(57)【要約】  本発明は、赤血球生成促進薬物（ESA）、例えばエリスロポエチン及びその誘導体による治療に関して、特に貧血に関して、心血管合併症を経験するリスクの診断に関する。より具体的には、本発明は、赤血球生成促進薬物（ESA）による将来の薬物投与の結果として心血管合併症を経験する患者のリスクを診断する方法であって、（a）患者のサンプル中のBNP型ペプチドのレベルを測定するステップ、（b）BNP型ペプチドの測定レベルを、少なくとも1つの基準レベルと比較することによって、上記リスクを診断するステップを含む方法を提供する。BNP型ペプチドは、例えば脳性ナトリウム利尿ペプチド（BNP）又はBNPのN末端断片、すなわちNT-proBNPでありうる。心血管合併症としては、卒中、一過性脳虚血発作、急性冠症候群、心筋梗塞、うっ血性心不全などの合併症が含まれる。特に、本発明は、過粘稠を引き起こすことのないESA薬物投与の用量にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
赤血球生成促進薬物（ESA）による将来の薬物投与の結果として心血管合併症を経験する患者のリスクを診断する方法であって、以下のステップ：
（a）患者由来サンプル中のBNP型ペプチド又はその変異体のレベルを測定するステップ、
（b）BNP型ペプチド又はその変異体の測定レベルを、少なくとも1つの基準レベルと比較することによって、上記リスクを診断するステップ、
を含む方法。
【請求項２】
ステップ（a）及び／又はステップ（b）をESAによる薬物投与の開始前に実施する、並びに／あるいは患者はまだESAによる薬物投与を受けていない、請求項１記載の方法。
【請求項３】
BNP型ペプチドがBNP、NT-proBNP又はその変異体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
BNP型ペプチドがNT-proBNP又はその変異体である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
基準レベルが、NT-proBNPの血漿レベル300〜500pg/ml、特に350〜450pg/mlに相当する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
基準レベルを超える測定レベルはリスクが高いことを示す、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
高リスクが、平均患者のリスク、好ましくは同じ年齢、性別及び貧血誘発疾患の平均患者のリスクと比較して、少なくとも1.5倍、特に2倍、より特には3倍高いことに関連する、請求項６記載の方法。
【請求項８】
高リスクが、患者を高用量のESAで処置すべきではないことを示す、請求項６又は７記載の方法。
【請求項９】
高用量のESAが、血中ヘモグロビン濃度が少なくとも14pg/dl、特に14.5g/dl、より特には15g/dlに達するのに十分な用量に相当する、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ESAが、（a）尿から単離されたエリスロポエチン、（b）エポエチンβ、（c）エポエチンδ、（e）エポエチンω、（f）ダーベポエチンα、及び（g）Ceraからなる群より選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
心血管合併症が、冠状動脈性心臓病、急性冠症候群、心筋梗塞、左心室機能障害、うっ血性心不全又は血栓症である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
BNP型ペプチドのレベルが、特異的に結合するリガンド、好ましくは抗体又はアプタマーを用いて測定される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ESAによる将来の薬物投与の結果として心血管合併症を経験する患者のリスクを診断するための、BNP型ペプチド、特にNT-proBNPの患者のレベルを測定、好ましくはin vitroで測定することが可能な診断手段の使用。
【請求項１４】
ESAによる将来の薬物投与の結果として心血管合併症を経験する患者のリスクを診断するための、BNP型ペプチド又はその変異体、特にNT-proBNP又はその変異体の患者のレベルを測定、好ましくはin vitroで測定することが可能な手段を含むキットの使用。
【請求項１５】
ESAによる将来の薬物投与の結果として心血管合併症を経験する患者のリスクを診断するためのデバイスであって、
（a）患者由来のサンプルにおいてBNP型ペプチド又はその変異体の量を測定するための手段、及び
（b）測定したレベルを少なくとも1つの基準レベルと比較することにより上記リスクを診断するための手段
を含むデバイス。
【請求項１６】
ESA、特に高用量のESAによる患者の将来の薬物投与を決定する方法であって、
（a）BNP型ペプチド又はその変異体のレベルを測定、好ましくはin vitroで測定するステップ、
（b）BNP型ペプチド又はその変異体の測定レベルを少なくとも1つの基準レベルと比較することにより、計画した薬物投与の結果として心血管合併症を経験する患者のリスクを診断するステップ、
（c）場合により、心臓専門医による患者の診察を開始するステップ、
（d）前記方法がESA薬物投与の結果として心血管合併症を経験する高リスクの存在を示す場合には、ESA薬物投与を控えることを推奨する、又は低用量のESAによる薬物投与のみを推奨するステップ
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、赤血球生成促進薬物による薬物投与の結果として心血管合併症を経験するリスクの診断に関する。本発明はまた、心血管合併症を経験するリスクに関して、赤血球生成促進薬物（ESA）の用量の最適化に関する。
【背景技術】
【０００２】
現代医療における目標の1つは、個人又は個別対応の治療法を提供することである。これらは、例えば個々の患者の必要に合わせて特定の薬物投与又は特定の薬物投与量を選択することによって、患者の個々の必要性又はリスクを考慮に入れる治療法である。
【０００３】
赤血球生成促進薬物（ESA）は、多様な障害を治療するため、特に貧血を治療するために投与されている。貧血は、赤血球（酸素運搬赤血球細胞）の数が低減する一般的な障害である。貧血は、特に、癌及び腎疾患（例えば糖尿病患者など）では併存疾患となることが多い。貧血患者は高頻度で心血管合併症を経験する。貧血患者では血液が低減した酸素量しか運搬することができず、これによって次に心臓が体の酸素需要を満たすためにより迅速に血液をポンプ供給することになるために、これらの合併症がおそらく生じるのだろう。これは、左心室増大（growth）及び左心室肥大に至る可能性がある。したがって、貧血患者は心血管合併症を経験することが多い。
【０００４】
エリスロポエチン（EPO）による治療を用いて、慢性心不全を患う患者の貧血を治療すること、並びに心機能及び症候を有意に改善することが実現されている（van der Meer, P., Voors, A.A., Lipsic, E., et al. (2004). Erythropoietin in cardiovascular diseases. European Heart Journal, vol. 25, pp. 285-291）。EPO治療の利点はおそらく赤血球数を増大することによるものであり、これが血中のヘモグロビン濃度を増大させ、それゆえ血液がより多くの酸素を運搬することが可能となる。結果として、心臓に対する負担が軽減し、これによって左心室肥大が退縮（regression ）し、その発症が防止される可能性さえある。
【０００５】
赤血球数の異常レベルへの上昇（例えば運動選手によるEPO乱用の場合など）が心血管合併症を引き起こす可能性があることが知られている（Dhar, R,. Stout, C.W., Link, M.S., Homoud, M.K., et al. (2005). Cardiovascular toxicities of performance-enhancing substances in sports. Mayo Clinic Proc, vol. 80, pp. 1307-1315, Mayo Clinic Proc, January 2006, vol. 81, p. 133において訂正）。そのようなEPOの乱用とは対照的に、貧血を正常又はほぼ正常なレベルのヘモグロビンになるまで矯正するために必要な投与量でESAを投与することは安全であると以前は考えられている。そのような投与量又は標的ヘモグロビンレベルは現在有益であると考えられている。
【０００６】
しかしながら、EPOによる薬物投与が貧血の有効な慣用的治療となってはいるものの、多くの貧血患者が依然として心血管合併症で死亡している。一方、心血管疾患を患う患者の多くが貧血である。
【０００７】
BNP型ペプチド（例えば脳性ナトリウム利尿ペプチド（BNP）及び／又はそのN末端プロペプチド断片（NT-proBNP））と、特定の心血管合併症の診断のためのその分子マーカー又は生化学マーカーとしての使用は公知である。WO02/089657号では、心筋梗塞を診断するために、脳性ナトリウム利尿ペプチド（BNP）を測定することが提案されている。WO02/083913号では、うっ血性心不全、心筋梗塞、ST上昇型心筋梗塞、又は非ST上昇型急性冠症候群を患う患者における、短期間罹患率又は死亡率を予測するのにBNPを用いることが提案されている。しかしながら、このような使用は、貧血を患う患者における心血管合併症の問題に関するものではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、貧血を経験する患者における心血管合併症の問題に対処し、貧血の治療を改善する必要が依然としてある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の目的は、赤血球生成促進薬物（ESA）による薬物投与、特に将来的な薬物投与の結果として心血管合併症を経験する患者のリスクを診断する方法であって、
（a）患者由来のサンプル中のBNP型ペプチド又はその変異体のレベルを測定するステップ、
（b）BNP型ペプチド又はその変異体の測定レベルを、少なくとも1つの基準レベルと比較することによって、上記リスクを診断するステップ
を含む方法により達成される。
【００１０】
この方法は、患者の体液又は組織サンプルを採取するステップを含んでもよい。好ましくは、患者の体液又は組織サンプル中のレベルが測定される。
【００１１】
本発明は、ESAによる薬物投与の結果として心血管合併症を経験するリスクを診断することが可能な方法及び手段、具体的にはマーカーを提供する。より具体的には、本発明に関して、BNP型ペプチドの測定レベルが、ESAによる薬物投与の結果として心血管合併症を経験するリスクの程度を示すことができるということを見出した。したがって、本発明は、ESA薬物投与を受ける前に患者のリスクを特定するための方法及び手段を提供する。具体的には、本発明によって、ヘモグロビンレベルを正常値又は正常値付近に増大させるために十分な用量のESAを投与された場合に心血管系の高リスクを有する患者を特定することが可能になる。本発明は、心血管合併症の病歴が知られていない患者にとって特に有利に用いることができる。本方法及び手段は、簡便、迅速、廉価であり、そして一般開業医及び／又は非心臓専門医による使用に適している。本発明はまた、本発明に係るマーカー、手段及び方法のいずれかの対応する用途を提供する。
【００１２】
