(57)【要約】  本発明は、疾患の処置に使用される、対象の細胞においてコードされたタンパク質または核酸治療分子を制御発現させるための、改良された発現系を提供する。特に本発明は、改良された制御遺伝子発現系、ならびに疾患を処置するためのその医薬組成物およびその使用を提供する。
2010523131.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくともベクターを含む制御発現系であって、前記ベクターは：i）治療活性を持つ治療分子（TM）をコードする第1核酸配列と、ii）前記第1核酸に作動的に連結された第1プロモーターおよび第1ポリ(A)部位とを含み、前記TMが対象の細胞中で発現され、かつ前記TMの発現または活性が用量依存的であり、制御因子分子（RM）の存在下で制御または誘導される、第1発現カセット；ならびにi）前記制御因子分子（RM）をコードする第2核酸配列と、ii）前記第2核酸配列に作動的に連結された第2プロモーターおよび第2ポリ(A)部位とを含み、前記RMが前記細胞中で発現され、かつ活性化因子分子（AM）の存在下で活性化され、それによって、前記TMの発現または活性を制御する、第2発現カセットを含み、前記AMは修飾ステロイド受容体調節因子である、制御発現系。
【請求項２】
前記修飾ステロイド受容体調節因子が修飾PR調節因子である、請求項1の制御遺伝子発現系。
【請求項３】
前記修飾PR調節因子がPRリガンド類似体である、請求項2の制御遺伝子発現系。
【請求項４】
前記PRリガンド類似体が修飾抗プロゲスチン、修飾メソプロゲスチン、または修飾プロゲスチンである、請求項3の制御遺伝子発現系。
【請求項５】
前記修飾抗プロゲスチンが修飾MFPである、請求項4の制御遺伝子発現系。
【請求項６】
前記修飾メソプロゲスチンが修飾アソプリスニルである、請求項4の制御遺伝子発現系。
【請求項７】
前記修飾アソプリスニルがBLX-93である、請求項6の制御遺伝子発現系。
【請求項８】
前記PRリガンド類似体がBLX-899である、請求項3の制御遺伝子発現系。
【請求項９】
前記PRリガンド類似体がBLX-952である、請求項3の制御遺伝子発現系。
【請求項１０】
前記PRリガンド類似体がBLX-610である、請求項3の制御遺伝子発現系。
【請求項１１】
前記PRリガンド類似体がBLX-117である、請求項3の制御遺伝子発現系。
【請求項１２】
前記PRリガンド類似体がBLX-784である、請求項3の制御遺伝子発現系。
【請求項１３】
前記AMが前記ベクターとは別個に投与される、請求項1の制御発現系。
【請求項１４】
前記TMの発現または活性が前記制御因子分子（RM）の存在下で誘導される、請求項1の制御発現系。
【請求項１５】
前記TMの発現または活性が前記制御因子分子（RM）の存在下で抑制される、請求項1の制御発現系。
【請求項１６】
前記TMの発現または活性が前記制御因子分子（RM）の存在下で増加する、請求項1の制御発現系。
【請求項１７】
前記制御因子分子（RM）が前記活性化因子分子（AM）の存在下で活性化される、請求項16の制御発現系。
【請求項１８】
前記制御因子分子（RM）の発現が構成的または一過性である、請求項1の制御発現系。
【請求項１９】
前記制御因子分子（RM）の発現が構成的である、請求項18の制御発現系。
【請求項２０】
前記制御因子分子（RM）の発現が制御される、請求項1の制御発現系。
【請求項２１】
前記第2プロモーターが被制御プロモーターである、請求項20の制御発現系。
【請求項２２】
前記第2プロモーターが組織特異的プロモーターである、請求項1の制御発現系。
【請求項２３】
前記第2プロモーターが筋特異的プロモーターである、請求項22の制御発現系。
【請求項２４】
前記第2プロモーターがアクチンプロモーターである、請求項23の制御発現系。
【請求項２５】
前記制御因子分子（RM）が前記第1プロモーターに結合し、それによって前記TMの発現または活性を誘導する、請求項14の制御発現系。
【請求項２６】
前記制御因子分子（RM）が活性化され、それによって前記第1プロモーターに結合し、前記TMの発現または活性を誘導する、請求項14の制御発現系。
【請求項２７】
前記制御因子分子（RM）がトランス活性化ドメインを含む、請求項1の制御発現系。
【請求項２８】
前記トランス活性化ドメインがVP16もしくはp65トランス活性化ドメインまたはその一部分を含む、請求項27の制御発現系。
【請求項２９】
前記制御因子分子（RM）がリガンド結合ドメイン（LBD）を含む、請求項1の制御発現系。
【請求項３０】
前記制御因子分子（RM）がリガンド結合ドメイン（LBD）を含み、前記活性化因子分子（AM）が前記LBDに結合し、それによって前記RMを活性化する、請求項29の制御発現系。
【請求項３１】
前記制御因子分子（RM）がDNA結合ドメイン（DBD）を含む、請求項1の制御発現系。
【請求項３２】
前記DNA結合ドメイン（DBD）がGAL-4 DBDまたはその一部分を含む、請求項31の制御発現系。
【請求項３３】
前記制御因子分子（RM）が前記RMにおけるコンフォメーション変化によって活性化される、請求項1の制御発現系。
【請求項３４】
前記制御因子分子（RM）が前記RMの修飾によって活性化される、請求項1の制御発現系。
【請求項３５】
前記制御因子分子（RM）が天然分子もしくはその変種である、請求項1の制御発現系。
【請求項３６】
前記制御因子分子（RM）が修飾された分子である、請求項1の制御発現系。
【請求項３７】
前記制御因子分子（RM）がタンパク質である、請求項35の制御発現系。
【請求項３８】
前記タンパク質がヒト化タンパク質である、請求項37の制御発現系。
【請求項３９】
前記タンパク質がヒトタンパク質またはその変種である、請求項38の制御発現系。
【請求項４０】
前記タンパク質が転写活性化因子である、請求項39の制御発現系。
【請求項４１】
前記転写活性化因子が核内ステロイド受容体である、請求項40の制御発現系。
【請求項４２】
前記転写活性化因子が修飾核内ステロイド受容体である、請求項41の制御発現系。
【請求項４３】
前記修飾核内ステロイド受容体が修飾プロゲステロン受容体である、請求項42の制御発現系。
【請求項４４】
前記修飾プロゲステロン受容体が突然変異型リガンド結合ドメイン（LBD）を含む、請求項43の制御遺伝子発現系。
【請求項４５】
前記修飾プロゲステロン受容体がリガンド結合ドメイン（LBD）内に少なくとも一つの部位特異的突然変異を含む、請求項44の制御遺伝子発現系。
【請求項４６】
リガンド結合ドメイン（LBD）内の前記部位特異的突然変異が前記LBDのアミノ酸配列中の719位における単一突然変異である、請求項45の制御遺伝子発現系。
【請求項４７】
リガンド結合ドメイン（LBD）内の前記部位特異的突然変異が前記LBDのアミノ酸配列中の755位における単一突然変異である、請求項45の制御遺伝子発現系。
【請求項４８】
リガンド結合ドメイン（LBD）内の前記部位特異的突然変異が前記LBDの一次アミノ酸配列中の729位および755位または726位および755位における二重突然変異である、請求項45の制御遺伝子発現系。
【請求項４９】
前記第2発現カセットが、前記第2核酸配列に作動的に連結された第2の機能配列をさらに含む、請求項1の制御発現系。
【請求項５０】
前記第2ポリ(A)部位がシミアンウイルス40（SV40）ポリ(A)部位である、請求項1の制御発現系。
【請求項５１】
前記治療分子（TM）の発現が構成的または一過性である、請求項1の制御発現系。
【請求項５２】
前記第1プロモーターが被制御プロモーターである、請求項1の制御発現系。
【請求項５３】
前記第1プロモーターが誘導性プロモーターである、請求項1の制御発現系。
【請求項５４】
前記第1プロモーターが組織特異的プロモーターである、請求項1の制御発現系。
【請求項５５】
前記第1プロモーターが筋クレアチンキナーゼ（MCK）プロモーター、低酸素応答エレメント（HRE）プロモーター、内皮白血球接着分子（ELAM）プロモーター、CMV/アクチンキメラプロモーター、サイクリンAプロモーター、またはcdc6プロモーターからなるプロモーターの群より選択される、請求項1の制御発現系。
【請求項５６】
前記第1プロモーターがPolIIプロモーターである、請求項1の制御発現系。
【請求項５７】
前記PolIIプロモーターがE1Bプロモーターである、請求項52の制御発現系。
【請求項５８】
前記第1プロモーターが前記制御因子分子（RM）の前記DNA結合ドメインのための結合部位を含む、請求項31の制御発現系。
【請求項５９】
前記結合部位が少なくとも一つGAL-4結合部位を含む、請求項58の制御発現系。
【請求項６０】
前記結合部位が前記GAL-4結合部位の多量体を含む、請求項59の制御発現系。
【請求項６１】
前記結合部位が3〜18個のGAL-4結合部位を含む、請求項60の制御発現系。
【請求項６２】
前記第1ポリ(A)部位がヒト成長ホルモン（hGH）ポリ(A)部位である、請求項1の制御発現系。
【請求項６３】
前記第1発現カセットが前記第1核酸配列に作動的に連結された第1機能配列さらに含む、請求項1の制御発現系。
【請求項６４】
前記第1機能配列が5'非翻訳領域および/またはイントロンをコードする、請求項63の制御発現系。
【請求項６５】
前記第1機能配列がUT12を含む5'非翻訳領域をコードする、請求項64の制御発現系。
【請求項６６】
前記機能配列がIVS8を含むイントロンをコードする、請求項65の制御発現系。
【請求項６７】
前記治療分子（TM）が天然分子の変種である、請求項1の制御発現系。
【請求項６８】
前記治療分子（TM）が修飾された分子である、請求項1の制御発現系。
【請求項６９】
前記治療分子（TM）が合成分子または組換え分子である、請求項1の制御発現系。
【請求項７０】
前記治療分子（TM）がタンパク質である、請求項1の制御発現系。
【請求項７１】
前記治療分子（TM）がヒトタンパク質またはその変種である、請求項70の制御発現系。
【請求項７２】
前記治療分子（TM）がGM-CSF、リューカイン（Leukine）、IFN-アルファ、およびIFN-ベータ、または前記タンパク質の変種からなるタンパク質の群より選択される、請求項71の制御発現系。
【請求項７３】
前記治療分子（TM）がGM-CSFである、請求項72の制御発現系。
【請求項７４】
前記治療タンパク質（TM）がモノクローナル抗体である、請求項72の制御発現系。
【請求項７５】
前記モノクローナル抗体がCAMPATH（登録商標）である、請求項74の制御発現系。
【請求項７６】
前記ベクターがプラスミドベクターである、請求項1の制御発現系。
【請求項７７】
前記プラスミドベクターが、pGT1003、pGT1004、pGT1005、pGT1006、pGT1007、pGT1008、およびpGT1009からなる群より選択される、請求項76の制御発現系。
【請求項７８】
前記プラスミドベクターが、pGT1015、pGT1016、pGT1017、pGT1025、pGT1020、pGT1021、pGT1022、pGT1023、pGT1024、pGT1044、pGT1045、およびpGT1046からなる群より選択される、請求項76の制御発現系。
【請求項７９】
前記活性化因子分子（AM）が経口投与され、それによって前記制御因子分子（RM）を活性化する、請求項1の制御発現系。
【請求項８０】
前記ベクターが注射によって投与される、請求項1の制御発現系。
【請求項８１】
前記ベクターが、前記細胞を前記ベクターとインビボまたはエクスビボで接触させることによって投与される、請求項1の制御発現系。
【請求項８２】
前記接触がインビボでかつ注射によって行われる、請求項81の制御発現系。
【請求項８３】
前記注射が筋肉内注射によって行われる、請求項82の制御発現系。
【請求項８４】
前記注射が骨格筋細胞の筋肉内注射によって行われる、請求項83の制御発現系。
【請求項８５】
前記接触がエクスビボでかつエレクトロポレーションによって行われる、請求項81の制御発現系。
【請求項８６】
制御遺伝子発現系に使用するためのPRリガンド類似体。
【請求項８７】
BLX-913である、請求項86のPRリガンド類似体。
【請求項８８】
BLX-899である、請求項86のPRリガンド類似体。
【請求項８９】
BLX-952である、請求項86のPRリガンド類似体。
【請求項９０】
BLX-610である、請求項86のPRリガンド類似体。
【請求項９１】
BLX-117である、請求項86のPRリガンド類似体。
【請求項９２】
BLX-784である、請求項86のPRリガンド類似体。
【請求項９３】
pGT1003、pGT1004、pGT1005、pGT1006、pGT1007、pGT1008、またはpGT1009である、制御発現系で使用するためのベクター。
【請求項９４】
pGT1015、pGT1016、pGT1017、pGT1025、pGT1020、pGT1021、pGT1022、pGT1023、pGT1024、pGT1044、pGT1045、またはpGT1046である、制御発現系で使用するためのベクター。
【請求項９５】
pGT79である、制御発現系で使用するためのベクター。
【請求項９６】
前記ベクターがpGT1003、pGT1004、pGT1005、pGT1006、pGT1007、pGT1008、pGT1009、pGT1015、pGT1016、pGT1017、pGT1025、pGT1020、pGT1021、pGT1022、pGT1023、pGT1024、pGT1044、pGT1045、およびpGT1046からなる群より選択され、前記修飾抗プロゲスチンがBLX-913、BLX-899、BLX-952、BLX-610、BLX-117およびBLX-784からなる群より選択される突然変異体ミフェプリストン（MFP）類似体である、請求項1の制御遺伝子発現系。
【請求項９７】
突然変異型リガンド結合ドメイン（LBD）を含む修飾プロゲステロン受容体である、制御発現系で使用するための制御因子分子（RM）タンパク質。
【請求項９８】
pGT1003、pGT1004、pGT1005、pGT1006、pGT1007、pGT1008、およびpGT1009からなる群より選択されるベクターでトランスフェクトされた細胞中で発現される、請求項97の制御因子分子（RM）タンパク質。
【請求項９９】
pGT1015、pGT1016、pGT-1017、pGT1025、pGT1020、pGT1021、pGT1022、pGT1023、pGT1024、pGT1044、pGT1045、およびpGT1046からなる群より選択されるベクターでトランスフェクトされた細胞中で発現される、請求項98の制御因子分子（RM）タンパク質。
【請求項１００】
請求項1に記載の制御発現系を使って対象の細胞における治療分子（TM）の発現を制御するための方法であって、前記TMが前記細胞中で発現され、前記TMの発現または活性が前記細胞における前記制御因子分子（RM）の存在下で制御されるように、前記対象の細胞を前記発現系と接触させることを含む方法。
【請求項１０１】
請求項1に記載の制御発現系を使って対象の細胞に治療分子（TM）を投与するための方法であって、前記TMが前記細胞中で発現され、前記TMの発現または活性が前記細胞における前記制御因子分子（RM）の存在下で制御されるように、前記対象の細胞を前記発現系と接触させることを含む方法。
【請求項１０２】
請求項1に記載の制御発現系を使って対象の細胞に治療分子（TM）を送達するための方法であって、前記TMが前記細胞中で発現され、前記TMの発現または活性が前記細胞における前記制御因子分子（RM）の存在下で制御されるように、前記対象の細胞を前記発現系と接触させることを含む方法。
【請求項１０３】
請求項1に記載の制御発現系を使って、インビボまたはエクスビボで、対象の細胞において治療分子（TM）を発現させるための方法であって、前記TMが前記細胞中で発現され、前記TMの発現または活性が前記細胞における前記制御因子分子（RM）の存在下で制御されるように、前記対象の細胞を前記発現系と接触させることを含む方法。
【請求項１０４】
少なくとも一つの請求項1に記載の発現系を含む医薬組成物。
【請求項１０５】
請求項93のベクターを含む医薬組成物。
【請求項１０６】
請求項94のベクターを含む医薬組成物。
【請求項１０７】
対象の細胞に治療分子（TM）を送達するためのキットであって、少なくとも一つの請求項1に記載の制御発現系とその使用に関する指示とを含むキット。
【請求項１０８】
対象の細胞に治療分子（TM）を送達するためのキットであって、少なくとも一つの請求項93に記載のベクターとその使用に関する指示とを含むキット。
【請求項１０９】
対象の細胞に治療分子（TM）を送達するためのキットであって、少なくとも一つの請求項94に記載のベクターとその使用に関する指示とを含むキット。
【請求項１１０】
前記TMの発現または活性が前記制御因子分子（RM）の存在下で用量依存的である、請求項1の制御遺伝子発現系。
【請求項１１１】
前記TMの発現または活性が前記制御因子分子（RM）の存在下で方向依存的である、請求項1の制御遺伝子発現系。
【請求項１１２】
前記方向依存的なTMの発現または活性が前記制御遺伝子発現系におけるTM転写の5'→3'の向きに依存する、請求項111の制御遺伝子発現系。
【請求項１１３】
前記方向依存的なTMの発現または活性が前記制御遺伝子発現系における前記第1遺伝子発現カセットの5'→3'方向に依存する、請求項111の制御遺伝子発現系。
【請求項１１４】
前記方向依存的なTMの発現または活性が前記制御遺伝子発現系における制御因子分子（RM）転写の5'→3'の向きに依存する、請求項111の制御遺伝子発現系。
【請求項１１５】
前記方向依存的なTMの発現または活性が前記制御遺伝子発現系における前記第2遺伝子発現カセットの5'→3'方向に依存する、請求項111の制御遺伝子発現系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疾患の処置に使用される、コードされたタンパク質または核酸治療分子（TM）を制御発現させるための改良された発現系に関する。特に本発明は、そのような改良された制御遺伝子発現系のための新しい調節分子、ならびに疾患を処置するためのその医薬組成物および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
疾患を処置するための治療分子（TM）をコードする核酸の送達は、従来の処置方法に対し、治療モダリティーとして非常に大きな潜在的可能性をもたらすと考えられている。特に、遺伝子治療における治療タンパク質をコードする核酸の送達は、ボーラスタンパク質の投与を必要とする従来の治療法に対して、著しい利点をもたらす潜在的可能性を持っている。これらの潜在的利点には、例えば、最大限の治療効力と最小限の副作用とをもたらす患者の細胞におけるTMの長期にわたる制御発現や、毒性および感染性不純物ならびに全身性不純物の回避などが含まれる。
【０００３】
例えば、疾患を処置するためのボーラスタンパク質の送達は、例えば感染性および毒性不純物、全身毒性、注射部位壊死、インフルエンザ様症状、悪寒、発熱、疲労、食欲不振、および体重減少に関係するものを含む有害副作用をもたらすことが知られている。場合によっては、これらの事象が用量を制限し、処置全体の中止につながることもある。さらに、いくつかのタンパク質治療薬への連続的ばく露は、時が経つにつれて、耐性をもたらしうる。したがって、持続的なまたは長期間にわたる治療有効レベルのTMを与えることができ、それに加えて、TMのレベルを動的治療ウインドウ内に速やかに低下させまたは調節するための手段の特徴を持つ、制御された発現系が必要とされている。より具体的には、TMの濃度が潜在的に毒性であるレベルに到達したらオフにすることができる制御発現系が必要とされている。そのうえ、TMのレベルを増減調整することができれば、時が経つにつれてTMに対する耐性が増加する潜在的可能性がある場合に、投薬を調整することが可能になるだろう。
【０００４】
特に興味深く、必要とされているのは、ある疾患をもたらす状態もしくはある疾患によって引き起こされる状態を治療するために、またはある疾患の進行を停止もしくは減速するために、ターゲット患者細胞中で発現させることができる治療タンパク質をコードする遺伝子の送達である。例えば、多くの疾患状態の病因は、一つ以上の欠陥遺伝子産物の発現、または一つ以上の遺伝子産物の欠陥発現（例えばそれぞれ、突然変異したタンパク質の発現、またはあるタンパク質の過剰もしくは過少発現）の結果である。したがって、従来の処置方法には、そのような欠陥のあるタンパク質発現または欠陥タンパク質の発現を補正するための組換えタンパク質の投与が含まれる。しかし、患者へのタンパク質治療薬の投与は、異物として、患者免疫系によるそのタンパク質に対する抗体の生成およびそのタンパク質の拒絶をもたらすことが知られている。
【０００５】
したがって、疾患を処置するための治療タンパク質の遺伝子ベースの送達であって、タンパク質の制御された長期間にわたる発現を与えて、用量制限的な毒性副作用を最小限に抑えつつ治療効力をもたらすものが必要とされている。そのような制御発現系は、現行のタンパク質治療薬に付随する大きな制限因子の多くを回避しうる。しかし、既知の核酸送達系の大半は、臨床使用には適さず、細胞中で制御されたまたは長期間にわたる発現を与えない。実験室条件下で導入遺伝子発現を制御する能力を持つと報告されている既知の核酸送達系はわずかに過ぎず、臨床使用に関して、それらの送達系の適性および実用性はわかっていない（例えばGossen, M.およびBujard H. (1995) Science 268:1766-69；No, D.ら (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:3346-51；Amara, J.F.ら (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:10618-23；Wang, Y. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:8180-84；Nordstrom, J.L. (2002) Curr. Opin. Biotechnol. 13:453-58を参照されたい）。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、疾患の処置に使用される、コードされたタンパク質または核酸治療分子（TM）を制御発現させるための改良された発現系であって、TMの治療効力を最大化しかつ副作用を最小化することのできる発現系を提供する。特に本発明は、新しい調節分子、例えばそのような改良された制御遺伝子発現系のための新しい活性化因子分子（AM）、不活化因子分子（IM）、および制御因子分子（RM）、ならびに疾患を処置するためのその医薬組成物および方法を提供する。
【０００７】
特に本発明は、当該選択性を強化する修飾を持つRMに選択的に結合するAMまたはIMを提供する。したがって本発明の新しいAMおよびIMは、本発明の新しいRMと選択的に結合するか、または他の形で相互作用し、内在性タンパク質、特に内在性ヒトタンパク質、例えば受容体、より具体的にはステロイド受容体、さらに具体的にはPRまたはGRとの交差反応性を減少させまたは排除する、改良された性質を持つ。いくつかの態様では、本発明の新しいAMまたはIMがRM調節因子、特に修飾受容体調節因子、より具体的には修飾ステロイド受容体調節因子、さらに具体的には修飾PRまたはGR調節因子、例えばPRまたはGRリガンド類似体である。
【０００８】
ある態様では、本発明のAMまたはIMが、修飾LBD（より具体的には修飾LBP）を持つRMに選択的に結合し、例えば内在性PRもしくは他の内在性ステロイド受容体との交差反応性、堕胎活性または避妊活性などに関係する副作用が減少しているか、またはそのような副作用を持たない、PRリガンド類似体である。
【０００９】
より具体的には、本発明を、TMの発現を調節して、例えばTMを増加もしくは減少させ、またはオンおよびオフにすることができるように、TM発現のレベルを緻密にかつ特異的に制御する能力を含む、改良された性質を持つ新しいAM、IM、およびRMを提供する。重要なことに、本発明のAMおよびIMは、本発明のRMに対して改善された選択性を持つ。いくつかの態様では、RMのLBD（より具体的にはLBP）が、改善された特異性および選択性で、AMまたはIMを結合し、かつ/またはそれぞれAMまたはIMに応答するように修飾される。
【００１０】
例えば、本発明のAMは、RMに選択的に結合しかつ/またはRMを選択的に活性化し、内在性タンパク質、例えば内在性ステロイド受容体にはほとんどまたは全く影響を持たないAMであることができるが、これに限るわけではない。また、例えば本発明のRMは、AMと特異的に結合しかつ/または他の形で相互作用し、その結果、AMによって活性化されるように修飾されたRMであることができるが、これに限るわけではない。ある態様では、活性化されたRMがTMを増加させまたはTMの発現をオンにするように、AMが、RMと結合しまたは他の形で相互作用してRMを選択的に活性化する。これにより、本発明のAMおよび/またはRMは、TM発現および/またはTM活性のレベルを緻密にかつ特異的に制御する能力をもたらす。いくつかの実施形態では、AMが、AMに選択的に結合するように修飾されたユニークなRMに結合する。
【００１１】
いくつかの態様では、本発明のIMは、RMに選択的に結合しかつ/またはRMを選択的に不活化し、内在性タンパク質、例えば内在性ステロイド受容体にはほとんどまたは全く影響を持たないIMであることができるが、これに限るわけではない。また、例えば本発明のRMは、IMと特異的に結合しかつ/または他の形で相互作用し、その結果、IMによって不活化されるように修飾されたRMであることができるが、これに限るわけではない。ある態様では、不活化されたRMがTMを減少させまたはTMの発現をオフにするように、IMがRMと結合しまたは他の形で相互作用して、RMを選択的に不活化する。これにより、本発明のIMおよび/またはRMは、TM発現および/またはTM活性のレベルを緻密にかつ特異的に制御または調節する能力をもたらす。いくつかの実施形態では、IMが、IMに選択的に結合するように修飾されたユニークなRMに結合する。好ましい態様では、RMのリガンド結合ドメイン（LBD）、より具体的にはリガンド結合ポケット（LBP）が、改善された特異性および選択性でAMに結合しかつ/または応答するように修飾される。また、好ましい態様では、AMが、AMに選択的に結合するように修飾されたユニークなRMに結合する。例えば、本発明のAMは、RMに選択的に結合しかつ/またはRMを選択的に活性化し、内在性タンパク質、例えば受容体、より具体的にはステロイド受容体、さらに具体的にはPRまたはGRにはほとんどまたは全く影響を持たないAMであることができるが、これに限るわけではない。また例えば、本発明のRMは、AMと特異的に結合しかつ/または他の形で相互作用し、その結果、AMによって活性化されるように、修飾された受容体LBD（より具体的には修飾された受容体LBP）を持つRMであることができるが、これに限るわけではない。ある態様では、活性化されたRMがTMを増加させまたはTMの発現をオンにするように、AMが、RMと結合しまたは他の形で相互作用してRMを選択的に活性化する。これにより、本発明のAMおよび/またはRMは、TM発現および/またはTM活性のレベルを緻密にかつ特異的に制御する能力をもたらす。
【００１２】
本発明のコードされたTMは、ある疾患を持つ対象またはある疾患にかかりやすい対象に治療的利益を与える核酸またはタンパク質であることができる。例えば、そのような治療的利益または治療活性には、疾患または疾患の症状の改善、調節、減縮、安定化、または防止が含まれるが、これらに限るわけではない。
【００１３】
ある態様では、本発明は、対象の細胞に送達された時に、コードされたTMが発現され、TMの発現および/または活性が制御因子分子（RM）の存在下で制御されるように、少なくとも、TMをコードする核酸配列を持つ第1発現カセットを含む、改良された制御発現系を提供する。そのような制御の例には、RMの存在下におけるTM発現および/またはTM活性の誘導、抑制、増加、または減少が含まれるが、これらに限るわけではない。
【００１４】
本発明のある態様では、TMの発現および/または活性が、用量応答的または用量依存的に、例えば対象の細胞中に存在するまたは対象に投与されたRMの量に応じて、制御される。別の態様では、TMの発現および/または活性が、用量応答的または用量依存的に、例えば対象の細胞中に存在するまたは対象に投与された活性化因子分子（AM）または不活化因子分子（IM）の量に応じて、制御される。
【００１５】
本発明のもう一つの態様では、TMの発現および/または活性が方向依存的である。例えばある態様では、細胞におけるTMの発現および/または活性が、TMをコードする発現カセットの5'→3'方向に関して調節されるか、コードされたTMの転写または翻訳の5'→3'方向に関して調節される。したがって、TMをコードする発現カセットの特定の方向またはTMの転写もしくは翻訳の方向を選択することによって、TM発現および/またはTM活性を調節することができる。
【００１６】
もう一つの態様では、本発明の制御発現系が、対象の細胞に送達された時に、コードされたRMが発現され、その存在がTMの発現および/または活性を制御するように、RMをコードする第2発現カセットをさらに含む。好ましい一態様では、本発明の、TMをコードする第1発現カセットおよびRMをコードする第2発現カセットが、単一ベクター中に存在する。好ましい一態様では、その単一ベクターがpGT79である。もう一つの好ましい態様では、単一ベクターがpGT1003、pGT1004、pGT1005、pGT1006、pGT1007、pGT1008またはpGT1009である。さらにもう一つの好ましい態様では、単一ベクターがpGT1015、pGT1016、pGT1017、pGT1025、pGT1020、pGT1021、pGT1022、pGT1023またはpGT1024である。
【００１７】
本発明のTMは、核酸配列によってコードされかつ治療活性を持つ、単離されたDNA、RNA、もしくはタンパク質、またはその変種であることができる。より具体的には、本発明のTMは、修飾、合成、または組換えDNA、RNAまたはタンパク質であることができる。本発明のもう一つの態様では、コードされたTMが、治療活性を持つ核酸、例えばDNAまたはRNAである。本発明の一態様では、コードされたTMが、RNA、例えばsiRNAまたはshRNAである。本発明のもう一つの態様では、コードされたTMが、治療活性を持つタンパク質、好ましくはヒトタンパク質またはその変種である。ある態様では、コードされたTMが、治療活性を持つモノクローナル抗体である。ある態様では、コードされたTMが、モノクローナル抗体CAMPATH（登録商標）である。もう一つの態様では、そのようなタンパク質をコードする核酸配列が、遺伝子または遺伝子フラグメントである。ある態様では、コードされたTMが、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）またはGM-CSFの変種（例えばLeukine（登録商標））である。もう一つの態様では、コードされたTMが、インターフェロン、例えばインターフェロン-アルファ（IFN-α）またはインターフェロン-ベータ（IFN-β）であり、より具体的にはIFN-β-1aである。
【００１８】
本発明のRMは、天然分子またはその変種、例えば修飾された分子、または単離された分子であることができる。いくつかの態様では、本発明のRMが合成分子または組換え分子である。例えば、いくつかの態様では、本発明のRMが化学化合物、DNA、RNA、またはタンパク質である。さらにいくつかの態様では、本発明のRMが修飾された分子である。ある態様では、RMがヒト化タンパク質である。いくつかの態様では、本発明のRMが、LBD（より具体的にはLBP）を突然変異させてRMとAMの間またはRMとIMの間の結合および/または相互作用の選択性を増加させるように、修飾される。
【００１９】
もう一つの態様では、RMが、修飾された受容体LBD（より具体的には修飾された受容体LBP）、例えば修飾ステロイド受容体LBD（より具体的には修飾ステロイド受容体LBP）を持つ、ヒトタンパク質またはその変種である。ある態様では、RMが修飾PRまたはGR LBD（より具体的には修飾PRまたはGR LBP）を持つ。もう一つの態様では、RMが転写活性化因子である。もう一つの態様では、RMが、トランス活性化ドメイン（例えばVP16またはp65トランス活性化ドメイン）またはそのようなドメインの一部分を含む。もう一つの態様では、RMが、リガンド結合ドメイン（LBD）またはそのようなドメインの一部分を含む。さらにある態様では、AMが、RMのLBD（より具体的にはLBP）に結合し、その結果、活性化されたRMの存在がTM発現および/またはTM活性を制御するように、RMを活性化する。もう一つの態様では、RMがDBD、例えばGAL-4 DBDを含む。ある態様では、RMが、TMをコードする核酸に作動的に連結された機能配列（例えばプロモーター配列）に結合し、それによってTM発現を制御する（例えばTM発現を誘導する）、DBDを含む。
【００２０】
もう一つの態様では、本発明のRMが活性化され、その結果、TM発現および/またはTM活性が、活性化されたRMの存在下で制御される。ある態様では、本発明のRMが、不活化された形で、対象の細胞中で発現されまたは対象の細胞中に存在し、それがAMの存在下で活性化され、その結果、TM発現および/またはTM活性が、活性化されたRMによって制御される。ある態様では、AMがバイオマーカーである。さらにもう一つの態様では、AMが疾患または状態のバイオマーカーであり、より具体的には、疾患状況もしくは状態、またはその症状のバイオマーカーである。ある態様では、AMが、RMのコンフォメーション変化、酵素的プロセシングもしくは酵素的修飾、特異的結合、または二量体化を促進または阻害することによって、RMを活性化する。好ましい一態様では、AMが、RMのホモ二量体化を促進することによって、RMを活性化する。
【００２１】
本発明のAMは、天然分子もしくはその変種、例えば修飾された分子、または単離された分子であることができる。いくつかの態様では、本発明のAMが合成分子または組換え分子である。例えば、いくつかの態様では、本発明のAMが化学化合物、DNA、RNA、またはタンパク質である。さらにいくつかの態様では、本発明のAMが修飾された分子である。ある態様では、AMがヒト化タンパク質である。もう一つの態様では、AMがヒトタンパク質またはその変種である。好ましい態様では、本発明のAMが、ユニークなまたは特異的なRM、例えば修飾された受容体LBDを持つRM、より具体的にはAMを特異的に結合する修飾された受容体LBPを持つRMに選択的に結合し、かつ/または、そのようなRMと他の形で相互作用する。また、好ましい態様では、本発明のAMがRM調節因子、特に修飾受容体調節因子、より具体的には修飾ステロイド受容体調節因子、さらに具体的には修飾PRまたはGR調節因子、より一層具体的にはPRまたはGRリガンド類似体、さらに具体的には修飾抗プロゲスチン（例えば修飾MFP）または修飾メソプロゲスチン（例えば修飾アソプリスニル）である。もう一つの態様では、本発明のRMは不活化され、その結果、TM発現および/またはTM活性が、不活化されたRMの存在下で制御される。ある態様では、本発明のRMが、活性化された形で、対象の細胞中で発現されまたは対象の細胞中に存在し、それがIMの存在下で不活化され、その結果、TM発現および/またはTM活性が、不活化されたRMによって制御される。ある態様では、IMがバイオマーカーである。さらにもう一つの態様では、IMが疾患または状態のバイオマーカーであり、より具体的には疾患状況もしくは状態、またはその症状のバイオマーカーである。ある態様では、IMが、RMのコンフォメーション変化、酵素的プロセシング、特異的結合、または二量体化を促進または阻害することによって、RMを不活化する。好ましい一態様では、IMが、RMのホモ二量体化を阻害することによって、RMを不活化する。
【００２２】
本発明のIMは、天然分子もしくはその変種、または単離された分子であることができる。いくつかの態様では、本発明のIMが合成分子または組換え分子である。例えば、いくつかの態様では、本発明のIMが化学化合物、DNA、RNA、またはタンパク質である。さらにいくつかの態様では、本発明のIMが修飾された分子である。ある態様では、IMがヒト化タンパク質である。もう一つの態様では、IMがヒトタンパク質またはその変種である。好ましい態様では、本発明のIMが、ユニークなまたは特異的なRM、例えば修飾された受容体LBDを持つRM、より具体的にはIMを特異的に結合する修飾された受容体LBPを持つRMに選択的に結合しかつ/またはそのようなRMと他の形で選択的に相互作用する。また、好ましい態様では、IMがRM調節因子、特に修飾受容体調節因子、より具体的には修飾ステロイド受容体調節因子、さらに具体的には修飾PRまたはGR調節因子、例えばそれぞれPRまたはGRリガンド類似体である。
【００２３】
本発明のTM、RM、AM、またはIMの発現は構成的であるか一過性であることができる。いくつかの態様では、TM、RM、AM、またはIMの発現が制御されるか、または組織特異的（例えば筋特異的）である。制御されたRMの例には、AMによって活性化されるRM、またはIMによって不活化されるRMが含まれるが、これらに限るわけではない。ある態様では、本発明のTM、RM、AM、またはIMの発現が、被制御プロモーターまたは組織特異的プロモーターによって駆動される。さらにもう一つの態様では、被制御プロモーターまたは組織特異的プロモーターが、RMの存在下で、より具体的にはそのプロモーターへのRMの結合によって、制御される。例えばある態様では、本発明のRMが、TMをコードする核酸配列に作動的に連結されたプロモーターに結合し、それによって、対象の細胞における、本明細書に記載するコードされたTMの発現を制御する。ある態様では、TMをコードする核酸に作動的に連結されるプロモーターが、少なくとも一つのGAL-4 DNA結合部位（DBS）を含み、好ましくは3〜18個のGAL-4 DBSを含む。もう一つの態様では、プロモーターがPol IIまたはPol IIIプロモーターである。ある態様では、プロモーターがPol IIプロモーターU6H1である。もう一つの態様では、プロモーターが、筋クレアチンキナーゼプロモーター（MCK）、低酸素応答エレメントを含むプロモーター（HREプロモーター）、内皮白血球接着分子（ELAM）プロモーター、キメラプロモーター（例えばCMV/アクチンキメラプロモーター）、サイクリンAプロモーター、およびcdc6プロモーターからなる群より選択されるPol IIプロモーターである。
【００２４】
本発明は、本明細書に記載する本発明の改良された制御発現系を含む、疾患または状態を処置するための医薬組成物および方法も提供する。特定の態様において、本発明は、疾患または状態を処置し；TMの発現を制御し；TMを投与し；TMを送達し；または対象の細胞中でTMを発現させるための医薬組成物および方法であって、その方法が、コードされたTMが細胞中で発現され、そのTM発現がRMの存在下で制御されるように、細胞を本発明の制御発現系と接触させることを含むものを提供する。ある態様において、本発明は、白血病、黒色腫、肝炎、および心筋症を処置するための医薬組成物および方法を提供する。好ましい一態様では、本発明の制御発現系のコードされたTMが、白血病、黒色腫、肝炎、または心筋症を処置するためのIFN、例えばIFN-αまたはIFN-βである。
【００２５】
本発明の医薬組成物は、本明細書に記載する発現系の少なくとも一つ、特に本発明のTMおよびRMの少なくとも一つ、より具体的には、本発明のベクターの少なくとも一つ（例えばpGT79、pGT1003、pGT1004、pGT1005、pGT1006、pGT1007、pGT1008、pGT1009、pGT1015、pGT1016、pGT-1017、pGT1025、pGT1020、pGT1021、pGT1022、pGT1023またはpGT1024）を含む。いくつかの態様では、本発明の医薬組成物が、少なくとも一つの本発明のAMまたはIMを含む。ある態様では、本発明の医薬組成物が、少なくとも一つのTMおよび/またはRMをコードする一つ以上のベクターを含む。本発明のTM、RM、AM、およびIMは、本明細書に記載するまたは当技術分野で知られている任意の適切な投与手段を使って、別々にまたは一緒に、エクスビボでまたはインビボで、対象に投与することができる。そのような適切な投与手段の例には、注射（例えば皮下注射）、経口投与、およびエレクトロポレーションが含まれるが、これらに限るわけではない。ある態様では、本発明のTMおよびRMが単一ベクター中に存在し、RMを活性化するAM（そしてその結果、活性化されたRMの存在が、TM発現および/またはTM活性を制御する）とは別個に投与される。さらにもう一つの態様では、AMが、経口投与される化合物（例えばRM調節因子、特に修飾受容体調節因子、より具体的には修飾ステロイド受容体調節因子、さらに具体的には修飾PRまたはGR調節因子、より一層具体的にはPRまたはGRリガンド類似体、さらに具体的には修飾抗プロゲスチン（例えば修飾MFP）または修飾メソプロゲスチン（例えば修飾アソプリスニル））であり、TMおよびRMをコードする単一ベクターが、注射またはエレクトロポレーションによって対象の細胞（例えば骨格筋細胞）に投与される単一ベクターである。
【００２６】
本発明はさらに、本発明の改良された制御発現系を含むベクターおよびキットを提供する。いくつかの態様では、本発明の改良された制御発現系が一つ以上のベクターを含み、各ベクターが一つ以上の発現カセットを含む。ある態様では、本発明の改良された制御発現系が、少なくとも一つの発現カセット（より好ましくは少なくとも二つの発現カセット）を持つ単一ベクターを含む。好ましい一態様では、本発明の改良された制御発現系が、TMをコードする第1核酸配列を挿入するための少なくとも一つのクローニング部位を持つ第1発現カセットと、RMをコードする第2核酸配列を挿入するための少なくとも一つのクローニング部位を持つ第2発現カセットとを含む、単一ベクターを含む。もう一つの態様では、ベクターが、ウイルスを生産するために用いられるベクター、例えばアデノ随伴ウイルス（AAV）シャトルプラスミド、より具体的にはAAV-1シャトルプラスミドである。ある態様では、本発明のベクターが非ウイルスベクター（すなわちウイルスを生産しないベクター）、例えばウイルスを生産しないプラスミドベクターである。好ましい一態様では、ベクターが、TMをコードする配列を含む核酸配列を挿入するためのクローニング部位を含む本発明のプラスミドベクターである。そのような本発明のプラスミドベクターの例には、pGT79、pGT1003、pGT1004、pGT1005、pGT1006、pGT1007、pGT1008、pGT1009、pGT1015、pGT1016、pGT1017、pGT1025、pGT1020、pGT1021、pGT1022、pGT1023またはpGT1024が含まれるが、これらに限るわけではない。
【００２７】
本発明の発現カセットは、本発明のコードされた分子（例えばTM、RM、AM、またはIM）を発現させるための機能配列を含む。いくつかの態様では、発現カセットが、本発明の分子をコードする核酸配列に作動的に連結された少なくとも一つの機能配列を含む。機能配列の例は、5'または3'非翻訳領域（例えばUT12）、イントロン（例えばIVS8）、ポリ(A)部位（例えばSV40またはhGHポリ(A)部位）、またはDNA結合部位（DBS）（例えばGAL-4 DBS）であるが、これらに限るわけではない。ある態様では、機能配列が少なくとも一つのGAL-4 DBSを含み、好ましくはGAL-4 DBSの多量体（例えば3〜18個のGAL-4 DBS）を含む。そのような機能配列には、例えば、本発明の発現カセット中でそのような機能配列に作動的に連結された核酸配列によってコードされる分子の、それぞれ制御された発現または組織特異的発現を促進する、被制御プロモーターまたは組織特異的プロモーターをコードする配列も含まれる。もう一つの態様では、本発明の発現カセットが、本発明の分子（例えばTM、RM、AM、またはIM）をコードする核酸配列を挿入するための、少なくとも一つのクローニング部位、より好ましくはマルチクローニング部位（MCS）を含む。
【００２８】
ある態様では、本発明の第1発現カセットが、TMをコードする第1核酸配列を挿入するためのMCS、少なくとも一つのDBS（例えば3〜18個のGAL-4 DBS）を含む誘導性プロモーター、5'非翻訳領域（例えばUT12）、イントロン（例えばIVS8）、およびhGHポリ(A)部位を、第1核酸配列がMCSに挿入された時に、これらの機能配列が、その配列に作動的に連結されるような形で含む。もう一つの態様では、本発明の第2発現カセットが、制御されたRMをコードする第2核酸配列を挿入するためのMCSと、SV40ポリ(A)部位とを、第2核酸配列がMCSに挿入された時に、これらの機能配列が、その配列に作動的に連結されるような形で含む。好ましい一態様では、第1および第2発現カセットが単一ベクター中に存在する。本発明のキットは、本明細書に記載する少なくとも一つの本発明の発現系、より具体的には本発明の医薬組成物、ベクター、または分子（例えばTM、RM、AM、またはIM）の少なくとも一つと、それらの使用に関する指示とを含む。
【００２９】
本発明の上述した目的および他の目的、そのさまざまな特徴、ならびに本発明そのものは、以下の説明を添付の図面と合わせて読めば、より完全に理解されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明の制御発現系の例を表す図である。図1Aは、1）治療分子（TM）をコードする第1核酸配列と、第1核酸配列に作動的に連結されたDNA結合部位（DBS）およびTATA配列を含む第1プロモーター配列とを含む、第1発現カセット；2）制御因子分子（RM）をコードする第2核酸配列と、第2核酸配列に作動的に連結された第2プロモーター配列とを含む、第2発現カセット；3）DNA結合ドメイン（DBD）、リガンド結合ドメイン（LBD）、および制御ドメイン（RD）を含む融合タンパク質またはキメラタンパク質である、発現されたRM；ならびに4）それぞれRMを活性化するかまたはRMを不活化する、活性化因子分子または不活化因子分子（A/IM）を含む、本発明の制御発現系の限定でない例を表す図である。ある実施形態では、活性化因子分子（AM）がRMに結合してRMを活性化し、その結果、活性化されたRMが、TM配列に作動的に連結されたプロモーター配列のDBSに結合して、細胞（例えば哺乳動物細胞）におけるTM発現の誘導をもたらす。もう一つの実施形態では、第1および第2発現カセットが単一ベクター中に存在する。  図1Bは、1）TMをコードする第1核酸配列と、第1核酸配列に作動的に連結されたDBSおよびTATA配列をコードする第1プロモーター配列とを含む、第1発現カセット；2）制御因子分子（RM）をコードする第2核酸配列と、第2核酸配列に作動的に連結された第2プロモーター配列とを含む、第2発現カセット；3）DBD、LBD、および活性化ドメイン（AD）を含む融合タンパク質またはキメラタンパク質である、発現されたRM；ならびに4）活性化因子分子または不活化因子分子（A/IM）を含む本発明の制御発現系の限定でない例を表す図である。ある実施形態では、活性化因子分子（AM）がRMに結合してRMを活性化し、その結果、活性化されたRMが、TM配列に作動的に連結されたプロモーターのDBSに結合するホモ二量体を形成して、細胞（例えば哺乳動物細胞）におけるTM発現の誘導をもたらす。もう一つの実施形態では、第1および第2発現カセットが単一ベクター中に存在する。
【図２】組換えタンパク質を生成させるためのマウスIFN-yおよびヒトIFN-yプラスミドベクターを表す図である。図2AおよびBは、組換えタンパク質を生成させるため（A、pGER90（pCEP4/mIFN）および遺伝子ベースの送達を研究するため（B、pGER101（pgWiz/mIFN））のマウスIFN-y発現ベクターを表す図である。pGER90中に存在するCMVプロモーターおよびエンハンサーは、転写開始部位に対して-831bpから+1bpまで続き、5'UTRまたはイントロンを持たない。pGER101中に存在するCMV配列はプロモーター、エンハンサー、5'UTR、および天然のイントロンAを、-674bpから+942bpまでに含む。図2CおよびDは、組換えタンパク質を生成させるため（C、pGER123（pCEP4/hIFN））および遺伝子ベースの送達を研究するため（D、pGER125（pgWiz/hIFN）のヒトIFN-y発現ベクターを表す図である。
【図３】マウスにヒトIFN-y1aタンパク質を注射した後の薬物動態プロファイルを表す図である。C57Bl/6マウスに、25ng（低用量）または250ng（高用量）の組換えhIFN-y1aタンパク質を、i.v.注射またはi.m.注射によって投与した。注射後、表示の時点で行ったマウスの最終採血（terminal bleeding）後に得られる血清試料（1時点あたりn＝4匹）で、ヒトIFN-yレベルをELISA（Toray-Fugi Bio、Biosource International）によって決定した。各データポイントは平均値±標準偏差を表す。
【図４】マウスにAAV-1-hIFN-yを筋肉内注射した後の薬物動態プロファイルを表す図である。C57/Bl/6マウス（各群n＝6）に、0.5×1010、1.0x1010、または5.0×1010個のAAV-1-hIFN-yのウイルス粒子をi.m.注射した。注射後、表示の時点で血液試料を採取し、hIFN-y血清レベルをELISAによって決定した。各データポイントは平均値±標準偏差を表す。
【図５】mIFN-yによるインビトロ（L929細胞中）でのMx1 RNA誘導を表す図である。5×105細胞のL929細胞を6ウェルプレートに播種し、増加する一連の量の精製組換えmIFN-yタンパク質で刺激した。処理の4時間後に細胞を収集した。RNAを単離し、Mx1 RNAをTaqMan分析で定量した。Mx1 RNA発現量をGAPDH RNAと比較して増加倍率としてプロットする。
【図６】mIFN-yタンパク質のi.v.注射（A）またはi.m.注射（B）後のMx1 RNA誘導を表す図である。C57Bl/6マウスに、15、150、または500ngの精製組換えmIFN-yタンパク質（比活性−2.0×108単位/mg）を、i.v.注射（尾静脈経由）またはi.m.注射によって投与した（各群n＝3匹）。注射後、指定した時点で、マウスから採血し、RNAをPBMCから単離した。Mx1 RNAを定量RT-PCRによって測定した。Mx1 RNAの増加倍率を、同じ試料中で測定されるGAPDH値との比較で表す。対象には、ナイーブマウス（N）、および賦形剤緩衝液のみを注射し、注射後、2時間（V2h）または4時間（V4h）時点でMx1分析を行ったマウスが含まれる。各カラムは平均値±標準偏差を表す。
【図７】マウスIFN-yタンパク質のi.v.注射またはi.m.注射後のIP-10（A）およびJE（B）の誘導レベルを表す図である。C57Bl/6マウスに、15、150、または500ngの精製組換えmIFN-yタンパク質（比活性＝2.0×108単位/mg）を、i.v.注射（尾静脈経由）またはi.m.注射によって投与した（各群n＝3匹）。注射後、2、4、6、12、24、および48時間の時点で、マウスから採血し、IP-10およびJEの血漿レベルをELISA（R&D Systems）によって測定した。
【図８】マウスにおけるAAV-1-mIFN-y DNAの筋肉内注射後またはmIFN-yプラスミドDNAの筋肉内注射およびエレクトロポレーション（EP）後のIP-10の誘導を表す図である。正常マウス（C57Bl/6）に、AAV-1-mIFN-y（5x109個のウイルス粒子）をi.m.注射するか、またはmIFN-yプラスミドDNA（150μg）をi.m.注射してエレクトロポレーションを行った。表示の時点でマウスから採血し、血漿中のIP-10レベルをELISAで決定した。各カラムは平均値±標準偏差を表す（各群n＝5匹）。
【図９】mIFN-yプラスミドDNAの筋肉内注射後のMx1 mRNAの誘導を表す図である。マウスの後肢腓腹筋および脛骨筋に、異なる量の、mIFN-yをコードするプラスミドDNA（62.5、125、250、または500μg）を筋肉内注射した後、エレクトロポレーションを行った（各群n＝5）。注射後、指定した時点で、マウスから採血し、PBMCからRNAを単離し、定量RT-PCRによってMx1発現量を決定した。Mx1 RNAレベルをGAPDH発現量に対して標準化し、無処置対照（対照、n＝4）と比較して、0日目に測定されたバックグラウンドに対する誘導倍率として表す。各カラムは平均値±標準偏差を表す
【図１０】マウスにおけるAAV-1-mIFN-yウイルスの筋肉内注射後またはmIFN-yプラスミドDNAの筋肉内注射およびエレクトロポレーション後のMx1 mRNAの誘導を表す図である。正常マウス（C57Bl/6）に、AAV-1-mIFN-y（5x1010個のウイルス粒子）をi.m.注射するか、またはmIFN-yプラスミドDNA（150μg）をi.m.注射してエレクトロポレーションを行った。対照には、PBS注射マウス（i.m.対照）、およびSEAPプラスミド（pSEAP）またはSEAPを発現するAAV-1（AAV-SEAP）を注射したマウスを含めた。表示の時点でマウスから採血し、PBMCから単離したRNA中のMx1 RNAレベルを定量RT-PCRによって決定した。Mx1 RNA発現量をGAPDH発現量に対して標準化し、PBSを注射した対照マウスで0日目に測定されたバックグラウンドに対する誘導倍率として表す。各カラムは平均値±標準偏差を表す（各群n＝5匹）。
【図１１】マウス急性EAEモデル（実施例5および「材料と方法」A節に記載）におけるIFN-yタンパク質の効力を表す図である。100K単位のIFN-yで処置されたマウスでは、賦形剤処置マウスと比較して、EAEの臨床スコアが有意に低下した（p＝0.0046）。30K単位のIFN-yで処置したマウスでも賦形剤処置マウスと比較して臨床スコアが低下したが、この低下は統計的に有意な水準には達しなかった。この研究における陽性対照メソプラムおよびプレドニゾロンも、臨床スコアを有意に低下させた。
【図１２】マウス急性EAEモデルにおけるmIFN-yの遺伝子ベースの送達の効力を表す図である。「材料と方法」で詳述するように、雌SJLマウスを1日目にPLP/百日咳毒素で免疫した。研究2日目に、マウス群（各群n＝10）に、PBS、ヌルプラスミド（pNull）＋エレクトロポレーション（EP）（pNull＋EP、120μg）、またはmIFN-yをコードするプラスミドDNA（pmIFN-y）＋EP（pmIFN-y＋EP、120μg）を注射した。タンパク質送達のために、もう一つの動物群に、組換えmIFN-yタンパク質（100,000単に）をs.c.注射によって、研究1日目から始めて一日おきに投与した。pNull＋EP対照群と比較してpmIFN-y＋EPでは、疾患重症度の有意な低下が観察された（p＝0.0171）。これらの研究結果は「材料と方法」で詳しく説明する。
【図１３】実施例5および「材料と方法」で詳述するマウス急性EAEモデルにおけるIFN-yタンパク質の効力を表す図である。
【図１４】本発明の1プラスミド制御発現ベクターの限定でない例である、プラスミドベクターpGT1、pGT2、pGT3、およびpGT4（それぞれA、B、C、D）を表す図である。これらの例では、本発明の制御発現ベクターが、単一プラスミドベクター中に、1）治療分子（TM）をコードする核酸を挿入するためのマルチクローニング部位（MCS）を持つ第1発現カセットと、2）制御因子分子（RM）をコードする核酸を挿入するためのクローニング部位を持つ第2発現カセットとを含有する。これら4つのベクターでは、それぞれ、ここに説明し、図解するように、第1発現カセットおよび第2発現カセットが互いに関して異なる方向を持っている。第1発現カセットでは、プラスミドpLC1674由来の骨格筋プロモーター（skアクチンpro）、非翻訳領域12（UT12）、介在配列8（IV8）が、MCSおよびヒト成長ホルモンポリ(A)部位（hGHポリA）の上流に配置される。目的の治療分子（TM）を含む核酸、例えば導入遺伝子は、MCSに挿入することができる。
