(57)【要約】本開示は、高親和性で特異的にＢＴＬＡに結合する単離モノクローナル抗体、特にヒトモノクローナル抗体を提供する。本開示の抗体をコードする核酸分子、発現ベクター、宿主細胞、および本開示の抗体を発現するための方法も提供する。免疫複合体、二重特異性分子および本開示の抗体を含有する薬学的組成物も提供する。本開示は、ＢＴＬＡを検出するための方法、ならびに抗ＢＴＬＡ抗体を用いて癌および感染性疾患を含む様々な疾患を治療するための方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＢＴＬＡに結合し、かつ
（ａ）１×１０−７Ｍまたはそれ以下のＫＤでヒトＢＴＬＡに結合するか、
（ｂ）ＨＶＥＭのＢＴＬＡへの結合を阻害するか、または
（ｃ）ヒトＴｒｋＢ、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１またはＩＣＯＳに実質的に結合しない
という特性のうちの少なくとも１つを示す、単離ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２】
ＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプの完全長抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
抗体断片または一本鎖抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
５×１０−８Ｍまたはそれ以下のＫＤでヒトＢＴＬＡに結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
１×１０−８Ｍまたはそれ以下のＫＤでヒトＢＴＬＡに結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
５×１０−９Ｍまたはそれ以下のＫＤでヒトＢＴＬＡに結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
１×１０−８Ｍ〜１×１０−１０ＭのＫＤでヒトＢＴＬＡに結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項８】
ＢＴＬＡへの結合に対し、
（ａ）配列番号：１、２、３、４、５、６、７４、および８５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むヒト重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号：７、８、９、１０、１１、１２、１３、７５、７６、および８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むヒト軽鎖可変領域
を含む参照抗体と交差競合（ｃｒｏｓｓ−ｃｏｍｐｅｔｅ）する、単離ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項９】
前記ヒト重鎖可変領域が配列番号：１のアミノ酸配列を含み、かつ前記ヒト軽鎖可変領域が配列番号：７のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
前記ヒト重鎖可変領域が配列番号：２のアミノ酸配列を含み、かつ前記ヒト軽鎖可変領域が配列番号：８のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の抗体。
【請求項１１】
前記ヒト重鎖可変領域が配列番号：３のアミノ酸配列を含み、かつ前記ヒト軽鎖可変領域が配列番号：９のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の抗体。
【請求項１２】
前記ヒト重鎖可変領域が配列番号：３のアミノ酸配列を含み、かつヒト軽鎖可変領域が配列番号：１０のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の抗体。
【請求項１３】
前記ヒト重鎖可変領域が配列番号：４のアミノ酸配列を含み、かつヒト軽鎖可変領域が配列番号：１１のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の抗体。
【請求項１４】
前記ヒト重鎖可変領域が配列番号：５のアミノ酸配列を含み、かつ前記ヒト軽鎖可変領域が配列番号：１２のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の抗体。
【請求項１５】
前記ヒト重鎖可変領域が配列番号：６のアミノ酸配列を含み、かつヒト軽鎖可変領域が配列番号：１３のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の抗体。
【請求項１６】
前記ヒト重鎖可変領域が配列番号：７４のアミノ酸配列を含み、かつ前記ヒト軽鎖可変領域が配列番号：７５のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の抗体。
【請求項１７】
前記ヒト重鎖可変領域が配列番号：７４のアミノ酸配列を含み、かつヒト軽鎖可変領域が配列番号：７６のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の抗体。
【請求項１８】
前記ヒト重鎖可変領域が配列番号：８５のアミノ酸配列を含み、かつヒト軽鎖可変領域が配列番号：８６のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の抗体。
【請求項１９】
ヒトＶＨ２−０５遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、該抗体がＢＴＬＡに特異的に結合する、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２０】
ヒトＶＨ２−７０遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、該抗体がＢＴＬＡに特異的に結合する、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２１】
ヒトＶＨ４−５９遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、該抗体がＢＴＬＡに特異的に結合する、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２２】
ヒトＶＨ３−２０遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、該抗体がＢＴＬＡに特異的に結合する、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２３】
ヒトＶＨ３−３３遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、該抗体がＢＴＬＡに特異的に結合する、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２４】
ヒトＶＫＡ２７遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する軽鎖可変領域を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、該抗体がＢＴＬＡに特異的に結合する、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２５】
ヒトＶＫＬ１８遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する軽鎖可変領域を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、該抗体がＢＴＬＡに特異的に結合する、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２６】
ヒトＶＫＬ１５遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する軽鎖可変領域を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、該抗体がＢＴＬＡに特異的に結合する、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２７】
ヒトＶＫ０４遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する軽鎖可変領域を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、該抗体がＢＴＬＡに特異的に結合する、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２８】
（ａ）ヒトＶＨ２−０５遺伝子の重鎖可変領域、および
（ｂ）ヒトＶｋＡ２７遺伝子の軽鎖可変領域
を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、該抗体がＢＴＬＡに特異的に結合する、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２９】
（ａ）ヒトＶＨ２−７０遺伝子の重鎖可変領域、および
（ｂ）ヒトＶｋＡ２７遺伝子の軽鎖可変領域
を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、該抗体がＢＴＬＡに特異的に結合する、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３０】
（ａ）ヒトＶＨ４−５９遺伝子の重鎖可変領域、および
（ｂ）ヒトＶｋＬ１８遺伝子の軽鎖可変領域
を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、該抗体がＢＴＬＡに特異的に結合する、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３１】
（ａ）ヒトＶＨ４−５９遺伝子の重鎖可変領域、および
（ｂ）ヒトＶｋＡ２７遺伝子の軽鎖可変領域
を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、該抗体がＢＴＬＡに特異的に結合する、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３２】
（ａ）ヒトＶＨ３−２０遺伝子の重鎖可変領域、および
（ｂ）ヒトＶｋＬ１５遺伝子の軽鎖可変領域
を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、該抗体がＢＴＬＡに特異的に結合する、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３３】
（ａ）ヒトＶＨ３−３３遺伝子の重鎖可変領域、および
（ｂ）ヒトＶｋ０４遺伝子の軽鎖可変領域
を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、該抗体がＢＴＬＡに特異的に結合する、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３４】
（ａ）ヒトＶＨ３−３３遺伝子の重鎖可変領域、および
（ｂ）ヒトＶｋＡ２７遺伝子の軽鎖可変領域
を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、該抗体がＢＴＬＡに特異的に結合する、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３５】
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域、ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、
（ａ）該重鎖可変領域ＣＤＲ３配列が、配列番号：２６、２７、２８、２９、３０、３１、７９、および８９からなる群から選択されるアミノ酸配列ならびにその保存的修飾を含み、
（ｂ）該軽鎖可変領域ＣＤＲ３配列が、配列番号：４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、８２、９２、および９７からなる群から選択されるアミノ酸配列ならびにその保存的修飾を含み、かつ
（ｃ）該抗体が、ＢＴＬＡに特異的に結合する、
単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３６】
前記重鎖可変領域ＣＤＲ２配列が配列番号：２０、２１、２２、２３、２４、２５、７８、および８８のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列ならびにその保存的修飾を含み、かつ、前記軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列が配列番号：３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、８１、９１、および９６のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列ならびにその保存的修飾を含む、請求項３５に記載の抗体。
【請求項３７】
前記重鎖可変領域ＣＤＲ１配列が配列番号：１４、１５、１６、１７、１８、１９、７７、および８７のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列ならびにその保存的修飾を含み、かつ、前記軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列が配列番号：３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、８０、９０、および９５のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列ならびにその保存的修飾を含む、請求項３６に記載の抗体。
【請求項３８】
重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、
（ａ）該重鎖可変領域が、配列番号：１、２、３、４、５、６、７４、および８５からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を含み、
（ｂ）該軽鎖可変領域が、配列番号：７、８、９、１０、１１、１２、１３、７５、７６、および８６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を含み、
（ｃ）該抗体が１×１０−７Ｍまたはそれ以下のＫＤでヒトＢＴＬＡに結合し、かつ、
（ｄ）該抗体がヒトＴｒｋｂ、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１またはＩＣＯＳに実質的に結合しない、
単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３９】
前記抗体がＨＶＥＭのＢＴＬＡへの結合を遮断する、請求項３８に記載の抗体。
【請求項４０】
（ａ）配列番号：１４、１５、１６、１７、１８、１９、７７、および８７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号：２０、２１、２２、２３、２４、２５、７８、および８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号：２６、２７、２８、２９、３０、３１、７９、および８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号：３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、８０、９０、および９５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号：３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、８１、９１、および９６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号：４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、８２、９２、および９７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、該抗体がＢＴＬＡに特異的に結合する、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項４１】
（ａ）配列番号：１４を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号：２０を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号：２６を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号：３２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号：３９を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号：４６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む、請求項４０に記載の抗体。
【請求項４２】
（ａ）配列番号：１５を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号：２１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号：２７を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号：３３を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号：４０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号：４７を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む、請求項４０に記載の抗体。
【請求項４３】
（ａ）配列番号：１６を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号：２２を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号：２８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号：３４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号：４１を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号：４８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む、請求項４０に記載の抗体。
【請求項４４】
（ａ）配列番号：１７を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号：２３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号：２９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号：３６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号：４３を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号：５０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む、請求項４０に記載の抗体。
【請求項４５】
（ａ）配列番号：１８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号：２４を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号：３０を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号：３７を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号：４４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号：５１を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む、請求項４０に記載の抗体。
【請求項４６】
（ａ）配列番号：１９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号：２５を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号：３１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号：３８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号：４５を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号：５２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む、請求項４０に記載の抗体。
【請求項４７】
（ａ）配列番号：７７を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号：７８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号：７９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号：８０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号：８１を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号：８２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む、請求項４０に記載の抗体。
【請求項４８】
（ａ）配列番号：７７を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号：７８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号：７９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号：９５を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号：９６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号：９７を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む、請求項４０に記載の抗体。
【請求項４９】
（ａ）配列番号：８７を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号：８８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号：８９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号：９０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号：９１を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号：９２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む、請求項４０に記載の抗体。
【請求項５０】
（ａ）配列番号：１、２、３、４、５、６、７４および８５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号：７、８、９、１０、１１、１２、１３、７５、７６および８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、該抗体がＢＴＬＡに特異的に結合する、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項５１】
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号：７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項５０に記載の抗体。
【請求項５２】
（ａ）配列番号：２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号：８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項５０に記載の抗体。
【請求項５３】
（ａ）配列番号：３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号：９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項５０に記載の抗体。
【請求項５４】
（ａ）配列番号：３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号：１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項５０に記載の抗体。
【請求項５５】
（ａ）配列番号：４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号：１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項５０に記載の抗体。
【請求項５６】
（ａ）配列番号：５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号：１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項５０に記載の抗体。
【請求項５７】
（ａ）配列番号：６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号：１３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項５０に記載の抗体。
【請求項５８】
（ａ）配列番号：７４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号：７５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項５０に記載の抗体。
【請求項５９】
（ａ）配列番号：７４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号：７６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項５０に記載の抗体。
【請求項６０】
（ａ）配列番号：８５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号：８６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項５０に記載の抗体。
【請求項６１】
請求項１〜６０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分および薬学的に許容できる担体を含む、組成物。
【請求項６２】
治療物質に連結された、請求項１〜６０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分を含む免疫複合体。
【請求項６３】
請求項６２に記載の免疫複合体および薬学的に許容できる担体を含む、組成物。
【請求項６４】
前記治療物質が細胞毒素である、請求項６２に記載の免疫複合体。
【請求項６５】
請求項６４に記載の免疫複合体および薬学的に許容できる担体を含む組成物。
【請求項６６】
前記治療物質が放射性同位体である、請求項６２に記載の免疫複合体。
【請求項６７】
請求項６４に記載の免疫複合体および薬学的に許容できる担体を含む、組成物。
【請求項６８】
請求項１〜６０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分を含む二重特異性分子であって、該抗体またはその抗原結合部分と異なる結合特異性を有する第２の機能部分に連結された、二重特異性分子。
【請求項６９】
請求項６８に記載の二重特異性分子および薬学的に許容できる担体を含有する、組成物。
【請求項７０】
請求項１〜６０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分をコードする単離核酸分子。
【請求項７１】
請求項７０に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項７２】
請求項７１に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項７３】
請求項１〜６０のいずれか一項に記載の抗体を発現する、ヒト免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の導入遺伝子を含むトランスジェニックマウス。
【請求項７４】
前記抗体を産生する、請求項７３に記載のマウスから調製されるハイブリドーマ。
【請求項７５】
対象における免疫応答を調節する方法であって、対象における免疫応答が調節されるように、対象に請求項１〜６０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分を投与するステップを含む、方法。
【請求項７６】
対象における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、対象に治療有効量の抗ＢＴＬＡ抗体またはその抗原結合部分を投与するステップを含む、方法。
【請求項７７】
前記抗体がキメラ抗体である、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項７６に記載の方法。
【請求項７９】
前記抗体が完全ヒト抗体である、請求項７６に記載の方法。
【請求項８０】
前記腫瘍細胞が、メラノーマ、腎癌、前立腺癌、乳癌、大腸癌および肺癌からなる群から選択される癌のものである、請求項７６に記載の方法。
【請求項８１】
前記腫瘍細胞が、骨癌、膵癌、皮膚癌、頭頚部癌、皮膚または眼内悪性メラノーマ、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、睾丸癌、子宮癌、ファロピウス管癌、子宮内膜癌、子宮頚癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、急性骨髄性白血病と慢性骨髄性白血病と急性リンパ芽球性白血病と慢性リンパ球性白血病とを含む慢性または急性白血病、小児期の固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓癌または尿管癌、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹グリオーマ、下垂体腺腫、カポジ肉腫、扁平上皮癌、扁平上皮細胞癌、Ｔ細胞リンパ腫、アスベストにより誘発される癌を含む環境誘発性癌、ならびに該癌の組み合わせからなるリストから選択される癌のものである、請求項７６に記載の方法。
【請求項８２】
対象における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、該対象に請求項１〜６０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分を、該腫瘍細胞の増殖を阻害するのに有効な量で投与するステップを含む、方法。
【請求項８３】
対象における感染性疾患を治療する方法であって、該対象が該感染性疾患について治療されるように、該対象に請求項１〜６０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分を投与するステップを含む、方法。
【請求項８４】
前記感染性疾患が、ＨＩＶ；インフルエンザ；ヘルペス；ジアルジア；マラリア；リーシュマニア；（Ａ型、Ｂ型、およびＣ型）肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、ＶＺＶ、ＨＳＶ−１、ＨＡＶ−６、ＨＳＶ−ＩＩ、およびＣＭＶ、エプスタインバーウイルス）、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス（ｃｏｒｎｏｖｉｒｕｓ）、呼吸器合胞体ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＴＬＶウイルス、デング熱ウイルス、パピローマウイルス、モルスカムウイルス（ｍｏｌｌｕｓｃｕｍ  ｖｉｒｕｓ）、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルスおよびアルボウイルス脳炎ウイルスによる病原感染症；クラミジア菌（ｂａｃｔｅｒｉａ  ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、リケッチア菌（ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、連鎖球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、肺炎連鎖球菌（ｐｎｅｕｍｏｎｏｃｏｃｃｕｓ）、髄膜炎菌（ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ）およびコノコッカス（ｃｏｎｏｃｏｃｃｕｓ）、クレブシエラ（ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス（ｐｒｏｔｅｕｓ）、セラチア（ｓｅｒｒａｔｉａ）、シュードモナス（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、レジオネラ（ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、ジフテリア（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）、サルモネラ（ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、桿菌（ｂａｃｉｌｌｉ）、コレラ菌（ｃｈｏｌｅｒａ）、破傷風菌（ｔｅｔａｎｕｓ）、ボツリヌス菌（ｂｏｔｕｌｉｓｍ）、炭疽菌（ａｎｔｈｒａｘ）、ペスト菌（ｐｌａｇｕｅ）、レプトスピラ菌（ｌｅｐｔｏｓｐｉｒｏｓｉｓ）、およびライム病菌（Ｌｙｍｅｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）による病原感染症；真菌のカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）（アルビカンス（ａｌｂｉｃａｎｓ）、クルセイ（ｋｒｕｓｅｉ）、グラブラタ（ｇｌａｂｒａｔａ）、トロピカリス（ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）など）、クリプトコックス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属（フミガーツス（ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、ニガー（ｎｉｇｅｒ）など）、ケカビ目（Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ）の属（ケカビ属（ｍｕｃｏｒ）、アブシディア属（ａｂｓｉｄｉａ）、クモノスカビ属（ｒｈｉｚｏｐｈｕｓ））、スポロスリックス・シェンキー（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｃｈｅｎｋｉｉ）、ブラストミセス・デルマチチジス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、ブラジル・パラコクシジオイデス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、コクシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ）およびヒストプラスマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）による病原感染症；ならびに寄生虫の赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、大腸バランチジウム（Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ  ｃｏｌｉ）、ネグレリア・フォーレリ（Ｎａｅｇｌｅｒｉａｆｏｗｌ���ｒｉ）、アカントアメーバ（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ）種、ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｉａ）、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）種、ニューモシスティス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ）、ネズミバベシア（Ｂａｂｅｓｉａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、トリパノソーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ）、クルーズ・トリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）、ドノバンリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｄｏｎｏｖａｎｉ）、トキソプラズマ原虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉ）、ブラジル鉤虫（Ｎｉｐｐｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）による病原感染症からなるリストから選択される、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
対象における抗原に対する免疫応答を増強する方法であって、該対象における該抗原に対する免疫応答が促進されるように、該対象に（ｉ）該抗原と、（ｉｉ）請求項１〜６０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分とを投与するステップを含む、方法。
【請求項８６】
前記抗原が、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原または病原体由来の抗原である、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
抗ＢＴＬＡ抗体を調製するための方法であって、
（ｉ）配列番号：１４、１５、１６、１７、１８、１９、７７、および８７からなる群から選択されるＣＤＲ１配列と、配列番号：２０、２１、２２、２３、２４、２５、７８、および８８からなる群から選択されるＣＤＲ２配列と、配列番号：２６、２７、２８、２９、３０、３１、７９、および８９からなる群から選択されるＣＤＲ３配列とを含む重鎖可変領域抗体配列、または（ｉｉ）配列番号：３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、８０、９０、および９５からなる群から選択されるＣＤＲ１配列と、配列番号：３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、８１、９１、および９６からなる群から選択されるＣＤＲ２配列と、配列番号：４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、８２、９２、および９７からなる群から選択されるＣＤＲ３配列とを含む軽鎖可変領域抗体配列を提供するステップと、
該重鎖可変領域抗体配列および該軽鎖可変領域抗体配列から選択される少なくとも１つの可変領域抗体配列内の少なくとも１つのアミノ酸残基を改変し、少なくとも１つの改変抗体配列を生成するステップと、
タンパク質として該改変抗体配列を発現するステップと
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
背景
正および負の共刺激シグナルはＢおよびＴ細胞活性の調節において重要な役割を果たし、これらのシグナルを媒介する分子は免疫調節物質にとって有効な標的であることが判明している。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の関与に加え、正の共刺激が天然Ｔ細胞の最適な活性化にとって必要とされる一方、負の共刺激は、自己に対する免疫学的耐性の獲得、ならびにエフェクターＴ細胞の機能の終結にとって必要であると考えられる。抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上でのＢ７．１またはＢ７．２との相互作用時、原型的なＴ細胞共刺激分子であるＣＤ２８はＴＣＲの関与に応答してＴ細胞の増殖および分化を促進するシグナルを放出する一方、ＣＤ２８に相同な細胞毒性Ｔリンパ球抗原−４（ＣＴＬＡ−４）はＴ細胞増殖およびエフェクター機能の阻害を媒介する（チャンバーズ（Ｃｈａｍｂｅｒｓ）ら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９：５６５−５９４頁、２００１年；エゲン（Ｅｇｅｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３：６１１−６１８頁、２００２年）。
【０００２】
Ｂ７ファミリーに対する相同性を有する数種類の新しい分子が発見されており（アッバス（Ａｂｂａｓ）ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、５：１３４５−６頁、１９９９年；コイル（Ｃｏｙｌｅ）ら、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２：２０３−９頁、２００１年；カレーノ（Ｃａｒｒｅｎｏ）ら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０：２９−５３頁、２００２年；リアン（Ｌｉａｎｇ）ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４：３８４−９０頁、２００２年）、Ｔ細胞活性化におけるそれらの役割が現在解明され始めている。これらの新しい共刺激リガンドはＢ７ｈ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、およびＢ７−Ｈ３を含む。
【０００３】
Ｂ７ＲＰ−１（ヨシナガ（Ｙｏｓｈｉｎａｇａ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、４０２：８２７−３２頁、１９９９年）としても知られるＢ７ｈ（スワロウ（Ｓｗａｌｌｏｗ）ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１１：４２３−３２頁、１９９９年）、ＧＬ５０（リング（Ｌｉｎｇ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６４：１６５３−７頁、２０００年）、Ｂ７Ｈ２（ワン（Ｗａｎｇ）ら、Ｂｌｏｏｄ、９６：２８０８−１３頁、２０００年）、およびＬＩＣＯＳ（ブロディエ（Ｂｒｏｄｉｅ）ら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．、１０：３３３−６頁、２０００年）は、活性化されたＴ細胞上の誘導可能な共刺激剤（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）（ＩＣＯＳ）に結合し、Ｔ細胞増殖、ならびにインターロイキン４（ＩＬ−４）およびＩＬ−１０などのサイトカインの産生を共刺激する。
【０００４】
Ｂ７−Ｈ１（ドン（Ｄｏｎｇ）ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、５、１３６５−９頁、１９９９年）としても知られるＰＤ−Ｌ１（フリーマン（Ｆｒｅｅｍａｎ）ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９２：１０２７−３４頁、２０００年）およびＢ７−ＤＣ（ツォン（Ｔｓｅｎｇ）ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９３、８３９−４６頁、２００１年）としても知られるＰＤ−Ｌ２（ラッチマン（Ｌａｔｃｈｍａｎ）ら、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２：２６１−８頁、２００１年）は、ＴおよびＢ細胞上のプログラム死１（ＰＤ−１）受容体に結合する。
