(57)【要約】  本発明は、ヒト血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）を特異的に認識し、そのｉｎ  ｖｉｖｏ血管新生促進及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激効果に干渉する、組換え抗体関連ポリペプチド分子に関する。前述の組換えポリペプチド分子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのヒト内皮細胞の増殖、ＶＥＧＦ−Ａを含むマトリゲルプラグによって誘導されるマウスにおける皮下血管新生、及びヌードマウスに移植したヒト腫瘍の増殖に影響を与えることができる。これらの分子の幾つかは、非ヒト霊長類実験モデルにおいて脈絡膜血管新生を妨げる。前記分子は、特に加齢性黄斑変性症（滲出型）、癌及びその転移、血管新生緑内障、糖尿病性及び新生児網膜症、急性及び慢性炎症過程、感染性疾患、自己免疫疾患、臓器移植拒絶反応、血管腫及び血管線維腫などの、脈管構造の増大と関係がある過程を有する病的実体の受動免疫療法に使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号７及び配列番号８のヌクレオチド配列、又は相同配列によってコードされるヒト免疫グロブリン可変領域を含み、必ずしもそれだけに限られないが、その残基Ｃ１０２、Ｃ５７、Ｒ５６、Ｔ３１及びＬ３２との関連で定義されるヒトＶＥＧＦ−Ａにおけるエピトープを認識し、その血管新生促進効果に干渉することを特徴とする組換え抗体。
【請求項２】
配列番号７及び配列番号８の配列、又は相同配列が単鎖Ｆｖ抗体断片（ｓｃＦｖ）をコードする配列内に含まれ、ヒト抗体由来の重鎖と軽鎖の可変領域がリンカーセグメントによって分離されていることを特徴とする、請求項１に記載の組換え抗体。
【請求項３】
ｓｃＦｖコード配列が配列番号６である、請求項２に記載の組換え抗体。
【請求項４】
配列番号７及び配列番号８の配列、又は相同配列がコンセンサスヒトＩｇＧ免疫グロブリンの定常ドメインを伴うＦａｂ型抗体断片をコードする配列内に含まれることを特徴とする、請求項１に記載の組換え抗体。
【請求項５】
Ｆａｂ型断片をコードする配列が配列番号９及び配列番号１０であることを特徴とする、請求項４に記載の組換え抗体。
【請求項６】
配列番号７及び配列番号８の配列、又は相同配列がヒト免疫グロブリンヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３定常ドメインとスペーサーによって連結したｓｃＦｖ断片によって構成されるポリペプチド鎖をコードする配列内に含まれ、そのタンパク質形が他の同一ポリペプチド鎖と共有結合して二量体分子を形成することを特徴とする、請求項１に記載の組換え抗体。
【請求項７】
ヒト免疫グロブリン定常ドメインがＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４型のドメインであることを特徴とする、請求項６に記載の組換え抗体。
【請求項８】
ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３定常ドメインとスペーサーによって連結したｓｃＦｖ断片によって構成されるポリペプチド鎖をコードする配列が、配列番号１３又は配列番号１４であることを特徴とする、請求項６及び７に記載の組換え抗体。
【請求項９】
抗腫瘍又は抗血管新生能力を有する放射性同位体、又は化学的若しくは生物学的作用物質をさらに含むことを特徴とする、請求項１から８までに記載の組換え抗体。
【請求項１０】
ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍診断の潜在性を与える放射性同位体をさらに含むことを特徴とする、請求項１から８までに記載の組換え抗体。
【請求項１１】
組換え細菌若しくは酵母によって、又は哺乳動物細胞若しくは他の真核生物系中で生成されることを特徴とする、請求項１から８までに記載の組換え抗体。
【請求項１２】
組換えＤＮＡを介した遺伝子操作によって得られ、宿主細胞に組み込むことができるプラスミド又は配列である、請求項１から８までに記載の組換え抗体をコードするベクター。
【請求項１３】
請求項１から９までに記載の組換え抗体を含む医薬組成物。
【請求項１４】
受動免疫療法によって、眼の実体、腫瘍形成過程、急性及び慢性炎症過程、並びに自己免疫過程などの血管新生の増大と共に発達する実体を治療するための医薬品を製造するための、請求項１から９までに記載の組換え抗体の使用。
【請求項１５】
受動免疫療法によって悪性腫瘍及び転移を治療するための医薬品を製造するための、請求項１から９までに記載の組換え抗体の使用。
【請求項１６】
受動免疫療法によって加齢性黄斑変性症を治療するための医薬品を製造するための、請求項１から９までに記載の組換え抗体の使用。
【請求項１７】
画像化技法を使用した、悪性腫瘍及びその転移のｉｎ  ｖｉｖｏ診断用の放射性医薬品を製造するための、請求項１０に記載の組換え抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジー及び製薬産業の分野に、具体的には、ヒト血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）を特異的に認識し（Ｆｅｒｒａｒａ，Ｎ．ら、２００３．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ９：６６９〜６７６）、そのｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激効果及びｉｎ  ｖｉｖｏ血管新生促進活性に干渉する抗体に関連する組換えポリペプチド分子の開発及び適用例に関する。これらの分子には、単鎖Ｆｖ抗体断片（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ抗体断片、及び「完全抗体」型二価分子（ｓｃＦｖ２−Ｆｃ）がある。
【背景技術】
【０００２】
既存の血管からの新たな血管の形成の過程は血管新生と呼ばれ、血管新生促進因子と抗血管新生因子の平衡によって制御される。血管新生促進因子の異常な誘導及び新たな血管の形成と関連している疾患には、癌（原発性腫瘍及びその転移）、喘息、呼吸窮迫症、子宮内膜症、アテローム性動脈硬化症及び組織浮腫などの急性及び慢性炎症過程、肝炎及びカポジ肉腫などの感染由来の疾患、糖尿病、乾癬、関節リウマチ及び甲状腺炎などの自己免疫疾患、及び糖尿病性網膜症、臓器移植拒絶反応、加齢性黄斑変性症（滲出型）、血管新生緑内障、血管腫、及び血管線維腫などの幾つかの他の疾患及び状態がある（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，Ｐ．ａｎｄ  Ｊａｉｎ，ＲＫ．２０００．Ｎａｔｕｒｅ  ４０７：２４９〜２５７；Ｋｕｗａｎｏ  Ｍ、２００１．Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ  ４０：５６５〜５７２）。
【０００３】
多くのこれらの疾患に魅力的な治療手順は、中和分子の投与による、血管の異常な形成を刺激する血管新生促進因子の活性の阻害に基づいている。医療業務では、ヒトＶＥＧＦ−Ａの血管新生促進効果を認識し中和する、アバスチンとして商業上知られる組換えヒト化抗体ベバシズマブ（Ｆｅｒｒａｒａ，Ｎ．、２００５．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｕｎ  ３３３：３２８〜３３５）は、腫瘍過程の治療のために数カ国において承認されている。その効果は、腫瘍細胞及び腫瘍間質の他の細胞、マクロファージ及び線維芽細胞などによって生じるＶＥＧＦ−Ａ誘導型血管新生の阻害に主に依存することが示されている。この抗体は本来、哺乳動物細胞から得たヒトＶＥＧＦ−Ａのアイソフォーム１６５を用いたマウスの免疫感作によって、マウスモノクローナル抗体として得られた（Ｋｉｍ，ＫＪ．ら、１９９２．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ７：５３〜６４）。次いで抗体を遺伝子工学により改変してそのヒト化を達成し、それは分子にヒトへの使用時のより良い耐性及び治療有効性を与える。
【０００４】
近年、前述のアバスチン由来の抗体断片でありルセンティスとして商業上知られる、ラニビツマブ（Ｇａｕｄｒｅａｕｌｔ，Ｊ．、２００５．Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉ  ４６：７２６〜７３３）は、加齢性黄斑変性症（滲出型）の治療について数カ国において承認されている。ラニビツマブは、遺伝子工学を使用したベバシズマブの操作に由来する組換えＦａｂ抗体断片である。ラニビツマブの硝子体内注射は局所生成するＶＥＧＦ−Ａを中和し、この疾患の根本である網膜のさらなる血管新生を制御する。
【０００５】
血管内皮増殖因子は、直接及び特異的な型式で新しい血管の形成を誘導する分子のファミリーである（Ｌｅｕｎｇ，Ｄ．ら、１９８９．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１３０６〜１３０９）。このファミリーは、現在ＶＥＧＦ−Ａと命名されている血管内皮増殖因子としても知られる血管透過性因子（ＶＰＦ）、胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）、胎盤由来増殖因子（ＰＤＧＦ）ＰＤＧＦ−Ａ及びＰＤＧＦ−Ｂ、及びＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、及びＶＥＧＦ−Ｅと命名されるＶＥＧＦ−Ａに構造的及び機能的に関連がある他の分子を含む（Ｏｌｏｆｓｓｏｎ，Ｂ．ら、１９９６．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３：２５７６〜２５８１；Ｊｏｕｋｏｖ，Ｖ．ら、１９９６．ＥＭＢＯ  Ｊ  １５：２９０〜２９８；Ｙａｍａｄａ，Ｙ．ら、１９９７．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４２：４８３〜４８８；Ｏｇａｗａ，Ｓ．ら、１９９８．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３：３１２７３〜３１２８２）。
【０００６】
ＶＥＧＦ−Ａは、５個のモノマーのアイソフォームが存在し、１個の同じリボ核酸（ＲＮＡ）の差次的スプライシングから誘導される、２個の２３ｋＤａサブユニットによって形成されるホモ二量体糖タンパク質である（Ｆｅｒｒａｒａ，Ｎ．ら、１９８９．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｕｎ  １６１：８５１〜８５８）。これらは、細胞膜と結合した状態の２個のアイソフォーム（ＶＥＧＦ１８９及びＶＥＧＦ２０６）、及び３個の可溶性のアイソフォーム（ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１４５、及びＶＥＧＦ１６５）を含む。ＶＥＧＦ１６５は、ＶＥＧＦ１８９が多量に存在する肺と心臓（Ｎｅｕｆｅｌｄ  Ｇら、１９９５．Ｃａｎｃ  Ｍｅｔ  Ｒｅｖ  １５：１５３〜１５８）、及びＶＥＧＦ１２１が優勢である胎盤（Ｓｈｉｂｕｙａ，Ｍ．１９９５．Ａｄｖ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６７：２８１〜３１６）を除いた、哺乳動物の組織中に最も豊富に存在する。
【０００７】
ＶＥＧＦ−Ａはこのファミリーの最も研究及び特徴付けられているタンパク質であり、多数の疾患におけるその変化が記載されている。ＶＥＧＦ−Ａの過剰発現は、異なる由来及び局在の腫瘍、及びその転移（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ，Ｊ．ら、１９９９．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５９：１５９２〜１５９８）、潰瘍性大腸炎及びクローン病などの慢性炎症過程（Ｋａｎａｚａｗａ，Ｓ．ら、２００１．Ａｍ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  ９６：８２２〜８２８）、乾癬（Ｄｅｔｍａｒ，Ｍ．ら、１９９４．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８０：１１４１〜１１４６）、呼吸窮迫症（Ｔｈｉｃｋｅｔｔ，ＤＲ．ら、２００１．Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １６４：１６０１〜１６０５）、アテローム性動脈硬化症（Ｃｅｌｌｅｔｔｉ，ＦＬ．ら、２００１．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ７：４２５〜４２９）、子宮内膜症（ＭｃＬａｒｅｎ，Ｊ．２０００．Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｕｐｄａｔｅ  ６：４５〜５５）、喘息（Ｈｏｓｈｉｎｏ，Ｍ．ら、２００１．Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０７：２９５〜３０１）、関節リウマチ及び変型性関節炎（Ｐｕｆｅ，Ｔ．ら、２００１．Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  ２８：１４８２〜１４８５）、甲状腺炎（Ｎａｇｕｒａ，Ｓ．ら、２００１．Ｈｕｍ  Ｐａｔｈｏｌ  ３２：１０〜１７）、糖尿病性及び新生児網膜症（Ｍｕｒａｔａ，Ｔ．ら、１９９６．Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ  ７４：８１９〜８２５；Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，ＪＤ．２００１．Ｐａｅｄｉａｔｒ  Ｄｒｕｇｓ  ３：２６３〜２７２）、黄斑変性症及び緑内障（Ｗｅｌｌｓ，ＪＡ．ら、１９９６．Ｂｒ  Ｊ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  ８０：３６３〜３６６）、組織浮腫（Ｋａｎｅｒ，ＲＪ．ら、２０００．Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２：６４０〜６４１）、肥満（Ｔｏｎｅｌｌｏ，Ｃ．ら、１９９９．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ４４２：１６７〜１７２）、血管腫（Ｗｉｚｉｇｍａｎｎ，Ｓ．ｙ  Ｐｌａｔｅ，ＫＨ．１９９６．Ｈｉｓｔｏｌ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ  １１：１０４９〜１０６１）、炎症性萎縮を有する患者の洞房結節液中（Ｂｏｔｔｏｍｌｅｙ，ＭＪ．ら、２０００．Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １１９：１８２〜１８８）と関係があり、且つ移植片拒絶反応（Ｖａｓｉｒ，Ｂ．ら、２００１．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ７１：９２４〜９３５）と関係がある。腫瘍の特定の症例では、ＶＥＧＦ−Ａの３個の基本的アイソフォーム（１２１、１６５及び１８９）を発現する細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏでより速く増殖する細胞である（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ，Ｊ．２０００．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２０：７２８２〜７２９１）。
【０００８】
ＶＥＧＦファミリーの分子によって誘導される内皮細胞の機能の変化は、これまでＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ１）、ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｔ１）及びＶＥＧＦＲ３（Ｆｌｔ４）を含むチロシンキナーゼクラス３受容体とのそれらの結合によって媒介される（Ｋａｉｐａｉｎｅｎ，Ａ．１９９３．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １７８：２０７７〜２０８８）。これらの受容体の第２のＮ末端ドメインが、細胞質ドメインのリン酸化及びシグナル翻訳（ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）を助長するリガンド結合を担うとして同定されている（Ｄａｖｉｓ−Ｓｍｙｔｈ，Ｔ．ら、１９９６．ＥＭＢＯ  １５：４９１９〜４９２７）。
【０００９】
ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ１）はＶＥＧＦ−Ａの生物学的影響を媒介し、さらにＶＥＧＦ−Ｃ、及びＶＥＧＦ−Ｄと結合する。この受容体は活性内皮細胞及び腫瘍由来の幾つかの細胞系において差次的に発現され、この場合オートクリン様ループの刺激が分泌されるＶＥＧＦによって確立し得る。そのリガンドの過剰発現と関係がある前述の病状と関連があることに加えて、受容体の過剰発現は子宮内膜癌（Ｇｉａｔｒｏｍａｎｏｌａｋｉ，Ａ．ら、２００１．Ｃａｎｃｅｒ  ９２：２５６９〜２５７７）、悪性中皮腫（Ｓｔｒｉｚｚｉ，Ｌ．ら、２００１．Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １９３：４６８〜４７５）、星状細胞腫瘍（Ｃａｒｒｏｌｌ，ＲＳ．ら、１９９９．Ｃａｎｃｅｒ  ８６：１３３５〜１３４１）、原発性乳癌（Ｋｒａｎｚ，Ａ．ら、１９９９．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ８４：２９３〜２９８）、腸型胃癌（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｙ．ら、１９９６．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２：１６７９〜１６８４）、多型性膠芽腫、未分化希突起グリオーマ及び壊死性上衣細胞腫（Ｃｈａｎ，ＡＳ．ら、１９９８．Ａｍ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｐａｔｈｏｌ  ２２：８１６〜８２６）の進行とも関係している。ＫＤＲの過剰発現は、自律神経系ＶＨＬ疾患及び血管芽細胞腫（Ｗｉｚｉｇｍａｎｎ−Ｖｏｏｓ，Ｓ．ら、１９９５．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５５：１３５８〜１３６４）、糖尿病性網膜症の進行（Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ、Ｔ．２０００．Ｊｐｎ  Ｊ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  ４４：３２３〜３２４）とも関係している。Ｆｌｔ−１と共に、ＫＤＲは遅延型過敏反応と関係している（Ｂｒｏｗｎ，ＬＦ．ら、１９９５．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５４：２８０１〜２８０７）。
【００１０】
