであり、ヘモグロビンからのシグナルとの干渉を最小限にする。好ましい光吸収標識は、例えば＞１０5ｃｍ-1Ｍ-1の高い分子吸収性を有し、蛍光光学色素は高量子収率を有するであろう。光学色素の例としては、本明細書において参照するＷＯ９８／１８４９７、ＷＯ９８／１８４９６、ＷＯ９８／１８４９５、ＷＯ９８／１８４９８、ＷＯ９８／５３８５７、ＷＯ９６／１７６２８、ＷＯ９７／１８８４１、ＷＯ９６／２３５２４、ＷＯ９８／４７５３８に記載のものが挙げられるがこれに限定されない。光標識は、これまで記載されているように、フィブリン結合部分に直接共有結合させるか、またはリンカーを介してフィブリン結合部分に連結することができる。
【０１８１】
光学的に標識された化合物を注射した後、患者を、その物質に用いた光標識の適当な波長範囲の１以上の光源でスキャンする（例えば、レーザー）。用いる光は、単色でも多色でもよく、連続的でもパルスでもよい。透過、散乱または反射光を、１または複数の波長に調整した光検出器により検出して、患者の血栓の存在位置を決定する。光学的パラメーターの変化を所定の時間モニターして血栓の部位での光学的に標識された試薬の蓄積を検出することができる。標準的なイメージングプロセシングおよび検出機器を本発明の光学イメージング試薬と組み合わせて用いることができる。
【０１８２】
上記の光学造影剤はまた、光学的に標識された造影剤により行われる音響光学または音響ルミネセンスイメージングに用いることもできる（米国特許第５,１７１,２９８号、ＷＯ９８／５７６６６、およびそれらにおいて引用されている文献を参照）。音響光学イメージングにおいては、超音波を対象に照射し、透過光、発光または反射光の光学的パラメーターに影響を与える。音響ルミネセンスイメージングでは、適用した超音波は実際に検出される光を生じる。そのような技術を用いる適当なイメージング方法は、ＷＯ９８／５７６６６に記載されている。
【０１８３】
さらに、本発明のフィブリン結合部分を、光イメージングレポーターと光イメージングクエンチャーの両方に連結した酵素基質に結合することができる。フィブリン結合部分は、目的のフィブリンを有する組織（例えな腫瘍）への構築物の局在化に供し、酵素が酵素の基質を分解し、光イメージングクエンチャーを放出し、目的のフィブリンを有する組織の光イメージングを可能にする。
【０１８４】
核イメージング（放射性核種イメージング）および放射線治療
フィブリン結合部分はまた、シンチグラフィー、ＳＰＥＣＴ、またはＰＥＴイメージングに適当な放射性核種レポーターおよび／または放射線治療に適当な放射性核種を用いて放射性核種とコンジュゲートを形成することができる。フィブリン結合部分が診断イメージングに有用な放射性核種のためのキレート化剤と放射線治療に有用なキレート化剤の両方にコンジュゲートしている構築物は、本発明の範囲に含まれる。
【０１８５】
本発明の好ましい放射性核種としては、例えば99mＴｃ、51Ｃｒ、67Ｇａ、68Ｇａ、47Ｓｃ、167Ｔｍ、141Ｃｅ、111Ｉｎ、113Ｉｎ、168Ｙｂ、175Ｙｂ、140Ｌａ、90Ｙ、88Ｙ、153Ｓｍ、166Ｈｏ、165Ｄｙ、166Ｄｙ、61Ｃｕ、62Ｃｕ、64Ｃｕ、67Ｃｕ、97Ｒｕ、103Ｒｕ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、203Ｐｂ、211Ｂｉ、212Ｂｉ、213Ｂｉ、214Ｂｉ、105Ｒｈ、109Ｐｄ、１１７ｍＳｎ、149Ｐｍ、161Ｔｂ、177Ｌｕ、198Ａｕ、111Ａｇ、199Ａｕ、51Ｍｎ、52mＭｎ、52Ｆｅ、60Ｃｕ、72Ａｓ、94mＴｃまたは110Ｉｎ、142Ｐｒ、159Ｇｄが挙げられる。
【０１８６】
ＰＥＴ剤としての使用に関して、ペプチドを様々な陽電子放出金属イオン（例えば、51Ｍｎ、52Ｆｅ、60Ｃｕ、68Ｇａ、72Ａ、94mＴｃ、または110Ｉｎ）のいずれかと錯体を形成させる。本発明の結合部分はまた、放射性核種（例えば、18Ｆ、124Ｉ、125Ｉ、131Ｉ、123Ｉ、77Ｂｒ、および76Ｂｒ）を用いてハロゲン化によって標識することもできる。シンチグラフィーまたは放射線治療に好ましい金属放射性核種としては、99mＴｃ、51Ｃｒ、．67Ｇａ、68Ｇａ、47Ｓｃ、51Ｃｒ、167Ｔｍ、141Ｃｅ、111Ｉｎ、168Ｙｂ、175Ｙｂ、140Ｌａ、90Ｙ、88Ｙ、153Ｓｍ、166Ｈｏ、165Ｄｙ、166Ｄｙ、61Ｃｕ、62Ｃｕ、64Ｃｕ、67Ｃｕ、97Ｒｕ、103Ｒｕ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、203Ｐｂ、211Ｂｉ、212Ｂｉ、213Ｂｉ、214Ｂｉ、105Ｒｈ、109Ｐｄ、117mＳｎ、149Ｐｍ、161Ｔｂ、177Ｌｕ、198Ａｕおよび199Ａｕが挙げられる。金属の選択は、所望の治療または診断的適用に基づいて決定する。例えば、診断目的に好ましい放射性核種としては、64Ｃｕ、67Ｇａ、68Ｇａ、99mＴｃ、および111Ｉｎが挙げられる。治療目的に関して好ましい放射性核種としては、64Ｃｕ、90Ｙ、105Ｒｈ、111Ｉｎ、117ｍＳｎ、149Ｐｍ、153Ｓｍ、161Ｔｂ、166Ｄｙ、166Ｈｏ、175Ｙｂ、177Ｌｕ、186-188Ｒｅ、および199Ａｕが挙げられる。99mＴｃは低コスト、入手可能性、イメージング特性および高特異的活性のために特に診断用途に好ましい。特に、99mＴｃの核および放射性特性によりこの同位体は理想的なシンチグラフイメージング剤となる。実際、この同位体は１４０ｋｅＶの単光子エネルギーおよび約６時間の放射性半減期を有しており、99Ｍｏ−99mＴｃジェネレータから容易に入手可能である。
【０１８７】
金属放射性核種はキレート化剤によってキレートを形成することができる。適当なキレート化剤としては、上記のもの、ならびに、例えば、直鎖状、大環状、テルピリジン、およびＮ3、Ｎ2Ｓ2、またはＮ4キレート化剤（例えば、U.S. Pat. No. 5,367,080, U.S. Pat. No. 5,364,613, U.S. Pat. No. 5,021,556, U.S. Pat. No. 5,075,099,およびU.S. Pat. No. 5,886,142に開示のリガンド）および限定されないが、ＨＹＮＩＣ、およびビスアミノビスチオール（ＢＡＴ）キレート化剤（US 5,720,934も参照）等の他のキレート化剤が挙げられる。例えば、Ｎ4キレート化剤は、U.S. Pat. No. 6,143,274; U.S. Pat. No. 6,093,382; U.S. Pat. No. 5,608,110; U.S. Pat. No. 5,665,329; U.S. Pat. No. 5,656,254;およびU.S. Pat. No. 5,688,487に記載されている。ある特定の N3S キレート化剤は、ＰＣＴ／ＣＡ９４／００３９５、ＰＣＴ／ＣＡ９４／００４７９、ＰＣＴ／ＣＡ９５／００２４９およびU.S. Pat. No. 5,662,885; U.S. Pat. No. 5,976,495;およびU.S. Pat. No. 5,780,006に記載されている。また、キレート化剤としては、キレート化リガンドメルカプト−アセチル−アセチル−グリシル−グリシン（ＭＡＧ３）の誘導体もまた挙げられ、Ｎ3、およびＮ2Ｓ2系（例えば、ＭＡＭＡ（モノアミドモノアミンジチオール）、ＤＡＤＳ（Ｎ2Ｓジアミンジチオール）、ＣＯＤＡＤＳなどを含む。これらのリガンド系および他の種々のものは文献（Liu and Edwards, Chem Rev, 1999,. 99, 2235-2268）およびその参考文献に記載されている。
【０１８８】
キレーターとしてはまた、四座配位にて金属に供与されないリガンド原子を含む錯体も挙げることができる。これらとしては、例えばUS 5,183,653、US 5,387,409およびUS 5,118,797に記載されるテクネチウムおよびレニウムジオキシムのボロン酸付加体が挙げられる。
【０１８９】
別の具体的態様にて、本発明のフィブリン結合ポリペプチドのジスルフィド結合は、99ｍＴｃなどの放射性核種のキレート化のための２のリガンドとして用いられる。このように、ペプチドループはＴｃの導入（ペプチド−Ｓ−Ｓ−ペプチドがペプチド−Ｓ−Ｔｃ−Ｓ−ペプチドに変化する）により拡張される。これは、生物学的活性を維持しつつ、文献における他のジスルフィド含有ペプチドにも用いられている（Chen et al., J. Nucl. Med., 42:1847-1855 (2001))。Ｔｃの他のキレート化基は、骨格のアミド窒素、別のシスチンアミノ酸またはアミノ酸の修飾により供給され得る。
【０１９０】
特に好ましい金属キレート剤としては、以下の、式１、２、および３（111Ｉｎおよびランタニド（例えば、常磁性Ｇｄ3+）および放射性ランタニド（例えば177Ｌｕ、90Ｙ、153Ｓｍ、および166Ｈｏ））および式４、５、および６（放射性99mＴｃ、186Ｒｅ、および188Ｒｅ）に示すものが挙げられる。
【０１９１】
これらのおよびその他の金属キレート化基は、その全体が本明細書の一部を構成する、米国特許第６,０９３,３８２号および第５,６０８,１１０号に記載されている。さらに、式３のキレート化基は、例えば、米国特許第６,１４３,２７４号に、式５のキレート化基は、例えば、米国特許第５,６２７,２８６号および第６,０９３,３８２号に、および式６のキレート化基は、例えば、米国特許第５,６６２,８８５号；第５,７８０,００６号；および第５,９７６,４９５号に記載されている。
【化９】
2010512400.tif 000022
【化１０】
2010512400.tif 000023
【０１９２】
上式１および２にて、Ｒはアルキル、好ましくはメチルである。上式５において、ＸはＣＨ2またはＯのいずれかであり、ＹはＣ1−Ｃ10分枝鎖または非分枝鎖アルキル；Ｙは、アリール、アリールオキシ、アリールアミノ、アリールアミノアシル；Ｙは、アリールアルキル（ここに、アリール基に結合しているアルキル基は、Ｃ1−Ｃ10分枝鎖もしくは非分枝鎖アルキル基、Ｃ1−Ｃ10分枝鎖もしくは非分枝鎖ヒドロキシアルキル基もしくはポリヒドロキシアルキル基またはポリアルコキシアルキルもしくはポリヒドロキシ−ポリアルコキシアルキル基である）であり、ＪはＣ（＝Ｏ）−、ＯＣ（＝Ｏ）−、ＳＯ2−、ＮＣ（＝Ｏ）−、ＮＣ（＝Ｓ）−、Ｎ（Ｙ）、ＮＣ（＝ＮＣＨ3）−、ＮＣ（＝ＮＨ）−、Ｎ＝Ｎ−、合成もしくは天然アミノ酸由来のホモポリアミドまたはヘテロポリアミンであり、ｎはすべて１〜１００である。これらの構造の他の置換基は、米国特許番号６,０９３,３８２に記載されている。上述の特許、出願および引用文献のそれぞれの開示は、本明細書にそのまま引用される。
【０１９３】
キレート化剤は、上記のように、フィブリン結合部分に直接共有結合により連結するか、またはリンカーを介してフィブリン結合ポリペプチドに結合した後、選択した放射性金属 (WO 98/52618, U.S. Pat. No. 5,879,658,およびU.S. Pat. No. 5,849,261を参照)で直接標識することができる。
【０１９４】
特定の放射線治療の適用に使用する適当な核種の選択は以下を含む多くの因子に依存する：
ａ．物理的半減期−これは、放射性金属およびコンジュゲートから構成される放射線治療構築物の合成および精製と、注射の前の有意の放射能減衰なしに、注射部位への該構築物の送達が可能なように十分長いものでなければならない。好ましくは、放射性核種の物理的半減期は約０．５〜８日である。
ｂ．放射性核種からの放射のエネルギー−放射体（例えばアルファ線放射体、ベータ線放射体およびAuger電子放射体である放射性核種は、短い距離でエネルギーをため込む高エネルギーの粒子を放出し、それにより高度に局在化された損傷を与えるので特に有用である。これらの同位体からのベータ線照射体からのエネルギーは５〜約１５０細胞直径内でため込まれるので、ベータ線を発する放射性核種は特に好ましい。これらの核種から調製される放射線治療薬は、それらの存在部位に比較的近い疾患を有する細胞を死滅させることができるが、長い距離を移動して骨髄等の近くの正常な組織を破壊することはできない。
ｃ．比活性（即ち、放射性核種の質量あたりの放射能）−高い比活性を有する放射性核種（例えばジェネレーターで発生した９０−Ｙ、１１１−Ｉｎ、１７７−Ｌｕ）は特に好ましい。放射性核種の比活性は、その製造方法、それを製造するために用いる特定の標的、および問題となる同位体の特性によって決まる。
【０１９５】
ランタニドおよびランタノイドの多くは、それらがベータ線を放射するとき、それらを放射線治療薬剤として使用するのに適当にする核特性を有するラジオアイソトープを含んでいる。これらのいくつかを以下の表に記載する：
【表１３】
2010512400.tif 000024
ここで、ＰＭはプロメチウム、ＳＭはサマリウム、ＤＹはジスプロシウム、ＨＯはホルミウム、Ｙｂはイッテルビウム、ＬＵはルテチウム、Ｙはイットリウム、ＩＮはインジウムである。
【０１９６】
上記のランタニドの代替としての放射性レニウム同位体の使用は、当分野において周知であり本発明によって包含される。
【０１９７】
特に、186／188Ｒｅ同位体は、放射性医薬治療における数多く適用を有し、放射性医薬において特に興味深いものであることが明らかとなった。
【０１９８】
従って、本発明の好ましい態様では、本発明は、本発明のフィブリン結合部分が、イオン化放射線（例えばベータ粒子、アルファ粒子およびAugerまたはCoster-Kroning電子）を放出する適切にキレート化された放射性核種にコンジュゲートしている新規放射線治療剤に関する。より好ましくは、本発明のフィブリン−結合部分は、90Ｙ、111Ｉｎ、149Ｐｍ、153Ｓｍ、166Ｄｙ、166Ｈｏ、175Ｙｂおよび177Ｌｕから選択されるランタニドまたはランタノイド放射性核種で標識される。適切なキレート化リガンドの例は、図６ａ〜６ｃのものから選択することができる。
【０１９９】
治療用放射性核種で標識された本発明の化合物は、癌等の疾患の治療若しくは本発明の放射線治療薬がアジュバント化学療法と組み合わせて用いられる複合的治療(例えば、本明細書に開示の１または他の治療薬剤）における第１の治療として用いる放射性医薬か、マッチドペア（matched pair）治療薬の治療的部分として適用し得る。
【０２００】
実際、本発明の放射線治療剤のペプチド部分は、病的なフィブリン沈着（例えば、血栓症/凝血塊、動脈硬化斑および多発性硬化症に関与する炎症による損傷、特に充実性腫瘍）にキレート化された放射性同位体を局在化させることが可能である。細胞毒性量の放射性同位元素の局在化によって放射された電離放射線によって病的な組織の細胞死を引き起こすことが可能である。
【０２０１】
放射性 テクネチウムの錯体は、診断イメージングに特に有用であり、放射性レニウムの錯体は、放射線治療に特に有用である。放射性 テクネチウムの本発明の試薬との錯体化において、テクネチウム錯体は、好ましくはTc-99m 過テクネチウム酸の塩を還元剤の存在下で試薬と反応させる。好ましい還元剤は、亜ジチオン酸塩、スズおよび第鉄イオン; 最も好ましい還元剤は塩化スズである。そのような 錯体の調製手段は、標識される本発明の試薬の予め決定された量、および本発明の試薬をTc-99mで標識するための十分量の還元剤を含む密閉されたバイアルを含んでなるキットの形態で便利に提供される。
【０２０２】
あるいは、錯体は、テクネチウムとトランスファーリガンドとして知られた別の化合物との予め形成されたレービル錯体（labile complex）を有する適当なキレート化剤でコンジュゲートした本発明のペプチドを反応させることによって形成することができる。この方法は、リガンド交換として知られており当分野において周知である。レービル錯体は、そのようなトランスファーリガンドを、例えば酒石酸塩、クエン酸塩、グルコン酸塩またはマンニトールとして用いて形成することができる。本発明に有用なＴｃ−９９ｍ過テクネチウム酸塩には、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩）またはアンモニウム塩または低級アルキルアンモニウム塩が含まれる。
【０２０３】
金属が放射性レニウムである本発明の錯体の調製は、＋５または＋７酸化状態のレニウム出発物質を用いて行うことができる。レニウムがＲｅ（ＶＩＩ）状態である化合物の例としては、ＮＨ4ＲｅＯ4またはＫＲｅＯ4が挙げられる。Ｒｅ（Ｖ）は、例えば、［ＲｅＯＣ4］（ＮＢｕ4）、［ＲｅＯＣｌ4］（ＡｓＰｈ４）、ＲｅＯＣｌ3（ＰＰｈ3）2およびＲｅＯ2（ピリジン）4+（ここで、Ｐｈはフェニル、ＢＵはｎ−ブチルである）として入手可能である。レニウム錯体を形成することが可能なその他のレニウム試薬も用いることができる。
【０２０４】
本発明により提供される放射性標識シンチグラフィックイメージングは、適切な量の放射線を有して提供される。99mＴｃ放射性錯体を形成するとき、約０．０１ｍＣｉ〜１００ｍＣｉ／ｍＬの濃度にて放射線を含む溶液中にて放射性錯体を形成することが一般に好ましい。
【０２０５】
一般に投与される単位線量は、約０．０１ｍＣｉ〜約１００ｍＣｉ、好ましくは１ｍＣｉ〜２０ｍＣｉの放射線を有する。単位投与にて注射される溶液は、約０．０１ｍＬ〜約１０ｍＬである。
【０２０６】
本発明の放射性核種標識されたフィブリン結合造影剤の典型的な用量は、成人のヒトに１０−２０ｍＣｉをもたらす。フィブリン特異的放射性核種造影剤を患者へ注入した後、造影剤に取り込まれた核種のガンマ線エネルギーについてキャリブレーションしたガンマカメラを用いて試薬の取込の領域をイメージングし、その部位に存在する放射能量を測定する。インビボでの部位のイメージングは、ほんの数分で起こる。しかし、所望であれば、放射性標識ペプチドを患者へ注入した後、イメージングを数時間またはさらに長い時間起こすことができる。多くの場合、シンチフォトの撮影を可能にするために０．１時間以内に投与量の十分量がイメージングされる領域に蓄積する。
【０２０７】
本発明の化合物のための適切な投与スケジュールは当業者に知られている。化合物を、単回または複数回の静脈内または腹腔内注射を含むがこれに限定されない多くの方法を用いて投与することができる。本化合物は、標的とするフィブリン含有組織の損傷または除去を引き起こすのに十分であるが、実質的な損傷を非標的（正常組織）にもたらすほどではない放射能の量を用いた単回または複数回のIVまたはIP注射を含むが、これらに限定されない、多くの方法を用いて投与することができる。放射線治療に必要な量および投与量はまた、使用した同位体のエネルギーおよび半減期に依存して、取込の程度および体内からの試薬の排出および腫瘍量に応じて、異なる構築物で異なる。一般に、成人のヒトに対する投与量は、１回用量で約３０〜５０ｍＣｉから蓄積線量で約３キュリーまでである。
【０２０８】
本発明の放射線治療組成物は生理学的に許容される緩衝剤を含むことができ、注射前の化合物の放射線分解損傷を防ぐための放射線安定剤を必要とすることができる。放射線安定剤は当業者に知られており、例えばパラ-アミノ安息香酸, アスコルビン酸, ゲンチシン酸などを含むことができる。
【０２０９】
本発明の診断薬または治療薬を製造するために必要なすべての構成成分を含む単一のまたは複数のバイアルキットは、本発明の不可欠な部分である。
【０２１０】
単一バイアルキットは好ましくは、キレート化リガンド、スズ塩源または他の医薬的に許容される還元剤を含み、必要であれば、製薬的に許容される酸または塩基で適切に緩衝し、約３〜約９の値にｐＨを調節する。用いられる還元剤の量およびタイプは、主に形成される交換錯体の性質に依存するだろう。適切な条件は当業者によく知られている。好ましくは、キット内容物は凍結乾燥形態である。そのような単一バイアルキットは適宜不安定リガンドまたは交換リガンド、例えばグルコヘプトネート、グルコネート、マンニトール、リンゴ酸塩、クエン酸塩または酒石酸塩などを含んでいてもよく、最終生成物の放射性化学純度および安定性を改善するために供されるジエチレントリアミン四酢酸（ＤＰＴＡ）、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）またはα−、β−もしくはγ−シクロデキストリンなどの反応改変体も含むことができる。キットはまた、凍結乾燥工程に役立つよう設計される安定剤、マンニトールなどの膨張剤、および当業者に知られる他の添加剤も含むことができる。
【０２１１】
マルチバイアルキットは、好ましくは、同じ一般的成分を含むが、放射性医薬品を再構成する際に二つ以上のバイアルを用いる。例えば一つのバイアルは、過テクネチウム酸塩の添加における不安定なＴｃ（Ｖ）錯体を形成させるために必要なすべての成分（例えばスズ源または他の還元剤）を含むことができる。過テクネチウム酸塩をこのバイアルに加え、適当な時間放置した後、リガンド、ならびにｐＨを最良の値に調節するために適当な緩衝液を含む第二バイアルにこのバイアルの内容物を加える。約５〜６０分の反応時間後、本発明の錯体が形成される。このマルチバイアルキットの両方のバイアルの内容物は凍結乾燥されていることが好都合である。上記のように、反応修飾剤、交換リガンド、安定剤、充填剤などは、いずれかのまたは両方のバイアルに存在することができる。
【０２１２】
治療的適用
本発明の別の態様では、本発明のフィブリン結合部分を治療薬剤（治療的に活性な薬剤または部分とも称される）にコンジュゲートする。
【０２１３】
特に記載しない限り「治療的」なる用語は、与えられた状態の症状の少なくとも部分的な軽減を包含する。治療的に活性な薬剤は、有用となる症状の完全な軽減をもたらさなければならないというものではない。例えば、個人の治療は、腫瘍または罹患部位のサイズまたは血餅の減少、またはさらに腫瘍のサイズまたは罹患部位の増大の阻止ならびに他の症状の部分的軽減をもたらす。あるいは、治療はまた、目的とする領域における血管の数の減少またはそれらの増加の阻止をもたらすことができる。治療はまた、主な腫瘍の転移性の増殖の数またはサイズを阻止または減少することができる。
【０２１４】
本発明の治療薬剤の適当な例としては、抗凝固血栓溶解剤または凝血塊の溶解が可能なフィブリン溶解剤が挙げられる。抗血管形成剤、 細胞毒性物質（癌細胞を選択的に殺傷するおよび／または増殖を阻害する化学療法剤または殺腫瘍剤を含む）、特に放射線治療薬が挙げられる。
【０２１５】
本発明のある一態様では、治療薬剤は血栓溶解剤またはフィブリン溶解剤である。本発明のフィブリン結合ペプチドは、フィブリンに対する親和性とフィブリン塊または病的な血管形成活性の部位での滞留時間を改善することにより、血栓溶解剤および抗血管形成剤の活性を改善するために用いることができる。本発明のこの態様では、本発明のフィブリン結合ポリペプチドと血栓溶解剤をコンジュゲートしたハイブリッド血栓溶解剤が提供される。同様に、本発明のフィブリン結合ポリペプチドを抗血管形成剤とコンジュゲートすることにより抗血管形成剤が提供される。コンジュゲートの血栓溶解活性または抗血管新生活性が問題の部位にてより局在化し集中されるように、コンジュゲートのフィブリン結合ポリペプチド部分は、血栓溶解剤をフィブリン塊の部位または血管新生部位に「誘導」させた。
【０２１６】
そのようなコンジュゲートは、血栓を伴う疾患、特にヒトを含む哺乳類における急性心筋梗塞、卒中および肺塞栓の治療に特に有用であり、その方法は、血栓溶解剤とコンジュゲートした本発明のフィブリン結合部分の有効量を必要な哺乳類に投与することを含んでなる。本発明はまた、ヒトを含む哺乳類における血栓を伴う疾患の処置のための医薬の製造におけるそのようなコンジュゲートの使用を提供する。本発明のこの態様において使用するための適当な血栓溶解剤としては、フィブリン溶解 酵素（プラスミノーゲンアクチベーターを含む）が挙げられる。用語「プラスミノーゲンアクチベーター」には、ストレプトキナーゼ, ヒト 組織プラスミノーゲン活性化因子 (tPA)およびウロキナーゼ (一本鎖または二本鎖型の両方）が含まれる。そのような 酵素は、天然の供給源または組織または組換えによる製造により得られる。その他の適当な血栓溶解剤には、異なる２鎖プロテアーゼの鎖に連結した２鎖プロテアーゼの１つの鎖を含んでなり、ハイブリッドタンパク質の少なくとも１つの鎖がフィブリン溶解活性なプロテアーゼに由来するフィブリン溶解活性なハイブリッドタンパク質 (例えば、EP-A-155 387を参照)血栓溶解タンパク質コンジュゲート（例えば、EP-A-152 736を参照）（例えば、可逆的にブロックされたプラスミンに連結したウロキナーゼ）；フィブリン溶解活性に与かる酵素の触媒部位が、可逆的な連結基を介してそれに結合したヒトタンパク質によってブロックされている血栓溶解酵素の誘導体（例えば、ヒトプラスミンの活性中心に可逆的に連結したウロキナーゼ）；天然のプラスミノーゲンアクチベーターの突然変異体を含む遺伝子操作による誘導体；ハイブリッド分子（例えば、EP-A-297 882を参照）；インビボで可逆的にブロックされたフィブリン溶解酵素（ストレプトキナーゼとプラスミノーゲンのバイナリーコンプレックス）；最も好ましくは、分子内結合開裂を有しないp-アニソイルストレプトキナーゼ/プラスミノーゲン錯体 (U.S. Pat. No. 4,808,405に記載のアニストレプラーゼ); などが挙げられる。
