(57)【要約】ワクシニアウイルスB5R表面抗原に対するヒト化モノクローナル抗体。前記抗体は、天然痘感染の治療に有効である。そのような抗体の重鎖および軽鎖をコードする核酸およびそれらを発現する細胞についても開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体がＢ５Ｒ抗原に結合する、Ｂ５Ｒ抗原に対する抗原結合ドメインを含むヒト化モノクローナル抗体。
【請求項２】
ワクシニアウイルスに感染した患者に投与すると、前記抗体が感染の進行を遅くする、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
前記抗体は、２個以下の単一アミノ酸が異なっていてもよい配列番号１に一致する第一の重鎖ＣＤＲ配列、４個以下の単一アミノ酸が異なっていてもよい配列番号２に一致する第二の重鎖ＣＤＲ配列、および４個以下の単一アミノ酸が異なっていてもよい配列番号３に一致する第三の重鎖ＣＤＲ配列；ならびに４個以下の単一アミノ酸が異なっていてもよい配列番号４に一致する第一の軽鎖ＣＤＲ配列、３個以下の単一アミノ酸が異なっていてもよい配列番号５に一致する第二の軽鎖ＣＤＲ配列、および３個以下の単一アミノ酸が異なっていてもよい配列番号６に一致する第三の軽鎖ＣＤＲ配列を含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
前記抗体は単一のポリペプチドから構成される、請求項３に記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
前記第一の重鎖ＣＤＲ配列は、配列番号１と一致し、前記第二の重鎖ＣＤＲ配列は、配列番号２と一致し、そして前記第三の重鎖ＣＤＲ配列は、配列番号３と一致し；前記第一の軽鎖ＣＤＲ配列は、配列番号４と一致し、前記第二の軽鎖ＣＤＲ配列は、配列番号５と一致し、そして前記第三の軽鎖ＣＤＲ配列は、配列番号６と一致する、請求項３に記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
前記抗体は単一のポリペプチドから構成される、請求項５に記載のモノクローナル抗体。
【請求項７】
前記抗体は、ＡＴＣＣ寄託指定ＰＴＡ−７５９４のセルラインによって産生されるモノクローナル抗体と同じエピトープ特異性を有する、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項８】
前記抗体は、ＡＴＣＣ寄託指定ＰＴＡ−７５９４のセルラインによって産生される、請求項７に記載のモノクローナル抗体。
【請求項９】
前記抗体は単一のポリペプチドから構成される、請求項７に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１０】
２個以下の単一アミノ酸が異なっていてもよい配列番号１に一致する第一のＣＤＲ配列、４個以下の単一アミノ酸が異なっていてもよい配列番号２に一致する第二のＣＤＲ配列、および４個以下の単一アミノ酸が異なっていてもよい配列番号３に一致する第三のＣＤＲ配列を含む、ヒト化免疫グロブリン重鎖可変領域を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単離核酸。
【請求項１１】
前記第一のＣＤＲ配列は、配列番号１と一致し、前記第二のＣＤＲ配列は、配列番号２と一致し、そして前記第三のＣＤＲ配列は、配列番号３と一致する、請求項１０に記載の核酸。
【請求項１２】
前記コードされる核酸配列は、配列番号７を含む、請求項１１に記載の核酸。
【請求項１３】
４個以下の単一アミノ酸が異なっていてもよい配列番号４に一致する第一のＣＤＲ配列、３個以下の単一アミノ酸が異なっていてもよい配列番号５に一致する第二のＣＤＲ配列、および３個以下の単一アミノ酸が異なっていてもよい配列番号６に一致する第三のＣＤＲ配列を含む、ヒト化免疫グロブリン軽鎖可変領域を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単離核酸。
【請求項１４】
前記第一のＣＤＲ配列は、配列番号４と一致し、前記第二のＣＤＲ配列は、配列番号５と一致し、そして前記第三のＣＤＲ配列は、配列番号６と一致する、請求項１３に記載の核酸。
【請求項１５】
前記ポリペプチドは、配列番号８を含む、請求項１３に記載の核酸。
