(57)【要約】プロテイナーゼＫのようなセリンプロテアーゼによる血清タンパク質の消化、および競合的結合分析中でのプロテイナーゼＫ活性を阻害する順序立ったステップを含む、ビタミンＤ代謝物の事前の精製を必要としない、血漿または血清中で直接ビタミンＤ代謝物を定量する方法。この方法の利点は、生理的に適切な値の全範囲で高精度であること、ならびに血清および血漿試料の全自動分析に容易に適合させることができることにある。【選択図】図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビタミンＤ代謝物の事前の精製を必要としない、血漿または血清中で直接ビタミンＤ代謝物を定量する方法であって、下記の諸工程、すなわち、
（ａ）細胞内、外タンパク質分解活性（ｅｎｄｏ−  ａｎｄ  ｅｘｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を持つセリンプロテアーゼの、血漿または血清を含む試料への適量添加、および、ビタミンＤ結合タンパク質がもはやいかなるビタミンＤ代謝物とも結合できなくなるまで行う、血漿または血清中のビタミンＤ結合タンパク質の消化を実行する工程；
（ｂ）前記セリンプロテアーゼが実質的に不活性である、希釈緩衝剤を使用した、セリンプロテアーゼ、ビタミンＤ代謝物、および消化された血漿または血清タンパク質を含んでいる前記試料を希釈する工程；
（ｃ）固相に結合されているビタミンＤトレーサー組成物を提供する工程；
（ｄ）関連するビタミンＤ代謝物に抗するモノクローナル抗体を提供する工程；
（ｅ）前記ビタミンＤ代謝物を含む前記試料、前記ビタミンＤトレーサー組成物を固定した前記固相、および前記モノクローナル抗体の混合、ならびに前記セリンプロテアーゼが実質的に不活性である結合緩衝剤中で、ビタミンＤ代謝物、固相に結合したビタミンＤトレーサー、およびモノクローナル抗体の間で、事前に決められた期間の競合的結合を実施する工程；
（ｆ）前記結合緩衝剤から、ビタミンＤトレーサー化合物を固定した前記固相、および結合したモノクローナル抗体を分離し、選択的に前記固相を洗浄する工程；ならびに、
（ｇ）前記固相上のモノクローナル抗体量を決定し（ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ）、標準試料との相関による血漿または血清中のビタミンＤ代謝物を定量する工程、を具備する、
血漿または血清中で直接ビタミンＤ代謝物を定量する方法。
【請求項２】
前記セリンプロテアーゼはプロテイナーゼＫである、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記モノクローナル抗体は、２５−ヒドロキシビタミンＤ３、２５−ヒドロキシビタミンＤ２、１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ２および１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の一つまたはそれ以上と結合する、
請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
直接測定されるビタミンＤ代謝物は、２５−ヒドロキシビタミンＤ２、２５−ヒドロキシビタミンＤ３、１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ２および１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３からなる群から選択される、
請求項１〜３いずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
タンパク質結合分析は、エライザ（ＥＬＩＳＡ）（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ；酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；放射免疫測定法）、ＦＩＡ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；蛍光免疫測定法）、ＬＩＡ（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；発光免疫測定法）、またはＩＬＭＡのいずれか一つである、
請求項１〜４いずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ａ）のタンパク質の消化は、０．１〜１０ｍｇ／ｍＬのタンパク質変性剤の一つまたはそれ以上、およびサリチル酸、トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、アニリノナフタレンスルホン酸、ドデシル硫酸ナトリウム、ワルファリンから選択されるビタミンＤ解放剤（ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）の存在下、ｐＨ  ６．０〜１０．０の範囲内で行われる、請求項１〜５いずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
血漿または血清中で直接ビタミンＤ代謝物を定量する試験キットであって、少なくとも、
（ｉ）一つまたはそれ以上のビタミンＤ代謝物特異抗体、
（ｉｉ）固相に結合されたビタミンＤトレーサー、
（ｉｉｉ）原液としてのプロテイナーゼＫ、
（ｉｖ）タンパク質変性剤の一つまたはそれ以上、およびサリチル酸、トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、アニリノナフタレンスルホン酸、ドデシル硫酸ナトリウム、ワルファリンから選択されるビタミンＤ解放剤を有する、プロテイナーゼＫと使用するための緩衝剤；
（ｖ）プロテイナーゼＫの阻害剤をさらに有する、競合的結合分析で使用する緩衝剤、を具備する、
血漿または血清中で直接ビタミンＤ代謝物を定量する試験キット。
【請求項８】
緩衝剤（ｖ）は、０．１〜５０ｍＭのＥＧＴＡ、および０．５〜１０％（ｗ／ｗ）のサリチル酸およびその誘導体を有する、
請求項７に記載の試験キット。
【請求項９】
緩衝剤（ｉｖ）は、０．１〜１０ｍｇ／ｍＬの最終濃度が得られる量で変性剤およびビタミンＤ解放剤を有する、
請求項７に記載の試験キット。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか一つの方法、または請求項７〜９のいずれか一つの試験キットが、血清および血漿試料の完全自動分析に用いられる、血漿または血清中で直接ビタミンＤ代謝物を定量する装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は血清または血漿中のビタミンＤの定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
