(57)【要約】  本発明は、プロテアーゼによる分解に対して耐性である抗TNFR1ポリペプチドおよび抗体単一可変ドメイン(dAb)、ならびにこれらを含むアンタゴニストに関する。該ポリペプチド、dAb、およびアンタゴニストは、例えば、肺内投与、経口投与、患者の肺への送達、および患者の消化管への送達のため、ならびに関節炎またはCOPDなど炎症性疾患を治療するために患者に投与される場合に、プロテアーゼと遭遇する可能性の高い治療法および/または予防法に有用である。【選択図】図２
2010528646.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
DOM1h-131-511のアミノ酸配列(図3に示す)と少なくとも95％同一なアミノ酸配列を含む抗TNFα受容体1型(TNFR1;p55)免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項２】
位置53においてアスパラギン酸を含む(番号付けは、Kabatによる)、請求項１に記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項３】
位置91においてヒスチジンを含む(番号付けは、Kabatによる)、請求項１または２に記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項４】
DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、およびDOM1h-131-205からなる群から選択されるアミノ酸配列(図3に示す)と同一なアミノ酸配列を含む抗TNFα受容体1型(TNFR1;p55)免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項５】
DOM1h-131-511のヌクレオチド配列(図19に示す)と少なくとも80％同一なヌクレオチド配列によりコードされる抗TNFα受容体1型(TNFR1;p55)免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項６】
DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、またはDOM1h-131-205のヌクレオチド配列(図3に示す)と同一な配列によりコードされる抗TNFα受容体1型(TNFR1;p55)免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗TNFα受容体1型(TNFR1;p55)免疫グロブリン単一可変ドメインを含むTNFR1アンタゴニスト。
【請求項８】
第1および第2の免疫グロブリン単一可変ドメインを含み、各可変ドメインが請求項１〜６のいずれか１項に記載されたものである、請求項７に記載のアンタゴニスト。
【請求項９】
前記単一可変ドメインの単量体または前記単一可変ドメインのホモ二量体を含む、請求項７または８に記載のアンタゴニスト。
【請求項１０】
前記または各単一可変ドメインのアミノ酸配列が、アミノ酸配列DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、またはDOM1h-131-205(図3に示す)と同一である、請求項７、８、または９に記載のアンタゴニスト。
【請求項１１】
DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、およびDOM1h-131-205から選択されるアミノ酸配列(図3に示す)と同一であるか、または前記選択された配列と25ヵ所以下のアミノ酸位置で異なり、前記選択された配列のCDR1配列と少なくとも50％同一なCDR1配列を有するアミノ酸配列を含む抗TNFα受容体1型(TNFR1;p55)免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項１２】
DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、およびDOM1h-131-205から選択されるアミノ酸配列(図3に示す)と同一であるか、または前記選択されたアミノ酸配列と25ヵ所以下のアミノ酸位置で異なり、前記選択された配列のCDR2配列と少なくとも50％同一なCDR2配列を有するアミノ酸配列を含む抗TNFα受容体1型(TNFR1;p55)免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項１３】
DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、およびDOM1h-131-205から選択されるアミノ酸配列(図3に示す)と同一であるか、または前記選択されたアミノ酸配列と25ヵ所以下のアミノ酸位置で異なり、前記選択された配列のCDR3配列と少なくとも50％同一なCDR3配列を有するアミノ酸配列を含む抗TNFα受容体1型(TNFR1;p55)免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項１４】
DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、およびDOM1h-131-205から選択されるアミノ酸配列(図3に示す)と同一であるか、または前記選択されたアミノ酸配列と25ヵ所以下のアミノ酸位置で異なり、前記選択された配列のCDR1配列と少なくとも50％同一なCDR1配列を有し、前記選択された配列のCDR2配列と少なくとも50％同一なCDR2配列を有するアミノ酸配列を含む抗TNFα受容体1型(TNFR1;p55)免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項１５】
DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、およびDOM1h-131-205から選択されるアミノ酸配列(図3に示す)と同一であるか、または前記選択されたアミノ酸配列と25ヵ所以下のアミノ酸位置で異なり、前記選択された配列のCDR1配列と少なくとも50％同一なCDR1配列を有し、前記選択された配列のCDR3配列と少なくとも50％同一なCDR3配列を有するアミノ酸配列を含む抗TNFα受容体1型(TNFR1;p55)免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項１６】
DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、およびDOM1h-131-205から選択されるアミノ酸配列(図3に示す)と同一であるか、または前記選択されたアミノ酸配列と25ヵ所以下のアミノ酸位置で異なり、前記選択された配列のCDR2配列と少なくとも50％同一なCDR2配列を有し、前記選択された配列のCDR3配列と少なくとも50％同一なCDR3配列を有するアミノ酸配列を含む抗TNFα受容体1型(TNFR1;p55)免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項１７】
DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、およびDOM1h-131-205から選択されるアミノ酸配列(図3に示す)と同一であるか、または前記選択されたアミノ酸配列と25ヵ所以下のアミノ酸位置で異なり、前記選択された配列のCDR1配列と少なくとも50％同一なCDR1配列を有し、前記選択された配列のCDR2配列と少なくとも50％同一なCDR2配列を有し、前記選択された配列のCDR3配列と少なくとも50％同一なCDR3配列を有するアミノ酸配列を含む抗TNFα受容体1型(TNFR1;p55)免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項１８】
DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、およびDOM1h-131-205から選択されるアミノ酸配列(図3に示す)のCDR1配列と少なくとも50％同一なCDR1配列を有するTNFα受容体1型(TNFR1;p55)アンタゴニスト。
【請求項１９】
DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、およびDOM1h-131-205から選択されるアミノ酸配列(図3に示す)のCDR1配列と少なくとも50％同一なCDR2配列を有するTNFα受容体1型(TNFR1;p55)アンタゴニスト。
【請求項２０】
DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、およびDOM1h-131-205から選択されるアミノ酸配列(図3に示す)のCDR3配列と少なくとも50％同一なCDR3配列を有するTNFα受容体1型(TNFR1;p55)アンタゴニスト。
【請求項２１】
DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、およびDOM1h-131-205から選択されるアミノ酸配列(図3に示す)のCDR1配列と少なくとも50％同一なCDR1配列、ならびに前記選択された配列のCDR2配列と少なくとも50％同一なCDR2配列を有するTNFα受容体1型(TNFR1;p55)アンタゴニスト。
【請求項２２】
DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、およびDOM1h-131-205から選択されるアミノ酸配列(図3に示す)のCDR1配列と少なくとも50％同一なCDR1配列、ならびに前記選択された配列のCDR3配列と少なくとも50％同一なCDR3配列を有するTNFα受容体1型(TNFR1;p55)アンタゴニスト。
【請求項２３】
DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、およびDOM1h-131-205から選択されるアミノ酸配列(図3に示す)のCDR2配列と少なくとも50％同一なCDR2配列、ならびに前記選択された配列のCDR3配列と少なくとも50％同一なCDR3配列を有するTNFα受容体1型(TNFR1;p55)アンタゴニスト。
【請求項２４】
DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、およびDOM1h-131-205から選択されるアミノ酸配列(図3に示す)のCDR1配列と少なくとも50％同一なCDR1配列、前記選択された配列のCDR2配列と少なくとも50％同一なCDR2配列、ならびに前記選択された配列のCDR3配列と少なくとも50％同一なCDR3配列を有するTNFα受容体1型(TNFR1;p55)アンタゴニスト。
【請求項２５】
DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、およびDOM1h-131-205から選択されるアミノ酸配列(図3に示す)のCDR1配列、CDR2配列、および/またはCDR3配列を含む免疫グロブリン単一可変ドメインを含むTNFα受容体1型(TNFR1;p55)アンタゴニスト。
【請求項２６】
TNFR1に対する結合について、DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、またはDOM1h-131-205から選択されるアミノ酸配列と競合するTNFα受容体1型(TNFR1;p55)アンタゴニスト。
【請求項２７】
TNFα受容体1型(TNFR1;p55)結合部位を含む免疫グロブリン単一可変ドメインであって、
(i)37℃で少なくとも1時間の時間(t)にわたり、少なくとも10マイクログラム/mlの濃度(c)のプロテアーゼ;または
(ii)30℃で少なくとも1時間の時間(t)にわたり、少なくとも40マイクログラム/mlの濃度(c')のプロテアーゼ
とインキュベートした場合に、プロテアーゼに対して耐性であり、
DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、およびDOM1h-131-205のアミノ酸配列と少なくとも90％同一なアミノ酸配列を含む、上記免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項２８】
濃度(cまたはc')が、少なくとも100または1000マイクログラム/mlのプロテアーゼである、請求項２７に記載の可変ドメイン。
【請求項２９】
時間(t)が、1、3、もしくは24時間、または一晩である、請求項２７または２８に記載の可変ドメイン。
【請求項３０】
可変ドメインが条件(i)の下で耐性であり、濃度(c)が10または100マイクログラム/mlのプロテアーゼであり、時間(t)が1時間である、請求項２７に記載の可変ドメイン。
【請求項３１】
可変ドメインが条件(ii)の下で耐性であり、濃度(c')が40マイクログラム/mlのプロテアーゼであり、時間(t)が3時間である、請求項２７に記載の可変ドメイン。
【請求項３２】
プロテアーゼが、トリプシン、エラスターゼ、ロイコザイム、およびパンクレアチンから選択される、請求項２７〜３１のいずれか１項に記載の可変ドメイン。
【請求項３３】
プロテアーゼがトリプシンである、請求項２７〜３２のいずれか１項に記載の可変ドメイン。
【請求項３４】
トリプシンと、エラスターゼ、ロイコザイム、およびパンクレアチンから選択される少なくとも1種の他のプロテアーゼとに対して耐性である、請求項２７〜３３のいずれか１項に記載の可変ドメイン。
【請求項３５】
条件(i)または(ii)の下におけるインキュベーション後、TNFR1に特異的に結合する、請求項２７〜３４のいずれか１項に記載の可変ドメイン。
【請求項３６】
条件(i)または(ii)の下におけるインキュベーション後のELISAにおいて、少なくとも0.404のOD450結果を有する、請求項３５に記載の可変ドメイン。
【請求項３７】
条件(i)または(ii)の下におけるインキュベーション後において、プロテインAまたはプロテインLに特異的に結合する、請求項２７〜３６のいずれか１項に記載の可変ドメイン。
【請求項３８】
条件(i)または(ii)の下におけるインキュベーション後のゲル電気泳動法において実質的に単一バンドを示す、請求項２７〜３７のいずれか１項に記載の可変ドメイン。
【請求項３９】
請求項２７〜３８のいずれか１項に記載の可変ドメインを含む、TNFα受容体1型(TNFR1;p55)アンタゴニスト。
【請求項４０】
経口送達のための、請求項３９に記載のTNFR1アンタゴニスト。
【請求項４１】
患者の消化管への送達のための、請求項３９または４０に記載のTNFR1アンタゴニスト。
【請求項４２】
経口送達用医薬の製造における、請求項３９に記載のTNFR1アンタゴニストの使用。
【請求項４３】
患者の消化管への送達用医薬の製造における、請求項３９に記載のTNFR1アンタゴニストの使用。
【請求項４４】
可変ドメインが、トリプシン、エラスターゼ、および/またはパンクレアチンに対して耐性である、請求項３９、４０、もしくは４１に記載のアンタゴニスト、または請求項４２もしくは４３に記載の使用。
【請求項４５】
肺内送達のための、請求項３９に記載のTNFR1アンタゴニスト。
【請求項４６】
患者の肺への送達のための、請求項３９または４５に記載のTNFR1アンタゴニスト。
【請求項４７】
肺内送達用医薬の製造における、請求項３９に記載のTNFR1アンタゴニストの使用。
【請求項４８】
患者の肺への送達用医薬の製造における、請求項３９に記載のTNFR1アンタゴニストの使用。
【請求項４９】
可変ドメインがロイコザイムに対して耐性である、請求項４５もしくは４６に記載のアンタゴニスト、または請求項４７もしくは４８に記載の使用。
【請求項５０】
医薬の経口送達または患者の消化管もしくは患者の肺組織への送達の方法であって、請求項３９に記載の薬学的有効量のTNFR1アンタゴニストを患者に投与するステップを含む、上記方法。
【請求項５１】
炎症状態の治療および/または予防のための、請求項３９に記載のTNFR1アンタゴニスト。
【請求項５２】
炎症状態の治療用および/または予防用医薬の製造における、請求項３９に記載のTNFR1アンタゴニストの使用。
【請求項５３】
前記状態が、関節炎、多発性硬化症、炎症性大腸疾患、および慢性閉塞性肺疾患からなる群から選択される、請求項５１に記載のアンタゴニスト、または請求項５２に記載の使用。
【請求項５４】
前記関節炎が、関節リウマチまたは若年性関節リウマチである、請求項５３に記載のアンタゴニストまたは使用。
【請求項５５】
前記炎症性大腸疾患が、クローン病および潰瘍性大腸炎からなる群から選択される、請求項５３に記載のアンタゴニストまたは使用。
【請求項５６】
前記慢性閉塞性肺疾患が、慢性気管支炎、慢性閉塞性気管支炎、および肺気腫からなる群から選択される、請求項５３に記載のアンタゴニストまたは使用。
【請求項５７】
前記肺炎が細菌性肺炎である、請求項５３に記載のアンタゴニストまたは使用。
【請求項５８】
前記細菌性肺炎がブドウ球菌性肺炎である、請求項５７に記載のアンタゴニストまたは使用。
【請求項５９】
呼吸器疾患の治療および/または予防のための、請求項３９に記載のTNFR1アンタゴニスト。
【請求項６０】
呼吸器疾患の治療用および/または予防用医薬の製造における、請求項３９に記載のTNFR1アンタゴニストの使用。
【請求項６１】
前記呼吸器疾患が、肺炎症(lung inflammation)、慢性閉塞性肺疾患、喘息、肺炎、過敏性肺炎、好酸球増加を伴う肺浸潤、環境性肺疾患、肺炎、気管支拡張症、嚢胞性線維症、間質性肺疾患、原発性肺高血圧症、肺血栓塞栓症、胸膜障害、縦隔障害、横隔膜障害、低換気症、過換気症、睡眠時無呼吸症、急性呼吸促迫症候群、中皮腫、肉腫、移植片拒絶、移植片対宿主病、肺癌、アレルギー性鼻炎、アレルギー、アスベスト症、アスベルギルス腫、アスペルギルス症、気管支拡張症、慢性気管支炎、肺気腫、好酸球増加性肺炎、特発性肺線維症、侵襲性肺炎球菌疾患、インフルエンザ、非結核性抗酸菌症、胸膜滲出、塵肺、ニューモシスチス症、肺炎、肺放線菌症、肺胞タンパク質症、肺炭疽症、肺浮腫、肺塞栓症、肺炎症(pulmonary inflammation)、肺ヒスチオサイトーシスX、肺高血圧症、肺ノカルジア症、肺結核、肺静脈閉塞性疾患、リウマチ性肺疾患、サルコイドーシス、およびウェーゲナー肉芽腫症からなる群から選択される、請求項５９に記載のアンタゴニスト、または請求項６０に記載の使用。
【請求項６２】
請求項３９、４５、４６、または４９に記載のTNFR1アンタゴニストを含有する肺内送達デバイス。
【請求項６３】
吸入器または鼻腔内投与デバイスである、請求項６２に記載のデバイス。
【請求項６４】
請求項３９または４０に記載のTNFR1アンタゴニストを含む経口製剤。
【請求項６５】
錠剤、丸薬、カプセル剤、液剤、またはシロップ剤である、請求項６４に記載の製剤。
【請求項６６】
前記アンタゴニストが、請求項１〜６、１１〜１７、および２７〜３８のいずれか１項に記載の可変ドメインを含む、請求項７〜１０および３９〜６５のいずれか１項に記載のアンタゴニスト、使用、方法、デバイス、または製剤。
【請求項６７】
前記アンタゴニストが、少なくとも50℃のTmを有する可変ドメインを含む、請求項７〜１０および３９〜６５のいずれか１項に記載のアンタゴニスト、使用、方法、デバイス、または製剤。
【請求項６８】
少なくとも50℃のTmを有する、請求項１〜６、１１〜１７、および２７〜３８のいずれか１項に記載の可変ドメイン。
【請求項６９】
前記アンタゴニストが、MRC-5細胞アッセイにおいてTNFαにより刺激されたIL-8放出を2nM〜50pMのND50により中和する可変ドメインを含む、請求項７〜１０および３９〜６５のいずれか１項に記載のアンタゴニスト、使用、方法、デバイス、または製剤。
【請求項７０】
MRC-5細胞アッセイにおいてTNFαにより刺激されるIL-8放出を2nM〜50pMのND50により中和する、請求項１〜６、１１〜１７、および２７〜３８のいずれか１項に記載の可変ドメイン。
【請求項７１】
請求項１〜６、１１〜１７、２７〜３８、６８、および７０のいずれか１項に記載の可変ドメインを含む二重特異性リガンド。
【請求項７２】
請求項１〜６、１１〜１７、２７〜３８、６８、および７０のいずれか１項に記載の免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドをコードする単離または組み換え核酸。
【請求項７３】
請求項７２に記載の核酸を含むベクター。
【請求項７４】
請求項７２に記載の核酸または請求項７３に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項７５】
免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドを製造する方法であって、前記核酸またはベクターの発現に好適な条件下で請求項７４に記載の宿主細胞を維持し、それにより、免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドを産生させるステップを含む、上記方法。
【請求項７６】
ポリペプチドを単離するステップと、任意により、単離されたポリペプチドよりも改善された親和性および/またはND50を有する変異体、例えば、突然変異させた変異体を作製するステップとをさらに含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
請求項１〜６、１１〜１７、２７〜３８、６８、および７０のいずれか１項に記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン、または請求項７〜１０、１８〜２６、３９〜４１、４４〜４６、４９、５１、５３〜５９、６１、６６、６７、および６９のいずれか１項に記載のアンタゴニストと、製薬上許容される担体、賦形剤、または希釈剤とを含む医薬組成物。
【請求項７８】
DOM1h-131-511のアミノ酸配列(図3に示す)と少なくとも95％同一な配列を含むポリペプチド。
【請求項７９】
DOM1h-131-511のヌクレオチド配列のヌクレオチド配列(図19に示す)と少なくとも80％同一な配列によりコードされるポリペプチド。
【請求項８０】
請求項７８または７９に記載のポリペプチドを含む融合タンパク質。
【請求項８１】
請求項７８もしくは７９に記載のポリペプチド、または請求項８０に記載の融合タンパク質をコードする単離または組み換え核酸。
【請求項８２】
抗体定常ドメインを含む、請求項１〜６、１１〜１７、２７〜３８、６８、および７０のいずれか１項に記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン、または請求項７〜１０、１８〜２６、３９〜４１、４４〜４６、４９、５１、５３〜５９、６１、６６、６７、および６９のいずれか１項に記載のアンタゴニスト、または請求項７８もしくは７９に記載のポリペプチド。
【請求項８３】
任意により、FcのN末端が可変ドメインのC末端に連結されている(任意により、直接連結されている)抗体Fcを含む、請求項８２に記載の可変ドメイン、アンタゴニスト、またはポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテアーゼ耐性ポリペプチド、免疫グロブリン(抗体)単一可変ドメイン、およびこれらを含む抗腫瘍壊死因子1(TNFR1、p55、CD120a、P60、TNF受容体スーパーファミリーメンバー1A、TNFRSF1A)アンタゴニストに関する。本発明は、このような抗TNFR1リガンドを含む使用、製剤、組成物、およびデバイスにさらに関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリペプチドおよびペプチドは、産業的応用ならびに医学的作用物質、治療的作用物質、および診断的作用物質としての使用を含む、各種の応用においてますます重要な作用物質となっている。しかし、炎症状態(例えば、COPD)および癌など一部の生理的状態では、組織内、臓器内、または動物内に(例えば、肺内に、または腫瘍内もしくは腫瘍近傍に)存在するプロテアーゼ量が増大しうる。このプロテアーゼの増大の結果、内因性タンパク質ならびに疾患を治療するために投与される治療用のペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質の加速度的な分解および不活化がもたらされる。したがって、in vivoでの使用(例えば、疾患の治療、診断、または予防における使用)への可能性を有する一部の作用物質は、プロテアーゼにより急速に分解および不活化されるために、限られた有効性を有するにとどまる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
プロテアーゼ耐性ポリペプチドにより、複数の利点が提供される。例えば、in vivoでプロテアーゼ感受性作用物質よりも長時間にわたり活性を保ち、したがって、生物学的効果をもたらすのに十分な時間にわたり機能性を保つプロテアーゼ耐性ポリペプチド。プロテアーゼによる分解に対して耐性であり、また所望の生物学的活性も有するポリペプチドを選択する改善された方法に対する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
TNFR1
TNFR1は、リガンドに結合する細胞外領域と、内因性のシグナル伝達活性は欠くがシグナル伝達分子と結合しうる細胞内ドメインとを含有する、膜貫通受容体である。結合したTNFを伴うTNFR1複合体は、3本のTNFR1鎖および3本のTNF鎖を含有する(Bannerら、Cell、第73巻、第3号、431〜445頁(1993))。TNFリガンドは、3本のTNFR1鎖により結合される三量体として存在する(同上)。3本のTNFR1鎖は、受容体-リガンド複合体中で緊密一体にクラスター化し、このクラスター化が、TNFR1媒介性シグナル伝達の前提である。実際、抗TNFR1抗体など、TNFR1に結合する多価作用物質は、TNFの不在下においてTNFR1のクラスター化およびシグナル伝達を誘導することがあり、これらは一般に、TNFR1アゴニストとして用いられる(例えば、Belkaら、EMBO、第14巻、第6号、1156〜1165頁(1995);Mandik-Nayakら、J.Immunol、第167巻、1920〜1928頁(2001)を参照されたい)。したがって、TNFR1に結合する多価作用物質は、TNFR1に対するTNFαの結合を遮断する場合であっても、一般に、有効なTNFR1アンタゴニストではない。
【０００５】
TNFR1の細胞外領域は、13アミノ酸のアミノ末端セグメント(配列番号603(ヒト)のアミノ酸1〜13;配列番号604(マウス)のアミノ酸1〜13)、ドメイン1(配列番号603(ヒト)のアミノ酸14〜53;配列番号604(マウス)のアミノ酸14〜53)、ドメイン2(配列番号603(ヒト)のアミノ酸54〜97;配列番号604(マウス)のアミノ酸54〜97)、ドメイン3(配列番号603(ヒト)のアミノ酸98〜138;配列番号604(マウス)のアミノ酸98〜138)、ドメイン4(配列番号603(ヒト)のアミノ酸139〜167;配列番号604(マウス)のアミノ酸139〜167)、これに続く膜近接領域(配列番号603(ヒト)のアミノ酸168〜182;配列番号604(マウス)のアミノ酸168〜183)を含む(Bannerら、Cell、第73巻、第3号、431〜445頁(1993)、およびLoetscherら、Cell、第61巻、第2号、351〜359頁(1990)を参照されたい)。ドメイン2および3は、結合したリガンド(TNFβ、TNFα)と接触する(Bannerら、Cell、第73巻、第3号、431〜445頁(1993))。TNFR1の細胞外領域はまた、プレリガンド結合アセンブリードメインまたはPLADドメイン(配列番号603(ヒト)のアミノ酸1〜53;配列番号604(マウス)のアミノ酸1〜53)と称する領域も含有する(米国連邦政府、国際公開第01/58953号;Dengら、Nature Medicine、doi:10.1038/nm1304(2005))。
【０００６】
in vivoにおいて、TNFR1は、ドメイン4または膜近接領域(配列番号603(ヒト)のアミノ酸168〜182;配列番号604のアミノ酸168〜183)におけるTNFR1のタンパク質分解を含み、TNFR1の可溶性形態を生成する過程を介して、細胞表面から脱落する。可溶性TNFR1は、TNFαに対する結合能を保持し、それにより、TNFα活性の内因性阻害剤として機能する。
【０００７】
一態様において、本発明は、DOM1h-131-511のアミノ酸配列(図3に示す)と少なくとも95％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。一態様において、本発明は、DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、DOM1h-131-205、およびDOM1h-131-206のアミノ酸配列(図3に示す)と少なくとも95％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。一態様において、本発明は、DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、およびDOM1h-131-205のアミノ酸配列と少なくとも95％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。これらの態様の一実施形態において、パーセント同一性は、少なくとも96、97、98、または99％である。一実施形態において、ポリペプチドは、DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、DOM1h-131-205、またはDOM1h-131-206である。本発明は、(実質的に)純粋なDOM1h-131-511単量体、DOM1h-131-201単量体、DOM1h-131-202単量体、DOM1h-131-203単量体、DOM1h-131-204単量体、DOM1h-131-205単量体、またはDOM1h-131-206単量体をさらに提供する。一実施形態では、少なくとも98、99、99.5％純粋であるかまたは100％純粋な単量体が提供される。
【０００８】
一態様において、本発明は、DOM1h-131-511のアミノ酸配列と少なくとも90％同一なプロテアーゼ耐性アミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。一態様において、本発明は、DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、DOM1h-131-205、およびDOM1h-131-206のアミノ酸配列と少なくとも90％同一なプロテアーゼ耐性アミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。一態様において、本発明は、DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、およびDOM1h-131-205のアミノ酸配列と少なくとも90％同一なプロテアーゼ耐性アミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。これらの態様の一実施形態において、パーセント同一性は、少なくとも80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99％である。一実施形態において、ポリペプチドは、DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、DOM1h-131-205、またはDOM1h-131-206である。
【０００９】
一態様において、本発明は、DOM1h-131-511のヌクレオチド配列(図19に示す)と少なくとも80％同一なヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドを提供する。一態様において、本発明は、DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、DOM1h-131-205、またはDOM1h-131-206のヌクレオチド配列と少なくとも80％同一なヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドを提供する。一態様において、本発明は、DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、またはDOM1h-131-205のヌクレオチド配列と少なくとも80％同一なヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドを提供する。これらの態様の一実施形態において、パーセント同一性は、少なくとも70、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99％である。
【００１０】
一態様において、本発明は、DOM1h-131-511のヌクレオチド配列と少なくとも80％同一なヌクレオチド配列によりコードされるプロテアーゼ耐性ポリペプチドを提供する。一態様において、本発明は、DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、DOM1h-131-205、またはDOM1h-131-206のヌクレオチド配列と少なくとも80％同一なヌクレオチド配列によりコードされるプロテアーゼ耐性ポリペプチドを提供する。一態様において、本発明は、DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、またはDOM1h-131-205のヌクレオチド配列と少なくとも80％同一なヌクレオチド配列によりコードされるプロテアーゼ耐性ポリペプチドを提供する。一実施形態において、パーセント同一性は、少なくとも70、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99％である。
【００１１】
一態様において、本発明は、DOM1h-131-511のヌクレオチド配列と少なくとも57％同一なヌクレオチド配列によりコードされ、DOM1h-131-511のアミノ酸配列と少なくとも95％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。一態様において、本発明は、DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、DOM1h-131-205、またはDOM1h-131-206のヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも57％同一なヌクレオチド配列によりコードされ、それぞれDOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、DOM1h-131-205、またはDOM1h-131-206のアミノ酸配列と少なくとも95％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。一態様において、本発明は、DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、DOM1h-131-205、またはDOM1h-131-206のヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも57％同一なヌクレオチド配列によりコードされ、それぞれDOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、またはDOM1h-131-205のアミノ酸配列と少なくとも95％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。一実施形態において、ヌクレオチド配列のパーセント同一性は、少なくとも60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99％である。一実施形態において、アミノ酸配列のパーセント同一性は、少なくとも94、95、96、97、98、もしくは99％、または100％である。例えば、ヌクレオチド配列は、DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、DOM1h-131-205、またはDOM1h-131-206のヌクレオチド配列のコドン最適化型でありうる。配列のコドン最適化は、当技術分野で知られている。一実施形態において、ヌクレオチド配列は、細菌宿主細胞(例えば、大腸菌(E.coli)またはシュードモナス属(Pseudomonas)、例えば、シュードモナス・フルオレセンス(P.fluorescens))内、哺乳動物宿主細胞(例えば、CHO細胞)内、または酵母宿主細胞(例えば、ピキア属(Picchia)またはサッカロミセス属(Saccharomyces)、例えば、ピキア・パストリス(P.pastoris)またはサッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae))内における発現について最適化される。
【００１２】
一態様において、本発明は、本発明のポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する。
【００１３】
一態様において、本発明は、DOM1h-131-511のアミノ酸配列と少なくとも95％同一なアミノ酸配列を含む抗TNFα受容体1型(TNFR1;p55)免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。一態様において、本発明は、DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、DOM1h-131-205、またはDOM1h-131-206のアミノ酸配列と少なくとも95％同一なアミノ酸配列を含む抗TNFα受容体1型(TNFR1;p55)免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。一態様において、本発明は、DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、またはDOM1h-131-205のアミノ酸配列と少なくとも95％同一なアミノ酸配列を含む抗TNFα受容体1型(TNFR1;p55)免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。これらの態様の一実施形態において、パーセント同一性は、少なくとも96、97、98、または99％である。
【００１４】
一態様において、本発明は、DOM1h-131-511のアミノ酸配列と少なくとも90％同一なアミノ酸配列を含むプロテアーゼ耐性抗TNFα受容体1型(TNFR1;p55)免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。一態様において、本発明は、DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、DOM1h-131-205、またはDOM1h-131-206のアミノ酸配列と少なくとも90％同一なアミノ酸配列を含むプロテアーゼ耐性抗TNFα受容体1型(TNFR1;p55)免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。一態様において、本発明は、DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、またはDOM1h-131-205のアミノ酸配列と少なくとも90％同一なアミノ酸配列を含むプロテアーゼ耐性抗TNFα受容体1型(TNFR1;p55)免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。これらの態様の一実施形態において、パーセント同一性は、少なくとも80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99％である。
【００１５】
一態様において、本発明は、DOM1h-131-511のヌクレオチド配列と少なくとも57％同一なヌクレオチド配列によりコードされ、DOM1h-131-511のアミノ酸配列と少なくとも95％同一なアミノ酸配列を含む抗TNFα受容体1型(TNFR1;p55)免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。一態様において、本発明は、DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、DOM1h-131-205、またはDOM1h-131-206のヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも57％同一なヌクレオチド配列によりコードされ、それぞれDOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、DOM1h-131-205、またはDOM1h-131-206のアミノ酸配列と少なくとも95％同一なアミノ酸配列を含む抗TNFα受容体1型(TNFR1;p55)免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。一態様において、本発明は、DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、DOM1h-131-205、またはDOM1h-131-206のヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも57％同一なヌクレオチド配列によりコードされ、それぞれDOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、またはDOM1h-131-205のアミノ酸配列と少なくとも95％同一なアミノ酸配列を含む抗TNFα受容体1型(TNFR1;p55)免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。一実施形態において、ヌクレオチド配列のパーセント同一性は、少なくとも60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99％である。一実施形態において、アミノ酸配列のパーセント同一性は、少なくとも94、95、96、97、98、もしくは99％、または100％である。例えば、ヌクレオチド配列は、DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、DOM1h-131-205、またはDOM1h-131-206のヌクレオチド配列のコドン最適化型でありうる。配列のコドン最適化は、当技術分野で知られている。一実施形態において、ヌクレオチド配列は、細菌宿主細胞(例えば、大腸菌またはシュードモナス属、例えば、シュードモナス・フルオレセンス)内、哺乳動物宿主細胞(例えば、CHO細胞)内、または酵母宿主細胞(例えば、ピキア属またはサッカロミセス属、例えば、ピキア・パストリスまたはサッカロミセス・セレビシエ)内における発現について最適化される。
【００１６】
一実施形態において、免疫グロブリン単一可変ドメインは、位置53においてアスパラギン酸を含む(番号付けは、Kabat(「Sequences of Proteins of Immunological Interest」、米国保健福祉省、1991年)による)。
【００１７】
一実施形態において、免疫グロブリン単一可変ドメインは、位置91においてヒスチジンを含む(番号付けは、Kabatによる)。
【００１８】
一態様において、本発明は、DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、DOM1h-131-205、またはDOM1h-131-206のアミノ酸配列と同一なアミノ酸配列を含む抗TNFα受容体1型(TNFR1;p55)免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。一態様において、本発明は、DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、またはDOM1h-131-205のアミノ酸配列と同一なアミノ酸配列を含む抗TNFα受容体1型(TNFR1;p55)免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。
【００１９】
一態様において、本発明は、DOM1h-131-511のヌクレオチド配列と少なくとも80％同一なヌクレオチド配列によりコードされる抗TNFα受容体1型(TNFR1;p55)免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。一態様において、本発明は、DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、DOM1h-131-205、またはDOM1h-131-206のヌクレオチド配列と少なくとも80％同一なヌクレオチド配列によりコードされる抗TNFα受容体1型(TNFR1;p55)免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。一態様において、本発明は、DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、またはDOM1h-131-205のヌクレオチド配列と少なくとも80％同一なヌクレオチド配列によりコードされる抗TNFα受容体1型(TNFR1;p55)免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。一実施形態において、パーセント同一性は、少なくとも70、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99％である。
【００２０】
一態様において、本発明は、DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、DOM1h-131-205、またはDOM1h-131-206のヌクレオチド配列と同一な配列によりコードされる抗TNFα受容体1型(TNFR1;p55)免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。
【００２１】
一態様において、本発明は、本発明による抗TNFα受容体1型(TNFR1;p55)免疫グロブリン単一可変ドメインを含むTNFR1アンタゴニストを提供する。一実施形態において、アンタゴニストは第1および第2の免疫グロブリン単一可変ドメインを含み、各可変ドメインは本発明の通りである。例えば、アンタゴニストが前記単一可変ドメインの単量体または前記単一可変ドメインのホモ二量体を含む場合である。一実施形態において、前記または各単一可変ドメインのアミノ酸配列は、DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、DOM1h-131-205、またはDOM1h-131-206のアミノ酸配列と同一である。
【００２２】
一態様において、本発明は、DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、およびDOM1h-131-205(任意により、ならびにDOM1h-131-206)から選択されるアミノ酸配列(図3に示す)と同一であるか、または前記選択された配列と25ヵ所以下のアミノ酸位置で異なり、前記選択された配列のCDR1配列と少なくとも50％同一なCDR1配列を有するアミノ酸配列を含む抗TNFα受容体1型(TNFR1;p55)免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。一実施形態において、違いは、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1ヵ所以下のアミノ酸位置である。一実施形態において、CDR配列の同一性は、少なくとも55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、または99％である。
【００２３】
一態様において、本発明は、DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、およびDOM1h-131-205(任意により、ならびにDOM1h-131-206)から選択されるアミノ酸配列(図3に示す)と同一であるか、または前記選択されたアミノ酸配列と25ヵ所以下のアミノ酸位置で異なり、前記選択された配列のCDR2配列と少なくとも50％同一なCDR2配列を有するアミノ酸配列を含む抗TNFα受容体1型(TNFR1;p55)免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。一実施形態において、違いは、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1ヵ所以下のアミノ酸位置である。一実施形態において、CDR配列の同一性は、少なくとも55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、または99％である。
【００２４】
一態様において、本発明は、DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、およびDOM1h-131-205(任意により、ならびにDOM1h-131-206)から選択されるアミノ酸配列(図3に示す)と同一であるか、または前記選択されたアミノ酸配列と25ヵ所以下のアミノ酸位置で異なり、前記選択された配列のCDR3配列と少なくとも50％同一なCDR3配列を有するアミノ酸配列を含む抗TNFα受容体1型(TNFR1;p55)免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。一実施形態において、違いは、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1ヵ所以下のアミノ酸位置である。一実施形態において、CDR配列の同一性は、少なくとも55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、または99％である。
【００２５】
一態様において、本発明は、DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、およびDOM1h-131-205(任意により、ならびにDOM1h-131-206)から選択されるアミノ酸配列(図3に示す)と同一であるか、または前記選択されたアミノ酸配列と25ヵ所以下のアミノ酸位置で異なり、前記選択された配列のCDR1配列と少なくとも50％同一なCDR1配列を有し、前記選択された配列のCDR2配列と少なくとも50％同一なCDR2配列を有するアミノ酸配列を含む抗TNFα受容体1型(TNFR1;p55)免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。一実施形態において、違いは、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1ヵ所以下のアミノ酸位置である。一実施形態において、一方または両方のCDR配列の同一性は、それぞれ、少なくとも55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、または99％である。
【００２６】
一態様において、本発明は、DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、およびDOM1h-131-205(任意により、ならびにDOM1h-131-206)から選択されるアミノ酸配列(図3に示す)と同一であるか、または前記選択されたアミノ酸配列と25ヵ所以下のアミノ酸位置で異なり、前記選択された配列のCDR1配列と少なくとも50％同一なCDR1配列を有し、前記選択された配列のCDR3配列と少なくとも50％同一なCDR3配列を有するアミノ酸配列を含む抗TNFα受容体1型(TNFR1;p55)免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。一実施形態において、違いは、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1ヵ所以下のアミノ酸位置である。一実施形態において、一方または両方のCDR配列の同一性は、それぞれ、少なくとも55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、または99％である。
【００２７】
一態様において、本発明は、DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、およびDOM1h-131-205(任意により、ならびにDOM1h-131-206)から選択されるアミノ酸配列(図3に示す)と同一であるか、または前記選択されたアミノ酸配列と25ヵ所以下のアミノ酸位置で異なり、前記選択された配列のCDR2配列と少なくとも50％同一なCDR2配列を有し、前記選択された配列のCDR3配列と少なくとも50％同一なCDR3配列を有するアミノ酸配列を含む抗TNFα受容体1型(TNFR1;p55)免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。一実施形態において、違いは、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1ヵ所以下のアミノ酸位置である。一実施形態において、一方または両方のCDR配列の同一性は、それぞれ、少なくとも55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、または99％である。
【００２８】
一態様において、本発明は、DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、およびDOM1h-131-205(任意により、ならびにDOM1h-131-206)から選択されるアミノ酸配列(図3に示す)と同一であるか、または前記選択されたアミノ酸配列と25ヵ所以下のアミノ酸位置で異なり、前記選択された配列のCDR1配列と少なくとも50％同一なCDR1配列を有し、前記選択された配列のCDR2配列と少なくとも50％同一なCDR2配列を有し、前記選択された配列のCDR3配列と少なくとも50％同一なCDR3配列を有するアミノ酸配列を含む抗TNFα受容体1型(TNFR1;p55)免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。一実施形態において、違いは、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1ヵ所以下のアミノ酸位置である。一実施形態において、1つ、2つ、または各々のCDR配列の同一性は、それぞれ、少なくとも55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、または99％である。
【００２９】
一態様において、本発明は、DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、またはDOM1h-131-205(任意により、またはDOM1h-131-206)のCDR1配列(図3に示す)と少なくとも50％同一なCDR1配列を有するTNFα受容体1型(TNFR1;p55)アンタゴニストを提供する。一実施形態において、CDR配列の同一性は、少なくとも55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、または99％である。アンタゴニストは、プロテアーゼ、例えば、本明細書で説明される一連の条件下における、例えば、本明細書で説明される1種または複数種のプロテアーゼに対して耐性でありうる。
【００３０】
