(57)【要約】本発明は、REG4またはKIAA0101の発現を阻害するsiRNAの組成物と細胞を接触させることによる、癌細胞の増殖を阻害する方法を特徴とする。癌を治療する方法もまた、本発明に含まれる。本発明はまた、提供された方法において有用な核酸配列およびベクター、それらを含む組成物を含む製品を特徴とする。本発明はまた、REG4遺伝子を阻害することにより、例えば、膵癌細胞、前立腺癌細胞、乳房癌細胞および膀胱癌細胞、特に膵管腺癌（PDAC）のような腫瘍細胞を阻害するための方法を提供する。本発明はまた、REG4によってコードされるタンパク質に結合する抗体またはその断片の薬学的有効量を対象に投与する段階を含む、対象におけるPDACを治療または予防する方法に関する。本発明はまた、癌の化学-放射線治療抵抗性を診断する方法に関する。本発明はまた、該ポリペプチドを用いた癌の治療用薬剤または治療方法を提供する。本発明のポリペプチドは、QKGIGEFF/配列番号：21を含むポリペプチドから成るアミノ酸配列を含むアミノ酸配列から構成される。本発明のポリペプチドは、例えばポリアルギニンのようなトランスフェクション薬剤でポリペプチドを修飾することによって、癌細胞に導入され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
REG4またはKIAA0101の発現を阻害する少なくとも一つの低分子干渉RNA（siRNA）を含む組成物を対象に投与することを含む、対象において膵癌を治療または予防する方法。
【請求項２】
当該siRNAが、REG4またはKIAA0101由来の配列に特異的にハイブリダイズするセンス鎖核酸配列およびアンチセンス鎖核酸配列を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
治療される癌が、膵癌、前立腺癌、乳癌および膀胱癌からなる群から選択される、請求項1記載の方法。
【請求項４】
膵癌が膵管腺癌（PDAC）である、請求項3記載の方法。
【請求項５】
siRNAがREG4の発現を阻害し、治療される癌がPDACである、請求項1記載の方法。
【請求項６】
siRNAがKIAA0101の発現を阻害し、治療される癌が、膵癌、前立腺癌、乳癌および膀胱癌である、請求項1記載の方法。
【請求項７】
当該siRNAが、標的配列として配列番号：5または配列番号：32の配列に対応するリボヌクレオチド配列を含む、請求項2記載の方法。
【請求項８】
当該siRNAが、一般式5’-[A]-[B]-[A’]-3’を有し、式中、[A]は、配列番号：5または配列番号：32のヌクレオチドの配列に対応するリボヌクレオチド配列であり、[B]は3から23のヌクレオチドから成るリボヌクレオチドループ配列であり、そして、[A’]は、[A]の相補配列から成るリボヌクレオチド配列である、請求項7記載の方法。
【請求項９】
センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖分子であって、センス鎖は、配列番号：5または配列番号：32の標的配列に対応するリボヌクレオチド配列を含み、アンチセンス鎖は、該センス鎖に相補的であるリボヌクレオチド配列を含み、該センス鎖および該アンチセンス鎖は、互いにハイブリダイズして該二本鎖分子を形成し、そして、該二本鎖分子は、REG4またはKIAA0101遺伝子を発現している細胞に導入された場合に、該遺伝子の発現を阻害する、二本鎖分子。
【請求項１０】
該標的配列が、配列番号：1または配列番号：39のヌクレオチド配列由来の少なくとも約10個の連続するヌクレオチドを含む、請求項9記載の二本鎖分子。
【請求項１１】
該標的配列が、配列番号：1または配列番号：39のヌクレオチド配列由来の約19から約25個の連続するヌクレオチドを含む、請求項10記載の二本鎖分子。
【請求項１２】
該二本鎖分子が、一本鎖リボヌクレオチド配列を介して連結されたセンス鎖とアンチセンス鎖を含む、単一リボヌクレオチド転写物である、請求項11記載の二本鎖分子。
【請求項１３】
二本鎖分子が、約100未満のヌクレオチドのオリゴヌクレオチド長である、請求項10記載の二本鎖分子。
【請求項１４】
二本鎖分子が、約75未満のヌクレオチドのオリゴヌクレオチド長である、請求項13記載の二本鎖分子。
【請求項１５】
