(57)【要約】本発明は、ポリペプチド、核酸及び他の組成物を提供する。ポリペプチド、核酸及び他の組成物は、処置及び診断方法において有用である。一処置方法は、過剰増殖細胞の成長若しくは増殖を阻害する工程、又は細胞過剰増殖障害の細胞などの過剰増殖細胞の退行を誘発する工程又はＬＤＬ若しくはｏｘＬＤＬのレベルを低下させる工程を含む。一実施形態では、ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）として示される単離精製糖蛋白質、即ち、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質が提供される。一実施形態では、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質は、変性ゲル電気泳動により決定される約８０〜８２キロダルトン（ｋＤａ）の範囲の見かけ上の分子量、Ｇｒｐ７８と異なる少なくとも１つの窒素（Ｎ）又は酸素（Ｏ）−結合炭水化物部分を有し、ＳＡＭ−６として示される抗体がＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質に特異的に結合する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）として示される単離又は精製糖蛋白質であって、該ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質が、変性ゲル電気泳動により決定される約８０〜８２キロダルトン（ｋＤａ）の範囲の見かけ上の分子量を有し、Ｇｒｐ７８と異なる少なくとも１つの窒素（Ｎ）又は酸素（Ｏ）−結合炭水化物部分を有し、ＳＡＭ−６として示される抗体が該糖蛋白質に特異的に結合する、糖蛋白質。
【請求項２】
ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）として示される単離又は精製糖蛋白質であって、該ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質が、変性ゲル電気泳動により決定される約８０〜８２キロダルトン（ｋＤａ）の範囲の見かけ上の分子量を有し、Ｇｒｐ７８の炭水化物部分と異なる少なくとも１つの窒素（Ｎ）又は酸素（Ｏ）−結合炭水化物部分を有し、配列番号１に示されるＧｒｐ７８とのポリプペチド配列相同性を有する、糖蛋白質。
【請求項３】
前記糖蛋白質が約６５５個のアミノ酸の配列を含む、請求項２に記載の糖蛋白質。
【請求項４】
前記糖蛋白質が約１７個のアミノ酸の膜貫通ドメインを有する、請求項２に記載の糖蛋白質。
【請求項５】
前記糖蛋白質が約２２０個のアミノ酸の細胞外ドメインを有する、請求項２に記載の糖蛋白質。
【請求項６】
前記糖蛋白質が約４１１個のアミノ酸の細胞内ドメインを有する、請求項２に記載の糖蛋白質。
【請求項７】
前記炭水化物部分が、配列番号１のアスパラギン残基、セリン残基又はトレオニン残基に結合される、請求項２に記載の糖蛋白質。
【請求項８】
ＳＡＭ−６として示される抗体が前記糖蛋白質に特異的に結合する、請求項２に記載の糖蛋白質。
【請求項９】
前記ＳＡＭ−６抗体が、前記Ｎ若しくはＯ−結合炭水化物部分を含む前記糖蛋白質の一部、又は該Ｎ若しくはＯ−結合炭水化物部分に結合する、請求項８に記載の糖蛋白質。
【請求項１０】
グリコシダーゼ酵素による前記糖蛋白質の処理が、該糖蛋白質へのＳＡＭ−６抗体の結合を低減する、請求項２に記載の糖蛋白質。
【請求項１１】
前記グリコシダーゼ酵素がＯ−グリコシダーゼを含む、請求項１０に記載の糖蛋白質。
【請求項１２】
前記グリコシダーゼ酵素がＮ−グリコシダーゼを含む、請求項１０に記載の糖蛋白質。
【請求項１３】
前記Ｎ又はＯ−結合炭水化物部分が、１つ以上のガラクトース、アセチルガラクトース、マンノース、フコース、グルコース、アセチルグルコース、シアル酸、Ｎ−アセチルガラクトサミン又はＮ−アセチルグルコサミンを含む、請求項２に記載の糖蛋白質。
【請求項１４】
前記糖蛋白質のグリコシダーゼ酵素との接触が、約１〜５キロダルトン（ｋＤａ）だけ該糖蛋白質の見かけ上の分子量を減少させる、請求項１に記載の糖蛋白質。
【請求項１５】
前記グリコシダーゼ酵素がＯ−グリコシダーゼを含む、請求項１４に記載の糖蛋白質。
【請求項１６】
エンドグリコシダーゼＨ又はエンドグリコシダーゼＦによる処理が、前記糖蛋白質の見かけ上の分子量を減少させる、請求項２に記載の糖蛋白質。
【請求項１７】
請求項２に記載の糖蛋白質の部分配列であって、該部分配列は、Ｎ又はＯ−結合炭水化物部分を含む請求項１に記載の糖蛋白質の一部を含む、部分配列。
【請求項１８】
少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％若しくはそれを超える配列番号１との同一性を有するか又は配列番号１の部分配列を有する、請求項２に記載の糖蛋白質。
【請求項１９】
前記糖蛋白質が、新生細胞、癌細胞又は腫瘍細胞上に発現すると特徴づけられる、請求項２に記載の糖蛋白質。
【請求項２０】
前記糖蛋白質が、それぞれ、ＢＸＰＣ−３（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ−１６８７）又は２３１３２／８７（ＤＳＭＺ寄託番号ＡＣＣ２０１）として示される膵臓癌細胞株又は胃癌細胞株上に発現すると特徴づけられる、請求項２に記載の糖蛋白質。
【請求項２１】
請求項２に記載の糖蛋白質をコードする核酸配列。
【請求項２２】
配列番号１をコードする核酸配列と少なくとも７５〜９０％若しくはそれを超えて相補的であるか又は相同的である核酸配列。
【請求項２３】
Ｇｒｐ７８の炭水化物部分と異なる少なくとも１つの窒素（Ｎ）又は酸素（Ｏ）−結合炭水化物部分を結合させることが可能な請求項１に記載の糖蛋白質又はその部分配列をコードすることが可能な核酸配列であって、約１０〜２０、２０〜３０、３０〜５０、５０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜１０００、１０００〜２０００ヌクレオチド長を有する、核酸配列。
【請求項２４】
請求項２１から２３のいずれか一項に記載の核酸配列と特異的にハイブリダイズする核酸配列。
【請求項２５】
請求項２１に記載の核酸配列と特異的にハイブリダイズし、請求項２に記載のポリペプチド配列の発現を低減する、アンチセンスポリヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ又はリボザイム核酸。
【請求項２６】
前記ポリヌクレオチドが、約１０〜２０、２０〜３０、３０〜５０、５０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜１０００、１０００〜２０００ヌクレオチド長を有し、配列番号１をコードする核酸配列と少なくとも９０％相補的又は相同的である、請求項２５に記載のアンチセンスポリヌクレオチド。
【請求項２７】
発現制御配列を更に含む、請求項２１に記載の核酸。
【請求項２８】
請求項２に記載の糖蛋白質をコードする核酸を含むベクター。
【請求項２９】
ウイルスベクター、細菌ベクター、真菌ベクター又は哺乳動物ベクターを含む、請求項２８に記載のベクター。
【請求項３０】
請求項２８に記載の核酸又はベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項３１】
真核細胞である、請求項３０に記載の宿主細胞。
【請求項３２】
請求項２１又は２８に記載の核酸又はベクターで安定又は一過性に形質転換される、請求項３０に記載の宿主細胞。
【請求項３３】
過剰増殖細胞、不死化細胞、新生細胞、腫瘍細胞又は癌細胞である、請求項３０に記載の宿主細胞。
【請求項３４】
請求項１若しくは２に記載の糖蛋白質又は請求項１若しくは２に記載の糖蛋白質の免疫原性部分配列に特異的に結合する単離又は精製抗体。
【請求項３５】
請求項２に記載の糖蛋白質の少なくとも１つのＮ又はＯ−結合炭水化物部分を含むエピトープに特異的に結合する単離又は精製抗体。
【請求項３６】
請求項２に記載の糖蛋白質へのＳＡＭ−６の結合に対して競合するか、又は請求項２に記載の糖蛋白質へのＳＡＭ−６の結合を阻害若しくはブロックする抗体。
【請求項３７】
ＥＬＩＳＡアッセイで決定される、請求項２に記載の糖蛋白質へのＳＡＭ−６の結合を阻害又は阻止する抗体。
【請求項３８】
ＥＬＩＳＡアッセイで決定される、請求項１に記載の糖蛋白質へのＳＡＭ−６の結合の少なくとも５０％を阻害する抗体。
【請求項３９】
低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）又は酸化ＬＤＬ（ｏｘＬＤＬ）に結合する、請求項３４から３８のいずれか一項に記載の単離又は精製抗体。
【請求項４０】
前記糖蛋白質を発現する細胞への前記抗体の結合が、細胞死、溶解又はアポトーシスを刺激又は誘導する、請求項３４から３９のいずれか一項に記載の単離又は精製抗体。
【請求項４１】
前記糖蛋白質を発現する新生細胞、癌細胞又は腫瘍細胞への前記抗体の結合が、細胞死、溶解又はアポトーシスを刺激又は誘導する、請求項３４から３９のいずれか一項に記載の単離又は精製抗体。
【請求項４２】
ＢＸＰＣ−３又は２３１３２／８７細胞への前記抗体の結合が、ＢＸＰＣ−３若しくは２３１３２／８７細胞の成長若しくは増殖を阻害し、又はＢＸＰＣ−３若しくは２３１３２／８７の細胞死、溶解若しくはアポトーシスを刺激若しくは誘導する、請求項３４から３９のいずれか一項に記載の単離又は精製抗体。
【請求項４３】
前記糖蛋白質を発現する細胞への前記抗体の結合が、カスパーゼの活性化を引き起こす、請求項３４から３９のいずれか一項に記載の単離又は精製抗体。
【請求項４４】
前記カスパーゼが、カスパーゼ３、カスパーゼ８又はカスパーゼ９を含む、請求項４３に記載の単離又は精製抗体。
【請求項４５】
Ｎ又はＯ−結合炭水化物部分を含むエピトープに結合しない、請求項３４に記載の単離又は精製抗体。
【請求項４６】
Ｏ−グリコシダーゼによる前記糖蛋白質の処理が、該糖蛋白質への前記抗体の結合を低減する、請求項３４に記載の単離又は精製抗体。
【請求項４７】
ＳＡＭ−６の重鎖及び軽鎖配列と同一の重鎖及び軽鎖配列を有さない、請求項３４に記載の単離又は精製抗体。
【請求項４８】
ＳＡＭ−６の重鎖又は軽鎖可変配列と同一の重鎖又は軽鎖可変配列を有さない、請求項３４に記載の単離又は精製抗体。
【請求項４９】
配列番号１８として示される重鎖可変領域アミノ酸配列のＣＤＲ３（ＡＲＤＲＬＡＶＡＧＲＰＦＤＹ；配列番号１７）と１００％の同一性を有するＣＤＲを含む重鎖可変配列を含む、請求項３４に記載の単離又は精製抗体。
【請求項５０】
配列番号１８として示される重鎖可変領域アミノ酸配列と１００％の同一性を有する重鎖可変配列を含む、請求項３４に記載の単離又は精製抗体。
【請求項５１】
ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体である、請求項３４に記載の単離又は精製抗体。
【請求項５２】
ＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＭ，ＩｇＥ及びＩｇＤから選択される、請求項３４に記載の単離又は精製抗体。
【請求項５３】
前記ＩｇＧが、ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３又はＩｇＧ４である、請求項５２に記載の抗体。
【請求項５４】
ＩｇＭを含む、請求項３４に記載の単離又は精製抗体。
【請求項５５】
ＳＡＭ−６の結合親和性の約１〜５０００倍以内の前記糖蛋白質に対する結合親和性を有する、請求項３４に記載の単離又は精製抗体。
【請求項５６】
ＳＡＭ−６のＫＤ約１０−６Ｍ〜ＫＤ約１０−１３Ｍ以内の前記糖蛋白質に対する結合親和性を有する、請求項３４に記載の抗体。
【請求項５７】
前記糖蛋白質細胞外ドメインに結合する、請求項３４に記載の抗体。
【請求項５８】
前記糖蛋白質を発現している細胞に特異的に結合する、請求項３４から５７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５９】
前記糖蛋白質又は免疫原性断片に結合する抗体部分配列を含む、請求項３４に記載の抗体。
【請求項６０】
前記部分配列が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｄ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド連結されたＦｖｓ（ｓｄＦｖ）及びＶＬ若しくはＶＨから選択される、請求項５９に記載の抗体。
【請求項６１】
ＳＡＭ−６抗体の重鎖又は軽鎖可変領域配列に対して９０％〜９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれを超える同一性を有さない、請求項３４に記載の抗体。
【請求項６２】
前記ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質又は抗体が異種ドメインを更に含む、請求項１若しくは２に記載のＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質又は請求項３４から６１のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項６３】
前記異種ドメインが、検出可能な標識、タグ又は細胞傷害剤を含む、請求項６２に記載のＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質又は抗体。
【請求項６４】
前記検出可能な標識又はタグが、酵素；酵素基質；リガンド；受容体；放射性核種；Ｔ７−タグ、Ｈｉｓ−タグ、ｍｙｃ−タグ、ＨＡ−タグ若しくはＦＬＡＧ−タグ；高電子密度試薬；エネルギー伝達分子；常磁性標識；フルオロフォア；発色団；化学発光剤；及び生物発光剤を含む、請求項６３に記載のＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質又は抗体。
【請求項６５】
請求項３４に記載の抗体及び請求項２に記載の糖蛋白質を検出するための取扱説明書を含むキット。
【請求項６６】
請求項１若しくは２に記載のＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質又は請求項３４に記載の抗体及び請求項２に記載の糖蛋白質に結合する抗体で処置可能な状態を処置するための取扱説明書を含むキット。
【請求項６７】
前記取扱説明書が、望ましくない細胞増殖又は過剰増殖を処置するためのものである、請求項６６に記載のキット。
【請求項６８】
前記取扱説明書が、新生物、腫瘍又は癌を処置するためのものである、請求項６６に記載のキット。
【請求項６９】
抗細胞増殖又は免疫増強処置若しくは治療剤を更に含む、請求項６６に記載のキット。
【請求項７０】
抗新生物剤、抗癌剤又は抗腫瘍剤を更に含む、請求項６６に記載のキット。
【請求項７１】
前記取扱説明書がラベル又は添付文書上にある、請求項６６に記載のキット。
【請求項７２】
製品を更に含む、請求項６６に記載のキット。
【請求項７３】
前記製品が、抗体、抗細胞増殖又は免疫増強処置若しくは治療剤を被験体の局所、局部又は全身に送達するためのものである、請求項７２に記載のキット。
【請求項７４】
請求項１または２に記載のＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質又は請求項３４から６１のいずれか一項に記載の抗体及び医薬的に許容可能な担体若しくは賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項７５】
処置を必要とする被験体における細胞過剰増殖障害を処置するための方法であって、該被験体における細胞過剰増殖障害を処置するのに有効な量にて、請求項１若しくは２に記載のＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質又は請求項３４から６１のいずれか一項に記載の抗体を該被験体に投与する工程を含む方法。
【請求項７６】
前記細胞過剰増殖障害が、脳、頭頸部、乳房、食道、口、鼻咽頭、鼻若しくは洞、胃、十二指腸、回腸、空腸、肺、肝臓、膵臓、腎臓、副腎、甲状腺、膀胱、結腸、直腸、前立腺、子宮、子宮頸部、卵巣、骨髄、リンパ、血液、骨、精巣、皮膚若しくは筋肉又は造血系を冒すか、或いは少なくともその一部に存在する、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記細胞過剰増殖障害が、新生物、腫瘍又は癌を含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７８】
前記新生物、腫瘍又は癌が転移性又は非転移性である、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記新生物、腫瘍又は癌が、乳房、肺、甲状腺、頭頸部、鼻咽頭、鼻若しくは洞、脳、脊椎、副腎、甲状腺、リンパ、消化管、口、食道、胃、十二指腸、回腸、空腸、小腸、結腸、直腸、尿生殖路、子宮、卵巣、子宮頸部、膀胱、精巣、陰茎、前立腺、腎臓、膵臓、副腎、肝臓、骨、骨髄、リンパ、血液、筋肉又は皮膚を冒すか、或いは少なくともその一部に存在する、請求項７７に記載の方法。
【請求項８０】
前記新生物、腫瘍又は癌が造血性である、請求項７７に記載の方法。
【請求項８１】
前記新生物、腫瘍又は癌が、肉腫、癌腫、腺癌、黒色腫、骨髄腫、芽細胞腫、神経膠腫、リンパ腫又は白血病を含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項８２】
前記新生物、腫瘍又は癌が、肺腺癌、肺癌、びまん性若しくは間質性胃癌、結腸腺癌、前立腺腺癌、食道癌、乳癌、膵臓腺癌、卵巣腺癌又は子宮腺癌を含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項８３】
前記新生物、腫瘍又は癌が、Ｉ，ＩＩ，ＩＩＩ，ＩＶ又はＶ期の転移性又は非転移性の腫瘍又は癌を含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項８４】
前記新生物、腫瘍又は癌が進行的に悪化している、請求項７７に記載の方法。
【請求項８５】
前記新生物、腫瘍又は癌が寛解期にある、請求項７７に記載の方法。
【請求項８６】
前記新生物、腫瘍又は癌が固形又は液性である、請求項７７に記載の方法。
【請求項８７】
前記抗体を前記被験体に対して局所、局部又は全身に投与する、請求項７７に記載の方法。
【請求項８８】
前記処置が、前記細胞過剰増殖障害又は前記新生物、腫瘍若しくは癌と関連する１つ以上の有害身体症状の緩和又は改善をもたらす、請求項７５又は７７に記載の方法。
【請求項８９】
前記処置が、新生物、腫瘍若しくは癌の体積を低減もしくは減少させ、新生物、腫瘍若しくは癌の体積の増加を阻害若しくは阻止し、新生物、腫瘍若しくは癌の進行若しくは悪化を阻害し、新生物、腫瘍若しくは癌の細胞溶解若しくはアポトーシスを刺激し、又は新生物、腫瘍若しくは癌の増殖若しくは転移を阻害、低減若しくは減少させる、請求項７７に記載の方法。
【請求項９０】
前記処置が前記被験体の寿命を長くするか、又は延ばす、請求項７５又は７７に記載の方法。
【請求項９１】
前記処置が前記被験体の生活の質を改善する、請求項７５又は７７に記載の方法。
【請求項９２】
前記被験体が、抗新生物、抗腫瘍、抗癌若しくは免疫増強の処置若しくは治療の候補者であるか、それを受けているか、又はそれを受けたことがある、請求項７５又は７７に記載の方法。
【請求項９３】
抗細胞増殖又は免疫増強の処置又は治療を前記患者に施す工程を更に含む、請求項７５又は７７に記載の方法。
【請求項９４】
前記処置又は治療が、外科的切除、放射線治療、放射線療法、化学療法、免疫療法又は温熱療法を含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記抗細胞増殖処置又は治療が、アルキル化剤、代謝拮抗剤、植物抽出物、植物アルカロイド、ニトロソ尿素、ホルモン、ヌクレオシド又はヌクレオチド類似体を含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９６】
前記抗細胞増殖処置又は治療が、シクロホスファミド、アザチオプリン、シクロスポリンＡ、プレドニゾロン、メルファラン、クロラムブシル、メクロレタミン、ブスルファン、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、チオグアニン、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド、ＡＺＴ、５−アザシチジン（５−ＡＺＣ）及び５−アザシチジン関連化合物、ブレオマイシン、アクチノマイシンＤ、ミトラマイシン、マイトマイシンＣ、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾトシン、ヒドロキシウレア、シスプラチン、ミトタン、プロカルバジン、ダカルバジン、タキソール、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ドキソルビシン並びにジブロモマンニトールから選択される、請求項９３に記載の方法。
【請求項９７】
前記免疫増強処置又は治療が、リンパ球、形質細胞、マクロファージ、樹状細胞、ＮＫ細胞又はＢ細胞を含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９８】
前記免疫増強処置又は治療が、抗体、細胞増殖因子、細胞生存因子、細胞分化因子、サイトカイン又はケモカインを含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９９】
前記免疫増強処置又は治療が、ＩＬ−２、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−７、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、ＴＮＦβ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＤＦ−１、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、エオタキシン、エオタキシン−２、Ｉ−３０９／ＴＣＡ３、ＡＴＡＣ、ＨＣＣ−１、ＨＣＣ−２、ＨＣＣ−３、ＬＡＲＣ／ＭＩＰ−３α、ＰＡＲＣ、ＴＡＲＣ、ＣＫβ、ＣＫβ６、ＣＫβ７、ＣＫβ８、ＣＫβ９、ＣＫβ１１、ＣＫβ１２、Ｃ１０、ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＥＮＡ−７８、ＧＣＰ−２、ＰＢＰ／ＣＴＡＰＩＩＩβ−ＴＧ／ＮＡＰ−２、Ｍｉｇ、ＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１及びリンホタクチンから選択される、請求項９３に記載の方法。
【請求項１００】
前記抗体を、前記抗細胞増殖又は免疫増強の処置又は治療の施行前、その施行と実質的に同時又はその施行後に投与する、請求項９３に記載の方法。
【請求項１０１】
前記被験体が哺乳動物である、請求項７５から１００のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０２】
前記被験体がヒトである、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記被験体が、細胞過剰増殖障害の処置若しくは治療を受けているか、又はそれを受けたことがある、請求項７５から１００のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０４】
望ましくない又は過剰なＬＤＬ若しくはｏｘＬＤＬレベルと関連するか、或いはそれによって引き起こされる障害又は疾患を処置するための方法であって、被験体における望ましくない又は過剰なＬＤＬ若しくはｏｘＬＤＬレベルと関連するか、或いはそれによって引き起こされる障害又は疾患を処置するのに有効な量にて、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質に特異的に結合する抗体を該被験体に投与する工程を含む、方法。
【請求項１０５】
請求項１又は２に記載のポリペプチドを検出又はスクリーニングする方法であって、
ａ）請求項１又は２に記載のポリペプチドへの抗体の結合を可能にする条件下にて生物学的な物質又は試料を請求項３４又は３５に記載の抗体と接触させる工程と、
ｂ）該ポリペプチドへの該抗体の結合をアッセイする工程であって、該ポリペプチドへの該抗体の結合が、請求項１又は２に記載のポリペプチドの存在を検出する、工程と
を含む、方法。
【請求項１０６】
前記ポリペプチドが細胞又は組織上に存在する、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記生物学的な物質又は試料が哺乳動物被験体から得られる、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０８】
請求項３４又は３５に記載の抗体がＳＡＭ−６抗体と異なる、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０９】
新生物、腫瘍若しくは癌を有するか、又はそれを有する危険性が高い被験体を診断する方法であって、
ｃ）該被験体由来の生物学的な物質又は試料を提供する工程と、
ｄ）請求項１又は２に記載のポリペプチドへの抗体の結合を可能にする条件下にて該生物学的な物質又は試料を請求項３４又は３５に記載の抗体と接触させる工程と、
ｅ）該ポリペプチドへの該抗体の結合をアッセイする工程であって、該ポリペプチドへの該抗体の結合が、該被験体が新生物、腫瘍若しくは癌を有するか、又はそれを有する危険性が高いと診断する、工程と
を含む方法。
【請求項１１０】
前記生物学的な物質又は試料がヒトから得られる、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記生物学的な物質又は試料が生検材料を含む、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１２】
生物学的な物質又は試料が、肺、膵臓、胃、乳房、食道、卵巣又は子宮の生検材料を含む、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１３】
請求項３４又は３５に記載の抗体がＳＡＭ−６抗体と異なる、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１４】
ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）として示される糖蛋白質に特異的に結合する抗体を作製する方法であって、
ａ）変性ゲル電気泳動により決定される約８０〜８２キロダルトン（ｋＤａ）の範囲の分子量、少なくとも１つのＯ−結合炭水化物部分を有し、且つＧｒｐ７８に対して少なくとも部分的な配列相同性を有するポリペプチド、又はその断片を動物に投与する工程と、
ｂ）該ポリペプチドに結合する抗体の発現について該動物をスクリーニングする工程と、
ｃ）該ポリペプチド又はその断片に結合する抗体を産生する動物を選択する工程と、
ｄ）該選択された動物から該抗体を単離する工程と
を含む方法。
【請求項１１５】
ＳＡＭ−６／Ｒ抗体を作製する方法であって、
ａ）変性ゲル電気泳動により決定される約８０〜８２キロダルトン（ｋＤａ）の範囲の見かけ上の分子量、少なくとも１つのＮ又はＯ−結合炭水化物部分を有し、且つＧｒｐ７８に対して少なくとも部分的な配列相同性を有するポリペプチド又はその断片を動物に投与する工程と、
ｂ）該ポリペプチド又はその断片に結合する抗体の発現について該動物をスクリーニングする工程と、
ｃ）該ポリペプチドに結合する抗体を産生する動物を選択する工程と、
ｄ）該選択された動物から該抗体を単離する工程と
を含む方法。
【請求項１１６】
ヒトモノクローナルＳＡＭ−６／Ｒ抗体を作製する方法であって、
ａ）変性ゲル電気泳動により決定される約８０〜８２キロダルトン（ｋＤａ）の範囲の見かけ上の分子量、少なくとも１つのＮ又はＯ−結合炭水化物部分を有し、且つＧｒｐ７８に対して少なくとも部分的な配列相同性を有するポリペプチド又はその断片を、ヒト免疫グロブリンを発現することが可能な動物に投与する工程と、
ｂ）該ポリペプチド又はその断片に結合する抗体を産生する動物から脾臓細胞を単離する工程と、
ｃ）該脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを作製する工程と、
ｄ）ポリペプチド又はその断片に結合するヒトモノクローナル抗体の発現について該ハイブリドーマをスクリーニングする工程と
を含む方法。
【請求項１１７】
前記断片が、Ｎ又はＯ−結合炭水化物部分を含む請求項１又は２に記載のポリペプチド配列の一部を含む、請求項１１４から１１６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、200６年１１月２７日に出願された、米国仮出願第６0/８６７，２８５号（これは、明確にその全体が参考として本明細書に援用される）への優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ＳＡＭ−６として公知の抗体に結合するグリコシル化ペプチド又は糖蛋白質に関する。ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）として示される糖蛋白質、即ち、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質は、Ｇｒｐ７８（グルコース調節蛋白質７８）ポリペプチド配列と見かけ上の配列相同性を有し、且つ同一性を共有する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
導入
新生物、腫瘍及び癌を含む細胞過剰増殖障害などの望ましくない、又は異常な細胞増殖を処置する方法の必要性がある。本発明は、この必要性に対処するとともに関連する利益を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）として示される単離精製糖蛋白質、即ち、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質を提供する。一実施形態では、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質は、変性ゲル電気泳動により決定される約８０〜８２キロダルトン（ｋＤａ）の範囲の見かけ上の分子量、Ｇｒｐ７８と異なる少なくとも１つの窒素（Ｎ）又は酸素（Ｏ）−結合炭水化物部分を有し、ＳＡＭ−６として示される抗体がＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質に特異的に結合する。別の実施形態では、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質は、変性ゲル電気泳動により決定される約８０〜８２キロダルトン（ｋＤａ）の範囲の見かけ上の分子量、Ｇｒｐ７８の炭水化物部分と異なる少なくとも１つの窒素（Ｎ）又は酸素（Ｏ）−結合炭水化物部分並びに配列番号１に示されるＧｒｐ７８とのポリプペチド配列相同性（例えば、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又はそれより多くの同一性）を有する。
【０００５】
種々の態様において、ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）として示される単離精製糖蛋白質、即ち、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質は、約６５５個のアミノ酸の配列を含み、約１７個のアミノ酸の膜貫通ドメインを有し、約２２０個のアミノ酸の細胞外ドメインを有し、又は約４１１個のアミノ酸の細胞内ドメインを有する。種々の更なる態様では、ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）、即ち、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質は、新生、癌又は腫瘍細胞、例えば、それぞれ、ＢＸＰＣ−３（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ−１６８７）、２３１３２／８７（ＤＳＭＺ寄託番号ＡＣＣ２０１）として示される膵癌細胞株又は胃癌細胞株上に発現することを特徴とする。
【０００６】
別の態様では、ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）として示される単離精製糖蛋白質、即ち、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質の結合炭水化物部分は、（例えば、配列番号１の）アスパラギン残基、セリン残基又はトレオニン残基に結合される。更なる態様では、ＳＡＭ−６抗体はＮ若しくはＯ−結合炭水化物部分を含む糖蛋白質の一部に結合し、又はＮ若しくはＯ−結合炭水化物部分に結合する。更なる態様では、グリコシダーゼ酵素（例えば、エンドグリコシダーゼＨ又はエンドグリコシダーゼＦなどのＯ−グリコシダーゼ又はＮ−グリコシダーゼ）によるＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）、即ち、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質の処置は、糖蛋白質の見かけ上の分子量を約１〜５キロダルトン（ｋＤａ）減少させ、又はＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）、即ち、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質へのＳＡＭ−６抗体の結合を低下させる。なお更なる態様では、Ｎ又はＯ−結合炭水化物部分は１つ以上のガラクトース、アセチルガラクトース、マンノース、フコース、グルコース、アセチルグルコース、シアル酸、Ｎ−アセチルガラクトサミン又はＮ−アセチルグルコサミンを含む。
【０００７】
本発明は、ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）、即ち、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質の部分配列も提供する。一実施形態では、部分配列はＮ又はＯ−結合炭水化物部分を有する糖蛋白質の一部を含む。
【０００８】
