(57)【要約】  本発明は、プラスマロゲンの欠乏症が媒介する加齢に伴う疾患の診断及びリスク評価のための方法に関する。本発明は、プラスマロゲン生合成機能障害と、加齢関連障害の生化学的及び臨床的な所見との関係について記載する。具体的には、本発明は、成人発症性プラスマロゲン生合成障害（ＡＯ−ＰＢＤ）に罹患している対象における大腸癌、前立腺癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、腎臓癌、認知障害及び認知症の罹患率の増加について記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における成人発症性プラスマロゲン生合成障害を診断する方法であって、
ａ）ジアシルグリセリルホスホエタノールアミン、プラスマニルグリセリルホスホエタノールアミン、プラスメニルグリセリルホスホエタノールアミン、及び遊離脂肪酸からなる群から選択される、１又は複数の代謝産物マーカーについての定量的データを得るために、前記対象からの試料を解析するステップと、
ｂ）前記１又は複数の代謝産物マーカーについての前記定量的データと、１又は複数の基準試料から得た対応するデータとを比較するステップと
を含み、
前記比較を使用して、前記対象における成人発症性プラスマロゲン生合成障害の存在を決定することができる方法。
【請求項２】
対象におけるプラスマロゲン欠乏症関連ヒト健康障害又はプラスマロゲン欠乏症関連ヒト健康障害のリスクを診断する方法であって、
ａ）ジアシルグリセリルホスホエタノールアミン、プラスマニルグリセリルホスホエタノールアミン、プラスメニルグリセリルホスホエタノールアミン、及び遊離脂肪酸からなる群から選択される、１又は複数の代謝産物マーカーについての定量的データを得るために、前記対象からの試料を解析するステップと、
ｂ）前記１又は複数の代謝産物マーカーについての前記定量的データと、１又は複数の基準試料から得た対応するデータとを比較するステップと
を含み、
前記比較を使用して、前記対象におけるプラスマロゲン欠乏症関連障害又はプラスマロゲン欠乏症関連障害のリスクの存在を決定することができる方法。
【請求項３】
プラスマロゲン欠乏症関連障害が、乳癌、結腸直腸癌、前立腺癌、肺癌、卵巣癌、腎臓癌、アルツハイマー病、認知症又は認知障害からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
対象が２０歳超である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
対象におけるプラスマロゲン欠乏症関連ヒト健康障害又はプラスマロゲン欠乏症関連ヒト健康障害のリスクを診断する方法であって、
ａ）ジアシルグリセリルホスホエタノールアミン、プラスマニルグリセリルホスホエタノールアミン、プラスメニルグリセリルホスホエタノールアミン、及び遊離脂肪酸からなる群から選択される、１又は複数の代謝産物マーカーについての定量的データを得るために、前記対象からの試料を解析するステップと、
ｂ）内部対照の代謝産物に対する１又は複数の代謝産物マーカーそれぞれについての比を得るステップと、
ｃ）内部対照の代謝産物に対する前記１又は複数の代謝産物マーカーそれぞれの比と、１又は複数の基準試料から得た対応するデータとを比較するステップとを含み、
前記比較を使用して、前記対象におけるプラスマロゲン欠乏症関連障害又はプラスマロゲン欠乏症関連障害のリスクの存在を決定することができる方法。
【請求項６】
プラスマロゲン欠乏症関連障害が、乳癌、結腸直腸癌、前立腺癌、肺癌、卵巣癌、腎臓癌、アルツハイマー病、認知症又は認知障害からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
対象が２０歳超である、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プラスマロゲン欠乏症が媒介する加齢に伴う疾患の診断のための方法に関する。本発明は、プラスマロゲン生合成機能障害と、加齢関連障害の生化学的及び臨床的な所見との間の関係について記載する。具体的には、本発明は、プラスマロゲンのレベルが低下した対象における大腸癌、前立腺癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、腎臓癌、認知障害及び認知症の罹患率の増加について記載する。
【背景技術】
【０００２】
したがって、本願は、ヒトにおける、ペルオキシソーム性の機能障害の遅発性又は成人発症性の形態の発見について記載する。この疾患は、すべての年齢の対象において発症するが、発生率は、５０歳を過ぎると加齢と共に増加し、６０〜６９歳でピークに達し、それ以降は減少する。加齢関連プラスマロゲン欠乏症に罹患している対象においては、血清中の循環プラスマロゲンのレベルが異常に低く、加齢関連プラスマロゲン欠乏症ではない対象と比べて、大腸癌、前立腺癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、腎臓癌、認知障害及び認知症の罹患率が増加する。
【０００３】
最近になって、プラスマロゲンの生合成が、詳細に総説されている（Nagan N, Zoeller RA. Plasmalogens: biosynthesis and functions. Prog Lipid Res 2001; 40(3): 199-229）。プラスマロゲン生合成経路の最初の２段階は、もっぱらペルオキシソーム中で遂行される（完全な経路については、図１及び２２を参照されたい）。最初に、ジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ，dihydroxyacetone phosphate）の遊離ヒドロキシル基が、ＤＨＡＰアシルトランスフェラーゼ（ＤＨＡＰ−ＡＴ，DHAP acyltransferase）によってアセチル化される。次いで、アルキル−ＤＨＡＰシンターゼによりｓｎ−１アシル基を脂肪アルコールで置換することによって、エーテル結合（プラスマニル）が生み出される。点変異による、これらの２つの酵素のいずれかの機能の喪失、ペルオキシソーム性の標的化の障害、又は全般的なペルオキシソーム性の機能障害の結果、重度のプラスマロゲン欠乏症が生じる。残りの主要な合成プロセスは、小胞体（ＥＲ，endoplasmic reticulum）中で遂行され、ｓｎ−２位がアシル化され、ホスホエタノールアミンが、ｓｎ−３位に付加されて、プラスマニルグリセリルホスホエタノールアミン（ＧＰＥ，glycerlyphosphoethanolamine）を産生する。最後の段階では、１−Ｏ−アルキルエーテルを不飽和化して、ビニルエーテル（プラスメニル）ＧＰＥ種を形成するプラスマニルに特異的な酵素が関与する。このＧＰＥ種は通常、ＰｌｓＥｔｎ又はプラスメニルエタノールアミン（plasmenylethanolamine，ＰｌｓＥｔｎ）と呼ばれ、また一般的に、エタノールアミンプラスマロゲンとしても知られている。体内のすべての細胞が、これらの分子を合成することができる。
【０００４】
ペルオキシソームは、１９６０年代後半にde Duveによって最初に発見された（de Duve D. The peroxisome: a new cytoplasmic organelle. Proceedings of the Royal Society of London Series B, Containing papers of a Biological character 1969; 173(30): 71-83）。その時以来、５０を超える異なる生化学的経路が、ペルオキシソームによって遂行されることが記載されている（van den Bosch H, Schutgens RB, Wanders RJ, Tager JM. Biochemistry of peroxisomes. Annu Rev Biochem 1992; 61: 157-97）。９つの主たる生化学的な系を、表１に列挙する。ヒトの最初のペルオキシソーム性疾患（ツェルウェガー脳肝腎症候群）が、１９６４年にBowenらによって臨床的に記載された（Bowen P, Lee CS, Zellweger H, Lindenberg R. A Familial Syndrome of Multiple Congenital Defects. Bulletin of the Johns Hopkins Hospital 1964; 114: 402-14）。１９７３年には、これらの患者は、ミトコンドリアの機能に障害があり、機能性のペルオキシソームを有しないことが発見された（Goldfischer S, Moore CL, Johnson AB, et al. Peroxisomal and mitochondrial defects in the cerebro-hepato-renal syndrome. Science 1973; 182(107): 62-4）。現在、ペルオキシソーム起源として特徴付けられている、１７のヒトの疾患がある（Wandersによって概説されている（Wanders RJ. Peroxisomal disorders: clinical, biochemical, and molecular aspects. Neurochem Res 1999; 24(4): 565-80）、表２）。ペルオキシソーム性障害は均一ではない。異なる障害は、大きく異なる生化学的な異常を示し、これらの異常のいくつかは重複する。したがって、これらの疾患は、全般的、総合的なペルオキシソーム性の欠損があるペルオキシソームのバイオジェネシスの障害、又は特定のペルオキシソーム性のタンパク質若しくは酵素系の障害のいずれかとして特徴付けることができる（表３）。
【０００５】
