(57)【要約】  本発明は、ACAT阻害剤（たとえば、F-1394、アバシミベ、パクチミベ（CS505）、エフルシミベ（F12511）、エルダシミベ、NTE 122、AS183、KW3033、E5324、FY087、FCE27677、CI976、TEI6522、K604、オクチミバート、FR179254、S58-035 F-1394、アバシミベ、パクチミベ（CS505）、エフルシミベ（F12511）、エルダシミベ、NTE 122、AS183、KW3033、E5324、FY087、FCE27677、CI976、TEI6522、K604、オクチミバート、FR179254及びS58-035）又はその混合物の使用、それを含む組成物、及び線維症の予防又は治療のための、組織中のコラーゲン沈着の予防又は軽減のための、並びに過剰の線維性結合組織の予防及び軽減のための方法に関する。
2010509247.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織中のコラーゲン沈着の予防又は軽減のために有用な組成物であって、F-1394、アバシミベ、パクチミベ（CS505）、エフルシミベ（F12511）、エルダシミベ、NTE 122、AS183、KW3033、E5324、FY087、FCE27677、CI976、TEI6522、K604、オクチミバート、FR179254、S58-035を含むACAT阻害剤のうちの少なくとも１つの有効量或いはそれらの混合物及び許容可能な賦形剤を含む、組成物。
【請求項２】
前記ACAT阻害剤がF-1394である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組織が、心臓、肺、脳、眼、胃、脾臓、骨、膵臓、腎臓、肝臓、小腸、皮膚、子宮又は膀胱の組織である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
少なくとも１つの抗線維化剤及び許容可能な賦形剤を含む、抗線維化組成物。
【請求項５】
前記抗線維化剤がACAT阻害剤である、請求項４に記載の抗線維化組成物。
【請求項６】
前記ACAT阻害剤が、F-1394、アバシミベ、パクチミベ（CS505）、エフルシミベ（F12511）、エルダシミベ、NTE 122、AS183、KW3033、E5324、FY087、FCE27677、CI976、TEI6522、K604、オクチミバート、FR179254、S58-035又はそれらの混合物である、請求項５に記載の抗線維化組成物。
【請求項７】
前記ACAT阻害剤が、F-1394、アバシミベ、パクチミベ、FR179254又はS58-035である、請求項６に記載の抗線維化組成物。
【請求項８】
前記ACAT阻害剤がF-1394である、請求項７に記載の抗線維化組成物。
【請求項９】
組織中のコラーゲン沈着を予防又は軽減するための、ACAT阻害剤の使用。
【請求項１０】
前記ACAT阻害剤が、F-1394、アバシミベ、パクチミベ（CS505）、エフルシミベ（F12511）、エルダシミベ、NTE 122、AS183、KW3033、E5324、FY087、FCE27677、CI976、TEI6522、K604、オクチミバート、FR179254、S58-035又はそれらの混合物である、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記組織が、心臓、肺、脳、眼、胃、脾臓、骨、膵臓、腎臓、肝臓、小腸、皮膚、子宮又は膀胱の組織である、請求項９に記載の使用。
【請求項１２】
臓器中の過剰の線維性結合組織の形成又は発達を予防するための、ACAT阻害剤の使用。
【請求項１３】
前記ACAT阻害剤が、F-1394、アバシミベ、パクチミベ（CS505）、エフルシミベ（F12511）、エルダシミベ、NTE 122、AS183、KW3033、E5324、FY087、FCE27677、CI976、TEI6522、K604、オクチミバート、FR179254、S58-035又はそれらの混合物である、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記組織が、心臓、肺、脳、眼、胃、脾臓、骨、膵臓、腎臓、肝臓、小腸、皮膚、子宮又は膀胱の組織である、請求項１２に記載の使用。
【請求項１５】
組織中のコラーゲンレベルを減少させるための方法であって、組織を提供し、該組織を少なくとも１つのACAT阻害剤と接触させ、そして該組織中の減少したコラーゲンレベルを測定すること、を含む、方法。
【請求項１６】
前記ACAT阻害剤が、F-1394、アバシミベ、パクチミベ（CS505）、エフルシミベ（F12511）、エルダシミベ、NTE 122、AS183、KW3033、E5324、FY087、FCE27677、CI976、TEI6522、K604、オクチミバート、FR179254、S58-035又はそれらの混合物である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記組織が、線維性組織である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記組織が、心臓、肺、脳、眼、胃、脾臓、骨、膵臓、腎臓、肝臓、小腸、皮膚、子宮又は膀胱の組織である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
対象の臓器における過剰の線維性結合組織の形成又は発達を予防するための方法であって、前記対象に少なくとも１つのACAT阻害剤の有効量を投与することを含む、方法。
【請求項２０】
前記少なくとも１つのACAT阻害剤が、F-1394、アバシミベ、パクチミベ（CS505）、エフルシミベ（F12511）、エルダシミベ、NTE 122、AS183、KW3033、E5324、FY087、FCE27677、CI976、TEI6522、K604、オクチミバート、FR179254、S58-035又はそれらの混合物である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記組織が、心臓、肺、脳、眼、胃、脾臓、骨、膵臓、腎臓、肝臓、小腸、皮膚、子宮又は膀胱の組織である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記対象がヒトである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
対象における線維症又は線維性障害を予防又は治療するための方法であって、以下のステップ：
線維症に罹患しているか又は線維症を発症するリスクを有する対象を同定し；
該対象に、コラーゲンレベルを減少させるための十分量のACAT阻害剤を投与し；そして、
該対象における減少したコラーゲンレベルを測定する、
を含む、方法。
【請求項２４】
