(57)【要約】  本発明は、Ｆｃ含有タンパク質を含む液体における遊離Ｆｃ部分の濃度を低下させるプロセスであって、カチオン交換クロマトグラフィーステップを含むプロセスに関する。
2010501623.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆｃ含有タンパク質を含む液体中の遊離Ｆｃ部分の濃度を低下させる方法であって、当該方法が、当該液体をカチオン交換クロマトグラフィーにかけることを含む、前記方法。
【請求項２】
前記Ｆｃ含有タンパク質の等電点（ｐI）より少なくとも１単位低いｐＨで、カチオン交換レジン上に前記液体をロードするステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
５.５〜７.５のｐＨ及び６〜１０ｍＳ／ｃｍの電気伝導性を有する緩衝液で前記カチオン交換レジンを洗浄するステップを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記洗浄ステップを、８.２〜８.６ｍＳ／ｃｍの電気伝導性で行う、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記洗浄ステップを６.０〜７.０のｐＨで行う、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
前記洗浄ステップを７５〜１２５ｍＭリン酸ナトリウムを含む緩衝液中で行う、請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
７.０〜８.５の範囲のｐＨでＦｃ含有タンパク質を溶出するステップを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記溶出ステップが、１５〜２２ｍＳ／ｃｍの電気伝導性で行われる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記カチオン交換クロマトグラフィーが、強力なカチオン交換レジンで行われる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記カチオン交換レジンが、ＳＯ3-基を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記レジンが、架橋されたメタクリレートマトリクスを含む、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、及びヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーから選ばれる精製ステップをさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｆｃ含有タンパク質が、免疫グロブリン(Ｉｇ)定常領域を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記定常領域が、ヒト定常領域である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記免疫グロブリンが、ＩｇＧ1である、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記定常領域が、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｆｃ含有タンパク質が、免疫グロブリン可変領域を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記Ｆｃ含有タンパク質が抗体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｆｃ含有タンパク質が、Ｆｃ融合タンパク質である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記Ｆｃ含有タンパク質が、腫瘍壊死因子受容体(ＴＮＦＲ)スーパーファミリーのメンバーのリガンド結合性部分を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記リガンド結合性部分が、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、又はそのＴＮＦ結合性断片の細胞外ドメインから選ばれる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記リガンド結合性部分が、ＢＡＦＦ-Ｒ、ＢＣＭＡ、ＴＡＣＩ、又はそれらの断片であって、Ｂｌｙｓ若しくはＡＰＲＩＬのうちの少なくとも１に結合するものの細胞外ドメインから選ばれる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記Ｆｃ融合タンパク質が、以下の：
ａ.配列番号２の３４〜６６のアミノ酸；
ｂ.配列番号２の７１〜１０４のアミノ酸；
ｃ.配列番号２の３４〜１０４のアミノ酸；
ｄ.配列番号２の３０〜１１０のアミノ酸；
ｅ.配列番号３；
ｆ.配列番号４；
ｇ.高度にストリンジェントな条件下で、配列番号５、６又は７の相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；及び
ｈ.(ｃ)、(ｄ)、(ｅ)、又は(ｆ)のポリペプチドに少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％配列同一性を有する(ｃ)、(ｄ)、(ｅ)、又は(ｆ)のいずれかのムテイン；
から選ばれるポリペプチドを含み、ここで前記ポリペプチドが、Ｂｌｙｓ又はＡＰＲＩＬのうちの少なくとも１に結合する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
Ｆｃ含有タンパク質を含む組成物における遊離Ｆｃ部分の濃度を低下するためのカチオン交換クロマトグラフィーの使用。
【請求項２５】
遊離Ｆｃの前記濃度が、前記組成物の総タンパク質濃度の５％未満、２％未満、又は１％未満、又は０.５％未満、又は０.２％未満、又は０.１％未満に低減される、請求項２４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質精製の分野に属する。より具体的に、本発明は、特にＦｃ含有タンパク質調製における遊離Ｆｃ部分の量を低減するためのカチオン交換クロマトグラフィーを介したＦｃ含有タンパク質の精製に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質は、「生物製剤」と一般的に呼ばれる薬物として商業的に重要になってきている。最大の課題のうちの１つは、商業規模でタンパク質を精製するための費用の安くかつ効率のよい方法の開発である。多くの方法がタンパク質の大規模製造に利用できる一方で、粗生成物、例えば培養上清、は、所望の生成物ばかりでなく、所望の生成物から分離することが難しい不純物も含む。組換えタンパク質生成物を発現する細胞の細胞培養上清は、当該細胞が無血清倍地中で増殖されるならばあまり不純物を含まないかもしれないが、宿主細胞タンパク質(ＨＣＰ)を精製プロセスの間に除去する必要性が残る。さらに、保険機関は、ヒト投与用のタンパク質に高い基準の純度を要求する。
【０００３】
タンパク質精製に広く用いられる多くのクロマトグラフィーシステムが知られている。
【０００４】
イオン交換クロマトグラフィーシステムは、荷電の差異に基づいて、主にタンパク質の分離に用いられる。
【０００５】
アニオン交換体は、弱いアニオン交換体又は強いアニオン交換体として分類することができる。弱いアニオン交換体上の荷電基は弱塩基であり、脱プロトン化されており、そして高ｐＨではその荷電を失う。ＤＥＡＥセファロースは弱いアニオン交換体の例であり、ここで当該アミノ酸はｐＨ９以下で正に荷電され、そして高ｐＨ値でその荷電を徐々に失う。ジエチルアミノエチル(ＤＥＡＥ)又はジエチル-(2-ヒドロキシ-プロピル)アミノエチル(ＤＥＡＥ)又はジエチル-(２-ヒドロキシ-プロピル)アミノエチル(ＱＡＥ)は、例えば対イオンとして塩素を有する。他方、強力なアニオン交換体は、強力な塩基を含み、当該塩基はイオン交換クロマトグラフィーに通常用いられるｐＨ範囲(ｐＨ１〜１４)を通じて正に荷電されたままである。Ｑ-セファロース(Ｑは四級アンモニウムを表す)は、強力なアニオン交換体の例である。
【０００６】
カチオン交換体もまた、弱いカチオン交換体又は強いカチオン交換体に分類することができる。強いカチオン交換体は、ｐＨ１〜１４で荷電されたままである強い酸(例えば、スルホプロピル基)を含み；一方弱いカチオン交換体は弱い酸(例えばカルボキシメチル基)を含み、当該基はｐＨが４又は５以下に低下するとその荷電を徐々に失う。カルボキシメチル(ＣＭ)及びスルホプロピル(ＳＰ)は、例えばナトリウムを対イオンとして有する。
【０００７】
異なるクロマトグラフィーレジンは、ヒドロキシアパタイトと呼ばれる不溶性水酸化リン酸カルシウムに基づいている。ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、マトリクスとリガンドの両方を形成する不溶性水酸化リン酸カルシウム(Ｃａ5(ＰＯ4)3ＯＨ)2を利用するタンパク質の精製法である。官能基は、正に荷電したカルシウムイオン(Ｃ-サイト)と、負に荷電したリン酸基のクラスター(Ｐサイト)の対からなる。ヒドロキシアパタイトとタンパク質の相互作用は、複合的でありかつ多重モードである。本発明の１の方法では、タンパク質上の正に荷電したアミノ酸基は、負に荷電したＰサイトに会合し、そしてタンパク質のカルボキシル基はＣサイトに配位錯体によりＣサイトと相互作用する(Shepardら、2000)。
【０００８】
結晶ヒドロキシアパタイトは、クロマトグラフィーにおいて使用されるヒドロキシアパタイトの第一のタイプであった。セラミックヒドロキシアパタイト(ＣＨＡ)クロマトグラフィーは、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにおける更なる開発品である。セラミックヒドロキシアパタイトは、高い耐久性、良好なタンパク質結合性を有し、そして結晶ヒドロキシアパタイトよりも高い流量及び圧力で使用することができる(Volaら、1993)。
【０００９】
ヒドロキシアパタイトは、タンパク質、核酸、並びに抗体のクロマトグラフィーによる分離において使用されてきた。ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにおいて、カラムは通常平衡化されており、そしてサンプルを低濃度のリン酸緩衝液中で適用し、そして吸着されたタンパク質を次にリン酸緩衝液の濃度勾配で溶出する(Giovanniniら、2000)。
【００１０】
タンパク質のさらなる精製方法は、クロマトグラフィーに固定された別のタンパク質に対する目的のタンパク質の親和性に基づいている。このような固定されたリガンドの例は、特定の免疫グロブリンのＦｃ部分に対して特異性を有する細菌細胞壁タンパク質であるタンパク質Ａ及びタンパク質Ｇである。タンパク質Ａ及びタンパク質Ｇの両方が、ＩｇＧ抗体に対して強力な親和性を有するが、これらは他の免疫グロブリンクラス及びイソ型にもさまざまな親和性を有する。
【００１１】
タンパク質Ａは、細菌スタフィロコッカス アウレウス(Staphylococcus aureus)により生成され、そしてＩｇＧのＦｃ領域に対する４の結合部位を含む４３０００ダルトンのタンパク質である。タンパク質Ｇは、Ｇ群連鎖球菌から産生され、そしてＩｇＧ Ｆｃ領域に対して二つの結合部位を有する。両タンパク質は、さまざまなタイプの免疫グロブリンに対する親和性について広く特徴決定された。さらに、タンパク質ＡとＧの結合能を組み合わせる遺伝子操作されたタンパク質であるタンパク質Ａ／Ｇが開発された。さらにタンパク質Ｌは、ペプトストレプトコッカスに由来する細菌タンパク質であり、Ｉｇ軽鎖を含む免疫グロブリン及びその断片に結合する細菌タンパク質である(Akerstrom 及びBjork、1989)。
【００１２】
タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、及びタンパク質Ｌのアフィニティークロマトグラフィーは、抗体の単離及び精製に広く使用される。
