(57)【要約】  本発明は、抗体を作製するための方法、及び、この方法によって作製される抗体に関する。一実施形態において、本発明は、第１の生物種のポリペプチドに結合する抗体を作製するための方法であって、第２の生物種の哺乳動物を第２の生物種のトランスジェニック哺乳動物に由来する細胞により免疫化することを含み、第１の生物種のポリペプチドが、トランスジェニック哺乳動物に由来する細胞の表面に発現される方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の生物種のポリペプチドに結合する抗体を作製するための方法であって、
第２の生物種の哺乳動物を第２の生物種のトランスジェニック哺乳動物に由来する細胞により免疫化することを含み、前記第１の生物種のポリペプチドが、トランスジェニック哺乳動物に由来する細胞の表面に発現される、方法。
【請求項２】
ハイブリドーマ細胞を、前記免疫化された哺乳動物から得られる脾臓細胞から調製することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ハイブリドーマ細胞を、前記第１の生物種のポリペプチドに結合する抗体についてスクリーニングすることをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体がＭＡｂである、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の生物種がヒトである、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記第２の生物種が、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ラクダ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、ヒヒ、ウサギ、モルモット、ラット、ハムスター及びマウスからなる群より選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記第２の生物種がマウスである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記第１の前記生物種のポリペプチドがＧタンパク質共役受容体である、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｇタンパク質共役受容体が化学誘引物質受容体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記化学誘引物質受容体がＣ５ａＲである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記トランスジェニック哺乳動物に由来する前記細胞が免疫系の細胞である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記トランスジェニック哺乳動物に由来する前記細胞が抗原提示細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗原提示細胞が好中球である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれか一項に記載される方法によって作製される抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体を作製するための方法、及び、この方法によって作製される抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体は、移植、心臓血管疾患、感染性疾患、ガン及び自己免疫を含む、多くの異なる領域において様々な適用を有する一群の治療分子を表す。ハイブリドーマ技術が開発されたことにより、モノクローナル抗体（これはまた、ＭＡｂとも呼ばれる）を候補治療分子として単離することが可能となっている。ＭＡｂは今や、部分的には、その予測可能な薬物動態学的性質、臨床におけるその高い成功率、及び、大きなタンパク質−タンパク質相互作用を中和するその能力のために、治療剤の急速に成長しつつある一群を構成する。
【０００３】
化学誘引物質受容体は、細胞の遊走を容易にする一群のＧタンパク質共役受容体を表す（非特許文献１〜３）。これらの受容体は通常、有機小分子による阻害を受けやすく、また、これらの受容体又はそれらのリガンドを阻止することにより、様々な炎症性状態が少なくとも動物モデルでは改善されるので、これらの受容体は数多くの製薬企業の関心を集めている（非特許文献４〜６）。数多くの炎症性状態において非常に重要な役割を果たす１つの受容体が、Ｃ５ａについての受容体（Ｃ５ａＲ）である（非特許文献２、非特許文献７〜９）。かなりの努力により、有機小分子及びペプチドアンタゴニストを含めて、ヒトＣ５ａＲアンタゴニストが開発されるに至っている（非特許文献１０〜１１）。このような努力にもかかわらず、Ｃ５ａＲ及び他の化学誘引物質受容体についての好適な小分子アンタゴニストの開発は問題が多いことが判明している。
【０００４】
近年、様々なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が、化学誘引物質受容体を中和するための有用な作用因であること、また、ケモカイン／リガンド結合又はＨＩＶ−１結合のための重要な領域を特定するための有用な作用因であることが判明している（非特許文献１２）。しかしながら、化学誘引物質受容体に対する高親和性アンタゴニストｍＡｂの作製もまた、これまで困難であったことが判明している。従って、ポリペプチド、例えば、Ｇタンパク質共役受容体及び化学誘引物質受容体に対する高親和性の抗体を作製するための改善された方法が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Gerard & Gerard (1994a)
【非特許文献２】Gerard & Gerard (1994b)
【非特許文献３】Murphy (1994)
【非特許文献４】Mackay (2001)
【非特許文献５】von Andrian & Mackay (2000)
【非特許文献６】Luster et al. (2005)
【非特許文献７】Guo & Ward (2005)
【非特許文献８】Riedemann et al. (2003)
【非特許文献９】Ji et al. (2002)
【非特許文献１０】Sumichika (2004)
【非特許文献１１】Allegretti et al. (2005)
【非特許文献１２】Heath et al. (1997)
【発明の概要】
【０００６】
本発明者らは今回、ヒトのポリペプチドを発現するトランスジェニックマウスが、このトランスジェニックマウスに由来する細胞による野生型マウスの免疫化により、このヒトポリペプチドに対する高親和性のアンタゴニストｍＡｂを開発するために使用できることを発見している。
【０００７】
従って、本発明は、第１の生物種のポリペプチドに対する抗体を作製するための方法を提供し、この方法は、第２の生物種の哺乳動物を第２の生物種のトランスジェニック哺乳動物に由来する細胞により免疫化することを含み、第１の生物種のポリペプチドがトランスジェニック哺乳動物由来の細胞によって発現される。
【０００８】
好ましい実施形態において、第１の生物種のポリペプチドが、トランスジェニック哺乳動物に由来する細胞の表面に発現される。
【０００９】
さらなる好ましい実施形態において、この方法は、ハイブリドーマ細胞を、免疫化された哺乳動物から得られる細胞（好ましくは、脾臓細胞）から調製するというさらなる工程を含む。好ましくは、この方法はさらに、ハイブリドーマ細胞を、第１の生物種のポリペプチドに結合する抗体についてスクリーニングすることを含む。
【００１０】
本発明の好ましい実施形態において、抗体はＭＡｂである。本発明はまた、本発明によって作製される抗体に由来する組換え抗体又はヒト化抗体を包含する。
【００１１】
本発明の好ましい実施形態において、第１の生物種は、飼育動物、家畜動物又はヒトである。より好ましくは、第１の生物種はヒトである。
【００１２】
さらなる好ましい実施形態において、第２の生物種は、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ラクダ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、ヒヒ、ウサギ、モルモット、ラット、ハムスター及びマウスからなる群より選択される。齧歯類、例えば、ラット、マウス及びハムスターが第２の生物種の好ましい哺乳動物である。より好ましくは、第２の生物種はマウスである。
【００１３】
第１の生物種のポリペプチドは、目的とする任意の治療標的又は診断標的であり得ることが理解される。例えば、ポリペプチドはＧタンパク質共役受容体であり得る。好ましい実施形態において、Ｇタンパク質共役受容体は化学誘引物質受容体である。好ましくは、化学誘引物質受容体はＣ５ａＲである。
【００１４】
別の実施形態において、そのようなポリペプチドをコードする核酸分子が、トランスジェニック哺乳動物の細胞におけるこのポリペプチドの発現を亢進させるために遺伝子改変されている。
【００１５】
さらなる好ましい実施形態において、トランスジェニック哺乳動物に由来する細胞は、高レベルの、第１の生物種のポリペプチドを発現する細胞である。従って、好ましい細胞タイプはポリペプチドの性質に依存する。例えば、ポリペプチドが生来的に肝臓において高発現であるならば、トランスジェニック哺乳動物に由来する好ましい細胞は肝臓の細胞であり得る。代替において、ポリペプチドが免疫調節又は炎症性応答に影響を及ぼすならば、好ましい細胞タイプは、免疫系の細胞、例えば、抗原提示細胞などであり得る。好適な抗原提示細胞の例には、樹状細胞、マクロファージ、単球、好中球、好酸球、好塩基球、線維芽細胞、マスト細胞、Ｔ細胞及びＢ細胞が含まれる。
【００１６】
さらにさらなる好ましい実施形態において、トランスジェニック哺乳動物に由来する細胞は、高レベルの、第１の生物種のポリペプチドを発現するように遺伝子改変されている細胞である。
【００１７】
本発明はまた、本発明の方法によって作製される抗体を提供する。
【００１８】
本明細書を通して、単語「含む（「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」）」又は変化形、例えば、「cｏｍｐｒｉｓｅｓ」又は「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」は、言及された要素、構成要素全体（integer）又は工程、あるいは、複数の要素、構成要素全体又は工程の言及された群を包含することを意味するが、任意の他の要素、構成要素全体又は工程、あるいは、複数の要素、構成要素全体又は工程の任意の他の群を排除することを意味しないことが理解される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】Ｌ１．２／ｈＣ５ａＲ細胞により免疫化されたマウスから作製された抗ヒトＣ５ａＲ  ｍＡｂが、ヒト好中球への125Ｉ−Ｃ５ａの結合を様々な程度に阻害したことを示す。誤差バーはＳＤを示す。
【図２】野生型マウスにおけるＣ５ａＲ遺伝子座のマップ、及び、ｈＣ５ａＲノックインマウスを構築するために使用された標的化ベクター。マウスＣ５ａＲ遺伝子の第３エキソンのＣＤＳが、標的化ベクターにおけるヒトＣ５ａＲ遺伝子の第３エキソンのＣＤＳにより正確に置き換えられた。マウスＣ５ａＲ遺伝子の隣接配列は相同的組換えを可能にする。ｌｏｘＰ部位が両側で接する選択マーカーＰＧＫｎｅｏが、Ｃｒｅを使用して第１のノックインマウスから欠失された。３’プローブ及び５’プローブが、組換えがマウスＣ５ａＲ遺伝子座の中に正しく起こっている標的化ベクターを確認するために使用された。Ｘ、ＸｂａＩ；Ｖ、ＥｃｏＲＶ。