二本鎖分子が、約50未満のヌクレオチドのオリゴヌクレオチド長である、請求項14記載の二本鎖分子。
【請求項１６】
二本鎖分子が、約25未満のヌクレオチドのオリゴヌクレオチド長である、請求項15記載の二本鎖分子。
【請求項１７】
二本鎖分子が、約19と約25の間のヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドである、請求項16記載の二本鎖ポリヌクレオチド。
【請求項１８】
請求項10記載の二本鎖分子をコードするベクター。
【請求項１９】
ベクターが、二次構造を有する転写物をコードし、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む、請求項18記載のベクター。
【請求項２０】
転写物が、さらに該センス鎖および該アンチセンス鎖を連結する一本鎖のリボヌクレオチド配列を含む、請求項19記載のベクター。
【請求項２１】
センス鎖核酸とアンチセンス鎖核酸の組合わせを含むポリヌクレオチドを含むベクターであって、該センス鎖核酸が、配列番号：5または配列番号：32のヌクレオチド配列を含み、該アンチセンス鎖核酸が、センス鎖に相補的な配列から成る、ベクター。
【請求項２２】
該ポリヌクレオチドが、一般式5’-[A]-[B]-[A’]-3’を有し、式中、[A]が、配列番号：5または配列番号：32のヌクレオチド配列であり、[B]が、3から23のヌクレオチドから成るヌクレオチド配列であり、そして、[A’]が、[A]の相補的なヌクレオチド配列である、請求項21記載のベクター。
【請求項２３】
活性成分として、REG4の発現を阻害する低分子干渉RNA（siRNA）の薬学的有効量、および薬学的に許容される担体を含む、膵癌を治療または予防するための薬学的組成物。
【請求項２４】
siRNAが標的配列として配列番号：5または配列番号：32のヌクレオチド配列を含む、請求項23記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
siRNAが、一般式5’-[A]-[B]-[A’]-3’を有し、式中、[A]が、配列番号：5のヌクレオチド配列に対応するリボヌクレオチド配列であり、[B]が、3から23のヌクレオチドから成るリボヌクレオチ配列であり、そして、[A’]が、[A]の相補的なリボヌクレオチド配列である、請求項24記載の組成物。
【請求項２６】
活性成分として、KIAA0101の発現を阻害する低分子干渉RNA（siRNA）の薬学的有効量、および薬学的に許容される担体を含む、膵癌、前立腺癌、乳癌および膀胱癌を治療または予防するための薬学的組成物。
【請求項２７】
siRNAが、標的配列として配列番号：32のヌクレオチド配列を含む、請求項26記載の薬学的組成物。
【請求項２８】
該siRNAが、一般式5’-[A]-[B]-[A’]-3’を有し、式中、[A]が、配列番号：32のヌクレオチド配列に対応するリボヌクレオチド配列であり、[B]が、3から23のヌクレオチドから成るリボヌクレオチド配列であり、そして、[A’]が、[A]の相補的なリボヌクレオチド配列である、請求項27記載の組成物。
【請求項２９】
膵癌を治療または予防するための薬学的組成物を製造のための、REG4の発現を阻害する低分子干渉RNA（siRNA）の使用。
【請求項３０】
siRNAが、標的配列として配列番号：5のヌクレオチド配列を含む、請求項29記載の使用。
【請求項３１】
膵癌、前立腺癌、乳癌および膀胱癌を治療または予防するための薬学的組成物を製造するための、KIAA0101の発現を阻害する低分子干渉RNA（siRNA）の使用。
【請求項３２】
siRNAが、標的配列として配列番号：32のヌクレオチド配列を含む、請求項31記載の使用。
【請求項３３】
REG4の活性を中和する抗REG4抗体またはその断片を対象に投与することを含む、対象において膵癌を治療または予防する方法。
【請求項３４】
中和されるREG4の活性が、オートクリン/パラクリン様式で膵癌の細胞増殖を促進させる活性である、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
膵癌が、膵管腺癌（PDAC）である、請求項33記載の方法。
【請求項３６】
