(57)【要約】  本発明は、一般的に、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に、そして特に、ＨＴＶ−Ｉ感染に対して防御するための多構成要素ワクチンおよび該ワクチンを用いる方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物において、ＨＩＶ−１に対する免疫応答の産生を誘導する方法であって：
ｉ）中央化ＨＩＶ−１遺伝子配列、
ｉｉ）哺乳動物免疫寛容を破壊する剤、および
ｉｉｉ）ＨＩＶ−１が誘導するアポトーシスまたはＨＩＶ−１が誘導するアポトーシスの免疫抑制効果を阻害する剤
を前記哺乳動物に投与する工程を含む、
ここで（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）が前記産生を達成するのに十分な量で投与される
前記方法。
【請求項２】
前記中央化ＨＩＶ−１遺伝子配列が、コンセンサスまたはモザイクＨＩＶ−１遺伝子配列である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記中央化ＨＩＶ−１遺伝子配列がベクター中に存在する、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記ウイルスベクターが、組換えアデノウイルスベクターまたは組換え水疱性口内炎ウイルスベクターである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記ベクターが組換えマイコバクテリアベクターである、請求項３記載の方法。
【請求項７】
前記組換えマイコバクテリアベクターが、弱毒化ＴＢ、ｒＢＣＧまたはｒＭ．スメグマティス（ｒＭ．  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記中央化ＨＩＶ−１遺伝子配列が、コンセンサスＨＩＶ−１遺伝子配列である、請求項２記載の方法。
【請求項９】
前記コンセンサスＨＩＶ−１遺伝子配列が、コンセンサスＨＩＶ−１  ｅｎｖ、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｎｅｆまたはｔａｔ遺伝子配列である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記コンセンサスＨＩＶ−１遺伝子配列が、コンセンサスＨＩＶ−１  ｅｎｖ遺伝子配列である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記コンセンサスＨＩＶ−１  ｅｎｖ遺伝子配列が、コンセンサスＨＩＶ−１  ｇｐ１６０遺伝子配列である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記中央化ＨＩＶ−１遺伝子配列が、モザイクＨＩＶ−１遺伝子配列である、請求項２記載の方法。
【請求項１３】
前記モザイクＨＩＶ−１遺伝子配列が、モザイクＨＩＶ−１  ｇａｇまたはｎｅｆ遺伝子配列である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記中央化ＨＩＶ−１遺伝子配列が、細胞質ドメイン小胞体保持配列をコードする配列を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞質ドメイン小胞体保持配列がリジン−リジンを含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
哺乳動物免疫寛容を破壊する前記剤が、制御性Ｔ細胞阻害剤またはＴＬＲ−９アゴニストである、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
哺乳動物免疫寛容を破壊する前記剤が、オリゴＣｐＧを含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記オリゴＣｐＧが油性アジュバント中にある、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記オリゴＣｐＧがオリゴＣｐＧのＢ型である、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
哺乳動物免疫寛容を破壊する前記剤が、制御性Ｔ細胞阻害剤である、請求項１６記載の方法。
【請求項２１】
前記制御性Ｔ細胞阻害剤が、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦファミリー関連受容体リガンド（ＧＩＴＲＬ）コード配列、抗ＣＤ２５抗体またはＯＮＴＡＫを含む、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
ＨＩＶ−１が誘導するアポトーシスを阻害する前記剤が、抗ホスファチジルセリン（ＰＳ）抗体、抗ＣＤ３６抗体、または抗ＨＩＶ  ｔａｔ抗体を誘導する、請求項１記載の方法。
【請求項２３】
ＨＩＶ−１が誘導するアポトーシスを阻害する剤が、抗ＰＳ抗体を誘導し、そしてＰＳリポソームを含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記ＰＳ−リポソームがＨＩＶ免疫原を含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記ＰＳ−リポソームがＨＩＶ  ｅｎｖエピトープを含む、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記ＨＩＶ免疫原が２Ｆ５−ＧＴＨ１ペプチド脂質コンジュゲートを含む、請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
前記ＰＳリポソームがＣＯＮ−Ｓを含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２８】
ＨＩＶ−１が誘導するアポトーシスを阻害する前記剤が、ＰＳ−ＣＤ３６相互作用を阻害する抗ＰＳ抗体を誘導する、請求項２２記載の方法。
【請求項２９】
ＨＩＶ−１が誘導するアポトーシスを阻害する前記剤が、抗ＣＤ３６抗体を誘導する、請求項２２記載の方法。
【請求項３０】
ＨＩＶ−１が誘導するアポトーシスを阻害する前記剤が、前記哺乳動物の粘膜部位で、抗ＰＳまたは抗ＣＤ３６抗体を誘導する、請求項２２記載の方法。
【請求項３１】
ＨＩＶ−１が誘導するアポトーシスを阻害する前記剤が、抗ＨＩＶ  ｔａｔ抗体を誘導する、請求項２２記載の方法。
【請求項３２】
ＨＩＶ−１が誘導するアポトーシスの免疫抑制効果を阻害する前記剤を投与する、請求項１記載の方法。
【請求項３３】
ＨＩＶ−１が誘導するアポトーシスの免疫抑制効果を阻害する前記剤が、ＴＮＦ阻害剤を含む、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
前記ＴＮＦ阻害剤が、ＴＮＦ受容体に対するモノクローナル抗体、Ｆａｓ−Ｆａｓリガンド相互作用の阻害剤、またはＴＲＡＩＬ−ＤＲ５相互作用の阻害剤を含む、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記方法が、ＨＩＶ−１が誘導するアポトーシスに関連する免疫細胞活性化を阻害するのに十分な量の汎カスパーゼ阻害剤を、前記哺乳動物に投与する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３６】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１記載の方法。
【請求項３７】
中央化ＨＩＶ−１遺伝子配列、哺乳動物免疫寛容を破壊する剤、およびＨＩＶ−１が誘導するアポトーシスまたはアポトーシスの免疫抑制効果を阻害する剤を含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その全内容が本明細書に援用される、２００６年１１月１７日出願の米国仮出願第６０／８５９，４９６号の優先権を主張する。
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された助成金番号ＡＩ０６７８５０１号のもと、政府支援を受けて行われた。米国政府は本発明に特定の権利を有する。
【０００２】
本発明は、一般的に、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に、そして特に、ＨＩＶ−１感染に対して防御するための多構成要素ワクチンおよび該ワクチンを用いる方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＨＩＶ−１に対する有効なワクチンの産生は、ＡＩＤＳ研究の非常に重要な目的である。現在まで、予防ワクチンの開発は、ＨＩＶの多様性（Ｇａｓｃｈｅｎ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：２３５４（２００２））、粘膜部位での免疫細胞アポトーシスの迅速な開始（Ｍａｔｔａｐａｌｌｉｌら，  Ｎａｔｕｒｅ  ４３４：１０９３（２００５）；  Ｖｅａｚｅｙら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０：４２７（１９９８）；  Ｇｕａｄａｌｕｐｅら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ  ７７：１１７０８（２００３）；  Ｂｒｅｎｃｈｌｅｙら，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  ２００：７４９（２００４）；  Ｍｅｎｈａｎｄｒｕら，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  ２００：７６１（２００４））、ＨＩＶ−１がウイルスの細胞性貯蔵所を持つ組込みウイルスであるという事実（Ｆａｕｃｉ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４５：３０５（１９８９））、並びに自己ＨＩＶ−１生得的および中和抗体応答の誘導が、血漿におけるウイルス増加（ｒａｍｐ−ｕｐ）の８週〜１年後まで遅れること（Ａｂｅｌら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ  ８０：６３５７−６７（２００６），  Ｗｅｉら，  Ｎａｔｕｒｅ  ４２２：３０７−１２（２００３）；  Ｒｉｃｈｍａｎら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １００：４１４４−９（２００３））によって、成功していない。
