(57)【要約】抗体を含み、改良されたADCC及び代わりにグリコシル化パターンを伴う免疫糖タンパク質を提供する。該免疫糖タンパク質はカスタノスペルミンを含む培地でホスト細胞成長によって生産される。
2010507394.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスト細胞により生成される免疫糖タンパク質分子の抗体依存細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を増大させる方法であって、
前記ホスト細胞により生成される免疫糖タンパク質分子のＡＤＣＣを増大させるカスタノスペルミンを、２５μＭ〜約８００μＭ濃度で備え、容量が少なくとも１リットルである培地で前記ホスト細胞を成長させる工程を備える、免疫糖タンパク質分子の抗体依存細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を増大させる方法。
【請求項２】
ＡＤＣＣが少なくとも２倍に増大される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＡＤＣＣが少なくとも５倍に増大される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ホスト細胞により生成される免疫糖タンパク質分子のＣＤ１６結合を増大させる方法であって、
前記ホスト細胞により生成される免疫糖タンパク質分子のＣＤ１６結合を増大させるカスタノスペルミンを、２５μＭ〜約８００μＭの濃度で備え、容量が少なくとも１リットルである培地で前記ホスト細胞を成長させる工程を備える、免疫糖タンパク質分子のＣＤ１６結合を増大させる方法。
【請求項５】
ＣＤ１６結合を少なくとも５０％増大させる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＣＤ１６結合を少なくとも２倍（２００％）に増大させる、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
培地における免疫糖タンパク質の生成レベルが少なくとも１００μｇ／ｍＬである、請求項１乃至７のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
カスタノスペルミンが１００μＭ〜４００μＭの濃度で存在する、請求項１乃至７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
培地が実質的に漿液を含んでいない、請求項１乃至８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
ホスト細胞がバッチ培養法で育てられる、請求項１乃至９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ホスト細胞が連続培養法で育てられる、請求項１乃至９のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
培地は第二の糖修飾因子を含む、請求項１乃至９のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
請求項１乃至１２のいずれかの方法により生成される免疫糖タンパク質分子および無菌の医薬的に受け入れ可能な担体または希釈剤を含む、組成物。
【請求項１４】
請求項１３の組成物を投与する工程を備える、癌細胞を死滅させるか成長を抑制する方法であって、癌細胞が前記免疫糖タンパク質分子により結合される分子を表面に発現する、癌細胞を死滅させるか成長を抑制する方法。
【請求項１５】
請求項１３の組成物を投与する工程を備える、細胞を枯渇させる方法であって、該枯渇される細胞が、前記免疫糖タンパク質分子により結合される分子を表面に発現する、細胞を枯渇させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体を含む、特性が改良された免疫糖タンパク質に関し、それには、抗体依存性細胞傷害性およびグリコシル化パターン、細胞培養方法およびそのような免疫糖タンパク質を生成するための培地、並びに病気の処置における当該免疫糖タンパク質の使用が含まれる。
【０００２】
なお、本件出願は、２００６年１０月２４日に出願された米国仮出願第６０／８５３，９４４号の利益を享受し、その内容を援用することで全体は組み入れられているものである。
【背景技術】
【０００３】
免疫薬でターゲットとする細胞数を削減するのは、適応症のいくつかにおいては重要な治療処置である。そのように、ターゲットとする細胞の削減を達成するために、免疫薬が用いているメカニズムは、補体が媒体となる細胞の溶解、細胞消滅の信号を送る動作経路の活性化、生存のために必要な信号を送る経路の遮断、およびＦｃ依存性細胞傷害性とも称される、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を含み得る。ＡＤＣＣは、効力のあるメカニズムであり、多くの免疫薬の有効性にとって重要であると考えられている。
【０００４】
ＡＤＣＣの活性化のためのメカニズムには、ターゲット細胞の表面に結合される免疫薬分子へのＦｃ受容体の結合が必要である。免疫薬へのＦｃ受容体の結合は、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインのような、免疫グロブリンの一定領域内のドメインを媒体とすることができる。異なる種類の一定領域が、異なるＦｃ受容体と結合する。例として含まれるのは、ＩｇＧ１Ｆｃドメインの、同種のＦｃ受容体ＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩ）、ＣＤ３２（ＦｃγＲＩＩ‐Ｂ１および‐Ｂ２）およびＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）への結合、ＩｇＡＦｃドメインの、同種のＦｃ受容体ＣＤ８９（ＦｃαＲＩ）への結合、およびＩｇＥドメインの、同種のＦｃ受容体ＦｃεＲ１およびＣＤ２３への結合である。
【０００５】
Ｆｃ受容体の結合を高めた免疫薬組成物は、ＡＤＣＣにおいてより大きな有効性が呈示される。ＩｇＧＦｃドメインでこれを達成する方法として報告されているものには、アミノ酸の変化の導入や糖類構造の修飾 (modification) が含まれる。Ｆｃドメインにおけるアミノ酸の変化は、免疫薬組成の免疫原性を高めるので、糖類構造の修飾が好ましい。免疫グロブリン分子については、Ｎ‐リンクされた糖類の、ＣＨ２ドメインのＡｓｎ−２９７への付着がＡＤＣＣ機能にとっては重大であるということが示されている。酵素で、またはＮ‐リンクされた共通サイトの突然変異を通してそれを取り除くと、結果的に、ＡＤＣＣ機能がほとんどまたは全く無くなってしまう。免疫グロブリン分子についてのＡＤＣＣ機能のレベルもまた、糖類の構造に依存すると報告している研究もあるが、実際の糖類の、ＡＤＣＣに関する部位または構造は、いまだ解明されていない。まして、非免疫グロブリンＦｃ融合タンパク質のＡＤＣＣに最適な糖類の構造については、なおさら知られていない。
【０００６】
糖タンパク質において、糖類は、トリペプチドのモチーフＡｓｎ‐Ｘ‐Ｔｈｒ／Ｓｅｒにおけるアスパラギンの側鎖でアミド窒素原子に付着する。Ｎ‐リンクされたグリコシル化と称されるこの種のグリコシル化は、複数の単糖類がリン酸ドリコールに加わって１４‐残基側鎖の糖類複合体を形成している小胞体（ＥＲ）において開始する。そして、この糖類複合体は、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＳＴ）複合体によってタンパク質へと転移される。糖タンパク質がＥＲの内腔を離れる前に、３つのグルコース分子が、１４‐残基オリゴ糖から取り除かれる。酵素ＥＲグルコシダーゼＩ、ＥＲグルコシダーゼＩＩおよびＥＲマノシダーゼがＥＲ処理に関係している。
【０００７】
続いて、ポリペプチドがゴルジ複合体へと運ばれ、そこではＮ‐リンクされた糖鎖が異なる多くの方法で修飾される。ゴルジ複合体のシスおよび中間区画において、元の１４‐糖Ｎ‐リンクされた複合体は、マンノース（Ｍａｎ）残基を取り除いて切り詰められ、Ｎ‐アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮａｃ）および／またはフコース（Ｆｕｃ）残基を加えることで伸長される。Ｎ‐リンクの糖類の形は様々であるが、一般には、３つのマンノース残基と２つのＮ‐アセチルグルコサミン残基からなる五糖（ペンタサッカライド）を共有する。最後に、トランスゴルジにおいて、他のＧｌｃＮａｃ残基を加え、それに続いてガラクトース（Ｇａｌ）および末端シアル酸（Ｓｉａｌ）を加えることができる。ゴルジ複合体における糖処理は、「末端グリコシル化」と呼ばれ、ＥＲにおいて起こる「コアグリコシル化」とは区別される。最終の複合糖ユニットは、多くの形態および構造を取り得るものである、その中には、２本、３本または４本の側鎖（バイアンテナリー、トリアンテナリーまたはテトラアンテナリーと称する）を有するものもある。ゴルジ処理には、複数の酵素が関係しており、それらには、ゴルジマノシダーゼＩＡ、ＩＢおよびＩＣ、ＧｌｃＮＡｃ‐トランスフェラーゼＩ、ゴルジマノシダーゼＩＩ、ＧｌｃＮＡｃ‐トランスフェラーゼＩＩ、ガラクトシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼが含まれている。
【０００８】
ＦｃγＲＩＩＩａ受容体が媒体となるＡＤＣＣ機能の重大な糖の決定要素は、コアＮ‐リンクの構造に加えられるアルファ‐１、６‐フコース部の欠如であることを、ある報告が示唆している（シンカワら、J Biol Chem.   ２００３年１月３１日；２７８（５）：３４６６−７３；また、シールズら、J Biol Chem. ２００２年７月２６日；２７７（３０）：２６７３３−４０も参照）。別のレベルのグリコフォーム、すなわち、二等分されたＮ‐リンクの糖類もまたＡＤＣＣを増大することができるものとして提案されている（ウマナら、Nat Biotechnol. １９９９年２月；１７（２）：１７６−８０）が、それに反する証拠もある（シンカワら、J Biol Chem. ２００３年１月３１日；２７８（５）：３４６６−７３）。この反対の証拠が解明される可能性もあることが示唆されており、それは、ホスト細胞においてＧｎＴＩＩＩが増加することで、二等分された糖が増加しているのみならず、コアフコースの修飾が欠如している免疫グロブリンが生成されるという発見による（フェラーラら、Biotechnol Bioeng. ２００６年４月５日；９３（５）：８５１‐６１）。これは、フコースのみがＡＤＣＣの有効性を変える主要な役割を果たしており、他で見られる二等分された糖との関連は、ホスト細胞における２つの修飾の結び付きを反映しているという提言と一致している。しかしながら、ＧｎＴＩＩＩを備えるリタクサン抗体およびハーセプチン抗体の、二等分された糖を増やすためのインビトロの処置が、結果としてＡＤＣＣを増大させたという別の報告があり、二等分された糖の直接の影響が示唆されている（ホドニクツキーら、Biotechnol. Prog., ２００５年１１月−１２月；２１（６）：１６４４−５２）。しかしながら、非常に高いレベルでのＧｎｔＩＩＩの過大な発現は、細胞に対して有毒である（ウマナら、Biotechnol. Prog., １９９８年３月−４月；１４（２）：１８９−９２）。
【０００９】
フコース含有量の低い免疫グロブリンを生成する方法が提案されているが、治療の指標として最適なＡＤＣＣ機能を備えるバイオ医薬品の製造にとって大きな障害があるものもある。例えば、フコース残基（フコーシダーゼ）を取り除く酵素を備える免疫グロブリンの処置には、重大な経済上の、および薬品の安定性上の危険が潜在していて、費用のかかる製造工程を追加する必要がある。フコシル化糖タンパク質の合成に関係する主要酵素を破壊するための細胞系（line）の分子的な処理には、特別なホストの負担が必要であり、現在のプラクティスにおいては、治療上の使用のために有効性および安全性が最適化されるようＡＤＣＣの有効性を変えると、薬品の「調節可能な」生成が可能ではなくなる。ＡＤＣＣの高められていない比較生成物を生成するには、費用および時間がかかる。ＲＮＡｉまたはアンチセンス分子で細胞系(line)を処置してこれらの主要酵素のレベルを破壊すると、予想できない的外れの効果が得られ、また、生産を行う規模で実施される程度には実用的であるとしても、費用がかかるであろう。
このように、ＡＤＣＣの高められた免疫薬を調合するのに有効な方法、またそれによって生成され、治療上使用される改良された免疫薬が切望されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】J Biol Chem、２００３年１月３１日、２７８（５）、３４６６−７３
【非特許文献２】J Biol Chem、 ２００２年７月２６日、２７７（３０）、２６７３３−４０
【非特許文献３】J Biol Chem、 ２００３年１月３１日、２７８（５）、３４６６−７３
【非特許文献４】Nat Biotechnol、 １９９９年２月、１７（２）、１７６−８０
【非特許文献５】Biotechnol Bioeng、 ２００６年４月５日、９３（５）、８５１−６１
【非特許文献６】Biotechnol. Prog、 ２００５年１１月−１２月、２１（６）、１６４４−５２
【非特許文献７】Biotechnol. Prog、 １９９８年３月−４月、１４（２）、１８９−９２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、培地（培養媒体）および免疫糖タンパク質の特性を改良する大規模細胞培養方法を提供するが、これには、ＡＤＣＣのようなエフェクター機能および／またはフコース含有量の低減のようなグリコシル化パターンが含まれる。本発明はさらに、上記方法によって生成される、改良された免疫糖タンパク質、および病気の治療におけるそのような免疫糖タンパク質の使用を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、ホスト細胞により生成された免疫糖タンパク質分子の抗体依存傷害性（ＡＤＣＣ）を増大する方法を提供するが、それは、濃度が、約２５μM〜約８００μＭの間、または約１００μM〜約５００μＭの間、または約１００μM〜約４００μＭの間、または約１００μM〜約３００μＭのカスタノスペルミンを備える培地において、ホスト細胞を成長させることによるものである。代表的な実施例において、ＡＤＣＣは、少なくとも２倍、３倍、４倍または５倍に増大する。
