(57)【要約】本発明は、候補薬としての化合物を特定する方法において、ａ．遺伝子ＧＹＰＣ、ＡＧＰＡＴ３、ＡＧＬ、ＰＶＲＬ２、ＨＭＧＢ３、ＨＳＤＬ２を発現する細胞に前記化合物を接触させるステップと、ｂ．前記化合物が、前記遺伝子の少なくとも１つの発現を調節するか分析するステップと、を具えることを特徴とする方法に関する。本発明は、候補薬としての化合物の特定方法において、ａ．ＬＤＢ２遺伝子を発現する細胞に前記化合物を接触させるステップと、ｂ．前記化合物がＬＤＢ２の発現を調節するか分析するステップと、を具えることを特徴とする方法に関する。本発明は、特定した上記化合物の使用を具える、アテローム性動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症関連疾患および炎症疾患の治療方法において有用な一般的に修飾された細胞および動物に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
候補薬としての化合物を特定する方法において、
ａ．遺伝子ＧＹＰＣ、ＡＧＰＡＴ３、ＡＧＬ、ＰＶＲＬ２、ＨＭＧＢ３、ＨＳＤＬ２を発現する細胞に前記化合物を接触させるステップと、
ｂ．前記化合物が、前記遺伝子の少なくとも１つの発現を調節するか分析するステップと、
を具えることを特徴とする方法。
【請求項２】
ステップｂが、前記遺伝子の少なくとも２つの発現調節を分析するステップを具えることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップｂが、ＣＤ３６およびＰＰＡＲαからなる群から選択される遺伝子の発現調節を分析するステップを更に具えることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
候補薬としての化合物を特定する方法において、
ａ．ＧＹＰＣ、ＡＧＰＡＴ３、ＡＧＬ、ＰＶＲＬ２、ＨＭＧＢ３、ＨＳＤＬ２からなる群から選択される遺伝子の遺伝子産物と前記化合物を接触させるステップと、
ｂ．前記化合物が前記遺伝子産物の生物学的活性を調節するか分析するステップと、
を具えることを特徴とする方法。
【請求項５】
前記分析が、前記遺伝子産物の生物学的活性の増大に対して行われることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記分析が、前記遺伝子産物の生物学的活性の減少に対して行われることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記生物活性が、アテローム性動脈硬化症またはアテローム性動脈硬化症関連疾患の発症または進行に関連した遺伝子の発現調節であることを特徴とする請求項４乃至６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記生物活性が、ＧＹＰＣ、ＡＧＰＡＴ３、ＡＧＬ、ＰＶＲＬ２、ＨＭＧＢ３、ＨＳＤＬ２、ＣＤ３６およびＰＰＡＲαからなる群から選択される遺伝子の調節であることを特徴とする請求項４乃至７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
候補薬としての化合物の特定方法において、
ａ．ＬＤＢ２遺伝子を発現する細胞に前記化合物を接触させるステップと、
ｂ．前記化合物がＬＤＢ２の発現を調節するか分析するステップと、
を具えることを特徴とする方法。
【請求項１０】
候補薬としての化合物の特定方法において、
ａ．ＬＤＢ２遺伝子の遺伝子産物と前記化合物を接触させるステップと、
ｂ．前記化合物がＬＤＢ２の生物活性を調節するか分析するステップと、
を具えることを特徴とする方法。
【請求項１１】
前記生物活性が、アテローム性動脈硬化症またはアテローム性動脈硬化症関連疾患の発症または進行に関連した遺伝子発現の調節であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記生物活性が白血球の経内皮移動であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
ａ．ＬＤＢ２、ＧＹＰＣ、ＡＧＰＡＴ３、ＡＧＬ、ＰＶＲＬ２、ＨＭＧＢ３、ＨＳＤＬ２、および、選択可能で、前記遺伝子の発現を調節する配列エレメント、からなる群から選択される遺伝子のコード配列を具えるＤＮＡ分子を得るステップと、
ｂ．細胞株またはヒト以外の胎児細胞など、宿主細胞に前記ＤＮＡ分子を導入して、前記ＤＮＡ分子を細胞発現させるステップと、
ｃ．前記化合物を前記宿主細胞に接触させるステップと、
ｄ．前記化合物が前記ＤＮＡ分子の発現または前記遺伝子産物の生物活性を調節するか分析するステップと、
を具えることを特徴とする請求項１乃至１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記分析するステップが、白血球の経内皮移動の分析を具えることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
アテローム性動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症関連疾患および炎症疾患からなる群から選択される疾患を治療するための候補薬としての化合物を特定するステップを特徴とする請求項１乃至１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記化合物が、有機低分子、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体および抗体フラグメント、ＤＮＡならびにｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡを含むＲＮＡなどの核酸、ＰＮＡなどの修飾された核酸、または、治療効果が向上するように修飾した化合物からなる群から選択されることを特徴とする請求項１乃至１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
アテローム性動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症関連疾患または炎症疾患の発症および／またはその結果に関した疾病素質を評価する遺伝学的マーカを特定する方法において、
ａ．集団における個人から、ＬＤＢ２、ＧＹＰＣ、ＡＧＰＡＴ３、ＡＧＬ、ＰＶＲＬ２、ＨＭＧＢ３、ＨＳＤＬ２遺伝子からなる群から選択される遺伝子の遺伝子変異を検出するステップと、
ｂ．前記個人におけるアテローム性動脈硬化症およびアテローム性動脈硬化症関連疾患の発症および／またはその結果に関する疾病素質の差異に、前記遺伝子変異を相関させるステップと、
を具えることを特徴とする方法。
【請求項１８】
前記遺伝子変異が遺伝子産物の発現を調節する変異であることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記遺伝子変異が、遺伝子産物の生物学的活性を調節する変異であることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
動物種の遺伝学的に修飾した細胞において、
ａ．ＬＤＢ２、ＧＹＰＣ、ＡＧＰＡＴ３、ＡＧＬ、ＰＶＲＬ２、ＨＭＧＢ３、ＨＳＤＬ２遺伝子からなる群から選択される遺伝子コード配列を含む異種ＤＮＡ分子を具えること、および／または、
ｂ．不活性化されたＬＤＢ２、ＧＹＰＣ、ＡＧＰＡＴ３、ＡＧＬ、ＰＶＲＬ２、ＨＭＧＢ３、ＨＳＤＬ２遺伝子からなる群から選択される遺伝子を有すること、
を特徴とする遺伝学的に修飾した細胞。
【請求項２１】
前記ＤＮＡ分子が、ＬＩＭドメイン結合タンパク質２をコードしており、および／または、前記群から選択された遺伝子がＬＤＢ２であることを特徴とする請求項２０に記載の遺伝学的に修飾された細胞。
【請求項２２】
前記動物種が哺乳類であることを特徴とする請求項２０または２１に記載の遺伝学的に修飾された細胞。
【請求項２３】
前記動物種が、ヒト、ヒト以外の霊長類およびげっ歯動物からなる群から選択されることを特徴とする請求項２０乃至２２のいずれか一項に記載の遺伝学的に修飾された細胞。
【請求項２４】
請求項２０乃至２３のいずれか一項に記載の細胞を具えることを特徴とする遺伝学的に修飾されたヒト以外の動物。
【請求項２５】
アテローム性動脈硬化症またはアテローム性動脈硬化症関連疾患を患っている、または、その発症の危険性のある患者の治療方法において、
遺伝子ＬＤＢ２、ＧＹＰＣ、ＡＧＰＡＴ３、ＡＧＬ、ＰＶＲＬ２、ＨＭＧＢ３、ＨＳＤＬ２からなる群から選択された遺伝子の原物または修飾された変異体、または、請求項１乃至１２のいずれか一項に記載の方法で特定された化合物を、前記患者に投与するステップを具えることを特徴とする方法。
【請求項２６】
投与される遺伝子が、ＬＩＭドメイン結合２をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項２５に記載の方法。  
【請求項２７】
前記化合物がｓｉＲＮＡであることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
アテローム性動脈硬化症またはアテローム性動脈硬化症関連疾患を患っている、または、その発症の危険性のある患者の治療方法において、
ＬＤＢ２、ＧＹＰＣ、ＡＧＰＡＴ３、ＡＧＬ、ＰＶＲＬ２、ＨＭＧＢ３、ＨＳＤＬ２からなる群から選択された遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ分子からなる群から選択される化合物を前記患者に投与するステップを具えることを特徴とする方法。
【請求項２９】
アテローム性動脈硬化症またはアテローム性動脈硬化症関連疾患を発症する危険性が平均値より低い対象を特定する方法において、
前記対象のＬＤＢ２遺伝子を分析するステップを具え、
ＬＤＢ２遺伝子中における１ヌクレオチド多型ｒｓ１０９３９６７３のＴマイナアレルの存在が、危険性が平均値よりも低いことを示していることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬剤開発の分野に関し、アテローム性動脈硬化症およびアテローム性動脈硬化症関連疾患、ならびに、炎症および血流から疾患組織への白血球の遊走、に関する治療効果を有する化合物のスクリーニングに関する。
【背景技術】
【０００２】
改善されたライフスタイルや、スタチンなどの有効な脂質低下剤にもかかわらず、冠動脈疾患（ＣＡＤ）は、主な健康への脅威である。ＣＡＤは、動脈壁組成物（細胞内および細胞外）を徐々に変性させる血液細胞およびその他の血漿成分を循環させるストレスによって、数十年に亘って進行する変性疾患であり、結果的に、アテローム性動脈硬化症プラークの形成につながる。アテローム性動脈硬化の進行速度は、環境圧力および個人の遺伝子構成の両方に相関する。ＣＡＤに対する環境圧力は、主に、空気伝播の汚染物質（たばこの煙を含む）、感染、食物摂取（カロリおよびコレステロール）、ならびに、特にストレスの度合および運動など行動要素によって、主に影響を受ける。個人的な遺伝的構成を介して現れる実質的な環境圧力は、血流および成分の変化によって影響される。数年に亘り、環境因子および生活様式因子は、組織の遺伝子発現を変化させる。肝臓のエネルギ代謝および炎症、脂肪または骨格筋に関連する遺伝子発現における変化は、ＣＡＤに特に関連していると考えられる。次に、遺伝子発現の変化は循環に関する影響を受け、上記組織で合成された代謝マーカおよび炎症マーカが検出される。従って、血漿成分（例えば、コレステロールおよびトリグリセリド）、血中グルコース濃度および血中インスリン濃度、Ｃ反応性タンパク質などの炎症マーカの測定は、高グリセリド血症、高コレステロール血症、インスリン抵抗性、糖尿病、炎症および免疫活性状態、ならびに、その他のＣＡＤの表現型を検出するのに標準的な方法である。上記成分や、血液および血漿のほとんど未だに特定されてない成分は、アテローム性動脈硬化の進行速度を決定する。ＣＡＤの危険性は、脂質、グルコースおよび炎症マーカの血漿濃度から、ならびに、血圧、ボディマス指数およびヒップとウエストの比率から、主に判定される。喫煙、高脂肪摂取および高カロリ摂取、運動不足など、生活様式の危険因子を改善することで、高血圧および高体重を低減でき、血中の危険因子に有利な効果がある。ＣＡＤ危険因子は緊密に相関しており、ほとんどの人々の生涯において議論されるが、重度のアテローム性動脈硬化は、通常、終盤に検出され、心筋梗塞（ＭＩ）、卒中またはその他の臨床症状となる。
【０００３】
アテローム性動脈硬化は、生涯に亘り進行する疾患であり、人口の５０％で臨床的に重要となり、心筋梗塞や卒中につながり、最終的に、死に到る。アテローム性動脈硬化の最初の発現は、動脈壁の脈管内膜の泡沫細胞の形成であり、これにより、脂肪線条が組織学的に出現する。簡単に言うと、循環リポタンパク質、主にＬＤＬは、内皮マトリックスに付着し、酸化修飾が生じ、最終的に、内皮細胞の遺伝子およびタンパク質発現を変化させる。これらの変化で、モノサイトが補充され、動脈壁の脈管内膜に移動し、マクロファージに分化して、修飾ＬＤＬをエンドサイトーシスする。これらの初期段階の次は、さらなる炎症および免疫反応が生じ、平滑筋細胞移動、線維症が生じ、アテローム性プラークおよびアポトーシスの形成が最高点に達する。これらの生物学的プロセスの相互作用およびまだ特定されていないおそらくその他の要因が、アテローム性動脈硬化の進行の根底にある。近年、血漿コレステロールを低下させるスタチン治療は、アテローム性動脈硬化の発症を予防するか、または、いくつかの場合においては、後退させる（１）。しかしながら、アテローム性動脈硬化生涯の発症の根底にある転写変化のレパートリーについては、ほとんど何も知られていなく（２）、動脈壁の遺伝子発現に関して、血漿コレステロールを低下するのに有益な効果についてはほとんど何もない。