【００１３】
タンパク質Ａ及びタンパク質Ｇ残基の結合部位は免疫グロブリンのＦｃ領域にあるので、タンパク質Ａ及びタンパク質Ｇ(又はタンパク質Ａ／Ｇ)のアフィニティクロマトグラフィーは、いわゆるＦｃ融合タンパク質の精製を許容する。タンパク質Ｌは、Ｉｇ軽鎖に結合し、そうして軽鎖を含む抗体の精製に用いることができる。
【００１４】
抗体又は免疫グロブリン(Ｉｇ)は、ジスルフィド結合により結合された軽鎖と重鎖とからなる。各鎖のアミノ末端に位置する第一ドメインは、アミノ酸配列の点で様々であり、抗体結合特異性の広いスペクトルを提供する。これらのドメインは、可変重鎖(ＶＨ)及び可変軽鎖(ＶＬ)として知られている。各鎖の別のドメインは、アミノ酸配列の点では比較的不変性であり、そして定常重鎖(ＣＨ)及び定常軽鎖(ＣＬ)領域として知られている。
【００１５】
抗体の主要クラスは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭであり；そしてこれらのクラスは、さらにサブクラス(イソ型)にさらに分けることができる。例えば、ＩｇＧクラスは、４つのサブクラス、つまり、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、及びＩｇＧ4を有する。
【００１６】
抗体クラスの差異は、免疫グロブリンクラスに依存して、１〜４の定常ドメイン(ＣＨ１〜ＣＨ４)を含む重鎖定常領域における差異から生じる。いわゆるヒンジ領域は、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間に位置する。ヒンジ領域は特に、タンパク質分解性の切断に対して感受性であり；このようなタンパク質分解は、切断の正確な部位に依存して２又は３の断片をもたらす。ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む重鎖定常領域の当該部分は、免疫グロブリンの「Ｆｃ」部分とも呼ばれる。抗体はこうしてＦｃ含有タンパク質である。別のタイプのＦｃ含有タンパク質は、いわゆるＦｃ融合タンパク質である。
【００１７】
治療タンパク質として使用される幾つかの抗体が知られている。市場における組み換えタンパク質についての例は、例えば：アブシキシマブ、リツキシマブ、バシリキシマブ、ダクリズマブ、パリビズマブ、インフリキシマブ、ベバシズマブ又はオマリズマブである。
【００１８】
Ｆｃ融合タンパク質は、免疫グロブリンＧ(ＩｇＧ)であることが多い免疫グロブリンのＦｃ領域に融合されたタンパク質の効果領域、例えば抗体のＦａｂ領域又は受容体の結合領域、からなるキメラタンパク質である。Ｆｃ融合タンパク質は、Ｆｃ領域により付与される利点、例えば以下の：
ＩｇＧイソ型によって変化する親和性を用いてタンパク質Ａ又はタンパク質Ｇクロマトグラフィーを用いて精製することができること(ヒトＩｇＧ1、ＩｇＧ2、及びＩｇＧ4は、タンパク質Ａに強く結合し、そしてＩｇＧ3を含むヒトＩｇＧの全てはタンパク質Ｇに強く結合する。)、
Ｆｃ領域がリソソーム分解から保護するサルベージ受容体ＦｃＲｎに結合することから、循環器系において半減期が増加すること、
Ｆｃ融合タンパク質の医薬としての使用に基づき、Ｆｃエフェクター機能が望ましいことがあること(このようなエフェクター機能は、Ｆｃ受容体(ＦｃγＲｓ)との相互作用を介した抗体依存性細胞障害性(ＡＤＣＣ)と、補体成分１ｑ(Ｃ１ｑ)に結合することによる補体依存性細胞傷害性(ＣＤＣ)を含む。ＩｇＧイソ型は、異なるレベルのエフェクター機能を発揮する。ヒトＩｇＧ1及びＩｇＧ3は、強力なＡＤＣＣ及びＣＤＣ効果を有する一方で、ヒトＩｇＧ2は、弱いＡＤＣＣ及びＣＤＣ効果を有する。ヒトＩｇＧ4は、弱いＡＤＣＣを示し、そしてＣＤＣ効果を示さない。)
を提供するので、治療薬として広く使用される。
【００１９】
血清半減期及びエフェクター機能は、Ｆｃ融合タンパク質について意図された治療用途に依存して、それぞれＦｃＲｎ、ＦｃγＲｓ及びＣ１ｑへの結合性を増加又は低下するためにＦｃ領域を遺伝子操作することによって調節することができる。
【００２０】
ＡＤＣＣでは、抗体のＦｃ領域は、ナチュラルキラー及びマクロファージなどの免疫効果細胞の表面上のＦｃ受容体(ＦｃγＲ)に結合し、標的細胞の食作用又は溶解をもたらす。
【００２１】
ＣＤＣでは、抗体は、細胞表面で補体カスケードを引き起こすことにより標的細胞を殺傷する。ＩｇＧイソ型は、ＩｇＧ4＜ＩｇＧ2＜ＩｇＧ1＜ＩｇＧ3の順番で増加する異なるレベルのエフェクター機能を発揮する。ヒトＩｇＧ1は、高ＡＤＣＣ及びＣＤＣを示し、そして病原体及び癌細胞に対する治療用途に最も適している。
【００２２】
ある状況では、例えば、標的細胞の枯渇が所望されない場合、エフェクター機能の停止又は減少が要求されることもある。逆に、腫瘍学に用いることを意図した抗体の場合、エフェクター機能を増加させることは、治療活性を改善しうる(Carterら、2006)。
【００２３】
ＦｃγＲｓ又は補体因子の結合を改良又は低減のいずれかするために、Ｆｃ領域を遺伝子操作することにより、エフェクター機能の改変を達成することができる。
【００２４】
活性型ＦｃγＲ(ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩａ及びＦｃγＲＩＩＩｂ)及び阻害型ＦｃγＲ(ＦｃγＲＩＩｂ)、又は第一補体成分(Ｃ１ｑ)に対するＩｇＧの結合性は、ヒンジ領域及びＣＨ２ドメインに位置する残基に依存する。ＣＨ２ドメインの二つの領域は、ＦｃγＲ及び補体Ｃ１ｑ結合について決定的であり、そしてＩｇＧ2及びＩｇＧ4において固有の配列を有する。例えば、２３３〜２３６の位置でＩｇＧ2残基をヒトＩｇＧ1残基へと置換することは、ＡＤＣＣ及びＣＤＣをかなり低減する(Armourら、1999及びShields ら、2001)
【００２５】
ＩｇＧのＣＨ２ドメインに多くの突然変異を導入し、そしてそのＡＤＣＣ及びＣＤＣへの影響がin vitroで試験された(Shieldsら、2001、Idusogieら、2001及び2000、Steurerら、1995)。特に、Ｅ３３３のアラニンへの変異は、ＡＤＣＣ及びＣＤＣをともに増加させることが報告された(Ibusogieら、2000及び2001)。
【００２６】
治療抗体の血清半減期を増加させることは、その効力を改善するための別の方法であり、高い循環レベル、投与頻度を少なくし、そして用量の低下を可能にする。これは、Ｆｃ領域の新生児ＦｃＲ(ＦｃＲｎ)への結合性を高めることにより達成することができる。内皮細胞の表面に発現されるＦｃＲｎは、ｐＨ依存的な様式でＩｇＧに結合し、そしてＩｇＧを分解から保護する。ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとのあいだの接続部に位置する幾つかの突然変異がＩｇＧ1の半減期を増加させるということが示された(Hintonら、2004、及びVaccaroら、2005)。
【００２７】
以下の表は、ＩｇＧ Ｆｃ領域の幾つかの既知の変異を要約したものである(Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎのウェブサイトから引用)
【表１】
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【００２８】
治療有用性を有するＦｃ融合タンパク質のクラス、Ｆｃ領域は、腫瘍壊死因子受容体(ＴＮＦ-Ｒ)スーパーファミリーに属する特定の受容体の細胞外ドメインに融合した(Locksleyら2001、Bodmerら、2002、Bossenら、2006)。ＴＮＦＲファミリーのメンバーの特徴は、Naismith及びSprang、1998に記載されるように、細胞ガイドメインにおけるシステイン-リッチ シュード-リピート(pseudo-repeat)が存在することである。
【００２９】
２つのＴＮＦ受容体、ｐ５５(ＴＮＦＲ１)及びｐ７５ＴＮＦＲ(ＴＮＦＲ２)は、ＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーの例である。エタネルセプトは、ｐ７５ＴＮＦＲの可溶性部分を含有するＦｃ融合タンパク質である(例えば、WO91/03553、WO 94/06476)。エタネルセプトは、商標名Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）で子宮内膜症、Ｃ型肝炎ウイルス感染、ＨＩＶ感染症、乾癬性関節炎、乾癬、リウマチ様関節、喘息、強直性脊椎炎、心不全、移植片対宿主疾患、肺線維症、クローン病の治療用に市販されている。レネルセプトは、ヒトｐ５５ＴＮＦ受容体とヒトＩｇＧのＦｃ部分の細胞外成分を含む融合タンパク質であり、そして重篤な敗血症及び多発性硬化症の潜在的な治療に向けられる。
【００３０】
ＯＸ４０は、ＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーでもある。ＯＸ４０-ＩｇＧ1及びＯＸ４０-ｈｌＧ４ｍｕｔ融合タンパク質は、炎症及び自己免疫疾患、例えばクローン病などの治療用に調製された。
【００３１】
ＢＲ３とも呼ばれるＢＡＦＦ-ＲのＦｃ融合タンパク質(ＢＲ３-Ｆｃとも呼ばれる)は、一連のＢＡＦＦ(ＴＮＦファミリーのＢ細胞活性化因子)阻害剤由来の可溶性デコイ受容体(decoy受容体)であり、リューマチ様関節炎(ＲＡ)及び全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)などの自己免疫疾患の潜在的な治療のために開発された。
【００３２】
ＢＣＭＡは、ＴＮＦＲスーパーファミリーに属するさらなる受容体である。ＢＣＭＡ-Ｉｇ融合タンパク質が自己免疫疾患を抑制することが記載されていた(Melchers、2006)。
【００３３】
ＴＮＦ-Ｒスーパーファミリーの別の受容体は、ＴＡＣＩ、膜貫通活性化因子及びＣＡＭＬ-相互作用因子(von Bulow及びBram, 1997; US 5,969,102, Grossら、2000)であり、当該受容体は、２つのシステインリッチ シュード-リピートを含む細胞外ドメインを有する。１のリガンドは、ＢｌｙＳ、ＢＡＦＦ、ニュートロキン-α、ＴＡＬＬ-１、ｚＴＮＦ４、又はＴＨＡＮＫと名づけられる(Mooreら、1999)。他のリガンドは、ＡＰＲＩＬ、ＴＮＲＦデスリガンド-１又はＺＴＮＦ２と名づけられる(Hahneら、J. Exp. Med.188:1185(1998)。
【００３４】
ＩｇＧ Ｆｃ領域に融合するＴＡＣＩ受容体の可溶性形態を含む融合タンパク質がよく知られ、そしてＴＡＣＩ-Ｆｃと名づけられた(WO 00/40716、WO02/094852)。ＴＡＣＩ-Ｆｃは、ＢＬｙＳ及びＡＰＲＩＬのＢ-細胞に対する結合を阻害する(Xiaら、2000)。これは、全身性エリスマトーデス(ＳＬＥ)、リューマチ様関節炎(ＲＡ)及び悪性血液疾患を含む自己免疫疾患の治療、並びに多発性硬化症(ＭＳ)の治療のために開発された。これに加え、ＴＡＣＩ-Ｆｃは、多発性骨髄腫(Novakら,2004; Moreauら、2004)、及び非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)、慢性リンパ球性白血病(ＣＬＬ)及びヴァルデンストレームマクログロブリン血症においても発達した。
【００３５】
Ｆｃ含有タンパク質、特に抗体及びＦｃ融合タンパク質の治療的有用性を前提として、ヒト投与に適したかなりの量の高精製タンパク質についての必要性が存在する。
【発明の概要】
【００３６】
Ｆｃ含有タンパク質の製造の間に遭遇する問題のひとつは、「遊離Ｆｃ部分」、つまりＦｃ含有タンパク質由来のポリペプチド断片であって、抗体可変領域に由来するか、又はＦｃ融合タンパク質に通常存在する他の特異的タンパク質又はドメインに由来するかなりの部分を含まない断片の存在である。
【００３７】
本発明は、この問題に対処した。本発明は、Ｆｃ含有タンパク質の液体組成物又は調製品の精製過程の開発に基づいており、それにより不純物として存在しうる遊離Ｆｃ部分の量を低減することができる。
【００３８】
その結果、本発明は、Ｆｃ含有タンパク質を含む液体中の遊離Ｆｃ部分の濃度を低下させる方法であって、カチオン交換クロマトグラフィーに当該液体を供することを含む方法に関する。