本発明は、ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）糖蛋白質、即ち、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質をコードする核酸配列を更に提供する。一実施形態では、核酸配列は、配列番号１又はその部分配列をコードする核酸配列と少なくとも７５〜９０％又はそれ以上相補的又は相同的である。別の実施形態では、核酸配列は、Ｇｒｐ７８の炭水化物部分と異なる少なくとも１つの窒素（Ｎ）又は酸素（Ｏ）−結合炭水化物部分を結合させることができるＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）、即ち、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質をコードする。特定の態様では、核酸はＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）、即ち、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質の部分配列をコードする。他の態様では、核酸配列は、約１０〜２０、２０〜３０、３０〜５０、５０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜１０００、１０００〜２０００ヌクレオチド長を有する。更なる態様では、核酸配列は、配列番号１若しくはその部分配列をコードする核酸と特異的にハイブリダイズし、又は配列番号１若しくはその部分配列をコードする核酸と相補的な核酸配列と特異的にハイブリダイズする。更なる態様では、核酸は、ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）、即ち、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質をコードする核酸配列と特異的にハイブリダイズし、且つＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）、即ち、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質の発現を低下させるアンチセンスポリヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ又はリボザイム核酸である。アンチセンスポリヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ及びリボザイムポリヌクレオチドは、約１０〜２０、２０〜３０、３０〜５０、５０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜１０００、１０００〜２０００ヌクレオチド長を有し得、配列番号１又はその部分配列をコードする核酸配列と少なくとも９０％相補的又は相同的であり得る。なお更なる態様では、核酸配列は発現調節配列又はベクター（例えば、ウイルスベクター、細菌ベクター、真菌ベクター又は哺乳動物ベクター）を含みうる。
【０００９】
本発明は、ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）、即ち、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質又はその部分配列をコードする核酸で形質転換された宿主細胞を更に提供する。宿主細胞は核酸又はベクターで安定に、又は一過性に形質転換され得る真核（例えば、過剰増殖細胞、不死化細胞、新生細胞、腫瘍細胞又は癌細胞）細胞及び非真核細胞を含む。
【００１０】
本発明は、ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）、即ち、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質又はその部分配列に特異的に結合する、単離精製されたポリクローナル及びモノクローナル抗体を更に提供する。一実施形態では、抗体は少なくとも１つのＮ又はＯ−結合炭水化物部分を含むＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）、即ち、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質エピトープ（例えば、細胞外ドメイン）に特異的に結合する。別の実施形態では、抗体はＮ又はＯ−結合炭水化物部分を含むエピトープに結合しない。更なる実施形態では、抗体はＬＤＬ（例えば、酸化ＬＤＬ、“ｏｘＬＤＬ”）に結合する。更なる実施形態では、抗体は、ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）、即ち、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質若しくはその部分配列へのＳＡＭ−６抗体の結合と競合し、又はＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）、即ち、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質若しくはその部分配列へのＳＡＭ−６抗体の結合（例えば、ＳＡＭ−６抗体の結合の少なくとも５０％）を阻害若しくは阻止し（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイにて決定される）、又はＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）へのＳＡＭ−６抗体の結合と競合し、又はＬＤＬ若しくはｏｘＬＤＬへのＳＡＭ−６抗体の結合（例えば、ＳＡＭ−６抗体の結合の少なくとも５０％）を阻害若しくは阻止する（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイにて決定される）。なお更なる実施形態では、抗体はＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）、即ち、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質を発現している細胞（例えば、新生、癌若しくは腫瘍細胞又はＢＸＰＣ−３若しくは２３１３２／８７細胞などの細胞株）に結合し、インビトロ又はインビボにて細胞死、溶解若しくはアポトーシス、又はカスパーゼ（例えば、カスパーゼ３、カスパーゼ８又はカスパーゼ９）の活性化を刺激又は誘導する。更に別の実施形態では、Ｏ−グリコシダーゼによるＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）、即ち、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質の処置は、ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）、即ち、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質又はＬＤＬ若しくはｏｘＬＤＬへの抗体の結合を低下させる。なお更なる実施形態では、抗体はＳＡＭ−６の結合親和性の約１〜５０００倍以内のＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）、即ち、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質に対する結合親和性又はＳＡＭ−６のＫＤ約１０−６Ｍ〜ＫＤ約１０−１３Ｍ以内のＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）、即ち、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質に対する結合親和性を有する。なお更なる実施形態では、抗体はＳＡＭ−６の結合親和性の約１〜５０００倍以内のＬＤＬ若しくはｏｘＬＤＬに対する結合親和性又はＳＡＭ−６のＫＤ約１０−６Ｍ〜ＫＤ約１０−１３Ｍ以内のＬＤＬ若しくはｏｘＬＤＬに対する結合親和性を有する。
【００１１】
本発明の抗体はＳＡＭ−６抗体と異なる。一実施形態では、抗体はＳＡＭ−６の重鎖及び軽鎖配列と同一の重鎖及び軽鎖配列を有さない。別の実施形態では、抗体はＳＡＭ−６の重鎖又は軽鎖可変配列と同一の重鎖又は軽鎖可変配列を有さない。更なる実施形態では、抗体はＳＡＭ−６抗体の重鎖又は軽鎖可変領域配列に対して９０％〜９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれより多くの同一性を有さない。特定の実施形態では、ＳＡＭ−６抗体と異なる抗体は、配列番号１８として示される重鎖可変領域アミノ酸配列内の重鎖可変領域配列、即ち、ＣＤＲ（ＣＤＲ３；ＡＲＤＲＬＡＶＡＧＲＰＦＤＹ；配列番号１７）との１００％の同一性を有する重鎖配列を有する。
【００１２】
本発明の抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ及びＩｇＤを含む。種々の態様において、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４である。
【００１３】
本発明の抗体は、ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）、即ち、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質又はその部分配列（例えば、免疫原性断片）に結合する抗体部分配列も含む。種々の態様において、部分配列は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｄ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド連結されたＦｖｓ（ｓｄＦｖ）、ＶＬ又はＶＨである。
【００１４】
本発明は、異種ドメインを含む、ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）、即ち、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質及びその部分配列、ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）、即ち、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質に結合する抗体及び部分配列も提供する。一実施形態では、異種ドメインは、検出可能な標識、タグ又は細胞傷害剤を含む。特定の態様では、検出可能な標識又はタグは、酵素、酵素基質、リガンド、受容体、放射性核種、Ｔ７−タグ、Ｈｉｓ−タグ、ｍｙｃ−タグ、ＨＡ−タグ若しくはＦＬＡＧ−タグ、高電子密度試薬、エネルギー伝達分子、常磁性標識、フルオロフォア、発色団、化学発光剤又は生物発光剤である。
【００１５】
本発明は、更にキットを提供する。一実施形態では、キットは、ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）、即ち、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質に結合する抗体及びＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）、即ち、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質を検出するための取扱説明書を含む。別の実施形態では、キットは、ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）、即ち、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質に結合する抗体及びＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）、即ち、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質に結合する抗体により処置可能な疾患を処置するための取扱説明書を含む。更なる実施形態では、キットは、抗細胞増殖若しくは免疫増強のための処置若しくは治療剤又は抗新生物、抗癌剤若しくは抗腫瘍剤又は製品（例えば、抗体、抗細胞増殖若しくは免疫増強のための処置若しくは治療剤を局所、局部又は全身に送達するため）も含む。特定の態様では、取扱説明書は望ましくない細胞増殖若しくは過剰増殖を処置し、又は新生物、腫瘍若しくは癌を処置するためのものである。更なる態様では、取扱説明書はラベル又は添付文書に記載されている。
【００１６】
本発明は、更に医薬組成物を提供する。一実施形態では、組成物はＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）、即ち、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質及び医薬的に許容可能な担体若しくは賦形剤を含む。別の実施形態では、組成物はＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）、即ち、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質に特異的に結合する抗体及び医薬的に許容可能な担体若しくは賦形剤を含む。
【００１７】
本発明は、処置を必要とする被験体における障害を処置する方法を更に提供する。一実施形態では、方法は、被験体における細胞過剰増殖障害（例えば、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ又はＶ期の転移性又は非転移性、固形又は液性新生物、腫瘍又は癌）を処置するのに有効な量にて、ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）、即ち、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質、又はＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）、即ち、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質に特異的に結合する抗体を投与する工程を含む。種々の態様において、細胞過剰増殖障害は、脳、頭頸部、乳房、食道、口、鼻咽頭、鼻若しくは洞、胃、十二指腸、回腸、空腸、肺、肝臓、膵臓、腎臓、副腎、甲状腺、膀胱、結腸、直腸、前立腺、子宮、子宮頸部、卵巣、骨髄、リンパ、血液、骨、精巣、皮膚若しくは筋肉又は造血（ｈｅｍａｔｏｐｏｅｔｉｃ）系を冒し、或いはその少なくとも一部に存在する。更なる態様では、細胞過剰増殖障害は、乳房、肺、甲状腺、頭頸部、鼻咽頭、鼻若しくは洞、脳、脊椎、副腎、甲状腺、リンパ、消化管、口、食道、胃、十二指腸、回腸、空腸、小腸、結腸、直腸、尿生殖路、子宮、卵巣、子宮頸部、膀胱、精巣、陰茎、前立腺、腎臓、膵臓、副腎、肝臓、骨、骨髄、リンパ、血液、筋肉、皮膚を冒し、或いはその少なくとも一部に存在し、又は造血性である新生物、腫瘍若しくは癌を含む。特定の態様では、新生物、腫瘍又は癌は、肉腫、癌腫、腺癌、黒色腫、骨髄腫、芽細胞腫、神経膠腫、リンパ腫、白血病である。更なる特定の態様では、新生物、腫瘍又は癌は、肺腺癌、肺癌、びまん性若しくは間質性胃癌、結腸腺癌、前立腺腺癌、食道癌、乳癌、膵臓腺癌、卵巣腺癌又は子宮腺癌である。更なる特定の態様では、新生物、腫瘍又は癌は進行期又は寛解期にある。なお更なる態様では、処置は、細胞過剰増殖障害、即ち、新生物、腫瘍若しくは癌と関連する１つ以上の有害な身体症状の軽減若しくは改善をもたらし、又は新生物、腫瘍若しくは癌の体積を低減し、新生物、腫瘍若しくは癌の体積の増加を阻害若しくは抑制し、新生物、腫瘍若しくは癌の進行若しくは悪化を阻害し、新生物、腫瘍若しくは癌の細胞溶解若しくはアポトーシスを刺激し、又は新生物、腫瘍若しくは癌の増殖若しくは転移を阻害、減少若しくは低減し、又は被験体の寿命を長くし、若しくは延ばし、又は被験体の生活の質を改善する。
【００１８】
方法は被験体への局所、局部又は全身投与を含む。例示的な被験体（例えば、ヒトなどの哺乳動物）は、抗細胞増殖若しくは抗細胞過剰増殖障害（例えば、抗新生物、抗腫瘍、抗癌又は抗転移）又は免疫増強処置若しくは治療の候補者、及びその処置若しくは治療を受け、又は受けたことがある被験体を含む。
【００１９】
本発明は、処置を必要とする被験体における障害を処置する組合せ法も更に提供する。一実施形態では、方法は、被験体にＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）、即ち、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質、又はＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）、即ち、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質に特異的に結合する抗体を投与し、且つ抗細胞増殖又は免疫増強処置若しくは治療を施す工程を含む（例えば、互いに前後して、又は実質的に同時に）。種々の態様において、抗細胞増殖又は免疫増強処置若しくは治療は、外科的切除、放射線治療、放射線療法、化学療法、免疫療法、温熱療法、アルキル化剤、代謝拮抗剤、植物抽出物、植物アルカロイド、ニトロソ尿素、ホルモン、ヌクレオシド若しくはヌクレオチド類似体、リンパ球、形質細胞、マクロファージ、樹状細胞、ＮＫ細胞若しくはＢ細胞、抗体、細胞増殖因子、細胞生存因子、細胞分化因子、サイトカイン又はケモカインを含む。
【００２０】
本発明は、望ましくない又は過剰なＬＤＬ若しくはｏｘＬＤＬレベルと関連する、或いはそれによって引き起こされる障害又は疾患を処置する方法を更に提供する。一実施形態では、方法は、被験体において望ましくない又は過剰なＬＤＬ若しくはｏｘＬＤＬレベルと関連する、或いはそれによって引き起こされる障害又は疾患を処置するのに有効な量でＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）、即ち、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質に特異的に結合する抗体を被験体に投与する工程を含む。種々の態様において、望ましくない又は過剰なＬＤＬ若しくはｏｘＬＤＬレベルと関連する、或いはそれによって引き起こされる障害又は疾患は、脂質異常症、高コレステロール血症、動脈硬化症、心血管疾患、冠動脈性心疾患（ＣＨＤ）、卒中、糸球体壊死、高血圧又は糖尿病である。
【００２１】
本発明は、ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）、即ち、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質を検出又はスクリーニングする方法を提供する。一実施形態では、方法は、ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）、即ち、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質への抗体の結合を可能にする条件下にて生物学的な物質又は試料をＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）、即ち、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質に特異的に結合する抗体と接触させる工程と、ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）、即ち、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質への抗体の結合をアッセイする工程とを含む。ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）、即ち、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質への抗体の結合により、ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）、即ち、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質の存在が検出される。一態様では、ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）、即ち、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質は細胞又は組織上に存在する。別の態様では、生物学的な物質又は試料は哺乳動物被験体から得られる。
【００２２】
本発明は、細胞過剰増殖障害（例えば、新生物、腫瘍若しくは癌又は転移）を有するか、又はそれを有する危険性が高い被験体を診断する方法を更に提供する。一実施形態では、方法は、被験体由来の生物学的な物質又は試料を提供する工程と、ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）、即ち、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質への抗体の結合を可能にする条件下にて生物学的な物質又は試料をＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）、即ち、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質に特異的に結合する抗体と接触させる工程と、ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）、即ち、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質への抗体の結合をアッセイする工程とを含む。ポリペプチドへの抗体の結合により、被験体が新生物、腫瘍若しくは癌又は転移を有するか、又はそれを有する危険性が高いと診断される。一態様では、生物学的な物質又は試料はヒトから得られる。更なる態様では、生物学的な物質又は試料は、生検、例えば、肺、膵臓、胃、乳房、食道、卵巣又は子宮生検を含む。
【００２３】
本発明は、ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）、即ち、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質に特異的に結合する抗体を作製する方法を更に提供する。一実施形態では、方法は、ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）、即ち、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質又はその断片を動物に投与する工程と、ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）、即ち、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質又はその断片に結合する抗体の発現について動物をスクリーニングする工程と、ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）、即ち、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質又はその断片に結合する抗体を産生する動物を選択する工程と、選択動物から抗体を単離する工程とを含む。別の実施形態では、方法は、ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）、即ち、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質又はその断片を、ヒト免疫グロブリンを発現することが可能な動物に投与する工程と、ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）、即ち、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質又はその断片に結合する抗体を産生する動物から脾臓細胞を単離する工程と、脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを作製する工程と、ポリペプチド又はその断片に結合するヒト抗体の発現についてハイブリドーマをスクリーニングする工程とを含む。特定の態様では、ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）、即ち、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質の断片は、Ｎ又はＯ−結合炭水化物部分を有するポリペプチド配列の一部を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ＳＡＭ−６リポトーシス（ｌｉｐｏｐｔｏｔｉｃ）経路である。
【図２】ＳＡＭ−６標的である。
【図３】膜抽出物におけるＳＡＭ−６及び無関連ＩｇＭ対照の代表的なウエスタンブロットである。
【図４】サイズ排除クロマトグラフィ後のクロマトグラムである。
【図５】サイズ排除クロマトグラフィ後のＳＡＭ−６陽性画分のウエスタンブロット分析である。
【図６】サイズ排除クロマトグラフィ後のＳＤＳ−Ｐａｇｅゲルのクーマシー染色である。
【図７】イオン交換クロマトグラフィ後のクロマトグラムである。
【図８】イオン交換クロマトグラフィ後のＳＡＭ−６陽性画分のウエスタンブロット分析である。
【図９】イオン交換クロマトグラフィ後のクーマシーブルー染色である。
【図１０】ＭＡＬＤＩ質量分析によって得られた単離８０ｋＤａ蛋白質のペプチド質量マップである。
【図１１】ヒトＧｒｐ７８に割り当てられた、実験的に決定されたペプチド配列のアラインメント及びヒトＧｒｐ７８／ＢｉＰ［ＮＰ＿００５３３８］の蛋白質配列である。
【図１２】Ｇｒｐ７８−ｓｉＲＮＡトランスフェクトＢＸＰＣ−３細胞におけるＳＡＭ−６結合のＦＡＣＳ分析である。
【図１３】Ｇｒｐ７８−ｓｉＲＮＡトランスフェクトＢＸＰＣ−３細胞におけるＳＡＭ−６結合の分析である。ＳＡＭ−６表面抗原に対して陽性の細胞及び対照（Ｇｒｐ７８及びＣＤ５５）のパーセントが示される。
【図１４】Ｇｒｐ７８−ｓｉＲＮＡトランスフェクトＢＸＰＣ−３細胞に関する細胞死ＥＬＩＳＡである。
【図１５】ウエスタンブロット分析：膵臓癌細胞株ＢＸＰＣ−３の膜抽出物におけるＳＡＭ−６抗体の結合。
【図１６】グリコシダーゼによる処理後の膵臓癌細胞におけるＳＡＭ−６結合である。
【図１７】ＳＡＭ−６エンドサイトーシスの免疫蛍光である。
【図１８】抗体誘導性膵臓癌細胞（ＢＸＰＣ−３）のスダンＩＩＩ染色である。
【図１９】シトクロムＣ放出の測定によるＳＡＭ−６誘導性アポトーシスの分析である。
【図２０】カスパーゼ８、９、３及び６の活性化の測定によるＳＡＭ−６誘導性アポトーシスの分析である。
【図２１】胃癌腫瘍異種移植片増殖のＳＡＭ−６用量依存性阻害である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
詳細な説明
本発明は、ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）と称される糖蛋白質、即ち、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質に少なくとも部分的に基づく。ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質は、変性ゲル電気泳動により決定される約８０〜８２キロダルトン（ＫＤａ）の範囲の見かけ上の分子量を有する。ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質の非限定的で例示的な特徴は、Ｇｒｐ７８と異なる少なくとも１つの窒素（Ｎ）又は酸素（Ｏ）−結合炭水化物部分の結合である。ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質の非限定的で例示的な別の特徴は、ＳＡＭ−６として示される抗体がＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質に特異的に結合することである。
【００２６】
本発明に従って、変性ゲル電気泳動により決定される約８０〜８２キロダルトン（ＫＤａ）の範囲の見かけ上の分子量を有する、ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）として示される単離又は精製糖蛋白質、即ち、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質が提供される。一実施形態では、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質はＧｒｐ７８と異なる少なくとも１つの窒素（Ｎ）又は酸素（Ｏ）−結合炭水化物部分を有する。別の実施形態では、ＳＡＭ−６として示される抗体がＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質に特異的に結合する。
【００２７】
ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質の配列解析により、ＢｉＰ、Ｈｓｐａ５、７０ＫＤａ熱ショック蛋白質５及びＨｓｃｅ７０としても公知であってそのようにも称されるグルコース調節（又は調節された）蛋白質７８（Ｇｒｐ７８）との配列同一性が明らかになった。ヒトＧｒｐ７８／ＢｉＰ配列は図１１に示される通りである（配列番号１）。Ｇｒｐ７８／ＢｉＰ配列と同一であるように思われるＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質の配列は太字体にて示される。従って、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質の非限定的で例示的な別の特徴は、Ｇｒｐ７８に対して少なくとも部分的な配列相同性／同一性である。
【００２８】
本発明に従って、変性ゲル電気泳動により決定される約８０〜８２キロダルトン（ＫＤａ）の範囲の見かけ上の分子量を有する、ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）として示される単離又は精製糖蛋白質、即ち、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質が提供される。一実施形態では、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質は配列番号１に示されるようにＧｒｐ７８とのポリペプチド配列相同性を有する。
【００２９】
種々な非限定的態様において、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質は、約６５５個のアミノ酸の配列を含み、約１７個のアミノ酸の膜貫通ドメインを有し、約２２０個のアミノ酸の細胞外ドメインを有し、又は約４１１個のアミノ酸の細胞内ドメインを有する。他の非限定的態様では、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質は、アミノ酸、例えば、（例えば、配列番号１のように）アスパラギン残基、セリン残基又はトレオニン残基に結合した炭水化物部分を有する。ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質のＯ−グリコシル化の潜在的部位は、配列番号１における下線のトレオニン（Ｔ）残基により示される。
【００３０】
本明細書で用いられるように、「糖蛋白質」という用語は、蛋白質を構成するアミノ酸に共有結合した少なくとも１つの糖部分を有する蛋白質、ポリペプチド又はペプチドを指す。「炭水化物部分」とは、１つ以上の糖残基、例えば、単糖、二糖、三糖などを指す。オリゴ糖及び多糖は炭水化物という用語と同義である。
【００３１】
糖類、炭水化物、オリゴ糖及び多糖は、典型的には、グリコシド結合によってアミノ酸残基に結合される。真核生物では、一連の糖付加及び除去が翻訳後に生じ、糖蛋白質の炭水化物部分を形成する。例示的な糖類は、１つ以上のガラクトース、アセチルガラクトース、マンノース、フコース、グルコース、アセチルグルコース、シアル酸、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン及びノイラミン酸を含む。ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質は、例えば、セリン、トレオニン又はアスパラギンへのＮ又はＯ−結合によって結合した１つ以上のそのような特定の糖類を任意に有している。
【００３２】
ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質とグリコシダーゼ酵素との接触は、炭水化物部分を構成する１つ以上の糖残基の除去により、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質の見かけ上の分子量を減少させることができる。一実施形態では、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質とグリコシダーゼ酵素との接触は、約１〜１０キロダルトン（ＫＤａ）、例えば、約８２ＫＤａから７２ＫＤａに見かけ上の分子量を減少させる。別の実施形態では、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質とＯ−グリコシダーゼとの接触は、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質の見かけ上の分子量を減少させる。当然ながら、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質から除去可能な炭水化物部分（がある場合）の量及びタイプは、特定のグリコシダーゼ酵素の選択に依存し、次に、それがＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質の見かけ上の分子量の減少（がある場合）に影響を与えるということを当業者は理解するであろう。
【００３３】