【０００４】
本発明は、コンセンサスおよび／またはモザイクＨＩＶ遺伝子（Ｇａｓｃｈｅｎら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：２３５４（２００２）；  Ｌｉａｏら，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３５３：２６８（２００６），  Ｇａｏら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７９：１１５４（２００５），  Ｗｅａｖｅｒら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８０：６７５４（２００６），  Ｆｉｓｃｈｅｒら，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  １３（１）：１００−１０６（２００７），  Ｅｐｕｂ  ２００６  Ｄｅｃ  ２４）を、免疫寛容を破壊して、粘膜部位で中和抗体の所望の特異性の誘導を可能にする戦略（例えば制御性Ｔ細胞阻害および／またはＴＬＲ−９アゴニストアジュバントの使用を通じたもの）、並びにＨＩＶ−１に誘導されるアポトーシスを克服するよう設計された戦略（例えば抗ホスファチジルセリン（ＰＳ）抗体、抗ＣＤ３６抗体、および／または抗ｔａｔ抗体の誘導）と組み合わせて使用することによって、ＨＩＶの多様性から生じる問題に取り組む多構成要素ワクチンに関する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｇａｓｃｈｅｎ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：２３５４（２００２）
【非特許文献２】Ｍａｔｔａｐａｌｌｉｌら，  Ｎａｔｕｒｅ  ４３４：１０９３（２００５）
【非特許文献３】Ｖｅａｚｅｙら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０：４２７（１９９８）
【非特許文献４】Ｇｕａｄａｌｕｐｅら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ  ７７：１１７０８（２００３）
【非特許文献５】Ｂｒｅｎｃｈｌｅｙら，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  ２００：７４９（２００４）
【非特許文献６】Ｍｅｎｈａｎｄｒｕら，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  ２００：７６１（２００４）
【非特許文献７】Ｆａｕｃｉ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４５：３０５（１９８９）
【非特許文献８】Ａｂｅｌら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ  ８０：６３５７−６７（２００６）
【非特許文献９】Ｗｅｉら，  Ｎａｔｕｒｅ  ４２２：３０７−１２（２００３）
【非特許文献１０】Ｒｉｃｈｍａｎら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １００：４１４４−９（２００３）
【非特許文献１１】Ｌｉａｏら，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３５３：２６８（２００６）
【非特許文献１２】Ｇａｏら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７９：１１５４（２００５）
【非特許文献１３】Ｗｅａｖｅｒら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８０：６７５４（２００６）
【非特許文献１４】Ｆｉｓｃｈｅｒら，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  １３（１）：１００−１０６（２００７），  Ｅｐｕｂ  ２００６  Ｄｅｃ  ２４
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、一般的にＨＩＶに関する。より具体的には、本発明は、ＨＩＶ−１感染に対してヒトを防御するのに使用可能な多構成要素ＨＩＶワクチンに関する。
本発明の目的および利点は、以下の説明から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】急性ＨＩＶ−１感染直後の抗体応答の概要。
【図２−１】図２Ａ〜２Ｆ。Ｆａｓリガンド対ウイルス負荷。（図２Ａ）Ｆａｓリガンド、パネル６２４６。（図２Ｂ）Ｆａｓリガンド、パネル６２４０。（図２Ｃ）Ｆａｓリガンド、パネル９０７６。（図２Ｄ）Ｆａｓリガンド、パネル９０２１。（図２Ｅ）Ｆａｓリガンド、パネル９０２０。（図２Ｆ）Ｆａｓリガンド、パネル９０３２。
【図２−２】図２Ａ〜２Ｆ。Ｆａｓリガンド対ウイルス負荷。（図２Ａ）Ｆａｓリガンド、パネル６２４６。（図２Ｂ）Ｆａｓリガンド、パネル６２４０。（図２Ｃ）Ｆａｓリガンド、パネル９０７６。（図２Ｄ）Ｆａｓリガンド、パネル９０２１。（図２Ｅ）Ｆａｓリガンド、パネル９０２０。（図２Ｆ）Ｆａｓリガンド、パネル９０３２。
【図３−１】図３Ａ〜３Ｆ。Ｆａｓ（ＣＤ９５）対ウイルス負荷。（図３Ａ）Ｆａｓ（ＣＤ９５）、パネル６２４６。（図３Ｂ）Ｆａｓ（ＣＤ９５）、パネル６２４０。（図３Ｃ）Ｆａｓ（ＣＤ９５）、パネル９０７６。（図３Ｄ）Ｆａｓ（ＣＤ９５）、パネル９０２１。（図３Ｅ）Ｆａｓ（ＣＤ９５）、パネル９０２０。（図３Ｆ）Ｆａｓ（ＣＤ９５）、パネル９０３２。
【図３−２】図３Ａ〜３Ｆ。Ｆａｓ（ＣＤ９５）対ウイルス負荷。（図３Ａ）Ｆａｓ（ＣＤ９５）、パネル６２４６。（図３Ｂ）Ｆａｓ（ＣＤ９５）、パネル６２４０。（図３Ｃ）Ｆａｓ（ＣＤ９５）、パネル９０７６。（図３Ｄ）Ｆａｓ（ＣＤ９５）、パネル９０２１。（図３Ｅ）Ｆａｓ（ＣＤ９５）、パネル９０２０。（図３Ｆ）Ｆａｓ（ＣＤ９５）、パネル９０３２。
【図４−１】図４Ａ〜４Ｅ。ＴＮＦＲ２対ウイルス負荷。（図４Ａ）ＴＮＦＲ２、パネル６２４０。（図４Ｂ）ＴＮＦＲ２、パネル６２４４。（図４Ｃ）ＴＮＦＲ２、パネル６２４６。（図４Ｄ）ＴＮＦＲ２、パネル９０２０。（図４Ｅ）ＴＮＦＲ２、パネル９０２１。
【図４−２】図４Ａ〜４Ｅ。ＴＮＦＲ２対ウイルス負荷。（図４Ａ）ＴＮＦＲ２、パネル６２４０。（図４Ｂ）ＴＮＦＲ２、パネル６２４４。（図４Ｃ）ＴＮＦＲ２、パネル６２４６。（図４Ｄ）ＴＮＦＲ２、パネル９０２０。（図４Ｅ）ＴＮＦＲ２、パネル９０２１。
【図５】図５Ａおよび５Ｂ。ＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ関連アポトーシス誘導性リガンド）。（図５Ａ）ＴＲＡＩＬ、パネル９０２０。（図５Ｂ）ＴＲＡＩＬ、パネル９０２１。
【図６】図６Ａおよび６Ｂ。慢性ＨＩＶ−１感染において、ＴおよびＢ細胞上でＰＤ−１が上方制御される。（図６Ａ）ＣＤ３＋。（図６Ｂ）ＣＤ１９＋。
【図７】図７Ａ〜７Ｄ。（図７Ａおよび７Ｂ）非感染細胞上の抗ＰＳ。（図７Ｃおよび７Ｄ）ＭＮ感染細胞およびビリオン上の抗ＰＳ。
【図８−１】図８Ａおよび８Ｂ。ペプチド−リポソーム・コンジュゲートに対するｍＡｂ  ４Ｅ１０および２Ｆ５の結合。約１０００ＲＵの合成リポソーム（赤）；脂質−ＧＴＨ１−４Ｅ１０（図８Ａ、緑）；または４Ｅ１０−ＧＴＨ１−脂質（図８Ａ、青）のいずれかをＢＩＡｃｏｒｅ  Ｌ１センサーチップ上に係留した。４番目のフローセルは脂質を伴わず未処理のままであった（赤紫）。第二のセンサーチップ上、脂質−ＧＴＨ１−２Ｆ５（図８Ｂ、緑）；または２Ｆ５−ＧＴＨ１−脂質（図８Ｂ、青）またはリポソームのみ（図８Ｂ、赤）を係留した。Ｍａｂ  ４Ｅ１０（図８Ａ）またはｍＡｂ  ２Ｆ５（図８Ｂ）を各センサーチップ上に注入し、そしてＢＩＡｃｏｒｅ  ３０００装置上で結合応答を記録した。Ｋｄ値は、２工程コンホメーション変化モデルおよびＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用いた曲線適合分析に由来した。
【０００８】
方法。クロロホルム中に溶解されたリン脂質ＰＯＰＣ（１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン）、ＰＯＰＥ（１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン）、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン）；ＤＭＰＡ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート）およびコレステロールをＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（アラバマ州アラバスター）から購入した。クロロホルム耐性試験管中に適切なモル量のリン脂質を分配することによって、リン脂質リポソームを調製した。４５：２５：２０：１０（ＰＯＰＣ：ＰＯＰＥ：ＤＭＰＡ：コレステロール）のモル比で、脂質のクロロホルム溶液をペプチド溶液に添加した。ＨＩＶ−１膜近接ペプチドを７０％クロロホルム、３０％メタノール中に溶解した。各ペプチドを１：４２０のペプチド：総リン脂質のモル比で添加した。穏やかにボルテックスすることによってリン脂質を混合し、そして穏やかな窒素流下で、ドラフト中、混合物を乾燥させた。脂質を高真空下で保存する（１５時間）ことによって、いかなる残渣クロロホルムも除去した。ＰＢＳまたはＴＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４を添加することによって、リン脂質の水性懸濁物を調製し、そして断続的に激しくボルテックスしながらＴｍより高い温度で１０〜３０分間維持してリン脂質を再懸濁し、その後、水槽超音波処理装置（Ｍｉｓｏｎｉｘ  Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ  ３０００，  Ｍｉｓｏｎｉｘ  Ｉｎｃ．，  ニューヨーク州ファーミングデール）中で超音波処理した。周期あたり全超音波処理４５秒間を３回連続周期で行うように、超音波処理装置をプログラミングした。各周期には、５秒間の超音波処理パルス（７０ワット出力）、その後、１２秒間のパルスオフ期間が含まれた。超音波処理終了時、薄板状リポソーム懸濁物を４℃で保存し、そして融解し、そしてＢＩＡｃｏｒｅセンサーチップ上に捕捉する前に、上述のように再び超音波処理した。
