(57)【要約】  本発明は、腱、靭帯または骨の疾患、障害または損傷の治療または予防用の薬剤を調製するための、一連の二糖、ならびにそれらを含む組成物の使用に関する。本発明はまた、二糖を、イヌリンポリ硫酸、グリコサミノグリカン、成長因子または細胞と組み合わせて含む新規組成物にも関する。グリコサミノグリカンは、好ましくはコンドロイチン硫酸またはヒアルロン酸であり、成長因子はＩＦＧ−１である。
2010529972.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類における腱、靭帯または骨の疾患、障害または損傷の治療または予防用の薬剤を調製するための、式（Ｉ）の化合物、ならびにその溶媒和物及び製薬上許容される塩の使用。
【化１】
2010529972.tif 000014
（式中、Ｒ１は、水素、直鎖状もしくは分枝状のＣ１−Ｃ４アルキル、１０個未満の炭素原子のフェニルアルキルまたは−ＣＯＣＨ３であり、
Ｒ２は、水素、−ＣＯＣＨ３または−ＳＯ３Ｙであり、
Ｒ３は、水素、直鎖状もしくは分枝状のＣ１−Ｃ４アルキル、１０個未満の炭素原子のフェニルアルキル、−ＣＯＣＨ３または−ＣＯＰｈ（式中、Ｐｈはフェニルである）であり、
Ｇは、−ＣＯＯＲ４または−ＣＯＯＹ（式中、Ｒ４は、水素、Ｃ１−Ｃ２アルキルまたは１６個未満の炭素原子のアリールアルキルである）であり、
Ａは、水素、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３Ｙまたは−ＣＯＣＨ３であり、
Ｂは、水素、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３Ｙ、または−ＣＯＣＨ３であり、
この際、ＡまたはＢのいずれかは、必ず−ＳＯ３Ｈまたは−ＳＯ３Ｙ（式中、Ｙは、有機もしくは無機カチオンである）のいずれかである。）
【請求項２】
前記薬剤が腱の疾患、前記障害または損傷の治療または予防用である請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記薬剤が靭帯の疾患、前記障害または損傷の治療または予防用である請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記薬剤が骨の疾患、前記障害または損傷の治療または予防用である請求項１に記載の使用。
【請求項５】
Ｒ１が、水素または直鎖状Ｃ１−Ｃ４アルキルであり、Ｇが、−ＣＯＯＲ４または−ＣＯＯＹ（式中、Ｒ４は、水素またはＣ１−Ｃ２アルキルである）であり、Ｙが無機カチオンである請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
Ｒ１が水素であり、Ｒ２が−ＣＯＣＨ３であり、Ｒ３が水素である請求項５に記載の使用。
【請求項７】
Ｒ１がメチルであり、Ｒ２が−ＣＯＣＨ３であり、Ｒ３が水素である請求項５に記載の使用。
【請求項８】
Ａが水素であり、Ｂが−ＳＯ３Ｙであり、Ｇが−ＣＯＯＹ（式中、Ｙは無機カチオンである）である請求項６又は７に記載の使用。
【請求項９】
Ａが−ＳＯ３Ｙであり、Ｂが水素であり、Ｇが−ＣＯＯＹ（式中、Ｙは無機カチオンである）である請求項６又は７に記載の使用。
【請求項１０】
ＡおよびＢが−ＳＯ３Ｙであり、Ｇが−ＣＯＯＹ（式中、Ｙは無機カチオンである）である請求項６又は７に記載の使用。
【請求項１１】
式（Ｉ）の化合物が、次式で表される請求項８に記載の使用。
【化２】
2010529972.tif 000015
【請求項１２】
式（Ｉ）の化合物が、次式で表される請求項９に記載の使用。
【化３】
2010529972.tif 000016
【請求項１３】
式（Ｉ）の化合物が、次式で表される請求項１０に記載の使用。
【化４】
2010529972.tif 000017
【請求項１４】
前記靭帯が関節靱帯である請求項１〜１３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１５】
前記靭帯が歯周靱帯である請求項１〜１３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１６】
前記骨が歯周骨である請求項１〜１３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１７】
前記薬剤がグリコサミノグリカンをさらに含む請求項１〜１６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１８】
前記グリコサミノグリカンがコンドロイチン硫酸である請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
前記グリコサミノグリカンがヒアルロン酸である請求項１７に記載の使用。
【請求項２０】
前記薬剤がイヌリンポリ硫酸をさらに含む請求項１〜１６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２１】
前記薬剤が成長因子をさらに含む請求項１〜１６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２２】
前記成長因子がＩＧＦ−１である請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
前記薬剤が、腱細胞、エピテノン細胞（ｅｐｉｔｅｎｏｎ  ｃｅｌｌ）、靭帯細胞、歯周靱帯繊維芽細胞、セメント芽細胞、骨芽細胞、骨細胞および幹細胞からなる群より選択される細胞をさらに含む請求項１〜１６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２４】
前記疾患、障害または損傷が、腱症、腱炎、リウマチ様腱炎、腱鞘炎、腱滑膜炎、パラテノン炎（ｐａｒａｔｅｎｏｎｉｔｉｓ）、骨損失、歯周炎、歯周炎に関連する歯肉炎および任意の靭帯病からなる群より選択される請求項１〜２３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２５】
前記薬剤が経口投与に適している請求項１〜２２，２４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２６】
前記薬剤が病変内投与に適している請求項１〜２４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２７】
前記薬剤が病変部周囲投与に適している請求項１〜２４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２８】
前記薬剤がインプラントによる投与に適している請求項１〜２４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２９】
前記薬剤が、露出した腱、靭帯または骨への局所投与に適している請求項１〜２４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３０】
請求項１に記載の式（Ｉ）により表される化合物とグリコサミノグリカンを含む医薬組成物。
【請求項３１】
前記グリコサミノグリカンがコンドロイチン硫酸である請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
前記グリコサミノグリカンがヒアルロン酸である請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
請求項１に記載の式（Ｉ）により表される化合物とイヌリンポリ硫酸を含む医薬組成物。
【請求項３４】
請求項１に記載の式（Ｉ）により表される化合物と成長因子を含む医薬組成物。
【請求項３５】
前記成長因子がＩＧＦ−１である請求項３４に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
請求項１に記載の式（Ｉ）により表される化合物と、腱細胞、エピテノン細胞、靭帯細胞、歯周靱帯繊維芽細胞、セメント芽細胞、骨芽細胞、骨細胞および幹細胞からなる群より選択される細胞を含む医薬組成物。