人間は日光の助けにより、皮膚中でビタミンＤ３（コレカルシフェロール）を形成することができる。ビタミンＤ２（エルゴカルシフェロール）は食物から取り込まれる。ビタミンＤ２とＤ３は、その側鎖においてわずかに異なるけれども、それらは同一の生物活性を持っている。それらはビタミンＤ結合タンパク質（ＶＤＢＰ）によって、循環系に結び付けられ、さらに、肝臓に２５−ヒドロキシビタミンＤとして代謝される。２５−ヒドロキシビタミンＤは体内への貯蔵形態であり、血清または血漿中で最も高い濃度を持つビタミンＤ代謝物である。必要とされるとき、それは生物学的に活性な形態である１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ（いわゆるＤ−ホルモン）に、腎臓でヒドロキシル化される。そして、１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤは、腸でのカルシウムの吸収、骨のミネラル添加、 骨芽細胞（ｏｓｔｅｏｐｌａｓｔｓ）の分化、骨基質の合成、および、とりわけ神経筋機能もまた規制する。血清１ｍＬ当たり２５−ヒドロキシビタミンＤが１５ｎｇ（３７．５ｎｍｏｌ／Ｌ  ２５−ＯＨ−Ｖｉｔ．Ｄ／Ｌ）未満という、ごく少量の欠乏でさえ、カルシウム吸収の減少のために、副甲状腺ホルモン（ｐａｒａｔｈｏｒｍｏｎ）レベルの上昇を引き起こし、さらに骨吸収を増やした（Ｃｈａｐｕｙ ＭＣら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  １９９６；８１：１１２９−３３）。ビタミンＤ欠乏は老人性骨粗しょう症に対する重要なリスク要因である。早期検診とビタミンＤ２の補給が効果的な骨折の防止となる。血清１ｍＬ当たり２５−ヒドロキシビタミンＤが５ｎｇ（１２．５ｎｍｏｌ／Ｌ）未満である、重いビタミンＤ欠乏症は、子供たちにはくる病を、成人には骨軟化症をもたらす（Ｓｃｈａｒｌａら、Ｅｘｐ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ、１９９６、１０４：２８９−２９２）。過剰摂取によるビタミンＤの過剰は高カルシウム血症を引き起こす。冬の間ドイツにおいては、年齢５０歳以上の人口のおよそ３分の１が、暗闇のためにビタミンＤ欠乏症に苦しんでいる（Ｓｃｈａｒｌａら、Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｅ  Ｉｎｔ．１９９８；８（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ２）：Ｓ７−Ｓ１２）。より若い人々は、胃腸病、肝臓機能障害、吸収不適合症（マラドソープション（ｍａｌａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ））、または、例えば抗てんかん症（ａｎｔｉｅｐｉｌｅｐｔｉｃａ）によって起こされる薬剤誘発性の高代謝作用のために、同じくビタミンＤ欠乏症で苦しむことがある。
【０００３】
血清および血漿中の２５−ヒドロキシビタミンＤ決定（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）のための、従来の実験室レベルの技法は非常に手間がかかる（Ｔａｎｎｅｒら（１９８８）、Ｊ．Ａｓｓｏｃ．ｏｆ  Ａｎａｌｙｔ．Ｃｈｅｍ．、１７、６０７−７１０）。さらに、米国特許５９８１７７９号（Ｈｏｌｉｃｋら）、ＷＯ８９/０１６３１およびＥＰ０５８３９４５（ＤｅＬｕｃａら）は、ＶＤＢＰに結合することに基づいたビタミンＤ試験を教示する。それを達成するため、最初に、ビタミンＤ代謝物が有機溶媒を使用して血漿または血清から抽出され、それからクロマトグラフ法によって精製されなければならない。ＷＯ９９/６７２１１（Ａｒｍｂｒｕｓｔｅｒら）は、エタノールによる血漿および血清タンパク質の沈殿を含む試料調製を教える。タンパク質沈殿物が、それから遠心分離によって取り除かれ、さらに可溶のビタミンＤ代謝物を含むエタノール上澄み液が結合分析に使用される。ＥＰ０７５３７４３（Ｈｏｌｌｉｓ）が過ヨウ素酸塩沈殿を使う血漿または血清試料の調製を教示する。そこで、ビタミンＤ化合物の定量化がタンパク質除去上澄み液で行なわれる。ＤＥ１０１４４９０５（Ａｒｍｂｒｕｓｔｅｒら）は、ＶＤＢＰから２５−ヒドロキシビタミンＤを解放するために可溶性サリチル酸化合物が血清または血漿に加えられる、血漿または血清中の直接的なビタミンＤ決定方法を記述している。そこで、血漿または血清中の２５−ヒドロキシビタミンＤの量が、抗体を使用して直接決定される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上に述べた試料調製方法は手間がかかるか、もしくは誤りを起こし易いか、またはその両者である。本発明の目的は、血清または血漿中の２５−ヒドロキシビタミンＤを直接定量して決定するための、簡単で信頼性の高い方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
この課題は請求項１に基づく方法によって解決される。その方法の好ましい実施形態が従属請求項に開示されている。
【０００６】
本発明によれば、血漿または血清からのビタミンＤ代謝物の精製を必要としない、競合的結合分析による血漿または血清中のビタミンＤ代謝物の直接的定量方法は、次のステップを含んでいる：（ａ）プロテイナーゼＫのような、細胞内、外タンパク質分解活性（ｅｎｄｏ−  ａｎｄ  ｅｘｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を持つセリン・プロテアーゼの、血漿または血清を含む試料への適量添加、および、ビタミンＤ結合タンパク質がもうそれ以上のいかなるビタミンＤ代謝物とも結合できなくなるまで行う、血漿または血清中のビタミンＤ結合タンパク質の消化；（ｂ）その中ではセリンプロテアーゼが実質的に不活性である、希釈緩衝液を使用した、セリンプロテアーゼ、ビタミンＤ代謝物、および消化された血漿または血清タンパク質を含んでいる試料の希釈；（ｃ）固相に結合されているビタミンＤトレーサー組成物の提供；（ｄ）抗体、好ましくは関連するビタミンＤ代謝物に抗するモノクローナル抗体の提供。前記抗体は、使用されるセリンプロテアーゼの、細胞内タンパク質分解活性（ｅｎｄｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）に対して十分に耐性を有する。さらに、（ｅ）ビタミンＤ代謝物（検体）を含む試料、ビタミンＤトレーサー化合物を固定した固相、およびモノクローナル抗体の、事前に決められた期間の混合、ならびにその期間中の、結合緩衝剤中のモノクローナル抗体に対する、ビタミンＤ代謝物とビタミンＤトレーサーの競合的結合反応の実施。ここにおいて、セリンプロテアーゼは本質的に不活性であり、ビタミンＤと残っている血清タンパク質との非特異的結合は起きない。さらに、（ｆ）結合緩衝剤からの、ビタミンＤトレーサー化合物を固定した固相、および選択的に結合したモノクローナル抗体の分離、さらに選択的なその固相の洗浄；さらに、（ｇ）固相上のモノクローナル抗体量の決定、さらに、（ｈ）比較データを使用した血漿または血清中のビタミンＤ代謝物量の決定。
【０００７】