【０００９】
逆相ＨＰＬＣによってペプチドを合成し、そして精製し、そして質量分析によって、純度を確認した。この研究に用いたペプチドには以下が含まれた−
【００１０】
【化１】
2010510226.tif 000002
【図８−２】図８Ａおよび８Ｂ。ペプチド−リポソーム・コンジュゲートに対するｍＡｂ  ４Ｅ１０および２Ｆ５の結合。約１０００ＲＵの合成リポソーム（赤）；脂質−ＧＴＨ１−４Ｅ１０（図８Ａ、緑）；または４Ｅ１０−ＧＴＨ１−脂質（図８Ａ、青）のいずれかをＢＩＡｃｏｒｅ  Ｌ１センサーチップ上に係留した。４番目のフローセルは脂質を伴わず未処理のままであった（赤紫）。第二のセンサーチップ上、脂質−ＧＴＨ１−２Ｆ５（図８Ｂ、緑）；または２Ｆ５−ＧＴＨ１−脂質（図８Ｂ、青）またはリポソームのみ（図８Ｂ、赤）を係留した。Ｍａｂ  ４Ｅ１０（図８Ａ）またはｍＡｂ  ２Ｆ５（図８Ｂ）を各センサーチップ上に注入し、そしてＢＩＡｃｏｒｅ  ３０００装置上で結合応答を記録した。Ｋｄ値は、２工程コンホメーション変化モデルおよびＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用いた曲線適合分析に由来した。
【００１１】
方法。クロロホルム中に溶解されたリン脂質ＰＯＰＣ（１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン）、ＰＯＰＥ（１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン）、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン）；ＤＭＰＡ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート）およびコレステロールをＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（アラバマ州アラバスター）から購入した。クロロホルム耐性試験管中に適切なモル量のリン脂質を分配することによって、リン脂質リポソームを調製した。４５：２５：２０：１０（ＰＯＰＣ：ＰＯＰＥ：ＤＭＰＡ：コレステロール）のモル比で、脂質のクロロホルム溶液をペプチド溶液に添加した。ＨＩＶ−１膜近接ペプチドを７０％クロロホルム、３０％メタノール中に溶解した。各ペプチドを１：４２０のペプチド：総リン脂質のモル比で添加した。穏やかにボルテックスすることによってリン脂質を混合し、そして穏やかな窒素流下で、ドラフト中、混合物を乾燥させた。脂質を高真空下で保存する（１５時間）ことによって、いかなる残渣クロロホルムも除去した。ＰＢＳまたはＴＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４を添加することによって、リン脂質の水性懸濁物を調製し、そして断続的に激しくボルテックスしながらＴｍより高い温度で１０〜３０分間維持してリン脂質を再懸濁し、その後、水槽超音波処理装置（Ｍｉｓｏｎｉｘ  Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ  ３０００，  Ｍｉｓｏｎｉｘ  Ｉｎｃ．，  ニューヨーク州ファーミングデール）中で超音波処理した。周期あたり全超音波処理４５秒間を３回連続周期で行うように、超音波処理装置をプログラミングした。各周期には、５秒間の超音波処理パルス（７０ワット出力）、その後、１２秒間のパルスオフ期間が含まれた。超音波処理終了時、薄板状リポソーム懸濁物を４℃で保存し、そして融解し、そしてＢＩＡｃｏｒｅセンサーチップ上に捕捉する前に、上述のように再び超音波処理した。
【００１２】
逆相ＨＰＬＣによってペプチドを合成し、そして精製し、そして質量分析によって、純度を確認した。この研究に用いたペプチドには以下が含まれた−
【００１３】
【化２】
2010510226.tif 000003
【図９】本発明の多構成要素ワクチンが克服する有害な急性感染事象のスキーム。
【図１０】非ヒト霊長類（ＮＨＰ）ＯＮＴＡＫ枯渇（用量／動力学）。
【図１１】ｒＰＡで免疫したＮＨＰにおける制御性Ｔ。
【図１２】抗ＰＡ結合性ＥＬＩＳＡ。
【図１３】図１３Ａおよび１３Ｂ。炭疽毒素中和。
【図１４−１】図１４Ａ〜１４Ｃ。血漿アポトーシス性ＭＰの測定のためのフローサイトメトリー技術の開発。フローサイトメトリーで血漿をアッセイする新規プロトコルを開発するため、ポリスチレンビーズの混合物をまずアッセイした（図１４Ａ）。サイズ０．１μｍ〜１．０μｍの範囲のビーズを等比率で混合し、希釈し、そしてＢＤ  ＬＳＲＩＩを用いて分析した。サイズによって微粒子を定義する先の研究にしたがって、これらのサイズを用いた（Ｗｅｒｎｅｒ，  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．  Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｖａｓｃ．  Ｂｉｏｌ．  ２６（１）：１１２−６（２００６）  Ｅｐｕｂ  ２００５  Ｏｃｔ．  ２０，  Ｄｉｓｔｌｅｒら，  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  １０：７３１−７４１（２００５））。前方散乱検出装置のダイオードよりも、より小さい粒子を区別する能力が光電子増倍管で増進しているため、サイズを区別するものとして側方散乱を用いた。最適希釈範囲を決定するため、ポリスチレンビーズ混合物の連続希釈シリーズを分析した（図１４Ｂ）。こうした実験を行うことによって、十分に希釈されていない試料はいずれも、一致および高い中断率のため、不当に低い事象数を生じることが発見された。系が個々にプロセシングするには、ともに到着が近すぎるかまたは迅速すぎる（一致）ため、フローサイトメーターが事象をプロセシング不能であった場合に中断事象が生じる。一度に１つの粒子のみが検出装置を流れる点まで試料を希釈することによって、サイトメーターによってプロセシングされる事象数はより正確になる。実際、ビーズ混合物が１：１０００で希釈された場合、４つの異なるサイズのビーズはよく区別されないが、１：１００，０００希釈では、各サイズの明確な集団が検出可能である。血漿微粒子を分析するため（図１４Ｃ）、同様の希釈シリーズを用いて、最適希釈を実験的に決定した（データ未提示）。血漿中に存在するが、細胞微粒子より小さく、そして前方または側方散乱を持たない破片（ｄｅｂｒｉｓ）を計数する可能性を排除するため、定義した微粒子ゲート内で起こる事象を計数した。低い側方散乱範囲中に０．１μｍビーズを含み、そしてより高い側方散乱範囲中に１．０μｍビーズを含み、一方、非常にわずかな前方および側方散乱を有する粒子を排除することによって、このゲートを設定した（図１４Ａおよび１４Ｃ中の赤い囲み）。ポリスチレンサイズ設定ビーズをあらゆる実験実行に関して１：１００，０００希釈で実験して、すべてのデータが同じ方式でゲート処理されることを可能にした。血漿試料中、微粒子の大部分は０．１〜０．５μｍの間にあることが見出された（１０４未満の側方散乱領域を示す、赤い微粒子ゲート内の集団）。０．５μｍより大きいが、１．０μｍより小さい、より大きい微粒子が存在したが、比率は低かった。
【図１４−２】図１４Ａ〜１４Ｃ。血漿アポトーシス性ＭＰの測定のためのフローサイトメトリー技術の開発。フローサイトメトリーで血漿をアッセイする新規プロトコルを開発するため、ポリスチレンビーズの混合物をまずアッセイした（図１４Ａ）。サイズ０．１μｍ〜１．０μｍの範囲のビーズを等比率で混合し、希釈し、そしてＢＤ  ＬＳＲＩＩを用いて分析した。サイズによって微粒子を定義する先の研究にしたがって、これらのサイズを用いた（Ｗｅｒｎｅｒ，  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．  Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｖａｓｃ．  Ｂｉｏｌ．  ２６（１）：１１２−６（２００６）  Ｅｐｕｂ  ２００５  Ｏｃｔ．  ２０，  Ｄｉｓｔｌｅｒら，  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  １０：７３１−７４１（２００５））。前方散乱検出装置のダイオードよりも、より小さい粒子を区別する能力が光電子増倍管で増進しているため、サイズを区別するものとして側方散乱を用いた。最適希釈範囲を決定するため、ポリスチレンビーズ混合物の連続希釈シリーズを分析した（図１４Ｂ）。こうした実験を行うことによって、十分に希釈されていない試料はいずれも、一致および高い中断率のため、不当に低い事象数を生じることが発見された。系が個々にプロセシングするには、ともに到着が近すぎるかまたは迅速すぎる（一致）ため、フローサイトメーターが事象をプロセシング不能であった場合に中断事象が生じる。一度に１つの粒子のみが検出装置を流れる点まで試料を希釈することによって、サイトメーターによってプロセシングされる事象数はより正確になる。実際、ビーズ混合物が１：１０００で希釈された場合、４つの異なるサイズのビーズはよく区別されないが、１：１００，０００希釈では、各サイズの明確な集団が検出可能である。血漿微粒子を分析するため（図１４Ｃ）、同様の希釈シリーズを用いて、最適希釈を実験的に決定した（データ未提示）。血漿中に存在するが、細胞微粒子より小さく、そして前方または側方散乱を持たない破片（ｄｅｂｒｉｓ）を計数する可能性を排除するため、定義した微粒子ゲート内で起こる事象を計数した。低い側方散乱範囲中に０．１μｍビーズを含み、そしてより高い側方散乱範囲中に１．０μｍビーズを含み、一方、非常にわずかな前方および側方散乱を有する粒子を排除することによって、このゲートを設定した（図１４Ａおよび１４Ｃ中の赤い囲み）。ポリスチレンサイズ設定ビーズをあらゆる実験実行に関して１：１００，０００希釈で実験して、すべてのデータが同じ方式でゲート処理されることを可能にした。血漿試料中、微粒子の大部分は０．１〜０．５μｍの間にあることが見出された（１０４未満の側方散乱領域を示す、赤い微粒子ゲート内の集団）。０．５μｍより大きいが、１．０μｍより小さい、より大きい微粒子が存在したが、比率は低かった。
