(57)【要約】  本発明は抗ｈＴＮＦα抗体を結晶化させるためのバッチ晶析方法（この方法は、前記抗体の工業的規模の生産を可能にする。）、前記方法により得られるような抗体結晶、前記結晶を含有する組成物並びに前記結晶および組成物の使用方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）結晶化剤としての無機リン酸塩と混合した前記抗体の水溶液を準備する段階；および
（ｂ）前記抗体の結晶が形成されるまで前記水性結晶化混合物を温置する段階
を含む抗ｈＴＮＦα抗体を結晶化するためのバッチ晶析方法。
【請求項２】
前記水性結晶化混合物のｐＨが約ｐＨ３から５の範囲である、請求項１に記載の晶析方法。
【請求項３】
前記水性結晶化混合物が緩衝液を含有している、請求項１または２に記載の晶析方法。
【請求項４】
前記緩衝液が酢酸緩衝液を含む、請求項３に記載の晶析方法。
【請求項５】
前記緩衝液が酢酸ナトリウムを含む、請求項４に記載の晶析方法。
【請求項６】
前記水性結晶化混合物中の緩衝液濃度が０Ｍから０．５Ｍである、請求項３から５のいずれか一項に記載の晶析方法。
【請求項７】
リン酸塩がリン酸水素塩である、請求項１から６のいずれか一項に記載の晶析方法。
【請求項８】
リン酸塩がアルカリ金属塩、または少なくとも２種類の異なるアルカリ金属塩の混合物である、請求項７に記載の晶析方法。
【請求項９】
結晶化混合物中のリン酸塩濃度が約１から６Ｍの範囲である、請求項１から８のいずれか一項に記載の晶析方法。
【請求項１０】
結晶化混合物中の塩濃度が約１．０から３．０Ｍの範囲である、請求項９に記載の晶析方法。
【請求項１１】
以下の追加の結晶化条件：
ａ）温置を約１時間〜約６０日間実施する；
ｂ）温置を約４℃〜約３７℃の温度で実施する；
ｃ）抗体濃度を約０．５〜約１００ｍｇ／ｍｌの範囲とする
のうちの少なくとも１つを満足する、請求項１から１０のいずれか一項に記載の晶析方法。
【請求項１２】
前記結晶を乾燥する段階を更に含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の晶析方法。
【請求項１３】
結晶化母液を別の緩衝液と交換する段階を更に含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の晶析方法。
【請求項１４】
バッチ容量が約１ｍｌ〜２０．０００リットルの範囲である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の晶析方法。
【請求項１５】
請求項１から１４のいずれか一項に記載の晶析方法により取得可能な抗ｈＴＮＦα抗体の結晶。
【請求項１６】
抗体がインフリキシマブ以外のものである抗ｈＴＮＦα抗体の結晶。
【請求項１７】
約２〜５００μｍの最大長ｌと約３〜３０のｌ／ｄ比をもつ針状形態である請求項１５または１６に記載の結晶。
【請求項１８】
前記抗体がポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である、請求項１５から１７のいずれか一項に記載の結晶。
【請求項１９】
前記抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体、非糖鎖付加抗体、ヒト抗体およびマウス抗体から構成される群から選択される、請求項１８に記載の結晶。
【請求項２０】
前記抗体がＩｇＧ抗体である、請求項１７または１８に記載の結晶。
【請求項２１】
前記抗体がＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４抗体から構成される群から選択される、請求項１９に記載の結晶。
【請求項２２】
前記抗体がＩｇＧ１群の抗ヒトＴＮＦα抗体である、請求項２１に記載の結晶。
【請求項２３】
いずれも表面プラズモン共鳴法により測定した場合に１×１０−８Ｍ以下のＫｄと１×１０−３ｓ−１以下のＫａ速度定数でｈＴＮＦαから解離し、標準インビトロＬ９２９アッセイにおいて１×１０−７Ｍ以下のＩＣ５０でｈＴＮＦα細胞毒性を中和する単離ヒト抗体から作製される請求項２２に記載の結晶。
【請求項２４】
以下の特徴：即ちａ）表面プラズモン共鳴法により測定した場合に１×１０−３ｓ−１以下のＫｏｆｆ速度定数でヒトＴＮＦαから解離する；ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を含むまたは１、４、５、７もしくは８位の１カ所のアラニン置換または１、３、４、６、７、８および／もしくは９位の１〜５カ所の保存アミノ酸置換により配列番号３から改変されたアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３領域を有する；ｃ）配列番号４のアミノ酸配列を含む、または２、３、４、５、６、８、９、１０もしくは１１位の１カ所のアラニン置換または２、３、４、５、６、８、９、１０、１１および／もしくは１２位の１〜５カ所の保存アミノ酸置換により配列番号４から改変されたアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３領域を有するという特徴を備える単離ヒト抗体から作製される請求項２２に記載の結晶。
【請求項２５】
配列番号１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を有する単離ヒト抗体から作製される請求項２２に記載の結晶。
【請求項２６】
抗体Ｄ２Ｅ７から作製される請求項２５に記載の結晶。
【請求項２７】
（ａ）請求項１５から２６のいずれか一項に記載の抗ｈＴＮＦα抗体の結晶および（ｂ）少なくとも１種の医薬賦形剤を含有し、固体、半固体または液体製剤として提供され、各製剤は結晶形態の前記抗体を含有する、医薬組成物。
【請求項２８】
（ａ）請求項１５から２６のいずれか一項に記載の抗ｈＴＮＦα抗体の結晶および（ｂ）前記抗体の結晶を包埋または封入する少なくとも１種の医薬賦形剤を含有する、医薬組成物。
【請求項２９】
前記組成物の抗体濃度が約１ｍｇ／ｍｌを上回る請求項２６に記載の組成物。
【請求項３０】
前記組成物の抗体濃度が約２００ｍｇ／ｍｌを上回る請求項２７に記載の組成物。
【請求項３１】
前記賦形剤が少なくとも１種の場合により生分解性のポリマーキャリヤーまたは少なくとも１種の油類または脂質キャリヤーを含む請求項２６から２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３２】
前記ポリマーキャリヤーがポリ（アクリル酸）、ポリ（シアノアクリレート）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（酸無水物）、ポリ（デプシペプチド）、ポリ（エステル）、ポリ（乳酸）、乳酸・グリコール酸コポリマーないしＰＬＧＡ、ポリ（β−ヒドロキシブチレート）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（ジオキサノン）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド、ポリ（オルガノ）ホスファゼン、ポリ（オルトエステル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、無水マレイン酸・アルキルビニルエーテルコポリマー、プルロニックポリオール、アルブミン、アルギン酸塩、セルロースおよびセルロース誘導体、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン、ヒアルロン酸、オリゴ糖、グリコサミノグリカン、硫酸化多糖、これらのブレンドおよびコポリマーから構成される群の１種以上から選択されるポリマーである、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３３】
約１０から４００ｍｇ／ｍｌの範囲の抗体濃度にて請求項１５から２６のいずれか一項に記載の抗ｈＴＮＦα抗体結晶を含有する注射用液体組成物。
【請求項３４】
約１００ｍｇ／ｍｌを上回る抗体濃度にて請求項１５から２６のいずれか一項に記載の抗ｈＴＮＦα抗体結晶を含有する結晶スラリー。
【請求項３５】
有効量の請求項１５から２６のいずれか一項に記載の抗ｈＴＮＦα抗体結晶を哺乳動物に投与する段階を含む哺乳動物の治療方法。
【請求項３６】
有効量の請求項２７から３２のいずれか一項に記載の組成物を哺乳動物に投与する段階を含む哺乳動物の治療方法。
【請求項３７】
非経口経路、経口経路または注射により組成物を投与する請求項３４および３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
治療有効量の請求項１５から２６のいずれか一項に記載の抗体結晶を投与する段階を含む、対象におけるＴＮＦα関連疾患の治療方法。
【請求項３９】
前記ＴＮＦα関連疾患が、自己免疫疾患、特に関節リウマチ、リウマチ性脊椎炎、変形性関節症および痛風性関節炎、アレルギー、多発性硬化症、自己免疫性糖尿病、自己免疫性ぶどう膜炎およびネフローゼ症候群、感染性疾患、移植拒絶反応ないし移植片対宿主病、悪性腫瘍、肺障害、腸障害、心臓障害、炎症性骨障害、骨吸収疾患、アルコール性肝炎、ウイルス性肝炎、劇症肝炎、凝固障害、熱傷、再潅流障害、ケロイド形成、瘢痕組織形成、発熱、歯周病、肥満症および放射線傷害、脊椎関節症、肺障害、冠動脈障害、代謝障害、貧血、疼痛、肝障害、皮膚障害、爪障害、または血管炎、ベーチェット病、強直性脊椎炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、再狭窄、糖尿病、貧血、疼痛、クローン病関連障害、若年性関節リウマチ（ＪＲＡ）、Ｃ型肝炎ウイルス感染、乾癬、乾癬性関節炎、および慢性プラーク乾癬、加齢性悪液質、アルツハイマー病、脳浮腫、炎症性脳損傷、慢性疲労症候群、皮膚筋炎、薬物反応、脊髄内および／または周囲の浮腫、家族性周期性発熱、フェルティ症候群、線維症、糸球体腎炎（例えば連鎖球菌感染後糸球体腎炎やＩｇＡ腎症）、人工器官の緩み、顕微鏡的多発血管炎、混合性結合組織病、多発性骨髄腫、癌および悪液質、多発性臓器障害、骨髄異形成症候群、睾丸炎、骨溶解、急性、慢性および膵膿瘍を含む膵炎、歯周病、多発性筋炎、進行性腎不全、偽痛風、壊疽性膿皮症、再発性多発性軟骨炎、リウマチ性心臓病、サルコイドーシス、硬化性胆管炎、脳卒中、胸腹部大動脈瘤修復（ＴＡＡＡ）、ＴＮＦ受容体関連周期性症候群（ＴＲＡＰＳ）、黄熱病ワクチン接種関連症候群、耳関連炎症性疾患、慢性耳炎症、または小児耳炎症、ぶどう膜炎、座骨神経痛、前立腺炎、子宮内膜症、脈絡膜血管新生、狼瘡、ショーグレン症候群並びに滲出型黄斑変性症から構成される群から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
請求項３８に記載のＴＮＦα関連疾患を治療するための医薬組成物を製造するための請求項１５から２６のいずれか一項に記載の抗ｈＴＮＦα抗体結晶の使用。
【請求項４１】
医薬用としての請求項１５から２６のいずれか一項に記載の抗ｈＴＮＦα抗体結晶。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ｈＴＮＦα抗体を結晶化させるためのバッチ晶析方法として、前記抗体の工業的規模の生産を可能にする方法、前記方法により得られるような抗体結晶、前記結晶を含有する組成物並びに前記結晶および組成物の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ａ）抗体結晶
現在１００種類を上回るモノクローナル抗体が臨床試験フェーズ２または３で検討中であるように、ｍＡｂ市場は最も有望なバイオ医薬品市場の１つであるとみなすことができる。これらの薬剤は、多くの場合に１００ｍｇを上回る用量を単回送達すべきであるので、安定性、安全性および患者コンプライアンスを満足する適切な製剤化ストラテジーを見出すことが急務である。
【０００３】
しかし、高濃度液体ｍＡｂ製剤は粘度が高く、患者に優しい細い針で注射しにくい。更に、このような高濃度ｍＡｂ分子の凝集傾向は適度な濃度の溶液に比較して指数的に増加する。これは安全性および安定性要件に関して決して許容できない。
【０００４】
従って、高ｍＡｂ用量の送達は大容量に限られるが、その場合には一般に輸液により送達しなければならない。この投与方法はコストがかかり、患者のコンプライアンスを著しく悪化させる。
【０００５】
従って、医薬的に適用可能な低容量の皮下注射用ｍＡｂ結晶懸濁液が非常に望ましい。理論的には、結晶格子は剛性であり、蛋白質構造内の運動を妨げるので、ｍＡｂ完全性に影響を与える分解経路は著しく減速するはずである。更に、高濃度結晶懸濁液を液体製剤に比較すると、速度の増加は著しく少ないと予測することができる。持続放出の観点で、患者の体内に入るとゆっくりと溶解するように蛋白質結晶を作製または改変することは可能であると思われる。ｍＡｂ構造を損なう賦形剤とプロセスの多用が避けられるので、これは徐放製剤の非常に優れた送達方法となろう。
【０００６】
原薬としての蛋白質結晶の使用には大きな将来性があるが、このストラテジーを系統的に評価する試みは殆ど行われていない。
【０００７】
例外としてよく知られているのはインスリンであり、数十年前に結晶化に成功している。今日、インスリンの結晶懸濁液の使用は詳細に記載されており、安定な長時間作用型製剤が市場に定着している。インスリン結晶の開発と他の全蛋白質の結晶化の間のずれは、規則的インスリン凝集物が膵臓で天然に形成されるという事実と関係があると思われる。従って、インスリンを過剰の亜鉛イオンと接触させると、インスリン結晶が容易に得られる。大半の他の蛋白質は結晶よりも不規則沈殿を形成する傾向があるため、蛋白質の結晶化条件を見出すのは時間のかかる厄介な作業である。
【０００８】
Ｘ線回折分析用として蛋白質結晶を採取することに大きな関心が寄せられているが、原則として全蛋白質は挙動が異なるため、適切な結晶化条件を見出す作業は依然として経験科学である。今日までに、選択蛋白質に有効な結晶化条件を推論のみにより確実に予測できる一般原理はみつかっていない。従って、その後に予定されている目的用途に関係なく、所定の蛋白質の結晶を得ることは常に「隘路」であると言われている。
【０００９】
更に困ったことに、抗体は分子の柔軟性により、特に結晶化が難しいと言われている。
【００１０】
一方、免疫グロブリン結晶の例は古くから知られている。免疫グロブリン結晶の最初の例は１５０年前に英国の物理学者ヘンリー・ベンス・ジョーンズ（Ｈｅｎｒｙ  Ｂｅｎｃｅ  Ｊｏｎｅｓ）により記載され、彼は骨髄腫患者の尿から異常Ｉｇ軽鎖二量体の結晶を単離している（Ｊｏｎｅｓ  １８４８）。このような異常Ｉｇはそれ以来、ベンス・ジョーンズ蛋白質と呼ばれている。１９３８年に、骨髄腫患者の血清に由来する明白な異常Ｉｇの自然結晶化が記載されている（ｖｏｎ  Ｂｏｎｓｄｏｒｆ，Ｇｒｏｔｈら，１９３８）が、これはＩｇ重鎖オリゴマー（ＭＷ２００ｋＤａ）と見受けられる。
【００１１】
更に３０年後に、同じく主に骨髄腫患者から単離された（２本の重鎖が２本の軽鎖に結合した）正常構造の結晶ヒト免疫グロブリンが記載されている（Ｐｕｔｎａｍ  １９５５）。デイビーズ（Ｄａｖｉｅｓ）らはＸ線結晶構造解析を使用して「Ｄｏｂ」と呼ばれる無傷のヒト骨髄腫抗体の構造を最初に特性決定し（Ｔｅｒｒｙ，Ｍａｔｔｈｅｗｓら，１９６８）、１９７１年にその三次元構造を決定した（Ｓａｒｍａ，Ｓｉｌｖｅｒｔｏｎら，１９７１）。彼らの先駆的業績に続き、ＩｇＧ「Ｋｏｌ」（Ｈｕｂｅｒ，Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒら，１９７６）、ＩｇＧ「Ｍｃｇ」（Ｒａｊａｎ，Ｅｌｙら，１９８３）、およびイヌリンパ腫ＩｇＧ２ａ（Ｈａｒｒｉｓ，Ｌａｒｓｏｎら，１９９２）の結晶構造が得られた。
【００１２】
免疫グロブリンの結晶は再溶解後もその顕著な免疫活性を維持する。１９６８年にニソノフ（Ｎｉｓｏｎｏｆｆ）らは容易に結晶化されたウサギ抗ｐ−アゾベンゾエート抗体「Ｘ４」について報告している。抗体Ｘ４は結晶化前と結晶の再溶解後に詳細に特性決定されている。［１２５Ｉ］−ｐ−ヨードベンゾエートは再溶解後のＸ４と特異的に強く結合することが判明し、再溶解後の結晶は更に未精製ウサギ血清に特徴的な複数の特異的オクタロニー免疫拡散反応も示した（Ｎｉｓｏｎｏｆｆ，Ｚａｐｐａｃｏｓｔａら，１９６８）。コンネル（Ｃｏｎｎｅｌｌ）らは低温で血清から自然に結晶化した「Ｔｅｍ」と呼ばれるヒト骨髄腫γ免疫グロブリン−１κ（ＩｇＧ−Ｋ）について記載している（Ｃｏｎｎｅｌｌ，Ｆｒｅｅｄｍａｎら，１９７３）。Ｔｅｍ結晶は形が整っていることが判明し、菱面対称であった。Ｔｅｍを含有する血清はアガロース免疫拡散法により詳細に特性決定されている。Ｔｅｍ結晶の再溶解溶液の電気泳動と免疫拡散によると、この結晶は低温沈殿法により血清から得られる物質および単離骨髄腫蛋白質と一致することが判明した（Ｃｏｎｎｅｌｌ，Ｆｒｅｅｄｍａｎら，１９７３）。
【００１３】
ミルズ（Ｍｉｌｌｓ）らは１９８３年にアルブミンに対するヒトモノクローナル抗体に起因する異常な結晶クリオグロブリン血症について報告している（Ｍｉｌｌｓ，Ｂｒｅｔｔｍａｎら，１９８３）。ここでは、非常によく似た立方結晶が２人の患者から単離された。結晶の再溶解後に電気泳動と免疫電気泳動を行った処、結晶は１：２の比でモノクローナルＩｇＧ−λとヒト血清アルブミンの２つの蛋白質成分から構成されることが分かった（Ｊｅｎｔｏｆｔ，Ｄｅａｒｂｏｒｎら，１９８２）。元の結晶の溶解後にカラムクロマトグラフィーによりこれらの成分を分取規模で分離した。分離したどちらの成分もそのままでは結晶化しなかったが、組換え後に元の二元複合体が再形成された後、結晶化した。再溶解後に分離したＩｇＧとそのＦａｂフラグメントの顕著な沈降特性とヒト血清アルブミンに対する免疫反応性を更に検討した結果、再溶解後に分離した２成分の再会合体は本質的に免疫性であること、即ち結晶抗体は一旦再溶解しても（ヒト血清アルブミンに対する）高度に特異性のその天然結合特性を維持することが判明した（Ｍｉｌｌｓ，Ｂｒｅｔｔｍａｎら，１９８３）。
【００１４】
最近、マーゴリン（Ｍａｒｇｏｌｉｎ）らは結晶抗体の潜在的治療用途について報告している（Ｙａｎｇ，Ｓｈｅｎｏｙら，２００３）。彼らは治療用モノクローナル抗体トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））を結晶化できることを発見した（Ｓｈｅｎｏｙ，Ｇｏｖａｒｄｈａｎら，２００２）。結晶トラスツズマブ懸濁液はマウス腫瘍モデルで治療効果があったため、結晶トラスツズマブは生物活性を維持することが実証された（Ｙａｎｇ，Ｓｈｅｎｏｙら，２００３）。
【００１５】
ｂ）結晶化技術
所定の他の科学的または工学的試みと異なり、各種蛋白質の結晶化は規定方法またはアルゴリズムを使用して首尾よく実施することができない。確かに、世界的に著名な蛋白質結晶化の専門家であるエイ・マクファーソン（Ａ．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ）が述べているように、過去２０〜３０年間には目覚ましい技術進歩があった。マクファーソンは巨大分子の結晶化のための方策、ストラテジー、試薬および装置について詳細に記載している。しかし、彼は当業者がそれなりに成功を見込んで実際に所定の巨大分子を結晶化させることができるようにするための方法については記載していない。マクファーソンは例えば次のように述べている。「どのような手順であれ、分子間の特異的結合相互作用を助長および促進し、一旦形成された相互作用を安定化させるために、溶媒と溶質の両者の系のパラメーターを改良および最適化する努力を惜しんではならない。問題のこの後者側面は一般に結晶化させる特定蛋白質または核酸の特定の化学的および物理的性質に依存する。」（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ  １９９９，ｐ．１５９）。
【００１６】
新規該当蛋白質を選択し、明確な処理工程を適用し、それにより所望の結晶を取得するためのアルゴリズムが存在しないことは蛋白質結晶化分野の当業者に広く認められている。
【００１７】
特定蛋白質に潜在的に適切な結晶化条件のスクリーニングをマイクロリットル規模で可能にする数種類のスクリーニングシステムが市販されている（例えばＨａｍｐｔｏｎ  １および２，Ｗｉｚｚａｒｄ  ＩおよびＩＩ）。しかし、このようなスクリーニングシステムで良い結果が得られたとしても、より大規模の工業的に適用可能なバッチ規模の結晶化を必ずしも成功できるとは限らない。マイクロリットルサイズの結晶化試験を工業的寸法に転換するのは困難な作業であると言われている（Ｊｅｎら，２００１参照）。
【００１８】
バルドック（Ｂａｌｄｏｃｋ）ら（１９９６）は結晶化条件の初期スクリーニング法としてマイクロバッチ法と蒸気拡散法の比較について報告している。１組の結晶化溶液を使用して６種類の市販蛋白質をスクリーニングしている。スクリーニングは最も一般的な蒸気拡散法と、新規蒸発技術を含むマイクロバッチ晶析法の３種類の変形を使用して実施された。確認された５８種類の結晶化条件のうち、４３種類（７４％）はマイクロバッチ法により確認され、４１種類（７１％）は蒸気拡散法により確認された。２６種類の条件が両方の方法により確認され、マイクロバッチ法を全く使用しなかった場合には１７種類（２９％）は確認されなかった。このことから明らかなように、初期結晶化スクリーニングで最も一般的に使用されている蒸気拡散法により必ずしも良い結果が得られる訳ではない。
【００１９】
ｃ）ｈＴＮＦα抗体結晶
ヒトＴＮＦα（ｈＴＮＦα）は多数の疾患の原因物質とみなされている。従って、このようなｈＴＮＦα関連疾患の適切な治療方法が大いに必要とされている。１つの有望な治療アプローチは医薬有効用量の抗ヒトＴＮＦα抗体を投与する方法である。最近、Ｄ２Ｅ７（一般名アダリムマブ）と呼ばれるこのような抗体の１種が上市され、商品名ＨＵＭＩＲＡ（登録商標）で市販されている。
【００２０】
