(57)【要約】本発明は洗浄及び他の利用のための少なくとも１つのペルヒドロラーゼを含む組成物及び方法を提供する。ある実施態様において、本発明は長鎖過酸の生成のための組成物及び方法を提供する。本発明のある実施態様は洗浄、漂白、及び消毒に関与する利用における特定の使用を示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されるペルヒドロラーゼ酵素であって、長鎖アシルエステル基質を過加水分解するペルヒドロラーゼ酵素。
【請求項２】
前記酵素は長鎖アシルエステル基質及び過酸化物存在下長鎖過酸を生成することを特徴とする、請求項１に記載の単離されるペルヒドロラーゼ酵素。
【請求項３】
前記アシルエステル基質の鎖は少なくとも６個の炭素原子の鎖を含むことを特徴とする、請求項１に記載の単離されるペルヒドロラーゼ酵素。
【請求項４】
前記長鎖アシルエステル基質は少なくとも９個の炭素原子を含むことを特徴とする、請求項１に記載の単離されるペルヒドロラーゼ酵素。
【請求項５】
前記の酵素のアミノ酸配列は自然に発生するペルヒドロラーゼ酵素のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有することを特徴とする、請求項１に記載の単離されるペルヒドロラーゼ酵素。
【請求項６】
前記酵素のアミノ酸配列は配列番号２に記載のマイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）の野生型ペルヒドロラーゼのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有することを特徴とする、請求項１に記載の単離されるペルヒドロラーゼ酵素。
【請求項７】
前記酵素が配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むマイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ペルヒドロラーゼ中の位置と同等の位置のアミノ酸に少なくとも１つの置換を含み、前記少なくとも一つの置換基が１２、２２、５９、１５３、１５４、１９４、１９６、及び２０４の位置から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の単離されるペルヒドロラーゼ酵素。
【請求項８】
前記酵素が１２位においてＧＩｙ、Ｐｒｏ、または、Ｇｌｎ、２２位においてＴｒｐ、５９位においてＰｒｏ、１５３位においてＰｒｏ、１５４位においてＴｈｒ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、またはＧｌｎ、１９４位においてＧｌｙ、１９６位においてＳｅｒ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、またはＨｉｓ、２０４位においてＴｙｒまたはＴｒｐ、又はそれらの任意の組合わせであるアミノ酸置換の少なくとも１つを含み、前記アミノ酸の位置は配列番号２のマイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ペルヒドロラーゼ中１２、２２、５９、１５３、１５４、１９４、１９６、及び２０４の位置と位置的に同等であることを特徴とする、請求項7に記載の単離されるペルヒドロラーゼ酵素。
【請求項９】
前記酵素が１５４位においてＡｌａと１９４位においてＭｅｔ、１５４位においてＧｌｙと１９４位においてＶａｌ、又は１２位においてＧｌｙと１９４位においてＭｅｔであるアミノ酸置換の少なくとも１つを含み、前記アミノ酸の位置は、配列番号２のマイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ペルヒドロラーゼ中１２、１５４、及び１９４の位置と位置的に同等であることを特徴とする、請求項１に記載の単離されるペルヒドロラーゼ酵素。
【請求項１０】
前記酵素は過加水分解対加水分解の比が１以上の比の値を有することを特徴とする、請求項１に記載の単離されるペルヒドロラーゼ酵素。
【請求項１１】
前記酵素は配列番号２の過酸の加水分解活性速度より低い過酸の加水分解速度を有することを特徴とする、請求項１に記載の単離されるペルヒドロラーゼ酵素。
【請求項１２】
請求項１の単離されるペルヒドロラーゼ酵素をコードしている単離される核酸。
【請求項１３】
単離されるペルヒドロラーゼ酵素であって、長鎖アシルエステル基質を過加水分解するペルヒドロラーゼ酵素。
【請求項１４】
前記酵素は長鎖アシルエステル基質及び過酸化物存在下長鎖過酸を生成することを特徴とする、請求項１３に記載の単離されるペルヒドロラーゼ酵素。
【請求項１５】
前記アシルエステル基質の鎖は少なくとも６個の炭素原子の鎖を含むことを特徴とする、請求項１３に記載の単離されるペルヒドロラーゼ酵素。
【請求項１６】
前記長鎖アシルエステル基質は少なくとも９個の炭素原子を含むことを特徴とする、請求項１３に記載の単離されるペルヒドロラーゼ酵素。
【請求項１７】
組み換え核酸であって、
ａ）プロモーター及び
ｂ）請求項１２に記載の単離される核酸
を含み、前記プロモーター及び核酸が作動的に結合することを特徴とする、組み換え核酸。
【請求項１８】
請求項１７に記載の組み換え核酸を含むベクター。
【請求項１９】
請求項１７に記載の組み換え核酸を含む宿主細胞。
【請求項２０】
前記組み換え核酸が前記細胞において自動的に複製されるベクター又は前記細胞の染色体に存在することを特徴とする、請求項１９に記載の宿主細胞。
【請求項２１】
前記細胞が細菌又は真菌を宿主細胞とすることを特徴とする、請求項１９に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
前記ペルヒドロラーゼの生産に適した条件下請求項１９に記載の細胞を維持することを含むペルヒドロラーゼの生産方法。
【請求項２３】
請求項１に記載のペルヒドロラーゼ酵素を含む洗浄組成物。
【請求項２４】
前記組成物がさらに長鎖アシルエステル基質及び過酸化物の供給源を含むことを特徴とする、請求項２３に記載の洗浄組成物。
【請求項２５】
前記組成物がさらに界面活性剤を含む請求項２４に記載の洗浄組成物。
【請求項２６】
前記組成物が洗濯洗剤であることを特徴とする、請求項２３に記載の洗浄組成物。
【請求項２７】
前記基質を洗浄するために請求項２３に記載の洗浄組成物存在下基質を維持することを含む洗浄方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、現在放棄されている２００３年１２月３日提出の米国仮出願第６０／５２６，７６４に基づく権利を主張する出願で、米国法典第３５巻３７１条に基づく国際出願第ＵＳ０４／０４０４３８の米国国内移行出願で、２００６年５月３０日に提出され、現在審査中である米国特許出願第１０／５８１，０１４の一部継続出願であって、２００６年１１月９日提出された米国特許出願第１１／５９５，５３７について優先権を主張する。
【０００２】
本発明は洗浄及び他の利用のための少なくとも１つのペルヒドロラーゼを含む組成物及び方法の提供である。ある実施態様において、本発明は長鎖過酸の生成のための組成物及び方法の提供である。本発明のある実施態様は洗浄、漂白、及び消毒に関与する利用における特定の使用を示す。
【背景技術】
【０００３】
洗剤その他の洗浄組成物は通常は活性成分の複合的な組合わせを含む。例えば、たいていの洗浄製品は界面活性剤系、洗浄用酵素、漂白剤、ビルダー、発泡抑制剤、泥懸濁化剤、除泥剤、蛍光増白剤、柔軟剤、分散剤、色移り阻害化合物、研磨剤、殺菌剤及び香料を含む。現在の洗浄剤の複雑さにもかかわらず、完全に除去することが困難な多くの染みが存在する。さらに、しばしば、残渣が形成されることがあり、洗浄の不十分による変色（例えば、黄ばみ）及び美しさを損ねる結果となる。これらの問題は低い洗濯温度（例えば、冷水）及び短い洗濯サイクルの使用が増加していることで悪化している。それ以上に、多くの染みは繊維材料の混合複合体からなっており、主に炭水化物、炭水化物誘導体、繊維、及び細胞壁要素（例えば、植物材料、木材、土壌由来の泥／土及び果物）である。これらの染みによって洗浄組成物の設計及び使用に対しての困難な挑戦が存在する。
【０００４】
さらに、色のついた衣料品は薄くなりやすく及び見た目の色あせを生じやすい。この色あせの一部は洗濯過程での摩擦が原因であり、特に、自動洗濯機及び乾燥機によるものである。それ以上に、繊維の伸長強度は、使用、着用、及び／又は洗濯及び乾燥が原因による機械的及び化学的作用の避けられない結果となるように見える。つまり、色の着いた衣料品を効率的及び効果的に洗濯するための手段はこれらの外観の色あせを最小限にするために必要とされる。
【０００５】
エステラーゼ、リパーゼ、及びクチナーゼを含有する洗浄組成物は周知の技術である。しかしながら、これらの酵素は加水分解に対する過加水分解（ｐｅｒｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ）の割合が極めて低い。これは、より好ましい過酸にもかかわらず、多くのエステル基質の酸への変換に至る。設計の余地及び費用を考慮すると、限られた量の基質を含むことしかできないので、これは深刻な問題である。
【０００６】
まとめると、洗浄組成物の能力の改善にかかわらず、染みを除去し、衣料の色と外観の維持、及び色移りの防止をする洗剤にかかる技術の必要性が残っている。さらに、伸長強度の提供及び／又は回復、及び織物に対してしわ防止、毛玉防止、及び／又は縮み防止の性質の提供、及び静電気制御、織物の柔軟性の提供、所望の色の外観及び織物の耐摩耗性の性質及び利点を維持するような洗剤及び／又は柔軟剤への必要性が残ったままである。特に、洗濯した織物にしばしば付着したままの色ものの染みを除去することのできる組成物を含む必要性が残っている。さらに、繊維漂白に適した組成物及び方法の改善の必要性が残っている。
【０００７】
織物及び衣料のクリーニング領域に加えて、漂白は通常パルプ及び紙産業において用いられる。紙を生産する前に、通常、パルプは好ましくない着色の汚れを除去する措置をとる。これによって、着色汚れ及びパルプ中に存在する好ましくない成分を除去する措置をしないパルプより高い品質の紙を生産するために適したパルプを提供する。例えば、紙リサイクル産業において、インクの除去の必要性がある。標準的方法が油又は水性のインクを紙から除去するのに適用されるけれども、インクの除去が困難な静電気的インクの使用の増加によって、インク除去が問題となってきている。酵素の使用を含む紙からのインク除去に使用可能な種々の方法がある（例えば、Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．  ５，３７０，７７０参照）。しかしながら、紙（リサイクル及び新品）製品生産のためのパルプの処理に対する効率的、費用効果的方法を見出す技術の必要性がある。
【０００８】
また、漂白はパーソナルケア市場にて通常用いる（例えば、歯の漂白剤、髪の漂白剤等）。パーソナルケアの漂白製品は最近改良されてきたけれども、この状況に対する低刺激性で、使用簡便な、費用効果的な方法の必要性がある。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は洗浄及び他の利用のための少なくとも一つのペルヒドロラーゼを含む組成物及び方法の提供である。ある実施態様において、本発明は長鎖過酸の生成のための組成物及び方法の提供である。本発明のある実施態様は洗浄、漂白、及び消毒に関与する利用における特定の使用を示す。
【００１０】
本発明は長鎖アシルエステル基質を過加水分解する単離されるペルヒドロラーゼ酵素を提供する。ある実施態様おいて、酵素は長鎖アシルエステル基質と過酸化物存在下、長鎖過酸を生成する。ある好ましい実施態様において、長鎖アシルエステル基質は少なくとも６個の炭素原子の鎖を含む。特に好ましい実施態様おいて、長鎖アシルエステル基質は少なくとも９個の炭素原子の鎖を含む。
【００１１】
ある実施態様おいて、本発明のペルヒドロラーゼ酵素は自然に発生するなペルヒドロラーゼ（言い換えると、細胞の遺伝子によりコードされる野生型ペルヒドロラーゼ）のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％相同性を有する。ある実施態様おいて、該酵素は自然に発生するなマイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）（配列番２）に対して少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を有する。ある実施態様おいて、ペルヒドロラーゼ酵素は配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むマイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ペルヒドロラーゼ中の位置と同等の位置のアミノ酸に少なくとも１つの置換を含み、前記少なくとも１つの置換基が１２、２２、５９、１５３、１５４、１９４、１９６、及び２０４の位置から選択される。特に好ましい実施態様おいて、酵素が次のアミノ酸置換のいずれか一つ又は組合せを含む。それは、１２位においてＧＩｙ、Ｐｒｏ、または、Ｇｌｎ、２２位においてＴｒｐ、５９位においてＰｒｏ、１５３位においてＰｒｏ、１５４位においてＴｈｒ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、またはＧｌｎ、１９４位においてＧｌｙ、１９６位においてＳｅｒ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、またはＨｉｓ、２０４位においてＴｙｒまたはＴｒｐであり、アミノ酸の位置は配列番号２のマイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ペルヒドロラーゼ中１２、２２、５９、１５３、１５４、１９４、１９６、及び２０４の位置と位置的に同等である。他の実施態様おいて、酵素は次のアミノ酸を含む。それは、１５４位においてＡｌａと１９４位においてＭｅｔ、１５４位においてＧｌｙと１９４位においてＶａｌ、又は１２位においてＧｌｙと１９４位においてＭｅｔ、１５４位においてＴｈｒと１９６位においてＩｌｅ、１２位においてＧｌｎと１５４位においてＶａｌ、１２位においてＭｅｔと１５４位においてＧｌｕ、１２位においてＧｌｙと１５４位においてＧｌｙ、１５４位においてＧｌｕと１９４位においてＳｅｒ、１２位においてＧｌｙと２２位においてＴｈｐ、又はそれらの任意の組合せであり、アミノ酸の位置は、配列番号２のマイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ペルヒドロラーゼ中１２、２２、５９、１５３、１５４、１９４、１９６、及び２０４の位置と位置的に同等である。好ましい実施態様おいて、本発明のペルヒドロラーゼ酵素は、過加水分解対加水分解の比の値が少なくとも１であり、及び／又は配列番号２と比較して低い加水分解を有する。
【００１２】
また、本発明は長鎖アシルエステル基質を過加水分解する単離ペルヒドロラーゼ酵素の提供である。ある実施態様おいて、酵素は長鎖アシルエステル基質と過酸化物存在下、長鎖過酸を生成する。ある好ましい実施態様において、長鎖アシルエステル基質は少なくとも６個の炭素原子の鎖を含む。特に好ましい実施態様おいて、長鎖アシルエステル基質は少なくとも９個の炭素原子の鎖を含む。
【００１３】
また、本発明は本発明の単離ペルヒドロラーゼ酵素をコードする単離される核酸の提供である。好ましい実施態様おいて、組み換え核酸はプロモーターと単離される核酸を含み、そのプロモーターと単離される核酸は単離される核酸を転写するために作動的に結合している。
【００１４】
また、本発明は本発明の組み換え核酸を含むベクターの提供である。ベクターを含む宿主細胞もまた提供される。核酸が宿主細胞に存在する場合、組み換え核酸は細胞の遺伝子又は細胞において自動的に複製されるベクターに存在してもよい。ある実施態様おいて、組み換え核酸は宿主細胞から単離されるペルヒドロラーゼ蛋白質を分泌させる。宿主細胞は細菌又は真菌の宿主細胞でもよい。本発明の宿主細胞を含む培養及び培地を提供する。培地は細胞から分泌するペルヒドロラーゼ蛋白質を含んでもよい。
【００１５】
また、本発明は本発明のペルヒドロラーゼ酵素を調製する方法を提供する。一般的に、方法はペルヒドロラーゼの生産に適する条件下、本発明の宿主細胞を培養することを含む。好ましい実施態様おいて、ペルヒドロラーゼは培養培地から回収される。特に好ましい実施態様おいて、回収されたペルヒドロラーゼは洗浄組成物を作製するための他の試薬と組合わされる。
【００１６】
さらに、本発明は本発明の少なくとも一つのペルヒドロラーゼを含む洗浄組成物の提供である。好ましい実施態様おいて、さらに洗浄組成物は長鎖アシルエステル基質と過酸化物の供給源を含み、それらとペルヒドロラーゼ酵素は長鎖過酸を生成する。ある実施態様おいて、洗浄組成物は洗濯洗剤である。
【００１７】
本発明の洗浄組成物は基質に組成物を接触することにより、基質（例えば、織物）を洗浄することに有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は洗浄及び他の利用のための少なくとも１つのペルヒドロラーゼを含む組成物及び方法の提供である。いくつかの実施態様において、本発明は長鎖過酸の生成のための組成物及び方法の提供である。本発明のある実施態様は洗浄、漂白、及び消毒に関与する利用における特定の使用を示す。
【００１９】
他に示していない限り、本発明の実施例は生物学、微生物学、蛋白質精製、蛋白質工学、蛋白質とＤＮＡ配列、組み換えＤＮＡ、化学、生化学、及び酵素学であって当業者の能力の範囲内である分野の通常用いる従来技術を含む。実際に、そのような方法は当業者の周知範囲内であり、多くの教科書及び参考書に記載されている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，  ２ｎｄ  Ｅｄ．  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ），  ［１９８９］）；及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”  ［１９８７］を参照）。上記及び下記両方において本明細書にて言及されるすべての特許、特許出願、文献、及び刊行物は、参照によりこれによって明確に本明細書に取り込まれる。
【００２０】
さらに、本明細書にて記載される見出しは、本明細書全体を参照することにより理解することが可能な、本発明の種々の態様又は実施態様を限定するものでない。従って、この後に定義される用語は本明細書全体を参照することによってより完全に定義される。しかしながら、本発明の理解を容易にするために、多くの用語を下記にて定義する。
定義
【００２１】
本明細書にて他に定義されない限り、本明細書で用いるすべての技術及び科学用語は本発明に属する当業者によって通常理解されるものと同じ意味を持つ。例えば、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ，  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ２ｄ  Ｅｄ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  ＮＹ  （１９９４）；及びＨａｌｅ  ａｎｄ  Ｍａｒｈａｍ，  Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，  ＮＹ  （１９９１）が、当業者には本発明において用いる多くの用語の一般的辞書となる。本明細書に記載されるものと類似又は同等の任意の方法及び材料が本発明の実施において使用可能であるけれども、好ましい方法及び材料が本明細書にて記載される。従って、この後に定義される用語は本明細書全体を参照することによりさらに完全に説明される。また、他に文脈にて明確に指示しない限り、本明細書に記載する単数用語「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は複数の対象を含む。他に指示しない限り、それぞれ核酸は５’から３’の方向を左から右へ記載し、アミノ酸はアミノからカルボキシルの方向を左から右へ記載する。これらは当業者によって使用される内容次第で多様に変化するから、本明細書で用いる特定の方法論、手順、及び試薬は本発明に限定されるべきでないことは理解されるところである。
【００２２】
本明細書を通して与えられる各最大限定数値は、本明細書中に具体的に明記されたと同様に、それぞれ最大限定数値よりも低い数値とすることを含む。本明細書を通して与えられる各最小限定数値は、本明細書に具体的に明記されたと同様に、それぞれ最小限定数値よりも高い数値とすることを含む。本明細書を通して与えられる各数値範囲は、本明細書に具体的に明記されたと同様に、そのような広い数値範囲内の狭い数値範囲とすることを含む。
【００２３】
本明細書で用いる「過酸」という用語は、化学式ＲＣ（＝Ｏ）ＯＯＨの酸であり、Ｒは任意の有機質部分である。
【００２４】
本明細書で用いる「長鎖過酸」という用語は、化学式ＲＣ（＝Ｏ）ＯＯＨの酸であり、Ｒは６個以上の炭素原子の鎖を含む任意の有機質部分である。長鎖過酸は６から１０個の炭素原子（言い換えるとＣ６−Ｃ１０炭素鎖）又は少なくとも１１個の炭素原子の炭素鎖（言い換えるとＣ１１＋炭素鎖）を含んでもよい。典型的な長鎖過酸はＣ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ２１、又はＣ２２の炭素鎖を含むが、過カプロン酸、過カプリル酸、過ノナン酸、過デカン酸、過ドデカン酸、過ミリスチン酸、過パルミチン酸、過ステアリン酸、及び過オレイン酸に限定されない。
【００２５】
本明細書で用いる「過加水分解する」という用語は、過酸を生産する酵素反応をいう。ある実施態様において、過酸は、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）存在下、化学式Ｒ１Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ２であってＲ１及びＲ２は独立して任意の有機質部分であるエステル基質の過加水分解によって生産される。
【００２６】
本明細書で用いる「長鎖アシルエステル」という用語は、化学式Ｒ１Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ２であって、Ｒ１が少なくとも６個の炭素原子の鎖を含む任意の有機質部分とＲ２が任意の有機質部分であるエステルである。長鎖アシルエステルは６から１０個の炭素原子（言い換えるとＣ６−Ｃ１０炭素鎖）又は少なくとも１１個の炭素原子の炭素鎖（言い換えるとＣ１１＋炭素鎖）を含んでもよい。典型的な長鎖アシルエステルはＣ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ２１、又はＣ２２の炭素鎖を含む。典型的に長鎖アシルエステルはカプロン酸エステル、カプリル酸エステル、ノナン酸エステル、デカン酸エステル、ドデカン酸エステル、ミリスチン酸エステル、パルミチン酸エステル、ステアリン酸エステル、及びオレイン酸エステルを含む。
【００２７】
本明細書で用いる「過酸化水素供給源」という用語は、過酸化水素及び反応物として自然に発生するまたは酵素的に過酸化水素を生産することのできるシステムの成分を含む。
【００２８】
本明細書で用いる「漂白」という用語は、材料を鮮やかにする（言い換えると、白くする）及び／又は洗浄する効果のために適切なｐＨと温度のもと、充分な時間で任意の表面又は材料（例えば、織物、洗濯、パルプ等）の処理をすることをいう。例えば、漂白に適した試薬はＣｌＯ２、Ｈ２Ｏ２、過酸、ＮＯ２等を含むが、これらに限定されない。
【００２９】
本明細書で用いる「消毒」という用語は、表面からの汚れの除去及び製品の表面上の細菌を殺し又は阻害することをいう。本発明はいずれかの特定の表面、製品、汚れ、又は除去すべき細菌に限定することを意図していない。