【０００５】
最終的に、Ｂ７−Ｈ３は、活性化されたＴ細胞上の現在まだ未知のカウンターレセプター（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ）として結合し、ＣＤ４＋Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞およびＣＤ８＋細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬまたはＴｃ）の増殖を促進しかつＩＦＮ−γの発現を選択的に促進することが報告されている（チャポヴァル（Ｃｈａｐｏｖａｌ）ら、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２、２６９−７４頁、２００１年；サン（Ｓｕｎ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６８、６２９４−７頁、２００２年）。Ｂ７−Ｈ３は負の調節因子であることも報告されている（サー（Ｓｕｈ）ら、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４、８９９−９０６頁、２００３年；プラサド（Ｐｒａｓａｄ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７３、２５００−２５０６頁、２００４年）。Ｂ７−Ｈ３は負の調節因子であることも報告されている（サー（Ｓｕｈ）ら、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４、８９９−９０６頁、２００３年；プラサド（Ｐｒａｓａｄ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７３、２５００−２５０６頁、２００４年）。
【０００６】
Ｔ細胞共刺激活性を有するさらなる分子の同定は、その基本的な生物学的重要性およびその活性に作用可能な作用物質の治療的可能性が理由で関心の的である。共刺激シグナルを調節し、それによりＣＤ８＋ＣＴＬおよびＣＤ４＋Ｔｈ細胞の活性化および／またはエフェクター機能を調節する能力がある作用物質は、免疫応答の調節に有用性が見られ、極めて望ましい。
【０００７】
特に、多数の自己免疫疾患が自己反応性Ｔ細胞および自己抗体を含むことが知られている。免疫系の病原体に対する防御能を低下させることなく自己反応性リンパ球を疎外または除去する能力がある作用物質は極めて望ましい。
【０００８】
それに対し、多数の癌免疫療法、例えば養子免疫療法により腫瘍特異的なＴ細胞集団が拡大され、腫瘍細胞に対する攻撃および殺滅が指示される（ダドリー（Ｄｕｄｌｅｙ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９８：８５０−８５４頁、２００２年；パードル（Ｐａｒｄｏｌｌ）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２０：１２０７−１２０８頁、２００２年；エゲン（Ｅｇｅｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３：６１１−６１８頁、２００２年）。腫瘍の攻撃を増強する能力がある作用物質は極めて望ましい。
【０００９】
さらに、多数の異なる抗原（例えば微生物抗原または腫瘍抗原）に対する免疫応答は、検出可能であるが、同抗原を発現する作用物質（例えば感染性微生物または腫瘍細胞）により媒介される疾患プロセスに対する防御を可能にするほどに規模が十分でないことが多い。対象における抗原に対する免疫応答の増強に役立つアジュバントを抗原との併用で対象に投与することが望ましい場合が多い。
【００１０】
特定の環境下で抗原に対する正常な免疫応答を阻害することも望ましい。例えば、移植を受ける患者における正常な免疫応答の抑制は望ましく、かかる免疫抑制活性を示す作用物質は極めて望ましい。
【００１１】
共刺激シグナル、特に正の共刺激シグナルは、Ｂ細胞活性の調節においても役割を果たす。例えば、Ｂ細胞活性化および胚中心Ｂ細胞の生存には、抗原による刺激に加え、Ｔ細胞由来のシグナルを必要とする。ヘルパーＴ細胞の表面上に提示されるＣＤ４０リガンドは、Ｂ細胞の表面上でＣＤ４０と相互作用し、Ｂ細胞内での多数のかかるＴ細胞依存性の効果を媒介する。
【００１２】
タンパク質ＢＴＬＡ（ＢおよびＴリンパ球アテニュエーター）は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ、およびＰＤ−１も含む受容体のＣＤ２８ファミリーのメンバーである。ファミリーの最初のメンバーであるＣＤ２８およびＩＣＯＳは、モノクローナル抗体の添加後でのＴ細胞増殖の増強に対する機能的効果により発見された（ハトロフ（Ｈｕｔｌｏｆｆ）ら（１９９９年）Ｎａｔｕｒｅ  ３９７：２６３−２６６頁；ハンセン（Ｈａｎｓｅｎ）ら（１９８０年）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｓ  １０：２４７−２６０頁）。ＢＴＬＡは、ＴＨ１細胞内での異なる発現についてのスクリーニングを通じて発見された。さらに、ＢＴＬＡはＣＴＬＡ−４のように負の刺激シグナルを提供するものとして記載されている。アゴニスト抗ＢＴＬＡ  ｍＡｂの存在下で、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で活性化されたＴ細胞は、ＩＬ−２の産生および増殖の低下を示す（クレイグ（Ｋｒｅｉｇ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７５、６４２０−６４７２頁、２００５年）。無傷のＢＴＬＡ遺伝子が欠損したマウスが示す免疫後のＤＮＰ−ＫＬＨに対する力価はより高く、ＥＡＥに対する感受性は高まる（ワタナベ（Ｗａｔａｎａｂｅ）ら、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４、６７０−６７９頁、２００３年）。ＨＶＥＭ（ヘルペスウイルスエントリーメディエーター）はＢＴＬＡに対するリガンドであると考えられている（スカリー（Ｓｃｕｌｌｙ）ら（２００５年）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：９０−９８頁；ゴンザレス（Ｇｏｎｚａｌｅｚ）ら（２００５年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０２：１１１６−１１２１頁）。
【００１３】
したがって、ＢＴＬＡを認識する作用物質およびかかる作用物質を用いる方法が望ましい。
【発明の概要】
【００１４】
概要
本開示は、ＢＴＬＡに結合しかつ極めて多数の望ましい特性を示す単離モノクローナル抗体、特にヒトモノクローナル抗体を提供する。これらの特性は、例えばヒトＢＴＬＡに対する高親和性結合を含むが、ヒトＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、またはＩＣＯＳとの実質的な交差反応が欠如する。さらに、本開示の抗体は免疫応答を調節するように示されている。したがって、本開示の別の態様は、抗ＢＴＬＡ抗体を用いて免疫応答を調節する方法に関する。特に、本開示はＴ細胞応答を刺激する方法を提供する。また、本開示は抗ＢＴＬＡ抗体を用いてインビボで腫瘍細胞の増殖を阻害する方法を提供する。
【００１５】
一態様では、本開示は単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関し、ここで抗体は、
（ａ）１×１０−７Ｍ以下のＫＤでヒトＢＴＬＡに結合し、
（ｂ）ヒトＴｒｋＢ、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１またはＩＣＯＳに実質的に結合せず、
（ｃ）ＨＶＥＭのＢＴＬＡへの結合を阻害する
という特性のうちの少なくとも１つを示す。
【００１６】
一部の実施形態では、抗体はさらに
（ａ）Ｔ細胞応答を刺激し、
（ｂ）抗体応答を刺激し、
（ｃ）インビボで腫瘍細胞の増殖を阻害する。
【００１７】
好ましくは抗体はヒト抗体であるが、他の実施形態では、抗体は例えばマウス抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体であってもよい。
【００１８】
より好ましい実施形態では、抗体は５×１０−８Ｍ以下のＫＤでヒトＢＴＬＡに結合するか、１×１０−８Ｍ以下のＫＤでヒトＢＴＬＡに結合するか、５×１０−９Ｍ以下のＫＤヒトＢＴＬＡに結合するか、または１×１０−８Ｍ〜１×１０−１０ＭのＫＤでヒトＢＴＬＡに結合する。
【００１９】
別の実施形態では、本開示は、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体はＢＴＬＡへの結合に対して
（ａ）配列番号：１、２、３、４、５、６、７４、および８５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むヒト重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号：７、８、９、１０、１１、１２、１３、７５、７６、および８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むヒト軽鎖可変領域
を含む参照抗体と交差競合（ｃｒｏｓｓ−ｃｏｍｐｅｔｅ）する。
【００２０】
様々な実施形態では、参照抗体は
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号：７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含むか、または参照抗体は
（ａ）配列番号：２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号：８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含むか、または参照抗体は
（ａ）配列番号：３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号：９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含むか、または参照抗体は
（ａ）配列番号：３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号：１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含むか、または参照抗体は
（ａ）配列番号：４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号：１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含むか、または参照抗体は
（ａ）配列番号：５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号：１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含むか、または参照抗体は
（ａ）配列番号：６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号：１３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含むか、または参照抗体は
（ａ）配列番号：７４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号：７５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含むか、または参照抗体は
（ａ）配列番号：７４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号：７６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含むか、または参照抗体は
（ａ）配列番号：８５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号：８６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む。
【００２１】
別の態様では、本開示はヒトＶＨ２−０５遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関し、ここで抗体はＢＴＬＡに特異的に結合する。本開示はヒトＶＨ２−７０遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分をさらに提供し、ここで抗体はＢＴＬＡに特異的に結合する。本開示はヒトＶＨ４−５９遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分をさらに提供し、ここで抗体はＢＴＬＡに特異的に結合する。本開示はヒトＶＨ３−２０遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分をさらに提供し、ここで抗体はＢＴＬＡに特異的に結合する。本開示はヒトＶＨ３−３３遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分をさらに提供し、ここで抗体はＢＴＬＡに特異的に結合する。本開示はヒトＶＫＡ２７遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する軽鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分をさらに提供し、ここで抗体はＢＴＬＡに特異的に結合する。本開示はヒトＶＫＬ１８遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する軽鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分をさらに提供し、ここで抗体はＢＴＬＡに特異的に結合する。本開示はヒトＶＫＬ１５遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する軽鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分をさらに提供し、ここで抗体はＢＴＬＡに特異的に結合する。本開示はヒトＶＫ０４遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する軽鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分をさらに提供し、ここで抗体はＢＴＬＡに特異的に結合する。
【００２２】
好ましい実施形態では、本開示は、
（ａ）ヒトＶＨ２−０５遺伝子の重鎖可変領域、および
（ｂ）ヒトＶＫＡ２７遺伝子の軽鎖可変領域
を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体はＢＴＬＡに特異的に結合する。
【００２３】
別の好ましい実施形態では、本開示は、
（ａ）ヒトＶＨ２−７０遺伝子の重鎖可変領域、および
（ｂ）ヒトＶＫＡ２７遺伝子の軽鎖可変領域
を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体はＢＴＬＡに特異的に結合する。
【００２４】
別の好ましい実施形態では、本開示は、
（ａ）ヒトＶＨ４−５９遺伝子の重鎖可変領域、および
（ｂ）ヒトＶＫＬ１８遺伝子の軽鎖可変領域
を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体はＢＴＬＡに特異的に結合する。
【００２５】
別の好ましい実施形態では、本開示は、
（ａ）ヒトＶＨ４−５９遺伝子の重鎖可変領域、および
（ｂ）ヒトＶＫＡ２７遺伝子の軽鎖可変領域
を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体はＢＴＬＡに特異的に結合する。
【００２６】
別の好ましい実施形態では、本開示は、
（ａ）ヒトＶＨ３−２０遺伝子の重鎖可変領域、および
（ｂ）ヒトＶＫＬ１５遺伝子の軽鎖可変領域
を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体はＢＴＬＡに特異的に結合する。
【００２７】
別の好ましい実施形態では、本開示は、
（ａ）ヒトＶＨ３−３３遺伝子の重鎖可変領域、および
（ｂ）ヒトＶＫ０４遺伝子の軽鎖可変領域
を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体はＢＴＬＡに特異的に結合する。
【００２８】
別の好ましい実施形態では、本開示は、
（ａ）ヒトＶＨ３−３３遺伝子の重鎖可変領域、および
（ｂ）ヒトＶＫＡ２７遺伝子の軽鎖可変領域
を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体はＢＴＬＡに特異的に結合する。
【００２９】
別の好ましい実施形態では、本開示は、
（ａ）ヒトＶＨ２−０５遺伝子の重鎖可変領域、および
（ｂ）ヒトＶＫＡ２７遺伝子の軽鎖可変領域
を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体はＢＴＬＡに特異的に結合する。
【００３０】
別の態様では、本開示は、
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含み、ここでは
（ａ）重鎖可変領域のＣＤＲ３配列は、配列番号：２６、２７、２８、２９、３０、３１、７９および８９からなる群から選択されるアミノ酸配列ならびにその保存的修飾を含み、
（ｂ）軽鎖可変領域のＣＤＲ３配列は、配列番号：４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、８２、９２および９７からなる群から選択されるアミノ酸配列ならびにその保存的修飾を含み、
（ｃ）抗体はヒトＢＴＬＡに特異的に結合する。
【００３１】
好ましくは、重鎖可変領域ＣＤＲ２配列は、配列番号：２０、２１、２２、２３、２４、２５、７８および８８のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含み、かつ軽鎖可変領域のＣＤＲ２配列は、配列番号：３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、８１、９１および９６のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含む。好ましくは、重鎖可変領域のＣＤＲ１配列は、配列番号：１４、１５、１６、１７、１８、１９、７７および８７のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含み、かつ軽鎖可変領域のＣＤＲ１配列は、配列番号：３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、８０、９０および９５のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含む。
【００３２】
さらに別の態様では、本開示は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで
（ａ）重鎖可変領域は、配列番号：１、２、３、４、５、６、７４、および８５からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を含み、
（ｂ）軽鎖可変領域は、配列番号：７、８、９、１０、１１、１２、１３、７５、７６、および８６からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を含み、
（ｃ）抗体はヒトＢＴＬＡに１×１０−７Ｍ以下のＫＤで結合し、
（ｄ）抗体はヒトＴｒｋＢ、ＰＤ−１、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４またはＩＣＯＳに実質的に結合しない。
【００３３】
好ましい実施形態では、抗体はさらに１種もしくは複数種のＢＴＬＡリガンド（例えばＨＶＥＭ）のＢＴＬＡへの結合を阻害する。
【００３４】
さらにまたはその他として、抗体は上掲の他の特徴のうちの１つ以上を含みうる。
【００３５】
好ましい実施形態では、本開示は、
（ａ）配列番号：１４、１５、１６、１７、１８、１９、７７、および８７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号：２０、２１、２２、２３、２４、２５、７８、および８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号：２６、２７、２８、２９、３０、３１、７９、および８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号：３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、８０、９０、および９５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号：３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、８１、９１、および９６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｆ）配列番号：４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、８２、９２、および９７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体はＢＴＬＡに特異的に結合する。
【００３６】
好ましい組み合わせは、
（ａ）配列番号：１４を含む重鎖可変領域のＣＤＲ１
（ｂ）配列番号：２０を含む重鎖可変領域のＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号：２６を含む重鎖可変領域のＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号：３２を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号：３９を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号：４６を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ３
を含む。
【００３７】
別の好ましい組み合わせは、
（ａ）配列番号：１５を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号：２１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号：２７を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号：３３を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号：４０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号：４７を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。
【００３８】
別の好ましい組み合わせは、
（ａ）配列番号：１６を含む重鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号：２２を含む重鎖可変領域のＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号：２８を含む重鎖可変領域のＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号：３４を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号：４１を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号：４８を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ３
を含む。
【００３９】
別の好ましい組み合わせは、
（ａ）配列番号：１６を含む重鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号：２２を含む重鎖可変領域のＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号：２８を含む重鎖可変領域のＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号：３５を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号：４２を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号：４９を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ３
を含む。
【００４０】
別の好ましい組み合わせは、
（ａ）配列番号：１７を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号：２３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号：２９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号：３６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号：４３を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号：５０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。
【００４１】
別の好ましい組み合わせは、
（ａ）配列番号：１８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号：２４を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号：３０を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号：３７を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号：４４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号：５１を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。
【００４２】
別の好ましい組み合わせは、
（ａ）配列番号：１９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号：２５を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号：３１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号：３８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号：４５を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号：５２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。
【００４３】
別の好ましい組み合わせは、
（ａ）配列番号：７７を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号：７８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号：７９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号：８０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号：８１を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号：８２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。
【００４４】
別の好ましい組み合わせは、
（ａ）配列番号：８７を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号：８８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号：８９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号：９０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号：９１を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号：９２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。
【００４５】
別の好ましい組み合わせは、
（ａ）配列番号：７７を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号：７８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号：７９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号：９５を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号：９６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号：９７を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。
【００４６】
本開示の他の好ましい抗体またはその抗原結合部分は、
（ａ）配列番号：１、２、３、４、５、６、７４および８５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号：７、８、９、１０、１１、１２、１３、７５、７６および８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含み、ここで抗体はＢＴＬＡに対して特異的に結合する。
【００４７】
好ましい組み合わせは、
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号：７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む。
【００４８】
別の好ましい組み合わせは、
（ａ）配列番号：２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号：８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む。
【００４９】
別の好ましい組み合わせは、（ａ）配列番号：３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、（ｂ）配列番号：９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【００５０】
別の好ましい組み合わせは、（ａ）配列番号：３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、（ｂ）配列番号：１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【００５１】
別の好ましい組み合わせは、
（ａ）配列番号：４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号：１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む。
【００５２】
別の好ましい組み合わせは、
（ａ）配列番号：５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号：１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む。
【００５３】
別の好ましい組み合わせは、
（ａ）配列番号：６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号：１３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む。
【００５４】
別の好ましい組み合わせは、
（ａ）配列番号：７４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号：７５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む。
【００５５】
別の好ましい組み合わせは、
（ａ）配列番号：７４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号：７６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む。
【００５６】
別の好ましい組み合わせは、
（ａ）配列番号：８５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号：８６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む。
【００５７】
本開示の抗体は、例えばＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプの例えば完全長抗体でありうる。あるいは、抗体は、抗体断片、例えばＦａｂまたはＦａｂ’２断片、または一本鎖抗体でありうる。
【００５８】
本開示は、治療物質、例えば細胞毒素または放射性同位体に連結された本開示の抗体またはその抗原結合部分を含む免疫複合体も提供する。本開示は、抗体またはその抗原結合部分とは異なる結合特異性を有する第２の機能部分に連結された本開示の抗体またはその抗原結合部分を含む二重特異性分子も提供する。
【００５９】
本開示の抗体またはその抗原結合部分あるいは免疫複合体または二重特異性分子と薬学的に許容できる担体とを含む組成物も提供される。
【００６０】
本開示の抗体またはその抗原結合部分をコードする核酸分子、ならびにかかる核酸を含む発現ベクターおよびかかる発現ベクターを含む宿主細胞も本開示によって包含される。さらに、本開示は、本開示の抗体を発現する、ヒト免疫グロブリンの重鎖および軽鎖導入遺伝子を含むトランスジェニックマウス、ならびに本開示の抗体を産生する、かかるマウスから調製されるハイブリドーマを提供する。
【００６１】
さらに別の態様では、本開示は、対象における免疫応答を調節する方法であって、対象に本開示の抗体またはその抗原結合部分を、対象における免疫応答が調節されるように投与するステップを含む、方法を提供する。好ましくは、本開示の抗体は対象における免疫応答を増強、刺激または増強する。一部の実施形態では、本発明の抗体は対象における免疫応答を阻害、低減または抑制する。
【００６２】
さらなる態様では、本開示は、対象における腫瘍細胞増殖を阻害する方法であって、対象に治療有効量の抗ＢＴＬＡ抗体またはその抗原結合部分を投与するステップを含む、方法を提供する。本開示の抗体は、方法における使用として好ましいが、他の抗ＢＴＬＡ抗体との代替使用（または本開示の抗ＢＴＬＡ抗体との併用）が可能である。例えば、キメラ、ヒト化または完全ヒト抗ＢＴＬＡ抗体を、腫瘍増殖を阻害する方法において用いてもよい。
【００６３】
さらなる態様では、本開示は、対象における感染性疾患を治療する方法であって、対象に治療有効量の抗ＢＴＬＡ抗体またはその抗原結合部分を投与するステップを含む、方法を提供する。本開示の抗体は、方法における使用として好ましいが、他の抗ＢＴＬＡ抗体との代替使用（または本開示の抗ＢＴＬＡ抗体との併用）が可能である。例えば、キメラ、ヒト化または完全ヒト抗ＢＴＬＡ抗体を、感染性疾患を治療する方法において用いてもよい。
【００６４】
さらに、本開示は、対象における抗原に対する免疫応答を増強する方法であって、対象に（ｉ）抗原および（ｉｉ）抗ＢＴＬＡ抗体またはその抗原結合部分を、対象における抗原に対する免疫応答が増強されるように投与するステップを含む、方法を提供する。抗原は、例えば腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原または病原体由来の抗原でありうる。本開示の抗体は、方法における使用として好ましいが、他の抗ＢＴＬＡ抗体との代替使用（または本開示の抗ＢＴＬＡ抗体との併用）が可能である。例えば、キメラ、ヒト化または完全ヒト抗ＢＴＬＡ抗体を、対象における抗原に対する免疫応答を増強する方法において用いてもよい。
【００６５】
本開示は、本明細書中に提供される抗ＢＴＬＡ抗体の配列に基づいて「第二世代」抗ＢＴＬＡ抗体を作製するための方法も提供する。例えば、本開示は、抗ＢＴＬＡ抗体を調製するための方法であって、
（ａ）（ｉ）配列番号：１４、１５、１６、１７、１８、１９、７７、および８７からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、および／または配列番号：２０、２１、２２、２３、２４、２５、７８、および８８からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、および／または配列番号：２６、２７、２８、２９、３０、３１、７９、および８９からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域抗体配列、あるいは（ｉｉ）配列番号：３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、８０、９０、および９５からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、および／または配列番号：３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、８１、９１、および９６からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、および／または配列番号：４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、８２、９２、および９７からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域抗体配列を提供するステップと、
（ｂ）重鎖可変領域抗体配列および軽鎖可変領域抗体配列から選択される、少なくとも１つの可変領域抗体配列内で少なくとも１つのアミノ酸残基を改変し、少なくとも１つの改変抗体配列を作製するステップと、
（ｃ）改変抗体配列をタンパク質として発現するステップと、
を含む、方法を提供する。
【００６６】
本開示の他の特徴および利点は以下の詳細な説明および実施例から明白となり、それらは限定するものとして解釈されるべきではない。本願の全体を通じて言及されるあらゆる参考文献の内容、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号、特許および公開された特許出願は、参照により本明細書中に明示的に援用される。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１Ａ】１Ｂ４ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：５３）およびアミノ酸配列（配列番号：１）を示す。ＣＤＲ１（配列番号：１４）、ＣＤＲ２（配列番号：２０）およびＣＤＲ３（配列番号：２６）領域が図示され、Ｖ、ＤおよびＪ生殖細胞系誘導体（ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ）が示される。
【図１Ｂ】１Ｂ４ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：５９）およびアミノ酸配列（配列番号：７）を示す。ＣＤＲ１（配列番号：３２）、ＣＤＲ２（配列番号：３９）およびＣＤＲ３（配列番号：４６）領域が図示され、ＶおよびＪ生殖細胞系誘導体が示される。
【図２Ａ】Ｅ４Ｈ９ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：５４）およびアミノ酸配列（配列番号：２）を示す。ＣＤＲ１（配列番号：１５）、ＣＤＲ２（配列番号：２１）およびＣＤＲ３（配列番号：２７）領域が図示され、ＶおよびＪ生殖細胞系誘導体が示される。
【図２Ｂ】Ｅ４Ｈ９ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：６０）およびアミノ酸配列（配列番号：８）を示す。ＣＤＲ１（配列番号：３３）、ＣＤＲ２（配列番号：４０）およびＣＤＲ３（配列番号：４６）領域が図示され、ＶおよびＪ生殖細胞系誘導体が示される。
【図３Ａ】３Ｃ２ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：５５）およびアミノ酸配列（配列番号：３）を示す。ＣＤＲ１（配列番号：１６）、ＣＤＲ２（配列番号：２２）およびＣＤＲ３（配列番号：２８）領域が図示され、ＶおよびＪ生殖細胞系誘導体が示される。
【図３Ｂ】３Ｃ２ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：６１）およびアミノ酸配列（配列番号：９）を示す。ＣＤＲ１（配列番号：３４）、ＣＤＲ２（配列番号：４１）およびＣＤＲ３（配列番号：４８）領域が図示され、ＶおよびＪ生殖細胞系誘導体が示される。
【図３Ｃ】３Ｃ２ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：６２）およびアミノ酸配列（配列番号：１９）を示す。ＣＤＲ１（配列番号：３５）、ＣＤＲ２（配列番号：４２）およびＣＤＲ３（配列番号：４９）領域が図示され、ＶおよびＪ生殖細胞系誘導体が示される。
【図４Ａ】６Ａ５ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：５６）およびアミノ酸配列（配列番号：４）を示す。ＣＤＲ１（配列番号：１７）、ＣＤＲ２（配列番号：２３）およびＣＤＲ３（配列番号：２９）領域が図示され、ＶおよびＪ生殖細胞系誘導体が示される。
【図４Ｂ】６Ａ５ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：６３）およびアミノ酸配列（配列番号：１１）を示す。ＣＤＲ１（配列番号：３６）、ＣＤＲ２（配列番号：４３）およびＣＤＲ３（配列番号：５０）領域が図示され、ＶおよびＪ生殖細胞系誘導体が示される。
【図５Ａ】１１Ｅ２ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：５７）およびアミノ酸配列（配列番号：５）を示す。ＣＤＲ１（配列番号：１８）、ＣＤＲ２（配列番号：２４）およびＣＤＲ３（配列番号：３０）領域が図示され、ＶおよびＪ生殖細胞系誘導体が示される。
【図５Ｂ】１１Ｅ２ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：６４）およびアミノ酸配列（配列番号：１２）を示す。ＣＤＲ１（配列番号：３７）、ＣＤＲ２（配列番号：４４）およびＣＤＲ３（配列番号：５１）領域が図示され、ＶおよびＪ生殖細胞系誘導体が示される。
【図６Ａ】Ｅ８Ｄ９ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：５８）およびアミノ酸配列（配列番号：６）を示す。ＣＤＲ１（配列番号：１９）、ＣＤＲ２（配列番号：２５）およびＣＤＲ３（配列番号：３１）領域が図示され、ＶおよびＪ生殖細胞系誘導体が示される。
【図６Ｂ】Ｅ８Ｄ９ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：６５）およびアミノ酸配列（配列番号：１３）を示す。ＣＤＲ１（配列番号：３８）、ＣＤＲ２（配列番号：４５）およびＣＤＲ３（配列番号：５２）領域が図示され、ＶおよびＪ生殖細胞系誘導体が示される。
【図７】１Ｂ４の重鎖可変領域のアミノ酸配列とヒト生殖細胞系ＶＨ２−０５アミノ酸配列（配列番号：６６）とのアラインメントを示す。
【図８】１Ｂ４の軽鎖可変領域のアミノ酸配列とヒト生殖細胞系ＶｋＡ２７アミノ酸配列（配列番号：７０）とのアラインメントを示す。
【図９】Ｅ４Ｈ９の重鎖可変領域のアミノ酸配列とヒト生殖細胞系ＶＨ２−７０アミノ酸配列（配列番号：６７）とのアラインメントを示す。
【図１０】Ｅ４Ｈ９の軽鎖可変領域のアミノ酸配列とヒト生殖細胞系ＶｋＡ２７アミノ酸配列（配列番号：７０）とのアラインメントを示す。
【図１１】３Ｃ２の重鎖可変領域のアミノ酸配列とヒト生殖細胞系ＶＨ４−５９アミノ酸配列（配列番号：６８）とのアラインメントを示す。