国際公開第０２／０７２６３６号パンフレットは完全無傷の抗体リツキシマブ、インフリキシマブおよびトラスツマブの結晶化を開示している。結晶化実験の大半はイミダゾール、２−シクロヘキシルエタンスルホネート（ＣＨＥＳ）、メチルペンタンジオール、硫酸銅および２−モルホリノエタンスルホルート（ＭＥＳ）等の毒性が不明の化学薬品を使用して実施されている。実施例の大半は結晶化を開始するために種晶を使用している。
【００２１】
国際公開第２００４／００９７７６号パンフレットは等容量（１μｌ）の各種結晶化用緩衝液とＤ２Ｅ７  Ｆ（ａｂ）’２またはＦａｂフラグメントを混合することによりシッティングドロップ蒸気拡散法を使用したマイクロリットル規模の結晶化実験を開示している。前記フラグメントの各々について数種類の実験条件が報告されているが、完全無傷のＤ２Ｅ７抗体の結晶化の成功は報告されていない。
【００２２】
従って、所定の抗ヒトＴＮＦα完全抗体のいずれもの、特にＤ２Ｅ７の、結晶の作製方法は得られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２３】
【特許文献１】国際公開第０２／０７２６３６号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００４／００９７７６号パンフレット
【非特許文献】
【００２４】
【非特許文献１】Ｊｏｎｅｓ，Ｈ．Ｂ．（１８４８）．“Ｏｎ  ａ  ｎｅｗ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｕｒｉｎｅ  ｏｆ  ａ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｍｏｌｌｉｔｉｅｓ  ｏｓｓｉｕｍ．”Ｐｈｉｌｏｓｏｐｈｉｃａｌ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｌｏｎｄｏｎ  １３８：５５−６２
【非特許文献２】ｖｏｎ  Ｂｏｎｓｄｏｒｆ，Ｂ.，Ｈ．Ｇｒｏｔｈ，ｅｔ  ａｌ．（１９３８）．“Ｏｎ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ａ  Ｈｉｇｈ−ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  Ｂｌｏｏｄ  Ｓｅｒｕｍ  ｉｎ  Ｍｙｅｌｏｍａ．”Ｆｏｌｉａ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉａ  ５９：１８４−２０８．
【非特許文献３】Ｐｕｔｎａｍ，Ｆ．Ｗ．（１９５５）．“Ａｂｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ｇｌｏｂｕｌｉｎｓ．”Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）１２２：２７５−７．
【非特許文献４】Ｔｅｒｒｙ，Ｗ．Ｄ.，Ｂ．Ｗ．Ｍａｔｔｈｅｗｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９６８）．“Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ．”Ｎａｔｕｒｅ  ２２０（１６４）：２３９−４１．
【非特許文献５】Ｓａｒｍａ，Ｖ．Ｒ.，Ｅ．Ｗ．Ｓｉｌｖｅｒｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９７１）．“Ｔｈｒｅｅ-ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｔ  ６  Ａｎｇ．Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｇＧ１  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ．”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４６（１１）：３７５３−９．
【非特許文献６】Ｈｕｂｅｒ，Ｒ.，Ｊ．Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９７６）．“Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ａｎ  ＩｇＧ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ａｎｄ  ａｎ  Ｆｃ  ｆｒａｇｍｅｎｔ．”Ｎａｔｕｒｅ  ２６４（５５８５）：４１５−２０．
【非特許文献７】Ｒａｊａｎ，Ｓ．Ｓ.，Ｋ．Ｒ．Ｅｌｙ，ｅｔ  ａｌ．（１９８３）．“Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｃｇ  ＩｇＧ１  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ．”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２０（７）：７８７−９９．
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【非特許文献１６】Ｂａｌｄｏｃｋ  Ｐｅｔｅｒ；Ｍｉｌｌｓ，Ｖａｕｇｈａｎ；Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｐａｔｒｉｃｋ  Ｓｈａｗ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ（１９９６），１６８（１−４，Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ），１７０−１７４．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
従って、本発明が解決しようとする課題は、抗ｈＴＮＦα抗体、特にヒト抗ｈＴＮＦα抗体Ｄ２Ｅ７に適したバッチ晶析条件を開発し、工業的な抗体結晶生産に適した容量に適用可能な晶析プロセス条件を確立することである。同時に、このような抗体の医薬品としての利用可能性に悪影響を与える恐れのある毒性物質を使用しない晶析方法を確立する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
発明の要旨
上記問題は、生理的に許容可能な無機リン酸塩を結晶化誘導剤として利用することにより、マイクロリットル規模を上回るバッチ晶析容量にて完全抗ｈＴＮＦα抗体の結晶を得ることが可能であるという知見により意外にも解決された。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】６日後の実施例３７からのＤ２Ｅ７結晶を示す。
【図２】１ｍＬバッチ容量、周囲温度で製造したＤ２Ｅ７結晶を示す。
【図３】５０ｍＬバッチ容量、周囲温度で製造したＤ２Ｅ７結晶を示す。
【図４】１０Ｌバッチ容量、周囲温度で製造したＤ２Ｅ７結晶を示す。
【図５Ａ】本発明に従って製造したＤ２Ｅ７結晶とその複屈折を示す。
【図５Ｂ】本発明に従って製造したＤ２Ｅ７結晶とその複屈折を示す。
【図５Ｃ】本発明に従って製造したＤ２Ｅ７結晶とその複屈折を示す。
【図５Ｄ】本発明に従って製造したＤ２Ｅ７結晶とその複屈折を示す。
【図６】異なるゲージの針で注射した異なる濃度のＤ２Ｅ７結晶懸濁液を示す。
【図７】Ｄ２Ｅ７結晶懸濁液のＦＴ−ＩＲ分析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
好ましい態様
第１の側面において、本発明は抗ｈＴＮＦα抗体を結晶化するためのバッチ晶析方法に関し、この方法は、
ａ）例えば好ましくは溶解形態で存在する前記抗体の水溶液を溶解形態の結晶化剤としての無機リン酸塩を含有する結晶化水溶液と混合するか、あるいは固体形態の前記結晶化剤を加えることにより、結晶化剤としての無機リン酸塩と混合した前記抗体の水溶液を準備する段階と；および
（ｂ）前記抗体の結晶が形成されるまで前記水性結晶化混合物を温置する段階を含む。
【００２９】
本発明の晶析方法は一般に約ｐＨ３〜約５、特に約３．５〜約４．５または約３．７〜約４．２の範囲の前記水性結晶化混合物のｐＨで実施される。
【００３０】
更に、前記水性結晶化混合物は少なくとも１種類の緩衝液を含有することができる。前記緩衝液は特に主成分として酢酸塩成分、特にアルカリ金属塩、特に酢酸ナトリウムを含むことができる。酸、特に酢酸を加えることにより前記塩を必要なｐＨに調整する。晶析方法の好ましい１態様において、前記水性結晶化混合物中の緩衝液濃度（総酢酸塩）は０〜約０．５Ｍまたは約０．０２〜約０．５Ｍ、例えば約０．０５〜約０．３Ｍまたは約０．１５〜約０．２Ｍである。
【００３１】
本発明の晶析方法の別の特定態様において、沈殿剤として使用されるリン酸塩はリン酸一水素塩またはリン酸二水素塩等のリン酸水素塩から選択され、特にアンモニウム塩またはアルカリ金属塩、例えばＮａ＋もしくはＫ＋イオンを含有する塩または少なくとも２種類の異なる塩を含むその混合物が挙げられる。適切な例はＮａＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４およびその混合物である。
【００３２】
特に、結晶化混合物中のリン酸塩濃度は約１〜約６Ｍ、例えば約１．０〜約４．０Ｍ、または約１．０〜約３．０Ｍ、または約１．５〜約２．８Ｍ、または約２．０〜約２．６Ｍの範囲である。
【００３３】
本発明の好ましい１態様では、蛋白質溶液と結晶化溶液を約１：１の比で混合する。従って、元の結晶化溶液中の緩衝剤／結晶化剤のモル濃度は結晶化混合物中の濃度の約２倍である。
【００３４】
一般に、上記晶析方法は約１ｍｌ〜約２００００リットル、または１ｍｌ〜約１５０００リットル、または１ｍｌ〜約１２０００リットル、または約１ｍｌ〜約１００００リットル、または１ｍｌ〜約６０００リットル、または１ｍｌ〜約３０００リットル、または１ｍｌ〜約１０００リットル、または１ｍｌ〜約１００リットル、例えば約５０ｍｌ〜約８０００ｍｌ、または約１００ｍｌ〜約５０００ｍｌ、または約１０００ｍｌ〜約３０００ｍｌ、または約１リットル〜約１０００リットル、または約１０リットル〜約５００リットルの範囲のバッチ容量で実施される。
【００３５】
更に、本発明の晶析方法は以下の付加的な結晶化条件のうちの少なくとも１つを満足するように実施することができる。
ａ）温置を約１時間〜約６０日間、例えば約１〜約３０日間、または約２〜１０日間実施する；
ｂ）温置を約０℃〜約５０℃、例え約４℃〜約３７℃の温度で実施する；
ｃ）結晶化混合物中の抗体濃度（即ち蛋白質濃度）を約１〜２００ｍｇ／ｍｌまたは１〜１００ｍｇ／ｍｌ、例えば１．５〜２０ｍｇ／ｍｌ、特に約２〜１５ｍｇ／ｍｌまたは５〜１０ｍｇ／ｍｌの範囲とする。蛋白質濃度は標準蛋白質定量法に従って測定することができる。
【００３６】
特に好ましい方法によると、以下の結晶化混合物の条件下で結晶化を実施する。
リン酸塩：ＮａＨ２ＰＯ４、１．５〜２．５Ｍ
緩衝液：総酢酸塩，０〜０．３Ｍ
ｐＨ：３．６〜４．２
抗ｈＴＮＦα濃度：３〜１０ｍｇ／ｍｌ
温度：１８〜２４℃
バッチ容量：１〜１００リットル
撹拌：なし
期間：４〜１５日間。
【００３７】
上記に概説したような結晶化混合物は一般に溶液または固体としての結晶化剤を蛋白質溶液に加えることにより得られる。どちらの溶液も緩衝溶液とすることができるが、必ずしもそうでなくてもよい。元の結晶化溶液は蛋白質溶液で「希釈」されるので、元の結晶化溶液中の結晶化剤モル濃度と緩衝液モル濃度は一般に結晶化混合物中よりも高い。
【００３８】
別の態様において、本発明の晶析方法は得られた結晶を乾燥する段階を更に含むことができる。適切な乾燥方法としては蒸発乾燥、噴霧乾燥、凍結乾燥、真空乾燥、流動層乾燥、噴霧凍結乾燥、準臨界乾燥、超臨界乾燥および窒素ガス乾燥が挙げられる。
【００３９】
別の態様において、本発明の晶析方法は遠心、透析濾過、限外濾過または他の一般に使用されている緩衝液交換技術により結晶化母液を別の緩衝液、例えば約３００〜８０００ダルトンの範囲の分子量をもつポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはＰＥＧ混合物を含有する緩衝液と交換する段階を更に含むことができる。
【００４０】
本発明は更に上記晶析方法により取得可能な抗ｈＴＮＦα抗体の結晶および一般に抗ｈＴＮＦα抗体の結晶にも関する。
【００４１】
本発明の結晶は、一般に約２〜５００μｍまたは約１００〜３００μｍの最大長ｌと約３〜３０のｌ／ｄ比をもつ針状形態であることを特徴とするが、他の幾何学的外観でもよい。
【００４２】
前記結晶はポリクローナル抗体または好ましくはモノクローナル抗体から得ることができる。
【００４３】
特に、前記抗体は非キメラまたはキメラ抗体、ヒト化抗体，非糖鎖付加抗体，ヒト抗体およびマウス抗体から構成される群から選択される。特に、結晶化させる抗体は非キメラヒト抗体であり、場合により抗原結合を改善するように更に処理されている。
【００４４】
好ましくは、前記結晶は例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４抗体等のＩｇＧ抗体から得られる。特に、前記抗体はＩｇＧ１群の完全抗ヒトＴＮＦα抗体である。
【００４５】
好ましい１態様において、結晶はいずれも表面プラズモン共鳴法により測定した場合に１×１０−８Ｍ以下、より好ましくは１×１０−９Ｍ以下、更により好ましくは５×１０−１０Ｍ以下のＫｄと１×１０−３ｓ−１以下のＫａ速度定数でｈＴＮＦαから解離し、標準インビトロＬ９２９アッセイにおいて１×１０−７Ｍ以下のＩＣ５０でｈＴＮＦα細胞毒性を中和する単離ヒト抗体から作製される。
【００４６】
特に、前記結晶は以下の特徴：即ちａ）表面プラズモン共鳴法により測定した場合に１×１０−３ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度定数でヒトＴＮＦαから解離する；ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を含むまたは１、４、５、７もしくは８位の１カ所のアラニン置換または１、３、４、６、７、８および／もしくは９位の１〜５カ所の保存アミノ酸置換により配列番号３から改変されたアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３領域を有する；ｃ）配列番号４のアミノ酸配列を含むまたは２、３、４、５、６、８、９、１０もしくは１１位の１カ所のアラニン置換または２、３、４、５、６、８、９、１０、１１および／もしくは１２位の１〜５カ所の保存アミノ酸置換により配列番号４から改変されたアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３領域を有する、という特徴を備える単離ヒト抗体から作製することができる。
【００４７】
より好ましくは、抗体またはその抗原結合部分は５×１０−４ｓ−１以下のｋｏｆｆにてヒトＴＮＦαから解離する。更により好ましくは、抗体またはその抗原結合部分は１×１０−４ｓ−１以下のｋｏｆｆにてヒトＴＮＦαから解離する。
【００４８】
特に好ましい１態様において、前記結晶は配列番号１のアミノ酸を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）と、配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を有する単離ヒト抗体から作製される。
【００４９】
国際公開第９７／２９１３１号パンフレットに開示されているような抗体Ｄ２Ｅ７またはその機能的等価物から作製された結晶が最も好ましい。前記抗体はチャイニーズハムスター卵巣細胞で組換え生産され、配列番号６に記載の重鎖配列と配列番号５に記載の軽鎖配列を含む。
【００５０】
別の態様において、本発明は、（ａ）請求項１５から２６のいずれか一項に記載の抗ｈＴＮＦα抗体の結晶および（ｂ）抗体結晶を安定に維持する少なくとも１種の医薬的に許容可能な賦形剤を含有する、固体、液体または半固体医薬組成物に関する。
【００５１】
本発明の別の側面は、（ａ）本明細書に記載する抗ｈＴＮＦα抗体の結晶および（ｂ）前記抗体結晶を封入または包埋する少なくとも１種の医薬的に許容可能な賦形剤を含有する、固体、液体または半固体医薬組成物に関する。前記組成物は（ｃ）抗体結晶を安定に維持する少なくとも１種の医薬的に許容可能な賦形剤を更に含有することができる。更に、封入と包埋を併用してもよい。
【００５２】
特に、前記組成物は、約１ｍｇ／ｍｌを上回る抗体結晶濃度を有することができ、特に約２００ｍｇ／ｍｌ以上、例えば約２００〜約６００ｍｇ／ｍｌまたは約３００〜約５００ｍｇ／ｍｌを有することができる。
【００５３】
前記賦形剤は少なくとも１種の場合により生分解性のポリマーキャリヤーまたは少なくとも１種の油類もしくは脂質キャリヤーを含むことができる。
【００５４】
前記ポリマーキャリヤーはポリ（アクリル酸）、ポリ（シアノアクリレート）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（酸無水物）、ポリ（デプシペプチド）、ポリ（エステル）、ポリ（乳酸）、乳酸・グリコール酸コポリマーないしＰＬＧＡ、ポリ（β−ヒドロキシブチレート）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（ジオキサノン）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド、ポリ（オルガノ）ホスファゼン、ポリ（オルトエステル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、無水マレイン酸・アルキルビニルエーテルコポリマー、プルロニックポリオール、アルブミン、アルギン酸塩、セルロースおよびセルロース誘導体、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン、ヒアルロン酸、オリゴ糖、グリコサミノグリカン、硫酸化多糖、これらのブレンドおよびコポリマーから構成される群の１種以上から選択されるポリマーとすることができる。
【００５５】
前記油類（または油性液体）は、油性アーモンド油、コーン油、綿実油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、鉱物油、軽鉱物油、オクチルドデカノール、オリーブ油、落花生油、杏仁油、胡麻油、大豆油、スクアレン、液体トリグリセリド、液体蝋、高級アルコールから構成される群の１種以上から選択される油類（または油性液体）であり得る。
【００５６】
前記脂質キャリヤーは、脂肪酸および脂肪酸塩、脂肪アルコール、脂肪アミン、脂肪酸のモノ、ジおよびトリグリセリド、リン脂質、糖脂質、ステロールおよび蝋並びに関連類似物質から構成される群の１種以上から選択される脂質とすることができる。蝋は更に天然物と合成物に分類される。天然物としては蜜蝋、カルナウバ蝋またはモンタン蝋等の植物、動物または鉱物起源から得られる蝋が挙げられる。合成蝋製品の例としては塩素化ナフタレンとエチレンポリマーが挙げられる。
【００５７】
好ましい１態様において、前記組成物は約１０〜約４００または約５０〜約３００ｍｇ／ｍｌの範囲の抗体結晶濃度で上記抗ｈＴＮＦα抗体結晶を含有する注射用組成物である。
【００５８】
別の側面において、本発明は約１００ｍｇ／ｍｌを上回る抗体結晶濃度、例えば約１５０〜約６００ｍｇ／ｍｌ、または約２００〜約４００ｍｇ／ｍｌで上記抗ｈＴＮＦα抗体結晶を含有する結晶スラリーに関する。
【００５９】
本発明は更に有効量の上記完全抗ｈＴＮＦα抗体結晶または有効量の上記組成物を哺乳動物に投与する段階を含む哺乳動物の治療方法に関する。非経口経路、経口経路または注射により前記組成物を投与することが好ましい。
【００６０】
更に、本発明は治療有効量の上記抗体結晶を投与する段階を含む対象におけるＴＮＦα関連疾患の治療方法に関する。
【００６１】
特に、前記ｈＴＮＦα関連疾患は自己免疫疾患、特に関節リウマチ、リウマチ性脊椎炎、変形性関節症および痛風性関節炎、アレルギー、多発性硬化症、自己免疫性糖尿病、自己免疫性ぶどう膜炎およびネフローゼ症候群、感染性疾患、移植拒絶反応ないし移植片対宿主病、悪性腫瘍、肺障害、腸障害、心臓障害、炎症性骨障害、骨吸収疾患、アルコール性肝炎、ウイルス性肝炎、劇症肝炎、凝固障害、熱傷、再潅流障害、ケロイド形成、瘢痕組織形成、発熱、歯周病、肥満症および放射線傷害、脊椎関節症、肺障害、冠動脈障害、代謝障害、貧血、疼痛、肝障害、皮膚障害、爪障害、または血管炎、ベーチェット病、強直性脊椎炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、再狭窄、糖尿病、貧血、疼痛、クローン病関連障害、若年性関節リウマチ（ＪＲＡ）、Ｃ型肝炎ウイルス感染、乾癬、乾癬性関節炎、および慢性プラーク乾癬、加齢性悪液質、アルツハイマー病、脳浮腫、炎症性脳損傷、慢性疲労症候群、皮膚筋炎、薬物反応、脊髄内および／または周囲の浮腫、家族性周期性発熱、フェルティ症候群、線維症、糸球体腎炎（例えば連鎖球菌感染後糸球体腎炎やＩｇＡ腎症）、人工器官の緩み、顕微鏡的多発血管炎、混合性結合組織病、多発性骨髄腫、癌および悪液質、多発性臓器障害、骨髄異形成症候群、睾丸炎、骨溶解、急性、慢性および膵膿瘍を含む膵炎、歯周病、多発性筋炎、進行性腎不全、偽痛風、壊疽性膿皮症、再発性多発性軟骨炎、リウマチ性心臓病、サルコイドーシス、硬化性胆管炎、脳卒中、胸腹部大動脈瘤修復（ＴＡＡＡ）、ＴＮＦ受容体関連周期性症候群（ＴＲＡＰＳ）、黄熱病ワクチン接種関連症候群、耳関連炎症性疾患、慢性耳炎症、または小児耳炎症、ぶどう膜炎、座骨神経痛、前立腺炎、子宮内膜症、脈絡膜血管新生、狼瘡、ショーグレン症候群並びに滲出型黄斑変性症から選択される。
【００６２】
更に、本発明は上記ｈＴＮＦα関連疾患の治療用医薬組成物の製造用としての上記完全抗ｈＴＮＦα抗体結晶の使用に関する。
【００６３】
最後に、本発明は医薬用としての上記抗ｈＴＮＦα抗体結晶を提供する。
【００６４】
発明の詳細な説明
Ａ．定義