特に癌における血管新生の阻害に関する新しい治療戦略の大部分は、ＶＥＧＦ−Ａ及び／又はその受容体の阻害に基づく。承認されている製品又は臨床試験中の製品の中で際立ったものとして、本発明者らは以下の：（１）ＶＥＧＦ−Ａ又はＫＤＲを阻害するモノクローナル抗体、（２）ネオバスタット及びプリノマスタットなどのメタロプロテイナーゼ阻害剤、（３）タリドミド、スラミン、トロポニンＩ、ＩＦＮ−α及びネオバスタットなどのＶＥＧＦ阻害剤、（４）ＳＵ５４１６、ＦＴＫ７８７及びＳＵ６６６８などのＶＥＧＦ受容体阻害剤、（５）エンドスタチン及びＣＡ４−Ｐなどの腫瘍内皮のアポトーシスの誘導物質、及び（６）ＶＥＧＦの発現又はその受容体の発現を低下させるリボザイム（アンジオザイム）を見出す。
【００１１】
前述の全ての中で、ＶＥＧＦ−Ａの血管新生促進効果を中和する抗体（及び抗体断片）は、治療薬品としての用途及び承認に関して最も進んだ抗体（及び抗体断片）である。前述し既に登録されているベバシズマブ及びラニビツマブの例に加えて、ヒトＶＥＧＦを認識し中和する抗体及び抗体断片を述べる他の報告が存在する（Ｍｕｌｌｅｒ，Ｙ．ら、１９９７．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４：７１９２〜７１９７；Ａｓａｎｏ，Ｍ．ら、１９９８．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １７：１８５〜１９０；Ｖｉｔａｌｉｔｉ  Ａら、２０００．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６０：４３１１〜４３１４；Ｂｒｅｋｋｅｎ，ＲＡ．ｙ  Ｔｈｏｒｐｅ，ＰＥ．２００１．Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７４：１７３〜１８１；Ｊａｙｓｏｎ，Ｇ．ら、２００２．ＪＮＣＩ  ９４：１４８４〜１４９３；Ｂｒｅｋｋｅｎ，ＲＡ．ら、２０００．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６０：５１１７〜５１２４；Ｆｕｈ，Ｇ．ら、２００６．Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１：６６２５〜６６３１；ＵＳ５７３０９７７）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、配列番号７及び配列番号８のヌクレオチド配列、又は相同配列によってコードされるヒト免疫グロブリン可変領域（ＶＲ）を含み、必ずしもそれだけに限られないが、残基Ｃ１０２、Ｃ５７、Ｒ５６、Ｔ３１及びＬ３２に対して定義されるヒトＶＥＧＦ−Ａにおけるエピトープを認識し、ＶＥＧＦ−Ａの血管新生促進効果に干渉する抗体に関連する組換えポリペプチド分子を記載する。血管新生に関連するｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいてヒトＶＥＧＦ−Ａの血管新生促進効果を中和する、このような分子の能力を実証する。これらの分子は１つ又は複数の抗原結合部位によって形成され、そのような部位はヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖ＶＲのＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸によって構成される。
【００１３】
本発明の実施のために、以下の用語を定義する：
組換え抗体
（抗原結合部位と一般に命名される、免疫グロブリン重鎖と軽鎖可変領域の特定の組合せによって形成される）（Ｇａｖｉｌｏｎｄｏ  ｙ  Ｌａｒｒｉｃｋ．２０００．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２９：１２８〜１３６）１つ又は複数の相互作用ドメインによって抗原を特異的に認識する、合成手段によって（組換えＤＮＡ又は人工遺伝子合成によって）部分的又は完全に生成される、免疫グロブリン又はその一部分を記載する。組換え抗体の例はいわゆるキメラ及びヒト化抗体であり、その中で一種から得られる可変領域（又はその一部分）は、遺伝子工学を使用して他種の免疫グロブリン定常領域と結合させる。組換え抗体の中で、本発明者らは遺伝子工学によって生成する１つ又は複数の抗原結合部位を含む抗体断片も有する。組換え抗体断片の例は、（ｉ）免疫グロブリンのＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１を含むＦａｂ断片、（ｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインから成るＦｄ断片、（ｉｉｉ）抗体のＶＬ及びＶＨによって形成されるＦｖ断片、（ｉｖ）抗体のＶＨ及びＶＬドメインが、抗原結合部位を形成するための２ドメインの結合を可能にするペプチドリンカーセグメントによって異なる型（ＶＨ−ＶＬ又はＶＬ−ＶＨ）で連結しているｓｃＦｖ断片（Ｂｉｒｄら、１９８８．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３〜４２６；Ｈｕｓｔｏｎら、１９８８．ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８５：５８７９〜５８８３）、（ｖ）「ダイアボディ」という、ｓｃＦｖと同様の型式で構築されるが、小さなサイズのリンカーが１つのｓｃＦｖ分子のＶＨドメインとＶＬドメインが互いに結合するのを可能にせず、結合部位が２つ以上の個々のｓｃＦｖ分子の結合によって形成される必要のある多価又は多重特異性断片（ＷＯ９４／１３８０４；Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  Ｐら、１９９３．ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９０：６４４４〜６４４８）、（ｖｉ）ｄＡｂ（Ｗａｒｄ  ＳＥら、１９８９．Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４〜５４６）、単離相補性決定領域（ＣＤＲ）、Ｆ（ａｂ’）２断片、及びｓｃＦｖ二重特異性二量体（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５；Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  Ｐ  ｙ  Ｗｉｎｔｅｒ  Ｇ．１９９３．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４：４４６〜４４９；ｄｅ  Ｈａａｒｄ，Ｈ．ら、１９９８．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．３１：５〜３１）である。ｓｃＦｖ及びＦａｂなどの幾つかの型の断片は抗体ライブラリーから得ることもでき、この場合一種の広いレパートリーの（合成又は天然源由来の）ＶＲ遺伝子をランダムに組み合わせて、線状ファージの表面で後に提示される抗体ＶＲの個々の結合をもたらす。
【００１４】
遺伝子工学によって抗体定常領域と抗体断片を人為的に組み合わせた「抗体型」分子も、組換え抗体と考えられる。例えば、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、及び時折免疫グロブリンＦｃのＣＨ４ドメインによって形成される領域とｓｃＦｖを結合させることによって、二価「抗体型」分子を構築することが可能である。記載した領域の全て又は幾つかの有用性及びグリコシル化の存在に応じて、抗体型分子は、免疫グロブリンＦｃと一般に関係があるエフェクター機能を示すことができる。
【００１５】
抗原結合部位。エピトープ
最初の用語は、抗原（又はその一部分）と特異的に相互作用する抗体の一部分を記載する。抗原の分子サイズが大きいとき、抗体はエピトープと命名される抗原の特定のゾーンのみと結合することができる。抗体結合部位は、２つの抗体可変領域、軽鎖可変領域、及び重鎖可変領域によって主に形成される。抗体結合部位は、可変領域の非共有結合相互作用によって形成される。抗体結合部位は、ｓｃＦｖ断片の場合と同様に、抗原を特異的に認識するその性質に干渉しないリンカーペプチドと２つの抗体可変領域の連結によって、人為的に安定化することができる。本来、抗体結合部位は、可変領域の非共有結合相互作用によって構築され、これはそれぞれ分子の天然の構造の重鎖と軽鎖可変領域に続くＣＨ１及びＣＬ（カッパ（κ）又はラムダ（λ））ドメインの、非共有結合相互作用によって増強される。天然の完全抗体は、２つの同一の抗原結合部位を有する。抗原がタンパク質である場合に、抗体結合部位によって認識されるエピトープは、アミノ酸の直鎖配列によって形成される可能性があり、或いは立体配座であってよい、即ち抗体結合部位によって認識されるアミノ酸はタンパク質の三次構造中で近接するが、必ずしもその主要構造中で連続的ではない。タンパク質の場合、エピトープは本来、非共有結合によって抗体と相互作用する特定群のアミノ酸によって定義される目立たないゾーンである。
【００１６】
相同抗体
これは、他の抗体及び異なる抗体によってさらに特異的に同定される抗原のエピトープを特異的に認識する、天然又は遺伝子工学によって生成した抗体である。問題の２つの抗体はそれらの可変領域の配列の点で関係がある可能性があり（例えば、多かれ少なかれ広範囲であり得る突然変異により一方が他方に由来する）、或いは完全に異なる可変領域の配列を有する可能性がある。後者は、抗体と抗原の間の特異的相互作用は、特にタンパク質の場合、表面の相互作用、即ち、可変領域のアミノ酸残基間の非共有結合（水素結合、ファンデルワールス及び類似の結合）の形成によって行われる、事実によるものである（これは、可変領域と構造上近い幾つか他の目立たない残基が、時折その相互作用に関与する可能性もあると考えられる）。これは、配列の点で別個の結合部位を有するが、それにもかかわらず両者をそれに特異的にする特定のエピトープとの相互作用の十分な同一性を有する可能性がある、２つの異なる抗体を生成する。したがって相同抗体は、他の抗体によって認識される特定のエピトープを特異的に同定することができなければならない。ここで“相同”という用語は、組換え抗体（抗体断片、「抗体型」分子、及びその他）に関する前述の定義中に含まれる他の形の抗体に及ぶ。
【００１７】
特異的
抗体又は抗体断片が、その特異的結合パートナーと異なる他の分子に対して有意な結合を示さない状況を指す。この用語は、幾つかの関連又は無関連抗原において現われる特定のエピトープに対して抗原結合部位が特異的である場合にも適用可能であり、その場合、結合部位は前述のエピトープを有する数個の抗原と結合することができる。
【００１８】
本発明の一実施形態では、抗体に関連する組換えポリペプチド分子は、単鎖Ｆｖ型（ｓｃＦｖ）のヒト抗体断片（ｓｃＦｖ２Ｈ１）、Ｆａｂ抗体断片（Ｆａｂ２Ｈ１−３２）及び「完全抗体」型のｓｃＦｖ２−Ｆｃ二価分子（ｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１４．１及びｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１８．２）である。これらの全てにおいて、異なるＶＲが自然に集合して抗原結合部位を形成する。この集合の安定性は、人工連結セグメント（リンカー）又は免疫グロブリン定常ドメインなどの他の抗体関連配列に寄与する。これらのＶＲは、ヒトλ鎖のＶＲレパートリーを使用して構築した線状ファージの表面に提示されたヒト抗体断片のライブラリーから単離した、ｓｃＦｖ中に含まれるＶＲに由来する。
【００１９】
本発明において採用した方法により、本発明中に記載した抗体に関連する組換えポリペプチド分子は、新規のＤＮＡ配列を有し、ハイブリドーマ（Ｋｉｍ，ＫＪ．ら、１９９２．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ７：５３〜６４；Ｍｕｌｌｅｒ，Ｙ．ら、１９９７．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４：７１９２〜７１９７；Ａｓａｎｏ，Ｍ．ら、１９９８．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １７：１８５〜１９０；Ｓｃｈａｅｐｐｉ，ＪＭ．ら、１９９９．Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １２５：３３６〜３４２；Ｂｒｅｋｋｅｎ，ＲＡ．ら、２０００．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６０：５１１７〜５１２４；Ｂｒｅｋｋｅｎ，ＲＡ．ｙ  Ｔｈｏｒｐｅ，ＰＥ．２００１．Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７４：１７３〜１８１）、ヒト細胞のウイルス形質転換（ＵＳ５７３０９７７）、遺伝子工学による既存の抗体の改変（Ｊａｙｓｏｎ，Ｇ．ら、２００２．ＪＮＣＩ  ９４：１４８４〜１４９３；Ｆｅｒｒａｒａ，Ｎ．ら、２００５．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｕｎ  ３３３：３２８〜３３５）、及びヒト抗体断片ライブラリー（Ｖｉｔａｌｉｔｉ，Ａ．ら、２０００．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６０：４３１１〜４３１４；Ｆｕｈ，Ｇ．ら、２００６．Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１：６６２５〜６６３１）から誘導されたＶＲなどの、ＶＥＧＦ−Ａの血管新生促進作用を中和する抗体も入手している他の著者によって報告されたＶＲと異なる、免疫グロブリンＶＲを有する。本発明中に記載した抗体に関連する組換えポリペプチド分子は、ヒトＶＥＧＦ−Ａを中和する他の抗体によって定義されるものと異なるヒトＶＥＧＦ−Ａにおける立体配座エピトープを、それらが認識するという意味でも新規である（Ｍｕｌｌｅｒ，Ｙ．ら、１９９７．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４：７１９２〜７１９７；Ｍｕｌｌｅｒ，ＡＹ．ら、１９９８．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ６：１１５３〜１１６７；Ｓｃｈａｅｐｐｉ，ＪＭ．ら、１９９９．Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １２５：３３６〜３４２；Ｂｒｅｋｋｅｎ，ＲＡ．ら、２０００．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６０：５１１７〜５１２４；Ｆｕｈ，Ｇ．ら、２００６．Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１：６６２５〜６６３１；ＷＯ２００５０１２３５９）。
【００２０】
本発明中に記載した抗体に関連する組換えポリペプチド分子、及びそれらの同等の変異体の使用によって得られる抗血管新生効果は、活性状態の血管内皮細胞中に存在するヒトＶＥＧＦ−Ａとその受容体の間の相互作用の干渉に基づき、したがって増殖しそれらの生理的安定性を維持する後者の能力に影響を与える。
【００２１】
本発明の文脈において、「同等の変異体」は、ヒトＶＥＧＦ−Ａを特異的に認識し、内皮細胞の増殖を刺激するその生物学的影響、及び血管新生促進に干渉する能力を保持する、ＶＲの２Ｈ１ＲＶＣＰ（配列番号７）及びＶＲの２Ｈ１ＲＶＣＬ（配列番号８）、及び本発明中に含まれる他の相同ＶＲ（配列番号１３）内に含まれる配列の他の結合及び操作から誘導されるポリペプチド分子である。これらのポリペプチド分子は、配列中でＶＬドメインがＶＨドメインに先行する、或いは当技術分野で知られている他の結合セグメント（リンカー）がＶＲを結びつけるために使用されているｓｃＦｖなど、又はＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃ、Ｆａｃｂ、二量体ｓｃＦｖ、三量体ｓｃＦｖ、及び四量体ｓｃＦｖ抗体断片などの、他の組換え抗体断片の形をとることができる（Ｗｉｎｔｅｒ  Ｇ、Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ．１９９１．Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２９３〜２９９；ＷＯ９４／１３８０４；ｄｅ  Ｈａａｒｄ，Ｈ．ら、１９９８．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．３１：５〜３１）。さらに同等の変異体は、多価分子を形成するために免疫グロブリン由来の他の配列を加えた後に生成される（Ｂｅｓｔａｇｎｏ  Ｍら、２００１．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４０：１０６８６〜１０６９２）。「同等の変異体」分子は、分子の一部分がＶＥＧＦ−Ａに対するその特異性を維持し他の部分が異なる特異性を有する二重特異性抗体の形、又はＶＲ配列がヒト又は他の由来の免疫グロブリン定常領域と結合した完全抗体の形であってもよい。遺伝子工学を使用する全てのこれらの操作は、当業者に知られている。
【００２２】
「同等の変異体」は、例えばＥＰ−Ｂ−０２３９４００、ＥＰ−Ａ−１８４１８７、ＧＢ２１８８６３８Ａ又はＥＰ−Ａ−２３９４００中で明らかにされるように、その操作がヒトＶＥＧＦ−Ａを特異的に認識し、内皮細胞の増殖及び血管新生促進に干渉する能力に影響を与えないような方法で、ＶＲの２Ｈ１ＲＶＣＰ（配列番号７）及びＶＲの２Ｈ１ＲＶＣＬ（配列番号８）、及び例えば配列番号１３中に含まれるＶＲなどの他の相同ＶＲ内に含まれるＣＤＲ配列を、原形ではない配列骨格と人為的に隣接させる、いわゆる「ＣＤＲ移植」によって生成される分子も考慮する。
【００２３】
（ｓｃＦｖ２Ｈ１と命名した）ｓｃＦｖ断片の型の組換えポリペプチド分子は、ヒトＶＥＧＦ−Ａの異なるアイソフォームを特異的に認識する。ｓｃＦｖにおいて、ヒト免疫グロブリン重鎖と軽鎖のＶＲを、この順に１６アミノ酸のリンカーにより遺伝子工学によって結合させて、配列番号６で記載するＤＮＡ配列を形成する。ヒトλ鎖のＶＲレパートリーを使用して、既に記載されている方法（Ｒｏｊａｓ  Ｇら、２００５．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｕｎ  ３３６：１２０７〜１２１３）と類似の方法により構築した線状ファージにおいて提示されたｓｃＦｖ断片のライブラリーから選択した、ｓｃＦｖ２Ｈ１−Ｆと命名した相同ｓｃＦｖからｓｃＦｖ２Ｈ１断片を得た。軽鎖のＶＲレパートリー中に意図的な偏向を導入して、他の著者によって報告された抗体と異なり、以前に同定された機構と異なる機構によってＶＥＧＦ−Ａを中和し得る抗体を発見する可能性を増大させた。
【００２４】
