(57)【要約】脂質生成を調節する方法が本明細書中で開示される。この方法には、Ｃｃｄｃ８０遺伝子を発現している細胞を、Ｃｃｄｃ８０遺伝子またはＣｃｄｃ８０タンパク質の発現または活性を調節する薬剤と接触させる工程が含まれる。肥満、インスリン耐性、および／または２型糖尿病のような状態をＣｃｄｃ８０調節因子を用いて処置する方法が、本明細書中でさらに開示される。Ｃｃｄｃ８０調節因子を同定する方法もまた、本明細書中で開示される。
2010518821.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞中の脂質生成を調節する方法であって、該細胞を、Ｃｃｄｃ８０遺伝子またはＣｃｄｃ８０タンパク質の発現または活性を調節する薬剤と接触させる工程を包含する、方法。
【請求項２】
前記細胞が、前脂肪細胞、脂肪細胞、間葉系幹細胞、胚幹細胞および胎児線維芽細胞からなる群より選択される脂肪細胞性の細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記薬剤が、化合物、タンパク質、ペプチド、抗体、アプタマー、またはポリヌクレオチドである、請求項１および２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
前記薬剤が、Ｃｄｄｃ８０遺伝子の発現またはＣｃｄｃ８０タンパク質の発現もしくは活性を増大させる、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記薬剤が、Ｃｃｄｃ８０遺伝子の発現またはＣｃｄｃ８０タンパク質の発現もしくは活性を妨げるか、あるいは低下させる、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記薬剤が、Ｃｃｄｃ８０遺伝子の転写およびＣｃｄｃ８０メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）の翻訳のうちの少なくとも一方を妨げるかまたは低下させる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記薬剤がポリヌクレオチドである、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記薬剤が、前記Ｃｄｄｃ８０遺伝子もしくはＣｃｄｃ８０タンパク質の発現または活性を直接調節する、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチドが、リボ核酸（ＲＮＡ）である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリヌクレオチドが、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、リボザイム、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号７の核酸配列を含む短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記ポリヌクレオチドがデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記ポリヌクレオチドが、少なくとも１つの細胞表面受容体もしくは前記細胞の抗原に結合するペプチドまたは抗体に連結させられる、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
前記薬剤が、Ｃｃｄｃ８０タンパク質に対する抗体である、請求項５に記載の方法。
【請求項１５】
細胞中のＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達を調節する方法であって、該細胞を、Ｃｃｄｃ８０遺伝子またはＣｃｄｃ８０タンパク質の発現または活性を調節する薬剤と接触させる工程を包含する、方法。
【請求項１６】
前記薬剤が、化合物、タンパク質、ペプチド、抗体、アプタマー、またはポリヌクレオチドからなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記薬剤が、前記Ｃｃｄｃ８０遺伝子またはＣｃｄｃ８０タンパク質の発現または活性を直接調節する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記薬剤が、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記ｓｈＲＮＡに、配列番号３のＣｃｄｃ８０遺伝子配列に対して高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズする核酸配列が含まれる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ｓｈＲＮＡに配列番号７の核酸配列が含まれる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
肥満、インスリン耐性、または２型糖尿病から選択される状態を処置する方法であって、Ｃｃｄｃ８０遺伝子またはＣｃｄｃ８０タンパク質の発現または活性を調節する薬剤を、処置を必要とする被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２２】
処置される前記状態が肥満である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記薬剤が、肥満の美容的処置方法として、過剰な体重を有する被験体に対して投与される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
肥満を処置するために投与される前記薬剤が、Ｃｃｄｃ８０遺伝子の発現、またはＣｃｄｃ８０タンパク質の発現もしくは活性を増大させる、請求項２２および２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
肥満を処置するために投与される前記薬剤が、Ｃｃｄｃ８０遺伝子の発現、またはＣｃｄｃ８０タンパク質の発現もしくは活性を妨げるか、あるいは低下させる、請求項２２および２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記薬剤が、Ｃｃｄｃ８０遺伝子の転写またはＣｃｄｃ８０メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）の翻訳のうちの少なくとも一方を妨げるか、あるいは低下させる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記薬剤が、Ｃｃｄｃ８０遺伝子またはＣｃｄｃ８０タンパク質の発現または活性を直接調節する、請求項２１から２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記薬剤が、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、リボザイム、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記薬剤が、配列番号３のＣｃｄｃ８０遺伝子配列に対して高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズする核酸配列を含む短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記ｓｈＲＮＡに配列番号７の核酸配列が含まれる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
脂質生成を調節する薬剤をスクリーニングする方法であって、該方法は、
Ｃｃｄｃ８０遺伝子を発現する細胞を提供する工程；
該細胞を候補の薬剤と接触させる工程；および
該候補の薬剤の該細胞中のＣｃｄｃ８０遺伝子またはＣｃｄｃ８０タンパク質の発現または活性を調節する能力を評価する工程であって、ここで、該発現または活性を調節する候補の薬剤が脂質生成を調節する薬剤である、工程、
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞中での脂質生成を調節する方法に関する。具体的には、本発明はＣｃｄｃ８０遺伝子またはＣｃｄｃ８０タンパク質の発現または活性を調節する薬剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪組織は、「アディポカイン」と総称される様々な因子を分泌する活動性の内分泌器官として徐々に認められている（非特許文献１；非特許文献２）。既知のアディポカインとしては、代謝調節因子（例えば、レプチン、アディポネクチン、およびレジスチン）；血栓形成の調節因子（例えば、ＰＡＩ−１）；ならびに炎症媒介因子（例えば、ＴＮＦ−α）が挙げられる。アディポカインは、筋肉、肝臓、脳、および骨を含む様々な標的組織に対して内分泌様式または傍分泌様式で作用する。アディポカインはエネルギー恒常性に（例えば、レプチン）、インスリン感受性に（例えば、アディポネクチン）、血管機能に（例えば、ＰＡＩ−１）、および骨代謝に影響を及ぼす（非特許文献１、前出；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）。したがって、さらなるアディポカインの同定と、様々な標的組織に対するそれらの影響の特性決定が熱心に研究されている分野である。
【０００３】
Ｃｃｄｃ８０（マウスＵＲＢ（ボンベシン受容体サブタイプ−３ノックアウトマウスにおいてアップレギュレートされる（ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｂｏｍｂｅｓｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｔｙｐｅ−３  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｍｉｃｅ））、ヒトＤＲＯ１（ガン遺伝子１によってダウンレギュレートされる（ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ  １））、ラットＳＳＧ１（ステロイド感受性遺伝子１（ｓｔｅｒｏｉｄ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｇｅｎｅ  １））ニワトリＥＱＵＡＲＩＮとも呼ばれる）は、ボンベシン受容体サブタイプ−３ノックアウトマウスの茶色の脂肪組織の中でアップレギュレートされる至る所で発現されている遺伝子として最初に記載された（非特許文献７）。その後、ヒトＣｃｄｃ８０は、骨髄間質細胞の中で発現され、これらの細胞の骨芽細胞への分化の間にはダウンレギュレートされることが示された（非特許文献８）。Ｃｃｄｃ８０ｍＲＮＡおよびタンパク質はまた、マウスの胚発生の間には軟骨細胞および会合した細胞外マトリックスの中に存在することも示された（Ｌｉｕ  Ｙら、前出）。Ｃｃｄｃ８０のニワトリオルトログは、水晶体赤道領域だけで発現されることが明らかにされている（非特許文献９）。一方、マウスＣｃｄｃ８０およびニワトリＣｃｄｃ８０は、分泌型タンパク質であることが明らかにされているが（Ｌｉｕ  Ｙら、前出；Ｍｕ  Ｈら、前出）、ヒトＣｃｄｃ８０は、適切な量の分泌がないままに細胞内に局在化されることが報告されている（非特許文献１０）。ヒトＣｃｄｃ８０はβ−カテニンで腫瘍性形質転換された細胞の中でダウンレギュレートされることが明らかにされており、これらの細胞の中でのＣｃｄｃ８０の過剰発現は増殖を阻害することができ、それによって腫瘍抑制遺伝子の候補としてのＣｃｄｃ８０の指定が導かれる（Ｂｏｍｍｅｒ  ＧＴら、前出）。今日までには、全ての哺乳動物のＣｃｄｃ８０オルトログについての他の機能的データはほとんど報告されていないか、全く報告されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｇｉｍｅｎｏ  ＲＥ＆Ｋｌａｍａｎ  ＬＤ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（２００５）５：１２２−２８
【非特許文献２】Ｋｅｒｓｈａｗ  ＥＥ＆Ｆｌｉｅｒ  ＪＳ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．（２００４）８９：２５４８−５６
【非特許文献３】Ｋｈｏｓｌａ  Ｓ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（２００２）１４３：４１６１−６４
【非特許文献４】Ｆｕ  Ｌら、Ｃｅｌｌ（２００５）１２２：８０３−１５
【非特許文献５】Ｏｓｈｉｍａ  Ｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（２００５）３３１：５２０−２６
【非特許文献６】Ｔａｋｅｄａ  Ｓら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．（２００３）２３：４０３−１１
【非特許文献７】Ａｏｋｉ  Ｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（２００２）２９０：１２８２−８８
【非特許文献８】Ｌｉｕ  Ｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（２００４）３２２：４９７−５０７
【非特許文献９】Ｍｕ  Ｈら、Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．（２００３）１２０：１４３−５５
【非特許文献１０】Ｂｏｍｍｅｒ  ＧＴら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００５）２８０：７９６２−７５
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明により細胞中の脂質生成を調節する方法が提供される。本発明の方法は、治療的、予防的、および美容的処置に適用される。細胞中の脂質生成を調節する方法には、細胞をＣｃｄｃ８０遺伝子またはＣｃｄｃ８０タンパク質の発現または活性を調節する薬剤と接触させる工程が含まれる。細胞は脂肪細胞性の細胞、例えば、前脂肪細胞、脂肪細胞、間葉系幹細胞、胚幹細胞または胎児線維芽細胞であり得る。薬剤は、化合物、タンパク質、ペプチド、抗体、アプタマー、またはポリヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態においては、そのような薬剤はＣｄｄｃ８０遺伝子もしくはＣｃｄｃ８０タンパク質の発現または能力を直接調節することができる。いくつかの実施形態においては、薬剤は、Ｃｃｄｃ８０遺伝子の発現またはＣｃｄｃ８０タンパク質の発現もしくは活性を増大させる。いくつかの他の実施形態においては、薬剤は、Ｃｃｄｃ８０遺伝子の発現またはＣｃｄｃ８０タンパク質の発現もしくは活性を妨げるか、あるいは低下させる。
【０００６】
いくつかの実施形態においては、脂質生成を調節する方法には、細胞を、Ｃｃｄｃ８０遺伝子の転写もしくはＣｃｄｃ８０メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）の翻訳の少なくとも一方を妨げるかまたは低下させる薬剤と接触させる工程が含まれる。この薬剤はポリヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態においては、ポリヌクレオチドはリボ核酸（ＲＮＡ）である。特定の実施形態においては、ポリヌクレオチドはＣｃｄｃ８０アンチセンスポリヌクレオチドであり得る。ポリヌクレオチドは、例えば、ｄｓＲＮＡ、リボザイム、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態においては、ポリヌクレオチドはｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡであり得る。特定の実施形態においては、Ｃｃｄｃ８０ｍＲＮＡの翻訳を妨げるかまたは低下させるポリヌクレオチド薬剤はｓｈＲＮＡである。いくつかの実施形態においては、ｓｈＲＮＡには、配列番号３のＣｃｄｃ８０遺伝子配列に対して高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズする核酸配列が含まれる。ｓｈＲＮＡには、例えば、配列番号７の核酸配列が含まれる場合がある。いくつかの実施形態においては、配列番号３のＣｃｄｃ８０遺伝子配列に対して高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズする核酸配列は、配列番号７と少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれ以上同一である。
【０００７】
上記に記載されたように、Ｃｃｄｃ８０遺伝子の転写もしくはＣｃｄｃ８０ｍＲＮＡの翻訳の少なくとも一方を妨げるかまたは低下させるポリヌクレオチドはＲＮＡであり得る。あるいは、そのようなポリヌクレオチドはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である場合もある。ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの細胞表面受容体もしくは細胞の抗原に結合するペプチドまたは抗体に連結させられる場合がある。
【０００８】
いくつかの実施形態においては、薬剤は、Ｃｃｄｃ８０タンパク質の活性を妨げるかまたは低下させる。例えば、いくつかの実施形態においては、薬剤はＣｃｄｃ８０タンパク質に対する抗体である。
【０００９】
いくつかのさらなる実施形態においては、Ｃｃｄｃ８０遺伝子またはＣｃｄｃ８０タンパク質の発現または活性を調節する薬剤は、Ｃｃｄｃ８０ポリペプチドをコードする核酸であり得る。
【００１０】
いくつかの実施形態においては、Ｃｃｄｃ８０遺伝子を発現する細胞中の脂質生成を調節する方法には、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達を調節する工程が含まれる。いくつかの実施形態においては、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の調節にはＣＣＤｃ８０遺伝子またはＣｃｄｃ８０タンパク質の発現または活性を調節する薬剤を細胞に投与する工程が含まれる。薬剤は、例えば、化合物、タンパク質、ペプチド、抗体、アプタマー、またはポリヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態においては、そのような薬剤は、Ｃｃｄｃ８０遺伝子またはＣｃｄｃ８０タンパク質の発現または活性を直接調節する。Ｃｃｄｃ８０遺伝子またはＣｃｄｃ８０タンパク質の発現または活性を調節し、それによりＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達を調節するポリヌクレオチドは、ｓｈＲＮＡ（例えば、配列番号７の核酸配列を含むｓｈＲＮＡ）であり得る。いくつかの実施形態においては、Ｃｃｄｃ８０遺伝子またはＣｃｄｃ８０タンパク質の発現または活性を調節する核酸配列は、配列番号７と少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれ以上同一である。
【００１１】
本発明によってはさらに、肥満、インスリン耐性、または２型糖尿病から選択される状態を処置する方法が提供される。この方法には、Ｃｃｄｃ８０遺伝子またはＣｃｄｃ８０タンパク質の発現または活性を調節する薬剤をそれが必要な被験体に投与する工程が含まれる。いくつかの実施形態においては、薬剤はＣｃｄｃ８０遺伝子またはＣｃｄｃ８０タンパク質の発現または活性を直接調節する。いくつかの実施形態においては、処置される状態は肥満である
肥満は、本明細書中では体重疾患として定義される。いくつかの実施形態においては、肥満は、脂肪の形での過体重を記述する状態として定義することができる。肥満の治療的処置方法が提供されることに加えて、本発明によってはまた、肥満を処置する美容的方法も提供される。美容的処置方法には、脂肪の形の過剰な体重を有する被験体に対して、Ｃｃｄｃ８０遺伝子またはＣｃｄｃ８０タンパク質の発現または活性を調節する薬剤を投与する工程が含まれる。Ｃｃｄｃ８０遺伝子またはＣｃｄｃ８０タンパク質の発現または活性を調節する薬剤の、脂肪の形の過体重を減少させるための美容的製品としての薬剤の使用もまた提供される。さらに、肥満の美容的処置のための組成物、Ｃｃｄｃ８０遺伝子またはＣｃｄｃ８０タンパク質の発現または活性を調節する薬剤を含む組成物が提供される。
【００１２】
いくつかの実施形態においては、肥満を処置するために投与される薬剤は、Ｃｃｄｃ８０遺伝子の発現またはＣｃｄｃ８０タンパク質の発現もしくは活性を増大させる。いくつかの他の実施形態においては、肥満を処置するために投与される薬剤は、Ｃｃｄｃ８０遺伝子の発現またはＣｃｄｃ８０タンパク質の発現もしくは活性を妨げるか、あるいは低下させる。肥満を処置するために使用される薬剤は、Ｃｃｄｃ８０遺伝子の転写を妨げるかまたは低下させる薬剤であり得る。あるいは、肥満を処置するために使用される薬剤は、Ｃｃｄｃ８０ｍＲＮＡの翻訳を妨げるかまたは低下させる薬剤である場合もある。
【００１３】
Ｃｃｄｃ８０遺伝子の転写もしくはＣｃｄｃ８０ｍＲＮＡの翻訳の少なくとも一方を妨げるかまたは低下させる投与される抗肥満薬はポリヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態においては、このポリヌクレオチドはＲＮＡである。投与される抗肥満ＲＮＡは、例えば、Ｃｃｄｃ８０アンチセンスポリヌクレオチド（例えば、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ））、リボザイム、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。いくつかの他の実施形態においては、投与される抗肥満ＲＮＡは短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。
【００１４】
いくつかの実施形態においては、投与される抗肥満薬は短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。いくつかの実施形態においては、投与されるｓｈＲＮＡには配列番号３のＣｃｄｃ８０遺伝子配列に対して高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズする核酸配列が含まれる。投与される抗肥満ｓｈＲＮＡには、配列番号７の核酸配列が含まれる場合がある。いくつかの他の実施形態においては、投与される抗肥満ｓｈＲＮＡは、配列番号７に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれ以上同一である。
【００１５】
いくつかの実施形態においては、Ｃｃｄｃ８０遺伝子の転写もしくはＣｃｄｃ８０ｍＲＮＡの翻訳の少なくとも一方を妨げるかまたは低下させる抗肥満ポリヌクレオチドはＤＮＡである。いくつかのさらなる実施形態においては、抗肥満ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの細胞表面受容体もしくは細胞の抗原に結合するペプチドまたは抗体に連結させられる。
【００１６】
いくつかの他の実施形態においては、Ｃｃｄｃ８０遺伝子の発現またはＣｃｄｃ８０タンパク質の発現もしくは活性を妨げるかまたは低下させる抗肥満薬は、Ｃｃｄｃ８０タンパク質の活性を妨げるかまたは低下させる薬剤である。そのような抗肥満薬の一例は、Ｃｃｄｃ８０タンパク質に対する抗体である。
【００１７】
本発明によってはまた、脂質生成を調節する薬剤をスクリーニングする方法も提供される。この方法には、Ｃｃｄｃ８０遺伝子を発現する細胞を提供する工程；上記細胞を候補の薬剤と接触させる工程；そして候補の薬剤の細胞中のＣｃｄｃ８０遺伝子またはＣｃｄｃ８０タンパク質の発現または活性を調節する能力を評価する工程が含まれる。この発現または活性を調節する候補の薬剤が脂質生成を調節する薬剤である。いくつかの実施形態においては、候補の薬剤は、Ｃｃｄｃ８０遺伝子またはＣｃｄｃ８０タンパク質の発現または活性を直接調節するその能力が除外される。
【００１８】
本発明の別の態様は、肥満、インスリン耐性、または２型糖尿病から選択される状態の処置のための医薬品の製造におけるＣｃｄｃ８０遺伝子またはＣｃｄｃ８０タンパク質の発現または活性を調節する薬剤の使用に関する。この薬剤は、上記に記載されたように、例えば、化合物、タンパク質、ペプチド、抗体、アプタマー、またはポリヌクレオチドであり得る。
【００１９】
本発明のさらなる態様は、Ｃｃｄｃ８０遺伝子またはＣｃｄｃ８０タンパク質の発現または活性を調節する薬剤と薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物に関する。あるいは、Ｃｃｄｃ８０遺伝子またはＣｃｄｃ８０タンパク質の発現または活性を調節する薬剤は、Ｃｃｄｃ８０調節因子と本明細書中で呼ばれる場合がある。いくつかの実施形態においては、薬学的組成物中の薬剤は、上記に記載されたように、化合物、タンパク質、ペプチド、抗体、アプタマー、またはポリヌクレオチドであり得る。特定の実施形態においては、薬学的組成物中の薬剤はｓｈＲＮＡ、例えば、配列番号７の核酸配列を含むｓｈＲＮＡである。いくつかの実施形態においては、薬学的組成物中の薬剤は、配列番号７に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれ以上同一である。あるいは、本明細書中に記載されるように、ベクター（例えば、ｓｈＲＮＡを発現させるために使用されるレトロウイルスベクター）が本発明の組成物および方法において使用される場合もある。
【００２０】
別の態様は、肥満、インスリン耐性、または２型糖尿病から選択される状態に罹患している哺乳動物の処置のための方法であり、この方法には、治療有効量のＣｃｄｃ８０調節因子をそれが必要な哺乳動物に投与する工程が含まれる。
【００２１】
さらなる態様は、以下の工程を含むＣｃｄｃ８０受容体を同定する方法である：ａ）Ｃｃｄｃ８０受容体を含むと予想される脂肪細胞性の細胞に対してＣｃｄｃ８０ポリペプチドを提供する工程；ｂ）脂肪細胞性の細胞に対するＣｃｄｃ８０ポリペプチドの特異的結合を同定する工程；およびｃ）特異的結合の原因物質を単離する工程。
【００２２】
なおさらなる態様は、脂肪細胞性の細胞の増殖を低下させる方法であり、この方法には、脂肪細胞性の細胞を有効量のＣｃｄｃ８０調節因子と接触させる工程が含まれる。
【００２３】
さらなる態様は脂質の蓄積を減少させる方法であり、この方法には、脂肪細胞性の細胞を有効量のＣｃｄｃ８０調節因子と接触させる工程が含まれる。
【００２４】
別の態様は脂肪細胞性の細胞の脂質生成を減少させる方法であり、この方法には、脂肪細胞性の細胞を有効量のＣｃｄｃ８０調節因子と接触させる工程が含まれる。
【００２５】
さらなる態様は、哺乳動物中でのグルコース恒常性および／または脂質恒常性を調節する方法であり、この方法には、治療有効量のＣｃｄｃ８０抗体、Ｃｃｄｃ８０アンチセンス分子、またはＣｃｄｃ８０アンタゴニストをそれが必要な哺乳動物に投与する工程が含まれる。
【００２６】
別の態様は、以下の工程を含むＣｃｄｃ８０模倣物をスクリーニングする方法である：ａ）候補の模倣物とＣｃｄｃ８０ポリペプチドを提供する工程；およびｂ）候補の模倣物が、脂肪細胞性の細胞の中でのＣｃｄｃ８０ポリペプチド活性を評価するために設計されたアッセイにおいてＣｃｄｃ８０ポリペプチドと競合するかどうかを決定する工程。
【００２７】
さらなる態様は、以下の工程を含むＣｃｄｃ８０活性に影響を与える調節因子をスクリーニングする方法である：ａ）候補の調節因子とＣｃｄｃ８０ポリペプチドを提供する工程；およびｂ）候補の調節因子がＣｃｄｃ８０脂肪細胞活性を妨害するかまたは増強するかどうかを決定する工程。
【００２８】
本発明の他の目的と利点は、本明細書中以後の詳細な説明を参照すれば当業者に明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１−１】図１Ａは、正常なマウス組織：茶色の脂肪組織（ＢＡＴ）、脳、結腸、白色脂肪細胞（ＷＡＴ）、骨格筋（ＳｋＭ）、心臓、腎臓、肝臓、小腸（ＳＩ）、脾臓、および胃の中でのＣｃｄｃ８０ｍＲＮＡの組織分布を示している棒グラフである。図１Ｂは、増殖中の３Ｔ３−Ｌ１線維芽細胞（前脂肪細胞）および完全に分化した脂肪細胞の中でのマウスＣｃｄｃ８０ｍＲＮＡの発現を示している棒グラフである。図１Ｃは、餌を与えたマウスと絶食させた（２４時間）マウスの白色脂肪組織の中でのマウスＣｃｄｃ８０ｍＲＮＡの発現を示している棒グラフである。グラフは、２４時間絶食させたマウスにおけるＣｃｄｃ８０ｍＲＮＡの有意なダウンレギュレーションを示している。図１Ｄは、野生型マウスとｏｂ／ｏｂマウスの白色脂肪組織の中でのマウスＣｃｄｃ８０ｍＲＮＡの発現を示している棒グラフである。グラフは、野生型マウスと比較してｏｂ／ｏｂマウスの白色脂肪組織の中でのＣｃｄｃ８０ｍＲＮＡの有意なダウンレギュレーションを示している。図１Ｅは、賦形剤またはチアゾリジンジオン（ＴＺＤ）で処置したｏｂ／ｏｂマウスの白色脂肪組織中でのマウスＣｃｄｃ８０ｍＲＮＡの発現を示している棒グラフである。グラフは、ＴＺＤで処置した場合に図１Ｄに示されたＣｃｄｃ８０ｍＲＮＡの有意なアップレギュレーションを示している。
【図１−２】図１Ｆは、Ｃ５７ＢＩ／６Ｊマウスの精巣上体白色脂肪組織から単離された初代脂肪細胞または間質血管画分の中でのマウスＣＣＤＣ８０ｍＲＮＡの発現を示している棒グラフである。図１Ｇは、ヒトＣｃｄｃ８０ｍＲＮＡの組織分布を示している棒グラフである。
【図２】図２Ａは、ＦＬＡＧエピトープでタグが付けられたＣｃｄｃ８０（Ｃｃｄｃ８０−ＦＬＡＧ）をコードするプラスミドでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞からの全長Ｃｃｄｃ８０（約１４０ｋＤａ；矢印で示される）の分泌を示しているＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルである。馴化培地を銀染色によって分析した。Ｃｃｄｃ８０の同定は質量スペクトル分析によって確認した。図２Ｂは、全長のＣｃｄｃ８０（約１４０ｋＤａ、上の矢印）とＣｃｄｃ８０の切断断片（約９５ｋＤａと約５０ｋＤａ、それぞれ中央と下の矢印）の分泌を示しているウェスタンブロットである。抗ＦＬＡＧ  Ｍ２レジンでの免疫沈降前（Ｐｒｅ−ＩＰ）および後（Ｐｏｓｔ−ＩＰ）のＦＬＡＧタグ化バージョンのＣｃｄｃ８０（Ｃｃｄｃ８０−ＦＬＡＧ）を発現している２９３Ｔ細胞による馴化培地を、抗ＦＬＡＧ抗体を使用したウェスタンブロッティングによって分析した。図２Ｃは、プロテアーゼ阻害剤の添加によりＣｃｄｃ８０の切断が部分的に妨げられたことを示しているウェスタンブロットである。Ｃｃｄｃ８０−ＦＬＡＧを発現している２９３Ｔ細胞を、プロテアーゼ阻害剤のカクテルの存在下で４８時間インキュベートした。これらの細胞による馴化培地を抗ＦＬＡＧ抗体を使用したウェスタンブロッティングによって分析した。図２Ｄは、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞によるＣｃｄｃ８０の分泌を示しているウェスタンブロットである。Ｃｃｄｃ８０−ＦＬＡＧを発現している２９３Ｔ細胞または３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞および脂肪細胞による馴化培地を、Ｃｃｄｃ８０を認識する抗体を使用したウェスタンブロットによって分析した。３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞は、全長のＣｃｄｃ８０（約１４０ｋＤａ）とＣｃｄｃ８０の切断断片（約５０ｋＤａ）を分泌する（矢印で示す）。
【図３】図３Ａは、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞の分化のプロトコールの模式図である。遺伝子発現は、矢印で示した分化の特定の段階（すなわち、増殖、増殖停止、クローン性増殖、および最終分化）の間に分析した。図３Ｂは、増殖、増殖停止、クローン性増殖、および最終分化の間の３Ｔ３−Ｌ１細胞の中でのＣｃｄｃ８０ｍＲＮＡ発現を示している棒グラフである。グラフは、Ｃｃｄｃ８０が分化の間に３ｔ３−Ｌ１細胞中でニ峰様式で発現されることを示している。図３Ｃは、増殖を停止した細胞（時間＝０時間）の中での、そして脂質生成誘導因子（デキサメタゾン、ＩＢＭＸ、およびインスリン）の添加により８時間、１６時間、および２４時間分化を誘導した際の、Ｃｃｄｃ８０ｍＲＮＡ発現を示している棒グラフである。グラフは、クローン性増殖の間のＣｃｄｃ８０の抑制を示している。図３Ｄは、Ｃｃｄｃ８０発現に対する脂質生成誘導因子の影響を示している棒グラフである。増殖を停止した３Ｔ３−Ｌ１細胞は未処理のままとしたか、または１種類以上の脂質生成誘導因子で９６時間処理した。Ｃｃｄｃ８０ｍＲＮＡ発現（パネルＢ〜Ｄ）をリアルタイムＰＣＲによって測定した（１グループあたりｎ＝３）。
【図４】図４Ａは、Ｃｃｄｃ８０ｍＲＮＡ発現に対するＲＮＡ干渉によるＣｃｄｃ８０のサイレンシングの影響を示している棒グラフである。非サイレンシングｓｈＲＮＡをコードするレトロウイルス（白色の棒）またはマウスＣｃｄｃ８０に対するｓｈＲＮＡ（黒色の棒）を形質導入した安定な３Ｔ３−Ｌ１細胞株を作製した。Ｃｃｄｃ８０発現は、増殖、増殖停止、クローン性増殖、および最終分化の間にリアルタイムＰＣＲによって決定した。＊非サイレンシングｓｈＲＮＡに対してｐ＜０．０５。グラフは、ＲＮＡ干渉によるＣｃｄｃ８０のサイレンシングによりＣｃｄｃ８０ｍＲＮＡレベルが著しく低下したことを示している。図４Ｂは、Ｃｃｄｃ８０の分泌に対するＲＮＡ干渉によるＣｃｄｃ８０のサイレンシングの影響を示しているウェスタンブロットである。増殖を停止した、最終分化した３Ｔ３−Ｌ１による馴化培地を、Ｃｃｄｃ８０を認識する抗体を使用したウェスタンブロッティングによって分析した。最終分化した脂肪細胞による馴化培地中の全長のＣｃｄｃ８０（約１４０ｋＤａ）とＣｃｄｃ８０の切断断片（約５０ｋＤａ）を矢印で示す。グラフは、ＲＮＡ干渉によるＣｃｄｃ８０のサイレンシングによりタンパク質の分泌が顕著に鈍くなったことを示している。図４Ｃは、脂質生成、代謝、およびシグナル伝達に関与している遺伝子のｍＲＮＡ発現プロフィールの棒グラフである。試料は、マウスのゲノムマイクロアレイを使用した分化プロトコールの最後に分析した。＊非サイレンシングｓｈＲＮＡに対してｐ＜０．０５。図４Ｄは、分化の間の脂質生成マーカーの正規化されたｍＲＮＡ発現レベルの棒グラフである。ａＰ２、Ｃ／ＥＢＰα、およびＰＰＡＰγの発現を、増殖、増殖停止、クローン性増殖、および最終分化の間にリアルタイムＰＣＲによって決定した。＊非サイレンシングｓｈＲＮＡに対してｐ＜０．０５。図４Ｅは、インスリンによるＡｋｔおよびＥＲＫの活性化を示しているウェスタンブロットである。血清欠乏３Ｔ３−Ｌ１細胞は未処理のままとしたか、またはインスリン（１０ｍＭ）で１０分間処理した。細胞溶解物をウェスタンブロッティングによって分析した。Ｓｅｒ４７３でのＡｋｔとＴｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４でのＥＲＫ１／２のリン酸化を、リン酸特異的抗体を使用して決定した。ＡｋｔとＥＲＫ１／２の全レベルもまた示す。
【図５】図５Ａは、５００、１０００、または２０００のＭＯＩでアデノウイルスに感染させた３Ｔ３−Ｌ１細胞中でのリアルタイムＰＣＲによって決定したＣｃｄｃ８０ｍＲＮＡ発現を示している棒グラフである。＊Ａｄ−ＬａｃＺに対してｐ＜０．０５。３Ｔ３−Ｌ１細胞を、ＬａｃＺ（Ａｄ−ＬａｃＺ、白色の棒）またはマウスＣｃｄｃ８０（Ａｄ−Ｃｃｄｃ８０、黒色の棒）のいずれかをコードするアデノウイルスに、様々な感染多重度（ＭＯＩ）で感染させた。図５Ｂは、Ｃｃｄｃ８０の分泌を示しているウェスタンブロットである。増殖を停止し、最終分化した、２０００のＭＯＩでアデノウイルスに感染させた３Ｔ３−Ｌ１による馴化培地を、Ｃｃｄｃ８０を認識する抗体を使用したウェスタンブロッティングによって分析した。増殖を停止し、最終分化した脂肪細胞からの馴化培地中の全長のＣｃｄｃ８０（約１４０ｋＤａ）とＣｃｄｃ８０の切断断片（約５０ｋＤａおよび約２５ｋＤａ）を矢印で示す。図５Ｃは、脂質生成マーカーの正規化されたｍＲＮＡ発現を示している棒グラフである。ａＰ２、Ｃ／ＥＢＰα、およびＰＰＡＲγの発現を、１０００または２０００のＭＯＩでアデノウイルスに感染させた３Ｔ３−Ｌ１細胞の中で、リアルタイムＰＣＲによって決定した。＊Ａｄ−ＬａｃＺに対してｐ＜０．０５。
【００３０】
図５Ｄは、分化の間の脂質生成マーカーの誘導を示している棒グラフである。ａＰ２、Ｃ／ＥＢＰα、およびＰＰＡＲγの発現を、増殖、増殖停止、クローン性増殖、および最終分化の間に、２０００のＭＯＩでアデノウイルスに感染させた３Ｔ３−Ｌ１細胞中で、リアルタイムＰＣＲによって決定した。＊Ａｄ−ＬａｃＺに対してｐ＜０．０５。