「バッチ晶析方法」は結晶化させようとする抗体の溶液に好ましくは溶解形態の結晶化剤を含有する結晶化溶液を加える段階を含む。
【００６５】
「マイクロスケール晶析方法」は、例えば蒸気拡散法に基づくことができ、結晶化剤を含有するリザーバ緩衝液とマイクロリットル範囲の小容量の抗体溶液を混合する段階と；密閉容器に入れた前記混合物の液滴を前記リザーバ緩衝液のアリコートの隣に並べる段階と；蒸気拡散により液滴とリザーバの間で溶媒を交換させる段階とを含み、この間に前記液滴の溶媒含量が変化し、適切な結晶化条件に達すると、結晶化が認められる。
【００６６】
「結晶化剤」（本発明の場合にはリン酸塩）は結晶化させようとする抗体の結晶形成を助長する。
【００６７】
「結晶化溶液」は溶解形態の前記結晶化剤を含有する。好ましくは、前記溶液は水性系であり、即ちその液体成分は主に水から構成される。例えば、８０〜１００重量％または９５〜１００重量％または９８〜１００重量％を水とすることができる。
【００６８】
抗体「結晶」は前記蛋白質の物質の固体状態の１形態であり、第２の固体形態即ち原則的に無秩序な不均質固体として存在する非晶質状態から区別される。結晶は一般に格子と呼ばれる規則的な三次元構造をもつ。抗体結晶は抗体分子の規則的な三次元配列を含む。Ｇｉｅｇｅ，Ｒ．ａｎｄ  Ｄｕｃｒｕｉｘ，Ａ．Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，第２版，１〜１６頁，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９９）参照。
【００６９】
本発明により結晶化された「完全」ないし「無傷」の抗ｈＴＮＦα抗体はその抗原であるヒトＴＮＦαをインビトロおよび／またはインビボで認識してこれと結合することが可能な機能的抗体である。前記抗体は抗体とその抗原の結合に関連する患者の後続免疫系反応、特に直接細胞傷害作用、補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）および抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を開始することができる。抗体分子は相互に共有結合した２本の同一の重鎖（各々ＭＷ約５０ｋＤａ）とおよび各々重鎖の一方と共有結合した２本の同一の軽鎖（各々ＭＷ約２５ｋＤａ）とから構成される構造をもつ。４本鎖は典型的「Ｙ」字型モチーフとして配置されている。各重鎖は重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲないしＶＨと略称する）と重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域はＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３の３領域から構成される。各軽鎖は軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲないしＶＬと略称する）と軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は１個の領域ＣＬから構成される。ＶＨ領域とＶＬ領域は更に相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域と、その間に配置された比較的保存度の高いフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる領域に分けることができる。各ＶＨおよびＶＬはアミノ末端からカルボキシ末端に向かってＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配置された３個のＣＤＲと４個のＦＲから構成される。完全な抗体分子は２個の抗原結合部位をもち、即ち「二価」である。これらの２個の抗原結合部位は単一のｈＴＮＦα抗原に特異的であり、即ち抗体は「単一特異性」である。
【００７０】
「モノクローナル抗体」はＢリンパ球（Ｂ細胞）の単一クローンに由来し、同一の抗原決定基を認識する抗体である。完全モノクローナル抗体は２本の完全な重鎖と２本の完全な軽鎖を含む上記典型的分子構造をもつ抗体である。モノクローナル抗体は抗体産生Ｂ細胞を不死化骨髄腫細胞と融合させ、細胞培養で持続的にモノクローナル抗体を産生するＢ細胞ハイブリドーマを作製することにより生産するのが通例である。例えばファージディスプレイ技術を使用して細菌、酵母、昆虫または哺乳動物細胞培養でモノクローナル抗体を発現させる方法；完全ヒトＢ細胞ゲノムを組込み、これを発現するように改変されたウシ、ヤギ、ブタ、ウサギ、ニワトリまたはトランスジェニックマウス等の遺伝子改変動物におけるインビボ生産；あるいはタバコやトウモロコシ等の遺伝子改変植物における生産等の他の生産方法も利用できる。このような全起源に由来する抗ｈＴＮＦα抗体を本発明により結晶化させることができる。
【００７１】
本発明により結晶化させるモノクローナル抗体としては重鎖および／または軽鎖の一部が特定種に由来または特定抗体分類もしくは亜分類に属する抗体中の対応配列と同一または相同であり、その他の部分が別の種に由来または別の抗体抗体分類もしくは亜分類に属する抗体中の対応配列と同一または相同である「キメラ」抗ｈＴＮＦα抗体が挙げられる。１例として、マウス抗体の可変領域抗原結合部分とヒト抗体に由来する定常領域部分を含むマウス／ヒトキメラを挙げることができる。
【００７２】
非ヒト（例えばマウス）抗ｈＴＮＦα抗体の「ヒト化」形態も含まれる。これらは非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。多くの場合、ヒト化抗体はヒト免疫グロブリンの相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変ループ（ＨＶＬ）からの残基が所望機能をもつマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類等の非ヒト種のＣＤＲまたはＨＶＬの残基で置換されたヒト免疫グロブリンである。抗原結合親和性を改善するためにヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基を対応する非ヒト残基により置換することができる。更に、ヒト化抗体は対応するヒトまたはヒト抗体部分のどちらにも存在しない残基を含むことができる。抗体効力を更に改善するためにこれらの改変が必要であろう。
【００７３】
「ヒト抗体」ないし「完全ヒト抗体」はヒトにより産生される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列をもつ抗体または組換え生産された抗体である。本明細書で使用する「ヒト抗体」なる用語はヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域と定常領域をもつ抗体を意味する。本発明のヒト抗体はヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基（例えばランダムもしくは部位特異的インビトロ変異誘発またはインビボ体細胞変異により誘導される変異）を例えばＣＤＲ、特にＣＤＲ３に含むことができる。他方、本明細書で使用する「ヒト抗体」なる用語はマウス等の別の哺乳動物種の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列をヒトフレームワーク配列に配置した抗体を意味しない。
【００７４】
本明細書で使用する「組換えヒト抗体」なる用語は組換え手段により作製、発現、創製または単離された全ヒト抗体を意味し、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現された抗体、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子に対してトランスジェニックな動物（例えばマウス）から単離された抗体（例えばＴａｙｌｏｒ，Ｌ．Ｄ．ら（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：６２８７−６２９５参照）またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列と他のＤＮＡ配列のスプライシングを伴う他の任意手段により作製、発現、創製もしくは単離された抗体が挙げられる。このような組換えヒト抗体はヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域と定常領域をもつ。しかし、ある態様において、このような組換えヒト抗体はインビトロ変異誘発処理（または、ヒトＩｇ配列にトランスジェニックな動物を使用する場合にはインビボ体細胞変異誘発処理）されるので、組換え抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列ＶＨおよびＶＬ配列に由来するが、インビボヒト抗体生殖細胞系列レパートリー内に天然に存在し得ない配列である。
【００７５】
本明細書で使用する「中和抗体」（または「ｈＴＮＦα活性を中和した抗体」）なる用語はｈＴＮＦαと結合することによりｈＴＮＦαの生物活性を阻害する抗体を意味する。ｈＴＮＦαの生物活性のこの阻害はｈＴＮＦαにより誘導される（インビトロまたはインビボ）細胞傷害作用、ｈＴＮＦαにより誘導される細胞活性化およびｈＴＮＦαとｈＴＮＦα受容体の結合等のｈＴＮＦα生物活性の１種類以上の指標を測定することにより評価することができる。ｈＴＮＦα生物活性のこれらの指標は当分野で公知の数種のインビトロまたはインビボアッセイの１種以上により評価することができる。ｈＴＮＦαにより誘導されるＬ９２９細胞の細胞傷害作用の阻害によりｈＴＮＦα活性を中和する抗体の能力を評価することが好ましい。ｈＴＮＦα活性の付加的または代替パラメーターとしては、ｈＴＮＦαにより誘導される細胞活性化の尺度としてＨＵＶＥＣでｈＴＮＦαにより誘導されるＥＬＡＭ−１の発現を阻害する抗体の能力を評価することができる。
【００７６】
「親和性成熟」抗ｈＴＮＦα抗体は１個以上の超可変領域の１カ所以上の改変により、親抗体に比較して抗体の抗原親和性が改善された抗体である。親和性成熟抗体は標的抗体に対する親和性値がナノモルまたはピコモルとなる。親和性成熟抗体は当分野で公知の方法により生産される。Ｍａｒｋｓら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２）はＶＨおよびＶＬ領域シャフリングによる親和性成熟について記載している。ＣＤＲおよび／またはフレームワーク残基のランダム突然変異誘発はＢａｒｂａｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３８０９−３８１３（１９９４）；Ｓｃｉｅｒら，Ｇｅｎｅ  １６９：１４７−１５５（１９９５）；Ｙｅｌｔｏｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１９９４−２００４（１９９５）；Ｊａｃｋｓｏｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４（７）：３３１０−９（１９９５）；およびＨａｗｋｉｎｓら，Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６（１９９２）に記載されている。
【００７７】
本明細書で使用する「単離抗体」なる用語は異なる抗原特異性をもつ他の抗体を実質的に含まない抗体を意味する（例えばｈＴＮＦαと特異的に結合する単離抗体はｈＴＮＦα以外の抗原と特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。他方、ｈＴＮＦαと特異的に結合する単離抗体は他の種に由来するｈＴＮＦα分子等の他の抗原に対して交差反応性をもつ場合がある。更に、単離抗体は他の細胞材料および／または化学薬品を実質的に含まない場合がある。
【００７８】
本明細書で使用する「ヒトＴＮＦα」（本明細書ではｈＴＮＦαまたは単にｈＴＮＦと略称する）なる用語は１７ｋＤａ分泌型および２６ｋＤａ膜結合型として存在し、その生物活性形態が非共有的に結合した分子の三量体から構成されるヒトサイトカインを意味する。ｈＴＮＦαの構造は例えばＰｅｎｎｉｃａ，Ｄ．ら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：７２４−７２９；Ｄａｖｉｓ，Ｊ．Ｍ．ら（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６：１３２２−１３２６；およびＪｏｎｅｓ，Ｅ．Ｙ．ら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３３８：２２５−２２８に更に記載されている。ヒトＴＮＦαなる用語は標準組換え発現法により作製可能または市販品として購入可能な組換えヒトＴＮＦα（ｒｈＴＮＦα）を意味する（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，カタログ番号２１０−ＴＡ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）。
【００７９】
本明細書で使用する「ｋｏｆｆ」なる用語は抗体が抗体／抗原複合体から解離する解離速度定数を意味する。
【００８０】
本明細書で使用する「Ｋｄ」なる用語は特定抗体−抗原相互作用の解離定数を意味する。
【００８１】
本発明により結晶化された特定「親」抗ｈＴＮＦα抗体の「機能的等価物」とは同一の抗原特異性を示すが、アミノ酸レベルまたは糖鎖付加レベルで「親」抗体の分子組成と相違する抗体である。但し、前記相違は単に結晶化条件が本明細書に開示するようなパラメーター範囲内であるという程度であり得る。
【００８２】
抗体結晶の「封入」とは組込まれる結晶がコーティング材料の少なくとも１層により各々被覆された製剤を意味する。好ましい１態様において、このようなコーティング付き結晶は延長された溶解速度を有することができよう。
【００８３】
抗体結晶の「包埋」とは封入の有無に拘わらず、結晶が分散状態で固体、液体または半固体キャリヤーに組込まれた製剤を意味する。このような包埋結晶化抗体分子はキャリヤーから制御下で持続的に放出または溶解させることができる。
【００８４】
Ｂ．晶析方法
本発明の晶析方法は、原則として、抗ｈＴＮＦα抗体のいずれにもに適用される。前記抗体はポリクローナル抗体または好ましくはモノクローナル抗体とすることができる。前記抗体は各々糖鎖付加または非糖鎖付加型のキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体または非ヒト（例えばマウス）抗体とすることができる。特に、前記方法はＤ２Ｅ７とその機能的等価物に適用可能である。
【００８５】
好ましくは、前記抗ｈＴＮＦα抗体はＩｇＧ抗体、特にＩｇＧ１群の抗ヒトＴＮＦα抗体である。
【００８６】
特に指定しない限り、本発明の晶析方法は当分野で公知の技術装置、化学薬品および手法を利用する。しかし、上記に説明したように、本発明は特定結晶化条件、特に特定結晶化剤を選択し、場合により更に対応物質（緩衝液、抗体、結晶化剤）の特定ｐＨ条件および／または濃度範囲も選択することにより、抗体、特にｈＴＮＦαに対する非キメラヒト抗体の安定な結晶を再現可能に大規模製造することが初めて可能になり、これらの結晶を更に処理し、非常に有利な優れた医薬組成物の活性成分を形成できるという驚くべき発見に基づく。
【００８７】
晶析方法を実施するための出発材料は通常、結晶化させようとする抗体の濃厚溶液を含む。蛋白質濃度は例えば約５〜７５ｍｇ／ｍｌの範囲とすることができる。前記溶液は前記溶解抗体を安定化させる添加剤を添加することができ、前記添加剤を予め除去するとよいと思われる。これは緩衝液交換工程を実施することにより実現することができる。
【００８８】
好ましくは、結晶化を実施するための前記出発材料はｐＨを約３．２〜８．２または約４．０〜８．０、特に約４．５〜６．５、好ましくは約５．０〜５．５の範囲に調整した水溶液中に抗体を含有する。ｐＨは適切な緩衝液を終濃度約１〜５０ｍＭ、特に約１〜１０ｍＭで添加することにより調整することができる。溶液を更に安定化させるために、例えば溶液の総重量に対して約０．０１〜１５または０．１〜５または０．１〜２重量％の割合で塩、糖、糖アルコールおよび界面活性剤等の添加剤を溶液に添加することができる。賦形剤は医薬製剤に慣例的に添加される生理的に許容可能な化合物から選択することが好ましい。非限定的な例として、ＮａＣｌ等の塩；ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ  ８０）、ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ  ２０）等の界面活性剤；スクロース、トレハロース等の糖；マンニトール、ソルビトール等の糖アルコール；リン酸緩衝系（例えば上記のようなリン酸水素ナトリウム緩衝液およびリン酸水素カリウム緩衝液）、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、マレイン酸緩衝液または琥珀酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液等の緩衝剤；ヒスチジン、アルギニンおよびグリシン等のアミノ酸が挙げられる。
【００８９】
緩衝液交換は例えば透析や限外濾過等の常法により実施することができる。
【００９０】
出発材料として使用する水溶液の初期蛋白質濃度は約０．５〜約２００または約１〜約５０ｍｇ／ｍｌの範囲とすべきである。
【００９１】
（１ｍｌ〜２００００リットルの範囲であり得る）目的最終バッチ寸法に応じて、初期容量の前記抗体水溶液を不活性材料（例えばガラス、ポリマーまたは金属）製の適当な容器（例えば液体容器、ビンまたはタンク）に入れる。前記水溶液の初期容量は最終バッチ寸法の約３０〜８０％、通常は約５０％に対応する量とすることができる。
【００９２】
必要に応じて、前記容器に充填後の溶液を標準条件に設定する。特に、温度を約４℃〜約３７℃の範囲に調整する。
【００９３】
次に、場合により抗体溶液と同様に予め条件設定した適当な濃度の結晶化剤を含有する結晶化溶液を抗体溶液に加える。
【００９４】
結晶化溶液の添加は２液の混合を助長するために場合により温和な撹拌下に連続的または不連続的に実施する。蛋白質溶液を撹拌下に添加し、結晶化溶液（またはその固体形態の結晶化剤）を制御下に添加する条件下では、連続的に添加することが好ましい。
【００９５】
結晶化剤として上記に記載したようなリン酸塩、特にリン酸水素塩、好ましくはアルカリ金属塩、または少なくとも２種類の異なるアルカリ金属塩の混合物を添加することにより、抗体結晶の形成を開始する。結晶化溶液は前記結晶化混合物中のリン酸塩の終濃度を約１〜６Ｍの範囲とするために十分な濃度の結晶化剤を含有する。
【００９６】
好ましくは、結晶化溶液は更に結晶化混合物のｐＨを約３〜５の範囲に調整させるのに適した濃度の酸性緩衝液、即ち抗体溶液の緩衝液とは異なる緩衝液を含有する。
【００９７】
前記結晶化溶液の添加の完了後、最大収率の抗体結晶を得るために、こうして得られた混合物を約１時間〜約６０日間更に保温してもよい。必要に応じて、混合物を例えばそれ自体公知の方法で撹拌、温和に撹拌、回転または運動させてもよい。
【００９８】
最後に、公知方法、例えば濾過または遠心、例えば室温または４℃にて約２００〜２００００ｒｐｍ、好ましくは５００〜２０００ｒｐｍで遠心することにより、得られた結晶を分離することができる。残りの母液は捨ててもよいし、更に処理してもよい。
【００９９】
必要に応じて、こうして単離した結晶を洗浄後、乾燥してもよいし、懸濁抗体の保存および／または最終利用に適した別の溶媒系に母液を交換してもよい。
【０１００】
本発明により形成された抗体結晶は種々の形状をとることができる。形状としては一般に針状、円錐状、球状およびウニ状形状が挙げられる。結晶の寸法は高値のｎｍからｍｍ寸法（例えば長さ）程度とすることができる。所定態様では、結晶は少なくとも約１０μｍの寸法であり、肉眼で見える。治療投与では、結晶の寸法は投与経路により異なり、例えば皮下投与の場合、結晶寸法は静脈内投与よりも大きくすることができる。
【０１０１】
蛋白質結晶と低分子量有機および無機分子の結晶の両者について従来記載されているように、結晶の形状は特定の付加的な添加剤を結晶化混合物に添加することにより変えることができる。
【０１０２】
必要に応じて、結晶が実際に前記抗体の結晶であることを検証してもよい。抗体の結晶を複屈折について顕微鏡分析することができる。一般に、内部立方対称以外の結晶では偏光の偏光面が回転する。更に別の方法では、結晶を単離し、洗浄し、再可溶化させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、場合により抗Ｆｃ受容体抗体で染色することができる。場合により、再可溶化させた抗体も標準アッセイを使用してそのｈＴＮＦαとの結合について試験することができる。
【０１０３】
本発明により得られた結晶を更に相互に架橋させてもよい。このような架橋は結晶の安定性を増すことができる。結晶の架橋方法は例えば米国特許第５，８４９，２９６号明細書に記載されている。グルタルアルデヒド等の二官能性試薬を使用して結晶を架橋させることができる。架橋させたら、結晶を凍結乾燥し、例えば診断または治療用途に備えて保存することができる。
【０１０４】
場合により、結晶を乾燥することが望ましい場合がある。窒素ガス等の不活性ガス、真空オーブン乾燥、凍結乾燥、蒸発、トレー乾燥、流動層乾燥、噴霧乾燥、真空乾燥またはローラー乾燥等により結晶を乾燥することができる。適切な方法は周知である。
【０１０５】
本発明により形成された結晶は、元の結晶化溶液中に維持されてもよいし、洗浄され、本発明の結晶を含有する組成物または製剤を形成するための不活性キャリヤーまたは成分等の他の物質が加えられてもよい。このような組成物または製剤は例えば治療および診断用途で使用することができる。
【０１０６】