一態様において、本発明は、DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、またはDOM1h-131-205(任意により、またはDOM1h-131-206)のCDR1配列と少なくとも50％同一なCDR2配列を有するTNFα受容体1型(TNFR1;p55)アンタゴニストを提供する。一実施形態において、CDR配列の同一性は、少なくとも55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、または99％である。アンタゴニストは、プロテアーゼ、例えば、本明細書で説明される一連の条件下における、例えば、本明細書で説明される1種または複数種のプロテアーゼに対して耐性でありうる。
【００３１】
一態様において、本発明は、DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、またはDOM1h-131-205(任意により、またはDOM1h-131-206)のCDR3配列と少なくとも50％同一なCDR3配列を有するTNFα受容体1型(TNFR1;p55)アンタゴニストを提供する。一実施形態において、CDR配列の同一性は、少なくとも55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、または99％である。アンタゴニストは、プロテアーゼ、例えば、本明細書で説明される一連の条件下における、例えば、本明細書で説明される1種または複数種のプロテアーゼに対して耐性でありうる。
【００３２】
一態様において、本発明は、DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、またはDOM1h-131-205(任意により、またはDOM1h-131-206)から選択されるアミノ酸配列のCDR1配列と少なくとも50％同一なCDR1配列を有し、前記選択された配列のCDR2配列と少なくとも50％同一なCDR2配列を有するTNFα受容体1型(TNFR1;p55)アンタゴニストを提供する。一実施形態において、一方または両方のCDRによるCDR配列の同一性は、それぞれ、少なくとも55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、または99％である。アンタゴニストは、プロテアーゼ、例えば、本明細書で説明される一連の条件下における、例えば、本明細書で説明される1種または複数種のプロテアーゼに対して耐性でありうる。
【００３３】
一態様において、本発明は、DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、またはDOM1h-131-205(任意により、またはDOM1h-131-206)から選択されるアミノ酸配列のCDR1配列と少なくとも50％同一なCDR1配列を有し、前記選択された配列のCDR3配列と少なくとも50％同一なCDR3配列を有するTNFα受容体1型(TNFR1;p55)アンタゴニストを提供する。一実施形態において、一方または両方のCDRによるCDR配列の同一性は、それぞれ、少なくとも55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、または99％である。アンタゴニストは、プロテアーゼ、例えば、本明細書で説明される一連の条件下における、例えば、本明細書で説明される1種または複数種のプロテアーゼに対して耐性でありうる。
【００３４】
一態様において、本発明は、DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、またはDOM1h-131-205(任意により、またはDOM1h-131-206)から選択されるアミノ酸配列のCDR2配列と少なくとも50％同一なCDR2配列を有し、前記選択された配列のCDR3配列と少なくとも50％同一なCDR3配列を有するTNFα受容体1型(TNFR1;p55)アンタゴニストを提供する。一実施形態において、一方または両方のCDRによるCDR配列の同一性は、それぞれ、少なくとも55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、または99％である。アンタゴニストは、プロテアーゼ、例えば、本明細書で説明される一連の条件下における、例えば、本明細書で説明される1種または複数種のプロテアーゼに対して耐性でありうる。
【００３５】
一態様において、本発明は、DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、またはDOM1h-131-205(任意により、またはDOM1h-131-206)から選択されるアミノ酸配列のCDR1配列と少なくとも50％同一なCDR1配列を有し、選択された配列のCDR2配列と少なくとも50％同一なCDR2配列を有し、選択された配列のCDR3配列と少なくとも50％同一なCDR3配列を有するTNFα受容体1型(TNFR1;p55)アンタゴニストを提供する。一実施形態において、1つ、2つ、または各々のCDRによるCDR配列の同一性は、それぞれ、少なくとも55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、または99％である。アンタゴニストは、プロテアーゼ、例えば、本明細書で説明される一連の条件下における、例えば、本明細書で説明される1種または複数種のプロテアーゼに対して耐性でありうる。
【００３６】
一態様において、本発明は、DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、またはDOM1h-131-205(任意により、またはDOM1h-131-206)のCDR1、CDR2、および/またはCDR3(例えば、CDR1、CDR2、CDR3、CDR1および2、CDR1  および3、CDR2および3、またはCDR1、2、および3)の配列を含む免疫グロブリン単一可変ドメインを含むTNFα受容体1型(TNFR1;p55)アンタゴニストを提供する。アンタゴニストは、プロテアーゼ、例えば、本明細書で説明される一連の条件下における、例えば、本明細書で説明される1種または複数種のプロテアーゼに対して耐性でありうる。
【００３７】
一態様において、本発明は、TNFα受容体1型(TNFR1;p55)に対する結合について、DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、DOM1h-131-205、またはDOM1h-131-206から選択される免疫グロブリン単一可変ドメインと競合するTNFR1アンタゴニストを提供する。こうして、アンタゴニストは、DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、DOM1h-131-205、またはDOM1h-131-206と同じエピトープまたはこれに重複するエピトープに結合しうる。一実施形態において、アンタゴニストは、DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、DOM1h-131-205、またはDOM1h-131-206のアミノ酸配列(図3に示す)と少なくとも91％同一なアミノ酸配列を有する免疫グロブリン単一可変ドメインを含む。一実施形態において、パーセント同一性は、少なくとも80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99％である。一実施形態において、選択される可変ドメインは、DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、DOM1h-131-205、またはDOM1h-131-206である。アンタゴニストは、プロテアーゼ、例えば、本明細書で説明される一連の条件下における、例えば、本明細書で説明される1種または複数種のプロテアーゼに対して耐性でありうる。一実施形態において、アンタゴニストは、抗体またはTNFR1に対する結合特異性を有する一価の抗原結合フラグメント(例えば、scFv、Fab、Fab'、dAb)など、その抗原結合フラグメントである。アンタゴニストの他の例は、TNFR1に結合する、本明細書で説明されるリガンドである。リガンドは、TNFR1に対する結合特異性を有する免疫グロブリン単一可変ドメインもしくはドメイン抗体(dAb)、または適切なフォーマットにおけるこのようなdAbの相補性決定領域を含みうる。一部の実施形態において、リガンドは、基本的にTNFR1に対する結合特異性を有する免疫グロブリン単一可変ドメインもしくはdAbからなる、またはこれらからなるdAb単量体である。他の実施形態において、リガンドは、抗体フォーマットなど、適切なフォーマットにおけるdAb(またはdAbのCDR)を含むポリペプチドである。
【００３８】
本発明のTNFR1アンタゴニストの一部はTNFR1に対するTNFαの結合は阻害しないが、TNFR1を介するシグナル伝達は阻害する。例えば、TNFR1アンタゴニストは、TNFαにより誘導されるTNFR1のクラスター化を阻害することが可能であり、これは、TNFR1を介するシグナル伝達に先立つ。このようなアンタゴニストにより、複数の利点が提供される。例えば、このようなアンタゴニストの存在下において、TNFαは細胞の表面上で発現されるTNFR1に結合することが可能であり、細胞環境から除去されうるが、TNFR1媒介性シグナル伝達は活性化されない。こうして、TNFR1シグナルに誘導されるさらなるTNFαおよび他の炎症メディエーターの生成は阻害される。同様に、TNFR1に結合し、TNFR1を介するシグナル伝達は阻害するが、TNFR1に対するTNFαの結合は阻害しないTNFR1アンタゴニストは、TNFα結合は阻害しないが、内因的に生成される可溶性TNFR1の活性は阻害する。したがって、このようなアンタゴニストを、それを必要とする哺乳動物に投与することにより、in vivoにおけるTNFα活性およびTNFR1活性を阻害する内因的な調節経路を補完することができる。本発明はまた、(i)TNFR1に結合し(例えば、ドメイン1において)、(ii)TNFR1媒介性シグナル伝達活性をアンタゴナイズするが、(iii)TNFR1に対するTNFαの結合は阻害しないリガンドにも関する。このようなリガンドは、可溶性TNFR1に結合するが、該可溶性受容体がTNFαに結合することは妨げず、したがって、このようなアンタゴニストを、それを必要とする哺乳動物に投与することにより、血清中における可溶性受容体の半減期を延長させることで、in vivoにおけるTNFα活性を阻害する内因的な調節経路を補完することができる。これらの利点は、例えば、PEG基、血清アルブミン、トランスフェリン、トランスフェリン受容体もしくは少なくともそのトランスフェリン結合部分、抗体Fc領域の付着を介して、または、抗体ドメインに対するコンジュゲーションを介して、より大きな流体力学的サイズを有するようにフォーマットされたリガンドに特に関連する。例えば、dAb単量体など、(i)TNFR1に結合し(例えば、ドメイン1において)、(ii)TNFR1媒介性シグナル伝達活性をアンタゴナイズするが、(iii)TNFR1に対するTNFαの結合は阻害しない作用物質(例えば、ポリペプチド、可変ドメイン、またはアンタゴニスト)を、抗体のより大型の抗原結合フラグメントまたは抗体としてフォーマットする(例えば、Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2、IgG、scFvとしてフォーマットする)ことができる。本明細書で説明される通り(参照によりその全体において本明細書に組み込まれる国際公開第2006038027号の付録1を参照されたい)、in vivoにおける半減期を延長させる抗原またはエピトープに結合する結合ドメイン(例えば、抗体または抗体フラグメント)に、TNFR1結合作用物質(アンタゴニスト;可変ドメイン)をコンジュゲートさせるかまたは連結することによっても、リガンドの流体力学的サイズを増大させ、その血清中半減期を延長させることができる。例えば、TNFR1結合作用物質(例えば、ポリペプチド)は、抗血清アルブミンまたは抗新生児Fc受容体の抗体または抗体フラグメント、例えば、抗SAもしくは抗新生児Fc受容体のdAb、Fab、Fab'、もしくはscFv、または抗SAアフィボディもしくは抗新生児Fc受容体アフィボディにコンジュゲートさせるかまたは連結することができる。
【００３９】
本発明によるTNFR1結合リガンドにおける使用に適するアルブミン、アルブミンフラグメント、またはアルブミン変異体の例は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる国際公開第2005/077042A2号および国際公開第2006038027号で説明されている。
【００４０】
本開示全体で説明される本発明の他の実施形態では、本発明のアンタゴニストまたはリガンドにおける「dAb」の使用ではなく、当業者が、TNFR1に結合するdAbのCDR(例えば、適切なタンパク質の足場または骨格、例えば、アフィボディ、SpA足場、LDL受容体クラスAドメイン、またはEGFドメイン上に移植されたCDR)を含むか、またはTNFR1に対する結合部位を含むタンパク質ドメインであって、例えば、アフィボディ、SpA足場、LDL受容体クラスAドメイン、またはEGFドメインから選択されるドメインでありうるドメインを用いうることが意図される。したがって、全体としての本開示は、dAbに代わってこのようなドメインを用いるアンタゴニスト、リガンド、および方法の開示を提供することを意図する。
【００４１】
本発明のポリペプチド、免疫グロブリン単一可変ドメイン、およびアンタゴニストは、以下:セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、チオールプロテアーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼ(例えば、カルボキシペプチダーゼA、カルボキシペプチダーゼB)、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、エラスターゼ、ロイコザイム(leucozyme)、パンクレアチン、トロンビン、プラスミン、カテプシン(例えば、カテプシンG)、プロテイナーゼ(例えば、プロテイナーゼ1、プロテイナーゼ2、プロテイナーゼ3)、テルモリシン、キモシン、エンテロペプチダーゼ、カスパーゼ(例えば、カスパーゼ1、カスパーゼ2、カスパーゼ4、カスパーゼ5、カスパーゼ9、カスパーゼ12、カスパーゼ13)、カルパイン、フィカイン、クロストリパイン、アクチニダイン、ブロメライン、およびセパラーゼのうちの１以上に対して耐性でありうる。具体的な実施形態において、プロテアーゼは、トリプシン、エラスターゼ、またはロイコザイムである。プロテアーゼはまた、生物学的抽出物、生物学的ホモジネート、または生物学的調製物によっても提供することができる。所望の場合、方法は、インキュベーションの完了後、レパートリーとプロテアーゼとの組合せにプロテアーゼ阻害剤を添加するステップをさらに含む。一実施形態において、プロテアーゼは、喀痰、粘液(例えば、胃粘液、鼻腔粘液、気管支粘液)、気管支肺洗浄液、肺ホモジネート、肺抽出物、膵臓抽出物、胃液、唾液、または涙液中に見出されるプロテアーゼである。一実施形態において、プロテアーゼは、眼および/または涙液中に見出されるプロテアーゼである。一実施形態において、プロテアーゼは、非細菌性プロテアーゼである。ある実施形態において、プロテアーゼは、動物プロテアーゼ、例えば、哺乳動物プロテアーゼ、例えば、ヒトプロテアーゼである。ある実施形態において、プロテアーゼは、消化管プロテアーゼまたは肺組織プロテアーゼ、例えば、ヒトにおいて見出される消化管プロテアーゼまたは肺組織プロテアーゼである。本明細書で列挙されるこのようなプロテアーゼはまた、本明細書で説明される、プロテアーゼに対するライブラリーレパートリーの曝露を含む方法においても用いることができる。
【００４２】
一態様において、本発明は、TNFα受容体1型(TNFR1;p55)結合部位を含み、
(i)37℃で少なくとも1時間の時間(t)にわたり、少なくとも10マイクログラム/mlのプロテアーゼの濃度(c);または
(ii)30℃で少なくとも1時間の時間(t)にわたり、少なくとも40マイクログラム/mlのプロテアーゼの濃度(c')
によりインキュベートした場合、プロテアーゼ、例えば、トリプシンに対して耐性である、免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。一実施形態において、可変ドメインに対するプロテアーゼ、例えば、トリプシンの比(モル/モルベースの)は、8,000〜80,000のプロテアーゼ:可変ドメインである、例えば、Cが10マイクログラム/mlの場合、該比は800〜80,000のプロテアーゼ:可変ドメインであるか;またはCもしくはC'が100マイクログラム/mlの場合、該比は8,000〜80,000のプロテアーゼ:可変ドメインである。一実施形態において、可変ドメインに対するプロテアーゼ(例えば、トリプシン)の比(重量/重量、例えば、マイクログラム/マイクログラムベースの)は、16,000〜160,000のプロテアーゼ:可変ドメインである、例えば、Cが10マイクログラム/mlの場合、該比は1,600〜160,000のプロテアーゼ:可変ドメインであるか;またはCもしくはC'が100マイクログラム/mlの場合、該比は1,6000〜160,000のプロテアーゼ:可変ドメインである。一実施形態において、濃度(cまたはc')は、少なくとも100または1000マイクログラム/mlのプロテアーゼである。一実施形態において、可変ドメインは、DOM1h-131-511のアミノ酸配列と少なくとも90％同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態において、可変ドメインは、DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、DOM1h-131-205、およびDOM1h-131-206のアミノ酸配列と少なくとも90％同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態において、可変ドメインは、DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、およびDOM1h-131-205のアミノ酸配列と少なくとも90％同一なアミノ酸配列を含む。これらの態様の一実施形態において、パーセント同一性は、少なくとも80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99％である。一実施形態において、濃度(cまたはc')は、少なくとも100または1000マイクログラム/mlのプロテアーゼである。ペプチドまたはポリペプチドのレパートリーまたはライブラリーにより作業する場合に用いられるプロテアーゼのタンパク質溶解活性に適する条件(例えば、w/wパラメータ)については、本明細書における説明が参照される。これらの条件は、特定の免疫グロブリン単一可変ドメインのプロテアーゼ耐性を決定する条件に用いることができる。一実施形態において、時間(t)は、1、3、もしくは24時間、または一晩(例えば、約12〜16時間)、あるいは約1、3、もしくは24時間、または一晩である。一実施形態において、可変ドメインは条件(i)の下で耐性であり、濃度(c)は10もしくは100マイクログラム/mlのプロテアーゼまたは約10もしくは100マイクログラム/mlのプロテアーゼであり、時間(t)は1時間である。一実施形態において、可変ドメインは、条件(ii)の下で耐性であり、濃度(c')は40マイクログラム/mlのプロテアーゼまたは約40マイクログラム/mlのプロテアーゼであり、時間(t)は3時間である。一実施形態において、プロテアーゼは、トリプシン、エラスターゼ、ロイコザイム、およびパンクレアチンから選択される。一実施形態において、プロテアーゼはトリプシンである。一実施形態において、プロテアーゼは、喀痰、粘液(例えば、胃粘液、鼻腔粘液、気管支粘液)、気管支肺洗浄液、肺ホモジネート、肺抽出物、膵臓抽出物、胃液、唾液、または涙液中に見出されるプロテアーゼである。一実施形態において、プロテアー��は、眼および/または涙液中に見出されるプロテアーゼである。一実施形態において、プロテアーゼは、非細菌性プロテアーゼである。ある実施形態において、プロテアーゼは、動物プロテアーゼ、例えば、哺乳動物プロテアーゼ、例えば、ヒトプロテアーゼである。ある実施形態において、プロテアーゼは、消化管プロテアーゼまたは肺組織プロテアーゼ、例えば、ヒトにおいて見出される消化管プロテアーゼまたは肺組織プロテアーゼである。本明細書で列挙されるこのようなプロテアーゼはまた、本明細書で説明される、プロテアーゼに対するライブラリーレパートリーの曝露を含む方法においても用いることができる。
【００４３】
一実施形態において、可変ドメインは、トリプシンならびに/またはエラスターゼ、ロイコザイム、およびパンクレアチンから選択される少なくとも1種の他のプロテアーゼに対して耐性である。例えば、耐性は、トリプシンおよびエラスターゼ;トリプシンおよびロイコザイム;トリプシンおよびパンクレアチン;トリプシン、エラスターゼ、およびロイコザイム;トリプシン、エラスターゼ、およびパンクレアチン;トリプシン、エラスターゼ、パンクレアチン、およびロイコザイム;またはトリプシン、パンクレアチン、およびロイコザイムに対する耐性である。
【００４４】
一実施形態では、例えば、106〜1013のファージライブラリーサイズ、例えば、108〜1012の複製単位(感染性ビリオン)で、条件(i)または(ii)の下においてインキュベートされるときに細菌ファージ上で提示される場合のプロテアーゼ耐性について可変ドメインを調べる。
【００４５】
一実施形態において、可変ドメインは、条件(i)または(ii)の下におけるインキュベーション後、TNFR1に特異的に結合し、例えば、BiaCore(商標)またはELISA、例えば、ファージELISAまたはモノクローナルファージELISAを用いて評価される。
【００４６】
一実施形態において、本発明の可変ドメインは、プロテインAまたはプロテインLに特異的に結合する。一実施形態において、プロテインAまたはLに対する特異的結合は、条件(i)または(ii)の下におけるインキュベーション後に示される。
【００４７】
一実施形態において、本発明の可変ドメインは、例えば、条件(i)または(ii)の下におけるインキュベーション後のELISA、例えば、ファージELISAまたはモノクローナルファージELISAにおいて、少なくとも0.404のOD450リーディングを有しうる。
【００４８】
一実施形態において、本発明の可変ドメインは、例えば、条件(i)または(ii)の下におけるインキュベーション後のゲル電気泳動法において、(実質的に)単一バンドを示す。
【００４９】
一部の実施形態において、本発明は、TNFR1に結合する、本発明による第1のdAbと、第1のdAbと同一であるかまたは異なる結合特異性を有する第2のdAbとを含む二重特異性リガンドであるTNFRアンタゴニストを提供する。第2のdAbは、ApoE、Apo-SAA、BDNF、カルジオトロフィン-1、CEA、CD40、CD40リガンド、CD56、CD38、CD138、EGF、EGF受容体、ENA-78、エオタキシン、エオタキシン-2、エクソダス-2、FAPα、酸性FGF、塩基性FGF、線維芽細胞成増殖因子-10、FLT3リガンド、フラクタルカイン(CX3C)、GDNF、G-CSF、GM-CSF、GF-β1、ヒト血清アルブミン、インスリン、IFN-γ、IGF-I、IGF-II、IL-1α、IL-1β、IL-1受容体、IL-1受容体1型、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8(72アミノ酸)、IL-8(77アミノ酸)、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18(IGIF)、インヒビンα、インヒビンβ、IP-10、ケラチノサイト成長因子-2(KGF-2)、KGF、レプチン、LIF、リンホタクチン、ミュラー管抑制物質、単球コロニー阻害因子、単球付着タンパク質、M-CSF、MDC(67アミノ酸)、MDC(69アミノ酸)、MCP-1(MCAF)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MDC(67アミノ酸)、MDC(69アミノ酸)、MIG、MIP-1α、MIP-1β、MIP-3α、MIP-3β、MIP-4、骨髄始原細胞阻害因子-1(MPIF-1)、NAP-2、ニュールツリン、神経成長因子、β-NGF、NT-3、NT-4、オンコスタチンM、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PF-4、RANTES、SDF1α、SDF1β、SCF、SCGF、幹細胞因子(SCF)、TARC、TGF-α、TGF-β、TGF-β2、TGF-β3、腫瘍壊死因子(TNF)、TNF-α、TNF-β、TNF受容体I、TNF受容体II、TNIL-1、TPO、VEGF、VEGF A、VEGF B、VEGF C、VEGF D、VEGF受容体1、VEGF受容体2、VEGF受容体3、GCP-2、GRO/MGSA、GRO-β、GRO-γ、HCC1、1-309、HER 1、HER 2、HER 3、HER 4、血清アルブミン、vWF、アミロイドタンパク質(例えば、アミロイドアルファタンパク質)、MMP12、PDK1、IgE、IL-13Rα1、IL-13Ra2、IL-15、IL-15R、IL-16、IL-17R、IL-17、IL-18、IL-18R、IL-23、IL-23R、IL-25、CD2、CD4、CD11a、CD23、CD25、CD27、CD28、CD30、CD40、CD40L、CD56、CD138、ALK5、EGFR、FcER1、TGFb、CCL2、CCL18、CEA、CR8、CTGF、CXCL12(SDF-1)、キマーゼ、FGF、フリン、エンドセリン-1、エオタキシン(例えば、エオタキシン、エオタキシン-2、エオタキシン-3)、GM-CSF、ICAM-1、ICOS、IgE、IFNa、I-309、インテグリン、L-セレクチン、MIF、MIP4、MDC、MCP-1、MMP、好中球エラスターゼ、オステオポンチン、OX-40、PARC、PD-1、RANTES、SCF、SDF-1、シグレック8、TARC、TGFb、トロンビン、Tim-1、TNF、TRANCE、トリプターゼ、VEGF、VLA-4、VCAM、α4β7、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR8、アルファvベータ6、アルファvベータ8、cMET、CD8、vWF、アミロイドタンパク質(例えば、アミロイドアルファタンパク質)、MMP12、PDK1、およびIgEから選択される標的に結合しうる。
【００５０】
一例において、二重特異性リガンドは、TNFR1上における第1のエピトープに結合する第1のdAbと、異なる標的上におけるエピトープに結合する第2のdAbとを含む。別の例において、第2のdAbは、血清アルブミン上におけるエピトープに結合する。
【００５１】
他の実施形態において、リガンドは、TNFR1に対する結合特異性を有する第1のエピトープ結合ドメインと、第1のエピトープ結合ドメインとは異なる結合特異性を有する少なくとも1つの他のエピトープ結合ドメインとを含む多重特異性リガンドである。例えば、第1のエピトープ結合ドメインは、TNFR1に結合するdAbでもありえ、TNFR1に結合するdAbのCDR(例えば、適切なタンパク質の足場または骨格、例えば、アフィボディ、SpA足場、LDL受容体クラスAドメイン、またはEGFドメイン上に移植されたCDR)を含むドメインでもありえ、アフィボディ、SpA足場、LDL受容体クラスAドメイン、またはEGFドメインから選択される、TNFR1に結合するドメインでもありうる。
【００５２】
一部の実施形態において、ポリペプチド、アンタゴニスト、リガンド、または抗TNFR1 dAb単量体は、以下のもののうちの１以上により特徴付けられる:(1)表面プラズモン共鳴により決定される50nM〜20pMの解離定数(Kd)、および5×10-1〜1×10-7秒-1の速度定数KoffによりヒトTNFR1から解離する;(2)500nM〜50pMのIC50によりTNFR1に対する腫瘍壊死因子アルファ(TNFα)の結合を阻害する;(3)標準的なL929細胞アッセイにおいて、500nM〜50pMのND50によりヒトTNFR1を中和する;(4)標準的な細胞アッセイにおいて、≦100nMのND50によりTNFR1活性をアンタゴナイズし、該アッセイにおいて、dAbは、≦10μMの濃度で、TNFR1活性を≦5％アゴナイズする;(5)マウスLPS/D-ガラクトサミン誘導敗血症ショックモデルにおける致死性を阻害する;(6)凝集に対して耐性である;(7)大腸菌またはピキア属種(例えば、ピキア・パストリス)内で発現される場合、少なくとも約0.5mg/Lの量で分泌される;(8)可逆的に折りたたみを解除する;(9)マウスコラーゲン誘導関節炎モデル、マウスΔARE関節炎モデル、マウスΔARE炎症性大腸疾患モデル、マウスデキストラン硫酸ナトリウム誘導炎症性大腸疾患モデル、慢性閉塞性肺疾患のマウス喫煙モデル、および適切な霊長類モデル(例えば、霊長類コラーゲン誘導関節炎モデル)からなる群から選択される慢性炎症性疾患モデルにおいて有効性を有する;ならびに/または(10)慢性炎症性疾患の治療、抑制、もしくは予防において有効性を有する。アッセイおよび試験ならびに条件(1)〜(10)に適用されるパラメータの詳細については、国際公開第2006038027号を参照し、この文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００５３】
具体的な実施形態において、ポリペプチド、アンタゴニスト、リガンド、またはdAb単量体は、表面プラズモン共鳴により決定される50nM〜20pMの解離定数(Kd)、および5×10-1〜1×10-7秒-1の速度定数KoffによりヒトTNFR1から解離し;500nM〜50pMのIC50によりTNFR1に対する腫瘍壊死因子アルファ(TNFα)の結合を阻害し;標準的なL929細胞アッセイにおいて、500nM〜50pMのND50によりヒトTNFR1を中和する。他の具体的な実施形態において、ポリペプチド、アンタゴニスト、リガンド、またはdAb単量体は、50nM〜20pMの解離定数(Kd)、および5×10-1〜1×10-7秒-1の速度定数KoffによりヒトTNFR1から解離し;500nM〜50pMのIC50によりTNFR1に対する腫瘍壊死因子アルファ(TNFα)の結合を阻害し;マウスコラーゲン誘導関節炎モデル、マウスΔARE関節炎モデル、マウスΔARE炎症性大腸疾患モデル、マウスデキストラン硫酸ナトリウム誘導炎症性大腸疾患モデル、慢性閉塞性肺疾患のマウス喫煙モデル、および適切な霊長類モデル(例えば、霊長類コラーゲン誘導関節炎モデル)からなる群から選択される慢性炎症性疾患モデルにおいて有効性を有する。他の具体的な実施形態において、ポリペプチド、アンタゴニスト、リガンド、またはdAb単量体は、50nM〜20pMの解離定数(Kd)、および5×10-1〜1×10-7秒-1の速度定数KoffによりヒトTNFR1から解離し;標準的なL929細胞アッセイにおいて、500nM〜50pMのND50によりヒトTNFR1を中和し;標準的な細胞アッセイにおいて、≦100nMのND50によりTNFR1活性をアンタゴナイズし、該アッセイにおいて、dAbは、≦10μMの濃度で、TNFR1活性を≦5％アゴナイズする。
【００５４】
本発明のプロテアーゼ耐性ポリペプチド、免疫グロブリン単一可変ドメイン、およびアンタゴニストは、哺乳動物、例えば、ヒトにおける疾患または状態の治療、予防、および診断における有用性を有する。特に、ペプチドおよびポリペプチドは、ヒトなどの患者に投与される場合にプロテアーゼと遭遇する可能性の高い薬物主成分としての有用性を有する。例えば、消化管に投与される(例えば、経口投与、舌下投与、直腸内投与される)場合、ポリペプチド、免疫グロブリン単一可変ドメイン、およびアンタゴニストは、上部消化管、下部消化管、口腔、胃、小腸、および大腸のうちの１以上におけるプロテアーゼの影響を受ける可能性がある。したがって、一実施形態は、患者の消化管に経口投与、舌下投与、または直腸内投与されて、患者における疾患または状態を治療および/または予防するプロテアーゼ耐性ポリペプチド、免疫グロブリン単一可変ドメイン、またはアンタゴニストを提供する。例えば、関節炎(例えば、関節リウマチ)、IBD、乾癬、またはクローン病など、TNFαを介する状態または疾患の治療および/または予防のための患者(例えば、ヒト患者)への経口投与。別の例において、ポリペプチド、可変ドメイン、またはアンタゴニストは、肺組織(例えば、肺または気道)へ投与(例えば、吸入投与または鼻腔内投与により)される場合にも、プロテアーゼに遭遇する可能性が高い。したがって、一実施形態は、患者(例えば、ヒト)の肺組織への吸入投与または鼻腔内投与により患者における疾患または状態を治療および/または予防する、プロテアーゼ耐性ポリペプチド、免疫グロブリン単一可変ドメイン、またはアンタゴニストの患者への投与を提供する。このような状態は、喘息(例えば、アレルギー性喘息)、COPD、インフルエンザ、または参照により本明細書に組み込まれる国際公開第2006038027号で開示されている任意の他の肺疾患または肺状態でありうる。本発明によるアンタゴニスト、ポリペプチド、および免疫グロブリン単一可変ドメインは、改善されたかまたは比較的高温の融解温度(Tm)を示し、安定性の増強を提供しうる。高親和性標的結合もまた、アンタゴニスト、ポリペプチド、および可変ドメインの特徴でありえ、これが代替的な特徴でもありうる。1つまたは複数のこれらの特徴をプロテアーゼ耐性と組み合わせることにより、アンタゴニスト、可変ドメイン、およびポリペプチドは、例えば、消化管または肺組織への投与でプロテアーゼに遭遇する可能性が高いヒトなどの哺乳動物において、薬物として用いやすくなる。別の例において、ポリペプチド、可変ドメイン、またはアンタゴニストは、患者の眼に投与(例えば、眼球内注射投与または点眼剤投与)される場合にプロテアーゼに遭遇する可能が高い。したがって、一実施形態は、患者(例えば、ヒト)における疾患または状態(例えば、眼の疾患または状態)を治療および/または予防する、プロテアーゼ耐性ポリペプチド、免疫グロブリン単一可変ドメイン、またはアンタゴニストの患者への投与を提供する。投与は、点眼剤の形態におけるかまたは眼内注射、例えば、硝子体液中への注射による局所投与でありうる。
【００５５】
したがって、一態様において、本発明は、経口送達のためのTNFR1アンタゴニストを提供する。一態様において、本発明は、患者の消化管への送達のためのTNFR1アンタゴニストを提供する。一態様において、本発明は、経口送達のための医薬の製造におけるTNFR1アンタゴニストの使用を提供する。一態様において、本発明は、患者の消化管への送達のための医薬の製造におけるTNFR1アンタゴニストの使用を提供する。一実施形態において、可変ドメインは、トリプシンならびに/またはエラスターゼ、ロイコザイム、およびパンクレアチンから選択される少なくとも1種の他のプロテアーゼに対して耐性である。例えば、耐性は、トリプシンおよびエラスターゼ;トリプシンおよびロイコザイム;トリプシンおよびパンクレアチン;トリプシン、エラスターゼ、およびロイコザイム;トリプシン、エラスターゼ、およびパンクレアチン;トリプシン、エラスターゼ、パンクレアチン、およびロイコザイム;またはトリプシン、パンクレアチン、およびロイコザイムに対する耐性である。
【００５６】
一態様において、本発明は、肺内送達のためのTNFR1アンタゴニストを提供する。一態様において、本発明は、患者の肺への送達のためのTNFR1アンタゴニストを提供する。一態様において、本発明は、肺内送達のための医薬の製造におけるTNFR1アンタゴニストの使用を提供する。一態様において、本発明は、患者の肺への送達のための医薬の製造におけるTNFR1アンタゴニストの使用を提供する。一実施形態において、可変ドメインは、ロイコザイムに対して耐性である。
【００５７】
一態様において、本発明は、医薬の経口送達または患者の消化管もしくは患者の肺(lungまたはpulmonary)組織への送達の方法であって、本発明の薬学的有効量のTNFR1アンタゴニストを患者に投与するステップを含む方法を提供する。
【００５８】
一態様において、本発明は、炎症状態の治療および/または予防のための本発明のTNFR1アンタゴニストを提供する。一態様において、本発明は、炎症状態の治療および/または予防のための医薬の製造におけるTNFR1アンタゴニストの使用を提供する。一実施形態において、状態は、関節炎、多発性硬化症、炎症性大腸疾患、および慢性閉塞性肺疾患からなる群から選択される。例えば、前記関節炎は、関節リウマチまたは若年性関節リウマチである。例えば、前記炎症性大腸疾患は、クローン病および潰瘍性大腸炎からなる群から選択される。例えば、前記慢性閉塞性肺疾患は、慢性気管支炎、慢性閉塞性気管支炎、および肺気腫からなる群から選択される。例えば、前記肺炎は細菌性肺炎である。例えば、前記細菌性肺炎は、ブドウ球菌性(Staphylococcal)肺炎である。
【００５９】
一態様において、本発明は、呼吸器疾患の治療および/または予防のためのTNFR1アンタゴニストを提供する。一態様において、本発明は、呼吸器疾患の治療および/または予防のための薬剤の製造におけるTNFR1アンタゴニストの使用を提供する。例えば、前記呼吸器疾患は、肺炎症(lung inflammation)、慢性閉塞性肺疾患、喘息、肺炎、過敏性肺炎、好酸球増加を伴う肺浸潤、環境性肺疾患、肺炎、気管支拡張症、嚢胞性線維症、間質性肺疾患、原発性肺高血圧症、肺血栓塞栓症、胸膜障害、縦隔障害、横隔膜障害、低換気症、過換気症、睡眠時無呼吸症、急性呼吸促迫症候群、中皮腫、肉腫、移植片拒絶、移植片対宿主病、肺癌、アレルギー性鼻炎、アレルギー、アスベスト症、アスベルギルス腫、アスペルギルス症、気管支拡張症、慢性気管支炎、肺気腫、好酸球増加性肺炎、特発性肺線維症、侵襲性肺炎球菌疾患、インフルエンザ、非結核性抗酸菌症、胸膜滲出、塵肺、ニューモシスチス症、肺炎、肺放線菌症、肺胞タンパク質症、肺炭疽症、肺浮腫、肺塞栓症、肺炎症(pulmonary inflammation)、肺ヒスチオサイトーシスX、肺高血圧症、肺ノカルジア症、肺結核、肺静脈閉塞性疾患、リウマチ性肺疾患、サルコイドーシス、およびウェーゲナー肉芽腫症からなる群から選択される。例えば、疾患は慢性閉塞性肺疾患(COPD)である。例えば、疾患は喘息である。
【００６０】
TNFR1を阻害する作用物質であって、抗体フラグメント(例えば、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、Fvフラグメント(例えば、scFv、ジスルフィド結合したFv)、F(ab')2フラグメント、dAb)、リガンド、ならびにdAb単量体およびdAb多量体(例えば、ホモ二量体またはヘテロ二量体)からなる群から選択される作用物質を含む本発明のアンタゴニストは、任意の適切な方法を用いて、被験体の肺組織(例えば、肺)へと局所投与することができる。例えば、作用物質は、吸入投与または鼻腔内投与を介して肺組織へと局所投与することができる。吸入投与または鼻腔内投与の場合、TNFR1アンタゴニストは、噴霧器、吸入器、アトマイザー、エアゾール噴霧器、ミスト噴霧器、乾燥粉末吸入器、用量計量型吸入器、用量計量型スプレー噴霧器、用量計量型ミスト噴霧器、用量計量型アトマイザー、または他の適切な吸入器もしくは鼻腔内送達デバイスを用いて投与することができる。こうして、一実施形態において、本発明は、TNFR1アンタゴニストを含有する肺内送達デバイスを提供する。一実施形態において、該デバイスは、吸入器または鼻腔内送達デバイスである。
【００６１】
一態様において、本発明は、TNFR1アンタゴニストを含む経口製剤を提供する。製剤は、錠剤、丸薬、カプセル剤、液剤、またはシロップ剤でありうる。
【００６２】
一実施形態において、本発明は、肺への送達のための肺用製剤であって、粒子サイズ範囲が5ミクロン未満、例えば、4.5、4、3.5、または3ミクロン未満(例えば、6.5〜8.0のpH、例えば、7〜7.5のpH、例えば、pH7またはpH7.5における、例えば、Britton-Robinson緩衝液中での場合)である本発明のアンタゴニスト、ポリペプチド、または可変ドメインを含む肺用製剤を提供する。
【００６３】
一実施形態において、本発明の製剤および組成物は、6.5〜8.0、例えば、7〜7.5、例えば、7、例えば、7.5のpHで提供される。
【００６４】
本発明の任意の態様による可変ドメインは、少なくとも50℃、または少なくとも55℃、または少なくとも60℃、または少なくとも65℃、または少なくとも70℃のTmを有しうる。本発明のアンタゴニスト、使用、方法、デバイス、または製剤は、このような可変ドメインを含みうる。
【００６５】
本発明の一態様において、本発明のポリペプチド、可変ドメイン、アンタゴニスト、組成物、または製剤は、Britton-Robinson緩衝液中37〜50℃で14日間わたるインキュベーション(1mg/mlのポリペプチド濃度または可変ドメイン濃度での)後において実質的に安定である。一実施形態において、少なくとも65、70、75、80、85、86、87、88、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％のポリペプチド、アンタゴニスト、または可変ドメインは、摂氏37度でのこのようなインキュベーション後においても依然として未凝集である。一実施形態において、少なくとも65、70、75、80、85、86、87、88、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％のポリペプチドまたは可変ドメインは、摂氏37度でのこのようなインキュベーション後においても依然として単量体である。一実施形態において、少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、86、87、88、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％のポリペプチド、アンタゴニスト、または可変ドメインは、摂氏50度でのこのようなインキュベーション後においても依然として未凝集である。一実施形態において、少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、86、87、88、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％のポリペプチドまたは可変ドメインは、摂氏50度でのこのようなインキュベーション後においても依然として単量体である。一実施形態では、任意の1種類のこのようなインキュベーション後においても、ポリペプチド、可変ドメイン、アンタゴニストの凝集は見られない。一実施形態において、ポリペプチドまたは可変ドメインのpIは、摂氏37度、Britton-Robinson緩衝液中1mg/mlのポリペプチド濃度または可変ドメイン濃度でのインキュベーション後において依然として不変である、または実質的に不変である。
【００６６】
本発明の一態様において、本発明のポリペプチド、可変ドメイン、アンタゴニスト、組成物、または製剤は、7〜7.5のpH(例えば、pH7またはpH7.5)におけるBritton-Robinson緩衝液中4℃で7日間わたるインキュベーション(100mg/mlのポリペプチド濃度または可変ドメイン濃度での)後において実質的に安定である。一実施形態において、少なくとも95、95.5、96、96.5、97、97.5、98、98.5、99、または99.5％のポリペプチド、アンタゴニスト、または可変ドメインは、このようなインキュベーション後においても依然として未凝集である。一実施形態において、少なくとも95、95.5、96、96.5、97、97.5、98、98.5、99、または99.5％のポリペプチドまたは可変ドメインは、このようなインキュベーション後においても依然として単量体である。一実施形態では、任意の1種類のこのようなインキュベーション後においても、ポリペプチド、可変ドメイン、アンタゴニストの凝集は見られない。
【００６７】
本発明の一態様において、本発明のポリペプチド、可変ドメイン、アンタゴニスト、組成物、または製剤は、例えば、ジェット噴霧器、例えば、Pari LC+カップ内における、例えば、室温、摂氏20度、または37℃で1時間にわたる噴霧(40mg/mlのポリペプチド濃度または可変ドメイン濃度での)後において実質的に安定である。一実施形態において、少なくとも65、70、75、80、85、86、87、88、90、91、92、93、94、95、95.5、96、96.5、97、97.5、98、98.5、99、または99.5％のポリペプチド、アンタゴニスト、または可変ドメインは、このような噴霧後においても依然として未凝集である。一実施形態において、少なくとも65、70、75、80、85、86、87、88、90、91、92、93、94、95、95.5、96、96.5、97、97.5、98、98.5、99、または99.5％のポリペプチドまたは可変ドメインは、このような噴霧後においても依然として単量体である。一実施形態では、任意の1種類のこのような噴霧後においても、ポリペプチド、可変ドメイン、アンタゴニストの凝集は見られない。
【００６８】
本発明の任意の態様による可変ドメインは、MRC-5細胞アッセイにおいてTNFαにより刺激されたIL-8放出を2nM〜50pMのND50により中和しうる。本発明のアンタゴニスト、使用、方法、デバイス、または製剤は、このような可変ドメインを含みうる。
【００６９】
一態様において、本発明は、本発明の任意の態様による免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドをコードするか、または本発明の任意の態様によるポリペプチド、アンタゴニスト、または可変ドメインをコードする単離または組み換えの核酸を提供する。一態様において、本発明は、核酸を含むベクターを提供する。一態様において、本発明は、核酸またはベクターを含む宿主細胞を提供する。一態様において、本発明は、免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドを作製する方法であって、前記核酸またはベクターの発現に適する条件下に宿主細胞を維持し、それにより、免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドを作製するステップを含む方法を提供する。該方法は、ポリペプチド、可変ドメイン、またはアンタゴニストを単離するステップと、任意により、単離されたポリペプチド、可変ドメイン、またはアンタゴニストよりも改善された親和性および/またはND50を有する変異体、例えば、突然変異させた変異体を作製するステップとをさらに含みうる。免疫グロブリン単一可変ドメインの結合親和性を改善する技法、例えば、親和性成熟法は、当技術分野で知られている。
【００７０】
一態様において、本発明は、本発明の任意の態様の免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、またはアンタゴニストと、製薬上許容される担体、賦形剤、または希釈剤とを含む医薬組成物を提供する。
【００７１】
一実施形態において、本発明の任意の態様の免疫グロブリン単一可変ドメインまたはアンタゴニストは、抗体定常ドメイン、例えば、任意により、FcのN末端が可変ドメインのC末端に連結される(任意により、直接連結される)抗体Fcを含む。
【００７２】
本発明のポリペプチドまたは可変ドメインは、単離体および/または組み換え体でありうる。
【００７３】
本明細書では、プロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチドを選択する方法が説明される。該方法は、ペプチドまたはポリペプチドのレパートリーを提供するステップと、プロテアーゼ活性に適する条件下でレパートリーとプロテアーゼとを組み合わせるステップと、所望の生物学的活性(例えば、TNFR1に対する特異的結合)を有するペプチドまたはポリペプチドを回収し、それにより、プロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチドを選択するステップとを含む。
【００７４】
レパートリーとプロテアーゼとは、一般に、少なくとも約30分間にわたりインキュベートされる。該方法では、以下、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、チオールプロテアーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼ(カルボキシペプチダーゼA、カルボキシペプチダーゼB)、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、エラスターゼ、ロイコザイム、パンクレアチン、トロンビン、プラスミン、カテプシン(例えば、カテプシンG)、プロテイナーゼ(例えば、プロテイナーゼ1、プロテイナーゼ2、プロテイナーゼ3)、テルモリシン、キモシン、エンテロペプチダーゼ、カスパーゼ(例えば、カスパーゼ1、カスパーゼ2、カスパーゼ4、カスパーゼ5、カスパーゼ9、カスパーゼ12、カスパーゼ13)、カルパイン、フィカイン、クロストリパイン、アクチニダイン、ブロメライン、およびセパラーゼのうちの１以上など、任意の所望のプロテアーゼを用いることができる。具体的な実施形態において、プロテアーゼは、トリプシン、エラスターゼ、またはロイコザイムである。プロテアーゼはまた、生物学的抽出物、生物学的ホモジネート、または生物学的調製物によっても提供することができる。所望の場合、該方法は、インキュベーションの完了後、レパートリーとプロテアーゼとの組合せにプロテアーゼ阻害剤を添加するステップをさらに含む。
【００７５】
一部の実施形態において、所望の生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドは、結合活性に基づいて回収される。例えば、ペプチドまたはポリペプチドは、プロテインA、プロテインG、またはプロテインLなどの一般リガンドに対する結合に基づいて回収される。結合活性はまた、標的リガンドに対する特異的結合でもありうる。例示的な標的リガンドは、ApoE、Apo-SAA、BDNF、カルジオトロフィン-1、CEA、CD40、CD40リガンド、CD56、CD38、CD138、EGF、EGF受容体、ENA-78、エオタキシン、エオタキシン-2、エクソダス-2、FAPα、酸性FGF、塩基性FGF、線維芽細胞成増殖因子-10、FLT3リガンド、フラクタルカイン(CX3C)、GDNF、G-CSF、GM-CSF、GF-β1、ヒト血清アルブミン、インスリン、IFN-γ、IGF-I、IGF-II、IL-1α、IL-1β、IL-1受容体、IL-1受容体1型、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8(72アミノ酸)、IL-8(77アミノ酸)、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18(IGIF)、インヒビンα、インヒビンβ、IP-10、ケラチノサイト成長因子-2(KGF-2)、KGF、レプチン、LIF、リンホタクチン、ミュラー管抑制物質、単球コロニー阻害因子、単球付着タンパク質、M-CSF、MDC(67アミノ酸)、MDC(69アミノ酸)、MCP-1(MCAF)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MDC(67アミノ酸)、MDC(69アミノ酸)、MIG、MIP-1α、MIP-1β、MIP-3α、MIP-3β、MIP-4、骨髄始原細胞阻害因子-1(MPIF-1)、NAP-2、ニュールツリン、神経成長因子、β-NGF、NT-3、NT-4、オンコスタチンM、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PF-4、RANTES、SDF1α、SDF1β、SCF、SCGF、幹細胞因子(SCF)、TARC、TGF-α、TGF-β、TGF-β2、TGF-β3、腫瘍壊死因子(TNF)、TNF-α、TNF-β、TNF受容体I、TNF受容体II、TNIL-1、TPO、VEGF、VEGF A、VEGF B、VEGF C、VEGF D、VEGF受容体1、VEGF受容体2、VEGF受容体3、GCP-2、GRO/MGSA、GRO-β、GRO-γ、HCC1、1-309、HER 1、HER 2、HER 3、HER 4、血清アルブミン、vWF、アミロイドタンパク質(例えば、アミロイドアルファタンパク質)、MMP12、PDK1、IgE、IL-13Rα1、IL-13Ra2、IL-15、IL-15R、IL-16、IL-17R、IL-17、IL-18、IL-18R、IL-23 IL-23R、IL-25、CD2、CD4、CD11a、CD23、CD25、CD27、CD28、CD30、CD40、CD40L、CD56、CD138、ALK5、EGFR、FcER1、TGFb、CCL2、CCL18、CEA、CR8、CTGF、CXCL12(SDF-1)、キマーゼ、FGF、フリン、エンドセリン-1、エオタキシン(例えば、エオタキシン、エオタキシン-2、エオタキシン-3)、GM-CSF、ICAM-1、ICOS、IgE、IFNa、I-309、インテグリン、L-セレクチン、MIF、MIP4、MDC、MCP-1、MMP、好中球エラスターゼ、オステオポンチン、OX-40、PARC、PD-1、RANTES、SCF、SDF-1、シグレック8、TARC、TGFb、トロンビン、Tim-1、TNF、TRANCE、トリプターゼ、VEGF、VLA-4、VCAM、α4β7、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR8、アルファvベータ6、アルファvベータ8、cMET、CD8、vWF、アミロイドタンパク質(例えば、アミロイドアルファタンパク質)、MMP12、PDK1、およびIgEを含む。
【００７６】
具体的な実施形態において、ペプチドまたはポリペプチドは、パニングにより回収される。
【００７７】
一部の実施形態において、レパートリーは、ディスプレイシステムを含む。例えば、ディスプレイシステムは、細菌ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、エマルジョンコンパートメント化およびディスプレイ、酵母ディスプレイ、ピューロマイシンディスプレイ、細菌ディスプレイ、プラスミド上におけるディスプレイ、または共有結合ディスプレイでありうる。例示的なディスプレイシステムは、核酸のコード機能と核酸によりコードされるペプチドまたはポリペプチドの機能的特性とを連関させる。具体的な実施形態において、ディスプレイシステムは、複製可能な遺伝子パッケージを含む。
【００７８】
一部の実施形態において、ディスプレイシステムは、細菌ファージディスプレイを含む。例えば、細菌ファージは、fdファージ、M13ファージ、ラムダファージ、MS2ファージ、またはT7ファージでありうる。具体的な実施形態において、細菌ファージディスプレイシステムは、多価である。一部の実施形態において、ペプチドまたはポリペプチドは、pIII融合タンパク質として提示される。
【００７９】
他の実施形態において、該方法は、所望の生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸を増幅するステップをさらに含む。具体的な実施形態において、核酸は、ファージ増幅、細胞増殖、またはポリメラーゼ連鎖反応により増幅される。
【００８０】
一部の実施形態において、レパートリーは、免疫グロブリン単一可変ドメインのレパートリーである。具体的な実施形態において、免疫グロブリン単一可変ドメインは、重鎖可変ドメインである。より具体的な実施形態において、重鎖可変ドメインは、ヒト重鎖可変ドメインである。他の実施形態において、免疫グロブリン単一可変ドメインは、軽鎖可変ドメインである。具体的な実施形態において、軽鎖可変ドメインは、ヒト軽鎖可変ドメインである。
【００８１】
別の態様では、標的リガンド(例えば、TNFR1)に結合するペプチドまたはポリペプチドを、ペプチドまたはポリペプチドのレパートリーから高親和性により選択する方法が提供される。該方法は、ペプチドまたはポリペプチドのレパートリーを提供するステップと、プロテアーゼ活性に適する条件下でレパートリーとプロテアーゼとを組み合わせるステップと、標的リガンドに結合するペプチドまたはポリペプチドを回収するステップとを含む。
【００８２】