【００３０】
本明細書で用いる「ペルヒドロラーゼ」という用語は、洗浄、漂白及び消毒のような利用に適した充分高い量の過酸の形成に至る触媒反応能力を有する酵素をいう。ある好ましい実施態様において、本発明のペルヒドロラーゼ酵素は長鎖過酸を生産するために長鎖アシルエステルを過加水分解し、長鎖過酸は広範囲の洗浄関連の適用の使用に適している。特に好ましい実施態様においては、本発明のペルヒドロラーゼは特有の３次構造及び１次配列を有することにより特徴付けられる。さらに特に好ましい実施態様においては、本発明のペルヒドロラーゼはマイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ペルヒドロラーゼの変異体である。しかしながら、本発明はこれらの特定のペルヒドロラーゼに限定されることを意図していない。
【００３１】
本明細書で用いる「マルチマー」という用語は、溶液中に共有又は非共有結合及び複合体として存在する２以上の蛋白質又はペプチドをいう。「２量体」は２個の蛋白質又はペプチドを含むマルチマーであり、「３量体」は３個の蛋白質又はペプチドを含むこと等である。本明細書で用いる「８量体」という用語は、８個の蛋白質又はペプチドのマルチマーをいう。
【００３２】
本明細書で用いる「過加水分解対加水分解の比」という用語は、決定した条件下及び決定した時間内にペルヒドロラーゼによって酵素的に生産される過酸の量に対する酵素的に生産される酸の量の比をいう。実施態様において、酵素によって生産された過酸と酸の量を測定するために本明細書にて示した試験を用いる。
【００３３】
本明細書で用いる「パーソナルケア製品」という用語は、毛髪、皮膚、頭皮、及び／又は歯の洗浄、漂白、及び／又は消毒において用いる製品をいうが、シャンプー、ボディーローション、シャワーゲル、局所用保湿剤、歯磨き粉、及び／又は他の局所用洗剤に限定されない。ある実施態様においては、これらの製品は人間に利用さる一方で、他の実施態様において、これらの製品は人間でない動物（例えば、獣医学の利用）に用いることがある。
【００３４】
本明細書で用いる「薬剤的に許容できる」という用語は、有益性／危険性の割合が合理的に見合っており、過度の毒性、不適合性、不安定性、刺激、アレルギー反応及びそれらのようなものがなく、人及び動物の組織に接触する使用に適した、薬品、薬剤、及び／又は不活性成分をいう。
【００３５】
本明細書で用いる「洗浄組成物」及び「洗浄製剤」という用語は、織物、皿、コンタクトレンズ、他の個体製品、毛髪（シャンプー）、皮膚（石鹸及びクリーム）、歯（口腔洗浄、歯磨き粉）等のような洗浄されるものから好ましくない化合物の除去に有用な組成物をいう。組成物中に用いるペルヒドロラーゼ及び他の酵素と適合性がある限りは、好ましい洗浄組成物の特定の型及びその製品の形態（例えば、液体、ゲル、顆粒、又はスプレー組成物）から選択される任意の材料／化合物をその用語は含む。洗浄される表面、製品、織物及び使用中の洗浄条件のための組成物の所望の形態を考慮して洗浄組成物の材料の特定の選別は容易にされる。
【００３６】
これらの用語は対象物及び／又はその表面を洗浄、漂白、消毒、及び／又は滅菌するのに適する任意の組成物をいう。その用語は洗剤組成物（例えば、液体及び／又は固体洗濯洗剤、上質の織物洗剤、例えば、グラス、木材、セラミックと金属カウンター甲板及び窓のような硬い表面の洗浄製剤、絨毯洗浄剤、オーブン洗浄剤、織物仕上げ剤、織物柔軟剤、及び織物と洗濯のプレスポッター（ｐｒｅ‐ｓｐｏｔｔｅｒｓ）及び食器洗浄剤）を含むが、これらに限定されない。
【００３７】
実際に、本明細書で用いる「洗浄組成物」という用語は、他に定義しない限り、粒状または粉状または重質洗浄剤を含み、特に洗浄洗剤であって、液体、ゲルまたはペースト状多目的洗浄剤、特にいわゆる重質液体（ＨＤL）タイプであって、目の詰まった織物用液体洗浄剤、手用食器洗浄剤または軽質食器洗浄剤、特に高い泡立ちタイプのものであって、種々の錠剤、粒状、液体及び台所用と業務用使用のための泡切れの良いタイプを含む食器洗浄機用食器洗浄剤、抗菌作用の手洗浄タイプ、洗浄棒、口腔洗浄液、歯科用クリーナー、車または絨毯用シャンプー、浴槽洗剤、毛髪用シャンプーと毛髪用リンス、シャワーゲル及び泡状入浴剤及び金属洗浄剤及び漂泊添加剤及び「ステインスティック」（ｓｔａｉｎ−ｓｔｉｃｋ）又は前処理タイプのような洗浄補助剤を含む液体状の洗浄及び消毒洗浄剤である。
【００３８】
本明細書で用いる「洗剤組成物」及び「洗剤製剤」という用語は、汚れた物のクリーニングのための洗浄手段としての使用を意図する混合物に関して用いる。ある実施態様において、その用語は洗濯織物及び衣類（例えば「洗濯洗剤」）に関して用いる。他の実施態様において、その用語は、食器、刃物などの洗浄に使用するもののような他の洗剤をいう。本発明はいずれかの特別な洗剤製剤又は組成物に限定することを意図するものではない。実際に、これらの用語はペルヒドロラーゼの他に、界面活性剤、トランスフェラーゼ、加水分解酵素、酸化還元酵素、ビルダー、漂白剤、漂白活性剤、青味剤と蛍光染料、凝固阻害剤、マスキング剤、酵素活性化剤、抗酸化剤及び可溶化剤を有する洗剤を含む意味で用いられる。
【００３９】
本明細書で用いる「高性能」という用語は、標準洗濯サイクル後の通常の評価によって決定されるように、漂白剤に敏感な染み（例えば、草、紅茶、ワイン、血、黒ずみ等）の洗浄力が増加する性能として定義される。ある実施態様において、本発明はペルヒドロラーゼ酸化において高性能を提供し、着色染みと泥の除去を提供する。さらに実施態様において、本発明のペルヒドロラーゼは染みの除去及び／又は脱色について高性能を有する。さらに加えて実施態様において、本発明のペルヒドロラーゼは脂質に基づく染み及び泥の除去について高性能を有する。さらに実施態様において、本発明のペルヒドロラーゼは食器及び他のものから泥及び染みを除去することについて高性能を有する。
【００４０】
本明細書で用いる「固い表面の洗浄組成物」という用語は、床、壁、タイル、浴室及び台所に取り付けられた備品、及びその類似品のような固い表面を洗浄するための洗剤組成物をいう。そのような組成物は任意の形態を含み、固体、液体、乳液等を含むが、これらに限定されない。
【００４１】
本明細書で用いる「食器洗い用組成物」という用語は、食器を洗浄するためのすべての形態の組成物をいい、粒状、液状の形態を含むが、これらに限定されない。
【００４２】
本明細書で用いる「織物用洗浄組成物」という用語は、織物を洗浄するための洗剤組成物のすべての形態をいい、粒状、液状、及び棒状の形態を含むが、これらに限定されない。
【００４３】
本明細書で用いる「繊維」という用語は、織物繊維、短繊維、及び毛糸、織物、ニットおよび不織布へ転換又は使用に適した糸をいう。その用語は自然及び合成繊維（例えば、人造繊維）から作られた毛糸を含む。
【００４４】
本明細書で用いる「繊維原料」という用語は、ファイバー、毛糸の中間体、毛糸、及び織物から作られる製品（例えば、衣類及び他のもの）を意味する一般的な用語である。
【００４５】
本明細書で用いる「織物」という用語は、いずれの繊維原料をも含む。すなわちその用語は衣類及び布地、毛糸、ファイバー、人造繊維原料、自然原料、合成原料、及びいずれの他の繊維原料をも含む。
【００４６】
本明細書で用いる「適合性がある」という用語は、通常の使用状態の間ペルヒドロラーゼが所望の効果を発揮しないようになる程度までに、洗浄組成物がペルヒドロラーゼの酵素活性を低減しないことをいう。特定の洗浄組成物原料は後に本明細書にて詳細に例示する。
【００４７】
本明細書で用いる「ペルヒドロラーゼ酵素の効果的な量」という用語は、特定の利用（例えば、パーソナルケア製品、洗浄組成物等）に必要とされる酵素活性を得るのに必要なペルヒドロラーゼ酵素の量をいう。そのような効果的量は当業者によって容易に確定され、特定の酵素変異体の使用、洗浄利用、洗浄組成物の特定の組成及び液状の組成物または乾燥状（例えば、粒状、棒状）組成物のいずれが必要かなどの多くの因子に基づく。
【００４８】
本明細書で用いる「不織布洗浄組成物」という用語は、固い表面の洗浄組成物、食器用組成物、パーソナルケア洗浄組成物（例えば、口腔用洗浄組成物、歯科用洗浄組成物、パーソナル洗浄組成物等）、及びパルプ及び紙産業における使用に適した組成物を含む。
【００４９】
本明細書で用いる「口腔用洗浄組成物」という用語は、歯磨剤、歯磨きペースト、歯磨きゲル、歯磨き粉、口腔洗浄、口腔スプレー、口腔ゲル、チューイングガム、薬用キャンディー、サシェ、錠剤、バイオゲル、予防ペースト、歯科処置用液、及びその類似品をいう。本発明のペルヒドロラーゼとともに使用される口腔ケア組成物は周知な技術として示されている（引用により本明細書にすべてが組み込まれている例えば、米国特許番号５，６０１，７５０、６，３７９，６５３、及び５，９８９，５２６を参照願いたい）。
【００５０】
本明細書で用いる「パルプ処理組成物」という用語は、紙を製造するときの使用に適する組成物において用いる本発明のペルヒドロラーゼ酵素をいう。その用語は、木材、及び例えば、「農業廃棄物」と「繊維作物」のような非木材の原料、すなわち麦わら、稲わら、トウモロコシの茎、バガス（サトウキビ）、ホソムギわら、亜麻仁わら、亜麻仁、ケナフ、工業用大麻、サイザル麻、平織りわら、へスペルアロエ等を含むが、これらに限定されないものを含むいずれのパルプ原料の処理にも適した組成物を含む。つまり、本発明はパルプ処理方法における本発明のペルヒドロラーゼの使用も含む。
【００５１】
本明細書で用いる「酸化試薬」という用語は、パルプ又はいずれかの他の原料を漂白する能力を有する試薬をいう。酸化薬品は漂白に適した量、ｐＨ、及び温度がある。これは過酸化水素と過酸を含むが、これらに限定されない。
【００５２】
本明細書で用いる「アシル」という用語は、有機酸基の一般的な名前であり、ＯＨ基除去後のカルボン酸の残基である（例えば、塩化エタノイルＣＨ３ＣＯ−Ｃｌはエタン酸ＣＨ３ＣＯＯＨから形成された塩化アシルである）。個々のアシル基の名前は酸を意味する「−ｉｃ」を「−ｙｌ」に交換することにより作られる。
【００５３】
本明細書で用いる「アシル化」という用語は、アシル基を分子内へ置換、一般的にＯＨ基の活性水素原子に置換する化学変換をいう。
【００５４】
本明細書で用いる「トランスフェラーゼ」という用語は、官能基を一連の基質へ変換することを触媒する酵素をいう。
【００５５】
本明細書で用いる「離脱基」という用語は、別の求核試薬による置換に基づき、アシル供与体から切断される求核試薬をいう。
【００５６】
本明細書で用いる「酵素的変換」という用語は、基質を中間体へ変化させ又は基質又は中間体を酵素と接触させることにより中間体を最終産物へ変化させることをいう。ある実施態様にいて、適切な酵素に基質又は中間体が直接触れることにより接触を行う。他の実施態様おいて、接触とは基質又は中間体を生物に接触させ酵素を発現及び／又は分泌させ、及び／又は基質及び／又は中間体を好ましい中間体及び／又は最終産物へそれぞれ代謝させる生物へ触れさせることを含む。
【００５７】
本明細書で用いる「洗剤安定性」という語句は、洗剤組成物の安定性をいう。ある実施態様において、安定性は洗剤使用中に評価される。一方、他の実施態様において、その用語は貯蔵中の洗剤組成物の安定性をいう。
【００５８】
本明細書で用いる「蛋白質分解の安定性」という語句は、蛋白質分解に耐性を有する蛋白質（例えば、酵素）の能力をいう。その用語は蛋白質の安定性を評価するための任意の特定のプロテアーゼの使用に限定することを意図するものではない。
【００５９】
本明細書で用いる「酸化安定性」は、酸化的条件下蛋白質が機能を果たす能力をいう。実際に、その用語は種々の濃度のＨ２Ｏ２及び／又は過酸存在下、蛋白質が機能を果たす能力をいう。種々の酸化的条件下、当業者に知られている標準的な手法で及び／又は本明細書に記載する方法のいずれかによって、安定性は測定される。酸化化合物の非存在下、酵素活性の存在と比較して、酸化安定性の実質的変化は酵素活性の半減期において少なくとも約５％又はより多くの増加または減少（多くの実施態様については好ましい増加である）が生ずることにより明らかとなる。
【００６０】
本明細書で用いる「ｐＨ安定性」とは、特定のｐＨにて、蛋白質が機能を果たす能力をいう。一般的に多くの酵素は、酵素が機能を果たすべき有限的なｐＨ範囲を有する。ｐＨ中間範囲（言い換えると約ｐＨ７）において機能を果たす酵素に加えて、非常に高い又は非常に低いｐＨの条件下、作用能力を有する酵素がある。当業者に知られている標準的な手法で及び／又は本明細書に記載する方法にいずれかによって、種々のｐＨにおける安定性は測定される。酵素の最適ｐＨにおける酵素活性と比較して、ｐＨ安定性における実質的変化は、酵素活性の半減期において少なくとも約５％又はより多くの増加または減少（多くの実施態様については好ましい増加である）が生ずることにより明らかとなる。しかしながら、本発明はいずれかのｐＨ安定性基準及びｐＨ範囲に限定することを意図していない。
【００６１】
本明細書で用いる「熱安定性」とは、特定の温度にて蛋白質が機能を果たす能力をいう。一般的に多くの酵素は、酵素が機能を果たすべき有限的な温度範囲を有する。温度中間範囲（例えば、室温）において作用する酵素に加えて、非常に高い又は非常に低い温度の条件下、作用能力を有する酵素がある。周知の手法で及び／又は本明細書に記載する方法のいずれかによって、熱安定性は測定される。酵素活性に対する最適温度より異なる温度（言い換えると、より高い又はより低い温度）に曝されたとき、熱安定性における実質的変化は変異体の触媒活性の半減期において少なくとも約５％又はより多くの増加または減少（多くの実施態様については好ましい増加である）が生ずることにより明らかとなる。しかしながら、本発明はいずれかの温度安定性基準及び温度範囲に限定することを意図していない。
【００６２】
本明細書で用いる「化学安定性」という用語は、その活性に悪影響を与える薬品に対する蛋白質（例えば、酵素）の安定性をいう。ある実施態様において、そのような薬品は過酸化水素、過酸、陰イオン洗剤、陽イオン洗剤、非イオン洗剤、キレート等を含むが、これらに限定されない。しかしながら、本発明はいずれかの化学安定性基準及び化学安定性の範囲に限定することを意図していない。
【００６３】
本明細書で用いる「ペルヒドロラーゼ活性の改善」という語句は、標準酵素と比較して、ペルヒドロラーゼ活性が相対的に改善されることをいう。ある実施態様において、その用語は、過加水分解産物の改善された割合をいい、一方、他の実施態様において、その用語はより少ない加水分解産物を生産するペルヒドロラーゼ組成物を含む。さらに実施態様において、その用語は改変された基質特異性をもつペルヒドロラーゼ組成物をいう。
【００６４】
本明細書で用いる「基質特異性の変化」という語句は、酵素の基質特異性における変化をいう。ある実施態様において、基質特異性の変化は、酵素変異体又は他の酵素組成物と比較した酵素との間に観察されるＫｃａt／Ｋｍ比の違いとして定義される。酵素の基質特異性は基質の試験次第で変化する。酵素の基質特異性は異なる基質で有する触媒効率を比較することにより決定される。関心ある特定の基質に対してより高い比を有する種々の酵素を生産することが一般的に必要とされるように、これらの決定は変異酵素の効率性を評価する時に特に使用される。例えば、本発明のペルヒドロラーゼ酵素は、洗浄、漂白、及び消毒に利用の際に実際に用いる酵素よりエステル基質から過酸を生産することにおいてよりよい効率性を有する。本発明の他の例は、野生型に比較して過酸分解に対して低い活性を有するペルヒドロラーゼである。本発明の他の例は、酢酸より疎水性の高いアシル基に対してより高い活性を有するペルヒドロラーゼである。しかしながら、本発明はいずれかの特定の基質組成物及びいずれかの特定の基質特異性に限定することを意図していない。
【００６５】
本明細書で用いる「表面特性」とは、荷電、及び蛋白質表面に存在する疎水性及び／又は親水性のような特性に関して用いる。
【００６６】
本明細書で用いる「．．．からなる群から独立的に選択される」という語句は、次に例を示すように、引用したマーカッシュ群から選択された部分又は要素が同じものでも、異なるものでも、いずれかの要素の混合のものでもよいことを意味する。
【００６７】
即ち、３個のＲ基を有する分子があって、各々のＲ基がＡ、Ｂ、及びＣからなる群から独立的に選択される分子の場合、これは、その３個のＲ基はＡＡＡ、ＢＢＢ、ＣＣＣ、ＡＡＢ、ＡＡＣ、ＢＢＡ、ＢＢＣ、ＣＣＡ、ＣＣＢ、又はＡＢＣであってよいことを意味する。
【００６８】
化学組成物に関して本明細書で用いる「置換される」という用語は、その用語が適用される有機組成物又はラジカルが次の場合をいう。すなわち、（ａ）少なくとも一つの要素又はラジカルの放出により不飽和になること；又は（ｂ）その化合物又はラジカル中の少なくとも１つの水素が１以上の（i）炭素（ii）酸素（iii）硫黄（iv）窒素又は（v）ハロゲン原子を含む部分と置換されること；又は（ｃ）（ａ）及び（ｂ）両方である場合である。
【００６９】
上記（ｂ）に記載したように水素に置換する部分で炭素と水素原子のみを含む部分は、炭化水素としてアルキル、アルケニル、アルキニル、アルキルジエニル、シクロアルキル、フェニル、アルキルフェニル、ナフチル、アントリル、フェナントリル、フルオリル、ステロイド基、及びこれらの基の相互の組み合わせ及びアルキレン、アルキリデン、アルキリジン基のような多価の炭化水素基との組み合わせを含むが、これらに限定されない。上記（ｂ）に記載したように水素を置換する酸素原子を含む部分はヒドロキシル、アシル、又はケト、エーテル、エポキシ、カルボキシル、及びエステル基を含むが、これらに限定されない。上記（ｂ）に記載したように水素を置換する硫黄原子を含む部分は硫黄含有酸及び酸エステル基、チオエーテル基、メルカプト基及びチオケト基を含むが、これらに限定されない。上記（ｂ）に記載したように水素を置換する窒素原子を含む部分は、アミノ基、ニトロ基、アゾ基、アンモニウム基、アミド基、アジド基、イソシアネート基、シアノ基、及びニトリル基を含むが、これらに限定されない。上記（ｂ）に記載したように水素を置換するハロゲン原子を含む部分は塩素、臭素、フッ素、ヨウ素基及び安定した置換部分を形成するためにハロ基によって置換されたペンダントアルキル又は水素である先に説明したいずれかの部分を含む。
【００７０】
（ｂ）（i）から（ｂ）（v）のいずれかの上記の部分は、一価の置換により又は多価置換で水素を失うことによって有機化合物又はラジカル中の水素を置換できる別の一価の部分を形成することができる。
【００７１】
本明細書で用いる「精製される」及び「単離される」という用語は、サンプルから不純物を除去することをいう。例えば、ペルヒドロラーゼは液体又は調整液内でペルヒドロラーゼではない蛋白質及び他の化合物の不純物を除去することによって精製される。ある実施態様において、組み換えペルヒドロラーゼは細菌又は真菌宿主細胞中にて発現し、これらの組み換えペルヒドロラーゼは宿主細胞の構成物質を除去することにより精製される。つまり、組み換えペルヒドロラーゼポリペプチドの割合はこれによりサンプル中にて増加する。
【００７２】
本明細書で用いる「対象蛋白質」とは、分析される、同定される及び／又は修飾される蛋白質（例えば、酵素又は「対象酵素」）をいう。自然発生及び組み換え蛋白質はともに本発明において用いられる。
【００７３】
本明細書で用いる「蛋白質」とは、アミノ酸及び当業者によって蛋白質として認識されるものを含有する任意の組成物をいう。その用語「蛋白質」、「ペプチド」及びポリペプチドは本明細書にて互換可能に用いる。本明細書でペプチドが蛋白質の一部であるときは、当業者は文脈からその用語の使用を理解できる。
【００７４】
本明細書で用いる機能的及び／又は構造的に類似する蛋白質は「関連蛋白質」と考えられる。ある実施態様において、これらの蛋白質は異なる属及び／又は種に由来し、生物の区分間で差異を含む（例えば、細菌の蛋白質及び真菌の蛋白質）。ある実施態様おいて、これらの蛋白質は異なる属及び／又は種に由来し、生物の区分間で差異を含む（例えば、細菌の酵素及び真菌の酵素）。さらに実施態様において、関連蛋白質は同じ種から提供される。実際に、本発明は特定の源由来の関連蛋白質に限定することを意図していない。加えて、その用語「関連蛋白質」は、３次元構造相同性及び１次配列相同性（例えば、本発明のペルヒドロラーゼ）を含む。さらなる実施態様において、その用語は、免疫的交差反応を有する蛋白質を含む。特に好ましい実施態様において、本発明の関連蛋白質は非常に高い過加水分解対加水分解比を有する。
【００７５】
本明細書で用いる「誘導体」という用語は、Ｃ及びＮ末端のどちらか一方又は両方に一以上のアミノ酸を追加、アミノ酸配列中一つ又は多くの異なる位置の置換及び／又は蛋白質のどちらか一方又は両方において又はアミノ酸配列中一以上の部位での一つ又はそれ以上のアミノ酸の欠損及び／又はアミノ酸配列中一以上の部位での一以上のアミノ酸の挿入をすることによって得られる蛋白質由来の蛋白質をいう。蛋白質誘導体の調製は好ましくは自然の蛋白質をコードするＤＮＡ配列を修飾し、そのＤＮＡ配列を最適な宿主細胞に形質転換し、及び修飾蛋白質を発現してその修飾蛋白質を形成することにより達成される。
【００７６】
関連（及び誘導体）蛋白質は「変異蛋白質」を含む。ある実施態様において、少量のアミノ酸残基の数の違いによって変異蛋白質は親蛋白質と異なり、またお互いに異なる。異なるアミノ酸残基の数は一以上であってよく、好ましくは約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、又はそれ以上のアミノ酸残基であってよい。好ましい実施態様において、変異体間の異なるアミノ酸の数は１及び１０の間である。特に好ましい実施態様において、特に関連蛋白質及び変異蛋白質は少なくとも約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、または約９９％のアミノ酸相同性を有する。加えて、本明細書にて用いる関連蛋白質又は変異蛋白質は、特徴的な領域のアミノ酸の数について別の関連蛋白質又は親蛋白質と異なる蛋白質をいう。例えば、ある実施態様において、変異蛋白質は約１、２、３、４、５、又は１０個の特徴的な領域が親蛋白質と異なる。
【００７７】
本発明のペルヒドロラーゼ酵素の変異体を作成するのに適した周知のいくつかの方法は部位飽和突然変異誘発、スキャニング突然変異誘発、挿入突然変異誘発、ランダム突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、及び指向進化、同様に、種々の他の組み換え手法を含むが、これらに限定されない。
【００７８】
ある実施態様において、所望の活性を有する酵素を生産するために相同性のある酵素を設計する。特に好ましい実施態様において、設計された蛋白質はＳＧＮＨ−ヒドロラーゼファミリー蛋白質の範囲に入る。ある実施態様において、設計された蛋白質は次の保存残基の少なくとも１つ又は組み合わせを含む。すなわち、Ｌ６、Ｗ１４、Ｗ３４、Ｌ３８、Ｒ５６、Ｄ６２、Ｌ７４、Ｌ７８、Ｈ８１、Ｐ８３、Ｍ９０、Ｋ９７、Ｇ１１０、Ｌ１１４、Ｌ１３５、Ｆ１８０、Ｇ２０５である。別の実施態様において、これらの設計された蛋白質はＧＤＳＬ（配列番号２８）及びＧＲＴＴ  （配列番号２９）及び／又はＡＲＴＴ（配列番号３０）のモチーフを含む。さらなる実施態様において、酵素はマルチマーであり、２量体、８量体及び４量体を含むが、これらに限定されない。さらに実施態様において、設計された蛋白質は過加水分解対加水分解の比の値が１以上であることを示す。
【００７９】
もし、ペルヒドロラーゼのアミノ酸残基がマイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）の特定の残基又はその一部に対して相同体（言い換えると、１次及び／又は３次構造いずれかにおいて、相当する位置を有する）であるか、又はその特定の残基又はその一部の類似体（言い換えると、結合、反応、及び／又は化学的相互作用に対して同様又は類似の機能的能力を有する）のいずれかであるならば、これはマイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）の残基と同等である。