前記ACAT阻害剤が、F-1394、アバシミベ、パクチミベ（CS505）、エフルシミベ（F12511）、エルダシミベ、NTE 122、AS183、KW3033、E5324、FY087、FCE27677、CI976、TEI6522、K604、オクチミバート、FR179254、S58-035又はそれらの混合物である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ACAT阻害剤がF-1394である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記対象がヒトである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記線維性障害が、強皮症、ケロイド及び肥厚性瘢痕、レイノー症候群の発症に関連する膠原病、肺の炎症及び線維症、間質性肺疾患、特発性肺線維症、サルコイドーシス、ウイルス感染又は寄生虫感染に起因する肝硬変及び肝線維症、未制御のTGF-β活性に関連する腎障害、過度の線維化、間質性腎線維症、移植患者における腎線維症、巣状糸球体硬化症、マルファン症候群により引き起こされる線維症、心臓の線維症、放射線誘発性線維症、創傷治癒による線維症、眼の疾患、腹膜線維症、腸線維症、及び化学療法剤誘発性線維症又は火傷である、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ACAT阻害剤を用いて、線維性障害に関連する線維化を予防しそして軽減させるための新規な方法及び組成物を提供する。より特別には、本発明は、線維症を予防又は治療するための、組織中のコラーゲン沈着を調節するための組成物及び方法における、並びに、臓器中の過剰な線維性結合組織の予防及び軽減におけるACAT阻害剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
創傷治癒の一部としての組織修復過程は２つの相を含む。第一の相は、再生相であり、損傷された細胞が同じタイプの細胞によって置換される。第二の相は、線維増殖又は線維化と呼ばれる線維組織の形成であり、結合組織が柔組織を置換する。組織修復過程は、線維化相が抑制されずに持続すると病原性のものとなることができ、広範囲の組織リモデリング及び永続的な瘢痕組織の形成に導く（Wynn 2004）。
【０００３】
線維性障害は、ほとんどすべての組織及び臓器系を侵す。主要な臓器線維性疾患は、肺の炎症及び線維化をもたらす間質性肺疾患（ILD）を含む。ILDには、サルコイドーシス、珪肺症、膠原病性脈管疾患などの多くの原因が知られている。最も一般的なタイプのILDは、特発性肺線維症（IPF）であり、いまだに原因がわかっていない（特発性）。他の繊維性障害は、ウイルス性肝炎に起因する肝硬変及び線維症、糸球体腎炎（GN）、間質性腎線維症、移植患者における腎線維症などの未制御のTGF-β活性及び過度の線維化に関連する腎障害、そして黄斑変性症並びに網膜性及び硝子体網膜症などの眼の疾患を含む。さらに、線維増殖性疾患は、全身性及び局所性の強皮症、ケロイド及び肥厚性瘢痕、並びにレイノー症候群の発症に関連する膠原病を含む。手術により生じる過度の瘢痕、化学療法剤誘発性の線維症、放射線誘発性の線維症及び火傷も線維増殖性疾患の一部である。
【０００４】
アシル‐CoA：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ACAT）は、コレステロール及び長鎖脂肪酸アシルコエンザイムAの両方を基質として用いるコレステリルエステルの生成を触媒する。ACATは、小腸粘膜、肝臓、副腎、精巣及びマクロファージを含む様々な組織に存在する。ACAT阻害剤は、動物モデルにおいてアテローム性病変の出現を減少させるか又は予防することが知られている。
【０００５】
線維性障害の現在の治療は、コルチコステロイドなどの一般的な免疫抑制剤及び他の抗炎症剤を含む。これらの治療法は線維化の軽減又は予防において常に有効ではなく、それはおそらく線維化の制御に関与するメカニズムが炎症のそれ及び抗炎症療法とは異なると考えられるからである。少数の治験中の治療法が、線維化に関連する炎症過程を変更または逆行させることが証明されている。
【０００６】
さらに、マトリックスメタロプロテイナーゼ及びそれらの阻害剤、並びに腫瘍成長因子β（TGF-β）などの前線維形成性サイトカインを含む、線維形成に直接関与するものなどの、抗線維症療法の可能性のある種々の標的が同定されている。TGF-βは、サイトカイン産生、並びにコラーゲン及び他の細胞外マトリックス成分の過剰かつ異常な発現に至る事象のカスケードを開始する主要な役割を演じる。
【０００７】
数種の動物モデルが新しい抗線維化剤を同定し特徴付けするために有用である。肺線維症のブレオマイシン‐ハムスターモデル(lyer，Margolin et al. 1998)及び腎線維症の片側性尿管閉塞モデル（Shimizu, Kuroda et al. 1998）において、ピルフェニドンの抗線維化効果が最近実証された。ALK5（TGF-βレセプターII型）の阻害剤がジメチルニトロソアミン誘発性の肝線維症（DMN）ラットモデルにおいて防御性であることが示された（de Gouville andHuet 2006）。
【０００８】
ここに、本発明者らは、ACAT阻害能力を有する化合物が線維症の治療及び予防のための分子の選択肢であることを見出した。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、ACAT阻害剤を用いて線維症及び／又は線維性障害を予防し軽減させるための新規な方法及び組成物を提供する。
【００１０】
1つの側面においては、本発明は、少なくとも１つの抗線維化剤の有効量及び許容可能な賦形剤を含む抗線維化組成物を提供する。
【００１１】
他の側面においては、本発明は、組織におけるコラーゲン沈着を予防又は軽減するためのACAT阻害剤の使用に関する。
【００１２】
さらに、本発明の他の側面は、臓器における過剰の線維性結合組織の形成又は発達を予防するためのACAT阻害剤の使用に関する。
【００１３】
本発明は、組織中のコラーゲンレベルを減少させるための方法も包含し、該方法は、組織を提供し、該組織を少なくとも１つのACAT阻害剤と接触させ、そして、該組織中の減少したコラーゲンレベルを測定することを含む。
【００１４】
他の側面によれば、本発明は、対象の臓器中の過剰な線維性結合組織の形成又は発達を予防するための方法に関し、該方法は、該対象に少なくとも１つのACAT阻害剤の有効量を投与することを含む。
【００１５】
他の側面においては、本発明は、対象における線維症又は線維性障害を予防又は治療するための方法を提供し、該方法は、以下のステップ：
−線維症に罹患しているか又は線維症を発症するリスクを有する対象を同定し；
−該対象に、コラーゲンレベルを減少させるための十分量のACAT阻害剤を投与し；そして、
−該対象における減少したコラーゲンレベルを測定する、
を含む。
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明は、ACAT阻害剤を用いて線維性障害に関連する線維化を予防及び軽減するための新規な方法及び組成物を提供する。
【００１７】
定義
本明細書中で使用されるとおり、「ACAT阻害剤」という表現は、酵素アシルCoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ACAT）を阻害する任意の化合物を意味する。ACAT阻害剤の例は、有機小分子、すなわち５０超〜約２５００未満の分子量を有する有機分子を含む。ACAT阻害剤は、タンパク質及び／又は核酸分子との構造的相互作用に必要な化学官能基を含み、そして、典型的には少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシル又はカルボキシル基、好ましくは、上記化学官能基の少なくとも２つを含む。ACAT阻害剤は、１つ以上の上記官能基で置換された環状炭素又は複素環構造及び／又は芳香族又は多環芳香族構造を含むことができる。
【００１８】