【図３】ヘテロ接合のｈＣ５ａＲノックインマウス（ｈＣ５Ｒ１+/-）の間での交雑から得られたマウスの尾から得られるＥｃｏＲＶ消化されたゲノムＤＮＡのサザンブロットを示す。ブロットを、マウスのＣ５ａＲ対立遺伝子（１０．０ｋｂ）と、ｈＣ５ａＲノックイン対立遺伝子（８．１ｋｂ）とを識別する３’プローブとハイブリダイゼーションした。
【図４】ｈＣａ５Ｒ+/+マウス、ｈＣ５Ｒ１+/-マウス及び野生型マウスの好中球におけるＣ５ａＲの発現。好中球を、ＦＩＴＣコンジュゲート化された抗ヒトＣ５ａＲ  ｍＡｂ（７Ｆ３）又は抗マウスＣ５ａＲ  ｍＡｂ２０／７０により染色した。
【図５】ｈＣ５Ｒ１+/+マウスの好中球から作製された抗体が、ｍＡｂクローンに依存して、完全な阻害から、部分的阻害又はほとんど非阻害にまで及ぶ幅広いスペクトルの125Ｉ−Ｃ５ａ結合阻害を示した。結果は、それぞれの抗体についての少なくとも２つの独立した実験を表しており、誤差バーはｓ．ｅ．ｍ．を示す。
【図６】抗Ｃ５ａＲ  ｍＡｂはナノモル以下のＩＣ50値を有する。ｈＣ５Ｒ１+/+マウスの好中球から作製された抗体（３Ｃ５、７Ｈ３及び８Ｇ７）が、Ｌ１．２／ｈＣ５ａＲトランスフェクタントを使用して作製された最も良いｍＡｂ（７Ｆ３）の１／５から１／１０のＩＣ50を示した。ＩＣ50値を３回又は４回の独立した競合的125Ｉ−Ｃ５ａリガンド結合実験から求めた。
【図７】ヒト白血球におけるＣ５ａＲ発現。ヒストグラム分析によって明らかにされるＣ５ａＲ発現（暗灰色）対コントロール染色（明灰色）。間接的免疫蛍光染色を、ｍＡｂの７Ｆ３（暗灰色）、アイソタイプコントロール（明灰色）及びＦＩＴＣコンジュゲート化ヤギ抗マウスＩｇＧを使用して行った。
【図８】抗ｈＣ５ａＲ  ｍＡｂの治療効力の比較。ｈＣ５Ｒ１+/+マウスに、７Ｆ３、３Ｃ５又は８Ｇ７を、炎症が発生した後５日目に一回、（ＰＢＳにおいて１ｍｇ／ｋｇ又は３ｍｇ／ｋｇで）ｉ．ｐ．注入した。コントロール群はＰＢＳを受けた。グラフは、０日目からの足（足首）サイズにおける変化を示す。群平均（群あたり、ｎ＝５から７）。
【図９】抗ｈＣ５ａＲ  ｍＡｂの治療効力の比較。ｈＣ５Ｒ１+/+マウスに、７Ｆ３、３Ｃ５又は８Ｇ７を、炎症が発生した後５日目に一回、（ＰＢＳにおいて１ｍｇ／ｋｇ又は３ｍｇ／ｋｇで）ｉ．ｐ．注入した。コントロール群はＰＢＳを受けた。グラフは臨床スコアを示す。群平均（群あたり、ｎ＝５から７）。
【００２０】
発明の詳細な説明
一般的技術
具体的に別途定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、当業者（例えば、細胞培養、分子遺伝学、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学及び生化学における当業者）によって一般に理解されるのと同じ意味を有するように解釈されなければならない。
【００２１】
別途示されない限り、本発明において利用される組換えタンパク質技術、細胞培養技術及び免疫学的技術は、当業者には周知である標準的な手法である。そのような技術が様々な出典の文献の至る所に記載及び説明され：例えば、J. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approarch, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approarch, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996), and F.M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988、現在までのすべての更新を含む), Ed Harlow and David Lane (editors), Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988), およびJ.E. Coligan et al. (editors), Current Protocols Immunology, John Wiley & Sons (現在までのすべての更新を含む)、これらは参照により本明細書中に組み込まれる。
【００２２】
抗体を産生させる方法
本発明者らは今回、ヒトのポリペプチドを発現するノックインマウスが、このノックインマウスに由来する細胞による野生型マウスの免疫化により、このヒトポリペプチドに対する高親和性のアンタゴニストｍＡｂを開発するために使用できることを発見している。
【００２３】
従って、本発明は、第１の生物種のポリペプチドに対する抗体を作製するための方法を提供し、この方法は、第２の生物種の哺乳動物を第２の生物種のトランスジェニック哺乳動物に由来する細胞により免疫化することを含み、ただし、第１の生物種のポリペプチドがトランスジェニック哺乳動物由来の細胞によって発現される。
【００２４】
好ましい実施形態において、第１の生物種のポリペプチドが、トランスジェニック哺乳動物に由来する細胞の表面に発現される。
【００２５】
本発明の方法は、様々な異なるポリペプチドに対する抗体を産生させるために使用できることが理解される。好ましくは、ポリペプチドは、治療的又は診断的に注目されるものである。例えば、ポリペプチドはＧタンパク質共役受容体であり得る。好ましい実施形態において、Ｇタンパク質共役受容体は化学誘引物質受容体である。好ましくは、化学誘引物質受容体はＣ５ａＲである。
【００２６】
ポリペプチドは、目的とする任意の生物種であり得る第１の生物種に由来する。好ましくは、第１の生物種は、治療的処置又は予防的処置のために選択される生物種である。例えば、第１の生物種は、飼育動物、家畜動物又はヒトであり得る。好ましい実施形態において、第１の生物種はヒトである。
【００２７】
好ましくは、トランスジェニック哺乳動物はヒト以外の哺乳動物であり、例えば、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ラクダ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、ヒヒ、ウサギ、モルモット、ラット、ハムスター及びマウスである。齧歯類、例えば、ラット、マウス及びハムスターが、好ましいトランスジェニック哺乳動物である。
【００２８】
トランスジェニック哺乳動物に由来する任意の細胞を免疫化のために使用することができる。しかしながら、トランスジェニック哺乳動物から得られる細胞はポリペプチドを比較的高い密度でその表面に発現することが好ましい。細胞あたり１００，０００個又は２００，０００個を越えるポリペプチドの発現レベルが好ましい。
【００２９】
従って、好ましい細胞タイプはポリペプチドの性質に依存することが理解される。例えば、ポリペプチドが生来的に肝臓において高発現であるならば、トランスジェニック哺乳動物に由来する好ましい細胞は肝臓の細胞であり得る。代替において、ポリペプチドが免疫調節又は炎症性応答に影響を及ぼすならば、好ましい細胞タイプは、免疫系の細胞、例えば、抗原提示細胞であり得る。好適な抗原提示細胞の例には、樹状細胞、マクロファージ、単球、好中球、好酸球、好塩基球、線維芽細胞、マスト細胞、Ｔ細胞及びＢ細胞が含まれる。
【００３０】
免疫化されるための哺乳動物は、免疫化のための細胞を得るために使用されるトランスジェニック哺乳動物と同じ生物種の哺乳動物である。免疫化されるための哺乳動物は、抗体を産生させることにおける使用のために好適な任意の哺乳動物が可能である。再度ではあるが、齧歯類、例えば、ラット、マウス及びハムスターが、免疫化のために使用される好ましい哺乳動物である。
【００３１】
免疫化のための様々な技術が当業者には周知である。一実施形態において、例えば、哺乳動物が、トランスジェニック哺乳動物から得られる細胞により２週間間隔で多数回、免疫化される。
【００３２】
好ましい実施形態において、本発明の方法はさらに、ハイブリドーマ細胞を、最後の免疫化の後の免疫化された哺乳動物から得られる脾臓細胞から調製することを含む。好ましくは、本発明の方法はさらに、ハイブリドーマ細胞を、第１の生物種のポリペプチドに結合する抗体についてスクリーニングすることを含む。
【００３３】
本発明の方法によって作製される抗体は、その後、下記で詳しく記載されるように、組換え抗体又はヒト化抗体を作製するために使用することができる。例えば、本発明の方法によって作製される抗体の重鎖及び／又は軽鎖のＣＤＲ領域を、本発明の方法によって作製される抗体に対する類似した結合特性を有するヒト化抗体を作製するために、異なるヒト抗体に由来するフレームワーク領域に継ぎ足すことができる。このような様式で作製されるヒト化抗体又は組換え抗体もまた本発明によって包含される。
【００３４】
第１の生物種のポリペプチド
本発明は、第１の生物種のポリペプチドに対する抗体を産生させる方法に関連する。好ましい実施形態において、ポリペプチドに対して産生される抗体は、第１の生物種の対象を処置又は診断するための治療剤又は診断剤としての使用のために好適である。
【００３５】
当業者は、本発明の方法が、様々な生物学的に活性なポリペプチドに対する抗体を作製するために使用できることを理解する。好適なポリペプチドの例には、既に治療用抗体又は診断用抗体の製造のための標的であるポリペプチドが含まれる。
【００３６】
好ましい一実施形態において、ポリペプチドは、傷害、移植片拒絶又は感染に対する急性期の炎症性応答の免疫調節又は免疫誘導に影響を及ぼす。例えば、ポリペプチドはＧタンパク質共役受容体であり得る。好ましい実施形態において、Ｇタンパク質共役受容体は化学誘引物質受容体である。好ましくは、化学誘引物質受容体はＣ５ａＲである。代替では、ポリペプチドは、Ｃ５ａ、ＣＤ１８、ＣＤ１４７、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２５、ＣＤ３、ＴＮＦ−α、ＣＤ４、ＩｇＧ１又はＣＤ６４（ＦｃＲ）であり得る。
【００３７】
本発明において使用されるさらなるポリペプチドの限定されない例には、ＩＬ−８、ｇｐ１２０、ＶＬＡ−４、ＤＣ１１ａ、ＶＥＧＦ、ＩＣＡＭ−１、ＣＤ２、ＥＧＦＲ、Ｅ−セレクチン、第ＶＩＩＩ因子、β２−インテグリン及びＥｐＣＡＭが含まれる。
【００３８】
「第１の生物種のポリペプチド」とは、第１の生物種の対象に由来する生来的配列のすべて又は一部分に対して相同的であるか、又は、好ましくは同一である配列を有するポリペプチドのことである。生来的配列のすべて又は一部分に対して相同的である配列を有するポリペプチドは、全長の生来的配列のポリペプチド、シグナルペプチドを有しない生来的配列のポリペプチド、ポリペプチドの細胞外ドメイン、又は、全長の生来的配列の任意の他のフラグメントとの少なくとも約８０％の配列同一性を好ましくは有する生物学的に活性なポリペプチド、より好ましくは、少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有する生物学的に活性なポリペプチド、より好ましくは、少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性を有する生物学的に活性なポリペプチド、より好ましくは、少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性を有する生物学的に活性なポリペプチド、より好ましくは、少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性を有する生物学的に活性なポリペプチド、最も好ましくは、少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有する生物学的に活性なポリペプチドである。
【００３９】