現在特徴付けられているペルオキシソーム性障害のうち、肢根型点状軟骨異形成症（ＲＣＤＰ，Rhizomelic Chondrodysplasia Punctata）のみが、プラスマロゲン欠乏症単独で引き起こされるということができる。ＲＤＣＰ障害は、Ｉ型、ＩＩ型又はＩＩＩ型にさらにグループ化される。すべての３つのＲＤＣＰの型が、血漿中のプラスマロゲンのレベルの低下、及び肝臓におけるプラスマロゲン新規合成能力の低下を示す。これらの対象におけるペルオキシソームのそれ以外の機能は、Ｉ型ＲＣＤＰの場合のフィタン酸のα−酸化の減少以外は、正常であると考えられている。
【０００６】
ＲＣＤＰに罹患している対象は、いくつかある異常の中でも特に、重度の精神遅滞及び発育阻止に至る骨の異形成を示す。ＲＣＤＰの対象は、多数の神経学的な異常を示し、それらのうち、ミエリン形成の遅延が最も顕著である（Alkan A, Kutlu R, Yakinci C, Sigirci A, Aslan M, Sarac K. Delayed myelination in a rhizomelic chondrodysplasia punctata case: MR spectroscopy findings. Magnetic resonance imaging 2003; 21(1): 77-80、Sztriha L, Al-Gazali LI, Wanders RJ, Ofman R, Nork M, Lestringant GG. Abnormal myelin formation in rhizomelic chondrodysplasia punctata type 2 (DHAPAT-deficiency). Developmental medicine and child neurology 2000; 42(7): 492-5）。これは、プラスマロゲン合成の減少の直接的な結果であると考えられている。ＲＣＤＰの対象の大部分は、誕生から２年以内に死亡する。
【０００７】
異形成は、細胞の外観の異常であり、これは、新生物への変質に向かう早期の段階を示す。異形成は、細胞の前新生物状態である。この異常な増殖は、起源である系又は場所に限定され、例えば、上皮層における異形成は、より深い組織中には侵入することはなく、又は赤血求細胞系中の異形成（不応性貧血）は、もっぱら骨髄系及び心血管系内に留まる。異形成の最もよく知られている形態は、子宮頚部上皮内腫瘍（ＣＩＮ，cervical intraepithelial neoplasia）と呼ばれている、子宮頚癌の前駆体病変である。この病変は通常、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ，human papilloma virus）感染によって引き起こされる。ほとんど常に、女性は子宮頚部の異形成に気付かない。これは通常、スクリーニング試験、即ち、Ｐａｐスメアによって発見される。この試験の目的は、疾患がまだ異形成の段階にあり、治癒が容易である間の早期に、疾患を診断することである。異形成は、細胞が、その正常な形態から外れて、異常な、分化程度の低い形態へと変化し始めた、前癌病変の最も早期の形態である。上皮内癌は、「限局性の癌（cancer in place）」を意味し、異形成細胞の癌への最終的な変質を表すが、癌は、局所に留まり、元の部位からは移動していない。異形成は、癌ではない。
【０００８】
癌は、細胞が組織の同一性を失い、迅速に、調節されることなく増殖する原始的な細胞の形態へと元に戻ってしまう状態である。浸潤性細胞腫が、この筋道の最後の段階である。これは、元々の組織層を越えて侵入しており、また、身体のその他の部分へ拡散する（転移する）こともできる癌であり、癌の増殖がそこから始まり、影響を受ける臓器を破壊する。これは、治療することができるが、治療が常に成功するとは限らない。しかし、治療せずに放置すれば、ほとんど常に致命的となる。
【０００９】
要約すると、プラスマロゲン生合成の選択的な欠乏は、重度の神経学的な及び細胞増殖の異常の臨床所見に至ることが知られている。さらに、プラスマロゲン生合成の低下の、生存するうえでの不利は、深刻である。
【００１０】
癌、認知症又は認知機能の低下等の多くの各種のヒトの疾患の発生率が、加齢と共に増加することはよく知られている。疫学的及び統計学的な見地からは、これらの疾患が非常に類似しているように見えることが多い。しかし、臨床的な見地からは、癌、認知症及び認知機能の低下はそれぞれ、非常に異なる。現在のところ、これらの障害の最も大きなリスク要因は、対象の年齢である。さらに、大部分の癌、認知症及び認知機能の低下は、疾患が存在するが、無症候状態を示す、長期の前駆期（５〜１５年）を有することが十分に確立されている。明らかにリスクが上昇している対象を的確且つ正確に同定するための実際に役立つ方法は、たとえあったとしても、ごくわずかに過ぎない。したがって、癌、認知症及び認知機能の低下等の慢性の加齢関連障害の既知の生化学的な病因と因果関係がある生化学的な異常を有する、一般集団の対象のうちのサブセットを的確に同定し、次いで、これらの対象を、生化学的な異常を矯正し、この亜集団における疾患発症のリスクを低下させることができる安全で且つ良好な耐容性を示す治療剤を用いて治療することができるようになることが非常に強く求められている。
【００１１】
膜コレステロールの調節、膜の動態、ムスカリン受容体シグナル伝達、及びＡＰＰプロセシングの障害が、様々な程度で、認知症及び認知機能の低下において観察される種々の症状及び病態に関係しているとみなされている。これらの生化学的な系と認知症との間の関連性は十分に確立されている。アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣＥ，acetylcholinesterase）阻害剤は、シナプス間隙におけるＡＣｈの滞留時間を延長させ、したがって、ムスカリン受容体伝達を増加させることによって作用する（Behl P, Lanctot KL, Streiner DL, Guimont I, Black SE. Cholinesterase inhibitors slow decline in executive functions, rather than memory, in Alzheimer's disease: a 1-year observational study in the Sunnybrook dementia cohort. Current Alzheimer research 2006; 3(2): 147-56）。スタチンは、コレステロールのレベルを低下させることによって作用する（Sparks DL, Sabbagh M, Connor D, et al. Statin therapy in Alzheimer's disease. Acta Neurol Scand Suppl 2006; 185: 78-86）。現在、アミロイドを低下させる薬物が、開発途上にあり、アミロイド斑の蓄積の除去について、又はアミロイド斑の産生を減少させる目的で、臨床治験中である。したがって、上記で示した直接的な知見は、プラスマロゲン生合成の障害を、認知症及び認知機能の低下の病因と強力に関係付ける。本出願人の同時係属出願国際出願番号ＰＣＴ／ＣＡ２００７／０００３１３では、ホスファチジルコリン関連化合物、エタノールアミンプラスマロゲン、内因性脂肪酸、必須脂肪酸、脂質酸化副産物、及びこれらの代謝クラスの代謝産物誘導体から選択される代謝産物が、認知症に罹患している患者からの検体中では低いレベルにあることが見出された。本発明では、プラスマロゲンの減少が、その他の加齢関連疾患に罹患している患者において見出されている。
【００１２】
癌細胞について定義する特色の１つは、エネルギーを得るためには、呼吸にほとんど完全に依存する正常細胞とは異なり、癌細胞は、エネルギーを得るために、呼吸及び解糖の両方を活用することができる点である。癌に関しては、現在、多くの仕事が、解糖経路を阻害する薬物の開発に集中している。癌における好気性の解糖を定義する特色の１つが、ミトコンドリアのクエン酸の排出の増強及びアセチルＣｏＡを形成するための細胞質クエン酸の使用である。したがって、プラスマロゲン生合成の障害の結果、膜コレステロールレベルの増加及び細胞質のアセチルＣｏＡの活用の増加の両方が生じるという上記で示した直接的な知見は、プラスマロゲン生合成の障害を、癌の病因と強力に関係付ける。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】国際出願番号ＰＣＴ／ＣＡ２００７／０００３１３
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Nagan N, Zoeller RA. Plasmalogens: biosynthesis and functions. Prog Lipid Res 2001; 40(3): 199-229
【非特許文献２】de Duve D. The peroxisome: a new cytoplasmic organelle. Proceedings of the Royal Society of London Series B, Containing papers of a Biological character 1969; 173(30): 71-83
【非特許文献３】van den Bosch H, Schutgens RB, Wanders RJ, Tager JM. Biochemistry of peroxisomes. Annu Rev Biochem 1992; 61: 157-97
【非特許文献４】Bowen P, Lee CS, Zellweger H, Lindenberg R. A Familial Syndrome of Multiple Congenital Defects. Bulletin of the Johns Hopkins Hospital1964; 114: 402-14
【非特許文献５】Goldfischer S, Moore CL, Johnson AB, et al. Peroxisomal and mitochondrial defects in the cerebro-hepato-renal syndrome. Science 1973; 182(107): 62-4