例えば、本発明のACAT阻害剤は、表１（「表１」とは「表1-1、1-2、1-3及び1-4」をいう、以下同じ）に挙げられる以下の化合物：F-1394、アバシミベ（Avasimibe）、パクチミベ（Pactimibe（CS-505））、エフルシミベ（Eflucimibe（F12511））、エルダシミベ（Eldacimibe）、NTE 122、AS-183、KW-3033、E5324、FY 087、FCE 27677、CI976、TEI6522、K-604、オクチミバート（Octimibate）、FR17924及びS 58-035である。
【００１９】
本明細書中で使用される用語、「線維化」は、修復又は反応過程としての線維性組織の形成をさす。線維化は、特定の組織における線維芽細胞の蓄積と正常な沈着を超えたコラーゲン沈着を特徴とする。
【００２０】
本明細書中で使用される表現、「線維性障害」、「線維増殖性疾患」又は「線維性疾患」は、１つ以上の組織における線維化を含む状態をさす。
【００２１】
線維性障害は、強皮症、ケロイド及び肥厚性瘢痕、レイノー症候群に関連する膠原病、肺の炎症及び線維症、間質性肺疾患、特発性肺線維症、サルコイドーシス、ウイルス感染又は寄生虫感染に起因する肝硬変及び肝線維症、糸球体腎炎（GN）、間質性腎線維症、移植患者における腎線維症、巣状糸球体硬化症などの未制御のTGF-β活性及び過度の線維化に関連する腎障害、マルファン症候群により引き起こされる線維症、心臓の線維症、放射線誘発性線維症、そして創傷治癒による線維症、黄斑変性症並びに網膜性及び硝子体網膜症などの眼の疾患を含むが、これらに限定されない。それはさらに、腹膜線維症、腸線維症、化学療法剤誘発性線維症及び火傷を含む。
【００２２】
本明細書中で使用される用語、「強皮症」は、皮膚を侵し、さらに深刻な場合には血管及び内部臓器を侵しうるコラーゲンの過剰沈着を特徴とする、稀な慢性疾患を意味する。典型的には、最も明白な症状は、皮膚の硬化及びそれに伴う瘢痕であり、血管もより明らかであるかもしれない。
【００２３】
「特発性肺線維症」は、原因不明（特発性）の炎症性肺疾患であり、小さな空気嚢（肺胞）又は肺の管の間の線維性組織の異常形成（線維化）を特徴とする。
【００２４】
「肝線維症」は、対象の肝臓における堅い線維性の瘢痕組織の蓄積をさす。
【００２５】
本明細書中で使用される用語、「対象」は、動物及びヒトをさす。したがって、この用語は、制限されることなく、霊長類、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ラット、ウサギ、モルモットなどの家畜、動物園の動物などの捕獲動物及び野生動物を含む。
【００２６】
本明細書中で使用される用語、「組織」は、臓器又は皮膚組織、肺組織、腎臓組織などの特殊化した細胞及び他のタイプの細胞の集合物をさす。
【００２７】
本明細書中で使用される用語、「治療／治療すること」は、それによって線維性障害、線維性疾患、線維症及び上記に例示された関連する障害の症状が緩和されるか又は完全に除去される過程をさす。
【００２８】
本明細書中で使用される用語、「予防／予防すること」は、それによって線維性障害、線維性疾患、線維症及び上記に例示された関連する障害の症状が妨害、遅延又は回避される過程をさす。
【００２９】
本明細書中で使用される表現、「有効量」は、臨床試験の結果及び／又は動物モデルによって判定される所望の効果をもたらす量を示す。この量は、当業者によって日常的に決定されることができる。採用されるべき組成物の有効量は、たとえば、治療状況及び目的に依存する。したがって、当業者は、治療のための適切な用量が送達されるACAT阻害剤のタイプ、ACAT阻害剤が使用される適応症、投与経路、並びに患者のサイズ（体重、体表面積又は臓器のサイズ）及び状態（年齢及び一般的健康状態）に一部依存することを理解する。したがって、医師は最適の治療効果を得るために用量を漸増し、そして投与経路を調節することができる。
【００３０】
任意の化合物について最初に、細胞培養アッセイ、或いはマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ブタ又はサルなどの動物モデルのいずれかにおいて有効用量が推定可能である。動物モデルは、適切な濃度範囲及び投与経路を決定するためにも使用されてよい。そして、かかる情報は、ヒトにおける有用な用量及び投与経路を決定するために使用可能である。
【００３１】
本明細書中で使用される表現、「許容可能な賦形剤」は、組成物中で使用される成分であって、組成物の活性成分の生理活性の有効性を妨害せず、かつ、治療の対象とされる宿主、組織または臓器に対して毒性でないものを意味する。
【００３２】
本明細書中で使用される、「許容可能な賦形剤」という表現は、組成物中で使用される成分であって、組成物の活性成分の生理活性の有効性を妨害せず、かつ、宿主または患者に対して毒性でないものを意味する。さらに、賦形剤は、治療される対象の免疫系によって拒絶される可能性が最小である化合物であることが有利である。
【００３３】
かかる「許容可能」及び／又は「医薬として許容可能な賦形剤」は、安定化剤、緩衝剤、懸濁剤、担体などの多様な目的のために使用され、British Pharmacopeia、the JapanesePharmacopeia、及びthe United States Pharmacopeia XXII及びNational Formulary XVII並びにその補遺などを含む多数の文書に列挙され、そして記載されている。
【００３４】
線維症又は線維性障害の予防及び治療におけるACAT阻害剤の使用
本発明の発明者らは、ACAT阻害能力を有する一連の化合物が、線維性障害の広く受け入れられている動物モデルにおいて線維化及び関連する障害を軽減又は予防するために有用であることを発見した。
【００３５】
1つの側面において本発明は、少なくとも１つの抗線維化剤の有効量及び許容可能な賦形剤を含む抗線維化組成物を提供する。より特別には、該抗線維化剤はACAT阻害剤である。例えば、該ACAT阻害剤は表１に挙げられるACAT阻害剤のうちの一つ又はそれらの混合物であってよい。
【００３６】
本発明によって考慮される好ましいACAT阻害剤を表すCAS登録番号及び／又は刊行物／特許が表１に見いだされる。それらは以下の化合物：F-1394、アバシミベ、パクチミベ（CS-505）、エフルシミベ（F12511）、エルダシミベ、NTE 122、AS-183、KW-3033、E5324、FY 087、FCE 27677、CI976、TEI 6522、K-604、オクチミバート、FR179254及びS 58-035を含む。
【００３７】
関連する側面において、本発明は、対象における線維症又は線維性障害を予防又は治療する方法に関する。該方法は、線維症に罹っているか又は線維症を発症するリスクを有する対象を同定する第一のステップ、それに続く該対象にコラーゲンのレベルを減少させるのに十分な量のACAT阻害剤を投与するステップを含む。該方法は、対象において減少したコラーゲンのレベルを測定するさらなるステップも含む。ACAT阻害剤は、表１に挙げられるACAT阻害剤のうちの一つまたはそれらの組み合わせであることが好ましい。
【００３８】