【請求項１６】
請求項１に記載のモノクローナル抗体を含む、培養細胞。
【請求項１７】
請求項３に記載のモノクローナル抗体を含む、培養細胞。
【請求項１８】
請求項１１に記載の核酸を含む、培養細胞。
【請求項１９】
請求項１３に記載の核酸を含む、培養細胞。
【請求項２０】
２個以下の単一アミノ酸が異なっていてもよい配列番号１に一致する第一のＣＤＲ配列、４個以下の単一アミノ酸が異なっていてもよい配列番号２に一致する第二のＣＤＲ配列、および４個以下の単一アミノ酸が異なっていてもよい配列番号３に一致する第三のＣＤＲ配列を含むヒト化免疫グロブリン重鎖可変領域を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単離核酸をさらに含む、請求項１９に記載の培養細胞。
【請求項２１】
請求項１に記載の抗体の効果的な量を必要とする患者に投与することを含む、天然痘感染の患者を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本発明は、２００６年８月２３日に出願された米国仮出願第６０／８３９，５７９号に対して優先権を主張するものであり、その内容は全体として参照によって引用される。
【背景技術】
【０００２】
天然痘は重篤であり、感染性が高く、そしてポックスウイルス・ファミリーである天然痘ウイルスによって引き起こされる時には致死的な感染病である。天然痘の大発生は何千年もの間しばしば起こってきたが、世界的なワクチン接種計画が成功した後、１９７７年ころに天然痘は効果的に根絶した。
【０００３】
天然痘が根絶した後、もはや予防の必要がなくなったため、公衆に対する定期的な天然痘のワクチン接種はストップした。したがって、現在の多くの人が天然痘に対して免疫性を持っていない。結果として、バイオテロリストの天然痘ウイルス攻撃は壊滅的になるであろう。重要なことは、そのような攻撃が起きた場合、ワクチン接種ではあまりに遅く、標的となった人々における天然痘の急速な広がりを効果的に阻止することはできない。それ故、即効性があり、効果的な天然痘感染の治療用組成物が求められている。
【発明の概要】
【０００４】
要約
本発明は、天然痘ウイルスの近縁種であるポックスウイルスファミリーの一つであるワクシニアウイルスのＢ５Ｒ抗原に対するヒト化モノクローナル抗体が天然痘感染を無効化するのに有効であるという予期せぬ発見に部分的には基づいている。
【０００５】
したがって、本発明の一態様は、Ｂ５Ｒ抗原に対する抗原結合ドメインを含むヒト化モノクローナル抗体に関する。そのようなヒト化モノクローナル抗体（ｈＢ５ＲｍＡｂ）は、ワクシニアウイルス感染に罹患した患者に投与すると、ワクシニアウイルス感染の進行を遅くすることができる。それは、ＥＭ−１０００ハイブリドーマセルライン（ＡＴＣＣ  Ｄｅｐｏｓｉｔ  Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ  ＰＴＡ−７５９４）によって産生されたモノクローナル抗体と同じエピトープ特異性を持つことができる。ヒト化抗体は、２個以下の単一アミノ酸が異なっていてもよい配列番号１（下記に示す）に一致する第一の重鎖相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲ）配列、４個以下の単一アミノ酸が異なっていてもよい配列番号２（下記に示す）に一致する第二の重鎖ＣＤＲ配列、および４個以下の単一アミノ酸が異なっていてもよい配列番号３（下記に示す）に一致する第三の重鎖ＣＤＲ配列；ならびに４個以下の単一アミノ酸が異なっていてもよい配列番号４（下記に示す）に一致する第一の軽鎖ＣＤＲ配列、３個以下の単一アミノ酸が異なっていてもよい配列番号５（下記に示す）に一致する第二の軽鎖ＣＤＲ配列、および３個以下の単一アミノ酸が異なっていてもよい配列番号６（下記に示す）に一致する第三の軽鎖ＣＤＲ配列を含むことができる。ヒト化抗体は、上述の重鎖および軽鎖ＣＤＲ配列を含む単一ポリペプチドから構成されていてもよい。
【０００６】
本発明の他の態様は、上述の抗体を含む培養細胞に関する。
【０００７】
本発明のさらに他の態様は、上述の重鎖または軽鎖ＣＤＲ配列を含むヒト化重鎖可変領域配列を含むポリペプチドをコードする単離された核酸に関する。
【０００８】
本発明のさらなる他の態様は、該核酸の一つを含む培養細胞に関する。