【００３９】
第二態様では、本発明は、Ｆｃ含有タンパク質調製品における遊離Ｆｃの低下のためのカチオン交換クロマトグラフィーの使用に関する。
【００４０】
第三態様では、本発明は、５％未満、又は２％未満、又は１％未満、又は０.５％未満、又は０.２％未満、又は０.１％未満のＦｃ部分を含む精製Ｆｃ含有タンパク質に関する。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】図１は、実施例２に記載されたカチオン交換クロマトグラフィーから生じたさまざまな画分の非還元銀染色ＳＤＳ-ＰＡＧＥを示す。レーン１：分子量マーカー、レーン２：精製ＴＡＣＩ-Ｆｃ、Ｌａｎｅ３：ロード、Ｌａｎｅ４：洗浄液２、レーン５：溶出液２、レーン６：洗浄液３、レーン７：溶出液３、レーン８：洗浄液１、レーン９溶出液１、レーン１０：精製遊離Ｆｃ。
【００４２】
【図２】図２は、実施例２に記載されるカチオン交換クロマトグラフィーのクロマトグラフィープロファイルを示す。
【００４３】
配列番号１は、ＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーに共通するシステイン フィンガープリント配列(システインリッチシュードリピート)である。
配列番号２は、ヒトＴＡＣＩレセプターの全長配列である(例えば、WO 98/39361に記載される)。
配列番号３は、本発明のヒトＦｃ配列の例である(例えば、WO02/094852に記載される)。
配列番号４は、本発明の好ましいＦｃ融合タンパク質であって、ＴＡＣＩの細胞外部分とヒトＩｇＧ1Ｆｃ部分に由来する配列を含むタンパク質である(例えば、WO 02/094852に記載される)。
配列番号５は、配列番号２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
配列番号６は、配列番号３のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
配列番号７は、配列番号４のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
本発明は、カチオン交換クロマトグラフィーが、Ｆｃ含有タンパク質の液体又は組成物中に存在しうる遊離Ｆｃ部分の量又は程度を低減することができるという発見に基づいている。
【００４５】
その結果、本発明は、Ｆｃ含有タンパク質を含む液体中に遊離Ｆｃ部分の濃度を低下させる方法であって、当該方法が当該液体をカチオン交換クロマトグラフィーに供することを含む、方法に関する。
【００４６】
Ｆｃ含有タンパク質を含む液体は、例えばヒト又は動物由来の体液、又は細胞培養から得られた液体、例えば細胞培養上清などの任意の組成物又は調製品であってもよい。当該液体は、他の精製ステップから生じる液体、例えば捕捉ステップ又は任意のほかの適切な精製ステップ、例えば以下に詳細に説明されるステップから生じる溶出液又は通液（flow through)であってもよい。
【００４７】
本明細書に使用される「Ｆｃ含有タンパク質」という語句は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４ドメイン、又はその任意の組み合わせ、そして好ましくはヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインから選ばれる少なくとも１の免疫グロブリン定常ドメインを有する任意のタンパク質を指す。免疫グロブリン定常ドメインは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、又はその組み合わせ若しくはイソ型に由来することもある。好ましくは、当該免疫グロブリンはＩｇＧ、例えばＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、又はＩｇＧ4である。より好ましくは、免疫グロブリンはＩｇＧ1である。
【００４８】
本発明に従ったＦｃ含有タンパク質は、こうして、例えば抗体又はＦｃ融合タンパク質、又はそのバリアント、例えば抗体若しくはＦｃ融合タンパク質の断片、突然変異タンパク質又は機能誘導体であってもよい。
【００４９】
本発明のＦｃ含有タンパク質は、モノマー、ダイマー、又はマルチマーであってもよい。Ｆｃ含有タンパク質は、二量体のＦｃ部分(例えば、２個のジスルフィド架橋ヒンジ-ＣＨ２-ＣＨ３コンストラクトのダイマー)を含み、そのうちの１つのみが免疫グロブリン可変ドメイン、リガンド結合性かつ場合により抑制性の受容体の断片、又は任意の他のタンパク質などのさらなる断片に融合する「シュードダイマー(pseudo-dimer)」であってもよい(「モノマー」と呼ばれることもある)。このようなシュード-ダイマーの例は、２個のＩｇＧヒンジ-ＣＨ２-ＣＨ３コンストラクトのうちの１つに融合されたインターフェロン-βを有するＦｃ融合タンパク質、例えばWO 2005/001025に記載されるタンパク質である。
【００５０】
Ｆｃ含有タンパク質は、２つの異なる非免疫グロブリン部分又は免疫グロブリン可変ドメインを含むヘテロダイマー、又は単一の非免疫グロブリン部分又は免疫グロブリン可変ドメインの２つのコピーを含むホモダイマーであってもよい。
【００５１】
好ましくは、Ｆｃ含有タンパク質はダイマーである。本発明のＦｃ含有タンパク質がホモダイマーであることも好ましい。
【００５２】
本発明では、Ｆｃ含有タンパク質のＦｃ部分は、エフェクター機能を調節するために改変されてもよい。
【００５３】
Ｆｃ部分がＩｇＧ1に由来するならば、例えば、ＥＵインデックス位置(Kabatら、1991)に従った以下のＦｃ変異を導入することができる：
Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ
Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ  ＋  Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ
Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／ΔＧ２３６  ＋  Ａ３２７Ｇ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ
Ｅ３３３Ａ；Ｋ３２２Ａ
【００５４】
さらなるＦｃ変異は、例えば３３０、３３１、２３４、若しくは２３５、又はその組み合わせから選ばれるＥＵインデックス位置における置換であってもよい。ＣＨ２ドメインに位置するＥＵインデックス位置でのアミノ酸置換は、本発明との関連でＦｃ部分に導入されてもよく、Ｎ-結合性の炭化水素結合の潜在位置を取り除くことになる。さらに、ＥＵインデックス位置２２０のシステイン残基をセリン残基に置換してもよく、免疫グロブリン軽鎖定常領域と通常ジスルフィド結合を形成するシステイン残基を取り除くことになる。
【００５５】
本発明に従って、Ｆｃ部分が、配列番号３を含むか又は配列番号３からなるか、又は配列番号６を含むか又は配列番号６からなるポリヌクレオチドによりコードされることが好ましい。
【００５６】
好ましい実施態様では、Ｆｃ含有タンパク質は、免疫グロブリン可変領域、例えば１又は複数の重鎖可変ドメイン及び／又は１又は複数の軽鎖可変ドメインを含む。好ましくは、抗体は１又は２の重鎖可変ドメインを含む。より好ましくは、抗体は１又は２の軽鎖定常及び／又は可変ドメインを含む。
【００５７】
Ｆｃ含有タンパク質が抗体であることが好ましい。
【００５８】
「抗体」という語句は、免疫グロブリン又はその断片を指し、そして抗原結合部位を含む任意のポリペプチドを包含する。当該語句は、非限定的に、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、多特異性抗体、非特異性抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、合成抗体、組み換え抗体、ハイブリッド抗体、変異導入抗体、置換え抗体(grafted antibody)、又はin vitro生成抗体を含む。当該抗体は、既知の抗体イソ型、例えばＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭのいずれかから選ばれてもよい。当該抗体は、モノマー、ダイマー、又はマルチマー、例えばトリマー又はペンタマーであってもよい。
【００５９】
本発明にしたがって精製することができる抗体の例は、アブシキシマブ、リツキシマブ、バシリキシマブ、ダクリズマブ、パリビズマブ、インフリキシマブ、トラスツズマブ、アレムツズマブ、アダリムマブ、セツキシマブ、エファリズマブ、イブリツモマブ、ベバシズマブ、又はオマリズマブである。本発明に記載のカチオン交換クロマトグラフィーに供することができる抗体のさらなる例は、以下の：ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１４７、ＣＤ１６４、ＩＬ-２受容体、ＩＬ-４受容体、ＩＬ-６受容体、ＩＬ-１２受容体、ＩＬ-１８受容体サブユニット(ＩＬ-１８Ｒ-α、ＩＬ-１８Ｒ-β)、ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ、ＢＡＦＦ-Ｒ、ＥＧＦ受容体、ＶＥＧＦ受容体、インテグリンα４β７、インテグリンＶＬＡ４、Ｂ２インテグリン、ＴＲＡＩＬ受容体１、２、３、及び４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、上皮細胞接着分子(ＥｐＣＡＭ)、細胞接着分子-３(ＩＣＡＭ-３)、ＣＴＬＡ４、Ｆｃ-γ-Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩ受容体、ＨＬＡ-ＤＲ１０β、ＨＬＡ-ＤＲ抗原、又はＬ-セレクチンに対する抗体である。
【００６０】
ＴＮＦ、Ｂｌｙｓ、又はインターフェロンγに対する抗体は、治療用として関心の高い抗体のさらなる例である。
【００６１】
Ｆｃ融合タンパク質は、好ましくは本発明の方法に供されるＦｃ含有タンパク質である。
【００６２】
本明細書に使用される「Ｆｃ融合タンパク質」という語句は、タンパク質、特に治療用タンパク質であって、免疫グロブリン由来部分(本明細書では「Ｆｃ部分」と呼ばれる)、及び第二非免疫グロブリンタンパク質由来の部分(本明細書では疾患の治療を意図していようといまいとに関わらず「治療部分」と呼ばれる)を含むタンパク質を包含することを意味する。
【００６３】
治療用Ｆｃ融合タンパク質、つまり動物疾患の治療又は予防を意図されるか、又はヒトの治療又は投与を意図されたＦｃ融合タンパク質は、本発明にしたがって生成することが特に適している。
【００６４】
任意のＦｃ融合タンパク質、例えばインターフェロン-β-含有融合タンパク質は、本発明にしたがって精製されてもよい。好ましくは、本発明の方法は、腫瘍壊死因子受容体(ＴＮＦＲ)スーパーファミリーのメンバーのリガンド結合性断片、例えば細胞外ドメインの全て又は一部を含むＦｃ融合タンパク質を精製するための方法である。
【００６５】
Ｆｃ融合タンパク質の治療部分は、例えばＥＰＯ、ＴＰＯ、成長ホルモン、インターフェロン-α、インターフェロン-β、インターフェロン-γ、ＰＤＧＦ-β、ＶＥＧＦ、ＩＬ-１α、ＩＬ-１β、ＩＬ-２、ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-８、ＩＬ-１０、ＩＬ-１２、ＩＬ-１８、ＩＬ-１８結合性タンパク質、ＴＧＦ-β、ＴＮＦ-α、又はＴＮＦ-βであってもよいし、又はこれらに由来してもよい。
【００６６】