【００８０】
ある実施態様において、１次構造の相同性を構築するためには、ペルヒドロラーゼのアミノ酸配列はマイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）のペルヒドロラーゼ１次構造及び特に、配列が明らかなすべてのペルヒドロラーゼにおいて不変な領域の残基と直接比較する。アライメントを維持するために挿入及び欠損を行うことの必要性（言い換えると、任意の欠損と挿入を通して保存残基の放出を避けること）を考慮しながら、保存残基の整列化後、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）のペルヒドロラーゼ１次構造における特有のアミノ酸に相当する残基を確定する。ある実施態様においては、保存残基のアライメントはその相当する残基の１００％である。しかしながら、保存残基の約７５％以上又は約５０％ほどのアライメントもまた同等性を与える残基として十分である。好ましい実施態様において、触媒セリン及びヒスチジンの保存は維持された。
【００８１】
他のペルヒドロラーゼ（例えば、他のマイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、及びいずれの他の生物由来ペルヒドロラーゼ）においても「マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）の相当する同等なアミノ酸残基を決定するために、保存残基を用いる。
【００８２】
本発明のある実施態様においては、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ペルヒドロラーゼをコードするＤＮＡ配列が修飾される。ある実施態様おいて、次の残基が修飾される。すなわち、Ｃｙｓ７、Ａｓｐ１０、Ｓｅｒ１１、Ｌｅｕ１２、Ｔｈｒ１３、Ｔｒｐ１４、Ｔｒｐ１６、Ｐｒｏ２４、Ｔｈｒ２５、Ｌｅｕ５３、Ｓｅｒ５４、Ａｌａ５５、Ｔｈｒ６４、Ａｓｐ６５、Ａｒｇ６７、Ｃｙｓ７７、Ｔｈｒ９１、Ａｓｎ９４、Ａｓｐ９５、Ｔｙｒ９９、Ｖａｌ１２５、Ｐｒｏ１３８、Ｌｅｕ１４０、Ｐｒｏ１４６、Ｐｒｏ１４８、Ｔｒｐ１４９、Ｐｈｅ１５０、Ｉｌｅ１５３、Ｐｈｅ１５４、Ｔｈｒ１５９、Ｔｈｒ１８６、Ｉｌｅ１９２、Ｉｌｅ１９４、及びＰｈｅ１９６である。しかしながら、本発明はこれらの位置が修飾されている配列に限定することを意図していない。実際に、本発明は種々の修飾及び修飾の組み合わせを含むことを意図している。
【００８３】
さらに実施態様において、同等の残基は、Ｘ線結晶学によって決定されている３次及び４次構造のペルヒドロラーゼに対して、３次及び４次構造のレベルで相同性を決定することにより、明確にする。この文脈において、「同等の残基」とは、アライメント後、カルボニルヒドラーゼ及びマイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ペルヒドロラーゼの特有のアミノ酸残基における２以上の主鎖原子の原子座標（Ｎ対Ｎ、ＣＡ対ＣＡ、Ｃ対Ｃ、及びＯ対Ｏ）が０．１３ｎｍ及び好ましくは０．１ｎｍ以内である残基として定義される。対象とされるマイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ペルヒドロラーゼにおけるペルヒドロラーゼの水素以外の蛋白質原子の原子座標が最大限重なるように最良モデルを配向し位置づけた後に、アライメントを行う。周知技術に知られているように、最良モデルとは最も高い分解能での実験回折データに対して最も低いＲ因子を示す結晶学的モデルである。マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ペルヒドロラーゼの特定の残基に機能的及び／又は構造的に類似性のある同等の残基は、それらが蛋白質構造を改変し、修飾し、又は調節するに当たり特異的に構造を選択し、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ペルヒドロラーゼの特定の残基を特徴とし、これに由来する状態で基質結合及び／又は触媒作用の変化に効果を与えるペルヒドロラーゼのアミノ酸と定義される。さらに、それらは、与えられた残基の主鎖原子が対応する位置の位置決めに基づき同等の基準を満さない場合でも、残基の少なくとも２つの側鎖原子の原子座標がマイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ペルヒドロラーゼの相当する側鎖の０．１３ｎｍに位置する範囲に対応する位置をとっているペルヒドロラーゼ（３次構造がＸ線結晶学によって得られている場合に）の残基である。マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ペルヒドロラーゼの３次元構造の座標が決定され、ＷＯ０５／０５６７８２の実施例１４に説明され、３次構造レベルにおける相当する残基を決定するために上記の様に用いる。
【００８４】
ある実施態様において、置換、挿入、及び欠損のために同定された幾つかの残基は、保存残基であるが、その他の残基はそうでない。本発明のペルヒドロラーゼ変異体はシグナル配列を含有する核酸によってコードされる種々の変異体を含む。ある実施態様において、そのような配列によりコードされるペルヒドロラーゼ変異体は宿主の発現により分泌される。さらにある実施態様において、そのような配列によりコードされるペルヒドロラーゼ変異体は宿主の発現により細胞質に生産される。さらなる実施態様において核酸配列は分泌シグナルを有する相同体を含む。
【００８５】
野生型及び変異蛋白質の特徴付けは適切な任意の手段によって行われる。好ましくは評価対象となる特徴の評価に基づく。例えば、本発明のある実施態様においては、ｐＨ及び／又は温度、洗剤の安定性及び／又は酸化安定性が決定される。実際に、一以上のこれらの特徴（例えばｐＨ、温度、蛋白質分解安定性、洗剤安定性、及び／又は酸化安定性）において種々の安定度を有する酵素が有用であると考えられる。他の実施態様においては、低い過酸分解活性を有するペルヒドロラーゼが選択される。さらなる実施態様においては、より高い過酸生成を有するペルヒドロラーゼが選択される。
【００８６】
本明細書で用いる「発現ベクター」とは、適切な宿主中にＤＮＡの発現をもたらすことのできる適切な制御配列に作動的に連結するＤＮＡ配列を有するＤＮＡ構築体をいう。そのような制御配列は転写に影響するプロモーター、そのような転写を制御する任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列及び転写と翻訳のターミネーションを制御する配列を含む。ベクターはプラスミド、ファージ粒子でもよく、単に潜在遺伝子の挿入でもよい。一度適切な宿主へ形質転換されたら、ベクターは複製し、宿主遺伝子から独立して機能する可能性があり、又はある場合はその遺伝子自身へ組み込まれる可能性がある。現在プラスミドはベクターの形態として最も普通に用いるので本明細書における「プラスミド」（ｐｌａｓｍｉｄ）、「発現構築体」（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ(ｓ)）、及び「ベクター」（ｖｅｃｔｏｒ）という用語は時々互換可能に使用される。しかしながら本発明は同等の機能を果たし周知であるか又は周知になりつつある発現ベクターの他の形態を含むものである。
【００８７】
好ましい実施態様において、ペルヒドロラーゼ遺伝子は適切な発現プラスミドにライゲーションする。ペルヒドロラーゼ遺伝子を発現するためにクローン化ペルヒドロラーゼ遺伝子は宿主細胞に形質転換又はトランスフェクションするのに用いる。ある実施態様においては、プラスミドはその複製に必要な周知の要素を含むという点に着目して、このプラスミドを宿主にて複製し、一方、他の実施態様においては、プラスミドを宿主染色体へ組み込むために設計する。必要な要素を効率的な遺伝子発現のために用いる（例えば、対象となる遺伝子に作動的に連結するプロモーター）。ある実施態様においては、これらの必要な要素は、もしそれが認識される（言い換えると、宿主によって転写される）場合、遺伝子自身の相同的なプロモーターとして供給され、また外来性又はペルヒドロラーゼ遺伝子の内因性ターミネーターによって供給される転写ターミネーター（例えば、真核性宿主細胞のポリアデニル化領域）として供給される。抗菌剤含有培地中の増殖によりプラスミドが感染した宿主細胞の継続培養を維持することのできる抗菌剤耐性遺伝子のような選択遺伝子をもまた用いられる。
【００８８】
ある実施態様においては、他の方法も本発明にて用いることができるが、次のカセット変異法が本発明のペルヒドロラーゼ変異体の構築を容易にするのに用いられる。
【００８９】
まず、本明細書に記載するように、ペルヒドロラーゼをコードする自然に発生する遺伝子を取得し、全体または一部の塩基配列を決定する。それから、コードされたペルヒドロラーゼ中一以上の変異（例えば、一以上の欠損、挿入、及び／又は置換）をさせたい位置に配列をスキャンさせる。この位置に隣接する配列については、発現の際、種々の変異体をコードするように、オリゴヌクレオチドをプールしている遺伝子の短い断片を置換するための制限酵素認識部位の存在が調べられる。そのような制限酵素認識部位は、好ましくは、遺伝子断片の置換が容易となるような蛋白質遺伝子内の特徴部位である。しかしながら、制限的消化により生じる遺伝子フラグメントが正しい配列にて再構築される限り、ある実施態様においては、ペルヒドロラーゼ遺伝子中過度に重複していない適当な制限酵素認識部位を用いてもよい。もし制限酵素認識部位が選択した位置から都合のよい距離内（例えば１０から１５ヌクレオチドまで）の場所に存在していない場合、そのような部位は最終的な構築体中にてリーディングフレーム又はアミノ酸コードを変更しない方法で遺伝子のヌクレオチドを置換することにより作製される。ある実施態様においては、所望の配列に合わせてその配列を変更するために遺伝子の変異は一般的に周知な方法であるＭ１３プライマー伸長法によって成し遂げられる。適切なフランキング領域の位置を探し、二つの都合のよい制限酵素認識部位の配列に至るために必要な変更を調べることを、遺伝子コードの重複、遺伝子の制限酵素地図、及び多くの異なる制限酵素によって所定の方法にて行う。もし、都合のよいフランキング制限酵素認識部位が入手可能であれば、上述の方法は、該当部位を含まないフランキング領域との関係においてのみの使用が必要となる。
【００９０】
一度自然に発生するＤＮＡ及び／又は合成ＤＮＡがクローン化されると、変異される位置に隣接する制限酵素認識部位は、同種の制限酵素で消化され、多くの末端相補的オリゴヌクレオチドカセットは遺伝子にライゲーションする。すべてのオリゴヌクレオチドは、同じ制限酵素認識部位、及び制限酵素認識部位を創る必要のない合成リンカーを有するように合成できるので、この方法によって突然変異を簡素化できる。
【００９１】
本明細書で用いる「に相当する」とは、蛋白質又はペプチド中列挙される位置での残基、又は蛋白質又はペプチド中列挙される残基に対して類似性、相同性、同等である残基をいう。
【００９２】
本明細書で用いる「相当する領域」とは、一般的に関連蛋白質又は親蛋白質に沿う類似する位置をいう。
【００９３】
「核酸分子をコードする」、「核酸配列をコードする」、「ＤＮＡ配列をコードする」、及び「ＤＮＡをコードする」という用語は、一本鎖デオキシリボ核酸に沿ったデオキシリボ核酸の順序または配列をいう。これらデオキシリボ核酸の順序はポリペプチド（蛋白質）鎖に沿ったアミノ酸の順序を決定する。つまりＤＮＡ配列はアミノ酸配列をコードする。
【００９４】
本明細書で用いる「類似配列」という用語は、対象蛋白質（言い換えると、一般的に対象となる原型蛋白質）として、同様の機能、３次構造、及び／又は保存残基を有する蛋白質内の配列をいう。例えば、アルファへリックス又はベータシート構造を含むエピトープ領域において、類似配列中のアミノ酸の置換は好ましくは同じ特有の構造を維持する。その用語は核酸配列、及びアミノ酸配列もいう。ある実施態様においては、類似配列は開発され、その結果、置換アミノ酸によって同様の又は改善された機能を示す種々の酵素を得る。ある実施態様においては、対象蛋白質中アミノ酸の３次構造及び／又は保存残基は対象セグメント又はフラグメントに位置し、または近くに位置する。すなわち、対象セグメント又はフラグメントが、例えば、アルファ‐へリックス又はベータ‐シート構造を含む場合には、置換アミノ酸は好ましくはその特有の構造を維持するのがよい。
【００９５】
本明細書で用いる「相同蛋白質」とは、対象蛋白質（例えば、別のソース由来ペルヒドロラーゼ）と同様の作用及び／又は構造を有する蛋白質（例えば、ペルヒドロラーゼ）をいう。相同体は必ずしも進化的関連性があることを意図していない。即ち、その用語は異なる種から得られる同じ又は同様の酵素（言い換えると、構造及び機能に関して）を含むことを意図する。ある実施態様において、対象蛋白質中のセグメント又はフラグメントを相同体由来の類似セグメントで置換すると変化による混乱が低減するので、対象蛋白質と同様の４次、３次、及び／又は１次構造もつ相同体を同定する必要がある。ある実施態様において、相同蛋白質は対象蛋白質と同様の免疫反応を誘導する。
【００９６】
本明細書で用いる「相同遺伝子」とは、お互いに対応する遺伝子及びお互いに同一又は非常に似た異種由来の少なくとも一対の遺伝子をいう。その用語はスピシエーション（言い換えると、新種の開発）（例えば、オーソロジー遺伝子）によって分離される遺伝子、及び遺伝子複製（パラロジー遺伝子）によって分離される遺伝子を含む。これらの遺伝子は「相同遺伝子」をコードする。
【００９７】
本明細書で用いる「野生型」、「天然の」、及び「自然に発生する」蛋白質とは、自然界に見られるものをいう。本明細書にて互換可能に用いられる「野生型配列」、及び「野生型遺伝子」の用語は、宿主細胞に天然に又は自然に発生する配列をいう。ある実施態様においては、野生型配列は蛋白質工学プロジェクトの開始点である対象配列をいう。自然に発生する蛋白質をコードする遺伝子は当業者が周知である一般的方法で得られて良い。その方法は一般的に対象蛋白質の領域をコードする推定配列を有する標識プローブを合成し、蛋白質発現生物由来の遺伝子ライブラリーを調製し、そのプローブにハイブリダイゼーションすることにより関心ある遺伝子についてそのライブラリーをスクリーニングすることを含む。最終的にハイブリダイズされたクローンは遺伝子地図が作られ、配列が決定される。
【００９８】
本明細書で用いる「組み換えＤＮＡ分子」という用語は、分子生物学の技術手段により結合するＤＮＡ断片を含むＤＮＡ分子をいう。
【００９９】
「組み換えオリゴヌクレオチド」という用語は、分子生物学的操作を用いて創作されるオリゴヌクレオチドをいい、ポリヌクレオチド配列の制限酵素消化、オリゴヌクレオチドの合成（例えば、プライマー又はオリゴヌクレオチドの合成）、及び類似するものにより生じる２以上のオリゴヌクレオチドのライゲーションを含むが、これらに限定されない。
【０１００】
配列間の相同性の程度は先行技術（例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，  Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．，  ２：４８２  [１９８１]；  Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，  Ｊ．  ＭｏＩ．  Ｂｉｏｌ．，  ４８：４４３  [１９７０];  Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：２４４４  [１９８８]；  ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ソフトウェアパッケージ  （Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）中ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡのようなプログラム及びＤｅｖｅｒｅｕｘ他、  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，  １２：３８７−３９５  [１９８４]を参照願いたい）にて知られている任意の適切な方法を用いて決定される。
【０１０１】
例えばＰＩＬＥＵＰは相同性レベルを決定する有用なプログラムである。ＰＩＬＥＵＰはプログレッシブアライメント、ペアワイズアライメントを用いて関連配列グループから多重配列整列を創る。それはアライメントを創るために用いるクラスターの類似関係を示す系統図のプロットもできる。ＰＩＬＥＵＰはＦｅｎｇ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅのプログレッシブアライメント法を単純化したものである。（Ｆｅｎｇ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，  Ｊ．  ＭｏＩ．  Ｅｖｏｌ．，  ３５：３５１−３６０  [１９８７]）。方法はＨｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐによる記載のものと同様である（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，  ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３  [１９８９]）。有用なＰＩＬＥＵＰパラメータは３．００のデフォルトギャップウエイト（ｄｅｆａｕｌｔ  ｇａｐ  ｗｅｉｇｈｔ）を、０．１０のデフォルトギャップレングスウエイト（ｄｅｆａｕｌｔ  ｇａｐ  ｌｅｎｇｔｈ  ｗｅｉｇｈｔ）、及び加重エンドギャップ（ｗｅｉｇｈｔｅｄ  ｅｎｄ  ｇａｐｓ）を含む。有用なアルゴリズムの別の例はＡｌｔｓｃｈｕｌ他により記載されたＢＬＡＳＴアルゴリズムである(Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  ＭｏＩ．  Ｂｉｏｌ．，  ２１５：４０３−４１０，  [１９９０]及びＫａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７  [１９９３])。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムはＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  ２６６：４６０−４８０  [１９９６]参照)である。パラメータ「Ｗ」、「Ｔ」、及び「Ｘ」はアライメントの感度とスピードで決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは１１のワードの長さ（ワード（Ｗ））、５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列(Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：１０９１５  [１９８９])アライメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ‘５、Ｎ’−４、及び両鎖の比較をデフォルトとして用いる。
【０１０２】
本明細書で用いる「核酸配列相同性の割合（％）」とは、配列のヌクレオチド残基と同一性のある候補配列中のヌクレオチド残基の割合として定義される。
【０１０３】
本明細書で用いる「ハイブリダイゼーション」という用語は、先行技術として周知のように、塩基対を通して、核酸の一本鎖が相補鎖と結合する過程をいう。
【０１０４】
本明細書で用いる「ハイブリダイゼーション条件」という語句は、ハイブリダイゼーション反応を行う条件をいう。これらの条件は通常ハイブリダイゼーションが測定される条件下「ストリンジェンシー」の程度によって区分される。例えば、ストリンジェンシー」の程度は複合体又はプローブに結合する核酸の融解温度（Ｔｍ）を基準にすることができる。例えば、「最大ストリンジェンシー」は通常約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍを下回る５℃）において生じ、「高いストリンジェンシー」はＴｍを約５℃から１０℃下回る温度、「中間のストリンジェンシー」はプローブのＴｍを約１０℃から２０℃下回る温度、及び「低いストリンジェンシー」はＴｍを約２０℃から２５℃下回る温度で生じる。かわりに、又は追加的に、ハイブリダイゼーションの条件はハイブリダイゼーション及び／又は一以上のストリンジェンシー洗浄での塩濃度又はイオン強度条件に基づくこともできる。例えば、６ｘＳＳＣ＝非常に低いストリンジェンシー、３ｘＳＳＣ＝低いから中間のストリンジェンシー、１ｘＳＣＣ＝中間のストリンジェンシー、及び０．５ｘＳＳＣ＝高いストリンジェンシーである。機能的に見て、最大ストリンジェンシー条件はハイブリダイゼーションプローブと厳密的に同一又は厳密に同一に近い核酸配列を同定するために用いてよく、一方、高いストリンジェンシー条件は約８０％以上プローブと同一である配列を有する核酸配列を同定するために用いてよい。
【０１０５】
高い選択性を必要とする適用のためには、ハイブリッドを作成するのに比較的ストリンジェントな条件（例えば、相対的に低塩及び／又は高温を使用）を用いることが望ましい。
【０１０６】
少なくとも２つの核酸又はポリペプチドの文脈での「実質的に同様の」及び「実質的に同一の」という語句は、通常ポリヌクレオチド又はポリペプチドが引用（例えば、野生型）の配列と比較して、少なくとも約４０％の相同性、さらに好ましくは少なくとも約５０％の相同性、もっと好ましくは少なくとも約６０％の相同性、好ましくは少なくとも約７５％の相同性、より好ましく少なくとも約８０％の相同性、さらにもっと好ましくは少なくとも約９０％の相同性、好ましくは約９５％の相同性、好ましくは９７％の相同性、時には９８％と同じ程度、及び約９９％の配列相同性を有する配列を含むことを意味する。標準パラメータ(例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  ＭｏＩ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３‐４１０  ［１９９０］；  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：１０９１５  ［１９８９］  ；  Ｋａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：５８７３  ［１９９３］；  及びＨｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ，  Ｇｅｎｅ  ７３：２３７  ‐  ２４４  [１９８８］を参照)を用いるＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、及びＣＬＵＳＴＡＬのような周知のプログラムを用いて配列相同性を決定してよい。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは全米バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を通じて誰でも入手可能である。またデータベースはＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：２４４４‐２４４８  ［１９８８］）を用いて検索してもよい。二つのポリペプチドが実質的に同一であるとは第一のポリペプチドが第二のポリペプチドと免疫的に交差反応を有することが１つの指標である。典型的に、同類アミノ酸置換による異なるポリペプチドは免疫的に交差反応を有する。すなわち、例えば、同類アミノ酸置換よってのみ異なる二つのペプチドの場合、第一のポリペプチドは第二のポリペプチドと実質的に同一である。二つの核酸が実質的に同一であるとはストリンジェントな条件（例えば中間から高いストリンジェンシーの範囲内）下、２分子がお互いにハイブリダイズすることが別の指標となる。