炭水化物部分の１つ以上の糖類又は炭水化物構造全体を除去することが可能なグリコシダーゼは、典型的にはセリン又はトレオニン残基の酸素（Ｏ）に結合した炭水化物部分を構成する糖類を切断するＯ−グリコシダーゼ、並びに、典型的には、アスパラギン残基の窒素（Ｎ）に結合した炭水化物部分を構成する糖類を切断するＮ−グリコシダーゼを含む。そのようなグリコシダーゼの特定例は、Ｏ−グリコシダーゼ、Ｎ−グリコシダーゼＦ、エンドグリコシダーゼＨ（ｅｎｄｏ  Ｈ）、ノイラミニダーゼ及びフコシダーゼである。Ｏ−グリコシダーゼはセリン又はトレオニン−結合オリゴ糖を切断する。Ｎ−グリコシダーゼＦは、オリゴ糖が最小長のキトビオースコアユニットを有する場合、アスパラギン結合Ｎ−グリカンを切断する。Ｅｎｄｏ  Ｈは、Ｎ−結合糖蛋白質から高マンノースのキトビオースコア内及び一部のハイブリッドオリゴ糖を切断するグリコシダーゼである。ノイラミニダーゼは末端アシルノイラミン酸残基を除去する。フコシダーゼは、例えば、ラクトース及び複合炭水化物からフコースを除去する。そのようなグリコシダーゼは、典型的には、切断される糖結合の点から少なくともある程度の特異性を有し、炭水化物部分がＯ又はＮ−結合であるにしても、従って、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質の炭水化物部分の組成及び構造を特徴づけるために用いられうる。
【００３４】
一団の炭水化物がＳＡＭ−６抗体の結合についてスクリーニングされた。具体的には、（ＧｌｃＮＡｃ）２、Ｍａｎ３、ｓＴｎ、ＧＭ４、Ｌａｃ−ジ−Ｎａｃ、β−Ｄ−ガラクトース−３−サルフェート、Ｈ３型、Ｎｅｕ５Ａｃ６Ｇａｌ、ＧｌｃＮａｃβ３Ｇａｌ、α−Ｎ−アセチルノイラミン酸、３’−ＳＬ、Ａｔｒｉ、Ｔｋ、３’ＳＬＮ、ｓＬｅａ、Ｂｔｒｉ、ＧＡ１Ｐｋ、Ｇｂ３、ｓＬｅｘ、Ａｄｉ、Ａ２型、Ｔαβ、６’−ＳＬ、Ｂｄｉ、Ｂ２型、Ｇａｌβ３Ｇａｌ、Ｔββ、Ｈ２型、Ｇａｌａ１−３’Ｌａｃ、Ｌｅａ３’−Ｏ−ｓｕ−Ｌｅａ、６’−Ｏ−ｓｕ−ＬａｃＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃβｌ−２’ＴＦ、Ｌｅｂ、３’−Ｏ−ｓｕ−Ｌｅｘ、Ｈｄｉ、Ｇａｌα４ＧｌｃＮＡｃ、Ｌｅｄ（Ｈ１型）、３’−ｓｕ−ＬａｃＮＡｃ、３’−Ｏ−ｓｕ−ＴＦ、β−Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｌｅｃ、３’−ｓｕ−Ｌｅｃ、ＧｌｃＮＡｃβ１−３’ＬａｃＮＡｃ、マルトース、Ｌｅｘ、メリビオース、ジ−ＧａｌＮＡｃβ、α−Ｄ−グルコース、Ｌｅｙ、Ｇａｌαｌ−３’ＬａｃＮＡｃ、３’−ＳｉａＴＦ、β−Ｄ−グルコース、Ｌａｃ、ＧｌｃＮＡｃα１−３’ＴＦ、コア３、α−Ｄ−ガラクトース、ＬａｃＮＡｃ、（Ｓｉａ）２、コア６、β−Ｄ−ガラクトース、ＴＦ、（Ｓｉａ）３、コア４、α−Ｄ−マンノース、Ｆｕｃα３ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃβ１−３’ＴＦ、３，６−ＳｉａＴＦ、α−Ｄ−マンノース−６−ホスフェート、Ｆｕｃα４ＧｌｃＮＡｃ  Ｌｅ、Ｇａｌ２βＧａｌ、６−ＳｉａＴＦ、α−Ｌ−フコース、Ｆｓ−２、６−Ｏ−ｓｕ−ＬａｃＮＡｃ、ＹＤＳ、β−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、コア５、コア２、９−ＯＳ、α−Ｎ−アセチル−Ｄ−ｇｌａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ（Ｔｎ）、Ｔαα、Ｈ４型、７−ＯＳ、β−Ｎ−アセチル−Ｄ−ｇｌａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ、３’−ＳｉａＬｅｃ、ＬＮＴ、３，６−ＳｉａＴｎ、β−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン−６−サルフェート、Ｇａｌα２Ｇａｌ、ＬＮｎＴ及び３−ＳｉａＴｎがすべて、ＳＡＭ−６抗体への結合についてスクリーニングされた。ＳＡＭ−６抗体はこれらの炭水化物のいずれにも検出可能に結合しなかった。従って、本発明のＳＡＭ−６抗体は、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質に結合するが１つ以上の前述の炭水化物に結合しない抗体を含む。
【００３５】
ＳＡＭ−６として示される抗体がＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質に結合する実施形態では、ＳＡＭ−６抗体は炭水化物部分（例えば、Ｎ又はＯ−結合炭水化物部分）を含むＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質の少なくとも一部に結合する。Ｏ−グリコシダーゼ酵素によるＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質の処理では、おそらく、ＳＡＭ−６／Ｒ抗体結合エピトープを構成する１つ、複数又はすべての糖（類）の除去により、該糖蛋白質へのＳＡＭ−６／Ｒ抗体の結合は低減した（図１６）。Ｎ−グリコシダーゼＦ酵素によるＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質の処理では、該糖蛋白質へのＳＡＭ−６／Ｒ抗体の結合を破壊しなかった（図１６）。従って、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質へのＳＡＭ−６抗体の結合は、Ｎ−結合炭水化物部分ではなく、Ｏ−結合炭水化物部分を必要とし、又はそれにより媒介されるように思われる。従って、ＳＡＭ−６／ＲへのＳＡＭ−６結合は、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質のＯ−結合炭水化物部分を構成する１つ以上の糖類を少なくとも部分的に必要とし、又はそれにより媒介され得、一方、ＳＡＭ−６／ＲへのＳＡＭ−６結合は、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質のＮ−結合炭水化物部分を必要としないように思われる。
【００３６】
「ＳＡＭ−６」又は「ＳＡＭ−６抗体」という用語は、軽鎖可変領域配列（配列番号１３）及び重鎖可変領域配列（配列番号１５）を有するヒトＩｇＭ抗体を指す。「ＳＡＭ−６」又は「ＳＡＭ−６抗体」はＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質に特異的に結合する。Ｏ−グリコシダーゼによるＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質の処理後に認められるＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質へのＳＡＭ−６結合の低減により示されるように、ＳＡＭ−６はＯ−結合炭水化物部分を含むＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質の領域に結合するように思われ、又はＯ−結合炭水化物部分自体に結合する。Ｎ−グリコシダーゼＦによるＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質の処理後のＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質へのＳＡＭ−６結合の維持により示されるように、ＳＡＭ−６はＮ−結合炭水化物部分を含むＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質の領域に結合しないように思われる。ＳＡＭ−６は低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ又はｏｘＬＤＬ）に結合することも示されている。
【００３７】
相補性決定領域（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）を含むＳＡＭ−６軽鎖及び重鎖可変領域のアミノ酸及び核酸配列が以下のように示される。
【００３８】
ＳＡＭ−６抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列（配列番号１３）：
【００３９】
【化１】
2010510772.tif 000002
ＳＡＭ−６抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）のヌクレオチド配列（配列番号１４）：
【００４０】
【化２】
2010510772.tif 000003
ＳＡＭ−６抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列（配列番号１５）：
【００４１】
【化３】
2010510772.tif 000004
ＳＡＭ−６抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）のヌクレオチド配列（配列番号１６）：
【００４２】
【化４−１】
2010510772.tif 000005
【００４３】
【化４−２】
2010510772.tif 000006
特定の実施形態では、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質は、過剰増殖細胞、例えば、新生細胞、癌細胞又は腫瘍細胞上に発現すると特徴づけられる。ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質が検出されている新生細胞、癌細胞又は腫瘍細胞の非限定例は、例えば、食道、胃、乳房、肺、結腸、膵臓、前立腺、子宮及び卵巣を含む。より特定の態様では、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質は、ＢＸＰＣ−３（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ−１６８７；米国バージニア州２０１０８マナッサス（Ｍａｎａｓｓａｓ）、私書箱１５４９）及び２３１３２／８７（ＤＳＭＺ寄託番号ＡＣＣ２０１；Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）、ドイツＢｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ３８１２４，Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｓｅ  ７Ｂ）として示される腫瘍細胞株上に発現すると特徴づけられる。
【００４４】
本発明に従って、変性ゲル電気泳動により決定される約８０〜８２キロダルトン（ＫＤａ）の範囲の見かけ上の分子量を有する、ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）として示される単離又は精製糖蛋白質、即ち、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質が提供され、これは、配列番号１との少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又はそれより多くの、或いはそのようなパーセント値以内又はそれを包含する任意の数値若しくは範囲の同一性を任意に有する。一実施形態では、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質は、配列番号１に示されるように、Ｇｒｐ７８配列の全部又は一部と同一のポリペプチド配列を有する。特定の態様では、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質は、１つ以上の以下のアミノ酸配列（配列番号２〜１２）の全部又は一部と同一のポリペプチド配列を有する：
【００４５】
【化５】
2010510772.tif 000007
又は
【００４６】
【化６】
2010510772.tif 000008
別の実施形態では、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質は、Ｇｒｐ７８炭水化物部分と異なる、これに結合した炭水化物部分を有する。特定の態様では、該炭水化物部分はＮ−結合又はＯ−結合部分である。
【００４７】
「同一」又は「同一性」という用語は、２つ以上の言及物が同じであるということである。従って、２つの蛋白質配列が同一である場合、それらは少なくとも言及領域又は部分内にて同じアミノ酸配列を有する。２つの核酸が同一である場合、それらは少なくとも言及領域又は部分内にて同じポリヌクレオチド配列を有する。「同一性の領域」とは、同じである２つ以上の言及物の部分を指す。従って、２つの蛋白質又は核酸配列が１つ以上の配列領域にわたって同一である場合、それらはその領域内にて同一性を共有する。
【００４８】
「相同」又は「相同性」という用語は、２つ以上の言及物が所与の領域又は部分にわたって少なくとも部分的な同一性を共有することを意味する。「実質的な相同性」とは、分子が基準分子の１つ以上の構造若しくは機能（例えば、生物学的機能）の少なくとも部分的な構造若しくは機能、又は相同性を共有する基準分子の関連／対応領域若しくは部分を有し、或いは有すると予測されるように、該分子が構造的且つ機能的に保存されることを意味する。例示的な相同性は、基準ポリペプチドとの５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又はそれより多くの配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドである。実質的な相同性を有するポリペプチドは、基準ポリペプチドと同様の少なくとも部分的な活性を有し、又は有すると予測される。例えば、特定の実施形態では、ＳＡＭ−６への少なくとも部分的な結合を保持する１つ以上の修飾（例えば、炭水化物部分又はアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有するＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質は、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質との実質的な相同性を有するとみなされる。
【００４９】
「蛋白質」、「ポリペプチド」及び「ペプチド」という用語は、アミド結合又は等価物によって共有結合した２つ以上のアミノ酸又は「残基」を指すために、本明細書で互換的に用いられる。ポリペプチドは種々の長さでよく、アミノ酸は、例えば、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、二官能性マレイミド又はＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）により形成されるものを含む非天然及び非アミド化学結合によって結合されうる。非アミド結合は、例えば、ケトメチレン、アミノメチレン、オレフィン、エーテル、チオエーテルなどを含む（例えば、Ｓｐａｔｏｌａ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ中、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、第７巻、２６７〜３５７頁（１９８３）、“Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｃｋｅｒ社、ニューヨーク参照）。
【００５０】
組成物の修飾因子として用いられる「単離」という用語は、該組成物がヒトの手によって作製され、又は天然のインビボ環境における１つ以上の他の構成要素から分離されるということである。一般的に、そのように分離される組成物は、通常、それらが本来関連する１つ以上の物質、例えば、１つ以上の蛋白質、核酸、脂質、炭水化物、細胞膜を実質的に含まない。従って、単離組成物は、組成物が天然に生じる生物の細胞における他の生物学的要素から、又はそれが産生される（例えば、合成的に、又は細胞培養を通じて）人工培地から実質的に分離される。例えば、単離ポリペプチドは、他のポリペプチド及び核酸から実質的に分離され、何百万ものポリペプチド又は核酸配列の間に存在するポリペプチド又はポリヌクレオチドのライブラリー、例えば、ポリペプチド、ゲノム又はｃＤＮＡライブラリーを含まない。単離核酸は、他のポリペプチド及び核酸から実質的に分離され、何百万ものポリペプチド又は核酸配列の間に存在するポリペプチド又はポリヌクレオチドのライブラリー、例えば、ポリペプチド、ゲノム又はｃＤＮＡライブラリーを含まない。「単離」という用語は組成物の代替物理形態を除外せず、例えば、単離蛋白質は蛋白質多量体、翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、リン酸化）又は誘導体化形態を含みうる。
【００５１】
組成物の修飾因子として用いられる「精製」という用語は、典型的には、本来関連する物質の大部分又は全部を含まない組成物を指す。従って、細胞から分離される蛋白質は、標準的方法によって細胞構成要素から分離される場合、実質的に精製されるとみなされるとともに、化学合成核酸配列は、その化学的前駆体から分離される場合、実質的に精製されるとみなされる。従って、精製は絶対純度を必要としない。更に、「精製」組成物は１つ以上の他の分子と結合されうる。従って、「精製」という用語は組成物の組合せを除外しない。
【００５２】
「精製」蛋白質及び核酸は標準的精製法によって生成される蛋白質及び核酸を含む。該用語は宿主細胞における組換え発現及び化学合成によって生成される蛋白質及び核酸も含む。「精製」は、汚染物質レベルがヒト又は非ヒト動物への投与について規制当局、例えば、米食品医薬品局（ＦＤＡ）にとって許容可能なレベル以下である組成物も指しうる。
【００５３】
実質的な純度は分子の少なくとも約６０質量％以上でよい。純度は約７０％又は８０％以上でもよく、それを超える、例えば、９０％以上であってよい。純度は、例えば、医薬担体においてより低くてよく、重量％で分子の量は６０％未満でよいが、通常、それが関連する他の構成要素と比べた分子の相対的比率はより高い。純度は、例えば、ＵＶ分光法、クロマトグラフィ（例えば、ＨＰＬＣ、気相）、ゲル電気泳動（例えば、銀又はクーマシー染色）及び配列解析（ペプチド及び核酸）を含む任意の適切な方法によって求められうる。
【００５４】
ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質は悪性及び非悪性新生物、腫瘍及び癌細胞上に発現する。例えば、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質は悪性及び非悪性胃組織、肺扁平上皮癌、肺腺癌、黒色腫及び鼻癌細胞上に発現する。
【００５５】
ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質は種々の病期及びグレードにおける腫瘍にも発現する。例えば、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質は、肺扁平上皮癌及び腺癌のＩＡ、ＩＢ、ＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ及びＩＶ期並びにＧ１、Ｇ２及びＧ３グレードのすべてにおいて検出された。
【００５６】
ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質は更に腫瘍転移において発現する。例えば、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質は肺扁平上皮癌及び腺癌のリンパ節及び脳への転移において検出され、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質は乳癌（浸潤性乳管癌）のリンパ節への転移において検出され、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質は結腸腺癌の肝臓及びリンパ節への転移において検出され、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質は胃腺癌（腸管及びびまん性）のリンパ節への転移において検出され、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質は膵臓腺癌のリンパ節への転移において検出され、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質は頭頸部扁平上皮癌のリンパ節への転移において検出され、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質は黒色腫の直腸、食道、皮膚、耳下腺、結腸、副腎及び鼻上皮への転移において検出された。
【００５７】
ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質は更に腫瘍細胞株において発現する。例えば、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質は、ＢＸＰＣ−３（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ−１６８７；米国バージニア州２０１０８マナッサス（Ｍａｎａｓｓａｓ）、私書箱１５４９）２３１３２／８７（ＤＳＭＺ寄託番号ＡＣＣ２０１；Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）、ドイツＢｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ３８１２４，Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｓｅ  ７Ｂ）黒色腫細胞株ＣＲＬ１４２４及びＨＴＢ−６９並びに鼻癌細胞（ＲＰＭＩ２６５０）として示される腫瘍細胞株上に発現する。単離又は精製ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質は、本明細書で開示され、又は当該技術分野において公知の精製法を用いて、これらの腫瘍、転移、細胞株及び他の細胞（一次分離株又は継代若しくは不死化細胞株）から得ることができる。
【００５８】
本発明に従って、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質及びＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質の免疫原性部分配列並びにＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質を発現する細胞に特異的に結合する抗体が提供される。そのようなＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質抗体は、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質に特異的に結合する抗体、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質に結合した炭水化物部分を含むエピトープに特異的に結合する抗体及びＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質に結合した炭水化物部分に特異的に結合する抗体を含む。
【００５９】
ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質は典型的には非癌細胞上で発現されない。例えば、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質は、副腎、小脳、大脳、下垂体、乳房、結腸、食道、心臓、腎臓、肝臓、肺、骨格筋、中皮（ｍｅｓｏｔｈｉｌｅａｌ）、末梢神経、坐骨神経、三叉神経（ｔｒｉｇｅｍｉｎａｌ  ｎｅｒｖｅｗ）、卵巣、膵臓、胎盤、前立腺、唾液腺、皮膚、小腸、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、扁桃腺、子宮、子宮頸部又は骨髄由来の新鮮凍結（ＦＤＡ基準）正常ヒト組織上に検出されなかった。ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質は、リンパ球、顆粒球、ヒト線維芽細胞及び正常鼻細胞（ＨＮＥＰＣ）上にも検出されなかった。従って、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質に特異的に結合する抗体は、１つ以上の前述の正常ヒト組織型、得られる細胞又はそのような正常ヒト組織型を代表するとみなされるものやリンパ球、顆粒球、ヒト線維芽細胞又は正常鼻細胞（ＨＮＥＰＣ）にも結合しないと予期される。
【００６０】
ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質に特異的に結合する抗体は、単離抗体、精製抗体及び抗体部分配列を含む。一実施形態では、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質の細胞外ドメインに結合する抗体が提供される。別の実施形態では、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質の少なくとも１つのＮ又はＯ−結合炭水化物部分を含むエピトープに特異的に結合する抗体が提供される。更なる実施形態では、Ｇｒｐ７８と異なる、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質に結合した炭水化物部分に結合する抗体が提供される。更なる実施形態では、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質に特異的に結合するが、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質がグリコシダーゼと接触した後に結合の低減を示す抗体が提供される。一態様では、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質のＯ−グリコシダーゼ処理は、ＳＡＭ−６／Ｒへの抗体の結合を低減又は破壊する。別の態様では、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質のＮ−グリコシダーゼＦ処理は、ＳＡＭ−６／Ｒへの抗体の結合を低減又は破壊しない。更に別の実施形態では、抗体はＬＤＬ又はｏｘＬＤＬに結合する。なお更なる実施形態では、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質のＮ又はＯ−結合炭水化物部分を含むエピトープに結合しない抗体が提供される。
【００６１】
ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質に特異的に結合する本発明の抗体はＳＡＭ−６抗体と異なる。例えば、本発明の抗体は、本明細書で示されるＳＡＭ−６抗体の重鎖及び軽鎖可変領域配列と同一の重鎖及び軽鎖可変領域配列を有さない。本発明の抗体は、ＳＡＭ−６抗体の重鎖又は軽鎖可変配列と同一の重鎖又は軽鎖可変配列を有さない抗体も含む。本発明の抗体は、ＳＡＭ−６の重鎖又は軽鎖可変配列の１〜３又は３〜５、５〜７又は７〜１０個のアミノ酸置換を有さない抗体を更に含む。本発明の抗体は、ＳＡＭ−６抗体の重鎖若しくは軽鎖可変領域配列（又はそのような重鎖若しくは軽鎖可変領域配列内の１つ以上のＣＤＲ）との９０％〜９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれを超える（例えば、１００％）の、或いはそのようなパーセント値以内の、又はそれを包含する任意の数値若しくは範囲の同一性を有さない抗体を更に含む。
【００６２】
特定の実施形態では、本明細書で定義されるＳＡＭ−６抗体と異なるＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質に特異的に結合する抗体は、重鎖可変領域配列又は以下のように示される重鎖可変領域アミノ酸配列（配列番号１８）内の第３のＣＤＲ（ＣＤＲ３；ＡＲＤＲＬＡＶＡＧＲＰＦＤＹ；配列番号１７）に対する１００％の同一性を有する重鎖配列を有する。
【００６３】
【化７】
2010510772.tif 000009
本発明の抗体は、ＳＡＭ−６抗体の１つ以上の活性又は機能を有する抗体を含む。一実施形態では、抗体はＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質を発現している細胞に特異的に結合する。別の実施形態では、抗体は、対応する非新生物、非腫瘍若しくは非癌又は非転移細胞より強い新生物、腫瘍若しくは癌又は転移細胞への結合を示す。更なる実施形態では、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質を発現している細胞へのＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質抗体の結合は、細胞成長若しくは増殖を阻害又は低減し、或いは細胞の死滅、溶解若しくはアポトーシスを刺激又は誘導する。
【００６４】
抗体が結合するＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質を発現する非限定的細胞は、悪性及び非悪性胃組織細胞、任意の病期（例えば、ＩＡ、ＩＢ、ＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ又はＩＶ期）又はグレード（例えば、Ｇ１、Ｇ２又はＧ３グレード）の肺扁平上皮細胞癌、肺腺癌細胞、黒色腫及び鼻癌細胞を含む。抗体が結合するＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質を発現する更なる非限定的細胞は、腫瘍転移、例えば、肺扁平上皮癌及び腺癌のリンパ節及び脳への転移；乳癌（浸潤性乳管癌）のリンパ節への転移；結腸腺癌の肝臓及びリンパ節への転移を含み、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質は胃腺癌（腸管及びびまん性）のリンパ節への転移；膵臓腺癌のリンパ節への転移；頭頸部扁平上皮癌のリンパ節への転移；並びに黒色腫の直腸、食道、皮膚、耳下腺、結腸、副腎及び鼻上皮への転移において検出された。
【００６５】
抗体が結合するＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質を発現する更なる非限定的細胞は、腫瘍細胞株、例えば、ＢＸＰＣ−３（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ−１６８７；米国バージニア州２０１０８マナッサス（Ｍａｎａｓｓａｓ）、私書箱１５４９）、２３１３２／８７（ＤＳＭＺ寄託番号ＡＣＣ２０１；Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）、ドイツＢｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ３８１２４，Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｓｅ  ７Ｂ）、黒色腫細胞ＣＲＬ１４２４及びＨＴＢ−６９並びに鼻癌細胞ＲＰＭＩ２６５０を含む。
【００６６】
従って、更なる実施形態では、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質を発現している新生物、腫瘍若しくは癌又は転移細胞へのＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質抗体の結合は、細胞成長若しくは増殖を阻害又は低減し、或いは細胞死、溶解若しくはアポトーシスを刺激又は誘導する。更に別の実施形態では、ＢＸＰＣ−３、２３１３２／８７、ＣＲＬ１４２４、ＨＴＢ−６９又はＲＰＭＩ２６５０細胞へのＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質抗体の結合は、ＢＸＰＣ−３、２３１３２／８７、ＣＲＬ１４２４、ＨＴＢ−６９又はＲＰＭＩ２６５０細胞の成長又は増殖を阻害又は低減し、或いはＢＸＰＣ−３、２３１３２／８７、ＣＲＬ１４２４、ＨＴＢ−６９又はＲＰＭＩ２６５０細胞の死滅、溶解又はアポトーシスを刺激又は誘導する。特定の態様では、細胞成長又は増殖は、対照（未処理）細胞に対して少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％若しくはそれを超える、或いはそのようなパーセント値以内の、又はそれを包含する任意の数値若しくは範囲にて阻害又は低減される。更なる特定の態様では、細胞死、溶解又はアポトーシスは、対照（未処理）細胞に対して少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％若しくはそれを超える、或いはそのようなパーセント値以内の、又はそれを包含する任意の数値若しくは範囲である。なお更なる実施形態では、該糖蛋白質を発現している細胞への抗体の結合は、カスパーゼ（例えば、カスパーゼ３、カスパーゼ８又はカスパーゼ９）の活性化を生じさせる。
【００６７】
本発明の抗体はポリクローナル及びモノクローナル抗体を含む。抗体に関連して用いられる場合、「モノクローナル」という用語は、任意の真核生物、原核生物又はファージクローンを含む単一クローンに基づくか、該単一クローンから得られるか、或いは単一クローンに由来する抗体を指す。従って、「モノクローナル」抗体は、それが作製される方法ではなく、構造的に本明細書で定義される。
【００６８】
本発明の抗体は任意の抗体クラスＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ又はサブクラスに属しうる。ＩｇＧの例示的なサブクラスはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４である。
【００６９】
本発明の抗体は、天然抗体のように完全長のカッパ若しくはラムダ軽鎖配列、その混合物（即ち、カッパ及びラムダ鎖配列の融合）又はその部分配列／断片を有しうる。天然抗体分子は２本のカッパ又は２本のラムダ軽鎖を含む。カッパ軽鎖とラムダ軽鎖との主な相違は定常領域の配列にある。
【００７０】
本発明に従って、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質に特異的に結合し、且つＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質へのＳＡＭ−６の結合に対して部分的又は完全に競合する抗体が提供される。一実施形態では、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質へのＳＡＭ−６の結合を阻害する抗体が提供される。種々の態様において、該抗体はＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質へのＳＡＭ−６の結合の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれを超える、或いはそのようなパーセント値以内の、又はそれを包含する任意の数値若しくは範囲にて競合的に阻害する。別の実施形態では、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質へのＳＡＭ−６の結合を阻止又はブロックする抗体が提供される。