Ｆｃ-融合タンパク質の治療部分は、受容体、例えば膜貫通受容体に由来してもよいし、好ましくは受容体の細胞外ドメインであってもよいし、又はこれに由来してもよいし、そして特に所定の受容体の細胞外部分又はドメインのリガンド結合性断片であってもよいし、これに由来してもよい。治療の関心高い受容体の例は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１４７、ＣＤ１６４、ＩＬ-２受容体、ＩＬ-４受容体、ＩＬ-６受容体、ＩＬ-１２受容体、ＩＬ-１８受容体サブユニット(ＩＬ-１８Ｒ-α、ＩＬ-１８Ｒ-β)、ＥＧＦ受容体、ＶＥＧＦ受容体、インテグリンα４ １０β７、インテグリンＶＬＡ４、Ｂ２インテグリン、ＴＲＡＩＬ受容体１、２、３、及び４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、冗費細胞接着分子(ＥｐＣＡＭ)、細胞内接着分子-３(ＩＣＡＭ-３)、ＣＴＬＡ４(当該分子は細胞障害性Ｔリンパ球関連抗原である)、Ｆｃ-γ-Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩ受容体、ＨＬＡ-ＤＲ１０β、ＨＬＡ-ＤＲ抗原、Ｌ-セレクチンである。
【００６７】
治療部分が、ＴＮＦＲスーパーファミリーに属する受容体に由来するということが特に好ましい。治療部分は、ＴＮＦＲ１(ｐ５５)、ＴＮＦＲ２(ｐ７５)、ＯＸ４０、オステオプロテグリン(Osteoprotegerin)、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＤＲ３、Ｆａｓリガンド、ＴＲＡＩＬ-Ｒ１、ＴＲＡＩＬ-Ｒ２、ＴＲＡＩＬ-Ｒ３、ＴＡＩＬ-Ｒ４、ＮＧＦＲ、ＡＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＢＣＭＡ、ＴＡＣであってもよいし、又はこれらに由来する。
【００６８】
本発明に従うと、ＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーに由来する治療部分は、好ましくはＴＮＦＲのメンバーの細胞外ドメインの全て又は一部を含むか又はこれらからなり、そしてより好ましくはＴＮＦＲのかかるメンバーのリガンド結合性断片を含む。
【００６９】
以下の表５は、本発明に従った治療部分の由来元のＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバー、及びそれぞれのリガンドを列挙する。当業者は、簡単に、例えば所定の受容体のタンパク質断片とそれぞれのリガンドとの間の結合性を計測する単純なin vitroアッセイでＴＮＦＲファミリーのメンバーの「リガンド結合性断片」を決定することができる。このようなアッセイは、例えば、単純なin vitroＲＩＡ又はＥＬＩＳＡ型のサンドイッチアッセイであり、ここでタンパク質のひとつ、例えば受容体断片は、担体(例えばＥＬＩＳＡプレート)に固定され、そしてインキュベートされ、担体上のタンパク質結合部位を第二タンパク質、例えばリガンドで適切にブロッキングを行う。インキュベート後、リガンド結合性、例えばリガンドを放射性標識し、そして、適切な洗浄後にシンチレーションカウンターで結合された放射活性を決定する事により決定される。リガンドの結合性は、標識抗体で、又は第一リガンド特異的抗体と第一抗体の定常部に対する第二標識抗体で決定することができる。こうしてリガンド結合性は、用いられる標識に依存して、例えば呈色反応で容易に決定することができる。
【００７０】
好ましくは、本発明の方法は、以下の表５に列挙されるものから選ばれるＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーに由来する治療部分を含む。
【表２】
2010501623.tif 000004
【００７１】
好ましい実施態様では、Ｆｃ融合タンパク質は、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、又はそれらのＴＮＦ結合性断片の細胞外ドメインから選ばれる治療部分を含む。
【００７２】
更に好ましい実施態様では、Ｆｃ融合タンパク質は、ＢＡＦＦ-Ｒ、ＢＣＭＡ、又はＴＡＣＩ、或いはＢｌｙｓ若しくはＡＰＲＩＬのうちの少なくとも１に結合する断片の細胞外ドメインから選ばれる治療部分を含む。
【００７３】
Ｂｌｙｓ又はＡＰＲＩＬに結合する能力を試験するアッセイは、例えばHymowitzら、2006に記載される。
【００７４】
さらに好ましい実施態様では、Ｆｃ融合タンパク質の治療部分は、配列番号１のシステインリッチシュードリピートを含む。
【００７５】
治療部分がｔＡＣＩに由来することがさらに好ましい。ＴＡＣＩは、好ましくはヒトＴＡＣＩである。配列番号２は、ヒト全長ＴＡＣＩレセプターのアミノ酸配列に対応する(ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ登録番号Ｏ１４８３６)。より好ましくは、治療部分は、好ましくはＴＡＣＩの細胞外ドメインに由来するＴＡＣＩの可溶性部分を含む。好ましくは、ＴＡＣＩ由来の治療部分は、配列番号２の少なくともアミノ酸３３〜６７及び／又は配列番号２のアミノ酸７０から１０４を含む。好ましい実施態様では、本発明に記載の治療部分に含まれるＴＡＣＩ細胞外ドメインは、配列番号２のアミノ酸１〜１６６、又は配列番号２のアミノ酸３０〜１６６、又は配列番号２のアミノ酸３０〜１１９、又は配列番号２のアミノ酸３０〜１１０を含むか、又はこれらからなる。これらの治療部分の全ては、本発明の方法により精製されるＦｃ融合タンパク質の調製に好ましく、そして上に詳細に記載されるＦｃ-部分、そして特に配列番号３を含むか又は配列番号３からなる部分と組み合わされる。本発明にしたがって精製される得に好ましいＦｃ融合タンパク質は、配列番号４を含むか又は配列番号４からなるか、又は配列番号７のポリヌクレオチドによりコードされる。
【００７６】
それゆえ、Ｆｃ融合タンパク質が、以下の：
ａ.配列番号２のアミノ酸３４〜６６；
ｂ.配列番号２のアミノ酸７１〜１０４；
ｃ.配列番号２のアミノ酸３４〜１０４；
ｄ.配列番号２のアミノ酸３０〜１１０；
ｅ.配列番号３；
ｆ.配列番号４；
ｇ.高度にストリンジェントな条件下で、配列番号５、６又は７の相補物にハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；そして
ｈ.(ｃ)、(ｄ)、(ｅ)、又は(ｆ)のポリペプチドに対して少なくとも８０％、又は８５％、又は９０％、又は９５％の配列同一性を有する(ｃ)、(ｄ)、(ｅ)又は(ｆ)のいずれかのムテイン
から選ばれるポリペプチドを含むということが極めて好ましい。
【００７７】
本発明に従って、Ｆｃ含有タンパク質は、総タンパク質濃度の少なくとも５０、４０、３０、２０、若しくは１０％、又はより好ましくは１０％未満に遊離Ｆｃ部分を低減、減少、又は除去するために、カチオン交換クロマトグラフィーにかけられる。
【００７８】
「遊離Ｆｃ部分(複数)」、「遊離Ｆｃ部分」、又は単に「遊離Ｆｃ」という語句は、本明細書に使用される場合、本発明にしたがって精製されるＦｃ含有タンパク質の任意の部分を包含することを意味し、当該タンパク質は、免疫グロブリン定常ドメイン(単数又は複数)に由来し、完全なさらなるドメインを含むことはない。こうして、Ｆｃ含有タンパク質が免疫グロブリン可変ドメインを含む場合、遊離Ｆｃは、可変ドメインのかなりの部分を含まない。Ｆｃ含有タンパク質がＦｃ融合タンパク質である場合、遊離Ｆｃは、Ｆｃ融合タンパク質の治療部分のかなりの部分を含まない。遊離Ｆｃは、例えば、治療部分又は免疫グロブリン可変ドメインのかなりの部分に結合することはないＩｇＧヒンジのダイマー、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン、例えば、パパイン切断により生成するＦｃ部分を含んでもよい。「かなりの部分」は、例えば、８０、８５、９０、９５、９８又は９９％以上の全長可変ドメインであってもよいし、又はＦｃ含有タンパク質に存在する治療部分であってもよい。
【００７９】
Ｆｃ部分に由来するモノマーは、遊離Ｆｃ画分に含まれてもよい。遊離Ｆｃが治療部分又はＩｇ可変ドメイン由来の多くのアミノ酸残基、例えばさらにＦｃ部分に融合する治療部分又は可変ドメインに属する１〜５０、又は１〜２０、又は１〜１０、又は１〜５アミノ酸、又は１若しくは２の単一アミノ酸を含んでもよいということは理解される。
【００８０】
カチオン交換クロマトグラフィーは、任意の適切なカチオン交換レジン、例えば本発明の背景技術において上で説明された弱い又は強いカチオン交換体上で行われてもよい。
【００８１】
好ましくは、カチオン交換クロマトグラフィーは、強力なカチオン交換レジンで行われる。より好ましくは、カチオン交換物質は、ＳＯ3-基で修飾された架橋メタクリレートを含む。Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＳＯ3-(Ｍｅｒｃｋ社から購入)の商標名で市販されているカラムは、本方法の文脈において特に適しているカチオン交換レジンの例である。
【００８２】
好ましくは、Ｆｃ含有タンパク質を含む液体又は組成物は、Ｆｃ融合タンパク質の等電点(ｐＩ)より少なくとも１の小さいｐＨでカチオン交換レジンに充填される。
【００８３】
好ましい実施態様では、カチオン交換レジンは、ｐＨ５.５〜７.５で、６〜１０ｍＳ／ｃｍの電気伝導性を有する緩衝液で洗浄される。
【００８４】
緩衝液は、６.１、６.２、６.３、６.４、６.５、６.６、６.７、６.８、６.９、７、７.１、７.２、７.３、７.４、７.５、７.６、７.７、７.８、７.９、８、８.１、８.２、８.３、８.４、８.５、８.６、８.７、８.８、８.９、９、９.１、９.２、９.３、９.４、９.５、９.６、９.７、９.８、又は９.９ｍＳ／ｃｍの電気伝導性を有してもよい。
【００８５】
より好ましくは、電気伝導性は、７.６〜９.２、つまり８.４±０.８ｍＳ／ｃｍの範囲である。洗浄ステップは、好ましくは、５.５〜７.５、好ましくは６.０〜７.０の範囲のｐＨで行われる。
【００８６】
より好ましくは、電気伝導性範囲は、７.６〜９.２、つまり８.４±０.８ｍＳ／ｃｍの範囲である。洗浄ステップは、好ましくは５.５〜７.５、好ましくは６.０〜７.０の範囲のｐＨで行われる。
【００８７】
緩衝液のｐＨは、例えば、５.５、５.６、５.７、５.８、５.９、６.０、６.１  、６.２、６.３、６.４、６.５、６.６、６.７、６.８、６.９、７.０、７.１  、７.２、７.３、７.４、又は７.５であってもよい。
【００８８】
さらに好ましい実施態様では、６０〜１４０、好ましくは７０〜１３０、より好ましくは７５〜１２５ｍＭのリン酸ナトリウムを含む緩衝液中で洗浄ステップは行われる。当該緩衝液は、例えば６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、又は１４０ｍＭのリン酸ナトリウムを含んでもよい。
【００８９】
さらに好ましい実施態様では、カチオン交換カラムは、７.０〜８.５の範囲のｐＨで、好ましくは７.２５、７.３、７.３５、７.４、７.４５、７.５、７.５５、７.６、７.６５、７.７、７.７５、７.８、７.８５、７.９、７.９５、８.０、８.０５、８.１、８.１５、８.２、８.２５、８.３、８.３５、８.４、８.４５、又は８.５で溶出される。
【００９０】
溶出は、好ましくは１５〜２２ｍＳ／ｃｍの範囲の電気伝導性で行われうる。例えば、電気伝導性は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２ｍＳ／ｃｍから選ばれてもよい。
【００９１】
溶出用の好ましい緩衝液は、リン酸緩衝液である。
【００９２】
本発明にしたがって、カチオン交換クロマトグラフィーは、好ましくは５〜１５倍の範囲で遊離Ｆｃの除去又は低下のために使用することができる。こうして、液体、調製品、又は組成物を含むＦｃ含有タンパク質中の遊離Ｆｃの濃度を、総タンパク質濃度の２０％未満、又は１５％未満、又は１０％未満、又は５％未満、又は２％未満、１％未満、０.８％未満、０.５％未満、０.３％未満、０.２％未満、又は０.１％未満へと低下させることを達成することができる。
【００９３】
好ましい実施態様では、カチオン交換クロマトグラフィーは、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、及びヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーから選ばれる１又は複数の追加ステップを有する精製方法で使用されてもよい。
【００９４】
高度に好ましい実施態様では、本発明の方法は、以下のステップ：