本発明の関連において、第１の生物種のポリペプチドはトランスジェニック哺乳動物によって発現される。トランスジェニック哺乳動物は、第１の生物種の遺伝子に由来する生来的なコード領域をトランスジェニック哺乳動物のゲノムに導入することによって作製することができる。しかしながら、完全な生来的コード領域をトランスジェニック哺乳動物のゲノムに導入することは必ずしも必要ない。代わりに、トランスジェニック哺乳動物におけるポリペプチドの少なくとも１つのドメイン（又はその実質的な部分）についてのコード領域を第１の生物種のポリペプチドの対応するドメインにより置き換えることが可能である場合がある。例えば、第１の生物種のポリペプチドがヒトＣ５ａＲであるならば、トランスジェニック哺乳動物を、内因性Ｃ５ａＲの少なくとも１つの細胞外ドメインをヒトＣ５ａＲの対応する細胞外ドメインにより置き換えることによって作製することができる。従って、トランスジェニック哺乳動物によって発現されるヒトＣ５ａＲはヒトＣ５ａＲの１つだけの細胞外ドメインを含むことができる。別の例では、トランスジェニック哺乳動物によって発現されるヒトＣ５ａＲは、内因性Ｃ５ａＲの細胞内ドメインと、ヒトＣ５ａＲの細胞外ドメインとを含む。
【００４０】
ポリペプチドをコードする核酸分子を、ポリペプチドの発現又は安定性を高めるために改変することができる。例えば、核酸の性質を、下記の方策の１つ又はそれ以上を使用して発現収率を改善するために最適化することができる：１）不完全なＫｏｚａｋ配列を置換すること、２）ＲＮＡの５’ＧＣ含有量及び二次構造を減らすこと、３）コドン使用頻度を最適化すること、４）代わりのリーダー配列を使用すること、５）キメラなイントロンを含めること、又は、６）最適化されたポリ−ＡテールをメッセージのＣ末端に付加すること。ポリペプチドの性質もまた、下記の方策の１つ又はそれ以上を使用して発現収率を改善するために最適化することができる：１）シグナル配列を最適化すること、２）タンパク質分解プロセシング部位を最適化すること、３）不適切なジスルフィド結合の形成を最小限に抑えるために１つ又はそれ以上のシステイン残基を置換すること、４）タンパク質折り畳みの速度又は効率を改善すること、又は、５）タンパク質の安定性、特に、タンパク質分解の安定性を増大させること。
【００４１】
代替では、様々な改変を、ポリペプチドの発現レベルを高めるために、プロモーター配列に対して行うことができる。一実施形態において、生来的なプロモーター配列が、第２の生物種の哺乳動物を免疫化するために使用されるトランスジェニック動物に由来する細胞においてポリペプチドを発現させるプロモーター配列により置き換えられる。
【００４２】
ポリペプチドはまた、発現ポリペプチドの送達をトランスジェニック細胞の表面に標的化するために改変することができる。事実上すべての細胞表面タンパク質及び分泌タンパク質は、シグナルペプチドと呼ばれる、長さが５個から３０個のアミノ酸残基に及ぶアミノ末端の延長部を含有する前駆体として発現される。分泌プロセスを開始させるために要求される情報が、この短いシグナルペプチド延長部の中に存在すると考えられる。シグナルペプチドは、膜を横切って移行するとき、タンパク質から切断される。加えて、膜貫通（ＴＭ）ドメインと呼ばれるタンパク質内の他の疎水性領域により、細胞表面タンパク質は細胞膜に固定される。
【００４３】
多くのシグナルペプチドのアミノ酸配列が公知である。直接的なアミノ酸配列相同性がシグナルペプチドの間にはほとんどないが、それらの全体的な構造が高度に保存されている。真核生物のシグナルペプチド誘導の分泌経路に関わる細胞内要素が十分に明らかにされており、これらは、小胞体（ＥＲ）膜を横切るタンパク質の移行を容易にしている。
【００４４】
対照的に、ある種のタンパク質は、膜貫通セグメントとして役立つ、切断されないシグナル配列（「シグナルアンカー配列」）を有する。シグナルアンカーＩ型タンパク質は、細胞質ゾルに位置するＣ末端を有し、これはＩ型膜タンパク質と類似し、これに対して、シグナルアンカーＩＩ型タンパク質は、細胞質ゾルに位置するＮ末端を有する。
【００４５】
従って、トランスジェニック細胞によって発現されるポリペプチドの表面呈示を、目的とするポリペプチドと、細胞表面に生来的に呈示される別のタンパク質に由来する膜貫通ドメインとを含有する融合タンパク質を産生することによって達成することができる。代替として、典型的にはポリペプチドの分泌に関わるシグナルペプチドを、タンパク質分解的切断のための部位をもはや含有しないように改変することができる。シグナル配列に対するこの改変は、ポリペプチドが細胞表面に発現され、分泌されないことをもたらす。
【００４６】
トランスジェニック動物
「ノックイン」トランスジェニック動物を作製するための様々な技術が当分野では周知である。この主題に関する有用な一般的教本が、Houdebine, Transgenic animals-Generation and Use (Harwood Academic, 1997)である（これは、魚類からマウス及びウシまでのトランスジェニック動物を作製するために使用される技術の広範囲に及ぶ総説である）。本発明の関連で特に注目されるのが、トランスジェニック非ヒト哺乳動物、例えば、ウシ、ブタ、ヤギ、ウマなど、及び、特に、齧歯類、例えば、ラット、マウス、ハムスターなどである。好ましくは、トランスジェニック動物はマウスである。
【００４７】
胚の顕微操作のための技術における進歩は今や、異種のＤＮＡを、例えば、受精した哺乳動物卵に導入することを可能している。例えば、全能性又は多能性の幹細胞を、顕微注入、リン酸カルシウム媒介沈殿、リポソーム融合、レトロウイルス感染又は他の手段によって形質転換することができ、その後、形質転換された細胞が胚に導入され、その後、胚が発達してトランスジェニック動物になる。好ましい方法において、発達途中の胚がエレクトロポレーションによって所望のＤＮＡによりトランスフェクションされ、トランスジェニック動物が感染胚から作製される。しかしながら、さらなる好ましい方法において、適切なＤＮＡが、好ましくは単細胞段階で胚の前核又は細胞質に同時注入され、胚を成熟したトランスジェニック動物に発達させることができる。それらの技術は周知である。Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo, Krimpenfort et al., Bio/Technology 9:844 (1991);Palmiter et al., Cell, 41:343 (1985);Kraemer et al., Genetic manipulation of the Mammalian Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratories Press, 1985);Hammer et al., Nature、315:680 (1985)；米国特許第５，１７５，３８５号；米国特許第５，１７５，３８４号（これらのそれぞれの内容が参照により本明細書中に組み込まれる）を含めて、哺乳動物の受精卵への異種ＤＮＡの顕微注入のための標準的な実験室手法の総説を参照のこと。
【００４８】
トランスジェニック動物を作製するために使用される別の方法は、核酸を標準的な方法によって前核段階の卵に顕微注入することを伴う。注入された卵は、その後、偽妊娠レシピエントの卵管の中に移される前に培養される。
【００４９】
トランスジェニック動物はまた、Schnieke et al., 1997, Science, 278:2130、及び、Cibelli et al., 1998, Science, 280:1256に記載されるような核移入技術によって作製することができる。この方法を使用して、ドナー動物に由来する線維芽細胞が、目的とする結合ドメイン又は結合性パートナーについてのコード配列を調節制御下で取り込むプラスミドにより安定にトランスフェクションされる。安定なトランスフェクタントは、その後、徐核された卵母細胞に融合され、培養され、メスのレシピエントに移される。
【００５０】
導入遺伝子配列を含有し得る動物の分析が、典型的には、標準的な方法に従ってＰＣＲ分析又はサザンブロット分析のいずれかによって行われる。
【００５１】
トランスジェニック哺乳動物、例えば、ウシを構築するための具体的な一例として、哺乳動物から新たに取り出された卵巣から得られる卵母細胞に、ＧＦＰに融合される結合ドメインをコードする配列を含むヌクレオチド構築物が、例えば、米国特許第４，８７３，１９１号に記載される技術を使用して顕微注入される。卵母細胞が、卵胞から吸引され、そして、ヘパリンにより受精能を獲得し、運動性画分を単離するためにＰｅｒｃｏｌｌ勾配によって事前に分画した解凍凍結精子との受精の前に静置させられる。
【００５２】
受精させた卵母細胞は、前核を注入のために可視化するために、例えば、１５，０００ｇで８分間、遠心分離され、その後、接合体段階から桑実胚段階又は胚盤胞段階まで卵管組織馴化培地で培養される。この培地は、卵管からかき取り、培養培地で希釈した管腔組織を使用することによって調製される。接合体は顕微注入後２時間以内に培養培地に置かなければならない。
【００５３】
その後、発情が、コプロスタノールを投与することによって、意図されたレシピエント哺乳動物、例えば、ウシにおいて同期化される。発情が２日以内に生じ、胚が発情後５日から７日でレシピエントに移される。成功した移入をサザンブロットによって子孫において評価することができる。
【００５４】
代替として、所望される構築物を胚性幹細胞（ＥＳ細胞）に導入し、細胞を、導入遺伝子による改変を確実にするように培養することができる。その後、改変された細胞が胚芽期の胚胞に注入され、胚胞が偽妊娠宿主に戻される。得られる子孫はＥＳ細胞及び宿主細胞に関してキメラであり、ＥＳの後代をもっぱら含む非キメラ系統を、従来の交雑育種を使用して得ることができる。この技術が、例えば、国際特許出願公開ＷＯ９１／１０７４１に記載される。
【００５５】
トランスジェニック動物は、染色体外エレメントとして存在する外因性の核酸配列を含むか、あるいは、その細胞のすべて又は一部分において、特に、生殖細胞において安定に組み込まれる外因性の核酸配列を含む。トランスジェニック動物が生殖系列配列に対する安定な変化を含むことが好ましい。安定な変化が一般には、ＤＮＡを細胞のゲノムに導入することによって達成される。安定な組み込みのためのベクターには、プラスミド、レトロウイルス及び他の動物ウイルス、ならびに、ＹＡＣなどが含まれる。動物の初期構築の期間中において、「キメラ体」又は「キメラ動物」が生じ、この場合、細胞のあるサブセットのみが、変化したゲノムを有する。キメラ体は主として、所望されるトランスジェニック動物を作製するために、育種目的のために使用される。ヘテロ接合の変化を有する動物がキメラ体の交配によって作製される。オスのヘテロ接合体及びメスのヘテロ接合体が典型的には、ホモ接合の動物を作製するために交配される。従って、好ましい実施形態において、トランスジェニック哺乳動物はノックイン遺伝子についてホモ接合である。
【００５６】
さらなる好ましい実施形態において、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、ヒトの導入遺伝子を非ヒト動物の生殖系列に導入することによって作製される。胚性幹細胞（ＥＳ）が、相同的組換えを達成するために、ヒトの導入遺伝子を非ヒト動物に導入するための標的細胞の主要なタイプである。ＥＳ細胞を、インビトロで培養された着床前の胚から得ることができ、胚と融合させることができる（Evans et al. (1981) Nature 292, 154-156;Bradley et al. (1984) Nature 309, 255-258;Gossler et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83 9065-9069;及び、Robertoson et al. (1986) Nature 322, 445-448）。導入遺伝子を、ＤＮＡトランスフェクションによって、又は、レトロウイルス媒介の形質導入によってＥＳ細胞に効率よく導入することができる。そのような形質転換されたＥＳ細胞は、その後、非ヒト動物に由来する胚盤胞と一緒にすることができる。その後、ＥＳ細胞は胚に定着し、得られるキメラ動物の生殖系列に寄与する。総説については、Jaenisch (1988), Science 240, 1468-1474を参照のこと。トランスフェクションされた胚細胞は様々な量の時間にわたってインビトロでインキュベーションすることができ、又は、代理宿主に再び着床させることができ、又は、両方を行うことができる。