レパートリーとプロテアーゼとは、一般に、少なくとも約30分間にわたりインキュベートされる。該方法では、以下、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、チオールプロテアーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼ(例えば、カルボキシペプチダーゼA、カルボキシペプチダーゼB)、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、エラスターゼ、ロイコザイム、パンクレアチン、トロンビン、プラスミン、カテプシン(例えば、カテプシンG)、プロテイナーゼ(例えば、プロテイナーゼ1、プロテイナーゼ2、プロテイナーゼ3)、テルモリシン、キモシン、エンテロペプチダーゼ、カスパーゼ(例えば、カスパーゼ1、カスパーゼ2、カスパーゼ4、カスパーゼ5、カスパーゼ9、カスパーゼ12、カスパーゼ13)、カルパイン、フィカイン、クロストリパイン、アクチニダイン、ブロメライン、およびセパラーゼのうちの１以上など、任意の所望のプロテアーゼを用いることができる。具体的な実施形態において、プロテアーゼは、トリプシン、エラスターゼまたはロイコザイムである。プロテアーゼはまた、生物学的抽出物、生物学的ホモジネート、または生物学的調製物によっても提供することができる。所望の場合、該方法は、インキュベーションの完了後、レパートリーとプロテアーゼとの組合せにプロテアーゼ阻害剤を添加するステップをさらに含む。
【００８３】
ペプチドまたはポリペプチドは、本明細書で開示される標的リガンド(例えば、TNFR1)など、任意の所望の標的リガンドに対する結合に基づき回収することができる。具体的な実施形態において、ペプチドまたはポリペプチドは、パニングにより回収される。
【００８４】
一部の実施形態において、レパートリーは、ディスプレイシステムを含む。例えば、ディスプレイシステムは、細菌ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、エマルジョンコンパートメント化およびディスプレイ、酵母ディスプレイ、ピューロマイシンディスプレイ、細菌ディスプレイ、プラスミド上によるディスプレイ、または共有結合ディスプレイでありうる。例示的なディスプレイシステムにより、核酸のコード機能と核酸によりコードされるペプチドまたはポリペプチドの機能的特性とが連関する。具体的な実施形態において、ディスプレイシステムは、複製可能な遺伝子パッケージを含む。
【００８５】
一部の実施形態において、ディスプレイシステムは、細菌ファージディスプレイを含む。例えば、細菌ファージは、fdファージ、M13ファージ、λファージ、MS2ファージ、またはT7ファージでありうる。具体的な実施形態において、細菌ファージディスプレイシステムは、多価である。一部の実施形態において、ペプチドまたはポリペプチドは、pIII融合タンパク質として提示される。
【００８６】
他の実施形態において、該方法は、所望の生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸を増幅するステップをさらに含む。具体的な実施形態において、核酸は、ファージ増幅、細胞増殖、またはポリメラーゼ連鎖反応により増幅される。
【００８７】
一部の実施形態において、レパートリーは、免疫グロブリン単一可変ドメインのレパートリーである。具体的な実施形態において、免疫グロブリン単一可変ドメインは、重鎖可変ドメインである。より具体的な実施形態において、重鎖可変ドメインは、ヒト重鎖可変ドメインである。他の実施形態において、免疫グロブリン単一可変ドメインは、軽鎖可変ドメインである。具体的な実施形態において、軽鎖可変ドメインは、ヒト軽鎖可変ドメインである。
【００８８】
別の実施形態において、本明細書では、プロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチドのレパートリーを作製する方法が説明される。該方法は、ペプチドまたはポリペプチドのレパートリーを提供するステップと、プロテアーゼ活性に適する条件下でペプチドまたはポリペプチドのレパートリーとプロテアーゼとを組み合わせるステップと、所望の生物学的活性を有する複数のペプチドまたはポリペプチドを回収し、それにより、プロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチドのレパートリーを作製するステップとを含む。
【００８９】
一部の実施形態において、レパートリーとプロテアーゼとは、少なくとも約30分間にわたりインキュベートされる。例えば、該方法で用いられるプロテアーゼは、以下、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、チオールプロテアーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼ(例えば、カルボキシペプチダーゼA、カルボキシペプチダーゼB)、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、エラスターゼ、ロイコザイム、パンクレアチン、トロンビン、プラスミン、カテプシン(例えば、カテプシンG)、プロテイナーゼ(例えば、プロテイナーゼ1、プロテイナーゼ2、プロテイナーゼ3)、テルモリシン、キモシン、エンテロペプチダーゼ、カスパーゼ(例えば、カスパーゼ1、カスパーゼ2、カスパーゼ4、カスパーゼ5、カスパーゼ9、カスパーゼ12、カスパーゼ13)、カルパイン、フィカイン、クロストリパイン、アクチニダイン、ブロメライン、およびセパラーゼのうち１以上でありうる。具体的な実施形態において、プロテアーゼは、トリプシン、エラスターゼまたはロイコザイムである。プロテアーゼはまた、生物学的抽出物、生物学的ホモジネート、または生物学的調製物によっても提供することができる。所望の場合、該方法は、インキュベーションの完了後、レパートリーとプロテアーゼとの組合せにプロテアーゼ阻害剤を添加するステップをさらに含む。
【００９０】
一部の実施形態において、所望の生物学的活性を有する複数のペプチドまたはポリペプチドは、結合活性に基づいて回収される。例えば、複数のペプチドまたはポリペプチドは、プロテインA、プロテインG、またはプロテインLなどの一般リガンドに対する結合に基づいて回収される。結合活性はまた、本明細書で説明される標的リガンドなど、標的リガンドに対する特異的結合でもありうる。具体的な実施形態において、所望の生物学的活性を有する複数のペプチドまたはポリペプチドは、パニングにより回収される。
【００９１】
一部の実施形態において、レパートリーは、ディスプレイシステムを含む。例えば、ディスプレイシステムは、細菌ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、エマルジョンコンパートメント化およびディスプレイ、酵母ディスプレイ、ピューロマイシンディスプレイ、細菌ディスプレイ、プラスミド上によるディスプレイ、または共有結合ディスプレイでありうる。具体的な実施形態では、ディスプレイシステムにより、核酸のコード機能と核酸によりコードされるペプチドまたはポリペプチドの機能的特性とが連関する。具体的な実施形態において、ディスプレイシステムは、複製可能な遺伝子パッケージを含む。
【００９２】
一部の実施形態において、ディスプレイシステムは、細菌ファージディスプレイを含む。例えば、細菌ファージは、fdファージ、M13ファージ、ラムダファージ、MS2ファージ、またはT7ファージでありうる。具体的な実施形態において、細菌ファージディスプレイシステムは、多価である。一部の実施形態において、ペプチドまたはポリペプチドは、pIII融合タンパク質として提示される。
【００９３】
他の実施形態において、該方法は、所望の生物学的活性を有する複数のペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸を増幅するステップをさらに含む。具体的な実施形態において、核酸は、ファージ増幅、細胞増殖、またはポリメラーゼ連鎖反応により増幅される。
【００９４】
一部の実施形態において、レパートリーは、免疫グロブリン単一可変ドメインのレパートリーである。具体的な実施形態において、免疫グロブリン単一可変ドメインは、重鎖可変ドメインである。より具体的な実施形態において、重鎖可変ドメインは、ヒト重鎖可変ドメインである。他の実施形態において、免疫グロブリン単一可変ドメインは、軽鎖可変ドメインである。具体的な実施形態において、軽鎖可変ドメインは、ヒト軽鎖可変ドメインである。
【００９５】
別の態様において、本明細書では、標的リガンド(例えば、TNFR1)に結合する免疫グロブリン単一可変ドメイン(dAb)を含むプロテアーゼ耐性ポリペプチドをレパートリーから選択する方法が説明される。一実施形態において、該方法は、免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドのレパートリーを含むファージディスプレイシステムを提供するステップと、プロテアーゼ活性に適する条件下でファージディスプレイシステムと、エラスターゼ、ロイコザイム、およびトリプシンからなる群から選択されるプロテアーゼとを組み合わせるステップと、標的リガンドに結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドを提示するファージを回収するステップとを含む。
【００９６】
一部の実施形態では、プロテアーゼを100μg/mlで用い、ファージディスプレイシステムとプロテアーゼとの組合せを約37℃で一晩インキュベートする。
【００９７】
一部の実施形態において、標的リガンドに結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドを提示するファージは、前記標的に対する結合により回収される。他の実施形態において、標的リガンドに結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドを提示するファージは、パニングにより回収される。
【００９８】
本明細書ではまた、本明細書で説明される方法により選択可能なまたはそれにより選択される、単離されたプロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチドについても説明される。具体的な実施形態では、本明細書で説明される方法により選択可能なまたはそれにより選択される、単離されたプロテアーゼ(例えば、トリプシン、エラスターゼ、ロイコザイム)耐性免疫グロブリン単一可変ドメイン(例えば、ヒト抗体重鎖可変ドメイン、ヒト抗体軽鎖可変ドメイン)についても説明される。
【００９９】
本明細書では、本明細書で説明される方法により選択可能なまたはそれにより選択されるプロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチド(例えば、トリプシン耐性免疫グロブリン単一可変ドメイン、エラスターゼ耐性免疫グロブリン単一可変ドメイン、またはロイコザイム耐性免疫グロブリン単一可変ドメイン)をコードする単離または組み換えの核酸、ならびに該核酸を含むベクター(例えば、発現ベクター)および宿主細胞についてもさらに説明される。
【０１００】
本明細書では、本明細書で説明される方法により選択可能なまたはそれにより選択されるプロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチド(例えば、トリプシン耐性免疫グロブリン単一可変ドメイン、エラスターゼ耐性免疫グロブリン単一可変ドメイン、またはロイコザイム耐性免疫グロブリン単一可変ドメイン)を製造する方法であって、プロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチドをコードする組み換え核酸を含有する宿主細胞を発現に適する条件下で維持し、それにより、プロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチドを製造するステップを含む方法についてもさらに説明される。
【０１０１】
本明細書では、医療で(例えば、治療または診断のために)用いられる、本明細書で説明される方法により選択可能なまたはそれにより選択されるプロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチド(例えば、トリプシン耐性免疫グロブリン単一可変ドメイン、エラスターゼ耐性免疫グロブリン単一可変ドメイン、またはロイコザイム耐性免疫グロブリン単一可変ドメイン)についてもさらに説明される。本明細書では、疾患を治療する医薬の製造のための、本明細書で説明される方法により選択可能なまたはそれにより選択されるプロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチド(例えば、トリプシン耐性免疫グロブリン単一可変ドメイン、エラスターゼ耐性免疫グロブリン単一可変ドメイン、またはロイコザイム耐性免疫グロブリン単一可変ドメイン)の使用についてもさらに説明される。本明細書では、本明細書で説明される方法により選択可能なまたはそれにより選択される有効量のプロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチド(例えば、トリプシン耐性免疫グロブリン単一可変ドメイン、エラスターゼ耐性免疫グロブリン単一可変ドメイン、またはロイコザイム耐性免疫グロブリン単一可変ドメイン)を、それを必要とする被験体に投与するステップを含む、疾患の治療法についてもさらに説明される。
【０１０２】
本明細書では、本発明のポリペプチド、免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)、またはアンタゴニストと、使用説明書(例えば、試料中におけるTNFR1の存在および/または量を決定するための)とを含み、試料中にTNFR1が存在するかどうか、または試料中にどのくらいのTNFR1が存在するかを決定するための診断用キットについてさらに説明される。一部の実施形態において、該キットは、適切な緩衝液または適切な検出用試薬(例えば、本発明のポリペプチドもしくはdAbまたはこれらに結合もしくはコンジュゲートする部分に結合する、検出可能な形で標識された抗体またはその抗原結合フラグメント)など、1種または複数種の付属試薬をさらに含む。
【０１０３】
本発明はまた、固定されたポリペプチドまたはdAbがTNFR1に結合するように、その上に本発明のポリペプチド、アンタゴニスト、またはdAbが固定される固体表面を含むデバイスにも関する。例えば、ガラス、プラスチック、炭水化物(例えば、アガロースビーズ)など、その上に抗体またはその抗原結合フラグメントを固定しうる任意の適切な固体表面を用いることができる。所望の場合、支持体は、固定を容易化する所望の官能基を含有する場合もあり、これを含有するように改変する場合もある。該デバイスおよび/または支持体は、例えば、シート、ロッド、ストリップ、プレート、スライド、ビーズ、ペレット、ディスク、ゲル、チューブ、球体、チップ、プレート、またはディッシュなど任意の適切な形状を有しうる。一部の実施形態において、該デバイスは、ディップスティックである。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】ファージディスプレイレパートリーを作製するために用いたpDOM13(pDOM33としても知られる)のマルチクローニング部位を示す図である。
【図２】40μg/mlトリプシンと共に30℃でインキュベートしたdAbの様々な時点の試料を泳動した複数のNovex 10〜20％トリシン(Tricene)ゲルを示す写真である。試料は、トリプシンの添加の直前、1時間後、3時間後、および24時間後に取得した。タンパク質を1×SureBlueを用いて染色した。ゲルは、DOM15-10およびDOM15-26-501の両方がトリプシンとのインキュベーションの初めの3時間の間に著しく消化されたことを示している。DOM15-26、DOM4-130-54、およびDOM1h-131-511の消化は、トリプシンとのインキュベーションの24時間後に初めて明らかになった。
【図３】DOM1h-131-511および24個の選択した変異体のアミノ酸配列を示す図である。選択したクローンにおける親配列と異なるアミノ酸は強調してある(同一のアミノ酸は点で示した)。CDR1、CDR2、およびCDR3に相当するループは四角で囲んだ。
【図４】DOM4-130-54および27個の選択した変異体のアミノ酸配列を示す図である。選択したクローンにおける親配列と異なるアミノ酸は強調してある(同一のアミノ酸は点で示した)。CDR1、CDR2、およびCDR3に相当するループは四角で囲んだ。
【図５】DOM15-26-555および21個の選択した変異体のアミノ酸配列を示す図である。選択したクローンにおける親配列と異なるアミノ酸は強調してある(同一のアミノ酸は点で示した)。CDR1、CDR2、およびCDR3に相当するループは四角で囲んだ。
【図６】DOM15-10および16個の選択した変異体のアミノ酸配列を示す図である。選択したクローンにおける親配列と異なるアミノ酸は強調してある(同一のアミノ酸は点で示した)。CDR1、CDR2、およびCDR3に相当するループは四角で囲んだ。
【図７Ａ】種々の濃度(0〜100μg/ml)のトリプシンと共に37℃で一晩インキュベートした後の親dAb、DOM1h-131-511(図7A)および3つの変異体dAb、DOM1h-131-203(図7B)、DOM1h-131-204(図7C)、およびDOM1h-131-206(図7D)の固定化TNFR1に対する結合を示すBIAcoreトレース図である。結果は、3つすべての変異体が、高濃度(100μg/ml)のトリプシンでのタンパク質分解に対して親よりも耐性が高いことを示している。
【図７Ｂ】種々の濃度(0〜100μg/ml)のトリプシンと共に37℃で一晩インキュベートした後の親dAb、DOM1h-131-511(図7A)および3つの変異体dAb、DOM1h-131-203(図7B)、DOM1h-131-204(図7C)、およびDOM1h-131-206(図7D)の固定化TNFR1に対する結合を示すBIAcoreトレース図である。結果は、3つすべての変異体が、高濃度(100μg/ml)のトリプシンでのタンパク質分解に対して親よりも耐性が高いことを示している。
【図７Ｃ】種々の濃度(0〜100μg/ml)のトリプシンと共に37℃で一晩インキュベートした後の親dAb、DOM1h-131-511(図7A)および3つの変異体dAb、DOM1h-131-203(図7B)、DOM1h-131-204(図7C)、およびDOM1h-131-206(図7D)の固定化TNFR1に対する結合を示すBIAcoreトレース図である。結果は、3つすべての変異体が、高濃度(100μg/ml)のトリプシンでのタンパク質分解に対して親よりも耐性が高いことを示している。
【図７Ｄ】種々の濃度(0〜100μg/ml)のトリプシンと共に37℃で一晩インキュベートした後の親dAb、DOM1h-131-511(図7A)および3つの変異体dAb、DOM1h-131-203(図7B)、DOM1h-131-204(図7C)、およびDOM1h-131-206(図7D)の固定化TNFR1に対する結合を示すBIAcoreトレース図である。結果は、3つすべての変異体が、高濃度(100μg/ml)のトリプシンでのタンパク質分解に対して親よりも耐性が高いことを示している。
【図８Ａ】エラスターゼおよびロイコザイム(leucozyme)と共に一晩インキュベートした後のdAb DOM1h-131-511(図8A)、DOM1h-131-202(図8B)、およびDOM1h-131-206(図8C)の固定化TNFR1に対する結合を示すBIAcoreトレース図である。これらのdAbは、エラスターゼおよびロイコザイムの両方に対して、親と比較したタンパク質分解に対する耐性の上昇を示している。
【図８Ｂ】エラスターゼおよびロイコザイム(leucozyme)と共に一晩インキュベートした後のdAb DOM1h-131-511(図8A)、DOM1h-131-202(図8B)、およびDOM1h-131-206(図8C)の固定化TNFR1に対する結合を示すBIAcoreトレース図である。これらのdAbは、エラスターゼおよびロイコザイムの両方に対して、親と比較したタンパク質分解に対する耐性の上昇を示している。
【図８Ｃ】エラスターゼおよびロイコザイム(leucozyme)と共に一晩インキュベートした後のdAb DOM1h-131-511(図8A)、DOM1h-131-202(図8B)、およびDOM1h-131-206(図8C)の固定化TNFR1に対する結合を示すBIAcoreトレース図である。これらのdAbは、エラスターゼおよびロイコザイムの両方に対して、親と比較したタンパク質分解に対する耐性の上昇を示している。
【図９】トリプシンとのインキュベーションの前および100μg/mlトリプシンで1時間、3時間、および24時間インキュベーションした後のdAb DOM1h-131-511、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、DOM1h-131-206、DOM1h-131-54、DOM1h-131-201、およびDOM1h-131-202の試料を泳動した2つの4〜12％ Novex Bis-Trisゲルを示す写真である。
【図１０Ａ】種々の濃度(0〜100μg/ml)のトリプシンと共に37℃で一晩インキュベートした後のDOM4-130-54(図10A)、DOM4-130-201(図10B)、およびDOM4-130-202(図10C)の固定化IL-1R1融合タンパク質に対する結合を示すBIAcoreトレース図である。結果は、両方の変異体が、高濃度(100μg/ml)のトリプシンでのタンパク質分解に対して親よりも耐性が高いことを示している。
【図１０Ｂ】種々の濃度(0〜100μg/ml)のトリプシンと共に37℃で一晩インキュベートした後のDOM4-130-54(図10A)、DOM4-130-201(図10B)、およびDOM4-130-202(図10C)の固定化IL-1R1融合タンパク質に対する結合を示すBIAcoreトレース図である。結果は、両方の変異体が、高濃度(100μg/ml)のトリプシンでのタンパク質分解に対して親よりも耐性が高いことを示している。
【図１０Ｃ】種々の濃度(0〜100μg/ml)のトリプシンと共に37℃で一晩インキュベートした後のDOM4-130-54(図10A)、DOM4-130-201(図10B)、およびDOM4-130-202(図10C)の固定化IL-1R1融合タンパク質に対する結合を示すBIAcoreトレース図である。結果は、両方の変異体が、高濃度(100μg/ml)のトリプシンでのタンパク質分解に対して親よりも耐性が高いことを示している。
【図１１Ａ】エラスターゼおよびロイコザイムと共に一晩インキュベートした後のDOM4-130-54(図11A)、DOM4-130-201(図11B)、およびDOM4-130-202(図11C)の固定化IL-1R1融合タンパク質に対する結合を示すBIAcoreトレース図である。これらのdAbは、試験されたプロテアーゼの両方に対して、親と比較したタンパク質分解に対する耐性の上昇を示している。
【図１１Ｂ】エラスターゼおよびロイコザイムと共に一晩インキュベートした後のDOM4-130-54(図11A)、DOM4-130-201(図11B)、およびDOM4-130-202(図11C)の固定化IL-1R1融合タンパク質に対する結合を示すBIAcoreトレース図である。これらのdAbは、試験されたプロテアーゼの両方に対して、親と比較したタンパク質分解に対する耐性の上昇を示している。
【図１１Ｃ】エラスターゼおよびロイコザイムと共に一晩インキュベートした後のDOM4-130-54(図11A)、DOM4-130-201(図11B)、およびDOM4-130-202(図11C)の固定化IL-1R1融合タンパク質に対する結合を示すBIAcoreトレース図である。これらのdAbは、試験されたプロテアーゼの両方に対して、親と比較したタンパク質分解に対する耐性の上昇を示している。
【図１２】DOM15-26-555および6個の変異体のアミノ酸配列を示す図である。選択したクローンにおける親配列と異なるアミノ酸は強調してある(同一のアミノ酸は点で示した)。
【図１３】親dAb DOM15-26-555(図13A)およびプロテアーゼ耐性が最も高い変異体DOM15-26-593(図13B)の固定化VEGFに対する結合を示すBIAcoreトレース図である。親および変異体を、200μg/mlの濃度のトリプシンと共にインキュベーションした後、100nMの濃度のdAbでのhVEGF結合についてBIAcoreで比較した。反応は、37℃で3時間または24時間行った。結果は、変異体が、トリプシン処理の24時間後、タンパク質分解に対して親よりも耐性が高いことを示している。
【図１４】DOM15-26-555変異体によるhVEGF結合に対するトリプシン処理の影響を示すグラフである。結果は、すべての変異体が、トリプシン処理の24時間後、タンパク質分解に対して親(DOM15-26-555)よりも耐性が高いことを明確に示している。
【図１５】DOM15-26-555またはDOM15-26-593の処理および未処理試料15μgをロードした2つのNovex 10〜20％トリシン(Tricine)ゲルを示す写真である。試料は、トリプシン添加の直前、1時間後、3時間後、および24時間後に取得した。タンパク質を1×SureBlueを用いて染色した。ゲルは、DOM15-26-593のトリプシン耐性プロフィールがBIAcore実験によって示されたプロフィールとは異なっていることを示している。
【図１６】DOM15-10および変異体DOM15-10-11のアミノ酸配列を示す図である。変異体における親配列と異なるアミノ酸は強調してある(同一のアミノ酸は点で示した)。
【図１７】親DOM15-10(図17A)および変異体DOM15-10-11(図17B)の固定化VEGFに対する結合を示すBIAcoreトレースである。親および変異体を、200μg/mlの濃度でトリプシンと共にインキュベートした後、100nMの濃度のdAbでのhVEGF結合についてBIAcoreで比較した。反応は、37℃で1時間、3時間、および24時間行った。結果は、変異体が、トリプシン処理の24時間後、タンパク質分解に対して親よりも耐性が高いことを示している。
【図１８】DOM15-10およびDOM15-10-11の試料15μgをロードした2つのNovex 10〜20％トリシン(Tricene)ゲルを示す写真である。試料は、トリプシン添加の直前、1時間後、3時間後、および24時間後に取得した。タンパク質をSureBlue(1×)を用いて染色した。結果は、BIAcore試験で確認された結合活性が、タンパク質の完全性を直接反映していることを示している。
【図１９Ａ】DOM1h-131-511またはDOM4-130-54の変異体であるdAbをコードする複数の核酸のヌクレオチド配列を示す図である。これらのヌクレオチド配列は、図3および図4のそれぞれに示したアミノ酸配列をコードしている。
【図１９Ｂ】DOM1h-131-511またはDOM4-130-54の変異体であるdAbをコードする複数の核酸のヌクレオチド配列を示す図である。これらのヌクレオチド配列は、図3および図4のそれぞれに示したアミノ酸配列をコードしている。
【図１９Ｃ】DOM1h-131-511またはDOM4-130-54の変異体であるdAbをコードする複数の核酸のヌクレオチド配列を示す図である。これらのヌクレオチド配列は、図3および図4のそれぞれに示したアミノ酸配列をコードしている。
【図１９Ｄ】DOM1h-131-511またはDOM4-130-54の変異体であるdAbをコードする複数の核酸のヌクレオチド配列を示す図である。これらのヌクレオチド配列は、図3および図4のそれぞれに示したアミノ酸配列をコードしている。
【図１９Ｅ】DOM1h-131-511またはDOM4-130-54の変異体であるdAbをコードする複数の核酸のヌクレオチド配列を示す図である。これらのヌクレオチド配列は、図3および図4のそれぞれに示したアミノ酸配列をコードしている。
【図１９Ｆ】DOM1h-131-511またはDOM4-130-54の変異体であるdAbをコードする複数の核酸のヌクレオチド配列を示す図である。これらのヌクレオチド配列は、図3および図4のそれぞれに示したアミノ酸配列をコードしている。
【図１９Ｇ】DOM1h-131-511またはDOM4-130-54の変異体であるdAbをコードする複数の核酸のヌクレオチド配列を示す図である。これらのヌクレオチド配列は、図3および図4のそれぞれに示したアミノ酸配列をコードしている。
【図１９Ｈ】DOM1h-131-511またはDOM4-130-54の変異体であるdAbをコードする複数の核酸のヌクレオチド配列を示す図である。これらのヌクレオチド配列は、図3および図4のそれぞれに示したアミノ酸配列をコードしている。
【図１９Ｉ】DOM1h-131-511またはDOM4-130-54の変異体であるdAbをコードする複数の核酸のヌクレオチド配列を示す図である。これらのヌクレオチド配列は、図3および図4のそれぞれに示したアミノ酸配列をコードしている。
【図１９Ｊ】DOM1h-131-511またはDOM4-130-54の変異体であるdAbをコードする複数の核酸のヌクレオチド配列を示す図である。これらのヌクレオチド配列は、図3および図4のそれぞれに示したアミノ酸配列をコードしている。
【図１９Ｋ】DOM1h-131-511またはDOM4-130-54の変異体であるdAbをコードする複数の核酸のヌクレオチド配列を示す図である。これらのヌクレオチド配列は、図3および図4のそれぞれに示したアミノ酸配列をコードしている。
【図１９Ｌ】DOM1h-131-511またはDOM4-130-54の変異体であるdAbをコードする複数の核酸のヌクレオチド配列を示す図である。これらのヌクレオチド配列は、図3および図4のそれぞれに示したアミノ酸配列をコードしている。
【図２０Ａ】DOM15-26-555またはDOM15-10の変異体であるdAbをコードする複数の核酸のヌクレオチド配列を示す図である。これらのヌクレオチド配列は、図5および図6のそれぞれに示したアミノ酸配列をコードしている。
【図２０Ｂ】DOM15-26-555またはDOM15-10の変異体であるdAbをコードする複数の核酸のヌクレオチド配列を示す図である。これらのヌクレオチド配列は、図5および図6のそれぞれに示したアミノ酸配列をコードしている。
【図２０Ｃ】DOM15-26-555またはDOM15-10の変異体であるdAbをコードする複数の核酸のヌクレオチド配列を示す図である。これらのヌクレオチド配列は、図5および図6のそれぞれに示したアミノ酸配列をコードしている。
【図２０Ｄ】DOM15-26-555またはDOM15-10の変異体であるdAbをコードする複数の核酸のヌクレオチド配列を示す図である。これらのヌクレオチド配列は、図5および図6のそれぞれに示したアミノ酸配列をコードしている。
【図２０Ｅ】DOM15-26-555またはDOM15-10の変異体であるdAbをコードする複数の核酸のヌクレオチド配列を示す図である。これらのヌクレオチド配列は、図5および図6のそれぞれに示したアミノ酸配列をコードしている。
【図２１】pDOM 38のベクターマップを示す図である。
【図２２】30℃で様々な時間、dAb:トリプシンの比率が25:1でトリプシン処理したDOM10-53-474およびDOM15-26-593タンパク質のLabchipで泳動したゲルを示す写真である。矢印は、完全長タンパク質を示している。
【図２３−１】MMCクロマトグラフィーおよびこれに続く陰イオン交換によって精製した後の各試料に対して得られた高レベルの純度を示すサイズ排除クロマトグラフィーのトレースである。225nmでUVをモニタリングし、1×PBS 10％エタノール(v/v)中でカラムにかけた。モノマーのパーセンテージを、ベースライン補正したピーク面積の積分によって算出した。
【図２３−２】MMCクロマトグラフィーおよびこれに続く陰イオン交換によって精製した後の各試料に対して得られた高レベルの純度を示すサイズ排除クロマトグラフィーのトレースである。225nmでUVをモニタリングし、1×PBS 10％エタノール(v/v)中でカラムにかけた。モノマーのパーセンテージを、ベースライン補正したピーク面積の積分によって算出した。
【図２４】DOM1h-131-511、DOM1h-131-202、およびDOM1h-131-206のプロテアーゼ安定性のデータを示す。
【図２５】37℃および50℃でBritton-Robinson緩衝液中のDOM1h-131-202、DOM1h-131-206、およびDOM1h-131-511の14日までの安定性データを示すSECである。すべてのdAbのタンパク質濃度は1mg/mlとした。SECを用いて、熱ストレスがかかった際にタンパク質に変化が生じたか否かを決定し、時間=0(T0)の試料と比較して溶液中に残ったモノマーの量を測定した。
【図２６−１】DOM1h-131-511(A〜C)、DOM1h-131-202(D〜F)、およびDOM1h-131-206(G〜I)に対する熱ストレス(37℃および50℃)の影響を示すSECトレースである。また、T=0と比較して所与の時点における溶液中に残ったモノマーのパーセンテージも示している。
【図２６−２】DOM1h-131-511(A〜C)、DOM1h-131-202(D〜F)、およびDOM1h-131-206(G〜I)に対する熱ストレス(37℃および50℃)の影響を示すSECトレースである。また、T=0と比較して所与の時点における溶液中に残ったモノマーのパーセンテージも示している。
【図２６−３】DOM1h-131-511(A〜C)、DOM1h-131-202(D〜F)、およびDOM1h-131-206(G〜I)に対する熱ストレス(37℃および50℃)の影響を示すSECトレースである。また、T=0と比較して所与の時点における溶液中に残ったモノマーのパーセンテージも示している。
【図２７】熱ストレス実験から24時間後、48時間後、7日後、および14日後のDOM1h-131-202、DOM1h-131-206、およびDOM1h-131-511のIEF分析を示す。試料は、Britton-Robinson緩衝液中で37℃または50℃でインキュベートした。
【図２８】TNFR-1のRBAによる、DOM1h-131-202、DOM1h-131-206、およびDOM1h-131-511の50℃での14日間のインキュベーションの影響を示す。タンパク質濃度を1mg/mlとした。抗原に結合しない陰性対照dAb(VHダミー)も示している。
【図２９−１】約100mg/mlのA:DOM1h-131-202、B:DOM1h-131-206、およびC:DOM1h-131-511を、+4℃でBritton-Robinson緩衝液中で7日間保存した影響を示す。UVを280nmでモニタリングした。
【図２９−２】約100mg/mlのA:DOM1h-131-202、B:DOM1h-131-206、およびC:DOM1h-131-511を、+4℃でBritton-Robinson緩衝液中で7日間保存した影響を示す。UVを280nmでモニタリングした。
【図３０】Pari E-flowおよびLC+でのDOM1h-131-202、DOM1h-131-206、およびDOM1h-131-511の噴霧化試験のデータを示す。タンパク質の濃度は、Britton-Robinson緩衝液中で5mg/mlとした。
【図３１】Britton-Robinson緩衝液中で5mg/mlでのDOM1h-131-202、DOM1h-131-206、およびDOM1h-131-511の噴霧化の際のモノマー濃度の相対変化率(％)を示すグラフである。
【図３２】Pari LC+で噴霧化された後のBritton-Robinson緩衝液中のDOM1h-131-206およびDOM1h-131-511のSECトレース図である。
【図３３】PBS中で40mg/mlでのDOM1h-131-206の1時間の噴霧化プロセス中のSECトレースである。噴霧カップおよびエアロゾルの両方でのタンパク質は、噴霧化の際にdAbが受けうるせん断ストレスおよび熱ストレスの影響に対する耐性が高い。
【図３４】3つのリードタンパク質(DOM1h-131-206、DOM1h-131-511、およびDOM1h-131-202)のそれぞれの沈降速度曲線を示す。低濃度の試料DOM1h-131-206について観察された二峰性ピークは、この場合はセルからの試料の漏れによるアーチファクトである。
【図３５】GSK 1995056A(DOM1h-131-511)の噴霧化液滴サイズに対する緩衝液およびデバイスの影響を示す。
【図３６】SECによって測定した二量体形成により評価した様々なデバイスでの噴霧化後のGSK1995056A(DOM1h-131-511)の安定性を示す。
【図３７】Pari E-flowおよびLC+でのGSK1922567A(202)、GSK1995057A(206)、およびGSK1995056A(511)の噴霧化試験を示す。Aは、Britton-Robinson緩衝液中で試験し、Bは、PEG1000/スクロース緩衝液中で試験した。
【図３８】ヒトTNFR1受容体結合アッセイでのTNF-αの用量曲線を示す。各試料は、4回反復試験した。
【図３９】ヒトTNFR1受容体結合アッセイでのGSK1922567A(DOM1h-131-202)、GSK1995057A(DOM1h-131-206)、およびGSK1995056A(DOM1h-131-511)による阻害を示す。各試料は、4回反復試験した。
【図４０】VEGF RBAでのDOM15-26およびDOM15-26-593 dAbの効力を示すグラフである。
【図４１】ラットに5mg/mgで単回ボーラスIV投与した後のDMS1529(DOM 15-26-593)およびDMS1545(DOM15-26-501)の薬物動態を示す。
【図４２】図42aは、単量体の特性を確認するDMS1529 Fc融合体(DOM 15-26-593 Fc融合体)のSEC-MALL(サイズ排除クロマトグラフィー・多角レーザー光散乱)分析を示す。屈折率(すなわち濃度、破線)および光散乱(実線)に対して同様の特性を実証する2つの異なるバッチを示している。矢印で示した線は、分子量計算を表している。図42bは、単量体の特性を確認するDMS1529 Fc融合体(DOM 15-26-593 Fc融合体)のAUC(分析的超遠心分離)分析を示す。物質の1つのバッチを、PBS緩衝液中の約0.2mg/ml、約0.5mg/ml、および約1.0mg/mlの3つの異なる濃度で試験した。沈降速度の分析により、分子量が約80kDaであることを確認した。
【図４３】DMS1529(DOM15-26-593)およびDOM15-26-501のDSCトレースである。
【図４４】2つの異なるバッチの物質に対する10回の凍結融解サイクルの前後のDMS1529(DOM 15-26-593)のVEGF結合ELISAの結果である。
【図４５】10回の凍結融解サイクルの前後のDOM 15-26-593のSECプロフィールの一貫性を示す。
【図４６】DMS1529融合体(DOM 15-26-593 Fc融合体)の加速安定性試験、すなわち図示した温度で7日間インキュベートした後の活性を実証する結合ELISAからの結果を示す。
【図４７】図47Aは、37℃で14日間および15日間インキュベートした後のヒトまたはカニクイザルにおけるDMS1529(DOM 15-26-593)の安定性を示す。図47Bは、37℃で14日間および15日間インキュベートした後のヒト血清中のDMS1529(DOM 15-26-593)の安定性を示す。
【図４８】VEGFのRBAでのFc融合体(DMS1564およびDMS1529のそれぞれ)としてのDOM15-26およびDOM15-26-593 dAbの効力を示す。
【図４９】DMS1529融合体(DOM15-26-593 FC融合体)によるHUVEC細胞増殖の阻害を示す。
【図５０】pDom33ベクターのマップである。
【図５１ａ−１】血清アルブミンに結合するdAbの配列(アミノ酸およびヌクレオチド)を示す。
【図５１ａ−２】血清アルブミンに結合するdAbの配列(アミノ酸およびヌクレオチド)を示す。
【図５１ａ−３】血清アルブミンに結合するdAbの配列(アミノ酸およびヌクレオチド)を示す。
【図５１ａ−４】血清アルブミンに結合するdAbの配列(アミノ酸およびヌクレオチド)を示す。
【図５１ａ−５】血清アルブミンに結合するdAbの配列(アミノ酸およびヌクレオチド)を示す。
【図５１ａ−６】血清アルブミンに結合するdAbの配列(アミノ酸およびヌクレオチド)を示す。
【図５１ａ−７】血清アルブミンに結合するdAbの配列(アミノ酸およびヌクレオチド)を示す。
【図５１ｂ−１】血清アルブミンに結合するdAbの配列(アミノ酸およびヌクレオチド)を示す。
【図５１ｂ−２】血清アルブミンに結合するdAbの配列(アミノ酸およびヌクレオチド)を示す。
【図５１ｂ−３】血清アルブミンに結合するdAbの配列(アミノ酸およびヌクレオチド)を示す。
【図５１ｂ−４】血清アルブミンに結合するdAbの配列(アミノ酸およびヌクレオチド)を示す。
【図５１ｂ−５】血清アルブミンに結合するdAbの配列(アミノ酸およびヌクレオチド)を示す。
【図５１ｂ−６】血清アルブミンに結合するdAbの配列(アミノ酸およびヌクレオチド)を示す。
【図５１ｂ−７】血清アルブミンに結合するdAbの配列(アミノ酸およびヌクレオチド)を示す。
【図５１ｂ−８】血清アルブミンに結合するdAbの配列(アミノ酸およびヌクレオチド)を示す。
【図５１ｂ−９】血清アルブミンに結合するdAbの配列(アミノ酸およびヌクレオチド)を示す。
【図５１ｂ−１０】血清アルブミンに結合するdAbの配列(アミノ酸およびヌクレオチド)を示す。
【図５１ｂ−１１】血清アルブミンに結合するdAbの配列(アミノ酸およびヌクレオチド)を示す。
【図５１ｂ−１２】血清アルブミンに結合するdAbの配列(アミノ酸およびヌクレオチド)を示す。
【図５１ｂ−１３】血清アルブミンに結合するdAbの配列(アミノ酸およびヌクレオチド)を示す。
【図５１ｂ−１４】血清アルブミンに結合するdAbの配列(アミノ酸およびヌクレオチド)を示す。
【図５１ｂ−１５】血清アルブミンに結合するdAbの配列(アミノ酸およびヌクレオチド)を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１０５】
本明細書では、明確で簡潔な明細書が書かれることを可能とする形で、実施形態への参照を伴いながら本発明を説明してきた。本発明から逸脱しない限りにおいて、実施形態を様々な形で組み合わせることも分離することも可能であると意図されており、また、そのように理解されたい。
【０１０６】
別段に定義しない限り、本明細書で用いられるすべての科学技術用語は、当業者(例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション法、および生化学における)により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。分子的方法、遺伝学的方法、および生化学的方法(参照により本明細書に組み込まれるSambrookら、「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」、第2版(1989)、ニューヨーク州、コールドスプリングハーバー、Cold Spring Harbor Laboratory Press社、およびAusubelら、「Short Protocols in Molecular Biology」(1999)、第4版、John Wiley & Sons社を全般的に参照されたい)、ならびに化学的方法については、標準的な技法が用いられる。
【０１０７】
本明細書で用いられる「腫瘍壊死因子受容体1(TNFR1)アンタゴニスト」または「抗TNFR1アンタゴニスト」などの用語は、TNFR1に結合し、TNFR1のある(すなわち、1種または複数種の)機能を阻害しうる作用物質(例えば、分子、化合物)を指す。例えば、TNFR1アンタゴニストには、TNFR1に対するTNFαの結合の阻害、および/またはTNFR1を介するシグナル伝達の阻害が可能である。したがって、TNFR1アンタゴニストにより、TNFR1媒介性の過程および細胞応答(例えば、標準的なL929細胞傷害性アッセイにおけるTNFα誘導細胞死)を阻害することができる。
【０１０８】
本明細書で用いられる「ペプチド」とは、ペプチド結合により一体に結合される少なくとも約2〜約50アミノ酸を指す。
【０１０９】
本明細書で用いられる「ポリペプチド」とは、ペプチド結合により一体に結合される少なくとも約50アミノ酸を指す。ポリペプチドは、一般に、三次構造を含み、機能的ドメインに折りたたまれる。
【０１１０】
本明細書で用いられる「プロテアーゼ分解に対して耐性の」ペプチドまたはポリペプチド(例えば、ドメイン抗体(dAb))は、プロテアーゼ活性について適切な条件下でプロテアーゼと共にインキュベートしてもプロテアーゼにより実質的に分解されない。ポリペプチド(例えば、dAb)が実質的に分解されないのは、プロテアーゼ活性に適する温度で約1時間にわたるプロテアーゼとのインキュベーション後において、プロテアーゼにより分解されるタンパク質が約25％以下、約20％以下、約15％以下、約14％以下、約13％以下、約12％以下、約11％以下、約10％以下、約9％以下、約8％以下、約7％以下、約6％以下、約5％以下、約4％以下、約3％以下、約2％以下、約1％以下であるかまたは実質的に皆無の場合である。例えば、摂氏37度または同50度においてである。タンパク質分解は、任意の適切な方法、例えば、本明細書で説明されるSDS-PAGEまたは機能アッセイ(例えば、リガンド結合)を用いて評価することができる。
【０１１１】
本明細書で用いられる「ディスプレイシステム」とは、物理的特性、化学的特性、または機能的特性など、所望の特性に基づく選択に、ポリペプチドまたはペプチドのコレクションを用いうるシステムを指す。ディスプレイシステムは、ポリペプチドまたはペプチドの適切なレパートリー(例えば、溶液中における、適切な支持体上に固定化された)でありうる。ディスプレイシステムはまた、細胞発現システム(例えば、形質転換細胞、感染細胞、トランスフェクト細胞、または形質導入細胞内における核酸ライブラリーの発現、および細胞表面上におけるコードされたポリペプチドの提示)、または非細胞発現システム(例えば、エマルジョンコンパートメント化およびディスプレイ)を用いるシステムでもありうる。例示的なディスプレイシステムにより、核酸のコード機能と、核酸によりコードされるポリペプチドまたはペプチドの物理的特性、化学的特性、および/または機能的特性とが連関する。このようなディスプレイシステムを用いると、所望の物理的特性、化学的特性、および/または機能的特性を有するポリペプチドまたはペプチドを選択することができ、選択されたポリペプチドまたはペプチドをコードする核酸を容易に単離または回収することができる。例えば、細菌ファージディスプレイ(ファージディスプレイ、例えば、ファージミドディスプレイ)、リボソームディスプレイ、エマルジョンコンパートメント化およびディスプレイ、酵母ディスプレイ、ピューロマイシンディスプレイ、細菌ディスプレイ、プラスミド上におけるディスプレイ、または共有結合ディスプレイ(例えば、EP0436597(Dyax)、米国特許第6,172,197号(McCaffertyら)、米国特許第6,489,103号(Griffithsら)を参照されたい)など、核酸のコード機能と、ポリペプチドまたはペプチドの物理的特性、化学的特性、および/または機能的特性とを連関させる多数のディスプレイシステムが当技術分野では知られている。
【０１１２】
本明細書で用いられる「レパートリー」とは、アミノ酸配列の多様性により特徴付けられるポリペプチドまたはペプチドのコレクションを指す。レパートリーの個別のメンバーは、共通の構造的特徴(例えば、共通のコア構造)および/または共通の機能的特徴(例えば、共通のリガンド(例えば、一般リガンドまたは標的リガンド、TNFR1)に対する結合能)など、共通の特徴を有しうる。
【０１１３】
本明細書で用いられる「機能的」とは、特異的結合活性などの生物学的活性を有するポリペプチドまたはペプチドについて述べる。例えば、「機能的ポリペプチド」という用語は、その抗原結合部位を介して標的抗原に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。
【０１１４】
本明細書で用いられる「一般リガンド」とは、所与のレパートリーの大部分の(例えば、実質的にすべての)機能的メンバーに結合するリガンドを指す。一般リガンド(例えば、共通の一般リガンド)は、所与のレパートリーのメンバーが共通の標的リガンドに対する結合特異性を共有しなくてもその多くのメンバーにも結合しうる。一般に、ポリペプチド上における機能的な一般リガンド結合部位の存在(一般リガンドに対する結合能により示される)により、ポリペプチドが適正に折りたたまれ機能的であることが示される。一般リガンドの適切な例は、スーパー抗原、レパートリーの大部分の機能的メンバー上において発現されるエピトープに結合する抗体などを含む。
【０１１５】
「スーパー抗原」とは、これらのタンパク質の標的リガンド結合部位とは異なる部位において免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーと相互作用する一般リガンドを指す当技術分野の用語である。ブドウ球菌性エンテロトキシンが、T細胞受容体と相互作用するスーパー抗原の例である。抗体に結合するスーパー抗原は、IgG定常領域に結合するプロテインG(BjorckおよびKronvall、J.Immunol.、第133巻、969頁(1984))、IgG定常領域およびVHドメインに結合するプロテインA(ForsgrenおよびSjoquist、J.Immunol.、第97巻、822頁(1966))、ならびにVLドメインに結合するプロテインL(Bjorck、J.Immunol.、第140巻、1194頁(1988))を含む。
【０１１６】
本明細書で用いられる「標的リガンド」とは、ポリペプチドまたはペプチドにより特異的または選択的に結合されるリガンドを指す。例えば、ポリペプチドが抗体またはその抗原結合フラグメントである場合、標的リガンドは、任意の所望の抗原またはエピトープでありうる。標的抗原に対する結合は、ポリペプチドまたはペプチドの機能性に依存する。
【０１１７】
本明細書で用いられる抗体とは、天然に抗体を生成する任意の生物種に由来するか、または組み換えDNA法により作製されるかのいずれであれ、血清、B細胞、ハイブリドーマ、トランスフェクトーマ、酵母、または細菌のいずれから単離されるのであれ、IgG、IgM、IgA、IgD、もしくはIgE、またはフラグメント(Fab、F(ab')2、Fv、ジスルフィド結合したFv、scFv、閉じた立体構造の多重特異性抗体、ジスルフィド結合したscFv、ダイアボディなど)を指す。
【０１１８】
本明細書で用いられる「抗体フォーマット」とは、構造上における抗原に対する結合特異性を賦与するように1つまたは複数の抗体可変ドメインを組み込みうる、任意の適切なポリペプチド構造を指す。キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、単鎖抗体、二重特異性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖および/または抗体軽鎖のホモ二量体およびヘテロ二量体、前出のいずれかの抗原結合フラグメント(例えば、Fvフラグメント(例えば、単鎖Fv(scFv)、ジスルフィド結合したFv)、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')2フラグメント)抗体単一可変ドメイン(例えば、dAb、VH、VHH、VL)、および前出のいずれかの改変型(例えば、ポリエチレングリコールもしくは他の適切なポリマーまたはヒト化VHHの共有結合による改変)など、各種の適切な抗体フォーマットが当技術分野では知られている。
【０１１９】
「免疫グロブリン単一可変ドメイン」とは、他のV領域またはVドメインとは独立した形で抗原またはエピトープに特異的に結合する抗体可変ドメイン(VH、VHH、VL)を指す。免疫グロブリン単一可変ドメインは、他の領域またはドメインが単一の免疫グロブリン可変ドメインによる抗原結合に必要とされない場合(免疫グロブリン単一可変ドメインがさらなる可変ドメインとは独立した形で抗原に結合する場合)、他の可変領域または可変ドメインを有するフォーマット(例えば、ホモ多量体またはヘテロ多量体)中に存在しうる。「ドメイン抗体」または「dAb」は、本明細書で用いられる通り、「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同義である。「単一の免疫グロブリン可変ドメイン」とは、本明細書で用いられる通り、「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同義である。「単一の抗体可変ドメイン」または「抗体単一可変ドメイン」は、本明細書で用いられる通り、「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同義である。一実施形態において、免疫グロブリン単一可変ドメインはヒト抗体可変ドメインであるが、げっ歯類(例えば、参照によりその内容が全体において本明細書に組み込まれる国際公開第00/29004号で開示されている)、テンジクザメ、およびラクダ科動物(Camelid)のVHH dAbなど、他の動物種に由来する単一の抗体可変ドメインもまた含む。ラクダ科動物のVHHは、ラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダ、およびグアナコを含む動物種に由来し、天然において軽鎖を欠く重鎖抗体を生成する免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドである。VHHは、ヒト化されうる。
【０１２０】
「ドメイン」とは、タンパク質の残余部分とは独立した三次構造を有する、折りたたまれたタンパク質構造である。一般に、ドメインは、タンパク質の個別の機能的特性の一因となり、多くの場合、タンパク質の残余部分および/または該ドメインの機能を失わずに、付加するか、除去するか、または他のタンパク質に移動させることができる。「単一の抗体可変ドメイン」は、抗体可変ドメインの配列特性を含む、折りたたまれたポリペプチドドメインである。したがって、それは、完全な抗体可変ドメイン、ならびに、例えば、1つまたは複数のループが抗体可変ドメインに特徴的でない配列によって置換されている改変可変ドメイン、あるいは切断されているかまたはNもしくはC末端伸長を含む抗体可変ドメインのほか、少なくとも全長ドメインの結合活性および特異性を保持する可変ドメインの折りたたまれたフラグメントも含む。
【０１２１】
「ライブラリー」という用語は、異種ポリペプチドまたは核酸の混合物を指す。ライブラリーは、その各々が単一のポリペプチド配列またはヌクレオチド配列を有するメンバーからなる。この限りにおいて、「ライブラリー」は、「レパートリー」と同義である。ライブラリーメンバー間における配列の違いは、ライブラリー内に存在する多様性の一因となる。ライブラリーは、ポリペプチドまたは核酸の単純な混合物の形態をとる場合もあり、核酸ライブラリーにより形質転換された生物または細胞、例えば、細菌、ウイルス、動物細胞、または植物細胞などの形態でもありうる。一実施形態において、各個の生物または細胞は、ただ1つであるか限られた数のライブラリーメンバーを含有する。一実施形態において、核酸は、核酸によりコードされるポリペプチドの発現を可能とするため、発現ベクター内に組み込まれる。したがって、一態様において、ライブラリーは、各生物が、発現されてその対応するポリペプチドメンバーを生成しうる核酸形態における単一のライブラリーメンバーを含有する発現ベクターの1つまたは複数のコピーを含有する、宿主生物集団の形態をとりうる。こうして、宿主生物集団は、多様なポリペプチドの大規模なレパートリーをコードする潜在的能力を有する。
【０１２２】
「普遍的フレームワーク」とは、Kabat(「Sequences of Proteins of Immunological Interest」、米国保健福祉省)により定義される配列中に保存される抗体の領域に対応するか、またはChothiaおよびLesk(1987)、J.Mol.Biol.、第196巻、910〜917頁により定義されるヒト生殖細胞系列免疫グロブリンのレパートリーまたは構造に対応する単一の抗体フレームワーク配列である。ライブラリーおよびレパートリーでは、超可変領域内のみにおいてではあるが、事実上いかなる結合特異性の誘導も可能とすることが分かっている単一フレームワークまたはこのようなフレームワークのセットを用いることができる。