前記方法の好ましい一つの実施形態において、０．１〜５．０％（ｗ／ｖ）のゼラチン、１〜１０ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡまたはＥＧＴＡ、および任意にセリンプロテアーゼ阻害剤、ならびに０．００５〜０．０５０％（ｗ／ｖ）のβ−メルカプトエタノールの存在下に、ｐＨの値が３から１０の間で、結合分析が行われる。ステップ（ｄ）および（ｆ）で使用される抗体は、また、モノクローナル抗体の混合物であってもよく、それらは、各々２５−ヒドロキシビタミンＤ３および２５−ヒドロキシビタミンＤ２に特異的に結合する。本発明の一つの実施形態において、モノクローナル抗体は２５−ヒドロキシビタミンＤ３もしくは２５−ヒドロキシビタミンＤ２またはその両者と結合することができる。本発明の前記方法の別の実施形態において、モノクローナル抗体は１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ２もしくは１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、またはその両ジヒドロキシビタミンＤ代謝物と結合することができる。
【０００８】
本発明に従う方法によって決定されるビタミンＤ代謝物は、２５−ヒドロキシビタミンＤ２、２５−ヒドロキシビタミンＤ３、１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ２、１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３から選択される。タンパク質結合分析、およびその後の定量は、好ましくは、エライザ（ＥＬＩＳＡ）（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ；酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（ｒａｄｉｏ−ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；放射免疫測定法）、ＦＩＡ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；蛍光免疫測定法）、ＬＩＡ（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；発光免疫測定法）、ＩＬＭＡ（ｉｍｍｕｎｏｌｕｍｉｎｏｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ）、またはＥＣＬＡ（ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ａｓｓａｙ；電気化学的発光分析）により行われる。結合モノクローナル抗体の量は、好ましくは二次抗体を使用して決定される。また、その二次抗体は通常異なった種の一つである。結合分析のためのモノクローナル抗体は、また、定量化可能な色、酵素、蛍光、発光、化学発光（ｃｈｅｍｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）（例えばアクリジン）または電界発光（ｅｌｅｃｔｒｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）（例えばルテニウム錯体）標識に結合され得る。
【０００９】
本発明のさらなる態様は、ビタミンＤ代謝物に特異的な一つまたはそれ以上の抗体、固相に固定したビタミンＤトレーサー、プロテイナーゼＫおよび適当な緩衝液を含む、上記の方法を実行するための検査キットに関係する。本発明の検査キットの好ましい緩衝液は、薬剤変性した消化緩衝剤（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）、後からプロテイナーゼＫのようなセリンプロテアーゼによって消化され、破壊される、折り重ならない（ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ）ビタミンＤ結合タンパク質、分析緩衝剤、を有し、好ましくは、プロテイナーゼＫ阻害物質およびサリチル酸解放薬剤（ｓａｌｉｃｙｌｉｃ  ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、好ましくは、ビタミンＤが部分消化された血清タンパク質へ非特異的に背後結合（ｂａｃｋ−ｂｉｎｄｉｎｇ）するのを避けるため、０．１〜１．０ｍｏｌ／Ｌのサリチル酸を含んでいる。
【００１０】
上記の通り、本発明の方法において、血漿または血清試料は、分析の前に、ビタミンＤ代謝物に結合し得るすべての血漿または血清タンパク質が、もはやどのようにしても２５−ヒドロキシビタミンＤまたは他のどんなビタミンＤ代謝物とも結合しないように消化され、および分解されるようにプロテイナーゼＫで処理される。これは、好ましくはプロテイナーゼＫによって消化されて達成される。もっとも好ましくは、タンパク質Ｄ結合タンパク質が折り重ならず、タンパク質分解酵素によって消化されるように、タンパク質変性剤およびビタミンＤ解放剤（ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）の存在下に消化されるのが好ましい。その後、血清または血漿を処理したプロテイナーゼＫの分割量が、プロテイナーゼＫの活性を阻害して止め、また、残存する血清タンパク質にビタミンＤ代謝物が非特異的または特異的に結合するのを防止する、緩衝液で薄められる。さらに、試料中のビタミンＤ代謝物の必要量は抗体、好ましくはプロテイナーゼＫに対して十分に耐性があるモノクローナル抗体の競合的結合分析を用いてすばやく決定される。上記の通り、セリンプロテアーゼでの消化の前に変性剤（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）を添加することによって、ビタミンＤ結合タンパク質の完全な消化が確実になされ得る。有用なタンパク質変性剤は、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）（０.１％）、洗浄剤、ならびに次のようなビタミンＤ解放薬剤、すなわち、サリチル酸、ワルファリン、スルホン酸、トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、アニリノナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ）、特に１−アニリノナフタレン−８−スルホン酸（１、８−ＡＮＳ）および８−アニリノナフタレン−１−スルホン酸（８−ＡＮＳ）、サリチル酸類およびそれらの誘導体のような酸性変性剤である。そして、これら薬剤の濃度は、血清１ｍＬ当たりの濃度で、好ましくは、０．０１〜２０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは、０．１〜１０ｍｇ／ｍＬ、もっとも好ましくは、０．５ｍｇ／ｍＬ以上の、有効濃度である。変性剤の量と型は、それぞれの血清タンパク質分解酵素に対して個々に選択され、選定されなければならない。
【００１１】