【請求項３７】
式（Ｉ）の化合物が、次式で表される請求項３０〜３６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【化５】
2010529972.tif 000018
【請求項３８】
式（Ｉ）の化合物が、次式で表される請求項３０〜３６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【化６】
2010529972.tif 000019
【請求項３９】
式（Ｉ）の化合物が、次式で表される請求項３０〜３６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【化７】
2010529972.tif 000020
【請求項４０】
哺乳類における腱、靭帯または骨の疾患、障害または損傷の治療または予防に使用するための、請求項１において定義した、式（Ｉ）の化合物、またはその溶媒和物もしくは製薬上許容される塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腱、靭帯または骨の疾患、障害または損傷の治療または予防用の薬剤を調製するための一連の二糖の使用に関する。同様に、本発明は、二糖を含む新規組成物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
多数の研究から、骨および軟組織、例えば靭帯および腱は、特に成人において、自己修復能力に限界があることが確認されている。
【０００３】
腱および靭帯の機能特性および構造特性はとてもよく似ている。腱は筋肉を骨につなぐ解剖学的構造であり、靭帯は骨を他の骨につなぐ類似構造である。どちらも、密性結合組織から形成された、張力に一方向に適応する、コラーゲン（主としてＩ型コラーゲン）繊維が平行する円柱状の細長い構造である。前記組織の血管新生が少ないことが腱および靭帯の治癒が遅い原因の１つである。
【０００４】
腱の主要細胞は腱細胞と呼ばれている。腱細胞の働きは、分解過程と合成過程を通じてマトリックス構造を維持することである。しかし、腱は細胞密度が比較的低く、有糸分裂活性はほとんどない。このことから、この組織の置換率が低いことは明らかであり、そしてこれらの細胞に本来備わっている治癒作用を促進することができる程度は疑わしい。
【０００５】
腱の損傷は、最もよくある整形外科的損傷である。例えば、米国では１年に少なくとも１００，０００例のアキレス腱損傷が診断され、治療されている（Ａ．Ｐｒａｅｍｅｒら、「Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔａｌ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ」，１ｓｔ  ｅｄ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ  Ｓｕｒｇｅｏｎｓ，Ｐａｒｋ  Ｒｉｄｇｅ，ＩＬ，１９９２）。また、米国では毎年１５０，０００〜２００，０００例の前十字靱帯（ＡＣＬ）損傷があると推定されている（Ｓ．Ｌ．Ｗｏｏら、「Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃｓ，ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ  ａｎｄ  ｒｅｈａｂｉｌｉｔａｔｉｏｎ：ｔｈｅ  ｐａｓｔ  ｐｒｅｓｅｎｔ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ」，Ｓｕｒｇｅｏｎ  ２（３），１２５−１３６（２００４））。
【０００６】
腱および靭帯の損傷は、スポーツの実施または事故による損傷、膨脹、不適切な姿勢、細菌感染、薬物の副作用、関節の関節炎をはじめとする様々な要因によって、そして様々な疾患の結果として起こる。
【０００７】
最適水準に達しない治癒、長いリハビリテーション期間、そして高い再発率が腱および靭帯の損傷を適切に治療することを困難にしている。
【０００８】
腱障害（腱疾患）および靭帯病（靭帯疾患）の最も多い薬物学的治療としては、以下が挙げられる：安静、理学療法（運動、マッサージ、超音波、レーザー、水治療法、温冷）、栄養補助食品、外科手術、ならびに非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、グルココルチコイドおよび抗生物質を含む薬剤（薬剤は疾患が感染によって起こった場合である）。ＮＳＡＩＤおよびグルココルチコイドの両方に副作用があることは知られている。ＮＳＡＩＤの副作用には、胃酸過多、むかつき、下痢、めまいが含まれ、場合によっては、胃潰瘍および肝炎も含まれる。グルココルチコイドの副作用は、出血、腱断裂および感染であり得、コラーゲン合成までも減速し得る。さらに、最近の刊行物では腱再生におけるＮＳＡＩＤの効力を疑問視している（Ｄ．Ｍａｒｓｏｌａｉｓら、「Ｎｏｎｓｔｅｒｏｉｄａｌ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｒｕｇ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ａｎｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｂｕｔ  ｄｏｅｓ  ｎｏｔ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｔｅｎｄｏｎ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ」，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．８３（７），９９１−９９９（２００３））。
【０００９】
ここ数年の間に、幹細胞（Ｒ．Ｇ．Ｙｏｕｎｇら、「Ｕｓｅ  ｏｆ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ａ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｍａｔｒｉｘ  ｆｏｒ  Ａｃｈｉｌｌｅｓ  ｔｅｎｄｏｎ  ｒｅｐａｉｒ」，Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．１６（４），４０６−４１３（１９９８））、腱細胞（米国特許出願公開第２００５０６００３３号）、靭帯細胞（Ｊ．Ａ．Ｃｏｏｐｅｒ，Ｊｒ．，「Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｃｒｕｃｉａｔｅ  ｌｉｇａｍｅｎｔ，ｍｅｄｉａｌ  ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ  ｌｉｇａｍｅｎｔ，Ａｃｈｉｌｌｅｓ  ｔｅｎｄｏｎ  ａｎｄ  ｐａｔｅｌｌａｒ  ｔｅｎｄｏｎ  ａｓ  ｃｅｌｌ  ｓｏｕｒｃｅｓ  ｆｏｒ  ｔｉｓｓｕｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｌｉｇａｍｅｎｔ」，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２７，２７４７−２７５４（２００６））、成長因子（国際公開第０１／８２９５１号パンフレット；Ｌ．Ａ．Ｄａｈｌｇｒｅｎら、「Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−Ｉ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｉｎ  ａ  ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｆｌｅｘｏｒ  ｔｅｎｄｏｎｉｔｉｓ」，Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．２０，９１０−９１９（２００２））で、または遺伝子（Ｒ．Ｓ．Ｇｏｏｍｅｒら、「Ｎｏｎｖｉｒａｌ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ａｒｔｉｃｕｌａｒ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ａｎｄ  ｔｅｎｄｏｎ  ｒｅｐａｉｒ」，Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｏｃｔ（３７９  Ｓｕｐｐｌ），Ｓ１８９−２００（２０００））での、腱障害および靭帯病の治療について調査が行われている。