また本発明は、心血管系リスクに関してESAの用量（標的Hbレベルによって定義される、さらに以下の用量の定義を参照のこと）を最適化することが可能な方法及び手段を提供する。本発明は、医薬として有効でありかつ同時に望ましくない副作用（特に心血管合併症）を回避する標的ヘモグロビンレベル（従ってESAの用量）を決定するための方法及び手段を提供する。従って、各個体について、より有益な標的ヘモグロビンレベル又はESA用量を決定することができる。
【００１３】
本発明においていくつかの知見が得られた。すなわち、以前は治療上有益であると考えられていたヘモグロビンの用量又は標的レベルにおいて、ESA治療が心血管合併症の原因となることと関連している可能性があることが観察された。従って、ESA薬物投与の結果として心血管合併症が発症する場合がある。貧血患者において以前はESAによる治療が、心臓に対する負荷を低減することによってむしろ心血管合併症を低減すると考えられていたことから、この観察結果は予想外のものであった。
【００１４】
さらに、本発明において、ESA薬物投与の結果としての心血管合併症は、主に患者のわずかな集団において生じることが観察された。またさらに、この患者集団は患者におけるBNP型ペプチドのレベルによって特定することができることも見出された。このような患者はリスクのある患者と考えられる。従って、本発明は、特定の用量のESAに関するリスクについてのみ説明するものではなく、患者が特定のリスクを有することについての指導（guidance）をも提供する。結果として、本発明によって、リスクのある患者を特定することが可能となると共に、標準的患者においてより高用量のESA（又はより高い標的ヘモグロビンレベル）による治療が可能となる。このようなリスクのある患者は、心血管合併症を経験するリスクを低減又は回避するために、より低用量のESA（若しくはより低い標的ヘモグロビンレベル）で又はESAを用いないで治療することが好ましい。しかしながら、このような決定は、考慮される特定の患者についてのリスク対効果比を含めて主治医の裁量である。
【００１５】
本発明によって、ESA薬物投与の開始前又はESA用量を高める前にリスクを診断することが可能となるため、その薬物投与の用量を最適化、特に増大させて、心血管合併症を回避しつつ各患者において治療効果を最大化することができる。
【００１６】
従って、本発明によって、ESA薬物投与を適用すべきか、その用量、及び／又は好適に付随する治療若しくはモニターを準備することを注意深くかつ情報をもって決定することが可能となる。
【００１７】
本発明は、特に、心臓内科医による大規模な心疾患学的試験を頻繁に利用する手段をもたない一般開業医、専門医師、及び専門病棟、専門部局、又は専門医院に利点がある。例として、糖尿病専門医、癌専門医、腎臓専門医がある。他の例としては、癌、腎臓又は糖尿病の外来診療医院又は部局である。本発明は、そのような非心臓内科医に、複数の患者の中から、ESA薬物投与の結果として心血管合併症を経験するリスクのある患者をの簡便にかつ信頼性をもってスクリーニングするため手段及び方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】一次心血管評価項目（primary cardiovascular endpoint）についてのカプラン・マイヤーグラフ及びリスク比（HR、危険率）を示す。
【図２】心臓有害事象（心臓合併症）についてのカプラン・マイヤーグラフ及びリスク比（HR、危険率）を示す。
【図３】心血管有害事象（AE）（心血管合併症）についてのカプラン・マイヤーグラフ及びリスク比（HR、危険率）を示す。
【図４】心血管有害事象（CVAE）及び一次心血管評価項目（P Endp）についての推定リスク比（HR、危険率）を95％信頼区間と共にグラフで表示する。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
赤血球生成促進薬物は一般的に、赤血球生成レベルの上昇によって治療可能な障害、特に貧血の場合に適用される。
【００２０】
赤血球生成は当業者に公知である。特にこの用語は、赤血球（赤血球細胞）の発生に関連している。120日という比較的短い寿命のために、赤血球は絶えず再生されている。この再生又は発生は、幹細胞の増殖及び分化によって行われる。現在、赤血球生成におけるいくつかのステップが知られている。主要なステップは、増殖と、BFC-E細胞（赤血球バースト形成細胞、BFC-E（又はバースト形成ユニット、BFU-E））からCFC-E細胞（赤血球コロニー形成細胞（又はコロニー形成ユニット、CFU-E））を介した核含有赤芽球（続いてこれが赤血球へと分化する）への分化である。インターロイキン-3（IL-3）がBFC-E細胞の生存と増殖を促進する。
【００２１】
赤芽球は、核を押し出して未成熟赤血球（網状赤血球）となることによって分化し、これが骨髄に放出され、血流に移行する。1〜2日後、網状赤血球はそのミトコンドリア及びリボソームを失って、成熟赤血球になる。本発明においてESAは、このプロセスの任意の段階、特に赤血球前駆細胞から赤芽球への分化ステップにその影響を発揮するものである。このステップは、Epo受容体（EpoR）を介したシグナル伝達によって制御されている。特に、本発明においてESAは、EpoRを刺激（促進）、より具体的にはEpoRへの結合によって刺激する。本発明においてESAは、エリスロポエチンの内因性産生を、例えば、低酸素誘導因子-プロリルヒドロキシラーゼ（HIF-PH）の阻害によって、刺激（促進）することも可能である。
【００２２】
「貧血」という用語は当業者に公知である。特に、貧血は、赤血球細胞の欠損を特徴とする障害である。貧血は、例えば血液のヘモグロビン含量によって定義することができる。男性の正常ヘモグロビン（Hb）レベルは14〜18g/dl（140〜180g/L）であり、女性の正常レベルは12〜16g/dlである。ヘモグロビンレベルがこれらの値よりも低い場合には、患者は貧血を患っている。本発明において貧血は、男性において、特には14g/dl未満、より詳細には13g/dl、11g/dl、10g/dl、9g/dl、8g/dl、7.5g/dl、6.5g/dl、6g/dl、5.5g/dl未満、又は最も詳細には5g/dl未満のHbレベル、そして女性において、12g/dl未満、より詳細には11g/dl、10g/dl、9g/dl、8g/dl、7.5g/dl、6.5g/dl、6g/dl、5.5g/dl未満、最も詳細には5g/dl未満のHbレベルに関する。中程度の貧血は、11.0〜12.5g/dlのHbレベルに相当すると考えられる。ヘモグロビンレベルが75g/L（7.5g/dl）未満に減少した場合には、安静時心拍出量が心拍及び１回拍出量の両方の増大と共に有意に上昇する。患者は、動悸又は激しい鼓動を訴えることになるだろう。心不全の症候は、患者の心筋の予備力が低下している場合に発症しうる。
【００２３】
貧血には、様々な原因、例えば過剰な失血（例：急性若しくは慢性出血性貧血）、低下した若しくは不十分な赤血球生成、又は溶血（溶血性貧血、例として、単球-マクロファージ系の過剰な活性による貧血、脾機能高進症若しくは脾腫による貧血、免疫溶血性貧血（自己免疫溶血性貧血、ヘモグロビン尿症など）、赤血球の機械的破壊による貧血（例として微小血管症性溶血性貧血、感染による溶血））がある。
【００２４】
本発明は、ESAによる治療によって貧血の重篤度を低減することができる、任意の種類の貧血に関して適用することができる。特に、本発明は、腎疾患（特に慢性腎疾患）による貧血、癌に関連した貧血、及び慢性疾患（例えば感染性若しくは炎症性）による貧血に関して適用することができる。癌に関連した貧血は、内出血及び／又は細胞増殖抑制剤による治療の副作用によって生じうる。貧血はまた、癌治療の副作用、特に細胞増殖抑制剤治療の副作用として生じることもある。貧血は、腎不全、特に糖尿病性腎症、の合併症として広く知られている。
【００２５】
赤血球生成促進薬物（ESA）は当業者に公知である。ESAという用語は、赤血球生成を、具体的にはin vivoで、より具体的には患者において、促進することが可能なあらゆる種類の薬物を含む。促進（stimulation）という用語の意味は公知であり、この用語は、好ましくは、赤血球生成を増大又は誘導することに関する。本発明に関して、ESAという用語は、総ヘモグロビンレベルを少なくとも0.5g/dl、より具体的には1g/dl、より具体的には1.5g/dl増大させることが可能な、あらゆる種類の赤血球生成促進薬物に関する。ESAは、非心血管副作用に関して合理的に安全であると通常考えられている用量でそのような増大を誘導することができることが好ましい。
【００２６】
ESAが赤血球生成をどのように促進するかのメカニズムは本発明に関しては特に重要ではない。例えば、本発明においてESAは、骨髄における多能性幹細胞の赤芽球への分化を促進可能であってもよいし、及び／又は赤芽球から赤血球への分化を促進可能なものであってもよい。しかしながら、ESAは、EpoRの促進又はそれを介してEpoRが作用する経路の促進によって作用することが好ましい。 
本発明においてESAの例としては、「小分子」並びにタンパク質又はペプチドが挙げられる。
【００２７】
「小分子」は、5000Da未満、好ましくは2000Da未満、より好ましくは1000Da未満、最も好ましくは500Da未満の分子量を示す、タンパク質、ペプチド、抗体又は核酸ではない分子として理解される。このような小分子は、ライブラリから開始するハイスループット手順／スクリーニングアッセイにおいて同定される。このような方法は当技術分野で公知である。好適な小分子は、コンビナトリアルケミストリとして知られる方法によって設計したり又はさらに改変することもできる。小分子の例は、FG-2216、すなわち低酸素誘導因子-プロリルヒドロキシラーゼ（HIF-PH）の阻害剤である（FibroGen Inc., Astellasにライセンス供与）。FG-2216は、エリスロポエチンの内因性レベルを上昇させて、それにより赤血球生成を促進することができる。別の例は、低分子量EPO類似体（analogon）PBI-1402である（ProMetic Biosciences）。
【００２８】
本発明においてESAの例としては、天然のESA（血中又は尿から単離されるエリスロポエチンなど、米国国立衛生研究所のウェブサイト上のOnline Mendelian Inheritance in Man (OMIM)におけるアクセッション番号133170を参照のこと。http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）、並びに（例えばヒト又は動物細胞の細胞培養において、特に組換え技術を用いて）組換え産生されたESAが挙げられる。「変異体」という用語は、当業者であれば理解することができ、本明細書の他の箇所で定義されている。
【００２９】
ESAの変異体は、例えば、その産生方法（例えば、タンパク質又はペプチドベースのESAの組換え産生のために使用する宿主細胞の細胞型）によって異なるグリコシル化形態のエリスロポエチンが知られている。
【００３０】
本発明において好ましいESAはエリスロポエチン及びその変異体である。エリスロポエチンは、30〜40kDa分子量の糖タンパク質である（Lee-Huang, S. (1984) Cloning and expression of human erythropoietin cDNA in Escherichia coli. Proc. Nat. Acad. Sci. vol. 81, pp. 2708-2712; Romanowski, R.R., Sytkowski, A.J. (1994). The molecular structure of human erythropoietin. Hemat. Oncol. Clin. North Am., vol. 8, pp. 885-894, 1994）。エリスロポエチンの変異体としては、EPOの異なるグリコシル化形態及び／又はいわゆる生体類似体（biosimilar）が挙げられる。変異体の例としては、エポエチンα（Amgen）、エポエチンβ（例えばNeoRecormonTM、(Roche)）、エポエチンδ、エポエチンω、ダーベポエチンα（Amgen）、及びCera（連続赤血球生成受容体アクチベーター、Hoffman-LaRoche）が挙げられる。