【図６】図６Ａは、Ｗｎｔ／β−カテニン経路の構成要素の正規化されたｍＲＮＡ発現レベルを示している棒グラフである。非サイレンシングｓｈＲＮＡ（白色の棒）またはマウスＣｃｄｃ８０に対するｓｈＲＮＡ（黒色の棒）をコードするレトロウイルスを形質導入した安定な３Ｔ３−Ｌ１細胞株を作製し、これらの実験で使用した。遺伝子発現を低密度アレイを使用したリアルタイムＰＣＲによって決定した。＊非サイレンシングｓｈＲＮＡに対してｐ＜０．０５。図６Ｂは、ＴＣＦ／ＬＥＦ転写因子の正規化されたｍＲＮＡ発現レベルを示している棒グラフである。非サイレンシングｓｈＲＮＡ（白色の棒）またはマウスＣｃｄｃ８０に対するｓｈＲＮＡ（黒色の棒）をコードするレトロウイルスを形質導入した安定な３Ｔ３−Ｌ１細胞株を作製し、これらの実験で使用した。遺伝子発現を低密度アレイを使用したリアルタイムＰＣＲによって決定した。＊非サイレンシングｓｈＲＮＡに対してｐ＜０．０５。図６Ｃは、Ｗｎｔ／β−カテニン標的を示している棒グラフである。非サイレンシングｓｈＲＮＡ（白色の棒）またはマウスＣｃｄｃ８０に対するｓｈＲＮＡ（黒色の棒）をコードするレトロウイルスを形質導入した安定な３Ｔ３−Ｌ１細胞株を作製し、これらの実験で使用した。遺伝子発現を低密度アレイを使用したリアルタイムＰＣＲによって決定した。＊非サイレンシングｓｈＲＮＡに対してｐ＜０．０５。
【図７】図７Ａは、クローン性増殖の間のサイクリンＤ１抑制を示している棒グラフである。サイクリンＤ１発現は、非サイレンシングｓｈＲＮＡ（白色の棒）またはマウスＣｃｄｃ８０に対するｓｈＲＮＡ（黒色の棒）をコードするレトロウイルスが安定に形質導入された３Ｔ３−Ｌ１の中で［ノックダウン；グラフの左側の部分］、あるいは、２０００のＭＯＩのＬａｃＺ（Ａｄ−ＬａｃＺ、白色の棒）またはマウスＣｃｄｃ８０（Ａｄ−Ｃｃｄｃ８０、黒色の棒）のいずれかをコードするアデノウイルスに感染させられた３Ｔ３−Ｌ１の中で［過剰発現；グラフの右側部分］、リアルタイムＰＣＲによって決定した。データは、増殖停止からクローン性増殖までのサイクリンＤ１発現の変化率（％）として示される。＊非サイレンシングｓｈＲＮＡに対してｐ＜０．０５。図７Ｂは、クローン性増殖の間のＴＯＰＦＬＡＳＨレポーター活性を示している棒グラフである。非サイレンシングｓｈＲＮＡ（白色の棒）またはマウスＣｃｄｃ８０に対するｓｈＲＮＡ（黒色の棒）をコードするレトロウイルスが安定に形質導入された３Ｔ３−Ｌ１を、ＴＯＰＦＬＡＳＨレポータープラスミドでトランスフェクトした。ルシフェラーゼ活性を、増殖を停止した細胞（時間＝０時間）の中で、脂質生成誘導因子（デキサメタゾン、ＩＭＢＸ、およびインスリン）の添加による２４時間、４８時間、および９６時間の分化の誘導について測定した。図７Ｃは、ＴＯＰＦＬＡＳＨレポーター活性を示している棒グラフである。β−カテニンタンパク質の発現をグラフの上部に示す。ＧＦＰ（Ａｄ−ＧＦＰ、白色の棒）またはヒトＣｃｄｃ８０（Ａｄ−Ｃｃｄｃ８０、黒色の棒）のいずれかをコードするアデノウイルスに、１００、２５０、および５００のＭＯＩで感染させたＨｅｐＧ２細胞を、ＴＯＰＦＬＡＳＨレポータープラスミドでトランスフェクトした。β−カテニンタンパク質の発現とルシフェラーゼ活性を２４時間後に測定した。図７Ｄは、それによりＣｃｄｃ８０が脂質生成を調節する、提案されている機構の模式図である。前脂肪細胞は、増殖停止に到達するとＣｃｄｃ８０を高いレベルで発現し、これは、クローン性増殖の間のＷｎｔ／β−カテニングシグナル伝達、およびそれに続くＣ／ＥＢＰαとＰＰＡＲγの誘導／活性化、そして最終分化の間の脂質の蓄積の効率的な抑制に必要である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
配列の簡単な説明
配列番号１は正方向Ｃｃｄｃ８０プライマーである。
【００３２】
配列番号２は逆方向Ｃｃｄｃ８０プライマーである。
【００３３】
配列番号３は、マウスＣｃｄｃ８０に対する短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする。
【００３４】
配列番号４は、標的である２２塩基長の配列のヌクレオチドアラインメント／ＢＬＡＳＴによって決定された、いずれの既知の哺乳動物遺伝子とも一致しない非サイレンシングｓｈＲＮＡをコードする。
【００３５】
配列番号５はＣｃｄｃ８０ペプチドである。
【００３６】
配列番号６はＣｃｄｃ８０ペプチドである。
【００３７】
配列番号７はマウスＣｃｄｃ８０に対する短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。
【００３８】
配列番号７は上記配列番号３によってコードされる。
【００３９】
（発明の詳細な説明）
出願人らは、本開示の中で引用された全ての参考文献の内容全体を具体的に組み込む。さらに、量、濃度、または他の値もしくはパラメーターが、範囲、好ましい範囲、または最大の好ましい値と最少の好ましい値の列挙のいずれかとして与えられる場合には、これらの範囲が別々に開示されているかどうかとは無関係に、これはいずれかの最大範囲限界または好ましい値と、いずれかの最少範囲限界または好ましい値の任意の対によって形成されるあらゆる範囲を具体的に開示していると理解される。数値範囲が本明細書中に記載される場合には、他の場所に明記されない限りは、この範囲はその端点と、その範囲内にあるあらゆる整数および端数を含むように意図される。本発明の範囲は範囲を定義する際に記載された特定の値に限定されるようには意図されない。
【００４０】
本発明の実施では、他の場所に明記されない限りは、当業者の能力の範囲内にある細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組み換えＤＮＡ、および免疫学の従来技術が使用されるであろう。そのような技術は文献の中で完全に説明されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ、およびＭａｎｉａｔｉｓ編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９８９）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；米国特許第４，６８３，１９５号；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１５４巻および第１５５巻（Ｗｕらｅｄｓ．）、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ、（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８６）を参照のこと。
【００４１】
Ｃｃｄｃ８０はアディポカインと一致する様式で発現され、調節される。マウスＣｃｄｃ８０とヒトＣｃｄｃ８０はいずれも白色脂肪組織の中で優先的に発現される。マウスＣｃｄｃ８０ｍＲＮＡは間質細胞と比較して脂肪細胞中でより高いレベルで発現され、脂肪細胞の分化の間にアップレギュレートされる。白色脂肪組織中でのＣｃｄｃ８０の発現は絶食させられると有意に低下し、肥満および２型糖尿病の遺伝モデルであるｏｂ／ｏｂマウスにおいても低下する。ｏｂ／ｏｂマウスのインスリン感受性のある薬剤であるロシグリタゾンでの処置は、マウスの糖尿病を改善し、またＣｃｄｃ８０もアップレギュレートする。この発現と調節のパターンは、代謝疾患におけるＣｃｄｃ８０の役割を示唆している。文献においてこれまでに報告されていることとは対照的に、ヒトＣｃｄｃ８０は培地中に効率よく分泌され得、これはヒトにおけるアディポカインとしてのＣｃｄｃ８０の作用と一致する。
【００４２】
３Ｔ３−Ｌ１細胞中での、マウスＣｃｄｃ８０に対するｓｈＲＮＡの安定したレトロウイルス発現によるＣｃｄｃ８０発現の低下は、前脂肪細胞の増殖を増加させ、それらの成熟脂肪細胞への転化を減少させた。
【００４３】
さらに、増強されたＣｃｄｃ８０の過剰発現は脂質生成を阻害できる。
【００４４】
Ｉ．定義
本開示の状況においては、当然多数の用語が利用されるであろう。
【００４５】
本明細書中で使用される場合は、用語「約」または「およそ」は、提供される値または範囲の２０％以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内を意味する。
【００４６】
「脂肪細胞性の細胞」には、前脂肪細胞、脂肪細胞、間葉系幹細胞、胚幹細胞、および胎児線維芽細胞が含まれる。
【００４７】
用語「脂質生成」は、本明細書中で使用される場合は、脂肪の生産、脂肪の蓄積、脂肪細胞の分化による新しい脂肪細胞の作製、または炭水化物もしくはタンパク質から脂肪への変換をいう。
【００４８】
用語「アディポカイン」は、本明細書中で使用される場合は、自己分泌、傍分泌、および／または内分泌機能を有している脂肪組織から分泌されたタンパク質をいう。
【００４９】
「抗体」には、抗原上に存在するエピトープに結合できる免疫グロブリン分子が含まれる。本明細書中で使用される場合は、この用語には、モノクローナル抗体やポリクローナル抗体のような完全な免疫グロブリン分子だけではなく、必要な特異性の抗原認識部位を含む、抗イディオタイプ抗体、変異体、断片、融合タンパク質、二重特異的抗体、ヒト化タンパク質、および免疫グロブリン分子の修飾物も含まれる。
【００５０】
用語「Ｃｃｄｃ８０」または「コイルド−コイルドメイン含有８０」は、本明細書中では、その別名であるＵＲＢ、ＤＲＯ１、ＳＳＧ１、およびＥＱＵＡＲＩＮと互換的に使用される。Ｃｃｄｃ８０配列についての例示的なＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）登録番号としては以下が挙げられる：ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ、ＮＭ＿１９９５１１）、マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ、ＮＭ＿０２６４３９）、ラット（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、ＮＭ＿０２２５４３）、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ、ＮＭ＿２０４４３１）。
【００５１】
用語「ｃＤＮＡ」には、逆転写酵素のような酵素を用いてｃＤＮＡにされた、細胞または有機体の中に存在するｍＲＮＡ分子である相補性ＤＮＡが含まれる。「ｃＤＮＡライブラリー」には、酵素である逆転写酵素でｃＤＮＡに変換され、その後、ベクターに挿入された、細胞または有機体の中に存在するｍＲＮＡ分子の集合体が含まれる。その後、ライブラリーは、目的の特異的ｃＤＮＡ（ひいてはｍＲＮＡ）でプローブすることができる。
【００５２】
本明細書中で使用される場合は、Ｃｃｄｃ８０「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」には、Ｃｃｄｃ８０以外のポリペプチドに動作可能であるように連結されたＣｃｄｃ８０ポリペプチドが含まれる。「Ｃｃｄｃ８０ポリペプチド」は、Ｃｃｄｃ８０ポリペプチドに対応するアミノ酸配列を有しているポリペプチドをいい、一方、「Ｃｃｄｃ８０以外のポリペプチド」は、Ｃｃｄｃ８０タンパク質と実質的に相同ではないタンパク質（例えば、Ｃｃｄｃ８０とは異なるタンパク質、および同じ有機体または異なる有機体に由来するタンパク質）に対応するアミノ酸配列を有しているポリペプチドをいう。Ｃｃｄｃ８０融合タンパク質の中では、Ｃｃｄｃ８０ポリペプチドは、Ｃｃｄｃ８０タンパク質全体、またはＣｃｄｃ８０タンパク質の一部に対応し得る。好ましい実施形態においては、Ｃｃｄｃ８０融合タンパク質には、Ｃｃｄｃ８０タンパク質の少なくとも１つの生物学的活性部分が含まれる。融合タンパク質の中では、用語「動作可能であるように連結された」は、Ｃｃｄｃ８０ポリペプチドとＣｃｄｃ８０以外のポリペプチドが互いにインフレームで融合されていることを示すように意図される。Ｃｃｄｃ８０以外のポリペプチドは、Ｃｃｄｃ８０ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合させることができる。
【００５３】
ＤＮＡ「コード配列」は、適切な調節配列の制御下に置かれた場合に、インビトロまたはインビボで細胞中でポリペプチドに転写され、翻訳される二本鎖のＤＮＡ配列である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端では開始コドン、そして３’（カルボキシル）末端では翻訳停止コドンによって決定される。コード配列としては、原核生物配列、真核生物のｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳動物）のＤＮＡに由来するゲノムＤＮＡ配列、さらには合成ＤＮＡ配列を挙げることができるが、これらに限定されない。コード配列が真核生物細胞中での発現のために意図される場合には、ポリアデニル化シグナルと転写終結配列が、通常はコード配列の３’に配置されるであろう。
【００５４】
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似する側鎖を有しているアミノ酸残基で置き換えられている置換である。類似する側鎖を有しているアミノ酸残基のファミリーは当該分野で定義されており、これには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、電荷を持たない極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。したがって、Ｃｃｓｃ８０ポリペプチド中の非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーに由来する別のアミノ酸残基で置き換えられることが好ましい。
【００５５】
用語「有効量」、「治療有効量」、および「有効投与量」は、本明細書中で使用される場合は、必要としている哺乳動物に投与された場合に、例えば、肥満、インスリン耐性、および／または２型糖尿病に関連する状態を少なくとも部分的に改善するために有効であり、そして／あるいは、例えば、グルコース濃度および／または脂質恒常性を少なくとも部分的に調節するために有効である、分子の量をいう。
【００５６】
本明細書中で使用される場合は、用語「発現」には、それによって遺伝子がｍＲＮＡに転写されるプロセスが含まれる。本明細書中で使用される場合は、用語「発現」にはまた、それによってｍＲＮＡがアミノ酸配列へと翻訳されるプロセスも含まれる。本明細書中で使用される場合は、用語「発現」にはさらに、それによってポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写され、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質へと翻訳されるプロセスが含まれる。本明細書中で使用される場合は、表現「Ｃｃｄｃ８０遺伝子またはＣｃｄｃ８０タンパク質の発現または活性を調節する」は、ｍＲＮＡもしくはポリペプチドのレベルの増大または低下、さらには、タンパク質活性の増大または低下が含まれるように意図される。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡから導かれる場合には、発現には、適切な真核生物宿主が選択された際のｍＲＮＡのスプライシングが含まれる場合がある。発現に必要な調節エレメントには、ＲＮＡポリメラーゼに結合するためのプロモーター配列と、リボソーム結合のための転写開始配列が含まれる。例えば、細菌発現ベクターには、ｌａｃプロモーターのようなプロモーター、転写開始のためのシャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列、そして開始コドンＡＵＧが含まれる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．、ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９）。同様に、真核生物発現ベクターには、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのための異種もしくは同種プロモーター、下流のポリアデニル化シグナル、開始コドンＡＵＧ、およびリボソームの離脱のための終結コドンが含まれる。そのようなベクターは商業的に入手することができ、また、当該分野で周知の方法（例えば、例えば、ベクターの構築について以下に一般的に記載される方法）に記載される配列によって組み立てることもできる。
【００５７】
用語「発現構築物」は、ＲＮＡ（例えば、下流の目的の遺伝子またはコード領域（例えば、タンパク質をコードするｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ断片、または目的の任意のＲＮＡ）に動作可能であるように連結された少なくとも１つのプロモーターを含む構築物）を転写するように設計された任意の二本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＲＮＡを意味する。発現構築物のレシピエント細胞へのトランスフェクションまたは形質転換は、細胞が発現構築物によってコードされるＲＮＡまたはタンパク質を発現することを可能にする。発現構築物は、遺伝子操作されたプラスミド、ウイルス、または、例えば、バクテリオファージ、アデノウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、もしくはヘルペスウイルスから導かれた人工染色体であり得る。発現構築物は生存している細胞の中で複製させることができ、また、合成によって作製することもできる。この適用の目的については、用語「発現構築物」、「発現ベクター」、「ベクター」、および「プラスミド」は、本発明の適用を一般的な例示の意味で説明するために互換的に使用され、本発明を特定のタイプの発現構築物に限定するようには意図されない。さらに、用語発現構築物またはベクターは、アッセイに利用される細胞にそのようなＤＮＡ配列がすでに内生的に含まれている事例も含むように意図される。
【００５８】
「遺伝子」には、転写、翻訳された後に特定のポリペプチドまたはタンパク質をコードすることができる、少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドが含まれる。本明細書中に記載される任意のポリヌクレオチド配列は、それらが会合する遺伝子のより大きな断片または全長のコード配列を同定するために使用することができる。より大きな断片配列を単離する方法は当該分野で公知であり、そのいくつかは本明細書中に記載される。
【００５９】
用語「遺伝子修飾された」には、外来遺伝子もしくは核酸配列を含むおよび／または発現する細胞が含まれ、外来遺伝子はそれにより、細胞もしくはその子孫の遺伝子型または表現形を修飾する。この用語には、細胞の内因性ヌクレオチドに対する任意の付加、欠失、または破壊が含まれる。
【００６０】
用語「遺伝子産物」は、本明細書中で使用される場合には、他の場所に明記されない限りは、遺伝子が転写または翻訳された場合にその遺伝子によって生産される生成物をいう。「遺伝子産物」は、特異的な遺伝子座から導かれた任意の転写または翻訳産物であり得る。典型的には、この用語は、例えば、メッセンジャーＲＮＡのような核酸、またはタンパク質もしくはポリペプチドをいう。「遺伝子産物」には、遺伝子が転写され、翻訳された場合に作製されたアミノ酸配列（例えば、ペプチドまたはポリペプチド）が含まれる。
【００６１】
用語「異種」は、自然界には存在しないエレメントの組み合わせをいう。例えば、異種ＤＮＡは、自然な状態では細胞中には、または細胞の染色体部位には存在しないＤＮＡをいう。好ましくは、異種ＤＮＡには細胞に対して外来物である遺伝子が含まれる。異種発現調節エレメントは、自然界においてそれが動作可能であるように会合するもの以外の別の遺伝子と動作可能であるように会合させられたそのようなエレメントである。
【００６２】
用語「同種」は、本明細書中で使用される場合は、２つの重合体分子の間（例えば、２つの核酸分子間、例えば、２つのＤＮＡ分子または２つのＲＮＡ分子間、あるいは、２つのポリペプチド分子間）での配列類似性をいう。２つの分子の両方の中でヌクレオチドまたはアミノ酸位置が同じ単量体ヌクレオチドまたはアミノ酸によって占められている場合、例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれの中の１つの位置がアデニンに占められている場合は、これらはその位置で相同である。２つの配列間の相同性は、一致しているかまたは相同である位置の数の一次関数であり、例えば、２つの複合物の中の位置のうちの半分（例えば、ポリマーの１０個のサブユニットの長さのうちの５つの位置）が相同である場合には、２つの配列は５０％相同であり、位置のうちの９０％（例えば、１０のうちの９）が一致しているかまたは相同である場合には、２つの配列は９０％の相同性がある。例として、ＤＮＡ配列５’ＡＴＴＧＣＣ３’と５’ＴＡＴＧＣＧ３’は５０％の相同性がある。用語「実質的に相同」は、本明細書中で使用される場合は、所望される核酸に対して約５０％相同である、別の実施形態においては約６０％相同である、別の実施形態においては約７０％相同である、別の実施形態においては約８０％相同である、別の実施形態においては約８５％相同である、別の実施形態においては約９０％相同である、別の実施形態においては約９５％相同であるＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。
【００６３】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一性の割合（％）を決定するためには、配列が最適比較の目的のためにアラインメントされる（例えば、ギャップを、最適なアラインメントのために第１と第２のアミノ酸もしくは核酸配列のうちの一方または両方に導入することができる）。好ましい実施形態においては、比較の目的のためにアラインメントされる参照配列の長さは、参照配列の長さのうちの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、なおより好ましくは少なくとも６０％、そしてなおさらに好ましくは少なくとも７０％、８０％、または９０％である。その後、対応する位置にある残基が比較され、一方の配列の中の１つの位置が他方の配列の中の対応する位置と同じ残基によって占められている場合には、これらの分子はその位置で同一である。したがって、２つの配列間の同一性の割合（％）は、２つの配列が共有する同一である位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一である位置の数／位置の総数×１００）。２つの配列間での同一性の割合（％）は、２つの配列の最適アラインメントのために導入されたギャップの数、各ギャップ長を考慮した、これらの配列が共有する同一である位置の数の関数である。
【００６４】
２つの配列間での配列の比較と同一性の割合（％）の決定は、数学的アルゴリズムを使用して行うことができる。配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの限定ではない例は、Ｋａｒｌｉｎ  ＳおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−７７（１９９３）の中で改良されたＫａｒｌｉｎ  ＳおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−６８（１９９０）のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０（１９９０）のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラムスコア＝１００、ワード長＝１２を用いて行うことができ、相同ヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて行うことができ、本発明のタンパク質分子と相同であるアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためのギャップが入ったアラインメントを得るためには、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７）に記載されているように利用することができる。ＢＬＡＳＴプログラムとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合は、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴとＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを使用することができる。配列比較のために利用される別の好ましい限定ではないアルゴリズムは、Ｍｙｅｒｓ  ＥＷおよびＭｉｌｌｅｒ  Ｗ、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．４：１１−１７（１９８８）のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合は、ＰＡＭ１２０重量残基表、１２のギャップ長ペナルティー、および４のギャップペナルティーを使用することができる。
【００６５】
タンパク質配列のアラインメントに利用される数学的アルゴリズムの別の限定ではない例は、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎアルゴリズム（Ｌｉｐｍａｎ  ＤＪおよびＰｅａｒｓｏｎ  ＷＲ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２７：１４３５−４１（１９８５））である。Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎアルゴリズムを使用する場合は、ＰＡＭ２５０重量残基表、１２のギャップ長ペナルティー、４のギャップペナルティー、および２のＫｕｔｐｌｅを使用することができる。核酸配列のアラインメントに利用される数学的アルゴリズムの好ましい限定ではない例は、Ｗｉｌｂｕｒ−Ｌｉｐｍａｎアルゴリズム（Ｗｉｌｂｕｒ  ＷＪおよびＬｉｐｍａｎ  ＤＪ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：７２６−３０（１９８３））である。Ｗｉｌｂｕｒ−Ｌｉｐｍａｎアルゴリズムを使用する場合は、２０のウィンドウ、３のギャップペナルティー、３のＫｔｕｐｌｅを使用することができる。Ｌｉｐｍａｎ−ＰｅａｒｓｏｎアルゴリズムとＷｉｌｂｕｒ−Ｌｉｐｍａｎアルゴリズムはいずれも、例えば、ＤＮＡＳＴＡＲ配列分析ソフトウェアパッケージの一部であるＭＥＧＡＬＩＧＮプログラム（例えば、バージョン３．１．７）に組み込まれている。
【００６６】
配列分析のためのさらなるアルゴリズムは当該分野で公知であり、これには、Ｔｏｒｅｌｌｉ  ＡおよびＲｏｂｏｔｔｉ  ＣＡ、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１０：３−５（１９９４）に記載されているＡＤＶＡＮＣＥおよびＡＤＡＭ、ならびに、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＷＲおよびＬｉｐｍａｎ  ＤＪ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４−４８（１９８８）に記載されているＦＡＳＴＡが含まれる。
【００６７】
１つの実施形態においては、２つのアミノ酸配列間の同一性の割合（％）は、ＧＣＧソフトウェアパッケージの中のＧＡＰプログラムを使用し、Ｂｌｏｓｕｍ  ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれかと、１６、１４、１２、１０、８、６、４、もしくは２のギャップ重量、および１、２、３、４、５、もしくは６の長さ重量（ｌｅｎｇｔｈ  ｗｅｉｇｈｔ）を使用して決定される。なお別の実施形態においては、２つのヌクレオチド配列間の同一性の割合（％）は、ＧＣＧソフトウェアパッケージの中のＧＡＰプログラムを使用し、ＮＷＳｇａｐｄｎａ、ＣＭＰマトリックス、および４０、５０、６０、７０、もしくは８０のギャップ重量、および１、２、３、４、５、もしくは６の長さ重量を使用して決定される。
【００６８】
タンパク質のアラインメントもまた、Ｇｅｎｅｗｏｒｋｓグローバルタンパク質アラインメントプログラム（例えば、バージョン２．５．１）を使用して、５に設定された開放ギャップに対するコスト、５に設定された伸張されたギャップに対するコスト、４に設定された最小対角長（ｍｉｎｉｍｕｍ  ｄｉａｇｏｎａｌ  ｌｅｎｇｔｈ）、１３０に設定された最大対角オフセット（ｍａｘｉｍｕｍ  ｄｉａｇｏｎａｌ  ｏｆｆｓｅｔ）、５０％に設定されたコンセンサスカットオフを用い、そしてＰａｍ  ２５０マトリックスを利用して行うことができる。
【００６９】
「宿主細胞」は、ベクターの、あるいは、外因性の核酸分子、ポリヌクレオチド、および／またはタンパク質の取り込みのためレシピエントであり得るかもしくはベクターのレシピエントである、任意の個々の細胞または細胞培養物を含むように意図される。これはまた、単一細胞の子孫を含むようにも意図される。子孫は、自然な、偶発的な、または意図的な変異が原因でもともとの親細胞と（形態学的に、またはゲノム成分もしくは全ＤＮＡ成分において）完全に同じである必要がない場合がある。細胞は原核生物のものである場合も、真核生物のものである場合もあり、これには細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、動物細胞、および哺乳動物細胞（例えば、マウス、ラット、サル、またはヒトの細胞）が含まれるが、これらに限定されない。
【００７０】
「ハイブリダイゼーション」には、ヌクレオチド残基の塩基間での水素結合によって安定化される複合体を形成するように１つ以上のポリヌクレオチドが反応する反応が含まれる。水素結合は、ワトソンクリック（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ）塩基対形成、Ｈｏｏｇｓｔｅｉｎ結合、または任意の他の配列特異的様式により起こり得る。複合体には、二本鎖構造を形成する２本の鎖、多重鎖複合体を形成する３本以上の鎖、自己ハイブリダイズする１本の鎖、またはこれらの任意の組み合わせが含まれ得る。ハイブリダイゼーション反応は、ＰＣＲ反応の開始またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素的切断のような、より大規模なプロセスの中の１つの工程を構成する場合がある。
【００７１】
ハイブリダイゼーション反応は、異なる「ストリンジェンシー」の条件下で実施され得る。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーには、任意の２つの核酸分子が互いにハイブリダイズするであろう難しさが含まれる。ストリンジェントな条件下では、互いに少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上同一である核酸分子は互いにハイブリダイズしたままであり、一方、同一性の割合が低い分子はハイブリダイズしたままではいられない。より高いストリンジェントのハイブリダイゼーション条件の好ましい限定ではない例は、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）の中での約４５℃でのハイブリダイゼーション、その後の、５０℃、好ましくは５５℃、より好ましくは６０℃、なおさらに好ましくは６５℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中での１回以上の洗浄である。
【００７２】
ハイブリダイゼーションが２つの一本鎖ポリヌクレオチド間の逆平行の配置で起こる場合は、この反応は「アニーリング」と呼ばれ、これらのポリヌクレオチドは「相補的」であると記載される。ハイブリダイゼーションが、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドの鎖の１つの間で起こり得るならば、二本鎖ポリヌクレオチドは、別のポリヌクレオチドと「相補的」または「相同」であり得る。「相補性」または「相同性」（１つのポリヌクレオチドが別のポリヌクレオチドと相補である程度）は、一般的に許容される塩基対形成の規則に従って互いに水素結合を形成すると考えられる向かい合っている鎖の中の塩基の割合という点で定量可能である。
【００７３】
本明細書中で使用される場合は、用語「単離された」は、言及される材料がそれが通常見られる環境から取り出されていることを意味する。したがって、単離された生物材料には、細胞性の成分、すなわち、その材料が見られるかまたは生産される細胞の成分は含まれ得ない。核酸分子の場合には、単離された核酸としては、例えば、ＰＣＲ産物、単離されたｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、または制限断片が挙げられる。別の実施形態においては、単離された核酸は、好ましくは、それがその中に見られ得る染色体から切り出され、より好ましくは、非調節領域、調節領域に対して、あるいは、染色体内に見られる場合には、単離された核酸分子に含まれる遺伝子の上流または下流に存在する他の遺伝子にはもはや連結されていない。なお別の実施形態においては、単離された核酸は１つ以上のイントロンを欠く。単離された核酸分子には、プラスミド、コスミド、人工染色体などに挿入された配列が含まれる。したがって、特異的な実施形態においては、組み換え体核酸は単離された核酸である。単離されたタンパク質は、細胞の中でそれが会合する他のタンパク質もしくは核酸またはそれらの両方と、あるいはそれが膜会合タンパク質である場合には細胞膜と、会合させられ得る。単離された細胞小器官、細胞、または組織は、有機体の中で見られる解剖学的部位から取り出されている。単離された材料は精製することができるが、そうである必要はない。
【００７４】
用語「哺乳動物」は、ヒト、ヒト以外の霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、または他の家畜または実験用哺乳動物をいう。当業者は、１つの哺乳動物種において病状の重篤度を下げる治療が、別の種の哺乳動物についての治療効果の予測であることを理解する。
【００７５】
「Ｃｃｄｃ８０遺伝子またはＣｃｄｃ８０タンパク質の発現または活性を調節する薬剤」の場合の用語「調節する」は、この薬剤がこの発現もしくは活性を直接または間接的に調節することを意味する。本明細書中で使用される場合は、「Ｃｃｄｃ８０遺伝子またはＣｃｄｃ８０タンパク質の発現または活性を直接調節する薬剤」の場合の用語「直接調節する」は、この薬剤またはその誘導体が、Ｃｃｄｃ８０タンパク質もしくはＣｃｄｃ８０ポリヌクレオチド（例えば、遺伝子もしくは遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ）に直接結合するか、あるいは直接それらと相互作用し、それによってＣｃｄｃ８０タンパク質の機能的活性を阻害するかまたは刺激することを意味する。例えば、どの１つの理論にも束縛されることはないが、Ｃｃｄｃ８０タンパク質の機能的活性は、Ｃｃｄｃ８０タンパク質と直接相互作用する薬剤（例えば、中和Ｃｃｄｃ８０抗体または低分子）によって抑えられ得るか、または阻害され得る。別の例として、Ｃｃｄｃ８０ｍＲＮＡの翻訳は、Ｃｃｄｃ８０遺伝子の発現を特異的にサイレンシングさせるＣｃｄｃ８０特異的ＲＮＡｉ（例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））のような薬剤によって抑制され得るか、または低下させられ得る。いくつかの実施形態においては、薬剤は、Ｃｃｄｃ８０タンパク質、Ｃｃｄｃ８０ＲＮＡ、またはＣｃｄｃ８０遺伝子のプロモーターへの結合により「直接調節する」。
【００７６】
例えば、ロシグリタゾンは、実施例２に示されるように、Ｃｃｄｃ８０を調節する。しかし、ロシグリタゾンが薬物のチアゾリジンジオンクラスの抗糖尿病薬であり、同様の他のチアゾリジンジオンがペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）の細胞内受容体クラス、具体的には、ＰＰＡＲγに結合する（すなわち、ロシグリタゾンはＰＰＡＲγの選択的リガンドであり、ＰＰＡＲα結合作用は持たない）ので、これはＣｃｄｃ８０を直接には調節しない。
【００７７】
用語「調節する」には、標的分子に応じた活性の低下または増大のいずれかが含まれる。例えば、Ｃｃｄｃ８０調節因子は、そのようなＣｃｄｃ８０調節因子の存在がＣｃｄｃ８０活性の増大または低下を生じる場合には、Ｃｃｄｃ８０の活性を調節すると見なされる。本明細書中で使用される場合は、表現「Ｃｃｄｃ８０遺伝子またはＣｃｄｃ８０タンパク質の発現または活性を調節する」は、ｍＲＮＡもしくはポリペプチドのレベルの増大または低下、ならびに、タンパク質活性の増大または低下を含むように意図される。そのような増大または低下は、それが統計学的に有意であるという条件で、様々な大きさであり得る。例えば、統計学的に有意な変化、例えば、（化合物が存在しない条件で検出されるものと比較した）化合物の存在下でのＣｃｄｃ８０タンパク質活性レベルの低下または増大は、この化合物がＣｃｄｃ８０調節因子であることの指標である。増大または低下は、対照アッセイにおいて観察されるものと比較して様々な大きさであり得る。ｍＲＮＡもしくはポリペプチドレベルの低下、またはタンパク質活性の低下は、徹底的である場合も、部分的である場合もある。低下は、所定の細胞または細胞のタイプの中での参照レベルと比較して、徹底的である場合も部分的である場合もある。