【０２１７】
血栓溶解剤およびフィブリン結合部分は、公知の方法で、上記のリンカーと同じタイプのものを用いて連結または融合することができる。好ましいリンカーは、置換されたまたは置換されていない、アルキル鎖、 アミノ酸鎖、 ポリエチレングリコール鎖、および当分野で公知の他の単純ポリマー性リンカーである。より好ましくは、血栓溶解剤自体が、コードしているDNA配列が公知であるタンパク質である場合は、組換えDNA技術を用いて、血栓溶解剤タンパク質およびフィブリン結合ポリペプチドを同じ合成遺伝子から同時発現させることができる。フィブリン結合ポリペプチドをコードする配列は、血栓溶解剤タンパク質の配列とインフレームで融合して、ペプチドが血栓溶解タンパク質のアミノ末端またはカルボキシ末端で、またはそのような配置によって血栓溶解タンパクまたはフィブリン結合ポリペプチドの要求される生物学的機能を破壊しないと決定されれば末端間の場所で発現するようにできる。
【０２１８】
本発明の治療的に活性な部分の適切な例としては、血栓溶解可能な抗凝固-血栓溶解剤または線維素溶解薬、血管新生阻害剤、がん細胞の増殖を選択的に殺傷しおよび／または阻害するための化学療法剤または殺腫瘍剤などの細胞毒性薬、特に放射線治療剤が挙げられる。
【０２１９】
本発明のある具体的態様にて、Tは血栓溶解剤または線維素溶解薬である。
線維素溶解薬の適切な例は、例えばプラスミノーゲン活性化剤、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼおよびアニストレプラーゼなどの線維素溶解酵素を含む。コンジュゲートのそのような部位への親和性を改善する。コンジュゲートの血栓溶解活性または抗血管新生活性が問題の部位にてより局在化し集中されるように、本発明の治療的に有効な化合物のフィブリン結合ポリペプチド部分は、血栓溶解剤をフィブリン塊の部位または血管新生部位に「誘導」させた。
従って、Tが血栓溶解剤または線維素溶解剤である式(I)の化合物は、ヒトなどの哺乳動物における血栓関連疾患、特に急性心筋梗塞、卒中および肺塞栓症の治療に特に有用であろう。
【０２２０】
本発明化合物は、脈管内（例えば静脈内、動脈内、冠動脈内、心室内投与など）、髄腔内、腹腔内、リンパ管内および腔内投与に用いることができるため、広範囲の用途を有する。さらに、それらは、経口または非経口投与、それゆえ具体的には胃腸管のイメージングに適する。
その好ましい具体的態様にて、本発明は、有効成分として少なくとも一つの式(I)の化合物（その医薬的に許容される塩を含む）を1以上の医薬的に許容される担体または賦形剤とともに含む、医薬組成物に関する。
【０２２１】
投与の所望の経路のための組成物は、当分野にてよく知られる任意の方法により製造することができる。投与量、剤形、投与形態、組成物などの詳細は、参照により本明細書に組み込まれる文献（Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Alfonso R. Gennaro, ed. (Mack Publishing Co., Easton, PA 1990)）などの標準的医薬文献にてさらに記載される。
例えば非経口投与について、組成物は、好ましくはpHが6.0〜8.5の範囲であることができる、滅菌水溶液または懸濁液として製剤化することができる。
【０２２２】
これらの水溶液または懸濁液は、0.002〜1.0 Mの範囲の濃度にて投与することができる。これらの製剤は、そのまま凍結乾燥され供されて使用前に再構成することができる。
胃腸管用途または体腔内注射について、これらの薬剤は、例えば粘性を制御するために適宜適切な賦形剤を含んでもよい溶液または懸濁液として製剤化することができる。
経口投与について、薬剤は医薬技術にて通常用いられる製造方法により、または胃の酸性pHに対してさらなる保護を得るためにコーティング製剤として製剤化することができ、従って特に胃液の典型的なpH値にて起こるキレート金属イオンの放出を予防することができる。
例えば甘味料および／または着香料などの他の賦形剤もまた、医薬製剤の既知の技術により加えることができる。
【０２２３】
本発明のある具体的態様にて、Tは血栓溶解剤または線維素溶解薬である。
線維素溶解薬の適切な例は、例えばプラスミノーゲン活性化剤、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼおよびアニストレプラーゼなどの線維素溶解酵素を含む。コンジュゲートのそのような部位への親和性を改善する。コンジュゲートの血栓溶解活性または抗血管新生活性が問題の部位にてより局在化し集中されるように、本発明の治療的に有効な化合物のフィブリン結合ポリペプチド部分は、血栓溶解剤をフィブリン塊の部位または血管新生部位に「誘導」させた。
従って、Tが血栓溶解剤または線維素溶解剤である式(I)の化合物は、ヒトなどの哺乳動物における血栓関連疾患、特に急性心筋梗塞、卒中および肺塞栓症の治療に特に有用であろう。
【０２２４】
本発明の別の具体的態様にて、Tは化学療法剤または殺腫瘍剤である。
腫瘍標的治療剤の適切な例は、例えば白金化合物（例えばスピロプラチン、シスプラチンおよびカルボプラチン）、メトトレキセート、アドリアマイシン、マイトマイシン、アンサミトシン、ブレオマイシン、シトシン、アラビノシド、アラビノシルアデニン、メルカプトポリリジン、ビンクリスチン、ブスルファン、クロラムブシル、メルファラン（例えばPAM、L-PAMまたはフェニルアラニンマスタード）、メルカプトプリン、ミトタン、塩酸プロカルバジン、ダクチノマイシン（アクチノマイシンD）、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、タキソール、マイトマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、アミノグルテチミド、エストラムスチンリン酸ナトリウム、フルタミド、酢酸ロイプロリド、酢酸メゲストロール、クエン酸タモキシフェン、テストラクトン、トリロスタン、アムサクリン（m-AMSA）、アスパラギナーゼ（L-アスパラギナーゼ）、エルウィニア（Erwina）アスパラギナーゼ、エトポシド（VP-16)、インターフェロンcx-2a、インターフェロンcx-2b、テニポシド（VM-26）、硫酸ビンブラスチン（VLB）、硫酸ビンクリスチンおよび硫酸ブレオマイシンなどの抗腫瘍剤を含む。
【０２２５】
そのさらなる具体的態様にて、本発明は、インビトロおよびインビボの両方における生存哺乳類患者、好ましくはヒト患者由来の細胞、体液および生物組織などの病理学的系ならびにフィブリン沈着が起こる腫瘍またはがん組織、炎症などのヒト体器官、領域または組織の診断イメージングに用いられる診断用製剤の製造のため、ならびに病変の治療の進行および結果をモニターするためのTが診断的に活性な部分である式(I)の化合物の使用に関する。
【０２２６】
本発明のこの態様において用いるための適当な治療薬としては以下のものが挙げられるがこれに限定されない：抗新生物剤（例えば、白金化合物（例えば、スピロプラチン、シスプラチン、およびカルボプラチン）、メトトレキセート、アドリアマイシン、マイトマイシン、アンサミトシン、ブレオマイシン、シトシン、アラビノシド、アラビノシルアデニン、メルカプトポリリジン、ビンクリスチン、ブスルファン、クロラムブチル、メルファラン（例えば、ＰＡＭ、Ｌ−ＰＡＭ、またはフェニルアラニンマスタード）、メルカプトプリン、ミトタン、プロカルバジンハイドロクロライド、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシンハイドロクロライド、ドキソルビシンハイドロクロライド、タキソール、マイトマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、アミノグルテチミド、エストラムスチンリン酸塩ナトリウム、フルタミド、酢酸リュープロレリン、酢酸メゲストロール、タモキシフェンクエン酸塩、テストラクトン、トリロスタン、アムサクリン（ｍ−ＡＭＳＡ）、アパラギナーゼ（Ｌ−アパラギナーゼ）、Erwina アパラギナーゼ、エトポシド（ＶＰ−１６）、インターフェロンｃｘ−２ａ、インターフェロンｃｘ−２ｂ、テニポシド（ＶＭ−２６、ビンブラスチン硫酸塩（ＶＬＢ）、ビンクリスチン硫酸塩、ブレオマイシン硫酸塩、アドリアマイシン、およびアラビノシル；抗血管形成剤（例えば、血管新生および／または腫瘍成長に重要なシグナル伝達分子に対する活性を有するチロシンキナーゼ阻害剤（例えば、SU5416およびSU6668 (Sugen/Pharmacia & Upjohn)、エンドスタチン（ＥｎｔｒｅＭｅｄ）、アンジオスタチン（ＥｎｔｒｅＭｅｄ）、コンブレスタチン（ＯｘＩｇＥｎｅ）、シクロスポリン、５−フルオロウラシル、ビンブラスチン、ドキソルビシン、パクリタキセル、ダウノルビシン、抗毒素；凝固因子；抗ウイルス薬（例えば、アシクロビル、アマンタジンアジドチミジン（ＡＺＴまたはジドブジン）、リバビリンおよびビダラビン一水和物（アデニンアラヒノシド、ａｒａ−Ａ）；抗生物質、抗マラリア薬、抗原虫薬（例えば、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、メトロイダゾール、キニンおよびメグルミンアンチモン酸塩；抗炎症薬（例えば、ジフルニサル、イブプロフェン、インドメタシン、メクロフェナメイト、メフェナミン酸、ナプロキセン、オキシフェンブタゾン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、スリンダク、トルメチン、アスピリンおよびサリチル酸塩．
【０２２７】
本明細書において用語「治療剤」または「治療的に有効な部分」は、同義であり、インビボにて有益な治療効果または細胞毒性効果を有する化合物または物質を意味する。治療剤としては、例えば生物活性剤、細胞毒性薬、薬物、化学療法剤、放射線治療剤、遺伝物質などと称される成分が挙げられる。
本明細書において用語「患者」は、哺乳動物、特にヒトを意味する。
【０２２８】
二価または多価にかかわらず、Yは限定されるものではないが、置換または非置換、飽和または不飽和、直鎖または分枝鎖アルキレン；直鎖、分枝鎖または環状アミノ酸由来のアミノ酸およびペプチド（例えば結合部分のN-またはC-末端の拡張）；誘導体化または非誘導体化ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレンまたはポリビニルピリジン鎖；置換または非置換ポリアミド鎖；誘導体化または非誘導体化ポリアミン、ポリエステル、ポリエチレンイミン、ポリアクリレート、ポリ(ビニルアルコール)、ポリグリセロールまたはオリゴ糖（例えばデキストラン）鎖；グリコシル化アミノ酸残基、交互ブロックコポリマー；マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸およびピメリン酸；カプロン酸；単独ジアミンおよびジアルコール；本明細書記載の他の任意のリンカーならびに例えばWO 98/18497およびWO 98/18496に記載の当分野で知られる他の任意の単独ポリマー性リンカーを挙げることができる。
【０２２９】
例えば、MRI法にて用いるための本発明の常磁性造影剤は注射用組成物の形態にて患者に投与する。MRI造影剤の投与方法は、好ましくは非経口、静脈内、動脈内、髄腔内、間質的または腔内である。フィブリン沈着、特に固形腫瘍のイメージングのために、静脈内または動脈内投与が好ましい。
【０２３０】
例えばMRIについて、対象は、MRシグナルを標的（例えば血管新生部位）にて少なくとも10%増強させるのに十分な投与量の造影剤を受けるものである。本発明のフィブリン標的MRI造影剤の注射後に、患者は、標的を含む任意の部位の位置を測定するためのMRI装置にてスキャンする。標的局在化における治療設定において、細胞毒性剤または治療剤はすぐに投与することができ、必要ならば次いで、患者をスキャンし、治療効果を視覚化することができる。
【０２３１】
本発明のMRI造影剤は、例えば従来のMRI造影剤と同様に用いることができる。標的が例えば組織内の腫瘍部位である場合、いくつかのMR技術およびパルス配列がバックグラウンド血液および組織に対する該部位のコントラストを増強することが好ましいことがある。これらの技術としては、例えばファーストスピンエコー系列（例えばAlexander et al., Magnetic Resonance in Medicine, 40(2): 298-310 (1998)を参照のこと）およびフロースポイルドグラジエントエコー系列（例えばEdelman et al., Radiology, 177(1): 45-50 (1990)を参照のこと）などの血液を暗くしようとするブラックブラッド血管造影配列が挙げられるがこれらに限定されない。これらの方法はまた、脈管形成腫瘍などの組織を含む標的とバックグラウンド組織とのコントラストを増大する、反転回復調製配列または飽和回復調製配列などのコントラストにおける相違を増強するフロー独立技術も含む。
【０２３２】
放射線治療の場合、当分野にて知られる適切な投与計画を本発明の放射線治療化合物に用いることができる。
本化合物は、標的組織の損傷または切除を引き起こすのに十分であるが、実質的な損傷が非標的（正常な組織）にもたらされるほどではない放射能の量を用いた単回または複数回のIVまたはIP注射を含むが、これらに限定されない、多くの方法を用いて投与することができる。必要な量および投与量は、用いられる同位体のエネルギーおよび半減期、薬剤の摂取の程度および体内から薬剤を除去する程度、および腫瘍量に応じて構築物で異なる。一般に投与量は、約0.01 mCi〜約100 mCi、好ましくは1 mCi〜50 mCiの範囲であることができる。典型的に、約30-50 mCiの単回用量から約3 Curiesまでの累積用量を適用することができる。
【０２３３】
本発明の放射線治療組成物は生理学的に許容される緩衝剤を含むことができ、注射前の化合物の放射線分解損傷を防ぐための放射線安定剤を必要とすることができる。放射線安定剤は当業者に知られており、例えばパラ-アミノ安息香酸, アスコルビン酸, ゲンチシン酸などを含むことができる。
放射性核種イメージングの場合、本発明化合物は注射により患者に投与することができる。イメージング剤に取り込まれる核種のガンマ線エネルギーを測定するPETカメラまたはガンマカメラを用いて、薬剤の摂取領域を造影し、部位内に存在する放射能量を定量する。インビボにおける部位のイメージングは数分で生じうる。しかし、イメージングは所望ならば、放射性標識ペプチドを患者に注射した後数時間またはそれ以上にて生じうる。たいていの場合、十分な量の投与量が約1時間の約0.1内にイメージされる領域に蓄積されて、シンチフォトの撮影を可能にする。
【０２３４】
所望の予防的、治療的または診断的効果を得るために、治療的または診断的に有効な用量または量の有効成分を、都合良く単位用量の形態にて毎日1回以上で投与する。日用量は、導入される生物学的に活性な分子に応じて医療従事者により明らかに選択される。
本明細書において用語「有効用量または有効量」は、その目的とする診断または治療目的：すなわち例えば細胞、体液および生物組織ならびにフィブリン沈着により影響されるヒト体器官、領域もしくは組織などの患者生物学的要素を視覚化するため、またはそれを目的とする治療目的；またはフィブリンと関連する病態の発症を遅延させもしくは予防させるため；または症状の進行、重大化または悪化を遅らせもしくは停止させるためという目的を果たすのに十分な、本発明の診断もしくは治療分子またはその医薬組成物の任意の量を意味する。
【０２３５】
そのさらなる具体的態様にて、本発明は、インビトロおよびインビボの両方における生存哺乳類患者、好ましくはヒト患者由来の細胞、体液および生物組織などの病理学的系ならびにフィブリン沈着が起こる腫瘍またはがん組織、炎症などのヒト体器官、領域または組織の診断イメージングに用いられる診断用製剤の製造のため、ならびに病変の治療の進行および結果をモニターするためのTが診断的に活性な部分である式(I)の化合物の使用に関する。
【０２３６】
さらなる別の態様にて、本発明は、Tが診断的に活性な部分である式(I)の化合物を哺乳類患者に投与することにより、例えば式(I)の適切な化合物を例えば生体外サンプルの生物サンプルおよび組織と接触させることによりインビトロおよびインビボの両方にて固形腫瘍または腫瘍細胞をイメージングする方法を提供する。
さらなる具体的態様にて、本発明、インビトロおよびインビボの両方における生存哺乳類患者、好ましくはヒト患者由来の細胞、体液および生物組織などの病理学的系ならびにフィブリン沈着が起こる腫瘍またはがん組織、炎症などのヒト体器官、領域または組織の予防および／または治療に用いられる治療用製剤の製造のためのTが治療的に活性な部分である式(I)の化合物の使用に関する。
【０２３７】
本発明において、特に記載しないかぎり、用語「保護基」は、それが結合している官能基の化学的官能性を保存する保護基を意味する。具体的には、保護基は、アミノまたはカルボキシル基の官能性を保存するために用いることができる。適当な保護基としては、例えば、ベンジル, ベンジルオキシカルボニル、またはアルキルまたはベンジルエステルまたはそのような官能基の保護に一般的に用いられる当業者に周知の他の置換基（例えばFmoc）が挙げられ、保護基は、T.W. グリーン, Protective Groups in Organic Synthesis (Wiley, NY 1981)などの慣用の教科書に記載されている。
【０２３８】
特に明記されなければ、本明細書において用語ホモ二官能性またはヘテロ二官能性単位または部分は、それぞれ同一または異なる少なくとも二の反応性官能基を有する単位または部分を意味する。
【０２３９】
ホモ二機能性単位の適当な例としては、例えば、それぞれ以下の式を有するジカルボキシル部分およびジアミン 部分が挙げられる：
-OC−Z −CO- , および
-NH−Z−NH-, 
where Ｚは鎖好ましくはselected from 以下の:  
-(CH2)n− 
−CH2−(CH2O)m−
−(CH2(CH2)pO)m-(CH2)m−
−(CH2)n−ＮＨＣＯ−(CH2)n−
−(CH2)n−ＮＨＣＯ−CH2O-(CH2(CH2)pO)m -(CH2)m−
−(CH2)p−ＣＨ（R2)−(CH2)m−
−(CH2)p− ＣＨ（R2)-(CH2)m -ＮＨＣＯ− CH2O- (CH2(CH2)pO)m -(CH2)m  −, 
（n=1-10, m=1-5およびp=0-5）
およびカルボキシルおよびアミノ基が適当に活性化されているまたは保護された形態であるそれらの誘導体。
【０２４０】
ヘテロ二機能性ユニットの適当な例としては、例えば、
-HN−(CH2) n−CO-
HN−(CH2) n-ＣＨ（R2)−CO-
-HN−(CH2)2−O−(CH2)2−O−CH2−CO-
−HN-（CH2)p-ＣＨ（R2)-(CH2)m-CO-
-OC−ＣＨ（NR1)−(CH2)m−NH-
-OC−(CH2)m −NHOC−(CH2)mO-(CH2)m −NH -
−HN-（CH2)p− ＣＨ（R2)-(CH2)m -ＮＨＣＯ−CH2O-(CH2(CH2)pO)m -(CH2)m -NH −
（ここで、n, mおよびp は前記と同意義である）およびそれらの適当な組合せが挙げられる。
【０２４１】
より好ましくは、本発明の２価の連結部分Yは以下の単位のいずれかを含んでなる: 
-HN−CH2 −CO-,  
-OC-(CH2)n−CO-,
-HN−(CH2)2−O−(CH2)2−O−CH2−CO-,
-HN-ＣＨ（ＣＯＮＨ2)−(CH2)m-NH-,
-NH-ＣＨ（ＣＯＮＨ2)-(CH2)m-ＮＨＣＯ-(CH2)n−CO-,
-CO-CH2O-(CH2)2−O−(CH2)2−ＮＨＣＯ-CH2O-(CH2)2−O−(CH2)2−NH-,
またはそれらの適当な反復および／または組合せ。
【０２４２】
本発明の特に好ましい態様において、,２価の 連結部分Ｙは、−Gly-Gly-Gly-Lys（GlyがグリシンでありLyＳがリジン）（GGGKとも称される）である。
【０２４３】
本発明の異なる態様では、Ｙは直鎖状または分岐鎖の多官能性連結部分である。特に記載しない限り、本明細書において用いられる「多官能性連結部分」および「多官能性リンカー」は、直鎖または分岐鎖（少なくとも3、好ましくは３〜８ およびより好ましくは３〜５の官能基）であり、その１方が該多官能性部分にAのＮ末端 (-NH2)またはＣ末端(-ＣＯＯＨ)の基で連結し、もう一方が多官能性部分が少なくとも2、好ましくは2〜7およびより好ましくは２〜５の同等または異なる診断的または治療的に有効な部分に連結している。
【０２４４】
好ましくは、該多官能性リンカー Ｙは、場合により-O-, -ＣＯＮＨ-, -CO-  -ＮＨＣＯ-および−NR3,から選択される１以上の基が介在していてもよく、所望により置換された１以上の−R4 基（ここでＲ3はHまたは−ＣＯＯＨまたは-NH2 基により所望により置換されたC1-C5アルキル基）であり、R4 は-NH2 , −ＣＯＯＨから選択される）で置換されていてもよい、直鎖状または分岐鎖のC1-C150、好ましくはC1-C100 および, より好ましくは、C1-C75 のアルキル 鎖、または その誘導体（例えば所望により-ＣＯＯＨ, -ＣＯＮＨ2および−NHR3から選択される基により置換された、低級アルキル エステルまたは -ＣＯＮＨ2 アミド,(C1-C5)アルキルまたは所望により置換されたベンゼン環）であり、さらに鎖は一方がＡと連結し、残りの官能基のそれぞれが診断的または治療的に有効部分Tと連結する多官能性部分である少なくとも３つの官能基を含んでいてもよい。
【０２４５】
多官能鎖の適切な例としては、例えば
(a) N-分枝リジン系（f. i., Veprek, P et al., J. Pept. Sci. 5, 5 (1999); 5, 203 (1999)を参照のこと）
(b) ポリカルボキシル化合物およびその適切な誘導体（ここに、カルボキシル基は適切に活性化または保護された形態である）
(c) ポリアミノ化化合物およびその適切な誘導体（ここに、アミノ基は適切に活性化または保護された形態である）
(d) アミノ酸およびポリオルニチン、ポリアルギニン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸などのポリアミノ酸
を挙げることができる。
【０２４６】
本発明の好ましい態様では、多官能性連結部分Yは、上記のホモ二機能性およびヘテロ二機能性単位から選択される１またはそれ以上のサブユニット、以下から選択される１以上のサブユニットを含んでいる：
−HN-（CH2)n-ＣＨ（NR3)−CO-
−OC-ＣＨ（NR3)-(CH2)n−NH-
−OC-(CH2)m−NR3−(CH2)m−CO-
−HN-ＣＨ（R4)−(CH2)m CO-
−HN-ＣＨ（R4)−( CH2)n−NH-
−HN-（CH2)p-((CH2)p −ＣＨ（R4))−(CH2)m-NH-
−OC-(CH2)p-((CH2)p −ＣＨ（NR3)−(CH2)m-NH-
（ここで、n, m, p , R3 およびR4 は上記と同意義である）。
【０２４７】
特に好ましい態様では、該多官能性Y部分は、以下のサブユニットのいずれかを含んでなる：
−Gly-Gly-Gly-Lys、
−OC-(CH2)p-((CH2)p−ＣＨ（NH2))−(CH2)m-NH-
-HN−ＣＨ（ＣＯＮＨ2)−(CH2)m-ＮＨＣＯ-CH2−O−(CH2)2−O−(CH2)2−NH-
−OC-ＣＨ（NH2)-(CH2)m−ＮＨＣＯ-ＣＨ（NH2)−(CH2)2−NH-
−OC-(CH2)m−CO-
−HN-ＣＨ（ＣＯＯＨ)−( CH2)n−NH-
-HN−CH2 −CO-
-OC-(CH2)n−CO-
-HN−(CH2)2−O−(CH2)2−O−CH2−CO-
-OC−CH2−O−(CH2)2−O−(CH2)2−NH-
またはそれらの適当な反復 および／または組合せ（ここでサブユニットのH2N-およびHOOC-基のそれぞれは、連結部分の伸張および／または分岐が可能なカルボキサミド架橋-連結反応を可能とするものである）である。
【０２４８】
例えば、適当な、場合により保護されたＹ部分と、または適当な場合により保護されたＹ部分のサブユニットとコンジュゲートしたペプチド部分をふくんでいる本発明の任意の中間体化合物は、本発明の更なる目的である。これらの中間体およびそれらの調製は、例えば、本明細書の以下の実験の項に記載する。
【０２４９】
非限定的な例として、図１は、ペプチド部分がＹがTable 1に示したSeq005のアミノ酸配列を含む本発明のリンカー官能化ペプチド部分(Seq005-P)でありおよびコンジュゲート連結部分が−GGGKJJ- (J はFmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸）（Aldrich Neosystem and Peptide International catalogueを参照)であるの調製のための合成手順を示す。