【図１２】３Ｃ２の軽鎖可変領域のアミノ酸配列とヒト生殖細胞系ＶｋＬ１８アミノ酸配列（配列番号：７１）とのアラインメントを示す。
【図１３】３Ｃ２ａの軽鎖可変領域のアミノ酸配列とヒト生殖細胞系ＶｋＬ１５アミノ酸配列（配列番号：７２）とのアラインメントを示す。
【図１４】６Ａ５の重鎖可変領域のアミノ酸配列とヒト生殖細胞系ＶＨ２−０５アミノ酸配列（配列番号：６６）とのアラインメントを示す。
【図１５】６Ａ５の軽鎖可変領域のアミノ酸配列とヒト生殖細胞系ＶｋＡ２７アミノ酸配列（配列番号：７０）とのアラインメントを示す。
【図１６】１１Ｅ２の重鎖可変領域のアミノ酸配列とヒト生殖細胞系ＶＨ３−２０アミノ酸配列（配列番号：６９）とのアラインメントを示す。
【図１７】１１Ｅ２の軽鎖可変領域のアミノ酸配列とヒト生殖細胞系ＶｋＬ１５アミノ酸配列（配列番号：７２）とのアラインメントを示す。
【図１８】Ｅ８Ｄ９の重鎖可変領域のアミノ酸配列とヒト生殖細胞系ＶＨ２−０５アミノ酸配列（配列番号：６６）とのアラインメントを示す。
【図１９】Ｅ８Ｄ９の軽鎖可変領域のアミノ酸配列とヒト生殖細胞系ＶｋＡ２７アミノ酸配列（配列番号：７０）とのアラインメントを示す。
【図２０】ヒトＢＴＬＡの配列（配列番号：７３）を示す。
【図２１Ａ】１０Ｈ６ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：８３）およびアミノ酸配列（配列番号：７４）を示す。ＣＤＲ１（配列番号：７７）、ＣＤＲ２（配列番号：７８）およびＣＤＲ３（配列番号：７９）領域が図示され、Ｖ、ＤおよびＪ生殖細胞系誘導体が示される。
【図２１Ｂ】１０Ｈ６ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：９８）およびアミノ酸配列（配列番号：７５）を示す。ＣＤＲ１（配列番号：８０）、ＣＤＲ２（配列番号：８１）およびＣＤＲ３（配列番号：８２）領域が図示され、ＶおよびＪ生殖細胞系誘導体が示される。
【図２１Ｃ】１０Ｈ６ａヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：９８）およびアミノ酸配列（配列番号：７６）を示す。ＣＤＲ１（配列番号：９５）、ＣＤＲ２（配列番号：９６）およびＣＤＲ３（配列番号：９７）領域が図示され、ＶおよびＪ生殖細胞系誘導体が示される。
【図２２】１０Ｈ６の重鎖可変領域のアミノ酸配列とヒト生殖細胞系ＶＨ３−３３アミノ酸配列（配列番号：９９）とのアラインメントを示す。
【図２３】１０Ｈ６の軽鎖可変領域のアミノ酸配列とヒト生殖細胞系Ｖｋ０４アミノ酸配列（配列番号：１００）とのアラインメントを示す。
【図２４】１０Ｈ６ａの軽鎖可変領域のアミノ酸配列とヒト生殖細胞系ＶｋＡ２７アミノ酸配列（配列番号：７０）とのアラインメントを示す。
【図２５Ａ】４Ｃ９ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：９３）およびアミノ酸配列（配列番号：８５）を示す。ＣＤＲ１（配列番号：８７）、ＣＤＲ２（配列番号：８８）およびＣＤＲ３（配列番号：８９）領域が図示され、Ｖ、ＤおよびＪ生殖細胞系誘導体が示される。
【図２５Ｂ】４Ｃ９ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：９４）およびアミノ酸配列（配列番号：８６）を示す。ＣＤＲ１（配列番号：９０）、ＣＤＲ２（配列番号：９１）およびＣＤＲ３（配列番号：９２）領域が図示され、ＶおよびＪ生殖細胞系誘導体が示される。
【図２６】４Ｃ９の重鎖可変領域のアミノ酸配列とヒト生殖細胞系ＶＨ２−０５アミノ酸配列（配列番号：６６）とのアラインメントを示す。
【図２７】４Ｃ９の軽鎖可変領域のアミノ酸配列とヒト生殖細胞系ＶｋＡ２７アミノ酸配列（配列番号：７０）とのアラインメントを示す。
【図２８Ａ】ＢＴＬＡ−ＣＨＯ細胞に対する抗ＢＴＬＡ抗体の濃度依存性の結合を示す。
【図２８Ｂ】抗ＢＴＬＡ抗体がＨＶＥＭのＢＴＬＡ−ＣＨＯ細胞への濃度依存性の結合を阻止することを示す。
【図２８Ｃ】抗ＢＴＬＡ抗体がＨＶＥＭのＢＴＬＡ−ＣＨＯ細胞への濃度依存性の結合を阻止することを示す。
【図２９】抗ＢＴＬＡ抗体の抗原特異性を示す。Ａ．様々な抗ＢＴＬＡ抗体の、他のＣＤ２８分子へのそれらの結合に対する結合特異性を図示する。Ｂ．高原特異的な対照を図示する。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
詳細な説明
一態様では、本開示は、ＢＴＬＡに特異的に結合する単離モノクローナル抗体、特にヒトモノクローナル抗体に関する。特定の実施形態では、本開示の抗体は、１つ以上の望ましい機能特性、例えばＢＴＬＡに対する高親和性結合、他のＣＤ２８ファミリーメンバーに対する交差反応の欠如、Ｔおよび／またはＢ細胞増殖に対する刺激能、１種もしくは複数種のＢＴＬＡリガンド（例えばＨＶＥＭ）のＢＴＬＡへの結合に対する阻害能、インビボでの腫瘍細胞の増殖に対する阻害能、抗原特異的な記憶応答に対する刺激能、および／または抗体応答に対する刺激能を示す。一部の実施形態では、本開示の抗体は免疫応答を阻害する。さらにまたはその他として、本開示の抗体は特定の重鎖および軽鎖生殖細胞系配列に由来し、かつ／または特定のアミノ酸配列を含むＣＤＲ領域などの特定の構造的特徴を含む。
【００６９】
本開示は、例えば単離抗体、かかる抗体を作製する方法、かかる抗体を含む免疫複合体および二重特異性分子、ならびに本開示の抗体、免疫複合体または二重特異性分子を含有する薬学的組成物を提供する。
【００７０】
別の態様では、本開示は、抗ＢＴＬＡ抗体を用いて対象における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法に関する。抗ＢＴＬＡ抗体は、インビボで腫瘍細胞の増殖を阻害可能である。本開示は、抗体を用いて免疫応答を改良するとともに癌または感染性疾患などの疾患を治療するかあるいは（例えば抗ＢＴＬＡと目的の抗原との同時投与により）防御的な自己免疫応答を刺激するかまたは抗原特異的な免疫応答を刺激する方法にも関する。
【００７１】
本開示がより容易に理解されうるように、最初に特定の用語が定義される。さらなる定義が詳細な説明を通じて示される。
【００７２】
「ＢおよびＴリンパ球アテニュエーター」および「ＢＴＬＡ」遺伝子／タンパク質という用語は同義的に用いられ、変異体、アイソフォーム、相同体、オーソログおよびパラログを含む。例えば、ヒトＢＴＬＡに特異的な抗体は、特定の実施形態ではヒト以外の種由来のＢＴＬＡと交差反応しうる。他の実施形態では、ヒトＢＴＬＡに特異的な抗体は、ヒトＢＴＬＡに完全に特異的である可能性があり、かつ交差反応性の種または他のタイプを示すことがない。「ヒトＢＴＬＡ」という用語は、ヒト配列ＢＴＬＡ、例えばＧｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ＿８６１４４５を有するヒトＢＴＬＡの完全なアミノ酸配列を示す。ヒトＢＴＬＡ配列は、例えば保存突然変異または非保存領域内の突然変異を有する点で配列番号：７３のヒトＢＴＬＡと異なる可能性があり、ＢＴＬＡは配列番号：７３のヒトＢＴＬＡと実質的に同じ生物学的機能を有する。例えば、ヒトＢＴＬＡの生物学的機能は免疫応答、例えばＴ細胞応答を抑制することである。すなわち、ＢＴＬＡは負の調節因子であると考えられる。それはＩＬ−２の産生およびＴ細胞の拡大に関与するＣ末端阻害剤モチーフを有する（ワタナベ（Ｗａｔａｎａｂｅ）ら、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４、６７０−６７９頁、２００３年；ケムニッツ（Ｃｈｅｍｎｉｔｚ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７６、６６０３−６６１４頁、２００６年）。さらに、ヒトＢＴＬＡの生物学的機能は、例えば本開示の抗体により特異的に結合されるＢＴＬＡの細胞外ドメイン内にエピトープを有している可能性がある。
【００７３】
特定のＢＴＬＡ配列は、一般にアミノ酸配列が配列番号：７３のヒトＢＴＬＡと少なくとも９０％同一であり、かつアミノ酸配列が他の種（例えばマウス）のＢＴＬＡアミノ酸配列と比較される場合にヒトであることが同定されるアミノ酸残基を有することになる。特定の場合、ヒトＢＴＬＡは、配列番号：７３のヒトＢＴＬＡに対して少なくとも９５％、またはさらに少なくとも９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一でありうる。特定の実施形態では、ヒトＢＴＬＡ配列は、配列番号：７３のＢＴＬＡとは１０以下のアミノ酸の違いを示すことになる。特定の実施形態では、ヒトＢＴＬＡは、配列番号：７３のＢＴＬＡとは５以下またはさらに４、３、２、もしくは１以下のアミノ酸の違いを示す場合がある。パーセント同一性は、本明細書中に記載のように判定されうる。
【００７４】
「免疫応答」という用語は、侵入する病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織、癌細胞、または自己免疫もしくは病的炎症の場合での正常なヒト細胞もしくは組織に対する選択的損傷、それらの破壊または人体からの除去をもたらす、例えば、（抗体、サイトカイン、および補体を含む）上記の細胞または肝臓によって生成されるリンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球、および可溶性高分子の作用を示す。
【００７５】
「シグナル伝達経路」は、細胞のある部分から細胞の別の部分へのシグナルの伝達を担う種々のシグナル伝達分子間の生化学的関係を示す。本明細書で用いられる「細胞表面受容体」という語句は、例えばシグナルの受け取りおよび細胞の原形質膜を通過するかかるシグナルの伝達が可能な分子および分子の複合体を含む。本発明の「細胞表面受容体」の例として、ＢＴＬＡ受容体が挙げられる。
【００７６】
本明細書で記載の「抗体」という用語は、全抗体および任意の抗原結合断片（すなわち「抗原結合部分」）またはその一本鎖を含む。「抗体」は、ジスルフィド結合により相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖またはその抗原結合部分を含む糖タンパク質を示す。各重鎖は重鎖可変領域（本明細書中でＶＨと略記）および重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域はＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３という３つのドメインからなる。各軽鎖は軽鎖可変領域（本明細書中でＶＬと略記）および軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域はＣＬという１つのドメインからなる。ＶＨおよびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変領域にさらに再分化され、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存される領域が組み入れられうる。各ＶＨおよびＶＬは３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなり、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へ配列される。重鎖および軽鎖の可変領域は抗原と相互作用する結合ドメインを有する。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの宿主組織または免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）および古典的補体系の第１の成分（Ｃｌｑ）を含む因子への結合を媒介しうる。
【００７７】
本明細書で用いられる抗体の「抗原結合部分」（または単に「抗体部分」）という用語は、抗原（例えばＢＴＬＡ）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を示す。抗体の抗原結合機能が完全長抗体の断片により果たされうることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語の範囲内に包含される結合断片の例として、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域でのジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一の腕のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（ワード（Ｗａｒｄ）ら、（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６頁）；単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインのＶＬおよびＶＨが別々の遺伝子でコードされるが、ＶＬおよびＶＨ領域が、それらの一価分子を形成するように対をなす場合の単一のタンパク質鎖としての作製を可能にする合成リンカーによる組換え方法を用いて連結されうる（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えばバード（Ｂｉｒｄ）ら（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６頁、およびハストン（Ｈｕｓｔｏｎ）ら（１９８８年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９−５８８３頁を参照）。かかる一本鎖抗体は、抗体の「抗原結合部分」という用語の範囲内に包含されるようにも意図されている。これらの抗体断片は、当業者に既知の従来の技術を用いて得られ、断片における有用性が無傷抗体の場合と同様の方法でスクリーニングされる。
【００７８】
本明細書で用いられる「単離抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を示すように意図されている（例えば、ＢＴＬＡに対して特異的に結合する単離抗体は、ＢＴＬＡ以外の抗原に対して特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかし、ＢＴＬＡに対して特異的に結合する単離抗体は、他の抗原、例えば他の種由来のＢＴＬＡ分子に対する交差反応性を有しうる。さらに、単離抗体は、他の細胞材料および／または化学物質を実質的に含まない場合がある。
【００７９】
本明細書で用いられる「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一の分子組成物の抗体分子の調製物を示す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す。
【００８０】
本明細書で用いられる「ヒト抗体」という用語は、フレームワークおよびＣＤＲ領域の双方がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する場合の可変領域を有する抗体を含むように意図されている。さらに、抗体が定常領域を有する場合、定常領域もヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する。本開示のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によりコードされることのないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムまたは部位特異的な突然変異誘発またはインビボでの体細胞突然変異により導入される突然変異）を含みうる。しかし、本明細書で用いられる「ヒト抗体」という用語は、別の哺乳類種、例えばマウスの生殖細胞系かに由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植されている場合の抗体を含むように意図されていない。
【００８１】
「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、フレームワークおよびＣＤＲ領域の双方がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する場合の可変領域を有する単一の結合特異性を提示する抗体を示す。一実施形態では、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合されたヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスから得られるＢ細胞を含むハイブリドーマにより産生される。
【００８２】
本明細書で用いられる「組換えヒト抗体」という用語は、組換え手段により調製、発現、作製または単離されるすべてのヒト抗体、例えば（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子におけるトランスジェニックまたはトランスクロモゾ−ム（ｔｒａｎｓｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ）である動物（例えばマウス）あるいはそれから調製されるハイブリドーマから単離される抗体（さらに下記に記載）、（ｂ）形質転換されることでヒト抗体を発現する宿主細胞、例えばトランスフェクトーマ（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｍａ）から単離される抗体、（ｃ）組換えられたコンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離される抗体、および（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意の他の手段により調製、発現、作製または単離される抗体を含む。そのような組換えヒト抗体は、フレームワークおよびＣＤＲ領域がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する場合の可変領域を有する。しかし、特定の実施形態では、そのような組換えヒト抗体に対し、インビトロでの突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列に対してトランスジェニックな動物が用いられる場合、インビボでの体細胞突然変異誘発）を実施可能であり、それ故、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系ＶＨおよびＶＬ配列に由来しかつそれらに関連する一方、インビボでヒト抗体生殖細胞系レパートリーの範囲内に天然に存在することがない配列である。
【００８３】
本明細書で用いられる「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によりコードされる抗体クラス（例えばＩｇＭまたはＩｇＧｌ）を示す。
【００８４】
「抗原を認識する抗体」および「抗原に対して特異的な抗体」という語句は、本明細書中で「抗原に対して特異的に結合する抗体」という用語と同義的に用いられる。
【００８５】
「ヒト抗体誘導体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）」という用語は、ヒト抗体の任意の修飾形態、例えば抗体と別の作用物質または抗体との複合体を示す。
【００８６】
「ヒト化抗体」という用語は、別の哺乳類種、例えばマウスの生殖細胞系に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植されている場合の抗体を示すように意図されている。さらなるフレームワーク領域の修飾がヒトフレームワーク配列内でなされうる。
【００８７】
「キメラ抗体」という用語は、可変領域配列が１種に由来しかつ定常領域配列が別種に由来する場合の抗体、例えば可変領域配列がマウス抗体に由来しかつ定常領域配列がヒト抗体に由来する場合の抗体を示すように意図されている。
【００８８】
本明細書で用いられる「ヒトＢＴＬＡに特異的に結合する」抗体は、１×１０−７Ｍ以下、より好ましくは５×１０−８Ｍ以下、より好ましくは１×１０−８Ｍ以下、より好ましくは５×１０−９Ｍ以下のＫＤでヒトＢＴＬＡに結合する抗体を示すように意図されている。
【００８９】
本明細書で用いられる「Ｋａｓｓｏｃ」または「Ｋａ」という用語は特定の抗体−抗原相互作用の結合速度を示すように意図されている一方、本明細書で用いられる「Ｋｄｉｓ」または「Ｋｄ」という用語は特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を示すように意図されている。本明細書で用いられる「ＫＤ」という用語は解離定数を示すように意図されており、それはＫｄ対Ｋａの比（すなわちＫｄ／Ｋａ）から得られ、かつモル濃度（Ｍ）として表現されるものである。抗体におけるＫＤ値は、当技術分野で十分に確立された方法を用いて決定可能である。抗体のＫＤを決定するための好ましい方法は、表面プラスモン共鳴、好ましくはビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムの利用によるものである。
【００９０】
本明細書で用いられるＩｇＧ抗体に対する「高親和性」という用語は、標的抗原に対して１０−８Ｍ以下、より好ましくは１０−９Ｍ以下およびさらにより好ましくは１０−１０Ｍ以下のＫＤを有する抗体を示す。しかし、「高親和性」結合は他の抗体アイソタイプに対して変化しうる。例えば、ＩｇＭアイソタイプに対する「高親和性」結合は、１０−７Ｍ以下、より好ましくは１０−８Ｍ以下、さらにより好ましくは１０−９Ｍ以下のＫＤを有する抗体を示す。
【００９１】
本明細書で用いられる「対象」という用語は任意のヒトまたは非ヒト動物を示す。「非ヒト動物」という用語は、すべての脊椎動物、例えば哺乳類および非哺乳類、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などを含む。
【００９２】
本開示の様々な態様は、以下のサブセクションでさらに詳述する。
【００９３】
抗ＢＴＬＡ抗体
本開示の抗体は、抗体の特定の機能的特徴または特性により特徴づけられる。例えば、抗体はＢＴＬＡに特異的に結合する（例えばヒトＢＴＬＡに結合しかつ他の種、例えばカニクイザルに由来するＢＴＬＡと交差反応しうる）。好ましくは、本開示の抗体は高親和性、例えば１×１０−７Ｍ以下のＫＤでＢＴＬＡに結合する。本開示の抗ＢＴＬＡ抗体は、好ましくは、
（ａ）１×１０−７Ｍ以下のＫＤでヒトＢＴＬＡに結合する
（ｂ）ヒトＴｒｋＢ、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１またはＩＣＯＳに実質的に結合しない、または
（ｃ）ＨＶＥＭのＢＴＬＡへの結合を阻害する
という特性のうちの１つ以上を示す。
【００９４】
さらなる実施形態では、本開示の抗ＢＴＬＡ抗体は、
（ａ）免疫応答を刺激する
（ｂ）抗体応答を刺激する、または
（ｃ）インビボで腫瘍細胞の増殖を阻害する
という特性を示す。
【００９５】
さらなる実施形態では、本開示の抗ＢＴＬＡ抗体は免疫応答を刺激する。すなわち一部の実施形態では、本開示の抗体はアンタゴニスト抗体でありかつＨＶＥＭ媒介性の阻害シグナルを阻止する一方、他の実施形態では、本開示の抗体は、ＢＴＬＡを活性化するアゴニスト抗体でありかつ阻害シグナルをＢＴＬＡを発現する細胞に提供する。
【００９６】
好ましくは、抗体は５×１０−８Ｍ以下のＫＤでヒトＢＴＬＡに結合するか、１×１０−８Ｍ以下のＫＤでヒトＢＴＬＡに結合するか、５×１０−９Ｍ以下のＫＤでヒトＢＴＬＡに結合するか、または１×１０−８Ｍ〜１×１０−１０Ｍ以下のＫＤでヒトＢＴＬＡに結合する。
【００９７】
本開示の抗体は、上掲の特徴の任意の組み合わせ、例えば上掲の特徴のうちの２つ、３つ、４つ、５つもしくはそれより多数を示しうる。
【００９８】
抗体のＢＴＬＡに対する結合能を評価するための標準アッセイは当技術分野で既知であり、例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットおよびＲＩＡを含む。抗体の結合動態（例えば結合親和性）は、当技術分野で既知の標準アッセイ、例えばビアコア分析によっても評価されうる。上記の特性のいずれかの評価に適するアッセイを実施例に詳述する。
【００９９】
モノクローナル抗体１Ｂ４、Ｅ４Ｈ９、３Ｃ２、３Ｃ２ａ、６Ａ５、１１Ｅ２、Ｅ８Ｄ９、１０Ｈ６、１０Ｈ６ａ、および４Ｃ９
本開示の好ましい抗体は、実施例１および２に記載のように単離され構造的に特徴づけられた、ヒトモノクローナル抗体１Ｂ４、Ｅ４Ｈ９、３Ｃ２、３Ｃ２ａ、６Ａ５、１１Ｅ２、Ｅ８Ｄ９、１０Ｈ６、１０Ｈ６ａ、および４Ｃ９である。１Ｂ４、Ｅ４Ｈ９、３Ｃ２、６Ａ５、１１Ｅ２、Ｅ８Ｄ９、１０Ｈ６、１０Ｈ６ａ、および４Ｃ９のＶＨアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：１、２、３、４、５、６、７４、および８５で示される。３Ｃ２ａのＶＨアミノ酸配列は３Ｃ２と同じものである。１０Ｈ６ａのＶＨアミノ酸配列は１０Ｈ６と同じものである。１Ｂ４、Ｅ４Ｈ９、３Ｃ２、３Ｃ２ａ、６Ａ５、１１Ｅ２、Ｅ８Ｄ９、１０Ｈ６、１０Ｈ６ａ、および４Ｃ９のＶＬアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：７、８、９、１０、１１、１２、１３、７５、７６、および８６で示される。
【０１００】
これらの各抗体がＢＴＬＡに結合しうると仮定すると、ＶＨおよびＶＬ配列が「混合され、一致する」ことで、本開示の他の抗ＢＴＬＡ結合分子の作製が可能である。かかる「混合され、一致する」抗体のＢＴＬＡ結合については上記でかつ実施例に記載の結合アッセイ（例えばＥＬＩＳＡ）を用いて試験されうる。好ましくは、ＶＨおよびＶＬ鎖が混合され、一致する場合、特定のＶＨ／ＶＬ対由来のＶＨ配列は構造的に類似のＶＨ配列と交換される。同様に、好ましくは特定のＶＨ／ＶＬ対由来のＶＬ配列は構造的に類似のＶＬ配列と交換される。
【０１０１】
したがって、一態様では、本開示は、
（ａ）配列番号：１、２、３、４、５、６、７４、および８５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号：７、８、９、１０、１１、１２、１３、７５、７６、および８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体はＢＴＬＡ、好ましくはヒトＢＴＬＡに特異的に結合する。
【０１０２】
好ましい重鎖および軽鎖の組み合わせは、
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および（ｂ）配列番号：７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
（ａ）配列番号：２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および（ｂ）配列番号：８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
（ａ）配列番号：３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および（ｂ）配列番号：９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
（ａ）配列番号：３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および（ｂ）配列番号：１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
（ａ）配列番号：４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および（ｂ）配列番号：１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
（ａ）配列番号：５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および（ｂ）配列番号：１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
（ａ）配列番号：６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および（ｂ）配列番号：１３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
（ａ）配列番号：７４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および（ｂ）配列番号：７５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
（ａ）配列番号：７４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および（ｂ）配列番号：７６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
（ａ）配列番号：８５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および（ｂ）配列番号：８６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
を含む。
【０１０３】
別の態様では、本開示は、１Ｂ４、Ｅ４Ｈ９、３Ｃ２、３Ｃ２ａ、６Ａ５、１１Ｅ２、Ｅ８Ｄ９、１０Ｈ６、１０Ｈ６ａ、および４Ｃ９の重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３またはそれらの組み合わせを含む抗体を提供する。１Ｂ４、Ｅ４Ｈ９、３Ｃ２、６Ａ５、１１Ｅ２、Ｅ８Ｄ９、１０Ｈ６、および４Ｃ９のＶＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：１４、１５、１６、１７、１８、１９、７７、および８７で示される。１Ｂ４、Ｅ４Ｈ９、３Ｃ２、６Ａ５、１１Ｅ２、Ｅ８Ｄ９、１０Ｈ６、および４Ｃ９のＶＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：２０、２１、２２、２３、２４、２５、７８、および８８で示される。１Ｂ４、Ｅ４Ｈ９、３Ｃ２、６Ａ５、１１Ｅ２、Ｅ８Ｄ９、１０Ｈ６、および４Ｃ９のＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：２６、２７、２８、２９、３０、３１、７９、および８９で示される。１Ｂ４、Ｅ４Ｈ９、３Ｃ２、３Ｃ２ａ、６Ａ５、１１Ｅ２、Ｅ８Ｄ９、１０Ｈ６、１０Ｈ６ａ、および４Ｃ９のＶｋＣＤＲ１のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、８０、９０、および９５で示される。１Ｂ４、Ｅ４Ｈ９、３Ｃ２、３Ｃ２ａ、６Ａ５、１１Ｅ２、Ｅ８Ｄ９、１０Ｈ６、１０Ｈ６ａ、および４Ｃ９のＶｋＣＤＲ２のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、８１、９１、および９６で示される。１Ｂ４、Ｅ４Ｈ９、３Ｃ２、３Ｃ２ａ、６Ａ５、１１Ｅ２、Ｅ８Ｄ９、１０Ｈ６、１０Ｈ６ａ、および４Ｃ９のＶｋＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、８２、９２、および９７で示される。ＣＤＲ領域は、カバト（Ｋａｂａｔ）システム（カバト  Ｅ．Ａ．（Ｋａｂａｔ  Ｅ．Ａ．）ら（１９９１年）「免疫学的利益に関するタンパク質配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）」、第５版、米国保健福祉省（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２）を用いて、図示される。
【０１０４】
これらの各抗体がＢＴＬＡに結合可能でありかつ抗原結合特異性が主にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域により提供されると仮定すると、ＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列とＶＫＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列が「混合されて一致する」（すなわち、各抗体がＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３とＶＫＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を有する必要があるが、異なる抗体由来のＣＤＲが混合されて一致する）ことで、本開示の他の抗ＢＴＬＡ結合分子の作製が可能である。かかる「混合されて一致する」抗体のＢＴＬＡへの結合は、上記や実施例に記載の結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、ビアコア分析）を用いて試験可能である。好ましくは、ＶＨＣＤＲ配列が混合されて一致する場合、特定のＶＨ配列由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列は構造的に類似のＣＤＲ配列と置換される。同様に、ＶＫＣＤＲ配列が混合されて一致する場合、特定のＶＫ配列由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列は、好ましくは構造的に類似のＣＤＲ配列と置換される。新規のＶＨおよびＶＬ配列の作製が、１つ以上のＶＨおよび／またはＶＬＣＤＲ領域配列をモノクローナル抗体１Ｂ４、Ｅ４Ｈ９、３Ｃ２、３Ｃ２ａ、６Ａ５、１１Ｅ２、Ｅ８Ｄ９、１０Ｈ６、１０Ｈ６ａおよび４Ｃ９における本明細書中に開示されるＣＤＲ配列由来の構造的に類似の配列と置換することにより可能であることは当業者に容易に理解されるであろう。
【０１０５】
したがって、別の態様では、本開示は、
（ａ）配列番号：１４、１５、１６、１７、１８、１９、７７および８７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号：２０、２１、２２、２３、２４、２５、７８および８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域のＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号：２６、２７、２８、２９、３０、３１、７９および８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域のＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号：３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、８０、９０および９５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号：３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、８１、９１および９６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号：４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、８２、９２および９７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ３；
を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体はＢＴＬＡ、好ましくはヒトＢＴＬＡに対して特異的に結合する。
【０１０６】
好ましい実施形態では、抗体は、
（ａ）配列番号：１４を含む重鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号：２０を含む重鎖可変領域のＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号：２６を含む重鎖可変領域のＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号：３２を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号：３９を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号：４６を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ３
を含む。
【０１０７】
別の好ましい実施形態では、抗体は、
（ａ）配列番号：１５を含む重鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号：２１を含む重鎖可変領域のＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号：２７を含む重鎖可変領域のＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号：３３を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号：４０を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号：４７を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ３
を含む。
【０１０８】
別の好ましい実施形態では、抗体は、
（ａ）配列番号：１６を含む重鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号：２２を含む重鎖可変領域のＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号：２８を含む重鎖可変領域のＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号：３４を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号：４１を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号：４８を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ３
を含む。
【０１０９】
別の好ましい実施形態では、抗体は、
（ａ）配列番号：１６を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号：２２を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号：２８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号：３５を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号：４２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号：４９を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。
【０１１０】
別の好ましい実施形態では、抗体は、
（ａ）配列番号：１７を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号：２３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号：２９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号：３６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号：４３を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号：５０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。
【０１１１】
別の好ましい実施形態では、抗体は、
（ａ）配列番号：１８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号：２４を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号：３０を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号：３７を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号：４４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号：５１を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。
【０１１２】
別の好ましい実施形態では、抗体は、
（ａ）配列番号：１９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号：２５を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号：３１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号：３８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号：４５を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号：５２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。
【０１１３】
別の好ましい実施形態では、抗体は、
（ａ）配列番号：７７を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号：７８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号：７９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号：８０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号：８１を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号：８２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。
【０１１４】
別の好ましい実施形態では、抗体は、
（ａ）配列番号：８７を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号：８８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号：８９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号：９０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号：９１を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号：９２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。
【０１１５】
別の好ましい実施形態では、抗体は、
（ａ）配列番号：７７を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号：７８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号：７９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号：９５を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号：９６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号：９７を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。
【０１１６】
ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２ドメインから独立したＣＤＲ３ドメインが単独で抗体の同族抗原に対する結合特異性を決定しうることと、共通のＣＤＲ３配列に基づく同じ結合特異性を有する複数の抗体が予測通りに産生されうることは、当技術分野で周知である。例えば、（マウス抗ＣＤ３０抗体Ｋｉ−４の重鎖可変ドメインＣＤＲ３のみを用いるヒト化抗ＣＤ３０抗体の産生について記載する）クリムカ（Ｋｌｉｍｋａ）ら、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ．ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ８３（２）：２５２−２６０頁（２０００年）；（親マウスＭＯＣ−３１抗ＥＧＰ−２抗体の重鎖ＣＤＲ３配列のみを用いる組換え上皮糖タンパク質−２（ＥＧＰ−２）抗体について記載する）ベイボアー（Ｂｅｉｂｏｅｒ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：８３３−８４９頁（２０００年）；（マウス抗インテグリンαｖβ３抗体ＬＭ６０９の重鎖および軽鎖可変ＣＤＲ３ドメインを用いる一群のヒト化抗インテグリンαｖβ３抗体においては、各メンバー抗体は、ＣＤＲ３ドメイン外部の異なる配列を含み、親マウス抗体と同じエピトープに親マウス抗体と同程度に高いまたはそれより高い親和性で結合可能である点について記載する）レイダー（Ｒａｄｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：８９１０−８９１５頁（１９９８年）；（ＣＤＲ３ドメインが抗原結合に対して最も有意な寄与をもたらす点を開示する）バーバス（Ｂａｒｂａｓ）ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：２１６１−２１６２頁（１９９４年）；（ヒト胎盤ＤＮＡに対する３つのＦａｂ（ＳＩ−１、ＳＩ−４０、およびＳＩ−３２）の重鎖ＣＤＲ３配列の抗破傷風トキソイドＦａｂの重鎖上への移植により既存の重鎖ＣＤＲ３が置換される点を記載し、ＣＤＲ３ドメインが単独で結合特異性を与えた点について示している）バーバス（Ｂａｒｂａｓ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：２５２９−２５３３頁（１９９５年）；および（単一特異性ＩｇＧ破傷風トキソイドに結合するＦａｂ  ｐ３１３抗体の重鎖に対する親多重特異性Ｆａｂ  ＬＮＡ３の重鎖ＣＤＲ３のみの転移が親Ｆａｂの結合特異性を保持するのに十分であったという移植試験について記載する）ディッツェル（Ｄｉｔｚｅｌ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：７３９−７４９頁（１９９６年）を参照のこと。これらの各参考文献はその全体が参照により本明細書中に援用される。
【０１１７】
したがって、特定の態様の範囲内で、本開示は、非ヒト抗体、例えばマウスまたはラット抗体に由来する１つ以上の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含むモノクローナル抗体を提供し、ここでモノクローナル抗体はＢＴＬＡに特異的に結合可能である。一部の実施形態の範囲内で、非ヒト抗体由来の１つ以上の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含む本発明の抗体は、（ａ）結合に対して競合可能であり、（ｂ）機能特性を保持し、（ｃ）同じエピトープに結合し、および／または（ｄ）対応する親非ヒト抗体と類似の結合親和性を有する。
【０１１８】
他の態様の範囲内で、本開示は、例えば非ヒト動物から得られるヒト抗体などの第１のヒト抗体由来の１つ以上の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含むモノクローナル抗体を提供し、ここで第１のヒト抗体はＢＴＬＡに特異的に結合可能であり、かつ第１のヒト抗体由来のＣＤＲ３ドメインはＢＴＬＡへの結合特異性が欠如したヒト抗体内のＣＤＲ３ドメインを置き換えることでＢＴＬＡに特異的に結合可能な第２のヒト抗体が産生される。一部の実施形態の範囲内で、第１のヒト抗体由来の１つ以上の重鎖および／または軽鎖のＣＤＲ３ドメインを含む本発明の抗体は、（ａ）結合に対して競合可能であり、（ｂ）機能特性を保持し、（ｃ）同じエピトープに結合し、および／または（ｄ）対応する第１の親ヒト抗体と類似の結合親和性を有する。
【０１１９】
特定の生殖細胞系配列を有する抗体
特定の実施形態では、本開示の抗体は、特定の生殖細胞系重鎖免疫グロブリン遺伝子由来の重鎖可変領域および／または特定の生殖細胞系軽鎖免疫グロブリン遺伝子由来の軽鎖可変領域を含む。
【０１２０】
例えば、好ましい実施形態では、本開示は、ヒトＶＨ２−０５遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体はＢＴＬＡ、好ましくはヒトＢＴＬＡに特異的に結合する。別の好ましい実施形態では、本開示は、ヒトＶＨ２−７０遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体はＢＴＬＡ、好ましくはヒトＢＴＬＡに特異的に結合する。別の好ましい実施形態では、本開示は、ヒトＶＨ４−５９遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体はＢＴＬＡ、好ましくはヒトＢＴＬＡに特異的に結合する。別の好ましい実施形態では、本開示は、ヒトＶＨ３−２０遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体はＢＴＬＡ、好ましくはヒトＢＴＬＡに特異的に結合する。別の好ましい実施形態では、本開示は、ヒトＶＨ３−３３遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体はＢＴＬＡ、好ましくはヒトＢＴＬＡに特異的に結合する。さらに別の好ましい実施形態では、本開示は、ヒトＶＫＡ２７遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する軽鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体はＢＴＬＡ、好ましくはヒトＢＴＬＡに特異的に結合する。さらに別の好ましい実施形態では、本開示は、ヒトＶＫＬ１８遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する軽鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体はＢＴＬＡ、好ましくはヒトＢＴＬＡに特異的に結合する。さらに別の好ましい実施形態では、本開示は、ヒトＶＫＬ１５遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する軽鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体はＢＴＬＡ、好ましくはヒトＢＴＬＡに特異的に結合する。さらに別の好ましい実施形態では、本開示は、ヒトＶＫ０４遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する軽鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体はＢＴＬＡ、好ましくはヒトＢＴＬＡに特異的に結合する。さらに別の好ましい実施形態では、本開示は単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体は、
（ａ）ヒトＶＨ２−０５、２−７０、４−５９、３−２０、または３−３３の産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域を含み（同遺伝子はそれぞれ配列番号：６６、６７、６８、６９、または９９で示されるアミノ酸配列をコードする）、
（ｂ）ヒトＶＫＡ２７、Ｌ１８、Ｌ１５または０４遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する軽鎖可変領域を含み（同遺伝子はそれぞれ配列番号：７０、７１、または７２で示されるアミノ酸配列をコードする）、かつ
（ｃ）ＢＴＬＡに特異的に結合する。
【０１２１】
ＶＨ２−０５のＶＨおよびＶＫＡ２７のＶＫを有する抗体の例が１Ｂ４、６Ａ５、およびＥ８Ｄ９である。ＶＨ２−７０のＶＨおよびＶＫＡ２７のＶＫを有する抗体の例がＥ４Ｈ９である。ＶＨ４−５９のＶＨおよびＶＫＬ１８のＶＫを有する抗体の例が３Ｃ２である。ＶＨ４−５９のＶＨおよびＶＫＡ２７のＶＫを有する抗体の例が３Ｃ２ａである。ＶＨ３−２０のＶＨおよびＶＫｌ１５のＶＫを有する抗体の例が１１Ｅ２である。ＶＨ３−３３のＶＨおよびＶＫ０４のＶＫを有する抗体の例が１０Ｈ６である。ＶＨ３−３３のＶＨおよびＶＫＡ２７のＶＫを有する抗体の例が１０Ｈ６ａである。ＶＨ２−０５のＶＨおよびＶＫＡ２７のＶＫを有する抗体の例が４Ｃ９である。
【０１２２】
本明細書で用いられるヒト抗体は、抗体の可変領域がヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子を用いる系から得られる場合、特定の生殖細胞系配列「の産物」であるかまたはそれ「に由来する」重鎖または軽鎖可変領域を含む。かかる系は、目的の抗原とともにヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスを免疫するステップまたは目的の抗原とともにファージ上に提示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリをスクリーニングするステップを含む。ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列「の産物」であるかまたはそれ「に由来する」ヒト抗体が、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖細胞系免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較し、配列においてヒト抗体の配列に対して最も近い（すなわち最大の％同一性がある）ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列を選択することにより、かかるものとして同定されうる。特定のヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列「の産物」であるかまたはそれ「に由来する」ヒト抗体は、例えば自然発生的体細胞突然変異または部位特異的突然変異の意図的導入に起因し、生殖細胞系配列と比べてアミノ酸の差を有しうる。しかし、選択されたヒト抗体は、典型的にはアミノ酸配列においてヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子にコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であり、かつ、ヒト抗体が他種の生殖細胞系免疫グロブリンアミノ酸配列（例えばマウス生殖細胞系配列）と比較される場合にヒトであるものと同定されるアミノ酸残基を有する。特定の場合、ヒト抗体は、アミノ酸配列において生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子にコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％またはさらに少なくとも９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一でありうる。典型的には、特定のヒト生殖細胞系配列に由来するヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子にコードされるアミノ酸配列とは１０個以下のアミノ酸の差を示すことになる。特定の場合、ヒト抗体は、生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子にコードされるアミノ酸配列とは５個以下またはさらには４、３、２もしくは１個以下のアミノ酸の差を示しうる。
【０１２３】
相同抗体
さらに別の実施形態では、本開示の抗体は、本明細書中に記載の好ましい抗体のアミノ酸配列に相同なアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖可変領域を含み、ここで抗体は本開示の抗ＢＴＬＡ抗体の所望の機能特性を保持する。
【０１２４】
例えば、本開示は、
（ａ）重鎖可変領域は配列番号：１、２、３、４、５、６、７４および８５からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を含み、
（ｂ）軽鎖可変領域は配列番号：７、８、９、１０、１１、１２、１３、７５、７６および８６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を含み
かつ、抗体は、
（ｉ）抗体は１×１０−７Ｍ以下のＫＤでヒトＢＴＬＡに結合し、
（ｉｉ）抗体はヒトＴｒｋＢ、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１またはＩＣＯＳに実質的に結合せず、
（ｉｉｉ）抗体はＨＶＥＭのＢＴＬＡへの結合を阻害し、
（ｉｖ）抗体は免疫応答を刺激し、
（ｖ）抗体は抗体応答を刺激し、
（ｖｉ）抗体はインビボで腫瘍細胞の増殖を阻害する
という特性のうちの１つ以上を示す。
【０１２５】
他の実施形態では、抗体は免疫応答を阻害または抑制する。
【０１２６】
他の実施形態では、ＶＨおよび／またはＶＬアミノ酸配列は、上で示される配列に８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％相同でありうる。上で示される配列のＶＨおよびＶＬ領域に対して高い（すなわち８０％以上の）相同性を有するＶＨおよびＶＬ領域を有する抗体が、配列番号：５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４および／または６５をコードする核酸分子の突然変異誘発（例えば、部位特異的またはＰＣＲ媒介性突然変異誘発）と、その後の本明細書中に記載の機能アッセイを用いてのコードされた改変抗体の保持された機能（すなわち上記（ｃ）から（ｇ）に示される機能）についての試験により得られうる。
【０１２７】
本明細書で用いられる２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、２つの配列間のパーセント同一性に相当する。２つの配列間のパーセント同一性は、ギャップの数および各ギャップの長さを考慮した、配列で共有される同一位置の数の関数（すなわち％相同性＝同一位置の数／位置の全体数×１００）であり、２つの配列の最適なアラインメントにおいて導入される必要がある。配列の比較および２つの配列間のパーセント同一性の決定は、下記の非限定例にて記載のように数学的アルゴリズムを用いて行われうる。
【０１２８】
２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、Ｅ．メイヤーズ（Ｅ．Ｍｅｙｅｒｓ）およびＷ．ミラー（Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ）のアルゴリズム（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．、４：１１−１７頁（１９８８年））を用いて決定可能であり、同アルゴリズムはＰＡＭ１２０重み残基テーブル（ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）、１２のギャップ長ペナルティ（Ｇａｐ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｅｎａｌｔｙ）および４のギャップペナルティを用いてＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に導入されている。さらに、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）およびヴンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ）（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３頁（１９７０年））アルゴリズムを用いて決定可能であり、同アルゴリズムはブロッサム（Ｂｌｏｓｓｕｍ）６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれかと、１６、１４、１２、１０、８、６もしくは４のギャップ重量および１、２、３、４、５もしくは６の長さ重量を用いてＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）内のＧＡＰプログラム中に包含されている。
【０１２９】
さらにまたはその他として、本開示のタンパク質配列をさらに「クエリー配列」として用い、公的データベースで探索を行い、例えば関連配列を同定することが可能である。かかる探索は、アルツシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、（１９９０年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０頁のＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて実行可能である。ＢＬＡＳＴタンパク質の探索をＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて行うことで、本開示の抗体分子に相同なアミノ酸配列が得られうる。比較目的でギャップドアラインメント（ｇａｐｐｅｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ）を得るため、アルツシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２頁に記載のようにギャップドＢＬＡＳＴ（Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ）が用いられうる。ＢＬＡＳＴおよびギャップドＢＬＡＳＴ（Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ）プログラムを用いる場合、各プログラムのデフォルトパラメータ（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）が有用でありうる（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照のこと）。
【０１３０】
保存的修飾を有する抗体
特定の実施形態では、本開示の抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域およびＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含み、ここでこれらのＣＤＲ配列のうちの１つ以上は本明細書中に記載の好ましい抗体（例えば、１Ｂ４、Ｅ４Ｈ９、３Ｃ２、３Ｃ２ａ、６Ａ５、１１Ｅ２またはＥ８Ｄ９）に基づく特定のアミノ酸配列またはその保存的修飾を含み、かつここで抗体は本開示の抗ＢＴＬＡ抗体の所望の機能特性を保持する。したがって、本開示は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域およびＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで
（ａ）重鎖可変領域のＣＤＲ３配列は、配列番号：２６、２７、２８、２９、３０、３１、７９および８９のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含み、
（ｂ）軽鎖可変領域のＣＤＲ３配列は、配列番号：４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、８２、９２および９７のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含み、かつ
抗体は、
（ｉ）抗体は１×１０−７Ｍ以下のＫＤでヒトＢＴＬＡに結合し、
（ｉｉ）抗体はヒトＴｒｋＢ、ＰＤ−１、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４またはＩＣＯＳに実質的に結合せず、
（ｉｉｉ）抗体はＨＶＥＭのＢＴＬＡへの結合を阻害し、
（ｉｖ）抗体は免疫応答を刺激し、
（ｖ）抗体は抗体応答を刺激し、
（ｖｉ）抗体はインビボで腫瘍細胞の増殖を阻害する
という特性のうちの１つ以上を示す。
【０１３１】
他の実施形態では、抗体は免疫応答を阻害または抑制する。
【０１３２】
好ましい実施形態では、重鎖可変領域のＣＤＲ２配列は、配列番号：２０、２１、２２、２３、２４、２５、７８および８８のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含み、かつ軽鎖可変領域のＣＤＲ２配列は、配列番号：３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、８１、９１および９６からなる群から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含む。別の好ましい実施形態では、重鎖可変領域のＣＤＲ１配列は、配列番号：１４
、１５、１６、１７、１８、１９、７７および８７のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含み、かつ軽鎖可変領域のＣＤＲ１配列は、配列番号：３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、８０、９０および９５からなる群から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含む。
【０１３３】
本明細書で用いられる「保存的配列修飾」という用語は、アミノ酸配列を有する抗体の結合特性に対して有意に作用または改変することのないアミノ酸修飾を示すように意図されている。かかる保存的修飾は、アミノ酸置換、付加および欠失を含む。修飾は、当技術分野で既知の標準技術、例えば部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介性突然変異誘発により本開示の抗体に導入されうる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基と置換される場合の置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーについては当技術分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。したがって、本開示の抗体のＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸残基は同じ側鎖ファミリー由来の他のアミノ酸残基で置換可能であり、改変抗体は保持された機能（すなわち上記に示される機能）について本明細書中に記載の機能アッセイを用いて試験可能である。
【０１３４】
本開示の抗ＢＴＬＡ抗体の場合と同じエピトープに結合する抗体
別の実施形態では、本開示は、本開示のＢＴＬＡモノクローナル抗体のいずれかの場合と同じヒトＢＴＬＡ上のエピトープに結合する抗体（すなわちＢＴＬＡへの結合に対して本開示のモノクローナル抗体のいずれかと交差競合する能力を有する抗体）を提供する。好ましい実施形態では、交差競合試験における参照抗体は、（ＶＨおよびＶＬ配列（それぞれ配列番号：１および７で示される）を有する）モノクローナル抗体１Ｂ４または（ＶＨおよびＶＬ配列（それぞれ配列番号：２および８で示される）を有する）モノクローナル抗体Ｅ４Ｈ９または（ＶＨおよびＶＬ配列（それぞれ配列番号：３および９で示される）を有する）モノクローナル抗体３Ｃ２または（ＶＨおよびＶＬ配列（それぞれ配列番号：３および１０で示される）を有する）モノクローナル抗体３Ｃ２ａまたは（ＶＨおよびＶＬ配列（それぞれ配列番号：４および１１で示される）を有する）モノクローナル抗体６Ａ５または（ＶＨおよびＶＬ配列（それぞれ配列番号：５および１２で示される）を有する）モノクローナル抗体１１Ｅ２または（ＶＨおよびＶＬ配列（それぞれ配列番号：６および１３で示される）を有する）モノクローナル抗体Ｅ８Ｄ９または（ＶＨおよびＶＬ配列（それぞれ配列番号：７４および７５で示される）を有する）モノクローナル抗体１０Ｈ６または（ＶＨおよびＶＬ配列（それぞれ配列番号：７４および７６で示される）を有する）モノクローナル抗体１０Ｈ６ａまたは（ＶＨおよびＶＬ配列（それぞれ配列番号：８５および８６で示される）を有する）モノクローナル抗体４Ｃ９でありうる。かかる交差競合抗体は、標準のＢＴＬＡ結合アッセイにおいて、１Ｂ４、Ｅ４Ｈ９、３Ｃ２、３Ｃ２ａ、６Ａ５、１１Ｅ２、Ｅ８Ｄ９、１０Ｈ６、１０Ｈ６ａまたは４Ｃ９と交差競合するそれらの能力に基づいて同定されうる。例えば、ビアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）分析、ＥＬＩＳＡアッセイまたはフローサイトメトリーを用い、本開示の抗体との交差競合が示されうる。試験抗体の、例えば１Ｂ４、Ｅ４Ｈ９、３Ｃ２、３Ｃ２ａ、６Ａ５、１１Ｅ２、Ｅ８Ｄ９、１０Ｈ６、１０Ｈ６ａまたは４Ｃ９のヒトＢＴＬＡへの結合に対する阻害能により、試験抗体がヒトＢＴＬＡへの結合に対して１Ｂ４、Ｅ４Ｈ９、３Ｃ２、３Ｃ２ａ、６Ａ５、１１Ｅ２、Ｅ８Ｄ９、１０Ｈ６、１０Ｈ６ａまたは４Ｃ９と競合可能であることから、１Ｂ４、Ｅ４Ｈ９、３Ｃ２、３Ｃ２ａ、６Ａ５、１１Ｅ２、Ｅ８Ｄ９、１０Ｈ６、１０Ｈ６ａまたは４Ｃ９の場合と同じヒトＢＴＬＡ上のエピトープに結合することが示される。好ましい実施形態では、１Ｂ４、Ｅ４Ｈ９、３Ｃ２、３Ｃ２ａ、６Ａ５、１１Ｅ２、Ｅ８Ｄ９、１０Ｈ６、１０Ｈ６ａまたは４Ｃ９の場合と同じヒトＢＴＬＡ上のエピトープに結合する抗体はヒトモノクローナル抗体である。かかるヒトモノクローナル抗体は、実施例に記載のように調製され、単離されうる。
【０１３５】
改変され修飾された抗体
さらに、本開示の抗体を出発原料として本明細書中に開示されるＶＨおよび／またはＶＬ配列のうちの１つ以上を有する抗体を用いて調製し、修飾抗体を改変することが可能であり、ここで修飾抗体は最初の抗体からの改変された特性を有しうる。抗体は、一方もしくは両方の可変領域（すなわちＶＨおよび／またはＶＬ）内、例えば１つ以上のＣＤＲ領域内および／または１つ以上のフレームワーク領域内での１つ以上の残基の修飾によって改変可能である。さらにまたはその他として、抗体は、例えば定常領域内で残基を修飾し、抗体のエフェクター機能を改変することによって改変可能である。
【０１３６】
行われうる様々な領域を改変することの一つは、ＣＤＲ移殖である。抗体は、６つの重鎖および軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）内に位置するアミノ酸残基全体に支配的な標的抗原と相互作用する。この理由のため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、各抗体間でＣＤＲ外部の配列よりも多様である。ＣＤＲ配列が大部分の抗体−抗原相互作用に関与することから、特定の天然抗体の特性を模倣する組換え抗体を、異なる特性を有する異なる抗体由来のフレームワーク配列上に移植された特定の天然抗体由来のＣＤＲ配列を含む発現ベクターの作成により発現することは可能である（例えば、リーヒマン  Ｌ．（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  Ｌ．）ら（１９９８年）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７頁；ジョーンズ  Ｐ．（Ｊｏｎｅｓ  Ｐ．）ら（１９８６年）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５頁；クイーン  Ｃ．（Ｑｕｅｅｎ  Ｃ．）ら（１９８９年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｅ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１００２９−１００３３頁；ウインター（Ｗｉｎｔｅｒ）に交付された米国特許第５，２２５，５３９号明細書ならびにクイーン（Ｑｕｅｅｎ）らに交付された米国特許第５，５３０，１０１号明細書；米国特許第５，５８５，０８９号明細書；米国特許第５，６９３，７６２号明細書および米国特許第６，１８０，３７０号明細書を参照）。
【０１３７】
したがって、本開示の別の実施形態は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列（各々、配列番号：１４、１５、１６、１７、１８、１９、７７および８７、、配列番号：２０、２１、２２、２３、２４、２５、７８および８８、ならびに配列番号：２６、２７、２８、２９、３０、３１、７９および８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む）を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列（各々、配列番号：３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、８０、９０および９５、配列番号：３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、８１、９１および９６、ならびに配列番号：４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、８２、９２および９７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む）を含む軽鎖可変領域とを含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関する。したがって、かかる抗体は、モノクローナル抗体１Ｂ４、Ｅ４Ｈ９、３Ｃ２、３Ｃ２ａ、６Ａ５、１１Ｅ２、Ｅ８Ｄ９、１０Ｈ６、１０Ｈ６Ａおよび４Ｃ９のＶＨおよびＶＬ  ＣＤＲ配列を有し、これらはさらにこれらの抗体由来の異なるフレームワーク配列を有しうる。
【０１３８】
かかるフレームワーク配列は、生殖細胞系の抗体遺伝子配列を含む公的なＤＮＡデータベースまたは出版された参考文献から得られうる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子における生殖細胞系ＤＮＡ配列は、（インターネット上のｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅで入手可能な）「Ｖベース（ＶＢａｓｅ）」ヒト生殖細胞系配列データベースや、カバト  Ｅ．Ａ．（Ｋａｂａｔ  Ｅ．Ａ．）ら（１９９１年）「免疫学的利益に関するタンパク質配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）（第５版）」、米国保健福祉省（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２；トムリンソン  Ｉ．Ｍ．（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  Ｉ．Ｍ．）ら（１９９２年）「Ｔｈｅ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ＶＨ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  Ｒｅｖｅａｌｓ  ａｂｏｕｔ  Ｆｉｆｔｙ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｏｆ  ＶＨ  Ｓｅｇｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  Ｌｏｏｐｓ」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−７９８；ならびにコックス  Ｊ．Ｐ．Ｌ．（Ｃｏｘ  Ｊ．Ｐ．Ｌ．）ら（１９９４年）「Ａ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｒｍ−ｌｉｎｅ  ＶＨ  Ｓｅｇｍｅｎｔｓ  Ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  Ｓｔｒｏｎｇ  Ｂｉａｓ  ｉｎ  ｔｈｅｉｒ  Ｕｓａｇｅ」Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７−８３６頁（これら各々の内容は参照により本明細書中に明示的に援用される）において見出されうる。
【０１３９】
抗体タンパク質配列は、当業者に周知のギャップドＢＬＡＳＴ（Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ）と称される配列類似性を探索する方法（アルツシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２５：３３８９−３４０２頁）の１つを用いて集められたタンパク質配列データベースに対して比較される。ＢＬＡＳＴは、抗体配列とデータベース配列の間での統計的に有意なアラインメントが整列されたワードの高スコアリングセグメント対（ＨＳＰ）を有する傾向が高いという点でヒューリスティックアルゴリズムである。スコアが延長またはトリミングにより改善できないセグメント対はヒットと称される。つまり、Ｖベース（ＶＢＡＳＥ）由来のヌクレオチド配列（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅ１／ｌｉｓｔ２．ｐｈｐ）が翻訳され、かつＦＲ１〜ＦＲ３フレームワーク領域の間の領域および同領域を含む領域が保持される。データベース配列は平均９８残基長を有する。タンパク質の全長にわたり正確に一致する二重配列が除去される。オフの低複雑性フィルタを除くデフォルトの標準パラメータおよびＢＬＯＳＵＭ６２の置換マトリックスを備えたｂｌａｓｔｐプログラムを用いるタンパク質におけるＢＬＡＳＴ探索では、配列一致をもたらす上位５つのヒットがフィルタにかけられる。ヌクレオチド配列は全部で６つのフレームで翻訳され、データベース配列の一致するセグメント内に停止コドンを全く有しないフレームはヒットの可能性があると考えられる。次いで、これはＢＬＡＳＴプログラムｔｂｌａｓｔｘを用いて確認され、これにより全部で６つのフレーム内で抗体配列が翻訳され、全部で６つのフレーム内で動的に翻訳されたＶベース（ＶＢＡＳＥ）ヌクレオチド配列に対する翻訳が比較される。
【０１４０】
同一性は、抗体配列と配列の全長にわたるタンパク質データベースとの間の正確なアミノ酸の一致である。正（同一性＋置換の一致）は同一ではなく、ＢＬＯＳＵＭ６２置換行列によって導かれるアミノ酸置換である。抗体配列がデータベース配列のうちの２つと同じ同一性で一致する場合、大部分の正を伴うヒットであれば一致する配列ヒットであることが決定されることになる。
【０１４１】
本開示の抗体での使用において好ましいフレームワーク配列は、選択された本開示の抗体により用いられるフレームワーク配列に構造的に類似のもの、例えば本開示の好ましいモノクローナル抗体により用いられる、ＶＨ２−０５フレームワーク配列（配列番号：６６）および／またはＶＨ２−７０フレームワーク配列（配列番号：６７）および／またはＶＨ４−５９フレームワーク配列（配列番号：６８）および／またはＶＨ３−２０フレームワーク配列（配列番号：６９）および／またはＶＨ３−３３フレームワーク配列（配列番号：９９）および／またはＶＫＡ２７フレームワーク配列（配列番号：７０）および／またはＶＫＬ１８フレームワーク配列（配列番号：７１）および／またはＶＫＬ１５フレームワーク配列（配列番号：７２）および／またはＶＫ０４フレームワーク配列（配列番号：１００）に類似のものである。ＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列、ならびにＶＫＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列はフレームワーク配列の元となる生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子内に見出される配列と同一の配列を有するフレームワーク領域上に移植されうるか、あるいはＣＤＲ配列は生殖細胞系配列と比べて１つ以上の突然変異を有するフレームワーク領域上に移植されうる。例えば、特定の例ではフレームワーク領域内の残基を突然変異させ、抗原の抗体への結合能を維持または増強することが有益であることが見出されている（例えば、クイーン（Ｑｕｅｅｎ）らに交付された米国特許第５，５３０，１０１号明細書；米国特許第５，５８５，０８９号明細書；米国特許第５，６９３，７６２号明細書および米国特許第６，１８０，３７０号明細書を参照）。
【０１４２】
可変領域修飾の別のタイプは、アミノ酸残基をＶＨおよび／またはＶＫのＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３領域内で変異させ、それにより目的の抗体の１つ以上の結合特性（例えば親和性）を改善するものである。部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介性突然変異誘発を行い、突然変異を導入可能であり、かつ、目的の抗体の結合または他の機能特性に対する効果が、本明細書中に記載されかつ実施例に提供されるインビトロまたはインビボアッセイにおいて評価されうる。好ましくは、（上で考察の）保存的修飾が導入される。突然変異は、アミノ酸の置換、付加または欠失でありうるが、好ましくは置換である。さらに典型的には、ＣＤＲ領域内の１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つ以下の残基が改変される。
【０１４３】
したがって、別の実施形態では、本開示は、（ａ）配列番号：１４、１５、１６、１７、１８、１９、７７および８７からなる群から選択されるアミノ酸配列あるいは配列番号：１４、１５、１６、１７、１８、１９、７７および８７と比べて１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ１領域；（ｂ）配列番号：２０、２１、２２、２３、２４、２５、７８および８８からなる群から選択されるアミノ酸配列あるいは配列番号：２０、２１、２２、２３、２４、２５、７８および８８と比べて１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ２領域；（ｃ）配列番号：２６、２７、２８、２９、３０、３１、７９および８９からなる群から選択されるアミノ酸配列あるいは配列番号：２６、２７、２８、２９、３０、３１、７９および８９と比べて１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ３領域；（ｄ）配列番号：３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、８０、９０および９５からなる群から選択されるアミノ酸配列あるいは配列番号：３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、８０、９０および９５と比べて１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＫＣＤＲ１領域；（ｅ）配列番号：３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、８１、９１および９６からなるる群から選択されるアミノ酸配列あるいは配列番号：３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、８１、９１および９６と比べて１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＫＣＤＲ２領域；ならびに（ｆ）配列番号：４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、８２、９２および９７からなる群から選択されるアミノ酸配列あるいは配列番号：４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、８２、９２および９７と比べて１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＫＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域を含む単離抗ＣＸＣＲ４モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【０１４４】
本開示の改変抗体は、例えば抗体の特性を改善するためにＶＨおよび／またはＶＫ内のフレームワーク残基に修飾が施されている場合の抗体を含む。典型的には、かかるフレームワーク修飾を施すことで抗体の免疫原性が低下する。例えば、１つのアプローチは、１つ以上のフレームワーク残基を対応する生殖細胞系配列に「復帰突然変異する（ｂａｃｋｍｕｔａｔｅ）」ことである。より詳細には、体細胞突然変異を経ている抗体は、抗体が由来する生殖細胞系配列とは異なるフレームワーク残基を有しうる。かかる残基は、抗体フレームワーク配列を抗体が由来する生殖細胞系配列と比較することにより同定されうる。
【０１４５】
例えば、下記の表１は、親生殖細胞系配列と異なる抗ＢＴＬＡ抗体１Ｂ４、Ｅ４Ｈ９、３Ｃ２、３Ｃ２ａ、６Ａ５、１１Ｅ２、Ｅ８Ｄ９、１０Ｈ６、１０Ｈ６ａおよび４Ｃ９のフレームワーク領域内での多くのアミノ酸変化を示す。フレームワーク領域配列内のアミノ酸残基のうちの１つ以上をそれらの生殖細胞系配置に戻すため、体細胞突然変異が、例えば部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介性の突然変異誘発により生殖細胞系配列に「復帰突然変異（ｂａｃｋｍｕｔａｔｅｄ）」されうる。
【０１４６】
１Ｂ４におけるＶＨ領域と親生殖細胞系ＶＨ２−０５アミノ酸配列とのアラインメントが図７に示される。１Ｂ４におけるＶｋ領域と親生殖細胞系ＶｋＡ２７アミノ酸配列とのアラインメントが図８に示される。Ｅ４Ｈ９におけるＶＨ領域と親生殖細胞系ＶＨ２−７０アミノ酸配列とのアラインメントが図９に示される。Ｅ４Ｈ９におけるＶｋ領域と親生殖細胞系ＶｋＡ２７アミノ酸配列とのアラインメントが図１０に示される。３Ｃ２におけるＶＨ領域と親生殖細胞系ＶＨ４−５９アミノ酸配列とのアラインメントが図１１に示される。３Ｃ２におけるＶｋ領域と親生殖細胞系ＶｋＬ１８アミノ酸配列とのアラインメントが図１２に示される。３Ｃ２ａにおけるＶｋ領域と親生殖細胞系ＶｋＬ１５アミノ酸配列とのアラインメントが図１３に示される。６Ａ５におけるＶＨ領域と親生殖細胞系ＶＨ２−０５アミノ酸配列とのアラインメントが図１４に示される。６Ａ５におけるＶｋ領域と親生殖細胞系ＶｋＡ２７アミノ酸配列とのアラインメントが図１５に示される。１１Ｅ２におけるＶＨ領域と親生殖細胞系ＶＨ３−２０アミノ酸配列とのアラインメントが図１６に示される。１１Ｅ２におけるＶｋ領域と親生殖細胞系ＶｋＬ１５アミノ酸配列とのアラインメントが図１７に示される。Ｅ８Ｄ９におけるＶＨ領域と親生殖細胞系ＶＨ２−０５アミノ酸配列とのアラインメントが図１８に示される。Ｅ８Ｄ９におけるＶｋ領域と親生殖細胞系ＶｋＡ２７アミノ酸配列とのアラインメントが図１９に示される。１０Ｈ６におけるＶＨ領域と親生殖細胞系ＶＨ３−３３アミノ酸配列とのアラインメントが図２２に示される。１０Ｈ６におけるＶｋ領域と親生殖細胞系Ｖｋ０４アミノ酸配列とのアラインメントが図２３に示される。１０Ｈ６ａにおけるＶｋ領域と親生殖細胞系Ｖｋ０４  Ａ２７アミノ酸配列とのアラインメントが図２４に示される。４Ｃ９におけるＶＨ領域と親生殖細胞系ＶＨ２−０５アミノ酸配列とのアラインメントが図２６に示される。４Ｃ９におけるＶｋ領域と親生殖細胞系ＶｋＡ２７アミノ酸配列とのアラインメントが図２７に示される。
【０１４７】
（表１）生殖細胞系配置からの抗体１Ｂ４、Ｅ４Ｈ９、３Ｃ２、６Ａ５、１１Ｅ２に対する修飾
2010509920.tif 000002
【０１４８】
フレームワーク修飾の別のタイプは、フレームワーク領域内またはさらに１つ以上のＣＤＲ領域内で１つ以上の残基を変異させ、Ｔ細胞エピトープを除去し、それにより抗体の潜在的な免疫原性を低下させることを含む。このアプローチは、「脱免疫（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）」とも称され、カー（Ｃａｒｒ）らによる米国特許出願公開第２００３０１５３０４３号明細書にさらに詳述されている。
【０１４９】
フレームワークまたはＣＤＲ領域内でなされる修飾に加えまたはその他として、本開示の抗体は、Ｆｃ領域内で修飾を含み、典型的には抗体の１つ以上の機能特性、例えば血清半減期、補体固定、Ｆｃ受容体結合性および／または抗原依存性の細胞毒性を変化させるように改変されうる。さらに、本開示の抗体は、化学的に修飾されうる（例えば１つ以上の化学的部分が抗体に付着されうる）か、または修飾によりそのグリコシル化が改変されさらに抗体の１つ以上の機能特性が改変されうる。これらの各実施形態は下記にさらに詳述されている。Ｆｃ領域内の残基の番号付与はカバトのＥＵ指数のものである。
【０１５０】
一実施形態では、ＣＨ１のヒンジ領域が、ヒンジ領域内のシステイン残基の数が変化する、例えば増加または減少するように修飾される。このアプローチは、ボドマー（Ｂｏｄｍｅｒ）らによる米国特許第５，６７７，４２５号明細書にさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域内のシステイン残基の数が変化することで、例えば軽鎖および重鎖の構築が促進されるかあるいは抗体の安定性が増大または低下する。
【０１５１】
別の実施形態では、抗体のＦｃヒンジ領域の突然変異により抗体の生物学的半減期が減少する。より詳細には、抗体により天然Ｆｃ−ヒンジドメインＳｐＡ結合に対するブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｙｌ）プロテインＡ（ＳｐＡ）結合が低下している程度に、１つ以上のアミノ酸変異がＦｃ−ヒンジ断片のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン界面領域に導入される。このアプローチは、ワード（Ｗａｒｄ）らによる米国特許第６，１６５，７４５号明細書にさらに詳述されている。