抗REG4抗体が、モノクローナル抗体である、請求項33記載の方法。
【請求項３７】
抗体が、VHとVL鎖を含み、各VHおよびVL鎖が、フレームワークアミノ酸配列によって分離されたCDR1、CDR2およびCDR3と称されるCDRアミノ酸配列を含み、各VHおよびVL鎖内の各CDRのアミノ酸配列が以下からなる群より選択される、請求項33記載の方法：
VH  CDR1：SYWMH（配列番号：20）、
VH  CDR2：NIYPGSGSTNYD（配列番号：21）、
VH  CDR3：GGLWLRVDY（配列番号：22）、
VL  CDR1：SASSSVSYMH（配列番号：23）、
VL  CDR2：DTSKLAS（配列番号：24）、および、
VL  CDR3：QQWSSNPF（配列番号：25）。
【請求項３８】
ヒトVHが、配列番号：18のアミノ酸配列を含み、ヒトVLが、配列番号：19のアミノ酸配列を含む、請求項36記載の方法。
【請求項３９】
活性成分として、REG4の活性を中和する抗REG4抗体またはその断片の薬学的有効量、および薬学的に許容される担体を含む、膵癌を治療または予防するための薬学的組成物。
【請求項４０】
膵癌が、膵管腺癌（PDAC）である、請求項39記載の薬学的組成物。
【請求項４１】
抗REG4抗体が、モノクローナル抗体である、請求項39記載の薬学的組成物。
【請求項４２】
抗体が、VHとVL鎖を含み、各VHおよびVL鎖が、フレームワークアミノ酸配列によって分離されたCDR1、CDR2およびCDR3と称されるCDRアミノ酸配列を含み、各VHおよびVL鎖内の各CDRのアミノ酸配列が以下からなる群より選択される、請求項39記載の薬学的組成物：
VH  CDR1：SYWMH（配列番号：20）、
VH  CDR2：NIYPGSGSTNYD（配列番号：21）、
VH  CDR3：GGLWLRVDY（配列番号：22）、
VL  CDR1：SASSSVSYMH（配列番号：23）、
VL  CDR2：DTSKLAS（配列番号：24）、および、
VL  CDR3：QQWSSNPF（配列番号：25）。
【請求項４３】
ヒトVHが、配列番号：18のアミノ酸配列を含み、ヒトVLが、配列番号：19のアミノ酸配列を含む、請求項42記載の組成物。
【請求項４４】
VHとVL鎖とを含み、各VHおよびVL鎖が、フレームワークアミノ酸配列によって分離されたCDR1、CDR2およびCDR3と称されるCDRアミノ酸配列を含み、各VHおよびVL鎖内の各CDRのアミノ酸配列が以下に示すものである、抗体：
VH  CDR1：SYWMH（配列番号：20）、
VH  CDR2：NIYPGSGSTNYD（配列番号：21）、
VH  CDR3：GGLWLRVDY（配列番号：22）、
VL  CDR1：SASSSVSYMH（配列番号：23）、
VL  CDR2：DTSKLAS（配列番号：24）、および、
VL  CDR3：QQWSSNPF（配列番号：25）。
【請求項４５】
ヒトVHが、配列番号：18のアミノ酸配列を含み、ヒトVLが、配列番号：19のアミノ酸配列を含む、請求項44記載の抗体。
【請求項４６】
請求項44記載の抗体をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４７】
請求項44記載の抗体をコードするポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項４８】
請求項44記載の抗体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む、単離された宿主細胞。
【請求項４９】
ポリヌクレオチドを発現するために請求項48記載の宿主細胞の培養、および培養宿主細胞からの抗体の取得を含む、抗体を産生する工程。
【請求項５０】
請求項44記載の抗体をコードするポリヌクレオチドまたはそれを含むベクターを含む、膵癌を治療または予防するための薬学的組成物。
【請求項５１】
膵癌の治療または予防のための薬学的組成物を製造するための、REG4によってコードされるタンパク質に結合する抗体、またはその断片の使用。
【請求項５２】
抗体が、VHとVL鎖とを含み、各VHおよびVL鎖が、フレームワークアミノ酸配列によって分離されたCDR1、CDR2およびCDR3と称されるCDRアミノ酸配列を含み、各VHおよびVL鎖内の各CDRのアミノ酸配列が以下に示すものである、請求項51記載の使用：