【非特許文献６】Wanders RJ. Peroxisomal disorders: clinical, biochemical, and molecular aspects. Neurochem Res 1999; 24(4): 565-80
【非特許文献７】Alkan A, Kutlu R, Yakinci C, Sigirci A, Aslan M, Sarac K. Delayed myelination in a rhizomelic chondrodysplasia punctata case: MR spectroscopy findings. Magnetic resonance imaging 2003; 21(1): 77-80
【非特許文献８】Sztriha L, Al-Gazali LI, Wanders RJ, Ofman R, Nork M, Lestringant GG. Abnormal myelin formation in rhizomelic chondrodysplasia punctata type 2 (DHAPAT-deficiency). Developmental medicine and child neurology 2000; 42(7): 492-5
【非特許文献９】Behl P, Lanctot KL, Streiner DL, Guimont I, Black SE. Cholinesterase inhibitors slow decline in executive functions, rather than memory, in Alzheimer's disease: a 1-year observational study in the Sunnybrook dementia cohort. Current Alzheimer research 2006; 3(2): 147-56
【非特許文献１０】Sparks DL, Sabbagh M, Connor D, et al. Statin therapy in Alzheimer's disease. Acta Neurol Scand Suppl 2006; 185: 78-86
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本出願は、血漿中のプラスマロゲンのレベルが異常に低いヒト成人（４０歳を超える）のサブセットについて記載する。この欠乏症は、プラスマロゲン生合成の低下に起因し、酸化的ストレスの増加には起因しないことが決定されている。この障害の対象では、認知障害、認知症及び癌の罹患率が増加する。これらの疾患の早期診断、又はこれらの疾患を発症する前の対象におけるリスク評価により、これらの対象の長期の生活の質が大幅に改善され、既存の医療制度に対する長期のコストが大幅に削減されるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、プラスマロゲン欠乏症が媒介する加齢に伴う疾患の診断のための方法に関する。本発明は、プラスマロゲン生合成の機能障害と、加齢関連障害の生化学的及び臨床的な所見との間の関係について記載する。具体的には、本発明は、プラスマロゲンのレベルが低下した対象における大腸癌、前立腺癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、腎臓癌、認知障害及び認知症の罹患率の増加について記載する。
【００１７】
本発明は、未知の疾患状況の対象から採取した血漿検体中に存在する１又は複数のプラスメニルエーテル脂質又はプラスマニルエーテル脂質のレベルを測定し、これらのレベルを「正常」レベル又は加齢関連プラスマロゲン欠乏症の基準レベルと比較し、この比較を通して、加齢関連プラスマロゲン欠乏症陽性又は加齢関連プラスマロゲン欠乏症陰性のいずれかの診断に到達することによって、１又は複数の対象における加齢関連プラスマロゲン欠乏症の存在を診断する新規な方法を開示する。
【００１８】
本発明は、未知の疾患状況の１又は複数の対象から採取した血漿検体中に存在する１又は複数のプラスメニルエーテル脂質又はプラスマニルエーテル脂質の測定によって数学的に決定したプラスマロゲンスコアを比較し、このスコアを「正常」レベル又は加齢関連プラスマロゲン欠乏症の基準レベルと比較し、この比較を通して、加齢関連プラスマロゲン欠乏症陽性又は加齢関連プラスマロゲン欠乏症陰性のいずれかの診断に到達することによって、１又は複数の対象における加齢関連プラスマロゲン欠乏症の存在を診断する新規な方法を開示する。
【００１９】
本発明は、未知の疾患状況の１又は複数の対象から採取した血漿検体からの、加齢関連プラスマロゲン欠乏症によって影響を受けていない又は最小限にしか影響を受けていない１又は複数の内因性分子に対する、１又は複数のプラスメニルエーテル脂質又はプラスマニルエーテル脂質の比を比較し、これらの比を「正常」レベル又は加齢関連プラスマロゲン欠乏症の基準レベルと比較し、この比較を通して、加齢関連プラスマロゲン欠乏症陽性又は加齢関連プラスマロゲン欠乏症陰性のいずれかの診断に到達することによって、１又は複数の対象における加齢関連プラスマロゲン欠乏症の存在を診断する新規な方法を開示する。
【００２０】
加齢関連プラスマロゲン欠乏症の対象は、癌及び認知症に罹患するリスクが上昇しているので、本発明は、癌又は認知症の発症のリスクが上昇している対象を同定するための新規な方法を開示する。したがって、本発明は、未知の疾患状況の対象から採取した血漿検体中に存在する１又は複数のプラスメニルエーテル脂質又はプラスマニルエーテル脂質のレベルを測定し、これらのレベルを「正常」レベル又は加齢関連プラスマロゲン欠乏症の基準レベルと比較し、この比較を通して、リスクの上昇の有無の決定に到達することによって、１又は複数の対象における癌又は認知症に罹患するリスクの上昇を診断する新規な方法を開示する。
【００２１】
加齢関連プラスマロゲン欠乏症の対象は、癌及び認知症に罹患するリスクが上昇しているので、本発明は、癌又は認知症の発症のリスクが上昇している対象を同定するための新規な方法を開示する。したがって、本発明は、未知の疾患状況の１又は複数の対象から採取した血漿検体中に存在する１又は複数のプラスメニルエーテル脂質又はプラスマニルエーテル脂質の測定から数学的に決定したプラスマロゲンスコアを比較し、このスコアを「正常」レベル又は加齢関連プラスマロゲン欠乏症の基準レベルと比較し、この比較を通して、リスクの上昇の有無の決定に到達することによって、１又は複数の対象における癌又は認知症に罹患するリスクの上昇を診断する新規な方法を開示する。
【００２２】
加齢関連プラスマロゲン欠乏症の対象は、癌及び認知症に罹患するリスクが上昇しているので、本発明は、未知の疾患状況の１又は複数の対象から採取した血漿検体からの、加齢関連プラスマロゲン欠乏症によって影響を受けていない又は最小限にしか影響を受けていない１又は複数の内因性分子に対する、１又は複数のプラスメニルエーテル脂質又はプラスマニルエーテル脂質の比を比較し、これらの比を「正常」レベル又は加齢関連プラスマロゲン欠乏症の基準レベルと比較し、この比較を通して、リスクの上昇の有無の決定に到達することによって、１又は複数の対象における癌又は認知症に罹患するリスクの上昇を診断する新規な方法を開示する。
【００２３】
癌又は認知症に現在罹患している対象においては、加齢関連プラスマロゲン欠乏症の罹患率が増加するので、本発明は、診断未確定の癌又は認知症の対象を同定するための新規な方法を開示する。したがって、本発明は、未知の疾患状況の対象から採取した血漿検体中に存在する１又は複数のプラスメニルエーテル脂質又はプラスマニルエーテル脂質のレベルを測定し、これらのレベルを「正常」レベル又は加齢関連プラスマロゲン欠乏症の基準レベルと比較することによって、１又は複数の対象における診断未確定の癌又は認知症を同定する新規な方法を開示する。加齢関連プラスマロゲン欠乏症について結果が陽性である対象は、次いで、従来の癌及び認知症の診断方法によって試験して、前記対象中に存在する癌の場所並びに／又は認知症の重症度及び型を決定する。
【００２４】
癌又は認知症に現在罹患している対象においては、加齢関連プラスマロゲン欠乏症の罹患率が増加するので、本発明は、診断未確定の癌又は認知症の対象を同定するための新規な方法を開示する。したがって、本発明は、未知の疾患状況の１又は複数の対象から採取した血漿検体中に存在する１又は複数のプラスメニルエーテル脂質又はプラスマニルエーテル脂質の測定から数学的に決定したプラスマロゲンスコアを比較し、このスコアを「正常」レベル又は加齢関連プラスマロゲン欠乏症の基準レベルと比較することによって、１又は複数の対象における診断未確定の癌又は認知症を同定する新規な方法を開示する。加齢関連プラスマロゲン欠乏症について結果が陽性である対象は、次いで、従来の癌及び認知症の診断方法によって試験して、前記対象中に存在する癌の場所並びに／又は認知症の重症度及び型を決定する。
【００２５】
癌又は認知症に現在罹患している対象においては、加齢関連プラスマロゲン欠乏症の罹患率が増加するので、本発明は、診断未確定の癌又は認知症の対象を同定するための新規な方法を開示する。したがって、本発明は、未知の疾患状況の１又は複数の対象から採取した血漿検体からの、加齢関連プラスマロゲン欠乏症によって影響を受けていない又は最小限にしか影響を受けていない１又は複数の内因性分子に対する、１又は複数のプラスメニルエーテル脂質又はプラスマニルエーテル脂質の比を比較し、これらの比を「正常」レベル又は加齢関連プラスマロゲン欠乏症の基準レベルと比較することによって、１又は複数の対象における診断未確定の癌又は認知症を同定する新規な方法を開示する。加齢関連プラスマロゲン欠乏症について結果が陽性である対象は、次いで、従来の癌及び認知症の診断方法によって試験して、前記対象中に存在する癌の場所並びに／又は認知症の重症度及び型を決定する。
【００２６】
