(57)【要約】細胞若しくは組織標的へのアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよびＲＮＡｉを包含するオリゴヌクレオチドの送達のための生物適合性のポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）に基づくポリマーソーム系、ならびにそのための使用方法が提供され、該方法は、とりわけ癌若しくは細胞過剰増殖のような疾患を処置するために生物分解性の中性ナノ変形ポリマーソーム送達ベヒクル中にオリゴヌクレオチドを内包すること、および内包されたオリゴヌクレオチドをｉｎ  ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ  ｖｉｖｏで細胞若しくは組織標的に送達することを含んでなる。生物分解性ポリマーソームおよびその中に安定に内包されたオリゴヌクレオチドは、細胞により受動的に取り込まれかつエンドリソソームに送達され、そこでポリマーソームが既知の速度で既知のｐＨで分解して、それにより内包されたオリゴヌクレオチドを制御された様式で細胞内に放出しかつ細胞標的の核へのアンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはｓｉＲＮＡ若しくはＲＮＡｉの送達を助長する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよびＲＮＡｉを包含するオリゴヌクレオチドの細胞若しくは組織標的への送達方法であって、該方法は
生物分解性の中性ナノ変形ポリマーソーム送達ベヒクル中にオリゴヌクレオチドを内包すること；および
内包されたオリゴヌクレオチドをｉｎ  ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ  ｖｉｖｏで細胞若しくは組織標的に送達することであって、ポリマーソーム送達ベヒクルは既知のｐＨで既知の速度で分解し、それにより内包されたオリゴヌクレオチドを制御された様式で細胞若しくは組織標的内に放出する、
を含んでなる、上記方法。
【請求項２】
送達することがそれの必要な患者の細胞へのｉｎ  ｖｉｖｏでの送達を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞若しくは組織標的が筋細胞を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
内包されたオリゴヌクレオチドを送達することが、筋ジストロフィーのモデル動物の標的とされる細胞若しくは組織にｉｎ  ｖｉｖｏで送達することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
内包されたオリゴヌクレオチドを送達することが、それに対する必要性を有するヒト筋ジストロフィー患者の標的とされる細胞若しくは組織にｉｎ  ｖｉｖｏで送達することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
内包されたヌクレオチドの送達方法が、筋細胞の核にヌクレオチドを送達して、筋の長さに沿ったタンパク質発現およびジストロフィン陽性線維の産生を遂げることをさらに含んでなる、請求項２若しくは３に記載の方法。
【請求項７】
ポリマーソームベヒクルの分解がエンドリソソーム内で起こり、それにより内包されたオリゴヌクレオチドの放出を促進する、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
細胞若しくは組織標的の核への送達のためのその中に内包された最低１種のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでなる生物分解性のポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）に基づくポリマーソーム送達系であって、ＰＥＯをベーストするポリマーソーム系は、水性溶液中で自己集合する１種若しくはそれ以上の両親媒性コポリマーを含んでなり、および、両親媒性コポリマーの最低１種が親水性ブロックコポリマーであり、総コポリマー分子量に関するその重量分率が中性の表面電荷を有する二重層小胞構造中への両親媒性分子の自己集合を指図し、ならびに、ＰＥＯの体積分率および鎖化学がアンチセンスオリゴヌクレオチドの放出キネティクスを制御してそれによりポリマーソーム膜分解を調節する、上記送達系。
【請求項９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドがアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ若しくはＲＮＡｉを含んでなる、請求項８に記載のＰＥＯをベーストするポリマーソーム系。
【請求項１０】
親水性コポリマーがポリエチレンオキシドを含んでなる、請求項８に記載のＰＥＯをベーストするポリマーソーム系。
【請求項１１】
疎水性コポリマーがポリラクチド若しくはポリカプロラクトンを含んでなる、請求項８に記載のＰＥＯをベーストするポリマーソーム系。
【請求項１２】
ポリマーソーム系および内包物がそれぞれ生物適合性である、請求項８に記載のＰＥＯをベーストするポリマーソーム系。
【請求項１３】
ポリマーソーム小胞が、ｉｎ  ｖｉｖｏの細胞内の内包されたオリゴヌクレオチドの核送達を助長する、請求項８に記載のＰＥＯをベーストするポリマーソーム系。
【請求項１４】
生物分解性小胞の分解が細胞エンドリソソーム内で起こり、それにより内包されたオリゴヌクレオチドの放出および細胞の核へのオリゴヌクレオチドの提示を促進する、請求項８に記載のＰＥＯをベーストするポリマーソーム系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引用
本特許出願は、２００７年１１月１４日に出願された仮出願第６０／８５８，８６２号明細書（そっくりそのまま本明細書に組込まれる）に対する優先権を主張する。
【０００２】
政府の支援
本研究は国立保健研究所からの助成金すなわち助成金番号Ｒ２１により部分的に支援された。米国政府は本発明にある種の権利を有しうる。
【０００３】
技術分野
本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびｓｉＲＮＡのような核酸のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの送達のためのＰＥＯをベーストするポリマーソーム（ｐｏｌｙｍｅｒｓｏｍｅ）および徐放性送達ベヒクルとしてのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
アンチセンス剤は、ｍＲＮＡ分解を触媒する二本鎖ＲＮＡ干渉（非特許文献１）から、多様な疾患の遺伝子特異的治療における応用を見出しつつある一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）までの範囲にわたる。ＡＯＮの生物安定性の最近の進歩はとりわけ重要であり、２’Ｏ−メチル修飾がとりわけ安定なＡＯＮの重要な一分類を定義する。（非特許文献２）。しかしながら分解に対する安定性は機能的および効率的な送達を保証せず、それは未だアンチセンス治療での重大な一問題である。
【０００５】
アンチセンスが配列特異的様式で遺伝子の転写および／若しくは翻訳を阻害するのみならず、また遺伝子突然変異を回避するようにエキソンをスプライスもし得るという発見は、分子治療の新たなモダリティーを切り開いた。（非特許文献３、非特許文献４）。今やＡＯＮ治療を施すことができるとみなせる１疾患は、ウイルスおよび多様なトランスフェクション試薬を用いる最近の細胞および動物研究がジストロフィン転写物のＡＯＮ誘発性エキソンスプライシングを示すところのデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）である。（非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０）。しかしながら、こうしたＡＯＮの筋への効率的送達はしばしば大きな課題であり、そしてＡＯＮの分解およびクリアランスに対する保護を提供する担体、ならびに循環、細胞進入および核中への放出の機構に大きく依存する。（非特許文献１１、非特許文献１２）。