【００１３】
また本発明は、ホスト細胞により生成された免疫糖タンパク質分子のＣＤ１６結合を増大する方法を提供するが、それは、濃度が、約２５μMと約８００μＭの間、または約１００μMと約５００μＭの間、または約１００μMと約４００μＭの間、または約１００μMと約３００μＭの間にあるカスタノスペルミンを備える培地において、ホスト細胞を成長させることによるものである。代表的な実施例において、ＣＤ１６結合は、少なくとも５０％、７５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％または２００％増大する。
【００１４】
本発明の方法において、細胞の成長、生存度および／または密度は大きな影響を受けない（例えば、処置されていない細胞の少なくとも８０％以上に留まる）。培地における免疫糖タンパク質の生成のレベルは、少なくとも１００μg／ｍＬ、１２５μg／ｍＬまたは１５０μg／ｍＬである。
【００１５】
前記本発明において、培地は実質的に漿液が含まれておらず、第二の糖修飾因子が含まれている。
【００１６】
本発明では、上記方法で生成された免疫糖タンパク質分子を、必要に応じて無菌の薬学的に受け入れ可能な担体または希釈剤とともに含む組成物もまた意図されている。かかる組成物は、前記免疫糖タンパク質分子が結合した分子を表面に発現する癌細胞を死滅させる、あるいは、その成長を抑制する方法、または前記免疫糖タンパク質分子が結合する分子を表面に発現する細胞を枯渇させる方法において投与される。
【００１７】
本発明の方法は、一般に、適当な濃度の糖修飾因子、例えば、カスタノスペルミンを含む培地において、免疫糖タンパク質を生成するホスト細胞を培養することを伴い、細胞の成長またはタンパク質生成レベルに大きな影響を与えることなく、エフェクター機能を向上させるという利点がある。本発明の方法を用いて製造することのできる代表的な免疫糖タンパク質には、免疫グロブリンおよび小さなモジュラー免疫薬（ＳＭＩＰＴＭ）生成物が含まれる。本発明の方法により調製されるそのような結合分子には、ターゲットへの結合特性を実質的に同じに保ち、その結果、生物的活性が直接得られ、エフェクターを媒体とする機能の向上が呈示されるという利点がある。
【００１８】
本発明は、抗体依存傷害性（ＡＤＣＣ）および／またはホスト細胞により生成される免疫糖タンパク質のＦｃ受容体結合を向上させる方法を提供する。当該方法は、糖修飾因子、例えば、カスタノスペルミンを、ホスト細胞が生成した免疫糖タンパク質分子の組成物のＡＤＣＣ活性および／またはＦｃ受容体結合を増大させるような濃度で備え、少なくとも体積が７５０ｍＬ、１Ｌ、２Ｌ、３Ｌ、４Ｌ、５Ｌ、１０Ｌ、１５Ｌ、２０Ｌまたはそれ以上の培地において、ホスト細胞を成長させることを伴っている。かかる糖修飾因子、例えば、カスタノスペルミンの最適な濃度は、糖修飾因子の有効性および所望のＡＤＣＣの関連する調節（modulation）に依存するが、培地における糖修飾因子の代表的な最終濃度は、８００μＭ未満または７５０、７００、６５０、６００、５５０、５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１２５、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０または１０μＭ未満である。
【００１９】
それに関係した、ＡＤＣＣへの影響は、細胞培養に適用される糖修飾因子、例えば、カスタノスペルミンの濃度または持続時間を変えることで調整されるが、グリコシル化を変えることでＡＤＣＣを向上させる従来の方法と比較すると、顕著な利点がある。ＡＤＣＣ活性は、当業界で知られているアッセイを用いて測定され表されるが、代表的な実施例においては、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍または２０倍増大する。
【００２０】
グリコシル化および糖含有量は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣおよび循環半減期を含む、免疫グロブリンエフェクターを媒介とする様々な機能に影響を及ぼすことが知られている。ここに記述されるデータでは、本発明の方法によって、驚くことに、ＣＤＣまたは半減期に影響を及ぼすことなく、ＡＤＣＣが増大することを示す免疫糖タンパク質が提供されるということが示されている。このように、代表的な実施例において、免疫糖タンパク質分子組成物のＡＤＣＣは増大するが、補体依存傷害性（ＣＤＣ）および／または長くなった循環半減期のような他の免疫グロブリン型エフェクター機能は、同様であるか大きくは影響を受けない（例えば、２倍未満の増大または減少、あるいは５０％、４０％、３０％、２０％または１０％未満の増大または減少）。
【００２１】
免疫糖タンパク質分子の組成物のＦｃ受容体結合は、糖修飾因子で処置された免疫糖タンパク質分子対ＣＤ１６に結合する処置されていない免疫糖タンパク質分子という相対比として測定される。代表的なアッセイが、以下の例で記述される。代表的な実施例におけるＦｃ受容体結合は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、３倍、４倍、５倍または６倍増大する。本発明により、糖修飾因子、例えば、カスタノスペルミンで処置されたホスト細胞が生成した免疫糖タンパク質組成は、ＣＤ１６（高または低親和形態、すなわちアミノ酸１５８でＶまたはＦ）および／またはＣＤ３２ａまたはｂおよび／またはＣＤ６４に、そのように処置されていないホスト細胞が生成する免疫糖タンパク質組成物よりもＦｃＲ結合検査において大きな親和力で結合する。Ｆｃ受容体結合親和力がこのように増大するのは、ＡＤＣＣ機能の向上と相関していることがここに示されている。
【００２２】
本発明によって、糖含有量／グリコシル化パターンを変え、および／または免疫糖タンパク質のフコース含有量を低減する方法もまた提供されるが、該方法は、総フコース含有量を低減し、および／またはホスト細胞が生成する免疫糖タンパク質分子の組成物のグリコシル化パターンを変えるような濃度で、糖修飾因子、例えばカスタノスペルミンを備え、体積が、少なくとも７５０ｍＬ、１Ｌ、２Ｌ、３Ｌ、４Ｌ、５Ｌ、１０Ｌ、１５Ｌ、２０Ｌまたはそれ以上である培地において、ホスト細胞を成長させることによるものである。培地における糖修飾因子の代表的な最終濃度は、８００μＭ未満または７５０、７００、６５０、６００、５５０、５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１２５、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０または１０μＭ未満である。
【００２３】
フコース含有量への影響もまた、細胞培養に適用される糖修飾因子、例えば、カスタノスペルミンの濃度または持続時間を変えることによって調整される。組成物の総フコース含有量は、フコース化されていない免疫糖タンパク質分子の、組成物における免疫糖タンパク質分子の総数に対する相対比またはパーセンテージとして表される。代表的な組成物は、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上のフコース化されていない分子を含む。本発明により、糖修飾因子、例えば、カスタノスペルミンで処置されたホスト細胞が生成する免疫糖タンパク質組成物のフコース含有量は、そのように処置されなかったホスト細胞が生成する組成物と比べて、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍以上低減される。
【００２４】
前述の本発明の方法のいずれにおいても、ホスト細胞は、糖修飾因子、例えば、カスタノスペルミンにさらされている間、高いレベルでの成長を呈示している。例えば、免疫糖タンパク質を生成するＣＨＯ細胞の代表的な倍化時間は、約２４時間であるが、本発明による糖修飾因子の濃度（例えば、ＡＤＣＣを増大するのに有効な濃度）によって、そのような倍化時間が低減されるとの期待はない。理想的には、糖修飾因子、例えば、カスタノスペルミンの有効な濃度では、糖修飾因子を加えてから７２時間後の時点で、１０、２０、３０、４０、５０、６０または７０％を超えるほどには、細胞の成長は低減されない。
【００２５】
前述の方法のいずれにおいても、ホスト細胞は、糖修飾因子、例えば、カスタノスペルミンにさらされている間、高いレベルでのタンパク質生成を呈示している。例えば、糖修飾因子、例えば、カスタノスペルミンが有効な濃度であるときのタンパク質生成レベルは、約５０μｇ／ｍＬ以上であり、または約７５、１００、１２５または１５０μｇ／ｍＬ以上である。好ましくは、ホスト細胞は、高いレベルでの成長および高いレベルでのタンパク質生成の双方を呈示する。
【００２６】
実質的に漿液を含まない培地を含む、当業界で知られている任意の培地を用いても良い。バッチ培養、流加培養、連続培養、その他の業界で知られている培養方法を本発明の方法で用いることができる。糖修飾因子が、急速な成長段階後に、シーズ列に添加され、すなわち、最初のバッチ培地に添加されるか、又は連続して培地と一緒に（例えば、連続して供給する間に）添加される。例えば、糖修飾因子は、１０Ｘまたは１００Ｘの濃度で初期のシーズ列または原料に添加されるが、次いで培地を加えると、糖修飾因子の濃度が希釈されるが、組み換え生成物のＡＤＣＣを増大させるのになおも有効なレベルになるようにする。あるいは、糖修飾因子が、細胞に添加されるあらゆる培地に有効な濃度で含まれ、希釈する必要は無いものとする。いずれにしても、糖修飾因子は、細胞培養プロセスにおいて比較的早期に加えられ、免疫糖タンパク質の均質性を最適化するために、培養処理の間有効な濃度が維持される。糖修飾因子の効果は、長期に続くものである、糖修飾因子を一度加えると、少なくとも１１乃至１２日間は持続して認められる。
【００２７】
代表的な糖修飾因子には、コアグリコシル化抑制剤、端末グリコシル化抑制剤、マノシダーゼ抑制剤および／または初期段階糖修飾因子が含まれており、選択的にフコシル化に特有の抑制剤が含まれていても含まれていなくてもよく、さらなる詳細は以下に記述される。本発明におていは、２つ以上あるいは３つ以上の糖修飾因子を組み合わせることでさらに利点が得られるということが意図されている。カスタノスペルミンは、特に有効な１つの糖修飾因子である。
【００２８】
さらに、本発明によって、前述の方法のいずれかで生成された免疫糖タンパク質分子を含み、好ましくは、ターゲット分子について少なくとも１０７Ｍ−１または少なくとも１０８Ｍ−１または１０９Ｍ−１の結合親和力Ｋｄを有する組成物が提供される。そのような組成物は、無菌の、薬学的に受け入れ可能な担体または希釈剤を１つ以上含んでいてもよい。
【００２９】
さらに、本発明によって、上記組成物の被体への投与を伴っている治療方法が提供されるが、その被体は、当該投与から効果を得ることができるもので、例えば、ターゲット分子を発現する細胞が媒体となる障害を患っているか、癌細胞が表面にターゲット分子を発現するある種の癌を患っている。本発明によって、上記組成物を、ターゲット分子を表面に発現している細胞を枯渇する方法において用いることもまた意図されている。ターゲットがＣＤ３７であるところでは、本発明によって、癌細胞の成長を抑制するか、癌細胞を破壊する方法が特に意図されており、それは、本発明の方法により生成されたアンチＣＤ３７ＳＭＩＰ生成物を含む組成物を被体に投与する工程を備えている。同様に、ターゲットがＣＤ２０であるところでは、本発明によって、癌細胞の成長を抑制するか癌細胞を破壊する方法が特に意図されており、それは、本発明の方法により生成されたアンチＣＤ２０ＳＭＩＰ生成物を含む組成物を被体に投与する工程を備えている。好適な形態において、癌の進行を停止させるか反転させることを伴って癌を治療する方法が意図されている。本発明によって、本発明の方法により生成されたアンチＣＤ３７またはアンチＣＤ２０ＳＭＩＰ生成物を投与することで、自己免疫性または炎症性の疾患を治療する方法がさらに提供される。さらに、本発明において、ここに記述される疾患または障害のいずれかを治療する薬剤を調製するための、無菌又は滅菌された担体または希釈剤を選択的に有する、本発明の糖タンパク質組成物の使用が意図されている。
【００３０】
免疫糖タンパク質
「免疫糖タンパク質」という語は、ターゲット分子と結合するグリコシル化ポリペプチドのことを称し、免疫グロブリンの一定領域から得られる十分なアミノ酸配列を含んで、好ましくは、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣというエフェクター機能を提供する。代表的な分子には、免疫グロブリンのＣＨ２ドメインから得られるシーケンス、または１つ以上の免疫グロブリンから得られるＣＨ２およびＣＨ３ドメインが含有される。本発明によって生成することが意図された免疫糖タンパク質の特定の部分集合には、ヒンジにおける共有結合性の、または非共有結合性の結合および／またはＣＨ３ドメインを通して選択的に二量体になる単鎖タンパク質が含まれる。単鎖タンパク質のこの部分集合には、免疫グロブリンの典型的な四量体の形態は含まれない（軽鎖が無いことによる）が、Ｆｃ配位子またはＦｃ可溶の受容体融合が含まれる。単鎖タンパク質の特定の例には、ＳＭＩＰ生成物が含まれる。
【００３１】