ａ.Ｆｃ含有タンパク質を含む液体を、タンパク質Ａ又はタンパク質Ｇ又はタンパク質Ｌアフィニティクロマトグラフィーに供し；
ｂ.ステップ(ａ)の溶出液をカチオン交換クロマトグラフィーに供し；
ｃ.ステップ(ｂ)の溶出液をアニオン交換クロマトグラフィーに供し；
ｄ.ステップ(ｃ)の通液をヒドロキシアパタイト・クロマトグラフィーに供し、溶出液を回収して精製Ｆｃ含有タンパク質を溶出する
を含むＦｃ含有タンパク質の製造スキームの第二のステップとして使用される。
【００９５】
本発明にしたがって、Ｆｃ含有タンパク質を含む液体を、まずタンパク質Ａ又はタンパク質Ｇ又はタンパク質Ｌ又はタンパク質Ａ／Ｇアフィニティークロマトグラフィーに供する。好ましくは、当該液体は、細胞培養物質、例えば可溶化細胞、より好ましくは細胞培養上清であってもよい。本明細書で使用されるとき「細胞培養上清」という語句は、細胞を培養する培地を指し、そして適切な細胞シグナル、いわゆるシグナルペプチドを含む場合にその中にタンパク質が分泌される。Ｆｃ含有タンパク質を発現する細胞は、無血清培養条件下で培養されることが好ましい。こうして、好ましくは、細胞培養上清は、動物血清由来成分を欠いている。もっとも好ましくは、細胞培養培地は、化学合成培地である。
【００９６】
アフィニティークロマトグラフィーに用いられるタンパク質Ａ、Ｇ、Ａ／Ｇ、又はＬは、例えば組み換え体であってよい。これは、(例えば、GE Healthcareから市販されているMabSelect SuReと呼ばれるレジン中において)その性質を改良するために改変されてもよい。好ましい実施態様では、ステップ(ａ)は、組み換えタンパク質Ａで改変された架橋アガロースを含むレジンにおいて行われる。商標名Mabselect Xtra(GE Healthcare社)で市販されているカラムは、本発明の方法のステップ(ａ)に特に適しているアフィニティーレジンの例である。
【００９７】
タンパク質Ａ又はＧ又はＬアフィニテイークロマトグラフィーは、細くステップとして好ましくは用いられ、そうしてＦｃ含有タンパク質の精製として、特にホスト細胞タンパク質及びＦｃ含有タンパク質凝集体の除去、そしてＦｃ含有タンパク質調製品の濃縮として役に立つ。
【００９８】
本明細書に使用される「凝集体」という語句は、タンパク質凝集体を指すことが意味され、そして精製に供されるＦｃ含有タンパク質のマルチマー(例えば、ダイマー、テトラマー、又はそれより高次の凝集体)を包含し、そして例えば高分子量凝集体をもたらすこともある。
【００９９】
アフィニティークロマトグラフィーは、凝集体レベルを２〜４分の１に低減するというさらなる利点を有する。
【０１００】
タンパク質Ａ又はＧ又はＡ／Ｇ又はＬアフィニティークロマトグラフィーを用いると、宿主細胞タンパク質のレベルを１００〜３００分の１に低減することもある。
【０１０１】
本発明の好ましい実施態様では、ステップ(ａ)の溶出は、２.８〜４.５のｐＨ範囲、好ましくは３.０〜４.２の範囲、より好ましくは３.５、３.５５、３.６、３.６５、３.７、３.７５、３.８、３.８５、３.９、３.９５、４.０、４.０５、４.１、又は４.１５のｐＨ範囲で行われる。ステップ(ａ)の溶出は、ｐＨ勾配、好ましくはｐＨ４.５〜２.８の勾配で行われてもよい。
【０１０２】
さらに好ましい実施態様では、ステップ(ａ)の溶出は、酢酸ナトリウム又はクエン酸ナトリウムから選ばれる緩衝液中で行われる。適切な緩衝液濃度は、例えば、５０ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭ又は２５０ｍＭから選ばれる。
【０１０３】
本発明では、タンパク質Ａ又はタンパク質Ｇ又はタンパク質Ａ／Ｇ又はタンパク質Ｌクロマトグラフィーからの溶出液は、上に詳細に説明されるようにカチオン交換クロマトグラフィーに供される。
【０１０４】
好ましくは、カチオン交換クロマトグラフィーの溶出、つまりステップ(ｂ)の溶出は、アニオン交換カラム上にロードする前に、適切なロード緩衝液に希釈されるか又は透析される。アニオン交換カラムは、好ましくはロード緩衝液で平衡化される。
【０１０５】
ロード緩衝液の好ましいｐＨは、ｐＩより１ユニット未満であるｐＨである。６.０〜８.５、好ましくは７.０〜８.０の範囲、例えば７.０、７.０５、７.１、７.１５、７.２、７.２５、７.３、７.３５、７.４、７.４５、７.５、７.５５、７.６、７.６５、７.７、７.７５、７.８、７.８５、７.９、７.９５、又は８.０である。ロード緩衝液に対する好ましい電気伝導性は、３.０〜４.６ｍＳ／ｃｍの範囲である。
【０１０６】
適切な平衡化／ロード緩衝液は、例えば５〜３５、好ましくは２０〜３０ｍＭの範囲の濃度のリン酸ナトリウムであってもよい。緩衝液濃度は、例えば、１０、１５、２０、２５、３０ｍＭであってもよい。本発明の構成では、目的のＦｃ含有タンパク質を含むアニオン交換クロマトグラフィーの通液(ブレークスルーともよがれる)が回収される。
【０１０７】
本発明の方法のステップ(ｃ)は、凝集体を３分の１〜５分の１、そして宿主細胞タンパク質３０分の１〜７０分の１に低減する。
【０１０８】
本発明では、ステップ(ｃ)のアニオン交換クロマトグラフィーの通液型ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにより更なる精製に用いられる。任意のヒドロキシアパタイトレジンは、本発明に従った方法のステップ(ｄ)を行うために用いられることもある。好ましい実施態様では、ステップ(ｄ)は、セラミックヒドロキシアパタイトレジン、例えば１型又は２型ヒドロキシアパタイトレジンなど上で行われる。ヒドロキシアパタイトレジンは、２０、４０、又は８０μｍなどの任意のサイズの粒子を有してもよい。かなり好ましい実施態様では、セラミックヒドロキシアパタイトレジンは、４０μｍのサイズを有する粒子を含む。本発明の方法のステップ(ｄ)に特に適しているヒドロキシアパタイトレジンは、ＣＨＴ Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ１型、４０μｍの商標名で市販されているカラムである。
【０１０９】
好ましい実施態様では、ステップ(ｃ)の通液を直接、つまり適切なロード緩衝液に前もって希釈又は透析することなく、ヒドロキシアパタイトレジンにロードする。ロードは、好ましくは、ｐＨ６.５〜７.５、例えば６.６、６.７、６.８、６.９、７.１、７.２、７.３、７.４及び好ましくは７.０で行われる。
【０１１０】
さらに好ましい実施態様では、ステップ(ｄ)の溶出は、２〜１０ｍＭ、好ましくは２.７５〜５.２５ｍＭ、例えば３、３.２５、３.５、３.７５、４、４.２５、４.５、４.７５、５の範囲で行われる。
【０１１１】
さらに好ましい実施態様では、ステップ(ｄ)の溶出は、６.０〜７.０、例えば６.１、６.２、６.３、６.４、６.５、６.６、６.７、６.８、６.９のｐＨで行われる。
【０１１２】
別の好ましい実施態様では、ステップ(ｄ)の溶出は、０.４〜１Ｍ、好ましくは０.４５、０.５、０.５５、０.６、０.６５、０.７、０.７５、０.８、０.８５、０.９、０.９５Ｍ、最も好ましくは０.６Ｍで行われる。
【０１１３】
本発明では、最終的に精製されたＦｃ含有タンパク質調製品を含むヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの溶出液を回収する。
【０１１４】
本発明と組み合わせて使用されうる適切なマトリクス物質、つまり、ステップ(ａ)〜(ｃ)で使用されるクロマトグラフィーレジン用の担体物質は、例えばアガロース(セファロース、スペロース)デキストラン(セファデックス)、ポリプロピレン、メタクリレートセルロース、ポリスチレン/ジビニルベンゼンなどであってもよい。レジン物質は、特定の用途に依存して異なる架橋形態で存在してもよい。
【０１１５】
使用されるレジンの体積、カラムの長さ及び直径、並びに動的容量及び流速は、処理される液体の体積、本発明の処理にかける液体中のタンパク質の濃度などに依存する。各ステップについてのこれらのパラメーターの決定は、当業者の平均的な技術の範囲内である。
【０１１６】
本精製プロセスの好ましい実施態様では、１又は複数の限外ろ過ステップが行われる。限外ろ過は、前段階のクロマトグラフィーステップから得られる溶出液中の小有機分子及び塩の除去に有用であり、バルク緩衝液中のＦｃ含有タンパク質を平衡化するか、又はＦｃ含有タンパク質を所望の濃度に濃縮する。このような限外ろ過は、例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０ｋＤａ以上のより小さい分子量を有する成分の除去を可能にする孔サイズを有する限外ろ過膜で行われてもよい。
【０１１７】
好ましくは、限外ろ過は、ステップ(ｂ)と(ｃ)との間で行われるか、及び／又はステップ(ｄ)の後で行われる。より好ましくは、２回の限外ろ過ステップが行われ、１回はステップ(ｂ)と(ｃ)の間であり、もう１回はステップ(ｄ)の後で行われる。
【０１１８】
本発明の方法に従って精製されたタンパク質が、ヒトへの投与を意図されるならば、当該プロセスにおいてウイルスを除去する１又は複数のステップを含むことが有利である。好ましくは、ウイルス除去ろ過ステップは、ステップ(ｄ)の後で行われる。より好ましくは、ウイルス除去ステップは、ナノろ過ステップであり、ここで当該フィルターは、名目上２０ｎｍの孔サイズを有する。本発明の方法、特にナノろ過と組み合わせたステップ(ａ)、(ｃ)、(ｄ)は、効果的に最大約１５〜２５の複合ＬＲＶ(combined LRV: 対数減少率)にウイルスロードをろ過する。
【０１１９】
貯蔵又は輸送を容易にするために、例えば物質は本発明の任意の精製ステップの前及び／又は後で、凍結融解されてもよい。
【０１２０】
本発明に従って、組換えＦｃ含有タンパク質は、真核発現系、例えば酵母、昆虫、又は哺乳動物細胞などで生成されてもよく、グリコシル化されたＦｃ含有タンパク質をもたらす。
【０１２１】
本発明に従うと、動物細胞株などの哺乳動物細胞において、又はヒト細胞株において、Ｆｃ含有タンパク質を発現させることが最も好ましい。チャイニーズハムスター卵巣細胞(ＣＨＯ)又はマウス骨髄腫細胞株ＮＳ０は、精製用のＦｃ含有タンパク質を発現するのに特に適している細胞株の例である。Ｆｃ含有タンパク質は、好ましくは、ヒト細胞株、例えばヒト線維肉腫ＨＴ１０８０細胞株、ヒト網膜芽細胞腫細胞株ＰＥＲＣ6、又はヒト胚性腎臓細胞株２９３、又はＥＰ1２３０３５４に記載される永久羊膜細胞株(permanent amniocyte cell line)において生成することができる。
【０１２２】
精製されるＦｃ含有タンパク質は、タンパク質を分泌する哺乳動物細胞により発現され、本発明の精製プロセスの開始物質は、細胞培養上清であり、回収物又は粗製回収物ともよばれる。細胞を動物血清を含む培地中で培養する場合、細胞培養上清は、血清蛋白質を不純物として含む。
【０１２３】
好ましくは、Ｆｃ含有タンパク質を発現及び分泌する細胞は、無血清条件下で培養される。Ｆｃ含有タンパク質は、化学合成培地中で生成されてもよい。この場合、本発明の精製プロセスの開始物質は、宿主細胞タンパク質を不純物として主に含む無血清細胞培養上清である。インスリンなどの成長因子が細胞培養培地に加えられる場合、例えばこれらのタンパク質も同様に精製プロセスの間に除去されよう。
【０１２４】
細胞培養上清に放出される可溶性の分泌されたＦｃ含有タンパク質を生成するために、Ｆｃ含有タンパク質の治療部分の天然シグナルペプチドか、又は好ましくは異種シグナルペプチド、つまり用いられる特定の発現系において有効である別の分泌タンパク質に由来するシグナルペプチド、例えばウシ又はヒト成長ホルモンシグナルペプチド、又は免疫グロブリンシグナルペプチドが用いられる。
【０１２５】
上に言及されるように、本発明にしたがって精製される好ましいＦｃ含有タンパク質が、ヒトＴＡＣＩに由来する治療部分(配列番号２)、及び特にその細胞外ドメインに由来する断片(配列番号２のアミノ酸１〜１６５)を有する融合タンパク質である。好ましい断片は、配列番号２のアミノ酸３０〜１１０を含む。以下において、ＴＡＣＩの細胞外ドメインに由来する治療部分は、「可溶性ＴＡＣＩ」又は「ｓＴＡＣＩ」と呼ばれよう。好ましいＦｃ部分は、配列番号３を含み、配列番号４に記載のＦｃ融合タンパク質をもたらし、以下において、「ＴＡＣＩ-Ｆｃ」と呼ばれる。本明細書に使用されるＴＡＣＩ-Ｆｃという語句は、ＴＡＣＩ-Ｆｃのムテインも包含する。