好ましい１態様は製剤の結晶を賦形剤により包埋または封入するように適切なキャリヤーまたは成分を本発明の結晶に添加する方法である。適切なキャリヤーはポリ（アクリル酸）、ポリ（シアノアクリレート）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（酸無水物）、ポリ（デプシペプチド）、ポリ（エステル）、ポリ（乳酸）、乳酸・グリコール酸コポリマーないしＰＬＧＡ、ポリ（β−ヒドロキシブチレート）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（ジオキサノン）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド、ポリ（オルガノ）ホスファゼン、ポリ（オルトエステル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、無水マレイン酸・アルキルビニルエーテルコポリマー、プルロニックポリオール、アルブミン、アルギン酸塩、セルロースおよびセルロース誘導体、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン、ヒアルロン酸、オリゴ糖、グリコサミノグリカン、硫酸化多糖、そのブレンドおよびコポリマー、ＳＡＩＢ、脂肪酸および脂肪酸塩、脂肪アルコール、脂肪アミン、脂肪酸のモノ、ジおよびトリグリセリド、リン脂質、糖脂質、ステロールおよび蝋並びに関連類似物質の非限定的な群から選択することができる。蝋は更に天然物と合成物に分類される。天然物としては蜜蝋、カルナウバ蝋またはモンタン蝋等の植物、動物または鉱物起源から得られる蝋が挙げられる。合成蝋製品の例としては塩素化ナフタレンとエチレンポリマーが挙げられる。
【０１０７】
Ｃ．組成物
本発明の別の側面は、少なくとも１種のキャリヤー／賦形剤と共に抗ｈＴＮＦα抗体結晶を含有する組成物／製剤に関する。
【０１０８】
この製剤は固体、半固体または液体とすることができる。
【０１０９】
本発明の製剤は、必要な純度の抗体をキャリヤー、賦形剤および／または安定剤等の生理的に許容可能な添加剤（例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０）参照）と懸濁液として混合することにより保存および／または使用に適した形態で製造され、凍結乾燥または別の方法で乾燥される。場合により、例えば別の抗体、生体分子、化学的または酵素により合成された低分子量分子等の他の活性成分も配合してもよい。
【０１１０】
許容可能な添加剤は使用する用量および濃度でレシピエントに非毒性である。その非限定的な例を以下に挙げる。
−酢酸、クエン酸、フマル酸、塩酸、リンゴ酸、硝酸、リン酸、希リン酸、硫酸、酒石酸等の酸性化剤。
−ブタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、イソブタン、プロパン、トリクロロモノフルオロメタン等のエアゾール用噴射剤。
−二酸化炭素、窒素等の空気置換剤。
−メチルイソブチルケトン、オクタ酢酸スクロース等のアルコール変性剤。
−アンモニア溶液、炭酸アンモニウム、ジエタノールアミン、ジイソプロパノールアミン、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、トロラミン等のアルカリ化剤。
−ジメチコン、シメチコン等の消泡剤。
−塩化ベンズアルコニウム、塩化ベンズアルコニウム溶液、塩化ベンズエトニウム、安息香酸、ベンジルアルコール、ブチルパラベン、塩化セチルピリジニウム、クロロブタノール、クロロクレゾール、クレゾール、デヒドロ酢酸、エチルパラベン、メチルパラベン、メチルパラベンナトリウム、フェノール、フェニルエチルアルコール、酢酸フェニル水銀、硝酸フェニル水銀、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、プロピルパラベン、プロピルパラベンナトリウム、安息香酸ナトリウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、ソルビン酸、チメロサール、チモール等の抗菌防腐剤。
−アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、次亜リン酸、モノチオグリセロール、没食子酸プロピル、ナトリウムホルムアルデヒドスルホキシレート、メタ重亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、二酸化硫黄、トコフェロール、トコフェロール賦形剤等の酸化防止剤。
−酢酸、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、ホウ酸、クエン酸、乳酸、リン酸、クエン酸カリウム、メタリン酸カリウム、一塩基性リン酸カリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム溶液、二塩基性リン酸ナトリウム、一塩基リン酸ナトリウム、ヒスチジン等の緩衝剤。
−エデト酸二ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸および塩、エデト酸等のキレート剤；
−カルボキシメチルセルロースナトリウム、酢酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、エチルセルロース、ゼラチン、医薬品用艶出し剤、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタル酸エステメ、メタクリル酸コポリマー、メチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリ酢酸ビニルフタル酸エステル、シェラック、スクロース、二酸化チタン、カルナウバ蝋、微結晶蝋、ゼイン、ポリアミノ酸、他のポリマー（例えばＰＬＧＡ等）、およびＳＡＩＢ等のコーティング剤。
−酸化第二鉄等の着色剤。
−エチレンジアミン四酸化および塩（ＥＤＴＡ）、エデト酸、ゲンチシン酸エタノールアミド、硫酸オキシキノリン等の錯化剤。
−塩化カルシウム、硫酸カルシウム、二酸化ケイ素等の乾燥剤。
−アラビアガム、コレステロール、ジエタノールアミン（付加物）、モノステアリン酸グリセリル、ラノリンアルコール、レシチン、モノおよびジグリセリド、モノエタノールアミン（付加物）、オレイン酸（付加物）、オレイルアルコール（安定剤）、ポロキサマー、ステアリン酸ポリオキシエチレン５０、ポリオキシル３５ヒマシ油、ポリオキシル４０水素化ヒマシ油、ポリオキシル１０オレイルエーテル、ポリオキシル２０セトステアリルエーテル、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、プロピレングリコールジアセテート、モノステアリン酸プロピレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、ステアリン酸、トロラミン、乳化蝋等の乳化および／または可溶化剤。
−粉末セルロース、精製珪藻土等の濾過助剤。
−アネトール、ベンズアルデヒド、エチルバニリン、メントール、サリチル酸メチル、グルタミン酸一ナトリウム、オレンジ花油、ハッカ、ハッカ油、ハッカ精、バラ油、高濃度バラ水、チモール、トルーバルサムチンキ、バニラ、バニラチンキ、バニリン等の香味剤および香料。
−ケイ酸カルシウム、ケイ酸マグネシウム、コロイド状二酸化ケイ素、タルク等の流動促進剤および／または凝結防止剤。
−グリセリン、ヘキシレングリコール、プロピレングリコール、ソルビトール等の湿潤剤。
−ラノリン、無水ラノリン、親水性軟膏、白色軟膏、黄色軟膏、ポリエチレングリコール軟膏、ペトロラタム、親水性ペトロラタム、白色ペトロラタム、バラ水軟膏、スクアレン等の軟膏基剤。
−ヒマシ油、ラノリン、鉱物油、ペトロラタム、ギ酸ベンジル、クロロブタノール、フタル酸ジエチル、ソルビトール、ジアセチル化モノグリセリド、フタル酸ジアセチル、グリセリン、グリセロール、モノおよびジアセチル化モノグリセリド、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、トリアセチン、クエン酸トリエチル、エタノール等の可塑剤。
−低分子量（約１０残基未満）等のポリペプチド。
−血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン等の蛋白質。
−酢酸セルロース膜等のポリマー膜。
−アセトン、アルコール、希アルコール、アミレン水和物、安息香酸ベンジル、ブチルアルコール、四塩化炭素、クロロホルム、コーン油、綿実油、酢酸エチル、グリセリン、ヘキシレングリコール、イソプロピルアルコール、メチルアルコール、塩化メチレン、メチルイソブチルケトン、鉱物油、落花生油、ポリエチレングリコール、炭酸プロピレン、プロピレングリコール、胡麻油、注射用水、注射用滅菌水、持続洗浄用滅菌水、精製水、液体トリグリセリド、液体蝋、高級アルコール等の溶剤。
−粉末セルロース、活性炭、精製珪藻土、二酸化炭素吸着剤、水酸化バリウム、石灰、ソーダ石灰等の吸着剤。
−水素化ヒマシ油、セトステアリルアルコール、セチルアルコール、セチルエステル蝋、硬質脂肪、パラフィン、ポリエチレン賦形剤、ステアリルアルコール、乳化蝋、白蝋、黄蝋等の硬化剤。
−カカオバター、硬質脂肪、ポリエチレングリコール等の坐剤基剤。
−アラビアガム、寒天、アルギン酸、モノステアリン酸アルミニウム、ベントナイト、精製ベントナイト、マグマベントナイト、カルボマー９３４ｐ、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム１２、カラギーナン、微結晶およびカルボキシメチルセルロースナトリウムセルロース、デキストリン、ゼラチン、グアーガム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、メチルセルロース、ペクチン、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポビドン、アルギン酸プロピレングリコールエステル、二酸化ケイ素、コロイド状二酸化ケイ素、アルギン酸ナトリウム、トラガカントガム、キサンタンガム等の懸濁および／または増粘剤。
−アスパルテーム、デキストレート、デキストロース、デキストロース賦形剤、フルクトース、マンニトール、サッカリン、サッカリンカルシウム、サッカリンナトリウム、ソルビトール、ソルビトール溶液、スクロース、圧縮糖、粉糖、シロップ等の甘味剤。
−アラビアガム、アルギン酸、カルボキシメチルセルロースナトリウム、微結晶セルロース、デキストリン、エチルセルロース、ゼラチン、液体グルコース、グアーガム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、ポリエチレンオキシド、ポビドン、糊化デンプン、シロップ等の錠剤結合剤。
−炭酸カルシウム、二塩基性リン酸カルシウム、三塩基性リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、微結晶セルロース、粉末セルロース、デキストレート、デキストリン、デキストロース賦形剤、フルクトース、カオリン、ラクトース、マンニトール、ソルビトール、デンプン、糊化デンプン、スクロース、圧縮糖、粉糖等の錠剤および／またはカプセル希釈剤。
−アルギン酸、微結晶セルロース、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、ポラクリリンカリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、デンプン、糊化デンプン等の錠剤崩壊剤。
−ステアリン酸カルシウム、ベヘン酸グリセリル、ステアリン酸マグネシウム、軽鉱物油、ポリエチレングリコール、フマル酸ステアリルナトリウム、ステアリン酸、精製ステアリン酸、タルク、水素化植物油、ステアリン酸亜鉛等の錠剤および／またはカプセル滑沢剤。
−デキストロース、グリセリン、マンニトール、塩化カリウム、塩化ナトリウム等の浸透圧調節剤。
賦形剤：香味付けおよび／または甘味剤入り芳香エリキシル、化合物ベンズアルデヒドエリキシル、イソアルコールエリキシル、ハッカ水、ソルビトール溶液、シロップ、トルーバルサムシロップ。
−油性アーモンド油、コーン油、綿実油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、鉱物油、軽鉱物油、ミリスチルアルコール、オクチルドデカノール、オリーブ油、落花生油、杏仁油、胡麻油、大豆油、スクアレン、固体キャリヤー粒状糖、注射用滅菌静菌水、静菌塩化ナトリウム注射液、液体トリグリセリド、液体蝋、高級アルコール等の賦形剤。
−シクロメチコン、ジメチコン、シメチコン等の撥水剤；
−塩化ベンズアルコニウム、塩化ベンズエトニウム、塩化セチルピリジニウム、ドクサートナトリウム、ノノキシノール９、ノノキシノール１０、オクトキシノール９、ポロキサマー、ポリオキシル３５ヒマシ油、ポリオキシル４０、水素化ヒマシ油、ステアリン酸ポリオキシル５０、ポリオキシル１０オレイルエーテル、ポリオキシル２０、セトステアリルエーテル、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、ラウリル硫酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、チロキサポール等の湿潤および／または可溶化剤。
【０１１１】
安定性および／または持続放出を実現するために結晶にポリマーキャリヤーを添加してもよい。このようなポリマーとしては生体適合性で生分解性のポリマーが挙げられる。ポリマーキャリヤーは単一ポリマー種でよいまたは複数のポリマー種の混合物から構成してもよい。ポリマーキャリヤーの非限定的な例は上記に挙げた通りである。
【０１１２】
好ましい成分または賦形剤の例を以下に挙げる。
−グリシン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アスパラギン、グルタミン、プロリン、ヒスチジン等のアミノ酸の塩；
−グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、アラビノース、キシロース、リボース等の単糖類；
−ラクトース、トレハロース、マルトース、スクロース等の二糖類；
−マルトデキストリン、デキストラン、デンプン、グリコーゲン等の多糖類；
−マンニトール、キシリトール、ラクチノール、ソルビトール等のアルジトール；
−グルクロン酸、ガラクツロン酸；
−メチルシクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−（３−シクロデキストリン）等のシクロデキストリン類；
−塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、ホウ酸、炭酸アンモニウムおよびリン酸アンモニウム等の無機塩類；
−酢酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩、乳酸塩等の有機塩類；
−アラビアガム、ジエタノールアミン、モノステアリン酸グリセリル、レシチン、モノエタノールアミン、オレイン酸、オレイルアルコール、ポロキサマー、ポリソルベート、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸、モノラウリン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタンおよび他のソルビタン誘導体、ポリオキシル誘導体、蝋、ポリオキシエチレン誘導体、ソルビタン誘導体等の乳化または可溶化剤；並びに
−寒天、アルギン酸とその塩、グアーガム、ペクチン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキシド、セルロースとその誘導体、炭酸プロピレン、ポリエチレングリコール、ヘキシレングリコールおよびチロキサポール等の増粘剤。
【０１１３】
本明細書に記載する製剤は更に有効量の結晶抗体を含有する。特に、本発明の製剤は「治療有効量」または「予防有効量」の本発明の抗体結晶を含有することができる。「治療有効量」とは必要な用量および投与期間にて所望治療結果を達成するために有効な量を意味する。この抗体結晶の「治療有効量」は個体の疾患状態、年齢、性別および体重並びに個体に所望の応答を誘発する抗体の能力等の因子により変動し得る。治療有効量は抗体の有益な治療作用が毒性ないし有害作用を上回る量でもある。「予防有効量」とは必要な用量と投与期間で所望予防結果を達成するために有効な量を意味する。一般に、予防用量は、疾患以前または疾患の初期段階の対象において使用されるので、予防有効量は治療有効量よりも少なくなる。
【０１１４】
適切な用量は標準方法を使用して容易に決定することができる。抗体は、患者に一度に投与されるまたは複数回に分けて投与されるのが適切である。例えば１回もしくは２回以上に分けて投与するかまたは連続輸液により投与するかに関係なく、上記因子に応じて、抗体約１μｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、例えば０．１〜２０ｍｇ／ｋｇが患者に投与する初期候補用量である。典型的な１日または１週間用量としては、症状に応じて約１μｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上が挙げられ、疾患症状の所望の抑制が得られるまで投与を繰返す。しかし、他の投与レジメンが有用な場合もある。場合により、製剤は再可溶化時に少なくとも約１ｇ／Ｌ以上の濃度の抗体を含有する。他の態様では、抗体濃度は再可溶化時に少なくとも約１ｇ／Ｌ〜約１００ｇ／Ｌとする。
【０１１５】
抗体の結晶またはこのような結晶を含有する製剤は、単独で投与してもよいまたは医薬製剤の一部として投与してもよい。これらは、非経口、経口または局所経路にて投与され得る。これらは、例えば、経口、肺、鼻、耳、肛門、皮膚、眼球、静脈内、筋肉内、動脈内、腹腔内、粘膜、舌下、皮下、経皮、局所または頭蓋内経路で投与され得るまたは口腔内に投与され得る。投与技術の特定例としては、肺吸入、病巣内投与、注射、乾燥粉末吸入、皮膚エレクトロポレーション、エアゾール送達および無針注射技術（無針皮下投与を含む）が挙げられる。
【０１１６】
以下、非限定的な実施例により本発明を更に詳細に説明する。当業者は以下の記載の概論部分と自身の一般知識に基づき、過度の実験を要することなしに本発明の他の態様に想到できよう。
【０１１７】
実験の部
Ａ．材料
ａ）蛋白質
凍結モノクローナル抗体（ｍＡｂ）Ｄ２Ｅ７はＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。全実験は初期ｍＡｂ濃度５０ｍｇ／ｍｌの薬剤製品ロットから実施した。
ｂ）精製化学薬品
酢酸ナトリウムはＧｒｕｓｓｉｎｇ  ＧｍｂＨ，Ｆｉｌｓｕｍから入手した。各種重合度のポリエチレングリコールはＣｌａｒｉａｎｔ  ＧｍｂＨ，Ｓｕｌｚｂａｃｈから入手した。更に、所定のマイクロスケール実験には市販結晶化スクリーニングキットおよび試薬（Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｎｅｘｔａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。全化学薬品はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＳｔｅｉｎｈｅｉｍまたはＭｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔから入手した。
【０１１８】
Ｂ．一般方法
ａ）Ｄ２Ｅ７原薬の融解
Ｄ２Ｅ７は撹拌下の水浴中で２５℃にて融解した。
ｂ）緩衝液交換−方法Ａ
Ｄ２Ｅ７溶液のアリコートを３０ＫＤａ  ＭＷＣＯ  Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ２０コンセントレーター（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ）にピペットで注入した。蛋白質サンプルを新しい緩衝液で１０倍に希釈し、４℃にて５，０００×ｇ（Ｓｉｇｍａ  ４Ｋ  １５実験室用遠心機）で遠心することにより、サンプル容量を元のサンプル容量に戻した。希釈／遠心工程を１回繰返し、元のサンプル緩衝液の１００倍緩衝液を得た。蛋白質濃度の調整後、０．２μｍシリンジ駆動式フィルターユニットで溶液を滅菌濾過した。
ｂ）緩衝液交換−方法Ｂ
Ｄ２Ｅ７溶液のアリコートをＳＬＩＤＥ−Ａ−ＬＹＺＥＲ透析カセット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）に入れた。選択緩衝液を充填したビーカーに透析カセットを入れ、４℃で一晩撹拌下に緩衝液交換を行った。蛋白質濃度の調整後、２μｍシリンジ駆動式フィルターユニットで溶液を滅菌濾過した。
ｃ）ＯＤ２８０−蛋白質濃度測定
ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  ＵＶ１装置を使用し、消光係数１．３９ｃｍ２ｍｇ−１を適用して波長２８０ｎｍで蛋白質濃度を調べた。このために、結晶化スラリーのアリコートを１４，０００ｒｐｍで遠心し、上清中の残留蛋白質濃度を測定した。
ｄ）ｐＨ測定
ｐＨ測定はＭｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ  ＭＰ２２０  ｐＨ計を使用して実施した。  Ｉｎｌａｂ  ４１３電極とＩｎｌａｂ  ４２３微小電極を利用した。
ｅ）晶析方法
ｅ１）マイクロスケール結晶化−シッティングドロップ蒸気拡散Ｈｙｄｒａ  ＩＩ
Ｈｙｄｒａ  ＩＩ結晶化ロボットとＧｒｅｉｎｅｒ  ９６ウェルプレート（３ドロップウェル，Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して初期結晶化スクリーニングを実施した。プレートをセットアップ後、ウェルをＣｌｅａｒｓｅａｌフィルム（Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で密閉した。