【０２５０】
これらの新規中間体としては、適当な連結単位とコンジュゲートしたペプチド部分または式（Ｉ）で示される化合物の調製のための中間体として適用できるそのサブユニットが挙げられる。
【０２５１】
式（Ｉ）で示される化合物である、本発明のこのましい態様では、Ｔは診断的に有効な部分または放射線治療部分である。
【０２５２】
本明細書において用いられる「診断的に有効な部分」または「イメージングに有効な部分」なる語は、イメージング診断法によって検出可能な任意の部分、即ち、
任意のやり方で、イメージング診断技術（例えば、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）、放射性イメージング、Ｘ線イメージング、光イメージング）により検出されるシグナルを有利に修飾するために提供、改善し、診断上有用な記録、好ましくはそのような技術と関連して用いた場合にコントラストの高いイメージが可能な任意の部分を意味する。
【０２５３】
本発明による診断的に有効な部分の例としては、例えばキレート化ガンマ線または陽電子放出核種；キレート化またはポリキレート化錯体の形態である常磁性金属イオン、20より多い原子数の原子を含むX線吸収剤；色素分子；蛍光分子；リン光性分子；UVスペクトルに吸収される分子；量子ドット；近または遠赤外線内に吸収可能な分子、一般に検出可能な物質を生成するすべての部分が挙げられる。以上により、用いられるイメージングモダリティは本発明の診断化合物が含むイメージング検出可能部分により選択されるべきであることは当業者に知られている。
【０２５４】
ＭＲＩ造影剤
本発明の特に好ましい態様では、式（Ｉ）の化合物において、ＴがＭＲＩ検出可能な部分である。
【０２５５】
ＴがＭＲＩ検出可能な部分である式（Ｉ）の化合物は、ＭＲＩ造影剤としての使用に好ましい。
【０２５６】
従って、好ましい一態様では、本発明は、ＴがＭＲＩ検出可能な部分である式（Ｉ）の新規ＭＲＩ造影剤に関する。
【０２５７】
好ましくは、該MRI 検出可能な部分は、磁気共鳴映像法 (MRI)によって検出可能な常磁性金属元素で標識されたキレート化リガンドの残基を含んでなる。
【０２５８】
好ましい常磁性金属元素は、２０〜３１、３９、４２、４３、４４、４９および５７〜８３の元素番号を有するものである。より好ましい常磁性金属イオンは以下：Ｆｅ（２＋）、Ｆｅ（３＋）、Ｃｕ（２＋）、Ｎｉ（２＋）、Ｒｈ（２＋）、Ｃｏ（２＋）、Ｃｒ（３＋）、Ｇｄ（３＋）、Ｅｕ（３＋）、Ｄｙ（３＋）、Ｔｂ（３＋）、Ｐｍ（３＋）、Ｎｄ（３＋）、Ｔｍ（３＋）、Ｃｅ（３＋）、Ｙ（３＋）、Ｈｏ（３＋）、Ｅｒ（３＋）、Ｌａ（３＋）、Ｙｂ（３＋）、Ｍｎ（３＋）、Ｍｎ（２＋）から選択され、Ｇｄ（３＋）が最も好ましい。
【０２５９】
本明細書において同義である用語「キレーター」、「キレート化リガンド」または「キレート剤」は、遷移金属または別の金属体との2以上の配位結合を含む錯体を形成することができる極性基の存在により特徴付けられる、化学部分、物質、化合物または分子を意味する。本発明の好ましい態様にて、キレート化リガンドとしては、環状または直鎖のポリアミノ ポリカルボン酸またはポリホスホン酸が挙げられ、遊離または適宜活性化されていてもよい官能基として提示される少なくとも1のアミン、チオールまたはカルボキシル基を含み、これは連結鎖Yの適切な官能基とのコンジュゲーション反応における使用に適切なものである。
【０２６０】
本明細書において同義である「キレート剤の残基」または「キレート化リガンドの残基」は、上記コンジュゲーション後に残存するキレートリガンドの一部を意味する。好ましいコンジュゲーションは、キレート配位子の酸性基（-COOH）またはその適切な反応性誘導体と連結部分Yのアミノ基（-NH2）から、あるいはキレート化リガンドの適切な反応性アミノ基およびY部分のカルボキシル基またはその適切な誘導体から形成され、カルボキサミド結合を生じる。架橋反応に関与するキレート化リガンドの酸性またはアミノ基は、リガンド残基のキレート可能性を軽減または改変しないために適切に選択される。
【０２６１】
用語「標識された」または「キレート化した」は「金属原子で標識されたキレート化リガンド」は、金属とキレート化リガンドとの間のキレート、配位錯体の形成を意味する。
【０２６２】
本明細書において同義である用語「金属体」または「金属元素」は、イメージング技術により検出可能な金属イオンを意味する。そのような金属体としては、具体的には磁気共鳴映像法（MRI）などのイメージング技術により検出可能な常磁性金属イオン、またはシンチグラフイメージング、単光子放射コンピュータ断層撮影法（SPECT）および陽電子放出断層撮影法（PET）などのイメージング技術により検出可能な金属イオン（例えば放射性核種）、または治療用放射性核種が挙げられる。
【０２６３】
適切なキレート化リガンドとしては、本明細書に記載のものが挙げられるが、特に、例えばベンゾDTPA、ジベンゾDTPA、フェニルDTPA、ジフェニルDTPA、ベンジルDTPAおよびジベンジルDTPA、N,N-ビス[2-[(カルボキシメチル)[(メチルカルバモイル)メチル]エチル]-グリシン（DTPA-BMA）、N-[2-[ビス(カルボキシメチル)アミノ]-3-(4-エトキシフェニル)プロピル)]-N-[2-[ビス(カルボキシメチル)アミノ]エチル]グリシン（EOB-DTPA）、4-カルボキシ-5,8,11-トリス(カルボキシメチル)-1-フェニル-2-オキサ-5,8,11-トリアザトリデカン-13-オン酸（BOPTA）、N,N-ビス[2-[ビス(カルボキシメチル)アミノ]エチル]L-グルタミン酸（DTPA-GLU）などのジエチレントリアミンペンタ酢酸（DTPA）およびその誘導体を含むポリアミノポリカルボン酸およびその誘導体；DTPA-Lys（Figure 3aの化合物1を参照のこと）；エチレンジアミンテトラ酢酸（EDTA）；例えば[10-(2-ヒドロキシプロピル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン 1,4,7,-トリ酢酸（HPDO3A）などの1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン 1,4,7,-トリ酢酸（DO3A）およびその誘導体；1,4,7-トリアザシクロノナン N,N',N''-トリ酢酸（NOTA）；例えば本明細書に引用されるWO 03/008390記載の6-[ビス(カルボキシメチル)アミノ]テトラヒドロ-6-メチル-1H-1,4-ジアゼピン-1,4(5H)-ジ酢酸（AAZTA）およびその誘導体、例えばベンゾ-DOTA、ジベンゾ-DOTA、(α,α',α'',α''')-テトラメチル-1,4,7,10-テトラアザシクロテトラデカン-1,4,7,10-テトラ酢酸（DOTMA）などの1,4,7,10-テトラアザシクロテトラデカン-1,4,7,10-テトラ酢酸（DOTA）およびその誘導体；または1,4,8,11-テトラアザシクロテトラデカン-N,N',N'',N'''-テトラ酢酸（TETA）；または1以上のカルボン酸基がホスホン酸基および／またはホスフィン酸基により置き換えられる対応化合物、例えばN,N'-ビス-(ピリドキサル-5-ホスフェート) エチレンジアミン-N.N'-ジ酢酸（DPDP）；エチレンジニトリロテトラキス(メチルホスホン酸)（EDTP）、1,4,7,10-テトラアザシクロテトラデカン-1,4,7,10-テトラ(メチレンホスホン酸)（DOTP）、例えばUS5362476およびUS5,409,689記載のホスホノアルキル-ポリアザ大環状化合物およびUS6509324記載の直線状ホスホノアルキル誘導体など；またはテキサフィリン、ポルフィリン、フタロシアニンなどの大環状キレート剤からなる群から選択されるキレート化リガンドである。
【０２６４】
本発明の好ましいキレート化リガンドとしては、図６ａ〜６ｃに示すものが挙げられ、その製造に関する適切な文献の参照も含む。
【０２６５】
特に好ましくは、DTPA、DTPA-GLU、DTPA-Lys、DOTA、AAZTAおよびそれらの以下の誘導体：
【化１１】
2010512400.tif 000025
である。
【０２６６】
本発明の特にMRI造影剤は以下のものが含まれる：
キレート錯体１
【化１２】
2010512400.tif 000026
キレート錯体２
【化１３】
2010512400.tif 000027
キレート錯体３
【化１４】
2010512400.tif 000028
キレート錯体４
【化１５】
2010512400.tif 000029
キレート錯体５
【化１６】
2010512400.tif 000030
キレート錯体６
【化１７】
2010512400.tif 000031
キレート錯体７
【化１８】
2010512400.tif 000032
キレート錯体８
【化１９】
2010512400.tif 000033
キレート錯体９
【化２０】
2010512400.tif 000034
キレート錯体１０
【化２１】
2010512400.tif 000035
【０２６７】
核イメージング（放射性核種イメージング）および放射線治療
本発明の別の好ましい具体的態様にて、式（Ｉ）の化合物中、Ｔは放射性イメージング検出可能部分または放射性治療部分である。
【０２６８】
Ｔが放射性イメージング検出可能部分である式（Ｉ）の化合物は、Ｘ線造影剤としての使用に好ましい。
【０２６９】
従って別の好ましい具体的態様にて、本発明はＴが放射性イメージング検出可能部分である式（Ｉ）の新規Ｘ線造影剤に関する。
【０２７０】
特に明記されなければ、本明細書において「放射性イメージング検出可能部分」は、シンチグラフイメージング、単光子放射コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）および陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）などのイメージング技術により検出可能である部分を意味する。
【０２７１】
好ましい放射性イメージング検出可能部分は、シンチグラフ、ＳＰＥＣＴまたはＰＥＴイメージング法により検出可能な放射性核種を有するキレート剤標識の残基を含む。
【０２７２】
Ｔは放射線治療部分である場合、好ましくは治療的に活性な放射性核種を有するキレート化リガンド標識の残基を含む。好ましい態様では、放射線治療部分は、治療的に活性な放射性核種で標識されたキレート化リガンドの残基を含んでなる。
【０２７３】
上記のキレート化リガンドとともに、放射性核種のキレート化リガンドの適当な例としては、直鎖状、大環状テルピリジンおよびＮ3Ｓ、Ｎ2Ｓ2またはＮ4キレート剤（さらに、例えばU.S. 5,367,080, U.S. 5,364,613, U.S. 5,021,556, U.S. 5,075,099, U.S. 5,886,142に開示のリガンドを参照）および、例えばＨＹＮＩＣ、ＴＥＴＡおよびビスアミノビスチオール（ＢＡＴ）キレート剤（U.S. 5,720,934もまた参照のこと）に限定されないがこれらを含む、当業者に知られている他のキレート剤を挙げることができる。例えばＮ4キレート化リガンドは、米国特許番号6,143,274; 6,093,382; 5,608,110; 5,665,329; 5,656,254;および5,688,487に記載されている。特定のＮ3Ｓキレート剤は、PCT/CA94/00395, PCT/CA94/00479, PCT/CA95/00249および米国特許番号5,662,885; 5,976,495および5,780,006に記載されている。キレート剤としてはまた、Ｎ3Ｓ、およびＭＡＭＡ（モノアミドモノアミンジチオール）、ＤＡＤＳ（Ｎ2Ｓジアミンジチオール）、ＣＯＤＡＤＳなどのＮ2Ｓ2系を含む、キレート化リガンド、メルカプト−アセチル−グリシル−グリシル−グリシン（ＭＡＧ３）の誘導体を挙げることができる。これらのリガンド系および他の種々のリガンドは、Liu and Edwards, Chem Rev. 1999, 99, 2235-2268およびその文献中の参考文献に記載されている。
【０２７４】
また、キレート化剤には、四座配位子にて金属に配位していないリガンド原子を含む錯体が上げられる。これらには、本明細書の一部を構成する米国特許番号5,183,653、5,387,409および5,118,797に記載されるようなテクネチウムおよびレニウムジオキシムのボロン酸付加体も挙げられる。
【０２７５】
本発明の好ましい放射性核種としては、以下のものが挙げられる：99mＴｃ、51Ｃｒ、67Ｇａ、68Ｇａ、47Ｓｃ、167Ｔｍ、141Ｃｅ、111Ｉｎ、113Ｉｎ、168Ｙｂ、175Ｙｂ、140Ｌａ、90Ｙ、88Ｙ、153Ｓｍ、166Ｈｏ、165Ｄｙ、166Ｄｙ、61Ｃｕ、62Ｃｕ、64Ｃｕ、67Ｃｕ、97Ｒｕ、103Ｒｕ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、203Ｐｂ、211Ｂｉ、212Ｂｉ、213Ｂｉ、214Ｂｉ、105Ｒｈ、109Ｐｄ、117mＳｎ、149Ｐｍ、161Ｔｂ、177Ｌｕ、198Ａｕ、111Ａｇ、199Ａｕ、51Ｍｎ、52mＭｎ、52Ｆｅ、60Ｃｕ、72Ａ、94mＴｃ、110Ｉｎ、142Ｐｒ、および159Ｇｄ。
【０２７６】
適切なリガンド残基の選択はリガンド標識に用いられる放射性核種に依存する。従って、キレート化リガンドの好ましい残基としては図６a〜６ｃに示したもの（111Inおよび例えば177Lu、90Y、153Smおよび166Hoなどの放射性ランタニド、または67Ga、68Ga、61Cu、62Cu、64Cuまたは67Cuについて）および図７a〜７bに示したもの（放射性99mTc、186Re、188Reについて）が挙げられる。特に、111In、ランタニドおよび放射性ランタニドなどの金属体について、特に好ましくは以下のリガンド残基である：
【化２２】
2010512400.tif 000036
上記式17および18にて、Rはアルキル、好ましくはメチルである。
99mTc、186Reおよび188Re放射性核種について、特に好ましくは以下のリガンド：
【化２３】
2010512400.tif 000037
ならびに以下のリガンド 残基:
【化２４】
2010512400.tif 000038
である。
【０２７７】
これらおよび他の金属キレート基は、本明細書の一部を構成する米国特許第 6,093,382および5,608,110, 6,143,274; 米国特許第5,627,286および6,093,382, 5,662,885; 米国特許第5,780,006;および5,976,495記載のものである。さらに、上記式9のキレート基は、例えばUS 6,143,274に記載されており；上記式１４および１５のキレート基はUS 5,627,286およびUS 6,093,382に記載されており；式１６のキレート基はUS 5,662,885、US 5,780,006およびUS 5,976,495に記載されている。
【０２７８】
式１４および１５において、XはCH2またはOであり、YはC1-C10分枝鎖または非分枝鎖アルキルであり；Yはアリール、アリールオキシ、アリールアミノ、アリールアミノアシルであり；Yはアリール部分に結合しているアルキル基がC1-C10分枝鎖もしくは非分枝鎖アルキル基、C1-C10分枝鎖もしくは非分枝鎖ヒドロキシまたはポリヒドロキシアルキル基またはポリアルコキシアルキルまたはポリヒドロキシ-ポリアルコキシアルキル基であるアリールキルであり、JはC(=O)−、OC(=O)-、SO2、NC(=O)-、NC(=S)-、N(Y)、NC(=NCH3)-、NC(=NH)-、N=N-、nがすべて1-100である、合成または天然アミノ酸由来のホモポリアミドまたはヘテロポリアミンである。他のすべての構造の変形は例えばUS 6,093,382に記載されている。上記各特許、出願および参考の開示は本明細書の一部を構成する。
【０２７９】
放射性核種の選択は所望の治療的または診断的用途に基づくだろう。放射線治療または放射線診断における使用では、好ましい放射性核種としては203Ｐｂ、67Ｇａ、68Ｇａ、72Ａ、111Ｉｎ、113Ｉｎ、90Ｙ、97Ｒｕ、61Ｃｕ、62Ｃｕ、64Ｃｕ、52Ｆｅ、52mＭｎ、140Ｌａ、175Ｙｂ、153Ｓｍ、166Ｈｏ、149Ｐｍ、177Ｌｕ、142Ｐｒ、159Ｇｄ、212Ｂｉ、47Ｓｃ、149Ｐｍ、67Ｃｕ、111Ａｇ、199Ａｕ、161Ｔｂ、51Ｃｒ、167Ｔｍ、141Ｃｅ、168Ｙｂ、88Ｙ、165Ｄｙ、166Ｄｙ、97Ｒｕ、103Ｒｕ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、99mＴｃ、211Ｂｉ、212Ｂｉ、213Ｂｉ、214Ｂｉ、105Ｒｈ、109Ｐｄ、117mＳｎ、177Ｓｎおよび199Ａｕおよびそれらの酸化物および窒化物が挙げられる。例えば、治療目的では（例えば、原発性腫瘍および転移に対して放射線治療を行うための）、好ましい放射性核種としては、64Ｃｕ、90Ｙ、105Ｒｈ、111Ｉｎ、117mＳｎ、149Ｐｍ、153Ｓｍ、161Ｔｂ、166Ｄｙ、166Ｈｏ、175Ｙｂ、177Ｌｕ、186／188Ｒｅ、および199Ａｕが挙げられ、177Ｌｕおよび90Ｙが特に好ましい。診断目的（例えば、原発性腫瘍および転移の診断または治療プロセスのモニターのための）では、好ましい放射性核種としては、64Ｃｕ、67Ｇａ、68Ｇａ、99mＴｃおよび111Ｉｎが挙げられる。
【０２８０】
特に、99mＴｃは低コスト、入手可能性、イメージング特性および高特異的活性のために特に診断用途に好ましい。99mＴｃの核および放射性特性によりこの同位体は理想的なシンチグラフイメージング剤となる。この同位体は１４０ｋｅＶの単光子エネルギーおよび約６時間の放射性半減期を有しており、99Ｍｏ−99mＴｃジェネレータから容易に入手可能である。
【０２８１】
ＰＥＴイメージングに用いられる好ましい金属放射性核種は例えば51Ｍｎ、52Ｆｅ、60Ｃｕ、68Ｇａ、72Ａｓ、94mＴｃまたは110Ｉｎなどの陽電子放出金属イオンである。
【０２８２】
シンチグラフ適用に好ましいものは、Ｔが、99mＴｃおよび186／188Ｒｅから選択される放射性核種で標識された図７ａ〜７ｂのキレート化リガンドである式（Ｉ）の放射線診断造影剤である。より好ましくは、Ｔが式２２〜３３のキレート化リガンドの残基であるものである。特にシンチグラフ適用に好ましいのは、Ｔが、99mＴｃで標識された図２２〜３３の式で示されるリガンドの残基である式（Ｉ）の造影剤である。
【０２８３】
放射線治療における使用に好ましい放射性核種としては、64Ｃｕ、90Ｙ、105Ｒｈ、111Ｉｎ、117mＳｎ、149Ｐｍ、153Ｓｍ、161Ｔｂ、166Ｄｙ、166Ｈｏ、175Ｙｂ、90Ｙ、177Ｌｕ、186／188Ｒｅおよび199Ａｕが挙げられ、177Ｌｕおよび90Ｙが特に好ましい。
【０２８４】
ＰＥＴイメージング
本発明のさらなる具体的態様にて、式（Ｉ）の化合物中、Ｔは標識される場合、ＰＥＴイメージングに用いるために適宜標識されていてもよい糖部分である。
【０２８５】
従って、別の好ましい態様にて、本発明はＴが適切に標識された糖部分である式（Ｉ）の化合物に関する。
【０２８６】
本発明の好ましい態様では、Ｔとしては、放射性核種（例えば124Ｉ、125Ｉ、131Ｉ、123Ｉ、77Ｂｒ、76Ｂｒおよび18Ｆであって、18Ｆが特に好ましい）でのハロゲン化により標識された糖部分が挙げられる。
【０２８７】
治療的に有効な薬剤
本発明の別の具体的態様にて、式(I)の化合物中、Tは治療的に活性な部分である。
それゆえ、本明細書において同義である、Tが治療的に活性な部分または治療薬剤である式(I)の化合物は本発明のさらなる目的を構成する。
【０２８８】
本発明の治療的に活性な部分の適切な例としては、凝血塊の溶解が可能な血栓溶解可能またはフィブリン溶解剤、例えば、がん細胞の増殖を選択的に殺傷および／または阻害するための細胞毒性薬、および放射線治療薬剤が挙げられる。
【０２８９】
本発明のある態様において、Tは上記の血栓溶解剤またはフィブリン溶解剤のいずれか、好ましくはストレプトキナーゼまたはウロキナーゼである。Tが血栓溶解剤またはフィブリン溶解剤を含む、式(I)の化合物は、ヒトなどの哺乳動物における血栓関連疾患、特に急性心筋梗塞、の治療に特に有用であろう。
【０２９０】
従って、本発明のことなる態様では、本発明は、ヒトを含む哺乳動物における血栓関連疾患の処置のための医薬製剤の製造のための、Ｔが血栓溶解剤またはフィブリン溶解剤である式（Ｉ）の化合物に関する。
【０２９１】
従って、本発明のことなる態様では、本発明は、Ｔが抗新生物剤である式（Ｉ）の化合物に関する。
【０２９２】
該試薬の適当な例としては、例えば、上記の抗新生物化合物ならびに毒素が挙げられる。
【０２９３】
本発明の好ましい態様では、Ｔは、治療用放射性核種を含んでなる放射線治療薬である。好ましくは、Ｔは治療的に活性な放射性核種で標識されたキレート化リガンドの残基である。これら化合物は本発明の放射線治療薬としての使用に好ましい。
【０２９４】
従って、別の態様において、本発明は、Ｔが、治療的に活性な放射性核種で適切に標識されたキレート化リガンドの残基である、式（Ｉ）の新規な放射線治療薬に関する。
【０２９５】
放射線治療に用いられる好ましい放射性核種としては、64Cu、90Y、105Rh、111In、117mSn、149Pm、153Sm、161Tb、166Dy、166Ho、175Yb、177Lu、186/188Reおよび199Auが挙げられ、特に好ましくは177Luおよび90Yである。
【０２９６】
特に放射線治療用途に適切な放射性核種の選択は以下のものを含む多くの因子に依存する：
a.  物理的半減期−これは、注射前の有意な放射性崩壊を伴わないで、放射性金属およびコンジュゲートからの放射線治療構築体の合成および精製、注射部位への該構築体の送達を可能とするのに十分長くあるべきである。好ましい放射性核種は約0.5〜約8日の物理的半減期を有するべきである。
b.  放射性核種からの放出エネルギー−短い距離にわたりそのエネルギーを預ける高エネルギー的な粒子を放出し、それにより非常に局在化した損傷を生じるため、粒子放射体である放射性核種（アルファ放射体、ベータ放射体およびAuger電子放射体など）は特に有用である。これらの同位体からのベータ粒子放出からのエネルギーが約5〜約150細胞直径内に預けられるため、ベータ放出放射性核種が特に好ましい。これらの核種から製造された放射線治療薬剤は、その局在化部位に比較的近いが骨髄などの隣接する正常な組織を損傷するほど長距離を移動できない疾患細胞を殺傷することができる。
c.  特異的活性（すなわち放射能／放射性核種の質量）−高い特異的活性を有する放射性核種（例えばジェネレータ生成90Y、111In、177Lu）は特に好ましい。放射性核種の特異的活性は、その製造方法、製造についての特定の標的および問題の同位体の特性により決定される。
【０２９７】
多くのランタニドおよびランタノイドとしては、ベータ粒子を放出するため放射線治療薬剤としての使用に適切なものとなる核特性を有する放射性同位体が挙げられる。これらのうちいくつかを以下の表に記載する。
【表１４】
2010512400.tif 000039
表中：Pmはプロメチウムであり、Smはサマリウムであり、Dyはジスプロシウムであり、Hoはホルミウムであり、Ybはイッテルビウムであり、Luはルテチウムであり、Yはイットリウムであり、Inはインジウムである。
【０２９８】
上記ランタニドおよびランタノイドの代替としての放射性レニウム同位体の使用は当分野にてよく知られている。
【０２９９】
特に186/188Re同位体は、放射線医薬治療における多くの適用を有する核医学において特に有用であることが分かっている。
【０３００】
従って、好ましい具体的態様にて、本発明はTがベータ粒子、アルファ粒子およびAugerまたはCoster-Kroning電子などのイオン化放射線を放出する適切にキレートされた放射性核種の残基である、式(I)の新規な放射線治療薬剤に関する。
【０３０１】
より好ましくは、Tは、90Y、111In、149Pm、153Sm、166Dy、166Ho、175Ybおよび177Luから選択されるランタニドまたはランタノイド放射性核種で標識されたキレート化リガンドの残基である。適切なキレート化リガンドの例は、図６a〜６cに示すものから選択することができる。
【０３０２】
このように、特に好ましい態様において、本発明は、Tが90Y、111Inまたは177Luで標識された図６a〜６cのキレート化リガンドの残基である、式(I)の新規な放射線治療薬剤に関する。
【０３０３】
別の好ましい態様において、本発明は、Tが、186Reまたは188Reで標識された図１０〜１６のキレート化リガンドの残基である、式(I)の新規放射線治療薬剤に関する。
【０３０４】