【００５７】
代理宿主のトランスジェニック子孫は、任意の好適な方法によって導入遺伝子の存在及び／又は発現についてスクリーニングすることができる。スクリーニングは多くの場合、導入遺伝子の少なくとも一部分に対して相補的であるプローブを使用してサザンブロット分析又はノーザンブロット分析によって達成される。導入遺伝子によってコードされるタンパク質に対する抗体を使用するウエスタンブロット分析を、導入遺伝子産物の存在についてスクリーニングするための代替方法又はさらなる方法として用いることができる。典型的には、トランスジェニックマウスにおいては、ＤＮＡが尾組織から調製され、導入遺伝子についてサザン分析又はＰＣＲによって分析される。代替では、導入遺伝子を最高レベルで発現すると考えられる組織又は細胞が、サザン分析又はＰＣＲを使用して導入遺伝子の存在及び発現について試験されるが、任意の組織又は細胞タイプをこの分析のために使用することができる。トランスジェニック動物の後代を、トランスジェニック動物を好適な相手と交配することによって、あるいは、トランスジェニック動物から得られる卵子及び／又は精子のin vitro受精によって得ることができる。
【００５８】
トランスジェニックマウスを、内因性遺伝子と、導入遺伝子構築物との間での相同的組換えによって作製する方法が、Hanksら（Science 269:679-682, 1995）によって記載され、これは参照により特に本明細書中に組み込まれる。これは、例えば、ヒトのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド構築物を哺乳動物のゲノムへの標的化された組込みにより哺乳動物のゲノムに導入することによって達成され得ることが理解される。
【００５９】
本発明の操作性にとって必ずしも必要ないが、本明細書中に記載されるトランスジェニック動物は、上記の遺伝子変化に加えて、内因性遺伝子に対する変化を含むことができる。従って、宿主動物は、目的とするポリペプチドをコードする遺伝子について「ノックアウト」及び「ノックイン」の両方である場合がある。ノックアウトは、目的とする内因性遺伝子の一方又は両方の対立遺伝子における機能の部分的喪失又は完全な喪失を有する。例えば、目的とするポリペプチドがＣ５ａＲであるならば、宿主動物の内因性Ｃ５ａＲを「ノッックアウト」することができ、また、異なる生物種に由来するＣ５ａＲを「ノックイン」することができる。この例では、組込み後、内因性のＣ５ａＲ部位が、ヒトＣ５ａＲをコードするポリヌクレオチドを含むように、ヒトＣ５ａＲの全長又はフラグメントをコードするポリヌクレオチド構築物を内因性Ｃ５ａＲ配列の内部に組み込むことができる。
【００６０】
「ノックアウト」に関して、好ましくは、標的遺伝子の発現は検出できないか、又は、微々たるものである。例えば、Ｃ５ａＲ遺伝子のノックアウトは、内因性Ｃ５ａＲ遺伝子の機能が実質的に低下しており、その結果、発現が検出可能でないか、又は、微々たるレベルで存在するだけであることを意味する。このことは、コード配列の破壊の導入（例えば、１つ又はそれ以上の停止コドンの挿入、ＤＮＡフラグメントの挿入など）、コード配列の欠失、コード配列のための停止コドンの置換などを含めて、様々な機構によって達成することができる。機能的「ノックアウト」もまた、生来的遺伝子の発現の阻止するアンチセンス構築物の導入によって達成することができる（例えば、Li and Cohen(1996) Cell 85:319-329を参照のこと）。「ノックアウト」にはまた、条件的ノックアウトが含まれ、例えば、この場合、標的遺伝子の変化が、動物を、標的遺伝子の変化を促進させる物質にさらしたときに、又は、標的遺伝子部位における組換えを促進させる酵素（例えば、Ｃｒｅ−ｌｏｘ系におけるＣｒｅ）を導入したときに、又は、標的遺伝子の変化を出生後に行わせるための他の方法のときに生じる。
【００６１】
抗体
上記の方法によって作製される抗体が本発明によって包含される。例示的な抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体及びヘテロコンジュゲート抗体が含まれる。
【００６２】
本発明において使用される用語「抗体」には、無傷な分子、ならびに、エピトープ決定基と結合することができるそのフラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖが含まれる。これらの抗体フラグメントは、その抗原又は受容体に関して選択的に結合するいくらかの能力を保持しており、下記のように定義される：
（１）Ｆａｂ、すなわち、抗体分子の一価の抗原結合性フラグメントを含有するフラグメントを、完全な抗体を酵素パパインにより消化して、無傷な軽鎖と、１つの重鎖の一部分とを生じさせることによって作製することができる；
（２）Ｆａｂ’、抗体分子のこのフラグメントを、完全な抗体をペプシンにより処理し、続いて還元して、無傷な軽鎖と、重鎖の一部分とを生じさせることによって得ることができる；２つのＦａｂ’フラグメントが抗体分子あたり得られる；
（３）（Ｆａｂ’）2、すなわち、完全な抗体を酵素パパインにより消化し、その後の還元を行わないことによって得ることができる抗体のフラグメント；Ｆ（ａｂ）２は、２つのジスルフィド結合によってつなぎ合わされる２つのＦａｂ’フラグメントのダイマーである；
（４）Ｆｖ、これは、２つの鎖として発現される軽鎖の可変領域及び重鎖の可変領域を含有する遺伝子操作されたフラグメントとして定義される；
（５）単鎖抗体（「ＳＣＡ」）、これは、遺伝子融合された単鎖分子として、軽鎖の可変領域及び重鎖の可変領域を、好適なポリペプチドリンカーによって連結して含有する遺伝子操作された分子として定義される；及び
（６）単一ドメイン抗体、典型的には、軽鎖を有しない可変重鎖ドメイン。
【００６３】
ポリクローナル抗体
本発明の方法によって作成される抗体はポリクローナル抗体である場合がある。ポリクローナル抗体を調製する様々な方法が当業者には公知である。ポリクローナル抗体を、例えば、トランスジェニック哺乳動物に由来する第１の生物種のポリペプチドを発現する細胞と、所望されるならば、アジュバントとを１回又はそれ以上注射することによって、哺乳動物において惹起させることができる。典型的には、細胞及び／又はアジュバントが多数回の皮下注射又は腹腔内注射によって哺乳動物において注射される。用いることができるアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント及びＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコラート）が含まれる。免疫化プロトコルは、過度な実験を行うことなく、当業者によって選択することができる。
【００６４】
モノクローナル抗体
本発明の方法によって作成される抗体は、代替では、モノクローナル抗体である場合がある。モノクローナル抗体を、ハイブリドーマ法を使用して、例えば、Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)によって記載される方法などを使用して調製することができる。ハイブリドーマ法において、第１の生物種のポリペプチドに特異的に結合する抗体を産生するか、又は、産生することができるリンパ球を誘発させるために、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物が典型的には、トランスジェニック哺乳動物に由来する第１の生物種のポリペプチドを発現する細胞により免疫化される。
【００６５】
一般に、ヒト起原の細胞が所望されならば、末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）が使用されるか、あるいは、非ヒト哺乳動物の供給源が所望されるならば、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。その後、リンパ球は、ハイブリドーマ細胞を形成するために、好適な融合剤、例えば、ポリエチレングリコールを使用して不死化細胞株と融合される（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press (1986), pp. 59-103）。不死化細胞株は通常、形質転換された哺乳動物細胞であり、具体的には、齧歯類、ウシ及びヒトを起原とする骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫細胞株が用いられる。ハイブリドーマ細胞は、融合されていない不死化細胞の成長又は生存を阻害する１つ又はそれ以上の物質を好ましくは含有する好適な培養培地で培養することができる。例えば、親の細胞が酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を有しないならば、ハイブリドーマのための培養培地は典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含み（「ＨＡＴ」培地）、これらの物質はＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を妨げる。
【００６６】
好ましい不死化細胞株は、効率よく融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定した高レベルの発現を支援し、培地、例えばＨＡＴ培地に対して感受性である不死化細胞株である。より好ましい不死化細胞株はマウスの骨髄腫系統であり、これらは、例えば、Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）及びＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．）から得ることができる。ヒト骨髄腫細胞株及びマウス−ヒトのヘテロ骨髄腫細胞株もまた、ヒトモノクローナル抗体の作製のために記載されている（Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Application, Marcel Dekker,Inc., New York, (1987) pp. 51-63）。
【００６７】
その後、ハイブリドーマ細胞が培養される培養培地は、第１の生物種のポリペプチドに対して向けられたモノクローナル抗体の存在についてアッセイすることができる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性が、免疫沈降によって、又は、インビトロ結合アッセイ、例えば、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって求められる。そのような様々な技術及びアッセイが当分野では公知である。モノクローナル抗体の結合親和性を、例えば、Munson and Polland, Anal. Biochem., 107:220 (1980)のスキャッチャード分析によって求めることができる。
【００６８】