【００３１】
赤血球生成レベルは、当業者により適当と考えられる任意の方法によって測定することができる。患者において、赤血球生成レベルは、例えば、網状赤血球及び／又は赤血球の数を計数することにより、あるいは総ヘモグロビンレベルを測定することにより、簡便に測定することができる。このレベルはまた、総血中血球容積が大部分が赤血球数によって決まり、また容易に測定することができることから、総血中血球容積のレベルを測定することによっても決定することができる。このような赤血球生成レベルの測定方法は当業者に周知である。赤血球生成レベルを測定した場合には、その促進の程度は、例えばESAの薬物投与の前とその間の赤血球生成レベルを比較することによって、決定することができる。
【００３２】
「薬物投与（medication）」という用語の意味は当業者に公知である。本発明の関係において、この用語は、患者へのESAのあらゆる種類の投与、例えば経口投与、静脈内注射、皮下注射又は筋内注射による投与、を含む広い意味で理解されるべきである。好ましくは、薬物投与という用語は、各薬剤の長期投与、例えば、少なくとも2ヶ月、好ましくは少なくとも3ヶ月、より好ましくは少なくとも6ヶ月、より好ましくは少なくとも12ヶ月、より好ましくは少なくとも2年、より好ましくは少なくとも3年にわたり赤血球数の増加を引き起こす投与に関する。実施例から、リスクの相対的な差異は長期間にわたって類似しているが、心血管合併症の総数は投与の時間とともに連続的に増大することがわかる。従って、特定の臨床的適応の観点から、本発明において特定されたリスクのある患者には短期間（例えば、最大でも1週間、4週間、2ヶ月又は4ヶ月）でESAを投与することが許容されるだろうが、このようなリスクのある患者での長期投与についての決定は、好ましくはリスクと利益のより注意深い評価に基づいてなされるべきである。結果として、本発明は、ESAによる短期及び／又は長期の薬物投与の結果としての心血管合併症を経験するリスクの診断にも関する。
【００３３】
本発明は、特定の生化学マーカー又は分子マーカーを利用する。「生化学マーカー」及び「分子マーカー」という用語は、当業者にとって公知である。詳細には、生化学マーカー又は分子マーカーとは、ある特定の状態、疾患、又は合併症の存在下又は非存在下に示差的に発現される（すなわち、上方制御されるか、又は下方制御される）遺伝子発現産物である。通常、分子マーカーは核酸（mRNAなど）と定義され、生化学マーカーは、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドである。適当な生化学マーカー又は分子マーカーのレベルは、状態、疾患、又は合併症の存在又は不在の指標となり、これによって診断を可能にする。
【００３４】
本発明は特に、BNP型ペプチドを生化学マーカーとして利用する。生化学マーカーとしての任意の組合せのBNP型ペプチドの使用もまた本発明において考慮される。
【００３５】
BNP型ペプチドには、プレプロBNP、プロBNP、NT-proBNP、及びBNPが含まれる。
【００３６】
プレプロペプチド（プレプロBNPの場合には134アミノ酸）は、短いシグナルペプチドを含み、このシグナルペプチドは、酵素により切断されて、プロペプチド（プロBNPの場合には108アミノ酸）を遊離する。このプロペプチドがさらにN端プロペプチド（NT-プロペプチド、NT-proBNPの場合には76アミノ酸）と、活性ホルモン（BNPの場合には32アミノ酸）とに切断される。
【００３７】
本発明において好ましいBNP型ペプチドは、プロBNP、NT-proBNP、BNP、及びそれらの変異体である。BNPは活性なホルモンであり、不活性なNT-proBNPよりもin vivoでの半減期が短い。
【００３８】
NT-proBNPを用いれば前分析がより着実なものとなり、中央試験室へのサンプルの輸送が簡単になる（Mueller T、Gegenhuber A、Dieplinger B、Poelz W、Haltmayer M、Long-term stability of endogenous B-type natriuretic peptide (BNP) and amino terminal proBNP (NT-proBNP) in frozen plasma samples、Clin Chem Lab Med、2004年、42:942-4）。血液サンプルは室温で数日間保存することもできるし、又は回収の損失なしに郵送若しくは出荷することもできる。対照的に、BNPを室温又は4℃で48時間保存した場合には、少なくとも20％の濃度喪失が生じる（Mueller T、Gegenhuber A、et al、Clin Chem Lab Med 2004;42:942-4、前掲;Wu AH、Packer M、Smith A、Bijou R、Fink D、Mair J、Wallentin L、Johnston N、Feldcamp CS、Haverstick DM、Ahnadi CE、Grant A、Despres N、Bluestein B、Ghani F、Analytical and clinical evaluation of the Bayer ADVIA Centaur automated B-type natriuretic peptide assay in patients with heart failure: a multisite study、Clin Chem 2004年、50:867-73）。
【００３９】
対象の時間経過、分析機器又は利用可能な保存条件に応じて、活性型又は不活性型のいずれかの測定が有利でありうる。本発明において最も好ましいBNP型ペプチドはNT-proBNP及びその変異体である。
【００４０】
本明細書においては、「変異体」という用語は、上記のペプチドに実質的に類似したペプチドに関するものである。当業者にとって、「実質的に類似」という用語は十分に理解されている。詳細には、変異体とは、ヒト集団における最も一般的なペプチドアイソフォームのアミノ酸配列と比較した際に、アミノ酸の交換を示すアイソフォーム又はアレルである。好ましくは、そのような実質的に類似したペプチドは、そのペプチドの最も一般的なアイソフォームに対して、少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも95％の配列類似性を有する。診断手段によって、又はそれぞれの全長ペプチドに対するリガンドによってなおも認識される分解産物（例えばタンパク分解性分解産物）も、実質的に類似している。「変異体」という用語はまたスプライス変異体に関することも意味する。
【００４１】
「変異体」という用語は、グリコシル化ペプチドなど、翻訳後修飾されたペプチドにも関する。サンプル採取後に、例えば標識、具体的には放射性標識又は蛍光標識の、ペプチドへの共有結合性又は非共有結合性の付加によって修飾されたペプチドも、「変異体」である。
【００４２】
特定の変異体の具体例並びにそれらの測定方法は公知である（例えば、Ala-Kopsala, M., Magga, J., Peuhkurinen, K.ら (2004): Molecular heterogeneity has a major impact on the measurement of circulating N-terminal fragments of A-type and B-type natriuretic peptides. Clinical Chemistry, vol. 50(9), 1576-1588参照）。
【００４３】
本発明の他の実施形態は、種々のマーカーを組み合わせて、同時又は非同時に測定することを含む。一例は、NT-proBNPをBNPと組み合わせて測定することである。
【００４４】
本発明に係る診断には、関連する疾患、障害、合併症又はリスクの、判定、モニター、確認、細分類、及び予測が含まれる。判定は、疾患、障害、合併症又はリスクを認識することに関する。モニターは、例えば疾患の進行、あるいは疾患又は障害の進行に対する特定の治療の効果を分析するために、既に診断された疾患、障害、合併症又はリスクの動向を把握することに関する。確認は、既に行われた診断を、他の指標又はマーカーを用いて強化又は実証することに関する。細分類は、診断された疾患、障害、合併症又はリスクの種々のサブクラスに従って、診断をさらに詳しく特定すること、例えば疾患まの軽度な形態及び重度な形態に従って特定を行うことに関する。予測は、他の症候若しくはマーカーが明らかになるか、又は著しく変化する前に、疾患、障害又は合併症を予測することに関する。
【００４５】
当業者には理解されるように、かかる診断は通常、診断対象の被験者の100％について正しいことを意図していない。しかし、この用語は、被験者の統計的に有意な部分が関連する疾患、障害、合併症又はリスクに関して診断できることを必要とする。ある部分が統計的に有意であるかどうかは、当業者がさらに手間をかけることなく、様々な周知の統計的評価手法、例えば、信頼区間の決定、p値決定、スチューデントのt検定、マン−ホイットニー検定などを用いて決定することができる。詳細は、Dowdy and Wearden、Statistics for Research、John Wiley & Sons、New York 1983に見出される。好ましい信頼区間は、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも97％、少なくとも98％又は少なくとも99％である。p値は、好ましくは、0.1、0.05、0.01、0.005、又は0.0001である。
【００４６】
本発明において心血管合併症には、心血管系に影響を及ぼすあらゆる機能障害、特に斑又は血栓形成に関連するあらゆる合併症が含まれる。
【００４７】
心血管系における斑又は血栓形成に関連する合併症は広く知られている。斑又は血栓は、血管の狭窄又は閉鎖を生じて、血流及び酸素供給を低減することがある。臨床的に関連する合併症は、破たんプラークによって、又は血管（冠状動脈若しくは肺動脈など）に詰まるまで血流に沿って運ばれる血栓によって高頻度に生じる。
【００４８】
心血管合併症は、心臓又は非心臓合併症でありうる。
【００４９】
非心臓合併症は、深部静脈血栓症などの末梢（末梢血管疾患）で起こることがあり、例えば壊疽、細小血管障害、又は肺陥入を生じうる。例としては、壊死及びおそらく切断術に至る末梢血管疾患である。斑又は血栓形成に関連する非心臓合併症の他の例としては、脳を侵すような合併症、例えば一過性脳虚血発作（TIA、脳における一過性虚血事象）又は卒中が挙げられる。非心臓性の心血管合併症の他の例としては、高血圧、低血圧が挙げられる。
【００５０】
心臓系（心臓及び冠動脈）において、斑又は血栓の形成に関連する合併症には、安定狭心症（SAP）及び急性冠症候群（ACS）がある。狭心症は、心筋梗塞、すなわち、特に酸素要求が高まる条件下（例えば運動の場合）における、不十分な酸素供給を特徴とする。ACS患者は、不安定狭心症（UAP）を示す可能性があり、あるいは、これらの個体は既に、心筋梗塞（MI）に罹っていることもある。心筋梗塞は、より小さな又は大きな壊死事象（すなわち酸素供給不足による組織破壊）を特徴とする。MIは、心電図における出現に従って、ST上昇型MI、又は非ST上昇型MIとなる。MIの発症に続いて、左心室機能障害（LVD）が発症することがある。LVD患者は、約15％の死亡率で鬱血性心不全（CHF）を発症する。しかしながら、心不全は急性（急性心不全、AHF）となることもある。
