(57)【要約】  感染細胞の抗原プロセシング能力、ひいてはそれらの免疫原性を高めるためのＴＡＰ−１及び／又はＴＡＰ−２を含む、哺乳類（ヒトを含む）などの生体におけるポックスウイルスのウイルス感染と闘うためのワクチン組成物。この組成物は、とりわけ天然痘ウイルスの感染の治療又は予防において、単独で用い得るか、又は、好ましくは、ポックス抗原に基づくワクチンと共に、免疫原性を増強させるアジュバントとして用い得る。
2010510992.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＡＰ−１及び／若しくはＴＡＰ−２又はその前駆体を含む、生体のための、ポックスウイルス感染症の治療又は予防組成物。
【請求項２】
ＴＡＰ−１及びＴＡＰ−２又はその前駆体の両方を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ＴＡＰ−１及びＴＡＰ−２をコードする発現可能な遺伝子を含む核酸分子を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
ＴＡＰ−１及びＴＡＰ−２をコードする発現可能な遺伝子を含む組換えウイルスベクターを含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
ウイルスベクターがワクシニアウイルスベクターである、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
ウイルスベクターがアデノヒトウイルスベクターである、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
ポックスウイルス感染症が天然痘である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
生の又は弱毒化した天然痘ウイルスに基づく天然痘ワクチンと共に投与するためのアジュバントの形態である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
天然痘ウイルスが、ワクシニア株の修飾ワクシニア・アンカラ（ＭＶＡ）に基づくものである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
ポックスウイルスの感染を治療又は予防するための、生体に投与するための薬学的組成物であって、同時投与又は連続投与のために、
（ａ）生の又は弱毒化したポックスウイルス科ウイルスを含む、ポックスウイルス科ウイルスワクチン、並びに
（ｂ）ＴＡＰ−１及び／若しくはＴＡＰ−２又はその前駆体を含む薬学的に許容可能な組成物を含むアジュバント
を含む薬学的組成物。
【請求項１１】
アジュバントが、ＴＡＰ−１及びＴＡＰ−２をコードする発現可能な遺伝子を含む核酸分子を含む、請求項１０に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
核酸分子が、ＴＡＰ−１及びＴＡＰ−２をコードする発現可能な遺伝子を含む組換えウイルスベクターを含む、請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
ウイルスベクターがワクシニアウイルスベクターである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
ウイルスベクターがアデノヒトウイルスベクターである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
ポックスウイルスのワクチンが天然痘ワクチンである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１６】
天然痘ワクチンが、ワクシニア株の修飾ワクシニア・アンカラ（ＭＶＡ）に基づくものである、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
アジュバントが、リポソーム内にカプセル化されたＴＡＰ−１タンパク質及び／又はＴＡＰ−２タンパク質である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１８】
生体におけるポックスウイルスの感染と闘うために、生体を治療又は予防する方法であって、ＴＡＰ−１及び／若しくはＴＡＰ−２又はその前駆体を含む薬学的に許容可能な組成物を、有効量で患者に投与することを含む方法。
【請求項１９】
前記組成物が、生の又は弱毒化したポックスウイルス科ウイルスを含むポックスウイルス科ウイルスワクチンと共にアジュバントとして投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
アジュバントが、ＴＡＰ−１及びＴＡＰ−２をコードする発現可能な遺伝子を含む核酸分子を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
核酸分子が、ＴＡＰ−１及びＴＡＰ−２をコードする発現可能な遺伝子を含む組換えウイルスベクターを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ウイルスベクターがワクシニアウイルスベクターである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ウイルスベクターがアデノヒトウイルスベクターである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
ポックスウイルス科のワクチンが天然痘ワクチンである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
天然痘ワクチンが、ワクシニア株の修飾ワクシニア・アンカラ（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  Ａｎｋａｒａ）（ＭＶＡ）に基づくものである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
アジュバントが、リポソーム内にカプセル化されたＴＡＰ−１タンパク質及び／又はＴＡＰ−２タンパク質である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２７】
ポックスウイルスのワクチンが天然痘ワクチンである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