【０１２６】
本明細書に使用される「ムテイン」という語句は、ｓＴＡＣＩ又はｔＡＣＩ-Ｆｃのアナログに関し、ここで、ｓＴＡＣＩ又はＴＡＣＩ-Ｆｃの１又は複数のアミノ酸残基は、ことなるアミノ酸残基により置換されるか、又は欠失されるか、又は１又は複数のアミノ酸残基が、元のｓＴＡＣＩ又はＴＡＣＩ-Ｆｃと比べて得られた生成物の活性をかなり変えることはなく、ｓＴＡＣＩ又はＴＡＣＩ-Ｆｃの元の配列に加えられる。これらのムテインは、既知の合成及び／又は部位特異的突然変異誘導技術により製造されるか、又はそれに適した他の周知の技術により調製される。
【０１２７】
本発明に従ったムテインは、核酸、例えば配列番号２又は４のいずれかに記載されｓＴＡＣＩ又はＴＡＣＩ-ＦｃをコードするＤＮＡ又はＲＮＡの相補物にストリンジェント条件下でハイブリダイズするＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸によりコードされるタンパク質を含む。ＴＡＣＩ-ＦｃをコードするＤＮＡ配列の例は、配列番号７である。
【０１２８】
「ストリンジェント条件」という語句は、当業者が慣用的に「ストリンジェント」を指すハイブリダイゼーションとそれに続く洗浄条件を指す。Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, N.Y., §§6.3及び6.4(1987,1992)を参照のこと。非限定的に、ストリンジェント条件の例は、研究しているハイブリッドの計算されたＴｍの１２〜２０℃下の洗浄条件を含み、例えば２×ＳＳＣ及び０.５％ＳＤＳで５分、２×ＳＳＣ及び０.１％ＳＤＳで１５分間；３７℃０.１×ＳＳＣ及び０.５％ＳＤＳで３０〜６０分、そして次に６８℃０.１×ＳＳＣ及び０.５％ＳＤＳで３０〜６０分である。ストリンジェント条件が、ＤＮＡ配列、オリゴヌクレオチドプローブ(例えば１０〜４０塩基)又は混合されたオリゴヌクレオチドプローブに依存するということが当業者により理解される。混合されたプローブが使用される場合、ＳＳＣの代わりにテトラメチルアンモニウムクロリド(ＴＭＡＣ)を使用することが好ましい。上記Ausubelを参照のこと。
【０１２９】
別の実施態様では、任意のそのようなムテインは、それに対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の同一性又は相同性を有する。
【０１３０】
同一性は、配列を比較することにより決定される２若しくは複数のポリペプチド配列又は２若しくは複数のポリヌクレオチド配列との間の関係を反映する。一般的に、同一性は、比較される配列の長さにわたり２つのポリヌクレオチド配列の正確なヌクレオチドとヌクレオチドの一致、又は２つのポリペプチド配列のアミノ酸とアミノ酸の一致を指す。
【０１３１】
正確な一致がないＦｃ配列では、「同一性％」が決定されることもある。一般的に、比較される２個の配列を整列させて、配列の間で最大相関を与えるようにする。これは、１又は両方の配列に「ギャップ」を挿入してアライメントの程度を高める。Ａ％の同一性は、比較される配列の各々の全長に渡って決定されてもよく(いわゆる全長アライメント)、これは同一又はかなり近い長さの配列について特に適している。一方かなり短い規定の長さに渡って決定されてもよく(いわゆるローカルアライメント)、これは長さが等しくない配列についてより適している。
【０１３２】
２以上の配列の同一性及び相同性を比較する方法は、当該技術分野において周知である。こうして、例えば、Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 9.1 (Devereux Jら、1984)で利用できるプログラム、例えばＢＥＳＴＦＩＴ及びＧＡＰのプログラムは、２つのポリヌクレオチド間の同一性％を決定するために、そして２ｋのポリペプチド配列の間の相同性％を決定するために使用されてもよい。ＢＥＳＴＦＩＴは、Smith及びWaterman(1981)の「ローカルホモロジー」アルゴリズムを用い、２個の配列間における類似性についての最適単一領域を見つける。配列間の同一性及び／又は類似性を決定する他のプログラム、例えばＢＬＡＳＴプログラムファミリー(Altschul S Fら、1990, Altschul S Fら、1997、wwww.ncbi.nlm.nih.govでＮＣＢＩのホームページを通してアクセス可能)及びＦＡＳＴＡ(Pearson W R, 1990) も当業者に知られている。
【０１３３】
任意のこのようなムテインは、好ましくは、ｓＴＡＣＩ又はＴＡＣＩ-Ｆｃのアミノ酸配列とかなり重複しているアミノ酸配列を有し、例えば配列番号２又は４のタンパク質と実質的に同様のリガンド結合活性を有する。例えば、ＴＡＣＩの１の活性は、Ｂｌｙｓ又はＡＰＲＩＬに結合する能力である(Hymowitzら、2006)。ムテインが実質的にＡＰＲＩＬ又はＢｌｙｓ結合活性を有する限り、ムテインは、ＴＡＣＩに実質的に類似する活性を有すると考えることができる。こうして、通常の実験により、任意の所定のムテインが、実質的に配列番号２又は４のタンパク質と同じ活性有するかを当業者は容易に決定することができる。
【０１３４】
本発明にしたがったムテインについての好ましい変更は、「保存的」置換として知られている変更である。ＴＡＣＩ又はＴＡＣＩ-Ｆｃの保存的アミノ酸置換は、十分に似た生化学的性質を有するので、当該群のメンバー間の置換が、当該分子の生化学的機能を保存する群の範囲内の同義アミノ酸を含みうる(Grantham、1974)。特に挿入又は欠失が、数個のアミノ酸、例えば３０未満、２０未満、又は好ましくは１０未満しか含まず、そしてシステイン残基などの機能的立体配座に決定的であるアミノ酸を除去又は置換することがない場合に、アミノ酸の挿入及び欠失が、その機能を変化させることなく上記配列においてなされうるということが明らかである。このような欠失及び／又は挿入により生成されるタンパク質及びムテインも本発明の範囲に含まれる。
【０１３５】
好ましくは、保存アミノ酸群は、表2に定義されるアミノ酸群である。より好ましくは、同義アミノ酸群は、表3に定義される群であり；そして最も好ましくは、同義アミノ酸群は、表４に定義される群である。
【表３】
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【表４】
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【表５】
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【０１３６】
機能的誘導体は、本発明にしたがって精製されたＦｃ融合タンパク質から生成されてもよい。本明細書に使用される「機能的誘導体」は、本発明にしたがって精製されるＦｃ含有タンパク質の誘導体を網羅し、当該誘導体は、当該誘導体が医薬として許容される限り、つまり上に定義されるように未改変Ｆｃ含有タンパク質の活性に実質的に類似するタンパク質の活性を破壊することがなく、かつ当該誘導体を含む組成物について毒性性質を与えることがない限り、残基又はＮ若しくはＣ末端基上の側鎖の官能基から製造されうる。
【０１３７】
Ｆｃ含有タンパク質の機能誘導体は、当該タンパク質の性質、例えば安定性、半減期、生物学的利用能、人体による耐用性、又は免疫原性を改善するためにポリマーに結合することができる。この目的を達成するために、Ｆｃ含有タンパク質は、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)に結合されてもよい。ＰＥＧ化は、例えばＷＯ９２/１３０９５に記載される既知の方法により行うことができる。
【０１３８】
機能的誘導体は、例えば、カルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニア又は一級若しくは二級アミンで反応させることによるカルボキシル基のアミド、アシル部分で形成されたアミノ酸残基の遊離アミノ基のＮアシル誘導体(例えば、アルカノイル又はカルボキシルアロイル基)、又はアシル部分で形成される遊離水酸基のＯ-アシル誘導体(例えばセリル又はスレオニル残基)を含んでもよい。
【０１３９】
第３の態様では、本発明は、本発明に記載される精製プロセスにより精製されるタンパク質に関する。このようなタンパク質は、以下で「精製Ｆｃ含有タンパク質」と呼ばれる。
【０１４０】
このような精製Ｆｃ含有タンパク質は、好ましくは高度に精製されたＦｃ含有タンパク質である。高度に精製されたＦｃ融合タンパク質は、１レーンあたり２μｇの量のタンパク質をロードした後に、例えば銀染色、非還元ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルで単一バンドの存在により決定される。精製されたＦｃ-融合タンパク質は、ＨＰＬＣの単一ピークとして溶出されると定義されてもよい。
【０１４１】
本発明の精製プロセスから得られるＦｃ含有タンパク質調製品は、２０％未満の不純物、好ましくは１０％、５％、３％、２％、又は１％の不純物を含んでもよいし、または均一になるまで、つまり、例えば銀染色されたＳＤＳ-ＰＡＧＥ又はＨＰＬＣにより測定する際に検出可能なタンパク質のコンタミを含まなくなるまで、精製されてもよい。
【０１４２】
精製されたＦｃ含有タンパク質は、治療用に、特にヒト患者に対して投与することを意図されてもよい。精製されたＦｃ含有タンパク質が、患者に投与される場合、当該タンパク質は全身に投与され、そして好ましくは、皮下、又は筋中、又は局所(topically)、つまり局所(locally)に投与されてもよい。精製されたＦｃ含有タンパク質の特定の医療用途に依存して、直腸又はくも膜下内投与にも適していることがある。
【０１４３】
この目的では、本発明の好ましい実施態様では、精製されたＦｃ含有タンパク質は、つまり医薬として許容される担体、賦形剤などと一緒に医薬組成物に剤形されることもある。
【０１４４】
「医薬として許容される」という定義は、活性成分の生物学的活性の有効性と相互作用せず、かつ投与を受ける宿主に対して毒性ではない任意の担体を包含することを意図する。例えば、非経口投与では、活性タンパク質(単数又は複数)は、生理食塩水、デキストロース溶液、血清アルブミン及びリンゲル溶液などのビヒクルに注射用単位投与形態に剤形されうる。
【０１４５】
本発明に従った医薬粗製物の活性成分は、さまざまな方法で個人に投与することができる。投与経路は、皮内、経皮(例えば、徐放性剤)、筋中、腹腔内、静脈内、皮下、経口、頭蓋内、硬膜外、局所、直腸、及鼻腔内経路を含む。任意の他の治療有効な投与経路を使用することができ、例えば上皮又は内皮組織を通じた吸収、又は遺伝子治療(ここで活性薬剤をコードするＤＮＡ分子が患者に(例えばベクターを介して)投与され、これはin vivoで活性薬剤の発現及び分泌を引き起こす)により使用することができる。さらに、本発明に従ったタンパク質(単数又は複数)は、生物的に活性な薬剤、例えば医薬として許容される界面活性剤、賦形剤、担体、希釈剤、及びビヒクルなどの他の成分とあわせて投与することができる。
【０１４６】
非経口投与(例えば、静脈内、皮下、筋中)投与では、活性タンパク質(単数又は複数)は、医薬として許容される非経口ビヒクル(例えば、水、生理食塩水、デキストロース溶液)、及び等張性若しくは化学安定性を維持する添加物(例えばマンニトール、保存剤及び緩衝剤)とあわせて溶液、懸濁液、乳濁液、又は凍結乾燥粉末として剤形することができる。製剤は、一般的に使用される技術によって滅菌される。
【０１４７】
活性タンパク質(単数又は複数)の治療有効量は、多くの変数、例えばＦｃ含有タンパク質のタイプ、Ｆｃ含有タンパク質のそのリガンドに対する親和性、投与経路、患者の臨床状態などの関数であろう。
【０１４８】
「治療有効量」は、投与された場合に、Ｆｃ含有タンパク質は、上に説明され、そして特に上の表５で言及されているように、Ｆｃ融合タンパク質の治療部分のリガンドの抑制をもたらす量である。
【０１４９】