ＳＭＩＰ生成物とそれらを生成する方法は、共同で所有される米国出願第１０／６２７，５５６号および米国特許公報２００３／１３３９３９、米国特許公報２００３／０１１８５９２および米国特許公報２００５／０１３６０４９において以前記述されており、それらは各々、援用することでその内容全体をここに組み入れる。エフェクター機能を備える単鎖多価結合タンパク質が、２００７年６月１２日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０７／７１０５２号に記述されている（２００６年６月１２日に出願されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／８１３，２６１および２００６年１０月２０日に出願されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／８５３，２８７の利益を主張する）が、それらは各々、援用することでその内容全体をここに組み入れる。ＳＭＩＰ生成物は、抗原、反対受容体等の同種の構造についての結合ドメインを特徴とする新規の結合ドメイン‐免疫グロブリン融合タンパク質であり、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＡまたはＩｇＥヒンジ領域ポリペプチド、または０、１または２のシスティン残基を有する突然変異ＩｇＧ１ヒンジ領域ポリペプチドおよび免疫グロブリンＣＨ２およびＣＨ３ドメインである。一例においては、結合ドメイン分子は、１つまたは２つのシスティン残基を有する。また他の例においては、結合ドメイン分子が２つのシスティン残基を備えるとき、典型的には重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間の結合に携わる第一のシスティンが削除されたり、アミノ酸で置換されたりすることの無いように意図されている。ＳＭＩＰ生成物は、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣが可能であるが、二硫化物に結合した多量体を形成する能力で折り合っている。代表的なＳＭＩＰ生成物は、免疫グロブリンから得られる可変軽鎖および／または可変重鎖結合領域の免疫グロブリン上科要素の結合領域のような１つ以上の結合領域を有する。代表的な例において、これらの領域は、リンカーペプチドで分離されるが、そのリンカーペプチドは、ドメインまたは領域接合と適合性のあることが当業界で知られているいずれのものであっても良い。代表的なリンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ、ただしｎ＝３〜５、のようなＧｌｙ４Ｓｅｒリンカーモチーフに基づくリンカーである。本発明により生成できる代表的なＳＭＩＰ生成物には、ＣＤ２０またはＣＤ３７を結合する生成物が含まれている。ＣＤ２０またはＣＤ３７を結合し、特定の結合シーケンスおよび／またはアミノ酸の修飾を備えるＳＭＩＰ生成物は、共同で出願された米国出願１０／６２７，５５６および米国出願１１／４９３，１３２に記述されており、これらの各々の内容は、ここに援用することでその全体をここに組み入れる。
【００３２】
免疫糖タンパク質の他の例には、結合ドメイン‐Ｉｇ融合体が含まれており、ここで、結合ドメインは、非自然発生のペプチドまたは自然発生のリガンドまたはレセプターのフラグメントである。レセプターの場合、細胞外ドメインのフラグメント（断片）が好ましい。免疫グロブリンまたはＦｃ領域を備える代表的な融合体には、Ｆｃ領域を備えるｓＴＮＦＲＩＩの融合タンパク質であるエタナーセプト（米国特許第５，６０５，６９０号）、Ｆｃ領域を備える抗原提示細胞で示されるＬＦＡ‐３の融合タンパク質であるアレファセプト（米国特許第５，９１４，１１１号）、Ｆｃ領域を備える細胞毒性Ｔリンパ球関連の抗原‐４（ＣＴＬＡ‐４）の融合タンパク質［J. Exp. Med. １８１、１８６９（１９９５）］、Ｆｃ領域を備えるインターロイキン１５の融合タンパク質［J. Immunol. １６０、５７４２（１９９８）］、Ｆｃ領域を備える因子VIIの融合タンパク質［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, ９８，１２１８０（２００１）］、Ｆｃ領域を備えるインターロイキン１０の融合タンパク質［J. Immunol. １５４、５５９０（１９９５）］、Ｆｃ領域を備えるインターロイキン２の融合タンパク質［J. Immunol. １４６、９１５（１９９１）］、Ｆｃ領域を備えるＣＤ４０の融合タンパク質［サージェリー、１３２、１４９（２００２）］、抗体Ｆｃ領域を備えるＦｌｔ‐３（ｆｍｓ様チロシンキナーゼ）の融合タンパク質［Acta. Haemato., ９５、２１８（１９９６）］、抗体Ｆｃ領域を備えるＯＸ４０の融合タンパク質［J. Leu. Biol., ７２、５２２（２００２）］、他のＣＤ分子［例えば、ＣＤ２、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８）、ＣＤ９５（Ｆａｓ）、ＣＤ１０６（ＶＣＡＭ‐１）、ＣＤ１３７］、接着分子［例えば、ＡＬＣＡＭ（活性化白血球細胞接着分子）、カドヘリン、ＩＣＡＭ（細胞間接着分子）‐１、ＩＣＡＭ‐２、ＩＣＡＭ‐３］、サイトカイン受容体［例えば、インターロイキン‐４Ｒ、インターロイキン‐５Ｒ、インターロイキン‐６Ｒ、インターロイキン‐９Ｒ、インターロイキン‐１０Ｒ、インターロイキン‐１２Ｒ、インターロイキン‐１３Ｒα１、インターロイキン‐１３Ｒα２、インターロイキン‐１５Ｒ、インターロイキン‐２１Ｒ］、ケモカイン、細胞死誘発信号分子［例えば、Ｂ７‐Ｈ１、ＤＲ６（死受容体６）、ＰＤ‐１（プログラム化死‐１）、ＴＲＡＩＬ  Ｒ１］、同時刺激分子［例えば、Ｂ７‐１、Ｂ７‐２、Ｂ７‐Ｈ２、ＩＣＯＳ（誘発性共同刺激因子）］、成長要因［例えば、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＨＧＦＲ］、分化誘発因子（例えば、Ｂ７‐Ｈ３）、活性化要因（例えば、ＮＫＧ２Ｄ）、信号転送分子（例えば、ｇｐ１３０）が含まれてる。
【００３３】
免疫糖タンパク質のさらに別の例としては、抗体が含まれる。ここで「抗体」という語は、完全に組み立てられた抗体、単クローン抗体、多クローン抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、抗原を結合できる抗体断片（例えば、Ｆａｂ’、Ｆ’（ａｂ）２、Ｆｖ、単鎖抗体、ダイアボディ）、および所望の抗原結合活性を呈示する限りにおいて前述のいずれかを備える組み換えペプチドを含むように定義される。化学的に誘導される抗体を含んで、損傷のない完全な分子および／または断片の多量体または集合体が意図されている。ＩｇG、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２，ＩｇG３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む、あらゆるアイソタイプの分類または下位分類の抗体が意図されている。異なるアイソタイプは異なるエフェクター機能を有し、例えばＩｇＧ１およびＩｇＧ３アイソタイプは、抗体依存細胞傷害性（ＡＤＣＣ）活性を有する。
【００３４】
「免疫グロブリン」または「自然のままの抗体」は、同一の二組のポリペプチド鎖（二つの「軽」鎖および二つの「重」鎖）からなる四量体糖タンパク質である。各鎖のアミノ端子部には、抗原を認識する主要な役割を果たす約１００乃至１１０またはそれ以上のアミノ酸の「可変」（「Ｖ」）領域が含まれている。この可変領域内では、「超可変性の」領域または「相補性判別領域」（ＣＤＲ）は、［カバトらが免疫学に関係する一連のタンパク質（Sequences of Proteins of Immunological Interest）第５版、保健サービス、国立衛生研究所、ベセズダ、メリーランド州（Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. ）(1991) で説明したような］軽鎖可変ドメインにおける残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）および８９−９７（Ｌ３）および重鎖可変ドメインにおける３１−３５（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）および９５−１０２（Ｈ３）、および／または［チョシアらがJ. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987) で説明したような］超可変性のループからのこれらの残基（すなわち、軽鎖可変ドメインにおける残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）および９１−９６（Ｌ３）および重鎖可変ドメインにおける２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）および９６−１０１（Ｈ３））からなる。
【００３５】
各鎖のカルボキシ端部には、一定領域が含まれる。軽鎖は、その一定領域内に単一ドメインを有する。そうして軽鎖は、可変領域を１つと一定領域ドメインを１つ有する。重鎖は、一定領域内にいくつかのドメインを有する。ＩｇG、ＩｇＡおよびＩｇＤ抗体中の重鎖は、一定領域ドメインを３つ有しており、それらはＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３と称され、ＩｇＭとＩｇＥ抗体における重鎖は、一定領域ドメイン４つと、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４を有する。従って、重鎖は、可変領域を１つと一定領域を３乃至４つ有する。
【００３６】
免疫グロブリンの重鎖はまた、３つの機能領域、Ｆｄ領域（ＶＨおよびＣＨ１、すなわち、重鎖のN−端末領域を２つ有する断片）、ヒンジ領域およびＦｃ領域（一定領域から得られ、ペプシン消化の後に形成される「断片結晶化」領域）に分けることができる。軽鎖と組み合わせられるＦｄ領域が、Ｆａｂを形成する（「断片抗原結合」）。抗原は、各Ｆａｂのアミノ端末で抗原結合領域と立体化学的に反応するので、ＩｇG分子は二価であり、すなわち、それは、抗原分子２つと結合する。Ｆｃ領域は、細胞で免疫グロブリン受容体、および補体カスケードの最初の要素と相互作用するドメインを含有する。従って、Ｆｃ断片は一般に、補体固定やＦｃ受容体への結合のような免疫グロブリンのエフェクター機能の原因であると考えられている。
【００３７】
ここで用いられている「単一クローン性抗体」という語は、実質的に均一な抗体の母集団から得られる抗体のことを称し、すなわち、その母集団に備わる個々の抗体は同一であるが、雑種細胞から生成されても、組み換えＤＮＡ技術から生成されても、可能性として自然に起こる突然変異、あるいは少量において現れる翻訳後の修飾単一クローン性抗体は除外される。単一クローン性抗体の例には、制限が無く、マウス、キメラ、ヒト化またはヒトの抗体またはそれらの変種または誘導体が含まれる。
【００３８】
抗体シーケンスをよりヒト様であるようにヒト化または変更することは、例えば、ジョーンズらによる ネイチャー321: 522 525 (1986); モリソンらによるProc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 81: 6851 6855 (1984); モリソンおよびオオイによるAdv. Immunol., 44: 65 92 (1988); バーホエヤらによるサイエンス239: 1534 1536 (1988); パドランによる Molec. Immun. 28: 489 498 (1991); パドランによる Molec. Immunol. 31(3): 169 217 (1994); ケトルボロウ, C. A. らによるProtein Eng. 4(7): 773 83 (1991);コウ, M. S. らによる(1994), J. Immunol. 152, 2968-2976); スタドニッカらによるプロテインエンジニアリング7: 805-814 (1994) に記載されており、それら各々は、ここで援用することでその内容をここに組み入れる。
【００３９】
ヒトの単一クローン性抗体を分離する１つの方法は、ファージディスプレイ技術を用いることである。ファージディスプレイは、例えば、ダワーらによるWO 91/17271, マキャファーティらによるWO 92/01047 およびケイトンとコプロウスキーによるProc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6450-6454 (1990) に記載されており、それら各々の内容は、援用することでここに組み入れる。ヒトの単一クローン性抗体を分離する別の方法は、内生的に免疫グロブリンを生成せず、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含有するよう操作されるトランスジェニックの動物を用いることである。例えば、ヤコボビッツらによるProc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551 (1993); ヤコボビッツらによるネイチャー, 362: 255-258 (1993); ブラガーマンらによるYear in Immuno., 7: 33 (1993); WO 91/10741、WO 96/34096、WO 98/24893または米国特許公報第20030194404号、米国特許公報第20030031667号、米国特許公報第20020199213号が参照され、それら各々の内容は、援用することでここに組み入れる。
【００４０】