治療又は回避されるべき線維性障害は例えば、強皮症、ケロイド及び肥厚性瘢痕、レイノー症候群の発症に関連する膠原病、肺の炎症及び線維症、間質性肺疾患、特発性肺線維症、サルコイドーシス、ウイルス感染又は寄生虫感染に起因する肝硬変及び肝線維症、未制御のTGF-β活性に関連する腎障害、過度の線維化、間質性腎線維症、移植患者における腎線維症、巣状糸球体硬化症、マルファン症候群により引き起こされる線維症、心臓の線維症、放射線誘発性線維症、そして創傷治癒による線維症、眼の疾患、腹膜線維症、腸線維症及び化学療法剤誘発性線維症又は火傷である。
【００３９】
組織中のコラーゲン沈着の予防又は軽減のためのACAT阻害剤の使用
いくつかのタイプの線維症が、増加したコラーゲン合成及び／又は減少したコラーゲン分解により引き起こされる異常なコラーゲン沈着を特徴とすることはよく知られている。
【００４０】
したがって、本発明は、組織中のコラーゲン沈着を予防又は軽減するための少なくとも１つのACAT阻害剤の使用に関する。
【００４１】
「組織中のコラーゲン沈着を予防又は軽減すること」という表現は、特定の組織において正常な沈着を超えるコラーゲン沈着が妨害され、遅延され又は回避され、或いは該組織において正常な沈着に比べて過剰なコラーゲン沈着が緩和されるか又は除去されることを意味する。
【００４２】
例えば、組織中のコラーゲン沈着を予防又は軽減するために使用されるACAT阻害剤は、表１に挙げられるACAT阻害剤のうちの一つ又はそれらの混合物であってよい。
【００４３】
本発明はまた、組織を提供するステップ、それに続く該組織を少なくとも１つのACAT阻害剤と接触させるステップを含む、組織中のコラーゲンレベルを減少させる方法も提供する。次のステップは、組織中の減少したコラーゲンレベルを測定することからなる。好ましい実施態様によれば、この方法において使用されるACAT阻害剤は、表１に挙げられる化合物のうちの一つ又はそれらの混合物である。該組織は、線維性組織であることが好ましい。それは、心臓、肺、脳、眼、胃、脾臓、骨、膵臓、腎臓、肝臓、小腸、皮膚、子宮又は膀胱であってよい。
【００４４】
関連する側面においては、本発明はまた、組織中のコラーゲン沈着の予防又は軽減において有用な組成物にも関し、該組成物は表１に挙げられるACAT阻害剤のうちの少なくとも１つまたはそれらの混合物、及び許容可能な賦形剤を含む。
【００４５】
組織が、例えば、ヒトなどの対象の臓器の組織であることは理解されるであろう。臓器の組織は、たとえば、心臓、肺、脳、眼、胃、脾臓、骨、膵臓、腎臓、肝臓、小腸、皮膚、子宮及び膀胱から選ばれる臓器の組織である。
【００４６】
臓器中の過剰の線維性組織の形成又は発達の予防におけるACAT阻害剤の使用
組織修復過程においては、線維化相は、結合組織が柔組織にとって代わる、線維性組織の形成からなる。線維化相が制限なく持続すると、組織修復過程は、病原性となり、広範囲の組織リモデリングに導くことができる。
【００４７】
したがって、本発明は、臓器中の過剰の線維性結合組織の形成又は発達を予防するためのACAT阻害剤の使用を提案する。より特別には、ACAT阻害剤は表１に挙げられる化合物のうちの一つ又はそれらの混合物であってよい。
【００４８】
「臓器中の過剰の線維性結合組織の形成又は発達を予防する」という表現によって、特定の臓器において正常な形成を超える線維性結合組織の形成が妨害され、遅延され又は回避されることが意味される。
【００４９】
例えば、該臓器がヒトなどの対象の臓器であることは理解されるであろう。該臓器は例えば、心臓、肺、脳、眼、胃、脾臓、骨、膵臓、腎臓、肝臓、小腸、皮膚、子宮又は膀胱である。
【００５０】
関連する側面において、本発明は、対象の臓器中の過剰の線維性結合組織の形成又は発達を予防する方法を提供し、該方法は、少なくとも１つのACAT阻害剤の有効量を対象に投与することを含む。より特別には、ACAT阻害剤は表１に挙げられるACAT阻害剤のうちの一つ又はそれらの混合物であってよい。好ましい実施態様において臓器は、心臓、肺、脳、眼、胃、脾臓、骨、膵臓、腎臓、肝臓、小腸、皮膚、子宮、及び膀胱から選ばれ、そして、対象はヒトである。
【００５１】
【表１−１】
2010509247.tif 000003
【００５２】
【表１−２】
2010509247.tif 000004
【００５３】
【表１−３】
2010509247.tif 000005
【００５４】
【表１−４】
2010509247.tif 000006
【００５５】
本発明のACAT阻害剤組成物
本発明による組成物は、例えばACAT阻害剤を送達する一方、該抗線維化剤を保持し保存するのに有用である、担体若しくはビヒクルを含む少なくとも１つの賦形剤又は製剤原料を含有する。製剤は、治療される状態に適合可能である。例えば、線維性障害の治療剤は、局所に、経口で、又は注射によって送達されてよい。或いは、組成物は吸入療法によって送達されてよい。治療用分子の導入に好適な他の手段は、埋め込み可能な薬物送達装置を含む。
【００５６】
最適の組成物は、所望の投与経路、その送達様式及び目的の用量などに依存して当業者によって決定されるであろう。
【００５７】
本発明によって好ましいと考えられる腸管外注射のための好適なビヒクルは、その中で所望のACAT阻害剤が滅菌された等張溶液として製剤され、適切に保存される、滅菌蒸留水である。
【００５８】
本発明の組成物が水性の注射用懸濁液である場合、それらは、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランなどの懸濁液の粘度を増加させる物質を含むことが好ましい。さらに、所望のACAT阻害剤の懸濁液は、適切な油性の注射用懸濁液であってよい。好適な親油性溶媒又はビヒクルは、ゴマ油などの脂肪油又はオレイン酸エチルなどの合成脂肪酸エステル、トリグリセライド又はリポソームを含む。非脂質のポリカチオン性アミノポリマーも送達のために使用されてよい。場合により、懸濁液は、好適な安定化剤、またはACAT阻害剤の溶解性を増加させて、高濃度溶液の調製を可能とする剤も含んでよい。
【００５９】
本発明の組成物は、吸入用に製剤されてもよい。例えば、ACAT阻害剤は、吸入のための乾燥粉末として製剤されてもよい。ACAT阻害剤の吸入液はエアロゾル送達のための噴霧剤とともに製剤されてもよい。或いは、溶液は噴霧されてよい。
【００６０】
ACAT阻害剤を含む組成物は、局所投与用に製剤されてよい。局所用組成物の例は、クリーム、軟膏又はローションの形態をとってよい。
【００６１】
本発明の組成物が経口投与されてよいことも考慮される。経口投与のための組成物は、本分野で周知の許容可能な担体を用いて、経口投与のための適切な用量で製剤されることができる。かかる担体は、製剤される組成物が、患者による摂取のために錠剤、ピル、ドラジェ、カプセル、液体、ジェル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして製剤化されることを可能とする。
【００６２】
さらにカプセルは、バイオアベイラビリティーが最大化し全身にゆきわたる前の分解が最小化される胃腸管の地点において、製剤の活性部分が放出されるように設計されてもよい。ACAT阻害剤の吸収を促進するために追加の剤が含められることができる。希釈剤、風味剤、低融点ワックス、植物油、潤滑剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤、及び結合剤も採用されてよい。
【００６３】
経口製剤の例が、本発明によって考慮されるACAT阻害剤を賦形剤としてのラクトース及びコーンスターチ並びに結合剤としてのヒドロキシプロピルセルロースとともに造粒することによって調製可能である、カプセルからなるものであってよいことは理解されるであろう。かかるカプセルは、所望の量のACAT阻害剤を含有する白色ハードゼラチンカプセルからなるものであってよい。