【図１５】マウスIFN-y（pGT23、pGT24、pGT25、およびpGT26）（A）またはヒトIFN-y（pGT27、pGT28、pGT29、およびpGT30）（B）の遺伝子ベースの送達を行うための、本発明の制御発現プラスミドベクターの限定でない例を表す図である。これらの例では、本発明の制御発現ベクターが、単一プラスミドベクター中に、1）マルチクローニング部位（MCS）と、そのMCSに挿入された、ヒトIFN-y遺伝子またはマウスIFN-y遺伝子のどちらか一方をコードする核酸とを持つ、第1発現カセット、および2）クローニング部位と、その部位に挿入された、（例えば配列番号22のアミノ酸配列を含む、または配列番号21の核酸配列によってコードされる）プロゲステロン受容体の修飾LBDを含有する制御因子分子（RM）をコードする核酸とを持つ、第2発現カセットを含有する。これらのベクターでは、それぞれ、「材料と方法」F節で詳述するとおり、ここに説明し、図解するように、第1発現カセットおよび第2発現カセットが互いに関して異なる方向を持っている。
【図１６】実施例6のC節で詳述するマウス骨格筋細胞における本発明のhIFN-y制御発現プラスミドベクターのインビトロ検証を表す図である。構成的（pGER125）および誘導性（pGT27、pGT28、pGT29、およびpGT30）hIFN-yプラスミドベクターをマウス筋C2C12細胞にトランスフェクトし、MFP（10nM）で処理し、培地を集めた。培地をhIFN-yについてELISAでアッセイした。2回の独立したトランスフェクションの平均を示す。プラスミドベクターpGS1694＋pGER129は、本発明者らがhIFN-y遺伝子を挿入したValentisの2プラスミド系である。RMカセットの上流または下流にフォワード向き（hIFN，y）またはリバース向き（hIFNr，y）のhIFN-y遺伝子を持つ本発明の制御発現ベクターを構築した。
【図１７】実施例6のC節で詳述するマウス骨格筋細胞における本発明のmIFN-y制御発現プラスミドベクターのインビトロ検証を表す図である。構成的（pGER101）および誘導性（pGT23、pGT24、pGT25、およびpGT26）mIFN-y発現プラスミドを、マウス筋C2C12細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間（hr）後に、MFP（10nM）を含むまたは含まない新鮮培地で、培地を置き換えた。24時間後に培地を集め、レポーター遺伝子アッセイにより、mIFN-yについてアッセイした。チャートは3回の独立したトランスフェクションの平均を表す。pGS1694＋pGER127は、本発明者らがmIFN-y遺伝子を挿入したValentisの2プラスミド系である。RMカセットの上流または下流にフォワード向き（mIFN，y）またはリバース向き（mIFNr，y）のmIFN-y遺伝子を持つ本発明の制御発現ベクターを構築した。
【図１８】本発明のpBRES-1 mIFN-y制御発現系を使ったインビボでのMx1 RNA誘導を表す図である。構成的（pGER101）および誘導性制御発現（pGT26）mIFN-yプラスミドベクターを、マウスの脛骨筋および腓腹筋中に注射し、エレクトロポレートした（1匹あたり150μg）。注射の7日後に血液を集めた。注射の7日後〜10日後に、1日1回、経口胃管法により、マウスをMFP（0.33mg/kg）で処置した。注射の11日後および18日後に血液を集めた。PBMCを血液から単離し、PBMCからRNAを調製し、RT-PCRでアッセイしてMx1 RNAのレベルを決定した。Mx1発現レベルをGAPDHに対して標準化した。結果を平均（各群n＝5匹）±標準偏差として表す。「材料と方法」C節で詳述するように、結果は、pBRES-1-mIFNを使った場合に、7日時点では、MFPの非存在下でMx1 RNAの活性はほとんどまたは全くなく、11日時点では、MFPの存在下でCMV-mIFNによるものより高いレベルまで強く誘導されることを示している。18日時点では、MFPの非存在下で、Mx1 RNAはほぼベースラインまで減少した。
【図１９】本発明のpBRES-1 mIFN-y制御発現系によるIP-10およびJE誘導を表す図である。構成的（pGER101）および誘導性pBRES-1（pGT26）mIFN発現プラスミドをC57Bl/6マウスの後肢筋中に注射し、エレクトロポレートした。7日目（MFPの非存在下）、11日目（4日間連続でMFPを経口投与した後）、および18日目に、動物から採血し、血漿をケモカインIP-10およびJEについてELISAでアッセイした。結果を平均（各群n＝5匹）±標準偏差として表す。「材料と方法」C節で詳述するように、結果は、pBRES-1-mIFNを使った場合に、7日時点では、MFPの非存在下でケモカイン（IP-10およびJE）の活性はほとんどまたは全くなく、11日時点では、MFPの存在下でCMV-mIFNによるものより高いレベルまで強く誘導されることを示している。18日時点では、MFPの非存在下で、ケモカインはベースラインに戻った。
【図２０】「材料と方法」F節で詳述するプラスミドベクターpGER（pgWiz/mIFN）（C）の構築に使用したプラスミドベクターpbSER189（A）およびpgWIZ（B）を表す図である。
【図２１】「材料と方法」F節で詳述するプラスミドベクターpGER125（pgWiz/hIFN）を表す図である。
【図２２】「材料と方法」F節で詳述するプラスミドベクターpGene/V5-HisAを表す図である。
【図２３】「材料と方法」F節で詳述するプラスミドベクターpGene-mIFN（pGER127）を表す図である。
【図２４】「材料と方法」F節で詳述するプラスミドベクターpGene-hIFN（pGER129）を表す図である。
【図２５】「材料と方法」F節で詳述するプラスミドベクターpSwitch（Invitrogen）を表す図である。
【図２６】「材料と方法」F節で詳述するプラスミドベクターpGS1694を表す図である。
【図２７】「材料と方法」F節で詳述するプラスミドベクターpLC1674を表す図である。
【図２８】「材料と方法」F節で詳述するpGT-hGMCSFおよびpGT-mGMCSFシャトルプラスミドならびにその構築を表す図である。
【図２９】「材料と方法」F節で詳述するpZac2.1-RM-hGMCSFおよびpZac2.1-RM-mGMCSFシャトルプラスミド（A）ならびにpZac2.1-CMV-hGMCSF（pGT713）およびpZac2.1-CMV-mGMCSF（pGT714）シャトルプラスミド（B）と、その構築とを表す図である。
【図３０】「材料と方法」F節で詳述するpZac2.1-RM-hGMCSFおよびpZac2.1-RM-mGMCSFの構築にそれぞれ使用したpORF-hGMCSFおよびpORF9-mGMCSFを表す図である。
【図３１】「材料と方法」F節で詳述するpGT715（A）およびpGT716（B）シャトルプラスミドを表す図である。
【図３２】本発明のmIFN-y制御発現プラスミドベクターによるインビボでのIP-10誘導を表す図である。誘導性（pGT23、pGT24、pGT25、およびpGT26）mIFN-y発現プラスミドをC57Bl/6マウスの後肢筋中に注射し、エレクトロポレートした。7日目（MFPの非存在下）、11日目（4日間連続でMFPを経口投与した後）、および18日目に、動物から採血し、血清をケモカインIP-10についてELISAでアッセイした。結果を平均（各群n＝5匹）±標準偏差として示す。
【図３３】本発明のhIFN-y制御発現プラスミドベクターによるインビボでのhIFN誘導を表す図である。構成的（pGER125）および誘導性（pGT27、pGT28、pGT29、およびpGT30）hIFN-y発現プラスミドをC57Bl/6マウスの後肢筋中に注射し、エレクトロポレートした。7日目（MFPの非存在下）、11日目（4日間連続でMFPを経口投与した後）、および18日目に、動物から採血し、血清をhIFNについてELISAでアッセイした。結果を平均（各群n＝5匹）±標準偏差として示す。
【図３４】図34Aは本発明のhEPO制御発現プラスミドベクターによるインビボでのhEPO誘導を表す図である。誘導性2プラスミド（pGS1694＋pEP1666）および1プラスミドBRES-1（pGT27、pGT28、pGT29、およびpGT30）hEPO発現プラスミドを、C57Bl/6マウスの後肢筋中に注射し、エレクトロポレートした。各群の5匹に、4日間連続（7〜10日）して、MFPをi.p.注射によって投与し、最後のMFP注射の6時間後に、全ての動物から採血した。各群の残りの5匹は、MFP処置の非存在下で10日目に採血した。血清をhEPOについてELISAでアッセイした。結果を平均（各群n＝5匹）±標準偏差として表す。  図34Bは本発明のhEPO制御発現プラスミドベクターによるインビボでのヘマトクリット値の誘導を表す図である。誘導性2プラスミド（pGS1694＋pEP1666）および1プラスミドBRES-1（pGT27、pGT28、pGT29、およびpGT30）hEPO発現プラスミドを、C57Bl/6マウスの後肢筋中に注射してエレクトロポレートし、上述のように動物をMFPで処置するか、無処置のままにしておき、採血した。マイクロキャピラリー管中で血液を凝固させ、遠心分離して、％赤血球（RBC）を測定した。結果を平均（各群n＝5匹）±標準偏差として表す。
【図３５】本発明のhIFN-y制御発現AAVベクターによるインビボでの長期持続性多重hIFN誘導を表す図である。誘導性hIFN-y発現AAVベクターAAV-1-GT58をC57Bl/6マウスの後肢筋に注射した。表示のとおりMFPの非存在下または存在下（連続4日間のi.p.注射）で動物から採血し、血清をhIFNについてELSIAでアッセイした。結果を平均（各群n＝5匹）±標準偏差として表す。
【図３６】本発明のmIFN-y制御発現プラスミドベクターの反復投与により、インビボで、MFPの増加する一連の投薬量に応答して起こる、長期持続性多重IP-10誘導を表す図である。誘導性mIFN-y発現プラスミドpGT26を、0日目に、C57Bl/6マウスの後肢筋中に注射し、エレクトロポレートした。動物に、さまざまな濃度のMFPを4日間連続（7〜10日目および63〜66日目）でi.p.注射によって投与した後、翌日（11日目および67日目）に採血した。プラスミドDNAを77日目および189日目に再注射した。プラスミド再注射後のMFP処置はそれぞれ84〜87日目および196〜199日目に行った。採血はそれぞれ88日目および200日目に行った。血清をケモカインIP-10についてELISAでアッセイした。結果を平均（各群n＝5匹）として表す。
【図３７】図37Aは本発明のhIFN-y制御発現AAVベクターによるインビボでのhIFN誘導の動態を表す図である。誘導性hIFN-y発現AAVベクターAAV-1GT58をC57Bl/6マウスの後肢筋中に注射した。動物に4日間連続してi.p.注射によってMFPを投与した後、チャート内に示すように、最初のMFP注射後のさまざまな時点で、採血した。血清をhIFNについてELISAでアッセイした。結果を平均（各群n＝5匹）±標準偏差として表す。  図37Bは、本発明のhIFN-y制御発現AAVベクターによるインビボでのhIFN脱誘導の動態を表す図である。誘導性hIFN-y発現AAVベクターAAV-1GT58をC57Bl/6マウスの後肢筋中に注射した。動物に4日間連続してi.p.注射によってMFPを投与し、チャート内に示すように、最後のMFP注射後のさまざまな時点で、採血した。血清をhIFNについてELISAでアッセイした。結果を平均（各群n＝5匹）±標準偏差として表す。  図37Cは、本発明のmIFN-y制御発現プラスミドベクターによる、パルス的または慢性的なMFP処置に応答して起こるmIFNの誘導および脱誘導、ならびに数ヶ月にわたる遺伝子発現の持続を表す図である。構成的（pGER101、CMV）および誘導性（BRES-1、pGT26）mIFN発現プラスミドをマウスの後肢筋中に注射し、エレクトロポレーションを行い、チャートに表示するとおり、MFP処置前、MFP処置中、またはMFP処置後のさまざまな時点に、動物から採血した。血清をケモカインIP-10についてELISAでアッセイした。結果を平均（各群n＝5匹）として表す。
【図３８】本発明のmIFN-y制御発現プラスミドベクターによるインビボでのMx-1誘導を表す図である。誘導性mIFN-y発現プラスミドpBRES-1 mIFN（pGT26）またはpBRES-1 Null-MFP（対照）プラスミドを、急性EAEを持つSJLマウスの後肢筋中に注射し、エレクトロポレートした。プラスミドの注射後、マウスを、1日1回（d）または3日に1回（etd）のi.p.注射により、MFP（0.33mg/kg）で処置した。注射後、5日目に血液を集めた。PBMCを血液から単離し、そこからRNAを調製し、Mx1 RNAのレベルを決定するためにRT-PCRでアッセイした。Mx1発現レベルをGAPDHに標準化した。結果を平均±標準偏差として示す。
【図３９】制御因子分子（RM）と治療分子（TM）またはレポーター遺伝子とを単一プラスミド上に併せ持つ制御発現系を表す図である。RMおよびTM/レポーター遺伝子には4つの異なる方向が考えられる。一例としてpGT79の方向を示す。
【図４０】本発明の制御発現系の活性化の全体像を示す。AMはRMに結合し、その二量体化と核内へのトランスロケーションとを誘導する。このように形成されたAM/RM複合体は被制御プロモーターに結合し、TMまたはレポーター遺伝子の転写を活性化する。
【図４１】指向的スクリーニング（directed screen）（実施例10および11参照）において、その構造の保存的変化を特徴とし、より強力な抗プロゲスチン化合物と類似する抗プロゲスチン様構造を保持していると同定された8個の化合物による、ルシフェラーゼ発現の誘導を表す図である。マウス線維芽細胞NIH3T3細胞にpBRES-Lucプラスミドを一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後に、細胞を、濃度1、10および100nMのMFPまたは試験化合物で処理した。24時間の処理後に、発現されたルシフェラーゼレポーターの量を測定することによって、RM活性化の程度を決定した。
【図４２】指向的スクリーニングにおいて、その構造の保存的変化を特徴とし、より強力な抗プロゲスチン化合物と類似する抗プロゲスチン様構造を保持していると同定された8個の化合物による、プロゲステロン受容体活性の阻害を表す図である。PRリッチなヒトT47D細胞を、96ウェルプレートに播種し、一晩、接着させた。10％FBSを含有する増殖培地を、フェノール不含培地および3％活性炭処理済みFBSを含有するアッセイ培地と交換した。翌日、200pMプロメゲストン（PMG）（T47D細胞中でアルカリホスファターゼ（AP）の発現をPR経路によって刺激するPRアゴニスト）の存在下、細胞を、濃度0.1、1および10nMのMFPまたは試験化合物で、24時間処理した。処理された細胞の溶解物中のAP活性を、パラ-ニトロフェニルホスフェートを加水分解するその能力により、発色アッセイで測定した。抗プロゲスチンはPRへの結合に関してPMGと競合し、T47D細胞におけるAPの発現を阻害する。この阻害の程度を、最も強力な化合物（例えばMFP）がPR依存的なAP発現を100％阻害できるものとして、阻害パーセントの形で表す。
【図４３】A）構造に基づく（structure-guided）突然変異誘発アプローチのために選択されたBLX-913化合物；B）先進的臨床候補アソプリスニル；C）臨床的に承認された抗プロゲスチン・ミフェプリストン；D）プロゲステロンの構造を示す。BLX-913構造とアソプリスニル構造の間の類似性は、アソプリスニルに関する安全性データとBLX913に関する安全性データの間の強い相関を示唆する。
【図４４】強力な抗プロゲスチン・ミフェプリストン（MFP）および新しい活性化分子候補化合物BLX-913による、PR誘導アルカリホスファターゼ（AP）活性の阻害を表す図である。PRリッチなヒトT47D細胞を96ウェルプレートに播種し、一晩、接着させた。10％FBSを含有する増殖培地を、フェノール不含培地および3％活性炭処理済みFBSを含有するアッセイ培地と交換した。翌日、200pMプロメゲストン（PMG）（T47D細胞中でアルカリホスファターゼ（AP）の発現をPR経路によって刺激するPRアゴニスト）の存在下、細胞を、MFPまたはBLX-913で、24時間処理した。処理された細胞の溶解物中のAP活性を、パラ-ニトロフェニルホスフェートを加水分解するその能力により、発色アッセイで測定した。抗プロゲスチンはPRへの結合に関してPMGと競合し、T47D細胞におけるAPの発現を阻害するので、抗プロゲスチン濃度が高いほど、AP活性の速度が低くなる。
【図４５】MFPとの複合体を形成したGRのX線結晶構造（1NHZ.pdb）に基づく、MFPとの複合体を形成したRM LBDのホモロジーモデルの立体像を示す。
【図４６】RM LBDのLBP中に結合したBLX-913の予測モデルの立体像を示す。BLX-913の11β-ベンズアルドキシム置換基とRMのトリプトファン755側鎖の間の衝突を破線で示す。
【図４７】元のRMタンパク質の活性化と比較して改善された、BLX-913によるW755A突然変異体RMの活性化を表す図である。ヒト胎児腎臓（HEK293）細胞に、719位または755位に突然変異を持つpBRES-Lucプラスミドを、wt-pBRES（pGT79）コンストラクトと並行して、一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後に、細胞を96ウェルプレートに再播種し、翌日、濃度1、10および100nMのBLX-913化合物で処理した。24時間の処理後に、発現されたルシフェラーゼレポーターの量を測定することによって、RM活性化の程度を決定した。
【図４８】元のRMタンパク質の活性化と比較して改善された、BLX-913によるV729L/W755A突然変異体RMの活性化を表す図である。ヒト胎児腎臓（HEK293）細胞に、729位および/または755位に突然変異を持つpBRES-Lucプラスミドを、wt-pBRES（pGT79）コンストラクトと並行して、一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後に、細胞を96ウェルプレートに再播種し、翌日、濃度1、10および100nMのBLX-913化合物で処理した。24時間の処理後に、発現されたルシフェラーゼレポーターの量を測定することによって、RM活性化の程度を決定した。
【図４９】BLX-913に対するRM突然変異体の用量応答を表す図である。ヒト胎児腎臓（HEK293）細胞に、729位および/または755位に突然変異を持つpBRES-Lucプラスミドを、wt-pBRES（pGT79）コンストラクトと並行して、一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後に、細胞を96ウェルプレートに再播種し、翌日、濃度1μMまでのBLX-913化合物で処理した。24時間の処理後に、発現されたルシフェラーゼレポーターの量を測定することによって、RM活性化の程度を決定した。
【図５０】LBD突然変異がRMタンパク質レベルに及ぼす影響を表す図である。HEK293細胞中で野生型（pGT79）(レーン1）、W755A（pGT1009）（レーン2）およびV729L/W755A（pGT1017）（レーン3）pBRESコンストラクトから発現されるRMタンパク質のレベルを示す。各RMタンパク質を発現させる細胞溶解物を等量ずつ10％SDS-PAGEで分割し、HEK293細胞中の内在性p65タンパク質（65kDa）およびRMタンパク質（70kDa）を認識するウサギ抗NF-κB p65Ab（1：200、Santa Cruz、sc-372）を使って、ウェスタンブロット上で可視化した。
【図５１】15位および16位に修飾を持つ四つのMFP類似体構造を示す。
【図５２】15位および16位に修飾を持つ四つのMFP類似体によるプロゲステロン受容体活性の阻害を表す図である。PRリッチなヒトT47D細胞を96ウェルプレートに播種し、一晩、接着させた。10％FBSを含有する増殖培地を、フェノール不含培地および3％活性炭処理済みFBSを含有するアッセイ培地と交換した。翌日、200pMプロメゲストン（PMG）（T47D細胞中でアルカリホスファターゼ（AP）の発現をPR経路によって刺激するPRアゴニスト）の存在下、細胞を、濃度0.1、1および5nMのMFPまたは試験化合物で、24時間処理した。処理された細胞の溶解物中のAP活性を、パラ-ニトロフェニルホスフェートを加水分解するその能力により、発色アッセイで測定した。抗プロゲスチンはPRへの結合に関してPMGと競合し、T47D細胞におけるAPの発現を阻害する。この阻害の程度を、最も強力な化合物（例えばMFP）がPR依存的なAP発現を100％阻害できるものとして、阻害パーセントの形で表す。
【図５３】4位および7位に修飾を持つMFPおよびアソプリスニル類似体の構造を示す。
【図５４】4位および7位に修飾を持つMFP類似体によるプロゲステロン受容体活性の阻害を表す図である。PRリッチなヒトT47D細胞を96ウェルプレートに播種し、一晩、接着させた。10％FBSを含有する増殖培地を、フェノール不含培地および3％活性炭処理済みFBSを含有するアッセイ培地と交換した。翌日、200pMプロメゲストン（PMG）（T47D細胞中でアルカリホスファターゼ（AP）の発現をPR経路によって刺激するPRアゴニスト）の存在下、細胞を、濃度1、10および100nMのMFPまたは試験化合物で、24時間処理した。処理された細胞の溶解物中のAP活性を、パラ-ニトロフェニルホスフェートを加水分解するその能力により、発色アッセイで測定した。抗プロゲスチンはPRへの結合に関してPMGと競合し、T47D細胞におけるAPの発現を阻害する。この阻害の程度を、最も強力な化合物（例えばMFP）がPR依存的なAP発現を100％阻害できるものとして、阻害パーセントの形で表す。
【図５５】pBRES発現系の模範的でありかつ限定でない実施形態を表す図である。この実施形態では、RMへのMFPの結合がRMを活性化して、その後のpBRES発現系からのTMの発現をもたらす。MFPは、いくつかの内在性ヒトステロイド受容体に対してアンタゴニストであることがわかっており、不必要な副作用を潜在的にもたらしうる。
【図５６】新規な活性化因子分子および制御因子分子をスクリーニングするための模範的でありかつ限定でないアプローチを表す図である。（1）化合物上の立体的またはイオン的摂動の存在により内在性ヒトPRと相互作用しないPRリガンド類似体の指向的スクリーニングから新しいAMを同定する。（2）モデリングに基づく（modeling guided）突然変異誘発法を使って、RMのLBP中に補償的突然変異を導入し、それによって改変RM分子を作出する。(3）新しいAMを改変RMと一緒に使って、改善された性質（例えばTM発現の特異的かつ緻密な制御、および内在性タンパク質（特に内在性ヒトタンパク質、例えば内在性ヒトステロイド受容体）に対する不必要な副作用の減縮もしくは改善、またはそれら内在性タンパク質との交差反応性の減縮もしくは改善）を持つ活性なAM-RM複合体を作り出す。この模範的でありかつ限定でないアプローチは、新規不活化因子分子のスクリーニングにも使用することができる。
【図５７】二つ以上の中等度に選択的なAM-RMペアからSARを使って高度に選択的なAM-RM複合体を開発するための模範的でありかつ限定でないアプローチを表す図である。(1）図57に概説したアプローチを使って新しいAM1を同定し、補償的突然変異をRMのLBP内にある領域1に組み込んで、中等度に選択的なAM1-RM1複合体を作出する。（2）新しいAM2を図57に概説したアプローチを使って同定し、補償的突然変異をRMのLBP内にある領域2に作製して、中等度に選択的なAM2-RM2複合体を作出する。（3）化学合成を使って、AM1とAM2に由来する選択性付与修飾を一つの化合物AM3中で組み合わせる。LBP内の領域1および領域2にある補償的突然変異を、部位特異的突然変異誘発を使って、単一のRM3コンストラクト内で組み合わせる。二つ以上の選択性付与特徴を利用することにより、AM3をRM3と一緒に使用すると、AM1またはAM2と比較して大きな選択性を持つAM-RM複合体が得られる。この模範的でありかつ限定でないアプローチは、高度に選択的なIM-RM複合体を開発するためにも使用することができる。
【図５８】C2C12マウス筋細胞における、wtまたはV729L/W755A(*)RPを持つpBRESからのルシフェラーゼ発現の誘導を示す。各コンストラクト内でのRP遺伝子の方向（中空の矢印）およびルシフェラーゼ遺伝子の方向（中実の矢印）を示す。
【図５９】C2C12マウス筋細胞における、wtまたはV729L/W755A(*)RPを持つpBRESからのmSEAP発現の誘導を示す。各コンストラクト内でのRP遺伝子の方向（中空の矢印）およびmSEAP遺伝子の方向（中実の矢印）を示す。
【図６０】C2C12マウス筋細胞における、wtまたはV729L/W755A(*)RPを持つpBRESからのhIFNb発現の誘導を示す。各コンストラクト内でのRP遺伝子の方向（中空の矢印）およびhIFNb遺伝子の方向（中実の矢印）を示す。
【図６１】BLX-913/改変RP系のインビボ試験の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本明細書で言及する参考文献は、例えば特許、特許出願、雑誌、単行本、およびウェブサイト公開を含めて、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる。
【００３２】
略号
AAV（アデノ随伴ウイルス）
AAV-1（アデノ随伴ウイルス、血清型1）
AAV-2（アデノ随伴ウイルス、血清型2）
AM（活性化因子分子）
AMP（アンピシリン）
bp（塩基対）
BRES-1（バーレックス（Berlex）制御発現系1）
BGH（ウシ成長ホルモン）
CMV（サイトメガロウイルス）
DBD（DNA結合ドメイン）
DNA（デオキシリボ核酸）
EAE（実験的アレルギー性脳脊髄炎）
enh（エンハンサー）
E1b TATA（アデノウイルスE1b遺伝子プロモーターTATAボックス）
EBNA-1（エプシュタイン・バーウイルス核抗原）
EDTA（エチレンジアミン四酢酸）
EF-1α（伸長因子-1アルファ）
ELAM（内皮白血球接着分子）
ELISA（酵素結合免疫吸着アッセイ）
EP（エレクトロポレーション）
EPO（エリスロポエチン）
GAL-4（酵母GAL-4タンパク質）
6×GAL-4（6コピーのGAL-4 DNA結合部位）
GAPDH（グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ）
GMCSF（顆粒球マクロファージ刺激因子）
hGMCSF（ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）
hIFN（ヒトインターフェロン）
hIFN-β（ヒトインターフェロンβ）
hr（時間）
HR（ホルモン受容体）
HRE（低酸素応答エレメント）
hGH（ヒト成長ホルモン）
hPR（ヒトプロゲステロン受容体）
HTLV（ヒトT細胞リンパ球向性ウイルス）
HSV（単純ヘルペスウイルス）
Hygro（ハイグロマイシン）
IFN-β（インターフェロンβ）
IFN-β1a（インターフェロンβ1a）
IFNβ1b（インターフェロンβ1b）
IFN sig seq（インターフェロンシグナル配列）
IgΚ（免疫グロブリンカッパ）
i.m. またはIM（筋肉内）
inj.（注射）
INRまたはinr（転写開始エレメント）
IP-10またはIP-10（インターフェロン-アルファ誘導性タンパク質10）
ITR（逆方向末端反復配列）
i.p.またはIP（腹腔内）
IVS8（介在配列またはイントロン8）
i.v.またはIV（静脈内）
JE（MCP-1のマウス類似体）
kDA（キロダルトン）
kan（カナマイシン）
KanR（カナマイシン耐性遺伝子）
LBD（リガンド結合ドメイン）
LBP（リガンド結合ポケット）
MCP-1（単球化学誘引物質タンパク質）
MCS（マルチクローニング部位）
MFP（ミフェプリストン）
mg（ミリグラム）
mGMCSF（マウス顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）
mIFN（マウスインターフェロン）
mIFN-β（マウスインターフェロン-ベータ）
ml（ミリリットル）
min（分）
MCK（筋クレアチンキナーゼ）
Mx1（MxAのマウスホモログ）
MxA（ヒトミクソウイルスタンパク質）
ng（ナノグラム）
ORF（オープンリーディングフレーム）
Ori（複製起点）
OriP（エプスタイン・バーウイルスの複製起点）
pBRES（プラスミド・バーレックス制御発現系）
p65（NFカッパB p65タンパク質の転写制御ドメイン）
PBS（リン酸緩衝食塩水）
PEG（ポリエチレングリコール）
PINC（保護的相互作用性非凝集性（Protective Interacting Non-Condensing）ポリマー）
pg（ピコグラム）
pk（薬物動態）
ポリAまたはポリ(A)（ポリアデニル化部位）
PR（プロゲステロン受容体）
pro（プロモーター）
P TK（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子のプロモーター）
pUC ori（pUCプラスミドの複製起点）
r（リバース）
RM（制御因子分子）
RNA（リボ核酸）
rpm（回転毎分）
RT（室温）
s.c.またはSC（皮下）
SEAP（分泌型アルカリホスファターゼ）
SHR（ステロイドホルモン受容体）
shRNA（低分子ヘアピンRNA）
siRNA（低分子干渉RNA）
skアクチンpro（骨格筋プロモーター）
SkMまたはSk（骨格筋）
SV40（シミアンウイルス40）
TK（チミジンキナーゼ）
TKpA (チミジンキナーゼポリA）
TM（治療分子）
UbiB（ユビキチンB）
μg（マイクログラム）
5'UTR（5'非翻訳領域）
UT12（非翻訳領域12）
VP-16（ヘルペスウイルスVP-16トランス活性化ドメイン）
vol.（体積）
WPRE（ウッドチャック転写後制御因子エレメント）。
【００３３】
技術用語および科学用語
本明細書で使用する技術用語および科学用語は、別段の定義がない限り、本発明が関係する技術分野の通常の知識を持つ者が共通して理解している意味を持つ。本明細書では当業者に知られるさまざまな方法論に言及する。そのような既知の方法論を説明する刊行物および他の材料であって本明細書で言及するものは、あたかも完全に記載されたかのように、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる。組換えDNA技術の一般原理を説明している標準的な参考図書には、Sambrook, J.ら（1989）「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」（第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、ニューヨーク州プランビュー）；McPherson, M.J.編 (1991）「Directed Mutagenesis: A Practical Approach」（IRL Press、オックスフォード）；Jones, J. (1992）「Amino Acid and Peptide Synthesis」（Oxford Science Publications、オックスフォード）；Austen, B.M.およびWestwood, O.M.R. (1991）「Protein Targeting and Secretion」（IRL Press、オックスフォード）が含まれる。本発明を実施する際には、当業者に知られる任意の適切な材料および/または方法を利用することができるが、好ましい材料および/または方法について説明する。以下の説明で言及される材料、試薬などは、別段の注記がない限り、商業的供給源から入手することができる。
【００３４】
制御発現系
本発明の改良された制御発現系は、対象の細胞に送達されてその細胞中で発現されうる治療分子（TM）をコードする核酸を、発現されるTMの発現および/または活性が制御され、疾患の処置に関してその対象に治療的利益を与えるような形で提供する、極めて革新的な技術である。特に本発明は、改良された性質を持つ新しい活性化因子分子（AM）、不活化因子分子（IM）、および制御因子分子（RM）を提供する。
【００３５】
例えば、本発明の新しいAMおよびIMの利点は、それらが、当該選択性を強化する修飾（例えばRM LBD中の修飾、より具体的にはRM LBP中の修飾）を持つRMに、選択的に結合することにある。したがって本発明の新しいAMおよびIMは、本発明のRMと選択的に結合するか、または他の形で相互作用し、内在性タンパク質、特に内在性ヒトタンパク質、例えば受容体、より具体的にはステロイド受容体、さらに具体的にはPRまたはグルココルチコイド受容体（GR）との交差反応性を減少させまたは排除する、改良された性質を持つ。いくつかの実施形態では、本発明の新しいAMまたはIMがRM調節因子、特に修飾受容体調節因子、より具体的には修飾ステロイド受容体調節因子、さらに具体的には修飾PRまたはGR調節因子、例えばそれぞれPRまたはGRリガンド類似体である。ある実施形態では、PRリガンド類似体が、修飾LBD（より具体的には修飾LBP）を持つRMに選択的に結合し、例えば内在性PRもしくは他の内在性ステロイド受容体との交差反応性、堕胎活性、または避妊活性などに関係する副作用が減少しているか、またはそのような副作用を持たない。
【００３６】
より具体的には、本発明の制御発現系の利点は、TMの発現および/または活性を調節して、TM発現および/またはTM活性を増加もしくは減少させ、またはオンおよびオフにすることができるように、本発明の新しいAM、IM、およびRMが、対象の細胞におけるTM（例えばタンパク質または核酸）の緻密に調節された発現をもたらすことにある。重要なことに、本発明のAMおよびIMは、内在性タンパク質よりもRMに対して、改善された選択性を持つ。
【００３７】
いくつかの実施形態では、RMのリガンド結合ドメイン（LBD）、より具体的にはリガンド結合ポケット（LBP）が、改善された特異性および選択性でAMを結合しかつ/またはそのAMに応答するように修飾される。いくつかの実施形態では、AMが、AMに選択的に結合するように修飾されたユニークなRMに結合する。例えば本発明のAMは、RMに選択的に結合しかつ/またはRMを選択的に活性化し、内在性タンパク質、例えば受容体、より具体的にはステロイド受容体、さらに具体的にはPRまたはGRにはほとんどまたは全く影響を持たないAMであることができるが、これに限るわけではない。また、例えば本発明のRMは、AMと特異的に結合しかつ/または他の形で相互作用し、その結果、AMによって活性化されるように、修飾された受容体LBD（より具体的には修飾された受容体LBP）を持つRMであることができるが、これに限るわけではない。ある実施形態では、活性化されたRMがTMを増加させまたはTMの発現をオンにするように、AMが、RMと結合しまたは他の形で相互作用してRMを選択的に活性化する。これにより、本発明のAMおよび/またはRMは、TM発現および/またはTM活性のレベルを緻密にかつ特異的に制御する能力をもたらす。
【００３８】
いくつかの実施形態では、RMのリガンド結合ドメイン（LBD）、より具体的にはリガンド結合ポケット（LBP）が、改善された特異性および選択性でIMを結合しかつ/またはそのIMに応答するように修飾される。いくつかの実施形態では、IMが、IMに選択的に結合するように修飾されたユニークなRMに結合する。例えば本発明のIMは、RMに選択的に結合しかつ/またはRMを選択的に不活化し、内在性タンパク質、例えば受容体、より具体的にはステロイド受容体、さらに具体的にはPRまたはGRにはほとんどまたは全く影響を持たないIMであることができるが、これに限るわけではない。また、例えば本発明のRMは、IMと特異的に結合しかつ/または他の形で相互作用し、その結果、AMによって活性化されるように、修飾された受容体LBD（より具体的には修飾された受容体LBP）を持つRMであることができるが、これに限るわけではない。ある実施形態では、活性化されたRMがTMを増加させまたはTMの発現をオンにするように、AMが、RMと結合しまたは他の形で相互作用してRMを選択的に活性化する。これにより、本発明のAMおよび/またはRMは、TM発現および/またはTM活性のレベルを緻密にかつ特異的に制御する能力をもたらす。
【００３９】
本発明のさらにもう一つの利点は、本発明が、用量依存的または方向依存的（本明細書で説明する）な、例えばそれぞれ、対象中に存在するもしくは対象に投与された制御因子分子（RM）の量、またはTMをコードする核酸の方向に依存する、対象の細胞におけるTMの発現および/または活性を提供することにある。したがって、本発明の組成物および方法のもう一つの利点は、対象の疾患または疾患状況に特異的な形で治療を最適化するためにそれを使用することができることにある。本発現系のさらにもう一つの利点は、それが、対象に1回の注射で投与することができる単一の核酸ベクターを含みうることにある。このように本発現系は、既知の核酸ベースの治療法またはボーラスタンパク質ベースの治療法に対して、有意義な利点を持っている。
【００４０】
特に、本発明の発現系は、対象の細胞におけるTM（例えばタンパク質または核酸）の制御された長期発現を可能にし、用量制限的な副作用を最小限に抑えつつ、治療効力をもたらす。より具体的には、本発明の発現系を使った遺伝子治療は、タンパク質の制御された長期発現をもたらすことにより、ある対象の疾患の処置に関して、用量制限的な副作用を最小限に抑え、そのタンパク質の治療効力を最大化することができる。例えばインターフェロン・ベータ（IFN-β）は、多発性硬化症（MS）を持つ患者にとって、疾患の重症度を低下させその進行を遅らせるのに有効なタンパク質薬物であることが示されている。しかしIFN-βは循環中で短い半減期を持つことがわかっている。さらに、タンパク質の頻繁な局所投与は、用量依存的な副作用を引き起こしうる。しかし本発明の制御発現系を使えば、IFN-β（例えばIFN-β-1a）をコードする核酸を対象の細胞に投与することができ、細胞におけるコードされたIFN-ベータの発現を長期間にわたって制御し、最適化して、MSの処置に関して、IFN-β薬の治療効力を最大限に増やし、用量制限的な副作用を最小限に抑えることができる。
【００４１】
ある実施形態では、経口利用が可能な丸剤の形態をした小分子活性化因子であるAMが、プロモーター誘導と、本発明の制御された発現系の核酸配列によってコードされるTMのその後の発現とを管理する。このようにして、対象の循環における発現されたTM（例えばタンパク質または核酸）のレベルを、オン/オフ的に、かつ/または用量依存的に、緻密に制御することができる。本発明のAMはTMの発現を直接的または間接的に管理することができる。例えばある実施形態では、AMがRMを活性化し、その結果、活性化されたRMの存在が、対象の細胞におけるTMの発現を調節（例えば誘導）する。このように、本発明の制御発現系の利点は、それが、TMの治療効力を最適化し、それと同時にその副作用を最小限に抑えるために、対象の細胞中で発現されるTM（例えばタンパク質または核酸）の連続治療かパルス治療かの選択、およびTMの発現レベルの調節を可能にすることにある。特に本発明の制御発現系は、MS対象において、連続的かつ持続的なIFN-βタンパク質治療か、パルス的IFN-βタンパク質治療かの選択を初めて可能にする。さらに、本発明のもう一つの利点は、それが、TMをコードする核酸ベクターの反復投与によって、対象の細胞における回復可能なTMの発現をもたらしうることにある。
【００４２】
より具体的には、本制御発現系は、最大限の治療効力および最小限の副作用が達成されるように対象の細胞におけるTMの発現レベルを調節し、最適化することによって、対象特異的または疾患特異的な治療法を可能にする。本明細書にいう「対象特異的」または「疾患特異的」治療法とは、特定の疾患、疾患の段階、または疾患状態もしくは症状を持つ対象に特異的な処置を指す。例えば、本発明の制御発現系を使用することにより、MSを持つ対象の細胞中で発現されるIFN-βのレベルを、MSの特定の状態、症状、もしくは段階（例えば再発寛解型、一次進行型、または二次進行型）を処置するために、またはIFN-βに対する対象の応答もしくは耐性に応じて、最大限の治療効力および最小限の副作用が達成されるように、調節し、最適化することができる。
【００４３】
より具体的に述べると、本発明は、改良された制御遺伝子発現系、ならびにその医薬組成物および方法を提供する。コードされたTMは、ある疾患を持つ対象またはある疾患にかかりやすい対象に治療的利益を与える核酸またはタンパク質であることができる。本明細書にいう「治療的利益」または「治療活性」には、疾患または疾患の症状もしくは状態の改善、調節、減縮、抑制、安定化、あるいはその発生または進行の防止、遅延、または減速が含まれるが、これらに限るわけではない。本明細書にいう「対象」は、哺乳動物（例えばヒト）を指し、より具体的には、ある疾患に関する処置を必要とする哺乳動物を指す。「処置」「処置すること」「処置する」または文法上これと等価な用語は、ある疾患（ある疾患の段階、症状または状態を含む）に関して、対象に治療的利益を与えることを指す。本明細書にいう「疾患」には、ある疾患の段階、症状、状態、もしくは病因、またはある疾患に関する遺伝的素因が包含される。そのような疾患は自己免疫疾患または炎症性疾患であることができる。いくつかの実施形態では、疾患ががんである。いくつかの実施形態では、疾患が、例えば多発性硬化症、白血病、黒色腫、肝炎、または心筋症である。さらに本発明の改良された制御発現系は、動物モデルにおける遺伝子機能を正確に解析し、ヒト疾患の信頼できる動物モデル（例えばマウスモデル）を作製することができるように、動物ゲノム（例えばマウスゲノム）中に変化を工学的に作り出すための新しいアプローチを提供する。特に本発明の改良された制御発現系は生物医学研究用の非常に貴重なツールになる。なぜなら、この系を使用することにより、ターゲット分子、例えば動物ゲノム中のターゲット遺伝子（または他の本発明の分子）を、時間的に、および空間特異的に、制御することができるからである。
【００４４】
さらに、本発明の改良された制御発現系は、インビトロおよびインビボの両方でターゲットshRNAを選択的またはユニークに発現させるための新しいアプローチを提供する。例えば、本発明の制御発現系を使用することにより、ポリメラーゼII（POL II）に基づく発現系を修飾して、ターゲットshRNAを選択的またはユニークに生成させることができる。例えば、ターゲットshRNAをユニークに生成させるには、shRNAを生成させるために、POL IIプロモーターをイントロン含有遺伝子に作動的に連結することにより、この制御された発現系を修飾して使用することができ、その結果生じるスプライスされたイントロンは、MIR配列の包含により、プロセシングされてターゲットshRNAを発現させる。また例えば、RMタンパク質がターゲットとする、本明細書に記載する本ベクターおよび発現カセットのGAL-4結合部位を、U6プロモーターの上流に挿入して、RM反応性の系を作出することもでき、さらにp65トランス活性化因子をポリメラーゼIII（POL III）活性化因子（例えばOct-2Q）と交換するという追加の修飾も考えられるだろう。
【００４５】
ある実施形態において、本発明は、対象の細胞に送達された時に、コードされたTMが発現され、TMの発現および/または活性が制御因子分子（RM）の存在下で制御されるように、少なくとも、TMをコードする核酸配列を持つ第1発現カセットを含む、改良された制御発現系を提供する。本明細書にいう、本発明の分子（例えばTM）の活性および/または発現の「制御」とは、当該分子の活性および/または発現の誘導、抑制、増加、または減少などをもたらす、その分子の発現および/または活性の調節を指す。そのような制御のさらなる例には、本発明の分子（例えばTM）の量、コンフォメーション、シグナル伝達、結合特異性、半減期、安定性、または他の細胞修飾もしくはプロセシングの調節が含まれるが、これらに限るわけではない。好ましい実施形態では本発現系のTMが制御される。しかし、本発現系での制御に適している他の分子の例には、本明細書に記載のRM、活性化因子分子（AM）、および不活化因子分子（IM）も含まれるが、これらに限るわけではない。
【００４６】
本発明の一実施形態では、TMの発現および/または活性が、例えば対象の細胞中に存在するまたは対象に投与されたRMの量に応じて、用量応答的または用量依存的に制御される。別の実施形態では、TMの発現および/または活性が、例えば対象の細胞中に存在するまたは対象に投与された活性化因子分子（AM）または不活化因子分子（IM）の量に応じて、用量応答的または用量依存的に制御される。ある実施形態では、TMの発現および/または活性が、対象の細胞中に存在するまたは対象に投与された同じTMまたは異なるTMの量に応じて、用量応答的または用量依存的に制御される。本明細書にいう「用量応答的」または「用量依存的」とは、本発明の分子（例えばTM）の発現および/または活性と、特定の用量または量の第2分子の対象の細胞における存在または対象の細胞への投与との相関関係を指す。そのような第2分子の例には、RM、AM、IM、またはTMが含まれるが、これらに限るわけではない。第2分子のさらなる例には、細胞性分子、例えばバイオマーカー（例えば疾患に関連するバイオマーカー）が含まれる。
【００４７】
本明細書にいう「対象の細胞」とは、対象に由来する自己細胞、または対象には由来しないが本明細書に記載するように対象に送達または投与される異種細胞（またはドナー細胞）を指す。好ましくは、自己細胞は対象中に存在し、異種細胞は対象中に送達されて対象中に存在する。好ましい実施形態では、本発明の組成物、例えばTMおよび/またはRMをコードするベクターが、コードされた分子が対象中に存在する細胞内で発現されるように、対象の自己細胞にインビボで送達される。ある実施形態では、本発明の組成物、例えばTMおよび/またはRMをコードするベクターが対象の自己または異種細胞にエクスビボで送達され、次に、コードされた分子が対象中に存在する細胞内で発現されるように、処理された細胞が対象に送達される。
【００４８】
本発明のもう一つの実施形態では、TMの発現および/または活性が方向依存的である。本明細書にいう「方向依存的」とは、本発明のTMをコードする発現カセットの5'→3'方向、または本発明のコードされたTMの転写もしくは翻訳の5'→3'向きを指し、いくつかの実施形態では、方向が、発現カセットを含むベクターまたはTMをコードするベクターに関するか、同じベクター上のもう一つの発現カセットの方向に関するか、または同じベクターがコードするもう一つの分子の発現の方向に関する。例えば、ある実施形態では、細胞におけるTMの発現および/または活性が、TMをコードする発現カセットの5'→3'方向に関して調節されるか、コードされたTMの翻訳の5'→3'方向に関して調節される。したがって、TM発現および/またはTM活性は、TMをコードする発現カセットの特定の方向またはTMの転写もしくは翻訳の方向を選択することによって、調節することができる。
【００４９】
本発明の制御発現系はTMをコードする発現カセットを少なくとも一つは含み、一つ以上の本発明の分子、例えばTM、RM、AM、またはIMをコードする追加の発現カセットを含むことができる。さらに一つ以上の発現カセットは、単一ベクター中に存在するか、二つ以上のベクター中に存在することができる。さらに本発明は単一のTM、RM、AM、またはIMに限定されず、一つ以上のまたは多重の本発明のTM、RM、AM、またはIM（これらは単一ベクターまたは二つ以上のベクターに単独でまたは一緒に存在することができる）を持つ実施形態を包含する。本明細書にいう「ベクター」とは、一つ以上の本発明の分子、例えばTM、RM、AM、またはIMをコードする核酸配列を挿入し、それを細胞内で発現させるのに適した核酸を指す。本明細書にいう「発現カセット」とは、本発明の分子（例えばタンパク質または核酸TM、RM、AM、またはIM）を細胞中で発現させるための必須コンポーネントまたは機能配列をコードする核酸を指し、ここではその分子が、発現カセット（例えば発現カセット中のクローニング部位）に作動的に挿入された核酸配列によってコードされ、発現カセットの機能配列に作動的に連結される。本明細書にいう「機能的に連結された」または「機能的に挿入された」配列または配列群とは、各配列が意図したとおりに、知られているとおりに、かつ/または特定の成果が達成されるように機能するような形で、もう一つの配列と融合され、接合され、付着され、または他の形で一つにまとめられた配列または配列群（例えばコードされた遺伝子の転写を促進するために遺伝子配列に作動的に連結されたプロモーター配列）を指す。
【００５０】
図1Aおよび1Bは、1）治療分子（TM）をコードする第1核酸配列と、第1核酸配列に作動的に連結されたDNA結合部位（DBS）およびTATA配列を含む第1プロモーター配列とを含む、第1発現カセット；2）制御因子分子（RM）をコードする第2核酸配列と、第2核酸配列に作動的に連結された第2プロモーター配列とを含む、第2発現カセット（この場合、RMは、DNA結合ドメイン（DBD）、リガンド結合ドメイン（LBD）、および制御ドメイン（RD）、より具体的に述べると図1Bでは活性化ドメイン（AD）を含む）；ならびに4）それぞれRMを活性化するかまたはRMを不活化する、活性化因子分子または不活化因子分子（AM/IM）を含み、活性化されたまたは不活化されたRMの存在がTMの発現および/または活性を制御するようになっている、本発明の制御発現系の限定でない例を表す図である。
【００５１】
図39は、単一プラスミド上に制御因子分子（RM）および治療分子（TM）またはレポーター遺伝子を併せ持つ制御発現系を表す図である。本発明の制御発現系は、pGT79方向に表すと、1）治療分子（TM）またはレポーター遺伝子をコードする第1核酸配列と、第1核酸配列に作動的に連結されたDNA結合部位（DBS）およびTATA配列をコードする第1プロモーター配列とを含む、第1発現カセット；2）制御因子分子（RM）をコードする第2核酸配列と、第2核酸配列に作動的に連結された第2プロモーター配列とを含む、第2発現カセットを含み、この場合、RMは、DNA結合ドメイン（DBD）、リガンド結合ドメイン（LBD）、およびVP16またはp65トランス活性化ドメイン（AD）を含む。活性化因子分子（AM）は、活性化または不活化されたRMがTMの発現および/または活性を制御するように、RMを活性化する（図40）。
【００５２】
ある実施形態では、第1発現カセットが、次に挙げる作動的に連結された機能配列を含み：6×GAL-4 DBS、E1b TATA、および転写開始部位（例えば配列番号1）、5'非翻訳領域UT12（例えば配列番号2）、合成イントロンIVS8（例えば配列番号3）、マルチクローニング部位（例えば配列番号4または配列番号5）、ヒト成長ホルモン（hGH）ポリアデニル化（ポリ(A)）部位（例えば配列番号6）；第2発現カセットが、次に挙げる作動的に連結された機能配列を含む：ニワトリ骨格筋アルファ-アクチンプロモーター（例えば配列番号7）およびSV40ポリ(A)部位（例えば配列番号8）。好ましい一実施形態では、第1および第2発現カセットが（例えば図1A〜Bに概略を図解するように）単一ベクター中に存在する。もう一つの好ましい実施形態では、ベクターが単一プラスミドベクター、例えばpGT1（配列番号9および配列番号4の配列を含む）、pGT2（配列番号10および配列番号4の配列を含む）、pGT3（配列番号11および配列番号4の配列を含む）、もしくはpGT4（配列番号12）であるか（この場合、各ベクターは（例えば図14A〜Dに概略図を示すように）IVS8の3'側かつhGHポリ(A)部位の5'側に位置するマルチクローニング部位（配列番号4）を含む）、またはpGT11（配列番号9および配列番号5の配列を含む）、pGT12（配列番号10および配列番号5の配列を含む）、pGT13（配列番号11および配列番号5の配列を含む）、もしくはpGT14（配列番号12および配列番号5の配列を含む）である（この場合、各ベクターは、IVS8の3'側かつhGHポリ(A)部位の5'側に位置するマルチクローニング部位（配列番号5）を含む）。好ましい一実施形態では、ベクターが単一プラスミドベクター、例えばpGT79（配列番号59）またはpGT79から誘導される単一プラスミドベクター、例えばpGT1003（配列番号61によって表されるアミノ酸配列をコードする配列番号60を含む核酸配列を含む）、pGT1004（配列番号63によって表されるアミノ酸配列をコードする配列番号62を含む核酸配列を含む）、pGT1005（配列番号65によって表されるアミノ酸配列をコードする配列番号64を含む核酸配列を含む）、pGT1006（配列番号67によって表されるアミノ酸配列をコードする配列番号66を含む核酸配列を含む）、pGT1007（配列番号69によって表されるアミノ酸配列をコードする配列番号68を含む核酸配列を含む）、pGT1008（配列番号71によって表されるアミノ酸配列をコードする配列番号70を含む核酸配列を含む）、pGT1009（配列番号73によって表されるアミノ酸配列をコードする配列番号72を含む核酸配列を含む）、pGT1015（配列番号75によって表されるアミノ酸配列をコードする配列番号74を含む核酸配列を含む）、pGT1016（配列番号77によって表されるアミノ酸配列をコードする配列番号76を含む核酸配列を含む）、pGT1017（配列番号79によって表されるアミノ酸配列をコードする配列番号78を含む核酸配列を含む）、pGT1025（配列番号81によって表されるアミノ酸配列をコードする配列番号80を含む核酸配列を含む）、pGT1020（配列番号83によって表されるアミノ酸配列をコードする配列番号82を含む核酸配列を含む）、pGT1021（配列番号85によって表されるアミノ酸配列をコードする配列番号84を含む核酸配列を含む）、pGT1022（配列番号87によって表されるアミノ酸配列をコードする配列番号86を含む核酸配列を含む）、pGT1023（配列番号89によって表されるアミノ酸��列をコードする配列番号88を含む核酸配列を含む）、またはpGT1024（配列番号91によって表されるアミノ酸配列をコードする配列番号90を含む核酸配列を含む）である。
【００５３】
さらに、好ましい実施形態では、TMがIFN-βまたはGM-CSFである。例えば、ある実施形態では、第1核酸配列が、配列番号13のアミノ酸配列を含み配列番号14の核酸配列によってコードされるヒトIFN-β1aであるTMをコードする。もう一つの実施形態では、第1核酸配列が、配列番号15のアミノ酸配列を含み配列番号16の核酸配列によってコードされるマウスIFN-βであるTMをコードする。もう一つの実施形態では、第1核酸配列が、配列番号17のアミノ酸配列を含み配列番号18の核酸配列によってコードされるヒトGM-CSFであるTMをコードする。もう一つの実施形態では、第1核酸配列が、配列番号19のアミノ酸配列を含み配列番号20の核酸配列によってコードされるマウスGM-CSFであるTMをコードする。さらに、好ましい実施形態では、RMが野生型または天然プロゲステロン受容体（PR）の変種である。例えば、ある実施形態では、第2核酸配列が、配列番号22のアミノ酸配列を含み配列番号21の核酸配列によってコードされる突然変異型PRであるRMをコードする。
【００５４】