【図１５−１】図１５Ａ〜１５Ｄ。血漿ＭＰの表現型に対する凍結／融解周期の影響。血漿ドナー試料中の細胞外マーカーのいくつかの発現レベルが低かったため、微粒子表現型に対する血漿の凍結および融解の影響を研究した。ＨＩＶ−１慢性感染ドナー由来の血漿を３つのアリコットに分けた。第一のものは２０℃のままにした（新鮮）。第二のものを、−８０℃で１０分間凍結し、そして融解し（凍結１ｘ）、そして第三のものを、同様に凍結し、融解し、そして再凍結した（凍結２ｘ）。次いで、３つの試料すべてを希釈し、ろ過し、そして遠心分離した。ＭＰ再懸濁物をＣＤ３（図１５Ａ）、ＣＤ４５（図１５Ｂ）、ＣＤ６１（血小板ＭＰマーカー）（図１５Ｃ）、およびアネキシンＶ（図１５Ｄ）で染色した。緑の囲み内の割合は、同時にアッセイしたアイソタイプ対照のバックグラウンド減算後、その特定のマーカーに関して陽性であるＭＰの割合を示す。これらの割合は、第一の凍結／融解周期に際して増加し、そしてもう１回の凍結／融解周期後に減少することが観察され、血漿ＭＰの表現型決定には、試料完全性が重要な役割を果たすことが示された。
【図１５−２】図１５Ａ〜１５Ｄ。血漿ＭＰの表現型に対する凍結／融解周期の影響。血漿ドナー試料中の細胞外マーカーのいくつかの発現レベルが低かったため、微粒子表現型に対する血漿の凍結および融解の影響を研究した。ＨＩＶ−１慢性感染ドナー由来の血漿を３つのアリコットに分けた。第一のものは２０℃のままにした（新鮮）。第二のものを、−８０℃で１０分間凍結し、そして融解し（凍結１ｘ）、そして第三のものを、同様に凍結し、融解し、そして再凍結した（凍結２ｘ）。次いで、３つの試料すべてを希釈し、ろ過し、そして遠心分離した。ＭＰ再懸濁物をＣＤ３（図１５Ａ）、ＣＤ４５（図１５Ｂ）、ＣＤ６１（血小板ＭＰマーカー）（図１５Ｃ）、およびアネキシンＶ（図１５Ｄ）で染色した。緑の囲み内の割合は、同時にアッセイしたアイソタイプ対照のバックグラウンド減算後、その特定のマーカーに関して陽性であるＭＰの割合を示す。これらの割合は、第一の凍結／融解周期に際して増加し、そしてもう１回の凍結／融解周期後に減少することが観察され、血漿ＭＰの表現型決定には、試料完全性が重要な役割を果たすことが示された。
【図１６】図１６Ａ〜１６Ｃ。ＨＩＶ、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）およびＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）被験体の血漿ウイルス負荷。３０のＨＩＶ＋抗体陽転血漿パネル（ＨＢＶおよびＨＣＶ陰性）、１０のＨＢＶ抗体陽転パネル（ＨＩＶ陰性）、および１０のＨＣＶ抗体陽転パネル（ＨＩＶ陰性）を研究した。パネルは、ＨＩＶ（図１６Ａ）、ＨＣＶ（図１６Ｂ）、およびＨＢＶ（図１６Ｃ）におけるウイルス負荷増加の動力学を示す。第０日は、ウイルス負荷が、ＨＩＶに関しては１００コピー／ｍｌ、ＨＣＶに関しては６００コピー／ｍｌ、そしてＨＢＶに関しては７００コピー／ｍｌに達した最初の日であることが決定された。
【図１７−１】図１７Ａ〜１７Ｃ。アポトーシスの血漿マーカー。図１７Ａ。ＥＬＩＳＡによって各血漿試料に関してＴＲＡＩＬ、ＴＮＦＲ２、およびＦａｓリガンドを測定し、そしてウイルス負荷レベルと比較した。３人の代表的な被験体を示す。図１７Ｂ。被験体間のアポトーシスの血漿マーカーの増加を比較するため、第０日より前の平均を、第０日より後の平均と比較し、そして増加パーセントを計算した。図１７Ｃ。アポトーシスの同じ血漿マーカーをＨＣＶおよびＨＢＶ感染被験体において測定した。１人のＨＣＶおよび１人のＨＢＶ被験体の結果を示す。
【図１７−２】図１７Ａ〜１７Ｃ。アポトーシスの血漿マーカー。図１７Ａ。ＥＬＩＳＡによって各血漿試料に関してＴＲＡＩＬ、ＴＮＦＲ２、およびＦａｓリガンドを測定し、そしてウイルス負荷レベルと比較した。３人の代表的な被験体を示す。図１７Ｂ。被験体間のアポトーシスの血漿マーカーの増加を比較するため、第０日より前の平均を、第０日より後の平均と比較し、そして増加パーセントを計算した。図１７Ｃ。アポトーシスの同じ血漿マーカーをＨＣＶおよびＨＢＶ感染被験体において測定した。１人のＨＣＶおよび１人のＨＢＶ被験体の結果を示す。
【図１７−３】図１７Ａ〜１７Ｃ。アポトーシスの血漿マーカー。図１７Ａ。ＥＬＩＳＡによって各血漿試料に関してＴＲＡＩＬ、ＴＮＦＲ２、およびＦａｓリガンドを測定し、そしてウイルス負荷レベルと比較した。３人の代表的な被験体を示す。図１７Ｂ。被験体間のアポトーシスの血漿マーカーの増加を比較するため、第０日より前の平均を、第０日より後の平均と比較し、そして増加パーセントを計算した。図１７Ｃ。アポトーシスの同じ血漿マーカーをＨＣＶおよびＨＢＶ感染被験体において測定した。１人のＨＣＶおよび１人のＨＢＶ被験体の結果を示す。
【図１８−１】図１８Ａおよび１８Ｂ。アポトーシスの血漿マーカーの概要。図１８Ａ。各データ群に関して、ボックスプロット分析を行った。急性ＨＩＶ−１、ＨＢＶおよびＨＣＶパネルの結果を示し、天地方向の線は、最大値および最小値を示す。スチューデントＴ検定を用いて、Ｐ値を計算した。青い囲みはｐ＜０．０１を示す。図１８Ｂ。最大ウイルス拡大（ｒ０）に比較した分析物ピークのタイミング。ペアード・ウイルコクソン順位和検定から結果を得て、そして低いｐ値は、（関心対象のピーク日の）２つの平均が有意に異なることを示す。これは、ピークの平均「到達時間」（例えば拡大ピーク日およびＴＲＡＩＬピーク日）が有意に異なることを示す。到達時間間の「遅延」は、平均、中央値、および四分位範囲に関して記載されうる。このパネル上、各分析物最大値の「到達時間」をウイルス拡大ピークの時間（赤い囲み）と比較する。ウイルコクソン検定から生じるｐ値を、関心対象の分析物の上に示す。平均遅延時間（括弧内の中央値時間）もまた示す。白抜きの円は異常値を示す。
【図１８−２】図１８Ａおよび１８Ｂ。アポトーシスの血漿マーカーの概要。図１８Ａ。各データ群に関して、ボックスプロット分析を行った。急性ＨＩＶ−１、ＨＢＶおよびＨＣＶパネルの結果を示し、天地方向の線は、最大値および最小値を示す。スチューデントＴ検定を用いて、Ｐ値を計算した。青い囲みはｐ＜０．０１を示す。図１８Ｂ。最大ウイルス拡大（ｒ０）に比較した分析物ピークのタイミング。ペアード・ウイルコクソン順位和検定から結果を得て、そして低いｐ値は、（関心対象のピーク日の）２つの平均が有意に異なることを示す。これは、ピークの平均「到達時間」（例えば拡大ピーク日およびＴＲＡＩＬピーク日）が有意に異なることを示す。到達時間間の「遅延」は、平均、中央値、および四分位範囲に関して記載されうる。このパネル上、各分析物最大値の「到達時間」をウイルス拡大ピークの時間（赤い囲み）と比較する。ウイルコクソン検定から生じるｐ値を、関心対象の分析物の上に示す。平均遅延時間（括弧内の中央値時間）もまた示す。白抜きの円は異常値を示す。
【図１９−１】図１９Ａおよび１９Ｂ。血漿試料における相対的微粒子数。図１９Ａ。研究した３０人の被験体各々に関して、各連続時点に関して相対的微粒子数を得た。３人の代表的な被験体を示す。図１９Ｂ。１０人のＨＢＶおよび１０人のＨＣＶ感染被験体に関して、同じ分析を行った。１人のＨＣＶおよび１人のＨＢＶ被験体の結果を示す。
【図１９−２】図１９Ａおよび１９Ｂ。血漿試料における相対的微粒子数。図１９Ａ。研究した３０人の被験体各々に関して、各連続時点に関して相対的微粒子数を得た。３人の代表的な被験体を示す。図１９Ｂ。１０人のＨＢＶおよび１０人のＨＣＶ感染被験体に関して、同じ分析を行った。１人のＨＣＶおよび１人のＨＢＶ被験体の結果を示す。
【図２０】急性ＨＩＶ−１感染被験体から採取した血漿ＭＰの透過型電子顕微鏡写真。超遠心によって血漿ＭＰをペレットにし、そしてスクロースパッド上で精製した。ＭＰはサイズ０．０５ミクロン〜０．８ミクロンの範囲である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、ｉ）ＨＩＶ多様性、ｉｉ）中和抗体誘導の寛容制約、およびｉｉｉ）アポトーシス性に誘導される免疫抑制を克服することを目標とする、多構成要素、多機能ＨＩＶワクチンに関する。本発明は、中央化ＨＩＶ遺伝子挿入物（コンセンサス、モザイク）、寛容破壊構成要素（例えばＴＬＲアゴニスト、制御性Ｔ細胞阻害）、およびアポトーシスの免疫抑制を阻害しうるかまたはアポトーシス自体を阻害しうる構成要素（例えば抗ＰＳ、抗ＣＤ３６抗体誘導、および／または抗ＨＩＶ  ｔａｔ抗体誘導）を含むＨＩＶワクチンを提供する。
【００１５】
ＨＩＶ−１エンベロープ免疫に対して通常は作製されない抗体特異性の作製を生じるアジュバントおよび他の免疫措置の使用が先に提唱されてきている（ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１３６８４；米国出願第１１／７８５，００７号；米国出願第１１／８１２，９９２号；米国仮出願第６０／９６０，４１３号）。この研究は、広く中和する抗ＨＩＶ−１モノクローナル抗体の多くが自己抗体であり、そして免疫制御調節下にあるようであるという観察に由来する（Ｈａｙｎｅｓら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０８：１９０６（２００５），  Ｈａｙｎｅｓら，  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  １４：５９（２００６））。マウスにおける寛容を破壊するのに用いられてきた１つのアジュバントレジュメは、油性アジュバント中のオリゴＣｐＧである（Ｔｒａｎら，  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １０９：２７８（２００３））。ヒトに関しては、２００６または１０１０３  ｏＣｐＧを含むＢ型のオリゴＣｐＧが使用可能である（ＭｃＣｌｕｓｋｉｅおよびＫｒｉｅｇ，  Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐｉｃ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３１１：１５５−１７８（２００６））。しかし、寛容調節は、一時的にであってさえ、完全に克服することは困難であり、そして自己抗体産生もまた、制御性Ｔ細胞調節下にある（Ｓｈｅｖａｃｈ，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２５：１９５−２０１（２００６））。したがって、制御性Ｔ細胞を一時的に不活性化する措置と組み合わせて、アジュバント措置での免疫を用いると、通常は陰性免疫制御機構によって誘導が防止されている抗ＨＩＶ−１抗体を誘導可能である。グルココルチコイド誘導性ＴＮＦファミリー関連受容体リガンド（ＧＩＴＲＬ）ＤＮＡ（Ｓｔｏｎｅら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８０：１７６２−７２（２００６））、ＣＤ４０リガンドＤＮＡ（Ｓｔｏｎｅら，  Ｃｌｉｎ．  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３：１２２３−３０（２００６））で免疫するか、あるいはＣＤ２５  ｍａｂまたはＩＬ−２−毒素コンジュゲートであるＯＮＴＡＫを同時に投与するか（ＰＣＴ／ＵＳ２００５／３７３８４、ＰＣＴ／ＵＳ０６／４７５９１、米国出願第１１／３０２，５０５号および米国出願第１１／６６５，２５１号）のいずれかによって、制御性Ｔ細胞を不活性化するかまたは除去することも可能である（以下の実施例２に示すデータは、アカゲザルへのＯＮＴＡＫの投与が抗原に対する抗体生成を増進することを立証する）。