所望されるハイブリドーマ細胞が特定された後、クローンは限界希釈手法によってサブクローン化することができ、標準的な方法によって成長させることができる。この目的のための好適な培養培地には、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地及びＲＰＭＩ−１６４０培地が含まれる。代替では、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物において腹水のようにインビボで成長させることができる。
【００６９】
サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製手法によって、例えば、プロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィーなどによって培養培地又は腹水から単離又は精製することができる。
【００７０】
モノクローナル抗体はまた、組換えＤＮＡ方法によって、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載される方法によって作製することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡを、（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）従来の手法を使用して容易に単離し、配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。単離されると、ＤＮＡを発現ベクターに設置することができ、その後、発現ベクターは、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を得るために宿主細胞、例えば、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は、他の場合には免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞にトランスフェクションされる。ＤＮＡはまた、例えば、ヒトの重鎖定常ドメイン及び軽鎖定常ドメインのためのコード配列を相同的なマウス配列の代わりに使用することによって（米国特許第４，８１６，５６７号）、あるいは、非免疫グロブリンポリペプチドのためのコード配列のすべて又は一部分を免疫グロブリンのコード配列に共有結合により連結することによって改変することができる。そのような非免疫グロブリンポリペプチドは本発明の抗体の定常ドメインの代わりに使用することができ、又は、キメラな二価抗体を作製するために本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変領域の代わりに使用することができる。
【００７１】
抗体は一価の抗体である場合がある。一価の抗体を調製するための様々な方法が当分野では周知である。例えば、１つの方法は、免疫グロブリンの軽鎖及び改変された重鎖の組換え発現を伴う。重鎖は、重鎖が架橋することを防止するように、一般にはＦｃ領域内の任意のところで短縮化される。代替では、問題とされるシステイン残基が別のアミノ酸残基により置換されるか、又は、架橋を防止するように欠失される。
【００７２】
インビトロ方法もまた、一価の抗体を調製するために好適である。抗体を、そのフラグメント、具体的には、Ｆａｂフラグメントを作製するために消化することを、当分野では公知である日常的な技術を使用して達成することができる。
【００７３】
ヒト抗体及びヒト化抗体
本発明の抗体はヒト化抗体又はヒト抗体である場合がある。非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含有するキメラな免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はそのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、又は、抗体の他の抗原結合性部分配列）である。ヒト化抗体には、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基が、所望される特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）、例えば、マウス、ラット又はウサギのＣＤＲに由来する残基によって置換されるヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）が含まれる。いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基によって置換される。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体において、あるいは、移入されたＣＤＲ配列又はフレームワーク配列において、そのどちらにも見出されない残基を含むことができる。一般に、ヒト化抗体は少なくとも１つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、典型的には、２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、この場合、ＣＤＲ領域のすべて又は実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、ＦＲ領域のすべて又は実質的にすべてがヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体は最適にはまた、免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分を含み、典型的には、ヒト免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分を含む（Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986);Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988);及び、Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)）。
【００７４】
非ヒト抗体をヒト化するための様々な方法が当分野では周知である。一般に、ヒト化抗体では、１つ又はそれ以上のアミノ酸残基が、非ヒトである供給源からヒト化抗体に導入されている。これらの非ヒトアミノ酸残基は「移入」残基と呼ばれることが多く、この場合、「移入」残基は典型的には「移入」可変ドメインから取られる。ヒト化は本質的には、齧歯類のＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列の代わりに使用することによって、Winter及び共同研究者らの方法に従って行うことができる（Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986);Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988);Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)）。従って、そのような「ヒト化」抗体は、実質的に無傷でないヒト可変ドメインが非ヒト種由来の対応する配列によって置換されているキメラな抗体である（米国特許第４，８１６，５６７号）。実際、ヒト化抗体は典型的には、いくつかのＣＤＲ残基、及び、おそらくはいくつかのＦＲ残基が、齧歯類抗体における類似部位に由来する残基によって置換されるヒト抗体である。
【００７５】
ヒト抗体はまた、当分野では公知である様々な技術を使用して作製することができ、そのような技術には、ファージディスプレーライブラリーが含まれる（Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991);Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)）。Ｃｏｌｅら及びＢｏｅｒｎｅｒらの技術もまた、ヒトモノクローナル抗体を調製するために利用することができる（Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)；及び、Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)）。同様に、ヒト抗体を、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をトランスジェニック動物、例えば、内因性の免疫グロブリン遺伝子が部分的又は完全に不活性化されているマウスに導入することによって作製することができる。抗原投与されたとき、ヒト抗体の産生が認められ、この場合、そのヒト抗体の産生は、遺伝子再配置、組立て及び抗体レパートリーを含めて、すべての点でヒトにおいて認められる抗体産生と非常に類似する。この方法が、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号、同第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号及び同第５，６６１，０１６号に記載され、また、下記の科学刊行物に記載される：Marks et al., Bio/Technology 10, 779-783 (1992);Lonberg et al., Nature 368 856-859 (1994);Morrison, Nature 368, 812-13 (1994);Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996);Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996);Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995)。
【００７６】
抗体はまた、当分野では公知であるような公知の選抜方法及び／又は変異誘発方法を使用して親和性成熟させることができる。好ましい親和性成熟した抗体は、成熟した抗体が調製される出発抗体（一般には、マウス抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体）よりも５倍大きい親和性を有し、より好ましくは１０倍大きい親和性を有し、一層より好ましくは２０倍又は３０倍大きい親和性を有する。
【００７７】
二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原についての結合特異性を有するモノクローナルな、好ましくはヒト抗体又はヒト化抗体である。例えば、そのような結合特異性の一方がＣ５ａＲについてであり得るし、もう一方が、任意の他の抗原についてであり、好ましくは、細胞表面のタンパク質又は受容体又は受容体サブユニットについてであり得る。
【００７８】
二重特異性抗体を作製するための様々な方法が当分野では公知である。従来的には、二重特異性抗体の組換え作製は、２つの重鎖が異なる特異性を有する２対の免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の共発現に基づいている（Milstein and Cuello, Nature, 305:537-539 (1983)）。免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖がランダムに組み合わされるので、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０種の異なる抗体分子の潜在的な混合物を産生し、この場合、それらのうちの１つのみが、正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製が通常、アフィニティークロマトグラフィー工程によって達成される。類似する手法が、国際特許出願公開ＷＯ９３／０８８２９（１９９３年５月１３日公開）、及び、Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)に開示される。