【００７８】
本明細書中で使用される場合は、「自然界に存在している」核酸分子は、本来存在しているヌクレオチド配列（例えば、天然のタンパク質をコードする）を有しているＲＮＡまたはＤＮＡ分子をいう。
【００７９】
用語「動作可能であるように連結された」は、核酸分子（例えば、ＤＮＡ）と１つ以上の調節配列（例えば、プロモーターまたはその一部）が、適切な分子が調節配列に結合させられている場合に、核酸分子からのｍＲＮＡの転写を可能にするかまたは核酸分子の産物（すなわち、ポリペプチド）の発現を可能にする様式で連結されていることを意味する。融合構築物の中では、用語「動作可能であるように連結された」は、Ｃｃｄｃ８０ポリヌクレオチドとＣｃｄｃ８０以外のポリヌクレオチドが互いにインフレームで融合されていることを示すように意図される。Ｃｃｄｃ８０以外のポリヌクレオチドは、Ｃｃｄｃ８０ポリヌクレオチドの３’または５’に融合させることができる。
【００８０】
本明細書中で使用される場合は、用語「ポリヌクレオチド」と「オリゴヌクレオチド」は互換的に使用され、これらには、任意の長さのヌクレオチドの重合形態（デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれか）あるいはそれらのアナログが含まれる。ポリヌクレオチドは任意の三次元構造を有し、そして公知であるかまたは明らかになっていない任意の機能を果たし得る。以下はポリヌクレオチドの限定ではない例である：遺伝子または遺伝子断片、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組み換え体ポリヌクレオチド、分岐を持つポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマー。ポリヌクレオチドには、修飾されたヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログが含まれ得る。存在する場合には、ヌクレオチド構造の修飾を、重合体の組み立ての前または後に行うことができる。ヌクレオチド配列には、ヌクレオチド以外の成分を割り込ませることができる。ポリヌクレオチドはさらに、重合の後に、例えば、標識成分との結合によって修飾される場合がある。この用語にはまた、二本鎖分子と一本鎖分子の両方が含まれる。他の場所に明記されるか、必要とされる場合を除き、ポリヌクレオチドである本発明の任意の実施形態には、二本鎖の形態と、二本鎖形態を組み立てることが知られているかまたは予想される２つの相補的な一本鎖の形態のそれぞれの両方が含まれる。
【００８１】
本明細書中で使用される場合は、用語「ｓｈＲＮＡ」は、短いヘアピンＲＮＡをいう。短いヘアピンＲＮＡは、ＲＮＡ干渉によって遺伝子発現をサイレンシングさせるために使用することができる堅固なヘアピンターンを作製するＲＮＡの配列である。本明細書中で使用される場合は、ｓｈＲＮＡを含む組成物またはｓｈＲＮＡの使用方法における用語「ｓｈＲＮＡ」は、ｓｈＲＮＡの上記組成物または方法、ならびに遺伝子発現を阻害するためのｓｈＲＮＡを発現するベクター（例えば、ウイルスベクター）での使用を含むように意図される。
【００８２】
用語「ｓｉＲＮＡ」は、本明細書中で使用される場合は、低分子干渉ＲＮＡをいい、短い干渉ＲＮＡまたはサイレンシングＲＮＡとして知られている場合もある。一般的には、これらの用語は特定の遺伝子の発現を妨害するＲＮＡ分子の１つのクラスをいう。
【００８３】
ポリヌクレオチドは、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）の４種類のヌクレオチド塩基の特異的な配列からなり、ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合はチミンはウラシル（Ｕ）である。したがって、用語「ポリヌクレオチド配列」は、ポリヌクレオチド分子のアルファベットでの提示である。
【００８４】
用語「ポリペプチド」には、２つ以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸アナログ、またはペプチド模倣物の化合物が含まれる。サブユニットはペプチド結合によって連結させられ得る。別の実施形態においては、サブユニットは他の結合（例えば、エステル結合、エーテル結合など）によって連結される場合がある。本明細書中で使用される場合は、用語「アミノ酸」には、自然界に存在しているおよび／または自然界には存在しないアミノ酸、あるいは合成のアミノ酸のいずれかが含まれ、これには、グリシン、そしてＤまたはＬ光学異性体の両方、ならびにアミノ酸アナログおよびペプチド模倣物が含まれる。３個以上のアミノ酸のペプチドは、一般にオリゴペプチドと呼ばれる。３個以上よりも長いアミノ酸のペプチド鎖は、ポリペプチドまたはタンパク質と呼ばれる。
【００８５】
「プライマー」には、標的とハイブリダイズし、その後、標的に相補的なポリヌクレオチドの重合を促進することによって目的の試料中に存在する標的または「鋳型」に結合する遊離の３’−ＯＨ基を通常持つ、短いポリヌクレオチドが含まれる。「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）は、標的ポリヌクレオチドの複製コピーが「上流」プライマーと「下流」プライマーからなる「プライマーの対」または「プライマーのセット」と、重合の触媒（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、通常は熱安定性ポリメラーゼ酵素）を使用して行われる反応である。ＰＣＲ法は当該分野で周知であり、例えば、ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ  Ｍら、ＰＣＲ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１）に教示されている。ポリヌクレオチドの複製コピーを作製する全てのプロセス（例えば、ＰＣＲまたは遺伝子クローニング）は本明細書中ではまとめて「複製」と呼ばれる。プライマーは、サザンまたはノーザンブロット分析のようなハイブリダイゼーション反応においてプローブとして使用することもできる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．、ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９を参照のこと）。
【００８６】
「プローブ」には、ポリヌクレオチドの操作の状況で使用される場合は、標的とハイブリダイズすることによって目的の試料中に存在する標的を検出するための試薬として提供されるオリゴヌクレオチドが含まれる。通常、プローブには、標識、またはそれによってハイブリダイゼーション反応の前または後のいずれかに標識を結合させることができる手段が含まれるであろう。適切な標的としては、放射性同位体、蛍光色素、化学発光性化合物、色素、およびタンパク質（酵素を含む）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００８７】
「プロモーター配列」は、細胞中のＲＮＡポリメラーゼを結合することができ、下流（３’方向）のコード配列の転写を開始することができるＤＮＡ調節領域である。本発明のを定義する目的のためには、プロモーター配列は、転写開始部位によってその３’末端で境界され、バックグラウンドを上回る検出可能なレベルで転写を開始するために必要な最小数の塩基またはエレメントを含むように上流（５’方向）に伸びる。プロモーター配列の中には、転写開始部位（例えば、ヌクレアーゼＳ１でのマッピングによって定義されることが便利である）、さらには、ＲＮＡポリメラーゼの結合に関与しているタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見られるであろう。
【００８８】
用語「精製された」は、本明細書中で使用される場合は、それから材料が得られた天然の材料を含む無関係な材料（すなわち、混入物）の存在を減少させるかまたは排除する条件下で単離された材料をいう。例えば、精製されたタンパク質は、それが細胞の中で会合している他のタンパク質または核酸を実質的に含まないことが好ましい。精製された核酸分子は、細胞の中で一緒に見ることができるタンパク質または他の無関係な核酸分子を実質的に含まないことが好ましい。本明細書中で使用される場合は、用語「実質的に含まない」は、材料の分析試験の状況では、操作的に使用される。好ましくは、混入物を実質的に含まない精製された材料は、少なくとも５０％純粋、より好ましくは少なくとも９０％純粋、なおさらに好ましくは少なくとも９９％純粋である。純度は、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、免疫アッセイ、組成分析、生物学的アッセイ、および当該分野で公知の他の方法によって評価することができる。
【００８９】
用語「試験化合物」には、公知の化学構造を有している化合物が含まれるが、必ずしも公知の機能的活性または生物学的活性を有している必要はない。試験化合物はまた、構造が特定されていない場合もあり、また例えば、植物抽出物のような粗生物学的試料に由来する未知の化合物の混合物である場合もある。多数の化合物は、精製された化合物のコレクションまたは様々な供給源に由来する粗抽出物のコレクションをいう、「化学的ライブラリー」から無作為にスクリーニングすることができる。化学的ライブラリーには、化学合成されたかまたは天然の産物から精製された化合物が含まれ得る。化合物には、例えば、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、ステロイド、脂質、リン脂質、核酸およびリポタンパク質のような、無機もしくは有機低分子または大きな有機化合物が含まれ得る。試験される化合物の量は、化学的ライブラリーに応じて様々であり得るが、精製された（均質な）化合物のライブラリーについては、１０μＭが通常は試験される最も高い初回量である。試験化合物を細胞に導入する方法は当該分野で周知である。
【００９０】
ＩＩ．Ｃｃｄｃ８０をコードする単離されたポリヌクレオチドまたはその一部
本発明の方法の実施においては、様々な薬剤を、細胞中のＣｃｄｃ８０の活性および／または発現を調節するために使用することができる。１つの実施形態においては、薬剤は、Ｃｃｄｃ８０ポリペプチドまたはその一部をコードする核酸分子であり、これには例えば、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ、ＮＭ＿１９９５１１）、マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ、ＮＭ＿０２６４３９）、ラット（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、ＮＭ＿０２２５４３）、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ、ＮＭ＿２０４４３１）が含まれる。
【００９１】
ポリヌクレオチドは、標準的なＰＣＲ増幅技術にしたがって、鋳型としてのｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、あるいはゲノムＤＮＡと、適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅することができる。そのように増幅されたポリヌクレオチドは適切なベクターにクローニングすることができ、ＤＮＡ配列分析によって特性決定することができる。さらに、Ｃｃｄｃ８０ポリヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドを、標準的な合成技術によって、例えば、自動ＤＮＡ合成装置を使用して調製することができる。
【００９２】
さらに、Ｃｃｄｃ８０ポリヌクレオチドには、Ｃｃｄｃ８０全長ポリヌクレオチド配列の一部だけ（例えば、プローブもしくはプライマーとして使用することができる断片、またはＣｃｄｃ８０タンパク質の生物学的活性部分をコードする断片）が含まれ得る。Ｃｃｄｃ８０遺伝子のクローニングによって決定されたポリヌクレオチド配列は、他のＣｃｄｃ８０ファミリーメンバー、ならびに他の種に由来するＣｃｄｃ８０ファミリーのホモログの同定および／またはクローニングでの使用のために設計されたプローブおよびプライマーの作製を可能にする。
【００９３】
プローブ／プライマーには、通常、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドが含まれる。１つの実施形態においては、オリゴヌクレオチドには、全長のＣｃｄｃ８０ポリヌクレオチド配列、または上記全長配列の自然界に存在している対立遺伝子変異体もしくは突然変異体のセンス配列の少なくとも約１２個または１５個、好ましくは約２０個または２５個、より好ましくは約３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、または１００個の連続するポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の１つの領域が含まれる。別の実施形態においては、ポリヌクレオチドには、少なくとも約１００、２００、３００、４００、５００、６００、または７００ヌクレオチドの長さであり、全長のＣｃｄｃ８０ポリヌクレオチド配列またはその相補物のポリヌクレオチド配列に対してストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列が含まれる。
【００９４】
「Ｃｃｄｃ８０タンパク質の生物学的活性部分」をコードする核酸断片は、Ｃｃｄｃ８０生物学的活性を有している（例えば、前脂肪細胞の増殖を調節する、および／または脂質の蓄積を調節する）ポリペプチドをコードする全長のＣｃｄｃ８０ポリヌクレオチド配列の一部分を単離し、Ｃｃｄｃ８０タンパク質をコードする部分を発現させ（例えば、インビトロでの組み換え体発現による）、そしてＣｃｄｃ８０タンパク質のコード部分の活性を評価することによって調製することができる。
【００９５】
別の実施形態はアンチセンスポリヌクレオチドに関する。アンチセンスポリヌクレオチドは、通常、被験体に投与されるか、あるいは、これらがＣｃｄｃ８０タンパク質をコードする細胞性ｍＲＮＡおよび／もしくはゲノムＤＮＡとハイブリダイズするか、またはそれらに結合して、例えば、転写および／または翻訳を阻害することによってタンパク質の発現を阻害するようにインサイチュで生じさせられる。ハイブリダイゼーションは、安定な二本鎖を形成する従来のヌクレオチド相補性によってもたらされる場合があり、また、例えば、ＤＮＡ二本鎖に結合するアンチセンスポリヌクレオチドの場合には、二重螺旋の主溝の中での特異的相互作用によってもたらされる場合もある。本発明のアンチセンスポリヌクレオチドの投与経路の一例として、組織部位への直接の注射が挙げられる。あるいは、アンチセンスポリヌクレオチドは、選択された細胞を標的化するように修飾することができ、その後全身投与される。例えば、全身投与については、アンチセンス分子は、これらが選択された細胞上に発現される受容体または抗原に特異的に結合するように、例えば、アンチセンスポリヌクレオチドを、細胞表面受容体もしくは抗原に結合するペプチドまたは抗体に連結させることによって修飾することができる。アンチセンスポリヌクレオチドはまた、本明細書中に記載されるベクターを使用して細胞に送達させることもできる。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を得るためには、アンチセンスポリヌクレオチドが強いｐｏｌ  ＩＩまたはｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターの制御下に配置されているベクター構築物が好ましい。
【００９６】
なお別の実施形態においては、アンチセンスポリヌクレオチドはα−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、鎖が互いに平行に伸びる通常のβ−単位とは対照的に、相補性ＲＮＡと特異的二本鎖ハイブリッドを形成する（Ｇａｕｌｔｉｅｒ  Ｃら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６６２５−４１（１９８７））。アンチセンス核酸分子にはまた、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅ  Ｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６１３１−４８（１９８７））、またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（Ｉｎｏｕｅ  Ｈら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２１５：３２７−３０（１９８７））も含まれ得る。
【００９７】
なお別の実施形態においては、アンチセンスポリヌクレオチドはリボザイムである。リボザイムは、それらが相補性領域を有している一本鎖核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を切断することができるリボヌクレアーゼ活性を持つ触媒性ＲＮＡ分子である。したがって、リボザイム（例えば、ハンマーヘッドリボザイム（Ｈａｓｅｌｈｏｆｆ  ＪおよびＧｅｒｌａｃｈ  ＷＬ、Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５８５−９１（１９８８）に記載されている））を、Ｃｃｄｃ８０ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断し、それによりＣｃｄｃ８０ｍＲＮＡの翻訳を阻害するために使用することができる。Ｃｃｄｃ８０をコードする核酸に対して特異性を有しているリボザイムは、例えば、上記Ｃｃｄｃ８０ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）配列のいずれかのヌクレオチド配列に基づいて設計することができる。例えば、活性部位のヌクレオチド配列がＣｃｄｃ８０をコードするｍＲＮＡの中で切断されるヌクレオチド配列に相補的であるテトラヒメナＬ−１９  ＩＶＳ  ＲＮＡの誘導体を構築することができる（例えば、米国特許第４，９８７，０７１号および同第５，１１６，７４２号を参照のこと）。あるいは、Ｃｃｄｃ８０ｍＲＮＡは、ＲＮＡ分子のプールから特異的リボヌクレアーゼ活性を有している触媒性ＲＮＡを選択するために使用することができる（例えば、Ｂａｒｔｅｌ  ＤおよびＳｚｏｓｔａｋ  ＪＷ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１４１１−１８（１９９３）を参照のこと）。
【００９８】
あるいは、遺伝子発現は、Ｃｃｄｃ８０の調節領域（例えば、Ｃｃｄｃ８０プロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列を標的化して、標的細胞中でのＣｃｄｃ８０遺伝子の発現を妨げる三重ヘリックス構造を形成させることによって阻害することができる（概要については、Ｈｅｌｅｎｅ  Ｃ、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．６：５６９−８４（１９９１）；Ｈｅｌｅｎｅ  Ｃら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．６６０：２７−３６（１９９２）；Ｍａｈｅｒ  ＬＪ、Ｂｉｏａｓｓａｙｓ  １４：８０７−１５（１９９２）を参照のこと）。
【００９９】
他の実施形態においては、オリゴヌクレオチドには、ペプチド（例えば、インビボで宿主細胞受容体を標的化するため）または細胞膜を超える輸送を容易にする薬剤（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ＲＬら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：６５５３−５６（１９８９）；Ｌｅｍａｉｔｒｅ  Ｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：６４８−５２（１９８７）；ＰＣＴ国際公開公報ＷＯ８８／０９８１０を参照のこと）、または血液−脳関門を超える輸送を容易にする薬剤（例えば、ＰＣＴ国際公開公報ＷＯ８９／１０１３４を参照のこと）のような他の付加された基が含まれる場合もある。加えて、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションによって誘発される切断薬（例えば、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒｏｌ  ＡＲら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８−７６（１９８８）を参照のこと）または挿入剤（例えば、Ｚｏｎ  Ｇ、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−４９（１９８８）を参照のこと）で修飾することができる。この目的のためには、オリゴヌクレオチドは、別の分子（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤、輸送剤、またはハイブリダイゼーション誘発開裂剤）に結合させられる場合がある。
【０１００】
１つの実施形態においては、Ｃｃｄｃ８０発現は、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によって阻害することができる。ｓｉＲＮＡは、１９〜２５ヌクレオチドを有しているｄｓＲＮＡであり得る。ｓｉＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒと呼ばれるＲＮａｓｅ  ＩＩＩ関連ヌクレアーゼによるより長いｄｓＲＮＡ分子の分解によって内生的に生産され得る。ｓｉＲＮＡはまた、外部から、または発現構築物の転写によって細胞に導入することもできる。一旦形成すると、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として知られるエンドヌクレアーゼ含有複合体になるようにタンパク質成分とともにアセンブリする。ＡＴＰによって生じたｓｉＲＮＡの巻き戻しはＲＩＳＣを活性化させ、これは次いで、ワトソン−クリック塩基対形成により相補的なｍＲＮＡ転写物を標的化し、それによってｍＲＮＡの切断し、破壊する。ｍＲＮＡの切断は、ｓｉＲＮＡ鎖が結合した領域の中央付近で起こる。この配列特異的ｍＲＮＡ分解により遺伝子のサイレンシングが生じる。
【０１０１】
ｓｉＲＮＡ媒介性遺伝子サイレンシングを行うためには少なくとも２つの方法を使用することができる。第１に、ｓｉＲＮＡをインビトロで合成し、遺伝子発現を一時的に抑制するために細胞に導入することができる。合成ｓｉＲＮＡはＲＮＡｉを行うための簡単であり効果的な方法を提供する。ｓｉＲＮＡは、例えば、対称な２ヌクレオチドの３’突出を有している１９個のＲＮＡヌクレオチドを含むことができる短い混合オリゴヌクレオチドの二本鎖である。合成の２１ｂｐのｓｉＲＮＡ二本鎖（例えば、１９個のＲＮＡ塩基と、それに続くＵＵまたはｄＴｄＴの３’突出）を使用して、配列特異的遺伝子サイレンシングを哺乳動物細胞の中で行うことができる。これらのｓｉＲＮＡは、多くのタンパク質の翻訳の非特異的抑制を生じる可能性がある、より長い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によるＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）を活性化させることなく、哺乳動物細胞の中の標的化された遺伝子の翻訳を特異的に抑制することができる。
【０１０２】
第２に、ｓｉＲＮＡは、ベクターからインビボで発現させることができる。このアプローチは、細胞またはトランスジェニック動物の中でｓｉＲＮＡを安定して発現させるために使用することができる。１つの実施形態においては、ｓｉＲＮＡ発現ベクターは、ポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ  ＩＩＩ）転写単位からのｓｉＲＮＡ転写を駆動するように操作される。Ｐｏｌ  ＩＩＩ転写単位は、これらが、ｓｉＲＮＡ機能を助ける特徴であるヘアピンｓｉＲＮＡに対する２ｂｐの突出（例えば、ＵＵ）の付加を導く、ＡＴを多く含む短い転写終結部位を崩壊させるので、ヘアピンｓｉＲＮＡ発現に適している。Ｐｏｌ  ＩＩＩ発現ベクターはまた、ｓｉＲＮＡを発現するトランスジェニックマウスを作成するためにも使用することができる。
【０１０３】
別の実施形態においては、ｓｉＲＮＡは、組織特異的様式で発現させることができる。このアプローチでは、長いｄｓＲＮＡが、選択された細胞株またはトランスジェニックマウスの核の中でプロモーター（例えば、ＣＭＶ（ｐｏｌ  ＩＩ））から最初に発現させられる。長いｄｓＲＮＡは核の中で（例えば、Ｄｉｃｅｒによって）ｓｉＲＮＡになるようにプロセシングされる。ｓｉＲＮＡは核から出て、遺伝子特異的サイレンシングを媒介する。同様のアプローチを、組織特異的ノックダウンマウスを作製するために組織特異的（ｐｏｌ  ＩＩ）プロモーターと組み合わせて使用することができる。
【０１０４】
任意の３’の２ヌクレオチド突出（例えば、ＵＵ）を、ｓｉＲＮＡの設計に使用することができる。いくつかの場合には、突出の中のＧ残基は、ｓｉＲＮＡが一本鎖のＧ残基でＲＮａｓｅによって切断される可能性あることが原因で回避される。
【０１０５】
ｓｉＲＮＡ配列自体に関しては、３０〜５０％のＧＣ含量を有しているｓｉＲＮＡが、特定の場合により高いＧ／Ｃ含量を有しているものよりも活性が高い場合があることが明らかにされている。さらに、４〜６ヌクレオチドのポリ（Ｔ）トラクトはＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩの終結シグナルとして作用する可能性があるので、標的配列中の４個を超えるＴまたはＡのストレッチは、ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターから発現させられるように配列が設計されている特定の場合には回避され得る。加えて、ｍＲＮＡのいくつかの領域は、高次構造をとるか、または調節タンパク質によって結合されるかのいずれかであり得る。したがって、遺伝子配列の長さに沿って様々な位置にあるｓｉＲＮＡ標的部位を選択することが役に立ち得る。最後に、可能性のある標的部位は、適切なゲノムデータベース（ヒト、マウス、ラットなど）と比較することができる。他のコード配列に対して１６〜１７個を超える連続する塩基対の相同性を有している任意の標的配列は、特定の場合には検討から除外される場合がある。
【０１０６】
１つの実施形態においては、ｓｉＲＮＡは、短いスペーサー配列によって隔てられた２つの逆向きの繰り返しを持ち、転写終結部位となるＴのストリングで終結するように設計することができる。この設計により、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ、例えば、配列番号７、これは、未分化の３Ｔ３−Ｌ１細胞と最終分化した３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞のいずれにおいてもＣｃｄｃ８０ｍＲＮＡをダウンレギュレートし（実施例３を参照のこと）、成熟脂肪細胞へと分化する３Ｔ３−Ｌ１細胞の能力を弱めること（実施例４を参照のこと）が本明細書中で明らかにされる）になるように折り畳まれると予想されるＲＮＡ転写物が生じる。ｓｉＲＮＡ標的配列、推定されるヘアピンのステムをコードする逆向きの繰り返しの長さ、逆向きの繰り返しの順序、ヘアピンのループをコードするスペーサー配列の長さと組成、および５’突出の有無の選択は、所望される結果が得られるように変えることができる。
【０１０７】
ｓｉＲＮＡ標的は、ＡＡの２ヌクレオチドのｍＲＮＡ配列をスキャンし、ＡＡのすぐ下流にある１９ヌクレオチドを記録することによって選択することができる。ｓｉＲＮＡ標的を選択するためには、他の方法もまた使用されている。１つの例においては、ｓｉＲＮＡ標的配列の選択は、標的配列がＧＧで始まり、ＢＬＡＳＴ検索によって分析された場合に他の遺伝子と有意な配列相同性を共有しない限りは、純粋に経験的に決定される（例えば、Ｓｕｉ  Ｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：５５１５−２０（２００２）を参照のこと）。別の例においては、より巧妙な方法がｓｉＲＮＡ標的配列を選択するために使用される。この手順は、内因性ｍＲＮＡの任意の利用できる部位を合成オリゴデオキシリボヌクレオチド／ＲＮａｓｅ  Ｈ法による分解のために標的できるという観察を利用する（例えば、Ｌｅｅ  ＮＳら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：５００−０５（２００２）を参照のこと）。
【０１０８】
別の実施形態においては、ヘアピンｓｉＲＮＡ発現カセットは、標的のセンス鎖、その後ろに短いスペーサー、標的のアンチセンス鎖、そして転写ターミネーターとしての５〜６個のＴを含むように構築される。ｓｉＲＮＡ発現構築物の中でのセンス鎖とアンチセンス鎖の順序は、ヘアピンｓｉＲＮＡの遺伝子サイレンシング活性に影響が及ばない限りは変更することができる。特定の場合には、順序を逆にすることにより、遺伝子サイレンシング活性の部分的な低下が起こる場合がある。
【０１０９】
ｓｉＲＮＡ発現カセットのステムとして使用されるヌクレオチド配列の長さは、例えば、１９から２９の範囲であり得る。ループの大きさは、３から２３ヌクレオチドまでの範囲であり得る。他の長さおよび／またはループの大きさもまた使用することができる。
【０１１０】
なお別の実施形態においては、ヘアピンｓｉＲＮＡが遺伝子サイレンシングに関して機能的である限りにおいて、ヘアピンｓｉＲＮＡ構築物の中で５’突出を使用することができる。１つの特異的な例においては、５’突出には約６個のヌクレオチド残基が含まれる。
【０１１１】
なおさらに別の実施形態においては、ＲＮＡｉの標的配列は２１塩基長の配列断片である、標的配列の５’末端は２ヌクレオチド「ＮＡ」を有し、この場合、「Ｎ」はどの塩基であってもよく、「Ａ」はアデニンを示す。残りの１９塩基長の配列は、３５％から５５％の間のＧＣ含量を有する。加えて、残りの１９塩基長の配列には、任意の４個の連続するＡまたはＴ（すなわち、ＡＡＡＡまたはＴＴＴＴ）、３個の連続するＧまたはＣ（すなわち、ＧＧＧまたはＣＣＣ）、あるいは７個の連続する「ＧＣ」は含まれない。
【０１１２】
さらなる基準を、ＲＮＡｉ標的配列を選択するために使用することもできる。例えば、残りの１９塩基長の配列のＧＣ含量を４５％から５５％の間に限定することができる。さらに、連続している３個の同じ塩基（すなわち、ＧＧＧ、ＣＣＣ、ＴＴＴ、またはＡＡＡ）あるいは５個以上の塩基を有しているパリンドローム配列を持つ任意の１９塩基長の配列は除外される。さらに、残りの１９塩基長の配列は、他の遺伝子に対して低い配列相同性を有するように選択することができる。１つの特異的な例においては、可能性のある標的配列が、ＮＣＢＩのヒトＵｎｉＧｅｎｅクラスター配列データベースに対するＢＬＡＳＴＮによって検索される。ヒトＵｎｉＧｅｎｅデータベースには、遺伝子の方向性が決定されたクラスターの重複しないセットが含まれる。個々のＵｎｉＧｅｎｅクラスターには、固有の遺伝子を提示する配列が含まれる。ＢＬＡＳＴＮ検索において他のヒト遺伝子にヒットしない１９塩基長の配列を選択することができる。検索の際には、ｅ−値をストリンジェントな値（例えば、「１」）に設定することができる。
【０１１３】
ｓｉＲＮＡ配列、ならびに本発明にしたがって導かれた任意の他のＲＮＡｉ配列の有効性は、当該分野で公知の様々な方法を使用して評価することができる。例えば、本発明のｓｉＲＮＡ配列は、Ｃｃｄｃ８０遺伝子を発現する細胞に導入することができる。細胞中のＣｃｄｃ８０遺伝子のポリペプチドまたはｍＲＮＡレベルを検出することができる。ｓｉＲＮＡ配列の導入の前と後でのＣｃｄｃ８０遺伝子の発現レベルの実質的な変化は、Ｃｃｄｃ８０遺伝子の発現を抑制することにおけるｓｉＲＮＡ配列の有効性の指標である。１つの特異的な例においては、他の遺伝子の発現レベルもまた、ｓｉＲＮＡ配列の導入の前と後でモニターされる。Ｃｃｄｃ８０遺伝子発現に対して阻害作用を有しているが、他の遺伝子の発現には有意には影響を与えないｓｉＲＮＡ配列を選択することができる。別の特異的な例においては、複数のｓｉＲＮＡまたは他のＲＮＡｉ配列を同じ標的細胞に導入することができる。これらのｓｉＲＮＡまたはＲＮＡｉ配列はＣｃｄｃ８０遺伝子の発現を特異的に阻害するが、他の遺伝子の発現は阻害しない。なお別の特異的な例においては、Ｃｃｄｃ８０遺伝子および他の遺伝子（単数または複数）の発現を阻害するｓｉＲＮＡあるいは他のＲＮＡｉ配列を使用することができる。
【０１１４】
アンチセンスポリヌクレオチドは、トランスフェクト細胞またはトランスジェニック細胞中の異種発現カセットから生産され得る。あるいは、アンチセンスポリヌクレオチドには、インビトロで培養培地中またはインビボで循環システムもしくは間質液の中のいずれかで、外部環境に投与される可溶性オリゴヌクレオチドが含まれ得る。外部環境中に存在する可溶性アンチセンスポリヌクレオチドは、細胞質に侵入すること、そして特定のｍＲＮＡ種の翻訳を阻害することが示されている。
【０１１５】
ＩＩＩ．単離されたＣｃｄｃ８０タンパク質およびその断片
天然のＣｃｄｃ８０タンパク質は、標準的なタンパク質精製技術を使用して適切な精製計画によって細胞または組織供給源から単離することができる。別の実施形態においては、Ｃｃｄｃ８０タンパク質は組み換えＤＮＡ技術によって生産される。組み換え体発現の代わりに、Ｃｃｄｃ８０タンパク質またはポリペプチドは、標準的なペプチド合成技術を使用して化学合成することができる。Ｃｃｄｃ８０タンパク質（例えば、ヒト、マウス、ラット、またはニワトリのＣｃｄｃ８０（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）登録番号ＮＭ＿１９９５１１、ＮＭ＿０２６４３９、ＮＭ＿０２２５４３、ＮＭ＿２０４４３１））の使用についての議論においては、全長のＣｃｄｃ８０ポリペプチドではないそのようなタンパク質の断片と、全長Ｃｃｄｃ８０タンパク質を使用できることが理解されるであろう。
【０１１６】
好ましい実施形態においては、Ｃｃｄｃ８０タンパク質には、上記ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）配列またはその一部のいずれかのアミノ酸配列が含まれる。他の実施形態においては、Ｃｃｄｃ８０タンパク質は、その上記ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）配列部分のいずれかに示されたアミノ酸配列と、少なくとも６５％、少なくとも７０％のアミノ酸同一性、少なくとも８０％のアミノ酸同一性、少なくとも８５％のアミノ酸同一性、少なくとも９０％のアミノ酸同一性、または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する。Ｃｃｄｃ８０ポリペプチド分子の好ましい部分は生物学的に活性であり、例えば、前脂肪細胞の増殖および／または脂質の蓄積を調節する能力を有しているＣｃｄｃ８０ポリペプチドの一部分である。
【０１１７】
Ｃｃｄｃ８０タンパク質の生物学的活性部分には、全長のＣｃｄｃ８０タンパク質よりも少ない数のアミノ酸を含み、Ｃｃｄｃ８０タンパク質の少なくとも１つの活性を示す、Ｃｃｄｃ８０タンパク質のアミノ酸配列に対して十分に相同であるか、またはＣｃｄｃ８０タンパク質のアミノ酸配列から導かれたアミノ酸配列を含むペプチドが含まれる。
【０１１８】
本発明によってはまた、Ｃｃｄｃ８０キメラタンパク質またはＣｃｄｃ８０融合タンパク質も提供される。例えば、１つの実施形態においては、融合タンパク質は、Ｃｃｄｃ８０メンバー配列がＧＳＴ配列のＣ末端に融合させられた、ＧＳＴ−Ｃｃｄｃ８０メンバー融合タンパク質である。別の実施形態においては、融合タンパク質は、Ｃｃｄｃ８０メンバー配列がインフルエンザヘマグルチニンエピトープタグに対してインフレームで融合させられるようにＣｃｄｃ８０メンバーのポリヌクレオチド配列がベクター（例えば、ｐＣＥＰ４−ＨＡベクター（Ｈｅｒｒｓｃｈｅｒ  ＲＦら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．９：３０６７−８２（１９９５）））に挿入された、Ｃｃｄｃ８０−ＨＡ融合タンパク質である。さらなる実施形態においては、融合タンパク質はＦｃ−融合タンパク質であり得る。例えば、有用なＦｃ融合タンパク質は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃ領域に融合させられたＣｃｄｃ８０からなるキメラタンパク質であり得る。融合は、Ｆｃ領域のＮ末端またはＣ末端のいずれで行うこともできる。Ｆｃ融合タンパク質は、発現プラスミドを使用して細胞中で発現させることができる。得られるＦｃ融合タンパク質は培養培地に分泌され得る。例えば、いくつかの実施形態においては、免疫グロブリンのＦｃ領域をＮ末端融合パートナーとして使用することができ、これは、多くの異なるタイプのタンパク質（Ｃｃｄｃ８０のような分泌型タンパク質を含むがこれに限定されない）を高レベルで発現し、分泌するように細胞性のプロセスを指示することができる。