一回又は複数回用量として個人に投与される用量は、さまざまな因子、例えばＦｃ融合タンパク質の薬物動態性質、投与経路、患者状態、及び特性(性別、年齢、体重、健康状態、大きさ)、症状の程度、併用療法、治療頻度、所望される効果に依存して変化しよう。確立された用量範囲の調節及び操作は、当業者の能力の範囲内であり、並びに個体における治療部分の天然リガンドの抑制を決定するin vitro及びin vivo方法の範囲内である。
【０１５０】
精製されたＦｃ含有タンパク質は、０.００１〜１００ｍｇ/ｋｇ体重、又は０.０１〜１０ｍｇ/ｋｇ体重、又は１から３ｍｇ／ｋｇ体重、又は２ｍｇ／ｋｇ体重の量で使用されてもよい。
【０１５１】
さらに好ましい実施態様では、精製されたＦｃ含有タンパク質は、毎日又は一日おきに、又は週３回、又は週１回投与される。
【０１５２】
１日用量は、通常、分割用量で、又は所望の結果を得るために有効な徐放形態で通常与えられる。２回目又はそれに続く投与は、同じ用量、個人に投与された初回又は前回の用量よりも少ないか又は多い用量行うことができる。２回目又はそれに続く投与は、疾患の間、疾患の開始前に投与することができる。
【０１５３】
本発明は、さらにＦｃ含有タンパク質を含む組成物において遊離Ｆｃ部分の濃度を低下するためにカチオン交換クロマトグラフィーを使用することに関する。
【０１５４】
好ましい実施態様では、遊離Ｆｃの濃度は、当該組成物の総タンパク質濃度の２０％未満、又は１５％未満、又は１０％未満、又は５％未満、又は２％未満、又は１％未満、又は０.８％未満、又は０.５％未満、又は０.２％未満、又は０.１％未満に低下される。
【０１５５】
本発明が完全に記載されたが、本発明の本質及び範囲から逸脱することなく、かつ過度の実験をすることなく、同一の発明が、同等のパラメーター、濃度、及び条件の範囲内で行うことができるということが当業者に明らかであろう。
【０１５６】
本発明は、その具体的な実施態様に関して記載されている一方で、さらなる変更が可能であるということが理解されよう。本出願は、一般的に本発明の原理に従い、そして本発明の属する技術分野において既知又は慣用の実行の範囲内であり、かつ添付の特許請求の範囲に従う以下に記載される必須の特徴に適用されうる本開示からの逸脱を含む、本発明の任意の変更、使用又は適用、をカバーすることを意図する。
【０１５７】
本明細書に引用される全ての引用文献、例えば論文、又は要約、未発行又は発行済み米国又は外国特許出願、米国又は外国特許公報、又は他の引用文献は、引用文献中にあらわされる全てのデータ、表、図面、及び文章が完全に本明細書に援用される。さらに、本明細書に引用される引用文献において引用される引用文献の全ての内容が完全に援用される。
【０１５８】
既知の方法ステップ、慣用の方法ステップ、既知の方法又は慣用方法についての言及は、本発明の任意の態様、記載、又は実施態様が関連分野において開示され、教示され、又は示唆されているということを認めるものではない。
【０１５９】
前述の特定の実施態様の記載は、完全に本発明の一般的性質を完全に明らかにしているので、第三者は、当該分野の技術(例えば本明細書に引用される引用文献の内容)の範囲の知識を適用することにより、過度の実験をすることなく、本発明の一般的な概念から逸脱することなく、かかる特定の実施態様などのさまざまな適用について容易に改変及び／又は適用することができる。その結果、かかる適応及び改変は、本明細書に示される教示及び示唆に基づいて、開示された実施態様の同等物の範囲を意味する範囲内であることが意図される。本明細書の表現又は用語は、説明を目的としており、そして制限することを目的とするものではない。その結果、本明細書の表現又は用語は、当業者の知識と組み合わせて、本明細書に示される教示及び示唆の範囲で当業者により解釈されるべきである。
【実施例】
【０１６０】
無血清ＣＨＯ細胞上清からの組み換えヒトＴＡＣＩ-Ｆｃの精製
全ての実施例に使用される用語
ＢＶ：                  総容積
ＣＨＯ：                チャイニーズハムスター卵巣
ＤＳＰ：                下流処理
ＥＤＴＡ：              エチレンジアミン四酢酸
ＥＬＩＳＡ：            酵素結合免疫吸着アッセイ
ＨＡＣ：                ヒドロキシアパタイト・クロマトグラフィー
ＨＣＰ：                宿主細胞タンパク質
ＨＰＬＣ：              高速液体クロマトグラフィー
ｉｄ：                  内径
Ｋ：                    カリウム
ｋＤ：                  キロダルトン
ＭＥＳ：                ２-モルフォリノエタンスルホン酸
Ｎａ：                  ナトリウム
ＮａＡｃ：              酢酸ナトリウム
ｎ／ｄ：                未検出
ＰＡ-ＳＥ-ＨＰＬＣ：    タンパク質Ａサイズ排除高速液体クロマトグラフィー
ｐｐｍ：                百万分の１
ＲＯ：                  逆浸透
ＲＴ：                  室温
ＳＤＳ-ＰＡＧＥ:        ドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＳＥ-ＨＰＬＣ：         サイズ排除高速液体クロマトグラフィー
Ｔ℃：                  温度
ＴＭＡＣ：              テトラメチルアンモニウム・クロリド
ＵＶ：                  紫外線
ＷＦＩ：                注射用の水
ＷＲＯ：                逆浸透用の水
【０１６１】
実施例１：捕捉ステップ：タンパク質Ａ上のアフィニティー精製
開始物質は、無血清条件下で培養され、そして使用まで凍結乾燥されるＴＡＣＩ-Ｆｃを発現するＣＨＯ細胞クローンの精製回収物であった。
【０１６２】
ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｘｔｒａ(商標)カラム(ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ １７-５２６９-０３)の捕捉ステップをプロトコルに従い、１７ｃｍの高さのベッドを有するカラムで行った。ロード溶液を除いて、全ての操作は室温で行った。ロード溶液は１５℃以下の温度に維持された。２８０ｎｍのＵＶシグナルを記録した。
【０１６３】
浄化
少なくとも３ＢＶの０.１Ｍ酢酸＋２０％エタノールを２５０ｃｍ／ｈで逆流させてカラムを浄化した。１時間流れを止めた。
【０１６４】
洗浄ステップ
少なくとも２ＢＶのＲＯ水を２５０ｃｍ／ｈで逆流させてカラムを洗浄した。
【０１６５】
平衡化
少なくとも５ＢＶの２５ｍＭリン酸ナトリウム＋１５０ｍＭのＮａＣｌｐＨ７.０(電気伝導性及びｐＨパラメーターが、特定範囲：ｐＨ７.０±０.１、電気伝導性１８±２ｍＳ／ｃｍの範囲内となるまで)を下降流でカラムを平衡化させた。
【０１６６】
ロード
Ｂｉａｃｏｒｅアッセイにより計測した場合に最大１５ｍｇ総ＴＡＣＩ-Ｆｃ／ｍｌパッケージレジンの容量に１５℃以下の温度に維持された精製回収物で、３５０ｃｍ／ｈの水流でロードした。
【０１６７】
洗浄ステップ
３５０ｃｍ／ｈで少なくとも２ＢＶの平衡化緩衝液でカラムを洗浄し、次に４５０ｃｍ／ｈで少なくとも４ＢＶの平衡化緩衝液で(ＵＶシグナルがベースラインに戻るまで)洗浄した。
【０１６８】
溶出
表１に示される異なる溶出緩衝液で、３５０ｃｍ／ｈの流量で表１に示される異なる溶出緩衝液を用いて溶出した。溶出画分をＵＶシグナルが６.０±０.５ＢＶの溶出液に増加し始めるところから回収した。４.１以下のｐＨ(必要に応じてクエン酸溶液を加えることにより調節する)で室温にて１時間溶出液をインキュベートし、次に３２％ＮａＯＨ溶液を加えることにより、ｐＨを５.０±０.１に調節した。
【０１６９】
再生
少なくとも３ＢＶの５０ｍＭ・ＮａＯＨ＋１Ｍ ＮａＣｌを４５０ｃｍ／ｈで逆流させ、水流を１５分間止め、次に少なくとも３ＢＶを４５０ｃｍ／ｈの流速で(ＵＶシグナルがベースラインに戻るまで)再開してカラムを再生した。
このステップから、カラムを逆流様式で操作した。
【０１７０】
洗浄ステップ
少なくとも２ＢＶのＲＯ水で４５０ｃｍ／ｈにてカラムを洗浄した。
【０１７１】
浄化
２５０ｃｍ／ｈで少なくとも３ＢＶの浄化緩衝液でカラムを浄化し、流れを止め、そしてカラムを６０分間インキュベートした。
【０１７２】
最終洗浄ステップ
カラムを少なくとも１ＢＶのＲＯ水で２５０ｃｍ／ｈで洗浄し、次に少なくとも３ＢＶの平衡化緩衝液で２５０ｃｍ／ｈ洗浄し、そして最後に２５０ｃｍ／ｈの少なくとも２ＢＶのＲＯ水で洗浄した。
最終的に、少なくとも３ＢＶの２０％エタノールで２５０ｃｍ／ｈｙで濯いだ後にカラムを貯蔵した。
【０１７３】
【表６】
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【０１７４】
結論
精製回収物中のＴＡＣＩ-Ｆｃ５は、３５０ｃｍ／ｈの流速で充填されたレジン１Ｌあたり、１５ｇの総ＴＡＣＩ-Ｆｃ５の動的容量でＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｘｔｒａカラム上に直接捕捉された。溶出条件、特にｐＨは、生成物の回収を最大にするように最適化されたが、一方で凝集レベルの有意な低減を提供する。０.１Ｍのクエン酸ナトリウム溶出緩衝液ｐＨ３.９が選択され、精製回収物中の約２５〜４０％殻初めて約５〜１０％の凝集レベルを与え、そして濁りは観察されなかった。ＨＣＰレベルは、一般に１５００〜２０００ｐｐｍであった。ポリクローナル抗体を用いてＥＬＩＳＡによりＨＣＰレベルを計測した。非トランスフェクトＣＨＯ細胞の精製及び濃縮細胞培養上清に由来する宿主細胞タンパク質に対して抗体混合物を精製した。
【０１７５】
実施例２：カチオン交換クロマトグラフィー
適切なロード緩衝液中で透析されたタンパク質Ａについての捕捉ステップ由来の溶出液をカチオン交換クロマトグラフィーについて開始物質として用いた。
１０ｃｍの高さのベッドを有するＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＳＯ3-カラム(Merck 1.16882.0010)をこのステップで用いた。１５ｃｍのベッド高さを有するＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＳＯ3-カラムが同様に使用されてもよい。後の場合、動的容量及び流量を適用することが必要であることもあり、これは当業者の通常知識の範囲内である。
全ての操作を室温で行い、そして流速を１５０ｃｍ／ｈで定常に維持した。２８０ｎｍのＵＶシグナルを全時間にわたり記録した。
【０１７６】
洗浄ステップ
カラムを、少なくとも１ＢＶのＷＲＯ(逆浸透水)で洗浄した。
【０１７７】
浄化
次にカラムを少なくとも３ＢＶの０.５Ｍ ＮａＯＨ＋１.５Ｍ ＮａＣｌで浄化した。上向流様式で浄化した。
【０１７８】
すすぎ
カラムを下向き流様式で少なくとも４ＢＶのＷＲＯですすいだ。
【０１７９】
平衡化
カラムを少なくとも４ＢＶの(又は、標的電気伝導性１２±１ｍＳ／ｃｍ及びｐＨ５.０±０.１に達するまで)１００ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ５.０で平衡化した
【０１８０】
ロード
ｐＨ５.０(５.０±０.１のｐＨ、１２±１ｍＳ／ｃｍの電気伝導性)、そして充填されたレジン１ｍｌあたり５０ｍｇ以下(ＳＥＨＰＬＣアッセイにより決定される)のｔＡＣＩ-Ｆｃの容量でカラムを捕捉後物質で充填した。
【０１８１】
洗浄ステップ
次にカラムを少なくとも５ＢＶの１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６.５で洗浄した。
【０１８２】
溶出
カラムを異なる緩衝液で溶出し、そして以下の表ＩＩ〜ＩＶに報告されるように異なる条件下で溶出した。
【０１８３】
再生及び浄化
上向き流様式で４ＢＶの０.５Ｍ ＮａＯＨ＋１.５Ｍ ＮａＣｌで再生し、そして浄化した。次に水流を３０分間止めた。
【０１８４】
すすぎ