【発明の概要】
【０００４】
ヒトゲノムのマッピングは、ゲノムに関する観点からＣＡＤなどの複雑な疾患を研究するための新規技術を急増させた。複雑な生体システムに備わる分子活動の完全なレパートリーを解明することによって、疾患の早期特定や、疾患の中心経路を標的とした新規な治療のために、上記の新規技術を使用することができる（３−５）。実際に、このことは、所定の経路または遺伝子の狭い観点からではなく、疾患につながる活性の全ての観点から、上記技術を用いて、以下の研究成果が、疾患の機構を特定することができることを意味する。全ての分子活性を測定することができるので、治療のために最も中心的に発現する分子は、ターゲットとして最も高くランク付けされ、候補駆動仮説（ｃａｎｄｉｄａｔｅ−ｄｒｉｖｅｎ  ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ）に基づいて予め選択されたデータによって特定される全てのターゲットの病歴（ｈｉｓｔｏｒｙ）とは対照的である。この病歴バイアスは、臨床実験の後期（フェーズＩＩおよびＩＩＩ）で、しばしば、多くのターゲットが失敗することの原因であろう。ここで示される新規に特定されたターゲット遺伝子は、アテローム性動脈硬化症およびその関連疾患の可能性のある全てのターゲットに関連して、高ランクに基づいて選択された新規な世代のターゲットである。
【０００５】
主にマウスの研究で見つかった、本明細書に挙げられたターゲット遺伝子は、独自のマウスモデルを使用して特定されており、このマウスモデルにおいて、血漿コレステロールは、成熟マウスのライフで所定の時間点で活性化される肝臓の「遺伝子スイッチ」を用いて低下できる（９）。血漿コレステロールを低下させるのは、アテローム性動脈硬化の進行を停止させる今日の最も効率的方法である。残念ながら、人口の少数（＜１０％）のみが、血漿コレステロールを下げる治療を受けられる。このマウスモデルを用いて、本発明者らは、血漿コレステロールの低下に反応して、アテローム性動脈硬化症を予防する有益な効果をインターベンションする遺伝子ターゲットを同定した。従って、これらのターゲットは、アテローム性動脈硬化症に苦しむ多くの患者に作用するのに有効であり、高濃度の血漿コレステロールも低下する。直接標的を補足する化合物を開発するために、特定された分子は、上記患者のアテローム性動脈硬化症の進行を予防または後退を補助する。
【０００６】
ヒトの研究によって見つかったターゲット遺伝子は、白血球の経内皮移動が、内臓脂肪および動脈壁の生物学的プロセスであり、これが、アテローム性動脈硬化症の進行に関係することを示した。このプロセスは、全ての炎症反応で一般的であり、従って、特定されたターゲット（すなわち、このプロセスに応答する遺伝子）は、リウマチ様関節炎、炎症性腸疾患、アルツハイマ疾患など、アテローム性動脈硬化症以外のその他の炎症性疾患を予防するのに有用である。ヒトで行われる本発明につながる研究の他の側面は、疾患のある動脈壁（すなわち、アテローム性動脈硬化症の動脈壁）にのみ見られるのではなく、肝臓、骨格筋および内臓脂肪にも見られる。このような複数組織でのスクリーニングは、アテローム性動脈硬化症の発症に影響を与える可能性のある全ての組織に対する疾患自体の分子活性のレパートリ全体を超えて、推定上のターゲットの範囲を拡大させる。本発明は、白血球の経内皮移動に関与する１２９の遺伝子を含む（表８）。この出願の焦点は、１２９のうちの１２２の高い階層のレギュレータであることがわかったＬＤＢ２であり、従って、インターベンションに適した適宜なターゲットである。
【０００７】
本発明は、特に、ＬＤＢ２、ＧＹＰＣ、ＡＧＰＡＴ３、ＡＧＬ、ＰＶＲＬ２、ＨＭＧＢ３およびＨＳＤＬ２など、表４および表８に開示されている遺伝子と、アテローム性動脈硬化症およびその関連疾患との関係に関する発見に基づいている。
【０００８】
第１の側面においては、候補となる薬としての化合物を特定する方法に関し、当該方法は、特に、ＬＤＢ２、ＧＹＰＣ、ＡＧＰＡＴ３、ＡＧＬ、ＰＶＲＬ２、ＨＭＧＢ３およびＨＳＤＬ２など、表４および表８に開示されている遺伝子からなる群から選択される遺伝子を発現する細胞に、前記化合物を接触させるステップと、前記化合物が、前記遺伝子の少なくとも１つの発現を調節するか分析するステップと、を具える。
【０００９】
発現の調節は、転写されたｍＲＮＡ量、生成された遺伝子産物の量、遺伝子産物の活性の測定、または、導入したレポータの測定など、当業者に入手可能な適宜な直接的手段または間接的手段によって、未処置のコントロールの基準レベルに対して、測定した。
【００１０】
この側面によれば、本発明の一実施例において、分析は、前記遺伝子の少なくとも２つの発現の調節の分析を具える。更なる実施例において、この分析は、ＣＤ３６およびＰＰＡＲαからなる群から選択される遺伝子発現の分析を更に具える。
【００１１】
第２の側面において、本発明は、候補薬としての化合物を特定方法に関し、当該方法は、特に、ＬＤＢ２、ＧＹＰＣ、ＡＧＰＡＴ３、ＡＧＬ、ＰＶＲＬ２、ＨＭＢＧ３、ＨＳＤＬ２など、表４および表８からなる群から選択された遺伝子の遺伝子産物と、前記化合物を接触させるステップと、前記化合物が前記遺伝子産物の生物学的活性を調節するか分析するステップと、を具える。
【００１２】
この側面において、調節は、活性を増加または低減させる。通常、この活性は、例えば、ＬＤＢ２、ＧＹＰＣ、ＡＧＰＡＴ３、ＡＧＬ、ＰＶＲＬ２、ＨＭＧＢ３、ＨＳＤＬ２、ＣＤ３６およびＰＰＡＲαからなる群から選択される遺伝子や白血球の経内皮移動など、アテローム性動脈硬化症またはその関連疾患の発症または進行を示唆する遺伝子産物または遺伝子発現の調節に関連した活性である。
【００１３】
さらなる側面において、本発明は、上述の側面のいずれかによる方法に関しており、当該方法は、
ＬＤＢ２、ＧＹＰＣ、ＡＧＰＡＴ３、ＡＧＬ、ＰＶＲＬ２、ＨＭＧＢ３、ＨＳＤＬ２、および、選択可能に、前記遺伝子を調節する配列エレメント、からなる群から選択されるＤＮＡ分子を得るステップと、
細胞株やヒト以外の胚など、宿主細胞に前記ＤＮＡ分子を導入し、前記ＤＮＡ分子を細胞発現させるステップと、
前記宿主細胞を前記化合物に接触させるステップと、
前記化合物が、前記ＤＮＡ分子の発現、または、前記遺伝子産物の生物学的活性を調節するか分析するステップと、を具える。
【００１４】
この側面による方法の分析ステップは、白血球の経内皮移動の分析を具える。
【００１５】
上記側面による方法の好ましい実施例において、この方法は、アテローム性動脈硬化症およびその関連疾患からなる群から選択される疾患の治療用の、候補薬としての化合物の特定に関する。
【００１６】
上述した側面において、候補として同定された化合物は、有機低分子、ペプチド、ポリペプチドすなわちタンパク質、ｓｉＲＮＡやｍｉＲＮＡを含むＤＮＡやＲＮＡなどの核酸、ＰＮＡなどの修飾された核酸、医薬組成物に組み込まれるその他の化合物である。
【００１７】
さらなる側面において、本発明は、アテローム性動脈硬化症と、冠動脈疾患、卒中および心筋梗塞または炎症疾患などアテローム性動脈硬化症関連と、の疾患の発症および／またはその結果に対して、疾病素質を評価する遺伝子マーカを特定する方法に関し、当該方法は、集団における人々の間において、特に、ＬＤＢ２、ＧＹＰＣ、ＡＧＰＡＴ３、ＡＧＬ、ＰＶＲＬ２、ＨＭＧＢ３、ＨＳＤＬ２など、表４および表８に開示される遺伝子からなる群から選択される遺伝子における遺伝子変異を検出するステップと、前記人々の間において、アテローム性動脈硬化症およびその関連疾患の発症および／またはその結果に対して、疾病素質の差に対する遺伝子変異を相関させるステップと、を具える。
【００１８】
本発明のこの側面においては、遺伝子変異は、例えば、遺伝子の発現または遺伝子産物の活性を増大または低下させるように調節する遺伝子変異でもよい。
【００１９】
さらなる側面においては、本発明は、遺伝学的に修飾された細胞および動物に関し、当該細胞および動物は、特に、ＬＤＢ２、ＧＹＰＣ、ＡＧＰＡＴ３、ＡＧＬ、ＰＶＲＬ２、ＨＭＧＢ３、ＨＳＤＬ２など表４および表８に開示された遺伝子から習う群から選択される遺伝子のコーティング配列を含む異種ＤＮＡ分子を具え、および／または、不活性化された上記遺伝子の１つを有する。「ノックアウト」動物は、当分野で周知であり、商業ベースで必要に応じて作製される。遺伝子の不活性化は、１００％を必要としない；ノックアウト動物の表現型が、関連実験で使用できる範囲で遺伝子を不活性化させるので十分である。遺伝子産物の発現を調節可能な調節配列とともに、ノックアウト遺伝子のコード配列を具えた異種ＤＮＡ分子を動物に導入することも可能である。
【００２０】
この側面において、動物は、ヒト以外の動物でもよく、好ましくは、霊長類などの哺乳類か、マウスやラットなどのげっ歯動物である。遺伝学的に修飾した細胞は、どの起源のものでもよく、当分野の当業者は、適宜な発現系を決定できる。この側面による、遺伝学的に修飾された細胞および動物は、候補薬としての化合物を特定する上記方法に使用される。
【００２１】
この側面の一実施例においては、異種ＤＮＡ分子は、特に、ＬＤＢ２、ＧＹＰＣ、ＡＧＰＡＴ３、ＡＧＬ、ＰＶＲＬ２、ＨＭＧＢ３、ＨＳＤＬ２など、表４および表８に開示された遺伝子からなる群から選択される遺伝子の調節配列を更に具える。
【００２２】
更なる側面において、本発明は、アテローム性動脈硬化症と、冠動脈疾患、卒中および心筋梗塞または炎症疾患など、アテローム性動脈硬化症関連疾患に苦しむ患者、または、発症する危険性のある患者の治療方法に関し、当該方法は、特に、ＬＤＢ２、ＧＹＰＣ、ＡＧＰＡＴ３、ＡＧＬ、ＰＶＲＬ２、ＨＭＧＢ３、ＨＳＤＬ２など、表４および表８に開示された遺伝子からなる群から選択される遺伝子のオリジナルまたは修飾バリアント、あるいは、上述した側面による本発明で特定した化合物、を前記患者に投与するステップを具える。
【００２３】
更なる側面において、本発明はアテローム性動脈硬化症またはその関連疾患に苦しむ患者または発症する危険性のある患者の治療方針に関し、当該方法は、ＬＤＢ２、ＧＹＰＣ、ＡＧＰＡＴ３、ＡＧＬ、ＰＶＲＬ２、ＨＭＧＢ３、ＨＳＤＬ２からなる群から選択される遺伝子をターゲットとするｓｉＲＮＡ分子から構成される群から選択される化合物を、前記患者に投与するステップを具える。
【００２４】
さらに、この側面は、ＬＤＢ２、ＧＹＰＣ、ＡＧＰＡＴ３、ＡＧＬ、ＰＶＲＬ２、ＨＭＧＢ３、ＨＳＤＬ２、選択可能で、薬学的に許容されるキャリア、賦形剤、希釈剤など、からなる群から選択された遺伝子をターゲットとするｓｉＲＮＡ分子を具える医薬組成物を包含する。上記ｓｉＲＮＡ分子は、さらに、摂取量の上昇、インビボの半減期の延長など、特性を向上させるために修飾されてもよい。
【００２５】
更なる側面においては、本発明は、アテローム性動脈硬化症またはその関連疾患を発症する平均的リスクよりも低い対象を特定する方法に関し、当該方法は、前記対象のＬＤＢ２遺伝子を分析し、１のヌクレオチドのＴマイナーアレル（ｍｉｎｏｒ  ａｌｌｅｌｅ）存在下で、ＬＤＢ２遺伝子の多型ｒｓ１０９３９６７３は、平均的なリスクよりも低いことを示唆した。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ピンアウトした大動脈をスダン（Ｓｕｄａｎ）ＩＶ染色で評価したＬｄｌｒ−／−Ａｐｏｂ１００／１００Ｍｔｔｐｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスのアテローム性動脈硬化症の進行度合。２０週（ｎ＝１２）、３０週（ｎ＝２５）、４０週（ｎ＝１５）、５０週（ｎ＝１５）および６０週（ｎ＝１０）のアテローム性動脈硬化症のボックスプロット。Ｐ＜０．０５、２０週対３０週；Ｐ＜０．０００１、３０週対４０週；Ｐ＜０．０２、４０週対５０週。値は、大動脈全体の割合としての表面の病変である。ボックスは、百分位数の７５位から２５位の間の値を包含し、バーは、百分位数の９０位から１０位の間の値を示し、黒色のドットは、これらの境界の外で観察される個人を示す。
【図２】アテローム性動脈硬化症細胞タイプの細胞特異的なマーカーの相対発現レベル。細胞タイプあたりのマーカー数を示す。統計学的に有意のある増加は、泡沫細胞の数であり、２０週乃至３０週（Ｐ＜０．００１）の間で２０％増加し、６０週まで上昇を維持した。
【図３】病変の進行に関する血漿コレステロール低下の効果。病変表面積を、分岐点から大動脈根まで、ピンアウトした大動脈の総面積に対する、病変領域の割合を判定した。２８週齢で、マウスは、ｐＩ−ｐＣの腹膜内注射を受け、肝臓のＭｔｔｐの組み替えを誘導し、コレステロールが低下して１２週後または１週間後に屠殺した。高コレステロールコントロールマウスにＰＢＳを注射した。（Ａ）４０週齢で、低血漿コレステロールのマウスの病変表面（すなわち、ｐＩ−ｐＣ処理、ｎ＝７）は、進行せず、４０週で高コレステロールのコントロール（すなわち、ＰＢＳ処理、ｎ＝６）とは大きく異なった（＊ｐ＜０．００５）。（Ｂ，Ｃ）１週間の低レベルのコレステロール（３０週齢マウス）は、（Ｂ）病変寸法（Ｐ＝０．９６）に影響を与えなかった。病変領域における相対変化の割合を示す。（Ｃ）泡沫細胞の数（Ｐ＝０．５２）、内皮細胞の数（Ｐ＝０．１８）（ＳＭＣ）およびＴ細胞（Ｐ＝０．３４）。