【０１１９】
そのような融合タンパク質は、組み換え体Ｃｃｄｃ８０メンバーの精製を容易にすることができる。例えば、Ｆｃ融合タンパク質に関して、Ｆｃ領域は容易な検出と精製を提供する。具体的には、Ｆｃ融合タンパク質は、当該分野で周知の方法にしたがってプロテインＡまたはプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーを使用してタンパク質を使用して１工程で精製することができる。プロテインＡおよびプロテインＧは、ＩｇＧのＦｃ領域に特異的に結合する。Ｆｃ融合タンパク質に関して、Ｆｃ領域はまた、改善された薬学的特性（例えば、変化した半減期およびエフェクター機能）も提供し、そして治療薬として使用され得る。
【０１２０】
組み換え技術によって生産された融合タンパク質およびペプチドは分泌される場合があり、このタンパク質またはペプチドを含む細胞および培地の混合物から単離され得る。あるいは、タンパク質またはペプチドは細胞質中で維持される場合があり、細胞が回収され、溶解させられ、そしてタンパク質が単離される。細胞培養物には、通常、宿主細胞、培養液、および他の副生成物が含まれる。細胞培養に適している培養液は当該分野で周知である。タンパク質およびペプチドは、細胞培養液、宿主細胞、またはそれらの両方から、タンパク質およびペプチドの精製のための当該分野で公知の技術を使用して単離することができる。宿主細胞をトランスフェクトし、タンパク質およびペプチドを精製するための技術は当該分野で公知である。
【０１２１】
１つの実施形態においては、Ｃｃｄｃ８０融合タンパク質は標準的な組み換えＤＮＡ技術によって生産される。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡ断片は、従来技術にしたがって、例えば、連結のための平滑末端もしくは突出末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、必要に応じて付着端のフィルイン、望ましくない連結を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素連結を使用して、互いにインフレームで連結させられる。別の実施形態においては、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成装置を含む従来技術によって合成することができる。あるいは、遺伝子断片のＰＣＲ増幅を、２つの連続する遺伝子断片（これはその後、キメラ遺伝子配列を生じるようにアニーリングさせ、再度増幅させることができる）の間に相補的な突出を生じるアンカープライマーを使用して行うことができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：１９９２を参照のこと）。さらに、予め融合部分（例えば、ＧＳＴポリペプチドまたはＨＡエピトープタグ）をコードする多くの発現ベクターが市販されている。Ｃｃｄｃ８０をコードする核酸は、融合部分がＣｃｄｃ８０タンパク質に対してインフレームで連結されるようにそのような発現ベクターにクローニングすることができる。
【０１２２】
別の実施形態においては、融合タンパク質は、そのＮ末端に異種シグナル配列を含むＣｃｄｃ８０タンパク質である。特定の宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）においては、Ｃｃｄｃ８０の発現および／または分泌を、異種シグナル配列の使用によって増大させることができる。本発明のＣｃｄｃ８０融合タンパク質は薬学的組成物に配合することができ、インビボで被験体に投与することができる。Ｃｃｄｃ８０融合タンパク質は、肥満、インスリン耐性、および／または２型糖尿病の処置に治療的に有用であり得る。
【０１２３】
本発明はまた、Ｃｃｄｃ８０アゴニスト（模倣物）として機能するＣｃｄｃ８０タンパク質の変異体にも関する。Ｃｃｄｃ８０タンパク質の変異体は、突然変異誘発（例えば、Ｃｃｄｃ８０タンパク質の不連続な点変異または短縮）によって生じる可能性がある。Ｃｃｄｃ８０タンパク質のアゴニストは、自然界に存在している形態のＣｃｄｃ８０タンパク質の生物学的活性と同じ生物学的活性またはそのサブセットを実質的に保持し得る。Ｃｃｄｃ８０タンパク質のアンタゴニストは、自然界に存在している形態のＣｃｄｃ８０タンパク質の活性のうちの１つ以上を、例えば、Ｃｃｄｃ８０タンパク質の細胞性活性を競合的に調節することによって阻害することができる。したがって、特異的な生物学的作用を、限られた機能の変異体での処理によって誘発することができる。１つの実施形態においては、自然界に存在している形態のタンパク質の生物学的活性の１つのサブセットを有している変異体での被験体の処置は、自然界に存在している形態のＣｃｄｃ８０タンパク質での処理と比較して、被験体に与える副作用が少ない。
【０１２４】
１つの実施形態においては、本発明は、酸化、還元、または当該分野で公知の他の誘導プロセスによってＣｃｄｃ８０の少なくとも１つのアミノ酸残基を修飾することによって形成することができるＣｃｄｃ８０の誘導体に関する。
【０１２５】
１つの実施形態においては、Ｃｃｄｃ８０アゴニスト（模倣物）として機能するＣｃｄｃ８０タンパク質の変異体は、Ｃｃｄｃ８０タンパク質の変異体（例えば、短縮変異体）の組み合わせライブラリーを、Ｃｃｄｃ８０タンパク質アゴニスト活性についてスクリーニングすることによって同定することができる。１つの実施形態においては、Ｃｃｄｃ８０変異体の多様化されたライブラリーが核酸レベルでの組み合わせ突然変異誘発によって作製され、多様化された遺伝子ライブラリーによってコードされる。Ｃｃｄｃ８０変異体の多様化されたライブラリーは、例えば、可能性のあるＣｃｄｃ８０配列の縮重セットが個々のポリペプチドとして、あるいはその中にＣｃｄｃ８０配列のセットを含む（例えば、ファージディスプレイのための）より大きな融合タンパク質のセットとして発現され得るように、合成オリゴヌクレオチドの混合物を複数の遺伝子配列になるように酵素によって連結することによって作製することができる。縮重オリゴヌクレオチド配列から可能性のあるＣｃｄｃ８０変異体のライブラリーを生産するために使用することができる様々な方法が存在している。縮重遺伝子配列の化学合成は自動ＤＮＡ合成装置の中で行うことができ、その後、合成遺伝子が適切な発現ベクターに連結させられる。遺伝子の縮重セットの使用は、１つの混合物において、可能性のあるＣｃｄｃ８０配列の所望されるセットをコードする配列の全てを提供することを可能にする。縮重オリゴヌクレオチドを合成するための方法が当該分野で公知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ  ＳＡ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ３９：３−２２（１９８３）；Ｉｔａｋｕｒａ  Ｋら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３−５６（１９８４）；Ｉｔａｋｕｒａ  Ｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８：１０５６−６３（１９７７）；Ｉｋｅ  Ｙら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１１：４７７−８８（１９８３）を参照のこと）。
【０１２６】
加えて、Ｃｃｄｃ８０タンパク質コード配列の断片のライブラリーを、Ｃｃｄｃ８０タンパク質のスクリーニングとその後の選択のためのＣｃｄｃ８０断片の多様化された集団を作製するために使用することができる。１つの実施形態においては、コード配列断片のライブラリーは、切断が１つの分子あたり約１回だけ起こる条件下でＣｃｄｃ８０コード配列の二本鎖ＰＣＲ断片をヌクレアーゼで処理し、二本鎖ＤＮＡを変性させ、様々な切断産物に由来するセンス／アンチセンス対を含む可能性がある二本鎖ＤＮＡが形成されるようにＤＮＡを変性させ、ＳＩヌクレアーゼでの処理によって再度形成させられた二本鎖から一本鎖部分を除去し、そして得られた断片ライブラリーを発現ベクターに連結することによって、作製することができる。この方法により、Ｃｃｄｃ８０タンパク質の様々な大きさのＮ末端、Ｃ末端、および内部断片をコードする発現ライブラリーを誘導することができる。
【０１２７】
点変異または短縮によって作製された組み合わせライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするため、および選択された特性を有している遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのいくつかの技術が当該分野で公知である。そのような技術は、Ｃｃｄｃ８０タンパク質の組み合わせ突然変異誘発によって作製された遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適応させることができる。高スループット分析を行いやすい、大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために最も広く使用されている技術には、通常、遺伝子ライブラリーの複製可能発現ベクターへのクローニング、得られるベクターのライブラリーでの適切な細胞の形質転換、および所望される活性の検出がその産物が検出される遺伝子をコードするベクターの単離を容易にする条件下での組み合わせ遺伝子の発現が含まれる。ライブラリー中の機能的変異体の頻度を高める技術である再帰アンサンブル変異誘発（Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  Ｅｎｓｅｍｂｌｅ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＲＥＭ）を、Ｃｃｄｃ８０変異体を同定するためのスクリーニングアッセイと組み合わせて使用することができる（Ａｒｋｉｎ  ＡＰおよびＹｏｕｖａｎ  ＤＣ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：７８１１−１５（１９９２）；Ｄｅｌｇｒａｖｅ  Ｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．６：３２７−３１（１９９３））。
【０１２８】
１つの実施形態においては、細胞をベースとするアッセイ（ｃｅｌｌ  ｂａｓｅｄ  ａｓｓａｙ）を、多様化されたＣｃｄｃ８０ライブラリーを分析するために利用することができる。例えば、発現ベクターのライブラリーは、Ｃｃｄｃ８０を通常合成し、分泌する細胞株にトランスフェクトすることができる。その後、Ｃｃｄｃ８０および特定の変異体Ｃｃｄｃ８０が分泌されるようにトランスフェクトされた細胞が培養され、細胞上清中のＣｃｄｃ８０活性に対する変異体の発現の影響を、例えば、多数の酵素アッセイのうちのいずれかによって検出することができる。その後、プラスミドＤＮＡを、阻害、あるいは、Ｃｃｄｃ８０活性の強化についてスコアされる細胞から回収することができ、個々のクローンがさらに特性決定される。
【０１２９】
自然界に存在しているアミノ酸だけから構成されているＣｃｄｃ８０ポリペプチドに加えて、Ｃｃｄｃ８０ペプチド模倣物もまた有用である。ペプチドアナログは、鋳型ペプチドの特性と同様の特性を持つ非ペプチド薬物として製薬業界で一般的に使用されている。これらのタイプの非ペプチド化合物は、「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｍｅｔｉｃｓ）」または「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｅｍｉｍｅｔｉｃｓ）と呼ばれ（Ｆａｕｃｈｅｒｅ  Ｊ、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．１５：２９（１９８６）；Ｖｅｂｅｒ  ＤＦおよびＦｒｅｉｄｉｎｇｅｒ  ＲＭ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．８：３９２−９６（１９８５）；Ｅｖａｎｓ  ＢＥら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９−３９（１９８７））、コンピューターによる分子モデル化を活用して通常開発される。治療上有用なペプチドと構造的に類似しているペプチド模倣物が、同等の治療的または予防的効果を得るために使用される場合がある。一般的には、ペプチド模倣物は、ヒトＣｃｄｃ８０のようなパラダイムポリペプチド（すなわち、生物学的または薬理学的活性を有しているポリペプチド）と構造的に類似しているが、当該分野で公知であり、以下の参考文献にさらに記載される方法によって、−−ＣＨ２ＮＨ−−、−−ＣＨ２Ｓ−−、−−ＣＨ２ＣＨ２−−、−−ＣＨ＝ＣＨ−−（シスおよびトランス）、−−ＣＯＣＨ２−−、−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−、および−−ＣＨ２ＳＯ−−からなる群より選択される連結によって状況に応じて置き換えられた１つ以上のペプチド結合を有する：Ｓｐａｔｏｌａ  ＡＦ、“Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”、Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐ．２６７（１９８３）；Ｓｐａｔｏｌａ、ＡＦ、Ｖｅｇａ  Ｄａｔａ（１９８３年３月）、第１巻、Ｉｓｓｕｅ  ３、“Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ”（一般的概念）；Ｍｏｒｌｅｙ  ＪＳ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍｃｏｌ．Ｓｃｉ．１：４６３−６８（１９８０）（一般的概念）；Ｈｕｄｓｏｎ  Ｄら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．１４：１７７−８５（１９７９）（−−ＣＨ２ＮＨ−−、ＣＨ２ＣＨ２−−）；Ｓｐａｔｏｌａ  ＡＦら、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．３８：１２４３−４９（１９８６）（−−ＣＨ２Ｓ−−）；Ｈａｎｎ  ＭＭ、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．１、３０７−３１４（１９８２）（−−ＣＨ＝ＣＨ−−、シスおよびトランス）；Ａｌｍｑｕｉｓｔ  ＲＧら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２３：１３９２−９８（１９８０）（−−ＣＯＣＨ２−−）；Ｊｅｎｎｉｎｇｓ−Ｗｈｉｔｅ  Ｃら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２３：２５３３−３４（１９８２）（−−ＣＯＣＨ２−−）；ＥＰ  ０  ０４５  ６６５（−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−）；Ｈｏｌｌａｄａｙ  ＭＷら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．、２４：４４０１−０４（１９８３）（−−Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２−−）；Ｈｒｕｂｙ  ＶＪ、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．３１：１８９−９９（１９８２）（−−ＣＨ２Ｓ−−）。特に好ましい非ペプチド結合は、−−���Ｈ２ＮＨ−−である。そのようなペプチド模倣物は、ポリペプチドの複数の実施形態を上回る有意な利点を持つ場合があり、これには例えば、以下が含まれる：より経済的な生産、より高い化学的安定性、増強された薬理学的特性（半減期、吸収、効力、効能など）、変化した特異性（例えば、広範囲の生物学的活性）、低い抗原性など。ペプチド模倣物の標識には、通常、定量的な構造−活性データおよび／または分子モデル化により予想される、ペプチド模倣物上の干渉しない位置（単数または複数）に対する、直接あるいはスペーサー（例えば、アミド基）を介した１つ以上の標識の共有結合が含まれる。そのような干渉しない位置は、通常は、ペプチド模倣物が治療効果を生じるためにそこに結合する、巨大分子（単数または複数）との直接の接触を形成しない位置である。ペプチド模倣物の誘導（例えば、標識）は、ペプチド模倣物の所望される生物学的または薬理学的活性を実質的には妨害しないはずである。
【０１３０】
Ｃｃｄｃ８０アミノ酸配列の１つ以上のアミノ酸の、同じタイプのＤ−アミノ酸での意図的な置換（例えば、Ｌ−リジンの代わりにＤ−リジン）を、より安定なペプチドを作製するために使用することができる。加えて、Ｃｃｄｃ８０アミノ酸配列または実質的に同じである配列バリエーションを含む拘束されたペプチドは、当該分野で公知の方法（Ｒｉｚｏ  ＪおよびＧｉｅｒａｓｃｈ  ＬＭ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３８７−４１６（１９９２））によって、例えば、ペプチドを環化させる分子内ジスルフィド結合を形成することができる内部システイン残基を付加することによって作製することができる。
【０１３１】
Ｃｃｄｃ８０ポリペプチドのアミノ酸配列により、当業者は、Ｃｃｄｃ８０ペプチド配列に対応するポリペプチドおよびその配列変異体を生産することができるであろう。そのようなポリペプチドは、Ｃｃｄｃ８０ペプチド配列をコードするポリヌクレオチドの、多くの場合はより長いポリペプチドの一部としての発現によって、原核生物または真核生物宿主細胞の中で生産させることができる。あるいは、そのようなペプチドは、化学的方法によって合成される場合がある。異種タンパク質の組み換え体宿主の中での発現、ポリペプチドの化学合成、およびインビトロでの翻訳のための方法は当該分野で周知であり、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８９）、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．；ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１５２巻、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８７）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．；Ｇｕｔｔｅ  ＢおよびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  ＲＢ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９１：５０１−０２（１９６９）；Ｃｈａｉｋｅｎ  ＩＭ、ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１：２５５−３０１（１９８１）；Ｋａｉｓｅｒ  ＥＴら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：１８７−９２（１９８９）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  Ｂ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：３４１−４７（１９８６）；Ｋｅｎｔ  ＳＢＨ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：９５７−８９（１９８８）；Ｏｆｆｏｒｄ、Ｒ．Ｅ．（１９８０）Ｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｗｉｌｅｙ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇにさらに記載されている。
【０１３２】
ペプチドは、例えば、直接的な化学合成によって生産することができる。ペプチドは、Ｎ末端および／またはＣ末端に対する共有結合によって結合させられた非ペプチド部分を持つ修飾されたペプチドとして生産することができる。特定の好ましい実施形態においては、カルボキシ末端またはアミノ末端のいずれか、あるいは両方が化学修飾される。末端アミノ基とカルボキシル基の最も一般的な修飾は、それぞれ、アセチル化とアミド化である。アシル化（例えば、アセチル化）またはアルキル化（例えば、メチル化）のようなアミノ末端修飾と、アミド化のようなカルボキシ末端修飾、ならびに環化を含む他の末端修飾を、本発明の様々な実施形態に組み入れることができる。特定のアミノ酸末端および／またはカルボキシ末端修飾、ならびに／あるいはコア配列に対するペプチドの伸張は、有利な物理的、化学的、生化学的、および薬理学的特性（例えば、高い安定性、高い効力および／または効能、血清プロテアーゼに対する耐性、所望される薬物動態特性など）を提供することができる。ペプチドは、疾患を処置するために治療的に使用され得る。
【０１３３】
単離されたＣｃｄｃ８０タンパク質またはその一部もしくは断片はまた、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の調製のための標準的な技術を使用して、Ｃｃｄｃ８０に結合する抗体を作製するための免疫原として使用することもできる。全長のＣｃｄｃ８０タンパク質を使用することができ、または代わりに、本発明は免疫原として使用されるＣｃｄｃ８０の抗原性ペプチド断片を提供する。Ｃｃｄｃ８０の抗原性ペプチドには少なくとも８個のアミノ酸残基が含まれ、そのペプチドに対して惹起された抗体がＣｃｄｃ８０とともに特異的な免疫複合体を形成するようにＣｃｄｃ８０のエピトープが含まれる。他の実施形態においては、抗原性ペプチドには、少なくとも１０個のアミノ酸残基、少なくとも１５個のアミノ酸残基、少なくとも２０個のアミノ酸残基、または少なくとも３０個のアミノ酸残基が含まれる。
【０１３４】
１つの実施形態においては、抗原性ペプチドに含まれるエピトープは、タンパク質の表面（例えば、親水性領域）に位置する、Ｃｃｄｃ８０ポリペプチドに特有である、Ｃｃｄｃ８０ポリペプチドの複数の領域である。１つの実施形態においては、そのようなエピトープは、１つの種（例えば、マウスまたはヒト）由来のＣｃｄｃ８０タンパク質に特異的であり得る（すなわち、種間では保存されていないＣｃｄｃ８０ポリペプチドの１つの領域に及ぶ抗原性ペプチドが免疫原として使用される；そのような保存されていない残基は、本明細書中に記載されるようなアラインメントプログラムを使用して決定することができる）。標準的なタンパク質の疎水性分析を、親水性領域を同定するために実施することができる。
【０１３５】
Ｃｃｄｃ８０免疫原は、通常、適切な被験体（例えば、ウサギ、ヤギ、マウス、または他の哺乳動物）を免疫原で免疫化することによって抗体を調製するために使用される。適切な免疫原性調製物には、例えば、組み換え発現されたＣｃｄｃ８０タンパク質、または化学合成されたＣｃｄｃ８０ペプチドが含まれ得る。調製物にはさらに、アジュバント（例えば、フロイトの完全なまたは不完全なアジュバント）または類似する免疫賦活剤が含まれ得る。適切な被験体の免疫原性Ｃｃｄｃ８０調製物での免疫化により、ポリクローナル抗Ｃｃｄｃ８０抗体応答が誘導される。
【０１３６】
したがって、別の態様は、抗Ｃｃｄｃ８０抗体の使用に関する。ポリクローナル抗Ｃｃｄｃ８０抗体は、Ｃｃｄｃ８０免疫原で適切な被験体を免疫化することによって上記に記載されたように調製することができる。免疫化された被験体中での抗Ｃｃｄｃ８０抗体力価は、標準的な技術、例えば、固定されたＣｃｄｃ８０ポリペプチドを使用する酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）を用いて、経時的にモニターすることができる。所望される場合には、Ｃｃｄｃ８０ポリペプチドに対する抗体分子は、哺乳動物から（例えば、血液から）単離することができ、周知の技術（例えば、ＩｇＧ画分を得るためのプロテインＡクロマトグラフィー）によってさらに精製することができる。免疫化後の適切なタイミングで、例えば、抗Ｃｃｄｃ８０抗体力価が最大である時点で、抗体を生産している細胞を被験体から得ることができ、標準的な技術（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ＧおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−９７（１９７５）に最初に記載されたハイブリドーマ技術（Ｂｒｏｗｎ  ＪＰら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７：５３９−４６（１９８１）；Ｂｒｏｗｎ  ＪＰら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：４９８０−８３（１９８０）；Ｙｅｈ  ＭＹら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：２９２７−３１（１９７９）；Ｙｅｈ  ＭＹら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ２９：２６９−７５（１９８２）もまた参照のこと）、より最近のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ  ＤおよびＲｏｄｅｒ  ＪＣ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ４：７２−７９（１９８３））、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら（１９８５）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、ｐｐ．７７−９６）、またはトリオーマ技術）によってモノクローナル抗体を調製するために使用することができる。モノクローナル抗体ハイブリドーマを生産するための技術は周知である（概要については、Ｒ．Ｈ．Ｋｅｎｎｅｔｈ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  Ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９８０）；Ｌｅｒｎｅｒ  ＥＡ、Ｙａｌｅ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、５４：３８７−４０２（１９８１）；Ｇｅｆｔｅｒ  ＭＬら、Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．３：２３１−３６（１９７７）を参照のこと）。簡単に説明すると、不死化細胞株（通常は、骨髄腫）が、上記に記載されたようにＣｃｄｃ８０免疫原で免疫化された哺乳動物に由来するリンパ球（通常は、脾細胞）に融合させられ、得られるハイブリドーマ細胞の培養上清が、Ｃｃｄｃ８０ポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを同定するためにスクリーニングされる。
【０１３７】
リンパ球と不死化細胞株を融合させるために使用される多くの周知のプロトコールのうちの任意のものを、抗Ｃｃｄｃ８０モノクローナル抗体を作製する目的に適応することができる（例えば、Ｇａｌｆｒｅ  Ｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ２６６：５５０−５２（１９７７）；Ｇｅｉｆｅｒ  ＭＬら、前出；Ｌｅｒｎｅｒ  ＥＡ、前出；Ｋｅｎｎｅｔｈ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、前出を参照のこと）。さらに、当業者は、そのような方法の多くのバリエーションが存在し、これらもまた有用であることを理解するであろう。通常、不死化細胞株（例えば、骨髄腫細胞株）は、リンパ球のような同じ哺乳動物種から誘導される。例えば、マウスハイブリドーマは、本発明の免疫原性調製物で免疫化されたマウスに由来するリンパ球を、不死化マウス細胞株と融合させることによって作製することができる。好ましい不死化細胞株は、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含む培養培地（「ＨＡＴ培地」に選択性がある、マウス骨髄腫細胞株である。多数の骨髄腫細胞株のうちの任意のものを、標準的な技術にしたがって融合パートナー（例えば、Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３またはＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４骨髄腫株）として使用することができる。これらの骨髄腫株は、ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄから入手することができる。通常、ＨＡＴ感受性マウス骨髄腫細胞は、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）を使用してマウス脾臓細胞に融合させられる。融合によって得られたハイブリドーマ細胞は、その後、融合していない、または非生産的に融合された骨髄腫細胞を死滅させるＨＡＴ培地を使用して選択される（融合していない脾臓細胞はそれらは形質転換されないので、数日後に死滅する）。本発明のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞は、Ｃｃｄｃ８０分子に結合する抗体についてハイブリドーマ培養上清を、例えば、標準的なＥＬＩＳＡアッセイを使用してスクリーニングすることによって検出される。
【０１３８】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを調製する代わりに、モノクローナル抗Ｃｃｄｃ８０抗体を同定し、組み換え体である組み合わせ免疫グロブリンライブラリー（例えば、抗体ファージディスプレイライブラリー）をＣｃｄｃ８０を用いてスクリーニングし、それによりＣｃｄｃ８０ポリペプチドに結合する免疫グロブリンライブラリーメンバーを単離することによって単離することができる。ファージディスプレイライブラリーを作製し、スクリーニングするためのキットは市販されている（例えば、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号２７−９４００−０１）。さらに、抗体ディスプレオライブラリーを作製し、スクリーニングする用途に特に適している方法と試薬の例は、例えば、以下に見ることができる：米国特許第５，２２３，４０９号；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９１／１７２７１；ＷＯ９２／２０７９１；ＷＯ９２／１５６７９；ＷＯ９３／０１２８８；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／０９６９０；ＷＯ９０／０２８０９；Ｆｕｃｈｓ  Ｐら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎ．Ｙ．）９：１３７０−７２（１９９１）；Ｈａｙ  ＢＮら、Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３：８１−８５（１９９２）；Ｈｕｓｅ  ＷＤら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−８１（１９８９）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ＡＤら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５−３４（１９９３）；Ｈａｗｋｉｎｓ  ＲＥら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−９６（１９９２）；Ｃｌａｒｋｓｏｎ  Ｔら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−２８（１９９１）；Ｇｒａｍ  Ｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：３５７６−８０（１９９２）；Ｇａｒｒａｒｄ  ＬＪら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎ．Ｙ．）９：１３７３−７７（１９９１）；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ＨＲら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：４１３３−３７（１９９１）；Ｂａｒｂａｓ  ＣＦら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：７９７８−８２（１９９１）；およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  Ｊら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５４（１９９０）。
【０１３９】
さらに、ヒト部分とヒト以外の部分の両方を含む組み換え体抗Ｃｃｄｃ８０抗体（例えば、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体）を、当該分野で公知の組み換えＤＮＡ技術によって、例えば、以下に記載されている方法を使用して生産することができる：ＷＯ８７／０２６７１；ＥＰ  ０  １８４  １８７；ＥＰ  ０  １７１  ４９６；ＥＰ  ０  １７３  ４９４；ＷＯ８６／０１５３３；米国特許第４，８１６，５６７号；ＥＰ  ０  １２５  ０２３；Ｂｅｔｔｅｒ  Ｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−４３（１９８８）；Ｌｉｕ  ＡＹら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：３４３９−４３（１９８７）；Ｌｉｕ  ＡＹら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１−２６（１９８７）；Ｓｕｎ  ＬＫら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：２１４−１８（１９８７）；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  Ｙら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：９９９−１００５（１９８７）；Ｗｏｏｄ  ＣＲら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４４６−４９（１９８５）；Ｓｈａｗ  ＤＲら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８０：１５５３−５９（１９８８）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＳＬ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２−０７（１９８５）；米国特許第５，２２５，５３９号；Ｖｅｒｈｏｃｙａｎ  Ｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−３６（１９８８）；およびＢｅｉｄｌｅｒ  ＣＢら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３−６０（１９８８）。
【０１４０】
加えて、ヒト化抗体は、米国特許第５，５６５，３３２号に開示されているプロトコールのような標準的なプロトコールにしたがって作製することができる。別の実施形態においては、抗体鎖または特異的結合対メンバーは、例えば、米国特許第５，５６５，３３２号；同第５，８７１，９０７号；または同第５，７３３，７４３号に記載されているような当該分野で公知の技術を使用して、特異的な結合対メンバーのポリペプチド鎖と１つの結合対メンバーの第２のポリペプチド鎖をコードする核酸分子を含む複製可能遺伝子ディスプレイパッケージおよびベクターの成分との融合体をコードする核酸分子を含むベクター間での組み換えによって生産することができる。
【０１４１】