本発明は、加齢関連プラスマロゲン欠乏症標的療法が有益であろう個体を同定するための方法を提供し、この方法は、表５に列挙した代謝産物又は密接に関連する実体のすべて又はサブセットに関する定量的データを得るために、試験対象からの血液試料を解析するステップと、前記試験対象における前記代謝産物に関して得たデータを、複数の加齢関連プラスマロゲン欠乏症のヒトの解析から又は複数の非加齢関連プラスマロゲン欠乏症のヒトから得た基準データと比較するステップと、前記比較を使用して、試験対象において加齢関連プラスマロゲン欠乏症標的療法が有益である確率を決定するステップとを含む。
【００２７】
本発明は、加齢関連プラスマロゲン欠乏症標的療法の効果をモニターするための方法を提供し、この方法は、表５に列挙した代謝産物又は密接に関連する実体のすべて又はサブセットに関する定量的データを得るために、そのような療法を開始する前、施している間、又は施した後に試験対象からの複数の血液検体を解析するステップと、前記試料中の前記代謝産物について得たデータを、相互に、又は複数の加齢関連プラスマロゲン欠乏症のヒトの解析から若しくは複数の非加齢関連プラスマロゲン欠乏症のヒトから得た基準データと比較するステップと、前記比較を使用して、試験対象において加齢関連プラスマロゲン欠乏症標的療法の継続治療が有益である確率を決定するステップとを含む。
【００２８】
文字通り誰もが生涯にわたる長期にスクリーニングを受けて、リスクを評価することができることから、加齢関連プラスマロゲン欠乏症及び加齢関連プラスマロゲン欠乏症が引き起こすであろう疾患の診断に対する本発明の影響力は多大であろう。
【００２９】
加齢関連プラスマロゲン欠乏症と、癌及び認知症との間の因果関係が、以前に記載されたいずれの関係よりも強く、本発明に記載する方法の性能の特徴が、一般集団についての代表的なものであることを考慮すると、これらの方法単独でも、癌、認知症及び認知障害についての、いずれかのその他の現在利用可能なスクリーニングの方法よりも優れている場合がある。これは、本発明の方法が、臨床症状が出現する前に疾患の進行を検出する可能性を有し得、これらの疾患に罹患している対象にとっては、より早期の介入及びそれに続くより良好な予後が可能となるからである。
【００３０】
本発明のこの概要は、必ずしも本発明のすべての特徴を記載するとは限らない。
【００３１】
本発明のこれら及びその他の特徴が、添付の図面を参照する以下の説明からより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】プラスマロゲンの生合成経路を示す図である。
【図２】異なる疾患にわたる、ジアシル１６：０／１８：０に対するプラスメニル１６：０／２２：６の比の平均を示すグラフである。
【図３】異なる疾患にわたる、ジアシル１６：０／１８：０に対するプラスメニル１６：０／１８：２の比の平均を示すグラフである。
【図４】ジアシル１６：０／１８：０（Ｍ０１）、プラスマニル１６：０／１８：２（Ｍ１１）、プラスメニル１６：０／１８：２（Ｍ１６）、プラスマニル１６：０／２２：６（Ｍ０９）及びプラスメニル１６：０／２２：６（Ｍ１９）の平均＋／−ＳＥＭを示すグラフである。
【図５】正常者集団におけるプラスマロゲンの濃度分布を示すグラフである。
【図６】認知機能から確認された正常者におけるプラスマロゲンの濃度分布を示すグラフである。
【図７】ＡＤである可能性が高い患者におけるプラスマロゲンの濃度分布を示すグラフである。
【図８】腎臓癌患者におけるプラスマロゲンの濃度分布を示すグラフである。
【図９】前立腺癌患者におけるプラスマロゲンの濃度分布を示すグラフである。
【図１０】卵巣癌患者におけるプラスマロゲンの濃度分布を示すグラフである。
【図１１】肺癌患者におけるプラスマロゲンの濃度分布を示すグラフである。
【図１２】大腸癌患者におけるプラスマロゲンの濃度分布を示すグラフである。
【図１３】乳癌患者におけるプラスマロゲンの濃度分布を示すグラフである。
【図１４】血清プラスマロゲンレベルが正常レベルの５０％未満である対象のパーセントを示すグラフである。
【図１５】認知症の重症度及びＳＤＡＴの病態の、血清ＰｌｓＥｔｎレベルに対する影響を示すグラフである。（図１５Ａ）モノ及びジ不飽和ＰｌｓＥｔｎ。（図１５Ｂ）ポリ不飽和ＰｌｓＥｔｎ及び遊離ＤＨＡ（２２：６）。ＰｌｓＥｔｎの略語：（脂肪酸炭素：ビニルエーテル二重結合を含まない二重結合）及びグリセロール骨格上の位置（ｓｎ−１／ｓｎ−２）。２２：６は、遊離ＤＨＡを示す。値は、平均±ＳＥＭ（ｎ＝１９〜１１２）として表す。
【図１６】２５６人のＳＤＡＴ対象における、疾患の重症度及び血清ＰｌｓＥｔｎ１６：０／２２：６レベルの線形回帰分析を示すグラフである。Ｘ＝ＡＯ−ＰＢＤ発症の予測される時期。値は、平均±ＳＥＭ（ｎ＝６６〜１１２）として表す。臨床上の進行として、７．５ＡＤＡＳ−ｃｏｇ点／年を想定している。
【図１７】認知症の病因を示す図である。
【図１８】これから１５年のうちに癌を発症すると予測される健常な対象のパーセントを示すグラフである。
【図１９】加齢関連プラスマロゲン欠乏症の５０〜５９歳及び６０〜６９歳の健常な人のうち、２０年以内に認知症又は１５年以内に癌を発症すると予測されるパーセント、並びに加齢関連プラスマロゲン欠乏症が原因であると予測される症例のパーセントを示すグラフである。
【図２０】アルツハイマー病でないことが剖検により確認された対象における、プラスメニル１６：０／２２：６の分布を示すグラフである。
【図２１】アルツハイマー病であることが剖検により確認された対象における、プラスメニル１６：０／２２：６の分布を示すグラフである。
【図２２】哺乳類におけるプラスマロゲンの生合成経路を示す図である。
【図２３】健常なヒトの血清における、ＰｌｓＥｔｎ１６：０／２２：６のＱ−Ｔｒａｐフローインジェクション分析の検量線を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明は、プラスマロゲン欠乏症が媒介する加齢に伴う疾患の診断のための方法に関する。本発明は、プラスマロゲン生合成の機能障害と、加齢関連障害の生化学的及び臨床的な所見との間の関係について記載する。具体的には、本発明は、プラスマロゲンのレベルが低下した対象における大腸癌、前立腺癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、腎臓癌、認知障害及び認知症の罹患率の増加について記載する。
【００３４】
したがって、本発明は、ヒトにおける、ペルオキシソーム性の機能障害の遅発性又は成人発症性の形態の発見について記載する。この疾患は、すべての年齢の対象において発症するが、発生率は、５０歳を過ぎると加齢と共に増加し、６０〜６９歳でピークに達し、それ以降は減少する。加齢関連プラスマロゲン欠乏症に罹患している対象においては、血清中の循環プラスマロゲンのレベルが異常に低く、加齢関連プラスマロゲン欠乏症ではない対象と比べて、大腸癌、前立腺癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、腎臓癌、認知障害及び認知症の罹患率が増加する。加齢関連プラスマロゲン欠乏症、又は成人発症性プラスマロゲン生合成障害、又はＡＯ−ＰＢＤ（adult onset plasmalogen biosynthesis disorder）という用語は、この障害を説明するために、本出願を通して使用されている。本発明の実施形態は、大腸癌、前立腺癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、腎臓癌、認知障害又は認知症の罹患率の増加について例示しているが、本発明により、その他の加齢関連プラスマロゲン欠乏症障害を診断することができるか、又は前記障害を獲得するリスクを査定することができる。
【００３５】
本発明の診断方法は、最小限に侵襲性であり、ＡＯ−ＰＢＤを示す。この方法の、現在の臨床化学実験室ハードウェアに対応する臨床アッセイへの転換は、商業的に許容でき、有効である。さらに、本発明の方法は、試験を実施し、解釈するために、高度に訓練された人材を必要としない。
【００３６】
生物学的試料は、体内の任意の場所を起源としてよく、例として、これらに限定されないが、血液（血清／血漿）、脳脊髄液（ＣＳＦ，cerebral spinal fluid）、尿、糞便、息、唾液、又は腫瘍、隣接する正常な平滑筋及び骨格筋、脂肪組織、肝臓、皮膚、毛、脳、腎臓、膵臓、肺、大腸、胃を含めた任意の固形組織の生検等が挙げられる。特に興味深いのは、血清又はＣＳＦである試料である。「血清」という用語を本明細書では使用するが、当業者であれば、血漿、又は全血若しくは全血の一部を使用することができることを認識するであろう。
【００３７】
患者から血液試料を取り出す場合、試料を処理することができる、いくつかの方法がある。処理の範囲は、手を加えない（即ち、凍結全血）、ほとんど処理しない状態であっても、又は特定の細胞型の単離のように複雑な処理であってもよい。最も一般的且つ日常的な手順は、全血からの血清又は血漿のいずれかの調製である。また、ろ紙又はその他の固定化材料等の固相の支持体上に、血液試料をスポットすることを含めた、すべての血液試料の処理方法も本発明によって企図される。
【００３８】
次いで、上記記載の処理済み血液試料をさらに処理して、これを、処理済み血清試料内に含有されている生体化学物質の検出及び測定において利用する順序立った解析技法に適合させる。処理の型は、さらなる処理はしない、ほとんど処理しない状態から、示差的な抽出及び化学的な誘導体化のように複雑な処理に及んでよい。抽出方法として、メタノール、エタノール、アルコールと水の混合液、又は酢酸エチル若しくはヘキサン等の有機溶媒等、通常の溶媒中における超音波処理、ソックスレー抽出、マイクロ波照射抽出（ＭＡＥ，microwave assisted extraction）、超臨界流体抽出法（ＳＦＥ，supercritical fluid extraction）、高速溶媒抽出（ＡＳＥ，accelerated solvent extraction）、加圧液体抽出（ＰＬＥ，pressurized liquid extraction）、加圧熱水抽出（ＰＨＷＥ，pressurized hot water extraction）、及び／又は界面活性剤支援抽出（ＰＨＷＥ，surfactant assisted extraction）が挙げられるであろう。ＨＴＳ解析のための代謝産物を抽出する好ましい方法は、非極性の代謝産物を有機溶媒中に溶解させ、極性の代謝産物を水性溶媒中に溶解させる、液体／液体抽出の実施である。