【０１２３】
本明細書で用いられる「用量」という用語は、1回にすべて(単位用量)であるか、または規定期間にわたる2回以上の投与において被験体に投与されるリガンド量を指す。例えば、用量は、1日(24時間)(毎日の投与)、2日間、1週間、2週間、3週間、または1カ月以上の期間にわたり(例えば、単回投与または2回以上の投与により)被験体に投与されるリガンド(例えば、標的抗原に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むリガンド)量を指す場合がある。投与間の間隔は、任意の所望の長さの時間でありうる。
【０１２４】
「半減期」という表現は、in vivoにおいて、リガンド(例えば、dAb、ポリペプチド、またはアンタゴニスト)の血清濃度が、例えば、天然のメカニズムによるリガンドの分解および/またはリガンドのクリアランスもしくは隔離により50％低下するのにかかる時間を指す。本発明のリガンドは、in vivoでの安定化が可能であり、その半減期は、分解および/またはクリアランスもしくは隔離に対して耐性である分子に結合することにより延長される。典型的に、このような分子は、それ自体がin vivoにおいて長い半減期を有する天然のタンパク質である。リガンドの半減期は、その機能活性が、in vivoにおいて、半減期延長分子に特異的でない類似のリガンドよりも長期間にわたって持続する場合に延長される。例えば、ヒト血清アルブミン(HAS)および標的分子に特異的なリガンドを、HSAに対する特異性が存在しない、すなわち、HSAには結合しないが別の分子には結合する同じリガンドと比較する。例えば、それは、細胞上における第3の標的に結合しうる。典型的に、半減期は、10％、20％、30％、40％、50％以上延長される。2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍以上の範囲の半減期の延長が可能である。あるいはまた、または加えて、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍以下の範囲の半減期の延長が可能である。
【０１２５】
本明細書で用いられる「流体力学的サイズ」とは、水溶液全体への分子(例えば、タンパク質分子、リガンド)の拡散に基づく分子の見かけのサイズを指す。溶液全体へのタンパク質の拡散または移動を分析処理することで、タンパク質粒子の「ストークス半径」または「流体力学的半径」により与えられるタンパク質の見かけのサイズを導出する。タンパク質の「流体力学的半径」は、質量と形状(立体構造)の両方に依存するので、同じ分子量を有する2種類のタンパク質が、タンパク質の全体的な立体構造に基づき、異なる流体力学的サイズを有しうる。
【０１２６】
本明細書で参照される「競合する」という用語は、その同種標的結合ドメインに対する第1の標的の結合が、前記同種標的に特異的な第2の結合ドメインの存在下において阻害されることを意味する。例えば、結合は、立体的に、例えば、結合ドメインの物理的な遮断によるかまたは標的に対するその親和性(affinityまたはavidity)を低下させるような結合ドメインの構造または環境の変化により阻害することができる。競合ELISA実験および競合BiaCore実験を行って第1の結合ドメインと第2の結合ドメインとの間の競合を判定する方法の詳細については、国際公開第2006038027号を参照されたい。
【０１２７】
2つの配列間における「相同性」または「同一性」または「類似性」(本明細書において、これらの用語は互換的に用いられる)の計算は、以下の通りに行う。配列を、最適比較を目的としてアラインする(例えば、第1および第2のアミノ酸配列または核酸配列の一方または両方にギャップを導入して最適アライメントを行い、比較を目的として非相同配列を無視することができる)。ある実施形態において、比較を目的としてアラインされた基準配列長は、基準配列長の少なくとも30％、または少なくとも40％、または少なくとも50％、または少なくとも60％、または少なくとも70％、80％、90％、100％である。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第1の配列における位置が、第2の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドにより占有されている場合、分子はその位置において同一である(本明細書で用いられるアミノ酸または核酸の「相同性」は、アミノ酸または核酸の「同一性」に相当する)。2つの配列の最適アライメントのために導入することが必要なギャップ数および各ギャップの長さを考慮すると、2つの配列間におけるパーセント同一性は、配列により共有される同一位置数の関数である。本明細書で定義されるアミノ酸配列およびヌクレオチド配列のアライメントおよび相同性、類似性、または同一性は、BLAST 2 Sequencesアルゴリズムのデフォルトパラメータを用いて準備および決定することができる(Tatusova,T.A.ら、FEMS Microbiol Lett、第174巻、187〜188頁(1999))。
【０１２８】
選択法
一実施形態における本発明は、所望の生物学的活性を有するプロテアーゼ耐性のペプチドおよびポリペプチドの選択法により選択されるポリペプチドおよびdAbに関する。該方法では、2種類の選択圧を用いて、プロテアーゼ分解に対して高度に安定的で耐性であり、所望の生物学的活性を有するポリペプチドを選択する効率的な過程を創出する。本明細書で説明される通り、プロテアーゼ耐性のペプチドおよびポリペプチドは、一般に生物学的活性を保持する。これに対し、プロテアーゼ感受性のペプチドおよびポリペプチドは、本明細書で説明される方法においてプロテアーゼにより切断または消化され、したがって、その生物学的活性を失う。したがって、プロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチドは、一般に、結合活性など、その生物学的活性に基づいて選択される。
【０１２９】
本明細書で説明される方法により、複数の利点が提供される。例えば、本明細書で開示および例示される通り、1種類のプロテアーゼ(例えば、トリプシン)によるタンパク質消化に対する耐性について選択される可変ドメイン、アンタゴニスト、ペプチド、またはポリペプチドはまた、他のプロテアーゼ(例えば、エラスターゼ、ロイコザイム)による分解に対しても耐性である。一実施形態において、プロテアーゼ耐性は、ペプチドまたはポリペプチドのより高温の融解温度(Tm)と相関する。より高温の融解温度は、より安定的な可変ドメイン、アンタゴニスト、ペプチド、およびポリペプチドを示す。一実施形態において、プロテアーゼ分解に対する耐性はまた、標的リガンドに対する高親和性結合とも相関する。こうして、本明細書で説明される方法は、プロテアーゼ耐性であり安定的であるために所望の生物学的活性を有し、in vivoでの治療的および/または診断的使用に十分に適する、可変ドメイン、アンタゴニスト、ペプチド、ポリペプチドを選択、単離、および/または回収する効率的な方法を提供する。一実施形態において、プロテアーゼ耐性は、PKの改善、例えば、プロテアーゼ耐性でない可変ドメイン、アンタゴニスト、ペプチド、またはポリペプチドを上回る改善と相関する。PKの改善は、AUC(曲線下面積)の改善および/または半減期の改善でありうる。一実施形態において、プロテアーゼ耐性は、せん断および/もしくは熱ストレスに対する可変ドメイン、アンタゴニスト、ペプチド、もしくはポリペプチドの安定性の改善、ならびに/または噴霧時における凝集傾向の低減、例えば、プロテアーゼ耐性でない可変ドメイン、アンタゴニスト、ペプチド、もしくはポリペプチドを上回る改善と相関する。一実施形態において、プロテアーゼ耐性は、保管安定性の改善、例えば、プロテアーゼ耐性でない可変ドメイン、アンタゴニスト、ペプチド、またはポリペプチドを上回る改善と相関する。一態様では、プロテアーゼ分解に対する耐性、より高温のTm、および標的リガンドに対する高親和性結合である利点の1つ、2つ、3つ、4つ、またはすべてが提供される。
【０１３０】
一態様では、プロテアーゼ(例えば、1種または複数種のプロテアーゼ)による分解に対して耐性であるペプチドおよびポリペプチドのライブラリーまたはレパートリー(例えば、ディスプレイシステム)からペプチドまたはポリペプチドを選択、単離、および/または回収する方法が提供される。一実施形態において、該方法は、プロテアーゼ(例えば、1種または複数種のプロテアーゼ)による分解に対して耐性であるペプチドおよびポリペプチドのライブラリーまたはレパートリー(例えば、ディスプレイシステム)からポリペプチドを選択、単離、および/または回収する方法である。一般に、該方法は、ペプチドまたはポリペプチドのライブラリーまたはレパートリーを提供するステップと、プロテアーゼ活性に適する条件下でライブラリーまたはレパートリーとプロテアーゼ(例えば、トリプシン、エラスターゼ、ロイコザイム、パンクレアチン、喀痰)とを組み合わせるステップと、プロテアーゼによる分解に対して耐性であり、所望の生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドを選択、単離、および/または回収するステップとを含む。プロテアーゼにより分解されたペプチドまたはポリペプチドは、一般に、プロテアーゼ活性により生物学的活性を低下させるか、またはその生物学的活性を失う。したがって、結合活性(例えば、一般的リガンドに対する結合、特異的リガンドに対する結合、基質に対する結合)、触媒活性、または他の生物学的活性など、その生物学的活性に基づく方法を用いて、プロテアーゼ分解に対して耐性であるペプチドまたはポリペプチドを選択、単離、および/または回収することができる。
【０１３１】
ペプチドまたはポリペプチドのライブラリーまたはレパートリーは、プロテアーゼ活性に適する条件下でプロテアーゼ(例えば、1種または複数種のプロテアーゼ)と組み合わされる。プロテアーゼのタンパク質分解活性に適する条件と、タンパク質分解活性を含有する生物学的調製物または混合物とは、当技術分野でよく知られているか、または当業者によって容易に決定することができる。所望の場合、例えば、ある範囲のpH条件、プロテアーゼ濃度、温度下でプロテアーゼ活性を評価するステップ、および/またはライブラリーまたはレパートリーとプロテアーゼとを反応させる時間の長さを変化させるステップにより、適切な条件を同定または最適化することができる。例えば、一部の実施形態において、ペプチドまたはポリペプチド(例えば、可変ドメイン)に対するプロテアーゼ、例えば、トリプシンの比(モル/モルベースの)は、800〜80,00(例えば、8,000〜80,000)のプロテアーゼ:ペプチドもしくはポリペプチドである、例えば、10マイクログラム/mlのプロテアーゼを用いる場合、該比は800〜80,000のプロテアーゼ:ペプチドもしくはポリペプチドであるか;または100マイクログラム/mlのプロテアーゼを用いる場合、該比は8,000〜80,000のプロテアーゼ:ペプチドもしくはポリペプチドである。一実施形態において、ペプチドまたはポリペプチド(例えば、可変ドメイン)に対するプロテアーゼ(例えば、トリプシン)の比(重量/重量、例えば、マイクログラム/マイクログラムベースの)は、1,600〜160,000(例えば、16,000〜160,000)のプロテアーゼ:ペプチドもしくはポリペプチドである、例えば、10マイクログラム/mlのプロテアーゼを用いる場合、該比は1,600〜160,000のプロテアーゼ:ペプチドもしくはポリペプチドであるか;または100マイクログラム/mlのプロテアーゼを用いる場合、該比は16,000〜160,000のプロテアーゼ:ペプチドもしくはポリペプチドである。一実施形態において、プロテアーゼは、少なくとも100または1000マイクログラム/mlの濃度で用いられ、ペプチドまたはポリペプチド(例えば、可変ドメイン)に対するプロテアーゼ、例えば、トリプシンのプロテアーゼ:ペプチド比(モル/モルベースの)は、8,000〜80,000のプロテアーゼ:ペプチドもしくはポリペプチドである。一実施形態において、プロテアーゼは、少なくとも10マイクログラム/mlの濃度で用いられ、ペプチドまたはポリペプチド(例えば、可変ドメイン)に対するプロテアーゼ、例えば、トリプシンのプロテアーゼ:ペプチド比(モル/モルベースの)は、800〜80,000のプロテアーゼ:ペプチドもしくはポリペプチドである。一実施形態において、ペプチドまたはポリペプチド(例えば、可変ドメイン)に対するプロテアーゼ(例えば、トリプシン)の比(重量/重量、例えば、マイクログラム/マイクログラムベースの)は、例えば、Cが10マイクログラム/mlの場合、1600〜160,000のプロテアーゼ:ペプチドもしくはポリペプチドであるか;またはCもしくはC'が100マイクログラム/mlの場合、該比は16,000〜160,000のプロテアーゼ:ペプチドもしくはポリペプチドである。一実施形態において、濃度(CまたはC')は、少なくとも100または1000マイクログラム/mlのプロテアーゼである。個別であるかまたは単離されたペプチドまたはポリペプチド(例えば、免疫グロブリン可変ドメイン)、例えば、レパートリーまたはライブラリーから既に単離されているペプチドまたはポリペプチドを調べる場合、適切な緩衝液(例えば、PBS)中におけるペプチドまたはポリペプチドの溶液にプロテアーゼを添加して、少なくとも約0.01％(w/w)のプロテアーゼ/ペプチドもしくはポリペプチド、約0.01％〜約5％(w/w)のプロテアーゼ/ペプチドもしくはポリペプチド、約0.05％〜約5％(w/w)のプロテアーゼ/ペプチドもしくはポリペプチド、約0.1％〜約5％(w/w)のプロテアーゼ/ペプチドもしくはポリペプチド、約0.5％〜約5％(w/w)のプロテアーゼ/ペプチドもしくはポリペプチド、約1％〜約5％(w/w)のプロテアーゼ/ペプチドもしくはポリペプチド、少なくとも約0.01％(w/w)のプロテアーゼ/ペプチドもしくはポリペプチド、少なくとも約0.02％(w/w)のプロテアーゼ/ペプチドもしくはポリペプチド、少なくとも約0.03％(w/w)のプロテアーゼ/ペプチドもしくはポリペプチド、少なくとも約0.04％(w/w)のプロテアーゼ/ペプチドもしくはポリペプチド、少なくとも約0.05％(w/w)のプロテアーゼ/ペプチドもしくはポリペプチド、少なくとも約0.06％(w/w)のプロテアーゼ/ペプチドもしくはポリペプチド、少なくとも約0.07％(w/w)のプロテアーゼ/ペプチドもしくはポリペプチド、少なくとも約0.08％(w/w)のプロテアーゼ/ペプチドもしくはポリペプチド、少なくとも約0.09％(w/w)のプロテアーゼ/ペプチドもしくはポリペプチド、少なくとも約0.1％(w/w)のプロテアーゼ/ペプチドもしくはポリペプチド、少なくとも約0.2％(w/w)のプロテアーゼ/ペプチドもしくはポリペプチド、少なくとも約0.3％(w/w)のプロテアーゼ/ペプチドもしくはポリペプチド、少なくとも約0.4％(w/w)のプロテアーゼ/ペプチドもしくはポリペプチド、少なくとも約0.5％(w/w)のプロテアーゼ/ペプチドもしくはポリペプチド、少なくとも約0.6％(w/w)のプロテアーゼ/ペプチドもしくはポリペプチド、少なくとも約0.7％(w/w)のプロテアーゼ/ペプチドもしくはポリペプチド、少なくとも約0.8％(w/w)のプロテアーゼ/ペプチドもしくはポリペプチド、少なくとも約0.9％(w/w)のプロテアーゼ/ペプチドもしくはポリペプチド、少なくとも約1％(w/w)のプロテアーゼ/ペプチドもしくはポリペプチド、少なくとも約2％(w/w)のプロテアーゼ/ペプチドもしくはポリペプチド、少なくとも約3％(w/w)のプロテアーゼ/ペプチドもしくはポリペプチド、少なくとも約4％(w/w)のプロテアーゼ/ペプチドもしくはポリペプチド、または約5％(w/w)のプロテアーゼ/ペプチドもしくはポリペプチドなどのペプチドまたはポリペプチド/プロテアーゼ溶液を作製することができる。混合物は、プロテアーゼ活性に適する温度(例えば、室温、約37℃)でインキュベートすることができ、ある時間間隔(例えば、1時間、2時間、3時間など)で試料を取得することができる。試料は、SDS-PAGE解析またはリガンド結合など任意の適切な方法を用いてタンパク質分解について解析することができ、結果は、分解の時間経過を確立するのに用いることができる。
【０１３２】
本明細書で説明される方法では、任意の所望のプロテアーゼまたは複数種の所望のプロテアーゼを用いることができる。例えば、単一のプロテアーゼ、異なるプロテアーゼの任意の所望の組合せ、またはタンパク質分解活性を含有する任意の生物学的調製物、生物学的抽出物、または生物学的ホモジネートを用いることができる。用いられるプロテアーゼまたは複数種のプロテアーゼのアイデンティティーを知る必要はない。単独または任意の所望の組合せで用いうるプロテアーゼの適切な例は、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、チオールプロテアーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼ(例えば、カルボキシペプチダーゼA、カルボキシペプチダーゼB)、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、エラスターゼ、ロイコザイム、パンクレアチン、トロンビン、プラスミン、カテプシン(例えば、カテプシンG)、プロテイナーゼ(例えば、プロテイナーゼ1、プロテイナーゼ2、プロテイナーゼ3)、テルモリシン、キモシン、エンテロペプチダーゼ、カスパーゼ(例えば、カスパーゼ1、カスパーゼ2、カスパーゼ4、カスパーゼ5、カスパーゼ9、カスパーゼ12、カスパーゼ13)、カルパイン、フィカイン、クロストリパイン、アクチニダイン、ブロメライン、およびセパラーゼなどを含む。タンパク質分解活性を含有する適切な生物学的抽出物、ホモジネート、または調製物は、喀痰、粘液(例えば、胃粘液、鼻腔粘液、気管支粘液)、気管支肺洗浄液、肺ホモジネート、肺抽出物、膵臓抽出物、胃液、唾液、涙液などを含む。プロテアーゼは、タンパク質分解が生じるのに適する量で用いることができる。例えば、本明細書で説明される通り、プロテアーゼは、約0.01％〜約5％(w/w、プロテアーゼ/ペプチドまたはポリペプチド)で用いることができる。プロテアーゼを、ペプチドまたはポリペプチドのレパートリーを含むディスプレイシステム(例えば、ファージディスプレイシステム)と組み合わせる場合、例えば、プロテアーゼは、約10μg/ml〜約3mg/ml、約10μg/ml、約20μg/ml、約30μg/ml、約40μg/ml、約50μg/ml、約60μg/ml、約70μg/ml、約80μg/ml、約90μg/ml、約100μg/ml、約200μg/ml、約300μg/ml、約400μg/ml、約500μg/ml、約600μg/ml、約700μg/ml、約800μg/ml、約900μg/ml、約1000μg/ml、約1.5mg/ml、約2mg/ml、約2.5mg/ml、または約3mg/mlの濃度で用いることができる。
【０１３３】
プロテアーゼは、プロテアーゼ活性に適する温度で、ペプチドまたはポリペプチドのコレクション(ライブラリーまたはレパートリー)と共にインキュベートされる。例えば、プロテアーゼとペプチドまたはポリペプチドのコレクションとは、約20℃〜約40℃の温度(例えば、室温、約20℃、約21℃、約22℃、約23℃、約24℃、約25℃、約26℃、約27℃、約28℃、約29℃、約30℃、約31℃、約32℃、約33℃、約34℃、約35℃、約36℃、約37℃、約38℃、約39℃、約40℃)でインキュベートすることができる。プロテアーゼとペプチドまたはポリペプチドのコレクションとは、タンパク質分解が生じるのに十分な時間にわたり、共にインキュベートされる。例えば、ペプチドまたはポリペプチドのコレクションは、約30分間〜約24時間または約48時間にわたりプロテアーゼと共にインキュベートすることができる。一部の例において、ペプチドまたはポリペプチドのコレクションは、一晩、または少なくとも約30分間、約1時間、約1.5時間、約2時間、約3時間、約4時間、約5時間、約6時間、約7時間、約8時間、約9時間、約10時間、約11時間、約12時間、約13時間、約14時間、約15時間、約16時間、約17時間、約18時間、約19時間、約20時間、約21時間、約22時間、約23時間、約24時間、約48時間以上にわたり、プロテアーゼと共にインキュベートされる。
【０１３４】
一般に、少なくとも初期の選択ラウンド(例えば、ディスプレイシステムを用いる場合)では、プロテアーゼにより、プロテアーゼとのインキュベーションを含まない選択と比較して、選択される所望の生物学的活性を有するクローン数が少なくとも1桁分減少することが望ましい。具体例において、該方法で用いられるプロテアーゼ量および条件は、回収されるクローン数を、少なくとも約1対数(10倍)分、少なくとも約2対数(100倍)分、少なくとも約3対数(1000倍)分、または少なくとも約4対数(10,000倍)分減少させるのに十分である。回収されるクローンの所望の減少を結果としてもたらす適切なプロテアーゼ量およびインキュベーション条件は、従来の方法および/または本明細書で提供される指針を用いて容易に決定することができる。
【０１３５】
プロテアーゼとペプチドまたはポリペプチドのコレクションとは、任意の適切な方法(例えば、in vitro、in vivo、またはex vivoにおける)を用いて、組合せインキュベートすることができる。例えば、プロテアーゼとペプチドまたはポリペプチドのコレクションとは、プロテアーゼ活性に適する容器内で組み合わせ、これに適する温度で静置、振とう(rocked、shaken)、旋回などの状態に保持することができる。所望の場合、プロテアーゼとペプチドまたはポリペプチドのコレクションとは、ポリペプチドコレクション(例えば、ファージディスプレイによるライブラリーまたはレパートリー)を適切な動物(例えば、マウス)中に導入し、プロテアーゼ活性に十分な時間が経過した後でペプチドまたはポリペプチドのコレクションを回収することなどにより、in vivoまたはex vivoのシステムにおいて組み合わせることができる。別の例では、臓器または組織をポリペプチドコレクション(例えば、ファージディスプレイによるライブラリーまたはレパートリー)により灌流し、プロテアーゼ活性に十分な時間が経過した後でペプチドまたはポリペプチドのコレクションを回収する。
【０１３６】
インキュベーション後、結合活性など所望の生物学的活性に基づいて、プロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチドを選択することができる。所望の場合、選択前にプロテアーゼ阻害剤を添加することができる。該選択法に実質的に干渉しない任意の適切なプロテアーゼ阻害剤(または2種類以上のプロテアーゼ阻害剤の組合せ)を用いることができる。適切なプロテアーゼ阻害剤の例は、α1-抗トリプシン、α2-マクログロブリン、アマスタチン、アンチパイン、アンチトロンビンIII、アプロチニン、4-(2-アミノエチル)ベンゼンスルホニルフロリドヒドロクロリド(AEBSF)、(4-アミジノ-フェニル)-メタン-スルホニルフロリド(APMSF)、ベスタチン、ベンザミジン、キモスタチン、3,4-ジクロロイソクマリン、ジイソプロピルフルオロホスフェート(DIFP)、E-64、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、エラスタチナール、ロイペプチン、N-エチルマレイミド、フェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)、ペプスタチン、1,10-フェナントロリン、ホスホラミドン、セリンプロテアーゼ阻害剤、N-トシル-L-リシン-クロロメチルケトン(TLCK)、Na-トシル-Phe-クロロメチルケトン(TPCK)などを含む。加えて、複数のクラスのプロテアーゼの阻害剤を含有する多くの調製物が市販されている(例えば、キモトリプシン、サーモリシン、パパイン、プロナーゼ、膵臓抽出物およびトリプシンを阻害するRoche Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets(商標)(米国、インディアナ州、インディアナポリス、Roche Diagnostics社製))。
【０１３７】
プロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチドは、所望の生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドを、所望の生物学的活性を有しないペプチドまたはポリペプチドと区別し、これらに優先して選択することを可能とする、所望の生物学的活性による選択法を用いて選択することができる。一般に、プロテアーゼにより消化または切断されたペプチドまたはポリペプチドがその生物学的活性を失うのに対し、プロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチドは機能性を保つ。こうして、生物学的活性に適するアッセイを用いて、プロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチドを選択することができる。例えば、適切な結合アッセイ(例えば、ELISA、パニング)を用いて、共通の結合機能(例えば、一般的リガンドに対する結合、特異的リガンドに対する結合、または基質に対する結合)を評価することができる。例えば、パニングによるかまたは適切な親和性マトリックスを用いて、プロテインA、プロテインL、または抗体などの標的リガンドまたは一般リガンドに結合するポリペプチドを選択、単離、および/または回収することができる。パニングは、適切な容器(例えば、試験管、ペトリディッシュ)にリガンド(例えば、一般リガンド、標的リガンド)溶液を添加し、リガンドを容器の壁面に沈着させるかまたはリガンドで容器の壁面をコーティングすることにより達成することができる。過剰なリガンドは洗い流し、容器にポリペプチド(例えば、ファージディスプレイライブラリー)を添加し、固定化されたリガンドにポリペプチドが結合するのに適する条件下で容器を維持することができる。結合しなかったポリペプチドは洗い流し、結合したポリペプチドは、例えば、こすり取るかまたはpHを低下させるなど任意の適切な方法を用いて回収することができる。
【０１３８】
ファージディスプレイシステムを用いる場合、ファージELISAにより結合を調べることができる。ファージELISAは、任意の適切な手順に従い実施することができる。一例では、ELISAにより、選択された標的リガンドまたは一般リガンドに対する結合について、選択の各ラウンドで生成されるファージ集団をスクリーニングし、プロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチドを提示するファージを同定することができる。所望の場合、例えば、CまたはN末端タグに対する試薬を用いる、例えば、ELISAにより、可溶性のペプチドおよびポリペプチドを、標的リガンドまたは一般リガンドに対する結合について調べることができる(例えば、Winterら(1994)、Ann.Rev.Immunology、第12巻、433〜55頁を参照されたい)。選択されたファージの多様性はまた、PCR産物に対するゲル電気泳動法(Marksら、1991年、前出;Nissimら、1994年、前出)、プロービング(Tomlinsonら、1992年、J.Mol.Biol.、第227巻、776頁)、またはベクターDNAの配列決定によっても評価することができる。
【０１３９】
TNFR1に対する特異性に加えて、抗TNFR1プロテアーゼ耐性ポリペプチド(例えば、単一の抗体可変ドメイン)を含むアンタゴニストまたはポリペプチド(例えば、二重特異性リガンド)は、サイトカイン、成長因子、サイトカイン受容体、成長因子受容体、酵素(例えば、プロテアーゼ)、酵素の補因子、DNA結合タンパク質、脂質、および炭水化物を含むヒトタンパク質または動物タンパク質など、一般リガンドまたは任意の所望の標的リガンドに対する結合特異性を有しうる。
【０１４０】
一部の実施形態において、プロテアーゼ耐性のペプチドもしくはポリペプチド(例えば、dAb)またはアンタゴニストは、肺組織内でTNFR1に結合する。一実施形態において、アンタゴニストまたはポリペプチドはまた、肺組織内でさらなる標的にも結合する。
【０１４１】
本明細書で説明される方法においてディスプレイシステム(例えば、核酸のコード機能と核酸によりコードされるペプチドまたはポリペプチドの機能的特性とを連関させるディスプレイシステム)を用いる場合、選択されたペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸のコピー数を増幅するかまたは増大させることがしばしば有利でありうる。それにより、本明細書で説明される方法または他の適切な方法を用いる、さらなるラウンドの選択に、またはさらなるレパートリー(例えば、親和性成熟レパートリー)を調製するのに十分な量の核酸および/またはペプチドもしくはポリペプチドを得る効率的な方法が提供される。こうして、一部の実施形態において、該方法は、ディスプレイシステム(例えば、核酸のコード機能と核酸によりコードされるペプチドまたはポリペプチドの機能的特性とを連関させるファージディスプレイなどのディスプレイシステム)を用いるステップを含み、選択されたペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸のコピー数を増幅するかまたは増大させるステップをさらに含む。ファージ増幅、細胞増殖、またはポリメラーゼ連鎖反応などによる任意の適切な方法を用いて、核酸を増幅することができる。
【０１４２】
本明細書で説明される方法を、所望の場合、他の適切な選択法を含みうるプログラムの一部として用いて、プロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチド、例えば、dAbを単離することができる。これらの状況では、他の選択法を用いる前または後など、該プログラムの任意の所望の時点において、本明細書で説明される方法を用いることができる。本明細書で説明される方法はまた、本明細書で説明および例示される通り、2ラウンド以上の選択を提供するのにも用いることができる。
【０１４３】
一例において、該方法は、エラスターゼによる分解に対して耐性であるペプチドまたはポリペプチド、例えば、dAbを選択する方法であって、ペプチドまたはポリペプチドのライブラリーまたはレパートリーを提供するステップと、エラスターゼによるタンパク質消化に適する条件下でライブラリーまたはレパートリーをエラスターゼ(またはエラスターゼを含む生物学的調製物、抽出物、またはホモジネート)と組み合わせるステップと、エラスターゼによる分解に対して耐性であり、TNFR1結合活性を有するペプチドまたはポリペプチドを選択、単離、および/または回収するステップとを含む方法である。
【０１４４】
具体的な実施形態では、エラスターゼによる分解に対して耐性であり、TNFR1に結合する免疫グロブリン単一可変ドメイン(dAb)を選択する方法が提供される。これらの実施形態では、dAbを含むライブラリーまたはレパートリーが提供され、これが、エラスターゼによるタンパク質消化に適する条件下でエラスターゼ(またはエラスターゼを含む生物学的調製物、抽出物、またはホモジネート)と組み合わされる。TNFR1に特異的に結合するエラスターゼ耐性dAbが選択される。例えば、エラスターゼ耐性dAbは、37℃で0.04％(w/w)のエラスターゼ溶液中で少なくとも約2時間にわたりインキュベートしても、実質的には分解されない。一実施形態において、エラスターゼ耐性dAbは、37℃で0.04％(w/w)のエラスターゼ溶液中で少なくとも約12時間にわたりインキュベートしても、実質的には分解されない。一実施形態において、エラスターゼ耐性dAbは、37℃で0.04％(w/w)のエラスターゼ溶液中で少なくとも約24時間、少なくとも約36時間、または少なくとも約48時間にわたりインキュベートしても、実質的には分解されない。
【０１４５】
ある実施形態では、エラスターゼによる分解に対して耐性であり、TNFR1に結合する免疫グロブリン単一可変ドメイン(dAb)を選択する方法が提供される。該方法は、免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドレパートリーを含むファージディスプレイシステムを提供するステップと、該ファージディスプレイシステムをエラスターゼ(約100μg/ml)と組み合わせるステップと、混合物を約37℃で、例えば、一晩(例えば、12〜16時間)にわたりインキュベートするステップと、次いで、TNFR1に特異的に結合するdAbを提示するファージを選択するステップとを含む。
【０１４６】
一例では、ロイコザイムによる分解に対して耐性であるペプチドまたはポリペプチド(例えば、dAb)を選択する方法であって、ペプチドまたはポリペプチドのライブラリーまたはレパートリーを提供するステップと、ロイコザイムによるタンパク質消化に適する条件下でライブラリーまたはレパートリーをロイコザイム(またはロイコザイムを含む生物学的調製物、抽出物、またはホモジネート)と組み合わせるステップと、ロイコザイムによる分解に対して耐性であり、特異的なTNFR1結合活性を有するペプチドまたはポリペプチドを選択、単離、および/または回収するステップとを含む方法が提供される。
【０１４７】
具体的な実施形態では、ロイコザイムによる分解に対して耐性であり、TNFR1に結合する免疫グロブリン単一可変ドメイン(dAb)を選択する方法が提供される。これらの実施形態では、dAbを含むライブラリーまたはレパートリーが提供され、これが、ロイコザイムによるタンパク質消化に適する条件下でロイコザイム(またはロイコザイムを含む生物学的調製物、抽出物、またはホモジネート)と組み合わされる。TNFR1に特異的に結合するロイコザイム耐性dAbが選択される。例えば、ロイコザイム耐性dAbは、37℃で0.04％(w/w)のロイコザイム溶液中で少なくとも約2時間にわたりインキュベートしても、実質的には分解されない。一実施形態において、ロイコザイム耐性dAbは、37℃で0.04％(w/w)のロイコザイム溶液中で少なくとも約12時間にわたりインキュベートしても、実質的には分解されない。一実施形態において、ロイコザイム耐性dAbは、37℃で0.04％(w/w)のロイコザイム溶液中で少なくとも約24時間、少なくとも約36時間、または少なくとも約48時間にわたりインキュベートしても、実質的には分解されない。
【０１４８】
ある実施形態では、ロイコザイムによる分解に対して耐性であり、TNFR1に特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメイン(dAb)を選択する方法が提供される。該方法は、免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドレパートリーを含むファージディスプレイシステムを提供するステップと、該ファージディスプレイシステムをロイコザイム(約100μg/ml)と組み合わせ、約37℃で、例えば、一晩(例えば、12〜16時間)にわたりインキュベートするステップと、次いで、TNFR1に特異的に結合するdAbを提示するファージを選択するステップとを含む。
【０１４９】
別の例では、トリプシンによる分解に対して耐性であるペプチドまたはポリペプチド、(例えば、dAb)を選択する方法であって、ペプチドまたはポリペプチドのライブラリーまたはレパートリーを提供するステップと、トリプシンによるタンパク質消化に適する条件下でライブラリーまたはレパートリーをトリプシンと組み合わせるステップと、トリプシンによる分解に対して耐性であり、TNFR1に特異的に結合するペプチドまたはポリペプチドを選択、単離、および/または回収するステップとを含む方法が提供される。
【０１５０】
具体的な実施形態では、トリプシンによる分解に対して耐性であり、TNFR1に結合する免疫グロブリン単一可変ドメイン(dAb)を選択する方法が提供される。これらの実施形態では、dAbを含むライブラリーまたはレパートリーが提供され、これが、トリプシンによるタンパク質消化に適する条件下でトリプシン(またはトリプシンを含む生物学的調製物、抽出物、またはホモジネート)と組み合わされる。TNFR1に結合するトリプシン耐性dAbが選択される。例えば、トリプシン耐性dAbは、37℃で0.04％(w/w)のトリプシン溶液中で少なくとも約2時間にわたりインキュベートしても、実質的には分解されない。一実施形態において、トリプシン耐性dAbは、37℃で0.04％(w/w)のトリプシン溶液中で少なくとも約3時間にわたりインキュベートしても、実質的には分解されない。一実施形態において、トリプシン耐性dAbは、37℃で0.04％(w/w)のトリプシン溶液中で少なくとも約4時間、少なくとも約5時間、少なくとも約6時間、少なくとも約7時間、少なくとも約8時間、少なくとも約9時間、少なくとも約10時間、少なくとも約11時間、または少なくとも約12時間にわたりインキュベートしても、実質的には分解されない。
【０１５１】
例示的な実施形態では、トリプシンによる分解に対して耐性であり、TNFR1に結合する免疫グロブリン単一可変ドメイン(dAb)を選択する方法が提供される。該方法は、免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドレパートリーを含むファージディスプレイシステムを提供するステップと、該ファージディスプレイシステムをトリプシン(約100μg/ml)と組み合わせ、約37℃で、例えば、一晩(例えば、12〜16時間)にわたりインキュベートするステップと、次いで、TNFR1に特異的に結合するdAbを提示するファージを選択するステップとを含む。
【０１５２】
別の態様では、プロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチド(例えば、dAb)のレパートリーを作製する方法が提供される。該方法は、ペプチドまたはポリペプチドのレパートリーを提供するステップと、プロテアーゼ活性に適する条件下でペプチドまたはポリペプチドのレパートリーとプロテアーゼとを組み合わせるステップと、TNFR1に特異的に結合する複数のペプチドまたはポリペプチドを回収し、それにより、プロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチドのレパートリーを作製するステップとを含む。該方法で用いるのに適するプロテアーゼ、ディスプレイシステム、プロテアーゼ活性のための条件、およびペプチドまたはポリペプチドを選択する方法について、本明細書では他の方法との関連で説明する。
【０１５３】
一部の実施形態では、ペプチドまたはポリペプチドのレパートリーを含むディスプレイシステム(例えば、核酸のコード機能と核酸によりコードされるペプチドまたはポリペプチドの機能的特性とを連関させるディスプレイシステム)が用いられ、該方法は、選択された複数のペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸のコピー数を増幅するかまたは増大させるステップをさらに含む。ファージ増幅、細胞増殖、またはポリメラーゼ連鎖反応などによる任意の適切な方法を用いて、核酸を増幅することができる。
【０１５４】
具体的な実施形態では、抗TNFR1 dAbを含むプロテアーゼ耐性ポリペプチドレパートリーを作製する方法が提供される。該方法は、dAbを含むポリペプチドレパートリーを提供するステップと、プロテアーゼ活性に適する条件下でペプチドまたはポリペプチドのレパートリーとプロテアーゼ(例えば、トリプシン、エラスターゼ、ロイコザイム)とを組み合わせるステップと、TNFR1に対する結合特異性を有するdAbを含む複数のポリペプチドを回収するステップとを含む。該方法を用いて、ナイーブレパートリー、またはTNFR1に対する結合特異性を有する親dAbに基づく親和性成熟レパートリーなど、所望の結合特異性に偏向したレパートリーを作製することができる。
【０１５５】
ポリペプチドディスプレイシステム
本明細書で説明される方法において用いるのに提供されるペプチドまたはポリペプチドのレパートリーまたはライブラリーは、適切なディスプレイシステムを含む。ディスプレイシステムは、プロテアーゼ(例えば、単一種類のプロテアーゼまたはプロテアーゼの組合せ、およびタンパク質分解活性を含有する任意の生物学的抽出物、ホモジネート、または調製物(例えば、喀痰、粘液(例えば、胃粘液、鼻腔粘液、気管支粘液)、気管支肺洗浄液、肺ホモジネート、肺抽出物、膵臓抽出物、胃液、唾液、涙液など))による分解に対して耐性でありうる。一実施形態において、ディスプレイシステムならびにディスプレイシステムと提示されるポリペプチドとの間の連結は、プロテアーゼに対して、レパートリーで最も安定的なペプチドまたはポリペプチドと少なくとも同程度に耐性である。それにより、選択される提示されたポリペプチドをコードする核酸を、容易に単離および/または増幅することが可能となる。
【０１５６】
一例において、プロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチド、例えば、dAbは、溶液中にあるか、またはプラスチックもしくはガラス(例えば、マイクロ滴定プレート、マイクロアレイなどのポリペプチドアレイ)などの適切な表面に共有結合または非共有結合したペプチドまたはポリペプチドのレパートリーから選択、単離、および/または回収することができる。例えば、表面上におけるペプチドアレイは、各個別のライブラリーメンバー(例えば、固有のペプチド配列)をアレイ中の個別で所定の位置に配置する形で用いることができる。このようなアレイ中における各ライブラリーメンバーのアイデンティティーは、アレイ中におけるその空間的な位置により決定される。例えば、標的リガンドと反応性ライブラリーメンバーとの間における結合相互作用が生じるアレイ中の位置を決定し、それにより、空間的な位置に基づいて、反応性メンバーの配列を同定することができる(例えば、米国特許第5,143,854号、国際公開第90/15070号、および国際公開第92/10092号を参照されたい)。
【０１５７】
一実施形態において、該方法では、核酸のコード機能と、核酸によりコードされるポリペプチドの物理的特性、化学的特性、および/または機能的特性とを連関させるディスプレイシステムが用いられる。このようなディスプレイシステムは、細菌ファージまたは細胞(細菌)など、複数種の複製可能な遺伝子パッケージを含みうる。一実施形態において、ディスプレイシステムは、細菌ファージディスプレイライブラリーなどのライブラリーを含む。
【０１５８】
多数の適切な細菌ファージディスプレイシステム(例えば、一価ディスプレイシステムおよび多価ディスプレイシステム)が説明されている(例えば、Griffithsら、米国特許第6,555,313B1号(参照により本明細書に組み込まれる);Johnsonら、米国特許第5,733,743号(参照により本明細書に組み込まれる);McCaffertyら、米国特許第5,969,108号(参照により本明細書に組み込まれる);Mulligan-Kehoe、米国特許第5,702,892号(参照により本明細書に組み込まれる);Winter,G.ら、Annu.Rev.Immunol.、第12巻、433〜455頁(1994);Soumillion,P.ら、Appl.Biochem.Biotechnol.、第47巻、第2〜3号、175〜189頁(1994);Castagnoli,L.ら、Comb.Chem.High Throughput Screen、第4巻、第2号、121〜133頁(2001)を参照されたい)。細菌ファージディスプレイシステム内で提示されるペプチドまたはポリペプチドは、例えば、線状ファージ(例えば、fdファージ、M13ファージ、F1ファージ)、溶菌性ファージ(例えば、T4ファージ、T7ファージ、ラムダファージ)、またはRNAファージ(例えば、MS2ファージ)などの任意の適切な細菌ファージ上で提示することができる。
【０１５９】
一般に、ペプチドレパートリーまたはファージポリペプチドを提示するファージライブラリーは、適切なファージコートタンパク質(例えば、fd pIIIタンパク質)を伴う融合タンパク質として作製または提供される。融合タンパク質は、ファージコートタンパク質の先端部において、または所望の場合、内部タンパク質において、ペプチドまたはポリペプチドを提示しうる。例えば、提示されたペプチドまたはポリペプチドは、pIIIのドメイン1(pIIIのドメイン1はまた、N1とも称する)のアミノ末端である位置に存在しうる。提示されたポリペプチドは、pIII(例えば、pIIIのドメイン1のN末端)に直接に融合させる場合もあり、リンカーを用いてpIIIに融合させる場合もある。所望の場合、融合体は、タグ(例えば、mycエピトープ、Hisタグ)をさらに含みうる。提示されるペプチドまたはポリペプチドを適切な宿主細菌内へとコードするファージベクターまたはファージミドベクターのライブラリーを導入するステップ、および結果として得られる細菌を培養してファージを生成する(例えば、適切なヘルパーファージを用いるか、または所望の場合、プラスミドを補完して)ステップなどによる任意の適切な方法を用いて、ファージ外被タンパク質を伴う融合タンパク質として提示されるペプチドまたはポリペプチドのレパートリーを含むライブラリーを作製することができる。沈殿または遠心分離など任意の適切な方法を用いて、培養物からファージライブラリーを回収することができる。
【０１６０】
ディスプレイシステムは、任意の所望量の多様性を含有するペプチドまたはポリペプチドのレパートリーを含みうる。例えば、レパートリーは、生物、生物群(例えば、ラクダ科動物から単離されるVHH dAb配列のレパートリー)、所望の組織、または所望の細胞型により発現される天然のポリペプチドに対応するアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドを含有する場合もあり、無作為であるかまたは無作為化されたアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドを含有する場合もある。所望の場合、ポリペプチドは、共通のコアまたは足場を共有しうる。このようなレパートリーまたはライブラリー内のポリペプチドは、無作為であるかまたは無作為化されたアミノ酸配列の画定領域および共通のアミノ酸配列領域を含みうる。一部の実施形態において、レパートリー内のすべてであるかまたは実質的にすべてのポリペプチドは、所望の酵素(例えば、ポリメラーゼ)または抗体の所望の抗原結合フラグメント(例えば、ヒトVHまたはヒトVL)など、所望の種類である。複数の実施形態において、ポリペプチドディスプレイシステムは、各ポリペプチドが抗体可変ドメインを含むポリペプチドレパートリーを含む。例えば、レパートリー内の各ポリペプチドは、VH、VL、またはFv(例えば、単鎖Fv)を含有しうる。
【０１６１】
任意の適切な方法を用いて、ペプチドもしくはポリペプチドまたは足場の任意の所望の領域内にアミノ酸配列の多様性を導入することができる。例えば、任意の適切な突然変異誘発法(例えば、低忠実度PCR、オリゴヌクレオチドを介するかまたは部位に方向付けられた突然変異誘発、NNKコドンを用いる多様化)または他の任意の適切な方法を用いて多様化されたポリペプチドをコードする核酸ライブラリーを調製するステップにより、抗体の可変ドメインまたは疎水性ドメインの相補性決定領域などの標的領域内にアミノ酸配列の多様性を導入することができる。所望の場合、多様化されるポリペプチドの領域を無作為化することができる。
【０１６２】
レパートリーを構成するポリペプチドのサイズは、多くの場合選択の問題であり、一様なポリペプチドサイズは必要とされない。一実施形態において、レパートリー内のポリペプチドは、少なくとも三次構造を有する(少なくとも1つのドメインを形成する)。
【０１６３】
選択/単離/回収
任意の適切な方法を用いて、レパートリーまたはライブラリー(例えば、ディスプレイシステム内における)からプロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチド(例えば、プロテアーゼ耐性ポリペプチドの集団)を選択、単離、および/または回収することができる。一実施形態において、プロテアーゼ耐性ポリペプチドは、選択可能な特性(例えば、物理的特性、化学的特性、機能的特性)に基づき選択または単離される。適切で選択可能な機能的特性は、レパートリー内におけるペプチドまたはポリペプチドの生物学的活性、例えば、一般リガンド(例えば、スーパー抗原)に対する結合、標的リガンド(例えば、抗原、エピトープ、基質)に対する結合、抗体に対する結合(例えば、ペプチドまたはポリペプチド上において発現するエピトープを介する)、および触媒活性を含む(例えば、Tomlinsonら、国際公開第99/20749号;国際公開第01/57065号;国際公開第99/58655号を参照されたい)。一実施形態において、選択は、TNFR1に対する特異的結合に基づく。別の実施形態において、選択は、メンバーがプロテアーゼ耐性である第2のレパートリーを生成する機能的特性の選択後における、第2のレパートリーからのTNFR1に特異的に結合するメンバーの選択に基づく。
【０１６４】
一部の実施形態において、プロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチドは、実質的にすべてのプロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチドが共通の選択可能な特徴を共有するペプチドまたはポリペプチドのライブラリーまたはレパートリーから選択および/または単離される。例えば、プロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチドは、実質的にすべてのプロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチドが共通の一般リガンドに結合するか、共通の標的リガンドに結合するか、共通の抗体に結合する(かまたはこれに結合される)か、または共通の触媒活性を保有するライブラリーまたはレパートリーから選択することができる。この種の選択は、例えば、免疫グロブリン可変ドメインの親和性成熟を実施する場合に、所望の生物学的活性を有する親ペプチドまたは親ポリペプチドに基づくプロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチドのレパートリーを調製するのに特に有用である。
【０１６５】
共通の一般リガンドに対する結合に基づく選択により、元のライブラリーまたはレパートリーの成分であったすべてであるかまたは実質的にすべてのプロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチドを含有するペプチドまたはポリペプチドのコレクションまたは集団がもたらされる。例えば、パニングによるかまたは適切な親和性マトリックスを用いて、プロテインA、プロテインL、または抗体などの標的リガンドまたは一般リガンドに結合するペプチドまたはポリペプチドを選択、単離、および/または回収することができる。パニングは、適切な容器(例えば、試験管、ペトリディッシュ)にリガンド(例えば、一般リガンド、標的リガンド)溶液を添加するステップと、リガンドを容器の壁面に沈着させるかまたはリガンドに容器の壁面を被覆させるステップとにより達成することができる。過剰なリガンドは洗い流し、容器にペプチドまたはポリペプチド(例えば、プロテアーゼと共にインキュベートされたレパートリー)を添加し、固定化されたリガンドにペプチドまたはポリペプチドが結合するのに適する条件下で容器を維持することができる。結合しなかったペプチドまたはポリペプチドは洗い流し、結合したペプチドまたはポリペプチドは、例えば、こすり取るかまたはpHを低下させるなど任意の適切な方法を用いて回収することができる。
【０１６６】
適切なリガンド親和性マトリックスは、一般に、リガンドがそれに共有結合または非共有結合する固体の支持体またはビーズ(例えば、アガロース)を含有する。親和性マトリックスは、マトリックス上におけるリガンドに対するペプチドまたはポリペプチドの結合に適切な条件下におけるバッチ過程、カラム過程、または他の任意の適切な過程を用いて、ペプチドまたはポリペプチド(例えば、プロテアーゼと共にインキュベートされたレパートリー)と組み合わせることができる。親和性マトリックスに結合しないペプチドまたはポリペプチドは洗い流すことができ、結合したペプチドまたはポリペプチドは、低pHの緩衝液、微弱な変性剤(例えば、尿素)、またはリガンドに対する結合について競合するペプチドによる溶出など、任意の適切な方法を用いて溶出および回収することができる。一例では、ビオチニル化させた標的リガンドを、レパートリー内のペプチドまたはポリペプチドが標的リガンド(TNFR1)に結合するのに適する条件下においてレパートリーと組み合わせる。固定化されたアビジンまたはストレプトアビジン(例えば、ビーズ上における)を用いて、結合したペプチドまたはポリペプチドを回収する。
【０１６７】
一部の実施形態において、一般リガンドは、抗体またはその抗原結合フラグメントである。ライブラリーまたはレパートリーのペプチドまたはポリペプチド中において実質的に保存されているペプチドまたはポリペプチドの構造的特徴部分に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントは、一般リガンドとして特に有用である。プロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチドを単離、選択、および/または回収するためのリガンドとしての使用に適する抗体および抗原結合フラグメントは、モノクローナルでもポリクローナルでもありえ、任意の適切な方法を用いて調製することができる。
【０１６８】
ライブラリー/レパートリー
他の態様では、プロテアーゼ耐性のペプチドおよびポリペプチドのレパートリー、プロテアーゼ耐性のペプチドおよびポリペプチドをコードするライブラリー、ならびにこのようなライブラリーおよびレパートリーを作製する方法が提供される。
【０１６９】
任意の適切な方法を用いて、プロテアーゼ耐性のペプチドおよびポリペプチドをコードおよび/または含有するライブラリーを調製することもでき、これを得ることもできる。ライブラリーは、対象となるペプチドまたはポリペプチド(例えば、ライブラリーから選択される抗TNFR1のペプチドまたはポリペプチド)に基づき、プロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチドをコードするように設計することもでき、本明細書で説明される方法を用いて別のライブラリーから選択することもできる。例えば、適切なポリペプチドディスプレイシステムを用いて、プロテアーゼ耐性ポリペプチド濃縮ライブラリーを調製することができる。
【０１７０】
一例では、本明細書で説明される通り、免疫グロブリン単一可変ドメイン(例えば、VH、Vk、Vλ)を含む提示されたポリペプチドのレパートリーを含むファージディスプレイライブラリーを、プロテアーゼ活性に適する条件下でプロテアーゼと組み合わせる。結合活性(例えば、一般リガンドに対する結合、標的リガンドに対する結合)など、所望の生物学的活性に基づき、プロテアーゼ耐性ポリペプチドを回収し、それにより、プロテアーゼ耐性のポリペプチド濃縮ファージディスプレイライブラリーがもたらされる。一実施形態において、回収は、濃縮ライブラリーをもたらす一般リガンドに対する結合の後におけるTNFR1に対する特異的結合に基づく該ライブラリーの抗TNFR1メンバーの選択に基づく。
【０１７１】
別の例では、まず、免疫グロブリン単一可変ドメイン(例えば、VH、Vκ、Vλ)を含む提示されたポリペプチドのレパートリーを含むファージディスプレイライブラリーをスクリーニングして、所望の標的抗原(TNFR1)に対する結合特異性を有するレパートリーメンバーを同定する。本明細書で説明される通り、所望の結合特異性を有するポリペプチドコレクションを回収し、プロテアーゼ活性に適する条件下でコレクションをプロテアーゼと組み合わせる。所望の標的結合特異性を有するプロテアーゼ耐性ポリペプチドのコレクションが回収され、プロテアーゼ耐性で高親和性のポリペプチド濃縮ライブラリーがもたらされる。本明細書の一実施形態で説明される通り、この選択法におけるプロテアーゼ耐性は、高親和性結合と相関する。