ライブラリーからの選択の過程で、実施例１中に示すように、グルタミン酸とのその置換によって残基Ｒ８２、Ｋ８４、Ｈ８６が突然変異したヒトＶＥＧＦ−Ａのアイソフォーム１２１を含み、ＫＤＲ受容体とのその相互作用に影響を与える（Ｓｈｅｎ，Ｂ．ら、１９９８．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３：２９９７９〜２９９８５）融合タンパク質を、本発明者らは利用した。（Ｐ６４４７ａａ−ＶＥＧＦ、配列番号３と命名した）この組換え融合タンパク質は細菌において生成し、ヒトＶＥＧＦ−Ａのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生物活性を有する分子種に利用した型と同様の型で精製した。結果として、本発明中で使用する抗原は、ヒトＶＥＧＦを認識するモノクローナル又は組換え抗体を入手した他の著者によって使用された、抗原又は免疫原と異なる。Ｐ６４４７ａａ−ＶＥＧＦのＮ末端に局在する髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＰ６４Ｋタンパク質のドメインは免疫原性を増大させ、大腸菌中での高レベルの発現及び生物活性を有するヒトＶＥＧＦと同様の二量体型の形成を可能にする。突然変異ゾーンは、ＶＥＧＦ−Ａの生物学的機能を中和するとして報告された他の抗体によって既に認識されているエピトープを含む（Ｍｕｌｌｅｒ，Ｙ．ら、１９９７．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４：７１９２〜７１９７；Ｍｕｌｌｅｒ，ＡＹ．ら、１９９８．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ６：１１５３〜１１６７）。
【００２５】
本発明と一致して、λ鎖のＶＲレパートリーを含むｓｃＦｖ抗体断片のライブラリーからヒトＶＥＧＦに関する結合部位を選択するための、融合タンパク質Ｐ６４４７ａａ−ＶＥＧＦの使用は、以前に記載されなかったヒトＶＥＧＦ−Ａの立体配座エピトープを認識する抗体断片（ｓｃＦｖ２Ｈ１−Ｆ）の同定における決定要素であった。
【００２６】
ポリペプチド分子ｓｃＦｖ２Ｈ１を生成するために、ライブラリーから得たｓｃＦｖ２Ｈ１−Ｆ断片のＤＮＡ配列は、対応するファージミドベクターからペリプラズム発現用ベクターにクローニングした。２９ｋＤａより幾分大きいみかけの分子量を有するｓｃＦｖ２Ｈ１抗体断片を、形質転換細菌の培地及びペリプラズムから回収し、金属イオン親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を使用して容易に精製する（Ｐｏｒａｔｈ  Ｊ．１９９２．Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．３：２６３〜２８１）。発現ベクターｐＡＣＲ．１は、分子ｓｃＦｖ２Ｈ１のＣ末端に、分析目的の「タグ」として使用されるｃ−ｍｙｃペプチドドメイン、次にＩＭＡＣを使用した精製を容易にするための６ヒスチジンドメインを加える。
【００２７】
（Ｆａｂ２Ｈ１−３２と命名した）Ｆａｂ断片の型の組換えポリペプチド分子は、ヒトＶＥＧＦ−Ａの異なるアイソフォームを特異的に認識する。Ｆａｂにおいて、２Ｈ１ＲＶＣＰ（配列番号７）及び２Ｈ１ＲＶＣＬ（配列番号８）と命名したｓｃＦｖ２Ｈ１のＶＲをコードするＤＮＡ配列をベクターｐＦａｂＨｕｍ−１にクローニングし、配列番号１０及び配列番号９で記載したように、それぞれヒトＩｇＧ型免疫グロブリンのＣＨ１及びＣλと遺伝子工学によって結合させた。ｐＦａｂＨｕｍ−１プラスミドは、細菌ペリプラズムにおけるＣλ及びＣＨ１ヒト定常領域を有するＦａｂ断片の発現用に構築された、バイシストロン性ベクターである。生成するポリペプチド鎖は、ＶＲ及びその各々の軽鎖又は重鎖定常領域を含み、それらが構築して細菌ペリプラズムにおいてＦａｂ断片を形成し、ベクターによって与えられるシグナルペプチドによって細胞質からペリプラズムに輸送される。Ｆａｂのペリプラズム構築は、軽鎖と重鎖ＶＲの間、及びＣＨ１とＣλドメインの間の非共有結合相互作用に基づくが、それは、やはりベクターによってもたらされる、ＣＨ１及びＣλ領域のＣ末端の近くに位置する２システイン間のジスルフィド型の共有結合によって補強される。Ｆａｂ２Ｈ１−３２は、５０ｋＤａのみかけの分子サイズを有する。
【００２８】
ｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１−８．２及びｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１−４．１と命名した「完全抗体」型の組換えポリペプチド二価分子は、ｓｃＦｖ２Ｈ１のＶＲ配列、次に１０個のスペーサーアミノ酸をコードする配列、ヒト免疫グロブリンＩｇＧ１型のヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインをコードするヌクレオチド配列（配列番号１４）、及び幾つかのＶＲ塩基の限られた変化を有する前の配列と非常に類似した配列（配列番号１３）をそれぞれ含む。これらの分子は、ｐＶＳＪＧ−ＨｕｃＦｃベクターにおける（ｃ−ｍｙｃペプチド及び６ヒスチジンをコードする）その３’ドメインを除外したｓｃＦｖ２Ｈ１をコードする遺伝子のＰＣＲ産物のクローニング後に得た。ｐＶＳＪＧ−ＨｕｃＦｃベクターは、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリンのＦｃと結合した２個の同一のｓｃＦｖを含む「完全抗体」型分子の哺乳動物細胞における発現用に設計する。これらの二価分子に移行するポリペプチド鎖は、ｐＶＳＪＧ−ＨｕｃＦｃベクター中に存在する免疫グロブリンシグナルペプチドによって哺乳動物細胞の小胞体に輸送される。ペプチドは小胞体において除去され、２本の同一のポリペプチド鎖は、ヒンジ領域中のジスルフィド結合、ＣＨ２領域とＣＨ３領域の非共有結合相互作用によって補強される結合によって共有結合する。ｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１−４．１分子とｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１−８．２分子は、１００ｋＤａと１２０ｋＤａの間の同様のみかけの分子サイズを有する。これらの分泌タンパク質はそれらのアミノ末端に、ベクターによって与えられる４個の追加的なアミノ酸（ＱＶＬＫ）を有する。
【００２９】
ｓｃＦｖ２Ｈ１、Ｆａｂ２Ｈ１−３２、ｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１−４．１及びｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１−８．２のような本発明の組換え抗体は、トランスジェニック植物の場合と同様に、他の真核生物系において生成することもできる（Ｐｕｊｏｌ，Ｍ．ら、２００５．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２３：１８３３〜１８３７）。
【００３０】
本発明の他の態様では、前に記載した組換えポリペプチド分子は、ヒトＶＥＧＦ−Ａのアイソフォーム１２１及び１６５を特異的に認識し、マウスのＶＥＧＦは同定しない。これらの分子は、可溶性のヒトＶＥＧＦ−Ａ、固相表面に吸着したヒトＶＥＧＦ−Ａ、若しくはヒトＶＥＧＦ−Ａを生成するヒト細胞と結合しているか又はそれらの近くのヒトＶＥＧＦ−Ａ、後者の中ではヌード（無胸腺）マウス中で増殖するヒト腫瘍中に存在するヒトＶＥＧＦ−Ａと結合することができる。
【００３１】
本発明中に記載した組換えポリペプチド分子ｓｃＦｖ２Ｈ１、Ｆａｂ２Ｈ１−３２、ｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１−４．１及びｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１−８．２は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのヒト内皮細胞におけるその増殖促進活性、及びｉｎ  ｖｉｖｏでの血管新生過程に干渉するような形式で、ヒトの活性状態のＶＥＧＦ−Ａと相互作用し、ｉｎ  ｖｉｖｏでの血管新生過程は、マウス中の皮下マトリゲルペレット、及び同系無胸腺マウス（ヌードマウス）に移植したヒト腫瘍細胞の実験モデルにおいて測定する。本発明中に記載した組換えポリペプチド分子はマウスＶＥＧＦ−Ａを認識せず、ヒトＶＥＧＦ−Ａと可溶型のＫＤＲ受容体の間の結合に効果的に干渉する。ポリペプチド分子ｓｃＦｖ２Ｈ１及びｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１−４．１の施用は、レーザーを用いた光凝固によってＣＮＶが生じる非ヒト霊長類の実験モデルにおいて、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）を妨げ、又はその展開を改善する。ポリペプチド分子Ｆａｂ２Ｈ１−３２及びｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１−８．２も、ヒトＶＥＧＦに対するそれらの特異性がポリペプチド分子ｓｃＦｖ２Ｈ１及びｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１４．１の特異性と類似しており、他のｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいて抗血管新生効果を有することを考慮に入れると、ＣＮＶに対するこのような影響を生み出し得る。
【００３２】
本発明中に記載した組換えポリペプチド分子は、酵素又はその断片、生物学的応答改変物質、毒素又は薬剤、又は放射性同位体と結合することができ、このことは原形分子にヒトＶＥＧＦ−Ａとの結合という特性以外の機能特性を加え、これは、高濃度のヒトＶＥＧＦ−Ａが存在し、又はそのすぐ近くにあり、又は細胞膜と結合したＶＥＧＦ−Ａ型と相互作用することにより多細胞生物の特定の解剖学的位置にある細胞の生存能力を確認する且つ／又はそれに影響を与える能力である。
【００３３】
本発明の目的の組換えポリペプチド分子は、ヒトＶＥＧＦ−Ａを認識しそれと相互作用する能力、及びその血管新生促進活性に干渉する能力、及び内皮細胞の増殖を刺激する能力を有するので、免疫応答の負の調節において分子が作用する生物学的機能などの、ヒトＶＥＧＦに関して記載された他の生物学的機能に影響を与えることもできる（Ｃｈｏｕａｉｂ  Ｓら、１９９７．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １８：４９３〜４９７）。
【００３４】
一組の要素が、本発明の目的の組換えポリペプチド分子を、ヒトＶＥＧＦ−Ａを中和する他の抗体及び抗体断片に対して新規なものにする。これらの要素の中には以下のものがある：
（ａ）本発明の目的のポリペプチド分子の抗原結合部位を形成するＶＲをコードする塩基配列は以前に報告されておらず、他のＶＥＧＦ−Ａ抗体の塩基配列と異なる。ＶＲのＣＤＲ配列、及び特に重鎖ＶＲのＣＤＲ３のそれは、特定のエピトープの認識と関係している芳香族アミノ酸チロシン及び／又はトリプトファンが多量に存在する他の以前に報告された配列（Ｆｅｌｌｏｕｓｅ  Ｆ．Ａ．ら、２００４．ＰＮＡＳ  １０１：１２４６７〜１２４７２）と著しく異なる。本発明中に記載したポリペプチド分子の場合、重鎖ＶＲのＣＤＲ３はチロシンを有していない。
（ｂ）ヒトＶＥＧＦ−Ａに対する本発明の目的のポリペプチド分子の免疫化学的特異性は、マウスＶＥＧＦ−Ａもさらに認識する、他のライブラリー（Ｆｕｈ  Ｇ．ら、２００６．Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１：６６２５〜６６３１）から得られるヒトＦａｂ断片のそれと異なる。
（ｃ）還元剤でＶＥＧＦ−Ａを処理した後に検出された認識の消失によって示されるように、本発明中に記載したポリペプチド分子は、ヒトＶＥＧＦ−Ａのそれらの認識をその生物活性がある二量体の立体配座に非常に依存している。
（ｄ）本発明中に記載したポリペプチド分子は、ヒトＶＥＧＦ−Ａの生物学的機能を中和する他の抗体及び抗体断片を認識するエピトープと比較して以前は記載されなかった、ヒトＶＥＧＦにおける立体配座エピトープを認識する（Ｍｕｌｌｅｒ  Ｙ．ら、１９９７．ＰＮＡＳ  ９４：７１９２〜７１９７；Ｍｕｌｌｅｒ  ＡＹ．ら、１９９８．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ６：１１５３〜１１６７；Ｓｃｈａｅｐｐｉ  Ｊ．−Ｍ．ら、１９９９．Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １２５：３３６〜３４２；Ｆｕｈ  Ｇ．ら、２００６．Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１：６６２５〜６６３１；ＷＯ２００５０１２３５９）。
【００３５】
実施例９中に示すように、１２アミノ酸のコンビナトリアルペプチドライブラリーからｓｃＦｖ２Ｈ１抗体断片によって特異的に選択したペプチド配列間の考えられる結合のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分析、及びヒトＶＥＧＦ−Ａの一次構造及び三次構造の既知のデータは、ｓｃＦｖ２Ｈ１の抗原結合部位はヒトＶＥＧＦ−Ａ分子における立体配座エピトープと相互作用していることをいずれも示唆する。ＶＥＧＦの三次構造中の認識されるゾーンは、ヒトＶＥＧＦ−Ａを中和する他の抗体及び抗体断片に関して記載されたエピトープと一致せず、したがって新規である。このエピトープの定義は、まだ依然として解明されていない、ヒトＶＥＧＦ−Ａとその受容体ＫＤＲの間の複雑な相互作用に関する知識の新たな可能性も開拓する。
【００３６】
本発明中に記載したポリペプチド分子ｓｃＦｖ２Ｈ１、Ｆａｂ２Ｈ１−３２、ｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１−４．１及びｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１−８．２、及びそれらの同等の変異体は、ヒトの活性ＶＥＧＦ−Ａと相互作用することができ、血管新生を刺激するその効果を妨げることができる。このため、これらの分子は、（ａ）癌（原発性腫瘍及び転移）、（ｂ）加齢性黄斑変性症（滲出型）、血管新生緑内障、糖尿病性及び新生児網膜症などの眼疾患、（ｃ）喘息、呼吸窮迫症、子宮内膜症、アテローム性動脈硬化症及び組織浮腫などの急性及び慢性炎症過程、（ｄ）肝炎及びカポジ肉腫などの感染由来の疾患、（ｅ）糖尿病、乾癬、関節リウマチ、甲状腺炎などの自己免疫疾患、及び（ｆ）臓器移植拒絶反応、血管腫、及び血管線維腫などの他の幾つか疾患及び状態などの、異常及び過剰な血管新生が存在する疾患のための新規な治療の開発に有用である。
【００３７】
本発明の他の態様は、血管新生の阻害及び関連病状の治療用の医薬組成物を生成するための、記載した分子の使用である。このような治療は、有効量の本発明中に記載した分子のヒトへの投与を含む。
【００３８】
本発明の一実施形態では、ヒトＶＥＧＦを認識する組換えポリペプチド分子は、悪性腫瘍形成過程及びそれらの転移の治療に有用である。好ましい実施形態では、これらの分子は癌腫、肉腫及び血管新生腫瘍の治療において有効である。実施例１２において本発明者らは、本発明中に記載した分子の適用が、ヌード無胸腺マウスに移植したヒト癌腫の増殖の阻害にどのような影響があったかを示す。この戦略を使用して治療することができる腫瘍の幾つかの例には、類上皮腫、頭部及び頸部腫瘍などの扁平腫、大腸腫瘍、前立腺、乳房、肺（小細胞及び非小細胞腫瘍含む）、膵臓、甲状腺、卵巣、及び肝臓腫瘍がある（が、これらだけには限られない）。これらの分子は、カポジ肉腫、中枢神経系腫瘍形成（神経芽細胞腫、毛細血管腫、髄膜腫、及び脳転移）、黒色腫、腎臓癌、胃腸腫瘍、横紋筋肉腫、膠芽細胞腫、及び平滑筋芽細胞腫などの他の形の腫瘍の治療においても有効であるはずである。
【００３９】
本発明中に記載した抗体に関連する組換えポリペプチド分子は、実施例５中に示すように、ベバシズマブとそれらを区別するヒトＶＥＧＦ−Ａのエピトープ認識を示し、したがってそれらがヒトＶＥＧＦ−Ａとその受容体の結合に干渉する形式が異なるので、これらの分子は、この相互作用を阻害することによっても働く他の分子と異なるｉｎ  ｖｉｖｏ治療効果をもたらすことができる。同じ抗原に対して産生されたが、異なるエピトープを認識し、又は抗原に対して異なる親和性を有する抗体を用いて、異なるｉｎ  ｖｉｖｏ治療効果、及び異なる治療の副作用を得ることが可能であることは十分文書化されている（Ａｌｌａｎ  Ｄ．Ｇ．Ｐ．２００５．Ｔｈｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ  １０：７６０〜７６１）。ヒト化抗体ベバシズマブによって同定された領域と異なる領域によってヒトＶＥＧＦを認識する分子は、ＶＥＧＦとその受容体の間の干渉の影響を生み出すことができることも当業者によって知られている（Ｌｅｅ，Ｆ−Ｈ．ら、２００５．ＰＮＡＳ  １０２）。
【００４０】
ベバシズマブ及びラニビツマブなどの抗体及び抗体断片は、過剰な血管新生が進行する他の疾患において用途を有することは知られている（Ｇａｕｄｒｅａｕｌｔ，Ｊ．ら、２００５．Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉ  ４６：７２６〜７３３；Ｃｏｓｔａ，ＲＡ．ら、２００６．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉ  ４７：４５６９〜４５７８）。本発明の一実施形態では、記載した組換えポリペプチド分子は、その滲出型の加齢性黄斑変性症の治療に有用である。本発明中に記載した分子の２つ、具体的にはｓｃＦｖ２Ｈ１及びｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１−４．１は、実験的非ヒト霊長類モデルにおいてレーザー照射によって誘導した、脈絡膜血管新生に対する予防及び治療効果を示した（実施例１４）。当技術分野に現存する分子に対する言及した分子の治療可能性の考えられる違いの根本に関して、本発明者らは抗原認識の本質的な違い（異なるエピトープ）、及びｓｃＦｖ２Ｈ１はＦａｂ断片ラニビツマブの約半分の分子サイズを有するという事実、網膜層のより良い浸透を可能にし得る事実、より良い治療効果に重要であるとして強調されている問題点を強調しなければならない。さらに、ｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１−４．１分子はベバシズマブより小さな分子サイズ、及びこの場合前者と比較したとき同様の考えられる利点を有する。
【００４１】
本発明の他の実施形態では、記載した組換えポリペプチド分子、又はそれらの同等の変異体を、例えば結腸、肺又は乳腺腺癌、及びその他などの、ＶＥＧＦを発現するヒトの癌に関するｉｎ  ｖｉｖｏの診断手順中で使用する。このため、本発明中に記載したヒトＶＥＧＦ−Ａに特異的なポリペプチド分子は、ヒト中でＶＥＧＦ−Ａを発現する腫瘍の存在及び局在を示す画像の生成を可能にする作用物質の形で、放射標識及び注射することができる。このため、本発明中に記載したのと同様のポリペプチド分子は放射性同位体と結合し、これらと腫瘍の結合を評価する。その方法は、ヒトへの放射標識分子の投与を含むことができる。本発明中に実験的に示したように、１２５Ｉで放射標識したｓｃＦｖ２Ｈ１断片は、無胸腺ヌードマウスに移植したヒト腫瘍細胞によって発現されるヒトＶＥＧＦ−Ａと結合し、腫瘍領域中に特異的に蓄積する。異常に多量のヒトＶＥＧＦ−Ａを発現する組織との反応性は、任意の適切な方法を用いて検出することができる。１２５Ｉ、１１１Ｉｎ又は９９ｍＴｃなどの放射性核種を利用して本発明中に記載したポリペプチド分子を標識するとき、これらは腫瘍中に優先的に局在し、正常組織中には局在せず、腫瘍組織中の放射性標識の存在は、γ線カメラ又はγ線カウンターを使用して検出及び定量化することができる。得られる腫瘍画像の質は、シグナル：バックグラウンド比と直接相関する（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ  ＤＭ．１９９２．Ｉｎｔ．Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｍａｒｋｅｒｓ、７；１８３〜１８８）。１２５Ｉの実験的使用を本発明中に例示するが、他の異なる放射性核種の潜在的使用を制限するものではない。１３１Ｉ、９０Ｙなどの放射性核種が治療能力を有する場合、本発明中に記載した放射標識ポリペプチド分子は、ヒトＶＥＧＦ−Ａを生成する腫瘍の解剖学的領域中のそれらの滞留、並びに腫瘍細胞に対するその影響、腫瘍血管を形成する細胞に対するその影響、及び腫瘍間質を構成しＶＥＧＦ−Ａを生成する他の細胞エレメントに対するその影響により、患者に対して有益な治療効果をもたらすことができる。