【０１５２】
別の実施形態では、抗体の修飾によりその生物学的半減期が増加する。様々なアプローチが可能である。例えば、ワード（Ｗａｒｄ）に交付された米国特許第６，２７７，３７５号明細書に記載のように、１つ以上の以下の変異、すなわちＴ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆが導入可能である。あるいは、プレスタ（Ｐｒｅｓｔａ）らによる米国特許第５，８６９，０４６号明細書および米国特許第６，１２１，０２２号明細書に記載のように、生物学的半減期を増加させるため、抗体はＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから得られるサルベージ（ｓａｌｖａｇｅ）受容体結合エピトープを有するようにＣＨ１またはＣＬ領域内で改変されうる。
【０１５３】
さらに他の実施形態では、Ｆｃ領域は少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基と置換し、抗体のエフェクター機能を改変することによって改変される。例えば、アミノ酸残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０および３２２から選択される１つ以上のアミノ酸が、抗体がエフェクターリガンドに対して改変された親和性を有しても親抗体の抗原への結合能を保持する程度に異なるアミノ酸残基と置換されうる。親和性が改変される対象のエフェクターリガンドは、例えばＦｃ受容体または補体のＣ１成分でありうる。このアプローチは、米国特許第５，６２４，８２１号明細書および米国特許第５，６４８，２６０号明細書（いずれもウインター（Ｗｉｎｔｅｒ）らによる）にさらに詳述されている。
【０１５４】
別の例では、アミノ酸残基３２９、３３１および３２２から選択される１つ以上のアミノ酸が、抗体がＣ１ｑ結合を改変しおよび／または補体依存性の細胞毒性（ＣＤＣ）を低減または根絶している程度に異なるアミノ酸残基と置換されうる。このアプローチは、米国特許第６，１９４，５５１号明細書（イドゥソギー（Ｉｄｕｓｏｇｉｅ）らによる）にさらに詳述されている。
【０１５５】
別の例では、アミノ酸位置２３１および２３９内の１つ以上のアミノ酸残基が改変されることにより、抗体の補体を固定する能力が改変される。このアプローチは、ボドマー（Ｂｏｄｍｅｒ）らによるＰＣＴ公開、国際公開第９４／２９３５１号パンフレットにさらに記載されている。
【０１５６】
さらに別の例では、以下の位置、すなわち２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８もしくは４３９での１つ以上のアミノ酸の修飾によるＦｃ領域の修飾により、抗体の抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を媒介する能力が増大しおよび／または抗体のＦｃγ受容体に対する親和性が増大する。このアプローチは、ＰＣＴ公開、国際公開第００／４２０７２号パンフレット（プレスタ（Ｐｒｅｓｔａ）による）にさらに記載されている。さらに、ヒトＩｇＧ１上のＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃＲｎに対する結合部位がマッピングされており、かつ結合が改善された変異体について記載されている（シールズ  Ｒ．Ｌ．（Ｓｈｉｅｌｄｓ  Ｒ．Ｌ．）ら（２００１年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１−６６０４頁を参照）。位置２５６、２９０、２９８、３３３、３３４および３３９での特異的変異がＦｃγＲＩＩＩに対する結合を改善することが示された。さらに、以下の変異体の組み合わせ、すなわちＴ２５６Ａ／Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｋ２２４ＡおよびＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４ＡがＦｃγＲＩＩＩに対する結合を改善することが示された。
【０１５７】
さらに別の実施形態では、抗体のグリコシル化が修飾される。例えば、アグリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）抗体が作製されうる（すなわち抗体におけるグリコシル化が失われる）。グリコシル化の改変により、例えば抗体の抗原に対する親和性が増大しうる。かかる炭水化物修飾は、例えば抗体配列内の１つ以上のグリコシル化部位を改変することによりなされうる。例えば、１つ以上のアミノ酸置換がなされうる結果、１つ以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の除去によりその部位でのグリコシル化が失われる。かかるアグリコシル化により、抗原に対する抗体の親和性が増大しうる。かかるアプローチは、米国特許第５，７１４，３５０号明細書および米国特許第６，３５０，８６１号明細書（コ（Ｃｏ）らによる）にさらに詳述されている。
【０１５８】
さらにまたはその他として、グリコシル化の改変タイプを有する抗体、例えば減量されたフコシル残基を有する低フコシル化（ｈｙｐｏｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）抗体または増強されたＧｌｃＮａｃ二分構造を有する抗体を作製することができる。かかる改変されたグリコシル化パターンにより、抗体のＡＤＣＣ能力が増大することが示されている。かかる炭水化物修飾は、例えばグリコシル化機構が改変された宿主細胞内で抗体を発現することにより行われうる。グリコシル化機構が改変された細胞については当技術分野で記載されており、本開示の組換え抗体を発現することによりグリコシル化が改変された抗体が産生される宿主細胞として、用いることができる。例えば、細胞系Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５およびＭｓ７０９は、Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５およびＭｓ７０９細胞系内で発現される抗体がその炭水化物上にフコースを含まないように、フコシルトランスフェラーゼ遺伝子ＦＵＴ８（α（１、６）フコシルトランスフェラーゼ）を含まない。Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５およびＭｓ７０９  ＦＵＴ８−／−細胞系は、２つの置換ベクターを用いたＣＨＯ／ＤＧ４４細胞内での標的化されたＦＵＴ８遺伝子の破壊により作製された（ヤマネ（Ｙａｍａｎｅ）らによる米国特許出願公開第２００４０１１０７０４号明細書およびヤマネ−オオヌキ（Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ）ら（２００４年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ８７：６１４−２２頁を参照）。別の例として、ハナイ（Ｈａｎａｉ）らによる欧州特許第１，１７６，１９５号明細書は、機能的に破壊されたフコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子を有する細胞系について記載している。かかる細胞系内で発現される抗体は、α１，６結合に関連した酵素の低減または除去により低フコシル化（ｈｙｐｏｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）を示す。花井（Ｈａｎａｉ）らは、フコースを抗体のＦｃ領域に結合するＮ−アセチルグルコサミンに添加するのに低い酵素活性を有するかまたは酵素活性を有することのない細胞系、例えばラット骨髄腫細胞系ＹＢ２／０（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６６２）についても記載している。プレスタ（Ｐｒｅｓｔａ）によるＰＣＴ公開、国際公開第０３／０３５８３５号パンフレットには、フコースをＡｓｎ（２９７）に連結された炭水化物に付着させる能力が低下した（その宿主細胞内で発現される抗体の低フコシル化ももたらす）変異ＣＨＯ細胞系、Ｌｅｃ１３細胞について記載されている（シールズ  Ｒ．Ｌ．（Ｓｈｉｅｌｄｓ  Ｒ．Ｌ．）ら（２００２年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０頁も参照）。ウマナ（Ｕｍａｎａ）らによるＰＣＴ公開、国際公開第９９／５４３４２号パンフレットには、糖タンパク質を修飾するグリコシルトランスフェラーゼ（例えばβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を、改変された細胞系内で発現される抗体が抗体のＡＤＣＣ活性の増大をもたらすＧｌｃＮａｃ二分構造の増大を示すように発現するように改変された細胞系について記載されている（ウマナ（Ｕｍａｎａ）ら（１９９９年）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６−１８０頁も参照）。あるいは、抗体のフコース残基はフコシダー���酵素を用いて切断されうる。例えば、フコシダーゼのα−Ｌ−フコシダーゼはフコシル残基を抗体から除去する（タランティーノ  Ａ．Ｌ．（Ｔａｒｅｎｔｉｎｏ  Ａ．Ｌ．）ら（１９７５年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４：５５１６−２３頁）。
【０１５９】
本開示で検討される本明細書中の抗体の別の修飾がペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）である。抗体をペグ化することで、例えば抗体の生物学的（例えば血清）半減期が増加されうる。抗体をペグ化するため、抗体またはその断片は典型的にはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えばＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体と、１つ以上のＰＥＧ基が抗体または抗体断片に付着した状態になるという条件下で反応する。好ましくは、ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（または類似反応性の水−可溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して行われる。本明細書で用いられる「ポリエチレングリコール」という用語は、他のタンパク質、例えばモノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−もしくはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドを誘導体化するのに用いられているＰＥＧの形態のいずれかを包含するように意図されている。特定の実施形態では、ペグ化されるべき抗体はアグリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）抗体である。タンパク質をペグ化するための方法は当技術分野で既知であり、本開示の抗体に適用可能である。例えば、ニシムラ（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ）らによる欧州特許第０１５４３１６号明細書およびイシカワ（Ｉｓｈｉｋａｗａ）らによる欧州特許第０４０１３８４号明細書を参照のこと。
【０１６０】
抗体を改変する方法
上で考察のように、本明細書中に開示されるＶＨおよびＶＫ配列を有する抗ＢＴＬＡ抗体を用い、ＶＨおよび／またはＶＫ配列またはそれらに付着される定常領域を修飾することにより新しい抗ＢＴＬＡ抗体の作製が可能である。したがって、本開示の別の態様では、本開示の抗ＢＴＬＡ抗体、例えば１Ｂ４、Ｅ４Ｈ９、３Ｃ２、３Ｃ２ａ、６Ａ５、１１Ｅ２またはＥ８Ｄ９の構造的特徴を用い、本開示の抗体の少なくとも１つの機能特性、例えばヒトＢＴＬＡへの結合性を保持する構造的に関連のある抗ＢＴＬＡ抗体が作製される。上で考察のように、例えば１Ｂ４、Ｅ４Ｈ９、３Ｃ２、３Ｃ２ａ、６Ａ５、１１Ｅ２またはＥ８Ｄ９の１つ以上のＣＤＲ領域またはその変異を既知のフレームワーク領域および／または他のＣＤＲと組換え的に組み合わせて、さらなる組換え操作された本開示の抗ＢＴＬＡ抗体の作製が可能である。修飾の他のタイプとして、前セクションに記載のタイプが挙げられる。改変方法における出発原料は、本明細書中に提供される１つ以上のＶＨおよび／もしくはＶＫ配列またはそれらの１つ以上のＣＤＲ領域である。改変抗体を作製するのに、本明細書中に提供される１つ以上のＶＨおよび／もしくはＶＫ配列またはそれらの１つ以上のＣＤＲ領域を有する抗体を実際に調製する（すなわちタンパク質として発現させる）必要はない。それに対し、配列内に含まれる情報を出発原料として用い、元の配列かに由来する「第二世代」配列が作製され、次いで「第二世代」配列が調製され、タンパク質として発現される。
【０１６１】
したがって、別の実施形態では、本開示は、抗ＢＴＬＡ抗体を調製するための方法であって、
（ａ）（ｉ）配列番号：１４、１５，１６、１７、１８、１９、７７および８７からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号：２０、２１、２２、２３、２４、２５、７８および８８からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、および／または配列番号：２６、２７、２８、２９、３０、３１、７９および８９からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域抗体配列；ならびに／あるいは（ｉｉ）配列番号：３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、８０、９０および９５からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号：３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、８１、９１および９６からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、および／または配列番号：４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、８２、９２および９７からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域抗体配列を提供するステップと、
（ｂ）重鎖可変領域抗体配列および／または軽鎖可変領域抗体配列の内部の少なくとも１つのアミノ酸残基を改変し、少なくとも１つの改変抗体配列を作製するステップと、
（ｃ）改変抗体配列をタンパク質として発現するステップと、
を含む方法を提供する。
【０１６２】
標準の分子生物学技術を用い、改変抗体配列の調製および発現が可能である。
【０１６３】
好ましくは、改変された抗体配列によりコードされる抗体は、本明細書中に記載の抗ＢＴＬＡ抗体の機能特性のうちの１つ、一部または全部を保持する抗体であり、ここでの機能特性は、限定はされないが、
（ａ）抗体は１×１０−７Ｍ以下のＫＤでヒトＢＴＬＡに結合し、
（ｂ）抗体はヒトＴｒｋＢ、ＰＤ−１、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４またはＩＣＯＳに実質的に結合せず、
（ｃ）抗体はＨＶＥＭのＢＴＬＡへの結合を阻害し、
（ｄ）抗体は免疫応答を刺激し、
（ｅ）抗体は抗体応答を刺激し、
（ｆ）抗体はインビボで腫瘍細胞の増殖を阻害する。
【０１６４】
他の実施形態では、抗体は免疫応答を阻害または抑制する。
【０１６５】
改変抗体の機能特性は、当技術分野で使用可能でありおよび／または本明細書中に記載の標準アッセイ、例えば実施例で示されるアッセイ（例えば、フローサイトメトリー、結合アッセイ）を用いて評価可能である。
【０１６６】
本開示の抗体を改変する方法の特定の実施形態では、変異が、抗ＢＴＬＡ抗体のコード配列の全部もしくは一部に沿ってランダムまたは選択的に導入可能であり、かつ、得られる修飾された抗ＢＴＬＡ抗体における結合活性および／または本明細書中に記載の他の機能特性についてスクリーニング可能である。突然変異方法については当技術分野で記載されている。例えば、ショート（Ｓｈｏｒｔ）によるＰＣＴ公開、国際公開第０２／０９２７８０号パンフレットでは、抗体変異を飽和突然変異誘発、合成的ライゲーションアセンブリー（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙ）またはそれらの組み合わせを用いて作製しスクリーニングするための方法が記載されている。あるいは、レーザー（Ｌａｚａｒ）らによるＰＣＴ公開、国際公開第０３／０７４６７９号パンフレットでは、コンピュータによるスクリーニング方法を用いて抗体の生理化学的特性を最適化する方法が記載されている。
【０１６７】
本開示の抗体をコードする核酸分子
本開示の別の態様は、本開示の抗体をコードする核酸分子に関する。核酸は、全細胞内に、細胞溶解液中にまたは部分精製形態もしくは実質的に純粋な形態で存在しうる。核酸は、当技術分野で周知のアルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動およびその他を含む標準技術により、他の細胞成分または他の汚染物質、例えば他の細胞核酸もしくはタンパク質から除去精製される場合、「単離される」かまたは「実質的に純粋な状態にされる」。Ｆ．アウスベル（Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編（１９８７年）「分子生物学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）のグリーン・パブリッシング・アンド・ワイリー・インターサイエンス（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）を参照のこと。本開示の核酸が例えばＤＮＡまたはＲＮＡでありうるとともに、イントロン配列を有するかまたは有しない場合がある。好ましい実施形態では核酸はｃＤＮＡ分子である。
【０１６８】
本開示の核酸は、標準の分子生物学技術を用いて得られうる。ハイブリドーマ（例えばさらに下記のヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスから調製されるハイブリドーマ）により発現される抗体においては、ハイブリドーマにより作製される抗体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡが標準のＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング技術により得られうる。（例えばファージディスプレイ技術を用いる）免疫グロブリン遺伝子ライブラリから得られる抗体については、本抗体をコードする核酸がライブラリから回収されうる。
【０１６９】
本開示の好ましい核酸分子は、１Ｂ４、Ｅ４Ｈ９、３Ｃ２、３Ｃ２ａ、６Ａ５、１１Ｅ２、Ｅ８Ｄ９、１０Ｈ６、１０Ｈ６ａまたは４Ｃ９モノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬ配列をコードするものである。１Ｂ４、Ｅ４Ｈ９、３Ｃ２、６Ａ５、１１Ｅ２、Ｅ８Ｄ９、１０Ｈ６、および４Ｃ９のＶＨ配列をコードするＤＮＡ配列は、それぞれ配列番号：５３、５４、５５、５６、５６、５８、８３および９３で示される。１Ｂ４、Ｅ４Ｈ９、３Ｃ２、３Ｃ２ａ、６Ａ５、１１Ｅ２、Ｅ８Ｄ９、１０Ｈ６、１０Ｈ６ａまたは４Ｃ９のＶＬ配列をコードするＤＮＡ配列は、それぞれ配列番号：５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、８４、９８、および９４で示される。
【０１７０】
一旦ＶＨおよびＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片が得られると、これらのＤＮＡ断片を標準の組換えＤＮＡ技術によりさらに操作することで、例えば可変領域遺伝子が完全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子またはｓｃＦｖ遺伝子に変換されうる。これらの操作では、ＶＬもしくはＶＨをコードするＤＮＡ断片が別のタンパク質、例えば抗体の定常領域またはフレキシブルリンカー（ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ｌｉｎｋｅｒ）をコードする別のＤＮＡ断片に作動可能に連結される。これに関連して用いられる「作動可能に連結される」という用語は、２つのＤＮＡ断片が２つのＤＮＡ断片によってコードされるアミノ酸配列がインフレームに保持するように連結されることを意味するように意図されている。
【０１７１】
ＶＨ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＶＨをコードするＤＮＡを重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することにより完全長重鎖遺伝子に変換されうる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野で既知であり（例えばカバト  Ｅ．Ａ．（Ｋａｂａｔ  Ｅ．Ａ．）ら（１９９１年）「免疫学的利益に関するタンパク質配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）」、第５版、米国保健福祉省（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２を参照）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片が標準のＰＣＲ増幅により得られうる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域でありうるが、最も好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ４定常領域である。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子については、ＶＨをコードするＤＮＡは重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結されうる。
【０１７２】
ＶＬ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することにより完全長軽鎖遺伝子（およびＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換されうる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野で既知であり（例えばカバト  Ｅ．Ａ．（Ｋａｂａｔ  Ｅ．Ａ．）ら（１９９１年）「免疫学的利益に関するタンパク質配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）」、第５版、米国保健福祉省（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２を参照）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は標準のＰＣＲ増幅により得られうる。軽鎖定常領域はカッパまたはラムダ定常領域でありうるが、最も好ましくは、カッパ定常領域である。
【０１７３】
ｓｃＦｖ遺伝子を作製するのに、ＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡ断片がフレキシブルリンカー、例えばアミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３をコードする別の断片に作動可能に連結されることで、ＶＨおよびＶＬ配列はフレキシブルリンカーで連結されたＶＬおよびＶＨ領域を有する隣接した一本鎖タンパク質として発現されうる（例えば、バード（Ｂｉｒｄ）ら（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６頁；ハストン（Ｈｕｓｔｏｎ）ら（１９８８年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３頁；およびマッカファーティ（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ）ら（１９９０年）、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４頁を参照）。
【０１７４】
本開示のモノクローナル抗体の産生
本開示のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、従来のモノクローナル抗体の方法、例えばコーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）（１９７５年）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５頁の標準の体細胞ハイブリダイゼーション技術を含む種々の技術により産生可能である。原理上、体細胞ハイブリダイゼーション法が好ましいが、モノクローナル抗体を産生するための他の技術、例えばＢリンパ球のウイルス性または発癌性の形質転換が用いられうる。
【０１７５】
ハイブリドーマを調製するための好ましい動物系はマウス系である。マウスにおけるハイブリドーマ生成は極めて十分に確立された方法である。融合のために免疫された脾細胞を単離するための免疫プロトコルおよび技術は当技術分野で既知である。融合相手（例えばマウス骨髄腫細胞）および融合方法についても既知である。
【０１７６】
本開示のキメラまたはヒト化抗体は、上記のように調製されるマウスモノクローナル抗体の配列に基づいて調製されうる。重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡは、目的のマウスハイブリドーマから得られ、標準の分子生物学技術を用いて非マウス（例えばヒト）免疫グロブリン配列を有するように改変されうる。例えば、キメラ抗体を作製するため、マウス可変領域は当技術分野で既知の方法を用いてヒト定常領域に連結されうる（例えばキャビリー（Ｃａｂｉｌｌｙ）らに交付された米国特許第４，８１６，５６７号明細書）。ヒト化抗体を作製するため、マウスＣＤＲ領域は当技術分野で既知の方法を用いてヒトフレームワークに挿入されうる（例えば、ウインター（Ｗｉｎｔｅｒ）に交付された米国特許第５，２２５，５３９号明細書ならびにクイーン（Ｑｕｅｅｎ）らに交付された米国特許第５，５３０，１０１号明細書；米国特許第５，５８５，０８９号明細書；米国特許第５，６９３，７６２号明細書および米国特許第６，１８０，３７０号明細書を参照）。
【０１７７】
好ましい実施形態では、本開示の抗体はヒトモノクローナル抗体である。ＢＴＬＡに対するかかるヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなくヒト免疫系の一部を保有するトランスジェニックまたはトランスクロモゾ−ムマウスを用いて産生されうる。これらのトランスジェニックおよびトランスクロモゾ−ムマウスは、本明細書中で各々ＨｕＭＡｂマウスおよびＫＭマウス（商標）と称されるマウスを含み、本明細書中で総称して「ヒトＩｇマウス」と称される。
【０１７８】
ＨｕＭＡｂマウス（登録商標）（メダレックス（Ｍｅｄａｒｅｘ），Ｉｎｃ．））は、内因性μおよびκ鎖遺伝子座を不活性化する標的化された変異とともに未転位のヒト重鎖（μおよびγ）ならびにκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座（ｍｉｎｉｌｏｃｉ）を有する（例えば、ロンバーグ（Ｌｏｎｂｅｒｇ）ら  １９９４年）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８（６４７４）：８５６−８５９頁を参照）。したがって、マウスは、マウスＩｇＭまたはκの発現の低下を示し、免疫に応答し、導入されたヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子がクラススイッチおよび体細胞突然変異を受け、高親和性のヒトＩｇＧκモノクローナルが産生される（ロンバーグ  Ｎ．（Ｌｏｎｂｅｒｇ  Ｎ．）ら（１９９４年）上記；ロンバーグ  Ｎ．（Ｌｏｎｂｅｒｇ  Ｎ．）（１９９４年）「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ」１１３：４９−１０１頁にレビュー；ロンバーグ  Ｎ．（Ｌｏｎｂｅｒｇ  Ｎ．）およびハスザー  Ｄ．（Ｈｕｓｚａｒ  Ｄ．）（１９９５年）Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３頁；ならびにハーディング  Ｆ．（Ｈａｒｄｉｎｇ  Ｆ．）およびロンバーグ  Ｎ．（Ｌｏｎｂｅｒｇ  Ｎ．）（１９９５年）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６−５４６頁）。ＨｕＭａｂマウスの調製および使用ならびにかかるマウスにより保有されるゲノム修飾については、テイラー  Ｌ．（Ｔａｙｌｏｒ  Ｌ．）ら（１９９２年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０：６２８７−６２９５頁；チェン  Ｊ．（Ｃｈｅｎ  Ｊ．）ら（１９９３年）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５：６４７−６５６頁；テュアイヨン（Ｔｕａｉｌｌｏｎ）ら（１９９３年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：３７２０−３７２４頁；チョイ（Ｃｈｏｉ）ら（１９９３年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４：１１７−１２３頁；チェン  Ｊ．（Ｃｈｅｎ  Ｊ．）ら（１９９３年）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：８２１−８３０頁；テュアイヨン（Ｔｕａｉｌｌｏｎ）ら（１９９４年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２９１２−２９２０頁；テイラー  Ｌ．（Ｔａｙｌｏｒ  Ｌ．）ら（１９９４年）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６：５７９−５９１頁；ならびにフィッシュワイルド  Ｄ．（Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  Ｄ．）ら（１９９６年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１頁にさらに記載されている（これらすべての内容はそれら全体が参照により本明細書中に具体的に援用される）。さらに、米国特許第５，５４５，８０６号明細書；米国特許第５，５６９，８２５号明細書；米国特許第５，６２５，１２６号明細書；米国特許第５，６３３，４２５号明細書；米国特許第５，７８９，６５０号明細書；米国特許第５，８７７，３９７号明細書；米国特許第５，６６１，０１６号明細書；米国特許第５，８１４，３１８号明細書；米国特許第５，８７４，２９９号明細書；および米国特許第５，７７０，４２９号明細書（すべてはロンバーグ（Ｌｏｎｂｅｒｇ）およびケイ（Ｋａｙ）に交付）、スラニ（Ｓｕｒａｎｉ）らに交付された米国特許第５，５４５��８０７号明細書；ＰＣＴ公開、国際公開第９２／０３９１８号パンフレット、国際公開第９３／１２２２７号パンフレット、国際公開第９４／２５５８５号パンフレット、国際公開第９７／１３８５２号パンフレット、国際公開第９８／２４８８４号パンフレットおよび国際公開第９９／４５９６２号パンフレット（すべてはロンバーグ（Ｌｏｎｂｅｒｇ）およびケイ（Ｋａｙ）に交付）、ならびにコーマン（Ｋｏｒｍａｎ）らに交付されたＰＣＴ公開、国際公開第０１／１４４２４号パンフレットを参照のこと。
【０１７９】
別の実施形態では、本開示のヒト抗体は、導入遺伝子およびトランスクロモゾ−ム上でヒト免疫グロブリン配列を保有するマウス、例えばヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖トランスクロモゾ−ムを保有するマウスを用いて産生されうる。かかるマウスは、本明細書中で「ＫＭマウス（商標）」と称されるが、これは、イシダ（Ｉｓｈｉｄａ）らに交付されたＰＣＴ公開、国際公開第０２／４３４７８号パンフレットに詳述されている。
【０１８０】
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する他のトランスジェニック動物系は当技術分野で使用可能であり、その使用により、本開示の抗ＢＴＬＡ抗体が産生されうる。例えば、キセノマウス（Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ）（アブジェニクス社（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．））として称される他のトランスジェニック系の使用が可能であり、かかるマウスは、例えばクチャーラパティ（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ）らに交付された米国特許第５，９３９，５９８号明細書；米国特許第６，０７５，１８１号明細書；米国特許第６，１１４，５９８号明細書；米国特許第６，１５０，５８４号明細書および米国特許第６，１６２，９６３号明細書に記載されている。
【０１８１】
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する他のトランスクロモゾ−ム動物系は当技術分野で使用可能であり、その使用により、本開示の抗ＢＴＬＡ抗体の産生が可能である。例えば、「ＴＣマウス」と称される、ヒト重鎖トランスクロモゾ−ムとヒト軽鎖トランスクロモゾ−ムとの双方を保有するマウスの使用が可能であり、かかるマウスについてはトミヅカ（Ｔｏｍｉｚｕｋａ）ら（２０００年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９７：７２２−７２７頁に記載されている。さらに、ヒト重鎖および軽鎖トランスクロモゾ−ムを保有するウシについての記載が当技術分野でなされており（例えば、クロイワ（Ｋｕｒｏｉｗａ）ら（２００２年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：８８９−８９４頁）、その使用により、本開示の抗ＢＴＬＡ抗体の産生が可能である。
【０１８２】
本開示のヒトモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリをスクリーニングするためのファージディスプレイ法を用いても調製可能である。ヒト抗体を単離するためのかかるファージディスプレイ法は、当技術分野で確立されたものである。例えば、ラドナー（Ｌａｄｎｅｒ）らに交付された米国特許第５，２２３，４０９号明細書；米国特許第５，４０３，４８４号明細書；および米国特許第５，５７１，６９８号明細書；ドワー（Ｄｏｗｅｒ）らに交付された米国特許第５，４２７，９０８号明細書および米国特許第５，５８０，７１７号明細書；マッカファーティ（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ）らに交付された米国特許第５，９６９，１０８号明細書および米国特許第６，１７２，１９７号明細書；ならびにグリフィス（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ）らに交付された米国特許第５，８８５，７９３号明細書；米国特許第６，５２１，４０４号明細書；米国特許第６，５４４，７３１号明細書；米国特許第６，５５５，３１３号明細書；米国特許第６，５８２，９１５号明細書および米国特許第６，５９３，０８１号明細書を参照のこと。
【０１８３】
本開示のヒトモノクローナル抗体はまた、ヒト抗体反応が免疫時に生成されうるようにヒト免疫細胞が再構成されているＳＣＩＤマウスを用いて調製されうる。かかるマウスは、例えばウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）らに交付された米国特許第５，４７６，９９６号明細書および米国特許第５，６９８，７６７号明細書に記載されている。
【０１８４】
ヒトＩｇマウスの免疫
ヒトＩｇマウスの使用により本開示のヒト抗体が産生される場合、かかるマウスは、ロンバーグ  Ｎ．（Ｌｏｎｂｅｒｇ  Ｎ．）ら（１９９４年）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８（６４７４）：８５６−８５９頁；フィッシュワイルド  Ｄ．（Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  Ｄ．）ら（１９９６年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１頁；ならびにＰＣＴ公開の国際公開第９８／２４８８４号パンフレットおよび国際公開第０１／１４４２４号パンフレットに記載のように、ＢＴＬＡ抗原および／または組換えＢＴＬＡ、またはＢＴＬＡ融合タンパク質の精製または濃縮された調製物で免疫されうる。好ましくは、マウスは１回目の注入時には６〜１６週齢となる。例えば、ＢＴＬＡ抗原の精製または組換え調製物（５〜５０μｇ）を用い、ヒトＩｇマウスの腹腔内での免疫が可能である。
【０１８５】
ＢＴＬＡに対する完全ヒトモノクローナル抗体を産生するための詳細な方法が下記の実施例１に記載されている。様々な抗原を用いる試験を重ねることで、トランスジェニックマウスが、最初にリビ（Ｒｉｂｉ）（シグマ（Ｓｉｇｍａ）Ｍ６５３６；ＭＰＬ＋ＴＤＭ）中の抗原で腹腔内（ＩＰ）に免疫され、それに続き、アジュバント中の抗原で隔週、最大で全６回ＩＰ免疫される時、応答することが示されている。しかし、リビ（フロイント完全アジュバントおよびフロイント不完全アジュバント）以外のアジュバントについても有効であることが見出されている。さらに、アジュバントの非存在下では全細胞における免疫原性が高いことが見出されている。免疫応答は、後眼窩（ｒｅｔｒｏｏｒｂｉｔａｌ）の出血により得られる血漿試料を用いる免疫プロトコルを通して監視可能である。血漿はＥＬＩＳＡでスクリーニング可能であり（後述するように）、十分な力価の抗ＢＴＬＡヒト免疫グロブリンを有するマウスが融合において用いられうる。マウスは、殺滅および脾臓摘出の３日前、抗原で静脈内に追加免疫されうる。免疫ごとに２〜３の融合がなされる必要がありうることが想定される。典型的にはマウス６〜２４匹が各抗原に対して免疫される。通常、ＨＣｏ７およびＨＣｏ１２株の双方が用いられる。さらに、ＨＣｏ７およびＨＣｏ１２導入遺伝子は共に２つの異なるヒト重鎖導入遺伝子（ＨＣｏ７／ＨＣｏ１２）を有する単一のマウスに育種されうる。その他としてまたはさらに、ＫＭマウス（商標）株が実施例１に記載のように用いられうる。
【０１８６】
ヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの生成
本開示のヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを生成するため、免疫されたマウス由来の脾細胞および／またはリンパ節細胞が単離され、適切な不死化細胞系、例えばマウス骨髄腫細胞系に融合されうる。生成されたハイブリドーマでは、抗原特異的な抗体の産生についてスクリーニング可能である。例えば、免疫されたマウス由来の脾臓リンパ球の単一の細胞懸濁液が、５０％ＰＥＧとともにＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３非分泌マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ１５８０）に融合されうる。細胞を平底マイクロタイタープレート内に約２×１０５でプレーティング後、１０％ＦＢＳ、３〜５％オリゲン（Ｏｒｉｇｅｎ）（ＩＧＥＮ）、ＯＰＩサプリメント（シグマ（Ｓｉｇｍａ）  Ｏ  ５００３：１．１×１０−３Ｍのオキサロ酢酸、４．５×１０−４Ｍのピルビン酸ナトリウム、および２４国際単位／Ｌのウシインスリン）、４ｍＭのＬ−グルタミン、０．０５５ｍＭの２−メルカプトエタノール、５０単位／ｍｌのペニシリン、５０ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、および１×ＨＡＴ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）Ｈ０２６２）を含有する選択培地内で２週間インキュベートされる。約２週間後、細胞はＨＡＴがＨＴ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）Ｈ０１３７）と交換された培地内で培養されうる。次いで、各ウェルにおけるヒトモノクローナルＩｇＧ抗体についてはＥＬＩＳＡによりスクリーニング可能である。抗体を分泌するハイブリドーマは、再プレーティングされ、再びスクリーニングされ、依然としてヒトＩｇＧ陽性である場合、ハイブリドーマは限界希釈により少なくとも２回サブクローニングされうる。次いで、特徴づけのため、安定なサブクローンをインビトロで培養することで、組織培地内に少量の抗体が産生されうる。
【０１８７】
ヒトモノクローナル抗体を精製するため、選択されたハイブリドーマはモノクローナル抗体の精製用の２リットルのスピナーフラスコ内で増殖しうる。親和性クロマトグラフィー前、上清がプロテインＡ−セファローズ（ニュージャージー州ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）のファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））を用いて濾過され、濃縮される。溶出されたＩｇＧをゲル電気泳動および高性能液体クロマトグラフィーで検査することで純度が保証されうる。緩衝溶液はＰＢＳに交換可能であり、濃度は１．４３の減衰係数を用い、ＯＤ２８０により判定可能である。モノクローナル抗体は、一定量に分割され、−８０℃で保存されうる。
【０１８８】
モノクローナル抗体を産生するトランスフェクトーマの生成
本開示の抗体は、例えば当技術分野で周知のように組換えＤＮＡ技術と遺伝子形質移入方法を併用し、宿主細胞のトランスフェクトーマ内でも産生されうる（例えば、モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ），Ｓ．（１９８５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２頁）。
【０１８９】
例えば、抗体またはその抗体断片を発現するため、部分長または完全長の軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡが標準の分子生物学技術（例えば目的の抗体を発現するハイブリドーマを用いるＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング）により得られ、ＤＮＡは、遺伝子が転写および翻訳制御配列に作動可能に連結されるように発現ベクターに挿入されうる。これに関連し、「作動可能に連結される」という用語は、抗体遺伝子が、ベクター内の転写および翻訳制御配列が抗体遺伝子の転写および翻訳を調節するというその意図された機能を果たすようにベクターにライゲートされることを意味するように意図されている。発現ベクターおよび発現制御配列は、用いられる発現宿主細胞と適合可能であるように選択される。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は別々のベクターに挿入されうるかまたは、より典型的には両遺伝子は同じ発現ベクターに挿入される。抗体遺伝子は、標準の方法（例えば、抗体遺伝子断片およびベクター上での相補的制限部位のライゲーションまたは制限部位が全く存在しない場合での平滑末端ライゲーション）により発現ベクターに挿入される。本明細書中に記載の抗体の軽鎖および重鎖可変領域を用い、それらを、所望のアイソタイプの重鎖定常領域および軽鎖定常領域を既にコードする発現ベクターに、ＶＨセグメントがベクター内のＣＨセグメントに作動可能に連結されかつＶＫセグメントがベクター内のＣＬセグメントに作動可能に連結されるように挿入することにより、任意の抗体アイソタイプの完全長抗体遺伝子を作製可能である。さらにまたはその他として、組換え発現ベクターは、抗体鎖の宿主細胞からの分泌を促進するシグナルペプチドをコードしうる。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームに連結されるようにベクターにクローン化されうる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種のシグナルペプチド（すなわち非免疫グロブリンンパク質由来のシグナルペプチド）でありうる。
【０１９０】