【００７９】
所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体−抗原結合部位）を免疫グロブリンの定常ドメイン配列に融合することができる。この融合は好ましくは、ヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合である。融合体の少なくとも１つに存在する軽鎖結合のために必要な部位を含有する最初の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体をコードするＤＮＡ、及び、所望されるならば、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡが、別個の発現ベクターに挿入され、好適な宿主生物に共トランスフェクションされる。二重特異性抗体のさらなる詳細については、例えば、Suresh et al., Methods in Emzymology, 121:210 (1986)を参照のこと。
【００８０】
国際特許出願公開ＷＯ９６／２７０１１に記載される別の方法によれば、１対の抗体分子の間における境界面を、組換え細胞の培養から回収されるヘテロダイマーの百分率を最大にするために操作することができる。好ましい境界面は抗体の定常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法では、第１の抗体分子の境界面に由来する１つ又はそれ以上の小さいアミノ酸側鎖が、より大きい側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）により置換される。大きい側鎖と同一のサイズ又は類似したサイズの代償的「空洞」が、大きいアミノ酸側鎖をより小さいアミノ酸側鎖（例えば、アラニン又はトレオニン）により置換することによって第２の抗体分子の境界面に作製される。これは、他の望まれない最終生成物、例えば、ホモダイマーを上回ってヘテロダイマーの収率を増大させるための機構を提供する。
【００８１】
二重特異性抗体は全長型抗体又は抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）2二重特異性抗体）として調製することができる。二重特異性抗体を抗体フラグメントから作製するための様々な技術が文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体を、化学的連結を使用して調製することができる。Brennan et al., Science 229:81 (1985)は、無傷の抗体をタンパク質分解的に切断して、Ｆ（ａｂ’）2フラグメントを作製する手法を記載する。これらのフラグメントは、隣接ジチオールを安定化し、分子間ジスルフィドの形成を防止するためにジチオール複合体化剤の亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元される。その後、作製されたＦａｂ’フラグメントはチオニトロベンゾアート（ＴＮＢ）誘導体に変換される。その後、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の１つがメルカプトエチルアミンによる還元によってＦａｂ’−チオールに再変換され、二重特異性抗体を形成するために等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合される。作製された二重特異性抗体は、酵素を選択的に固定化するための作用因として使用することができる。
【００８２】
Ｆａｂ’フラグメントを大腸菌（E.coli）から直接に回収することができ、二重特異性抗体を形成するために化学的にカップリングすることができる。Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)は、完全にヒト化された二重特異性抗体のＦ（ａｂ’）2分子の作製を記載する。それぞれのＦａｂ’フラグメントが大腸菌から別々に分泌され、二重特異性抗体を形成するためにインビトロでの誘導的化学的カップリングに供された。このようにして形成された二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ２受容体を過剰発現する細胞、及び、正常なヒトＴ細胞に結合することができ、同様にまた、ヒト乳腫瘍標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性を誘発することができた。
【００８３】
二重特異性抗体フラグメントを作製し、組換え細胞の培養から直接に単離するための様々な技術もまた記載されている。例えば、二重特異性抗体が、ロイシンジッパーを使用して作製されている。Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓタンパク質及びＪｕｎタンパク質に由来するロイシンジッパーペプチドが、遺伝子融合によって２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結された。抗体ホモダイマーが、モノマーを形成するためにヒンジ領域で還元され、その後、抗体ヘテロダイマーを形成するために再酸化された。この方法はまた、抗体ホモダイマーを作製するために利用することができる。Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)によって記載される「ジアボディー」技術が、二重特性抗体フラグメントを作製するための代替機構を提供している。フラグメントは、同じ鎖における２つのドメインの間での対形成を許すには短すぎるリンカーによって軽鎖可変ドメイン（ＶL）につながれた重鎖可変ドメイン（ＶH）を含む。従って、１つのフラグメントのＶHドメイン及びＶLドメインが別のフラグメントの相補的なＶLドメイン及びＶHドメインと強制的に対形成させられ、それにより、２つの抗原結合部位を形成する。二重特性抗体フラグメントを単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーの使用によって作製するための別の方策もまた報告されている。Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994)を参照のこと。
【００８４】
２価以上の結合価を有する抗体が意図される。例えば、三重特異性の抗体を調製することができる。Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)。
【００８５】
ヘテロコンジュゲート抗体
ヘテロコンジュゲート抗体もまた、本発明の範囲内である。ヘテロコンジュゲート抗体は、共有結合により連結された２つの抗体から構成される。そのような抗体は、例えば、免疫系の細胞を望まれない細胞に対して標的化するために提案されており（米国特許第４，６７６，９８０号）、また、ＨＩＶ感染を処置するために提案されている（国際特許出願公開ＷＯ９１／００３６０、同ＷＯ９２／２００３７３、欧州特許第０３０８９号）。抗体が、架橋剤を伴う方法を含めて、合成タンパク質化学における公知の方法を使用してインビトロで調製され得ることが意図される。例えば、免疫毒素を、ジスルフィド交換反応を使用して、又は、チオエーテル結合を形成することによって構築することができる。この目的のための好適な試薬の例には、イミノチオラート及びメチル−４−メルカプトブチルイミダート、ならびに、例えば、米国特許第４，６７６，９８０号に開示される試薬が含まれる。
【００８６】
エフェクター機能工学
本発明の抗体を、例えば、ガンを処置することにおける抗体の有効性を高めるように、エフェクター機能に関して改変することが望ましい場合がある。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入することができ、それにより、この領域における鎖間ジスルフィド結合の形成を可能することができる。このようにして作製されたホモダイマー抗体は、改善された内部移行能力、及び／又は、増大した補体媒介細胞殺傷及び抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を有することができる。Caron et al., J. Exp. Med., 176:1191-1195 (1992)、及び、Shopes, J. Immunol., 148:2918-2922 (1992)を参照のこと。強化された抗腫瘍活性を有するホモダイマー抗体もまた、Wolff et al. Cancer Research, 53:2560-2565 (1993)に記載されるようなヘテロ二官能基架橋剤を使用して調製することができる。代替として、二重のＦｃ領域を有し、それにより、強化された補体溶解能力及びＡＤＣＣ能力を有し得る抗体を設計することができる。Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989)を参照のこと。
【００８７】
免疫コンジュゲート
本発明はまた、細胞傷害性薬剤にコンジュゲートされた抗体を含む免疫コンジュゲートに関連する（例えば、化学療法剤にコンジュゲートされた抗体、トキシン（例えば、細菌、菌類、植物もしくは動物を起原とする酵素活性なトキシン又はそのフラグメント）にコンジュゲートされた抗体、又は、放射性同位体にコンジュゲートされた抗体（すなわち、放射性コンジュゲート）などを含む免疫コンジュゲート）。
【００８８】
そのような免疫コンジュゲートの作製において有用である化学療法剤が上記に記載されている。使用することができる酵素活性なトキシン及びそのフラグメントには、ジフテリアＡ鎖、ジフテリアトキシンの非結合性の活性なフラグメント、エキソトキシンＡ鎖（緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン（modeccine）Ａ鎖、α−サルシン（sarcin）、シナアブラギリ（Aleurites fordii）タンパク質、ダイアンシン（dianthin）タンパク質、アメリカヤマゴボウ（Phytolaca americana）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ（momordica charantia）阻害剤、クルシン（curcin）、クロチン、サパオナリア・オフィシナリス（sapaonaria officinalis）阻害剤、ゲロニン（gelonin）、ミトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン（restrictocin）、フェノマイシン（phenomycin）、エノマイシン（enomycin）及びトリコテセン類が含まれる。様々な放射性核種が放射性コンジュゲート化抗体の作製のために利用可能である。例には、212Ｂｉ、131Ｉ、131Ｉｎ、90Ｙ及び186Ｒｅが含まれる。抗体及び細胞傷害性薬剤の様々なコンジュゲートが、様々な二官能性のタンパク質カップリング剤を使用して、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミダートＨＣＬ）、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベラート）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアナート（例えば、トルエン２，６−ジイソシアナート(tolyene 2,6-diisocyanate)）、及び、ビス活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を使用して作製される。例えば、リシンの免疫毒素を、Vitetta et al., Science, 238:1098 (1987)に記載されるように調製することができる。炭素−１４で標識された１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）が、放射性ヌクレオチド（radionucleotide）を抗体にコンジュゲート化するための例示的なキレート化剤である。国際特許出願公開ＷＯ９４／１１０２６を参照のこと。