【図４】泡沫細胞形成の調節遺伝子ネットワーク。１２のコレステロール応答性アテローム性動脈硬化症遺伝子は、ｓｉＲＮＡを用いてＴＨＰ−１マクロファージで捕捉した。トランスフェクションして２日後、ｓｉＲＮＡ標的マクロファージと、非特異的ｓｉＲＮＡで処置したコントロールとを、４８時間、ＡｃＬＤＬ（５０μｇ／ｍＬ）でインキュベートした；総ＲＮＡを単離し、ＣＥおよび脂質蓄積を測定した。（Ａ）１２ｓｉＲＮＡ実験からの１６の発現プロファイル（ＨＧ−Ｕ１３３＿Ｐｌｕｓ＿２ａｒｒａｙｓ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）と、４つのプールされたコントロールを使用して、ＰＰＡＲａおよびＣＤ３６を含む泡沫細胞形成に関与する８つのコレステロール応答遺伝子の調節遺伝子ネットワークを生成した。（Ｂ）ＣＥ蓄積は、８遺伝子のうちの５つのｓｉＲＮＡ阻害によって減少し、その他の２つの阻害によって上昇した；１つの遺伝子の阻害は、効果がなかった（表２参照）。
【図５】冠動脈狭乍症、頸動脈狭乍症、白血球経内皮移動経路ののベン図（Ｖｅｎｎ  ｄｉａｇｒａｍ）。表７のクラスタによって示される遺伝子のベン図。７つの遺伝子が、アテローム性動脈硬化症大動脈根／ＩＭＡクラスタおよび縦隔脂肪クラスタの双方で発見され（Ｐｃ＜７×１０−１０）、１７個が、アテローム性動脈硬化症大動脈根／ＩＭＡクラスタおよび頸動脈クラスタで発見され（Ｐｃ＜１×１０−３０）、１６個が、縦隔脂肪クラスタおよび頸動脈クラスタで発見された（Ｐｃ＜９×１０−２７）。６つの遺伝子は、３つのクラスタで発見された（Ｐｃ＜７．１５×１０−２３）。３つのクラスタの統合は、１２９遺伝子だった。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明は、アテローム性動脈硬化症の発症の間、ゲノム中の全遺伝子の活性およびその活性プロファイルの情報を有している、マウスおよびヒト由来の転写データのクラスタアルゴリズムステートを使用した、システム生物学的プロセスに基づいている。対象となる遺伝子を最初に選択するのが一般的な当分野の標準的技術と対照的に、この方法によって本発明者らは、アテローム性動脈硬化症に関する全ての遺伝子について偏見のない調査が可能となった。他の見解においては、この方法によって本発明者らは、アテローム性動脈硬化症に対する重要度の順番において、全てのヒト遺伝子を格付けすることができるようになった。この方法はさらに、下記の２つの実験例で説明される。
【００２８】
実験例１においては、本発明者らは、アテローム性動脈硬化症病変の急速な拡大の前に、血漿コレステロールを低下することで、アテローム性動脈硬化症病変のさらなる拡大を阻止したことを示し、この効果を仲介する遺伝子（すなわち、ターゲット）を特定した。本発明者らが使用したバイオインフォマティクスの方法論（すなわち、リバースエンジニアリング）によって、コレステロール応答性アテローム性動脈硬化症ターゲット遺伝子の遺伝子ネットワークを構築した。スタチンの投与など、血漿コレステロールを低下させる治療の有益な効果は、少なくとも部分的にこの遺伝子ネットワークの作用を介してなされる。従って、本発明は、どのように候補薬が、アテローム性動脈硬化症またはその関連疾患の発症および／または進行を阻止、または、さらには後退させるかに関して、血漿コレステロール調節遺伝子ネットワークの効果に対する候補薬をスクリーニングする方法に関する。この方法が機能する検証として、ネットワーク中の個々の遺伝子を標的にするｓｉＲＮＡ分子を使用して、遺伝子の発現を調節した。遺伝子発現の調節によって、アテローム性動脈硬化症の進行に不可欠なプロセスである、マクロファージ中のコレステロールエステルの蓄積に効果があることがわかった。
【００２９】
実験例２においては、本発明者らは、複数組織の全ゲノム発現プロファイリングを使用して、アテローム性動脈硬化症およびその関連疾患に関する全ての分子活性を特定した。全患者の４つの異なる組織にわたって、同様の発現パターンを有する遺伝子を特定するクラスタアルゴリズムを使用して、本発明者らは、全部で６０のクラスタを特定した。この中で、３つは、アテローム性動脈硬化症の内容と関連していることがわかった。これらの３つのクラスタは合わせて１２９の遺伝子を示し、その大半は、内皮細胞を介した疾患組織への白血球移動の役割があった。このプロセスは、肝臓や骨格筋ではなく、動脈壁に活性がある場合のアテローム性動脈硬化症の程度に関連している。これらの発見は、頸動脈（頭部の動脈）のアテローム性動脈硬化症に苦しむ患者群の検証で再現された。１２９遺伝子の内の１２２は、共通のレギュレータ；ＬＩＭドメイン結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）２（ＬＤＢ２）を有することがわかった。この高い階層のレギュレータは、アテローム性動脈硬化症およびその関連疾患の発病度（ｓｅｖｅｒｉｔｙ）の調節に関与していた。１ヌクレオチド多型のＴマイナアレル、ＬＤＢ２中のｒｓ１０９３９６７３は、心筋梗塞の生存者で過小評価されていて、ＬＤＢ２ｍＲＮＡおよび冠動脈に関しては逆であった。従って、このＳＮＰは、冠動脈のアテローム性動脈硬化症のリスクを低減するための遺伝子マーカーとして使用した。
【００３０】
白血球の移動は、炎症反応の必須経路であるので、このプロセスのレギュレータとしてＬＤＢ２の本発明は、アステローム性動脈硬化症以外の他の炎症関連疾患のマーカー、および／または、治療ターゲットと密接な関係がある。
【００３１】
本願に開示されている新規な遺伝子ネットワークおよび高い階層のレギュレータＬＤＢ２は、アテローム性動脈硬化症またはその関連疾患の疾病素質、または、上記疾患の発症または結果の予見に関する、遺伝子マーカーを特定する新たな可能性を提供する。従って、本発明は、アテローム性動脈硬化症またはその関連疾患を患う患者の遺伝子型を、上記疾患に患っていない対象と比較することによって、上記遺伝子マーカーを特定する方法に部分的に関する。ＬＤＢ２の場合は、アテローム性動脈硬化症以外の他の炎症関連疾患に関する。
【００３２】
本発明は、さらに、１つはマウス、１つはヒトの、２つの発現プロファイルの調査を記載しており、特定した遺伝子と、アテローム性動脈硬化症およびその関連疾患と、の関連を示している。これらの調査は、本発明を例示し、実証するのに役立つが、添付の請求項によって規定される本発明の範囲を限定するものと考えるべきでない。本発明を実施する場合、当分野の当業者であれば、薬化学、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、トランスジェニック動物、組み替えＤＮＡ技術分野の従来技術を使用できるであろう。これらは、以下のものに記載される：Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ”３ｒｄ  ｅｄ．２００１；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．“Ｓｈｏｒｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ”５ｔｈ  ｅｄ．１９９５；“Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｔａｙｌｏｒ（ｅｄｓ．）．“ＰＣＲ２：Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ”１９９５；“Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（ｅｄｓ．）”“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ”１９８８；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（ｅｄ．）“Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌ  ｃｅｌｌｓ”４ｔｈ  ｅｄ．２０００；Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．“Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９９４；または、これらの以降の版。
【００３３】
実験例１：コレステロール応答アテローム性動脈硬化症ターゲット遺伝子を特定するための転写プロファイリングおよび血漿コレステロールの遺伝学的低下
アテローム性動脈硬化症の進行の転写表現型は、ほとんど知られていない。我々は、ヒト様（ｈｕｍａｎ−ｌｉｋｅ）高コレステロール血症を患い、肝臓のリポタンパク質の生成を遮断（ｔｕｒｎ  ｏｆｆ）遺伝子スイッチを有するアテローム性動脈硬化症を起こしやすいマウスで、１０週間、病変進行の転写プロファイリングを行った。我々は、アテローム性動脈硬化症が最初はゆっくりと進行し、脂肪線条がプラークに移行した後、急速に拡大し、進行した病変が形成された後、安定することを示した。１２５９遺伝子の活性（３２９はアテローム性動脈硬化症に予め関連のある）は、この展開（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）で実行された４つの異なる発現クラスタが形成された。病変の初期段階で、マウスの血漿コレステロールを遺伝学的に低下させることで、明確な転写応答があり、急速な拡大とプラークへの移行を阻止することができる。３７のコレステロール応答遺伝子（表４）を同定し、その９０％以上が、アテローム性動脈硬化症とは前述の関係性がなかった。６つのサイレンシング干渉ＲＮＡを介した１０のコレステロール応答遺伝子の阻害において、ＴＨＰ−１マクロファージからの泡沫細胞の生成にも影響が出た。従って、病変進行の転写表現型と、血漿コレステロールの低下に伴う阻害を注意深く調査することで、コレステロール応答アテローム性動脈硬化症ターゲット遺伝子を特定することができた。
【００３４】
アテローム性動脈硬化症は、人口の５０％で臨床的に重要となる進行性の疾患であり、心筋梗塞や卒中となり、最終的には死に到る。近年、血漿コレステロールを低下させるスタチン治療が、アテローム性動脈硬化症の発症を阻止または場合によっては後退させることが示されている。しかしながら、アテローム性動脈硬化症の病変進行中の転写変化のレパートリについては知られていることは極わずかで、動脈壁遺伝子発現の血漿コレステロール低下の有益な効果についてはほとんど何も知られていない。ヒト（６，７）およびマウス（８）のゲノムプロジェクトの結果、開発された全ゲノム測定技術によって、アテローム性動脈硬化症などの複雑な疾患に関連した発現変化のレパートリ全体を解明する機会が提供された。我々は、Ｌｄｌｒ−／−Ａｐｏｂ１００／１００Ｍｔｔｐｆｌｏｘ／ｆｌｏｘＭｘ１−Ｃｒｅマウスモデル（９）を研究し、病変進行、潜在的な転写表現型および血漿コレステロール低下の効果を調査した。これらのマウスは、家族性の高コレステロール血症（Ｌｄｌｒ−／−Ａｐｏｂ１００／１００）のものと同様の血漿リポタンパク質プロファイルを有し、肝臓でのリポタンパク質合成を切断するための遺伝子スイッチ（Ｍｔｔｐｆｌｏｘ／ｆｌｏｘＭｘ１−Ｃｒｅ）を有している。
【００３５】
アテローム性動脈硬化症の進行
１０、２０、３０、４０、５０および６０週齢でマウスを試験した。血漿コレステロールは、所定時間に亘りわずかに上昇したが、トリグリセリドおよびグルコースレベルは、有意には変化しなかった（表１）。病変領域および形態学的変化を、８７のＬｄｌｒ−／−Ａｐｏｂ１００／１００Ｍｔｔｐｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスで評価した（図１）。１０週で、スダンＩＶ染色のスポットを検出することがあったが（ｎ＝１０、図示せず）、２０週で全てのマウスで病変を検出した。病変の寸法は、２０週乃至３０週の間で約１．６％上昇し（Ｐ＝０．０５）、３０乃至４０週で約７．２％上昇した（Ｐ＜０．０００１）。２０週で、主な形態学的特徴は、脂肪線条だった（境界が拡散した赤い透明領域）；プラークは検出されなかった。しかしながら、３０週で、全てのマウスは、大動脈弓で小さなプラークを有し（境界のはっきりした赤い不透明な領域）、４０週で実質的に拡張した。５０および６０週で、プラークの成長は抑制された。所定期間に亘って病変の進行は、Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ染色の変化およびＣＤ６８抗原からの蛍光（図示せず）によって反映された。
【００３６】
アテローム性動脈硬化症の進行の転写表現型
次に、我々は、アテローム性動脈硬化症の進行中、組織学的変化の下での転写変化を特定した。マウスゲノム情報データベース（ｗｗｗ．ｊａｘ．ｏｒｇ参照）の１９，８７９遺伝子中、６．３％は、少なくとも１つの時間比較において、異なるように発現し（ＦＤＲ＜０．０５、未修正Ｐ＜０．００００８、ｎ＝１２５９）、３２９（２７％）は、アテローム性動脈硬化症に関連している。残りの７３％のうち、９５％はＧＯ分析によって周知の生物学的機能をもっていた。アテローム性動脈硬化症における確立した役割を有する遺伝子のうち、７８％は、少なくとも１つの時間比較において、異なる発現をした（Ｐ＜０．０５、ｎ＝８８／１１１）。
【００３７】