抗体鎖遺伝子に加え、本開示の組換え発現ベクターは、宿主細胞内で抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を保有する。「調節配列」という用語は、抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御するプロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御因子（例えばポリアデニル化シグナル）を含むように意図されている。かかる調節配列は、例えばゲッデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）（「遺伝子発現技術（Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）（１９９０年））に記載されている。調節配列の選択を含む発現ベクターの設計が形質転換対象の宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベルなどの要素に依存しうることが当業者により理解されるであろう。哺乳類宿主細胞の発現のための好ましい調節配列は、哺乳類細胞内で高レベルのタンパク質発現を誘導するウイルス因子、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（例えばアデノウイルスメジャー後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））およびポリオーマに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサーを含む。あるいは、非ウイルス調節配列、例えばユビキチンプロモーターまたはβ−グロビンプロモーターが用いられうる。さらに、異なる供給源由来の配列からなる調節因子、例えばＳＲαプロモーター系は、ヒトＴ細胞白血病ウイルスタイプ１のＳＶ４０初期プロモーターおよび長い末端リピートに由来する配列を有するものである（武部（Ｔａｋｅｂｅ），Ｙ．ら（１９８８年）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：４６６−４７２頁）。
【０１９１】
抗体鎖遺伝子および調節配列に加え、本開示の組換え発現ベクターは、追加配列、例えば宿主細胞内でのベクターの複製（例えば複製の起点）を調節する配列および選択可能マーカー遺伝子を保有しうる。選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を促進する（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号明細書、米国特許第４，６３４，６６５号明細書および米国特許第５，１７９，０１７号明細書（いずれもアクセル（Ａｘｅｌ）らによる）を参照）。例えば典型的には、選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞上で薬物、例えばＧ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキセートに耐性を与える。好ましい選択可能マーカー遺伝子は、（メトトレキセートの選択／増幅の場合にｄｈｆｒ−宿主細胞内で用いられる）ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子および（Ｇ４１８の選択用の）ネオ遺伝子を含む。
【０１９２】
軽鎖および重鎖の発現においては、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターは、標準技術により宿主細胞に形質移入される。「形質移入」という用語の様々な形態は、外因性ＤＮＡの原核または真核宿主細胞への導入のための一般に用いられる多種多様な技術、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストランによる形質移入などを包含するように意図されている。原核または真核宿主細胞のいずれかにおいて本開示の抗体を発現することは理論的に可能であるが、真核細胞内および最も好ましくは哺乳類宿主細胞内での抗体の発現が、かかる真核細胞および特に哺乳類細胞が適切に折り畳まれ免疫学的に活性な抗体を構築し分泌する可能性が原核細胞よりも高いことから最も好ましい。原核生物での抗体遺伝子の発現は、高収量の活性抗体の産生にとって無効であることが報告されている（ボス（Ｂｏｓｓ），Ｍ．Ａ．およびウッド（Ｗｏｏｄ），Ｃ．Ｒ．（１９８５年）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ６：１２−１３頁）。
【０１９３】
本開示の組換え抗体を発現するための好ましい哺乳類宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（例えばＲ．Ｊ．カウフマン（Ｋａｕｆｍａｎ）およびＰ．Ａ．シャープ（Ｓｈａｒｐ）（１９８２年）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１頁に記載のように、ＤＨＦＲ選択可能マーカーとともに用いられる、ウアラウプ（Ｕｒｌａｕｂ）およびチェイシン（Ｃｈａｓｉｎ）（１９８０年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７７：４２１６−４２２０頁に記載のｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞を含む。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞の場合の使用においては、別の好ましい発現系は、国際公開第８７／０４４６２号パンフレット、国際公開第８９／０１０３６号パンフレットおよび欧州特許第３３８，８４１号明細書に開示されるＧＳ遺伝子発現系である。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが哺乳類宿主細胞に導入される場合、抗体は、宿主細胞内での抗体の発現またはより好ましくは抗体の宿主細胞が増殖する培地への分泌を実現するのに十分な期間、宿主細胞を培養することにより産生される。抗体は、標準のタンパク質精製方法を用いて培地から回収されうる。
【０１９４】
抗体の抗原への結合の特徴づけ
本開示の抗体のＢＴＬＡへの結合については、例えば標準ＥＬＩＳＡにより試験可能である。つまり、マイクロタイタープレートをＰＢＳ中、１μｇ／ｍｌの精製ＢＴＬＡでコーティングし、次いでＰＢＳ／トゥイーン中の１％ウシ血清アルブミンでブロッキングする。抗体の希釈物（例えばＢＴＬＡ免疫マウス由来の血漿の希釈物）を各ウェルに添加して、周囲温度で１〜２時間インキュベートする。プレートをＰＢＳ／トゥイーンで洗浄し、次いでアルカリホスファターゼに複合された二次試薬（例えば、ヒト抗体においてはヤギ−抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃに特異的なポリクローナル試薬）とともに３７℃で１時間インキュベートする。洗浄後、プレートをｐＮＰＰ基質（１ｍｇ／ｍｌ）で発色させ、４０５〜６５０のＯＤで分析する。好ましくは、最高の力価を生じるマウスが融合に用いられることになる。
【０１９５】
上記のＥＬＩＳＡアッセイを用い、ＢＴＬＡ免疫原と陽性の反応性を示すハイブリドーマについてのスクリーニングも可能である。高い結合活性でＢＴＬＡに結合するハイブリドーマのサブクローニングと、さらなる特徴づけが行われる。各ハイブリドーマ由来の１つのクローンは、（ＥＬＩＳＡにより）親細胞の反応性を保持し、−１４０℃で保存された５〜１０のバイアルの細胞バンクの作製および抗体精製のために選択されうる。
【０１９６】
抗ＢＴＬＡ抗体を精製するため、選択されたハイブリドーマを組織培養フラスコまたはスピナーフラスコ内で１〜２リットルまで増殖させ、モノクローナル抗体の精製を行ってもよい。上清を、プロテインＡ−セファローズ（ニュージャージー州ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）のファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））を用いる親和性クロマトグラフィー前に濾過し、濃縮してもよい。溶出されたＩｇＧをゲル電気泳動および高性能液体クロマトグラフィーにより検査し、純度を保証してもよい。緩衝溶液をＰＢＳに交換し、濃度を、１．４３消衰係数を用いるＯＤ２８０によって決定してもよい。モノクローナル抗体を一定量に分割し、−８０℃で保存してもよい。
【０１９７】
選択された抗ＢＴＬＡモノクローナル抗体が固有のエピトープに結合するか否かを判定するため、各抗体が市販の試薬（イリノイ州ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）のピアス（Ｐｉｅｒｃｅ））を用いてビオチン化されうる。未標識モノクローナル抗体とビオチン化モノクローナル抗体を用いる競合試験が、上記のＢＴＬＡでコーティングされたＥＬＩＳＡプレートを用いて実施可能である。ビオチン化ｍＡｂの結合が、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼプローブで検出可能である。さらに、同様の競合試験が、ＢＴＬＡ−ＣＨＯ細胞上でＦＡＣＳにより実施可能である。ビオチン標識ＢＴＬＡ抗体の細胞への結合が、ストレプトアビジン−フィコエリトリンプローブで検出可能である。
【０１９８】
精製抗体アイソタイプを判定するため、アイソタイプＥＬＩＳＡを特定のアイソタイプの抗体に対して特異的な試薬を用いて行ってもよい。例えば、ヒトモノクローナル抗体アイソタイプを判定するため、マイクロタイタープレートのウェルを１μｇ／ｍｌの抗ヒト免疫グロブリンで４℃で一晩コーティングしてもよい。１％  ＢＳＡでブロック後、プレートは１μｇ／ｍｌ以下の試験モノクローナル抗体または精製されたアイソタイプ対照と周囲温度で１〜２時間反応される。次いで、ウェルをヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＭのいずれかに特異的なアルカリホスファターゼと複合されたプローブと反応させてもよい。上記のように、プレートを発色させ分析する。
【０１９９】
本開示の抗体が、細胞上に発現される天然ＢＴＬＡに結合していることを検証するため、ＦＡＣＳアッセイが用いられる。つまり、ＰＢＳ−１％ＢＳＡ＋０．５％アジ化ナトリウム（ＦＡＣＳ緩衝液）中の抗体の希釈物が、ＢＴＬＡを発現する形質移入されたＣＨＯ細胞（１０５個の細胞）とともに４℃で３０分間インキュベートされる。細胞は、遠心分離、上清の吸引、および新しいＦＡＣＳ緩衝液の添加により２回洗浄される。抗体の細胞上のＢＴＬＡへの結合が、ＰＥ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的な）抗体中の細胞を４℃で３０分間インキュベートし、上記のように細胞を２回洗浄し、ＦＡＣＳで分析することにより検出される。
【０２００】
抗ＢＴＬＡヒトＩｇＧでは、ウエスタンブロッティングにより、ＢＴＬＡ抗原との反応性についてさらに試験してもよい。つまり、ＢＴＬＡに対し、調製し、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ってもよい。電気泳動後、分離された抗原はニトロセルロース膜に移され、１０％ウシ胎仔血清でブロックされ、試験対象のモノクローナル抗体でプローブされる。ヒトＩｇＧの結合性を、抗ヒトＩｇＧアルカリホスファターゼを用いて検出し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質タブレット（ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）のシグマ・ケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．））を用いて発色させてもよい。
【０２０１】
抗体の物理的特性
本開示の抗体は、抗ＢＴＬＡ抗体の様々な物理的特性によりさらに特徴づけられうる。様々なアッセイを用い、これらの物理的特性に基づいて抗体の異なるクラスの検出および／または識別が可能である。
【０２０２】
一部の実施形態では、本開示の抗体は、軽鎖または重鎖可変領域のいずれかにおいて１つ以上のグリコシル化部位を有しうる。可変領域内に１つ以上のグリコシル化部位が存在する結果、抗原結合の改変により抗体の免疫原性または抗体のｐＫの変化が増大しうる（マーシャル（Ｍａｒｓｈａｌｌ）ら（１９７２年）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ４１：６７３−７０２頁；ガラ  Ｆ．Ａ．（Ｇａｌａ  Ｆ．Ａ．）およびモリソン  Ｓ．Ｌ．（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  Ｓ．Ｌ．）（２００４年）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７２：５４８９−９４頁；ワリック（Ｗａｌｌｉｃｋ）ら（１９８８年）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １６８：１０９９−１０９頁；スピロ  Ｒ．Ｇ．（Ｓｐｉｒｏ  Ｒ．Ｇ．）（２００２年）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １２：４３Ｒ−５６Ｒ頁；パレク（Ｐａｒｅｋｈ）ら（１９８５年）Ｎａｔｕｒｅ  ３１６：４５２−７頁；ミムラ（Ｍｉｍｕｒａ）ら（２０００年）Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３７：６９７−７０６頁）。グリコシル化はＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列を有するモチーフで生じることが知られている。可変領域のグリコシル化はグライコブロット（Ｇｌｙｃｏｂｌｏｔ）アッセイを用いて試験可能であり、同アッセイでは、抗体の切断によりＦａｂが産生され、次いで過ヨウ素酸酸化およびシッフ（Ｓｃｈｉｆｆ）塩基形成を測定するアッセイを用いてグリコシル化が試験される。あるいは、可変領域のグリコシル化はディオネックス（Ｄｉｏｎｅｘ）光クロマトグラフィー（ディオネックス−ＬＣ（Ｄｉｏｎｅｘ−ＬＣ））を用いて試験可能であり、そこでは糖類がＦａｂから切断されて単糖類にされ、各糖類の含量が分析される。いくつかの例では、可変領域のグリコシル化を有しない抗ＢＴＬＡ抗体を有することが好ましい。これは、可変領域内にグリコシル化モチーフを有しない抗体を選択するか、またはグリコシル化モチーフ内の残基を、当技術分野で周知の標準技術を用いて突然変異させることにより行われうる。
【０２０３】
好ましい実施形態では、本発明の抗体はアスパラギン異性部位を有しない。脱アミドまたはイソアスパラギン酸効果がそれぞれＮ−ＧまたはＤ−Ｇ配列上で生じうる。脱アミドまたはイソアスパラギン酸効果の結果、主鎖ではなく側鎖のカルボキシ末端から離れてキンク構造を生成することにより抗体の安定性を低下させるイソアスパラギン酸が生成される。イソアスパラギン酸の生成は等量アッセイ（ｉｓｏ−ｑｕａｎｔ  ａｓｓａｙ）を用いて測定可能であり、そこでは逆相ＨＰＬＣを用いてイソアスパラギン酸についての試験が行われる。
【０２０４】
各抗体は特有の等電点（ｐＩ）を有することになるが、一般に抗体は６〜９．５のｐＨ範囲に収まることになる。ＩｇＧ１抗体におけるｐＩは典型的には７〜９．５のｐＨ範囲内に収まり、かつＩｇＧ４抗体におけるｐＩは典型的には６〜８のｐＨ範囲内に収まる。抗体はこの範囲外のｐＩを有する場合がある。効果は一般に未知であるが、正常な範囲外のｐＩを有する抗体がインビボ条件下である程度のアンフォールディングおよび不安定性を有しうることが推定される。等電点はキャピラリー等電点電気泳動アッセイを用いて試験可能であり、それはｐＨ勾配を生成し、そこでは精度向上のためにレーザ集光が用いられうる（ジャニニ（Ｊａｎｉｎｉ）ら（２００２年）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２３：１６０５−１１頁；マ（Ｍａ）ら（２００１年）Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉａ  ５３：Ｓ７５−８９頁；ハント（Ｈｕｎｔ）ら（１９９８年）Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ  ８００：３５５−６７頁）。いくつかの例では、正常な範囲内に収まるｐＩ値を有する抗ＢＴＬＡ抗体を有することが好ましい。これは、正常な範囲内のｐＩを有する抗体を選択するか、または帯電した表面残基を、当技術分野で周知の標準の技術を用いて突然変異することによりなされうる。
【０２０５】
各抗体は、熱安定性を示す融解温度を有することになる（クリシュナムルティ  Ｒ．（Ｋｒｉｓｈｎａｍｕｒｔｈｙ  Ｒ．）およびマニング  Ｍ．Ｃ．（Ｍａｎｎｉｎｇ  Ｍ．Ｃ．）（２００２年）Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３：３６１−７１頁）。より高い熱安定性は、インビボで全体的により高い抗体安定性を示す。抗体の融解点は、示差走査熱量測定などの技術を用いて測定されうる（チェン（Ｃｈｅｎ）ら（２００３年）Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  ２０：１９５２−６０頁；ガーランド（Ｇｈｉｒｌａｎｄｏ）ら（１９９９年）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ６８：４７−５２頁）。ＴＭ１は抗体の初期のアンフォールディングの温度を示す。ＴＭ２は抗体の完全なアンフォールディングの温度を示す。一般に、本発明の抗体のＴＭ１が６０℃超、好ましくは６５℃超、さらにより好ましくは７０℃超であることが好ましい。あるいは、抗体の熱安定性は円二色性を用いて測定されうる（マレイ（Ｍｕｒｒａｙ）ら  （２００２年）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｓｃｉ  ４０：３４３−９頁）。
【０２０６】
好ましい実施形態では、急速に分解することのない抗体が選択される。抗ＢＴＬＡ抗体の断片化は、当技術分野で十分に理解されているようにキャピラリー電気泳動（ＣＥ）およびＭＡＬＤＩ−ＭＳを用いて測定されうる（アレキサンダー  Ａ．Ｊ．（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  Ａ．Ｊ．）およびヒュー  Ｄ．Ｅ．（Ｈｕｇｈｅｓ  Ｄ．Ｅ．）（１９９５年）Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ６７：３６２６−３２頁）。
【０２０７】
別の好ましい実施形態では、最小の凝集効果を有する抗体が選択される。凝集が、望ましくない免疫応答および／または改変されるかもしくは好ましくない薬物動態学的特性の誘因となりうる。一般に、抗体では、２５％以下、好ましくは２０％以下、さらにより好ましくは１５％以下、さらにより好ましくは１０％以下およびさらにより好ましくは５％以下の凝集が許容される。凝集は、単量体、二量体、三量体または多量体を同定するためのサイズ排除カラム（ＳＥＣ）高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および光散乱を含む、当技術分野で周知のいくつかの技術により測定されうる。
【０２０８】
免疫複合体
別の態様では、本開示は、治療的部分、例えば細胞毒素、薬剤（例えば免疫抑制剤）または放射性毒素に複合された、抗ＢＴＬＡ抗体、またはそれらの断片を特徴とする。かかる複合体は本明細書中で「免疫複合体」と称される。１つ以上の細胞毒素を含む免疫複合体は「免疫毒素」と称される。細胞毒素または細胞毒性物質は、細胞に対して有害な（例えば細胞を殺滅する）任意の作用物質を含む。例として、タクソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ  ａｎｔｈｒａｃｉｎ  ｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピューロマイシンならびにそれらの類似体または相同体が挙げられる。治療物質は、例えば、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ  ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ））、アルキル剤（例えば、メクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣおよびシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（旧ダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（旧アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシン（ＡＭＣ））ならびに抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）も含む。
【０２０９】
本開示の抗体に複合可能な細胞毒素治療薬の他の好ましい例として、デュオカルマイシン、カリケアマイシン、メイタンシンおよびオーリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎｓ）およびそれらの誘導体が挙げられる。カリケアマイシン抗体複合体の例として市販のもの（ミロターグ（Ｍｙｌｏｔａｒｇ）（商標）；ワイス・アエースト（Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ））が挙げられる。
【０２１０】
細胞毒素は、当技術分野で利用可能なリンカー技術を用いて本開示の抗体に複合されうる。細胞毒素を抗体に複合させるのに用いられているリンカータイプの例として、限定はされないが、ヒドラゾン、チオエーテル、エステル、ジスルフィドおよびペプチドを含有するリンカーが挙げられる。例えば、リソソーム区画内で低いｐＨにより切断を受けやすいかまたはプロテアーゼ、例えばカテプシン（例えば、カテプシンＢ、Ｃ、Ｄ）などの腫瘍組織内で優先的に発現されるプロテアーゼにより切断を受けやすいリンカーを選択してもよい。
【０２１１】
細胞毒素のタイプ、リンカーおよび治療物質を抗体に複合させるための方法についてのさらなる考察としては、斉藤  Ｇ．（Ｓａｉｔｏ  Ｇ．）ら（２００３年）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５５：１９９−２１５頁；トレイル  Ｐ．Ａ．（Ｔｒａｉｌ  Ｐ．Ａ．）ら（２００３年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５２：３２８−３３７頁；ペイン  Ｇ．（Ｐａｙｎｅ  Ｇ．）（２００３年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ３：２０７−２１２頁；アレン  Ｔ．Ｍ．（Ａｌｌｅｎ  Ｔ．Ｍ．）（２００２年）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ２：７５０−７６３頁；パスタン  Ｉ．（Ｐａｓｔａｎ  Ｉ．）およびクレイトマン  Ｒ．Ｊ．（Ｋｒｅｉｔｍａｎ  Ｒ．Ｊ．）（２００２年）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ  ３：１０８９−１０９１頁；センター  Ｐ．Ｄ．（Ｓｅｎｔｅｒ  Ｐ．Ｄ．）およびスプリンガー  Ｃ．Ｊ．（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｃ．Ｊ．）（２００１年）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５３：２４７−２６４頁も参照のこと。
【０２１２】
本開示の抗体を、放射性同位体にも複合し、放射性免疫複合体とも称される細胞毒性のある放射性製剤を生成してもよい。診断または治療用途として抗体に複合可能な放射性同位体の例として、限定はされないが、ヨウ素１３１、ヨウ素１２５、インジウム１１１、イットリウム９０およびルテチウム１７７が挙げられる。放射性免疫複合体を調製するための方法は、当技術分野で確立されている。放射性免疫複合体の例は、ゼバリン（Ｚｅｖａｌｉｎ）（商標）（ＩＤＥＣファーマシューティカルズ（ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ））およびベクサール（Ｂｅｘｘａｒ）（商標）（コリクサ・ファーマシューティカルズ（Ｃｏｒｉｘａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ））などが市販されており、同様の方法を用い、本開示の抗体を用いて放射性免疫複合体を調製してもよい。
【０２１３】
本開示の抗体複合体を用いて所与の生物学的応答を修飾可能であり、薬剤部分は従来の化学治療物質に限定されるものとして解釈されるべきではない。例えば、薬剤部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリペプチドでありうる。かかるタンパク質は、例えば、酵素活性毒素またはその活性断片、例えばアブリン、リシンＡ、シュードモナスエキソトキシンまたはジフテリア毒素；腫瘍壊死因子またはインターフェロン−γなどのタンパク質；あるいは、例えばリンホカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）または他の成長因子などの生物学的応答修飾因子を含みうる。
【０２１４】
かかる治療部分を抗体に複合させるための技術は周知であり、例えば、アーノン（Ａｒｎｏｎ）ら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、レイスフェルド（Ｒｅｉｓｆｅｌｄ）ら（編）、２４３−５６頁（アラン・アール・リス（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）１９８５年）；ヘルストローム（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ）ら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（第２版）、ロビンソン（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）ら（編）、６２３−５３頁（マーセル・デッカー（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）１９８７年）；ソルペ（Ｔｈｏｒｐｅ）、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ピンチエラ（Ｐｉｎｃｈｅｒａ）ら（編）、４７５−５０６頁（１９８５年）；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ  ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ、ボールドウィン（Ｂａｌｄｗｉｎ）ら（編）、３０３−１６頁（アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）１９８５年）；ならびにソルペ（Ｔｈｏｒｐｅ）ら、「Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−５８頁（１９８２年）を参照のこと。
【０２１５】
二重特異性分子
別の態様では、本開示は、本開示の抗ＢＴＬＡ抗体またはその断片を含む二重特異性分子を特徴とする。本開示の抗体またはその抗原結合部分が別の機能分子、例えば別のペプチドまたはタンパク質（例えば別の抗体または受容体にのリガンド）に誘導体化または連結され、少なくとも２つの異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異性分子が生成されうる。本開示の抗体が実際に２つ以上の他の機能分子に誘導体化または連結され、３つ以上の異なる結合部位および／または標的分子に結合する多重特異性分子が生成される可能性があり、かかる多重特異性分子は本明細書で用いられる「二重特異性分子」という用語に包含されるようにも意図されている。本開示の二重特異性分子を作製するため、本開示の抗体は、二重特異性分子が生成されるように、１つ以上の他の結合分子、例えば別の抗体、抗体断片、ペプチドまたは結合模倣体（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｉｍｅｔｉｃ）に（例えば化学共役、遺伝子融合、非共有結合またはその他により）機能的に連結されうる。
【０２１６】
したがって、本開示は、ＢＴＬＡに対する少なくとも１つの第１の結合特異性および第２の標的エピトープに対する第２の結合特異性を含む二重特異性分子を含む。本開示の特定の実施形態では、第２の標的エピトープはＦｃ受容体、例えばヒトＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）またはヒトＦｃα受容体（ＣＤ８９）である。したがって、本開示は、ＦｃγＲまたはＦｃαＲを発現するエフェクター細胞（例えば、単球、マクロファージまたは多形核球細胞（ＰＭＮ））とＢＴＬＡを発現する標的細胞の双方に結合可能な二重特異性分子を含む。これらの二重特異性分子は、エフェクター細胞に対するＢＴＬＡ発現細胞を標的にし、かつ、Ｆｃ受容体媒介性のエフェクター細胞活性、例えばＢＴＬＡ発現細胞の食作用、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、サイトカイン放出あるいはスーパーオキシドアニオンの生成を引き起こす。
【０２１７】
二重特異性分子が多重特異性である場合の本開示の実施形態では、同分子は、抗Ｆｃ結合特異性および抗ＢＴＬＡ結合特異性に加え、第３の結合特異性をさらに含みうる。一実施形態では、第３の結合特異性は、抗促進因子（ａｎｔｉ−ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｆａｃｔｏｒ）（ＥＦ）部分、例えば細胞毒性活性に関与する表面タンパク質に結合し、それにより標的細胞に対する免疫応答を高める分子である。「抗促進因子部分」は、所与の分子、例えば抗原または受容体に結合し、それによりＦｃ受容体または標的細胞抗原における結合決定因子の効果の増強をもたらす抗体、機能抗体断片またはリガンドでありうる。「抗促進因子部分」はＦｃ受容体または標的細胞抗原に結合しうる。あるいは、抗促進因子部分は、第１および第２の結合特異性の結合対象である実体とは異なる実体に結合しうる。例えば、抗促進因子部分は、（例えば標的細胞に対する免疫応答の増大をもたらすＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＩＣＡＭ−１または他の免疫細胞を介して）細胞毒性Ｔ細胞に結合しうる。
【０２１８】
一実施形態では、本開示の二重特異性分子は、結合特異性として、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、または一本鎖Ｆｖを含む、少なくとも１つの抗体またはその抗体断片を含む。ラドナー（Ｌａｄｎｅｒ）らの米国特許第４，９４６，７７８号明細書（その全体は参照により明示的に援用される）に記載のように、抗体は、Ｆｖまたは一本鎖コンストラクトなどの軽鎖または重鎖二量体またはその任意の最小断片でもありうる。
【０２１９】
一実施形態では、Ｆｃγ受容体に対する結合特異性はモノクローナル抗体により提供され、その結合はヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）により遮断されることはない。本明細書で用いられる「ＩｇＧ受容体」という用語は、染色体１上に位置する８つのγ鎖遺伝子のいずれかを示す。これらの遺伝子は、３つのＦｃγ受容体クラス：ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）にグループ化された全部で１２の膜貫通または可溶性受容体アイソフォームをコードする。好ましい一実施形態では、Ｆｃγ受容体はヒト高親和性ＦｃγＲＩである。ヒトＦｃγＲＩは７２ｋＤａの分子であり、単量体ＩｇＧに対して高い親和性を示す（１０８−１０９Ｍ−１）。
【０２２０】
特定の好ましい抗Ｆｃγモノクローナル抗体の産生および特徴づけについては、ＰＣＴ公開、国際公開第８８／０００５２号パンフレットおよび米国特許第４，９５４，６１７号明細書においてファンガー（Ｆａｎｇｅｒ）らに記載されており、それらの教示内容は参照により本明細書中に十分に援用される。これらの抗体は受容体のＦｃγ結合部位から離れた部位でＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩまたはＦｃγＲＩＩＩのエピトープに結合することから、それらの結合がＩｇＧの生理的レベルにより実質的に遮断されることはない。本開示で有用な特異的な抗ＦｃγＲＩ抗体は、ｍＡｂ２２、ｍＡｂ３２、ｍＡｂ４４、ｍＡｂ６２およびｍＡｂ１９７である。ｍＡｂ３２を産生するハイブリドーマは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ＡＴＣＣ登録番号ＨＢ９４６９から入手可能である。他の実施形態では、抗Ｆｃγ受容体抗体はモノクローナル抗体２２のヒト化形態である（Ｈ２２）。Ｈ２２抗体の産生および特徴づけについては、グラジアノ（Ｇｒａｚｉａｎｏ），Ｒ．Ｆ．ら（１９９５年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ１５５（１０）：４９９６−５００２頁およびＰＣＴ公開、国際公開第９４／１０３３２号パンフレットに記載されている。Ｈ２２抗体産生細胞系は、ＨＡ０２２ＣＬ１の指定の下でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されたものであり、登録番号ＣＲＬ１１１７７を有する。
【０２２１】
さらに他の好ましい実施形態では、Ｆｃ受容体に対する結合特異性はヒトＩｇＡ受容体、例えばＦｃ−α受容体（ＦｃαＲＩ（ＣＤ８９））に結合する抗体により提供され、その結合は好ましくはヒト免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）により遮断されることはない。「ＩｇＡ受容体」という用語は、染色体１９上に位置する１つのα遺伝子の遺伝子産物（ＦｃαＲＩ）を含むように意図されている。この遺伝子は、５〜１１０ｋＤａの数種の交互にスプライスされた膜貫通アイソフォームをコードすることが知られている。ＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）は、単球／マクロファージ、好酸性および好中性顆粒球上に構成的に発現されるが、非エフェクター細胞集団上に発現されることはない。ＦｃαＲＩは、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２の双方に対して中程度の親和性（約５×１０７Ｍ−１）を有し、Ｇ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカインへの曝露時に増加する（モートン（Ｍｏｒｔｏｎ），Ｈ．Ｃ．ら（１９９６年）、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６：４２３−４４０頁）。Ａ３、Ａ５９、Ａ６２およびＡ７７として同定された４つのＦｃαＲＩに特異的なモノクローナル抗体は、ＩｇＡリガンド結合ドメイン外部のＦｃαＲＩに結合するものであり、記載がなされている（モンテイロ（Ｍｏｎｔｅｉｒｏ），Ｒ．Ｃ．ら（１９９２年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１７６４頁）。
【０２２２】
ＦｃαＲＩおよびＦｃγＲＩは、（１）主に免疫エフェクター細胞、例えば単球、ＰＭＮ、マクロファージおよび樹状細胞の上で発現され、（２）高レベルで発現され（例えば１細胞当たり５，０００−１００，０００）、（３）細胞毒性活性のメディエーター（例えばＡＤＣＣ、食作用）であり、（４）それらに対して標的とされる、自己抗原を含む抗原の抗原提示の促進を媒介することから、本開示の二重特異性分子において用いられる要因となる好ましい誘発受容体である。
【０２２３】
ヒトモノクローナル抗体が好ましい一方、本開示の二重特異性分子において用いられうる他の抗体がマウス、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体である。
【０２２４】
本開示の二重特異性分子は、構成要素の結合特異性、例えば抗ＦｃＲおよび抗ＢＹＬＡ結合特異性を当技術分野で既知の方法を用いて複合することにより調製されうる。例えば、二重特異性分子の各結合特異性は、別々にもたらされ、次いで互いに複合されうる。結合特異性がタンパク質またはペプチドである場合、種々の共役剤または架橋剤が共有結合に用いられうる。架橋剤の例として、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）およびスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）が挙げられる（例えば、カルボウスキー（Ｋａｒｐｏｖｓｋｙ）ら（１９８４年）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６０：１６８６頁；リウ  Ｍ．Ａ．（Ｌｉｕ  Ｍ．Ａ．）ら（１９８５年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：８６４８頁を参照）。他の方法として、パウルス（Ｐａｕｌｕｓ）（１９８５年）Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｉｎｓ．Ｍｉｔｔ．Ｎｏ．７８：１１８−１３２頁；ブレナン（Ｂｒｅｎｎａｎ）ら（１９８５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１−８３頁）およびグレニー（Ｇｌｅｎｎｉｅ）ら（１９８７年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：２３６７−２３７５頁に記載の方法が挙げられる。好ましい複合剤はＳＡＴＡおよびスルホ−ＳＭＣＣであり、いずれもピアス・ケミカル（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）（イリノイ州ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ））から入手可能である。
【０２２５】
結合特異性が抗体である場合、それらは２つの重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合を介して複合されうる。特に好ましい実施形態では、ヒンジ領域は、複合に先立ち、奇数、好ましくは１つのスルフヒドリル残基を有するように修飾される。
【０２２６】
あるいは、両方の結合特異性は同じベクター内にコードされ、かつ同じ宿主細胞内で発現され、構築されうる。この方法は、二重特異性分子がｍＡｂ×ｍＡｂ、ｍＡｂ×Ｆａｂ、Ｆａｂ×Ｆ（ａｂ’）２またはリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質である場合に特に有用である。本開示の二重特異性分子は、１つの一本鎖抗体および結合決定因子を含む一本鎖分子、または２つの結合決定因子を含む一本鎖二重特異性分子でありうる。二重特異性分子は、少なくとも２つの一本鎖分子を含みうる。二重特異性分子を調製するための方法は、例えば米国特許第５，２６０，２０３号明細書；米国特許第５，４５５，０３０号明細書；米国特許第４，８８１，１７５号明細書；米国特許第５，１３２，４０５号明細書；米国特許第５，０９１，５１３号明細書；米国特許第５，４７６，７８６号明細書；米国特許第５，０１３，６５３号明細書；米国特許第５，２５８，４９８号明細書；および米国特許第５，４８２，８５８号明細書に記載されている。
【０２２７】
二重特異性分子のその特異的な標的に対する結合は、例えば酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＦＡＣＳ分析、バイオアッセイ（例えば増殖阻害）またはウエスタンブロットアッセイによって確認されうる。これらの各アッセイでは、一般に、特別な目的のタンパク質−抗体複合体の存在が目的の複合体に対して特異的な標識試薬（例えば抗体）の使用により検出される。例えば、ＦｃＲ−抗体複合体は、例えば、抗体−ＦｃＲ複合体を認識しかつそれに対して特異的に結合する酵素結合抗体または抗体断片を用いて検出されうる。あるいは、複合体は種々の他のイムノアッセイのいずれかを用いて検出されうる。例えば、抗体は放射活性物質で標識され、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）で用いられうる（例えば、ワイントラウブ  Ｂ．（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ  Ｂ．）、「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｔｒａｉｎｉｎｇ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｏｎ  Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、米国内分泌学会（Ｔｈｅ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）、１９８６年３月（参照により本明細書中に援用される）を参照）。放射性同位体は、ガンマカウンターまたはシンチレーションカウンターの使用などの手段あるいはオートラジオグラフィーにより検出されうる。
【０２２８】
薬学的組成物
別の態様では、本開示は、組成物、例えば薬学的に許容できる担体とともに製剤化された本開示のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分のうちの１つまたは組み合わせを含有する薬学的組成物を提供する。かかる組成物は、本開示の（例えば２種もしくは３種以上の異なる）抗体または免疫複合体または二重特異性分子のうちの１つまたはそれらの組み合わせを含有しうる。例えば、本開示の薬学的組成物は、標的抗原上で異なるエピトープに結合するかまたは相補的活性を有する抗体（または免疫複合体または二重特異性抗体）の組み合わせを含有しうる。
【０２２９】
本開示の薬学的組成物は、併用療法、すなわち他の作用物質との併用であっても投与可能である。例えば、併用療法は、本開示の抗ＢＴＬＡ抗体と、少なくとも１つの他の抗炎症物質または免疫抑制剤との併用を含みうる。併用療法で用いられうる治療物質の例が、本開示の抗体の使用に関する下記セクションにおいてより詳細に記載される。
【０２３０】
本明細書で用いられる「薬学的に許容できる担体」は、生理学的に適合可能な、あらゆる溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与（例えば注射または注入による）に適する。投与経路に依存し、活性化合物、すなわち抗体、免疫複合体または二重特異性分子は、化合物を酸の活性および化合物を不活性化しうる他の天然条件から保護するための材料でコーティングされうる。
【０２３１】
本開示の薬学的化合物は、１つ以上の薬学的に許容できる塩を含む。「薬学的に許容できる塩」は、親化合物の所望の生物学的活性を保持する塩を示し、任意の望ましくない毒物学的効果を与えることがない（例えば、ベルゲ（Ｂｅｒｇｅ），Ｓ．Ｍ．ら（１９７７年）、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９頁を参照）。かかる塩の例として、酸添加塩および塩基添加塩が挙げられる。酸添加塩は、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸などの非毒性無機酸や、脂肪族モノカルボキシル酸およびジカルボキシル酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などの非毒性有機酸に由来する塩を含む。塩基添加塩は、アルカリ土類金属、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどや、非毒性有機アミン、例えばＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどに由来する塩を含む。
【０２３２】
本開示の薬学的組成物は、薬学的に許容できる酸化防止剤も含有しうる。薬学的に許容できる酸化防止剤の例として、（１）水溶性酸化防止剤、例えばアスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；（２）油可溶性酸化防止剤、例えばアスコルビン酸パルミテート、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなど；および（３）金属キレート剤、例えばクエン酸、エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などが挙げられる。
【０２３３】