【０００６】
可溶性化合物のための水性管腔をもつ徐放性ポリマー小胞または「ポリマーソーム」が、酸化感受性（非特許文献１３）若しくは加水分解感受性（非特許文献１４、非特許文献１５）いずれかのブロックコポリマー両親媒性物質を使用して形成された。自己穿孔（ｓｅｌｆ−ｐｏｒａｔｉｎｇ）ポリマーソームは、実際、核酸送達について複数の潜在的利点を有する。ポリマー小胞はＤＮＡ挿入薬の核送達に既に活用されている（非特許文献１６）。
【０００７】
「刺激応答性」小胞、すなわち可溶性物質を水中に捕捉しかつ循環の間にそれらの安定性を維持するが、しかし標的に達する場合に内包物（ｅｎｃａｐｓｕｌａｎｔ）を迅速に放出するように特定の環境刺激に際して効果的に不安定化されたようになるものを設計することが高度に望ましいであろう。
【０００８】
温度、ｐＨ、電解質濃度および電位を包含する外的刺激に感受性である応答性ブロック
コポリマー自己集合体（ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ）は、天然の系を模倣するための新規容器、マイクロリアクターおよびアクチュエーターとして非常に興味深い。
【０００９】
ナノ変形（ｎａｎｏ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ）集合体は、それらが非毒性代謝物まで分解するために大きな注目を集めている。それらは多くの環境問題に対する重要な解決策であり、そして多様な生物医学の用途にとりわけ有用である。多くの労力がバルク若しくは薄膜および単層としての分解性ポリマーおよびそれらのコポリマーに集中している。制限された研究のみが、軟質材料工学に極めて重要である溶液中の分解性両親媒性コポリマー自己集合体（球状ミセル、ワームミセルおよび小胞）を探求した。ほとんどは球状ミセル、および稀な場合に小胞が、報告によれば、親水性ブロックとしての生物適合性のステルシー（ｓｔｅａｌｔｈｙ）ポリ（エチレンオキシド）に結合された疎水性ブロックとしての分解性ポリエステル、典型的にはポリラクチド若しくはポリカプロラクトンとのコポリマーから作成されている。
【００１０】
本発明まで、ｉｎ  ｖｉｖｏで循環中の安定性を保持しかつ免疫応答を低下させつつ水溶解性分子および治療薬のための生物適合性のリポソーム様送達系に対する当該技術分野における必要性が存続した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｆｉｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：８０６−８１１（１９９８）
【非特許文献２】Ｋｕｒｒｅｃｋ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：１６２８−１６４４（２００３）
【非特許文献３】Ｓｈｉら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ  ９７：１８９−２０９（２００４）
【非特許文献４】Ｗｉｌｔｏｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ８：１３０−５（２００６）
【非特許文献５】Ｌｕら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ９：１００９−１０１４（２００３）
【非特許文献６】Ｗｅｌｌｓら、ＦＥＢＳ  ５５２、１４５（２００３）
【非特許文献７】Ｍａｎｎら、ＰＮＡＳ  Ｕ．Ｓ．Ａ．９８：４２−４７（２００１）
【非特許文献８】Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ  １４：８８−９６（２００６）
【非特許文献９】Ｂｒｅｍｍｅｒ−Ｂｏｕｔら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ  １０：２３２−２４０（２００４）
【非特許文献１０】‘ｔ  Ｈｏｅｎら、Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ  ７：２８１−９７（２００６）
【非特許文献１１】Ｄａｓｓ、Ｐｈａｒｍａｃｙ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ５４：３−２７（２００２）
【非特許文献１２】Ｌｏｒｅｎｚら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．Ｃｅｌｌ  ９：１００７−１０２３（１９９８）
【非特許文献１３】Ｎａｐｏｌｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍａｔ．３：１８３−１８９（２００４）
【非特許文献１４】Ａｈｍｅｄら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ  ９６：３７−５３（２００４）
【非特許文献１５】Ｄｉｓｃｈｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９７：９６７−９７３（２００２）
【非特許文献１６】Ａｈｍｅｄら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ３（３）：３４０−３５０（２００６）
【発明の概要】
【００１２】
［発明の要約］
本発明は、生物適合性および免疫適合性の双方でありならびに小胞内に分子組成物を内包することが可能である中性のポリマーソーム小胞を提供する。
【００１３】
本発明は、徐放性ポリマーソームベヒクル内への有効成分の内包による選択された標的への分子組成物のような「有効成分」の制御送達方法をさらに提供する。
【００１４】
本発明のポリマーソームは、ある範囲の組成物をポリマーソームの膜コア中に内包することが可能であることが示される。極めて広範な親水性素材をポリマーソームと会合若しくはそれ内で内包し得る。本発明は、従って、「充填」若しくは「内包」ポリマーソームを形成する、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム分子、ｓｉＲＮＡ若しくはＲＮＡｉ分子のような組成物またはそれらのフラグメントを制限なしに包含する１種若しくはそれ以上の「有効成分」を内包するポリマーソームを提供する。
【００１５】
本発明は、アンチセンス、リボザイム若しくはＲＮＡｉ分子組成物のような１種若しくはそれ以上の選択された有効成分をそれの必要な患者に輸送するためのポリマーソームの使用方法をさらに提供する。該ポリマーソームは、それから最終的に個々の細胞の核に有効成分が送達されることができる患者の組織若しくは血流に有効成分を送達するのに使用し得る。例えば、ポリマーソームは、アンチセンスＲＮＡのような治療的有効成分をそれの必要な患者の細胞の核に効果的に送達して、従って限定されるものでないが癌を挙げることができる根底にある分子基盤をもつ疾患のための分子治療としてはたらく。
【００１６】
半透性の薄壁性内包化膜およびその中の最低１種の内包物を有し、ならびにｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで細胞の核に該内包物を送達する、安定な合成の自己集合性徐放性ポリマーソーム小胞が提供される。該ポリマーソームは、両親媒性コポリマーのような純粋に合成の両親媒性分子の多様な水性溶液中の自己集合により作成される。とりわけ、本発明のポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）に基づくポリマーソームは、制御された内包化、内包された物質の輸送および放出のための薬物送達ベヒクルを提供する。