【００７１】
ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質へのＳＡＭ−６抗体の結合に対して競合する本発明の抗体は、ＳＡＭ−６抗体の結合特異性を有しうる。従って、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質への結合に対してＳＡＭ−６抗体と競合するＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質抗体は、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質に結合した炭水化物部分を含むエピトープ又はＳＡＭ−６抗体が結合するＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質に結合した炭水化物部分に特異的に結合することができる。ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質抗体は、ＬＤＬ又はｏｘＬＤＬへの結合に対してもＳＡＭ−６抗体と競合することができる場合もある。従って、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質に特異的に結合し、且つＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質又はＬＤＬ若しくはｏｘＬＤＬへのＳＡＭ−６の結合に対して部分的又は完全に競合する抗体が提供され、ＳＡＭ−６抗体と同じエピトープ、同じエピトープの一部又は炭水化物部分に結合する抗体を含む。
【００７２】
抗体のＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質へのＳＡＭ−６抗体の結合に対して競合するＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質抗体は、従来の競合結合アッセイを用いてスクリーニング及び同定することができる。スクリーニングされた抗体は、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質又はＬＤＬ若しくはｏｘＬＤＬへのＳＡＭ−６の結合に対して競合する能力に基づいて選択される。ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質へのＳＡＭ−６の結合に対して競合し、或いはＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質又はＬＤＬ若しくはｏｘＬＤＬへのＳＡＭ−６の結合を阻止又はブロックする抗体能は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を含めた当該技術分野において公知の種々のアッセイにより求めることができる。
【００７３】
本発明の抗体はＳＡＭ−６抗体の結合親和性を有する抗体を含む。そのような抗体の結合親和性はＳＡＭ−６抗体と異なっていてよく（即ち、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質、ＬＤＬ又はｏｘＬＤＬに対するより高い又は低い親和性を有する）、従って、該抗体はＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質、ＬＤＬ又はｏｘＬＤＬへの結合に対して競合する能力に多様性がありうる。従って、本発明の抗体は、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質、ＬＤＬ又はｏｘＬＤＬに対する、ＳＡＭ−６抗体より高い又は低い親和性を有する抗体を含む。例えば、本発明のＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質抗体は、基準抗体（例えば、ＳＡＭ−６抗体）と比べて、２〜５、５〜１０、１０〜１００、１００〜１０００若しくは１０００〜１０，０００倍を超える又は未満の親和性或いはそのような値以内の、又はそれを包含する任意の数値若しくは範囲の親和性を有しうる。具体的な非限定的ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質抗体は、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質、ＬＤＬ又はｏｘＬＤＬに対するＳＡＭ−６の結合親和性の約１〜５，０００倍以内のＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質、ＬＤＬ又はｏｘＬＤＬに対する結合親和性を有する。更なる具体的な非限定的抗体は、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質、ＬＤＬ又はｏｘＬＤＬに対するＳＡＭ−６のＫｄ約１０−２Ｍ〜Ｋｄ約１０−１５Ｍ以内、又はＫｄ約１０−６Ｍ〜Ｋｄ約１０−１２Ｍ以内或いはそのような値以内の、又はそれを包含する任意の数値若しくは範囲のＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質、ＬＤＬ又はｏｘＬＤＬに対する結合親和性を有する。より詳細な実施形態では、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ及び１０−１５Ｍ或いはそのような値以内の、又はそれを包含する任意の数値若しくは範囲未満の解離定数（ＫＤ）を有するＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質、ＬＤＬ又はｏｘＬＤＬに対する結合親和性を有する。
【００７４】
結合親和性は会合（Ｋａ）及び解離（Ｋｄ）速度により求めることができる。平衡親和定数ＫＤはＫａ／Ｋｄ比である。会合（Ｋａ）及び解離（Ｋｄ）速度は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（Ｒｉｃｈ及びＭｙｓｚｋａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１：５４（２０００）；Ｅｎｇｌｅｂｉｅｎｎｅ，Ａｎａｌｙｓｔ．１２３：１５９９（１９９８））を用いて測定することができる。結合速度のリアルタイム検出及びモニタリングのための器具類及び方法は公知であり、市販されている（ＢｉａＣｏｒｅ  ２０００，Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、スウェーデンＵｐｓａｌａ；及びＭａｌｍｑｖｉｓｔ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２７：３３５（１９９９））。ＫＤ値はＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質における結合部位の半分（５０％）を満たすのに必要な抗体濃度と定義されうる。
【００７５】
ポリクローナル及びモノクローナル抗体を作製する方法は当該技術分野において公知である。例えば、任意に、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）若しくはオボアルブミン（例えば、ＢＳＡ）などの担体にコンジュゲートされ、又はフロイント完全若しくは不完全アジュバントなどのアジュバントと混合されたＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質若しくはその免疫原性断片が、動物を免疫化するために用いられる。従来のハイブリドーマ技術を用いてＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質に応答する免疫化動物由来の脾臓細胞が単離され、骨髄腫細胞と融合されうる。そのハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体は、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質又はその免疫原性断片との反応性についてスクリーニングされうる。
【００７６】
免疫化されうる動物は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ若しくは去勢ウシ、テンジクネズミ又は霊長動物を含む。初回及び任意のその後の免疫化は、静脈内、腹腔内、筋肉内又は皮下経路を通じうる。その後の免疫化は同じ又は異なる濃度のＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質調製物であってよく、一定又は不規則間隔であってよい。
【００７７】
動物はヒトＩｇＧ遺伝子座を含むように遺伝子操作された動物を含み、従って、それはヒト抗体を産生するために用いられうる。内因性免疫グロブリンを発現しない１つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニック動物が、例えば、米国特許第５，９３９，５９８号に述べられている。ヒトポリクローナル抗体及びヒトモノクローナル抗体を作製する更なる方法について述べられている（例えば、Ｋｕｒｏｉｗａら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：８８９（２００２）；ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９６／３４０９６；ＷＯ９６／３３７３５；米国特許第５，４１３，９２３号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，５６９，８２５号；第５，６６１，０１６号；第５，５４５，８０６号；第５，８１４，３１８号；第５，８８５，７９３号；第５，９１６，７７１号；及び第５，９３９，５９８号参照）。ヒト抗体を作製する技術の概要が、Ｌｏｎｂｅｒｇ及びＨｕｓｚａｒ（Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５（１９９５））に述べられている。
【００７８】
ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質抗体は、ハイブリドーマ、組換え及びファージ提示技術又はその組合せを含む他の技法を用いて作製することもできる（米国特許第４，９０２，６１４号、第４，５４３，４３９号及び第４，４１１，９９３号参照；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ社、Ｋｅｎｎｅｔｔ，ＭｃＫｅａｒｎ及びＢｅｃｈｔｏｌ（編）、１９８０、並びにＨａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ社、第２版、１９８８も参照されたい）。
【００７９】
ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質抗体は、例えば、ＣＤＲ移植（欧州特許第２３９，４００号；Ｗ０９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；第５，５３０，１０１号；及び第５，５８５，０８９号）、化粧張り（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）若しくは表面再建（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（欧州特許第５９２，１０６号；欧州特許第５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９（１９９１）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７：８０５（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：９６９（１９９４））及び鎖シャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）を含む、当該技術分野において公知の種々の技法を用いてヒト化することができる。ヒトコンセンサス配列（Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１６９（１９９４）；及びＰａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９（１９９１））は、ヒト化抗体を作製するために既に用いられている（Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４２８５（１９９２）；及びＰｒｅｓｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３（１９９３））。
【００８０】
キメラ抗体を作製する方法は当該技術分野において公知である（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１（１９８９）；並びに米国特許第５，８０７，７１５号；第４，８１６，５６７号；及び第４，８１６，３９７号）。１つの種の抗体由来の可変ドメインが別の種の可変ドメインの代わりに用いられるキメラ抗体が、例えば、Ｍｕｎｒｏ，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：５９７（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４（１９８４）；Ｓｈａｒｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３０９：３６４（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１（１９８４）；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６４３（１９８４）；Ｃａｐｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３７：５２５（１９８９）；及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３９：６８（１９８９）に述べられている。
【００８１】
抗体法において更に用いられうる好適な技法は、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質ベースの親和性精製、非変性ゲル精製、ＨＰＬＣ若しくはＲＰ−ＨＰＬＣ、サイズ排除、プロテインＡカラムにおける精製又はこれらの技法の任意の組合せを含む。抗体のアイソタイプはＥＬＩＳＡアッセイを用いて決定することができ、例えば、ヒトＩｇはマウスＩｇ吸着抗ヒトＩｇを用いて同定することができる。
【００８２】
抗体を作製するのに好適なＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質は、当該技術分野において公知の任意の種々の標準の蛋白質精製又は組換え発現技術によって作製することができる。例えば、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質は、ＢＸＰＣ−３細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ−１６８７；米国バージニア州２０１０８マナッサス（Ｍａｎａｓｓａｓ）、私書箱１５４９）又は２３１３２／８７細胞（ＤＳＭＺ寄託番号ＡＣＣ２０１；Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）、ドイツＢｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ３８１２４，Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｓｅ  ７Ｂ）などの細胞から得ることができる。
【００８３】
免疫応答を生じさせるのに好適なＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質の形態は、完全長ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質のペプチド部分配列、例えば、少なくとも１つのＮ若しくはＯ−結合炭水化物部分を有する免疫原性断片又はＳＡＭ−６抗体に結合する免疫原性断片を含む。ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質の更なる形態は、調製物又は細胞抽出物若しくは分画を含むＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質、部分的に精製されたＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質並びにＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質を発現する全細胞又はそのようなＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質発現細胞の調製物を含む。
【００８４】
本発明に従って、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質に特異的に結合する抗体を作製する方法が更に提供される。一実施形態では、方法は、変性ゲル電気泳動により決定される約８０〜８２キロダルトン（ｋＤａ）の範囲の分子量を有し、少なくとも１つのＯ−結合炭水化物部分を有し、且つＧｒｐ７８に対して少なくとも部分的な配列相同性を有するポリペプチド又はその断片を動物に投与する工程と、該ポリペプチドに結合する抗体の発現について該動物をスクリーニングする工程と、該ポリペプチドに結合する抗体を産生する動物を選択する工程と、該選択動物から抗体を単離する工程とを含む。別の実施形態では、方法は、変性ゲル電気泳動により決定される約８０〜８２キロダルトン（ｋＤａ）の範囲の見かけ上の分子量を有し、少なくとも１つのＮ又はＯ−結合炭水化物部分を有し、且つＧｒｐ７８に対して少なくとも部分的な配列相同性を有するポリペプチド又はその断片を動物に投与する工程と、該ポリペプチドに結合する抗体の発現について該動物をスクリーニングする工程と、該ポリペプチドに結合する抗体を産生する動物を選択する工程と、該選択動物から抗体を単離する工程とを含む。更なる実施形態では、方法は、変性ゲル電気泳動により決定される約８０〜８２キロダルトン（ｋＤａ）の範囲の見かけ上の分子量を有し、少なくとも１つのＮ又はＯ−結合炭水化物部分を有し、且つＧｒｐ７８に対して少なくとも部分的な配列相同性を有するポリペプチド又はその断片を、ヒト免疫グロブリンを発現することが可能な動物に投与する工程と、該ポリペプチド又はその断片に結合する抗体を産生する動物から脾臓細胞を単離する工程と、該脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを作製する工程と、変性ゲル電気泳動により決定される約８０〜８２キロダルトン（ｋＤａ）の範囲の見かけ上の分子量を有し、少なくとも１つのＮ又はＯ−結合炭水化物部分を有し、且つＧｒｐ７８に対して少なくとも部分的な配列相同性を有するポリペプチド又はその断片に結合する抗体の発現について該ハイブリドーマをスクリーニングする工程とを含む。種々の態様において、該ポリペプチド断片はＮ又はＯ−結合炭水化物部分を有するポリペプチドの一部を含む。
【００８５】
本発明の方法は、ＳＡＭ−６抗体の１つ以上の機能又は活性を有する、ＳＡＭ−６抗体と異なる抗体を作製する工程を含む。例示的な機能又は活性は、例えば、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質（例えば、細胞外ドメイン）への結合；ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質の炭水化物部分を含むエピトープ又はＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質の免疫原性断片への結合；ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質へのＳＡＭ−６抗体の結合に対する競合；ＬＤＬ又はｏｘＬＤＬへの結合；ＬＤＬ又はｏｘＬＤＬへのＳＡＭ−６抗体の結合に対する競合；ＳＡＭ−６抗体の結合親和性（例えば、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質に対するより高い又は低い親和性）の具有、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質を発現している細胞への結合；ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質を発現している細胞への結合並びに細胞成長若しくは増殖の低減又は該細胞（例えば、新生物、腫瘍若しくは癌又は転移細胞）の死滅、溶解若しくはアポトーシスの刺激若しくは誘導；ＢＸＰＣ−３若しくは２３１３２／８７細胞への結合並びにＢＸＰＣ−３若しくは２３１３２／８７細胞の成長若しくは増殖の阻害又はＢＸＰＣ−３若しくは２３１３２／８７細胞の死滅、溶解若しくはアポトーシスの刺激若しくは誘導；カスパーゼ（例えば、カスパーゼ３、カスパーゼ８又はカスパーゼ９）の活性化の誘発を含む。例示的な機能又は活性は、グリコシダーゼに対するＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質の結合感受性又は非感受性も含み、例えば、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質のＯ−グリコシダーゼ酵素処理は、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質への抗体の結合を低減又は破壊し、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質のＮ−グリコシダーゼＦ酵素処理は、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質への抗体の結合を低減又は破壊しない。
【００８６】
本発明に従って、修飾形態の蛋白質、抗体、核酸及び他の組成物も提供される。但し、該修飾形態は非修飾又は基準蛋白質、核酸若しくは抗体の機能又は活性の少なくとも一部を保持するものとする。例えば、修飾ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質（例えば、部分配列又は断片）は免疫原として用いられ、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質に特異的に結合する抗体を生成することができる。修飾ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質抗体（例えば、部分配列又は断片）は、本発明の処置、診断、スクリーニング及び検出法において用いることができる。
【００８７】
本明細書で用いられるように、「修飾する」という用語及びその文法的変形は、組成物が基準組成物から逸脱するということである。そのような修飾蛋白質、核酸及び他の組成物は、基準非修飾蛋白質、核酸又は組成物より高い若しくは低い活性又はそれとは異なる機能を有しうる。
【００８８】
修飾はＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質のアミノ酸及び炭水化物部分の置換、付加及び欠失を含み、これらは「変異体」と称されうる。アミノ酸修飾の具体的な非限定例はＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質部分配列及び断片を含む。例示的なＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質部分配列及び断片は、Ｎ又はＯ−結合炭水化物部分を含むＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質の一部を含み、該炭水化物部分はＧｒｐ７８の炭水化物部分と任意に異なる。例示的なＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質部分配列及び断片は、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質の免疫原性部分、例えば、１つ以上のＮ又はＯ−結合炭水化物部分を含むＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質の一部も含む。例示的なＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質部分配列及び断片は、ＳＡＭ−６抗体に結合するＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質の一部を更に含む。炭水化物部分の修飾の具体的な非限定例は、ＳＡＭ−６抗体への結合を低減若しくは破壊する１つ以上の糖残基の欠失（Ｏ−結合部分又はその糖）又はＳＡＭ−６抗体への結合を低減若しくは破壊しない１つ以上の糖残基の欠失（Ｎ−結合部分又はその糖）を有するＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質を含む。
【００８９】
本明細書で用いられるように、「部分配列」又は「断片」という用語は完全長分子の一部を意味する。ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質の部分配列は、完全長ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質より１つ以上少ないアミノ酸を有する（例えば、アミノ又はカルボキシ末端からの１つ以上の内部又は末端アミノ酸欠失）。ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質抗体の部分配列は、完全長ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質抗体より１つ以上少ないアミノ酸を有する。核酸配列は完全長対照核酸配列より少なくとも１つ少ないヌクレオチドを有する。従って、部分配列は完全長天然分子に至るまでの任意の長さでよい。
【００９０】
本発明の例示的なＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質抗体部分配列及び断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド連結されたＦｖｓ（ｓｄＦｖ）並びにＶＬ及びＶＨドメイン断片を含む。そのような部分配列及び断片は、完全長抗体と同様の結合親和性、完全長抗体と同様の結合特異性又は完全長抗体と同様の１つ以上の活性若しくは機能、例えば、ＳＡＭ−６抗体の機能若しくは活性を有しうる。抗体に言及する場合の「機能的部分配列」及び「機能的断片」という用語は、無傷の基準抗体と同様の１つ以上の機能又は活性、例えば、ＳＡＭ−６抗体の機能又は活性の少なくとも一部を保持する抗体部分を指す。例えば、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質に結合する抗体部分配列、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質、ＬＤＬ又はｏｘＬＤＬの免疫原性断片は機能的部分配列とみなされる。
【００９１】
抗体部分配列及び断片は結合されうる。例えば、ＶＬ又はＶＨ部分配列はリンカー配列によって結合されてよく、これにより、ＶＬ−ＶＨキメラを形成する。単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）部分配列の組合せはリンカー配列によって結合され得、これにより、ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖキメラを形成する。抗体部分配列及び断片は、単独で、又は他の部分配列の全部若しくは一部と組み合わせて単鎖抗体若しくは可変領域を含む。
【００９２】
抗体部分配列及び断片は、例えば、全抗体のペプシン又はパパイン消化により、抗体の蛋白質加水分解によって調製することができる。ペプシンによる酵素的切断によって生成される抗体部分配列及び断片は、Ｆ（ａｂ’）２として示される５Ｓ断片を供する。この断片はチオール還元剤を用いて更に切断され、３．５Ｓ  Ｆａｂ’一価断片を生成することができる。或いは、ペプシンを用いた酵素的切断は２つの一価Ｆａｂ’断片及びＦｃ断片を直接生成する（例えば、米国特許第４，０３６，９４５号及び第４，３３１，６４７号；並びにＥｄｅｌｍａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｙｍｏｌ．１：４２２（１９６７）参照）。抗体を切断する他の方法、例えば、重鎖の分離による一価軽鎖−重鎖断片の形成、断片の更なる切断又は他の酵素的若しくは化学的手段も用いられうる。
【００９３】
蛋白質及び抗体並びにその部分配列及び断片は、遺伝学的方法により作製することができる。そのような技術は、蛋白質又は抗体をコードする遺伝子の全部又は一部の、Ｃｏｓ細胞又は大腸菌などの宿主細胞への発現を含む。組換え宿主細胞は完全長又は部分配列、例えば、ｓｃＦｖを合成する（例えば、Ｗｈｉｔｌｏｗら、Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ中  ２：９７（１９９１）、Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３（１９８８）；及び米国特許第４，９４６，７７８号参照）。単鎖Ｆｖ及び抗体は、米国特許第４，９４６，７７８号及び第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０３：４６（１９９１）；Ｓｈｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：７９９５（１９９３）；並びにＳｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０３８（１９８８）に述べられているように作製することができる。
【００９４】
修飾蛋白質は、Ｌ−アミノ酸と置換される１つ以上のＤ−アミノ酸（及びその混合物）、構造的且つ機能的類似体、例えば、合成若しくは非天然アミノ酸又はアミノ酸類似体及び誘導体化形態を有するペプチド模倣体も含む。修飾は、分子のアミノ及びカルボキシ末端間の末端間アミド結合或いは分子内又は分子間ジスルフィド結合などの環状構造を含む。
【００９５】
修飾蛋白質はアミノ酸置換を更に含む。特定の実施形態では、修飾蛋白質は１又は数個の保存的又は非保存的置換を有する。アミノ酸置換を含むそのような蛋白質は核酸にコードされうる。従って、アミノ酸置換を含む蛋白質をコードする核酸配列も提供される。
【００９６】
「保存的置換」は、生物学的、化学的又は構造的に類似の残基による１つのアミノ酸の置換である。生物学的類似とは、置換が、生物活性、例えば、ＳＡＭ−６結合活性を破壊しないということである。構造的類似とは、アミノ酸がアラニン、グリシン、セリンなどの同様の長さを有する側鎖又は同様のサイズを有するということである。化学的類似性とは、残基が同じ電荷を有し、又は共に親水性若しくは疎水性であるということである。特定例は、別の残基に代わる１つの疎水性残基、例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン若しくはメチオニンの置換又は別の残基に代わる１つの極性残基の置換、例えば、リシンに代わるアルギニンの置換、アスパラギン酸に代わるグルタミン酸若しくはアスパラギンに代わるグルタミン、トレオニンに代わるセリンなどを含む。
【００９７】
修飾形態は、誘導体化配列、例えば、遊離アミノ基がアミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基；塩類、メチル及びエチルエステル由来の遊離カルボキシ基；Ｏ−アシル又はＯ−アルキル誘導体を形成する遊離ヒドロキシル（ｈｙｄｒｏｘｌ）基を形成するアミノ酸、並びに天然アミノ酸誘導体、例えば、プロリンに対する４−ヒドロキシプロリン、リシンに対する５−ヒドロキシリシン、セリンに対するホモセリン、リシンに対するオルニチンなどを含む。修飾は当該技術分野において公知の方法を用いて生じさせることができる（例えば、ＰＣＲベースの部位特異的欠失及び挿入突然変異誘発、化学的修飾及び突然変異誘発、架橋結合など）。
【００９８】
蛋白質（例えば、抗体）、核酸及び他の組成物の修飾形態は付加及び挿入を含む。例えば、付加は、蛋白質（例えば、抗体）、核酸又は他の組成物に対する任意のタイプの分子の共有又は非共有結合でありうる。典型的には、付加及び挿入は別個の機能又は活性を付与する。
【００９９】
付加及び挿入は融合（キメラ）ポリペプチド又は核酸配列を含み、これは、配列に共有結合した基準天然（野生型）配列に通常存在しない１つ以上の分子を有する配列である。特定の例は、多機能蛋白質（例えば、多特異的抗体）を作製するための別の蛋白質（例えば、抗体）のアミノ酸配列である。
【０１００】
本発明に従って、異種ドメインを含む蛋白質、抗体、核酸及び他の組成物が提供される。異種ドメインはアミノ酸付加又は挿入でありうるが、アミノ酸残基に限定されない。従って、異種ドメインは任意の種々異なるタイプの大又は小機能性部分からなりうる。そのような部分は、核酸、ペプチド、炭水化物、脂質又は小有機化合物、例えば、薬物（例えば、細胞増殖剤）、金属（金、銀）などを含む。
【０１０１】
異種ドメインの特定の非限定例は、例えば、タグ、検出可能な標識及び細胞傷害剤を含む。タグ及び検出可能な標識の具体例は、酵素（西洋ワサビペルオキシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）；酵素基質；リガンド（例えば、ビオチン）；受容体（アビジン）；放射性核種（例えば、Ｃ１４、Ｓ３５、Ｐ３２、Ｐ３３、Ｈ３、Ｉ１２５、Ｉ１３１、ガリウム−６７及び６８、スカンジウム−４７（ｓｃａｎｔｉｕｍ−４７）、インジウム−１１１、ラジウム−２２３）；Ｔ７−、Ｈｉｓ−、ｍｙｃ−、ＨＡ−及びＦＬＡＧ−タグ；高電子密度試薬；エネルギー伝達分子；常磁性標識；フルオロフォア（フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｅｒｔｈｒｉｎ））；発色団；化学発光（イミダゾール、ルシフェラーゼ）；並びに生物発光剤を含む。細胞傷害剤の具体例は、ジフテリア、毒素、コレラ毒素及びリシンを含む。
【０１０２】