【０００９】
本発明の他の特徴または利点は、下記の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであろう。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
下記に述べるのは、天然痘ウイルスの検出および該ウイルスの宿主細胞に感染する能力を阻害することに有用である、ワクシニアウイルスＢ５Ｒ抗原に対するドナー（例えば、ラットまたはマウス）モノクローナル抗体由来の新規なヒト化モノクローナル抗体（ｈＢ５ＲｍＡｂ）である。ヒトへの治療剤としてげっ歯類のモノクローナル抗体を投与すると、有害な免疫反応を起こす可能性がある。本発明のヒト化モノクローナル抗体はこの免疫反応を引き起こさず、したがって、治療薬または予防薬として有用でありうる。
【００１１】
本明細書において用いられる場合、「モノクローナル抗体」なる語は、免疫グロブリン重鎖または軽鎖可変領域を含むポリペプチドを指す。そのようなポリペプチドとしては、例えば、二価抗体、一価抗体、一本鎖抗体（すなわち重鎖および軽鎖可変領域を含む単一ポリペプチド）、Ｆａｂフラグメント、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、ミニボディー（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）、および免疫グロブリンと関連のない、または相同性が低い（すなわち６０％未満）アミノ酸配列へのこれらの融合体が挙げられる。
【００１２】
「ヒト化モノクローナル抗体」なる語は、前述のポリペプチドのどれも指し、該ポリペプチドにおいては、可変領域骨格配列（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の少なくとも一つが、例えば、ヒト免疫グロブリンファージディスプレイライブラリーから単離された抗体のような、ヒトの骨格配列に近い、または一致している。
【００１３】
本明細書で述べられているｈＢ５ＲｍＡｂによって認識されるＢ５Ｒタンパク質の配列（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＣＡＡ４６４９６）を以下に示す：
【００１４】
【表１】
2010507362.tif 000002
【００１５】
Ｂ５Ｒ抗原に対する親抗体（ｐａｒｅｎｔａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）またはヒト化抗体の親和性測定に有用なアッセイは本分野においてよく知られている。例えば、Ａｚｉｍｚａｄｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４１（２）：１９９−２０８（１９９１）；およびＯｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１７（５）：４７１−７（１９９８）参照。ｈＢ５ＲｍＡｂは、下記のＥＭ−１０００ハイブリドーマによって産生される抗体と同じＢ５Ｒ抗原エピトープ特異性を有することができる。エピトープマッピングの方法は、十分に確立されており、例えば、Ｓｔｅｉｎｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７８（１７）：９０３０−４０（２００４）で説明されているように、容易に行うことができる。
【００１６】
本明細書で記載されるｈＢ５ＲｍＡｂは、Ｂ５Ｒ抗原に対するドナー（例えば、マウスまたはラット）モノクローナル抗体由来の、下記の第一、第二および第三の重鎖相補性決定領域（Ｈ−ＣＤＲ  １−３）を有することができる：
【００１７】
【表２】
2010507362.tif 000003
【００１８】
ｈＢ５ＲｍＡｂは、下記の第一、第二および第三の軽鎖相補性決定領域（Ｌ−ＣＤＲ  １−３）を有することができる：
【００１９】
【表３】
2010507362.tif 000004
【００２０】
上記要約部で指摘したように、本明細書で記載されるｈＢ５ＲｍＡｂ中の各ＣＤＲ配列は、上記列挙した配列番号１〜６について、いくつかのアミノ酸の相違を含んでいてもよい。
【００２１】
【表４】
2010507362.tif 000005
【００２２】