従来の方法と比較して本発明による方法は、ビタミンＤ結合タンパク質がそれらの消化の後に測定を妨害することができないという利点を持っている。ＶＤＢＰを別として、多くの他のタンパク質、例えばアルブミン、フェトプロテインなどがビタミンＤと結合でき、そしてこれらのタンパク質が血清中に豊富であることは指摘されるべきである。これらのタンパク質は、周知の方法に従ってエタノールまたは過ヨウ素酸塩を使用して従来の沈殿により、主にビタミンＤ代謝物から分離されるけれども、緩衝剤が交換される競合的結合分析の間に、いくらかの残存量が試料中に留まり復元されることもあり、その後、結合分析を妨害し得る。残存タンパク質の量はまた、容器壁または固相に、さらに、使用される型によっては、ビタミンＤトレーサーにさえ結合することができ、このため、このことが測定を著しく改ざんする。解放および結合緩衝剤中での、サリチル酸化合物またはワルファリンのようなビタミンＤ置換剤（ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｇｅｎｔｓ）の使用は、この根本的な問題を解決しない。
【００１２】
この問題は、血清または血漿をプロテイナーゼＫと処理することによって、根本的に変えられる。第一に、このような血漿および血清タンパク質の酵素的処理は、制御が容易な確立された方法であり、予期しない沈殿の危険が無い。第二に、変性沈殿とは対照的に、消化の後、さらに、培地または緩衝剤の変更後においてさえ、タンパク質は復元されない。第三に、変性剤とビタミンＤ解放剤の添加によって、測定結果が安定させられるか、または強くされ、補完されるまで、消化は随意に延ばされ得る。第四に、タンパク質沈殿とは対照的に、プロテイナーゼＫを使用する消化は容易に自動化され得る。したがって、残っている問題は、プロテイナーゼＫの存在によって競合的結合分析が妨害されないことを確保することのみである。本発明によれば、この問題はｐＨ条件を変化させ、ゼラチン含有緩衝剤中のプロテイナーゼＫの希釈によって、より一般的には、これらがプロテイナーゼＫの活性を阻害するように条件を変えることによって、解決される。プロテイナーゼＫの活性はＥＧＴＡの添加によって、さらに阻害され得る。
【００１３】
ＥＧＴＡ は化学物質エチレングリコール四酢酸、すなわち、より良く知られているＥＤＴＡと同類のキレート剤であるが、マグネシウムイオンに対するよりカルシウムイオンに対して、ずっと高い親和力を有する。それは生きている細胞の中の環境、すなわち、通常カルシウムイオンがマグネシウムより少なくとも１０００倍以下の濃度である環境に似ている、緩衝液を作ることに役立つ。四塩基性ＥＧＴＡによるカルシウムイオン結合のためのｐＫａは１１．００であり、ＥＧＴＡはさらにプロテイナーゼＫの阻害物質である。さらに、本発明による競合的結合分析は、十分にプロテイナーゼＫに対して抵抗する結合パートナーの使用によって特徴付けられる。この本発明による競合的結合分析は、プロテイナーゼＫのような非結合タンパク質をすばやく希釈し、分析系内から系外に洗い出す、さらに多数の洗浄を含む。容器壁または固相内に残存しているプロテイナーゼＫの量は無効にされて、結合分析または結合抗体量の決定の妨害をしない。
【００１４】
本発明のさらなる利点、特徴および実施形態が、発明の詳細な説明、実施例および図に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、本発明の実施例1に従ってＥＬＩＳＡ（３７℃で1時間プロテイナーゼＫを消化）により決定される血清２５−ヒドロキシビタミンＤの直接測定値と、従来のサリチル酸解離試薬を利用してのＥＬＩＳＡによる値との相関をグラフ表示で示す。
【図２】図２は、本発明の実施例1に従ってＥＬＩＳＡ（３７℃で1時間プロテイナーゼＫを消化）により決定される血清２５−ヒドロキシビタミンＤの直接測定値と、ＩＤＳ社に所有権のあるワルファリン含有の解放および解離緩衝剤を利用する、イムノディアグノスチック  システムズ  リミティッド（Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌｉｍｉｔｉｅｄ；ＩＤＳ）社（Ｌｉｍｉｔｅｄ）、ＵＫの２５−ヒドロキシビタミンＤ  ＥＬＩＳＡによって決定される血清２５−ヒドロキシビタミンＤ値との相関をグラフ表示で示す。
【図３】図３は、ビタミンＤを測定するために別個に確立された二つの分析標準法、すなわち、ＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィー質量分析）／ＭＳ（質量分析）測定法、およびＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）測定法の相関図を示す。
【図４】図４は、実施例５に従った、ＩＤＳ法と標準ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法とによって得られる、直接の血清値の相対的な差を表すブランドアンドアルトマンプロット（Ｂｌａｎｄ  ＆  Ａｌｔｍａｎ  Ｐｌｏｔ）を示す。
【図５】図５は、実施例５に従った、本発明による方法によって得られた測定結果と標準ＨＰＬＣの測定結果の箱髭図（ｂｏｘ  ａｎｄ  ｗｈｉｓｋｅｒ  ｐｌｏｔ）を示す。
【図６】図６は、実施例５に従った、本発明による方法によって得られた測定結果と標準ＨＰＬＣの測定結果の相関プロットを示す。
【図７】図７は、本発明の方法によって得られた測定結果と、実施例５に従って得られた平均量を比較しての百分率の差を表すブランドアンドアルトマンプロット（Ｂｌａｎｄ  ＆  Ａｌｔｍａｎ  Ｐｌｏｔ）を示す。
【図８】図８は、本発明による直接タンパク質分解法（ＩＤ  酵素免疫測定法（ＥＩＡ））、直接解離法（ＩＤＳ  放射免疫測定法（ＲＩＡ））、および三つの間接的な商業的方法（Ｒｏｃｈｅ、ＤｉａＳｏｒｉｎ  ＲＩＡおよびＤｉａＳｏｒｉｎ  ＬＩＡ）によって得られるビタミンＤ血清値、ならびに標準ＨＰＬＣによって得られる血清値とを比較する、箱髭図（ｂｏｘ  ａｎｄ  ｗｈｉｓｋｅｒ  ｐｌｏｔ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
プロテイナーゼＫは、質量２８．９０４Ｄａ（ドルトン）の、菌トリチラチウムアルブム（ｆｕｎｇｕｓ  Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ  ａｌｂｕｍ）からの高活性なサブチリシン型（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ−ｔｙｐｅ）セリンプロテアーゼである。その酵素は、天然タンパク質および変性タンパク質に対して広い特異性を持ち、一般的にＤＮＡおよびＲＮＡの精製に使用される。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）または尿素のような変性剤、および５０〜６０℃への加温もまた、その活性を増進する。その推奨される濃度は、タンパク質除去および酵素活性化のためには、５０〜１００μｇ／ｍＬであり、組織処理のためには２ｍｇ／ｍＬまでである。血漿および血清タンパク質の除去において、好ましくは、プロテイナーゼＫは３７〜５０℃で、１００〜３００μｇ／ｍＬ（血清１ｍＬ当たり）の最終濃度で使用された。プロテイナーゼＫは、通常、リポフィライズド粉（ｌｙｐｏｐｈｉｌｉｓｅｄ  ｐｏｗｄｅｒ）から２０ｍｇ／ｍＬの原液として調製され、さらに、使用するまで−２０℃で保存される。その酵素は、ｐＨ７．５〜１２の範囲で活性である。それは５０〜６０℃でその最大の触媒活性に到達する。