アテローム性動脈硬化症の進行中、遺伝子の発現パターンを明らかにするために、我々は、１２５９の異なる発現をする遺伝子のｍＲＮＡレベルのクラスタ解析を行った。４つの明らかなクラスタが生成された（表３）。クラスタ１（ｎ＝２３９）の遺伝子は、病変の急速な拡大中に活性化し（図１）、６０週に亘って活性を持続し、アテローム性動脈硬化症およびアテローム性動脈硬化症細胞タイプと予め関連のある遺伝子は、最も高い割合だった（表３）。クラスタ１の遺伝子のうち、８９％は、５倍上昇したマクロファージマーカーＣＤ６８を含む炎症細胞に関連しており、上昇したＣＤ６８の発現は、免疫組織化学的にも同定された（図示せず）。これらの発見と、８つのマクロファージマーカーの相対数の増加（図２）とを合わせると、クラスタ１の発現パターンが、病変マクロファージの増員と活性化に影響していることが強力に示唆される。遺伝子活性は、クラスタ２（ｎ＝３３１）の３０週、クラスタ４（ｎ＝３００）の４０週でピークであり、アテローム性動脈硬化症進行の最終段階で抑制された。これらのクラスタの遺伝子のうち、７３％は、アテローム性動脈硬化症またはアテローム性動脈硬化症細胞タイプと予め関連性はなかった。２０の転写因子（ＴＦ）のうち、１７は不活性であり、３つのみ活性があった。クラスタ２および４の機能に関する注釈は、平滑筋細胞の増殖および病変内への移動関する可能性を示唆する。クラスタ３（ｎ＝３３９）を特に明らかにした。これらの遺伝子のｍＲＮＡレベルは、３０週でピークであり、４０週で抑制され、アテローム性動脈硬化症病変の急速な拡大と一致した。さらに、このクラスタは、クラスタ２または４より多く、クラスタ１よりは少ないアテローム性動脈硬化症関連遺伝子を含んでおり、主にカルボン酸代謝および脂質代謝に関連した遺伝子からなっていた。このクラスタの１９の転写因子中のうちの１３は、ペルオキシソーム増殖因子活性化レセプタ（ＰＰＡＲ）、ＰＰＡＲａ、ＰＰＡＲｄおよびＰＰＡＲγ、ならびに、ステロール調節因子エレメント結合因子２など、脂質代謝およびエネルギ代謝でよく確立されたものだった。アポトーシスおよび細胞死は、クラスタ１ではなく、クラスタ２から４において、活性化プロセスがあった。この発見は、細胞死およびアポトーシスがアテローム性動脈硬化症進行の全てのフェーズで継続的プロセスである概念と一致した。
【００３８】
泡沫細胞の転写表現型
２０週から３０週の間で数が増大する（Ｐ＜０．００１；図２）泡沫細胞とは別に、他の主な病変細胞タイプ（すなわち、内皮細胞、平滑筋およびＴ細胞）の相対量は、細胞タイプ特異的な遺伝子マーカーのｍＲＮＡレベルによって示唆されるように、所定時間に亘って比較的安定であった。
【００３９】
３０週で、脂質が欠乏したマクロファージが増員し、４０週で拡張して脂質リッチになったことは、免疫組織化学的に証明された。
【００４０】
まとめると、遺伝子発現データは、脂質が欠乏したマクロファージが、病変発症の初期段階で徐々に蓄積されていき、３０週で十分な質量となり（図２）、炎症反応を誘発し（表３、クラスタ１）、泡沫細胞の脂質蓄積が増大し（表３、クラスタ３）、急激に病変が確拡張する（図１）ことを示唆している。泡沫細胞の脂質蓄積は、４０週まで維持された（表３、クラスタ３）。この炎症は、後期段階まで持続する（表３、クラスタ１）。クラスタ２および４は、アテローム性動脈硬化症に関連した新規なものである（表３）。
【００４１】
アテローム性動脈硬化症の進行におけるＬＤＬコレステロール低下の効果
次に、我々は、ポリイノシン酸ポリシトデシル酸（ｐｏｌｙｃｙｔｏｄｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）（ｐＩ−ｐＣ）で処置することで３０週齢マウスの血漿ＬＤＬコレステロールを徐々に低下させ、主に肝臓で、ＣｒｅトランスジーンのＭｘ１プロモータを誘導し、Ｍｔｔｐ（Ｌｄｌｒ−／−Ａｐｏｂ１００／１００Ｍｔｔｐ△／△）の組み替えが生じた；コントロールのマウスは、食塩水で処置した。これにより、アテローム性動脈硬化症病変の急速な拡大が先行するのと、所定時間に亘って病変および泡沫細胞で、特定されたアテローム性動脈硬化症遺伝子の発現パターンと、の理由から、我々は３０週の時点を選択した。血漿コレステロールレベルは、Ｍｔｔｐの組み替えに基づいて８０％以上低下し（４２７から５４±３１）、屠殺するまで１０週間このレベルを維持した。屠殺時には、これらのマウスの病変寸法は、増大せず、高コレステロールの４０週齢マウスよりも大幅に少なかった（図３Ａ、Ｐ＜０．００５）。従って、３０週での血漿コレステロールの低下は、高血漿コレステロールレベルのマウスで観察された、アテローム性動脈硬化症病変の急速な拡大を阻止した（約７．２％、Ｐ＜０．０００１；表１および図１）。
【００４２】
アテローム性動脈硬化症の転写表現型に関するコレステロール低下の効果
血漿コレステロール低下によって誘発される転写変化を特定するために、我々は再度、２８週齢のマウスで肝臓Ｍｔｔｐを組み替えたが、今回は、コレステロールの低下を達成（３０週）してから１週間でマウスを屠殺した。病変での遺伝子発現の変化を試験する前に、我々は、病変での発現に影響を与える他の可能性となる原因について試験した。まず、我々は、病変寸法および４つの主な細胞タイプの相対数が、コレステロールの低下した（Ｍｔｔｐ組み替え）ｐＩ−ｐＣ処置マウスに分化したマウスと、高コレステロール（Ｍｔｔｐインタクト）の食塩水処置のコントロールと、が異なるかどうか試験した。細胞タイプ特異的遺伝子マーカーの発現レベルによって示唆されるように、病変寸法（図３Ｂ）または細胞タイプの細胞数（図３Ｃ）に違いはなかった。これらの観察は、Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ染色した病変の組織学的様相と、ＣＤ６８の発現に関する病変の免疫組織化学的分析と、によって確認した（図示せず）。アテローム性動脈硬化症動脈壁中の３７の血漿コレステロール応答遺伝子の最も有意な変化は、表４に示す。
【００４３】
あらゆる遺伝子発現の変化が、コレステロールの低下ではなく、Ｍｘ−１  Ｃｒｅトランスジーンの肝臓での活性化に由来するという可能性を排除するために、我々は、Ｍｔｔｐプロモータおよびエキソン１（Ｌｄｌｒ−／−Ａｐｏｂ１００／１００Ｍｔｔｐｗｔ／ｗｔ）に隣接するｌｏｘＰサイトを欠損したマウスを飼育して、ｐＩ−ｐＣ処置マウスおよびＰＢＳ処置マウス（各々ｎ＝５）から単離した病変ＲＮＡの転写プロファイリングを行った。表４の遺伝子は、この比較において特定されたいくつかの有意に変化した動脈壁遺伝子の中にはなかった（図示せず）。
【００４４】
培養ＴＨＰ−１マクロファージ由来の泡沫細胞形成に対する遺伝子サイレンシング効果
いくつかの理由から、泡沫細胞形成は、３０週から４０週の間で病変の急速な拡大における重要な役割を果たしているように考えられる。第１に、病変の急速な拡大は、３０週で動脈壁のマクロファージ蓄積によって進行する（図２）。第２に、細胞内脂質代謝に重要な遺伝子を含む病変クラスタ３は、３０週で一過的に活性化された。第３に、炎症および免疫応答は、３０週の病変クラスタ１で活性化された。第４に、最も重要と思われるもので、泡沫細胞中の炎症および脂質ホメオスタシスで確立した役割を果たす転写因子が、４０週で不活性化された（ＰＰＡＲｓおよびＳＲＥＢＰ−２）。
【００４５】
３０週から４０週での病変の急速な拡大は、主に、３０週で存在する泡沫細胞の脂質充填によって生じる（表２のクラスタ１および２）。我々は、３０週で特定されたコレステロール応答遺伝子（表４）のいくつかがこのプロセスに必須ではないかと疑った。これを解決するために、我々は、泡沫細胞に関連しているか、周知のマクロファージ遺伝子（方法を参照）３７遺伝子のうちから１２個を選択した。これらの１２の遺伝子は、ＡｃＬＤＬとともに培養したＴＨＰ−１マクロファージのｓｉＲＮＡでターゲティングした。標的細胞からのｍＲＮＡを転写プロファイル（ｎ＝１５）にかけて、泡沫細胞形成の調節遺伝子ネットワークを参考文献（１１）に記載されるように推定した（方法を参照）。
【００４６】
標的遺伝子のうち８つは、共通の調節遺伝子ネットワーク（図４）に属し、ｓｉＲＮＡで効率的に阻害された（表２）。これらの遺伝子は、泡沫細胞形成を促進するＣＤ３６、および、泡沫細胞形成を阻止するＰＰＡＲａを含む。ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ様２（ＨＤＳＬ２）は、ＰＰＡＲａを上方制御し、ＣＤ３６を下方制御した。さらに、ポリオウィルスレセプタ関連２（ＰＶＲＬ２）もＣＤ３６を制御し、その発現を上昇させ、ＨＳＤＬ２を負の制御をして、従って、間接的にＰＰＡＲａの活性を抑制させる。この調節ネットワークのＣＤ３６およびＰＰＡＲａの調節から（図４Ａ）、我々は、ＰＶＲＬ２の阻害は、泡沫細胞形成を阻止し、ＨＤＳＬ２の阻害は、泡沫細胞形成を促進すると予測した。これらの予測を試験し、このネットワーク内の個々の遺伝子を阻害する効果を評価するために、我々は、コレステロール−エステル（ＣＥ）および脂質蓄積を測定した（図４Ｂおよび表２）。一般的に、このＣＥ測定は、我々の予測に間違いないことを示し、他のネットワーク遺伝子のいくつかは、ＴＨＰ−１マクロファージにおけるＣＥ蓄積にも影響を与えることを示した（図４Ｂ、表２）。
【００４７】
この実験においては、我々は、アテローム性動脈硬化症が緩やかに進行して、低レベルの炎症のみが存在する前の重要なポイントを特定した。その後、病変は急速に拡大し、炎症は顕著に増大する。炎症が、後期段階で持続すると、進行したプラークが形成され、病変は、１０週間の間、一過的に増大した。急速な病変の拡張は、主に、マクロファージの同等の急速なＣＥ蓄積によって生じた。少量の脂質とともにマクロファージは、アテローム性動脈硬化症の進行の初期段階で蓄積し、脂質の急速な蓄積および炎症が開始される臨界（ｃｒｉｔｉｃａｌ）密度に達する。この臨界点での血漿コレステロールの低下は、病変の急速な拡大および進行したプラーク形成を阻止する。コレステロール低下効果は、３７のコレステロール応答アテローム性動脈硬化症遺伝子によって少なくとも部分的になされる。ＡｃＬＤＬとともに培養したｓｉＲＮＡターゲットＴＨＰ−１マクロファージの転写プロファイリングによって、これらの遺伝子のいくつかを検証することで、泡沫細胞形成の調節遺伝子ネットワークを明らかにした。このネットワークの構造は、進行したプラーク形成を阻止する将来の治療のための優れたターゲットになりえる新規な候補遺伝子としてのＰＶＲＬ２およびＨＳＤＬ２を強調した。
【００４８】
アテローム性動脈硬化症病変の転写プロファイルを解釈しようする（２）。このような病変は、いくつかの細胞タイプを含んでおり、所定の細胞タイプの平均的なｍＲＮＡの役割は、疾患の進行とともに変化する。従って、ｍＲＮＡレベルの変化は、細胞ｍＲＮＡ濃度の実際の変化と、細胞タイプの混合物の変化と、の混合物を表している。さらに、増殖および分化の異なる段階の細胞（例えば、マクロファージの泡沫細胞への分化）が、所定の細胞タイプ内の問題に追加される。しかしながら、病変ｍＲＮＡの濃度は、生物学的プロセスおよび病変における活性化された経路の一般的な全体像（ｐｉｃｔｕｒｅ）を提供する。
【００４９】
病変ｍＲＮＡのクラスタの分析（表３）は、まず、マクロファージが動脈壁にゆっくり浸潤し、それから脂肪線条が形成されることを示している。次いで、特定の時間点でみられるように、これらの細胞は活性化され、炎症活性が爆発し、マクロファージにＣＥが急速に蓄積するとともに、進行したプラークが形成される。我々は、このトランスフォーメーションが、動脈壁のマクロファージの密度に関連している可能性があると考える。所定の密度で、マクロファージは、自身を刺激するだけでなく（自己分泌：ａｕｔｏｃｒｉｎｅ）、互いに刺激し（パラ分泌：ｐａｒａｃｒｉｎｅ）、炎症活性が爆発し、脂質吸収が増大する（１２）。このような機構がヒトにもある場合、アステローム性動脈硬化症進行を阻止または遅らせる治療のタイミングが重要となる。実際に、マウスでは、進行したプラークの形成は、急速に病変が拡大する直前に、遺伝学的に低下させることによって阻止された（図３Ａ）。
【００５０】
病変進行とは対照的に、病変の種々の細胞タイプの範囲と相対成分は、血漿コレステロールの亜急性（ｓｕｂａｃｕｔｅ）低下の前後で同様だった（図３Ｂ、Ｃ）。従って、ＧｅｎｅＣｈｉｐで測定したｍＲＮＡ濃度の変化は、細胞ｍＲＮＡレベルの実際の変化を反映しているようにみえる。マクロファージの脂質蓄積が、急速な病変の拡張における中心経路だったので、３７のコレステロール応答遺伝子のうちの１２個を、ＡｃＬＤＬとともに培養したＴＨＰ−１マクロファージのｓｉＲＮＡで確認した。８つの遺伝子は、ＰＶＲＬ２およびＨＳＤＬ２が中心的な役割を果たす共通の調節遺伝子ネットワークに属していることがわかった。ＰＶＲＬ２およびＨＳＤＬ２（それぞれ、ＰｕｂＭｅｄでヒットする６個および３個を生成した）についてほとんど知られていない。ＰＶＲＬ２の配列バリアントは、複数の硬化症の重症度と関連がある（１３）。ＨＳＤＬは、ステロール運搬体タンパク質２、すなわち、インビトロで膜間の脂質輸送を促進する小さな細胞内基本タンパク質ドメインをコードしている（１４）。調節遺伝子ネットワークによって示唆されるように（図４Ａ）、調節ネットワーク中のノード（すなわち、遺伝子）はいずれも、泡沫細胞形成を促進または阻害をせず、複雑な疾患における候補遺伝子の真の複雑さを理解して評価するために、遺伝子ネットワークを推定することの重要性が強調された（１１，１５）。
【００５１】