治療用放射性核種で標識された本発明の化合物は、癌等の疾患の治療若しくは本発明の放射線治療薬がアジュバント化学療法と組み合わせて用いられる複合的治療(例えば、本明細書に開示の１または他の治療薬剤）における第１の治療として用いる放射性医薬か、マッチドペア（matched pair）治療薬の治療的部分として適用し得る。
【０３０５】
実際, 本発明の放射線治療剤のペプチド部分は、キレート化された放射性同位体を病的なフィブリン沈着（例えば、血栓／凝血塊、動脈硬化斑および多発性硬化症に関与する炎症による損傷、特に充実性腫瘍）へ局在化することが可能である。放射性同位元素の局在化によって放射された細胞毒性量の電離放射線によって病的な組織の細胞死を引き起こすことが可能である。
【０３０６】
塩
リガンドおよび式（Ｉ）で示される常磁性または放射性核種キレート化合物は両者とも生理学的な塩の形態であってよい。
【０３０７】
本明細書において用語「医薬的に許容される塩」は、親化合物が、親化合物の活性を破壊しない無毒性の安定な塩の形態に内部で中和されない酸性または塩基性基を作ることにより改変される、本発明化合物の誘導体を意味する。
【０３０８】
当該塩の適切な例としては、アミンなどの塩基性残基の鉱酸塩または有機酸塩；カルボン酸などの酸性残基のアルカリまたは有機塩が挙げられる。
【０３０９】
本発明化合物を塩化するために適切に用いることができる無機塩基の好ましいカチオンは、カリウム、ナトリウム、カルシウムまたはマグネシウムなどのアルカリまたはアルカリ土類金属のイオンを含む。有機塩基の好ましいカチオンは、とりわけエタノールアミン、ジエタノールアミン、モルホリン、グルカミン、N-メチルグルカミン、N,N-ジメチルグルカミンなどの第一級、第二級および第三級アミンのものを含む。
【０３１０】
本発明の錯体を塩化するために適切に用いることができる無機酸の好ましいアニオンは、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸などのハロ酸のイオンのものまたは硫酸などの他のイオンのものを含む。
【０３１１】
有機酸の好ましいアニオンは、例えば酢酸、コハク酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸またはシュウ酸などの塩基性物質の塩化のための医薬技術に通常用いられる酸のものを含む。
【０３１２】
アミノ酸の好ましいカチオンおよびアニオンは、例えばタウリン、グリシン、リジン、アルギニン、オルニチンまたはアスパラギン酸およびグルタミン酸のものを含む。
【０３１３】
光学イメージング
本発明のさらなる好ましい態様において、式(I)の化合物中、Tは光学活性なイメージング部分を示す。
【０３１４】
Tが光学活性なイメージング部分である式(I)の化合物は、新規であり、本発明のさらなる目的を構成する。これらの化合物は光学的イメージング造影剤としての使用に好ましい。
【０３１５】
従って、さらなる具体的態様にて、本発明は、Tが光学活性イメージング部分である式(I)を有する光学的イメージングのための新規な造影剤に関する。
【０３１６】
光学活性なイメージング部分の適切な例としては、本明細書に記載したもの、例えば色素分子；例えばフルオレセインなどの蛍光分子；リン光分子；UVスペクトルに吸収される分子；量子ドット；または近もしくは遠赤外線の吸収が可能な分子が挙げられる。
【０３１７】
イメージの作製において検出されるべき光学的パラメータとしては、例えば透過電磁波、吸収、蛍光またはリン光放射、光反射、振幅または最大吸光度の変化および弾性散乱放射線を挙げることができる。例えば生物学的組織は、650-1000 nmの範囲の近赤外（NIR）波長における光に比較的半透明である。NIR放射は数センチメートルまで組織を貫通することができ、ＮＩＲ部分を含む本発明の診断剤の使用してインビボでの標的を含んでいる組織のイメージングが可能である。 
【０３１８】
近赤外色素としては、例えばCy5.5、IRDye800、インドシアニングリーン（ICG）、テトラスルホン酸置換インドシアニングリーン（TS-ICG）などのインドシアニングリーン誘導体およびその組合せなどのシアニンまたはインドシアニン誘導体を挙げることができる。
【０３１９】
別の態様において、本発明化合物としては、拡張的にコンジュゲートし、そのため非局在化した環系を有し、400-1500 nmの範囲の最大吸収または放出を有する、有機発色団またはフルオロフォアなどの光学色素などの光標識を挙げることができる。あるいは、本発明化合物は生物発光分子で誘導体化することができる。光標識の最大吸収の好ましい範囲は、ヘモグロビンからのシグナルとの干渉を最小限にする600〜1000 nmである。好ましくは、光吸収標識は、例えば＞ 105 cm-1M-1の高い分子吸収性を有し、蛍光光学色素は高量子収率を有する。光学色素の例としては、WO 98/18497, WO 98/18496, WO 98/18495, WO 98/18498, WO 98/53857, WO 96/17628, WO 97/18841, WO 96/23524, WO 98/47538およびそれら文献に記載の参考文献に記載のものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３２０】
例えば、光標識は本発明のペプチド部分に直接共有結合により連結することができるか、１またはそれ以上の光標識を、上記の分岐鎖Ｙを介して連結させてもよい。
【０３２１】
本発明の光学標識診断誘導体の注射後に、患者は薬剤に用いられる光標識についての適切な波長範囲における1以上の光源（例えばレーザー）でスキャンする。用いられる光は単色または多色で連続的またはパルスであってよい。透過光、散乱光または反射光は対象における一または複数の波長に調整された光検出器により検出し、標的含有組織（例えば血管新生組織）の位置を決定する。光学的パラメータの変化は時間とともにモニターされ、標的部位における光学標識試薬の蓄積を検出することができる。標準イメージ加工および検出装置は、本発明の光学イメージング試薬とともに用いることができる。
【０３２２】
好ましい態様において、本発明は、Tが5-カルボキシフルオレセインの残基である式(I)の新規な光学的イメージング試薬に関する。
【０３２３】
別の態様では、本発明は、活性成分として、少なくとも１つの式（Ｉ）の化合物（その医薬上許容される塩を含む）を１以上の可能な製薬的に許容し得る担体または賦形剤と組み合わせて含有する医薬組成物に関する。
【０３２４】
さらなる態様にて、本発明は、Tが、生きている哺乳類の患者、好ましくはヒト、由来の細胞、体液および生物組織などの病理学的系の（生体外サンプルの）インビトロでの診断のための診断的に活性な部分である式(I)の化合物に関する。さらに本発明は、Ｔが、フィブリン沈着が起こる腫瘍またはがん組織、炎症などのヒトの臓器、部位または組織の
インビボでの診断イメージングにおいて使用するための医薬組成物の製造のための診断的に活性な部分である、式（Ｉ）の化合物の使用に関する。
【０３２５】
更なる態様において、本発明は、本発明の診断用造影剤およびイメージング技術の使用を含んでなる、インビトロ (生体外のサンプル)およびインビボ両方での充実性腫瘍または腫瘍細胞のイメージング方法を提供する。
【０３２６】
さらに、本発明は、本発明の治療剤を投与することを含んでなる、インビボで充実性腫瘍または腫瘍細胞を処置および／または軽減するための方法を提供する。
【０３２７】
製造
Ｔが、常磁性金属イオンまたは放射性核種で標識されたキレート化剤の残基である、式（Ｉ）で示される化合物または生理学的に許容し得る塩の形態の製造は、本発明のさらなる目的である。
【０３２８】
本発明のフィブリン結合部分およびその診断的にまたは治療的に活性な部分とのコンジュゲートの単離、コンジュゲーションおよび使用は、さらに実施例にて例示される。以下の実施例に含まれる具体的なパラメータは、本発明の実践を例示するものであり、何ら本発明の範囲を限定するために提示されるものではない。
【実施例】
【０３２９】
以下の材料を用いて以下の実施例を行った：
材料：
用いられるFmoc保護アミノ酸は、Nova-Biochem（San Diego, CA, USA）、Advanced ChemTech（Louisville, KY, USA）、Chem-Impex International（Wood Dale Ill, USA）およびMultiple Peptide System（San Diego, CA, USA）から得た。DPPE、DSPE-PG4-NH2およびDPPE-PG4-NH2はAvanti Polar Lipids（Alabaster, AL）から得た。Fmoc-PEG3400-NHSはShearwater Polymers (Huntsville, AL）から得た。他の試薬はAldrich Chemical Co.（Milwaukee, WI）およびVWR Scientific Products（Bridgeport, NJ）から得た。ペプチド合成用溶媒はPharmco Co.（Brookfield, CT）から得た。
【０３３０】
実施例１〜７および２３は、以下に記載する手順Ａ〜Ｌを参照して行う。
ペプチド合成の手順
手順A：自動ペプチド固相ペプチド合成
個別のペプチドはABI 433A器具（Applied Biosystems, Foster City, CA）を用いて製造した。PAL-Peg-PS-樹脂（1.2 g, 0.18 mmol/g）またはNovaSyn TGR樹脂（1.25 g, 0.20 mmol/g）（NovaBiochem, Novato, CA）をすべての合成について用いた。FastMocTMプロトコールを用いて樹脂上にペプチドを組み立てた。合成後、樹脂をDCM（2×）で洗浄し、乾燥した。
【０３３１】
手順B：アミノ酸のカップリング説明
特に明記されなければ、カップリング溶媒としてDMFを用いた。DMF中の適当なFmoc-アミノ酸（0.25M溶液, 3当量）をHATU（NMP中0.5M, 3.0当量）およびDIEA（6.0当量）で処理した。混合物を〜2分間振盪した後、樹脂の入った合成容器に移した。次いで容器を常温にて終夜振盪した。樹脂をろ過し、過剰な試薬を除去した後、DMFで洗浄した（4×）。
【０３３２】
手順C：Fmoc保護基の除去説明
Fmoc保護アミノ酸を含む樹脂を10分間DMF中の20%ピペリジンで処理した（v/v, 15.0 mL/g樹脂）。溶液を樹脂から排出した。この手順を一度繰り返した後、DMFで樹脂を洗浄した（4×）。
【０３３３】
手順D：ivDde基の除去（固相）
ivDde保護アミノ酸を含む樹脂をDMF（10 mL/g樹脂）中の10%（v/v）ヒドラジンで10分間処理した。溶液を樹脂から排出した。この手順を一度繰り返した後、樹脂をDMFで洗浄した（4×）。
【０３３４】
手順E：溶液中におけるペプチドからのivDde基の除去
ペプチド50 mgをDMF（2.0 mL）に溶解し、ニートのヒドラジン40-200μLで10分間処理した。混合物を水で希釈し、10 mLの容積とし、これを直接C18逆相カラムに適用し、一般的手順に記載の分取用HPLCにより精製した。
【０３３５】
手順F：Fmoc-Adoa（Fmoc-J）のカップリング
Fmoc-Adoa（2当量）およびHATU（2当量）をDMFに溶解し、DIEA（4当量）を混合物に加えた。混合物を1分間撹拌した後、活性化された酸を樹脂に担持させた。試薬の濃度を上記標準的ペプチドカップリングについてのものとした。カップリングを常温にて12時間続けた。樹脂から反応体を除去し、DMFで洗浄した（4×）。二のAdoa単位が樹脂に担持した場合、第一担持Fmoc-Adoa単位のFmoc基を除去し（手順C）、樹脂をDMFで洗浄した後（4×）、第二Adoa部分をカップリングした。
【０３３６】
手順G：樹脂結合ペプチドの開裂および側鎖脱保護
試薬B（88:5:5:2 - TFA:水:フェノール:TIPS - v/v/wt/v）、15 mL/g樹脂を樹脂〜1.0 gに加え、容器を常温にて4.5時間振盪した。樹脂をろ過し、TFAで2回洗浄した（5 mL/g樹脂）。ろ液を集め、濃縮してシロップを得、これをEt2O 20 mL／樹脂gでトリチュレーションし固体残渣を得、これを5-15分間撹拌した後、遠心分離した。上清をデカンテーションし、工程を3回繰り返した。得られた固体を高真空下または乾燥窒素ガス流下で乾燥した。
【０３３７】
手順H：ジスルフィド環化
Et2Oとの粗製の開裂混合物のトリチュレーションから得られた析出物をビーカーに移し、DMSO（5-10μL/mg粗製ペプチド）を加えた。N-メチル-D-グルカミン（H2O中10-100 mM）を加えることにより溶液のpHを8に調節した。混合物を48時間撹拌した後、分取用HPLCにより精製した。
【０３３８】
手順I：ペプチドの5-カルボキシフルオレセイン（CF5）誘導体の製造
ペプチドのDMF（15μL/mg）およびDIEA（20当量／ペプチド当量）溶液に5-カルボキシフルオレセインNHSエステル（1.3-1.5当量）のDMF（20μL/mg）を加えた。混合物を1-3時間撹拌した。反応を質量分析および分析用HPLCによりモニターした。反応完了後、組成物をろ過し、分取用HPLCにより精製した。
【０３３９】
手順J：Aloc-Gly-OHの製造
Gly-O-t-Bu・AcOH（1 g, 5.24 mmol）をDCM（15 mL）に溶解し、ジアリルピロカーボネート（1.1 g, 5.91 mmol, 1.13当量）を滴加した。混合物を常温にて0.5時間撹拌した。次いでDIEA（3.7 g, 5 mL, 28.68 mmol, 5.47当量）を加えた。混合物を常温にて終夜撹拌した。揮発物を除去し、粗製の残渣をEtOAc（100 mL/粗製物g）に溶解し、有機層を1N HCl（2×）で洗浄した。揮発物を除去し、粗製物を高真空下乾燥した。NMR（500 MHz, CDCl3）は純粋な生成物を示し、構造式と一致した。次いで粗製物をTFA/DCM（1/1, v/v, 25 mL）の溶液に溶解し、溶液を終夜撹拌した。揮発物を除去し、EtOAcを加えてフラスコ壁から残渣を洗浄した後、揮発物をロータリーエバポレータにて留去した。これを繰り返した。得られた生成物を終夜高真空下にて乾燥した。物質のNMR分析（CDCl3, 500 MHz）は予測された構造式と一致し、純度はカップリングマニュアルプロトコールにおける使用に十分であることが分かった。
【０３４０】
手順K：Aloc-Arg(Pmc)-OHの製造
H-Arg(Pmc)-OH（5 g, 11.35 mmol）をH2Oおよびジオキサン（1/1, v/v, 125 mL）の混合物に溶解し、ジアリルピロカーボネート（6.34 g, 34.05 mmol, 3.0当量）を加えた。Na2CO3を加えることにより混合物のpHを＞10.0に調節した。混合物を撹拌し、還流温度にて終夜維持した。揮発物をロータリーエバポレーションにて留去し、粗製物をEtOAc（粗製物100 mL/g）に溶解し、溶液を1N HCl（2×）で洗浄した。揮発物をロータリーエバポレーションにより留去し、粗製物をCHCl3に溶解し、溶液をシリカゲルカラムに充填した。カラムを2のカラム容積のCHCl3で溶出した後、同様にMeOHの5%CHCl3溶液で溶出した。所望の化合物を含むフラクションを集め、揮発物をロータリーエバポレーションにより留去し、高真空下にて減圧し、Aloc-Arg(Pmc)-OH 4.2 g（70%収率）を得た。プロトンNMRスペクトル（CDCl3, 500 MHz）を予測された構造式および必要な純度と一致した。
【０３４１】
手順L：ペプチドからのAloc保護基の除去
Aloc保護ペプチドを5-20 mL/ペプチド100 mgのNMM:酢酸:DMF（1:2:10）溶液に溶解した。Pd(PPh3)4（1-10当量／ペプチド当量）を加えた。混合物を0.5〜4時間撹拌した。MSおよび分析用HPLCを用いて反応をチェックした。反応完了後、粗製の反応混合物をH2O中10%〜25% CH3CNで2倍に希釈し、ろ過し、分取用HPLCにより精製した。
【０３４２】
解析および精製の方法
分析用HPLC
カラム: Waters Corp. X-Terra, MS-C18; 4.6 mm i.d. x 50 mm; 5μm粒子; 溶離液A: 水（0.1重量%のTFAを含むHPLCグレード）; 溶離液B: アセトニトリル（0.1重量%のTFA）。用いられる初期条件および勾配溶出プロファイルは、標記化合物の分析のための各実験手順に記載する。溶出速度: 3 mL/min; 検出: UV 220 nm.
【０３４３】
分取用HPLC精製
カラム: Waters Corp. X-Terra MS-C18; 50 mm i.d. x 250 mm; 10μm粒子; 溶離液: 溶離液A: 水 (0.1重量% TFAを含むHPLCグレード); 溶離液B: アセトニトリル (0.1重量% TFA); 用いられる初期条件および勾配溶出プロファイルは、標記化合物の分析のための各実験手順に記載する。溶出速度: 100 mL/min; 検出: UV 220 nm.
【０３４４】
リン脂質ペプチド コンジュゲートの分取用ＨＰＬＣ 精製
Kromasil Prep C4 HPLC カラムを用いるリン脂質ペプチド コンジュゲートの精製
反応混合物を脱イオン蒸留水で希釈し、逆相 C4 分取用 カラムで精製した(Kromasil（登録商標）Prep C4, 粒子サイズ 10 μｍ, 孔サイズ 300Å, 20 x 250 mm), CH3OH:CH3CN (1:1, v/v, 0.1%ＴＦＡ)中50-100％水（0.1％ＴＦＡ)のグラジェント、100 mL/minにて３０分間）。フラクション (15 mL)ををHPLCにより解析した (カラム: YMC C-4, 5μm, 300Å, 4.6 x 250 mm)および純粋な生成物を含むフラクションををプールした。 ロータリーエバポレーターにより、集めた生成物を含有するフラクションからメタノールを留去し; 得られた溶液を１０％アセトニトリル水溶液で希釈し, 凍結乾燥して所望の生成物を得た。
【０３４５】
Zorbax Prep C-3 HPLC カラムを用いるリン脂質ペプチド コンジュゲートの精製
−希釈した反応混合物を、予め流速30 mL/分間にて25% B (CH3CN with 0.1% ＴＦＡ)で平衡化したZorbax C-3 カラム (21.2 mm i.d. × 150 mm)に付し、流速30 mL/minにて同溶離液にてＤＭＦのプラグが溶出するまで溶出した。３分間で溶離液Ｂの割合を２５％から３０％に高め、５０分間で１００％まで高めた。フラクション (15 mL) を集め、生成物を含有するフラクション をプールし、凍結乾燥した。
【０３４６】
化合物の分析に用いられるHPLC法
脂質ペプチド コンジュゲートの分析に用いられるHPLC系
A系: カラム: Waters XTerra MS-C18 4.6 x 50 mm; 粒子サイズ: 5ミクロン; 溶離液: A: 水 (0.1% TFA), B: アセトニトリル (0.1% TFA); 溶出: 7分で直線勾配5-55% B; 流速: 3 mL/min; 検出: UV, λ= 220 nm.
【０３４７】
B系: カラム: Waters XTerra MS-C18 4.6 x 50 mm; 粒子サイズ: 5ミクロン; 溶離液: A: 水 (0.1% TFA), B: アセトニトリル (0.1% TFA); 溶出: 7分で直線勾配5-65% B; 流速: 3 mL/min; 検出: UV, λ= 220 nm.
【０３４８】
C系: カラム: Waters XTerra MS-C18 4.6 x 50 mm; 粒子サイズ: 5ミクロン; 溶離液: A: 水 (0.1% TFA), B: アセトニトリル (0.1% TFA); 溶出: 7分で直線勾配15-65% B; 流速: 3 mL/min; 検出: UV, λ= 220 nm.
【０３４９】
D系: カラム: Waters XTerra MS-C18 4.6 x 50 mm; 粒子サイズ: 5ミクロン; 溶離液: A: 水 (0.1% TFA), B: アセトニトリル (0.1% TFA); 溶出: 6分で直線勾配15-70% B; 流速: 3 mL/min; 検出: UV, λ= 220 nm.
【０３５０】
E系: カラム: Waters XTerra MS-C18, 4.6 mm i.d. x 50 mm; 粒子サイズ: 5ミクロン; 溶離液: A: 水 (0.1% TFA), B: アセトニトリル (0.1% TFA); 溶出: 6分で直線勾配15-60% B; 流速: 3.0 mL/min; 検出: UV, λ= 220 nm.
【０３５１】
F系: カラム: YMC C18, 4.6 x 250 mm; 溶離液: A: 水 (0.1%TFA), B: アセトニトリル (0.1%TFA), 初期条件: 20% B, 溶出: 20分で直線勾配20-80% B; 流速: 1.0 mL/min; 検出: UV, λ= 220 nm.
【０３５２】
G系: カラム: Waters XTerra MS-C18, 4.6 mm i.d. x 50 mm; 粒子サイズ: 5ミクロン; 溶離液: A:水 (0.1% TFA), B: アセトニトリル (0.1% TFA); 溶出: 初期条件: 10% B, 8分にわたり直線勾配10-50% B; 流速: 3 mL/min; 検出: UV, λ= 220 nm.
【０３５３】
H系: カラム: Waters XTerra MS-C18 4.6 x 50 mm; 粒子サイズ: 5ミクロン; 溶離液: A: 水 (0.1% TFA), B: アセトニトリル (0.1% TFA); 溶出: 初期条件: 5% B, 8分で直線勾配5-65% B; 流速: 3 ml/min; 検出: UV λ= 220 nm.
【０３５４】
I系: カラム: Waters XTerra  C-4, 4.6 x 50 mm; 溶離液: A: 水（0.1%ＴＦＡ), B: アセトニトリル:メタノール (1:1)(0.1%ＴＦＡ); 溶出: 初期条件:  80% B, 6分間で直線勾配 80-100% B; 流速: 3.0 mL/min; 検出: UV, λ= 220 nm.
【０３５５】
J系: カラム: YMC C-4, 4.6 x 250 mm; 溶離液: A: 水（0.1%ＴＦＡ), B: アセトニトリル:メタノール (1:1)(0.1%ＴＦＡ); 溶出: 初期条件:  80% B, 50分間で直線勾配 80-100% B; 流速: 2.0 mL/min; 検出: UV, λ= 220 nmおよびELSD: 感度10, Temp. 51 ℃, 圧力 2.2 Torr.
【０３５６】
K系: カラム: YMC C4; 250 mm x 4.6 mm i.d.; 粒子サイズ: 5.0 ミクロン; 溶離液: A:水（0.1% ＴＦＡ), B:アセトニトリル(0.1% ＴＦＡ); 溶出: 初期条件:  80% B,１００分間で直線勾配 80-90% B、１分間で 100% B、100% Bを１分間保持; 流速: 2.0 mL/min; 検出: UV, λ= 220 nmおよびELSD: 感度10, Temp. 51 ℃, 圧力 2.2 Torr.
【０３５７】
L系: カラム: YMC C-4, 4.6 x 250 mm; 溶離液: A: 水（0.1% ＴＦＡ), B: アセトニトリル/メタノール (1:1, v/v)(0.1%ＴＦＡ); 溶出: 初期条件:  60% B,２０分間で直線勾配 60-100% B; 流速: 2.0 mL/min; 検出: UV, λ= 220 nmおよびELSD: 感度10, Temp. 51 ℃, 圧力 2.2 Torr.
【０３５８】
M系: カラム: YMC C-4, 4.6 x 250 mm; 溶離液: A: 水（0.1% ＴＦＡ), B: アセトニトリル/メタノール (1:1, v/v)(0.1%ＴＦＡ); 溶出: 初期条件:  50% B,１０分間で直線勾配 50-90% B; 流速: 3.0 mL/min; 検出: UV, λ= 220 nm およびELSD: 感度10, Temp. 51 ℃, 圧力 2.2 Torr.  
【０３５９】
N系: カラム: Zorbax 300SB C-3, 3 mm i.d. x 150 mm; 粒子サイズ3.5 μm; 溶離液A : 水（0.1% ＴＦＡ); 溶離液 B:アセトニトリル(0.1% ＴＦＡ).  初期条件:  50% B;溶出: ３分間で直線勾配50-90% B, 90% Bを１１分間保持; 溶出速度: 0.5 mL/min; 検出: UV, λ= 220 nmおよびELSD: 感度10, Temp. 51 ℃, 圧力 2.2 Torr.
【０３６０】
O系: カラム: YMC C-4, 4.6 x 50 mm; 溶離液: A: 水（0.1%ＴＦＡ), B: アセトニトリル-メタノール (1:1 v/v)(0.1%ＴＦＡ); 溶出: 初期条件:  75% B,１０分間で直線勾配 70-100% B; 流速: 3.0 mL/min; 検出: UV, λ= 220 nmおよびELSD: 感度10, Temp. 51 deg C, 圧力 2.2 Torr.