プロテイナーゼＫは、安定性のためにはカルシウムイオンの存在を必要とするが、タンパク質分解活性のためにはカルシウムイオンの存在を必要としない。本発明によれば、通常、血漿または血清中でのタンパク質の消化は、２００μｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫ（５０ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ  ８．０；１０ｍＭのＣａＣｌ２中、２０ｍｇのプロテイナーゼＫ／ｍＬを含む原液からの）によって、２５〜５０℃、好ましくは３０〜４０℃、最も好ましくは３７℃において、６０分間にわたって起き、任意に（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）、０．１％ＳＤＳ、または、ワルファリン、８−ＡＮＳ 、１、８−ＡＮＳ、トルエンスルホン酸等のようなビタミンＤ解放剤の存在下に、最も好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは０．５〜２ｍｇ／ｍＬの８−ＡＮＳの存在下に起きる。
【００１７】
Ｘ線回折結晶学的研究は、プロテイナーゼＫが２つのカルシウム結合部を持っていることを示した（Ｂａｊｏｒａｔｈら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ  ３３７、４８１−４８４）。Ｃａ２＋は直接触媒機構に関与してはいないけれども、それを除去するとプロテイナーゼＫの活性を、元の値の約２０％に減少させる。これは、合成スクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ｐ−ニトロアニリド標準基質を使用して測定された。本発明によれば、Ｃａ２＋の除去は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）またはエチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）のような金属イオン封鎖剤またはキレート剤の、例えば２〜１０ｍｍｏｌ／ｍＬ濃度での添加によって達成される。プロテイナーゼＫはさらに、フッ化フェニルメチルスルフォニル（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌｆｌｕｏｒｉｄｅ；ＰＭＳＦ）、ジイソプロピルフルオロホスホン酸塩（ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｆｌｕｏｒｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ＤＦＰ）または４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルフォニルフルオライド［ ４−（２−Ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ；ＡＥＢＳＦ］のようなセリンプロテアーゼ阻害剤によって非活性化される。ＡＥＢＳＦはＰＭＳＦより類似の抗菌力スペクトラムを持つが、しかし、特に低いｐＨ環境で、かなりいっそう安定している。一般的には、０．１〜１ｍＭ濃度の溶液が使用される。パラ−クロロマーキュリーベンゾエート（ｐａｒａ−ｃｈｌｏｒｏｍｅｒｃｕｒｙｂｅｎｚｏａｔｅ；ＰＣＭＢ）、Ｌ−１−トシルアミド−２−フェニルエチクロロメチルケトン（Ｌ−１−ｔｏｓｙｌａｍｉｄｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｅｔｈｙｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｙｌｋｅｔｏｎｅ ；ＴＰＣＫ）、Ｎ−アルファ−ｐ−トシル−Ｌ−リシル−クロロメチルケトン（Ｎ−ａｌｐｈａ−ｐ−ｔｏｓｙｌ−Ｌ−ｌｙｓｙｌ−ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｙｌｋｅｔｏｎｅ）、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）、ヨードアセトアミド（ｉｏｄａｃｅｔａｍｉｄｅ）、およびｏ−フェナントロリン（ｏ−ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅ）のようなスルフヒドリル試薬が、プロテイナーゼＫの活性に限定された影響のみを与える。
【００１８】
試料のｐＨは、抗体上のタンパク質結合分析のために、３．０〜１０．０へ、好ましくは７．０〜８．０へ設定される。特に望ましい実施形態では、抗体上のタンパク質結合分析は６.０〜８.０のｐＨにおいて実行される。さらに、緩衝剤は遊離Ｃａ２＋を結合するために、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）またはエチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）のような金属イオン封鎖剤またはキレート剤を過剰に、例えば２〜１０ｍｍｏｌ／ｍＬ含んでいる。タンパク質分解酵素のどんな残存活性をも相殺するために、血清中の通常のカルシウム濃度が十分であるので、プロテイナーゼＫの消化のためにＣａ２＋イオンを添加する必要はない。最終的に、タンパク質結合分析のための希釈緩衝剤は、０．５〜１０重量％のゼラチン、好ましくは０．５〜２重量％のゼラチンを、１ｍｍｏｌ／Ｌのβ−メルカプトエタノールとともに含む。それゆえ、結合緩衝剤は、ｐＨ６．０〜１０．０（好ましくはｐＨ８．０）の、５０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）／リン酸水素ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）、１〜２％（好ましくは０．０５〜０．５％）のゼラチン、２−５ｍｍｏｌ／ＬのＥＧＴＡ、０．００５−２ｍＭ（好ましくは０．００５重量％）のβ−メルカプトエタノール、および任意にプロテイナーゼＫ阻害剤、を有する緩衝剤を含むことが好ましい。
【００１９】
結合分析において、遊離脂肪酸、コレステロールおよび他の脂質の妨害を防ぐために、任意に、０．１〜５重量％、好ましくは１〜３重量％の天然および／または化学修飾されたシクロデキストリンを添加することができる。それゆえ、一つの好ましい実施形態において、脂肪酸、コレステロール等の妨害分子を封鎖および遮蔽（ｍａｓｋｉｎｇ）するために、洗浄および希釈緩衝剤はシクロデキストリンを含む。シクロデキストリンは、試料中の最終濃度を基にして、好ましくは０．１〜１０重量％、好ましくは０．２〜７．５重量％、最も好ましくは１〜５重量％添加される。シクロデキストリンはまた、例えば、メチル、エチル、プロピル、ヒドロキシエチル、２−ヒドロキシプロピル、グリコシル、マルトシル（ｍａｌｔｏｓｙｌ）、カルボキシメチルの各基によって化学修飾される。天然シクロデキストリンおよび２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンが特に好ましい。
【００２０】