我々の発見は、血漿コレステロール低減剤を用いた干渉の時期が重要であることを示唆している。アテローム性動脈硬化症の合併症を発症するリスクのある患者には（例えば、卒中および心筋梗塞）、若年期に治療できる利点がある。初期のアテローム性動脈硬化症を検出する非侵襲性技術は、この点で重要である。その他のアテローム性動脈硬化症の危険因子を有する正常なコレステロールのヒトにとっては、血漿コレステロール低下の有益な効果を介在するアテローム性動脈硬化症遺伝子をターゲティングする新規な治療法は、有用である。
【００５２】
従って、本発明の１つの側面は、後期アテローム性動脈硬化症病変の進行を阻止する将来の治療のための、コレステロール応答遺伝子をターゲティングする候補薬としての化合物を特定するものである。この側面は、添付の特許請求の範囲でさらに規定する。
【００５３】
方法
マウスモデル
Ｌｄｌｒ−／−Ａｐｏｂ１００／１００Ｍｔｔｐｆｌｏｘ／ｆｌｏｘＭｘ１−Ｃｒｅマウスモデルは、アテローム性動脈硬化症の急速な進行が生じる、家系的な高コレステロール血症のものと同様の血漿リポタンパク質プロファイルを有する（９）。Ｍｔｔｐ欠損に関し、１日おきに６日間、マウスに５００μｌのｐＩ−ｐＣを注射し、Ｃｒｅ発現を誘導し、これによって、Ｌｄｌｒ−／−Ａｐｏｂ１００／１００Ｍｔｔｐｗｔ／ｗｔＭｘ１−Ｃｒｅマウスにおいて、Ｍｔｔｐ（Ｍｔｔｐ△／△）を組み替えるか、または、組み替えなかった。同腹子のコントロールは、ＰＢＳを摂取した（Ｍｔｔｐｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ）。これらの実験マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６（＜５％１２９／ＳｖＪａｅおよび＞９５％Ｃ５７ＢＬ／６）と５回戻し交配し、病原フリーのバリア施設（１２時間の明期／１２時間の暗期の周期）で飼育し、４％の脂質を含むげっ歯類の食餌を与えた。遺伝子型は、尻尾の組織診から得たゲノムＤＮＡを用いたポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によって決定した。血漿コレステロール濃度および血漿トリグリセリド濃度を、比色計アッセイ（Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ／ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ  ｋｉｔ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｔｒａｃｅ）で決定し、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｘｔｒａ（ＭｅｄｉＳｃｉｅｎｃｅ、ニュージャージ州チェリーヒル）で決定した。
【００５４】
正面（Ｅｎ  Ｆａｃｅ）分析および組織診断
大動脈を、参考文献（１６）に記載のように、黒色ワックス面の上でフラットにピンアウトして、スダンＩＶで染色して、ＮｉｋｏｎＳＭＺ１０００マイクロスコープで撮影し、Ｅａｓｙ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ２０００ソフトウェア（Ｔｅｋｎｏ  Ｏｐｔｉｋ社、スウェーデン、ストックホルム）で分析した。病変領域を、大動脈根と腸骨分岐点との間の大動脈方面全体の割合として算出した。動脈根を単離して、ＯＣＴ化合物（Ｈｉｓｔｏｌａｂ社、スウェーデン、Ｖａｓｔｒａ  Ｆｒｏｌｕｎｄａ）液体窒素ですぐに凍結した。凍結試料（２０μｍ）を切断し、（１７）に記載されるように、ヘマトキシリンおよびＯｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏで染色し、他のセクション（６−８μｍ）を、４℃で一晩、ラット抗マウスＣＤ６８抗体またはコントロール抗体（Ｓｅｒｏｔｅｃ）を用いて培養し、次いで、蛍光抗ラットＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、カリフォルニア州バーリンゲム）を用いて培養し、ＤＡＰＩ含有封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて対比染色した。
【００５５】
転写プロファイリング
大動脈をＲＮＡｌａｔｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ社、カリフォルニア州バレンシア）で浸し、第３リブの上から大動脈根までの大動脈弓を除去し、ＦａｓｔＰｒｅｐ（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ、カリフォルニア州アーヴィン）でホモジナイズした。ＤＮＡｓｅＩ処理ステップを用いて総ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）で単離した。ＲＮＡ品質を、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州サンタクレア）を用いて評価した。高品質ＲＮＡサンプル（Ｍｔｔｐｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスから３２、Ｍｔｔｐ△／△マウスから５、Ｍｔｔｐｗｔ／ｗｔマウスから９）を、１０週（ｎ＝７）、２０週（ｎ＝５）、３０週（ｎ＝６＋５）（ｐＩ−ｐＣ）で、および、９Ｍｔｔｐｗｔ／ｗｔ（ｎ＝５（ＰＢＳ）＋４（ｐＩ−ｐＣ））は、４０週（ｎ＝５）、５０週（ｎ＝５）および６０週（ｎ＝４）で、ｃＤＮＡアレイを用いたグローバル遺伝子発現測定（マウスゲノム４３０  ２．０ＧｅｎｅＣｈｉｐｓ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社、カリフォルニア州サンタクレア）に使用した。全てのサンプルを、製造者によって推奨される２サイクルプロトコルで調製した。アレイを、ＧｅｎｅＣｈｉｐＳｃａｎｎｅｒ３０００を用いてスキャンし、ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いて分析した。
【００５６】
テキストマイニングおよびアテローム性動脈硬化症の知識
ＰｕｂＭｅｄの自動テキストマイニングを使用して、アテローム性動脈硬化症、泡沫細胞、平滑筋細胞、内皮細胞およびＴ細胞に関する遺伝子リストを作成した。簡単に説明すると、考慮した遺伝子は、Ｐｕｂｍｅｄの記事アブストラクト中において、以下の用語とともに同時に載っていたかどうかに関連したものである：アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症（「アテローム性動脈硬化症関連」）、泡沫細胞、マクロファージ、モノサイト（「泡沫細胞関連」）、平滑筋細胞、内皮細胞およびＴ細胞。これらの該当物（ｈｉｔ）は、ほぼ網羅的に構成されており、実質的に重複しているアテローム性動脈硬化症またはアテローム性動脈硬化症に関連した細胞タイプ（すなわち、偽陽性を含み、偽陰性の数は低い）において、可能性のある役割を有する特定の遺伝子リストから構成されているわけではない。さらに、我々は、アテローム性動脈硬化症に関して重要なものとして周知な、最近レビューされた遺伝子から手動で抽出した「確立した」アテローム性動脈硬化症遺伝子のリストを生成した。
【００５７】
アセチル化ＬＤＬを用いて培養したＴＨＰ−１マクロファージのｓｉＲＮＡ
６×１０５細胞／ウェルで、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）−ＲＰＭＩ１６４０培地にＬ−グルタミン（２ｍＭ）およびＨＥＰＥＳ緩衝液（２５ｍＭ）（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）と、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）およびストレプトマイシン（μｇ／ｍＬ）（ＰＥＳＴ）を加えたものに、ヒトモノサイト細胞株ＴＨＰ−１のモノサイトを６ウェル培養皿（Ｆａｌｃｏｎ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ）に播種し、ホルボール１２−ミリスチン酸１３−酢酸（ＰＭＡ）（５０ｎｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ）を用いて７２時間、マクロファージに分化するように誘導した。各々の遺伝子に関して、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用いて、製造者の指示（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って、ＦＣＳ、ＰＥＳＴおよびＰＭＡを除いた培地で、細胞に最大で３つのｓｉＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ、テキサス州オースチン）をトランスフェクションした。トランスフェクションして２日後、ｓｉＲＮＡターゲットマクロファージと、モック（ｍｏｃｋ）処理コントロール（非特異的ｓｉＲＮＡ）とを、ＰＥＳＴを有する１％ＦＣＳ培地で４８時間、アセチル化ＬＤＬ（ＡｃＬＤＬ、５０μｇ／ｍＬ）とともに培養した。ＡｃＬＤＬを、（１８）に記載のように調製した。サンプルを４℃でＰＢＳに対して透析した。ＡｃＬＤＬタンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ方法で測定した。ＬＤＬを連続超遠心分離によって健康なドナーの血漿から単離した（１９）。
【００５８】
脂質、タンパク質および遺伝子発現測定
脂質イメージングに関して、ＴＨＰ−１−由来の泡沫細胞を１０分間、ＰＢＳホルムアルデヒドで固定した。細胞を２０分間、Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ（６０％イソプロパノール中０．３％）で染色し、６０％イソプロパノールで２回洗浄し、ＰＢＳで２回洗浄し、４０×倍率でＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｅ８００顕微鏡を用いて試験した。１時間、室温で、脂質をヘキサン／イソプロパノール（３：２）で抽出することで単離し、その後、１５分間、０．５ｍｌのクロロホルムで単離した（２０）。脂質抽出物を乾燥させ、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ）を添加した８０μｌのイソプロパノールに再懸濁した。泡沫細胞の脂質内容物を、総コレステロール（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｔｒａｃｅ）用のＩｎｆｉｎｉｔｙキットおよびフリーコレステロール用キット（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、バージニア州リッチモンド）を用いた酵素アッセイによって決定した。脂質抽出後、３７℃で５時間、０．５Ｍ水酸化ナトリウムで培養することで、同一のウェルからタンパク質を抽出した。タンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ法で決定した。
【００５９】
ＨＧ−Ｕ１３３＿Ｐｌｕｓ＿２アレイ分析（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）に関して、ｓｉＲＮＡによるノックダウンの度合を決定するために、総ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＡｃＬＤＬ培養ＴＨＰ−１細胞から単離した。この濃度は、スペクトルフォトメータ（ＮＤ−１００、ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、デラウェア州ウィルミントン）で決定した。ｃＤＮＡ合成に関して、製造者のプロトコルに従って、０．５μｇの総ＲＮＡを、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｉｎｆｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて逆転写した。５倍希釈後、製造者のプロトコルに従って、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ７０００（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびソフトウェアで、１×ＴａｑＭａｎユニバーサルＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）を用いて、ｃＤＮＡ（３μｌ）をリアルタイムＰＣＲで増幅した。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの、対応するプライマとプローブを含むアッセイオンデマンドキットを使用し、発現の値を、酸性リボソームリンタンパク質Ｐ０でノーマライズした。各サンプルを２回分析した。
【００６０】
統計および計算