【０１７２】
所望の種類のポリペプチドレパートリーをコードするライブラリーは、任意の適切な方法を用いて容易に作製することができる。例えば、所望の種類のポリペプチド(例えば、ポリメラーゼ、免疫グロブリン可変ドメイン)をコードする核酸配列を得ることができ、例えば、エラープローンポリメラーゼ連鎖反応(PCR)システムを用いるか、化学的突然変異誘発(Dengら、J.Biol.Chem.、第269巻、9533頁(1994))によるか、または細菌変異株(Lowら、J.Mol.Biol.、第260巻、359頁(1996))を用いて核酸を増幅するステップにより、各々が1つまたは複数の変異を含有する核酸のコレクションを調製することができる。
【０１７３】
他の実施形態では、核酸の特定の領域を多様化の標的とすることができる。選択された位置を変異させる方法もまた当技術分野でよく知られており、例えば、PCRの使用を伴うかまたは伴わないミスマッチオリゴヌクレオチドまたは縮重オリゴヌクレオチドの使用を含む。例えば、抗原結合ループを変異の標的とすることにより、合成抗体ライブラリーが作製されている。無作為または半無作為の抗体H3領域およびL3領域を生殖細胞系列免疫グロブリンV遺伝子セグメントに付加して、未変異のフレームワーク領域を有する大規模なライブラリーが作製されている(HoogenboomおよびWinter(1992)、前出;Nissimら(1994)、前出;Griffithsら(1994)、前出;DeKruifら(1995)、前出)。このような多様化は、他の抗原結合ループの一部またはすべてを含む程度にまで拡張されている(Crameriら(1996)、Nature Med.、第2巻、100頁;Riechmannら(1995)、Bio/Technology、第13巻、475頁;Morphosys、国際公開第97/08320号、前出)。他の実施形態では、例えば、第1段階のPCR産物を「メガプライマー」として用いる2段階のPCR戦略により、核酸の特定の領域を多様化の標的とすることができる(例えば、Landt,O.ら、Gene、第96巻、125〜128頁(1990)を参照されたい)。例えば、SOE PCRによってもまた、標的化された多様化を達成することができる(例えば、Horton,R.M.ら、Gene、第77巻、61〜68頁(1989)を参照されたい)。
【０１７４】
選択された位置における配列多様性は、その位置に多数の可能なアミノ酸(例えば、20種類すべてであるかまたはその一部)を組み込むことができるように、ポリペプチド配列を指定するコード配列を変化させることにより達成することができる。IUPACによる命名法を用いると、すべてのアミノ酸およびTAG終止コドンをコードする最も融通性のあるコドンはNNKコドンである。必要とされる多様性を導入するために、NNKコドンを用いることができる。さらなる終止コドンであるTGAおよびTAAの生成をもたらすNNNコドンを含む、同じ目的を達成する他のコドンもまた有用である。このような標的化法により、標的領域内における全配列空間の探索を可能とすることができる。
【０１７５】
ライブラリーは、既知の主鎖立体構造(例えば、Tomlinsonら、国際公開第99/20749号を参照されたい)を有するプロテアーゼ耐性抗体ポリペプチドを含みうる。
【０１７６】
ライブラリーは、適切なプラスミドまたはベクター内で調製することができる。本明細書で用いられるベクターとは、異種のDNAを細胞内に導入して、それを発現および/または複製するのに用いられる個別のエレメントを指す。プラスミド(例えば、細菌プラスミド)、ウイルスベクターまたは細菌ファージベクター、人工染色体、およびエピソームベクターを含む、任意の適切なベクターを用いることができる。このようなベクターを単純なクローニングおよび突然変異誘発に用いることもでき、発現ベクターを用いてライブラリーの発現を駆動することもできる。ベクターおよびプラスミドは通常、1つまたは複数のクローニング部位(例えば、ポリリンカー)、複製起点、および少なくとも1種類の選択マーカー遺伝子を含有する。発現ベクターは、エンハンサーエレメント、プロモーター、転写終結シグナル、シグナル配列など、ポリペプチドの転写および翻訳を駆動するエレメントをさらに含有しうる。これらのエレメントは、ポリペプチドをコードするクローニングされた挿入配列に作動的に連結することで、このような発現ベクターを発現に適する条件下で(例えば、適切な宿主細胞内で)維持するとポリペプチドが発現および産生されるような形で配置することができる。
【０１７７】
クローニングベクターおよび発現ベクターは、一般に、ベクターが1種または複数種の選択された宿主細胞内において複製することを可能とする核酸配列を含有する。クローニングベクター内において典型的に、この配列は、ベクターが宿主の染色体DNAとは独立に複製することを可能とし、複製起点または自律的複製配列を含む配列である。このような配列は、各種の細菌、酵母、およびウイルスについてよく知られている。大半のグラム陰性菌にはプラスミドpBR322に由来する複製起点が適し、酵母には2ミクロンのプラスミド起点が適し、哺乳動物細胞内におけるクローニングベクターには各種のウイルス起点(例えば、SV40、アデノウイルス)が有用である。一般に、複製起点は、COS細胞など、高レベルのDNAを複製する能力のある哺乳動物細胞中で用いられるのでない限り、哺乳動物発現ベクターには必要でない。
【０１７８】
クローニングベクターまたは発現ベクターは、選択マーカーとも称される選択遺伝子を含有しうる。このようなマーカー遺伝子は、選択培地中で増殖する形質転換された宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードする。したがって、選択遺伝子を含有するベクターを形質転換されていない宿主細胞は、培地中では生存しない。典型的な選択遺伝子は、抗生剤または他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、またはテトラサイクリン、栄養要求性補体欠損症に対する耐性を賦与するか、または増殖培地中では供給されない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
【０１７９】
適切な発現ベクターは、多数の構成要素、例えば、複製起点、選択マーカー遺伝子、転写制御エレメント(例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター)および/または1種または複数種の翻訳シグナル、シグナル配列、またはリーダー配列など、1種または複数種の発現制御エレメントを含有しうる。発現制御エレメントおよびシグナル配列またはリーダー配列は、存在する場合、ベクターまたは他の供給源により供給されうる。例えば、抗体鎖をコードするクローニングされた核酸の転写制御配列および/または翻訳制御配列は、発現を方向付けるのに用いることができる。
【０１８０】
プロモーターを供給して、所望の宿主細胞内における発現を行うことができる。プロモーターは、構成的または誘導性でありうる。例えば、プロモーターは、抗体、抗体鎖、またはその一部をコードする核酸に作動的に連結され、該核酸の転写を方向付けることが可能である。原核生物宿主に適する各種のプロモーター(例えば、β-ラクタマーゼおよびラクトースによるプロモーターシステム、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーターシステム、大腸菌のためのlacプロモーター、tacプロモーター、T3プロモーター、T7プロモーター)および真核生物宿主に適する各種のプロモーター(例えば、シミアンウイルス40早期プロモーターまたは後期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス長端末反復配列プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、EG-1aプロモーター)が使用できる。
【０１８１】
加えて、発現ベクターは、ベクターを保有する宿主細胞選択のための選択マーカーと、複製可能な発現ベクターの場合の複製起点とを含むのが典型的である。抗生耐性または薬剤耐性を賦与する生成物をコードする遺伝子が一般的な選択マーカーであり、原核細胞(例えば、β-ラクタマーゼ遺伝子(アンピシリン耐性)、テトラサイクリン耐性のためのTet遺伝子)および真核細胞(例えば、ネオマイシン(G418またはジェネチシン)耐性遺伝子、gpt(ミコフェノール酸)耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、またはハイグロマイシン耐性遺伝子)において用いることができる。ジヒドロ葉酸レダクターゼマーカー遺伝子は、各種の宿主におけるメトトレキサートによる選択を可能とする。宿主の栄養要求性マーカーの遺伝子産物をコードする遺伝子(例えば、LEU2、URA3、HIS3)は、酵母における選択マーカーとして用いられることが多い。ウイルス(例えば、バキュロウイルス)ベクターまたはファージベクター、およびレトロウイルスベクターなど、宿主細胞のゲノム内に組み込むことのできるベクターの使用もまた意図される。
【０１８２】
原核細胞(例えば、大腸菌などの細菌細胞)または哺乳動物細胞における発現に適する発現ベクターは、例えば、pETベクター(例えば、pET-12a、pET-36、pET-37、pET-39、pET-40、Novagen社製および他社製)、ファージベクター(例えば、pCANTAB 5 E、Pharmacia社製)、pRIT2T(プロテインA融合ベクター、Pharmacia社製)、pCDM8、pCDNA1.1/amp、pcDNA3.1、pRc/RSV、pEF-1(カリフォルニア州、カールスバード、Invitrogen社製)、pCMV-SCRIPT、pFB、pSG5、pXT1(カリフォルニア州、ラホラ、Stratagene社製)、pCDEF3(Goldman,L.A.ら、Biotechniques、第21巻、1013〜1015頁(1996))、pSVSPORT(メリーランド州、ロックビル、GibcoBRL社製)、pEF-Bos(Mizushima,S.ら、Nucleic Acids Res.、第18巻、5322頁(1990))などを含む。原核細胞(大腸菌)、昆虫細胞(ショウジョウバエ(Drosopila)シュナイダーS2細胞、同Sf9細胞)、酵母(ピキア・メタノリカ(P.methanolica)、ピキア・パストリス、サッカロミセス・セレビシエ)、および哺乳動物細胞(例えば、COS細胞)など、各種の発現宿主における使用に適する発現ベクターが使用できる。
【０１８３】
ベクターの例は、ポリペプチドライブラリーメンバーに対応するヌクレオチド配列の発現を可能とする発現ベクターである。こうして、ポリペプチドライブラリーメンバーを発現する単一クローンの個別の増殖および発現により、一般リガンドおよび/または標的リガンドによる選択を行うことができる。上述の通り、選択ディスプレイシステムは、細菌ファージディスプレイでありうる。こうして、ファージベクターまたはファージミドベクターを用いることができる。ベクターの例は、大腸菌複製起点(二本鎖複製のための)を有し、また、ファージ複製起点(一本鎖DNA作製のための)も有するファージミドベクターである。このようなベクターの操作および発現は、当技術分野でよく知られている(HoogenboomおよびWinter(1992)、前出;Nissimら(1994)、前出)。略述すると、ベクターは、適切なリーダー配列、複数のクローニング部位、1つまたは複数のペプチドタグ、1つまたは複数のTAG終止コドン、およびpIIIファージタンパク質を含有しうる発現カセットの上流において、ファージミドおよびlacプロモーターに対する選択性を賦与するβ-ラクタマーゼを含有しうる。こうして、大腸菌の各種のサプレッサー株および非サプレッサー株を用い、また、グルコース、イソプロピルチオ-β-D-ガラクトシド(IPTG)またはVCS M13などのヘルパーファージを添加することにより、ベクターは、発現しないプラスミドとしての複製が可能であり、大量のポリペプチドライブラリーメンバーのみ、またはその一部がその表面上に少なくとも1コピーのポリペプチド-pIII融合体を含有する生成物ファージを生成する。
【０１８４】
本明細書で説明されるライブラリーおよびレパートリーは、抗体フォーマットを含有しうる。例えば、ライブラリーおよびレパートリー内に含有されるポリペプチドは、そのいずれかが改変されるかまたは改変されない、個別の全VHドメインまたは全VLドメインでありうる。scFvフラグメントならびに他の抗体ポリペプチドは、任意の適切な方法を用いて容易に作製することができる。当技術分野では、多数の適切な抗体エンジニアリング法がよく知られている。例えば、scFvは、2つの可変ドメインをコードする核酸を、(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3または他の適切なリンカーペプチドなどの適切なリンカーペプチドをコードする適切なオリゴヌクレオチドと連結することにより形成することができる。リンカーにより、第1のV領域のC末端と第2のV領域のN末端とが架橋される。Fvフラグメント、Fabフラグメント、およびF(ab')2フラグメントなど他の抗体フォーマット構築のための同様の技法も用いることができる。FabフラグメントおよびF(ab')2フラグメントをフォーマットするためには、VHポリペプチドおよびVLポリペプチドを、再配列遺伝子、生殖細胞系列C遺伝子から単離することもでき、抗体配列データから合成することもできる定常領域セグメントと組み合わせることができる。本明細書で説明されるライブラリーまたはレパートリーは、VHまたはVLのライブラリーまたはレパートリーでありうる。
【０１８５】
プロテアーゼ耐性可変ドメインを含むポリペプチドは、標的リガンド(TNFR1)結合部位と一般リガンド結合部位とを含みうる。一部の実施形態において、一般リガンド結合部位は、プロテインA、プロテインL、またはプロテインGなどのスーパー抗原に対する結合部位である。可変ドメインは、任意の所望の可変ドメイン、例えば、ヒトVH(例えば、VH1a、VH1b、VH2、VH3、VH4、VH5、VH6)、ヒトVλ(例えば、VλI、VλII、VλIII、VλIV、VλV、VλVI、またはVκ1)、もしくはヒトVκ(例えば、Vκ2、Vκ3、Vκ4、Vκ5、Vκ6、Vκ7、Vκ8、Vκ9、またはVκ10)、またはラクダ科動物VHH、任意により、ヒト化されたラクダ科動物VHHに基づくことができる。
【０１８６】
核酸、宿主細胞、およびプロテアーゼ耐性ポリペプチドを作製する方法
本発明は、プロテアーゼ耐性のペプチドおよびポリペプチドをコードする単離核酸および/または組み換え核酸、例えば、本明細書で説明される方法により選択可能であるかまたは選択される核酸に関する。
【０１８７】
本明細書で「単離された」と称する核酸は、その元の環境(例えば、細胞内またはライブラリーなどの核酸混合物中)における他の物質(例えば、ゲノムDNA、cDNA、および/またはRNAなど、他の核酸)から分離された核酸である。単離された核酸は、ベクター(例えば、プラスミド)の一部として単離することができる。
【０１８８】
本明細書で「組み換え」と称する核酸は、例えば、制限酵素、相同組み換え、ウイルスなどを用いるベクターまたは染色体内へのクローニングなどの人工的な組み換えに依拠する方法を含む組み換えDNA法により作製された核酸、およびポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて調製された核酸である。
【０１８９】
本発明はまた、プロテアーゼ耐性のペプチドおよびポリペプチド、例えば、本明細書で説明される方法により選択可能であるかまたは選択されるペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸を含む(1種または複数種の)組み換え核酸または発現構築物を含む組み換え宿主細胞にも関する。プロテアーゼ耐性のペプチドおよびポリペプチドを調製する方法であって、本発明の組み換え宿主細胞を、プロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチドの発現に適切な条件下で維持するステップを含む方法もまた提供される。該方法は、所望の場合、プロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチドを単離または回収するステップをさらに含みうる。
【０１９０】
例えば、(1種または複数種の)核酸分子が、1種または複数種の発現制御エレメント(例えば、ベクター内、細胞内過程により創出され、宿主細胞ゲノムに組み込まれた構築物内における)に機能的に連結されるように、選択された宿主細胞に適切な任意の方法(例えば、形質転換、トランスフェクション、電気穿孔、感染)を用いて、プロテアーゼ耐性のペプチドもしくはポリペプチドをコードする核酸分子(すなわち、1種または複数種の核酸分子)、または(1種または複数種の)このような核酸分子を含む発現構築物(すなわち、1種または複数種の構築物)を適切な宿主細胞に導入して、組み換え宿主細胞を作製することができる。結果として得られる組み換え宿主細胞を発現に適する条件下(例えば、誘導剤の存在下、適切な動物体内、適切な塩、成長因子、抗生剤、栄養補助物質などを補給した適切な培地中)で維持し、それにより、コードされたペプチドまたはポリペプチドを生成することができる。所望の場合、コードされたペプチドまたはポリペプチドは、単離または回収(例えば、動物、宿主細胞、培地、ミルクから)することができる。この過程には、トランスジェニック動物の宿主細胞内における発現も包含される(例えば、GenPharm International社、国際公開第92/03918号を参照されたい)。
【０１９１】
本明細書で説明される方法により選択されるプロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチドはまた、化学合成または他の任意の適切な方法により、in vitroにおける適切な発現系でも生成することができる。こうして、本発明は、プロテアーゼ耐性のペプチドおよびポリペプチドを提供する。
【０１９２】
ポリペプチド、dAb、およびアンタゴニスト
本明細書で説明および例示される通り、本発明のプロテアーゼ耐性dAbは、一般に、その標的リガンドに高親和性で結合する。こうして、別の態様では、TNFR1に高親和性で結合する本発明のポリペプチドまたはdAbを選択、単離、および/または回収する方法が提供される。一般に、該方法は、ペプチドまたはポリペプチド(例えば、dAb)のライブラリーまたはレパートリーを提供するステップと、プロテアーゼ活性に適する条件下でライブラリーまたはレパートリーをプロテアーゼ(例えば、トリプシン、エラスターゼ、ロイコザイム、パンクレアチン、喀痰(sputum))と組み合わせるステップと、リガンド(例えば、標的リガンド)に結合するペプチドまたはポリペプチドを選択、単離、および/または回収するステップとを含む。ライブラリーまたはレパートリーは、プロテアーゼ感受性のペプチドまたはポリペプチドが消化される条件下でプロテアーゼに曝露されているので、プロテアーゼ活性により、結合親和性の低い、安定性のより低いポリペプチドが除去され、それにより、高親和性結合するペプチドまたはポリペプチドのコレクションが生成される。例えば、本発明のポリペプチドまたはdAbは、1μM以上、または約500nM〜0.5pMの親和性(表面プラズモン共鳴により決定されるKD;KD=Koff(kd)/Kon(ka))により、TNFR1に結合しうる。例えば、本発明のポリペプチドまたはdAbは、約500nM、約100nM、約10nM、約1nM、約500pM、約100pM、約10pM、約1pM、または約0.5pMの親和性により、TNFR1に結合しうる。本発明者らは、いかなる特定の理論にも拘束されるものではないが、プロテアーゼに対して耐性であるペプチドおよびポリペプチドは、より低いエントロピーおよび/またはより高い安定化エネルギーを有すると考えられる。こうして、プロテアーゼ耐性と高親和性結合との間の相関関係は、本明細書で説明される方法により選択されるペプチドおよびポリペプチドならびにdAbの表面の稠密性および安定性と関連しうる。
【０１９３】
一実施形態において、本発明のポリペプチド、dAb、またはアンタゴニストは、TNFα受容体I(p55受容体)に対するTNFαの結合を、約500nM〜50pM、または100nM〜50pM、または10nM〜100pM、または1nM〜100pM;例えば、50nM以下、または5nM以下、または500pM以下、または200pM以下、または100pM以下の50％阻害濃度(IC50)により阻害する。
【０１９４】
一部の実施形態において、ポリペプチド、dAb、またはアンタゴニストは、TNFR1、例えば、ヒトTNFR1に特異的に結合し、表面プラズモン共鳴により決定される300nM〜1pM、または300nM〜5pM、または50nM〜1pM、または50nM〜5pM、または50nM〜20pM、または約10pM、または約15pM、または約20pMの解離定数(KD)によりヒトTNFR1から解離する。一部の実施形態において、ポリペプチド、dAb、またはアンタゴニストは、TNFR1、例えば、ヒトTNFR1に特異的に結合し、表面プラズモン共鳴により決定される5×10-1秒-1〜1×10-7秒-1、または1×10-3秒-1〜1×10-7秒-1、または1×10-4秒-1〜1×10-7秒-1、または1×10-5秒-1〜1×10-7秒-1、または1×10-4秒-1、または1×10-5秒-1の速度定数KoffによりヒトTNFR1から解離する。一部の実施形態において、ポリペプチド、dAb、またはアンタゴニストは、1×10-3M-1秒-1〜1×10-7M-1秒-1、または1×10-3M-1秒-1〜1×10-6M-1秒-1、または約1×10-4M-1秒-1、または約1×10-5M-1秒-1のKonによりTNFR1、例えば、ヒトTNFR1に特異的に結合する。一実施形態において、ポリペプチド、dAb、またはアンタゴニストは、TNFR1、例えば、ヒトTNFR1に特異的に結合し、本段落で定義された解離定数(KD)およびKoffによりヒトTNFR1から解離する。一実施形態において、ポリペプチド、dAb、またはアンタゴニストは、TNFR1、例えば、ヒトTNFR1に特異的に結合し、本段落で定義された解離定数(KD)およびKonによりヒトTNFR1から解離する。一部の実施形態において、ポリペプチドまたはdAbは、本段落で列挙されたKDおよび/またはKoffおよび/またはKonによりTNFR1(例えば、ヒトTNFR1)に特異的に結合し、DOM1h-131-206のアミノ酸配列(図3に示す)と少なくとも約80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％同一なアミノ酸配列を含む。
【０１９５】
ポリペプチド、dAb、またはアンタゴニストは、大腸菌またはピキア属種(例えば、ピキア・パストリス)内で発現させることができる。一実施形態において、リガンドまたはdAb単量体は、大腸菌またはピキア属種(例えば、ピキア・パストリス)内で発現させると、少なくとも約0.5mg/Lの量で分泌される。本明細書で説明されるリガンドおよびdAb単量体は、大腸菌またはピキア属種(例えば、ピキア・パストリス)内で発現させると分泌可能でありうるが、大腸菌またはピキア属種を用いない合成化学法または生物学的作製法など、任意の適切な方法を用いて作製することができる。
【０１９６】
一部の実施形態において、ポリペプチド、dAb、またはアンタゴニストは、ラクダ科動物の免疫グロブリン可変ドメイン、または、例えば、位置108、37、44、45、および/または47において、ラクダ科動物生殖細胞系列抗体遺伝子セグメントによりコードされる免疫グロブリン可変ドメインに固有の1つもしくは複数のフレームワークアミノ酸を含まない。
【０１９７】
本発明によるTNFR1アンタゴニストは、一価または多価でありうる。一部の実施形態において、アンタゴニストは一価であり、本発明のポリペプチドまたはdAbにより提供され、TNFR1と相互作用する1つの結合部位を含む。一価のアンタゴニストは1つのTNFR1に結合し、受容体の活性化およびシグナル伝達をもたらしうる細胞表面上におけるTNFR1の架橋形成またはクラスター化を誘導することがありえない。
【０１９８】
他の実施形態において、TNFR1アンタゴニストは多価である。多価TNFR1アンタゴニストは、TNFR1に対する特定の結合部位の2つ以上のコピーを含有する場合もあり、TNFR1に結合する2つ以上の異なる結合部位を含有し、該結合部位の少なくとも1つが本発明のポリペプチドまたはdAbにより提供される場合もある。例えば、本明細書で説明される通り、TNFR1アンタゴニストは、TNFR1に結合する本発明の特定のポリペプチドもしくはdAbの2つ以上のコピー、またはTNFR1に結合する本発明の2種類以上の異なるポリペプチドもしくはdAbを含む二量体、三量体、または多量体でありうる。一実施形態での標準的な細胞アッセイにおいて、多価TNFR1アンタゴニストは、実質的にTNFR1をアゴナイズ(TNFR1のアゴニストとして作用)しない(すなわち、該アッセイにおいて、1nM、10nM、100nM、1μM、10μM、100μM、1000μM、または5,000μMの濃度で存在する場合、TNFα(100pg/ml)により誘導される約5％以下のTNFR1媒介活性が結果としてもたらされる)。
【０１９９】
一部の実施形態において、多価TNFR1アンタゴニストは、所望のTNFR1エピトープまたはTNFR1ドメインに対する2つ以上の結合部位を含有する。例えば、多価TNFR1アンタゴニストは、TNFR1のドメイン1内の同じエピトープに結合する2つ以上の結合部位を含みうる。
【０２００】
他の実施形態において、多価TNFR1アンタゴニストは、本発明のポリペプチドまたはdAbにより提供され、TNFR1の異なるエピトープまたはドメインに結合する、2つ以上の結合部位を含有する。一実施形態において、このような多価アンタゴニストは、標準的なL929細胞傷害性アッセイまたは国際公開第2006038027号で説明される標準的なHeLa IL-8アッセイにおいて約1nM、または約10nM、または約100nM、または約1μM、または約10μMの濃度で存在する場合、TNFR1をアゴナイズしない。
【０２０１】
他のTNFR1アンタゴニストは、TNFR1に対するTNFαの結合を阻害しない。このようなリガンド(およびアンタゴニスト)は、試料中におけるTNFR1に結合し、これを検出、定量、または測定するのに用いうるが、TNFR1に対する結合について試料中におけるTNFと競合しないので、診断剤としての有用性を有しうる。したがって、試料中にTNFR1が存在するかどうかまたはそれがどれだけ存在するかの正確な決定を行うことができる。
【０２０２】
他の実施形態において、ポリペプチド、dAb、またはアンタゴニストは、本明細書で説明されるKdによりTNFR1に特異的に結合し、標準的なマウスLPS/D-ガラクトサミン誘導敗血症ショックモデルにおける致死性を阻害する(すなわち、適切な対照と比較して、少なくとも約10％致死性を阻止するかまたは致死性を低下させる)。一実施形態において、ポリペプチド、dAb、またはアンタゴニストは、約5mg/kg以上、例えば、約1mg/kgで投与する場合、標準的なマウスLPS/D-ガラクトサミン誘導敗血症ショックモデルにおける適切な対照と比較して、少なくとも約25％、または少なくとも約50％致死性を阻害する。
【０２０３】
他の実施形態での標準的な細胞アッセイにおいて、ポリペプチド、dAb、またはアンタゴニストは、TNFRIに結合して≦100nMのND50によりTNFR1活性をアンタゴナイズし、また、該アッセイにおいて、dAbは、≦10μMの濃度でTNFR1活性を≦5％アゴナイズする。
【０２０４】
具体的な実施形態での標準的な細胞アッセイにおいて、ポリペプチド、dAb、またはアンタゴニストは、実質的にTNFR1をアゴナイズ(TNFR1のアゴニストとして作用)しない(すなわち、該アッセイにおいて、1nM、10nM、100nM、1μM、10μM、100μM、1000μM、または5,000μMの濃度で存在する場合、TNFα(100pg/ml)により誘導される約5％以下のTNFR1媒介活性が結果としてもたらされる)。
【０２０５】
一部の実施形態において、本発明のポリペプチド、dAb、またはアンタゴニストは、有効量を投与すると、慢性炎症性疾患モデルにおいて有効である。一般に、有効量は、約1mg/kg〜約10mg/kg(例えば、約1mg/kg、約2mg/kg、約3mg/kg、約4mg/kg、約5mg/kg、約6mg/kg、約7mg/kg、約8mg/kg、約9mg/kg、または約10mg/kg)である。炎症性疾患モデル(国際公開第2006038027号で説明されるモデルを参照されたい)は、当業者により、ヒトにおける治療有効性を予測するものとして認知されている。
【０２０６】
具体的な実施形態において、ポリペプチド、dAb、またはアンタゴニストは、標準的なマウスコラーゲン誘導関節炎モデル(モデルの詳細については、国際公開第2006038027号を参照されたい)において有効である。例えば、有効量のポリペプチド、dAb、またはアンタゴニストを投与することにより、標準的なマウスコラーゲン誘導関節炎モデルにおける全四肢平均関節炎スコアを、適切な対照と比較して、例えば、約1〜約16、約3〜約16、約6〜約16、約9〜約16、または約12〜約16低下させることができる。別の例では、有効量のポリペプチド、dAb、またはアンタゴニストを投与することにより、標準的なマウスコラーゲン誘導関節炎モデルにおける関節炎症状の発現を、適切な対照と比較して、例えば、約1日間、約2日間、約3日間、約4日間、約5日間、約6日間、約7日間、約10日間、約14日間、約21日間、または約28日間遅延させることができる。別の例では、有効量のポリペプチド、dAb、またはアンタゴニストを投与することの結果として、標準的なマウスコラーゲン誘導関節炎モデルにおける0〜約3、約3〜約5、約5〜約7、約7〜約15、約9〜約15、約10〜約15、約12〜約15、または約14〜約15の全四肢平均関節炎スコアを得ることができる。
【０２０７】
他の実施形態において、ポリペプチド、dAb、またはアンタゴニストは、マウスΔARE関節炎モデル(モデルの詳細については、国際公開第2006038027号を参照されたい)において有効である。例えば、有効量のポリペプチド、dAb、またはアンタゴニストを投与することにより、マウスΔARE関節炎モデルにおける平均関節炎スコアを、適切な対照と比較して、例えば、約0.1〜約2.5、約0.5〜約2.5、約1〜約2.5、約1.5〜約2.5、または約2〜約2.5低下させることができる。別の例では、有効量のポリペプチド、dAb、またはアンタゴニストを投与することにより、マウスΔARE関節炎モデルにおける関節炎症状の発現を、適切な対照と比較して、例えば、約1日間、約2日間、約3日間、約4日間、約5日間、約6日間、約7日間、約10日間、約14日間、約21日間、または約28日間遅延させることができる。別の例では、有効量のポリペプチド、dAb、またはアンタゴニストを投与することの結果として、マウスΔARE関節炎モデルにおける0〜約0.5、約0.5〜約1、約1〜約1.5、約1.5〜約2、または約2〜約2.5の平均関節炎スコアを得ることができる。
【０２０８】
他の実施形態において、ポリペプチド、dAb、またはアンタゴニストは、マウスΔARE炎症性大腸疾患(IBD)モデル(モデルの詳細については、国際公開第2006038027号を参照されたい)において有効である。例えば、有効量のポリペプチド、dAb、またはアンタゴニストを投与することにより、マウスΔARE IBDモデルにおける平均急性炎症スコアおよび/または同慢性炎症スコアを、適切な対照と比較して、例えば、約0.1〜約2.5、約0.5〜約2.5、約1〜約2.5、約1.5〜約2.5、または約2〜約2.5低下させることができる。別の例では、有効量のポリペプチド、dAb、またはアンタゴニストを投与することにより、マウスΔARE IBDモデルにおけるIBD症状の発現を、適切な対照と比較して、例えば、約1日間、約2日間、約3日間、約4日間、約5日間、約6日間、約7日間、約10日間、約14日間、約21日間、または約28日間遅延させることができる。別の例では、有効量のポリペプチド、dAb、またはアンタゴニストを投与することの結果として、マウスΔARE IBDモデルにおける0〜約0.5、約0.5〜約1、約1〜約1.5、約1.5〜約2、または約2〜約2.5の平均急性炎症スコアおよび/または同慢性炎症スコアを得ることができる。
【０２０９】
他の実施形態において、ポリペプチド、dAb、またはアンタゴニストは、マウスデキストラン硫酸ナトリウム(DSS)誘導IBDモデル(モデルの詳細については、国際公開第2006038027号を参照されたい)において有効である。例えば、有効量のポリペプチド、dAb、またはアンタゴニストを投与することにより、マウスDSS IBDモデルにおける平均重症度スコアを、適切な対照と比較して、例えば、約0.1〜約2.5、約0.5〜約2.5、約1〜約2.5、約1.5〜約2.5、または約2〜約2.5低下させることができる。別の例では、有効量のポリペプチド、dAb、またはアンタゴニストを投与することにより、マウスDSS IBDモデルにおけるIBD症状の発現を、適切な対照と比較して、例えば、約1日間、約2日間、約3日間、約4日間、約5日間、約6日間、約7日間、約10日間、約14日間、約21日間、または約28日間遅延させることができる。別の例では、有効量のポリペプチド、dAb、またはアンタゴニストを投与することの結果として、マウスDSS IBDモデルにおける0〜約0.5、約0.5〜約1、約1〜約1.5、約1.5〜約2、または約2〜約2.5の平均重症度スコアを得ることができる。
【０２１０】
具体的な実施形態において、ポリペプチド、dAb、またはアンタゴニストは、慢性閉塞性肺疾患(COPD)のマウス喫煙モデル(モデルの詳細については、国際公開第2006038027号および国際公開第2007049017号を参照されたい)において有効である。例えば、有効量のリガンドを投与することにより、COPD症状の発現を、適切な対照と比較して軽減するかまたは遅延させることができる。
【０２１１】
疾患に対する防御またはその治療におけるTNFR1アンタゴニスト(例えば、そのリガンド、抗体、または結合タンパク質)の有効性をスクリーニングするのに用いうる動物モデルシステムが使用できる。感受性マウスにおいて全身性エリテマトーデス(SLE)を調べる方法は、当技術分野で知られている(Knightら(1978)、J.Exp.Med.、第147巻、1653頁;Reinerstenら(1978)、New Eng.J.Med.、第299巻、515頁)。重症筋無力症(MG)は、雌SJL/Jマウスにおいて、別の動物種に由来する可溶性AchRタンパク質により疾患を誘導することにより調べられる(Lindstromら(1988)、Adv.Immunol.、第42巻、233頁)。関節炎は、感受性マウス系統において、II型コラーゲンの注射により誘導される(Stuartら(1984)、Ann.Rev.Immunol.、第42巻、233頁)。感受性ラットにおける抗酸菌熱ショックタンパク質の注射によりアジュバント関節炎を誘導するモデルが説明されている(Van Edenら(1988)、Nature、第331巻、171頁)。甲状腺炎は、説明される通り、マウスにおけるサイログロブリンの投与により誘導される(Maronら(1980)、J.Exp.Med.、第152巻、1115頁)。インスリン依存性糖尿病(IDDM)は、天然に存在するかまたはKanasawaら(1984)、Diabetologia、第27巻、113頁により説明されるマウス系統など一部のマウス系統において誘導することができる。マウスおよびラットにおけるEAEは、ヒトにおけるMSモデルとして用いられる。このモデルでは、ミエリン塩基性タンパク質の投与により、脱髄疾患が誘導される(Paterson(1986)、「Textbook of Immunopathology」、Mischerら編、ニューヨーク、Grune and Stratton社、179〜213頁;McFarlinら(1973)、Science、第179巻、478頁;およびSatohら(1987)、J.Immunol.、第138巻、179頁を参照されたい)。
【０２１２】
一般に、本リガンド(例えば、アンタゴニスト)は、精製形態において、製薬上適切な担体と共に用いられる。典型的に、これらの担体は、アルコール溶液/水溶液、エマルジョンまたは懸濁液、生理食塩水および/または緩衝媒体を含む任意の担体を含む。非経口媒体は、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウムおよび乳酸加リンゲル液を含む。ポリペプチド複合体を懸濁液中において維持することが必要な場合は、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、およびアルギン酸などの増粘剤から、生理学的に許容される適切なアジュバントを選択することができる。
【０２１３】
静脈内ビヒクルは、リンゲルデキストロースに基づく場合など、流体ならびに栄養補充剤および電解質補充剤を含む。防腐剤ならびに抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤、および不活性ガスなど他の添加剤もまた存在しうる(Mack(1982)、「Remington's Pharmaceutical Sciences」、第16版)。持続放出製剤を含む各種の適切な製剤を用いることができる。
【０２１４】
本発明のリガンド(例えば、アンタゴニスト)は、個別に投与される組成物として用いることもでき、他の作用物質と共に用いることもできる。これらは、シクロスポリン、メトトレキサート、アドリアマイシン、またはシス白金など各種の免疫治療作用物質および抗毒素を含みうる。医薬組成物は、本発明のリガンドと共に、またはさらに、投与前にそれらがプールされる場合であれされない場合であれ、異なる標的抗原またはエピトープを用いて選択されるリガンドなど、異なる特異性を有する本発明によるリガンドの組合せと共に、各種の細胞傷害性作用物質または他の作用物質の「カクテル」を含みうる。
【０２１５】
本発明による医薬組成物の投与経路は、当業者に一般に知られる投与経路のいずれかでありうる。免疫療法を含むがこれに限定されない治療の場合、標準的な技法に従い、選択された本発明のリガンドを任意の患者に投与することができる。
【０２１６】
投与は、非経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、経皮投与、肺内経路を介する投与、または適切な場合、カテーテルによる直接注入による投与も含む任意の適切な方式によることが可能である。投与の量および回数は、患者の年齢、性別、および状態、他の薬剤の併用投与、医師により考慮されるべき禁忌および他のパラメータに依存する。投与は、適応に応じて、局所投与(例えば、肺内投与、例えば、鼻腔内投与による肺への局所送達)または全身投与でありうる。
【０２１７】
本発明のリガンドは、保存用に凍結乾燥し、使用前に適切な担体中で再調製することができる。この技法は、従来の免疫グロブリンに対して有効であることが示されており、当技術分野で知られる凍結乾燥法および再調製法を用いることができる。凍結乾燥および再調製により、様々な程度での抗体活性の喪失(例えば、従来の免疫グロブリンの場合、IgM抗体の方が、IgG抗体よりも大きな活性喪失を示す傾向がある)が生じることがあり、これを補うために、使用レベルを上方に調整する必要がありうることが、当業者には理解されるであろう。
【０２１８】
本リガンド(例えば、アンタゴニスト)またはそのカクテルを含有する組成物は、予防的処置および/または治療的処置用に投与することができる。一部の治療的応用では、選択された細胞集団の少なくとも部分的な阻害、抑制、調節、殺滅、または他の一部の測定可能なパラメータを達成するのに十分な量を、「治療有効用量」と定義する。この用量を達成するのに必要な量は、疾患の重症度および患者固有の免疫系の全般的状態に依存するが、一般には、体重キログラム当たり0.005〜5.0mgの範囲のリガンド、例えば、dAbまたはアンタゴニストであり、0.05〜2.0mg/kg/回の用量が最も一般的に用いられる。予防的応用の場合、本リガンドまたはそのカクテルを含有する組成物はまた、疾患の発症を予防するか、阻害するか、または遅延させる(例えば、寛解もしくは休止を維持するか、または急性相を予防する)のに同様であるかまたはやや低量の用量でも投与することができる。当業者は、疾患を治療、抑制、または予防するのに適切な投与間隔を決定することができるであろう。TNFR1リガンド(例えば、アンタゴニスト)を投与して慢性炎症性疾患を治療、抑制、または予防する場合、例えば、約10μg/kg〜約80mg/kg、約100μg/kg〜約80mg/kg、約1mg/kg〜約80mg/kg、約1mg/kg〜約70mg/kg、約1mg/kg〜約60mg/kg、約1mg/kg〜約50mg/kg、約1mg/kg〜約40mg/kg、約1mg/kg〜約30mg/kg、約1mg/kg〜約20mg/kg、約1mg/kg〜約10mg/kg、約10μg/kg〜約10mg/kg、約10μg/kg〜約5mg/kg、約10μg/kg〜約2.5mg/kg、約1mg/kg、約2mg/kg、約3mg/kg、約4mg/kg、約5mg/kg、約6mg/kg、約7mg/kg、約8mg/kg、約9mg/kg、または約10mg/kgの用量で1日4回、毎週2回、毎週1回、隔週1回、毎月1回、または隔月1回以下投与することができる。具体的な実施形態では、TNFR1リガンド(例えば、アンタゴニスト)を、約10μg/kg〜約10mg/kg(例えば、約10μg/kg、約100μg/kg、約1mg/kg、約2mg/kg、約3mg/kg、約4mg/kg、約5mg/kg、約6mg/kg、約7mg/kg、約8mg/kg、約9mg/kg、または約10mg/kg)の用量で隔週1回または毎月1回投与して、慢性炎症性疾患を治療、抑制、または予防することができる。
【０２１９】
本明細書で説明される組成物を用いて実施される治療または療法は、1種または複数種の症状が、治療前に存在するこのような症状と比べて、またはこのような組成物によって治療されていない個体(ヒトまたはモデル動物)もしくは他の適切な対照におけるこのような症状と比べて軽減される(例えば、少なくとも10％または臨床評価尺度において少なくとも1ポイント)場合に、「有効」であると考えられる。症状は、標的とする疾患または障害に応じて明らかに変化するが、当業者による測定が可能である。このような症状は、例えば、疾患または障害の1種または複数種の生化学的指標のレベル(例えば、疾患と相関する酵素レベルまたは代謝物レベル、罹患細胞数など)のモニタリング、身体症状(例えば、炎症、腫瘍サイズなど)のモニタリング、または許容された臨床評価尺度、例えば、総合障害度評価尺度(多発性硬化症のための)、アービン炎症性大腸疾患問診表(腸機能、全身症状、社会的機能、および情動状態に関して32項目にわたる評価により生活の質を評価する：スコアは32〜224の範囲にわたり、より高いスコアによりより良好な生活の質が示される)、関節リウマチ生活の質評価尺度、もしくは当分野で知られる他の許容された臨床評価尺度により測定することができる。少なくとも10％または臨床評価尺度における1ポイントもしくは複数ポイントの疾患または障害の症状の持続的な(例えば、1日間以上、またはこれより長期間にわたる)軽減は、「有効な」治療を示す。同様に、本明細書で説明される組成物を用いて実施される予防は、1種または複数種の症状の発現または重症度が、組成物によって治療されていない同様の個体(ヒトまたは動物モデル)におけるこのような症状と比べて遅延するか、軽減されるか、または除去される場合に、「有効」であると考えられる。
【０２２０】
本発明によるリガンド(例えば、アンタゴニスト)またはそのカクテルを含有する組成物を予防的状況および治療的状況において用いて、哺乳動物における選択された標的細胞集団の変更、不活化、殺滅、または除去を補助することができる。加えて、本明細書で説明される選択されたポリペプチドレパートリーを体外またはin vitroで用いて、細胞の異種コレクションから標的細胞集団を選択的に殺滅するか、枯渇させるか、または別の形で効果的に除去することもできる。標準的な技法に従って、哺乳動物に由来する血液を体外でリガンドと組み合わせ、それにより、血液から望ましくない細胞を殺滅するかまたは別の形で除去し、哺乳動物に戻すことができる。
【０２２１】
本発明によるリガンド(例えば、アンタゴニスト)を含有する組成物を予防的状況および治療的状況において用いて、哺乳動物における選択された標的細胞集団の変更、不活化、殺滅、または除去を補助することができる。
【０２２２】
リガンド(例えば、抗TNFR1アンタゴニスト、dAb単量体)は、1種または複数種のさらなる治療または活性作用物質と共に投与および/または製剤化することができる。リガンド(例えば、dAb)をさらなる治療作用物質と共に投与する場合、リガンドは、さらなる作用物質の投与前、投与と同時、または投与後に投与することができる。一般に、リガンドおよびさらなる作用物質は、治療効果の重複を提供する形で投与される。
【０２２３】
一実施形態において、本発明は、それを必要とする哺乳動物に、本発明による治療有効用量または有効量のTNFR1ポリペプチド、dAb、またはアンタゴニストを投与するステップを含む、慢性炎症性疾患を治療、抑制、または予防する方法である。
【０２２４】
一実施形態において、本発明は、それを必要とする哺乳動物に、本発明による治療有効用量または有効量のTNFR1ポリペプチド、dAb、またはアンタゴニストを投与するステップを含む、関節炎(例えば、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎)を治療、抑制、または予防する方法である。
【０２２５】
別の実施形態において、本発明は、それを必要とする哺乳動物に、本発明による治療有効用量または有効量のTNFR1ポリペプチド、dAb、またはアンタゴニストを投与するステップを含む、乾癬を治療、抑制、または予防する方法である。
【０２２６】
別の実施形態において、本発明は、それを必要とする哺乳動物に、本発明による治療有効用量または有効量のTNFR1ポリペプチド、dAb、またはアンタゴニストを投与するステップを含む、炎症性大腸疾患(例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎)を治療、抑制、または予防する方法である。
【０２２７】
別の実施形態において、本発明は、それを必要とする哺乳動物に、本発明による治療有効用量または有効量のTNFR1ポリペプチド、dAb、またはアンタゴニストを投与するステップを含む、慢性閉塞性肺疾患(例えば、慢性気管支炎、慢性閉塞性気管支炎、肺気腫)を治療、抑制、または予防する方法である。
【０２２８】
別の実施形態において、本発明は、それを必要とする哺乳動物に、本発明による治療有効用量または有効量のTNFR1ポリペプチド、dAb、またはアンタゴニストを投与するステップを含む、肺炎(例えば、ブドウ球菌性肺炎などの細菌性肺炎)を治療、抑制、または予防する方法である。
【０２２９】
本発明は、慢性閉塞性肺疾患および肺炎に加え、他の肺疾患を治療、抑制、または予防する方法も提供する。本発明により治療、抑制、または予防されうる他の肺疾患は、例えば、嚢胞性線維症および喘息(例えば、ステロイド耐性喘息)を含む。こうして、別の実施形態において、本発明は、それを必要とする哺乳動物に、本発明による治療有効用量または有効量のTNFR1ポリペプチド、dAb、またはアンタゴニストを投与するステップを含む、肺疾患(例えば、嚢胞性線維症、喘息)を治療、抑制、または予防する方法である。
【０２３０】
具体的な実施形態において、TNFR1アンタゴニストは、吸入(例えば、気管支内吸入、鼻腔内吸入、または経口吸入)などによる肺内送達によるかまたは全身送達(例えば、非経口送達、静脈内送達、筋肉内送達、腹腔内送達、皮下送達)により投与される。
【０２３１】
別の実施形態において、本発明は、それを必要とする哺乳動物に、本発明による治療有効用量または有効量のTNFR1ポリペプチド、dAb、またはアンタゴニストを投与するステップを含む、敗血症ショックを治療、抑制、または予防する方法である。
【０２３２】
本発明のさらなる態様では、本発明によるTNFR1ポリペプチド、dAb、またはアンタゴニストと、製薬上許容される担体、希釈剤、または賦形剤とを含む組成物が提供される。
【０２３３】
さらに、本発明は、本発明によるTNFR1ポリペプチド、TNFR1 dAb、もしくはTNFR1アンタゴニスト、または組成物を用いる疾患の治療法を提供する。ある実施形態において、疾患は、癌または炎症性疾患、例えば、関節リウマチ、喘息、またはクローン病である。
【０２３４】
フォーマット
免疫グロブリン、とりわけ、抗体、および中でもとりわけ、サイズの小さな抗体フラグメントのin vivoにおける適用では、半減期の延長が有用である。このようなフラグメント(Fv、ジスルフィド結合したFv、Fab、scFv、dAb)は、体内からの急速なクリアランスを受け、このため、これらは、体内の大半の部分に迅速に到達することができ、迅速に作製され取り扱いも容易である一方、そのin vivoにおける適用は、in vivoにおけるそのわずかな短い存続により制約されている。本発明の一実施形態では、in vivoにおけるリガンド半減期の延長と、その結果としての体内におけるリガンド機能活性のより長時間の持続時間を提供することによりこの問題が解決される。
【０２３５】
リガンド半減期の薬物動態解析および決定の方法は、当業者によく知られている。詳細は、Kenneth,Aら、「Chemical Stability of Pharmaceuticals:A Handbook for Pharmacists」、およびPetersら、「Pharmacokinetc analysis:A Practical Approach」(1996)において見出すことができる。tアルファ半減期およびtベータ半減期ならびに曲線下面積(AUC)などの薬物動態パラメータについて説明する「Pharmacokinetics」、M GibaldiおよびD Perron、Marcel Dekker社、増補改訂第2版(1982)もまた参照される。
【０２３６】
半減期(t1/2アルファおよびt1/2ベータ)およびAUCは、時間に対する血清リガンド濃度曲線から決定することができる。例えば、WinNonlin解析パッケージ(Pharsight Corp.、Mountain View、CA94040、USAから入手可能)を用いて、曲線をモデル化することができる。第1相(アルファ相)において、リガンドは、ある量の除去を伴いながらも、主要部分では患者において分布しつつある。第2相(ベータ相)は、リガンドが分布し、リガンドが患者から除去されるのに応じて血清濃度が低下しつつある終末相である。tアルファ半減期は第1相の半減期であり、tベータ半減期は第2相の半減期である。こうして、一実施形態において、本発明は、15分間以上の範囲のtα半減期を有する本発明によるリガンドまたは同リガンドを含む組成物を提供する。一実施形態において、該範囲の下端は、30分間、45分間、1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、10時間、11時間、または12時間である。それに加えて、またはその代わりに、本発明によるリガンドまたは組成物は、12時間以下の範囲のtα半減期を有する。一実施形態において、該範囲の上端は、11、10、9、8、7、6、または5時間である。適切な範囲の例は、1〜6時間、2〜5時間、または3〜4時間である。
【０２３７】
一実施形態において、本発明は、2.5時間以上の範囲のtβ半減期を有する本発明によるリガンド(ポリペプチド、dAb、またはアンタゴニスト)または同リガンドを含む組成物を提供する。一実施形態において、該範囲の下端は、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、10時間、11時間、または12時間である。それに加えて、またはその代わりに、本発明によるリガンドまたは組成物は、21日間以下の範囲のtβ半減期を有する。一実施形態において、該範囲の上端は、12時間、24時間、2日間、3日間、5日間、10日間、15日間、または20日間である。一実施形態において、本発明によるリガンドまたは組成物は、12〜60時間の範囲のtβ半減期を有する。さらなる実施形態において、それは、12〜48時間の範囲内にある。さらなる実施形態において、それは、12〜26時間の範囲内にある。
【０２３８】
上記特徴に加えて、またはその代わりに、本発明は、1mg分/ml以上の範囲のAUC(曲線下面積)値を有する本発明によるリガンドまたは同リガンドを含む組成物を提供する。一実施形態において、該範囲の下端は、5、10、15、20、30、100、200、または300mg分/mlである。それに加えて、またはその代わりに、本発明によるリガンドまたは組成物は、600mg分/ml以下の範囲のAUCを有する。一実施形態において、該範囲の上端は、500、400、300、200、150、100、75、または50mg分/mlである。一実施形態において、本発明によるリガンドは、以下:15〜150mg分/ml、15〜100mg分/ml、15〜75mg分/ml、および15〜50mg分/mlからなる群から選択される範囲のAUCを有する。
【０２３９】
本発明のポリペプチドおよびdAbならびにこれらを含むアンタゴニストは、例えば、PEG基、血清アルブミン、トランスフェリン、トランスフェリン受容体、または少なくとも、そのトランスフェリン結合部分、抗体Fc領域の連結により、または、抗体ドメインに対するコンジュゲーションにより、より大きな流体力学的サイズを有するようにフォーマットすることができる。例えば、抗体のより大型の抗原結合フラグメントとしてまたは抗体としてフォーマットされた(例えば、Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2、IgG、scFvとしてフォーマットされた)ポリペプチド、dAb、およびアンタゴニストである。
【０２４０】
本発明のリガンド(例えば、dAb単量体および多量体)の流体力学的サイズは、当技術分野でよく知られる方法を用いて決定することができる。例えば、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いて、リガンドの流体力学的サイズを決定することができる。架橋アガロースマトリックスなど、リガンドの流体力学的サイズを決定するのに適するゲル濾過マトリックスはよく知られており、容易に入手できる。
【０２４１】
リガンドフォーマットのサイズ(例えば、dAb単量体に付着したPEG部分のサイズ)は、所望の適用に応じて変化しうる。例えば、リガンドが循環を離れて末梢組織中に入ることを意図する場合は、リガンドの流体力学的サイズを、血流からの溢出が容易となる程度に低く保つことが望ましい。代替的に、リガンドがより長期間にわたり全身循環内にとどまることが望ましい場合は、リガンドサイズを、例えば、Igをタンパク質のようにフォーマットすることにより増大させることができる。
【０２４２】
in vivoにおける半減期を延長させる抗原またはエピトープを標的化することによる半減期の延長
リガンドの流体力学的サイズとその血清半減期とはまた、本明細書で説明される通り、in vivoにおける半減期を延長させる抗原またはエピトープに結合する結合ドメイン(例えば、抗体または抗体フラグメント)に、本発明のTNFR1結合ポリペプチド、dAb、またはアンタゴニストをコンジュゲートまたは結合させることによっても延長させることができる。例えば、TNFR1結合作用物質(例えば、ポリペプチド)は、抗血清アルブミンまたは抗新生児Fc受容体の抗体または抗体フラグメント、例えば、抗SAもしくは抗新生児Fc受容体のdAb、Fab、Fab'、もしくはscFv、または抗SAアフィボディもしくは抗新生児Fc受容体アフィボディもしくは抗SAアビマー、あるいはCTLA-4、リポカリン、SpA、アフィボディ、アビマー、GroEl、およびフィブロネクチンからなる群から選択されるがこれらに限定されないことが好ましい足場を含む抗SA結合ドメイン(それらのドメインおよびそれらの配列が参照により本明細書に組み込まれ、本文開示の一部を形成するこれらの結合ドメインの開示については、2008年2月8日に出願されたPCT/GB2008/000453を参照されたい)にコンジュゲートさせるかまたは連結することができる。コンジュゲートとは、血清アルブミンに結合する結合ドメインに結合(共有結合または非共有結合)する、本発明のポリペプチド、dAb、またはアンタゴニストを含む組成物を指す。