【００５１】
本発明において、心臓合併症はまた不整脈、徐脈及び頻脈であってもよい。
【００５２】
心臓合併症は、収縮期又は拡張期（すなわち、罹患した心室の駆出期（収縮）又は充満期（拡張）に主に影響を及ぼす）であってよい。
【００５３】
本発明に関して、「心血管合併症」は特に、冠状動脈性心臓病、SAP、ACS、UAP、MI（ST上昇型MI及び非ST上昇型MIを含む）、LVD、CHF、心血管系死亡、TIA、又は卒中に関する。より具体的には、「心血管合併症」は、ACS、UAP、MI（ST上昇型MI及び非ST上昇型MIを含む）、LVD、CHF、心血管系死亡、TIA、又は卒中に関する。
【００５４】
心血管合併症は、ニューヨーク心臓協会（New York Heart Association、NYHA）による機能的分類システムで分類される症候を引き起こしうる。クラスIの患者は、心血管疾患のいかなる明白な症候も示さない。身体的活動が制限されず、通常の身体的活動によって過度の疲労、動悸、又は呼吸困難（呼吸の短縮）が生じない。クラスIIの患者は、身体的活動にわずかな制限を受ける。患者は安静時には快適であるが、通常の身体的活動によって疲労、動悸、又は呼吸困難がある。クラスIIIの患者は、身体的活動に著しい制限を受ける。患者は安静時には快適であるが、通常の活動より軽い身体的活動によって疲労、動悸、又は呼吸困難が起こる。クラスIVの患者は、不快感なしにはいかなる身体的活動も行うことができない。患者は安静時にも心不全の症候を示し、何らかの身体的活動を行うと、不快感が増強する。
【００５５】
これに従って、患者は、臨床的症状を示さない個体と、症候（例えば、呼吸困難）を示す個体とに分けることができる。
【００５６】
「左心室駆出分画率」（LVEF）は、「駆出率」としても知られ、心血管疾患の別の特性となりうる。健康な心臓をもつ人々は、通常、健全なLVEFを有し、これは通常50％を越えると説明される。徴候的な収縮期性心疾患に罹る人々のほとんどが、通常40％以下のLVEFを有する。
【００５７】
拡張期心臓疾患の場合、LVEFは正常（正常な拡張期を反映する）でありうるが、その充満は不十分である。しかしながら、拡張期心臓疾患は、心室壁の厚さの増大を特徴とする。
【００５８】
本発明において心血管合併症は、症候、特にNYHAクラスII〜IVの症候、より詳細にはNYHAクラスIII〜IVの症候を引き起こすものである。
【００５９】
本発明において心血管合併症は、40％以下のLVEFを伴うものであってもよい。
【００６０】
本発明において心血管合併症は、「代償性」であっても、「非代償性」であってもよい。代償性とは、身体における通常の酸素需要を満たすことがまだできることを意味し、一方、非代償性とは、身体における通常の酸素需要が既に満たされていないことを意味する。
【００６１】
本発明において、「心血管合併症を経験する」ということには、既存の心血管合併症の悪化が含まれる。
【００６２】
本発明において、「患者」という用語は、健康な個体、明らかに健康な個体、又は、特に疾患に罹っている個体に関する。詳細には、患者は、例えば癌又は腎疾患（特に慢性腎疾患、例として糖尿病性腎症）により、貧血に罹っているか、又はその治療を受けている。従って、患者はまた、癌、腎疾患又は糖尿病を患う患者であってもよい。さらにより詳細には、測定又は診断の時点において、患者は、心血管合併症のいかなる既知な病歴もなく、かつ／又は心血管合併症の症候を示さないか、わずかに（NYHAクラスI若しくはII）のみ示し、かつ／又は心血管合併症の治療を受けていない。
【００６３】
特に、患者は、ESA薬物投与を受ける対象となっているものである。より詳細には、測定又は診断の時点において、ESA（より詳細にはエリスロポエチン又はその変異体）による患者の以前の薬物投与が、少なくとも1ヶ月、詳細には少なくとも2ヶ月、より詳細には少なくとも6ヶ月、より詳細には少なくとも1年前に行われている。よりさらに詳細には、測定又は診断の時点において、患者はESAによる以前の薬物投与を受けていない。
【００６４】
どのような状況下で、心血管合併症がESA薬物投与の「結果」として発症したとみなされるかは、当業者に公知である。臨床研究においては、ESA薬物投与を受けている患者群とESA薬物投与を受けていない患者群との比較によって、ESA薬物投与を受けている患者がESA薬物投与の結果として心血管合併症を経験することになるかどうかが明らかとなる。ESAの投与を受ける患者がより高頻度で心血管合併症を経験するのであれば、これは、心血管合併症の数が、特定のESA薬物投与の結果として増大することを示す。同様に、異なる量のESA薬物投与が心血管合併症の数の増大を引き起こすかどうかを比較することができる。このような分析の例は、実施例の項目で示している。
【００６５】
ESA薬物投与の「結果として」という用語は、ESAが通常心血管合併症を引き起こす知見として解釈されるべきではない。実際、以前に説明されているように、ESA薬物投与によって、心臓に対する負荷が低減するために心血管合併症のリスクが低減することがあると通常は考えられている。ESA（特に、それぞれ高用量又は高い標的ヘモグロビンレベル）が特定の患者において心血管合併症のリスクを高めうるという観察結果の根拠となる生物学的メカニズムは現在わかっていない。しかしながら、上述したように、本発明に関して、本明細書に記載のマーカーが、ESA、特に高用量（又は高い標的ヘモグロビンレベル）のESAを患者に投与した場合に、心血管合併症を経験するリスクのある患者を検出するために適しているということを見出した。
【００６６】
本発明において診断は、診断手段を用いて行うことが好ましい。診断手段とは、目的の物質、詳細には目的のペプチド又はポリペプチド、より具体的にはBNP型ペプチドのレベル、量、又は濃度の測定を可能にするいかなる手段でもよい。
【００６７】
それぞれのペプチドレベルを測定するのに使用することができる方法及び診断手段は当業者に公知である。これらの方法には、マイクロプレートELISAに基づく方法、完全自動化イムノアッセイ又はロボットイムノアッセイ（例えば、ElecsysTM又はCobasTM分析器が利用可能）、CBA（酵素コバルト結合アッセイ、例えば、Roche-HitachiTM分析器が利用可能）、及びラテックス凝集反応（例えば、Roche-HitachiTM分析器が利用可能）が含まれる。測定のための方法及び手段としては、ポイントオブケア（Point-of-care）デバイス（例えば、Cardiac ReaderTM（Roche Diagnosticsから入手可能））も挙げられる。
【００６８】
ポイントケアデバイスは、患者のベッドサイドで測定することが可能なデバイスとして一般的に理解されている。その例は、例えばNT-proBNPのための試験ストリップ（Roche Diagnosticsから「Cardiac proBNP」として入手可能）と組み合わせた、Cardiac ReaderTM（Roche Diagnosticsから入手可能）である。このような試験では、対象のペプチド（例えばBNP型ペプチド）に対して生起された２つの（好ましくはモノクローナル）抗体を用いうる。抗体は、例えばElecsysTM又はCobasTMアッセイにおいて用いられる抗体と同じであってもよい。例えば１次抗体はビオチンで標識し、２次抗体は金粒子で標識する。試験は、少量（例えば150μl）の血液サンプルを試験ストリップ上（例えば試験ストリップのサンプルウエル中）に添加することによって開始することができる。サンプル中の赤血球は、試験ストリップへの添加前又は後に残りの血漿から、例えばサンプルを適当なフリース（例えばガラス繊維フリース）を通過させる場合に、分離することができる。当該分離手段（例えばフリース）は、試験ストリップの一部であることが好ましい。抗体（好ましくは試験ストリップに既に存在する）を残りの血漿に溶解する。抗体は、対象のペプチド又はポリペプチドに結合して、3つの構成要素からなるサンドイッチ複合体を形成することができる。抗体（結合又は非結合抗体）は、ストリップから検出ゾーンへと流れる。検出ゾーンは、結合した複合体を検出するための手段を含み、例えばストレプトアビジンを含みうる。これは、複合体を固定し、固定された複合体を金標識抗体により紫色線として可視化する。好ましくは、残存する遊離の金標識抗体を、次いでさらにストリップに流し、そこで検出対象のBNP型ペプチドのエピトープを含む合成ペプチド又はポリペプチドを含むゾーンに捕捉し、別の紫色線として可視化する。このような２回目の線の存在は対照として機能することができるが、それはサンプル流が正しく動き、抗体がインタクトであることを示すためである。試験ストリップは、対象のペプチド又はポリペプチドをそのストリップを用いて検出することができることを示すラベルを含んでもよい。また、検出ゾーンにおいて検出可能な標識の量の光学的検出のためのデバイスによって読み取ることができるバーコード又は他のコードを含んでもよい。このようなバーコードは、対象のペプチド又はポリペプチドをそのストリップを用いて検出することができることを示す情報を含みうる。バーコードはまた、試験ストリップについてのロットに特異的な情報を含みうる。
【００６９】
Cardiac Readerそのものが、試験ストリップの検出ゾーンを光学的に読み取るカメラ（例えば電荷結合素子、CCD）を含む。シグナル及び対照線は、パターン認識アルゴリズムによって特定することができる。シグナル線における標識の強度は、対象のペプチド又はポリペプチドの量に典型的には比例する。光学シグナルは、コードチップに記録されていてもよい、ロット特異的検量線によって濃度に変換することができる。検量コード及び試験ロットの取り決め（agreement）は、試験ストリップのバーコードによって確認することができる。
【００７０】
さらに、当業者であれば、ペプチド又はポリペプチドのレベルを測定する様々な方法に精通している。「レベル」という用語は、患者体内又は患者から採取されたサンプル中のペプチド又はポリペプチドの量又は濃度に関する。
【００７１】
本発明において「測定」という用語は、核酸、ペプチド、ポリペプチド、又は他の目的の物質の量又は濃度を、好ましくは半定量的又は定量的に、決定することに関する。測定は、直接的にでも、間接的にでも行うことができる。間接的な測定には、細胞応答、結合リガンド、標識、又は酵素反応生成物の測定が含まれる。好ましくは、測定はin vitroで行われる。
【００７２】
本発明に関しては、量は濃度にも関する。既知のサイズのサンプル中における、目的の物質の総量から、その物質の濃度が計算できること、また、この逆も同様であることは自明である。
【００７３】
測定は、当技術分野で公知のいかなる方法で行うこともできる。好ましい方法を以下に記載する。
【００７４】
好ましい実施形態では、目的のペプチド又はポリペプチド、具体的にはBNP型ペプチドのレベルを測定する方法は、（a）上記ペプチド又はポリペプチドに対し細胞応答しうる細胞を、適当な時間にわたり、上記ペプチド又はポリペプチドと接触させるステップと、（b）上記細胞応答を測定するステップとを含む。
【００７５】
別の好ましい実施形態では、目的のペプチド又はポリペプチド、具体的にはBNP型ペプチドのレベルを測定する方法は、（a）ペプチド又はポリペプチドを、十分な時間にわたり、適当な基質と接触させるステップと、（b）産物の量を測定するステップとを含む。
【００７６】