好ましい実施形態では、TMをコードする核酸配列が、単一プラスミドベクターの第1発現カセットのMCSのSpeIおよびNotI制限酵素部位中に挿入またはクローニングされる。ある実施形態では、TMをコードする核酸配列を含む単一プラスミドベクターが、例えばpGT23（配列番号23）、pGT24（配列番号24）、pGT25（配列番号25）、またはpGT26（配列番号26）であり、この場合、コードされたTMはマウスIFN-β（例えば配列番号15のアミノ酸配列を含み、かつ/または配列番号16を含む核酸配列によってコードされるもの）であって、コードされたTMおよび挿入された核酸配列の転写の5'-3'方向を図15Aに模式図で図解する（矢印参照）。もう一つの実施形態では、TMをコードする核酸配列を含む単一プラスミドベクターが、例えばpGT27（配列番号27）、pGT28（配列番号28）、pGT29（配列番号29）、またはpGT30（配列番号30）であり、この場合、コードされたTMはヒトIFN-β（例えば配列番号13のアミノ酸配列を含み、かつ/または配列番号14を含む核酸配列によってコードされるもの）である。好ましい一実施形態では、TMをコードする核酸配列を含む単一プラスミドベクターが、例えばpGT79（配列番号59）、またはpGT79から誘導される単一プラスミドベクター、例えばpGT1003（配列番号61によって表されるアミノ酸配列をコードする配列番号60を含む核酸配列を含む）、pGT1004（配列番号63によって表されるアミノ酸配列をコードする配列番号62を含む核酸配列を含む）、pGT1005（配列番号65によって表されるアミノ酸配列をコードする配列番号64を含む核酸配列を含む）、pGT1006（配列番号67によって表されるアミノ酸配列をコードする配列番号66を含む核酸配列を含む）、pGT1007（配列番号69によって表されるアミノ酸配列をコードする配列番号68を含む核酸配列を含む）、pGT1008（配列番号71によって表されるアミノ酸配列をコードする配列番号70を含む核酸配列を含む）、pGT1009（配列番号73によって表されるアミノ酸配列をコードする配列番号72を含む核酸配列を含む）、pGT1015（配列番号75によって表されるアミノ酸配列をコードする配列番号74を含む核酸配列を含む）、pGT1016（配列番号77によって表されるアミノ酸配列をコードする配列番号76を含む核酸配列を含む）、pGT1017（配列番号79によって表されるアミノ酸配列をコードする配列番号78を含む核酸配列を含む）、pGT1025（配列番号81によって表されるアミノ酸配列をコードする配列番号80を含む核酸配列を含む）、pGT1020（配列番号83によって表されるアミノ酸配列をコードする配列番号82を含む核酸配列を含む）、pGT1021（配列番号85によって表されるアミノ酸配列をコードする配列番号84を含む核酸配列を含む）、pGT1022（配列番号87によって表されるアミノ酸配列をコードする配列番号86を含む核酸配列を含む）、pGT1023（配列番号89によって表されるアミノ酸配列をコードする配列番号88を含む核酸配列を含む）、またはpGT1024（配列番号91によって表されるアミノ酸配列をコードする配列番号90を含む核酸配列を含む）であり、コードされたTMは、マウスIFN-β（例えば配列番号15のアミノ酸配列を含み、かつ/または配列番号16を含む核酸によってコードされるもの）またはヒトIFN-β（例えば配列番号13のアミノ酸配列を含み、かつ/または配列番号14を含む核酸によってコードされるもの）である。
【００５５】
さらに、ある実施形態では、単一プラスミドベクターが、ベクターバックボーンの核酸配列（例えば配列番号12）、MCS（例えば配列番号31）、およびSpeI-NotIフラグメント（配列番号31）を含み、そのフラグメントは、マウスIFN-βであるTMをコードし、MCS中のSpeI-NotI部位へのそのフラグメントの挿入に適合した5'端のSpeI配列と3'端のNotI配列とを持ち、MCSのSpeI-NotI部位に挿入される。さらに、ある実施形態では、単一プラスミドベクターが、ベクターバックボーン（例えば配列番号12）、MCS（例えば配列番号32）、およびSpeI-NotIフラグメント（配列番号31）を含み、そのフラグメントは、ヒトIFN-βであるTMをコードし、MCS中のSpeI-NotI部位へのそのフラグメントの挿入に適合した5'端のSpeI配列と3'端のNotI配列とを持ち、MCSのSpeI-NotI部位に挿入される。
【００５６】
さらに、ある実施形態では、AMがRMに結合してRMを活性化し、その結果、活性化されたRMはTM配列に作動的に連結されたプロモーターのDBS配列に結合して、細胞（例えば哺乳動物細胞）におけるTM発現および/またはTM活性の誘導をもたらす。しかしもう一つの実施形態は、不活化因子分子（IM）がRMに結合してRMを不活化し、その結果、不活化されたRMはTMプロモーターのDBSに結合せず、TM発現および/またはTM活性の誘導の抑制または欠如をもたらす。図1Bに図解する例の一実施形態では、活性化因子分子（AM）がRMのLBDに結合してRMを活性化し、その結果、活性化されたRMが、TM配列に作動的に連結されたプロモーターのDBSに結合するホモ二量体を形成して、細胞（例えば哺乳動物細胞）におけるTM発現および/またはTM活性の誘導をもたらす。図1Aおよび1Bに図解する例のもう一つの実施形態では、第1および第2発現カセットが単一ベクター中に存在する。もう一つの実施形態では、TMをコードする第1発現カセットと本発明のRMをコードする第2発現カセットとが、単一ベクター（例えばpGT23（配列番号23）、pGT24（配列番号24）、pGT25（配列番号25）、pGT26（配列番号26）、pGT27（配列番号27）、pGT28（配列番号28）、pGT29（配列番号29）、またはpGT30（配列番号30））中に存在する。図40に図解する例の一実施形態では、活性化因子分子（AM）がRMのLBDに結合してRMを活性化し、その結果、活性化されたRMが、TM配列に作動的に連結されたプロモーターのDBSに結合するホモ二量体を形成して、細胞（例えば哺乳動物細胞）におけるTM発現および/またはTM活性の誘導をもたらす。図39に図解する例のもう一つの実施形態では、第1および第2発現カセットが単一ベクター中に存在する。もう一つの好ましい実施形態では、本発明のTMをコードする第1発現カセットと、本発明のRMをコードする第2発現カセットとが、単一ベクター（例えばpGT79、pGT1003、pGT1004、pGT1005、pGT1006、pGT1007、pGT1008、pGT1009、pGT1015、pGT1016、pGT1017、pGT1025、pGT1020、pGT1021、pGT1022、pGT1023またはpGT1024）中に存在する。
【００５７】
本明細書にいう「治療分子」または「TM」とは、治療活性を持つ分子または治療的利益を与える分子を指す。本発明のTMは、核酸配列によってコードされ、治療活性を持つ、単離されたDNA、RNA、もしくはタンパク質、またはその変種であることができる。本明細書にいう「変種」には、ムテイン、例えば単離されたDNA、RNA、タンパク質、または化学化合物のムテインが含まれる。より具体的には、本発明のTMは、修飾、合成、または組換えDNA、RNAまたはタンパク質であることができる。本明細書にいう「修飾」には、例えば突然変異型分子、融合分子、またはキメラ分子を含む、化学的に、合成的に、または組換え技術によって修飾された分子が包含される。ある実施形態では、コードされたTMが、対象の細胞中で発現され、切断またはプロセシングされることによって、複数のTM、または活性化されたTM、または発現されかつ切断もしくはプロセシングを受けていないTMとは異なるTMをもたらすタンパク質である。本発明のもう一つの実施形態では、コードされたTMが治療活性を持つ核酸（例えばRNA）である。ある実施形態では、コードされたRNAが、対象の細胞において多発的（multiply）または差異的（differentially）にスプライスされる複数のスプライス部位をコードする。いくつかの実施形態では、多発的または差異的にスプライスされるRNAが、類似する治療活性または別々の治療活性を持つ、異なるタンパク質もしくは変種タンパク質をコードするか、または異なるRNAもしくは変種RNAを含む。いくつかの実施形態では、多発的または差異的にスプライスされるRNAが、特異的因子、疾患、状態、または組織の存在に応答してスプライスされる。
【００５８】
本発明のもう一つの実施形態では、コードされたTMが治療活性を持つタンパク質、好ましくはヒトタンパク質またはその変種である。さらにもう一つの実施形態では、そのようなタンパク質をコードする核酸配列が、遺伝子または遺伝子フラグメントの核酸配列である。ある実施形態では、TMが顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）である。もう一つの実施形態では、TMがインターフェロン、例えばインターフェロン-ベータ（IFN-β）であり、より具体的にはIFN-β1aまたはIFN-β1bである。いくつかの実施形態では、コードされたTMが抗体、好ましくはモノクローナル抗体（例えばCAMPATH）である。モノクローナル抗体をコードする適切な配列は、当技術分野で知られている方法を使って、同定し、製造し、それを本明細書に記載するように本発明の制御発現系のベクター中に挿入することができる。モノクローナル抗体の治療活性は報告されている（例えばGatto, B. (2004) 4:411-414；Gronerら (2004) 4:539-547を参照されたい）。
【００５９】
本明細書にいう「制御因子分子」または「RM」とは、本発明のTMの発現および/または活性を制御する分子を指す。本発明のRMによるそのような制御の例には、本発明のRMによる、TM発現および/またはTM活性の調節、より具体的には、TM発現および/またはTM活性の増加、減少、活性化（もしくは誘導）、または不活化（もしくは抑制）が含まれるが、これらに限るわけではない。さらに、本発明のRMによるTM発現および/またはTM活性のそのような調節は、直接的（例えばRMとTMとの直接的接触）または間接的（例えばRMがTM発現および/またはTM活性の調節をもたらすシグナル伝達系路中の分子に影響を及ぼす場合）であることができる。本発明の制御された発現系での使用に適したRMのさらなる例には、本発明のTMの細胞発現、活性、またはプロセシングに影響を及ぼす分子が含まれるが、これらに限るわけではない。そのような適切なRMの例には、転写制御分子（例えば、発現されるTMのRNAの転写を活性化し、不活化し、減少させ、または増加させるもの）、RNAプロセシング分子（例えば、発現されるTMのRNAのRNAスプライシング、ポリアデニル化、または切断などといったRNAプロセシングを活性化し、不活化し、減少させ、または増加させる分子）、またはタンパク質翻訳もしくはタンパク質の翻訳後プロセシングに影響を及ぼす分子（例えば、発現されるTMのタンパク質の特定のコンフォメーションまたは多量体型のリン酸化、切断、または形成を活性化し、不活化し、減少させ、または増加させる酵素）が含まれるが、これらに限るわけではない。
【００６０】
本発明のRMは、天然分子、修飾もしくは単離された分子、またはその変種であることができる。いくつかの実施形態では、本発明のRMが合成分子または組換え分子である。例えば、いくつかの実施形態では、本発明のRMが、化学化合物、DNA、RNA、またはタンパク質である。さらに、いくつかの実施形態では、本発明のRMが修飾された分子である。ある実施形態では、RMがヒト化タンパク質である。もう一つの実施形態では、RMがヒトタンパク質またはその変種である。例えば、ある実施形態では、RMが転写活性化因子、例えばステロイド受容体、より具体的には、プロゲステロン受容体である。ある実施形態では、RMが、トランス活性化ドメイン（例えばVP16またはp65トランス活性化ドメイン、例えばSchmitzら (1991) EMBO J 10:3805-3817；Mooreら (1993) Molec and Cell Biol 13:1666；Blairら (1994) Molec and Cell Biol 14:7226-7234を参照されたい）、および/または共活性化因子（例えばp300/CBP）、基本転写因子（例えばTFIIB）、もしくはヒストンアセチルトランスフェラーゼ（例えばp300/CBPまたはP/CAF、Latchman, D. (2004)「Eukaryotic Transcription Factors」Elsevier Academic Press、ロンドン；Goodmanら (2000) Genes & Devl 14:1553-1577；Shikamaら (1997) Trends in Cell Bio 7:230-236）の他の機能ドメイン（例えば基本因子相互作用ドメイン）を含む。もう一つの実施形態では、RMがリガンド結合ドメイン（LBD）を含む。さらにある実施形態では、活性化されたRMの存在がTM発現および/またはTM活性を制御するように、AMがRMのLBDに結合し、それによってRMを活性化する。もう一つの実施形態では、RMがDBD、例えばGAL-4 DBDを含む。ある実施形態では、RMが、TMをコードする核酸に作動的に連結された機能配列（例えばプロモーター配列）に結合することによってTM発現を制御（例えばTM発現を誘導）するDBDを含む。
【００６１】
もう一つの実施形態では、本発明のRMが活性化因子分子（AM）によって活性化され、その結果、TM発現および/またはTM活性は、活性化されたRMの存在下で制御される。本明細書にいう「活性化因子分子」または「AM」とは、本発明のRMの発現および/または活性を誘導しまたは増加させる分子を指す。AMによるそのような活性化の例には、本発明のRMの発現および/または活性の誘導または増加が含まれるが、これらに限るわけではない。さらに、本発明のAMによるRM発現および/またはRM活性のそのような活性化は、直接的（例えばAMとRMとの直接的接触）または間接的（例えばAMがRM発現および/またはRM活性の調節をもたらすシグナル伝達系路中の分子に影響を及ぼす場合）であることができる。本発明の制御発現系における使用に適したAMのさらなる例には、本発明のRMの細胞プロセシングに影響を及ぼす分子（そのような細胞プロセシングの例は、例えば上述のように、本明細書に記載する）が含まれるが、これらに限るわけではない。
【００６２】
ある実施形態では、AMがバイオマーカーである。さらにもう一つの実施形態では、AMが疾患または状態のバイオマーカーであり、より具体的には疾患状況もしくは状態またはその症状のバイオマーカーである。ある実施形態では、AMが、RMのコンフォメーション変化、酵素的プロセシングまたは酵素的修飾、特異的結合、または二量体化を促進または阻害することによって、RMを活性化する。好ましい一実施形態では、AMが、RMのホモ二量体化を促進することによって、RMを活性化する。ある実施形態では、AMが、RMに結合することによって、より具体的にはRMの機能ドメイン、例えばRMのLBDに結合することによって、RMを活性化する。
【００６３】
本発明のAMは天然分子もしくは単離された分子、またはその変種であることができる。いくつかの実施形態では、本発明のAMが合成分子または組換え分子である。例えば、いくつかの実施形態では、本発明のAMが化学化合物、DNA、RNA、またはタンパク質である。さらに、いくつかの実施形態では、本発明のAMが修飾された分子である。ある実施形態では、AMがヒト化タンパク質である。もう一つの実施形態では、AMがヒトタンパク質またはその変種である。ある実施形態では、AMが化学化合物、例えば抗プロゲスチンである。ある実施形態では、AMがミフェプリストンである。好ましい一実施形態では、AMがPRリガンド類似体、例えばBLX-913、BLX-833、BLX-899、BLX-593、BLX-599、BLX-952、BLX-610、BLX-117、またはBLX-784である。
【００６４】
ある実施形態では、本発明の制御発現系が、1）TMをコードする第1核酸配列と、第1核酸配列の上流に位置して第1核酸配列に作動的に連結された少なくとも一つのGAL-4DNA結合部位（DBS）、より具体的には6個のGAL-4 DBS（6×GAL-4 DBS）とを持つ、第1発現カセット、2）VP-16 ADまたはp65 AD（例えば配列番号39の核酸配列または配列番号40のアミノ酸配列を含むp65 AD）、プロゲステロン（PR）LBD、およびGAL-4 DBDを含む修飾プロゲステロン受容体であるRMをコードする第2核酸配列と、第2核酸配列の上流に位置して第2核酸配列に作動的に連結されたアクチンプロモーター配列とを持つ、第2発現カセット、ならびに3）小分子誘導因子（対象に経口投与された時に、対象の細胞中で発現されたRMを活性化し、その結果、活性化されたRMが6×GAL-4 DBSに結合する二量体を形成して、コードされたTMの発現を誘導するもの）（例えばPRリガンド類似体）であるAMを含む。好ましい一実施形態では、第1および第2発現カセットが単一ベクター中に存在する。
【００６５】
もう一つの実施形態では、本発明のRMが転写制御因子、より具体的には突然変異型ステロイド受容体である。ある実施形態では、RMが突然変異型ヒトPR（hPR）であって、突然変異型hPR受容体LBDを含み（例えば約19〜66アミノ酸のC末端欠失を持ち）、そのRMは、その突然変異体PRが由来する野生型PRのアンタゴニストであるAMの存在下で活性化される。好ましい一実施形態では、RM LBDが、LBD（より具体的にはLBP）内に一つ以上の部位特異的突然変異を含む突然変異型ヒトPR LBD（より具体的には突然変異型ヒトPR LBP）を含む。もう一つの実施形態では、本発明のRMが、制御ドメイン（RD）、例えば活性化ドメイン（AD）、より具体的にはトランス活性化ドメイン（TD）を含む。本発明のRMにおける使用に関して適切な制御ドメインの例には、当技術分野で知られているもの、または本明細書に記載するもの（例えばTAF-1、TAF-2、TAU-1、およびTAU-2）が含まれるが、これらに限るわけではない。
【００６６】
もう一つの実施形態では、本発明のRMが不活化され、その結果、TM発現および/またはTM活性が、不活化されたRMの存在下で制御される。本明細書にいう「不活化因子分子」または「IM」とは、本発明のRMの発現および/または活性を不活化する分子を指す。IMによるそのような不活化の例には、本発明のRMの発現および/または活性の抑制または減少が含まれるが、これらに限るわけではない。さらに、本発明のIMによるRM発現および/またはRM活性のそのような不活化は直接的（例えばIMとRMとの直接的接触）または間接的（例えばIMがRM発現および/またはRM活性の不活化をもたらすシグナル伝達系路中の分子に影響を及ぼす場合）であることができる。本発明の制御された発現系での使用に適したIMのさらなる例には、本発明のRMの細胞プロセシング（そのような細胞プロセシングの例は、例えば上述のように、本明細書に記載する）に影響を及ぼす分子が含まれるが、これらに限るわけではない。
【００６７】
ある実施形態では、本発明のRMが、対象の細胞において、活性化された形態で発現されるかまたは存在し、不活化因子分子（IM）の存在下で不活化され、その結果、TM発現および/またはTM活性が、不活化されたRMによって制御される。もう一つの実施形態では、IMがバイオマーカーである。さらにもう一つの実施形態では、IMが疾患または状態のバイオマーカーであり、より具体的には疾患状況もしくは状態、またはその症状のバイオマーカーである。ある実施形態では、IMがRMのコンフォメーション変化、酵素的プロセシング、特異的結合、または二量体化を促進または阻害することによってRMを不活化する。好ましい一実施形態では、IMがRMのホモ二量体化を阻害することによってRMを不活化する。ある実施形態では、IMが、RMに結合することによって、より具体的にはRMの機能ドメイン、例えばRMのADに結合することによって、RMを不活化する。本発明のIMは天然分子もしくは単離された分子、またはその変種であることができる。いくつかの実施形態では、本発明のIMが合成分子または組換え分子である。例えば、いくつかの実施形態では、本発明のIMが化学化合物、DNA、RNA、またはタンパク質である。さらに、いくつかの実施形態では、本発明のIMが修飾された分子である。ある実施形態では、IMがヒト化タンパク質である。もう一つの実施形態では、IMがヒトタンパク質またはその変種である。好ましい一実施形態では、IMが化学化合物である。
【００６８】
本発明のTM、RM、AM、またはIMの発現は構成的または一過性であることができる。いくつかの実施形態では、TM、RM、AM、またはIMの発現が制御されるか、または組織特異的（例えば筋特異的）である。制御されたRMの例には、AMによって活性化されるか、またはIMによって不活化されるRMが含まれるが、これに限るわけではない。ある実施形態では、本発明のTM、RM、AM、またはIMの発現が、被制御プロモーターまたは組織特異的プロモーターによって駆動される。さらにもう一つの実施形態では、被制御プロモーターまたは組織特異的プロモーターがRMの存在下で制御され、より具体的には、そのプロモーターへのRMの結合によって制御される。ある実施形態では、組織特異的プロモーターが筋特異的プロモーター、より具体的にはアクチンプロモーターである。ある実施形態では、本発明のRMが、TMをコードする核酸配列に作動的に連結されたプロモーターに結合し、それによって、対象の細胞における本明細書に記載のコードされたTMの発現を制御する。
【００６９】
本発明のTM、RM、AM、またはIMは、本明細書で例えば以下に説明するように、核酸、タンパク質および化学化合物に関する既知の方法およびアッセイを使って、単離し、製造し、修飾することができる。
【００７０】
医薬組成物および処置方法
本発明は、本明細書に記載する本発明の改良された制御発現系を含む、さまざまな疾患を処置するための医薬組成物および方法も提供する。
【００７１】
特定の実施形態において、本発明は、疾患または状態を処置するため；TMの発現を制御するため；TMを投与するため；TMを送達するため；または対象の細胞中でTMを発現させるの医薬組成物および方法を提供し、この場合、その方法は、コードされたTMが対象の細胞内で発現され、そのようなTM発現がRMの存在下で制御されるような形で、対象の細胞を本発明の制御発現系と接触させることを含む。
【００７２】
本発明の医薬組成物は、少なくとも一つの本発明のTM、RM、AM、またはIMを含み、いくつかの実施形態では、そのような分子をコードする核酸配列が、単一ベクターまたは二つ以上のベクター中に、単独で、または一緒に存在する。別の実施形態において、本発明の医薬組成物は、各TM、RM、AM、またはIM、および二種類以上のそれら（例えば第1および第2のTM、RM、AM、および/またはIM）のうちの二つ以上を含むことができる。より具体的には、本発明の医薬組成物は、各TM、RM、AM、またはIM、および二種類以上のそれらのうちの二つ以上をコードする核酸配列を含むことができる。ある実施形態では、本発明の医薬組成物が、少なくとも一つの本発明のベクター（例えばpGT23（配列番号23）、pGT24（配列番号24）、pGT25（配列番号25）、pGT26（配列番号26）、pGT27（配列番号27）、pGT28（配列番号28）、pGT29（配列番号29）、またはpGT30（配列番号30）、pGT79（配列番号59）、pGT1003（配列番号60を含む）、pGT1004（配列番号62を含む）、pGT1005（配列番号64を含む）、pGT1006（配列番号66を含む）、pGT1007（配列番号68を含む）、pGT1008（配列番号70を含む）、pGT1009（配列番号72を含む）、pGT1015（配列番号74を含む）、pGT1016（配列番号76を含む）、pGT1017（配列番号78を含む）、pGT1025（配列番号80を含む）、pGT1020（配列番号82を含む）、pGT1021（配列番号84を含む）、pGT1022（配列番号86を含む）、pGT1023（配列番号88を含む）、またはpGT1024（配列番号90を含む））を含む。
【００７３】
いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物が少なくとも一つの本発明のAMまたはIMを含む。ある実施形態では、本発明の医薬組成物が、少なくとも一つのTMおよび/またはRMをコードする一つ以上のベクターを含む。本発明のTM、RM、AM、およびIMは、本明細書に記載するまたは当技術分野で知られている任意の適切な投与手段を使って、エクスビボまたはインビボで、対象に個別にまたは一緒に投与することができる。そのような適切な手段の例には、注射（例えば筋肉内または皮下注射）、経口投与、およびエレクトロポレーションが含まれるが、これらに限るわけではない。ある実施形態では、本発明のTMおよびRMが単一ベクター中に存在し、RMを活性化するAMとは別個に投与される（これにより、活性化されたRMの存在が、TM発現および/またはTM活性を制御する）。さらにもう一つの実施形態では、AMが、対象に経口投与される化合物、例えばPRまたはGRリガンド類似体、より具体的には修飾抗プロゲスチン（例えば修飾MFP）または修飾メソプロゲスチン（例えば修飾アソプリスニル）であり、TMおよびRMをコードする単一ベクターが、注射によって、または対象の細胞（例えば骨格筋細胞）へのエレクトロポレーションによって投与される単一ベクターである。本発明の組成物を投与するための適切な手段のさらなる例には、対象の細胞に組成物（例えばTMおよび/またはRMをコードする核酸ベクター）をエクスビボ投与した後、コードされた分子が対象中の細胞内で発現されるように、処理された細胞を対象に送達することが含まれる（例えばStudenyら (2004) J Natl Cancer Inst 96(21):1593-1603；Studenyら (2002) Cancer Res 62(13):3603-3608を参照されたい）。
【００７４】
ある実施形態では、本発明の制御発現系が、注射によって対象に投与される治療遺伝子（例えばIFN-β遺伝子）をコードする核酸配列を含む。本明細書にいう「治療遺伝子」とは、TM（例えば治療活性を持つタンパク質（例えばIFN-β1aまたは1b））をコードする遺伝子を指す。特定の一実施形態では遺伝子がIFN-β1aであり、本発明のベクターを使って、定期的に、例えば3〜6ヶ月ごとに、単回筋肉内注射として投与される。別の実施形態では、治療遺伝子が1〜3ヶ月、3〜6ヶ月、6〜9ヶ月、または9〜12ヶ月ごとに投与される。もう一つの実施形態では、発現されたタンパク質の循環レベルの制御が、ターゲット対象細胞または対象組織におけるコードされたタンパク質の発現を駆動するプロモーターの管理された誘導によって達成される。
【００７５】
好ましい一実施形態では、RMが、プロモーター誘導とその後のTM（より具体的には治療遺伝子）の発現とを管理する経口利用可能な丸剤の形態をした小分子活性化因子である。このようにして、循環中の発現されたTM（例えばタンパク質または核酸）のレベルを、オン/オフ的に、かつ/または用量依存的に、緻密に制御することができる。このように、本発明の制御された発現系は、TMの治療効力を最適化し、それと同時にその副作用を最小限に抑えるために、TM（例えばタンパク質または核酸）の連続治療かパルス治療かの選択、およびTMの発現レベルの調節を、初めて可能にする。特に、本発明の制御発現系は、対象における連続的TM治療かパルス的TM治療かの選択を初めて可能にし、より具体的には、ある疾患の処置に関して最大限の治療効力および最小限の副作用が達成されるように、対象の細胞におけるTMの発現レベルを調節し最適化することによって、対象特異的な治療を可能にする。
【００７６】
本発明の制御発現系を使用することにより、TM（例えばタンパク質または核酸）をコードする核酸を、疾患を処置するために、対象のターゲット細胞に送達することができる。より具体的には、本発明の制御された発現系を使用することにより、TMをコードする核酸を、発現されたTMが治療有効用量または治療有効量で提供されるように、対象のターゲット細胞に送達することができる。本明細書にいう本発明のTMの「治療有効用量」または「治療有効量」は、ある疾患の処置を必要とする対象の細胞中に存在する場合に、その対照に治療的利益をもたらす（すなわちその疾患の処置をもたらす）ような用量または量である。さらに、対象に投与されるまたは対象の細胞中に存在する、TMをコードする核酸の適切な量または用量、あるいは対象の細胞におけるTMの存在および/または治療有効量のTMをもたらす、対象に投与されるおよび/または対象の細胞中に存在する、RM、AM、もしくはIM、またはRM、AM、またはIMをコードする核酸の量または用量を、当業者は実験的に決定することができる。例えばある実施形態では、対象に投与される、RMまたはRMをコードする核酸の適切な用量または量は、治療有効用量が達成されるように、対象の細胞におけるTMの発現および/または活性を制御（例えば誘導）する用量または量である。
【００７７】
治療有効用量を構成するTMの量に影響する因子には、処置されるべき疾患の重症度および履歴、ならびに治療を受けている対象の年齢、健康状態、および身体状態が含まれるが、これらに限るわけではない。本発明のTMの治療有効量は、投与頻度および処置を受けている対象における疾患の重症度にも依存しうる。本発明のTMの投与レジメンは、本明細書に記載するとおり、所望の効果、すなわち、例えば疾患、疾患に関連する症状、疾患重症度、および/または疾患の再発の周期性の防止および/または改善などを達成するのに必要である限り、継続することができる。ある実施形態では、投与レジメンが最高1年〜無期限に、例えば1ヶ月〜30年、約3ヶ月〜約20年、約6ヶ月〜約10年にわたって継続される。
【００７８】
本発明の制御発現系における使用に関して適切な核酸の例には、治療活性を持つホルモン、増殖因子、酵素、サイトカイン、受容体、またはMHC分子の遺伝子をコードする核酸が含まれるが、これらに限るわけではない。また、本発明の組成物および方法における使用に関して適切な遺伝子には、その関心対象の遺伝子をコードする核酸を導入することができる細胞にとって外因性または内在性である核酸配列も含まれる。疾患を処置するための本発明の組成物および方法における使用に関して特に興味深く、適しているのは、遺伝子疾患を持つ対象または遺伝子疾患にかかりやすい対象において、存在しないか、産生量が減少しているか、または突然変異体型として産生されるポリペプチドをコードする遺伝子である。そのような遺伝子疾患の例には、網膜芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、アデノシンデアミナーゼ欠損症（ADA）、サラセミア症候群、嚢胞性線維症、鎌形血球症、ハンチントン病、デュシェンヌ型筋ジストロフィ、フェニルケトン尿症、レッシュ-ナイハン症候群、ゴーシェ病、およびテイ-サックス疾患が含まれるが、これらに限るわけではない。
【００７９】
疾患を処置するための本発明の組成物および方法における使用に関して特に興味深く、適しているのは、腫瘍抑制遺伝子をコードする核酸である。そのような適切な腫瘍抑制遺伝子の例には、網膜芽細胞腫、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、ヒト成長ホルモン（HGH）、TNF、TGF-β、TGF-α、ヘモグロビン、インターロイキン、共刺激因子B7、インスリン、第VIII因子、第IX因子、PDGF、EGF、NGF、EPO、およびβ-グロビン、ならびにそのような遺伝子がコードするタンパク質の生物学的に活性なまたは治療的に活性なムテインが含まれるが、これらに限るわけではない。ターゲット細胞に送達するための適切な遺伝子は任意の種に由来しうるが、好ましくは哺乳動物種、よりこのましくはヒトに由来する。さらに、適切な遺伝子の由来源として好ましい種は、本発明の方法および組成物を使ってその関心対象の遺伝子を送達しようとしている種、例えば哺乳動物種、好ましくはヒトである。
【００８０】
本発明の組成物および方法における使用に適した核酸のさらなる例には、抗炎症活性、抗ウイルス活性、または抗がん活性を持つタンパク質または核酸TMをコードするものが含まれるが、これらに限るわけではない。そのような適切な核酸の例には、抗がん活性を持つ顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）またはその変種（例えばLeukine（登録商標）またはヒトGMCSFLeu23Asp27Glu39）をコードするもの（例えば米国特許第5,032,676号；同第5,391,485号；および同第5,393,870号のGM-CSF突然変異体を参照されたい）が含まれるが、これらに限るわけではない。また例えば、適切な核酸には、抗炎症活性または抗ウイルス活性を持つインターフェロン、例えばインターフェロン、特にIFN-β、より具体的にはIFN-β1aまたはIFN-β1bをコードするものも含まれるが、これらに限るわけではない。
【００８１】
好ましい一実施形態では、本明細書に記載するとおり、本発明の組成物および方法を使って、処置を必要としている対象に、IFN-β（より具体的にはIFN-β1a）であるTMをコードする核酸を、そのIFN-βが対象の細胞内で発現され、そのIFN-βの発現および/または活性がRMによって制御されるように送達することにより、MSが処置される。
【００８２】
MSは中枢神経系（CNS）における巣状炎症を特徴とする慢性重症疾患である（例えばHemmerら (2002) Neuroscience 3:291-301；Keeganら (2002) Ann. Rev. Med. 53:285-302；Young, V. Wee (2002) Neurology 59:802-808；Goodinら (2001) Am. Academy of Neurology 58:169-178を参照されたい）。神経細胞の軸索の周りからの絶縁性ミエリン鞘の付随的喪失（脱髄）と軸索の変性も、この疾患の顕著な特徴である。巣状炎症の結果、アストロサイト増加性神経膠症が、白質における硬化性病巣の形成につながる（例えばPrineas (1985)「Demyelinating Diseases」Elsvevier：アムステルダム；Raine (1983)「Multiple Sclerosis」Williams and Wilkins：バルチモア；Raineら (1988) J. Neuroimmunol. 20:189-201；およびMartin (1997) J. Neural Transmission (Suppl) 49:53-67を参照されたい）。
【００８３】
疾患の発生時点において、MS対象集団には、再発寛解型MSを持つ対象と一次進行型MSを持つ対象という、二つの主要タイプがある。再発寛解型MSは、新しい神経学的欠陥が発生するかまたは既存の神経学的欠陥が悪化するエピソード（いわゆる再発または増悪）と、臨床症状が安定化または減少する寛解期とを特徴とし、一方、一次進行型MS対象は、増悪を伴わない進行性の神経学的変質を患う。再発寛解型MSを持つ対象の大部分は、その疾患過程で、再発と重なるまたは再発とは重ならない、再発に依存しない神経症状の悪化も経験する。疾患がこの段階に達すると、それは二次進行型MSと呼ばれる。
【００８４】
MSの臨床症状は、脳および脊髄への炎症性浸潤物の侵入を許す血液脳関門（BBB）の巣状破損によってもたらされると考えられる。さらに、これらの浸潤物は、脱髄、軸索変性および瘢痕組織形成、ならびにCNSミエリン産生に不可欠なオリゴデンドロサイトの変性をもたらすさまざまなリンパ球およびマクロファージからなると考えられる（例えばMartin (1997) J. Neural Transmission (Suppl) 49:53-67を参照されたい）。したがって、神経を絶縁するミエリンと、損傷したミエリンを修復するオリゴデンドリグリア細胞の能力とが、著しく損なわれる（例えばScientific American 269(1993):106-114）。MSのこれらの症状には、腕および足の疼痛および刺痛、限局性および全身性のしびれ感、筋痙直および筋脱力、起立時または歩行時のバランス困難、発語および嚥下困難、認知欠陥、疲労、ならびに腸および膀胱機能障害が含まれる。
【００８５】
MSの治療方法はわかっていないが、インターフェロンによる免疫調節療法は、MSを持つ対象における基礎疾患の重症度をうまく低下させることが証明されている。インターフェロンは、抗ウイルス活性、抗増殖活性、および免疫調節活性を特徴とする重要なサイトカインである。これらの活性は、多発性硬化症を持つ対象の処置で観察されてきた臨床的利益の根拠を形成する。インターフェロンはI型およびII型クラスに分類される。IFN-βは、インターフェロン-アルファ、タウおよびオメガも含まれるI型インターフェロンのクラスに属し、一方、インターフェロンガンマは明確に異なるII型クラスの唯一の既知メンバーである。
【００８６】
ヒトIFN-βは、166アミノ酸残基からなる22kDaの分子量を持つ制御ポリペプチドである。このポリペプチドは、ウイルス感染または他の生物学的因子へのばく露に応答して、体内の大半の細胞（特に線維芽細胞）によって産生されうる。さらに、IFN-βは多量体型細胞表面受容体に結合し、生産的受容体結合は、IFNB誘導性遺伝子の発現につながる細胞内イベントのカスケードをもたらし、それが結果として、抗ウイルス作用、抗増殖作用および免疫調節作用に分類することができる作用を生み出す。
【００８７】
ヒトIFN-βはよく特徴づけられたポリペプチドである。ヒトIFN-βのアミノ酸配列はわかっている（例えばGene 10:11-15, 1980およびEP 83069、EP 41313および米国特許第4,686,191号を参照されたい）。また結晶構造も、ヒトおよびマウスIFN-βについて、それぞれ報告されている（例えばProc. Natl. Acad. Sci. USA 94:11813-11818, 1997、J. Mol. Biol. 253:187-207, 1995を参照されたい；また、Cell Mol. Life Sci. 54:1203-1206, 1998に総説がある）。他にもタンパク質工学によるIFN-βの変種が報告されている（例えばWO 9525170、WO 9848018、米国特許第5,545,723号、米国特許第4,914,033号、EP 260350、米国特許第4,588585号、米国特許第4,769,233号、Stewartら, DNA Vol.6 No.2 1987 pp.119-128、Runkelら, 1998, Jour. Biol. Chem. 273, No.14, pp.8003-8008を参照されたい）。また、CHO細胞におけるIFN-βの発現も報告されている（例えば米国特許第4,966,843号、米国特許第5,376,567号および米国特許第5,795,779号を参照されたい）。さらに、IFN-β融合タンパク質が、例えばWO 00/23472などに報告されている。
【００８８】
IFN-βの商業的調製物はMSを持つ対象の処置に関して承認されており、Betaseron（登録商標）（Betaferon（登録商標）またはIFN-β1bser17とも呼ばれ、これは非グリコシル化型であり、組換え細菌細胞を使って製造され、N末端メチオニン残基の欠失とC17S突然変異とを持つ）、Avonex（登録商標）およびRebif（登録商標）（IFN-β1aとも呼ばれ、これはグリコシル化型であり、組換え哺乳動物細胞を使って製造される）という名称で販売されている。さらに、構造および機能に関するIFN-β1aとIFN-β1bの比較も、Pharm. Res. 15:641-649, 1998に提示されている。
【００８９】
IFN-βは、MSの進行を遅延させることが示された初めての治療的介入である。また、IFN-βの承認用量は、MSの増悪率を低下させるのに有効であることが示されており、プラセボ処置対象と比較して、より多くの対象が長期間にわたる無増悪状態を保った。さらにまた、能力障害の蓄積率も低下する（例えばNeurol. 51:682-689, 1998を参照されたい）。
【００９０】
IFN-βは白血球の増殖および抗原提示に対して阻害作用を持つ。さらにまた、IFN-βはサイトカイン産生のプロファイルを抗炎症性表現型へと調節しうる。最後にIFN-βは、T細胞マトリックスメタロプロテアーゼの活性を阻害することにより、T細胞の遊走を減少させることができる。そのようなIFN-β活性が協調して作用することにより、MSを持つ対象の処置におけるIFN-βの有益な作用の原因になるようである（例えばNeurol. 57:682-689, 1998を参照されたい）。
【００９１】
好ましい一実施形態では、本発明の組成物および方法が、臨床的に認識されるさまざまな形態のMS（例えば再発寛解型MS、さまざまなタイプの進行型MS（例えば一次進行型MSおよび二次進行型MS、進行再発型MSを含むが、これらに限るわけではない）や、MSを示唆するCIS（clinically isolated syndrome）も含むが、これらに限るわけではない）を患っている対象の処置に使用される。
【００９２】
本明細書にいう「再発寛解型」MSとは、明確に定義される散発的増悪または再発（この間は、既存の症状が重症度を増し、かつ/または新しい症状が現われる）を特徴とするMSの臨床経過である。そのような増悪または再発の後には、部分的回復、または完全な回復および寛解が続きうる。これらの散発的増悪または再発の間の時間の長さは数ヶ月または数年に及ぶことがあり、この間も、炎症性病巣、脱髄、軸索喪失、および瘢痕形成は進行しうる。再発寛解型MSは最も一般的な開始相であり、その症例の約50％は発症から10〜15年以内に進行し、他の40％は25年以内に進行すると報告されている。
【００９３】
本明細書にいう「一次進行型」MSとは、プラトーもしくは寛解を伴わないか、偶発的プラトーおよび極めて短寿命の軽微な改善しか伴わない進行性の疾患であることを最初から特徴とするMSの臨床経過である。疾患が進行するにつれて、対象は、一般に再発寛解型MSの特徴を示す明確な炎症性発作が存在しないまま、歩行困難、運動技能の着実な減退、および何ヶ月も何年にもわたる能力障害の増加を体験しうる。
【００９４】
本明細書にいう「二次進行型」MSとは、最初は再発寛解型であり、その後、再発には依存せずにさまざまな速度で進行型になるMSの臨床経過である。このタイプのMSを患っている対象は炎症性発作または増悪を経験し続けうるが、疾患が一次進行型MSに観察される特徴的変質を呈しつつ、結局のところ増悪および寛解期間が減少する。
【００９５】
本明細書にいう「進行再発型」MSとは、疾患の発症から永続的な神経学的変質を示しうるが、再発寛解型MSのように見える明確な急性増悪または再発を伴うMSの臨床経過である。これらの対象の場合、失われた機能は決して復活しないだろう。このタイプのMSは、無処置の場合、高い死亡率を持つと報告されている。
【００９６】
MSを示唆するCISには、早発性多発性硬化症および単一症状性MSが含まれるが、これらに限るわけではない。本発明に関して「多発性硬化症」という用語は、別段の指定がない限り、この疾患のこれらの臨床像のそれぞれおよびMSを示唆するCISを包含するものとする。例えば、MSまたはMSに関連する症状を持つ対象とは、MSまたは付随するMSの症状の処置を必要とする対象である。ある実施形態において、MSを患っている対象が本発明の医薬組成物および方法による処置を受ける場合、処置は、MSの疾患症状、疾患重症度および/またはこの疾患の再発の周期性の防止および/または改善をもたらすことができ、すなわち、本発明の組成物および方法を使ったMSの処置は、症状が再燃するエピソード間の期間の延長をもたらすことができ、かつ/またはこの疾患に関連する進行中の免疫応答または自己免疫応答（これは、無処置のまま放置すれば、疾患の進行および能力障害を強化することになりうる）を抑制することができる。
【００９７】
さらに対象は、本発明の医薬組成物または方法を用いる処置に先だって、医薬組成物で前処置されていてもよいし、医薬組成物による前処置を受けたことがないナイーブな対象であってもよい。例えば、MSの処置の場合、前処置された対象は、本発明の組成物または方法による処置に先だってIFN-βタンパク質薬（例えばIFN-β1a）またはIFN-β変種（例えばIFN-β1b）による前処置を受けたことがある対象であることができる。例えば、Betaseron（登録商標）、Avonex（登録商標）、またはRebif（登録商標）の承認用量を使って、対象を前処置することができる。このように、本発明の医薬組成物および方法は、前処置された対象およびナイーブな対象の処置における使用に適している。
【００９８】
本発明の医薬組成物および方法は、疾患に関連する生理学的変質および病原的変質、例えば脳および神経系の他の領域における炎症応答、血液脳関門の破損または破壊、脳における病巣の出現、組織破壊、脱髄、自己免疫炎症応答、急性もしくは慢性炎症応答、ニューロン死、および/または神経膠死を阻止しまたは減少させるためにも使用することができる。本発明の医薬組成物および方法の有益な作用には、疾患を防止すること、確立された疾患の発生を減速すること、疾患の症状を改善すること、増悪率を低下させること、疾患の進行を減速すること、および認知低下、失職、入院、最終的には死を含む能力障害を延期または防止することが含まれるが、これらに限るわけではない。特定タイプの疾患（例えばMS）のエピソード性再発は、例えばそのエピソードに関連する症状（例えば上述の症状）の重症度を下げることによって、またはエピソードの出現の間の期間を例えば日、週、月、もしくは年単位で延長すること（この場合、エピソードは疾患症状の急激な再燃および増悪を特徴としうる）によって、処置することができる（神経学的炎症性病巣の説明については例えばAdams (1993)「Principles of Neurology」777頁を参照されたい）。
【００９９】
さらに、本発明の組成物および方法での使用に適した核酸は、融合タンパク質もしくはキメラタンパク質または融合核酸もしくはキメラ核酸（例えばRNA）であるTMをコードすることができる。いくつかの実施形態において、本発明のTMは、遺伝子産物の発現を制御するか、生物学的経路（例えば敗血症経路）の一つ以上のステップを遮断し、それによって、治療的利益を与えることができる。さらに核酸は、TMに融合された毒素をコードし（例えば融合された毒素を腫瘍細胞またはウイルスなどのターゲットに向かわせる受容体リガンド遺伝子または抗体）、それによって治療効果を持つことができる。核酸配列を作動的に挿入および/または融合するための標準的方法、または本発明のアミノ酸配列にアミノ酸配列を挿入するための標準的方法は、本明細書に記載し、当技術分野でも記載されている（例えばSambrookら「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, ニューヨーク州コールドスプリングハーバー (1989)；Ausubelら編「Current Protocols In Molecular Biology」John Wiley and Sons (1987)を参照されたい）。
【０１００】
いくつかの疾患処置レジメンによる有害作用が当技術分野では知られている（例えばMunschauerら, (1997) Clinical Therapeutics 19(5):883-893；Waltherら (1999) Neurology 53:1622-1627；Lublinら (1996) 46:12-18；Bayasら (2000) 2: 149-159；Reeら (2002）8:15-18；Waltherら (1998) 5(2): 65-70を参照されたい）。例えば、MSの処置による有害作用の一部には、例えばインフルエンザ様症状；痙縮の増加または神経学的症状の悪化；月経障害；検査値異常（例えばヘモグロビン、白血球、顆粒球、リンパ球、または血小板に関する異常な血球数/値）；肝臓酵素に関する検査値異常（ビリルビン、トランスアミナーゼ、またはアルカリホスファターゼ）；注射部位反応（例えば炎症、疼痛、または紅斑）；皮膚壊死または皮下壊死；およびうつ病が含まれるが、これらに限るわけではない。疾患（例えばMS）の処置による有害作用を処置するための、適切な同時薬物適用ならびに本発明の組成物および方法と合わせたそれら同時薬物適用の使用は、そのような作用を処置するために当技術分野で広く知られている同時薬物適用に従って決定することができる（例えばMunschauerら, (1997) Clinical Therapeutics 19(5): 883-893；Waltherら (1999) Neurology 53:1622-1627；Lublinら (1996) 46: 12-18；Bayasら (2000) 2:149-159；Reeら (2002）8:15-18；Waltherら (1998) 5(2):65-70を参照されたい）。そのような同時薬物適用に関する用量および投与レジメンも広く知られている。そのような同時薬物適用は当技術分野ではよく知られており、例えば、疾患による有害作用または疾患の処置による有害作用の軽減または緩和を助けるものが含まれうるが、これらに限るわけではない。そのような同時薬物適用の例には、鎮痛薬、非ステロイド性抗炎症薬（NSAID）、およびステロイドが含まれるが、これらに限るわけではない。
【０１０１】
同時薬物適用の他の適切な例には、例えばイブプロフェン、アセトアミノフェン、アセチルサリチル酸、プレドニゾン、ペントキシフィリン、バクロフェン、ステロイド、抗細菌剤、および抗うつ薬が含まれるが、これらに限るわけではない（例えばWaltherら (1999) Neurology 52:1622-1627を参照されたい）。例えば、インフルエンザ様症状はNSAID（例えばイブプロフェンもしくはアセチルサリチル酸）またはパラセタモールまたはペントキシフィリンで処置することができ；痙縮の増加または神経学的症状の悪化もNSAIDおよび/または筋弛緩薬（例えばバクロフェン）で処置することができ；月経障害は経口避妊薬で処置することができ；注射部位反応は全身性NSAIDおよび/またはステロイド（例えばヒドロコルチゾン）で処置することができ；皮膚壊死または皮下壊死は抗細菌剤で処置することができ、うつ病は抗うつ薬で処置することができる（例えばWaltherら (1999) Neurology 53: 1622-1627を参照されたい）。
【０１０２】
特定の疾患の処置に有効であり異なる有害作用プロファイルを持つ他の薬物との併用療法は、処置効果を増大させ、有害事象プロファイルを平坦にしうる。MSの処置の場合、併用療法の例には、例えば酢酸グラチラマー（コパクソン）、ミトキサントロン、シクロホスファミド、シクロスポリンA、クラドリビン、モノクローナル抗体（例えばCampath-H1（登録商標）またはAntegren（登録商標）/Natazulimab（登録商標））、およびスタチン類が含まれるが、これらに限るわけではない。
【０１０３】
本発明の方法を使った対象における疾患の有効な処置は、例えばMSの処置については、EDSS（総合障害度評価尺度）スコア、機能複合スコア（Functional Composite Score）、認知検査、増悪の出現、またはMRIを含むいくつかの代替的方法で、検討することができる。EDSSはMSによる臨床障害を等級分けするための手段である（例えばKurtzke (1983) Neurology 33:1444を参照されたい）。8つの機能系、歩行可動域、歩行能力、およびセルフケア機能を維持する能力が、神経学的障害のタイプおよび重症度について評価される。例えば、処置に先だって、以下の系の障害が評価される：錐体路、小脳、脳幹、感覚、膀胱直腸、視覚、大脳、その他。歩行可動域の評価、補助具ありまたは補助具なしでの歩行能力の評価、およびセルフケア機能を維持する能力と合わせて、最終的なEDSSスコアが算出される。次に、所定の処置間隔で、経過観察スコアが得られる。この等級尺度は例えば0（正常）〜10（MSによる死）に及びうる。丸1ステップ分（またはベースラインEDSSスコアが高い場合は0.5ステップ分）の増加によって、疾患の進行を定義することができる（例えばKurtzke (1994) Ann. Neurol. 36:573-79、Goodkin (1991) Neurology. 41:332を参照されたい）。
【０１０４】
MSの処置に関して、増悪とは、MSに起因すると考えることができ、かつ適当な新しい神経学的異常が付随する、新しい症状の出現と定義することができる（例えばIFN-β MS Study Groupを参照されたい）。増悪は典型的には少なくとも24時間持続し、少なくとも30日間の安定または改善が先行するか、最後のイベントの発生からは少なくとも30日間の隔たりがある。標準的な神経学的検査は、神経学的評価尺度（Neurological Rating Scale）の変化（例えばSipeら (1984) Neurology 34:1368を参照されたい）および/またはEDSSスコアの変化、または評価医の意見に応じて、軽度、中等度、または重度と分類される増悪をもたらしうる。次に、年間増悪率（または例えば反復的再発のハザード比のような再発の頻度に関する他の尺度）、無増悪対象の比率、および疾患活動性に関する他の再発に基づく尺度を決定し、これらの測定のいずれかについて、治療の有効性を処置群とプラセボ群の間で査定する。
【０１０５】
さらに、疾患を処置するための本発明の組成物および方法における使用に適したベクターは、最小限の免疫毒性を持つもの、例えばプラスミドまたはAAVベクターである。例えば、CMVプロモーターの制御下にあるTGF-βまたはIL-4をコードするプラスミドベクターは、最小限の免疫毒性でミエリン塩基性タンパク質（MBP）誘発性EAEからマウスを保護すると報告されている（例えばC.A. PiccirilloおよびG.J. Prud'homme (1999) Human Gene Therapy 10: 1915-22を参照されたい）。さらに、髄腔内投与後にIL-4、IL-10、またはIL-1アンタゴニストを発現させる非複製型単純ヘルペス（HSV）1型ベクターを含めて、さまざまなベクターおよびターゲット組織が、EAEモデルおいてサイトカインを発現させるための使用に適していると報告されている（例えばG. Martinoら (2000) J. Neuroimmunol 107: 184-90を参照されたい）。
【０１０６】
いくつかの新しい技術も、疾患（例えばMS）を診断しその処置を管理するために使用することができる。例えば磁気共鳴映像法（MRI）スキャニングは疾患および疾患活動の併用指標とすることができ、診断ツールとして使用することもできる（例えばPatyら (1993) Neurology 43: 662-667；Frankら (1994) Ann. Neurology 36(suppl.):S86-S90；(1995) Neurology 45:1277-1285；Filippiら (1994) Neurology 44:635-641を参照されたい）。例えば、MSの処置に関して、MRIは、例えばガドリニウム-DTPA強化T1加重イメージングを使って活動性病巣を測定するために（例えばMcDonaldら (2001) Ann. Neurol. 50:121-127を参照されたい）、またはT2加重およびT1加重技法を使って病巣の位置および程度を測定するために使用することができる。ベースラインMRIを取得し、その後は同じ撮像平面および対象位置を以降の研究に使用することができる。MSの場合、病巣領域の輪郭を画き、スライスごとに合計して総病巣面積を求め、例えば次に挙げるさまざまな基準を検討することができる：1）新しい病巣の証拠；2）活動性または新しい病巣の出現率；および3）病巣面積または病巣体積の変化（例えばPatyら (1993) Neurology 43:665を参照されたい）。したがって、次に、例えば個々の対象にベースラインと比較して統計的に有意な改善があった場合や、プラセボ群との比較で処置群に統計的に有意な改善があった場合に、治療による改善を確証することができる。
【０１０７】
組成物の製剤および投与
好ましい実施形態では、本発明の核酸組成物が、対象の細胞への投与または送達のために製剤される。いくつかの実施形態では、本発明の核酸組成物が非イオン性および/またはアニオン性ポリマーを使って製剤される。そのようなポリマーは、トランスフェクション効率および核酸によってコードされる分子の発現を強化し、核酸を分解から保護することができる。このように、トランスフェクション効率または発現が本発明の製剤された核酸組成物を使って強化されるいくつかの実施形態では、核酸組成物（例えば本発明の分子（例えば本発明のTMおよび/またはRM）をコードするベクター）の使用量を減らすことができる。本明細書にいう「生分解性ポリマー」とは、対象により生体内で代謝または除去されうるポリマーであり、かつ対象に対する毒性作用または副作用がないかごくわずかしかないポリマーを指す。