【００３９】
本発明の１つの実施形態は、サブセットがＡＯ−ＰＢＤと正常な血清との間で統計学的に有意に異なる存在量を有することが見出された、代謝産物のパネルを検出し、測定する。１つの実施形態では、代謝産物のパネルは、表５に列挙する１又は複数の代謝産物である。
【００４０】
本発明は、患者におけるＡＯ−ＰＢＤ又はＡＯ−ＰＢＤのリスクを診断するための方法を提供し、この方法は、
ａ）１又は複数の代謝産物マーカーについての定量的データを得るために、前記患者からの試料を解析するステップと、
ｂ）前記１又は複数の代謝産物マーカーについての定量的データを、１又は複数の基準試料から得た対応するデータと比較するステップとを含み、
前記比較を使用して、ＡＯ−ＰＢＤ又はＡＯ−ＰＢＤのリスクを診断することができる。
【００４１】
試料を解析するステップは、質量分析計（ＭＳ，mass spectrometer）を使用して、試料を解析することを含むことができる。例えば、限定する意図はないが、そのような質量分析計は、ＦＴＭＳ、orbitrap、飛行時間（ＴＯＦ，time of flight）、又は四極子の型であってよい。代替的に、質量分析計に、追加の質前置検出器質量フィルターが備わっていてもよいであろう。例えば、限定する意図はないが、そのような機器は通常、四極子ＦＴＭＳ（Ｑ−ＦＴＭＳ，quadrupole-FTMS）、四極子ＴＯＦ（Ｑ−ＴＯＦ，quadrupole-TOF）、又は三連四重極（ＴＱ，triple quadrupole、又はＱＱＱ）と呼ばれる。さらに、質量分析計は、親イオン検出モード（ＭＳ）又はＭＳｎモードのいずれかにおいて運転することができるであろう。但し、ｎ≧２である。ＭＳｎは、親イオンが、衝突誘起解離（ＣＩＤ，collision induced dissociation）又はその他の断片化の手順によって断片化されて、断片イオンを生み出し、次いで、前記断片のうちの１又は複数が、質量分析計によって検出される状況を指す。次いで、そのような断片は、さらに断片化されて、さらなる断片を生み出すことができる。代替的に、液体若しくは気体のクロマトグラフシステムを使用して、又は直接的な注入によって、試料を質量分析計に導入することもできるであろう。
【００４２】
当技術分野で知られている任意の適切な方法を使用して、抽出した試料を解析することができる。例えば、いずれの場合であっても限定する意図はないが、生物学的試料の抽出物は、本質的には、いずれの質量分析プラットフォーム上においても、直接的な注入又はクロマトグラフ的な分離後のいずれかによって解析することができる。典型的な質量分析計は、試料内の分子をイオン化する源、及びイオン化された分子若しくは分子の断片を検出するための検出器からなる。通常の源の非限定的な例として、電子衝撃、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ，electrospray ionization）、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ，atmospheric pressure chemical ionization）、大気圧光イオン化（ＡＰＰＩ，atmospheric pressure photo ionization）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ，matrix assisted laser desorption ionization）、表面増強レーザー脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ、surface enhanced laser desorption ionization）、及びそれらの誘導形態が挙げられる。通常の質量の分離及び検出システムとして、四極子、四重極イオントラップ、線形イオントラップ、飛行時間（ＴＯＦ）、磁場、イオンサイクロトロン（ＦＴＭＳ）、Orbitrap、並びにそれらの誘導形態及び組合せを挙げることができる。ＦＴＭＳがその他のＭＳに基づくプラットフォームを上回る利点は、わずか数百分の１ダルトンだけ異なる代謝産物の分離を可能にする、その高い分解能である。こうした分離の多くは、分解能がより低い機器では達成されないであろう。
【００４３】
「代謝産物」という用語は、特異的な小型分子を意味し、そのレベル又は強度を試料中で測定し、この分子を、疾患状況を診断するためのマーカーとして使用することができる。これらの小型分子はまた、本明細書では、「代謝産物マーカー」、「代謝産物構成成分」、「バイオマーカー」又は「生化学的マーカー」とも呼ぶことができる。
【００４４】
代謝産物は一般に、上記の方法において使用する質量分析の技法によって測定した、それらの正確な質量によって特徴付けられる。正確な質量はまた、「正確な中性質量」又は「中性質量」と呼ぶこともできる。代謝産物の正確な質量は、本明細書では、ダルトン（Ｄａ，Dalton）、又はそれと実質的に同等な質量で示す。「それと実質的に同等な」によって、当業者であれば認識するであろうが、正確な質量の＋／−５ｐｐｍの差は、同一の代謝産物を示すことを意味する。正確な質量は、中性の代謝産物の質量として示す。当業者であれば認識するであろうが、試料の解析の間に生じる代謝産物のイオン化においては、代謝産物は、１又は複数の水素原子の喪失又は獲得のいずれか、及び電子の喪失又は獲得を引き起こす。これは、正確な質量を「イオン化された質量」に変化させ、「イオン化された質量」は、正確な質量とは、イオン化の間に喪失又は獲得した水素（又はナトリウム、カリウム、アンモニア及び当技術分野で既知のその他等のその他の付加体）並びに電子の質量だけ異なる。別段の指定がない限り、本明細書では、正確な中性質量について言及する。
【００４５】
同様に、代謝産物をその分子式によって記載する場合には、中性の代謝産物の分子式を示す。当然ながら、イオン化された代謝産物の分子式は、中性の分子式とは、イオン化の間に喪失又は獲得した水素（又はナトリウム、カリウム、アンモニア及び当技術分野で既知のその他等のその他の付加体）の数だけ異なる。
【００４６】
データを、解析の間に収集し、１又は複数の代謝産物についての定量的データを得る。試料中に存在する特異的な代謝産物のレベル又は強度を測定することによって、「定量的データ」を得る。
【００４７】
定量的データを、１又は複数の基準試料からの対応するデータと比較する。「基準試料」は、特定の疾患状況についての任意の適切な基準試料である。例えば、いずれの方法においても限定する意図はないが、本発明では、基準試料は、非ＡＯ−ＰＢＤの対照の個体、即ち、いずれの加齢関連プラスマロゲン欠乏症疾患にも罹患していない人（また、本明細書では「『正常な』対応物」とも呼ぶ）からの試料であってよい。当業者であれば理解するであろうが、２つ以上の基準試料を、定量的データと比較するために使用することができる。
【００４８】
本発明のさらに別の実施形態では、患者におけるＡＯ−ＰＢＤ又はＡＯ−ＰＢＤのリスクを診断するための方法を提供する。この方法は、
ａ）１又は複数の代謝産物マーカーについての定量的データを得るために、前記患者からの試料を解析するステップと、
ｂ）内部対照の代謝産物に対する１又は複数の代謝産物マーカーそれぞれについての比を得るステップと、
ｃ）内部対照の代謝産物に対する前記１又は複数の代謝産物マーカーそれぞれの比を、１又は複数の基準試料から得た対応するデータと比較するステップとを含み、
前記比較を使用して、ＡＯ−ＰＢＤ又はＡＯ−ＰＢＤのリスクを診断することができる。
【００４９】
試料を解析するステップは、上記の記載に従うことができる。１又は複数の基準試料は、非ＡＯ−ＰＢＤの対照の個体から得た第１の基準試料であってよい。「内部対照の代謝産物」は、患者内に天然に存在する内因性代謝産物を指す。疾患状況を通じて変動しない任意の適切な内因性代謝産物を、内部対照の代謝産物として使用することができる。例えば、限定する意図はないが、内部対照の代謝産物は、表５に示すように、ホスファチジルエタノールアミン１６：０／１８：０（ＰｔｄＥｔｎ（phosphatidylethanolamine）１６：０／１８：０，Ｍ０１）であってよく；この内部対照の代謝産物は、Ｃ３９Ｈ７８ＮＯ８Ｐの分子式を有し、以下に示す構造によって特徴付けられる。
【００５０】
【化１】
2010523986.tif 000002
【００５１】
内部対照の代謝産物に対する代謝産物マーカーの比を使用することによって、代謝産物マーカーの絶対的なレベルの測定よりも、安定で且つ再現性のある測定が得られる。内部対照の代謝産物は、すべての試料中に天然に存在し、疾患状況を通じて顕著に変動するようには見えないので、（取扱い、抽出等による）試料対試料のばらつきが最小限に抑えられる。
【００５２】
本発明に記載する分子を、表５に列挙する。分子のこの選択は、ジアシルＧＰＥ、プラスマニルＧＰＥ及びプラスメニルＧＰＥの代表的なサンプリングを表す。しかし、類似の生化学的経路に関与する類似の構造のその他の分子を類似の目的で以下の記載に従って使用することができるであろうことを認識する当業者も中にはあろう。本発明のすべてのそのような変形形態が、本明細書では企図される。
【００５３】