本発明による方法は、２５−ヒドロキシビタミンＤ２、２５−ヒドロキシビタミンＤ３の定量に適しており、および、他の実施形態においては、１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ２および１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の定量に適している。もし、Ｄ−ホルモンの濃度がビタミンＤ貯蔵型とは別に決定されるならば、試料の精製が必要とされる。Ｄ−ホルモンは、ジヒドロキシ種に対して特異的である抗体に結合することによって識別される。Ｄ−ホルモンに対して特異的であるが、２５−ヒドロキシビタミンＤには特異的でないモノクローナル抗体がよく知られている。
【００２１】
本発明によるタンパク質結合分析は、エライザ（ＥＬＩＳＡ）（酵素免疫測定法）またはＲＩＡ（放射免疫測定法）として実行され得る。特に好ましいのは、蛍光またはケモルミネッセント（ｃｈｅｍｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）標識（ＦＩＡまたはＬＩＡ）に基づいた非放射方式（システム）である。もしビタミンＤトレーサーが酵素、例えばアルカリホスファターゼまたは蛍光性もしくはケモルミネッセント（ｃｈｅｍｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）標識に結合されるならば、固相または反応容器壁が、通常、決定されるはずであるビタミンＤ化合物に抗する抗体で覆われる。
【００２２】
本発明の方法において、ビタミンＤ代謝物の定量が血漿の血清のような液体試料で直接行なわれ得ることは有利である。試料は、問題のあるタンパク質沈殿、有機物の抽出および／またはカラムクロマトグラフィーのような準備を必要としない。その代わりに、決定されるはずであるビタミンＤ代謝物は、ビタミンＤ結合タンパク質（ＶＤＢＰ、アルブミンおよびその他多くのもの）のタンパク質分解酵素Ｋの消化によって、その結合部から切り離される。もちろん、サリチル酸化合物は、インビトロでタンパク質からビタミンＤ代謝物を切り離すことができるが、再活性化形態に変性されたタンパク質（ｄｉｖｅｒｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）の結合分析において、関与を避けることができない。我々の分析は、ビタミンＤ結合タンパク質／サリチル酸錯体がまた、その壁に吸収され、さらに後に、またビタミンＤトレーサーに結合することを示唆する。前述した通り、ビタミンＤ結合タンパク質は高特異的ＶＤＢＰ（Ｇｃ−グロブリンまたは群特異的成分）だけでなく、アルブミン、α−フェトプロテインおよびその他多くのもののような多くのタンパク質を含んでいる。これらのタンパク質はまた、２５−ヒドロキシビタミンＤおよび１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤと、大体高い特異性及び親和性を持って結合し得る。もしビタミンＤ試料の精製が、エタノールによる、または変性によるタンパク質沈殿の場合のように、比較的不完全であれば、そのときは、試料溶液中のタンパク質は、競合的結合分析の間、ビタミンＤトレーサーと結合し得る。さらに、ビタミンＤの定量は、タンパク質沈殿の完全性または試料中のコレステロールの量といった偶然の一致に依存する。有機物の抽出および／またはビタミンＤ化合物のクロマトグラフィーによる精製は、これらのステップがまた、試料の性質に依存して、中でも、ビタミンＤ結合タンパク質が試料中にどれだけ多く存在しているか、そして、それがリパエミック（ｌｉｐａｅｍｉｃ）等であるかに依存して、トレースが可能なビタミンＤの量に影響を与え、さらに変化させるので、その定量を改善しない。一方、本発明による方法は、誤りを起し易いビタミンＤ代謝物の精製は必要ではなく、さらにタンパク質結合分析は血漿または血清中で直接行われるという利点を有する。
【００２３】
本発明はまた式ＩのビタミンＤ誘導体の使用を含む：
2010518369.tif 000003
ここで、Ｚはエーテル基の酸素もしくは硫黄原子または炭素である；Ｘは、０．８〜４．２ｎｍの長さの置換または非置換炭化水素部分である；Ｙは水素または水酸基である；Ａは、機能性ビタミンＤ誘導体を固相に結合させるために、高親和性を持つプロテイナーゼＫに耐久性のあるタンパク質、例えば、モノクローナル抗体またはストレプトアビジンによって結合され得る、固相（容器壁、ビーズ、標識固体粒子または磁粉）、または官能基である。ＲはビタミンＤ代謝物の側鎖、好ましくはビタミンＤ２またはビタミンＤ３の２５−ヒドロキシル化側鎖である。
【００２４】
リンカーＸは、Ｓ，Ｏ，ＮもしくはＰのような一般的なヘテロ原子，ペプチド、ケトン、または置換もしくは非置換アミノポリエーテル部分を含む、０．８−４．２ｎｍ、好ましくは約０．９−１．５ｎｍの長さの、Ｃ８−Ｃ１２基であり、最も好ましくは、アミノ−ウンデカン酸、またはヘキサミド（ｈｅｘａｍｉｄｏ）、オクタミド（ｏｃｔａｍｉｄｏ）もしくはデカミド（ｄｅｃａｍｉｄｏ）−アミドプロピルリンカー基である。側鎖Ｒおよび基Ｙを有する、基ＡおよびビタミンＤ抗原決定因子の間の間隙は、モノクローナル抗体が固相からの妨害無しに結合できることを許す。好ましいのは、ストレプトアビジンを介して固相に結合される、２５−ヒドロキシビタミンＤ−３β−３−［６−Ｎ−（ビオチニル）ヘキサミド］ アミドプロピルエーテル、および対応する１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤビオチン化合物である。
【００２５】
本発明による方法は、それゆえに、血清または血漿中の２５−ヒドロキシビタミンＤおよび１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤの非放射性定量を、複雑な試料調製を要求すること無く可能にする。したがって、本方法は特に、骨粗しょう症の予防のための逐次試験に適している。
【００２６】
本発明のさらなる態様は、２５−ヒドロキシビタミンＤおよび１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤのようなビタミンＤ代謝物の決定のための、特に、機能性ビタミンＤおよび適切なプロテイナーゼＫ水溶液を含む試薬キットに関する。任意に、そのキットは、２５−ヒドロキシビタミンＤ２／３、または１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ２／３、または異なるビタミンＤ代謝物に抗する抗体を意味する抗ビタミンＤ抗体、コーティングされた（ｃｏａｔｅｄ）マイクロタイタープレート、および／または磁性もしくは他の微小粒子、および試薬を含む。
【００２７】
原則として、血漿または血清試料の代わりに、牛乳（ミルク）またはチーズ等のような食料が、それらのビタミンＤ含有量を直接分析され得る。ある場合には、基質（ｍａｔｒｉｘ）の性状によって、妨害物質を抽出または沈殿によって試料から取り除くことは明白であり得る。精製後に残っているビタミンＤ結合タンパク質の妨害は、その後、プロテイナーゼＫと共に消化によって取り除かれ得る。
【００２８】
＜実施例１＞血清または血漿中の２５−ヒドロキシビタミンＤの決定