抗Ｃｃｄｃ８０抗体（例えば、モノクローナル抗体）を、標準的な技術（例えば、アフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降）によってＣｃｄｃ８０ポリペプチドを単離するために使用することができる。抗Ｃｃｄｃ８０抗体は、細胞に由来する天然のＣｃｄｃ８０ポリペプチドの、および宿主細胞中で発現された組み換え生産されたＣｃｄｃ８０ポリペプチドの精製を容易にすることができる。さらに、抗Ｃｃｄｃ８０抗体は、Ｃｃｄｃ８０タンパク質を（例えば、細胞溶解物または細胞上清中で）検出するために使用することができる。検出は、検出可能な物質に抗体を結合させること（すなわち、物理的に連結させること）によって容易になる場合がある。したがって、１つの実施形態においては、本発明の抗Ｃｃｄｃ８０抗体は検出可能な物質で標識される。検出可能な物質の例としては、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、および放射性物質が挙げられる。適当な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられる。適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンが挙げられる。発光物質の例としては、ルミノールが挙げられる。適切な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが挙げられる。
【０１４２】
いくつかの実施形態においては、細胞外Ｃｃｄｃ８０を認識する抗体をＣｃｄｃ８０タンパク質活性を阻害するために使用される。例えば、可溶性（分泌型）Ｃｃｄｃ８０タンパク質を生産するためには、Ｃｃｄｃ８０−Ｆｃ融合タンパク質をＰＣＲによって作製し、配列決定し、そして発現ベクターにクローニングし、その後、ＣＨＯ細胞のような細胞にトランスフェクトすることができる。可溶性Ｃｃｄｃ８０−Ｆｃ融合タンパク質はトランスフェクトされた細胞によって培養培地に分泌され、その後、例えば、当該分野で周知の方法にしたがってプロテインＡクロマトグラフィーを使用することによって培養培地から精製される。被験体（例えば、ウサギ、ラット、またはマウス）が、その後、アジュバントと混合された精製されたＣｃｄｃ８０−Ｆｃ融合タンパク質で免疫化され得る。免疫化された被験体（単数または複数）の血清中の抗Ｃｃｄｃ８０抗体力価は、標準的な技術によって（例えば、固定されたＣｃｄｃ８０ポリペプチドを使用する酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて）経時的にモニターすることができる。
【０１４３】
細胞外Ｃｃｄｃ８０ポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体分子は、免疫化された哺乳動物から（例えば、血清から）単離することができ、ＩｇＧ画分を得るためのプロテインＡクロマトグラフィーのような周知の技術によってさらに精製することができる。あるいは、抗Ｃｃｄｃ８０モノクローナル抗体が作製される場合もある。例えば、最も高い抗Ｃｃｄｃ８０特異的応答を有している免疫化された被験体の脾臓に由来する細胞を、標準的な技術（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ＧおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−９７（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ技術）によってモノクローナル抗体を調製するために使用することができる。細胞外Ｃｃｄｃ８０またはその細胞外ドメインを認識するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、細胞外Ｃｃｄｃ８０タンパク質の機能的活性を阻害するために使用することができる。
【０１４４】
さらなる実施形態においては、細胞内Ｃｃｄｃ８０を認識する抗Ｃｃｄｃ８０抗体を、例えば、Ｃｃｄｃ８０タンパク質活性を阻害するために細胞内で使用することができる。細胞中のタンパク質機能を阻害するために細胞内抗体を使用することは当該分野で公知である（例えば、Ｃａｒｌｓｏｎ  ＪＲ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：２６３８−４６（１９８８）；Ｂｉｏｃｃａ  Ｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．９：１０１−０８（１９９０）；Ｗｅｒｇｅ  ＴＭら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２７４：１９３−９８（１９９０）；Ｃａｒｌｓｏｎ  ＪＲ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：７４２７−２８（１９９３）；Ｍａｒａｓｃｏ  ＷＡら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：７８８９−９３（１９９３）；Ｂｉｏｃｃａ  Ｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎ．Ｙ．）１２：３９６−９９（１９９４）；Ｃｈｅｎ  Ｓ−Ｙら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：５９５−６０１（１９９４）；Ｄｕａｎ  Ｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：５０７５−７９（１９９４）；Ｃｈｅｎ  Ｓ−Ｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：５９３２−３６（１９９４）；Ｂｅｅｒｌｉ  ＲＲら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２３９３１−３６（１９９４）；Ｂｅｅｒｌｉ  ＲＲら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０４：６６６−７２（１９９４）；Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒ  ＡＭら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：１５４２−５１（１９９５）；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ  ＪＨら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：３１３７−４１（１９９５）；ＷＯ９４／０２６１０；およびＷＯ９５／０３８３２を参照のこと）。
【０１４５】
１つの実施形態においては、ベクターが細胞に導入されると、抗体鎖が機能的抗体として細胞によって発現される形態の抗体鎖をコードする組み換え体発現ベクターが調製される。分泌されたＣｃｄｃ８０活性の阻害のためには、Ｃｃｄｃ８０に特異的に結合する抗体は細胞外Ｃｃｄｃ８０を認識し、細胞から分泌されることが好ましい。例えば、発現プラスミドは、Ｆｃ融合タンパク質の作製を容易にするために使用することができる。この場合、融合タンパク質は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃ領域に融合させられた抗Ｃｃｄｃ８０抗体のＦａｂ領域からなるキメラタンパク質である。Ｆｃ領域は抗体の検出のための手段を提供する。いくつかのさらなる実施形態においては、細胞によって発現された抗体は細胞内Ｃｃｄｃ８０を認識することができる。本発明の阻害方法によるＣｃｄｃ８０活性の阻害のためには、Ｃｃｄｃ８０タンパク質に特異的に結合する細胞内抗体が細胞から分泌されることが好ましい。
【０１４６】
抗体発現ベクターを調製するためには、目的の標的タンパク質（例えば、Ｃｃｄｃ８０）に特異的な抗体鎖をコードする抗体の軽鎖および重鎖ｃＤＮＡが、通常は、Ｃｃｄｃ８０タンパク質に特異的なモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマから単離される。抗Ｃｃｄｃ８０モノクローナル抗体または組み換え体抗Ｃｃｄｃ８０モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマは上記のように調製することができる。一旦、Ｃｃｄｃ８０タンパク質に特異的なモノクローナル抗体（例えば、ハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体または組み合わせライブラリー由来の組み換え体抗体のいずれか）が同定されると、モノクローナル抗体の軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡが標準的な分子生物学的技術によって単離される。ハイブリドーマ由来の抗体については、軽鎖および重鎖のｃＤＮＡは、例えば、ＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングによって得ることができる。組み換え体抗体（例えば、ファージディスプレイライブラリーに由来する）については、ライブラリースクリーニングプロセスの間に単離された軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡをディスプレイパッケージ（例えば、ファージ）から回収することができる。ＰＣＲプライマーまたはｃＤＮＡライブラリープローブをそれから調製することができる抗体の軽鎖および重鎖遺伝子のヌクレオチド配列は当該分野で公知である。例えば、多くのそのような配列は、Ｋａｂａｔ  ＥＡら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２に、そして「Ｖｂａｓｅ」ヒト生殖細胞系列配列データベースに開示されている。
【０１４７】
一旦得られれば、抗体の軽鎖および重鎖の配列は標準的な方法を使用して組み換え体発現ベクターにクローニングされる。抗体発現ベクターは、いくつかの様々な形態のうちの１つで抗体をコードすることができる。例えば、１つの実施形態においては、ベクターは全長の抗体軽鎖と重鎖をコードし、その結果、全長の抗体が発現される。細胞中のＣｃｄｃ８０活性を阻害するためには、抗Ｃｃｄｃ８０細胞内または細胞外抗体をコードする発現ベクターが、本明細書中で議論されるような標準的なトランスフェクション方法によって細胞に導入される。
【０１４８】
ＩＶ．組み換え体発現ベクターおよび宿主細胞
組み換え体発現ベクターには、宿主細胞中での核酸の発現に適している形態で核酸が含まれ得る。これは、組み換え体発現ベクターに、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択された１つ以上の調節配列（これは、発現させられる核酸配列に動作可能であるように連結されている）が含まれることを意味する。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサー、および他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むように意図される。そのような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている。調節配列には、多くのタイプの宿主細胞の中でヌクレオチド配列の構成的発現を指示するもの、および特定の宿主細胞の中でのみヌクレオチド配列の発現を指示するもの（例えば、組織特異的調節配列）が含まれる。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望されるタンパク質の発現レベルなどの要因によって様々であり得ることは当業者に明らかであろう。本発明の発現ベクターは宿主細胞に導入することができ、それによって、融合タンパク質またはペプチドを含む本明細書中に記載される核酸によってコードされるタンパク質またはペプチド（例えば、Ｃｃｄｃ８０タンパク質、Ｃｃｄｃ８０タンパク質の変異体形態、融合タンパク質など）を生産することができる。
【０１４９】
組み換え体発現ベクターは、原核生物細胞または真核生物細胞中でのタンパク質またはタンパク質断片の発現のために設計することができる。例えば、Ｃｃｄｃ８０タンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用する）、酵母細胞、または哺乳動物細胞の中で発現させることができる。適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）の中でさらに議論されている。あるいは、組み換え体発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列とＴ７ポリメラーゼを使用して、インビトロで転写し、翻訳することができる。
【０１５０】
原核生物細胞中でのタンパク質の発現は、融合タンパク質または非融合タンパク質のいずれかの発現を指示する構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含むベクターを用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の中で最も頻繁に行われている。融合ベクターは、その中でコードされるタンパク質に対して、通常は、組み換え体タンパク質のアミノ末端に対して多数のアミノ酸を付加する。そのような融合ベクターは、通常、以下の３つの目的を果たす：１）組み換え体タンパク質の発現を増大させること；２）組み換え体タンパク質の溶解度を高めること；および３）親和性精製におけるリガンドとして作用することにより組み換え体タンパク質の精製を助けること。多くの場合には、融合体発現ベクターにおいては、融合タンパク質の精製後に融合部分から組み換え体タンパク質を分離することができるように、原核生物の切断部位が融合部分と組み換え体タンパク質の連結部位に導入される。そのような酵素、およびそれらの同族の認識配列には、Ｘａ因子、トロンビン、およびエンテロキナーゼが含まれる。代表的な融合体発現ベクターとしては、例えば、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．；Ｓｍｉｔｈ  ＤＢおよびＪｏｈｎｓｏｎ  ＫＳ、Ｇｅｎｅ  ６７：３１−４０（１９８８））およびｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｓｓ．）が挙げられる。これらは、標的である組み換え体タンパク質に対して、それぞれ、遊離のグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはマルトースＥ結合タンパク質を融合させる。
【０１５１】
適切な誘導性非融合大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎ  Ｅら、Ｇｅｎｅ  ６９：３０１−１５（１９８８））およびｐＥＴ１１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）ｐｐ．６０−８９）が挙げられる。ｐＴｒｃベクターからの標的遺伝子の発現は、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写に依存する。ｐＥＴ１１ｄベクターからの標的遺伝子の発現は、同時発現されるウイルスＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７  ｇｎ１）によって媒介されるＴ７  ｇｎ１０−ｌａｃ融合プロモーターからの転写に依存する。このウイルスポリメラーゼは、ｌａｃＵＶ５プロモーターの転写制御下にＴ７  ｇｎ１遺伝子を持つ内在性のプロファージによって、宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）により供給される。
【０１５２】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の中での組み換え体タンパク質の発現を最大にするための１つの方法論は、組み換え体タンパク質をタンパク質分解により切断する能力が低下した宿主細菌の中でタンパク質を発現させることである（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ  Ｓ、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）ｐｐ．１１９−２８）。別の方法論は、それぞれのアミノ酸についての個々のコドンが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の中で優先的に利用されるものになるように、発現ベクター中に挿入される核酸の核酸配列を変化させることである（Ｗａｄａ  Ｋら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０（Ｓｕｐｐｌ．）：２１１１−１８（１９９２））。本発明の核酸配列のそのような変更は、標準的なＤＮＡ合成技術によって行うことができる。
【０１５３】
別の実施形態においては、発現ベクターは酵母発現ベクターである。酵母サッカロマイセス・セレビッシェ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の中での発現のためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ  Ｃら、ＥＭＢＯ  Ｊ．６：２２９−３４（１９８７））、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ  ＪおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ  Ｉ、Ｃｅｌｌ  ３０：９３３−４３（１９８２））、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ  ＬＤら、Ｇｅｎｅ  ５４：１１３−２３（１９８７））、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）、およびｐｉｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ）が挙げられる。
【０１５４】
あるいは、タンパク質またはポリペプチドはバキュロウイルス発現ベクターを使用して昆虫細胞の中で発現させることができる。培養された昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）の中でのタンパク質の発現のために利用できるバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈ  ＧＥら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６−６５（１９８３））、およびｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ  ＶＡおよびＳｕｍｍｅｒｓ  ＭＤ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０：３１−３９（１９８９））が挙げられる。
【０１５５】
なお別の実施形態においては、核酸は哺乳動物発現ベクターを使用して哺乳動物細胞の中で発現させられる。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ  Ｂ、Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：８４０−４１（１９８７））およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ  ＲＪら、ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１８７−９５（１９８７））が挙げられる。哺乳動物細胞の中で使用される場合は、発現ベクターの制御機能は、多くの場合にはウイルス調節エレメントによって提供される。例えば、一般的に使用されているプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、およびシミアンウイルス４０に由来する。原核生物細胞および真核生物細胞の両方についての他の適切な発現システムについては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．、およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９の第１６章と１７章を参照のこと。
【０１５６】
別の実施形態においては、組み換え体哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞のタイプの中で優先的に核酸の発現を指示することができる（例えば、組織特異的調節エレメントが核酸を発現させるために使用される）。組織特異的調節エレメントは当該分野で公知である。適切な組織特異的プロモーターの限定ではない例としては、以下が挙げられる：アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔ  ＣＡら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１：２６８−７７（１９８７））、リンパ特異的プロモーター（Ｃａｌａｍｅ  ＫおよびＥａｔｏｎ  Ｓ、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５−７５（１９８８））、特に、Ｔ細胞受容体のプロモーター（Ｗｉｎｏｔｏ  ＡおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ  Ｄ、ＥＭＢＯ  Ｊ．８：７２９−３３（１９８９））および免疫グロブリンのプロモーター（Ｂａｎｅｒｊｉ  Ｊら、Ｃｅｌｌ  ３３：７２９−４０（１９８３）；Ｑｕｅｅｎ  ＣおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ  Ｄ、Ｃｅｌｌ  ３３：７４１−４８（１９８３））、ニューロン特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター；Ｂｙｒｎｅ  ＧＷおよびＲｕｄｄｌｅ  ＦＨ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：５４７３−７７（１９８９））、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄ  Ｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：９１２−１６（１９８５））、および乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号およびＥＰ  ０  ２６４  １６６）。発生過程で調節されるプロモーター（例えば、マウスｈｏｘプロモーター（Ｋｅｓｓｅｌ  ＭおよびＧｒｕｓｓ  Ｐ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３７４−７９（１９９０））およびα−フェトプロテインプロモーター（Ｃａｍｐｅｒ  ＳＡおよびＴｉｌｇｈｍａｎ  ＳＭ、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．３：５３７−４６（１９８９）））もまた含まれる。
【０１５７】
さらに、哺乳動物細胞中で使用される誘導性の調節システムが当該分野で公知である。例えば、遺伝子発現が、重金属イオンによって調節される（例えば、Ｍａｙｏ  ＫＥら、Ｃｅｌｌ  ２９：９９−１０８（１９８２）；Ｂｒｉｎｓｔｅｒ  ＲＬら、Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２（１９８２）；Ｓｅａｒｌｅ  ＰＦら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１４８０−８９（１９８５）を参照のこと）、熱ショックによって調節される（例えば、Ｎｏｕｅｒ  Ｌら（１９９１）、Ｈｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ、Ｎｏｕｅｒ  Ｌ．編、ＣＲＣ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．、ｐｐ．１６７−２２０を参照のこと）、ホルモンによって調節される（例えば、Ｌｅｅ  Ｆら、Ｎａｔｕｒｅ  ２９４：２２８−３２（１９８１）；Ｈｙｎｅｓ  ＮＥら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：２０３８−４２（１９８１）；Ｋｌｏｃｋ  Ｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：７３４−３６（１９８７）；Ｉｓｒａｅｌ  ＤＩおよびＫａｕｆｍａｎ  ＲＪ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：２５８９−２６０４（１９８９）；ＷＯ９３／２３４３１を参照のこと）、ＦＫ５０６関連分子によって調節される（例えば、ＷＯ９４／１８３１７を参照のこと）、またはテトラサイクリンによって調節される（Ｇｏｓｓｅｎ  ＭおよびＢｕｊａｒｄ  Ｈ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５５４７−５１（１９９２）；Ｇｏｓｓｅｎ  Ｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：１７６６−６９（１９９５）；ＷＯ９４／２９４４２；ＷＯ９６／０１３１３）システムが当該分野で公知である。したがって、別の実施形態においては、本発明により、ＤＮＡが誘導性の真核生物プロモーターに動作可能であるように連結され、それによって真核生物細胞の中でタンパク質の誘導性発現が可能である、組み換え体発現ベクターが提供される。
【０１５８】
１アームの（ｏｎｅ−ａｒｍ）相同組み換えを使用して内因性タンパク質を発現させるための方法もまた当該分野で公知である（例えば、米国特許出願公開番号２００５／０００３３６７；Ｚｅｈら、Ａｓｓａｙ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１：７５５−６５（２００３）；Ｑｕｒｅｓｈｉら、Ａｓｓａｙ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１：７６７−７６（２００３）を参照のこと）。簡単に説明すると、標的化配列に動作可能であるように連結されたプロモーターを含む単離されたゲノム構築物は、細胞の均質な集団（例えば、ヒト細胞株の均質な集団）に導入される。プロモーターは、標的遺伝子については異種なものである。組み換え後、プロモーターは、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの転写を制御する。その後、細胞の集団は、ポリペプチドの発現を生じる条件下でインキュベートされる。
【０１５９】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換またはトランスフェクション技術によって、原核生物細胞または真核生物細胞に導入することができる。本明細書中で使用される場合は、用語「形質転換」と「トランスフェクション」は、宿主細胞の中に外来核酸（例えば、ＤＮＡ）を導入するための様々な当該分野で理解されている技術をいうように意図され、これには、例えば、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションが含まれる。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションするための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９）および他の実験室マニュアルに見ることができる。
【０１６０】
哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションのためには、使用される発現ベクターとトランスフェクション技術によっては、極少量の細胞だけに、それらのゲノムに外来ＤＮＡを組み込まれる場合があることが公知である。これらの組み込み体を同定し、選択するためには、選択マーカー（例えば、抗生物質耐性）をコードする遺伝子が、通常は、目的の遺伝子とともに宿主細胞に導入される。好ましい選択マーカーとしては、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、およびメトトレキセートのような、薬物に対する耐性を付与するマーカーが挙げられる。選択マーカーをコードする核酸分子は、タンパク質をコードするベクターと同じベクター上で宿主細胞に導入することができ、また、別のベクター上で導入することもできる。導入された核酸分子で安定にトランスフェクトされた細胞は、薬物選択によって同定することができる（例えば、選択マーカー遺伝子が組み込まれた細胞は生存するであろうが、他の細胞は死滅する）。
【０１６１】
Ｃｃｄｃ８０で安定にトランスフェクトされた、例えば、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＣＨＯ、ＣＯＳ、Ｃ２Ｃ１２、３Ｔ３−Ｌ１、または間葉系幹細胞の場合には、そのような株は、Ｃｃｄｃ８０遺伝子が、例えば、Ｔｅｔ−ｏｎ／Ｔｅｔ−ｏｆｆシステムを使用して誘導できるように作製される。
【０１６２】
Ｖ．本発明の使用および方法
本明細書中に記載されるＣｃｄｃ８０調節因子は、以下の方法の１つ以上において使用することができる：ａ）好ましくは、脂肪細胞性の細胞の中での処置方法；ｂ）スクリーニングアッセイ；ｃ）予測医薬（例えば、診断アッセイ、予後診断アッセイ、臨床試験のモニタリング、または薬物動態学）。単離された本発明の核酸分子は、例えば、以下にさらに記載されるように、（例えば、遺伝子治療用途において宿主細胞中の組み換え体発現ベクターにより）Ｃｃｄｃ８０タンパク質を発現させるために、および、Ｃｃｄｃ８０活性を調節するために使用することができる。加えて、Ｃｃｄｃ８０タンパク質は、自然界に存在しているＣｃｄｃ８０結合タンパク質をスクリーニングするために、Ｃｃｄｃ８０活性を調節する薬物または化合物をスクリーニングするために、さらには、Ｃｃｄｃ８０の調節により利点が得られる障害（例えば、Ｃｃｄｃ８０タンパク質の生産の不足もしくは過剰生産、またはＣｃｃ８０野生型タンパク質と比較して活性が低いかもしくは異常な活性を有しているＣｃｄｃ８０タンパク質形態の生産を特徴とする）を処置するために使用することができる。いくつかの実施形態においては、本発明の方法（例えば、Ｃｃｄｃ８０の検出、調節など）は、脂肪細胞性の細胞の中で行われる。
【０１６３】
Ａ．Ｃｃｄｃ８０の調節方法
１つの調節方法にしたがうと、Ｃｃｄｃ８０活性は、細胞を刺激因子と接触させることによって細胞の中で刺激される。そのような刺激因子の例としては、活性なＣｃｄｃ８０タンパク質、およびＣｃｄｃ８０をコードする核酸分子が挙げられる。これらは、細胞中のＣｃｄｃ８０活性を増大させるために細胞に導入される。細胞中でＣｃｄｃ８０タンパク質を発現させるためには、通常、Ｃｃｄｃ８０ｃＤＮＡは、最初に、本明細書中に記載されるように、標準的な分子生物学の技術を使用して組み換え体発現ベクターに導入される。Ｃｃｄｃ８０ｃＤＮＡは、例えば、ＰＣＲを使用する増幅によって、または本明細書中に記載されるような適切なｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングによって得ることができる。Ｃｃｄｃ８０ｃＤＮＡの単離または増幅の後、本明細書中に記載されるように、標準的な方法によってＤＮＡ断片が発現ベクターに導入され、標的細胞にトランスフェクトされる。Ｃｃｄｃ８０タンパク質の活性および／または発現を刺激するために使用することができる他の刺激因子は、前脂肪細胞の増殖および／または脂質の蓄積のＣｃｄｃ８０による調節に影響を与える化合物のような、細胞中のＣｃｄｃ８０活性および／または発現を刺激する化合物である。そのような化合物は、本明細書中に詳細に記載されるように、そのような化合物を選択するスクリーニングアッセイを使用して同定することができる。
【０１６４】
調節方法は、インビトロで行うことができ（例えば、細胞を薬剤とともに培養することによるか、または培養物中の細胞に薬剤を導入することによる）、また代わりに、インビボで行うこともできる（例えば、被験体に薬剤を投与することによるか、または被験体の細胞に薬剤を導入することによる、例えば、遺伝子治療による）。インビトロで調節方法を実施するためには、細胞は、標準的な方法によって被験体から得ることができ、そしてインビトロで、細胞中のＣｃｄｃ８０活性を調節する調節試薬とともにインキュベートする（すなわち、培養する）ことができる。脂質生成のＣｃｄｃ８０調節因子はまた、培養物中の単離された前脂肪細胞または脂肪細胞（例えば、３Ｔ３−Ｌ１、３Ｔ３  Ｆ４２２Ａ、ｏｂ  １７７１、またはＣｃｄｃ８０を過剰発現するように誘導することができるトランスジェニック動物由来の前脂肪細胞および脂肪細胞）の分化を誘導するかあるいは阻害するために使用することができる。単離された前脂肪細胞もしくは脂肪細胞にＣｃｄｃ８０調節因子を投与すること、およびインビトロの細胞の分化を観察することは、当業者の能力の範囲内である（例えば、実施例４を参照のこと）。
【０１６５】
核酸を含む試薬（Ｃｃｄｃ８０タンパク質、アンチセンスＲＮＡ、細胞内抗体、または優性陰性阻害剤をコードする組み換え体発現ベクターを含む）については、試薬は、インビボで細胞に核酸（例えば、ＤＮＡ）を導入するための当該分野で公知の方法を使用して被験体の細胞に導入することができる。そのような方法の例には、以下を含む非ウイルス法とウイルス法の両方が含まれる：
直接注入：裸のＤＮＡを、細胞にＤＮＡを直接注入することによってインビボで細胞に導入することができる（例えば、Ａｃｓａｄｉ  Ｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：８１５−１８（１９９１）；Ｗｏｌｆｆ  ＪＡら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１４６５−６８（１９９０）を参照のこと）。例えば、インビボで細胞にＤＮＡを注入するための送達装置（例えば、「遺伝子銃」）を使用することができる。そのような装置は（例えば、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆから）市販されている。
【０１６６】
陽イオン脂質：裸のＤＮＡは、ＤＮＡを陽イオン性脂質と複合体形成させることにより、またはＤＮＡを陽イオン性リポソーム中にカプセル化することにより、インビボで細胞に導入することができる。適切な陽イオン性脂質処方物の例としては、Ｎ−［−１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）、および１：１モル比の１，２−ジミリスチルオキシ−プロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロマイド（ＤＭＲＩＥ）、およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）（例えば、Ｌｏｇａｎ  ＪＪら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：３８−４９（１９９５）；Ｓａｎ  Ｈら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４：７８１−８８（１９９３）を参照のこと）が挙げられる。
【０１６７】
受容体によって媒介されるＤＮＡの取り込み：裸のＤＮＡはまた、ポリリジンのような陽イオン（これは細胞表面受容体のリガンドに結合させられる）に対してＤＮＡを複合体形成させることによって、インビボで細胞に導入することもできる（例えば、Ｗｕ  ＧＹおよびＷｕ  ＣＨ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１−２４（１９８８）；Ｗｉｌｓｏｎ  ＪＭら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３−６７（１９９２）；および米国特許第５，１６６，３２０を参照のこと）。ＤＮＡ−リガンド複合体の受容体への結合は、受容体によって媒介されるエンドサイトーシスによるＤＮＡの取り込みを促進する。本来エンドソームを破壊し、それによって細胞質中に物質を放出するアデノウイルスキャプシドに連結させられたＤＮＡ−リガンド複合体を、細胞内リソソームによる複合体の分解を回避するために使用することができる（例えば、Ｃｕｒｉｅｌ  ＤＴら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８８５０−５４（１９９１）；Ｃｒｉｓｔｉａｎｏ  ＲＪら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２１２２−２６（１９９３）を参照のこと）。
【０１６８】