【００１０】
骨組織は、特殊化した結合組織であり、残りの結合組織と同様に、細胞、繊維および細胞質基質によって形成されるが、他の結合組織とは違って、その細胞外成分が石灰化し、それによりその支持および保護機能に適した硬質の、堅固な物質となる。骨組織は、体を内部支持し、運動に不可欠である筋肉、腱および靭帯に付着部位を提供する。
【００１１】
骨欠損は、大きな医学的かつ社会経済的課題である。例えば、最新の調査には、損傷した骨組織の再建のための様々な種類の生体材料の適用（Ｕ．Ｋｎｅｓｅｒ，ら、「Ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｂｏｎｅ：ｔｈｅ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  ｓｕｒｇｅｏｎ’ｓ  ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  ｖｉｅｗ」，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１０（１），７−１９（２００６））、ならびに成長因子（国際公開第２００６／０４４３３４号パンフレット）および幹細胞（米国特許第６，８６３，９００号）の使用がある。
【００１２】
上述の骨、腱および靭帯は、筋骨格系の要素であり、それらの全ては胚レベルにおいて中胚葉から生じる。
【００１３】
本発明の化合物は、特許文献１（欧州特許第１３００４１１号（米国特許第６，６８０，３０４号））において初めて記載された二糖であり、変形性関節症（関節症）の治療において有用性がある。また、前記特許文献は、炎症性疾患、例えば炎症性関節炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、リウマチ熱、回帰性リウマチ、ライター症候群、紅斑性狼瘡および強直性脊椎炎の治療における、ならびに血液凝固制御におけるそれらの有用性についても言及している。これらの化合物の基本構造は、β−（１−＞３）結合によって結合された単糖のグルクロン酸とグルコサミンを含み、単糖のグルコサミンのＣ−４および／またはＣ−６に硫酸基を有する。
【００１４】
本発明のいくつかの組成物の一部をなすグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）は、生きた生物に本来存在している高分子量のポリマー生体分子であり、生きた生物においてそれらは異なる生理学的機能を発揮する。
【００１５】
コンドロイチン硫酸は、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンとＤ−グルクロン酸により形成された、反復する二糖を特徴とするポリマー構造を有する天然硫酸化グリコサミノグリカンである。Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基の大部分は硫酸化されている。コンドロイチン硫酸は、関節軟骨中に存在するアグリカンの必須成分である。
【００１６】
異なる疾患を治療するための、例えば心血管疾患の治療における（米国特許第３，８９５，１０６号）または乾癬の治療における（国際公開第２００５／０１４０１２号パンフレット）、コンドロイチン硫酸の使用は既に記載されているが、しかし、その最も拡張された使用は、ヒアリン関節軟骨の変性を特徴とする変形性関節症の治療にある（Ｍ．Ｇ．Ｌｅｑｕｅｓｎｅ，Ｒｅｖ．Ｒｈｕｍ．Ｅｎｇ．Ｅｄ．，６１，６９−７３（１９９４）；Ｇ．Ｖｅｒｂｒｕｇｇｅｎら、Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃａｒｔ．，６（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  Ａ），３７−３８（１９９８））。
【００１７】
ヒアルロン酸は、単糖のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとＤ−グルクロン酸により形成された、反復する二糖を特徴とするポリマー構造を有する非硫酸化グリコサミノグリカンである。ヒアルロン酸は、軟骨、滑膜および滑液の主成分の１つである。変形性関節症、一般的には関節内の治療におけるヒアルロン酸の使用は特に重要である。創傷治癒を速めるための眼科学、ならびに化粧品におけるヒアルロン酸の使用もまた記載されている。
【００１８】
腱障害の治療におけるコンドロイチン硫酸、コンドロイチンポリ硫酸およびヒアルロン酸の使用について、矛盾した結果が発表されている。化合物の有益な効果を記載している著者らがいる一方で（Ｅ．Ｍ．Ｇａｕｇｈａｎら、「Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｓｏｄｉｕｍ  ｈｙａｌｕｒｏｎａｔｅ  ｏｎ  ｔｅｎｄｏｎ  ｈｅａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｏｒｓｅｓ」，Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．５２（５），７６４−７７３（１９９１）；Ｈ．Ｓｕｎｄｑｖｉｓｔら、「Ａ  ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ  ｎｏｖｅｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ａｃｈｉｌｌｅｓ  ｐｅｒｉｔｅｎｄｉｎｉｔｉｓ」，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｐｏｒｔｓ  Ｍｅｄ．８，２９８−３０３（１９８７））、治療した腱と対照群との間には有意な差は認められないとする著者らもいる（Ｓ．Ｊ．Ｄｙｓｏｎ，「Ｍｅｄｉｃａｌ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ  ｄｉｇｉｔａｌ  ｆｌｅｘｏｒ  ｔｅｎｄｏｎｉｔｉｓ：ａ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｓｔｕｄｙ  ｉｎ  ２１９  ｈｏｒｓｅｓ（１９９２−２０００）」，Ｅｑｕｉｎｅ  Ｖｅｔ．Ｊ．３６（５），４１５−４１９（２００４）；Ｊ．Ｗ．Ｆｏｌａｎｄら、「Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｓｏｄｉｕｍ  ｈｙａｌｕｒｏｎａｔｅ  ｉｎ  ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ  ｄｉｇｉｔａｌ  ｆｌｅｘｏｒ  ｔｅｎｄｉｎｉｔｉｓ  ｉｎ  ｈｏｒｓｅｓ」，Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．５３（１２），２３７１−２３７６（１９９２））。
【００１９】
本発明の組成物の一部をなすイヌリンポリ硫酸は、天然多糖イヌリンから得られる。異なる硫酸化度のイヌリン硫酸のアルカリ塩は、化学工業において増粘剤、接着剤として、そして石油採掘に用いるマッド用の添加剤として用いられている。イヌリン硫酸が抗凝固活性（Ａｒｋｉｖ  ｆｏｒ  ｋｅｍｉ，ｍｉｎｅｒａｌｏｇｉ  ｏ．ｇｅｏｌｏｇｉ．，Ｂｄ  ２４Ｂ（５），１−４（１９４６））および抗高脂血活性（Ａｒｃｈ．Ｉｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎ，ＸＣＩＸ，３３４（１９５４））を有することが記載されている。
【００２０】