異種ドメインの更なる例は、例えば、抗細胞増殖剤（例えば、抗新生物、抗腫瘍若しくは抗癌又は抗転移剤）を含む。抗細胞増殖剤の具体的な非限定例は、本明細書で開示され、当該技術分野において公知である。
【０１０３】
リンカー配列は、蛋白質（例えば、抗体）、核酸又は他の組成物と付加又は挿入（例えば、異種ドメイン）との間に挿入され得、そのため、その２つの実体物は少なくとも部分的に異なる機能又は活性を維持する。リンカー配列は、いずれのドメインも促進し、又はいずれのドメインとも相互作用しうる柔軟構造、規則的二次構造形成不能又は疎水性若しくは荷電特性を含む１つ以上の特性を有しうる。柔軟蛋白質領域において典型的に見出されるアミノ酸は、Ｇｌｙ、Ａｓｎ及びＳｅｒを含む。他の中性に近いアミノ酸、例えば、Ｔｈｒ及びＡｌａもリンカー配列において用いられうる。リンカー配列の長さは多様でありうる（例えば、米国特許第６，０８７，３２９号参照）。リンカーは化学的架橋及びコンジュゲート剤、例えば、スルホスクシンイミジル誘導体（スルホ−ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＰＢ）、スベリン酸ジスクシンイミジル（ＤＳＳ）、グルタル酸ジスクシンイミジル（ＤＳＧ）及び酒石酸ジスクシンイミジル（ＤＳＴ）を更に含む。
【０１０４】
付加の更なる例は、グリコシル化、脂肪酸、脂質、アセチル化、リン酸化、アミド化、ホルミル化、ユビキチン化及び保護／ブロック基による誘導体化並びに任意の多くの化学的修飾を含む。他の置換及び可能性は当業者には容易に明らかとなり、本発明の範囲内にあるとみなされる。
【０１０５】
そのような修飾配列は、細胞発現又はインビトロ翻訳を介した組換えＤＮＡ技術を用いて作製することができる。ポリペプチド及び核酸配列も当該技術分野において公知の方法、例えば、自動ペプチド合成装置（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、カリフォルニア州フォスターシティ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ））を用いて化学合成により作製することができる。
【０１０６】
本発明に従って、変性ゲル電気泳動により決定される約８０〜８２キロダルトン（ＫＤａ）の範囲の見かけ上の分子量を有する、ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）として示される糖蛋白質、即ち、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質をコードする単離又は精製核酸が提供される。一実施形態では、核酸配列は、配列番号１において示されるＧｒｐ７８とのポリペプチド配列相同性を有するＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質をコードする。別の実施形態では、核酸配列は、Ｇｒｐ７８と異なる少なくとも１つの窒素（Ｎ）又は酸素（Ｏ）−結合炭水化物部分を結合させることが可能なＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質をコードする。更なる実施形態では、核酸配列は、ＳＡＭ−６抗体が特異的に結合するエピトープ又はエピトープの一部である、少なくとも１つの窒素（Ｎ）又は酸素（Ｏ）−結合炭水化物部分を結合させることが可能なＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質をコードする。従って、本発明による核酸は、１）配列番号１において示されるＧｒｐ７８とのポリペプチド配列同一性を有するＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質；２）ＳＡＭ−６が特異的に結合可能なＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質配列（例えば、少なくとも１つの窒素（Ｎ）又は酸素（Ｏ）−結合炭水化物部分を結合させることが可能な）；及び３）ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質部分配列及び断片（例えば、配列番号２〜１２）をコードする配列を含む。
【０１０７】
本発明に従って、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質の部分配列及び断片をコードする単離又は精製核酸も提供される。一実施形態では、核酸配列は、少なくとも１つの窒素（Ｎ）又は酸素（Ｏ）−結合炭水化物部分を結合させることが可能なＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質配列をコードし、該炭水化物部分はＧｒｐ７８の炭水化物部分と任意に異なる。特定の態様では、該核酸配列は、約１０〜２０、２０〜３０、３０〜５０、５０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜１０００、１０００〜２０００ヌクレオチド長或いはそのような長さ以内の、又はそれを包含する任意の数値若しくは範囲の長さを有し、任意に、Ｇｒｐ７８の炭水化物部分と異なる少なくとも１つの窒素（Ｎ）又は酸素（Ｏ）−結合炭水化物部分を結合させることが可能なＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質をコードする。
【０１０８】
「核酸」及び「ポリヌクレオチド」などの用語は、リン酸エステル結合又は等価物を介して結合される、少なくとも２つ以上のリボ核酸又はデオキシリボ核酸塩基対（ヌクレオチド）を指す。核酸はポリヌクレオチド及びポリヌクレオシドを含む。核酸は、単一、二重又は三重、環状又は直鎖状分子を含む。例示的な核酸は、限定されないが、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノム核酸、天然及び非天然核酸、例えば、合成核酸を含む。
【０１０９】
核酸は種々の長さであってよい。典型的には、核酸長は、約２０ヌクレオチド〜２０Ｋｂの範囲或いはそのような長さ以内の、又はそれを包含する任意の数値若しくは範囲、１０ヌクレオチド〜１０Ｋｂ、１〜５Ｋｂ以下、１０００〜約５００ヌクレオチド以下の長さである。核酸はより短くてもよく、例えば、１００〜約５００ヌクレオチド又は約１２〜２５、２５〜５０、５０〜１００、１００〜２５０又は約２５０〜５００ヌクレオチド長或いはそのような長さ以内の、又はそれを包含する任意の数値若しくは範囲でよい。一般に、短いポリヌクレオチドは「オリゴヌクレオチド」又は一本鎖若しくは二本鎖ＤＮＡの「プローブ」と称される。しかし、そのようなオリゴヌクレオチドの長さに上限はない。
【０１１０】
ポリヌクレオチドはＬ又はＤ型及びその混合物を含み、被験体に投与される際に分解に耐性を示すように更に修飾されうる。特定の例は、被験体の種々の組織又は流体に存在するエンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼに耐性を示す５’及び３’結合を含む。
【０１１１】
別の実施形態では、本発明は、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質配列の全部又は部分配列若しくは断片をコードする核酸配列と少なくとも７５〜９０％相補的又は相同的である、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質配列の全部又は部分配列若しくは断片をコードする核酸とハイブリダイズする核酸を提供する。一実施形態では、該核酸配列は、約１０〜２０、２０〜３０、３０〜５０、５０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜１０００、１０００〜２０００ヌクレオチド長或いはそのような長さ以内の、又はそれを包含する任意の数値若しくは範囲の長さを有する。特定の態様では、該核酸配列は、Ｇｒｐ７８と異なる少なくとも１つの窒素（Ｎ）又は酸素（Ｏ）−結合炭水化物部分を結合させることが可能なＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質をコードする核酸配列とハイブリダイズする。
【０１１２】
「ハイブリダイズする」という用語及びその文法的変形は核酸配列間の結合を指す。一般的に、ハイブリダイズする配列は、基準（例えば、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質）配列のアミノ酸配列をコードする核酸との約５０％以上の相同性（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれを超える同一性）又は基準（例えば、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質）配列のアミノ酸配列をコードする核酸と相補的な配列を有する。基準配列、例えば、基準（例えば、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質）配列のアミノ酸配列をコードする核酸と１００％又は完全に相補的なハイブリダイズする配列は、ミスマッチを含まない１００％の塩基対合を示す。ハイブリダイズする配列間のハイブリダイゼーション領域は、典型的には、少なくとも約１２〜１５ヌクレオチド、１５〜２０ヌクレオチド、２０〜３０ヌクレオチド、３０〜５０ヌクレオチド、５０〜１００ヌクレオチド、１００〜２００ヌクレオチド又はそれを超える或いはそのような長さ以内の、又はそれを包含する任意の数値若しくは範囲である。
【０１１３】
本発明に従って、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質若しくはその一部をコードする核酸配列又はＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質若しくはその一部をコードする核酸と相補的な配列と特異的にハイブリダイズするアンチセンスポリヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ及びリボザイム核酸が更に提供される。アンチセンスポリヌクレオチドは、約１０〜２０、２０〜３０、３０〜５０、５０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜１０００、１０００〜２０００ヌクレオチド長或いはそのような長さ以内の、又はそれを包含する任意の数値若しくは範囲の長さを有しうる。一実施形態では、核酸配列は、Ｇｒｐ７８の炭水化物部分と異なるＮ又はＯ−結合炭水化物部分を結合させることが可能なＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質をコードする核酸配列と特異的にハイブリダイズするアンチセンスポリヌクレオチドを含む。特定の態様では、アンチセンスは、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質をコードする核酸配列、若しくはＧｒｐ７８の炭水化物部分と異なる少なくとも１つの窒素（Ｎ）又は酸素（Ｏ）−結合炭水化物部分を結合させることが可能なＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質をコードする核酸配列と少なくとも９０％相補的若しくは相同的であり、又はＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質をコードする核酸若しくはＧｒｐ７８の炭水化物部分と異なる少なくとも１つの窒素（Ｎ）又は酸素（Ｏ）−結合炭水化物部分を結合させることが可能なＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質をコードする核酸配列と相補的な配列である。
【０１１４】
本明細書で用いられるように、「アンチセンス」という用語は、特定のＤＮＡ又はＲＮＡ配列に結合可能なポリヌクレオチド又はペプチド核酸を指す。アンチセンスは、ＲＮＡ転写物又はＤＮＡに結合する一本鎖、二本鎖、三本鎖又はそれより多くの鎖のＲＮＡ及びＤＮＡポリヌクレオチド並びにペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。特定の例はセンスＲＮＡに結合するＲＮＡ及びＤＮＡアンチセンスを含む。例えば、一本鎖核酸は、代謝、異化、細胞からのグリコーゲンの除去又は分解（例えば、ｍＲＮＡ）に関与する蛋白質転写物を標的とすることができる。アンチセンス分子は典型的にはセンス鎖と９５〜１００％相補的であるが、「部分的に」相補的であってよく、その場合、わずかに一部のヌクレオチドがセンス分子に結合する（１００％未満相補的、例えば、９５％、９０％、８０％、７０％及び時にはそれ未満）或いはそのようなパーセント値以内の、又はそれを包含する任意の数値若しくは範囲。
【０１１５】
三重鎖形成アンチセンスは二本鎖ＤＮＡに結合することができ、これにより、遺伝子の転写を阻害する。遺伝子の転写開始部位、例えば、開始部位から−１０及び＋１０位間由来のオリゴヌクレオチドは１つの特定例である。
【０１１６】
遺伝子発現を阻害するための低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ又はＲＮＡｉと称される）は当該技術分野において公知である（例えば、Ｋｅｎｎｅｒｄｅｌｌら、Ｃｅｌｌ  ９５：１０１７（１９９８）；Ｆｉｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ，３９１：８０６（１９９８）；ＷＯ０２／４４３２１；ＷＯ０１／６８８３６；ＷＯ００／４４８９５，ＷＯ９９／３２６１９，ＷＯ０１／７５１６４，ＷＯ０１／９２５１３，ＷＯ０１／２９０５８，ＷＯ０１／８９３０４，ＷＯ０２／１６６２０；及びＷＯ０２／２９８５８参照）。ＲＮＡｉサイレンシングは、「ヘアピン」構造を形成するＲＮＡをコードする核酸により、又はコード核酸の各末端からＲＮＡを発現し、ハイブリダイズする２個のＲＮＡ分子を作出することにより誘導することができる。
【０１１７】
ＲＮＡの特定の切断を触媒する酵素的ＲＮＡ分子であるリボザイムは、コード化蛋白質の発現を阻害するために用いることができる。リボザイムは相補的標的ＲＮＡと配列特異的ハイブリッドを形成し、次に、それは切断される。具体例は、例えば、代謝、異化、グリコーゲンの除去又は分解に関与する蛋白質をコードする配列のヌクレオチド鎖切断を特異的且つ効率的に触媒することができる改変ハンマーヘッドモチーフリボザイム分子を含む。
【０１１８】
アンチセンス、リボザイム、ＲＮＡｉ及び三重鎖形成核酸は、集合的に本明細書で「阻害性核酸」又は「阻害性ポリヌクレオチド」と称される。そのような阻害性核酸又はポリヌクレオチドは、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質の発現を阻害又は阻止することができる。
【０１１９】
阻害性ポリヌクレオチドはインビボにて機能するために発現制御因子を必要としない。阻害性ポリヌクレオチドは細胞に吸収され、又は受動拡散により細胞に進入しうる。阻害性ポリヌクレオチドは、任意に、ベクターを用いて細胞に導入されうる。阻害性ポリヌクレオチドは転写されるように核酸にコードされうる。更に、阻害性ポリヌクレオチドをコードする核酸は、細胞又はインビボでのコード化アンチセンスの持続又は増加発現のための発現制御因子に機能的に結合されうる。阻害性核酸は、本明細書で開示され、或いはデータベースで利用可能な蛋白質及び核酸配列に基づいて設計されうる。
【０１２０】
核酸配列は、ヌクレオチド及びヌクレオシドの置換、付加及び欠失並びに誘導体化形態及び融合／キメラ配列（例えば、組換えポリペプチドをコードする）を更に含む。例えば、遺伝暗号の縮退により、核酸は、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質及びその部分配列若しくは断片（例えば、Ｇｒｐ７８と異なる少なくとも１つの窒素（Ｎ）又は酸素（Ｏ）−結合炭水化物部分を結合させることが可能なＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質断片）又は変異体をコードする核酸に対して縮退した配列及び部分配列を含む。他の例は、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質及びその部分配列若しくは断片のアミノ酸配列をコードする配列と相補的な核酸である。
【０１２１】
核酸の欠失（部分配列及び断片）は、約１０〜２５、２５〜５０又は５０〜１００ヌクレオチドを有しうる。そのような核酸は、細胞、培地、生体試料（例えば、組織、臓器、血液又は血清）又は被験体において、ポリペプチド部分配列の発現に、遺伝子操作に（プライマー及びＰＣＲ増幅用テンプレートとして）、及び蛋白質をコードする配列の存在若しくは量を検出するためのプローブとして（例えば、ハイブリダイゼーションを介して）有用である。
【０１２２】
核酸は種々の標準クローニング及び化学合成技法を用いて作製することができる。技法は、限定されないが、抗体をコードする配列にアニーリングすることが可能なプライマー（例えば、縮重プライマー混合物）を用いたゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ標的による核酸増幅、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む。核酸は化学合成（例えば、固相ホスホラミダイト合成）又は遺伝子からの転写により作製することもできる。作製された配列は、次に、インビトロにて翻訳され、又はプラスミドにクローニングされて増殖され、次に、細胞（例えば、宿主細胞、例えば、酵母若しくは細菌、真核生物、例えば、動物若しくは哺乳動物細胞又は植物）に発現されうる。
【０１２３】
本発明に従って、本発明の核酸配列を含むベクターが更に提供される。一実施形態では、ベクターはＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質をコードする核酸配列を含む。別の実施形態では、ベクターは、ＳＡＭ−６抗体が特異的に結合することが可能な少なくとも１つの窒素（Ｎ）又は酸素（Ｏ）−結合炭水化物部分を結合させることが可能なＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質部分配列又は断片をコードする核酸配列を含む。
【０１２４】
ベクターは、ウイルス、原核生物（細菌）及び真核生物（植物、真菌、哺乳動物）ベクターを含む。ベクターはインビトロ又はインビボでの核酸の発現に用いることができる。「発現ベクター」と称されるそのようなベクターは、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質、その部分配列及び断片をコードする核酸を含む核酸、阻害性核酸をコードする核酸を導入し、コード化蛋白質又は阻害性核酸（例えば、液相又は固相中）をインビボにて細胞又は被験体に発現させるのに有用である。
【０１２５】
ベクターは核酸の操作に用いることもできる。遺伝子操作のために「クローニングベクター」を用いて挿入核酸を転写又は翻訳することができる。
【０１２６】
一般的に、ベクターはインビトロ又はインビボでの細胞における増殖のための複製起点を含む。必要に応じて転写及び翻訳を容易にするため、ベクター内に存在する、発現制御因子を含む制御因子が含まれうる。
【０１２７】
ベクターは選択マーカーを含みうる。「選択マーカー」は遺伝子を含む細胞の選択を可能にする遺伝子である。「正の選択」とは、選択マーカーを含む細胞が正の選択への暴露後に生存するプロセスを指す。薬剤耐性は正の選択マーカーの一例であり、該マーカーを含む細胞は選択薬剤を含む培地中で生存し、該マーカーを欠く細胞は死滅する。選択マーカーは、薬剤耐性遺伝子、例えば、Ｇ４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ；ハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒ；及びピューロマイシンに対する耐性を付与するｐｕｒｏを含む。他の正の選択マーカー遺伝子は、該マーカーを含む細胞の特定又はスクリーニングを可能にする遺伝子を含む。これらの遺伝子は、特に、蛍光蛋白質（ＧＦＰ及びＧＦＰ様発色団、ルシフェラーゼ）用遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子及びＣＤ８などの表面マーカーを含む。「負の選択」とは、負の選択マーカーを含む細胞が適切な負の選択剤への暴露後に死滅するプロセスを指す。例えば、単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子を含む細胞（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ  １１：２２３（１９７７））は、薬剤：ガンシクロビル（ＧＡＮＣ）に対して感受性を示す。同様に、ｇｐｔ遺伝子は細胞を６−チオキサンチンに対して感受性にさせる。
【０１２８】
ウイルスベクターは、レトロウイルス（分裂及び非分裂細胞に感染するためのレンチウイルス）に基づくベクター、泡沫状ウイルス（米国特許第５，６２４，８２０号、第５，６９３，５０８号、第５，６６５，５７７号、第６，０１３，５１６号及び第５，６７４，７０３号；ＷＯ９２／０５２６６及びＷＯ９２／１４８２９）、アデノウイルス（米国特許第５，７００，４７０号、第５，７３１，１７２号及び第５，９２８，９４４号）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）（米国特許第５，６０４，０９０号）、単純ヘルペスウイルスベクター（米国特許第５，５０１，９７９号）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ベースのベクター（米国特許第５，５６１，０６３号）、レオウイルス、ロタウイルスゲノム、サルウィルス４０（ＳＶ４０）又はパピローマウイルス（Ｃｏｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６３４９（１９８４）；Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社、Ｇｌｕｚｍａｎ（編）、１９８２；Ｓａｒｖｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１：４８６（１９８１）；米国特許第５，７１９，０５４号）を含む。アデノウイルスは徐々に複製し、且つ／或いは最終分化した細胞に効率的に感染し、徐々に複製し、且つ／或いは最終分化した細胞を標的とするために用いることができる。発現に有用な更なるウイルスベクターは、パルボウイルス、ノーウォークウイルス、コロナウイルス、パラミクソ及びラブドウイルス、トガウイルス（例えば、シンドビスウイルス及びセムリキ森林ウイルス）並びに水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を含む。
【０１２９】
核酸を含むベクターは、該核酸が発現制御因子に機能的に結合されると、発現しうる。本明細書で用いられるように、「機能的に結合」という用語は、目的とする様式にて機能することを許容する言及因子間の物理的又は機能的関係を指す。従って、核酸に「機能的に結合」した発現制御因子とは、該制御因子が核酸転写及び、必要に応じて転写物の翻訳を調節するということである。
【０１３０】
「発現制御因子」という用語は、機能的に結合した核酸の発現に影響を与える核酸を指す。プロモータ及びエンハンサは発現制御因子の特定の非限定例である。「プロモータ配列」は、下流（３’方向）配列の転写を開始することが可能なＤＮＡ調節領域である。プロモータ配列は転写の開始を容易にするヌクレオチドを含む。エンハンサも遺伝子発現を調節するが、それが機能的に結合した遺伝子の転写開始部位から離れて機能しうる。エンハンサは遺伝子の５’若しくは３’末端及び遺伝子内（例えば、イントロン又はコード配列内）にて機能する。更なる発現制御因子は、リーダー配列及び融合パートナー配列、多重遺伝子又はポリシストロン性メッセージの生成のための内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）因子、イントロン用のスプライシングシグナル、ｍＲＮＡのインフレーム翻訳を許容するための遺伝子の適正リーディングフレームの維持、対象とする転写物の適切なポリアデニル化を付与するためのポリアデニル化シグナル並びに終止コドンを含む。
【０１３１】
発現制御因子は、機能的に結合した核酸の転写がシグナル又は刺激なしに生じる「構成因子」を含む。機能的に結合した核酸の発現を増減する、シグナル又は刺激に応答して発現を付与する発現制御因子は「調節可能」である。シグナル又は刺激に応答して機能的に結合した核酸の発現を増加させる調節可能な因子は、「誘導性因子」と称される。シグナル又は刺激に反応して機能的に結合した核酸の発現を減少させる調節可能な因子は、「抑制性因子」と称される（即ち、シグナルが発現を減少させる；シグナルが除去され、又は存在しない場合、発現は増加する）。
【０１３２】
発現制御因子は、「組織特異的発現制御因子」と称される、特定の組織又は細胞型において活性を示す因子を含む。組織特異的発現制御因子は、典型的には、特定の細胞又は組織型において活性を示す転写活性化因子蛋白質又は他の転写調節因子に認識されるため、他の細胞又は組織型と比べて特定の細胞又は組織型においてより活性を示す。
【０１３３】
組織特異的発現制御因子は、新生物、腫瘍及び癌並びに転移を含む細胞増殖障害などの過剰増殖細胞において活性を示すプロモータ及びエンハンサを含む。そのようなプロモータの特定の非限定例は、ヘキソキナーゼＩＩ、ＣＯＸ−２、アルファ−フェトプロテイン、癌胎児性抗原、ＤＥ３／ＭＵＣ１、前立腺特異抗原、Ｃ−ｅｒＢ２／ｎｅｕ、テロメラーゼ逆転写酵素及び低酸素反応性プロモータである。
【０１３４】
細菌発現では、構成プロモータはＴ７を含み、且つ誘導プロモータは、例えば、バクテリオファージλのｐＬ、ｐｌａｃ、ｐｔｒｐ、ｐｔａｃ（ｐｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモータ）を含む。昆虫細胞系では、構成又は誘導プロモータ（例えば、エクジソン）が用いられうる。酵母では、構成プロモータは、例えば、ＡＤＨ又はＬＥＵ２を含み、誘導プロモータは、例えば、ＧＡＬを含む（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ中、第２巻、第１３章、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ａｓｓｏｃ．＆  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ社（編）、１９８８；Ｇｒａｎｔら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ中、１５３：５１６−５４４（１９８７）、Ｗｕ  ＆  Ｇｒｏｓｓｍａｎ（編）、１９８７、Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ社、ニューヨーク；Ｇｌｏｖｅｒ，ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第ＩＩ巻、第３章、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ社、ワシントンＤ．Ｃ．，１９８６；Ｂｉｔｔｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ中、１５２：６７３−６８４（１９８７）、Ｂｅｒｇｅｒ  ＆  Ｋｉｍｍｅｌ（編）、Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ社、ニューヨーク；及びＳｔｒａｔｈｅｒｎら、Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ社（編）、第Ｉ及びＩＩ巻（１９８２）参照）。
【０１３５】
哺乳動物発現では、ウイルス又は他の起源の構成プロモータが用いられうる。例えば、ＳＶ４０若しくはウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）など又は哺乳動物細胞のゲノム由来（例えば、メタロチオネインＩＩＡプロモータ；熱ショックプロモータ、ステロイド／甲状腺ホルモン／レチノイン酸応答要素）又は哺乳動物ウイルス由来（アデノウイルス後期プロモータ；マウス乳癌ウイルスＬＴＲ）の誘導プロモータが用いられる。
【０１３６】
本発明に従って、本発明の核酸又はベクターで形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞が提供される。宿主細胞は、限定されないが、原核及び真核細胞、例えば、細菌、真菌（酵母）、植物、昆虫及び動物（例えば、霊長動物及びヒトを含む哺乳動物）細胞を含む。例えば、組換えバクテリオファージ核酸、プラスミド核酸又はコスミド核酸発現ベクターで形質転換された細菌；組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）で感染され、又は組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染された昆虫細胞系；並びに組換えウイルス発現ベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス）で感染された動物細胞系又は安定な発現のために操作された形質転換動物細胞系。
【０１３７】
該細胞は、エキソビボ又は被験体における（インビボ）一次細胞分離株、細胞培養物（例えば、継代、樹立又は不死化細胞株）或いは複数の細胞の一部又は組織若しくは臓器でよい。特定の実施形態では、細胞は、過剰増殖細胞、細胞過剰増殖障害を含む細胞、不死化細胞、新生細胞、腫瘍細胞若しくは癌細胞又は転移細胞である。
【０１３８】
細胞（例えば、宿主細胞）又は生物に関連して用いられる「形質転換された」又は「トランスフェクトされた」という用語は、外因性分子、例えば、蛋白質又は核酸（例えば、導入遺伝子）の細胞への取込み後の細胞における遺伝子変化のことである。従って、「トランスフェクトされた」又は「形質転換された」細胞は、ヒトの手により、例えば、組換えＤＮＡ技術によって外因性分子が導入された細胞又はその子孫である。
【０１３９】
核酸又は蛋白質は、細胞及びその子孫において安定又は一過性にトランスフェクト又は形質転換（発現）されうる。細胞は増殖され、導入蛋白質は発現され、又は核酸は転写されうる。トランスフェクト又は形質転換された細胞の子孫は、複製時に生じる突然変異がありうるため、親細胞と同一でない可能性がある。
【０１４０】
典型的には、細胞トランスフェクション又は形質転換では、核酸の挿入又は取込みによって操作されうるプラスミド、ウイルス、例えば、ウイルスベクター又は当該技術分野において公知の他のビヒクルを指す「ベクター」を用いる。
【０１４１】
ウイルス粒子又はベシクルは、標的細胞リガンド又は受容体に結合する表面上の蛋白質の封入により、特定の細胞型（例えば、過剰増殖細胞）に標的化されるように設計することができる。或いは、核酸を標的細胞に発現するため、細胞型特異的プロモータ及び／又はエンハンサをベクターに封入することができる。従って、ウイルス粒子若しくはベシクル自体、ウイルスベクター又はウイルス表面上の蛋白質は、インビトロ、エキソビボ又はインビボでのトランスフェクション又は形質転換のため、細胞を標的とするように作製することができる。
【０１４２】
標的細胞（例えば、宿主細胞）への組成物（例えば、蛋白質及び核酸）の導入は、当該技術分野において公知の方法、例えば、浸透圧ショック（例えば、リン酸カルシウム）、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合などによって実施することもできる。インビトロ、エキソビボ及びインビボでの核酸及びポリペプチドの導入は、他の技法を用いて遂行することもできる。例えば、重合体物質、例えば、ポリエステル、ポリアミン酸、ヒドロゲル、ポリビニルピロリドン、エチレン−ビニルアセテート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、硫酸プロタミン又はラクチド／グリコリドコポリマー、ポリラクチド／グリコリドコポリマー又はエチレンビニルアセテートコポリマー。核酸は、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース若しくはゼラチンマイクロカプセル又はポリ（メチルメタクリレート（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｒｏｌａｔｅ））マイクロカプセルの使用により、或いはコロイド系にて、コアセルベーション法又は界面重合によって調製されたマイクロカプセルに封入することができる。コロイド分散系は、巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ並びに水中油型乳剤、ミセル、混合ミセル及びリポソームを含む脂質ベース系を含む。
【０１４３】
種々の組成物を細胞に導入するためのリポソームは当該技術分野において公知であり、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、リポフェクチン及びＤＯＴＡＰを含む（例えば、米国特許第４，８４４，９０４号、第５，０００，９５９号、第４，８６３，７４０号及び第４，９７５，２８２号；並びにＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社、メリーランド州ゲイサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ））。遺伝子治療に有用なピペラジンベースの両親媒性（ａｍｐｈｉｌｉｃ）陽イオン性脂質も公知である（例えば、米国特許第５，８６１，３９７号参照）。陽イオン性脂質系も公知である（例えば、米国特許第５，４５９，１２７号参照）。重合体物質、マイクロカプセル、及びリポソームなどのコロイド分散系は、本明細書で集合的に「ベシクル」と称される。従って、インビトロ、インビボ及びエキソビボでの細胞、組織又は臓器への送達のウイルス及び非ウイルスベクター手段が含まれる。
【０１４４】