【００１７】
本発明の付加的な目的、利点および新規特徴は後に続く記述、実施例および図面に部分的に示されることができ、そして部分的に以下の検査に際して当業者に明らかとなるであろうか、若しくは本発明の実施により学習されうる。
【００１８】
［発明の詳細な記述］
「ポリマーソーム」すなわち両親媒性ブロックコポリマーの水性溶液中で自己集合した大型の半透性の薄壁性内包膜を含んでなる安定ななお生物分解性の小胞の形成は、公開された米国特許出願第ＵＳ２００５／０００３０１６号明細書ならびに米国特許第６，８３５，３９４号および同第７，２１７，４２７号明細書（それらの内容はそっくりそのまま引用することにより本明細書に組込まれる）に以前に開示されている。本発明のポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）に基づくポリマーソーム小胞は、しかしながら、それらが細胞中への送達および輸送ならびに小胞膜の不安定化を標的としてそれにより内包されたオリゴヌクレオチドの放出を制御された様式で助長するための、アンチセンスオリゴヌクレオチド分子のような有効成分を内包することが可能な中性のナノ変形ポリマーソームであるために独特である。
【００１９】
ポリマーソーム小胞。本発明の「ポリマーソーム」は、数種の物質設計ならびに低分子量界面活性剤および生物学的脂質からの小胞を上回る性能の利点を提供する両親媒性ブロ
ックコポリマーから集成される合成小胞である。所望の分子量、体積分率および化学を有する十分に定義されたブロックコポリマーの合理的設計および合成は、脂質小胞のものに類似の流動性および変形性を保持しつつ小胞の安定性を改良する。とりわけ、本発明のポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）に基づくポリマーソームは、制御された内包化、内包された物質の輸送および放出のための堅牢な薬物送達ベヒクルである。
【００２０】
該用語が本発明で使用されるところの「小胞」は、水若しくは水性溶液中で自己集合する両親媒性物質若しくは超両親媒性物質（ｓｕｐｅｒ−ａｍｐｈｉｐｈｉｌｅ）いずれかから（質量で）主に構成される自己集合した安定な膜により（縁を伴わず）囲まれるところの水性溶液の本質的に半透性の袋である。
【００２１】
該用語が本発明で使用されるところの「ナノ変形」は、加水分解性主鎖をもつ分解性ポリマー素材から成るナノ変形集合体を指す。疎水性ブロックとしての分解性ポリエステル、典型的にはポリラクチド若しくはポリカプロラクトンを、親水性ブロックとしての生物適合性ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）に結合し得る。加水分解性主鎖の分解は小胞の形態の変化をもたらす。従って、本発明のポリマーソームは、小胞が加水分解的分解を受ける際に膜の形態の変化が該膜内に内包化されている物質の放出を助長するために「生物分解性」である。
【００２２】
本発明のポリマーソームは水性溶液中で合成ポリマーから集成される。リポソームと異なり、ポリマーソームはその主成分として脂質若しくはリン脂質を包含しない。結果、ポリマーソームは、脂質小胞の最も安定なものと熱的、機械的および化学的に異なりならびにとりわけより耐久性かつ弾性であり得る。例示的一実施において、ポリマーソームは中性（正若しくは負の電荷を表さないことにおけるような）のナノ変形粒子である。ポリマーソームは、例えば薄膜若しくはバルクの再水和、または付加的な泳動（ｐｈｏｒｅｓｉｓ）段階、あるいは他の既知の方法により、層状膨潤の過程の間に集成する。リポソームと同様に、ポリマーソームは「自己集合体」すなわち閉鎖半透膜の自発的なエントロピーに駆動される製造過程により生じる。
【００２３】
本発明のポリマーソームは、１〜４０００ｇ／ｍｏｌの範囲以上の分子量を有するジブロック両親媒性コポリマーから製造される小胞である。「両親媒性」物質は極性（水溶解性）および疎水性（水不溶性）双方の基を含有するものである。「ポリマー」は結合された単量体の不均質な分子を含んでなる巨大分子である。ポリマーの物理的挙動は、総分子量、ポリマーの組成（例えば多様な単量体の相対濃度）、各単量体単位の化学的同一性および溶媒とのその相互作用、ならびにポリマーの構造（それが一本鎖であるか若しくは分枝状鎖であるかどちらか）を包含する数種の特徴により指図される。例えば、エチレンオキシド（ＥＯ）のポリマーであるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）中で、リン脂質に共有結合される場合にリポソームの循環寿命を最適化する鎖長は、３４〜１１４個の共有結合された単量体のおよその範囲（ＥＯ３４ないしＥＯ１１４）にあることが既知である。
【００２４】
「ブロックコポリマー」は異なる化学の最低２個の縦列の相互結合された領域を有するポリマーである。各領域は単量体の反復配列を含んでなる。従って「ジブロックコポリマー」は２種のこうした結合された領域（Ａ−Ｂ）を含んでなり；「トリブロックコポリマー」は３種（Ａ−Ｂ−Ｃ）、などである。各領域はそれ自身の化学的同一性および溶媒に対する好みを有しうる。従って広範なブロック化学が理論上可能であり、合成化学者の慧眼によってのみ制限される。
【００２５】
本発明の好ましいコポリマーは親水性ＰＥＯ（ポリエチレンオキシド）ブロックおよびポリマーソームの自己集合を駆動する数種の疎水性ブロックの１種を含んでなる。多様な細胞骨格フィラメントの柔軟性を模倣するジブロック若しくはトリブロックコポリマー両
親媒性物質は、米国特許第６，８３５，３９４号明細書、および米国特許出願第１０／８８２，８１６号明細書を包含するそれに関する係属中出願（引用することにより本明細書に組込まれる）に記述されている。ポリマーのＰＥＯブロック（ポリエチレングリコール；ＰＥＧと同一である）は界面を非常に生物適合性にすることが公知である。従って、生じるポリマーソームは両親媒性凝集物であり、そして流動性および流体力学がそれらの形成で重要な役割を演じる。ポリマーソームはｉｎ  ｖｉｔｒｏで血液中でおよびｉｎ  ｖｉｖｏで血流中で安定である。
【００２６】
適切な分類の両親媒性分子は、限定されるものでないがブロックコポリマー、例えば疎水性ポリエチルエチレン（ＰＥＥ）若しくはポリ乳酸（ＰＬＡ）に結合された親水性ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）により表される。ブロックコポリマーの合成の多様性は、天然に存在するリン脂質の範囲から現在使用可能であるものを大きく拡大する物質特性をもつ多様な小胞を作成する機会を提供する。
【００２７】
表１（下の実施例１を参照されたい）は、水性溶液中で半透性小胞に自己集合することが可能である分子量で１モルあたり多キログラムの合成両親媒性物質のいくつかを列挙する。好ましいＰＥＯ−ＰＥＥブロックコポリマーの一団は、２０％から５０％までの範囲にわたる親水性体積分率ｆＥＯを伴い分子量が１４００から８７００までの範囲にある。表１は本発明での使用に適する合成両親媒性物質を代表することのみ意図している。それは制限することを意図していない。夥しい分子変数をこれらの具体的に説明するポリマーで変えることができ、これゆえに多様な物質特性がポリマーソームの製造に利用可能である。当業者は、本発明の教示に基づきポリマーソームの製造で使用し得る多くの他の適するブロックコポリマーを容易に認識するであろう。
【００２８】