【００４２】
前述の事項と一致して、且つ前の実施例において示唆されたように、他の作用物質と結合した、本発明中に記載した組換えポリペプチド分子、又はそれらの同等の変異体は、医薬品又は医薬組成物としてのそれらの投与を含む治療法の基盤であり得る。治療用放射性核種、毒素、薬剤、又は生物学的応答改変物質と、化学的に又は遺伝子工学によって結合したこれらの分子は、腫瘍の領域であり得る異常に高い濃度のヒトＶＥＧＦ−Ａを有する解剖学的領域、及びそのすぐ近くに結合した要素の治療効果を誘導することができ、且つ治療効果を発揮することができる。投与量、投与の頻度、及び間隔は、疾患の性質及び重度にいずれも依存し、これらの決定は、当技術分野で既に知られていることに基づいて、専門家及び他の医師の責任である。
【００４３】
本発明の組成物は、単離形又は他の治療剤と組み合わせて、同時的又は連続的のいずれかで、いずれも治療する疾患に応じて投与することができる。医薬組成物は、活性成分以外に、薬剤として許容される賦形剤、バッファー、安定剤又は医薬「担体」、又は当業者によく知られている他の物質を含む。これらの物質は無毒であり、活性成分の有効性に干渉せず、且つそれらの正確な性質は、経口、粘膜、又は非経口（例えば、静脈内注射）である投与の経路に依存する。
【００４４】
本発明中に記載した分子、又はそれらの同等の変異体は、それらをコードする核酸の発現によって生成される。その結果、これらの記載したポリペプチド分子のいずれかをコードする核酸配列、及びこのような核酸の発現に関する手順も本発明の一部分である。好ましい実施形態では、核酸は、分子ｓｃＦｖ２Ｈ１、Ｆａｂ２Ｈ１−３２、ｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１−４．１及びｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１−８．２に関して記載したＤＮＡ塩基配列を主に（ただしそれのみに限定するものではない）コードする。
【００４５】
本発明中に記載した分子、又はそれらの同等の変異体の組換え発現を達成するために、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、ポリアデニル化、マーカー遺伝子、及び他の関連配列を含めた各々の場合に必要となる制御配列を含む、適切なベクターを選択又は構築することができる。ベクターはプラスミドであってよい。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】大腸菌のペリプラズム及び培地における可溶性ｓｃＦｖ断片の生成中に使用した、プラスミドｐＡＣＲ．１を示す概略図である。そのベクターはＬａｃＺプロモーター、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）及びシグナルペプチド（ＳＰ）ｐｅ／Ｂを有する。
【図２】大腸菌においてｐＡＣＲ．１ベクターを用いて生成した、組換え抗体断片ｓｃＦｖ２Ｈ１をコードするＤＮＡ配列（配列番号６）を示す図である。最初の３５４塩基はヒト免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＲ）（２Ｈ１ＲＶＣＰ、配列番号７と命名）、次に結合セグメント（リンカー）をコードする４８塩基と一致し、ヒト免疫グロブリン軽鎖ＶＲ（２Ｈ１ＲＶＣＬ、配列番号８と命名）をコードする３３３塩基が続き、ベクター自体によってコードされるクローニング部位、ｃ−ｍｙｃペプチド、及び６ヒスチジンの近辺で生成するアミノ酸をコードする６９塩基で終わる。下線を引いた塩基は、Ｋａｂａｔらに従った相補性決定領域（ＣＤＲ）の注釈を表す（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９１）（（上部から底部に）：重鎖ＶＲ（ＶＨ）のＣＤＲ１、ＶＨのＣＤＲ２、ＶＨのＣＤＲ３、軽鎖ＶＲ（ＶＬ）のＣＤＲ１、ＶＬのＣＤＲ２及びＶＬのＣＤＲ３の順で）。
【図３】形質転換した大腸菌ＢＬ−２１細胞におけるｓｃＦｖ２Ｈ１の発現を示す図である。左から右に：分子量マーカー（６６、４５、３５、２９、２０及び１４．２ｋＤａ；レーン１）；対照ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖＭ３；レーン２）、プラスミドｐＡＣＲ．１−ｓｃＦｖ２Ｈ１で形質転換した細菌由来の培養上清（レーン３）、この場合２９ｋＤａ付近を移動する増強バンドを見ることができる、及び空プラスミドｐＡＣＲ．１で形質転換した細菌由来の培養上清（レーン４）。
【図４】ＩＭＡＣを使用したｓｃＦｖ２Ｈ１の精製の結果を示す図である。図４Ａは、（左から右に）：約２９ｋＤａの分子サイズを有する対照ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖＭ３）（レーン１）、ｓｃＦｖ２Ｈ１を含む出発物質（レーン２）、及び高純度で溶出したｓｃＦｖ２Ｈ１（レーン３）である、１２％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の図である。図４Ｂは、図４Ａ中に示すＳＤＳ−ＰＡＧＥのレプリカのウエスタンブロットを示す図である。これらのタンパク質中に存在するｃ−ｍｙｃドメインに対するモノクローナル抗体９Ｅ１０は、検出のために使用した。
【図５】可溶性ＶＥＧＦ受容体分子（ＫＤＲ−Ｆｃ）とリガンドヒトＶＥＧＦ−Ａのアクセスを阻害する精製ｓｃＦｖ２Ｈ１の能力を評価した、競合ＥＬＩＳＡの結果を示す図である。ＶＥＧＦ−Ａは固相に吸着した。異なる濃度（８０μｇ／ｍＬまで）のｓｃＦｖ２Ｈ１を使用した。Ｂ型肝炎表面抗原に特異的なｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ抗ＨＢｓＡｇ）を陰性対照として使用した。このアッセイでは、ＶＥＧＦ−Ａと結合したＫＤＲ−Ｆｃの検出は、ペルオキシダーゼ結合抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ）を使用して行った。
【図６】大腸菌のペリプラズム及び培地におけるＦａｂ型の可溶性抗体断片の生成に使用した、プラスミドｐＦａｂＨｕｍ−１の概略図である。
【図７】細菌ペリプラズムにおいて自己集合する、Ｆａｂ断片２Ｈ１−３２の成熟分子を形成する２本の鎖をコードするＤＮＡ配列（配列番号９及び配列番号１０）を示す図である。図７Ａ及び５’−３’センスで、免疫グロブリン軽鎖ＶＲをコードし、次に免疫グロブリンＣλ定常ドメインをコードする配列を示す。下線を引いた塩基は、（上部から底部に）：軽鎖ＶＲ（ＶＬ）のＣＤＲ１、ＶＬのＣＤＲ２及びＶＬのＣＤＲ３の順で、ＣＤＲの注釈を表す。図７Ｂ及び５’−３’センスで、免疫グロブリン重鎖ＶＲをコードし、次にＣＨ１免疫グロブリン定常ドメイン、６ヒスチジン及びｃ−ｍｙｃペプチドをコードする配列を示す。下線を引いた塩基は、（上部から底部に）：重鎖ＶＲ（ＶＨ）のＣＤＲ１、ＶＨのＣＤＲ２及びＶＨのＣＤＲ３の順でＣＤＲの注釈を表す。
【図８】図８Ａは、制限部位ＡｆｌＩＩとＸｂａＩの間のｓｃＦｖ断片のクローニング後に、「完全抗体」型の二価分子を発現させるために使用したプラスミドｐＶＳＪＧ−ＨｕｃＦｃのマップである。図８Ｂは、所与のｓｃＦｖ挿入物を含むプラスミドでトランスフェクトした哺乳動物細胞によって生成された分子の概略図である。
【図９】ｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１−４．１と命名した成熟抗体様分子をコードするＤＮＡ配列（配列番号１３）を示す図である。５’−３’センスで、免疫グロブリン重鎖可変領域、次にリンカー及び免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードする塩基、１０アミノ酸、次にＩｇＧ１ヒト免疫グロブリンのヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインをコードするスペーサーを見ることができる。下線を引いた塩基は、（上部から底部に）：ＶＨのＣＤＲ１、ＶＨのＣＤＲ２、ＶＨのＣＤＲ３、ＶＬのＣＤＲ１、ＶＬのＣＤＲ２及びＶＬのＣＤＲ３の順でＣＤＲの注釈を表す。
【図１０】ｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１−８．２と命名した成熟抗体様分子をコードするＤＮＡ配列（配列番号１４）を示す図である。５’−３’センスで、免疫グロブリン重鎖可変領域、次にリンカー及び免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードする塩基、１０アミノ酸、次にＩｇＧ１ヒト免疫グロブリンのヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインをコードするスペーサーを見ることができる。下線を引いた塩基は、（上部から底部に）：ＶＨのＣＤＲ１、ＶＨのＣＤＲ２、ＶＨのＣＤＲ３、ＶＬのＣＤＲ１、ＶＬのＣＤＲ２及びＶＬのＣＤＲ３の順でＣＤＲの注釈を表す。
【図１１】過剰なヒトＶＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）の存在下で固相に吸着した断片との結合を評価した、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて決定した、断片ｓｃＦｖ２Ｈ１の結合部位に関するファージディスプレイペプチドの特異的認識を示す図である。この図は、全３５の試験クローンによって示された挙動を代表するペプチドを提示する１０のファージクローンを示す。実験中、ファージサンプルは溶液中においてＶＥＧＦ有り又は無し（ｗ／ｏ）でインキュベートした。
【図１２】文献中に記載された他の抗体関連分子と比較した、ＶＥＧＦ−Ａ分子においてｓｃＦｖ２Ｈ１によって認識されたエピトープを主として確認する残基のマッピングを示す図である。αヘリックス、β鎖及びループで、その二量体立体配座のヒトＶＥＧＦ−Ａの三次構造を表す図形を使用する。２つの同一の二量体分子はライトグレー及び黒色で存在する。ｓｃＦｖ２Ｈ１によって認識されたエピトープを主に示すとして定義した残基の位置は、二量体のライトグレー鎖においてのみ記され、ファンデルワールス（ＶＤＷ）球として表される黒色で存在する。他の抗体によって認識された残基は、図Ａ〜Ｄ中でライトグレーのＶＤＷとして示す。図１２Ｅは、ｓｃＦｖ２Ｈ１に関して主に示された残基（黒色のＶＤＷ中）によって定義されるエピトープの位置に関して、ヒトとマウスのＶＥＧＦ−Ａの配列を比較するときの、異なる（ライトグレーのＶＤＷ中の）近隣アミノ酸の位置を示す。
【図１３】培養中のヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨｕＶＥＣ）に対するヒトＶＥＧＦ−Ａの増殖刺激効果に干渉する、分子ｓｃＦｖ２Ｈ１、Ｆａｂ２Ｈ１−３２、ｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１４．１及びｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１８．２の能力を示す図である。精製したｓｃＦｖ２Ｈ１、Ｆａｂ２Ｈ１−３２、ｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１４．１及びｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１８．２を３つの異なる濃度（縞模様線：２μｇ／ｍＬ；黒線：１μｇ／ｍＬ；白線：０．５μｇ／ｍＬ）及び１０ｎｇ／ｍＬのヒトＶＥＧＦ−Ａ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）で加えた。
【図１４】２．５ｍｇ／ｋｇ（図１４Ａ）及び２５ｍｇ／ｋｇ（図１４Ｂ）の用量での、ｓｃＦｖ２Ｈ１、Ｆａｂ２Ｈ１−３２、ｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１４．１及びｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１８．２の抗腫瘍活性を示す図である。曲線中の点は、１群当たり５匹の動物に関して推定した腫瘍体積の平均を指す。陰性対照：最高用量での無関係なモノクローナル抗体ＣＢ−Ｈｅｐ．１（抗ＨＢｓＡｇ）。
【図１５】Ａ４３１細胞由来のヒト腫瘍を有するヌードマウスに１２５Ｉで放射標識した断片ｓｃＦｖ２Ｈ１（黒線）又は断片ｓｃＦｖＨｅｐ．１（白線）を接種した後、２４時間（各組織中の第１の２本の線）及び４８時間（各組織中の第２の２本の線）での組織１グラム当たりの注射用量の割合を示す図である。それぞれの線は、５匹のマウスから得た器官／組織から回収した数の平均を表す。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００４７】
（実施例１）
Ｐ６４Ｋと融合したヒトＶＥＧＦのアイソフォーム１２１のクローニング、細菌における発現及び精製。
（ａ）ヒトＶＥＧＦのアイソフォーム１２１のクローニング
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）及び製造者によって推奨された手順を利用して、ＶＥＧＦのアイソフォーム１２１の単離及びクローニングのためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用した。表１中に示す合成オリゴヌクレオチド番号１（配列番号１）及び番号２（配列番号２）を、ＰＣＲにおけるプライマーとして使用した。
表１．−ヒトＶＥＧＦのアイソフォーム１２１のＰＣＲにおいて使用したプライマー。
【表１】
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【００４８】
この技法では、使用したＤＮＡ鋳型は、以前にＶＥＧＦアミノ酸残基Ｒ８２、Ｋ８４及びＨ８６をグルタミン酸に置換する突然変異を含むようにＰＣＲによって改変されたプラスミドｐＶＥＧＦであった（Ｏｊａｌｖｏ，Ａ．Ｇ．ら、２００３．Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６、２０８〜２２２）。
【００４９】
増幅産物に対応するバンドを２％アガロースゲルから抽出した。エンドヌクレアーゼＮｈｅＩ及びＢａｍＨ１でバンドを消化した後、ＤＮＡを精製し、ベクターｐＭ２３８（Ｙｅｒｏ，Ｄ．ら、２００６．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．ＢｉｏＣｈｅｍ  ４４：２７〜３４）にクローニングした。このベクターを用いて細菌において発現させたタンパク質は、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＰ６４Ｋタンパク質の４７アミノ酸のＮ末端ドメインを有する融合タンパク質である。生成したプラスミド（Ｐ６４４７ａａ−ＶＥＧＦ）を配列決定し、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ｗｗｗ．ｅｍｂｌ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ）によって報告された対応するクローニングしたヒトＶＥＧＦのアイソフォームのアミノ酸配列に関して、配列番号３で示す、前に記載したｅｘｐｒｏｆｅｓｏ突然変異のみを含むと決定した。
【００５０】
（ｂ）大腸菌における融合タンパク質の発現
プラスミドＤＮＡをクローンＰ６４４７ａａ−ＶＥＧＦから抽出し、これを使用して大腸菌ＢＬ２１を形質転換した。幾つかの生成したコロニーを、アンピシリン及びトリプトファンを含む５０ｍＬのＬＢ培地に接種し、３７℃で５時間増殖させた。２５ｍＬのこれらの培養物を、アンピシリンを含む２５０ｍＬの富栄養Ｍ９培地に接種し、３７℃で２時間再度インキュベートした。４０μｇ／ｍＬの３−β−インドールアクリル酸を加えることによって誘導を行った。細胞は８時間後に回収し、超音波による破壊後、対象とするタンパク質が沈殿中に残存した。タンパク質の可溶化はリン酸ナトリウムバッファー及び６Ｍ尿素で行った。上清はＮｉ−ＮＴＡゲル（ＱＩＡＧＥＮ）中のＩＭＡＣに施した。
【００５１】
溶出分画は２６ｋＤａ、５４ｋＤａ及びより大きなバンドを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して評価し、２つの最初のバンドは調製物中に９８％を超えるタンパク質を含んだ。最初のサイズはモノマーのサイズに対応し、第２のサイズは二量体分子に対応し、より大きな重量のバンドはさらなる凝集体に対応する。溶出分画はＰＢＳで透析し、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  Ｆ１２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）におけるクロマトグラフィーに施し、より大きなみかけの分子量（約５４ｋＤａ）を有する種のみを選択し、これらをＰ６４４７ａａ−ＶＥＧＦと命名した。この調製物はさらなる使用のために−２０℃で凍結させた。
【００５２】
（ｃ）融合タンパク質Ｐ６４４７ａａ−ＶＥＧＦの受容体結合アッセイ。
Ｍａｘｉｓｏｒｐ（Ｎｕｎｃ）９６ウエルイムノプレートを、４℃で１６時間ＰＢＳ中においていずれも５μｇ／ｍＬで、精製Ｐ６４４７ａａ−ＶＥＧＦ融合タンパク質又はヒトＶＥＧＦ−Ａ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を用いてコーティングした。プレートは１時間の間ＰＢＳ−ミルク４％を用いて２２℃でブロッキングした。可溶性ヒト受容体ＫＤＲ−Ｆｃ（Ｓｉｇｍａ）は異なる濃度でＰＢＳ−ミルク４％に希釈し、プレートに加え、２２℃で１時間インキュベートした。繰り返し洗浄した後、コーティングと受容体の結合を、ペルオキシダーゼと結合したヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ）、次にオルト−フェニレンジアミン０．５ｍｇ／ｍＬ及び過酸化水素０．０１５％で構成され、クエン酸バッファーｐＨ５．５に溶かした基質溶液を使用して発色させた。プレートは４９２ｎｍにおいてＥＬＩＳＡプレートリーダーで読み取り、実験サンプル１つ当たり３つの同一ウエルから平均吸光度の値を推定した。表１は、可溶性受容体の結合は、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈからのヒト非突然変異ＶＥＧＦ−Ａでコーティングした固相に限られていたことを示す。３つの重要な突然変異を本発明者らが意図的に導入した（残基Ｒ８２、Ｋ８４及びＨ８６がグルタミン酸によって置換された）融合タンパク質Ｐ６４４７ａａ−ＶＥＧＦは可溶性ＫＤＲによって同定されず、Ｓｈｅｎら、（Ｓｈｅｎ，Ｂ．ら、１９９８．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３：２９９７９〜２９９８５）によってなされた予測と一致する結果、ヒトＶＥＧＦを中和する抗体及び抗体断片の開発に使用された文献中で報告されている他の抗原と、本発明者らの抗原は異なるものとなる。