別の好ましい実施形態では、目的のペプチド又はポリペプチド、特にBNP型ペプチドのレベルを測定する方法は、（a）ペプチド又はポリペプチドを、特異的な結合リガンドと接触させるステップと、（b）（場合により）非結合リガンドを除去するステップと、（c）結合したリガンドの量を測定するステップとを含む。
【００７７】
このペプチド又はポリペプチドは、サンプル中、特に体液又は組織サンプル中に含有されて、サンプル中のペプチド又はポリペプチドの量が測定されることが好ましい。
【００７８】
ペプチド及びポリペプチド（タンパク質）は、組織、細胞、及び体液サンプル中、すなわち、好ましくはin vitroで、測定することができる。目的のペプチド又はポリペプチドは、体液サンプル中で測定されることが好ましい。
【００７９】
本発明において組織サンプルは、ヒト又は動物の死体又は生体から得られるいかなる種類の組織も指す。組織サンプルは、当業者に公知のいかなる方法でも、例えば生検又は掻爬術によって得ることができる。
【００８０】
本発明において体液には、血液（その派生物、例えば血清又は血漿などを含む）、リンパ液、脳液、唾液、及び尿が含まれうる。具体的には、体液には、血液（その派生物、例えば血清又は血漿などを含む）、及び尿が含まれる。体液サンプルは、当技術分野で公知のいかなる方法で入手することもできる。
【００８１】
一般開業医にとって、心臓診断を行うために高価な診断ツールはもはや必要ない。サンプルとして尿を使用することによって、被験者に対して行われる侵襲的ステップは回避されるという利点がある。驚くべきことに、本発明の根底となる研究において、尿中のBNP型ペプチド、特にNT-proBNPの量が血中の量と同様に診断に有益でありかつ信頼性のあるものであることが見出された。通常、BNP型ペプチドの主なクリアランスは腎臓において糸球体ろ過によって行われると考えられているため、尿中にはBNP型ペプチドはわずかなレベルしか存在しないと予測されるだろう。そのため、（i）十分な量のBNP型ペプチド、特にNT-proBNPが尿中に存在すると予想されることは全くないだろう。尿中の測定は、好ましくは重大な腎合併症のない患者、より好ましくは正常又は正常に近い糸球体ろ過の患者において行う。
【００８２】
本発明において「尿」という用語は、全尿又はその分画を含む。分画は、ペプチド又はポリペプチドを含む尿の分画である。尿サンプルは、当技術分野で公知の任意の方法によって得ることができる。サンプルには、本発明の方法を適用する前に種々の公知の前処理を行ってもよい（すなわち処理済尿サンプル）。
【００８３】
細胞サンプルを入手する方法には、単一細胞又は小細胞群の直接的調製、組織の解離（例えば、トリプシンを用いる）、及び、例えば濾過又は遠心による、体液からの細胞の分離が含まれる。本発明において細胞には、血小板及び他の非核細胞、例えば赤血球も含まれる。
【００８４】
必要な場合、サンプルはさらに処理されてもよい。詳細には、核酸、ペプチド、又はポリペプチドは、濾過、遠心法、又はクロロホルム／フェノール抽出などの抽出法などの当技術分野で公知の方法に従って、サンプルから精製してもよい。
【００８５】
細胞応答を測定するには、サンプル又は処理サンプルを、細胞培養物に添加し、細胞内外の応答を測定する。細胞応答には、リポーター遺伝子の発現、又は物質、例えば、ペプチド、ポリペプチド、若しくは小分子の分泌が含まれる。
【００８６】
測定に好ましい他の方法には、目的のペプチド又はポリペプチドに特異的なリガンド結合の量を測定することが含まれうる。本発明において結合には、共有結合及び非共有結合の両方が含まれる。
【００８７】
本発明においてリガンドは、目的のペプチド又はポリペプチドに結合するいかなるペプチド、ポリペプチド、核酸、又は他の物質でもありうる。ペプチド又はポリペプチドは、ヒト又は動物の細胞から採取又は精製した場合、例えばグリコシル化によって、修飾できることが周知である。本発明において適当なリガンドは、そのような部位を介してペプチド又はポリペプチドに結合するものでもよい。
【００８８】
リガンドは、測定対象のペプチド又はポリペプチドに、好ましくは特異的に結合すべきである。本発明において「特異的結合」とは、リガンドが、試験対象のサンプル中に存在する別のペプチド、ポリペプチド又は物質に実質的に結合する（それと「交差反応する」）べきではないことを意味する。特異的に結合するタンパク質又はアイソフォームは、いかなる他の関連するペプチド又はポリペプチドよりも、好ましくは少なくとも3倍以上高い親和性、より好ましくは少なくとも10倍以上高い親和性、さらにより好ましくは少なくとも50倍以上高い親和性で結合すべきである。本発明において、このような他の関連するペプチド又はポリペプチドは、他の構造的に関連した又は相同のペプチド又はポリペプチドであってよい。
【００８９】
試験対象のペプチド又はポリペプチドが、例えばウェスタンブロット上の大きさによって、又はそれがサンプル中で比較的豊富に存在することによって、識別可能であり、かつ明確に測定できる場合、非特異的結合も許容されることがある。
【００９０】
リガンドの結合は、当技術分野で公知のいかなる方法で測定することもできる。この方法は、半定量的であるか、又は定量的であることが好ましい。適切な方法を以下に記載する。
【００９１】
第1に、リガンドの結合は、例えば、NMR又は表面プラズモン共鳴で、直接測定することができる。
【００９２】
第2に、リガンドが目的のペプチド又はポリペプチドのもつ酵素活性の基質として機能する場合には、酵素反応産物を測定することができる（例えば、プロテアーゼの量は、切断された基質の量を、例えば、ウェスタンブロットで測定することによって、測定することができる）。
【００９３】
酵素反応産物を測定するためには、基質の量が飽和状態に近いことが好ましい。基質は、反応前に検出可能な標識で標識されてもよい。サンプルは適当な時間、基質に接触させることが好ましい。適当な時間とは、検出可能であり、好ましくは測定可能な量の産物が生成されるのに必要な時間を指す。産物の量を測定する代わりに、所定（例えば、検出可能な）量の産物が生じるのに必要な時間を測定することもできる。
【００９４】
第3に、リガンドは、リガンドの検出及び測定を可能にする標識と、共有結合又は非共有結合によって結合させることができる。
【００９５】
標識は、直接的方法で行っても、間接的方法で行ってもよい。直接標識は、標識をリガンドに直接（共有結合又は非共有結合によって）結合させるものである。間接標識は、二次リガンドを一次リガンドに結合させる（共有結合又は非共有結合によって）ものである。二次リガンドは、一次リガンドに特異的に結合すべきものである。二次リガンドは、適当な標識と結合してもよく、及び／又は二次リガンドに結合する三次リガンドの標的（受容体）であってもよい。シグナルを増強するために、二次、三次、又はさらに高次のリガンドがしばしば用いられる。適当な二次リガンド、及びより高次のリガンドには、抗体、二次抗体、及び周知のストレプトアビジン-ビオチン系（Vector Laboratories社）がある。
【００９６】
リガンド又は基質は、当技術分野で公知の、1つ又は複数のタグで「タグ標識」してもよい。そのようなタグは、その後、より高次のリガンドの標的となりうる。適当なタグには、ビオチン、ジゴキシゲニン、Hisタグ、グルタチオンSトランスフェラーゼ、FLAG、GFP、mycタグ、インフルエンザAウイルスヘマグルチニン（HA）、マルトース結合タンパク質などが含まれる。ペプチド又はポリペプチドの場合、タグは、N末端及び／又はC末端にあることが好ましい。
【００９７】
適切な検出方法で検出可能ないかなる標識も、適当な標識である。典型的な標識には、金粒子、ラテックスビーズ、アクリダンエステル、ルミノール、ルテニウム、酵素的に活性な標識、放射性標識、磁性標識（例えば、常磁性及び超常磁性標識を含めた「磁性ビーズ」）、及び蛍光標識が含まれる。
【００９８】
酵素的に活性な標識には、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、及びこれらの誘導体が含まれる。検出用に適当な基質には、ジアミノベンジジン（DAB）、3,3’-5,5’-テトラメチルベンジジン、NBT-BCIP（4-ニトロブルーテトラゾリウム塩化物及び5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-リン酸、Roche Diagnostics社から既成の原液として購入可能）、CDP-StarTM（Amersham Biosciences社）、及びECFTM（Amersham Biosciences社）が含まれる。適当な酵素と基質との組合せは、有色の反応生成物、蛍光、又は化学発光をもたらすことがあり、それらは、当技術分野で公知の方法で測定することができる（例えば、感光性フィルム又は適当なカメラシステムを用いて）。酵素反応を測定することに関しては、上記の規準が同様に適用される。
【００９９】
典型的な蛍光標識には、蛍光タンパク質（GFP、YFP、RFP及びその誘導体など）、Cy3、Cy5、テキサスレッド、フルオレセイン、Alexa色素（例えばAlexa 568）、及び量子ドットが含まれる。この他の蛍光標識は、例えば、Molcular Probes社（Oregon）から購入可能である。
【０１００】
典型的な放射性標識には、35S、125I、32P、33P、及び同様のものが含まれる。放射性標識は、例えば感光性フィルム又は蛍光造影装置（phosphor imager）など、公知でありかつ適切ないかなる方法でも検出できる。
【０１０１】
本発明において適切な測定方法には、沈殿（特に免疫沈降反応）、電気化学発光法（電気的に発生する化学発光）、RIA（ラジオイムノアッセイ）、ELISA（酵素結合免疫吸着アッセイ）、サンドイッチ酵素免疫試験、電気化学発光サンドイッチイムノアッセイ（ECLIA）、解離増強ランタニド蛍光イムノアッセイ（DELFIA）、シンチレーション近接アッセイ（SPA）、比濁分析、比ろう分析、ラテックス強化比濁分析若しくは比ろう分析、固相免疫試験、及び質量分析法（SELDI-TOF、MALDI-TOF、又はキャピラリー電気泳動−質量分析（CE-MS）など）も含まれる。当技術分野で公知の他の方法（ゲル電気泳動、２次元ゲル電気泳動、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）、ウエスタンブロッティングなど）は、単独で使用することも、上述の標識化法又は他の検出方法と組み合わせて使用することもできる。
【０１０２】
好ましいリガンドには、抗体、核酸、ペプチド、又はポリペプチド、及びアプタマー、例えば核酸アプタマー又はペプチドアプタマー（例えばスピーゲルマー（spiegelmer）又はアンチカリン（anticalin））が含まれる。そのようなリガンドを取得する方法は、当技術分野で周知である。例えば、適当な抗体又はアプタマーの同定及び製造は、供給業者によって提供される。当業者は、そのようなリガンドの、より高い親和性又は特異性を有する誘導体を開発する方法に精通している。例えば、核酸、ペプチド、又はポリペプチドにランダム変異を導入することができる。これらの誘導体は、その後、当技術分野で公知のスクリーニング方法、例えばファージディスプレイによって、結合について試験することができる。
【０１０３】
本明細書において用いる「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の両方と、Fv、Fab、及びF(ab)2フラグメントなどの、抗原又はハプテンに結合可能なそれらの変異体又はフラグメントとが含まれる。「抗体」の用語には、一本鎖抗体も含まれる。
【０１０４】