（ｉ）ビタミンＤトレーサーの固相への結合
２５−ヒドロキシビタミンＤ−３β−３−［６−Ｎ−（ビオチニル）ヘキサミド］アミドプロピルエーテルが、ストレプトアビジンを介して固相に結合された。このために、ストレプトアビジンの１００ｎｇの部分が、ｐＨ９．６で、６０ｍＭの重炭酸ナトリウム２００μＬに溶解されて、最初に、マイクロタイタープレートの空洞に導入され、さらに、当該プレートは４℃で一晩インキュベートされた。ストレプトアビジン溶液はその後除去され、当該空洞は２００μＬの洗浄緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液、ｐＨ  ６．０、０．０５％のツイーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０（登録商標））で５回洗浄された。次に、２５０μＬのブロック（ｂｌｏｃｋ）緩衝剤（リン酸緩衝液、ｐＨ  ６．０、０．５％のカゼイン、１％のゼラチン、１％のチメロサール）が各々の空洞に満たされ、１時間インキュベートした後除去され、その後、各空洞は再度２００μＬの洗浄緩衝液で５回洗浄された。その後、２００μＬの洗浄緩衝液中１０ｎｇの２５ビオチン−ヒドロキシビタミンＤが、各空洞に導入されて、２〜８℃下、振とうしながら暗所で一晩インキュベートされ、ビオチン−ビタミンＤ溶液が取り除かれ、さらに該空洞が再度２００μＬの洗浄緩衝液で５回洗浄された。つづいて、液体の標準物質または試料から２５−ヒドロキシビタミンＤの存在下、ビタミンＤとモノクローナルマウス抗体（ＩＤ２）の結合が行われた。
【００２９】
（ｉｉ）試料処理と調製
血清および血漿試料は、単に室温で短期間貯蔵された。もし分析が試料採取後２４時間以内に実行されるならば、該試料は４〜８℃で貯蔵される。そうでなければ、試料は分析まで−２０℃で貯蔵される。試料を何度も冷凍および解凍することは避けられた。溶血は結果を妨害しない。全血液は試料物質として使用されないかもしれない。リパエミック（Ｌｉｐａｅｍｉｃ）試料は、約３０，０００×Ｇで１０分間遠心分離され、その後、水相がピペットを使用して上澄みの脂肪層を通して取り除かれた。強いリパエミック（ｌｉｐａｅｍｉｃ）の試料の場合には、脱脂キットが使用された。
【００３０】
８０μＬの血漿または血清が、８００μＬのプロテイナーゼＫ溶液（５０ｍＭのトリス塩酸中２００μｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫＬ、ｐＨ  ８．０；１０ｍＭのＣａＣｌ２、１０％ＳＤＳまたは１ｍｇ／ｍＬの８−ＡＮＳ）に添加され、よく混合され、水浴中３７℃で１時間インキュベートされた。この間に、プロテイナーゼＫは、ＶＤＢＰ（Ｇｃ-Ｇｌｏｂｕｌｉｎ）およびアルブミンのような他のビタミンＤ結合血清タンパク質を、それらがもはや２５−ヒドロキシビタミンＤ２／３またはジヒドロキシビタミンＤ２／３と結合できなくなる大きさまで分解する。
【００３１】
（ｉｉｉ）競合的結合
洗浄緩衝液（５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ  ８．０、２．０ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．００５％のβ−メルカプトエタノール、０．１％（ｗ／ｖ）のゼラチン、任意に、０．５〜１０％のサリチル酸）中の２００μＬモノクローナルマウス抗２５−ＯＨ−ビタミンＤ抗体（１：１２５，０００）と、２０μＬの標準、対照（コントロール）または試料が各々の空洞に導入された。マイクロタイタープレートが、８〜１０℃下、暗所で一晩振とうされた。その後、試料中の２５−ヒドロキシビタミンＤは、モノクローナル抗ビタミンＤ抗体上の結合部（サイト）に対して、内壁上のビタミンＤトレーサーと競合した。その後、溶液が空洞から取り除かれ、該空洞は２５０μＬ洗浄緩衝液で各々５回洗浄された。
【００３２】
ｐＨ、緩衝剤中のゼラチンおよびＥＧＴＡによる遊離Ｃａ２＋の除去は、競合結合分析の間、プロテイナーゼＫがどんな残存量であっても、モノクローナル抗体は切断されないということをもたらした。しかしながら、血清アルブミン（ｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎ）のような、試料中に存在しているビタミンＤ結合タンパク質は、最新技術において、しばしば誤って高いビタミンＤ含有量を導きだす、ビタミンＤトレーサーへのより長い結合はすることができなかった。
【００３３】
（ｉｖ）競合的結合の決定
２００μＬの複合体（マークされた、やぎ−抗−マウス−ＭＡＢ抗体ペルオキシダーゼ）が、洗浄緩衝液中に１：２，５００で溶解され、空洞に導入されて、振とうしながら室温で１時間インキュベートされた。その後、溶液が取り除かれ、該空洞は２５０μＬ洗浄緩衝液で各々５回洗浄された。呈色反応のために、２００μＬのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）−基質溶液（ＢｉｏＦＸラボラトリーズ社の）が、該空洞に導入された。２０分後に、空洞当たり５０μＬの２Ｍ硫酸の添加によって、色の発生が止められた。光学的濃度（ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ）測定が、４５０ｎｍと６２０ｎｍの参照波長（または６９０ｎｍ）で、光度計により実行された。
【００３４】
＜実施例２＞：本発明によるタンパク質分解試験システムの分析感度
本発明による試験システムの検出限界の決定のために、競合的結合および測定が、ビタミンＤ代謝物を含まないか、または標準的な規定量を含む以外は、本質的に実施例１と同じように行われた。結果は下記の表１に示される。
【００３５】
【表１】
2010518369.tif 000004
【００３６】
ブランク試料の平均ＯＤは１．４１、標準偏差は０．０５ＯＤであった。２５−ヒドロキシビタミンＤの検出限界は、わずか２ｎｍｏｌ／Ｌであり、これは約０．８ｎｇ／Ｌ（平均値−２×標準偏差、較正曲線に挿入された）であり、血清中のビタミンＤ濃度の生理的に適切な範囲の決定に全く十分である。
【００３７】
＜実施例３＞：タンパク質分解システムの再現性
タンパク質分解システム１のための独立した測定値間の対応が決定された。正確さは、離散値と平均値との間の標準偏差および相対的な標準偏差（変動係数）に起因する。標準的な血清試料が肯定的な（ポジティブ）比較試料として使用された。平均濃度は４１．４ｎｍｏｌの２５−ＯＨ−Ｖｉｔ．Ｄ／Ｌであった。残存値（ｒｅｍａｉｎｉｎｇ  ｖａｌｕｅｓ）に対して、決定された検出限界が使用された。血清試料に対する結果は表２に示される。
【００３８】
【表２】
2010518369.tif 000005
【００３９】
個別分析系間の（分析法間の）正確さは、一つまたはそれ以上の周知および未知の要因の変化を示す。これを達成するために、上記試料は、異なる日に１０回、準備され、分析された。結果は表３に示される。
【００４０】
【表３】
2010518369.tif 000006
【００４１】
＜実施例４＞：方法比較および相関分析