【０２４３】
in vivoにおける血清半減期を延長させる適切なポリペプチドは、例えば、トランスフェリン受容体特異的リガンド-神経医薬作用物質融合タンパク質(参照によりその教示が本明細書に組み込まれる米国特許第5,977,307号を参照されたい)、脳毛細血管内皮細胞受容体、トランスフェリン、トランスフェリン受容体(例えば、可溶性トランスフェリン受容体)、インスリン、インスリン様成長因子1(IGF1)受容体、インスリン様成長因子2(IGF2)受容体、インスリン受容体、血液凝固因子X、α1-抗トリプシン、およびHNF 1αを含む。血清半減期を延長させる適切なポリペプチドはまた、アルファ-1糖タンパク質(オロソムコイド、AAG)、アルファ-1アンチキモトリプシン(ACT)、アルファ-1マイクログロブリン(プロテインHC、AIM社製)、アンチトロンビンIII(AT III)、アポリポタンパク質A-1(Apo A-1)、アポリポタンパク質B(Apo B)、セルロプラスミン(Cp)、補体成分C3(C3)、補体成分C4(C4)、C1エラスターゼ阻害剤(C1 INH)、C反応性タンパク質(CRP)、フェリチン(FER)、ヘモペキシン(HPX)、リポタンパク質(a)(Lp(a))、マンノース結合タンパク質(MBP)、ミオグロビン(Myo)、プレアルブミン(トランスサイレチン、PAL)、レチノール結合タンパク質(RBP)、およびリウマチ因子(RF)も含む。
【０２４４】
細胞外マトリックスに由来する適切なタンパク質は、例えば、コラーゲン、ラミニン、インテグリン、およびフィブロネクチンを含む。コラーゲンは、細胞外マトリックスの主要なタンパク質である。例えば、骨、皮膚、腱、靭帯、角膜、内臓中で見出されるI型コラーゲン(体内コラーゲンの90％を占める)、または軟骨、椎間板、脊索、および眼の硝子体液中で見出されるII型コラーゲンなど、体内の様々な部位に見出される約15種類のコラーゲン分子が現在知られている。
【０２４５】
血液に由来する適切なタンパク質は、例えば、血漿タンパク質(例えば、フィブリン、α-2マクログロブリン、血清アルブミン、フィブリノーゲン(例えば、フィブリノーゲンA、フィブリノーゲンB)、血清アミロイドタンパク質A、ハプトグロビン、プロフィリン、ユビキチン、ウテログロビン、およびβ-2-マイクログロブリン)、酵素および酵素阻害剤(例えば、プラスミノーゲン、ライソザイム、シスタチンC、アルファ-1-アンチトリプシン、および膵臓トリプシン阻害剤)、免疫グロブリンタンパク質(例えば、IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、免疫グロブリン軽鎖(κ鎖/λ鎖))などの免疫系のタンパク質、輸送タンパク質(例えば、レチノール結合タンパク質、α-1マイクログロブリン)、デフェンシン(例えば、ベータ-デフェンシン1、好中球デフェンシン1、好中球デフェンシン2、好中球デフェンシン3)などを含む。
【０２４６】
血液脳関門または神経組織中において見出される適切なタンパク質は、例えば、メラノコルチン受容体、ミエリン、アスコルビン酸輸送体などを含む。
【０２４７】
in vivoにおける血清半減期を延長させる適切なポリペプチドはまた、腎臓に局在化するタンパク質(例えば、ポリシスチン、IV型コラーゲン、有機陰イオン輸送体K1、ヘイマン抗原)、肝臓に局在化するタンパク質(例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ、G250)、肺に局在化するタンパク質(例えば、IgAに結合する分泌成分)、心臓に局在化するタンパク質(例えば、拡張型心筋症と関連するHSP 27タンパク質)、皮膚に局在化するタンパク質(例えば、ケラチン)、骨形成活性を示す形質転換成増殖因子βスーパーファミリーのサブセットタンパク質である形態形成タンパク質(BMP)(例えば、BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8)などの骨特異性タンパク質、腫瘍特異性タンパク質(例えば、トロホブラスト抗原、ハーセプチン受容体、エストロゲン受容体、カテプシン(例えば、肝臓および脾臓中で見出されうるカテプシンB))も含む。
【０２４８】
適切な疾患特異的タンパク質は、例えば、LAG-3(リンパ球活性化遺伝子)、オステオプロテジェリンリガンド(OPGL;例えば、Nature、第402巻、304〜309頁(1999)を参照されたい)、OX40(活性化されたT細胞上で発現され、ヒトT細胞白血病ウイルスI型(HTLV-I)生成細胞において特異的にアップレギュレーションされるTNF受容体ファミリーメンバー;Immunol.、第165巻、第1号、263〜70頁(2000)を参照されたい)を含む、活性化されたT細胞上のみで発現される抗原を含む。適切な疾患特異的タンパク質はまた、例えば、ショウジョウバエCG6512、ヒトパラプレジン、ヒトFtsH、ヒトAFG3L2、マウスftsHを含むメタロプロテアーゼ(関節炎/癌と関連する);および酸性線維芽細胞成増殖因子(FGF-1)、塩基性線維芽細胞成増殖因子(FGF-2)、血管内皮細胞増殖因子/血管透過性因子(VEGF/VPF)、形質転換成増殖因子-α(TGFα)、腫瘍壊死因子-アルファ(TNF-α)、アンジオジェニン、インターロイキン-3(IL-3)、インターロイキン-8(IL-8)、血小板由来内皮細胞成長因子(PD-ECGF)、胎盤成長因子(PlGF)、ミッドカイン、血小板由来成長因子-BB(PDGF)、およびフラクタルカインを含む血管新生性成長因子も含む。
【０２４９】
in vivoにおける血清半減期を延長させる適切なポリペプチドはまた、熱ショックタンパク質(HSP)などのストレスタンパク質も含む。HSPは通常、細胞内において見出される。これらが細胞外において見出される場合、それは、細胞が死滅し、その内容物を溢出させたことの指標である。この非プログラム細胞死(壊死)は、外傷、疾患、または損傷の結果として、細胞外HSPが免疫系からの応答を誘発する場合に生じる。細胞外HSPへの結合の結果、本発明の組成物の疾患部位への局在化がもたらされる。
【０２５０】
Fc輸送に関与する適切なタンパク質は、例えば、ブランベル受容体(FcRBとしても知られる)を含む。このFc受容体は、そのいずれもが送達に潜在的に有用な2つの機能を有する。該機能は、(1)胎盤を超える母体から胎児へのIgGの輸送、(2)それによりその血清半減期を延長させるIgGの分解に対する防御である。該受容体は、エンドソームからIgGをリサイクルすると考えられている(Holligerら、Nat Biotechnol、第15巻、第7号、632〜6頁(1997)を参照されたい)。
【０２５１】
血清アルブミンに結合するdAb
一実施形態において、本発明は、TNFR1に結合する抗TNFR1 dAb(第1のdAb)と、血清アルブミン(SA)に結合する第2のdAbとを含み、第2のdAbが表面プラズモン共鳴により決定される1nM〜1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、100、200、300、400、もしくは500μM(すなわち、×10-9〜5×10-4)、または100nM〜10μM、または1〜5μM、または3〜70nM、または10nM〜1、2、3、4、もしくは5μMのKDによりSAに結合する、ポリペプチドまたはアンタゴニスト(例えば、二重特異性リガンド)を提供する。例えば、表面プラズモン共鳴により決定される30〜70nM。一実施形態では、第1のdAb(またはdAb単量体)が表面プラズモン共鳴により決定される約1、50、70、100、150、200、300nM、または1、2、もしくは3μMのKDによりSA(例えば、HSA)に結合する。一実施形態において、第1の抗SA dAbと第2のTNFR1に対するdAbとを含む二重特異性リガンドの場合、第2のdAbのその標的に対する親和性(例えば、表面プラズモン共鳴により、例えば、BiaCoreを用いて測定されるKDおよび/またはKoff)は、SAに対する第1のdAbの親和性の1〜100000倍(例えば、100〜100000、または1000〜100000、または10000〜100000倍)である。一実施形態において、血清アルブミンはヒト血清アルブミン(HSA)である。例えば、第1のdAbが、約10μMの親和性によりSAに結合するのに対し、第2のdAbは、100pMの親和性によりその標的に結合する。一実施形態において、血清アルブミンはヒト血清アルブミン(HSA)である。一実施形態において、第1のdAbは約50、例えば、70、100、150、または200nMのKDによりSA(例えば、HSA)に結合する。二重特異性リガンドの詳細は、国際公開第03002609号、国際公開第04003019号、および国際公開第04058821号において見出される。
【０２５２】
一実施形態において、本発明のリガンドは、表面プラズモン共鳴により決定される1nM〜1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、100、200、300、400、もしくは500μM(すなわち、×10-9〜5×10-4)、または100nM〜10μM、または1〜5μM、または3〜70nM、または10nM〜1、2、3、4、もしくは5μMのKDにより血清アルブミン(SA)に結合するdAbを含む。例えば、表面プラズモン共鳴により決定される30〜70nM。一実施形態では、第1のdAb(またはdAb単量体)が表面プラズモン共鳴により決定される約1、50、70、100、150、200、300nM、または1、2、もしくは3μMのKDによりSA(例えば、HSA)に結合する。一実施形態において、第1のdAbと第2のdAbとは、リンカー、例えば、1〜4アミノ酸のリンカー、または1〜3アミノ酸のリンカー、または3アミノ酸を超えるリンカー、または4、5、6、7、8、9、10、15、もしくは20アミノ酸を超えるリンカーにより連結される。一実施形態では、より長いリンカー(3アミノ酸を超える)を用いて効力(アンタゴニスト中の一方または両方のdAbのKD)を増強する。
【０２５３】
リガンドおよびアンタゴニストの具体的な実施形態において、dAbはヒト血清アルブミンに結合し、アルブミンに対する結合について以下のものからなる群から選択されるdAbと競合する：
MSA-16、MSA-26(それらの配列およびそれらの核酸対応物が参照により本明細書に組み込まれ、本文の開示の一部を形成する、これらの配列の開示については、国際公開第04003019号を参照されたい)、
DOM7m-16(配列番号473)、DOM7m-12(配列番号474)、DOM7m-26(配列番号475)、DOM7r-1(配列番号476)、DOM7r-3(配列番号477)、DOM7r-4(配列番号478)、DOM7r-5(配列番号479)、DOM7r-7(配列番号480)、DOM7r-8(配列番号481)、DOM7h-2(配列番号482)、DOM7h-3(配列番号483)、DOM7h-4(配列番号484)、DOM7h-6(配列番号485)、DOM7h-1(配列番号486)、DOM7h-7(配列番号487)、DOM7h-22(配列番号489)、DOM7h-23(配列番号490)、DOM7h-24(配列番号491)、DOM7h-25(配列番号492)、DOM7h-26(配列番号493)、DOM7h-21(配列番号494)、DOM7h-27(配列番号495)、DOM7h-8(配列番号496)、DOM7r-13(配列番号497)、DOM7r-14(配列番号498)、DOM7r-15(配列番号499)、DOM7r-16(配列番号500)、DOM7r-17(配列番号501)、DOM7r-18(配列番号502)、DOM7r-19(配列番号503)、DOM7r-20(配列番号504)、DOM7r-21(配列番号505)、DOM7r-22(配列番号506)、DOM7r-23(配列番号507)、DOM7r-24(配列番号508)、DOM7r-25(配列番号509)、DOM7r-26(配列番号510)、DOM7r-27(配列番号511)、DOM7r-28(配列番号512)、DOM7r-29(配列番号513)、DOM7r-30(配列番号514)、DOM7r-31(配列番号515)、DOM7r-32(配列番号516)、DOM7r-33(配列番号517)(それらの配列およびそれらの核酸対応物が参照により本明細書に組み込まれ、本文の開示の一部を形成する、これらの配列の開示については、国際公開第2007080392号を参照されたい;本段落内の配列番号は、国際公開第2007080392号においてみられる配列番号である)、
dAb8(dAb10)、dAb 10、dAb36、dAb7r20(DOM7r20)、dAb7r21(DOM7r21)、dAb7r22(DOM7r22)、dAb7r23(DOM7r23)、dAb7r24(DOM7r24)、dAb7r25(DOM7r25)、dAb7r26(DOM7r26)、dAb7r27(DOM7r27)、dAb7r28(DOM7r28)、dAb7r29(DOM7r29)、dAb7r29(DOM7r29)、dAb7r31(DOM7r31)、dAb7r32(DOM7r32)、dAb7r33(DOM7r33)、dAb7r33(DOM7r33)、dAb7h22(DOM7h22)、dAb7h23(DOM7h23)、dAb7h24(DOM7h24)、dAb7h25(DOM7h25)、dAb7h26(DOM7h26)、dAb7h27(DOM7h27)、dAb7h30(DOM7h30)、dAb7h31(DOM7h31)、dAb2(dAbs 4、7、41)、dAb4、dAb7、dAb11、dAb12(dAb7m12)、dAb13(dAb 15)、dAb15、dAb16(dAb21、dAb7m16)、dAb17、dAb18、dAb19、dAb21、dAb22、dAb23、dAb24、dAb25(dAb26、dAb7m26)、dAb27、dAb30(dAb35)、dAb31、dAb33、dAb34、dAb35、dAb38(dAb54)、dAb41、dAb46(dAbs 47、52および56)、dAb47、dAb52、dAb53、dAb54、dAb55、dAb56、dAb7m12、dAb7m16、dAb7m26、dAb7r1(DOM 7r1)、dAb7r3(DOM 7r3)、dAb7r4(DOM7r4)、dAb7r5(DOM7r5)、dAb7r7(DOM7r7)、dAb7r8(DOM7r8)、dAb7r13(DOM7r13)、dAb7r14(DOM7r14)、dAb7r15(DOM7r15)、dAb7r16(DOM7r16)、dAb7r17(DOM7r17)、dAb7r18(DOM7r18)、dAb7r19(DOM7r19)、dAb7h1(DOM7h1)、dAb7h2(DOM7h2)、dAb7h6(DOM7h6)、dAb7h7(DOM7h7)、dAb7h8(DOM7h8)、dAb7h9(DOM7h9)、dAb7h10(DOM7h10)、dAb7h11(DOM7h11)、dAb7h12(DOM7h12)、dAb7h13(DOM7h13)、dAb7h14(DOM7h14)、dAb7p1(DOM7p1)、およびdAb7p2(DOM7p2)(それらの配列およびそれらの核酸対応物が参照により本明細書に組み込まれ、本文の開示の一部を形成する、これらの配列の開示については、2008年2月8日に出願されたPCT/GB2008/000453を参照されたい。)(代替的な名称は、dAbに後続するカッコ内に示される、例えば、dAb8は、dAb10という代替名を有する、すなわち、dAb8(dAb10)。これらの配列はまた、図51aおよびbにも示されている。)。
【０２５４】
一部の実施形態において、dAbはヒト血清アルブミンに結合し、以下のものからなる群から選択されるdAbのアミノ酸配列と少なくとも約80％、または少なくとも約85％、または少なくとも約90％、または少なくとも約95％、または少なくとも約96％、または少なくとも約97％、または少なくとも約98％、または少なくとも約99％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む：
MSA-16、MSA-26、
DOM7m-16(配列番号473)、DOM7m-12(配列番号474)、DOM7m-26(配列番号475)、DOM7r-1(配列番号476)、DOM7r-3(配列番号477)、DOM7r-4(配列番号478)、DOM7r-5(配列番号479)、DOM7r-7(配列番号480)、DOM7r-8(配列番号481)、DOM7h-2(配列番号482)、DOM7h-3(配列番号483)、DOM7h-4(配列番号484)、DOM7h-6(配列番号485)、DOM7h-1(配列番号486)、DOM7h-7(配列番号487)、DOM7h-22(配列番号489)、DOM7h-23(配列番号490)、DOM7h-24(配列番号491)、DOM7h-25(配列番号492)、DOM7h-26(配列番号493)、DOM7h-21(配列番号494)、DOM7h-27(配列番号495)、DOM7h-8(配列番号496)、DOM7r-13(配列番号497)、DOM7r-14(配列番号498)、DOM7r-15(配列番号499)、DOM7r-16(配列番号500)、DOM7r-17(配列番号501)、DOM7r-18(配列番号502)、DOM7r-19(配列番号503)、DOM7r-20(配列番号504)、DOM7r-21(配列番号505)、DOM7r-22(配列番号506)、DOM7r-23(配列番号507)、DOM7r-24(配列番号508)、DOM7r-25(配列番号509)、DOM7r-26(配列番号510)、DOM7r-27(配列番号511)、DOM7r-28(配列番号512)、DOM7r-29(配列番号513)、DOM7r-30(配列番号514)、DOM7r-31(配列番号515)、DOM7r-32(配列番号516)、DOM7r-33(配列番号517)(本段落内の配列番号は、国際公開第2007080392号においてみられる配列番号である)、
dAb8、dAb 10、dAb36、dAb7r20、dAb7r21、dAb7r22、dAb7r23、dAb7r24、dAb7r25、dAb7r26、dAb7r27、dAb7r28、dAb7r29、dAb7r30、dAb7r31、dAb7r32、dAb7r33、dAb7h21、dAb7h22、dAb7h23、Ab7h24、Ab7h25、Ab7h26、dAb7h27、dAb7h30、dAb7h31、dAb2、dAb4、dAb7、dAb11、dAb12、dAb13、dAb15、dAb16、dAb17、dAb18、dAb19、dAb21、dAb22、dAb23、dAb24、dAb25、dAb26、dAb27、dAb30、dAb31、dAb33、dAb34、dAb35、dAb38、dAb41、dAb46、dAb47、dAb52、dAb53、dAb54、dAb55、dAb56、dAb7m12、dAb7m16、dAb7m26、dAb7r1、dAb7r3、dAb7r4、dAb7r5、dAb7r7、dAb7r8、dAb7r13、dAb7r14、dAb7r15、dAb7r16、dAb7r17、dAb7r18、dAb7r19、dAb7h1、dAb7h2、dAb7h6、dAb7h7、dAb7h8、dAb7h9、dAb7h10、dAb7h11、dAb7h12、dAb7h13、dAb7h14、dAb7p1、およびdAb7p2。
【０２５５】
例えば、ヒト血清アルブミンに結合するdAbは、以下のものと少なくとも約90％、または少なくとも約95％、または少なくとも約96％、または少なくとも約97％、または少なくとも約98％、または少なくとも約99％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含みうる：
DOM7h-2(配列番号482)、DOM7h-3(配列番号483)、DOM7h-4(配列番号484)、DOM7h-6(配列番号485)、DOM7h-1(配列番号486)、DOM7h-7(配列番号487)、DOM7h-8(配列番号496)、DOM7r-13(配列番号497)、DOM7r-14(配列番号498)、DOM7h-22(配列番号489)、DOM7h-23(配列番号490)、DOM7h-24(配列番号491)、DOM7h-25(配列番号492)、DOM7h-26(配列番号493)、DOM7h-21(配列番号494)、DOM7h-27(配列番号495)(本段落内の配列番号は、国際公開第2007080392号においてみられる配列番号である)、
dAb8、dAb 10、dAb36、dAb7h21、dAb7h22、dAb7h23、Ab7h24、Ab7h25、Ab7h26、dAb7h27、dAb7h30、dAb7h31、dAb2、dAb4、dAb7、dAb11、dAb12、dAb13、dAb15、dAb16、dAb17、dAb18、dAb19、dAb21、dAb22、dAb23、dAb24、dAb25、dAb26、dAb27、dAb30、dAb31、dAb33、dAb34、dAb35、dAb38、dAb41、dAb46、dAb47、dAb52、dAb53、dAb54、dAb55、dAb56、dAb7h1、dAb7h2、dAb7h6、dAb7h7、dAb7h8、dAb7h9、dAb7h10、dAb7h11、dAb7h12、dAb7h13およびdAb7h14。
【０２５６】
一部の実施形態において、dAbはヒト血清アルブミンに結合し、以下のものからなる群から選択されるdAbのアミノ酸配列と少なくとも約少なくとも約80％、または少なくとも約85％、または少なくとも約90％、または少なくとも約95％、または少なくとも約96％、または少なくとも約97％、または少なくとも約98％、または少なくとも約99％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む：
DOM7h-2(配列番号482)、DOM7h-6(配列番号485)、DOM7h-1(配列番号486)、DOM7h-7(配列番号487)、DOM7h-8(配列番号496)、DOM7h-22(配列番号489)、DOM7h-23(配列番号490)、DOM7h-24(配列番号491)、DOM7h-25(配列番号492)、DOM7h-26(配列番号493)、DOM7h-21(配列番号494)、DOM7h-27(配列番号495)(本段落内の配列番号は、国際公開第2007080392号においてみられる配列番号である)、
dAb7h21、dAb7h22、dAb7h23、Ab7h24、Ab7h25、Ab7h26、dAb7h27、dAb7h30、dAb7h31、dAb2、dAb4、dAb7、dAb38、dAb41、dAb7h1、dAb7h2、dAb7h6、dAb7h7、dAb7h8、dAb7h9、dAb7h10、dAb7h11、dAb7h12、dAb7h13およびdAb7h14。
【０２５７】
より具体的な実施形態において、dAbは、ヒト血清アルブミンに結合し、以下のものからなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVκdAbである：
DOM7h-2(配列番号482)、DOM7h-6(配列番号485)、DOM7h-1(配列番号486)、DOM7h-7(配列番号487)、DOM7h-8(配列番号496)(本段落内の配列番号は、国際公開第2007080392号においてみられる配列番号である)、
dAb2、dAb4、dAb7、dAb38、dAb41、dAb54、dAb7h1、dAb7h2、dAb7h6、dAb7h7、dAb7h8、dAb7h9、dAb7h10、dAb7h11、dAb7h12、dAb7h13およびdAb7h14。
【０２５８】
より具体的な実施形態において、dAbは、ヒト血清アルブミンに結合し、dAb7h30およびdAb7h31から選択されるアミノ酸配列を有するVH dAbである。
【０２５９】
より具体的な実施形態において、dAbは、dAb7h11またはdAb7h14である。
【０２６０】
他の実施形態において、dAb、リガンド、またはアンタゴニストはヒト血清アルブミンに結合し、前出のアミノ酸配列のいずれかの1つ、2つ、または3つのCDR、例えば、dAb7h11またはdAb7h14の1つ、2つ、または3つのCDRを含む。
【０２６１】
血清アルブミンに結合する適切なラクダ科動物VHHは、配列A(配列番号518)、配列B(配列番号519)、配列C(配列番号520)、配列D(配列番号521)、配列E(配列番号522)、配列F(配列番号523)、配列G(配列番号524)、配列H(配列番号525)、配列I(配列番号526)、配列J(配列番号527)、配列K(配列番号528)、配列L(配列番号529)、配列M(配列番号530)、配列N(配列番号531)、配列O(配列番号532)、配列P(配列番号533)、配列Q(配列番号534)、(これらの配列番号は、国際公開第2007080392号または国際公開第2004/041862号(Ablynx N.V.)で引用される配列番号に対応する)など、国際公開第2004/041862号(Ablynx N.V.)および国際公開第2007080392号で開示されるVHH(それらのVHH配列およびそれらの核酸対応物が参照により本明細書に組み込まれ、本文の開示の一部を形成する)を含む。一部の実施形態において、該ラクダ科動物VHHは、ヒト血清アルブミンに結合し、国際公開第2007080392号で開示されるALB1または配列番号518〜534のいずれか1つ(これらの配列番号は、国際公開第2007080392号または国際公開第2004/041862号で引用される配列番号に対応する)と少なくとも約80％、または少なくとも約85％、または少なくとも約90％、または少なくとも約95％、または少なくとも約96％、または少なくとも約97％、または少なくとも約98％、または少なくとも約99％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０２６２】
一部の実施形態において、リガンドまたはアンタゴニストは、血清アルブミン(例えば、ヒト血清アルブミン)に対する結合について、本明細書で開示される任意の抗血清アルブミンdAbと競合する抗血清アルブミンdAbを含む。
【０２６３】
代替的な実施形態において、アンタゴニストまたはリガンドは、2008年2月8日に出願された同時係属出願であるPCT/GB2008/000453において説明される非免疫グロブリン配列を含む、TNFR1(例えば、ヒトTNFR1)に特異的な結合部分(これらの結合部分、それらの作製および選択(例えば、多様なライブラリーからの)の方法、ならびにそれらの配列の開示は、本文の開示の一部として参照により本明細書に組み込まれている)を含む。
【０２６４】
半減期延長部分(例えば、アルブミン)に対するコンジュゲーション
一実施形態では、ある(1種または複数種の)半減期延長部分(例えば、アルブミン、トランスフェリン、ならびにこれらのフラグメントおよび類似体)を、本発明のTNFR1結合ポリペプチド、dAb、またはアンタゴニストにコンジュゲートまたは結合させる。TNFR1結合フォーマットで用いるのに適するアルブミン、アルブミンフラグメント、またはアルブミン変異体の例は、その開示が参照により本明細書に組み込まれ、本文の開示の一部を形成する、国際公開第2005077042号で説明されている。特に、以下のアルブミン、アルブミンフラグメント、またはアルブミン変異体を本発明において用いることができる:
・配列番号1(国際公開第2005077042号で開示され、この配列は、参照により本開示中に明示的に組み込まれている);
・国際公開第2005077042号における配列番号1のアミノ酸1〜387を含むかまたはこれらからなるアルブミンフラグメントまたは変異体;
・(a)国際公開第2005077042号における配列番号1のアミノ酸54〜61;(b)国際公開第2005077042号における配列番号1のアミノ酸76〜89;(c)国際公開第2005077042号における配列番号1のアミノ酸92〜l00;(d)国際公開第2005077042号における配列番号1のアミノ酸170〜176;(e)国際公開第2005077042号における配列番号1のアミノ酸247〜252;(f)国際公開第2005077042号における配列番号1のアミノ酸266〜277;(g)国際公開第2005077042号における配列番号1のアミノ酸280〜288;(h)国際公開第2005077042号における配列番号1のアミノ酸362〜368;(i)国際公開第2005077042号における配列番号1のアミノ酸439〜447;(j)国際公開第2005077042号における配列番号1のアミノ酸462〜475;(k)国際公開第2005077042号における配列番号1のアミノ酸478〜486;および(l)国際公開第2005077042号における配列番号1のアミノ酸560〜566からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むアルブミン、またはそのフラグメントもしくは変異体。
【０２６５】
TNFR1結合フォーマットで用いるのに適するアルブミン、フラグメント、および類似体のさらなる例は、その開示が参照により本明細書に組み込まれ、本文の開示の一部を形成する、国際公開第03076567号で説明されている。特に、以下のアルブミン、フラグメント、または変異体を本発明において用いることができる:
・国際公開第03076567号、例えば、図3(この配列情報は、参照により本開示中に明示的に組み込まれている)で開示されるヒト血清アルブミン;
・66,500の分子式分子量を有する585アミノ酸の単一非グリコシル化ポリペプチド鎖からなるヒト血清アルブミン(HA)(Melounら、FEBS Letters、第58巻、136頁(1975);Behrensら、Fed.Proc.、第34巻、591頁(1975);Lawnら、Nucleic Acids Research、第9巻、6102〜6114頁(1981);Minghettiら、J.Biol.Chem.、第261巻、6747頁(1986)を参照されたい);
・Weitkampら、Ann.Hum.Genet.、第37巻、219頁(1973)において説明されているアルブミン多型変異体または類似体またはフラグメント;
・EP322094で説明されているアルブミンフラグメントまたは変異体、例えば、HA(1〜373)、HA(1〜388)、HA(1〜389)、HA(1〜369)、およびHA(1〜419)、ならびに1〜369と1〜419との間のフラグメント;
・EP399666で説明されているアルブミンフラグメントまたは変異体、例えば、HA(1〜177)およびHA(1〜200)、ならびにHA(1〜X)におけるフラグメント(ここで、Xは178〜199の任意の数字である)。
【０２６６】
ある(1種または複数種の)半減期延長部分(例えば、アルブミン、トランスフェリン、ならびにこれらのフラグメントおよび類似体)を用いて、本発明のTNFR1結合ポリペプチド、dAb、およびアンタゴニストをフォーマットする場合、例えば、TNFR1結合部分のNまたはC末端に位置する半減期延長部分を有するポリペプチド単鎖としてコードされる融合タンパク質をコードする単一ヌクレオチド構築物を用いることによるTNFR1結合部分(例えば、抗TNFR1 dAb)に対する直接の融合によるなど、任意の適切な方法を用いてコンジュゲートさせることができる。あるいはまた、コンジュゲーションは、部分間のペプチドリンカー、例えば、国際公開第03076567号または国際公開第2004003019号で説明されているペプチドリンカー(これらのリンカーの開示は、参照により本開示に組み込まれ、本発明における使用例を提供する)を用いることによっても達成することができる。典型的に、in vivoにおける血清半減期を延長させるポリペプチドは、in vivoで天然にもたらされ、生物(例えば、ヒト)から望ましくない物質を除去する内因性機構による分解または除去に対して耐性のポリペプチドである。例えば、in vivoにおける血清半減期を延長させるポリペプチドは、細胞外マトリックスに由来するタンパク質、血中に見出されるタンパク質、血液脳関門または神経組織において見出されるタンパク質、腎臓、肝臓、肺、心臓、皮膚、または骨に局在化するタンパク質、ストレスタンパク質、疾患特異的タンパク質、またはFc輸送に関与するタンパク質から選択することができる。
【０２６７】
本開示全体で説明される本発明の実施形態において、本発明のアンタゴニストまたはリガンドにおける抗TNFR1「dAb」の使用の代わりに、当業者は、TNFR1に結合する本発明のdAbの1つもしくは複数または3つすべてのCDRを含むポリペプチドまたはドメイン(例えば、適切なタンパク質の足場または骨格、例えば、アフィボディ、SpA足場、LDL受容体クラスAドメイン、またはEGFドメイン上に移植されたCDR)を用いうることが意図されている。したがって、全体としての本開示は、dAbの代わりにこのようなドメインを用いるアンタゴニストの開示を提供することを意図する。この点に関しては、2008年2月8日に出願され、その開示が参照により組み込まれるPCT/GB2008/000453を参照されたい。
【０２６８】
したがって、一実施形態において、本発明のアンタゴニストは、TNFR1に対する結合特異性を有する免疫グロブリン単一可変ドメインもしくはドメイン抗体(dAb)、または適切なフォーマットにおけるこのようなdAbの相補性決定領域を含む。該アンタゴニストは、このようなdAbからなるか、または基本的にこのようなdAbからなるポリペプチドでありうる。アンタゴニストは、抗体フォーマット(例えば、IgG様フォーマット、scFv、Fab、Fab'、F(ab')2)、またはTNFR1に結合するdAbと、別の標的タンパク質、抗原、もしくはエピトープ(例えば、血清アルブミン)に結合する第2のdAbとを含む二重特異性リガンドなどの適切なフォーマットにおけるdAb(またはdAbのCDR)を含むポリペプチドでありうる。
【０２６９】
本発明によるポリペプチド、dAb、およびアンタゴニストは、IgG様フォーマット、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、単鎖抗体、二重特異性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖および/または抗体軽鎖のホモ二量体およびヘテロ二量体、任意の前出の抗原結合フラグメント(例えば、Fvフラグメント(例えば、単鎖Fv(scFv)、ジスルフィド結合したFv)、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')2フラグメント)、単一可変ドメイン(例えば、VH、VL)、dAb、および任意の前出の改変型(例えば、ポリアルキレングリコール(例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール)または他の適切なポリマーの共有結合による改変)など、当技術分野で知られる各種の適切な抗体フォーマットとしてフォーマットすることができる。
【０２７０】
一部の実施形態において、本発明は、IgG様フォーマットであるリガンド(例えば、抗TNFR1アンタゴニスト)を提供する。このようなフォーマットは、1つまたは複数の可変領域(VHおよび/またはVL)が本発明のdAbにより置換された、従来のIgG分子の4本鎖構造(2本の重鎖および2本の軽鎖)を有する。一実施形態において、各可変領域(2つのVH領域および2つのVL領域)は、その少なくとも1つが本発明による抗TNFR1 dAbであるdAbまたは単一可変領域により置換される。IgG様フォーマット中に含まれる(1種または複数種の)dAbまたは(1種または複数種の)単一可変ドメインは、同じ特異性を有しても異なる特異性を有してもよい。一部の実施形態において、IgG様フォーマットは4価であり、1種類(抗TNFR1のみ)、2種類(抗TNFR1および抗SA)、3種類、または4種類の特異性を有しうる。例えば、IgG様フォーマットは単一特異性で同じ特異性を有する4つのdAbを含む場合もあり;二重特異性で同じ特異性を有する3つのdAbと、異なる特異性を有する別のdAbとを含む場合もあり;二重特異性で同じ特異性を有する2つのdAbと、異なる特異性を有する2つのdAbとを含む場合もあり;三重特異性で同じ特異性を有する第1および第2のdAbと、異なる特異性を有する第3のdAbと、第1、第2、および第3のdAbとは異なる第4のdAbとを含む場合もあり;四重特異性で各々が異なる特異得性を有する4つのdAbを含む場合もある。IgG様フォーマットの抗原結合フラグメント(例えば、Fab、F(ab')2、Fab'、Fv、scFv)を調製することができる。一実施形態において、IgG様フォーマットまたはその抗原結合フラグメントはTNFR1を架橋せず、例えば、該フォーマットはTNFR1に対して1価である。補体活性および/または抗体依存性細胞傷害(ADCC)機能が所望の場合、リガンドは、IgG様フォーマットでありうる。所望の場合、IgG様フォーマットは、Fc受容体に対する結合および/または補体結合能を最小化するために、変異定常領域(変異IgG重鎖定常領域)を含むことがある(例えば、Winterら、GB 2,209,757B;Morrisonら、国際公開第89/07142号;Morganら、国際公開第94/29351号、1994年12月22日を参照されたい)。
【０２７１】
本発明のリガンド(ポリペプチド、dAb、およびアンタゴニスト)は、第2の免疫グロブリン単一可変ドメインに直接に融合される第1の免疫グロブリン単一可変ドメインを含有する融合タンパク質としてフォーマットすることができる。所望の場合、このようなフォーマットは、半減期延長部分をさらに含みうる。例えば、リガンドは、血清アルブミンに結合する免疫グロブリン単一可変ドメインに直接融合される第2の免疫グロブリン単一可変ドメインに直接に融合される第1の免疫グロブリン単一可変ドメインを含みうる。
【０２７２】
一般に、標的に対する結合特異性を有する結合部位を有するポリペプチドドメインの順番、およびリガンドがリンカーを含むかどうかは、設計上の選択の問題である。しかし、リンカーを伴うかまたは伴わない一部の順番により、他の順番よりも良好な結合特性が得られる場合もある。本発明により包含されるすべての順番(例えば、dAb1-リンカー-dAb2、dAb2-リンカー-dAb1)が、所望の結合特性を提供する順番を含有するリガンドであることは、スクリーニングにより容易に同定することができる。
【０２７３】
dAb単量体、二量体、および三量体を含む本発明によるポリペプチドおよびdAbは、CH2ドメインおよびCH3ドメインの一方または両方、ならびに任意によりヒンジ領域を含む抗体Fc領域に連結することができる。例えば、Fc領域に対する単一ヌクレオチド配列として連結されたリガンドをコードするベクターを用いて、このようなポリペプチドを調製することができる。
【０２７４】
本発明はさらに、前述のdAb単量体の二量体、三量体、およびポリマーも提供する。
【０２７５】
コドン最適化配列
上記で説明した通り、本発明の実施形態は、本発明のポリペプチドおよび可変ドメインをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を提供する。以下の例示で示される通り、同じ可変ドメインをコードする同一性約70％のコドン最適化配列を作製することができる(この場合、可変ドメインアミノ酸配列は、DOM1h-131-206と同一である)。この場合、配列は、ピキア・パストリス(コドン最適化配列1〜3)または大腸菌(コドン最適化配列4または5)による発現について最適化された。
【０２７６】
本発明者らは、遺伝子コードにおける縮重を考慮に入れて計算を実施し、図19で示されるDOM1h-131-206のヌクレオチド配列およびDOM1h-131-206と同一な可変ドメインをやはりコードする理論的なヌクレオチド配列によりコードされる各縮重コドン内におけるヌクレオチド変化の数を最大化した。計算により、理論的な配列は、図19で示されるDOM1h-131-206のヌクレオチド配列に対して、57％の同一性を有するに過ぎないことが明らかとなった。
【０２７７】
コドン最適化配列1
DNA配列
gaggttcaattgttggaatccggtggtggattggttcaacctggtggttctttgagattgtcctgtgctgcttccggttttactttcgctcacgagactatggtttgggttagacaggctccaggtaaaggattggaatgggtttcccacattccaccagatggtcaagatccattctacgctgactccgttaagggaagattcactatctccagagacaactccaagaacactttgtacttgcagatgaactccttgagagctgaggatactgctgtttaccactgtgctttgttgccaaagagaggaccttggtttgattactggggacagggaactttggttactgtttcttcc
対応するアミノ酸配列
evqllesggglvqpggslrlscaasgftfahetmvwvrqapgkglewvshippdgqdpfyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyhcallpkrgpwfdywgqgtlvtvss。
【０２７８】
・野生型配列に対する74.1％のヌクレオチド配列同一性
2010528646.tif 000003
【０２７９】
コドン最適化配列2
DNA配列
gagaaaagagaggttcaattgcttgaatctggaggaggtttggtccagccaggagggtcccttcgactaagttgtgctgccagtgggtttacgtttgctcatgaaactatggtatgggtccgacaggcacctggtaaaggtcttgaatgggtttcacatatccctccagacggtcaagacccattttacgctgattccgtgaaaggcagatttacaatttcacgagataattctaaaaacaccttgtacttacaaatgaactcattgagagctgaggacactgcagtttatcactgcgctttactaccaaaacgtggaccttggtttgattattggggccaaggtacgttagtgactgttagttct
対応するアミノ酸配列
ekrevqllesggglvqpggslrlscaasgftfahetmvwvrqapgkglewvshippdgqdpfyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyhcallpkrgpwfdywgqgtlvtvss
・野生型配列に対する71.1％のヌクレオチド配列同一性
2010528646.tif 000004
【０２８０】
コドン最適化配列3
DNA配列
gaagtgcagcttcttgaaagtggtggagggctagtgcagccagggggatctttaagattatcatgcgctgccagtggatttacttttgctcacgagacgatggtctgggtgagacaagctcctggaaaaggtttagagtgggtttctcacattccacctgatggtcaagatcctttctacgcagattccgtcaaaggaagatttactatctccagagataatagtaaaaacactttgtacctacagatgaactcacttagagccgaagataccgctgtgtaccactgcgccttgttgccaaagagaggtccttggttcgattactggggtcagggtactctggttacagtctcatct
対応するアミノ酸配列
evqllesggglvqpggslrlscaasgftfahetmvwvrqapgkglewvshippdgqdpfyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyhcallpkrgpwfdywgqgtlvtvss
・野生型配列に対する72.6％のヌクレオチド配列同一性
2010528646.tif 000005
【０２８１】
コドン最適化配列4
DNA配列
gaagtacaactgctggagagcggtggcggcctggttcaaccgggtggttccctgcgcctgtcctgtgcggcatctggtttcaccttcgcacacgaaaccatggtgtgggttcgccaagctccgggcaaaggcctggaatgggtaagccacattcctccagatggccaggacccattctatgcggattccgttaagggtcgctttaccatttctcgtgataactccaaaaacaccctgtacctgcagatgaactccctgcgcgccgaggatactgcggtgtaccattgtgcgctgctgcctaaacgtggcccgtggttcgattactggggtcagggtactctggtcaccgtaagcagc
対応するアミノ酸配列
evqllesggglvqpggslrlscaasgftfahetmvwvrqapgkglewvshippdgqdpfyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyhcallpkrgpwfdywgqgtlvtvss
・野生型配列に対する76.5％のヌクレオチド配列同一性
2010528646.tif 000006
【０２８２】
コドン最適化配列5
DNA配列
gaggttcaactgctggaatctggtggtggtctggtacaaccgggtggttccctgcgtctgagctgtgcagcctctggtttcaccttcgctcatgagaccatggtttgggtacgccaggctccgggtaaaggcctggagtgggtaagccatatccctcctgatggtcaggacccgttctatgctgattccgtcaaaggccgttttaccatttctcgtgacaacagcaaaaacactctgtacctgcaaatgaactccctgcgtgcagaagacacggcggtttatcactgtgcactgctgccaaaacgcggcccttggttcgactactggggccagggtactctggtcactgtatcttct
対応するアミノ酸配列
evqllesggglvqpggslrlscaasgftfahetmvwvrqapgkglewvshippdgqdpfyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyhcallpkrgpwfdywgqgtlvtvss
・野生型配列に対する78.4％のヌクレオチド配列同一性
2010528646.tif 000007
【実施例】
【０２８３】
実施例A:ヒトTNFR1に対するドメイン抗体のリード選択および特徴付け
作製したドメイン抗体は、ファージライブラリーに由来する。受動的に吸収されたヒトTNFR1に対する可溶性選択およびパニングの両方を、適当な標準的な方法に従って行った。ヒトTNFR1は、R&Dシステムズ(Cat No 636-R1-025/CF)またはPeprotech(Cat no.310-07)から可溶性組み換えタンパク質として購入し、直接(受動選択の場合)使用するか、または第1級アミンによるカップリングを用いてビオチン化し、生物学的アッセイにおけるヒトTNFR1の活性の品質管理を行い、そして質量分析によるヒトTNFR1の分子量およびビオチン化の程度の分析を行ってから使用した。次の回の選択での抗原のレベルの低下を利用して一般的な3回の選択を行った。
【０２８４】
選択からのアウトプットを、抗TNFR1結合クローンの存在についてのファージELISAによってスクリーニングした。これらのファージ選択でDNAを単離し、可溶性dAbフラグメントの発現のために発現ベクターにサブクローニングした。可溶性dAbフラグメントを96ウェルプレートで発現させて、抗c-mycを検出する直接結合ELISAを用いるか、またはストレプトアビジン/ビオチン化TNFR1 BIAcore(商標)チップを使用するBIAcore(商標)を用いて、抗TNFR1結合dAbの存在について上清をスクリーニングし、解離速度に従ってランク付けした。
【０２８５】
以下に示すリード分子は、DOM1h-131と呼ぶ親dAbに由来する(国際公開第2006038027号に記載)。この分子は、60nMビオチン化抗原を用いた3回の選択の後、ファージディスプレイライブラリーから選択した。ストレプトアビジンまたはニュートラアビジン(neutravidin)でコーティングされたDynaビーズを、ストレプトアビジンまたはニュートラアビジンに対する結合剤の選択を回避するために選択の各回で捕捉試薬として交互に使用した。この段階でのリードDOM1h-131の効力は、MRC-5線維芽細胞/IL-8放出細胞アッセイで決定すると、低いμM範囲であった。BIAcore(商標)によって決定した結合動力学は、通常は高速結合/高速解離速度で表示される。C末端がmyc標識された単量体であるこのDOM1h-131リード分子の大腸菌発現レベルは約8mg/lであった。
【０２８６】
リードの親和性成熟:
効力が高く、生物物理学的特徴が改善された変異体を生成するためにDOM1h-131を親和性成熟させた(DOM1h-131由来リードのアミノ酸配列については図3を参照されたい)。エラープローンPCRポリメラーゼ(Genemorph II,Stratagene)を用いてエラープローンライブラリー(dAb配列当たり平均1個のアミノ酸の変化、ライブラリーのサイズは8×107)を作製後、これらのエラープローンライブラリーを用いた7回の選択を行った。この方法により、4個のアミノ酸の変化(フレームワーク1(FR1)に1つ、CDR1に1つ、CDR3に1つ、FR4に1つ)によってMRC-5細胞アッセイで測定した効力(最大4nM)が約100倍に改善された分子、クローンDOM1h-131-8を単離できた。このアッセイでは、MRC-5細胞を、試験試料と共に1時間インキュベートしてから、TNF-α(200pg/ml)を添加した。一晩インキュベートした後、IL-8放出を、IL-8 ABI 8200細胞検出アッセイ(FMAT)で検出した。TNF-α用量曲線を各実験に含めた。TNFR1(200pg/ml)に結合するdAbとの競合に使用するTNF-αの濃度は、このアッセイの最大TNF-α反応の約70％であった。
【０２８７】
さらに効力を改善するために、1つのアミノ酸の位置を、エラープローンリードコンセンサス情報によって示唆された重要な位置でのオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発法(oligo-directed mutagenesis)によって多様化した。このプロセスの際に、DOM1h-131-8クローンの改良型である、1つのK94Rアミノ酸突然変異(Kabatに従ったアミノ酸の番号付け)および200〜300pMのRBA効力を有するDOM1h-131-24(訂正前の元の名称はDOM1h-131-8-2)を、BIAcore(商標)スクリーニングによって単離した。
【０２８８】
このリードおよびこのリードの元であるNNSライブラリーに基づいた別のエラープローンライブラリーを作製し、熱処理によってファージ選択を3回行った(この方法については、Jespers Lら、「Aggregation-resistant domain antibodies selected on phage by heat denaturation.」、Nat Biotechnol.2004 Sep;第22巻、第9号:1161〜5頁を参照)。この選択の際に、ライブラリーをプールし、この2回目の選択で得たクローンにより、熱安定性が高いとみなされるDOM1h-131-53などのdAbが得られた。これらのクローンは、優れた生物物理学的特徴を有するであろうと仮定された。クローンDOM1h-131-53における一部のフレームワークの突然変異を、生殖細胞系列系で生じさせ、クローンDOM1h-131-83を生成した。このクローンは、上記したファージディスプレイ選択法またはエマルジョンを用いるin-vitroコンパートメント化法を用いたオリゴヌクレオチド指定個別CDR突然変異誘発法によるさらなる多様化の基礎とした。ファージディスプレイ選択法により、DOM1h-131-117およびDOM1h-131-151を生成した。in-vitroコンパートメント化法により、DOM1h-131-511を生成した。
【０２８９】
この段階では、これら3つのリードを、生物物理学的アッセイおよび生物学的アッセイで比較したところ、DOM1h-131-511が最適な特性を有する分子であった。さらに、これらの分子を、トリプシンまたはロイコザイムの存在下でのタンパク質分解切断に対する耐性について試験した。ロイコザイムは、嚢胞性線維症の患者からのプールした喀痰からなり、高レベルのエラスターゼおよび他のプロテアーゼを含み、肺疾患におけるin vivo条件の代わりとして用いた。このデータは、これらの3つのリード、すなわちDOM1h-131-117、DOM1h-131-151、およびDOM1h-131-511のすべてが、トリプシンまたはロイコザイムの存在下で迅速に分解されることを示している。この結果により、患者の体内におけるDOM1h-131-511のin vivo耐性についての懸念が生じ、トリプシンに対する改善された耐性を選択するための方法が開発された。このような改善されたトリプシン耐性が、分子の他の生物物理学的特性に対して有利な効果を有するという仮説を立てた。本質的に、標準的なファージ選択法を、抗原に対する選択の前にプロテアーゼの存在下での選択を可能にするように改変した。このため、新しいファージベクターを、提示されたdAbがファージから切断されることなく、トリプシンの存在下で選択ができるようにc-mycタグを欠失させて作製した。DOM1h-131-511系エラープローンライブラリーを作製し、pDOM33ベクターにクローニングした(pDOM33ベクターのマップについては図50を参照)。このライブラリーから作製したファージストックを、37℃で24時間、1mg/mlまたは100μg/mlトリプシンで前処理し、次いで、対応する抗原に対する選択の前に、トリプシン活性を遮断するためにプロテアーゼインヒビター、Roche社製Completeプロテアーゼインヒビター(2×)を添加した。4回の選択を行った。可溶性発現TNFR1結合dAbを、トリプシン(100μg/mlまたは1000μg/mlの最終トリプシン濃度)の存在下または非存在下、37℃で1時間または一晩インキュベートする際に、プロテアーゼの存在下または非存在下、TNFR1結合能についてBIAcore(商標)を用いて評価した。
【０２９０】
それにより、BIAcore(商標)抗原結合実験によって示した改善されたプロテアーゼ耐性を実証した2つのリード分子、DOM1h-131-202およびDOM1h-131-206が単離された。興味深いことに、DOM1h-131-202は、DOM1h-131-511と比べるとCDR2(V53D)(すべてのアミノ酸の番号付けはKabatに従った)に唯一の突然変異を含み、DOM1h-131-206は、わずか2つの突然変異を含み、最初の突然変異がDOM1h-131-202(CDR2におけるV53Dの突然変異)と同じであり、2番目の突然変異がFR3のY91H突然変異である(図3を参照)。このFR3のY91H変異は、3-20ヒト生殖細胞系遺伝子で起こっており、この残基がヒト抗体で起こることを示唆している。3つのクローン、すなわちDOM1h-131-511、DOM1h-131-202、およびDOM1h-131-206は、図3に示すアミノ酸配列を有する。
【０２９１】
以下に示すように分子の活性を決定した:
ヒトTNFR1に対する結合についてのDOM1H-131-202、DOM1H-131-511、およびDOM1H-131-206のBIAcore(商標)結合親和性評価
ヒト組み換え大腸菌発現ヒトTNFR1への結合に対するDOM1H-131-202、DOM1H-131-511、およびDOM1H-131-206の結合親和性をBIAcore(商標)分析によって評価した。この分析は、ビオチン化ヒトTNFR1を用いて行った。1400RUのビオチン化TNFR1を、ストレプトアビジン(SA)チップ上にコーティングした。この表面は、軽度酸溶出条件を用いてベースラインまで再生した。DOM1H-131-202、DOM1H-131-511、およびDOM1H-131-206を所定の濃度で、50μl/分の流速でこの表面に流した。この作業は、BIAcore(商標)3000装置で行い、データを分析し、1:1結合モデルにフィットさせた。結合データは、試験したすべての分子に対して1:1モデルに十分にフィットした。すべてのKD値を、kon速度およびkoff速度から算出した。BIAcore(商標)実験は、25℃で行った。