また、本発明は、ＡＯ−ＰＢＤの診断のための高スループットな方法も提供する。この方法には、親分子の断片化が関与し；非限定的な例では、これは、Q-Trap（商標）システムによって達成することができる。代謝産物の検出は、比色分析化学アッセイ（ＵＶ若しくはその他の波長）、抗体に基づいた酵素結合免疫吸着測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ，enzyme-linked immunosorbant assay）、核酸検出アッセイのためのチップに基づいたポリメラーゼ連鎖反応、ビーズに基づいた核酸検出の方法、試験紙による化学アッセイ又はその他の化学反応、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ，magnetic resonance imaging）、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ，positron emission tomography）による走査、コンピュータ断層撮影（ＣＴ，computerized tomography）による走査、核磁気共鳴（ＮＭＲ，nuclear magnetic resonance）等の画像解析、及び種々の質量分析に基づいたシステムを含めた、種々のアッセイプラットフォームのうちの１つを使用して実施することができる。好ましい方法は、高スループットスクリーニングアッセイである。  
【００５４】
高スループットスクリーニング（ＨＴＳ，high throughput screening）を、Agilent 1100 LCシステムにつないだ線形イオントラップ質量分析計（Q-trap 4000、Applied Biosystem社製）を用いて実施した。試料を、１５μＬの内部標準（５μｇ／ｍＬの（２４−１３Ｃ）−コール酸、メタノール中）を、各試料の１２０μＬの酢酸エチル画分に添加することによって調製した。１００μｌの試料を、フローインジェクション分析（ＦＩＡ，flow injection analysis）によって注入し、負のＡＰＣＩモード下でモニターした。この方法は、各代謝産物及び１つの内部標準についての１つの親／娘の遷移の複数反応のモニタリング（ＭＲＭ，multiple reaction monitoring）走査モードに基づいた。各移行を、７０ミリ秒間、２．４７５秒の全サイクル時間にわたり走査した。溶出を、ＭｅＯＨ中、１０％ＥｔＯＡｃの均一濃度、３６０μｌ／分の流速で１分間実施した。源のパラメータを以下に設定した：ＣＵＲ：１０．０、ＣＡＤ：８、ＮＣ：−４．０、ＴＥＭ：４００、ＧＳ１：３０、ＧＳ２：５０、インターフェイスヒーターはスイッチを入れた。化合物のパラメータを以下に設定した：ＤＰ：−１２０．０、ＥＰ：−１０、ＮＣ：−４．０、ＣＥ：−４０、ＣＸＰ：−１５。図２３に、内部標準（２４−１３Ｃ）−コール酸）の一定濃度を維持しながら、正常な血清試料を希釈することによって得たＰｌｓＥｔｎ１６：０／２２：６について、この方法の代表的な検量線を図示する。
【００５５】
本発明によると、プラスマロゲンの減少と癌及び／又は認知症との間には診断上の関係がある。加齢関連パルスマロゲン（palsmalogen）欠乏症の対象は、癌又は認知症を発症するリスクが上昇しているので、本発明は、未知の疾患状況の対象から採取した血漿検体中に存在する１又は複数のプラスメニルエーテル脂質又はプラスマニルエーテル脂質のレベルを測定し、これらのレベルを「正常」レベル又は加齢関連欠乏症の基準レベルと比較し、この比較を通して、リスクの上昇の有無の決定に到達することによって、対象における癌又は認知症に罹患するリスクの上昇を診断する方法も提供する。本発明のこの態様による試料及び診断方法は、上記の詳細な記載に従う。
【００５６】
癌又は認知症に現在罹患している対象においては、加齢関連プラスマロゲン欠乏症の罹患率が増加するので、本発明は、診断未確定の癌又は認知症の対象を同定するための新規な方法も開示する。したがって、本発明は、未知の疾患状況の対象から採取した血漿検体中に存在する１又は複数のプラスメニルエーテル脂質又はプラスマニルエーテル脂質のレベルを測定し、これらのレベルを「正常」レベル又は加齢関連プラスマロゲン欠乏症の基準レベルと比較することによって、１又は複数の対象における診断未確定の癌又は認知症を同定する新規な方法を開示する。本発明のこの態様による試料及び診断方法は、上記の詳細な記載に従う。加齢関連プラスマロゲン欠乏症について結果が陽性である対象は、次いで、従来の癌及び認知症の診断方法によって試験して、前記対象中に存在する癌の場所並びに／又は認知症の重症度及び型を決定する。
【００５７】
本発明の実用性を、以下の実施例を使用してさらに例証する。
［実施例］
【実施例１】
【００５８】
ＡＯ−ＰＢＤの個別の独特な疾患状況としての特徴付け
ＡＯ−ＰＢＤが、本当に個別の疾患状況であるのか、それとも以前に特徴付けられたヒト疾患の単なる症状であるのかを決定するために、以下の実験を実行した。
【００５９】
並存疾患の解析
ＲＣＤＰの症状が、癌及び神経学的な疾患の両方に関係するとみなされていることから、肺癌、乳癌、大腸癌、前立腺癌、卵巣癌及び腎臓癌、３つの型の多発性硬化症（再発寛解型、二次性進行型及び一次性進行型）、可能性が高いアルツハイマー型の認知症、並びに病理学的に確認されたアルツハイマー病における種々のＧＰＥのレベルを調査した。４つのジアシルＧＰＥ、８つのプラスマニルＧＰＥ及び８つのプラスメニルＧＰＥ、並びに遊離ＤＨＡ及びアラカドン酸の血清レベルを、種々の年齢及び疾患の１３６９人の対象において解析した（表４及び５）。表６〜１１は、研究した分子のそれぞれについての結果を示す。図２及び３は、２つの原型的なプラスメニルＧＰＥ（それぞれ１６：０／１８：２及び１６：０／２２：６）の平均及びＳＥＭを示す。プラスメニル１６：０／１８：２は、ｓｎ−２において単純なジ不飽和脂肪酸を含有する原型的な白質のプラスマロゲン（リノール酸）であり、プラスメニル１６：０／２２：６は、ｓｎ−２においてポリ不飽和脂肪酸を含有する原型的な灰白質のプラスマロゲン（ＤＨＡ）である。各分子を、ジアシルＧＰＥ１６：０／１８：０に対する比として表し、観察しやすいように、対照集団の比の平均に対してさらに正規化する。プラスメニル１６：０／１８：２及び１６：０／２２：６は、癌の群及び可能性が高いアルツハイマー群のすべてにおいて有意により低いが、多発性硬化症の群ではいずれもがそうではなかった。実際、プラスメニル１６：０／２２：６は、二次性進行型ＭＳ及び一次性進行型ＭＳにおいては、実際に、統計学的に上昇している。これら２つのグラフからのその他の重要な観察は、５０〜５９歳の年齢群と比較すると、６０〜６９歳の年齢群では、プラスマロゲンが有意に減少することである。
【００６０】
レベルの低下は、プラスマロゲンの酸化的分解の増加に起因するか否かの決定
図１及び２２に示すように、
プラスマロゲン合成の最後の段階がＥＲにおいて生じ、１−Ｏ−エーテルの１−Ｏ−ビニルエーテルへの脱飽和が関与する。この１−Ｏ−ビニルエーテルは、プラスマロゲンの特性の多く、特に、抗酸化能力にとって重大な意味をもつ。合成とは関係のない、酸化的ストレスの増加に至る状況はいずれも、プラスメニル種を優先的に消滅させるであろう。このことを調査するために、１６：０／１８：２及び１６：０／２２：６についてプラスマニル／プラスメニルの対を測定した（図４）。観察されたのは、血清プラスマロゲンレベルの低下を示した疾患においては、プラスマニル種及びプラスメニル種の両方が、共に低下することであった。このことから、癌及び認知症におけるプラスマロゲンのレベルの低下は、これらの疾患における酸化的ストレスの増加には起因しないことが示されている。
【００６１】
異なる年齢群及び疾患におけるＡＯ−ＰＢＤの罹患率の決定
ＡＯ−ＰＢＤの罹患率を決定するために、最初に、すべての対象について、ジアシル１６：０／１８：０に対するプラスメニル１６：０／１８：２及びプラスメニル１６：０／２２：６の比を計算し、次いで、各対象を、正常集団の平均で割り、次いで、各値をｌｏｇ２に変換して正規化した。次いで、各対象について、それら２つのｌｏｇ２の値のうちの最も低いものを使用して、図５〜１３に示す集団ヒストグラムを生み出した。−１のカットオフ値を使用したが、所望の感度及び特異性をもたらす任意のカット値を使用することができるであろう。ｌｏｇ２の値が−１未満である対象は、集団の平均の５０％未満の血清プラスマロゲンレベルを有する。このことを広い視野から眺めると、Perichonによって使用されたＲＤＣＰ細胞系（Perichon R, Moser AB, Wallace WC, Cunningham SC, Roth GS, Moser HW. Peroxisomal disease cell lines with cellular plasmalogen deficiency have impaired muscarinic cholinergic signal transduction activity and amyloid precursor protein secretion. Biochem Biophys Res Commun 1998; 248(1): 57-61）は、対照の約３０％のプラスマロゲンレベルを有した。このカットオフを使用すると、癌の罹患率は、前立腺癌のちょうど５０％未満から乳癌の１００％までに及ぶことが観察された。（図１４）。認知症の対象と認知が正常と確認された者との間の差はそれぞれ、３９％と６％であった。
【００６２】
癌と認知症との間の並存疾患が明らかでないことから（Artaz MA, Boddaert J, Heriche-Taillandier E, Dieudonne B, Verny M. [Medical comorbidity in Alzheimer's disease: baseline characteristics of the REAL.FR Cohort]. La Revue de medecine interne / fondee 2006; 27(2): 91-7）、癌と認知症との間の共通の根底にある生化学的異常はこれまで確立されていない。これらのデータは、ＡＯ−ＰＢＤは、癌の症状でも、認知症の症状でもなく、したがって、それ自体の病因を有するはずであることを強く示している。
【００６３】
ＡＯ−ＰＢＤの病因についての調査