別の好ましい実施形態では、リガンドが、好ましくは、核酸、ペプチド、ポリペプチド又はアプタマーからなる群から選択され、アレイ上に存在する。
【０１０５】
上記アレイは、少なくとも1つの追加リガンドを含有し、これは、目的のペプチド、ポリペプチド、又は核酸に対するリガンドでもよい。上記追加リガンドは、本発明に関しては、特に関心のないペプチド、ポリペプチド、又は核酸に対するリガンドでもよい。アレイ上には、本発明との関連で目的の少なくとも3つ、好ましくは少なくとも5つ、より好ましくは少なくとも8つのペプチド又はポリペプチドに対するリガンドが含有されることが好ましい。
【０１０６】
本発明において、「アレイ」という用語は、その表面に少なくとも2つの化合物が一次元、二次元、又は三次元配置で付着又は結合されている固相又はゲル様担体を指す。そのようなアレイ（「遺伝子チップ」、「プロテインチップ」、抗体アレイなどを含む）は、一般に当業者に公知であり、通常、顕微鏡用ガラススライド上、特に、ポリカチオン、ニトロセルロース、又はビオチンでコーティングされたガラススライドなどのコーティングされたガラススライド上、カバーガラス上、並びに、例えば、ニトロセルロース又はナイロンを主材とする膜などの膜上に作製される。
【０１０７】
アレイは、結合リガンド、又はそれぞれ少なくとも1つのリガンドを発現する少なくとも2つの細胞を含んでもよい。
【０１０８】
別の好ましい実施形態において、リガンドは、好ましくは核酸、ペプチド、ポリペプチド、抗体及びアプタマーからなる群より選択され、固相支持体、好ましくはアレイ上に存在する。本発明において、「アレイ」（「遺伝子チップ」、「プロテインチップ」、抗体アレイなども含む）という用語は、少なくとも2つの化合物が一次元、二次元又は三次元の配置で付着又は結合している固相又はゲル様担体を意味する。BNP型ペプチドに対するリガンド又は結合物質を含む固相支持体又はアレイは当技術分野で周知であり、とりわけ、市販のカラム材料、ポリスチレンビーズ、ラテックスビーズ、磁性ビーズ、コロイド金属粒子、ガラス及び／又はシリコンのチップ及び表面、ニトロセルロース・ストリップ、メンブレン、シート、デュラサイト（duracyte）、反応トレイのウエル及び壁面、プラスチックチューブなどが挙げられる。リガンド又は物質は多くの異なる担体に結合していてもよい。周知の担体の例としては、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、デキストラン、ナイロン、アミロース、天然及び修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、及びマグネタイトなどが挙げられる。本発明の目的のために担体の性質は可溶性であっても不溶性であってもよい。前記リガンド又は物質を固定／固定化するための好適な方法は周知であり、限定されるものでないが、イオン性、疎水性、共有結合性の相互作用などが含まれる。
【０１０９】
本発明において、アレイとして、「懸濁液アレイ」を用いることも想定される（Nolan JP, Sklar LA(2002)、Suspension array technology:evolution of the flat-array paradigm、Trends Biotechnol、20(1):9〜12）。そのような懸濁液アレイでは、担体（例えば、マイクロビーズ又はミクロスフェア）が懸濁液中に存在する。このアレイは、様々なリガンドを保持し、場合によっては標識された様々なマイクロビーズ又はミクロスフェアからなる。
【０１１０】
本発明はさらに、上記に定義したような、少なくとも1つのリガンドが他のリガンドに加えて担体物質にも結合するアレイを作製する方法にも関する。
【０１１１】
そのようなアレイを作製する方法、例えば固相化学及び感光性保護基に基づく方法は一般的に公知である（米国特許第5,744,305号）。そのようなアレイは、物質又は物質ライブラリと接触させて、相互作用、例えば、結合又はコンフォメーション変化について試験することができる。したがって、上記に定義したようなペプチド又はポリペプチドを含むアレイは、上記のペプチド又はポリペプチドに特異的に結合するリガンドを特定するために使用してもよい。
【０１１２】
従って、本発明はまた、ESAによる将来の薬物投与の結果として心血管合併症を経験する患者のリスクを診断するための、患者のBNP型ペプチド（特にNT-proBNP）のレベルを、好ましくはin vitroで、測定することが可能な診断手段の使用に関する。
【０１１３】
本発明はまた、ESAによる将来の薬物投与の結果として心血管合併症を経験する患者のリスクを診断するための、患者のBNP型ペプチド（特にNT-proBNP）のレベルを、好ましくはin vitroで、測定することが可能な手段を含むキットの使用に関する。
【０１１４】
本発明はまた、BNP型ペプチドを測定するための手段又は薬物を含むキットに関する。かかる手段又は薬物は当業者に公知の任意の好適な手段又は薬物である。そのような手段及び薬物並びにそれらの使用方法の例は本明細書中に示されている。例えば、好適な薬物は、BNP型ペプチドに特異的に結合することができる任意の種類のリガンド又は抗体でありうる。キットはまた、それぞれの生化学マーカーのレベルの測定に関して適当と考えられる他の任意の成分、例えば好適なバッファー、フィルターなどを含んでもよい。
【０１１５】
場合により、キットはさらに、ESA薬物投与、特に将来のESA薬物投与の結果として患者が心血管合併症を経験するリスクの診断に関して測定（複数でもよい）の結果を解釈するためのユーザー用マニュアルを含んでもよい。具体的には、かかるキットは、測定レベルがどの程度のリスクと対応するかについての情報を含みうる。これは、本明細書の他の箇所で詳細に説明している。さらに、このようなユーザー用マニュアルは、それぞれの生化学マーカーのレベルを測定するためのキット成分の正確な使用に関する説明を提供するものであってもよい。
【０１１６】
本発明はまた、ESAによる薬物投与、特に将来の薬物投与の結果として心血管合併症を経験する患者のリスクを診断するための前記キットの使用に関する。また本発明は、ESA薬物投与、特に将来のESA薬物投与の結果として心血管合併症を経験する患者のリスクを診断するための本発明に係る方法のいずれかにおける前記キットの使用に関する。
【０１１７】
本発明はさらに、ESAによる将来の薬物投与の結果として心血管合併症を経験する患者のリスクを診断するためのデバイスであって、
（a）患者由来サンプル中のBNP型ペプチドの量を測定するための手段、及び
（b）測定したレベルを少なくとも1つの基準レベルと比較することにより前記リスクを診断するための手段、
を含むデバイスを包含する。
【０１１８】
本発明はまた、ESAによる将来の薬物投与の結果として心血管合併症を経験する患者のリスクを診断するためのかかるデバイスの使用に関する。
【０１１９】
本明細書において用いる「デバイス」という用語は、心不全の診断を可能にするように互いに機能的に連結された上記手段を少なくとも含む手段のシステムに関する。BNP型ペプチドのレベルを測定するための好ましい手段及びリスクを診断するための好ましい手段は本発明の方法と関連して本明細書中の他の段落に開示されている。前記手段を機能するように連結する手法はそのデバイスに含まれる手段の種類に応じて異なる。例えば、BNP型ペプチドのレベルを自動測定する手段を適用する場合、この自動操作手段により得たデータを、例えば、コンピュータプログラムにより処理して、リスクを診断することができる。好ましくはそのような場合には、上記手段は単一のデバイス内に含まれる。このデバイスはアプライされたサンプル中のBNP型ペプチドのレベルを測定するための分析ユニット及び診断のために結果のデータを処理するコンピュータユニットを含み得る。あるいは、BNP型ペプチドのレベルを測定するために試験ストリップなどの手段を用いる場合、診断手段は、測定されたレベルを、上述したような心不全に伴うことが知られているレベル又は健常な被験者であることの指標となると知られているレベルに割り当てる、対照のストリップ又は表を含んでもよい。試験ストリップは、好ましくは、BNP型ペプチドに特異的に結合するリガンド又は薬物が結合されている。前記ストリップ又はデバイスは、好ましくは、BNP型ペプチドとリガンド又は薬物との結合を検出する手段を含む。好ましい検出手段は、上の本発明の方法に関する実施形態に関連して開示されている。かかる場合、前記システムの使用者は、前記量の測定結果とマニュアルに示された指示及び解釈によるその診断値とを一緒にするという点で、前記の手段は機能的に連結される。かかる実施形態において、前記手段は分離したデバイスとして存在してもよく、そして好ましくはキットとして一緒にパッケージ化されている。当業者はさらに手間をかけることなく上記手段を連結する方法を認識するであろう。好ましいデバイスは、専門の臨床医の特定の知識なしに利用できるものであり、例えば、単にサンプルを充填するだけでよい試験ストリップ又は電子デバイスである。結果は、医師による解釈が必要である診断用のパラメータ又は生データの出力として提供されてもよい。さらなる好ましいデバイスには、分析ユニット／デバイス（例えば、バイオセンサ、アレイ、BNPを特異的に認識するリガンド又は薬物を結合させた固相支持体、表面プラズモン共鳴装置、NMR分光計、質量分析計など）又は本発明の方法に関連して上に言及した評価ユニット／デバイスが含まれる。
【０１２０】
本発明に係る方法は、BNP型ペプチドの測定レベルを、少なくとも1つの基準レベル、例えば患者の様々な程度のリスクに関連した既知レベル、と比較することによって、患者のリスクを診断するステップを含む。
【０１２１】
本発明において、「リスク」という用語は、特定の事象、より具体的には心血管合併症が起こる確率に関する。例えば、リスクは、所定の事象（incident）が、特定の時間のうちに、例えば500、750、1000又は1250日のうちに、所定の患者において少なくとも2％、5％、10％、15％又は20％の確率で起こることになることである。臨床研究によって、そのようなリスクを示すデータが得られる。所定のリスクは、例えば、所定の事象までの時間についての好適なカプラン・マイヤープロット（例えば実施例３参照）から、また本明細書で言及する特定のリスク及び危険率から導くことができる。
【０１２２】
リスクは絶対値で表すことができるが、相対的な用語、例えば特定の所定リスクに対するリスクが高い又は非常に高いという用語で、リスクを表すことがより有用であることが多い。当業者は、そのような相対用語に非常に精通している。例えば、一般的な集団における心血管合併症を経験する所定のリスクの平均がある。しかしながら、特定の患者が心血管合併症を経験するさらなるリスクを有し、それによってこの患者の総リスクは「高い」か否かを知ることがより適切である。本発明はまた、このような相対リスクを診断することができる利点がある。
【０１２３】
相対リスクは、危険率で表すことができる。「危険率」という用語は当業者に公知である。これは、2つの小集団の間のリスクの関係、例えば高用量群と低用量群の間の危険率を表すことができる。別の例は、低レベルのBNP型ペプチド対高レベルのBNP型ペプチドについての高用量群対低用量群の間の危険率である。危険率の差は、相互作用モデル、例えば特定のBNPレベルを有する用量群のモデル、から抽出される相互作用として知られている。相互作用及び相互作用モデルという用語は当業者に公知である。
【０１２４】
特に、本発明によって、高用量のESA（すなわち高い標的ヘモグロビンレベルを目的としている）により治療される場合に、心血管合併症を経験するリスクが高い患者を特定することが可能となる。
【０１２５】