【０１０８】
本明細書にいう「アニオン性ポリマー」とは、例えば中性pHで正味の負電荷を持つイオン化したカルボキシル基、リン酸基または硫酸基を含む繰り返しサブユニットを持つポリマーを指す。本発明での使用に適したアニオン性ポリマーの例には、ポリアミノ酸（例えばポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸およびその組合せ）、ポリ核酸、ポリアクリル酸、ポリガラクツロン酸、およびポリビニル硫酸が含まれるが、これらに限るわけではない。ポリマーがポリマー酸であるいくつかの実施形態では、そのポリマーが塩型として利用される。他のポリマーの例には、PVP、PVA、およびキトサンが含まれるが、これらに限るわけではない。本明細書にいう「ポリ-L-グルタミン酸」は、本明細書では、「ポリ-L-グルタミン酸ナトリウム塩」「ナトリウムポリ-L-グルタメート」および「ポリ-L-グルタメート」と可換的に使用される。本明細書にいう「ポリ-L-グルタメート」とは、ポリ-L-グルタミン酸のナトリウム塩を指す。さらに、好ましい実施形態では、本発明の組成物にポリグルタミン酸のL立体異性体を使用するが、別の実施形態では、他の立体異性体または異性体のラセミ混合物が本発明の組成物での使用に適する。さらに、いくつかの実施形態では、アニオン性アミノ酸ポリマーの他の塩が、本発明の組成物での使用に適する。
【０１０９】
本明細書で使用する「アニオン性アミノ酸ポリマー」という用語は、ポリマー状の所与のアニオン性アミノ酸、例えばポリグルタミン酸またはポリアスパラギン酸を指す。いくつかの実施形態では、アニオン性アミノ酸、例えばグルタミン酸およびアスパラギン酸から形成されるポリマーが、本発明の組成物での使用に等しく適しうる。
【０１１０】
医薬組成物を製剤するための方法は当技術分野では広く知られている。製剤および薬学的に許容できる担体、安定剤、およびイソモライト（isomolyte）の選択に関する詳細な議論については、例えば「Remington's Pharmaceutical Sciences」増補18版（Mack Pub. Co.：ペンシルバニア州イートン、1990）を参照されたい（また、例えば米国特許第4,588,585号；同第5,183,746号；同第5,795,779号；および同第5,814,485号；米国特許出願第10/190,838号、同第10/035,397号；ならびにPCT国際出願番号PCT/US02/21464およびPCT/US01/51074も参照されたい）。
【０１１１】
本発明の医薬組成物および方法では薬学的に許容できる担体および他のコンポーネント（例えば同時適用薬）を使用することができる。本明細書にいう「薬学的に許容できる担体」は、医薬組成物の治療成分の貯蔵、投与および/または所望の作用を容易にするために当技術分野において従来から使用されている担体または希釈剤である。担体は、対象への本発明の医薬組成物の投与または送達の望ましくない副作用も減少させうる。適切な担体は好ましくは安定であり、例えば製剤中の他の成分と反応する能力を持たない。さらに、適切な担体は、好ましくは、治療に使用される用量および濃度で対象に局所性または全身性の有害作用を生じない。そのような担体は当技術分野では広く知られている。
【０１１２】
適切な薬学的に許容できる担体は、例えば、本発明の医薬組成物の不適合コンポーネントではない、溶媒、分散媒、抗細菌および抗真菌剤、マイクロカプセル、リポソーム、カチオン性脂質担体、等張化および吸収遅延剤などである。治療有効物質または治療活性物質のための、そのような媒質および薬剤の使用は、当技術分野ではよく知られている。補足的な活性成分を本発明の医薬組成物に組み込み、本発明の方法で使用することもできる。
【０１１３】
本発明の医薬組成物における使用に関して薬学的に適切な担体のさらなる例は、大きくて安定な高分子、例えばアルブミン、ゼラチン、コラーゲン、多糖、単糖、ポリビニルピロリドン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アミノ酸ポリマー、固定油、オレイン酸エチル、リポソーム、 グルコース、スクロース、ラクトース、マンノース、デキストロース、デキストラン、セルロース、マンニトール、ソルビトール、ポリエチレングリコール（PEG）、ヘパリン・アルギネートなどである。徐放担体、例えばヒアルロン酸も、適切でありうる。
【０１１４】
本発明の医薬組成物には、その安定性を強化するために、ヒト血清ルブミン（HSA）、マンニトール、デキストロース、トレハロース、チオグリセロール、およびジチオスレイトール（DTT）などの安定剤も加えることができる。適切な安定剤には、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）またはその塩の一つ、例えばEDTA二ナトリウム；ポリオキシエチレンソルビトールエステル、例えばポリソルベート80（TWEEN80）、ポリソルベート20（TWEEN20）；ポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレンエステル、例えばプルロニックF68およびプルロニックF127；ポリオキシエチレンアルコール、例えばブリッジ35；シメチコン（semethicone）；ポリエチレングリコール、例えばPEG400；リゾホスファチジルコリン；およびポリオキシエチレン-p-t-オクチルフェノール、例えばトリトンX-100が含まれるが、これらに限るわけではない。界面活性剤による医薬組成物の安定化は当技術分野では広く知られている（例えばLevineら (1991) J. Parenteral Sci. Technol. 45(3):160-165を参照されたい）。
【０１１５】
本発明の医薬組成物の他の許容できるコンポーネントには、水、食塩水、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸、アスパラギン酸塩、および他の有機酸またはそれらの塩などといった等張性を強化する緩衝剤が含まれうるが、これらに限るわけではない。好ましくは、本発明の医薬組成物は、組成物を体液と等張にするのに十分な量の非イオン性等張化剤（tonicifying agent）を含む。本発明の医薬組成物は、当業者に広く知られているいくつかの非イオン性浸透圧調整剤、例えばさまざまな種類の糖質（例えばVoetおよびVoet (1990)「Biochemistry」（John Wiley & Sons、ニューヨークを参照されたい）；アルドース（例えばグルコース、マンノース、アラビノース）およびリボースと分類される単糖類、ならびにケトースと分類されるもの（例えばフルクトース、ソルボース、およびキシルロース）；二糖類（例えばスクロース、マルトース、トレハロース、およびラクトース）；ならびにアルジトール類（非環状ポリヒドロキシアルコール）、例えばグリセロール、マンニトール、キシリトール、およびソルビトールを使って、等張性にすることができる。好ましい一実施形態では、非イオン性等張化剤がトレハロース、スクロース、およびマンニトール、またはその組合せである。
【０１１６】
好ましくは、非イオン性等張化剤は、製剤を体液と等張にするのに十分な量で加えられる。ある実施形態では、本発明の医薬組成物（例えばHSA非含有医薬組成物を含む）に組み込まれる場合、非イオン性等張化剤は、使用する薬剤に依存して、約1％〜約10％の濃度で存在する（例えば米国特許出願第10/190,838号、同第10/035,397号；ならびにPCT国際出願番号PCT/US02/21464およびPCT/US01/51074を参照されたい）。
【０１１７】
さらに、本発明の好ましい医薬組成物は、注射によって生じる局所疼痛および刺激の少ない緩衝剤、または本発明の医薬組成物（例えばTM、RM、AM、および/またはIMを含み、かつ/またはコードするもの）のコンポーネントの溶解度もしくは安定性を改善する緩衝剤を組み込みうる。そのような緩衝剤には、例えば低濃度リン酸塩、アスパラギン酸塩、およびコハク酸塩緩衝剤が含まれるが、これらに限るわけではない。
【０１１８】
本発明の医薬組成物はさらに、組成物のコンポーネントの溶解度を高める能力を持つ可溶化化合物または可溶化製剤を含みうる。適切な可溶化化合物には、例えばグアニジウム基を含有する化合物、好ましくはアルギニンが含まれる。適切な可溶化化合物の他の例には、例えばアミノ酸アルギニン、または本発明のIFN-βムテインの溶解度を高める能力を保っているアルギニンのアミノ酸類似体が含まれるが、これらに限るわけではない。そのようなアミノ酸類似体の例には、例えばアルギニンを含有するジペプチドおよびトリペプチドが含まれるが、これらに限るわけではない。適切な可溶化化合物のさらなる例は、例えば米国特許第4,816,440号；同第4,894,330号；同第5,005,605号；同第5,183,746号；同第5,643,566号；およびWangら (1980) J. Parenteral Drug Assoc. 34:452-462で議論されている。
【０１１９】
好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物（例えばTM、RM、AM、および/またはIMを含み、かつ/またはコードするもの）が、溶液剤、懸濁剤、もしくは乳剤などの単位剤形かつ注射可能な形態で、または投与前に溶液剤、懸濁剤、もしくは乳剤に変換することができる凍結乾燥粉末の形態で製剤される。本発明の医薬組成物は、膜濾過によって滅菌し（これにより凝集物も除去される）、密封したバイアル、アンプルまたはシリンジなどの1回量容器または多用量容器に保存することができる。
【０１２０】
もう一つの実施形態では、本発明のAMまたはIMが経口投与用に製剤される。ある実施形態では、本発明のTMおよび/またはRMをコードする核酸が注射またはエレクトロポレーションによる投与のために製剤され、本発明のAMおよび/またはIMが経口投与用に製剤される。例えば好ましい一実施形態では、本発明の制御発現系が、対象の細胞におけるAMの存在がRMを活性化し、結果として、RMが対象の細胞内でTMの発現を誘導するように、注射またはエレクトロポレーションによって対象の細胞に送達するために製剤された少なくともTMおよびRMをコードする単一ベクターと、対象への経口投与用に製剤されたAMとを含む。
【０１２１】
液状、凍結乾燥型、または噴霧乾燥型の本発明の医薬組成物は、例えば水性または非水性の溶液または懸濁液として、当技術分野で知られているとおりに製造した後、本発明の方法に従って対象に投与することができる。これらの医薬組成物のそれぞれは、治療的または予防的に有効または活性なコンポーネントを含みうる。本明細書にいう治療的または予防的に「有効」または「活性」なコンポーネントとは、本発明の医薬組成物および方法を使って、処置を必要とする対象における疾患または状態の処置、防止、または診断に関して、所望の治療的または予防的応答を生じさせるために、本発明の医薬組成物中に含まれる量の本発明の分子（例えばTM、RM、AM、および/またはIMを含み、かつ/またはコードするもの）である。好ましくは、本発明の医薬組成物は、製造および貯蔵中の生物学的活性または治療活性の喪失に関連する問題を最小限に抑えるために、適当な安定剤、充填剤、またはその両方を含む。
【０１２２】
本発明の医薬組成物の製剤は、好ましくは、生産条件下および貯蔵条件下で安定であり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護される。微生物汚染を防止する方法はよく知られており、例えばさまざまな抗細菌および抗真菌剤によって達成することができる。
【０１２３】
本発明の医薬組成物の適切な形態には、水性の溶液剤または分散剤、および滅菌された注射用の溶液剤または分散剤を即時調製するための滅菌粉末を含めることができる。適切な形態は、好ましくは、滅菌されていて、容易に服用またはシリンジで注射できる程度に流動性である。典型的な担体には、例えば水、緩衝水溶液（すなわち生体適合性緩衝液）、エタノール、ポリオール、例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、その適切な混合物、界面活性剤、または植物油などを含有する溶媒または分散媒を含めることができる。滅菌は、濾過または抗細菌もしくは抗真菌剤（例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸またはチメロサール）の添加を含む（ただしこれらに限るわけではない）当技術分野で認識されている任意の技法によって達成することができる。さらに、対象組成物には糖類または塩化ナトリウムなどの等張化剤も組み込むことができる。
【０１２４】
本発明の医薬組成物を含有する滅菌注射可能溶液の製造は、所望する量の組成物を、適当な製剤に、要望に合わせてさまざまな成分（例えば本明細書に挙げるもの）と一緒に組み込むことによって達成することができ、次に滅菌が行われる。滅菌粉末を得るには、上記の溶液を必要に応じて真空乾燥または凍結乾燥することができる。
【０１２５】
このように、便利で効果的な投与のために、本発明の医薬組成物は、薬学的に有効な量で、治療有効用量の適切な薬学的に許容できる担体と共に、調合することができる。ヒトに適用する場合の本発明の組成物および方法の正確な治療有効量は、当業者により、年齢、体重、炎症細胞による細胞浸潤の程度およびMS対象の状態の個体差を考慮して決定されうる。
【０１２６】
投与を容易にし、投薬量を均一にするために、非経口組成物を投薬単位形態で製剤することは、とりわけ有利である。本明細書にいう投薬単位形態とは、処置される哺乳動物対象への単位投薬量として適している物理的に不連続な単位であって、各単位が、必要な医薬担体と一緒になって所望の治療効果をもたらすように計算された所定の量の活性物質を含有しているものを指す。
【０１２７】
便利で効果的な投与のために、主要活性成分は、本明細書に記載する投薬単位形態中に、薬学的に許容できる担体と共に、治療有効量で調合することができる。さらに、同時適用薬は、当技術分野で広く知られている量で、単位剤形に含有される。補足的な活性成分、例えば同時適用薬を含有する組成物の場合、投薬量は、例えばその成分の既知の投与用量および投与方法を参照するなどして決定することができる。
【０１２８】
本発明の医薬組成物は、その投薬剤形に適合する方法で、治療的に有効になるような量で、投与することができる。さらに本発明の医薬組成物は、医学的に許容でき、処置される疾患または関連症状の具体的タイプまたは段階に依存しうる、任意の方法で投与することができる。考えうる投与経路には、血管内、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、腫瘍内、腹腔内、室内（intraventricular）、硬膜外（intraepidural）などの非経口経路による注射、ならびに経口、鼻腔内、目、直腸、局所外用、または吸入による投与経路が含まれる。好ましい一実施形態では、投与経路が筋肉内である。好ましい一実施形態では、本発明の医薬組成物が、3〜12ヶ月ごとに筋肉内投与される。もう一つの好ましい実施形態では、筋肉内投与が医薬組成物の自動注射または用手注射（例えばシリンジを使用）によって行われる。例えば浸食性インプラントを使った徐放投与も考えられる。
【０１２９】
特に、本発明の核酸医薬組成物は、本明細書に記載するまたは当技術分野で知られる任意の手段を使って、例えば注射または他の適切な手段によって、対象の細胞に送達することができる。例えば、物理的手段によって細胞に核酸を送達する既知の方法は、使用に適しており、そのような方法には、エレクトロポレーション、ソノポレーション、および圧力が含まれるが、これらに限るわけではない。いくつかの実施形態では、本発明の核酸組成物の送達がエレクトロポレーションによって行われ、パルス状の電場を適用して、細胞膜に一過性の細孔を生じさせることを含み、その結果、外因性分子、例えば本発明の核酸組成物が細胞に送達される。エレクトロポレーションシステムによって生成される電気パルスを調整することによって、そのような手法中に生成される通路または細孔を通って、核酸分子が細胞内に到達しうることは知られている（例えば米国特許第5,704,908号、米国特許第5,704,908号を参照されたい）。
【０１３０】
本明細書にいう「パルス電圧装置」または「パルス電圧注入装置」とは、限局的な電気パルスを細胞に放ち、それによって細胞膜を不安定化して、細胞膜における通路または細孔の形成をもたらすことにより、対象の細胞内への核酸分子の取込みを引き起こす能力を持つ、またはそのような取込みを引き起こす装置を指す。従来からあるこのタイプの装置は、本発明の核酸組成物を送達するための使用に適している。いくつかの実施形態では、当業者がパルス状電圧の所望の電圧振幅および/または持続時間を選択しかつ/または調整することができるように、装置が較正される。パルス電圧核酸送達装置には、例えば、米国特許第5,439,440号、米国特許第5,704,908号、米国特許第5,702,384号、および国際特許公開番号WO96/12520、WO96/12006、WO95/19805またはWO97/07826などに記載されているエレクトロポレーション装置を含めることができる。
【０１３１】
本発明の医薬組成物の活性成分を含有させるために用いられる梱包材料は、ガラス、プラスチック、金属または他の任意の適切な不活性材料を含むことができ、好ましくはそこに含有される成分のいずれとも化学反応しない梱包材料である。ある実施形態では、医薬組成物が透明なガラス製の使い捨てバイアル中に梱包され、薬物の各バイアルごとに、希釈剤を含有する別個のバイアルが含まれる。もう一つの好ましい実施形態では、希釈剤がシリンジ中に用意される（すなわちシリンジには希釈剤が前もって充填される）。さらにもう一つの好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物がシリンジ中に溶液として用意され（すなわちシリンジには溶液状の医薬組成物が前もって充填され）、すぐに使用できる状態にある。ある実施形態では、本発明の医薬組成物を冷蔵庫中、2〜8℃（36〜46°F）で保存することができる。好ましい一実施形態では、医薬組成物が室温で保存される。
【０１３２】
ベクターおよびキット
本発明はさらに、疾患を処置するための、本発明の改良された制御発現系を含むベクターおよびキットを提供する。いくつかの実施形態では、本発明の改良された制御発現系が一つ以上のベクターを含み、各ベクターが一つ以上の発現カセットを含む。ある実施形態では、本発明の改良された制御発現系が、少なくとも一つの発現カセット（より好ましくは少なくとも二つの発現カセット）を持つ単一ベクターを含む。
【０１３３】
本発明の制御された発現系における使用に関して適切なベクターには、対象の細胞に投与された場合に、コードされたTM、および/または本発明のコードされた他の分子（例えばRM、AM、またはIM）を発現させる能力を持つものが含まれるが、これらに限るわけではない。適切なベクターの例には、本明細書に記載するものおよび当技術分野で知られているもの（ウイルスを生産するためのベクターおよび非ウイルスベクター（ウイルスを生産しないベクター）を含む）が含まれるが、これらに限るわけではない。例えば、適切なベクターの一クラスでは、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、またはSV40ウイルスなどの動物ウイルスから誘導された、自律的に複製する染色体外プラスミドを与えるDNAエレメントを利用する。さらに、ウイルスを生産するための既知のベクター（例えばWangら, Gene Therapy, 4:432-441, 1997；Oliginoら, Gene Therapy 5:491-496, 1998を参照されたい）を修飾し、本発明の制御発現系での使用に適合させてもよい。さらに、本発明のベクターは、コードされた分子の発現が最適になるように追加の作動的に連結された機能配列を含むように修飾することができる。適切な機能配列の例には、スプライシング、ポリアデニル化および他のタイプのRNAプロセシング配列、ならびに転写プロモーター、エンハンサー、および終結配列が含まれるが、これらに限るわけではない。そのような機能配列を組み込んだ適切なcDNA発現ベクターには、Okayama, H., Mol. Cell. Biol. 3:280 (1983)に記載されているものなどが含まれる。
【０１３４】
本明細書にいう「プラスミド」とは、染色体DNAには依存せずに複製することができる、通常はDNAの環状二重鎖である、染色体外遺伝物質を含む組成物を指す。プラスミドは本明細書に記載するとおりベクターとして使用することができる。本明細書にいう「ベクター」とは、標的細胞の形質転換またはトランスフェクションを指示するように設計された遺伝物質を含む組成物（例えば核酸コンストラクト）を指す。さらにベクターは、本発明のコードされた分子が転写され、必要ならばトランスフェクト細胞または形質転換細胞内で翻訳されうるように、そのベクターの他の配列に対して位置的および順序的に正しく配置された、複数の機能配列を含有しうる。ベクターまたは発現カセットが本発明の分子（例えばTM、RM、AMまたはIM）をコードする場合、それは、本明細書に記載する本発明の制御発現系に従って、異種細胞（例えば対象の細胞）中でコードされた分子を発現させるための必須コンポーネント（例えばプロモーター、ポリ(A)部位、転写開始部位および転写停止部位）を含む。
【０１３５】
好ましい一実施形態では、本発明の改良された制御発現系が、TMをコードする第1核酸配列を挿入するための少なくとも一つのクローニング部位を持つ第1発現カセットと、RMをコードする第2核酸配列を挿入するための少なくとも一つのクローニング部位を持つ第2発現カセットとを含む単一ベクターを含む。もう一つの実施形態では、ベクターが、本明細書に記載するように対象の細胞に送達するための本発明の分子（例えばTMおよび/またはRM）をコードするウイルスを生産するためのベクター、例えばシャトルプラスミド、より具体的にはAAV-1シャトルプラスミド（例えば表8を参照されたい）である。
【０１３６】
もう一つの好ましい実施形態では、ベクターが単一プラスミドベクター、例えばpGT1（配列番号9および配列番号4の配列を含む）、pGT2（配列番号10および配列番号4の配列を含む）、pGT3（配列番号11および配列番号4の配列を含む）もしくはpGT4（配列番号12）（この場合、各ベクターは（例えば図14A〜Dに概略図を示すように）IVS8の3'側かつhGHポリ(A)部位の5'側に位置するマルチクローニング部位（配列番号4）を含む）、またはpGT11（配列番号9および配列番号5の配列を含む）、pGT12（配列番号10および配列番号5の配列を含む）、pGT13（配列番号11および配列番号5の配列を含む）もしくはpGT14（配列番号12および配列番号5の配列を含む）（この場合、各ベクターは、IVS8の3'側かつhGHポリ(A)部位の5'側に位置するマルチクローニング部位（配列番号5）を含む）である。最も好ましい実施形態では、単一プラスミドベクターが、例えばpGT79（配列番号59）、またはpGT79から誘導される単一プラスミドベクター、例えばpGT1003（配列番号60を含む）、pGT1004（配列番号62を含む）、pGT1005（配列番号64を含む）、pGT1006（配列番号66を含む）、pGT1007（配列番号68を含む）、pGT1008（配列番号70を含む）、pGT1009（配列番号72を含む）、pGT1015（配列番号74を含む）、pGT1016（配列番号76を含む）、pGT1017（配列番号78を含む）、pGT1025（配列番号80を含む）、pGT1020（配列番号82を含む）、pGT1021（配列番号84を含む）、pGT1022（配列番号86を含む）、pGT1023（配列番号88を含む）、もしくはpGT1024（配列番号90を含む）である。
【０１３７】
本発明の発現カセットは、本発明のコードされた分子（例えばTM、RM、AM、またはIM）を発現させるための機能配列を含む。いくつかの実施形態では、発現カセットが本発明の分子をコードする核酸配列に作動的に連結された少なくとも一つの機能配列を含む。本明細書にいう「機能配列」とは、細胞内で機能または活性、例えばある分子の細胞発現、プロセシング、もしくはクローニングに関係する機能もしくは活性、あるいはある分子の生物学的活性もしくは機能または細胞活性もしくは細胞機能に関係する機能もしくは活性を持つ、核酸またはアミノ酸配列を指す。機能配列の例には、本発明の分子（例えばTM、RM、AM、もしくはIM）をコードする配列、プロモーター、タンパク質もしくは核酸結合部位、スプライス部位、転写停止部位、制御ドメイン（例えば活性化ドメイン）、転写開始部位、タンパク質もしくは核酸安定化部位、介在配列、制限酵素部位もしくはクローニング部位、ウイルスパッケージングシグナル、または他の細胞タンパク質もしくは核酸プロセシングもしくは制御シグナル（例えばシグナル伝達配列もしくは組織特異的配列）が含まれる。機能配列のさらなる例は、5'もしくは3'非翻訳領域（例えばUT12、配列番号2）、イントロン（例えばIVS8、配列番号3）、ポリアデニル化（ポリ(A)）部位（例えばSV40ポリ(A)部位（配列番号8）もしくはhGHポリ(A)部位（配列番号6））、またはDNA結合部位（DBS）（例えば配列番号49）であるが、これらに限るわけではない。
【０１３８】
そのような機能配列には、例えば、本発明の発現カセット中でそのような機能配列に作動的に連結された核酸配列によってコードされる分子の、それぞれ制御された発現または組織特異的発現を促進する、被制御プロモーターまたは組織特異的プロモーターをコードする配列も含まれる。適切なプロモータの例には、CMVプロモーター、筋特異的プロモーター（例えばアクチンプロモーターまたは筋クレアチンキナーゼ（MCK）プロモーター）、状態特異的（例えば低酸素症または炎症）プロモーターまたはエレメント（例えばELAMプロモーターまたはHRE）、構成的プロモーター（例えばユビキチン、PGK、またはEF1αプロモーター）、合成またはキメラプロモーター（例えばCMV/アクチンプロモーター）、細胞周期特異的プロモーター（例えばサイクリンAまたはcdc6プロモーター）が含まれるが、これらに限るわけではない。ある実施形態では、プロモーターが、生理学的応答性プロモーター、例えば炎症に応答するプロモーター、好ましくは疾患または状態の発生または存在を示すサイトカインまたはケモカインまたは他の生物学的分子の存在に応答するプロモーターである。適切なプロモーターのさらなる例を下記表1に記載する。
表1
【表１】
2010523131.tif 000003
【０１３９】
ある実施形態では、本発明の制御発現系が、融合タンパク質またはキメラタンパク質である本発明の分子をコードする核酸配列に作動的に連結されたCMVプロモーター配列を持つ少なくとも一つの発現カセットを含む一つ以上のベクターを含み、そのプロモーターがコードされた分子（例えばTM、RM、AM、またはIM）の発現を駆動する。いくつかの実施形態では、適切なプロモーターが、対象の細胞において、コードされた分子の永続的な発現レベルをもたらすものであるだろう。ある実施形態では、核酸ベクターが、対象の細胞における永続的な発現をもたらすプロモーターに作動的に連結された本発明の分子（例えばTM、RM、AM、またはIM）をコードし、その核酸ベクターは、分子が細胞内で（好ましくは投与部位にある細胞内で）発現されるように、エレクトロポレーションによって対象の細胞に投与される。好ましい一実施形態では、コードされた分子がTMである。
【０１４０】
もう一つの実施形態では、本発明の制御発現系が、本発明のTMをコードする核酸配列に作動的に連結された少なくとも一つのGAL-4 DBSを含むプロモーター配列を持つ第1発現カセットを含む一つ以上のベクターを含む。ある実施形態では、プロモーター配列がGAL-4 DBSの多量体、例えば3〜18個のGAL-4 DBSを含むを含む。
【０１４１】
さらに、本発明の発現カセットは、所望の核酸配列を挿入するためのクローニング部位を含むように、適切に修飾することができる。もう一つの実施形態では、本発明の発現カセットが、本発明の分子（例えばTM、RM、AM、またはIM）をコードする核酸配列を挿入するための少なくとも一つのクローニング部位、より好ましくはマルチクローニング部位（MCS）を含む。本明細書にいう「クローニング部位」とは、当技術分野で知られる従来の方法を使って、そこに核酸配列を、例えばその配列がその意図する目的のために機能するように挿入し、作動的に連結し、または他の形で取付けることができるような、核酸中の酵素部位または他の部位である。ある実施形態では、本発明の第1発現カセットが、TMをコードする第1核酸配列を挿入するためのMCS、少なくとも一つのDBS（例えば3〜18個のGAL-4 DBS）を含む誘導性プロモーター、5'非翻訳領域（例えばUT12、配列番号2）、イントロン（例えばIVS8、配列番号3）、およびhGHポリ(A)部位（例えば配列番号6）を、第1核酸配列がMCS（例えば配列番号4または配列番号5）に挿入された時にこれらの機能配列が第1核酸配列に作動的に連結されるように含む。もう一つの実施形態では、本発明の第2発現カセットが、制御されるRMをコードする第2核酸配列を挿入するためのMCSと、SV40ポリ(A)部位（例えば配列番号8）とを、第2核酸配列がMCSに挿入された時にこれらの機能配列が第2核酸配列に作動的に連結されるように含む。好ましい一実施形態では、第1および第2発現カセットが、上述のように単一ベクター中に存在する。
【０１４２】
本発明のキットは、本明細書に記載する本発明の発現系の少なくとも一つ、より具体的には、本発明の医薬組成物、ベクター、または分子（例えばTM、RM、AM、またはIM）の少なくとも一つと、それらの使用に関する指示とを含む。
【０１４３】
組成物の単離および構築
本発明の組成物は、例えば化学化合物、タンパク質、および核酸（例えばDNAまたはRNA分子）、とくにタンパク質またはRNAをコードする核酸を含む。本発明の化学物質、核酸、およびタンパク質組成物は、本明細書に記載するように、または当技術分野で記載されているように、従来の方法およびアッセイを使って、単離し、構築し、かつ/または試験することができる。
【０１４４】
本明細書にいう「タンパク質」または「アミノ酸分子」とは、ペプチド、完全長タンパク質、または完全長タンパク質のフラグメントもしくは一部分を指す。さらに本発明のタンパク質は融合、キメラ、修飾、単離、合成、または組換えアミノ酸分子であることができる。特に、本発明の組成物および方法での使用に適したタンパク質の例には、野生型、完全長タンパク質（その分泌型を含む）、または生物学的活性もしくは治療活性を持つその類似体、誘導体、もしくは変種が含まれるが、これらに限るわけではない。より具体的には、本発明のタンパク質変種はムテイン、すなわち、その変種が生物学的活性または治療活性を保つような突然変異（例えば単一または複数のアミノ酸置換、欠失または付加）を持つものであることができる。タンパク質をコードする配列は、例えば、野生型タンパク質配列のコドン最適化版、またはヒト化配列を含みうる。ヒトにおける最適なコドン使用は、発現されるヒト遺伝子に関するコドン使用頻度から同定することができ、当技術分野で知られる方法によって、例えばWisconsin Sequence Analysis Packageバージョン8.1（Genetics Computer Group、ウィスコンシン州マディソン）のプログラム「Human High.codN」によって決定することができる。例えば、多量に発現されるヒト遺伝子において最も頻繁に使用されるコドンは、ヒト対象の細胞における発現にとって最適なコドンであると思われ、したがってそれを、合成コード配列を構築するための根拠として使用することができる。
【０１４５】
本発明の分子に関して本明細書にいう「核酸」とは、核酸分子、例えばDNAもしくはRNA、またはその融合、キメラ、修飾、単離、合成、もしくは組換え型を指す。特に、本発明の組成物および方法での使用に適した核酸の例には、タンパク質をコードする野生型完全長DNAもしくはRNA（例えばmRNA）、または生物学的活性もしくは治療活性を持つ他の核酸分子（例えばshRNA、siRNA、リボザイム、アンチセンスRNAもしくはDNA、RNAもしくはDNAオリゴヌクレオチド）、またはその類似体、誘導体もしくは変種が含まれるが、これらに限るわけではない。より具体的には、本発明の核酸変種はムテイン、すなわち、その変種が生物学的活性または治療活性を保つまたは持つような突然変異（例えば単一または複数のアミノ酸置換、欠失または付加）を含むものであることができる。
【０１４６】
さらに、本明細書に記載するまたは当技術分野で記載されている従来の方法およびアッセイを使って、本発明の制御された発現系の修飾を行い、試験することができる。
【０１４７】
本発明の分子（例えばTM、RM、AM、および/またはIMを含み、かつ/またはコードするもの）に関して本明細書にいう「修飾」とは、基準核酸、アミノ酸、または化学分子の変化または改変を引き起こして所望する本発明の組成物または分子をもたらす任意の反応または操作（例えば、野生型タンパク質または核酸の突然変異であって、特定の生物学的活性および/または治療活性を持つ、その所望する変種をもたらすもの；タンパク質または核酸配列の突然変異であって、所望するヒト化配列をもたらすもの；または化学化合物の変形であって、所望する化学構造、および/または生物学的活性および/または治療活性をもたらすもの）を指す。例えば、本発明の分子に作動的に連結された任意の配列または本発明の分子をコードする任意の配列（例えばベクター配列または転写制御配列を含む）を含む、本発明の分子の機能ドメインまたは機能配列を修飾して、所望する本発明の組成物または分子をもたらすことができる。
【０１４８】
特に、本発明の制御発現系は、本明細書に記載するように、疾患の処置に使用するために、特定の特異性（例えば特定の組織、状態、疾患、またはバイオマーカーもしくは他の分子に対して特異的なもの）、ストリンジェンシー、または制御、発現および/または活性の量が得られるように、修飾または最適化することができる。例えば、本発明の制御された発現系は、そのような目的を達成するために、以下に挙げるものを単離または構築することによって、修飾または最適化することができる：1）RMのLBDに対して所望の結合特異性を持つ新しいまたは変種AMおよびIM；2）新しいもしくは変種AD、LBD（例えば新しいまたは変種AMまたはIMを結合するもの）および/またはDBD（例えば新しいまたは変種プロモーター配列を結合するもの）を持つRM；3）特定のRMの存在に対して高い特異性および応答性を示す活性を持つプロモーター（例えば特定のRMの存在下で（例えば特定のRMの結合などによって）特異的に活性化または不活化されるもの）；4）完全ヒト化配列（例えばGAL-4 DBDおよびGAL-4 DBSをコードする配列を、その配列が完全にヒト化されるように修飾すること）；5）RNA（例えばshRNA、siRNA、リボザイム、またはアンチセンスRNA）、特にRNA TMを発現させるための発現カセット；および6）プロモーターまたは他の機能配列を、非特異的発現（特にそのプロモーターまたは他の機能配列に作動的に連結された配列によってコードされるTMの非特異的発現）を減少させるために、修飾すること。
【０１４９】
ある実施形態では、RMの投与に対する依存性を増加させ、それによって、投与されたプラスミドの用量に依存するのではなく外因的に制御されるTM発現によって安全域を増大させるために、TMの基礎発現が有意に減少するように、本発明の制御発現系が修飾される。例えば、プロモーターの応答性（およびその結果生じるTM発現）をGAL-4 DBDを持つRMの存在（例えばその結合）によって調節することができるように、TMをコードする核酸コード配列に作動的に連結されたプロモーター配列をGAL-4 DBSのコピー数に関して修飾し、最適化することができる。また例えば、標準的方法を使って最小プロモーターを構築し、修飾し、TMの基礎発現を減少させるためにTMに作動的に連結することもできる。
【０１５０】
さらに、いくつかの実施形態では、TMが、対象の細胞中に送達されかつ/または存在する時にTMが低レベルに発現されるような核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、対象の細胞中に送達されかつ/または存在するTMをコードする核酸の固有の性質によって、TM発現のレベルを制御することが好ましい。例えば、いくつかの実施形態において、対象の細胞中の基礎TM発現のレベルは、TMをコードする核酸の量が増加するにつれて増加するので、対象の細胞中の、発現されるTMタンパク質の量を、弱いプロモーターを利用して減少させることが望ましいかもしれない。
【０１５１】
プロモーター領域中にユニークな制限エンドヌクレアーゼ部位を利用することにより、プロモーターおよび5'UTRの異なる領域を修飾して、本発明のRMの存在下または非存在下でのTMの発現に対して影響を持ちうる配列を欠失させることができる。例えば、もう一つの実施形態では、TMをコードする配列に作動的に連結された誘導性プロモーターの固有の活性が修飾されるように（例えばその活性が減少または増加するように）、転写開始領域（inr）をコードする配列中に欠失が施される。もう一つの実施形態では、転写開始領域（inr）の下流に、UT12（CMVの5'非翻訳領域、+1〜+112）をコードする作動的に連結された配列がある。
【０１５２】
もう一つの実施形態では、TATAボックス配列に作動的に連結された6×GAL-4 DBSを持つ誘導性プロモーター配列（例えば配列番号1）に作動的に連結された核酸配列によってTMがコードされる。2型アデノウイルスのEIb領域由来のTATAボックスを含有する-33から-22までの配列（NCBIアクセッション番号J01917の残基1665-1677）は、本発明のそのような実施形態における使用に適している。もう一つの実施形態では、プロモーター配列が、Ad EIb TATAボックス配列に作動的に連結された6X GAL-4 DBSと、CMVプロモーターの推定イニシエーター（inr）領域を含有するCMV配列とを、これらの機能配列がTMをコードする核酸に作動的に連結されるように含む（Maciasら, Journ. of Virol. 70(6):3628 (1996)）。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、17ヌクレオチド配列5'-TGGAGTACTGTCCTCCG-3'または5'-CGGAGTACTGTCCTCCG-3'（例えば配列番号49のコンセンサスGAL-4 DBS）を含むGAL-4 DBSの複数コピーに作動的に連結された核酸配列によって、TMがコードされる。ある実施形態では、例えば配列番号50のように、ヌクレオチド配列5'-AGTTTAAAAG-3'を持つ10ヌクレオチドスペーサーで隔てられた17ヌクレオチド配列5'-CGGAGTACTGTCCTCCG-3'をそれぞれが含む4コピーのGAL-4 DBSに作動的に連結された核酸配列によって、TMがコードされる。もう一つの実施形態では、それぞれ3コピーのGAL-4 DBSを含む2つの群に配置された6コピーのGAL-4 DBS（この場合、1）各群（3コピーのGAL-4 DBSを含有するもの）において、2番目のGAL-4 DBSコピーは17ヌクレオチド配列5'-TGGAGTACTGTCCTCCG-3'を含み、1番目および3番目のGAL-4 DBSコピーはそれぞれ17ヌクレオチド配列5'-CGGAGTACTGTCCTCCG-3'を含み、2）3コピーの群内の各コピーは、2ヌクレオチド5'-AG-3'によって隔てられ、3）2つの3コピー群の間には、それより長いスペーサー配列5'-AGTCGAGGGTCGAAG-3'が存在する（例えば説明したように6コピーのGAL-4 DBSを含む配列番号51の配列））に作動的に連結された核酸配列によって、TMがコードされる。
【０１５４】
特定の組織における発現が望まれるいくつかの実施形態では、組織特異的プロモーターを含むように本発明の制御発現系を修飾することができる。例えば、TM発現の標的組織が筋である場合は、TMをコードする核酸配列を筋特異的プロモーター、例えばアクチンプロモーター配列に作動的に連結することができる。組織特異的プロモーター（例えば筋特異的プロモーター）は、コードされたTMの発現の忠実性を増加させうる。いくつかの実施形態において、組織特異的プロモーターは、樹状細胞および他の抗原提示細胞における発現量を減少させ、よって発現されたTM（例えばタンパク質または核酸）に対する免疫応答を回避するという利点を提供しうる。
【０１５５】
ある実施形態では、特に核酸送達に対する炎症応答がある場合に、TMをコードする核酸（例えばベクター）の送達とTM発現の誘導との間に遅延時間が生じるように、本発明の制御発現系が修飾される。この実施形態では、炎症応答が減少するまで、TM発現を遅延させることができる。例えばいくつかの実施形態では、遅延期間（TM発現を誘導するまでの時間）の長さを例えば12日から54日まで増やすことにより、抗TM抗体産生の発生率を減少させることができる。さらに、いくつかの実施形態では、TMをコードする核酸の導入と、対象の細胞におけるTMの発現および/または活性を制御するAM（例えばRM調節因子、特に修飾受容体調節因子、より具体的には修飾ステロイド受容体調節因子、さらに具体的には修飾PRまたはGR調節因子、より一層具体的にはPRまたはGRリガンド類似体、さらに具体的には修飾抗プロゲスチン(例えば修飾MFP）または修飾メソプロゲスチン（例えば修飾アソプリスニル））の投与との間の遅延を長くすることが望ましい（例えばAMがRMを活性化し、その結果、活性化されたRMの存在がTM発現および/またはTM活性を制御する場合）。ある実施形態では、遅延期間が12日、好ましくは20日、より好ましくは55日、または免疫応答が減少しきるまでである。
【０１５６】
ある実施形態では、TM発現および/またはTM活性の特異性、選択性、正確なタイミングおよび/またはレベルがRMの存在下で調節されるように、制御発現系が修飾される。さらにもう一つの実施形態では、RMが本発明のRMを投与された対象中で迅速なクリアランスを持つ。
【０１５７】
ある実施形態では、RMがタンパク質であり、それが特異的リガンドまたはコグネイトリガンドの存在下で活性化され、その結果、活性化されたRMの存在がTMの発現および/または活性を制御するように、修飾される。さらに、AMの非存在下で二量体を形成する性質が最小限に抑えられるようにRMのGAL-4 DBDを突然変異させることによって、RMの活性化の特異性およびストリンジェンシーを最適化することができる。より具体的に述べると（例えばAMの非存在下で）RMの非特異的活性化および/または二量体形成を最小限に抑えるために、GAL-4 DBDのC末端の一部分（例えばC末端の20残基）を欠失させるか他の形で突然変異させ、それによってGAL-4ホモ二量体形成の一因になると予測されるコイルドコイル構造の長さを減少させることによる、GAL-4ドメインの突然変異によって、RMを修飾することができる。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、GAL-4 DNA結合ドメイン（「GAL-4 DBD」）が、GAL-4のN末端DBDのアミノ酸1〜93の一部分またはフラグメントを含む（この場合、例えばアミノ酸2〜93の配列は配列番号37であり、アミノ酸1はメチオニンである）。例えば、いくつかの実施形態では、GAL-4 DBDが、GAL-4のN末端DBDのアミノ酸2〜93（例えば配列番号38のアミノ酸配列を含むか、または配列番号37の核酸配列によってコードされるもの）を含む。ある実施形態では、GAL-4 DBDが、例えば配列番号46のように（または配列番号45の核酸配列によってコードされるように）、GAL-4のN末端DBDのアミノ酸2〜93と、作動的に連結されたN末端ペプチド配列とを含み、この場合は、例えばそのN末端ペプチド配列の直後にGAL-4のN末端DBDのアミノ酸2〜93が続く。別の実施形態では、GAL-4 DBDが、GAL-4のN末端DNA結合ドメインのアミノ酸2〜74を含む（例えば配列番号48のアミノ酸配列を含むか、配列番号47の核酸配列によってコードされる）。いくつかの実施形態では、適切なGAL-4 DBDが、カノニカルな17マー結合部位CGGAAGACTCTCCTCCGに結合する能力は保つが自己二量体化に必要なヘリックス三次構造を形成する能力が低下するようなGAL-4 DBDの突然変異をもたらす修飾を、アミノ酸配列またはアミノ酸配列中に持つ。いくつかの実施形態では、突然変異または欠失が、GAL-4 DBD配列のアミノ酸75〜93および/または54〜74にまたがる領域に施される。例えばある実施形態では、突然変異型GAL-4 DBDを含むRMのコイルドコイル領域によって自己二量体化が最小限に抑えられるように、欠失がGAL-4 DBD配列のアミノ酸54〜64または65〜75からなる。
【０１５９】
ある実施形態では、RMの核酸配列が、一つ以上の機能ドメイン、例えばDNA結合ドメイン（DBD）、リガンド結合ドメイン（LBD）、および/または制御ドメイン（RD）（例えば活性化ドメイン）を含む融合タンパク質またはキメラタンパク質をコードするように修飾される。本発明の融合タンパク質またはキメラタンパク質における使用に関して適切な機能ドメインの例には、GAL-4 DBD、ヒトプロゲステロン受容体（hPR）LBD、およびNFカッパB p65 ADが含まれるが、これらに限るわけではない。
【０１６０】
本発明のRMにおける使用に関して適切な制御ドメイン（RD）の例には、NFカッパB p65、VP-16、TAF-1、TAF-2、TAU-1、TAU-2、ORF-10、TEF-1、および制御機能を持つ（例えば本発明の分子の発現および/または活性を制御する）、より具体的には転写制御機能を持つ、他の任意の核酸またはアミノ酸配列が含まれるが、これらに限るわけではない（例えばPhamら (1992) Mol. Endocrinol. 6(7):1043-50；Dahlman-Wrightら (1994）Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:1619-1623；Milhonら (1997) Mol. Endocrinol. 11(12):1795-805；Moriuchiら (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92(20):9333-7)；Hwangら (1993）EMBO J 12(6):2337-48を参照されたい）。ある実施形態では、好ましいRDがヒトトランス活性化ドメイン（例えばNFカッパB p65）である。もう一つの実施形態では、RM、特にRMの機能ドメイン（例えばRD）がヒト化される。
【０１６１】
ある実施形態では、本発明のRMのLBDが、ステロイド受容体ファミリー内の受容体、例えばプロゲステロン受容体（PR）、より具体的にはヒトプロゲステロン受容体（hPR）の野生型LBDに相関するアミノ酸配列に由来する。もう一つの実施形態では、RMがステロイド受容体であり、そのステロイド受容体（例えばPR、より具体的にはhPR）のLBDのアミノ酸配列を、プロゲスチンではなく抗プロゲスチンであるAMに選択的に結合する突然変異型ステロイド受容体LBD（例えば突然変異型hPR LBD）がもたらされるように突然変異させる。したがってこの実施形態では、突然変異型ステロイド受容体LBD（例えば突然変異型hPR LBD）であるRMを、天然プロゲスチンではなく抗プロゲスチンであるAMによって、選択的に活性化することができる。特に、ある実施形態では、その抗プロゲスチンが天然PRに結合するが、アンタゴニストとして作用する。
【０１６２】
ある実施形態では、プロゲスチンが野生型PRに結合してアゴニストとして作用し、切断型または突然変異型PRには結合しない。もう一つの実施形態では、突然変異型PRが抗プロゲスチンを結合する能力を保っているが、アゴニストとしてのそれらに応答する。好ましい一実施形態では、抗プロゲスチンがRMである突然変異型PRに結合すると、その突然変異型PRタンパク質は活性化され、二量体を形成する。この実施形態では、次に、二量体-抗プロゲスチン複合体がプロモーター配列のDBSに結合し、それによって、TMをコードする核酸配列（この核酸配列はそのプロモーターに作動的に連結される）の転写を誘導する。
【０１６３】
ある実施形態では、抗プロゲスチンMFP（RU486）の存在下で、キメラRMが、TMをコードする核酸配列に作動的に連結された17マーGAL-4 DBSに結合し、TM発現の効率のよいリガンド誘導性トランス活性化をもたらす。RMの修飾ステロイドホルモンLBDを、カルボキシ末端アミノ酸（好ましくは約1〜120個のカルボキシ末端アミノ酸）の欠失によって修飾することもできる。標準的な分子生物学的技法を使って望ましい欠失の程度を得ることにより、所望のリガンドに対する選択性と、リガンドを投与した場合の高い誘導性との両方を達成することができる。ある実施形態では、約1〜約60個のカルボキシ末端アミノ酸の欠失によって、突然変異型ステロイドホルモン受容体LBDを突然変異させる。もう一つの実施形態では、42個のカルボキシ末端アミノ酸を欠失させる。高い選択性と高い誘導性の両方を持つさらにもう一つの実施形態では、19個のカルボキシ末端アミノ酸を欠失させる。
【０１６４】
ある実施形態では、RMの核酸配列が、切断型GAL-4 DBDをコードする配列、19アミノ酸のC末端欠失を持つ突然変異型プロゲステロン受容体、およびp65トランス活性化ドメインを含む（例えば配列番号39）。もう一つの実施形態では、RMの核酸配列が、突然変異型プロゲステロン受容体リガンド結合ドメイン、切断型GAL-4 DNA結合ドメイン、およびVP16またはp65トランス制御ドメインを持つキメラ受容体をコードする配列を含み、p65トランス制御ドメインはヒトp65タンパク質の活性化ドメイン（NFカッパB複合体のコンポーネント）の一部である。VP16をさまざまなヒト由来活性化ドメイン（例えばヒトp65の残基286〜550）で置き換えることにより、タンパク質を「ヒト化」させ、またはウイルスVP16コンポーネントによる外来タンパク質免疫応答を減少させると同時に、キメラ受容体の強力な誘導性を保つことができる。
【０１６５】
本発明のRMのDBDは、本明細書に記載する修飾GAL-4 DBDに限定されない。例えば、いくつかの実施形態では、適切なDBDが、結合部位の認識にとって不可欠ではないがその二次構造ゆえに自己二量体化の一因になると予測されうる配列が除去されるように、修飾されているものである。そのように修飾され適切でありうる他のDBDには、例えばステロイド受容体ファミリーのメンバー（例えばグルココルチコイド受容体、プロゲステロン受容体、レチノイン酸受容体、甲状腺受容体、アンドロゲン受容体、エクジソン受容体）または他の細胞DNA結合タンパク質、例えばcAMP応答エレメント結合タンパク質（CREB）もしくはSP1などのジンクフィンガーDNA結合タンパク質の既知DBDが含まれる。
【０１６６】
遺伝子制御タンパク質のステロイド受容体ファミリーも本発明のRMの構築に適している。ステロイド受容体はリガンド活性化転写因子であり、そのリガンドは、ステロイドから、レチノイド、脂肪酸、ビタミン、甲状腺ホルモン、および他のまだ未同定の小分子にまで及びうる。これらの化合物は受容体に結合し、ステロイドによる制御を受ける遺伝子の発現をアップレギュレートまたはダウンレギュレートする。これらの化合物は、既存の機序によって身体から取り除かれると報告されており、通常は無毒性である。本発明において、ステロイド受容体のリガンドは、例えばステロイド受容体のLBDに結合するかまたはそれと他の形で相互作用することなどによって、ステロイド受容体を活性化する任意の化合物または分子であることができる。
【０１６７】
本明細書で使用する用語「ステロイドホルモン受容体」とは、ステロイド受容体のスーパーファミリーに含まれるステロイドホルモン受容体を指す。ステロイドホルモン受容体ファミリーの代表例には、エストロゲン、プロゲステロン、グルココルチコイド、鉱質コルチコイド、アンドロゲン、甲状腺ホルモン、レチノイン酸、レチノイドX、ビタミンD、COUP-TF、エクジソン、Nurr-1およびオーファン受容体が含まれるが、これらに限るわけではない。ステロイド/甲状腺/レチノイドスーパー遺伝子ファミリーに含まれるホルモン受容体は、例えば、ホルモン感受性遺伝子の制御領域中のターゲット配列に結合してそれらの転写を強化または抑制する転写因子である。これらの受容体は、リガンド結合ドメイン（LBD）、DNA結合ドメイン（DBD）、二量体化ドメイン、および一つ以上のトランス活性化ドメインを含む一連の離散した構造ドメイン中に、進化的に保存された類似性を持つ。
【０１６８】
異なる構造ドメインのアミノ酸配列中にさまざまな突然変異または変化を生成させて、変種ステロイド受容体、より具体的に述べると突然変異型ステロイド受容体を形成させることができる。ある実施形態では、突然変異型ステロイド受容体が、野生型または天然ホルモン受容体リガンドへの結合よりも、むしろ非天然または非ネイティブリガンドに優先的に結合する能力を持つ。ある実施形態では、突然変異型ホルモン受容体が、基準ホルモン受容体（例えば野生型または天然ホルモン受容体）のカルボキシ末端にあるアミノ酸の欠失（例えば基準ホルモン受容体のカルボキシ末端からの約1〜約120アミノ酸の欠失）によって生成される。もう一つの実施形態では、本発明の突然変異型プロゲステロン受容体が、基準プロゲステロン受容体（例えば野生型または天然ホルモン受容体）の約1〜約60アミノ酸のカルボキシ末端欠失を含む。もう一つの実施形態では、突然変異型プロゲステロン受容体が、基準プロゲステロン受容体（例えば野生型または天然ホルモン受容体）の19アミノ酸のカルボキシ末端欠失を含む。ある実施形態では、RMが、ヒトプロゲステロン受容体（hPR）のアミノ酸690〜914を含むLBDまたはその一部分内に一つ以上の部位特異的突然変異を持つプロゲステロン受容体LBDまたはその一部分を含む。いくつかの実施形態では、突然変異型プロゲステロン受容体LBDまたはその一部分が、pGT1003、pGT1004およびpGT1005のように、719位に一つの部位特異的突然変異を含むか、pGT1006、pGT1007、pGT1008およびpGT1009のように、755位に一つの部位特異的突然変異を含むか、pGT1015、pGT1016、pGT1017およびpGT1025のように、729位および755位に二つの部位特異的突然変異を含むか、またはpGT1020、pGT1021、pGT1022、pGT1023およびpGT1024のように、726位および755位に二つの部位特異的突然変異を含む。
【０１６９】
本発明の組成物および方法における修飾および/または使用のための修飾または突然変異型ステロイドホルモン受容体のさらなる例は、例えば以下の文献に記載されている：（1）「Adenoviral Vector-Mediated Delivery of Modified Steroid Hormone Receptors and Related Products and Methods」国際特許公開番号WO 0031286（PCTAJS99/26802）；（2）「Modified Glucocorticoid Receptors, Glucocorticoid Receptor/Progesterone Receptor Hybrids」国際特許公開番号WO 9818925（PCTAJS97/19607)；（3）「Modified Steroid Hormones for Gene Therapy and Methods for Their Use」国際特許公開番号WO 9640911（PCT/US96/0432）；（4）「Mutated Steroid Hormone Receptors, Methods for Their Use and Molecular Switch for Gene Therapy」国際特許公開番号WO 9323431（PCTAJS93/0439）；（5）「Progesterone Receptors Having C-Terminal Hormone Binding Domain Truncations」米国特許第5,364,791号；（6）「Modified Steroid Hormone Receptors, Methods for Their Use and Molecular Switch for Gene Therapy」米国特許第5,874,534号；および（7）「Modified Steroid Hormone Receptors, Methods for Their Use and Molecular Switch for Gene Therapy」米国特許第5,935,934号。