本開示の薬学的組成物中に用いられうる適切な水性および非水性担体の例として、水、エタノール、ポリオール（グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適切な混合物、植物オイル、例えばオリーブオイルならびに注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルが挙げられる。適切な液性が、例えば、コーティング材、例えばレシチンの使用、分散の場合に必要とされる粒径の維持ならびに界面活性剤の使用により維持されうる。
【０２３４】
これらの組成物は、防腐剤、浸潤剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントも含有しうる。微生物の出現の防止は、上記の滅菌法と、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの封入との双方により保証されうる。組成物中に等張剤、例えば糖、塩化ナトリウムなどを含めることも望ましい場合がある。さらに、注射可能な薬学的形態の吸収遅延がモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延させる作用物質の封入によりもたらされうる。
【０２３５】
薬学的に許容できる担体は、注射可能な無菌溶液または分散系の即時調製のための無菌水溶液または分散系および無菌粉末を含む。薬学的に活性な物質におけるかかる媒体および作用物質の使用については当技術分野で既知である。任意の従来の媒体または作用物質が活性化合物と混合できない場合を除き、本開示の薬学的組成物におけるそれらの使用が検討される。補助活性化合物も組成物中に組み込み可能である。
【０２３６】
治療組成物は、典型的には製造および保存の条件下で無菌かつ安定でなければならない。組成物は、高い薬物濃度に適する溶液、マイクロエマルジョン、リポソームまたは他の規則的構造として製剤化することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散系でありうる。適切な液性が、例えば、レシチンなどのコーティング材の使用、分散の場合に必要とされる粒径の維持ならびに界面活性剤の使用により維持されうる。多くの場合、組成物中に、等張剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコールまたは塩化ナトリウムを含めることが好ましいことになる。注射可能な組成物の遅延された吸収は、組成物中に吸収を遅延させる作用物質、例えばモノステアレート塩（ｍｏｎｏｓｔｅａｒａｔｅ  ｓａｌｔ）およびゼラチンを含めることによりもたらされうる。
【０２３７】
注射可能な無菌溶液は、必要に応じ、上掲の原料の１つもしくは組み合わせを有する適切な溶媒中に必要量の活性化合物を組み込み、その後に滅菌および精密濾過を施すことにより調製されうる。一般に、分散系は、塩基性分散系および上掲の原料由来の必要な他の原料を含有する無菌溶媒に活性化合物を組み込むことにより調製される。注射可能な無菌溶液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分の粉末に加え任意の所望の追加原料をその予め無菌濾過された溶液から生成する真空乾燥およびフリーズドライ（凍結乾燥）である。
【０２３８】
担体材料と組み合わせることで単一の剤形を生成可能な活性成分の量は、治療される対象および特定の投与方法に依存して変化することになる。単一の剤形を生成するための担体材料と併用可能な活性成分の量は、一般に治療効果をもたらす組成物の量となる。一般に、この量は、薬学的に許容できる担体との併用で、１００％のうち、活性成分の約０．０１％〜約９９％、好ましくは活性成分の約０．１％〜約７０％、最も好ましくは活性成分の約１％〜約３０％の範囲となる。
【０２３９】
投与計画を調節することで最適な所望の応答（例えば治療応答）がもたらされる。例えば、単回ボーラスが投与されうるか、数回の分割用量が長期にわたり投与されうるかまたは同用量が治療状況の要件で示されるように比例的に漸減または増加されうる。投与の容易さおよび用量の均一性を意図し、非経口組成物を投与単位形態で調製することが特に有利である。本明細書で用いられる投与単位形態は、試験されるべき対象に対する単一の用量として適合する物理的に別々の単位であり、各単位は必要とされる薬学的担体と関連して所望の治療効果をもたらすように計算された既定量の活性化合物を有する。本開示の投与単位形態における仕様は、（ａ）活性化合物固有の特性および達成されるべき特定の治療効果と、（ｂ）個体における感受性を治療するためにかかる活性化合物を化合する当技術分野に内在する制限により決定づけられ、かつそれらに直接依存している。
【０２４０】
抗体の投与においては、用量は、宿主体重の約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、およびより一般的には０．０１〜５ｍｇ／ｋｇの範囲である。例えば用量は、０．３ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重もしくは１０ｍｇ／ｋｇ体重または１−１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であってもよい。典型的な治療計画では、毎週１回、２週ごとに１回、３週ごとに１回、４週ごとに１回、１か月に１回、３か月ごとに１回または３〜６か月ごとに１回の投与が必要とされる。本開示の抗ＢＴＬＡ抗体に対する好ましい投与計画は、抗体の静脈内投与を介した１ｍｇ／ｋｇ体重または３ｍｇ／ｋｇ体重を含み、ここで抗体は（ｉ）６回投与を４週ごと、次いで３か月ごと；（ｉｉ）３週ごと；（ｉｉｉ）１回の３ｍｇ／ｋｇ体重、次いで３週ごとに１ｍｇ／ｋｇ体重という投与計画のうちの１つを用いて投与される。
【０２４１】
いくつかの方法では、異なる結合特異性を有する、２つ以上のモノクローナル抗体が同時投与され、いずれの場合でも投与される各抗体の用量は指定範囲内に含まれる。多くの場合、抗体が通常投与される。単回投与間の間隔は、例えば、週単位、月単位、３か月単位または年単位であってもよい。患者における抗体の標的抗原に対する血中濃度の測定により示されるように、間隔は不規則であってもよい。用量は、ある方法では約１〜１０００μｇ／ｍｌ、またある方法では約２５〜３００μｇ／ｍｌの血漿抗体濃度を得るように調節される。
【０２４２】
あるいは、抗体は徐放製剤として投与可能であり、いずれの場合でも低頻度の投与が必要とされる。用量および頻度は、患者における抗体の半減期に依存して変化する。一般に、ヒト抗体は最長の半減期を示し、ヒト化抗体、キメラ抗体および非ヒト抗体がそれに続く。投与の用量および頻度は、治療が予防的であるかまたは治療的であるかに依存して変化しうる。予防的適用においては、比較的低用量が長期にわたり比較的低頻度の間隔で投与される。一部の患者が、余生にわたって治療を受け続けている。治療的適用においては、疾患の進行が低下または終結されるまで、好ましくは患者が疾患の徴候の部分的または完全な改善を示すまで、比較的短い間隔で比較的高用量が必要とされる場合がある。その後、患者は予防計画通りに投与されうる。
【０２４３】
本開示の薬学的組成物中での活性成分の実際の用量レベルは、患者に毒性をもたらすことなく、特定の患者、組成物および投与様式について所望の治療応答を得るのに有効な活性成分の量を得るように変化しうる。選択される用量レベルは、用いられる本開示の特定の組成物またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、用いられる特定の化合物の投与経路、投与時間、排出速度、用いられる特定の組成物と併用される治療薬、他の薬物、化合物および／または材料の持続時間、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、一般健康および過去の病歴、ならびに医術において周知の要素のようなものを含む種々の薬物動態学的因子に依存することになる。
【０２４４】
本開示の抗ＢＴＬＡ抗体の「治療有効用量」は、好ましくは疾患徴候の重症度の低下、疾患徴候のない期間の頻度および持続時間の増大あるいは疾患の苦しみに起因する機能障害または身体障害の予防をもたらす。例えば、腫瘍の治療における「治療有効用量」は、好ましくは細胞増殖または腫瘍増殖を、未治療の対象に対し、少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらにより好ましくは少なくとも約６０％、およびさらにより好ましくは少なくとも約８０％阻害する。化合物の腫瘍増殖に対する阻害能は、ヒト腫瘍における有効性を予測する動物モデル系において評価可能である。あるいは、組成物のこの特性は、化合物の細胞増殖に対する阻害能の試験により評価可能である（当業者に既知のアッセイによるインビトロでのかかる阻害）。治療有効量の治療化合物により、腫瘍サイズを低減することができるか、またはそうでなくても対象における徴候を改善することができる。当業者であれば、対象の大きさ、対象の徴候の重症度および選択された投与における特定の組成物または経路などの要素に基づき、かかる量を決定できるであろう。
【０２４５】
本開示の組成物は、種々の当技術分野で既知の方法のうちの１つ以上を用い、１つ以上の投与経路を介して投与されうる。当業者に理解されるように、投与の経路および／または方法は所望の結果に応じて変化することになる。本開示の抗体における好ましい投与経路は、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または他の非経口投与経路、例えば注射もしくは注入によるものを含む。本明細書で用いられる「非経口投与」という語句は、経腸および局所投与以外の投与方法、通常は注射によるものを意味し、限定はされないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内への注射および注入を含む。
【０２４６】
あるいは、本開示の抗体は、非経口でない（ｎｏｎ−ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）経路、例えば局所経路、表皮または粘膜の投与経路を介し、例えば、経鼻的、経口的、経膣的、経直腸的、舌下的または局所的に投与されうる。
【０２４７】
活性化合物は、迅速な放出に対する化合物、例えばインプラント、経皮パッチおよびマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤を保護することになる担体とともに調製されうる。生体分解性、生体適合性ポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸が用いられうる。かかる製剤を調製するための多数の方法が特許化されているかまたは一般に当業者に既知である。例えば、「Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」、Ｊ．Ｒ．ロビンソン（Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）編、マーセル・デッカー社（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、１９７８年を参照のこと。
【０２４８】
治療組成物は、当技術分野で既知の医療器具を用いて投与可能である。例えば、好ましい実施形態では、本開示の治療組成物は、ニードルレス皮下注射器具、例えば米国特許第５，３９９，１６３号明細書；米国特許第５，３８３，８５１号明細書；米国特許第５，３１２，３３５号明細書；米国特許第５，０６４，４１３号明細書；米国特許第４，９４１，８８０号明細書；米国特許第４，７９０，８２４号明細書；または米国特許第４，５９６，５５６号明細書に開示された器具を用いて投与可能である。本開示において有用な周知のインプラントおよびモジュールの例として、薬物を制御された速度で小出しするための埋め込み式マイクロ注入ポンプを開示する米国特許第４，４８７，６０３号明細書、皮膚を通してメディカント（ｍｅｄｉｃａｎｔ）を投与するための治療器具を開示する米国特許第４，４８６，１９４号明細書、薬物を正確な注入速度で送達するための薬物注入ポンプを開示する米国特許第４，４４７，２３３号明細書、連続的薬物送達のための流量可変の埋め込み式注入装置を開示する米国特許第４，４４７，２２４号明細書、マルチチャンバ式の区画を有する浸透圧薬物送達システムを開示する米国特許第４，４３９，１９６号明細書、ならびに浸透圧薬物送達システムを開示する米国特許第４，４７５，１９６号明細書が挙げられる。これらの特許は参照により本明細書中に援用される。多数の他のかかるインプラント、送達システムおよびモジュールは当業者に既知である。
【０２４９】
特定の実施形態では、本開示のヒトモノクローナル抗体を製剤化し、インビボで適切な分布を保証することが可能である。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は多数の親水性の高い化合物を排除する。（必要に応じて）本開示の治療化合物がＢＢＢを通過することを保証するため、それらを例えばリポソームの形で製剤化することができる。リポソームを作製する方法については、例えば米国特許第４，５２２，８１１号明細書；米国特許第５，３７４，５４８号明細書；および米国特許第５，３９９，３３１号明細書を参照のこと。リポソームは特定の細胞または器官に選択的に輸送される１つ以上の部分を含みうることから、標的化された薬剤送達が促進される（例えば、Ｖ．Ｖ．ラナーデ（Ｖ．Ｖ．Ｒａｎａｄｅ）（１９８９年）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：６８５頁を参照）。典型的な標的化部分は、葉酸またはビオチン（例えばロウ（Ｌｏｗ）らに交付された米国特許第５，４１６，０１６号明細書を参照）；マンノシド（ウメザワ（Ｕｍｅｚａｗａ）ら（１９８８年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５３：１０３８頁）；抗体（Ｐ．Ｇ．ブロエマン（Ｐ．Ｇ．Ｂｌｏｅｍａｎ）ら（１９９５年）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３５７：１４０頁；Ｍ．オワイス（Ｍ．Ｏｗａｉｓ）ら（１９９５年）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３９：１８０頁）；界面活性剤のプロテインＡ受容体（ブリスコエ（Ｂｒｉｓｃｏｅ）ら（１９９５年）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３３：１３４頁）；ｐ１２０（シュライアー（Ｓｃｈｒｅｉｅｒ）ら（１９９４年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９０９０頁）を含み、Ｋ．ケイナネン（Ｋ．Ｋｅｉｎａｎｅｎ）；Ｍ．Ｌ．ラウッカネン（Ｍ．Ｌ．Ｌａｕｋｋａｎｅｎ）（１９９４年）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３４６：１２３頁；Ｊ．Ｊ．キリオン（Ｊ．Ｊ．Ｋｉｌｌｉｏｎ）；Ｉ．Ｊ．フィドラー（Ｉ．Ｊ．Ｆｉｄｌｅｒ）（１９９４年）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ４：２７３頁も参照のこと。
【０２５０】
本開示の使用および方法
本開示の抗体、抗体組成物および方法は、例えばＢＴＬＡの検出またはＢＴＬＡの遮断による免疫応答の増強を含む、極めて多数のインビトロおよびインビボでの有用性を有する。一部の実施形態では、抗体はＢＴＬＡへの結合により免疫応答を抑制する。この実施形態では、抗体はアゴニストとして機能する。好ましい実施形態では、本開示の抗体はヒト抗体である。例えば、これらの分子を培地内の細胞にインビトロもしくは生体外でまたはヒト対象に例えばインビボで投与し、種々の状況において免疫を増強することが可能である。したがって、一態様では、本開示は、対象における免疫応答を改良する方法であって、対象に本開示の抗体またはその抗原結合部分を対象における免疫応答が改良されるように投与するステップを含む、方法を提供する。好ましくは、応答は増強、刺激または上方制御される。
【０２５１】
本明細書で用いられる「対象」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物を含むように意図されている。非ヒト動物は、あらゆる脊椎動物、例えば哺乳類および非哺乳類、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、両生類および爬虫類を含むが、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシおよびウマなどの哺乳類が好ましい。好ましい対象は、免疫応答の増強を必要とするヒト患者を含む。本方法は、Ｔ細胞媒介性の免疫応答の増強によって治療可能な疾患を有するヒト患者の治療に特に適する。特定の実施形態では、本方法はインビボでの癌細胞の治療に特に適する。免疫の抗原特異的な増強を得るため、抗ＢＴＬＡ抗体を目的の抗原と並行投与してもよい。ＢＴＬＡに対する抗体が別の作用物質と並行投与される場合、２剤は順次投与または同時投与のいずれであってもよい。
【０２５２】
本開示は、試料中でのヒトＢＴＬＡ抗原の存在を検出するかまたはヒトＢＴＬＡ抗原の量を測定するための方法であって、試料および対照試料を、ヒトＢＴＬＡに特異的に結合するヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分と、抗体またはその一部とヒトＢＴＬＡとの複合体の形成を可能にする条件下で接触させるステップを含む、方法をさらに提供する。次いで複合体の形成が検出され、ここで対照試料に対する試料間の複合体形成の違いは試料中でのヒトＢＴＬＡ抗原の存在を示す。
【０２５３】
本開示の抗体がＣＤ２８、ＩＣＯＳおよびＣＴＬＡ−４と比べてＢＴＬＡに特異的に結合すると仮定すると、本開示の抗体を用いて細胞の表面上でのＢＴＬＡの発現を特異的に検出し、さらに同抗体を用いて免疫親和性精製を介してＢＴＬＡを精製することが可能である。
【０２５４】
癌
抗体によるＢＴＬＡの遮断は、患者における癌細胞に対して免疫応答を増強しうる。ＢＴＬＡに対するリガンドＨＶＥＭはＴＮＦＲファミリーメンバーであり、一部の身体組織を生成可能であり、かつＴ、Ｂ、ＮＫ、樹状および骨髄性細胞を含むリンパ球様細胞内に存在する（マーフィ（Ｍｕｒｐｈｙ）ら、Ｎａｔ．Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、６、６７１−６８１頁、２００６年）。ＨＶＥＭ／ＢＴＬＡ相互作用により誘発される免疫抑制は、ＨＶＥＭに対するＢＴＬＡの局所相互作用を阻害することにより無効化されうる（ワタナベ（Ｗａｔａｎａｂｅ）ら、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４、６７０−６７９頁、２００３年；オオツキ（Ｏｔｓｕｋｉ）ら、ＢＢＲＣ  ３４４、１１２１−１１２７頁、２００６年）。一態様では、本開示は、癌腫瘍の増殖が阻害されるように抗ＢＴＬＡ抗体を用いる、インビボでの対象の治療に関する。抗ＢＴＬＡ抗体の単独使用により、癌腫瘍の増殖が阻害されうる。あるいは、抗ＢＴＬＡ抗体は、下記のような他の免疫原性物質、標準の癌治療薬、または他の抗体と併用可能である。
【０２５５】
したがって、一実施形態では、本開示は、対象における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、対象に治療有効量の抗ＢＴＬＡ抗体またはその抗原結合部分を投与するステップを含む、方法を提供する。好ましくは、抗体はヒト抗ＢＴＬＡ抗体（本明細書中に記載のヒト抗ヒトＢＴＬＡ抗体のいずれかなど）である。さらにまたはその他として、抗体はキメラまたはヒト化抗ＢＴＬＡ抗体でありうる。
【０２５６】
増殖が本開示の抗体を用いて阻害されうる好ましい癌は、典型的には免疫療法に応答性がある癌を含む。治療にとって好ましい癌の非限定例として、メラノーマ（例えば転移性悪性メラノーマ）、腎癌、前立腺癌、乳癌、大腸癌および肺癌が挙げられる。本開示の方法を用いて治療可能な他の癌の例として、骨癌、膵癌、皮膚癌、頭頚部癌、皮膚または眼内悪性メラノーマ、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、睾丸癌、子宮癌、ファロピウス管癌、子宮内膜癌、子宮頚癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病を含む慢性または急性白血病、小児期の固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓癌または尿管癌、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹グリオーマ、下垂体腺腫、カポジ肉腫、扁平上皮癌、扁平上皮細胞癌、Ｔ細胞リンパ腫、アスベストにより誘発される癌を含む環境誘発性癌、ならびに前記癌の組み合わせが挙げられる。本開示は、転移性癌の治療にとっても有用である。
【０２５７】
場合により、ＢＴＬＡに対する抗体を、免疫原性物質、例えば癌細胞、（組換えタンパク質、ペプチド、および炭水化物分子を含む）精製した腫瘍抗原、細胞、免疫刺激性サイトカインをコードする遺伝子が形質移入された細胞と組み合わせてもよい（ヘ（Ｈｅ）ら  （２００４年）  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：４９１９−２８頁）。使用可能な腫瘍ワクチンの非限定例として、メラノーマ抗原のペプチド、例えばｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原、Ｔｒｐ−２、ＭＡＲＴ１および／もしくはチロシナーゼのペプチド、またはサイトカインＧＭ−ＣＳＦを発現するように形質移入された腫瘍細胞が挙げられる（下記にさらに考察される）。
【０２５８】
ヒトでは、メラノーマなどの一部の腫瘍は免疫原性があることが示されている。ＢＴＬＡの遮断によるＴ細胞の活性化の閾値の上昇により宿主内での腫瘍応答の活性化が想定可能であると予想される。
【０２５９】
ＢＴＬＡの遮断は、ワクチン接種プロトコルと組み合わせられる場合に最も有効でありうる。腫瘍に対するワクチン接種については多数の実験方法が考案されている（ローゼンバーグ  Ｓ．（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  Ｓ．）、２０００年、「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ」、ＡＳＣＯエデュケーショナル・ブック・スプリング（ＡＳＣＯ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏｏｋ  Ｓｐｒｉｎｇ）：６０−６２頁；ロゴセティス  Ｃ．（Ｌｏｇｏｔｈｅｔｉｓ  Ｃ．）、２０００年、ＡＳＣＯエデュケーショナル・ブック・スプリング（ＡＳＣＯ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏｏｋ  Ｓｐｒｉｎｇ）：３００−３０２頁；キャヤット  Ｄ．（Ｋｈａｙａｔ  Ｄ．）  ２０００年、ＡＳＣＯエデュケーショナル・ブック・スプリング（ＡＳＣＯ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏｏｋ  Ｓｐｒｉｎｇ）：４１４−４２８頁；フーン  Ｋ．（Ｆｏｏｎ  Ｋ．）  ２０００年、ＡＳＣＯエデュケーショナル・ブック・スプリング（ＡＳＣＯ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏｏｋ  Ｓｐｒｉｎｇ）：７３０−７３８頁；デヴィタ  Ｖ．（ＤｅＶｉｔａ  Ｖ．）ら（編）、１９９７年、「Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ」中のレスティフォ  Ｎ．（Ｒｅｓｔｉｆｏ  Ｎ．）およびスズノル  Ｍ．（Ｓｚｎｏｌ  Ｍ．）、「Ｃａｎｃｅｒ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ」、第６１章、３０２３−３０４３頁も参照）。これらの方法のうちの一方法では、ワクチンが自系または同種腫瘍細胞を用いて調製される。これらの細胞ワクチンは、腫瘍細胞の形質導入によりＧＭ−ＣＳＦが発現される場合に最も有効であることが示されている。ＧＭ−ＣＳＦは、腫瘍ワクチン接種における抗原提示の強力な活性化因子であることが示されている（ドラノフ（Ｄｒａｎｏｆｆ）ら（１９９３年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：３５３９−４３頁）。
【０２６０】
様々な腫瘍における遺伝子発現および大規模な遺伝子発現パターンに関する試験から、いわゆる腫瘍特異的な抗原が定義されている（ローゼンバーグ  Ｓ．Ａ．（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  Ｓ．Ａ．）  （１９９９年）  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １０：２８１−７頁）。多くの場合、これらの腫瘍特異的な抗原は、腫瘍内および腫瘍が発生した細胞内、例えばメラノサイト抗原ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原、およびＴｒｐ−２において発現される分化抗原である。より重要なことには、これら抗原の多数は、宿主内に見出される腫瘍特異的なＴ細胞の標的であることが示されうる。ＢＴＬＡの遮断は、腫瘍内に発現される組換えタンパク質および／またはペプチドの、これらのタンパク質に対する免疫応答を生成することを意図した採取と併せて用いられうる。これらのタンパク質は一般に免疫系により自己抗原として見られることからそれらに対して耐性を示す。腫瘍抗原は、染色体のテロメアの合成に必要とされかつ８５％超のヒト癌内および極めてわずかの身体組織内で発現されるタンパク質テロメラーゼも含みうる（キム  Ｎ．（Ｋｉｍ  Ｎ．）ら（１９９４年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：２０１１−２０１３頁）（これらの身体組織は様々な手段による免疫攻撃から保護されうる）。腫瘍抗原は、タンパク質配列を改変するかまたは２つの非関連配列間の融合タンパク質（すなわちフィラデルフィア染色体内のｂｃｒ−ａｂｌ）を生成する体細胞突然変異故に癌細胞内に発現される「新抗原（ｎｅｏ−ａｎｔｉｇｅｎｓ）」またはＢ細胞腫瘍由来のイディオタイプでもありうる。
【０２６１】
他の腫瘍ワクチンは、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、肝炎ウイルス（ＨＢＶおよびＨＣＶ）およびカポジヘルペス肉腫ウイルス（ＫＨＳＶ）などのヒト癌に関与するウイルス由来のタンパク質を含みうる。ＢＴＬＡの遮断と併せて用いられうる別の形態の腫瘍特異的な抗原が、腫瘍組織自体から単離される精製熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）である。これらの熱ショックタンパク質は、腫瘍細胞由来のタンパク質の断片を含有し、かつこれらのＨＳＰは腫瘍免疫の誘導のための抗原提示細胞への送達において極めて効率が高い（スオット  Ｒ．（Ｓｕｏｔ  Ｒ．）およびスリヴァスタヴァ  Ｐ．（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  Ｐ．）（１９９５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：１５８５−１５８８頁；タムラ  Ｙ．（Ｔａｍｕｒａ  Ｙ．）ら（１９９７年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８：１１７−１２０頁）。
【０２６２】
樹状細胞（ＤＣ）は、抗原特異的応答のプライミングに使用可能な強力な抗原提示細胞である。ＤＣは生体外で生成され、様々なタンパク質およびペプチド抗原ならびに腫瘍細胞抽出物が負荷されうる（ネッスル  Ｆ．（Ｎｅｓｔｌｅ  Ｆ．）ら（１９９８年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４：３２８−３３２頁）。ＤＣでの遺伝的手段による形質導入により、これらの腫瘍抗原の発現もなされうる。ＤＣはまた、免疫を目的として腫瘍細胞に直接融合されている（カグラー  Ａ．（Ｋｕｇｌｅｒ  Ａ．）ら（２０００年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６：３３２−３３６頁）。ワクチン接種の方法としてＤＣ免疫をＢＴＬＡの遮断と有効に併用することで、より強力な抗腫瘍応答の活性化が可能である。
【０２６３】
ＢＴＬＡの遮断は標準の癌治療との併用も可能である。ＢＴＬＡの遮断は化学療法レジームと有効に併用されうる。これらの例では、化学療法試薬の投与用量の低減が可能でありうる（モキル  Ｍ．（Ｍｏｋｙｒ  Ｍ．）ら（１９９８年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５８：５３０１−５３０４頁）。かかる併用の例として、メラノーマを治療するためのデカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）と併用される抗ＢＴＬＡ抗体が挙げられる。かかる併用の別の例として、メラノーマを治療するためのインターロイキン−２（ＩＬ−２）と併用される抗ＢＴＬＡ抗体が挙げられる。ＢＴＬＡの遮断と化学療法剤との併用の背後にある科学的根拠は、大部分の化学療法化合物の細胞毒性作用の結果である細胞死により抗原提示経路内での腫瘍抗原のレベルの上昇が生じることである。細胞死を通じてＢＴＬＡの遮断との相乗効果をもたらしうる他の併用療法が、放射線、手術、およびホルモン欠乏である。これらの各プロトコルにより宿主内に腫瘍抗原の供給源がもたらされる。血管新生阻害剤もＢＴＬＡの遮断との併用が可能である。血管新生の阻害は腫瘍細胞死を引き起こし、それにより腫瘍抗原が宿主抗原提示経路に供給されうる。
【０２６４】
ＢＴＬＡを遮断する抗体は、腫瘍細胞に対するＦｃαまたはＦｃγ受容体を発現するエフェクター細胞を標的にする二重特異性抗体との併用も可能である（例えば米国特許第５，９２２，８４５号明細書および米国特許第５，８３７，２４３号明細書を参照）。二重特異性抗体を用い、２つの別々の抗原を標的化してもよい。例えば、抗Ｆｃ受容体／抗腫瘍抗原（例えばＨｅｒ−２／ｎｅｕ）二重特異性抗体を用い、腫瘍の部位に対してマクロファージが標的化されている。この標的化により、腫瘍特異的な応答がより有効に活性化されうる。これら応答のＴ細胞アームであれば、ＢＴＬＡの遮断の使用により増強されることになる。あるいは、抗原は、腫瘍抗原および樹状細胞に特異的な細胞表面マーカーに結合する二重特異性抗体の使用によりＤＣに直接送達されうる。
【０２６５】
腫瘍は多種多様な機序により宿主の免疫監視を回避する。これらの機序の多くは、腫瘍により発現されかつ免疫抑制性を示すタンパク質の不活性化により克服されうる。これらは、特にＴＧＦ−β（カール  Ｊ．（Ｋｅｈｒｌ  Ｊ．）ら（１９８６年）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６３：１０３７−１０５０頁）、ＩＬ−１０（ハワード  Ｍ．（Ｈｏｗａｒｄ  Ｍ．）およびオガッラ  Ａ．（Ｏ’Ｇａｒｒａ  Ａ．）（１９９２年）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １３：１９８−２００頁）、およびＦａｓリガンド（ハーネ  Ｍ．（Ｈａｈｎｅ  Ｍ．）ら（１９９６年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：１３６３−１３６５頁）を含む。これら実体の各々に対する抗体を抗ＢＴＬＡと併用することで、免疫抑制剤の効果が妨げられかつ宿主による腫瘍免疫応答が増強されうる。
【０２６６】
宿主の免疫応答性の活性化に使用可能な他の抗体が抗ＢＴＬＡと併用されうる。これらは、ＤＣの機能および抗原提示を活性化する樹状細胞の表面上の分子を含む。抗ＣＤ４０抗体は、Ｔ細胞ヘルパー活性と有効に代替可能であり（リッジ  Ｊ．（Ｒｉｄｇｅ  Ｊ．）ら（１９９８年）Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：４７４−４７８頁）、ＢＴＬＡ抗体と併用されうる（イトウ  Ｎ．（Ｉｔｏ  Ｎ．）ら（２０００年）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１（５）５２７−４０頁）。ＣＴＬＡ−４（例えば米国特許第５，８１１，０９７号明細書）、ＯＸ−４０（ワインバーグ  Ａ．（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  Ａ．）ら（２０００年）Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６４：２１６０−２１６９頁）、４−１ＢＢ（メレロ  Ｉ．（Ｍｅｌｅｒｏ  Ｉ．）ら（１９９７年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３：６８２−６８５頁（１９９７年）、およびＩＣＯＳ（ハトロフ  Ａ．（Ｈｕｔｌｏｆｆ  Ａ．）ら（１９９９年）Ｎａｔｕｒｅ  ３９７：２６２−２６６頁）などのＴ細胞同時刺激分子に対する抗体の活性化は、Ｔ細胞活性化のレベルの上昇ももたらしうる。
【０２６７】
種々の造血源の腫瘍を治療するため、現在では骨髄移植が用いられている。移植片対宿主病がこの治療の結果である一方、治療上の利益が移植片対腫瘍応答から得られうる。ＢＴＬＡの遮断を用い、移植されたドナーでの腫瘍特異的なＴ細胞の有効性が高まりうる。
【０２６８】
腫瘍に対する抗原特異的なＴ細胞のため、抗原特異的なＴ細胞の生体外での活性化および拡大ならびにこれらの細胞のレシピエントへの養子免疫伝達を含む実験的治療プロトコルもいくつか存在する（グリーンバーグ  Ｒ．（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  Ｒ．）およびリデル  Ｓ．（Ｒｉｄｄｅｌｌ  Ｓ．）（１９９９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：５４６−５１頁）。これらの方法を用い、ＣＭＶなどの病原菌に対するＴ細胞応答を活性化することも可能である。抗ＢＴＬＡ抗体の存在下での生体外活性化により、養子免疫伝達されたＴ細胞の頻度および活性の増大が予想されうる。
【０２６９】
感染性疾患
本開示の他の方法を用い、特定の毒素または病原体に曝露されている患者が治療される。したがって、本開示の別の態様は、対象における感染性疾患を治療する方法であって、対象に抗ＢＴＬＡ抗体またはその抗原結合部分を、対象における感染性疾患が治療されるように投与するステップを含む、方法を提供する。好ましくは、抗体はヒト抗ヒトＢＴＬＡ抗体（本明細書中に記載のヒト抗ＢＴＬＡ抗体のいずれかなど）である。さらにまたはその他として、抗体はキメラまたはヒト化抗体でありうる。
【０２７０】
上で考察のように腫瘍へのその適用と同様、抗体媒介性のＢＴＬＡの遮断を単独で用いるかまたはアジュバントとしてワクチンと併用することで、病原体、毒素、および自己抗原に対する免疫応答が刺激されうる。この治療的アプローチが特に有用でありうる病原体の例として、現在では全く有効でないワクチンが存在する場合の病原体または従来型ワクチンの有効性が決して完全でない場合の病原体が挙げられる。これらは、限定はされないが、ＨＩＶ、（Ｂ型およびＣ型）肝炎、インフルエンザ、ヘルペス、ジアルジア、マラリア、リーシュマニア、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  Ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）を含む。ＢＴＬＡの遮断は、感染の経過を通じて改変抗原を提示するＨＩＶなどの作用物質による確立された感染に対して特に有用である。これら新規のエピトープは、抗ヒトＢＴＬＡの投与時に外来物として認識されることから、ＢＴＬＡを通る負のシグナルにより抑制されることがない強力なＴ細胞応答が引き起こされる。
【０２７１】
本開示の方法により治療可能な感染を引き起こす病原ウイルスの一部の例として、ＨＩＶ、（Ｂ型またはＣ型）肝炎、ヘルペスウイルス（例えば、ＶＺＶ、ＨＳＶ−１、ＨＡＶ−６、ＨＳＶ−ＩＩ、およびＣＭＶ、エプスタインバーウイルス）、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス（ｃｏｒｎｏｖｉｒｕｓ）、呼吸器合胞体ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＴＬＶウイルス、デング熱ウイルス、パピローマウイルス、モルスカムウイルス（ｍｏｌｌｕｓｃｕｍ  ｖｉｒｕｓ）、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルスおよびアルボウイルス脳炎ウイルスが挙げられる。
【０２７２】
本開示の方法により治療可能な感染を引き起こす病原細菌の一部の例として、クラミジア（ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、リケッチア菌（ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、連鎖球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、肺炎連鎖球菌（ｐｎｅｕｍｏｎｏｃｏｃｃｕｓ）、髄膜炎菌（ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ）およびコノコッカス（ｃｏｎｏｃｏｃｃｕｓ）、クレブシエラ（ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス（ｐｒｏｔｅｕｓ）、セラチア（ｓｅｒｒａｔｉａ）、シュードモナス（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、レジオネラ（ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、ジフテリア（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）、サルモネラ（ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、桿菌（ｂａｃｉｌｌｉ）、コレラ菌、破傷風菌、ボツリヌス菌、炭疽菌、ペスト菌、レプトスピラ菌、およびライム病菌が挙げられる。
【０２７３】
本開示の方法により治療可能な感染を引き起こす病原真菌の一部の例として、真菌のカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）（アルビカンス（ａｌｂｉｃａｎｓ）、クルセイ（ｋｒｕｓｅｉ）、グラブラタ（ｇｌａｂｒａｔａ）、トロピカリス（ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）など）、クリプトコックス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属（フミガーツス（ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、ニガー（ｎｉｇｅｒ）など）、ケカビ目（Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ）の属（ケカビ属（ｍｕｃｏｒ）、アブシディア属（ａｂｓｉｄｉａ）、クモノスカビ属（ｒｈｉｚｏｐｈｕｓ））、スポロスリックス・シェンキー（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｃｈｅｎｋｉｉ）、ブラストミセス・デルマチチジス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、ブラジル・パラコクシジオイデス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、コクシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ）およびヒストプラスマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）が挙げられる。
【０２７４】
本開示の方法により治療可能な感染を引き起こす病原寄生虫の一部の例として、寄生虫の赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、大腸バランチジウム（Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ  ｃｏｌｉ）、ネグレリア・フォーレリ（Ｎａｅｇｌｅｒｉａｆｏｗｌｅｒｉ）、アカントアメーバ（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ）種、ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｉａ）、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）種、ニューモシスティス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ）、ネズミバベシア（Ｂａｂｅｓｉａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、トリパノソーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ）、クルーズ・トリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）、ドノバンリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｄｏｎｏｖａｎｉ）、トキソプラズマ原虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）、ブラジル鉤虫（Ｎｉｐｐｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）が挙げられる。
【０２７５】
上記の方法のすべてにおいて、ＢＴＬＡの遮断は、腫瘍抗原の提示の促進をもたらす、サイトカイン治療（例えばインターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−２）または二重特異性抗体療法などの他の形態の免疫療法と併用されうる（例えば、ホリガー（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ）（１９９３年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８頁；ポルジャック（Ｐｏｌｊａｋ）（１９９４年）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３頁を参照）。
【０２７６】
自己免疫反応
抗ＢＴＬＡ抗体は自己免疫反応を引き起こし、増幅しうる。実際、腫瘍細胞およびペプチドワクチンを用いた抗腫瘍応答の誘発により、多数の抗腫瘍応答がヴァン・エルサス（ｖａｎ  Ｅｌｓａｓ）ら、上記における抗自己反応性（抗ＣＴＬＡ−４＋ＧＭ−ＣＳＦで修飾されたＢ１６メラノーマで観察される脱色；Ｔｒｐ−２ワクチン接種マウスにおける脱色（オーバーウィック  Ｗ．（Ｏｖｅｒｗｉｊｋ  Ｗ．）ら（１９９９年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：２９８２−２９８７頁）；ＴＲＡＭＰ腫瘍細胞ワクチンにより誘発される自己免疫前立腺炎（ハーヴィッツ  Ａ．（Ｈｕｒｗｉｔｚ  Ａ．）（２０００年）上記）、メラノーマペプチド抗原ワクチン化およびヒト臨床試験で観察される白斑（ローゼンバーグ  Ｓ．Ａ．（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  Ｓ．Ａ．）およびホワイト  Ｄ．Ｅ．（Ｗｈｉｔｅ  Ｄ．Ｅ．）（１９９６年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  Ｅｍｐｈａｓｉｓ  Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９（１）：８１−４頁）を含むことが示される。
【０２７７】
したがって、疾患治療用にこれらの自己タンパク質に対する免疫応答を効率的に生成するためのワクチン接種プロトコルを考案するため、抗ＢＴＬＡの遮断と様々な自己タンパク質との併用が考えられうる。例えば、アルツハイマー病は脳内のアミロイド沈着物中にＡβペプチドの不適切な蓄積を含むが、アミロイドに対する抗体応答によりこれらのアミロイド沈着物の除去が可能である（シェンク（Ｓｃｈｅｎｋ）ら（１９９９年）Ｎａｔｕｒｅ  ４００：１７３−１７７頁）。
【０２７８】
他の自己タンパク質は、アレルギーおよび喘息の治療におけるＩｇＥや関節リウマチにおけるＴＮＦαなどの標的としても用いられうる。最終的に、様々なホルモンに対する抗体応答が抗ＢＴＬＡ抗体の使用により誘発されうる。生殖ホルモンに対する中和抗体応答は避妊に用いられうる。ホルモンおよび特定の腫瘍の増殖に必要とされる他の可溶性因子に対する中和抗体応答は有望なワクチン接種標的とも考えられうる。
【０２７９】