【００６４】
ACAT阻害剤、F-1394のためのカプセル製剤の他の例が表２に提供される。それは、腸溶性コートを備えたゼラチンカプセルからなる。
【００６５】
【表２】
2010509247.tif 000007
【００６６】
経口用途用の製剤は、所望のACAT阻害剤を固体賦形剤と併合し、そして得られた（場合により粉砕後の）顆粒混合物を加工して錠剤又はドラジェコアを得ることによって入手することもできる。かかる製剤のための好適な賦形剤は、たとえば、ラクトース、シュークロース、マンニトールおよびソルビトール；トウモロコシ、小麦、コメ、ジャガイモ又は他の植物からのデンプン；メチルセルロース又はカルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース；並びにゼラチン及びコラーゲンなどのタンパク質などの、炭化水素またはタンパク質充填剤を含む。
【００６７】
本発明のACAT阻害剤の持続性又は徐放性送達製剤を提供することは本発明の範囲内にある。当業者はかかる製剤の調製方法を知っているであろう。
【００６８】
治療のための用量レベルは、送達されるACAT阻害剤のタイプ、ACAT阻害剤が使用される適応症、投与経路、並びに患者のサイズ（体重、体表面積又は臓器のサイズ）及び状態（年齢及び一般的健康状態）に一部依存するであろう。例えば、医師は、最適の治療効果を得るために用量を漸増し、そして投与経路を調節することができる。
【００６９】
任意の化合物について最初に、細胞培養アッセイ或いはマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ブタ又はサルなどの動物モデルのいずれかにおいて有効用量が推定可能である。動物モデルは、適切な濃度範囲及び投与経路を決定するためにも使用されてよい。そして、かかる情報は、ヒトにおける有用な用量及び投与経路を決定するために使用可能である。
【００７０】
投薬の頻度は、使用される特定の製剤中のACAT阻害剤の薬物動態パラメータに依存するであろう。典型的には、組成物は所望の効果を達成する用量に達するまで投与される。したがって組成物は、単回投与又は（同じ又は異なる濃度／用量の）複数回投与として経時的に投与されるか、或いは持続点滴として投与されてよい。適切な用量のさらなる微調整が日常的に行われる。適切な用量応答データを用いることによって、適切な用量が確認されることができる。
【００７１】
例として、25mgのACAT阻害剤F-1394を含む表２に記載のカプセルは、少なくとも１日１回、好ましくは少なくとも１日２回投与されることができた。しかしながら、日用量並びにF-1394カプセルの含有量は、最適な治療効果を得るために調整されることができた。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】図１は、ヒトにおけるTGF-β経路を模式的に表したものを、寄生虫ホモログとともに示す。
【図２】図２は、ACAT阻害剤がTGF-βシグナリングを減少させることを示す。耐性幼虫の形成が、daf-14（m77）突然変異株において測定された。以下の化合物が試験された、アバシミベ（n=651）、F-1394（n=935）、パクチミベ（n=1166）、FR179254（n=1056）、及びS 58-035（n=765）。DMSOが対照溶媒として使用された（n=941）。試験されたすべての化合物が、対照処置に比べて耐性幼虫の形成を促進した。
【図３】図３は、ACAT阻害剤が１つ超のTGF-β恒常的突然変異株においてTGF-βシグナリングを減少させたことを示す。アバシミベ（ａ）及びF-1394（ｂ）により誘導された耐性幼虫の形成が、実施例１の材料及び方法の項において記載されたとおりに測定された。（ａ）アバシミベは、daf-7（e1372）（n=560対539（対照について））において；daf-1（m40）（n=870対636（対照について））において；そしてdaf-8（e1393）(n=852対502（対照について）)において試験された。（ｂ）F-1394は、daf-7（e1392）（n=99対134（対照について））において；daf-1（m40）（n=145対108（対照について））において；そしてdaf-8（e1393）（n=47対140（対照について））において試験された。試験された化合物は、すべての突然変異株において耐性幼虫の形成を促進した。
【図４】図４は、F-1394（示すとおり、０．３、０．６及び１μg ml-1）の存在下又は不存在下において、未刺激（対照）又はトランスフォーミング成長因子（TGF;５ng ml-1）−β1で刺激されたA549細胞におけるα1（I）コラーゲンmRNAの発現の相対的定量化を示す。露出時間は、TGFβ1について７２時間であった。F-1394は、TGFβ1の１時間前から実験終了まで存在した。TGFβ1−誘発性のα1（I）コラーゲンmRNA発現の増加は、F-1394によって濃度依存的に阻害された。α1（I）コラーゲンmRNA発現は、リアルタイムRT-PCRを用いることによって△△Ct法によって測定され；カラムは、３つの独立した実験の２−△△Ct値の平均±SEMとしてのα1（I）コラーゲンmRNA発現の、GAPDH値に対する増加の倍数を示す。＊：対照に対してｐ＜０．０５；＃：TGFβ1に対してｐ＜０．０５。
【図５】図５は、気道にブレオマイシン（BLM）又は塩水（対照）を受容するマウスの肺組織中のα1（I）コラーゲンmRNAの相対的発現を示す。カラムは、一群あたり３〜５匹の動物の平均±s.e.m.を示す。ANOVAによって、＊：対照に対してｐ＜０．０５；＃：BLEOに対してｐ＜０．０５。
【図６】図６は、薬物ビヒクル＋塩水（a）、F-1394＋塩水（b）、N-アセチルシステイン＋塩水（c）、薬物ビヒクル＋ブレオマイシン（d、e、f）、F-1394＋ブレオマイシン(g、h)及びN-アセチルシステイン＋ブレオマイシン（i）で処置されたマウスにおける、肺の組織学の代表的顕微鏡写真を示す。すべての肺切片をヘマトキシリン−エオシンで染色した。倍率×４０。塩水処置したマウスは、正常な構造を示す。ブレオマイシンに露出されたマウスは、炎症細胞、肥厚した肺胞中隔、浮腫および密な線維化巣を伴う顕著な細気管支周囲の間質の浸潤を示した。これらの肺の病変は、F-1394で、及びN-アセチルシステインで経口処置された動物において減少した。
【図７】図７は、線維化の数値スコアによる肺中の線維化変化の評価を示す。バーは、示された各実験群のAscroftスコア（平均±SEM）を示す。Mann-Whitney検定によって、ビヒクルに対して、＊P＜０．０５。肺の病変は、F-1394並びにN-アセチルシステインで経口処置された動物において減少した。
【図８】図８は、染色された間質領域の平均パーセンテージとして表した、皮質領域中の１０個の重複しない視野における、シリウスレッド染色後に測定した線維化のパーセンテージを示し；ビヒクル群と比べて、＊＊＊P＜０．０１；一群あたりn=１０；データをその後にNewman-Keuls検定が続くANOVAにより分析した。
【発明を実施するための形態】
【００７３】
以下の実施例は、添付図面を参照して本発明を例解する。これらの実施例は、本発明の広い適用可能性の実例であり、その範囲を限定することを目的とするものでない。本発明の精神及び範囲を離れることなく、その改変及び変更が行われることができる。本明細書中に記載された方法及び材料に類似するか又は等価な任意のものが本発明の試験の実施において使用可能であるが、好ましい方法及び材料が記載される。