本発明はインビボ法を含む。例えば、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質を発現する過剰増殖細胞などの細胞又は細胞過剰増殖障害が、哺乳動物（例えば、ヒト被験体）などの被験体に存在しうる。従って、細胞増殖又は細胞過剰増殖障害を含む細胞は、例えば、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質に特異的に結合する抗体又はその部分配列若しくは断片或いはＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質の阻害性核酸を投与することによって処置されうる。細胞増殖又は細胞過剰増殖障害を含む細胞は、例えば、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質に対する免疫応答を誘発し、これにより、ワクチンとして機能することができるＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質又はその部分配列を投与することによっても処置されうる。加えて、望ましくない、又は過剰なＬＤＬ若しくはｏｘＬＤＬレベルと関連するか、或いはそれによって引き起こされる障害及び疾患は、本発明に従って、例えば、ＬＤＬ又はｏｘＬＤＬを減少させる、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質に特異的に結合する抗体又はその部分配列若しくは断片を投与することによって処置されうる。
【０１４５】
本発明に従って、被験体における細胞増殖又は細胞増殖若しくは細胞過剰増殖障害を処置する方法が提供される。一実施形態では、方法は、被験体における細胞増殖又は細胞増殖若しくは細胞過剰増殖障害を処置するのに有効な量にて、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質抗体に特異的に結合する抗体を該被験体に投与する工程を含む。別の実施形態では、方法は、被験体における細胞増殖又は細胞増殖若しくは細胞過剰増殖障害を処置するのに有効な量にて、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質を該被験体に投与する工程を含む。
【０１４６】
本明細書で用いられるように、「細胞増殖障害」及び「細胞過剰増殖障害」という用語並びにその文法的変形は、細胞、組織又は臓器に関連して用いられる場合、任意の望ましくない、過剰又は異常な細胞、組織又は臓器の成長、増殖、分化又は生存を指す。過剰増殖細胞はその成長、増殖又は生存の程度が、所望の、例えば、基準正常細胞、例えば、同じ組織又は臓器であるが過剰増殖細胞ではない細胞、又は正常に分化しない細胞より大きい。細胞増殖又は細胞過剰増殖障害は、被験体における望ましくない、過剰又は異常な細胞数、細胞成長、細胞増殖、細胞生存又は分化を特徴とする共に良性過形成状態の疾患及び生理的状態を含む。そのような障害の具体例は、転移性並びに非転移性新生物、腫瘍及び癌（悪性腫瘍）を含む。
【０１４７】
種々の実施形態において、方法は、被験体における細胞増殖又は細胞過剰増殖障害を処置するのに有効な量にて、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質に特異的に結合する抗体又はその部分配列を該被験体に投与する工程を含む。特定の態様では、該障害は、新生物、腫瘍又は転移若しくは非転移癌（悪性腫瘍）である。更なる態様では、該障害は、乳房、肺、甲状腺、頭頸部、鼻咽頭、鼻若しくは洞、脳、脊椎、副腎、甲状腺、リンパ、消化管（口、食道、胃、十二指腸、回腸、空腸（小腸）、結腸、直腸）、尿生殖路（子宮、卵巣、子宮頸部、膀胱、精巣、陰茎、前立腺）、腎臓、膵臓、副腎、肝臓、骨、骨髄、リンパ、血液、筋肉、皮膚又は造血系を冒し、或いはその少なくとも一部に存在する。
【０１４８】
「新生物」及び「腫瘍」という用語は本明細書で互換的に用いられ、その成長、増殖又は生存が、正常な対照細胞の成長、増殖又は生存より程度が大きい細胞、任意の細胞の細胞集団、組織又は臓器起源を指す。「癌」は、典型的には、他の領域、組織又は臓器に浸潤し、且つ血液又はリンパ管輸送を介して他の部位に転移する潜在性を有する悪性新生物又は腫瘍である。
【０１４９】
新生物、腫瘍及び癌は、肉腫、癌腫、腺癌、黒色腫、骨髄腫、芽細胞腫、神経膠腫、リンパ腫又は白血病を含む。例示的な癌は、例えば、肉腫、癌腫、腺癌、黒色腫、神経（芽細胞腫、膠腫）、中皮腫及び網内系、リンパ系若しくは造血系新生物障害（例えば、骨髄腫、リンパ腫又は白血病）を含む。特定の態様では、新生物、腫瘍又は癌は、肺腺癌、肺癌、びまん性若しくは間質性胃癌、結腸腺癌、前立腺腺癌、食道癌、乳癌、膵臓腺癌、卵巣腺癌又は子宮腺癌を含む。
【０１５０】
新生物、腫瘍及び癌は、良性、悪性、転移性及び非転移性タイプを含み、任意の病期（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ又はＶ期）又はグレード（Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３など）の新生物、腫瘍若しくは癌或いは進行し、悪化し、安定し、又は寛解期にある新生物、腫瘍、癌若しくは転移を含む。
【０１５１】
新生物、腫瘍及び癌は、乳房、肺、甲状腺、頭頸部、鼻咽頭、鼻若しくは洞、脳、脊椎、副腎、甲状腺、リンパ、消化管（口、食道、胃、十二指腸、回腸、空腸（小腸）、結腸、直腸）、尿生殖路（子宮、卵巣、子宮頸部、膀胱、精巣、陰茎、前立腺）、腎臓、膵臓、副腎、肝臓、骨、骨髄、リンパ、血液、筋肉、皮膚及び造血系を含むがこれに限定されない多くの原発腫瘍型から生じる場合があり、二次部位に転移しうる。
【０１５２】
「固形新生物、腫瘍又は癌」とは、典型的には、共に凝集し、塊を形成する新生物、腫瘍又は癌（例えば、転移）を指す。具体例は、黒色腫、乳房、膵臓、子宮及び卵巣癌、セミノーマを含む精巣癌、胃又は結腸癌、肝臓癌、副腎、腎臓及び膀胱癌、肺、頭頸部癌並びに脳腫瘍／癌などの内臓腫瘍を含む。
【０１５３】
癌腫は上皮及び内分泌組織の悪性腫瘍を指し、呼吸系癌、消化管系癌、泌尿生殖器系癌、精巣癌、乳癌、前立腺癌、内分泌系癌及び黒色腫を含む。該用語は、例えば、癌性及び肉腫性組織からなる悪性腫瘍を含む癌肉腫も含む。腺癌は腺組織の癌腫又は腫瘍が腺様構造を形成する癌腫を含む。黒色腫は、皮膚、眼（網膜を含む）又は身体の他の領域において生じうる、色素細胞起源由来のメラニン細胞及び他の細胞の悪性腫瘍を指す。更なる癌腫は、子宮／頸部、肺、頭部／頸部、結腸、膵臓、精巣、副腎、腎臓、食道、胃、肝臓及び卵巣から生じうる。
【０１５４】
肉腫は間葉細胞起源の悪性腫瘍を指す。例示的な肉腫は、例えば、リンパ肉腫、脂肪肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫及び線維肉腫を含む。
【０１５５】
神経新生物は、神経膠腫、神経膠芽腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、星状細胞腫、希突起膠細胞腫を含む
処置可能な新生物、腫瘍及び癌の具体的な非限定例は、悪性及び非悪性新生物、腫瘍及び癌並びに転移を含む。詳細には、任意の病期（例えば、ＩＡ、ＩＢ、ＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ又はＩＶ期）又はグレード（例えば、Ｇ１、Ｇ２又はＧ３グレード）の黒色腫、胃組織、肺扁平上皮癌、肺腺癌細胞及び鼻癌細胞。転移の具体的な非限定例は、肺扁平上皮癌及び腺癌のリンパ節及び脳への転移；乳癌（浸潤性乳管癌）のリンパ節への転移；結腸腺癌の肝臓及びリンパ節への転移；ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質は胃腺癌（腸管及びびまん性）のリンパ節への転移において検出された；膵臓腺癌のリンパ節への転移；頭頸部扁平上皮癌のリンパ節への転移；並びに黒色腫の直腸、食道、皮膚、耳下腺、結腸、副腎及び鼻上皮への転移を含む。
【０１５６】
「液性新生物、腫瘍又は癌」とは、網内系又は造血系の新生物、腫瘍若しくは癌、例えば、リンパ腫、骨髄腫若しくは白血病又はびまん性の新生物を指す。白血病の特定例は、急性並びに慢性リンパ芽球性、骨髄芽球性（ｍｙｅｏｌｂｌａｓｔｉｃ）及び多発性骨髄腫を含む。典型的には、そのような疾患は、低分化急性白血病、例えば、赤芽球性白血病及び急性巨核芽球性白血病から生じる。具体的な骨髄性疾患は、限定されないが、急性前骨髄性白血病（ＡＰＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を含む。リンパ性悪性疾患は、限定されないが、Ｂ系統ＡＬＬ及びＴ系統ＡＬＬを含む急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、ヘアリー細胞白血病（ＨＬＬ）並びにワルデンシュトレームマクログロブリン血症（ＷＭ）を含む。具体的な悪性リンパ腫は、非ホジキンリンパ腫及び変種、末梢Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、大型顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＦ）、ホジキン病並びにリードシュテルンベルク病を含む。
【０１５７】
本発明に従って、ＬＤＬ又はｏｘＬＤＬを低減する方法、並びに望ましくない、又は過剰なＬＤＬ若しくはｏｘＬＤＬレベルと関連するか、或いはそれによって引き起こされる障害及び疾患を処置する方法が提供される。一実施形態では、方法は、被験体における望ましくない、又は過剰なＬＤＬ若しくはｏｘＬＤＬレベル（例えば、血漿濃度）と関連するか、或いはそれによって引き起こされる障害又は疾患を処置するのに有効な量にて、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質に特異的に結合する抗体を該被験体に投与する工程を含む。
【０１５８】
望ましくない、又は過剰なＬＤＬ若しくはｏｘＬＤＬレベルと関連する非限定的で例示的な障害及び疾患は、脂質異常症、高コレステロール血症、動脈硬化症、心血管疾患、冠動脈性心疾患（ＣＨＤ）、卒中、糸球体壊死、高血圧及び糖尿病を含む。従って、更なる実施形態では、方法は、脂質異常症、高コレステロール血症、動脈硬化症、心血管疾患、冠動脈性心疾患（ＣＨＤ）、卒中、糸球体壊死、高血圧又は糖尿病を処置するのに有効な量にて、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質に特異的に結合する抗体を被験体に投与する工程を含む。
【０１５９】
本明細書で用いられるように、「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置（する）（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語及びその文法的変形は、個々の患者をプロトコル、レジメン、プロセス又は治療に供するということであり、その場合、その患者において生理学的応答又は転帰を得ることが所望される。すべての処置患者が特定の処置プロトコル、レジメン、プロセス又は治療に応答するわけではないため、処置は、所望の生理学的応答又は転帰が如何なる患者又は患者集団においても達成されることを必要としない。従って、所与の患者若しくは患者集団は処置に応答せず、又は不適切に応答しうる。
【０１６０】
本発明の方法は、任意の投与様式又は任意の経路、全身、局部及び局所投与によって実施されうる。例示的な投与経路は、静脈内、動脈内（ｉｎｔｒａｒｔｅｒｉａｌ）、皮内、筋内、皮下、胸膜内、経皮（局所）、経粘膜、頭蓋内、髄腔内、眼球内、直腸、経口（消化管）及び粘膜を含む。
【０１６１】
本発明の方法は、特に、細胞増殖若しくは細胞過剰増殖障害、新生物、腫瘍若しくは癌又は転移の存在と関連する１つ以上の有害（身体）症状若しくは結果の緩和又は改善、即ち、治療有益性又は有益な効果などの、所与の被験体の状態の検出可能又は測定可能な改善を提供する方法を含む。
【０１６２】
治療有益性又は有益な効果は、状態又は病変における主観的又は客観的な一過性、一時的又は長期的改善、或いは新生物、腫瘍若しくは癌又は転移などの細胞増殖又は細胞過剰増殖障害と関連し、又はそれによって引き起こされる有害症状の発現、重症度、期間若しくは頻度の低減である。本発明による処置方法の良好な臨床エンドポイントは、例えば、１つ以上の関連病変、有害症状又は合併症の重症度、期間若しくは頻度の漸減又は部分的低減、或いは新生物、腫瘍若しくは癌又は転移などの細胞増殖又は細胞過剰増殖障害の１つ以上の生理学的、生化学的又は細胞徴候若しくは特徴の抑制又は転換がある場合に達成される。従って、治療有益性又は改善は、標的増殖細胞（例えば、新生物、腫瘍若しくは癌又は転移）の破壊、或いは新生物、腫瘍若しくは癌又は転移などの細胞増殖又は細胞過剰増殖障害と関連し、又はそれによって引き起こされる１つ以上、大部分又はすべての病変、有害症状又は合併症の消失などの治癒である。しかし、治療有益性又は改善は、治癒或いは標的増殖細胞（例えば、新生物、腫瘍若しくは癌又は転移）の完全破壊或いは新生物、腫瘍若しくは癌又は転移などの細胞増殖又は細胞過剰増殖障害と関連し、又はそれによって引き起こされるすべての病変、有害症状又は合併症の消失である必要はない。例えば、腫瘍又は癌細胞塊の部分的破壊或いは腫瘍又は癌の進行又は悪化を抑制することによる腫瘍又は癌塊、サイズ若しくは細胞数の安定化は、一部又は大量の腫瘍又は癌塊、サイズ若しくは細胞が残存するとしても、死亡率を減少させ、わずかに数日間、数週間又は数カ月間であるとしても寿命を延ばすことができる。
【０１６３】
治療有益性の具体的な非限定例は、新生物、腫瘍若しくは癌又は転移の体積（サイズ又は細胞塊）又は細胞数の減少、新生物、腫瘍又は癌体積の増加の抑制又は阻止（例えば、安定化）、新生物、腫瘍又は癌の進行、悪化又は転移の鈍化又は抑制、新生物、腫瘍又は癌細胞の溶解又はアポトーシスの刺激、誘導又は増加、或いは新生物、腫瘍又は癌の増殖、成長又は転移の阻害を含む。本発明の方法は直ちに奏功しえない。例えば、処置に続いて新生物、腫瘍又は癌の細胞数又は塊の増加が生じうるが、経時的に所与の被験体における腫瘍細胞塊、サイズ又は細胞数の最終的な安定化又は減少が、新生物、腫瘍若しくは癌又は転移の細胞溶解又はアポトーシス後に引き続いて生じうる。ＬＤＬ又はｏｘＬＤＬ濃度の低下は処置後数日、数週又は更には数カ月かかりうる。
【０１６４】
更なる利益は、被験体におけるＬＤＬ又はｏｘＬＤＬの減少、動脈又は静脈の狭窄の低減又は転換を含む。脂質プロファイルの改善及びＨＤＬ濃度の上昇も処置有益性の非限定例である。
【０１６５】
抑制、低減、遅延又は阻止可能な、新生物、腫瘍、癌及び転移と関連する更なる有害症状及び合併症は、例えば、悪心、食欲不振、嗜眠、疼痛及び不快感を含む。従って、細胞過剰増殖障害と関連し、又はそれによって引き起こされる有害症状又は合併症の重症度、期間又は頻度の部分的又は完全な低減、被験体の健康の改善、例えば、活力、食欲、心理的健康の増大はすべて、治療有益性の特定の非限定例である。従って、治療有益性又は改善は処置被験体の生活の質の主観的改善も含む。
【０１６６】
種々の実施形態において、方法は、新生物、腫瘍若しくは癌又は転移の体積を低減し、新生物、腫瘍又は癌の体積の増加を抑制又は阻止し、新生物、腫瘍又は癌の進行又は悪化を抑制又は遅延し、新生物、腫瘍若しくは癌又は転移の細胞溶解又はアポトーシスを刺激し、或いは新生物、腫瘍又は癌の増殖又は転移を阻害、低減又は遅延する。更なる実施形態では、方法は被験体の寿命を長くするか、又は延ばす。更なる実施形態では、方法は被験体の生活の質を改善する。
【０１６７】
新生物、腫瘍若しくは癌又は転移を含む生検試料（例えば、血液又は組織試料）の検査により、新生物、腫瘍又は癌の細胞体積又は細胞数を、従って、新生物、腫瘍若しくは癌細胞の塊若しくは数の減少若しくは安定化又は新生物、腫瘍若しくは癌細胞の増殖、成長若しくは生存の阻害（アポトーシス）が生じたかを確定することができる。固形新生物、腫瘍又は癌では、侵襲的及び非侵襲的画像法により、新生物、腫瘍又は癌のサイズ又は体積を確認することができる。例えば、細胞の集団、数及びタイプ（例えば、造血（ｈｅｍａｔｏｐｏｅｔｉｃ）細胞過剰増殖障害）に対する血液又は血清の検査により、新生物、腫瘍若しくは癌細胞の塊若しくは数の減少若しくは安定化、又は新生物、腫瘍若しくは癌細胞の増殖、成長若しくは生存の阻害（アポトーシス）が生じたかを確定することができる。
【０１６８】
本発明の組成物及び方法は、所望の効果を提供する任意の他の処置又は治療と組み合わせることができる。特に、抗細胞増殖活性又は機能を有すると特徴づけられている処置及び治療が適用可能である。例示的な処置及び治療は抗細胞増殖又は免疫増強剤を含む。ＬＤＬ又はｏｘＬＤＬ濃度の場合、更なる処置及び治療はＬＤＬ又はｏｘＬＤＬ低下薬剤及び薬物、例えば、スタチンを含む。処置及び治療は、本発明の任意の他の方法、例えば、抗細胞増殖細胞過剰増殖障害（例えば、新生物、腫瘍若しくは癌又は転移）又はＬＤＬ低下の処置又は治療の前、それと実質的に同時に実施することができる。
【０１６９】
従って、本発明は、本発明の方法が任意の治療レジメン、処置プロトコル又は組成物、例えば、本明細書で示され、或いは当該技術分野において公知の抗細胞増殖又はＬＤＬ低下プロトコル、薬剤若しくは薬物と組み合わせて用いられる組合せ法を提供する。一実施形態では、方法は、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質抗体又は阻害性核酸と、抗細胞増殖又は免疫増強処置、薬剤若しくは薬物とを投与する工程を含む。抗細胞増殖又は免疫増強処置、薬剤若しくは薬物は、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質抗体又は阻害性核酸の投与前、投与と実質的に同時又は投与後に投与することができる。別の実施形態では、方法は、ＬＤＬ又はｏｘＬＤＬ低下処置、薬剤若しくは薬物を投与する工程を含む。
【０１７０】
本明細書で用いられるように、「抗細胞増殖」、「抗新生物」、「抗腫瘍」又は「抗癌」処置、治療、活性若しくは効果とは、異常な、又は望ましくない細胞増殖（細胞過剰増殖）、細胞過剰増殖障害、新生物、腫瘍若しくは癌又は転移と関連するか、或いはそれによって引き起こされる病変、有害症状又は合併症の処置に有用な任意の治療、処置レジメン、薬剤、薬物、プロトコル又はプロセスのことをいう。特定の治療、処置レジメン、薬剤、薬物、プロトコル又はプロセスは、細胞増殖、細胞成長、細胞過剰増殖、新生物、腫瘍又は癌（悪性）の成長、増殖、生存又は転移を阻害、減少、鈍化、低下、遅延又は阻止することができる。そのような処置、治療、レジメン、プロトコル、薬剤及び薬物は、細胞周期進行又は細胞増殖若しくは成長を阻止、低減、抑制又は遅延する；細胞のアポトーシス、溶解又は死滅を増加、刺激又は亢進する；核酸又は蛋白質の合成又は代謝を阻害する；細胞分裂を低減、阻害又は遅延する；或いは細胞生存又は細胞生存因子、増殖因子若しくはシグナリング経路（細胞外又は細胞内）の生成若しくは利用を低減又は阻害することによって機能することができる。
【０１７１】
抗細胞増殖処置及び治療の例は、化学療法、免疫療法、放射線療法（イオン化又は化学的）、局所若しくは局部温熱（加温）療法及び外科的切除を含む。
【０１７２】
抗細胞増殖薬剤及び薬物の具体的な非限定クラスは、アルキル化剤、代謝拮抗剤、植物抽出物、植物アルカロイド、ニトロソウレア、ホルモン（ステロイド）、ヌクレオシド及びヌクレオチド類似体を含む。微生物毒素の具体的な非限定例は、細菌コレラ毒素、百日咳毒素、炭疽毒素、ジフテリア毒素及び植物毒素リシンを含む。薬剤の具体例は、シクロホスファミド、アザチオプリン、シクロスポリンＡ、メルファラン、クロラムブシル、メクロレタミン、ブスルファン、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、チオグアニン、５−フルオロウラシル、５−フルオロウリジン、シトシンアラビノシド、ＡＺＴ、５−アザシチジン（５−ＡＺＣ）及び５−アザシチジン関連化合物、ブレオマイシン、アクチノマイシンＤ、ミトラマイシン、マイトマイシンＣ、カルムスチン、カリケアマイシン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾトシン、テニポシド、エトポシド、ヒドロキシウレア、シスプラチン、カルボプラチン、レバミゾール、ミトタン、プロカルバジン、ダカルバジン、タキソール、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ドキソルビシン、ダウノマイシン並びにジブロモマンニトールを含む。ホルモンの具体的な非限定例は、プレドニゾン、プレドニゾロン、ジエチルスチルベステロール、フルタミド、ロイプロリド及びゴナトロフィン（ｇｏｎａｔｒｏｐｈｉｎ）放出ホルモンアンタゴニストを含む。
【０１７３】
放射線療法は被験体への内部又は外部照射を含む。例えば、アルファ、ベータ、ガンマ及びＸ線は、被験体がラジオアイソトープを取り込み、又はこれと物理的に接触することなく、被験体の外部に施行されうる。Ｘ線量の具体例は、長期間（３〜５／週）での５０〜２００レントゲンの１日線量から２０００〜６０００レントゲンの単回線量に及ぶ。線量は広範に異なり、暴露時間、アイソトープの半減期、放出放射線のタイプ、細胞型及び処置部位並びに疾患の進行期に依存する。放射性核種の具体的な非限定例は、例えば、４７Ｓｃ６７Ｃｕ、７２Ｓｅ、８８Ｙ、９０Ｓｒ、９０Ｙ、９７Ｒｕ、９９Ｔｃ、１０５Ｒｈ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１４９Ｔｂ、１５３Ｓｍ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１９４Ｏｓ、２０３Ｐｂ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１２Ｐｂ、２２３Ｒａ、２２５Ａｃ、２２７Ａｃ及び２２８Ｔｈを含む。
【０１７４】
腫瘍細胞に結合する抗体は、抗細胞増殖処置又は治療の特定の一例である。抗腫瘍抗体は、例えば、白血病細胞ＣＤ３３抗原に結合するＭ１９５抗体（米国特許第６，５９９，５０５号）；卵巣癌ＣＡ６腫瘍関連抗原に結合するモノクローナル抗体ＤＳ６（米国特許第６，５９６，５０３号）；上皮細胞表面Ｈ抗原に結合するヒトＩＢＤ１２モノクローナル抗体（米国特許第４，８１４，２７５号）；並びに結腸、乳房、卵巣及び肺癌によって発現されるＬｅｘ炭水化物エピトープに結合するＢＲ９６抗体を含む。用いられうる更なる抗腫瘍抗体は、例えば、ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）（抗Ｈｅｒ−２  ｎｅｕ抗体）、リツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ）（登録商標）、ゼバリン（Ｚｅｖａｌｉｎ）、ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）（アバスチン（Ａｖａｓｔｉｎ））、ベキサール（Ｂｅｘｘａｒ）、キャンパス（Ｃａｍｐａｔｈ）（登録商標）、オンコリム（Ｏｎｃｏｌｙｍ）、１７−１Ａ（エドレコロマブ（Ｅｄｒｅｃｏｌｏｍａｂ））、３Ｆ８（抗神経芽細胞腫抗体）、ＭＤＸ−ＣＴＬＡ４、ＩＭＣ−Ｃ２２５（セツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ））及びマイロターグ（Ｍｙｌｏｔａｒｇ）を含む。
【０１７５】
本明細書で用いられるように、「免疫増強」という用語は、処置、治療、薬剤又は薬物に関連して用いられる場合、処置、治療、薬剤又は薬物が体液性又は細胞媒介性の免疫応答の増大、刺激、誘発又は促進を付与するということである。そのような治療は免疫応答を全身的に増強し、或いは特定の標的、例えば、新生物、腫瘍若しくは癌又は転移などの細胞増殖又は細胞過剰増殖障害に対する免疫応答を増強することができる。
【０１７６】
免疫増強剤の具体的な非限定例は、抗体、細胞増殖因子、細胞生存因子、細胞分化因子、サイトカイン及びケモカインを含む。免疫増強剤及び処置の更なる例は、細胞増殖障害に対する抗体を発現し、又は細胞増殖障害に対する免疫応答を開始するリンパ球、形質細胞、マクロファージ、樹状細胞、ＮＫ細胞及びＢ細胞などの免疫細胞を含む。免疫原性を亢進又は刺激するサイトカインは、これも免疫増強剤の非限定例であるＩＬ−２、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−７、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α及びＴＮＦβを含む。ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＤＦ−１、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、エオタキシン、エオタキシン−２、Ｉ−３０９／ＴＣＡ３、ＡＴＡＣ、ＨＣＣ−１、ＨＣＣ−２、ＨＣＣ−３、ＰＡＲＣ、ＴＡＲＣ、ＬＡＲＣ／ＭＩＰ−３α、ＣＫβ、ＣＫβ６、ＣＫβ７、ＣＫβ８、ＣＫβ９、ＣＫβ１１、ＣＫβ１２、Ｃ１０、ＩＬ−８、ＥＮＡ−７８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＣＰ−２、ＰＢＰ／ＣＴＡＰＩＩＩβ−ＴＧ／ＮＡＰ−２、Ｍｉｇ、ＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１及びリンホタクチンを含むケモカインは、免疫増強剤の更なる非限定例である。
【０１７７】
本発明の方法は、特に、別の処置プロトコル又は治療レジメン、プロセス又は治療の必要性又は使用の低減をもたらす方法も含む。例えば、新生物、腫瘍若しくは癌又は転移に対し、本発明の方法は、所与の被験体において抗細胞増殖（例えば、抗新生物、抗腫瘍又は抗癌）又は免疫増強処置若しくは治療、例えば、化学療法剤、放射線療法、免疫療法、或いは新生物、腫瘍若しくは癌又は転移の手術処置又は治療の低頻度若しくは減少用量又は排除をもたらす場合、治療有益性を有する。
【０１７８】
本発明に従って、抗細胞増殖（例えば、抗新生物、抗腫瘍、抗癌又は抗転移）処置又は治療の必要性又は使用を低減する方法が提供される。一実施形態では、方法は、細胞過剰増殖障害（例えば、新生物、腫瘍若しくは癌又は転移）を処置し、且つ抗細胞増殖（抗新生物、抗腫瘍若しくは抗癌又は抗転移）又は免疫増強療法の必要性を低減又は排除するのに有効な量にて、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質に結合する抗体を被験体に投与する工程を含む。該方法は、抗新生物、腫瘍、癌若しくは転移又は免疫増強療法の施行前、施行と実質的に同時又は施行後に実施されうる。
【０１７９】
治療有益性又は改善を達成することが所望される処置又は治療の方法における用量又は「有効量」若しくは「十分量」は、例えば、標的（例えば、細胞過剰増殖障害）と関連し、又はそれによって引き起こされる１つ、複数又はすべての病変、有害症状又は合併症の測定可能又は検出可能な程度の主観的又は客観的緩和若しくは改善を含むが、標的（例えば、細胞過剰増殖障害）病変、有害症状又は合併症の進行又は悪化の阻止、抑制又は遅延が良好な転帰である。従って、細胞過剰増殖障害の場合、用量は、所与の被験体に治療有益性を与え、又は所与の被験体における該障害の病変、有害症状若しくは合併症を緩和又は改善するのに十分である。用量は、処置若しくは治療標的（例えば、細胞過剰増殖障害）の状態又は処置若しくは治療の何らかの副作用に示されるように比例的に増減されうる。
【０１８０】
例示的な非限定量（用量）は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの範囲及びその範囲内の任意の数値若しくは範囲若しくは値である。より多い又は少ない量（用量）、例えば、０．０１〜５００ｍｇ／ｋｇ及びその範囲内の任意の数値若しくは範囲若しくは値が投与されうる。更なる例示的な非限定量（用量）は、約０．５〜５０ｍｇ／ｋｇ、１．０〜２５ｍｇ／ｋｇ、１．０〜１０ｍｇ／ｋｇ及びその範囲内の任意の数値若しくは範囲若しくは値に及ぶ。
【０１８１】
本発明の方法は、１日、１週又は１年当たり１回又はそれ以上の回数（例えば、１〜１０、１〜５又は１〜３回）、実施されうる。当業者は投与を遅延又は中止することがいつ適切であるかを理解する。例示的な非限定的投与計画は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０又はそれ以上の週数、１週当たり１〜７回及びその範囲内の任意の数値若しくは範囲若しくは値である。
【０１８２】
当然ながら、いずれの処置又は治療についても典型的であるように、異なる被験体は処置に対する異なる応答を示し、一部は特定の処置プロトコル、レジメン又はプロセスに応答しえず、又は不適切に反応しうる。従って、有効又は十分な量は、処置対象障害（例えば、細胞過剰増殖、良性過形成又は新生物、腫瘍若しくは癌及びタイプ若しくは病期、例えば、腫瘍若しくは癌のグレード及び、進行性の場合、後期若しくは初期）、所望の治療効果、並びに個々の被験体（例えば、被験体におけるバイオアベイラビリティ、性別、年齢など）及び遺伝的且つエピジェネティックな変異（例えば、薬理ゲノム学）に基づく処置に対する被験体の応答に少なくとも部分的に依存する。
【０１８３】
細胞毒性及び生存性（細胞アポトーシス、溶解、成長増殖など）は、当該技術分野において公知の比色分析、発光、放射分析又は蛍光分析アッセイに基づき、種々の方法にて測定されうる。細胞生存度を測定するための比色分析法は、例えば、トリパンブルー排除を含む（例えば、実施例１及び２参照）。簡潔に述べると、細胞はトリパンブルーで染色され、血球計を用いて計数される。生存細胞はその色素を排除し、一方、死滅細胞及び死細胞は青色色素を取り込み、光学顕微鏡下にて容易に識別される。ニュートラルレッドは生存細胞によって吸収され、細胞リソソームに凝縮する。生存細胞はニュートラルレッドで染色された細胞の数を定量することにより、光学顕微鏡で定量することができる。
【０１８４】
細胞生存度を定量するための蛍光分析法は、例えば、ヨウ化プロピジウム、蛍光ＤＮＡ挿入剤を含む。ヨウ化プロピジウムは生存細胞から排除されるが、死細胞の核を染色する。そして、ヨウ化プロピジウム標識細胞のフローサイトメトリーを用いて、生存細胞及び死細胞を定量することができる。乳酸脱水素酵素（ＬＤＬ）の放出は細胞の構造損傷及び死滅を示し、分光学的酵素アッセイによって測定されうる。ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）は新たに合成されたＤＮＡに取り込まれ、蛍光色素標識抗体で検出されうる。蛍光色素ヘキスト３３２５８はＤＮＡを標識化し、細胞の増殖を定量するために用いられうる（例えば、フローサイトメトリー）。蛍光色素カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ又はＣＦＤＡ−ＳＥ）の量的取込みは、細胞分裂分析を供することができる（例えば、フローサイトメトリー）。この技法はインビトロ又はインビボにて用いられうる。７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）は、ＤＮＡとの会合後にスペクトルシフトを受ける蛍光挿入剤であり、細胞分裂分析を供することができる（例えば、フローサイトメトリー）。
【０１８５】
細胞増殖を定量するための放射分析法は、例えば、［３Ｈ］−チミジンを含み、これは、生細胞の新たに合成されたＤＮＡに取り込まれ、細胞の増殖を定量するために高頻度に用いられる。死細胞からのクロム（５１Ｃｒ）放出は、細胞生存度を定量するため、シンチレーション計数によって定量されうる。
【０１８６】
細胞生存度を定量するための発光法は、例えば、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ発光細胞生存度アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）を含む。この技法では、生存細胞数を測定するため、存在するＡＴＰの量を定量化する。
【０１８７】
細胞生存度及び細胞増殖を測定するための市販キットは、例えば、細胞増殖Ｂｉｏｔｒａｋ  ＥＬＩＳＡ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）；蛍光試薬の取込み差に基づく迅速細胞計数及び生存度測定を供するＧｕａｖａ  ＶｉａＣｏｕｎｔ（商標）アッセイ（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カリフォルニア州ヘイワード（Ｈａｙｗａｒｄ））；ＣｙＱＵＡＮＴ（登録商標）細胞増殖アッセイキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、オレゴン州ユージーン（Ｅｕｇｅｎｅ））；並びにＣｙｔｏＬｕｘアッセイキット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ボストン）を含む。ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）アッセイキット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ボストン）は、時間分解蛍光分析法を用いて細胞増殖及び生存度を測定することができる。Ｑｕａｎｔｏｓ（商標）細胞増殖アッセイは、溶解細胞由来のＤＮＡ−色素複合体の蛍光を測定する蛍光ベースのアッセイである（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、カリフォルニア州ラ・ホーヤ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ））。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ細胞生存度アッセイは、細胞生存度を測定するための発光アッセイである（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ））。
【０１８８】
「被験体」及び「患者」という用語は本明細書で互換的に用いられ、動物、典型的には哺乳動物、例えば、ヒト、非ヒト霊長動物（ゴリラ、チンパンジー、オランウータン、マカク、テナガザル）、家畜（イヌ及びネコ）、農場及び牧場動物（ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ）、実験室及び実験動物（マウス、ラット、ウサギ、モルモット）を指す。被験体は、インビボでの有効性を検討するための（例えば、マウス、ラット、及び非ヒト霊長類）疾患モデル動物（例えば、新生物、腫瘍若しくは癌又は転移動物モデル）を含む。ヒト被験体は、小児、例えば、１〜５歳、５〜１０歳及び１０〜１８歳の新生児、乳幼児、幼児及び十代、１８〜６０歳の成人並びに、例えば、６０〜６５歳、６５〜７０歳及び７０〜１００歳の高齢者を含む。
【０１８９】
被験体は処置を必要とする哺乳動物（例えば、ヒト）を含み、即ち、被験体は、望ましくない、若しくは異常な細胞増殖（細胞過剰増殖）又は細胞過剰増殖障害を有する。被験体は、細胞過剰増殖障害を有する危険性がある（例えば、細胞過剰増殖障害になる傾向がある、望ましくない細胞増殖を示す）被験体、下述のような処置を行う正当な理由を有する検査又は臨床診断により、抗細胞増殖又は免疫増強処置若しくは治療の候補被験体或いはそれを必要とする被験体、抗細胞増殖又は免疫増強治療を受けている被験体、並びに抗細胞増殖又は免疫増強治療を受けたことがあって再燃又は再発の危険性がある被験体を含む。