イヌリンポリ硫酸（米国特許第４，０２１，５４５号）が補体阻害活性を有することは記載されている；そのため、イヌリンポリ硫酸を、関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡およびある特定の種類の脈管炎などの疾患の治療に用いることができた。変形性関節症の治療におけるイヌリンポリ硫酸の使用もまた記載されている（国際公開第２００５／０８４６１０号パンフレット）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２１】
【特許文献１】欧州特許第１３００４１１号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
本発明の目的は、腱、靭帯または骨の疾患、障害または損傷の治療または予防において有用である代替薬物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
腱、靭帯または骨の治療における本発明の二糖の使用は、今まで記載されていない。
【００２４】
二糖を含む本発明の組成物もまた記載されていない。
【００２５】
思いがけなく、特許文献１に記載された化合物が、腱、靭帯または骨の疾患、障害または損傷の治療において有用であることはこれまでに見出されている。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】化合物Ｉｃについての、３つの濃度（２００μｇ／ｍＬ、１，０００μｇ／ｍＬおよび３，０００μｇ／ｍＬ）における、付着ヒト腱細胞の数に対する７１時間にわたる効果を示すグラフである。０時点での対照およびＩＧＦ−１も含まれる。
【図２】成長因子ＩＧＦ−１および対照（化合物の不在下での培養）についての、付着ヒト腱細胞の数に対する７１時間にわたる効果を示すグラフである。
【図３】化合物の不在下で１時間の培養後の、透過型電子顕微鏡によるヒト腱細胞（対照）を示す図である。
【図４】化合物Ｉｃとの１時間のインキュベーション後の、透過型電子顕微鏡によるヒト腱細胞を示す図である。
【図５】化合物の不在下で培養したヒト腱細胞（対照）によるＩ型コラーゲンの発現を、赤色免疫蛍光により示す図である。
【図６】化合物Ｉｃとの１時間のインキュベーション後のヒト腱細胞によるＩ型コラーゲンの発現を、赤色免疫蛍光により示す図である。
【図７】化合物の不在下で培養したヒト腱細胞（対照）による接着分子β１−インテグリンの発現を、赤色免疫蛍光により示す図である。
【図８】化合物Ｉｃとの１時間のインキュベーション後のヒト腱細胞（対照）による接着分子β１−インテグリンの発現を、赤色免疫蛍光により示す図である。
【図９】コンドロイチン硫酸と化合物Ｉｃで作製した混合物（ＣＳ／Ｉｃ）についての、３つの濃度（５００／５００μｇ／ｍＬ、１，０００／２００μｇ／ｍＬおよび１，０００／５００μｇ／ｍＬ）における、付着ヒト腱細胞の数に対する１４日間にわたる効果を示すグラフである。０時点での対照およびＩＧＦ−１も含まれる。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本実施形態は、哺乳類における腱、靭帯または骨の疾患、障害または損傷の治療または予防用の薬剤を調製するための、式（Ｉ）：
【化１】
2010529972.tif 000003
（式中、Ｒ１は、水素、直鎖状もしくは分枝状のＣ１−Ｃ４アルキル、１０個未満の炭素原子のフェニルアルキルまたは−ＣＯＣＨ３であり、Ｒ２は、水素、−ＣＯＣＨ３または−ＳＯ３Ｙであり、Ｒ３は、水素、直鎖状もしくは分枝状のＣ１−Ｃ４アルキル、１０個未満の炭素原子のフェニルアルキル、−ＣＯＣＨ３または−ＣＯＰｈ（式中、Ｐｈはフェニルである）であり、Ｇは、−ＣＯＯＲ４または−ＣＯＯＹ（式中、Ｒ４は、水素、Ｃ１−Ｃ２アルキルまたは１６個未満の炭素原子のアリールアルキルである）であり、Ａは、水素、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３Ｙまたは−ＣＯＣＨ３であり、およびＢは、水素、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３Ｙ、または−ＣＯＣＨ３であり、この際、ＡまたはＢは、必ず−ＳＯ３Ｈまたは−ＳＯ３Ｙ（式中、Ｙは、有機もしくは無機カチオンである）のいずれかである）の化合物、ならびにその溶媒和物および製薬上許容される塩の使用に関する。
【００２８】
本実施形態において用語「治療」とは、腱、靭帯または骨の修復または再生を含む。
【００２９】
式（Ｉ）の化合物は、構造中にアノマー炭素を含む。本発明は、アノマー型αおよびβの混合物と個別のアノマー型αおよびβの両方を含む。
【００３０】
好ましい実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、Ｒ１が、水素または直鎖状Ｃ１−Ｃ４アルキルであり、Ｇが、−ＣＯＯＲ４または−ＣＯＯＹ（式中、Ｒ４は、水素またはＣ１−Ｃ２アルキルである）であり、Ｙが無機カチオンである、化合物である。
【００３１】
より好ましい実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、Ｒ１が水素であり、Ｒ２が−ＣＯＣＨ３であり、Ｒ３が水素である、化合物である。Ｒ１がメチルであり、Ｒ２が−ＣＯＣＨ３であり、Ｒ３が水素である式（Ｉ）の化合物も同様に好ましい。
【００３２】
特に好ましい実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、Ａが水素であり、Ｂが−ＳＯ３Ｙであり、Ｇが−ＣＯＯＹ（式中、Ｙは無機カチオンである）である、化合物である。Ａが−ＳＯ３Ｙであり、Ｂが水素であり、Ｇが−ＣＯＯＹ（式中、Ｙは無機カチオンである）である式（Ｉ）の化合物もまた特に好ましい。ＡおよびＢが−ＳＯ３Ｙであり、Ｇが−ＣＯＯＹ（式中、Ｙは無機カチオンである）である式（Ｉ）の化合物も同様に特に好ましい。
【００３３】
本発明の特に好ましい個別化合物は、下式で表される
【化２】
2010529972.tif 000004
のメチル２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−（β−Ｄ−グルコピラノシルウロン酸）−４−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシド、二ナトリウム塩である。
【００３４】
本発明の別の特に好ましい個別化合物は、下式で表される
【化３】
2010529972.tif 000005
のメチル２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−（β−Ｄ−グルコピラノシルウロン酸）−６−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシド、二ナトリウム塩である。
【００３５】
本発明の別の特に好ましい個別化合物は、下式で表される
【化４】
2010529972.tif 000006
のメチル２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−（β−Ｄ−グルコピラノシルウロン酸）−４，６−ジ−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシド、三ナトリウム塩である。
【００３６】
靭帯は、好ましくは関節または歯周の靱帯であり、骨は歯周骨である。
【００３７】
別の好ましい実施形態では、薬剤は、グリコサミノグリカン、好ましくはコンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸またはデルマタン硫酸をさらに含む。
【００３８】
別のさらに好ましい実施形態では、薬剤はイヌリンポリ硫酸をさらに含む。
【００３９】
別のさらに好ましい実施形態では、薬剤は、成長因子、好ましくはＩＧＦ−１をさらに含む。
【００４０】