【実施例】
【００７４】
実施例１：ACAT阻害剤はTGF-βシグナリング経路を阻害する
TGF-βは、動物の発達において重要な役割を演じる分泌ペプチド成長因子の大きなファミリーに属する。リガンドの結合によって、I型及びII型受容体が複合体中に動員され、そして、II型受容体がリン酸化し、それによってI型受容体を活性化する。今度は、I型受容体がR-Smad（受容体制御型）サブファミリーのSmadをリン酸化する。R-SmadはCo-Smadともに複合体を形成し、核内に蓄積して他の転写因子を介して遺伝子の転写を制御する（図１）。この経路は多くの細胞内プロセスを制御し、そして正常な発達において重要な役割を演じる。該経路の破壊は、癌、循環器の、炎症性の、そして線維性の疾患、並びにマルファン症候群を含む、様々な疾患に導きうる。
【００７５】
寄生虫においてTGF-β経路は、悪条件の下での生存に特化された別の幼虫段階である、耐性幼虫段階に入ることを制御する。TGF-ベータ経路の破壊は、恒常的な耐性幼虫形成に導き、すなわち、好条件のもとでさえ、耐性幼虫の形成に導く。したがって、耐性幼虫形成の増加は、該経路を通るシグナリングの減少を示唆する。しかしながら、寄生虫において耐性幼虫の形成に影響を与える、インスリン様シグナリング経路などの他のシグナリング経路も存在する。TGF-β経路を介する、恒常的な耐性幼虫形成は、DAF-3及びDAF-5の活性を必要とするが、インスリン様シグナリング経路を介する恒常的な耐性幼虫の形成はその活性を必要としない。
【００７６】
本研究の目的は、ACAT阻害剤がTGF-βシグナリング経路を妨害する能力を有することを証明することであった。
【００７７】
材料及び方法
一般的方法
すべてのアッセイを２４ウエルプレート中で実施した。ウエルは１．５mLの線虫用培地（NGM）を含んだ。第１日に、適切な体積の化合物原液をNGMウエルの表面に加え、そして暗所で少なくとも２時間、放置して乾燥させた。そして、１５倍に濃縮したOP50細菌培養液３〜５μLをウエルに播種した。寄生虫を卵として第１日にウエルに移し、そして、（daf-8、daf-14及びdaf-4；daf-5については）２０℃で、又は（daf-1及びdaf-7については）２２℃で３日間成長させた。耐性幼虫段階の寄生虫のパーセンテージを第４及び／又は第５日に測定した。
【００７８】
寄生虫
寄生虫株は、Caenorhabditis Genetics Center (CGC)から入手し、そして標準的な細胞培養方法を用いて２０℃に維持した。使用した野生型株はCaenorhabditis elegansBristol株、N2であった。この試験で用いた突然変異株は：daf-7(e1372)III、daf-1(m40)IV、daf-4(m63)III、daf-8(e1393)I、daf-14(m77)IV、及びdaf-5(e1386)IIである。
【００７９】
化合物
アバシミベ、パクチミベ、F-1394、FR19254、S58035は、１０mMの原液として−２０℃で保存した。すべての化合物をDMSOに溶解した。daf-14突然変異株において１０．３μM、他の突然変異株では５５μMでアッセイしたアバシミベを除き、化合物は８２．５μMの最終濃度でアッセイした。
【００８０】
結果及び検討
TGF-β経路を介してシグナリングを減少させることによって、ACAT阻害剤は耐性幼虫の形成に影響を及ぼす
試験したすべてのACAT阻害剤は、TGF-β経路における耐性幼虫の恒常的突然変異株であるC.エレガンスdaf-14突然変異株において耐性幼虫の形成を促進した（図２）。この効果はDAF-5の活性を必要とし、それは、試験したすべてのACAT阻害剤がdaf-4；daf-5二重突然変異株において効果を有さなかったからである（表３）。実際、daf-5はTGF-βシグナリング阻害による耐性幼虫形成に必要であり、daf-5突然変異株バックグラウンドにおいてACAT阻害剤による耐性幼虫形成が誘導されないことは、それらの耐性幼虫に対する効果がTGF-βシグナリング経路の阻害を介するものであることを示唆している。さらに、発明者らは、特別にF-1394およびアバシミベをTGF-β経路における数種の他の耐性幼虫恒常的突然変異株、すなわちdaf-7、daf-1及びdaf-8において試験した。発明者らは、F-1394並びにアバシミベが、これらの突然変異株において耐性幼虫形成を促進することを発見し（図３）、これは図２に記載の結果と一致する。要するに、これは、ACAT阻害剤がTGF-β経路を介するシグナリングを特異的に減少させることによって耐性幼虫形成に影響を及ぼすことを示唆する。
【００８１】
【表３】
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【００８２】
表３：ACAT阻害剤はdaf-4(m63)；daf-5(e1386)二重突然変異株において耐性幼虫形成を誘導しない。材料及び方法の項において記載したとおり、以下の化合物：アバシミベ（n=651）、F1394(n=935)、パクチミベ（n=1166）、FR179254（n=1056）、及びS 58-035（n=765）を試験した。DMSO溶媒を対照として使用した（n=941）。試験した化合物は試験した寄生虫バックグラウンドにおいて耐性幼虫誘導活性を有さない。
【００８３】
実施例２：ヒト肺上皮細胞株A549、ヒト肺線維症及びCOPDに関連するインビトロ動物モデルにおけるTGF-β1誘導性マトリックスタンパク質発現に対するF-1394の効果
多機能性又は多面的サイトカインである、トランスフォーミング成長因子TGF−β1は、細胞増殖、分化、アポトーシス、線維化、創傷治癒及び炎症を含む多くの生物学的過程に参加する（Ning W. et al. 2002;  Martin G.E.M. et al.2006）。特に、（TGF）−β1は、傷害に対する肺組織の応答の重要なメディエーターとしての役割を有する成長因子であり；したがって、炎症過程に続く肺の修復及び線維化のメカニズムに関与する（Bellocq A. et al. 1999）。反応性酸素及び窒素は、炎症及び線維化過程間の分子リンクを構成するであろう、ヒト肺胞上皮細胞からのTGFβ1放出の増加を仲介する（Bellocq A. et al. 1999）。
【００８４】
線維性コラーゲンI型は、線維芽細胞型の細胞によって合成されることを特徴とする（Kasai H. et al. 2005）。
【００８５】
先の研究は、他の炎症性サイトカインではなくTGFβ1が、肺胞上皮II型細胞表現型を有するA549細胞が線維芽細胞表現型マーカーの発現を含む上皮間葉移行を行うように誘導することを実証した（Kasai H. et al. 2005）。
【００８６】
材料及び方法
実験モデル
ヒト肺胞上皮細胞癌株A549（American TypeCulture Collection; Rockville, MD）をMata M. et al. 2005に概説したように増殖させた。組み換えヒトTGFβ1を５ng/mLの濃度で使用した。適宜、TGFβ1及びF-1394を再添加しながら、培地を２４時間毎に交換した。F-1394は、TGFβ1の最初の添加の１時間前から実験の最後まで存在した。
【００８７】
mRNA分析