【０１７０】
さらにまた、野生型受容体のアゴニストの存在下でさえ突然変異体受容体を活性化するという野生型ステロイドホルモン受容体のアンタゴニストの能力に基づいて、突然変異型ステロイドホルモン受容体LBDを選択してもよい。例えばある実施形態において、プロゲステロンはプロゲステロン受容体の通常のリガンドであり、この受容体にとって強いアゴニストとして機能する。抗プロゲスチンMFP（RU486）はプロゲステロン受容体の非天然または非ネイティブリガンドである。MFPは、野生型プロゲステロン受容体に対してアゴニスト作用を発揮することができるものの、プロゲステロンのアゴニスト作用を阻害するので、「抗プロゲスチン」とみなされる。このように、通常のアゴニストの存在下では、すなわち野生型プロゲステロン受容体の存在下でMFPとプロゲステロンの両方が共存する場合には、MFPは野生型プロゲステロン受容体の「アンタゴニスト」とみなしうる。しかし、本発明のいくつかの実施形態において、突然変異型プロゲステロンステロイドホルモン受容体は、プロゲステロン（野生型受容体のアゴニスト）によって活性化されないが、MFP（野生型受容体の「アンタゴニスト」）の存在下で活性化される。また、ある実施形態では、プロゲステロンがMFPによる突然変異型ステロイドホルモン受容体の活性化を阻止しない。このように突然変異型受容体は、野生型受容体のアンタゴニスト（例えばMFP）に結合したときに、野生型プロゲステロン受容体のアゴニスト（例えばプロゲステロン）の存在下でさえ、活性化されると特徴づけることができる。
【０１７１】
ある実施形態では、突然変異型ステロイド受容体が、野生型ステロイドホルモン受容体のアンタゴニストの存在下で所望のTMの転写を活性化する。いくつかの実施形態では、アンタゴニストが、野生型ステロイド受容体（例えば野生型ステロイドホルモン受容体）のアンタゴニストとして作用する非天然または非野生型リガンドである。ある実施形態では、野生型ステロイドホルモン受容体のアンタゴニストが、野生型ステロイドホルモン受容体と相互作用するか野生型ステロイドホルモン受容体に結合してその受容体のアゴニストの活性を阻止する分子である。もう一つの実施形態では、野生型ステロイドホルモン受容体のアゴニストが、野生型ステロイドホルモン受容体と相互作用して対象の細胞におけるTMの発現および/または活性を制御する分子である。そのようなアゴニストの例には、プロゲステロン受容体10の場合、プロゲステロンまたはプロゲスチンが含まれる（この場合、プロゲステロンは野生型プロゲステロン受容体に結合してプロゲステロンの制御を受ける遺伝子の転写を活性化する）が、これらに限るわけではない。
【０１７２】
ある実施形態では、適切なプロゲステロン受容体アゴニストが、プロゲステロンを模倣する化学化合物である。例えば、RU486とも呼ばれるミフェプリストン（MFP）は、野生型プロゲステロン受容体に同様に結合して、結合に関してプロゲステロンと競合する、非天然リガンドである。本発明の好ましい実施形態では、AMが、野生型プロゲステロン受容体または他の任意の内在性ステロイド受容体と低いアフィニティーで結合するか、そのような受容体とは結合もしくは相互作用しないか、または他の形での作用を持たず、そのAMに対して選択的または特異的な修飾LBDを持つRMに選択的および/または特異的に結合する、PRリガンド類似体である。好ましい一実施形態では、PRリガンド類似体が、例えばBLX-913、BLX-833、BLX-899、BLX-593、BLX-599、BLX-952、BLX-610、BLX-117、またはBLX-784である。プロゲステロン受容体（PR）は、それがMFPのみに結合し、プロゲステロンには結合しないように、例えばプロゲステロン受容体のLBD内を修飾することができる。例えば、プロゲステロン受容体のLBDの突然変異は、MFPの結合がプロゲステロン受容体を活性化するようなものであることができる。ある実施形態では、MFPの結合がRMを選択的に活性化して、PRのDBDによって認識されるプロモーターによって駆動されるTM発現および/またはTM活性をトランス活性化するように、突然変異型PR LBD、より一般的には他の任意の突然変異型ステロイド受容体LBDが、特定のDBD（例えばGAL-4 DBD）と融合される。このように、いくつかの実施形態において、本発明の突然変異型ステロイド受容体は、野生型ステロイド受容体のアゴニストの存在下では活性化されないが、その代わりに、非天然リガンドの存在下で、突然変異型ステロイド受容体が活性化される。
【０１７３】
「非天然リガンド」または「非ネイティブリガンド」という用語は、受容体のリガンド結合ドメインに結合する、非野生型の、または非天然リガンドである、化合物を指す。非天然リガンドの例は、選択的プロゲステロン受容体調節因子（SPRM）またはメソプロゲスチンである（例えばChwaliszら (2002）Ann NY Acad Sci 955:373-388；Elgerら (2000) Steroids 65(10-11):713-723；Chwaliszら (2004）Semin Reprod Med 22(2):113-119；DeMannoら (2003）68(10-13):1019-1032；Fuhrmannら (2000) J Med Chem 43(26):5010-5016を参照されたい）。SPRMまたはメソプロゲスチンの例を、下記表2に記載し、図解する（化合物1〜16）。
【０１７４】
表2
1．名称：17β-メトキシ-17α-(メトキシメチル)-11β-メトキシフェニル-4,9-エストラ-ジエン-3-オン
構造：
【化１】
2010523131.tif 000004
式：C28H36O4
分子量：436.60g/mol
融点：184-186℃（ジクロロメタン）
2．名称：4-[17β-メトキシ-17α-(メトキシメチル)-3-オキソエストラ-4,9-ジエン-11β-イル]ベンズアルデヒド-1(E)-[O-(エトキシ)カルボニル]オキシム
構造：
【化２】
2010523131.tif 000005
式：C31H39NO6
分子量：521.66g/mol
融点：143-151℃（分解、メタノール）
3．名称：4-[17β-メトキシ-17α-(メトキシメチル)-3-オキソエストラ-4,9-ジエン-11β-イル]ベンズアルデヒド-1(E)-オキシムアセテート
構造：
【化３】
2010523131.tif 000006
式：C30H37NO5
分子量：491.63g/mol
融点：110-119℃（酢酸エチル）
4．名称：4-[17α-(エトキシメチル)-17β-メトキシ-3-オキソエストラ-4,9-ジエン-11β-イル]ベンズアルデヒド-1(E)-オキシム
構造：
【化４】
2010523131.tif 000007
式：C29H37NO4
分子量：463.62g/mol
融点：90-95℃（メチルtert-ブチルエーテル）
純度HPLC：98.9面積％（264nm）
5．名称：4-[17β-メトキシ-17α-(メトキシメチル)-3-オキソエストラ-4,9-ジエン-11β-イル]ベンズアルデヒド-チオセミカルバゾン
構造：
【化５】
2010523131.tif 000008
式：C29H37N3O3S
分子量：507.69g/mol
融点：217-236℃（メタノール）
6．名称：4-[17β-ヒドロキシ-17α-(メトキシメチル)-3-オキソエストラ-4,9-ジエン-11β-イル]ベンズアルデヒド-1(E)-オキシムアセテート
構造：
【化６】
2010523131.tif 000009
式：C29H35NO5
分子量：477.61
融点：112℃（アセトン、分解）
αD＝＋209°（CHCl3）
7．名称：4-[17β-ヒドロキシ-17α-(メトキシメチル)-3-オキソエストラ-4,9-ジエン-11β-イル]ベンズアルデヒド-1-(E)-[O-(エチルアミノ)カルボニル]オキシム
構造：
【化７】
2010523131.tif 000010
式：C30H38N2O5
分子量：506.65g/mol
融点：184-190℃（塩化メチレン/酢酸エチル）
8．名称：4-[17β-メトキシ-17α-(メトキシメチル)-3-オキソエストラ-4,9-ジエン-11β-イル]ベンズアルデヒド-1-(E)-[O-(メトキシ)カルボニル]オキシム（ZK280993）
構造：
【化８】
2010523131.tif 000011
式：C30H37NO6
分子量：507.63g/mol
融点：110℃（mtbe、分解）
9．名称：4-(17β-ヒドロキシ-17α-メチル-3-オキソエストラ-4,9-ジエン-11β-イル]ベンズアルデヒド-1(E)-オキシム（ZK280999）
構造：
【化９】
2010523131.tif 000012
式：C26H31NO3
分子量：405.53g/mol
融点：163-165℃（エタノール/水）
10．名称：4-[17β-メトキシ-17α-(メトキシメチル)-3-オキソエストラ-4,9-ジエン-11β-イル]ベンズアルデヒド-1(E)-[O-(エチルチオ)カルボニル]オキシム (ZK190425）
構造：
【化１０】
2010523131.tif 000013
式：C31H39NO5S
分子量：537.72g/mol
融点：148-155℃分解（アセトン/n-ヘキサン）
11．名称：4-[17β-ヒドロキシ-17α-(2-プロポキシメチル)-3-オキソエストラ-4,9-ジエン-11β-イル]ベンズアルデヒド-1(E)-オキシム（ZK281100）
構造：
【化１１】
2010523131.tif 000014
式：C29H37NO4
分子量：463.62g/mol
融点：192-196℃（ジエチルエーテル、分解）
12．名称：4-(4'-ブロモ-17β-メトキシ-17α-(メトキシメチル)-3-オキソエストラ-4,9-ジエン-11β-イル]ベンズアルデヒド-1(E)-オキシム（ZK281117）
構造：
【化１２】
2010523131.tif 000015
キラル
式：C28H34BrNO4
分子量：528.48g/mol
融点：138-141℃（ジエチルエーテル/n-ヘキサン）
13．名称：4-[17β-メトキシ-17α-(メトキシメチル)-3-オキソエストラ-4,9-ジエン-11β-イル]アセトフェノン-11β-(4-アセチルフェニル)-17β-メトキシ-17α-(メトキシメチル)-4,9-エストラジエン-3-オン（ZK139905）
構造：
【化１３】
2010523131.tif 000016
式：C29H36O4
分子量：448.61g/mol
融点：133-137℃（ジエチルエーテル/塩化メチレン）
14．名称：11β-[4-(ジメチルアミノ)フェニル]-17β-メトキシ-17α-(メトキシメチル)-4,9-エストラジエン-3-オン（ZK281317）
構造：
【化１４】
2010523131.tif 000017
式：C29H39NO3
分子量：449.64
泡状（ヘキサン）、αD＝＋184°（CHCl3）
15．名称：4-[17α-エチニル-17β-メトキシ-3-オキソエストラ-4,9-ジエン-11β-イル]ベンズアルデヒド-1(E)-オキシム（ZK281527）
構造：
【化１５】
2010523131.tif 000018
式：C28H31NO3
分子量：429.56g/mol
融点：149-157℃（アセトン）
16．名称：4-[9α,10α-エポキシ-17β-ヒドロキシ-17α-(メトキシメチル)-3-オキソエストラ-4-エン-11β-イル]ベンズアルデヒド-(E)-オキシム（ZK234965）
構造：
【化１６】
2010523131.tif 000019
式：C27H33NO5
分子量：451.57
融点：110℃分解（アセトン/メチルtert-ブチルエーテル）
【０１７５】
また、非天然リガンドおよび非ネイティブリガンドの例は抗ホルモンであり、これには次に挙げるものが含まれうる：11-(4-ジメチルアミノフェニル)-17-ヒドロキシ-17c-プロピニル-4,9-エストラジエン-3-オン（RU38486またはミフェプリストン）；11-(4-ジメチルアミノフェニル)-17o-ヒドロキシ-17-(3-ヒドロキシプロピル)-13-メチル-4,9-ゴナジエン-3-オン（ZK98299またはオナプリストン）；11-(4-アセチルフェニル)-17-ヒドロキシ-17c-(1-プロピニル)-4,9-エストラジエン-3-オン（ZK112993)；11-(4-ジメチルアミノフェニル)-17-ヒドロキシ-17(z-(3- ヒドロキシ-1(Z)-プロペニル-エストラ-4,9-ジエン-3-オン（ZK98734）；(7,11,17)-11-(4-ジメチルアミノフェニル)-7-メチル-4',5'-ジヒドロスピロ[エステル-4,9-ジエン-17,2'(3'H)-フラン]-3-オン（Org31806)；(11,14,17c)-4',5'-ジヒドロ-11-(4-ジメチルアミノフェニル)-[スピロエストラ-4,9-ジエン-17,2'(3'H)-フラン]-3-オン（Org31376）；5-c-プレグナン-3,2-ジオン、Org 33628（Kloosterboerら (1995) Ann N Y Acad Sci Jun 12；761 :192-201）、Org 33245（Schoonenら (1998) J Steroid Biochem Mol Biol Feb；64(3-4):157-70）。そのようなリガンドのさらにもう一つの例は、例えば本発明のRMの誘導因子として作用する非ステロイドプロゲステロン受容体結合リガンドである。
【０１７６】
好ましい非天然リガンドは、本明細書に記載のPRリガンド類似体、例えばBLX-913（図43に図示）、BLX-833、BLX-899、BLX-593、BLX-599（図51に図示）、およびBLX-952、BLX-610、BLX-117、またはBLX-784（図53に図示）である。化合物スクリーニングデータをタンパク質工学と組み合わせることにより、本発明の制御発現系のための、これらの、および他の新しい、機能選択的なPRリガンド類似体を同定し、ユニークなAM-RM複合体を開発することができる。エストロゲン受容体（Kinzel, O.ら (2006) J. Med. Chem. 49: 5404-5407；Whelan, J.ら (1996) J. Steroids Biochem. Molec. Biol. 58:3-12；Gallinari, P.ら (2005) Chem. Biol. 72:883-893；Shi, Y.ら (2001) Chem. Biol. 8:501-510；Chockalingam, K.ら (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:5691-5696；Tedesco, R.ら (2001）Chem. Biol. 8:277-287；Roscilli, G.ら (2002) Mol. Ther. 6: 653-663）、エクジソン受容体（Kumar, M.B. (2004) J. Biol. Chem. 279:27211-27218）、レチノイドX受容体（Doyle, D.F.ら (2001) J. Am. Chem. Soc. 123:11367-11371；Schwimmer, L.J.ら (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:14707-14712）および甲状腺受容体（Hassan, A.Q.ら (2006) J. Am. Chem. Soc. 128:8868-8874）に基づく制御発現系が関わる核内ホルモン受容体-リガンドペアへの特異性および選択性のエンジニアリングの使用が記載されている。
【０１７７】
本発明者らが開発したpBRESベースのルシフェラーゼスクリーニングアッセイを使って、独自の抗プロゲスチン様ステロイド化合物（その多くがMFPと有意な構造上の類似性を共有する）を同定し、試験することができる。この指向的スクリーニングから導き出される構造活性相関（SAR）データを使って、おそらくはRM LBD内での化合物とリガンド結合ポケット（LBP）を裏打するアミノ酸との間の立体衝突または電子衝突ゆえにpBRES発現系を活性化しない化合物を、同定することができる。こうして同定された化合物をさらにT47D細胞ベースの二次アッセイでスクリーニングして、そのpBRES不活性化合物が抗PR活性も欠くことを確認する。これらの不活性候補化合物から出発して、モデリングに基づくLBDエンジニアリングアプローチを使ってpBRES活性化を再樹立することにより、機能選択的な、すなわち他の生理学的ターゲットに関してオルソゴナルな、AM-RM複合体を開発することができる。
【０１７８】
MFP様化合物とhPR由来LBDの間の相互作用に関する構造データは利用できないので、MFPとの複合体を形成したGRのX線結晶構造に基づいて、MFP-RM LBD複合体に関するホモロジーモデルを開発することができる（Kauppi B.ら (2003) J. Biol. Chem. 278:22748-22754）。指向的スクリーニングで同定された不活性化合物を、RM LBDのモデルにドッキングさせ、各化合物とLBP残基との間の衝突を同定することができる。次に、それらの衝突を軽減させることを目的とする一連の突然変異をモデル化し、RM LBPに組み込むことができる。
【０１７９】
本明細書で説明するように、改変pBRES発現系を活性化する候補化合物の能力は、pBRESベースのルシフェラーゼアッセイで測定することができる。先に不活性だった化合物と改変されたRM LBDの間の相互作用を改善する突然変異をモデル中にドッキングさせ、それを使って、リガンド結合ポケットを新しいAMにより良くフィットさせるように設計されたさらなる突然変異を提案することができる。突然変異誘発と細胞ベースのアッセイにおける試験というサイクルを繰り返すことにより、本発明のAMに対する応答において、元のRMよりも活性な、新しい突然変異型RM LBDを同定することができる。例えばいくつかの実施形態では、新しい突然変異型RMが、突然変異していない元のまたは基準RMと比較して、本発明のAMに対する応答において、少なくとも10〜50倍、50〜100倍、100〜200倍、200〜300倍、300〜400倍、400〜500倍、500〜600倍、600〜700倍、または700〜800倍活性である。ある実施形態では、新しい突然変異体RMは、本発明のAMに対する応答において、30〜50倍活性が高い。これらの研究はpBRES発現系の臨床応用可能性を証明している。
【０１８０】
アミノ酸修飾または核酸修飾（例えば欠失、挿入、点突然変異、融合などを含む）の標準的方法を使って、本発明の分子（例えばTM、RM、AM、IM、またはTM、RM、AM、もしくはIMをコードする核酸）のタンパク質ドメイン（例えばAD、LBD、DBD）または機能的核酸配列（例えばタンパク質、RNA、プロモーター、スプライス部位、イントロン、DNA結合部位、またはポリ(A)部位をコードする配列）を修飾し、またはそのような制御、発現、および/または活性を最適化することができる。さらに、本発明の分子（例えばTM、RM、AM、IM、またはTM、RM、AM、もしくはIMをコードする核酸）を、その分子の発現および/または活性が一過性または構成的になるように、かつ/または特定の状態、疾患、バイオマーカーもしくは他の分子の存在によって制御されるように、または自己制御されるように、修飾することもできる。より具体的には、結合、活性化、不活化、またはコンフォメーションの特定のストリンジェンシー、特異性、または量が達成されるように（例えばホモ二量体もしくはヘテロ二量体または他の多量体を形成するように、あるいは特異的またはコグネイトリガンドまたは部位を結合するように）、本発明の核酸もしくはアミノ酸分子、または化学化合物の一次、二次、または三次構造を、修飾することができる。
【０１８１】
例えば、本発明の発現カセットの被転写部分は、作動的に連結され、コードされ、そして発現される分子（例えばTM、RM、AM、またはIM）の発現および/または活性の特異性、レベルおよび忠実性を最適化または改善する転写後エレメント（例えばUTR、スプライス部位、イントロン、および/またはポリ(A)シグナル）を含むように修飾することができる。さらに、本発明の分子をコードする作動的に連結された配列のプロモーター配列は、コードされた分子の発現が例えば一過性または構成的、誘導性または抑制性になるように、かつ/または特異的状態もしくは分子の存在によって調節もしくは他の形で制御されるように、修飾することができる。
【０１８２】
本発明の発現カセットのさまざまな機能配列を修飾して、コードされた分子（例えばTM、RM、AM、またはIM）の発現および/または活性を最適化することができる。例えばイントロン配列を修飾して、そのような配列からのRNA転写物の高効率かつ正確なスプライシングを最適化することができる。それにより、クリプティック（cryptic）スプライシングを最小限に抑え、本発明の核酸によってコードされる所望の分子（例えばTM、RM、AM、またはIM）の発現を最大化することができる。本発明の組成物における使用に関して適切な合成イントロンの例には、5'スプライス部位、3'スプライス部位、および/または分岐点のコンセンサス配列が含まれるが、これらに限るわけではない。5'スプライス部位はU1 snRNAと対になると報告されている。適切な5'スプライス部位コンセンサス配列は、U1 RNAと合成5'スプライス部位との間のヘリックス形成の自由エネルギーを最小化するように最適化されるもの、例えば5'-CAGGUAAGU-3'を含む5'スプライス部位配列である。さらに、分岐点（BP）配列は、単一バルジ（bulged）A残基を除いて、U2 snRNAと対になると報告されている。したがって分岐点配列を最適化して、U2 RNAとその配列との間のヘリックス形成の自由エネルギーを最小化することができる。BPは典型的には3'スプライス部位の18〜38nt上流に位置する。ある実施形態では、合成イントロンのBP配列が3'スプライス部位から24nt上流に位置し、例えば5'UACUAC3'を含むBP配列である。さらに、3'スプライス部位のコンセンサス配列のポリピリミジントラクトを、3'スプライス部位機能に関して最適化することができる。例えば、少なくとも5個の連続ウラシル残基が、3'スプライス部位機能にとって最適であると報告されているので、いくつかの実施形態では、本発明の合成イントロンのポリピリミジントラクトが7個の連続ウラシル残基を持つ。
【０１８３】
同様にイントロンの長さを最適化することができる。例えば、天然イントロンは長さが90〜200ntだろうということが知られている。ある実施形態では、結果として生じる内部エキソンの長さが300ヌクレオチド未満である。ある実施形態では、合成イントロンがIVS8（例えば配列番号3）であり、制限酵素部位BbsIおよびEarI（合成イントロン内に位置する）ならびにPstIおよびNheIを含む。制限酵素BbsIは、DNAを正確に5'スプライス部位で切断するために使用することができ、EarIはDNAを正確に3'スプライス部位で切断するために使用することができる。さらに、本発明の分子をコードする核酸配列の複数部位に、合成イントロンを挿入してもよい。例えばいくつかの実施形態では、本発明の分子をコードする核酸配列が、複数のイントロンを含むように修飾される。
【０１８４】
もう一つの実施形態では、合成イントロンIVS8（例えば配列番号3）に加えて、本発明の発現カセットが、発現制御エレメントであるUT12と呼ばれるCMV 5'UTRをコードする核酸配列（例えば配列番号2）を含むように修飾される。もう一つの実施形態では、本発明の発現カセットが、SV40ポリ(A)シグナルをコードする核酸配列（例えば配列番号8）を含むように修飾される。さらにもう一つの実施形態では、本発明の発現カセットが、ヒト成長ホルモン（「hGH」）ポリ(A)シグナルをコードする核酸配列（例えば配列番号6）を含むように修飾される。本明細書に記載するこれらの修飾および他の修飾は、本明細書に記載するように、本発明の核酸配列によってコードされる（例えば発現カセットまたはベクターの核酸配列によってコードされる）コードされた分子（例えばTM、RM、AM、IM）の発現のレベルおよび忠実性を最適化するために使用することができる。
【０１８５】
本明細書で使用する「イントロン」という用語は、RNAポリメラーゼによってRNA分子中に転写されるが、成熟メッセンジャーRNAを形成させるために、スプライシングによって除去される、DNA配列中にコードされる配列を指す。「合成イントロン」とは、最初に天然イントロン配列から複製されるのではなく、一般的には天然の配列を持たないが、通常の転写後プロセシング中にRNA転写物から除去されるであろう配列を指す。そのような合成イントロンは、さまざまな異なる特徴を持つように設計することができ、特にそのようなイントロンは、所望の強さのスプライス部位および所望の長さを持つように設計することができる。本発明の好ましい実施形態では、分子スイッチ発現カセットと治療遺伝子発現カセットがどちらも合成イントロンを含む。合成イントロンは、5'スプライス部位、3'スプライス部位、および分岐点のコンセンサス配列を含む。治療遺伝子を発現させるために設計された真核細胞ベクター中に組み込まれた場合、合成イントロンは、高効率かつ正確なRNA転写物のスプライシングを指示し、それによってクリプティックスプライシングを最小限に抑え、所望の遺伝子産物の生産量を最大化するだろう。
【０１８６】
さらに、既知の方法を使って、タンパク質のドメインをコードする機能配列を、タンパク質の活性に関して最適化するために、修飾することができる。例えば、分子モデリングを使って、GAL-4 DBDを持つタンパク質の配列特異的DNA結合活性を保ちつつ、二量体化の潜在的可能性が低下するように、切断突然変異体を設計することができる。GAL-4 DBDは、パリンドローム17マーGAL-4 DBS（CGGAAGACTCTCCTCCG）に二量体として結合すると報告されており、そのような二量体結合は、GAL-4 DBSを持つ誘導性プロモーターの活性化をもたらすと報告されている。したがって、GAL-4 DBDを持つタンパク質をコードする核酸配列は、GAL-4 DBDの三次構造が最適化されて、無制御（例えばAM非依存的）な二量体化または不必要な二量体化が減少し、その結果、誘導性プロモーターの活性化が起こるように、修飾することができる。
【０１８７】
GAL-4 DBD配列の構造および機能は知られている（例えばPCT/US01/30305を参照されたい）。例えばシステイン（C）は亜鉛のキレートに関与しうる；二量体化エレメントを形成するコイルドコイル構造は残基54〜74および86〜93を含む；概して疎水的なアミノ酸が各7アミノ酸繰り返し配列の第1および第4位にあると報告されている；残基Ser47およびArg51は二量体を形成するタンパク質鎖間の水素結合を形成すると報告されている；そして残基8〜40はZn結合ドメインまたはDNA認識ユニットを形成すると報告されている。このDNA認識ユニットは、コンパクトな球状構造を形成し、Znの存在下で、ジンクフィンガーではなく二核金属イオンクラスター構造である（すなわち、システインリッチアミノ酸配列（CysXa-Xaa2-Cys14-Xaaa-CysZ1-Xaa6-CysZS-Xaa2-Cys31-Xaaa-Cys38）は、2つのZn(II)イオンを結合する）と報告されている構造をもたらす、二つのαヘリックスドメインを持つ（PanおよびColeman (1990) PNAS 87:2077-81）。このZnクラスターは、17マー結合部位の最末端で3bpの主溝と接触する原因になるりうる；そして、26位のプロリン（シスプロリン）は亜鉛クラスタードメインの二つのαヘリックスドメインをつなぐループを形成し、この機能にとって、やはり極めて重要であると報告されている。さらに、残基41〜49は、DNA認識ユニットと二量体化エレメント残基54〜74および86〜93とをつなぐと報告されている。
【０１８８】
二量体化されると、二量体の残基47〜51も、DNAターゲットのリン酸基と相互作用することができる。残基50〜64は弱い二量体化に関与しうる。二量体は、両親媒性アルファヘリックスを形成する短いコイルドコイルからなり、二つのアルファヘリックスがロイシンジッパーに似た平行コイルドコイルにパッキングされる。残基54〜74内に見出される3対のロイシンおよび1対のバリンの疎水性相互作用に加えて、2対のArg-Glu 2O塩結合と、一方の単量体のArg51と他方の単量体のSer47との間の水素結合とが存在する。残基65〜93は強い二量体化ドメインを形成しうる。残基65〜71の構造は、7アミノ酸繰り返し配列1つ分の一続きのコイルドコイル構造である。残基72〜78はプロリンを含有し、それゆえに両親媒性ヘリックスを破壊する。しかし残基79〜99は潜在的にαヘリックスである7アミノ酸配列をさらに3つ含有する（Marmorsteinら (1992) Nature 356:408-414）。さらに、GAL-4残基1〜100の結合に関するKdは、3nMであると報告されている（ReeceおよびPtashne (1993）Science 261:909-911）。
【０１８９】
GAL-4 DBD配列の構造と機能を考慮して、GAL-4ドメインの領域には、考えうる修飾をいくつか施すことができる。いくつかの実施形態では、基礎発現の排除または低減および配列特異的DNA結合の保持に関して最適化されるように、GAL-4領域が修飾される。より具体的には、いくつかの実施形態において、GAL-4 DBDの相互作用コイルドコイル配列（例えば残基54〜74および残基86〜93）を含有する領域の長さを、欠失によって（例えばアミノ酸配列54〜64、65〜74、54〜74、または86〜93を欠失させることによって）短縮することができる。また、コイルドコイル領域の一方を欠失させることによって、コイルドコイル領域を1つしか持たないGAL-4突然変異体を構築することもできる。また、例えばアルファヘリックス7アミノ酸配列のそれぞれの接合部分などに位置するユニークな制限部位を使って、GLA-4ドメイン中に突然変異体配列または人工配列を挿入してもよい。このように、アルファヘリックス7アミノ酸配列の数が徐々に減少していく修飾型のGAL-4ドメインを製造することができる。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、ネイティブGAL-4配列が修飾されてN末端メチオニンが除去され、その配列のN末端に追加のアミノ酸が付加される。これらの実施形態において、ネイティブGAL-4配列のN末端アミノ酸に加えられる修飾は、それらがZn結合ドメインの残基8〜40の三次構造に影響を及ぼさない限り、重要な問題ではない。さらに、いくつかの実施形態では、GAL-4 DBDを持つタンパク質（例えばRM）の突然変異型hPR LBDへの小分子AM（例えばPRリガンド類似体、特に修飾MFPなどの修飾抗プロゲスチン、または修飾アソプリスニルなどの修飾メソプロゲスチン）の特異的結合は、そのタンパク質の二量体化を開始させるように、タンパク質におけるコンフォメーション変化をトリガーする。また、いくつかの実施形態では、本発明の発現カセットが、配列番号37のGAL-4 DBD配列の残基2〜93をコードする核酸配列を含む。さらに、ある実施形態では、GAL-4 DBDのDNA認識配列が配列番号37のGAL-4 DBD配列の残基9〜40を含む。
【０１９１】
本発明のある実施形態では、GAL-4ドメインがGAL-4 DBDのC末端部分にある19アミノ酸の欠失によって切断され、配列番号37のGAL-4 DBD配列の残基75〜93を含む。ある実施形態では、本発明のRMが、配列番号37のGAL-4 DBD配列の残基2〜74を含む突然変異型プロゲステロン受容体と、AMの存在下で特異的に活性化される突然変異型プロゲステロン受容体LBDとを含む、キメラタンパク質である。さらに、AMの非存在下では、RM活性化と、その結果生じる、GAL-4 DBSを持つプロモーターに作動的に連結された核酸配列の転写の誘導または活性化が、ほとんどまたは全くない。
【０１９２】
上述のように、ネイティブ分子（例えばタンパク質または核酸）の変種をコードする核酸も、本発明の組成物および方法における使用に適している。例えば、IFN-β（例えばIFN-β1b）の変種は、特にMSの処置に関して、本発明の組成物および方法におけるTMとしての使用に適している。好ましくはIFN-β変種はネイティブヒトIFN-βの変種である。ネイティブヒトIFN-βの変種（これは天然（例えばIFNβ遺伝子座に生じる対立遺伝子変種）であってもよいし、組換え的または合成的に製造されてもよい）は、成熟したネイティブIFN-β配列に類似する、または実質的に類似する、アミノ酸配列を持つ。例えばIFN-β1a（例えば配列番号14）など、ネイティブヒトIFN-β（例えば配列番号13のアミノ酸配列を含むもの）をコードする核酸は、本発明の組成物および方法における使用に適している。また、例えばIFN-β1bなど、ヒトIFN-β変種をコードする核酸も、本発明の組成物および方法における使用に適している（例えば米国特許出願第4,588,585号、同第4,737,462号、および同第4,959,314号を参照されたい）。変種には、生物学的活性または治療活性を保っている、ネイティブ分子（例えばタンパク質または核酸）のフラグメントまたは切断型をコードする核酸も包含される。例えばこれらの生物学的に活性なフラグメントまたは切断型をコードする核酸。さらに、いくつかの実施形態において、発現された本発明のタンパク質は、グリコシル化される場合も、グリコシル化されない場合もある。
【０１９３】
さらに、本発明の組成物および方法での使用に関して適切なタンパク質または核酸変種は、それぞれ、任意の哺乳動物種（トリ、イヌ、ウシ、ブタ、ウマ、およびヒトを含むが、これらに限るわけではない）のネイティブまたは野生型タンパク質または核酸の変種であることができる。例えば核酸によってコードされる、本発明に包含されるIFN-β変種の限定でない例、例えばNagataら (1980) Nature 284:316-320；Goeddelら (1980) Nature 287:411-416；Yelvertonら (1981) Nucleic Acids Res. 9:731-741；Streuliら (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:2848-2852；EP028033B1、およびEP109748B1。また、例えば米国特許第4,518,584号；同第4,569,908号；同第4,588,585号；同第4,738,844号；同第4,753,795号；同第4,769,233号；同第4,793,995号；同第4,914,033号；同第4,959,314号；同第5,545,723号；および同第5,814,485号も参照されたい。これらの引用は、生物学的活性を喪失させずに変化させることができるIFN-βタンパク質の残基および領域に関する指針も与える。
【０１９４】
本発明の発現されるタンパク質および核酸（例えばRNA）の変化または修飾は、それらをコードするヌクレオチド配列への突然変異によって、発現された分子の生物学的活性または治療活性を変化させずに、発現されたタンパク質のアミノ酸配列または核酸配列に変化を生じさせることにより、導入することができる。例えば、基準タンパク質または出発タンパク質のアミノ酸配列とは異なる配列を持つ変種タンパク質をコードする単離された核酸分子は、一つ以上のアミノ酸置換、付加または欠失が、基準タンパク質または出発タンパク質をコードする配列に導入され、それによって、コードされるタンパク質が発現された時に変種タンパク質が生じるように、対応するヌクレオチド配列中に一つ以上のヌクレオチド置換、付加、または欠失を導入することによって、生成させることができる（IFN-β変種については、例えば米国特許第5,588,585号、米国特許第4,959,314号；同第4,737,462号；L. Lin (1998) Dev. Biol. Stand. 96:97-104を参照されたい）。例えば、突然変異は、核酸またはアミノ酸配列を修飾するための標準的技法（部位特異的突然変異誘発またはPCRによる突然変異誘発など）によって導入することができる。
【０１９５】
さらに、タンパク質をコードする核酸配列は、一つ以上の予測された、好ましくは非必須の、アミノ酸残基において、保存的アミノ酸置換をコードするように修飾することができる。本明細書にいう「非必須」アミノ酸残基は、その生物学的活性または治療活性を変化させずに、タンパク質の基準配列から変化させることができる残基であり、一方、「必須」アミノ酸残基は、そのような活性に要求される。本明細書にいう「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似する側鎖を持つアミノ酸残基で置き換えられるものである。類似する側鎖を持つアミノ酸残基のファミリーは当技術分野において定義づけられている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を持つアミノ酸（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を持つアミノ酸（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を持つアミノ酸（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を持つアミノ酸（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖を持つアミノ酸（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を持つアミノ酸（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。好ましい実施形態では、そのような置換が、保存されたアミノ酸残基、または保存されたモチーフ内に存在するアミノ酸残基には行われない。
【０１９６】
さらに、基準分子のコード配列の全部または一部に沿ってランダムに突然変異を導入することによって（例えば飽和突然変異誘発によって）、変種分子のヌクレオチド配列を作製し、その結果生じた突然変異体を、生物学的活性または治療活性についてスクリーニングすることもできる。突然変異誘発後に、コードされたタンパク質を組換え発現させ、本明細書に記載するまたは当技術分野で知られる標準的アッセイ技法を使って、そのタンパク質の活性を決定することができる。好ましい実施形態では、生物学的または治療的に活性なタンパク質変種が、比較の基礎または基準となる基準タンパク質のアミノ酸配列に対して、少なくとも80％、より好ましくは約90％〜約95％以上、最も好ましくは約96％〜約99％以上のアミノ酸配列一致度を持つ。本明細書にいう「配列一致」とは、その変種のアミノ酸配列の指定された連続セグメントを、基準分子のアミノ酸配列と整列させ、比較した場合に、変種タンパク質内および基準となるタンパク質分子内に見出される、同じアミノ酸残基である。
【０１９７】
配列一致度を決定するための二つの配列の最適アラインメントに関して、変種のアミノ酸配列の連続セグメントは、基準分子のアミノ酸配列と比較して、追加のアミノ酸残基または欠失したアミノ酸残基を持ちうる。基準アミノ酸配列との比較に用いられる連続セグメントは、少なくとも20個の連続アミノ酸残基を含むだろう。変種のアミノ酸配列へのギャップの包含に関連して増加した配列一致度に関する補正は、ギャップペナルティを割り当てることによって行うことができる。配列アラインメントの方法は当技術分野ではよく知られている。
【０１９８】
例えば、任意の二配列間の一致率の決定は、数学的アルゴリズムを使って達成することができる。配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの好ましい、限定でない例の一つは、例えばMyersおよびMiller (1988) Comput. Appl. Biosci. 4:11-7のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、GCGアラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム（バージョン2.0）で利用される。アミノ酸配列を比較する場合、ALIGNプログラムでは、PAM120重み残基テーブル（weight residue table）、ギャップ・レングス・ペナルティ（gap length penalty）12、およびギャップペナルティ（gap penalty）4を使用することができる。二つの配列を比較する際に使用される数学的アルゴリズムのもう一つの好ましい、限定でない例は、KarlinおよびAltschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:5873-5877のように変形された、KarlinおよびAltschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:5873-5877のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、Altschulら (1990) J. Mol. Biol. 275:403-410のNBLASTおよびXBLASTプログラムに組み込まれる。BLASTアミノ酸配列検索をXBLASTプログラム、スコア（score）＝50、ワードレングス（word length）＝3で行うことにより、関心対象のタンパク質と類似するアミノ酸を得ることができる。
【０１９９】
比較のためのギャップ付きアラインメントを得るには、Altschulら (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記述されているように、gapped BLASTを利用することができる。あるいは、PSI-BLASTを使って、分子間の遠い関係を検出する統合検索を行うこともできる（例えばAltschulら (1997) 前掲を参照されたい）。BLAST、gapped BLAST、またはPSI-BLASTプログラムを利用する場合は、デフォルトのパラメータを使用することができる（例えばwww.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい）。ALIGNプログラム（Dayhoff (1978)「Atlas of Protein Sequence and Structure 5: Suppl.3」（National Biomedical Research Foundation、ワシントンD.C.）に記載）およびWisconsin Sequence Analysis Package（バージョン8）（Genetics Computer Group（ウィスコンシン州マディソン）から入手可能）中のプログラム、例えばGAPプログラムも参照されたい（この場合、そのプログラムのデフォルトパラメータが利用される）。
【０２００】
アミノ酸配列一致率を考慮する場合、いくつかのアミノ酸残基位置は、タンパク質の機能に影響を及ぼさない保存的アミノ酸配列置換の結果として異なりうる。これらの場合は、保存的に置換されたアミノ酸の類似性を説明するために、配列一致率を上向きに調整することができる。そのような調整は当技術分野ではよく知られている（例えばMyersおよびMiller (1988) Comput. Appl. Biosci. 4:11-17を参照されたい）。
【０２０１】
さらに、RM、AM、またはIMがタンパク質である実施形態では、そのタンパク質を例えばポリエチレングリコール（PEG）またはアルブミンなどに共有結合で連結することができる。これらの共有結合ハイブリッド分子は、対象への投与後の延長された血清中半減期など、一定の望ましい性質を持つことができる。PEG-IFN付加物を生成させるための方法では、モノメトキシポリエチレングリコールの化学修飾によって活性化型化合物を生成させ、それを本発明のタンパク質と反応させる。PEG連結タンパク質を製造し使用するための方法は、例えばDelgadoら (1992) Crit. Rev. Ther. Drug. Carrier Syst. 9:249-304に報告されている（また、本明細書の「背景技術」でも説明したとおりである）。アルブミン融合タンパク質を生成させるための方法は、関心対象のタンパク質とアルブミンのコード配列の融合を伴い、例えば米国特許第5,876,969号などに報告されている。
【０２０２】
本発明が包含する生物学的または治療的に活性なタンパク質または核酸変種は、好ましくは、生物学的活性または治療活性を保つ、またはそのような活性を持つ。いくつかの実施形態では、変種が、基準分子（例えばタンパク質または核酸）の生物学的活性または治療活性の少なくとも約25％、約50％、約75％、約85％、約90％、約95％、約98％、約98％以上を保つ。基準分子（例えばタンパク質または核酸）と比較して増加した活性を持つ変種も包含される。変種の生物学的活性または治療活性は、当技術分野で知られる任意の方法によって測定することができる（例えばFellousら (1982) Proc. Natl. Acad. Sci USA 79:3082-3086；Czernieckiら (1984) J. Virol. 49(2）:490-496；Markら (1984) Proc. Natl Acad. Sci. USA 81:5662-5666；Brancaら (1981) Nature 277:221-223；Williamsら (1979) Nature 282:582-586；Herbermanら (1979) Nature 277:221-223；Andersonら (1982) J. Biol. Chem. 257(19):11301-11304に記載のアッセイを参照されたい）。
【０２０３】
一般に、クローニング、試験および本明細書に記載する他の用途には、本発明の核酸、タンパク質および化学組成物を、当技術分野で知られる方法を使って製造または合成することができる。例えばタンパク質は、本発明のタンパク質または核酸をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養することによって製造することができる。宿主細胞は、そのヌクレオチド配列を転写して、所望のタンパク質または核酸を産生することができるものであり、原核細胞（例えば大腸菌）または真核細胞（例えば酵母、昆虫、または哺乳動物細胞）であることができる。IFN-βの組換え生産の例は、適切な発現ベクターを含めて、例えばManteiら (1982) Nature 297:128；Ohnoら (1982) Nucleic Acids Res. 10:967；Smithら (1983) Mol. Cell. Biol. 3:2156、ならびに米国特許第4,462,940号、同第5,702,699号、および同第5,814,485号；米国特許第5,795,779号に記載されている。
【０２０４】
さらに、遺伝子は組換えDNA（「rDNA」）技術を使ってクローニングされており、それを、例えば動物細胞もしくは植物細胞、またはトランスジェニック動物中で製造し、試験することができる（例えばNagolaら (1980) Nature 284:316；Goeddelら (1980) Nature 287:411；Yelvertonら (1981) Nuc. Acid Res. 9:731；Streuliら (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:2848を参照されたい）。タンパク質も、rDNA技術を使って、例えばウイルス誘導ヒト細胞からポリAリッチ12SメッセンジャーRNAを抽出し、そのmRNAをテンプレートとして使って二本鎖cDNAを合成し、そのcDNAを適当なクローニングベクター中に導入し、そのベクターで適切な微生物を形質転換し、その微生物を収集し、そこからタンパク質を抽出することなどによって製造することができる（例えば欧州特許出願第28033号（1981年5月6日公開）；同第32134号（1981年7月15日公開）；および同第34307号（1981年8月26日公開）を参照されたい）。
【０２０５】
また、ペプチド技術分野の当業者に知られるいくつかの技法のいずれかによって、タンパク質を化学的に合成し、試験することもできる（例えばLiら (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2216-2220、StewardおよびYoung (1984)「Solid Phase Peptide Synthesis」（Pierce Chemical Company、イリノイ州ロックフォード）、ならびにBaraneyおよびMerrifield (1980)「The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology」GrossおよびMeinhofer編、第2巻（Academic Press、ニューヨーク、1980）の3〜254頁（固相ペプチド合成技法に関する議論）、ならびにBodansky (1984)「Principles of Peptide Synthesis」（Springer-Verlag、ベルリン）、ならびにGrossおよびMeinhofer編 (1980)「The Peptides. Analysis, Synthesis, Biology」第1巻（Academic Press、ニューヨーク、古典的溶液合成に関する議論）を参照されたい）。本発明のタンパク質は、例えば同時多重ペプチド合成の方法などによって、化学的に製造することもできる。例えばHoughten (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5131-5135；および米国特許第4,631,211号を参照されたい。
【０２０６】
さらに、一般に容認された適当な動物モデルと当技術分野で知られる方法とを使って、疾患の処置に関して、本発明の組成物を試験する方法は、当業者にはわかるだろう。例えば、実験的アレルギー性脳脊髄炎（EAE）、関節炎、狼蒼、およびNOD糖尿病モデルなどを含むいくつかの動物自己免疫疾患モデルにサイトカインを送達するために、遺伝子送達系を使用することができると、報告されている（例えばG.C. TsokosおよびGT. Nepom (2000) Clin. Invest. 106:181-83；G.J. Prud'homme (2000) J. Gene Med. 2:222-32を参照されたい）。EAEは、一定のCNS自己抗原、例えば脳由来プロテオリピドまたはミエリン塩基性タンパク質などによる免疫化後に起こる、中枢神経系炎症のモデルである。その経過および臨床症状はヒトにおける多発性硬化症（MS）に類似し、MSを研究するための一般に容認されたモデルになっている。マウスおよびラットEAEモデルにおいて、タンパク質として送達された（15〜20）、およびベクターによって送達された（例えばK. Triantaphyllopoulosら (1998) Gene Therapy 5:253-63；J.L. Croxfordら (1998) J. Immunol. 160: 5181-87を参照されたい）、I型IFNの試験を記載する報告はいくつかある。Yuらは、EAE疾患誘導時にmIFN-βタンパク質を投与されたマウスが、正常マウスと比較して、（臨床スコアによって測定される）能力障害への遅延した進行、再発の遅延した発生、および増悪頻度の減少を示すことを明らかにしている（例えばM. Yuら (1996) J. Immunol. 64:91-100を参照されたい）。この結果は、IFN-β処置によるヒト結果とよく似ている。Triantaphyllopoulosらは、遺伝子治療ベースのアプローチにおいて、ニューロン特異的プロモータの制御下でCNSにIFN-βを送達するために、プラスミドベースのベクターを使った（例えばK. Triantaphyllopoulosら (1998) Gene Therapy 5:253-63を参照されたい）。これらのベクターは、EAEのエフェクター相中にマウスに頭蓋内注射され、疾患の臨床徴候を減少させ、または防止した。マウスEAEモデルにおいてIFN-βを使って現在までに行われた研究の結果は、IFNが、EAEモデルにおいて疾患の発生を遅延させ、疾患の症状発現を逆転するのに有効な治療法であることを証明している。このモデルにおいてIFN-βを送達するための遺伝子治療法（局所頭蓋内投与）は有効であることが示されている。
【０２０７】
実施例
以下の実施例は例示のために提供するものであって、決して本発明を限定しようとするものではない。
【０２０８】
以下の実施例で説明するように、ヒトIFN-β（hIFN-β）およびマウスIFN-β（mIFN-β）発現ベクターを構築し、血清中のIFN-βを直接測定するためのアッセイを開発し、インビボでIFN-β発現と相関するバイオマーカーを同定した。さらに、薬物動態研究を正常マウスで行って、IFN-βの遺伝子ベースの送達をボーラスタンパク質送達と比較し、IFN-βをコードする非ウイルスプラスミドDNAまたはアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターの筋肉内注射を使って、優れた薬物動態プロファイルを証明した。また、hIFN-βを発現させるAAV-1ベクターを使ってほぼ6ヶ月にわたるhIFN-βの長期安定発現を観察した。また、mIFN-βをコードするプラスミドDNAの単回筋肉内注射は、実験的アレルギー性脳脊髄炎（EAE）のマウスモデルにおいて有効であり、mIFN-βタンパク質の隔日注射と同程度に効果的であることが示された。以下に述べるように、本発明の制御発現系の例を構築し、試験した。例えば、TMおよびRMが単一プラスミドベクターに含有される本発明の制御発現系を使って、IFN-βの制御発現が正常マウスで証明された。
【０２０９】
これらの実施例に記載する研究で得られたデータは、疾患を処置するための、核酸にコードされたTMの送達に関して、本発明の制御された発現系の潜在的可能性を証明している。特にこれらの実施例は、MSを処置するためのタンパク質を長期制御発現させるために、IFN-β（例えばIFN-β1a）をコードする核酸の送達に本発明の制御発現系を使用することの潜在的可能性を証明している。ある実施形態では、送達ベクターが、それぞれTM（例えばIFN-β）およびRMをコードする第1および第2発現カセットを含む単一プラスミドベクターであり、これは、持続的（例えば3ヶ月超）かつAM（例えば小分子誘導因子（例えばMFP））の経口投与によって回復可能な発現をもたらし、さらにそのベクターは、筋肉内注射による反復投与が可能である。
【実施例１】
【０２１０】
IFN-βまたはGMCSF遺伝子治療に使用するためのベクターの構築
A．プラスミドベクター：細菌発現ベクターpbSER189由来のマウスIFN-β（mIFN-β）遺伝子を、免疫グロブリンカッパ（IgΚ）（タンパク質精製用）またはmIFN-β（遺伝子治療用）シグナル配列を5'プライマー上に付加して、PCR増幅した。そのPCR産物を、発現ベクターpCEP4/WPRE中のサイトメガロウイルス（CMV）プロモーターの下流に挿入して、組換えタンパク質発現および精製用のpGER90（図2A）を作製し、pgWiz中のサイトメガロウイルスプロモーターの下流に挿入して、遺伝子治療用のpGER101（図2B）を作製した。
【０２１１】
細菌発現ベクターpbSER178由来のヒトIFN-β遺伝子を、mIFN-β遺伝子と同じ手法（ただし遺伝子治療ベクターにはhIFNシグナル配列を使用）でPCR増幅し、pCEP4/WPREに挿入して、組換えタンパク質発現および精製用のpGER123（図2C）を作製し、pgWizに挿入して、遺伝子治療用のpGER125（図2D）を作製した。