ポックスウイルスのワクチンが、カナリア痘ウイルス、鶏痘ウイルス、ハワイガンポックスウイルス、ハトポックスウイルス、コンドルポックスウイルス、カプリポックスウイルスのＲａｐｉｎｅ株、ヤギ痘ウイルス、ランピースキン病ウイルス、及びヒツジ痘ウイルス、悪性ウサギ線維腫ウイルス、粘液腫ウイルス、ウサギ線維腫ウイルス、及びショープ線維腫ウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、アラサツバウイルス、ＢｅＡｎ５８０５８ウイルス、バッファローポックスウイルス、ラクダ痘ウイルス、カンタガロオルトポックスウイルス、牛痘ウイルス、エクトロメリアウイルス、ゾウポックスウイルス、サル痘ウイルス、ウサギポックスウイルス、アライグマポックスウイルス、スカンクポックスウイルス、タラポックスウイルス、ワクシニアウイルス、ハタネズミポックスウイルス、ウシ丘疹性口炎ウイルス、ｏｒｆウイルス、偽牛痘ウイルス、アカシカパラポックスウイルス、アザラシポックスウイルス、豚痘ウイルス、タナポックスウイルス、ヤバサル腫瘍ウイルス、並びにヤバ様疾病ウイルスに由来するポックスウイルス抗原に基づくものである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
生体におけるポックスウイルスの感染を治療又は予防するための薬学的組成物の調製又は製造における、ＴＡＰ−１及び／若しくはＴＡＰ−２又はその前駆体を含む組成物の使用。
【請求項３０】
生の又は弱毒化したポックスウイルス科のウイルスを含むポックスウイルス科のウイルスワクチンと組み合わせた、前記組成物の、請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
アジュバントが、ＴＡＰ−１及びＴＡＰ−２をコードする発現可能な遺伝子を含む核酸分子を含む、請求項２９に記載の使用。
【請求項３２】
核酸分子が、ＴＡＰ−１及びＴＡＰ−２をコードする発現可能な遺伝子を含む組換えウイルスベクターを含む、請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
ウイルスベクターがワクシニアウイルスベクターである、請求項３１に記載の使用。
【請求項３４】
ウイルスベクターがアデノヒトウイルスベクターである、請求項３１に記載の使用。
【請求項３５】
ポックスウイルスのワクチンが天然痘ワクチンである、請求項３０に記載の使用。
【請求項３６】
天然痘ワクチンが、ワクシニア株の修飾ワクシニア・アンカラ（ＭＶＡ）に基づくものである、請求項３５に記載の使用。
【請求項３７】
アジュバントが、リポソーム内にカプセル化されたＴＡＰ−１タンパク質及び／又はＴＡＰ−２タンパク質である、請求項３０に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ワクチン、ワクチン組成物、ワクチンの調製方法、及び哺乳類の患者（ヒトを含む）におけるウイルス感染の予防及び治療におけるその使用に関する。より詳細には、本発明は、ワクシニアウイルス（ＶＶ）及び天然痘ウイルスなどのポックスウイルスファミリーのウイルスと闘うために有用なワクチン及びワクチン組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポックスウイルス科のウイルス、とりわけＶＶ及び天然痘に対するワクチンは知られており、長年にわたって用いられ、多大な成功をおさめている。しかし、標準的な用量の接種材料に対する有害反応は、ＶＶ及び天然痘に対するワクチン接種において非常に頻繁に生じる問題である。その結果、従来のワクチンは、免疫が低下しているか、又は、確立されているワクチンプロトコールに対して普通であれば有害反応を示すであろう集団の大部分には投与することができない。この割合は、予防接種の対象となる個体の２０％にまでのぼり得る。有効用量をより少なくすることが可能な、より効果的な接種材料の組成物は、この点において大きな利点となろう。効果のないワクチン接種を受けた患者は、感染性疾患の拡大の深刻な脅威をもたらす。
【０００３】
様々な病原体に対するワクチン接種がさらに広まってきているため、集団の全てにワクチン接種するために必要なワクチンのバッチのサイズを減少させる一方で、接種材料の効率を上げることが必要とされてきている。これは、迅速な応答が必要とされる緊急の要求（例えば、バイオテロリストの攻撃、突発的な流行）の際にとりわけ重要である。
【０００４】
先行技術の簡単な参照
ワクチンの効能及び効率を上げるために、様々なアジュバントが開発されている。これらのアジュバントとしては、ヒトへの使用には毒性が高過ぎることが明らかにされている、加熱死菌マイコバクテリウム・ツベルクローシスを含むエマルジョンである完全フロイントアジュバント（ＦＣＡ）、免疫系において細胞傷害性メカニズムをもたらすＴｈ−１応答を引き起こす、ＩＬ−２及びＩＬ−１２などのサイトカイン、並びに、免疫刺激物質（炎症性細菌産物）を含む油乳剤／アルミニウム塩がある。これらの多くは、ヒトへの使用には毒性が高過ぎる。他のものは、その作用の態様が不明瞭であるため、用いることができない。
【０００５】
好ましい効果的なワクチン及びワクチンとアジュバントとの組合せは、哺乳類の対象において液性応答及び細胞介在性応答の両方を引き起こすものではなくてはならない。液性応答により、侵入病原体の抗原に対して特異的な抗体が生じ、その結果、同一の病原体による将来的な侵入に対して恒久的な防御が得られる。細胞介在性応答は、キラーＴ細胞、すなわち細胞傷害性Ｔリンパ球、つまりＣＴＬによる、感染細胞の破壊を伴う。
【０００６】
細胞傷害性Ｔリンパ球細胞（ＣＴＬ）の応答は、免疫監視並びに感染細胞及び表面上に外来抗原を発現している侵入生物との破壊において活性な、免疫系の主要な構成要素であることが知られている。抗原のペプチド断片は、主要組織適合複合体分子（ＭＨＣ）に結合し、抗原特異的Ｔ細胞受容体のリガンドを形成する。細胞傷害性Ｔリンパ球は、感染細胞の表面上にあるＭＨＣクラス１分子に結合したペプチドを認識し、それを破壊する。これが生じるためには、三重複合体であるＭＨＣクラス１分子が細胞内において形成され、細胞表面に運ばれなくてはならない。三重複合体の形成には、細胞の細胞質におけるタンパク質分解により生じるペプチドの、小胞体（ＥＲ）の内腔内への運搬が関与すると考えられている。この運搬には、ＭＨＣ領域内にある、ＴＡＰ−１及びＴＡＰ−２と呼ばれる、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）ファミリーのタンパク質をコードする２つの遺伝子が関与し（Ｄｅｖｅｒｓｏｎ，Ｅ．Ｖ．ら、“Ｎａｔｕｒｅ”３４８：７３８、１９９０）、ＴＡＰは、「抗原プロセシングに関与するトランスポーター」の略である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ポックスウイルスがウイルス感染した細胞におけるＴＡＰ−１又はＴＡＰ−２の存在を、例えばその細胞におけるＴＡＰの発現を増強することにより増大させると、ＭＨＣクラス１、すなわち細胞による抗原提示が大幅に増加し、その結果、感染細胞の免疫原性が大幅に増大するということの発見に基づくものである。これは、細胞傷害性Ｔリンパ球の応答の大幅な増大と、その結果生じるＣＴＬによる感染細胞の破壊の増大として現れる。