【０３６１】
P系: カラム: ES industories MacroSep C4, 4.6 x 50 mm; 粒子サイズ: 5 μ; 溶離液: A: 水（0.1% ＴＦＡ), B: アセトニトリル/メタノール (1:1, v/v)(0.1% ＴＦＡ); 溶出: 初期条件:  25% B,７分間で直線勾配 25-100%; 流速; 3 mL/min; 検出:紫外線 220 nm
【０３６２】
５−カルボキシ蛍光標識 ペプチドを用いる直接結合蛍光偏光 (FP)法によるフィブリン結合ペプチドのアッセイ
プロトコル
1.    ０．０１％Tweenを添加したHEPES希釈バッファー (HDB)中、５−カルボキシ蛍光標識ペプチドの４０ｎＭ溶液１ｍLを調製。
HDB (10 mM HEPE、 150 mM NaCl2, 2 mM CaCl2)
2.    40 nM溶液を希釈し、試験用５−カルボキシ蛍光標識 ペプチドの２０ｎＭ溶液１ｍLを得る。
3.    予想されるKDの約５〜１０倍となる濃度のＤＤＥ溶液を調製する。記載したアッセイについて８μＭ の濃度のＤＤＥを調製した。
4.    同容量のDDE溶液と40 nM ペプチド溶液を混合する。
5.    0.01% Tween20および20 nMの５−カルボキシ蛍光標識 ペプチドを添加した結合緩衝液を含有する溶液中でＤＤＥを連続希釈する。
6.    Labsystems 384-ウェルマイクロプレートにて以下の表に示すうように希釈を行い、溶液の吸引とウェルへのディスペンスの繰り返しにより混合を行う。
7.    プレートを2000 RPMにて５分間遠心し、ウェル中の気泡を除去する。
8.    485 nm にてTecan 極性プレートリーダーで異方性値（anisotropy value）を読み取る。
【表１５】
2010512400.tif 000040
【０３６３】
異方性（mP − ミリポラリゼーション単位)対レセプター濃度 (micromoles/liter)の対数値をグラフ化する。解離定数は、その極値がAfreeおよびA bound である曲線の中点で求めた（ここでAfreeはフリーのペプチドの異方性であり、Abounは完全に結合したペプチドの異方性である）。理論、操作方法、数学的解析は、例えば、以下の文献: Fluorecencee Polarization Technical Resource Guide Technical Resource Guide 4th Edn. Invitrogen Corporation 501 Charmany Drive Madison, WI 53719 USAに記載されている。特に、データの数学的解析および結合定数の算出は、Chapter 8:解析of FP Binding Data pp 8−2〜8−7に記載されている。
【０３６４】
非標識試験ペプチド vs 標準的な５−カルボキシ蛍光標識ペプチドSeq000-CF5の競合を用いる競合結合蛍光偏光 (FP)法によるフィブリン結合 ペプチドのアッセイ
10-5Mの濃度のDDEを９６ウェルプレートに分注した。標準的な5CF-標識ペプチドSeq000-CF5をDDE含有ウェルに加え、初発トレーサー濃度を10-6Mとした。競合ペプチドのアリコートを各ウェルに加え、10-10M to 10-3Mの濃度範囲とした。ペプチドをDDE/Seq000-CF5錯体と２時間インキュベーションした。次いで、異方性値をTecan 極性プレートリーダーで485 nmにて読み取った。試験ペプチドのすべての濃度を用いて競合曲線を作製した。データの数学的解析およびPrism Graph Pad（登録商標）ソフトウェアにおける回帰ルーティーンを用いて試験ペプチドのIC50の計算を行った。実験手順およびデータ解析についての理論的および数学的根拠は、例えば: ”Practical Use of Fluorescence Polarization In Competitive Receptor Binding Assays” - Section P of ”Receptor Binding Assays” http://www.Ncgc.Nih.Gov/Guidance/Section5.Html#Practical-Fluor-Polar.  著作権 2005, Eli Lilly and Company and National Institutes Of Health Chemical Genomics Centerに記載されている。試験ペプチド対Seq000-CF5のIC50の相対値は、それらのIC50をSeq005-CF5/DDE 錯体へのSeq005の滴定によって得られた値で割ることにより求めた。
IC50の相対値が低いほど、強力な結合ペプチドであることを示す。上記Table 1および2を参照。
【０３６５】
実施例１〜３は、例示ペプチド Seq016, Seq017,およびSeq049の調製を記載する。
【０３６６】
実施例１：Ａｃ−ＧＷＱＰＣ*ＰＷＥＳＷＴＦＣ*ＷＤＰＧＧＧＫ−ＮＨ2環状（５→１３）ペプチド（Ｓｅｑ０１６）の調製
FastMocTMプロトコールを用いて行ったFmoc化学を用いて、ペプチド配列をABIペプチドシンセサイザーを用いた手順Aに記載のFmoc-PAL-PEG-PS樹脂（0.18 mmol/g, 1.38 g, 0.25 mmol）からSPSSにより製造した。開裂および側鎖脱保護を手順Gに記載のように行い、ジスルフィド環化を手順Hに記載のように行った。HPLC精製により精製環状ペプチド105 mg（17.8%収率）を得た。
【０３６７】
実施例２：Ａｃ−ＳＧＳＧＪＷＱＰＣ*ＰＷＥＳＷＴＦＣ*ＷＤＰＧＧＧＫ−ＮＨ2（環状９→１７）ペプチド（Ｓｅｑ０１７）の調製
手順A、GおよびHを用いて0.266 mmolスケールにてペプチドを製造し、HPLC精製により純粋な生成物130 mg（18.8%収率）を得た。
【０３６８】
実施例３：Ａｃ−ＲＷＱＰＣ*ＰＡＥＳＷＴ−Ｃｈａ−Ｃ＊ＷＤＰＧＧＧＫ−ＮＨ2環状（５→１３）ペプチド（Ｓｅｑ０４９）の調製
手順A、GおよびHの方法を用いてペプチドを製造した。HPLC精製により生成物140 mg（27.5%収率）部を綿状白色固体として得た。
【０３６９】
以下の実施例４および図１は、Adoa-Adoa リンカー官能化Seq005の調製のために用いた方法を記載する。
【０３７０】
実施例４：Ａｃ−ＷＱＰＣ*ＰＡＥＳＷＴＦＣ*ＷＤＰＧＧＧＫ（ＪＪ）−ＮＨ2環状（４→１２）ペプチド、（Ｓｅq005−ＪＪ）の調製
ivDde保護ペプチドAc-W(Nin-Boc)-Q(Trt)-P-C(Trt)-P-A-E(OtBu)-Ser(tBu)-W(Nin-Boc)-T(tBu)-F-C(Trt)-W(Nin-Boc)-D(OtBu)-P-GGGK(ivDde)-NH-TGRを130μmolスケール（0.65 g樹脂）にて組み立てた（手順A）。DMF中10%ヒドラジン6.5 mLで10分間（2×）樹脂を処理することによりivDde基を除去した（手順D）。次いで樹脂をDMF（4×）で洗浄した。分離フラスコにて、NMP（1 mL）中のFmoc-Adoa (100 mg, 0.26 mmol, 2.0当量)をDMF（0.5 mL）中のHATU (99 mg, 0.26 mmol, 2当量)およびDIEA (67 mg, 91μL, 0.52 mmol, 4当量)で2分間処理した後、樹脂を含む容器に溶液を移し、次いで常温にて12時間容器を撹拌した（手順F）。
【０３７１】
樹脂をDMF（4×5 mL）で洗浄し、DMF (10 mL, 2×10分)中20%ピペリジンで処理してFmoc基を除去した後、DMFで洗浄（4×10 mL）した（手順C）。次いでFmoc-Adoaを上記樹脂（上記参照）とカップリングし、Fmoc保護基（上記参照）を除去し、樹脂を洗浄した。開裂および側鎖脱保護（手順G）を試薬B (10 mL)を用いて4.5時間行った。樹脂を取り出し、TFA (5 mL)で洗浄し、集めた溶液の溶媒を留去し、エーテルでトリチュレーションし、粗製の直線状ペプチドを灰白色固体として得た。固体をDMSO (3 mL)に溶解した後、0.1M水性N-メチルグルカミンを添加することにより溶液のpHを8に調節した。混合物を48時間撹拌し（手順H）、反応時間を分析用HPLCおよび質量分析でモニターした。反応完了時に、全溶液をH2O中10% CH3CNで15 mLに希釈し、水性TFAを添加することによりpHを2に調節した。
【０３７２】
得られた溶液を分取用逆相C18カラムに適用し、10% CH3CN (0.1% TFA)〜H2O (0.1% TFA)の直線勾配を用いて精製した。フラクション15 mLを集め、純粋な生成物を含むフラクションをプールし、冷凍し、凍結乾燥し、ペプチド42 mg (13%収率)を綿状白色固体として得、これをHPLCおよび質量分析により特徴付けた。HPLC: tR 3.83 min; カラム: Waters XTerra MS-C18 4.6 x 50 mm; 粒子サイズ: 5ミクロン; 溶離液: A: 水 (0.1% TFA), B: アセトニトリル (0.1% TFA); 溶出: 7分で直線勾配5-65% B; 流速: 3 mL/min; 検出: UV,λ = 220 nm. 質量スペクトル (API-ES): Neg.イオン: [M-H]: 2480.6; [M-2H]/2: 1239.9 
【０３７３】
以下の実施例５および６はＮ末端Ａｌｏｃ−アルギニンを有するペプチドの調製を記載する。
実施例５：Ａｌｏｃ−ＲＷＱＰＣ*ＰＷＥＳＷＴＦＣ*ＷＤＰＧＧＧＫ−ＮＨ2環状（５→１３）ペプチド（Ｓｅｑ０２３−Ａｌｏｃ）の調製
【０３７４】
W(Nin-Boc)-Q(Trt)-P-C(Trt)-P-W(Nin-Boc)-E(OtBu)-S(tBu)-W(Nin-Boc)-T(tBu)-F-C(Trt)-W(Nin-Boc)-D(OtBu)-P-GGG-K(Boc)-PAL-PEG-PS樹脂0.54 mmol (3 g)を自動SPSSにより製造した（手順A）。以下の手順Bの改変を用いてAloc-Arg(Pmc)をN-末端に連結した。樹脂をマニュアル固相合成容器に加え、軽く撹拌することによりDMF (20 mL)中に懸濁した。Aloc-Arg(Pmc)-OH (524 mg, 1.00 mmol, 1.85当量)、HATU (380 mg, 1.0 mmol, 1.85当量)およびDIEA (257 mg, 347  L, 1.98 mmol, 3.67当量)を容器の撹拌を停止して連続して加え、容器を終夜振盪した。陰性ニンヒドリン試験により示されるようにカップリング反応を完了した。樹脂をDCM (3×20 mL)で洗浄し、乾燥した。
【０３７５】
試薬B (88:5:5:2-TFA: 水: フェノール: TIPS - v/v/wt/v) (25 mL)を容器に加え、容器を常温にて5時間振盪した。樹脂をろ過し、TFA (2×5 mL)で洗浄した。集めたろ液を濃縮し、シロップとし、これをEt2O (20 mL)でトリチュレーションし、得られた固体を遠心分離によりペレット化した。上清をデカンテーションし、工程を3回繰り返した（手順G）。得られた固体を集め、記載のように（手順H）環化し（48時間）、逆相C18カラムでHPLCにより精製した。生成物含有フラクションをプールし、冷凍し、凍結乾燥し、所望の生成物290 mg (21%収率)を得た。
【０３７６】
実施例６：Ａｌｏｃ−ＲＷＱＰＣ*ＰＡＥＳＷＴ−Ｃｈａ−Ｃ＊ＷＤＰＧＧＧＫ−ＮＨ2（Ｓｅｑ０５７−Ａｌｏｃ）の調製
ペプチドを手順A、B、GおよびHの方法により製造し、生成物230 mg (26.7%収率)を綿状白色固体として得た。
【０３７７】
以下の実施例7およびFigure 2は、ペプチドの5-カルボキシフルオレセイン誘導体の製造を記載し、説明する。
【０３７８】
実施例７：ＲＷＱＰＣ*ＰＡＥＳＷＴＦＣ*ＷＤＰＧＧＧＫ（ＣＦ５）−ＮＨ2環状（５→１３）ペプチド（Ｓｅｑ０５６−ＣＦ５）の調製
ペプチドAloc-RWQPC*PAESWTFC*WDPGGGK-NH2環状(5→13)ペプチド (Seq056-Aloc)を手順A、B、GおよびHの方法により製造し、HPLCにより精製した。N-末端Aloc Nε20-CF5誘導体を以下の手順Iにより製造した。ペプチド (70 mg, 0.029 mmol)を撹拌しながら無水DMF (1 mL)に溶解した後、DIEA (0.074 g, 100μL, 0.572 mmol, 19.7当量)、次いでCF5-NHS (20 mg, 0.042 mmol, 1.45当量)の無水DMF溶液を加えた。混合物を常温にて1時間撹拌した。反応混合物をH2O中20% CH3CNでその容積の2倍に希釈し、C18逆相分取用HPLCカラムで精製し、Aloc-RWQPC*PAESWTFC*WDPGGGK(CF5)-NH2環状(5→13)ペプチド50 mg (62.8%収率)を得た。
【０３７９】
この中間体のAloc基を以下の手順Lにより除去した。中間体をNMM:HOAc:DMF (1:2:10, v/v/v, 5 mL)の溶液に溶解し、混合物を撹拌し、Pd(PPh3)4 (21 mg, 0.018 mmol, 1.0当量)を加えた。混合物を常温にて1時間撹拌した。次いで反応混合物をH2O中10% CH3CNでその容積の2倍に希釈し、CH3CN (0.1% TFA)〜H2O (0.1% TFA)の直線勾配を用いて分取用逆相C18カラムで精製した。純粋生成物含有フラクションをプールし、冷凍し、凍結乾燥し、生成物29 mg (60.4%収率)を橙色固体として得た。
【０３８０】
以下の実施例８〜１６および図３〜５は、リポペプチド、特にＤＳＰＥ−ＰＧ４−ペプチドコンジュゲート、ＤＰＰＥ−ＰＧ４−ペプチドコンジュゲート、ＤＰＰＥ−ＰＧ２−ペプチドコンジュゲート、およびＤＰＰＥ−Ｐｒｏ９−Ｇｌｕｔ−Ｔｔｄａ−Ｄｇａ−ペプチドコンジュゲートの調製を記載する。以下のＴａｂｌｅ５は、リポペプチドのＭＳおよび解析データを示す：
【表１６】
2010512400.tif 000041
【０３８１】
実施例８：Ａｃ−ＷＱＰＣ*ＰＡＥＳＷＴＦＣ*ＷＤＰＧＧＧＫ（ＤＳＰＥ−ＰＧ４−Ｇｌｕｔ）−ＮＨ2環状（４→１２）ペプチド（Ｓｅq005−ＰＬ１）の調製
ペプチドAc-ＷＱＰＣ*PAESWＴＦＣ*WDPGGGK-NH2 環状 (4→12)ペプチド(Seq005) (150 mg, 0.069 mmol)のDMF (1.0 mL)溶液をDSG (0.34 mmol, 112 mg, 5 当量）およびDIEA (15 mg, 20 μL, 0.12 mmol, 1.67 当量）のDMF (1.0ｍL）溶液に攪拌しながら加えた。混合物を0.5時間攪拌し、反応の進行をＨＰＬＣおよびMSによりモニターした。反応が完了したら、揮発性成分をを減圧留去し、残留物を酢酸エチル(3 × 10 mL) で洗浄して未反応のDSGを除去した。残留物を乾燥し、無水ＤＮＦ (1.0 mL) に再溶解し、DSPE-PG4-NH2 (134 mg, 0.048 mmol)のDMF (1.0 mL)溶液、次いで、DIEAA (15 mg, 20 μL, 0.12 mmol, 1.67 当量）を加えた。混合物を １６時間攪拌した。反応の進行をＨＰＬＣによりモニターし、アミノPEG化リン脂質が１６時間で消費されたことを示した。
【０３８２】
反応混合物 を脱イオン化蒸留水で希釈し、逆相 分取用 カラム (YMCPrep C4, 粒子サイズ 10 μm, 30 x 250 mm)で精製した（50-75％水のグラジェント（0.1％ＴＦＡ) into CH3OH:CH3CN (1:1, v/v, 0.1%ＴＦＡ) 流速：30 mL/min（５分）次いで、100% B （50分間で）。フラクション (15 mL)をHPLCにより解析し、純粋な生成物を含有するフラクションをプールした。ロータリーエバポレーターにより、集めた生成物を含有するフラクションからメタノールを留去し、得られた溶液を１０％アセトニトリル水溶液で希釈し、凍結乾燥して１０８ｍｇ（４４％収率）の所望の生成物を綿状の白色の固体として得た。
【０３８３】
実施例９：Ａｃ−ＳＧＳＧＳＧＳＧＷＱＰＣ*ＰＷＥＳＷＴＦＣ*ＷＤＰＧＧＧＫ（ＤＳＰＥ−ＰＧ４−Ｇｌｕｔ）−ＮＨ2環状（１２→２０）ペプチド（Ｓｅｑ０２４−ＰＬ１）の調製
DSG (50 mg, 0.15 mmol, 4.41 当量）およびDIEA (20 mg, 0.15 mmol, 4.41 当量）の無水ＤＮＦ (2.0 mL)溶液を攪拌し、ペプチドAc-SGSGSGSGＷＱＰＣ*PWESWＴＦＣ*WDPGGGK-NH2 環状 (12→20)ペプチド(Seq024) (100 mg, 0.034 mmol)を固体の形態で、上記溶液に少量ずつ加えた。混合物を室温にて３０分間攪拌た。反応混合物の体積をEtＯＡcの添加により５０ mLに調整し、遠心および上清の傾斜により、析出した固体をペレット化した。洗浄を繰り返し（３回）てペプチドのグルタル酸モノアミド モノ−NHSエステル（マススペクトル解析により同一性が確認された [(M-2H)/2: 1546.1, (M-3H)/3: 1030.5]）を無色の固体として得た。 
【０３８４】
このペプチドのグルタル酸モノアミド モノ−NHSエステルを乾燥ＤＭＦ-DCM (2.0 mL, 8:2, v/v)に溶解した。DIEAA (40 mg, 54 μL, 0.31 mmol) を加え、混合物を攪拌した。
DSPE-PG4-NH2 (45 mg, 0.038 mmol, 0.9 当量）を固体として加え、混合物を常温にて２４時間攪拌した。CH3OH (50%)およびCH3CN−水（1:1) (50%)の添加により混合物の体積を100 mLに調整し、得られた溶液を濾過して 不溶性物質を除去した。
【０３８５】
濾過した溶液を、30 mL/分間にて50% CH3OHおよびCH3CN (溶離液A)−水（溶離液B) (1:1) で予め平衡化したC4 逆相 カラム(YMC,Prep C4, 10μM, 100Å, 30 x 250 mm) にロードした。カラムをDMFがカラムから溶出するまで同溶離液で洗浄した。移動相組成物を１分間に７０％Ｂまで増加させ、１％Ｂ／ｍｉｎの直線勾配率で１００％まで溶出を継続し、カラムを１００％Ｂで生成物が完全にカラムから溶出するまで溶出した。フラクション（１５ｍＬ）を集め、純度＞９８％で生成物を含有するフラクションを集め、ロータリーエバポレーターで濃縮してＣＨ3ＯＨの含量を減少させた。濃縮溶液を１０％ＣＨ3ＣＮ水溶液で希釈し、凍結乾燥して６５ｍｇ（６０％収率）の生成物を無色の固体として得た。
【０３８６】
実施例１０：Ａｃ−ＧＷＱＰＣ*ＰＷＥＳＷＴＦＣ*ＷＤＰＧＧＧＫ（ＤＳＰＥ−ＰＧ４−Ｇｌｕｔ）−ＮＨ2環状（５→１３）ペプチド（Ｓｅｑ０１６−ＰＬ１）の調製
ペプチドAc-GＷＱＰＣ*PWESWＴＦＣ*WDPGGGK-NH2 環状 (5→13)ペプチド(Seq016) (90 mg, 0.038 mmol)を無水ＤＮＦ (0.5 mL)に溶解し、この溶液をDSG (65 mg, 0.2 mmol, 5.26 当量）およびDIEA (25 mg, 33.8 μL, 0.2 mmol, 5.26 当量）の無水ＤＮＦ (0.5 mL)溶液に攪拌しながら加えた。混合物を２時間攪拌した後、EtＯＡc (20 mL)を加え、固体を形成させ、これを遠心によりペレット化した。上清液を傾斜し、この操作を２回繰り返して残存するDSGを除去した。固体を減圧下（＜0.1 mm) ３０分間乾燥した後、DMF (0.5ｍL）中で攪拌することにより再溶解した。固体のDSPE-PG4-NH2 (53 mg, 0.19 mmol)を少しずつ加え、得られた混合物を 一晩攪拌した。混合物を水（5 mL)で希釈し、粗製の混合物を分取用ＨＰＬＣにより精製して60 mg (30% 収率）の所望の生成物を 白色の凍結乾燥物として得た。
【０３８７】
実施例１１：Ａｃ−ＳＧＳＧＪＷＱＰＣ*ＰＷＥＳＷＴＦＣ*ＷＤＰＧＧＧＫ（ＤＳＰＥ−ＰＧ４−Ｇｌｕｔ）−ＮＨ2環状（９→１７）ペプチド（Ｓｅｑ０１７−ＰＬ１）の調製
ペプチドＡｃ−ＳＧＳＧＪＷＱＰＣ*ＰＷＥＳＷＴＦＣ*ＷＤＰＧＧＧＫ−ＮＨ2環状（９→１７）ペプチド(Seq017) (100 mg, 0.039 mmol)を、SEQ005-PL1の調製について記載した手順を用いて使用した。HPLC 精製により53 mg (25.7% 収率） 目的とする リン脂質-ペプチド コンジュゲートを得た。
【０３８８】
実施例１２：ＲＷＱＰＣ*ＰＷＥＳＷＴＦＣ*ＷＤＰＧＧＧＫ（ＤＳＰＥ−ＰＧ４−Ｇｌｕｔ）−ＮＨ2環状（５→１３）ペプチド（Ｓｅｑ０２３−ＰＬ１）の調製
Aloc-RＷＱＰＣ*PWESWＴＦＣ*WDPGGGK-NH2 環状 (5→13)ペプチド(Seq023-Aloc) (100 mg, 0.04 mmol) のDMF (0.5 mL)溶液をDSG (50 mg, 0.153 mmol, 3.825 当量）のDMF (0.5ｍL）溶液に加えた。DIEAA (7.4 mg, 10 μL, 0.057 mmol, 1.43 当量）をこの溶液に加え、常温で１時間攪拌を続けた後、質量分析は反応の完了を示した。揮発性成分を高真空下で留去して半固体の残留物を得た。EtＯＡc (5 mL)をこの残留物に加えて微細な固形物を形成させ、これを遠心によりペレット化した。上清液を傾斜し、洗浄をを繰り返した（５回）。これにより、100 mg (92％収率）の白色の固体（ペプチドの中間体Ｎε19-グルタル酸酸モノアミド モノ−NHSエステル）を得た。同じように２回目の操作を行い、さらに100 mgの白色の固体を得た。マススペクトル解析は予測される中間体の構造と一致した。中間体NHSエステルのモノアイソトピック分子量は2713である。上記の手順により得られた白色の固体のマススペクトル解析 (API-ES 陰イオン)は1356 [(M-2H)/2]および1431.6 [(M+ＴＦＡ-2H)/2]にピークを有していた。
【０３８９】
ペプチドのグルタル酸モノアミドモノ−NHSエステル (200 mg, 0.074 mmol)をDMF (1 mL)に溶解し、攪拌しながらDIEA (11 mg, 15 μL, 0.085 mmol, 1.15 当量）を加えた。DSPE-PG4-NH2 (160 mg, 0.8 当量）のDMF (1 mL)溶液を混合物に加え、常温で一晩攪拌した。揮発性成分を高真空下で留去した。残留物を13 ｍLのNMM/HＯＡc/DMF (1:2:10, v/v/v) に再溶解した。Pd(ＰＰh3)4 (300 mg, 3.0 当量）を一度に加えた。混合物を１時間攪拌した。MSおよびHPLC解析は反応の完了を示した。粗製の反応混合物 を同体積の20% CH3CN水溶液で希釈し不溶性物質 を濾過した。 得られた溶液をC4 逆相 HPLC カラムに直接付し、Seq005-PL1について記載したのと同様にして分取用ＨＰＬＣで精製した。純粋な生成物を含有するフラクション をプールし、凍結乾燥して140 mg (29% 収率 DSPE-PG4-NH2のインプットに基づく) の標的化合物を 綿状の固形物として得た。
【０３９０】
実施例１３：Ａｃ−ＲＷＱＰＣ*ＰＡＥＳＷＴ−Ｃｈａ−Ｃ＊ＷＤＰＧＧＧＫ（ＤＳＰＥ−ＰＧ４−Ｇｌｕｔ）−ＮＨ2、環状（５→１３）ペプチド（Ｓｅｑ０４９−ＰＬ１）の調製
Seq005-PL1で記載したのと同様にして、Ac-RＷＱＰＣ*PAESWT-Cha-C*WDPGGGK-NH2 環状 (5→13)ペプチド(94 mg, 0.04 mmol, 1.25 当量）を用いて57 mg (34% 収率）の目的とするリン脂質ペプチド コンジュゲートを得た。
【０３９１】
実施例１４：ＲＷＱＰＣ*ＰＡＥＳＷＴ−Ｃｈａ−Ｃ＊ＷＤＰＧＧＧＫ（ＤＳＰＥ−ＰＧ４−Ｇｌｕｔ）−ＮＨ2環状（５→１３）ペプチド（Ｓｅｑ０５７−ＰＬ１）の調製
Aloc-RＷＱＰＣ*PAESWT-Cha-C*WDPGGGK-NH2 環状 (5→13)ペプチド(Seq057-Aloc) (230 mg, 0.096 mmol) の無水ＤＮＦ (1 mL)溶液を、DIEAA (110 mg, 0.86 mmol, ペプチドに対して8.9当量)を含有するDSG (180 mg, 0.55 mmol, 5.75 ペプチドに対して当量) の無水ＤＮＦ (0.5 mL)溶液に攪拌しながら滴加した。反応混合物を３時間攪拌し、反応の進行を解析 HPLCおよび質量分析によりモニターした。溶媒を３０℃にて高真空下で留去して粘稠な残留物を得た。残留物をEtＯＡc (15 mL)容器にさらに加えてトリチュレートし白色の固体を得、これを遠心によりペレット化した。上清液を傾斜し、同様にして固体を洗浄（３回）し、乾燥窒素ガス気流により乾燥した。 
【０３９２】