【０２１２】
プラスミドベクターの構築は「方法と材料」F節に詳しく説明する。
【０２１３】
B．AAV-1ベクター：hIFN-βをコードするpGWIZ/hIFN-βの平滑末端化HincII/NotIフラグメントを、AAV-1ベクターpTReGFPの平滑末端化AgeI-SalI部位に挿入することによって、hIFN-βをコードするAAV-1-hIFN-βシャトルプラスミドを構築した。その結果生じたシャトルプラスミドをpGT62（配列番号44）と名付け、hIFN-βをコードするAAV-1ウイルスの生産に使用した。標準的方法を使って、本明細書に記載するようにAAV-1ウイルスのバッチを二つ調製し、それを薬物動態研究（図4）に使用した。それらの二つのウイルスバッチにおけるhIFN-βの発現レベルをELISAで検証した。
【０２１４】
また、mGMCSFまたはhGMCSFをコードするフラグメントをベクターpGENE/V5HisA（Invitrogen）に挿入することによって、mGMCSFまたはhGMCSFをコードするAAV-1-GM-CSFシャトルプラスミドpGT714およびpGT713（図30B）を構築した。その結果生じたベクターをpGT723-GENE/hGMCSFおよびpGT724-GENE/mGMCSFと名付けた。次に、mGM-CSFをコードするフラグメントを、pGT724-GENE/mGMCSFから、このベクターをKpnI-XbaIで消化することによって切り出した。同様に、hGM-CSFをコードするフラグメントを、pGT723-GENE/hGMCSFから、このベクターをKpnI-XbaIで消化することによって切り出した。ベクターpZac2.1をKpnI-XbaIで消化し、子ウシ腸ホスファターゼ（CIP）で処理した後、mGMCSFまたはhGMCSFのどちらか一方をコードする切り出されたフラグメントを、pZac2.1のKpnI-XbaI部位に挿入した。その結果生じたシャトルプラスミドをpGT713（pZac2.1-CMV-hGMCSF）およびpGT714（pZac2.1-CMV-mGM-CSF）（図30B）と名付けた。
【０２１５】
本発明のベクターの構築は「方法と材料」F節で詳しく説明する。
【実施例２】
【０２１６】
IFN-β遺伝子送達の薬物動態研究
A．ヒトIFN-βによる薬物動態研究：ヒトIFN-β（hIFN-β）のボーラスタンパク質ベースの送達と遺伝子ベースの送達とを比較するために、薬物動態研究を正常マウスで行った。
【０２１７】
1）ヒトIFN-β1aタンパク質薬物動態研究：筋肉内（i.m.）注射または静脈内（i.v.）注射のどちらかによって送達される組換えhIFN-β1aのボーラス注射を使用し、市販のELISAを使ってhIFN-βの血清レベルを検出することにより、C57/Bl6マウスで薬物動態研究を行った。図3に、25ng（1μg/kg）または250ng（10μg/kg）のhIFN-β1aタンパク質の単回i.m.またはi.v.注射後のマウスの血清におけるhIFN-β1aタンパク質の薬物動態プロファイルを示す。i.v.注射後、hIFN-β1aは第1時点（30分）では血清中に用量依存的に検出され、迅速に除去されて、6時間までにはレベルがアッセイの検出限界（LOD）近くになった（LOD＝12.5pg/ml）。組換えhIFN-β1aタンパク質のi.m.注射後は、hIFN-β1a血清レベルが注射2時間後に最大レベルに達した後、6時間までに約10分の1に減少した。6時間時点で血清中に残っているhIFN-β1aの量は、i.v.注射と比較してi.m.注射の方が高かった。i.v.注射でもi.m.注射でも、高用量と低用量の間には血清hIFN-β1aレベルに10倍の差が見られた。組換えhIFN-β1aのボーラス注射後に示される高度に一過性の動態は、ヒトおよび他の動物種で先に報告された結果と極めて似ている（Buchwalder, P-Aら (2000) J Interferone Cytokine Res 20:57-66；Pepinsky, RBら (2001) J Pharm Exp Ther 297:1059-55）。
【０２１８】
2）AAV-1-CMV hIFN-β1aの遺伝子ベースの送達の薬物動態研究：ヒトIFN-βを構成的に発現させるようにAAV-1ベクターを構築し（AAV-1-CMV hIFN-β1a）、三つの用量（0.5×1010、1.0×1010、または5.0×1010ウイルス粒子）でi.m.注射によってC57Bl/6マウスに送達した。その結果を図4に示す。マウスの血清におけるヒトIFN-β1a発現は、2日目は低かったが、10日目まで急速に増加し、その時点で、血清レベルは三つの用量群のいずれにおいてもプラトーに達するか、または漸増した。投与された増加する一連の量のAAV-1-CMV hIFN-β1aベクターで、明確な用量応答が観察された。高い方の二用量では、定常レベルのhIFN-β1a発現が注射171日後の血清中に検出された。組換えhIFN-β1aタンパク質のボーラスi.m.注射を使った研究とは対照的に、hIFN-β1aをコードするAAV-1ベクターの遺伝子ベースの送達を使ったこの研究は、ベクターの単回注射後の血清におけるhIFN-β1aの長期発現を証明している。
【実施例３】
【０２１９】
遺伝子治療のためのIFN-βバイオマーカーの同定および使用
A．mIFN-βバイオマーカーの開発：インビボでのマウスIFN-β（mIFN-β）活性の検出における感度を高めるために、mIFN-βタンパク質またはmIFN-βをコードする遺伝子治療ベクターの注射後のマウスで、mIFN-β活性に関するバイオマーカーを同定した。バイオマーカーは、ベタセロン（Betaseron）（IFN-β1b）で処置された患者から得られる臨床試料中のヒトIFN-β活性を追跡するために使用することができる（例えばArnason, BG (1996) Clin Immunol Immunopathol 81:1-11；Deisenhammer, Fら (2000) Neurology 54:2055-60；Knobler, RLら (1993) J Interferon Res 13:333-40；Kracke, Aら (2000) Neurology 541:193-9を参照されたい）。IFN-β臨床研究に使用される主要バイオマーカーの一つは、MxAであるが（例えばKracke, Aら (2000) Neurology 541:193-9；Bertoloto, Aら (2001) J Imm Meth 256:141-152を参照されたい）、これは、それがI型IFNによって特異的誘導されるからである（例えばvon Wussow, Pら (1990) J Imm 20:2015-19を参照されたい）。本研究では、マウス末梢血単球（PBMC）から単離されるMxAマウスホモログMx1（例えばHug, Hら Mol Cell Biol 8: 3065-79；Pavlovic, J (1993）Ciba Found Symp 176: 233-43を参照されたい）の発現を使って、生物学的に活性なmIFN-βの存在を検出した。
【０２２０】
マウスPBMC中のMx1 mRNAのレベルを定量するために定量PCR/RT-PCRアッセイを開発した。具体的に述べると、mIFN-βタンパク質で処置したマウスから、またはmIFN-β遺伝子の遺伝子ベースの送達後に、末梢血単核球（PBMC）を単離した。処置マウスから得られた血液試料を、フィコールクッションにのせて、2,000rpmで25分間遠心分離した。精製PBMCをペレット化し、Qiagenの「RNAeasy」ミニ抽出キットを使って、Mx1アッセイ用のRNAを精製した。そのRNAをH2O中、-80℃で保存した。TaqMan（登録商標）ケミストリーを使ってMx1 RT-PCRを行い、Applied Biosystems（ABI）PRISM（登録商標）7700配列検出装置で解析を行った。RNAの逆転写およびcDNAの増幅には、ABIの「One-step TaqMan（登録商標）RNA」キットを使用した。RNAを48℃で30分間逆転写し、増幅は、変性ステップを95℃で30秒、アニーリング/伸長ステップを60℃で1分として、40サイクル行った。試料をMx1特異的なプローブ/プライマーの組合せで解析した。Mx1発現を、ABIの標準的アッセイを使って並行して測定したGAPDH発現に対して標準化した。
【０２２１】
精製組換えmIFN-βタンパク質で処理したマウスL929細胞におけるMx1 RNA誘導を調べることにより、このアッセイをインビトロで検証した（図5）。Mx1 RNAの発現に用量依存的な増加が観察され、EC50は約50pg/ml mIFN-βで、Mx1 RNAのレベルが100倍増加した。
【０２２２】
B．mIFN-βタンパク質のボーラス注射はインビボで一過性のバイオマーカー応答を誘導する：これらの研究では、精製組換えmIFN-βのボーラス注射後のバイオマーカー応答を測定した。i.v.投与したかi.m.投与したかにかかわらず、試験した各mIFN-β濃度で、Mx1 RNA発現の誘導（賦形剤注射マウスと比較して25〜50倍）が観察された（図6）。最も高いMx1発現レベルは注射の2時間後に測定された。mIFN-βをi.m.送達した場合は、この時点で明確な用量応答が観察された。Mx1発現は急速に低下し、注射後12時間を超えると、バックグラウンドを上回るMx1 RNAレベルは検出されなくなった。mIFN-βをi.v.注射した場合、最も高い誘導は150ngで観察された。500ng用量では、Mx1 RNA誘導レベルの減少が起こった。この飽和効果は他の研究でも観察されており、それらの研究では、高いIFN-βレベルが、おそらくはI型IFN受容体のダウンレギュレーションによると思われる、生物応答の目に見えるダウンレギュレーションをもたらす（例えばMager, DEおよびJusko, WJ (2002）Pharm Res 19:1537-43を参照されたい）。i.v.注射マウスにおけるMx1 RNA発現も注射の約2時間後にピークに達し、その後は急速に低下した。マウスにおけるmIFN-βの活性を追跡するためのバイオマーカーとしてMx1 RNAの発現が使用されたのは、これが初めてである。これらの結果は、Mx1 RNAがマウスPBMCにおいて低いレベルで構成的に発現され、それがmIFN-β処置によって強くアップレギュレートされうることを明確に示している。しかし、このアップレギュレーションは短期間であり、12〜24時間以内に、高い発現レベルからバックグラウンドへと急速に低下する。この迅速な動態は、I型インターフェロンに関してヒト（例えばSalmon, Pら (1996) J Interferon Cytokine Res 16:759-64；Buchwalder, P-Aら (2000) J Interferon Cytokine Res 20:57-66を参照されたい）および他の動物種（Pepinsky, RBら (2001) J Pharm Exp Ther 297:1059-55；Mager, DEら (2003) J Pharm Exp Ther 306:262-70）で報告されている短い半減期と一致する。
【０２２３】
C．ケモカインIP-10およびJE：mIFN-βタンパク質で処置したマウスから採取した血漿試料の分析中に、二つのマウスケモカインIP-10と、MCP-1（単球走化性タンパク質、例えばYoshimura, T (1989) FEBS Lett 244:487-93を参照されたい）のマウスホモログであるJEも、mIFN-βに対してMx1 RNAと類似の応答および活性化を持つことが同定された（図7および8）。IP-10およびJEの強い誘導が、mIFN-βタンパク質のi.v.またはi.m.投与の2時間後に見られた。IP-10レベルは、i.v.送達された高用量では、3000倍増加した。試験した三つのmIFN-β用量のそれぞれで、24時間までに、IP-10およびJEの血漿レベルの、バックグラウンドへの急速な低下が観察された。どちらの投与経路でもIP-10およびJEに関して明確な用量応答が観察された。
【０２２４】
IFN-βによるIP-10およびJEのこのような強い用量依存的誘導は、本発明者らが証明するまで、過去には知られていなかった。IP-10はそのプロモーター領域中のインターフェロン応答性エレメント（ISRE）ゆえにIFN-γの生物学的マーカーとして知られているが（例えばLuster, ADら (1985) Nature 315:672-76を参照されたい）、これがマウスにおけるmIFN-βの特異的バイオマーカーであることは、今まで知られていなかった。
【０２２５】
D．インビボでのmIFN-β遺伝子送達後の長期バイオマーカー応答：これらの研究では、mIFN-βをコードするプラスミドDNAまたはAAV-1ベクターの筋肉内送達後のマウスにおけるmIFN-βバイオマーカーの誘導の測定を証明する。
【実施例４】
【０２２６】
mIFN-β遺伝子の送達
A．mIFN-β遺伝子のプラスミド送達：プラスミド送達のために、mIFN-βをコードするプラスミドDNAを異なる用量でマウスにi.m.注射した後、注射を受けた筋のエレクトロポレーションを行った。個々の動物から単離されたPBMCからのMx1発現を測定し、対照群のバックグラウンドレベルに対する増加倍率として表した（図9）。mIFN-βプラスミドDNAを投与された4群の全てにおいて、注射後2日目に、Mx1 RNAの強いアップレギュレーション（40〜130倍の誘導）が起こっていた。4群全てにおいて、Mx1発現は、バックグラウンドを有意に上回っていた（p＜0.002）。Mx1発現データは、250μgを至適DNA濃度とする用量応答があることを示した。エレクトロポレーション後の1日目に最初のピークがあり、その後、発現量の低下が起こるが、さらに後の時点では、発現レベルが再び増加した。バイオマーカー応答のこの変動は、ケモカインIP-10およびJEのレベルにも反映され（未掲載データ）、IFN-βのプラスミド送達を用いる他の研究でも再現性のある現象であるらしい。有意なレベルのMx1誘導がこの研究の49日目まで観察された。
【０２２７】
B．mIFN-β遺伝子のAAV-1送達：C57Bl/6マウスに、mIFN-βをコードするpGT61のDNA、またはmIFNβをコードするpGT61から生産されたウイルス、またはSEAPをコードするpGER75のDNAを注射した（「材料と方法」G節を参照されたい）。
【０２２８】
注射の2、10、14および17日後にマウスから採血した。pGT61 DNAの投与を受けたマウスは、2日目に、バックグラウンドに対して約15倍のMx1 RNAの誘導を示した（図10）。Mx1発現は、10日目までに、バックグラウンドの100倍を越えるレベルまで増加し続けた。17日目までに、Mx1 RNA発現レベルはバックグラウンドの約180倍になった。pGER75 DNAの投与を受けた対照群では、増加したMx1発現は観察されなかった。pGT61から生産されたウイルスを注射したマウスにおけるMx1 RNA発現レベルは、pGT61 DNAの投与を受けたマウスと比較して、10日目、14日目および17日目に約5倍高かった。これは、注射を受けた筋で行ったIFN-β RNA RT-PCR分析によって裏付けられた。動物を屠殺した17日目に、筋におけるmIFN-β RNA発現は、DNA注射筋では9.0×105コピー/μg RNAだったのに対して、ウイルス注射筋では2.0×106コピー/μg RNAだった（未掲載データ）。
【０２２９】
また、血漿試料をIP-10およびJEについて分析した（図7および8）。得られた結果はMx1 RNA誘導について得られたものと非常に似ていた。エレクトロポレーションによるDNAの投与を受けたマウスは、2日目には、AAV-1-mIFN-β発現ウイルスを注射されたマウスと比較して、高いIP-10血漿レベルを示した。しかし、AAV-1-m IFN-βを注射されたマウスにおけるIP-10レベルは、10日目までに、強い増加を示し、プラスミドmIFN-β注射マウスより平均して5〜10倍高くなった。
【０２３０】
C．要約と結論：ヒトIFN-β1aタンパク質のボーラス注射後の薬物動態プロファイルは、健常ヒトボランティアおよび患者に投与されるhIFN-β1aを用いた研究の以前公表された報告に極めて似ている（例えばBuchwalder, P-A (2000) J Interferon Cytokine Res 20:57-66を参照されたい）。i.v.注射されたヒトIFN-β1aタンパク質は迅速に除去され、6時間までには血清レベルがアッセイの検出限界未満になる。タンパク質のi.m.注射後は、ピーク値は低いものの、血清中半減期は長くなる。しかし、その動態は依然として極めて迅速であり、血清レベルは数時間以内に検出限界未満に下がる。PEG化型のIFN-β1aを使ってマウス、ラットおよびサルで行われた最近の薬物動態研究は、20kDaポリマーのポリエチレングリコール（PEG）を取付けることによって半減期（t1/2）が約1時間から約10時間に伸びることを示している（例えばPepinsky, RBら (2001) J Pharm Exp Ther 297: 1059-66を参照されたい）。
【０２３１】
プラスミドDNA送達後のhIFN-βの血清レベルを測定する試みは、検出可能なレベルのhIFN-βタンパク質が注射を受けた筋の溶解物中にELISAによって測定されてはいるものの、おそらくは導入遺伝子の低い発現ゆえに、成功していない（未掲載データ）。しかし、hIFN-βをコードするAAV-1ベクターを使用することにより、i.m.注射後に、極めて高い血清レベルのhIFN-βタンパク質が、hIFN-β ELISAによって、用量依存的に検出された。そのうえ、極めて安定かつ持続的なレベルが、注射のほぼ6ヶ月後まで測定された。抗hIFN-β抗体の存在について血液を分析してはいないが、このモデルでは外来導入遺伝子としてのhIFN-β発現に対して、目に見える免疫原性応答が見られなかったことは興味深い。hIFN-βのボーラスタンパク質送達は、他の動物モデル（例えばサル、参考文献33参照）では、高度に免疫原性であると報告されている。これらの結果は、hIFN-βをコードするAAV-1ベクターのi.m.投与が、長期間にわたって高い導入遺伝子発現を達成するためのプラットフォームとして開発されうることを示唆している。
【０２３２】
マウスIFN-Bのタンパク質送達または遺伝子送達を使った薬物動態研究を行うために、三つのmIFN-βバイオマーカーを同定し、検証した。mIFN-βを投与されたマウスのPBMCから単離されるMx1 RNAの誘導を測定するために、極めて高感度な定量RT-PCRアッセイを開発した。二つのマウスケモカインIP-10およびJEも高感度IFN-βバイオマーカーとして同定され、市販のELISAを使って、迅速に定量し、Mx1 TaqManアッセイで得られた結果を裏付けることができた。二つの異なるタイプの遺伝子送達ベクター、すなわちプラスミドDNA（＋エレクトロポレーション）とAAV-1を試験した。ボーラスmIFN-βタンパク質のi.v.またはi.m.投与は、三つのバイオマーカーの全てについて、強いが一過性である誘導をもたらし、Tmaxは約2時間だった。バイオマーカーレベルは注射後12〜24時間以内にバックグラウンドまで急速に低下した。mIFN-βをi.m.注射した場合は、Mx1、IP-10およびJEに関して、用量応答が観察された。バイオマーカーレベルの急速な低下は、ボーラスタンパク質投与後のIFN-βの迅速な全身クリアランスを直接反映している。
【０２３３】
プラスミド＋エレクトロポレーションまたはAAV-1ベクターを使ったmIFN-βの遺伝子ベースの送達は、mIFN-βタンパク質を注射した場合に観察されるものよりも大きなバイオマーカー応答をもたらした。プラスミドDNAでは、バイオマーカー応答が49日まで測定され、63日目にはバックグラウンドレベルまで低下した。これらのデータにより、mIFN-β発現プラスミドは生物学的に活性なmIFN-βを少なくとも7週間は発現させる能力を持つことが、初めて証明された。mIFN-β DNAをAAV-1ベクターによって送達した場合は、バイオマーカー応答の動態が、わずかに異なっていた。応答は感染後初期は比較的低く、最初の1週間かけて増加した。高レベルでのバイオマーカー応答の安定化が感染後の2週間目および3週間目に観察された。
【０２３４】
要約すると、マウスにおけるボーラスタンパク質投与と比較して、遺伝子ベースの送達の優れた薬物動態プロファイルが、ヒトおよびマウスIFN-βの両方について証明された。第1に、血清中で直接測定される、またはIFN-βバイオマーカーの誘導に反映される、発現されたIFN-βのレベルは、タンパク質送達で達成されるレベルと同じか、それを上回る。第2に、IFN-βベクターの単回注射からのIFN-β発現の持続時間は、タンパク質投与で観察される一過性の動態（数時間）と比較して、はるかに長い（数週間〜数ヶ月にわたる安定な発現）。
【実施例５】
【０２３５】
mIFN-βの遺伝子ベースの送達を使った効力研究
これらの研究は、遺伝子ベースの送達がMSの動物モデルにおいて有効であることを証明する。齧歯類EAEモデルは、MSのモデルとして広く認められており、IFN-βがこれらのモデルで活性であると示されている報告はいくつかある（Yu, Mら (1996) J Imm 64:91-100）。IFN-Bの遺伝子ベースの送達がこれらのモデルの一部で有効であるという報告もある（例えばTriantaphyllopoulos, Kら., (1998) Gene Therapy 5:253-63を参照されたい）。これらの研究の結果は、mIFN-βタンパク質を使ってマウスEAEモデルを検証し、このモデルにおけるmIFN-βの遺伝子ベースの送達とタンパク質送達とを比較する。
【０２３６】
A．マウス急性EAEモデルにおけるmIFN-βタンパク質の効力：8週齢雌SJLマウスをプロテオリピドタンパク質（PLP）で1日目に免疫した後、研究の経過中は1日おきに、異なる用量（1群あたり10,000、20,000、30,000、または100,000単位）の精製組換えマウスIFN-βタンパク質の皮下（s.c.）注射で処置した。この研究に使用した陽性対照は、1日2回腹腔内（i.p.）投与されるメソプラムおよびプレドニゾロンである。
【０２３７】
具体的に述べると、mIFN-βをコードする遺伝子をpCEP4発現ベクター（Invitrogen）中にクローニングした。mIFN-βをコードする発現プラスミドを293E細胞（Edge Biosystems）中に、X-tremeGene Ro-1539トランスフェクション試薬（Roche）を使って、一過性にトランスフェクトした。マウスIFN-βタンパク質をイオン交換クロマトグラフィーおよび疎水相互作用クロマトグラフィーによって培地から精製した。生成物を、希釈緩衝液（50mM酢酸ナトリウム、pH5.5、150mM塩化ナトリウム、および5％ポリプロピレングリコール）に対して透析（sialyze）および濃縮し、滅菌濾過した。精製タンパク質を小分けして-80℃で保存した。Access Biomedical（カリフォルニア州サンディエゴ）の市販mIFN-β標準試料を使用し、ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ（Hardyら (2001) Blood 97:473-482）を使って、精製タンパク質の活性を評価した。精製タンパク質の比活性は2×108単位/mgだった。
【０２３８】
動物研究用に、精製mIFN-βを希釈緩衝液に100μg/mLまで希釈した。動物に注射する直前に、mIFN-β原液を所望のmIFN-β濃度に希釈した。これらの研究で使用した賦形剤対照はmIFN-βを含まない希釈緩衝液である。
【０２３９】
この研究の結果を図11に示す。100,000単位のIFN-β（約500ng、20μg/kg）で処置したマウスは、賦形剤処置マウスと比較して有意に低下したEAEの臨床スコアを生じた（p＝0.0046）。30,000単位のIFN-βで処置したマウスも、賦形剤処置マウスと比較して低下した臨床スコアを示したが、この低下は統計的に有意な水準には達しなかった。この研究における陽性対照であるメソプラムおよびプレドニゾロンも、臨床スコアを有意に低下させた。
【０２４０】
B．mIFN-βの遺伝子ベースの送達はマウス急性EAEモデルにおいて有効である：mIFN-βタンパク質はマウス急性EAEモデルにおいて有効であることを証明する先の研究の結果に基づいて、mIFN-βのプラスミド送達をタンパク質送達と共に試験し、比較するために、第2の研究を行った。最初の研究と同様に、マウスには1日目にPLPを注射した。遺伝子送達の場合は、研究2日目に、PBS、ヌルプラスミドDNA（pNull）＋エレクトロポレーション（EP）、mIFN-βプラスミドDNA（＋EP）、または「PINC」と呼ばれるポリマー製剤（Mumper, RJら (1998) J Controlled Release 52:191-203）を使って製剤されたmIFN-βプラスミドDNAを、マウスに筋肉内注射した。タンパク質送達の場合は、マウスIFN-βタンパク質（100,000単位、s.c.注射）または賦形剤を、マウスに1日おきに注射した。
【０２４１】
この研究の結果を図12に示す。先の研究と同様に、100,000単位のmIFN-βタンパク質で処置されたマウスは、賦形剤対照処置マウスと比較して、有意に低下した臨床スコアを持っていた（p＝0.045）。mIFN-β＋EPの遺伝子送達も、pNullおよびEPの遺伝子送達と比較して、臨床スコアを有意に低下させた（p＝0.0171）。IFN-βのPINC製剤を使った遺伝子送達は、pNullと比較して、臨床スコアを統計的に低下させなかった（未掲載データ）。この研究の完全な結果は「材料と方法」A節と図13に記載する。
【０２４２】
C．要約と結論：研究の経過中、1日おきに100,000単位のmIFN-βを注射すると、賦形剤対照と比較して、疾患の重症度が有意に低下することを証明することにより、組換えmIFN-βタンパク質を使って、マウス急性EAEモデルが検証された。mIFN-βをコードするプラスミドの、エレクトロポレーションによる、遺伝子ベースの送達は、罹患マウスにおける臨床スコアを有意に低下させることが示された。研究2日目のプラスミドの単回注射は、スコアを低下させるのに、IFN-βタンパク質の1日おきの注射と同じぐらいの効果があった。これらの結果は、IFN-βの遺伝子ベースの送達がMSの動物モデルにおいて有効であることを証明している。
【実施例６】
【０２４３】
制御発現系を使ったインビボでのIFN-βの制御発現
A．設計、構築およびインビトロ検証：本発明の制御発現系には既知の発現系を上回る利点がある。好ましい一実施形態において、本発明の系は、単一ベクター中に、関心対象の治療分子（TM）（例えばIFN-β導入遺伝子）をコードする第1発現カセットと、そのTMの発現を制御する制御因子分子（RM）をコードする第2発現カセットとを持つことにより、いくつかの開発上および製造上の問題を解決する。
【０２４４】
好ましい実施形態の一例として、本発明者らは、新しい改良された制御発現系を提供する。この実施形態では、本発明の制御された発現系の発現カセットが、BRES-1と呼ばれる単一プラスミドベクター中に存在する。BRES-1単一ベクターは、その設計に組み込まれた多用途的特徴を、例えば異なる導入遺伝子を挿入するためのマルチクローニング部位（MCS）ならびに制御タンパク質の発現を駆動するための異なるプロモーターを含めて、いくつか持っている。また、BRES-1発現カセットのサイズは、プラスミドおよびAAVベクターを含む、多くの異なる送達ベクターに適合する。
【０２４５】
B．遺伝子治療用のmIFN-βおよびhIFN-β誘導性発現ベクターの構築：それぞれpGER101およびpGER125由来のmIFN-βおよびhIFN-β遺伝子を、一連の四つのBRES-1ベクター（図14A〜D）に移した。その結果生じたプラスミドは、マウスまたはヒトIFN-β遺伝子をコードする発現カセットと、RM遺伝子をコードする発現カセットとを、互いに関して四つの異なる方向で持っている（図15A〜B）。結果として生じた、mIFN-βをコードするBRES-1プラスミドを、pGT23、pGT24、pGT25、およびpGT26（図15A）と命名し、結果として生じた、hIFN-βをコードするBRES-1プラスミドを、pGT27、pGT28、pGT29、およびpGT30（図15B）と命名した。これらのプラスミドの構築に関する完全な説明については「材料と方法」F節を参照されたい。
【０２４６】
C．IFN-β発現ベクターのインビトロ検証：構成的（pGER125）および誘導性（pGT27、pGT28、pGT29、およびpGT30）hIFN-β発現プラスミドをマウス筋C2C12細胞にトランスフェクトした。その細胞を誘導因子MFPで処理し、培地をhIFN-βについてELISAでアッセイした（図16）。その結果は、MFPの非存在下ではhIFN-β発現がほとんどないことを示している。BRES-1-hIFN-βプラスミドからのヒトIFN-β発現はMFPによって、CMVプロモーター（pGER125）から発現されるものの約50％までのレベルに、約20〜90倍誘導される。2プラスミド発現系（pGS1694＋pGER129）と比較して、BRES-1系の四つのプラスミド方向の全てが、MFPの非存在下では同等な基礎活性を示し、MFPの存在下では2プラスミドと同じかそれを上回る活性を誘導した。同様のインビトロ研究をmIFN-βBRES-1プラスミドでも行ったところ（図17）、その結果はhIFN-βBRES-1プラスミドで説明したものと極めて似ていた。
【０２４７】
D．インビボでのIFN-βの制御発現：pGER101をSalIで消化し、5'突出部をクレノウDNAポリメラーゼで埋めることによって平滑末端化し、SpeIリンカーをライゲートし、SpeIおよびNotIで消化し、その結果生じたmIFN遺伝子を保持するフラグメントをpGT4のSpeI部位とNotI部位の間に挿入することによって構築したmIFN-βBRES-1プラスミドベクターpGT26を使って、ナイーブC57Bl/6マウスで研究を行った。
【０２４８】
誘導因子MFPの経口投与によってmIFN-βの発現をオフ/オン/オフのパルス状に制御することができるかどうか、プラスミドベクターpGT26を使って調べた。構成的および誘導性BRES-1 mIFN-β発現プラスミドを、マウスの後肢筋に注射すると共に、エレクトロポレーションを行った。マウスを、プラスミド注射後7日目に開始して、4日連続してMFPで処置した。血液を注射後11日目および18日目に集め、PBMCを単離し、Mx1 RNAレベルをRT-PCRによって決定した。また、血漿試料をケモカインIP-10およびJEについてアッセイした。Mx1 RNAのバイオマーカー分析およびケモカイン分析に関する研究の結果を図18および19にそれぞれ示す。MFPの非存在下では、バイオマーカー誘導は7日時点でほとんどまたは全く観察されない。MFPの経口投与後は、全てのバイオマーカーが、11日目に、CMV-mIFN-βの場合よりも高いレベルにまで、強く誘導された。18日目までには、ケモカインレベルはベースラインに戻り、Mx1 RNAレベルはほぼベースラインまで低下していた（この研究と対照の説明については、後述する「材料と方法」G節を参照されたい）。
【０２４９】
E．要約と結論：本発明者らは、慢性疾患（例えばMS）を処置するための治療分子（TM）（例えばIFN-β遺伝子）の送達に適した二つのベクター、すなわち非ウイルスプラスミドDNAとアデノ随伴ウイルス1型（AAV-1）を同定した。さらに本発明者らは、どちらのベクターも、筋肉内注射によって骨格筋に送達され、マウス動物モデルにおいて測定可能かつ持続的なIFN-β発現レベルを生成させうることを示した。プラスミドDNAの場合、本発明者らは、mIFN-βをコードするプラスミドの単回注射（＋エレクトロポレーション）がMSの動物モデルにおいて有効であり、mIFN-βタンパク質の1日おきの注射と同じぐらいの効果があることを証明した。本発明者らは、プラスミドがコードするmIFN-βの発現が、単回プラスミド注射後、少なくとも45日間は持続することを示すために、mIFN-βのバイオマーカーを開発した。AAV-1ベクターの場合、ヒトIFN-βをコードするAAV-1ベクターの単回筋肉内注射が、6ヶ月持続する高血清レベルのヒトIFN-βタンパク質をもたらすことを、本発明者らは明らかにした。プラスミドベクターとAAV-1ベクターはどちらも、本発明のBRES-1制御発現系と適合することが示された。例えば本発明者らは、本発明の単一プラスミドベクターBRES-1制御発現系を使って、マウスにおけるIFN-βの制御発現を証明した。
【０２５０】
新しい改良されたBRES-1制御発現系の一実施形態では、発現カセットが単一ベクター中、例えば単一プラスミドベクター中に存在する。この実施形態では、BRES-1単一プラスミドベクターが、制御因子分子（RM）（例えば修飾ステロイドホルモン受容体などの転写活性化因子）と治療分子（TM）（例えばヒトまたはマウスIFN-β）の両方の発現カセットを、単一のシャトルプラスミド発現ベクター上に含有する。BRES-1制御発現系の単一ベクターは、プロモーター、制御エレメントおよび導入遺伝子のプラスミドバックボーンへの挿入または置換を簡単にするために、マルチクローニング部位（MCS）を含有する。本発明者らが本明細書で証明するように、BRES-1 mIFN-βおよびBRES-1 hIFN-β単一プラスミドベクターを構築し、インビトロで試験したところ、活性化因子分子（AM）である小分子誘導因子MFPの非存在下では低いバックグラウンド活性を持つことが明らかになり、MFPの存在下では高い誘導性（2プラスミド系に匹敵する）を示した。
【０２５１】
BRES-1 mIFN-βプラスミドベクターとMFPの経口投与とを使って、正常マウスでインビボ試験を行った。バイオマーカーを使ってmIFN-β発現レベルを監視したところ、結果は、MFPの非存在下でのmIFN-βバイオマーカーの低いバックグラウンド発現、MFP投与後の強い誘導、およびMFP休薬時の基礎発現レベルへの復帰を示した（図18および19）。これらの結果に基づき、本発明者らは、本発明の制御発現系を使って、インビボでのIFN-βの制御発現を達成した。
【０２５２】
このように、これらの研究の成果ならびに本発明の組成物および方法は、疾患または状態、例えば抗炎症性疾患または状態、より好ましくはMSを処置するための、IFN-βの長期制御発現をもたらすであろう、IFN-βの遺伝子ベースの送達系である。本発明の遺伝子治療ベクターは、疾患または状態を処置するための関心対象の治療分子（TM）（例えばIFN-β）を送達するために、一つ以上の発現カセットを組み込むことができる。ある実施形態において、本明細書に記載する制御発現系は、小分子誘導因子MFPの経口投与による長期にわたる回復可能な発現を提供することができる。単一ベクターBRES-1系は、例えば筋肉内注射による反復投与が可能であり、クリニックにおける連続的IFN-β治療とパルス的IFN-β治療との対比試験を可能にするだろう。
【実施例７】
【０２５３】
候補ベクターの選択
BRES-1制御発現系
A．BRES-1方向：実施したインビボ研究では、図15で説明した四つのBRES-1方向の一つを利用した。本明細書で説明するように、これは、コンストラクトpGT26がMFPの存在下で最も高い導入遺伝子発現レベルを持っていたことを示すインビトロデータに基づくものだった。本明細書に記載するプロトコールを使って、これら四つのBRES-1方向をインビボで試験することにより、どれが最も良い導入遺伝子発現の「ウインドウ」（例えばMFPなしで最も低い基礎発現レベルおよびMFPありで最も高い誘導発現レベル）を与えるかを決定することができる。
【０２５４】
i．BRES-1プラスミドにおけるターゲット遺伝子発現に対する方向依存的効果：mIFN発現のバイオマーカーとして役立つケモカインIP-10のレベルによってアッセイされるmIFN発現のレベルを決定するために、mIFN-β BRES-1プラスミドベクターpGT23、24、25、および26を使用して、ナイーブC57Bl/6マウスで研究を行った。1群あたり15匹の動物を使って、pGT23、pGT24、pGT25、およびpGT26をマウスの後肢筋中に注射し、エレクトロポレーションを行った。MFPの非存在下で7日目に各群5匹のマウスから採血した。各群の残り10匹を、プラスミド注射後7日目から4日間連続して、MFPで処置した。注射後11日目および18日目に血液を集め、血漿をIP-10についてアッセイした（詳細は「実験計画」を参照されたい）。結果は、インビトロ結果と合致して、pGT26が低発現−MFPと高発現＋MFPの最善の組合せを与えたことを示している（図32）。pGT24はIP-10発現の誘導が最も高かったが、MFPの非存在下におけるIP-10レベルが他の方向よりも高かった。pGT25は−MFPでも＋MFPでもIP-10レベルが低く、pGT23は＋MFPでのIP-10レベルがpGT26とほぼ同じだった。しかし、pGT24−MFPでのIP-10レベルはpGT26よりかなり高かった。これらの結果は、全体として、基礎ターゲット遺伝子発現および誘導ターゲット遺伝子発現の両方に対する方向依存的効果を示している。
【０２５５】
実験計画：BRES-1/mIFNプラスミドのインビボトランスフェクションおよびpBRES-1/mIFNの四つの方向の比較は以下のように行った。正常C57Bl/6マウスに単一ベクターBRES-1マウスIFN発現プラスミドを注射しエレクトロポレートした。バイオマーカー応答およびmIFN RNA分析によってmIFN発現を監視した。マウスを、MFP処置のオフ/オン/オフサイクルに、1回かけた。
【０２５６】
DNA溶液：全ての注射群の各マウスに、PBS 150μl中のプラスミドDNA 250μgを投与した。
表3
【表２】
2010523131.tif 000020
【０２５７】
DNA送達：0日目に、PBS 150μl中のプラスミドDNA 250μgを、成体雄C57Bl/6マウスに、両側的に注射した。DNA溶液を、各後脚の脛骨筋中に25μl、腓腹筋中に50μl注射し、次にキャリパーを使ってエレクトロポレーションを行った（200V/cm、1Hz、20ミリ秒/パルスで8パルス）。
【０２５８】
MFP処置：以下の表に示すように、0.33mg/kg（新しく調製した100μlの0.083mg/mlゴマ油）のMFPを、第1〜4群（全て注射マウス）に、経口胃管法によって投与した。
表4
【表３】
2010523131.tif 000021
【０２５９】
血液収集およびエンドポイント解析/アッセイ手順：上記の表に示した時点で、尾ニック（tail nick）または心臓穿刺（最終採血）によって、マウスから採血した。血液はマイクロテイナチューブ（EDTA含有）中にRT（室温）で集めた。尾採血からIP-10アッセイ用の血漿を集めた。最終採血からはPBMCを分離して集め、残りの血漿をELISAによってIP-10についてアッセイした。
【０２６０】
ii．BRES-1プラスミドにおけるターゲット遺伝子発現に対する方向依存的効果：BRES-1/hIFNプラスミドも上記と同様の方法で試験した。構成的（pGER125）または誘導性BRES-1/hIFN（pGT27、pGT28、pGT29、およびpGT30）プラスミドを、ナイーブC57Bl/6マウスの後肢筋中に注射し、エレクトロポレーションを行った。MFPの非存在下で4日目にマウスから採血した後、プラスミド注射後7日目から4日間連続して、MFPで処置した。注射後11日目および18日目に血液を集めた。凝固血から血清を集め、試料をELISAによりhIFNについてアッセイした（詳細については下記「実験計画」を参照されたい）。
【０２６１】
結果は、インビトロ結果と合致して、pGT28が低発現−MFPと高発現＋MFPの最善の組合せを与えたことを示している（図33）。4日目でのhIFN−MFPの発現は、どのBRES-1/hIFNプラスミドでも検出不能だった。7日目でのhIFN＋MFPの発現は、CMVプロモーターの場合と比べて、pGT27では低かったが、pGT28、29、および30では高かった。pGT28からのhIFNの発現は、CMVからの発現の5倍にもなった。18日目までに全てのBRES-1/hIFNプラスミドで発現はほぼ検出不能な状態まで低下しており、この時点での発現はpGT28が最も低かった。これらの結果は、全体として、基礎ターゲット遺伝子発現および誘導ターゲット遺伝子発現の両方に対する方向依存的効果を示している。
【０２６２】
実験計画：BRES-1/hIFNプラスミドのインビボトランスフェクションおよびpBRES-1/hIFNの四つの方向の比較は以下のように行った。正常C57Bl/6マウスにBRES-1/hIFNまたはCMV-hIFN発現カセットを保持するプラスミドベクターを注射した。1回の、MFP処置のオフ/オン/オフサイクル中に、ヒトIFN発現をアッセイした。
【０２６３】
プラスミドDNA溶液：第2〜6群のマウス（プラスミド）に、マウス1匹あたり、体積150μl中のDNA 250μgを投与した。
表5
【表４】
2010523131.tif 000022
【０２６４】
DNA送達：第2〜6群（プラスミド）については、各後脚の脛骨筋中に25μlのDNA溶液を、また腓腹筋中に50μlを注射した後、キャリパーを使ってエレクトロポレーションを行った（200V/cm、1Hz、20ミリ秒/パルスで8パルス）。
【０２６５】
MFP処置：第2〜5群には、以下の表に示すように、0.33mg/kg（新しく調製した100μlの0.083mg/mlゴマ油）のMFPを、7〜10日目に、i.p.注射によって投与した。
表6：サイクル1
【表５】
2010523131.tif 000023
【０２６６】
血液収集およびエンドポイント解析/アッセイ手順：上記の表に示した時点で、尾ニックまたは心臓穿刺（最終採血）によって、マウスから採血した。血液はマイクロテイナチューブ（抗凝固剤なし）中に集めた。血液から血漿を分離して集めた後、ELISAにより、hIFNについてアッセイした。
【０２６７】
iii．BRES-1プラスミドにおけるターゲット遺伝子発現に対する方向依存的効果：BRES-1/hEPOプラスミドも上記と同様の方法で試験した。各群10匹の動物を使って、誘導性1プラスミドBRES-1/hEPO（pGT15、pGT16、pGT17、およびpGT18）または2プラスミド（pGS1694＋pEP1666）ベクターを、ナイーブC57Bl/6マウスの後肢筋中に注射し、エレクトロポレーションを行った。各群の5匹をプラスミド注射後7日目から4日間連続してMFPで処置し、各群の5匹にはMFPを投与しなかった。注射後10日目、最後のMFP処置の6時間に、血液を集めた。凝固血から血清を集め、試料をELISAによりhEPOについてアッセイした（詳細については下記の実験計画を参照されたい）。結果は、誘導発現レベルが、四つのBRES-1/EPOプラスミドのうち三つについては、2プラスミド系よりも高いこと、ならびにmIFNおよびhIFN BRES-1プラスミドと合致して、発現レベルが方向によって異なることを示している（図34A）。結果は、EPO発現とヘマトクリットレベルの間の良好な相関関係を示しており（図34B）、これは誘導性EPO遺伝子発現の生理作用を証明している。これらの結果は、全体として、基礎ターゲット遺伝子発現および誘導ターゲット遺伝子発現の両方に対する方向効果を示している。
【０２６８】
実験計画：BRES-1/hEPOプラスミドのインビボトランスフェクションおよび四方向のpBRES-1/hEPOと2プラスミド制御発現系との比較は、以下のように行った。BRES-1/hEpoプラスミドベクター、またはEpoをGS応答性ターゲット遺伝子とする2プラスミド制御発現系を、正常成体C57Bl/6マウスに注射した。ヒトEpo発現をMFP処置の非存在下および存在下でアッセイした。以下のプロトコールは五つのマウス群（N＝10、ここに「N」は動物の数である）からなる。各群について、10匹のマウス全てに、四つのpBRES-1プラスミドの一つまたは上記2プラスミドを注射/エレクトロポレートした。N＝10のもう一つの群（第6群）は注射を行わずに陰性対照とした。
【０２６９】
以下の各尾採血または最終採血について、10μlの血液をヘマトクリットアッセイのために直ちに集め、残りの血液からの血清も集めた。下記「血液収集およびエンドポイント解析/アッセイ手順」の項を参照されたい。第1〜5群のそれぞれについて、7〜10日目の朝に、5匹のマウスにMFPを注射し、10日目の午後、最後のMFP注射の約6時間後に、尾から採血した（誘導試料）。各群の残り5匹のマウスはMFPで誘導せず、11日目に最終採血した（最終採血は正確な非誘導レベルを知るために必要だった）。第6群は11日目に最終採血した。
【０２７０】
このように、この実験では、pBRES-1系と2プラスミド系とを、それらのMFP誘導レベルおよび非誘導レベルに関して比較し、それらの経時的な定常的誘導レベルも比較した。
【０２７１】
プラスミドDNA溶液：第1群のマウスには、マウス1匹につき、体積150μl中の各プラスミド100μgを投与した。第2〜5群のマウスには、マウス1匹につき、体積150μl中のDNA 200μgを投与した。
表7
【表６】
2010523131.tif 000024
【０２７２】
DNA送達：各後脚の脛骨筋に25μlを注射し、腓腹筋に50μlを注射した後、キャリパーを使ってエレクトロポレーションを行った（200V/cm、1Hz、20ミリ秒/パルスで8パルス）。
【０２７３】
MFP処置：100μlのMFP溶液（0.083mg/mlゴマアブラ）のi.p.注射によってマウスにMFPを投与した。
表8
【表７】
2010523131.tif 000025
【０２７４】
血液収集およびエンドポイント解析/アッセイ手順：上記の表に示した時点で、尾ニックまたは心臓穿刺（最終採血）によって、マウスから採血した。血液をマイクロテイナチューブ（抗凝固剤なし）に集め、凝固させ、遠心分離し、血清を集めた。血清をELISAでhEpoについてアッセイした。
【０２７５】
ヘマトクリット：約10μlの血液を、尾ニックからキャピラリチューブ中に直接集め（吸引し）、粘土で密封し、収集後10分以内に、約10,000gで約5分間遠心分離した。血液をキャピラリチューブ内で3層、すなわち底部のRBC（総体積の40〜50％）、小さい「バフィー層」（WBCおよび血小板）および残りの血漿に分離させた。スライディングゲージ（sliding gauge）を使ってヘマトクリット（全血液に対するRBCのパーセンテージ）を読み取った。
【０２７６】
B．BRES-1バックボーン：本明細書に記載する本発明のBRES-1ベクターのプラスミドバックボーン修飾であって（本明細書に記載の方法によって決定した場合に）導入遺伝子発現のレベルおよび/または持続時間の有意な増加を示すものはいずれも、本発明のBRES-1ベクターに組み込むことができる。本発明のBRES-1ベクターへのさらなる修飾には、より強力なプロモーターが含まれうる。このタイプの修飾は、BRES-1系のモジュール設計ゆえに、試験が比較的容易である。
【０２７７】
C．BRES-1/ベクター試験：本発明者らによる薬物動態および効力研究では、CMVプロモーターエンハンサーを利用するIFN-β発現カセットを使用した。本発明のBRES-1発現系は、本明細書で説明するとおり、特定の治療ニーズに適するように加工することができる。例えば、本発明のベクターまたは発現カセットの変化または修飾は、C57Bl/6ナイーブマウスで試験することができる。これらの研究は、例えば、1）治療レベルの治療分子（TM）（例えばIFN-β）を達成するために必要なベクターおよび活性化因子分子（AM）（例えば小分子誘導因子MFP）の至適用量を、連続処置パラダイムまたはパルス処置パラダイムのいずれか一方について体系的に決定するために、および2）経時的に導入遺伝子発現の持続時間を決定すると共に、ベクターおよび誘導因子の反復投与の至適時間を明確にするために行うことができる。これらのパラメータがマウス（または他の適切な動物）で確立されたら、次に、これらの最適化された送達条件を別の種、好ましくは非ヒト霊長類で使用することにより、遺伝子ベースの送達の優れた薬物動態プロファイル（例えば発現のレベル、発現の持続性、回復可能な発現）を、タンパク質送達と対比して、確証することができる。
【実施例８】
【０２７８】
候補ベクターの選択
ベクターのタイプの選択は、具体的研究によって決定することができる。例えば、プラスミドDNAの場合は、治療レベルの治療分子（TM）、例えば治療レベルIFN-βを得るために、エレクトロポレーションが筋肉内注射の望ましいコンポーネントであるかどうかを決定することができる。本発明の遺伝子治療ベクターのエレクトロポレーションによる投与が望ましい場合には、本明細書に記載するように、そしてまた当技術分野で知られていることから、臨床的に実施可能で許容できる装置およびプロトコールを設計することができる。例えば、本発明のAAV-1ベクターの場合は、AAVベクターに関して報告された潜在的免疫原性に基づいて、ベクターの反復投与が望ましいかどうかを決定することができる（例えばChirmule, Nら (2000) J Virol 74:2420-25を参照されたい）。
【０２７９】
A．プラスミドDNAを使った骨格筋のトランスフェクションを改善するための方法：プラスミドDNAは、遺伝子ベースの送達にとって望ましいベクターである。なぜなら、それは単純であり、非免疫原性であり、作製および生産が容易だからである。筋肉内注射によるプラスミドDNAの骨格筋（SkM）トランスフェクション効率を強化するために、いくつかの異なる方法が開発されている。これらの方法には、送達に先だって筋および周囲の細胞外マトリックスを処理するためのヒアルロニダーゼなどの酵素の使用（例えばMennuni, Cら (2002) Hum Gene Ther 13:355-65を参照されたい）、さまざまなポリマー製剤の使用（例えばMumper, RJら (1998) J Controlled Release 52:191-203；Nicol, Fら (2002) Gene Ther 9:1351-58を参照されたい）、ならびにエレクトロポレーション（例えばAihara, Hら (1998) Nat. Biotech 16:867-70；Bloquel, Cら (2004) J Gene Med 6:S11-S23を参照されたい）または超音波（例えばSchratzberger, Pら (2002) Mol Ther 6:576-83を参照されたい）などの装置の使用が含まれる。高圧および大容量（「カフ（cuff）法」）を使った肢SkMへのプラスミドDNAの血管内送達も、このターゲット組織へのプラスミドDNAの高いトランスフェクションおよび広い分布に効果的であることが示されている（例えばBudker, Vら (1998) Gene Ther 5:272-76を参照されたい）。これらの方法の全てのなかで、エレクトロポレーションと血管内送達は、最も効果的であると報告されており、いくつかの動物モデルで、SkMへのプラスミドDNAのトランスフェクションを、裸のDNAのみの場合より、2〜3桁強化することが示されている（例えばBloquel, Cら (2004) J Gene Med 6: S11-S23；Qian, HSら (2004) Mol Ther 9: Supp 1, S91を参照されたい）。本発明者らは、エレクトロポレーションをプラスミドDNAの送達と併用した場合に、血清中に検出可能なレベルのIFN-β（測定可能な血清中IFN-βタンパク質、バイオマーカー応答、または効力）が達成されることを、プラスミドDNAを使って示した。
【０２８０】
IFN-βプラスミドDNAの送達における臨床使用に関して適切なエレクトロポレーション装置は、本明細書に記載の方法または当技術分野で知られる方法を使って、ウサギおよび他のより大きな動物で試験することにより、評価し、決定することができる。そのような試験および使用に適しうるエレクトロポレーション装置には、Inovio AS、Ichor Medical Systems、Genetronics, Inc.によって開発されたものが含まれうる。Genetronicsは、ある装置のヒトにおける試験を報告している（Gordon Research Conference on Bioelectrochemistry（7月25〜30日、ニューハンプシャー州）における未公表プレゼンテーション）。Inovioも、ヒトボランティアでエレクトロポレーション技術を試験した結果を報告している（例えばKjelen, Rら (2004) Mol Ther 9:Supp 1, S60を参照されたい）。Ichor Medical Systemsは、最近、治療DNAの送達に適したエレクトロポレーション装置の開発を報告している（例えばEvans, CFら (2004) Mol Ther 9:Supp 1, S56を参照されたい）。
【０２８１】
LacZレポーター遺伝子をコードするプラスミドを使用することにより、本発明者らは、プラスミド溶液の動脈内送達を使ったラット後肢骨格筋への高いトランスフェクション効率を証明している。Mirusは最近、低い圧力下に少ない体積でプラスミドDNAを送達するための静脈内送達法を報告しており、これを、本明細書に記載の方法または当技術分野で知られる方法を使って、SkMへのプラスミド送達について試験することができる（例えばHagstrom, JEら (2004) Mole Ther 10:386-98を参照されたい）。
【０２８２】
SkMへのプラスミドDNAの取込みと、その後の導入遺伝子の発現とを強化するための、エレクトロポレーションおよび血管内送達以外の方法を試験し、本明細書に記載の方法または当技術分野で知られる方法を使って、プラスミドDNAの送達に関するそれらの適性を決定することができる。これに関連して、SkMへのベクターの取込みを強化すると報告されている一定の化学薬剤を試験することができ、それらは、ポリマー製剤およびアンテノペディア（antennopedia）ペプチド（AP）を含めて、本発明のプラスミドベクターの送達における使用に適しているかもしれない。例えば「F68」は、プラスミドDNAを製剤し送達するために使用することができるポロキサマー製剤であり、SkMへのプラスミドDNAの送達を約10倍強化すると報告されている（例えばMumper, RJら (1998) J Controlled Release 52:191-203；Qian, HSら (2004) Mol Ther 9:Supp 1, S91を参照されたい）。アンテナペディア（AP）ペプチドおよび類似する組成の他のペプチドは、細胞膜を横切る大きな高分子の輸送を容易にすると報告されている（例えばBucci, Mら (2000) Nat. Med 6:1362-67；Gratton, J-Pら (2003) Nat Med 9:357-62を参照されたい）。
【０２８３】
B．プラスミドDNAベクターからのIFN-β発現のレベルおよび持続時間を増加させるための方法：SkMへのプラスミドDNAの取込みを強化する一定の化学薬剤を評価することに加えて、本発明のプラスミドDNAベクターからの導入遺伝子発現のレベルおよび持続時間を増加させるために、さまざまなアプローチを使用することができる。例えば、プラスミドDNAから細菌DNA配列を除去して、発現カセットだけを含有する環状プラスミド（「ミニサークルDNA」）を生成させると、マウス中の肝臓のトランスフェクション後に、標準的プラスミドDNAと比較して、10〜100倍高い導入遺伝子発現（導入遺伝子として第IX因子およびアルファ1-アンチトリプシンを使用）がもたらされると報告されている（例えばChen, Z-Yら (2003) Mol Ther 8:495-500を参照されたい）。CpG領域に富む細菌DNA配列の除去は、導入遺伝子発現サイレンシングを減少させ、プラスミドDNAベクターからのより持続的な発現をもたらすことが示されている（例えばEhrhardt, Aら (2003) Hum Gene Ther 10:215-25；Yet, NS (2002) Mol Ther 5: 731-38；Chen, ZYら (2004) Gene Ther 11:856-64を参照されたい）。本発明の制御発現系は、プラスミドDNAベクターを使った導入遺伝子発現のレベルを増加させ長引かせるために、そのようなアプローチを使って修飾することができる。好ましい一実施形態では、導入遺伝子発現のレベルを増加させ長引かせるために、IFN-βをコードするBRES-1プラスミドベクターを修飾する。