【０１０７】
本明細書で用いる「ハイブリッドペルヒドロラーゼ」及び「融合ペルヒドロラーゼ」という用語は、二つの異なる又は「親の」蛋白質から設計された蛋白質をいう。好ましい実施態様において、これらの親の蛋白質は別の蛋白質の相同体である。例えば、ある実施態様において、好ましいハイブリッドペルヒドロラーゼ又は融合蛋白質は蛋白質Ｎ末端とその蛋白質相同体のＣ末端を含む。ある実施態様においては、完全長活性蛋白質に相当するために二箇所の末端を結合する。
【０１０８】
本明細書で用いる「調節エレメント」という用語は、核酸配列の発現におけるある局面を制御する遺伝子的要素をいう。例えば、プロモーターは作動的に結合したコード領域の転写開始を促進させる調節エレメントである。さらに調節エレメントはスプライシングシグナル、ポリアデニレーションシグナル、及びターミネーションシグナルを含む。
【０１０９】
本明細書で用いる「宿主細胞」とは、一般的に周知技術の組み換えＤＮＡを用いて構築されたベクターに形質転換又はトランスフェクションされる原核生物又は真核生物の宿主をいう。形質転換された宿主細胞は、蛋白質変異体をコードするベクターを複製し、又は所望の蛋白質変異体を発現することができる。蛋白質変異体の前駆体又はプレプロプロテインの形態でコードするベクターの場合、そのような変異体が発現するとき、通常、宿主細胞培地へ宿主細胞から分泌される。
【０１１０】
細胞へ核酸配列を挿入するという文脈中「導入される」という用語は、形質転換、形質導入、及びトランスフェクションのような方法をいう。形質転換の手段は周知の技術（Ｃｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ，  ＭｏＩ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．，  １６８：１１１  ‐  １１５  [１９７９]；  Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ,  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ５１：６３４  [１９８６]；及びｔｈｅ  ｒｅｖｉｅｗ  ａｒｔｉｃｌｅ  ｂｙ  Ｆｅｒｒａｒｉ  ｅｔ  ａｌ，  ｉｎ  Ｈａｒｗｏｏｄ，  Ｂａｃｉｌｌｕｓ，  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．，  ｐｐ．  ５７‐７２  [１９８９]を参照）としてプロトプラスト形質転換、塩化カルシウム沈殿法、電気穿孔、ｎａｋｅｄ  ＤＮＡ等を含む。
【０１１１】
本明細書で用いる「プロモーター／エンハンサー」という用語は、プロモーター及びエンハンサー機能（例えば、プロモーター及びエンハンサー機能両方を含むレトロウイルスの末端反復配列（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔｓ））の両方を提供することができる配列を含むＤＮＡ断片を意味する。エンハンサー／プロモーターは「内因性」、「外因性」、及び「異種性」でもよい。内因性エンハンサー／プロモーターは染色体中の遺伝子と自然に結合しているものである。外因性（異種性）のエンハンサー／プロモーターは遺伝子操作（言い換えると、分子生物学的技術）の手段によって遺伝子に並んで置かれるものをいう。
【０１１２】
発現ベクター上「スプライシングシグナル」の存在によってしばしば組み換え体の転写物の発現がより高いレベルとなる。スプライシングシグナルは一次ＲＮＡ転写物からイントロンの除去を仲介し、スプライス供与及び受容部位（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ［１９８９］，  ｐｐ．  １６．７‐１６．８）からなる。通常用いるスプライシング供与及び受容部位はＳＶ４０の１６ＳＲＮＡ由来のスプライス部位である。
【０１１３】
「安定なトランスフェクション」又は「安定にトランスフェクションされる」という用語は、トランスフェクションされる細胞の遺伝子への外来ＤＮＡの導入及び組み込みをいう。「安定なトランスフェクタント」という用語はトランスフェクションされる細胞の遺伝子ＤＮＡに外来及び外因性ＤＮＡを安定的に組み込まれる細胞をいう。
【０１１４】
本明細書で用いる「選択可能なマーカー」又は「選択可能な遺伝子産物」という用語は、選択可能なマーカーが発現する細胞において、抗生物質又は薬物に耐性を与える酵素活性をコードする遺伝子の使用をいう。
発明の詳細な説明
【０１１５】
本発明は洗浄及び他の利用のための少なくとも１つのペルヒドロラーゼを含む組成物及び方法の提供である。いくつかの実施態様において、本発明は長鎖過酸の生成のための組成物及び方法を提供する。本発明のある実施態様は洗浄、漂白、及び消毒に関与する利用における特定の使用を示す。
【０１１６】
ある実施態様においては、本発明はエステル基質及び過酸化水素から長鎖過酸を酵素的に生成するために用いるペルヒドロラーゼ酵素を提供する。本発明のペルヒドロラーゼにより生成される過酸は本発明のペルヒドロラーゼにより過加水分解されるエステル基質によって決まる。ある実施態様においては、対象であるペルヒドロラーゼによって生産される過酸は、過カプロン酸、過カプリル酸、過ノナン酸、過デカン酸、過ドデカン酸、過ミリスチン酸、過パルミチン酸、過ステアリン酸、及び過オレイン酸を含むが、これらに限定されない。
【０１１７】
ある実施態様において、より詳しく以下に記載するように、長鎖エステル基質は、所望の過酸次第であるが、Ｃ６からＣ１０基質又はＣ１１＋基質（言い換えると、Ｃ１１からＣ２２基質）である。より詳しく以下に記載するように、多様な異なる長鎖エステル基質が本発明にて用いられる。特に好ましい実施態様において、エステル基質は次の一以上から選択される。それは、カプロン酸エステル、カプリル酸エステル、ノナン酸エステル、デカン酸エステル、ドデカン酸エステル、ミリスチン酸エステル、パルミチン酸エステル、ステアリン酸エステル、及びオレイン酸エステル、又はそれらのいずれかの飽和又は置換体である。さらに実施態様において、本発明において多重エステルを用いる。
【０１１８】
本発明のペルヒドロラーゼ酵素及び過酸はｐＨ及び温度の広い範囲に渡って洗浄、漂白、及び／又は消毒に使用できる。ある実施態様において、この作業に用いるｐＨの範囲は約４から約１２である。ある実施態様において、用いる温度範囲は約５℃から約９０℃の間である。実際に、本発明の実施態様において、現在使用しているシステム（例えば、ＥＰ  Ａｐｐｌｎ．  ８７‐３０４９３３．９参照）を超える効果を与える。本発明での場合、過酸酸化の最適ｐＨで漂白が可能であり、同様に、中性ｐＨ、酸性ｐＨ、及び低い温度で漂白ができる。長鎖過酸は臭いが弱く又は臭いがない。そのような本発明ペルヒドロラーゼの使用は他のシステム（例えば、顕著な臭いを有するより短い鎖の過酸を生成することに限定する他のペルヒドロラーゼ）に特定の効果をもたらす。
【０１１９】
本発明は、洗濯及び衣類のケアに関してもっとも多く本明細書にて記載するが、本発明はこれらの適用に限定するものではない。実際に、本発明は種々の状況、特に過酸及び／又は過酸化水素による漂白において使用でき、洗濯、食器洗浄、織物処理、パルプ及び紙工程、パーソナルケア利用、消毒、及び硬い表面の洗浄を含むが、これらに限定されない。例えば、本発明の組成物はパルプの漂白における使用が考えられる、米国特許第６，５６９，２８６、５，７８５，８１２、６，１６５，３１８、及び４，４００，２３７にて説明されるような方法での使用を含み、これらすべて参照により、本明細書に組み込まれる。
【０１２０】
歴史的に、過ホウ酸ナトリウム、及び最近では、過炭酸ナトリウムが特にヨーロッパの洗濯洗剤において漂白化合物として使用されている。これらの化合物は過ホウ酸ナトリウムは活性漂白種である過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を生成するために、水溶液中にて迅速に分解する傾向がある。過ホウ酸ナトリウムは８０℃以上の温度でより活性があり、４０から６０℃（言い換えると、１９５０年代最も一般的に好ましいとされてきた洗濯温度）の温度範囲で活性が消失するので、漂白活性剤が過ホウ酸ナトリウム含有洗濯洗剤へ添加された。実際に、多くの洗濯洗剤は漂白活性剤を含む。これらの活性剤はペルオキシ酢酸を生成するために強度な求核ヒドロペルオキシアニオンと反応できるＯ―、Ｎ―結合アセチル基を有する化合物である。反応種はヒドロペルオキシアニオンなので、アルカリ性のｐＨがこれらの活性剤の過酸への効率的な変換に必須である。ペルオキシ酢酸は一重項酸素（例えば、Ｈｏｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｐｒａｋｔ．  Ｃｈｅｍ．，  ３３４：２９３‐２９７  ［１９９２］参照）を形成するので、弱塩基性媒体中分解される。
【０１２１】
過酸化水素はある状況で織物を洗濯する際、一般的に用いる高い温度（例えば、＞４０℃）及びｐＨ（＞１０）条件で特に効果的な漂白ができる。しかしながら、上述のように、冷水での洗濯がより一般的な使用になりつつあり、熱水の使用よりＨ２Ｏ２による効果的漂白が減少する結果となる。低温での不利益を克服するために、洗剤製剤は一般的にＴＡＥＤ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’‐テトラアセチルエチレンジアミン（Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’‐ｔｅｔｒａａｃｅｔｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ））、ＮＯＢＳ（ノナノイルオキシベンゼンスルホネート  （ｎｏｎａｎｏｙｌｏｘｙｂｅｎｚｅｎｅ  ｓｕｌｆｏｎａｔｅ））等のような漂白ブースターを含む。ＮＯＢＳは過ノナン酸を形成するためにＨ２Ｏ２と結合する一方、ＴＡＥＤはＨ２Ｏ２単独より効果的な過酸種である過酢酸を形成するためにＨ２Ｏ２と結合する。それは洗剤漂白能力を補助するけれども、ＴＡＥＤ中４つのアシル基のうち２つのみ過酸へ変換されるので、ＴＡＥＤの反応は僅か約５０％の効率性しかない。加えて、過酸化水素による過酢酸へのＴＡＥＤの変換はアルカリ性のｐＨ及び高い温度の場合のみ効率的である。つまり、ＴＡＥＤの反応はすべての漂白適用（例えば、中性または酸性ｐＨ及び冷水に関係するもの）においての使用のために最適化されていない。本発明はＴＡＥＤ使用の不利益を克服するための手段を提供する。例えば、本発明の特に好ましい実施態様において、冷水での適用、及び中性又は酸性ｐＨレベルに関係する適用に有用である。さらに特に、好ましい本発明の実施態様は過加水分解対加水分解の比が高い比の値である過酸化水素から過酸を生成するための手段を提供する。そのような手段は過加水分解対加水分解の比の値が低いエステラーゼ及びリパーゼのような酵素含有組成物よりも有利な点をもたらす。
【０１２２】
洗剤中の適用に加え、好ましい実施態様は繊維漂白及び種々の他の利用における過酸の使用のための方法及び組成物を提供する。ある実施態様において、本発明は繊維工程の適用のために一段階法を提供し、一段階湯通し、汚れのこすり落とし、漂白過程（例えば、すべて引用により本明細書に組み込まれるＷＯ  ０３／００２８１０、ＥＰ  １２５５８８８、ＷＯ  ０１／６４９９３、及びＵＳ  ２００２／０００７５１６を参照、願いたい）を含むが、これらに限定されない。本明細書にてより詳しく記載するように、ある実施態様おいて、漂白は、染色する前及び／又は繊維製品へ組み込まれた後、繊維原料を処理することに関与する。しかしながら、本発明はいずれかの特定の使用計画またはいずれかの特定の繊維原料に限定することを意図しない。
【０１２３】
さらに、多くの過酸は効果的な殺菌剤（Ｂａｌｄｒｙ，  Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  ５４：４１７‐４２３  ［１９８３］参照）として有用である。すなわち、本発明のある実施態様は多様な目的物の殺菌／消毒のための組成物及び方法を提供し、医療装置、医療器具、産業用器具、及び培養装置の他にまた殺菌／消毒を必要とする任意の目的物を含むがこれらに限定されない。追加的な実施態様において、本発明は冷却塔のようなバイオフィルム抑制にかかる使用に有用な組成物及び方法を提供する。
【０１２４】
また、以下の実施例により詳しく記載するように、本発明は広い範囲の目的物の洗浄／消毒に対して多くの有利な点を提供する。さらに実施態様において、本発明は洗浄温度及びｐＨの範囲にわたって洗浄、漂白、消毒について効果的な組成物を提供する。またさらに実施態様において、本発明ペルヒドロラーゼ過酸分解活性を通して過酸の分解に有用である。ある実施態様においては、この活性は過酸廃棄における利用に用いられる。
【０１２５】
さらに、本発明のあるペルヒドロラーゼ酵素は種々のアシル供与基質に対して活性を有し、低い基質濃度でも活性を有する。そして、過酸：酸の比が高いので効率的な過加水分解の手段を提供する。実際に、加水分解に対してより高い過加水分解の割合が高い漂白利用（例えば、すべて引用により本明細書に組み込まれるＵ．Ｓ．  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．  ５，３５２，５９４、５，１０８，４５７、５，０３０，２４０、３９７４，０８２、及び５，２９６，６１６を参照）において好適であると認識されている。本発明のあるペルヒドロラーゼ酵素は過加水分解対加水分解の比が１以上の比の値を有する。ある実施態様において、ペルヒドロラーゼ酵素は１以上の過加水分解対加水分解の比の値を有し、漂白において有用である。
【０１２６】
さらに、本発明のペルヒドロラーゼは通常使用される洗剤製剤（例えば、Ａｒｉｅｌ  Ｆｕｔｕｒ、ＷＯＢ、等）において活性を有することが明らかとなる。即ち、本発明のペルヒドロラーゼは種々の洗浄状況において多くの利点を提供する。
【０１２７】
上記に示すように、酵素的過加水分解による過酸生産のためのある構成要素は酵素、エステル基質、及び過酸化水素である。ある実施態様において、過酸化水素は直接バッチに添加され、一方他の実施態様において、それはそのままで連続的に生産される。
現在の洗浄粉は自然にＨ２Ｏ２へ分解する過炭酸塩又は過ホウ酸塩の形式でバッチにＨ２Ｏ２を加えている。本発明のペルヒドロラーゼ酵素はＨ２Ｏ２を供給源とする同じ洗浄粉バッチ方法に関して有用である。しかしながら、これらの酵素は、Ｈ２Ｏ２にかかる他のいずれかの適した供給源にも用いられ、化学的、電気化学的、及び／又は酵素的手段によって発生するＨ２Ｏ２を含む。例えば、化学的供給源は上記に記載される過炭酸塩及び過ホウ酸塩を含むが、これらに限定されない。電気化学的非制限的な例は酸素及び水素ガスを供給される燃料電池であり、一方、酵素的例の非制限的例はグルコースオキシダーゼを用いたグルコース及び酸素の反応からＨ２Ｏ２の生成を含む。次の式は本発明を用いる一対のシステムの例を示す。
【化１】
2010508843.tif 000002
【０１２８】
本発明のいずれの実施態様も本発明に用いるのに適した基質でＨ２Ｏ２を生成する任意の酵素として、特定の酵素に限定することを意図していない。例えば乳酸及び酸素からＨ２Ｏ２を創ることが知られているラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種由来の乳酸オキシダーゼは本発明に有用である。実際に、本発明のある方法の一つの利点は、酸（例えば、上記例中のグルコン酸の生成）によって、漂白において過酸の最も効果的なｐＨの範囲（言い換えると、ｐＫａ付近）に基本溶液のｐＨを低減することである。過酸化水素を生成することのできる他の酵素（例えば、アルコールオキシダーゼ、エチレングリコールオキシダーゼ、グリセロールオキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ等）もまた過酸を生成するために本発明のペルヒドロラーゼ酵素と組合わせてエステル基質と供に用いることができる。
【０１２９】
本明細書により詳しく記載するように、本発明は洗浄及び他の利用のための少なくとも一つのペルヒドロラーゼを含む組成物及び方法を提供する。いくつかの実施態様において、本発明は長鎖過酸の生成のための組成物及び方法を提供する。本発明の好ましい実施態様は洗浄、漂白、及び消毒に関与する利用における特定の使用を示す。
【０１３０】
長鎖過酸を生成するために長鎖アシルエステル基質を過加水分解するペルヒドロラーゼ酵素を含む組成物だけでなく使用方法も提供する。ある実施態様において、本発明は洗浄、漂白及び／又は消毒を含む適用において特に有用である。
【０１３１】
上記に記載したように、特許出願ＷＯ０５／０５６７８２について本出願は優先権を主張する。ＷＯ０５／０５６７８２の全部の開示は、ペルヒドロラーゼ酵素、アミノ酸改変、結晶構造、試験方法、使用方法、配列、相同体、オーソログ、配列アライメント、図、表、洗浄組成物、等のすべての説明を含むが、これらに限定されない。そして、すべての目的のために本明細書にて参照することにより、本明細書によって取り込まれる。また、特に好ましい実施態様において、酵素は本明細書にて長鎖アシルエステル基質を加水分解するだけでなく過加水分解することを提供する。
過加水分解酵素
【０１３２】
上記に示すように、本発明は長鎖アシルエステル基質を過加水分解する単離ペルヒドロラーゼ酵素を提供する。ある好ましい実施態様おいて、長鎖アシルエステル基質及び過酸化水素存在下、酵素は長鎖及び中鎖過酸を生成する。ある実施態様において、ペルヒドロラーゼは、自然に発生するペルヒドロラーゼ（例えば、自然に発生するマイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）のペルヒドロラーゼ（配列番号２））に比較して改変された基質特異性を有する。それは本発明のペルヒドロラーゼが短鎖エステル基質に対する加水分解の速度よりも速い速度で長鎖アシルエステル基質を過加水分解することができる点である。ある実施態様において、短鎖エステル基質に対する過加水分解の速度よりも少なくとも約１０％速く、少なくとも約５０％速く、少なくとも約１００％速く、少なくとも約２００％速く、少なくとも約５００％速く、又は少なくとも約１０，０００％速い速度でペルヒドロラーゼは長鎖エステル基質を過加水分解できる。ある実施態様において、本発明にかかるペルヒドロラーゼの長鎖エステル過加水分解速度対短鎖エステル加水分解速度の比の値は少なくとも約１、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約１０、少なくとも約１００、又は少なくとも約１０，０００である。この場合短鎖エステル基質は過酢酸エステル及び過ブタン酸エステルを含み、長鎖エステル基質は過オクタン酸エステルを含む。
【０１３３】
本発明のペルヒドロラーゼ酵素中の種々のアミノ酸は、酵素（例えば、「本発明のペルヒドロラーゼは１２位にＧｌｙを含む」）の１次アミノ酸配列におけるアミノ酸の位置に関して、本明細書中に言及されている。上記に記載のように、及び当業者にとって容易に明らかなように、本発明のペルヒドロラーゼ酵素のアミノ酸の位置は配列番号２（言い換えると、野生型マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ペルヒドロラーゼ）のペルヒドロラーゼに相当する位置に比較して決定される。好ましい実施態様において、構造解析及び／又は課題のペルヒドロラーゼ酵素及び配列番号２の１次アミノ酸配列を整列化することにより相当するアミノ酸の位置を同定する。関連酵素の１次アミノ酸配列を整列する方法は周知である（例えば、Ｕｐｔｏｎ  ａｎｄ  Ｂｕｃｋｌｅｙ，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．，  ２０：１７８  ［１９９５］を参照）。さらに、非制限的アライメントはＷＯ０５／０５６７８２に開示されている。
【０１３４】
ある実施態様において、本発明のペルヒドロラーゼは、親酵素（例えば、設計された酵素が親酵素として用いる場合、微生物によってコードされた野生型酵素だが、本発明を種々の野生型酵素に限定すること意図していない）のアミノ酸配列に少なくとも約３５％相同性を有するアミノ酸配列をもつ。ある実施態様において、本発明のペルヒドロラーゼは微生物の染色体によってコードされる野生型酵素に関係しているが、同じではない。特に好ましい実施態様において、本発明のペルヒドロラーゼは、親酵素（例えば、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）の野生型ペルヒドロラーゼ、又はＷＯ０５／０５６７８２に記載の変異体、又はＷＯ０５／０５６７８２に記載のような、細菌の染色体によってコードされる自然に発生するアシルトランスフェラーゼ関連酵素）のアミノ酸に少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％、相同性を有するアミノ酸配列を有する。
【０１３５】
好ましい実施態様おいて、本発明のペルヒドロラーゼのアミノ酸配列はアミノ酸残基の数が少し親酵素と異なる。異なるアミノ酸残基の数は約１、約２、約３、約４、約５、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、又はそれ以上のアミノ酸残基でもよい。ある実施態様において、変異体間の異なるアミノ酸の数は約１と約１０の間である。
【０１３６】
ある実施態様において、本発明のペルヒドロラーゼ酵素は任意の１又は次のアミノ酸の組合わせを含む。それは、１２位においてＧＩｙ、Ｐｒｏ、または、Ｇｌｎ、２２位においてＴｒｐ、５９位においてＰｒｏ、１５３位においてＰｒｏ、１５４位においてＴｈｒ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、またはＧｌｎ、１９４位においてＧｌｙ、１９６位においてＳｅｒ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、またはＨｉｓ、及び／又は２０４位においてＴｙｒまたはＴｒｐである。特に好ましい実施態様おいて、本発明のペルヒドロラーゼ酵素はａ）１５４位のＡｌａと１９４位のＭｅｔ、ｂ）１５４位のＧｌｙと１９４位のＶａｌ、又はｃ）１２位のＧｌｙと１９４位のＭｅｔ、ｄ）１５４位のＴｈｒと１９６位のＩｌｅ、ｅ）１２位のＧｌｎと１５４位のＶａｌ、ｆ）１２位のＭｅｔと１５４位のＧｌｕ、ｇ）１２位のＧｌｙと１５４位のＧｌｙ、ｈ）１５４位のＧｌｕと１９４位のＳｅｒ、又はｉ）１２位のＧｌｙと２２位のＴｒｐ、又はこれらの任意の組合せを含む。
【０１３７】
本発明は任意の特定の機構に限定することを意図しないが、これらのアミノ酸の存在によって、長鎖過酸を生成するために長鎖アシルエステルを加水分解することができるペルヒドロラーゼを提供する。ある実施態様において、上記アミノ酸の一つと野生型ペルヒドロラーゼのアミノ酸を置換することによって、野生型ペルヒドロラーゼ酵素と比較して、改変された基質特異性をもつペルヒドロラーゼを作成することができる。
【０１３８】
一以上の上記アミノ酸置換を含まない同等のペルヒドロラーゼ酵素が同じ基質を検出できる程度に過加水分解しない場合に、本発明のペルヒドロラーゼ酵素は長鎖アシルエステル基質を過加水分解する。他の実施態様において、本発明のペルヒドロラーゼは短鎖アシルエステル基質より長鎖アシルエステル基質に対して顕著な特異性を有する。
【０１３９】
ＷＯ０５／０５６７８２に記載されるように、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）の自然に発生するペルヒドロラーゼとそれらの数百もの活性変異体と他の種由来の相同的な酵素を含むいくつかのペルヒドロラーゼ酵素の構造／機能関係は詳しく調査された。実際に、その活性を消失せずに、広範囲のアミノ酸置換がペルヒドロラーゼ酵素になされうると考えられる。さらに、上記に記載の特定のアミノ酸は、長鎖過酸を生成できるペルヒドロラーゼを作成するために任意のペルヒドロラーゼへ置換することができる。