認知症の病因については、広範に研究がなされていることから、３２４人の対象（１７６人の女性、１４８人の男性）、５６〜９５歳を使用して、認知症の重症度の作用を決定した。対象には、６８人の認知機能から確認された認知症でない対象（簡易知能評価スケール（ＭＭＳＥ，Mini Mental State Examination）（ＭＭＳＥ≧２８））、及び認知症と現在診断されている２５６人の対象（アルツハイマー病評価スコア、認知機能サブセット（ＡＤＡＳ−ｃｏｇ，Alzheimer's Diseases Assessment Score, cognitive sub-set）６〜７０、ＭＭＳＥ０〜２６））が含まれた。対象を、ＭＭＳＥスコア［≧２８＝認知機能上正常］、又はＡＤＡＳ−ｃｏｇスコア［５〜１９＝低度の認知障害；２０〜３９＝中等度；４０〜７０＝重度］のいずれかに基づいて、４つの認知症重症度コホートのうちの１つにグループ化した。各グループについて、８つのＰｌｓＥｔｎ及び遊離ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ，docosahexaenoic acid、２２：６）の血清レベルの平均を決定した（図１５）。すべての認知症のサブグループにおいて、８つのＰｌｓＥｔｎのすべてが、認知機能の対照と比べ、有意に低下していることが観察された（２４個の一対比較、ｔ検定ｐ値：２．６ｅ−２〜２．０ｅ−１０、平均＝３．９ｅ−５）。遊離ＤＨＡは、中等度及び重度の認知症の対象においてのみ有意に減少していた（ｐ＜０．０５）。
【００６４】
図１５中のデータから、血清ＰｌｓＥｔｎの減少は認知症の増悪と相関することが示されている。この概念を詳細に調査するために、これら３つのコホートのそれぞれについて、線形回帰分析を、認知症コホートのそれぞれの血清ＰｌｓＥｔｎ１６：０／２２：６レベルの平均（ＣＮに対して正規化）、及びＡＤＡＳ−ｃｏｇスコアの平均を使用して実施した（図１６）。これら３つの認知症コホートの血清ＰｌｓＥｔｎ１６：０／２２：６レベルの平均とＡＤＡＳ−ｃｏｇスコアの平均との間において、非常に高い相関性が観察された（ｒ２＝０．９９）。しかし、この線形の減少は、外挿した場合、ＣＮ群から外れた（Ｘ対ＣＮ）。認知症が１年当たり７．５ＡＤＡＳ−ｃｏｇ単位臨床上進行すると想定すると、この外挿入から、ＰｌｓＥｔｎ１６：０／２２：６のレベルは、臨床的な認知障害（ＡＤＡＳ−ｃｏｇ＝１５）が明らかになる少なくとも７年前には下降し始めることが予測される。これらのデータは、アルツハイマー型の認知症の９年の前駆期を観察した、Amievaらによる最近の知見（Amieva H, Jacqmin-Gadda H, Orgogozo JM, et al. The 9 year cognitive decline before dementia of the Alzheimer type: a prospective population-based study. Brain 2005; 128(Pt 5): 1093-101）と一致する。生化学的変化の作用は、線形であるのは稀であり、より一般的には指数関数的な効果を反映することを考慮すると、生化学的な前駆期は、臨床的な前駆期よりも長いことが予想されるであろう。このことは、アミロイド斑は４０〜４９歳で蓄積し始める（Esiri MM, Biddolph SC, Morris CS. Prevalence of Alzheimer plaques in AIDS. J Neurol Neurosurg Psychiatry 1998; 65(1): 29-33）が、アルツハイマー病が臨床的に顕在化するのは、６０歳代後半〜７０歳代前半になってからであるという事実によって支持されている。これらの２つの研究、及び血清プラスマロゲンが臨床症状の発症前から減少するという我々自身の証拠に基づくと、認知症の病因は、図１７によって表現することができる。
【００６５】
さらに、大部分の癌は、１０〜１５年の前駆期間を有することが予測されている。癌の場合、１５年の前駆期間があると想定すると、無症状の対象がこれから１５年のうちに癌を発症するパーセントを計算することができる（図１８）。同様に、認知症についても計算することができる。すべての値は、カナダの癌及び認知症の統計に基づいて計算した。図１９は、５０〜５９歳及び６０〜６９歳の無症状の集団の対照におけるＡＯ−ＰＢＤの実際の罹患率を示す。これらの値を、これから１５年のうちに癌又は２０年のうちに認知症のいずれかを発症するであろう無症状の対象を、これら２つの集団の合計で割ったパーセントと比較する。最後の列は、これらの疾患におけるＡＯ−ＰＢＤの罹患率（認知症の場合、４０％、及び癌の場合、７０％）に基づいて、ＡＯ−ＰＢＤを先在疾患として有する結果、癌又は認知症に罹患してしまうことが予想される、これらの対象のパーセントを示す。この解析によって明らかになるのは、これから１５〜２０年のうちに、５０〜５９歳のうち２０％が癌又は認知症のいずれかを発症し、６０〜６９歳のうち４０％が癌又は認知症のいずれかを発症するであろうことが予測される点である。これらのデータは、５０〜５９歳（１５％）及び６０〜６９歳（３０％）において観察されたＡＯ−ＰＢＤの罹患率に著しく近い。
【００６６】
認知症の場合、ＡＯ−ＰＢＤがアルツハイマー病（ＡＤ，Alzheimer's Disease）の病態の単なる結果ではない点について確信を得るために、ＡＤを有することが病理学的に確認された２０人の対象（１０人の男性及び１０人の女性）、及びＡＤを有さないことが病理学的に確認された１９人の対象から収集した血清試料を調査した。図２０及び２１に見ることができるように、ＡＯ−ＰＢＤは、ＡＤの症例のうちわずか５５％において存在するに過ぎず、対照では、１６％に存在する。このことは、ＡＤの対象のうち４５％においては、根底にある原因はＡＯ−ＰＢＤ以外の何かであることを意味する。明らかに、ＡＯ−ＰＢＤとＡＤとは、同一の疾患ではない。
【００６７】
上記の研究が示すのは、ＡＯ−ＰＢＤが癌及び認知症のいずれとも関係のない、固有の病因を示す点である。癌及び認知症の罹患率は、少なくとも９０歳までは加齢と共に増加し続けるのに対して、ＡＯ−ＰＢＤの罹患率は６０〜６９歳でピークに達し、次いで、７０歳以降は減少する。さらに、ＡＯ−ＰＢＤは、ＲＣＤＰと類似の生化学的プロファイルを示すが、ＡＯ−ＰＢＤをＲＣＤＰと混同してはならない。ＲＤＣＰの３つの形態はすべて、小児に影響を及ぼす遺伝的な障害である。ＡＯ−ＰＢＤの根底にある原因は、現時点では分かっていないが、代謝の先天性の異常ではないことは確かである。ＲＣＤＰとＡＯ−ＰＢＤとの間の関係は、ダウン症候群（遺伝的に決定される疾患）とアルツハイマー病（原因の分かっていない成人発症性の疾患）との間の関係に類似する。ダウン症候群及びアルツハイマー病の両方が、類似した生化学的特色（即ち、脳におけるアミロイド斑の蓄積）を示すが、臨床所見は劇的に異なる。
【実施例２】
【００６８】
代謝産物の血清レベルを使用する、ＡＯ−ＰＢＤを有する対象の同定
認知機能が正常で、癌を有しない複数の対象について、上記実施例１に記載したもの等の検証された解析方法を使用して、表５に列挙した全代謝産物のすべて又はサブセットについての血清レベルの平均±ＳＥＭを測定した。これは、男性と女性とを分離して又は組み合わせて実施することができる。こうして測定した各代謝産物の平均値が、正常基準値となる。
【００６９】
試験対象について、上記に記載したもの等の検証された解析方法を使用して、表５に列挙した全代謝産物のそれぞれ又はサブセットの血清レベルを計算した。
【００７０】
次いで、正常集団の血清レベルの平均に対する試験対象の血清レベルの比を決定し、この比をカットオフ値と比較した（例えば、限定する意味はないが、０．５の値を、本出願を通して使用した）。０．５未満の比を有する対象は、ＡＯ−ＰＢＤであるとみなされる。
【実施例３】
【００７１】
内因性基準代謝産物に対する表５に列挙した代謝産物の血清レベルの比の数学的に決定したプラスマロゲンスコアを使用する、ＡＯ−ＰＢＤの対象の同定
認知機能が正常で、癌を有しない複数の対象について、上記実施例１に記載したもの等の検証された解析方法を使用して、表５に列挙した全代謝産物のすべて又はサブセットについて、血清レベルの平均±ＳＥＭを決定した。これは、男性と女性とを分離して又は組み合わせて実施することができる。
【００７２】
認知機能が正常なコホート又は既知の認知症コホートからの対応する平均に対するこれらの代謝産物の比を決定した。実施例１の記載に従って、データをｌｏｇ２に変換した。Ｍ１６及びＭ１９の最も低いｌｏｇ２スコアを選択した。次いで、このｌｏｇ２スコアを、カットオフ値（本出願では−１．０を使用する）と比較して、対象がＡＯ−ＰＢＤであるか否かを決定した。
【実施例４】
【００７３】
試験対象から得た、内因性基準代謝産物に対する１又は複数の代謝産物の比を、正常な基準集団から得たそのような比の平均と比較することによるＡＯ−ＰＢＤ対象の同定
患者間の変動を減少させるために、試験している変動要因の間では顕著に変化しない内因性代謝産物を使用することができる。例えば、Ｍ０１はＡＯ−ＰＢＤにおいては顕著に変化しないので、これを使用することができよう。上記に記載したもの等の検証された解析方法を使用して、表５に列挙した全代謝産物のすべて又はサブセットの比を計算した。また、複数の正常な対象について、これらの代謝産物のそれぞれについての血清の比のレベルの平均±ＳＥＭも計算した。これは、男性と女性とを分離して又は組み合わせて実施することができる。
【００７４】
また、ＡＯ−ＰＢＤの未知の状況の対象について、表５に列挙した代謝産物のうちの１又は複数の血清の比のレベルも決定した。対応する正常な濃度の平均に対する１又は複数のこれらの代謝産物の比を計算し、カットオフ値と比較した。この比較を使用して、前記対象がＡＯ−ＰＢＤであるか否かを決定した。
【００７５】
すべての引用は、参照により本明細書に組み込まれている。
【００７６】
本発明を、１又は複数の実施形態に関して説明してきた。しかし、特許請求の範囲において定義する本発明の範囲から逸脱することなく、多くの変形形態及び改変形態を作製することができることが、当業者には明らかであろう。