表１ａ．ＥＬＩＳＡにおけるコーティングとしてＶＥＧＦ−Ａ又は融合タンパク質Ｐ６４４７ａａ−ＶＥＧＦを使用する、ＫＤＲ−Ｆｃに関する結合アッセイ。
【表２】
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【００５３】
（実施例２）
Ｐ６４４７ａａ−ＶＥＧＦタンパク質を用いたＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫感作及び市販のヒトＶＥＧＦのアイソフォーム１２１を認識する血清の能力の評価。
ＶＥＧＦ中和抗体を生成する融合タンパク質Ｐ６４４７ａａ−ＶＥＧＦの能力を、８〜１０週齢の１０匹のＢＡＬＢ／ｃメスマウス（ＣＥＮＰＡＬＡＢ、Ｈａｖａｎａ）を免疫感作して評価した。７日間隔、４つの皮下用量のスキームで、ＶＳＳＰとして知られるアジュバント（Ｅｓｔｅｖｅｚ  Ｆ．ら、１９９９．Ｖａｃｃｉｎｅ  ９９：１９０〜１９７）を使用して、１回の投与当たり１００μｇのＰ６４４７ａａ−ＶＥＧＦタンパク質で動物を免疫感作した。最後の免疫感作後１週間で動物を出血させ、血清を分離し、−２０℃で分割して保存した。
【００５４】
Ｐ６４４７ａａ−ＶＥＧＦで免疫感作したマウス由来の血清が、ＶＥＧＦに特異的な抗体を有していたかどうかを決定するために、ヒトＶＥＧＦ−Ａのアイソフォーム１２１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を用いてコーティングするＥＬＩＳＡを開発した。後者は、４℃で１６時間ＰＢＳ中において１μｇ／ｍＬの濃度で、９６ウエルＭａｘｉｓｏｒｐ（Ｎｕｎｃ）イムノプレートに固定した。プレートは１時間の間ＰＢＳ−ミルク４％を用いて２２℃でブロッキングした。ＰＢＳ−ミルク４％への一連の血清希釈液は１時間インキュベートし、プレートは洗浄し、抗マウスペルオキシダーゼ結合体（Ｓｉｇｍａ）と共にインキュベートした。反応混合物は、オルト−フェニレンジアミン０．５ｍｇ／ｍＬ及び過酸化水素０．０１５％で構成され、クエン酸バッファーｐＨ５．５に溶かした基質溶液を用いて発色させた。Ｐ６４４７ａａ−ＶＥＧＦタンパク質で免疫感作した動物の血清は、１：３２，０００までの力価で市販のヒトＶＥＧＦを特異的に認識した。
【００５５】
（実施例３）
ヒトＶＥＧＦに対する抗体結合部位の選択。
ヒトＶＥＧＦのアイソフォーム１２１に対する結合部位を選択するために、本発明用に特異的に構築したヒト単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体断片の線状ファージディスプレイライブラリーを、本発明者らは使用した。このライブラリー中、生成するｓｃＦｖ中に存在するヒト軽鎖可変領域（ＶＲ）は、λＶＲレパートリーに対応する。公開された手順（Ｒｏｊａｓ  Ｇら、２００５．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｕｎ  ３３６：１２０７〜１２１３）に従い構築する、λＶＲ（Ｖλ）に偏ったこのライブラリーを開発するプロセスでは、ヒト重鎖ＶＲのレパートリーをコードする遺伝子をセミライブラリーから回収し、１：１ベクター：挿入物の比でＶλ領域の他のセミライブラリーのプラスミドＤＮＡと連結させた。連結の生成物はＴＧ１細胞にエレクトロポレーションして、最終ライブラリーを得た。挿入物の存在又はサイズは、３０コロニー、及びクローニングしたｓｃＦｖの隣接領域と結合したオリゴヌクレオチドのサンプルにおいて決定した。
【００５６】
選択において、この新たに構築したライブラリーを使用して、本発明者らは組換え融合タンパク質Ｐ６４４７ａａ−ＶＥＧＦを抗原として利用した。ライブラリーに適合するファージの混合物は、過剰（１ｍｇ／ｍＬ）のＰ６４ｋ溶液を用いた吸着除去過程に事前に施して、このタンパク質に特異的である望ましくないｓｃＦｖを排除した。吸着除去した混合物を使用して、Ｍａｘｉｓｏｒｐ（Ｎｕｎｃ）イムノチューブに固定したＰ６４４７ａａ−ＶＥＧＦタンパク質をプローブ処理した。このために、イムノチューブは一晩４℃でＰＢＳ中において１０μｇ／ｍＬのタンパク質でコーティングし、次いでＰＢＳ−スキムミルク４％を用いてブロッキングした。非結合ファージは、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ０．１％の溶液を用いた２０回の洗浄、次にＰＢＳを用いた２回の洗浄によって排除した。結合ファージを１０分間１００ｍｍｏｌ／Ｌのトリエチルアミン溶液を用いて溶出させ、それを０．５ｍｏｌ／Ｌのトリス（ｐＨ７．５）ですぐに中和した。溶出ファージはＴＧ１大腸菌株において増幅させ、次の選択サイクル用の出発物質として使用した。この手順を同じ条件下で３回繰り返した。第２及び第３の選択サイクルから溶出したファージを感染させたＴＧ１細胞のランダムな個々のコロニーを使用して、９６ウエルスケールでファージを生成した。ｓｃＦｖ抗体断片を提示してＰ６４４７ａａ−ＶＥＧＦと結合するこれらのファージクローンの能力を、ＥＬＩＳＡを使用して評価した。Ｍａｘｉｓｏｒｐ（Ｎｕｎｃ）９６ウエルプレートを、１０μｇ／ｍＬのＰ６４４７ａａ−ＶＥＧＦでコーティングし、次いでブロッキングした。ＰＢＳ−スキムミルク４％に希釈したファージを２２℃で１時間プレート中においてインキュベートし、次いで数回洗浄した。結合ファージは、２２℃で１時間ペルオキシダーゼと結合した抗Ｍ１３抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて検出した。数回の洗浄後、反応混合物は基質溶液を加えることによって発色させた。吸光度は４９２ｎｍにおいてマイクロプレートリーダーで読み取った。ＥＬＩＳＡで評価した９６個のファージクローンの中で、８７個が陽性の結果を示した。ＥＬＩＳＡ中で陽性の結果を示したファージクローンによって提示されるｓｃＦｖ抗体断片をコードするＤＮＡをＰＣＲによって増幅させ、酵素ＢｓｔＮ−Ｉを用いた制限分析に施した。この消化の産物は４％アガロースゲルで調べた。この分析から、本発明者らは７個の異なる制限パターンを同定し、各々を代表するクローンを選択した。選択クローンは、１６時間２８℃で増殖させたＴＧ１細菌細胞を感染させることによって生成した。培養上清中に含まれていたファージは、ＰＥＧ５０００の２．５ＭＮａＣｌ溶液を用いて沈殿させ、以下の免疫化学的特徴付けのために分割して保存した。
【００５７】
（実施例４）
ライブラリーから選択したファージにおけるｓｃＦｖの免疫化学的特徴付け。
（ａ）ヒト及びマウスＶＥＧＦの異なるアイソフォームの認識
ヒトＶＥＧＦのアイソフォーム１２１及び１６５、及びマウスＶＥＧＦのアイソフォーム１２０の特異的認識を決定するために、ｓｃＦｖ断片を提示する７個のファージクローンにＥＬＩＳＡアッセイを施した。イムノプレートは、ＰＢＳ中に１μｇ／ｍＬの濃度での、ヒトＶＥＧＦ−Ａのアイソフォーム１２１及び１６５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）及びマウスＶＥＧＦのアイソフォーム１２０（Ｒ＆Ｄ）によってコーティングした。プレートをブロッキングした後、前に記載したように精製しＰＢＳ−スキムミルク４％に希釈したファージを加え、２２℃で１時間インキュベートした。数回の洗浄後、抗Ｍ１３ペルオキシダーゼ結合抗体を用いて結合ファージを検出した。反応混合物は、実施例２に記載したように発色させ定量化した。陰性対照として、前に記載したように沈殿させた、非選択ライブラリーのファージの混合物のサンプルを使用した。表２中に見られるように、７個の選択ファージクローンはヒトＶＥＧＦのアイソフォーム１２１及び１６５を特異的に同定する。これらの中で、クローン２Ｈ１−Ｆ及び３Ｃ１はマウスＶＥＧＦのアイソフォーム１２０を認識しない。この表は、ＥＬＩＳＡにおいて得られる光学濃度の値が陰性対照の値の少なくとも５倍であるとき、陽性（＋）として分類されるクローンの認識能力を示す。
表２．線状ファージにおいて提示されたｓｃＦｖの７個のクローンによる、ヒト及びマウスＶＥＧＦ−Ａの異なるアイソフォームの認識。
【表３】
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【００５８】
（ｂ）天然及び還元型のヒトＶＥＧＦ−Ａの差次的認識
ライブラリーから選択した異なる抗体断片による認識に関するＶＥＧＦ−Ａの天然ホモ二量体のフォールディングの重要性を、ヒトＶＥＧＦ−Ａのアイソフォーム１２１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）をＥＬＩＳＡプレートにコーティングしたＥＬＩＳＡを使用して試験した。プレートをブロッキングした後、ウエルの半分を２２℃で１時間の間５０ｍＭのＤＴＴ溶液、ＰＢＳ−ミルク４％中で処理し、他の半分はＰＢＳ−ミルク４％のみで処理した。数回の洗浄後、ＶＥＧＦ−ＡをＤＴＴ溶液で還元したウエルを１００ｍＭのヨードアセトアミド、ＰＢＳ−ミルク４％中で処理し、２２℃で１時間インキュベートした。残りのウエルはＰＢＳ−ミルク４％で維持した。プレートを新たに洗浄した後、ＰＢＳ−ミルク４％に希釈した精製ファージを全てのウエルに加え、２２℃で１時間インキュベートした。数回の洗浄後、抗Ｍ１３ペルオキシダーゼ結合抗体を用いて結合ファージを検出した。陰性対照として、非選択ライブラリーのファージの混合物のサンプルを使用した。表３は、３パターン、（クローン３１Ｃによって例示される）認識がＶＥＧＦ還元によって影響を受けなかった第１パターン、（クローン２Ｂ２及び３Ｅ８によって例示される）還元の部分的な影響が見られた第２パターン、及び（クローン２Ｄ２、２Ｅ１、２Ｈ１−Ｆ及び２Ｅ３によって例示される）還元型のＶＥＧＦに対する認識の完全な消失が記された第３パターンを示す。ＶＥＧＦ−Ａに関するクローンの認識の能力を、陰性対照により得られたものを低い方の参照値として、実験中の３つの同一ウエルの平均光学濃度（４９２ｎｍ）の観点で測定した。
表３．線状ファージにおいて提示された７個のｓｃＦｖクローンによるＤＴＴ処理有り又は無しでのヒトＶＥＧＦ−Ａの認識。
【表４】
2010508033.tif 000005
【００５９】
（ｃ）可溶型のＫＤＲ受容体（ＫＤＲ−Ｆｃ）とヒトＶＥＧＦ−Ａに関して選択したファージの間の競合ＥＬＩＳＡ
競合ＥＬＩＳＡを使用して、可溶性ＶＥＧＦ受容体と抗原のアクセスを阻害する選択したファージクローンの能力を評価した。このために、Ｍａｘｉｓｏｒｐ（Ｎｕｎｃ）９６ウエルイムノプレートを、ヒトＶＥＧＦ−Ａのアイソフォーム１２１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）でコーティングした。プレートをブロッキングし、２μｇ／ｍＬの可溶性受容体（ＫＤＲ−Ｆｃ、Ｓｉｇｍａ）有り又は無しで、ＰＢＳ−ミルク４％に希釈した対応するファージの混合物と共にさらにインキュベートした。抗Ｍ１３ペルオキシダーゼ結合抗体を使用して結合ファージを検出した（Ａｍｅｒｓｈａｍ）。表４中に示すように、ＶＥＧＦ−ＡとのＫＤＲ−Ｆｃ結合の高い阻害を示したクローンは２Ｈ１−Ｆと命名した。この表は、陰性対照により得られたものを低い方の参照値として、実験中の３つの同一ウエルの平均光学濃度（４９２ｎｍ）の観点で測定した、ＶＥＧＦ−Ａに関するクローンの認識の能力を示す。
表４．７個のファージディスプレイｓｃＦｖクローンと２μｇ／ｍＬのＫＤＲ−Ｆｃを個々に混合した後、又はしなかった場合の、ヒトＶＥＧＦ−Ａの認識。
【表５】
2010508033.tif 000006
【００６０】
（実施例５）
大腸菌におけるｓｃＦｖ２Ｈ１断片の発現、精製、及びそのヒトＶＥＧＦ認識の特徴付け。
（ａ）ｐＡＣＲ．１ベクターにおけるｓｃＦｖ２Ｈ１のクローニング及び配列決定
ｐＡＣＲ．１ベクターは、大腸菌のペリプラズムにおける抗体断片の発現用に設計したプラスミドである（図１）。ベクターの主なエレメントとして、本発明者らはＬａｃＺプロモーター、シグナルペプチド、断片遺伝子の挿入用の制限部位ＮｃｏＩ及びＮｏｔＩ、ｃ−ｍｙｃペプチド及びＩＭＡＣを使用する発現産物の精製用の６ヒスチジンをコードする配列をコードするドメインを有する。２Ｈ１−Ｆと命名したｓｃＦｖを含むファージミドＤＮＡを、ＰＣＲ用の鋳型として使用した。この手順は、製造者の説明書の下で酵素ＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて行った。合成オリゴヌクレオチド番号３（配列番号４）及び番号４（配列番号５）を、この手順におけるプライマーとして使用した（表５）。
表５．ベクターｐＡＣＲ．１におけるそのクローニング用のファージミドベクター中に含まれるｓｃＦｖ２Ｈ１−Ｆを増幅及び改変するための合成オリゴヌクレオチド。
【表６】
2010508033.tif 000007
【００６１】
増幅後に得た予想サイズ（７００ｂｐ）のバンドを、ＱＩＡＧＥＮのＤＮＡゲル抽出キットを使用して１％アガロースゲルから精製し、ＮｃｏＩ及びＮｏｔＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で消化し、連結用に再度精製した。ｐＡＣＲ．１ベクターはＮｃｏＩ及びＮｏｔＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で消化し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して消化したバンドと連結させた。連結産物を使用して、エレクトロポレーションによって大腸菌コンピテント細胞（菌株ＸＬ−１Ｂｌｕｅ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を形質転換した。形質転換細胞は選択固体培地に平板培養し、３７℃で増殖させた。利用した方法は広く知られている（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．１９８９．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ）。
【００６２】
プラスミドＤＮＡを異なるコロニーから精製し（ＱＩＡＧＥＮのＭｉｎｉＰｒｅｐキット）、既に記載した制限酵素を用いた予想連結産物に関する消化によって調べた。幾つかのプラスミドを選択し、自動配列決定法及びベクターｐＡＣＲ．１のクローニング領域と外面的にハイブリダイズする特異的プライマーを使用して、ｓｃＦｖ２Ｈ１のＤＮＡコンセンサス配列を得た。ｓｃＦｖ２Ｈ１と命名した完全断片（ＶＨ−リンカー−ＶＬ−ｃ  ｍｙｃ−ヒスチジン）に関して得たＤＮＡコンセンサス配列（配列番号６）は、図２中に示す。この構築体の代表的なプラスミドはｐＡＣＲ．１−ｓｃＦｖ２Ｈ１と命名した。この図は、重鎖ＶＲ（２Ｈ１ＲＶＣＰと命名、配列番号７）及び軽鎖ＶＲ（２Ｈ１ＲＶＣＬと命名、配列番号８）の個々の配列を表す。Ｋａｂａｔらの分類に従えば、２Ｈ１ＲＶＣＰはヒト免疫グロブリンＶＲの亜群Ｉに属し、２Ｈ１ＲＶＣＬはヒト免疫グロブリンλ型ＶＲの幾つかの群に分類することができる。図中で下線を引いたのは、Ｋａｂａｔらの分類に従い注釈付けしたＣＤＲ配列である。
【００６３】
（ｂ）大腸菌におけるｓｃＦｖ２Ｈ１の発現
ｐＡＣＲ．１−ｓｃＦｖ２Ｈ１を使用して、コンピテントＢＬ２１大腸菌細胞を形質転換した。この菌株は、ペリプラズム及び／又は培地における異種タンパク質の発現を可能にする。形質転換細胞は選択固体培地に平板培養し、３７℃で増殖させた。構築体の代表的なコロニーを液体培地中で増殖させ、１．０のＤＯ５３０ｎｍを得たとき、培地中で１ｍＭのデイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を使用して１２時間誘導を行った。細胞は遠心分離にかけ、浸透圧ショック及び簡単な超音波処理によってペリプラズム含有物を単離した。このペリプラズム分画と培養上清の両方を、１２％変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥで評価した。このアッセイは、分子量マーカー及び癌胎児性抗原に対するｓｃＦｖ［ｓｃＦｖ−Ｍ３］と比較したとき、２９ｋＤａを超える予想上のみかけの分子量のタンパク質の発現を示した（Ｐｅｒｅｚ  Ｌ．ら、２００６．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４３：３９〜４８）（図３）。大部分のｓｃＦｖ２Ｈ１断片は培養上清中に見られる。
【００６４】
（ｃ）ＩＭＡＣを使用するｓｃＦｖ２Ｈ１断片の精製
ｐＡＣＲ．１ベクターによって与えられたタンパク質中に存在する６ヒスチジンのドメインを使用して、精製手順を確立した。この配列は、異なるクロマトグラフィー支持体にキレート化し得る金属イオン（例えばＺｎ＋２、Ｃｕ＋２、Ｎｉ＋２）に対する非常に高い親和性をタンパク質に与える。ｐＡＣＲ．１−ｓｃＦｖ２Ｈ１ベクターで形質転換した細菌を遠心分離にかけ、上清を単離し、カップリングバッファー（ＮａＨ２ＰＯ４  ５０ｍＭ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７〜８）中で７２時間透析し、アガロース−ＮＴＡ（ＱＩＡＧＥＮ）に直接施した。図４Ａは、ゲル中で移動する２９ｋＤａをわずかに超える高純度タンパク質が、精製後に得られることを示す。得られた分画は、ｓｃＦｖ中及び対照（ｓｃＦｖ−Ｍ３）中に存在するｃ−ｍｙｃペプチドに特異的なモノクローナル抗体（９Ｅ１０）、次にペルオキシダーゼと結合したウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ）を使用するウエスタンブロットに施した。図４Ｂは、９Ｅ１０モノクローナル抗体がｓｃＦｖ２Ｈ１を検出したこと、及び重大な分解は見られないことを示す。
【００６５】
（ｄ）ＥＬＩＳＡにおけるｓｃＦｖ２Ｈ１によるヒトＶＥＧＦの特異的認識
Ｍａｘｉｓｏｒｐ（Ｎｕｎｃ）９６ウエルイムノプレートを、４℃で１６時間、ＰＢＳ中に１μｇ／ｍＬの濃度でのヒトＶＥＧＦ−Ａのアイソフォーム１２１及び１６５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）及びマウスＶＥＧＦのアイソフォーム１２０（Ｒ＆Ｄ）でコーティングした。ＰＢＳ−スキムミルク４％でプレートをブロッキングした後、精製したｓｃＦｖ２Ｈ１をＰＢＳ−スキムミルク４％に溶かした異なる濃度で加え、２２℃で１時間インキュベートした。数回の洗浄後、ｃ−ｍｙｃペプチドに特異的なモノクローナル抗体（９Ｅ１０）（１μｇ／ｍＬ）、次に西洋ワサビペルオキシダーゼと結合したウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ）を加えた。固相中の抗原と断片の結合が明らかとなり、それを他の実施例中に記載したように測定した。無関係な抗ＨＢｓＡｇＡｓｃＦｖを陰性対照として使用し、ｓｃＦｖ２Ｈ１に関して前に記載したのと同様の形式で入手し精製した。表６は、ｓｃＦｖ２Ｈ１は原型ファージｓｃＦｖ（２Ｈ１−Ｆ）の特異的認識を維持することを示す。この表は、陰性対照により得られた値を参照として、実験中の３つの同一ウエルから報告された値から計算した平均光学濃度（４９２ｎｍ）の観点で、異なるＶＥＧＦ−Ａに関する断片の認識の能力を示す。
表６．断片ｓｃＦｖ２Ｈ１による、ヒト及びマウスＶＥＧＦ−Ａの異なるアイソフォームの認識。
【表７】
2010508033.tif 000008
【００６６】
（ｅ）可溶型のＫＤＲ受容体（ＫＤＲ−Ｆｃ）とＶＥＧＦ−Ａに関するｓｃＦｖ２Ｈ１断片の間の競合ＥＬＩＳＡ