【００１６】
投与された免疫原に対する寛容を破壊するさらなるアプローチは、リジン−リジンなどの細胞質ドメイン小胞体保持配列を含む組換え挿入遺伝子を設計し、そして小胞体に保持するため、ＨＩＶ遺伝子（Ｅｎｖｅｌｏｐｅなど）をターゲットとすることである（Ｃｏｒｎａｌｌら，  ＪＥＭ  １９８：１４１５−２５（２００３））。こうした設計遺伝子は、例えば、ＤＮＡ、組換えアデノウイルス免疫原もしくはＤＮＡ、組換え水疱性口内炎ウイルス免疫原またはその組み合わせであってもよい。また、多様な他のベクターのいずれかを用いて、挿入物遺伝子を送達してもよい（例えば表１に示すようなもの）。
【００１７】
表１
【００１８】
【表１−１】
2010510226.tif 000004
【００１９】
【表１−２】
2010510226.tif 000005
【００２０】
【表１−３】
2010510226.tif 000006
【００２１】
【表１−４】
2010510226.tif 000007
【００２２】
【表１−５】
2010510226.tif 000008
【００２３】
コンセンサス（ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３０３９７、ならびに米国出願第１０／５７２，６３８号および第１１／８９６，９３４号）および／またはモザイク（ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０３２９０７）遺伝子Ｔ細胞およびＢ細胞ワクチン設計戦略を用いることによって、ＨＩＶの多様性に取り組んでもよい。これらの戦略の使用は、ＨＩＶのクレード間およびクレード内多様性の多くを排除し、そして野生型ＨＩＶ遺伝子に勝る、ＨＩＶ−１に対する交差クレードＴ細胞およびＢ細胞応答を誘導しうる（Ｇａｓｃｈｅｎら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：２３５４（２００２）；  Ｌｉａｏら，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３５３：２６８（２００６），  Ｇａｏら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７９：１１５４（２００５），  Ｗｅａｖｅｒら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８０：６７５４（２００６））。モザイク遺伝子アプローチ（Ｆｉｓｃｈｅｒら，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １３（１）：１００−１０６（２００７），  Ｅｐｕｂ  ２００６  Ｄｅｃ  ２４；  ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０３２９０７）は、一緒に免疫原として用いた際に、抗ＨＩＶ  Ｔ細胞応答を誘導するのに最適なＴ細胞エピトープ範囲を提供する遺伝子を設計するため、インシリコ進化（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）を使用する。したがって、本ＨＩＶワクチン構築物の不可欠な部分は、コンセンサスｅｎｖ、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｎｅｆ、およびｔａｔ遺伝子である。好ましい遺伝子には、Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ＨＩＶ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ配列由来の２００３年Ｍ群コンセンサス遺伝子配列、またはあるいは、Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  ＨＩＶ  ＡＩＤＳ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙで開発されたものなどの感染ＨＩＶ単離体データベースから選択される、より新規のコンセンサス遺伝子配列が含まれる。さらに、ｇａｇおよびｎｅｆなどのモザイクＨＩＶ遺伝子の使用を用いて、Ｔ細胞応答を多数のＨＩＶ株に広げてもよい。中和抗体の誘導のため、Ｅｎｖ構築物は、例えばｇｐｌ６０、ｇｐｌ４０Ｃ、ｇｐｌ４０ＣＦまたはｇｐｌ４０ＣＦＩの形の、Ｍ群コンセンサス２００１年、ＣＯＮ−Ｓ、２００３年ＣＯＮ−Ｔ、あるいは感染ＨＩＶ株由来のより新規のコンセンサスＥｎｖであってもよい（Ｌｉａｏら，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３５３：２６８（２００６））（ｇｐ１４０ＣＦＩは、膜貫通および細胞質ドメインの欠失に加えて、切断部位が欠失され（Ｃ）、融合部位が欠失され（Ｆ）、そしてｇｐ４１免疫優性領域が欠失された（Ｉ）、ＨＩＶ−Ｉエンベロープ設計を指す）。あるいは、広く反応性の中和抗体の誘導に、２００３年Ａ１コンセンサス、２００３クレードＣコンセンサスＥｎｖ（表２、３および４）を用いてもよい（米国出願第１０／５７２，６３８号）。
【００２４】
表２
【００２５】
【表２】
2010510226.tif 000009
【００２６】
表３
【００２７】
【表３】
2010510226.tif 000010
【００２８】
表４
【００２９】
【表４】
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【００３０】
ＨＩＶ−１遺伝子を投与するのに用いられるベクターには、プライミング用のＤＮＡ（Ｌｅｔｖｉｎら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１２：１５３０−３３（２００６））、ブースト用の組換えアデノウイルス（Ｂａｒｏｕｃｈら，  Ｎａｔｕｒｅ  ４４１：２３９−４３（２００６），  Ｌｅｔｖｉｎら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１２：１５３０−３３（２００６），  Ｔｈｏｒｎｅｒら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  Ｅｐｕｂ．  Ｏｃｔｏｂｅｒ  １１，  ２００６）、組換え水疱性口内炎ウイルス（Ｐｕｂｌｉｃｏｖｅｒら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７９：１３２３１−８（２００５））、および弱毒化ＴＢ、ｒＢＣＧまたはｒＭ．スメグマティス（ｒＭ．  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）などの組換えマイコバクテリア（Ｈｏｖａｖら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ｅｐｕｂ．，  Ｏｃｔｏｂｅｒ  １８，  ２００６，  Ｙｕら，  Ｃｌｉｎ．  Ｖａｃｃ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３：１２０４−１１（２００６），  Ｄｅｒｒｉｃｋら，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ｅｐｕｂ．  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ３１，  ２００６）が含まれる。これらのベクターはいずれも、プライム／ブースト組み合わせで使用可能であり、そして免疫経路は全身性（例えばＩＭ、ＳＣ）または粘膜（ｐｏ、ＩＮ、膣内、直腸内）であってもよい。
【００３１】
上に示すように、本発明のワクチン接種アプローチには、ＨＩＶ−１が誘導するアポトーシスおよび免疫抑制を克服して、粘膜部位でのＨＩＶ−１感染後のＴ細胞およびＢ細胞応答の遅延を解消するための構成要素が含まれる。急性ＨＩＶ感染において、多数の抗体種が非常に初期に生じるが、非中和抗ｇｐ４１抗体が最初に生じ、そして自己中和抗体は感染数ヶ月後まで生じないことが最近示された（図１）（Ｗｅｉ，  Ｎａｔｕｒｅ  ４２２：３０７−１２（２００３），  Ｒｉｃｈｍａｎ  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １００：４１４４−９（２００３））。ＳＩＶに感染したアカゲザルにおいて、感染および血漿ウイルス負荷の増加（ｒａｍｐ−ｕｐ）と同時に大規模なアポトーシスが生じることを考慮すると、免疫細胞のこうした大規模なアポトーシスがヒト急性ＨＩＶ感染の極初期の段階で生じているかどうかに関して疑問が生じていた。アポトーシスは、最も一般的には、Ｆａｓ（ＣＤ９５）およびＦａｓリガンド（ＣＤ１７８）、ＴＮＦ受容体ＩおよびＩＩ、ならびにＴＮＦ関連アポトーシス誘導性リガンド（ＴＲＡＩＬ）を含む腫瘍壊死因子受容体ファミリーのメンバーによって仲介される。
【００３２】