別のさらに好ましい実施形態では、薬剤は、腱細胞、エピテノン細胞（ｅｐｉｔｅｎｏｎ  ｃｅｌｌｓ）、靭帯細胞、歯周靱帯繊維芽細胞、セメント芽細胞、骨芽細胞、骨細胞および幹細胞からなる群より選択される細胞をさらに含む。
【００４１】
疾患、障害または損傷は、好ましくは、腱症、腱炎、リウマチ様腱炎、腱鞘炎、腱滑膜炎、パラテノン炎（ｐａｒａｔｅｎｏｎｉｔｉｓ）、骨損失、歯周炎、歯周炎に関連する歯肉炎および任意の靭帯病からなる群より選択される。同様に、疾患、障害または損傷は、外傷、酷使または病状、例えば、感染性疾患、代謝性疾患もしくは内分泌疾患の結果である。
【００４２】
薬剤は、好ましくは、経口投与、病変内投与、病変部周囲投与、関節内投与に、インプラントによる投与にまたは露出した腱、靭帯または骨への局所投与に適している。
【００４３】
本実施形態はまた、式（Ｉ）により表される化合物とグリコサミノグリカンを含む医薬組成物を記載する。グリコサミノグリカンは、好ましくはコンドロイチン硫酸またはヒアルロン酸である。
【００４４】
式（Ｉ）により表される化合物とイヌリンポリ硫酸を含む医薬組成物もまた好ましい。
【００４５】
式（Ｉ）により表される化合物と成長因子を含む医薬組成物もまた好ましい。成長因子は、好ましくはＩＧＦ−１である。
【００４６】
式（Ｉ）により表される化合物と、腱細胞、エピテノン細胞、靭帯細胞、歯周靱帯繊維芽細胞、セメント芽細胞、骨芽細胞、骨細胞および幹細胞からなる群より選択される細胞を含む医薬組成物もまた好ましい。
【００４７】
式（Ｉ）の化合物が、下式で表される
【化５】
2010529972.tif 000007
のメチル２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−（β−Ｄ−グルコピラノシルウロン酸）−４−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシド、二ナトリウム塩である医薬組成物が特に好ましい。
【００４８】
同様に、式（Ｉ）の化合物が、下式で表される
【化６】
2010529972.tif 000008
のメチル２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−（β−Ｄ−グルコピラノシルウロン酸）−６−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシド、二ナトリウム塩である医薬組成物が特に好ましい。
【００４９】
同様に、式（Ｉ）の化合物が、下式で表される
【化７】
2010529972.tif 000009
のメチル２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−（β−Ｄ−グルコピラノシルウロン酸）−４，６−ジ−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシド、三ナトリウム塩である医薬組成物が特に好ましい。
【００５０】
本実施形態はまた、哺乳類における腱、靭帯または骨の疾患、障害または損傷の治療または予防に使用するための、上記に定義した式（Ｉ）により表される化合物、またはその溶媒和物もしくは製薬上許容される塩にも関する。
【００５１】
本実施形態による式（Ｉ）の化合物の調製は、欧州特許第１３００４１１号に記載されている合成経路に従って行うことができる。
【００５２】
カチオンＹの性質（有機または無機、金属カチオン、無機金属カチオンであることが好ましい）に応じて、有機または無機塩が得られる。無機塩の例としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アルミニウム塩、アンモニウム塩およびリチウム塩が挙げられる。有機塩の例としては、例えば、エタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩および塩基性アミノ酸塩が挙げられる。
【００５３】
本実施形態による医薬組成物は、式（Ｉ）の化合物とグリコサミノグリカン、例えばコンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸またはデルマタン硫酸を含み得る。
【００５４】
本実施形態のいくつかの組成物の成分であるコンドロイチン硫酸は、それを得るための起源およびプロセスによって、１０，０００ダルトン〜６０，０００ダルトン間に含まれる分子量を有する硫酸化グリコサミノグリカンである。コンドロイチン硫酸は、文献（ＥＳ５４７７６９）に記載されている方法に従って、動物軟骨組織、例えばブタまたはウシ気管、およびサメ軟骨性骨格から得ることができる。コンドロイチン硫酸のポリマー構造は、Ｎ−アセチルガラクトサミンとＤ−グルクロン酸により形成された、反復する二糖を特徴とする。Ｎ−アセチルガラクトサミン残基の大部分は硫酸化されている。
【００５５】
軟骨流出物からのコンドロイチン硫酸は、主に、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基中に存在する硫酸基の位置が異なる２つの異性体、コンドロイチン４−硫酸（コンドロイチン硫酸Ａ）およびコンドロイチン６−硫酸（コンドロイチン硫酸Ｃ）で見られ、これらの異性体は次の構造により表される。
【化８】
2010529972.tif 000010
【００５６】
用語「コンドロイチン硫酸」は、コンドロイチン４−硫酸およびコンドロイチン６−硫酸に加えて、デルマタン硫酸としても知られるコンドロイチン硫酸Ｂ、コンドロイチン２，６−二硫酸として知られるコンドロイチン硫酸Ｄ、コンドロイチン４，６−二硫酸として知られるコンドロイチン硫酸Ｅも含む。
【００５７】
本実施形態において、用語「コンドロイチン硫酸」とは、これら化合物全て、ならびにその混合物を包含する。
【００５８】
本実施形態の組成物に用いるヒアルロン酸は、１００，０００ダルトン〜３，０００，０００ダルトン間に含まれる分子量を有する非硫酸化グリコサミノグリカンである。ヒアルロン酸は、文献（Ｄ．Ａ．Ｓｗａｎｎ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １５６，１７−３０（１９６８）；米国特許第４，７８０，４１４号）に記載されている方法に従って、鳥類または哺乳類組織から、例えば、硝子体液、哺乳類皮膚、臍帯、鳥冠から、抽出によって、また微生物、例えば、連鎖球菌の発酵によって得ることができる。
【００５９】
ヒアルロン酸のポリマー構造は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとＤ−グルクロン酸により形成された、反復する二糖を特徴とする。
【化９】
2010529972.tif 000011
【００６０】
本実施形態において用いるいくつかの組成物の成分であるイヌリンポリ硫酸は、文献（国際公開第２００５／０８４６１０号パンフレット）に記載されている方法に従って、天然多糖イヌリン構造中に存在する遊離ヒドロキシル基のスルホン化によって得ることができる。イヌリンポリ硫酸は次の構造により表される。
【化１０】
2010529972.tif 000012
【００６１】
デルマタン硫酸は、コンドロイチン硫酸Ｂとも呼ばれ、文献（Ｎ．Ｖｏｌｐｉ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１８，３８２−３９１（１９９４）；米国特許第５，１１６，９６３号）に記載されている方法に従って、鳥類または哺乳類組織から、例えば、ウシまたはブタ粘膜および鳥冠から得ることができる。
【００６２】
本実施形態において成長因子について言及する場合には、骨、腱または靭帯の成長において重要な役割を有する成長因子を指す、これらの成長因子には、数ある中でも、ＩＧＦ−１（インスリン様成長因子１）およびＢＭＰ−２（骨形成タンパク質２）が特に含まれる。
【００６３】
本実施形態において幹細胞について言及する場合には、胚幹細胞と成人幹細胞の両方を指す。成人幹細胞には間葉細胞が含まれる。
【００６４】
本実施形態において病変内投与について言及する場合には、実際の損傷への直接投与を指す。
【００６５】
本実施形態において病変部周囲投与について言及する場合には、損傷周囲への投与を指す。