得られた固形物中間体を攪拌しながら無水ＤＮＦ (1 mL)に溶解し、DIEA (110 mg, 149 μL, 0.86 mmol, ペプチドに対して８．９当量)を加え、DSPE-PG4-NH2 (213 mg, 0.077 mmol, 0.8 当量）の 無水ＤＮＦ (1ｍL）を滴加した。混合物を常温で一晩攪拌した後、HPLC解析および質量分析により脂質の消費を示した。
【０３９３】
揮発性成分を高真空下で留去し、攪拌しながら、粗製の混合物を、13 ｍLのNMM:HＯＡc:DMF (1:2:10, v/v/v)の溶液に加えた。Pd(ＰＰh3)4 (250 mg, 0.22 mmol, ペプチドに対して２．２５当量) を攪拌しながら溶液に加え、攪拌を４時間継続した。固形物を濾過し、得られた溶液を25% CH3CN水溶液で２倍量に希釈した。得られた溶液を、25% B (0.1% ＴＦＡを添加したCH3CN) で流速：30 mL/分間で予め平衡化したZorbax C-3 カラム (21.2 mm i.d. × 150 mm) に付した。カラムをDMFのプラグが溶出するまで流速30 mL/minで同溶離液で溶出した。３分間で溶離液Bの濃度を25% B〜30% Bに増大させ、50分間で100% Bまで増大させた。フラクション (15 mL) を集め、生成物を含有するフラクション をプールし、凍結乾燥した。 単離された生成物のHPLC解析は更なる精製が必要であることを示した。精製を繰り返し、プールした純粋な生成物を含有するフラクションを凍結し、凍結乾燥することにより単離して、23 mg (4.5% 収率）の目的のリン脂質-ペプチド コンジュゲートを得た。
【０３９４】
以下の実施例１５は、リポペプチドＤＰＰＥ−ＰＧ４−ペプチドコンジュゲートの精製を記載する。
実施例１５Ａ：Ａｃ−ＷＱＰＣ*ＰＡＥＳＷＴＦＣ*ＷＤＰＧＧＧＫ（ＤＰＰＥ−ＰＧ４−Ｇｌｕｔ）−ＮＨ2環状（４→１２）ペプチド（Ｓｅq005−ＰＬ２）の調製
DSPE-PG4-NH2の代わりにDPPE-PG4-NH2を用いることを除いては、Seq005-PL1について記載したのと同様の手順により行った。ペプチドAc-ＷＱＰＣ*PAESWＴＦＣ*WDPGGGK-NH2 環状 (4→12)ペプチド(Seq005) (66 mg, 0.03 mmol)およびDIEA (11 mg, 15 μL, 0.085 mmol, 2.84 当量）のDMF (0.5 mL)溶液を、DSG (33 mg, 0.10 mmol, 3.3 当量）のDMF (0.5ｍL）溶液に攪拌しながら加えた。混合物を １時間攪拌し、反応の進行をＨＰＬＣおよびMSによりモニターした。反応が完了したら, 揮発性成分をを減圧留去し、残留物を酢酸エチルで洗浄し(4 × 5 mL)、未反応のDSGを中間体ペプチドグルタル酸モノアミド モノ−NHSエステルから除去した。
【０３９５】
得られた 固形物 を乾燥し、無水ＤＮＦ(1.00 mL) に再溶解し、DPPE-PG4-NH2 (95 mg, 0.035 mmol, 1.16 当量）のDMF (1.0 mL)溶液とともに２４時間攪拌した。反応の進行をＨＰＬＣによりモニターし、中間体ペプチドグルタル酸モノアミド モノ−NHSエステルの完全な消費を示した。この溶液を水で希釈し、 逆相 C4 分取用 カラム (Kromasil（登録商標）Prep C4, 10 μm, 300Å, 20 x 250 mm, 流速 25 mL/min)で精製した（60-100％水（0.1％ＴＦＡ)のグラジェントおよびCH3OHおよびCH3CN (1:1, 0.1% ＴＦＡ) の混合物（30分間）。フラクションを１５ｍLずつ集め、ELSDおよび紫外線検出器(λ = 220 nm)を用いてHPLC (カラム: YMC C-4, 5 μm, 300Å, 4.6 x 250 mm)により解析した。純粋な生成物を含有するフラクションを集め、ロータリーエバポレーターで濃縮して溶出液からメタノールを留去し、得られた溶液を10% CH3CN水溶液で希釈し、凍結乾燥して、72 mg (48% 収率）の所望の生成物を綿状の白色の固体として得た。
【０３９６】
実施例15B：Seq000-PL1として称される、DSPE-PG4-Glutとコンジュゲートした競合ペプチドSeq000の調製
実施例15Aの手順と同様にして、Ac-ＷＱＰＣ*PWESWＴＦＣ*WDPGGGK(DPPE-PG4-Glut)-NH2 環状 (4→12)ペプチドSeq000-PL1を調製した。ペプチドAc-ＷＱＰＣ*PWESWＴＦＣ*WDPGGGK-NH2 環状 (4→12)ペプチド(Seq000) (115 mg, 0.05 mmol)およびDIEA (130 mg, 176 μL, 1.0 mmol, 20 当量）のDMF (2.0 mL)溶液をDSG (100 mg, 0.30 mmol, 6 当量）のDMF (0.5ｍL）溶液に攪拌しながら加えた。混合物を １時間攪拌し、反応の進行をＨＰＬＣおよびMSによりモニターした。反応が完了したら、揮発性成分を減圧留去し、残留物を酢酸エチルで洗浄し(4 × 20 mL) 未反応のDSGを中間体ペプチドグルタル酸モノアミド モノ−NHSエステルから除去した。
【０３９７】
得られた固形物を乾燥し、無水ＤＮＦ(1.0 mL)に再溶解し、DPPE-PG4-NH2 (160 mg, 0.0573 mmol, 1.11 当量）のDMF (1.0 mL)溶液とともに２４時間攪拌した。反応の進行をＨＰＬＣによりモニターして、中間体ペプチドグルタル酸モノアミド モノ−NHSエステルの完全な消費を示した。この溶液を水で希釈し、逆相 C4 分取用 カラム (Kromasil（登録商標）Prep C4, 10 μm, 300Å, 20 x 250 mm, 流速 25 mL/min)により精製した（50-100％水（0.1％ＴＦＡ)のグラジェントおよびCH3OHおよびCH3CN (1:1, 0.1% ＴＦＡ) の混合物（30分間）。フラクションを１５ｍLずつ集め、 ELSDおよび紫外線検出器 (λ = 220 nm)を用いてHPLC (カラム: YMC C-4, 5 μm, 300Å, 4.6 x 250 mm) により解析した。純粋な生成物を含有するフラクションを集め、ロータリーエバポレーターで濃縮してメタノールを溶出液から留去し、得られた溶液を10% CH3CN水溶液でで希釈し、凍結乾燥して、138 mg (52% 収率）の所望の生成物を綿状の白色の固体として得た。
マススペクトル: 方法: MALDI, モード: 陽イオン, [M+Na+2H]: 5199 (average)
HPLC: Ret. time: 5.88 min; アッセイ: ＞98% (area %); カラム: YMC C-4, 5μM, 300Å, 4.6 x 50 mm; 溶離液: A: 水（0.1% ＴＦＡ), B: アセトニトリル:メタノール(1:1, v/v)(0.1%ＴＦＡ); 溶出: 初期条件:  80% B,直線勾配 80-100% B （10分間）; 流速: 3.0 mL/min; 検出:紫外線（ 220 nm） ＆ ELSD.
【０３９８】
以下の実施例１６Ａおよび図５は、ＤＰＰＥ−Ｇｌｕｔ−ＰＧ２−ペプチドコンジュゲートの調製を記載する。
実施例１６Ａ：Ａｃ−ＷＱＰＣ*ＰＡＥＳＷＴＦＣ*ＷＤＰＧＧＧＫ（ＤＰＰＥ−Ｇｌｕｔ−ＰＧ２−ＪＪ）−ＮＨ2環状（４→１２）ペプチド（Ｓｅq005−ＰＬ３）の調製
ペプチド Ac-ＷＱＰＣ*PAESWＴＦＣ*WDPGGGK(JJ)-NH2 環状 (4→12)ペプチド(Seq005-JJ) (63 mg, 0.025 mmol) をDMF (1.0 mL)に溶解し、DIEA (9.8 mg, 13.3 μL, 0.076 mmol, 3 当量）を加えた。溶液を手短に攪拌し、Fmoc-PG2-NHS (111 mg, 0.032 mmol, 1.28 当量）のDMF (1.0 mL)溶液を攪拌しながら滴加した。混合物を１６時間攪拌し、HPLC解析により出発物質のペプチドの消費を示した。反応混合物をピペリジン(172 mg, 200 μL, 2.02 mmol, 80 equiv, final 濃度 ~9% v/v in 反応混合物) で３０分間処理した後、反応混合物をH2Oで希釈し、以下の方法により、逆相 C4 カラム (Kromasil（登録商標）Prep C4, 10μm, 300Å, 20 x 250 mm)を用いる分取用ＨＰＬＣにより精製し（溶出: DMFのプラグを初濃度20%のCH3CN水溶液(0.1% ＴＦＡ)で溶出した後、20%-80％CH3CN (0.1% ＴＦＡ)のH2O (0.1% ＴＦＡ)への直線勾配（40分間流速：25 mL/min）生成物を溶出した。フラクション (15 mL) を集め、純粋な生成物を含むフラクション (HPLC 解析) をプールし、凍結乾燥して 70 mg (47% 収率）のPG2-誘導体化されたペプチドＡｃ−ＷＱＰＣ*ＰＡＥＳＷＴＦＣ*ＷＤＰＧＧＧＫ（ＮＨ2−ＰＧ２−ＪＪ）−ＮＨ2環状（４→１２）ペプチドを得た。
【０３９９】
Ac-ＷＱＰＣ*PAESWＴＦＣ*WDPGGGK(NH2-PG2-JJ)-NH2 環状 (4→12)ペプチド(50 mg, 0.009 mmol, 1.14 当量）のDMF (1.0 mL)溶液をDIEAA (14.8 mg, 20 μL, 0.114 mmol, 14.6 当量）、次いでDMF:CH2Cl2の1:1 混合物（1.0 mL)中のDPPE-Glut-NHS (7 mg, 0.0078 mmol)で処理し、混合物を室温にて１６時間攪拌した。溶液をH2Oで希釈し 10 mLに希釈し、逆相 C4 分取用 カラム (Kromasil（登録商標）Prep C4, 10μM, 300Å, 10 x 250 mm, 流速：10 mL/min)で精製した（50-80％水（0.1％ＴＦＡ)/アセトニトリル:MeOH (1:1, 0.1%ＴＦＡ)のグラジェント（40分間）。純粋な生成物を含有するフラクション をプールし、凍結乾燥して26 mg (42% 収率） の標的化合物を 綿状の白色の固体として得た。
【０４００】
以下の実施例１６Ｂ〜１６Ｃは、ＤＰＰＥ−Ｐｒｏ９−Ｇｌｕｔ−Ｔｔｄａ−Ｄｇａ−ペプチドコンジュゲートの調製を記載する。以下の実施例１６ＤはリポペプチドＳｅq000−ＰＬ２のＳｅq000（Ａｄｏａ−Ａｄｏａ）およびＤＰＰＥからの調製を記載する。
【０４０１】
実施例16B:  Ac-WQPCPAESWTFCWDPGSAGSK(DPPE-Pro9-Glut-Ttda-Dga)-NH2 環状 (4→12)ペプチド(Seq005-PL4)の調製
Seq005-P2(Ttda-Dga)の調製
0.2 mmol スケール(手順A)の1.2 gのFmoc-Pal-Peg-PS樹脂 (0.17 mmol/g)にてペプチド鎖の伸張を行い、Ac-W(Nin-Boc)-Q(Trt)-P-C(Trt)-P-A-E(OtBu)-S(tBu)-W(Nin-Boc)-T(tBu)-F-C(Trt)-W(Nin-Boc)-D(OtBu)-P-GS(tBu)-A-G-S(tBu)-K (ivDde)-NH-Pal-Peg-PS樹脂を得た。これを２回行い、得られた樹脂を合わせた。ivDde基を20 ｍLの10% ヒドラジンのDMF溶液を用いて脱離した (2 x 10 min)。次いで無水ジグリコール酸 (0.464 g, 10当量）およびDIEA (0.516 g, 0.7 mL, 4.0 mmol)のDMF (20 mL)溶液を樹脂に加え、樹脂を１５時間攪拌した。樹脂をDMF (5 x 20 mL)で洗浄した後、N1-(tert−ブトキシカルボニル)-1,3-ジアミノ-4,7,10−トリオキサトリデカン (0.513 g, 1.6 mmol, 4当量）, HATU (0.608 g, 1.6 mmol, 4当量）およびDIEA (0.413 g, 0.558 mL, 3.2 mmol, 8当量） のDMF (20 mL) 溶液で１５時間処理した。樹脂をDMF (5 x 20ｍL）で洗浄した。ペプチドを試薬B （手順G)を用いて樹脂から開裂させ、粗製の固形物ペプチドをジスルフィド環化 （手順H)に付した。粗製の混合物 を水で約５倍量に希釈し、Waters XTerra C-18 (250 mm x 50 mm i.d.) カラムに付し、標題の手順に記載したとおりACN (0.1% ＴＦＡ) のH2O (0.1% ＴＦＡ) への直線勾配溶出を用いて精製した。純粋な生成物を含有するフラクションをプールし、凍結乾燥して 175 mg (16.2％収率）のペプチドを綿状の白色の固体として得た。
【０４０２】
Ａｃ−ＷＱＰＣＰＡＥＳＷＴＦＣＷＤＰＧＳＡＧＳＫ（ＤＰＰＥ−Ｐｒｏ９−Ｇｌｕｔ−Ｔｔｄａ−Ｄｇａ）−ＮＨ2環状（４→１２）ペプチド（Ｓｅq005−ＰＬ４）のＤＰＰＥ−Ｐｒｏ９−ＨおよびＳｅq005−Ｐ２（Ｔｔｄａ−Ｄｇａ）からの調製
DPPE-(Pro)9-H（120 mg, 0.077 mmol）をDSG (100 mg, 0.306 mmol, 4.0当量）のDMF (2 mL)溶液に加えた後、DIEAA (0.059 g, 0.08 mL, 0.46 mmol, 6.0 当量）を加えた;混合物を４時間攪拌した。揮発性成分を高真空下で留去した。得られた粗製の残留物をEtＯＡcで２回洗浄してDSG、残留した微量のDMFおよびDIEAを除去した。粗製物をDMF (1 mL)に再溶解し、Seq005-P2(Ttda-Dga) [Ac-WQPCPAESWTFCWDPGSAGSK(Dga-Ttda)-NH2], (170 mg, 0.063 mmol) のDMF (1 mL)溶液を加え、次いでDIEAA (0.088 g, 0.12 mL, 0.69 mmol, 加えたペプチドに対し11当量)を加えた。 混合物を４０℃にて１５時間攪拌した。  得られた混合物を35% MeOH水溶液（25 mL) で希釈し、0.45 ミクロンのフィルターで濾過した。溶液を分取用ＨＰＬＣで精製した。純粋な生成物を含有するフラクションを集め、凍結乾燥して生成物(90 mg, 32.8% 収率）を綿状の固形物として得た。
【０４０３】
実施例16C: Ac-WQPCPAESWTFCWDPGAGSGK(DPPE-Pro9-Glut-Ttda-Dga)-NH2環状 (4→12)ペプチド(Seq005-PL5)の調製
Seq005-P3(Ttda-Dga)の調製
0.2 mmol スケール(手順A)の1.2 gのFmoc-Pal-Peg-PS樹脂 (0.17 mmol/g)にてペプチド鎖の伸張を行い、Ac-W(Nin-Boc)-Q(Trt)-P-C(Trt)-P-A-E(OtBu)-S(tBu)-W(Nin-Boc)-T(tBu)-F-C(Trt)-W(Nin-Boc)-D(OtBu)-P-G-A-G-S(t-Bu)-G-K(ivDde)-NH-Pal-Peg-PS樹脂を得た。これを２回行い、得られた樹脂を合わせた。ivDde基を20 ｍLの10% ヒドラジンのDMF溶液を用いて脱離した (2 x 10 min)。次いで無水ジグリコール酸(0.464 g, 10当量）およびDIEA(0.516 g, 0.7 mL, 4.0 mmol)のDMF (20 mL)溶液を樹脂に加え、樹脂を１５時間攪拌した。樹脂をDMF (5 x 20 mL)で洗浄した後、N1-(tert−ブトキシカルボニル)-1,3-ジアミノ-4,7,10−トリオキサトリデカン(0.385 g, 1.2 mmol, 3当量）, HATU (0.456 g, 1.2 mmol, 3当量）およびDIEA (0.310 g, 0.419 mL, 2.4 mmol, 6当量）のDMF  (15 mL) 溶液で１５時間処理した。樹脂をDMF (5 x 20ｍL）で洗浄した。ペプチドを試薬B （手順G)を用いて樹脂から開裂させ、粗製の固形物ペプチドをジスルフィド環化 （手順H)に付した。粗製の混合物 を水で約５倍量に希釈し、Waters XTerra C-18 (250 mm x 50 mm i.d.) カラムに付し、標題の手順に記載したとおりACN (0.1% ＴＦＡ) のH2O (0.1% ＴＦＡ) への直線勾配溶出を用いて精製した。純粋な生成物を含有するフラクションをプールし、凍結乾燥して227.7 mg (21.3％収率）のペプチドを綿状の白色の固体として得た。
【０４０４】
Ａｃ−ＷＱＰＣＰＡＥＳＷＴＦＣＷＤＰＧＡＧＳＧＫ（ＤＰＰＥ−Ｐｒｏ９−Ｇｌｕｔ−Ｔｔｄａ−Ｄｇａ）−ＮＨ2環状（４→１２）ペプチド（Ｓｅq005−ＰＬ５）ｆｒｏｍＤＰＰＥ−Ｐｒｏ９−ＨおよびＳｅq005−Ｐ３（Ｔｔｄａ−Ｄｇａ）の調製
DSG (75 mg, 0.230 mmol, 3.59当量）のDMF (0.75 mL)溶液を攪拌し、この混合物にDCM (0.5ｍL）に溶解したDPPE-(Pro)9-H (100 mg, 0.064 mmol)を加えた。次いで、DIEAA (0.03 g, 0.04 mL, 0.23 mmol, 3 当量）を加え、混合物を４時間攪拌した。マススペクトル解析により、DPPE-(Pro)9のグルタル酸モノ−アミド-モノ−NHSエステルの形成を確認した。揮発性成分を高真空下で留去し、粗製の残留物を高真空下に２時間維持した。得られた粗製の残留物をトリチュレートし、EtＯＡcで洗浄して、DSGおよび残留する微量のDMFおよびDIEAを除去した。粗製物をDCM (1 mL)に再溶解し、Seq005-P3(Ttda-Dga) [Ac-WQPCPAESWTFCWDPGSAGSK(Ttda-Dga)-NH2], (165 mg, 0.062 mmol)のDMF (1 mL)溶液を加えた後、DIEAA (0.088 g, 0.12 mL, 0.69 mmol, 加えたペプチドに対し11当量)を加えた。混合物を４０℃にて１５時間攪拌した後、HPLCおよびMS解析は所望の生成物を形成を示した。得られた混合物を35% MeOH の水（15 mL)溶液 で希釈し、0.45ミクロンのフィルターを用いて濾過した。溶液を分取用ＨＰＬＣC2 カラムを用いて精製した。化合物をカラム（25% ACN-MeOH 1:1, v/v (溶離液B)  水（溶離液A)中）に付した。化合物をアプライした後、溶媒プラグを溶出し、溶離組成物の濃度を50% Bに高め、ついで３０分間で50-100% Bに増加させた。純粋な生成物を含有するフラクションを集め、大部分のMeOHをロータリーエバポレーターにより留去した。Tert−ブチルアルコールを混合物に加え、混合物を 凍結乾燥して生成物 (125 mg, 46.5% 収率）を綿状の固形物として得た。
【０４０５】
実施例16D:競合リポペプチド Seq000-PL2の調製
完全に側鎖が保護されたペプチド配列Ac-W(Boc)-Q(Trt)-P-C(Trt)-P-W(Boc)-E(O-t-Bu)-S(t-Bu)-W(Boc)-T(ΨMe,Mepro)-F-C(Trt)-W(Boc)-D(O-t-Bu)-P-GGGK(ivDde)-TGRを0.2 mmolスケールで調製した。ivDde 保護基を400 mg (通常0.08 mmol)の樹脂から脱離した（手順D)。樹脂をDMF (2 × 20 mL)およびDCM (20 mL)で洗浄し、DMF (10 mL)に再懸濁し、Fmoc-Adoa (154 mg, 0.4 mmol), HOBt (54 mg, 0.4 mmol),ＤＩＣ (51 mg, 62 μL, 0.4 mmol)およびDIEA (139 μL, 0.8 mmol) で４時間処理した。試薬を濾過し、樹脂をDMF (2 × 20 mL)およびDCM (20ｍL）で洗浄した。Fmoc基を20%ピペリジンのDMF (2x20 mL) (修飾した手順C)で処理することにより脱離し、樹脂をDMF (2 × 20 mL)およびDCM (20ｍL）で洗浄した。Fmoc-Adoaとカップリングし、Fmoc脱離を繰り返した。樹脂をDMF (7 mL)に再懸濁し、3,6,9-トリオキサウンデカン-1,11−二酸無水物溶液で [対応する酸(1.0 g, 0.45 mmol))およびDIC (0.56 g, 0.45 mmol)を塩化メチレン (5.0 mL)中１２時間反応させることにより調製、溶液を濾過し直接用いた]１６時間処理した。試薬を濾取し、樹脂をDCM (2x 20 mL)およびDMF (2x 20 mL)で洗浄し、DCM (10 mL)に再懸濁し、ジパルミトイル ホスファチジル エタノールアミン (690 mg, 1.0 mmol), HATU (450 mg, 1.0 mmol)DIEAA (400 mg)のDCM (5.0 mL)溶液で処理し、混合物を２６時間振盪した（修飾した手順Ｂ）。試薬を濾取し、樹脂をDMF (2 × 20 mL)およびDCM (2x 20 mL)で洗浄し、乾燥した。次いで、樹脂を試薬B (30 mL)で４時間処理した（手順G)。樹脂を濾取し、ろ液を濃縮し、200 ｍLの無水 Et2Oで処理して、濾過により粗製物を固体として集めた。得られた400 mgの粗製物をDMSO (4.0 mL)に溶解した後、溶液のpＨをn-メチル-D-グルカミンの水溶液によりを7.5に調整し、空気中で48h攪拌して環状ペプチドジスルフィドを形成させた。溶液 を水で40 mLに希釈し、逆相 分取用ＨＰＬＣ (Kromasil（登録商標）Prep C4, 10μ, 300Å, 20 x 250 mm, 流速 10 mL/min)（50-100％水（0.1％ＴＦＡ)/アセトニトリル:MeOH (1:1, 0.1%ＴＦＡ)グラジェント（１５分間））で精製した。純粋な生成物を含有するフラクションを集め、凍結乾燥して標的化合物 (28 mg, 10% 収率）を綿状の白色の固体として得た。
【０４０６】
以下の実施例17〜20は、リン脂質にコンジュゲートしたフィブリン−結合 ポリペプチド(リポペプチド)を有する標的化されたマイクロバブルの調製方法を記載する。そのような マイクロバブルは、超音波イメージングに特に適している。
実施例１７: DSPC/DPPGエンベロープを有する標的化されたマイクロバブルの調製
実施例17A − 比較リポペプチド Seq000-PL1を有する
383 mgのDSPC/DPPG/Seq000-PL1混合物(モル比47.5/47.5/5, それぞれ157.5, 148.5および 77.3 mgの３成分に対応)および22.6 gのPEG-4000を、120 gのt-ブチルアルコール（湯浴中６０℃）に溶解した。溶液をそれぞれ0.8 mLバイアルに封入した。サンプルを−45℃にて凍結乾燥した。ヘッドスペースの空気をC4F10/窒素 (50/50)混合物で置換し、バイアルをキャップしておよび圧着した。凍結乾燥したサンプルを、各バイアルにつき、5 ｍLのH2Oで再構成した。
【０４０７】
実施例17B - Seq005-PL1
Seq000-PL1を同モル比のSeq005-PL1に置き換えて実施例17A を繰り返した。
【０４０８】
実施例18 −DPPE/DPPG エンベロープを有する標的化された マイクロバブル
実施例18A - 比較 リポペプチド Seq000-PL1
DSPE-PEG1000 (0.5 mg − 0.28 μmole)およびSeq000-PL1 (3.3 mg − 0.63 μmole) の水性懸濁液を500μLの蒸留 水（60℃）中で調製してミセル懸濁液を得た。
【０４０９】
別途、DPPE (15.8 mg − 22.8 μmoles)およびDPPG (4.2 mg − 5.7 μmoles) を２０ｍLの蒸留水（７０℃）中のPEG4000 10%にて２０分間分散させた。次いで、分散液を室温に冷却した。高速ホモジナイザー (Polytron PT3000, プローブ径3 cm) を10000 rpmにて１分間用いペルフルオロヘプタン (1.6 mL)を水相に加えてエマルジョンを得た。
【０４１０】
ミセル懸濁液をエマルジョンと混合し、得られた混合物を80℃に１時間攪拌しながら加熱した。室温に冷却した後(1時間)、混合物を遠心(200g/10min - Sigma centrifuge 3K10) により１回洗浄し、過剰のリン脂質を除去した。上清(溶媒の乳化した微液滴を含む)を回収し、元の容量の10% PEG 4000 水溶液で再懸濁した。
【０４１１】
得られた懸濁液をDIN8R バイアル (1 mL / バイアル)にサンプリングした。次いで、バイアルを−50℃ (Christ Epsilon  ２−12DS Freeze Dryer)に冷却し、-25℃、0.2 mbarにて12時間凍結乾燥し、最終の乾燥ステップ（30℃および0.1 mbar）を７時間行った。
【０４１２】
凍結乾燥体をC4F10/窒素 (50/50体積)を含む雰囲気に暴露し、バイアルを密閉した。
【０４１３】
凍結乾燥品を、手で穏やかに振盪しながら、元の２倍容量の水に分散させた。