測定値の精度は、同一被検体の検出のための異なった試験システムからの定量結果の相関によって決定された。相関分析の目的は、一方では、本発明によるタンパク質分解システムであり、他方では、ＤＥ１０１４４９０５およびＥＰ１０９７１３２によるＥＬＩＳＡであった。それらの方法は主に試料調製において異なった。実施例１で記載されたように、タンパク質分解法は実行された。図１と表４が測定値の相関を示す。
【００４２】
【表４】
2010518369.tif 000007
【００４３】
その相関分析は、本発明のタンパク質分解プロトル（ｐｒｏｔｏｌ）および血清中の直接測定の明確な利点を示す。特に、不十分な血清、おそらく、固相にビタミンＤトレーサーを結合するＶＤＢＰ（Ｇｃ−ｇｌｏｂｕｌｉｎ）のような、ビタミンＤ結合血清タンパク質およびビタミンＤ結合血漿タンパク質の、解離後の高すぎる値、のような場合。それゆえ、血清または血漿中のＧｃ−グロブリン（ｇｌｏｂｕｌｉｎ）レベルはビタミンＤの決定を妨害する。相関分析は低ビタミンＤ値で逸脱する後退を示す。
【００４４】
さらに、本発明による方法は、ＩＤＳ社、ＵＫの商業的ビタミンＤ酵素免疫測定法と比較された。ＩＤＳ社の２５−ヒドロキシビタミンＤキットは、血清または血漿中の２５−ヒドロキシビタミンＤおよび他のヒドロキシル化された代謝物の定量のための酵素免疫測定法である。この標準法において、コントロールと試料が、ＩＤＳに独占所有権のある（ｐｒｏｐｒｉｅｔｏｒｙ）解離緩衝剤（おそらくビタミンＤ置換剤としてワルファリンを含んでいる）で処理され、その後、２５−ヒドロキシビタミンＤの既知量が結合競合物質として添加され、希釈試料が、特定の２５−ヒドロキシビタミンＤ抗体でコーティングされたマイクロタイタープレートの空洞内で２時間インキュベートされ、その後吸引され、最終的に当該空洞は洗浄される。ビオチン標識された２５−ヒドロキシビタミンＤの結合が、ビオチンに選択的に結合する西洋わさびペルオキシダーゼ標識アビジンで検出された。さらなる洗浄ステップの後、発色基質（ＴＭＢ）中で、実施例１のように、発色（ｃｏｌｏｕｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）が実行された。中断された反応混合物の吸収が、マイクロタイタープレート光度計で測定された。測定色強度は、２５−ヒドロキシビタミンＤ濃度に反比例していた。ＩＤＳ試験キットは、血清または血漿中の結合タンパク質から２５−ヒドロキシビタミンＤおよびその代謝物を解離するための、会社所有の未開示試薬を使用する。
【００４５】
図２は、２５−ヒドロキシビタミンＤおよびそのヒドロキシル化された代謝物の検出のための、二つの方法／試験の量的な単一結果（８４血清）を示す。結果は直線に沿って、その周囲に存在している。相関係数Ｒは０．９６９である。しかしながら、回帰（ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）はパラレルオフセット（ｐａｒａｌｌｅｌ  ｏｆｆｓｅｔ）である。したがって、解離法でのＩＤＳ−ＥＬＩＳＡは常に高い値を産出する。
【００４６】
＜実施例５＞：ＬＣ−ＭＳ／ＭＳおよび高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して測定された値の比較
図３は、高速液体クロマトグラフィーおよびＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる測定結果である、二つの別個に確立された分析標準法の相関図である。その図は、これらの二つの方法が、それらが、間接的および直接的ビタミンＤイムノアッセイ（免疫学的測定）によって得られる値の正確さのために、基準として使用され得るようによく一致することを示す。
【００４７】
２９１の試料の一組が商業的ＩＤＳ分析を使用して分析され（実施例４参照）、結果がＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を使用して得られた結果と比較された。試料調製とＥＬＩＳＡは、試験キットに付いている取扱説明書に正確に従って実行された。図４は、その二つの方法によって得られた測定値間の相対的な差を表しているブランドアンドアルトマンプロットである（Ｂｌａｎｄ  ＪＭ，  Ａｌｔｍａｎ  ＤＧ（１９８６）臨床的測定の二つの方法間の一致を評価する統計的方法。Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ，ｉ，３０７−３１９；Ｂｌａｎｄ  ＪＭ，  Ａｌｔｍａｎ  ＤＧ（１９９９）方法比較研究における測定一致。Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，８，１３５−１６０）。
【００４８】
測定値の分布は、より低い（臨床的に関連する）濃度において、ＩＤＳ法は過大評価されたビタミンＤ含有量を導き、一方、より高い濃度においては、ＩＤＳ法はビタミンＤ含有量を過小評価する。
【００４９】
さらに４０試料の一組が、本発明による方法、および高速液体クロマトグラフィー測定を使用して分析された。結果を表５に示す。
【００５０】
【表５】
2010518369.tif 000008
【００５１】
試料６にはＨＰＬＣ測定値が無いので、この試料は無視される。表６に示されるように、上記二組の測定値は、対になっている（ｐａｉｒｅｄ）標本（ｓａｍｐｌｅｓ）ｔ−検定を使用して比較される。
【００５２】
【表６】
2010518369.tif 000009
【００５３】
対になっている標本ｔ−検定は、本発明による方法によって得られる測定値と、比較される高速液体クロマトグラフィー基準測定値との間で、有意差が無いことを示す。図５は二つの方法によって得られる測定値の箱髭図（ｂｏｘ  ａｎｄ  ｗｈｉｓｋｅｒ  ｐｌｏｔ）であり、本発明の方法および基準法を使用する測定値によって得られる類似の分布パターンを示す。図６は二つの方法の相関図であり、それらの方法によって得られる値の良い一致を視覚化している。図７は、本発明の方法を用いた結果と、比較される高速液体クロマトグラフィー基準測定値との間の百分率の差を表す。それは、基準と比較してタンパク質分解法の非常に低い過大評価（＜２％）を示し、および測定値の一致を示す。
【００５４】
試料はさらに異なった商業的方法を使用して分析された。結果の分布は図８に箱髭図で示される。この図は、ＤｉａＳｏｒｉｎ（ＬＩＡおよびＲＩＡ）ビタミンＤ分析およびＩＤＳ分析は、高速液体クロマトグラフィー基準測定値と比較して常に低すぎる結果を与え、一方、本発明の方法およびＥｌｅｃｓｙｓビタミンＤ分析（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）診断法）試験は、基準値に相当していること、を示している。しかしながら、ロシュ試験は間接的方法であり、本発明の方法と比較して不利な試料調製を必要とする。
【００５５】
これらの結果は明らかに、本発明による直接測定方法は、従来技術と比較して、確立された基準法と、より良い相関を与えることを示す。
【図１】
2010518369.tif 000010
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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