【０１４０】
自然に発生するマイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ペルヒドロラーゼ酵素のアミノ酸座標と同じ酵素の結晶構造の考察はＷＯ０５／０５６７８２に開示されている。さらにＷＯ０５／０５６７８２にて報告されているように、酵素の各アミノ酸の位置におけるアミノ酸置換に対する効果を体系的に試験するために、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ペルヒドロラーゼに飽和突然変異誘発を行った。これらの実験において、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ペルヒドロラーゼの各アミノ酸は各１９アミノ酸残基にて置換され、各変異体は種々の活性について体系的に試験された。活性とは、それらの加水分解活性、それらの過加水分解（「ＰＡＦ」）活性、過酸分解（「ＰＡＤ」）活性、ｐＨ安定性、熱安定性、化学安定性等である。ある実施態様によって及びおいて認容された数百ものアミノ酸置換のリストは、ＷＯ０５／０５６７８２に記載されるマイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ペルヒドロラーゼの加水分解活性、過加水分解活性、過酸分解活性、又は安定性を改変するために用いてよい。
【０１４１】
本発明の実施態様において、本明細書に記載する蛋白質変異体をつくるために、長鎖エステル基質を過加水分解する能力を獲得する任意のアミノ酸の改変は、ＷＯ０５／０５６７８２記載のいずれかのアミノ酸改変との組合せである。ある実施態様においては、アミノ酸改変は過酸化水分解の速度を増加または減少し、及び／又は過加水分解／加水分解の比の値が増加又は減少する変異体をつくるための組合せである。
【０１４２】
好ましい実施態様において、長鎖過酸を提供する一以上のアミノ酸の改変は高い過加水分解対加水分解の比の値（例えば、１以上の比の値）、及び低い過酸加水分解速度（例えば、配列番号２と比較して、０．８以下の過酸加水分解速度）を有するペルヒドロラーゼを提供する改変との組合せであり、その結果長鎖過酸を効率的に生成するペルヒドロラーゼ酵素を提供することができる。
【０１４３】
ある実施態様において、及びいずれの特定の配列に本発明の特徴を限定することを意図せずに、本発明のペルヒドロラーゼ酵素はａ）改変を提供する一以上の上記記載の長鎖過酸、及びｂ）野生型マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ペルヒドロラーゼと比較して、約０．８以下の過酸加水分解の速度を有する一以上の改変を含む。いくつかのこれらの実施態様おいて、約０．８以下の過酸加水分解の速度を有する一以上の改変は次のアミノ酸から選択される少なくとも一つの置換を含む。それはA122,  A23,  A29,  A55,  D45,  D62,  D65,  E26,  E50,  F150,  F46,  G110,  G124,  G43,  L109,  L119,  L42,  L68,  L78,  L82,  L84,  N59,  P66,  R101,  R27,  R4,  R67,  S112,  S54,  S76,  T116,  T120,  T25,  V125,  V48,  W149,  Y73,  A44,  A79,  D85,  E51,  G124,  G126,  G15,  G52,  1194,  K97,  L119,  L12,  L38,  L53,  L68,  L86,  N94,  P18,  R101,  R27,  R4,  R67,  S54,  S72,  T58,  T80,  V118,  V87,  W34,  R4,  I5,  D10,  L12,  W14,  V19,  T25,  W34,  I49,  E50,  E51,  L53,  S54,  A55,  R56,  N59,  D62,  T64,  D65,  R67,  L68,  N69,  S76,  C77,  T80,  L82,  P83,  L86,  V87,  N94,  T96,  F100,  R101,  L109,  M111,  L114,  L119,  W149,  Y1d29,  A122,  G126,  T127,  A23,  A55,  A79,  D65,  D85,  E26,  F154,  G110,  G124,  G126,  G22,  G36,  G43,  G52,  G70,  I49,  K97,  L109,  L114,  L119,  L12,  L38,  L42,  L53,  L68,  L86,  P104,  P83,  Q41,  R102,  R56,  R67,  S54,  T57,  V118,  V125,  W14,  W149,  Y129,  Y73,  A122,  A23,  A79,  D45,  D65,  D85,  E26,  E47,  E51,  F150,  F196,  F28,  G110,  G124,  G36,  G43,  G52,  G70,  I107,  I5,  I60,  L109,  L119,  L53,  L6,  L68,  L82,  M111,  P104,  P66,  R102,  R67,  S11,  S112,  S121,  S54,  S72,  T25,  T35,  T57,  T58,  V118,  V125,  V19,  W149,  W16,  A108,  A122,  A23,  A29,  A79,  C7,  D106,  D21,  D45,  D62,  D65,  D85,  E50,  F150,  F28,  G124,  G126,  G22,  G36,  G52,  I107,  I194,  K97,  L105,  L109,  L114,  L119,  L38,  L68,  L78,  L82,  L84,  M111,  N69,  N94,  P104,  P63,  P66,  R102,  R27,  S11,  S112,  S54,  S72,  T116,  T120,  T127,  T13,  T25,  T57,  T80,  T96,  V113,  A122,  A29,  A71,  A79,  C7,  D106,  D21,  D61,  D65,  D85,  E47,  E50,  F150,  F196,  F28,  F46,  G124,  G126,  G15,  G36,  G70,  I49,  I5,  I60,  L105,  L109,  L12,  L38,  L42,  L53,  L84,  L86,  M111,  N59,  P146,  P24,  P66,  Q41,  R102,  R27,  R56,  S112,  S121,  S54,  S72,  T116,  T120,  T127,  T128,  T13,  T57,  T64,  V125,  V17,  V19,  W14,  W149,  W16,  Y129,  Y99,  A108,  A122,  A23,  A29,  A44,  A55,  A71,  A79,  C77,  D45,  D61,  D65,  D85,  D95,  E47,  E51,  F150,  F196,  F46,  G110,  G126,  G36,  G43,  G52,  I107,  I194,  I49,  I5,  I60,  I89,  L114,  L42,  L53,  L68,  L78,  L84,  M111,  N59,  N94,  P146,  P24,  P30,  P63,  P66,  P83,  Q117,  R101,  R4,  S112,  S121,  S72,  T116,  T120,  T127,  T13,  T57,  T96,  V113,  V125,  V17,  V19,  V32,  V87,  W149,  Y129,  Y73,  G190,  V191,  G193,  T197,  N201,  D203,  L208,  A209,  V212,  L215,  及び  L216である。ある実施態様において、約０．１又はそれ以下の過酸加水分解の比の値を提供する一以上の改変であって、改変は次から選択される少なくとも一つの置換である。それはR4,  L12,  G15,  P18,  R27,  W34L38,  A44,  E51,  G52,  L53,  S54,  T58,  R67,  L68,  S72,  A79,  T80,  D85,  L86,  V87,  N94,  K97,  R101,  V118,  L119,  G124,  G126,  及び  I194である。
【０１４４】
さらなる実施態様において及び再度いずれの特定の配列に本発明の特徴を限定することを意図せずに、本発明のペルヒドロラーゼ酵素はａ）改変を提供する一以上の上記記載の長鎖過酸、及びｂ）変異体ペルヒドロラーゼの過加水分解対野生型ペルヒドロラーゼの過加水分解の比が少なくとも約１．２の比の値であるような、過加水分解中の変化を与える一以上の改変を含む。これらの実施態様のいくつかにおいて、変異体ペルヒドロラーゼの過加水分解対野生型ペルヒドロラーゼの過加水分解の比が少なくとも約１．２の比の値であるような、過加水分解中の変化を与える一以上の改変を与える一以上の改変は次のアミノ酸うちから選択される。それらは、C7,  D10,  L12,  G15,  P18,  V19,  G22,  T25,  E26,  R27,  F28,  A29,  P30,  D31,  G36,  Q40,  Q41,  L42,  G43,  A44,  D45,  F46,  E47,  I49,  E51,  L53,  S54,  A55,  T57,  D61,  P63,  T64,  D65,  P66,  R67,  L68,  N69,  A71,  S72,  Y73,  S76,  L78,  A79,  T80,  L82,  P83,  D85,  L86,  D95,  K97,  R101,  T103,  P104,  L105,  D106,  I107,  L109,  M111,  V113,  Q117,  V118,  S121,  G124,  V125,  G126,  T127,  P148,  F150,  I153,  F154,  及び  F196である。好ましい実施態様において、変異体ペルヒドロラーゼの過加水分解対野生型ペルヒドロラーゼの過加水分解の比が少なくとも約２の比の値であるような、過加水分解中の変化を与える一以上の改変は次から選択される改変である。それらはA44,  C7,  D10,  D85,  D95,  E26,  E47,  I107,  L12,  L42,  P104,  P148,  S54,  Q40,  Q117,  D203,  V206,  E210,  K97,  L12,  P104,  V125,  D85,  L53  及び  L78である。
【０１４５】
別の好ましい実施態様において、及び再度いずれの特定の配列に本発明の特徴を限定することを意図せずに、本発明のペルヒドロラーゼ酵素は改変を提供する一以上の上記記載の長鎖過酸、及び野生型ペルヒドロラーゼと比較して、過加水分解活性の比が少なくとも約１．２、及び過酸加水分解活性の比が約０．８以下を示すペルヒドロラーゼを提供するアミノ酸置換を含む。これらのある実施態様おいて、置換はA29,  A44,  A55,  A71,  A79,  C7,  D10,  D106,  D31,  D85,  E26,  E47,  F150,  F154,  F196,  F28,  G124,  G126,  G36,  G43,  I153,  L109,  L42,  L53,  L109,  L42,  L53,  L109,  L42,  L53,  L68,  L82,  L86,  M111,  N69,  P104,  P148,  P18,  P63,  P66,  P83,  Q117,  Q40,  R101,  R67,  S54,  S121,  S72,  S76,  T25,  T64,  V115,及びV19から選択される。ある好ましい実施態様おいては、次のアミノ酸置換が使用される。それはＷＯ０５／０５６７８２記載のようにL12I及びS54V、L12M及びS54T、L12T及びS54V、L12Q、T25S  及びS54V、L53H及びS54V、S54P及びV125R、S54V及びV125G、S54V及びF196G、S54V、K97R及びV125G及びA55G、R67T、K97R,  及びV125Gである。
【０１４６】
活性を消失せずにペルヒドロラーゼにおいて、改変に適したアミノ酸として、本発明のペルヒドロラーゼ活性に重要であるアミノ酸をＷＯ０５／０５６７８２に記載する。またＷＯ０５／０５６７８２にはマイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）以外の種由来のいくつかのペルヒドロラーゼ酵素も、ペルヒドロラーゼのファミリー中に保存される領域も記載され、アグロバクテリウム  リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）（Ｑ９ＫＷＡ６）、アグロバクテリウム  リゾゲネス（Ａ．  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）（Ｑ９ＫＷＢ１）、アグロバクテリウム  ツメファシエンス（Ａ．  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）（Ｑ８ＵＦＧ４）、アグロバクテリウム  ツメファシエンス（Ａ．  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）  (Ｑ８ＵＡＣ０)、アグロバクテリウム  ツメファシエンス（Ａ．  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）（Ｑ９ＺＩ０９）、アグロバクテリウム  ツメファシエンス（Ａ．  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）  （ＡＣＡ）、プロシェコバクター  デジョンゲイイ（Ｐｒｏｓｔｈｅｃｏｂａｃｔｅｒ  ｄｅｊｏｎｇｅｉｉ）（ＲＶＭ０４５３２）、リゾビウム  ロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ．  ｌｏｔｉ）（Ｑ９８ＭＹ５）、リゾビウム  メルロティ（Ｒ．  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）（Ｑ９２ＸＺ１）、リゾビウム  メルロティ（Ｒ．  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）（Ｑ９ＥＶ５６）、リゾビウム  リゾゲネス（Ｒ．  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）（ＮＦ００６）、リゾビウム  リゾゲネス（Ｒ．  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）（ＮＦ００６０２８７５）、リゾビウム  ソラナセラム（Ｒ．  ｓｏｌａｎａｃｅｒａｒｕｍ）（Ｑ８ＸＱＩ０）、シノリゾビウム  メリロティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）（ＲＳＭ０２１６２）、シノリゾビウム  メリロティ（Ｓ．  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）（ＲＳＭ０５６６６）、メソリゾビウム  ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ）（ＲＭＬＯ００３０１）、アグロバクテリウム  リゾゲネス（Ａ．  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）（Ｑ９ＫＷＡ６）、アグロバクテリウム  リゾゲネス（Ａ．  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）（Ｑ９ＫＷＢ１）、アグロバクテリウム  ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）（ＡＡＤ０２３３５）、メソリゾビウム  ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ）  （Ｑ９８ＭＹ５）、メソリゾビウム  ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ）（ＺＰ００１９７７５１）、ラルストニア  ソラナセラム（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）（Ｑ８ＸＱＩ０）、ラルストニア  ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）（ＺＰ００１６６９０１）、モラクセラ  ボビス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｂｏｖｉｓ）（ＡＡＫ５３４４８）、バークホルデリア  セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）（ＺＰ００２１６９８４）、クロモバクテリウム  ビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）（Ｑ７ＮＲＰ５）、ピレルラ属の一種（Ｐｉｒｅｌｌｕｌａ  ｓｐ．）（ＮＰ＿８６５７４６)、ビブリオ  バルニフィカス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）（ＡＡ００７２３２）、サルモネラ  ティフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍ���ｒｉｕｍ）（ＡＡＣ３８７９６）、シノリゾビウム  メリロティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）（ＳＭａｌ９９３）、シノリゾビウム  メリロティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）（Ｑ９２ＸＺ１）、  及びシノリゾビウム  メリロティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）（Ｑ９ＥＶ５６）を含むが、これらに限定されない。これらの蛋白質のアミノ酸配列、配列アライメント、及び上記にかかるすべての他の情報はＷＯ０５／０５６７８２からすべての目的のために本明細書に参照により取り込まれる。
【０１４７】
特に好ましい実施態様において、ペルヒドロラーゼ酵素はＷＯ０５／０５６７８２に記載のＧＤＳＬ‐ＧＲＴＴ／ＡＲＴＴ又はＳＧＮＨヒドロラーゼである。ある実施態様において、酵素は次の保存残基の少なくとも一つ又は組合わせを含む。それは、L6,  W14,  W34,  L38,  R56,  D62,  L74,  L78,  H81,  P83,  M90,  K97,  G110  L114,  L135,  F180,及びG205である。
【０１４８】
ＷＯ０５／０５６７８２記載のように、種々の方法がペルヒドロラーゼ酵素の活性測定に有用である。しかしながら、本発明はいずれの特定の試験方法に限定することを意図しない。
【０１４９】
ペルヒドロラーゼが長鎖エステル基質を使用できるか否かを決定する有用なレポーター基質は少なくともＣ６炭素原子（例えば、カプロン酸ｐ‐ニトロフェニル（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｃａｐｒｏａｔｅ）、カプリル酸ｐ‐ニトロフェニル（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｃａｐｒｙｌａｔｅ）、ノナン酸ｐ‐ニトロフェニル（ｐ‐ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｎｏｎａｎｏａｔｅ）、  デカン酸ｐ‐ニトロフェニル（ｐ‐ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｄｅｃａｎｏａｔｅ）、  ドデカン酸ｐ‐ニトロフェニル（ｐ‐ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｄｏｄｅｃａｎｏａｔｅ  ａｃｉｄ）、  ミリスチン酸ｐ‐ニトロフェニル（ｐ‐ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｍｙｒｉｓｔａｔｅ）、  パルミチン酸ｐ‐ニトロフェニル（ｐ‐ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｐａｌｍｉｔａｔｅ）、ステアリン酸ｐ‐ニトロフェニル（ｐ‐ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｓｔｅａｒａｔｅ）、及びオレイン酸ｐ‐ニトロフェニル（ｐ‐ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｏｌｅａｔｅ））を含むｐ‐ニトロフェニルエステルを含むが、これらに限定されない。さらに長鎖エステル基質はヘキサン酸エステル、へプタン酸エステル、オクタン酸エステル、ノナン酸エステル、及びＣ１０からＣ１８以上の高いカルボン酸エステルを含むが、これらに限定されない。
ペルヒドロラーゼ生産
【０１５０】
野生型マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ペルヒドロラーゼはその天然宿主中の細胞外蛋白質である。ある実施態様おいて、本発明のペルヒドロラーゼのペルヒドロラーゼ酵素を非天然の宿主中の細胞外に生産する。ある実施態様において、シグナル配列はペルヒドロラーゼに追加され、それにより、ペリプラズム（言い換えると、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）のようなグラム陰性微生物）へ又は細胞外空間（言い換えると、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）及びアクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）のようなグラム陽性微生物）又は真菌の宿主（例えば、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、及びピキア（Ｐｉｃｈｉａ））へ分泌によりペルヒドロラーゼの発現を促進する。本発明は種々の他の生物としてこれらの特定の宿主に限定することを意図せず、本発明の発現宿主として有用である他の原核生物、真核生物を含む。
【０１５１】
多くの商業的に入手可能な発現システムはグラム陰性宿主（例えば、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ））中ペルヒドロラーゼの発現に有用なｐＢＡＤ、ｐｌａｃ、Ｔ７を含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、プロモーターの同様のタイプは別のグラム陰性宿主である、パントエア  シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａ）で有用である。