mRNAの分析のために、培養A549細胞をMata M. et al. 2005中で概説したとおりに調製した。製造者の指示にしたがってTriZol Reagent(商標)（Invitrogen,Carlsbad, CA, USA）を使用することによって、全RNAを抽出した。抽出されたRNAの完全性をBioanalizer（商標）（Agilent, Palo Alto, CA, USA）を用いて確認した。定量的RT-PCRによってα1（I）コラーゲンmRNAを概説されたとおりに（Manoury B. et al. 2006）決定した。測定時間：先に概説したとおり、７２時間の時点（Kasai H. et al. 2005）。
【００８８】
実験群
以下のように、適切な陰性及び陽性対照並びにF-1394及び参照化合物による処理群及びそれらの各対照を用いてインビトロ実験を実施した：
１）対照ビヒクル（DMSO）
２）F-1394（DMSO中）用量レベル３（３μg/mL）
３）TGFβ1＋DMSO
４）TGFβ1＋F-1394（DMSO中）用量レベル１（０．３μg/mL）
５）TGFβ1＋F-1394（DMSO中）用量レベル２（０．６μg/mL）
６）TGFβ1＋F-1394（DMSO中）用量レベル３（３μg/mL）
【００８９】
結果及び検討
データを平均±SEMとして表す。その後にBonferroni検定（GraphPad Software Inc, San Diego, CA, USA）が続く分散分析（ANOVA）によって結果の統計解析を実施した。P<０．０５の場合に有意であると認めた。
【００９０】
図４に示すように、TGFβ1はα1（I）コラーゲンmRNAの発現を顕著に増加させた。
【００９１】
このTGFβ1誘発性の発現増加は、F-1394の存在下において濃度依存性に顕著に減少した（図４）。
【００９２】
原型ACAT阻害剤としてのF-1394は、ヒト気道上皮細胞株である培養A549細胞においてTGFβ1によって引き起こされたα1（I）コラーゲンmRNAの発現増加を顕著に減少させるのに有効であった。
【００９３】
実施例３：ヒト肺線維症に関連したインビボ動物モデルであるブレオマイシン誘発性の肺損傷に対するF-1394の効果
ブレオマイシン誘発性の肺損傷は、新しい化合物の抗炎症及び抗線維化（リモデリング）活性の研究に関する確立されたモデルと考えられる。
【００９４】
材料及方法
全６６頭のマウスが試験に参加した。群あたりの動物数は、（必要に応じて）約１０〜１２であった。各マウスは、販売時（６週）の体重が約２０ｇであった。
【００９５】
F-1394を０．５％カルボキシメチルセルロース（CMC）の懸濁液として３００mg/kgで14日間経口投与した。N-アセチル-L-システイン（NAC）を参照物質として使用した。F-1394及びNACは両方とも１０ml/kgの体積で経管栄養法によって経口投与した。
【００９６】
実験モデル
それぞれ体重約２０ｇの雄性成体C57BL/6マウスは、５０μlの塩水（０．９％NaCl）に溶解した単回投与の０．０７５U硫酸ブレオマイシン（Sigma カタログB 5507（２〜８℃で保存、固体１ｍｇあたり１．２〜１．５単位））を経口経路で気管内に受容した。対照動物は同じプロトコールで、ブレオマイシンの代わりに気管内に塩水を受容した。ハロタン麻酔下で気道滴下を実施した。ブレオマイシン／塩水の気管内投与の１４日後、動物を麻酔し（ペントバルビタールナトリウム）、その後、腹部大動脈からの大量失血によって動物を屠殺した。肺を摘出して重量測定した。そして、組織学及び生化学試験のために右及び左の肺を別々に以下に示すように処理した。ブレオマイシンの１４日後をコラーゲン合成のピーク時として選択した（Lazemby et al 1990）。
【００９７】
組織学的評価
組織学的試験のために、最初に肺をその主要気管支を介して静水圧２５cmに維持した固定液（１０％中性緩衝ホルマリン）で１５分間かん流し、固定液中に２４時間浸漬し、そして塊を取り出した。固定液でよく膨張した肺のみを分析した。組織の塊をホルマリン中に入れ、一連の段階的なエタノール中で脱水し、パラフィン包埋し、４μmの厚さの連続的な切片に切断し、そしてヘマトキシリン−エオシン染色して炎症細胞と線維化領域を同定した。本研究室の先の研究に基づき、肺実質中の炎症及び線維化の範囲及び重症度についての準定量的盲検採点法を用いることによって、病変部の組織学的等級づけを実施した（Cortijo et al., 2001; Mata et al., 2003; Serrano-Mollar et al., 2002；Serrano-Mollar et al, 2003）。線維化の重症度をAshcroft及び共同研究者らにしたがって採点した。すなわち、肺線維化のグレードを以下の基準にしたがって０〜８点のスケールに採点した：グレード０、正常な肺；グレード１、肺葉又は気管支壁の最小の線維性肥厚；グレード３、肺の構造の明らかな損傷を伴わない、壁の中度の線維性肥厚；グレード５、肺の構造の明確な損傷及び線維の帯又は小さな線維の塊を伴う、線維化の増加；グレード７、構造の重度の破壊及び大きな線維化領域；グレード８、視野全体の線維性閉塞。グレード２、４及び６を中間の概念として使用した。各肺セクションにおける線維性の変化の重症度を、観察した顕微鏡視野からの平均重症度スコアとして評価した。各セクション中の１０の無作為な視野を分析した。二人の観察者による盲検により等級づけを実施し、そして平均値を線維化スコアとした。
【００９８】
実験群
適切な陰性及び陽性対照並びに異なる薬物処置を受けた群及び必要に応じたそれらの各対照（薬物ビヒクル；処置された陰性対照）を用いてインビボ実験を実施した。
・陰性対照：F-1394−ビヒクル（経口）＋塩水（気管内）
・陽性対照：F-1394−ビヒクル（経口）＋ブレオマイシン（気管内）
・F-1394  ３００mg/kg（経口）＋ブレオマイシン（気管内）
・NAC ５００mg/kg（経口）＋ブレオマイシン（気管内）
【００９９】
結果及び検討
データを平均±SEMで表す。その後に適宜Bonferroni検定又はノンパラメトリック検定（GraphPad Software Inc, San Diego, CA, USA）が続く分散分析（ANOVA）によって結果の統計解析を実施した。GraphPad Software Inc（Prism 4.03）を用いることにより、ログランク検定によって生存曲線を分析した。P<０．０５の場合に有意であると認めた。
【０１００】
肺組織中のα1（I）コラーゲンmRNA
F-1394並びにNACは、α1（I）コラーゲン転写物の発現に対する顕著な阻害効果を示し、これはコラーゲン沈着の減少によって抗線維化効果を示唆する（図５）。
【０１０１】
原型ACAT阻害剤としてのF-1394は、肺組織中のα1（I）コラーゲンmRNAの発現レベルにおいて抗線維化特性を持つ有益な化合物である。
【０１０２】
組織学的評価
対照動物からの肺は組織学的に正常であった。ブレオマイシンの投与は、細気管支周囲及び間質への炎症細胞（大部分がマクロファージ及びリンパ球を含む単核細胞であり、少数の好中球及び散在性の好酸球を含む）の浸潤が顕著な領域を含む特徴的な組織学的病変、槽間中隔の広範な細胞肥厚、間質性浮腫及び線維芽細胞の出現を伴う間質細胞の増加をもたらした。病変の分布のパターンは、多巣性であった（すなわち、斑状の肺線維化領域）。多巣性の実質病変部も存在したが、F-1394による処置は肺の形態変化を顕著に減少させ；炎症性浸潤はより少なく、コラーゲン沈着はより少なく、そして中隔の拡大はより少なかった（図６）。Aschcroftスコアの顕著な低下がみられた（図７）。類似の結果がN-アセチルシステイン（NAC）についても得られた。