【０４１４】
実施例18B - Seq017-PL1
Seq000-PL1を同モル比のSeq017-PL1に置き換えて実施例18A を繰り返した。
【０４１５】
実施例18C - Seq005-PL1
Seq000-PL1を同モル比のSeq005-PL1に置き換えて実施例18A を繰り返した。
【０４１６】
実施例19 − DSPC/DSPG エンベロープを有する標的化された マイクロバブルの調製
実施例19A - DSPC/DSPG 製剤比較 リポペプチド Seq000-PL1 
DSPE-PEG1000 (0.5 mg − 0.28 μmole)およびSeq000-PL1 (3.3 mg − 0.63 μmole)の水性懸濁液を500μLの蒸留 水（60℃）中で調製してミセル懸濁液を得た。
【０４１７】
別途、DSPC (18mg、 22.75 μmoles)およびDSPG (2 mg 、2.53 μmoles) を８０℃のシクロオクタン（１．６ｍL）に再溶解した。高速ホモジナイザー (Polytron PT3000, プローブ径3 cm) を9000 rpmにて１分間用い、この有機相を水（２０ｍL）中のPEG4000 10%に加えてエマルジョンを得た。
【０４１８】
ミセル懸濁液をエマルジョンと混合し、得られた混合物を80℃に１時間攪拌しながら加熱した。室温に冷却した後(1時間)、得られたエマルジョンを遠心(1500g/10min - Sigma centrifuge 3K10) により１回洗浄し、過剰のリン脂質を除去した。上清(溶媒の乳化した微液滴を含む)を回収し、元の容量の10% PEG 4000 水溶液で再懸濁した。
【０４１９】
得られた懸濁液をDIN8R バイアル (1 mL / バイアル)にサンプリングした。次いで、バイアルを−50℃ (Christ Epsilon  ２−12DS Freeze Dryer)に冷却し、-25℃、0.2 mbarにて12時間凍結乾燥し、最終の乾燥ステップ（30℃および0.1 mbar）を７時間行った。
【０４２０】
凍結乾燥体をC4F10/窒素 (35/65体積)を含む雰囲気に暴露し、バイアルを密閉した。
【０４２１】
凍結乾燥品を、手で穏やかに振盪しながら、元の２倍容量の水に分散させた。
【０４２２】
実施例19B DSPC/DSPG製剤比較ペプチドSeq000-PL1 
2.6mg of DSPE-PEG1000 (1.44 μmoles)および1.9mgのSeq000-PL1 (0.36μmole)を用いて実施例19A を繰り返してミセル懸濁液を調製した。
【０４２３】
実施例19C Seq024-PL1を有するDSPC/DSPG製剤
2.6mg Seq024-PL1 (0.45 μmoles)および0.8mg DSPE-PEG1000 (0.45 μmoles) を用いて実施例19A を繰り返してミセル懸濁液を調製した。
【０４２４】
実施例19D Seq023-PL1を有するDSPC/DSPG 製剤
2.4mg Seq023-PL1 (0.45 μmoles)および0.8mg DSPE-PEG1000 (0.45 μmoles) を用いて実施例19A を繰り返してミセル懸濁液を調製した。
【０４２５】
実施例19E D Seq016-PL1 を有するSPC/DSPG 製剤
2.3mg Seq016-PL1 (0.45 μmoles)および0.8mg DSPE-PEG1000 (0.45 μmoles) を用いて実施例19A を繰り返してミセル懸濁液を調製した。
【０４２６】
実施例20A〜20D - DSPC/ステアリン酸 エンベロープを有する標的化された マイクロバブルの調製
実施例20A - 比較 リポペプチド Seq000-PL1 
DSPE-PEG1000 (0.5 mg − 0.28 μmoles)およびSeq000-PL1 12 (3.3 mg − 0.63 μmoles) の水性懸濁液を500μLの蒸留 水（60℃）中で調製してミセル懸濁液を得た。
【０４２７】
別途、DSPC (18.2 mg − 23.1 μmoles)およびステアリン酸 (1.8 mg − 5.8 μmoles) を２０ｍLの蒸留水（７０℃）中のPEG4000 10%にて２０分間分散させた。次いで、分散液を室温に冷却した。高速ホモジナイザー (Polytron PT3000, プローブ径3 cm) を10000 rpmにて１分間用いペルフルオロヘプタン (1.6 mL)を水相に加えてエマルジョンを得た。
【０４２８】
ミセル懸濁液をエマルジョンと混合し、得られた混合物を６０℃に４時間攪拌しながら加熱した。室温に冷却した後(1時間)、得られたエマルジョンを遠心(200g/10min - Sigma centrifuge 3K10) により１回洗浄し、過剰のリン脂質を除去した。上清(溶媒の乳化した微液滴を含む)を回収し、元の容量の10% PEG 4000 水溶液で再懸濁した。
【０４２９】
得られた懸濁液をDIN8R バイアル (1 mL / バイアル)にサンプリングした。次いで、バイアルを−50℃ (Christ Epsilon  ２−12DS Freeze Dryer)に冷却し、-25℃、0.2 mbarにて12時間凍結乾燥し、最終の乾燥ステップ（30℃および0.1 mbar）を７時間行った。
【０４３０】
凍結乾燥体をC4F10/窒素 (３５/６５体積)を含む雰囲気に暴露し、バイアルを密閉した。
【０４３１】
凍結乾燥品を、手で穏やかに振盪しながら、元の２倍容量の水に分散させた。
【０４３２】
実施例20B - Seq017-PL1 
Seq000-PL1を同モル比のSeq017-PL1に置き換えて実施例20Aを繰り返した。
【０４３３】
実施例20C - Seq005-PL1 
Seq000-PL1を同モル比のSeq005-PL1に置き換えて実施例20を繰り返した。
【０４３４】
実施例20D - Seq016-PL1 
DSPGを5.8 μmolesのステアリン酸に置き換えて実施例20を繰り返した。
【０４３５】
実施例20E〜20H - DSPC/DSPA エンベロープを有する標的化された マイクロバブルの調製
実施例20E − Seq005-PL4
DSPC (16.3 mg − 20.58 μmoles), DSPA (3.7 mg − 5.15 μmoles)およびSeq005-PL4(0.26 μmole、上記のとおり調製)をシクロオクタン (1.6 mL)（80℃）に再溶解した。
【０４３６】
高速ホモジナイザー (Polytron PT3000, プローブ径3 cm) を8000 rpmにて１分間用い、有機の懸濁液をPEG4000 10% 水相 (20 mL)中で乳化してエマルジョンを得た。
【０４３７】
得られたエマルジョンを80℃に１時間攪拌しながら加熱した。室温に冷却した後(1時間)、エマルジョンを遠心(1500g/10min - Sigma centrifuge 3K10) により１回洗浄し、過剰のリン脂質を除去し、上清(微液滴)を回収し、元の容量の２倍量の10% PEG 4000 水溶液で再懸濁した。
【０４３８】
エマルジョンをDIN8R バイアル (1 mL / バイアル)にサンプリングした後、以下のとおり凍結乾燥した (ラボラトリーフリーズドライヤーLyobeta-35 TELSTＡR）。
凍結: 2h （-50℃）
主乾燥: 12h（-25℃および0.2mBar）
最終乾燥: 6h （30℃および0.1mBar）
【０４３９】
再分散の前に、凍結乾燥物ををC4F10/空気 (５０/５０体積)を含む雰囲気に暴露した。次いで、穏やかに攪拌、振盪しながら凍結乾燥物を元の体積の２倍量の水に分散させた。
【０４４０】
実施例20F − Seq005-PL4
DSPC (16.3 mg − 20.58 μmoles), DSPA (3.7 mg − 5.15 μmoles)およびSeq005-PL4(0.795 μmole、上記のとおり調製)をシクロオクタン (1.6 mL)（80℃）に再溶解した。
【０４４１】
高速ホモジナイザー (Polytron PT3000, プローブ径3 cm) を8000 rpmにて１分間用い、有機の懸濁液をPEG4000 10% 水相 (20 mL)中で乳化してエマルジョンを得た。
【０４４２】
得られたエマルジョンを80℃に１時間攪拌しながら加熱した。室温に冷却した後(1時間)、エマルジョンを遠心(1500g/10min - Sigma centrifuge 3K10) により１回洗浄し、過剰のリン脂質を除去し、上清(微液滴)を回収し、元の容量の２倍量の10% PEG 4000 水溶液で再懸濁した。
【０４４３】
エマルジョンをDIN8R バイアル (1 mL / バイアル)にサンプリングした後、以下のとおり凍結乾燥した (ラボラトリーフリーズドライヤーLyobeta-35 TELSTＡR）。
凍結: 2h （-50℃）
主乾燥: 12h（-25℃および0.2mBar）
最終乾燥: 6h （30℃および0.1mBar）
【０４４４】
再分散の前に、凍結乾燥物ををC4F10/空気 (５０/５０体積)を含む雰囲気に暴露した。次いで、穏やかに攪拌、振盪しながら凍結乾燥物を元の体積の２倍量の水に分散させた。
【０４４５】
実施例20G − Seq005-PL5
DSPC (16.3 mg − 20.58 μmoles), DSPA (3.7 mg − 5.15 μmoles)およびSeq005-PL5(0.26 μmole、上記のとおり調製) をシクロオクタン (1.6 mL)（80℃）に再溶解した。
【０４４６】
高速ホモジナイザー (Polytron PT3000, プローブ径3 cm) を8000 rpmにて１分間用い、有機の懸濁液をPEG4000 10% 水相 (20 mL)中で乳化してエマルジョンを得た。
【０４４７】
得られたエマルジョンを80℃に１時間攪拌しながら加熱した。室温に冷却した後(1時間)、エマルジョンを遠心(1500g/10min - Sigma centrifuge 3K10) により１回洗浄し、過剰のリン脂質を除去し、上清(微液滴)を回収し、元の容量の２倍量の10% PEG 4000 水溶液で再懸濁した。
【０４４８】
エマルジョンをDIN8R バイアル (1 mL / バイアル)にサンプリングした後、以下のとおり凍結乾燥した (ラボラトリーフリーズドライヤーLyobeta-35 TELSTＡR）。
凍結: 2h （-50℃）
主乾燥: 12h（-25℃および0.2mBar）
最終乾燥: 6h （30℃および0.1mBar）
【０４４９】
再分散の前に、凍結乾燥物ををC4F10/空気 (５０/５０体積)を含む雰囲気に暴露した。次いで、穏やかに攪拌、振盪しながら凍結乾燥物を元の体積の２倍量の水に分散させた。
【０４５０】
実施例20H − 比較ペプチドSeq000-PL2 
DSPC (16.3 mg − 20.58 μmoles), DSPA (3.7 mg − 5.15 μmoles)およびSeq000-PL2 (0.26 μmole、上記のとおり調製) をシクロオクタン (1.6 mL)（80℃）に再溶解した。
【０４５１】
高速ホモジナイザー (Polytron PT3000, プローブ径3 cm) を8000 rpmにて１分間用い、有機の懸濁液をPEG4000 10% 水相 (20 mL)中で乳化してエマルジョンを得た。
【０４５２】
得られたエマルジョンを80℃に１時間攪拌しながら加熱した。室温に冷却した後(1時間)、エマルジョンを遠心(1500g/10min - Sigma centrifuge 3K10) により１回洗浄し、過剰のリン脂質を除去し、上清(微液滴)を回収し、元の容量の２倍量の10% PEG 4000 水溶液で再懸濁した。
【０４５３】
エマルジョンをDIN8R バイアル (1 mL / バイアル)にサンプリングした後、以下のとおり凍結乾燥した (ラボラトリーフリーズドライヤーLyobeta-35 TELSTＡR）。
凍結: 2h （-50℃）
主乾燥: 12h（-25℃および0.2mBar）
最終乾燥: 6h （30℃および0.1mBar）
【０４５４】
再分散の前に、凍結乾燥物ををC4F10/空気 (５０/５０体積)を含む雰囲気に暴露した。次いで、穏やかに攪拌、振盪しながら凍結乾燥物を元の体積の２倍量の水に分散させた。
【０４５５】
実施例21 −フィブリン結合ペプチドを有する標的化された微小胞の動的結合試験
フィブリンコートカバーガラスの調製
カバーガラス (40 mm 経, Bioptechs Inc., Butler, PA, USA)を以下の方法にしたがってフィブリンでコーティングした。
【０４５６】
５ｍLのBSA 1% w/v の溶液（PBS中 pH 7.4）を、カバーガラス１枚を入れた60 mm のペトリ皿に加え、３７℃で１５分間インキュベーションした。カバーガラスを5 ｍLのTween 80/PBS (0.1%, v:v)で３回洗浄した。ヒト フィブリノーゲン溶液 (50 mM ナトリウム リン酸塩中0.5 mg/mL, NaCl 280 mM, pH 7.4)１ｍLにつき、２５ μLのヒトトロンビン溶液（5 U/mL）を、静かに混合した。この溶液５ｍLを直ぐに各ペトリ皿にそれぞれ分注した。カバーガラスを３７℃で１時間、次いで４５℃で一晩インキュベーションした。
【０４５７】
結合アッセイ
標的化された 微小胞の結合試験は、パラレルプレートフローチェンバー(FCS2, Bioptech Inc., Butler, PA, USA) （チェンバーガスケット厚：０．２５mm、上下のチェンバーの反転のためにアダプターを取付）を用いて行った。ガス充填 微小胞 (5 x 106 バブル/mL（50% ヒト 血漿PBS中）) を、60 mL syringe (Terumo)を取り付けた調整可能な注入ポンプ（Auto Syringe（登録商標） AS50 Infusion Pump, Baxter, Deerfiel−ジL, USA）を用いてフローチェンバーがら吸引した。所望のずり速度（約 114 s-1）になるようにポンプの流速を1 mL/minに調整した。１０分後、フローを停止し、Olympus IX 50 倒立顕微鏡に取り付けた、40 x 対物レンズおよびCCDモノクロカメラ(F-View II, Soft Imaging System、 Germany)を用いて、カバーガラスの異なる位置(約 0.025 mm2の表面）でランダムに写真撮影を行った。各写真における微小胞の数を測定し、写真全体について平均値を求め、得られた数値を１０で割った(“スロープ”即ち、 １分当たりの結合下微小胞の平均数を求めた)。 
【０４５８】
実施例17〜20の各調製物について、結合アッセイを４回繰り返し、スロープの平均値を求めた。スロープは、標的物質に対する微小胞の結合速度を示す。例えば、スロープ値８は１０分間に平均８０個の微小胞がコーティングされたカバーガラスに結合したことを示す。スロープの値が高い程、フロー状態で標的に結合する微小胞の能力が優れていることを示す。
【０４５９】
実施例１７〜２０で調製した微小胞の結合活性について、以下の Table５〜１０に示す、これらの表に示されるように、本発明のペプチド（特にそれらの各リポペプチド)は、比較対象のペプチドSeq000 (特に、対応するリポペプチド Seq000-PL1およびSeq000-PL2)に対して優れた活性を示す。
【表１７】
2010512400.tif 000042
【表１８】
2010512400.tif 000043
【表１９】
2010512400.tif 000044
【表２０】
2010512400.tif 000045
【表２１】
2010512400.tif 000046
【０４６０】
実施例22
キレート錯体1の調製
【０４６１】
キレート錯体１の調製のための合成手順をスキーム５に示す。
【化２５】
2010512400.tif 000047
【０４６２】
キレート錯体１
図１に図示されるように製造したFmoc-PAL-PEG-PS樹脂担持中間体A (5.00 g; 0.90 mmol)をSPPS容器にてDMAC (40 mL)中1時間振盪し、樹脂を膨潤させた。溶媒をろ過した後、Fmoc-GGG-OH (1.48 g; 3.60 mmol)、HOBt (0.55 g; 3.60 mmol)、DIC (0.56 mL; 3.60 mmol)およびDMAC (40 mL)を樹脂に加え、懸濁液を室温にて6時間振盪し、混合物をろ過し、樹脂をDMAC (5x40 mL)で洗浄した。次いで樹脂をDMAC (7 mL)中50%モルホリンで10分間振盪し、混合物をろ過し、新たにDMAC (7 mL)中50%モルホリンを加えた。懸濁液を20分間撹拌した後、混合物をろ過し、樹脂をDMAC (5x40 mL)で洗浄した。Fmoc-Lys(Fmoc)-OH (2.13 g; 3.60 mmol)、HOBt (0.55 g; 3.60 mmol)、DIC (0.56 mL; 3.60 mmol)およびDMAC (40 mL)を樹脂に加え、懸濁液を室温にて6時間振盪し、ろ過し、樹脂をDMAC (5x40 mL)で洗浄した。次いで樹脂をDMAC (7 mL)中50%モルホリンで10分間振盪し、混合物をろ過し、新たにDMAC (7 mL)中50%モルホリンを加えた。懸濁液を20分間撹拌した後、混合物をろ過し、樹脂をDMAC (5x40 mL)で洗浄した。Fmoc-Lys(Fmoc)-OH (4.26 g; 7.20 mmol)、HOBt (1.10 g; 7.20 mmol)、DIC (1.12 mL; 7.20 mmol)およびDMAC (40 mL)を樹脂に加え、懸濁液を室温にて6時間振盪し、ろ過し、樹脂をDMAC (5x40 mL)で洗浄した。次いで樹脂をDMAC (7 mL)中50%モルホリンで10分間振盪し、混合物をろ過し、新たにDMAC (7 mL)中50%モルホリンを加えた。懸濁液を20分間撹拌した後、混合物をろ過し、樹脂をDMAC (5x40 mL)で洗浄した。DTPA-Glu (10.7 g; 14.4 mmol)、HOBt (2.20 g; 14.4 mmol)、DIC (2.26 mL; 14.4 mmol)、DIEA (4.90 mL; 28.8 mmol)およびDMAC (40 mL)を樹脂に加えた。懸濁液を室温にて24時間振盪し、ろ過し、樹脂をDMAC (5x40 mL)、CH2Cl2 (5x40 mL)で洗浄した後、減圧乾燥した。樹脂を「試薬B」150 mLとフラスコ中にて4.5時間振盪した。樹脂をろ過し、溶液を減圧留去し、油状粗製物を得、Et2O (40 mL)で処理した後、析出物を得た。析出物を遠心分離し、デカンテーションし、Et2O (4x40 mL)で洗浄し、白色固体2.10 gを得た。この生成物2.10 gをDMSO (36 mL)およびH2O (4.0 mL)の混合物に溶解し、D-(-)-N-メチルグルカミン1.23 gでpHを8に調節した。溶液を室温にて96時間撹拌した後、分取用HPLCにより精製した。生成物を含むフラクションを凍結乾燥し、所望のキレートリガンド (0.280 g; 0.058 mmol)を白色固体として得た。リガンド (0.240 g; 0.050 mmol)をH2O (80 mL)に懸濁し、0.1 N NaOH (8.50 mL; 0.85 mmol)をpH 6.5まで加えて溶解した。0.1 N NaOH (6.0 mL; 0.60 mmol)によりpH 6.5を維持して5.187 mM水性GdCl3 (38.3 mL; 0.202 mmol)を加えた。溶液を0.1 N NaOHでpH 7.0に調節した後、XAD 1600 カラムに充填し、H2O／ACN勾配(所望の生成物はACN = 30の百分率で溶出する)で溶出し、溶媒を留去した後、化合物キレート錯体1ナトリウム塩(0.167 g; 0.029 mmol)を白色固体として得た。総収率 3.8 %。
【０４６３】
キレート錯体1の分析データ
Mr: 5663.73 (C205H276Gd4N48Na10O83S2)
CE (キャピラリー電気泳動): 88.5%(領域%)
MS: 得られたデータはキレート錯体1構造と一致する。
【０４６４】
MS (質量分析) : 得られたデータはキレート錯体1の構造と一致した。
【０４６５】
実施例23
キレート錯体2の調製
【０４６６】
キレート錯体２の調製のための合成手順をスキーム６に示す。
【化２６】
2010512400.tif 000048
【０４６７】
キレート錯体2
上記手順Aにより得られたFmoc-PAL-PEG-PS樹脂担持中間体B (3.00 g; 0.60 mmol)をDMAC (25 mL)の入ったSPPS容器中1時間振盪し、樹脂を膨潤した。溶媒をろ過した後、樹脂をDMF (5x25 mL)で洗浄した。次いで樹脂をDMF (25 mL)中10%ヒドラジンと15分間振盪し、溶媒をろ過し、新たにDMF (25 mL)中10%ヒドラジンを加えた。
【０４６８】
懸濁液をさらに20分間撹拌した後、混合物をろ過し、樹脂をDMF (5x25 mL)、次いでDMAC (5x25 mL)で洗浄した。Fmoc-Lys(Fmoc)-OH (1.42 g; 2.40 mmol)、HOBt (0.36 g; 2.40 mmol)、DIC (0.37 mL; 2.40 mmol)およびDMAC (25 mL)を樹脂に加え、懸濁液を室温にて24時間振盪し、ろ過し、樹脂をDMAC (5x25 mL)で洗浄した。次いで樹脂をDMAC (25 mL)中50%モルホリンと10分間振盪し、混合物をろ過し、新たにDMAC (25 mL)中50%モルホリンを加えた。懸濁液を20分間撹拌した後、混合物をろ過し、樹脂をDMAC (5x25 mL)で洗浄した。Fmoc-Lys(Fmoc)-OH (2.84 g; 4.80 mmol)、HOBt (0.73 g; 4.80 mmol)、DIC (0.75 mL; 4.80 mmol)およびDMAC (25 mL)を樹脂に加え、懸濁液を室温にて24時間振盪し、ろ過し、樹脂をDMAC (5x25 mL)で洗浄した。次いで樹脂をDMAC (25 mL)中50%モルホリンと10分間振盪し、混合物をろ過し、新たにDMAC (25 mL)中50%モルホリンを加えた。懸濁液を20分間撹拌した後、混合物をろ過し、樹脂をDMAC (5x25 mL)で洗浄した。DTPA-Glu (7.17 g; 9.60 mmol)、HOBt (1.47 g; 9.60 mmol)、DIC (1.50 mL; 9.60 mmol)、DIEA (3.26 mL; 9.60 mmol)およびDMAC (25 mL)を樹脂に加えた。懸濁液を室温にて24時間振盪し、ろ過し、樹脂をDMAC (5x25 mL)、CH2Cl2 (5x25 mL)で洗浄した後、真空乾燥した。樹脂をフラスコ中「試薬B」100 mLと4.5時間振盪した。樹脂をろ過し、溶液を減圧留去し、油状粗製物を得、Et2O (40 mL)で処理した後、析出物を得た。析出物を遠心分離し、デカンテーションし、Et2O (4x40 mL)で洗浄し、白色固体1.60 gを得た。この生成物1.60 gをDMSO (27 mL)およびH2O (3.0 mL)の混合物に溶解し、D-(-)-N-メチルグルカミン0.94 gでpHを8に調節した。溶液を室温にて96時間撹拌した後、分取用HPLCにより精製した。生成物を含むフラクションを凍結乾燥し、所望のキレート配位子 (0.260 g; 0.060 mmol)を白色固体として得た。リガンド (0.220 g; 0.050 mmol)をH2O (80 mL)に懸濁し、pH 6.5まで0.1 N NaOH (7.40 mL; 0.74 mmol)を加えて溶解した。0.1 N NaOH (6.10 mL; 0.61 mmol)でpH 6.5を維持しながら6.21 mM 水性GdCl3 (32.60 mL; 0.202 mmol)を加えた。溶液を0.1 N NaOHでpH 7.0に調節した後、XAD 1600 カラムに充填し、H2O／ACN勾配 (所望の生成物はACN = 30の百分率で溶出する)で溶出し、溶媒留去後、キレート錯体2ナトリウム塩 (0.174 g; 0.033 mmol)を白色固体として得た。収率 6.6 %。
【０４６９】
分析データ
Mr: 5202.26 (C187H245Gd4N43Na10O74S2)
CE: 87.8%(領域%)
MS: 得られたデータはキレート錯体2構造と一致する。
【０４７０】
実施例24
キレート錯体4の製造
反応式６の合成手順に従い、対応するDTPAリガンドの代わりに適切なAAZTAリガンドを用いて、キレート錯体4も製造した。
キレート錯体4
【化２７】
2010512400.tif 000049
【０４７１】
リファレンス錯体