選択された遺伝子のｍＲＮＡレベルの差異、マウス血漿測定値、および、時間ポイント間の病変面積を、独立（ｕｎｐａｉｒｅｄ）ｔ検定を用いて分析した。遺伝子発現のシグナルレベルのデータを、デフォルトの設定を用いたＭＡＳ５．０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）で算出し、ログ変換し、総強度（グローバルスケーリング）に対してノーマライズした。ノーマライゼーション後、対応するＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブセットのシグナルを平均化することで、マウスゲノム情報データベース（ＭＧＤ遺伝子、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ｗｗｗ．ｊａｘ．ｏｒｇ）の各遺伝子について、シグナル強度を計算した。データベース中にマッチするものがない１１，９７９のＧｅｎｅＣＨｉｐプローブセット（マウスゲノム４３０  ２．０ＧｅｎｅＣｈｉｐ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）のうち、１．５％は、差異的に（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ）発現し（偽発見率（ｆａｌｓｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒ  ｒａｔｅ（ＦＤＲ）＜０．０５、ｎ＝１７７）、これは、さらなる分析を考慮しない遺伝子／プローブセットのフラクションを示している。残りの３３，１２２プローブセットは、１９，８７９ＭＧＤ遺伝子中（総合すると３２，０９５中）に少なくとも１つのマッチがある。Ｌｏｗｅｓｓノーマリゼーション（２１）を、差異発現テストの前に、対をなす様式で適用した。差異発現およびＦＤＲの可能性を計算する際、複数の試験について較正するために、我々は、経験的Ｂａｙｅｓ法統計学を使用した（２２）。クラスタリングを、Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａ５．１のＦｉｎｄＣｌｕｓｔｅｒアルゴリズム（Ｗｏｌｆｒａｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，イリノイ州シャンペーン）を用いて行った。ＧＯおよび経路分析を、ＥＡＳＥソフトウェア（２３）を用いて行った。ＡｃＬＤＬとともに培養したＴＨＰ−１マクロファージの調節遺伝子ネットワークを、（１１）に記載のように、推定した（下記参照）。
【００６１】
コレステロール応答アテローム性動脈硬化症遺伝子の特定
コレステロール応答アテローム性動脈硬化症遺伝子は、アテローム性動脈硬化症マウスの大動脈弓で差異的に（ＦＤＲ＜０．０５）発現した遺伝子と考え、これらのマウスにおいては、ＰＢＳを注射したコントロールと比べて、５００μｌのｐＩｐＣ（１μｇ／μｌ）で腹膜内注射によって肝臓のＭｔｔｐ組み替え（上述）を誘導した（表４参照、ｎ＝３７）。これらの注射は、２日間の間隔で４回の連続する時間ポイントで行い、２９週の初日に開始して、２９週の最終日まで継続した。ｐＩｐＣ処置によって、３０週で屠殺したマウスの血漿で測定した場合、全てのマウスで８０％又はそれ以上の血漿コレステロールの低下が生じた。食塩水で処理したコントロールマウスの血漿コレステロールレベルには影響がなかった。３０週の間、マウスをそのままにして、注射の残りの効果を洗い出した。上記の３７遺伝子は、ｌｏｘＰが導入された（ｆｌｏｘｅｄ）Ｍｔｔｐ（Ｌｄｌｒ−／−Ａｐｏｂ１００／１００Ｍｔｔｐｗｔ／ｗｔＭｘ１−Ｃｒｅ）を欠損し、従って、Ｍｔｔｐの組み替えは起こらず、血漿コレステロールも低下しない、ｐＩｐＣ処置したコントロールマウスでは特定されなかった。これらのコントロールマウスを遺伝子チップアレイで調査し、血漿コレステロール応答遺伝子が、アテローム性動脈硬化症病変において、ｐＩｐＣで誘導された遺伝子であるという可能性を排除した。
【００６２】
ｓｉＲＮＡターゲット用に選択されたコレステロール応答遺伝子
３７の特定されたコレステロール応答遺伝子のうち、２７は、ｔａｑｍａｎおよびｓｉＲＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で予め特定されていた。表４において、３７遺伝子のうちの１２は、太字で記載されており、これらの遺伝子は、ＴＨＰ−１マクロファージによって発現されたとして以前に報告されていることを示す。これらは、サイレンシング干渉ＲＮＡによってターゲティングした。これらのうち、ＣＤ３６で誘導されるのが、ポジティブコントロール１であり、ＰＰＡＲ−ａで誘導されるのがネガティブコントロール２である。
【００６３】
調節ネットワーク識別
発現データ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｈｕ１３０、２．０＋）を１２のｓｉＲＮＡ実験から作成し（全ての時間に関して＞５８％阻害、表４も参照、太字で示された遺伝子）、４つのコントロールのプールを非特異的なｓｉＲＮＡ（ｍｏｃｋ）で処理した。ＰＭＡによって活性化された細胞培養において、総ＲＮＡをターゲットおよびコントロールＴＨＰ−１マクロファージから単離し、ｓｉＲＮＡまたはモックで処理し、次いで、４８時間の間、アセチル化ＬＤＬとともに培養した（上記参照）。３つのトランスクリプト、すなわちＧＰＲ１２０、ＧＰＲ８１およびＳＯＸ６は、ＧｅｎｅＣｈｉｐの検出限界以下であり、このことは、上記遺伝子が、検出すべき泡沫細胞形成の実験モデルで十分に活性化されていないか、または、不活性であったことを示唆する。残りの遺伝子は、９×９データマトリックスで組織した。各遺伝子の発現データを、コントロールの平均発現レベルで除算することでノーマライズし、ログ変換した。直線遺伝子調節モデル
2010509912.tif 000002
は、（１１）に記載されたデータに適合した。ここで、ｘは、発現データベクタを意味し、Ｗはネットワーク隣接マトリックスであり、ｐは摂動（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）ベクタである。各々のノックダウン実験において、ｐの要素は、摂動（ｐｅｒｔｕｂｅｄ）遺伝子に関しては−１、他の全ての遺伝子については０とした。ログ変換するので、これは、実際の発現レベルにおける乗法（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｖｅ）モデルに対応していることに留意されたい。このアルゴリズムは、精密さと、１つのパラメータｄによるリコール（再現能力）との間のトレードオフを制御する。我々の実験において、ｄ＝０．２を選択した。シミュレーションにおいては、我々は、この値が約６０％の精密さと８０％のリコールに対応していることがわかった。注釈として、遺伝子間の相互作用（すなわち、効果を刺激または抑制する有向辺（ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｄｇｅ））は、直接の生物学的相互作用を意味するのではなく、ほとんどの場合、間接的（例えば、タンパク質、代謝または中間の遺伝子によって仲介される場合（転写因子など発現レベルが低い））を意味する。
【００６４】
実験２
複数の組織遺伝子発現プロファイリングは、冠動脈疾患の新規な候補遺伝子を示す。
この実験例においては、我々は、ストックホルムアテローム性動脈硬化症遺伝子発現（ＳＴＡＧＥ）研究において、冠動脈疾患（ＣＡＤ）を患う患者の複数組織発現プロファイリングを実行した。
【００６５】
方法
ＳＴＡＧＥ研究において、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ１１３  ＧｅｎｅＣｈｉｐｓを使用して、アテローム性動脈硬化症および悪影響のない動脈壁（ｎ＝４０×２）、ならびに、冠動脈バイパス移植中の肝臓、骨格筋および縦隔脂肪（ｎ＝６６×３）から２７８転写プロファイルを得た。検証用の集団（２５人の頸動脈狭窄症患者）を分析した。ｍＲＮＡレベルのクラスタを、２方向結合型（ｃｏｕｐｌｅｄ  ｔｗｏ−ｗａｙ）クラスタリングによって特定した。
【００６６】
患者および生研材料の収集
新規のＣＡＤおよびアテローム性動脈硬化症発現表現型を診査するために、ソルナのＫａｒｏｌｉｎｓｋａ大学病院でＣＡＢＧと認められた１２４人の患者が、ＳＴＡＧＥ研究に含まれた。ストックホルムセーデル（Ｓｏｄｅｒ）病院で頸動脈手術を受けた４２人の患者を、検証用の集団（ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｃｏｈｏｒｔ）として動員した。除外基準は、他の重篤な疾患（例えば、癌、肝臓疾患および慢性全身炎症疾患）とした。これらの研究は、ソルナにあるＫａｒｏｌｉｎｓｋａ大学病院の倫理委員会によって認証された。全ての患者はインフォームドコンセントを得た。遺伝学的検証を、６０歳未満のコントロールにマッチした３８７人のＭＩ生存者（ｓｕｒｖｉｖｏｒ）（３９）、および、ストックホルム心臓疫学プログラム（ＳＨＥＥＰ）のコントロールにマッチした１０９１人のＭＩ生存者（２４）で実行した。
【００６７】
４人の外科医が、ＣＡＢＧ手術を実行し、２人が頸動脈手術を実行した。麻酔を標準化し；心収縮血圧を１５０ｍｍＨｇ未満に維持した。ＣＡＢＧ患者において、ＲＮＡｌａｔｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）で保存して−８０℃で凍結した内胸動脈（ＩＭＡ）、大動脈根、肝臓、骨格筋および縦隔脂肪から生研材料を得た。大動脈根サンプルのアテローム性動脈硬化症病変の存在（２５，２６）およびＩＭＡに病変がないこと（２７）は、肉眼試験および顕微鏡試験（図示せず）によって確定した。頸動脈プラークを、動脈壁から切開し、ミンチにして、ＲＮａｓｅフリー水で洗浄し、ＯＣＴ培地（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ、Ｈｉｓｔｏｌａｂ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）に埋め込み、液体イソペンテンおよびドライアイスで凍結し、−８０℃で保存した。
【００６８】
追跡調査訪問および実験室測定
１２４人のＣＡＢＧ患者のうち１１４人、および、４２人の頸動脈狭窄症患者のうち３９人は、３ヶ月の追跡調査訪問にきた。標準質問票を用いて、研究看護士（ｒｅｓｅｒｃｈ  ｎｕｒｓｅ）は、病歴および生活様式因子の情報（例えば、喫煙、アルコール摂取および運動）を得た。身体試験を行い、静脈血液サンプルを、ＮａＥＤＴＡを含む予冷の滅菌チューブ（Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に採って氷冷した。参考文献（２８）に記載のように、コレステロール、トリグリセリドおよびリポタンパク質の分析のために、血漿を３０分以内に遠心分離（２．７５０ｇ、２０分、４℃）によって回収した。血中グルコースを、グルコースオキシターゼ法（Ｋｏｄａｋ  Ｅｋｔａｃｈｅｍ）によって測定し、インスリンおよびプロインスリンを酵素結合免疫吸着剤アッセイ（Ｄａｋｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）によって測定した。
【００６９】
ＲＮＡ単離および発現プロファイリング
総ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ（ＢＲＬ−Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＦａｓｔＰｒｅｐ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を用いて単離し、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、ＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅセット（Ｑｉａｇｅｎ）で処理した。サンプル品質をＡｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００で評価した。ｃＲＮＡの収量を、ＨＧ−Ｕ１３３＿Ｐｌｕｓ＿２アレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）にハイブリダイゼーションする前に、スペクトルフォトメータ（ＮＤ−１０００、ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて評価した。これらのアレイをＦｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ４５０を用いて処理し、ＧｅｎｅＡｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒ  ３０００を用いてスキャンし、ＧｅｎｅＣｈｉｐオペレーションソフトウェア２．０を用いて分析した。４０人の患者の５つの生研材料、ＳＴＡＧＥ実験からのさらなる２６人の患者の３つの代謝用生研材料、および、頸動脈狭窄患者からランダムに選択された２５人の頸動脈病変に関して、発現プロファイリングを実行した。
【００７０】
冠動脈および頸動脈アテローム性動脈硬化症測定
全てのＣＡＢＧ患者は、手術前に、バイプレイン冠動脈造影法を受けた（Ｊｕｄｋｉｎｓ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）。血管造影図を量的冠動脈造影法（ＱＣＡ）技術（Ｍｅｄｉｓ）で評価した。左側および右側冠動脈およびその分岐は、セグメントに分けた（２９）。隔セグメントを末期心拡張期中に測定し、プラーク面積をセグメント総面積の割合として決定した。幾人かの患者は、右側冠動脈閉塞があり、ＱＣＡ評価を行わなかった。頸動脈狭窄症のスコアを、頸動脈の全アテローム性動脈硬化症病変から計算した（１ポイントを２０−５０％ルーメンの閉塞、２ポイントを５０％以上のルーメンの閉塞）。