内包化ポリマーソーム小胞。本発明のポリマーソームは、小胞膜内に有効成分を「内包すること」が可能であり、従ってポリマーソームは内包化膜である。内包化膜は、定義上、膜により境界を定められた空間体積の内側に含有されるか若しくは外側に維持されるかのいずれかの溶質に対し半透性若しくは選択的に透過性であることにより区画化する。本発明における「内包物」は、細胞若しくは組織標的への送達のためのポリマーソーム小胞内に「内包化」若しくは「充填」される核酸（ＲＮＡ／ＤＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉなどのような１種若しくはそれ以上の有効成分を指す。
【００２９】
「核酸」若しくは「オリゴヌクレオチド」により、デオキシリボヌクレオシドから構成されようと、リボヌクレオシドから構成されようと、ならびに、ホスホジエステル結合から構成されようと、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチルエステル、アセトアミデート、カルバメート、チオエーテル、架橋ホスホルアミデート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホルアミデート、架橋ホスホルアミデート、架橋メチレンホスホネート、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオエート、架橋ホスホロチオエート若しくはスルホン結合のような修飾結合およびこうした結合の組合せから構成されようと、いかなる核酸も意味している。
【００３０】
本発明は使用される核酸の性質により制限されることを意図していない。標的核酸は天然若しくは合成核酸でありうる。核酸はウイルス、細菌、動物若しくは植物供給源からでありうる。核酸はＤＮＡ若しくはＲＮＡであることができ、および二本鎖、一本鎖若しくは部分的二本鎖の形態で存在しうる。さらに、核酸はウイルス若しくは他の巨大分子の一部として見出されうる。例えばＦａｓｂｅｎｄｅｒら、１９９６、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：６４７９−８９（アデノウイルスの形態のＤＮＡのポリリシン縮合）を参照されたい。
【００３１】
本発明で有用な核酸は、例としてかつ限定するものでなく、アンチセンスＤＮＡおよび／若しくはＲＮＡ；リボザイム；遺伝子治療のためのＤＮＡ；ウイルスＤＮＡおよび／若しくはＲＮＡを包含するウイルスフラグメント；ＤＮＡおよび／若しくはＲＮＡキメラ；ｍＲＮＡ；プラスミド；コスミド；ゲノムＤＮＡ；ｃＤＮＡ；遺伝子フラグメント；一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、スーパーコイルＤＮＡおよび／若しくは三重らせんＤＮＡを包含する多様な構造形態のＤＮＡ；Ｚ−ＤＮＡ；などのようなオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを包含する。核酸は、核酸を大量に製造するのに典型的に使用されるいかなる慣習的手段によっても製造しうる。例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡは商業的に入手可能な試薬および合成機を使用して当該技術分野で公知である方法により化学合成しうる（例えば、Ｇａｉｔ、１９８５、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ
Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、英国オックスフォード）を参照されたい）。ＲＮＡはＳＰ６５（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ウィスコンシン州マディソン）のようなプラスミドを使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を介して高収量で製造しうる。
【００３２】
核酸は当該技術分野で公知であるところのいずれの適する手段によっても精製しうる。例えば、核酸は逆相若しくはイオン交換ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィーまたはゲル電気泳動により精製し得る。もちろん、当業者は、精製方法が精製されるべき核酸の大きさに部分的に依存することができることを認識するであろう。
【００３３】
本明細書で使用されるところの「アンチセンスオリゴヌクレオチド」（ＡＯＮ）という用語は、正常細胞若しくは冒された細胞中に存在する核酸にその少なくとも一部分が相補的である核酸ポリマーを意味している。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは好ましくは約１４と約５０の間のヌクレオチドを含んでなる。より好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは約１２と約３０の間のヌクレオチドを含んでなる。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、限定されるものでないがホスホロチオエートオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドの他の修飾を挙げることができる。オリゴヌクレオチド、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドおよび別の方法で修飾されたオリゴヌクレオチドの合成方法は当該技術分野で公知である（米国特許第５，０３４，５０６号明細書；Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｉ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１４９７（１９９１））。
【００３４】
一般に、「アンチセンス」ＲＮＡ配列はｍＲＮＡのコーディング配列の全部若しくは一部に相補的であるとは言え、アンチセンスＲＮＡがｍＲＮＡとハイブリダイズしかつその翻訳を阻害する限りはいくつかの「不適正」が存在しうる。小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は１〜２ヌクレオチドの３’オーバーハングを含有する一般に短い（例えば約２１〜２３ヌクレオチド長）二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）である。ｓｉＲＮＡはその相補ｍＲＮＡの切断および分解を助長する。
【００３５】
本発明のアンチセンス分子およびオリゴヌクレオチドは、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、短鎖アルキル若しくはシクロアルキル糖間結合または短鎖ヘテロ原子若しくは複素環糖間結合、ホスホロチオエートのような糖間バックボーン結合を含有するもの、ならびにＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２、ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２（メチレン（メチルイミノ）若しくはＭＭＩバックボーンとして知られる）、ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２、ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２およびＯ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２バックボーン（ここでホスホジエステルはＯ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ２である）をもつものを包含しうる。モルホリノバックボーン構造を有するオリゴヌクレオチドもまた使用しうる（米国特許第５，０３４，５０６号明細書）。代替の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヌクレオシド塩基がポリアミドバックボーン中のアザ窒素原子若しくはメチレン基に直接若しくは間接的に結合されているポリアミドバックボーンでオリゴヌクレオチドのホスホジエステルバックボーンを置き換えうる（Ｎｉｅｌｓｅｎら、
Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１４９７（１９９１）および米国特許第５，５３９，０８２号明細書）ペプチド核酸（ＰＮＡ、ときに「タンパク質核酸」と称される）バックボーンを有しうる。ホスホジエステル結合は、キラルかつ鏡像異性体特異的である構造で置換されうる。当業者は本発明の実施における使用のため他の結合を選択することが可能であろう。
【００３６】
オリゴヌクレオチドは最低１個の修飾ヌクレオチド塩基を包含する種もまた包含しうる。従って、天然に通常見出されるもの以外のプリンおよびピリミジンを使用しうる。同様に、ヌクレオチドサブユニットのペントフラノシル部分の修飾もまた遂げることができる。こうした修飾の例は２’−０−アルキル−および２’−ハロゲン置換ヌクレオチドである。本発明で有用である糖部分の２’位の修飾のいくつかの特定の例は、ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ３、Ｆ、ＯＣＮ、Ｏ（ＣＨ２）ｎ、ＮＨ２若しくはＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３（ここでｎは１から約１０までである）；Ｃ１ないしＣ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール（ａｌｋａｒｙｌ）若しくはアラルキル；Ｃｌ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ３；ＯＣＦ３；Ｏ−、Ｓ−若しくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−若しくはＮ−アルケニル；ＳＯＣＨ３；ＳＯ２ＣＨ３；ＯＮＯ２；ＮＯ２；Ｎ３；ＮＨ２；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリール；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換シリル；ＲＮＡ切断基；レポーター基；インターカレーター；オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改良するための基；またはオリゴヌクレオチドの薬動力学特性を改良するための基、および類似の特性を有する他の置換基である。１個若しくはそれ以上のペントフラノシル基を、別の糖、シクロブチルのような糖模倣物、若しくは糖の代わりをする別の部分により置き換えてよい。
【００３７】
内包物の徐放。例示されるポリマーソームは、両親媒性の高分子量のＰＥＯをベーストするポリマーソームを製造するための親水性成分（１種若しくは複数）およびより疎水性のブロックコポリマー成分（１種若しくは複数）の加水分解性ＰＥＯブロックコポリマーの混合比率（モル％）により徐放を提供し、ＰＥＯ体積分率（ｆＥＯ）および鎖の化学が、コポリマー小胞からの内包物の放出キネティクスおよびポリマーソーム担体膜不安定化を制御する。
【００３８】
ポリマーソーム膜は「バルク」すなわち小胞を囲む溶液と物質を交換し得る。バルク中の各成分はある分配係数を有し、バルク中に留まるある確率ならびに膜中に存続するある確率をそれが有することを意味している。条件は、選択された型の分子の分配係数が小胞の膜内ではるかにより高くなることができ、それによりポリマーソームがバルク中のコレステロールのような分子の濃度を低下することを可能にするように、予め決定し得る。好ましい一態様において、リン脂質分子が、バルクへのリン脂質分子の単純添加によりポリマーソーム膜内に取り込むことが示されている。代替において、ポリマーソームは膜内に取り込まれたホルモン、タンパク質、オリゴヌクレオチド、遺伝子などのような選択された分子とともに形成し得、その結果、分配係数を制御することにより、該分子は、ポリマーソームがより高い分配係数を有する最終目標に到達する場合にバルク中に放出されることができる。
【００３９】
本発明のポリマーソームは有効成分、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）などの輸送にとりわけ有用であるが、しかしそれらの有効性の秘訣は、放出される組成物が例えば細胞標的内で最も有用である時刻および場所での内包された有効成分の放出の制御方法を提供する様式でブロックコポリマーを組合せることである。加えて、本発明のＰＥＯポリマーソーム小胞は、それらが生物適合性である、すなわちそれらが有機溶媒残渣を含有せずかつ生物学的細胞および組織と適合性である非毒性物質から作成されるために、内包された分子の核送達に理想的である。従って、それらは有害な免疫学的影響を伴わずに植物若しくは動物組織と相互作用し得るため、患者に送達可能ないかなる有効成分
若しくは分子も送達のため生物適合性ポリマーソームに組み込み得る。
【００４０】
本発明のポリマーソームは分解性であり、エンドリソソームによるポリマーソーム小胞の取り込みに際して両親媒性コポリマーが加水分解を受ける際にポリマーソームの膜が分解することを開始することを意味している。内包物がポリマーソームから放出される際の分解の間の構造変化は動的光散乱のような方法により評価しうる。図１は、本発明の例示的分解性ポリマーソームが、内包されたアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を放出した直後に小型の界面活性剤様ミセルに変形することを示す。細胞内の小型エンドリソソーム内のこうしたミセルの高濃度はエンドリソソームを溶解する傾向があることができ、そして従って細胞の内側の内包されたＡＯＮの放出を促進してそれによりＡＯＮの核送達を助長する。
【００４１】
図２は、例示的なＡＯＮが内包されたポリマーソームの分解がポリマーソームからのＡＯＮの放出に至ることを示す。中性のナノ変形ポリマーソームは、細胞中にアンチセンスＲＮＡのような内包された核酸を送達することが可能であり、そこで放出された内包物が細胞核内に取り込まれかつ局在化される（実施例１により詳細に記述される）。
【００４２】
ポリマーソームは内包された有効成分の細胞標的の核への制御送達および放出のための例外的ベヒクルであるため、本発明の内包化ポリマーソームは遺伝子および／若しくは分子基盤をもつ障害に苦しめられる患者を処置するための分子治療にとりわけ適する。例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーのような障害、ならびに発癌物質、ウイルスおよび／若しくは癌遺伝子発現の調節不全により誘発されるものを包含する癌のような他の分子に基づく障害。
【００４３】
所定の内包化ポリマーソームの投薬量は、慣習的考慮を使用して、例えば主題の製剤の差別的活性の通例の比較および既知の適切な慣習的薬理学的手順により決定し得る。投薬量はさらに投与経路に依存する。適切な投与経路および投薬量は多様なパラメータにより、例えば処置されている個体若しくは処置されるべき障害、または、あるいは移入されるべき治療的有効成分若しくは目的の遺伝子（１種若しくは複数）とともに変動する。使用される特定の製剤は、腫瘍すなわち過剰増殖性の標的組織の特性、および有効成分の最適活性を確実にするための所望の作用部位、すなわち内包化された有効成分が本明細書の方法および系による送達後にその標的組織に達する程度に依存して、慣習的知識に従って選択することができる。