WO 02/055544により既知のペプチドAc-WQPC*PWESWTFC*WDGGGK-NH2を出発物質とし、反応式５および６の合成手順に従い、キレート配位子部分を適切に改変してリンカー官能基化ペプチド中間体にコンジュゲートすることにより、いくつかのキレート化合物をインビボおよびインビトロ試験のためのリファレンス化合物として製造した。
以下の参照化合物を特に製造した：
リファレンス1
【化２８】
2010512400.tif 000050
リファレンス2
【化２９】
2010512400.tif 000051
リファレンス3  
【化３０】
2010512400.tif 000052
リファレンス4
【化３１】
2010512400.tif 000053
リファレンス5
【化３２】
2010512400.tif 000054
【０４７２】
実施例25
ヒト／マウス凝血塊におけるフィブリンMRIイメージング
インビトロMRI試験
異なる種（ヒト、モルモットおよびマウス）からの小血漿凝血塊は、クエン酸血漿 (1:3,v/v) リン脂質（試薬パトロンチン（Pathromtin））およびCaCl2 0.008 M (Dade Behring, Germany)を2ml小バイアル中37℃にて混合することにより形成した。凝血塊をTBS 1Xで3回洗浄し、造影剤で100μMの錯体濃度にて37℃30分間インキュベートした。二の凝血塊をインキュベーションの各溶液について調製した。インキュベーション後、凝血塊をTBS 1Xで4回洗浄し、MRI分析のためにTBS 1Xを充填した小バイアルに入れた。T1加重2Dスピンエコー(SE)イメージを以下のパラメータ：TR/TE = 400/8 ms、空間分解能 = 430μmおよびスライス厚さ = 2 mmを用いて取得した。凝血塊を含む各イメージの最大シグナル強度を測定し、TBSでインキュベーションされた凝血塊のシグナルと比較した。MRI後に凝血塊をICP分析のために調製した。
【０４７３】
インキュベーション媒体中の種々の錯体濃度(25, 100および400μM)にて、ＭＲＩにより、本発明のキレート錯体１、リファレンス化合物１，リファレンス化合物２、リファレンス化合物５をヒトの凝血塊について試験した。
【０４７４】
結果
１００μＭ の濃度の化合物とインキュベーションした後に得られた凝血塊におけるシグナル増強を比較することにより、試験化合物をパフォーマンスの観点から以下のように分類することができた：
【表２２】
2010512400.tif 000055
【０４７５】
この結果は、本発明の化合物キレート錯体1が最大シグナルの増強を有することを示している。
【０４７６】
実施例26
腫瘍モデルにおけるフィブリンMRIイメージング
インビボMRI試験：
それぞれ５匹の群（３群；2.106神経芽細胞腫細胞をPBで接種）を用い、以下のとおり試験した：
群a: リファレンス化合物 2,  
群 b: キレート錯体1 
群 c: ProHance（登録商標）(プロトコル参照)
【０４７７】
腫瘍細胞植菌の10日後、インビボMRI試験のために、同様の腫瘍サイズ(直径5-10 mm)を有するマウスを各群少なくとも４匹選抜した。プレコントラストＭＲＩ（T1およびT2高分解能2Dスピンエコーおよび3Dグラジエントエコーイメージ）取得の後に、試験化合物を投与（２５μＭol／kg  iv.）し、注射後4時間および24時間にMRIを行った。最大シグナル強度を、全腫瘍領域にて測定し、全腫瘍を含むポストコントラストの各イメージにて測定し、プレコントラストイメージと比較した。MRI試験の終わりに、すべての動物を屠殺し、腫瘍、血液、肝臓、腎臓および大腿骨を取り出し、ICP-AESによりGdアッセイのために調製した。
【０４７８】
結果
すべての群において腫瘍サイズは同様であった（訳５００mm3）
【０４７９】
キレート錯体１の注射後１時間で有意の腫瘍シグナルの増強が観察されたが、リファレンス化合物２では増強は低く腫瘍全体をカバーしていなかった（９に対して＜３スライス、約３０％のスライスが腫瘍をカバーした）図８は、２５μＭol／ｋgの錯体の注射後、２Ｔで行った、T1加重ＭＲＩイメージの観察結果を示す。ProHance（登録商標）注射については、シグナル分布は境界においてのみであり、腫瘍内部でのシグナルの増強は観察されなかった。
【０４８０】
実施例２５および２６に記載のインビトロおよびインビボ試験は、以下のプロトコルにしたがって行った。
プロトコル
本発明のフィブリン標的化化合物のスクリーニング
本発明の化合物の特異性および効率を試験する目的で、以下の２つのプロトコルを開発し、用いた。１つは、凝血塊に対するインビトロＭＲＩについて記載するものであり、もう一方は、神経芽細胞腫マウスに対するインビボＭＲＩ試験について記載するものである。
【０４８１】
インビトロ試験
このプロトコルは、本発明のフィブリン標的化構築物試薬の特異性と効率を試験するために開発し用いた。本試験を種々の血漿種からインビトロで生成した凝血塊をに対して行った。フィブリン標的化構築物試薬とインキュベーションした各サンプルからのシグナル増強を評価し、標準の構築物試薬ProHance（登録商標）と比較した。
【０４８２】
物質
被験物質
化合物：試験における造影剤は、フィブリンペプチド、任意のリンカーおよび少なくとも一のガドリニウムのキレート錯体を含む本発明化合物である。
試薬
化合物：生物サンプル（種、生体液および株）：
モルモット血漿(Dunkin Hartley)
マウス血漿CD（登録商標）-1(ICR)BR IGS
ウサギ血漿(New Zealand White)
保存：−２０℃
【０４８３】
試験系
用いた試験系は、適切なモデルであり、本検討のために複製しやすいことから選択した、異なる血漿種（ヒト、モルモット、マウスおよびウサギ）からインビトロにて生成した凝血塊であった。
【０４８４】
装置
すべてのMRI実験は、最大強度110 mT/mおよび回転速度75μsで勾配設定をし、６つのTECHRON（登録商標）アンプ（４：１：１配置）により駆動するセルフシールドグラジェントセット（１６ｃｍ径）を取り付けた、MRRSコンソール(MR Research Systems Ltd, Surrey UK)と接続した、2T Oxford magnet (bore= 45 cm i.d.)にて行った。バードケージ共振器アンテナ(7.3 cm i.d.)を用いた。
【０４８５】
方法
インビトロ試験
送達された対照血漿Ｎを健康な血液ドナーから集めたプールされた血漿から得、ＨＥＰＥＳ緩衝溶液（１２ｇ／Ｌ）で安定化し、凍結乾燥した。使用前に、注意深く懸濁液を振盪して凍結乾燥血漿を溶解させることにより血漿対照Ｎを蒸留水中にて再構成した。凝血塊を２ｍＬバイアル中に形成させ、ここに、再構成された血漿３００μｌおよびパトロンチン**ＳＬ（二酸化ケイ素粒子、野菜リン脂質、塩化ナトリウム２．４g/L, Hepes 14.3 g/L, pH 7.6) 300μLを加えた。混合物を３７℃で２分間インキュベーションした後、先に３７℃にてインキュベーションした塩化カルシウム溶液３００μＬを加え、３７℃にて３０分間さらにインキュベーションして新たな混合物を得た。得られた塊を５ｍＬチューブに移し、ＴＢＳ３ｍＬで３回洗浄し、被験物質を０．０〜０．２ｍＭの最終濃度にて３７℃３０分間インキュベーションした。インキュベーションの終わりに、凝血塊をＴＢＳ３ｍＬで４回洗浄し、未結合被験物質を除去した後、ＭＲＩ法のために１．５ｍｌバイアルに入れた。
【０４８６】
次いでT1加重スピンエコー(SE)系列を用い、高分解能MRIを行った。T1マップをまた、2Dグラジエントエコーイメージまたは反転回復スピンエコーイメージの取得から算出した。
【０４８７】
実験の終わりに、凝血塊をICP-AES分析のために分析実験室に送った。
【０４８８】
生物サンプルにおけるガドリニウムのアッセイ
装置
アッセイは、以下の装置パラメータで操作するJobin-Yvon Mod 24分光計にて行った：
サンプル流速: 1 mL/min
プラズマフレア: 6000〜10000℃
波長: 342.247 nm
アルゴンフロー: ネブライザー0.3 L/min, トランスポートガス0.2 L/min, 冷却ガス12 L/min.
サンプル分解をマイクロウェーブ系により行った(MDS-2000 CEM Corporation)。
【０４８９】
サンプル調製および分析条件
各生物学的マトリックスについて、種々の調製物を用いた。
硝酸(65% v/v)1.5 mL中に塊を懸濁させることにより凝血塊溶液を調製した。硝酸(65% v/v)1.5 mLをインキュベーション（インキュベーション前および後）の溶液および洗浄溶液に加えた。
【０４９０】
サンプルにマイクロウェーブオーブン系による湿式灰化工程を行うことにより有機マトリクスの破壊を行った。
【０４９１】
最終的に所望な残渣をHCL 5%(v/v)3.0 mLに溶解した後、ICP-AESにより分析した。
【０４９２】
データ処理
簡潔に、直線性を二の標準についてそれぞれHCl 5% (v/v)中0.00〜20 mg(Gd)/Lの範囲にて低および高と評価した。機器較正直線を用いて、試験サンプル中のガドリニウムの全含量を算出し、μg(Gd)/mLとして表す。
【０４９３】
MRIデータ分析
平均シグナル強度を、凝血塊などの目的の領域(ROI)内にて測定し、専用ソフトウェア(MR Research Systems Ltd, Surrey UK)を用いて各MRイメージにてオペレータにより示した。シグナル強度増強(Enh%)を以下のように測定した：
Enh%= 100*(SIx-SI0)/SI0
（式中、SI0およびSIxはそれぞれ試験化合物無し、および有りでインキュベーションさせた凝血塊のシグナル強度である）。
【０４９４】
インビボテストのためのプロトコル
本試験の目的は、充実性腫瘍内のフィブリンの感受性検出のための造影剤として本発明のフィブリン標的物質の特異性および有効性を評価することであった。
【０４９５】
本試験は、A/Jマウスの右脇腹にNeuro-2a細胞を皮下注射により導入した神経芽細胞腫のマウスモデルにて行った（例えばY. Chen et al.）。マウスにおける神経芽細胞腫に対する照射腫瘍ワクチンと顆粒球由来マクロファージコロニー刺激因子の連続的な局在化注入の効果。J. Pediatr Surg. 2003. 37(9), 1298-1304; Anthony D. Sandler, Hiroshi Chihara and Gen Kobayashi.  et al., Cancer Research 2003, 63, 394-399を参照のこと）。
【０４９６】
腫瘍内のシグナル増強動力学を本発明のフィブリン標的造影剤の注射後に評価し、標準物質ProHance（登録商標）と比較した。
材料
試験物
化合物:試験した造影剤は、フィブリン標的ペプチド、任意のリンカーおよび少なくとも一のガドリニウムのキレート複合物を含む。
参照物
化合物: ProHance（登録商標）
濃度: 0.5 M
バッチ：Ｔ２０５９
保存条件：室温、遮光
試薬
化合物: ペニシリン／ストレプトマイシン (10000μg/mL), 供給業者: Biochrom KG, Berlin, Germany
化合物: L-グルタミン (200mM), 供給業者: SIGMA-ALDRICH, Steinheim, Germany
化合物: ウシ胎仔血清, 供給業者: HyClone（登録商標）, Logan, Utah, USA
化合物: 最小必須培地イーグル, 供給業者: SIGMA-ALDRICH, Steinheim, Germany
化合物: ダルベッコリン酸緩衝食塩水(PBS), 供給業者: SIGMA Chemicals, St. Louis, MO, U.S.A.
化合物: Zoletil 100, 供給業者: Virbac, Carros, France
化合物: Rompun（登録商標）, 供給業者: Bayer AG, Laverkusen, Germany
【０４９７】
試験系
動物
種および株: マウスA/J（神経芽細胞腫に対する薬物毒物学的およびイメージング試験に適当なモデルを選択）
動物の数および性別：１０匹（雄性）（５匹（雄性）／群）；交換用に５匹
到着時の体重および齢：２０〜２５ｇ；５〜６週齢
供給元：Harlan Italy, S. Pietro al Natisone (UD), Italy
【０４９８】
装置
すべての実験は、最大グラジェント強度110 mT/mおよびスルーレート75μsで、six TECHRON（登録商標）増幅装置により運転し、16cm i.d. セルフシールド勾配設定を設けた、2T Oxford magnet (bore= 45 cm i.d.)と接続した、MRRSコンソール(MR Research Systems Ltd, Surrey UK)にて行った。R.F.コイルとして、マウスの大きさに最適化された直交共振器を用いた。
【０４９９】
方法
実験設計
マウス神経芽細胞株(BS TCL 128 Neuro-2a)は、Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell'Emilia, Bresciaにより供給された。細胞を90% MEM培地および10%ウシ胎仔血清中にて増殖させ、集め、生理食塩水で2回洗浄し、PBS (106細胞/0.2mL)中にて再懸濁した。106細胞を各動物の右脇腹に皮下注射した。
【０５００】
MRI実験の日まで腫瘍直径を測定することにより植菌後一日おきに腫瘍の発症を追跡した。300〜700 mmの腫瘍直径を有する動物をインビボイメージングのために選択した。腫瘍のシグナル増強を被験物質の投与後24時間までMRIにより追跡し、参照物質のものと比較した。動物を麻酔し、実験中は麻酔を維持した。
【０５０１】
被験物質およびProHance（登録商標）(参照物質)をそれぞれ0.025〜0.1 mmol/kgの用量にて投与した。
【０５０２】
高分解能T1加重スピンエコーおよびグラジエントエコー系列を用いて、適切なコントラストのイメージを達成し、腫瘍を検出し、被験物質および参照物質のコントラストグラフィック効果を追跡した。
【０５０３】
実験終了時に動物を屠殺した。腫瘍、血液、腎臓、肝臓および大腿骨を取り出し、重量を測定し、ICP-AESにより分析するまで約4℃にて貯蔵した。
【０５０４】
生物サンプルにおけるガドリニウムのアッセイ
装置
アッセイは、以下の器具パラメータで操作したJobin-Yvon Mod 24分光計にて行った：
サンプル流速: 1 mL/min
プラズマフレア: 6000〜10000℃
波長: 342.247 nm
アルゴンフロー: ネブライザー0.3 L/min, トランスポートガス0.2 L/min, 冷却ガス12 L/min.
サンプル分解をマイクロウェーブ系により行った(MDS-2000 CEM Corporation)。
【０５０５】
サンプル調製および分析条件
各生物学的マトリックスについて、異なる調製物を用いた：
硝酸(65% v/v)1.5 mL中に正確に重量を量った腫瘍を懸濁させることにより腫瘍溶液を調製した。
【０５０６】
硝酸(65% v/v)1.5 mL中に正確に重量を量った肝臓を測定することにより肝臓を調製した。
【０５０７】
硝酸(65% v/v)1.5 mL中に正確に重量を量った各腎臓を懸濁させることにより腎臓溶液を調製した。
【０５０８】
硝酸(65% v/v)1.5 mL中に血液1 mLを混合することにより血液溶液を調製した。
【０５０９】
硝酸(65% v/v)1.5 mL中に正確に重量を量った各大腿骨を懸濁させることにより骨溶液を調製した。
【０５１０】
サンプルにマイクロウェーブオーブン系による湿式灰化工程を行うことにより有機マトリクスの破壊を行った。
【０５１１】
最終的に所望な残渣をHCL 5%(v/v)3.0 mLに溶解した後、ICP-AESにより分析した。
【０５１２】
データ処理
簡潔に、直線性を二の標準についてそれぞれHCl 5% (v/v)中0.00〜20 mg(Gd)/Lの範囲にて低および高と評価した。機器較正直線を用いて、試験サンプル中のガドリニウムの全含量を算出し、μg(Gd)/mLとして表す。
【０５１３】
MRIデータ分析
シグナル強度を全腫瘍などの興味の領域(ROI)内にて測定し、専用ソフトウェア(MR Research Systems Ltd, Surrey UK)を用いて各MRイメージにてオペレータにより示した。シグナル強度増強(Enh%)を以下のように測定した：
Ｅｎｈ％＝１００*（ＳＩx−ＳＩ0）／ＳＩ0
（式中、ＳＩ0およびＳＩx（ｔ）はそれぞれ造影剤（被験物質または参照物質）の注射前および後の腫瘍のシグナル強度であった）。
【０５１４】
集めたデータ（体重、臨床兆候、総病理学検査）は定性分析を行った。
【０５１５】
代表的な態様
以下に列挙するの非限定的な態様により、本発明をさらに記載する：
１．Ｔａｂｌｅ１またはＴａｂｌｅ２に示される配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する単離されたフィブリン結合ペプチド。
２．フィブリン結合ペプチドが検出可能な標識に連結している、態様１のフィブリン結合ペプチドを含んでなる診断用造影剤。
３．フィブリン結合ペプチドが、所望によりキレート化剤を介して、少なくとも１つの常磁性金属原子に連結している、磁気共鳴映像法に適した態様２の造影剤。
４．フィブリン結合ペプチドが音波を発生する標識に連結している、超音波イメージングに適当な態様２の造影剤。
５．フィブリン結合ペプチドが、所望によりキレート化剤を介して、診断用放射性核種に連結している、態様２の造影剤。
６．診断用放射性核種が64Ｃｕ、67Ｇａ、68Ｇａ、99mＴｃおよび111Ｉｎからなる群から選択される、態様５の造影剤。
７．フィブリン結合ペプチドがフルオレセイン化されている態様２の造影剤。
８．フィブリン結合ペプチドが治療薬剤に連結している態様１のフィブリン結合ペプチドを含んでなる治療薬剤。
９．フィブリン結合ペプチドが、所望によりキレート化剤を介して、治療用放射性核種に連結している、態様８の治療薬剤。
１０．治療用放射性核種が64Ｃｕ、90Ｙ、105Ｒｈ、111Ｉｎ、117ｍＳｎ、149Ｐｍ、153Ｓｍ、161Ｔｂ、166Ｄｙ、166Ｈｏ、175Ｙｂ、177Ｌｕ、186-188Ｒｅおよび199Ａｕからなる群から選択される、態様９の治療薬剤。
１１．キレート化剤が、ＤＴＰＡ、ＤＴＰＡ−ＧＬＵ、ＤＴＰＡ−Ｌｙｓ、ＤＯＴＡ、ＡＡＺＴＡ、および以下に示すそれらの誘導体：
【化３３】
2010512400.tif 000056
からなる群から選択される態様３の造影剤。
１２．以下からなる群から選択される態様３の造影剤：
キレート錯体１
【化３４】
2010512400.tif 000057
キレート錯体２
【化３５】
2010512400.tif 000058
キレート錯体３
【化３６】
2010512400.tif 000059
キレート錯体４
【化３７】
2010512400.tif 000060
キレート錯体５
【化３８】
2010512400.tif 000061
キレート錯体６
【化３９】
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キレート錯体７
【化４０】
2010512400.tif 000063
キレート錯体８
【化４１】
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キレート錯体９
【化４２】
2010512400.tif 000065
キレート錯体１０
【化４３】
2010512400.tif 000066
１３．超音波イメージングに適当な音波発生標識がガスを含んでなるマイクロバルーンを含んでなる、態様４の造影剤。
１４．超音波イメージングに適当な音波発生標識がガスを含んでなるマイクロバブルを含んでなる、態様４の造影剤。
１５．マイクロバブルが、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＧ、ＤＰＰＡ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ１０００、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ３４００、ＤＰＰＥ−ＰＥＧ３４００、パルミチン酸およびステアリン酸からなる群から選択される２またはそれ以上の混合物を含んでなる、態様１４の造影剤。
１６．ガスを含んでなるマイクロバブルを含んでなる超音波造影剤であって、マイクロバブルが、リン脂質に連結した態様１のフィブリン結合ペプチドを含んでなるリポペプチドを含んでなる、超音波造影剤。
１７．Seq000−ＰＬ１、Seq005−ＰＬ１、Seq0１６−ＰＬ１、Seq0１７−ＰＬ１、Seq0２３−ＰＬ１およびSeq0２４−ＰＬ１からなる群から選択されるリポペプチドを含んでなる、態様１６の超音波造影剤。
１８．マイクロバブルがさらにＤＳＰＣおよびＤＰＰＧを含んでなる態様１７の超音波造影剤。
１９．マイクロバブルがさらにＤＳＰＥ−ＰＥＧ１０００、ＤＰＰＥおよびＤＰＰＧを含んでなる態様１７の超音波造影剤。
２０．マイクロバブルがさらにＤＳＰＥ−ＰＥＧ１０００、ＤＳＰＣおよびＤＳＰＧを含んでなる態様１７の超音波造影剤。
２１．ガスが、所望により空気、窒素、酸素または二酸化炭素と混合されているＳＦ6またはａペルフルオロ炭素を含んでなる、態様１７の超音波造影剤。
２２．ガスが、所望により空気、窒素、酸素または二酸化炭素と混合されているＣ4Ｆ10を含んでなる態様１８〜２０のいずれかの超音波造影剤。
２３．さらに凍結乾燥添加剤および／または充填剤を含んでなる態様１６の超音波造影剤。
２４．アミノ酸配列Ａｃ−ＷＱＰＣ*ＰＷＥＳＷＴＦＣ*ＷＤＰＧＧＧＫ−ＮＨ2において以下の修飾：
（ａ）Ｔｒｐ6をＡｌａに置換；
（ｂ）Ｐｈｅ11をＣｈａに置換；および
（ｃ）Ｎ末端での１以上の極性アミノ酸の付加
の１以上を有する単離されたフィブリン結合ペプチド。
２５．態様２４のフィブリン結合ペプチドを含んでなる診断用造影剤であって、フィブリン結合ペプチドが検出可能な標識に連結している診断用造影剤。
２６．態様２４のフィブリン結合ペプチドを含んでなる治療薬剤であって、フィブリン結合ペプチドが治療薬剤と連結している治療薬剤。
２７．一般式（Ｉ）
A[-Y(-T)r]s              (I)
［式中、
Ａは、Ｔａｂｌｅ１またはＴａｂｌｅ２に示す配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるフィブリン結合ペプチド部分；
Ｙは、少なくとも１つのＴと連結している適当な連結部分であり、Ｓが２であるとき、Ｙは同一または互いに異なっていてもよく；
Ｔは、独立にそれぞれ診断的または治療的に活性な部分；
ｓは、１または２、および
ｒは、独立にそれぞれ１〜８の整数］
で示される化合物またはその生理学的に許容し得る塩。
２８．Ｔが診断的に活性な部分である態様２７の化合物。
２９．診断的に活性な部分が、キレート化ガンマ線またはキレート化またはポリキレート化錯体の形態の陽電子放出核種、常磁性金属イオン、原子番号２０を超える原子を含むＸ線吸収剤、色素分子、蛍光分子、リン光分子、紫外線スペクトルに吸収される分子、量子ドット、近赤外線または遠赤外線における吸収が可能な分子および超音波により検出可能な部分からなる群から選択される、態様２８の化合物。
３０．Ｔが治療上活性な部分である態様２７の化合物。
３１．治療上活性な部分が、血栓溶解剤、フィブリン溶解剤、細胞毒性物質、腫瘍細胞の選択的な殺傷および／または成長阻害のための薬剤および放射線治療薬からなる群から選択される態様３０の化合物。
３２．Ｙが、直鎖状または分岐鎖の２価の連結部分および直鎖状または分岐鎖の多官能性連結部分からなる群から選択される態様２７の化合物。
３３．２価の連結部分が−ＧＧＧＫを含んでなる態様３２の化合物。
３４．Ｔａｂｌｅ１に示されるSeq005を含んでなる態様２７の化合物。
３５．所望により保護されたＹ部分、または所望により保護されたＹ部分のサブユニットとコンジュゲートを形成するペプチド部分Ａを含んでなる中間体化合物であって、Ａが、Ｔａｂｌｅ１またはＴａｂｌｅ２に示す配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するフィブリン結合ペプチドであり、Ｙが連結部分である、中間体化合物。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【国際調査報告】
2010512400.tif 000078