【０００８】
したがって、本発明の１つの態様によると、ＴＡＰ−１及び／若しくはＴＡＰ−２又はその前駆体を含む、生体におけるポックスウイルス感染を治療又は予防するためのワクチン組成物が提供される。
【０００９】
別の態様によると、本発明は、ポックスウイルス感染を治療又は予防するために、生の又は弱毒化したポックスウイルス科ウイルスを含むポックスウイルス科ウイルスワクチンと共に、生体に投与するためのアジュバントを提供するものであり、前記アジュバントは、ＴＡＰ−１及び／若しくはＴＡＰ−２又はその前駆体を含む、薬学的に許容可能な組成物を含む。
【００１０】
本発明のさらなる態様は、ポックスウイルス感染と闘うために、生体を治療又は予防する方法であって、ＴＡＰ−１及び／若しくはＴＡＰ−２又はその前駆体を含む薬学的に許容可能な組成物を有効量、場合によっては、生の又は弱毒化したポックスウイルス科ウイルスを含むポックスウイルス科ウイルスワクチンと共に、患者に投与することを含む方法を提供するものである。
【００１１】
本発明はまた、別の態様から、生体におけるポックスウイルス科の感染を治療又は予防するための薬学的組成物の調製又は製造における、ＴＡＰ−１及び／若しくはＴＡＰ−２又はその前駆体を含む組成物の使用も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】以下に詳述する特定の実験的な実施例１の結果を示すグラフである。
【図２】以下に詳述する特定の実験的な実施例１の結果を示すグラフである。
【図３】以下に詳述する特定の実験的な実施例２の結果を示すグラフである。
【図４】以下に詳述する特定の実験的な実施例３の結果を示すグラフである。
【図５】以下に詳述する特定の実験的な実施例３の結果を示すグラフである。
【図６】以下に詳述する特定の実験的な実施例４の結果を示すグラフである。
【図７】以下に詳述する特定の実験的な実施例５の結果を示すグラフである。
【図８】図８ａ及び図８ｂは、以下に詳述する特定の実験的な実施例７の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
生体における、抗原を提示し得る細胞におけるポックスウイルス科ウイルスの抗原との適切な機能的関係を有するＴＡＰの過剰発現又は過剰なＴＡＰの存在により、抗原の提示が増大し、その結果、ポックスウイルス科のウイルス感染に応じた抗原特異的な細胞傷害性が増す。ＴＡＰ−１タンパク質及び／又はＴＡＰ−２タンパク質は、生存している哺乳類細胞においてｉｎ  ｓｉｔｕで生じ得るか、又は事前に形成されたタンパク質として細胞内に導入され得るが、この導入は、１つ又は複数のＴＡＰタンパク質の少なくともいくつかが細胞の抗原提示経路に入り、この経路に関与することを確実にする任意の方法で行われる。
【００１４】
細胞の抗原提示経路にＴＡＰを関与させる好ましい方法は、例えば、細胞においてＴＡＰを発現させるＴＡＰ−１遺伝子及び／又はＴＡＰ−２遺伝子を有する発現系を、生体に投与することにより、前記経路内にＴＡＰを過剰発現させることである。したがって、本発明の好ましいワクチン組成物は、ポックスウイルス感染した生体又は類似の感染の危険性を有する生体に注射するために、ＴＡＰ−１遺伝子又はＴＡＰ−２遺伝子の一方又は両方を、発現可能な形態で含む。ＴＡＰ−１遺伝子及びＴＡＰ−２遺伝子は、適切なプロモーター配列、シグナル配列、及び発現配列と共に、ワクシニアウイルスベクターなどの組換えウイルスベクター又はアデノヒトウイルスベクターの構成要素として適切に提供され、その結果、ワクチン自体として、又は、生の若しくは弱毒化したポックス抗原含有ワクチンと共にワクチンアジュバントとして注射された後、ＴＡＰ−１及び／又はＴＡＰ−２はこのようにして抗原提示細胞において過剰発現する。これにより、これらのトランスポーターの活性が増大し、それにより抗原提示経路のアウトプットが著しく増大する。ＴＡＰの過剰発現は、免疫正常宿主及び免疫不全宿主における、ポックスウイルス科ウイルス、とりわけ天然痘ウイルスに対する応答を増大させるためのアジュバントとして作用し得る。
【００１５】
本発明を実施するための別の方法は、ＴＡＰ−１遺伝子及び／又はＴＡＰ−２遺伝子をコードする裸のＤＮＡプラスミドを調製し、免疫を獲得する対象である抗原、例えば天然痘抗原と共に、生体に投与することである。抗原は、投与後に生物の細胞において発現するためにＤＮＡプラスミドにおいてコードされてもよく、又は、ＴＡＰをコードするプラスミドとは別の存在として細胞に加え得る。
【００１６】
ＴＡＰ−１遺伝子及びＴＡＰ−２遺伝子の発現産物であり、細胞培養技術及びその他の方法により得ることができる、ＴＡＰ−１タンパク質及び／又はＴＡＰ−２タンパク質は、それ自体、選択的に、ワクチン又はワクチンアジュバントとして直接使用することができる。１つ又は複数のＴＡＰタンパク質自体が、単独で、又はポックスウイルスに基づくワクチンと共にアジュバントとして用いられる場合、それらは、細胞内へのそれらの侵入を容易にする形態で投与されなくてはならない。そのような方法の適切な１つは、リポソーム内にカプセル化されたタンパク質の投与である。これを行うための技術は当技術分野で知られている。
【００１７】