【００７７】
【表１】
2010523986.tif 000003
【００７８】
【表２】
2010523986.tif 000004
【００７９】
【表３】
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【００８０】
【表４】
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【００８１】
【表５】
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【００８２】
【表６】
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【００８３】
【表７】
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【００８４】
【表８】
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【００８５】
【表９】
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【００８６】
【表１０】
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【００８７】
【表１１】
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【００８８】
（参考文献）
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年12月1日(2009.12.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における成人発症性プラスマロゲン生合成障害を判定する方法であって、
ａ）１又は複数の代謝産物マーカーについての定量的データを得るために、前記対象からの試料を解析するステップと、
ｂ）前記試料中の前記１又は複数の代謝産物マーカーのレベルの減少を同定するために、前記１又は複数の代謝産物マーカーについての前記定量的データを、１又は複数の基準試料から得た対応するデータと比較するステップと、
ｃ）前記対象における成人発症性プラスマロゲン生合成障害の存在を判定するために、前記試料中の前記１又は複数の代謝産物マーカーのレベルの前記減少を使用するステップと
を含み、
前記１又は複数の代謝産物マーカーが、ジアシルグリセリルホスホエタノールアミン、プラスマニルグリセリルホスホエタノールアミン、プラスメニルグリセリルホスホエタノールアミン、及び遊離脂肪酸からなる群から選択される１又は複数の分子を含む方法。
【請求項２】
対象におけるプラスマロゲン欠乏症関連ヒト健康障害又はプラスマロゲン欠乏症関連ヒト健康障害のリスクを判定する方法であって、
ａ）１又は複数の代謝産物マーカーについての定量的データを得るために、前記対象からの試料を解析するステップと、
ｂ）前記試料中の前記１又は複数の代謝産物マーカーのレベルの減少を同定するために、前記１又は複数の代謝産物マーカーについての前記定量的データと、１又は複数の基準試料から得た対応するデータとを比較するステップと、
ｃ）前記対象におけるプラスマロゲン欠乏症関連障害又はプラスマロゲン欠乏症関連障害のリスクの存在を判定するために、前記試料中の前記１又は複数の代謝産物マーカーのレベルの前記減少を使用するステップと
を含み、
前記１又は複数の代謝産物マーカーが、ジアシルグリセリルホスホエタノールアミン、プラスマニルグリセリルホスホエタノールアミン、プラスメニルグリセリルホスホエタノールアミン、及び遊離脂肪酸からなる群から選択される１又は複数の分子を含む方法。
【請求項３】
１又は複数の内部対照の代謝産物についての定量的データを得るために、患者からの試料を解析するステップと、
前記１又は複数の内部対照の代謝産物について得たレベルに対する、前記１又は複数の代謝産物マーカーのレベルそれぞれについての比を得るステップと
をさらに含み、
前記比較するステップ（ｂ）が、各比と、１又は複数の基準試料について得た１又は複数の対応する比とを比較することを含む、請求項１又は２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
ジアシルグリセリルホスホエタノールアミンが、ＰｔｄＥｔ１６：０／１８：０、ＰｔｄＥｔ１６：０／１８：１、ＰｔｄＥｔ１８：０／１８：０、ＰｔｄＥｔ１８：０／１８：１、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
プラスマニルグリセリルホスホエタノールアミンが、プラスマニル１６：０／１８：１、プラスマニル１６：０／１８：２、プラスマニル１６：０／２０：４、プラスマニル１６：０／２２：４、プラスマニル１６：０／２２：６、プラスマニル１８：０／１８：１、プラスマニル１８：０／１８：２、プラスマニル１８：０／２０：４、プラスマニル１８：０／２２：４、プラスマニル１８：０／２２：６、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
プラスメニルグリセリルホスホエタノールアミンが、プラスメニル１６：０／１８：１、プラスメニル１６：０／１８：２、プラスメニル１６：０／２０：４、プラスメニル１６：０／２２：４、プラスメニル１６：０／２２：６、プラスメニル１８：０／１８：１、プラスメニル１８：０／１８：２、プラスメニル１８：０／２０：４、プラスメニル１８：０／２２：４、プラスメニル１８：０／２２：６、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
遊離脂肪酸が、遊離ドコソヘキサン酸（ＤＨＡ）２２．６、遊離ＤＨＡ２０：４、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
プラスマロゲン欠乏症関連障害が、乳癌、結腸直腸癌、前立腺癌、肺癌、卵巣癌、腎臓癌、アルツハイマー病、認知症又は認知障害からなる群から選択される、請求項２〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
対象が２０歳超である、請求項２〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
定量的データを、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計、飛行時間質量分析計、オルビトラップ質量分析計、四極子質量分析計、又は三連四重極質量分析計を使用して得られる、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
質量分析計がクロマトグラフシステムを備える、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
試料が血液試料である、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
試料が血清試料である、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
試料が脳脊髄液試料である、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
試料に対して液体／液体抽出を実施し、それによって、非極性の代謝産物が有機溶媒中に溶解され、極性の代謝産物が水性溶媒中に溶解される、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
抽出した試料を、正若しくは負のエレクトロスプレーイオン化、又は正若しくは負の大気圧化学イオン化によって解析する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
抽出した試料をＭＳ／ＭＳ遷移によって解析する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
抽出した試料を、抽出イオン電流（ＥＩＣ）クロマトグラフィー及びＭＳ／ＭＳ遷移によって解析する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
請求項４に記載のジアシルグリセリルホスファチジルエタノールアミンについてのＭＳ／ＭＳ遷移が、それぞれ７１８．０／２５５．０、７１６．０／２５５．０、７４６．０／２８３．０及び７４４．０／２８３．０である、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項５に記載のプラスマニルグリセリルホスホエタノールアミンについてのＭＳ／ＭＳ遷移が、それぞれ７０２．０／２８１．０、７００．０／２７９．０、７２４．０／３０３．０、７５２．０／３３１．０、７４８．０／３２７．０、７３０．０／２８１．０、７２８．０／２７９．０、７５２．０／３０３．０、７８０．０／３３１．０及び７７６．０／３２７．０である、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２１】
請求項６に記載のプラスメニルグリセリルホスホエタノールアミンについてのＭＳ／ＭＳ遷移が、それぞれ７００．０／２８１．０、６９８．０／２７９．０、７２２．０／３０３．０、７５０．０／３３１．０、７４６．０／３２７．０、７２８．０／２８１．０、７２６．０／２７９．０、７５０．６／３０３．２、７７８．０／３３１．０及び７７４．０／３２７．０である、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２２】
請求項７に記載の遊離脂肪酸ついてのＭＳ／ＭＳ遷移が、それぞれ３２７．２／２８３．０及び３０３．２／２５９．５である、請求項１７又は１８に記載の方法。
【国際調査報告】
2010523986.tif 000037
2010523986.tif 000038
2010523986.tif 000039