抗体フラグメント（断片）は、組み換えＤＮＡ技法、または完全な抗体を酵素でまたは化学的に分割することで生成される。「抗体断片」は、全長を保った完全な抗体の一部、好ましくは、抗原結合または完全な抗体の可変領域を備え、抗体断片から形成される多重特異性（二重特異性、三重特異性等）抗体を含んでいる。抗体断片の例には制限が無く、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ［可変領域］ドメイン抗体（ｄＡｂ）［ワードらによるネイチャー341: 544-546, 1989］、相補性判別領域（ＣＤＲ）断片、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）［バードらによるサイエンス242: 423-426, 1988、およびハスチョンらによるProc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883, 1988、選択的にポリペプチドリンカーを含む；また選択的に多重特異性である、グルバーらによるJ. Immunol. 152: 5368 (1994)］単鎖抗体断片、ダイアボディ［EP 404, 097; WO 93/11161; ホリンガーらによるProc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)］、トライアボディ、テトラボディ、ミニボディ［オラフセンらによるProtein Eng Des Sel. 2004 Apr; 17(4): 315-23］、線形抗体［ザパタらによるProtein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995)］；キレート化組み換え抗体［ネリらによるJ Mol Biol. 246: 367-73, 1995］、トライボディまたはバイボディ［スクーンジャンズらによる J Immunol. 165: 7050-57, 2000; ウィレムズらによるJ Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 786: 161-76, 2003］、イントラボディ［ビオッカらによるEMBO J. 9: 101-108, 1990; コルビーらによるProc Natl Acad Sci USA. 101: 17616-21, 2004］、ナノボディ［コルテツレタモゾらによるキャンサーリサーチ64: 2853-57, 2004］、抗原結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質、キャメル化抗体［デスミターらによるJ. Biol. Chem. 276: 26285-90, 2001; エワートらによるバイオケミストリー41: 3628-36, 2002、米国特許公報第20050136049号および米国特許公報第20050037421号］、ＶＨＨ含有抗体、ミメチボディ［米国特許公報第20050095700号および米国特許公報第20060127404号; WO 04/002424 A2; WO 05/081687 A2］またはそれらの変種または誘導体および、抗体が所望の抗原結合活性を保持する限りにおいて、ＣＤＲシーケンスのような、ポリペプチドへの特定の抗原結合を起こすのに十分な免疫グロブリンの少なくとも一部を含むポリペプチドが含まれてる。
【００４１】
「変種」という語は、抗体との関係で用いられるとき、その変種が、所望のターゲット結合親和力または生物学的活性を保持するとすれば、可変領域または可変領域と等価な部分に少なくとも１つのアミノ酸が置き換えられるか削除されるか挿入されるかしている抗体のペプチドシーケンスのことを称する。加えて、本発明の抗体は、一定領域においてアミノ酸を変更して、半減期またはクリアランス、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性を含めて抗体のエフェクター機能を変更する。そのような変更は、薬物動態を高めるか、例えば癌の治療をする上で抗体の有効性を高める。ＩｇＧ１の場合、一定領域、とりわけヒンジまたはＣＨ２領域の変更は、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性を含めてエフェクター機能を増大または減少させる。他の例においては、ＩｇＧ２一定領域が変更されて、抗体−抗原集合体の形成が低減される。ＩｇＧ４の場合、一定領域、とりわけヒンジ領域の変更によって、半抗体の形成が低減される。
【００４２】
「誘導体」という語は、抗体との関係で用いられるとき、治療または診断試薬への共役、（例えば、放射性核種または種々の酵素での）ラベリング、ペジレーション（ポリエチレングリコールでの誘導体化）のような共有結合高分子付着、および人工アミノ酸の化学合成による挿入または置き換えによって共有結合で変更される抗体のことを称する。本発明の誘導体は、本発明の、誘導されていない分子の結合特性を保持する。癌をターゲットとする抗体の細胞毒性試薬、例えば、放射性同位体（例えば、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０およびＲｅ１８６）、化学療法剤、または毒素への共役は、癌細胞の破壊を高める。
【００４３】
ターゲット分子にとって「特定の」免疫糖タンパク質は、他のどのターゲットよりも大きな親和力で、そのターゲットに結合する。本発明の免疫糖タンパク質は、Ｋａが少なくとも約１０４Ｍ−１またはその代わりに少なくとも約１０５Ｍ−１、１０６Ｍ−１、１０７Ｍ−１、１０８Ｍ―１、１０９Ｍ−１または１０１０M−１というターゲットについて親和力を有する。そのような親和力は、通常の技法、例えば、ＢＩＡコアインスツルメントを用いることまたは放射能標識のついたターゲット抗原を用いる放射免疫測定によって容易に測定される。親和力データは、例えば、スキャッチャードらによるAnn N.Y. Acad. Sci., 51: 660 (1949) の方法によって分析される。
【００４４】
糖修飾因子
「糖修飾因子」は、好ましくは、分子量が＜１０００ドルトンの、ポリペプチドに付着する炭水化物（糖）の一部である糖の付加、除去または修飾に関与する酵素の活性を抑制する小さな有機化合物である。グリコシル化は、小胞体（「コアグリコシル化」）およびゴルジ体（「端末グリコシル化」）で起こる極めて複雑なプロセスである。
【００４５】
本発明においては、初期段階の糖修飾因子の活性を抑制するＲＮＡｉまたはアンチセンスを含む、グリコシル化酵素の、ポリペプチドベースまたはポリヌクレオチドベースの抑制体が有用であるが、「糖修飾因子」の定義からは除外する。
【００４６】
ここで用いられるように、「初期段階の糖修飾因子」は、Ｎ‐アセチルグルコサミンをマンノースに加える前の１つ以上のグリコシル化工程のインヒビターのことを称し、ＥＲグルコシダーゼＩ、ＥＲグルコシダーゼＩＩ、ＥＲマンノシダーゼ、ゴルジマンノシダーゼＩＡ、ゴルジマンノシダーゼＩＢ、ゴルジマンノシダーゼＩＣおよびＧｌｃＮＡｃ‐トランスフェラーゼＩが含まれる。
【００４７】
それに続くグリコシル化工程には、ゴルジマンノシダーゼＩＩ、ＧｌｃＮＡｃ‐トランスフェラーゼＩＩ、ガラクトシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼおよびフコキナーゼが含まれる。
【００４８】
代表的な糖修飾因子には、以下のいずれかが含まれる。カスタノスペルミンは、グルコシダーゼＩおよびＩＩのインヒビターであると考えられている。デオキシフコノジリミシンは、フコシダーゼのインヒビターである。６‐メチル‐テトラヒドロ‐ピラン‐２H‐２、３、４‐トリオールは、インビトロで、Ｌ‐フコースのリン酸化、すなわち、ＧＤＰ‐Ｌ‐フコースの生合成の第一工程を阻害することが報告されている。６、８ａ‐ジエピカスタノスペルミンは、フコシルトランスフェラーゼのインヒビターであると報告されている。１‐Ｎ‐イミュノシュガーＡおよびＢ（それぞれ、１‐ブチル‐５‐メチル‐ピペリジン‐３、４‐ジオール塩酸塩および５‐メチル‐ピペリジン‐３、４‐ジオール塩酸塩としても知られている）は、フコシルトランスフェラーゼのインヒビターであることが報告されている。デオキシマンノジリミシン（ＤＭＪ）は、ＥＲマンノシダーゼＩのインヒビターである。キフネンシン（Ｋｆ）は、ＥＲマンノシダーゼＩのインヒビターである。スワインゾニン（Ｓｗ）は、ＥＲマンノシダーゼＩＩのインヒビターである。モネンシン（Ｍｎ）は、コアオリゴ糖の伸長に干渉するＥＲとゴルジとの間の細胞内タンパク質輸送のインヒビターである。
【００４９】
本明細書に記述されているデータが示すように、さまざまなグリコシダーゼおよび／またはマンノシダーゼのインヒビターによって、ＡＤＣＣ活性を増大する１つ以上の所望の効果が得られ、Ｆｃ受容体の結合が増大され、グリコシル化パターンが変えられている。
【００５０】
代表的な例においては、カスタノスペルミン（ＭＷ１８９．２１）が、培地に添加され、最終の濃度を約２００μＭ（約３７．８μｇ／ｍＬに相当する）とするか、濃度範囲を約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０または１５０μＭより大きく、約３００、２７５、２５０、２２５、２００、１７５、１５０、１２５、１００、７５、６０または５０μｇ／ｍＬまでとする。例えば、１０−５０か、５０−２００か、５０−３００か、１００−３００か、１５０−２５０μMの範囲が意図されている。
【００５１】
他の代表的な例において、ＤＭＪ、例えば、ＤＭＪ−ＨＣｌ（ＭＷ１９９．６）が培地に加えられて、最終の濃度を約２００μＭ（約３２．６μｇＤＭＪ／ｍＬに相当する）とするか、濃度範囲を約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０または１５０μＭより大きく、約３００、２７５、２５０、２２５、２００、１７５、１５０、１２５、１００、７５、６０または５０μｇ／ｍＬまでとする。例えば、１０−５０か、５０−２００か、５０−３００か、１００−３００か、１５０−２５０μMの範囲が意図されている。
【００５２】
他の代表的な例において、キフネンシン（ＭＷ２３２．２）が培地に加えられて、最終の濃度を約１０μM（約２．３μｇ／ｍＬに相当する）とするか、濃度範囲を約０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０μＭより大きく、約５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２または１１μＭまでとする。例えば、１−１０か、１−２５か、１−５０か、５−１０か、５−２５か、５−１５μＭの範囲が意図されている。
【００５３】
組み換え構造物、細胞および培養方法
ここで用いられるように、「ホスト細胞」は、蚕食性ハイブリドーマを特に除外するが、グリコシル化（すなわち、ポリペプチドのアミノ酸への糖の付加）が可能であり、かつ組み換え手段を通して修飾され、レベルの増大したタンパク質プロダクトを発現させる他の細胞を含む。組み換え修飾とタンパク質プロダクトを発現する能力を保持するホスト細胞の子孫も「ホスト細胞」という語の中に含まれる。
【００５４】
発現ベクトルまたは規定シーケンスの代表的な要素には、複製の元になるもの、プロモーター、オペレーターまたは転写および翻訳の媒体となるその他の要素が含まれる。プロモーターは、構成性であるか活性であり、かつさらに細胞種特異であるか、組織特有であるか、個々の細胞に特異有であるか、イベント特異であるか、一時的特異であるか、誘導性である。イベントに特異なプロモーターは、イベントが起こるときのみに活性であるか上方制御される。プロモーターに加えて、抑制体シーケンス、負の調節遺伝子または組織に特有のサイレンサーが挿入されて特異でない発現を低減する。他の要素には、内部リボゾーム結合サイト、ポリアデニル化シーケンスを含む転写ターミネータシーケンス、スプライスドナーおよび受容体サイト、エンハンサー、選択可能なマーカー等が含まれる。
【００５５】
培地には、当業界で知られている必要なまたは望ましい成分をいずれも含み得るが、例えば、グルコースを含む糖類、必須および／または非必須アミノ酸、脂質および脂質前駆体、核酸前駆体、ビタミン、無機塩、希少金属を含む微量要素および／または細胞成長因子が含まれる。培地は、化学的に定義され、漿液、植物加水分解物またはその他の誘導された物質が含まれる。培地は、実質的にまたは完全に漿液や動物要素が含まれない。「実質的に漿液が含まれない」は、媒体には漿液が欠如しているか、わずかな量の漿液しか含んでいないことを意味する。細胞培養の間に枯渇される代表的な補遺のアミノ酸には、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、シスチン、イソロイシン、ロイシン、トロプトファンおよびバリンが含まれる。
【００５６】
商業的に入手できる脂質および／または脂質前駆体には、コリン、エタノールアミンまたはホスホエタノールアミン、コレステロール、オレイン酸のような脂肪酸、リノール酸、リノレン酸、メチルエステル、例えば、酢酸塩の形でのＤ‐アルファ‐トコフェノール、ステアリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトオレイン酸、またはアラキノン酸が含まれる。必須アミノ酸には、アルギニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファンおよびバリンが含まれる。非必須アミノ酸には、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸塩、システイン、グルタミン酸塩、グルタミン、グリシン、プロリン、セリンおよびチロシンが含まれる。適当な塩として供給され、商業的に入手できる無機または微量要素には、ナトリウム、カルシウム、カリウム、マグネシウム、銅、鉄、亜鉛、セレニウム、モリブデン、バナジウム、マンガン、ニッケル、ケイ素、錫、アルミニウム、バリウム、カドミウム、クロム、コバルト、ゲルマニウム、カリウム、銀、ルビジウム、ジルコニウム、フッ化物、臭化物、ヨウ化物および塩化物が含まれる。媒体にはまた、混合や通気から細胞が保護されるように、非イオン性界面活性剤または表面活性剤が選択的に含まれる。培地はまた、重炭酸ソーダ、一塩基性および二塩基性リン酸塩、ＨＥＰＳおよび／またはトリスのような緩衝剤を含む。培地はまた、酪酸ナトリウムまたはカフェインのようなタンパク質生成の誘発剤を含む。
【００５７】
本発明によって、免疫糖タンパク質を生成する方法もまた提供されるが、任意の培地において、またはここに記述されるいずれかの条件のもとで、ホスト細胞を培養することを含むものである。当該方法はさらに、ホスト細胞または培地から免疫糖タンパク質を調製する工程を含む。糖修飾因子は、最初の培地に含まれているか、または最初の成長段階またはその後の段階で添加される。組み換えタンパク質が媒体中に分泌されるとき、培地を周期的に取り出すことができ、また何回かの取り出しサイクルを経て新しい培地と置き換えることができる。