【０２８４】
ある実施形態では、本発明の制御発現系におけるIFN-β導入遺伝子の発現が、強いサイトメガロウイルス（CMV）プロモーターによって駆動され、IFN-βを構成的に発現させた。CMVプロモーターを使った遺伝子ベースの発現は、インビボでプロモーター領域の広範なメチル化によるサイレンシングを受けると報告されている（例えばBrooks, Aら (2004) J Gene Med 6:395-404を参照されたい）。また、BRES-1遺伝子治療プラスミドベクターpGT26-mIFN-βを使った本発明者らによるインビボ研究からの結果は、BRES-1発現カセットを使った場合に、CMV駆動の発現カセットを使って達成されるレベルよりも高いIFN-βレベルを示した（例えば実施例6を参照されたい）。これらの結果を考慮すると、本発明のIFN-β BRES-1発現系は、CMV駆動プラスミドDNA発現カセットを使ってこれまでに観察されていたものよりも有意に高く、より持続的な発現レベルを生じさせることができ、したがって、エレクトロポレーションなしでBRES-1プラスミドベクターの送達を調べるのに適している。
【０２８５】
好ましい一実施形態では、投与方法が、エレクトロポレーションを伴わずに、IFN-βプラスミド溶液の筋肉内注射による方法である。血清中の検出可能なレベルのIFN-βは、ナイーブマウスへの筋肉内注射でプラスミドベクターを投与することによって試験することができる。BRES-1発現カセットの発現レベルおよび持続性の完全な特徴づけを行い、先に使用されたCMVベクターと比較することができる。F68ポロキサマーおよびアンテナペディアペプチドを含むプラスミド製剤を、SkMのプラスミドトランスフェクションと、その後のIFN-β導入遺伝子発現とを強化するそれらの能力について、試験することができる。最後に、プラスミドベクターバックボーンの修飾（例えば細菌配列の除去）を、導入遺伝子発現を増加させ引き延ばすための手段として、調査することができる。
【０２８６】
C．AAV-1ベクター：アデノ随伴ウイルス（AAV）は、最初はヒトからのアデノウイルス分離株の夾雑物質として単離された一本鎖DNAウイルス（パルボウイルス）である。AAVは、それを遺伝子治療ベクターとしてとりわけ魅力的なものにする特徴を、いくつか持っている。ヘルパーウイルスの非存在下でのその非病原性および複製欠損性に加えて、これは、たった2つの遺伝子repおよびcapからなる非常に簡単なゲノムを含有する。組換えAAVベクターでは、これらの遺伝子が、それぞれ約135塩基対の特徴的な5'および3'逆位末端反復配列（ITR）に挟まれた所望の導入遺伝子で置き換えられる。このITRは、ベクター送達に要求される、AAV由来DNAの唯一の残存コンポーネントである。これまでの研究により、rep遺伝子を持たない組換えAAVベクターはインビボで組み込みを起こさず、むしろ非分裂細胞中でエピソーム性を保つ大きなコンカテマー構造を形成することが示されている（例えばDuan, Dら (1998) J Virol 72:8568-77；Vincent-Lacaze, Nら (1999) J Virol 73:1949-55；Schnepp, BCら (2003) J Virol 77:3495-3504を参照されたい）。
【０２８７】
AAVはDNAの収容力が約4.5kbと比較的小さいが、最大級の治療導入遺伝子を除けば、どの治療導入遺伝子でも、通常は十分に対応することができる。AAV2はヒト遺伝子治療治験で試験され、長期発現および最小限の炎症をもたらすことが示されている（例えばSilwell, JLおよびSamulski, RJ (2003) BioTechniques 34:148-59を参照されたい）。最近、代替的AAV血清型が、このベクター系に特有の長期発現に加えて、SkMへの優れたトランスフェクション効率を持つことが示されている（例えばGrimm, DおよびKay, MA (2003）Curr Gene Ther 3:281-304を参照されたい）。CMVプロモーター下でルシフェラーゼを発現させるAAV-1ベクターを使った本発明者らの研究は、マウスの後肢への筋肉内注射後12ヶ月を越えて持続する高い発現を示した（例えばQian, HSら (2004) Mol Ther 9:Supp 1, S60を参照されたい）。非ヒト霊長類では5年に及ぶhEPOの持続的発現が報告されている（例えばXiao, Wら (1999) J Virol 73:3994-4003を参照されたい）。
【０２８８】
本明細書に記載するように、本発明者らは、AAV-1 IFN-β発現ベクター（CMVプロモーター/エンハンサーを使った構成的発現）を試験して、C57Bl/6マウスの後肢への筋肉内注射後の、ロバストなレベルのhIFN-βタンパク質ならびにmIFN-βバイオマーカー応答を証明した。
【０２８９】
MSなどの慢性疾患を処置するためにウイルスベースの送達ベクターを選択する際に、本明細書に記載する方法または当技術分野で知られる方法を使って、本発明の制御発現系を、治療導入遺伝子の長期発現を示すその能力についてだけでなく、遺伝子の再投与が可能な点についても、試験することができる（例えばChirmule, Nら (2000) J Virol 74:2420-25を参照されたい）。AAV-1が再投与に関して適切なベクターであるかどうかを決定するために、例えば候補ベクターAAV-1およびAAV-2（ヒト集団において最も優勢であると考えられる血清型）を使って研究を行うことができる。そのようなアプローチを使って、1）AAV2またはAAV-1に対する既存の抗体が、AAV-1ベクター中にコードされている遺伝子を送達し発現させる能力に影響を及ぼすかどうか、および2）マウスにおけるIFN-βの治療レベルを維持するのに十分な用量でAAV-1ベクターを再投与することができるかどうか、を決定することができる。AAV-1ベクターまたはAAV2ベクター中のレポーター遺伝子ルシフェラーゼまたは治療遺伝子マウスIFN-βを発現させるベクターを、異なる用量でi.m.投与し、導入遺伝子発現を監視することができる。4週間後にベクターを再投与し、導入遺伝子発現を再び監視することができる。中和抗体は、細胞ベースのアッセイにおいてウイルス取込みを阻害するという免疫化マウス血清の能力により、エクスビボで測定することができる。
【０２９０】
i．pBRES-1-hIFN AAVベクターのインビボ活性：マウスの後肢筋中に注射されるhIFN-β BRES-1 AAVベクター、AAV-1 GT58を使って、ナイーブC57Bl/6マウスで研究を行った。MFPの非存在下で4日目にマウスから採血した後、プラスミド注射後7日目から4日間連続して、MFPで処置した。注射後11日目および18日目に血液を集めた。凝固血から血清を集め、試料をELISAでhIFNについてアッセイした（詳細については下記「実験計画」を参照されたい）。次に、約6〜8週間の間隔を開けて、マウスをさらに7サイクルのMFP処置および採血に付した。各サイクルはMFP処置の3日前に行われる採血、次に4日間のMFP、次にMFP最終日の翌日に行われる採血、次にその7日後に行われるもう1回の採血からなった。結果は、極めて高い誘導性hIFN発現を示し、注射の約3ヶ月後には、最も強いBRES-1/hIFNプラスミドで得られたレベルより75倍も高いレベルのピークに達する（図35）。hIFN発現は時間の経過と共に徐々に減少し、バックグラウンド発現−MFPは実験の全過程を通して低いままだった。これは、AAVベクターからの治療ターゲット遺伝子の、長期にわたる、持続的な（実施例9Bも参照されたい）、誘導性発現を証明している。
【０２９１】
実験計画：BRES-1/hIFN発現カセットを保持するAAVベクターを、正常成体C57Bl/6マウスに、下記のように注射した。MFP処置の複数のオフ/オン/オフサイクルを通じて、ヒトIFN発現をアッセイした。
【０２９２】
ウイルス溶液：第1群のマウス（AAV）には、マウス1匹につき、体積75μl中の5×1010ウイルス粒子（vp）を投与した。
表9
【表８】
2010523131.tif 000026
【０２９３】
MFP処置：第1群には、以下の表に示すように、7〜10日目に、0.33mg/kg（新しく調製した100μlの0.083mg/mlゴマ油）のMFPを、i.p.注射によって投与した。
表10：サイクル1〜3：1〜12週
【表９】
2010523131.tif 000027
表11：サイクル4〜8：4〜11ヶ月
【表１０】
2010523131.tif 000028
【０２９４】
血液収集およびエンドポイント解析/アッセイ手順：上記の表に示した時点で、尾ニックによって、マウスから採血した。血液はマイクロテイナチューブ（抗凝固剤なし）中に集め、血清を分離して集めるために遠心分離した。血清をELISAでhIFNについてアッセイした。
【実施例９】
【０２９５】
制御発現系を使った遺伝子治療
A．用量/応答および動態研究：プラスミドによって送達されるにせよAAV-1によって送達されるにせよ、マウス（または他の適切な動物）において治療レベルの治療分子（TM）（例えばIFN-β）を達成するのに必要な、本発明の遺伝子治療ベクターの送達量を決定するために、用量/応答研究を行うことができる。ある実施形態では、治療レベルが、そのベクターによって全身的に達成される、mg/kgベースでヒトに与えられる治療量の治療タンパク質のボーラスによって達成される治療タンパク質のレベルと等価な、治療分子（TM）（例えば治療タンパク質をコードする導入遺伝子）の誘導レベルと定義される。例えば、好ましい一実施形態では、治療レベルが、本発明の遺伝子治療ベクターによって全身的に達成される、mg/kgベースでヒトに与えられるボーラスIFN-βタンパク質によって達成されるIFN-βのレベルと等価な、IFN-βの誘導レベルと定義される。ヒトでは、現在のIFN-β1aの一回量は、30μgまたは44μg（Rebif）である。
【０２９６】
また、治療分子（TM）の発現の完全な薬物動態プロファイルを活性化因子分子（AM）を使って行うことにより、AM用量/応答ならびにAM投与後のTM発現の誘導の動態を決定することもできる。例えば好ましい一実施形態では、IFN-β発現の完全な薬物動態プロファイルを誘導因子MFPを使って行うことにより、MFP用量/応答ならびにMFP投与後のIFN-β誘導の動態を決定することができる。
【０２９７】
i．インビボでBRES-1/mIFNプラスミドを使ったMFP用量/応答およびプラスミド再注射：mIFN-β BRES-1プラスミドベクターpGT26を使って、ナイーブC57Bl/6マウスで研究を行うことにより、さまざまな用量のMFPに応答して起こるmIFN発現のレベル（ケモカインIP-10のレベルでアッセイされるもの）を決定した。pGT26をマウスの後肢筋中に注射してエレクトロポレーションを行い、プラスミド注射後7〜10日目に、その動物を0.0033mg/kg〜1.0mg/kgのMFPで処置した。注射後11日目に血液を集め、血清試料をIP-10についてアッセイした（詳細については下記「実験計画」を参照されたい）。結果は、IP-10レベルのMFP用量依存的な増加を示す（図36）。MFPの非存在下または0.0033mg/kgでは、バックグラウンドIP-10レベルを上回る増加はなかった。次いで、IP-10レベルは0.01mg/kg MFPから1.0mg/kgまで増加する。2サイクル目および3サイクル目のMFP誘導は39日目および67日目に同じ濃度で行った。67日目までに、IP-10のレベルが11日目のレベルから数分の1に低下していたので、プラスミドDNAを77日目に再注射した。さらにもう1サイクルのMFP処置を行い、88日目にマウスから採血した。結果は、11日目と同じレベルにまで回復したIP-10発現の誘導を示す。さらに2回のMFPサイクルを102日目および137日目に行い、MFP用量応答を引き続いて観察したところ、時間の経過と共にIP-10レベルが徐々に低下した。次に、3回目のプラスミドDNAを189日目に注射したところ、その後のMFPサイクルおよび200日目の採血が、再び強いMFP用量応答を示し、IP-10発現が11日目および88日目とほぼ同じレベルまで回復した。これは、ターゲット遺伝子発現と誘導因子用量との正の相関関係を証明すると共に、プラスミドベクターの反復投与による遺伝子発現の持続性および回復も証明している（下記実施例9Bを参照されたい）。
【０２９８】
ヒトでの安全性研究のために、活性化因子分子（AM）およびTM発現がAMの休薬後に「オフ」になりうる速度の完全な特徴づけを行うことができる。TMの定常状態レベルを達成するのに必要なAM投与の頻度を評価することができる。好ましい一実施形態では、MFPおよびIFN-β発現が誘導因子の休薬後に「オフ」になりうる速度の完全な特徴づけを、評価することができる。さらに、IFN-βの定常状態レベルを達成するのに必要なMFP投与の頻度を評価することができる。
【０２９９】
実験計画：以下のように、正常なC57Bl/6マウスに単一ベクターBRES-1マウスIFN発現プラスミドを注射およびエレクトロポレートし、さまざまな用量のMFPで処置し、mIFN発現をバイオマーカー応答によってアッセイした。
表12
【表１１】
2010523131.tif 000029
表13
【表１２】
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表14
【表１３】
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【０３００】
DNA溶液：各マウスにPBS 150μl中のプラスミドDNA 250μgを投与した。
【０３０１】
DNA送達：0日目に、マウス1匹につき、PBS 150μl中のプラスミドDNA 250μgを、成体雄C57Bl/6マウスに、両側的に注射した。DNA溶液を、各後脚の脛骨筋中に25μl、腓骨筋ン中に50μl注射し、次にキャリパーを使ってエレクトロポレーションを行った（200V/cm、1Hz、20ミリ秒/パルスで8パルス）。
【０３０２】
MFP処置：上記および下記の表に示すように、第1〜7群には、7日目〜10日目に、100μlのゴマ油のみ、またはさまざまな濃度のMFPを含むゴマ油を、i.p.注射によって投与した。
表15：サイクル1
【表１４】
2010523131.tif 000032
表16：サイクル2：サイクル1と同じMFP濃度
【表１５】
2010523131.tif 000033
表17：サイクル3：サイクル1および2と同じMFP濃度
【表１６】
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【０３０３】
77日目のDNAの再注射：各マウスにPBS 150μl中のプラスミドDNA 250μgを投与した。
表18
【表１７】
2010523131.tif 000035
表19：サイクル4：第2〜7群についてはサイクル1〜3と同じMFP濃度。対照群（1および8）は0.33m/kg MFPで処置。
【表１８】
2010523131.tif 000036
表20：サイクル5：第2〜7群についてはサイクル1〜5と同じMFP濃度。対照群（1および8）は0.33m/kg MFPで処置。
【表１９】
2010523131.tif 000037
表21：サイクル6：サイクル5の場合と同じMFP処置
【表２０】
2010523131.tif 000038
【０３０４】
189日目のDNAの再注射：各マウスにPBS 150μl中のプラスミドDNA 250μgを投与した。第9群は年齢を可能な限り厳密に対応させた新しい対照マウスである。第1群にもプラスミドを注射した。
表22
【表２１】
2010523131.tif 000039
表23：サイクル7：第3〜7群についてはサイクル4〜6と同じMFP濃度。対照群（1、2、8および9）は0.33m/kg MFPで処置した。
【表２２】
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表24：サイクル8：サイクル7と同じMFP濃度。第3〜7群を最終的に収集し、筋からRNAおよびDNAを調製した。
【表２３】
2010523131.tif 000041
【０３０５】
血液収集およびエンドポイント解析/アッセイ手順：マウスから尾ニックまたは心臓穿刺によって採血し、その血液をマイクロテイナチューブ（抗凝固剤なし）に集めた。次に、その血液から血清を分離し、集め、ELISAでIP-10についてアッセイした。
【０３０６】
ii．インビボでのBRES-1 AAVベクターからのhIFNの誘導および脱誘導動態の決定：誘導および脱誘導の動態を調べるために、hIFN-β BRES-1 AAVベクターAAV-1GT58を使って、ナイーブC57Bl/6マウスで研究を行った。AAV-1GT58をC57Bl/6マウスの後肢筋に注射し、その動物にMFPをi.p.注射により4日間連続して投与し、その期間中に、誘導動態を決定する目的で、最初のMFP注射後のさまざまな時点で、動物から採血した。次に、脱誘導動態を決定するために、最後のMFP注射後のさまざまな時点で、動物から採血した（詳細については下記の「実験計画」を参照されたい）。血清をELISAでhIFNについてアッセイした。結果は、誘導および脱誘導動態が迅速であり、hIFNのピークレベルには、最初のMFP処置後48〜72時間までに到達し（図37A）、MFP処置後96時間以内にバックグランドレベルまで減少した（図37B）ことを示している。これは、BRES-1系がインビボで迅速にオンおよびオフされうることを証明している。
【０３０７】
A．実験計画：BRES-1/hIFN発現カセットを保持するAAV1ベクターを、下記のように、正常成体C57Bl/6マウスに注射した。各群について、5匹の動物（n＝5）を、下記の表に表示した「収集時期」に屠殺した。MFPの非存在下、または単回/複数回MFP投与後に、血清でのヒトIFN発現をELISAによって決定した。
表25
【表２４】
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【０３０８】
ウイルス溶液および送達：第1群のマウスには75μlのPBSを投与し、第2〜6群のマウスには、マウス1匹につき5×1010ウイルス粒子（vp）を、体積75μlのPBSに入れて、一方の後脚（右脚）に投与した。25μlを脛骨筋中に注射し、50μlを腓腹筋中に注射した。
表26
【表２５】
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【０３０９】
MFP処置：第3〜6群には、次のスケジュールに従って、0.33mg/kg（新しく調製した100μlの0.083mg/mlゴマ油）のMFPを、i.p.注射によって投与した：第3群＝17日目、第4群＝16＋17日目、第5群＝15〜17日目、第6群＝18〜21日目。
【０３１０】
血液収集およびエンドポイント解析/アッセイ手順：表27に示す時点で心臓穿刺（最終採血）によってマウスから採血した。血液をマイクロテイナチューブ（抗凝固剤なし）に集め、血清を血液から分離し、集めて、ELISAにより、hIFNについてアッセイした。
【０３１１】
B．発現の持続性および反復投与研究：これまでに生成したデータは、CMVプロモーターに基づくコンストラクトを使った発現が、構成的IFN-βに関して、プラスミドDNAを使った場合で少なくとも49日、AAV-1ベクターを使った場合で6ヶ月持続することを示している。ここでの計画は、BRES-1系を持つ候補ベクターを使ってこれらの研究を繰り返し、拡張することにより、少なくとも3ヶ月にわたる、持続的かつ制御可能なIFN-βの発現を証明しようというものである。これらの研究はナイーブC57/Bl6マウスで行うことができる。
【０３１２】
本発明のBRES-1ベクターは、C57Bl/6マウス（または他の適切な動物）において、ELISAまたは投与に応答する反復バイオマーカーエンドポイントに関して、活性化因子分子（AM）の投与を使って試験することができる。BRES-1ベクター、発現された治療分子（例えば導入遺伝子）、制御因子分子（RM）または治療タンパク質に対する中和抗体の存在を監視することができる。例えば、活性化因子分子（AM）は、治療分子（TM）の発現レベルを経時的に維持する能力と、AM投与によってオン/オフ的に回復可能な発現レベルをもたらす能力とを評価するために、慢性的にもパルス的にも投与することができる。
【０３１３】
好ましい一実施形態では、本発明のIFN-β BRES-1ベクターを、C57Bl/6マウス（または他の適切な動物）において、MFP投与またはIFN-βの投与に応答する反復バイオマーカーについて試験することができる。ベクター、IFN分子（IFNM）（例えばIFN-β導入遺伝子）、制御因子分子（RM）、またはIFN-βタンパク質に対する中和抗体の存在を監視することができる。MFPは、IFN-β発現レベルを経時的に維持する能力と、MFP投与によってオン/オフ的に回復可能な発現レベルをもたらす能力とを評価するために、慢性的にもパルス的にも投与することができる。
【０３１４】
i．BRES-1プラスミドからのmIFN誘導および脱誘導の動態、パルス的および慢性的MFP処置：mIFN-β BRES-1プラスミドベクターによる誘導および脱誘導の動態を調べ、MFPのパルス投与または慢性投与に応答するmIFN遺伝子発現を比較し、数ヶ月にわたって遺伝子発現の持続性を調べるために、pGT26を使ってナイーブC57Bl/6マウスで研究を行った。構成的（pGER101、CMV）または誘導性（pGT26、BRES-1）mIFN発現プラスミドを各群20匹のマウスの後肢筋中に注射してエレクトロポレーションを行い、各群の5匹からMFPの非存在下で7日目に採血した。pGT26を投与した20匹のマウス全てを、プラスミド注射後7〜10日目にMFPで処置した。脱誘導の動態を調べるために、注射後11日目、12日目、14日目、16日目および18日目のそれぞれに、各群のマウス5匹から血液を集めた。次に、21〜24日目に20匹のpGT26マウス全てにMFPを投与し、誘導の動態を調べるために、22日目、23日目、および25日目のそれぞれに、各群のマウス5匹から血液を集めた（詳細については下記「実験計画」を参照されたい）。MFPによる連続処置に応答して起こるターゲット遺伝子発現を調べるために、pGT26を投与されたマウスに、35日目から50日目まで毎日、MFPをi.p.注射し、この期間中の35日目（MFP処置前）、39日目、42日目、45日目、および51日目に、各群のマウス5匹から採血した。3.5ヶ月後の遺伝子発現を調べるために、105日目にマウスから採血し、次に105〜108日目にMFPで処置し、109日目および116日目に採血した。血清試料を、mIFN発現に関するバイオマーカーとしてのIP-10についてアッセイした。
【０３１５】
結果（図37C）は、MFP処置時にBRES-1プラスミドからのIFN発現の誘導は24時間以内に起こり、ピーク誘導後の24〜48時間で、発現はベースラインまで減少することを示している。BRES-1系からのmIFNの発現は、CMVプロモーターによって駆動される発現よりも高かった。2〜3ヶ月にわたる3サイクルのmIFN発現は全て高レベルだった。連続MFP処置は、2週間を越えるmIFNの持続的な高レベル発現をもたらした。3.5ヶ月後のIP-10レベルは先のMFPサイクルより約2分の1〜3分の2は低かったが、依然としてバックグラウンドIP-10レベルは十分に上回っており、同様に時間の経過と共にほぼ同じ動態（3.5ヶ月後に3分の2の発現喪失）で減少したCMVプロモーターからのmIFNの発現によって生成するものよりは、かなり高かった。全体としてこの実験は、数ヶ月を越える連続的な高レベルターゲット遺伝子発現に対応するBRES-1系の能力と、複数回にわたって迅速にオフにされ、再びオンにされる能力とを証明している。
【０３１６】
実験計画：正常C57Bl/6マウスに、下記のように、BRES-1およびCMVプロモーターマウスIFN発現プラスミドを注射し、エレクトロポレートした。mIFN活性のエンドポイントバイオマーカーとしてIP-10を使用することにより、IFN発現を少なくとも数ヶ月にわたって監視した。「オン」および「オフ」応答の動態を決定するために、MFP処置および採血を計画した。
【０３１７】
DNA溶液：全ての注射群の各マウスに、PBS 150μl中のプラスミドDNA 250μlを投与した。
表27
【表２６】
2010523131.tif 000044
【０３１８】
DNA送達：0日目に、マウス1匹につきPBS 150μl中のプラスミドDNA 250μgを、成体C57Bl/6マウスに、両側的に注射した。DNA溶液を、各後脚の脛骨筋中に25μl、腓腹筋中に50μl注射し、次にキャリパーを使ってエレクトロポレーションを行った（200V/cm、1Hz、20ミリ秒/パルスで8パルス）。
【０３１９】
MFP処置：下記の表に示すように、0.33mg/kg（新しく調製した100μlの0.083mg/mlゴマ油）のMFPを、第2群に、i.p.注射によって投与した。
【０３２０】
スケジュール：サイクル1（7〜18日目）：「オフ」動態を決定する。サイクル2（21〜25日目）：「オン」動態を決定する。
表28：サイクル1
【表２７】
2010523131.tif 000045
表29：サイクル2
【表２８】
2010523131.tif 000046
表30：サイクル3：連続MFP処置
【表２９】
2010523131.tif 000047
【０３２１】
血液収集およびエンドポイント解析/アッセイ手順：上記の表に示した時点で、尾ニックまたは心臓穿刺（最終採血）によって、マウスから採血した。血液をマイクロテイナチューブ（抗凝固剤なし）に集め、血清を分離して集めるために遠心分離した。第1群および第2群からの血清をELISAでIP-10についてアッセイした。
【０３２２】
C．生物学的同等性研究：例えば上述の研究で確立された送達条件下で、候補ベクターおよびBRES-1発現系を使って、正常マウスと他の一種、好ましくは非ヒト霊長類において、薬物動態研究を行うことができる。「生物学的同等性」は、例えば本発明の本制御発現系が、例えば以下の表に定義するように（ただしこれらに限るわけではない）、どちらの動物モデルにおいても、IFN-βの遺伝子ベースの送達に関して、IFN-βタンパク質送達よりも優れた薬物動態プロファイルを与えることを証明することなどでありうるが、これに限るわけではない。
表31：生物学的同等性基準の限定でない例
【表３０】
2010523131.tif 000048
【０３２３】
D．安全性/毒性研究：AAV-1を候補ベクターとして選択する場合は、その候補ベクターのi.m.投与後の体内分布研究を行うことができる。エンドポイントには、ターゲット組織（筋）、血液、リンパ、心臓、肝臓、腎臓、肺、男性および女性生殖腺（精巣、卵巣）へのベクターDNAならびに発現されたIFN-β RNAおよびタンパク質の分布が含まれるだろう。
【０３２４】
E．疾患または状態を処置するための遺伝子ベースの送達：これらの研究の成果は、疾患または状態の処置を目的として、治療分子（TM）（例えば治療タンパク質をコードする導入遺伝子）を送達するための、遺伝子ベースの送達系である。好ましい一実施形態において本発明は、MSを処置するためにIFN-βの長期制御発現をもたらすことになる、IFN-β導入遺伝子を送達するための制御発現系を提供する。好ましい一実施形態において、これらの研究の成果は、本発明のBRES-1ベクターが、小分子誘導因子MFPの経口投与により、（例えば3ヶ月を越える）持続的で回復可能な発現を提供しうること、および筋肉内注射による反復投与が可能なことである。
【０３２５】
i．EAE疾患マウスにおけるBRES-1 mIFNプラスミド活性の特徴づけ：MSの動物疾患モデルにおける生物学的作用を示すために、能動的EAEを持つSJLマウスで研究を行った。構成的（pGER101、pmIFN）または誘導性（pGT26、pBRES-1/mIFN）mIFN発現プラスミドおよびヌルプラスミド対照を、SJLマウスの後肢筋中に注射し、エレクトロポレーションを行った。pmIFN注射の前日および翌日、ならびにpBRES-1/mIFN注射の7日後および9日後に、PLP139-151/百日咳毒素の注射によって、マウスにEAEを誘発した。プラスミド注射後、1日1回（d）または3日に1回（etd）のi.p.注射により、マウスをMFP（0.33mg/kg）で処置した。血液を注射後5日目に集めた。PBMCを血液から単離し、そこからRNAを調製し、RT-PCRでアッセイすることにより、Mx1 RNAのレベルを決定した（詳細については下記「実験計画」を参照されたい）。結果は、pBRES-1/mIFN＋毎日のMFP注射によってMx1 RNAレベルが約8倍増加することと、MFPの非存在下ではヌルベクターを上回る有意な増加がないことを示す（図38）。これは、このモデルで有効であることが示されているものと類似する、動物疾患モデルにおける生物学的応答を表す。
【０３２６】
実験計画：雌SJLマウス（8週齢、Jackson Labs、約20g）を12群（1群につきn＝13）に分配し、以下のとおり、確立されたA-EAEプロトコールに従って、1日目および3日目に、各群にPLP139-151/百日咳毒素を注射した。
第1群、無処置。無処置対照。
第2〜3群、CMVプラスミド＋エレクトロポレーション（EP）：2日目に、脛骨筋（20μl）および腓腹筋（40μl）へ、ヌル（pgWiz）またはmIFN（pGER101）CMVプラスミドDNAの2回両側筋肉内（m）注射を施し、その直後にEPを行った。
第4〜9群、BRES1プラスミド＋EP：疾患開始の1週間前（-7日目）に、脛骨筋（20μl）および腓腹筋（40μl）へ、BRES-1ヌル（pGT4）またはBRES-1 mIFN（pGT26）プラスミドDNAの2回両側筋肉内（im）注射を施し、続いてEPを行った。MFP（0.33mg/kg）を1日目から開始して毎日または3日に1回（etd）、ip注射によって投与した。MFP投与「etd」を受ける動物には、1日目、4日目、7日目、10日目、13日目、16日目、19日目、および22日目に投与した。
第10〜11群、緩衝液対照、mIFNタンパク質：IFNタンパク質緩衝液またはmIFNタンパク質（100,000単位＝500ng）を1日目から始めて1日おきにsc注射によって投与した。
第12群、プレドニゾロン：1日目からプレドニゾロン（毎日、1日2回）を腹腔内（ip）注射によって投与した。
表32
【表３１】
2010523131.tif 000049
表33
【表３２】
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【０３２７】
第11群 mIFNタンパク質：100,000単位（500ng）/100μl inj.×13匹×15回注射＝1.95×107単位（97.5μg）/19.5ml。mIFN原液＝100μg/mLまたは2×107単位/mL。希釈液チューブは100μL×15匹＝1.5mLを含有した（150mM NaCl、50mM酢酸ナトリウム、pH5、5％プロピレングリコールを含有する合計15本の希釈液チューブを作製した）。各チューブに75μLの原液を加えた。最終濃度＝106単位/mL。
【０３２８】
エンドポイント解析（Mx1 RNA解析）：第1〜9群の3匹を5日目に屠殺し、Mx1 RNA解析用に、最終採血し（EDTAを含有する紫色チューブを使用）、注射を受けた筋をIFN RNA解析用に収集した。
【０３２９】
F．製造：BRES-1 hIFN-β発現カセットを含む本発明の遺伝子治療ベクターの製造法はcGMP製造に適している。本明細書に記載する方法または当技術分野で知られる方法を使って、前臨床開発研究を行うのに十分な純度、力価および安定性を持つ本発明のBRES-1ベクターを作製することができる。本発明の遺伝子治療ベクター、そして好ましくは本発明のBRES-1ベクターは、プラスミドバックボーン、キャプシド（送達ベクターとしてのAAVの場合）、導入遺伝子発現産物（IFN-β）、および誘導因子（MFP）に関して、本明細書に記載の方法または当技術分野で知られる方法を使って、完全に特徴づけることができる。
【０３３０】
G．薬理学：タンパク質送達との生物学的同等性は動物モデルで証明することができる。ベクターおよび誘導因子または活性化因子分子（AM）（例えば小分子誘導因子MFP）に関する用量/応答を、インビボで特徴づけ、最適化することができる。反復投与および導入遺伝子発現の持続性を詳しく特徴づけることができる。候補ベクターを使って免疫原性研究を行うことができる。
【０３３１】
H．薬物動態/安全性/毒性：発現されたIFN-β導入遺伝子の薬物動態研究は、発現された導入遺伝子の直接検出およびIFN-βバイオマーカーの測定を使って行うことができる。選択された候補ベクターがAAV-1である場合は、ベクターDNAおよびその発現産物の運命を調べるために、体内分布研究を行うことができる。
【実施例１０】
【０３３２】
制御発現系のための新しい活性化因子分子（AM）の同定
A．AM-RM LBD複合体の開発
化合物スクリーニングデータをタンパク質工学と組み合わせて、ユニークなAM-RM LBD複合体を開発することにより、本発明の制御発現系のための新しい機能選択的PRリガンド類似体を同定した。pBRESベースのルシフェラーゼスクリーニングアッセイを使って、独自の抗プロゲスチン様ステロイド化合物（その多くがMFPと有意な構造上の類似性を共有する）を同定し、試験した。この指向的スクリーニングから導き出された構造活性相関（SAR）データを使って、おそらくはRM LBD内での化合物とリガンド結合ポケット（LBP）を裏打するアミノ酸との間の立体衝突または電子衝突ゆえにpBRES発現系を活性化しない化合物を同定した。こうして同定された化合物をさらに、T47D細胞ベースの二次アッセイでスクリーニングして、そのpBRES不活性化合物が抗PR活性も欠くことを確認した。これらの不活性候補化合物から出発して、モデリングに基づくLBDエンジニアリングアプローチを使ってpBRES活性化を再樹立することにより、機能選択的な、すなわち他の生理学的ターゲットに関してオルソゴナルな、AM-RM複合体を開発した。
【０３３３】
MFP様化合物とhPR由来LBDの間の相互作用に関する構造データは利用できなかったので、指向的スクリーニングで試験されるRM LBDと化合物の間の相互作用の分子的根拠をよりよく理解するために、MFPとの複合体を形成したGRのX線結晶構造に基づいて、MFP-RM LBD複合体に関するホモロジーモデルを開発した（Kauppi B.ら (2003) J. Biol. Chem. 278:22748-22754）。指向的スクリーニングで同定された不活性化合物を、RM LBDのモデルにドッキングさせ、各化合物とLBP残基との間の衝突を同定した。それらの衝突を軽減させることを目的とする一連の突然変異をモデル化し、RM LBPに組み込んだ。
【０３３４】
改変pBRES発現系を活性化する候補化合物の能力を、pBRESベースのルシフェラーゼアッセイで測定した。先に不活性だった化合物と改変されたRM LBDの間の相互作用を改善する突然変異をモデル中にドッキングさせ、それを使って、リガンド結合ポケットを新しいAMにより良くフィットさせるように設計されたさらなる突然変異を提案した。突然変異誘発と細胞ベースのアッセイにおける試験というサイクルを2回繰り返すことにより、新しいAM BLX-913に対する応答において、元のRMよりも39倍活性な、突然変異体RM LBDを同定した。これらの研究はpBRES発現系の臨床応用可能性を証明している。
【０３３５】
B．PRリガンド類似体の試験
抗プロゲスチン様構造特徴を持つ115個のステロイド化合物が同定された。特に、プロゲステロン（例えば図43Dを参照されたい）および抗プロゲスチン様構造（例えば図43A〜Cを参照されたい）との構造的類似性を示し、11β位に嵩高い置換基を含有する化合物を、pBRESコンストラクトを安定に発現させているヒトMCF10A細胞株中でpBRESを活性化するその能力について、TMの代わりにホタルルシフェラーゼ（Luc）レポーター遺伝子を使って試験した。Luc発現を刺激する試験化合物の能力を25nMのMFPと比較した。ルシフェラーゼ発現を活性化することができない化合物を調べ、それらを次の三つの化合物クラスに大別した：1）効果的なRM活性化に要求される抗プロゲスチン構造の要件を満たさないもの；2）この研究の範囲を超える大規模な結合ポケット突然変異誘発を要求するであろう激しい構造変化を特徴とするもの；3）保存的構造変化を特徴とし、より強力な化合物に対して著しい構造的類似性を保っている（すなわち構造類似体である）もの。一過性にトランスフェクトされたNIH 3T3細胞でのpBRES-Lucアッセイで、8個のクラス3化合物を再試験した（図41）。さらにこれらの化合物を、ヒトT47D細胞ベースのアッセイで、抗PR活性について試験した（図42）。両方のアッセイで最低レベルの活性を示す化合物が、BLX-913であると同定された（図43A）。
【０３３６】
実験計画：安定MCF10A細胞株の構築
ヒト乳腺上皮細胞株MCF10A（ATCC番号CRL-10317）を10cmディッシュで培養した。細胞に、Fugene 6トランスフェクション試薬（Roche）を使って、pGT137プラスミド（pBRES-Luc、ピューロマイシン選択）をトランスフェクトした。簡単に述べると、6μgのDNAおよび36μLのFugene 6を、750μLの無血清Opti-MEMに希釈した。DNAおよびFugene 6を混合し、室温で15分間インキュベートした。細胞を2日間培養してから、1μg/mLピューロマイシンで3週間スクリーニングした。陽性クローンを選択し、pBRES-Luc発現および活性化について、ルシフェラーゼアッセイで検証した。
【０３３７】
ルシフェラーゼ活性測定によるpBRES活性化の決定
全ての細胞を穏やかなトリプシン処理で収集してから、PBSで洗浄した。次に、細胞を800rpmで5分間遠心分離し、細胞ペレットを10mlの組織培養培地に再懸濁した。次に細胞を、滅菌条件下で、96ウェル平底黒色培養プレートに、1×104細胞/ウェル（体積は100μl/ウェル）の細胞密度で播種した。次に細胞を5％CO2下37℃で24時間インキュベートした。その後、滅菌条件下に、培地を注意深い吸引によって除去し、ウェルを95μlの新鮮培地で置き換えてから、5μl/ウェルの適当に希釈された化合物または対照緩衝液を加えることにより、0.00064〜50nM（最終的に0.05％DMSO中）の範囲の最終化合物濃度を得た。次に細胞培養プレートを覆い、37℃の培養器で24時間インキュベートした。その後、培地をプレートから穏やかな吸引によって除去し、プレートの液体を紙に吸い取り、ルシフェラーゼアッセイシステムキット（Promega, Inc.）のルシフェラーゼアッセイ基質試薬50μl/ウェルで細胞を溶解させた。次に、ルシフェラーゼ基質試薬の添加後にプレートを穏やかに1分間振とうしてから、Microbetaルミネセンス・プレート・リーダー（PerkinElmer）を使用し、標準化ルシフェラーゼ読み取りプロトコールを使って、さまざまな時点でルシフェラーゼ酵素活性を測定した（5分、30分、60分）。
【０３３８】
C．BLX-913
化合物BLX-913は、先進的臨床開発候補アソプリスニル（図43B）に対して著しい類似性を示した。比較のために最も強力なpBRES AMであるMFPも示されている（図43C）。MFPおよびBLX-913の抗プロゲスチン活性を図44に示すが、これは、BLX-913がMFPの30分の1という弱い抗プロゲスチンであることを明らかにしている。BLX-913とアソプリスニルの間の実質的類似性により、アソプリスニルに関して既にその臨床開発中に蓄積されている広範囲にわたる安全性、投薬およびPK/PDデータが、BLX-913化合物の性質に直接対応するであろうことが示唆された。先進的臨床段階にある密接な類似体の存在が、潜在的な新しいpBRES AMとしてのBLX-913化合物の価値を増大させた。
【０３３９】
D．ホモロジーモデルの構築
化合物がpBRES発現系を刺激できない原因になっている、RMのLBP内でのBLX-913化合物とアミノ酸の部分間の衝突を同定するために、BLX-913を伴うRM LBDのホモロジーモデルを構築した。何らかのステロイド抗プロゲスチンを伴うRMまたはその親hPR LBDの構造は利用できなかったので、MFPに結合したGR LBDのX線結晶構造に基づいて、MFPに結合したRM LBDのモデルを、まず最初に構築した（図45）。RM LBDとGR LBDとはアミノ酸配列に44％の一致度および68％の類似度を持つので、得られたモデルはLBD側鎖上に低レベルのコンフォメーション歪みを示し、RMモデルと親GR構造の間の保存されたLBDアミノ酸の二乗平均平方根偏差（RMSD）は0.1オングストローム未満だった。RM LBDモデルの結合ポケットにおいて、MFPリガンドをBLX-913化合物で置き換えた。755位（hPRナンバリング）のトリプトファンはBLX-913の11β-ベンズアルドキシム部分と衝突することがわかり（図46）、この衝突を軽減するための突然変異誘発を開始した。
【０３４０】
E．部位特異的突然変異がルシフェラーゼ活性測定に及ぼす影響の評価
755位に一群の突然変異を組み込み、その結果生じたpBRESコンストラクトを、一過性にトランスフェクトされたHEK293細胞におけるルシフェラーゼアッセイで評価した。W755A突然変異を内包するRMタンパク質は、BLX-913に対する応答において、元のRMタンパク質と比較して約4倍改善された活性化を示した（図47）。W755A RM LBPとBLX-913の間の改良された界面をホモロジーモデル内で構築し、突然変異の追加によって相互作用をさらに改善するための手掛かりについて詳しく調べた。改変RM-BLX-913複合体の活性をさらに改善するために、第2ラウンドの突然変異を組み込んで、LBPの形が新しいAMにより良く合致するようにした。V729L/W755A二重突然変異を含有するRMコンストラクトpGT1017は、BLX-913の存在下で、元のRMタンパク質と比較して39倍改善された活性を示した（図48）。BLX-913の用量を増やした時のV729L/W755A RM突然変異体の応答を、第1ラウンドのW755A RM突然変異体pGT1009およびwt-pBRES pGT79コンストラクトと比較したところ、V729L/W755A二重突然変異体は、元のpBRESコンストラクトおよび最良の第1ラウンド突然変異体に対する改良を相当することが確認された（図49）。突然変異体RMタンパク質に見られる改善された活性がタンパク質レベルの増加によるものではないことを検証するために、一過性トランスフェクション（wt-pBRES pGT79、W755A RM pGT1009またはV729L/W755 RM pGT1017）によって得たHEK293細胞溶解物をSDS-PAGE上で分割し、p65 ADに対する抗体（Santa Cruz、sc-372）を使ってウェスタンブロット上で可視化した（図50）。LBD突然変異は細胞内でRMタンパク質レベルに影響しなかったので、BLX-913に応答して起こる活性化の改善は、リガンドとLBDの間の相互作用が改善されたことによるものである可能性が最も高かった。
【０３４１】
実験計画：HEK293細胞における一次pBRES-ルシフェラーゼアッセイ
ヒト胎児腎臓293（HEK293）細胞（ATCC番号CRL-1573）において試験化合物がpBRES活性に及ぼす影響を決定するために、4mM L-グルタミンおよび10％熱非働化FBSを含むMEMアルファ5mL中、5×105細胞/ディッシュの密度で、細胞を60mmディッシュにプレーティングした。24時間後に、Lipofectamine 2000（Invitrogen）を1：2.5というDNA（μg）：Lipofectamine 2000（μL）試薬の比率で使って、pBRESコンストラクトを細胞にトランスフェクトした。脂質複合体を含有する培地を4時間後に除去し、細胞を新鮮増殖培地中で24時間回復させた。細胞を、増殖培地中、10,000細胞/ウェルの密度で、96ウェルプレートに再播種した。翌日、同じ培地を使って細胞をMFPまたは試験化合物で処置した。化合物を100％エタノール賦形剤に溶解し、処置培地を使用することによって希釈した。処置培地中のエタノールの最終濃度は0.1％だった。各処置は三つの複製物からなった。処置の24時間後に、ルシフェラーゼ活性を以下のように測定した：培地を除去し、細胞をダルベッコPBSで1回洗浄した。細胞を20μL/ウェルの1×Passive Lysis Buffer（PLB、Promega）で溶解し、タイタープレート振とう機で振とうしながら室温で10分間インキュベートした。プレートを-80℃で20分間凍結し、タイタープレート振とう機で振とうしながら室温で20分間融解した。Berthold MicroLumat Plusルミノメーターを使用し、Promegaルシフェラーゼアッセイシステム（カタログ番号E1501）基質（100μL/ウェル）を使って、ルシフェラーゼ活性を測定した。
【０３４２】
T47D細胞における二次PRアッセイ
ヒト乳癌T47D細胞（ATCC番号HTB-133）においてヒトプロゲステロン受容体が誘導するアルカリホスファターゼ活性に試験化合物が及ぼす影響を決定するために、増殖培地（1mMピルビン酸ナトリウム、0.2単位/mLインスリン、4mM L-グルタミンおよび10％FBSを含むRPMI1640）中、20,000細胞/ウェルの密度で、細胞を96ウェルプレートにプレーティングした。終夜培養後、培地をアッセイ培地（1mMピルビン酸ナトリウム、0.2単位/mLインスリン、4mM L-グルタミンおよび3％活性炭処理FBSを含むRPMI1640（フェノールレッドフリー）に代えた。翌日、細胞を200pMプロメゲストンの存在下にMFPまたは試験化合物で処理した。化合物は100％エタノール賦形剤に溶解し、アッセイ培地を使って希釈した。アッセイ培地中のエタノールの最終濃度は0.2％だった。各処置は5〜6個の複製物からなった。処置の24時間後に、細胞のアルカリホスファターゼ活性を次のように測定した：培地を除去し、細胞をDPBSで2回洗浄した。残留DPBSを除去した後、50μLの細胞溶解緩衝液（100mMトリス-HCl pH9.8、0.2％トリトンX-100）を各ウェルに加え、プレートを-80℃で30分間凍結した。そのプレートを、タイタープレート振とう機で振とうしながら、室温で20分間融解した。150μLの基質緩衝液（100mMトリス-HCl pH9.8、4mMp-ニトロフェニルホスフェート）を各ウェルに加えた。405nmの試験波長で吸光度測定を5分間隔で1時間行った。
【０３４３】
RM LBDのホモロジーモデル
GR LBD/MFP複合体に基づくRM LBDのホモロジーモデルを、DeepView Swiss PDB Viewerバージョン3.70のSwissModel機能を使って作成した（Guex, N.およびPeitsch, M.C. (1997) Electrophoresis 18:2714-2723. http://expasy.org/spdbv/）。簡単に述べると、ヒトプロゲステロン受容体（アクセッションNP_000917）の残基640〜914に対応する一次アミノ酸配列をヒトグルココルチコイド受容体のX線結晶構造1NHZ.pdb上にフィットさせ、最小化のためにSwiss-Protサーバーに提出した。その結果生じたモデルの、GR/MFP結晶構造へのフィットを、Insight2ソフトウェア（Accelrys Software Inc.）を使って調べた。
【０３４４】
RM-LBD-化合物相互作用のモデリング
Discovery Studio Viewer Proバージョン6.0（Accelrys Software Inc.）を使って、RMリガンド結合ポケットに結合したMFP、BLX-913および他の試験化合物のモデルを作成し、rlig_viewスクリプト（Berlex社生物物理部門のMarc Adler博士、未公表）により、活性部位残基を同定した。
【０３４５】
部位特異的突然変異誘発
Quick Change突然変異誘発法を使用し、下記のプライマー（新たに組み込まれるコドンに下線を付す）を使って、RM LBD内の部位特異的突然変異を組み込んだ。アミノ酸ナンバリングスキームはhPRアミノ酸ナンバリングに従う。719位および755位の単一突然変異はpGT79テンプレートを使って組み込んだ。729位および726位の二重突然変異はpGT1009（W755A）テンプレートを使って組み込んだ。
N719Q（pGT1003）（配列番号60）5'-CTT TGC TGA CAA GTC TTC AGC AAC TAG GCG AGA GG-3'および5'-CCT CTC GCC TAG TTG CTG AAG ACT TGT CAG CAA AG-3'；
N719A（pGT1004）（配列番号62）5'-CTT TGC TGA CAA GTC TTG CCC AAC TAG GCG AGA GG-3'および5'-CCT CTC GCC TAG TTG GGC AAG ACT TGT CAG CAA AG-3'；
N719G（pGT1005)（配列番号64）5'-CTT TGC TGA CAA GTC TTG GCC AAC TAG GCG AGA GG-3'および5'-CCT CTC GCC TAG TTG GCC AAG ACT TGT CAG CAA AG-3'；
W755F（pGT1006)（配列番号66）5'-CTC TCA TTC AGT ATT CTT TCA TGA GCT TAA TGG TG-3'および5'-CAC CAT TAA GCT CAT GAA AGA ATA CTG AAT GAG AG-3'；
W755L（pGT1007)（配列番号68）5'-CTC TCA TTC AGT ATT CTC TGA TGA GCT TAA TGG TG-3'および5'-CAC CAT TAA GCT CAT CAG AGA ATA CTG AAT GAG AG-3'；
W755V（pGT-1008)（配列番号70）5'-CTC TCA TTC AGT ATT CTG TGA TGA GCT TAA TGG TG-3'および5'-CAC CAT TAA GCT CAT CAC AGA ATA CTG AAT GAG AG-3'；
W755A（pGT1009)（配列番号72）5'-CTC TCA TTC AGT ATT CTG CCA TGA GCT TAA TGG TG-3'および5'-CAC CAT TAA GCT CAT GGC AGA ATA CTG AAT GAG AG-3'；
V729A/W755A（pGT1015)（配列番号74）5'-GAG GCA ACT TCT TTC AGC CGT CAA GTG GTC TAA ATC-3'および5'-GAT TTA GAC CAC TTG ACG GCT GAA AGA AGT TGC CTC-3'；
V729G/W755A（pGT1016)（配列番号76）5'-GAG GCA ACT TCT TTC AGG CGT CAA GTG GTC TAA ATC-3'および5'-GAT TTA GAC CAC TTG ACG CCT GAA AGA AGT TGC CTC-3'；
V729L/W755A（pGT1017)（配列番号78）5'-GAG GCA ACT TCT TTC ACT GGT CAA GTG GTC TAA ATC-3'および5'-GAT TTA GAC CAC TTG ACC AGT GAA AGA AGT TGC CTC-3'；
V729F/W755A（pGT1025)（配列番号80）5'-GAG GCA ACT TCT TTC ATT CGT CAA GTG GTC TAA ATC-3'および5'-GAT TTA GAC CAC TTG ACG AAT GAA AGA AGT TGC CTC-3'；
L726V/W755A（pGT1020)（配列番号82）5'-GGC GAG AGG CAA GTG CTT TCA GTA GTC AAG-3'および5'-CTT GAC TAC TGA AAG CAC TTG CCT CTC GCC-3'；
L726A/W755A（pGT1021)（配列番号84）5'-GGC GAG AGG CAA GCC CTT TCA GTA GTC AAG-3'および5'-CTT GAC TAC TGA AAG GGC TTG CCT CTC GCC-3'；
L726G/W755A（pGT1022）（配列番号86）5'-GGC GAG AGG CAA GGG CTT TCA GTA GTC AAG-3'および5'-CTT GAC TAC TGA AAG CCC TTG CCT CTC GCC-3'；
L726I/W755A（pGT1023）（配列番号88）5'-GGC GAG AGG CAA ATC CTT TCA GTA GTC AAG-3'および5'-CTT GAC TAC TGA AAG GAT TTG CCT CTC GCC-3'；
L726F/W755A（pGT1024）（配列番号90）5'-GGC GAG AGG CAA TTC CTT TCA GTA GTC AAG-3'および5'-CTT GAC TAC TGA AAG GAA TTG CCT CTC GCC-3'；
【実施例１１】
【０３４６】
第3ラウンド突然変異
突然変異誘発および細胞ベースのアッセイにおけるその後の評価の各ラウンドは、我々がRMリガンドと結合ポケットを裏打するアミノ酸の間のSARを理解するのに貢献する。第1ラウンドのW755Aおよび第2ラウンドのV729L/W755A突然変異体で得られた結果を考慮して、RM LBPをさらに調節するために設計された第3ラウンドの突然変異が、組み込まれた：V729F/W755A、L726V/W755A、L726A/W755A、L726G/W755A、L726I/W755AおよびL726F/W755A。個々の突然変異からの寄与は評価中であり、適宜組み合わせて単一のコンストラクトとすることにより、最良のBLX-913-改変RMリガンド受容体ペアが得られる。嵩高い化合物に対応するために結合ポケットの一部分を単に拡大するだけでは、強力な新しいAM-RM複合体を得るには十分でないので、占有されていない空間を最小化し、それによって外来の水を排除するように、ポケットをリガンドに合わせて注意深く形成させることが要求される。
【０３４７】
ユニークなAM-RM複合体のさらなる改良は、BLX-913の類似体を生成させるための化学ベースの多様化アプローチと組み合わせて達成しうる。より強力なAM-RMリガンド受容体ペアは、より嵩高い（すなわちより選択的な）11位でのBLX-913の誘導体を使って開発しうる。RM結合リガンドの11位にあるアルドキシム部分について、その配向および要求される補償的突然変異が同定され、検証されているので、より本質的な破壊基を組み込んで、親PRに対する絶対的選択性を確保することができる。AM上のより大きな置換基に、モデリングに基づく突然変異誘発アプローチで対応することにより、不必要な生理学的作用を持たない高度に選択的なAMを得ることができる。さらにまた、化学合成-突然変異誘発アプローチの併用により、自然に存在するまたは合成的に導入された水素結合ネットワークを利用する類似体を作製することもできる。11位に加えて、リガンド-RM界面の他の領域にも、化学修飾および対応する突然変異誘発を適用しうる。15位および16位に修飾を持つ既存のMFP類似体（図13）が同定され、抗プロゲスチン活性についてスクリーニングされている（図14）。これらの化合物の一つBLX-899は、T47D細胞ベースのアッセイでMFPの約5分の1という抗PR活性を持つ。この化合物はpBRES-Lucアッセイでも試験され、MFPと比較して、2分の1の誘導を示した。この化合物をRM LBDホモロジーモデルに当てはめたところ、16位のメチル基と結合ポケット残基の間の衝突が同定された。アミノ酸Leu887およびLeu797の側鎖は、リガンドの15位および16位が結合する領域におけるRM LBPのトポロジーを規定する。BLX-899上の構造的隆起に対応してpBRES活性化を修復させるために、これらのロイシン残基をバリン、アラニンまたはグリシンに縮小することができる。BLX-899に応答して起こる、887位および/または797位突然変異体を含有するpBRESコンストラクトの刺激の改善は、機能選択的制御発現系として使用するには、それだけではあまり十分でないが、15位メチル基と11β-ベンズアルドキシム部分の両方を単一の分子に組み込む化学合成アプローチを促すことになるだろう。二つの選択性特徴を持つ新しいリガンドに対応するために、W755AおよびV729L突然変異を、887位および/または797位突然変異と一緒に、単一のpBRESコンストラクトに組み込んでもよい。