ｅ２）マイクロスケール結晶化−ハンギングドロップ蒸気拡散
ＶＤＸプレート（シーラント付き，Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）と夫々ＯｐｔｉＣｌｅａｒプラスチックカバースライド（正方形，Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）またはシリコンコートガラスカバースライド（円形，Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用してハンギングドロップ蒸気拡散実験を実施した。リザーバ溶液の調製後、カバースライド上でリザーバ溶液１滴を蛋白質溶液１滴と混合し、液滴がリザーバの上に垂れ下がるようにカバースライドを裏返してウェルを密閉した。
ｅ３）バッチ晶析−方法Ａ（２４ウェルプレート）
ウェル内で蛋白質溶液を等量の結晶化用緩衝液（５００μｌ）と混合することによりバッチ晶析を実施した。次いで、水分蒸発を防ぐためにウェルを接着テープで密閉した。
ｅ４）バッチ晶析−方法Ｂ（エッペンドルフ反応チューブ）
１．５ｍＬまたは２ｍＬエッペンドルフ反応チューブ内で蛋白質溶液を等量の結晶化用緩衝液と混合することによりバッチ晶析を実施した。
ｅ５）バッチ晶析−方法Ｃ（ファルコンチューブ，撹拌）
５０ｍＬファルコンチューブ内で蛋白質溶液を等量の結晶化用緩衝液と混合することによりバッチ晶析を実施した。蓋をした直後にチューブを実験室用振盪器（ＧＦＬ３０１３またはＧＦＬ３０１５）に載せるか、あるいは旋回により撹拌した。これらの方法を適用することにより、サンプルに撹拌器を挿入するのを避けた。
ｅ６）バッチ晶析−方法Ｄ（１リットルポリプロピレン容器）
滅菌した１リットルポリプロピレンびんで蛋白質溶液を等量の結晶化用緩衝液と混合することによりバッチ晶析を実施した。蓋をした直後に、容器を周囲温度で非撹拌下に保存した。この方法を適用することにより、サンプルに撹拌器を挿入するのを避けた。
ｆ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
蛋白質濃度を８μｇ／２０μＬに調整することによりサンプルを作製した。ブロモフェノールブルーを添加したＳＤＳ／Ｔｒｉｓ／グリセリンでサンプルを希釈した。
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＮｕＰａｇｅ  １０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌｓ、ＮｕＰａｇｅ  ＭＥＳ  ＳＤＳ  Ｒｕｎｎｉｎｇ  ＢｕｆｆｅｒおよびＭａｒｋ１２  Ｗｉｄｅ  Ｒａｎｇｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓを使用してＳＤＳ  ＰＡＧＥによる定性分析を実施した。サンプル２０μＬをゲルポケットにピペットで注入した。ゲルを泳動させ、酢酸／メタノール試薬で固定後、Ｎｏｖｅｘ  Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎ  Ｋｉｔを使用して染色を実施した。Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ  Ｇｅｌ−Ｄｒｙ乾燥液を使用してゲルを乾燥した。
ｇ）光学顕微鏡分析
Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２５またはＮｉｋｏｎ  Ｌａｂｏｐｈｏｔ顕微鏡を使用して結晶を観察した。後者には偏光フィルターセットとＪＶＣ  ＴＫ  Ｃ１３８０カラービデオカメラを接続した。
ｈ）ＳＥ−ＨＰＬＣ
Ｄ２Ｅ７サンプルの凝集レベルをＳＥ−ＨＰＬＣにより評価した。Ｄｉｏｎｅｘ  Ｐ６８０ポンプと、ＡＳＩ−１００オートサンプラーと、ＵＶＤ１７０Ｕ検出器を使用した。批准Ａｂｂｏｔｔ標準ブロトコール（ＣＬ１６−ＰＳ−０２，アダリムマブ純度）を適用してＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ６  １０／３００  ＧＬゲル濾過カラムにより凝集種を単量体から分離した。
【０１１９】
Ｃ．蒸気拡散結晶化実験
以下の実施例に記載する濃度値は抗体溶液とリザーバ溶液を混合する前の各溶液の初期値である。
【０１２０】
特に指定しない限り、全ｐＨ値は結晶化剤等の他の物質を加える前の酢酸緩衝液ストックのｐＨを表す。
【０１２１】
特に指定しない限り、全緩衝液モル濃度は一般に氷酢酸を使用して実施したｐＨ調整前のストック溶液中の酢酸ナトリウム濃度を表す。
【実施例】
【０１２２】
（実施例１）
ハンギングドロップ蒸気拡散法によるＰＥＧ４，０００／酢酸ナトリウムグリッドスクリーニング
約０．１Ｍ酢酸ナトリウムを含有するｐＨ約５．２の緩衝液によりＤ２Ｅ７を希釈した。蛋白質濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調整した。
【０１２３】
グリース付きＶＤＸプレートおよび正方形ＯｐｔｉＣｌｅａｒプラスチックカバースライドを使用した。酢酸緩衝液、５０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ４，０００溶液および（完全に脱塩し、場合により予め蒸留した）ミリＱ水を各ウェル内で混合することにより特定リザーバ溶液５００μＬを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約０．１Ｍで一定に維持し、ＰＥＧ４，０００を約６％ｗ／ｖから約２８％まで２％刻みで変化させた。ｐＨは全工程で約５．２とした。各条件を２回ずつ評価した。正方形ＯｐｔｉＣｌｅａｒプラスチックカバースライド上で蛋白質溶液約１μＬを特定リザーバ溶液約１μＬと混合し、スライドを裏返してウェルを密閉し、ハンギングドロップ実験を行った。プレートを周囲温度で保存した。翌日から３０日間、液滴の顕微鏡観察を複数回実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、および沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に状態を分類した。
【０１２４】
結果：評価した２４個のウェルから結晶は認められなかった。
【０１２５】
（実施例２）
蛋白質濃度を変更したハンギングドロップ蒸気拡散法によるＰＥＧ４，０００／酢酸ナトリウムグリッドスクリーニング
約０．１Ｍ酢酸ナトリウムを含有するｐＨ約５．２の緩衝液によりＤ２Ｅ７を希釈した。蛋白質濃度を５０ｍｇ／ｍＬに調整した。蛋白質濃度以外のプロセス条件を実施例１と同一とした。
【０１２６】
結果：評価した２４個のウェルから結晶は認められなかった。
【０１２７】
（実施例３）
ハンギングドロップ蒸気拡散法によるＰＥＧ４００／酢酸ナトリウムグリッドスクリーニング
約０．１Ｍ酢酸ナトリウムを含有するｐＨ約５．２の緩衝液によりＤ２Ｅ７を希釈した。蛋白質濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調整した。
【０１２８】
グリース付きＶＤＸプレートおよび正方形ＯｐｔｉＣｌｅａｒプラスチックカバースライドを使用した。酢酸緩衝液、５０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ４００溶液およびミリＱ水を各ウェル内で混合することにより特定リザーバ溶液５００μＬを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約０．１Ｍで一定に維持し、ＰＥＧ４００を約３０％ｗ／ｖから約４０％まで２％刻みで変化させた。ｐＨは全工程で約５．２とした。各条件を２回ずつ評価した。正方形ＯｐｔｉＣｌｅａｒプラスチックカバースライド上で蛋白質溶液約１μＬを特定リザーバ溶液約１μＬと混合し、スライドを裏返してウェルを密閉し、ハンギングドロップ実験を行った。プレートを周囲温度で保存した。翌日から３０日間、液滴の顕微鏡観察を複数回実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、および沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に状態を分類した。
【０１２９】
結果：評価した１２個のウェルから結晶は認められなかった。
【０１３０】
（実施例４）
蛋白質濃度を変更したハンギングドロップ蒸気拡散法によるＰＥＧ４００／酢酸ナトリウムグリッドスクリーニング
約０．１Ｍ酢酸ナトリウムを含有するｐＨ約５．２の緩衝液によりＤ２Ｅ７を希釈した。蛋白質濃度を５０ｍｇ／ｍＬに調整した。蛋白質濃度以外のプロセス条件を実施例３と同一とした。
【０１３１】
結果：評価した１２個のウェルから結晶は認められなかった。
【０１３２】
（実施例５）
ハンギングドロップ蒸気拡散法によるＰＥＧ１０，０００／酢酸ナトリウムグリッドスクリーニング
約０．１Ｍ酢酸ナトリウムを含有するｐＨ約５．２の緩衝液によりＤ２Ｅ７を希釈した。蛋白質濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調整した。
【０１３３】
グリース付きＶＤＸプレートおよび正方形ＯｐｔｉＣｌｅａｒプラスチックカバースライドを使用した。酢酸緩衝液、５０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ４００溶液およびミリＱ水を各ウェル内で混合することにより特定リザーバ溶液５００μＬを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約０．１Ｍで一定に維持し、ＰＥＧ１０，０００を約４％ｗ／ｖから約１４％ｗ／ｖまで２％刻みで変化させた。ｐＨを全工程において約５．２とした。各条件を２回ずつ評価した。正方形ＯｐｔｉＣｌｅａｒプラスチックカバースライド上で蛋白質溶液約１μＬを特定リザーバ溶液約１μＬと混合し、スライドを裏返してウェルを密閉し、ハンギングドロップ実験を行った。プレートを周囲温度で保存した。翌日から３０日間、液滴の顕微鏡観察を複数回実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、および沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に状態を分類した。
【０１３４】
結果：評価した１２個のウェルから結晶は認められなかった。
【０１３５】
（実施例６）
蛋白質濃度を変更したハンギングドロップ蒸気拡散法によるＰＥＧ１０，０００／酢酸ナトリウムグリッドスクリーニング
約０．１Ｍ酢酸ナトリウムを含有するｐＨ約５．２の緩衝液によりＤ２Ｅ７を希釈した。蛋白質濃度を４５〜５５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは５０ｍｇ／ｍＬに調整した。蛋白質濃度以外のプロセス条件は実施例５と同一とした。
【０１３６】
結果：評価した１２個のウェルから結晶は認められなかった。
【０１３７】
（実施例７）
設定を変更したハンギングドロップ蒸気拡散法によるＰＥＧ４００／酢酸ナトリウムグリッドスクリーニング
約０．１Ｍ酢酸ナトリウムを含有するｐＨ約５．２の緩衝液によりＤ２Ｅ７を希釈した。蛋白質濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調整した。
【０１３８】
グリース付きＶＤＸプレートおよび正方形ＯｐｔｉＣｌｅａｒプラスチックカバースライドを使用した。酢酸緩衝液、５０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ１０，０００溶液およびミリＱ水を各ウェル内で混合することにより特定リザーバ溶液５００μＬを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約０．１Ｍで一定に維持し、ＰＥＧ４００を約３２％ｗ／ｖおよび約３４％ｗ／ｖとした。ｐＨを約４．２、４．７、５．２、５．７、６．２または６．７とした。各条件を２回ずつ評価した。正方形ＯｐｔｉＣｌｅａｒプラスチックカバースライド上で蛋白質溶液約１μＬを特定リザーバ溶液約１μＬと混合し、スライドを裏返してウェルを密閉し、ハンギングドロップ実験を行った。プレートを周囲温度で保存した。翌日から３０日間、液滴の顕微鏡観察を複数回実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、および沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に状態を分類した。
【０１３９】
結果：評価した２４個のウェルから結晶は認められなかった。
【０１４０】
（実施例８）
蛋白質濃度と設定を変更したハンギングドロップ蒸気拡散法によるＰＥＧ４００／酢酸ナトリウムグリッドスクリーニング
約０．１Ｍ酢酸ナトリウムを含有するｐＨ約５．２の緩衝液によりＤ２Ｅ７を希釈した。蛋白質濃度を５０ｍｇ／ｍＬに調整した。蛋白質濃度以外のプロセス条件は実施例７と同一とした。
【０１４１】
結果：評価した２４個のウェルから結晶は認められなかった。
【０１４２】
（実施例９）
設定を変更したハンギングドロップ蒸気拡散法によるＰＥＧ４００／酢酸ナトリウムグリッドスクリーニング
約０．１Ｍ酢酸ナトリウムを含有するｐＨ約５．２の緩衝液によりＤ２Ｅ７を希釈した。蛋白質濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調整した。
【０１４３】
グリース付きＶＤＸプレートおよび正方形ＯｐｔｉＣｌｅａｒプラスチックカバースライドを使用した。酢酸緩衝液、５０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ４００溶液およびミリＱ水を各ウェル内で混合することにより特定リザーバ溶液５００μＬを調製した。本実施例では、約０．０２５Ｍ、０．０５Ｍ、０．０７５Ｍ、０．１５Ｍ、０．２Ｍまたは０．２５Ｍの酢酸緩衝液モル濃度を使用した。ＰＥＧ４００は約３２％ｗ／ｖから約３４％ｗ／ｖまで変化させた。ｐＨを約５．７または４．２とした。各条件を２回ずつ評価した。正方形ＯｐｔｉＣｌｅａｒプラスチックカバースライド上で蛋白質溶液約１μＬを特定リザーバ溶液約１μＬと混合し、スライドを裏返してウェルを密閉し、ハンギングドロップ実験を行った。プレートを周囲温度で保存した。翌日から３０日間、液滴の顕微鏡観察を複数回実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、および沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に状態を分類した。
【０１４４】
結果：評価した４８個のウェルから結晶は認められなかった。
【０１４５】
（実施例１０）
設定を変更したハンギングドロップ蒸気拡散法によるＰＥＧ４００／酢酸ナトリウムグリッドスクリーニング
約０．１Ｍ酢酸ナトリウムを含有するｐＨ約５．２の緩衝液によりＤ２Ｅ７を希釈した。蛋白質濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調整した。
【０１４６】
グリース付きＶＤＸプレートおよび正方形ＯｐｔｉＣｌｅａｒプラスチックカバースライドを使用した。酢酸緩衝液、５０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ４００溶液およびミリＱ水を各ウェル内で混合することにより特定リザーバ溶液５００μＬを調製した。本実施例では、約０．０２５Ｍ、０．０５Ｍまたは０．１Ｍの酢酸緩衝液モル濃度を使用した。ＰＥＧ４００は約２８％ｗ／ｖまたは約３０％ｗ／ｖとした。ｐＨを約５．２、５．７、６．２または６．７とした。各条件を２回ずつ評価した。正方形ＯｐｔｉＣｌｅａｒプラスチックカバースライド上で蛋白質溶液約１μＬを特定リザーバ溶液約１μＬと混合し、スライドを裏返してウェルを密閉し、ハンギングドロップ実験を行った。プレートを周囲温度で保存した。翌日から３０日間、液滴の顕微鏡観察を複数回実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、および沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に状態を分類した。
【０１４７】
結果：評価した４８個のウェルから結晶は認められなかった。
【０１４８】
（実施例１１）
ハンギングドロップ蒸気拡散法によるＰＥＧ４００とＰＥＧ４，０００／酢酸ナトリウムの併用のグリッドスクリーニング
約０．１Ｍ酢酸ナトリウムを含有するｐＨ約５．２の緩衝液によりＤ２Ｅ７を希釈した。蛋白質濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調整した。
【０１４９】
グリース付きＶＤＸプレートおよび正方形ＯｐｔｉＣｌｅａｒプラスチックカバースライドを使用した。酢酸緩衝液、５０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ４，０００溶液およびミリＱ水を各ウェル内で混合することにより特定リザーバ溶液５００μＬを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約０．１Ｍで一定に維持し、ＰＥＧ４，０００を約４％ｗ／ｖから約８％ｗ／ｖまで２％刻みで変化させた。同時に、ＰＥＧ４００を約２４％ｗ／ｖ、２６％ｗ／ｖ、２８％ｗ／ｖまたは３０％ｗ／ｖの濃度でＰＥＧ４，０００／酢酸溶液に加えた。ｐＨを全工程で約５．２とした。各条件を２回ずつ評価した。正方形ＯｐｔｉＣｌｅａｒプラスチックカバースライド上で蛋白質溶液約１μＬを特定リザーバ溶液約１μＬと混合し、スライドを裏返してウェルを密閉し、ハンギングドロップ実験を行った。プレートを周囲温度で保存した。翌日から３０日間、液滴の顕微鏡観察を複数回実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、および沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に状態を分類した。
【０１５０】
結果：評価した２４個のウェルから結晶は認められなかった。
【０１５１】
（実施例１２）
設定を変更したハンギングドロップ蒸気拡散法によるＰＥＧ４００とＰＥＧ４，０００／酢酸ナトリウムの併用のグリッドスクリーニング
約０．１Ｍ酢酸ナトリウムを含有するｐＨ約５．２の緩衝液によりＤ２Ｅ７を希釈した。蛋白質濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調整した。
【０１５２】
グリース付きＶＤＸプレートおよび正方形ＯｐｔｉＣｌｅａｒプラスチックカバースライドを使用した。酢酸緩衝液、５０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ４，０００溶液およびミリＱ水を各ウェル内で混合することにより特定リザーバ溶液５００μＬを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約０．１Ｍで一定に維持し、ＰＥＧ４，０００を約４％ｗ／ｖから約８％ｗ／ｖまで２％刻みで変化させた。同時に、ＰＥＧ４００を約３０％ｗ／ｖ、３２％ｗ／ｖ、３４％ｗ／ｖまたは３６％ｗ／ｖの濃度でＰＥＧ４，０００／酢酸溶液に加えた。ｐＨを全工程で約４．２とした。各条件を２回ずつ評価した。正方形ＯｐｔｉＣｌｅａｒプラスチックカバースライド上で蛋白質溶液約１μＬを特定リザーバ溶液約１μＬと混合し、スライドを裏返してウェルを密閉し、ハンギングドロップ実験を行った。プレートを周囲温度で保存した。翌日から３０日間、液滴の顕微鏡観察を複数回実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、および沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に状態を分類した。
【０１５３】
結果：評価した２４個のウェルから結晶は認められなかった。
【０１５４】
（実施例１３）
設定を変更したハンギングドロップ蒸気拡散法によるＰＥＧ４，０００／酢酸ナトリウムグリッドスクリーニング
約０．１Ｍ酢酸ナトリウムを含有するｐＨ約６．５、６．０、５．５、５．０、４．５または４．０の緩衝液によりＤ２Ｅ７を希釈した。蛋白質濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調整した。
【０１５５】
グリース付きＶＤＸプレートおよび正方形ＯｐｔｉＣｌｅａｒプラスチックカバースライドを使用した。酢酸緩衝液、５０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ４，０００溶液およびミリＱ水を各ウェル内で混合することにより特定リザーバ溶液５００μＬを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約０．１Ｍで一定に維持し、ＰＥＧ４，０００を約４％ｗ／ｖから約２６％ｗ／ｖまで２％刻みで変化させた。使用した酢酸緩衝液のｐＨは対応する蛋白質緩衝液と同一とした。各条件を２回ずつ評価した。正方形ＯｐｔｉＣｌｅａｒプラスチックカバースライド上で蛋白質溶液約１μＬを特定リザーバ溶液約１μＬと混合し、スライドを裏返してウェルを密閉し、ハンギングドロップ実験を行った。プレートを周囲温度で保存した。翌日から３０日間、液滴の顕微鏡観察を複数回実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、および沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に状態を分類した。
【０１５６】
結果：評価した１４４個のウェルから結晶は認められなかった。
【０１５７】
（実施例１４）
設定を変更したハンギングドロップ蒸気拡散法によるＰＥＧ４，０００／酢酸ナトリウムグリッドスクリーニング