【００６６】
本実施形態の化合物は、腱、靭帯または骨の疾患、障害または損傷の治療または予防に使用するために、従来の技術および賦形剤または担体、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２０００，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａに記載されているものを用いて、適した医薬組成物に処方される。
【００６７】
本実施形態の医薬組成物は、患者に必要用量で投与することができる。組成物の投与は、異なる経路、例えば、経口経路、静脈内経路、腹腔内経路、関節内経路、病変内経路、病変部周囲経路、腱内経路、腱周囲経路、くも膜下腔内経路、皮下経路、筋肉内経路、局所経路、舌下経路、皮内経路または鼻腔内経路によって行うことができる。本発明の医薬組成物は、治療上有効な量の有効成分を含み、その量は、例えば患者の健康状態、年齢、性別、特定の化合物、投与経路、症状の重篤度などの多くの因子や当技術分野で周知の他の因子によって決まる。さらに、当然のことながら、所望の治療効果を提供するために、前記用量の有効成分を単回または複数回用量単位で投与することができる。
【００６８】
本実施形態の医薬調製物は、一般的に、固体形態、液体形態でまたはゲルとして存在する。本発明に従って調製することができる固体形態の医薬調製物には、粉末、ペレット、ミクロスフェア、ナノ粒子、錠剤、分散性顆粒、カプセル剤、シールおよび坐剤が含まれる。液体形態の医薬調製物には、溶液、懸濁液、乳濁液、シロップおよびエリキシルが含まれる。使用直前に液体形態の調製物に変換される固体形態の医薬調製物も企図される。液体形態には、溶液、懸濁液および乳濁液が含まれる。
【００６９】
本実施形態の化合物の使用には、（ｉ）ヒト腱細胞増殖および接着の刺激を測定するためのインビトロアッセイにおいて、本発明の化合物の作用が成長因子ＩＧＦ−１の作用よりも速く；（ｉｉ）そのアッセイ後に、腱細胞には大量の小胞体および細胞外マトリックスが存在するため、腱細胞に対する毒性効果がなく、および（ｉｉｉ）Ｉ型コラーゲンおよび接着分子β１−インテグリンの発現には変化がない、などの利点があることが見出されている。
【００７０】
本実施形態に記載する図および実施例では、Ｉｃは、式：
【化１１】
2010529972.tif 000013
の化合物である。
【実施例】
【００７１】
次の実施例は、単なる例示であって、本発明の範囲を限定するものではない。
【００７２】
＜実施例１：ヒト腱細胞接着および増殖に対する化合物Ｉｃの効果＞
この目的は、薬物刺激腱細胞増殖および接着が腱の治療または修復において特に有用であったことから、インビトロ培養モデルにおけるヒト腱細胞増殖および接着に対する化合物Ｉｃの効果を判定することであった。
【００７３】
比較目的のため、同じ種類のインビトロ培養モデルにおけるヒト腱細胞増殖および接着に対する成長因子ＩＧＦ−１の効果を判定した。
【００７４】
１０箇所の顕微鏡視野内で手集計によって、付着腱細胞の増加を定量した。
【００７５】
＜実施例１の材料と方法＞
ヒト腱外植片（およそ３〜５ｍｍ）を、１０％ＦＣＳ、ＤＭＥＭ／Ｈａｍ−１２（５０／５０）（Ｈａｍ−１２を含む「ダルベッコ改変イーグル培地」）、５０ＩＵ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン、２５μｇ／ｍＬのアスコルビン酸、２．５μｇ／ｍＬのアムホテリシンＢ、１％グルタミンおよび１％必須アミノ酸で作製した培地を入れた培養フラスコ内で培養した。１〜２週間後に、腱細胞は腱組織から移動し始め、培養フラスコに付着し、単層を形成した。十分な量の腱細胞を得るまで、数回継代を行った。
【００７６】
１２−ウェルプレートを１５，０００腱細胞／ウェルで調製し、それらのプレートを１０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）とともにインキュベートした。翌日、細胞を無血清培地（０．５％ＦＣＳ）で３回洗浄し、無血清培地とともに３０分間インキュベートし、その後、対照培養物を計数した（時間「０時間」）。アッセイする化合物Ｉｃ（このアッセイは、３つの濃度：２００μｇ／ｍＬ、１，０００μｇ／ｍＬおよび３，０００μｇ／ｍＬにおいて行った）を加え、細胞を、無血清培地（０．５％ＦＣＳのみ）を用いてインキュベートした。対照培養物および成長因子ＩＧＦ−１培養物（１０ｎｇ／ｍＬ）も無血清培地でインキュベートした。
【００７７】
全てのアッセイにおいて、細胞を７１時間インキュベートし、各時点において、１０箇所の顕微鏡視野内で手集計によって、各ウェルを評価した。
【００７８】
＜実施例１の結果＞
本発明の化合物Ｉｃの３つのアッセイ濃度のうち、最適な濃度は１，０００μｇ／ｍＬである（図１）。この濃度で５時間後に、化合物Ｉｃは、対照（化合物を含まない）に対して付着腱細胞数のおよそ４５％の増加をもたらし、このレベルは２４時間まで維持されるが、一方、ＩＧＦ−１の場合では、この同じ増加は９時間後に達成される（図２）。
【００７９】
本発明の化合物Ｉｃはヒト腱細胞増殖および接着を刺激し、その作用はＩＧＦ−１の作用よりも速いと結論付けることができる。
【００８０】
＜実施例２：ヒト腱細胞接着および増殖に対するコンドロイチン硫酸と化合物Ｉｃの混合物の効果＞
実施例１に記載した手順に従ったが、この際、１２−ウェルプレートを１０，０００腱細胞／ウェルで調製した。コンドロイチン硫酸と化合物Ｉｃの混合物（ＣＳ／Ｉｃ）を３つの濃度：５００／５００μｇ／ｍＬ、１，０００／２００μｇ／ｍＬおよび１，０００／５００μｇ／ｍＬにおいてアッセイした。
【００８１】
＜実施例２の結果＞
コンドロイチン硫酸と化合物Ｉｃで作製した混合物（ＣＳ／Ｉｃ）の３つのアッセイ濃度のうち、最適濃度は１，０００／５００μｇ／ｍＬである（図９）。この濃度で７２時間後に、ＣＳ／Ｉｃ混合物は、対照（化合物を含めない）に対して付着腱細胞数のおよそ３３％の増加をもたらす。そのため、ＣＳ／Ｉｃ混合物はヒト腱細胞増殖および接着を刺激すると結論付けることができる。
【００８２】
＜実施例３：化合物Ｉｃとともにインキュベートした後の透過型電子顕微鏡による腱細胞の評価＞
この目的は、本発明の化合物の毒性を判定できるように、化合物を含めなかった（対照）または本発明の化合物Ｉｃを含めた１時間のインキュベーション後に腱細胞の活力およびアポトーシスの兆候を観察することであった。
【００８３】
＜実施例３の材料と方法＞
実施例１に記載の手順に従って、十分な量の単層腱細胞を調製した。次いで、３５ｍｍペトリ皿当たり１００，０００腱細胞を、１０％ＦＣＳ、ＤＭＥＭ／Ｈａｍ−１２（５０／５０）（Ｈａｍ−１２を含む「ダルベッコ改変イーグル培地」）、５０ＩＵ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン、２５μｇ／ｍＬのアスコルビン酸、２．５μｇ／ｍＬのアムホテリシンＢ、１％グルタミンおよび１％必須アミノ酸で作製した培地４ｍＬとともに播種し、腱細胞をコンフルエンスに達するまでインキュベートした。細胞を無血清培地（０．５％ＦＣＳ）で３回洗浄し、この同じ無血清培地とともに３０分間インキュベートした。アッセイする化合物を加える前に、０時間においてＫａｒｎｏｖｓｋｙの固定液を用いて対照を調製した。次いで、アッセイする化合物Ｉｃ（この化合物を３つの濃度：２００μｇ／ｍＬ、１，０００μｇ／ｍＬおよび３，０００μｇ／ｍＬでアッセイした）を加え、細胞を無血清培地とともに１時間インキュベートした。対照培養物およびＩＧＦ−１培養物（１０ｎｇ／ｍＬ）も無血清培地とともにインキュベートした。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、Ｋａｒｎｏｖｓｋｙの固定液で処理した。その後、ｃｅｌｌ−ｓｃｒａｐｅｒ（登録商標）を用いてペトリカプセルから細胞を取り出し、それらをエッペンドルフチューブに入れ、４００ｇで５分間遠心分離した。さらに、細胞のペレットをアルコールで脱水し、続いて、それを２％ＯｓＯ４で１時間固定した。アルコールでさらに脱水した後、細胞ペレットをエポン包埋した。超微細な切片を作製し、酢酸ウラニルを用いて対比した。これらの切片を透過型電子顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）で検査した。