レトロウイルス：欠損レトロウイルスは、遺伝子治療目的のための遺伝子導入での使用について十分に特性決定されている（概要については、Ｍｉｌｌｅｒ  ＡＤ、Ｂｌｏｏｄ  ７６：２７１−７８（１９９０）を参照のこと）。目的のヌクレオチド配列をレトロウイルスゲノムに取り込ませた組み換え体レトロウイルスを構築することができる。さらに、レトロウイルスゲノムの一部を、レトロウイルスの複製を欠損させるために除去することができる。その後、複製欠損レトロウイルスがビリオンにパッケージされ、これは、標準的な技術によるヘルパーウイルスの使用を通じて標的細胞を感染させるために使用することができる。組み換え体レトロウイルスを生産するため、およびインビトロもしくはインビボで細胞をそのようなウイルスに感染させるためのプロトコールは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌ  ＦＭら（編）Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、（１９８９）、セクション９．１０−９．１４および他の標準的な実験室マニュアルに見ることができる。適切なレトロウイルスの例としては、当業者に周知であるｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥ、およびｐＥＭが挙げられる。適切なパッケージングウイルス株の例としては、ψＣｒｉｐ、ψＣｒｅ、ψ２、およびψＡｍが挙げられる。レトロウイルスは、インビトロおよび／またはインビボで、多くの異なる細胞のタイプ（上皮細胞、内皮細胞、リンパ球、筋芽細胞、肝細胞、骨髄細胞を含む）に様々な遺伝子を導入するために使用されている（例えば、Ｅｇｌｉｔｉｓ  ＭＡら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１３９５−９８（１９８５）；Ｄａｎｏｓ  ＯおよびＭｕｌｌｉｇａｎ  ＲＣ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：６４６０−６４（１９８８）；Ｗｉｌｓｏｎ  ＪＭら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：３０１４−１８（１９８８）；Ａｒｍｅｎｔａｎｏ  Ｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：６１４１−４５（１９９０）；Ｈｕｂｅｒ  ＢＥら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８０３９−４３（１９９１）；Ｆｅｒｒｙ  Ｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８３７７−８１（１９９１）；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ  ＪＲら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１８０２−０５（１９９１）；ｖａｎ  Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍ  ＶＷら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：７６４０−４４（１９９２）；Ｋａｙ  ＭＡら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３：６４１−４７（１９９２）；Ｄａｉ  Ｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０８９２−９５（１９９２）；Ｈｗｕ  Ｐら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：４１０４−１５（１９９３）；米国特許第４，８６８，１１６号；米国特許第４，９８０，２８６号；ＷＯ８９／０７１３６；ＷＯ８９／０２４６８；ＷＯ８９／０５３４５；およびＷＯ９２／０７５７３を参照のこと）。レトロウイルスベクターには、細胞に核酸を安定に導入するためにレトロウイルスゲノム（およびそれに挿入された外来核酸）が宿主ゲノム中に組み込まれるために、標的細胞の分裂が必要である。したがって、標的細胞の複製を刺激することが必要な場合がある。
【０１６９】
アデノウイルス：アデノウイルスのゲノムは、これが目的の遺伝子産物をコードし、それを発現するが、正常な溶解性のウイルスの生活環においてそれが複製する能力に関しては不活化させられるように操作することができる（例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒ  ＫＬ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６−２９（１９８８）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ＭＡら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１−３４（１９９１）；およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄ  ＭＡら、Ｃｅｌｌ  ６８：１４３−５５（１９９２）を参照のこと）。アデノウイルス株Ａｄタイプ５ｄ１３２４または他のアデノウイルス株（例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７など）に由来する適切なアデノウイルスベクターは当業者に周知である。組み換え体アデノウイルスは、これらが有効な遺伝子送達担体であるためには分裂中の細胞を必要とせず、多種多様な細胞のタイプ（気道上皮細胞（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ＭＡら、Ｃｅｌｌ  ６８：１４３−５５（１９９２））、内皮細胞（Ｌｅｍａｒｃｈａｎｄ  Ｐら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：６４８２−８６（１９９２））、肝細胞（Ｈｅｒｚ  ＪおよびＧｅｒａｒｄ  ＲＤ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２８１２−１６（１９９３））、および筋細胞（Ｑｕａｎｔｉｎ  Ｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：２５８１−８４（１９９２））を含む）を感染させるために使用できる点で有利である。さらに、導入されたアデノウイルスＤＮＡ（およびその中に含まれる外来ＤＮＡ）は宿主細胞のゲノムには組み込まれず、エピソームに留まり、それによって、導入されたＤＮＡが宿主のゲノムに組み込まれる状況（例えば、レトロウイルスＤＮＡ）における挿入突然変異の結果として起こり得る、可能性がある問題が回避される。さらに、外来ＤＮＡについてのアデノウイルスゲノムの運搬能力は、他の遺伝子送達ベクターと比較すると大きい（８キロ塩基まで）（Ｂｅｒｋｎｅｒ  ＫＬら、前出；Ｈａｊ−Ａｈｍａｄ  ＹおよびＧｒａｈａｍ  ＦＬ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７−７４（１９８６））。現在使用されているほとんどの複製欠損アデノウイルスベクターは、ウイルスＥ１およびＥ３遺伝子全体またはそれらの一部について検出されるが、アデノウイルスのゲノム材料の８０％程度の量を保持している。
【０１７０】
アデノ随伴ウイルス：アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は自然界に存在している欠損ウイルスであり、これには、効率的な複製および／または生産性のある生活環のためのヘルパーウイルスとして、別のウイルス（例えば、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）が必要である（概要については、Ｍｕｚｙｃｚｋａ  Ｎ、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７−１２９（１９９２）を参照のこと）。これはまた、そのＤＮＡを分裂していない細胞に組み込むことができ、高い頻度で安定な組み込みを示すいくつかのウイルスのうちの１つでもある（例えば、Ｆｌｏｔｔｅ  ＴＲら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：３４９−５６（１９９２）；Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ＲＪら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−２８（１９８９）；およびＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ  ＳＫら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１９６３−７３（１９８８）を参照のこと）。３００塩基対程度の小さいＡＡＶを含むベクターをパッケージすることができ、組み込むことができる。外因性ＤＮＡについてのスペーサーは約４．５ｋｂに限定される。Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ  ＪＤら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１−６０（１９８５）に記載されているようなＡＡＶベクターを、細胞にＤＮＡを導入するために使用することができる。様々な核酸が、ＡＡＶベクターを使用して様々なタイプの細胞に導入されている（例えば、Ｈｅｒｍｏｎａｔ  ＰＬおよびＭｕｚｙｃｚｋａ  Ｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６４６６−７０（１９８４）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ  ＪＤら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２−８１（１９８５）；Ｗｏｎｄｉｓｆｏｒｄ  ＦＥら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２：３２−３９（１９８８）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ  ＪＤら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：６１１−１９（１９８４）；およびＦｌｏｔｔｅ  ＴＲら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：３７８１−９０（１９９３）を参照のこと）。
【０１７１】
特定の発現ベクターシステムと細胞に核酸を導入する方法の効率は、当該分野で日常的に使用されている標準的なアプローチによって評価することができる。例えば、細胞に導入されたＤＮＡは、フィルターハイブリダイゼーション技術（例えば、サザンブロッティング）によって検出することができ、導入されたＤＮＡの転写によって生産されたＲＮＡは、例えば、ノーザンブロッティング、ＲＮａｓｅ保護、または逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって検出することができる。遺伝子産物は、適切なアッセイによって、例えば、生産されたタンパク質の免疫学的検出によって、例えば、特異的抗体を用いて、あるいは、遺伝子産物の機能的活性を検出するための機能的アッセイによって検出することができる。
【０１７２】
１．予防方法
１つの態様においては、本発明により、Ｃｃｄｃ８０ポリペプチド、Ｃｃｄｃ８０ポリヌクレオチド、またはＣｃｄｃ８０ポリペプチドの発現もしくは少なくとも１つのＣｃｄｃ８０活性を調節する薬剤を被験体に投与することによる、Ｃｃｄｃ８０活性および／もしくは発現の調節が有効であろう疾患または状態（例えば、肥満、インスリン耐性、および／または２型糖尿病）を被験体において予防するための方法が提供される。異常なＣｃｄｃ８０発現または活性によって引き起こされるかあるいはそれらに関係がある疾患のリスクがある被験体は、例えば、当業者に公知の診断アッセイまたは予後診断アッセイのうちのいずれか、あるいはそれらの組み合わせによって同定することができる。予防薬の投与は、Ｃｃｄｃ８０の異常を特徴とする状態の発現の前に行うことができ、その結果、疾患または障害が予防されるか、あるいはその進行が遅らせられる。Ｃｃｄｃ８０の異常または状態のタイプに応じて、例えば、Ｃｃｄｃ８０ポリペプチド、Ｃｃｄｃ８０ポリヌクレオチド、またはＣｃｄｃ８０アゴニスト剤を、被験体を処置するために使用することができる。適切な薬剤は、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイに基づいて決定することができる。
【０１７３】
２．治療方法
本発明の別の態様は、治療目的のためにＣｃｄｃ８０発現または活性を調節する方法に関する。したがって、例示的な実施形態においては、本発明の調節方法には、細胞をＣｃｄｃ８０ポリペプチドまたは細胞と関係しているＣｃｄｃ８０タンパク質の活性の１つ以上を調節する薬剤と接触させる工程が含まれる。Ｃｃｄｃ８０タンパク質活性を調節する薬剤は、本明細書中に記載される薬剤、例えば、核酸またはタンパク質、Ｃｃｄｃ８０タンパク質の自然界に存在している標的分子（例えば、Ｃｃｄｃ８０結合タンパク質）、Ｃｃｄｃ８０アゴニスト、Ｃｃｄｃ８０アゴニストのペプチド模倣物、または他の低分子であり得る。１つの実施形態においては、薬剤は、１つ以上のＣｃｄｃ８０活性を刺激する。そのような刺激因子の例としては、活性なＣｃｄｃ８０タンパク質、および細胞に導入されるＣｃｄｃ８０ポリペプチドをコードする核酸分子が挙げられる。別の実施形態においては、薬剤は１つ以上のＣｃｄｃ８０活性を阻害する。そのような阻害剤の例としては、例えば、アンチセンスＣｃｄｃ８０核酸分子、抗Ｃｃｄｃ８０抗体、およびＣｃｄｃ８０阻害剤が挙げられる。これらの調節方法は、インビトロで（例えば、細胞を薬剤とともに培養することによって）、またはあるいは、インビボで（例えば、薬剤を被験体に投与することによって）行うことができる。このように、本発明により、Ｃｃｄｃ８０タンパク質の調節が有効であろう疾患または障害（例えば、肥満、インスリン耐性、および／または２型糖尿病）、あるいはＣｃｄｃ８０タンパク質もしくは核酸分子の異常な発現または活性を特徴とする疾患または状態に罹患した個体を処置する方法が提供される。１つの実施形態においては、この方法には、Ｃｃｄｃ８０の発現または活性を調節する薬剤（例えば、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイによって同定された薬剤）または複数の薬剤の組み合わせを投与する工程が含まれる。別の実施形態においては、この方法には、Ｃｃｄｃ８０タンパク質または核酸分子を、低下したかまたは異常なＣｃｄｃ８０発現もしくは活性を補うための治療薬として投与する工程が含まれる。
【０１７４】
Ｃｃｄｃ８０活性の刺激は、Ｃｃｄｃ８０が異常にダウンレギュレートされている状況、および／またはＣｃｄｃ８０活性の増大が有用な作用をもたらす可能性がある状況において所望される。同様に、Ｃｃｄｃ８０活性の阻害は、Ｃｃｄｃ８０が異常にダウンレギュレートされている状況、および／またはＣｃｄｃ８０活性の低下が有用な作用をもたらす可能性がある状況において所望される。Ｃｃｄｃ８０の調節が所望されるであろう例示的な状況は、肥満、インスリン耐性、および／または２型糖尿病のような状態の処置である。
【０１７５】
一般的には、脂質生成が関係している疾患には、体重疾患（例えば、肥満および悪液質）、ならびに非震え熱産生および震え熱産生が挙げられる。したがって、１つの態様においては、Ｃｃｄｃ８０調節因子は、体重が関係しているプロセスを調節するために（例えば、肥満および悪液質のような体重疾患、ならびに熱生産の処置を含む）有用である可能性がある。所望される結果に応じて、脂質生成を誘導すると同定されたＣｃｄｃ８０調節因子は体重を増加させるために有用である可能性があり、そして脂質生成を妨害すると同定されたＣｃｄｃ８０調節因子は体重を減少させるために有用である可能性がある。
【０１７６】
肥満については、様々なマーカー（３０以上、または併発状態では２７以上の肥満度指数（ＢＭＩ）を含む）を肥満の患者を決定するために使用することができる。過体重の患者は、２５以上のＢＭＩを有している患者である。併発状態には、心臓血管系の合併症（高血圧およびアテローム性動脈硬化症）、代謝性合併症（糖尿病および異常脂質症）肝臓の合併症（胆道疾患および胆石）、肺の合併症（睡眠時無呼吸および呼吸不全）、ならびに心理学的合併症（自信のなさ、および鬱病）が含まれる。１つの実施形態においては、肥満の処置の成功は、ＢＭＩの５〜１０％、またはそれ以上の低下である。
【０１７７】
脂質生成が関係している疾患にはまた、２型糖尿病、インスリン耐性、異常脂質症、肝臓脂肪症、およびメタボリック症候群も含まれる。特に、マウスにおいては、脂質生成の部分的な阻害が、体重を減少させ、インスリン耐性、血漿の脂質プロフィール、および肝臓脂肪症を改善することが示されている（Ｗｒｉｇｈｔ  ＷＳら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、５６：２９５−３０３（２００７）；Ｒｏｓｅｎ  ＥＤ＆ＭａｃＤｏｕｇａｌｄ  ＯＡ、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７：８８５−９６（２００６）；Ｍｉｌｌｗａｒｄ  ＣＡら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５６：１６１−６７（２００７））。したがって、脂質生成を完全には阻害しないが、減少させる処置が、肥満に関係がある障害（例えば、２型糖尿病、インスリン耐性、異常脂質症、肝臓脂肪症、およびメタボリック症候群）に有効である可能性がある。脂肪細胞の分化を部分的にブロックする有効な作用のうちのいくつかは、脂肪細胞の代謝の変化および／またはアディポカインの分泌の変化によって媒介され得る（Ｍｉｌｌｗａｒｄ  ＣＡら、前出；Ｗｒｉｇｈｔ  ＷＳら、前出）。脂質生成の完全な阻害が有害であり、マウスおよびヒトのいずれにおいても、リボジストロフィー、インスリン耐性、および２型糖尿病のような障害を生じることに留意することが重要である（Ｒｅｉｔｍａｎ  ＭＬ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．２２：４５９−８２（２００２）；Ａｇａｒｗａｌ  ＡＫ＆Ｇａｒｇ  Ａ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．７：１７５−９９（２００６））。Ｃｃｄｃ８０の発現または機能の増大が、これらの状況下では有効である可能性がある。
【０１７８】
加えて、肝臓でのグルコースの生産（ｈｅｐａｔｉｃ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）、空腹時グルコース生産、および全体的な代謝の制御の間には高い相関関係がある（グリコヘモグロビン濃度として評価される場合）（Ｇａｌｌｏｗａｙら、Ｃｌｉｎ．Ｔｈｅｒａｐ．１２：４６０−７２（１９９０））。したがって、空腹時血糖の制御が、高血糖の合併症を予防するために十分な代謝の全体的な正規化を行うためには重要である。
【０１７９】
糖尿病の被験体が被験体であり、例えば、熟練した医師または研究者によって糖尿病であると診断されている（または糖尿病と診断されるであろう）ヒト被験体である。糖尿病の診断に利用される例示的な試験としては、空腹時血漿グルコース（ＦＰＧ）試験およびブドウ糖負荷試験（例えば、７５ｇ経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ））が挙げられる。糖尿病の診断のための例示的な基準が表１に示される。
【０１８０】
【表１】
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インスリン耐性の被験体が被験体であり、例えば、熟練した医師または研究者によってインスリン耐性であると診断されている（またはインスリン耐性と診断されるであろう）ヒト被験体である。インスリン耐性の被験体は、例えば、上記被験体において空腹時血糖および／またはインスリン濃度を決定することによって同定することができる。好ましい実施形態においては、インスリン耐性の被験体は、１１０ｍｇ／ｄＬ未満の空腹時血糖値を有し、３０ｍＵ／Ｌより大きい空腹時インスリン濃度を有する。
【０１８１】
肥満の美容的処置に関して、脂肪の形で過剰な体重を有する被験体は、視覚的に、および／または２５以上のＢＭＩを有していることによって同定することができる。そのような被験体は過体重とみなされ、美容的処置のために体重を制御する必要がある。Ｃｃｄｃ８０遺伝子またはＣｃｄｃ８０タンパク質の発現または活性を調節する薬剤を、これらの被験体の脂肪の形での過体重を減少させるための美容的製品として使用することができる。肥満の美容的処置が必要な被験体にはＣｃｄｃ８０遺伝子またはＣｃｄｃ８０タンパク質の発現または活性を調節する薬剤を含む組成物が投与されるであろう。
【０１８２】
Ｂ．併用療法
Ｃｃｄｃ８０調節因子はまた、他の治療薬（単数または複数）（好ましくは、本発明の方法にしたがって脂質生成と関係がある特定の疾患を処置するために一般的に使用されているもの）と組み合わせて使用される場合もある。２型糖尿病に関する併用療法に適している治療薬としては、例えば、インスリンが挙げられる。本発明の方法および組み合わせとともに有用であるインスリンとしては、即効型インスリン、中間型インスリン、持続型インスリン、および中間型インスリンと持続型インスリンの組み合わせが挙げられる。インスリン療法は、体が生産できないインスリンに取って代わる。即効型または短時間作用型インスリンと、中間型または持続型インスリンの併用が、正常値または正常値に近い値での血糖値の維持に役立つ。これらの薬剤の使用は、米国特許出願公開番号２００２／０１８７９８０にさらに詳細に記載されており、その関連部分は引用により本明細書中に組み入れられる。
【０１８３】
スルホニル尿素剤もまた、Ｃｃｄｃ８０調節因子との２型糖尿病の併用療法に有用である。スルホニル尿素剤は、膵臓によって生産されるインスリンの量を増加させる。これらはまた、インスリン受容体の機能性を増大させ、そしてより多くのインスリン受容体の生産を刺激することにより、体の隅々にわたりインスリンの有効性を増大させる。これらの薬剤はまたインスリン耐性を低下させ、肝臓によってつくられる糖の量を減少させることができる。本発明の方法および組成物とともに有用であるスルホニル尿素剤としては、グリピジド、グリブリド（グリベンクラミド）、クロロプロパミド、トルブタミド、トラザミド、およびグリメプリリド、またはそれらの薬学的に許容される塩の形態が挙げられる。これらの薬剤の使用は、米国特許出願公開番号２００３／００８８６９にさらに詳細に記載されており、その関連部分は引用により本明細書中に組み入れられる。
【０１８４】
２型糖尿病の処置においてＣｃｄｃ８０調節因子と組み合わせて有用である別の治療薬はビグアニド剤である。ビグアニド剤は、糖新生において肝臓によって生産される糖の量を減少させることにより、血糖を下げる。これらはまた、筋細胞が吸収する糖の量を増加させ、インスリン耐性を軽減する。これらの薬剤は血液中のトリグリセリド濃度を下げ、特定の異常な凝固因子とアテローム性動脈硬化症を導く可能性がある炎症のマーカーを減少させることができる。本発明の方法および組成物とともに有用であるビグアニド剤としては、メフォルミンとその薬学的に許容される塩の形態が挙げられる。これらの薬剤の使用は、米国特許出願公開番号２００３／００１８０２８にさらに詳細に記載されており、その関連部分は引用により本明細書中に組み入れられる。
【０１８５】
チアゾリジンジオン剤もまた、２型糖尿病の処置においてＣｃｄｃ８０調節因子と組み合わせて使用することができる。チアゾリジンジオン剤は、インスリン耐性を軽減することにより、インスリンに応答する体内のｗａｙ  ｃｅｌｌｓを改善する。これらはまた、血液中のトリグリセリドを減少させ、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）を増加させることによって、高コレステロールの処置に役立ち得る。本発明の方法および組成物とともに有用であるチアゾリジンジオン剤は、ピオグリタゾンまたはロシグリタゾンの限定されないグループ、あるいはこれらの薬剤の薬学的に許容される塩の形態である。これらの薬剤の使用は、米国特許出願公開番号２００２／０１９８２０３にさらに詳細に記載されており、その関連部分は引用により本明細書中に組み入れられる。
【０１８６】
α−グリコシダーゼ阻害剤もまた、Ｃｃｄｃ８０調節因子との２型糖尿病の併用療法において有用である。α−グリコシダーゼ阻害剤は、体内での炭水化物の消化を遅らせ、腸が血液からグルコースを吸収する速度を遅くする。これにより、食事後に血液に流れ込む糖の量を減少させ、高血糖の期間を予防する。本明細書中に記載される本発明の方法および組成物とともに使用することができるα−グルコシダーゼ阻害剤は、ミグリトールまたはアカルボース、あるいは、これらの化合物の１つ以上の薬学的に許容される塩の形態である。これらの薬剤の使用は、米国特許出願公開番号２００３／００１３７０９にさらに詳細に記載されており、その関連部分は引用により本明細書中に組み入れられる。
【０１８７】
２型糖尿病の処置においてＣｃｄｃ８０調節因子と組み合わせて有用である別の治療薬は、抗脂血症薬である。本明細書中に記載される本発明の方法および組成物とともに利用することができる抗脂血症薬は抗脂質異常症薬としても知られており、胆汁酸抑制剤、フィブリン酸誘導体、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、およびニコチン酸化合物である。抗脂血症薬は、多数の機構を通じて血液中のコレステロールと脂肪の量を減少させる。例えば、胆汁酸抑制剤は腸の中の胆汁酸に結合し、血液からのそれらの再吸収を妨げる。その後、肝臓は失われた胆汁に取って代わるさらに多くの胆汁を生産する。体が胆汁を生産するためにコレステロールを必要とするので、肝臓は血液中のコレステロールを消費し、それによって血液中を循環しているＬＤＬコレステロールの量が減少する。これらの薬剤の使用は、米国特許出願公開番号２００２／０１９８２０２にさらに詳細に記載されており、その関連部分は引用により本明細書中に組み入れられる。
【０１８８】
アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤もまた、Ｃｃｄｃ８０調節因子との２型糖尿病の併用療法において有用である。ＡＣＥ阻害剤は血管を拡張させて、心臓が送り出す血液の量を改善し、血圧を下げる。ＡＣＥ阻害剤はまた血流を増大させ、これは、心臓が行わなければならない作業の量を減少させるのに役立つ。本明細書中に開示される方法および組成物において有用なＡＣＥ阻害剤としては、キナプリル、ラミプリル、ベラパミル、カプトプリル、ジルチアゼム、クロニジン、ヒドロクロルチアジド、ベナゼプリル、プラゾシン、フォシノプリル、リシノプリル、アテノロール、エナラプリル、ペリンドロプリル、ペリンドロプリルｔｅｒｔ−ブチルアミン、トランドラプリル、およびモエキシプリル、またはこれらの化合物の１つ以上の薬学的に許容される塩の形態が挙げられる。これらの薬剤の使用は、米国特許出願公開番号２００３／００５５０５８にさらに詳細に記載されており、その関連部分は引用により本明細書中に組み入れられる。
【０１８９】
二次的な糖尿作用に関して、アルドースレダクターゼ阻害剤は、糖尿病の人の眼および神経の損傷を防ぐ。アルドースレダクターゼは、通常は眼の中に存在しており、グルコースの、眼を傷つける可能性があるソルビトールへの代謝を誘発する酵素である。アルドースレダクターゼ阻害剤はこのプロセスを遅らせる。中でも、Ｃｃｄｃ８０調節因子と組み合わせて有用であるアルドースレダクターゼ阻害剤は、ミナルレスタト、トルレスタット、ソルビニル、メトソルビニル、ゾポルレスタット、エパルレスタット、ゼナレスタット、イミレスタット、およびポナルレスタット、またはそれらの薬学的に許容される塩の形態である。これらの薬剤の使用は、米国特許出願公開番号２００２／０１９８２０１にさらに詳細に記載されており、その関連部分は引用により本明細書中に組み入れられる。
【０１９０】
肥満に関連する併用療法に適している治療薬としては、例えば、中枢神経系（ＣＮＳ）刺激剤（例えば、フェンテルミン（例えば、商標名ｌｏｎａｍｉｎ（登録商標）およびＡｄｉｐｅｘ−Ｐ（登録商標）として販売されているもの）が挙げられる。フェンテルミンは、中枢神経系の刺激を模倣するそれらの能力について交感神経様作用薬として公知である薬物の１つのクラスのメンバーである。フェンテルミンは、脳の食欲制御中枢である視床下部に作用する。フェンテルミンの単剤療法は、食事療法や運動と組み合わせて使用された場合には、体重の減少を、食事療法や運動のみの場合と比較して大きくする。これらの薬剤の使用は、米国特許第５，０１９，５９４号にさらに詳細に記載されており、その関連部分は引用により本明細書中に組み入れられる。
【０１９１】
再取り込み阻害剤もまた、Ｃｃｄｃ８０調節因子との肥満の併用療法において有用である。再取り込み阻害剤は、神経伝達物質であるセロトニン、ノルエピネフィチン、およびドーパミンの再取り込みを阻害することによって食欲を抑制する。Ｃｃｄｃ８０調節因子と組み合わせて有用である再取り込み阻害剤としては、５ＨＴ−２Ｃ阻害剤（例えば、Ｍｅｒｉｄｉａ（登録商標）（シブトラミン）、ロルカセリン（ＡＰＤ−３５６））が挙げられる。これらの薬剤の使用は、米国特許第４，９２９，６２９号にさらに詳細に記載されており、その関連部分は引用により本明細書中に組み入れられる。
【０１９２】
肥満の処置においてＣｃｄｃ８０調節因子と組み合わせて有用である別の治療薬は、ＣＢ−１アンタゴニストである。ＣＢ−１アンタゴニストは、ニューロンのＣＢ−１受容体に対する内因性カンナビノイドの結合をブロックすることによって作用する。カンナビノイド受容体をブロックすることにより、ＣＢ−１アンタゴニストは被験体の食欲を低下させる。有用なＣＢ−１アンタゴニストとしては、リモナバント（Ａｃｏｍｐｌｉａ（登録商標））およびＣＰ−９４５５９８が挙げられる。これらの薬剤の使用は、米国特許第５，６２４，９４１号にさらに詳細に記載されており、その関連部分は引用により本明細書中に組み入れられる。
【０１９３】
ＧＬＰ−１アゴニストまたは模倣物もまた、Ｃｃｄｃ８０調節因子との肥満の併用療法において有用である。ＧＬＰ−１アゴニストは、グルコース依存性、インスリン依存性、およびインスリン非依存性の機構を通じて高血糖を正常化させる。ＧＬＰ−１アゴニストは、２型糖尿病の処置のための第１の薬剤として、そして１型糖尿病の処置のための補助剤として有用である。有用なＧＬＰ−１アゴニストとしては、エキセナチド（Ｂｙｅｔｔａ（登録商標））が挙げられる。これらの薬剤の使用は、米国特許第５，４２４，２８６号にさらに詳細に記載されており、その関連部分は引用により本明細書中に組み入れられる。
【０１９４】
Ｃｃｄｃ８０調節因子とさらなる治療薬（単数または複数）の投与の順序は変えることができる。例えば、いくつかの実施形態においては、Ｃｃｄｃ８０調節因子がさらなる治療薬（単数または複数）と同時に投与される。あるいは、Ｃｃｄｃ８０調節因子はさらなる治療薬（単数または複数）とは別に、そしてその前に投与することができる。別の実施形態においては、さらなる治療薬（単数または複数）は、Ｃｃｄｃ８０調節因子とは別に、その前に投与することができる。多くの実施形態においては、これらの投与レジュメは、数日間、数ヶ月間、または数年間続けられるであろう。
【０１９５】
Ｃ．スクリーニングアッセイ：
本発明により、調節因子（すなわち、Ｃｃｄｃ８０タンパク質に結合するか、あるいは、例えば、Ｃｃｄｃ８０発現もしくはＣｃｄｃ８０活性に対して刺激作用または阻害作用を有している候補もしくは試験化合物または薬剤（例えば、ペプチド、ペプチド模倣物、低分子、または他の薬物））を同定するための方法（本明細書中では「スクリーニングアッセイ」とも呼ばれる）が提供される。
【０１９６】
本発明の試験化合物は、以下を含む当該分野で公知の組み合わせライブラリー法において多数のアプローチのうちのいずれかを使用して得ることができる：生物学的ライブラリー；空間的に接近できる並列固相または液相ライブラリー；デコンボリューションが必要な合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法。生物学的ライブラリーのアプローチはペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマー、または化合物の低分子ライブラリーに適用可能である（Ｌａｍ  ＫＳ、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．１２：１４５−６７（１９９７））。
【０１９７】
分子ライブラリーの合成のための方法の例は、例えば、以下において当該分野で見ることができる：ＤｅＷｉｔｔ  ＳＨら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６９０９−１３（１９９３）；Ｅｒｂ  Ｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１４２２−２６（１９９４）；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ  ＲＮら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８−８５（１９９４）；Ｃｈｏ  ＣＹら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３−０５（１９９３）；Ｃａｒｒｅｌｌ  Ｔら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９−６１（１９９４）；Ｃａｒｒｅｌｌ  Ｔら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１−６４（１９９４）；およびＧａｌｌｏｐ  ＭＡら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３−５１（１９９４）。
【０１９８】
化合物のライブラリーは、例えば、溶液中に（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ  ＲＡら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２−２１（１９９２））、ビーズ上に（Ｌａｍ  ＫＳら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４（１９９１））、チップ上に（Ｆｏｄｏｒ  ＳＰＡら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５−５６（１９９３））、細菌上に（米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子上に（米国特許第５，２２３，４０９号）、プラスミド上に（Ｃｕｌｌ  ＭＧら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１８６５−６９（１９９２））、またはファージ上に（Ｓｃｏｔｔ  ＪＫおよびＳｍｉｔｈ  ＧＰ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−９０（１９９０）；Ｄｅｖｌｉｎ  ＪＪら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４−０６（１９９０）；Ｃｗｉｒｌａ  ＳＥら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：６３７８−８２（１９９０）；Ｆｅｌｉｃｉ  Ｆら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−１０（１９９１）；米国特許第５，２２３，４０９号）提示され得る。
【０１９９】
調節因子および天然の抽出物のライブラリーを試験する多くの薬物スクリーニングプログラムにおいては、所定の時間内に調査される調節因子の数を最大にするために、高スループットアッセイが所望される。細胞を含まないシステムにおいて行われる、例えば、精製されたタンパク質または半精製されたタンパク質を用いて導かれ得るアッセイは、しばしば「一次」スクリーニングと呼ばれ、ここではこれらは、迅速な進行と、試験調節因子によって媒介される分子標的の変化の比較的容易な検出が可能となるように作られ得る。さらに、試験調節因子の細胞毒性および／または生体利用性の影響は、インビトロシステムにおいては通常無視することができ、その代わりに、アッセイは、上流または下流のエレメントとの結合親和性の変化を明らかにする可能性があるので、分子標的に対する薬物の作用に主な焦点があてられる。
【０２００】