本発明に従って免疫応答を生じさせる対象であるウイルス抗原は、好ましくは天然痘ウイルスであり、それは、天然痘ウイルスが、ポックスウイルス科ファミリーのメンバーの最も一般的で最も重大なウイルス感染であるためである。しかしそれは、サブファミリーであるコルドポックスウイルス亜科及びエントモポックスウイルス亜科を含む、ポックスウイルス科ファミリーの他のメンバーに適用可能である。サブファミリーであるコルドポックスウイルス亜科としては、痘瘡ウイルス（天然痘ウイルス）属、アビポックスウイルス属（カナリア痘ウイルス種、鶏痘ウイルス種、ハワイガンポックスウイルス種、ハトポックスウイルス種、及びコンドルポックスウイルス種を含む）、カプリポックスウイルス属（カプリポックスウイルス種のＲａｐｉｎｅ株、ヤギ痘ウイルス種、ランピースキン病ウイルス種、及びヒツジ痘ウイルス種を含む）、レポリポックスウイルス属（悪性ウサギ線維腫ウイルス種、粘液腫ウイルス種、ウサギ線維腫ウイルス種、及びショープ線維腫ウイルス種を含む）、モルシポックスウイルス属（伝染性軟属腫ウイルス種を含む）、オルトポックスウイルス属（アラサツバウイルス種、ＢｅＡｎ５８０５８ウイルス種、バッファローポックスウイルス種、ラクダ痘ウイルス種、カンタガロオルトポックスウイルス種、牛痘ウイルス種、エクトロメリアウイルス種、ゾウポックスウイルス種、サル痘ウイルス種、ウサギポックスウイルス種、アライグマポックスウイルス種、スカンクポックスウイルス種、タラポックスウイルス種、ワクシニアウイルス種、及びハタネズミポックスウイルス種を含む）、パラポックスウイルス属（ウシ丘疹性口炎ウイルス種、ｏｒｆウイルス種、偽牛痘ウイルス種、アカシカパラポックスウイルス種、及びアザラシポックスウイルス種を含む）、スイポックスウイルス属（豚痘ウイルス種を含む）、並びにヤタポックスウイルス属（タナポックスウイルス種、ヤバサル腫瘍ウイルス種、及びヤバ様疾病ウイルス種を含む）がある。
【００１８】
したがって、本発明は、上記のウイルスのいずれかに感染した生体におけるウイルス感染の治療に関するものであり、生体は、哺乳類（ヒトを含む）、鳥、又は、ウイルスが天然の感染源であるか若しくはウイルスがトランスフェクトしたあらゆる他の生物である。本発明はまた、これらの生体のいずれかにおけるこのような感染の拡大の予防にも関するものである。
【００１９】
本発明の方法を予防的治療又はワクチンにおいて用いる場合、標的細胞は原則的に、それ以外ではポックス抗原に暴露されていなかった可能性のある正常な細胞（正常なＴＡＰレベルを発現する）である。そのような場合、ＴＡＰを増加させる作用物質が、免疫応答を生じさせようとする対象であるポックス抗原と共に同時投与される。上記に挙げたポックスウイルス科のウイルス種は、実質的に全てが天然痘ウイルスに十分に類似しており、抗原提示細胞におけるＴＡＰの過剰発現を伴う、それらのいずれかを用いたワクチン接種によって、治療した生物に、天然痘に対する効果的な程度の免疫が付与される。本発明の方法を治療として用いる場合、標的細胞は事前にポックスウイルスに感染したものであってよい。
【００２０】
本発明の特に好ましい使用は、ワクシニアの弱毒株であり、１９７０年代の終わりに西欧政府当局により行われた天然痘撲滅プログラムの後期に用いられた、修飾ワクシニア・アンカラ（ＭＶＡ）として知られているワクシニアの株に関連している。これは優れた安全性プロファイルを有しているが、広く商業的に使用されている「ｄｒｙｖａｘ」株よりも免疫原性の程度が低い。本発明に従ってＴＡＰ及びＴＡＰ発現系と組み合わせて用いることにより、ＭＶＡの非常に良好な安全性プロファイルを損なうことなくＭＶＡの免疫原性を上げると、ヒトの患者、とりわけ免疫不全のヒトの患者に対する優れた天然痘ワクチンを提供することができる可能性がある。
【００２１】
好ましい実施形態において、本発明の方法は、標的細胞におけるＴＡＰ発現のレベルを増大させるために、ＴＡＰ分子をコードする核酸分子を含む組換えウイルスベクターを投与することを伴う。
【００２２】
したがって、１つの好ましい実施形態において、本発明は、発現可能な形態でＴＡＰ分子をコードする配列を含む核酸分子を有効量で、それを必要とする哺乳類などの生体に投与することを含む、ポックス抗原に対する免疫応答を増強させる方法を提供する。
【００２３】
ＴＡＰ分子をコードする核酸分子はインビボで動物に投与することができ、その場合、ＴＡＰ分子はインビボで発現する。インビボで投与する場合、ＴＡＰ分子は、限定はしないが、腹腔内、静脈内、皮下、経口、皮膚乱切、筋肉内、又は皮内を含むあらゆる経路によって投与することができる。或いは、ＴＡＰ分子はエクスビボで標的細胞に投与することができ、その場合、ＴＡＰ分子はインビトロで細胞内に発現し、その後、ＴＡＰを発現している標的細胞を動物に投与することができる。
【００２４】
適切なプロモーターの制御下でＴＡＰ１及び／又はＴＡＰ２をコードする配列を含む核酸分子を、当技術分野において知られている技術を用いて容易に合成することができる。ＴＡＰ１をコードする配列としては、Ｔｒｏｗｓｄａｌｅ，Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：７４１、１９９０、及び１９９２年３月１９日に公開された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９１／０６１０５に示されているアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする配列が挙げられる。ＴＡＰ１をコードする配列を含む核酸分子は、例えば、ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、そして、ＴＡＰ１に特異的なオリゴヌクレオチドを用いたｃＤＮＡ末端の迅速な増幅（ＲＡＣＥ、Ｆｒｏｈｍａｎら、１９８６）を用いて、増幅の結果得られたクローンの配列を分析することにより、単離及び配列決定することができる。ＴＡＰ１に特異的なオリゴヌクレオチドは、本発明の核酸分子の核酸配列をＴＡＰ１の既知の配列と比較することにより同定することができる。ＴＡＰ１又はＴＡＰ２をコードする、本発明の方法において用いる核酸分子は、当技術分野において知られている手順を用いる化学合成及び酵素によるライゲーション反応によっても構築することができる。ＴＡＰ１又はＴＡＰ２をコードする配列は、組換えＤＮＡ法を用いて調製することもできる。
【００２５】
本発明の方法は、既知のＴＡＰ１配列及びＴＡＰ２配列を用いることを企図しているのみならず、既知のＴＡＰ配列に対して実質的な配列相同性を有する配列、既知のＴＡＰ配列にハイブリダイズする配列、及び既知のＴＡＰ配列の全ての類似体又は修飾形態の使用を含むものでもある。
【００２６】
「実質的な配列相同性を有する配列」という用語は、既知のＴＡＰ配列からわずかな又は重要ではない配列変異を有する核酸配列、すなわち、実質的に同一の様式で機能し、免疫応答を高めるために用いることができる配列を意味する。変異は、局所的な突然変異又は構造の修飾をもたらし得る。実質的な相同性を有する核酸配列には、ＴＡＰの既知の核酸配列と少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは９０〜９５％の同一性を有する核酸配列が含まれる。
【００２７】