競合ＥＬＩＳＡを使用して、可溶性ＶＥＧＦ受容体と抗原のアクセスを阻害する精製ｓｃＦｖ２Ｈ１断片の能力を評価した。このアッセイは、高濃度のｓｃＦｖ２Ｈ１を加えた後の、可溶型のＫＤＲ−Ｆｃ受容体と固相にコーティングしたヒトＶＥＧＦ−Ａの阻害に基づく。このために、Ｍａｘｉｓｏｒｐ（Ｎｕｎｃ）９６ウエルイムノプレートを、４℃において１６時間ＰＢＳに溶かしたヒトＶＥＧＦ−Ａのアイソフォーム１２１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）でコーティングした。プレートをブロッキングし、高濃度の精製ｓｃＦｖ２Ｈ１、及び０．５μｇ／ｍＬの可溶性受容体（ＫＤＲ−Ｆｃ、Ｓｉｇｍａ）又は賦形剤のみ（ＰＢＳ−ミルク４％）と共にさらにインキュベートした。抗ＨＢｓＡｇｓｃＦｖ抗体断片は陰性対照として使用した。抗Ｍ１３ペルオキシダーゼ結合抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して結合ファージを検出した。固相中でヒトＶＥＧＦ−Ａと結合したＫＤＲ−Ｆｃは、ペルオキシダーゼと結合した抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いて検出した。図５中に示すように、ｓｃＦｖ２Ｈ１は固相中での可溶性受容体とヒトＶＥＧＦ−Ａの結合に干渉することができ、使用する用量に明らかに依存する。
【００６７】
（ｆ）ｓｃＦｖ２Ｈ１とアバスチンの免疫化学的比較
細菌のｓｃＦｖ２Ｈ１を、ベバシズマブ（アバスチン（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）と、ｓｃＦｖ２Ｈ１−Ｆを生成した実施例３中に記載済みの抗体ファージ選択手順に本来使用した融合タンパク質Ｐ６４４７ａａ−ＶＥＧＦの、それらの識別能力に関して比較した。Ｐ６４４７ａａ−ＶＥＧＦ又はヒトＶＥＧＦ−Ａ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を、４℃で１６時間の間、ＰＢＳ中に１μｇ／ｍｌの濃度でＭａｘｉｓｏｒｐ（Ｎｕｎｃ）９６ウエルイムノプレートに固定した。プレートは、１時間の間ＰＢＳ−ミルク４％を用いて２２℃でブロッキングした。ＰＢＳ−ミルク４％に希釈した精製ｓｃＦｖ２Ｈ１又はベバシズマブの連続希釈液を１時間インキュベートし、プレートは洗浄し、以下のように：（ｉ）ｓｃＦｖ２Ｈ１に関しては、９Ｅ１０抗ｃ−ｍｙｃモノクローナル抗体、次に抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼ結合体（Ｓｉｇｍａ）と共に、及び（ｉｉ）ベバシズマブに関しては、ペルオキシダーゼと結合したヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ）と共に、さらにインキュベートした。反応混合物は、オルト−フェニレンジアミン０．５ｍｇ／ｍＬ及び過酸化水素０．０１５％で構成され、クエン酸バッファーｐＨ５．５に溶かした基質溶液を用いて発色させた。
【００６８】
試験サンプル１つ当たり３つの同一ウエルでＥＬＩＳＡプレートリーダーにおいて得られた４９２ｎｍにおける平均吸光度値を示す、表６ａ中に見られるように、ｓｃＦｖ２Ｈ１はＰ６４４７ａａ−ＶＥＧＦとヒトＶＥＧＦ−Ａの両方を認識し、一方ベバシズマブはＰｅｐｒｏｔｅｃｈからのヒトＶＥＧＦ−Ａのみを認識することができた。
【００６９】
無関係なｓｃＦｖ抗ＨＢｓＡｇ及びＴｈｅｒａＣＩＭ（抗ＥＧＦ受容体ヒト化ＩｇＧ１抗体；ＣＩＭＡＢ  ＳＡ、Ｈａｖａｎａ）は陰性対照として使用した。
表６ａ．Ｐ６４４７ａａ−ＶＥＧＦ及びヒトＶＥＧＦ−Ａのアイソフォーム１２１に対する、断片ｓｃＦｖ２Ｈ１及びベバシズマブの免疫反応性。
【表８】
2010508033.tif 000009
【００７０】
（実施例６）
ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）におけるｓｃＦｖ２Ｈ１の発現及びヒトＶＥＧＦに対するその認識の実証。
（ａ）ｐＰＳ９ベクターにおけるｓｃＦｖ遺伝子のクローニング
ｓｃＦｖ２Ｈ１をコードする遺伝子を、ピキア・パストリス発現ベクターｐＰＳ９におけるクローニング用のｐＡＣＲ．１−２Ｈ１ベクターからＮｃｏＩ／ＸｂａＩで消化した。プラスミドｐＰＳ９は、酵素アルコールオキシダーゼのプロモーター（ＡＯＸ．１）に対応する１．１５ｋｂ断片、次に出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のスクロースインベルターゼの分泌シグナル（ｓｕｃＩＩ）をコードする遺伝子、マルチクローニングサイト、転写終結に関する酵素グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇａｐｔ）に対応する９６０ｂｐ断片、及び選択マーカーとしての出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＨＩＳ３遺伝子を含む組込みベクターである。このベクターは、ＡＯＸ．１遺伝子の３’配列に対応する２．１ｋｂ断片も含む。全てのこれらのエレメントはｐＣＵ１８ベクター中に挿入する（ＥＰ０４３８２００Ａ１）。
【００７１】
ｓｃＦｖ−２Ｈ１遺伝子のＮｃｏＩ／ＸｂａＩ消化及びアガロースゲルからのその精製後、生成した配列を事前にＮｃｏＩ／ＳｐｅＩで消化したｐＰＳ９と連結させ、その連結産物を使用してＸＬ−１Ｂｌｕｅ大腸菌株を形質転換した。単離した形質転換コロニーは、プロモーター領域中でハイブリダイズするプライマーを用いたコロニーＰＣＲを使用して分析し、挿入物を含んでいたコロニーを選択した。配列決定は他の実施例中で報告したように行なった。ｐＰＳ２Ｈ１−１２及びｐＰＳ２Ｈ１−１３と命名した組換えプラスミドに関して得た配列は同一であり、配列番号６で報告するｓｃＦｖ−２Ｈ１のそれを含む。
【００７２】
Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）組換え菌株は、エレクトロポレーション及び野生型菌株ＭＰ３６ｈｉｓ３（Ｙｏｎｇ  Ｖ．ら、１９９２．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌｉｃ．９：５５〜６１）及び選択用のヒスチジンが欠損した最少培地を使用して、（ＰｖｕＩＩ［Ｐｒｏｍｅｇａ］で事前に消化した）これらの２つのプラスミドを用いて得た。プラスミドとＰ．パストリスのゲノム中の特定部位の異なる組換え機構によって、本発明者らは２つの異なる表現型の分泌細胞：（ａ）ＡＯＸ．１遺伝子が組換え中に影響を受けず、メタノール中で増殖することができ、野生型菌株と同様の挙動を示す菌株（Ｍｕｔ＋）、及び（ｂ）ＡＯＸ．１遺伝子が発現カセットによって置換され、メタノールの存在下で遅い増殖を示した菌株（Ｍｕｔｓ）を単離した。
【００７３】
（ｂ）発現試験
抗体断片に関する発現試験を、選択培地プレート中で増殖させた原栄養体Ｈｉｓ＋コロニーから始めて行なった。コロニーは、２８℃及び１５０ｒｐｍ下で、５０ｍＬチューブ中の１０ｍｌの富栄養緩衝培地において増殖させた。培養物が６００ｎｍで２Ｏ．Ｄを得たとき、それらを２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけた。細胞ペレットは、唯一の炭素源としてグリセロールの代わりにメタノールを含む１０ｍＬの富栄養培地中に再懸濁させた。その瞬間から、及び次の９６時間、対象とするタンパク質の誘導を、培養物に１％まで純メタノールを１日１回加えることによって行なった。空ベクターで形質転換したＭＰ３６ｈｉｓ３菌株は、陰性対照として使用した。
【００７４】
誘導終了時に、細胞を遠心分離にかけ、代謝培地を回収し、最終浄化のために再度遠心分離にかけ、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを利用してｓｃＦｖ２Ｈ１を検出した。このアッセイは、いずれの場合も予想上のみかけの分子量（２９ｋＤａ）を有するタンパク質の存在を明らかにし、これらは後に一次抗体としてモノクローナル抗体（Ｍａｂ）９Ｅ１０、次にペルオキシダーゼと結合したウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ）を使用するウエスタンブロットによって評価した。２つの組換えタンパク質はＭａｂ９Ｅ１０によって同定した。
【００７５】
（ｃ）ｓｃＦｖ２Ｈ１によるＥＬＩＳＡにおけるヒトＶＥＧＦ−Ａの認識
大腸菌由来のｓｃＦｖ２Ｈ１に関する前に記載したアッセイと、固相、試薬、コーティング、インキュベーション、発色及び制御条件に関して類似のＥＬＩＳＡアッセイを使用した。ＰＢＳ−１％ミルクに希釈した誘導型組換え酵母菌株の代謝培地の培養物サンプルを加え、室温で２時間インキュベートした。陰性対照として、野生型菌株ＭＰ３６ｈｉｓ３の代謝培地、及び無関係なｓｃＦｖ抗ＨＢｓＡｇ断片を使用した。陽性対照として、細菌由来の精製ｓｃＦｖ２Ｈ１断片を使用した。陰性対照によって生じた吸光度値より少なくとも４倍高い吸光度値を、陽性と考えた。形質転換Ｐ．パストリス酵母細胞の誘導後に生成した、ｓｃＦｖ２Ｈ１−Ｐｐ１７と命名したｓｃＦｖ２Ｈ１断片を含む代謝培地のサンプルは、固相と結合したヒトＶＥＧＦ−Ａを認識するそれらの能力に関して陽性であった。
【００７６】
（実施例７）
ｓｃＦｖ２Ｈ１の可変領域（ＶＲ）を使用した細菌Ｆａｂ断片の獲得及びそのヒトＶＥＧＦの認識の特徴付け。
（ａ）ｐＦａｂＨｕｍ−１ベクターにおけるｓｃＦｖ２Ｈ１のＶＲのクローニング及び配列決定
図６は、大腸菌のペリプラズム及び培地におけるＦａｂ型抗体断片の生成に使用した、プラスミドｐＦａｂＨｕｍ−１のスキームである。そのベクターはＬａｃＺプロモーター、ＲＢＳ、シグナルペプチド（ＰＳ）の配列、軽鎖可変領域（ＶＲ）のクローニング用部位（ＳａｌＩ及びＡｖｒＩＩ）、ヒト免疫グロブリンＣλドメインをコードする配列、次に他のＲＢＳ及びＰＳの配列、重鎖ＶＲのクローニング用部位（ＡｐａＬＩ及びＢｓｔＥＩＩ）、次に延長してヒトＩｇＧ１ヒンジ領域の第１システインを含むヒト免疫グロブリンＣＨ１ドメインをコードする配列を有する。どちらもそのＣ末端でＩＭＡＣ精製用の６ヒスチジンドメイン及び分析目的のｃ−ｍｙｃペプチドと結合した状態でＶＲ−ＣＨ１タンパク質が発現され、それはベクターによって得られる。
【００７７】
２Ｈ１−Ｆと命名したｓｃＦｖを有するファージミドに対応するＤＮＡを、最初にＳａｌＩ及びＡｖｒＩＩで消化して、軽鎖ＶＲを得た。１．５％アガロースゲル中でそのサイズを調べた後、ｐＦａｂＨｕｍ−１においてクローニングを行った。制限酵素を使用してクローニングを確認した後に、（ｐＦａｂ−Ｈｕｍ−１ＲＶＬと命名した）プラスミドを複製し、精製し、ＡｐａＬＩ及びＢｓｔＥＩＩで新たな消化を施した。ＢｓｔＥＩＩの場合、消化は部分的であった。１．５％アガロース中でバンドのサイズを確認した後、ｐＦａｂＨｕｍ−１ＲＶＬにおいてクローニングを行った。クローニングは、制限酵素及びｐＦａｂ２Ｈ１−３２と命名したプラスミドを用いて確認した。このプラスミドを複製し、精製し、自動配列決定を施した。成熟タンパク質Ｆａｂ２Ｈ１−３２をコードするＤＮＡ配列を図７中に示す。図７Ａは軽鎖ＶＲとＣλの組合せの配列を示し（配列番号９）、且つ図７Ｂは重鎖ＶＲとＣＨ１の組合せの配列を示す（配列番号１０）。ＣＤＲは下線で表し、Ｋａｂａｔらの分類に従い注釈付けする。
【００７８】
（ｂ）大腸菌におけるＦａｂの発現
プラスミドｐＦａｂ２Ｈ１−３２を使用して、大腸菌ＢＬ２１コンピテント細胞を形質転換した。形質転換細胞は固体選択培地に平板培養し、１６時間３７℃で増殖させた。代表的なコロニーを液体培地中で増殖させ、１のＯＤ５３０ｎｍを得た後、培養物は１ｍＭのＩＰＴＧを用いて１２時間誘導した。細胞を遠心分離にかけ、浸透圧ショック及び簡単な超音波処理によってペリプラズム含有物を単離し、このペリプラズム分画と培養上清の両方を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。このアッセイは予想サイズ（約５０ｋＤａ）のタンパク質の存在を明らかにし、これらは後に一次抗体としてｃ−ｍｙｃペプチドに対するモノクローナル抗体（９Ｅ１０）、次にペルオキシダーゼと結合したウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ）を使用するウエスタンブロットによって評価した。ウエスタンブロットは、培養上清中とペリプラズムサンプル中の両方で、９Ｅ１０抗体が予想サイズのタンパク質を検出したことを示した。
【００７９】
（ｃ）ＩＭＡＣを使用したＦａｂ２Ｈ１−３２の精製及びＥＬＩＳＡによるそのＶＥＧＦの認識の特徴付け
ｐＦａｂ２Ｈ１−３２を用いた形質転換によって生成した組換え細菌を遠心分離にかけ、上清をカップリングバッファーで７２時間透析した。Ｆａｂを含む調製物はアガロース−ＮＴＡ（ＱＩＡＧＥＮ）に直接施した。洗浄して大腸菌汚染物質を排除した後、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して推測して８５％に近い純度で、溶出分画中にＦａｂ２Ｈ１−３２を得た。
【００８０】
ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、ヒトＶＥＧＦを認識するその能力に関して精製Ｆａｂ断片を評価した。Ｍａｘｉｓｏｒｐ（Ｎｕｎｃ）９６ウエルプレートを、１μｇ／ｍＬにおいてヒトＶＥＧＦ−Ａのアイソフォーム１２１及び１６５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）又はマウスＶＥＧＦ−Ａのアイソフォーム１２０（Ｒ＆Ｄ）でコーティングした。精製Ｆａｂ断片を希釈し、２２℃で１時間インキュベートした。洗浄後、抗ｃ−ｍｙｃペプチドモノクローナル抗体（１μｇ／ｍＬ）、次にペルオキシダーゼと結合したウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ）を加えた。抗ＨＢｓＡｇｓｃＦｖは陰性対照として使用し、細菌の精製ｓｃＦｖ２Ｈ１は陽性対照として使用した。表７中に示すように、大腸菌において生成したＦａｂは、ＥＬＩＳＡにおいてヒトＶＥＧＦを特異的に認識する。この表は、陰性対照により得られた値を参照として、３つの同一ウエルから得られた平均光学濃度（４９２ｎｍ）値の観点で、異なるＶＥＧＦ−Ａアイソフォームに関するＦａｂＦａｂ２Ｈ１−３２断片の認識の能力を示す。
表７．Ｆａｂ断片２Ｈ１−３２による、ヒトＶＥＧＦ−Ａ及びマウスＶＥＧＦ−Ａの異なるアイソフォームの認識。
【表９】
2010508033.tif 000010
【００８１】
（実施例８）
ヒトＩｇＧ１Ｆｃと遺伝子工学によって融合させた２つのｓｃＦｖ単位を含む二量体分子の生成及び認識の特徴付け。
（ａ）抗ＶＥＧＦｓｃＦｖ２−Ｆｃ分子を生成するトランスフェクトーマ（形質転換細胞）
ｓｃＦｖ２Ｈ１によって定義される２つの同一結合部位を有する「完全抗体」型分子を得るために、ｓｃＦｖ２Ｈ１の遺伝子配列を含むプラスミドｐＡＣＲ．１−ｓｃＦｖ２Ｈ１、及び表８中に示すプライマー番号５（配列番号１０）及び番号６（配列番号１１）を鋳型として使用してＰＣＲを行い、抗体断片をコードするＤＮＡ配列を改変し、それを以下のクローニングに適合させた。この手順は、製造者の説明書の下でＰａｎｏＴａｑ（Ｐａｎｏｒａｍａ  Ｉｎｃ．）で行った。
表８．ｐＶＳＪＧ−ＨｕｃＦｃにおけるそのクローニング用にｐＡＣＲ．１−ｓｃＦｖ２Ｈ１を改変するために使用したＰＣＲプライマー。
【表１０】
2010508033.tif 000011
【００８２】
増幅したＤＮＡはベクターｐＶＳＪＧ−ＨｕｃＦｃにおいてクローニングした。このベクターを図８Ａ中に示し、それはポリペプチド鎖の哺乳動物細胞における発現用に設計し、マウスモノクローナル抗体の重鎖のリーダー配列（シグナルペプチド）、次にｓｃＦｖ断片、１０アミノ酸のスペーサー、及びヒトＩｇＧ１免疫グロブリンのヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域のコンセンサス配列をこの順に含む。リーダー配列はペプチド鎖を小胞体に誘導し、そこでそれはヒンジ領域間のジスルフィド結合の形成、及び２つの同一ポリペプチドのＣＨ２領域とＣＨ３領域の相補的結合によって二量体化する。そのＮ末端が２つの同一ｓｃＦｖを分けているヒト免疫グロブリンＦｃの二量体化ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、この二価構築体を「完全抗体」型分子に変換する（図８Ｂ）。このベクターの主な特徴の中で、本発明者らはサイトメガロウイルスプロモーターを発見する。
【００８３】
増幅産物に対応するバンドはＡｆｌＩＩ及びＸｂａＩで消化し、事前に同じ酵素で消化したｐＶＳＪＧ−ＨｕｃＦｃにクローニングした。形質転換から生じた細菌コロニーの中で、２つを配列決定用に選択した。自動配列決定は、２つのコロニーはｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１−４．１及びｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１−８．２と命名したほぼ同一の組換えプラスミドを生成したことを示した。この２つのプラスミド間の配列の唯一の違いは、前者はコードされるアミノ酸に関して異なり且つ「サイレント」である１つの重鎖ＶＲ塩基、及びｓｃＦｖ２Ｈ１のＶＲ配列（配列番号７及び配列番号８）に関して全てが異なる３つの軽鎖ＶＲ塩基を有することである。成熟ｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１−４．１及びｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１−８．２タンパク質をコードする配列は、それぞれ図９（配列番号１３）及び図１０（配列番号１４）中に示す。図中、ＣＤＲ配列に下線を引き、Ｋａｂａｔらの分類に従い注釈付けする。
【００８４】
２つのプラスミドはＰｕｒｅ  Ｙｉｅｌｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉｐｒｅｐ（Ｐｒｏｍｅｇａ）システムを使用してエンドトキシンフリー状態で精製し、これを利用してＰ３／ｘ６３．Ａｇ８．６５３ミエローマ細胞を、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用してトランスフェクトした。Ｇ４１８に耐性があった細胞から開発したトランスフェクトーマの上清を、ＥＬＩＳＡによって評価した。Ｍａｘｉｓｏｒｐ（Ｎｕｎｃ）９６ウエルイムノプレートは、ヒトＶＥＧＦのアイソフォーム１２１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）でコーティングした。トランスフェクトーマコロニーの上清はＰＢＳ−ミルク２％に希釈し、プレートに加え、ｓｃＦｖ２−Ｆｃ型の抗ＶＥＧＦ分子の存在は、ペルオキシダーゼと結合した抗ヒトＦｃ抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いて検出した。ＥＬＩＳＡにより検出して多量の抗ＶＥＧＦｓｃＦｖ２−Ｆｃ分子を分泌したトランスフェクトーマ細胞コロニーは、Ｇ４１８の存在下で限界希釈法によって繰り返しクローニングし、ＥＬＩＳＡにおいて抗ヒトＶＥＧＦシグナルを生成する選択したクローンの能力を絶えず評価した。２回の独立且つ連続したクローニングの後、ｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１−４．１及びｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１−８．２と命名したｓｃＦｖ２−Ｆｃを生成した、２つの安定したクローンを得た。
【００８５】
（ｂ）ｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１−４．１及びｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１−８．２の精製、及びＥＬＩＳＡにおいてヒトＶＥＧＦを認識するそれらの能力の評価
ｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１−４．１及びｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１−８．２分子を生成するトランスフェクトーマクローンを、１０％ウシ胎児血清の存在下において１６２ｃｍ２フラスコ中で培養し、高い細胞密度を得た後に上清を回収した。上清は０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．０に１：１に希釈し、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ４（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して、親和性クロマトグラフィーによって個別に精製した。分子ｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１−４．１及びｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１−８．２はグリシン０．２Ｍ、ｐＨ４．０バッファー中に溶出させ、１Ｍのトリス、ｐＨ１０．０を用いて迅速な中和を施した。ＰＢＳで透析した後、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度及び１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって推定した純度を使用して濃度を計算した。調製物は８５％を超えて純粋であったと決定した。精製分子は前に記載したようにＥＬＩＳＡに施し、非精製上清と比較すると、両方の精製調製物がヒトＶＥＧＦ−Ａを認識することができたことが示された。
【００８６】
（実施例９）
ｓｃＦｖ２Ｈ１によって認識されるヒトＶＥＧＦエピトープの同定
（ａ）線状ファージにおいて提示されるコンビナトリアルペプチドライブラリーからｓｃＦｖ２Ｈ１によって認識されるペプチドの選択
ｓｃＦｖ２Ｈ１によって認識されるヒトＶＥＧＦ−Ａエピトープを同定するために、本発明者らは線状ファージにおいて提示されるコンビナトリアル１２アミノ酸直鎖ペプチドライブラリー（Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ．Ｓａｎｔｉａｇｏ  Ｖｉｓｐｏ，Ｎ．（Ｅｄ．）Ｅｌｆｏｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉａｅ、２００４、Ｌａ  Ｈａｖａｎａ）にｓｃＦｖ２Ｈ１を向ける戦略に従った。ＰＢＳ−スキムミルク４％に希釈したライブラリーを構成するファージ混合物を、イムノチューブ（Ｎｕｎｃ、Ｍａｘｉｓｏｒｐ）に加え、そこに精製ｓｃＦｖ２Ｈ１を固定した。チューブをｓｃＦｖでコーティングし、固相をＰＢＳ−スキムミルク４％でさらにブロッキングした。イムノチューブ中でｓｃＦｖと結合しなかったファージは、ＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ溶液の２０回の洗浄、次にＰＢＳでの２回の洗浄によって排除した。結合したファージを１００ｍｍｏｌ／Ｌのトリエチルアミン溶液を用いて溶出させ、これを０．５ｍｏｌ／Ｌのトリス（ｐＨ７．５）ですぐに中和した。溶出したファージをＴＧ１細菌中で増幅し、新たな選択サイクル用の出発物質として使用した。この手順は同様の条件下で３回繰り返した。第２及び第３選択サイクルから溶出したファージを感染させたＴＧ１細胞のランダムなコロニーを使用して、９６ウエルスケールでファージを生成した。
【００８７】
ｓｃＦｖ２Ｈ１と結合するこれらのペプチドディスプレイファージクローンの能力を、ファージＥＬＩＳＡを使用して評価した。Ｍａｘｉｓｏｒｐ（Ｎｕｎｃ）９６ウエルプレートはｓｃＦｖ２Ｈ１でコーティングし、次いでブロッキングした。１つのウエルによって生成したファージをＰＢＳ−スキムミルク４％に希釈し、ｓｃＦｖ２Ｈ１でコーティングしたプレートの特定のウエルにおいて２２℃で１時間インキュベートし、次にＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎで数回洗浄した。結合したファージは、ペルオキシダーゼと結合した抗Ｍ１３抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して検出した。ＥＬＩＳＡにおいてアッセイした４０個のファージクローンの中で、３５個が陽性の結果を示し、以下の方法の中で使用した。
【００８８】
（ｂ）ｓｃＦｖ２Ｈ１結合ＥＬＩＳＡ競合アッセイ
ペプチドディスプレイファージの選択した３５個のクローンが、ｓｃＦｖ２Ｈ１の結合部位を特異的に認識するかどうか試験するために、固相にコーティングしたｓｃＦｖ２Ｈ１との結合に関してファージ上のペプチドとＶＥＧＦ−Ａが競合するＥＬＩＳＡを行った。Ｍａｘｉｓｏｒｐ（Ｎｕｎｃ）９６ウエルプレートは１ウエル当たり１０μｇのｓｃＦｖ２Ｈ１でコーティングし、次いでブロッキングした。ウエルの半分はＰＢＳ−４％スキムミルクに溶かした１０μｇ／ｍＬのＶＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）と共にインキュベートし、ＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎによる数回の洗浄後、１０μｇ／ｍＬのＶＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を含むＰＢＳ−４％スキムミルクに希釈したファージ調製物を加え、これらは既に記載した条件と同様の条件でインキュベートした。同時に、９６ウェルプレートの残りのウェルをＰＢＳ−スキムミルクと共にインキュベートし、ＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎによる数回の洗浄後、ＰＢＳ−４％スキムミルクに希釈したファージ調製物を加えた。結合したファージは、ペルオキシダーゼと結合した抗Ｍ１３抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して検出した。試験クローンのサンプルに関する図１１中に示すように、ＶＥＧＦの存在はファージにおいて提示されるペプチドと固定ｓｃＦｖ２Ｈ１の結合に完全に干渉する。
【００８９】
（ｃ）ペプチド配列決定
前述の手順で特徴付けられた３５個のペプチドファージクローンの２０のサンプルを使用して、自動配列決定用にファージミドＤＮＡを抽出した。２０の試験クローンに関して得られた配列は同一であり、これらはＣＣＲＴＬＭＬＬＱＹＨＲ（配列番号１５）であった。
【００９０】
（ｄ）ｓｃＦｖ２Ｈ１によって認識されるエピトープの予測試験
前に得た配列は、プログラムＦＩＮＤＥＰＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｏｍｐ．ｃｉｇｂ．ｅｄｕ．ｃｕ／ｆｉｎｄｅｐｉ）及び３Ｄ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ  Ａ．Ｊ．２００５．Ｃｏｍｐｕｔ  Ｃｈｅｍ  ２６：８７９〜８８７）を使用して分析し、同様の結果であった。前の方法は、タンパク質−タンパク質相互作用に関与する表面タンパク質群を予想する計算法である。インプットデータとして、これらの方法は、相互作用結合中のエレメントの１つ（鋳型タンパク質；本発明者らの場合、ＰＤＢタンパク質データバンクからのヒトＶＥＧＦ−Ａ、コード１ＢＪ１）、及び相互作用中の第２のエレメントのアミノ酸配列（結合タンパク質；本発明者らの場合、ペプチドＣＣＲＴＬＭＬＬＱＹＨＲ；配列番号１５）の３Ｄ構造を使用する。一例として、ＦＩＮＤＥＰＩプログラムは、幾つかの立体化学的規則を適用して、鋳型タンパク質中のそれぞれの表面群の考えられるミモトープ（Ｍｉｍｏｔｏｐｅ）のデータベースを生成する。このデータベースは、その結合により実験的に選択したペプチドとおそらく類似するミモトープを検出するための、プロファイルアラインメント法を使用して検索する。グルーピングアルゴリズムを適用した後、このプログラムは、２つのタンパク質の相間相互作用において局在する可能性がある、鋳型タンパク質の表面における一群の露出残基を報告する。方法の確実性は、その結晶構造が知られているタンパク質−タンパク質複合体を用いて評価されており、且つそれに関する実験データは、これらの分子によって結合したペプチドの配列に利用可能である。
【００９１】
いずれの使用したプログラムも、（ＰＤＢタンパク質データバンク、コード１ＢＪ１に従い注釈付けした）残基Ｃ１０２、Ｃ５７、Ｒ５６、Ｔ３１及びＬ３２を主に含むヒトＶＥＧＦ−Ａ分子における類似した相互作用ゾーンを定義する。本発明において、これらの残基はｓｃＦｖ２Ｈ１によって認識されるエピトープの主な指標と考えられる。予想に従うと、他の残基も前述の主な指標である残基と関係がある可能性があり、一方低いスコアを有するのは、これらのＧ５９、Ｃ６８、Ｖ６９、Ｐ７０及びＨ９９である。残基Ｃ１０２、Ｃ５７、Ｒ５６、Ｔ３１及びＬ３２によって主に定義されるエピトープは、ヒトＶＥＧＦを中和する他の抗体及び抗体断片に関して報告されたエピトープと一致しない（Ｍｕｌｌｅｒ  ＡＹら、１９９７．ＰＮＡＳ  ９４：７１９２〜７１９７；Ｍｕｌｌｅｒ  ＡＹ．ら、１９９８．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ６：１１５３〜１１６７；Ｓｃｈａｅｐｐｉ  Ｊ．−Ｍ．ら、１９９９．Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １２５：３３６〜３４２；Ｆｕｈ  Ｇ．ら、２００６．Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１：６６２５〜６６３１；ＷＯ２００５０１２３５９）。二量体をモノマーに分離するジスルフィド結合の還元で抗原を処理したときにヒトＶＥＧＦ−Ａに関するｓｃＦｖ２Ｈ１の認識の消失を示す、実施例４中に示す実験の結果を本発明者らが考慮する場合、残基Ｃ１０２、Ｃ５７、Ｒ５６、Ｔ３１及びＬ３２によって主に定義されるエピトープは、ＶＥＧＦ−Ａの二量体構造の保存と関係がある可能性がある。
【００９２】
図１２は、他の抗体に関して記載された残基と比較した、ｓｃＦｖ２Ｈ１によりＶＥＧＦ−Ａ分子において認識されるエピトープを主に定義する残基のマッピングを示す。αヘリックス、β鎖及びループで、その二量体立体配座のヒトＶＥＧＦ−Ａの三次構造を表すカートン（ｃａｒｔｏｏｎ）タイプの図形を使用する。二量体中の２つの同一の分子は、ライトグレー及び黒色として存在する。簡略化のために、ｓｃＦｖ２Ｈ１によって認識されるエピトープの主な指標として定義した残基の位置は、ライトグレー鎖においてのみ示し、黒色のファンデルワールス表示（ＶＤＷ）で存在する。他の抗体によって認識される残基は、図１２Ａ〜１２Ｄ中でライトグレーのＶＤＷとして示す。図１２Ａ及び１２Ｂは、ｓｃＦｖ２Ｈ１に関する主な指標残基によって定義されるエピトープは、ＦａｂＧ６及びＢ２０−４によって定義されるエピトープと隣接するが重複はしないことを示す（Ｆｕｈ  Ｇ．ら、２００６．Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１：６６２５〜６６３１）。図１２Ｃは、ｓｃＦｖ２Ｈ１に関する主な指標残基によって定義されるエピトープは非常に異なり、アバスチンとして商業上知られているヒト化抗体ベバシズマブに関して定義されるエピトープと構造上離れていることを示す。図１２Ｄは、ｓｃＦｖ２Ｈ１に関する主な指標残基によって定義されるエピトープは、抗体３．２Ｅ３．１．１によって定義されるエピトープと構造上重複しないことを示す（Ｍｕｌｌｅｒ  ＡＹら、１９９７．ＰＮＡＳ  ９４：７１９２〜７１９７）。
【００９３】
図１２Ｅは、ｓｃＦｖ２Ｈ１に関する主な指標残基Ｃ１０２、Ｃ５７、Ｒ５６、Ｔ３１及びＬ３２（黒色のＶＤＷ中）によって定義されるエピトープに関して、ヒトとマウスのＶＥＧＦ−Ａの配列を比較するときの、異なる（ライトグレーのＶＤＷ中の）近隣アミノ酸の位置を示す。所与のエピトープの隣接残基はその三次構造突出、したがって抗体によるその認識のために重要であること、及び単一アミノ酸の変化は、他種のそれに関する所与の種の分子に対する抗体の特異性を決定するのに十分であることは、当技術分野で知られている（Ｆｕｈ  Ｇ．ら、２００６．Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１：６６２５〜６６３１）。これらの結果は、何故ｓｃＦｖ２Ｈ１断片がマウスのＶＥＧＦ−Ａを認識しないかを説明することができる。
【００９４】
全てのこれらのエレメントは、ｓｃＦｖ２Ｈ１断片を構成するＶＲによって定義される抗原結合部位は、アミノ酸配列に関してだけでなく、抗原において認識されるエピトープ、及び結果として、天然ヒトＶＥＧＦの生物学的機能に干渉するその考えられる機構の点でも、文献中に報告されたヒトＶＥＧＦを中和する他の抗体及び抗体断片の抗原結合部位と異なることを示す。
【００９５】
（実施例１０）
ヒトＶＥＧＦで刺激したヒト臍帯内皮細胞のモデルにおける、ヒトＶＥＧＦを認識する異なる分子のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗増殖効果の評価。
分子ｓｃＦｖ２Ｈ１、Ｆａｂ２Ｈ１−３２、ｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１−４．１及びｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１−８．２のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗増殖効果を、ヒトＶＥＧＦで刺激したヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨｕＶＥＣ）のモデルにおいて決定した。簡単に言うと、１％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地において、１％ゼラチン（Ｓｉｇｍａ）で事前にコーティングした９６ウエル培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ）の１ウエル当たり３，０００個のＨｕＶＥＣ細胞（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ  ＧｍｂＨ）を平板培養し、２４時間の間５％ＣＯ２中で３７℃において増殖させた。細胞は１０ｎｇ／ｍＬのヒトＶＥＧＦ−Ａ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を補充した新たな培地で刺激し、異なる濃度の分子ｓｃＦｖ２Ｈ１、Ｆａｂ２Ｈ１−３２、ｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１−４．１及びｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１−８．２と共にインキュベートした。
【００９６】
図１３は、１００％（干渉無しの増殖対照、ＶＥＧＦ線）として任意に定義し、精製分子ｓｃＦｖ２Ｈ１、Ｆａｂ２Ｈ１−３２、ｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１４．１及びｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１８．２の混合物を３つの異なる濃度（縞模様線：２μｇ／ｍＬ；黒線：１μｇ／ｍＬ；及び白線：０．５μｇ／ｍＬ）で、１０ｎｇ／ｍＬのヒトＶＥＧＦ−Ａ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）と共に細胞に加えたときの、１０ｎｇ／ｍＬのヒトＶＥＧＦ−Ａの存在下で増殖させたＨｕＶＥＣ細胞の増殖を示す。阻害対照として、０．５μｇ／ｍＬの可溶性受容体ＫＤＲ−Ｆｃ（Ｓｉｇｍａ）の混合物を使用した。陰性対照として、ｓｃＦｖ抗ＨＢｓＡｇを混合物中に利用した。７２時間のインキュベーション後、２０％メタノールに溶かした０．５％クリスタルバイオレットで細胞を染色した。プレートを水で洗浄し、空気乾燥させた。染色液はエタノールと０．１Ｍクエン酸ナトリウムの１：１溶液で溶出させ、５６２ｎｍでプレートリーダーにおいて吸光度を読み取った。基底増殖状態の吸光度の値を全てのプレート値に対して引き、阻害対照と最大増殖対照の割合としてデータを表した。図１３中に示したように、分子ｓｃＦｖ２Ｈ１、Ｆａｂ２Ｈ１−３２、ｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１４．１及びｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１８．２は、４５％と５８％の間の値まで用量依存的にＨｕＶＥＣ細胞の増殖を阻害する。
【００９７】
（実施例１１）
マウス中の皮下マトリゲルペレットモデルにおける、ヒトＶＥＧＦを認識する異なる分子のｉｎ  ｖｉｖｏでの抗血管新生効果の評価。
分子ｓｃＦｖ２Ｈ１、Ｆａｂ２Ｈ１−３２、ｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１−４．１及びｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１−８．２のｉｎ  ｖｉｖｏでの抗血管新生効果を、Ｐａｓｓａｎｉｔｉら（Ｐａｓｓａｎｉｔｉ  Ａら、１９９２．Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．６７：５１９〜２８）によって記載された実験モデルにおいて試験した。このモデルでは、血管新生促進因子の存在下で細胞外マトリクス（マトリゲル、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）のタンパク質の抽出物を、Ｃ５７ＢＩ／６マウスに皮下接種することによって血管新生を誘導する。動物は１０のグループに分け、１００ｎｇのヒトＶＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を含む５００μＬのマトリゲル、及び無関係な抗体（ＣＢ−Ｈｅｐ．１、抗ＨＢｓＡｇ、Ｈｅｂｅｒ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｈａｖａｎａ）を含めた異なる濃度のアッセイ用分子を腹部領域に皮下注射した。６日後に動物を屠殺し、マトリゲルペレットを抽出し、製造者の説明書に従いＤｒａｂｋｉｎの試薬キット（Ｓｉｇｍａ）を使用するＤｒａｂｋｉｎ法によって、それぞれのヘモグロビン含有量を決定した。分子ｓｃＦｖ２Ｈ１、Ｆａｂ２Ｈ１−３２、ｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１−４．１及びｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１−８．２は、マトリゲルペレットにおいてヒトＶＥＧＦによって誘導される血管形成を有意に阻害し（ｐ＜０．００１）、これはヘモグロビン含有量の低下と相関関係がある。
【００９８】
（実施例１２）
Ａ４３１ヒト腫瘍細胞を異種移植したヌードマウスの実験モデルにおける、ヒトＶＥＧＦを認識する異なる分子のｉｎ  ｖｉｖｏでの抗血管新生効果の評価。