相違には、アミノ酸置換、欠失、挿入および付加が含まれうる。相違がアミノ酸置換である場合には、保存アミノ酸置換であることが好ましい。保存アミノ酸置換とは、あるアミノ酸が類似の化学的特性を有する別のアミノ酸によって置換されることを言う。
【００２３】
表１に、遺伝的にコードされた２０のアミノ酸が化学的特性にしたがってどのようにグループ化されうるかを示す。
【００２４】
【表５】
2010507362.tif 000006
【００２５】
前述の変異を導入する技術は、本分野においてよく知られている（例えば、部位特異的突然変異誘発法、エラープローンＰＣＲ、およびエラープローン宿主細胞中の複製配列）。上述のタイプの変異のいずれかを含むｈＢ５ＲｍＡｂのＢ５Ｒへの結合能力は、一般的に用いられている技術、例えば、ＥＬＩＳＡまたはファージ提示法によって、非常に効率的に試験することができる。これらのアッセイのハイスループット版は本分野で知られており、過度の努力なしにさらに高い抗原親和性を有するｈＢ５ＲｍＡｂを単離するために変異技術と組み合わせて用いることができる。例えば、米国特許第６，９１６，４７４号参照。
【００２６】
ｈＢ５ＲｍＡｂの可変領域として、抗原結合領域が由来するドナー抗体のクラスまたはタイプを考慮して、どんなヒトアクセプター可変領域フレームーク配列も用いることができる。ヒトアクセプター可変領域フレームーク配列もまたコンセンサス配列であり、すなわち、自然発生的な配列に基づいて生成したものである。用いられるヒトアクセプターフレームークのタイプは、ドナー抗体と同じ、または類似のクラスまたはタイプであることが好ましい。好適には、ヒトグループＩＩＩγ生殖細胞系フレームワークが合成重鎖用に用いられ、ヒトグループＩκ生殖細胞系フレームワークが合成軽鎖用に用いられる。ｈＢ５ＲｍＡｂの重鎖および軽鎖は、各々、ドナー可変領域フレームワーク配列から約１５残基まで含むことができる。ｈＢ５ＲｍＡｂフレームワーク領域配列内にドナー可変領域フレームワーク残基を含有することにより、抗原に対する抗体の親和性を増大させることができる。適切なドナーフレームワーク残基を選択する方法は、例えば、米国特許第５，９９８，５８６号および６，０５６，９５７号に記載されている。
【００２７】
本明細書に記載されたｈＢ５ＲｍＡｂの定常領域ドメインは、所望の提案された抗体の機能、特にエフェクター機能を考慮して選択される。例えば、定常領域ドメインは、ヒトＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭドメインでありうる。ｈＢ５ＲｍＡｂが治療用途を目的とし、抗体エフェクター機能が求められる場合には、特にＩｇＧヒト定常領域ドメイン、とりわけＩｇＧｌおよびＩｇＧ３アイソタイプのヒト定常領域ドメインを用いることができる。特定のエフェクター機能を変えるために１以上のアミノ酸残基が改変された、または削除された、改良されたヒト定常領域ドメインをまた用いてもよい。
【００２８】
本明細書で記載されたｈＢ５ＲｍＡｂは、付加されたエフェクターまたはレポーター分子（例えば、融合ポリペプチドとして）を有していてもよい。あるいは、重鎖または軽鎖の定常領域のアミノ酸配列が、機能的な非免疫グロブリンポリペプチド、例えば、アフィニティー標識、蛍光タンパク質、酵素、または毒素分子をコードするアミノ酸配列で置き換えられていてもよい。したがって、抗体分子の残余は、免疫グロブリン由来の配列のみから構成される必要はない。
【００２９】
本発明のさらなる実施態様は、ｈＢ５ＲｍＡｂを構成するヒト化重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡ配列を含む。該ＤＮＡ配列を含むクローニングおよび発現ベクター、ＤＮＡ配列で形質転換されたホストセル、および形質転換されたホストセル中でＤＮＡ配列を発現することを含む、抗体分子を製造するプロセスもまた、本発明の他の実施態様である。ベクターを構築する一般的方法、トランスフェクション方法および培養方法は、本分野でよく知られており、過度の努力を要することなく容易に行うことができる。抗−Ｂ５Ｒドナーアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列は、例えば国際特許出願ＷＯ  ９３／１６１８４中で説明されているように、公知の方法で容易に得ることができる。例えば、抗−Ｂ５Ｒコード配列は、適切なハイブリドーマセルラインから遺伝子クローニングまたはｃＤＮＡクローニングによって得ることができる。陽性クローンは、所望の重鎖および軽鎖に対する適切なプローブを用いてスクリーニングされうる。