【００８９】
別の実施形態において、抗体を、腫瘍の予備標的化において利用するために「受容体」（例えば、ストレプトアビジン）にコンジュゲート化することができ、この場合、抗体−受容体のコンジュゲートが患者に投与され、その後、非結合のコンジュゲートが、除去剤を使用して循環から除かれ、その後、細胞傷害性薬剤（例えば、放射性ヌクレオチド）にコンジュゲート化されている「リガンド」（例えば、アビジン）が投与される。
【００９０】
抗体アイソタイプ
特定の状況のもとでは、１つのアイソタイプのモノクローナル抗体が、その診断効力又は治療効力に関して別のアイソタイプのモノクローナル抗体よりも好ましい場合があるかもしれない。例えば、抗体媒介の細胞溶解に関する研究から、γ−２ａ及びγ−３のアイソタイプの修飾されていないマウスモノクローナル抗体が一般には、標的細胞を溶解することにおいて、γ−１アイソタイプの抗体よりも効果的であることが知られている。この示差的な効力は、γ−２ａアイソタイプ及びγ−３アイソタイプが標的細胞の細胞溶解的破壊においてより積極的に関係することができるためであると考えられる。モノクローナル抗体の特定のアイソタイプを、クラススイッチ変化体を単離するために同胞（sib）選抜技術を使用することによって、異なるアイソタイプのモノクローナル抗体を分泌する親のハイブリドーマから二次的に調製することができる（Steplewski, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:8653, 1985;Spira, et al., J. Immunol. Methods, 74:307, 1984）。
【実施例】
【００９１】
実験の詳細
ヒトＣ５ａＲノックインマウスの作製
ノックアウト／ノックイン戦略を、マウスＣ５ａＲではなく、ヒトＣ５ａＲをマウスのＣ５ａＲ遺伝子プロモーターの制御下で発現するトランスジェニックマウスを構築するために採用した。標的化ベクターは、Ｃ５ａＲ遺伝子の第３エキソンの上流側の、マウスＣ５７ＢＬ／６のゲノムＤＮＡの３．５ｋｂ領域、ヒトＣ５ａＲ遺伝子の第３エキソンのコード配列、マウスＣ５ａＲ遺伝子の３’非翻訳領域、ｌｏｘＰ部位が隣接するホスホグルコキナーゼプロモーター及びネオマイシン抵抗性遺伝子、ならびに、Ｃ５ａＲ遺伝子の下流側のマウスゲノムＤＮＡの３ｋｂ領域をベクターｐＬＯｚ（Ｏｚｇｅｎｅ、Ｐｅｒｔｈ、オーストラリア）に含んでいた。ゲノムＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲ増幅を使用して作製した。ベクターをＣ５７ＢＬ／６の胚性幹細胞にトランスフェクションし、Ｇ４１８耐性コロニーからのＤＮＡをサザンブロットによってスクリーニングした。Ｘｂａ  Ｉ及びＥｃｏＲ  Ｖにより消化されたＤＮＡを、５’末端及び３’末端の両方での正しい相同的組換え事象を有するクローンを特定するために、５’プローブ及び３’プローブとそれぞれハイブリダイゼーションさせた。正しく標的化されたＥＳクローンが注入された胚盤胞から作製されたキメラ体をＣ５７ＢＬ／６のメスと交配した。ヒトＣ５ａＲ遺伝子の生殖細胞系列伝達をマウスの尾のゲノムＤＮＡのサザンブロットによって確認した。ヒトＣ５ａＲ遺伝子についてホモ接合のマウス（ｈＣ５Ｒ１+/+）を作製し、ＰＣＲ、サザンブロット及びＦＡＣＳ染色により、ｍＣ５ａＲの非存在を確認した。
【００９２】
好中球の単離
ヒト好中球を、改変を伴って以前の記載（Haslett et al. (1985)）のように健康な志願者の末梢静脈血から単離した。簡単に記載すると、ＥＤＴＡ被覆されたバキュテーナー（vacutainer）に採血された血液サンプルを４００ｘｇで１５分間遠心分離し、その後、血漿及び軟膜を除いた。３０分間の１％デキストランでの沈降の後、白血球を３００ｘｇでの５分間の遠心分離によってペレット化し、ＰＢＳにより洗浄した。その後、細胞を６５％パーコール（密度、１．０９３ｇ／ｍｌ；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）のクッションにおいて５００ｘｇで３０分間遠心分離した。遠心分離後、好中球をＰＢＳに再懸濁した。マウス好中球を、１０％のウシ胎児血清を伴う５ｍｌのＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）培地を強制的にシリンジにより骨の中に通すことによって両方の後足大腿骨から単離した。好中球をＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）での密度遠心分離によって分離した。赤血球を低張性緩衝液（１５５ｍＭ ＮＨ4Ｃｌ、１０ｍＭ ＫＨＣＯ3、１ｍＭ ＥＤＴＡ）によって溶解した。細胞の生存率をトリパンブルー排除によって求め、好中球のペレットをＰＢＳに再懸濁した。
【００９３】
モノクローナル抗体の作製
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、高レベルのｈＣ５ａＲを発現する約２×１０7個のＬ１．２トランスフェクタント（Campbell et al. (1996)）により、ｉ．ｐ．により２週間間隔で５回、次いで、ｉ．ｖ．により１回、免疫化した。ｉ．ｖ．免疫化後４日で、脾臓を取り出し、その細胞を、標準的な手順を使用してＳＰ２／０細胞株を融合した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ｈＣ５Ｒ１+/+マウスの大腿骨から単離された約１×１０7個の好中球により、類似した様式（２回のｉ．ｖ．免疫化、１回のｉ．ｐ．免疫化、及び、最後のｉ．ｖ．免疫化）で免疫化した。ハイブリドーマを、１０％のＦｅｔａｌｃｌｏｎｅ（ＨｙＣｌｏｎｅ）及びＨＡＴ補充物（ＳＩＧＭＡ）を含有するＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）で成長させ、培養上清を最初のスクリーニングのために採取した。選択された抗体の製造をスケールアップし、ｍＡｂをプロテインＡクロマトグラフィー又はプロテインＧクロマトグラフィーによって精製し、濃縮し、緩衝液交換し、エンドトキシンを除いた。ＭＡｂ濃度を、マウスＩｇＧ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒｏｃｈｅ）を使用して求めた。
【００９４】
フローサイトメトリー
トランスフェクションされた細胞又は白血球に対するｍＡｂの反応性を評価するために、本発明者らは間接的免疫蛍光染色及びフローサイトメトリーを使用した。細胞をＰＢＳにより１回洗浄し、２％のヒト血清及び０．１％のアジ化ナトリウムを含有する１００μｌのＰＢＳ（染色緩衝液）、精製された抗体を含有する１００μｌのＰＢＳ、又は、５０μｌのハイブリドーマ培養上清を含有する１００μｌのＰＢＳに再懸濁した。４℃で２０分後、細胞を染色緩衝液により２回洗浄し、染色緩衝液に１：２００で希釈された５０μｌのＦＩＴＣコンジュゲート化されているアフィニティー精製されたＦ（ａｂ’）2ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に再懸濁した。４℃で２０分間インキュベーションした後、細胞を染色緩衝液により２回洗浄し、表面発現のレベルを求めるためにＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析した。ヨウ化プロピジウム染色を、死細胞を排除するために使用した。
【００９５】
結合アッセイ
ヒト好中球を洗浄し、結合緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＣａＣｌ２、５ｍＭ ＭｇＣｌ２及び０．５％ＢＳＡ）に１×１０7個／ｍｌで再懸濁した。（１２０μｌの最終体積での）それぞれの結合反応のために、適切な量の抗ｈＣ５ａＲ  ｍＡｂ、アイソタイプ一致のコントロールｍＡｂ、又は、非標識のヒトＣ５ａ（ＳＩＧＭＡ）を伴う４０μｌの細胞懸濁物（４×１０5個の細胞）を室温で１５分間インキュベーションした。125Ｉ標識のヒトＣ５ａ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を０．４ｎＭの最終濃度で加え、反応液を室温で６０分間インキュベーションした。その後、細胞を集め、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する結合緩衝液により３回洗浄した。その後、細胞をＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ  ２０シンチレーション液とともにＯｐｔｉプレート（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）に移し、放射能をＴｏｐＣｏｕｎｔ（Ｐａｃｋａｒｄ）で計測した。それぞれのサンプルを三連でアッセイした。
【００９６】
カルシウム流束アッセイ
新たに単離されたヒト好中球に、以前の記載（Ponath et al. (1996)）のように、Ｆｌｕｏ−３ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を３７℃で３０分間負荷した。サンプルをＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターで処理し、直線的蛍光強度を経時的に測定した。
【００９７】
走化性アッセイ
走化性緩衝液（５０％のＭ１９９（ＳＩＧＭＡ）及び２％のウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）を含むＲＰＭＩ１６４０）に懸濁されたヒト好中球又はマウス好中球（１から２×１０5細胞／ウエル）を１２ウエルのトランスウエルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ  Ｃｏ．）の上部チャンバーに入れ、３μｍのフィルターを横断して、ヒトＣ５ａ又はマウスＣ５ａを含有する下部チャンバーの中に３０分間遊走させた。遊走した細胞の数を６０秒間の計測によってＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒで計数した。厳しい前方角散乱ゲート及び側方散乱ゲートを、破片又は無関係な細胞を排除するように設定した。
【００９８】
発現ベクターのＬ１．２細胞へのトランスフェクション
マウスＬ１．２細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）が補充されたＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ）で成長させ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者の説明書に従って使用してトランスフェクションした。
【００９９】
Ｋ／ＢｘＮリウマチ様関節炎モデル