【０２９２】
以下に示すデータは、3つの別個の実験から作成した。各実験では、結果は、dAbの最高濃度kdおよび低い濃度kaを用いてフィットの数を平均して算出した。データは、結果の平均と標準偏差(カッコ内)として示す(表1)。
【表１】
2010528646.tif 000008
【０２９３】
DOM1H-131-202、DOM1H-131-511、およびDOM1H-131-206は、同様に結合し、ヒトTNFR1に対して高い親和性を有する。DOM1H-131-202およびDOM1H-131-206はそれぞれ、0.55nMおよび0.47nMの平均親和性で結合する。DOM1H-131-202およびDOM1H-131-206は両方とも、1.07nMの平均親和性を有するDOM1H-131-511と比べるとやや良好な親和性を有する。
【０２９４】
受容体結合アッセイ:
ヒトTNFR1に対するdAbの効力を受容体結合アッセイで決定した。このアッセイは、TNF-αのTNFR1に対する結合および可溶性dAbがこの相互作用を遮断する能力を測定する。TNFR1-FC融合体を、ヤギ抗ヒトIgG(H&L)で事前にコーティングしたビーズ上に捕捉される。受容体コーティングビーズを、側面が黒く底面が透明な384ウェルプレート内でTNF-α(10ng/ml)、dAb、ビオチンコンジュゲート抗TNF-α、およびストレプトアビジンAlexa Fluor 647と共にインキュベートする。6時間後、プレートをABI 8200 Cellular Detectionシステムで読み取り、ビーズ結合蛍光を測定する。dAbがTNF-αのTNFR1に対する結合を遮断すると、蛍光強度が低下する。
【０２９５】
データを、ABI8200分析ソフトウェアを用いて分析した。濃度効果曲線および効力(EC50)値を、GraphPad Prismおよびシグモイド型用量反応曲線(可変勾配)を用いて決定した。このアッセイは、3つの異なる時期に繰り返した。TNF-α用量曲線を各実験に含めた(図38および図39)。TNFR1(10ng/ml)に対するdAb結合との競合に使用するTNF-αの濃度は、このアッセイの最大TNF-α反応の約90％とした。
【０２９６】
TNF-αのTNFR1に対する結合を阻害するdAbの能力を示す代表的なグラフを図39に示している。3つすべての実験では、陰性対照試料(HEL4、抗雌鳥卵白リゾチームdAb(anti-hen egg white lysozyme dAb)、およびVHダミー(VH dummy))は、高濃度でTNF-αとTNFR1との間の相互作用を弱く阻害する。試験試料および陽性対照(R&D Systemsから入手した抗TNFR1 mAb、mAb225)およびEnbrel(商標)(エタネルセプト;IgG1のFc部分に結合したTNFR2からなる二量体融合体(dimeric fusion);リウマチ様関節炎の治療のために認可されている)の平均効力(EC50)の値を表2に示している。
【表２】
2010528646.tif 000009
【０２９７】
このアッセイでは、DOM1H-131-206が、試験した他の2つのdAbよりも効力が高いようであり、市販されている抗TNFE1 mAb、MAB225(R&D Systems)と同様の効力を有する。
【０２９８】
以下に示すようにピキア・パストリス(Pichia pastoris)からリードクローンを発現させた：
3つのリード分子の一次アミノ酸配列を用いて、ピキア・パストリスでの分泌発現のためにコドン最適化遺伝子を作製した。コドン最適化DOM1H-131-206と非コドン最適化DOM1H-131-206との間には75％の配列同一性が存在する。3つの合成遺伝子を、発現ベクターpPIC-Zα(Invitrogenから入手)にクローニングし、2つのピキア株、X33およびKM71Hに形質転換した。形質転換細胞を、複数の組み込み体を備えたクローンを選択するために、増加する様々な濃度(100μg/ml、300μg/ml、600μg/ml、および900μg/ml)のゼオシン(Zeocin)上に蒔いた。各細胞株についての約15のクローンおよび構築物を発現スクリーニングのために選択した。ピキア・パストリスにおける高/低遺伝子コピー数と発現レベルとの間の相関性が十分には分かっていないため、いくつかのクローンを様々な濃度のゼオシンから選定した。5L発酵槽の運転を、高生産性について広範にスクリーニングしていなかったクローンを用いて行った。それにより、さらなる試験のための大量の物質の生産が可能になった。
【０２９９】
タンパク質の特徴付けのための物質の生成:
プロテインA系クロマトグラフィー樹脂を広く用いて、VH dAbを微生物培養上清から精製した。それにより、ほとんどの場合通常は90％より高い高精製物質を生産する1段階精製法が可能となるが、一部の分子では、低pH溶出条件でも、凝集体が形成されることがある。また、dAbに対する親和性樹脂の限定された能力の問題があり、すなわち発酵槽から処理するために大量に樹脂を使用することを意味する。特徴付けおよびさらなる安定性試験および噴霧試験のために高品質の物質を生産するべく、第1の捕捉ステップとしての混合式電荷誘導樹脂および続く陰イオン交換を用いる下流精製プロセスを考案した。それにより、著しい最適化をしなくても、約95％の精製で約70％の発現dAbの回収が可能となった。
【０３００】
混合式電荷誘導樹脂、Capto MMC(GE Healthcareから入手)に対する捕捉ステップでは、50mMリン酸ナトリウム(pH6.0)を用いてカラム平衡化を行い、希釈またはpH調整をせずに上清を添加した。カラムの洗浄後、50mMトリス(pH9.0)である溶出緩衝液を用いてpH勾配によってタンパク質を溶出した。具体的な洗浄および勾配条件は、溶出するタンパク質のpIによって若干異なる。
【０３０１】
次いで、溶出液ピークを、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いたフロースルーステップでさらに精製する。これにより、アルコールオキシダーゼなどの残存HMW混入物が除去され、エンドトキシンが減少する。PBSまたは塩を含まないリン酸緩衝液(pH7.4)で樹脂を平衡化する。Capto MMCから入手した溶出液を陰イオン交換樹脂に添加すると、dAbが結合しないため、dAbをフロースルーから回収できる。エンドトキシンおよび他の汚染物質が樹脂に結合する。PBS緩衝液を使用すると、塩の存在により、このステップで、タンパク質回収率が塩を使用しない場合の86％から91％に改善される。しかしながら、塩の存在により、エンドトキシンを除去する効果が低下するため、塩を含むこのステップの後のdAbの一般的なエンドトキシン濃度は、塩が存在しない場合に得られる1.0EU/ml未満の濃度と比べ、58EU/mlと測定された。
【０３０２】
タンパク質の特徴付け:
5L発酵槽の運転で生産した物質を、エレクトロスプレー質量分析、アミノ末端配列決定、および等電点電気泳動を用いてアイデンティティーについて特徴付け、SDS-PAGE、SEC、およびGelcode糖タンパク質染色キット(Pierce)を用いて純度について特徴付けた。
【０３０３】
アイデンティティー:
各タンパク質の始めの5個の残基のアミノ末端配列分析は予想通りであった(EVQLL...)。C4 Zip-tips(Millipore)を用いてH2Oと0.1％氷酢酸含有アセトニトリルの比率を50:50になるように緩衝液交換を行ったタンパク質の試料に対して質量分析を行った。3種類の各タンパク質の測定質量は、内部ジスルフィド結合の形成から-2の質量差を許容した場合、一次アミノ酸配列に基づいた理論質量(平均質量を用いて算出)の0.5Daの範囲内であった。IEFを用いて、各タンパク質によって異なるpIに基づいてタンパク質を同定した。
【０３０４】
純度:
3種類の各タンパク質を、1μgおよび10μgの量で非還元SDS-PAGEゲルに2つずつ添加した。単一バンドが、すべての物質で観察された。また、純度のレベルを実証するためにサイズ排除クロマトグラフィーも行った。サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)では、各タンパク質100μgを、0.5ml/分で流れるTOSOH G2000 SWXLカラムにロードした。移動相は、PBS/10％エタノールとした。
【０３０５】
候補選択のためのdAb安定性の検討:
COPDを示すために、例えば噴霧デバイスを用いて肺にdABを送達する必要があることがある。これは、タンパク質が、使用する噴霧器のタイプによって様々なせん断ストレスおよび熱ストレスを受ける可能性があり、肺環境にあるプロテアーゼによって酵素分解されうることを意味している。このタイプのデバイスを用いてタンパク質を送達すると、正確な粒径分布が形成され、噴霧送達後に機能が維持されることが分かった。したがって、ベースライン安定性を示すアッセイおよび最高の感受性安定性を示すアッセイを決定するために、様々な物理的ストレスに対する各分子の固有の安定性を調べた。各タンパク質の安定性は、タンパク質を溶解する緩衝液に依存するため、いくつかの事前調製作業が必要であった。緩衝液やpHなどの情報も、下流精製プロセスおよび後の保管の際のタンパク質の安定性を理解する上で役立つであろう。様々な物理的ストレスに曝された際の分子の変化を特徴付けるために、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)、SDS-PAGE、および等電点電気泳動(IEF)などの様々な分析法を用いた。
【０３０６】
DOM1H-131-202、DOM1H-131-511、およびDOM1H-131-206のプロテアーゼ安定性の評価:
DOM1H-131-202、DOM1H-131-511、およびDOM1H-131-206のプロテアーゼ安定性を、過剰なプロテアーゼ存在下での規定時間のプレインキュベーションの後、残存結合活性のBIAcore(商標)分析によって評価した。約1400RUのビオチン化TNFR1をストレプトアビジン(SA)チップにコーティングした。250nM DOM1H-131-202、DOM1H-131-511、およびDOM1H-131-206を、PBSのみまたは100μg/mlトリプシン、エラスターゼ、もしくはロイコザイムと共に30℃で1時間、3時間、および24時間インキュベートした。プロテアーゼインヒビターのカクテルを添加して反応を停止させた。次いで、dAb/プロテアーゼ混合物を、参照細胞サブトラクションを用いてTNFR1コーティングチップの上を通過させた。チップ表面は、各注入サイクルの間に0.1Mグリシン(pH2.2)10μlを用いて再生した。プロテアーゼと共にプレインキュベート(10秒)したヒトTNFR1に結合したDOM1H-131-202、DOM1H-131-511、およびDOM1H-131-206のフラクションを、プロテアーゼを用いないdAb結合と比較して決定した。BIAcore(商標)分析は25℃で行った。データを、3つの独立した実験から作成した。棒グラフは結果の平均値を示し、エラーバーは結果の標準偏差を示している(結果については図24を参照)。
【０３０７】
DOM1H-131-202およびDOM1H-131-206は、DOM1H-131-511と比べると、トリプシン、エラスターゼ、またはロイコザイムによるタンパク質分解に対する耐性が高いことが分かった。DOM1H-131-202とDOM1H-131-206との間の差は、DOM1H-131-511と比べると、トリプシン処理の1時間後、およびエラスターゼまたはロイコザイム処理の3時間後に最も顕著であった。
【０３０８】
DSCを用いて決定した熱安定性:
分子が最も高い安定性を有するpHを決定するために、示差走査熱量計(DSC)を用いて、Britton-Robinson緩衝液中での各dAbの融解温度(Tm)を測定した。Britton-Robinsonは、3成分緩衝系(酢酸塩、リン酸塩、およびホウ酸塩)からなるため、同じ溶液で3〜10の範囲でpHをつくりだすことが可能である。理論pIは、タンパク質の一次アミノ酸配列から決定した。DSCから、dAbが最も高い固有熱安定性を有するpHは、DOM1H-131-202(202)についてpH7であり、M1H-131-206(206)についてpH7〜7.5であり、DOM1H-131-511(511)についてpH7.5であることが分かった。続くすべてのストレスおよび安定性の試験のために、各dAbに以下に示すpHを用いた：DOM1H-131-202(202)およびDOM1H-131-206(206)は、pH7.0のBritton-Robinson緩衝液、DOM1H-131-511(511)は、pH7.5のBritton-Robinson緩衝液とした。結果を以下に示す表3にまとめた。
【表３】
2010528646.tif 000010
【０３０９】
固有可溶性試験:
すべてのリードdAbを、それらの最大可溶性および濃縮時の回収レベルを決定するために遠心Vivaspin濃縮器(5Kカットオフ)で濃縮した。実験は、最も安定するpHのBritton-Robinson緩衝液中で行った。試料の体積および濃度を、一定の時間にわたって測定し、予想濃度から偏差を試料の回収率(％)と共に記録した。
【０３１０】
すべてのタンパク質は、Britton-Robinson緩衝液中で100mg/ml以上に濃縮できることが分かった。DOM1H-131-202(202)およびDOM1H-131-206(206)は共に、DOM1H-131-511(511)と比べると、予想よりも低い回収率を示したが、許容範囲内であった。
【０３１１】
リードdAbの噴霧送達:
異なる噴霧器および調製用緩衝液の試験により、dAbを様々な噴霧用デバイスで有効に送達できることが実証された。より重要なことに、調製用緩衝液に溶解したdAbの噴霧化により、タンパク質機能を維持したまま有効な肺への送達に適した所望の粒径分布(5μm未満の液滴の割合を用いて比較)が生成されることが初めて示された。これについて、以下に詳細に説明する。
【０３１２】
様々なデバイスの性能比較:
DOM1H-131-511(511)を、液体製剤用の噴霧デバイスの3つの主なグループ、すなわち超音波噴霧器、ジェット噴霧器、および振動メッシュ噴霧器のそれぞれから2つのデバイスを含む6つの噴霧デバイスで試験した。各デバイスでは、dAbを様々なPEG濃度で、5mg/mlで試験した。各試料に対して、5μm未満の液滴の割合を、Malvern Spraytekデバイス(Malvern Instruments Limited、UK)を用いて測定し、結果を図35に示す。カップおよび収集したエアロゾルの両方に残っている物質中で二量体化した試料の量を分析するために、噴霧化された後の各試料の安定性をSECを用いて評価した。結果は、図36で見ることができる。二量体形成の程度が少なければ少ないほど、安定性が高くなる。
【０３１３】
大部分のデバイスは、液体製剤の40％以上を適正なサイズ範囲で送達することができるが、eFlow(振動メッシュ噴霧デバイス)およびPARI LC(ジェット噴霧)デバイスがより性能が良く、PEGが緩衝液に含まれていると、PARI LC*(star)デバイスは80％超を送達する。PEGを用いたこの送達の増加は、eFlowでも観察され、PARI LC+では増加の程度が低かった。
【０３１４】
重要なことに、dAbの活性は、噴霧化後にも維持されることも分かった(図8の結果を参照されたい)。
【０３１５】
緩衝液添加物の効果:
DOM1H-131-511(511)の低い安定性のために、50mM調製用リン酸緩衝液には、せん断ストレスおよび熱ストレスの両方からのdAbの保護を助けるために、PEG 1000およびスクロースの両方を含めた(そして1.2％(w/v)スクロースを含む50mMリン酸緩衝液に溶解した約2％〜約10％のPEG 1000の溶液粘度にほぼ同等と定義した範囲内の粘度を有する)。DOM1H-131-202(202)およびDOM1H-131-206(206)の両方が高いTmを有し、熱ストレスに対してかなり改善された安定性を示したため、すべての分子を、元の調製用緩衝液およびBritton-Robinson緩衝液(調製用緩衝液よりも粘度が低い)の両方で試験した。dAbを、5mg/mlのタンパク質濃度、3.5分の運転時間でE-flowデバイスおよびPari LC+デバイスの両方で試験し、粒径分布をMalvern Spraytekデバイスで測定した。比較として、噴霧デバイスで送達される嚢胞性線維症の市販薬(標準タンパク質Xと名付ける)を、それ自体の調製用緩衝液で試験した。この結果を図37に示す。肺深くへの良好な送達および分布のために理想的な粒径は、6μm未満、例えば5μm未満である。すべてのdAbは、Britton-Robinson緩衝液および調製用緩衝液(先述)の両方で5μm未満の粒径と同等のレベルとなる。しかしながら、高粘度の調製用緩衝液は、例えば5μm未満の粒径の適切な粒径範囲内の粒子を生産するのに特に有用である場合があった。デバイスのカップ内のdAbの濃度を、噴霧投与の前後のA280測定値から決定した。タンパク質濃度が有意に変化しないことが分かり、これは、送達の際にタンパク質またはビヒクルのいずれも優先的に噴霧化されないことを示唆している。
【０３１６】
結論:
上記したように、dAbなどのポリペプチドを様々な市販の噴霧デバイスで噴霧化することができ、重要なことに噴霧化後もポリペプチドが安定性および生物活性を維持し、噴霧化後に著しい凝集が一切観察されないことを実証した。PEGなどの粘度増強賦形剤を調製用緩衝液に添加すると、粒径分布および5μm未満の液滴サイズの割合を改善することができるため、肺深くへのdAbの送達を改善できる可能性がある。
【０３１７】
肺へのdABの送達はまた、dABの安定性または活性を一切低下させることなく、dAB濃度(例えば最大約40mg/mlの濃度)および送達時間を増加させることによって改善することもできる。
【０３１８】
実施例１
ファージベクターpDOM13
線状ファージ(fd)ディスプレイベクター、pDOM13を用いた。このベクターは、ファージ外被タンパク質IIIとの融合タンパク質を産生する。pDOM13のマルチクローニング部位を図1に示す。dAbcをコードする遺伝子をSalI/NotIフラグメントとしてクローニングした。
【０３１９】
実施例２
様々なトリプシン耐性でのファージディスプレイドメイン抗体(dAb)に対する試験プロテアーゼ選択
IL-1R1に結合するdAb DOM4-130-54、TNFR1に結合するdAb DOM1h-131-511、およびVEGFAに結合するdAb DOM15-10、dAb DOM15-26、およびdAb DOM15-26-501をコードする遺伝子をpDOM13にクローニングし、これらのdAbを提示するファージを標準的な技術に従って作製した。ファージをPEG沈殿によって精製し、PBS中に再懸濁し、力価を測定した。
【０３２０】
上記のdAbは、単離したタンパク質として試験したときにトリプシンによる分解に耐える様々な能力を示した。分解に対する耐性を、以下に示すように評価した：PBS中のdAb(1mg/ml)を、40μg/mlトリプシンと共に30℃でインキュベートし、dAbとトリプシンのモル比25:1が得られた。トリプシン添加の直前、T=1時間、3時間、および24時間に試料(30μl)を採取した。プロテアーゼ活性を、Roche社製Completeプロテアーゼインヒビター(2×)の添加によって中和し、次いで液体窒素に浸漬し、ドライアイス上に保存した。次いで、各dAB試料15μgを、Novex 10〜20％トリシン(Tricine)ゲル上での電気泳動によって分析し、タンパク質をSureBlue(1×)で染色した。
【０３２１】
DOM15-10およびDOM15-26-501は両方とも、初めの3時間の間に著しく消化された。DOM15-26、DOM4-130-54、およびDOM1h-131-511は、より安定しているが、24時間後にdAbの消化が明らかになった(図2)。
【０３２２】
また、ファージディスプレイdAbのトリプシン耐性が単離された可溶性dAbで得た結果に相関しているかを評価するために、ファージディスプレイdAbを、トリプシンの存在下でインキュベートした。様々なトリプシン濃度およびインキュベーション時間で試験した。すべてのケースで、Roche社製Completeプロテアーゼインヒビターを用いたトリプシンの中和後、一般リガンド、すなわちすべてのVHドメイン抗体(例えば、DOM1h-131、DOM15-26、DOM15-26-501)に結合するプロテインAまたはすべてのVKドメイン抗体(例えば、DOM4-130-54、DOM15-10)に結合するプロテインLに対する結合能についてファージを試験した。また、標的抗原に対する結合についても、ファージを試験した。いずれのケースでも、結合が、タンパク質分解耐性によるdAbの構造的完全性の維持に相関していると推定された。結合活性を、ELISA(ファージにコンジュゲートした抗体を使用)または結合したファージの溶出および指数関数的に増殖する大腸菌TG1細胞の感染後の力価分析によって測定した。
【０３２３】
ファージ上のDOM15-10、DOM15-26、およびDOM15-26-501を用いた試験
各dAbを、様々なトリプシン濃度(100μg/ml、10μg/ml、および0μg/ml)で、室温で1時間処理した。トリプシン活性を、Roche社製Completeプロテアーゼインヒビター(1×)で遮断し、次いでファージを、PBS中の2％ Marvellに希釈し、50nMビオチン化抗原(組み換えヒトVEGF(R&D systems))と共に室温で1時間インキュベートした。PBS中の2％ Marvellと共に室温で1時間予めブロッキングしたストレプトアビジンコーティングビーズ(Dynabeads M-280(Invitrogen))を添加し、この混合物を室温で5分間インキュベートした。Dynabeadsを用いたすべてのインキュベーションステップを回転ホイールで行った。PBS中の0.1％ Tween-20 1mlでビーズを8回洗浄して、結合しなかったファージを洗い流した。結合したファージを、0.1Mグリシン(pH2.2)0.5mlで溶出させ、1M Tris-HCL(pH8.0)100μlで中和した。溶出したファージを用いて、指数関数的に増殖するTG1細胞を感染させ(37℃で1時間)、テトラサイクリンプレートに蒔いた。プレートを37℃で一晩インキュベートし、コロニーを計数した(表4を参照)。100μg/mlトリプシンとのインキュベーションでの選択により最高の結果が観察された。DOM15-26の収率は、DOM15-10およびDOM15-26-501と比べて約10倍増であった。
【０３２４】
より厳しいインキュベーション条件下でこれらの結果をさらに確認するために第2の実験を行った。ファージディスプレイdAbを、攪拌(250rpm)しながら、37℃で1時間または2時間処理した。100μg/mlトリプシンとの2時間のインキュベーションでの選択により最高の結果が観察された。DOM15-26の収率は、DOM15-26-501の収率よりも200倍高く、DOM15-10の収率よりも1000倍高かった。
【０３２５】
第3の実験では、DOM15-26およびDOM15-26-501を提示するファージを、開始時に1:1に混合した。次いで、この混合物を、攪拌(250rpm)しながら37℃で2時間トリプシン(1000μg/ml)と共に、またはトリプシンを用いずにインキュベートし、次いで上記のように抗原結合に対して選択した。各選択から得た10個のコロニーの配列決定により、トリプシン前処理をしなかった選択で得られたクローンの混合集団(DOM15-26:4/10;DOM15-26-501:6/10)が明らかになり、トリプシン処理での選択から得られたすべてのクローンは、予想通りDOM15-26をコードしていた。
【０３２６】
これらの実験は、dAbを提示するファージにプロテアーゼを添加することによって淘汰圧を得ることができ、タンパク質分解に対して最も安定しているdAbを提示するファージが優先的に選択される(一般的なリガンドまたは抗原に対するパニングの後)ことを示している。
【表４】
2010528646.tif 000011
【０３２７】
ファージ上のDOM4-130-54を用いた試験
DOM4-130-54を、上記と同様のプロトコルで試験した。変動するパラメータは、トリプシン濃度、温度、およびインキュベーション時間とした。PBS中の濃度1nMのIL-RI-Fc(IL-1RIとFcの融合体)に対してバイオパニングを行った。ファージの力価の有意な低下が、ファージを100μg/mlトリプシンと共に37℃で一晩インキュベートした後でのみ観察された(表5を参照されたい)。
【表５】
2010528646.tif 000012
【０３２８】
DOM1h-131ファージを用いた試験
DOM1h-131ファージ(アミノ酸配列によってDOM1h-131-511に密接に関連している)を、0μg/ml、10μg/ml、100μg/ml、および1000μg/mlトリプシンで、室温で1時間処理した。消化を、25×Completeプロテアーゼインヒビター(Roche)の添加によって阻害した。ファージの2倍希釈系列を、1nM TNFRIでコーティングされたELISAプレートに添加し、結合しているファージを抗M13-HRPで検出した。結果を以下の表6に示す。
【表６】
2010528646.tif 000013
【０３２９】
これらの試験は、100μg/mlのトリプシンおよび37℃の温度が、トリプシンによるタンパク質分解に対して様々な程度の耐性をもつdAbを提示するファージに対して淘汰圧を加えるのに適していることを明確に示した。プロテアーゼとのインキュベーション時間は、所望に応じて、各ファージディスプレイdAbに対して最適化することができる。
【０３３０】
実施例３
ドメイン抗体のファージディスプレイレパートリーのプロテアーゼ選択
親分子としてDOM4-130-54、DOM1h-131-511、DOM15-10、およびDOM15-26-555のdAbを用いて4つのレパートリーを作製した。Stratagene Mutazyme IIキット、ビオチン化プライマー、および試薬50μlに対して5〜50pgの鋳型を用いてPCRによって遺伝子にランダム突然変異を導入した。SalIおよびNotIでの消化後、ストレプトアビジンコーティングビーズを用いて未消化産物からインサートを精製し、pDOM13の対応する部位にライゲーションした。大腸菌TB1細胞を、精製したライゲーションミックスで形質転換し、大きいレパートリーのテトラサイクリン耐性クローン、8.5×108(DOM4-130-54)、1.5×109(DOM1h-131-511)、6×108(DOM15-10)、および3×109(DOM15-26-555)を得た。
【０３３１】
PEGで2回沈殿させ、PBS中に再懸濁してファージライブラリーを作製した。
【０３３２】
アミノ酸突然変異率は、DOM1h-131-511レパートリーについて2.3であり、DOM4-130-54レパートリーについて4.4であった。機能性を、プロテインAまたはプロテインL(1μg/ml)でコーティングしたウェルを用いてファージELISAで96のクローンを試験して評価した。DOM1h-131-511レパートリーでは、クローンの62.5％がdAbを機能的ディスプレイし、DOM4-130-54レパートリーでは、クローンの27％がdAbを機能的ディスプレイした。
【０３３３】
アミノ酸突然変異率は、DOM15-10レパートリーについて2.5であり、DOM15-26-555レパートリーについて4.6であった。機能性を、プロテインAまたはプロテインL(1μg/ml)でコーティングしたウェルを用いてファージELISAで96のクローンを試験して評価した。DOM15-10レパートリーでは、クローンの31.3％がdAbを機能的にディスプレイし、DOM15-26-555レパートリーでは、クローンの10.4％がdAbを機能的にディスプレイした。
【０３３４】
DOM4-130-54レパートリーおよびDOM1h-131-511レパートリー
プロテアーゼ耐性が改善されたdAbの選択のためにこれらのライブラリーを用いて4回の選択を行った。
【０３３５】
初回の選択は、ライブラリーを一掃して高い親和性で抗原に結合していないすべてのクローンを除去するために、プロテアーゼ処理を用いずに抗原結合(1nMまたは10nM抗原)によって行った。1回目のアウトプットは、108〜1010の範囲であり(1011のファージのインプットと比較して)、ライブラリーの大多数が高い親和性で抗原に結合したことを示している。
【０３３６】
2回目では、100μg/mlトリプシンを用いてプロテアーゼ処理を行い、このアウトプットを以下の表7に示す。
【表７】
2010528646.tif 000014
【０３３７】
dAbを、37℃で一晩、トリプシンで処理したときに著明な選択が行われた。このアウトプットを3回目に進め、ファージを、37℃で24時間、1mg/mlまたは100μg/mlトリプシンで処理した。3回目からのトリプシン処理ファージの力価は、DOM1h-131-511レパートリーで105〜106であり、DOM4-130-154レパートリーで107〜108であった。
【０３３８】
3回目のすべてのアウトプット(1mg/mlおよび100μg/ml DOM1h-131-511およびDOM4-130-154)を、100μg/mlトリプシンを用いて1nM抗原に対して4回目の選択に供した。力価は、3回目と同様に106〜108の範囲であった。DOM1h-131-511レパートリーでは、富化が見られたが、DOM4-130-54レパートリーでは見られなかった。
【０３３９】
DOM15-10レパートリーおよびDOM15-26-555レパートリー
初回の選択は、ライブラリーを一掃して高い親和性で抗原に結合していないすべてのクローンを除去するために、プロテアーゼ処理を用いずに2nMの濃度のビオチン化hVEGF(ヒト血管内皮細胞増殖因子)を用いて行った。1回目のアウトプットは、約108(DOM15-10について1010ファージのインプットおよびDOM15-26-555について1011ファージのインプットと比較して)であり、ライブラリーの大多数が高い親和性で抗原に結合したことを示している。
【０３４０】
2回目および3回目の選択を、2nMビオチン化hVEGFを用いて行った。hVEGFに対してパニングする前に、ファージを、トリプシン(100μg/ml)の存在下、37℃で、振盪機(250rpm)でインキュベートした。インキュベーション時間は、DOM15-10レパートリーに対しては1時間、DOM15-26-555レパートリーに対しては2時間とした。
【０３４１】
アウトプットは次の通りであった：DOM15-10レパートリーを用いた2回目および3回目の選択ではそれぞれ、1.5×106および9×105であり、DOM15-26-555レパートリーを用いた2回目および3回目の選択ではそれぞれ、2.2×108および3.9×109であった。
【０３４２】
実施例４
選択アウトプットの分析:DOM4-130-54レパートリーおよびDOM1h-131-511レパートリー
3回目および4回目の選択からのすべてのアウトプットを、pDOM5ベクターにサブクローニングし、JM83細胞に形質転換した。pDOM5ベクターは、pUC119系ベクターである。タンパク質の発現は、Placプロモーターによって駆動される。GAS1リーダー配列(国際公開第2005/093074号を参照)は、大腸菌JM83の周辺質および培養上清中への単離された可溶性dAbの分泌を確実にする。発現のために3回目および4回目の選択からそれぞれ、96個および72個の個々のクローンをランダムに選定した。
【０３４３】
3回目および4回目のアウトプットからの12〜24個のクローンを配列決定した。両方の選択でコンセンサス突然変異が観察され、コンセンサスモチーフを有する約25個のクローンをさらなる特徴付けのために選択した。これらのクローンのアミノ酸配列を、図3(DOM1h-131-511選択変異体)および図4(DOM4-130-54選択変異体)に示し、図19A〜19LにDNA配列として列記した。選択したクローンの親配列とは異なるアミノ酸は強調してある(同一のアミノ酸は点で示した)。CDR1、CDR2、およびCDR3に相当するループは四角で囲んだ。
【０３４４】
これらのクローンを、大量に発現させてプロテインL(DOM4-130-54変異体に対して)およびプロテインA(DOM1h-131-511変異体に対して)で精製し、トリプシン(100μg/mlまたは1000μg/mlの最終濃度)の存在下または非存在下、37℃で1時間または一晩インキュベートした後、BIAcore(商標)で抗原結合について試験した。
【０３４５】
一般に、DOM4-130-54選択からのアウトプットは安定性が高く、残っているほとんどのクローンがトリプシンに1時間耐え、最良のクローンは一晩耐えた。対照的に、DOM1h-131-511選択からのクローンは、少数がトリプシンに1時間耐えるのみで、一晩耐えたクローンは存在しなかった。
【０３４６】
実施例５
選択アウトプットの分析:DOM15-10レパートリーおよびDOM15-26-555レパートリー
トリプシン前処理での選択の効果をまず、トリプシン消化を用いて、または用いずにモノクローナルファージELISAで試験した。各ライブラリーの2回目の選択から得た18個のコロニーおよび3回目の選択から得た24個のコロニーを選定した。クローンDOM15-10、DOM15-26-501、およびDOM15-26を対照として使用した。別の対照として、2回目および3回目のトリプシン選択後の各ライブラリーからの増幅および精製したファージ溶液も含めた。
【０３４７】
各ファージ試料を2つに分割して、一方を100μg/mlトリプシンで処理し、他方はトリプシンで処理しなかった。これらの両方を、攪拌(250rpm)しながら37℃で1時間インキュベートし、Roche社製Completeプロテアーゼインヒビター(1×)を添加して遮断した。
【０３４８】
ファージELISAを、トリプシン消化試料および未消化試料を用いて行った。ELISAウェルを、0.1M炭酸緩衝液中の1μg/mlの濃度のニュートラアビジンでコーティングした。PBSを用いた洗浄ステップおよびPBS中の1％ Tween-20を用いた室温での1時間の抗原コーティングウェルのブロッキングの後、ウェルを、PBS中の1％ Tween-20で希釈した100ng/mlの濃度のビオチン化hVEGFでコーティングした。次いで、ウェルをPBSで洗浄し、1％ Tween-20/PBSで1:1に希釈した処理または未処理ファージ上清を添加した。37℃での30分のインキュベーションの後、ウェルを1％ Tween-20/PBSで洗浄し、次いで抗M13ファージHRPコンジュゲート(1％ Tween-20/PBSで1/5000に希釈)と共に37℃で30分間インキュベートした。次いで、ウェルをPBSおよびペルオキシダーゼで洗浄した。反応を、SureBlue試薬を添加して開始させた。約10分後、等量の1M HClで反応を停止させ、ウェルをOD450nMで読み取った。
【０３４９】
トリプシンで処理した不安定対照DOM15-10およびDOM15-26-501のELISAによる読み取り値から、OD450が0.404よりも低く、この値を不安定クローンの境界値とすることにした。ODが0.404よりも低いすべての試料を不安定とみなした。この値よりも高いすべての試料を安定とみなした。
【表８】
2010528646.tif 000015
【０３５０】
表8は、各ライブラリーの2回目および3回目のトリプシン選択後の安定クローンの割合(％)を示している。トリプシン耐性クローンの富化が、3回目の選択の後の両方のライブラリーで確認できる。各選択後の増幅され精製されたファージ混合物を含む対照ELISAウェルの値は、トリプシン消化後、いずれの場合でも0.404よりも大幅に高かった。さらに、3回目の選択から得たトリプシン処理ファージを2回目の選択から得たトリプシン処理ファージと比べると、シグナルのわずかな増加が観察された。DOM15-10ファージライブラリーは、約14％の開始値の増加を示した。DOM15-26-555ファージライブラリーは、開始値の約2％を表す増加を示した。
【０３５１】
これらの結果は、トリプシン前処理での選択が、DOM15-10レパートリーおよびDOM15-26-555レパートリーからトリプシン耐性ファージクローンを選択するのに有効であることを示している。
【０３５２】
2回目および3回目の選択(DOM15-26-555)および3回目のみの選択(DOM15-10)からのすべてのアウトプットを、pDOM5ベクターにサブクローニングし、HB2151エレクトロコンピテントセルに形質転換した。pDOM5ベクターは、pUC119系ベクターである。タンパク質の発現は、Placプロモーターによって駆動される。GAS1リーダー配列は、大腸菌HB2151の周辺質および培養上清中への単離された可溶性dAbの分泌を確実にする。各回の選択(3および4)からの184個の個々のクローンを、1mlの培養体積での発現のためにランダムに選定した。
【０３５３】
細菌上清を、HBS-EP BIAcore緩衝液で希釈し(1:1の体積比)、2つに分割した。トリプシンを、最終濃度20μg/mlとなるように片方のバイアルだけに添加した。攪拌(250rpm)しながら37℃で40分間インキュベートした。Roche社製Completeプロテアーゼインヒビター(1×)で反応を遮断してから、トリプシン処理および未処理ファージ上清の両方を、抗原結合についてBIAcore 3000で試験した(SAセンサーチップ上に2,000RUのビオチン化hVEGF)。
【０３５４】
クローンを選定する基準は、一般にプロテアーゼ処理に対するdAbの安定性を反映する、未処理dAbに対するトリプシン処理dAbの抗原結合の15％未満(選択した時点で達した最大RUに基づいて)の低下と、dAbの抗原からの解離中の2つの時点間の解離速度の40％未満の低下とした。これらの値に基づいて、DOM15-26-555ライブラリーの2回目および3回目の両方の選択からの60個のクローンならびにDOM15-10ライブラリーの3回目の選択からの17個のクローンを配列決定した。両方のライブラリーのアウトプットでコンセンサス突然変異が確認され、コンセンサスモチーフを有する各ライブラリーからの17個のクローンをさらなる特徴付けのために選定した。これらのクローンのアミノ酸配列を、図5(DOM15-26-555選択変異体)および図6(DOM15-10選択変異体)に示し、図20A〜20EにDNA配列として列記した。選択したクローンの親配列と異なるアミノ酸は強調してある(同一のアミノ酸は点で示した)。CDR1、CDR2、およびCDR3に一致するループは四角で囲んだ。
【０３５５】
これらのクローンを50mlの発現培養で発現させ、HBS-EP緩衝液で100nMの濃度に希釈したプロテインA(DOM15-26-555変異体に対して)およびプロテインL(DOM15-10変異体に対して)で精製し、トリプシン(最終濃度20μg/ml)の存在下または非存在下、攪拌(250rpm)しながら37℃で1.5時間インキュベートした後、BIAcore(商標)で抗原結合について試験した。
【０３５６】
また、これらのクローンを、実施例2に記載した方法を用いてトリプシン耐性について試験した。タンパク質をPBSに緩衝液交換して、1mg/mlに濃縮した。タンパク質25μgをトリプシン(Promega)1μgと混合して、30℃で0時間および24時間インキュベートした。この後、Roche社製Completeプロテアーゼインヒビター(1×)で反応を遮断し、DTTおよびローディング剤を加えた。試料を100℃で5分間変性させた。次いで、各試料15μgを、Novex 10〜20％トリシン(Tricine)ゲルでの電気泳動によって分析し、タンパク質をSureBlue(1×)で染色した。
【０３５７】
一般に、DOM15-26-555選択からのアウトプットは安定性が高く、残っているほとんどのクローンが、BIAcoreで試験すると1.5時間トリプシンに耐え、SDS-PAGEにかけると一晩耐えた。対照的に、SDS-PAGEにかけると、DOM15-10選択からの極少数のクローンのみが一晩のトリプシン処理に耐えた。
【０３５８】
実施例６
DOM1h-131-511変異体の同定
DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、およびDOM1h-131-206をさらに詳細に分析した。これらを、種々の濃度(0〜100μg/mlの範囲)のトリプシンと共に37℃で一晩インキュベートした後、500nMの濃度のdAbで、BIAcoreで比較した。BIAcoreのトレースを図7に示す。結果は、両方の変異体が、高濃度(100μg/ml)のトリプシンでのタンパク質分解に対して親よりも耐性であることを明確に示している。また、DOM1h-131-202およびDOM1h-131-206の2つのdAbを、100μg/mlの濃度のプロテアーゼを用いて、上記の条件下、ロイコザイム、エラスターゼ、およびパンクレアチンをはじめとする他の様々なプロテアーゼに対して親と比較した。dAbは、試験したすべてのプロテアーゼに対して、親dAbと比べるとタンパク質分解耐性の上昇を示していた。エラスターゼおよびロイコザイムについてのBIAcoreのトレースを図8に示す。
【０３５９】
5μMの各dAbを、配列決定グレードの100μg/mlトリプシンで0時間、1時間、3時間、および24時間処理した。反応を、Roche社製Completeプロテアーゼインヒビター(25×)で阻害した。反応は、4〜12％ Novex Bis-Trisゲル上で進めた。これらのゲルを図9に示す。
【０３６０】
実施例７
DOM4-130-54変異体の同定
DOM4-130-201およびDOM4-130-202をさらに詳細に分析した。これらを、種々の濃度(0〜100μg/mlの範囲)のトリプシンと共に37℃で一晩インキュベートした後、500nMの濃度のdAbで、BIAcoreで比較した。BIAcoreのトレースを図10に示す。結果は、3つすべての変異体が、高濃度(100μg/ml)のトリプシンでのタンパク質分解に対して親よりも耐性であることを明確に示している。また、DOM4-130-201およびDOM4-130-202を、100μg/mlの濃度のプロテアーゼを用いて、上記の条件下、ロイコザイム、エラスターゼ、およびパンクレアチンをはじめとする他の様々なプロテアーゼに対して親と比較した。結果は、トリプシンを用いた場合よりも明白ではないが、リードdAbは、試験したすべてのプロテアーゼに対して、親と比べるとタンパク質分解耐性の上昇を示していた。エラスターゼおよびロイコザイムについてのBIAcoreのトレースを図11に示す。
【０３６１】
5μMの各dAbを、配列決定グレードの100μg/mlトリプシンで0時間、1時間、3時間、および24時間処理した。反応を、Roche社製Completeプロテアーゼインヒビター(25×)で阻害した。反応は、4〜12％ Novex Bis-Trisゲル上で進めた。これらのゲルを図9に示す。
【０３６２】
実施例８
DOM1h-131-511変異体およびDOM4-130-54変異体のさらなる特徴付け
トリプシン耐性の上昇が融解温度(Tm)の上昇に相関しているか否かを決定するために、dAbを、初めに示差走査熱量計(DSC)を用いて分析した。トリプシン安定性の上昇は、Tmの上昇に明らかに相関している(表9を参照されたい)。
【表９】
2010528646.tif 000016
【０３６３】
また、DOM1h-131-511由来dAbを、MRC-5細胞系アッセイで比較した(表10を参照されたい)。このアッセイでは、トリプシン安定性の上昇が効果の低下につながるか否かを決定するために、TNFα刺激IL-8放出を中和するdAbの能力を測定した。しかしながら、アッセイにおけるトリプシン耐性dAbの活性は、実質的に影響を受けなかった。
【表１０】
2010528646.tif 000017
【０３６４】
IL-1のIL-RIに対する結合を阻害する同じ能力を維持しているか否かを調べるために、DOM4-130-54由来dAbを受容体結合アッセイで試験した(表11を参照されたい)。トリプシン耐性dAbの活性は、このアッセイで影響を受けなかった。
【表１１】
2010528646.tif 000018
【０３６５】
実施例９
DOM15-26-555変異体の同定
DOM15-26-588、DOM15-26-589、DOM15-26-591、およびDOM15-26-593を、これらの親と、2つの別のdAb、すなわち効力および安定性に最も影響を与える突然変異(E6VおよびF100S/I)を組み合わせるために突然変異誘発によって作製したDOM15-26-594およびDOM15-26-595と共にさらに詳細に分析した。配列を図12に示す。クローンを、200μg/mlの濃度のトリプシンと共にインキュベートした後、100nMのdAb濃度でhVEGF結合についてBIAcoreで比較した。反応は、攪拌(250rpm)しながら37℃で3時間および24時間行った。最良のクローンDOM15-26-593およびその親のBIAcoreトレースを図13に示す。他の結果は、図14にチャートとして示す。結果は、すべての変異体が、トリプシン処理の24時間後、タンパク質分解に対して、それらの親よりも耐性が高いことを明確に示している。
【０３６６】
また、DOM15-26-593およびその親のトリプシン耐性を、処理および未処理試料をSDS-PAGEにかけて検査した。簡単に述べると、タンパク質をPBSと緩衝液交換して1mg/mlに濃縮した。タンパク質25μgを配列決定グレードトリプシン(Promega)1μgと混合して、30℃で0時間、1時間、3時間、および24時間インキュベートした。この後、Roche社製Completeプロテアーゼインヒビター(1×)で反応を遮断し、DTTおよびローディング剤を加えた。試料を100℃で5分間変性させた。次いで、各試料15μgを、Novex 10〜20％トリシン(Tricine)ゲルにかけて、タンパク質をSureBlue(1×)で染色した。結果を図15に示す。この実験におけるDOM15-26-593のトリプシン耐性プロフィールは、BIAcore実験によって示されているプロフィールとは異なっており、反応条件の差がトリプシン切断の最終結果に影響を与えている可能性を示唆している。ところが、DOM15-26-593は、以下に示すように、他の選択したクローンよりも優れた生物物理学的特性および親和性を有する。また、DOM15-26-555変異体の特性のまとめを以下の表12に示す。
【表１２】
2010528646.tif 000019
【０３６７】
実施例１０
DOM15-10変異体の同定
DOM15-10-11をその親DOM15-10と共にさらに詳細に分析した。配列を図16に示す。dAbを、200μg/mlの濃度のトリプシンでインキュベートした後、100nMのdAb濃度でhVEGF結合についてBIAcoreで比較した。反応は、攪拌(250rpm)しながら37℃で1時間、3時間、および24時間行った。これらのdAbのBIAcoreトレースを図17に示す。結果は、選択した変異体が、トリプシン処理の24時間後、タンパク質分解に対して、それらの親よりも耐性が高いことを明確に示している。
【０３６８】
また、リードおよびその親のトリプシン耐性を、処理および未処理試料をSDS-PAGEにかけて検査した。簡単に述べると、タンパク質をPBSと緩衝液交換して1mg/mlに濃縮した。タンパク質25μgを配列決定グレードトリプシン(Promega)1μgと混合して、30℃で0時間、1時間、3時間、および24時間インキュベートした。この後、Roche社製Completeプロテアーゼインヒビター(1×)で反応を遮断し、DTTおよびローディング剤を加えた。試料を100℃で5分間変性させた。各試料15μgを、Novex 10〜20％トリシン(Tricine)ゲルにかけて、タンパク質をSureBlue(1×)で染色した。結果を図18に示す。この場合、トリプシン耐性プロフィールが、BIAcoreトリプシン試験と十分に相関しており、結合活性がタンパク質の完全性に直接反映されることを示している。
【０３６９】
実施例１１
DOM15-26-555変異体およびDOM15-10変異体のさらなる特徴付け
トリプシン耐性の上昇がTmの上昇に相関しているか否かを決定するために、dAbを、示差走査熱量計(DSC)を用いて分析した。結果を表13に示す。DOM15-26-555変異体のトリプシン耐性と融解温度との間に相関性が存在する。リードDOM15-26-588およびDOM15-26-593は、改善されたTmを示したが、他のクローンは改善を示さなかった。DOM15-26-555およびDOM15-10親分子の両方が、DOM4-130-54およびDOM1h-131-511親分子の開始時のTm(57.9〜54.1℃)よりも大幅に高い開始時のTm(63.3〜63.7℃)を有するが、全体としてプロテアーゼ耐性クローンが、同程度のTmに達することに注目されたい(DOM1h-131-511/DOM4-130-54変異体の平均Tmが65.1℃、DOM15-26-55/DOM15-10変異体の平均Tmが64.9℃)。
【表１３】
2010528646.tif 000020
【０３７０】
また、トリプシン安定性の上昇が有効性の低下につながるか否かを決定するために、dAbを受容体結合アッセイで比較し、BIAcoreカイネティクスを測定した。しかしながら、アッセイでのdAbの活性は、実質的に影響を受けなかったか、または改善されさえした。結果を表14に示す。
【表１４】
2010528646.tif 000021
【０３７１】
Tm上昇の利点
ドメイン抗体をはじめとするほとんどのタンパク質は、折りたたまれた状態(生物学的に活性な分子につながる)および折りたたまれていない状態(機能的な活性を有していない)の2つ状態で存在する。これらの2つの状態は、すべての温度で共存し、各状態の相対的比率は、通常は、折りたたみおよび非折りたたみ構造の動的定数の関数である定数Kによって決まる。融解温度は、通常は、K=1の温度、すなわち折りたたまれたタンパク質の率と折りたたまれていないタンパク質の率が等しい温度として定義される。定数Kは、タンパク質の分子内相互作用を安定させることおよび不安定にさせることによって決まるため、主にタンパク質のアミノ酸配列によって決まる。温度、pH、緩衝液組成、圧力などの外因性のパラメータが、K、したがって融解温度に影響を与える。
【０３７２】
折りたたまれていないタンパク質は、分解機構の容易な標的である：(i)ジスルフィド結合の露出により、状況によって酸化または還元のリスクが増加する。(ii)向上した主鎖の柔軟性が、自己タンパク質分解反応を助ける。(iii)ペプチドセグメントの露出により、in vivoでのプロテアーゼ、産生プロセス中のプロテアーゼ、および下流プロセシング中および長期貯蔵中のキャリーオーバープロテアーゼに標的がさらされる。(iv)凝集しやすいセグメントの露出により、分子間凝集およびタンパク質の沈殿が起こる。いずれの場合も、タンパク質の完全性、タンパク質含量、およびタンパク質の活性の低下が起こるため、(i)バッチ再現性の保障、(ii)保存中の長期安定性の保障、および(iii)in vivoでの効力が担保されなくなる。
【０３７３】
自然界では、タンパク質は、体温で十分に機能を果たし、かつ恒常性維持機構によって容易に置換されるように進化によってデザインされてきた。生物工学的プロセスによって操作された治療用タンパク質は、様々な環境に遭遇する：治療用タンパク質は、外来宿主中で組み換えDNA技術によって産生される場合が多く、大きな容器内で大量に発現され、下流プロセス全体にわたってpHまたは緩衝液成分が極めて重要な変化を受け、最終的に長期間の間、非生理緩衝液中に高濃度で貯蔵される。新規の送達技術(例えば、吸引、皮下パッチ、緩速送達ナノ粒子)も、治療用タンパク質が受けるストレスに加わる。最終的に、タンパク質工学技術の出現により、機能強化されたかまたは完全に新規の治療用タンパク質の生産が可能になった。ほとんどのタンパク質工学技術は、アミノ酸配列の変更または新規のアミノ酸配列の作製を目的としたin-vitro系技術であるため、生物学的タンパク質を徐々に改善した進化のプロセスを受けておらず、ストレス耐性に関しては最適以下の性能のタンパク質となる。
【０３７４】
本発明の技術は、ダーウィンの進化の間にタンパク質が遭遇した条件の1つを再現することを目的とする。ペプチドまたはポリペプチド、例えば免疫グロブリン単一可変ドメインを、組織リモデリングおよびタンパク質恒常性に重要な役割を果たすプロテアーゼと共に注入する。また、タンパク質をその機能に適するように改善しうるあらゆる特定の突然変異を、タンパク質が機能する環境の範囲内でのタンパク質の適合能力について試験する。このプロセスを本発明の一実施形態で再現し、ペプチドまたはポリペプチドの変異体のレパートリーを作製し、プロテアーゼに曝露する。第2のステップでは、変異体のレパートリーを特定の標的に接触させる。プロテアーゼによる分解に耐えたこれらのタンパク質の変異体のみが、標的に結合できるため、例えば「バイオパニング」と呼ばれる単純な親和性精製プロセスによって、これらの変異体を回収することができる。この方法は、in vivoプロセスと比較して多数の利点がある。具体的には、タンパク質レパートリーを、様々な条件、例えば様々なプロテアーゼ、高濃度、長期間、様々な緩衝液またはpH、および様々な温度に曝すことができる。したがって、このin vitro技術は、元々の環境よりも広範な環境で機能し安定性を維持できるタンパク質をデザインする手段を提供する。それにより、多数の利点が、特にバイオテクノロジー業界および治療用タンパク質の分野にもたらされることが明らかである。
【０３７５】
実施例１２
プロテアーゼ耐性リードのPK相関データ
4つのdAB系列のそれぞれの親dABおよびプロテアーゼ耐性dABをin vivoでさらに評価した(リストおよび詳細については以下の表15を参照されたい)。
【表１５】
2010528646.tif 000022
【０３７６】
トリプシン耐性を以下のように変換する：
1は低い
2は中程度
3は良好
4は高い
5はとても高い。
【０３７７】
つまり、親分子のトリプシン耐性は、
DOM4-130-54は良好
DOM1h-131-511は良好
DOM15-10は低い
DOM15-26-501は低い、
選択したリードについては、
DOM4-130-202はとても高い
DOM1h-131-206はとても高い
DOM15-10-11は高い
DOM15-26-593は高い。
【０３７８】
ドメイン抗体はサイズが小さいため(12〜15kDa)、IVまたはSC投与されると循環から迅速に排出される。実際、腎糸球体濾過のカットオフは、50kDaよりも高いため、dAbなどの小さいタンパク質は、腎臓を通過すると循環に残らない。したがって、in vivoでのプロテアーゼに対する耐性の長期の効果を評価するために、全身滞留性を向上させる部分でドメイン抗体を標識した。半減期を延長することを目的としたいくつかの方法(例えば、PEG、Fc融合、アルブミン融合など)が文献に報告されている。本出願では、ドメイン抗体をヒトIgG1抗体のFc部分で標識した(またはフォーマットした)。このフォーマットにより、2つの利点が得られた：(i)得られるdAb-Fcの分子サイズが、循環中に十分に維持される約75kDaである。(ii)抗体Fc部分が、FcRn受容体(「Brambell」受容体とも呼ばれる)に結合する。この受容体は、上皮細胞、内皮細胞、および肝細胞に局在し、抗体およびアルブミンの寿命の延長に関与している。実際、抗体および他の血清タンパク質の飲作用時に、タンパク質が酸性エンドソームに導かれるが、エンドソームに移送される前に、FcRn受容体が抗体を受け取り(Fc部分に対する結合によって)、それから抗体を循環に戻す。したがって、Fc部分をdAbに標識することにより、dAbが、それぞれが特定の一連のタンパク質分解酵素を含む血清およびプレエンドソームコンパートメントの少なくとも2つのコンパートメントに長期にわたって曝露される。加えて、FcRn受容体は、経細胞輸送を仲介し、それによりFc含有タンパク質が、血管外空間に対して出入りすることができる。
【０３７９】
Fcを用いたフォーマット化は、短い介在ペプチドリンカー(太字)によって、VHおよびVK dAbをコードする遺伝子をヒトIgG1 Fcをコードする遺伝子に融合することによって行った：
VH dAb(下線部)に対しては、
EVQ......GQGTLVTVSSASTHTCPPCPAPELLGGP...(hIgG1Fc)...PGK*
VK dAb(下線部)に対しては、