例えば、リスクは、高い又は非常に高いとすることができる。リスクはまた、高くないとすることができる。当業者は、これらの用語の意味に精通している。例えば、特定の患者が平均の患者よりも高いリスクを有している場合、当業者は、通常そのようなリスクを「高い」と呼ぶだろう。「高いリスク」という用語は、患者が高用量のESAによる治療を受けるべきではないことを示すと理解されることが好ましい。リスクが高い患者は、好ましくは、何らかの心血管合併症の発症についてさらなる注意をもってモニターする必要がある。当業者は、治療に関する最終決定が、さらなる因子、例えば患者の年齢、心血管合併症の病歴、モニター利用の可能性などを考慮する主治医によってなされることを理解するだろう。
【０１２６】
本発明に関して、ESAの投与の結果として心血管合併症を経験する高いリスクは、平均の患者、好ましくは同じ年齢及び性別の平均の患者、より好ましくは同じ年齢、性別及びESA薬物投与により治療可能な症候を生じる障害（例として糖尿病又は癌）の患者のリスクと比較して、少なくとも1.5倍、2倍、3倍、3.5倍又は4倍のリスクの増大と特に関連している。ESA薬物投与により治療可能な症候を生じるさらなる障害は、本明細書の他箇所に記載している。
【０１２７】
当業者であれば、ESA薬物投与の結果として心血管合併症を経験する様々な程度のリスクと関連した既知レベルのBNP型ペプチドを決定することができる。
【０１２８】
本発明において、BNP型ペプチドの測定レベルが高いほど、心血管合併症を経験するリスクが高い。
【０１２９】
好ましくは、リスクは、BNP型ペプチドの測定レベルと基準レベルとを比較することによって測定する。「基準レベル」という用語は当業者に公知である。具体的には、基準レベルは、特定のリスクと関係しているか、又は異なる程度のリスクの間で識別することができるものである。基準レベルは診断の所望の感度又は特異性に応じて選択されることが理解されるだろう。感度が高いほど、特定の診断を有する全患者のうち同定（特定）される患者の割合が高くなり、並びに／あるいは特定の診断を有する患者のうち診断された疾患、合併症又はリスクではないと誤診断される患者が少なくなることを意味する。特異性が高いほど、特定の診断を有すると特定された患者が実際に診断された疾患、合併症又はリスクを有する割合が高くなることを意味する。特定の診断についての所望の感度が高くなるほど、この診断の特異性は低くなり、その逆もそうである。従って、基準レベルは、所望の感度及び特異性に応じて当業者が選択することができる。
【０１３０】
この説明に関して、基準レベルは単一の値だけではなく、値の範囲を含むこともできることが明らかである。
【０１３１】
より具体的には、基準レベルは、例えば実施例に示したような臨床試験において、測定されたBNP型ペプチドのレベルから導くことができる。
【０１３２】
基準レベルの例を以下に示す。すなわち、本発明の過程で、ESA薬物投与の結果として心血管合併症を経験する所定の程度のリスクと関連する又はリスクを識別すると見出された、NT-proBNPの血漿レベルを示す。 
下記に示すレベルが、患者のリスクに関する第1分類としての役割しかないこともあることは、明らかである。例えば、リスクは、特定の患者の心臓の予備ポンピング容量（spare pumping capacity）にも依存している。
【０１３３】
本発明においては、例えば500pg/ml未満、より具体的には400pg/ml、もっとも具体的には300pg/ml未満、のNT-proBNPの血漿レベルに相当するレベルが、ESA薬物投与の結果として心血管合併症を経験するリスクが高くないことと関連づけられる。
【０１３４】
本発明においては、例えば300pg/ml以上、より具体的には400pg/ml以上、もっとも具体的には500pg/ml以上、のNT-proBNPの血漿レベルに相当するレベルが、ESA薬物投与の結果として心血管合併症を経験するリスクが高いことと関連づけられる。
【０１３５】
本発明においては、例えば1000pg/ml以上のNT-proBNPの血漿レベルに相当するレベルが、その患者がESAによる治療をとにかく行うべきか否かを再検討する程度にリスクが非常に高いことを示しうる。
【０１３６】
所定のレベルが、選択した感度及び特異性に応じて、重複することもあることが明らかである。したがって、本発明においては、例えば300〜500pg/ml、より具体的には350〜450pg/ml、より具体的には380〜420pg/ml、特には400pg/mlのNT-proBNP血漿レベルに相当するレベルが、ESA薬物投与の結果として心血管合併症を経験する高くないリスクと高いリスクとを識別することができる。測定レベルがこの識別レベルよりも高い場合には、この測定レベルは、ESA薬物投与の結果として心血管合併症を経験する高いリスクを示す。このような識別レベルは、「カットオフ」又は「識別閾値」とも呼ばれる。
【０１３７】
患者のリスクが診断された後、それは、以下に記載されるように、後続の治療に重要となりうる。後述するリスク程度は、特に、上記のNT-proBNPレベルに関連したリスク程度を指す。
【０１３８】
本発明に係る方法が、高リスクを示さない場合には、計画通りに治療を継続してもよい、例えば高用量のESAを投与しうる（あるいは、これに従ってESAの高い標的レベルを目的としてもよい）。ESA治療は、ある程度間隔をおいて（例えば4週毎、2ヶ月毎又は3ヶ月毎に）NT-proBNPのレベルをモニターすることと一緒に行いうる。
【０１３９】
基準レベルは、特定の患者群について適したものとすることもできる。例えば、血液サンプル中の測定についての基準レベルは、腎疾患を患う患者では10〜30％、より好ましくは15〜25％、より好ましくは20％増大する。
【０１４０】
本発明に係る方法が、高リスクを示す場合には、治療を調整することができる。治療は、本発明のBNP型ペプチドのレベルをさらに測定し、心電図記録法、心エコー法、又は熟練した心臓内科医に公知の任意の他の適当な方法などの別の診断を一緒に行うことが好ましい。ESA薬物投与の用量を低減してもよいし、又はESA薬物投与を適用しなくてもよい。従って、本発明はまた、ESA薬物投与を受ける又は受けようとしている患者の治療方法を提供する。
【０１４１】
上述したように、本発明によって、特に患者の心血管系リスクに関して、ESAによる薬物投与の最適用量を決定することも可能になる。よって、本発明はまた、特にESA薬物投与の結果として心血管合併症を経験する患者のリスクに関して、ESAの薬物投与、好ましくは将来の薬物投与の患者に投与すべき用量を決定する方法であって、（a）患者においてBNP型ペプチドのレベルを測定、好ましくはin vitroで測定するステップ、（b）BNP型ペプチドの測定レベルを、投与される異なる用量の間を識別する少なくとも1つの基準レベルと比較することにより、患者に投与すべき用量を決定するステップを含む方法に関する。
【０１４２】
ESAによる薬物投与の用量を選択する場合、一般には、貧血の有効な治療を達成するが望ましくない副作用を引き起こさない、最も高い可能な用量を選択することが望ましいとされている。しかしながら、主治医が特定の望ましくない副作用（心血管合併症など）のリスクを意識していない場合には、高用量すぎて心血管合併症を引き起こす可能性のある用量を誤って選択する可能性がある。対照的に、主治医が所定のリスクを決定することができない場合、低用量すぎて最適な治療効果（特に貧血の効果的な治療）に達することのない用量を選択する可能性がある。
【０１４３】
好ましくは、用量は、心臓に対する負荷を軽減するために、貧血を十分に治療するのに十分に高いべきである。好ましくは、用量は、ESA薬物投与から生じる心血管合併症を回避するのに十分に低い必要がある。
【０１４４】
本発明は、（1）ESA治療の結果として心血管合併症を経験するリスクがあるという情報、及び（2）心血管合併症のリスクを最小化するためのESAの用量（特に標的ヘモグロビンレベルに応じて）の最適化に関する情報を提供するという利点がある。
【０１４５】
本発明はまた、（3）比較的軽度な貧血、すなわち患者において既に比較的高いHbレベル（例えば11.0〜12.5g/dl）の場合（「初期治療」）あるいはわずかにより重篤な貧血（例えば10.5g/dl未満、すなわち9.5〜10.5g/dlのHb）の場合（「晩期治療」）でさえ、ESA治療を開始してもよいかどうかに関する情報を提供する。
【０１４６】
より具体的にはBNP型ペプチドのレベルが心血管合併症を経験する高リスク（本明細書の他箇所で記載したように）を示す場合、それは次いで、その患者は高用量のESAによる治療を行うべきではないことを示し、並びに／あるいはその患者は低用量のESAによる治療のみを行うことができることを示し、並びに／あるいは治療を早期に開始すべきではないことを示す。 またこれは、患者がESAによる治療を受けるべきではないことを示す。またこれは、患者は高リスクの場合について記載されているように追加的に治療を受ける必要があり、好ましくは他の箇所で記載のように患者はさらに追加的にモニターする必要があることを示している。
【０１４７】
本発明に関して、ESAの「低用量」及び「高用量」という用語は、好ましくは、特定の標的値にまでヘモグロビンレベルを高めるために必要な用量と理解される。従って、「低用量」及び「高用量」という用語は、貧血の「部分的」対「完全」な矯正に関するものとも理解される。低用量は、好ましくはHbレベルが13g/dlに達するために必要とされるよりも高くないESA用量、より好ましくはHbレベルが12g/dlに達するために必要とされるよりも高くない用量に関する。低用量の例には、標的Hbレベルが9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5又は13g/dlに達することを目的としたESA用量が含まれる。高用量は、好ましくはHbレベルが少なくとも14g/dlに達するのに十分なESA用量、より好ましくはHbレベルが14.5g/dlに達するのに十分な用量に関する。高用量の例には、標的Hbレベルが14、14.5、15g/dlに達することを目的としたESA用量が含まれる。
【０１４８】
あるいは、「低用量」及び「高用量」という用語は、Hbレベルを、2g/dl未満、特には1.5g/dl、1g/dl又は0.5g/dl未満（低用量）、あるいは少なくとも2g/dl、2.5g/dl又は3g/dl（高用量）増大することができる用量として理解される。
【０１４９】
例えば、高用量は、ESA薬物投与の開始前に11.0〜12.5g/dlのヘモグロビンレベルを有する患者において13〜15g/dlの標的ヘモグロビンレベルを維持するために十分な用量に相当する。別の例では、低用量は、ESA薬物投与の開始前に10.5g/dl未満のヘモグロビンレベル、好ましくは9.5〜10.5g/dlのレベルを有する患者において10.5〜11.5g/dlの標的ヘモグロビンレベルを維持するために十分な用量に相当する。
【０１５０】
本発明は、ESA治療の結果として心血管合併症を経験するリスクの診断に関する手段及び方法を提供する。特に、本発明の教示は、心血管合併症を経験するリスクに関連していないと以前は考えられていたESA用量、例えば血中ヘモグロビン濃度が少なくとも17、18、19又は20g/dlに達するのに必要なものよりも高くない用量に関する。従って、本発明の教示は、競技者の血液ドーピングに関して知られている血液の過粘稠又は他の何らかの有害事象を引き起こすことのない用量にも関する。
【０１５１】
「低」又は「高」用量に関する上記の特定の値は、健常な個体（ESAが上記レベルに達するのに全く必要ではない）で必要とされる用量とは関係がないが、貧血を患う患者に投与される用量に関係する。特に、上記レベルは、男性患者においてはHbレベル（ESA治療開始前）が12g/dl未満、詳細には10g/dl未満、より詳細には9g/dl未満、最も詳細には8g/dl未満の、又は女性患者においてはHbレベル（ESA治療開始前）が11g/dl未満、詳細には10g/dl未満、より詳細には9g/dl未満、最も詳細には8g/dl未満の患者に関係する。