血清を、以前の記載（Korganow et al. (1999)）のようにＫ／ＢｘＮ関節炎マウスから集めた。実験的関節炎を、１５０μｌの血清を０日目及び２日目にｉ．ｐ．注射することによってレシピエントマウスにおいて誘導し、疾患の進行を記載（Lee et al. (2002)）のようにモニターした。足首の厚さ及び臨床スコアを毎日求めた。臨床スコアを、４本の足についてのスコアの和を求めることによってそれぞれのマウスについて計算した：０−正常、１−軽度の赤み、２−赤い多少の腫れ、３−赤い大きな腫れ。抗ｈＣ５ａＲ  ｍＡｂ又はアイソタイプコントロールｍＡｂ（ＰＢＳにおいて１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ）を、−１日目及び１日目に（予防的処置）、又は、５日目に（治療的処置）、ｉ．ｐ．注射した。１０日目に、マウスを屠殺し、足を組織学のために集めた。足を固定液（１０％リン酸塩緩衝化ホルマリン）において４８時間、固定処理し、１０％ギ酸／固定液による５日間の処理によって脱灰した。その後、サンプルをＰＢＳにより洗浄し、パラフィンに包埋した。厚さ５μｍの切片をＨ＆Ｅにより染色した。
【０１００】
統計学的分析
ＫｘＢ／Ｎモデルにおける独立したコントロール群と、処置群との間における違いの統計学的有意性を、クラスカル・ウォリス検定を使用して求め、その後、ダン多重比較検定による事後分析を行った。
【０１０１】
実施例１：トランスフェクションされたＬ１．２細胞を使用する、Ｃ５ａＲに対するｍＡｂの作製（比較例）
本発明者らは、最初に化学誘引物質受容体についての公知の方法（Heath et al. (1997)；Qin et al. (1998)；Wu et al. (1997)；Qin et al. (1996)）を使用することによって、ｈＣ５ａＲに対するｍＡｂを産生させた。マウスを、非常に高いレベルのｈＣ５ａＲ（細胞あたり約８０，０００個の受容体）を発現するＬ１．２細胞（マウスＢ細胞リンパ腫系統）により免疫化した。５回の融合を行い、ｈＣ５ａＲトランスフェクタントと特異的に反応し、しかし、他の近縁の化学誘引物質受容体、例えば、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２など、又は、他のＣ５ａ結合受容体であるＣ５Ｌ２（Gerard et al. (2005)）を発現するトランスフェクタントとは反応しなかった、４０を越える異なるｍＡｂを特定した。これらのｍＡｂのいくつかが、125Ｉ標識されたヒトＣ５ａの、ｈＣ５ａＲトランスフェクタントへの結合を阻害した。特定された先導的ｍＡｂの７Ｆ３はＣ５ａ結合の強力な阻害を示し（図１）、走化性アッセイにおいてＣ５ａへのヒト好中球の走化性を阻害し、また、ヒト好中球におけるＣ５ａ誘導のカルシウム流束を阻止した（データは示されず）。
【０１０２】
実施例２：ｈＣ５ａＲノックインマウス由来の好中球を使用する、Ｃ５ａＲに対するｍＡｂの作製
強力な抗Ｃ５ａＲ  ｍＡｂを開発するための第２の取り組みにおいて、ヒトＣ５ａＲのノックインマウスを、マウスＣ５ａＲ遺伝子（Ｃ５Ｒ１）での標的化された相同的組換えによって作製した。同時での、内因性Ｃ５ａＲコード配列の欠失及びｈＣ５ａＲコード配列によるその置換を、マウスの胚性幹（ＥＳ）細胞を標的化構築物（図２）によりトランスフェクションすることによって達成した。スクリーニングされた６７２個のうちの２つのＥＳクローンを、正しく標的化されたｈＣ５ａＲ配列を含有するとして特定した。ｈＣ５ａＲ導入遺伝子の生殖細胞系列伝達が達成され、５匹のキメラマウスがこれらのＥＳ細胞から作製され、このようにして、ｈＣ５ａＲノックイン系統を樹立した。ｌｏｘＰ部位が両側に接するＰＧＫ−ｎｅｏ遺伝子を、ＢＬ／６のＣｒｅ欠失体系統を使用してノックイン遺伝子座から欠失した。ヒトＣ５ａＲ遺伝子についてホモ接合のマウス（ｈＣ５Ｒ１+/+）をサザンブロットによって特定した（図３）。これらのマウスから得られた好中球は、抗Ｃ５ａＲ  ｍＡｂによるＦＡＣＳ染色によって判断されるように、非常に高いレベルのｈＣ５ａＲを発現することが示された（図４）。野生型マウスから得られた好中球は抗ヒトＣ５ａＲ  ｍＡｂの７Ｆ３によって染色されず、抗マウスＣ５ａＲ  ｍＡｂの２０／７０によって強く染色された（Soruri et al. (2003)）（図４）。ヒトＣ５ａＲ及びマウスＣ５ａＲは６５％の相同性をともに有するだけであるが、ｈＣ５ａＲノックインマウスを開発するために重要なことではあるが、マウスＣ５ａ及びヒトＣ５ａは、類似する親和性でヒトＣ５ａＲに結合する（Gerard et al. (1992)）（及び本発明者らの未発表の観測結果）。ｈＣ５Ｒ１+/+マウスから得られた好中球は、類似する様式でヒトＣ５ａ及びマウスＣ５ａの両方に遊走した。
【０１０３】
１つの融合体から、本発明者らは数多くのｈＣ５ａＲ特異的ｍＡｂを作製した。リガンド結合アッセイにより、これらのｍＡｂの多くが、ｍＡｂの７Ｆ３よりも優れた、125Ｉ標識されたＣ５ａのヒト好中球への結合の阻害を示したことが明らかにされた。ｈＣ５Ｒ１+/+マウスの好中球から作製された抗体は、ｍＡｂクローンに依存して、実質的に完全な阻害から（例えば、３Ｃ５、８Ｇ７、７Ｈ３）、部分的阻害又はほとんど非阻害にまで及ぶ幅広いスペクトルの125Ｉ−Ｃ５ａ結合阻害を示した（図５）。最も強力な阻害剤のｍＡｂ  ３Ｃ５は、５０３ｐＭの、ｍＡｂ  ７Ｆ３についてのＩＣ５０との比較で、１７１ｐＭのＩＣ50を有していた（図６）。ｈＣ５Ｒ１+/+マウスから得られた好中球による野生型マウスの免疫化によって作製された抗Ｃ５ａＲ  ｍＡｂは、重鎖可変領域のアミノ酸配列がすべて異なっていたという点で、すべて異なっていた。このことは、これらの抗Ｃ５ａＲ  ｍＡｂが別個のクローンに由来したことを示している。数多くの高品質かつ高親和性の抗Ｃ５ａＲ  ｍＡｂの作製により、本発明者らは、ヒト白血球におけるＣ５ａＲ発現を正確に評価することが可能になった。Ｃ５ａＲが、好中球、好酸球、好塩基球及び単球によって高いレベルで発現され、ナイーブな記憶Ｔ細胞又はエフェクターＴ細胞のすべてのサブセット、ならびに、ほとんどのＢ細胞では非存在であった（図７）。
【０１０４】
実施例３：マウスのリウマチ様関節炎モデルにおける抗ｈＣ５ａＲ  ｍＡｂの試験
ヒトの様々な分子を発現するトランスジェニックマウスの開発は、ヒトにおける使用のために設計された新しいヒト治療剤を適切な動物モデルで試験するための好都合な手段である。Ｃ５ａＲは、マウスにおける炎症性関節炎の病理発生において不可欠な役割を果たす。例えば、Ｃ５ａＲ欠損マウスは、抗グルコース６−リン酸イソメラーゼ自己抗体（Ji et al. (2002)）又はＩＩ型コラーゲンｍＡｂ（Grant et al. (2002)）のいずれかにより誘導される関節炎から保護される。抗ｈＣ５ａＲ  ｍＡｂを、ｈＣ５Ｒ１+/+マウスにおける実験的関節炎の進行を保護又は逆戻りさせるその能力について試験した。関節炎Ｋ／ＢｘＮマウスから健康なマウスへの血清の移入により、Ｋ／ＢｎＸ疾患を模倣する関節特異的な炎症性反応が誘導される（Kouskoff et al. (1996)；Korganow et al. (1999)）。ｈＣ５Ｒ１+/+マウスを−１日目及び１日目に抗ｈＣ５ａＲ  ｍＡｂ又はアイソタイプ一致のコントロールｍＡｂのいずれかにより前処理し、Ｋ／ＢｘＮの血清を０日目及び２日目に腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。血清移入後、コントロール抗体により処置されたマウスは、関節腫大及び炎症性浸潤物を伴う典型的な臨床的関節炎を示し、これに対して、抗ｈＣ５ａＲ  ｍＡｂにより処置されたマウスは、臨床的又は組織学的に、炎症の完全な非存在を示した。認め得る違いが、疾患の発生において、ｈＣ５Ｒ１+/+マウスと、コントロールの同腹子との間には何らなかった（データは示されず）。このことは、ＫｘＢ／Ｎモデルにおける疾患はＣ５ａＲに依存している（Ji et al. (2002)；Grant et al. (2002)）ので、ヒトＣ５ａＲが完全に機能的であったことを示している。より重要なことは、抗体が疾患誘導後５日で投与されたとき、本発明者らは、確立された炎症の著しい逆戻りを認めた。ｈＣ５ａＲを発現するマウス好中球に対して惹起されたｍＡｂ（３Ｃ５及び８Ｇ７）の効果が、ｍＡｂの７Ｆ３よりも長く続いた。１ｍｇ／ｋｇもの少量のｍＡｂ  ３Ｃ５は炎症を逆戻りさせることができ、また、持続した阻害を提供することができた。
【０１０５】
考察
ｈＣ５ａＲノックインマウスが利用できることにより、本発明者らは、非常に高い親和性の抗ｈＣ５ａＲ  ｍＡｂを作製することが可能となった。このことはおそらくは、ｈＣ５Ｒ１+/+マウスの好中球の表面に高密度で発現されるヒトＣ５ａＲに対する非常に集中した免疫応答に関する。好中球が、細胞あたり２００，０００個までの非常に高いレベルのＣ５ａＲを発現し（Gerard & Gerard (1994a)）、これに対して、Ｌ１．２のＣ５ａＲトランスフェクタントは約８０，０００個の受容体を発現し、また、好中球よりも２倍から３倍大きい。従って、初代マウス好中球において達成され得るＣ５ａＲ発現のこのはるかにより大きい密度は重要な要因であり得る。好中球の表面に発現される抗原が、好中球の抗原提示機能のために、あるいは、細胞−細胞の相互作用又は遊走についてのその能力のために、より良好な応答を誘起することもまた考えられる。有効性が十分に確認されているヒト分子を発現するトランスジェニックマウスの開発は、最終的にはヒトにおける使用のために設計される新しい治療剤を試験するための好都合な手段であることが判明した。本発明者らの研究において、抗ｈＣ５ａＲ  ｍＡｂは安全であり、また、炎症性関節炎を処置するために驚くほど強力かつ効果的であった。ノックインマウスを作製する比較的低いコスト、ならびに、安全性及び効力の研究におけるその潜在的な使用は、そのようなマウスが前臨床開発のための標準的なツールになり得ることを示唆する。本研究からの他の重要な結果が、関節炎の炎症プロセスを完全に逆戻りさせることができたｍＡｂの開発であった。実際、本発明者らは、抗Ｃ５ａＲ  ｍＡｂによる処置により本発明者らが認めた程度に、これらのモデルにおいて関節炎をそのように完全に防止又は逆戻りさせる何らかの他の処置を知らない。加えて、抗Ｃ５ａＲ  ｍＡｂはこの効果を比較的低い用量（１ｍｇ／ｋｇ）で示した。この用量は、関節炎をマウスにおいて阻害するために使用される抗Ｃ５抗体の用量（約４０ｍｇ／ｋｇ、又は、マウスあたり１ｍｇ）よりもかなり少ない（Ji et al. (2002)；Wang et al. (1995)）。このことの１つの理由は、通常の場合に血液及び組織液に存在するＣ５の濃度が高いこと（約１８０ｕｇ／ｍｌ）に関し得る。加えて、本発明者らのｍＡｂはＣ５ａＲを認識するが、Ｃ５ａが結合したときに阻害シグナルをもたらす第２のＣ５ａ結合受容体のＣ５Ｌ２を認識しない（Gerard et al. (2005)）。従って、炎症性応答の抗Ｃ５ａＲ  ｍＡｂによるいくらかの阻害が、Ｃ５ａがＣ５Ｌ２に途切れなく結合することから生じ得る。まとめると、ｈＣ５ａＲノックインマウスは、ヒトＣ５ａＲに対する高親和性のｍＡｂを作製するための、また、これらの抗体の効能を、ヒトにおける使用のための治療剤を開発する前に疾患のマウスモデルにおいて確認するための非常に強力な手段を提供した。Ｃ５ａＲについて本明細書に記載される方法は一般に、他の重要な治療標的に対して適用可能である。
【０１０６】
数多くの変化及び／又は改変が、幅広く記載されるような本発明の精神又は範囲から逸脱することなく、具体的な実施形態において示されるような本発明に対して行われ得ることが当業者によって理解される。従って、本発明の実施形態は、すべての点において、限定的ではなく、例示的であるとして見なされなければならない。
【０１０７】
文献
【表１】
2010501165.tif 000002
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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