「ハイブリダイズする配列」という用語は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＴＡＰ配列にハイブリダイズすることのできる核酸配列を意味する。ＤＮＡのハイブリダイゼーションを促進する適切な「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、当業者に知られているか、又はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ及びＳｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）、６．３．１〜６．３．６のＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓにおいて見ることができる。例えば、およそ４５℃の６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）の後に、５０℃での２．０×ＳＳＣ、５０℃から６５℃での０．２×ＳＳＣ、又は４４℃から５０℃での２．０×ＳＳＣでの洗浄を行うことを採用することができる。ストリンジェンシーは、洗浄段階において用いる条件に基づいて選択することができる。例えば、洗浄段階における塩濃度は、５０℃でおよそ０．２×ＳＳＣの高ストリンジェンシーから選択することができる。加えて、洗浄段階における温度は、およそ６５℃の高ストリンジェンシー条件であってよい。
【００２８】
「類似体である核酸配列」という用語は、ＴＡＰ分子の既知の配列と比較して修飾されている核酸配列を意味し、この修飾は、本明細書に記載される配列の単一性を変えるものではない。修飾された配列又は類似体は、既知の配列よりも向上した特性を有し得る。類似体を調製するための修飾の一例は、既知の配列の自然に生じる塩基（すなわち、アデニン、キニーネ、シトシン、又はチミジン）の１つを、修飾された塩基、例えばキサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチルアデニン、２−プロピルアデニン、及び他のアルキルアデニン、５−ハロウラシル、５−ハロシトシン、６−アザウラシル、６−アザシトシン、及び６−アザチミン、シュードウラシル、４−チオウラシル、８−ハロアデニン、８−アミノアデニン、８−チオールアデニン、８−チオールアルキルアデニン、８−ヒドロキシルアデニン、及び他の８−置換アデニン、８−ハログアニン、８アミノグアニン、８−チオールグアニン、８−チオールアルキルグアニン、８−ヒドロキシルグアニン、及び他の８−置換グアニン、他のアザウラシル及びデアザウラシル、アザチミジン及びデアザチミジン、アザシトシン及びデアザシトシン、アザアデニン及びデアザアデニン、又はアザグアニン及びデアザグアニン、５−トリフルオロメチルウラシル、並びに５−トリフルオロシトシンで置換することである。
【００２９】
修飾の別の例は、修飾されたリン又は酸素へテロ原子を、核酸分子の、リン酸骨格である短鎖アルキル若しくはシクロアルキルの糖間結合又は短鎖ヘテロ原子若しくは複素環の糖間結合に含めることである。例えば、核酸配列は、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、ホスホン酸メチル、及びホスホロジチオエートを含み得る。
【００３０】
本発明の核酸分子の類似体のさらなる例は、ＤＮＡ（又はＲＮＡ）のデオキシリボース又は（リボース）のリン酸骨格が、ペプチドで見られるものと類似しているポリアミド骨格（Ｐ．Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９１、２５４、１４９７）で置換されている、ペプチド核酸（ＰＮＡ）である。ＰＮＡ類似体は、酵素による分解に対する耐性を有し、インビボ及びインビトロで寿命が長いことが示されている。ＰＮＡはまた、ＰＮＡ鎖とＤＮＡ鎖との間に電荷斥力がないために、相補的ＤＮＡ配列にも強く結合する。他の核酸類似体は、ポリマー骨格、環状骨格、又は非環状骨格を含むヌクレオチドを含み得る。例えば、ヌクレオチドは、モルホリノ骨格構造を有し得る（米国特許第５，０３４，５０６号）。類似体は、核酸配列の薬物動態特性又は薬力学特性を向上させるための群である、レポーター群などの群も含み得る。
【００３１】
本明細書において意図する方法のいくつかは、切断された機能的でない形態のＴＡＰ１又はＴＡＰ２をコードする配列を含む核酸分子を用いる。切断された機能的でない形態のＴＡＰ１及びＴＡＰ２は、ＴＡＰ１遺伝子又はＴＡＰ２遺伝子の一部を欠失させて断片を産生することにより同定することができる。このような断片は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下においてＴＡＰ１配列又はＴＡＰ２配列にハイブリダイズするはずである。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、特異性を得て、ミスマッチの数を減らすために十分にストリンジェントであり、さらに、満足な速度での安定なハイブリッドの形成を可能にするために十分に柔軟性があるものである。そのような条件は当業者に知られており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）、ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｄｅ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒに記載されている。切断された形態のＴＡＰ１及びＴＡＰ２の内因性ペプチドを運搬する能力は、本明細書において記載する方法を用いて決定することができる。
【００３２】
本発明はまた、ＴＡＰ１及びＴＡＰ２の両方を含む核酸構築物も含む。そのような場合、核酸構築物は、ＴＡＰ１とＴＡＰ２との融合タンパク質をコードする。本発明はまた、減少するように修飾されているＴＡＰ１若しくはＴＡＰ２、又は、構成的に活性なリン酸化制御部位若しくはペプチド付与部位若しくは集合構造物も含む。
【００３３】
上述した相同体及び修飾形態を含む、ＴＡＰ１及びＴＡＰ２をコードする配列を有する核酸分子は、既知の方法で、タンパク質又はその一部の良好な発現を確実にする適切な発現ベクターの中に組み込むことができる。考えられる発現ベクターとしては、限定はしないが、用いる標的細胞にそのベクターが適合する限りにおいて、コスミド、プラスミド（裸のＤＮＡプラスミド及びリポソームカプセル化プラスミドの両方を含む）、又は修飾されたウイルスがある。
【００３４】