ＦａｓおよびＦａｓＬは、慢性ＨＩＶ−１感染において調節不全となっている（Ｃｏｓｓａｒｉｚｚａら，  ＡＩＤＳ  １４：３４６（２０００）；  Ｗｅｓｔｅｎｄｏｒｐら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３７５：４９７（１９９５）；  Ｓｌｏａｎｄら，  Ｂｌｏｏｄ  ８９：１３５７（１９９７））。急性ＨＩＶ感染において、血漿ＦａｓまたはＦａｓＬにおいて上昇があるかどうかを決定する研究が行われてきている。多くのＡＨＩ患者において、血漿ウイルス負荷の上昇と一致して、血漿ＦａｓＬの劇的な増加があることが見出されている（図２）。さらに、すべてではないが何人かの患者において、血漿Ｆａｓが同時に上昇する（図３）。
【００３３】
ＴＮＦＲ２レベルは、慢性ＨＩＶで増加し、そして疾患進行を予測し（Ｚａｎｇｅｒｌｅら，  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ．  ４１：２２９（１９９４））、そしてＴＮＦＲ２は、ＨＩＶと単球の相互作用の初期段階で誘発される（Ｒｉｍａｎｉｏｌら，  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ９：９−１８（１９９７））。図４に示すように、ウイルス負荷の増加と一致して、感染プロセス中、何人かのＡＨＩ患者で可溶性ＴＮＦＲ２上昇が見られた。
【００３４】
最後に、ＴＲＡＩＬは、ＨＩＶ感染中、非感染Ｔ細胞のアポトーシスを仲介する（Ｋａｓｉｃｈら，  ＪＥＭ  １８６：１３６５（１９９７）；  Ｍｉｕｒａら，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９３：５１（２００１））。図５は、血漿ＴＲＡＩＬレベルもまたＡＨＩで上昇していることを示す。
【００３５】
したがって、ＨＩＶビリオンおよびＨＩＶエンベロープは、ＡＨＩでＴ細胞死を直接誘導可能であり、可溶性ＴＲＡＩＬは、非感染細胞に結合し、そしてＡＨＩにおいて死を誘導することも可能であり、そして細胞のＨＩＶ感染および大規模なアポトーシス両方が起こると、ＡＨＩにおいて、高レベルのホスファチジルセリン含有細胞および粒子が多い可能性がある。ＰＤ−１（プログラム細胞死分子−１）は、慢性ＨＩＶ感染においてヒトＢ細胞表面上に存在することが最近示された。これは、ヒトＢ細胞がＨＩＶ感染において、アポトーシスに関してプライミングされることを示唆する（図６）。ＨＩＶ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞ＰＤ−１発現は、ほとんど制御されていない慢性ＨＩＶ感染に対するＣＤ８＋  Ｔ細胞応答と相関する（Ｐｅｔｒｏｖａｓら，  ＪＥＭ  ２０３：２２８１（２００６））。ＨＩＶ感染細胞およびビリオンの表面上にホスファチジルセリン（ＰＳ）が見出されてきており（図７）、そしてＣａｌｌａｈａｎらは、ＰＳが単球のＨＩＶ感染に関する補因子であることを見出した（Ｃａｌｌａｈａｎ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７０：４８４０（２００３））。アポトーシス細胞のＰＳ依存性摂取は、ＴＧＦ−βｌ分泌を促進し（Ｈｕｙｎｈら，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １０９：４１（２００２））、そしてＰＳおよびＰＳ受容体間の相互作用は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗体応答を阻害する（Ｈｏｆｆｍａｎら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７４：１３９３（２００５））。抗ウイルスサイトカインであるＩＮＦ−αは、アポトーシスに対してリンパ球を感作する（Ｃａｒｒｅｒｏら，  ＪＥＭ  ２００：５３５（２００４））。慢性ＨＩＶ感染において、ＰＳ＋脱落（ｓｈｅｄ）膜粒子が増加し（Ａｕｐｅｉｘら，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ９９：１５４６（１９９７））、そしてアポトーシス微粒子がマクロファージ免疫応答を調節する（Ｄｉｓｔｌｅｒら，  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  １０：７３１（２００５））。アポトーシス微粒子は、非常に炎症促進性であり（Ｄｉｓｔｌｅｒら，  ＰＮＡＳ  １０２：２８９２（２００５））、そして炎症促進性サイトカインの誘導は、ＨＩＶ感染およびビリオン産生プロセスを増幅させる。酸化ＰＳ−ＣＤ３６相互作用は、アポトーシス細胞のマクロファージ依存性食作用に必須の役割を果たし、そしてＢ細胞もまたＣＤ３６を発現する（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら，  ＪＥＭ，  Ｎｏｖ．  １３，  ２００６，  オンライン公開）。
【００３６】
したがって、急性ＨＩＶ感染とともに起こり、ＴＲＡＩＬの放出、ＦＡＳ−ＦＡＳＬ相互作用によるアポトーシスの仲介、ならびにＰＳを含有するウイルス粒子および他の粒子の放出を生じる大規模なアポトーシスは、すべて共謀して最初に宿主の免疫を抑制して、迅速な防御Ｂ細胞応答を防止する。
【００３７】
本発明には、限定されるわけではないが、リポソームと会合するＣＯＮ−ＳまたはＣＯＮ−Ｔ  ｇｐ１４０またはＨＩＶ  ｅｎｖエピトープを伴うかまたは伴わないかいずれかで、ＰＳリポソームなどのＰＳを含有するＨＩＶ免疫原、例えばアジュバントと一緒に投与される２Ｆ５−ＧＴＨ１ペプチド脂質コンジュゲート（図８Ａおよび８Ｂ）を用いて、寛容を破壊し、そしてＰＳ−ＣＤ３６相互作用を阻害する抗ＰＳ抗体を誘導する、アポトーシスを予防する戦略が含まれる。あるいは、抗ＣＤ３６抗体を作製するために、組換えＣＤ３６がターゲティングされてもよく、好ましくは、抗ＰＳまたは抗ＣＤ３６抗体の両方が、粘膜部位で誘導されて、アポトーシスが仲介する免疫抑制を防止する。
【００３８】
アポトーシスを防止するのに使用可能な本発明の他の戦略は、免疫細胞においてｔａｔがアポトーシスを誘導する能力を阻害するであろう、ｔａｔタンパク質（Ｅｕｓｏｌｉら，  Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ．  ７：１３９２−９（２００５））に対する抗体を誘導するための、ＨＩＶワクチン免疫原中のＨＩＶ  ｔａｔ遺伝子またはタンパク質の包含である。使用可能なｔａｔの型には、１０１アミノ酸ｔａｔタンパク質またはこうしたタンパク質をコードする遺伝子が含まれる（Ｗａｔｋｉｎｓら，  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３：１７４２（２００６））。
【００３９】
上述のものに加えて、汎カスパーゼ阻害剤（例えばｚＶＡＤ−ＦＭＫ（Ｄｅａｎら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ．  Ｒｅｖ．  ３３：２０３−２１２（２００７），  Ｍｅｎｇら  Ｃｕｒｒｅｎｔ．  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １８：６６８−６７６（２００６）を参照されたい）をワクチン中に含めて、抗体応答が迅速に起こることを可能にするアポトーシスと関連する任意のワクチンまたは免疫細胞活性化を同時に阻害してもよい。免疫抑制に関連するいかなるＥｎｖも克服されるであろう。汎カスパーゼ阻害剤はまた、慢性ＨＩＶ感染の治療にも使用可能である。
【００４０】
Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ（二量体ヒトＴＮＦＲ  ｐ７５−ＦＣ融合タンパク質）などのＴＮＦの多様な阻害剤、またはＴＮＦαに対する抗体（ＩｎｆｌｉｘｉｍａｂまたはＡｄａｌｉｍｕｍａｂなど）（ＥＷ  Ｓｔ．  Ｃｌａｉｒ，  ＤＳ  ＰｉｓｅｔｓｋｙおよびＢＦ  Ｈａｙｎｅｓによる“Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ”，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  ２００４、特に第３１章および第３２章を参照されたい）、ならびにＦａｓ−Ｆａｓリガンド相互作用の阻害剤（Ｆａｓ−Ｆｃのようなもの）およびＴＲＡＩＬ−ＤＲ５相互作用の阻害剤（ＤＲ５−Ｆｃなど）（これらを一緒にまたは別個に用いてもよい）とともに、ＨＩＶ抗原で免疫することによって、免疫抑制性アポトーシス性損傷の修正もまた達成可能である。こうした剤はまた、慢性ＨＩＶ感染を治療するのにも使用可能である。
【００４１】
本発明の多構成要素ワクチンの構成要素は、当該技術分野に周知の技術を用いて、必要に応じて、薬学的に許容されうるキャリアーとともに配合可能である。ワクチン構成要素の適切な投与経路には、必要に応じて、全身性（例えば筋内または皮下）、粘膜または鼻内が含まれる。当業者が最適投薬措置を決定してもよいし、そしてこれは、患者および用いる特定の構成要素に応じて多様でありうる。
【００４２】
本発明の特定の側面は、以下の限定されない実施例に、より詳細に記載されうる。
【実施例】
【００４３】
実施例１
ワクチン構成要素
多構成要素ワクチンの基本的構成要素は：
１．免疫寛容を破壊する戦略、
２．多様性を克服し、そして広く反応性である中和抗体を誘導する免疫原、
３．急性ＨＩＶ感染時に生じる免疫および他の細胞の大規模なアポトーシスと関連する免疫抑制を回避する戦略、
４．粘膜免疫応答を提供するベクター／配合物
である。
【００４４】
本発明の例は、以下の多構成要素免疫原である：
各免疫付与とともに投与されるＤＮＡプラスミド中のＣＤ４０リガンドおよびＧＩＴＲＬと組み合わせた、ＫＫ細胞質ドメインモチーフを含む組換えＣＯＮ−Ｓコンセンサスｇｐ１６０  ＨＩＶ  Ｅｎｖを含有するＤＮＡプライム（寛容を破壊し、そして多様性、中和抗体応答に取り組む）、ＣＯＮ−Ｓ  ｇｐ１４０  Ｅｎｖおよびモザイクｇａｇ−ｎｅｆ遺伝子、コンセンサスｐｏｌ、ｔａｔ遺伝子を含有する組換え水疱性口内炎ウイルスを含む組換えブースト（多様性、粘膜免疫応答に取り組む）、ＤＮＡおよびｒＶＳＶ免疫付与と一緒に投与されるスクアレン・エマルジョン中の「Ｂ」または「Ｃ」型ｏＣｐＧ中の組換えＣＯＮ−Ｓ  ｇｐ１４０タンパク質プライムおよびブースト（中和抗体応答、免疫寛容破壊）。
【００４５】
実施例２
非ヒト霊長類炭疽ＰＡワクチン接種モデル（アカゲザル）