アッセイは、本発明のＣｃｄｃ８０ポリペプチドの正常な細胞性機能のアゴニストまたはアンタゴニストのいずれかであるＣｃｄｃ８０ホモログを含む調節因子をスクリーニングするために使用することができる。例えば、本発明により、Ｃｃｄｃ８０活性を有しているＣｃｄｃ８０タンパク質を持つ指示組成物が提供される方法が提供される。指示組成物は試験化合物と接触させることができる。その後、指示組成物の変化によって測定されるＣｃｄｃ８０活性に対する試験化合物の作用を決定することができ、それにより、Ｃｃｄｃ８０タンパク質の活性を調節する化合物を同定することができる。統計学的に有意な変化（例えば、（試験化合物が存在しない条件で検出されたレベルと比較した）試験化合物の存在下でのＣｃｄｃ８０活性のレベルの低下または増大）が、Ｃｃｄｃ８０調節因子である試験化合物の指標である。指示組成物は、例えば、細胞または細胞抽出物であり得る。
【０２０１】
調節因子の効力は、様々な濃度の試験調節因子を使用して得られたデータから用量応答曲線を作成することによって評価することができる。さらに、対照アッセイもまた、比較のためのベースラインを提供するために行うことができる。対照アッセイにおいては、単離され、精製されたＣｃｄｃ８０タンパク質が、Ｃｃｄｃ８０結合エレメントを含む組成物に添加され、複合体の形成が、試験調節因子が存在しない条件下で定量される。
【０２０２】
なお別の実施形態においては、本発明のアッセイは細胞を含まないアッセイであり、ここでは、Ｃｃｄｃ８０タンパク質またはその生物学的活性部分が試験化合物と接触させられ、Ｃｃｄｃ８０タンパク質またはその生物学的活性部分に結合する試験化合物の能力が決定される。Ｃｃｄｃ８０タンパク質に対する試験化合物の結合は、上記のように直接または間接的のいずれかで決定することができる。好ましい実施形態においては、アッセイには、Ｃｃｄｃ８０タンパク質またはその生物学的活性部分をＣｃｄｃ８０タンパク質に結合することが公知であるタンパク質と接触させてアッセイ混合物を形成させる工程、アッセイ混合物を試験化合物と接触させる工程、そしてＣｃｄｃ８０タンパク質と相互作用する試験化合物の能力を決定する工程が含まれる。ここでは、Ｃｃｄｃ８０タンパク質と相互作用する試験化合物の能力の決定には、公知の化合物と比較してＣｃｄｃ８０ポリペプチドまたはその生物学的活性部分に対して優先的に結合する試験化合物の能力の決定が含まれる。
【０２０３】
別の実施形態においては、アッセイは細胞を含まないアッセイであり、ここでは、Ｃｃｄｃ８０タンパク質またはその生物学的活性部分が試験化合物と接触させられ、Ｃｃｄｃ８０タンパク質またはその生物学的活性部分の活性を調節する試験化合物の能力が決定される。Ｃｃｄｃ８０タンパク質は、Ｃｃｄｃ８０を発現する細胞の溶解物として、精製されたかもしくは半精製されたポリペプチドとして、または組み換え発現されたポリペプチドとして提供され得る。１つの実施形態においては、細胞を含まないアッセイシステムにはさらに、細胞抽出物または細胞の単離された成分（例えば、ミトコンドリア）が含まれる。そのような細胞性の成分は、当該分野で公知の技術を使用して単離することができる。好ましくは、細胞を含まないアッセイシステムにはさらに、Ｃｃｄｃ８０がそれと相互作用する少なくとも１つの標的分子が含まれ、標的分子（単数または複数）とのＣｃｄｃ８０の相互作用を調節する試験化合物の能力がモニターされ、それにより、Ｃｃｄｃ８０の調節因子として試験化合物が同定される。Ｃｃｄｃ８０タンパク質の活性を調節する試験化合物の能力の決定は、例えば、直接結合を決定するための本明細書中に記載される方法のうちの１つによってＣｃｄｃ８０標的分子に結合するＣｃｄｃ８０タンパク質の能力を決定することによって行うことができる。Ｃｃｄｃ８０標的分子に結合するＣｃｄｃ８０タンパク質の能力の決定はまた、リアルタイム生体分子相互作用分析（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＢＩＡ））のような技術を使用して行うこともできる（例えば、Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ  ＳおよびＵｒｂａｎｉｃｚｋｙ  Ｃ、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３：２３３８−４５（１９９１）ａｎｄ  Ｓｚａｂｏ  Ａら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：６９９−７０５（１９９５）を参照のこと）。
【０２０４】
なお別の実施形態においては、細胞を含まないアッセイには、Ｃｃｄｃ８０タンパク質またはその生物学的活性部分をＣｃｄｃ８０タンパク質に結合することが公知である化合物と接触させてアッセイ混合物を形成させる工程、アッセイ混合物を試験化合物と接触させる工程、そしてＣｃｄｃ８０タンパク質と相互作用する試験化合物の能力を決定する工程が含まれる。ここでは、Ｃｃｄｃ８０タンパク質と相互作用する試験化合物の能力の決定には、Ｃｃｄｃ８０標的分子に優先的に結合するかまたはＣｃｄｃ８０標的分子の活性を調節するＣｃｄｃ８０タンパク質の能力の決定が含まれる。
【０２０５】
本発明の細胞を含まないアッセイは、可溶性形態のタンパク質および／または膜結合型のタンパク質（例えば、Ｃｃｄｃ８０がそれに結合する細胞内ドメインを有しているＣｃｄｃ８０タンパク質もしくは受容体）のいずれの使用にも適している。膜結合型のタンパク質が使用される細胞を含まないアッセイの場合には、膜結合型のタンパク質が溶液の中で維持されるように可溶化剤を利用することが所望され得る。そのような可溶化剤の例としては、非イオン性界面活性剤（例えば、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４、Ｔｈｅｓｉｔ（登録商標）、イソトリデシポリ（エチレングリコールエーテル）ｎ、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアミニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアミニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）、またはＮ−ドデシル＝Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート）が挙げられる。
【０２０６】
Ｃｃｄｃ８０分子のリガンドに結合するかまたはそれと相互作用するＣｃｄｃ８０タンパク質の能力の決定は、例えば、直接的な結合によって行うことができる。直接的な結合アッセイにおいては、Ｃｃｄｃ８０タンパク質は、放射性同位元素または蛍光標識と結合させることができ、その結果、Ｃｃｄｃ８０標的分子に対するＣｃｄｃ８０タンパク質の結合を、複合体の中の標識されたＣｃｄｃ８０タンパク質を検出することによって決定することができる。例えば、Ｃｃｄｃ８０分子（例えば、Ｃｃｄｃ８０タンパク質）は、例えば、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３Ｈで、直接または間接的のいずれかで標識することができ、放射性同位元素は、放射線の放射の直接のカウントによって、またはシンチレーションカウンティングによって検出することができる。あるいは、Ｃｃｄｃ８０分子は、例えば、西洋ワサビへルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素標識することができ、酵素標識は、適切な基質の生成物への変換の決定によって検出することができる。
【０２０７】
通常は、一方または両方のタンパク質の複合体形成していない形態からの複合体の分離を容易にするために、さらにはアッセイの自動化に順応させるために、Ｃｃｄｃ８０またはそれらのそれぞれの結合タンパク質を固定することが所望されるであろう。候補の薬剤の存在下および非存在下での、上流または下流の結合エレメントへのＣｃｄｃ８０の結合は、反応物を含めるのに適している任意の容器の中で行うことができる。例としては、マイクロタイタープレート、試験管、および微量遠心管が挙げられる。１つの実施形態においては、タンパク質がマトリックスに結合することを可能にするドメインを付加した融合タンパク質を提供することができる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／Ｃｃｄｃ８０（ＧＳＴ／Ｃｃｄｃ８０）融合タンパク質をグルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）またはグルタチオンで誘導したマイクロタイタープレート上に吸着させることができ、これはその後、細胞溶解物および試験調節因子と混合され、複合体形成を行わせるための条件下で（例えば、塩およびｐＨについての生理学的条件で）混合物がインキュベートされるが、わずかによりストリンジェンシーの高い条件が所望される場合がある。インキュベーション後、ビーズが洗浄されて結合していない全ての標識が除去され、マトリックスが固定され、放射常識が直接（キラキラ光っている場所にあるビーズ）、または続いて複合体が溶解させられた後に上清の中で決定される。あるいは、複合体はマトリックスから溶解させることができ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、そしてビーズ画分の中で見られるＣｃｄｃ８０結合タンパク質のレベルが標準的な電気泳動技術を使用してゲルから定量される。
【０２０８】
タンパク質をマトリックス上に固定するための他の技術もまた、本発明のアッセイでの使用に有用である。例えば、Ｃｃｄｃ８０またはその同種の結合タンパク質を、ビオチンとストレプトアビジンの結合を利用して固定することができる。ビオチニル化されたＣｃｄｃ８０分子は当該分野で周知の技術（例えば、ビオチニル化キット、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．））を使用してビオチン−ＮＨＳ（Ｈ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から調製することができ、ストレプトアビジンでコーティングされた９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のウェル中に固定することができる。あるいは、Ｃｃｄｃ８０と反応するが、上流または下流のエレメントの結合を妨害することのない抗体をプレートのウェルに誘導することができ、Ｃｃｄｃ８０を抗体結合体によってウェルの中に捕捉することができる。上記のように、Ｃｃｄｃ８０結合タンパク質（Ｃｃｄｃ８０−ＢＰ）と試験調節因子の調製物は、プレートのＣｃｄｃ８０を提示するウェルの中でインキュベートされ、ウェルの中に捕捉された複合体の量を定量することができる。ＧＳＴで固定された複合体について上記に記載された方法に加えて、そのような複合体を検出するための例示的な方法としては、Ｃｃｄｃ８０結合エレメントと反応するか、またはＣｃｄｃ８０タンパク質と反応し、結合エレメントと競合する抗体を使用する複合体の免疫検出、さらには、内因性活性または外因性活性のいずれかで結合エレメントと会合した酵素活性の検出に依存する酵素結合アッセイが挙げられる。後者の場合には、酵素は、Ｃｃｄｃ８０結合タンパク質と化学的に結合させることができ、また、ＣＣｄｃ８０結合タンパク質との融合タンパク質として提供することもできる。説明のために、Ｃｃｄｃ８０結合タンパク質は西洋ワサビペルオキシダーゼと化学的に架橋することができ、また遺伝的に融合させることもでき、複合体の中に捕捉されたタンパク質の量は、酵素の発色性基質（例えば、３，３’−ジアミノ−ベンザジンテトラヒドロクロライドまたは４−クロロ−１−ナフトール）を用いて評価することができる。同様に、タンパク質とグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼを含む融合タンパク質を提供することができ、複合体の形成は、１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼンを使用してＧＳＴ活性を検出することによって定量することができる（Ｈａｂｉｇ  ＷＨら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４９：７１３０−３９（１９７４））。
【０２０９】
複合体の中に捕捉されたタンパク質のうちの１つを定量するための免疫検出に依存するプロセスについては、タンパク質に対する抗体（例えば、抗ＣＤＣ８０抗体）を使用することができる。あるいは、複合体の中で検出されるタンパク質は、Ｃｃｄｃ８０配列に加えて、それについての抗体を容易に入手することができる（例えば、市販されている）第２のタンパク質を含む融合タンパク質の形態で「エピトープタグ化」することができる。例えば、上記のＧＳＴ融合タンパク質はまた、ＧＳＴ部分に対する抗体を使用する結合の定量のためにも使用することができる。他の有用なエピトープタグとしては、ｃ−ｍｙｃ由来の１０残基の配列を含むｍｙｃ−エピトープ（例えば、Ｅｌｌｉｓｏｎ  ＭＪおよびＨｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒ  Ｍ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２１１５０−５７（１９９１）を参照のこと）、さらには、ｐＦＬＡＧ（登録商標）システム（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）またはｐＥＺＺ−プロテインＡシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）が挙げられる。
【０２１０】
Ｃｃｄｃ８０とその標的分子との間での相互作用を調節する化合物の能力を、いずれの相互作用も標識することなく決定することもまた、本発明の範囲に含まれる。例えば、マイクロフィジオメーターを、Ｃｃｄｃ８０とその標的分子との相互作用を、Ｃｃｄｃ８０または標的分子を標識することなく検出するために使用することができる（例えば、ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ  ＨＭら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：１９０６−１２（１９９２）を参照のこと）。本明細書中で使用される場合は、「マイクロフィジオメーター」（例えば、サイトセンサー（Ｃｙｔｏｓｅｎｓｏｒ））は、細胞が光アドレス電位応答センサー（ＬＡＰＳ）を使用してその環境を酸化する速度を測定する分析機器である。この酸化速度の変化は、化合物と受容体との間の相互作用の指標として使用することができる。
【０２１１】
細胞を含まないアッセイに加えて、本発明によって提供されるＣｃｄｃ８０タンパク質の容易に入手することができる供給源はまた、低分子アゴニスト／アンタゴニストなどを同定するための細胞をベースとするアッセイの作成を容易にする。例えば、細胞には、目的の試験調節因子の存在下および非存在下で、試験薬剤によって媒介される標的細胞によるＣｃｄｃ８０応答の調節のためのアッセイスコアリングを用いて、組み換え体Ｃｃｄｃ８０タンパク質を発現または過剰発現を生じさせることができる。例えば、細胞を含まないアッセイを用いる場合と同様に、Ｃｃｄｃ８０依存性応答の統計学的に有意な変化（増大または減少）を生じる調節因子を同定することができる。
【０２１２】
Ｃｃｄｃ８０の発現に使用することができる組み換え体発現ベクターは当該分野で公知である（上記の議論を参照のこと）。１つの実施形態においては、発現ベクターの中では、Ｃｃｄｃ８０コード配列は、指示細胞（単数または複数）の中でＣｃｄｃ８０を構成的または誘導性発現させることができる調節配列に動作可能であるように連結せられる。細胞の中でＣｃｄｃ８０を構成的または誘導性発現させることができる組み換え体発現ベクターの使用が、Ｃｃｄｃ８０の活性を増大させるかまたは阻害する化合物の同定に好ましい。別の実施形態においては、発現ベクターの中では、Ｃｃｄｃ８０コード配列が、内因性Ｃｃｄｃ８０遺伝子の調節配列（すなわち、内因性遺伝子由来のプロモーター調節領域）に動作可能であるように連結させられる。Ｃｃｄｃ８０発現が内因性の調節配列によって制御される組み換え体発現ベクターの使用が、Ｃｃｄｃ８０の転写発現を増大させるかまたは阻害する化合物の同定に好ましい。１つの実施形態においては、アッセイは細胞をベースとするアッセイであり、これには、Ｃｃｄｃ８０標的分子（例えば、Ｃｃｄｃ８０細胞内相互作用分子）を発現している細胞を試験化合物と接触させる工程、およびＣｃｄｃ８０標的分子の活性を調節する（例えば、刺激するかまたは阻害する）試験化合物の能力を決定する工程が含まれる。Ｃｃｄｃ８０標的分子の活性を調節する試験化合物の能力の決定は、例えば、Ｃｃｄｃ８０標的分子またはそのリガンドに結合するか、あるいはそれらと相互作用するＣｃｄｃ８０タンパク質の能力を決定することによって行うことができる。
【０２１３】
例示的な実施形態においては、Ｃｃｄｃ８０の発現または活性は細胞の中で調節され、目的の読み出し値（例えば、前脂肪細胞の増殖および／または脂質の蓄積）に対する目的の調節因子の影響が測定される、および／または観察される。
【０２１４】
別の実施形態においては、標的分子に結合するかまたは標的分子と相互作用するＣｃｄｃ８０調節因子の能力の決定は、Ｃｃｄｃ８０または標的分子の活性の読み出し値を測定することによって行うことができる。例えば、Ｃｃｄｃ８０または標的分子の活性は、標的の細胞性二次メッセンジャーの誘導を検出すること、適切な基質に対する標的の触媒／酵素活性を検出すること、レポーター遺伝子（検出マーカー（例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）をコードする核酸に動作可能であるように連結された標的応答性調節エレメントを含む）の誘導を検出すること、あるいは、標的によって調節される細胞性の応答（例えば、前脂肪細胞の増殖および／または脂質の蓄積）を検出することによって決定することができる。
【０２１５】
ＶＩ．Ｃｃｄｃ８０調節因子の投与
Ｃｃｄｃ８０調節因子は、ＣＣｄｃ８０活性を増強する、または抑制するのいずれかのためのインビボでの薬学的投与に適している生物学的に適合する形態で被験体に投与される。「インビボでの投与に適している生物学的に適合する形態」によっては、調節因子の治療効果があらゆる毒性作用を上回る、投与されるＣｃｄｃ８０調節因子の形態が意味される。用語被験体は、その中で免疫応答を誘発することができる生存している有機体（例えば、哺乳動物）を含むように意図される。本明細書中に記載されるＣｃｄｃ８０調節因子の投与は、単独で、または薬学的に許容される担体との組み合わせにおいて治療有効量を含む任意の薬理学的形態であり得る。
【０２１６】
本発明のＣｃｄｃ８０調節因子の治療有効量の投与は、所望される結果を得るための必要な投与量、および投与期間で有効な量として定義される。例えば、Ｃｃｄｃ８０調節因子の治療有効量は、疾患の状態、年齢、性別、および個体の体重のような要因、ならびに、個体において所望される応答を誘発するペプチドの能力に応じて様々であり得る。投薬レジュメは、最適な治療応答がもたらされるように調整することができる。例えば、いくつかに分けられた用量を毎日投与することができ、また、治療状況の緊急性によって示されるように、用量を比例的に減少させることもできる。
【０２１７】
本発明の治療用または薬学的組成物は当該分野で公知の任意の適切な経路によって投与することができ、これには例えば、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、経皮投与、クモ膜下投与、または脳内投与、あるいは、エキソビボ処置プロトコールでの細胞への投与が含まれる。投与は注射によって行われるように迅速であり得るか、または、ゆっくりとした注入もしくは徐放処方物の投与によるように長期間にわたるかのいずれかであり得る。
【０２１８】
Ｃｃｄｃ８０調節因子はまた、所望される薬学的または薬物動態特性を提供する薬剤に連結させるか、またはそのような薬剤と結合させることもできる。例えば、Ｃｃｄｃ８０調節因子は、血液−脳関門を越える浸透または輸送を促進することが当該分野で公知である任意の物質（例えば、トランスフェリン受容体に対する抗体）に結合させることができ、静脈内注射によって投与することができる（例えば、Ｆｒｉｄｅｎ  ＰＭら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：３７３−７７（１９９３）を参照のこと）。さらに、Ｃｃｄｃ８０調節因子は、溶解度、安定性、半減期の所望される特性、および他の薬学的に有利な特性を得るために、ポリエチレングリコールのようなポリマーに安定に連結させることができる（例えば、Ｄａｖｉｓら、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｅｎｇ．４：１６９−７３（１９７８）；Ｂｕｒｎｈａｍ  ＮＬ、Ａｍ．Ｊ．Ｈｏｓｐ．Ｐｈａｒｍ．５１：２１０−１８（１９９４）を参照のこと）。
【０２１９】
さらに、Ｃｃｄｃ８０調節因子は、細胞の細胞質ゾルへの送達を助ける組成物の中に存在させることができる。例えば、Ｃｃｄｃ８０調節因子は、細胞の細胞質ゾルへペプチドを送達することができるリポソームのような担体部分と結合させることができる。そのような方法は当該分野で周知である（例えば、Ａｍｓｅｌｅｍ  Ｓら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ  ６４：２１９−３７（１９９３）を参照のこと）。あるいは、Ｃｃｄｃ８０調節因子は特異的な輸送ペプチドを含むように修飾することができ、また、そのような輸送ペプチドに融合させることができる。輸送ペプチドは、Ｃｃｄｃ８０調節因子を細胞へ送達することができる。加えて、調節因子は、マイクロインジェクションによって直接送達することもできる。
【０２２０】
Ｃｃｄｃ８０調節因子は、通常、薬学的調製物の形態で使用される。そのような調製は、薬学の分野で周知の様式で行われる。１つの好ましい調製では、生理食塩水溶液のビヒクルが利用されるが、他の薬学的に許容される担体（例えば、生理学的濃度の他の非毒性の塩、５％のグルコース水溶液、滅菌水など）もまた使用することができる。本明細書中で使用される場合は、「薬学的に許容される担体」としては、任意の、そしてあらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤、および吸収遅延剤などが挙げられる。薬学的に活性な物質についてのそのような媒体および薬剤の使用は当該分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性な化合物と不適合である場合を除き、治療用組成物の中でのその使用が意図される。補助活性な化合物もまた、組成物の中に配合することができる。適切な緩衝液を組成物の中に存在させることも所望される場合がある。そのような溶液は、所望される場合には、凍結乾燥させることができ、注射の準備のための滅菌水の添加によっていつでも再構成することができる滅菌のアンプルの中で保存することができる。主要な溶媒は水性であり得るか、あるいは、非水性であり得る。Ｃｃｄｃ８０調節因子はまた、処置が必要な組織に移植することができる、固体または半固体の生物学的適合性マトリックスの中に取り込ませることもできる。
【０２２１】
担体にはまた、ｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、滅菌性、安定性、溶解速度、または処方物の臭気を変化させるかあるいは維持するために、他の薬学的に許容される賦形剤を含めることができる。同様に、担体には、血液−脳関門を越える放出または吸収または浸透を変化させるかあるいは維持するために、さらに他の薬学的に許容される賦形剤が含まれる場合がある。そのような賦形剤は、単位投与量もしくは多用量の形態での非経口投与、あるいは持続注入または定期的な注入による直接注入のための投薬形態を処方するために通常、そして習慣的に使用されている物質である。
【０２２２】
用量の投与は、使用される投薬処方物および投与経路の薬物動態パラメーターに応じて繰り返すことができる。
【０２２３】
Ｃｃｄｃ８０調節因子を含む特定の処方物が経口投与されることもまた提供される。そのような処方物は、好ましくは、固体の投薬形態の中にカプセル化され、適切な担体とともに処方される。適切な担体、賦形剤、および希釈剤のいくつかの例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、ゼラチン、シロップ、メチルセルロース、メチル−およびプロピルヒドロキシ安息香酸、タルク、マグネシウム、ステアリン酸塩、水、鉱油などが挙げられる。処方物にはさらに、潤滑剤、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、保存剤、甘味剤、または香味剤を含めることができる。組成物は、当該分野で周知の手順を使用することによる患者への投与後に、有効成分の迅速な放出、持続放出、または徐放を提供するように処方することができる。処方物にはまた、タンパク質分解による分解を最少にする物質、および／または例えば、界面活性剤のような吸収を促進する物質を含めることができる。
【０２２４】
投与を容易にし、投与量を均一にするためには、単位投薬形態になるように非経口組成物を処方することが特に有効である。本明細書中で使用される単位投薬形態は、処置される哺乳動物被験体については単位投与に適している物理的に分けられている単位をいう。個々の単位には、必要な薬学的担体の協力による所望される治療効果を生じるように計算された、予め決定された量の活性な化合物が含まれる。本発明の単位投薬形態についての詳細は、（ａ）Ｃｃｄｃ８０調節因子の特有の特性と達成される特定の治療効果、および（ｂ）個体の感受性の処置のためにそのような活性な化合物を配合することについての当該分野で固有の限界によって、そしてそれらに応じて直接記載される。特異的な用量は、例えば、患者のおおよその体重もしくは体表面積、または占められる体の空間の容積にしたがって、当業者であれば容易に計算することができる。用量はまた、選択される特定の投与経路に応じて計算されるであろう。処置に適している投与量を決定するために必要な計算のさらなる微調整は、当業者であれば日常的に行われているように行うことができる。そのような計算は、標的細胞のアッセイ調製物において本明細書中に開示された活性を考慮して、当業者によって過度の実験が行われることなくなされ得る。正確な投与量は、標準的な用量応答実験と組み合わせて決定される。実際に投与される組成物の量は、処置される状態（単数または複数）、投与される組成物の選択、個々の患者の年齢、体重、および応答、患者の状態の重篤度、ならびに選択される投与経路を含む関連する状況を考慮して、熟練者によって決定されるであろう。
【０２２５】
そのようなＣｃｄｃ８０調節因子の毒性と治療効力は、細胞培養物または実験動物において、例えば、ＬＤ５０（集団のうちの５０％を死に至らせる用量）およびＥＤ５０（集団のうちの５０％において治療的に有効な用量）を決定するための標準的な薬学的手順によって決定することができる。毒性作用と治療効果との間での用量比は治療指数であり、これは、ＬＤ５０／ＥＤ５０として表現することができる。大きな治療指数を示すＣｃｄｃ８０調節因子が好ましい。毒性の副作用を示すＣｃｄｃ８０調節因子が使用される場合があるが、感染していない細胞を傷つける可能性を最小にし、それによって副作用を少なくするためには、罹患組織の部位にそのような調節因子を標的化させる送達システムを設計することに注意を払わなければならない。
【０２２６】
細胞培養アッセイまたは動物実験によって得られたデータは、ヒトにおいて使用される一定の範囲の投与量で処方するために使用することができる。そのようなＣｃｄｃ８０調節因子の投与量は、好ましくは、わずかしか毒性がないかまたは毒性がないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲にあることが好ましい。投与量は、使用される投薬形態と利用される投与経路に応じてこの範囲内で変化させることができる。本発明の方法で使用される任意のＣｃｄｃ８０調節因子について、治療有効量は、細胞培養アッセイから最初に試算することができる。用量は、細胞培養物の中で決定されたＩＣ５０（すなわち、状態の最大阻害の半分が達成されるＣｃｄｃ８０調節因子の濃度）を含む循環血漿濃度範囲に達するように、動物モデルに処方され得る。そのような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。血漿中での濃度は、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
【０２２７】
本発明の１つの実施形態においては、Ｃｃｄｃ８０ポリペプチドは、Ｃｃｄｃ８０の生物学的に活性な形態またはＣｃｄｃ８０の前駆体（すなわち、体によってＣｃｄｃ８０の生物学的活性のある形態へと容易に転換させられ得る分子）を生産することができるベクターあるいは細胞を患者に移植することによって治療的に投与することができる。
【０２２８】
１つのアプローチにおいては、Ｃｃｄｃ８０を分泌する細胞は、患者への移植のために半透膜の中にカプセル化することができる。細胞は、通常Ｃｃｄｃ８０またはその前駆体を発現する細胞であり得るか、あるいは、細胞は、Ｃｃｄｃ８０またはその生物学的活性のある断片またはその前駆体を発現するように形質転換することができる。細胞がヒト起源の細胞であることが好ましい。しかし、本明細書中の処方物および方法は、獣医学に、さらにはヒトでの適用に使用することができ、用語「患者」または「被験体」は、本明細書中で使用される場合は、ヒトと獣医学的患者を含むように意図される。
【０２２９】
Ｃｃｄｃ８０タンパク質の発現または活性に対するＣｃｄｃ８０調節因子の影響をモニターすることは、基本的な薬物のスクリーニングのみならず、臨床試験にも適用することができる。例えば、Ｃｃｄｃ８０遺伝子の発現、タンパク質レベルを増大させるか、またはＣｃｄｃ８０活性をアップレギュレートさせることについての、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイによって決定されたＣｃｄｃ８０調節因子の有効性は、低いＣｃｄｃ８０遺伝子の発現、タンパク質レベル、またはダウンレギュレートされたＣｃｄｃ８０活性を示している被験体の臨床試験においてモニターすることができる。あるいは、Ｃｃｄｃ８０遺伝子の発現、タンパク質レベルを低下させるか、またはＣｃｄｃ８０活性をダウンレギュレートすることについての、スクリーニングアッセイによって決定された薬剤の有効性は、高いＣｃｄｃ８０遺伝子の発現、タンパク質レベル、またはアップレギュレートされたＣｃｄｃ８０活性を示している被験体の臨床試験においてモニターすることができる。そのような臨床試験では、Ｃｃｄｃ８０遺伝子および好ましくは障害に関与している他の遺伝子の発現または活性を、特定の細胞の表現形の「読み出し」またはマーカーとして使用することができる。
【０２３０】
限定ではないが、例えば、Ｃｃｄｃ８０活性を調節する（例えば、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイにおいて同定された）Ｃｃｄｃ８０調節因子（例えば、化合物、薬物、または低分子）での処置によって細胞の中で調節されるＣｃｄｃ８０を含む遺伝子を同定することができる。したがって、Ｃｃｄｃ８０関連疾患に対する薬剤の作用を（例えば、臨床試験において）実験するためには、細胞を単離し、そしてＲＮＡを調製し、そしてＣｃｄｃ８０とＣｃｄｃ８０関連疾患に関与している他の遺伝子の発現レベルをそれぞれ分析することができる。遺伝子発現のレベル（すなわち、遺伝子発現パターン）は、本明細書中に記載されるようにノーザンブロット分析またはＲＴ−ＰＣＲによって、あるいは、本明細書中に記載される方法のうちの１つによって生産されたタンパク質の量を測定することによって、または、Ｃｃｄｃ８０遺伝子もしくは他の遺伝子の活性のレベルを測定することによって定量することができる。この方法では、遺伝子発現パターンは、マーカー、すなわち薬剤に対する細胞の生理学的応答の指標となり得る。したがって、この応答状態は、Ｃｃｄｃ８０調節因子での個体の処置の前、処置中の様々な時点で決定することができる。
【０２３１】
本発明によってはまた、以下の工程を含む、Ｃｃｄｃ８０調節因子（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣物、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子、または本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイによって同定された他の薬物候補）での被験体の処置の有効性をモニターするための方法も提供される：（ｉ）Ｃｃｄｃ８０調節因子の投与前に被験体から投与前試料を得る工程；（ｉｉ）投与前試料中のＣｃｄｃ８０タンパク質、ｍＲＮＡ、もしくはゲノムＤＮＡの発現レベルを検出する工程；（ｉｉｉ）被験体から１つ以上の投与後試料を得る工程；（ｉｖ）投与後試料中のＣｃｄｃ８０タンパク質、ｍＲＮＡ、もしくはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを検出する工程；（ｖ）投与前試料中のＣｃｄｃ８０タンパク質、ｍＲＮＡ、もしくはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを、投与後試料（単数または複数）中のＣｃｄｃ８０タンパク質、ｍＲＮＡ、もしくはゲノムＤＮＡと比較する工程；ならびに、（ｖｉ）それにしたがって被験体に対するＣｃｄｃ８０調節因子の投与を変更する工程。例えば、Ｃｃｄｃ８０調節因子の投与の増加が、検出されたよりも高いレベルにまでＣｃｄｃ８０の発現または活性を増大させるため、すなわち、薬剤の有効性を増大させるために所望され得る。あるいは、薬剤の投与の減少が、検出されたよりも低いレベルにまでＣｃｄｃ８０の発現または活性を低下させるため、すなわち、Ｃｃｄｃ８０調節因子の有効性を低下させるために所望され得る。そのような実施形態にしたがうと、観察できる表現形の応答が存在しない場合でも、Ｃｃｄｃ８０の発現または活性をＣｃｄｃ８０調節因子の有効性の指標として使用することができる。
【０２３２】
好ましい実施形態においては、Ｃｃｄｃ８０の発現および／または活性の調節によって利点が得られるであろう被験体において前脂肪細胞の増殖および／または脂質の蓄積を変化させるＣｃｄｃ８０調節因子の能力を、Ｃｃｄｃ８０調節因子の投与後の患者の状態の改善を検出することによって測定することができる。そのような改善は、当業者であれば患者の特異的な状態に適している指標を使用して容易に測定することができる。患者の状態の変化を測定することにより患者の応答をモニターすることは、生検材料の採取が高いリスクをもたらし、そして患者に有害である状況に好ましい。
【０２３３】
さらに、疾患の状態の処置においては、Ｃｃｄｃ８０を含む組成物を体外から投与することができ、血清中、任意の所望される組織区画中、または罹患組織中のＣｃｄｃ８０ポリペプチドの特定の標的レベルに到達させることが所望される可能性がある。したがって、患者中、または患者から得られた組織生検試料を含む生物学的試料中のＣｃｄｃ８０ポリペプチドのレベルをモニターすること、およびいくつかの場合には、天然のＣｃｄｃ８０のレベルをモニターすることもまた有効であろう。したがって、本発明によってはまた、患者由来の試料中のＣｃｄｃ８０の存在を検出するための方法も提供される。
【実施例】
【０２３４】
本発明は以下の実施例によってさらに定義される。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、説明の目的だけのために提供されることが理解されるべきである。上記の議論とこれらの実施例から、当業者は本発明の好ましい特徴を確定し、その精神および範囲から逸脱することなく、それが様々な用途および状態に適合するように本発明の様々な変更および改変を行うことができる。
【０２３５】
（実施例１）
実験手順
１．遺伝子発現プロフィールと定量的ＲＴ−ＰＣＲ