本明細書において記載する核酸分子は、挿入された配列の転写及び翻訳に必要なエレメントを含むことが企図されている。適切な転写エレメント及び翻訳エレメントは、細菌、真菌、ウイルス、哺乳類、又は昆虫の遺伝子を含む様々な源に由来し得る。適切な転写エレメント及び翻訳エレメントの選択は、以下に記載するようにして選択された標的細胞に左右されるものであり、当業者が容易に行うことができる。このようなエレメントの例としては、転写プロモーター及びエンハンサー又はＲＮＡポリメラーゼ結合配列、翻訳開始シグナルを含むリボソーム結合配列がある。さらに、選択された宿主細胞及び用いるベクターに依存して、複製起点、付加的なＤＮＡ制限部位、エンハンサー、及び転写の誘導性を付与する配列などの、他の遺伝子エレメントを発現ベクターに組み込むことができる。必要な転写エレメント及び翻訳エレメントを、天然のＴＡＰ１遺伝子、ＴＡＰ２遺伝子、及び／又はそれらのフランキング領域から供給し得ることも理解されよう。
【００３５】
核酸分子はまた、形質転換された又はトランスフェクトされた宿主細胞の選択を容易にするレポーター遺伝子も含み得る。レポーター遺伝子の例は、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、若しくは免疫グロブリンなどのタンパク質、又はその一部、例えば、好ましくはＩｇＧである免疫グロブリンのＦｃ部分をコードする遺伝子である。好ましい実施形態において、レポーター遺伝子はＬａｃＺである。レポーター遺伝子の転写は、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、又はホタルルシフェラーゼなどのレポータータンパク質の濃度における変化によって監視される。これにより、ＴＡＰの発現を可視化し、分析することが可能となる。
【００３６】
ＴＡＰ１又はＴＡＰ２をコードする配列を含む核酸分子は、形質転換、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーションなどを介して標的細胞内に導入することができる。外来ＤＮＡを発現させるために宿主細胞を形質転換、トランスフェクトなどするための方法は、当技術分野において周知である（例えば、参照することにより全て本明細書に組み込まれる、Ｉｔａｋｕｒａら、米国特許第４，７０４，３６２号；Ｈｉｎｎｅｎら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ７５：１９２９１９３３、１９７８；Ｍｕｒｒａｙら、米国特許第４，８０１，５４２号；Ｕｐｓｈａｌｌら、米国特許第４，９３５，３４９号、Ｈａｇｅｎら、米国特許第４，８０１，５４２号；Ａｘｅｌら、米国特許第４，３９９，２１６号；Ｇｏｅｄｄｅｌら、米国特許第４，７８４，９５０号；及びＡｘｅｌら、米国特許第４，３９９，２１６号；Ｇｏｅｄｄｅｌら、米国特許第４，７６６，９５０号；及びＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９を参照）。
【００３７】
哺乳類細胞における発現を導くための適切な発現ベクターとしては、通常、プロモーター並びに他の転写調節配列及び翻訳調節配列がある。一般的なプロモーターとしては、ＳＶ４０、ＭＭＴＶ、メタロチオネイン−１、アデノウイルスＥｌａ、ＣｍＶ、即時型初期、免疫グロブリン重鎖のプロモーター及びエンハンサー、並びにＲＳＶ−ＬＴＲがある。哺乳類細胞のトランスフェクションのプロトコールは当業者に周知である。
【００３８】
ＴＡＰをコードする核酸分子は、細胞への導入のために、ウイルスベクター、プラスミド、リポソーム、及びミクロスフェアなどの適切な担体内に組み込まれる。好ましい実施形態において、核酸分子は、ウイルスベクター、好ましくはワクチンウイルスベクター、アデノウイルスに基づくベクター、レンチウイルスに基づくベクター、及び単純ヘルペスウイルスに基づくベクター内にある状態で、標的細胞内に導入される。ベクターは、生の、弱毒化した、複製条件付きの、又は複製欠損のものであり得る。最も好ましくは、ウイルスベクターは弱毒化されたものである。
【００３９】
本発明はまた、本発明の方法を実施するための薬学的組成物又はワクチンも含む。したがって、本発明は、ＴＡＰ分子のレベルを上げ得る作用物質の有効量を適切な希釈剤又はキャリアーとの混合物として含む、免疫応答の増強に用いるための薬学的組成物を提供する。好ましい実施形態において、薬学的組成物は、ＴＡＰ分子をコードする配列を含む核酸分子を有効量で、適切な希釈剤又はキャリアーとの混合物として含む。
【００４０】
上記の、ＴＡＰ分子をコードする核酸分子又はその核酸分子を含むベクターは、インビボでの投与に適した、生物学的に適合した形態で対象に投与するために、薬学的組成物内に処方され得る。「インビボでの投与に適した、生物学的に適合した形態」とは、投与される物質の形態であって、あらゆる毒作用よりも治療効果が上回る形態を意味する。物質は、ヒト及び動物を含む生体に投与することができる。
【００４１】
薬学的組成物は、注射（皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮膚乱切など）、経口投与、吸入、経皮塗布、又は直腸投与によるもののような、都合の良い方法で投与することができる。投与の経路に従って、核酸分子は、酵素の作用、酸、及び化合物を不活性化させ得る他の天然条件から化合物を保護するための物質で被覆することができる。
【００４２】
本明細書に記載する組成物は、有効量の活性物質を薬学的に許容可能な担体との混合物内に組み合わせるような、対象に投与することができる薬学的に許容可能な組成物を調製するための、それ自体既知の方法によって調製することができる。適切な担体は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．、ＵＳＡ  １９８５）又はＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ（Ｍｉｃｈａｅｌ及びＩｒｅｎｅ  Ａｓｈ編、Ｇｏｗｅｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ａｌｄｅｒｓｈｏｔ、Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９５））に記載されている。これに基づき、組成物には、非排他的にではあるが、１つ又は複数の薬学的に許容可能な担体又は希釈剤と組み合わされ、且つ緩衝液内に含まれ得る、物質の溶液が含まれ、前記緩衝液は、適切なｐＨを有し、且つ／又は生理液と浸透圧が等しいものである。これに関しては、米国特許第５，８４３，４５６号を参照することができる。本明細書において記載される物質の投与は不活性なウイルスキャリアーによるものであり得ることも、当業者には理解されよう。