炭疽防御抗原（ｒＰＡ）に向けた宿主免疫応答に対する一過性制御性Ｔ不活性化の影響を試験するため、アカゲザル制御性Ｔ細胞枯渇モデルが開発されていた。アカゲザルにＯＮＴＡＫ（１５ｍｃｇ／Ｋｇ）を５日間注入すると、末梢血中のＣＤ４＋／ＣＤ２５＋細胞の割合が有意に減少した（ｐ＜０．０５）（赤い線対黒い太線；図１０）。ＮＨＰ（アカゲザル）ＣＤ２５を抗ｈｕＣＤ２５  ｍＡｂクローン２Ａ３（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で監視することが非常に重要である。ＯＮＴＡＫがｈｕＩＬ−２−ジフテリア毒素であり、そして動物からＣＤ２５＋細胞を枯渇させることが知られることに注目することもまた重要である。
【００４６】
ＯＮＴＡＫが生体防御免疫原に対する宿主免疫応答を改善するという仮説を試験するため、若年中国アカゲザル（Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｒｈｅｓｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ）をｒＰＡ（防御抗原；２５μｇ）のみで、または５日連続でＯＮＴＡＫ（１５ｍｃｇ／ｋｇ  ＩＶ）注入と組み合わせて免疫した。免疫−７日、５日、１０日、１２日、１９日、３３日、４０日後に、ＣＢＣ／ｄｉｆｆ、免疫表現型、化学パネル、血漿および血清のため、動物（ｎ＝３／群）から出血させた。図１１に示すのは、免疫群におけるＰＢ中のＣＤ４＋／ＣＤ２５制御性Ｔ細胞の頻度である。ＯＮＴＡＫ注入されたサルは、制御性Ｔ細胞区画に明確な減少を有する。ＰＡ＋ミョウバンで免疫された生理食塩水注入動物における制御性Ｔ区画は、影響を受けなかった。
【００４７】
２回の測定を用いて、ＮＨＰモデル＋／−ＯＮＴＡＫにおいて、ＰＡに対する一次体液性応答の度合いおよび品質を評価した。第一に、抗原特異的Ｉｇアイソタイプ結合を研究し、そして第二に、ＴＮＡアッセイにおいて、血清が炭疽毒素（ＰＡ＋ＬＦ）を中和する能力を決定した。用いたＰＡの用量（２５μｇ＋ミョウバン）は、対数スケール上にプロットされた幾何学的平均終点力価によって示されるように、第１９日から抗ＰＡ体液性応答を誘導した（図１２）。ＯＮＴＡＫは、第１９日の単回免疫後、ＰＡ特異的ＩｇＧおよびＩｇＭの終点結合力価を穏やかに改善したが、この差異は第４０日までは続かないことが観察された（図１２）。
【００４８】
炭疽毒素中和アッセイ（ＴＮＡ）は、マウスおよびアカゲザル血清で使用するために確立されている。試験血清をアッセイにおける希釈シリーズとして実験した。図１３Ａに示すのは、時間経過に渡る、１：５１２の最適希釈に関する中和％曲線である。図１３Ｂに示すのは、免疫１９日、３３日および４０日後の実験群に関するＮＴ５０である。免疫３３日後、炭疽毒素中和力価ピークにおいて、ＰＡ＋ミョウバンのみに対してＯＮＴＡＫで改善が観察され、したがって、ＮＨＰにおけるＯＮＴＡＫを用いた抗ＰＡ応答の機能的増進が示唆された。
【００４９】
実施例３
血漿ＦＡＳリガンド、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＩＬ、およびアポトーシス性微粒子のレベルは、急性ＨＩＶ−１感染において、ウイルス負荷増加中に上昇する
実験詳細
血漿試料
抗体陽転パネル（ＨＩＶ−１＋／ＨＣＶ−／ＨＢＶ−、ｎ＝３０、ＨＩＶ−１−／ＨＣＶ−／ＨＢＶ＋、ｎ＝１０、およびＨＩＶ−１−、ＨＣＶ＋／ＨＣＶ−、ｎ＝１０）をＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ニューヨーク州バッファロー）から得た。各パネルは血漿ドナーからおよそ３日おきに収集した連続血漿アリコット（４〜３０の範囲）からなった。ＨＩＶ−１−／ＨＣＶ−／ＨＢＶ−ヒト血漿（ｎ＝２５）をＩｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ミシガン州サウスフィールド）から得た。すべての研究は、デューク大学ヒト被験体施設内審査委員会によって認可された。
【００５０】
ウイルス負荷試験
Ｑｕｅｓｔ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（ニュージャージー州リンドハースト）によって血漿試料のウイルス負荷試験が行われた（ＨＩＶ−１  ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｕｌｔｒａ）。ＨＣＶおよびＨＢＶウイルス負荷はＺｅｐｔｏｍｅｔｒｉｘによって行われ；Ｐｈｉｌｉｐ  Ｎｏｒｒｉｓ、Ｂｌｏｏｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、カリフォルニア州サンフランシスコによって選択ＨＣＶウイルス負荷が提供された。
【００５１】
アポトーシスの血漿マーカーに関するＥＬＩＳＡ
製造者の指示にしたがって、Ｆａｓ、Ｆａｓリガンド、ＴＲＡＩＬ（Ｄｉａｃｌｏｎｅ、Ｂｅｓａｎｃｏｎ  Ｃｅｄｅｘ、フランス）およびＴＮＦＲ２（Ｈｙｃｕｌｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｕｄｅｎ、オランダ）に関するＥＬＩＳＡを行った。未希釈で（ＴＲＡＩＬ）、１：１０に希釈して（ＴＮＦＲ２）、または１：２に希釈して（Ｆａｓリガンド）、血漿をアッセイした。
【００５２】
アポトーシス性微粒子（ＭＰ）定量化
各血漿試料中のＭＰ数をフローサイトメトリーで決定した。ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンホセ）上ですべてのフローサイトメトリー分析を行い、そしてＦｌｏｗＪｏソフトウェア（オレゴン州アッシュランド）を用いてデータ分析を行った。任意のＭＰ実験で使用する前に、すべての緩衝液（カルシウムおよびマグネシウム不含ＰＢＳ）（Ｃｅｌｌｇｒｏ、バージニア州ハーンドン）およびホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）を０．２２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州ビラリカ）でろ過した。血漿試料を希釈するのに用いた緩衝液（カルシウムおよびマグネシウム不含ＰＢＳ中の１％ホルムアルデヒド）を用いて、バックグラウンドＭＰ数を定義した（フローサイトメーター上、６０秒間で〜１５００事象が計数される）。ＭＰゲートを定義するため、０．１μｍ〜１μｍのサイズ範囲のＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓ蛍光ミクロスフェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州ユージーン）をフローサイトメーター上で分析した。０．１μｍ、０．２μｍ、０．５μｍ、および１．０μｍビーズを含むビーズの周りにＭＰゲートを設定した。１％ホルムアルデヒド／ＰＢＳ中で各血漿試料を１：１００および１：１０００に希釈し、そしてデータを６０秒間獲得した。最適試料希釈を実験的に決定し、容認基準は、中断数＜５％の血漿希釈、およびノイズ対シグナル比＜０．１（ノイズ対シグナル比＝ＰＢＳ中のバックグラウンドＭＰ数／実験血漿ＭＰ数）であった（図１４および１５）。
【００５３】
微粒子表現型分析
血漿試料（２ｍｌ）を５ｍｌのろ過生理食塩水中で希釈し、そして次いで５μｍフィルター（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ニューヨーク州イーストヒルズ）でろ過した。次いで、希釈試料を遠心分離した（２００，０００ｘｇ、４℃で１時間）（Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ  Ｍ１５０  ＧＸ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州ウォルサム）。上清の上部２．５ｍｌを取り除き、２．５ｍｌの新鮮な生理食塩水を添加し、そして試料を２００，０００ｘｇで１時間遠心分離した。１ｍｌのろ過生理食塩水中でペレットを２回洗浄し；最後の洗浄後、９００μｌの上清を取り除き、そして残った２００μｌの生理食塩水中にペレットを再懸濁した。１０μｌのＭＰ懸濁物を抗体および／またはアネキシンＶとインキュベーションした（総体積１００μｌｘ２０分間、２０℃、暗所中）。抗体とのインキュベーション用の染色緩衝液として１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）を含む生理食塩水を用い、そしてアネキシンＶ染色には、緩衝液に２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２を添加した。アネキシンＶ対照には、５０ｍＭ  ＥＤＴＡを緩衝液に添加し、２０分間インキュベーションし、生理食塩水／ホルムアルデヒドで体積を５００μｌに調整し、そして２４時間以内にフローサイトメトリーによって分析した。コンジュゲート化抗体には、マウス抗ヒトＣＤ４５−ＰＥ、ＣＤ３−ＰＥ、ＣＤ４−ＰＥ、ＣＤ６ａ、ＣＤ６３、ＣＣＲ５−ＰＥ、ＣＤ１４−ＰＥ、ＣＤ１９−ＰＥ、およびアイソタイプ対照（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンホセ）、ならびにＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州ユージーン）にコンジュゲート化されたアネキシンＶが含まれた。
【００５４】
血漿微粒子の電子顕微鏡検査
ろ過生理食塩水中で８ｍｌの血漿を１：５に希釈し、そしてＭＰをペレットにした（２００，０００ｘｇ  ｘ１時間、４℃）。ペレットを洗浄した（２００，０００ｘｇ  ｘ１時間、４℃）。１ｍｌ生理食塩水中にペレットを再懸濁し、そして２回洗浄した（１００，０００ｘｇ  ｘ３０分間）。５００μｌの生理食塩水中にＭＰペレットを再懸濁し、そして１ｍｌの４０％スクロース溶液上に重層し、そしてＭＰを遠心分離した（１００，０００ｘｇ  ｘ９０分間）。ペレットを固定し（１％ホルムアルデヒド、４℃一晩）、ペレットにし（１００，００ｘｇ  ｘ６０分間）、１％四酸化オスミウム中に１０分間浸し、そして生理食塩水でリンスした。ペレットを寒天中にマウントし、そしてエポキシ樹脂中に包埋し、そして６０℃で一晩ベーキングした。超薄層切片を切り取り、そして染色し、そしてＰｈｉｌｉｐｓ  ＣＭ１２透過型電子顕微鏡で調べた。
【００５５】
統計分析