【００５８】
治療用のタンパク質生成に広く用いられているＣＨＯ細胞が好ましいけれども、グリコシル化タンパク質を生成することが当業界で知られているいずれのホスト細胞を用いてもよく、これには、酵母細胞、植物細胞、植物、昆虫細胞およびほ乳類の細胞が含まれる。代表的な酵母細胞には、ピキア属（Pichia）、例えば、P. パストリス（Pastoris）およびサッカロミセス属（Saccharomyces）、例えば、S. セレビシエ（cerevisiae） 並びにシゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、 クリベロミセス属（Kluyveromyces）、 K. ザクティス（Zactis）、 K. フラギリス（fragilis）、 K.ブルガリカス（ bulgaricus）、 K. ウィッケラミイ（wickeramii）、 K. ワルティイ（waltii）、 K. ドロソフィララム（drosophilarum）、 K.（サルノトレランス） thernotolerans、 K.（マルキアヌス） marxianus、 K. （ヤルロウィア）yarrowia、 トリコデルマ・リージア（Trichoderma reesia）、 アカバンカビ（Neurospora crassa）、シュワンニオミセス（ Schwanniomyces）、 シュワンニオミセス  オッシデンタリス（Schwanniomyces occidentalis）、ニューロスポラ（ Neurospora）、 ペニシリウム属（Penicillium）、 トチポクラディウム（Totypocladium）、 アスペルギウス属（Aspergillus）、 アスペルギウスニジュランス（A. nidulans）、 クロコウジカビ（A. niger）、 ハンゼヌラ（Hansenula）、 カンジダ属（Candida）、 クロエケラ属（Kloeckera）、トルロプシス（ Torulopsis）およびロドトルラ属（Rhodotorula）が含まれる。代表的な昆虫細胞には、オートグラファカリフォルニカ（Autographa californica）およびスポドプトーラフルギペルダ（ Spodoptola frugiperda）並びにショウジョウバエ属（Drosophila）が含まれる。代表的なほ乳類の細胞には、CHO、BHK、HEK-293、NS0、YB2/3、SP2/0の変種およびPER-C6またはHT1080のようなヒト細胞、並びにVERO、HeLa、COS、MDCK、NIH3T3、Jurkat、Saos、PC-12、HCT 116、 L929 、Ltk-、WI38、CV1、TM4、W138、Hep G2、MMT白血病細胞系、胚幹細胞または受精卵細胞が含まれる。
【００５９】
細胞は、当業界で知られているいかなる培養システムにおいても、かついかなる方法で培養されてもよく、それには、Ｔ‐フラスコ、スピナーおよび振とうフラスコ、ローラーボトル、撹拌タンクバイオリアクターが含まれる。付着依存性細胞もまた、撹拌タンクバイオリアクターに懸濁して保持されるマイクロキャリア、例えば、高分子球体で培養することができる。あるいは、細胞は、単細胞懸濁液において成長させることができる。培地が添加されるのは、バッチ処理であって、例えば、培地が単一のバッチで細胞に一度に添加されても良いし、培地の小さなバッチが周期的に添加される流加バッチ処理であっても良い。培地は、培養の終わりに回収されるか、培養中に何度かにわたって取り出される。継続的に潅流させる生成処理もまた当業界で知られており、新しい培地を、同じ量でリアクターから継続的に引き出しながら、培養に継続的に供給することが伴われる。潅流による培養は、一般にバッチによる培養よりも細胞密度が高く、繰り返して回収しながら何週間もまたは何ヶ月も維持できる。
【００６０】
免疫糖タンパク質の使用
本発明の免疫糖タンパク質は、ターゲット分子が媒体となる疾患を処置する治療術として有用であり、例えば、発現したまたは細胞表面と結びついたターゲット分子を有する癌細胞を死滅させるための細胞崩壊剤として有用である。
【００６１】
「処置」または「処置する」は、治療または予防または防止処置のことを言う。治療は処置を受ける被体の疾患の少なくとも１つの症状が良好となるか、被体において進行する疾患の悪化を遅延させ、あるいは関連する疾患が新たに発症することを防止する。改善された効果は、疾患状態について、当業界で周知の臨床基準を評価することで、査定される。
【００６２】
免疫糖タンパク質の「治療で有効なドース」または「有効なドース」は、処置される疾患の１つ以上の症状が結果的に良くなるのに十分な化合物の量のことを称する。個人に活性成分を単独で投与するとき、治療に有効なドースは、その成分のみについて称する。組み合わせて投与されるとき、治療で有効なドースは、連続して投与されようとも同時に投与されようとも、結果的に治療の効果が得られる活性成分を合わせた量のことを称する。ドースは、患者の体重に基づいて投与され、例えば０．０１乃至５０ｍｇ／ｋｇのドースであって、日単位または週単位で、あるいは二週間毎、三週間毎または月に一度投与される。
【００６３】
本発明の免疫糖タンパク質をヒトまたは実験動物に投与するのに、組成物が非経口的な投与のためのものであるならば、１つ以上の薬学的に許容され得る担体または希釈剤、好ましくは、殺菌されたまたは無菌の担体また希釈剤を有する組成物において、分子を調製するのが好ましい。「薬学的にまたは薬理学的に受け入れ可能な若しくは許容され得る」という文言は、以下に記述されるような当業界で周知の経路を用いて投与されるとき、アレルギーまたはその他の有害な反応を引き起こさない分子状態および組成物のことを称する。「薬学的に受け入れ可能な担体」には、臨床的に有用な溶剤、分散媒体、被覆、抗菌性剤および抗真菌性剤、等張剤および吸収遅滞剤等が全て含まれる。一般に、組成物にはまた、発熱物質並びに被体に有害であり得るその他の不純物は実質的に含まれない。
【００６４】
免疫糖タンパク質が投与されるのは、経口であっても、局部的であっても、経皮であっても、非経口であっても、吸入スプレーによっても、経膣であっても、頭蓋内注射によってでも良い。ここで用いられる非経口という語には、皮下注射、静脈内、筋肉内、嚢内への注射または注入技法が含まれる。静脈内、皮膚内、筋肉内、乳房内、腹腔内、髄膜内、眼球後方、肺内への注射および／または特定の場所への手術での注入による投与も同様に意図されている。
【００６５】
１つの例において、処置を必要とする癌または病気にかかった組織の箇所に、その箇所への直接の注射によるか、製剤を内部に放出できる、持続的な放出法または持続的な吐出メカニズムを介して投与が行われる。例えば、組成を持続して放出可能な生分解性の微小球またはカプセルその他の生分解性高分子構成物（例えば、可溶ポリペプチド、抗体または小分子）は、癌の近辺に注入される本発明の製剤に含ませることができる。
【００６６】
また治療組成物を、患者の複数の箇所に放出しても良い。複数の投与が同時に行われても、また継続した期間内に投与されても良い。
【００６７】
特に、水溶液の注入が好ましい。水性の組成物は、真空状態で凍結乾燥して貯蔵され、使用に先立って適切な担体で復元できる。この技法は、従来の免疫グロブリンで有効であることが示されている。真空状態で凍結乾燥し、復元する技法は、適切であれば任意のものを用いることができる。当業者には、真空状態で凍結乾燥して復元すると、活性の損失の度合いがさまざまであり、それを補償するために使用のレベルを調節しなければならないということが理解される。
【００６８】
あらゆる場合において、製剤は、殺菌され、かつ注射器での扱いが容易である程度に液化されていなければならない。例えば、レシチンのような被覆を用いること、分散している場合には必要な粒子のサイズを維持すること、および界面活性剤を用いることによって、適切な流動性を維持することができる。また、製造および貯蔵する条件のもとで安定していなければならず、バクテリアや菌類のような微生物の汚染作用を防いで保存される。微生物の作用は、さまざまな抗菌性剤および抗真菌性剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によって防ぐことができる。多くの場合、等張剤、例えば、砂糖または塩化ナトリウムを含むことが望ましい。
【００６９】
さらに、本発明での使用が意図されている組成物は、親水性と疎水性のバランスが良好であり、これによりインビトロおよびインビボの使用、特にインビボでの使用について実用性が高いが、他の組成物は、このようなバランスを欠いており実用性が相当に低い。とりわけ、本発明での使用が意図されている組成物は、身体での吸収および生物学的利用を可能とする水性媒体に可溶である度合いが適切であり、また一方、化合物が、細胞膜を横切って作用すると推定される箇所に至ることを可能とする程度に脂質にも可溶である。
【００７０】
また、本発明で意図されているのは、免疫糖タンパク質組成物を第二の薬剤と一緒に投与することである。
【００７１】
さらに、本発明には、本発明の方法を実施するために、１つ以上の化合物または組成物が容易に使用できるようにパッケージとなった状態で、それらを備えるキットまたは製品が含まれる。１つの例において、そのようなキットには、選択的に第二の治療薬と一緒に、密封された瓶または器のような容器にパッケージされた状態で、本発明における免疫糖タンパク質が含まれており、その容器にはラベルが貼られているか、該方法を実施する上での、化合物または組成物の使用について記述するパッケージに納められている。好ましくは、その化合物または組成物は、ドース単位の形でパッケージされている。そのキットにはさらに、特定の投与経路によりその組成物を投与するのに適切な、またはスクリーニングアッセイを行うのに適切な装置が含まれる。好ましくは、当該キットには、該組成物の使用について記述されたラベルが入っている。
【００７２】
さらに本発明では、免疫糖タンパク質が結びつくターゲットにより特徴付けられるか媒介される被体における、疾患、病状または障害を抑制、防止または処置するための医薬の製造で、本発明の免疫糖タンパク質を用いることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】図１は、様々な濃度のカスタノスペルミンを備える細胞媒体において成長するＴＲＵ‐０１６を発現するＣＨＯ細胞の成長を、ｃｅｌｌｓ／ｍｌという細胞数で示す。
【図２】図２は、様々な濃度のカスタノスペルミンを備える細胞媒体において成長するＴＲＵ‐０１６を発現するＣＨＯ細胞の生存度を、生存細胞の％で示す。
【図３】図３は、様々な濃度のカスタノスペルミンの存在で培養される細胞が生成するＴＲＵ‐０１５のＣＤ１６結合を示し、かつ幾何学的に示された平均蛍光強度対カスタノスペルミン濃度を示す。
【図４】図４は、様々な濃度の６、８ａ‐ジエピカスタノスペルミン、スワインソニンまたはデオキシマンノジリミシン（ＤＭＪ）の存在で培養される細胞が生成するＴＲＵ‐０１６のＣＤ１６結合を、幾何学的に示された平均蛍光強度で示す。
【図５】図５は、様々な濃度のキフネンシンの存在で培養される細胞が生成するＴＲＵ‐０１６のＣＤ１６結合を、蛍光強度の平均で示す。
【図６】図６は、様々な濃度のカスタノスペルミンの存在で培養される細胞が生成するタンパク質Ａが取り除かれたＴＲＵ‐０１６のＣＤ１６結合を、蛍光強度の平均で示す。
【図７】図７は、高親和性および低親和性ドナーのＰＢＭＣを用いて測定したＴＲＵ‐１５のＡＤＣＣを示し、添加ＴＲＵ‐０１５の濃度対％特有の致死量をプロットした図である。
【図８】図８は、高親和性および低親和性ドナーのＰＢＭＣを用いて測定したＴＲＵ‐１５のＡＤＣＣを示し、添加ＴＲＵ‐０１５の濃度対％特有の致死量をプロットした図である。
【図９】図９は、様々な濃度のカスタノスペルミンの存在で培養される細胞が生成するＴＲＵ‐０１６のＡＤＣＣを示し、％特有の致死量対添加ＴＲＵ‐０１６の濃度をプロットした図である。
【図１０】図１０は、様々な糖修飾因子の存在で培養される細胞が生成するＴＲＵ‐０１６のＡＤＣＣを示し、％特有の致死量対添加ＴＲＵ‐０１６の濃度をプロットした図である。
【図１１】図１１は、様々な糖修飾因子の存在で培養される細胞が生成するＴＲＵ‐０１６を投与されたマウスにおける薬物動態データを示す。
【図１２】図１２は、様々な糖修飾因子で処置した細胞が生成するＴＲＵ‐０１６を投与されたマウスの漿液におけるＴＲＵ‐０１６のＣＤ１６結合を示す。
【図１３】図１３は、腫瘍細胞をインプランとされ、様々な糖修飾因子で処置した細胞または処置していない細胞から生成されるＴＲＵ‐０１６を投与されたマウスにおいて８日後の腫瘍の相対容量を示す。
【図１４】図１４は、腫瘍細胞をインプラントされ、様々な糖修飾更因子で処置した細胞または処置していない細胞から生成されるＴＲＵ‐０１６を投与されたマウスの生存率％を示す。
【図１５】図１５は、カスタノスペルミンの存在で培養された細胞が生成するＴＲＵ‐０１５のＣＤＣを示し、ヨウ化プロピジウムでポジティブ（正）の％（死亡細胞）対ＴＲＵ‐０１５実験タンパク質の濃度をプロットした図である。
【図１６】図１６は、様々な糖修飾因子の存在で培養された細胞が生成するＴＲＵ‐０１６のＣＤＣを示し、ヨウ化プロピジウムでポジティブ（正）の％（死亡細胞）対ＴＲＵ‐０１６実験タンパク質の濃度をプロットした図である。
【図１７】図１７は、カスタノスペルミン濃度範囲に対する、ＴＲＵ‐０１６に特異なタンパク質生成を示す。
【図１８】図１８は、カスタノスペルミン濃度範囲に対する、ＴＲＵ‐０１６のＣＤ３７およびＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６）への同時結合についてのアッセイ結果を示す。
【図１９】図１９は、カスタノスペルミン濃度範囲に対する、ＴＲＵ‐０１６からＣＤ３７を発現する細胞の用量反応結合曲線を示す。
【図２０】図２０は、カスタノスペルミン濃度範囲に対する、ＴＲＵ‐０１６のＡＤＣＣ活性曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７４】