酢酸緩衝液モル濃度を約０．２Ｍ（沈殿用緩衝液のモル濃度）に一定に維持した以外は実施例１３と同一の実験条件とした。
【０１５８】
結果：評価した１４４個のウェルから結晶は認められなかった。
【０１５９】
（実施例１５）
設定を変更したハンギングドロップ蒸気拡散法によるＰＥＧ４，０００／酢酸ナトリウムグリッドスクリーニング
酢酸緩衝液モル濃度を０．１Ｍ（沈殿用緩衝液のモル濃度）に一定に維持した以外は実施例１３と同一の実験条件とした。
【０１６０】
結果：評価した１４４個のウェルから結晶は認められなかった。
【０１６１】
（実施例１６）
設定を変更したハンギングドロップ蒸気拡散法によるＰＥＧ４，０００／酢酸ナトリウムグリッドスクリーニング
酢酸緩衝液モル濃度を０．４Ｍ（沈殿用緩衝液のモル濃度）に一定に維持した以外は実施例１３と同一の実験条件とした。
【０１６２】
結果：評価した１４４個のウェルから結晶は認められなかった。
【０１６３】
（実施例１７）
ＰＥＧ４，０００／酢酸ナトリウムバルク実験
約０．１Ｍ酢酸ナトリウムを含有するｐＨ約５．５の緩衝液によりＤ２Ｅ７を希釈した。蛋白質濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調整した。
【０１６４】
エッペンドルフ反応チューブ４本に各々５００μＬずつ４個のアリコートをピペットで注入した。２４％ＰＥＧ４，０００を０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）に溶かした溶液が微かに不透明になるまで蛋白質溶液に滴定した。次に、溶液が再び透明になるまで水を溶液にピペットで注入した。この方法をバルク結晶化と言う。サンプル２個は周囲温度、残りの２個のサンプルは４℃で滴定を行った。次いで、各サンプル対の一方を夫々周囲温度または４℃で保存した。翌日から１週間、サンプルの１μＬアリコートの顕微鏡観察を複数回実施した。
【０１６５】
結果：４個のサンプルから結晶は得られなかった。
【０１６６】
（実施例１８）
温度を変更したハンギングドロップ蒸気拡散法によるＰＥＧ４，０００／酢酸ナトリウムグリッドスクリーニング
実験条件は実施例１３と同一とした。但し、チューブを４℃にてセットアップし、保存した。
【０１６７】
結果：評価した１４４個のウェルから結晶は認められなかった。
【０１６８】
（実施例１９）
蛋白質濃度を変更したハンギングドロップ蒸気拡散法によるＰＥＧ４，０００／酢酸ナトリウムグリッドスクリーニング
蛋白質濃度を５ｍｇ／ｍＬに調整した以外は、実施例１３と同一の実験条件とした。
【０１６９】
結果：評価した１４４個のウェルから結晶は認められなかった。
【０１７０】
（実施例２０）
ハンギングドロップ蒸気拡散法による硫酸アンモニウム／酢酸ナトリウムグリッドスクリーニング
約０．１Ｍ酢酸ナトリウムを含有するｐＨ約５．５の緩衝液によりＤ２Ｅ７を希釈した。蛋白質濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調整した。
【０１７１】
グリース付きＶＤＸプレートおよび正方形ＯｐｔｉＣｌｅａｒプラスチックカバースライドを使用した。酢酸緩衝液、硫酸アンモニウムストック溶液およびミリＱ水を各ウェル内で混合することにより特定リザーバ溶液５００μＬを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約０．１Ｍに一定に維持し、硫酸アンモニウム濃度を０．５Ｍから２．５Ｍまで０．２５Ｍ刻みで変化させた。酢酸緩衝液のｐＨを全工程で約５．５とした。各条件を２回ずつ評価した。正方形ＯｐｔｉＣｌｅａｒプラスチックカバースライド上で蛋白質溶液約１μＬを特定リザーバ溶液約１μＬと混合し、スライドを裏返してウェルを密閉し、ハンギングドロップ実験を行った。プレートを周囲温度でセットアップし、保存した。翌日から２週間、液滴の顕微鏡観察を複数回実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、および沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に状態を分類した。
【０１７２】
結果：評価した１８個のウェルから結晶は認められなかった。
【０１７３】
（実施例２１）
ハンギングドロップ蒸気拡散法による塩化ナトリウム／酢酸ナトリウムグリッドスクリーニング
約０．１Ｍ酢酸ナトリウムを含有するｐＨ約５．５の緩衝液によりＤ２Ｅ７を希釈した。蛋白質濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調整した。
【０１７４】
グリース付きＶＤＸプレートおよび正方形ＯｐｔｉＣｌｅａｒプラスチックカバースライドを使用した。酢酸緩衝液、塩化ナトリウムストック溶液およびミリＱ水を各ウェル内で混合することにより特定リザーバ溶液５００μＬを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約０．１Ｍで一定に維持し、塩化ナトリウム濃度を１．５Ｍから２．５Ｍまで０．５Ｍ刻みで変化させた。酢酸緩衝液のｐＨは全工程で約５．５とした。各条件を２回ずつ評価した。正方形ＯｐｔｉＣｌｅａｒプラスチックカバースライド上で蛋白質溶液約１μＬを特定リザーバ溶液約１μＬと混合し、スライドを裏返してウェルを密閉し、ハンギングドロップ実験を行った。プレートを周囲温度にてセットアップし、保存した。翌日から２週間、液滴の顕微鏡観察を複数回実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、および沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に状態を分類した。
【０１７５】
結果：評価した６個のウェルから結晶は認められなかった。
【０１７６】
（実施例２２）
ハンギングドロップ蒸気拡散法によるＰＥＧ４，０００／酢酸ナトリウムグリッドスクリーニング、界面活性剤の影響
約０．１Ｍ酢酸ナトリウムを含有するｐＨ約５．５の緩衝液によりＤ２Ｅ７を希釈した。蛋白質濃度を５ｍｇ／ｍＬに調整した。
【０１７７】
グリース付きＶＤＸプレートおよび正方形ＯｐｔｉＣｌｅａｒプラスチックカバースライドを使用した。酢酸緩衝液、５０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ４，０００溶液およびミリＱ水を各ウェル内で混合することにより特定リザーバ溶液５００μＬを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約０．１Ｍで一定に維持し、ＰＥＧ４，０００を約１０％ｗ／ｖから約２０％ｗ／ｖまで２％刻みで変化させた。酢酸緩衝液のｐＨを全工程で約５．５とした。更に、上記のように得られた全緩衝液にポリソルベート２０、ポリソルベート８０およびプルロニックＦ６８を夫々０％、０．０２％および０．１％の濃度で加えた。正方形ＯｐｔｉＣｌｅａｒプラスチックカバースライド上で蛋白質溶液約１μＬを特定リザーバ溶液約１μＬと混合し、スライドを裏返してウェルを密閉し、ハンギングドロップ実験を行った。プレートを周囲温度でセットアップし、保存した。翌日から２週間、液滴の顕微鏡観察を複数回実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、および沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に状態を分類した。
【０１７８】
結果：評価した８４個のウェルから結晶は認められなかった。評価した界面活性剤が結晶化システムの動作に及ぼす影響を認めることはできなかった。
【０１７９】
（実施例２３）
ハンギングドロップ蒸気拡散法による酢酸亜鉛／酢酸ナトリウムグリッドスクリーニング
約０．１Ｍ酢酸ナトリウムを含有するｐＨ約５．５の緩衝液によりＤ２Ｅ７を希釈した。蛋白質濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調整した。
【０１８０】
グリース付きＶＤＸプレートおよび正方形ＯｐｔｉＣｌｅａｒプラスチックカバースライドを使用した。酢酸緩衝液、酢酸亜鉛ストック溶液およびミリＱ水を各ウェル内で混合することにより特定リザーバ溶液５００μＬを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約０．１Ｍで一定に維持し、酢酸亜鉛濃度を０．１Ｍから０．９Ｍまで約０．２Ｍ刻みで変化させた。酢酸緩衝液のｐＨは全工程で約５．５とした。各条件を２回ずつ評価した。正方形ＯｐｔｉＣｌｅａｒプラスチックカバースライド上で蛋白質溶液約１μＬを特定リザーバ溶液約１μＬと混合し、スライドを裏返してウェルを密閉し、ハンギングドロップ実験を行った。プレートを周囲温度でセットアップし、保存した。翌日から２週間、液滴の顕微鏡観察を複数回実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、および沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に状態を分類した。
【０１８１】
結果：評価した１２個のウェルから結晶は認められなかった。
【０１８２】
（実施例２４）
蒸気拡散法による条件の広範なスクリーニング
２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／１５０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）によりＤ２Ｅ７を希釈した。蛋白質濃度を５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬまたは２０ｍｇ／ｍＬに調整した。
【０１８３】
Ｈｙｄｒａ  ＩＩ結晶化ロボットを使用し、数種類の市販結晶化スクリーニングキットを使用して９６ウェルＧｒｅｉｎｅｒプレートを周囲温度にてセットアップした。蛋白質溶液と結晶化剤を約１：１、好ましくは１：１比で混合した。
【０１８４】
以下のスクリーニングキットを使用した。
Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  １および２（Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），
Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｉｎｄｅｘ  Ｓｃｒｅｅｎ（Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），
Ｈａｍｐｔｏｎ  ＳａｌｔＲＸ  Ｓｃｒｅｅｎ（Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），
Ｎｅｘｔａｌ  Ｔｈｅ  Ｃｌａｓｓｉｃｓ，Ｔｈｅ  Ｃｌａｓｓｉｃｓ  Ｌｉｔｅ，Ｔｈｅ  ＰＥＧｓ，Ｔｈｅ  Ａｎｉｏｎｓ，ＴｈｅｐＨｃｌｅａｒ  ａｎｄ  Ｔｈｅ  Ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓｕｌｆａｔｅ（いずれもＮｅｘｔａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製品）。
【０１８５】
（上記のような３種類の異なる蛋白質濃度で各条件につき３滴ずつ）蛋白質を結晶化剤に添加後、プレートをＣｌｅａｒｓｅａｌフィルムで密閉した。各プレートを４枚ずつセットアップした後、夫々周囲温度、４℃、２７℃および３７℃で保存した。夫々５日後と１２日後に液滴の顕微鏡観察を行った。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴および沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に状態を分類した。
【０１８６】
結果：評価した８６４種類の市販条件のうち、２種類から少なくとも２週間後に以下の蛋白質濃度および温度で結晶が得られた。
−０．１Ｍ無水酢酸ナトリウム（ｐＨ４．６），０．９Ｍリン酸二水素ナトリウム，０．９Ｍリン酸二水素カリウム（＝Ｎｅｘｔａｌ  Ｔｈｅ  Ａｎｉｏｎｓ，Ｅ３）、１０もしくは２０ｍｇ／ｍＬおよび２７℃、または２０ｍｇ／ｍＬおよび３７℃。
−０．１Ｍ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｐｒｏｐａｎｅ（ｐＨ７．０），１．５Ｍ硫酸アンモニウム（＝Ｈａｍｐｔｏｎ  ＳａＩｔＲＸ，Ｆ２）、５、１０または２０ｍｇ／ｍＬおよび２７℃。
【０１８７】
結晶は針束状形態を示した。
【０１８８】
以下の条件では市販スクリーニングキットから結晶が得られなかった。詳細な溶液組成については、ｗｗｗ．ｈａｍｐｔｏｎｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｏｍおよびｗｗｗ．ｎｅｘｔａｌｂｉｏｔｅｃｈ．ｃｏｍを参照されたい。
Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  １−全条件（４８）
Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｃｒｙｔｓａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  ２−全条件（４８）
Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｉｎｄｅｘ  Ｓｃｒｅｅｎ−全条件（９６）
Ｈａｍｐｔｏｎ  ＳａｌｔＲＸ  Ｓｃｒｅｅｎ−「Ｆ２」以外の全条件（９５）
Ｎｅｘｔａｌ−Ｔｈｅ  Ｃｌａｓｓｉｃｓ−全条件（９６）
Ｎｅｘｔａｌ−Ｔｈｅ  Ｃｌａｓｓｉｃｓ  Ｌｉｔｅ−全条件（９６）
Ｎｅｘｔａｌ−Ｔｈｅ  ＰＥＧｓ−全条件（９６）
Ｎｅｘｔａｌ−Ｔｈｅ  Ａｎｉｏｎｓ−「Ｅ３」以外の全条件（９５）
Ｎｅｘｔａｌ−Ｔｈｅ  ｐＨ  Ｃｌｅａｒ−全条件（９６）
Ｎｅｘｔａｌ−Ｔｈｅ  ＡｍｍｏｎｉｕｍＳｕｌｆａｔｅ−全条件（９６）。
【０１８９】
（実施例２５）
設定を変更したハンギングドロップ蒸気拡散法によるＰＥＧ４，０００／酢酸ナトリウムグリッドスクリーニング
２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／１５０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）によりＤ２Ｅ７を希釈した。蛋白質濃度を５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬまたは２０ｍｇ／ｍＬに調整した。
【０１９０】
グリース付きＶＤＸプレートおよび円形シリコンコートガラスカバースライドを使用した。酢酸緩衝液、５０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ４，０００溶液およびミリＱ水を各ウェル内で混合することにより特定リザーバ溶液５００μＬを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約０．１Ｍで一定に維持し、ＰＥＧ４，０００濃度を４％から２６％まで２％刻みで変化させた。酢酸緩衝液のｐＨを全工程で約５．５とした。上記のような３種類の蛋白質濃度で各条件を設定した。円形シリコンコートガラスカバースライド上で蛋白質溶液約１μＬを特定リザーバ溶液約１μＬと混合し、スライドを裏返してウェルを密閉し、ハンギングドロップ実験を行った。プレートを周囲温度で保存した。６日後に液滴の顕微鏡観察を行った。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、および沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に状態を分類した。
【０１９１】
結果：評価した７２個のウェルから結晶は認められなかった。
【０１９２】
（実施例２６）
ハンプトン界面活性剤スクリーニングキットを利用したハンギングドロップ蒸気拡散実験
２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／１５０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）によりＤ２Ｅ７を希釈した。蛋白質濃度を５ｍｇ／ｍＬに調整した。
【０１９３】
グリース付きＶＤＸプレートおよび円形シリコンコートガラスカバースライドを使用した。酢酸緩衝液、５０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ４，０００溶液およびミリＱ水を各ウェル内で混合することにより特定リザーバ溶液５００μＬを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約０．１Ｍで一定に維持し、ＰＥＧ４，０００濃度を約１２％ｗ／ｖまたは１４％ｗ／ｖとした。酢酸緩衝液のｐＨを全工程で約５．５とした。円形シリコンコートガラスカバースライド上で蛋白質溶液約４μＬをＨａｍｐｔｏｎスクリーニングキットの特定界面活性剤溶液１μＬと混合した。次に液滴を特定リザーバ溶液５μＬと混合し、スライドを裏返してウェルを密閉し、ハンギングドロップ実験を行った。プレートを周囲温度で保存した。６日後に液滴の顕微鏡観察を行った。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、および沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に状態を分類した。
【０１９４】
結果：評価した１４４個のウェルから結晶は認められなかった。
【０１９５】
（実施例２７）
Ｈａｍｐｔｏｎ  ＰＥＧ／イオンスクリーニングキットを利用したハンギングドロップ蒸気拡散
２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／１５０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）によりＤ２Ｅ７を希釈した。蛋白質濃度を５ｍｇ／ｍＬまたは１０ｍｇ／ｍＬに調整した。
【０１９６】
グリース付きＶＤＸプレートと円形シリコンコートガラスカバースライドを使用した。夫々４８種類の緩衝液製剤各５００μＬをウェルにピペットで注入し、ミリＱ水２５０μＬと混合した。蛋白質サンプル約１μＬをカバースライド上にピペットで移した後、特定ウェルのリザーバ溶液約１μＬと混合した。スライドを裏返してウェルを密閉し、ハンギングドロップ実験を行った。プレートを周囲温度で保存した。翌日から７日間、液滴の顕微鏡観察を複数回実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、および沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に状態を分類した。
【０１９７】
結果：試験した９６種類の条件から結晶は認められなかった。
【０１９８】
（実施例２８）
Ｈａｍｐｔｏｎ  ＰＥＧ／イオンスクリーニングキットを利用し、設定を変更したハンギングドロップ蒸気拡散
２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／１５０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）によりＤ２Ｅ７を希釈した。蛋白質濃度を５ｍｇ／ｍＬに調整した。
【０１９９】
夫々４８種類の緩衝液製剤各５００μＬをウェルにピペットで注入し、ミリＱ水５００μＬと混合した以外は実施例２７と同一の実験条件とした。
【０２００】
結果：試験した４８種の条件から結晶は認められなかった。
【０２０１】
（実施例２９）
Ｈａｍｐｔｏｎ低イオン強度スクリーニングキットを利用したハンギングドロップ蒸気拡散
２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／１５０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）によりＤ２Ｅ７を希釈した。蛋白質濃度を５ｍｇ／ｍＬに調整した。
【０２０２】
グリース付きＶＤＸプレートおよび円形シリコンコートガラスカバースライドを使用した。２４％ｗ／ｖ  ＰＥＧ３，３５０脱水剤溶液１ｍＬを１０８個のウェルに夫々ピペットで注入した。蛋白質サンプル約２μＬをカバースライド上にピペットで移した後、１８種類の特定緩衝液試薬のうちの１種約１μＬと混合した。その後、６種類の異なる濃度のうちの１種のＰＥＧ３，３５０沈殿剤約２．５μＬを液滴に加えた。スライドを裏返してウェルを密閉し、１０８種類の異なるハンギングドロップ実験を行った。
【０２０３】
プレートを周囲温度で保存した。翌日から７日間、液滴の顕微鏡観察を複数回実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、および沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に状態を分類した。
【０２０４】
結果：試験した１０８種類の条件から結晶は得られなかった。
【０２０５】
（実施例３０）
ハンギングドロップ蒸気拡散法による硫酸アンモニウム／ビス−トリスプロパングリッドスクリーニング
２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／１５０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）によりＤ２Ｅ７を希釈した。蛋白質濃度を５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬまたは２０ｍｇ／ｍＬに調整した。
【０２０６】