【００４４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドのような核酸を内包したポリマーソームは多くの有望な治療的応用を有する。本発明のポリマーソームは生物適合性であり、そしてタンパク質発現の誤りを修正する、若しくは遺伝子発現を阻害する（遺伝子サイレンシング）ために核物質（ｎｕｃｌｅｉｃ  ｍａｔｅｒｉａｌ）を送達するのに使用し得るか、または癌のような分子基盤をもつ疾患に苦しめられている患者のための薬物療法のような伝統的治療とともに使用し得る。併用療法もまた癌処置への有望な一アプローチであり、協力して作用するｓｉＲＮＡが内包化されたポリマーソームおよび抗癌剤が、癌患者でしばしば見られる薬剤耐性を克服しならびに化学療法の処置を高めることができる。
【００４５】
本発明は以下の実施例にさらに記述される。これらの実施例は付随する請求の範囲の範囲を制限するとして解釈されるべきでない。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
本発明の前述の要約ならびに以下の詳細な記述は付随する図面とともに読まれる場合により良好に理解されるであろう。しかしながら、本発明は示される正確な配置および手段に制限されないことが理解されるべきである。
【図１】動的光散乱によるポリマーソーム小胞の平均水力学的大きさを示す。内包物の徐放に伴いおよそ１００ｎｍの小胞からおよそ４０ｎｍのミセルへのポリマーソームの大きさの移行が起こる。
【図２】アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）が内包された分解性ポリマーソームの放出キネティクスを示す。放出キネティクスは増大する温度とともに増大し；４℃で漏出は数日間検出不可能である。
【図３】物質の内包を伴うおよび伴わないＰＥＯ−ＰＬＡポリマーソーム小胞の水力学的大きさを示す。ｓｉＲＮＡ（１５ｋＤａ）の内包化は小胞の大きさをわずかに増大させる。
【図４】ｉｎ  ｖｉｔｒｏのラミンＡ／Ｃの遺伝子サイレンシングを示す。ラミン発現はｓｉＲＮＡが内包されたポリマーソームとの細胞の７２時間インキュベーション後の蛍光イムノアッセイにより測定した。
【図５】ｓｉＲＮＡが内包されたポリマーソームとの細胞の９６時間インキュベーション後のラミンＡ／Ｃの遺伝子サイレンシングを示す。［実施例］
【実施例１】
【００４７】
分解性の徐放性中性ポリマーソームによるｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでのアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）の核送達
本研究で使用されるコポリマーを表１に列挙する。ＰＥＧ−ポリカプロラクトン（ＰＥＧ−ＰＣＬ）はＰｏｌｙｍｅｒｓｏｕｒｃｅ（カナダ・モントリオール）からであり、そして必要とされるとおりさらに精製した。ＰＥＧ−ポリブタジエン（ＰＥＧ−ＰＢＤ）ブロックコポリマーはアニオン重合により合成した。透析チューブはＳｐｅｃｔｒｕｍ（カリフォルニア州ランチョ・ドミンゲス）から購入した。クロロホルムはＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（カリフォルニア州スワニー）からであった。無水アルコール、ＤＭＳＯ、ＰＫＨ２６およびＰＫＨ６７細胞追跡用色素、リン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州セントルイス）からであった。テトラメチルローダミンカルボキシルアジド（ＴＭＲＣＡ）、フルオレセイン−５−カルボニルアジドおよびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒアニオン性デキストランはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（オレゴン州ユージーン）からであった。
【００４８】
【表１】
2010509401.tif 000002
【００４９】
ポリマー小胞製造。不活性ＰＥＧ−ＰＢＤコポリマーと混合したＰＥＧ−ＰＣＬはポリマーソームからの放出キネティクスにわたる広範な制御を提供する。ここで使用した分解性ポリマーソームは、ＰＢＳを含むＤＭＳＯ溶液（８５：１５  ｖ／ｖ）に溶解したコポリマー（０．２ないし５．０ｍｇ／ｍｌ）の混合により調製した２５／７５％（ＰＥＧ−ＰＢＤおよびＰＥＧ−ＰＣＬ）から構成された。細胞若しくは組織中のコポリマーの運命
を追跡するため、疎水性フルオロフォアＴＭＲＣＡをＰＥＧ−ＰＢＤコポリマーのＰＥＧ側に化学的に結合した。ＰＥＧのヒドロキシル端はアシルアジドの転位によりテトラメチルローダミン（ＴＭＲ）に共有結合した。簡潔には、ＴＭＲアシルアジド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）をトルエン中で８０℃に加熱してイソシアネートへの転位を引き起こした。同時に、０．５ｍｇのＰＥＧ−ＰＢＤを１０：１の色素：コポリマーのモル比で１２時間添加し；２０ｍｇのＮＨ３ＯＨをその後、攪拌溶液に２時間添加して非蛍光ウレタン誘導体を脱保護し、これは溶液の色を桃色から深赤色に変えた。
【００５０】
ポリマー小胞中のＡＯＮ負荷。コポリマー溶液はＰＥＧ−ＰＣＬの加水分解を予防するために各使用について新たに調製した。室温でコポリマー溶液を脱イオン水中のオリゴヌクレオチド溶液にゆっくりと添加して必要とされる濃度に達し、そして短時間ボルテックス攪拌した。ＤＬＳ測定値は、成分を添加した順序が粒子径分布に影響しなかったことを示し、また、ポリマー濃度が粒子径分布に影響しなかったことを示した（示されない）。混合溶液を冷ＰＢＳ中で透析し（３．５ｋＤａ）ＤＭＳＯを抽出した。１００ｎｍ小胞を生成するため、小胞をナノ多孔質フィルターを通して押出した。使用したオリゴヌクレオチドは２’Ｏ−メチル２０−ｍｅｒオリゴヌクレオチド（５’−ＵＣＣＡＵＵＣＧＧＣＵＣＣＡＡＡＣＣＣＧＧ−３’）（配列番号１）であった。合成（Ｐｒｏｌｉｇｏ、コロラド州ボールダー）の間に各塩基をホスホロチオエート化し、そして２’炭素にメトキシ基を含有した。６−ＦＡＭ部分（フルオレセインイソチオシアネート［ＦＩＴＣ］誘導体）をＡＯＮの５’端に共有結合した。ホスホロチオエート化および２’−Ｏ−メチル化は、ヌクレアーゼ分解を低下させることおよび標的ＲＮＡ前駆体１４へのハイブリダイゼーションを増大させることが以前に示されている。遊離ＡＯＮを除去するための４℃での２４時間透析後に、負荷された小胞を細胞培養およびマウス研究に使用した。負荷されたポリマーソームからの遊離ＡＯＮの完全な透析を確実にするために遊離ＡＯＮを同時に透析した。対照研究のため、類似の分子量（１０ｋＤａ）の負に荷電したデキストランを小胞に負荷した。必要とされる場合にポリマーソームを標識するための疎水性蛍光色素（ＰＫＨ２６若しくはＰＫＨ６７）は小胞懸濁液に直接添加した。ＡＯＮが負荷された小胞の安定性をｐＨ（５．５および７．４）ならびに温度（４℃および３７℃）の関数として評価した。
【００５１】
可視化および蛍光測定。小胞を、６０倍油対物レンズ（ｏｉｌ  ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）およびＣａｓｃａｄｅ  ＣＣＤカメラを伴うＯｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７１倒立型蛍光顕微鏡で画像化した。二重膜コア中に分配した疎水性蛍光薬物／色素は＞１μｍの直径をもつ小胞の画像化を可能にする。ＴＭＲＣＡ複合コポリマーは＞０．５μｍの直径をもつ小胞の画像化を可能にした。培養細胞を２０倍、４０倍および６０倍の倍率で画像化した。光脱色研究はＮＩＫＯＮ  ＴＥ３００倒立型蛍光顕微鏡でパルス色素レーザー（Ｐｈｏｔｏｎｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、イリノイ州セントチャールズ）を使用して実施し、６０倍油浸対物レンズで画像化した。Ｉｍａｇｅ  Ｊ  Ｆｒｅｅｗａｒｅ（Ｊａｖａに基づく医用におけるデジタル画像と通信（ＤＩＣＯＭ）ビューワ）（ＮＩＨ）を画像解析に使用した。蛍光画像を使用して、時間にわたる蛍光強度の変化ならびにポリマー小胞、マウス研究からの培養筋管および筋切片の形態を測定した。ＡＯＮおよびテトラメチルローダミン−５カルボニルアジド（ＴＭＲＣＡ）標識小胞の蛍光強度を分光蛍光分析で測定した。ＡＯＮの励起／測定極大は４９２／５２０ｎｍであり、また、ＴＭＲＣＡ標識小胞のものは５４５／５７８ｎｍである。