例
例１
ＳＭＩＰプロダクトの製造
ＴＲＵ‐０１６
ＣＤ３７‐特有のＳＭＩＰが、共同で所有されている米国特許出願第１０／６２７，５５６号および米国特許公開第２００３／１３３９３９号、米国特許公開第２００３／０１１８５９２号および米国特許公開第２００５／０１３６０４９号に記述されており、それら各々は、援用することでその全体をここに組み入れられる。代表的なＳＭＩＰ、すなわちＴＲＵ‐０１６は、以下に記載されるようにして生成される。
【００７５】
ＴＲＵ‐０１６［G28-1 scFv VH11S(SSC-P)H WCH2 WCH3］は、ＣＤ３７抗原に結合する組み換え単鎖タンパク質である。ＴＲＵ‐０１６のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NOS: 1および2で並べられている。結合ドメインは、前段落に列挙されている特許公報において以前開示されたＧ２８‐１抗体シーケンスに基づいた。結合ドメインは、モディファイされたヒンジ領域を通して、エフェクタードメイン、すなわち、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメインに接続されている。ＴＲＵ‐０１６は、溶液において二量体として存在する。
【００７６】
ＴＲＵ‐０１６は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）ほ乳類細胞出現システムにおいて、組み換えＤＮＡ技術によって生成される。ＴＲＵ‐０１６ＳＭＩＰは、タンパク質Ａ親和クロマトグラフィーでＣＨＯ培養上清から精製される。ｄＰＢＳを用いると、５０ｍＬのｒタンパク質Ａ ＦＦセファロースカラム（ＧＥヘルスケアｒタンパク質ＡセファロースＦＦ、カタログ＃１７‐０９７４‐０４）は、１．５カラム体積（ＣＶ）について５．０ｍｌｓ／ｍｉｎ（１５０ｃｍ／ｈｒ）で平衡となる。ＡＫＴＡエクスプローラ１００Ａｉｒ（ＧＥヘルスケアＡＫＴＡエクスプローラ１００Ａｉｒ、カタログ＃１８‐１４０３‐００）を用いて、培養上清が１．７ｍｌｓ／ｍｉｎという流速でｒタンパク質ＡセファロースＦＦカラムに加えられ、組み換えＴＲＵ‐０１６を捕捉する。そのカラムは、５カラム容量（ＣＶ）分のｄＰＢＳで洗浄され、そして１．０Ｍ NaCl、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０で、さらに２５ｍＭ NaCl、２０ｍＭ NaOAc、ｐＨ５．０で洗浄される。これらの洗浄工程により、不特定に結合されたＣＨＯホスト細胞タンパク質が、溶出後の生成物沈殿に貢献するｒタンパク質Ａカラムから取り除かれる。
【００７７】
組み換えＴＲＵ‐０１６は、１００ｍＭグリシン、ｐＨ３．５を備えるカラムから溶出される。その溶出された生成物の一部である１０ｍＬが回収され、そしてその溶出された生成物が、０．５Ｍ  ２‐（Ｎ‐モルフォリノ）エタンスルフォン酸（ＭＥＳ）ｐＨ６．０の溶出した容量の２０％で、ｐＨ５．０とした。この溶出された生成物は、約２５ｍｇ／ｍＬのＴＲＵ‐０１６に濃縮されて濾過殺菌される。
【００７８】
そして、精製されたタンパク質がＧＰＣサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）にかけられ、より高い分子量の集合体からＴＲＵ‐０１６（二量体）分子をさらに精製する。ｄＰＢＳを用いて、１Ｌのスーパーデックス２００ＦＦセファロースを含むＸＫ５０／１００カラム（ＧＥヘルスケアＸＫ５０／１００からのクロマトグラフィーカラム、カタログ＃１８‐８７５３‐０１）が、１．５カラム容量（ＣＶ）について１２．６ｍｌｓ／ｍｉｎ（３８ｃｍ／ｈｒ）で平衡となる。サンプルの５４ｍｌｓ（３％ＣＶ）という最大容量が、カラムに適用される。カラムは、１２．６ｍｌ／ｍｉｎで操作され、容出されたタンパク質は、４０ｍｌの画分に分けられる。各画分は、分析ＨＰＬＣを用いて生成物品質について分析され、そして溶出された部分は、＞９５％ＰＯＩ（集合体になっていない）ＴＲＵ‐０１６についてプールされる。この得られたプール物が、０．２２μｍで濾過殺菌される。そして、物質が、２０ｍＭリン酸ナトリウムと２４０ｍＭショ糖で、ｐＨ６．０で濃縮されて形成される。
【００７９】
グリコバリアントを精製する代わりの方法は、以下の通りである。ＴＲＵ‐０１６が、タンパク質Ａ親和クロマトグラフィーによってＣＨＯ培養上清から精製される。ｄＰＢＳを用いて、１ｍＬ MabSelect親和クロマトグラフィーカラム（ＧＥヘルスケアHitrap MabSelect、カタログ＃２８‐４０８２‐５３）が、７カラム容量（ＣＶ）について１．０ｍＬ／ｍｉｎで平衡とされる。培養上清が、Ａｋｔａエクスプローラ１００Ａｉｒ（ＧＥヘルスケア、Ａｋｔａエクスプローラ１００Ａｉｒ、カタログ＃１８‐１４０３‐００）を用いて流速１．０ｍＬ／ｍｉｎでMabSelectカラムに加えられ、組み換えＴＲＵ‐０１６を捕捉する。そのカラムは、２０ＣＶ分のｄＰＢＳで洗浄され、そして２０ｍＭリン酸ナトリウム、５ＣＶ分の１．０Ｍ NaCl、ｐＨ７．０でそして３ＣＶ分のｄＰＢＳで洗浄する。
【００８０】
組み換えＴＲＵ‐０１６が、１０ｍＭクエン酸塩（シトレート）、ｐＨ３．５でカラムから溶出され、そのカラムは、８ＣＶ分の１０ｍＭシトレート３．０でストリップされる。ストリップに続いてそのカラムはｄＰＢＳで５ＣＶ分再平衡とされる。タンパク質は、溶出の間、各画分に集められて、それらは吸着度に基づいてプールされ、このプールされた物質は、溶出物５ｍＬにつき約４００μＬの０．５５Ｍ  ２‐（Ｎ‐モルフォリン）エタンスルフォン酸（ＭＥＳ）、ｐＨ６．０を加えてｐＨ５．０とされる。この中和された溶出物は、濾過殺菌されて、活性アッセイとプロセス分析アッセイの双方に課される。
【００８１】
親抗体のＣＤ３７細胞表面受容体への結合特異性がＴＲＵ‐０１６において保存されるということを確認するために実験が行われた。ヒトＰＢＭＣが、ＬＳＭ密度勾配を持って単離され、非抱合ＴＲＵ‐０１６およびＰＥ抱合抗ヒトＣＤ１９でインキュベートされる。細胞は洗浄され、４５分間氷上にて１：１００FITC GAH IgG（Ｆｃ特異）でインキュベートされる。細胞は、洗浄され、セルクエストソフトウェアを用いるFACsCaliburインスツルメントで二色フロー血球計算によって分析される。細胞は、ＣＤ１９染色によって、Ｂリンパ球または非Ｂリンパ球について振り分けられる。
【００８２】
ＴＲＵ‐０１６の濃度が増大すると、Ｂリンパ球でのＦＩＴＣ信号（ＣＤ１９正ゲート）が、０．０１‐１．０μｇ／ｍｌから、約１μｇ／ｍＬでの飽和または平均蛍光強度（ＭＦＩ）１０００に至るまで急速に増大する。反対に、非Ｂリンパ球数は、染色が検出可能であるが非常に低いので、scFvIgの濃度が増大すると、ゆっくりと増大する。
【００８３】
ＴＲＵ‐０１５
ＣＤ２０‐特異のＳＭＩＰが同様に調製される。ＣＤ２０‐特異のＳＭＩＰは、共同で所有される米国特許公報２００３／１３３９３９、２００３／０１１８５９２および２００５／０１３６０４９において記述され、各々は、援用することでその全体をここに組み入れられる。代表的なＳＭＩＰ、すなわち、ＴＲＵ‐０１５を以下に記載する。
【００８４】
ＴＲＵ‐０１５は、ＣＤ２０抗原に結合する組み換え単鎖タンパク質である。ＴＲＵ‐１５のヌクレオチドとアミノ酸シーケンスは、それぞれSEQ ID NOS:3および4で並べられる。結合ドメインは、公的に入手可能なヒトＣＤ２０抗体シーケンスに基づいた。結合ドメインは、修飾されたＣＳＳヒンジ領域を通して、エフェクタードメイン、すなわち、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメインに接続される。ＴＲＵ‐０１５は、溶液において二量体として存在する。
【００８５】
ＴＲＵ‐０１５は、SEQ ID NO:4のアミノ酸１−２３からの２ｅ１２リーダーペプチドクーロン化シーケンスと、SEQ ID NO:4におけるポジション３４で反映される、可変領域における残基１１でリジンからセリン（ＶＨＬ１１Ｓ）アミノ酸が置き換えられた２Ｈ７ネズミ抗ヒトＣＤ２０軽鎖可変領域と、SEQ ID NO:4の残基１２９で始まるasp-gly3-ser-(gly4ser)2リンカーと、重鎖領域の端にセリン残基が無く、すなわち、ＶＴＶＳＳからＶＴＶＳに変化した２Ｈ７ネズミ抗ヒトＣＤ２０重鎖可変領域と、（ＣＳＳ）シーケンスとワイルド型ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを備えるモディファイされたヒンジ領域を含むヒトＩｇＧ１ Fcドメインとを備える。
【００８６】
例２
糖修飾因子（モディファイア）を有するホスト細胞の培養
ＴＲＵ‐０１６またはＴＲＵ‐０１５ cDNAがトランスフェクトされたＣＨＯ細胞は、一般に以下に記述される手順によって、種々の糖修飾因子（modifier）について濃度を変えて、振とうフラスコまたは揺動バッグで培養された。
【００８７】
振とうフラスコでの作業については、ログ位相ホスト細胞がテストすべき濃度の糖修飾因子とともに１００，０００ cells／ｍｌで接種され、また選択的に５０ｎＭのメトトレキセートとともに接種された。
【００８８】
細胞は、ｔ＝０で１３５０ｍＬのEx-Cell 302培地（ＳＡＴＣバイオサイエンス；全てがインビトロゲンからの非必須アミノ酸、ピルケート、Ｌ‐グルタミン、ペン／ストレップ、ＨＴサプリメントおよびインシュリンを加えて）に３ｘ１０Ｅ６／ｍＬで接種され、Ｔ＞＝７２時間で合計容量５Ｌとされた。細胞は、３７℃でおよび５％の二酸化炭素で培養され、６−７日目から毎日成長および生存度についてモニターした。上清は、典型的には１０−１２日目に、細胞の生存度が６０％未満に落ちたとき回収された。
【００８９】
Ｎａアジドを加えて０．０２％とし、細胞を遠心で取り除き、かつ上清を０．２２μＭフィルターを通して濾過殺菌した。他の例に記述されるアッセイは、示された通りに、上清において行われるものもあり、また他のアッセイは、さらなるタンパク質Ａ精製を経た材料に対して行われるものもあった。揺動バッグの作業について、ログ位相ホスト細胞が、テストされるべき濃度の糖修飾因子（モディファイア）ともに１０−２０％という条件のEx-Cell 302媒体（ＳＡＴＣバイオサイエンス；全てがインビトロゲンからの非必須アミノ酸、ピルケート、Ｌ‐グルタミン、ペン／ストレップ、ＨＴサプリメントおよびインシュリンを加えて）において、１００，０００−２００，０００ cells／ｍＬで５Ｌ揺動バッグ中に接種された。細胞は、３７℃でかつ５％の二酸化炭素で培養され、成長と生存度について毎日モニターされた。上清は、典型的には、１１−１２日目に、または細胞生存率が５０％未満に低下したとき回収された。
【００９０】
ソルバールレジェンド（Sorvall Legend）における３０００ｒｐｍ（１９３２ｒｃｆ）での２０分間の遠心によって細胞が取り除かれ、上清は濾過殺菌された。他の例に記述されるアッセイは、示されたように、上清において行われたものもあるが、他のアッセイは、さらなるタンパク質Ａ精製を受けた材料において行われた。
【００９１】
種々の糖修飾因子の濃度を変えて培養される細胞により生成されるＴＲＵ‐０１６は、以下に記述されるように、ＣＤ１６結合、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、薬物動態パラメータ、およびインビボの活性についてアッセイされる。
【００９２】
図１および図２は、典型例を示しており、１０００μＭまでの濃度の糖修飾因子カスタノスペルミンでの処置は、サンプルを採取した期間全体を通して（１４４時間まで）、細胞数やパーセント細胞生存度に影響を与えなかったということが示されている。
【００９３】
例３
ＦｃＲｓへの結合
例２により生成される免疫糖タンパク質を、受容体の細胞外ドメインがネズミＩｇＧ２ａ Ｆｃに融合する、Ｆｃγ受容体の可溶性Ｉｇ‐融合バージョンへの結合について、インビトロでアッセイした。
【００９４】
可溶性Ｆｃγ受容体材料は、Ｆｃγ受容体Ｉ（Genbank Acc. No. BC032634）、ＩＩａ（Genbank Acc. No. NM_021642）、ＩＩｂ（Genbank Acc. No. BC031992）およびＩＩＩ‐Ｖ１５８（高親和対立遺伝子）（Genbank Acc. No. X07934）およびＩＩＩ‐Ｆ１５８（低親和対立遺伝子）それぞれの細胞外ドメインを、残基２３８（MIgG2aP238S）にPro乃至Serの突然変異があるネズミＩｇＧ２ａ Ｆｃに融合することによって生成された。ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）の双方の形について、ＨＥ４リーダーは、ＣＤ１６アミノ酸１‐１７８でクローン化され、そしてMIgG2aP238Sに融合される。
【００９５】
アッセイは以下のように行われた。１％ウシ胎仔漿液（ＦＢＳ）を含むリン酸塩で緩衝された生理食塩水（ＰＢＳ）において、４５分間、５μｇ／ｍｌのＴＲＵ‐０１５かＴＲＵ‐０１６かを入れたコスター９６ウェルプレートにおいて氷上で５００，０００のＷＩＬ２‐Ｓ細胞（表面上においてＣＤ３７並びにＣＤ２０を発現するＢリンパ腫細胞系（line））が培養された。結合されていないＴＲＵ‐０１５またはＴＲＵ‐０１６は、細胞をスピンし、希釈剤（ＰＢＳ＋１％ＦＢＳ）で洗浄し、ソルバールレジェンド RTにおいて１２００ｒｐｍで再度スピンすることで取り除かれた。そして細胞は、４５分間、氷上で１μｇ／ｍｌの濃度の同じ希釈剤において、所望のＦｃγＲ‐ＭＩｇと融合して培養された。
【００９６】
そして、錯体（WIL2-S細胞/SMIP/FcγR-MIg）が、１：１００の希釈の、ＰＥ抱合AffiniPure F(Ab’)2 ヤギ抗マウスＩｇG[ジャクソンイミュノリサーチ（Jackson Immunoresearch）]（ヒトＦｃと最小の交差反応性を有するマウスＦｃ‐特異の抗体）で培養された。細胞は、セルクエストソフトウェア（ベクトンディキンソン）を用いるFACsCaliburでの一色フロー血球計算によって分析された。
【００９７】