【０１９０】
危険性がある被験体は、家族歴、遺伝性素因を有する被験体又は細胞増殖若しくは細胞過剰増殖障害（例えば、良性過形成、新生物、腫瘍若しくは癌又は転移）により過去に苦痛を受けたことがあって再燃若しくは再発の危険性がある被験体を含む。危険性がある被験体は、喫煙者などの発癌性物質若しくは突然変異原への環境暴露又は職業（工業、化学、農業）環境にある被験体を更に含む。新生物、腫瘍又は癌などの細胞増殖又は細胞過剰増殖障害を発症する危険性があるそのような被験体は、腫瘍関連遺伝子、遺伝子欠失又は遺伝子変異の遺伝子スクリーニングで同定されうる。例えば、Ｂｒｃａ１を欠く被験体は乳癌を発症する危険性がある。例えば、結腸癌を発症する危険性がある被験体は、大腸腺腫様ポリポーシス（ＡＰＣ）などの腫瘍抑制遺伝子を欠失し、又は変異させている。細胞増殖障害に対する特定の遺伝性素因を有する危険性がある被験体は公知である（例えば、Ｂｅｒｔ  Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ（編）、Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｗ．Ｋｉｎｚｌｅｒ（編）、Ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  第２版（２００２）ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ；Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｃａｎｃｅｒ，ＷＢ  Ｃｏｌｅｍａｎ及びＧＪ  Ｔｓｏｎｇａｌｉｓ（編）（２００１）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ社；並びにＴｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎら、ＷＢ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ社（１９９５）参照）。
【０１９１】
従って、危険性がある被験体は、細胞増殖若しくは細胞過剰増殖障害を発症する可能性を抑制若しくは低減するために処置され得、又は、細胞増殖障害が治癒した後、同じ若しくは異なる細胞増殖若しくは細胞過剰増殖障害の再燃若しくは再発を患っている可能性がある。そのような処置の結果は、処置された危険性がある被験体において細胞増殖又は細胞過剰増殖障害を発症する危険性を低減し、或いは細胞増殖又は細胞過剰増殖障害又はその病変、有害症状若しくは合併症を阻止することでありうる。
【０１９２】
本発明は、蛋白質（例えば、抗体）、核酸、薬剤、薬物及び医薬製剤を含み、好適な包装材にパッケージングされ、任意に、キットの構成要素を使用するための取扱説明書、例えば、本発明の方法を実施するための取扱説明書と組み合わせたキットを更に提供する。一実施形態では、キットは、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質に結合する抗体及びＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質を検出するための取扱説明書を含む。別の実施形態では、キットは、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質に結合する抗体若しくは阻害性核酸、及びＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質若しくはＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質核酸に結合する抗体又は阻害性核酸で処置可能な状態を処置するための取扱説明書を含む。一態様では、該取扱説明書は、望ましくない細胞増殖若しくは過剰増殖又は細胞過剰増殖障害を処置するためのものである。別の態様では、該取扱説明書は、新生物、腫瘍若しくは癌又は転移を処置するためのものである。更なる実施形態では、キットは、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質に結合する抗体、望ましくない細胞増殖若しくは過剰増殖又は細胞過剰増殖障害を処置するための取扱説明書、並びに抗細胞増殖又は免疫増強処置、薬剤若しくは薬物を含む。種々の態様において、キットは、抗新生物剤、抗癌剤又は抗腫瘍剤を含む。なお更なる態様では、キットは、製品、例えば、抗体又は核酸、抗細胞増殖又は免疫増強処置、薬剤若しくは薬物を被験体に対して局所、局部又は全身に送達するための製品を含む。
【０１９３】
「包装材」という用語は、該キットの構成要素を収容する物理的構造を指す。該包装材は該構成要素を無菌的に維持することができ、そのような目的のために一般的に用いられる材料（例えば、紙、波形繊維、ガラス、プラスチック、ホイル、アンプルなど）で作製されうる。例えば、ラベル又は添付文書は、例えば、細胞増殖又は細胞過剰増殖障害を処置する本発明の方法、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質又はＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質核酸などをスクリーニング、検出又は同定するためのアッセイを実施する、適切な取扱説明書を含みうる。従って、更なる実施形態では、キットは、溶液中、インビトロ、インビボ又はエキソビボにて本発明の方法を実施するための取扱説明書を含むラベル又は添付文書を含む。
【０１９４】
従って、取扱説明書は、本明細書で述べられる本発明の任意の方法を実施するための取扱説明書を含みうる。例えば、本発明の医薬組成物は、細胞増殖又は細胞過剰増殖障害、例えば、新生物、腫瘍若しくは癌又は転移を処置するため、患者への投与のための取扱説明書と共に容器、パック又はディスペンサに含まれうる。取扱説明書は、良好な臨床エンドポイント又は生じうるすべての有害症状若しくは合併症の指標、保管情報、使用期限或いは、ヒト被験体で用いるために、米国食品医薬品局などの規制機関によって必要とされる任意の情報を更に含みうる。
【０１９５】
取扱説明書は、キット内の印刷物、例えば、紙若しくはボール紙、キット若しくは包装材に貼付され、又はキットの構成要素を含むバイアル若しくはチューブに添付されたラベルに記載されうる。取扱説明書はボイス又はビデオテープを含み得、更に、コンピュータ読取り可能媒体、例えば、ディスク（フロッピー（登録商標）ディスク又はハードディスク）、ＣＤなどの光学ＣＤ又はＤＶＤ−ＲＯＭ／ＲＡＭ、磁気テープ、電気記憶媒体、例えば、ＲＡＭ及びＲＯＭ並びに磁気／光記憶媒体などのこれらの混成物に含まれうる。
【０１９６】
本発明のキットは、緩衝剤、防腐剤又は蛋白質／核酸安定剤を更に含みうる。キットは、活性をアッセイするための対照要素、例えば、対照試料又は基準物も含みうる。キットの各構成要素は個々の容器内に、又は混合して封入され得、すべての種々の容器は単一又はマルチパッケージ内にありうる。
【０１９７】
本発明の蛋白質（例えば、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質）、抗体（例えば、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質抗体）核酸、並びに他の組成物及び方法は医薬製剤に含まれ得、又は医薬製剤を用いることができる。そのような医薬製剤はインビボ又はエキソビボでの被験体の処置又は被験体への投与若しくは送達に有用である。
【０１９８】
医薬製剤は「医薬的に許容可能な」及び「生理的に許容可能な」担体、希釈剤若しくは賦形剤を含む。本明細書で用いられるように、「医薬的に許容可能な」及び「生理的に許容可能な」という用語は、薬剤投与と適合する溶媒（水性又は非水性）、溶液、乳剤、分散媒、被覆剤、等張剤及び吸収促進若しくは遅延剤を含む。そのような製剤は、液体；乳剤、懸濁液、シロップ若しくはエリキシル又は固形形態；錠剤（コーティング又は非コーティング）、カプセル（ハード又はソフト）、粉末、顆粒、結晶若しくはマイクロビーズに含まれうる。補助化合物（例えば、防腐剤、抗菌剤、抗ウイルス剤及び抗真菌剤）も製剤に組み込まれうる。
【０１９９】
医薬製剤は、特定の局所、局部又は全身投与若しくは送達経路と適合するように作製されうる。従って、医薬製剤は、特定の経路による投与に好適な担体、希釈剤又は賦形剤を含む。本発明の組成物の投与経路の具体的な非限定例は、非経口、例えば、静脈内、動脈内、皮内、筋内、皮下、胸膜内、経皮（局所）、経粘膜、頭蓋内、髄腔内、眼球内、直腸、経口（消化管）、粘膜投与及び処置方法若しくは投与プロトコルに好適な他の任意の処方である。
【０２００】
非経口用途に用いられる溶液又は懸濁液は、滅菌希釈剤、例えば、注射用水、食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール若しくは他の合成溶媒；抗菌剤、例えば、ベンジルアルコール若しくはメチルパラベン；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸若しくは亜硫酸水素ナトリウム；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；緩衝剤、例えば、アセタート、シトラート若しくはホスフェート及び等張調整剤、例えば、塩化ナトリウム若しくはデキストロースを含みうる。ｐＨは塩酸又は水酸化ナトリウムなどの酸又は塩基で調整することができる。
【０２０１】
注射用医薬製剤は、滅菌水性溶液（水溶性）又は分散液及び滅菌注射用溶液又は分散液の即時調製用の滅菌粉末を含む。静脈内投与では、好適な担体は、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ社、ニュージャージー州Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ）又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含む。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど）及びその好適な混合物を含む溶媒又は分散媒でよい。流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散液の場合、必要な粒子サイズの維持により、そして、界面活性剤の使用により維持されうる。抗菌及び抗真菌剤は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸及びチメロサールを含む。等張剤、例えば、糖類、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムは組成物中に含まれうる。吸収を遅延させる作用物、例えば、モノステアリン酸アルミニウム又はゼラチンは、注射用組成物の吸収を延長することができる。
【０２０２】
滅菌注射用製剤は、上記成分の１つ又はその組合せと共に、必要量にて活性組成物を適切な溶媒に組み込むことによって調製することができる。一般的に、分散液は、塩基性分散媒及び他の任意の成分を含む滅菌ビヒクルに活性組成物を組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液の調製用の滅菌粉末の場合、調製方法は、例えば、活性成分と事前に調製されたその溶液由来の任意の追加所望成分との粉末を生じさせる真空乾燥及び凍結乾燥を含む。
【０２０３】
経粘膜又は経皮投与では、透過すべきバリアに適切な浸透剤が製剤において用いられる。そのような浸透剤は当該技術分野において公知であり、例えば、経粘膜投与では、洗浄剤、胆汁酸塩及びフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、鼻スプレー、吸入デバイス（例えば、吸入器）又は坐剤の使用を通じて遂行されうる。経皮投与では、活性化合物は、軟膏、膏薬、ゲル、クリーム又はパッチに製剤化される。
【０２０４】
医薬製剤は、放出制御製剤又は時間遅延物質、例えば、モノステアリン酸グリセリン又はステアリン酸グリセリルなどの、体内からの速やかな排泄を防ぐ担体で調製されうる。製剤は、局所、局部若しくは全身送達又は制御若しくは持続放出を達成するため、インプラントなどの製品及びマイクロカプセル化送達システムを用いて送達することもできる。
【０２０５】
生体分解性、生体適合性ポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルソエステル及びポリ乳酸が用いられうる。そのような製剤の調製方法は当業者には周知である。材料はＡｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（カリフォルニア州パロアルト（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ））から商業的に得ることもできる。リポソーム懸濁液（抗体又はウイルスコート蛋白質を用いて細胞又は組織に標的化されるリポソームを含む）も医薬的に許容可能な担体として用いられうる。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に述べられているように、公知の方法に従って調製されうる。
【０２０６】
投与に適切な更なる医薬製剤が当該技術分野において公知である（例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ（編）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ社（２０００）；Ａｎｓｅｌら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、第７版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ社（１９９９）；Ｋｉｂｂｅ（編）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、第３版（２０００）；及びＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｓｏｌｉｄ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｔｅｃｈｎｏｎｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．、ペンシルベニア州ランカスター（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ）（１９９３）参照）。
【０２０７】
蛋白質（抗体）、核酸（阻害性）、処置、治療、薬剤、薬物及び医薬製剤を含む、本発明に従って用いられる組成物は、投与容易性及び用量均一性のため、用量単位形態にてパッケージングされうる。本明細書で用いられる「用量単位形態」とは、単一用量処置として適した物理的に別個の単位を指し、各単位は、所望の処置又は治療（例えば、有益性）効果を生じさせるように計算された担体、賦形剤、希釈剤又はビヒクルと関連した組成物量を含む。用量単位形態は、特定の使用組成物、達成されるべき効果並びに処置対象被験体の薬物力学及び薬理ゲノミクスを含むがこれに限定されない種々の因子に依存する。
【０２０８】
本発明は、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質をスクリーニング、検出及び同定する、細胞非含有（例えば、溶液中、固相にて）及び細胞ベースの（例えば、インビトロ又はインビボ）方法を提供する。該方法は、生物学的な物質又は試料を用いてインビトロにて溶液中で、また、例えば、動物由来の新生物、腫瘍若しくは癌又は転移細胞、組織若しくは臓器（例えば、生検）を用いてインビボにて実施することができる。
【０２０９】
本発明に従って、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質を同定、検出又はスクリーニングする方法並びにＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質配列をコードする核酸又はその一部を同定、検出又はスクリーニングする方法が提供される。一実施形態では、方法は、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質への抗体の結合を可能にする条件下にて生物学的な物質又は試料をＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質に結合する抗体と接触させる工程と、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質への抗体の結合をアッセイする工程とを含む。抗体のＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質への結合により、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質の存在が検出される。別の実施形態では、方法は、核酸へのポリヌクレオチドの結合を可能にする条件下にて生物学的な物質又は試料をＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質配列をコードする核酸又はその一部とハイブリダイズするポリヌクレオチドと接触させる工程と、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質への抗体の結合をアッセイする工程とを含む。核酸へのポリヌクレオチドの結合により、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質の存在が検出される。一態様では、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質は細胞又は組織上に存在する。別の態様では、生物学的な物質又は試料は哺乳動物被験体から得られる。更なる態様では、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質に結合する抗体はＳＡＭ−６抗体と異なる。
【０２１０】
本発明は、望ましくない若しくは異常な細胞増殖又は細胞過剰増殖障害（例えば、新生物、腫瘍若しくは癌又は転移）を有し、或いはそれを有する危険性が高い被験体を診断する、細胞不含（例えば、溶液中、固相中）及び細胞ベースの（例えば、インビトロ又はインビボ）方法も提供する。該方法は、生物学的な物質又は試料、例えば、新生物、腫瘍若しくは癌又は転移細胞、組織若しくは臓器を含み得、或いはそれを示しうる疑わしい細胞の生検を用いてインビトロにて溶液中で実施することができる。該方法は、例えば、動物においてインビボにて実施することもできる。
【０２１１】
本発明に従って、望ましくない、若しくは異常な細胞増殖又は細胞過剰増殖障害（例えば、新生物、腫瘍若しくは癌又は転移）を有し、或いはそれを有する危険性が高い被験体を診断する方法が提供される。一実施形態では、方法は、被験体由来の生物学的な物質又は試料を提供する工程と、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質への抗体の結合を可能にする条件下にて該生物学的な物質又は試料をＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質に結合する抗体と接触させる工程と、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質への抗体の結合をアッセイする工程とを含む。ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質への抗体の結合により、被験体は、望ましくない若しくは異常な細胞増殖又は細胞過剰増殖障害（例えば、新生物、腫瘍若しくは癌又は転移）を有し、或いはそれを有する危険性が高いと診断される。一態様では、生物学的な物質又は試料はヒトから得られる。別の態様では、生物学的な物質又は試料は生検を含む（例えば、肺、膵臓、胃、乳房、食道、卵巣又は子宮の生検）。
【０２１２】
本発明の同定、検出、スクリーニング及び診断アッセイは、疑わしい過剰増殖細胞、例えば、細胞過剰増殖障害の細胞の分析によって実施されうる。細胞は、過剰増殖、不死化新生物、腫瘍及び癌細胞株並びに乳房、肺、甲状腺、頭頸部、鼻咽頭、鼻若しくは洞、脳、脊椎、副腎、甲状腺、リンパ、消化管（口、食道、胃、十二指腸、回腸、空腸（小腸）、結腸、直腸）、尿生殖路（子宮、卵巣、子宮頸部、膀胱、精巣、陰茎、前立腺）、腎臓、膵臓、副腎、肝臓、骨、骨髄、リンパ、血液、筋肉、皮膚及び造血系由来の一次分離株並びに転移又は二次部位を含む。
【０２１３】
蛋白質（例えば、抗体）、材料、試料などの組成物又は処置と関連して用いられる場合の「接触させる」という用語は、組成物（例えば、抗体などの蛋白質）と他の言及物との直接的又は間接的相互作用を意味する。直接的相互作用の特定の例は結合である。間接的相互作用の特定の例は、組成物が中間分子に作用し、次に、これが言及物に作用する場合である。従って、細胞（例えば、細胞過剰増殖障害を含む）を抗体と接触させることは、抗体を細胞に結合させ（例えば、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質を通じて）、又は抗体を中間物に作用させ、次に、これが細胞に作用することを含む。
【０２１４】
「アッセイする」及び「測定する」という用語並びにその文法的変形は、本明細書で互換的に用いられ、質的又は量的測定、或いは質的及び量的測定の両方を指す。該用語が結合に関連して用いられる場合、本明細書で示され、又は当該技術分野において公知の種々の方法を含む、結合の相対量、親和性又は特異性を評価する如何なる手段も検討される。例えば、抗体結合はＥＬＩＳＡアッセイによって分析又は測定することができる。
【０２１５】
別記しない限り、本明細書で用いられるすべての技術及び科学用語は、本発明が関連する当業者に一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書で述べられるものと同様又は同等の方法及び材料が、本発明の実施又は試験において用いられうるが、好適な方法及び材料は本明細書で述べられる。
【０２１６】
国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ／２００４／０１２９７０号（公開ＷＯ２００５／０４７３３２Ａ１）及び第ＰＣＴ／ＤＥ／２００４／００２５０３号（公開ＷＯ２００５／０４９６３５Ａ２）は、その全体を参照して本明細書に明示的に組み込まれる。本明細書で引用されるすべての他の刊行物、特許、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号及び他の参考文献は、その全体を参照して組み込まれる。矛盾する場合、定義を含めて本発明の明細書が統制する。
【０２１７】
本明細書で用いられるように、単数形「１つの（ａ）」、「及び（ａｎｄ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈上で他に明確に示さない限り、複数の指示対象を含む。従って、例えば、「１つの糖蛋白質」又は「抗体」への言及は、複数の糖蛋白質又は抗体を含み、「１回の処置又は治療」への言及は、多数又は連続の処置又は治療などを含みうる。
【０２１８】
本明細書で用いられるように、すべての数値又は数値範囲は、文脈上で他に明確に示さない限り、そのような範囲内又は該範囲を包含する全整数、及び範囲内若しくは該範囲を包含する値又は整数の端数を含む。従って、例えば、９０〜１００％の範囲への言及は、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５％、９７％など及び９１．１％、９１．２％、９１．３％、９１．４％、９１．５％など、９２．１％、９２．２％、９２．３％、９２．４％、９２．５％などを含む。例えば、１〜５，０００倍の範囲への言及は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０倍など及び１．１、１．２、１．３、１．４、１．５倍など、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５倍などを含む。
【０２１９】
概して、本発明は、多くの実施形態について述べるため、断定的な言語を用いて本明細書で開示される。本発明は、特定の主題、例えば、物質又は材料、方法の工程及び条件、プロトコル、手順、アッセイ又は分析が完全又は部分的に除外される実施形態を具体的に含む。従って、概して、本発明は、本発明が含まないものに関して本明細書で述べられないが、本発明に明示的に含まれない態様はそれにもかかわらず開示される。
【０２２０】
以下は炭水化物構造及びそれらの構造の略記の表である。
【０２２１】
【表１−１】
2010510772.tif 000010
【０２２２】
【表１−２】
2010510772.tif 000011
【０２２３】
【表１−３】
2010510772.tif 000012
本発明の多くの実施形態について述べてきた。しかし、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、様々な改変がなされうることが理解されるであろう。従って、以下の実施例は特許請求の範囲に示される本発明の範囲を例示するものであるが、限定するものではない。
【実施例】
【０２２４】
（実施例１）
本実施例では種々の典型的な材料及び方法について述べる。
【０２２５】
細胞培養
１０％熱不活性化ＦＣＳ（ＰＡＡ社、オーストリア、ウィーン）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン及びペニシリン／ストレプトマイシン（共に１％、ＰＡＡ社）が補充されたＲＰＭＩ１６４０（ＰＡＡ社、オーストリア・ウィーン）で、ヒト膵臓癌細胞株ＢＸＰＣ−３及びヒト胃腺癌細胞株２３１３２／８７を培養した。ＡＩＭ／Ｖ血清不含培地（（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ドイツＫａｒｌｓｒｕｈｅ）での細胞培養フラスコ（１７５ｃｍ２）内でＳＡＭ−６抗体産生ハイブリドーマ細胞を増殖させた。すべての細胞を７％ＣＯ２の加湿大気中にて３７℃でインキュベートした。
【０２２６】
ＳＡＭ−６抗体の精製
ＳＡＭ−６抗体の精製のため、細胞培養上清を回収し、高速液体クロマトグラフィ装置（ＦＰＬＣ）を用いた陽イオン交換カラム（ＨｉＴｒａｐ  ＳＰ  ＦＦカラム、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、ドイツＦｒｅｉｂｕｒｇ）を介して精製した。開始緩衝液（２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．９））によるカラム平衡化後、細胞培養上清（同ｐＨ）をカラムに添加した。非結合蛋白質は開始緩衝液で溶出し、一方、結合抗体は７５％溶出緩衝液（２０ｍＭリン酸緩衝液、１Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））で塩分濃度の上昇によって移動した。画分を含む抗体を０．９％塩化ナトリウムで希釈し、滅菌濾過し、使用するまで−７０℃で保存した。抗体の純度をＳＤＳゲル電気泳動により求め、活性を免疫組織化学（ｉｍｍｕｎｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）及び機能アッセイにより確認した。
【０２２７】
腫瘍細胞膜抽出物の調製（抗原精製用）
ＳＡＭ−６抗原（ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質）の精製のため、ＰｒｏｔｅｏＥｘｔｒａｃｔ（商標）天然膜蛋白質抽出キット（Ｍ−ＰＥＫ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、ドイツＤａｒｍｓｔａｄｔ）を用いて、ヒト胃腺癌細胞株２３１３２／８７から膜蛋白質を単離した。内在性膜結合蛋白質の天然２工程抽出の全手順を４℃又は氷上で実施した。必要な緩衝液及び試薬はすべてＭ−ＰＥＫに備わっていた。
【０２２８】
３〜５×１０６個の腫瘍細胞（凍結細胞ペレット）を２ｍｌの氷冷洗浄緩衝液で２回洗浄した。３００×ｇ及び４℃で１０分の遠心分離後、該ペレットを攪乱せずに上清を除去し、廃棄した。１０μｌのプロテアーゼ阻害剤カクテルを含む２ｍｌの氷冷抽出緩衝液中に該ペレットを慎重に再懸濁させた。ロータリーシェーカ上での穏やかな攪拌下、４℃で１０分のインキュベーション後、１６，０００×ｇ及び４℃で１５分間の遠心分離により不溶性物質を沈降させた。対照目的に、可溶性蛋白質に富む上清のアリコートを、細胞層を攪乱せずに試料管に移した。残余画分を廃棄した。第２の抽出工程において、５μｌの蛋白質阻害剤カクテルを含む１ｍｌの抽出緩衝液ＩＩを工程Ｉのペレットに加え、ピペットを用いて慎重に混合し、穏やかな攪拌下、４℃で３０分間インキュベートした。１６，０００×ｇ及び４℃で１５分間、不溶性物質を遠心分離した。今や内在性膜及び膜結合蛋白質に富む上清を、破片ペレットを攪乱せずに新たな試料管に完全に移した。ウシ血清アルブミンを基準として用いたＢＣＡ法による蛋白質含量の測定後、アリコートを−２０℃で保存した。
【０２２９】
ウエスタンブロット分析
標準プロトコルを用いて膜蛋白質の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（８％）及びウエスタンブロッティングを実施した。要するに、ブロットされた０．２μｍのニトロセルロース膜を、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０及び５％（ｗ／ｖ）低脂肪粉乳を含むＰＢＳでブロックし、次に、２０μｇ／ｍｌのＳＡＭ−６ヒトＩｇＭ抗体又は無関連ヒト対照ＩｇＭ（Ｃｈｒｏｍｐｕｒｅ  ＩｇＭ、Ｄｉａｎｏｖａ社、ドイツ・ハンブルク）と１時間インキュベートした。Ｐｉｅｒｃｅ社（Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ、ドイツ・ボン）製ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ化学発光キットで、二次抗体（ペルオキシダーゼ結合ウサギ抗ヒトＩｇＭ抗体１：１，０００；Ｄｉａｎｏｖａ社）を検出した。
【０２３０】
ＳＡＭ−６受容体の精製
ＳＡＭ−６抗体の抗原を精製するため、Ｍ−ＰＥＫによる抽出後に腫瘍細胞株２３１３２／８７から得られた膜画分を用いた。精製の第１工程では、サイズ排除クロマトグラフィを用いた。スーパーループシステム及び高速蛋白質液体クロマトグラフィ装置（ＦＰＬＣ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、ドイツＦｒｅｉｂｕｒｇ）を用いて１ｍｌ／分の流量にて１０ｍｌのＭ−ＰＥＫ抽出物（１ｍｇ／ｍｌ）をＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＸＫ１６／６０；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、スウェーデンＵｐｐｓａｌａ）に注入した。カラムを緩衝液Ａ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、４０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）で事前に平衡化し、２ｍｌ／分の流量にて同じ緩衝液で溶出した。各々２ｍｌの画分を回収し、ＳＡＭ−６受容体活性のピークに対応する画分を結合し、平衡化陰イオン交換カラム（ＨｉＴｒａｐ（商標）Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｑ  ＸＬ，５ｍｌ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、スウェーデンＵｐｐｓａｌａ）に添加した。非結合要素は緩衝液Ａで溶出し、一方、結合蛋白質は緩衝液Ｂ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を用いて線形ステップ勾配を介して塩濃度の上昇によって放出された。
【０２３１】
この場合も２ｍｌ／分の流量を用い、２ｍｌの画分を回収し、２８０ｎｍにてモニタリングした。−２０℃で一晩、アセトン沈殿を介して溶出液を濃縮した後、蛋白質ペレットを１×ＳＤＳ緩衝液中に溶解させ、ＳＡＭ−６抗体との反応についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット分析により検討した。陽性バンドをクーマシー染色ゲルから切り取り、配列決定した。
【０２３２】
ペプチド質量マッピングによる蛋白質の同定
ＴｏｐＬａｂ（ドイツＭａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ）により、蛋白質配列決定を行った。クーマシー染色による一次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、推定分子量８０ｋＤａを有する蛋白質バンドを切り取り、ヨードアセトアミドによる還元及びアルキル化後、バンドをトリプシンでゲル中消化した。トリプシンペプチドのプールを、ＺｉｐＴｉｐＣ１８を介して脱塩し、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析法（Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ  ＳＴＲ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、米国カリフォルニア州）により分析し、次に、データバンクリサーチを行った（Ｐｒｏｆｏｕｎｄ及びＭａｓｃｏｔ対ＮＣＢＩ）。Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌを用いて、最適マッチング蛋白質候補物質のヒット（１．００の確率）を比較した。
【０２３３】
Ｇｒｐ７８の低分子干渉ＲＮＡによるトランスフェクションの検討
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によるトランスフェクション後、ＳＡＭ−６受容体結合の検討について細胞株ＢＸＰＣ−３を用いた。標的分子Ｇｒｐ７８をサイレンシングするための事前設計且つ実証されたｓｉＲＮＡである、ヒトＨＳＰＡ５に対するＳｉＧＥＮＯＭＥ  ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ試薬をＤｈａｒｍａｃｏｎ社（米国コロラド州ラファイエット（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ））から購入した。ｓｉＲＮＡ導入によって生じる遺伝子発現に対する非特異的作用の対照として、Ｓｉｌｅｎｃｅｒ（商標）陰性対照をＡｍｂｉｏｎ社（英国ケンブリッジ）から購入した。