【００３０】
ヒトアクセプターアミノ酸配列は、標準的などんな方法によっても得ることができる。例えば、ヒトグループＩ軽鎖およびヒトグループＩＩＩ重鎖のようなヒトアクセプターフレームワークをコードするＤＮＡ配列が知られ、本分野に従事しているものにとって広く用いられている。
【００３１】
標準的な分子生物学手法が、所望のＤＮＡ配列を準備するために用いられうる。配列は、オリゴヌクレオチド合成技術を用いて、全部または一部を合成することができる。必要に応じて、部位特異的突然変異誘発法およびＰＣＲ技術を用いてもよい。例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，３２１，５２２（１９８６）に記載されているような、オリゴヌクレオチド直接合成法を用いることができる。Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９，１５３４−１５３６（１９８８）によって述べられているように、あらかじめ存在する可変領域のオリゴヌクレオチド定方向突然変異誘発をまた用いてもよい。さらに、Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ  ＵＳＡ，８６，１００２９−１００３３（１９８９）およびＷＯ９０／０７８６１に記載のＴ４  ＤＮＡポリメラーゼを用いたギャップ形成されたオリゴヌクレオチド（ｇａｐｐｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）の酵素的埋まり（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｆｉｌｌｉｎｇ−ｉｎ）を用いてもよい。
【００３２】
核酸は、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ（ａｔ  ｓｉｇｍａ−ｇｅｎｏｓｙｓ．ｃｏｍ／ｏｌｉｇｏ．ａｓｐ）；Ｔｈｅ  Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ（ｍｃｒｃ＠ｏｌｉｇｏｓ．ｃｏｍ）、Ｔｈｅ  Ｇｒｅａｔ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ（ａｔ  ｇｅｎｃｏ．ｃｏｍ）、ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ  Ｉｎｃ．（ａｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｇｅｎ．ｃｏｍ）、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ（アラメダ、カリフォルニア州）、その他のような種々の商業的供給源から注文することもできる。
【００３３】
いかなる適切なホストセルおよびベクターシステムもｈＢ５ＲｍＡｂ重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡ配列の発現に用いられうる。好ましくは、真核性（例えば、哺乳類）の宿主細胞発現系が用いられる。とりわけ、好適な哺乳類宿主細胞としては、ＣＨＯ細胞およびミエローマまたはハイブリドーマセルラインが挙げられる。
【００３４】
一実施形態として、ハイブリドーマラインＥＭ−１０００によってｈＢ５ＲｍＡｂは分泌される。出願人は、ブタペスト条約にしたがって、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣ）、マナッサス、バージニア州２０１１０−２２０９，米国にＥＭ−１０００ハイブリドーマセルライン（ＡＴＣＣ寄託指定（Ｄｅｐｏｓｉｔ  Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ）  ＰＴＡ−７５９４）を寄託した。寄託されたハイブリドーマラインは、本願の出願前から、ＥＭＡＢ  ＬＬＣ，３  Ｈｕｎｔ  Ｒｏａｄ，レキシントン，マサチューセッツ州０２４２１によって維持されている同じ寄託から引き継がれていた。