【００５２】
Ｃ２Ｃ１２細胞培養物。ポリマーソーム−ＡＯＮのこうした取り込みを評価するため、マウス由来Ｃ２Ｃ１２細胞をマイクロパターン化（ｍｉｃｒｏ−ｐａｔｔｅｒｎｅｄ）コラーゲンストリップ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州ビルリカ）上で増殖させた。細胞を分化させて筋管を得；明瞭な可視化のため十分に分離した筋管（成熟筋細胞）の低密度単層を可能にした。
【００５３】
Ｃ２Ｃ１２マウス骨格筋細胞（ＡＴＣＣ、メリーランド州ロックビルからのＣＲＬ−１７２２）を７５−ｃｍ２フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｇｌａｓｓ  Ｗｏｒｋｓ、ニューヨーク州コーニング）中２０％ウシ胎児血清、０．５％ニワトリ胚抽出物および０．５％ペニシリン／ストレプトマイシン（それぞれ１０，０００単位／ｍＬおよび１０，０００ｍｇ／ｍＬ）を補充した１０ｍＬ  ＤＭＥＭ中で維持した（全培養試薬はＧＩＢＣＯ（ニューヨーク州グランドアイランド）から）。細胞を２〜３日ごとに継代した。実験のための調製物中で、マイクロパターン化スライドガラス若しくはコラーゲン被覆６ウェル組織培養ペトリ皿に細胞を播種した。プレーティング１日後に培地を分化培地（１０％ウマ血清および０．５％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ）に変えた。細胞を１０日間分化して成熟筋管を得、そしてＤＭ培地を１日おきに交換した。
【００５４】
培養細胞へのポリマーソーム送達。ＡＯＮが負荷されたポリマーソームを１ｍｇ／ｍｌコポリマーおよび２μｇ／ｍｌ  ＡＯＮ濃度で培養Ｃ２Ｃ１２筋管に添加した。３時間のインキュベーション後に培地を新鮮ＤＭＥＭ培地と交換した。小胞取り込みの飽和は、１．５時間の時間定数および最低４日間の持続性核周囲局在化を伴い数時間以内に起こった。点状の内部移行された小胞は細胞全体に分布しているようであり、核周囲領域のポリマーの蓄積はエンドリソソーム中の小胞局在化と一致した。ポリマーソームの内部移行および筋管核へのＡＯＮ送達を、４’−６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（Ｓｉｇｍａ）で染色した後に蛍光顕微鏡検査により検出した。ＤＡＰＩは天然の二本鎖ＤＮＡと蛍光複合体を形成することが既知である。一定の感度および利得を蛍光強度分析のため維持し、そして画像を１６ビットスケールで解析した。
【００５５】
ＡＯＮ標識した核の高倍率画像は、核質全体のＡＯＮの広範に拡散しかつ非特異的な相互作用を示し、および、全般として視野あたり３と２０（＞５０筋管）の間の局在化されたＡＯＮの明るい「核小体」もまた示した。拡散しかつ局在化したプールの相互作用の性質を解明するため、迅速退色のためパルス色素レーザーを使用する光退色（ＦＲＡＰ）法後の蛍光回復によりＡＯＮの移動性を評価した。拡散したＡＯＮで、ＦＲＡＰは高移動性を示す約２秒のｔ１／２（ここでｔ１／２は退色スポットがその最初の強度の半分を回復するのに必要とされる時間である）を伴う約５秒以内の蛍光の本質的に完全な回復を示す。対照的に、核小体内のＡＯＮのＦＲＡＰ後の回復は最低限であり、そして核小体中の強い結合を示す。塩基対形成相互作用は一般に温度依存性であるため、拡散を２２℃で４２℃と比較したがしかし差違は測定され得なかった。ＦＲＡＰ研究は核質内の動的局在化を明瞭に確立し、それは少なくとも、機能を遂げるためのＲＮＡ前駆体のオンおよびオフスプライシングに対する必要性と矛盾しない。
【００５６】
ｍｄｘマウスへの筋肉内注入。ジストロフィン欠損ｍｄｘマウスは筋ジストロフィーの広範に使用される動物モデルである。加えて、送達の筋肉内注入試験の原理はｉｎ  ｖｉｖｏ循環の問題から分離し；遊離の内包化されていないＡＯＮは全身注入後数分以上循環しない一方、ポリマーソームは数時間循環する。
【００５７】
ｍｄｘマウス（６〜８週齢）の前脛骨（ＴＡ）筋に、遊離ＡＯＮ（対照）若しくはＡＯＮ−ポリマーソーム（５．０μｇ  ＡＯＮおよび１．５ｍｇ／ｍｌポリマー濃度）いずれかの３０μｌの溶液を筋中央（ｍｉｄ−ｍｕｓｃｌｅ）に注入した。注入後にマウス（複製物）を２群に分割した。１群はＡＯＮ筋送達を研究するため１２時間後に殺し、そして後者の群はジストロフィン発現のため３週後に殺した。簡潔には、ＴＡ筋をＯＣＴ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で急速凍結しかつ−７０℃で保存した。およそ５０の凍結切片（各７μｍの）を、各ＴＡ筋の長さ全体を包括するように得た。切片をメタノール中で１分間固定し、ブロッキングしかつ１００倍希釈のＤｙｓ１およびＤｙｓ２抗体（Ｎｏｖａｃａｓｔｒａ、英国ニューカッスル）を使用してジストロフィンについて免疫染色した。これらを４℃で一夜インキュベートし、スライドガラスをＰＢＳで３回洗浄し、そしてその後二次抗体（１０００倍）と１時間さらにインキュベートした。ＰＢＳで洗浄しかつＨｏｅｃｈｓｔ染色後に、ゲルマウント（Ｂｉｏｍｅｄｉａ；Ｓｉｇｍａ）を使用してスライドガラスをマウントした。蛍光ＡＯＮの核取り込みをＤＡＰＩ染色した核の蛍光画像化（２０倍若しくは６０倍対物レンズ）により評価した。各サンプルについて、無作為に選択した視野からの１０，０００以上の核を計数した。Ｉｍａｇｅ  Ｊフリーウェアを使用してジストロフィン陽性線維を計数し、そして対照、ＴＡ筋の中央および端切片と比較した。ジストロフィン発現を定量化するため、無作為に選択した視野から４０００以上の線維を計数した。
【００５８】
注入後、ポリマーソームで送達されたＡＯＮの核局在化は１２時間以内にＴＡ筋中で容易に明らかであり、蛍光画像により示された。蛍光色素は、蛍光顕微鏡検査による細胞内のＡＯＮの局在化を可視化するための赤色、緑色およびＨｏｅｃｈｓｔ青色指示色素を包含した。蛍光コポリマー（赤色に標識された−ここでは示されない）は緑色ＡＯＮに比較して拡散した分布を示し、そして遊離の（内包化されていない）ＡＯＮは核局在化の比較的わずかな証拠を示した。緑色ＡＯＮ核の数を単純に計数すること、およびＨｏｅｃｈｓｔ標識（細胞核に特異的な色素）青色核の数により除算することにより送達効率を定量化した。ＡＯＮ−ポリマーソームは５０％を超える平均送達効率を示し、そして筋長さ全体に沿って比較的均一な分布を示した。対照的に、遊離ＡＯＮは１０％未満の効率を示し、そして注入部位の近接近の中央切片（ｍｉｄ−ｓｅｃｔｉｏｎ）筋の核に主に局在化したようであった。
【００５９】
ｍｄｘマウスへのＡＯＮポリマーソーム製剤の単回筋肉内注入３週後にジストロフィン発現を免疫染色により直接可視化した。送達されたＡＯＮがｍｄｘマウス中の欠損エキソン２３を成功裏にスキップすることを確認するため、完全長ジストロフィンよりわずか７１アミノ酸より短いタンパク質について発現を評価した。ジストロフィンタンパク質の免疫検出は、Ｎ末端に対するＤｙｓ１抗体、および修正されたジストロフィンタンパク質のみを検出することができるＣ末端特異的抗体であるＤｙｓ２を用いて行った。
【００６０】
ポリマーソームでのＡＯＮ送達後のジストロフィン発現は、ジストロフィン抗体を用いるジストロフィン免疫染色後に２０倍の倍率で見た場合に正常の筋のものに類似の膜局在化パターンを明瞭に示すことにおいて確実と判明した。広まった膜局在化したジストロフィン発現は筋中央切片全体でのみならずしかし筋の端に向かってもまた観察された。中央切片から端までの筋切片を画像化し、そして筋線維を観察してジストロフィン陽性線維を計数した。４５００以上の筋線維を計数することにより、ポリマーソーム−ＡＯＮにより誘導されたジストロフィン陽性線維は２６％であり、そして対照サンプルは６％を超えず、従ってＡＯＮが内包化されたポリマーソームでのジストロフィン発現の４．３倍の増大を生じた。相対的に、空の小胞を注入した筋切片はゼロ発現を示した。