【０１０３】
実施例４：マウスの片側性尿管閉塞におけるF-1394の効果
片側性尿管閉塞（UUO）は、尿細管間質性線維症に導く閉塞性腎症の様々な特徴を模倣する、確立された加速実験モデルである。その迅速性及び高い再現性によって、このモデルは間質性コラーゲンの蓄積の予防における原型ACAT阻害剤としてのF-1394使用についての概念実証を迅速に提供するために使用された。
【０１０４】
本試験の目的は、間質性線維性コラーゲン沈着全体に対するF-1394による予防的処置の効果をシリウスレッドを用いる組織化学によって評価することであった。F-1394の効果は、閉塞された腎臓部分表面全体に対して特異的に染色された領域を相対的に定量することによって評価した。
【０１０５】
材料及び方法
動物
実験開始時に２５〜３０ｇの体重であった雄性C57BL/6Jマウスを使用した。マウスは一群５匹でポリプロピレン製のケージ中の木屑の上で飼育され、餌（Teklad（商標）5018；HARLAN,Gannat, France）及び水にはアクセス自由であった。動物のハウスは、７：００〜１９：００の間の人工の照明（１２時間）、制御された２０±１℃の周囲温度、そして６０％に維持された相対湿度下に維持した。マウスを断頭によって屠殺した。動物は剖検に供さなかった。
【０１０６】
試験材料
F-1394投与製剤を２つの異なる方法で調製し；２００mg/kg溶液は１％Tween80及び０．５％CMCを用いて、３００mg/kg溶液は０．５％CMCのみを用いて調製した。F-1394を最初の１０日間は２００mg/kg/日の投与量で、そしてプロトコールの残りの５日間は３００mg/kg/日で経口投与した。カプトプリル（Sigma-Aldrich, St.Louis, USA）を１％Tween80及び０．５％CMCに溶解し、そして３２mg/kg/日の投与量で１５日間経口投与した。
【０１０７】
主要装置
形態学的測定は、顕微鏡（Eclipse 600（商標）、NikonInstruments; Champigny sur Marne, France）及び２０×の対物レンズ（最終較正０．３６６μm/ピクセル）を備えたデジタルカメラ（MicroFire （商標）、Optronics；Avanex, Nozay, France）を介して観察した、シリウスレッドで染色された部分のコンピュータ化画像分析に基づいた。写真の定量分析は、ExploraNova MorphoLite（商標）及びExpert（商標）ソフトウエア（La Rochelle, France）を用いて実施した。
【０１０８】
実験プロトコール
それぞれマウス１０匹の４つの実験群を用いた：
１）偽手術されたマウス
２）ビヒクル（０．１％Tween80／０．５％CMC）で処置した閉塞マウス
３）F-1394で処置した閉塞マウス
４）カプトプリルで処置した閉塞マウス
経口処置は１５日間、そして閉塞は１４日間持続した。
【０１０９】
実験的片側性尿管閉塞症
片側性尿管閉塞は、Schanstra et al., 2002に記載されたとおりに実施した。すなわち、マウスを酸素−イソフルランの混合物（０．２L/分及び２％イソフルラン；Centravet, Lapalisse, France）で麻酔した。マウスの一番下の左肋骨末端から１cmのところで５mmの表皮切開を実施し、その後、５mmの筋肉切開を実施した。左尿管を露出し、そして腎盂尿管移行部で結紮（6/0カルディオニール縫合糸；Peters Surgical, Bobigny, France）した。そして、筋肉壁を閉じ（5/0エチコン縫合糸；Ethicon, Auneau, France）、そして表皮壁を縫合クリップで閉じた。手術の間中、動物は３５℃のホットプレート上に設置した。
【０１１０】
餌及び水は自由摂取させた。UUOの一日前に経口処置を開始し、閉塞は１４日間持続した。プロトコールの最後に、マウスを断頭によって屠殺し、閉塞した腎臓を取り出し、組織学的分析及びさらなる遺伝子発現分析の準備のために分割した。
【０１１１】
組織学的分析
閉塞した腎臓を取り出した後、組織学に使用する中心の断片を標準的手順にしたがって、カルノア溶液中で２４時間固定して、パラフィン中に包埋した。３〜４μmの厚さの組織学用横断面切片を作製し、線維性コラーゲン沈着全体の評価のためにシリウスレッドで染色した。
【０１１２】
切片を脱パラフィンし、再水和し、そして、飽和ピクリン酸水溶液中の０．１％シリウスレッドF3B（商標）（BDH Laboratory; VWR, Fontenay sous Bois, France）で１時間染色し、０．０１N のHCl中で１分間差異化し、迅速に脱水して標本にした。全皮質領域又は所与の部分のいずれかの中の染色された組織の面積を測定することによって、尿細管間質の線維性コラーゲン表面を決定した。糸球体及び脈管構造は、本試験における評価から除外した。
【０１１３】
記録分析
分析は、各腎臓部分の由来を知らないオペレーターが実施した。所与の画像内から選択された対象を二重盲検定量化したものを、ExploraNova（商標）ソフトウエアと組み合わせたMicrosoft Excelファイルに記録した。組織学的コードの除去は、結果の分類のために記録の最後に行った。結果は、試験した全領域に対する線維化のパーセンテージ（％）
として表した。
【０１１４】
結果の分析及び表現
結果を平均±平均の標準誤差（SEM）で表した。その後にすべてのカラム対の比較のためのNewman-Keuls検定（GraphPad Prism, San Diego,USA）が続く、一元配置ANOVAを群内の差異の比較のために使用した。P<０．０５の場合に有意であると認めた。
【０１１５】
結果及び検討
UUO誘発性の細尿管間質性線維症に対するF-1394及びカプトプリルの効果
間質の線維化は、ビヒクルで処置されたUUO群において偽手術された動物と比較して顕著に高く（図８）、それぞれ、腎臓の部分の１３．３６±０．６０％及び０．２６±０．０３％を表す間質性コラーゲンが発現した（n＝１０、ｐ＜０．００１、Newman-Kleus検定を伴うANOVA）。この効果は、先の文献（Schanstra et al, 2003及び2002）に合致している。
【０１１６】
F-1394は、ビヒクル群に比べてUUO誘発性の細尿管間質性線維症を減少させた（F-1394及びビヒクル群それぞれにおいて、５．４３±０．２９％対１３．３６±０．６０％、n=１０、ｐ＜０．００１、Newman-Keuls検定を伴うANOVA）。カプトプリル処置は、UUO誘発性の細尿管間質性線維症を予想された減少に導いた（カプトプリル及びビヒクル群それぞれにおいて、２．８９±０．１２％及び１３．３６±０．６０％、n=１０、ｐ＜０．００１、Newman-Keuls検定を伴うANOVA）。
【０１１７】
これらの結果は、ACAT阻害剤の原型としてのF-1394がUUOモデルにおいて細尿管間質性線維症をカプトプリルに匹敵する有効性で減少させたことを示す。
【０１１８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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2010509247.tif 000018
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