このアッセイで、精製されたＴＲＵ‐０１６タンパク質の代わりに例２のＴＲＵ‐０１６上清が用いられるときは、上清のＳＭＩＰ濃度は、ＴＲＵ‐０１６基準に沿って、希釈上清でＷＩＬ２‐Ｓ細胞を直接染色することによって定量化された。ＴＲＵ‐０１６は、１：５０希釈のＦＩＴＣ抱合F(Ab’)2ヤギ抗ヒト（ガンマ）[Caltag H10101]で染色することによって検出された。
【００９８】
低親和対立遺伝子か高親和対立遺伝子への結合が、ＡＤＣＣ活性に同じように相関するように測定された。ＣＤ１６（低または高親和対立遺伝子）結合の増大がＡＤＣＣ活性の増大と相関していた。
【００９９】
典型的な結果を、図３乃至図６に示す。
【０１００】
０、２、５、１０、３０または１００μｇ／ｍＬのカスタノスペルミンを含む媒体において培養されたＣＨＯ細胞により生成されるＴＲＵ‐０１５精製のタンパク質がＣＤ１６結合についてテストされた（低親和対立遺伝子）。幾何平均蛍光強度の典型的な結果が図３に示されており、培地におけるカスタノスペルミンの濃度が増大すると、ＣＤ１６結合が、用量依存的に増大することが示されている。
【０１０１】
５０または２５０μＭという濃度で６、８ａ‐ジエピカスタノスペルミンを、５０または２５０μＭという濃度でスワインソニンをまたは５０または２５０μＭという濃度でデオキシマンノジリミシン（ＤＭＪ）を含む培地で培養されたＣＨＯ細胞が生成したＴＲＵ‐０１６上清が、ＣＤ１６結合のためにテストされた。平均蛍光強度の典型的な結果が図４に示されており、ＤＭＪのいずれの濃度もＣＤ１６結合を増大させたことが示されている。これらの濃度では、６，８ａ‐ジエピカスタノスペルミンまたはスワインソニンについては効果が見られないが、精製されたタンパク質でさらなるテストが行われて効果を測定する。
【０１０２】
０、０．５、１、３、５または１０μＭという濃度のキフネンシンを含む培地で培養されたＣＨＯ細胞が生成するＴＲＵ‐０１６上清が、CD１６結合についてテストされた。平均蛍光強度の典型的な結果が図５に示されており、キフネンシンは、ＣＤ１６結合を増大させるのにＤＭＪよりずっと大きな効力があり、濃度が最低の０．５μＭであったときでさえ、ＣＤ１６結合を大きく増大させたことが示されている。
【０１０３】
０、１０、２５、５０、１００または２００μＭのカスタノスペルミンを含む培地で培養された、ＣＨＯ細胞により生成されるタンパク質Ａ精製ＴＲＵ‐０１６が、ＣＤ１６結合についてテストされた。平均蛍光強度の典型的な結果が図６に示されており、培地におけるカスタノスペルミンの濃度が増大するとＣＤ１６結合が用量依存的に増大することが示されている。
【０１０４】
例４
ＡＤＣＣ活性
精製されたＴＲＵ‐０１６のＡＤＣＣ活性を測定するために、標識化したＢＪＡＢ Ｂ細胞をターゲットとして用い、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をエフェクター細胞として用いた。ＩＭＤＭ／１０％ＦＢＳにおいて３７℃で二時間、ＢＪＡＢ Ｂ細胞（１０７個の細胞）が、５００μＣｉ／ｍＬ５１Ｃｒクロム酸ナトリウムで標識付けされた。ＰＢＭＣは、リンパ球分離メディア（ＬＳＭ、ＩＣＮバイオメディカル）勾配について分画することで、ヘパリン処理したヒト全血から単離された。１０％ＦＢＳをともなってＲＰＭＩ培地に試薬サンプルが加えられ、各試薬の一連の希釈物が調製された。５１Ｃｒで標識付けされたＢＪＡＢを、２ｘ１０４cells/wellで加えられた。そして、ＰＢＭＣが、２５：１のエフェクター（ＰＢＭＣ）：ターゲット（ＢＪＡＢ）の最終比について５ｘ１０５cells/wellだけ加えられた。反応は９６ウェルプレートの四つ組ウェルで提供された。ＴＲＵ‐０１６の一連の希釈物が、図に示されるように、１０ｎｇ／ｍＬから２０μｇ／ｍＬの範囲の最終濃度でウェルに加えられた。回収したり計数したりするのに先立って、５％ＣＯ２において３７℃で６時間反応を進行させた。放出されたＣＭＰが５０μｌの乾燥した培養上清からPackard TopCountNXTで測定された。パーセント特有の死亡率が減算（サンプルのｃｐｍ［４倍のサンプルの平均］‐ｃｐｍ自発放出）／（ｃｐｍ最大放出‐ｃｐｍ自発放出）ｘ１００によって計算され、データが％特有の死亡率対ＴＲＵ‐０１６濃度としてプロットされた。
【０１０５】
典型的な結果が、図７乃至図１０に示されている。
【０１０６】
０、２、５、１０、３０または１００μｇ／ｍＬのカスタノスペルミンを含む培地で培養されたＣＨＯ細胞が生成するＴＲＵ‐０１５精製タンパク質が、高親和（Ｖ／Ｖ１５８）および低親和（Ｆ／Ｆ１５８）ＣＤ１６ドナーからのＰＢＭＣを用いて測定されたＡＤＣＣについてテストされた。％特有の死亡率の典型的な結果が、図７および図８（それぞれ、高親和ドナーおよび低親和ドナー）に示されており、培養媒体におけるカスタノスペルミンの濃度が増大すると、ＡＤＣＣ活性が用量依存的に増大することが示されている。
【０１０７】
０、１０、２５、５０、１００または２００μＭのカスタノスペルミンを含む媒体で培養されたＣＨＯ細胞が生成するＴＲＵ‐０１６精製のタンパク質が、ＡＤＣＣについてテストされた。％特有の死亡率の典型的な結果が図９に示されており、培地におけるカスタノスペルミンの濃度が増大するとき、ＡＤＣＣ活性が用量依存的に増大することが示されている。
【０１０８】
２００μＭのＤＭＪ、１０μＭのキフネンシンまたは２００μＭのカスタノスペルミンを含む培地で培養されたＣＨＯ細胞により生成されるＴＲＵ‐０１６精製のタンパク質が、ＡＤＣＣについてテストされた。％特有の死亡率の典型的な結果が図１０に示されており、糖修飾因子の、これらの濃度の全てについて、ＣＨＯ細胞が生成する免疫糖タンパク質のＡＤＣＣが改良されたということが示されている。
【０１０９】
例５
ＣＤＣ活性
例２により生成されるＴＲＵ‐０１６精製のタンパク質のＣＤＣ活性を測定するために、ラモスＢ細胞が、７５μｌに５ｘ１０５cells/wellでイスコベス（ギブコ／インビトロゲン、グランドアイランド、ＮＹ）に懸濁された。指示された二倍の濃度でＴＲＵ‐０１６（７５μｌ）が細胞に加えられた。漿液を含まないイスコベスにおいて遠心分離および洗浄を行うのに先立ち、４５分間結合反応を進行させた。種々の濃度のヒト漿液（補体を含む）を備えるイスコベスにおいて細胞が再懸濁された。細胞は、３７℃で６０分間培養された。細胞は、遠心分離によって洗浄され、０．５μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムを備える染色媒体において再懸濁された。FACsCaliburおよびCellQuestソフトウェアを用いるフロー血球計算による分析に先立ち、暗所において室温で１５分間サンプルが培養された（ベクトンディキンソン）。
【０１１０】
未処置のＣＨＯ細胞が生成したＴＲ‐０１５精製タンパク質または３０μｇ／ｍｌのカスタノスペルミンで処置されたＣＨＯ細胞が、ＣＤＣ活性についてテストされた。結果を図１５に示す。
【０１１１】
未処置のＣＨＯ細胞が生成するＴＲＵ‐０１６精製のタンパク質、または２００μＭのＤＭＪ、１０μＭのキフネンシンまたは２００μＭのカスタノスペルミンを含む媒体で培養されたＣＨＯ細胞が、ＣＤＣ活性についてテストされた。結果を図１６に示す。
【０１１２】
これらの結果により、糖修飾ＴＲＵ‐０１５またはＴＲＵ‐０１６についてのＣＤＣは、未処置のＣＨＯ細胞が生成する、対応するタンパク質のＣＤＣに類似していたことが示され、ホスト細胞の培地に糖修飾因子が存在することで、ホスト細胞が生成する免疫糖タンパク質のＣＤＣに大きな影響が及ぼされなかったことを示している。
【０１１３】
例６
薬物動態プロフィール
雌のＢＡＬＢ／ｃマウスに２００μｇのＴＲＵ‐０１６テストタンパク質（未処置のＣＨＯ細胞が生成したＴＲＵ‐０１６または２００μＭのＤＭＪ、１０μＭのキフネンシンまたは２００μＭのカスタノスペルミンで処置したＣＨＯ細胞が生成したＴＲＵ‐０１６）を時刻０で静脈注射した。注射後１５分、２、６、２４、４８、７２、９６および１９２時間で漿液のサンプルが集められた（各時点でマウス３匹）。
【０１１４】
ＴＲＵ‐０１６テストサンプルの各々の漿液濃度を、ＣＤ３７＋ラモスヒト細胞ラインを用いるＦＡＣＳに基づく結合アッセイで測定した。ＣＤ３７＋ラモス細胞（５ｘ１０５cells/well）がテストすべき漿液サンプルと一緒に底の平らな９６ウェルプレートで培養された。スパイク漿液サンプルを用いて標準曲線とした。細胞は、４℃で１時間培養され、検出抗体を添加する前に洗浄した。ＴＲＵ‐０１６テストタンパク質のＣＤ３７＋ラモス細胞への結合は、フルオレッセイン結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγフラグメン特異抗体を用いて検出された。標準曲線を用いて、抗原濃度の関数として結合曲線を描いた。要するに、標準曲線は、ＦＡＣＳ緩衝剤で１：２０に希釈された通常のマウス漿液に加えられたＴＲＵ‐０１６テストタンパク質の周知の様々な濃度からなる。標準曲線は、各プレートにおいて二重に引かれていた。平均蛍光強度（ＭＦＩ）が、ＦＡＣＳ分析からソフトマックスプロソフトウェアに移入され、ＴＲＵ‐０１６テストタンパク質の漿液濃度を計算するのに用いられた。
【０１１５】
薬物動態研究の結果、２００μＭのＤＭＪ、１０μＭのキフネンシンまたは２００μＭのカスタノスペルミンを含む媒体で培養されたＣＨＯ細胞が生成したＴＲＵ‐０１６（図１１に示されている）が、マウスに投与されたとき、未処置のＣＨＯ細胞が生成したＴＲＵ‐０１６に類似する薬物動態プロフィールを呈示するということが示され、ホスト細胞の培地における糖修飾因子は、半減期またはその他の薬物動態パラメータに大きな影響を及ぼさないということが示された。
【０１１６】
ＴＲＵ‐０１６の投与後４８、７２、９６および１９２時間でマウスから得られる、ＴＲＵ‐０１６を含む漿液についてＣＤ１６アッセイを繰り返すことで、テストのあらゆる時点で、増大したＣＤ１６結合活性が漿液によって保持されるということが示された。結果を図１２に示す。
【０１１７】
例７
インビボの糖修飾免疫糖タンパク質活性
ヌードマウスが、０日目に、５ｘ１０６ラモス細胞を皮下に投与され、０、２、４、６および８日目に、２００μｇの対照ヒトＩｇGまたは２００μＭのＤＭＪ、１０μＭのキフネンシンまたは２００μＭのカスタノスペルミンで処置されたＣＨＯ細胞が生成したＴＲＵ‐０１６テストタンパク質を静脈に注射された。典型的には、マウスは６日以内に腫瘍が発達し、その後すぐに死亡する。腫瘍は、デジタルカリパスおよびラブキャットソフトウェアで週に３度測定され、腫瘍の体積は、１／２［長さｘ（幅）］２で計算される。また、週に１度体重を測定する。
【０１１８】
マウスは、腫瘍が１５００ｍｍ３（金曜日に１２００ｍｍ３）の大きさに到達するとき、死亡する。マウスはまた、腫瘍から潰瘍が形成されると死亡し、体重が２０％以上失われてしまうと、腫瘍によって動物としての動きが抑制されてしまう。
【０１１９】
研究が開始されてから８日目の相対的な腫瘍の体積について平均の結果を図１３に示す。研究開始後の生存率％についてのデータが、図１４および以下の表１に示される。
【０１２０】
【表１】
2010507394.tif 000003
【０１２１】
このインビボ研究の結果、２００μＭのＤＭＪ、１０μＭのキフネンシンまたは２００μＭのカスタノスペルミンで処置されたＣＨＯ細胞が生成したＴＲＵ‐０１６は、癌の動物モデルにおいて腫瘍の体積を低減し、平均生存時間を増大させることができた。
【０１２２】
例８
様々な濃度のカスタノスペルミンのタンパク質生成への影響
さらなる実験を行って、カスタノスペルミンの濃度の、ＴＲＵ‐０１６の細胞生存度、密度および特定のタンパク質生成への影響を測定した。
【０１２３】
実験の開始に先立って、ＴＲＵ‐０１６をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞が、加湿された培養器において３７℃かつ５％の二酸化炭素で、１ｘ非必須アミノ酸（メディアテック）、１ｘピルビン酸ナトリウム（メディアテック）、４ｍＭのＬ−グルタミン（メディアテック）、５００ｎＭのメトトレキセート（ＭＰバイオメディカルズ）および１ｍｇ／Ｌの組み換えインシュリン（リコンビュリン‐ジブコ／インビトロゲン社）を補ったEx-CellTM 302というＣＨＯ漿液の含まれない媒体（ＳＡＦＣバイオサイエンス）の入った振とうフラスコで成長された。殺菌されたカスタノスペルミンを、蒸留した／イオンを取り除いた水（メディアテック）で希釈し、０．２μｍＨＴタフリン膜を備える１３ｍｍのアクロディスク（Ｒ）（ポール社）を通して濾過することで、カスタノスペルミンの２００ｍＭの蓄積濃度（アレクシスバイオケミカルズ）が調節された。蓄積溶液を、殺菌され、Ｏリングのついた０．５ｍＬのマイクロ遠心分離チューブ（フィッシャーブランド、フィッシャーサイエンティフィック）に取り分け、−２０℃で凍らせた。実験を開始する約１時間前に、取り分けたサンプルの必要なものを室温に解凍し、ボルテックスして各小瓶の中身を良く混ぜた。
【０１２４】
各実験では、対数期成長の細胞が前述の培地に接種され、２５０ｍＬの振とうフラスコにおける合計容量を２００，０００ cells／ｍＬという密度で６０ｍＬとし、テストすべき濃度でＣＳを付加した。８００μM、４００μＭ、２００μＭ、１００μＭ、５０μＭ、２５μＭおよび０μＭという最終のＣＳ濃度が各々、対のフラスコでテストされた。加湿された培養器において３７℃および５％二酸化炭素で、全ての培養がなされ、生存細胞密度および全体の細胞の生存度について少なくとも１日おきにモニターした。
【０１２５】
８日目に全体の細胞の生存度が５０％乃至７０％（実験１）および３０％乃至５０％（実験２）であったときに、培養物が回収された。細胞および細胞のデブリが、３０００ｒｐｍのソルバールスーパー（Sorvall Super）T21で２０分間の遠心分離によって取り除かれ、その後、上清が、０．２２μｍミリポアエクスプレスプラス膜を備えるミリポアステリフリップ装置を通して殺菌濾過され、精製されるまで２℃乃至８℃で蓄積された。
【０１２６】