グリース付きＶＤＸプレートおよび円形シリコンコートガラスカバースライドを使用した。硫酸アンモニウムストック溶液、ビス−トリスプロパンストック溶液およびミリＱ水を各ウェル内で混合することにより特定リザーバ溶液５００μＬを調製した。本実施例では、硫酸アンモニウムモル濃度を約０．５Ｍ、１Ｍ、１．５Ｍまたは２Ｍとした。ビス−トリスプロパンモル濃度は全工程で０．１Ｍとし、ビス−トリスプロパン緩衝液ｐＨは約５．５、６．０、６．５、７．０、７．５または８．０とした。上記全３種類の蛋白質濃度と夫々周囲温度の保存または約２７℃の保存を適用し、合計２４種類の条件を評価した。円形シリコンコートガラスカバースライド上で蛋白質溶液約１μＬを特定リザーバ溶液約１μＬと混合し、スライドを裏返してウェルを密閉し、ハンギングドロップ実験を行った。プレートを周囲温度で保存した。３日後に液滴の顕微鏡観察を行った。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、および沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に状態を分類した。
【０２０７】
結果：試験した１４４種類の条件から３日後に結晶は得られなかった。
【０２０８】
（実施例３１）
ハンギングドロップ蒸気拡散法によるリン酸二水素ナトリウムカリウム／酢酸ナトリウムグリッドスクリーニング
２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／１５０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）によりＤ２Ｅ７を希釈した。蛋白質濃度を５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬまたは２０ｍｇ／ｍＬに調整した。
【０２０９】
グリース付きＶＤＸプレートおよび正方形ＯｐｔｉＣｌｅａｒプラスチックカバースライドを使用した。酢酸緩衝液、リン酸二水素ナトリウムストック溶液、リン酸二水素カリウムストック溶液およびミリＱ水を各ウェル内で混合することにより特定リザーバ溶液５００μＬを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約０．１Ｍで一定に維持し、酢酸緩衝液ｐＨを約４．１、４．６、５．１または５．６とした。
【０２１０】
リン酸二水素ナトリウムとリン酸二水素カリウムの以下の組み合わせを使用した。
−約０．３Ｍリン酸二水素ナトリウムと約０．３Ｍリン酸二水素カリウム；
−約０．６Ｍリン酸二水素ナトリウムと約０．６Ｍリン酸二水素カリウム；
−約０．９Ｍリン酸二水素ナトリウムと約０．９Ｍリン酸二水素カリウム；
−約１．８Ｍリン酸二水素ナトリウム；
−約２．１Ｍリン酸二水素ナトリウム；
−約２．４Ｍリン酸二水素ナトリウム。
【０２１１】
上記３種類の蛋白質濃度で各条件を設定した。正方形ＯｐｔｉＣｌｅａｒプラスチックカバースライド上にて蛋白質溶液約１μＬを特定リザーバ溶液約１μＬと混合し、スライドを裏返してウェルを密閉し、ハンギングドロップ実験を行った。プレートを周囲温度で保存した。翌日から１カ月間、液滴の顕微鏡観察を複数回実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、および沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に状態を分類した。
【０２１２】
結果：評価した７２個のウェルのうち、以下の結晶化用緩衝液から針束状結晶が生じた。
−約０．９Ｍリン酸二水素ナトリウムと約０．９Ｍリン酸二水素カリウム，ｐＨ約４．１；
−カリウム塩の不在下の約１．８Ｍリン酸二水素ナトリウム，ｐＨ約４．６。
【０２１３】
これらの条件では全３種類の蛋白質濃度で結晶が得られた。
【０２１４】
（実施例３２）
温度を変更したハンギングドロップ蒸気拡散法によるリン酸二水素ナトリウムカリウム／酢酸ナトリウムグリッドスクリーニング
保存温度を３０℃まで上げた以外は実施例３１と同一の実験条件とした。
【０２１５】
結果：評価した７２個のウェルのうち、以下の結晶化用緩衝液から針束状結晶が生じた。
蛋白質濃度約５ｍｇ／ｍＬ：
−約０．９Ｍリン酸二水素ナトリウムと約０．９Ｍリン酸二水素カリウム，ｐＨ約４．１；
−カリウム塩の不在下の約１．８Ｍリン酸二水素ナトリウム，ｐＨ約４．１；
−カリウム塩の不在下の約１．８Ｍリン酸二水素ナトリウム，ｐＨ約４．６；
−カリウム塩の不在下の約１．８Ｍリン酸二水素ナトリウム，ｐＨ約５．１。
蛋白質濃度約１０ｍｇ／ｍＬ：
−約０．９Ｍリン酸二水素ナトリウムと約０．９Ｍリン酸二水素カリウム，ｐＨ約４．１；
−カリウム塩の不在下の約１．８Ｍリン酸二水素ナトリウム，ｐＨ約４．６；
−カリウム塩の不在下の約１．８Ｍリン酸二水素ナトリウム，ｐＨ約５．１。
蛋白質濃度約２０ｍｇ／ｍＬ：
−約０．９Ｍリン酸二水素ナトリウムと約０．９Ｍリン酸二水素カリウム，ｐＨ約４．１；および
−カリウム塩の不在下の約１．８Ｍリン酸二水素ナトリウム，ｐＨ約４．１。
【０２１６】
蒸気拡散結晶化実験結果の考察：
先ず周知マイクロスケール手法を使用して結晶化実験を実施した。ＰＥＧ４，０００／酢酸ナトリウム緩衝液条件は別の抗原特異性または起源の各種抗体を用いて研究していた他の発明者により有望な結晶化条件であると報告されていたので、これらの物質から開始することにした。広範な実験後に、結晶化に影響を与える因子（蛋白質濃度、沈殿剤濃度、緩衝液イオン強度およびｐＨ、温度）の少なくとも検討した組み合わせではＰＥＧ４，０００を酢酸緩衝液に溶かした場合に結晶は形成されないことが判明したため、広範な結晶化スクリーニングを続けることにし、多様な化学薬品をスクリーニングプロセスに導入した。最終的に、リン酸二水素ナトリウムを酢酸緩衝液に溶かすと、Ｄ２Ｅ７の強力な結晶化剤となり、医薬的観点から許容不能な毒性試薬を導入せずに済むことが意外にも判明した。
【０２１７】
Ｄ．バッチ晶析実験
以下の実施例に記載する濃度値は抗体溶液と結晶化溶液を混合する前の各溶液の初期値である。
【０２１８】
特に指定しない限り、全ｐＨ値は結晶化剤等の他の物質を加える前の酢酸緩衝液ストックのｐＨを表す。
【０２１９】
特に指定しない限り、全緩衝液モル濃度は一般に氷酢酸を使用して実施したｐＨ調整前のストック溶液中の酢酸ナトリウム濃度を表す。
【０２２０】
（実施例３３）
８００μＬバッチ容量でのリン酸二水素ナトリウムカリウム／酢酸ナトリウムバッチ晶析
２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／１５０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）によりＤ２Ｅ７を希釈した。蛋白質濃度を５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬまたは２０ｍｇ／ｍＬに調整した。
【０２２１】
１．５ｍＬエッペンドルフ反応チューブ内で各蛋白質溶液約４００μＬを等量の結晶化溶液と混合することによりバッチ晶析を実施した。酢酸緩衝液、リン酸二水素ナトリウムストック溶液、リン酸二水素カリウムストック溶液およびミリＱ水を混合することにより特定結晶化溶液４００μＬを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を０．１Ｍとし、酢酸緩衝液ｐＨを約４．１とした。リン酸二水素ナトリウムおよびリン酸二水素カリウムの以下の組み合わせ：約０．９Ｍリン酸二水素ナトリウムおよび約０．９Ｍリン酸二水素カリウムを使用した。反応チューブを周囲温度で保存した。１１日後に１μＬアリコートの顕微鏡観察を行った。
【０２２２】
結果：１１日後に結晶は認められなかった。
【０２２３】
（実施例３４）
６００μＬバッチ容量でのリン酸二水素ナトリウム／酢酸ナトリウムバッチ晶析
２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／１５０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）でＤ２Ｅ７を希釈した。蛋白質濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調整した。
【０２２４】
１．５ｍＬエッペンドルフ反応チューブ内で蛋白質溶液約３００μＬを等量の結晶化溶液と混合することによりバッチ晶析を実施した。酢酸緩衝液、リン酸二水素ナトリウムストック溶液およびミリＱ水を混合することにより特定結晶化溶液３００μＬを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を０．１Ｍとし、酢酸緩衝液ｐＨを約４．１とした。リン酸二水素ナトリウムモル濃度は夫々約１．５Ｍ、１．８Ｍ、２．１Ｍおよび２．４Ｍとした。反応チューブを周囲温度で保存した。１１日後に１μＬアリコートの顕微鏡観察を行った。
【０２２５】
結果：１１日後に結晶は認められなかった。
【０２２６】
（実施例３５）
１ｍＬバッチ容量でのリン酸二水素ナトリウムカリウム／酢酸ナトリウムグリッドスクリーニングバッチ晶析
緩衝液を交換せずにＤ２Ｅ７を使用した。従って、初期組成はＤ２Ｅ７  ５０ｍｇ／ｍＬ、マンニトール１２ｍｇ／ｍＬ、ポリソルベート８０  １ｍｇ／ｍＬ、クエン酸一水和物１．３０５ｍｇ／ｍＬ、クエン酸ナトリウム０．３０５ｍｇ／ｍＬ、リン酸水素二ナトリウム二水和物１．５３ｍｇ／ｍＬ、リン酸二水素ナトリウム脱水物０．８６ｍｇ／ｍＬおよび塩化ナトリウム６．１６ｍｇ／ｍＬ，ｐＨ５．２とした。
【０２２７】
ミリＱ水で希釈することによりＤ２Ｅ７を濃度約１０ｍｇ／ｍＬとした。
【０２２８】
２４ウェルプレートのウェル内で蛋白質溶液約５００μＬを等量の結晶化溶液と混合することによりバッチ晶析を実施した。ウェル内で酢酸緩衝液、リン酸二水素ナトリウムストック溶液、リン酸二水素カリウムストック溶液およびミリＱ水を混合することにより特定結晶化溶液５００μＬを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を０．１Ｍとし、酢酸緩衝液ｐＨを約４．１、４．６、５．１または５．６とした。リン酸二水素ナトリウムとリン酸二水素カリウムの以下の組み合わせを使用した。
−約０．７Ｍリン酸二水素ナトリウムと約０．７Ｍリン酸二水素カリウム、
−約０．９Ｍリン酸二水素ナトリウムと約０．９Ｍリン酸二水素カリウム、
−カリウム塩の不在下で約１．８Ｍリン酸二水素ナトリウム、
−カリウム塩の不在下で約２．１Ｍリン酸二水素ナトリウム、
−カリウム塩の不在下で約２．４Ｍリン酸二水素ナトリウム。
【０２２９】
次いで、水分蒸発を防ぐために結晶化混合物の調製後にウェルを密閉した。４日後にプレートの顕微鏡観察を行った。
【０２３０】
結果：４日後に結晶は認められなかった。
【０２３１】
（実施例３６）
１ｍＬバッチ容量でのリン酸二水素ナトリウムカリウム／酢酸ナトリウムグリッドスクリーニングバッチ晶析
２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／１５０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）でＤ２Ｅ７を希釈した。蛋白質濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調整した。
【０２３２】
２４ウェルプレートのウェル内で蛋白質溶液約５００μＬを等量の結晶化溶液と混合することによりバッチ晶析を実施した。ウェル内で酢酸緩衝液、リン酸二水素ナトリウムストック溶液、リン酸二水素カリウムストック溶液およびミリＱ水を混合することにより特定結晶化溶液５００μＬを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を０．１Ｍとし、酢酸緩衝液ｐＨを約４．１または４．６とした。リン酸二水素ナトリウムとリン酸二水素カリウムの以下の組み合わせを使用した。
−約１．８Ｍリン酸二水素ナトリウムと約０．８Ｍリン酸二水素カリウム、
−約２．２Ｍリン酸二水素ナトリウムと約０．６Ｍリン酸二水素カリウム、
−夫々カリウム塩の不在下に０．２Ｍ刻みで約２．６Ｍリン酸二水素ナトリウムから約４．４Ｍリン酸二水素ナトリウムまで。
【０２３３】
次いで、水分蒸発を防ぐために結晶化混合物の調製後にウェルを密閉した。翌日から１週間、プレートの顕微鏡観察を複数回実施した。更に、３個のバッチの結晶収率をＯＤ２８０により測定した。懸濁液のアリコートを１４，０００ｒｐｍで遠心し、上清中の蛋白質濃度を調べた。
【０２３４】
結果：以下の８個のバッチで針束状結晶が認められた。
−酢酸緩衝液ｐＨ４．１およびリン酸二水素ナトリウムモル濃度（０．２Ｍ刻みで）約３．６Ｍから約４．４Ｍまで、
−酢酸緩衝液ｐＨ４．６およびリン酸二水素ナトリウムモル濃度（０．２Ｍ刻みで）約４．０Ｍから約４．４Ｍまで。
【０２３５】
酢酸緩衝液ｐＨ４．１およびリン酸二水素ナトリウムモル濃度約４．０Ｍ〜約４．４Ｍのバッチの結晶収率を調べた。上清中の残留蛋白質濃度からＯＤ２８０により測定した結晶収率は５日後に９５％を上回っていた。
【０２３６】
これらのバッチには蛋白質溶液と結晶化溶液の混合直後に明白に沈殿種が存在していた（典型的な光学顕微鏡写真で乳状懸濁液）。５日後に沈殿種は認められなかったので、先の沈殿種は結晶種に再編したものと判断された。蛋白質は結晶化混合物に高度過飽和状態であり、蛋白質はすぐに沈殿した。一部の蛋白質はまだ溶解している可能性があるが、ほんの僅かに過飽和であるまたは恐らく飽和未満である。結晶が形成され、溶解蛋白質濃度は更に低下する。更に、沈殿種は明らかに時間と共に溶解し、成長中の結晶に取り込まれる。
【０２３７】
（実施例３７）
蛋白質濃度を変更した１ｍＬバッチ容量でのリン酸二水素ナトリウム／酢酸ナトリウムグリッドスクリーニングバッチ晶析
緩衝液を交換せずにＤ２Ｅ７を使用した（実施例３５参照）。
【０２３８】
ミリＱ水で希釈することによりＤ２Ｅ７を濃度約１０ｍｇ／ｍＬとした。
【０２３９】
２４ウェルプレートのウェル内で蛋白質溶液約５００μＬを等量の結晶化溶液と混合することによりバッチ晶析を実施した。ウェル内で酢酸緩衝液、リン酸二水素ナトリウムストック溶液、リン酸二水素カリウムストック溶液およびミリＱ水を混合することにより特定結晶化溶液５００μＬを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を０．１Ｍとし、酢酸緩衝液ｐＨを約４．１または４．６とした。リン酸二水素ナトリウムモル濃度は約２．６Ｍリン酸二水素ナトリウムから約４．４Ｍリン酸二水素ナトリウムまで０．２Ｍ刻みで変化させた。次いで、水分蒸発を防ぐために結晶化混合物の調製後にウェルを密閉した。翌日から１週間、プレートの顕微鏡観察を複数回実施した。更に、１個の特定バッチの結晶収率をＯＤ２８０により測定した。懸濁液のアリコートを１４，０００ｒｐｍで遠心し、上清中の蛋白質濃度を調べた。
【０２４０】
結果：以下の６個のバッチにおいて針束状結晶が認められた。
−酢酸緩衝液ｐＨ４．１およびリン酸二水素ナトリウムモル濃度（０．２Ｍ刻みで）約３．４Ｍから約４．４Ｍまで。
【０２４１】
酢酸緩衝液ｐＨ４．１およびリン酸二水素ナトリウムモル濃度約４．２Ｍのバッチの結晶収率を調べた。上清中の残留蛋白質濃度からＯＤ２８０により測定した結晶収率は８日後に９５％を上回っていた。
【０２４２】
これらのバッチには蛋白質溶液と結晶化溶液の混合直後に明白に沈殿種が存在していた（典型的な光学顕微鏡写真で乳状懸濁液）。６日後に沈殿種は認められなかったので、先の沈殿種が結晶種に再編する相転移が生じたものと判断された。
【０２４３】
（実施例３８）
２ｍＬバッチ容量でのリン酸二水素ナトリウム／酢酸ナトリウムバッチ晶析
２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／１５０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）によりＤ２Ｅ７を希釈した。蛋白質濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調整した。
【０２４４】
２ｍＬエッペンドルフ反応チューブ内で蛋白質溶液約１ｍＬを等量の結晶化溶液と混合することによりバッチ晶析を実施した。酢酸緩衝液、リン酸二水素ナトリウムストック溶液およびミリＱ水を混合することにより特定結晶化溶液１ｍＬを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を０．１Ｍとし、酢酸緩衝液ｐＨを約４．１とした。リン酸二水素ナトリウムモル濃度は約４．０Ｍ、４．２Ｍまたは４．４Ｍとした。反応チューブを周囲温度で保存した。翌日から１週間、１μＬアリコートの顕微鏡観察を複数回実施した。
【０２４５】
結果：６日後に全バッチで針束状結晶が認められた。
【０２４６】
これらのバッチには蛋白質溶液と結晶化溶液の混合直後に明白に沈殿種が存在していた（典型的な光学顕微鏡写真で乳状懸濁液）。実施例３６に記載したように先の沈殿種は結晶種に再編した。
【０２４７】
（実施例３９）
蛋白質濃度を変更した１ｍＬバッチ容量でのリン酸二水素ナトリウム／酢酸ナトリウムグリッドスクリーニングバッチ晶析
緩衝液を交換せずにＤ２Ｅ７を使用した（実施例３５参照）。
【０２４８】
２４ウェルプレートのウェル内で蛋白質溶液約５００μＬを等量の結晶化溶液と混合することによりバッチ晶析を実施した。ウェル内で酢酸緩衝液、リン酸二水素ナトリウムストック溶液、リン酸二水素カリウムストック溶液およびミリＱ水を混合することにより特定結晶化溶液５００μＬを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を０．１Ｍとし、酢酸緩衝液ｐＨを約４．１とした。リン酸二水素ナトリウムモル濃度は約０．２Ｍから約４．４Ｍまで０．２Ｍ刻みで変化させた。次いで、水分蒸発を防ぐために結晶化混合物の調製後にウェルを密閉した。翌日から１週間、プレートの顕微鏡観察を複数回実施した。更に、バッチの結晶収率をＯＤ２８０により測定した。懸濁液のアリコートを１４，０００ｒｐｍで遠心し、上清中の蛋白質濃度を調べた。
【０２４９】
結果：以下の２個のバッチで針束状結晶が認められた。
−リン酸二水素ナトリウムモル濃度約３．４Ｍおよび約３．６Ｍ。
【０２５０】
これらの結晶含有バッチには沈殿種と油性沈殿相も存在していた。
【０２５１】
（実施例４０）
撹拌下の２０ｍＬバッチ容量でのリン酸二水素ナトリウム／酢酸ナトリウムバッチ晶析
緩衝液を交換せずにＤ２Ｅ７を使用した（実施例３５参照）。
【０２５２】
ミリＱ水で希釈することによりＤ２Ｅ７を濃度約１０ｍｇ／ｍＬとした。
【０２５３】
５０ｍＬファルコンチューブ内で蛋白質溶液約１０ｍＬを等量の結晶化溶液と混合することによりバッチ晶析を実施した。チューブ内で酢酸緩衝液、リン酸二水素ナトリウムストック溶液およびミリＱ水を混合することにより結晶化溶液１０ｍＬを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を０．１Ｍとし、酢酸緩衝液ｐＨを約４．１とした。リン酸二水素ナトリウムモル濃度は４．２Ｍとした。バッチを実験室用振盪器で撹拌しながらチューブを周囲温度で保存した。翌日から１カ月間、溶液の１μＬアリコートの顕微鏡観察を複数回実施した。
【０２５４】
結果：このバッチには沈殿物が認められた。
【０２５５】
（実施例４１ａ）
非撹拌下の１００ｍＬバッチ容量でのリン酸二水素ナトリウム／酢酸ナトリウムバッチ晶析
緩衝液を交換せずにＤ２Ｅ７を使用した（実施例３５参照）。
【０２５６】
ミリＱ水により希釈することによりＤ２Ｅ７を濃度約１０ｍｇ／ｍＬとした。
【０２５７】
１Ｌ透明ポリエチレンびん内で蛋白質溶液約５０ｍＬを等量の結晶化溶液と混合することによりバッチ晶析を実施した。チューブ内で酢酸緩衝液、リン酸二水素ナトリウムストック溶液およびミリＱ水を混合することにより結晶化溶液５０ｍＬを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を０．１Ｍとし、酢酸緩衝液ｐＨを約４．１とした。リン酸二水素ナトリウムモル濃度を４．２Ｍとした。容器を周囲温度で保存した。翌日から１カ月間、溶液の１μＬアリコートの顕微鏡観察を複数回実施した。
【０２５８】
結果：７日後に針束状結晶が認められた。上清中の残留蛋白質濃度からＯＤ２８０により測定した結晶収率は７日後に９５％を上回っていた。
【０２５９】
このバッチには蛋白質溶液と結晶化溶液の混合直後に明白に沈殿種が存在していた（典型的な光学顕微鏡写真で乳状懸濁液）。７日後に沈殿種は認められなかったので、先の沈殿種が結晶種に再編する相転移が生じたと判断された。
【０２６０】
（実施例４１ｂ）
非撹拌下の１ｍＬ、５０ｍＬおよび１０Ｌバッチ容量でのリン酸二水素ナトリウム／酢酸ナトリウムバッチ晶析
１０Ｌポリプロピレン容器（Ｎａｌｇｅｎｅ（登録商標））内でアダリムマブ市販緩衝液製剤（ｐＨ５．２）（実施例３５参照）中５０ｍｇ／ｍＬ  Ｄ２Ｅ７  １Ｌと注射用水（ＷＦＩ）４Ｌとを混合することによりＤ２Ｅ７の大規模結晶化をまた実施した。温和な振盪により溶液を均質化した。この５ＬのＤ２Ｅ７溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を次に沈殿剤溶液（５Ｍリン酸二水素ナトリウム，４，４００ｍＬ，１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ４．１，５００ｍＬ，ＷＦＩ（Ａｍｐｕｗａ），１００ｍＬ）５Ｌと混合した。沈殿剤溶液は５００ｍＬずつ加えた。添加後毎にびんを温和に回転／反転させることにより溶液を均質化した。沈殿剤溶液約２，５００〜３，０００ｍＬの添加後、白色沈殿が生じた。残りの沈殿剤を一度に加えた。その後、結晶生成物を再び均質化（温和に回転／反転）した。
【０２６１】
バッチ製造直後（即ちＤ２Ｅ７溶液５Ｌおよび沈殿剤５Ｌの添加直後）に１ｍＬ（低容量エッペンドルフサンプルバイアルに充填）および５０ｍＬ（５０ｍＬファルコンサンプルチューブに充填）のアリコートを抜き取り、対照の目的とＤ２Ｅ７結晶化に及ぼすバッチ寸法の影響の評価の目的で１０Ｌ容器の隣に並べて保存した。図２〜４に要約するように、バッチ容量（即ち夫々１ｍＬ、５０ｍＬおよび１０Ｌ）はＤ２Ｅ７結晶針／針束寸法に何ら影響を与えなかった。
【０２６２】