【００４３】
以下の特定の実施例において、本発明をさらに記載し、説明する。
【実施例】
【００４４】
材料及び方法
動物、細胞、及びウイルス
マウス系統Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）を、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手し、バイオテクノロジー繁殖施設（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）（ブリティッシュコロンビア大学）で飼育し、繁殖させた。マウスは、カナダ動物管理協会のガイドラインに従って維持した。マウスは、標準的な飼料と水を自由摂取できる状態に置いた。コロニーを、マイコプラズマ・プルモニス及びマイコプラズマ・アルスリティディス、齧歯動物のコロナウイルス（肝炎を含む）、並びにＳＶについて、Ｍｕｒｉｎｅ  ＩｍｍｕｎｏＣｏｍｂ  Ｔｅｓｔ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ）を用いて定期的にスクリーニングした。実験に用いたマウスは６週齢から１２週齢であった。
【００４５】
ヒトＴＡＰ１遺伝子及びＴＡＰ２遺伝子を有する組換えワクシニアウイルス（ＶＶ−ｈＴＡＰ１，２）並びにマウスＴＡＰ１を有する組換えワクシニアウイルス（ＶＶ−ｍＴＡＰ１）は、Ｊ．Ｙｅｗｄｅｌｌ、ＮＩＡ、ＮＩＡＩＤから譲り受けたものである。陰性対照として用いた、プラスミドＰＪＳ−５をコードするワクシニアウイルス（ＶＶ−ＰＪＳ−５）は、ブリティッシュコロンビア大学のＪ．Ａｌｉｍｏｎｔｉから譲り受けたものであるが、それは各所から入手できるか、また、当業者に既知の方法によって構築することが可能である。ワクシニアウイルスのウェスタンリザーブ株（ＶＶ）は、ブリティッシュコロンビア大学のＳ．Ｇｉｌｌａｍから譲り受けたものであるが、それは科学的な供給源から入手可能である。ＶＶ株はＣＶ−１細胞（ＡＴＣＣ）上で培養した。ＣＶ−１細胞は、ＤＭＥＭ／熱不活性化した１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＨｙＣｌｏｎｅ  ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、１００Ｂｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２０ｍＭのＨｅｐｅｓにおいて培養した。ＲＭＡ細胞は、ＲＰＭＩ／１０％ＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、１００Ｂｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２０ｍＭのＨｅｐｅｓにおいて培養した。ＶＶの力価は、それぞれＶｅｒｏ細胞及びＣＶ−１細胞を用いて、組織培養感染量（ＴＣＩＤ）アッセイ又は標準的なプラークアッセイ（ＰＦＵ）によって決定した。ＴＡＰ１及びＴＡＰ２の両方に陰性であるＴ２細胞を、マウスＫ−２Ｋｂでトランスフェクトし、標準的なプロトコールを用いて安定なクローンを樹立した。
【００４６】
（実施例１）
発現可能なＴＡＰ−１遺伝子及びＴＡＰ−２遺伝子を有する組換えワクシニアウイルス（ＶＶ−ｈＴＡＰ１，２）並びにワクシニアウイルスで、マウスを同時感染させた。得られた細胞傷害性Ｔリンパ球の活性を測定し、対照と比較した。得られた、致死性ウイルスのチャレンジからの防御を定量化した。
【００４７】
ＴＡＰ−１遺伝子及びＴＡＰ−２遺伝子を含む組換えワクシニアウイルス（ＶＶ−ｈＴＡＰ１，２）、並びにＴＡＰ遺伝子を含んでいない対照の組換えワクシニアウイルス（ＶＶ−ＰＪＳ−５）を、本明細書において概説する標準的な方法によって調製した。各群（ｎ＝３）のマウスを、等しい用量のＶＶ−ｈＴＡＰ１，２又はＶＶ−ＰＪＳ−５でワクチン接種し、１２日後に、致死量のワクシニアウイルス−ＷＲ（向神経性株）を用いて、経鼻経路でチャレンジした。体重の減少がチャレンジ前の体重の７５％まで落ちた場合、マウスは安楽死させた。
【００４８】
３×１０３ＩＵ、３×１０４ＩＵ、及び３×１０５ＩＵである３つの異なる用量のＶＶ−ｈＴＡＰ１，２を、３つの異なる動物群に投与した。４つ目の群には、ＰＢＳを用いて擬似的なワクチン接種を行った。結果を、添付の図面の図１にグラフで示す。これらのグラフは、ＶＶｈＴＡＰ１，２でワクチン接種したマウスが、擬似的なワクチン接種をした動物と比較して、罹患又は死亡を示すことなく、全ての用量でのチャレンジに対して耐性を有し得たことを示す。
【００４９】
同様の方法で、３つの群の対照マウスを、同一の３つの異なる用量のＶＶ−ＰＪＳ−５でワクチン接種し、同様に追跡した。これらの結果を、図１の擬似的なワクチン接種の結果と共に、添付の図２にグラフで示す。最も高いワクチン接種量のマウスのみが、罹患又は死亡を示すことなく、チャレンジに対して耐性を有し得た。ＶＶｈＴＡＰ１，２（３×１０３ＩＵ）と同一の防御を得るためには、ＶＶ−ＰＪＳ−５（３ｅ５ＩＵ）のワクチン接種量を１００倍増やす必要があった。
【００５０】
この実験は、組換えＶＶ−ｈＴＡＰ１，２が、単独で、その後に起こるポックスウイルス感染に対する効果的なワクチンとして作用することを示している。この用途において、組換えＶＶ−ｈＴＡＰ１，２は、ＴＡＰを有さないＶＶ−ＰＪＳ−５組換えウイルスよりも効果的であるため、その後にポックスウイルスの進入が起こる場合、格別な有効性は、ウイルスベクターのみではなく、細胞内におけるＴＡＰの存在によるものであると安全に結論づけることができる。
【００５１】
（実施例２）
体重の減少がウイルスチャレンジに対する耐性の適切な評価基準であることを確認するために、ＰＢＳ、ＶＶ−ｈＴＡＰ１，２（３×１０３ＩＵ）、又はＶＶ−ＰＪＳ−５（３×１０３ＩＵ）のいずれかでワクチン接種したマウス群において、ＶＶ−ＷＲでのチャレンジの３日後及び５日後に、肺のウイルス血症（動物の肺の血液におけるウイルスの存在）及び体重の減少を測定した。結果を、添付の図３にグラフで示す。体重減少と肺のウイルス血症との間には非常に大きな相関があった。
【００５２】
（実施例３）
ＶＶ−ＰＪＳ−５に対する最小及び最大の（ＣＴＬ）応答を得るために必要な感染量を決定した。
【００５３】