抗ＢＴＬＡ抗体に用いられる上記と類似の方法が、他の自己抗原、例えばアルツハイマー病におけるＡβを含むアミロイド沈着物、ＴＮＦαなどのサイトカイン、およびＩｇＥの不適切な蓄積を有する患者を治療するための治療的な自己免疫応答の誘発に用いられうる。
【０２８０】
さらに、一部の実施形態では、自己免疫応答の低下にアゴニズム（ａｇｏｎｉｓｍ）も用いられうる。抗ＢＴＬＡ抗体がアゴニストとして有用であることにより、通常ではＢＴＬＡを発現する免疫細胞により媒介される免疫応答が抑制される。かかるアゴニスト抗体を用いて治療可能な疾患のいくつかの例として、自己免疫疾患、移植拒絶、および炎症が挙げられる。
【０２８１】
ワクチン
抗ＢＴＬＡ抗体を用い、抗ＢＴＬＡ抗体と目的の抗原（例えばワクチン）との同時投与により抗原特異的な免疫応答が刺激されうる。したがって、別の態様では本開示は、対象における抗原に対する免疫応答を増強する方法であって、対象に（ｉ）抗原および（ｉｉ）抗ＢＴＬＡ抗体またはその抗原結合部分を、対象における抗原に対する免疫応答が増強されるように投与するステップを含む、方法を提供する。好ましくは、抗体はヒト抗ヒトＢＴＬＡ抗体（本明細書中に記載のヒト抗ＢＴＬＡ抗体のいずれかなど）である。さらにまたはその他として、抗体はキメラまたはヒト化抗体でありうる。抗原は、例えば腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原または病原体由来の抗原でありうる。かかる抗原の非限定例として、上のセクションで考察したもの、例えば上で考察した腫瘍抗原（または腫瘍ワクチン）、または上記のウイルス、細菌もしくは他の病原体に由来する抗原が挙げられる。
【０２８２】
本開示の抗体組成物（例えばヒトモノクローナル抗体、多重特異性および二重特異性分子および免疫複合体）をインビボおよびインビトロで投与する適切な経路は当技術分野で周知であり、当業者により選択されうる。例えば、抗体組成物を注射（例えば静脈内または皮下）により投与してもよい。用いられる分子の適切な用量は、対象の年齢および体重ならびに抗体組成物の濃度および／または製剤形態に依存することになる。
【０２８３】
上記のように、本開示のヒト抗ＢＴＬＡ抗体を、１つもしくは他の複数の治療物質、例えば細胞毒性物質、放射性毒性物質または免疫抑制剤と同時投与してもよい。抗体を（免疫複合体としての）作用物質に連結するかまたは作用物質とは別々に投与してもよい。後者（別々の投与）の場合、作用物質の前、後またはそれと同時に抗体を投与するかまたは他の既知の治療、例えば抗癌治療、例えば放射線と併せて同時投与してもよい。かかる治療物質は、特にドキソルビシン（アドリアマイシン）、シスプラチン、硫酸ブレオマイシン、カルムスチン、クロラムブシル、ダカルバジン、およびシクロホスファミド、ヒドロキシウレアなどの抗悪性腫瘍薬を含み、それら単独では患者に対して毒性または亜毒性のレベルでのみ有効である。シスプラチンは、４週ごとに１回、１００ｍｇ／用量で静脈内投与され、アドリアマイシンは、２１日ごとに１回、６０−７５ｍｇ／ｍｌ用量で静脈内投与される。本開示のヒト抗ＢＴＬＡ抗体またはそれらの抗原結合断片と化学療法剤の同時投与は、ヒト腫瘍細胞に細胞毒性効果をもたらす異なる機序を介して作用する２つの抗癌剤を提供する。かかる同時投与は、抗体に反応しなくなる薬剤に対する耐性または腫瘍細胞の抗原性における変化が生じることによる問題を解決しうる。  
【０２８４】
また、本開示の範囲内に、本開示の抗体組成物（例えば、ヒト抗体、二重特異性もしくは多重特異性分子、または免疫複合体）および使用説明書を含むキットが含まれる。キットは、少なくとも１つの追加試薬または１つ以上の追加の本開示のヒト抗体（例えば、第１のヒト抗体と異なるＢＴＬＡ抗原内のエピトープに結合する相補活性を有するヒト抗体）をさらに含みうる。キットは、典型的にはキットの内容物の使用目的を示すラベルを含む。ラベルという用語は、何らかの書き込み、またはキットに付けてもしくはキットとともに供給されるか、それ以外ではキットに付属する記録された材料を含む。
【０２８５】
本開示は以下の実施例によりさらに例示され、実施例はさらに限定するものとして解釈されるべきでない。本願を通して言及されるあらゆる図面およびあらゆる参考文献、特許および公開された特許出願の内容は、参照により本明細書中に明示的に援用される。
【０２８６】
実施例
実施例１：ＢＴＬＡに対するヒトモノクローナル抗体の産生
抗原
免疫プロトコルでは、抗原として（ｉ）ＢＴＬＡの細胞外部分を含む組換え融合タンパク質および（ｉｉ）膜に結合された完全長ＢＴＬＡの双方を用いた。両抗原をＣＨＯ細胞系内での組換え形質移入法により産生した。
【０２８７】
トランスジェニックＨｕＭａｂおよびＫＭマウス（商標）
ＢＴＬＡに対する完全ヒトモノクローナル抗体を、ＨｕＭａｂトランスジェニックマウスのＨＣｏ７株およびトランスジェニックトランスクロモゾームマウスのＫＭ株（それら各々はヒト抗体遺伝子を発現する）を用いて調製した。これらの各マウス株では、チェン（Ｃｈｅｎ）ら  （１９９３年）  ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：８１１−８２０頁に記載のように内因性マウスκ軽鎖遺伝子のホモ接合が破壊されており、ＰＣＴ公開の国際公開第０１／０９１８７号パンフレットの実施例１に記載のように内因性マウス重鎖遺伝子のホモ接合が破壊されている。これらの各マウス株は、フィッシュワイルド（Ｆｉｓｈｗｉｌｄ）ら（１９９６年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１頁に記載のようにヒトκ軽鎖導入遺伝子ＫＣｏ５を保有する。ＨＣｏ７株は、米国特許第５，５４５，８０６号明細書、米国特許第５，６２５，８２５号明細書、および米国特許第５，５４５，８０７号明細書に記載のようにＨＣｏ７ヒト重鎖導入遺伝子を保有する。ＫＭ株は、ＰＣＴ公開の国際公開第０２／４３４７８号パンフレットに記載のようにＳＣ２０トランスクロモゾームを保有する。
【０２８８】
ＨｕＭａｂおよびＫＭの免疫
ＢＴＬＡに対する完全ヒトモノクローナル抗体を産生するため、ＨｕＭａｂマウスおよびＫＭマウス（商標）に、抗原として精製した組換えＢＴＬＡ融合タンパク質およびＢＴＬＡ形質移入ＣＨＯ細胞を免疫した。ＨｕＭａｂマウスにおける一般の免疫スキームは、ロンバーグ  Ｎ．（Ｌｏｎｂｅｒｇ  Ｎ．）ら（１９９４年）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８（６４７４）：８５６−８５９頁；フィッシュワイルド  Ｄ．（Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  Ｄ．）ら（１９９６年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１頁およびＰＣＴ公開の国際公開第９８／２４８８４号パンフレットに記載されている。ＢＴＬＡ融合タンパク質抗原および５〜１０×１０６個の細胞の精製組換え調製物（５〜５０μｇ）を用い、ＨｕＭａｂマウスおよびＫＭマウス（商標）を腹腔内（Ｉｐ）または皮下（Ｓｃ）に免疫した。
【０２８９】
（表２）ＢＴＬＡ  ＫＭマウス（商標）における免疫スケジュール
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【０２９０】
表２のように、トランスジェニックＫＭマウス（商標）に９０日間にわたりＣＨＯ細胞上に発現されたＢＴＬＡ  Ｉｇ抗原とＢＴＬＡの組み合わせで免疫した。融合前に、ＢＴＬＡ−Ｉｇをリビアジュバント中でＳｃ＋Ｉｐ免疫としてかまたはＰＢＳ中で静脈間注射として投与した。細胞（１×１０７個／マウス）をＰＢＳ中でＩｐ投与した。免疫スケジュールを表２に示す。免疫応答を眼窩後方からの出血により監視した。血漿を（下記のように）ＥＬＩＳＡによりスクリーニングし、十分な力価の抗ＢＴＬＡヒト免疫グロブリンを有するマウスを融合に用いた。殺滅および脾臓の摘出の３日前、マウスに対し抗原を静脈内に追加免疫した。ＨｕＭａｂおよびＫＭ  マウス（商標）の各１０匹を免疫した。
【０２９１】
抗ＢＴＬＡ抗体を産生するＨｕＭａｂまたはＫＭマウス（商標）の選択
ＢＴＬＡに結合する抗体を産生するＨｕＭａｂまたはＫＭマウス（商標）を選択するため、フィッシュワイルド  Ｄ．（Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  Ｄ．）ら（１９９６年）に記載のように免疫マウス由来の血清をＥＬＩＳＡで試験した。つまり、マイクロタイタープレートを、ＰＢＳ中、１μｇ／ｍｌの形質移入ＣＨＯ細胞由来の精製組換えＢＴＬＡ融合タンパク質でコーティングし、１００μｌ／ウェルを４℃で一晩インキュベートし、次いでＰＢＳ／トゥイーン（０．０５％）中、２００μｌ／ウェルの１％ＢＳＡでブロッキングした。ＢＴＬＡ免疫マウス由来の血清希釈物を各ウェルに添加し、周囲温度で１〜２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／トゥイーンで洗浄し、次いでアルカリホスファターゼ（ＡＰ）と複合したヤギ−抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体とともに室温で１時間インキュベートした。洗浄後、プレートをｐＮＰＰ基質（シグマ（Ｓｉｇｍａ）Ｎ２７７０）で発色させ、ＯＤ４０５での分光光度計で分析した。最高の力価の抗ＢＴＬＡ抗体を生じたマウスを融合に用いた。下記のように融合を行い、ハイブリドーマ上清における抗ＢＴＬＡ活性をＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳで試験した。
【０２９２】
ＢＴＬＡに対するヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの生成
ＫＭマウス（商標）から単離したマウス脾細胞を、標準プロトコルに基づいてＰＥＧを用いてマウス骨髄腫細胞系に融合した。次いで、得られたハイブリドーマにおける抗原特異的な抗体の産生についてスクリーニングした。免疫マウス由来の脾細胞の単一の細胞懸濁液を、５０％ＰＥＧ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を用いるかまたは電気融合（イー・フュージョン（Ｅ−ｆｕｓｉｏｎ）、サイトパルス（Ｃｙｔｏ  Ｐｕｌｓｅ）（商標）技術）により、同数のＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３非分泌マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ１５８０）に融合した。細胞を平底マイクロタイタープレート内に約２×１０５でプレーティングした後、１０％ＦＢＳ、３〜５％オリゲン（Ｏｒｉｇｅｎ）（ＩＧＥＮ）、ＯＰＩサプリメント（シグマ（Ｓｉｇｍａ）Ｏ  ５００３：１．１×１０−３Ｍオキサロ酢酸、４．５×１０−４Ｍピルビン酸ナトリウム、および２４国際単位／Ｌのウシインスリン）、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．０５５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、５０単位／ｍｌのペニシリン、５０ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、および１×ＨＡＴを含有する選択培地内で２週間インキュベートした。約２週間後、細胞をＨＡＴがＨＴと交換された培地内で培養してもよい。次いで、各ウェルにおけるヒト抗ＢＴＬＡモノクローナルＩｇＧ抗体について、（上記のように）ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳによりスクリーニングした。抗体を分泌するハイブリドーマを再プレーティングし、再スクリーニングし、ヒトＩｇＧに対して依然として陽性である場合、抗ＢＴＬＡモノクローナル抗体を限界希釈により少なくとも２回サブクローン化した。次いでさらなる特徴づけのため、安定なサブクローンをインビトロで培養し、組織培地内で少量の抗体を産生した。
【０２９３】
さらなる分析のため、ハイブリドーマクローン１Ｂ４、Ｅ４Ｈ９、３Ｃ２、６Ａ５、１１Ｅ２、Ｅ８Ｄ９、１０Ｈ６および４Ｃ９を選択した。
【０２９４】
実施例２：ヒトモノクローナル抗体１Ｂ４、Ｅ４Ｈ９、３Ｃ２、３Ｃ２ａ、６Ａ５、１１Ｅ２、Ｅ８Ｄ９、１０Ｈ６および４Ｃ９の構造的特徴づけ
標準のＰＣＲ技術を用いて１Ｂ４、Ｅ４Ｈ９、３Ｃ２、３Ｃ２ａ、６Ａ５、１１Ｅ２、Ｅ８Ｄ９、１０Ｈ６および４Ｃ９モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡ配列をそれぞれ１Ｂ４、Ｅ４Ｈ９、３Ｃ２、３Ｃ２ａ、６Ａ５、１１Ｅ２、Ｅ８Ｄ９、１０Ｈ６および４Ｃ９ハイブリドーマから得て、標準のＤＮＡ配列決定技術を用いて配列決定した。
【０２９５】
１Ｂ４の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ図１Ａと配列番号：５３および１に示す。
【０２９６】
１Ｂ４の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ図１Ｂと配列番号：５９および７に示す。
【０２９７】
１Ｂ４重鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン重鎖配列との比較によると、１Ｂ４重鎖ではヒト生殖細胞系ＶＨ２−０５由来のＶＨセグメント、ヒト生殖細胞系３−１０由来のＤセグメント、およびヒト生殖細胞系ＪＨ６ｂ由来のＪＨセグメントが用いられることが示された。生殖細胞系ＶＨ２−０５配列に対する１Ｂ４ＶＨ配列のアラインメントを図７に示す。ＣＤＲ領域決定のカバトシステムを用いる１Ｂ４ＶＨ配列のさらなる分析により、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３領域がそれぞれ図１Ａおよび７と配列番号：１４、２０および２６に図示された。
【０２９８】
１Ｂ４軽鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン軽鎖配列との比較によると、１Ｂ４軽鎖ではヒト生殖細胞系ＶＫＡ２７由来のＶＬセグメントおよびヒト生殖細胞系ＪＫ５由来のＪＫセグメントが用いられることが示された。生殖細胞系ＶＫＡ２７配列に対する１Ｂ４ＶＬ配列のアラインメントを図８に示す。ＣＤＲ領域決定のカバトシステムを用いる１Ｂ４ＶＬ配列のさらなる分析により、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３領域がそれぞれ図１Ｂおよび８と配列番号：３２、３９および４６に図示された。
【０２９９】
Ｅ４Ｈ９の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ図２Ａと配列番号：５４および２に示す。
【０３００】
Ｅ４Ｈ９の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ図２Ｂと配列番号：６０および８に示す。
【０３０１】
Ｅ４Ｈ９重鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン重鎖配列との比較によると、Ｅ４Ｈ９重鎖ではヒト生殖細胞系ＶＨ２−７０由来のＶＨセグメント、ヒト生殖細胞系３−１０由来のＤセグメント、およびヒト生殖細胞系ＪＨ６ｂ由来のＪＨセグメントが用いられることが示された。生殖細胞系ＶＨ２−７０配列に対するＥ４Ｈ９ＶＨ配列のアラインメントを図９に示す。ＣＤＲ領域決定のカバトシステムを用いるＥ４Ｈ９ＶＨ配列のさらなる分析により、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３領域がそれぞれ図２Ａおよび９と配列番号：１５、２１および２７に図示された。
【０３０２】
Ｅ４Ｈ９軽鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン軽鎖配列との比較によると、Ｅ４Ｈ９軽鎖ではヒト生殖細胞系ＶＫＡ２７由来のＶＬセグメントおよびヒト生殖細胞系ＪＫ３由来のＪＫセグメントが用いられることが示された。生殖細胞系ＶＫＡ２７配列に対するＥ４Ｈ９ＶＬ配列のアラインメントを図１０に示す。ＣＤＲ領域決定のカバトシステムを用いるＥ４Ｈ９ＶＬ配列のさらなる分析により、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３領域がそれぞれ図２Ｂおよび３３と配列番号：４０および４７に図示された。
【０３０３】
３Ｃ２の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ図３Ａと配列番号：５５および３に示す。
【０３０４】
３Ｃ２の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ図３Ｂと配列番号：６１および９に示す。
【０３０５】
３Ｃ２重鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン重鎖配列との比較によると、３Ｃ２重鎖ではヒト生殖細胞系ＶＨ４−５９由来のＶＨセグメント、ヒト生殖細胞系６−１９由来のＤセグメント、およびヒト生殖細胞系ＪＨ４ｂ由来のＪＨセグメントが用いられることが示された。生殖細胞系ＶＨ４−５９配列に対する３Ｃ２ＶＨ配列のアラインメントを図１１に示す。ＣＤＲ領域決定のカバトシステムを用いる３Ｃ２ＶＨ配列のさらなる分析により、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３領域がそれぞれ図３Ａおよび１１と配列番号：１６、２２および２８に図示された。
【０３０６】
３Ｃ２軽鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン軽鎖配列との比較によると、３Ｃ２軽鎖ではヒト生殖細胞系ＶＫＬ１８由来のＶＬセグメントおよびヒト生殖細胞系ＪＫ４由来のＪＫセグメントが用いられることが示された。生殖細胞系ＶＫＬ１８配列に対する３Ｃ２ＶＬ配列のアラインメントを図１２に示す。ＣＤＲ領域決定のカバトシステムを用いる３Ｃ２ＶＬ配列のさらなる分析により、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３領域がそれぞれ図３Ｂおよび１１と配列番号：３４、４１および４８に図示された。
【０３０７】
３Ｃ２ａの軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ図３Ｃと配列番号：６２および１０に示す。
【０３０８】
３Ｃ２ａ軽鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン軽鎖配列との比較によると、３Ｃ２ａ軽鎖ではヒト生殖細胞系ＶＫＡ２７由来のＶＬセグメントおよびヒト生殖細胞系ＪＫ２由来のＪＫセグメントが用いられることが示された。生殖細胞系ＶＫＡ２７配列に対する３Ｃ２ａＶＬ配列のアラインメントを図１３に示す。ＣＤＲ領域決定のカバトシステムを用いる３Ｃ２ａＶＬ配列のさらなる分析により、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３領域がそれぞれ図３Ｃおよび１２と配列番号：３５、４２および４９に図示された。
【０３０９】
６Ａ５の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ図４Ａと配列番号：５６および４に示す。
【０３１０】
６Ａ５の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ図４Ｂと配列番号：６３および１１に示す。
【０３１１】
６Ａ５重鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン重鎖配列との比較によると、６Ａ５重鎖ではヒト生殖細胞系ＶＨ２−０５由来のＶＨセグメント、ヒト生殖細胞系３−１０由来のＤセグメント、およびヒト生殖細胞系ＪＨ６ｂ由来のＪＨセグメントが用いられることが示された。生殖細胞系ＶＨ２−０５配列に対する６Ａ５ＶＨ配列のアラインメントを図１４に示す。ＣＤＲ領域決定のカバトシステムを用いる６Ａ５ＶＨ配列のさらなる分析により、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３領域がそれぞれ図４Ａおよび１４と配列番号：１７、２３および２９に図示された。
【０３１２】
６Ａ５軽鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン軽鎖配列との比較によると、６Ａ５軽鎖ではヒト生殖細胞系ＶＫＡ２７由来のＶＬセグメントおよびヒト生殖細胞系ＪＫ５由来のＪＫセグメントが用いられることが示された。生殖細胞系ＶＫＡ２７配列に対する６Ａ５ＶＬ配列のアラインメントを図１５に示す。ＣＤＲ領域決定のカバトシステムを用いる６Ａ５ＶＬ配列のさらなる分析により、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３領域がそれぞれ図４Ｂおよび３６と配列番号：４３および５０に図示された。
【０３１３】
１１Ｅ２の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ図５Ａと配列番号：５７および５に示す。
【０３１４】
１１Ｅ２の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ図５Ｂと配列番号：６４および１２に示す。
【０３１５】
１１Ｅ２重鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン重鎖配列との比較によると、１１Ｅ２重鎖ではヒト生殖細胞系ＶＨ３−２０由来のＶＨセグメント、ヒト生殖細胞系３−１０由来のＤセグメント、およびヒト生殖細胞系ＪＨ６ｂ由来のＪＨセグメントが用いられることが示された。生殖細胞系ＶＨ３−２０配列に対する１１Ｅ２ＶＨ配列のアラインメントを図１６に示す。ＣＤＲ領域決定のカバトシステムを用いる１１Ｅ２ＶＨ配列のさらなる分析により、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３領域がそれぞれ図５Ａおよび１６と配列番号：１８、２４および３０に図示された。
【０３１６】
１１Ｅ２軽鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン軽鎖配列との比較によると、１１Ｅ２軽鎖ではヒト生殖細胞系ＶＫＬ１５由来のＶＬセグメントおよびヒト生殖細胞系ＪＫ１由来のＪＫセグメントが用いられることが示された。生殖細胞系ＶＫＬ１５配列に対する１１Ｅ２ＶＬ配列のアラインメントを図１７に示す。ＣＤＲ領域決定のカバトシステムを用いる１１Ｅ２ＶＬ配列のさらなる分析により、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３領域がそれぞれ図５Ｂおよび１７と配列番号：３７、４４および５１に図示された。
【０３１７】
Ｅ８Ｄ９の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ図６Ａと配列番号：５７および５に示す。
【０３１８】
Ｅ８Ｄ９の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ図６Ｂと配列番号：６５および１３に示す。
【０３１９】
Ｅ８Ｄ９重鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン重鎖配列との比較によると、Ｅ８Ｄ９重鎖ではヒト生殖細胞系ＶＨ２−０５由来のＶＨセグメント、ヒト生殖細胞系３−１０由来のＤセグメント、およびヒト生殖細胞系ＪＨ６ｂ由来のＪＨセグメントが用いられることが示された。生殖細胞系ＶＨ２−０５配列に対するＥ８Ｄ９ＶＨ配列のアラインメントを図１８に示す。ＣＤＲ領域決定のカバトシステムを用いるＥ８Ｄ９ＶＨ配列のさらなる分析により、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３領域がそれぞれ図６Ａおよび１８と配列番号：１９、２５および３１に図示された。
【０３２０】
Ｅ８Ｄ９軽鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン軽鎖配列との比較によると、Ｅ８Ｄ９軽鎖ではヒト生殖細胞系ＶＫＡ２７由来のＶＬセグメントおよびヒト生殖細胞系ＪＫ４由来のＪＫセグメントが用いられることが示された。生殖細胞系ＶＫＡ２７配列に対するＥ８Ｄ９ＶＬ配列のアラインメントを図１９に示す。ＣＤＲ領域決定のカバトシステムを用いるＥ８Ｄ９ＶＬ配列のさらなる分析により、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３領域がそれぞれ図６Ｂおよび１９と配列番号：３８、４５および５２に図示された。
【０３２１】
１０Ｈ６の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ図２１Ａと配列番号：８３および７４に示す。
【０３２２】
１０Ｈ６の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ図２１Ｂと配列番号：８４および７５に示す。
【０３２３】
１０Ｈ６重鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン重鎖配列との比較によると、１０Ｈ６重鎖ではヒト生殖細胞系ＶＨ３−３３由来のＶＨセグメント、ヒト生殖細胞系３−１０由来のＤセグメント、およびヒト生殖細胞系ＪＨ６ｂ由来のＪＨセグメントが用いられることが示された。生殖細胞系ＶＨ４−５９配列に対する１０Ｈ６ＶＨ配列のアラインメントを図２２に示す。ＣＤＲ領域決定のカバトシステムを用いる１０Ｈ６ＶＨ配列のさらなる分析により、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３領域がそれぞれ図２１Ａおよび２２と配列番号：７７、７８および７９に図示された。
【０３２４】
１０Ｈ６軽鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン軽鎖配列との比較によると、１０Ｈ６軽鎖では偽遺伝子として分類されるヒト生殖細胞系ＶＫ０４由来のＶＬセグメントが用いられることが示された。しかし、この状況ではそれは実際に発現されている。１０Ｈ６軽鎖ではヒト生殖細胞系ＪＫ２由来のＪＫセグメントも用いられる。生殖細胞系ＶＫ０４配列に対する１０Ｈ６ＶＬ配列のアラインメントを図２３に示す。ＣＤＲ領域決定のカバトシステムを用いる１０Ｈ６ＶＬ配列のさらなる分析により、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３領域がそれぞれ図２１Ｂおよび２３と配列番号：８０、８１および８２に図示された。
【０３２５】
１０Ｈ６ａの軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ図２１Ｃと配列番号：９８および７６に示す。
【０３２６】
１０Ｈ６ａ軽鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン軽鎖配列との比較によると、１０Ｈ６ａ軽鎖ではヒト生殖細胞系ＶＫＡ２７由来のＶＬセグメントおよびヒト生殖細胞系ＪＫ５由来のＪＫセグメントが用いられることが示された。生殖細胞系ＶＫＡ２７配列に対する１０Ｈ６ａＶＬ配列のアラインメントを図２４に示す。ＣＤＲ領域決定のカバトシステムを用いる１０Ｈ６ａＶＬ配列のさらなる分析により、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３領域がそれぞれ図２１Ｃおよび２４と配列番号：９５、９６および９７に図示された。
【０３２７】
４Ｃ９の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ図２５Ａと配列番号：９３および８５に示す。
【０３２８】
４Ｃ９の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ図２５Ｂと配列番号：９４および８６に示す。
【０３２９】
４Ｃ９重鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン重鎖配列との比較によると、４Ｃ９重鎖ではヒト生殖細胞系ＶＨ２−０５由来のＶＨセグメント、ヒト生殖細胞系３−１０由来のＤセグメント、およびヒト生殖細胞系ＪＨ６ｂ由来のＪＨセグメントが用いられることが示された。生殖細胞系ＶＨ２−０５配列に対する４Ｃ９ＶＨ配列のアラインメントを図２６に示す。ＣＤＲ領域決定のカバトシステムを用いる４Ｃ９ＶＨ配列のさらなる分析により、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３領域がそれぞれ図２５Ａおよび２６と配列番号：８７、８８、および８９に図示された。
【０３３０】
４Ｃ９軽鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン軽鎖配列との比較によると、４Ｃ９軽鎖ではヒト生殖細胞系ＶＫＡ２７由来のＶＬセグメントおよびヒト生殖細胞系ＪＫ１由来のＪＫセグメントが用いられることが示された。生殖細胞系ＶＫＡ２７配列に対する４Ｃ９ＶＬ配列のアラインメントを図２７に示す。ＣＤＲ領域決定のカバトシステムを用いる４Ｃ９ＶＬ配列のさらなる分析により、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３領域がそれぞれ図２５Ｂおよび２７と配列番号：９０、９１、および９２に図示された。
【０３３１】
実施例３：抗ＢＴＬＡヒトモノクローナル抗体の結合の特徴づけ
この実施例では、抗ＢＴＬＡ抗体の結合親和性および結合動態をビアコア分析で試験した。結合動態および阻害をフローサイトメトリーで試験した。
【０３３２】
結合親和性および動態
抗ＢＴＬＡ抗体の親和性および結合動態をビアコア分析（スウェーデン、ウップサラ（Ｕｐｐｓａｌａ）のビアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ  ＡＢ））により特徴づけた。標準のアミン共役化学反応およびビアコアにより提供されるキットを用い、精製組換えヒトＢＴＬＡ融合タンパク質を、一級アミンを介してＣＭ５チップ（カルボキシメチルデキストランでコーティングされたチップ）に共有結合させた。結合を、（ビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ）により提供される）ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中に抗体を２６７の濃度、５０μｌ／分の流速で流すことにより測定した。抗原−抗体結合動態を３分間追跡し、解離動態を７分間追跡した。ビアエバリュエーション（ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ）ソフトウェア（ビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ））を用い、結合および解離曲線を１：１ラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）結合モデルに適合させた。結合定数の評価において結合活性の効果を最小にするため、結合相および解離相に対応するデータの初期セグメントのみを適合に用いた。決定されたＫＤ値を表３に示す。
【０３３３】
（表３）ＫＤ、ＨおよびＬ鎖の質量
2010509920.tif 000004
【０３３４】
フローサイトメトリーによる結合特異性
細胞表面で組換えヒトＢＴＬＡを発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系を開発し、それを用いてＢＴＬＡヒトモノクローナル抗体の特異性をフローサイトメトリーにより測定した。ＣＨＯ細胞に、膜貫通型ＢＴＬＡをコードする完全長ｃＤＮＡを有する発現プラスミドを形質移入した。抗ＢＴＬＡヒトモノクローナル抗体の結合を、形質移入細胞を０．０１ｎＭ〜６６ｎＭの濃度での抗ＢＴＬＡヒトモノクローナル抗体とともにインキュベートすることにより評価した。抗体を、ＰＢＳ−１％ＢＳＡ中の１０５個のＢＴＬＡ  ＣＨＯ細胞とともに４℃で６０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳ−１％ＢＳＡで２回洗浄し、ＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ（ジャクソン・イムノリサーチ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｎｍｍｕｏＲｅｓｅａｒｃｈ）１０９−１１５−０９８）で染色した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）対抗体濃度の対数をプリズム（Ｐｒｉｓｍ）グラフソフトウェア（グラフパッド（ＧｒａｐｈＰａｄ）ソフトウェア）を用いてプロットすることにより、ＥＣ５０を図式的に判定した。フローサイトメトリー分析をファクスアレイ（ＦＡＣＳＡｒｒａｙ）フローサイトメトリー（カリフォルニア州サンホセ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ）のベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）））を用いて行った。結果を図２８Ａに図示する。
【０３３５】
実施例４：抗ＢＴＬＡ抗体はＨＶＥＭリガンドのＢＴＬＡを発現する細胞への結合を阻害する
ＢＴＬＡ  ＭａｂにおけるＢＴＬＡのＨＶＥＭへの結合に対する遮断能もＦＡＣＳにより測定したが、それは抗ＢＴＬＡ  ＩｇＧがＨＶＥＭ  Ｉｇの１０５個のＢＴＬＡ  ＣＨＯ細胞への最大結合の半分を遮断する濃度（ＩＣ５０）として表される。様々な濃度でのＢＴＬＡ  ＣＨＯ細胞および抗体を４℃で３０分間予備インキュベートし、次いで０．５ｕｇ／ｍｌのビオチンで標識されたＨＶＥＭ  Ｉｇ（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）ＢＡＦ３５６）をＢＴＬＡ  ＣＨＯ−ＩｇＧミックスに添加し、さらに３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳ−１％ＢＳＡで２回洗浄し、細胞をストレプトアビジン−ＰＥ（ＢＤファーミンゲン（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）３５５４０６１）で染色してからビオチンＨＶＥＭ  Ｉｇの結合をＦＡＣＳにより検出した。プリズム（Ｐｒｉｓｍ）ソフトウェア（グラフパッド（ＧｒａｐｈＰａｄ）ソフトウェア）を用い、ＩＣ５０値を図式的に判定した。結果を図２８Ｂおよび図２８Ｃに図示する。
【０３３６】
実施例５：抗ＢＴＬＡ抗体特異性の測定
１群の抗ＢＴＬＡ抗体のＢＴＬＡ受容体に対する特異性を検証しかつ受容体のＣＤ２８ファミリーの他のメンバーとの交差反応が全く実質的なものでないことを示すため、ＥＬＩＳＡアッセイを開発した。
【０３３７】
ＥＬＩＳＡプレートを、ヒトＩｇＧのＦｃ部分に融合された１群のＣＤ２８受容体ファミリー分子の細胞外ドメインからなる融合タンパク質で一晩コーティングした（表４）。プレートを洗浄し、ブロッキングして、非特異的結合を最小化した。１群の抗ＢＴＬＡ抗体およびアイソタイプ対照抗体（表５）および陽性対照の検出抗体（表３）を全て１ｕｇ／ｍＬに希釈し、アッセイプレートに二つ組で添加し１時間置いた。徹底洗浄後、適切なＨＲＰ複合検出抗体をプレートに添加し１時間置いた後、洗浄および基質として３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を用いる発色を行った。６５０ｎｍでの光学密度測定値を記録した。
表４：
表５：
【０３３８】
観察されたＢＴＬＡに特異的な反応性と比較し（図２９Ａおよび２９Ｂ）、試験対象の他のＣＤ２８ファミリーメンバー受容体のいずれかとの交差反応は全く実質的なものでなかった。これらの結果は、ここで試験される抗ＢＴＬＡ抗体群がヒトＢＴＬＡに特異的に結合することを示す。
【０３３９】
実施例６：抗ＢＴＬＡ抗体を用いたインビボでの腫瘍モデルの治療
癌性腫瘍を移植したマウスをインビボで抗ＢＴＬＡ抗体で治療し、抗体の腫瘍増殖に対するインビボ効果を試験する。抗ＣＴＬＡ−４抗体がインビボで腫瘍増殖を阻害することが示されていることからそれを陽性対照として用いる。
。
【０３４０】
腫瘍試験においては、６〜８週齢の雌ＡＪマウス（ハーラン・ラボラトリーズ（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））を体重により６群に無作為化する。０日目、２００μｌのＤＭＥＭ培地内に溶解した２×１０６個のＳＡ１／Ｎ線維肉腫細胞をマウスの右側腹の皮下に移植する。マウスをＰＢＳ媒体または１０ｍｇ／ｋｇの抗体で治療する。１、４、８および１１日目、動物に抗体または媒体を含有する約２００μｌのＰＢＳを腹膜内注射により投与する。各群は動物１０匹を有し、群は（ｉ）媒体群、（ｉｉ）対照マウスＩｇＧ、（ｉｉｉ）対照ハムスターＩｇＧ、（ｉｖ）ハムスター抗マウスＢＴＬＡ抗体、および（ｖ）完全ヒト抗ＢＴＬＡからなる。マウスの腫瘍増殖について、約６週間、週に２回監視する。電子キャリパーを用いて腫瘍を三次元（高さ×幅×長さ）測定し、腫瘍体積を計算する。腫瘍が腫瘍エンドポイント（１５００ｍｍ３）に達するかまたは１５％を超える体重減少を示す場合、マウスを安楽死させる。
【０３４１】
実施例７：抗体のさらなる結合の特徴づけ
１Ｂ４、Ｅ４Ｈ９、３Ｃ２、６Ａ５、１１Ｅ２および１０Ｈ６抗体の組換えＢＴＬＡタンパク質への結合を、抗体捕捉法を用いてビアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）（商標）で試験した。６つの抗ＢＴＬＡモノクローナル抗体の各々を、ヒト抗体の重鎖定常領域１に特異的な試薬抗体（ザイメド（Ｚｙｍｅｄ）、クローン（Ｃｌｏｎｅ）ＨＰ６０４５、ストック濃度１．０ｍｇ／ｍＬ）である抗ＣＨ１を用いて捕捉した。抗ＣＨ１をＣＭ５チップ（ＢＲ−１０００−１４、リサーチグレード）上、高密度（６２００−７９６０ＲＵ）でコーティングした。製造業者により推奨された標準の固定化手順に基づいてコーティングを行った。次いで、１〜１０μｇ／ｍＬの範囲の濃度を有する１Ｂ４、Ｅ４Ｈ９、３Ｃ２、６Ａ５、１１Ｅ２および１０Ｈ６精製抗体を、それぞれ抗ＣＨ１でコーティングしたチップ表面上、１０μｌ／分の流速で０．５〜１分間捕捉した。単一濃度の組換えヒトＢＴＬＡ融合タンパク質（２００ｎＭ）を、捕捉抗体上に３０μｌ／分の流速で４分間注入した。抗原を１０分間解離させておいた。各サイクル後にチップ表面を１０μＬの３０ｍＭ  ＮａＯＨで再生した後、３０μｌのＨＢＳ  ＥＰで洗浄した。アイソタイプ対照をそのチップ上で実行し、そのデータを用いて非特異的結合を差し引いた。あらゆる実験を、ビアコア・コントロール（ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）ソフトウェアｖ３．２を用い、ビアコア３０００表面プラスモン共鳴装置上で行った。データ分析を、ビアエバリュエーション（ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎ）ｖ３．２ソフトウェアを用いて行った。結果を下記表６に示す。
【０３４２】
（表６）抗BTLA抗体のヒトBTLAに対する結合親和性および動態
2010509920.tif 000005
【０３４３】
１Ｂ４、Ｅ４Ｈ９、３Ｃ２、６Ａ５、１１Ｅ２および１０Ｈ６に対するビアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）の結果により、抗体が高親和性でヒトＢＴＬＡに対する結合能を有するというフローサイトメトリーおよびそれに先立つビアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）の結果（上記実施例３に記載）が確認される。この実施例に記載の抗体捕捉方法を用いて得られるＫＤ値が、抗原捕捉方法が用いられた実施例３に記載のＫＤ値とやや異なることが注目される。これは、この実施例で用いられる抗体捕捉方法がそれに対する抗体結合活性成分を有しないという事実に起因しうる。さらにまたはその他として、２つの方法間の親和性の違いが、チップの表面上に捕捉された抗原対溶液中の抗原に対するｍＡｂによる分子認識プロセスにおける違いを示しうる。
【図１Ａ】
2010509920.tif 000006
【図１Ｂ】
2010509920.tif 000007
【図２Ａ】
2010509920.tif 000008
【図２Ｂ】
2010509920.tif 000009
【図３Ａ】
2010509920.tif 000010
【図３Ｂ】
2010509920.tif 000011
【図３Ｃ】
2010509920.tif 000012
【図４Ａ】
2010509920.tif 000013
【図４Ｂ】
2010509920.tif 000014
【図５Ａ】
2010509920.tif 000015
【図５Ｂ】
2010509920.tif 000016
【図６Ａ】
2010509920.tif 000017
【図６Ｂ】
2010509920.tif 000018
【図７】
2010509920.tif 000019
【図８】
2010509920.tif 000020
【図９】
2010509920.tif 000021
【図１０】
2010509920.tif 000022
【図１１】
2010509920.tif 000023
【図１２】
2010509920.tif 000024
【図１３】
2010509920.tif 000025
【図１４】
2010509920.tif 000026
【図１５】
2010509920.tif 000027
【図１６】
2010509920.tif 000028
【図１７】
2010509920.tif 000029
【図１８】
2010509920.tif 000030
【図１９】
2010509920.tif 000031
【図２０】
2010509920.tif 000032
【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２８Ｃ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年10月5日(2009.10.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３３７】
ＥＬＩＳＡプレートを、ヒトＩｇＧのＦｃ部分に融合された１群のＣＤ２８受容体ファミリー分子の細胞外ドメインからなる融合タンパク質で一晩コーティングした。プレートを洗浄し、ブロッキングして、非特異的結合を最小化した。１群の抗ＢＴＬＡ抗体およびアイソタイプ対照抗体および陽性対照の検出抗体（表３）を全て１ｕｇ／ｍＬに希釈し、アッセイプレートに二つ組で添加し１時間置いた。徹底洗浄後、適切なＨＲＰ複合検出抗体をプレートに添加し１時間置いた後、洗浄および基質として３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を用いる発色を行った。６５０ｎｍでの光学密度測定値を記録した。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３４１】
実施例７：抗体のさらなる結合の特徴づけ
１Ｂ４、Ｅ４Ｈ９、３Ｃ２、６Ａ５、１１Ｅ２および１０Ｈ６抗体の組換えＢＴＬＡタンパク質への結合を、抗体捕捉法を用いてビアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）（商標）で試験した。６つの抗ＢＴＬＡモノクローナル抗体の各々を、ヒト抗体の重鎖定常領域１に特異的な試薬抗体（ザイメド（Ｚｙｍｅｄ）、クローン（Ｃｌｏｎｅ）ＨＰ６０４５、ストック濃度１．０ｍｇ／ｍＬ）である抗ＣＨ１を用いて捕捉した。抗ＣＨ１をＣＭ５チップ（ＢＲ−１０００−１４、リサーチグレード）上、高密度（６２００−７９６０ＲＵ）でコーティングした。製造業者により推奨された標準の固定化手順に基づいてコーティングを行った。次いで、１〜１０μｇ／ｍＬの範囲の濃度を有する１Ｂ４、Ｅ４Ｈ９、３Ｃ２、６Ａ５、１１Ｅ２および１０Ｈ６精製抗体を、それぞれ抗ＣＨ１でコーティングしたチップ表面上、１０μｌ／分の流速で０．５〜１分間捕捉した。単一濃度の組換えヒトＢＴＬＡ融合タンパク質（２００ｎＭ）を、捕捉抗体上に３０μｌ／分の流速で４分間注入した。抗原を１０分間解離させておいた。各サイクル後にチップ表面を１０μＬの３０ｍＭ  ＮａＯＨで再生した後、３０μｌのＨＢＳ  ＥＰで洗浄した。アイソタイプ対照をそのチップ上で実行し、そのデータを用いて非特異的結合を差し引いた。あらゆる実験を、ビアコア・コントロール（ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）ソフトウェアｖ３．２を用い、ビアコア３０００表面プラスモン共鳴装置上で行った。データ分析を、ビアエバリュエーション（ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎ）ｖ３．２ソフトウェアを用いて行った。結果を下記表４に示す。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３４２】
（表４）抗BTLA抗体のヒトBTLAに対する結合親和性および動態
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【国際調査報告】
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