すべての血漿抗体陽転パネル全体での参照点を確立するため、ＨＩＶ−１では１００コピー／ｍｌ、ＨＣＶでは６００コピー／ｍｌ、そしてＨＢＶでは７００コピー／ｍｌにウイルス負荷が到達した日を第「０」日と定義した。
【００５６】
ＨＩＶ−１、ＨＢＶ、およびＨＣＶ感染中のアポトーシスの血漿マーカー中の増加パーセントを決定するため、第０日より前の平均ＴＲＡＩＬ、ＴＮＦＲ２、またはＦａｓリガンドレベルを第０日より後の平均レベルに比較し、そして増加パーセントを計算した（［（第０日より後の平均−第０日より前の平均）／第０日より後の平均］ｘ１００）。
【００５７】
感染経過中にアポトーシスの血漿マーカーを比較するため、非感染ドナーにおける、抗体陽転パネルの第一の試料における（最初の観察）、およびウイルス負荷ピーク時の、ＴＲＡＩＬ、ＴＮＦＲ２、およびＦａｓリガンドの平均レベルを、ＨＩＶ−１感染、ならびにＨＢＶおよびＨＣＶ感染において比較した（データ未提示）。次いで、各データ群に関してボックスプロット分析を行った。簡潔には、比較する各３群に関して、最大値、最小値、平均値、ならびに第一および第三・四分位（囲みに含まれる）を計算した。異常値（データの第三・四分位および第一・四分位間の相違の１．５倍）を削除した。スチューデントｔ検定を用いて、各群の平均を比較し、そしてＰ値を計算した。
【００５８】
ＨＩＶ−１感染中、アポトーシスの血漿マーカーの出現タイミングを分析するため、ウイルス拡大速度を特徴付けるための測定基準を開発した。開発した測定基準には、最大ウイルス拡大速度（ｒ０）、およびアポトーシスの各血漿マーカーに関するピーク日が含まれた。これらの分析のため、信頼性がある測定基準を得るには関連ウイルス負荷データがあまりにもわずかしか試料採取されていないために、総数３０のうち６人の被験体を排除した。最大拡大を生じるウイルス増加内の２点を用いてウイルス拡大速度（ｒ０）を決定した。ウイルス装填および分析物測定基準間のタイミングの関係を確立する目的のため、ペアを形成するデータに関して、ウイルコクソン順位和検定を行った。行った各検定は、最大ウイルス拡大日を測定基準ピーク日と比較した。
【００５９】
微粒子の研究のため、現存するフローサイトメトリープロトコルを最適化するために、多様な実験を行った。まず、ポリスチレンビーズの希釈シリーズをＬＳＲＩＩでアッセイして、許容され得るシグナル対ノイズ比および中断数を決定した（図１４）。ＣＤ３、ＣＤ４５、血小板マーカーＣＤ６１、およびアネキシンＶなどの細胞外マーカーの発現レベルが、１より多い凍結／融解周期では減少することもまた、実験的に決定され、試料完全性の重要性が示された（図１５）。
【００６０】
結果
ＴＲＡＩＬ、ＴＮＦＲ２およびＦａｓリガンドは、急性ＨＩＶ−１感染中のウイルス負荷増加直前または増加中のいずれかで、大部分の患者において上昇した。
【００６１】
１人の血漿ドナー患者と別の患者のウイルス動力学、ならびにアポトーシスの血漿マーカーおよび微粒子レベルのタイミングを比較するため、３０人のＨＩＶ−１、１０人のＨＣＶおよび１０人のＨＢＶ患者の各々に関して、共通の時点（第０日）を決定した（図１６）。第０日は、患者のＨＩＶ−１ウイルス負荷が１００コピー／ｍｌに到達し、ＨＣＶウイルス負荷が６００コピー／ｍｌに到達し、そしてＨＢＶウイルス負荷が７００コピー／ｍｌに到達した日と定義され、これらのレベルは、各ウイルス負荷決定のための検出限界によって課された。
【００６２】
次に、アポトーシスの血漿マーカーの変化が、急性ＨＩＶ−１感染プロセス中の初期時点で検出可能であるかどうかを決定するため、ＨＩＶ−１ウイルス負荷が陽性になった各血漿ドナーのすべての血漿試料中で、可溶性ＴＲＡＩＬ、ＴＮＦＲ２、およびＦａｓリガンドのレベルをアッセイし、そしてこれらのレベルをＨＣＶおよびＨＢＶ初期感染で見られるものと比較した（図１７）。第０日より前の平均分析物レベルを第０日より後の平均に比較することによって、血漿可溶性ＴＲＡＩＬ、ＴＮＦＲ２およびＦａｓリガンドレベルの変化パーセントを決定した。急性ＨＩＶ−１感染被験体のうち、２７／３０は、ＴＲＡＩＬの２０％より大きい増加を示し、２６／３０ではＴＮＦＲ２が増加し、そして２３／３０ではＦａｓリガンドレベルが増加した（図１７Ｂ）。比較すると、ＨＣＶ＋およびＨＢＶ＋感染被験体は、それぞれ、０／１０、３／１０、および２／１０のみ（ＨＢＶ）、１／１０、６／１０および７／１０のみ（ＨＣＶ）の被験体で、ＴＲＡＩＬ、ＴＮＦＲ２またはＦａｓリガンドの２０％を超える上昇を示した（図１７Ｃ）。
【００６３】
ボックスプロット分析を用いて、分析物レベルが、ウイルス負荷増加前の患者から採取した試料に比較して、ウイルス負荷ピーク時点で有意に異なるかどうかを決定した。第０日より前に、各急性ＨＩＶ−１感染患者から採取した極初期血漿試料に比較して、ウイルス負荷ピーク時点での平均ＴＲＡＩＬ、ＴＮＦＲ２、およびＦａｓリガンドレベルは、有意に異なった（ＴＲＡＩＬに関してはｐ＜０．０１、ＴＮＲＦ２に関してはｐ＜０．００１、およびＦａｓリガンドに関してはｐ＜０．００１）（図１８Ａ）。ＴＲＡＩＬ、ＴＮＦＲ２およびＦａｓリガンドレベルピークはまた、非感染血漿試料対照におけるＴＲＡＩＬ、ＴＮＦＲ２、およびＦａｓリガンドのレベルとも有意に異なった（それぞれ、ｐ＜０．００１、ｐ＜０．００１、およびｐ＜０．００１）（図１８Ａ）。
【００６４】
ウイルス負荷ピークに比較した、ＴＲＡＩＬ、ＴＮＦＲ２およびＦａｓリガンドのピークレベルのタイミングを調べるため、ウイルス負荷ピークに比較したアポトーシス性分析物ピークの発生間の関係、ならびにＨＩＶ−１ウイルス負荷ピーク前に、ピークと一致して、またはピーク後に生じる血漿アポトーシス性分析物のピークを有する被験体の数を決定した（表５）。急性ＨＩＶ−１感染被験体の大部分（ＴＲＡＩＬに関しては３０／３０、ＴＮＦＲ２に関しては２７／３０、そしてＦａｓリガンドに関しては２６／３０）は、３０日の時間枠（すなわちウイルス負荷ピークの１５日前、ピーク時、またはピーク後１５日以内）以内に生じる分析物レベルピークを示した（表５）。特に興味深いことに、被験体のＴＲＡＩＬレベルの大部分（２１／３０）は、ウイルス負荷ピーク前にピークとなり、一方、ＴＮＦＲ２およびＦａｓリガンドレベルは、ウイルス負荷とよりしばしば一致してピークとなった（表５）。
【００６５】
表５
【００６６】
【表５】
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【００６７】
研究した３０人の急性ＨＩＶ−１感染患者のうち、大部分はウイルス負荷ピークに近い（１５日以内）ＴＲＡＩＬ、ＴＮＦＲ２、およびＦａｓリガンドレベルピークを示した。さらに、これらの患者の大部分は、ウイルス負荷がピークとなる前にＴＲＡＩＬレベルピークを示し、そしてＴＮＦＲ２およびＦａｓリガンドレベルは、ウイルス負荷ピークと一致してピークとなった。研究した１０人のＨＣＶおよび１０人のＨＢＶ被験体に関して、同じ分析を行った。
【００６８】
ウイルス動力学に対する分析物レベルピークのタイミングを統計的に分析するため、ペアード・ウイルコクソン順位和検定（ｐａｉｒｅｄ  Ｗｉｌｃｏｘｏｎ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔ）を行った（図１８Ｂ）。有意なｐ値は、分析物レベルピークの平均日が、ウイルス拡大ピークの平均日（ｒ０）とは有意に異なることを示す。ウイルス拡大速度ピークは、ウイルスが最大速度で複製する日を示す（平均５．５日目）。ｒ０が、増殖率Ｒ０とは異なることに注目されたい。重要なことに、これらの分析は、ＴＲＡＩＬレベルが、ウイルス拡大ピーク後、最初に、または１．７日後にピークとなることを示した。ＴＮＦＲ２レベルが次であり、ウイルス拡大ピークの７．５日後にピークとなり、そしてＦａｓリガンドはｒ０の９．８日後にピークとなった。同じパネルを分析すると、ウイルス負荷は、第０日後、平均１３．９日で最大レベルに到達する（中央値１３日、四分位範囲３日間）ことが明らかになり、ＴＲＡＩＬレベルがウイルス負荷ピークよりはるかに前にピークとなり、一方、ＴＮＦＲ２およびＦａｓリガンドは、最大ウイルス負荷時点に非常に近い時点でピークレベルに達することが示される。
【００６９】
血漿微粒子の定量的フローサイトメトリー分析
血漿パネルでは、付随する（ｃｏｃｏｍｉｔａｎｔ）末梢血単核細胞試料が利用不能であるため、サイズ〜１０μＭ〜１．０μＭの血漿微粒子の相対レベルに関して、血漿パネルをアッセイし、そしてＭＰに関して、免疫細胞およびエキソソームマーカーの存在を決定した。フローサイトメトリー分析を用いて、ＭＰの相対レベルを決定し、各個体由来の潜伏期血漿試料に対して最初の血漿試料を比較した（図１９）。血漿ＭＰを視覚化するため、スクロース勾配上でバンドを形成したＭＰの透過型電子顕微鏡検査を用いた。上に概略を示す戦略を用いて、抗体陽転パネルの各試料中に存在するＭＰの相対数を決定した（図１４）。急性ＨＩＶ−１感染被験体の大部分は、ウイルス負荷ピークに近い（第０日より１５日前以内または１５日後以内）ＭＰ数ピークを示した。研究した３０のＨＩＶ−１抗体陽転パネルのうち、１８がウイルス負荷ピークに近い微粒子数ピークを有し、そしてこれらの１８のピークのうち１１が、ウイルス負荷ピーク直前に生じた（表６）。対照として、ＨＣＶおよびＨＢＶ抗体陽転パネルもまた分析して、微粒子数を定量化し、そしてＭＰピークはまったく観察されなかった。
【００７０】
表６
【００７１】
【表６】
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【００７２】
研究した３０人の急性ＨＩＶ−１感染患者のうち、大部分はウイルス負荷ピークに近い（１５日以内）ＭＰレベルピークを示し、そしてこれらの患者の大部分は、ウイルス負荷がピークとなる前にＭＰピークを示した。
【００７３】
血漿微粒子の表現型的および顕微鏡的分析
図２０は、スクロース勾配上でのＭＰバンド形成後の血漿ＭＰの透過型電子顕微鏡写真である。
【００７４】
上に引用するすべての文献および他の情報供給源は、その全体が本明細書に援用される。
【図１２】
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【図１３】
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【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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