【００７１】
手術前に、頸動脈をＢモード超音波を用いて試験した。内部剥離（ｅｎｄｏａｒｔｅｒｅｃｔｏｍｙ）側の内部脈管内膜中膜厚さ（ＩＭＴ）の測定に、共通の頸動脈の奥の壁を使用した（３０）。
【００７２】
遺伝子型同定（ＧＥＮＯＴＹＰＩＮＧ）
Ｑｉａｇｅｎの血液および細胞培養ＤＮＡキットを用いてＤＮＡを血液から抽出した。ＴａｑＭａｎＳＮＰ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ａｓｓａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて遺伝子型同定を行った。ＳＮＰブラウザソフトウェア３．５（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に従って、種々のリンク不均衡（ＬＤ）ブロックに均一に分布している５つの１ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を、ＬＩＭドメイン結合２（ＬＤＢ２）遺伝子（ｄｂＳＮＰ：ｒｓ８７２４７８、ｒｓ１５０１１２７、ｒｓ１０９３９６７３、ｒｓ２６５８５０９およびｒｓ７６７１４８２）において選択した。
【００７３】
０．５μｇの総ＲＮＡを、製造者のプロトコルに従って、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて逆転写した。５倍希釈した後、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ７０００（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の１×ＴａｑＭａｎユニバーサルＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と、製造者のプロトコルに従ってソフトウェアと、を用いて、ｃＤＮＡ（３μＬ）をリアルタイムＰＣＲによって増幅した。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍからの対応するプライマおよびプローブを含んだアッセイオンデマンドキットを使用した。ｍＲＮＡレベルを３６Ｂ４に対してノーマライズした。各サンプルを２回分析した。
【００７４】
計算および統計分析
臨床および代謝の特徴は、平均±ＳＤの継続変数、および、対象の数及び割合に関する分類上（ｃａｔｅｇｏｒｉｃａｌ）変数として与えられる。Ｐ値を独立ｔ検定を用いて計算し、歪んだ（ｓｋｅｗｅｄ）値ををログ変換した。ＳＮＰ解析に関して、ＡＮＯＶＡ、ｃｈｉｓｑｕａｒｅおよびロジスティック回帰分析（ＳｔａｔＶｉｅｗ５．０．１）を使用した。遺伝子発現値を前処理して、６０４，２５８の完全マッチＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブシグナルを、Ｑｕａｎｔｉｌｅ  ＮｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎおよびＲｏｂｕｓｔ  Ｍｕｌｔｉｃｈｉｐ  Ａｖｅｒａｇｅ（３１）（補助方法を参照）して、４２３，６３６がｒｅｆｓｅｑトランスクリプト（３２）にマップされ、１５，０４２のｒｅｆｓｅｑトランスクリプトを生成できた。遺伝子発現データを、２方向結合型手法によってクラスタリングした（３３，３４）。第１に、遺伝子クラスタをスーパーパラマグネチッククラスタリングアルゴリズム（３３）で特定した。第２に、各遺伝子クラスタに関して、患者を階級クラスタリング（３５）（補助方法を参照）によってグループ分けした。クラスタをＴｒｅｅＶｉｅｗ（３５）を用いて可視化した。差異発現および偽発見率の可能性を、（２２）に記載のように計算した。Ｇｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ（ＧＯ）および経路分析を、ＤＡＶＩＤソフトウェア（５６）を用いて行い、全ての計算をＭａｔｈｅｍａｔｉｃａ５．１で行った。テキストマイニングを使用してＣＡＤおよびアテローム性動脈硬化症に予め関連したトランスクリプトを決定した（補助方法を参照）。プロモータ解析に関して、ＴＲＡＮＳＦＡＣ（３６）を使用した。
【００７５】
補助方法
生研材料収集
ＳＴＡＧＥ実験に含まれる１１４人の患者は、独立した選択可能な冠動脈バイパス移植（ＣＡＢＧ）を受けた。５つの組織サンプルを手術中に得た。０．５ｇの骨格筋を切開部に近い頂腹直筋の内側縁（ｍｅｄｉａｌ  ｂｏｒｄｅｒ）から得て、約１ｇの縦隔脂肪を、心膜（ｐｅｒｉｃａｒｄｉｕｍ）および大血管の前面にある組織から得た。内胸動脈を左胸壁の内側から切開し、遠位部（ｄｉｓｔａｌ  ｐａｒｔ）の１ｃｍを切断した。完全な厚さの大動脈壁を、手術中に、大動脈根で、近位静脈移植吻合を形成するために使用した穴空け器から得た。約０．０５ｇの肝臓組織（直径３ｍｍ）を手術の最後に、左側肝葉辺縁部から得た。肝臓のこの部分は、胸部剣状突起のすぐ下で腹膜を数センチ切開した後、容易にアクセスすることができた。最小限の切り口を、生研材料を取り出した後、縫合し、腹腔を再度閉じた。全ての組織サンプルを、焼灼を利用せず、複雑化（ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ）せずに行った。これらは、すぐにＲＮＡｌａｔｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）溶液に入れ１０秒以内浸けて、更に処理するまで−８０℃で凍結した。
【００７６】
クラスタ解析
各組織からの遺伝子発現データを、Ｇｅｔｚらによって発明された（３４）、２方向結合型様式においてクラスタ化した。工程の第１のステップは、Ｔｅｔｋｏら（３３）によって実行されたスーパーパラマグネチッククラスタリングアルゴリズム（ＳＰＣ）を用いて、遺伝子をクラスタリングすることを含む。このアルゴリズムによって遺伝子を複数のクラスタに発現させることができる。遺伝子発現プロファイル間の類似性を、Ｓｐｅａｒｍａｎランク相関を用いて測定した。我々は、０．０１５の温度間隔に亘って安定なクラスタを同定し、重なったクラスタが６０％以上同一で、１０００メンバ以上のクラスタを処分する場合、重なったクラスタを除去した。個々の遺伝子クラスタに基づいて、我々は、Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａの平均リンクを有する階級（集団）を用いて、患者を２つのクラスタに分けた。マンハッタン距離を使用して、２つの患者発現プロファイル同士の類似性を測定した。小さな患者クラスタ（患者が３人またはそれ未満）をアウトライヤとみなして除外し、残りの患者をクラスタ化した。可視化のため、Ｅｉｓｅｎら（３５）によるクラスタにおける階級クラスタリングを用いて患者を再度クラスタリングした。これによって、我々の集積的（ａｇｇｌｏｍｅｒａｔｉｖｅ）アルゴリズムと全く同一なＴｒｅｅｖｉｅｗ（３５）を用いて可視化されたクラスタツリーが作成された。
【００７７】
ＣＡＤに予め関連したトランスクリプトの定義
ＣＡＤに予め関連している遺伝子の網羅的リストを確立するために、ＰｕｂＭｅｄの自動テキストマイニングを使用した。簡単に説明すると、遺伝子は、ＰｕｂＭｅｄの公開された記事のアブストラクトにおいて、以下の単語；冠動脈疾患、アテローム性動脈硬化症および動脈硬化症、のいずれかと共に出現する場合、関連があるとみなした。その他の２つのリストを、検索単語として「コレステロール」または「糖尿病」を用いて手動で作成した。いくつかの確立しているアテローム性動脈硬化症遺伝子が捕捉されなかったので、いくつかの遺伝子を、最近のＣＡＤおよびアテローム性動脈硬化症に関するレビューから手動で抽出した。ＣＡＤ関連遺伝子のリストは２８３２遺伝子から構成される。
【００７８】
プロモータ解析
プロモータ配列は、Ｂｉｏｍａｒｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｍａｒｔ．ｏｒｇ／）からダウンロードしたＥｎｓｅｍｂｌ  ｖ．４３からのもである。ＬＩＭドメイン（３７）またはＬＤＢ２と相互作用することが周知なもの（３８）を有する転写因子（ＴＦ）を特定した。これらのＴＦセットから、我々は、周知な転写因子結合部位（ＴＦＢＳ）に関してＴＲＮＳＦＡＣ  ｖ１０．４（３６）を検索した。７つのＴＦテーマで、全部で１７１の周知なＴＦＢＳがあった。我々は、ＰＡＴＣＨプログラム（３６）を使用して、１７１のモチーフがミスマッチせずに少なくとも６ｂｐマッチするプロモータ配列の位置を検索した。
【００７９】
遺伝学的検証用の集団
ＳＣＡＲＦ
ストックホルム冠動脈アテローム性動脈硬化症の危険因子（ＳＣＡＲＦ）に関する研究は、ケースコントロール研究であり、遺伝学的因子および生化学的因子である早期（ｐｒｅｃｏｃｉｏｕｓ）ＭＩの研究の基礎を形成するように計画されている。ストックホルムの北部の３つの病院（Ｄａｎｄｅｒｙｄ病院、Ｋａｒｏｌｉｎｓｋａ大学病院ＳｏｌａｎおよびＮｏｒｒａｌｊｅ病院）の冠動脈ケアユニットを投与された、第１の６０歳未満の全部で３８７人の生存者が含まれた。簡単に説明すると、包含基準に適合する任意抽出した患者を登録し、除外基準は、タイプ１真性糖尿病、腎不全（血漿クレアチニンが＞２００μｍｏｌ／Ｌとして規定）、あらゆる慢性炎症疾患、薬物中毒、精神疾患またはプロトコルに従うことができな者であった。梗塞後の患者に関して、性別および年齢に適合するコントロール用の人間を、一般人から動員した（応答率７９％）。指標となる心臓の障害（ｉｎｄｅｘ  ｃａｒｄｉａｃ  ｅｖｅｎｔ）から３ヶ月後、患者及びコントロールの双方は、医学検査を受けて、一晩絶食してから血液サンプルを採った。バックグランドのデータ（例えば、社会的な状況、生活様式、病歴および薬物療法）を構築した質問によって集めた。３世代逆上って自己申告による先祖に基づいて、人種を記録し、この研究の参加者の９９％以上がカフカス人だった。表９参照。
【００８０】
ストックホルム心臓疫学プログラム（ＳＨＥＥＰ）研究は、ＭＩになりやすい遺伝学的、生化学的および環境的因子を調査することを目的とした、大きな集団に基づいたケースコントロール研究である。この研究の参加者の可能性は（４５乃至７０歳）は、以前にＭＩとしての診断を受けたことのないストックホルム群に在住のスウェーデン市民だった。男性の場合、１９９２−１９９４年の間に動員され、女性の場合は１９９２−１９９４年に動員された。ＭＩ診断の基準は、１９９１年に心臓病学スウェーデン学会によって発酵されたガイドラインに基づいており、（１）典型的な症状、（２）酵素血清クレアチニンキナーゼ（Ｓ−ＣＫ）および乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の顕著な上昇、および、（３）特徴的な心電図の変化を含む。２又は３の基準が満たされていた場合、患者をＭＩとして診断した。１ケースにつき５人のコントロール候補者を、可能な非応答者の交換を可能にするために、ケース事象の２日以内にサンプリングした。梗塞後の患者に対して、ランダムに選択した健康な人を、年齢、性別及び対象範囲に適合させた後、ケース事象の２日以内にサンプリングした。いくつかの最初のコントロールから応答が遅かったので、場合によって、最初のコントロールおよび代替のコントロールの両方を含んだ。血液サンプルを患者の指標となる心臓障害の約３ヶ月後に採取し、全ての参加者は身体検査を受けた。表１０参照。
【００８１】
結果
患者の特性
１１４人のＳＴＡＧＥ患者は、典型的なＣＡＤ集団（表５）だった。重要なことは、これらの特性は、代謝遺伝子発現プロファイルを得た６６人のＳＴＡＧＥ患者のものと大幅に違わなかったことであり、さらには、５つの発現プラファイル全てを得た４０人のＳＴＡＧＥ患者のものとは違わなかった。遺伝子発現プロファイを得た頸動脈狭窄症患者の基本的な特性（ｎ＝２５）も、表５に示す。
【００８２】
冠動脈アテローム性動脈硬化症の範囲に関する遺伝子発現
アテローム性動脈硬化症関連遺伝子クラスタを規定するために、我々は、１５，０４２ｒｅｆｓｅｑトランスクリプトに関して、アテローム性動脈硬化症大動脈根と、悪影響のないＩＭＡ（方法）と、からのｍＲＮＡの比率に関して、２方向結合型クラスタリング分析（補助方法）を使用した。１４遺伝子クラスタのうち（表７）、１つは、（ｎ＝４９遺伝子）、冠動脈狭窄症の範囲が異なる２つのグループの患者をクラスタ化した（ｐ＝０．００８）。肝臓および骨格筋から特定した遺伝子クラスタ（それぞれ１５および１１クラスタ：表７）は、冠動脈狭窄症に関連していなかった。対照的に、縦隔脂肪遺伝子発現プロファイルの２方向クラスタリングは、２０遺伝子クラスタを生成した（表７）；１つは（ｎ＝５９）、冠動脈狭窄症の範囲が異なる２つのグループに患者をクラスタ化した（ｐ＝０．０００１５）。７つの遺伝子が、アテローム性動脈硬化症関連クラスタの両方にあり（偶然に生じる可能性（Ｐｃ）＜７×１０−１０）、このことは、縦隔脂肪およびアテローム性動脈硬化症大動脈根において、共通のアテローム性動脈硬化症関連遺伝子活性があることを示唆している。
【００８３】
頸動脈アテローム性動脈硬化症の範囲に関する遺伝子発現