【００３５】
ハイブリドーマの寄託は、ＡＴＣＣ寄託機関において、３０年間または直近のリクエストから５年間の期間、あるいは、特許権が有効である期間のいずれか長い方の期間、制限なく維持され、その期間の間で寄託が持続できない場合には、寄託は置き換われるだろう。
【００３６】
上述のｈＢ５ＲｍＡｂは、予防または治療用の薬剤組成物中に含まれうる。例えば、薬剤組成物は、ｈＢ５ＲｍＡｂの有効量および薬剤的に許容されるキャリアーを含むことができる。一般的には、有効量は、循環している天然痘またはワクシニアウイルスに定量的に結合するために、または感染患者中の感染の進行を遅らせるために十分なｈＢ５ＲｍＡｂの循環濃度であろう。それにもかかわらず、当業者によって認識されているように、感染の重篤性、診療の段階、患者の総体的な健康または年齢、以前に行われた治療、投与経路、賦形剤の使用、および他の予防または治療療法の併用の可能性によって、有効量は変化しうる。
【００３７】
上述の抗体の有効量を必要とする患者に対する投与による、患者の天然痘感染の治療方法もまた本発明の範囲内である。治療されるべき患者は、天然痘感染に関連する状態である、または天然痘感染に関連する状態となる危険性があると確認されうる。「治療」という用語は、疾患、疾患の徴候、疾患に続く病態、または疾患傾向を治癒、軽減、緩和、治療、または改善することを目的として、患者に対して組成物を投与することを指す。「有効量」とは、治療患者に医学上の望ましい結果をもたらすことができる組成物の量である。
【００３８】
本発明の方法を実行するために、ｈＢ５ＲｍＡｂ含有組成物を、非経口経路で全身投与することができる。投与の際、治療組成物は、好ましくは、発熱物質フリー、非経口で許容される水溶液の形態である。そのような非経口で許容されるタンパク質溶液の準備は、ｐＨ、等張性、安定性などを十分考慮して、本分野の技術内である。非経口で許容される賦形剤の中で、用いられうる溶媒はマンニトール、水、リンガー溶液、および生理食塩液である。
【００３９】
必要に応じ、ｈＢ５ＲｍＡｂを、ある期間にわたって持続的に投与することができる。持続的に組成物を注入し、徐々にその全身濃度を維持する方法は、本分野において公知である。例えば、本明細書で述べられている組成物は浸透ミニポンプまたは他の持続放出装置から放出され、また運搬されることができる。簡単な浸透ミニポンプからの放出速度は、放出開口部中に配置された細孔の、高速応答ゲルで調節することができる。浸透ミニポンプは、長期間（例えば、１時間から１週間）にわたり、組成物の放出を制御することに有用である。かようなミニポンプは、他の持続型放出装置と同様、例えば、ＤＵＲＥＣＴ社（クパチーノ、カルフォルニア州）から市販されている。活性配合もまた、直腸投与用の座薬形態で投与可能である。
【００４０】
下記の特定の実施例は、単に説明のために用いられ、いかなる形態であれ開示の残りの制限ではないと解釈されるべきである。さらに詳述することなく、本明細書の記載に基づいて、当業者は本発明を最大限の範囲まで利用することができると確信する。本明細書で引用される全ての文献は、本明細書に全体として参照により組み込まれる。
【実施例】
【００４１】
抗−ＢＲ５モノクローナル抗体による、インビボでのワクシニアウイルスの中和
ワクシニアウイルスウイルスエンベロープタンパク質Ｂ５Ｒに対するラットハイブリドーマ抗−ＢＲ５をＤＭＥＭ中で増やした（Ｓｃｈｍｅｌｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．，６８（ｌ）：１３０−１４７（１９９４）；ａｎｄ  Ｇａｌｍｉｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２５４（ｌ）：７１−８０（１９９９））。モノクローナル抗体は、プロテインＧセファロースで精製した。
【００４２】
６〜８週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（グループあたり３）を、ワクシニアウイルスの一群を形成する１０７斑を鼻腔内に感染させた。５時間後、抗−ＢＲ５モノムローナル抗体または前免疫ラットＩｇＧ（ＰＩ）の１０または３０μｇを腹腔内に注入した。次いで、マウスの体重を１２日間、１日おきに測定した。対応のない片側ｔ検定（ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｏｎｅ−ｓｉｄｅｄ  ｔ  ｔｅｓｔ）により、各投与量で抗−ＢＲ５およびＰＩ動物間で結果を比較した。