腫瘍及び幾つかの腫瘍間質細胞によって誘導される血管新生は、それらの増殖及び播種に必要不可欠であり、この血管新生は主にこれらの細胞エレメントによって生成されるＶＥＧＦによるものなので、抗血管新生物質のアッセイの有効なモデルは、動物における腫瘍増殖の阻害のモデルである。ｓｃＦｖ２Ｈ１、及びそのＶＲ由来の全ての他の分子はマウスＶＥＧＦではなくヒトＶＥＧＦを同定するので、ヒト腫瘍細胞を同系無胸腺マウス（ヌードマウス；ｎｕ／ｎｕ）に接種した、マウスにおける腫瘍増殖モデルを確立した。実験中、本発明者らは、８〜１０週齢であるＢＡＬＢ／ｃ系統（ＣＥＮＰＡＬＡＢ、Ｈａｖａｎａ）の５匹のｎｕ／ｎｕ無胸腺マウスの９群を使用した。治療群は、２つの用量レベル：ＰＢＳｐＨ７．２中でマウス１匹当たり２５ｍｇ／ｋｇ及び２．５ｍｇ／ｋｇを考慮して、試験用の４分子（ｓｃＦｖ２Ｈ１、Ｆａｂ２Ｈ１−３２、ｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１−４．１及びｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１−８．２）のそれぞれに関して編成した。第９群（陰性対照）は賦形剤（ＰＢＳｐＨ７．２）で治療した。右背面領域に５×１０６個のヒトＡ４３１腫瘍細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ１５５５）をマウスに皮下注射した。腫瘍が２００ｍｍ３の体積に達したとき、マウスを５匹の９群に無作為に分け、それぞれの実験群に関して示したように治療を開始した。投与は腹腔内に、３週間の間２日毎に２００μＬの体積で行った。対照には、最高用量で無関係なマウスモノクローナル抗体ＣＢ−Ｈｅｐ．１を接種した。腫瘍増殖の追跡は、デジタルカリパスを使用して、最高（長さ）、及び最小（幅）の腫瘍径の測定によって行った。腫瘍体積は、腫瘍体積（ｍｍ３）＝０．５２×長さ（ｍｍ）×幅２（ｍｍ）として計算した。観察期間中の腫瘍体積は、一元配置ＡＮＯＶＡ統計量及びボンフェロニの事後検定を使用して比較した。確定治療期間後、動物を屠殺し、腫瘍は外科手術によって除去し、ヘマトキシリン及びエオシンを使用して組織学的に分析した。
【００９９】
図１４中に示したように、ｓｃＦｖ２Ｈ１、Ｆａｂ２Ｈ１−３２、ｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１−４．１及びｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１−８．２を接種した全ての動物が、陰性対照に対する統計上有意な腫瘍体積の減少、及びマーカー用量依存性を示した。４個の分子の中で、ｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１４．１とｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１８．２から最良の結果が得られたが、おそらくこれは分子の大きなサイズと関係があり、それらの生物学的利用能を増大させるが、しかしながら単位質量当たりの結合部位の数の点で、ｓｃＦｖ２Ｈ１はこれらの分子に優るわずかな利点を有する。ＦａｂとｓｃＦｖ２Ｈ１断片に関して見られた違いは統計上有意ではなかったが、しかしながら分子質量はＦａｂがほぼ二倍である。これは、可溶性分子を中和するはずである抗体にとって、腫瘍細胞に直接影響を与えるよりも、（おそらく小さなサイズがよい）腫瘍浸潤は生物学的利用能ほど重要ではなく、ＦｃＲｎによって媒介される再循環と適合性があるＦｃの存在によりｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１４．１及びｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１８．２のような「ＩｇＧ型」分子のみを好むことに起因する可能性がある（Ｖａｃｃａｒｏ  Ｃ．ら、２００５．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２３：１２８３〜１２８８）。後者の性質に関しては、両者ともＦｃを欠くので、ｓｃＦｖ断片とＦａｂ断片はそれほど異ならない。組織学的分析は、治療した腫瘍には、血管密度の有意な低下、血管の直径の減少、腫瘍細胞アポトーシスの増大、及び有糸分裂数の減少があったことを示した。
【０１００】
（実施例１３）
Ａ４３１細胞を接種したヌードマウスを使用する腫瘍領域中に選択的に滞留する１２５Ｉ放射標識ｓｃＦｖ２Ｈ１断片の能力。
Ａ４３１細胞が増殖していた領域中に滞留するｓｃＦｖ２Ｈ１断片の能力を決定するために、この断片、及び対照断片（マウス抗Ｂ型肝炎表面抗原ｓｃＦｖ；ｓｃＦｖ−Ｈｅｐ．１）を、それぞれ１．３ＭＢｑ／５μｇ及び１．２８ＭＢｑ／５μｇの最終比放射能のためのヨードゲン手順（Ｆｒａｋｅｒ  ＰＪ、Ｓｐｅｃｋ  ＪＣ  Ｊｒ．１９７８．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ  ８０：８４９〜８５７）を使用して１２５Ｉ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＵＫ）で標識した。
【０１０１】
放射標識産物を薄層クロマトグラフィーで分析して、タンパク質の取り込みを検出し、それぞれ９３％と９５％の放射能の値を報告した。それらの対応する抗原（ヒトＶＥＧＦ及びＨＢｓＡｇ）を検出する放射標識産物の能力を、ポリスチレン製イムノチューブをヒト組換えＶＥＧＦのアイソフォーム１２１（５μｇ／ｍＬ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、又は組換えＨＢｓＡｇ（５μｇ／ｍＬ；Ｈｅｂｅｒ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｈａｖａｎａ）でコーティングしたシステムで試験し、次いでブロッキングし、対応する特異性の放射標識断片のサンプルと接触させて置き、理論上固相によって捕捉することが可能である量に調節した。インキュベーション及び洗浄の後、本発明者らは固相がそれぞれｓｃＦｖ２Ｈ１とｓｃＦｖ−Ｈｅｐ．１に関して８４％と８２％の放射能で結合することができたことを決定し、放射標識手順は重要なことに断片の生物活性を変えなかったことを示した。
【０１０２】
生体内分布を試験するために、本発明者らは２０匹のｎｕ／ｎｕマウスを使用した。右背面領域に５×１０６個のＡ４３１培養系のヒト腫瘍細胞を動物に皮下接種した。腫瘍が約３００ｍｍ３の体積に達したとき、動物を５匹の動物の４群に無作為に分け、治療を開始した。マウスは放射標識産物を尾静脈付近に注射し（１０匹にはｓｃＦｖ２Ｈ１、及び１０匹にはｓｃＦｖＨｅｐ．１）、２４時間及び４８時間後にそれぞれの産物に関して５匹の群を屠殺した。腫瘍、脾臓、肝臓、腎臓、腸、筋肉、骨髄及び血液サンプルを外科手術によって除去し、又はサンプリングした。放射能の蓄積は、組織１グラム当たりの注射用量の割合として表した。較正は標準サンプルの注射用量を使用して行った。放射能はシンチレーションγ線カウンターを使用して測定した。
【０１０３】
図１５は、注射全放射能に対する、異なる時間で試験組織１個当たりから回収した放射能の割合を示す。腫瘍:血液の放射能の比の具体例に関する表９中に示す結果と一緒にすると、この実験は、注射後２４〜４８時間で、非特異的ｓｃＦｖＨｅｐ．１と異なり、ｓｃＦｖ２Ｈ１断片は腫瘍組織中に優先的に局在することを示した。
表９．ヒトＶＥＧＦを発現するヒト腫瘍Ａ４３１細胞を移植したヌードマウスに関する腫瘍:血液の放射能の比。
【表１１】
2010508033.tif 000012
【０１０４】
これらの結果は、ｓｃＦｖ２Ｈ１断片は、Ａ４３１腫瘍中と同様に、高い局所濃度のヒトＶＥＧＦが存在する解剖学的領域に特異的に局在する可能性があるが、しかしながら放射性同位体、又は最終的には毒素又は薬剤などの、異なる治療薬のこの領域への特異的送達に有用であることを示唆する。値は、動物への異なる１２５Ｉ放射標識分子の注射後２４時間及び４８時間に対応する。５匹のマウスから回収した組織から導いた平均値から始めて、それぞれの比を計算した。
【０１０５】
（実施例１４）
ｓｃＦｖ２Ｈ１断片及び二価分子ｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１−４．１を使用する非ヒト霊長類における実験的脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）の予防。
実験的脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）に関するモデルとして、本発明者らはＫｒｚｙｓｔｏｌｉｋら（Ｋｒｚｙｓｔｏｌｉｋ  Ｍ．Ｇ．ら、２００６．Ａｃｔａ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ、１２０：３３８〜３４６）によって報告されたモデルを利用した。６匹のカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ、ＣＥＮＰＡＬＡＢ、Ｈａｖａｎａ）を、Ｇｏｏｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ機構のガイダンスに従い維持し扱った。動物には塩酸ケタミン、マレイン酸アセプロマジン、及び硫酸アトロピンの筋肉内注射を用いた全手順で麻酔をかけた。塩酸プロパラカインを用いた局所麻酔も使用した。摘出及び安楽死前の麻酔は、ペントバルビタールナトリウムの静脈内注射によって行った。黄斑におけるＣＮＶ膜はアルゴンレーザー照射を使用して誘導し、５０μｍと１００μｍの間の施用点で水膨れ及びわずかな出血をもたらす手順を確実にした。写真撮影及び蛍光血管造影法を使用して、病変の拡大及び特徴を検出及び測定した。動物の眼は、異なる日数、断片の施用前後、及びプラセボ及びレーザー照射手順、並びに摘出及び動物屠殺で終わる実験終期において調べた。
【０１０６】
試験する分子ｓｃＦｖ２Ｈ１抗体断片又は免疫グロブリン型の二価分子ｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１−４．１によって、動物を３匹の２群に分けた。それぞれの動物の右眼には、硝子体内注射により５０μＬのＰＢＳに溶かした５００μｇのｓｃＦｖ２Ｈ１又はｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１−４．１を群によって与え、一方左眼には賦型剤のみを注射した。眼にはレーザー治療の前に２回注射した（第０日及び第１４日）。第２１日に、ＣＮＶを誘導するためにレーザー治療を全ての眼に与えた。特定製品又は賦型剤を用いて第２日に、それぞれの眼において注射を繰り返した。レーザー誘導後３週間（第４２日）で、動物に硝子体内注射を行い、今回は全てにｓｃＦｖ２Ｈ１断片又はｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１−４．１分子を群によって与え、第５６日に最後の同様の注射で終了した。
【０１０７】
治療の第１段階（第４２日より前）では、試験は、それぞれの対照の眼と比較して、ｓｃＦｖ２Ｈ１又はｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１−４．１を投与した眼のグレード４の病変の発症の減少を示し、これらはいずれも分子がＣＮＶの予防を手助けすることを示唆する。治療の第２段階では、全ての眼にｓｃＦｖ２Ｈ１又はｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１−４．１を与えたとき、本発明者らはグレード４の病変の減少を検出したが、これは断片及び二価分子は確立した病変にも有効であることを示唆する。
【０１０８】
（実施例１５）
トランスジェニックタバコ植物における、ヒトＩｇＧ１のＦｃと遺伝子工学によって融合させたｓｃＦｖ断片の２単位を含む二量体分子の発現。
実施例８に記載したＰＣＲ条件を使用して、ｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１−４．１をコードする遺伝子を増幅させ、適切な制限部位（ＮｃｏＩ及びＸｂａＩ）を加えることにより末端を改変して植物細胞ベクターにクローニングした。ＰＣＲ中で使用した基本合成オリゴヌクレオチドは、配列番号１３で報告された配列に関して設計した。増幅したＤＮＡ断片は約１．４ｋｂの主要バンドとして検出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ、ＧｍｂＨ）を使用して１％アガロースゲル（Ｓｉｇｍａ）上で精製した。ＤＮＡは前述の酵素を用いて消化し、サツマイモスポラミンに関するシグナル配列の前にｓｃＦｖ−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３構築体の型のベクターｐＨＥＳ７４（Ｌｏｐｅｚ  Ａ．ら、１９９６．Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｉａ  Ａｐｌｉｃａｄａ  １３：２６５〜２７０）にクローニングした。このベクターは、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、生成タンパク質の翻訳量の増強因子として作用するオメガタバコモザイクウイルスのリーダー領域、及びトランスジェニック植物における外来遺伝子の高発現も促進するノパリンシンターゼターミネーターを有する。プロモーター−ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ターミネーター遺伝子発現「カセット」をバイナリーベクターｐＤＥ１００１中に導入して、最終プラスミドｐＤＥｓｃＦｖ−Ｆｃ．７０を生成した。この実施例中で使用した構築体に関する詳細は、以前に報告された詳細（Ｒａｍｉｒｅｚ，Ｎ．ら、２００２．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．１１：６１〜６４）と同様である。
【０１０９】
最終プラスミドｐＤＥｓｃＦｖ−Ｆｃ．７０を使用して、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）によって媒介される遺伝子導入によってタバコ品種Ｐｅｔｉｔ  Ｈａｖａｎａ  ＳＲ１細胞を形質転換した。Ｆ０及びＦ１植物を以前に記載された従来の手順によって得て、活性ｓｃＦｖ−Ｆｃ分子の発現は、実施例８に記載したのと同様のＥＬＩＳＡアッセイを使用して検出した。
【０１１０】
生物活性ｓｃＦｖ−Ｆｃ分子は、他に記載されたように微粉を得るまで、液体窒素中で０．４ｇの形質転換したタバコ植物の葉、又は非形質転換対照を粉砕することによって抽出した完全可溶性植物タンパク質（ＴＳＰ）の型で調製する。粉末は反応チューブに移し、抽出バッファー（６１ｍＭのトリス−ＨＣｌｐＨ６．９；２％ＳＤＳ；１２．５％グリセロール）と１：２（ｗ／ｖ）で混合し、５分間氷中でインキュベートする。不溶性物質は１３，０００ｒｐｍで遠心分離にかけることによって除去し、可溶性分画は、アルカリホスファターゼと結合した抗ヒトＦｃ抗体（Ｓｉｇｍａ）を使用して、異なる希釈でＥＬＩＳＡにおいてアッセイし発現を検出した。本発明者らは、トランスジェニック植物由来のＴＳＰが、対照植物由来のＴＳＰによって同定されなかった、固相にコーティングされたヒトＶＥＧＦを認識することができる分子を含んでいたことを検出した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図８】
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【図１３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年6月23日(2008.6.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＶＥＧＦ−Ａの血管新生促進効果に干渉し、配列番号７及び配列番号８のヌクレオチド配列、又は相同配列によってコードされるヒト免疫グロブリン可変領域を含み、且つ抗原残基Ｃ１０２、Ｃ５７、Ｒ５６、Ｔ３１及びＬ３２によって定義されるヒトＶＥＧＦ−Ａにおけるエピトープを認識することを特徴とする組換え抗体。
【請求項２】
配列番号７及び配列番号８の配列、又は相同配列が単鎖Ｆｖ抗体断片（ｓｃＦｖ）をコードする配列内に含まれ、ヒト抗体由来の重鎖と軽鎖の可変領域がリンカーセグメントによって分離されていることを特徴とする、請求項１に記載の組換え抗体。
【請求項３】
ｓｃＦｖコード配列が配列番号６である、請求項２に記載の組換え抗体。
【請求項４】
配列番号７及び配列番号８の配列、又は相同配列がコンセンサスヒトＩｇＧ免疫グロブリンの定常ドメインを伴うＦａｂ型抗体断片をコードする配列内に含まれることを特徴とする、請求項１に記載の組換え抗体。
【請求項５】
Ｆａｂ型断片をコードする配列が配列番号９及び配列番号１０であることを特徴とする、請求項４に記載の組換え抗体。
【請求項６】
配列番号７及び配列番号８の配列、又は相同配列がヒト免疫グロブリンヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３定常ドメインとスペーサーによって連結したｓｃＦｖ断片によって構成されるポリペプチド鎖をコードする配列内に含まれ、そのタンパク質形が他の同一ポリペプチド鎖と共有結合して二量体分子を形成することを特徴とする、請求項１に記載の組換え抗体。
【請求項７】
ヒト免疫グロブリン定常ドメインがＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４型のドメインであることを特徴とする、請求項６に記載の組換え抗体。
【請求項８】
ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３定常ドメインとスペーサーによって連結したｓｃＦｖ断片によって構成されるポリペプチド鎖をコードする配列が、配列番号１３又は配列番号１４であることを特徴とする、請求項６及び７に記載の組換え抗体。
【請求項９】
抗腫瘍又は抗血管新生能力を有する放射性同位体、又は化学的若しくは生物学的作用物質をさらに含むことを特徴とする、請求項１から８までに記載の組換え抗体。
【請求項１０】
ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍診断の潜在性を与える放射性同位体をさらに含むことを特徴とする、請求項１から８までに記載の組換え抗体。
【請求項１１】
組換え細菌若しくは酵母によって、又は哺乳動物細胞若しくは他の真核生物系中で生成されることを特徴とする、請求項１から８までに記載の組換え抗体。
【請求項１２】
組換えＤＮＡを介した遺伝子操作によって得られ、宿主細胞に組み込むことができるプラスミド又は配列である、請求項１から８までに記載の組換え抗体をコードするベクター。
【請求項１３】
請求項１から９までに記載の組換え抗体を含む医薬組成物。
【請求項１４】
受動免疫療法によって、眼の実体、腫瘍形成過程、急性及び慢性炎症過程並びに自己免疫過程などの血管新生の増大と共に発達する実体を治療するための医薬品を製造するための、請求項１から９までに記載の組換え抗体の使用。
【請求項１５】
受動免疫療法によって悪性腫瘍及び転移を治療するための医薬品を製造するための、請求項１から９までに記載の組換え抗体の使用。
【請求項１６】
受動免疫療法によって加齢性黄斑変性症を治療するための医薬品を製造するための、請求項１から９までに記載の組換え抗体の使用。
【請求項１７】
画像化技法を使用した、悪性腫瘍及びその転移のｉｎ  ｖｉｖｏ診断用の放射性医薬品を製造するための、請求項１０に記載の組換え抗体の使用。
【国際調査報告】
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