【０１５２】
バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種は細胞外蛋白質（例えば、プロテアーゼ）の発現のための有用な宿主としてよく知られている。蛋白質の細胞内発現はあまり知られていない。ある実施態様おいて、  バシラス  サブティリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるペルヒドロラーゼ蛋白質の細胞内発現を、遺伝子の５´末端上のシグナル配列非存在下、ｐＶｅｇ、ｐＳＰＡＣ、ｐＡｐｒＥ又はｐＡｍｙＥを含むが、これらに限定されない種々のプロモーターを用いて行った。ある実施態様おいては、発現が複製プラスミド（高い又は低いコピー数）から得られるが、一方で他の実施態様おいては、染色体に所望の構築体を組み込むことにより、発現が得られる。組み込みは任意の場所で可能であり、ａｐｒＥ、ａｍｙＥ、又はｐｐｓ部位を含むがこれらに限定されない。ある実施態様おいて、ペルヒドロラーゼは組み込み構築体の一以上のコピーから発現される。他の実施態様おいて、多数の組み込まれたコピーを増幅（例えば、抗生物質カセットに結合し、直接反復配列が側面に位置する）できる構築体の組み込みにより又は多数のコピーのライゲーションとその後に続く染色体への組み込みによって得る。ある実施態様において、複製プラスミド又は組み込まれる構築体いずれかを有するペルヒドロラーゼの発現を適切な培養中ｐＮＢ活性測定（本明細書にて記載）を用いてモニター観察する。
【０１５３】
バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）と同様に、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）中のペルヒドロラーゼの発現を、複製プラスミドを用いて行い、一方、他の実施態様おいて、ペルヒドロラーゼの発現を、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）遺伝子にベクターを組み込むことにより成し遂げる。ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）にて認識される任意のプロモーターはペルヒドロラーゼ遺伝子（例えば、グルコース異性化酵素のプロモーター又はＡ４プロモーター）の転写促進に有用である。また、プラスミド、シャトルベクター又はストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）のみのいずれかを複製することは、本発明の発現（例えば、ｐＳＥＣＧＴ）のためにも可能である。
【０１５４】
好ましい実施態様おいて、本発明のペルヒドロラーゼは宿主細胞から分泌され、その結果、ペルヒドロラーゼを宿主細胞が培養されている培養培地から回収可能である。
洗浄組成物
【０１５５】
上記に示すように、本発明は本発明の長鎖ペルヒドロラーゼ酵素を含む洗浄組成物を提供する。ある実施態様おいて、洗浄組成物は本発明の少なくとも１つのペルヒドロラーゼ、少なくとも１つの長鎖エステル基質、及び少なくとも１つの過酸化水素供給源を含む。好ましい実施態様おいて、長鎖エステル基質は、化学式Ｒ１Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ２であって、Ｒ１が少なくとも５個の炭素原子の置換または非置換の炭素原子鎖及びＲ２が任意の有機質部分を有する。エステル基質及び過酸化水素の供給源は本明細書の詳細な説明に記載する。また、多くの実施態様おいて、種々の他の化合物は本発明の洗浄組成物中に存在する。
【０１５６】
ある実施態様おいて、本発明の洗浄組成物は洗濯での利用、固い表面洗浄、及び／又は自動食器洗浄機、及びパーソナルケア／化粧品の利用（例えば、義歯、歯、毛髪、及び肌のために）に有用である。しかしながら、低温溶液中に増加される効果という独特な特徴及び優れた色の安全性プロファイルによって、本発明のペルヒドロラーゼ酵素は洗濯への利用（例えば、布地の漂白）について理想的に適している。さらに本発明の酵素は粒子及び／又は液体組成物として有用であり、ゲル、乳液を含む。
【０１５７】
また、本発明のペルヒドロラーゼ酵素は洗浄添加製品として有用である。好ましい実施態様おいて、洗浄添加製品はさらなる漂白効果を必要とする洗浄過程工程に取り入れるのに理想的に適している。このような例は低温溶液での洗浄適用を含むが、これに限定されない。ある実施態様おいて、添加製品は、簡単な形態であって、一以上の本発明の酵素である。ある実施態様おいて、添加製品は、ペルオキシゲン（ｐｅｒｏｘｙｇｅｎ）供給源が使用され、増強される漂白効果が必要である洗浄工程に添加するために製剤中に含まれる。そのような単一製剤形態は丸薬、錠剤、ゲルキャップ、又は他の単一製剤形態（例えば、前処理の粉又は液体）を含むが、これらに限定されない。ある実施態様おいて、洗浄組成物の体積を増加するために少なくとも１つの増量剤及び／又は担体原料が含まれる。適切な増量剤又は担体原料は種々の硫酸、炭酸、及びシリカの塩も、タルク、粘度も含むが、これらに限定されない。ある実施態様おいて、液体組成物のための増量剤及び／又は担体原料は、水又は多価アルコール及びジオールを含む低分子量の第一級及び第二級アルコールを含む。そのようなアルコールの例はメタノール、エタノール、プロパノール、及びイソプロパノールを含むが、これらに限定されない。ある実施態様おいて、組成物は約５％から約９０％のその原料を含む。さらなる実施態様おいて、酸性増量剤はｐＨを下げるのに用いる。別の実施態様おいて、洗浄添加剤は、アルコールエステル、ジオールエステル、又は多価アルコールのエステルのような活性ペルオキシゲン（ｐｅｒｏｘｙｇｅｎ）を含む。さらなる実施態様おいて、洗浄添加剤は一以上の添加物成分を含む。
【０１５８】
本発明の洗浄組成物及び洗浄添加剤は本発明により提供される効果的な酵素量を必要とする。特に好ましい実施態様おいて、本発明の洗浄組成物は、本発明の少なくとも１つのペルヒドロラーゼ酵素の少なくとも０．０００１重量パーセント、約０．０００１から約１、約０．００１から約０．５、さらには約０．０１から約０．１の重量パーセントの量で含む。
【０１５９】
通常の洗浄組成物に加えて、本発明のペルヒドロラーゼ変異体が天然又は野生型酵素が用いられる任意の目的において有用であることは容易に理解される。すなわち、そのような変異体は例えば、棒状及び液体石鹸の適用、食器洗浄製剤、表面洗浄適用、コンタクトレンズ洗浄溶液及び／又は製品、ゴミ処理、繊維適用、パルプ漂白、殺菌、スキンケア、口腔ケア、毛髪ケア等に有用である。実際に、本発明のペルヒドロラーゼのいずれの変異体が特定の使用に限定することを意図していない。例えば、ある実施態様おいて、本発明のペルヒドロラーゼ変異体は、さらにアレルギーの減少、洗剤組成物（野生型又は非変異ペルヒドロラーゼに比較して）の増強された効果を含む。
過酸化物の供給源
【０１６０】
ある実施態様おいて、本発明の洗浄組成物は過酸化水素供給源を含み、この場合、それ自体が過酸化水素である又は反応物として過酸化水素を生成する組成物である。反応物として過酸化水素を生成する適切な過酸化水素は次のものから選択されるペルオキシゲン（ｐｅｒｏｘｙｇｅｎ）供給源を含むが、これらに限定されない。それらは、（i）約０．０１から約５０、約０．１から約２０、又は約１から約１０の過酸塩基、ペルオキシ酸、過酸化尿素、及びこれらの混合物、（ii）約０．０１から約５０、約０．１から約２０、又は約１から約１０の重量パーセントの炭水化物の及び約０．０００１から約１、約０．００１から約０．５、又は約０．０１から約０．１の重量パーセントの炭水化物オキシダーゼ、及び（iii）それらの混合物である。適切な過酸塩基はアルカリ金属過ホウ酸塩、アルカリ金属過炭酸塩、アルカリ金属過リン酸塩、アルカリ金属過硫酸塩、及びこれらの混合物を含むが、これらに限定されない。
【０１６１】
好ましい実施態様おいて、炭水化物は単糖類（ｍｏｎｏ‐ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ）二糖類（ｄｉ‐ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ）、三糖類（ｔｒｉ‐ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ）、オリゴ糖類（ｏｌｉｇｏ‐ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ）、及びそれらの混合物から選択される。適切な炭水化物はＤ‐アラビノース、Ｌ‐アラビノース、Ｄ‐セロビオース、２‐デオキシ‐Ｄ‐ガラクトース、２‐デオキシ‐Ｄ‐リボース、Ｄ‐フルクトース、Ｌ‐フコース、Ｄ‐ガラクトース、Ｄ‐グルコース、Ｄ‐グリセロ‐Ｄ‐グロ‐ヘプトース（Ｄ‐ｇｌｙｃｅｒｏ‐Ｄ‐ｇｕｌｏ‐ｈｅｐｔｏｓｅ）、Ｄ‐ラクトース、Ｄ‐リキソース、Ｌ‐リキソース、Ｄ‐マルトース、Ｄ‐マンノース、メレジトース、Ｌ‐メリビオース、パラチノース、Ｄ‐ラフィノース、Ｌ‐ラムノース、Ｄ‐リボース、Ｌ‐ソルボース、スタキオース、スクロース、Ｄ‐トレハロース、Ｄ‐キシロース、Ｌ‐キシロース、及びそれらの混合物からなる炭水化物を含む。実際に、本発明は、本発明中の有用な種々の炭水化物のように、特定の炭水化物に限定することを意図していない。
【０１６２】
適切な炭水化物オキシダーゼは、アルドースオキシダーゼ（ＩＵＰＡＣ区分ＥＣ  
１．１．３．９）、ガラクトースオキシダーゼ（ＩＵＰＡＣ区分ＥＣ  １．１．３．９）セロビオースオキシダーゼ（ＩＵＰＡＣ区分ＥＣ  １．１．３．２５）、ピラノースオキシダーゼ（ＩＵＰＡＣ区分ＥＣ  １．１．３．１０）、ソルボースオキシダーゼ（ＩＵＰＡＣ区分ＥＣ  １．１．３．１１）、及び／又はヘキソースオキシダーゼ（ＩＵＰＡＣ区分ＥＣ  １．１．３．５）、グルコースオキシダーゼ（ＩＵＰＡＣ区分ＥＣ  １．１．３．４）、及びそれらの混合物から選択される炭水化物オキシダーゼを含むが、これらに限定されない。
エステル基質
【０１６３】
ある実施態様おいて、脂肪族化合物、及び／又は芳香族カルボン酸、及びアルコールを含む少なくとも１つのエステル基質は、本発明の少なくとも１つのペルヒドロラーゼ酵素を用いて利用される。ある実施態様おいて、基質は次の一以上から選択される。それは、カプロン酸エステル、カプリル酸エステル、ノナン酸エステル、デカン酸エステル、ドデカン酸エステル、ミリスチン酸エステル、パルミチン酸エステル、ステアリン酸エステル、及びオレイン酸エステル、及びより長い炭素鎖エステル基質である。
【０１６４】
好ましい実施態様おいて、エステル基質は洗浄組成物の約０．０１から約９９．９、約０．０１から約５０、約０．１から約２０、又は約１から約１５の重量パーセントの量で存在する。
【０１６５】
ある実施態様おいて、適切な分子はエステル部分が次の化学式を有する：
Ｒ１ＯＸ［（Ｒ２）ｍ（Ｒ３）ｎ］ｐ
ここでＲ１はＨ又は置換又は非置換のアルキル、ヘテロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、及びヘテロアリールからなる群より選択される部分であり、本発明のある実施態様おいて、Ｒ１は１から５０，０００の炭素原子、１から１０，０００の炭素原子、又は２から１００の炭素原子を含む。本発明のある実施態様おいて、各Ｒ２は任意の置換アルコキシキレート部分であり、各Ｒ２は独立して、エトキシレート、プロポキシレート、又はブトキシレート部分である。Ｒ３はその式を有するエステル形成部分である。すなわちＲ４ＣＯ‐であり、ここでＲ４は本発明のある実施態様おいて、Ｈ又は置換又は非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、及びヘテロアリールから選択され、一方、他の実施態様おいて、Ｒ４は置換又は非置換の直鎖又は枝分かれ鎖であるアルキル、アルケニル又はアルキニル、５から２２個以上の炭素原子を含む部分、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール又は５から１２個以上の炭素原子を含むヘテロアリール部分であり、又はＲ４は置換又は非置換のＣ５−Ｃ１０又はより長いアルキル部分であり、又はＲ４は置換又は非置換のＣ１１−Ｃ２２又はより長いアルキル部分である。Ｒ１がＨの場合ｘは１であり、Ｒ１がＨでない場合、ｘはＲ１中の炭素の数と等しい又はそれ以下の整数である。ｐはｘと同じ又はそれ以下の整数である。ｍは０から５０の整数、０から１８の整数、又は０から１２の整数であり、ｎは少なくとも１である。
【０１６６】
本発明のある実施態様において、エステル部分を含む分子は、化学式Ｒ１ＯＸ［（Ｒ２）ｍ（Ｒ３）ｎ］ｐを有するアルキルエトキシレート又はプロポキシレートである。ここで、ここでＲ１はＣ２−Ｃ３２置換又は非置換のアルキル、ヘテロアルキル部分であり、各Ｒ２は独立して、エトキシレート、プロポキシレート部分である。Ｒ３はその式を有するエステル形成部分である。すなわちＲ４ＣＯ‐であり、ここでＲ４は本発明のある実施態様おいて、Ｈ、置換、又は非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、及びヘテロアリールから選択され、一方、他の実施態様おいて、Ｒ４は置換又は非置換の直鎖又は枝分かれ鎖であるアルキル、アルケニル又はアルキニル、５から２２個以上の炭素原子を含む部分、置換又は非置換のアリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール又は５から１２個以上の炭素原子を含むヘテロアリール部分であり、又はＲ４は置換又は非置換のＣ５−Ｃ１０又はより長いアルキル部分であり、又はＲ４は置換又は非置換のＣ５−Ｃ２２又はより長いアルキル部分である。ｘはＲ１炭素原子数と等しい又はそれ以下の整数である。ｐはｘと等しい又はそれ以下の整数である。ｍは１から１２の整数であり、ｎは少なくとも１である。
【０１６７】
本発明のある実施態様おいて、エステル部分は次の化学式を含む分子である。
Ｒ１ＯＸ［（Ｒ２）ｍ（Ｒ３）ｎ］ｐ
ここで、Ｒ１はＨ又は第一級、第二級、第三級又は第四級アミン部分を含む部分である。アミン部分を含む前記Ｒ１部分は、置換又は非置換のアルキル、ヘテロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、及びヘテロアリールから選択される部分であり、本発明のある実施態様おいて、Ｒ１は１から５０，０００の炭素原子、１から１０，０００の炭素原子、又は２から１００の炭素原子を含む。本発明のある実施態様おいて、各Ｒ２はアルコキシキレート部分であり、各Ｒ２は独立して、エトキシレート、プロポキシレート、又はブトキシレート部分である。Ｒ３はその式を有するエステル形成部分である。すなわちＲ４ＣＯ‐であり、ここでＲ４は本発明のある実施態様おいて、Ｈ又は置換又は非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、及びヘテロアリールから選択され、一方、他の実施態様おいて、Ｒ４は置換又は非置換の直鎖又は枝分かれ鎖であるアルキル、アルケニル又は５から２２個の炭素原子を含むアルキニル部分、置換又は非置換のアリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール又は９から１２以上の炭素原子を含むヘテロアリール部分であり、又はＲ４は置換又は非置換のＣ５−Ｃ１０又はより長いアルキル部分であり、又はＲ４は置換又は非置換のＣ１１−Ｃ２２又はより長いアルキル部分である。Ｒ１がＨの場合ｘは１であり、Ｒ１がＨでない場合、ｘはＲ１中の炭素の数と等しい又はそれ以下の整数である。ｐはｘと同じ又はそれ以下の整数である。ｍは０から１２の整数、又は１から１２の整数であり、ｎは少なくとも１である。
【０１６８】
本発明の任意の上記実施態様おいて、エステル部分を含む分子は６００，０００ダルトン以下、３００，０００ダルトン以下、１００，０００ダルトン以下、又は６０，０００ダルトン以下の重量平均分子量を有する。
【０１６９】
エステル部分を含む適切な分子は、エステル部分を含む多糖類（ｐｏｌｙｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ）を含むが、これに限定されない。
添加材料
【０１７０】
本発明の使用に必ずしも必須ではないけれども、後に本明細書に示される添加物の非限定的リストは本発明の洗浄組成物において有用である。ある実施態様において、これらの材料は、香料、着色剤、染料、又は同類物のように、洗浄組成物の風合いを変化するため又は洗浄すべき基質の処理のために、洗浄効果を補助又は増強するために、取り入れられる。本発明の酵素に加えて、そのような添加剤は過酸化水素及びエステル基質であることは理解される。これらの添加成分の正確な特徴及びそれらの添加されるレベルは組成物の物理的形状及び用いる洗浄操作の特徴次第である。適切な添加材料は界面活性剤、ビルダー、キレート剤、色移り防止剤、沈澱補助、分散剤、追加酵素、及び酵素安定剤、触媒原料、漂白活性剤、漂白促進剤、使用される過酸、ポリマー分散剤、汚泥除去／再付着防止剤、蛍光剤、発泡抑制剤、染料、香料、構造伸縮性剤、織物用柔軟剤、担体、ヒドロトロープ、工程補助及び／又は染料を含むが、これらに限定されない。下記の記載に加えてそのような他の添加剤及び使用レベルの適切な例は、米国特許第５，５７６，２８２、６，３０６，８１２、及び６，３２６，３４８に記載され、参照により本明細書に組み込まれる。ある実施態様おいて、上記添加成分は本発明の洗浄組成物のバランスを構成する。
【０１７１】
界面活性剤−ある実施態様おいて、本発明により提供される洗浄組成物は界面活性剤が非イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、両性界面活性剤、両性イオン界面活性剤、半極性界面活性剤、及びそれらの混合物から選択されることを特徴とする少なくとも一つの界面活性剤又は界面活性剤システムを含む。
【０１７２】
好ましい実施態様おいて、界面活性剤は、本発明の洗浄組成物の重量に対して、約０．１％から約６０％、約１％から約５０％、又は約５％から約４０％でさえのレベルで通常存在する。
【０１７３】
周知の化合物の多くは本発明のペルヒドロラーゼ酵素を含む組成物に有用である適切な界面活性剤である。これらは非イオン、陰イオン、陽イオン、陰イオン、又は両性イオン界面活性剤（例えば、米国特許第４，４０４，１２８及び４，２６１，８６８を参照）を含む。適切な洗剤製剤は米国特許第５，２０４，０１５（参照により組み込まれる）に記載される。当業者は洗浄組成物として用いる異なる製剤に精通している。
【０１７４】
上記に示すように、好ましい実施態様おいて、本発明の洗剤組成物は洗剤組成物の使用としてよく知られている陰イオン、非イオン、及び両性イオン界面活性剤を含む表面活性剤（言い換えると、界面活性剤）を用いる。本発明の使用に有用な界面活性剤は、英国特許出願第２  ０９４  ８２６  Ａに記載され、参照により本明細書に組み込まれる。ある実施態様おいて、界面活性剤の混合物は本発明に用いる。
【０１７５】
本発明の洗剤組成物の使用に有用な陰イオン界面活性剤は直鎖又は枝分かれ鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩を含むが、これらに限定されない。それは、直鎖又は枝分かれ鎖アルキル基を有するアルキル又はアルケニルエーテル硫酸塩、アルキル又はアルケニル硫酸塩、オレフィンスルホン酸塩、アルカンスルホン酸塩、及びその類似物である。陰イオン界面活性剤の適切な対イオンはナトリウムおよびカリウムのようなアルカリ金属イオン、カルシウム及びマグネシウムのようなアルカリ土類金属、アンモニウムイオン、及び２又は３個の炭素原子をもつ１から３のアルカノール基を有するアルカノールアミンを含むが、これらに限定されない。
【０１７６】
本発明に用いる両性界面活性剤はスルホン酸第４級アンモニウム塩、ベタイン型両性界面活性剤、及びその類似物を含むが、これらに限定されない。そのような両性イオン界面活性剤は同じ分子内で陽性及び陰性荷電基の両方を有する。
【０１７７】
本発明に用いる非イオン界面活性剤は一般的にポリオキシアルキレンエーテルも、高い脂肪酸アルカノールアミド又はアルキレン酸化物、それらの付加体、脂肪酸グルセリンモノエステル、及びその類似物も含むが、これらに限定されない。
【０１７８】
好ましい実施態様おいて、本発明の洗剤組成物を含む界面活性剤又は界面活性剤混合物は洗剤組成物の総量の約１重量パーセントから９５重量パーセント、及び好ましくは、洗剤組成物の総量の約５重量パーセントから４５重量パーセントを有する。本明細書に示すように、本発明の種々の実施態様において、数多くの成分が本発明の組成物に含まれる。しかしながら、本発明はこれらの特定の実施例に限定されることを意味していない。実際に、追加的な組成物は本発明に有用であると考慮される。下記の説明は単なる任意の成分を示したに過ぎない。
【０１７９】
蛋白質、特に本発明のペルヒドロラーゼは３から１２の間のｐＨを有し、重量が約０．００１から約５％（好ましくは０．１％から０．５％）のレベルで周知の粉体及び液体洗剤中に組み込まれる。ある実施態様おいて、これらの洗剤洗浄組成物はプロテアーゼ、アミラーゼ、マンナーゼ、ペルオキジダーゼ、オキシドレダクターゼ、セルラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ペクチンリアーゼ、キシラナーゼ、及び／又はエンドグリコシダーゼのような他の酵素や、ビルダー及び安定剤もさらに含む。
【０１８０】
従来の洗浄組成物への蛋白質の追加は特定及び／又は使用に限定することはない。言い換えると、酵素が活性を有する範囲内のｐＨ及び記載の蛋白質が変性する温度以下の温度である限り、洗剤に有用な任意の温度とｐＨはまた本発明組成物に適する。さらに、本発明の蛋白質は、洗剤、さらに単独又は過酸化水素の供給源とエステル基質（例えば、エステルを含む染み、エステルを含むパルプ等のような利用するシステムに追加または内在する）、他の酵素、界面活性剤、ビルダー、安定剤等との組合せなしに、洗浄、漂白、及び消毒組成物に有用である。実際に、本発明はいずれかの特定の設計又は適用に限定することを意図していない。
【０１８１】
ビルダー‐本発明の洗浄組成物は一以上の洗剤ビルダー又はビルダーシステムを含んでよい。ビルダーを用いる場合、洗浄組成物は洗浄組成物の重量に対して少なくとも約１％、約３％から約６０％、又は約５％から約４０％ビルダーを通常含む。
【０１８２】
ビルダーはアルカリ金属、ポリリン酸のアンモニウムとアルカノールアンモニウム塩、アルカリ金属ケイ酸塩、アルカリ土類とアルカリ金属炭酸塩、アルミノケイ酸塩ビルダーポリカルボン酸化合物、エーテルヒドロキシカルボン酸塩、エチレン又はビニルメチルエーテルを有する無水マレイン酸コポリマー、１，３，５‐トリヒドロキシベンゼン‐２，４，６‐トリスルホン酸、及びカルボキシメチルオキシコハク酸、種々のアルカリ金属、エチレンジアミン４酢酸及びニトリロ３酢酸のようなポリ酢酸のアンモニウム及び置換アンモニウム塩、及びメリト酸、コハク酸、クエン酸、オキシジコハク酸、ポリマレイン酸、ベンゼン１，３，５‐トリカルボン酸、カルボキシメチルオキシコハク酸、及びそれらの塩のようなポリカルボン酸を含むが、これらに限定されない。
【０１８３】
キレート剤‐ある実施態様おいて、本明細書に記載の洗浄組成物は少なくとも一つのキレート剤を含む。最適なキレート剤は銅、鉄、及び／又はマンガンのキレート剤及びそれらの混合物を含むが、これらに限定されない。
【０１８４】
キレート剤を用いた場合、洗浄組成物は本発明の洗浄組成物の重量に対して約０．１％から約１５％、又は約３．０％から約１０％のキレート剤を通常含む。
【０１８５】
沈澱補助剤‐ある実施態様おいて、さらに、本明細書にて記載の洗浄組成物は少なくとも一つの沈澱補助剤を含む。適切な沈澱補助剤はポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリカルボキシレート、ポリテレフタル酸のような汚泥放出ポリマー、カオリナイト、モンモリロナイト、アタパルジャイト、イライト、ベントナイト、ハロイサイト、及びそれらの混合物のような粘土を含むが、これらに限定されない。