【００４３】
コントロール動物において、体重の落ちは、２日目で観察され、６日目にピークとなり、マウスは１２日目には回復した。抗−ＢＲ５処置動物においては、同様のパターンが観察された。しかしながら、抗−ＢＲ５の３０μｇ投与動物において、体重の落ちは６日目で顕著に少なくなった（ＰＩ状態と比較して、ｐ＜０．００１）。
【００４４】
抗−ＢＲ５モノクローナル抗体のヒト化
抗−ＢＲ５の軽鎖および重鎖の可変領域のｃＤＮＡをＰＣＲで増幅し、配列決定のためにｐＣＲＩＩ（インビトロジェン）中にサブクローン化した。ヌクレオチド配列は、いくつかの独立したクローンから得た。抗−ＢＲ５抗体の軽鎖または重鎖Ｖ領域を示す、独立したクローンから同一のｃＤＮＡ配列が選択された。
【００４５】
ＣＤＲグラフティングをラット抗−ＢＲ５抗体のヒト化に適用した。結合親和性と特異性を保持するために、ヒトフレームワーク上にＣＤＲをグラフティングする際に、Ｖ領域構造を保存することは不可欠である。アミノ酸配列を比較した後、ヒト抗体ＩＣ４のフレームワーク領域を、ラット抗ＢＲ５のヒト化用にフレームワークドナーとして用いた。
【００４６】
ヒト化抗−ＢＲ５可変領域のタンパク質配列をコードするために、シグナルペプチドを含む、プライマーの４対（各々約８０ベース長）を設計し、合成した。各々の対のプライマーは、約２０ヌクレオチドが部分的に一致した。遺伝子の回収および増幅は、４段階で行われた：（１）相補的オリゴヌクレオチドの４対を４つの個別の反応によりアニーリングし、Ｋｌｅｎｏｗフレグメントを用いて伸長させた；（２）得られた４つの二本鎖ＤＮＡフラグメントをペアワイズで混合し、変性し、リアニールし、そして２つの個別の反応で伸長した；（３）最終的な完全長二本鎖ＤＮＡを作製するために、得られた２つの二本鎖ＤＮＡを混合し、変性し、リアニールし、そして、伸長した；そして（４）得られたＤＮＡをプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、両端にＸｂａｌサイトを導入した。次いで、ＰＣＲフラグメントをＸｂａｌで消化し、Ｘｂａｌで消化したｐＶＫおよびρＶｇ４ベクターの各々に挿入した。
【００４７】
次いで、ヒト化抗ＢＲ−５の特異性を下記のようにテストした。ヒト化抗ＢＲ−５重鎖および軽鎖をコードするプラスミドを、ＣＯＳ−７細胞に共トランスフェクションした。次いで、培養細胞から上清（ｅｘｈａｕｓｔｅｄ  ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）を回収し、精製した。ヒト化抗ＢＲ−５をウエスタンブロット分析により、ＣＯＳ−７細胞またはＥ．ｃｏｌｉ中で発現させたＢ５Ｒの細胞外ドメインと相互作用できるかどうかについてテストした。
【００４８】
ヒト化抗ＢＲ−５を生産する安定なセルラインを開発するため、ヒト化抗ＢＲ−５重鎖および軽鎖をコードするプラスミドを、リポフェクタミン２０００（インビトロジェン社）を用いて、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞に一緒に共トランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を選択培地（αＭＥＭ中、２０ｎＭメトトレキサート）を含む９６ウェル組織培養プレート中に播種した。ＭＴＸ−耐性クローンをヒトＩｇＧ産生についてテストした。高産生モノクローナルセルラインを特定するために、限界希釈法を適用した。
【００４９】
他の実施態様
いかなる組み合わせにおいても、本明細書に開示されている全ての特徴を組み合わせることができる。本明細書に開示されている各特徴は、同じ、同等の、または類似の目的に役立つ代替可能な特徴によって置換されてもよい。
【００５０】
上記記述から、当業者であれば本発明の本質的特徴を容易に確かめることができ、本発明の精神および範囲を離れることなく、様々な使用および条件に適合させるために本発明に多様な変化および改良をなすことができる。したがって、他の実施態様もまた検討される。
【配列表】
2010507362000001.app
【国際調査報告】
2010507362.tif 000007