ＶＶに感染したマウスにおける細胞傷害性Ｔ細胞の活性は、感染量に依存する。様々な用量のＶＶに感染したマウスから得た脾細胞を、ＭＨＣクラス１拘束性ＶＶ抗原を表面上に有する細胞標的を殺す能力についてアッセイした。用量応答性の力価曲線を本明細書の図４として示す。低い感染量ではＶＶ特異的なＣＴＬ活性は刺激されない。最大のＣＴＬ活性は高用量で得られた。
【００５４】
ＶＶ−ＰＪ５−５（ＴＡＰをコードしていない組換えワクシニアウイルス）に対する最小及び最大のＣＴＬ応答を得るために必要な感染量を決定し、ＣＴＬ活性を、等しい低用量のＶＶ−ｈＴＡＰ１，２又はＶＶ−ＰＪＳ５に感染したマウスの間で比較した。結果を、添付の図５にグラフで示す。ＶＶ−ｈＴＡＰ１，２に感染したマウスにおけるＣＴＬ活性は、等しい低用量のＶＶ−ＰＪＳ−５により得られる活性よりもおよそ２倍大きく、このことは、観察された増大がｈＴＡＰ１，２の存在に特異的なものであったことを示している。
【００５５】
（実施例４）
ペプチド転移アッセイを用いて、細胞質の放射性標識ペプチドの、小胞体（ＥＲ）への蓄積を測定した。これはＴＡＰ活性の評価基準である。ＡＴＰの存否により、ＥＲにおけるペプチドの蓄積が、活性な輸送によるものであることが確認された。結果を、棒グラフとして図６に示す。ＴＡＰノックアウトマウスから得た脾細胞はペプチドを転移することができず、このことにより、観察された蓄積がＴＡＰの活性によるものであることが確認された。ペプチド転移の活性は、ＶＶ−ＰＪＳ−５に感染したマウス又は正常な未感染のマウスよりもＶＶ−ｈＴＡＰ１，２に感染したマウスにおいて高く、このことは、増大した活性がｈＴＡＰ１の発現によるものであったことを示している。
【００５６】
（実施例５）
ヒトＴＡＰを過剰発現するマウスの組織病理学的試験
マウスを、Ｉ：未処理、ＩＩ：ＶＶ−ｈＴＡＰ１，２（３×１０４ＩＵ）に感染、ＩＩＩ：ＶＶ−ＰＪＳ−５（３×１０４ＩＵ）に感染、の３つの群に無作為に分けた。ＩＩ群及びＩＩＩ群のマウスは、感染の５日後、１５日後、及び３０日後に屠殺した。未処理のマウス（群Ｉ）は、群Ｉ及びＩＩの感染の５日後に屠殺した。腎臓、唾液腺、腸、肺、及び関節を各マウスから採取した。組織を１０％ホルマリン緩衝液内で固定し、パラフィン包埋のための通常の処理を行った。各組織から得た（組織サンプルの全体にわたって間隔をあけて）１５個の切片を切断し、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。組織病理学的な変化を、経験を有する盲検者が評価した。各組織を、異常な病変及び炎症性浸潤について試験した。
【００５７】
自己免疫性炎症の形跡についての組織病理学的試験を、ＶＶ−ｈＴＡＰ１，２に感染したマウス、ＶＶ−ＰＪＳ−５に感染したマウス、又は未感染のマウスにおいて実施した。腎臓、唾液腺、腸、肺、及び関節を、異常な病変及び浸潤白血球について格付けした。結果を以下の表に示す。感染後３０日間にわたり、感染したマウスの組織及び未感染のマウスの組織において差は見られなかった。したがって、ＴＡＰの過剰発現による増強した炎症又は自己免疫の形跡は見られず、ＴＡＰの過剰発現は自己免疫を引き起こさないと確実に結論づけることができる。
【００５８】
表１．ＶＶ−ＰＪＳ−５に感染した動物及びＶＶ−ｈＴＡＰ１，２に感染した動物から得た組織の病変
【表１】
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＊正常は、試験した組織において病原又は浸潤白血球がないことであると定義される
【００５９】
（実施例６）
実験用マウスを用いて実験を行い、ＶＶ特異的なＴ細胞の免疫応答に対する、ＶＶに感染した細胞におけるＴＡＰの過剰発現の影響を調べた。
【００６０】
ＶＶ抗原に特異的なエフェクターを得るために、感染量の、ＶＶ−ｈＴＡＰ１，２低用量（１×１０４ＰＦＵ）、ＶＶ−ＰＪＳ−５低用量（１×１０４ＰＦＵ）、又はＶＶ−ＰＪＳ−５高用量（５×１０６ＰＦＵ）でマウスを感染させた。感染の６日後、脾細胞を取り出し、赤血球から分離し、培養し、ＶＶ−ＰＪＳ５に感染させた（３．４×１０７ＰＦＵ／１×１０８同系脾細胞、ＭＯＩ＝０．３３５）放射線照射した同系脾細胞を用いて、インビトロで３日間再刺激した。細胞傷害活性を測定するために、ＶＶ−ＰＪＳ−５に一晩感染させた（ＭＯＩ＝０．３４）標的ＲＭＡ細胞を用いて、標準的な４時間の５１Ｃｒ放出アッセイを行った。標的を、Ｎａ５１Ｃｒ０４を用いて３７℃で１時間標識し（７０ＢＣｉ／１０６細胞）、次に、標準的な４時間の５１Ｃｒ放出アッセイを行った。細胞傷害性の試験を、様々なエフェクター：標的の比率で、Ｖ型の９６ウェルプレートにおいて実施した。
【００６１】
用量及び結果を、添付の図７にグラフで示す。ＶＶ−ｈＴＡＰ１，２（４×１０３ＰＦＵ）に感染したマウスの脾臓から得たＴ細胞のＶＶ抗原特異的な活性は、ＶＶ−ＰＪＳ−５（４×１０３ＰＦＵ）に感染したマウスにおける活性よりも大幅に高く、これにより、ＴＡＰの過剰発現によりポックスウイルスに対するより大きなＴ細胞応答を得ることができることが確認される。ＶＶに特異的な細胞傷害活性のこの観察された増強は、ＴＡＰの活性の増大に起因する。
【００６２】
（実施例７）
Ｃ５７ＢＬ／６ナイーブ脾細胞を、インビトロで１Ｂｇ／ｍｌのＬＰＳを用いて２日間刺激し、次に、それぞれＭＯＩ＝５×１０４及びＭＯＩ＝０．２５の２つの用量で、ＶＶ−ＰＪＳ−５又はＶＶ−ｈＴＡＰ１，２のいずれかに一晩感染させた。感染した細胞を次に、表面のＨ−２Ｋｂの全発現、及びＶＶ抗原に関連したＨ−２Ｋｂの発現について試験した。ＦＡＣＳ分析の結果を図８ａに示し、この結果は、表面のＨ−２Ｋｂの発現が、ＶＶ−ｈＴＡＰ１，２に感染した脾細胞とＶＶ−ＰＪＳ５に感染した脾細胞との間で異ならないことを示している。ＶＶに特異的なＣＴＬアッセイの結果を図８ｂとしてグラフで示し、この結果は、ＶＶ−ＰＪＳ−５に感染した標的と比較して、ＶＶ−ｈＴＡＰ１，２に感染したナイーブ脾細胞標的の死滅が増大したことを示している。したがって、抗原提示細胞におけるＴＡＰの過剰発現は、脾細胞におけるＶＶ特異的なＭＨＣクラス１の発現を増大させることによってＣＴＬ活性を増大させるが、全ＭＨＣクラス１の発現を増大させることによっては増大させないことが示される。ＶＶに対するこの特異性は、この用途において特別な活性を有し且つ副作用を有さないポックスウイルスのワクチン及びワクチンアジュバントを開発するために、ＴＡＰ増大アプローチが、特定の、且つ特別に効果的な可能性を有することを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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