未分化の、および分化した３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞、正常な８〜１２週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに由来する組織、ならびに、１０週齢の雄のｏｂ／ｏｂと週齢が一致している野生型の対照マウス由来の組織から、ＲＮＡを、記載されているようにして得た（Ｌａｋｅら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ  ４６：２４７７−２４８７、２００５）。チアゾリジンジオン（ＴＺＤ）処置のために、１０週齢の雄のｏｂ／ｏｂマウスを、１日に１回、１５ｍｇ／ｋｇのロシグリタゾンまたはビヒクルで、２１日間にわたりチューブにより強制栄養補給した。初代脂肪細胞と間質の血管画分を、記載されているように８〜１２週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの精巣上体脂肪組織から調製した（Ｌａｋｅら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ  ４６：２４７７−２４８７、２００５）。全ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して抽出し、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。ヒト組織由来のＲＮＡはＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）から入手した。遺伝子発現プロファイリングを、以前に記載されたとおりに（Ｂｅｒａｓｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１：２７１６７−２７１７７、２００６）Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  ４３０  ２．０アレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用して行った。遺伝子発現はまた、リアルタイムＰＣＲによっても測定した（１つのグループあたりｎ＝３〜６匹のマウス）＊＜０．０５。Ｔａｑｍａｎリアルタイム定量的ＰＣＲを、製造業者の説明書にしたがって７９００ＨＴファストリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で、内因性対照として１８Ｓを使用して、以前に記載されたとおりに（Ｌａｋｅら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ  ４６：２４７７−２４８７、２００５）行った。予め設計した遺伝子特異的プライマーとプローブをＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手した。図１Ａ〜Ｅおよび１Ｇ、図３Ｂ〜Ｄ、図４Ｄ、図５Ａ、Ｃ、Ｄ、図６、ならびに図７Ａに示すデータはリアルタイムＰＣＲによって得た；図１Ｆおよび図４Ｃに示すデータはマイクロアレイ分析から導いた。
【０２３６】
２．分泌実験
Ｃｃｄｃ８０が分泌型タンパク質であることを明らかにするために、出願人らは、哺乳動物発現ベクターｐＳＭＥＤ２の中に、Ｃ末端ＦＬＡＧタグに融合させたヒトＣｃｄｃ８０（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）登録番号ＮＭ＿１９９５１１と同じ配列）のオープンリーディングフレームをクローニングした。以下のプライマーを使用した：
正方向５’−ＡＣＧＣＴＧＴＣＧＡＣＣＡＣＣＧＣＡＡＣＣＣＴＣＴＧＣＡＴＴＣＣＡＴＣＴＣ−３’（配列番号１）；および
逆方向５’−ＣＧＴＣＴＡＧＡＴＴＣＡＣＴＴＡＴＣＧＴＣＧＴＣＡＴＣＣＴＴＧＴＡＡＴＣＧＴＡＡＧＧＧＴＡＴＣＣＡＴＧＧＴＧＡＴＡＡＣＴＣ−３’（配列番号２）。
【０２３７】
Ｃｃｄｃ８０−ＦＬＡＧを含む発現ベクター（ｐＳＭＥＤ２−Ｃｃｄｃ８０−ＦＬＡＧ）、ならびに対照ベクター（ｐＳＭＥＤ２）をＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。具体的には、ＨＥＫ２９３Ｔを、２×１０６細胞の密度で１０ｃｍのペトリ皿に播種した。細胞をＦｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）を使用してｐＳｍｅｄ２またはｐＳｍｅｄ２−Ｃｃｄｃ８０−ＦＬＡＧでトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、細胞を無血清ＤＭＥＭにプレートし、培地を２４時間後に回収した。Ｃｃｄｃ８０の内因性の分泌を、３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞と完全に分化した脂肪細胞の中で評価した。３Ｔ３−Ｌ１細胞をＰＢＳで２回リンスし、培地を回収する前に無血清ＤＭＥＭ中で４８時間インキュベートした。馴化培地を４〜１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続く銀染色、または抗ＦＬＡＧ  Ｍ２（２９３Ｔ）もしくは抗Ｃｃｄｃ８０（３Ｔ３−Ｌ１）抗体での免疫学的検出によって分析した。
【０２３８】
３．抗体の生産
マウスＣｃｄｃ８０とヒトＣｃｄｃ８０と１００％の配列相同性を有している２つのペプチドを合成した：ＫＮＲＶＷＶＩＳＡＰＨＡＳＥＧＹＹＲ（配列番号５；マウス配列とヒト配列の両方のアミノ酸１４８〜１６５に対応している）およびＫＩＤＨＦＱＬＤＮＥＫＰＭＲ（配列番号６；ヒト配列およびマウス配列のそれぞれアミノ酸６７２〜６８５および６７１〜６８４に対応している）。ペプチドをＫＬＨに結合させ、血清の回収前に９０日間、２セットのウサギに注射した（Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）。
【０２３９】
４．レトロウイルスベクターと感染
非サイレンシングｓｈＲＮＡおよびマウスＣｃｄｃ８０ｓｈＲＮＡをコードするレトロウイルスベクターは、Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手した。ヘアピン配列は以下のとおりであった：
非サイレンシング短いヘアピンＲＮＡをコードする対照配列：
ＡＴＣＴＣＧＣＴＴＧＧＧＣＧＡＧＡＧＴＡＡＧＴＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＴＣＴＣＧＣＴＴＧＧＧＣＧＡＧＡＧＴＡＡＧＴＡＧＴＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＴＡＣＴＴＡＣＴＣＴＣＧＣＣＣＡＡＧＣＧＡＧＡＧＴＧＣＣＴＡＣＴＧＣＣＴＣＧＧＡ（配列番号４）；および
Ｃｃｄｃ８０（２０１５〜２０３７位）に対する短いヘアピンＲＮＡをコードする配列：
ＴＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＧＴＧＡＧＣＧＣＣＣＴＧＡＧＡＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＴＡＧＴＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＴＡＴＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＣＣＴＴＣＴＣＡＧＧＴＴＧＣＣＴＡＣＴＧＣＣＴＣＧＧＡ（配列番号３）。
【０２４０】
ウイルスパッケージングは、Ｆｕｇｅｎｅ６を使用してプラスミドで２９３−ＶＳＶＧ細胞をトランスフェクトすることによって行った。１０μｇ／ｍｌのポリブレンを補充したウイルス上清を、４８時間かけて３Ｔ３−Ｌ１細胞を感染させるために使用し、その後、２μｇ／ｍｌのピューロマイシンで選択した。
【０２４１】
配列番号３によってコードされるマウスＣｃｄｃ８０ｓｈＲＮＡは以下のとおりである：
ＵＧＣＵＧＵＵＧＡＣＡＧＵＧＡＧＣＧＣＣＣｕＧＡＧＡＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＧＵＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＵＧＵＡＵＵＵＣＵＵＣＵＵＣＵＣＣＵＵＣＵＣＡＧＧＵＵＧＣＣＵＡＣＵＧＣＣＵＣＧＧＡ（配列番号７）。
【０２４２】
５．アデノウイルスベクターと感染
マウスＣｃｄｃ８０ｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲによって作製した。簡単に説明すると、全ＲＮＡをＴＲＩＺＯＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してマウスの白色脂肪組織から単離した。ｃＤＮＡをランダムデカマー（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して逆転写によって合成した。全長のＣｃｄｃ８０をＰＣＲによって得、ｐＳｍｅｄ２のＳｍａＩ部位とＸｂａＩ部位に連結させた。Ｃｃｄｃ８０ｃＤＮＡをｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶにサブクローニングし、その後、ＰｍｅＩで直鎖状にし、ｐＡｄＥａｓｙ−１プラスミドで予め形質転換した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＪ５１８３細胞にエレクトロポレーションした。マウスＣｃｄｃ８０またはＬａｃＺ（対照）をコードする組換え体アデノウイルス粒子を、製造業者の説明書（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にしたがって作製した。
【０２４３】
３Ｔ３−Ｌ１のアデノウイルスでの感染は、原則として以前に記載されたとおりに行った（ＯｒｌｉｃｋｙおよびＳｃｈａａｃｋ、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ  ４２：４６０−４６６、２００１）。簡単に説明すると、細胞を、１．５×１０５細胞／ウェルの密度で６ウェルプレートに播種し、２４時間増殖させた。アデノウイルスを、０．５μｇ／ｍｌのポリ−Ｌ−リジン（Ｓｉｇｍａ）を含む無血清ＤＭＥＭの中で１００分間インキュベートし、混合物を１．５時間、ＰＢＳで洗浄した細胞上に層状に重ね、その後、２０％のウシ血清を含むＤＭＥＭを加えた。培地を４８時間後に除去し、細胞を以下に記載するように分化させた。
【０２４４】
６．脂肪細胞の分化
３Ｔ３−Ｌ１細胞を、３７℃の１０％のＣＯ２大気中で、２０％のウシ血清を含むＤＭＥＭ中で維持した。コンフルエンスの２日後に、細胞を、５００μＭの３−イソブチル−１−メチルキサンチン、１μＭのデキサメタゾン、および１．７μＭのインスリンを補充した１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭを使用して４日間、続いて、１０％のＦＢＳおよび０．８５μＭのインスリンを含むＤＭＥＭで２日間、その後、１０％のＦＢＳだけを含むＤＭＥＭでさらに２〜４日間、脂肪細胞へと分化するように誘導した。ホルマリンで固定した脂肪細胞中での中性脂質の蓄積を、当該分野で周知の方法にしたがってオイルレットＯ染色によって決定した。
【０２４５】
７．インスリンでの刺激と免疫ブロット分析
分化した３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を２時間かけて血清を枯渇させ、その後、１０ｎＭのインスリンで１０分間刺激した。細胞を氷冷したＰＢＳ中で２回リンスし、以前に記載されたとおりに溶解させた（ＴｒｅｍｂｌａｙおよびＭａｒｅｔｔｅ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：３８０５２−３８０６０、２００１）。等量のタンパク質を４〜１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、ニトロセルロース膜に移動させた。Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）およびＥＲＫ−１／２（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）のリン酸化を、リン酸特異的抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して決定した。
【０２４６】
８．ルシフェラーゼレポーターアッセイ
ＨｅｐＧ２細胞を、２４ウェルプレートに８×１０４細胞／ウェルの密度で播種し、１０％のＦＢＳを含む抗生物質を含まないＤＭＥＭ培地中で２４時間増殖させた。細胞を、リポフェクタミン２００２（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して０．８μｇのＴＯＰＦＬＡＳＨと０．２μｇのβ−ガラクトシダーゼレポータープラスミドでトランスフェクトし、４時間後にＰＢＳでリンスし、ｏｐｔｉ−ＭＥＭ中にＧＦＰまたはＣｃｄｃ８０のいずれかをコードするアデノウイルスに感染させた。血清（最終濃度：１０％のＦＢＳ）を、感染の２時間後に各ウェルに加え、細胞を２４時間後に回収した。３Ｔ３−Ｌ１細胞を、２４ウェルプレートに、２．５×１０５細胞／ウェルの密度で播種した。細胞を、Ｆｕｇｅｎｅ６を使用して１μｇのＴＯＰＦＬＡＳＥと０．２μｇのβ−ガラクトシダーゼレポータープラスミドでトランスフェクトし、２０％のウシ血清を含むＤＭＥＭ中で、コンフルエンシー後２日まで増殖させた。細胞を、上記のようなインスリン、３−イソブチル−１−メチルキサンチン、およびデキサメタゾンでの分化の誘導の前、および誘導後、２４、４８、および９６時間前に回収した。ルシフェラーゼ活性とβ−ガラクトシダーゼ活性を製造業者の説明書（Ｐｒｏｍｅｇａ）にしたがって測定した。ルシフェラーゼ値はβ−ガラクトシダーゼ活性に対して正規化した。
【０２４７】
９．統計分析
結果は平均＋／−ｓ．ｅ．ｍ．として表す。グループ間の差異を、対応のない両側スチューデントＴ検定（ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）を使用することによって決定し、ｐ＜０．０５を統計学的に有意であるとみなした。
【０２４８】
（実施例２）
可能性のある新規のアディポカインをコードする遺伝子としてのＣｃｄｃ８０の同定
アディポカインをコードする新規の遺伝子を同定する試みにおいて、代謝パラダイム（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｐａｒａｄｉｇｍ）の間の３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞およびマウスの白色脂肪組織（ＷＡＴ）中で起こる遺伝子発現の変化を分析した。可能性のある候補として見なされるためには、遺伝子は１）脂質生成、２）絶食、３）肥満、および４）インスリン感作の間に調節されるはずである。この転写プロファイリングアプローチにより、可能性のある分泌型タンパク質をコードする遺伝子としてコイルドコイルドメイン含有８０（ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ８０（Ｃｃｄｃ８０））が明らかとなった。Ｃｃｄｃ８０は、予想されれる１０８ｋＤａの分子量の９４９アミノ酸のタンパク質をコードする。Ｃｃｄｃ８０オープンリーディングフレームのヌクレオチド配列は、推定される切断可能なシグナルペプチド、複数の核局在化シグナル、３個のＮ結合グリコシル化部位、コイルドコイルドメイン、およびＳｕｓｈｉ反復含有タンパク質ＳＲＰＸ／ＳＲＰＸ２の５番目のドメインと相同性（約３０％）を共有している３個の内部反復の存在を示した。
【０２４９】
本発明者らは、脂肪組織の中で優先的に発現され、一次脂肪細胞の中で発現され、そして脂肪細胞の分化の間にアップレギュレートされる分泌型タンパク質を検索した。
【０２５０】
図１Ａを参照すると、正常なマウス組織の中での組織分布分析は、Ｃｃｄｃ８０がＷＡＴの中で高度に発現され、他の組織の中でははるかに低いｍＲＮＡレベルを有していることを示した。本発明者らはまた、Ｃｃｄｃ８０が、間質の血管画分の中よりも有意に高いレベルで、一次脂肪細胞の中に存在することを見出した（図１Ｆ）。さらに、脂質生成のインビトロモデルを使用して、本発明者らは、前脂肪細胞から完全に分化した脂肪細胞への３Ｔ３−Ｌ１細胞の転換が、Ｃｃｄｃ８０発現の５倍の増大と関係があることを見出した（図１Ｂ）。
【０２５１】
Ｃｃｄｃ８０遺伝子の発現はインビボで調節される。例えば、図１Ｃを参照すると、絶食させると、マウスＷＡＴの中でのＣｃｄｃ８０の発現は、不断給餌した動物と比較すると８０％低下した。加えて、Ｃｃｄｃ８０ｍＲＮＡレベルは、それらの野生型の対応物と比較して肥満のｏｂ／ｏｂマウスのＷＡＴの中で有意に低下し（図１Ｄ）、チアゾリジンジオン（ＴＺＤ）、ロシグリタゾンでの処置後に正常レベルに回復したことが明らかになった（図１Ｅ）。
【０２５２】
図１Ｇは、ヒト組織中でのＣｃｄｃ８０ｍＲＮＡの発現を示す。図１Ｇに示されるように、Ｃｃｄｃ８０ｍＲＮＡの発現は、最も高い発現が脂肪組織中で検出されたマウスと類似していた。有意であるが、低いＣｃｄｃ８０ｍＲＮＡの発現が、子宮、肺、心臓、および甲状腺で見られた。ヒトおよびマウスのパネル上での組織の様々な提示を考慮すると、ヒトＣｃｄｃ８０の組織分布はマウスでのパターンと類似しており、Ｃｃｄｃ８０がアディポカインであることと一致する。
【０２５３】
本実施例は、Ｃｃｄｃ８０が脂質生成の間に、そして、絶食、肥満、およびインスリン感作剤でのｏｂ／ｏｂマウスの処置後に、白色脂肪組織の中で調節されることを明らかに示している。これにより、Ｃｃｄｃ８０がエネルギーおよび／または栄養素の代謝の調節において役割を担っている証拠が提供された。
【０２５４】
（実施例３）
分泌型タンパク質としてのＣｃｄｃ８０の同定
本発明以前には、Ｃｃｄｃ８０遺伝子が分泌型タンパク質をコードするかどうかについての問題は、これがＮ末端シグナルペプチド配列を含むとの予想にもかかわらず、矛盾する結果をもたらしていた。例えば、１つの実験では、マウスＣｃｄｃ８０が一時的にトランスフェクトされたＣＯＳ７細胞から分泌されることが報告されている（Ｌｉｕ、ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３２２：４９７−５０７、２００４）が、別の実験は、ＣＯＳ細胞の中で異所的に発現されたヒトＣｃｄｃ８０の細胞内での発現が示されているが、その分泌は示されていない（Ｂｏｍｍｅｒ、ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：７９６２−７９７５、２００５）。
【０２５５】
Ｃｃｄｃ８０が分泌型タンパク質であることを確認するために、インフレームであるＣ末端ＦＬＡＧエピトープを含むヒトＣｃｄｃ８０をＨＥＫ２９３Ｔ細胞の中で発現させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、その後の銀染色による無血清馴化培地の分析は、Ｃｃｄｃ８０を発現する細胞由来の培地中に、容易に検出できる突出した１４０ｋＤａの存在を明らかにしたが、空のベクターでトランスフェクトした細胞由来の培地によっては存在は明らかにならなかった（図２Ａ）。このバンドをゲルから切り出し、質量スペクトル分析により、このタンパク質が全長Ｃｃｄｃ８０（６３％のアミノ酸範囲；未公開データ）であることを確認した。その後、本発明者らは、抗ＦＬＡＧ抗体を使用してウェスタンブロッティングによってＨＥＬ２９３Ｔ上清を分析し、Ｃｃｄｃ８０がその全長の形態（１４０ｋＤａ）で分泌されるだけではなく、９５ｋＤａおよび５０ｋＤａの切断された断片としても分泌されることを明らかにした（図２Ｂ）。全長のＣｃｄｃ８０とＣｃｄｃ８０の切断断片が馴化培地から効率よく枯渇させられ（レーン３対レーン４、図２Ｂ）、そしてＦＬＡＧペプチドでの溶出後に回収される（レーン３対レーン６、図２Ｂ）ことの観察は、完全なＣ末端の存在を示している。Ｃｃｄｃ８０のプロセシングが細胞外タンパク質分解事象に関与しているかどうかを決定するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、プロテアーゼ阻害剤のカクテルとともにインキュベートした。図２Ｃに示すように、Ｃｃｄｃ８０の５０ｋＤａの断片の分泌は、プロテアーゼ阻害剤の存在によってほぼ完全になくなり、これに付随して、全長のＣｃｄｃ８０および９５ｋＤａのＣｃｄｃ８０の切断形態の存在が増加する。これは、Ｃｃｄｃ８０の高分子量の形態（１４０ｋＤａおよび９５ｋＤａ）が細胞表面に結合したプロテアーゼの基質となることを示唆している。
【０２５６】
内因性Ｃｃｄｃ８０の分泌を試験するために、本発明者らは、マウスＣｃｄｃ８０およびヒトＣｃｄｃ８０との間で１００％の配列相同性を有している２つのペプチドを使用してポリクローナル抗体を作製した（実施例１）。Ｃｃｄｃ８０の分泌を、３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞と脂肪細胞から得られた馴化培地中で分析し、ヒトＣｃｄｃ８０を異所的に発現するＨＥＬ２９３Ｔ細胞由来の馴化培地と比較した。免疫ブロット分析により、Ｃｃｄｃ８０は脂肪細胞により分泌されるが、前脂肪細胞によっては分泌されないことが明らかになった（図２Ｄ）。加えて、Ｃｃｄｃ８０は、全長のタンパク質（１４０ｋＤａ）として、そしてＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来の馴化培地中で先に同定されたプロセシングされた断片（５０ｋＤａ）としても、脂肪細胞から分泌された（図２Ｄ）。
【０２５７】
本実施例は、Ｃｃｄｃ８０が分泌型タンパク質であり、これが全長タンパク質としても、また切断断片としても分泌されることを明らかにしている。
【０２５８】
（実施例４）
脂質生成の間のＣｃｄｃ８０発現の分析
Ｃｃｄｃ８０ｍＲＮＡレベルが脂質生成の間にアップレギュレートされることを示している実施例２に示された結果（図１Ｂ）を前提として、３Ｔ３−Ｌ１細胞の脂肪細胞への分化の間の様々な段階（図３Ａに模式的に示す）でＣｃｄｃ８０遺伝子の発現を試験した。図３Ｂに示すように、Ｃｃｄｃ８０はニ峰様式で発現され、細胞が増殖後に増殖停止に達した時点で、ｍＲＮＡレベルの最初の上昇がある。その後、Ｃｃｄｃ８０の低いｍＲＮＡレベルが、クローン性増殖の間に脂質生成誘導因子で分化を誘導した際に検出され、この後には、細胞が最終分化に到達した時点でのより高い発現が続く（図３Ｂ）。
【０２５９】
クローン性増殖の間の分化の誘導とＣｃｄｃ８０の抑制との間での時間的関係を決定するために、経時変化を確立した。Ｃｃｄｃ８０ｍＲＮＡレベルの有意な低下が、脂質生成誘導因子（デキサメタゾン、ＩＢＭＸ、およびインスリン）の添加後８時間で観察され、２４時間後に最大となった（図２Ｃ）。その後、本発明者らは、クローン性増殖の間のＣｃｄｃ８０の抑制における、全ての脂質生成誘導因子の個々の、および組み合わせによる寄与を評価した。カクテルのそれぞれの個々の成分はＣｃｄｃ８０ｍＲＮＡレベルを有意に低下させることができたが、デキサメタゾンとＩＢＭＸの両方の組み合わせが、Ｃｃｄｃ８０の発現を完全に抑制するためには必要であり、これは、インスリンの添加によってさらに大きくなることはなかった（図３Ｄ）。
【０２６０】
本実施例は、Ｃｃｄｃ８０が分化の間に３Ｔ３−Ｌ１細胞中でニ峰様式で発現されることを明らかにしている。
【０２６１】
（実施例５）
ＲＮＡｉによるＣｃｄｃ８０のサイレンシング
脂肪細胞機能におけるＣｃｄｃ８０の役割を試験するために、対照（非サイレンシング）ｓｈＲＮＡまたはＣｃｄｃ８０ｓｈＲＮＡのいずれかをコードするレトロウイルスベクターを発現する安定な細胞株を作製した。図４Ａに示すように、ＲＮＡ干渉によるＣｃｄｃ８０のサイレンシングにより、Ｃｃｄｃ８０の発現が４０〜５０％低下した。さらに、図４Ｂを参照すると、ＲＮＡ干渉によるＣｃｄｃ８０のサイレンシングにより、タンパク質の分泌は著しく低下した。さらに、脂肪細胞の分化のプロトコールの最後の時点での脂質の蓄積を、当該分野で周知の方法に従いオイルレッドＯ染色によって視覚化した。脂肪細胞へと分化するノックダウン細胞株の能力は、分化のプロトコールの最後の時点でのオイルレッドＯ染色の減少によって示されるように、阻害された（未公開データ）。これは、Ｃｃｄｃ８０が脂質生成に必要であることを示唆している。
【０２６２】
Ｃｃｄｃ８０が脂肪細胞の分化を制御する機構をさらに研究するために、脂質生成、代謝、およびシグナル伝達の公知の媒介因子の遺伝子発現プロフィールを確立した（図４Ｃ）。Ｃ／ＥＢＰαおよびＰＰＡＲγの発現は、Ｃｃｄｃ８０ノックダウン（ＫＤ）細胞の中では有意に低下したが、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰγ、ＣＲＥＢ１、Ｅ２Ｆ１、Ｅ２Ｆ４、およびＦＯＸＯ１の発現は低下しなかった（図４Ｃ、上のパネル）。加えて、ＰＰＡＲγのポジティブな調節因子であるＫＬＦ５（Ｏｉｓｈｉら、Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ．１：２７−３９、２００５）およびβ−カテニンシグナル伝達に関与している転写因子であるＴＣＦ４（ｖａｎ  ｄｅら、Ｃｅｌｌ  １１１：２４１−２５０、２００２）の発現は、Ｃｃｄｃ８０のサイレンシング後に有意に増大した（図４Ｃ、上のパネル）。これらのデータは、Ｃｃｄｃ８０がＣ／ＥＢＰβ／γとＫｌｆ５の下流で、そしてＣ／ＥＢＰαとＰＰＡＲγの上流で作用することを示唆している。ＴＣＦ転写因子を介するβ−カテニンシグナル伝達が、Ｃ／ＥＢＰαとＰＰＡＲγの発現の誘導を妨害し、脂質生成を阻害することが公知であるので（Ｒｏｓｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８９：９５０−９５３、２０００）、ＴＣＦ４発現がノックダウン細胞株の中で高くなることに注目することは興味深い。脂質の代謝に関与している複数の遺伝子（ａＰ２、ＣＤ３６、ＤＧＡＴ１／２、ＬＩＰＩＮ１、ＬＰＬ、およびＳＣＤ１／２）の発現は、Ｃｃｄｃ８０−ＫＤ細胞の中では低下しており（図４Ｃ、中央のパネル）、この観察はそれらの低いトリグリセリドの蓄積（分化のプロトコールの最後の時点での低いオイルレッドＯ染色によって示される）と一致する。加えて、インスリン感受性のグルコース輸送因子ＧＬＵＴ４の発現は、Ｃｃｄｃ８０遺伝子のサイレンシング後に低下したが、基底のグルコース輸送因子ＧＬＵ１の発現は変化しなかった。対照細胞とノックダウン細胞の発現プロフィールは、インスリンシグナル伝達経路の共通の媒介因子の発現に明らかな差は示さなかった（図４Ｃ、下のパネル）。分化の間のａＰ２、Ｃ／ＥＢＰα、およびＰＰＡＲγの発現の一時的な変化は、これらの遺伝子がクローン性増殖の間に劇的に誘導されること、そして、この増加の大きさはＣｃｄｃ８０−ＫＤ細胞においては大幅に小さくなり、最終分化を通じて阻害が維持されることを明らかにしている（図４Ｄ）。
【０２６３】
本発明者らは、次に、Ｃｃｄｃ８０−ＫＤ細胞中で観察された低下した脂質生成がインスリンシグナル伝達カスケードの２つの媒介因子ＡｋｔとＥＰＫの活性化の欠損と関係があるかどうかを決定した。ＡｋｔとＥＲＫ１／２の両方のインスリンで刺激されるリン酸化はＣｃｄｃ８０のサイレンシングには影響を受けず、これらのタンパク質の発現全体に変化はなかった（図４Ｅ）。興味深いことに、Ｃｃｄｃ８０−ＫＤ細胞はＥＲＫ１／２の基底リン酸化の上昇を示した。このリン酸化が脂質生成の阻害に関与しているかどうかを試験するために、本発明者らはこれらの細胞を、１μＭまたは１０μＭのＵ０１２６（ＭＥＫの阻害剤、ＥＲＫの上流活性化因子）で処理したが、ＥＲＫの阻害に伴う表現形の逆転は見られなかった（未公開データ）。さらに、本発明者らは、クローン性増殖の間のＵ０１２６での対照細胞の処理により脂質生成が阻害されることを見出した（未公開データ）。これは、脂肪細胞の分化においてＣ／ＥＢＰαのＭＥＫ依存性リン酸化が必要であることと一致していた（Ｐａｒｋら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２４：８６７１−８６８０、２００４；Ｔａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０２：９７６６−９７７１、２００５）。
【０２６４】
ＴＺＤは脂質生成の強力な誘導因子であり（Ｔｏｎｔｏｎｏｚら、Ｃｅｌｌ  ７９：１１４７−１１５６、１９９４）、ｏｂ／ｏｂマウスの脂肪組織の中でＣｃｄｃ８０の発現をアップレギュレートさせることができる（図１Ｅ）ので、本発明者らは、対照細胞とノックダウン細胞の中でのそれらの作用を決定した。細胞は、ロシグリタゾンの存在下、またはそれが存在しない条件下（＋／−ＴＺＤ）で予め分化させ（図３Ａ）、同時に、脂質生成誘導因子を添加した。具体的には、増殖を停止した３Ｔ３−Ｌ１細胞を、１００ｎＭのロシグリタゾンの存在下またはそれが存在しない条件下で脂質生成誘導因子（デキサメタゾン、ＩＢＭＸ、およびインスリン）で分化させた。脂質の蓄積を当該分野で周知の方法にしたがって、オイルレッドＯ染色によって視覚化した。ＴＺＤでの処理により、Ｃｃｄｃ８０−ＫＤ細胞の不完全な脂質生成と脂質の蓄積をほぼ完全に防ぐことができた（未公開データ）。この作用は、Ｃ／ＥＢＰαおよびＰＰＡＲγの発現の回復とは関係がなく、ＴＺＤが、その発現を増大させることによるのではなく、ＰＰＡＲγを活性化させることによってノックダウン細胞の分化を刺激することを示唆している。
【０２６５】
本実施例は、Ｃｃｄｃ８０のノックダウンが脂肪細胞の分化を阻害することを明らかにしている。
【０２６６】
（実施例６）
脂質生成に対するアデノウイルスによって媒介されるＣｃｄｃ８０の過剰発現の影響の分析
脂質生成におけるＣｃｄｃ８０の役割に関する知見をさらに得るために、本発明者らは、アデノウイルスによって媒介される過剰発現システムを使用してその発現を増大させた。その方法論を使用して、Ｃｃｄｃ８０の過剰発現を示さない（ＭＯＩ  ５００；１倍）、または低レベルのＣｃｄｃ８０発現（ＭＯＩ  １０００；２倍）および高レベルのＣｃｄｃ８０発現（ＭＯＩ  ２０００；５倍）を示す細胞を得た（図５Ａ）。したがって、増殖を停止した細胞および最終分化した細胞からのＣｃｄｃ８０の分泌は、Ｃｃｄｃ８０のアデノウイルスによって媒介される過剰発現の後に増大した（図５Ｂ）。本発明者らは、その後、Ｃｃｄｃ８０の過剰発現が脂質を蓄積させるこれらの細胞の能力に影響を与えるかどうかを決定した。５００、１０００、または２０００のＭＯＩでアデノウイルスに感染させた３Ｔ３−Ｌ１細胞中での脂質の蓄積を、当該分野で周知の方法に従うオイルレッドＯ染色によって、脂肪細胞の分化のプロトコールの最後の時点で視覚化した。Ｃｃｄｃ８０の過度の（ＭＯＩ  ２０００）過剰発現は、オイルレッドＯ染色の低下によって反映されるように脂質生成を阻害するが、中程度の（ＭＯＩ  １０００）過剰発現は阻害しないことが明らかとなった（未公開データ）。この後者の観察と一致して、Ｃｃｄｃ８０の高レベルでの発現は、ａＰ２、Ｃ／ＥＢＰα、およびＰＰＡＲγの発現を大幅に低下させたが、低レベルでの発現ではそうではなかった（図５Ｃ）。さらに、分化の間の遺伝子発現の変化の時間的解析は、通常はクローン性増殖の間に起こる、脂質生成のマーカーａＰ２、Ｃ／ＥＢＰα、およびＰＰＡＲγの誘導が、Ｃｃｄｃ８０の過度の過剰発現によって有意な影響を受けることを明らかにした（図５Ｄ）。本発明者らは、最後に、Ｃｃｄｃ８０の大きな過剰発現（ＭＯＩ  ２０００）に関係している低下した脂質生成の表現形を反転させる、ＴＺＤ処置の能力を評価した。２０００のＭＯＩでアデノウイルスに感染させた増殖を停止した３Ｔ３−Ｌ１細胞を、ロシグリタゾン（１００ｎＭ）の存在下、またはそれが存在しない条件下で、脂質生成誘導因子（デキサメタゾン、ＩＢＭＸ、およびインスリン）を用いて分化させた。脂質の蓄積を、当該分野で周知の方法にしたがって、オイルレッドＯ染色によって視覚化した。Ｃｃｄｃ８０−ＫＤ細胞を用いた場合には、クローン性増殖の開始時点でのロシグリタゾンでの持続的な処理（＋ＴＺＤ）により、通常の脂質生成カクテル（−ＴＺＤ）を使用して分化させた細胞と比較して、脂質を蓄積させるＣｃｄｃ８０を過剰発現する細胞の能力が有意に増大した（未公開データ）。
【０２６７】
本実施例は、Ｃｃｄｃ８０の過度の過剰発現は脂肪細胞の分化を阻害するが、中程度の過剰発現は脂肪細胞の分化を阻害しないことを明らかにしている。
【０２６８】
（実施例７）
Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達に対するＲＮＡｉによるＣｃｄｃ８０のサイレンシングの影響の分析
増殖を停止した３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞が脂肪細胞になる確約には、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達のダウンレギュレーションと、Ｃ／ＥＢＰαおよびＰＰＡＲγの誘導の確約が必要である（Ｆａｒｍｅｒ、Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ．４：２６３−２７３、２００６；ＲｏｓｅｎおよびＭａｃＤｏｕｇａｌｄ、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７：８８５−８９６、２００６）。脱調節されたβ−カテニンシグナル伝達がＣｃｄｃ８０−ＫＤ細胞の中での脂質生成の低下に関与している可能性を調べるために、本発明者らは、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達媒介因子、転写因子、および標的遺伝子をコードする遺伝子のｍＲＮＡレベルを、リアルタイムＰＣＲ低密度アレイを使用して測定した。この分析により、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の標的遺伝子（Ａｘｉｎ−２、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ−３、ＦＧＦ１８、およびＦｒｉｚｚｌｅｄ−７）の発現がＲＮＡｉによるＣｃｄｃ８０のサイレンシング後には２倍から３５倍、顕著にアップレギュレートされ、これが分化の後期段階で起こることが明らかになった（図６Ｃ）。β−カテニンシグナル伝達媒介因子（ＡＰＣ、β−カテニン、Ｄｖｌ−１、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−１、ＧＳＫ３β、ＬＲＰ５／６、およびＷｎｔ１０ｂ；図６Ａ）の発現の極わずかな変化は、分化の間のＷｎｔ標的遺伝子の激しいアップレギュレーションと関係があった（図６Ｃ）。さらに、ＴＣＦ／ＬＥＦ転写因子の発現は、クローン性増殖後にＬＥＦ１のダウンレギュレーションを、そしてＣｃｄｃ８０−ＫＤ細胞の中での最終分化後には高いＴＣＦ４  ｍＲＮＡレベルを示した（図６Ｂ）。これらの結果は、Ｃｃｄｃ８０が、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の成分自体の発現ではなく、転写活性（標的遺伝子の発現の増大によって反映される、図６Ｃ）を調節することを示唆している。
【０２６９】
本実施例は、Ｃｃｄｃ８０のノックダウンがＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達を増大させることを明らかにしている。
【０２７０】
（実施例８）
クローン性増殖の間のＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の効果的な抑制に対するＣｃｄｃ８０の影響の分析
Ｃｃｄｃ８０がＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達を調節する可能性をさらに調べるために、本発明者らは、クローン性増殖の間のサイクリンＤ１の発現を測定した。図７Ａに示すように、ＲＮＡｉによるＣｃｄｃ８０の低下は、クローン性発現の間にサイクリンＤ１  ｍＲＮＡレベルを抑制する脂質生成誘導因子の能力を大幅に低下させ、一方、Ｃｃｄｃ８０のアデノウイルスによって媒介される過剰発現は効果がなく、このことはＣｃｄｃ８０の内因性のレベルがサイクリンＤ１の発現を効果的に抑制するために十分であることを示唆している。次いで、本発明者らは、３Ｔ３−Ｌ１細胞中でのＴＯＰＦＬＡＳＥレポーター活性を測定することにより、ＴＣＦ媒介性の転写活性を試験した。増殖停止に到達した時点（Ｔ＝０）では、非サイレンシングｓｈＲＮＡまたはＣｃｄｃ８０ｓｈＲＮＡを発現している細胞は同程度のＴＯＰＦＬＡＳＨ活性を示した（図７Ｂ）。一旦分化が脂質生成性カクテルを用いて誘導されると、ＴＯＰＦＬＡＳＨ活性は、クローン性増殖の間中、Ｃｃｄｃ８０−ＫＤ細胞の中でさらに有意に上昇した（図７Ｂ）。逆に、β−カテニンの安定化形態を発現するＨｓｐＧ２細胞（ｄｅ  Ｌａ  Ｃｏｓｔｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：８８４７−８８５１、１９９８）の中でのＣｃｄｃ８０の過剰発現は、ＴＯＰＦＬＡＳＨレポーター活性の用量依存性阻害を生じ、これには、β−カテニンタンパク質の発現に対する影響は伴わなかった（図７Ｃ）。これらのデータは、増殖停止の間のＣｃｄｃ８０の発現の上昇が、クローン性増殖の間のＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の効果的な抑制には不可欠であることを示しており、さらに、脂肪細胞の最終分化の間のＣ／ＥＢＰαおよびＰＰＡＲγの誘導と正常な脂質の蓄積にこれが必要であることを示唆している（図７Ｄ）。
【０２７１】
本実施例は、Ｃｃｄｃ８０が脂質生成の間のＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の効率的な抑制に必要であることを明らかにしている。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年11月16日(2009.11.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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