【０１５２】
当業者は、Hbの特定のレベル又は標的値に達するためのESA用量を決定する方法に精通している。例えば、貧血患者（例えばHbレベル9.5〜12.5g/dlを有する）において、治療は、週に１回皮下投与される2000国際単位のNeoRecormonTMに相当する用量で開始しうる。このような患者におけるHbレベルは、例えば1週間後又は1ヶ月後に測定し、治療計画が所定の標的値を満たすことが確認されるまでさらに用量を調整する。例えば疾患の進行に従って、用量をさらに調整及びモニターしてもよい。実際に達したHbレベルは、ESAの投与頻度又は疾患の進行に応じて、ある程度変動することが理解される。
【０１５３】
ESA薬物投与の用量の決定の態様には本明細書に記載したいずれの好ましい実施形態又は特徴も準用する。
【０１５４】
本発明はまた、ESAによる薬物投与、特に将来の薬物投与の結果として心血管合併症を経験するリスクのモニターに関する。さらに、本発明は、リスクが診断された後にさらにリスクをモニターすることにも関する。より具体的には、モニターは、そのような最初の測定又は診断の時点で、以前の何らかのESA（より具体的にはエリスロポエチン又はその変異体）による薬物投与が、測定又は診断の時点の少なくとも1ヶ月、詳細には少なくとも2ヶ月、より詳細には少なくとも6ヶ月、より詳細には少なくとも1年前に行われた患者におけるモニターに関する。よりさらに具体的には、最初の測定又は診断の時点で、患者は、以前の何らかのESAによる薬物投与を受けていない。本発明は、そのような患者における現在の心血管状態のモニターにも関する。
【０１５５】
「モニター」という用語は当業者に公知であり、本明細書の他箇所で定義している。より具体的には、モニターは、一定間隔で、例えばおよそ2時間、10時間、1日、2日、3日、4日、1週間、2週間、3週間、4週間、1ヶ月、2ヶ月、4ヶ月、6ヶ月、又は1年の間隔で、患者のリスクを診断することによって行うことができる。この関係で「およそ」という用語は当業者に理解されている。従って、実際の間隔は、実施環境、例えば適当な予約の設定などに応じて、意図される一定間隔から逸脱してもよい。具体的には、間隔は、例えば最大100％、好ましくは最大50％、より好ましくは最大25％、より好ましくは最大10％逸脱しうる。
【０１５６】
モニターは、ESAによる薬物投与に付随して行ってもよいし、ESAによる治療に付随しなくてもよい。モニターによって、ESA薬物投与の用量をさらに調整し、最適化することも可能となる。
【０１５７】
モニターの態様には本明細書に記載したいずれの好ましい実施形態又は特徴も準用する。
【０１５８】
別の実施形態において、本発明は、ESA薬物投与による患者の治療を決定するための、及び／又は計画したESA薬物投与の用量を決定するための方法であって、（a）BNP型ペプチドのレベルを測定、好ましくはin vitroで測定するステップ、（b）BNP型ペプチドの測定レベルを患者におけるさまざまな程度のリスクと関連する既知レベルと比較することにより、ESA薬物投与の結果として心血管合併症を経験する患者のリスクを診断するステップ、（c）場合により、心臓専門医による患者の診察を開始するステップ、（d）場合により心臓専門医による患者の診察結果を考慮して、治療の開始又は治療の差し控えを推奨するステップを含む方法に関する。好ましくは、心臓専門医による診察の開始及び／又は治療の差し控えは、前記方法がESAによる薬物投与の結果として心血管合併症を経験する高リスクの存在を示す場合に、推奨される。前記方法が本明細書で言及する本発明のすべての実施形態又は好ましい態様に適合しうることは明らかである。
【０１５９】
以下の実施例は、本発明を例示するものであり、その範囲を何ら限定することを意図するものではない。
【０１６０】
最後に、本発明は、将来のESA薬物投与の結果として心血管合併症を経験する患者のリスクを診断するための、本明細書において上述したデバイス、又はBNP型ペプチド若しくはその変異体の使用をも包含する。
【０１６１】
本明細書で引用した全ての参照文献は、その全体の開示内容及び本明細書中具体的に指摘した開示内容について、参照により本明細書に組み入れられる。
【実施例１】
【０１６２】
NT-proBNPの測定：
NT-proBNPは、Elecsys 2010を用いた電気化学発光イムノアッセイ（Elecsys proBNPサンドイッチイムノアッセイ;Roche Diagnostics社、Mannheim、独国）で測定する。このアッセイは電気化学発光サンドイッチイムノアッセイの原理に従って機能する。第１ステップでは、ビオチン標識されたIgG（1-21）捕獲抗体と、ルテニウム標識されたF(ab')2(39-50)シグナル抗体と、20μlのサンプルとを37℃で9分間インキュベートする。その後、ストレプトアビジンでコーティングされた磁性微粒子を添加し、混合物をさらに9分間インキュベートする。第2のインキュベーションの後に、反応混合物を装置の測定セルに移す。ビーズは、そこで磁力により電極の表面に捕捉される。結合しなかった標識は、測定セルをバッファーで洗浄することによって除去する。
【０１６３】
最終のステップでは、トリプロピルアミンを含むバッファーの存在下で電極に電圧を印加し、この結果得られた電気化学発光シグナルを光電増倍管で記録する。すべての試薬及びサンプルはElecsys(登録商標)装置によって完全に自動的に操作される。結果は、2点較正と、試薬バーコードで得られるマスター曲線とで測定器に特有に生成された検量線を用いて決定する。試験は製造者の教示に従って行う。
【実施例２】
【０１６４】
サンプルの入手：
BNP型ペプチド分析用の血液は、必要に応じて、5000Uのアプロチニン（Trasylol, Beyer, Germany）を含有するEDTAチューブ中と、リチウムヘパリンチューブ（臨床化学用）中とに採取する。血液及び尿サンプルは、即座に4℃、3400rpmで10分間遠心する。上清を分析まで-80℃で保存する。
【実施例３】
【０１６５】
目的：
CREATE試験は、腎代償療法を受けていない慢性腎貧血を患う患者における心血管系リスクの低減に対する、エポエチンβによる初期貧血の矯正の効果を調べるための、公開、無作為化、並行群、多施設の試験であった。この研究の主な目的は、標的ヘモグロビン（Hb）レベルが13〜15g/dLとなる初期エポエチンβ処置の心血管疾患罹患率に対する影響を調べ、これらの影響を標的Hbレベル10.5〜11.5g/dLを維持するようにエポエチンβ処置が行われたものと比較することであった。
【０１６６】
方法：
一次評価項目は、プロトコールに特有の心血管事象（最初の事象までの時間）の全ての評価項目を組み合わせた：少なくとも24時間の入院又は入院の延長に至る狭心症、急性心不全、致死的又は非致死的心筋梗塞、致死的又は非致死的卒中、突然死、一過性脳虚血発作（TIA）、末梢血管疾患（切断、壊死）、少なくとも24時間の入院又は入院の延長に至る心不整脈。
【０１６７】
二次的変数：
−心血管死亡率、全ての原因の死亡率、慢性心不全（NYHA分類）、心血管介入（cardiovascular intervention）：事象までの時間及び事象の頻度
−心血管理由での入院及び入院の期間
−左心室容量指数、左心室容積、左心室駆出率、心筋短縮率
−クオリティオブライフ（SF-36質問）。
【０１６８】
NT-proBNP代替試験において、追加的な実験室測定を、基線にて、CREATE試験の患者の小集団について、6、12、24、36及び48ヶ月において行った。行った測定は、NT-proBNP及びいくつかの他の実験室測定である。
【０１６９】
試験コホート全体が、心臓及び心血管（CV）有害事象を含む有害事象の発生率について試験された。全てのCV事象は、専門的なRocheの薬物安全スタッフによってMedDRA（Medical Directionary of Regulatory Activities）カテゴリーに分類された。心臓事象には、狭心症、不整脈、急性又は慢性心不全、心筋梗塞、徐脈及び頻脈のような具体的な事象が含まれた。心血管事象は、さらに高血圧、低血圧、末梢血管疾患又は深部静脈血栓症などの血管系に関する事象を含む。有害事象の記録には、非特異的な事象もまた動悸又は紅潮などの心血管事象時にみとめられるのが典型的である。
【０１７０】
分析：
最初の予備分析においては、CREATE試験集団の266人の患者の基線NT-proBNPレベルを、2つの処置群（「Hb high」＝Hb標的値13〜15g/dL、「Hb low」＝Hb標的値10.5〜11.5pg/dL）に層別化した。さらに、コホート全体の予備中央NT-proBNPレベル（400pg/mlを超える及びそれ未満）によって群を分けた。この試験の一次評価項目によって定義される最初の心臓事象までの時間を、カプラン・マイヤーグラフにプロットした（例えば、この特定の事象を経験していない集団の割合）（図１）。危険率（すなわち、各リスクが高い又は低い因子）を計算し、p値<0.05を有意とみなした。同様に、最初の心臓有害事象及び心血管事象までの時間についてのカプラン・マイヤープロットを作成した（図２〜３）。
【０１７１】
予備結果：
2つの処置群の発生率の概要（事象の時期を無視する）を以下の表に示す。
【表１】
2010501073.tif 000002
【０１７２】
NT-proBNP基線レベルが400pg/ml未満の患者群においては、2つの処置群について一次CV評価項目又は心血管有害事象についての発生率の差がないことが明らかであるが、400pg/mlを超える基線値を有する患者、特に「Hb high」群は、発生率が高い。「事象までの時間（time-to-event）」法による最終的な分析（closer analysis）によって、一次心血管評価項目を経験する統計学的に有意に高いリスクが「Hb high」処置群（>3.7倍）においてみとめられ、「Hb low」群についての強い傾向は統計学的有意性には達しなかったことが示された（図１）。
【０１７３】
400pg/mlを超える値を有する患者は、400pg/ml未満の値を有する患者と比較して、両方の処置法群において統計学的に有意に多くの心臓事象を経験し、「Hb high」群についてはより高いリスク比を有した（図２）。心血管有害事象については、低い標的値の方法よりも高い標的値の方法で処置した群においてリスクが統計学的に有意に高かった（基線値>400pg/mlの患者群）（図３）。一次評価項目及び心血管有害事象についてのリスク分析の結果を、推定リスク比を信頼区間と共に示すフォレストプロット（図４）にまとめる。
【０１７４】
結論：
予備結果は、NT-proBNPが、低い及び高い標的Hb方法でエポエチンβにより安全に処置することができるCREATE集団内の患者集団（基線レベル400pg/ml未満）を特定しうることを示している。NT-proBNPレベルが基線で400pg/mlを超える患者においては、このマーカーは、心臓及び心血管事象について高いリスクの患者群を特定する。カットオフ値400pg/mlは、予備的選択であり、臨床決定状況に応じて他の選択肢の可能性もある。特に高い標的Hb方法について、注意深いリスク対効果分析、例えばこの処置方法についてのCV状態の綿密なモニターなどが示される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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