【００６１】
発現の広範な分布は、筋長さ全体に沿ったこれらのステルシー徐放小胞担体の実質的灌流を強調する。遠位発現は、遊離ＡＯＮで単純に見られないポリマーソーム中のＡＯＮの輸送の明瞭な証拠を提供した。コポリマーの非毒性の性質もまた、対照に比較して明らかな変性がポリマー処置したｍｄｘ筋で観察されなかったという事実で明らかである。全体に、同定された強いジストロフィン発現プロファイルは筋核へのＡＯＮ局在化を確認した。
【実施例２】
【００６２】
ＰＥＯ−ＰＬＡ二重層ポリマーソームによるｓｉＲＮＡの細胞送達
ポリマーソームがｓｉＲＮＡによる遺伝子サイレンシングを可能にするための効率的ナノ送達系であるかどうかを確認するため、ＰＥＯをベーストするポリマーソームを、２種
の小分子干渉ＲＮＡすなわちクラスタリンに対するｓｉＲＮＡおよびラミンＡ／Ｃに対するｓｉＲＮＡとともに独立に内包化した。
【００６３】
タンパク質のラミンファミリーは、内核膜（ＬＭＮＡとしてもまた知られる）の隣に位置するタンパク質のマトリックス、核ラミナを構成する。ラミンタンパク質は核の安定性、クロマチン構造および遺伝子発現に関与する。２つの型の哺乳動物のラミンＡおよびＢが存在する。選択的スプライシングによりこの遺伝子は３つのタイプＡラミンアイソフォームをコードする。ラミンＡ／Ｃ遺伝子中の突然変異は多数の疾患、すなわちエメリ・ドレフュス型筋ジストロフィー２型、家族性部分性リポジストロフィー、肢帯筋ジストロフィー１Ｂ型、拡張型心筋症、家族性部分性リポジストロフィー、シャルコー・マリー・トゥース病２Ｂ１型、下顎顔面形成異常、小児プロジェリア症候群（ハッチンソン・ギルフォード症候群）およびヴェルナー症候群の１サブセットにつながる。これらの疾患は従ってラミノパシー（ｌａｍｉｎｏｐａｔｈｙ）と称される。
【００６４】
ＰＥＯ−ＰＬＡを使用すると、ポリマーソームは薄膜水和法により両親媒性ポリマー（ｆＥＯ＜約０．２８）から合成される二重層小胞構造のものであり、生じるリポソーム様構造は循環の間の免疫系によるクリアランスを回避するため完全にＰＥＧ化した。ポリ（エチレンオキシド）−ポリ（乳酸）（ＰＥＯ  ０．７ｋＤａ−ＰＬＡ  ５ｋＤａ）はＰｏｌｙｍｅｒｓｏｕｒｃｅ，Ｉｎｃ．からであった。
【００６５】
蛍光標識ｓｉＲＮＡを使用して、遺伝子サイレンシングの時間経過をｍＲＮＡおよびタンパク質双方のレベルで検査した。フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）をｓｉＲＮＡに結合して、ラミンＡ／Ｃに対するＦＩＴＣ標識ｓｉＲＮＡをもたらした。（結合キットおよび結合ｓｉＲＮＡはＤｈａｒｍａｃｏｎ、コネチカット州ラファイエットから商業的に入手可能である。）リポフェクタミンはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．から購入し、また、ラミンＡ／Ｃ蛍光イムノアッセイキットをＲｏｃｈｅ，Ｉｎｃ．から購入した。
【００６６】
ｓｉＲＮＡが内包されたポリマーソームの製造。内包化手順は実施例１に記述された方法に類似であった。簡潔には、０．１ｍｌのＦＩＴＣ標識ｓｉＲＮＡ（３００μｇ／ｍｌ）をＤＭＳＯ中ＰＥＯ−ＰＬＡポリマーソーム溶液（２ｍｇ／ｍｌ）（Ｇｉｂｃｏ）に添加しそして１５秒間混合した。混合物を３．９ｍｌのＨ２Ｏに添加して５ｍｌ懸濁液を作成した。懸濁液を透析カセット（１０，０００ＭＷＣＯ）に移しそして水に対し４時間透析してＤＭＳＯを除去した。透析は透析チューブ（３００，０００ＭＷＣＯ）を用いて一夜継続して内包化されていないｓｉＲＮＡを除去した。ｓｉＲＮＡの内包は蛍光顕微鏡で確認し、そして内包化効率を蛍光分光計により測定した。
【００６７】
図３は、内包された物質を含むおよび含まないＰＥＯ−ＰＬＡポリマーソームの水力学的大きさ分布、ならびに商業的に入手可能なトランスフェクション対照（ＬＡ）との比較を示す。ｓｉＲＮＡ（１５ｋＤａ）の内包は粒子径をわずかに増大した。ＰＥＯ−ＰＬＡポリマーソーム単独は半径方向に８３ｎｍである一方、ｓｉＲＮＡの内包はポリマーソーム半径を９２．７ｎｍに増大した。
【００６８】
ｓｉＲＮＡが負荷されたポリマーソームおよびリポフェクタミンのＡ５４９細胞へのトランスフェクション。ラミンＡ／Ｃに対するＦＩＴＣ−ｓｉＲＮＡのリポフェクタミン（ＬＡ）中への内包はトランスフェクション試薬プロトコルに従った。ラミンＡ／Ｃに対するｓｉＲＮＡを負荷したＰＥＯ−ＰＬＡポリマーソームおよびＬＡの双方を、多様な濃度の遺伝子担体を２４ウェルプレート中の５０，０００細胞／ウェルと３７℃で６時間インキュベートすることによりヒト肺癌Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ、バージニア州マナサス）にトランスフェクトした。インキュベーション後に培地を新鮮培地で置き換え、そしてイン
キュベーションを３日間継続した。ＬＡ−ＲＮＡ、およびｓｉＲＮＡを内包化するＰＥＯ−ＰＬＡポリマーソーム双方が、顕微鏡検査により見られるとおり細胞により内部移行された。
【００６９】
蛍光イムノアッセイを用いてラミン発現レベルを測定することによりラミンＡ／Ｃ遺伝子サイレンシング効率を測定した。２４ウェルプレート（５０，０００細胞／ウェル）中で、ｓｉＲＮＡが内包化されたポリマーソームを２用量すなわち１２５ｎｇ／１７ｎＭおよび２５０ｎｇ／３３ｎＭで細胞とインキュベートした。７２時間後にラミンＡ／Ｃ遺伝子発現が用量１で２４％および用量２で３３％低下された。（図４を参照されたい）ラミンＡ／Ｃ発現は、１２５ｎｇ／３３ｎＭの用量のｓｉＲＮＡが内包化されたＰＥＯ−ＰＬＡポリマーソームとの細胞の９６時間のインキュベーション後にもまた測定した。ラミンＡ／Ｃ発現は対照に比較して２６％低下された。（図６を参照されたい）。
【００７０】
ラミンＡ／Ｃに対するｓｉＲＮＡとともに内包化されたＰＥＯ−ＰＬＡポリマーソームはｓｉＲＮＡを細胞に成功裏に送達し、そして他の遺伝子担体に匹敵する効率で生物学的効果を達成した。別に（しかし示されない）、ＰＥＯをベーストするポリマーソームを、肺癌で過剰発現されかつ処置を受けている癌患者でしばしば見られる薬剤耐性に寄与するクラスタリンに対するｓｉＲＮＡとともに内包化した。クラスタリンは第８染色体上に位置する遺伝子によりコードされる８０ｋＤａのタンパク質である。それは種を横断して高度に保存され、および広範な組織分布を示す。それは、プログラムされた細胞死、補体媒介性細胞溶解の調節、膜再循環、細胞−細胞接着およびｓｒｃ誘導性形質転換のような多様な活性に関与する。クラスタリンの過剰発現は、ｓｉＲＮＡが内包されたＰＥＯポリマーソームを使用する遺伝子サイレンシングにより低下された（データはここで示されない）。従って、ＰＥＯをベーストするポリマーソームは、癌のためのまたは抗癌剤若しくは慣習的化学療法との併用療法での新規かつ有用な処置を提供する。
【００７１】
前述の明細で引用されるそれぞれのおよびすべての特許、特許出願および刊行物はそっくりそのまま引用することにより本明細書に組込まれる。
【００７２】
前述の明細はある好ましい態様に関し記述され、そして多くの詳細が具体的説明の目的上示された一方、本発明は多様な改変および付加的な態様の影響を受けやすいことがあること、ならびに本明細書に記述される詳細のあるものは本発明の技術思想および範囲から離れることなくかなり変動し得ることが当業者に明らかであろう。こうした改変、同等の変形物および付加的な態様もまた付随する請求の範囲の範囲内にあることを意図している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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