DIQ.........GQGTKVEIKRTVAAPSTHTCPPCPAPELLGGP...(hIgG1Fc)...PGK*
【０３８０】
物質を、標準的なプロトコルに従って293-fectin(Invitrogen)を用いてHEK293/6E細胞の一過性トランスフェクションによって産生させた。これらの細胞は、pTTシリーズのベクター(Durocherら、2002)と共に使用すると高レベルで一過性に発現するようにデザインされている。したがって、dAb遺伝子を改変pTT5ベクター(pDOM38)にクローニングして、Fc融合発現ベクターを作製した(図21を参照されたい)。トランスフェクションされた細胞からの上清を、トランスフェクションの5日後に回収し、遠心分離によって清澄化し、0.2μmフィルターに通して濾過した。dAb-Fc融合タンパク質を、プロテインAストリームライン樹脂(GE Healthcare)上の捕捉体によって精製した。タンパク質を、10mMクエン酸ナトリウム(pH3)中でカラムから溶出させ、1Mクエン酸ナトリウム(pH6)を添加して、100mMクエン酸ナトリウム(pH6)の最終組成にした。
【０３８１】
dAb-Fc分子を、雌Sprague-Dawleyラットに対して5mg/kgの標的用量で、ラットのin vivoでの半減期について試験した(群当たりn=3)。標的用量が、ラットの標的濃度を大幅に超えるため、親dAbとトリプシン耐性dAbとの間の親和性の差(実施例11を参照)が、in vioでの分子の運命に影響を与えないと予想されることに留意されたい。したがって、dAb間のPKプロフィールの差は、抗原依存性排出プロセスを反映すると予想される。
【０３８２】
血液試料を、投与の0.03時間後、1時間後、4時間後、8時間後、24時間後、48時間後、72時間後、96時間後、120時間後、および168時間後に採取した。血餅形成後に、血清を取り出して、hIL-1R1、TNFR1、またはVEGF抗原捕捉アッセイで試験した：
hIL-1R1抗原捕捉アッセイ:
4μg/mL抗hIL-1R1でコーティングする
ブロッキングする
500ng/mL shIL-1R1を添加する
試料を添加する
抗ヒトFc HRP @1:10,000で検出する
TNFR1抗原捕捉アッセイ:
0.1μg/mL sTNFR1でコーティングする
ブロッキングする
試料を添加する
抗ヒトFc HRP @1:10,000で検出する
VEGF抗原捕捉アッセイ:
0.25μg/mL VEGFでコーティングする
ブロッキングする
試料を添加する
抗ヒトFc HRP @1:10,000で検出する。
【０３８３】
アッセイによる生のデータを、各血清試料中の薬物の濃度に変換した。次いで、各時点における平均μg/mL値を非コンパートメント解析(NCA)を用いてWinNonLinで解析した。各dAb-Fc対のPKプロフィールを、決定したPKパラメータをまとめた表16に示す。
【表１６】
2010528646.tif 000023
【０３８４】
結果は、dAb-Fc対である4-130-54〜1h-131-206のPKプロフィールはほとんど重ね合わせることができるが、他の対ではPKプロフィールが大きく異なることを明確に示している。AUC/Dを見ると効果がほぼ分かる。15-10のAUC/Dは、15-10-11のわずか42％である。15-26-501のAUC/Dは、15-26-593のわずか11％である。これらの重要な差は、半減期に影響を及ぼし(程度は小さい)、15-10の43.2時間に対して15-10-11の56.6時間である。大きな差が、DOM15-26系列で見られ、15-26-501の12.9時間に対して15-26-593の86.2時間である。実際、非コンパートメント解析を用いた良好なPK解析の場合、線形回帰の傾きをフィットさせるために少なくとも4つのデータポイントが必要であり、半減期として推定する期間は、算出した半減期の時間の少なくとも3倍にすべきである。
【０３８５】
本明細書の実施例に記載した生物物理学的特性から、トリプシンによる分解に耐えるどのdAbの能力も、ラット血清中でより長い期間循環するdAb-Fc融合体の能力に相関していることが明らかである。実際、例えば実施例10などの実施例に示すように、DOM15-10およびDOM15-26-501は、最も分解しやすいdAbであり、dAb 25μgをトリプシン1μgの存在下、30℃で約3時間インキュベートすると完全に分解される。この試験(dAb(すなわち、DOM15-10-11、DOM15-26-593、DOM4-130-202、およびDOM1h-131-206)がトリプシンで選択されたか否か、または親分子(DOM4-130-54およびDOM1h-131-511)のように既にある程度のトリプシン耐性を有するか否か)の他のすべてのdAbは、dAb-Fc分子に再フォーマットするとラットで同様のPKプロフィールを有する。したがって、このPK試験は、dAbが非常に低いタンパク質分解耐性を有する場合、タンパク質分解の受け易さが、これらのdAbのin vivoでの安定性に大きな影響を与えることを示唆している。また、このPK試験は、トリプシン分解に対する耐性のさらなる上昇(例えば、DOM4-130-206 v DOM4-130-54)が、一定のレベルを超えると、dAb-Fc分子の能力を著しく高めてin vivoでの排出をさらに遅らせることがないことも示している。
【０３８６】
3つのケースでは、トリプシン存在下での選択により、熱安定性(融解温度によって定義される)の高い新規の分子、DOM4-130-202、DOM1h-131-206、およびDOM15-26-593が得られた。PK試験は、本発明のデータセットでは、融解温度は、観察されたPKプロフィールを合理的に説明する十分なパラメータではないことを示している。実際、DOM15-10は、DOM15-10-11よりも高いTmを有しているが、DOM15-10-11よりも速く循環から排出される。他の場合、DOM4-130系列の2つのdAbは、顕著に異なったTm(10℃の差)を有するが、dAb-Fc分子にフォーマットされると、in vivoでほぼ同一の安定性を示す。融解温度は、in vivoでの安定性を予測する重要なパラメータとしてそれ自体は排除されないことに留意されたい。偶然、本発明のデータセットでは、大きなTmの差(54℃以上での)が、in vivoでのdAbの運命に著明な影響を与えなかった。このことは、54℃よりも低い融解温度では、dAbのin vivoでの安定性が、熱安定性または恐らく熱安定性とプロテアーゼ耐性の両方にさえ相関しうる可能性を排除するものではない。
【０３８７】
実施例１３
DOM10-53-474に対するトリプシン選択
精製DOM10-53-474のトリプシン安定性:
DOM10-53-474は、IL-13に強力に結合するドメイン抗体である。トリプシン存在下でのこのdAbの安定性を評価するために、精製dAbを長時間トリプシンで消化し、ゲルにかけてタンパク質分解のあらゆる可能性を調べた。1mg/mlの精製DOM10-53-474 25μlを、配列決定グレードの1mg/mlトリプシン1μlと共に30℃でインキュベートすると、dAbとトリプシンの分子比25:1が得られた。dAbをトリプシンと共に1時間、4時間、および24時間インキュベートし、次いでRoche社製Completeプロテアーゼインヒビター4μlを添加し、氷上でインキュベートしてプロテアーゼ活性を中和した。トリプシンを加えずにプロテアーゼインヒビターをdAbに添加して時間0の試料を用意した。次いで、試料2μlを、製造者の取扱説明書に従ってLabchipを用いて電気泳動によって分析した。
【０３８８】
図22は、長時間トリプシンと共にインキュベートしたDOM10-53-474でのゲル泳動を示している。比較のために、トリプシン安定性dAbの1つ、DOM15-26-593を上記のようにトリプシンで処理し、同時に泳動した。図に示すように、DOM15-26-593は、トリプシンとのインキュベーションの24時間後でも安定しているように見える。しかしながら、DOM10-53-474は、24時間後には一定程度分解されたが、1時間および4時間の時点では安定していたように見える。これらのデータは、DOM10-53-474がトリプシンによる分解にある程度の耐性を有するが、最もトリプシン安定性のdAbの1つ、DOM15-26-593ほどは安定ではないことを示唆している。
【０３８９】
ファージディスプレイDOM10-53-474のトリプシン安定性:
ファージディスプレイDOM10-53-474のトリプシン安定性を評価するために、DOM10-53-474をコードする遺伝子を、標準的な技術に従ってpDOM33のSal/Not部位(図50)にクローニングしファージを作製した。ファージをPEG沈殿によって精製し、PBS中に再懸濁し、力価を測定した。
【０３９０】
ファージディスプレイdAbを、トリプシン耐性を評価するために様々な時間トリプシンと共にインキュベートした。トリプシンとのインキュベーションの後、指数関数的に増殖する大腸菌TG1細胞の感染後に力価分析によって安定性を測定した。
【０３９１】
ファージ100μlを、100μg/mlトリプシンと共に、振蘯しながらインキュベータ中で1時間、2時間、4時間、および一晩37℃でインキュベートした。トリプシン活性をRoche社製Completeプロテアーゼインヒビター(×2)で遮断し、次いでファージをPBS中の2％ marvelで希釈し、10nMビオチン化IL-13と共に室温で1時間インキュベートした。PBS中の2％ marvelで室温で1時間予めブロッキングしたストレプトアビジンコーティングビーズ(Dynabeads M-280、Invitrogen)を添加し、その混合物を室温で5分間インキュベートした。Dynabeadsを用いたすべてのインキュベーションステップは回転ホイールで行った。結合していないファージを、PBS中の0.1％ Tween-20 1mlでビーズを8回洗浄して洗い流した。結合したファージは、0.1Mグリシン(pH2.2)0.5mlで溶出させ、1M Tris-HCL (pH8.0)100μlで中和した。溶出したファージを用いて、指数関数的に増殖するTG1に感染させ(37℃で1時間)、テトラサイクリンプレートに蒔いた。プレートを、37℃で一晩インキュベートし、コロニーを計数した。トリプシンでの消化後のアウトプットファージの力価を表17にまとめる。ファージ力価は、長時間トリプシンでインキュベートすると低下した。インキュベーションの24時間後には、すべてのファージが消化された。
【表１７】
2010528646.tif 000024
【０３９２】
トリプシンに対してより耐性のあるdAbの選択:
トリプシンによる消化に対してより耐性のあるdAbを選択するために、Stratergene Mutazyme 11キット、ビオチン化プライマー、および50μlの反応液に対して鋳型5〜50pgを用いたPCRによって、DOM10-53-474をコードする遺伝子にランダム突然変異を導入した。Sal1およびNot1での消化後、インサートを、ストレプトアビジンコーティングビーズを用いて未消化産物から精製し、対応する部位のpDOM33にライゲーションした。大腸菌TB1細胞を精製ライゲーション混合物で形質転換し、DOM10-53-474のエラープローンライブラリーを得た。ライブラリーのサイズは、1.9×109であり、アミノ酸突然変異率は1.3であった。
【０３９３】
プロテアーゼ耐性が改善されたdAbを選択するために、このライブラリーで3回の選択を行った。1回目の選択は、ライブラリーを一掃して高い親和性で抗原に結合していないすべてのクローンを除去するために、トリプシン処理を行わずに抗原結合のみで行った。この選択は、10nM IL-13で行った。1回目のアウトプットは、6×1010のインプットファージに対して2×109であり、ライブラリーの大多数が高い親和性で抗原に結合したことを示している。
【０３９４】
2回目および3回目の選択は、1nMビオチン化IL-13で行った。IL-13に対してパニングする前に、ファージを、100μg/mlトリプシンと共に振蘯機(250rpm)中で、37℃でインキュベートした。2回目の選択では、トリプシンとのインキュベーションを、室温または37℃で1時間行った。2回目の選択からのアウトプットを表18に示す。
【表１８】
2010528646.tif 000025
【０３９５】
37℃で1時間のトリプシン処理での2回目の選択からのファージアウトプットを、3回目の選択のインプットとして用いた。3回目の選択では、ファージを100μg/mlトリプシンで処理したが、37℃で2時間、37℃で4時間、室温で一晩、または37℃で一晩と長い時間をかけた。3回目の選択のアウトプットの力価を表19にまとめる。
【表１９】
2010528646.tif 000026
【０３９６】
1回目、2回目、および3回目の各選択のアウトプットからのいくつかのクローンを、配列多様性を評価するために配列決定した。トリプシン処理を行わない1回目の選択の後、選択のアウトプットの50％が、親DOM10-53-474配列を有していた。2回目の選択の後、親のパーセンテージは75％に上昇した。3回目の選択の後、親のパーセンテージは80％に上昇した。
【０３９７】
このデータは、DOM10-53-474がトリプシンによる分解に対して既に耐性があり、これらのトリプシン選択から新しいクローンを多く選択できないことを示している。図22は、精製タンパク質がトリプシンで消化されると、DOM10-53-474が、たとえトリプシンで一晩処理しても完全には消化されなかったことを示している。しかしながら、選択アウトプット中にDOM10-53-474よりもトリプシン耐性が高い新しいクローンが存在するか否かを調べるために、ファージをトリプシンを用いて37℃で一晩処理した選択3のアウトプットを、pDOM5にサブクローニングした。次いで、100個のクローンを、トリプシン耐性クローンを探すために配列決定した。分析した100個のクローンのうち、わずか26個のクローンが新しい配列を有していたが、これらのクローンはいずれも、トリプシン切断部位(リジンまたはアルギニン)に突然変異がなく、これらのクローンがDOM10-53-474よりもトリプシン耐性が高くないことを示唆している。
【０３９８】
実施例１４
トリプシン存在下でのファージ選択によるリードDOM0101(抗TNFR1)dAbに導入された保存性の改善および生物物理学的改善:
リード分子DOM1h-131-511のプロテアーゼ耐性を改善するために、上記したように、トリプシンの存在下でのファージ選択を行った。この方法により、親DOM1h-131-511分子と比べるとトリプシン安定性が改善された様々なクローンが作製された。2つのクローン、DOM1h-131-202およびDOM1h-131-206がトリプシンの作用に対して最も顕著な改善を示したため、さらなる特徴付けのためにこれらのクローンを選択した。以下に要点を述べるさらなる作業は、トリプシンの作用に対する改善された耐性に加え、主に、せん断ストレスおよび熱ストレスに対する分子の安定性に対する他の有利な効果が存在することを示す。これら2つのパラメータが、生物製剤の保存性および貯蔵安定性を向上させる主なパラメータである。
【０３９９】
ピキア・パストリスにおけるリードDOM0101 dAbの産生:
3つのリード分子の一次アミノ酸配列をコードする遺伝子を用いて、ピキア・パストリスで分泌タンパク質を産生させた。3つの合成遺伝子(DOM1h-131-511、DOM1h-131-202、およびDOM1h-131-206)を発現ベクターpPIC-Zαにクローニングし、次いで2つのピキア株、X33およびKM71Hに形質転換した。形質転換細胞を、複数の組み込み体を備えたクローンを選択するために、増加する濃度(100μg/ml、300μg/ml、600μg/ml、および900μg/ml)のゼオシン上に蒔いた。次いで、高発現細胞株を同定するために、いくつかのクローンを2Lフラスコでスクリーニングした。次いで、最も発現しているクローンを用いて、5L発酵槽で物質を生産した。
【０４００】
タンパク質の精製および物質の特徴付け:
特徴付けおよびさらなる安定性試験に際して高品質の物質を生産するために、第1の捕捉ステップとして混合式電荷誘導樹脂(Capto MMC)を用い、次いで陰イオン交換(Q Sepharose)を行う下流精製プロセスを考案した。このプロセスにより、大幅に最適化することなく、発現dAbを、約95％の純度で約70％回収することができる。エレクトロスプレー質量分析、アミノ末端配列決定、および等電点電気泳動を用いてアイデンティティーについて、そしてSDS-PAGEおよびSEC(サイズ排除クロマトグラフィー)を用いて純度について物質を特徴付けた。
【０４０１】
タンパク質アイデンティティー:
各タンパク質の初めの5個の残基のアミノ末端配列の分析は予想通りであった(EVQLL...)。C4 Zip-tips(Millipore)を用いてH2Oと0.1％氷酢酸含有アセトニトリルの比率が50:50になるように緩衝液交換を行ったタンパク質の試料に対して質量分析を行った。3種類の各タンパク質の測定質量は、内部ジスルフィド結合の形成から-2の質量差を許容した場合、一次アミノ酸配列に基づいた理論質量(平均質量を用いて算出)の0.5Daの範囲内であった。IEFを用いて、各タンパク質によって異なるpIに基づいてタンパク質を同定した。
【０４０２】
タンパク質精製:
3種類の各タンパク質を、1μgおよび10μgの量で非還元SDS-PAGEゲルに2つずつロードした。単一バンドが、すべての場合で観察された。
【０４０３】
また、純度のレベルを実証するためにサイズ排除クロマトグラフィーも行った。サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)では、各タンパク質100μgを、0.5ml/分で流れるTOSOH G2000 SWXLカラムにロードした。移動相は、PBS/10％エタノールとした。単量体のパーセンテージを、曲線下面積に基づいて測定した(図23を参照されたい)。
【０４０４】
DOM1h-131-511、DOM1h-131-202、およびDOM1h-131-206の安定性の比較
プロテアーゼ安定性の評価:
DOM1h-131-511、DOM1h-131-202、およびDOM1h-131-206のプロテアーゼ安定性を、過剰なプロテアーゼ存在下での所定時間のプレインキュベーションの後、残基結合活性のBIAcore(商標)分析によって評価した。約1400RUのビオチン化TNFR1をストレプトアビジン(SA)チップにコーティングした。250nM DOM1h-131-511、DOM1h-131-202、およびDOM1h-131-206を、PBSのみまたは100μg/mlトリプシン、エラスターゼ、もしくはロイコザイムと共に30℃で1時間、3時間、および24時間インキュベートした。プロテアーゼインヒビターのカクテルを添加して反応を停止させた。次いで、dAb/プロテアーゼ混合物を、参照細胞サブトラクションを用いてTNFR1コーティングチップの上を通過させた。チップ表面を、各注入サイクルの間に0.1Mグリシン(pH2.2)10μlを用いて再生した。プロテアーゼと共にプレインキュベート(10秒)したヒトTNFR1に結合したDOM1h-131-511、DOM1h-131-202、およびDOM1h-131-206の一部を、プロテアーゼを用いないdAb結合に対して決定した。BIAcore(商標)分析は25℃で行った。データを、3つの独立した実験から作成した。棒グラフは結果の平均値を示し、エラーバーは結果の標準偏差を示している(図24を参照されたい)。
【０４０５】
DOM1h-131-202およびDOM1h-131-206は、DOM1h-131-511と比べると、トリプシン、エラスターゼ、またはロイコザイムによるタンパク質分解に対する耐性が高いことが分かった。DOM1h-131-202とDOM1h-131-206との間の差は、DOM1h-131-511と比べると、トリプシン処理の1時間後、およびエラスターゼまたはロイコザイム処理の3時間後に最も顕著であった。DOM1h-131-206は、試験された条件のほとんどにおいて、DOM1h-131-202に比べてやや安定している傾向がある。
【０４０６】
DSCを用いて決定したdAbの熱安定性:
リード分子が最も高い安定性を有するpHを決定するために、示差走査熱量計(DSC)を用いて、Britton-Robinson緩衝液における各dAbの融解温度(Tm)を測定した。Britton-Robinsonは、3成分緩衝系(40mMの酢酸、リン酸、およびホウ酸)からなるため、同じ溶液で3〜10の範囲でpHを調整することが可能である。理論pIは、タンパク質の一次アミノ酸配列から決定した。DSCから、dAbが最も高い固有熱安定性を有するpHは、DOM1h-131-202についてpH7であり、DOM1h-131-206についてpH7〜7.5であり、DOM1h-131-511についてpH7.5であることが分かった。続くすべてのストレスおよび安定性の試験のために、各dAbに以下に示すpHを用いた：DOM1h-131-202およびGSK1995057A DOM1h-131-206は、pH7.0のBritton-Robinson緩衝液とし、DOM1h-131-511は、pH7.5のBritton-Robinson緩衝液とした。結果を表20にまとめる。
【表２０】
2010528646.tif 000027
【０４０７】
2週間の熱安定性試験
高温で長期間耐えるタンパク質の能力は、通常は安定性の良好な指標である。このような条件下では、タンパク質は、凝集や化学修飾などの複数の物理的プロセスを受けることがある。dAb(1mg/ml)を、Britton-Robinson緩衝液中で、37℃および50℃で14日間インキュベートした。14日間で、どの程度の単量体が溶液中に残ったかを測定するためにSECを用いた(図25)。
【０４０８】
図25から、DOM1h-131-202およびDOM1h-131-206の両方が、DOM1h-131-511よりも熱ストレスに対して安定性が顕著に高いことが分かる。37℃および50℃などの高温にタンパク質を曝露することは、薬物の長期保存に対する指標を得るために日常的に用いられている。このような高温は、アミド分解、酸化、または凝集などの室温での長期保存に関連した通常のプロセスを促進するために用いられる。溶液中での凝集形成のレベルは、SECを用いてモニタリングすることもできる(図26A〜26I)。37℃で14日後、DOM1h-131-511の溶液中からの減少は、SECによって測定されたように沈殿および高度の凝集形成の両方に起因することがある(図26B)。タンパク質の顕著に低い減少は、37℃で14日後にDOM1h-131-202およびDOM1h-131-206の両方で見られ、特にDOM1h-131-206では、凝集形成の増加がほとんどまたは実質的にまったく見られなかった(図26H)。50℃では、分子間の差はより顕著であり、DOM1h-131-206は、14日後にDOM1h-131-202よりもより高い温度で優れた安定性を示し、分子量の大きい凝集体の形成が著明に減少したことを示している(図26)。t=0では、DOM1h-131-206は、14日後に凝集形成のわずかな増加を示したが(図26I)、DOM1h-131-511は、溶液からほとんど沈殿した(図26C)。
【０４０９】
これは、トリプシン選択によってdAbに導入された変化、例えば、改善された熱安定性は、37℃および50℃でのタンパク質の保存安定性を著明に改善したことを示している。DOM1h-131-202およびDOM1h-131-206(より顕著)の両方は、明らかに溶液安定性が改善され、高温で凝集を形成する傾向が低くなり、これは、+4℃および室温などの適切な温度での長期保存性の改善と直接解釈することができる。
【０４１０】
次いで、タンパク質の総電荷に影響を与えるあらゆる生物物理学的変化をタンパク質が受けたか否かを確認するために、熱ストレス実験から24時間後、48時間後、7日後、および14日後の時点での試料をIEFにより分析した(図27)。
【０４１１】
同様に、DOM1h-131-202およびDOM1h-131-206の両方は、DOM1h-131-511と比べると、37℃で顕著な変化を示していない。DOM1h-131-511では、37℃で24時間後に微かな第2のバンドが出現している。この追加のバンドは、タンパク質の二量体化によるものであり、したがって電荷を覆い、2つの分子集団を形成すると考えられる。50℃での分子間の差はより顕著であり、DOM1h-131-206は明らかに、高温で著明な変化を示していないが、DOM1h-131-202は、24時間後にある種の変化の兆候を示している。DOM1h-131-511の大半は、Britton-Robinsonでの48時間後の沈殿により喪失している。
【０４１２】
高温に曝した後のタンパク質の機能を測定するために、50℃でのT=0日、7日、および14日時点でTNFR-1のRBAによって分析した(図28)。このアッセイは、現在は、ストレスによる分子のわずかな変化の検出ではSECやIEFほど感度が高くないが、dAbが抗原にまだ結合できることを示すために用いることができる。
【０４１３】
DOM1h-131-511の曲線の左への移動は、dAbの大半が沈殿によって喪失した事実を反映している。溶液に残った物質は、まだ抗原に結合することができる。図25に示すように、DOM1h-131-202およびDOM1h-131-206の両方の大半は、14日後でさえも溶液中に残存することができる。RBAは、すべての可溶性タンパク質が、いまだ機能的であり、TNFR1に結合できることを示している。
【０４１４】
高いタンパク質濃度における保存安定性試験:
4℃での極めて高いタンパク質濃度において各分子がどのように機能するかを確認するために、このような条件下での保存安定性を調べる実験を行った。リードdAbを、約100mg/mlのBritton-Robinson緩衝液(リードdAbが最も安定するpH)において、遠心Vivaspin濃縮装置(5Kのカットオフ)で濃縮した。次いで、高濃度での保存の際に試料に他の物理的変化が生じるか否かを調べるために、約100mg/mlの試料を4℃で7日間放置し、SECによって分析した(図29)。試料を、SECカラムにかける前に、1×PBS 10％エタノール(v/v)で約1mg/mlに希釈した。
【０４１５】
SECトレースから、DOM1h-131-202もDOM1h-131-206も、7日後に凝集形成の著明な増加を一切示していないが、DOM1h-131-511では単量体濃度が約2％減少していることが分かる。
【０４１６】
リードdAbの噴霧送達:
初期段階の毒物学および臨床試験のために、dAbを液体として製剤化し、噴霧用デバイスによって送達する。デバイス(例えば、超音波、ジェット、または振動メッシュ)によっては、dAbは、規定粒径のエアロゾルを生成するために噴霧化される際に、ある程度のせん断ストレスおよび熱ストレスを受ける。DOM1h-131-202およびDOM1h-131-206の両方は、DOM1h-131-511と比べると、高いTmを有しており、熱ストレスに対してかなり改善された安定性を示したが、噴霧化の際に生じるせん断/熱ストレスにどのように反応するかを調べるために、すべてのdAbを2つの噴霧デバイスで試験した。次いで、噴霧エアロゾルからのタンパク質およびデバイス内(すなわち、カップ内)に残ったdAbの両方を、プロセス中に生成された凝集の量を測定するためにSECによって分析した。
【０４１７】
すべての分子を、最も安定するpHで、Britton-Robinson緩衝液中で試験した。5mg/mlのタンパク質濃度、3.5分の運転で、dAbをE-flow Rapid(振動メッシュ)およびPari LC+(ジェット噴霧器)の両方で試験し、Malvern Spraytekを用いて粒径分布を測定した。この結果を図30に示す。肺深くへの良好な送達および分布のために理想的な粒径は5μm未満である。すべてのdAbは、Britton-Robinson緩衝液で5μm未満の粒径と同レベルになる。デバイスのカップ内のdAbの濃度を、噴霧化の前後でA280測定によって決定した(データは示していない)。タンパク質濃度が著明に変化していないことが分かり、タンパク質もビヒクルも送達の際に優先的に噴霧化されないことを示唆している。
【０４１８】
Britton-Robinson緩衝液中で噴霧化したdAbの試料を、送達の際にタンパク質が物理的変化を受けるか否かを測定するためにSECに供した。図31は、SECによって測定したカップまたはエアロゾルにおける相対変化(％)を示している。DOM1h-131-202およびDOM1h-131-206の両方が、DOM1h-131-511と比べると、単量体の濃度の相対変化が小さいことが分かる。これは、Tm'sが改善されたDOM1h-131-202およびDOM1h-131-206の両方が、噴霧化の際に凝集する傾向が低いことを実証している。
【０４１９】
図32は、噴霧化後のBritton-Robinson緩衝液中のDOM1h-131-206およびDOM1h-131-511の実際のSECトレースを示しており、単量体の相対的な減少(図31)が二量体の形成によるものであることを実証している。これは、同様に、DOM1h-131-202およびDOM1h-131-206によって示された高い熱安定性は、最適化されていない調製緩衝液であっても著しい凝集を防止できるという理論を裏付けるさらなる証拠となる。
【０４２０】
毒物学および安全性評価の試験では、患者に投与される治療用量よりも著しく高い濃度でdAbを動物に投与する必要がある。これは、著しく高いタンパク質濃度の使用および/または長期間のdAb送達によってのみ果たすことができる。DOM1h-131-511が3.5分間の5mg/mlでの噴霧化時に凝集を形成することが既に分かっているため、DOM1h-131-206を、PBS中で40mg/mlで、Pari LC+を用いて最大1時間噴霧化して試験した。長時間の噴霧化により、SECおよびタンパク質濃度(A280nmでの測定)によって決定されるせん断ストレスまたは熱ストレスが原因でdAbが凝集するか否かを調べるために、運転中の各時点でカップおよびエアロゾルから試料を採取した。表21は、A280によって測定したカップおよびエアロゾルの両方におけるdAbのタンパク質濃度を示している。
【表２１】
2010528646.tif 000028
【０４２１】
表21から、タンパク質の濃度が試験中に顕著に変化していなかったことが分かり、凝集によってタンパク質が顕著に減少しないことを実証している。図33は、1時間の噴霧化の間、DOM1h-131-206が、SECによって測定される二量体などの高次の凝集体を一切形成しないことを示している。このことから、トリプシン選択によって分子に導入された、改善された生物物理学的特性により、せん断ストレスおよび熱ストレスに対するdAbの耐性が著しく増大し、この増大が、保存期間およびタンパク質を噴霧化する能力の改善に直接相関し、それにより高次凝集体が形成されないことを明確に実証している。
【０４２２】
リードdAbの溶液状態:
3つすべてのリードdAbの分解の主な経路が、二量体化、続く凝集および最終的な沈殿となる自己結合であることように思われるため、自己結合の程度を決定するべく3つのリード分子をAnalytical Ultra-Centrifugation(AUC)によって分析した。タンパク質を、沈降平衡法および沈降速度法の2つの方法によって調べた。
【０４２３】
沈降平衡法の場合、3つの試料を、3つの異なるローター速度を用いて0.5mg/ml〜5mg/mlの範囲の3つの異なる濃度で遠心分離した。この方法により、DOM1h-131-511は、安定した二量体(26.1〜34.4kDa)であり、DOM1h-131-202は、測定濃度で比較的安定した二量体の状態である単量体/二量体平衡(22.7〜27.8kDa)で、Kdが1.3μMであり、DOM1h-131-206は、主に単量体(15.4〜17.9kDa)で、単量体から二量体結合のKdが360μMであることが分かった。
【０４２４】
沈降速度法により、すべての試料が、希釈時にある程度の解離を示した。得られた結果から、図34に示すように、DOM1h-131-511で観察された沈降係数が、高次凝集体を示唆しており、希釈時のピークのシフトが、これらの凝集体の解離を示唆している。タンパク質の凝集と解離は、互いに相殺され、沈降平衡法によって観察される安定した二量体であるという印象を与えることがある。DOM1h-131-202で観察された沈降係数は、迅速な動的平衡を示唆しており、単量体と二量体のピークを互いに分離できないため、試料の質量に対して適切な値よりも沈降係数が高い単一ピークが得られる。この結果は、沈降平衡法によって得られた結果に一致しており、解離定数は1μMと測定された。DOM1h-131-206は、他の2つの試料よりも単量体が多く、沈降係数が、他の2つの試料の2.5sに対して1.9sであると測定された。このデータは、沈降平衡法のデータによく一致している。360μMのKdよりも約10倍低い測定濃度では、試料は主に単量体である。
【０４２５】
実施例１５
DOM15-26-593 dAbの効力の増強:
親DOM15-26に対するDOM15-26-593 dAbのVEGFR2受容体結合アッセイにおける効力の増強の例を図40に示している。このアッセイでは、VEGFのVEGFR2に対する結合を防止する潜在的なインヒビターの能力を、プレートを用いたアッセイで測定する。このアッセイでは、VEGFR2-Fcキメラを、96ウェルELISAプレートにコーティングし、このプレートに、試験dAbの希釈系列と共にプレインキュベートした所定量のVEGFを添加する。結合していないタンパク質を洗い流した後、受容体に結合したVEGFの量を、抗VEGF抗体で検出し、そのレベルを比色測定した。用量反応効果を、試験物質の濃度の関数としてVEGF結合の阻害率(％)としてプロットした。したがって、有効なインヒビターは、低濃度でリガンドの結合を実質的に遮断することを実証したインヒビターである。
【０４２６】
FC融合体の効力および半減期:
腫瘍の治療におけるVEGF遮断の治療可能性は、30年前から認識されている。癌の慢性性から、生物製剤は、その効果を仲介するために長い血清半減期が必要となるが、これは、腎濾過による循環からの遊離dAbの迅速な排出と矛盾する。癌治療用の抗血管新生剤としてのVEGF dAbの有用性を評価するために、リードドメイン抗体を、2価の分子を形成するように、ハイブリッドリンカーによる野生型ヒトIgG1 Fcとの融合体としてフォーマットし、FcRn仲介抗体サルベージ経路の使用によって血清半減期を延長した。
【０４２７】
このFc融合体フォーマットでは、リードトリプシン選択dAb、DOM15-26-593の効力を、上記したアッセイを用いて初めの親dAb(DOM15-26)およびトリプシン不安定性dAb(DOM15-26-501)と比較した。結果を、以下の表22に示す。
【表２２】
2010528646.tif 000029
【０４２８】
これらの結果から、二量体Fc融合フォーマットでは、親和性および効力が、結合活性の効果によって遊離dAbに対して増加していることが分かる。トリプシン選択によってDOM15-26-593で得られた効力の増加が維持され、このFcフォーマットでより顕著であることが明らかである。さらに、熱安定性およびプロテアーゼ安定性の改善を、in vivoでの分子の薬物動態挙動における重要な変化に変換する。DOM15-26-501と比較したDOM15-26-593の排出半減期(図41を参照されたい)の改善は、dAbの安定性の増加の直接的な結果である可能性が高く、これによりエンドソームコンパートメント内で起こる分解プロセスに対する耐性が増加する。したがって、プロテアーゼ安定性が向上したdAbは、血清、粘膜表面、および様々な組織コンパートメントなどの他の生物学的コンパートメント(ここでは、タンパク質分解が、生物学的分子の代謝回転に関与する活動的プロセスである)でより長く持続できると予想される。
【０４２９】
薬物動態クリアランスプロフィール:
DOM15-26-593およびDOM15-26-501の薬物動態クリアランスプロフィールを、5mg/kgの濃度でDOM15-26-593およびDOM15-26-501を3匹のラットにIV投与した後に測定した。次いで、血清中のDOM15-26-593およびDOM15-26-501のレベルを、直接VEGF結合標準ELISAアッセイおよび抗ヒトFc抗体を用いて測定し、血清試料中の無傷の薬物のみが検出された。完全な薬物動態プロフィールを以下の表23に示す。
【表２３】
2010528646.tif 000030
【０４３０】
これらの結果から、DOM15-26-593は、例えば半減期の延長およびクリアランス速度の低下などの薬物動態プロフィールが著しく改善されていることが分かる。
【０４３１】
DOM15-26-593の効力および薬物動態特性の著しい改善により、様々な他の生物物理学的特性について化合物の分析を行った。
【０４３２】
溶液状態の特性:SEC-MALLおよびAUCによる分析:
以下に示すようにDOM15-26-593を用いて実験を行った：
DOM15-26-593は、約76kDaの計算上の無傷の分子量に一致する78〜81KDaの計算上の分子量で、最大2.5mg/mlの濃度で溶液中で単量体として振る舞う(図42aおよび42b)。
【０４３３】
熱融解特性:DSCによる分析
以下に示すようにDOM15-26-593を用いて実験を行った
トリプシン選択dAb(65℃、図43の中段パネル)の熱安定性の向上が、Fc融合体(64.5℃、図43の上段パネル)で維持された。DOM15-26-501 dAb(52℃、図43の下段パネル)のTm曲線は比較のために示す。
【０４３４】
凍結融解、熱ストレス、および血清成分に対する安定性
以下に示すようにDOM15-26-593を用いて実験を行った：
DOM15-26-593 dAbの安定特性は、DOM15-26-593 dAbが物理的および生物学的ストレスを受けても、VEGF結合能に対する影響が最小限度であることを意味する(図44〜47(aおよびb))。例えば、分子は、ELISAによって測定した結合活性を失うことなく、液体窒素(-196℃)から体温(37℃)に繰り返し10回凍結融解することができる(図44)。また、この処理は、従来のサイズ排除クロマトグラフィーによって評価した分子の凝集状態に明白な変化を生じさせない(図45)。さらなる試験により、分子を-80℃〜55℃の様々な温度に曝すと、168時間後に、最も高いインキュベーション温度でのみ抗原結合活性がわずかに低下することが実証された(図46)。さらに、ヒトまたはカニクイザルからの血清と共に37℃で14日間インキュベートしても、VEGF結合ELISAによって測定した抗原結合能力が低下しなかった(図47aおよび47b)。
【０４３５】
VEGFR2受容体結合アッセイおよびHUVEC細胞アッセイにおける効力:
以下に示すように上記の受容体結合アッセイを行った：
Fc融合体の効力を評価するために上記の受容体結合アッセイを用いた(図48)。このアッセイでは、DOM15-26-593 dAbの効力が増加し、dAbが、in vitroでのVEGFのVEGFR2に対する結合を遮断できることが分かった。また、DMS1529の効力を、HUVEC(ヒト臍静脈内皮細胞)アッセイで、HUVE細胞のVEGF刺激細胞増殖を阻害するVEGFアンタゴニストの能力を測定して実証した。所定量のVEGFおよび可変量の試験物質を用いた固定インキュベーション期間の最後に細胞数を測定する。アンタゴニストの効力が高くなればなるほど、観察される細胞増殖が少なくなる(図49)。
【０４３６】
DOM1h-131-511のヌクレオチド配列をこの段落で示し、「図19に示す」DOM1h-131-511のヌクレオチド配列に対するこの段落での言及は、この段落に示した配列の参照である。
【０４３７】
DOM1h-131-511のヌクレオチド配列:
GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC
TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGCG CATGAGACGA TGGTGTGGGT CCGCCAGGCT
CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCACAT ATTCCCCCGG TTGGTCAGGA TCCCTTCTAC
GCAGACTCCG TGAAGGGCCG GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTATAT
CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACAGCGGTAT ATTACTGTGC GCTGCTTCCT
AAGAGGGGGC CTTGGTTTGA CTACTGGGGT CAGGGAACCC TGGTCACCGT CTCGAGC
【図１】
2010528646.tif 000031
【図２】
2010528646.tif 000032
【図３】
2010528646.tif 000033
【図４】
2010528646.tif 000034
【図５】
2010528646.tif 000035
【図６】
2010528646.tif 000036
【図７Ａ】
2010528646.tif 000037
【図７Ｂ】
2010528646.tif 000038
【図７Ｃ】
2010528646.tif 000039
【図７Ｄ】
2010528646.tif 000040
【図８Ａ】
2010528646.tif 000041
【図８Ｂ】
2010528646.tif 000042
【図８Ｃ】
2010528646.tif 000043
【図９】
2010528646.tif 000044
【図１０Ａ】
2010528646.tif 000045
【図１０Ｂ】
2010528646.tif 000046
【図１０Ｃ】
2010528646.tif 000047
【図１１Ａ】
2010528646.tif 000048
【図１１Ｂ】
2010528646.tif 000049
【図１１Ｃ】
2010528646.tif 000050
【図１２】
2010528646.tif 000051
【図１３】
2010528646.tif 000052
【図１４】
2010528646.tif 000053
【図１５】
2010528646.tif 000054
【図１６】
2010528646.tif 000055
【図１７】
2010528646.tif 000056
【図１８】
2010528646.tif 000057
【図１９Ａ】
2010528646.tif 000058
【図１９Ｂ】
2010528646.tif 000059
【図１９Ｃ】
2010528646.tif 000060
【図１９Ｄ】
2010528646.tif 000061
【図１９Ｅ】
2010528646.tif 000062
【図１９Ｆ】
2010528646.tif 000063
【図１９Ｇ】
2010528646.tif 000064
【図１９Ｈ】
2010528646.tif 000065
【図１９Ｉ】
2010528646.tif 000066
【図１９Ｊ】
2010528646.tif 000067
【図１９Ｋ】
2010528646.tif 000068
【図１９Ｌ】
2010528646.tif 000069
【図２０Ａ】
2010528646.tif 000070
【図２０Ｂ】
2010528646.tif 000071
【図２０Ｃ】
2010528646.tif 000072
【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２１】
2010528646.tif 000075
【図２２】
2010528646.tif 000076
【図２３−１】
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【図２３−２】
2010528646.tif 000078
【図２４】
2010528646.tif 000079
【図２５】
2010528646.tif 000080
【図２６−１】
2010528646.tif 000081
【図２６−２】
2010528646.tif 000082
【図２６−３】
2010528646.tif 000083
【図２７】
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【図２８】
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【図２９−１】
2010528646.tif 000086
【図２９−２】
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【図３０】
2010528646.tif 000088
【図３１】
2010528646.tif 000089
【図３２】
2010528646.tif 000090
【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
2010528646.tif 000102
【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１ａ−１】
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【図５１ａ−２】
2010528646.tif 000110
【図５１ａ−３】
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【図５１ａ−４】
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【図５１ａ−５】
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【図５１ａ−６】
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【図５１ａ−７】
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【図５１ｂ−１】
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【図５１ｂ−２】
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【図５１ｂ−３】
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【図５１ｂ−４】
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【図５１ｂ−５】
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【図５１ｂ−６】
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【図５１ｂ−７】
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【図５１ｂ−８】
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【図５１ｂ−９】
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【図５１ｂ−１０】
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【図５１ｂ−１１】
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【図５１ｂ−１２】
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【図５１ｂ−１３】
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【図５１ｂ−１４】
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【図５１ｂ−１５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年2月5日(2010.2.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
DOM1h-131-511のアミノ酸配列(図3に示す)と少なくとも95％同一なアミノ酸配列を含む抗TNFα受容体1型(TNFR1;p55)免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項２】
位置53においてアスパラギン酸を含む(番号付けは、Kabatによる)、請求項１に記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項３】
位置91においてヒスチジンを含む(番号付けは、Kabatによる)、請求項１または２に記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項４】
DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、およびDOM1h-131-205からなる群から選択されるアミノ酸配列(図3に示す)と同一なアミノ酸配列を含む抗TNFα受容体1型(TNFR1;p55)免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項５】
DOM1h-131-511のヌクレオチド配列(図19に示す)と少なくとも80％同一なヌクレオチド配列によりコードされる抗TNFα受容体1型(TNFR1;p55)免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項６】
DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、またはDOM1h-131-205のヌクレオチド配列(図3に示す)と同一な配列によりコードされる抗TNFα受容体1型(TNFR1;p55)免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗TNFα受容体1型(TNFR1;p55)免疫グロブリン単一可変ドメインを含むTNFR1アンタゴニスト。
【請求項８】
第1および第2の免疫グロブリン単一可変ドメインを含み、各可変ドメインが請求項１〜６のいずれか１項に記載されたものである、請求項７に記載のアンタゴニスト。
【請求項９】
前記単一可変ドメインの単量体または前記単一可変ドメインのホモ二量体を含み、前記または各単一可変ドメインのアミノ酸配列が、アミノ酸配列DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、またはDOM1h-131-205(図3に示す)と同一である、請求項７または８に記載のアンタゴニスト。
【請求項１０】
DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、およびDOM1h-131-205から選択されるアミノ酸配列(図3に示す)のCDR1配列と少なくとも50％同一なCDR1配列、前記選択された配列のCDR2配列と少なくとも50％同一なCDR2配列、ならびに前記選択された配列のCDR3配列と少なくとも50％同一なCDR3配列を有するTNFα受容体1型(TNFR1;p55)アンタゴニスト。
【請求項１１】
DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、およびDOM1h-131-205から選択されるアミノ酸配列(図3に示す)のCDR1配列、CDR2配列、およびCDR3配列を含む免疫グロブリン単一可変ドメインを含むTNFα受容体1型(TNFR1;p55)アンタゴニスト。
【請求項１２】
TNFR1に対する結合について、DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、またはDOM1h-131-205から選択されるアミノ酸配列と競合するTNFα受容体1型(TNFR1;p55)アンタゴニスト。
【請求項１３】
TNFα受容体1型(TNFR1;p55)結合部位を含む免疫グロブリン単一可変ドメインであって、
(i)37℃で少なくとも1時間の時間(t)にわたり、少なくとも10マイクログラム/mlの濃度(c)のプロテアーゼ;または
(ii)30℃で少なくとも1時間の時間(t)にわたり、少なくとも40マイクログラム/mlの濃度(c')のプロテアーゼ
とインキュベートした場合に、プロテアーゼに対して耐性であり、
DOM1h-131-511、DOM1h-131-201、DOM1h-131-202、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、およびDOM1h-131-205のアミノ酸配列と少なくとも90％同一なアミノ酸配列を含む、上記免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項１４】
請求項１３に記載の可変ドメインを含む、TNFα受容体1型(TNFR1;p55)アンタゴニスト。
【請求項１５】
経口送達のための、請求項１４に記載のTNFR1アンタゴニスト。
【請求項１６】
患者の消化管への送達のための、請求項１４または１５に記載のTNFR1アンタゴニスト。
【請求項１７】
可変ドメインが、トリプシン、エラスターゼ、および/またはパンクレアチンに対して耐性である、請求項１４、１５または１６に記載のアンタゴニスト。
【請求項１８】
炎症状態の治療および/または予防のための、請求項１４に記載のTNFR1アンタゴニスト。
【請求項１９】
前記アンタゴニストが、少なくとも50℃のTmを有する可変ドメインを含む、請求項７〜９および１４〜１８のいずれか１項に記載のアンタゴニスト、使用、方法、デバイス、または製剤。
【請求項２０】
少なくとも50℃のTmを有する、請求項１〜６および１３のいずれか１項に記載の可変ドメイン。
【請求項２１】
MRC-5細胞アッセイにおいてTNFαにより刺激されるIL-8放出を2nM〜50pMのND50により中和する、請求項１〜６および１３のいずれか１項に記載の可変ドメイン。
【請求項２２】
請求項１〜６、１３、２０および２１のいずれか１項に記載の可変ドメインを含む二重特異性リガンド。
【請求項２３】
請求項１〜６、１３、２０および２１のいずれか１項に記載の免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドをコードする単離または組み換え核酸。
【請求項２４】
請求項２３に記載の核酸を含むベクター。
【請求項２５】
請求項２３に記載の核酸または請求項２４に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２６】
請求項１〜６、１３、２０および２１のいずれか１項に記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン、または請求項７〜１２および１４〜１９のいずれか１項に記載のアンタゴニストと、製薬上許容される担体、賦形剤、または希釈剤とを含む医薬組成物。
【請求項２７】
DOM1h-131-511のアミノ酸配列(図3に示す)と少なくとも95％同一な配列を含むポリペプチド。
【請求項２８】
DOM1h-131-511のヌクレオチド配列のヌクレオチド配列(図19に示す)と少なくとも80％同一な配列によりコードされるポリペプチド。
【請求項２９】
請求項２７または２８に記載のポリペプチドを含む融合タンパク質。
【請求項３０】
請求項２７もしくは２８に記載のポリペプチド、または請求項２９に記載の融合タンパク質をコードする単離または組み換え核酸。
【請求項３１】
抗体定常ドメインを含む、請求項１〜６、１３、２０および２１のいずれか１項に記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン、または請求項７〜１２および１４〜１９のいずれか１項に記載のアンタゴニスト、または請求項２７もしくは２８に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
任意により、FcのN末端が可変ドメインのC末端に連結されている(任意により、直接連結されている)抗体Fcを含む、請求項３１に記載の可変ドメイン、アンタゴニスト、またはポリペプチド。
【国際調査報告】
2010528646.tif 000131
2010528646.tif 000132
2010528646.tif 000133