各サンプルの細胞領域全体（ＩＣＡ）、表２、が指示するように、細胞の生存度と成長は、大きく影響を受けなかったように見えるが、カスタノスペルミンの濃度が増大すると免疫糖タンパク質の生成が低減した。結果を、図１７および以下の表２に示す。４００μmおよび８００μmのＣＳの濃度が、ＴＲＵ‐０１６タンパク質の生成をそれぞれ約４０％乃至５５％低減することが示されている。
【０１２７】
【表２】
2010507394.tif 000004
【０１２８】
例９
ＴＲＵ‐０１６のＣＤ３７およびＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６）への同時結合についてのアッセイ
【０１２９】
カスタノスペルミン濃度の、ＴＲＵ‐０１６の機能活性への影響を測定するために実験が行われ、それがＦｃγＲＩＩＩａに結合することおよびそれがターゲットの抗原ＣＤ３７に結合することにより測定された。
【０１３０】
例８において記述されるように生成されるＴＲＵ‐０１６は、以下のアッセイにおいてテストされたが、それによって同時に、ＴＲＵ‐０１６結合ドメインの、ＣＤ３７発現ターゲット細胞に結合する能力および、ＴＲＵ‐０１６ＳＭＩＰのＦｃ部の、ヒトＣＤ１６およびネズミＩｇＧＦｃの融合タンパク質に結合する能力が評価される。
【０１３１】
使用されるターゲット細胞は、ダウディ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ‐２１３）細胞系（line）である。ダウディ細胞は、バーキットリンパ腫から得られるヒトＢ‐リンパ芽球状細胞系であり、高レベルのＣＤ３７を発現する。カスタム可溶性ＣＤ１６：ＭｕＩｇＧＦｃ融合タンパク質は、ネズミＩｇＧＦｃに結び付いたヒトＣＤ１６（低親和多形性）である。
【０１３２】
適当な数のダウディ細胞（３５０，０００／ウェルのウェル数倍）がアリコートされて、２５０ｘｇで５分間、１５℃で遠心分離される。上清は取り除かれる。ＵＳＢ（ＵＳＢ ＵＳ１９９４３）１：４からの４％原料をＦＡＣＳ緩衝剤で希釈することによって、１％の冷たいパラホルムアルデヒドが調製される。ＦＡＣＤ緩衝剤は、２％ＦＢＳ（ギブコ）をダルベッコＰＢＳ（インビトロジェン）（ｖ／ｖ）に加え、０．２２μｍフィルターで殺菌濾過することによって調製される。ＦＡＣＳ緩衝剤は貯蔵され４℃で使用される。細胞は、１％パラホルムアルデヒド（５０μＬ／ウェルに等しい体積のウェル数倍）に再懸濁され、底の丸い９６ウェルプレートで培養される。細胞は、４℃で３０分間培養される。この培養に続いて、細胞は、１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝剤を各ウェルに加え、２５０ｘｇで３分間の遠心分離を１５℃で行い、上清を取り除くことによって洗浄される。細胞は、５０μＬのＦＡＣＳ緩衝剤に再懸濁される。ＴＲＵ‐０１６がＦＡＣＳ緩衝剤において、飽和からバックグラウンドのレベルの範囲にある濃度（２４μｇ／ｍＬ乃至０．０１１μg／mＬ）に希釈され、適当なウェル、５０μＬ／well、に加えられ、そして細胞は４℃で２５分間培養される。ＣＤ１６：ＭｕＩｇＧＦｃ融合タンパク質は、ＦＡＣＳ緩衝剤において飽和レベル（２０μｇ／ｍｌ）に希釈され、アッセイ（５０μＬ／ウェル）に加えられ、４℃でさらに３０分間培養されて、細胞表面に結合しているＴＲＵ‐０１６と複合体を形成する。結合していない試薬は、２５０ｘｇで３分間の遠心分離を１５℃で行い、上清を取り除いて、そして２００μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝剤で三回洗浄することによって取り除かれる。そして、細胞は、ネズミＦｃ特異の（かつヒトＦｃには最小限しか反応しないように選択された）、蛍光物質（Ｒ‐フィコエリトリン、ジャクソン１１５‐１１６‐０７１）でタグを付けたＦ（ａｂ’）２抗体で培養される。この抗体は、ＣＤ１６：ＭｕＩｇＧＦｃ融合タンパク質のＭｕＩｇＧＦｃ部に結合する。抗体は、ＦＡＣＳ緩衝剤において１：２００に希釈され、各ウェルに１００μＬが加えられる。プレートは、暗所において４℃で４５分間培養される。結合していないＲ‐ＰＥは、１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝剤を各ウェルに加え、２５０ｘｇで３分間の遠心分離を１５℃で行い、それに続いて上清を取り除くことで取り除かれる。これに続いて、２００μＬ／wellのＦＡＣＳ緩衝剤で二回目の洗浄を行い、２５０ｘｇで３分間の遠心分離を１５℃で行い、そして上清を取り除く。細胞は、２００μＬ／wellの１％パラホルムアルデヒドで再懸濁され、４℃で一晩静置される。
【０１３３】
各サンプルに結合した蛍光は、ＢＤ ＦＡＣＳキャリバーフロー血球計算システムで測定され、セルクエストプロソフトウェア（ベクトンディキンソンｖｅｒ５．２）で分析される。各サンプルのGeoMean蛍光強度がＴＲＵ‐０１６の濃度に対してプロットされる。用量反応が生成されて、SoftMax Proソフトウェア（モルキュラーデバイスｖｅｒ５．０．１）を用いて４パラメータ対数（４‐ＰＬ）曲線に当てはめられる。ＴＲＵ‐０１６の滴定を用いて、テスト物質および比較のための参照物質の用量反応曲線が求められる。処置したおよび未処置のサンプルを比較するために、「Ｄ」‐パラメータ（最大曲線漸近線）を参照として用いる。「Ｄ」値の増大は、対応するサンプルについての結合活性の増大を表す。
【０１３４】
実験の結果を図１８に示し、ＣＳの濃度に対する、用量依存的結合反応が４００μＭまで示され、この点で、結合が横ばいになっている。
【０１３５】
ＣＳで処置されたＴＲＵ‐０１６のサンプルのＣＤ１６への結合が高められても、それは、部分的には分子のＣＤ３７への結合が高められることによらないということを示すために、前記のアッセイを繰り返したが、処置されたまたは未処置のＴＲＵ‐０１６サンプルをアッセイプレートに加えて培養した後、２５０ｘｇで３分間遠心分離を１５℃で行い、上清を取り除き、そして２００μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝剤で三度洗浄することによって、結合していないＴＲＵ‐０１６をウェルから取り除くことは除外した。そして、細胞は、ＦＩＴＣ抱合ヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃ特定抗体（カルタグＨ１０５０１）で培養される。この抗体は、細胞に結合したＴＲＵ‐０１６のヒトＩｇＧ鎖のＦｃ領域に結合する。抗体は、ＦＡＣＳ緩衝剤において１：５０に希釈され、各ウェルに１００μＬ加えられる。プレートは暗所において４℃で４５分間培養される。１００μＬのＦＡＣＳ緩衝剤を各ウェルに加え、２５０ｘｇで３分間の遠心分離を１５℃で行い、続いて上清を取り除くことによって、未結合のＦＩＴＣラベル化された抗体を取り除く。これに続いて、２００μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝剤で二度目の洗浄を行う。細胞は、２００μＬ／ウェルの２％パラホルムアルデヒドで再懸濁され、４℃で一晩静置される。各サンプルに結合した蛍光は、ＢＤ ＦＡＣＳキャリバーフロー血球計算システムで測定され、セルクエストプロソフトウェア（ベクトンディキンソンｖｅｒ５．２）を用いて分析される。各サンプルのGeoMean蛍光強度が、ＴＲＵ‐０１６の濃度に対してプロットされる。用量反応曲線が生成され、SoftMax Proソフトウェア（モルキュラーデバイスｖｅｒ５．０．１）を用いて４パラメータ対数（４‐ＰＬ）曲線に当てはめられる。ＴＲＵ‐０１６の滴定を用いて、未処置の対照サンプルおよび比較のためにＣＳで処置されたサンプルの用量反応曲線が求められる。
【０１３６】
図１９に示されるように、ＣＳで処置されたサンプル全てについて、ＣＤ３７発現細胞に対する用量反応結合曲線は、相互に、および未処置のＴＲＵ‐０１６サンプルと実質的に同一であって、ＣＳでの処置によっても、ＴＲＵ‐０１６の、その特定のターゲット抗原への結合は変わらなかったということが示されている。
【０１３７】
例１０
抗体依存性細胞障害性（ＡＤＣＣ）のアッセイ
カスタノスペルミン濃度の、ＴＲＵ‐０１６の機能活性に対する影響を測定するために実験が行われ、それはＡＤＣＣ活性によって測定された。
【０１３８】
例８に記述されるように生成されたＴＲＵ‐０１６は、プライマリーヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）エフェクター細胞とともにＣＤ３７発現ダウディ癌Ｂ細胞系で培養されて、ＡＤＣＣ活性が評価される。
【０１３９】
ダウディターゲット細胞（５ｘ１０６）が、１５ｍｌの円錐チューブに加えられ、そして２５０ｘｇで５分間の遠心分離が２０℃で行われ、上清が取り除かれた。細胞ペレットは、０．３ｍＣｉクロム‐５１（５１Ｃｒ、ＧＥヘルスケア、ＣＪ５１）を加えることで再懸濁される。細胞は、５％のＣＯ２において、３７℃で７５分間培養され、細胞が放射性同位元素を取り込むことが可能となる。そして細胞は、三度洗浄され、取り込まれなかった５１Ｃｒが取り除かれる。これが行われるのは、１０ｍＬの完全培地‐１０％ＦＢＳ（ギブコ）を備えるＩＭＤＭ（ギブコ）‐をチューブに加え、２５０ｘｇで５分間の遠心分離を２０℃で行い、それに続いて上清を取り除くことによってである。最終の再懸濁は、１１．５ｍＬの完全培地においてである。ＴＲＵ‐０１６は、完全培地において、最大からバックグラウンドレベルまでの細胞溶解（５００ｎｇ／ｍＬ乃至０．００５ｎｇ／ｍＬ）を生成することができる濃度に希釈される。これらの滴定は、底の丸い９６ウェルプレートにおいて、５０μＬ／ウェルで行われる。５１Ｃｒのラベルを付けられたターゲット細胞が、５０μＬ／ウェルおよび対照ウェル（ＴＲＵ‐０１６の無い対照媒体）でＴＲＵ‐０１６の用量滴定に加えられる。プロトコル（ＬＳＭ、ＭＰバイオメディカル、５０４９４／３６４２７）に従う、リンパ球セパレーションメディアを用いての密度勾配遠心分離によって、ヘパリン処理した新鮮な全血からＰＢＬが分離される。ＰＢＬエフェクター細胞は、２５：１乃至３０：１の割合でウェルに、１００ｍＬ／ウェル加えられる（エフェクター：ターゲット）。５％のＣＯ２にてアッセイは３７℃で４．５乃至５時間培養される。エフェクター細胞は、ＴＲＵ‐０１６の濃度に対してターゲット細胞を溶解させ、比例した量の５１Ｃｒをアッセイの上清に放出する。培養に続いて、２５０ｘｇで３分間、プレートの遠心分離が２０℃で行われる。２５μＬ容量の細胞を含まない上清が、全てのウェルから取り除かれてシンチレーションプレート（パーキンエルマー６００５１８５）に入れられ、一晩乾燥される。シンチレーションプレートの各ウェルにおける５１Ｃｒ同位元素の量は、トップカウントプレートリーダー（パーキンエルマー、Ｃ９９０４ＶＯ）を用いて測定される。データは、特定の放出のパーセントとして表される。特定の放出は、以下のように計算される。
【０１４０】
（サンプル値‐自発値）／（最大値‐自発値）＊１００％
自発＝ターゲット細胞のみから放出される５１Ｃｒの量
最大放出＝洗浄溶解剤で処置されたターゲットから放出される５１Ｃｒの量
バックグラウンド対照＝ターゲット細胞＋エフェクター細胞（Ｎｏ ＴＲＵ‐０１６）から放出される５１Ｃｒの量
【０１４１】
用量反応が形成され、SoftMax Proソフトウェア（モルキュラーデバイスｖｅｒ５．０．１）を用いて４パラメータ対数曲線に当てはめられる。ＴＲＵ‐０１６の滴定を用いて、テスト物質および比較のための参照物質の用量反応曲線が求められる。処置したものについてのＥＣ５０値が、処置されていない対照（ＣＳでない）と比較され、ＡＤＣＣ活性のパーセント増大が測定される。以下の表に、図２０に示されるデータがまとめられている。データでは、１００μＭ乃至８００μＭの最終濃度の範囲についてＣＳで処置されたＴＲＵ‐０１６のＡＤＣＣ活性が、未処置のＴＲＵ‐０１６に対して大きく増大していることが示されている。
【０１４２】
【表３】
2010507394.tif 000005
【０１４３】
本発明の構成および方法は、前述の代表的な実施例について記述されているが、発明の概念、思想および範囲から逸脱することなく、ここに記述されている構成および／または方法および工程または方法における一連の工程には、変形を施してもよいことが当業者には明らかである。さらに詳しくは、化学的にも生理学的にも関係のある試薬をここに記述されている試薬と置き換えても、同じまたは同様の結果が達成されるということも明らかである。当業者に明らかなそのような類似の置き換えおよび変形は全て、添付の請求の範囲に定義される本発明の思想、範囲および概念内のものと看做される。
【０１４４】
本明細書の至る所に引用され、当該説明を例示によって詳細に増補する参考文献は全て、援用することでここに組み入れることを明示する。
【図１】
2010507394.tif 000006
【図２】
2010507394.tif 000007
【図３】
2010507394.tif 000008
【図４】
2010507394.tif 000009
【図５】
2010507394.tif 000010
【図６】
2010507394.tif 000011
【図７】
2010507394.tif 000012
【図８】
2010507394.tif 000013
【図９】
2010507394.tif 000014
【図１０】
2010507394.tif 000015
【図１１】
2010507394.tif 000016
【図１２】
2010507394.tif 000017
【図１３】
2010507394.tif 000018
【図１４】
2010507394.tif 000019
【図１５】
2010507394.tif 000020
【図１６】
2010507394.tif 000021
【図１７】
2010507394.tif 000022
【図１８】
2010507394.tif 000023
【図１９】
2010507394.tif 000024
【図２０】
2010507394.tif 000025
【国際調査報告】
2010507394.tif 000026
2010507394.tif 000027
2010507394.tif 000028
2010507394.tif 000029
2010507394.tif 000030