【００８４】
＜実施例３の結果＞
図３（対照、化合物を含まない）と図４（化合物を含む）を比較すると気付くように、化合物Ｉｃの存在下での１時間の培養後に、腱細胞に対する毒性効果は認められず、化合物Ｉｃは腱細胞には異化効果を及ぼさない。それというのも腱細胞には大量の小胞体および細胞外マトリックスが存在するためである。
【００８５】
＜実施例４：コンドロイチン硫酸と化合物Ｉｃの混合物とともにインキュベートした後の透過型電子顕微鏡による腱細胞の評価＞
実施例３に記載した手順に従った。コンドロイチン硫酸と化合物Ｉｃで作製した混合物（ＣＳ／Ｉｃ）を５００／５００μｇ／ｍＬの濃度でアッセイした。
【００８６】
＜実施例４の結果＞
コンドロイチン硫酸と化合物Ｉｃの混合物の存在下での１時間の培養後に、腱細胞に対する毒性効果は認められなかった。
【００８７】
＜実施例５：ヒト腱細胞を化合物Ｉｃとともにインキュベートした後の免疫蛍光によるＩ型コラーゲンおよびβ１−インテグリンの判定＞
この目的は、本発明の化合物Ｉｃとともにおよび化合物の不在下で（対照）１時間のインキュベーション後に、ヒト腱細胞によるＩ型コラーゲンおよび接着分子β１−インテグリンの発現を判定することであった。
【００８８】
Ｉ型コラーゲンは、腱でも靭帯でも見られ、それらの張力に対する抵抗に関与する。健康な腱は、主としてＩ型コラーゲンを含み、少量のＩＩＩ型コラーゲンを含む。しかし、腱症という問題においては、例えば、コラーゲンの一部が失われると、その構造はＩＩＩ型コラーゲンを合成することにより修復される（不完全な腱構造）。そのため、再生過程においてＩＩＩ型コラーゲンがＩ型コラーゲンに置き換えられることが望ましい。
【００８９】
β１−インテグリンは、細胞が細胞外マトリックスと結合し、反応すること（接着）ができるようにする膜受容体である。そのため、β１−インテグリンは、腱細胞の増殖特性、分化特性および生存特性を維持することが必要である。
【００９０】
＜実施例５の材料と方法＞
実施例１に記載の手順に従って、十分な量の単層腱細胞を調製した。次いで、１ウェル当たりおよそ５，０００腱細胞を８−ウェルＮｕｎｃ培養プレートに播種した。腱細胞を、１０％ＦＣＳ、ＤＭＥＭ／Ｈａｍ−１２（５０／５０）（Ｈａｍ−１２を含む「ダルベッコ改変イーグル培地」）、５０ＩＵ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン、２５μｇ／ｍＬのアスコルビン酸、２．５μｇ／ｍＬのアムホテリシンＢ、１％グルタミンおよび１％必須アミノ酸で作製した培地を用いて一晩インキュベートした。翌日、細胞を無血清培地（０．５％ＦＣＳ）で３回洗浄し、この同じ無血清培地とともに３０分間インキュベートした。アッセイする化合物Ｉｃ（この化合物を３つの濃度：２００μｇ／ｍＬ、１，０００μｇ／ｍＬおよび３，０００μｇ／ｍＬにおいてアッセイした）を加え、細胞を、無血清培地（０．５％ＦＣＳのみ）を用いてインキュベートした。対照およびＩＧＦ−１（１０ｎｇ／ｍＬ）の培養も無血清培地を用いて行った。１時間のインキュベーション後に、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、メタノールで室温にて１０分間固定した。
【００９１】
免疫蛍光標識では次の手順を用いた：細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）＋１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）とともに３０分間インキュベートし、一次抗体をＰＢＳ＋１％ＢＳＡで１：５０希釈し（Ｉ型コラーゲン、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、ＰＡＢ；β１−インテグリン、Ｓｉｇｍａ、ＭＡＢ）、細胞を一次抗体とともに湿式チャンバー内で３７℃でインキュベートした（２時間  ＭＡＢ、１時間  ＰＡＢ）。続いて、細胞を攪拌しながらＰＢＳで洗浄し、二次抗体をＰＢＳ＋１％ＢＳＡで１：５０希釈した（ＦＩＴＣ−ＧＡＭまたはＦＩＴＣ−ＧＡＲ、Ｄｉａｎｏｖａ）。細胞を二次抗体とともに湿式チャンバー内で２時間インキュベートした。この後、細胞を（光の不在下で）攪拌しながらＰＢＳで洗浄し、Ｍｏｗｉｏｌ封入剤（Ｆｌｕｋａ）で処理した。その後、それらを蛍光顕微鏡で検査した。
【００９２】
＜実施例５の結果＞
図６から見出されるように、腱細胞は、化合物Ｉｃの存在下での１時間の培養後もＩ型コラーゲンを発現し続ける。対照（図５）との相違は認められない。
【００９３】
図８は、化合物Ｉｃの存在下での１時間の培養後の接着分子β１−インテグリンの発現を示している。対照（図７）との相違は認められない。
【００９４】
判定の全てにおいて、細胞が健康な腱細胞の典型的な細長い形態を維持することが観察された。
【００９５】
＜実施例６：ヒト腱細胞をコンドロイチン硫酸と化合物Ｉｃの混合物とともにインキュベートした後の免疫蛍光によるＩ型コラーゲンおよびβ１−インテグリンの判定＞
実施例５に記載した手順に従ったが、この際、１ウェル当たり２，５００腱細胞を播種した。コンドロイチン硫酸と化合物Ｉｃの混合物（ＣＳ／Ｉｃ）を５００／５００μｇ／ｍＬの濃度でアッセイした。
【００９６】
＜実施例６の結果＞
腱細胞は、コンドロイチン硫酸と化合物Ｉｃの混合物とともに１時間の培養後にも、Ｉ型コラーゲンおよび接着分子β１−インテグリンを発現し続けた。対照（ＣＳ／Ｉｃ混合物の不在下でインキュベートした健康なヒト腱細胞）との相違は認められなかった。
【００９７】
判定の全てにおいて、腱細胞が健康な腱細胞の典型的な細長い形態を維持することが観察された。
【００９８】
＜実施例７：コンドロイチン硫酸と化合物Ｉｃの錠剤＞
従来の方法に従って錠剤を調製した。
１錠剤当たりの有効成分含量：
コンドロイチン硫酸、ナトリウム塩              ４００．０ｍｇ
化合物Ｉｃ                                    ４００．０ｍｇ
【００９９】
＜実施例８：コンドロイチン硫酸と化合物Ｉｃの注射可能物質＞
従来の方法に従って２ｍＬの注射用製剤を調製した。
１ｍＬ当たりの有効成分含量：
コンドロイチン硫酸、ナトリウム塩              ７５ｍｇ／ｍＬ
化合物Ｉｃ                                    ７５ｍｇ／ｍＬ
【０１００】
＜実施例９：ヒアルロン酸と化合物Ｉｃの注射可能物質＞
従来の方法に従って２ｍＬの注射用製剤を調製した。
１ｍＬ当たりの有効成分含量：
ヒアルロン酸ナトリウム                        ５ｍｇ／ｍＬ
化合物Ｉｃ                                    １００ｍｇ／ｍＬ
【図３】
2010529972.tif 000021
【図４】
2010529972.tif 000022
【図１】
2010529972.tif 000023
【図２】
2010529972.tif 000024
【図５】
2010529972.tif 000025
【図６】
2010529972.tif 000026
【図７】
2010529972.tif 000027
【図８】
2010529972.tif 000028
【図９】
2010529972.tif 000029
【手続補正書】
【提出日】平成22年2月16日(2010.2.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の化合物を含む、哺乳類における腱、靭帯または骨の疾患、障害または損傷の治療または予防用の薬剤。
【化１】
2010529972.tif 000030
（式中、Ｒ１は、水素、直鎖状もしくは分枝状のＣ１−Ｃ４アルキル、１０個未満の炭素原子のフェニルアルキルまたは−ＣＯＣＨ３であり、