【０３４８】
15位および16位類似体と同様のアプローチで、4位および7位に修飾を持つ化合物（図15）をT47D細胞ベースのアッセイで抗プロゲスチン活性について試験した（図16）。化合物BLX-952およびBLX-610は、MFPまたは今までに試験した他のどの化合物よりはるかに弱い抗プロゲスチンだった。すなわち、100nM濃度でさえ、これら二つの化合物は、このアッセイで、プロゲステロン受容体を完全には阻害することができない。この弱い抗プロゲスチン活性を弱いpBRES活性化とうまく相関させることができれば、結合部位内での衝突を同定して、除去することができる。7位のヒドロキシル部分およびエステル部分は、RMホモロジーモデルのLBD内でMet756と衝突するようである。リガンド上の隆起に対応するために、このメチオニンをアラニンに縮小して単純なホールを導入するか、アスパラギン酸またはグルタミン酸を使って、より発達した水素結合ネットワークの組み込みを企てることができる。結合ポケットを取り囲む個々の位置について発見される有益な化合物-突然変異体RM相互作用はいずれも、リガンドの化学合成および結合ポケットの部位特異的突然変異誘発により、単一の系に組み合わせることができる。数個の個別の特異性強化エレメントを組み合わせて単一のRM-AM複合体にすることにより、PRおよび他の内在性タンパク質に対する選択性が指数的に改善されうる。
【０３４９】
39倍選択的な本AM-RM複合体は動物モデル研究で試験される予定である。pBRES発現系の最適化中に行われた先の動物モデル研究は、ロバストな試験プロトコールならびに好結果の新しいAM-RM制御遺伝子発現系によって達成されるべき基準を与える。既存の動物モデルには、C57BL/6マウスにおける分泌型アルカリホスファターゼ（SEAP）またはルシフェラーゼレポーター遺伝子のライブイメージング、およびSJLマウスにおける多発性硬化症（MS）の実験的自己免疫性脳症（EAE）疾患モデルが含まれる。簡単に述べると、pBRES DNAを、各後脚の脛骨筋および腓腹筋に筋肉内（i.m.）注射によって送達した後、キャリパー電極を使ってエレクトロポレーションを行う（Inovio、カリフォルニア州サンディエゴ、200V/cm、1Hz、20ミリ秒/パルスで8パルス）。7〜10日目に0.33〜1.00mg/kgのAM（MFPまたはBLX-913）をゴマ油に入れてi.p.注射によって送達する。SEAP遺伝子またはルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現をマウス後肢のライブイメージングによって監視し、これによってpBRES/MFPおよびV729L W755A pBRES/BLX-913制御遺伝子発現系の比較が可能になる。マウスEAE疾患モデルでは、新しいpBRES/BLX-913複合体をpBRES/MFP複合体の既存の効力データとの関連でさらに特徴付けることができる。
【０３５０】
要約：本発明の新しいAMおよびIMの利点は、それらが、当該選択性を強化する修飾を持つユニークなRMに、選択的に結合することである。それゆえに、本発明の新しいAMおよびIMは、本発明のユニークかつ/または特異的なRMと選択的に結合するか、または他の形で相互作用し、内在性タンパク質（特に内在性ヒトタンパク質、例えば内在性PRまたは他の内在性ステロイド受容体）との交差反応性を減少させまたは排除するという、改良された性質を持つ。いくつかの実施形態において、本発明の新しいAMまたはIMはPRリガンド類似体、より具体的には修飾抗プロゲスチン、例えば修飾MFPである。ある実施形態では、PRリガンド類似体が修飾LBPを持つRMに選択的に結合し、例えば内在性PRまたは他の内在性ステロイド受容体との交差反応性に関係する副作用、堕胎活性、または避妊活性が減少しているか、そのような副作用を持たない。
【０３５１】
修飾MFPがAMである一定の実施形態では、本発明のRMを活性化するために使用されるMFPの用量が、この化合物の報告された堕胎活性の100分の1である。しかし本発明は、新しいAMが体内の内在性タンパク質（例えばPRおよびグルココルチコイド受容体（GR））に対して薬理作用をほとんどまたは全く持たないように、ユニークな新しいRMに対して選択的であり特異的である新しいAMも提供する。本明細書に記載するように（例えばT47Dベースの二次アッセイで測定した場合に）インビトロでPRに対する活性をほとんどまたは全く持たない化合物を同定した。PRリガンド結合ポケットとRMリガンド結合ポケット（LBP）が同一である一実施形態では、PRに対して不活性であることが見出された化合物は、pBRES系の刺激についても不活性であり、これは、この実施形態の限定でない一側面である。いくつかの実施形態において、新たに同定された化合物の、pBRES系における活性のレベルは、SARの情報源として使用することができるが、ここでは、選択基準として限定されるわけではない。
【０３５２】
本明細書に記載するように、いくつかの実施形態では、pBRES-Luc（pBRES-ルシフェラーゼ）アッセイを使って、指向的スクリーニングで不活性化合物を同定することができる。ある実施形態では、pBRES活性化と抗プロゲスチン活性の間の相関関係を使って、pBRES系を活性化せず、おそらくは抗プロゲスチン活性を欠く化合物を同定した。抗プロゲスチン活性の欠如を、有望な化合物のそれぞれについて、抗プロゲスチン活性に関するT47Dベースのアッセイで確認した。したがって、この二次抗PRアッセイから得たデータを使って、有望な本発明の化合物のアイデンティティを確認した。この実施形態では、元のRM（pGT79）コンストラクトを、新しいAM候補による改変RMのルシフェラーゼアッセイの対照として使用して、元のRMに対する活性が低く、より重要なことにはPRに対する活性が低い新規AM化合物に応答して起こる、改変RMにおける誘導レベルの改善に関する基準点とした。等しく不活性な元のRMを基準または対照として含めた。
【０３５３】
上記のアプローチを使って、化合物上の構造的特徴ゆえにヒトPRを結合または阻害しない化合物を同定することができる。その後、この新しい化合物をAMとして受け入れるために、改変RM分子を開発することができる。このアプローチを使用する場合、改変系の重要な特徴は、AM化合物がPRと相互作用しないということである。さらに、hPRと比較してRM内のLBDの19アミノ酸切断ゆえに、内在性ステロイドは改変RMを活性化しない。さらなる特徴付けのためのリード化合物が同定されたら、本明細書またはFuhrmann, U.ら (2000) J. Med. Chem. 43:5010-5016に記載のインビトロ細胞ベースアッセイおよびインビボアッセイを使ってスクリーニングすることができる。
【０３５４】
図55は、pBRES発現系の模範的でありかつ限定でない実施形態を表す図である。この実施形態では、RMへのMFPの結合がRMを活性化して、その後のpBRES発現系からのTMの発現をもたらす。MFPはいくつかの内在性ヒトステロイド受容体に関して既知のアンタゴニストであり、潜在的に不必要な副作用をもたらしうる。
【０３５５】
図56は、新規な活性化因子分子および制御因子分子をスクリーニングするための模範的でありかつ限定でないアプローチを表す図である。（1）化合物上の立体的またはイオン的摂動の存在により内在性ヒトPRと相互作用しないPRリガンド類似体の指向的スクリーニングから新しいAMを同定する。（2）モデリングに基づく突然変異誘発法を使って、RMのLBP中に補償的突然変異を導入し、それによって改変RM分子を作出する。(3）新しいAMを改変RMと一緒に使って、改善された性質（例えば、内在性タンパク質（特に内在性ヒトタンパク質、例えば内在性ヒトステロイド受容体）に対する不必要な副作用の減縮もしくは排除、またはそれら内在性タンパク質との交差反応性の減縮もしくは排除）を持つ活性なAM-RM複合体を作り出す。
【０３５６】
図57は、二つ以上の中等度に選択的なAM-RMペアからSARを使って高度に選択的なAM-RM複合体を開発するための模範的でありかつ限定でないアプローチを表す図である。(1）図57に概説したアプローチを使って新しいAM1を同定し、補償的突然変異をRMのLBP内にある領域1に組み込んで、中等度に選択的なAM1-RM1複合体を作出する。（2）新しいAM2を図57に概説したアプローチを使って同定し、補償的突然変異をRMのLBP内にある領域2に作製して、中等度に選択的なAM2-RM2複合体を作出する。（3）化学合成を使って、AM1とAM2に由来する選択性付与修飾を一つの化合物AM3中で組み合わせる。LBP内の領域1および領域2にある補償的突然変異を、部位特異的突然変異誘発を使って、単一のRM3コンストラクト内で組み合わせる。二つ以上の選択性付与特徴を利用することにより、AM3をRM3と一緒に使用すると、AM1またはAM2と比較して大きな選択性を持つAM-RM複合体が得られる。
【０３５７】
材料と方法
A．マウス急性EAEにおけるマウスIFN-βタンパク質の遺伝子ベースの送達の効力：Jackson Labsから入手した70匹の8週齢雌SJLマウスを、200μgの結核菌H37Raを補足した不完全フロイントアジュバント（IFA）中のプロテオリピドタンパク質（PLP）139-151 150μgを含有する0.1mlのSC（尾の基部と上背部に分割）注射で免疫した。このエマルションは、3mg/mlのPLPを含有する食塩水を、4mg/mlの粉砕結核菌を含有するIFAと、1：1で混合することによって得た。免疫化の直後に、全てのマウスに0.1mlの百日咳毒素IP注射を施した。免疫化の2日後（研究の3日目）に、全てのマウスに2回目の百日咳毒素のIP注射を施した。
【０３５８】
IFN-βタンパク質またはその賦形剤（20nM NaAc、pH5.5、150mM NaCl、5％プロピレングリコール）で処置したマウスには、免疫化の日から研究の最後まで1日おきに1回、0.1mlをSC投与した。この研究に使用した陽性対照は9mg/kgメソプラム（ZK-117137）および2.5mg/kgプレドニゾロンだった。どちらの対照も0.1ml/注射という投与体積を使用し、免疫化の朝から研究の最後まで、1日2回、IP投与される。
実験群（n＝10）：
1．賦形剤
2．10K単位のマウスIFN-β
3．20K単位のマウスIFN-β
4．30K単位のマウスIFN-β
5．100K単位のマウスIFN-β
6．メソプラム、9mg/kg IP
7．プレドニゾロン、2.5mg/kg IP
マウス急性EAEの臨床評価：以下の評価システムに基づいて、マウスを毎日スコア化した。
0＝正常
1＝尾を引きずる
2＝立ち直り困難
3＝一方または両方の後肢の不全麻痺
4＝一方もしくは両方の後肢の完全麻痺、または後肢は可動であるが引きずる
5＝両後肢の完全麻痺かつ前肢の脱力/麻痺、瀕死、または死亡。
【０３５９】
瀕死のマウスは安楽死させた。境界的臨床症状を示すマウスには0.5のスコアを加える。100K単位のIFN-βで処置したマウスでは、賦形剤処置マウスと比較して、EAEの臨床スコアが有意に減少した（p＝0.0046）。30K単位のIFN-βで処置したマウスでも賦形剤処置マウスと比較して臨床スコアが低下したが、この低下は統計的に有意な水準には達しなかった。この研究における陽性対照メソプラムおよびプレドニゾロンも、臨床スコアを有意に低下させた。実施例5および図13を参照されたい。
【０３６０】
B．マウス急性EAEにおけるマウスIFN-βの遺伝子ベースの送達の効力：Jackson Labsから入手した130匹の8週齢雌SJLマウスを、200μgの結核菌H37Raを補足した不完全フロイントアジュバント（IFA）中のプロテオリピドタンパク質（PLP）139-151 150μgを含有する0.1mlのSC（尾の基部と上背部に分割）注射で免疫した。このエマルションは、3mg/mlのPLPを含有する食塩水を、4mg/mlの粉砕結核菌を含有するIFAと、1：1で混合することによって得た。免疫化の直後に、全てのマウスに0.1mlの百日咳毒素IP注射を施した。2日目に、プラスミド＋エレクトロポレーション群のマウスには、適当な筋肉内注射を施し、その直後にエレクトロポレーションを行った。プラスミド＋PINC群のマウスにも適当な筋肉内注射を施した。免疫化の2日後（研究の3日目）に、全てのマウスに2回目の0.1ml百日咳毒素IP注射を施した。5日目に、プラスミド＋PINC群のマウスに、2日目と同じ処置を施した。
【０３６１】
IFN-βタンパク質またはその賦形剤（20nM NaAc、pH5.5、150mM NaCl、5％プロピレングリコール）で処置したマウスには、免疫化の日から研究の最後まで1日おきに1回、0.1mlをsc投与した。この研究に使用した陽性対照は9mg/kgメソプラム（ZK-117137）および2.5mg/kgプレドニゾロンだった。どちらの対照も0.1ml/注射という投与体積を使用し、免疫化の朝から研究の最後まで、1日2回、IP投与される。
【０３６２】
この研究には合計10群が含まれた。各群のマウスは13匹だった。各群の最後の3匹は、研究の6日目に、Mx1 RNA解析のために、尾ニックによって採血した。6日目に採血した同じ3匹を、研究の13日目に、PBMCからのMx1 RNA解析のために心臓穿刺によって採血し、注射を受けた筋を解析のために集めた。
実験群（n＝13）：
1．PBS対照
2．pNull＋EP
3．pmIFN-β＋EP
4．pNull＋PINC
5．pmIFN-β＋PINC
6．IFN-βタンパク質（100K単位）SC
7．賦形剤、SC
8．メソプラム、9mg/kg IP
9．プレドニゾロン、2.5mg/kg IP
10．無処置
EAEの臨床評価：以下の評価システムに基づいて、マウスを毎日スコア化した。
0＝正常
1＝尾を引きずる
2＝立ち直り困難
3＝一方または両方の後肢の不全麻痺
4＝一方もしくは両方の後肢の完全麻痺、または後肢は可動であるが引きずる
5＝両後肢の完全麻痺かつ前肢の脱力/麻痺、瀕死、または死亡。
【０３６３】
瀕死のマウスは安楽死させた。境界的臨床症状を示すマウスには0.5のスコアを加える。100K単位のマウスIFN-βで処置したマウスでは、賦形剤処置マウスと比較して、EAEの臨床スコアが有意に減少した（p＝0.045）。マウスIFN-β＋EPの遺伝子送達も、pNull＋EPの遺伝子送達と比較して、臨床スコアを有意に減少させた（p＝0.0171）。IFN-βのPINC製剤を使った遺伝子送達は、pNull＋PINCと比較して臨床スコアを統計的に減少させなかった。EAEモデルの陽性対照であるメソプラムとプレドニゾロンはどちらも臨床スコアを有意に減少させた。
【０３６４】
C．インビボでのmIFN-βの制御発現
IFN15-GS5：BRES-1/IFNプラスミドインビボトランスフェクション：マウス筋中にエレクトロポレートされたBRES-1/m FN-βプラスミドからのミフェプリストン（MFP）制御マウスインターフェロン-ベータ（mIFN-β）発現の証明
実験計画：下記の表34および35に記載するように、正常C57Bl/6マウスに、本発明のBRES-1単一ベクターおよび対照プラスミドDNAを、注射し、エレクトロポレートすることができる。
表34
【表３３】
2010523131.tif 000051
表35  群（n＝5/群）
【表３４】
2010523131.tif 000052
【０３６５】
mIFN-β発現は、三つの時点で、バイオマーカーおよび筋内のRNAレベルによってアッセイすることができる。DNA注射後の7日目に、第1、第3および第4群から最終的な収集を行い、第2群は尾採血することにより、GS/mIFN−MFP（第3群）を投与されたマウスにおける非誘導バックグラウンドmIFN-β発現およびバイオマーカー活性を、注射を受けていないマウス（第1群）および空のBRES-1ベクターを投与されたマウス（第2群）と比較して決定することができる。CMV/mIFN（第4群）は陽性対照として役立つ。第12群は、SEAP発現の非誘導バックグラウンドレベルを決定するために尾採血することができる。
【０３６６】
第2、第6、第9、第11および第12群のマウスは、DNA注射後の7〜10日目にMFPで処置することができる。11日目に、第5〜7群から最終的な収集を行って、RM/mIFN＋MFP（第6群）を投与されたマウスにおける誘導mIFN発現およびバイオマーカー活性を、CMV/mIFNを投与されたマウス（第7群）と比較して決定することができる。RM/mIFN−MFPを投与されたマウス（第5群）における非誘導レベルも、アッセイされるだろう。第2群（空のBRES-1ベクター）から最終的な収集を行って、MFPがバイオマーカー応答を刺激するかどうかを決定することができる。第8〜10群は、尾採血することにより、バイオマーカー活性が検出可能かどうかを決定すると共に、18日目の非誘導レベルと比較するための同じマウスにおける誘導時点を提供する。第11群（CMV/mIFN＋MFP）からは最終的な収集を行って、MFPがmIFN発現に影響を及ぼすかどうか、またはバイオマーカー応答を阻害するかどうかを決定することができる。第12群からは尾採血を行って、SEAP発現の誘導レベルを決定することができる。第13群はSEAP発現に関する陰性対照になるだろう。
【０３６７】
18日目、最後のMFP処置の8日後に、第8〜10群から最終的な収集を行って、RM/mIFN−/＋/−MFP群（第9群）におけるmIFN-β RNAレベルおよびバイオマーカー活性が、MFPを一度も投与されなかったRM/mIFNマウス（第8群）と比較してベースラインに戻っているかどうかを決定することができる。CMV/mIFN（第10群）はここでも陽性対照として役立つ。第12群からは最終採血を行って、SEAP発現がベースラインに戻っているかどうかを決定することができる。
【０３６８】
D．試薬類
DNA溶液：第2〜11群の各マウスには、PBS 150μl中のプラスミドDNA 250μgを投与することができる。第12群の各マウスには、PBS 150μl中のプラスミドDNA 25μgを投与することができる（以下の表36を参照されたい）。
表36：5匹/群＋α分のDNA溶液を調製する
【表３５】
2010523131.tif 000053
【０３６９】
E．動物実験手法
1）DNA送達（第2〜12群）：0日目に、成体雄C57Bl/6マウス（各群5匹）に、マウス1匹につき、PBS 150μl中のプラスミドDNA 250μg（第2〜11群）または25μg（第12群）を、両側的に注射することができる。DNA溶液は、各後脚の脛骨筋中に25μl、腓腹筋中に50μl注射し、次にキャリパーを使ってエレクトロポレーション（200V/cm、1Hz、20ミリ秒/パルスで8パルス）を行うことができる。
【０３７０】
2）MFP処置（第2、第6、第9、第11および第12群）：下記の表37に示すように、注射後7〜10日目に、0.33mg/kg（新しく調製した100μlの0.083mg/mlゴマ油）のMFPを、第2、第6、第9、第11および第12群のマウスに、経口胃管法によって投与することができる。第12群のマウスからは、7日目に、MFP処置に先だって採血することができる。
表37
【表３６】
2010523131.tif 000054
【０３７１】
3）血液および筋の収集（第1〜11群）：上記表6に示すDNA注射後の適当な日に、マウスから尾採血または最終採血することができる。マウスから最終採血する場合は、注射を受けた筋を集めることができる。
【０３７２】
血液：血液はマイクロテイナチューブ（EDTA含有）中に室温で集め、次にPBMCを分離して集めることができる。残りの血漿はサイトカインアッセイ用に-20℃で保存することができる。
【０３７３】
筋：両脚の、注射を受けた筋を収集し、一片が5mmを越えない細片に切断することができる。細断した筋の約4分の1を2mlチューブ中の1.5mlのRNA-Later溶液に入れることができる。残りの筋は-70℃で保存することができる。RNA-Later溶液中の筋試料からDNAおよびRNAを抽出することができる。試料は4℃で少なくとも24時間保存することができる。また、その後は-20℃に移すことができ、その場合は5日以上保存することができる。
【０３７４】
血液（第12群および第13群）：第12群のマウスからは、黄色マイクロテイナチューブ（抗凝固剤なし）に、7日目および11日目には尾採血し、18日目には最終採血することができる。マウスは7日目にMFP処置に先だって採血することができる。第13群のマウスからは11日目に黄色マイクロテイナチューブ（抗凝固剤なし）中に最終採血することができる。
【０３７５】
4）エンドポイント解析/アッセイ手法
バイオマーカーアッセイの結果：BRES-1-mIFN-β（pGT26）では、MFPの非存在下、7日の時点で、Mx1 RNAおよび両方のケモカイン（IP-10およびJE）は、ほとんどまたは全く活性を示さなかった。11日の時点では、MFPの存在下で、全てのバイオマーカーが、CMV-mIFN-βでのレベルより高いレベルにまで、強く誘導された。18日の時点では、MFPの非存在下で、ケモカインレベルがベースラインに戻っており、Mx1 RNAはほぼベースラインまで減少していた。図18および図19を参照されたい。
【０３７６】
PBMCのMx1 RNA：分離したPBMCからRNAを調製し、Mx1 RNAについて、TaqManでアッセイすることができる。
【０３７７】
血漿のJEおよびIP-10タンパク質：血漿をJEおよびIP-10サイトカインについてELISAでアッセイすることができる。
【０３７８】
筋のmIFN-β RNA：注射を受けた筋からRNAを調製し、mIFN-β RNAについて、TaqManでアッセイすることができる。
【０３７９】
筋のプラスミドDNA：注射を受けた筋からRNAを調製し、プラスミドDNAについて、TaqManでアッセイすることができる。第4、第7、第10および第11群からのDNAには、CMVプロモーターに特異的なプライマーおよびプローブを使用することができる。第2、第3、第5、第6、第8、および第9群については、制御因子タンパク質のGAL-4 DNA結合ドメインに特異的なプライマーおよびプローブを使用することができる。
【０３８０】
血清のSEAPタンパク質：第13群のマウスから得た血清を希釈剤として使用することにより、血清を、SEAP発現について、化学発光活性アッセイでアッセイすることができる。
【０３８１】
F．プラスミドベクターの構築
pGER101（pgWiz/mIFN）：マウスIFN-β（mIFN-β）遺伝子を、5'プライマー上に置かれたmIFNシグナル配列ならびに5'端および3'端に付加されたSalIおよびNotI制限酵素部位と共に、プラスミドベクターpbSER189（図20A）から、PCRによって増幅した。そのフラグメントをSalIおよびNotIで消化し、プラスミドベクターpgWIZ（図20B）のSalIおよびNotI部位に挿入することにより、プラスミドベクターpGER101（図20C）を得た。
【０３８２】
pGER125（pgWiz/hIFN）：ヒトIFN-β（hIFN-β）遺伝子を、5'プライマー上に置かれたhIFNシグナル配列ならびに5'端および3'端に付加されたSalIおよびNotI制限酵素部位と共に、プラスミドベクターpbSER178から、PCRによって増幅した。そのフラグメントをSalIおよびNotIで消化し、プラスミドベクターpgWIZのSalIおよびNotI部位に挿入することにより、プラスミドベクターpGER125（図21）を得た。
【０３８３】
pGene/V5-HisA：プラスミドベクターをInvitrogenから購入した。このベクターは、最小プロモーター（E1b TATA）の上流にある6個のGAL-4結合部位、CMV由来のUT12である5'非翻訳領域（UTR）、合成イントロン8（IVS8）、マルチクローニング部位（MCS）およびウシ成長ホルモン（bGH）ポリ(A)部位を含有する。MCSに挿入された遺伝子は、制御因子分子（RM）によって制御されうる。例えばMCSに挿入された遺伝子は、活性化された形態の修飾プロゲステロン受容体（例えば、配列番号22のアミノ酸配列を含む、または配列番号21の核酸配列によってコードされるもの）により、GAL-4部位への活性化型RMの結合時に、誘導されうる（図22）。
【０３８４】
pGene-mIFN（pGER127）：プラスミドベクターpGER101をSalIで消化し、クレノウで埋め、HindIIIリンカーにライゲートし、HindIIIおよびNotIで消化した。mIFN-β遺伝子フラグメントをプラスミドベクターpGene/V5-HisAのHindIIIおよびNotI部位に挿入して、プラスミドベクターpGene-mIFN（図23）を得た。
【０３８５】
pGene-hIFN（pGER129）：プラスミドベクターpGER125をSalIで消化し、クレノウで埋め、HindIIIリンカーにライゲートし、HindIIIおよびNotIで消化した。mIFN-β遺伝子フラグメントをプラスミドベクターpGene/V5-HisAのHindIIIおよびNotI部位に挿入して、プラスミドベクターpGene-hIFN（pGER129）（図24）を得た。
【０３８６】
pSwitch：このプラスミドベクターはInvitrogenから購入した。このプラスミドベクターは、RMタンパク質の遺伝子の発現を駆動するCMV由来の5'非翻訳領域12（UT12）および合成イントロン8（IVS8）の上流にある自己誘導性RM応答性プロモーター（4×GAL-4 DNA結合部位およびチミジンキナーゼ（tk）プロモーター）に連結された、修飾プロゲステロン受容体（例えば、配列番号22のアミノ酸配列を含む、または配列番号21の核酸配列によってコードされるもの）をコードする（図25）。
【０３８７】
pGS1694：プラスミドベクターpGS1694はValentisによって提供された。このプラスミドベクターは、修飾プロゲステロン受容体（例えば、配列番号22のアミノ酸配列を含む、または配列番号21の核酸配列によってコードされるもの）をコードする遺伝子の発現を駆動する、ニワトリ骨格筋アクチンプロモーター（skアクチンpro）、5'非翻訳領域12（UT12）および合成イントロン8（IVS8）を含有する（図26）。
【０３８８】
pLC1674：プラスミドベクターpLC1674はValentisによって提供された。このプラスミドベクターは、ホタルルシフェラーゼ遺伝子（luc）をコードする遺伝子の発現を駆動する、「RM応答性」プロモーター（すなわち活性化された形態の修飾プロゲステロン受容体（例えば、配列番号22のアミノ酸配列を含む、または配列番号21の核酸配列によってコードされるもの）に応答するプロモーター）、5'非翻訳領域12（UT12）および合成イントロン8（IVS8）を含有する（図27）。
【０３８９】
G．ウイルスを生産するためのベクターの構築
ウイルスを生産するためのベクター（例えばシャトルプラスミド）およびウイルス（例えばAAV-1ウイルス）を生産する方法は当技術分野では知られており、本発明のウイルスを生産するために使用することができる。いくつかの実施形態では、本発明のウイルスがシャトルプラスミド（例えば表38を参照されたい）から生産され、疾患を処置する目的で対象の細胞に本発明の分子（例えばそのベクターが含有する配列によってコードされるTMおよび/またはRM）を送達し発現させるために使用される。
【０３９０】
pGT2/mGMCSFおよびpGT/hGMCSF：シャトルプラスミドpGT2/mGMCSFおよびpGT/hGMCSFは次のように構築した（図28）。マウスGMCSF（mGM-CSF）をコードするフラグメントを、pORF9-mGMCSF（図30）から、そのベクタープラスミドをAgeIおよびNheIで消化することによって切り出した。次にこのフラグメントを平滑末端化した。同様に、ヒト（hGM-CSF）をコードするフラグメントを、pORF-hGMCSF（図30）から、そのベクタープラスミドをSgrAIおよびNheIで消化することによって切り出した。次にこのフラグメントを平滑末端化した。mGMCSFまたはhGMCSFのどちらか一方をコードする、切り出して平滑末端化したフラグメントを、pGT2ベクタープラスミドのEcoRV部位に挿入した。次に、制限消化マッピングによって、挿入の方向をチェックした。得られたシャトルプラスミドをpGT2/mGMCSF（マウスGMCSFをコードするもの）およびpGT2/hGMCSF（ヒトGMCSFをコードするもの）と名付けた（図28）。
【０３９１】
pZac2.1-RM-hGMCSFおよびpZac2.1-RM-mGMCSF：シャトルプラスミドpZac2.1-RM-hGMCSFおよびpZac2.1-RM-mGMCSFを次のように構築した（図29A）。マウスGMCSFをコードするフラグメントを、プラスミドpORF9-mGMCSF（図30）から、そのプラスミドをAgeIおよびNheIで消化することによって切り出して平滑末端化し、その結果生じた平滑末端フラグメントを、プラスミドpGT2のEcoRV部位に挿入することにより、プラスミドpGT2/mGMCSFを得た。同様に、ヒトGMCSFをコードするフラグメントを、プラスミドpORF-hGMCSF（図30）から、そのプラスミドをSgrAIおよびNheIで消化することによって切り出して平滑末端化し、その結果生じた平滑末端フラグメントを、プラスミドpGT2のEcoRV部位に挿入することにより、プラスミドpGT2/hGMCSFを得た。得られたベクタープラスミドのインサートを、制限消化マッピングによって、それぞれチェックし、検証した。
【０３９２】
次に、ベクタープラスミドpGT2/hGMCSFおよびpGT2/mGMCSFを、FseIおよびSrfIでそれぞれ消化した。次にこれらのBRES-1-GMCSFフラグメントを平滑末端化した。プラスミドベクターpZac2.1をBgl2およびClaIで消化し、平滑末端化した。平滑末端BRES-1-GMCSFフラグメントをそれぞれ平滑末端pZac2.1ベクターにライゲートした。陽性クローンを制限消化によって検証した。得られたシャトルプラスミドをpZac2.1-RM-hGMCSF（ヒトGMCSFをコードするもの）およびpZac2.1-RM-mGMCSF（マウスGMCSFをコードするもの）と名付けた（図29A）。
【０３９３】
pZac2.1-CMV-mGMCSFおよびpZac2.1-CMV-hGMCSF：シャトルプラスミドpZac2.1-CMV-mGMCSFおよびpZac2.1-CMV-hGMCSFを、次のように構築した（図29B）。ヒトGMCSFをコードするフラグメントおよびマウスGMCSFをコードするフラグメントを、それぞれ個別に、プラスミドベクターpGENE/V5HisA（Invitrogen）中にクローニングして、それぞれプラスミドs pGT723-GENE/hGMCSF（ヒトGMCSFをコードするもの）およびpGT724-GENE/mGMCSF（マウスGMCSFをコードするもの）を得た。マウスGMCSFをコードするフラグメントを、pGT724/mGMCSFから、そのプラスミドをKpnIおよびXbaIで消化することによって切り出し、ヒトGMCSFをコードするフラグメントを、pGT723/hGMCSFから、そのプラスミドをKpnIおよびXbaIで消化することによって切り出した。その結果生じたフラグメントをそれぞれ個別に、KpnIおよびXbaIで消化して子ウシアルカリホスファターゼ（CIP）で処理しておいたベクターpZac2.1のKpnI/XbaI部位に挿入した。得られたシャトルプラスミドを、ヒトGMCSFをコードするpGT713（またはpZac2.1-CMV-hGMCSF）と名付け、マウスGMCSFをコードするpGT714（またはpZac2.1-CMV-mGMCSF）と名付けた（図29B）。
【０３９４】
下記の表38に記載するように、さらなるシャトルプラスミドを構築した。
表38
【表３７】
2010523131.tif 000055
【表３８】
2010523131.tif 000056
【０３９５】
上記の表38では、AAV-1-BRES-1コンストラクトのために、BRES-1配列を含有するフラグメントをベクター中に挿入することが可能になるように、pZAC2.1シャトルプラスミドのMCSを修飾して、シャトルプラスミドpGT53を得た。BRES-1配列を含有するフラグメントをpGT53に挿入するために、適当なpGTプラスミド（上記表8に記載したもの）を、各IFNをコードするBRES-1配列全体を含有するフラグメントをもたらす制限酵素で消化し、そのフラグメントをpGT53の適合部位に挿入した。その結果生じたAAV-1シャトルプラスミドを使って、本明細書で記述するように、AAV-1ウイルスの標準的生産方法で、AAV-1ウイルス調製物を作製した。
【０３９６】
CMVプロモーター含有シャトルプラスミドの場合は、上記表8に記載するように、各IFN遺伝子をコードするフラグメントを適当なプラスミドベクターから制限酵素消化によって単離し、pZAC2.1プラスミドベクターの適合する制限部位に挿入した。
【０３９７】
BRES-1 hGM-CSFシャトルプラスミドの場合は、hGMCSFをコードするpORF9-hGMCSF（Invitrogen）のSrgAI/NheIフラグメントを平滑末端化し、pGT2のEcoRV部位に挿入して、pGT711を得た。BRES-1配列全体を含有するpGT712のFseI/SrfIフラグメントを平滑末端化し、pZAC2.1に挿入して、pGT715（図31A）を得た。
【０３９８】
BRES-1 mGMCSFシャトルプラスミドの場合は、mGM-CSFをコードするpORF9-mGMCSF（Invitrogen）のAgeI/NheIフラグメントを平滑末端化し、pGT2ベクターのEcoRV部位に挿入して、pGT712を得た。BRES-1配列全体を含有するpGT712のFseI/SrfIフラグメントを平滑末端化し、pZAC2.1に挿入して、pGT716（図31B）を得た。
【０３９９】
各pORF9プラスミド（Invitrogen）由来のマウスおよびヒトGM-CSF遺伝子は、それぞれをKpnI/XbaIで切り出してpZAC2.1にクローニングできるように、プラスミドpGENE/V5HisAプラスミド（Invitrogen）を介してクローニングした。
【０４００】
H．安定なMCF10A細胞株の構築
ヒト乳腺上皮細胞株MCF10A（ATCC、番号CRL-10317）を10cmディッシュで培養した。細胞に、Fugene 6トランスフェクション試薬（Roche）を使って、pGT137プラスミド（pBRES-Luc、ピューロマイシン選択）をトランスフェクトした。簡単に述べると、6μgのDNAおよび36μLのFugene 6を、750μLの無血清Opti-MEMに希釈した。DNAおよびFugene 6を混合し、室温で15分間インキュベートした。細胞を2日間培養してから、1μg/mLピューロマイシンで3週間スクリーニングした。陽性クローンを選択し、pBRES-Luc発現および活性化について、ルシフェラーゼアッセイで検証した。
【０４０１】
I．ルシフェラーゼ活性測定によるpBRES活性化の決定
全ての細胞を穏やかなトリプシン処理で収集してから、PBSで洗浄した。次に、細胞を800rpmで5分間遠心分離し、細胞ペレットを10mlの組織培養培地に再懸濁した。次に細胞を、滅菌条件下で、96ウェル平底黒色培養プレートに、1×104細胞/ウェル（体積は100μl/ウェル）の細胞密度で播種した。次に細胞を5％CO2下37℃で24時間インキュベートした。その後、滅菌条件下に、培地を注意深い吸引によって除去し、ウェルを95μlの新鮮培地で置き換えてから、5μl/ウェルの適当に希釈された化合物または対照緩衝液を加えることにより、0.00064〜50nM（最終的に0.05％DMSO中）の範囲の最終化合物濃度を得た。次に細胞培養プレートを覆い、37℃の培養器で24時間インキュベートした。その後、培地をプレートから穏やかな吸引によって除去し、プレートの液体を紙に吸い取り、ルシフェラーゼアッセイシステムキット（Promega, Inc.）のルシフェラーゼアッセイ基質試薬50μl/ウェルで細胞を溶解させた。次に、ルシフェラーゼ基質試薬の添加後にプレートを穏やかに1分間振とうしてから、Microbetaルミネセンス・プレート・リーダー（PerkinElmer）を使用し、標準化ルシフェラーゼ読み取りプロトコールを使って、さまざまな時点でルシフェラーゼ酵素活性を測定した（5分、30分、60分）。
【０４０２】
J．HEK293細胞における一次pBRES-ルシフェラーゼアッセイ
ヒト胎児腎臓293（HEK293）細胞（ATCC番号CRL-1573）において試験化合物がpBRES活性に及ぼす影響を決定するために、60mmディッシュに、4mM L-グルタミンおよび10％熱非働化FBSを含むMEMアルファ5mL中、5×105細胞/ディッシュの密度で、細胞をプレーティングした。24時間後に、Lipofectamine 2000（Invitrogen）を1：2.5というDNA（μg）：Lipofectamine 2000（μL）試薬の比率で使って、pBRESコンストラクトを細胞にトランスフェクトした。脂質複合体を含有する培地を4時間後に除去し、細胞を新鮮増殖培地中で24時間回復させた。細胞を、増殖培地中、10,000細胞/ウェルの密度で、96ウェルプレートに再播種した。翌日、同じ培地を使って細胞をMFPまたは試験化合物で処置した。化合物を100％エタノール賦形剤に溶解し、処置培地を使用することによって希釈した。処置培地中のエタノールの最終濃度は0.1％だった。各処置は三つの複製物からなった。処置の24時間後に、ルシフェラーゼ活性を以下のように測定した：培地を除去し、細胞をダルベッコPBSで1回洗浄した。細胞を20μL/ウェルの1×Passive Lysis Buffer（PLB、Promega）で溶解し、タイタープレート振とう機で振とうしながら室温で10分間インキュベートした。プレートを-80℃で20分間凍結し、タイタープレート振とう機で振とうしながら室温で20分間融解した。Berthold MicroLumat Plusルミノメーターを使用し、Promegaルシフェラーゼアッセイシステム（カタログ番号E1501）基質（100μL/ウェル）を使って、ルシフェラーゼ活性を測定した。
【０４０３】
K．T47D細胞における二次PRアッセイ
ヒト乳癌T47D細胞（ATCC番号HTB-133）においてヒトプロゲステロン受容体が誘導するアルカリホスファターゼ活性に試験化合物が及ぼす影響を決定するために、増殖培地（1mMピルビン酸ナトリウム、0.2単位/mLインスリン、4mM L-グルタミンおよび10％FBSを含むRPMI1640）中、20,000細胞/ウェルの密度で、細胞を96ウェルプレートにプレーティングした。終夜培養後、培地をアッセイ培地（1mMピルビン酸ナトリウム、0.2単位/mLインスリン、4mM L-グルタミンおよび3％活性炭処理FBSを含むRPMI1640（フェノールレッドフリー）に代えた。翌日、細胞を200pMプロメゲストンの存在下にMFPまたは試験化合物で処理した。化合物は100％エタノール賦形剤に溶解し、アッセイ培地を使って希釈した。アッセイ培地中のエタノールの最終濃度は0.2％だった。各処置は5〜6個の複製物からなった。処置の24時間後に、細胞のアルカリホスファターゼ活性を次のように測定した：培地を除去し、細胞をDPBSで2回洗浄した。残留DPBSを除去した後、50μLの細胞溶解緩衝液（100mMトリス-HCl pH9.8、0.2％トリトンX-100）を各ウェルに加え、プレートを-80℃で30分間凍結した。そのプレートを、タイタープレート振とう機で振とうしながら、室温で20分間融解した。150μLの基質緩衝液（100mMトリス-HCl pH9.8、4mMp-ニトロフェニルホスフェート）を各ウェルに加えた。405nmの試験波長で吸光度測定を5分間隔で1時間行った。
【０４０４】
L．RM LBDのホモロジーモデル
GR LBD/MFP複合体に基づくRM LBDのホモロジーモデルを、DeepView Swiss PDB Viewerバージョン3.70のSwissModel機能を使って作成した（Guex, N.およびPeitsch, M.C. (1997) Electrophoresis 18:2714-2723. http://expasy.org/spdbv/）。簡単に述べると、ヒトプロゲステロン受容体（アクセッションNP_000917）の残基640〜914に対応する一次アミノ酸配列をヒトグルココルチコイド受容体のX線結晶構造1NHZ.pdb上にフィットさせ、最小化のためにSwiss-Protサーバーに提出した。その結果生じたモデルの、GR/MFP結晶構造へのフィットを、Insight2ソフトウェア（Accelrys Software Inc.）を使って調べた。
【０４０５】
M．M-LBD-化合物相互作用のモデリング
Discovery Studio Viewer Proバージョン6.0（Accelrys Software Inc.）を使って、RMリガンド結合ポケットに結合したMFP、BLX-913および他の試験化合物のモデルを作成し、rlig_viewスクリプト（Berlex社生物物理部門のMarc Adler博士、未公表）により、活性部位残基を同定した。
【０４０６】
N．部位特異的突然変異誘発
Quick Change突然変異誘発法を使用し、下記のプライマー（新たに組み込まれるコドンに下線を付す）を使って、RM LBD内の部位特異的突然変異を組み込んだ。アミノ酸ナンバリングスキームはhPRアミノ酸ナンバリングに従う。719位および755位の単一突然変異はpGT79テンプレートを使って組み込んだ。729位および726位の二重突然変異はpGT1009（W755A）テンプレートを使って組み込んだ（表39を参照されたい）。
N719Q（pGT1003）（配列番号60）5'-CTT TGC TGA CAA GTC TTC AGC AAC TAG GCG AGA GG-3'および5'-CCT CTC GCC TAG TTG CTG AAG ACT TGT CAG CAA AG-3'；
N719A（pGT1004）（配列番号62）5'-CTT TGC TGA CAA GTC TTG CCC AAC TAG GCG AGA GG-3'および5'-CCT CTC GCC TAG TTG GGC AAG ACT TGT CAG CAA AG-3'；
N719G（pGT1005)（配列番号64）5'-CTT TGC TGA CAA GTC TTG GCC AAC TAG GCG AGA GG-3'および5'-CCT CTC GCC TAG TTG GCC AAG ACT TGT CAG CAA AG-3'；
W755F（pGT1006)（配列番号66）5'-CTC TCA TTC AGT ATT CTT TCA TGA GCT TAA TGG TG-3'および5'-CAC CAT TAA GCT CAT GAA AGA ATA CTG AAT GAG AG-3'；
W755L（pGT1007)（配列番号68）5'-CTC TCA TTC AGT ATT CTC TGA TGA GCT TAA TGG TG-3'および5'-CAC CAT TAA GCT CAT CAG AGA ATA CTG AAT GAG AG-3'；
W755V（pGT1008)（配列番号70）5'-CTC TCA TTC AGT ATT CTG TGA TGA GCT TAA TGG TG-3'および5'-CAC CAT TAA GCT CAT CAC AGA ATA CTG AAT GAG AG-3'；
W755A（pGT1009)（配列番号72）5'-CTC TCA TTC AGT ATT CTG CCA TGA GCT TAA TGG TG-3'および5'-CAC CAT TAA GCT CAT GGC AGA ATA CTG AAT GAG AG-3'；
V729A/W755A（pGT1015)（配列番号74）5'-GAG GCA ACT TCT TTC AGC CGT CAA GTG GTC TAA ATC-3'および5'-GAT TTA GAC CAC TTG ACG GCT GAA AGA AGT TGC CTC-3'；
V729G/W755A（pGT1016)（配列番号76）5'-GAG GCA ACT TCT TTC AGG CGT CAA GTG GTC TAA ATC-3'および5'-GAT TTA GAC CAC TTG ACG CCT GAA AGA AGT TGC CTC-3'；
V729L/W755A（pGT1017)（配列番号78）5'-GAG GCA ACT TCT TTC ACT GGT CAA GTG GTC TAA ATC-3'および5'-GAT TTA GAC CAC TTG ACC AGT GAA AGA AGT TGC CTC-3'；
V729F/W755A（pGT1025)（配列番号80）5'-GAG GCA ACT TCT TTC ATT CGT CAA GTG GTC TAA ATC-3'および5'-GAT TTA GAC CAC TTG ACG AAT GAA AGA AGT TGC CTC-3'；
L726V/W755A（pGT1020)（配列番号82）5'-GGC GAG AGG CAA GTG CTT TCA GTA GTC AAG-3'および5'-CTT GAC TAC TGA AAG CAC TTG CCT CTC GCC-3'；
L726A/W755A（pGT1021)（配列番号84）5'-GGC GAG AGG CAA GCC CTT TCA GTA GTC AAG-3'および5'-CTT GAC TAC TGA AAG GGC TTG CCT CTC GCC-3'；
L726G/W755A（pGT1022）（配列番号86）5'-GGC GAG AGG CAA GGG CTT TCA GTA GTC AAG-3'および5'-CTT GAC TAC TGA AAG CCC TTG CCT CTC GCC-3'；
L726I/W755A（pGT1023）（配列番号88）5'-GGC GAG AGG CAA ATC CTT TCA GTA GTC AAG-3'および5'-CTT GAC TAC TGA AAG GAT TTG CCT CTC GCC-3'；
L726F/W755A（pGT1024）（配列番号90）5'-GGC GAG AGG CAA TTC CTT TCA GTA GTC AAG-3'および5'-CTT GAC TAC TGA AAG GAA TTG CCT CTC GCC-3'；
表39
2010523131.tif 000057
pGT79方向のpBRES系において719位、726位、729位および755位に今までに組み込まれた突然変異の代表例
【０４０７】
BLX-913/改変RP系のインビトロ検証
さらにまた、HEK293細胞におけるルシフェラーゼレポーター遺伝子のBLX-913依存的活性化をレスキューすることが示されたLBD二重突然変異V729L/W755Aを、ルシフェラーゼ、マウス分泌型胚アルカリホスファターゼ（SEAP）およびヒトインターフェロンベータ（hIFNb）TMを使って、C2C12マウス筋細胞で試験した。RPカセットおよびTMカセットの最善の方向（すなわち誘導遺伝子の非存在下では最も低いTM発現レベルを示し、誘導因子の存在下では最も高いTM発現レベルを示す方向）はTMのアイデンティティに依存することが、以前に報告された（Szymanski Pら, Mol Ther 2007；15:1340-1347）。そこで本発明者らは、発現の誘導にMFPまたはBLX-913を使って、各TM群内で、4方向の新しい誘導因子および新しい改変RP LBDを評価した。
【０４０８】
結果を図58〜60に示す。MFPで誘導した場合、試験した上記三つの導入遺伝子では全ての方向で、改変RPは完全な活性を保っていた。
【０４０９】
事実上どの方向およびどの導入遺伝子でも（pGT1050およびpGT1058を除く）、新しい誘導因子BLX-913と改変RP（*）との組合せは、元のGSおよびMFPと同じかそれ以上に良いTM発現の誘導因子である。これらの研究では、ヒトプロゲステロン受容体より改善された選択性を持つ新しい誘導因子-pBRESの組合せとして、BLX-913化合物とV729L/W755A RP pBRESを検証する。
【０４１０】
BLX-913/改変RP系のインビボ検証
インビトロ試験を終えて、pGT45およびpGT1048中の、方向の異なるmSEAPおよびRPを、マウス研究で並行して試験した。結果を図61に示す。0日目に、マウスの後肢にプラスミドDNAを注射し、エレクトロポレーションを使ってDNAを筋細胞内に送達した。このプロトコールは、以前に、pBRES DNAおよびMFP誘導因子で使用されている。7日目、8日目、9日目および10日目に、マウスに、誘導因子化合物（賦形剤のみ、MFPまたはBLX-913）を、腹腔内（IP）注射により、ゴマ油賦形剤に入れて24時間間隔で投与した。10日目の最後の注射の6時間後に、血液試料をマウスの尾静脈から集めた。血清中のmSEAPレベルを測定して、化合物による誘導後の、このレポーター発現のレベルを決定した。mSEAP発現の低下を監視するために、7日目の誘導因子の注射前、ならびに18日目および25日目にも、さらなる血液試料を集めた。
【０４１１】
図61から、pGT45（元のRP）が0.33mg/kg濃度でも1mg/kg濃度でもMFPによく応答したことは明白である。BLX-913を誘導因子として使用した場合、これらのマウスはどちらの濃度でも応答しなかった。新しい改変RP DNAをpGT1048群のマウスに送達したところ、それらは、pGT45 DNAを投与したマウスよりもよくBLX-913に応答した。
【実施例１２】
【０４１２】
さらなるベクターの作製
pBRES RP LBPの突然変異誘発
全ての部位特異的突然変異体をpBRESプラスミドのQuikChange突然変異誘発によって構築し、配列決定によって確認した。プラスミドpGT77〜80（LBD突然変異V729L/W755AについてはpGT1044〜1046、pGT1017）は4方向のpBRES-ルシフェラーゼカセットを含有し、pGT44〜47（LBD突然変異V729L/W755AについてはpGT1047〜1050）は4方向のpBRESmSEAPカセットを含有し、pGT27〜30（LBD突然変異V729L/W755AについてはpGT1055〜pGT1058）は4方向のpBRES-hIFNbカセットを含有する。それぞれの方向は図58〜60から得ることができる。
【０４１３】
部位特異的突然変異誘発に使用したプライマー：
5'-CTT TGC TGA CAA GTC TTG CCC AAC TAG GCG AGA GG-3'および5'-CCT CTC GCC TAG TTG GGC AAG ACT TGT CAG CAA AG-3'（N719A）；
5'-CTT TGC TGA CAA GTC TTG GCC AAC TAG GCG AGA GG-3'および5'-CCT CTC GCC TAG TTG GCC AAG ACT TGT CAG CAA AG-3'（N719G）；
5'-CTC TCA TTC AGT ATT CTT TCA TGA GCT TAA TGG TG-3'および5'-CAC CAT TAA GCT CAT GAA AGA ATA CTG AAT GAG AG-3'（W755F）；
5'-CTC TCA TTC AGT ATT CTC TGA TGA GCT TAA TGG TG-3'および5'-CAC CAT TAA GCT CAT CAG AGA ATA CTG AAT GAG AG-3'（W755L）；
5'-CTC TCA TTC AGT ATT CTG TGA TGA GCT TAA TGG TG-3'および5'-CAC CAT TAA GCT CAT CAC AGA ATA CTG AAT GAG AG-3'（W755V）；
5'-CTC TCA TTC AGT ATT CTG CCA TGA GCT TAA TGG TG-3'および5'-CAC CAT TAA GCT CAT GGC AGA ATA CTG AAT GAG AG-3'（W755A）；
5'-CTC TCA TTC AGT ATT CTG GCA TGA GCT TAA TGG TG-3'および5'-CAC CAT TAA GCT CAT GCC AGA ATA CTG AAT GAG AG-3'（W755G）；
5'-GAG GCA ACT TCT TTC AGG CGT CAA GTG GTC TAA ATC-3'および5'-GAT TTA GAC CAC TTG ACG CCT GAA AGA AGT TGC CTC-3'（V729G）；
5'-GAG GCA ACT TCT TTC AGC CGT CAA GTG GTC TAA ATC-3'および5'-GAT TTA GAC CAC TTG ACG GCT GAA AGA AGT TGC CTC-3'（V729A）；
5'-GAG GCA ACT TCT TTC ACT GGT CAA GTG GTC TAA ATC-3'および5'-GAT TTA GAC CAC TTG ACC AGT GAA AGA AGT TGC CTC-3'（V729L）；
5'-GAG GCA ACT TCT TTC ATT CGT CAA GTG GTC TAA ATC-3'および5'-GAT TTA GAC CAC TTG ACG AAT GAA AGA AGT TGC CTC-3'（V729F）。
【０４１４】
本発明の一実施形態は、群、pGT77、pGT78、pGT79、pGT1044、pGT1045、pGT1017、pGT1046、pGT44、pGT45、pGT46、pGT47、pGT1047、pGT1048、pGT-1049、pGT1050、pGT27、pGT28、pGT29、pGT30、pGT1055、pGT1056、PGT1057、およびpGT1058のベクターである。
【０４１５】
さらにもう一つの実施形態は、本明細書に記載する任意の目的のための、特に本発明の制御発現系で使用するための、群、pGT77、pGT78、pGT79、pGT1044、pGT1045、pGT1017、pGT1046、pGT44、pGT45、pGT46、pGT47、pGT1047、pGT1048、pGT1049、pGT1050、pGT27、pGT28、pGT29、pGT30、pGT1055、pGT1056、pGT1057、およびpGT1058のベクターの使用である。また、本発明の一実施形態は、本発明の制御発現系の一部としての群、pGT77、pGT78、pGT79、pGT1044、pGT1045、pGT1017、pGT1046、pGT44、pGT45、pGT46、pGT47、pGT1047、pGT1048、pGT1049、pGT1050、pGT27、pGT28、pGT29、pGT30、pGT1055、pGT1056、pGT1057、およびpGT1058のベクターである。
【０４１６】
また、群、pGT77、pGT78、pGT79、pGT1044、pGT1045、pGT1017、pGT1046、pGT44、pGT45、pGT46、pGT47、pGT1047、pGT1048、pGT1049、pGT1050、pGT27、pGT28、pGT29、pGT30、pGT1055、pGT1056、pGT1057、およびpGT1058のベクターを含む本発明の制御発現系であって、活性化因子が修飾PR調節因子、PRリガンド類似体、修飾抗プロゲスチン、修飾メソプロゲスチン、修飾プロゲスチン、修飾MFP、修飾アソプリスニル、BLX-93、BLX-899、BLX-952、BLX-610、BLX-117、BLX-784、またはBLX-913からなる群より選択されるものも、本発明の一部である。
【０４１７】
本発明の組成物および方法が、本明細書に記載した目的を実行し、本明細書に記載した目標および利点ならびに本発明に固有の目標および利点を獲得するのによく適していることは、当業者には容易に理解されるだろう。当業者は、本発明の組成物および方法の変形ならびに他の用途を思いつくだろうが、そのような変形は、ここに記載し、クレームするとおり、予想され、包含される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３７Ｃ】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【国際調査報告】
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