【０１８６】
色移り阻害剤‐さらなる実施態様おいて、本発明の洗浄組成物はまた一以上の色移り阻害剤をも含む。適切なポリマー色移り防止剤はポリビニルピロリドンポリマー、ポリアミンＮ‐オキシドポリマー、Ｎ‐ビニルピロリドンとＮ‐ビニルイミダゾールのコポリマー、ポリビニルオキサゾリジン、及びポリビニルイミダゾール又はそれらの混合物を含むが、これらに限定されない。
【０１８７】
本発明の洗浄組成物中に色移り阻害剤が存在する場合、本発明の洗浄組成物の重量に対して約０．０００１％から約１０％、又は約０．０１％から約５％、又は約０．１％から約３％のレベルで色移り阻害剤を含む。
【０１８８】
分散剤‐さらなる実施態様おいて、本発明の洗浄組成物は分散剤を含む。適切な水溶性有機原料は２個の炭素原子以下でお互いに分離される少なくとも２個のカルボキシルラジカルを含むポリカルボン酸のようなホモ又はコポリマー酸又はその塩を含み、これらに限定されない。
【０１８９】
酵素‐さらなる実施態様おいて、本発明の洗浄組成物はクリーニング能力及び／又は織物のケアに有益である一以上の洗剤酵素を含む。適切な酵素の例は、ヘミセルロース、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、フォスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ケラチナーゼ、リダクターゼ、オキシダーゼ、フェーノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リギニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、βグルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルノニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、及びアミラーゼ、又はそれらの混合物を含むが、これらに限定されない。通常の組合せはアミラーゼとともに、プロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、及び／又はセルラーゼのような従来の適用酵素との混合である。
【０１９０】
酵素安定剤‐種々の方法により洗剤に用いる酵素を安定化する。酵素にイオンが提供される完成組成物おいてカルシウム及び／又はマグネシウムイオンの水溶性供給源の存在によって本明細書にて使用する酵素を安定化することができる。本明細書にて提供する洗浄組成物の実施態様において、酵素安定剤が有用であることは理解される。
【０１９１】
触媒用金属錯体‐ある実施態様おいて、本発明の洗浄組成物は触媒用金属錯体を含む。金属含有漂白の一つの型は、銅、鉄、チタニウム、ルテニウム、タングステン、モリブデン、又はマグネシウムカチオンのような明確な漂白触媒活性を有する遷移金属カチオン、亜鉛又はアルミニウムカチオンのようなわずかな又は全く漂白触媒活性がない補助金属カチオン、及び特にエチレンジアミンテトラ酢酸、エチレンジアミンテトラ（メチレンリン酸）及びそれらの水溶性塩のような触媒及び補助金属カチオンに対して、明確な安定度定数を有するイオン封鎖錯体を含む触媒系である。これらの触媒の実施例はＵ．Ｓ．  ４，４３０，２４３に記載され、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１９２】
ある実施態様おいて、マンガン化合物の手段によって、本明細書に記載の組成物を触媒する。そのような化合物と使用レベルは従来技術として周知であり、例えば、Ｕ．Ｓ．  ５，５７６，２８２に記載のマンガンによる触媒を含み、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１９３】
本明細書にて有用なコバルト漂白触媒は周知であり、例えばＵ．Ｓ．  ５，５９７，９３６及びＵ．Ｓ．  ５，５９５，９６７に記載され、両者とも参照により、本明細書に組み込まれる。そのようなコバルト触媒は周知の方法により容易に調製可能であり、例えば、Ｕ．Ｓ．  ５，５９７，９３６及びＵ．Ｓ．  ５，５９５，９６７に開示されている。
【０１９４】
ある実施態様おいて、本明細書に記載の組成物はまたマクロポリサイクリック的剛性配位子（ｍａｃｒｏｐｏｌｙｃｙｃｌｉｃ  ｒｉｇｉｄ  ｌｉｇａｎｄ）（「ＭＲＬ」）の少なくとも１つの遷移金属錯体を含む。実際に、限定手段によらないが、本明細書にて開示される組成物及び洗浄過程の実施態様おいて、洗浄溶液中に少なくとも１億分の１の濃度の活性ＭＲＬ錯体を有するよう調整され、好ましくは、洗浄溶液中ＭＲＬが約０．００５ｐｐｍから約２５ｐｐｍ、より好ましくは、約０．０５ｐｐｍから約１０ｐｐｍ、及び最も好ましいのは約０．１ｐｐｍから約５ｐｐｍである。
【０１９５】
即時遷移金属漂白触媒において、好ましい遷移金属はマンガン、鉄、及びクロムを含む。本明細書に記載の好ましいＭＲＬは５，１２‐ジエチル‐１，５，８，１２‐テトラアザビシクロ［６．６．２］ヘキサデカンのような架橋された超剛性配位子の特別な型である。
【０１９６】
適切な遷移金属ＭＲＬは、両者は参照により本明細書に組み込まれるＷＯ  ００／３３２６０１及びＵ．Ｓ．  ６，２２５，４６４の実施例に開示されるような周知技術にて容易に調製できる。
洗浄及び洗剤製剤
【０１９７】
本発明の洗剤組成物は任意の形態にて提供され、液体、顆粒、乳液、ゲル、及びペーストを含むが、これらに限定されない。個体洗剤組成物が使用される場合、好ましくは、洗剤は顆粒の形態で設計される。好ましくは、顆粒は保護剤（例えば、参照により本明細書に取り込まれる、Ｕ．Ｓ．  Ａｐｐｌｎ．  Ｓｅｒ．  Ｎｏ．  ０７／６４２，６６９  ｆｉｌｅｄ  Ｊａｎｕａｒｙ  １７，  １９９１参照）をさらに含むように設計される。同様に、ある実施態様おいて、顆粒は、洗浄溶剤（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，２５４，２８３を参照）への顆粒の溶解速度を低減するような材料を含むように設計される。さらに、本発明のペルヒドロラーゼ酵素が基質及び酵素が同じ顆粒中に存在する製剤において有用である。すなわち、ある実施態様おいて、酵素及び基質（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＵ．Ｓ．  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｎ．  Ｐｕｂｌ．  Ｎｏ．  ＵＳ  ２００３／０１９１０３３を参照）の高い局所的濃度を供給することにより、酵素の有効性が増加する。
【０１９８】
本発明の洗浄組成物は任意の適切な形態へ設計され、設計者により選択される任意の過程にて調製される。それらは米国特許第５，８７９，５８４、米国特許第５，６９１，２９７、米国特許第５，５７４，００５、米国特許第５，５６９，６４５、米国特許第No.  ５，５６５，４２２、米国特許第５，５１６，４４８、米国特許第５，４８９，３９２、及び米国特許第５，４８６，３０３に記載の実施例に限定されない。それらのすべてが参照により、本明細書に取り入れられる。
【０１９９】
本明細書に記載の洗浄組成物は水溶液での洗浄操作の間、洗浄液は約５から１１．５まで、又は約７．５から約１０．５までのようなｐＨを有する。液体製品製剤は約３．０から約９．０のｐＨを有するように通常設計される。粒状洗濯用製品は約９から約１１のｐＨを有するように通常設計される。推奨される使用レベルでのｐＨ制御方法は緩衝液、アルカリ、酸等、及び当業者に知られた使用を含む。
【０２００】
本発明の酵素が粒状組成物又は液体に使用される場合、保管中に粒状組成物の他の成分からそのような酵素を保護するために封入される粒子の形態をとることが時々望ましい。さらに、カプセル化はまた洗浄工程中の酵素の有効性を制御する手段でもあり、酵素の能力を増強させる。この場合、酵素は周知の任意の有用な材料でカプセル化される。
【０２０１】
カプセル用材料は少なくとも酵素の一部を通常封入する。一般的にカプセル用材料は水溶性及び／又は水分散性を有する。カプセル用材料は０℃またはそれより高め（例えば、参照により本明細書に取り込まれる、ＷＯ  ９７／１１１５１を参照）のガラス転移温度（Ｔｇ）を有してよい。
【０２０２】
ある実施態様おいて、カプセル化は炭水化物、天然の又は合成ガム、キチンとキトサン、セルロースとセルロース誘導体、ケイ酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、パラフィンワックス、及びそれらの組合わせから選択される。一般的にカプセル用材料は炭水化物である。適切な炭水化物は、ＥＰ  ０  ９２２  ４９９、米国特許第４，９７７，２５２、米国特許５，３５４，５５９、及び米国特許第５，９３５，８２６に記載され、参照により本明細書に各々取り込まれる。
【０２０３】
ある実施態様おいて、カプセル用材料はプラスチック（例えば、熱可塑性物質、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリロニトリル、及びそれらの混合物）から作られるミクロスフェアである。使用に有用であり、市場にて入手できるミクロスフェアは、登録商標ＥＸＰＡＮＣＥＬ（商標）のエクスパンセル（Ｓｔｏｃｋｖｉｋｓｖｅｒｋｅｎ，  Ｓｗｅｄｅｎ）により供給されるもの、及び商標名ＰＭ  ６５４５、ＰＭ  ６５５０、ＰＭ  ７２２０、ＰＭ  ７２２８、ＥＸＴＥＮＤＯＳＰＨＥＲＥＳ（商標）、ＬＵＸＳＩＬ（商標）、Ｑ‐ＣＥＬ（商標）  及びＳＰＨＥＲＩＣＥＬ（商標）を用いてＰＱ  Ｃｏｒｐ．（Ｖａｌｌｅｙ  Ｆｏｒｇｅ，  ＰＡ）よって供給されるものを含むが、これらに限定されない。
【０２０４】
上記の成分に加えて、香料、緩衝液、防腐剤、染料、及び類似物もまた本発明に用いる。これらの成分は当業者に周知の濃度及び形態で提供される。
【０２０５】
ある実施態様おいて、本発明の粉状洗剤基材は噴霧乾燥方法及び造粒方法を含む周知の調製方法によって調整される。特に、噴霧乾燥及び／又は噴霧乾燥造粒方法によって得られる洗剤基材が好ましい。噴霧乾燥方法により得られる洗剤基材は、調製条件に関して制限されない。噴霧乾燥方法により得られる洗剤基材は、界面活性剤及びビルダーのような熱耐性成分の液体スラリーを熱い空間に噴霧することにより得られる空洞顆粒の形態を有する。噴霧乾燥後、所望により、香料、酵素、漂白剤、無機のアルカリ性ビルダーを加える。噴霧乾燥造粒方法により、高密度で、粒状の洗剤基材を調製後、これに種々の成分をさらに添加する。
【０２０６】
ある実施態様においては、液体洗剤基材は均質液であるが、一方、他の実施態様おいて、それは不均一な分散体である。
【０２０７】
ある実施態様においては、本発明の洗剤組成物は産業用及び家庭用の織物（例えば、泥汚れの布地）とともに、これらの環境にて通常用いる温度、反応時間や、液体割合でインキュベートする。インキュベーション条件（言い換えると、本発明に従って洗剤組成物で材料を処理するのに効果的な条件）は当業者において容易に確定することができる。従って、本洗剤での処理における効果のある適切な条件は、野生型ペルヒドロラーゼを含む同様な洗剤組成物を用いるときの条件と同様である。
【０２０８】
上記に示すように、本発明により提供されるある実施態様おいては、柔軟性、布のけばたち除去、布のけばたち防止、表面繊維除去、又はクリーニングについて所望の改善を与えるのに十分な活性を有する、中間ｐＨでの適切な液体中の前処理洗浄剤としての洗浄組成物が設計される。洗剤組成物が前浸漬容液（例えば、前洗浄、又は前処理）組成物で、液体、スプレー、ゲル、又はペ−スト状の組成物である場合、ペルヒドロラーゼ酵素を前浸漬液又は前処理組成物の総重量に基づいて約０．００００１％から約５％重量で通常使用する。そのような組成物において、界面活性剤を任意に使用してよく、使用する場合、前浸漬組成物の総重量に基づいて約０．０００５％から約１％の濃度で通常存在する。組成物の残りの成分は前浸漬液に用いる通常の成分（例えば、希釈液、緩衝液、他の酵素（プロテアーゼ）等）を通常の濃度で含む。
【０２０９】
ある実施態様において、本発明により提供される洗浄組成物は、場所（例えば、表面又は繊維）をクリーニングするのに有用である。その場所の少なくとも一つの部分は本明細書にて提供する少なくとも一つの洗浄組成物と、原液の形態で又は洗浄液で希釈して接触させ、その場所は任意に洗浄及び／又はすすがれる。本発明において、洗浄はゴシゴシ洗い及び機械的攪拌を含むが、これらに限定されない。織物は普通の消費者が使用する条件にて洗濯することができる任意の布地を含む。本明細書にて提供される洗浄組成物は、通常、溶液中約５００ｐｐｍから約１５０００ｐｐｍの濃度で用いる。洗浄液が水の場合、水の温度は約５℃から約９０℃の範囲であり、その場所が織物の場合、水対織物の質量比は通常約１：１から約３０：１である。
【実施例】
【０２１０】
本発明にかかる特定の好ましい実施及び態様を明らかにし、さらに説明するために、次の実施例が与えられるが、これらは特許請求の範囲を限定するものとして解釈してはならない。
【０２１１】
ＰＣＴ公開ＷＯ０５／０５６７８２はペルヒドロラーゼ酵素の同定及び使用方法を提供する。この公報の各実施例はすべての方法の開示を含め、参照により本明細書にそれぞれ取り入れられる。その記載は、ペルヒドロラーゼ作製方法、ペルヒドロラーゼ同定方法、ペルヒドロラーゼ試験方法、ペルヒドロラーゼヌクレオチドとポリペプチド配列、ペルヒドロラーゼの使用方法、及びペルヒドロラーゼが使用される組成物の開示を含むが、これらに限定されない。
【０２１２】
以下に開示する実施例において、次の略語が適用される。
℃（摂氏  （ｄｅｇｒｅｅｓ  Ｃｅｎｔｉｇｒａｄｅ））、ｒｐｍ（回転数  (ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎｓ  ｐｅｒ  ｍｉｎｕｔｅ)、Ｈ２Ｏ（水  （ｗａｔｅｒ））、ＨＣｌ（塩酸  （ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｃ  ａｃｉｄ））、ａａ（アミノ酸  （ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ））、ｂｐ（塩基対  （ｂａｓｅ  ｐａｉｒ））、ｋｂ（キロ塩基対  （ｋｉｌｏｂａｓｅ  ｐａｉｒ））、ｋＤ（キロダルトン  （ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎｓ））、ｇｍ（グラム  （ｇｒａｍｓ））、μｇ及びｕｇ（マイクログラム  （ｍｉｃｒｏｇｒａｍｓ））、ｍｇ（ミリグラム  （ｍｉｌｌｉｇｒａｍｓ））、ｎｇ（ナノグラム  （ｎａｎｏｇｒａｍｓ)）、μｌ及びｕｌ（マイクロリットル  （ｍｉｃｒｏｌｉｔｅｒｓ））、ｍｌ（ミリリットル  （ｍｉｌｌｉｌｉｔｅｒｓ））、ｍｍ（ミリメートル  （ｍｉｌｌｉｍｅｔｅｒｓ））、ｎｍ（ナノメートル  （ｎａｎｏｍｅｔｅｒｓ））、μｍ及びｕｍ（マイクロメートル  （ｍｉｃｒｏｍｅｔｅｒ））、Ｍ（モル  （ｍｏｌａｒ））、ｍＭ（ミリモル  （ｍｉｌｌｉｍｏｌａｒ））、μＭ及びｕＭ（マイクロモル  （ｍｉｃｒｏｍｏｌａｒ））、Ｕ（ユニット  （ｕｎｉｔｓ））、Ｖ（ボルト  （ｖｏｌｔｓ））、ＭＷ（分子量  （ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ））、  ｓｅｃ（秒  （ｓｅｃｏｎｄｓ））、ｍｉｎ(ｓ)（分  （ｍｉｎｕｔｅ／ｍｉｎｕｔｅｓ））、ｈｒ(ｓ)（時間  （ｈｏｕｒ／ｈｏｕｒｓ））、ＭｇＣｌ２（塩化マグネシウム  （ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ））、ＮａＣｌ（塩化ナトリウム  （ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ））、ＯＤ２８０（光学密度２８０ｎｍ  （ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ａｔ  ２８０  ｎｍ））、ＯＤ６００（光学密度６００ｎｍ  （ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ａｔ  ６００  ｎｍ））、ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミド電気泳動  （ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ））ＥｔＯＨ（エタノール  （ｅｔｈａｎｏｌ））ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ  ［１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、  １０ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ、  ｐＨ７．２])、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム  （ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ））、Ｔｒｉｓ  （トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  （ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ））、ＴＡＥＤ（テトラアセチルエチレンヂアミン  （Ｎ,Ｎ,Ｎ‘Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ））、ｗ／ｖ（質量／体積  （ｗｅｉｇｈｔ  ｔｏ  ｖｏｌｕｍｅ））、ｖ／ｖ（体積／体積  （ｖｏｌｕｍｅ  ｔｏ  ｖｏｌｕｍｅ））、Ｐｅｒ（ペルヒドロラーゼ  （ｐｅｒｈｙｄｒｏｌａｓｅ））、ｐｅｒ（ペルヒドロラーゼ遺伝子  （ｐｅｒｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｇｅｎｅ））、Ｍｓ（マイコバクテリウム・スメグマチス  （Ｍ．  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ））、ＭＳ（質量分析  （ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ））、ＡＡＴＣＣ（米国繊維化学技術・染色技術協会  （Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｅｘｔｉｌｅ  ａｎｄ  Ｃｏｌｏｒｉｎｇ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ））、ＷＦＫ  （ｗｆｋ  Ｔｅｓｔｇｅｗｅｂｅ  ＧｍｂＨ，  Ｂｒｕｇｇｅ���−Ｂｒａｃｈｔ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ａｍｅｒｓｈａｍ  （アマシャム  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｉｎｃ．  Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，  ＩＬ））、Ｐｉｅｒｃｅ  （ピアス  （Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＬ）、Ａｍｉｃｏｎ  （アミコン  （Ａｍｉｃｏｎ，  Ｉｎｃ．，  Ｂｅｖｅｒｌｙ，  ＭＡ））、ＡＴＣＣ  （アメリカ培養細胞系統保存機関  （Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ））Ａｍｅｒｓｈａｍ  （アマシャム  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ））、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  （ベクトン  ディッキンソン  （Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ，  Ｌｉｎｃｏｌｎ  Ｐａｒｋ，  ＮＪ）、ＢｉｏＲａｄ  （バイオラッド  （ＢｉｏＲａｄ，  Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，  ＣＡ）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  （クローンテック  （ＣＬＯＮＴＥＣＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ））、Ｄｉｆｃｏ  （ディフコ  （Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｄｅｔｒｏｉｔ，  ＭＩ））、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ又はＧｉｂｃｏ  ＢＲＬ  （ギブコ  （Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ））、Ｎｏｖａｇｅｎ  （ノバジェン  （Ｎｏｖａｇｅｎ，  Ｉｎｃ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ））Ｑｉａｇｅｎ  （キアゲン  （Ｑｉａｇｅｎ，  Ｉｎｃ．，  Ｖａｌｅｎｃｉａ，  ＣＡ））、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  （インビトロジェン  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ））、Ｄｉｏｎｅｘ  （ダイオネクス  （Ｄｉｏｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．，  Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，  ＣＡ））、Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ  （シグマ  アルドリッチ  （Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ））、Ｓｏｒｖａｌｌ  （Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，  ａ  ｓｕｂｓｉｄｉａｒｙ  ｏｆ  ＤｕＰｏｎｔ  Ｃｏ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，  ＤＥ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  （ストラタジーン  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ））、Ｒｏｃｈｅ  （ロッシュ  （Ｈｏｆｆｍａｎｎ  Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｕｔｌｅｙ，  ＮＪ））、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  （モレキュラーデバイス  （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，  Ｃｏｒｐ，  Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，  ＣＡ））及びＡｇｉｌｅｎｔ  （アジレント  （Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ））.  