【０２３４】
更なる対照として、疑似トランスフェクト（ｓｉＲＮＡを含まない）及び非処理細胞（完全ＲＰＭＩ−１６４０で増殖され、トランスフェクトされない）が機能した。ｓｉＲＮＡのトランスフェクションでは、ｓｉＬｅｎｔＦｅｃｔ（商標）脂質（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｒａｔｏｒｉｅｓ社、米国カリフォルニア州）を用いた。加えて、細胞へのｓｉＲＮＡのトランスフェクションを制御するため、Ｓｉｌｅｎｃｅｒ  ＣＹ３  ＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ社、英国ケンブリッジ）をトランスフェクトし、共焦点顕微鏡法を用いて検証した。トランスフェクションの前日、１ウェル当たり１ｍｌの完全増殖培地にて２４ウェルプレートに１×１０４個の細胞を播種した（翌日、集密度５０％）。プレートを３７℃で一晩且つトランスフェクションの３０分前に７％ＣＯ２でインキュベートし、培地を１ウェル当たり０．４ｍｌの新鮮且つ完全な培地に慎重に置き換えた。各ウェルに対して１００μｌのトランスフェクション混合物を調製し、細胞に加えた。混合物は、室温で２０分間のインキュベーション後、４９μｌの血清不含ＯｐｔｉＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ドイツＫａｒｌｓｒｕｈｅ）、５０μｌのｓｉＲＮＡと組み合わせた１μｌのｓｉＬｅｎｔＦｅｃｔ（商標）脂質からなった。ＳｉＧＥＮＯＭＥ  ＳＭＡＲＴｐｏｏｌの最終濃度は１００ｎＭであり、対照ｓｉＲＮＡの２５ｎＭであった。トランスフェクト細胞を３７℃及び７％ＣＯ２大気で２４、４８及び７２時間にわたってインキュベートした。指示時間後、Ｇｒｐ７８のノックダウンをＦＡＣＳ分析によりモニタリングした。
【０２３５】
ＦＡＣＳ分析によるＧｒｐ７８蛋白質のノックダウンの検出
ヒトＧＲＰ７８に対するＳｉＧＥＮＯＭＥ  ｓｉＲＮＡを腫瘍細胞株ＢＸＰＣ−３にトランスフェクトした。トリプシン／ＥＤＴＡ（ＰＡＡ社、オーストリア、ウィーン）による穏やかな剥離により、１日及び３日後に細胞を採取した。１日及び３日後、ＦＡＣＳ分析によりＧＲＰ７８の蛋白質濃度をモニタリングした。２×１０５個の細胞を、それぞれ、ＳＡＭ−６抗体（１００μｇ／ｍｌ）、抗ＧＲＰ７８抗体（１００μｇ／ｍｌ；クローンＥＴ−２１、Ｓｉｇｍａ社、ドイツＴａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ）又は抗ＣＤ５５抗体（１：５０；クローン１４３−３０、ＤＰＣ  Ｂｉｅｒｍａｎｎ社、ドイツＢａｄ  Ｎａｕｎｈｅｉｍ）と３０分間氷上でインキュベートした。無関連ヒトＩｇＭ（Ｃｈｒｏｍｐｕｒｅ  ＩｇＭ、Ｄｉａｎｏｖａ社、ドイツ、ハンブルク）及びウサギ／マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ社、ドイツＴａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ）が陰性対照として機能した。ＦＩＴＣ標識二次抗体（ウサギ抗ヒトＩｇＭ抗体、Ｄａｋｏ社、ドイツ、ハンブルク；ヤギ抗ウサギＩｇＧ又はヤギ抗マウスＩｇＧ、共にＡｃｒｉｓ社、ドイツＨｉｄｄｅｎｈａｕｓｅｎ）との１５分間のインキュベーションが引き続いた。ＷｉｎＭＤＩソフトウェアを用いたフローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｎ；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、カリフォルニア州サンノゼ）により、細胞を分析した。
【０２３６】
トランスフェクト腫瘍細胞におけるＳＡＭ−６に関するアポトーシスアッセイ
ＧＲＰ７８ｓｉＲＮＡによるトランスフェクション前後のＢＸＰＣ−３細胞における抗体誘導アポトーシスの程度を、製造業者のプロトコルに従って細胞死検出ＥＬＩＳＡＰＬＵＳ（Ｒｏｃｈｅ社、ドイツＭａｎｎｈｅｉｍ）によって検出した。トランスフェクションの４８時間後、１×１０４個の細胞を９６ウェルプレート上に播種し、１００μｇ／ｍｌのＳＡＭ−６抗体又は無関連ＩｇＭ対照（ＣｈｒｏｍｐｕｒｅヒトＩｇＭ、Ｄｉａｎｏｖａ社、ドイツ、ハンブルク）の存在下、加湿大気中にて３７℃及び７％ＣＯ２で４時間インキュベートした。正常な増殖を実証するため、細胞に完全増殖培地を補充した。
【０２３７】
腫瘍細胞膜抽出物の調製（グリコシダーゼアッセイ用）
１００ｍｍ細胞培養プレート上で細胞株ＢＸＰＣ−３を集密度８０％まで増殖させた。リン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）（ＰＢＳ）で培養プレートを２回洗浄し、ＰＢＳ中にて接着細胞を採取し、次に、１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。細胞を氷冷低張緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、３ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中に再懸濁させ、１５分間インキュベートし、次に、５分間の超音波震動を行った。１０，０００×ｇで１０分の遠心分離により、核及び細胞骨格をペレット化した。上清を、ミクロソームペレットを生じさせるためにＳＷ２８ローターにて１００，０００×ｇで３０分間遠心分離し、最終的に、改変溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；１％ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）ＮＰ−４０及び０．２５％デオキシコール酸ナトリウム）中に再懸濁させた。１６，０００×ｇで１０分間の遠心分離により、不溶性物質を除去した。破片ペレットを攪乱せずに上清を新たな試料管に移した。ウシ血清アルブミンを基準として用いたＢＣＡ法による蛋白質含量の測定後、アリコートを−２０℃で保存した。全手順を４℃又は氷上で行った。完全プロテアーゼ阻害剤錠（Ｒｏｃｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を全溶液に加えた。
【０２３８】
グリコシダーゼアッセイ
分画遠心により調製したＢＸＰＣ−３細胞の膜抽出物をグリコシル化の検討に用いた。あらゆるタイプのＮ又はＯ−結合炭水化物鎖を切断するため、９５℃で３分間、１％ドデシル硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｅｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ）及び１％  β−メルカプトエタノールを含む緩衝液中にて膜抽出物を変性させた。変性抽出物を反応緩衝液（ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、１％ノニデット（ｎｏｎｉｄｅｔ）ＮＰ−４０、１％  β−メルカプトエタノール）で０．５ｍｇ／ｍｌの最終蛋白質濃度に希釈した。Ｏ及びＮ−結合炭水化物の脱グリコシル化のため、１００μｌのアリコートを１０Ｕ  Ｎ−グリコシダーゼＦ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社、ドイツＭａｎｎｈｅｉｍ）又は５ｍＵ  Ｏ−グリコシダーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社、ドイツＭａｎｎｈｅｉｍ）と３７℃で一晩インキュベートした。反応緩衝液中の非処理抽出物が対照として機能した。ＳＤＳ−Ｐａｇｅ及びウエスタンブロッティング法により、脱グリコシル化の程度を分析した。
【０２３９】
サイトスピンにおけるグリコシダーゼアッセイ
４×１０５個のヒト膵臓癌細胞（ＢＸＰＣ−３）を洗浄し、１ｍｌのダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ）リン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．２）（Ｓｉｇｍａ社、ドイツＴａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ）中に再懸濁させた。５Ｕ／ｍｌ  Ｎ−グリコシダーゼ又は２０ｍＵ／ｍｌ  Ｏ−グリコシダーゼ（共にＲｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社、ドイツＭａｎｎｈｅｉｍ）との３７℃で４時間のインキュベーションが引き続いた。リン酸緩衝液中の非処理細胞が対照として機能した。１００μｌの対応するアリコートを洗浄し、５００ｒｐｍで２分間、カバーガラス上で回転させた。乾燥サイトスピンをアセトンで固定し、免疫組織化学的に染色した。
【０２４０】
サイトスピンの免疫組織化学的染色
乾燥サイトスピンをアセトンで（１０分）固定し、低脂肪粉乳／ＰＢＳ（４％）で３０分間ブロックした。Ｔｒｉｓ／ＮａＣｌによる洗浄後、カバーガラスを抗体ＳＡＭ−６（５０μｇ／ｍｌ）又は対照抗体で３０分間インキュベートした。陰性対照として同濃度の非処理ヒトＩｇＭ（Ｃｈｒｏｍｐｕｒｅ  ＩｇＭ、Ｄｉａｎｏｖａ社、ドイツ、ハンブルク）が、また、陽性対照として抗ＣＤ５５抗体（１：３０；クローン１４３−３０、ＤＰＣ  Ｂｉｅｒｍａｎｎ社、ドイツＢａｄ  Ｎａｕｎｈｅｉｍ）が機能した。Ｔｒｉｓ／ＮａＣｌによる洗浄後、二次抗体との３０分間のインキュベーションが引き続いた（ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ヒト又はウサギ抗マウスコンジュゲート  １：５０）。最終的なＴｒｉｓ／ＮａＣｌによる洗浄及びＰＢＳ中での１０分間のインキュベーション後、室温で１０分間、ジアミノベンジジン（０．０５％）−過酸化水素（０．０２％）で染色を行った。反応を水道水下で停止し、カバーガラスをヘマトキシリンで対比染色した。グリセロール−ゼラチンによる封入後、光学顕微鏡法を用いて脱グリコシル化の程度を視覚的に分析した。
【０２４１】
フルオレセインイソチオシアネートによるＳＡＭ−６抗体の標識化
ヒト膵臓癌細胞株ＢＸＰＣ−３においてＳＡＭ−６抗体のエンドサイトーシスを求めた。免疫蛍光検査のため、製造業者のプロトコルに従って、Ｆｌｕｏｒｏ  Ｔａｇ  ＦＩＴＣコンジュゲーションキット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国セントルイス）によるモノクローナル抗体ＳＡＭ−６及びアイソタイプ対照ＩｇＭ（Ｃｈｒｏｍｐｕｒｅ  ＩｇＭ、Ｄｉａｎｏｖａ社、ドイツ、ハンブルク）のコンジュゲーションを行った。
【０２４２】
精製抗体ＳＡＭ−６又はＩｇＭアイソタイプ対照を、２．５ｍｇ／ｍｌの濃度で炭酸−重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）中に溶解させた。従って、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）Ｇ−２５カラム上で構成緩衝液を炭酸−重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）と交換した。抗体の最終濃度は約１．７ｍｇ／ｍｌであった（希釈係数１．５）。抗体への添加直前に、２ｍｌの０．１Ｍ炭酸−重炭酸緩衝液（ＦＩＴＣ  １バイアル当たり）中のフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）溶液を調製した。５０μｌのＦＩＴＣ溶液を０．２ｍｌの各抗体溶液に滴加し、穏やかな攪拌により暗所にて室温で２時間インキュベートした。最後に、ＩｇＭ（ＭＷ  ９００）に対するＦＩＴＣ（ＭＷ  ３８９）の２０：１のモル比を反応混合物において用い、３〜６のＦ／Ｐ比を有するフルオレセイン−抗体コンジュゲートが予期された。細胞をトリプシン処理し、１時間氷上に放置した。
【０２４３】
Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）Ｇ−２５カラム上でのゲル濾過により、ＦＩＴＣ標識抗体を遊離ＦＩＴＣから分離した。少なくとも３０ｍｌのＰＢＳによるカラム平衡化後、反応混合物をカラムゲル床の上部に添加した。カラム溶出は１０ｍｌのＰＢＳから開始し、０．２５ｍｌの画分を回収した。溶出時、２つの出現ピークの最初のピークはコンジュゲートを含んだ。ウシ血清アルブミン（Ｒｏｔｈ社、ドイツＫａｒｌｓｒｕｈｅ）を基準として用いたＢＣＡ法により、蛋白質含量を測定した。
【０２４４】
ＳＡＭ−６のエンドサイトーシス
ヒト膵臓癌細胞株ＢＸＰＣ−３においてＳＡＭ−６抗体に対するエンドサイトーシスを求めた。上述のように、Ｆｌｕｏｒｏ  Ｔａｇ  ＦＩＴＣコンジュゲーションキット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国セントルイス）により、モノクローナル抗体ＳＡＭ−６（精製）及びアイソタイプ対照（Ｃｈｒｏｍｐｕｒｅ  ＩｇＭ、Ｄｉａｎｏｖａ社、ドイツ、ハンブルク）をコンジュゲートした。４０μｇ／ｍｌの最終濃度でのコンジュゲート抗体を１×１０６個の細胞に直接付与し、３７℃で３０、６０、１２０分間インキュベートした。細胞を採取、すすぎ、リン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）（ＰＢＳ）中に再懸濁させた。１００μｌの各細胞懸濁液をスライドに固定した。最後に、スライドを蛍光封入剤（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ社、米国カーピンテリア（Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ））で封入し、共焦点顕微鏡法により分析した。
【０２４５】
スダンＩＩＩによる脂質染色
細胞内脂質染色のため、膵臓癌細胞ＢＸＰＣ−３をスライドグラス上で増殖させた。接着細胞を、１００μｇ／ｍｌのＳＡＭ−６抗体、抗Ｇｒｐ７８（クローンＥＴ−２１、Ｓｉｇｍａ社、ドイツＴａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ）又は無関連対照（Ｃｈｒｏｍｐｕｒｅ  ＩｇＭ、Ｄｉａｎｏｖａ社、ドイツ、ハンブルク）と４８時間インキュベートした。ＰＢＳによる２回の洗浄工程後、６０％イソプロパノールで細胞を５分間固定した。使用前にスダンＩＩＩ原液の６０％溶液（１００％イソプロパノール中、０．５％スダンＩＩＩ）を一晩熟成させ、濾過し、固定細胞に加えた。４０分後、細胞を蒸留水で洗浄し、６０％イソプロパノール中で分化させ、再度洗浄し、ヘマトキシリンで６分間対比染色した。最後に、細胞を１０分間すすぎ、グリセロールゼラチンで封入した。光学顕微鏡法を用いて脂質含有の程度を可視化した。
【０２４６】
シトクロムＣアッセイ
ＳＡＭ−６に誘導されたアポトーシス時にシトクロムｃが放出されたかをスクリーニングするため、シトクロムＣ  ＥＬＩＳＡキット（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、米国ラ・ホーヤ（ＬａＪｏｌｌａ））を用いた。要するに、１．５×１０６個の胃腺癌細胞（２３１３２／８７）を２００μｇ／ｍｌの精製ＳＡＭ−６又は無関連ＩｇＭ抗体と、それぞれ１時間、４時間インキュベートした。トリプシン処理後、細胞を冷ＰＢＳで３回洗浄し、溶解緩衝液中に再懸濁させ、穏やかな混合により室温で１時間インキュベートした。氷冷ＰＢＳによる３回の洗浄工程及び１，０００×ｇで１５分間の遠心分離後、上清を新鮮チューブに移し、Ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ  Ｄｉｌｕｅｎｔ  ＲＤ５Ｐ（１×）で希釈した（１：１０）。次に、Ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ  Ｄｉｌｕｅｎｔ  ＲＤ５Ｐ（１×）で希釈した各試料の混合物（１：１）を、キットで送達されるマイクロタイタープレートに加えた。室温での２時間のインキュベーション、次に、０．４％洗浄緩衝液による洗浄が引き続いた。次に、シトクロムＣコンジュゲートを各ウェルに入れた。インキュベーション及び洗浄工程を以前のように繰り返した。各ウェルへの基質溶液（発色試薬Ａ及びＢの１：１混合物）の添加後、プレートを室温で３０分間インキュベートした。停止液の添加後、４１５ｎｍ（基準波長５４０ｎｍ）での測定を行った。
【０２４７】
カスパーゼアッセイ
カスパーゼ２、３、６、８及び９活性について抗体処理細胞をスクリーニングするため、供給業者のマニュアルに従って、Ａｐｏ  Ｔａｒｇｅｔ（商標）比色プロテアーゼアッセイサンプラーキット（Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓａｍｐｌｅｒ  Ｋｉｔ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、米国ラ・ホーヤ（ＬａＪｏｌｌａ））を用いた。要するに、３×１０６個の胃癌細胞（２３１３２／８７）を２００μｇ／ｍｌの精製ＳＡＭ−６又は無関連ＩｇＭ抗体と、それぞれ１時間、４時間インキュベートした。トリプシン処理後、細胞を冷溶解緩衝液中に再懸濁させた。それらを氷上で１０分間インキュベートし、１０，０００×ｇで１分間遠心分離した。細胞溶解物中の蛋白質の量を求めるため、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイを用いた。各細胞質抽出物を４μｇ／ｍｌの蛋白質濃度に希釈した。次に、ＤＴＴ含む反応緩衝液及び種々のコンジュゲートしたプロテアーゼ基質を、９６ウェルマイクロタイタープレートにおける試料に加えた。溶解及び反応緩衝液の混合物（１：１）はブランクとして機能した。加湿ＣＯ２インキュベータにおける３７℃及び７％ＣＯ２で２時間のインキュベーション後、ＥＬＩＳＡリーダーにて４１５ｎｍで、吸収、従って、カスパーゼ活性の程度を測定した。カスパーゼ３阻害剤に関する実験では、上述のように同様の条件を用いて、供給業者のマニュアルに従って、カスパーゼ３細胞活性アッセイキット（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、米国ラ・ホーヤ（ＬａＪｏｌｌａ））を用いた。
【０２４８】
インビボ試験
インビボにおける腫瘍細胞増殖に対するＳＡＭ−６抗体の効果を判定するため、ヌードマウス／ヒト胃癌細胞系を用いた。簡潔には、２×１０６個の胃癌細胞（２３１３２／８７）を６〜７週齢のＮＭＲＩ−ｎｕ／ｎｕマウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｗｉｎｋｅｌｍａｎｎ  ＧｍｂＨ、ドイツＢｏｒｃｈｅｎ）に皮下（ｓ．ｃ．）注入し、次に、腫瘍が可視サイズに達すると、抗体ＳＡＭ−６抗体を注入した。癌細胞注入後９、１１、１４、１６及び１７日目に、それぞれ、５０、２５０、５００又は７５０μｇの抗体を腹腔内投与した。対照マウスには７５０μｇの無関連ヒトＩｇＭ（Ｃｈｒｏｍｐｕｒｅ  ＩｇＭ、Ｄｉａｎｏｖａ社、ドイツ、ハンブルク）を注入した。可視腫瘍増殖は実験時に肉眼的に測定した。腫瘍が最大許容サイズに達すると（１８日目）、試験を終了し、その際、マウスを殺処分し、それぞれ、腫瘍体積、腫瘍重量を測定し、腫瘍の拡散及び他の変化について臓器及び組織を検査した。
【０２４９】
（実施例２）
本実施例はＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質の精製及び分析の記述を含む。
【０２５０】
膜抽出物に関するウエスタンブロット分析
腫瘍細胞株２３１３２／８７及びＢＸＰＣ−３に対してＳＡＭ−６抗原の単離及び特徴づけを行った。ＳＡＭ−６抗体は約８０ｋＤａの相対分子量で抗原に結合した（図３）。両方の細胞株において、ウエスタンブロットでは出現するバンドのパターンにおける類似結果を示した。また、試料を調製するために分画遠心法又はＭＰＥＫ法を用いようとも、有意な相違はなかった。しかし、抗原の精製のため、低分子量におけるより高い富化及びより少ない非特異的バンドにより、天然膜抽出キットの方法を用いた。ＩｇＭ抗体の非特異的結合を見出すため、無関連ヒトＩｇＭを対照に用いた。非特異的結合は約５０ｋＤａにて認められうる。約６０及び１００ｋＤａの分子量での更なる著明な蛋白質バンドが、調製時の膜分画由来の不純物として形成した。
【０２５１】
ペプチド質量マッピングによるヒトＳＡＭ−６受容体の精製及び同定
ウエスタンブロットでＳＡＭ−６抗体に結合する８０ｋＤａ蛋白質を同定すべく、蛋白質を精製するために２工程のカラムクロマトグラフィを、また、蛋白質を同定するためにＭＡＬＤＩ質量分析を用いた。図４は最初の工程（サイズ排除クロマトグラフィ）後の代表的なクロマトグラムを示す。ＳＡＭ−６抗体に結合する蛋白質を含む画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、次に、ウエスタンブロット及びクーマシー染色により分析した。陽性画分は図５及び６に挙げられている。陰イオン交換クロマトグラフィを用いて第２工程が続いた（クロマトグラム、図７参照）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる引き続いての分析を図８及び９に示す。矢印は８０ｋＤａ蛋白質を表すバンドを示し、これは最終的に切り取り、配列決定した。ＴｏｐＬａｂ（ドイツＭａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ）により、蛋白質配列決定を行った。
【０２５２】
トリプシンペプチド質量の一致した組みによる配列データベース検索では、ヒトＧｒｐ７８（アクセッション番号ＮＰ＿００５３３８．１）を最高位の候補物質として計算した。総計２１のトリプシンペプチド質量を、最小３５％のアミノ酸配列範囲に対応するＧｒｐ７８蛋白質に割り当てた（図１０及び１１）。ペプチド質量エラーは５０ｐｐｍ未満であった。
【０２５３】
割当ペプチドの多さ及び広配列範囲のため、Ｇｒｐ７８蛋白質はデータベースから同定した。ヒトＧｒｐ７８／ＢｉＰの実験的に得られたペプチド配列及びデータベース蛋白質配列のアラインメントを図１１に示す。太字テキストはＭＡＬＤＩペプチド質量指紋によって得られる質量を示す配列であり、ペプチド質量マップにおいて星印がついている（図１０）。
【０２５４】
構造分析
スイスバイオインフォマティクス研究所（Ｓｗｉｓｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）（ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ）のＥｘＰＡＳｙ（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ）のプロテオミクスサーバーの配列解析ツールを用いて、潜在的膜貫通領域及びグリコシル化部位の構造解析を行った。アミノ酸１〜１７及び６５０〜６５４におけるシグナル領域以外に、Ｇｒｐ７８は、アミノ酸２２０〜２３７の膜貫通領域の可能性並びにアミノ酸残基１６６及び１８４における細胞外Ｏ−グリコシル化部位の潜在性を示す。Ｎ−グリコシル化部位を決定することはできなかった（図１１）。
【０２５５】
（実施例３）
本実施例はｓｉＲＮＡによるＧｒｐ７８発現阻害試験の記述を含む。
【０２５６】
Ｇｒｐ７８のノックダウン
Ｇｒｐ７８のノックダウンと一体となったＧｒｐ７８遺伝子のサイレンシングが、ＢＸＰＣ−３腫瘍細胞におけるＳＡＭ−６抗体の結合を低減するかを検討するため、試験を行った。Ｇｒｐ７８  ｓｉＲＮＡによる腫瘍細胞株ＢＸＰＣ−３のトランスフェクションは、蛋白質発現及びＳＡＭ−６抗体の結合を低減した。陰性ｓｉｌｅｎｃｅｒ（商標）ｓｉＲＮＡ（無関連ｓｉＲＮＡ）をトランスフェクトされた細胞上では、インキュベーション時全体でＳＡＭ−６及び対照抗体の強い結合が検出可能であり、Ｇｒｐ７８発現の有意な作用を示さない。Ｇｒｐ７８  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトされた細胞は、抗Ｇｒｐ７８（７６％の低減）及びＳＡＭ−６（７０％の低減）の結合低減を示す。サイレンシングは他の細胞表面膜分子の発現に影響しなかった。トランスフェクション後の抗ＣＤ５５の結合は以前と同様に強かった（図１２及び１３）。表面に存在するＧｒｐ７８のノックダウンは、標的蛋白質発現及びＳＡＭ−６抗体の結合を低減する（図１２及び１３）。
【０２５７】
アポトーシスアッセイ
トランスフェクト腫瘍細胞の抗体誘導性アポトーシスの程度を示すため、細胞死検出ＥＬＩＳＡＰＬＵＳ（Ｒｏｃｈｅ社）により、アポトーシス活性を測定した。トランスフェクト細胞を１００μｇ／ｍｌのＳＡＭ−６抗体と４時間インキュベートした。同濃度の無関連ヒトＩｇＭが陰性対照であった。ヒトＧｒｐ７８に対するｓｉＲＮＡをトランスフェクトされた腫瘍細胞は、無関連細胞及び無関連ｓｉＲＮＡをトランスフェクトされた細胞と比べ、ＳＡＭ−６抗体に誘導されるアポトーシス活性の明確な低下を示す（図１４）。アポトーシス細胞含量の計算は、完全培地で増殖される細胞の含量と関連した。
【０２５８】
（実施例４）
本実施例は、ＳＡＭ−６抗体結合に対するＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質のグリコシダーゼ処理の効果に関する試験の記述を含む。
【０２５９】
グリコシダーゼアッセイ
Ｏ−結合炭水化物におけるＳＡＭ−６抗体の結合を確認するため、腫瘍細胞株ＢＸＰＣ−３の膜抽出物の脱グリコシル化の効果について検討した。膜抽出物を、Ｏ又はＮ−グリコシダーゼによる還元条件下にて一晩脱グリコシル化し、その後、ＳＤＳ−Ｐａｇｅを介して分離し、ウエスタンブロッティングにより分析した。グリコシダーゼとのインキュベーション後、著明な８０ｋＤａ蛋白質の分子量は明確に減少し、ＳＡＭ−６の結合活性も低下する（図１５）。これらの結果は、ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質へのＳＡＭ−６抗体の結合に糖類が関与していることを示す。
【０２６０】
サイトスピンにおけるグリコシダーゼアッセイ
腫瘍細胞表面上のＯ−結合炭水化物部分におけるＳＡＭ−６抗体の結合を確認するため、サイトスピンにおいてグリコシダーゼアッセイを行った。ヒト膵臓癌細胞（ＢＸＰＣ−３）をＮ−グリコシダーゼ又はＯ−グリコシダーゼとインキュベートした。サイトスピンの調製後、ＳＡＭ−６抗体及び抗ＣＤ５５に関して染色を行った。
【０２６１】
ＳＡＭ−６抗体に関する免疫組織化学的染色は、Ｏ−グリコシダーゼで処理された場合、表面結合の有意な低減を示す。Ｎ−グリコシダーゼによる処理はＳＡＭ−６抗体結合に対する検出可能な効果を有さなかった（図１６）。
【０２６２】
細胞表面分子ＣＤ５５は膜一体性に対する対照として機能し、グリコシダーゼによる処理後に結合の変化を示さなかった。
【０２６３】
（実施例５）
本実施例は、細胞上に存在するＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質へのＳＡＭ−６抗体結合の試験の記述を含む。
【０２６４】
ＳＡＭ−６エンドサイトーシス
ＳＡＭ−６抗体は細胞膜ＳＡＭ−６／Ｒ糖蛋白質に結合する。この抗体／受容体結合は脂質の蓄積及びアポトーシスカスケードを開始する。ＳＡＭ−６抗体はｏｘＬＤＬにも結合し、これを癌細胞中に運搬する。通常、リポ蛋白質は受容体媒介性エンドサイトーシスによって取り込まれる。ＳＡＭ−６抗体が癌細胞膜に結合した後、何が生じるのかを検討するため、ＳＡＭ−６抗体及びアイソタイプ対照にＦＩＴＣをコンジュゲートした。ＬＤＬの存在下、コンジュゲート抗体をヒト膵臓癌細胞株ＢＸＰＣ−３に直接付与し、３０、６０、１２０分間インキュベートした。最終的に、細胞を共焦点顕微鏡法により分析した。ＳＡＭ−６抗体との３０分間のインキュベーション後、細胞表面への結合を認めることができた（図１７Ａ）。６０分後、ＳＡＭ−６抗体は膜に集中し、「キャッピング」の典型的な形成として認められる（図１７Ｂ）。１時間後、ＳＡＭ−６抗体は細胞内に完全に取り込まれる。対照的に、標識対照抗体は同様の事象を示さなかった（図１７Ｄ、Ｅ、Ｆ）。ｏｘＬＤＬは抗体と共に細胞内に運搬されると想定することができる。
【０２６５】
スダンＩＩＩによる脂質染色
ＳＡＭ−６抗体誘導性の細胞内脂質蓄積を検討するため、スダンＩＩＩによる染色を行った。この色素は中性脂肪及び脂肪酸の検出に特異的である。図１８は、膵臓癌細胞株ＢＸＰＣ−３においてＳＡＭ−６抗体、抗Ｇｒｐ７８又は無関連ヒト対照ＩｇＭとの４８時間のインキュベーション後に得られたデータを示す。ＳＡＭ−６抗体で処理されると、腫瘍細胞は抗体誘導性の中性脂肪滴の蓄積を明確に示す（図１８）。対照的に、それぞれ、抗Ｇｒｐ７８及び無関連対照抗体で処理された細胞は、脂質の有意な蓄積を示さない。これらのデータは、脂質の細胞内蓄積がＳＡＭ−６抗体に媒介される直接的作用であることを示す。
【０２６６】
ＳＡＭ−６アポトーシス
ＳＡＭ−６誘導性アポトーシスは脂質ホメオスタシスの撹乱の結果でありうる。しかし、これまでのところ、抗体結合脂質蓄積と最終的な細胞死との間の経路についても、カスパーゼが活性化されるのかについても何も知られていなかった。ＳＡＭ−６によって活性化されるシグナリング経路の更なる理解は、癌との闘いのための革新的な治療法に更に寄与するであろう。従って、カスパーゼはＳＡＭ−６誘導性アポトーシスプロセス時の活性について検討した。それぞれ、ＡＭ−６抗体及び対照ＩｇＭとのインキュベーション後、シトクロムＣが胃癌細胞内に放出されたかを検討するため、シトクロムＣ  ＥＬＩＳＡキットを用いた。サンドイッチ酵素イムノアッセイ法は、１時間後にシトクロムＣが無関連ヒトＩｇＭで処理された細胞よりＳＡＭ−６抗体で処理された細胞において高いレベルにて放出されることを示した。加えて、両方の試料におけるポリペプチドの量は４時間のインキュベーション後に更に異なった。更に認められることは、４時間後のＳＡＭ−６試料の減少である（図１９）。これは、ＳＡＭ−６誘導性経路においてミトコンドリアの撹乱が生じ、外膜の破壊をもたらし、シトクロムＣの放出となることを明確に示す。ＳＡＭ−６抗体処理された細胞におけるシトクロムＣレベルは、４時間のインキュベーション後、対照のレベルに近づき、ミトコンドリアの損傷が経路の初期のみに生じたことを意味する。カスパーゼがＳＡＭ−６抗体に誘導されるのか、また、どのカスパーゼがＳＡＭ−６抗体に誘導されるのかを判定するため、Ａｐｏ  Ｔａｒｇｅｔ（商標）比色プロテアーゼアッセイサンプラーキット（Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓａｍｐｌｅｒ  Ｋｉｔ）を用いた。抗体との１時間のインキュベーション後、カスパーゼ２、３、６、８及び９の活性を測定した。イニシエータカスパーゼ８及び９（２は違う）は、既に１時間後、無関連ヒトＩｇＭ対照で処理された細胞と比べ、ＳＡＭ−６抗体で処理された細胞において活性化した（図２０Ａ）。加えて、４時間後、エフェクターカスパーゼ３及び６の活性化を検出することができた。
【０２６７】
アーチファクトを除外するため、更に、カスパーゼ３阻害剤を用いた試験を一例として用意した。図２０Ｂは該阻害剤を加えた際のカスパーゼ３活性の抑制を示す。カスパーゼ３阻害剤の不在下、ＳＡＭ−６抗体で処理された腫瘍細胞においてカスパーゼ３の明確な活性化を認めることができた。
【０２６８】
（実施例６）
本実施例は悪性黒色腫のインビトロ試験の記述を含む。
【０２６９】
黒色腫細胞に対するＳＡＭ−６抗体の効果を判定するため、悪性黒色腫細胞ＨＴＢ−６９及びＣＲＬ  １４２４のＳＡＭ−６抗体に対する感受性を求めた。簡潔には、細胞をトリプシン処理し、２％ＦＣＳを含むＲＰＭＩで２×１０５細胞／ｍｌの濃度に希釈した。１ウェル当たり５０μｌの細胞懸濁液を９６ウェルプレートに播種した。抗体をＲＰＭＩによる１００μｇ／ｍｌに従って希釈した（１ウェル当たり１％ＦＣＳの最終濃度となる）。ＩｇＭ、ＲＰＭＩ及び緩衝液を対照として用いた。細胞を、３７℃で２、５、２４又は４８時間、インキュベータにてインキュベートし、上清を廃棄し、１ウェル当たり３０μｌのトリプシンを加え、数分間インキュベートし、細胞をウェルの底から移動させ、顕微鏡で観察した。１ウェル当たり６μｌのＦＣＳで反応を終了し、１ウェル当たり３２４μｌのＧｕａｖａ  ＶｉａＣｏｕｎｔ試薬（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国ヘイワード（Ｈａｙｗａｒｄ））を加え、軽く混合し、室温で５分間インキュベートし、Ｇｕａｖａ  ＰＣＡ−９６でデータを解析した。
【０２７０】
そのデータは、ＳＡＭ−６抗体が両方の黒色腫細胞型を死滅させることができたことを示す。細胞殺滅は４８時間インキュベートされたＨＴＢ−６９細胞で最大であった。
【０２７１】
（実施例７）
本実施例はインビボ試験の記述を含む。
【０２７２】
インビボにおける腫瘍細胞増殖に対するＳＡＭ−６抗体の効果を判定するため、ヌードマウス−ヒト胃癌細胞系を用いた。ヒト胃癌細胞株２３１３２／８７由来の２×１０６個の濃度の細胞を、ＮＭＲＩ  ｎｕ／ｎｕマウスに腹腔内（ｉ．ｐ．）注入した。腫瘍細胞の接種後９日目に、異なる用量のＳＡＭ−６抗体を腹腔内（ｉ．ｐ．）注入した。無関連ヒト対照ＩｇＭ及びＮａＣｌ溶液（０．９％）が陰性対照として機能した。癌細胞移植後１１、１４、１６及び１７日目に、該抗体を再度投与した。対照マウスに７５０μｇの無関連ヒトＩｇＭ（Ｃｈｒｏｍｐｕｒｅ  ＩｇＭ、Ｄｉａｎｏｖａ社、ドイツ、ハンブルク）を注入した。
【０２７３】
試験全体を通して腫瘍増殖を肉眼的に制御した。１８日後、マウスを殺処分し、腫瘍体積を測定し、処置群及び対照群間の腫瘍サイズを比較するため、スチューデントｔ検定を用いた。試験経過中に発現した腫瘍は、ＳＡＭ−６抗体で処置すると、体積の有意な減少を示した（図２１）。更に、ＳＡＭ−６抗体で処置されたマウスにおける腫瘍体積の減少は用量依存的であった。５０μｇのＳＡＭ−６抗体で既に処置されたマウスは、対照群と比べて明確に減少した腫瘍体積を示す。それぞれ、２５０μｇ、５００μｇのＳＡＭ−６抗体で処置された動物は、ＩｇＭ対照と比べた場合、統計的に有意に少ない腫瘍体積を有していた（ｔ検定、両方の濃度でｐ＜０．０５）。しかし、７５０μｇのＳＡＭ−６抗体で処置された動物は腫瘍体積の有意な減少を示さない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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