カラムを少なくとも４ＢＶのＷＲＯですすいだ。
【０１８５】
貯蔵
カラムを少なくとも３ＢＶの２０％エタノールで貯蔵した。
【０１８６】
結果
【表７】
2010501623.tif 000009
【０１８７】
表ＩＩＩは、１ｍｌのレジンあたりの１０ｍｇ及び３２ｍｇのＴＡＣＩ-Ｆｃの容量で充填し、そして１２〜３３ｍＳ／ｃｍの電気伝導性で溶出した際のＴＡＣＩ-Ｆｃ回収及びＨＣＰ排除を示す。ピークの回収は、１０±０.５ＢＶにＵＶが増加し始めたところから行った。
【０１８８】
【表８】
2010501623.tif 000010
【０１８９】
表ＩＶは、５０、１００、又は１５０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ６.５を用いた洗浄ステップのＴＡＣＩ-Ｆｃ回収及びＨＣＰ除去についての効果を示す。
【０１９０】
【表９】
2010501623.tif 000011
【０１９１】
洗浄２において用いられる緩衝液は、１００ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ６.５を含み、８.４ｍＳ／ｃｍの電気伝導性を有した。
【０１９２】
図１は、遊離Ｆｃ除去についての表ＩＶで示された３つの洗浄ステップを用いた実験から得られたサンプルについての銀染色された非還元型ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルを示す。
【０１９３】
図２は、異なる濃度のリン酸ナトリウムを用いた洗浄ステップ実験の重なり合うクロマトグラムを示す。
洗浄ステップは、リン酸ナトリウムの濃度を増加させて(５０〜１５０ｍＭ)ｐＨ６.５で最適化された。図１に見ることができるように、１５０ｍＭの洗浄緩衝液濃度(洗浄３、レーン６)は、ＴＡＣＩ-Ｆｃのロスをもたらす。５０ｍＭの洗浄緩衝液濃度(洗浄１、レーン８)は、純粋なＴＡＣＩ-Ｆｃのピークをもたらした。しかしながら、溶出液は、微量の遊離Ｆｃを含んだ。１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６.５を用いた洗浄ステップは、溶出のメインピークにおいて９８％の回収をもたらし、そして洗浄において２％のロスしかもたらさなかった(図２)。ＨＣＰ除去は３.２倍であった。ＳＤＳ-ＰＡＧＥによる洗浄液及び溶出液画分の分析は、洗浄ステップが、１００ｍＭ以上の緩衝液濃度で、いくらかの無傷のＴＡＣＩ-Ｆｃと一緒に遊離Ｆｃを含んだということを示す(図１、レーン４及び６)。１００ｍＭ以上の濃度は、溶出画分から遊離Ｆｃを完全に除去するために必須である(図１レーン５及び７)。
【０１９４】
結論
カチオン交換ステップは、捕捉ステップの後に第二精製ステップとして開発された。捕捉溶出液は、低いｐＨで(５.０)及び低い電気伝導性であり、そしてカチオン交換体上に直接ロードすることができる。Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＳＯ3-レジンを５０ｍｇ／ｍｌのロードキャパシティで選択した。非生物活性分解産物である遊離Ｆｃは、０.１Ｍリン酸ナトリウムｐＨ６.５を用いた洗浄ステップで効率的に取り除くことができる。溶出条件は、ＨＰＣの最良排除、及び高ＴＡＣＩ-Ｆｃ回収について最適化された(１７９ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ８.０、電気伝導性２０.７ｍＳ／ｃｍ)。
あるいは、溶出は、１０ＢＶの２０ｍＭリン酸ナトリウムおよび１８０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ8.0で、280ｎｍの吸光度が上昇の開始から行うことができる。
【０１９５】
実施例３：アニオン交換クロマトグラフィー
この精製ステップについて使用された開始物質は、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＳＯ-3上のカチオン交換ステップから得られ、適切なロード緩衝液に透析又は希釈された溶出液であった。
【０１９６】
このアニオン交換クロマトグラフィーステップは、１０ｃｍの高さのベッドを有するＳＯＵＲＣＥ３０Ｑカラム(ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ １７-１２７５-０１)で行われた。１５ｃｍの高さのベッドを備えるＳＯＵＲＣＥ ３０Ｑカラムは、同様にこのステップで使用されてもよい。後者の場合、動的容量及び流速を適合させる必要があり、これは当業者の通常知識の範囲内である。
【０１９７】
全ての操作を室温で行い、そして２８０ｎｍでＵＶシグナルを記録した。このステップを、１５０又は２００ｃｍ／ｈのいずれかの流速で行った。
【０１９８】
すすぎ
第一に、カラムを少なくとも１ＢＶのＲＯ水で、流速１５０ｃｍ／ｈですすいだ。
【０１９９】
浄化
次に、少なくとも３ＢＶの０.５Ｍ ＮａＯＨ＋１.５Ｍ ＮａＣｌでカラムを浄化した。
【０２００】
洗浄ステップ
少なくとも３ＢＶ、好ましくは４〜１０ＢＶの０.５Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７.５、流速２００ｃｍ／ｈでカラムを洗浄した。
【０２０１】
平衡化
少なくとも５ＢＶの１０、１５、２０、２５、又は３０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７.５でカラムを平衡化させた。場合により、３ＢＶの０.５Ｍリン酸ナトリウムｐＨ７.５でカラムをあらかじめ平衡化することができる。
【０２０２】
通液におけるＴＡＣＩ-Ｆｃのロード、洗浄、及び同時回収
ＳＥ-ＨＰＬＣアッセイにより測定された場合に１ｍｌの充填レジンあたり５０ｍｇ以下のＴＡＣＩ-Ｆｃの容量で１０〜３０ｍＭ、ｐＨ７.５のリン酸濃度を得るために希釈されたカチオン交換後の物質でカラムをロードし、ＵＶが増加し始めた点から洗浄ステップの終わりまで通液を回収し、当該回収は４±０.５ＢＶの平衡緩衝液中で行われる。
【０２０３】
再生／浄化
逆流様式で少なくとも３ＢＶの０.５Ｍ ＮａＯＨ＋１.５Ｍ ＮａＣｌを１５０ｃｍ／ｈの流速でカラムを再生及び浄化した。再生の最後において、ポンプを３０分間止めた。
【０２０４】
洗浄ステップ
２００ｃｍ／ｈの流速にて少なくとも３ＢＶのＲＯ水でカラムを洗浄した。
【０２０５】
貯蔵
１５０ｃｍ／ｈの流速にて少なくとも３ＢＶの２０％エタノール(ｖ／ｖ)で貯蔵する。
【０２０６】
結果
以下の表５は、上に記載される精製プロセスで得られる結果を要約する。
【表１０】
2010501623.tif 000012
【０２０７】
結論
通液様式でのＳｏｕｒｃｅ３０Ｑカラム上でのアニオン交換ステップは、ＨＣＰ及び凝集体の除去を最大化するように最適化される。ｐＨ７.５の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中に希釈又は透析されたロードカチオン交換溶出液は、生成物回収(９０％)及びＨＣＰの除去(約２０００ｐｐｍから４４ｐｐｍ)及び凝集体の除去(約２５％から５.６％)の最良の妥協点を与えた。充填されたレジン１ｍｌあたり５０ｍｇのＴＡＣＩ-Ｆｃの動的容量が、１５０〜２００ｃｍ／ｈの流速で用いられた。
【０２０８】
実施例４：ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー
この精製ステップについて用いられる開始物質は、アニオン交換クロマトグラフィーの通液であった(実施例３を参照のこと)。
【０２０９】
１０ｃｍの高さのベッドを備えるＣＨＴ Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ１型、４０μｍカラム(Ｂｉｏｒａｄ１５７-００４０)を用いた。
【０２１０】
全ての操作を室温で行った。流速を１７５ｃｍ／ｈで一定に維持し、そして２８０ｎｍでのＵＶシグナルを記録した。全ての溶液を滅菌ろ過し、そして使用前に水酸化ナトリウムを除去した。使用しない場合、０.５Ｍ ＮａＯＨ溶液の中でカラムを貯蔵した。
【０２１１】
初回洗浄ステップ(すすぎ及び予めの平衡化)
少なくとも１ＢＶの２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７.５の緩衝液でカラムを洗浄し、次に少なくとも３ＢＶの０.５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７.５でカラムを洗浄してｐＨを低下させた。
【０２１２】
平衡化
少なくとも５ＢＶの２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７.５でカラムを平衡化させた(又は、３.０±０.３ｍＳ／ｃｍの標的電気伝導性及びｐＨ７.５±０.１が達成されるまで)。
【０２１３】
ロード
ＳＯＵＲＣＥ３０Ｑ通液をカラムに充填し、０.５Ｍのストック溶液から終濃度が０.１ｍＭとなるように塩化カルシウムを加え、そして８５％オルトリン酸を加えることによりｐＨを７.０に調節し、１ｍｌの充填レジンあたりＳＥ-ＨＰＬＣアッセイにより計測される場合にＮＭＴ５０ｍｇのＴＡＣＩ-Ｆｃの容量にした。塩化カルシウムを伴わず、ｐＨ７.０に調節されたＳＯＵＲＣＥ ３０Ｑ通液をヒドロキシアパタイトカラムにロードすることも可能である。
【０２１４】
洗浄ステップ
少なくとも４ＢＶの３、４、又は５ｍＭのリン酸ナトリウム、１０ｍＭのＭＥＳ、０.１ｍＭのＣａＣｌ2、ｐＨ６.５でカラムを洗浄した。塩化カルシウムを伴わない同じ緩衝液を使用することも可能である。
【０２１５】
溶出
５、４、３又は２ｍＭのリン酸ナトリウム(表ＶＩを参照のこと)、１０ｍＭのＭＥＳ、０.１ｍＭのＣａＣｌ2、及び０.６、０.７、０.８、又は０.９ＭのＫＣｌ、ｐＨ６.５の緩衝液(表ＶＩＩを参照のこと)を用いて、異なるＢＶについてＵＶが増加し始めた点からカラムを溶出した(表ＶＩ及びＶＩＩを参照のこと)。当該溶出について塩化カルシウムを伴うことなく同一の緩衝液を使用することも可能である。
【０２１６】
すすぎ
以下の：
少なくとも１ＢＶの２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７.５緩衝液；
少なくとも３ＢＶの０.５Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７.５緩衝液；及び
少なくとも１ＢＶの２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７.５緩衝液を用いてカラムを濯いだ。
【０２１７】
結果
表ＶＩは、凝集体の除去及び生成物の回収についての溶出緩衝液におけるリン酸濃度(２〜5ｍＭ)の効果を示す。溶出ピーク画分を貯蔵し、そしてＳＥ-ＨＰＬＣによって、ＴＡＣＩ-Ｆｃ濃度及び凝集体レベルについて分析した。
【０２１８】
【表１１】
2010501623.tif 000013
【０２１９】
表ＶＩは、凝集体の除去及び生成物の回収率についての、溶出緩衝液中のＫＣｌ濃度の効果を示す。２つのリン酸ナトリウム濃度：２及び３ｍＭを調査した。溶出ピーク画分を貯蔵し、そしてＴＡＣＩ-Ｆｃ濃度及び凝集体レベルについてＳＥ-ＨＰＬＣにより分析した。
【０２２０】
【表１２】
2010501623.tif 000014
【０２２１】
結論
ヒドロキシアパタイト クロマトグラフィーは、ＴＡＣＩ-Ｆｃ凝集体レベルを低下させる信頼の置ける有効な方法を提供する。約５〜８％の凝集体レベルを有するアニオン交換クロマトグラフィーで精製された物質から始めて、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、８５〜９０％のＴＡＣＩ-Ｆｃを回収しつつ、凝集体のレベルを０.８％以下に低下させることができる。
【０２２２】
【表１３】
2010501623.tif 000015
【表１４】
2010501623.tif 000016
【図１】
2010501623.tif 000017
【図２】
2010501623.tif 000018
【配列表】
2010501623000001.app
【国際調査報告】
2010501623.tif 000019
2010501623.tif 000020