ＳＴＡＧＥ集団で特定されたアテローム性動脈硬化症関連遺伝子を検証するために、我々は、頸動脈手術を受けた頸動脈狭窄症患者集団を分析した（表５）。２５の頸動脈プラークの発現プロファイルの２方向結合型クラスタリングは、１１遺伝子クラスタ（表７）を生成し、その１つは（ｎ＝５５）、ＩＭＴスコアが異なる２つのグループに患者に患者をクラスタ化した（Ｐ＝０．００３８）。驚くべきことに、５５遺伝子のうち１６が、縦隔脂肪クラスタ遺伝子とオーバーラップし（Ｐｃ＜９×１０−２７）、１７が大動脈根／ＩＭＡクラスタ遺伝子とオーバーラップした（Ｐｃ＜１×１０−３０）。６つのトランスクリプト（Ｃ型レクチンドメインファミリ１４、カドヘリン５、クロモソーム２０オープンリーディングフレーム１６０、内皮分化スフィンゴ脂質Ｇタンパク質結合レセプタ１、Ｇタンパク質結合レセプタ１１６およびＬＤＢ２）は、全部で３つのクラスタ（Ｐｃ＜７．１５×１０−２３）にあり、全体で、１２９遺伝子があった（表８）。
【００８４】
遺伝子オントロジおよびＫＥＧＧ経路分析
３つの特定されたクラスタ（２つの患者集団の３つの別の組織におけるアテローム性動脈硬化症の範囲に関して、図５）間における極めて重要なオーバーラップが示唆しているのは、これらのクラスタが、アテローム性動脈硬化症の発症に重要な生物学的活性を包含していることである。これらのクラスタの遺伝子について（ｎ＝１２９、表８）さらに研究するために、我々はＧＯおよびＫＥＧＧ経路分析を行った。８９は、ＧＯカテゴリ生物学的経路に適合し、１００は分子機能に適合し、９３が細胞コンパートメントに適合した。これらのトップスコアは、生物学的プロセスにおける細胞伝達（ｎ＝４０、Ｐ＜１．４×１０−５）、シグナル伝達（ｎ＝３７、Ｐ＝３．７×１０−５）および細胞接着（ｎ＝１３、Ｐ＜６．５×１０−４）；分子機能において、グアニル−ヌクレオチド交換因子活性（ｎ＝７、Ｐ＜８．７×１０−５）、ＧＴＰａｓｅレギュレータ活性（ｎ＝９、Ｐ＜２．５×１０−４）、シグナルトランスデューサ活性（ｎ＝３４、Ｐ＝３．１×１０−４）；細胞コンポーネントにおいて、膜（ｎ＝６４、Ｐ＜１．３×１０−７）および血漿膜（ｎ＝３１、Ｐ＜４．８×１０−７）であった。１２９遺伝子のうち（表８）、３１遺伝子は、アテローム性動脈硬化症と既に関連があり、４０遺伝子は、生物学的プロセスのアノテーション（機能割当）がなく、７遺伝子はレギュレータ活性（転写因子（ＴＦ）およびそのコファクタ（ｃｏ−ｆａｃｔｏｒ））を含んだ。ＫＥＧＧ経路でアノテーションのあった３８遺伝子のうち、１６は、経内皮移動経路に関連があり、そのうちの８つは、正確にマッチした（ｎ＝８、Ｐ＜７．７×１０−７）。
【００８５】
プロモータ解析および遺伝学的検証
冠動脈および頸動脈アテローム性動脈硬化症（３つのクラスタ全てに交わる部分）の範囲に関して、より高いｍＲＮＡレベルを繰り返し示す６つの遺伝子のうち、ＬＤＢ２のみ、転写レギュレータとして突出していた。ＬＤＢ２が他の１２８遺伝子のいくつかを調節することができる可能性を確かめるために（ＬＤＢ２を除いた３つのクラスタすべてのユニオン）、我々は、コンピュータシミュレーション（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）をして、ＴＲＡＮＳＦＡＣにおける遺伝子のうちの１２２でみつかった１６１のプロモータに対して配列マッチングを行った。第１に、我々は、ＴＲＡＮＳＦＡＣ（ｖ１０．４）における周知の結合サイトモチーフおよびＬＩＭ結合ドメインを有するか、または、ＬＤＢ２との他の周知な相互作用する７つのＴＦを特定した（ＩＳＬ−１α、Ｌｍｏ２、Ｌｈｘ３ａ、Ｌｈｘ３ｂ、ＬＨＸ２、ＬＨＸ４およびＢＲＣＡ１）。我々は、少なくとも１つの上記結合サイトを有している１２９遺伝子のうちの１２２（９４％）でみつかった８１％の１６１プロモータ（ターゲットプロモータ）を見つけた。転写開始部位に対する［−６００、−１］領域を覆う１０２５５ヒトプロモータのバックグラウンドに関して、ターゲットプロモータとの結合は、統計学的に、１．２から５倍、高くなった。
【００８６】
クラスタおよびコンピュータシミュレーション上のプロモータ解析は、ＬＤＢ２が、アテローム性動脈硬化症の重症度に関連した１２９遺伝子のいくつかをインビボで調節することに関連している可能性があることを示唆する。もしそうであれば、ＬＤＢ２の発現に影響を与える機能的多型も、アテローム性動脈硬化症進行に影響を与えるであろう。この仮説を試すために、我々は、コントロールとマッチした３８７人のＭＩ生存者（３９）、１０９１人のＭＩ生存者、および、ＳＨＥＥＰのコントロール（２４）におけるＬＤＢ２遺伝子を遺伝学的に検証した。第１に、我々は、ＬＤブロックによって均等に分布したＬＤＢ２における５つのＳＮＰを特定し、次に、ＳＴＡＧＥ集団の遺伝子発現との関連をみた。ＳＮＰｒｓ１０９３９６７３のマイナーＴアレルのキャリアは、大動脈根／ＩＭＡ（Ｐ＝０．００４）および縦隔脂肪（Ｐ＝０．００１）のリアルタイムＰＣＲで評価したＬＤＢ２ｍＲＮＡレベルを低下させる傾向があった。さらに、Ｔアレルのキャリアは、冠動脈狭窄スコア（Ｐ＝０．０１２、ｎ＝３７５）およびプラーク面積割合（Ｐ＝０．０２９）（表６Ｄ）によって判定した場合、ＭＩ生存者（Ｐ＝０．０１４（ｎ＝３７５）、０．０３（ｎ＝９１７）および０．００５（ｎ＝１３０４、組み合わせ）、表６Ａ−Ｃ）中で、大幅に過小評価（ｕｎｄｅｒｒｅｐｒｅｓｅｎｔ）され、アテローム性動脈硬化症は低くかった。
【００８７】
結果のまとめ
全ての組織タイプで特定された６０のうち、２つが冠動脈狭窄症の範囲に関連していた：１つは、大動脈病変（ｎ＝４９）にあり、１つは、縦隔脂肪（ｎ＝５９）にある。注目すべきは、上記遺伝子のうちの２７が、頸動脈狭窄患者の検証用集団におけるアテローム性動脈硬化症の範囲に関するクラスタ（ｎ＝５５）で同定された。機能解析は、アテローム性動脈硬化症重症度の共通する特徴としての白血球の経内皮移動、および、転写調節に関連した７つの遺伝子のうちの１つとしてのＬＩＭドメイン結合２（ＬＤＢ２）を特定した。コンピュータシミュレーションでは、プロモータ解析は、ＬＤＢ２が間接的に、特定された遺伝子の大半を調節するできることを示唆していた。コントロールとマッチした３８７人の心筋梗塞製造者において、ＬＤＢ２におけるＳＮＰｒｓ１０９３９６７３のマイナＴアレルは、生存者で過小評価（ｕｎｄｅｒｒｅｐｒｅｓｅｎｔ）されており、逆に、冠動脈アテローム性動脈硬化症に関連していた。
【００８８】
ディスカッション
候補遺伝子または経路アプローチとは異なり、グローバル遺伝子発現分析など全ゲノムアプローチは、調査している生物学的または病理学的システムの知識に関連して、より偏見がない。従って、全ゲノム解析は、分子機構および複雑な生物学的問題の共通のレギュレータ法海を急速に高めた。ＳＴＡＧＥ研究において、５のＣＡＤ関連組織の１５０４２ｒｅｆｓｅｑシグナル値を、各患者について分析し、冠動脈アテローム性動脈硬化症の発症に重要な遺伝子活性を明らかにした。アテローム性動脈硬化症大動脈壁および縦隔内臓脂肪の１０１のトランスクリプトは、冠動脈アテローム性動脈硬化症の範囲に関連しており、肝臓及び骨格筋の遺伝子活性クラスタは関連がなかった。注目すべきは、１０１トランスクリプトの２７が、２５人の頸動脈狭窄患者の検証用集団におけるアテローム性動脈硬化症に関連した遺伝子活性クラスタのみで発見された。
【００８９】
バイオインフォマティクス的評価は、特定した遺伝子の３１のみが、アテローム性動脈硬化症と予め関連しており、４０は、生物学的プロセスのアノテーションはなく、１６は、経内皮白血球移動経路に関連していた。７つのトランスクリプトは、転写調節に関連しており、１つ（ＬＤＢ２）は、コンピュータシミュレーションでの配列プロモータ解析によって、特定したトランスクリプトの最大８１％を制御する可能性があった。集団（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）コントロールを有するＭＩ生存者の２つの集団（ｃｏｈｏｒｔ）におけるＬＤＢ２の遺伝学的検証は、ＳＮＰｒｓ１０９３９６７３のマイナＴアレルは、冠動脈狭窄症との関連が低く、ＭＩ生存者中で有意な効果（ｐｒｅｖａｌｅｎｔ）が小さかったことを示した。
【００９０】
これらの結果は、（１）縦隔の内臓脂肪が冠動脈アテローム性動脈硬化症に影響を与える炎症の局所的な供給源として作用し、（２）白血球の経内皮移動の増大は、アテローム性動脈硬化症重症度を増大に関連しており、（３）ＬＤＢ２は、ＣＡＤの発症と関連した高い階級のレギュレータであり、（４）ＬＤＢ２のアンタゴニストは、アテローム性動脈硬化症の治療として検査するのに値し、（５）ＬＤＢ２のＳＮＰｒｓ１０９３９６７３は、ＣＡＤ／ＭＩリスクの同定に有用である、ことを示している。
【００９１】
白血球の経内皮移動は、アテローム性動脈硬化症の確立した経路である。モノサイトの経内皮移動は、泡沫細胞形成と、アテローム性動脈硬化症プラーク発症の開始（ｉｎｉｔｉａｔｅ）に必須であり（４０，４１）、Ｔ細胞の経内皮移動は、後期アテローム性動脈硬化症の中心プロセスであると考えられている（４２）。実際に、白血球の経内皮移動は、アテローム性動脈硬化症治療の可能性のある標的として提案されている。我々のＫＥＧＧ経路分析は、白血球の経内皮移動の増大が、より重度のアテローム性動脈硬化症の患者に見られる共通の特徴である可能性を示唆している。加えて、アノテーションのない特定した遺伝子のいくつかは、この経路またはその調節における役割を有している。さらに、我々のデータは、この経路が、プラーク形成に直接関与しており、縦隔脂肪の炎症状態を増大させることによって間接的に関与していることを示唆している。
【００９２】
冠動脈狭窄症の重症度に関連した遺伝子クラスタで、肝臓または骨格筋において特定されたものはなかった。このことは、血漿コレステロールおよびグルコースレベル（すなわち、糖尿病）など、確立したＣＡＤリスク因子に対する組織の重要性を考慮すると、驚くべきことである。この発見は、上記危険因子の治療による遺伝子発現の正常化（ｎｏｒｍａｉｌｉｚａｔｉｏｎ）に影響を与える。縦隔脂肪（または、あらゆる内臓脂肪）と血中の確立したＣＡＤ危険因子との関連は、不明瞭である。しかしながら、ヒップウェスト比（腹部内臓脂肪量の増加の指標）の増加は、ＣＡＤの最も強力な予測因子の１つである。縦隔脂肪の興味深い面は、その解剖学的位置であり、最近のデータは、炎症メディエータの供給源として内臓脂肪の役割を示唆している。我々の研究は、縦隔脂肪がどのようにアテローム性動脈硬化症に作用しているかについて解決していないが、炎症メディエータの局所的供給源は、アテローム性動脈硬化症の進行速度を増大させる可能性がある（４４）。
【００９３】
ＬＤＢ２などのＬＩＭドメイン結合因子をコードする遺伝子を、核タンパク質のＬＩＭドメインと物理的に相互作用するタンパク質のスクリーニングにおいて、最初に単離した。これらのタンパク質は、種々のＴＦと結合し、エンハンサとして機能する可能性があり、種々の転写因子を合わせて、高次の活性複合体を形成する可能性がある（４５，４６）。ＬＤＢ２関連のＴＦについての我々のスクリーニングにおいて、ＩＳＬ−１α、Ｌｍｏ２、Ｌｈｘ３ａ、Ｌｈｘ３ｂ、Ｌｈｘ２、Ｌｈｘ４およびＢＲＣＡ１を特定した。ＩＳＬ−１αは、ＨＮＦ４の活性をエンハンスし、インスリンシグナル伝達を促進する（４７，４８）。Ｌｍｏ２は血管形成に関与している（４９，５０）。Ｌｈｘ３およびＬｈｘ４は、下垂体特異的細胞系列の増殖および分化を調節し（５１）、リンパ球および胸腺腫瘍細胞系列（５３）のサブセットで発現する。ＢＲＣＡ１は、末梢血モノサイトの細胞内接着分子１（５４）およびＴリンパ球のライフサイクル制御（５５）において、ＴＮＦαおよびＴＮＦα誘導による自然発生的およびＬＰＳ誘導生成物の選択的欠乏症に関連している。本研究が行われるまでは、ＬＤＢ２は、ＣＡＤまたはアテローム性動脈硬化症に関連していなかった。その高い階級の調節機能および多様な生物学的プロセスへの関与によって、複雑な疾患のさらなる評価において興味深いターゲットとなる。
【００９４】
結論として、いくつかのＣＡＤ関連組織の分子プロファイリングは、縦隔脂肪によって共有され、頸動脈病変で再現されたアテローム性動脈硬化症表現型の分子を明らかにした。この表現型は、白血球の経内皮移動と、アテローム性レアＳＮＰアレルを含有する高い階級のレギュレータとしてのコファクタＬＤＢ２のＴＦと、に関連している。
【００９５】
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値は平均値±ＳＤである。時間ポイント間で有意な差はなかった（ｐ＞０．０５）
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Ｐ値は、リポフェクタミントランスフェクション並行コントロール（ｎ＝６）と比べて、ターゲット遺伝子に対する泡沫細胞中のＣＥ含有率を示す。
ＣＥはコレステロールを示す。ＯＲＯはオイルレッドＯ、ｎｄは、差異なし、ｎｓは、有意差なし。
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Ｐ値は、ＳＴＡＧＥ中のサブグループを全ＳＴＡＧＥ集団（Ｎ＝１１４）と比較して、独立ｔ検定を用いて計算される。
＊Ｐ値＜０．０５；＊＊Ｐ値＜０．０１
￥プラーク面積は、左側冠動脈における７つのセグメントを介して集計される。
かっこ内の数字は、サブグループ全体の％を示す。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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