バッチ晶析実験結果の考察：
適用したマイクロスケール技術（上記セクションＤ参照）は蛋白質結晶の大規模製造には利用できないので、これらのマイクロスケール法により発見された結晶化条件を拡張可能なバッチ法に応用した。
【０２６３】
１００ｍＬバッチ容量では最終的に高い収率（＞９５％）と再現性でＤ２Ｅ７を結晶化させるのに成功し、この結晶化システムを工業的処理に適用可能であることが分かった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、結晶の蛋白性が立証された。再溶解結晶のＳＥ−ＨＰＬＣ分析によると、凝集種の増加はほんの僅かであった。約０．１Ｍ酢酸ナトリウム中に約４．２Ｍリン酸二水素ナトリウムにてリン酸二水素ナトリウムを含有するｐＨ約４．１の酢酸緩衝液を使用することにより結晶の洗浄が可能であった。ＯＤ２８０により分析した処、このような洗浄用緩衝液中に測定可能な溶解度のＤ２Ｅ７結晶は認められず、９０％を上回る結晶が回収された。
【０２６４】
上記バッチ実験の実験条件を下表１にまとめる。
【０２６５】
【表１】
2010507670.tif 000002
2010507670.tif 000003
【０２６６】
Ｅ．結晶処理および分析方法
（実施例４２）
結晶の洗浄
結晶の形成後には、結晶を再溶解させない洗浄工程が好ましい。従って、結晶化工程の終了後、結晶スラリーを遠心管に移し、５００〜１０００×ｇで２０分間遠心した。遠心は４℃で実施したが、他の利用可能な温度、例えば室温で実施してもよい。遠心後、上清を捨て、約０．１Ｍ酢酸ナトリウム中に約４．２Ｍリン酸二水素ナトリウムを含有するｐＨ約４．１の緩衝液に結晶ペレットを再懸濁した。ＯＤ２８０により分析した処、このような洗浄用緩衝液に測定可能な溶解度のＤ２Ｅ７結晶は認められなかった。次いで遠心／再懸濁工程を１〜３回繰返し、この洗浄工程後に、約０．１Ｍ酢酸ナトリウム中に約４．２Ｍリン酸二水素ナトリウムを含有するｐＨ約４．１の緩衝液にペレットを再懸濁し、保存した。
【０２６７】
（実施例４３）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる結晶の分析
結晶の蛋白性を立証するために、実施例４２に記載したように結晶を洗浄用緩衝液で洗浄した。遠心後に上清中に溶解蛋白質が存在しなくなっていることをＯＤ２８０により確認した後、上清を捨て、次いで結晶を蒸留水に溶解した。この溶液のＯＤ２８０測定によると、サンプルの吸光度は残留洗浄用緩衝液中と同程度まで有意に高くなっていたので、結晶は主に蛋白質から構成されることが判明した。再溶解結晶のこの溶液のＳＤＳ−ＰＡＧＥは、元のＤ２Ｅ７サンプルと同一パターンを示した。
【０２６８】
Ｆ．その他の実施例
以下の実施例に記載する濃度値は抗体溶液と結晶化溶液を混合する前の各溶液の初期値である。
【０２６９】
特に指定しない限り、全ｐＨ値は結晶化剤等の他の物質を加える前の酢酸緩衝液ストックのｐＨを表す。
【０２７０】
特に指定しない限り、全緩衝液モル濃度は一般に氷酢酸を使用して実施したｐＨ調整前のストック溶液中の酢酸ナトリウム濃度を表す。
【０２７１】
（実施例４４）
固体結晶化剤
緩衝液を交換せずにＤ２Ｅ７を使用した（実施例３５参照）。
【０２７２】
ミリＱ水により希釈することによりＤ２Ｅ７を濃度約１０ｍｇ／ｍＬとした。
【０２７３】
２４ウェルプレートのウェル内で蛋白質溶液約５００μＬを等量の酢酸緩衝液（夫々０．１Ｍ，ｐＨ４．１または４．６）と混合することによりバッチ晶析を実施した。各ｐＨ設定値に対して約０．２３ｇ、０．２７ｇ、０．３０ｇ、０．３３ｇ、０．３６ｇおよび０．３９ｇの６種類の異なる比で固体リン酸二水素ナトリウム二水和物を加えた。即ち、結晶化剤の完全な溶解後に、濃度を０．２Ｍ刻みで約１．５Ｍから２．５Ｍまでとした。次いでウェルを密閉し、結晶化剤が完全に溶解するまでプレートを実験室用振盪器で撹拌した。その後、２４ウェルプレートを非撹拌下に周囲温度で保存した。５日後にプレートの顕微鏡観察を行った。
【０２７４】
結果：以下の７個のバッチで針束状結晶が認められた。
−酢酸緩衝液ｐＨ４．１およびリン酸二水素ナトリウムモル濃度夫々約２．１Ｍ、２．３Ｍおよび２．５Ｍ。
−酢酸緩衝液ｐＨ４．６およびリン酸二水素ナトリウムモル濃度夫々約１．９Ｍ、２．１Ｍ、２．３Ｍおよび２．５Ｍ。
【０２７５】
（実施例４５）
別の緩衝液調製プロトコールおよび結晶の作製
本実施例では、次のように酢酸緩衝液を調製した。氷酢酸３を精製水約４２ｍＬで希釈した。水酸化ナトリウム溶液でｐＨを調整し、容量を５０ｍＬに調整した。この場合には、総酢酸塩量を１Ｍ（結晶化溶液中１００ｍＭ、または結晶化混合物中５０ｍＭ）に固定し、ｐＨ調整により増加しない。
【０２７６】
緩衝液を交換せずにＤ２Ｅ７を使用した（実施例３５参照）。
【０２７７】
ミリＱ水により希釈することによりＤ２Ｅ７を濃度約１０ｍｇ／ｍＬとした。
【０２７８】
２４ウェルプレートのウェル内で蛋白質溶液約５００μＬを等量の結晶化溶液と混合することによりバッチ晶析を実施した。ウェル内で酢酸緩衝液、リン酸二水素ナトリウムストック溶液、リン酸二水素カリウムストック溶液およびミリＱ水を混合することにより特定結晶化溶液５００μＬを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を０．１Ｍとし、酢酸緩衝液ｐＨを夫々約４．１および４．６とした。リン酸二水素ナトリウムモル濃度は約３．４Ｍから約４．４Ｍまで０．２Ｍ刻みで変化させた。次いで、水分蒸発を防ぐために結晶化混合物の調製後にウェルを密閉した。５日後にプレートの顕微鏡観察を行った。
【０２７９】
結果：以下の９個のバッチで針束状結晶が認められた。
−酢酸緩衝液ｐＨ４．１およびリン酸二水素ナトリウムモル濃度０．２刻みで約３．６から４．４まで。
−酢酸緩衝液ｐＨ４．６およびリン酸二水素ナトリウムモル濃度０．２刻みで約３．６から４．２まで。
【０２８０】
（実施例４６）
封入結晶の製造
実施例４１で得られた結晶はＭａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ｎａｎｏを使用するゼータ電位測定によると正に荷電している。
【０２８１】
結晶性を維持し、結晶を荷電状態に保つｐＨを有する賦形剤を含有する緩衝液で結晶を洗浄懸濁する。次に、適切な封入剤を結晶懸濁液に加える。この点で、適切な封入剤は毒性が低く、生分解性と対イオン特徴をもつ（ポリマー）物質である。この対イオン特徴により、前記物質は結晶に吸引され、コーティングを可能にする。この技術により、結晶性を維持する他の賦形剤を含有しない溶媒への結晶の溶解を持続することが好ましい。
【０２８２】
（実施例４７）
封入／包埋結晶の製造
実施例４１に記載したように結晶を得る。
【０２８３】
結晶性を維持する賦形剤を含有する緩衝液で結晶を洗浄懸濁する。
【０２８４】
次に、以下の操作を行うことができる。
−結晶を乾燥し、これらの乾燥した結晶を例えば圧縮、溶融分散等によりキャリヤーと混合することにより結晶を包埋する。
−結晶懸濁液を水不混和性キャリヤー溶液と混合することにより結晶を封入／包埋する。キャリヤーの溶媒の除去後にキャリヤーは沈殿する。次いで材料を乾燥する。
−結晶懸濁液を水混和性キャリヤー溶液と混合することにより結晶を封入／包埋する。キャリヤーは混合物中でその溶解度限界を越えると沈殿する。
−乾燥結晶または結晶懸濁液を水混和性キャリヤー溶液と混合することにより結晶を包埋する。
−乾燥結晶を水不混和性キャリヤー溶液と混合することにより結晶を包埋する。
【０２８５】
Ｇ．結晶特性決定
以下のセクションでは、結晶モノクローナル抗体Ｄ２Ｅ７が結晶材料の再溶解後に非結晶化Ｄ２Ｅ７に特徴的な生物活性を維持するか否かを判定するために実施した実験を要約する。
【０２８６】
Ｇ１．マウスＬ−９２９細胞による生物活性試験
ａ）一般方法
組換えヒトＴＮＦ（ｒＨｕＴＮＦ）の細胞傷害作用に対するＤ２Ｅ７溶液の中和効果を調べた。これは指標としてマウスＬ−９２９細胞を９６ウェルマイクロタイタープレート中に各種Ｄ２Ｅ７濃度の存在下に４８時間規定量のｒＨｕＴＮＦと共に３７℃で温置することにより実施した。生存細胞をクリスタルバイオレットで染色した。色強度をマイクロタイタープレートの各ウェルで分光測色法により測定し、評価した。ＩＣ５０、即ち細胞の５０％が生存するようにＬ−９２９細胞に及ぼすｒＨｕＴＮＦの細胞傷害作用を低下させるＤ２Ｅ７の濃度を測定した。
【０２８７】
別の希釈ボックスで、蛋白質１μｇ／ｍＬ希釈液から出発し、サンプルおよび参照標準用希釈管で夫々９個の滴定曲線測定点（曲線希釈液）を調製した。
【０２８８】
使用するＬ−９２９細胞懸濁液を培地により希釈し、細胞６０，０００個／ｍＬの濃度とした。次に、各細胞濃度の希釈液１００μＬ／ウェルを試験プレートの１〜１１列にピペットで注入した。１２列のウェルには培地各１００μＬのみを加えた。試験プレートで３７℃および５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２下に２４時間温置を行った。
【０２８９】
２４時間温置後に、９個の滴定曲線希釈液各５０μＬを希釈ボックスから参照標準またはサンプル用試験プレート、即ち参照標準用は１〜９列のＡ〜Ｄ行、サンプル用は１〜９列のＥ〜Ｈ行のウェルに移した。
【０２９０】
培地５０μＬを１０列にピペットで注入し、各１００μＬを１１列と１２列にピペットで注入した。
【０２９１】
１０列が１００％溶解値（ＴＮＦ対照）に対応するように、ＴＮＦ参照標準（蛋白質１２．５ｎｇ／ｍＬ培地）５０μＬを１〜１０列，Ａ〜Ｈ行にピペットで注入した。
【０２９２】
１１列は１００％増殖対照とし、１２列には細胞材料を加えず、従って、ブランクとして使用した。ウェル当たりの最終容量は２００μＬとした。
【０２９３】
３７℃で５％ＣＯ２下に４８時間試験プレートの温置を実施した。２日間温置後に、素早く裏返して下向きに１回激しく振ることにより試験プレートウェルから液体を捨てた。次にクリスタルバイオレット溶液（０．７５％クリスタルバイオレット、０．３５％塩化ナトリウム、３２．４％エタノールおよび８．６％ホルムアルデヒド）５０μＬを各ウェルにピペットで注入した。溶液をウェル内に１５分間放置した後、上記のように捨てた。次にプレートを洗浄し、室温で約３０分間乾燥した。次いで、試薬溶液（５０％エタノールおよび０．１％酢酸）１００μＬを各ウェルにピペットで注入した。プレートを（約３００ｒｐｍで１５分間）撹拌し、ウェルの各々に均一着色溶液を生じた。
【０２９４】
試験プレートウェル内の色素の吸光度をプレート光度計を用いて６２０ｎｍにて測定した。個々の値をグラフにプロットし、抗体の夫々の希釈度ないし濃度ｎｇ／ｍＬ（ｘ軸）に対して吸光度（ｙ軸）をプロットした。４パラメータープロットから、細胞の半数が生存し、半数が死滅する濃度（ＩＣ５０値）を読出した。この濃度は曲線データの４パラメーター関数のパラメーター３により計算した。参照標準濃度の平均値を計算した。参照標準の平均ＩＣ５０値をサンプルの個々のＩＣ５０値で割り、１００％を掛けることによりサンプルの相対生物活性を計算した。次に相対活性を平均した。
【０２９５】
ｂ）Ｄ２Ｅ７結晶の相対活性
参照標準に対するサンプルの生物活性の比較として試験を実施した。Ｄ２Ｅ７の濃度に対して吸収値をプロットし、４パラメーター非直線回帰により評価した処、抗体によるＴＮＦ作用を阻害するＩＣ５０値が判明した。両方のサンプルをマイクロプレート１枚で４回ずつ繰返して試験したので、夫々Ｄ２Ｅ７参照標準およびサンプルに４個のＩＣ５０値となる。次に、参照標準のＩＣ５０値の平均を計算し、参照標準の平均ＩＣ５０値をサンプルの該当ＩＣ５０値で割り、１００％を掛けることによりサンプルの各反復の相対生物活性を計算した。
【０２９６】
サンプル（実施例３６に記載したように調製した結晶懸濁液２．７ｍｇ／ｍＬ）の試験の結果、相対生物活性は１１１％であることが判明した。
【０２９７】
従って、サンプルは完全に生物学的に活性であるとみなすことができる。
【０２９８】
Ｇ２．顕微鏡による特性決定
以下、Ｄ２Ｅ７の結晶の顕微鏡による特性決定に関するデータについて記載する。
【０２９９】
ａ）ｍＡｂ結晶バッチサンプルの光学分析
均質化後、１〜１０μＬサンプル容量のアリコートを対物レンズホルダープレートにピペットで滴下し、ガラスカバースライドをかぶせた。Ｅ−ＰＩ  １０倍接眼レンズと夫々１０倍、２０倍および４０倍対物レンズを装着したＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２５倒立型光学顕微鏡を使用して結晶調製物を評価した。デジタルカメラ（Ｓｏｎｙ  Ｃｙｂｅｒｓｈｏｔ  ＤＳＣ  Ｓ７５）を使用して写真撮影した。
【０３００】
ｂ）蒸気拡散実験の光学分析、近似結晶寸法の評価および複屈折の検出
この目的には、ＣＦＷ  １０倍接眼レンズと夫々４倍、１０倍、２０倍および４０倍対物レンズを装着したＮｉｋｏｎ  Ｌａｂｏｐｈｏｔ顕微鏡を使用した。
【０３０１】
蒸気拡散実験を評価するために、２４ウェルプレートのサンプル液滴をスクリーニングした。
【０３０２】
ＪＶＣ  ＴＫ  Ｃ１３８０カラービデオカメラにより顕微鏡写真をコンピュータスクリーンに転送し、ＪＶＣ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｃｏｍｅｔソフトウェアバージョン３．５２ａを利用して代表的な針状または針束状結晶の長さまたは直径を測定することにより結晶寸法を評価した。更に、顕微鏡にフィルターセット（偏光板と検光板）を装着し、サンプルの複屈折挙動を調べた。
【０３０３】
偏光板と検光板のフィルターの偏光方向を相互に９０°の角度にセットする場合（「交差偏光」）には、光は顕微鏡接眼レンズまで透過せず、画像は暗くなるかまたは黒くなる。交差させた偏光板間の光ビームに挿入したサンプルが光の偏光面を回転させることができるならば、暗い背景に対してサンプルの鮮明な明滅光が観察されよう。この挙動は「複屈折」と呼ばれ、規則的な結晶（異方性）物質を不規則な非晶質（等方性）物質から区別する。複屈折は異方性物質に特徴的であるため、この明滅光の出現は結晶物質の存在を立証するものである。しかし、結晶は立方対称を示す場合もあり、従って、非晶質物質と同様に等方性の場合もあるので、複屈折を示さないからといって結晶物質が存在しないとは限らない。
【０３０４】
ｃ）結果
添付の図１〜４には、Ｄ２Ｅ７結晶の代表的な写真を示す。
【０３０５】
図１は実施例３７に従って室温で６日後に小規模バッチ晶析により得られたＤ２Ｅ７結晶を示す（最終蛋白質濃度５ｍｇ／ｍＬ；結晶化用緩衝液：０．１Ｍ酢酸ナトリウム中４．２Ｍリン酸二水素ナトリウム，ｐＨ４．１）。結晶は複屈折を示した。
【０３０６】
図２〜４は実施例４１ｂに従って大規模バッチ晶析により得られたＤ２Ｅ７結晶を示す。
【０３０７】
注射適性：蛋白質２００ｍｇ／ｍＬを結晶に組込み、２０％（ｍ／ｖ）ＰＥＧ４，０００を添加した緩衝液で製剤化したＤ２Ｅ７結晶懸濁液は２７  １／２Ｇ針で注射可能である。
【０３０８】
Ｇ３．複屈折
アダリムマブ結晶化により実際に結晶物質が得られることを実証するために、その複屈折を分析した。
【０３０９】
蛋白質：製剤化用緩衝液中７０ｍｇ／ｍｌアダリムマブを２回蒸留水で１０ｍｇ／ｍｌまで希釈。
【０３１０】
沈殿剤：４Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４（粉末を２回蒸留水に溶解）。
【０３１１】
方法：２ｍＬコンパートメントウェルを備えるハンギングドロップトレーでマイクロバッチ晶析。蛋白質溶液５００μｌを蛋白質５００μｌと混合；溶液にＮａＯＡｃは加えない。
【０３１２】
温度：２４℃。
【０３１３】
複屈折測定用技術装置：Ｎｉｋｏｎ  ＳＭＺ１５００立体解剖顕微鏡にＮｉｋｏｎ  ＣｏｏｌＰｉｘ  ＣＣＤカメラを接続。偏光板を交差させ、結晶複屈折を撮影した。倍率は約２００倍とする。
【０３１４】
対応する顕微鏡写真を図５Ａに示す。アダリムマブ針状結晶束の顕著な複屈折が認められる。結晶針軸の方向が偏光方向に対して回転するにつれて結晶の色は青から赤に変化した後、青に戻る。
【０３１５】
別の顕微鏡写真を図５Ｂ、ＣおよびＤに示す。
【０３１６】
全画像はＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｅ６００  ＰＯＬ顕微鏡とＮｉｋｏｎ  ＤＸＭ  １２００デジタルカメラを使用して撮影した。倍率は約４０倍である。
【０３１７】
図５Ｂの画像（グレー）は直線偏光で撮影し、粒子形態を示す。黒の背景上の白の結晶（図５Ｄ）は複屈折を示し、交差偏光で撮影した。紫色の背景上の青とオレンジ色の結晶（図５Ｃ）は複屈折を示し、交差偏光と赤色補償板ないし１／４波長板を使用して撮影した。
【０３１８】
Ｈ．結晶注射適性
以下のセクションでは、各種ゲージ針を使用してモノクローナル抗体Ｄ２Ｅ７（１０〜２００ｍｇ／ｍｌ）の（ＰＥＧ）結晶懸濁液の注射適性を検討するために実験を実施した。
【０３１９】
ＰＥＧ緩衝液：
２０％ＰＥＧ４，０００ｍ／ｖ
１２ｍｇ／ｍＬマンニトール
０．１ｍｇ／ｍＬポリソルベート８０
１．３０５ｍｇ／ｍＬクエン酸一水和物
０．３０５ｍｇ／ｍＬクエン酸ナトリウム
１．５３ｍｇ／ｍＬリン酸水素二ナトリウム脱水物
０．８６ｍｇ／ｍＬリン酸二水素ナトリウム脱水物
ｐＨは水酸化ナトリウムで５．２に調整した。
【０３２０】
投与中に患者が手動で実施しているように注射器消費（１ｍＬ充填容量）を実施した。２０〜２７．５Ｇ針サイズを評価した。
【０３２１】
注射器：
２０／２３／２６Ｇ：
Ｈｅｎｋｅ  Ｓａｓｓ  Ｗｏｌｆ  ＧｍｂＨ  １ｍＬ  Ｎｏｒｍ−Ｊｅｃｔ注射器に以下の針を装着した。
−Ｈｅｎｋｅ  Ｓａｓｓ  Ｗｏｌｆ  ＧｍｂＨ  Ｆｉｎｅ−Ｊｅｃｔ（登録商標）２０Ｇ針
−Ｔｅｒｕｍｏ（登録商標）２３Ｇ針
−Ｎｅｏｐｏｉｎｔ（登録商標）２６Ｇ針。
２７．５Ｇ：
ＢＤ  ＨｙＰａｋ  ＳＣＦ（登録商標）１ｍＬ長尺注射器に２７．５Ｇ  ＲＮＳ針３８８００  Ｌｅ  Ｐｏｎｔ  ｄｕ  Ｃｌａｉｘを装着した。
【０３２２】
結果（図６）から、高濃度では針のゲージが大きいほど結晶の送達が遅くなると思われる。
【０３２３】
Ｉ．安定性データ（ＳＥ  ＨＰＬＣ，ＦＴ−ＩＲ）
以下のセクションでは、２〜８℃で１２カ月保存後のモノクローナル抗体Ｄ２Ｅ７（５０および２００ｍｇ／ｍｌ）の結晶懸濁液の安定性を検討するために実験を実施した。
【０３２４】
注射適性試験で使用した溶媒に懸濁した結晶：
２０％ＰＥＧ４，０００ｍ／ｖ
１２ｍｇ／ｍＬマンニトール
０．１ｍｇ／ｍＬポリソルベート８０
１．３０５ｍｇ／ｍＬクエン酸一水和物
０．３０５ｍｇ／ｍＬクエン酸ナトリウム
１．５３ｍｇ／ｍＬリン酸水素二ナトリウム脱水物
０．８６ｍｇ／ｍＬリン酸二水素ナトリウム脱水物
ｐＨは水酸化ナトリウムで５．２に調整した。
【０３２５】
ＳＥ−ＨＰＬＣ
【０３２６】
【表２】
2010507670.tif 000004
【０３２７】
ＳＥＣによる安定性分析にはＤｉｏｎｅｘ  ＨＰＬＣシステム（Ｐ６８０ポンプ，ＡＳＩ  １００オートサンプラー，ＵＶＤ１７０Ｕ）を使用した。流速０．５ｍＬ／分を適用してＤ２Ｅ７サンプルをＧＥ  Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（登録商標）６カラムで分離した。波長２１４ｎｍでＵＶ定量（検出）を実施した。ランニング緩衝液は０．０２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中０．１５Ｍ塩化ナトリウムから構成した。Ｂｒｕｋｅｒ  Ｏｐｔｉｃｓ  Ｔｅｎｓｏｒ  ２７でＣｏｎｆｏｃｈｅｃｋを使用してＩＲスペクトルを記録した。ＭｉｃｒｏＢｉｏｌｙｔｉｃｓ  ＡｑｕａＳｐｅｃセルを使用して液体サンプルを分析した。２５℃で１２０〜５００個のスキャンの測定を少なくとも２回実施して各サンプルを評価した。ブランク緩衝液スペクトルを蛋白質スペクトルから夫々差し引いた。フーリエ変換により蛋白質二次導関数スペクトルを作成し、相対比較のために１５８０〜１７２０ｃｍ−１からベクトルを正規化した。結晶の再溶解を次のように実施した。結晶懸濁液をＨｕｍｉｒａ（登録商標）市販緩衝液で蛋白質濃度１０ｍｇ／ｍＬまで希釈した。ＰＥＧ濃度を低下させることにより、結晶は再溶解した。
青−標準、凍結／融解後のＨｕｍｉｒａ（登録商標）
赤−５０ｍｇ／ｍＬを２５℃で６カ月後に再溶解した結晶
緑−２００ｍｇ／ｍＬを２５℃で６カ月保存後に再溶解した結晶，。
【０３２８】
結果：図７は２５℃で６カ月間保存後に構造変化がなかったことを示す。
【０３２９】
Ｊ．形態
２〜８℃で１２カ月間保存後に、結晶の光学顕微鏡分析により有意形態変化は認められなかった。
【０３３０】
１〜１０μＬサンプル容量のアリコートを対物レンズホルダープレートにピペットで滴下し、製剤化用緩衝液（２０％ＰＥＧ）で希釈し、ガラスカバースライドをかぶせた。Ｅ−ＰＩ  １０倍接眼レンズと夫々１０倍、２０倍および４０倍対物レンズを装着したＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２５倒立型光学顕微鏡を使用して結晶調製物を評価した。
【０３３１】
【表３】
2010507670.tif 000005
2010507670.tif 000006
【図１】
2010507670.tif 000007
【図２】
2010507670.tif 000008
【図３】
2010507670.tif 000009
【図４】
2010507670.tif 000010
【図５Ａ】
2010507670.tif 000011
【図５Ｂ】
2010507670.tif 000012
【図５Ｃ】
2010507670.tif 000013
【図５Ｄ】
2010507670.tif 000014
【図６】
2010507670.tif 000015
【図７】
2010507670.tif 000016
【配列表】
2010507670000001.app
【国際調査報告】
2010507670.tif 000017
2010507670.tif 000018
2010507670.tif 000019