実施例１
カプロン酸ｐ‐ニトロフェニル（ｐＮＣ６）を加水分解するペルヒドロラーゼ酵素の同定
【０２１３】
ＰＣＴ公報ＷＯ０５／０５６７８２に記載のように、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ペルヒドロラーゼ遺伝子のペルヒドロラーゼ遺伝子をクローン化した。マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ペルヒドロラーゼ遺伝子のペルヒドロラーゼ遺伝子ヌクレオチド配列は
ATGGCCAAGCGAATTCTGTGTTTCGGTGATTCCCTGACCTGGGGCTGGGTCCCCGTCGAAGACGGGGCACCCACCGAGCGGTTCGCCCCCGACGTGCGCTGGACCGGTGTGCTGGCCCAGCAGCTCGGAGCGGACTTCGAGGTGATCGAGGAGGGACTGAGCGCGCGCACCACCAACATCGACGACCCCACCGATCCGCGGCTCAACGGCGCGAGCTACCTGCCGTCGTGCCTCGCGACGCACCTGCCGCTCGACCTGGTGATCATCATGCTGGGCACCAACGACACCAAGGCCTACTTCCGGCGCACCCCGCTCGACATCGCGCTGGGCATGTCGGTGCTCGTCACGCAGGTGCTCACCAGCGCGGGCGGCGTCGGCACCACGTACCCGGCACCCAAGGTGCTGGTGGTCTCGCCGCCACCGCTGGCGCCCATGCCGCACCCCTGGTTCCAGTTGATCTTCGAGGGCGGCGAGCAGAAGACCACTGAGCTCGCCCGCGTGTACAGCGCGCTCGCGTCGTTCATGAAGGTGCCGTTCTTCGACGCGGGTTCGGTGATCAGCACCGACGGCGTCGACGGAATCCACTTCACCGAGGCCAACAATCGCGATCTCGGGGTGGCCCTCGCGGAACAGGTGCGGAGCCTGCTGTAA（配列番号１）
である。
【０２１４】
マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ペルヒドロラーゼ酵素のアミノ酸配列は、
MAKRILCFGDSLTWGWVPVEDGAPTERFAPDVRWTGVLAQQLGADFEVIEEGLSARTTNIDDPTDPRLNGASYLPSCLATHLPLDLVIIMLGTNDTKAYFRRTPLDIALGMSVLVTQVLTSAGGVGTTYPAPKVLVVSPPPLAPMPHPWFQLIFEGGEQKTTELARVYSALASFMKVPFFDAGSVISTDGVDGIHFTEANNRDLGVALAEQVRSLL（配列番号２）
である。
【０２１５】
またＰＣＴ公報ＷＯ０５／０５６７８２記載のように、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ペルヒドロラーゼ酵素のありとあらゆるアミノ酸の位置は、部位飽和突然変異のライブラリーを作成する１９アミノ酸残基ごとに変異を行った。ＰＣＴ公報ＷＯ０５／０５６７８２の実施例２に記載の方法を用いて、野生型ペルヒドロラーゼと部位飽和突然変異ライブラリーのペルヒドロラーゼ変異体のそれぞれはＣ６アシルエステル基質であるカプロン酸‐ｐニトロフェニルに対する加水分解活性を試験された。
【０２１６】
野生型ペルヒドロラーゼはｐＮＣ６を加水分解できなかった。次のペルヒドロラーゼ変異体はｐＮＣ６に対する加水分解活性を有することにより同定された。
【表１】
2010508843.tif 000003
実施例２
組合せライブラリーの調製及びスクリーニング
【０２１７】
野生型ペルヒドロラーゼ（配列番号２）とＬ１２Ｇ変異体を親分子として用いて、ＮＡＳＬ１，ＮＡＳＬ２，ＮＡＳＬ３，及びＮＡＳＬ４である４つの異なるライブラリーを調製するために、表１に同定された変異体を互いに組合わせた。組合せライブラリーを作るために用いるプライマーは以下に示す。ここで、「ＮＮＳ」配列はすべての２０のアミノ酸と１つの停止コドンをコードする縮重コドンＮＮＧ／Ｃ（Ｎ＝Ｇ、Ａ、Ｔ又はＣ）を表す。
【表２】
2010508843.tif 000004
【０２１８】
ＷＯ０５／０５６７８２記載の方法を用いてＮＡＳＬ１からＮＡＳＬ４の組合せライブラリーを作るためにＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ｍｕｌｔｉ  ｓｉｔｅ‐ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（ＱＣＭＳ）を用いた。ＱＣＭＳ反応は１６．５μＬの滅菌蒸留水、２．５μＬのキット用１０倍緩衝液、１μＬのキット用ｄＮＴＰｓ、３μＬの２０プライマー混合物（前もって、１０μＬの各１００ｎｇ／μＬ濃度のプライマーを混合する）、鋳型（〜５０ｎｇ）として１μＬのｐＭＳＡＴ‐ＮｃｏＩｍｉｎｉｐｒｅｐＤＮＡ、及び１μＬのキット用酵素ブレンドからなり、総量が２５μＬとなる。サイクル条件は、９５℃で１分間を１回行い、９５℃で１分間、５５℃で１分間、及び６５℃で１０分間を３０回行う。次に、３７℃で４時間、１又は０．５μＬの酵素（ＱＣＭＳキット）を用いてＤｐｎＩ消化を続けて２回行う。２μＬの反応溶液を製品説明書のようにＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳコンピテント細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換した。形質転換細胞を１００ｐｐｍのカルベニシリン、０．１ｍＭのＩＰＴＧ、及び０．２５％のトリカプロイン（ｔｒｉｃａｐｒｏｉｎ）（超音波処理により培地に混合されたＣ６アシル鎖基質）を含むＬＢプレート上に塗布した。
【０２１９】
３７℃で２４時間、プレートを培養後、２日間室温に放置され、ハロー形成コロニーの集団は１００ｐｐｍのカルベニシリン含有ＬＢ培地で９６穴プレートを用いて３７℃で終夜培養される。ハロー形成を再評価するために、ＬＢ，１００ｐｐｍのカルベニシリン、０．１ｍＭのＩＰＴＧ、及び０．２５％のトリカプロインを含有する大きな寒天培地に培養物をレプリカスタンプする。
【０２２０】
表３は組合せライブラリー及びそれらのスクリーニングのさらなる詳細な説明を示す。
【表３】
2010508843.tif 000005
【０２２１】
どの変異がハロー形成の原因になったかを調べるためにハロー形成コロニーのペルヒドロラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドの配列を決定した（表４）。
【表４】
2010508843.tif 000006
実施例３
ハロー形成変異体の生化学的特徴
【０２２２】
親配列と異なるアミノ酸配列を有し、トリカプロインプレート上にハローを形成する変異体について、ＰＣＴ公報ＷＯ０５／０５６７８２の実施例２に記載の方法を用いて、１００ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．０、０．１％のＴｒｉｔｏｎ‐Ｘ１００、及び１ｍＭのｐＮＣ６又はｐＮＣ８の溶液中カプロン酸ｐ‐ニトロフェニル（ｐＮＣ６）及びオクタン酸ｐ‐ニトロフェニル（ｐＮＣ８）に対する加水分解活性を試験した。
【０２２３】
各ハロー形成変異体に対してｐ‐ニトロフェニルが現れるまでの速度を測定した。野生型酵素はｐＮＣ６又はｐＮＣ８に対する加水分解を示さなかった。ｐＮＣ６／ｐＮＣ８の加水分解の比は下記の表５に示す。
【表５】
2010508843.tif 000007
【０２２４】
変異体Ｆ１５４Ｔ  Ｆ１９６Ｉ、Ｌ１２Ｑ  Ｆ１５４Ｖ、Ｌ１２Ｍ  Ｆ１５４Ｅ、Ｌ１２Ｇ  Ｆ１５４Ｇ、Ｆ１５４Ｅ  Ｉ１９４Ｓ、及びＬ１２Ｇ  Ｇ２２Ｗはトリカプロインに対する加水分解活性を有するが、ｐＮＣ６又はｐＮＣ８に対する加水分解がなかった。
【０２２５】
データより、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ペルヒドロラーゼの特定の変異体は基質として中及び長鎖アシルエステルの使用が可能である。
実施例４
酵素分析
【０２２６】
この実施例において、酵素の純度及び活性を評価することに有用である方法を記載する。しかしながら、他の適切な方法が有用であるように、本発明はこれらの特定の方法に限定することを意図していない。
酵素活性測定（ｐＮＢ測定）
【０２２７】
この活性は酪酸ｐ‐ニトロフェニル（ｐ‐ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｂｕｔｙｒａｔｅ）又は他の長鎖ｐ‐ニトロフェニル化合物を加水分解することにより測定される。１０μｌのジメチルスルホキシド溶解１００ｍＭ  ｐ‐ニトロフェニルブチレートを９９０ｍｌの０．１％Ｔｒｉｏｔｏｎ  Ｘ−１００含有１００ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０に加えることによって反応液を調製する。加水分解のバックグラウンド速度を酵素添加前に４１０ｎｍで測定する。９９０ｍｌの反応溶液に１０μｌの酵素を添加することにより、反応を開始させ、４１０ｎｍでの吸光度の変化を室温（〜２３℃）で測定した。バックグラウンド補正後の結果をδＡ４１０／ｍｉｎ／ｍｌ又はδＡ４１０／ｍｉｎ／ｍｇ蛋白質として示す。
エステル交換
【０２２８】
エステル交換を反応溶液中における生成物のＧＣ分離によって測定する。プロパノールとの酢酸エチルエステル交換を測定するために反応液は１ｍｌの５０ｍＭ  ＫＰＯ４、ｐＨ７．０、２００ｍＭ  エチル酢酸、２００ｍＭ  １−プロパノール、及び酵素を含んだ。ネオペンチルグリコール（ＮＰＧ）との酢酸エチルエステル交換を測定するために反応液は１ｍｌの５０ｍＭ  ＫＰＯ４、ｐＨ７．０、３０３ｍＭ  エチル酢酸、１００ｍＭ  ＮＰＧ、及び酵素を含んだ。反応液を示した温度及び示した時間にてインキュベートした。分離を３０Ｍ  ＦＦＡＰカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を用いて行う。注入ｓｐｌｉｔ比は約１：２５、注入器は２５０℃、最高圧は１０ｐｓｉ  Ｈｅ、であり、２５０℃でＦＩＤにより検出した。クロマトグラフィープログラムは初期値４０℃で４分間セットし、続いて、１５℃／ｍｉｎの勾配で１８０℃にセットした。次の順番で化合物は溶出されたが、定量はされなかった。それは、エチル酢酸、エチルアルコール、プロピル酢酸、プロピルアルコール、酢酸、ＮＰＧ二酢酸、ＮＰＧ一酢酸、及びＮＰＧである。
基質の調製
【０２２９】
基質を本明細書に記載するように調製する。エチル酢酸（ＥｔＯＡｃ）又は他の水溶性エステルを１０ｍＭエステルの濃度になるように所望の緩衝液に希釈した。トリブチリン及び他の不溶性基質を基質集合物作ることにより調製した。ポリエステル集合物を５／８インチのパンチを用いて非染色ポリエステル繊維（Ｐｏｌｙｃｏｔｔｏｎ，  ＰＣＷ  ２２）から切断して、２４穴マイクロプレート（Ｃｏｓｔａｒ，  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｌａｔｅ）に置いた。不溶性エステルはヘキサンを用いて１．０３Ｍに希釈した。そして、１０μｌの不溶性エステル溶液をポリエステル集合物に吸収した。
加水分解の検出（ＧＣ  測定）
【０２３０】
下記に記載の加水分解測定は基質加水分解の量の検出方法を用いる。この測定において、測定溶液は５０ｍＭ  リン酸カリウム  ｐＨ７．５、１０ｍＭエステル基質、２９ｍＭ過酸化水素、及び２０ｍＭ  塩化カリウムの総量０．９９ｍｌの溶液と２５℃で１分ごとに２０ナノモルの酢酸を生成する酵素量を含んだ。
【０２３１】
水不溶性のエステルの加水分解を測定するために、反応混合物を不溶性エステル繊維集合物に添加した。集合物を上記（「基質の調製」）の記載のように調製した。他のエステル基質の排出を除いて、測定の他のすべての条件は同じであった。
【０２３２】
炎イオン化検出を結合したガスクロマトグラフィーを用いて、酵素によってアシル供与基質から生成される酸の増加をモニターすることにより、加水分解活性を測定した。０分時点の測定溶液における酸の量を検出するために、酵素以外のすべての成分を含む５０μＬの測定溶液を２００Ｌのメタノール（ＨＰＬＣ等級）にまずピペッティングすることによって測定を行った。それから、１分間に約２０ナノモルの酸を生成する所望の最終濃度になる反応液に１０μＬの酵素を添加した。時間を測定し始め、酵素添加後、種々の時間、通常２，５，１０，１５，２５，４０，６０分で反応溶液から５０μＬの試料をとりだし、２００μＬのメタノールに加えた。
【０２３３】
炎イオン化検出（Ａｇｉｌｅｎｔ  ６８９０Ｎ）結合ガスクロマトグラフィーにメタノール停止サンプルを注入し、加水分解成分である、酢酸、酪酸などを分析する。ニトロテレフタル酸修飾ポリエチレングリコールカラム（Ｚｅｂｒｏｎ  ＦＦＡＰ；寸法:  ３０ｍ長さ、２５０ｕｍ直径、２５０ｎｍ薄層）を用いて、ガスクロマトグラフィーを行った。１．０ｍＬ／ｍｉｎの一定ヘリウム流量下、スプリットレス注入によってカラムに３μＬの試料サンプルを注入した。注入口を２５０℃の温度に維持し、２分後、いずれの残渣サンプル成分を除去した。酢酸を分析する場合、カラムの温度を注入後１分間７５℃に維持し、２５℃／ｍｉｎの勾配で１００℃まで上げ、それから１５℃／ｍｉｎの勾配で２００℃まで上げた。
【０２３４】
酪酸を分析する場合、カラムの温度をさらに２５℃／ｍｉｎの勾配で２２５℃まで上げ、それから２２５℃で１分保持する以外はカラムの温度を上記のように制御した。クロマトグラフィーを通して、２５０℃、及び２５ｍＬ／ｍｉｎの一定水素流量、２００ｍＬ／ｍｉｎの一定空気流量及びカラムと３０ｍＬ／ｍｉｎの補給ヘリウム流量の組合せの下、炎イオン化検出器を維持した。クロマトグラムにおける酸のピークを総イオンカウントとして統合し、（酵素を含まない）反応溶液中の種々の濃度の酢酸と酪酸についての上記の条件下における標準曲線を用いてイオンカウントから酸を算出することによって、サンプル中の加水分解酸の量を測定する。
過加水分解の測定（ＯＰＤ測定）
【０２３５】
下記に記載の過加水分解活性測定は反応中の過酸生成の量を測定することにより行なう。これらの測定は、５０ｍＭ  リン酸カリウム  ｐＨ７．５、１０ｍＭエステル基質、２９ｍＭ過酸化水素、２０ｍＭ  塩化カリウム、及び１０ｍＭ  Ｏ‐フェニレンジアミンを含む。
【０２３６】
アシル供与体として水に不溶性のエステルを用いる場合、エステル吸収繊維集合物を基質として用い、上記（「基質の調製」）のように調製した。
【０２３７】
酵素で生成する過酸による酸化Ｏ‐フェニレンジアミン（ＯＰＤ）の４５８ｎｍでの吸光度の増加をモニタリングすることにより、過加水分解活性を測定した。１０ｍＭの最終濃度になるように反応溶液にＯＰＤを添加する以外、加水分解活性反応溶液と同様の方法で過加水分解活性反応溶液を調製した。７２ｍｇＯＰＤ（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ、二塩酸塩）を同じ１９．９４ｍＬの緩衝液に溶解し、６０μＬの１３．５Ｍ水酸化カリウムをゆっくり滴下することによってｐＨを調整して、測定開始直前にＯＰＤ溶液を調製した。もし必要なら、ｐＨを測定し、緩衝液のもとのｐＨにｐＨを戻すために少量の水酸化カリウムを加えた。それから、４９５μＬのこのＯＰＤ溶液を最終的に０．９９０ｍＬの反応体積になるように他の成分とともに加えた。また、２０ｍＬの１００ｍＭクエン酸と７０％エタノール中に３６ｍｇのＯＰＤを溶解することによって、反応停止溶液を調製した。
【０２３８】
測定を通常２５℃で行う。０分時点での過加水分解成分の量と反応溶液のバックグラウンド吸光度を測定するために２００μＬの停止溶液に酵素を添加する前に１００μＬの反応溶液をピペッティングすることにより反応を開始した。それから、１分間に約１０ナノモルの酸を生成する所望の最終濃度になるように反応液に１０μＬの酵素を添加した。時間を測定し始め、酵素添加後、種々の時間、通常２，５，１０，１５，２５，４０，６０分で反応溶液から１００μＬの試料をとりだし、２００μＬの停止溶液に加えた。すべての残留過酸でＯＰＤを酸化させるために反応停止溶液を３０分間インキュベートした。それから１００μＬの各反応停止溶液を９６穴マイクロプレート（Ｃｏｓｔａｒ）へ移し、吸光プレートリーダーＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，  ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ  ２５０）にて４５８ｎｍで溶液の吸光度を測定した。反応溶液（酵素含まず）中に種々の濃度での過酢酸を有する上記の条件下での標準曲線を用いて各反応停止サンプルの量を算出した。
過加水分解／加水分解の比：
【０２３９】
過加水分解／加水分解の比＝過加水分解測定で測定された過加水分解／（加水分解測定で検出された酸の総量―過加水分解測定で測定された過加水分解）
ペルヒドロラーゼの過酸生成測定
【０２４０】
過加水分解測定のために、過酸化水素存在下、特定の温度で選択した緩衝液中、基質エステルとともに酵素をインキュベートした。中又は長鎖エステルの過加水分解を測定するための通常の基質は、ヘキサン酸、へプタン酸、オクタン酸、ノナン酸のメチル又はエチルエステル、又はＣ１０からＣ２２又はそれ以上脂肪酸エステル及び他のものを含む。さらに、野生型酵素が短鎖酸のニトロフェニルエステルを加水分解できることがわかった。後者は酵素濃度を測定するために便利な基質である。ある実施態様において、過酸酸と酢酸をＡＢＴＳ又はＨＰＬC分析にて測定した。ニトロフェニルエステル加水分解は以下に記載する。
ＡＢＴＳ測定（１ミリリットル）：
【０２４１】
この測定はペルヒドロラーゼによる過酢酸の検出を提供する。この手順はＫａｒｓｔ他  （Ｋａｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ，  Ａｎａｌｙｓｔ，  １２２：５６７−５７１  ［１９９７］）から出典している。手短には、１００μＬの分析すべき溶液の一部を１ｍＬの１２５ｍＭＫ＋クエン酸  ｐＨ５、１ｍＭ  ＡＢＴＳ、５０μＭのＫＩに添加した。吸光度を最も高い感度にて４２０ｎｍで測定した。しかし追加的多波長をＡＢＴＳの幅広い吸光スペクトラムに対して用いた。検量線を周知の過酸濃度系列に基づいて作成した。         
ペルヒドロラーゼ反応生成物のＨＰＬＣ（モデル‐Ａｇｉｌｅｎｔ１１００）測定
【０２４２】
ペルヒドロラーゼ反応の過加水分解対加水分解の比の値を決定するために、最終濃度０．２４％メタンスルホン酸になるように酸性化処理にてペルヒドロラーゼ反応サンプルの反応を停止し、生成物をＤｉｏｎｅｘ  ＯＡカラム（ｃａｔ  ＃０６２９０３；  Ｄｉｏｎｅｘ）を用いた逆相ＨＰＬＣにより分離した。１００ｍＭＮａＰＯ４、ｐＨ３．９（緩衝液は１００ｍＭＮａ２ＰＯ４をメタンスルホン酸でｐＨ３．９になるように滴下して調製した）である移動相を３０℃でアイソクラティック条件下で流した。検出は２１０ｎｍであった。生成物の濃度を標準検量線に対して統合したピーク面積を比較することにより計算した。
ニトロフェニルエステル加水分解速度測定
【０２４３】
酵素と基質を１００ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．０（又は５０ｍＭ  Ｂ（ＯＨ）３  ｐＨ９．５又は他の緩衝液）  でインキュベートする。４０２ｎｍの吸光度でモニターした。ある実施態様おいて、測定を標準１ｍＬキュベットを用いて行い、一方、他の実験では、マイクロタイタープレートを用いた。後者の方法を変異ライブラリーのスクリーニングに用いた。酵素濃度を同様の反応条件下で得られた標準検量線と比較して算出した。
カプロン酸パラ‐ニトロフェニル加水分解測定
【０２４４】
１ｍＭのｐＮＣ６（１００ｍＭ保存液）、１ｍＬのＤＭＳＯ、１９ｍｌの１００ｍＭリン酸（ｐＨ８）、及び最終濃度が１０％になるグリセロールに混合してｐＮＣ６基質液を調整した。測定サンプルのために、１０μｌの細胞液を１９０μｌの基質溶液に添加し、４０５ｎｍで１５分間分光光度計にて測定した。結果を２回の実験の平均として表した。
酢酸パラ‐ニトロフェニル（ｐＮＡ）加水分解測定
【０２４５】
溶解細胞の一部を１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）に１から１００倍希釈した。サンプルを測定するために、５μｌの１から１００倍希釈した細胞の上澄み液をマイクロタイタープレートの各穴に移した。それから１９５μｌの反応緩衝液／基質混合液（１ｍＭ  ｐＮＡ、１００ｍＭリン酸、ｐＨ８、１０％グリセロール）を添加し、４０５ｎｍでの吸光速度を３分以上（カイネッティクプログラム、マイクロプレートリーダー）測定した。結果を２回の実験の平均として表した。
【０２４６】
本明細書にて記載したすべての特許及び刊行物は本発明が関わる当業者の水準に沿うものであることを表している。あたかも各々個々の刊行物が具体的に及び個別に参考により組み入れられていることを示すように、すべての特許及び刊行物は参考により本明細書に組み入れられる。
【０２４７】
本発明の好ましい実施態様を記載したが、開示された実施態様に種々の修飾が加えられることは当業者にとって明らかであり、そのような修飾は特許請求の範囲内であると意図することは当業者にとって明らかである。
【０２４８】
当業者は、本発明の目的を遂行し、記載された或いは内在的に示される結果及び利点を得ることに十分適応できることを容易に理解できる。本明細書に記載した組成物及び方法は好ましい実施態様の代表的なものであり、典型的なものなので、特許請求の範囲を限定するものとして意図していない。種々の置換及び修飾は特許請求の精神及び範囲を逸脱することなく本明細書に記載された本発明によってなされることは当業者にとって容易に理解できる。
【０２４９】
適切に本明細書に具体的に記載された本発明は本明細書に特に開示されない任意の要素や、限定のない状態で実施されてもよい。使用されたその用語及び表現は説明のための用語として用いられ、限定されず、示され及び記載された本発明の特徴またはそれらの一部といずれの均等のものも排除するような用語及び表現の使用を意図するものではない。しかし、種々の修飾がなされたとき、それらは可能な限り特許請求の範囲内であることが認識できる。すなわち、本発明は好ましい実施態様及び任意の技術によって開示されているけれども、本明細書に開示された内容の修飾や変化は当業者によって用いられることは理解され、そのような修飾又は変化は添付した特許請求の範囲によって特徴付けられた本発明の範囲内であると考慮されることは理解されるべきである。
【０２５０】
本発明は本明細書において広く及び一般的に記載されている。一般的に開示されたより狭い種類及び亜属のグループのそれぞれもまた本発明の一部を構成する。これは、削除した物質が特に本明細書に記載されているかどうかにかかわらず、任意の対象物質をその属から除く条件的または否定的限定を有する本発明の一般的な記載を含む。
【手続補正書】
【提出日】平成21年8月10日(2009.8.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されるペルヒドロラーゼ酵素であって、長鎖アシルエステル基質を過加水分解するペルヒドロラーゼ酵素。
【請求項２】
前記酵素は長鎖アシルエステル基質及び過酸化物存在下長鎖過酸を生成することを特徴とする、請求項１に記載の単離されるペルヒドロラーゼ酵素。
【請求項３】
前記アシルエステル基質の鎖は少なくとも６個の炭素原子の鎖を含むことを特徴とする、請求項１に記載の単離されるペルヒドロラーゼ酵素。
【請求項４】
前記長鎖アシルエステル基質は少なくとも９個の炭素原子の鎖を含むことを特徴とする、請求項１に記載の単離されるペルヒドロラーゼ酵素。
【請求項５】
前記の酵素のアミノ酸配列は自然に発生するペルヒドロラーゼ酵素のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有することを特徴とする、請求項１に記載の単離されるペルヒドロラーゼ酵素。
【請求項６】
前記酵素のアミノ酸配列は配列番号２に記載のマイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）の野生型ペルヒドロラーゼのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有することを特徴とする、請求項１に記載の単離されるペルヒドロラーゼ酵素。
【請求項７】
前記酵素が配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むマイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ペルヒドロラーゼ中の位置と同等の位置のアミノ酸に少なくとも１つの置換を含み、前記少なくとも一つの置換基が１２、２２、５９、１５３、１５４、１９４、１９６、及び２０４の位置から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の単離されるペルヒドロラーゼ酵素。
【請求項８】
前記酵素が１２位においてＧｌｙ、Ｐｒｏ、または、Ｇｌｎ、２２位においてＴｒｐ、５９位においてＰｒｏ、１５３位においてＰｒｏ、１５４位においてＴｈｒ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、またはＧｌｎ、１９４位においてＧｌｙ、１９６位においてＳｅｒ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、またはＨｉｓ、２０４位においてＴｙｒまたはＴｒｐ、又はそれらの任意の組合わせであるアミノ酸置換の少なくとも１つを含み、前記アミノ酸の位置は配列番号２のマイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ペルヒドロラーゼ中１２、２２、５９、１５３、１５４、１９４、１９６、及び２０４の位置と位置的に同等であることを特徴とする、請求項7に記載の単離されるペルヒドロラーゼ酵素。
【請求項９】
前記酵素が１５４位においてＡｌａと１９４位においてＭｅｔ、１５４位においてＧｌｙと１９４位においてＶａｌ、又は１２位においてＧｌｙと１９４位においてＭｅｔであるアミノ酸置換の少なくとも１つを含み、前記アミノ酸の位置は、配列番号２のマイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ペルヒドロラーゼ中１２、１５４、及び１９４の位置と位置的に同等であることを特徴とする、請求項１に記載の単離される
ペルヒドロラーゼ酵素。
【請求項１０】
前記酵素は過加水分解対加水分解の比が１以上の比の値を有することを特徴とする、請求項１に記載の単離されるペルヒドロラーゼ酵素。
【請求項１１】
前記酵素は配列番号２の過酸の加水分解活性速度より低い過酸の加水分解速度を有することを特徴とする、請求項１に記載の単離されるペルヒドロラーゼ酵素。
【請求項１２】
請求項１の単離されるペルヒドロラーゼ酵素をコードしている単離される核酸。
【請求項１３】
組み換え核酸であって、
ａ）プロモーター及び
ｂ）請求項１２に記載の単離される核酸
を含み、前記プロモーター及び核酸が作動的に結合することを特徴とする、組み換え核酸。
【請求項１４】
請求項１３に記載の組み換え核酸を含むベクター。
【請求項１５】
請求項１３に記載の組み換え核酸を含む宿主細胞。
【請求項１６】
前記組み換え核酸が前記細胞において自動的に複製されるベクター又は前記細胞の染色体に存在することを特徴とする、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
前記細胞が細菌又は真菌を宿主細胞とすることを特徴とする、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
前記ペルヒドロラーゼの生産に適した条件下請求項１５に記載の細胞を維持することを含むペルヒドロラーゼの生産方法。
【請求項１９】
請求項１に記載のペルヒドロラーゼ酵素を含む洗浄組成物。
【請求項２０】
前記組成物がさらに長鎖アシルエステル基質及び過酸化物の供給源を含むことを特徴とする、請求項１９に記載の洗浄組成物。
【請求項２１】
前記組成物がさらに界面活性剤を含む請求項２０に記載の洗浄組成物。
【請求項２２】
前記組成物が洗濯洗剤であることを特徴とする、請求項１９に記載の洗浄組成物。
【請求項２３】
前記基質を洗浄するために請求項１９に記載の洗浄組成物存在下基質を維持することを含む洗浄方法。
【国際調査報告】
2010508843.tif 000008
2010508843.tif 000009