Ｒ２は、水素、−ＣＯＣＨ３または−ＳＯ３Ｙであり、
Ｒ３は、水素、直鎖状もしくは分枝状のＣ１−Ｃ４アルキル、１０個未満の炭素原子のフェニルアルキル、−ＣＯＣＨ３または−ＣＯＰｈ（式中、Ｐｈはフェニルである）であり、
Ｇは、−ＣＯＯＲ４または−ＣＯＯＹ（式中、Ｒ４は、水素、Ｃ１−Ｃ２アルキルまたは１６個未満の炭素原子のアリールアルキルである）であり、
Ａは、水素、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３Ｙまたは−ＣＯＣＨ３であり、
Ｂは、水素、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３Ｙ、または−ＣＯＣＨ３であり、
この際、ＡまたはＢのいずれかは、必ず−ＳＯ３Ｈまたは−ＳＯ３Ｙ（式中、Ｙは、有機もしくは無機カチオンである）のいずれかである。）
【請求項２】
前記薬剤が腱の疾患、前記障害または損傷の治療または予防用である請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
前記薬剤が靭帯の疾患、前記障害または損傷の治療または予防用である請求項１に記載の薬剤。
【請求項４】
前記薬剤が骨の疾患、前記障害または損傷の治療または予防用である請求項１に記載の薬剤。
【請求項５】
Ｒ１が、水素または直鎖状Ｃ１−Ｃ４アルキルであり、Ｇが、−ＣＯＯＲ４または−ＣＯＯＹ（式中、Ｒ４は、水素またはＣ１−Ｃ２アルキルである）であり、Ｙが無機カチオンである請求項１〜４のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項６】
Ｒ１が水素であり、Ｒ２が−ＣＯＣＨ３であり、Ｒ３が水素である請求項５に記載の薬剤。
【請求項７】
Ｒ１がメチルであり、Ｒ２が−ＣＯＣＨ３であり、Ｒ３が水素である請求項５に記載の薬剤。
【請求項８】
Ａが水素であり、Ｂが−ＳＯ３Ｙであり、Ｇが−ＣＯＯＹ（式中、Ｙは無機カチオンである）である請求項６又は７に記載の薬剤。
【請求項９】
Ａが−ＳＯ３Ｙであり、Ｂが水素であり、Ｇが−ＣＯＯＹ（式中、Ｙは無機カチオンである）である請求項６又は７に記載の薬剤。
【請求項１０】
ＡおよびＢが−ＳＯ３Ｙであり、Ｇが−ＣＯＯＹ（式中、Ｙは無機カチオンである）である請求項６又は７に記載の薬剤。
【請求項１１】
式（Ｉ）の化合物が、次式で表される請求項８に記載の薬剤。
【化２】
2010529972.tif 000031
【請求項１２】
式（Ｉ）の化合物が、次式で表される請求項９に記載の薬剤。
【化３】
2010529972.tif 000032
【請求項１３】
式（Ｉ）の化合物が、次式で表される請求項１０に記載の薬剤。
【化４】
2010529972.tif 000033
【請求項１４】
前記靭帯が関節靱帯である請求項１〜１３のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項１５】
前記靭帯が歯周靱帯である請求項１〜１３のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項１６】
前記骨が歯周骨である請求項１〜１３のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項１７】
前記薬剤がグリコサミノグリカンをさらに含む請求項１〜１６のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項１８】
前記グリコサミノグリカンがコンドロイチン硫酸である請求項１７に記載の薬剤。
【請求項１９】
前記グリコサミノグリカンがヒアルロン酸である請求項１７に記載の薬剤。
【請求項２０】
前記薬剤がイヌリンポリ硫酸をさらに含む請求項１〜１６のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項２１】
前記薬剤が成長因子をさらに含む請求項１〜１６のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項２２】
前記成長因子がＩＧＦ−１である請求項２１に記載の薬剤。
【請求項２３】
前記薬剤が、腱細胞、エピテノン細胞（ｅｐｉｔｅｎｏｎ  ｃｅｌｌ）、靭帯細胞、歯周靱帯繊維芽細胞、セメント芽細胞、骨芽細胞、骨細胞および幹細胞からなる群より選択される細胞をさらに含む請求項１〜１６のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項２４】
前記疾患、障害または損傷が、腱症、腱炎、リウマチ様腱炎、腱鞘炎、腱滑膜炎、パラテノン炎（ｐａｒａｔｅｎｏｎｉｔｉｓ）、骨損失、歯周炎、歯周炎に関連する歯肉炎および任意の靭帯病からなる群より選択される請求項１〜２３のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項２５】
前記薬剤が経口投与に適している請求項１〜２２，２４のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項２６】
前記薬剤が病変内投与に適している請求項１〜２４のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項２７】
前記薬剤が病変部周囲投与に適している請求項１〜２４のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項２８】
前記薬剤がインプラントによる投与に適している請求項１〜２４のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項２９】
前記薬剤が、露出した腱、靭帯または骨への局所投与に適している請求項１〜２４のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項３０】
請求項１に記載の式（Ｉ）により表される化合物とグリコサミノグリカンを含む医薬組成物。
【請求項３１】
前記グリコサミノグリカンがコンドロイチン硫酸である請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
前記グリコサミノグリカンがヒアルロン酸である請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
請求項１に記載の式（Ｉ）により表される化合物とイヌリンポリ硫酸を含む医薬組成物。
【請求項３４】
請求項１に記載の式（Ｉ）により表される化合物と成長因子を含む医薬組成物。
【請求項３５】
前記成長因子がＩＧＦ−１である請求項３４に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
請求項１に記載の式（Ｉ）により表される化合物と、腱細胞、エピテノン細胞、靭帯細胞、歯周靱帯繊維芽細胞、セメント芽細胞、骨芽細胞、骨細胞および幹細胞からなる群より選択される細胞を含む医薬組成物。
【請求項３７】
式（Ｉ）の化合物が、次式で表される請求項３０〜３６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【化５】
2010529972.tif 000034
【請求項３８】
式（Ｉ）の化合物が、次式で表される請求項３０〜３６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【化６】
2010529972.tif 000035
【請求項３９】
式（Ｉ）の化合物が、次式で表される請求項３０〜３６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【化７】
2010529972.tif 000036
【請求項４０】
哺乳類における腱、靭帯または骨の疾患、障害または損傷の治療または予防に使用するための、請求項１において定義した、式（Ｉ）の化合物、またはその溶媒和物もしくは製薬上許容される塩。
【国際調査報告】
2010529972.tif 000037
2010529972.tif 000038