VH  CDR1：SYWMH（配列番号：20）、
VH  CDR2：NIYPGSGSTNYD（配列番号：21）、
VH  CDR3：GGLWLRVDY（配列番号：22）、
VL  CDR1：SASSSVSYMH（配列番号：23）、
VL  CDR2：DTSKLAS（配列番号：24）、および、
VL  CDR3：QQWSSNPF（配列番号：25）。
【請求項５３】
活性成分として、QKGIGEFF/配列番号：46を含むポリペプチド、該ポリペプチドに機能的に同等なポリペプチド、または該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、癌の治療および予防のいずれかまたは両方のための薬剤であって、該ポリペプチドが、配列番号：40から成るペプチドの生物学的機能を欠損させる、薬剤。
【請求項５４】
生物学的機能が、細胞増殖活性である、請求項53記載の薬剤。
【請求項５５】
ポリペプチドが、8から30の残基から成る、請求項53記載の薬剤。
【請求項５６】
ポリペプチドが、アミノ酸配列VRPTPKWQKGIGEFFRLSPK/配列番号：44またはTPKWQKGIGEFFRLSP/配列番号：45を含む、請求項53記載の薬剤。
【請求項５７】
ポリペプチドが、アミノ酸配列VRPTPKWQKGIGEFFRLSPK/配列番号：44またはTPKWQKGIGEFFRLSP/配列番号：45から成る、請求項53記載の薬剤。
【請求項５８】
活性成分が、ポリペプチドであり、当該ポリペプチドが、細胞膜透過性物質で修飾されている、請求項53記載の薬剤。
【請求項５９】
ポリペプチドが、次の一般式、[R]-[D]を有し、式中、[R]が、細胞膜透過性物質を表し、[D]が、QKGIGEFF/配列番号：46を含む断片配列のアミノ酸配列、または該ポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドのアミノ酸配列を表し、該ポリペプチドが、配列番号：40から成るペプチドの生物学的機能を欠損させる、請求項58記載の薬剤。
【請求項６０】
細胞膜透過性物質が、以下のものから成る群より選択されるいずれか1つである、請求項58記載の薬剤：
ポリアルギニン；
TAt/RKKRRＱRRR/配列番号：47；
ペネトラチン（Penetratin）/RQIKIWFQNRRMKWKK/配列番号：48；
ブフォリンII（Buforin II）/TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK/配列番号：49；
トランスポータン（Transportan）/GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL/配列番号：50；
MAP（両親媒性ペプチド）/KLALKLALKALKAALKLA/配列番号：51；
K-FGF/AAVALLPAVLLALLAP/配列番号：52；
Ku70/VPMLK/配列番号：53またはPMLKE/配列番号：61；
プリオン/MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP/配列番号：54；
pVEC/LLIILRRRIRKQAHAHSK/配列番号：55；
Pep-1/KETWWETWWTEWSQPKKKRKV/配列番号：56；
SynB1/RGGRLSYSRRRFSTSTGR/配列番号：57；
Pep-7/SDLWEMMMVSLACQY/配列番号：58；および
HN-1/TSPLNIHNGQKL/配列番号：59。
【請求項６１】
ポリアルギニンが、Arg 11（配列番号：60）である、請求項60記載の薬剤。
【請求項６２】
癌が、膵癌、前立腺癌、乳癌および膀胱癌から成る群より選択されるいずれか一つである、請求項53記載の薬剤。
【請求項６３】
QKGIGEFF/配列番号：46を含むポリペプチド、該ポリペプチドと機能的に同等なポリペプチド、またはこれらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを投与する段階を含む、癌の治療および予防のいずれかまたは両方のための方法であって、該ポリペプチドが配列番号：40からなるペプチドの生物機能を欠損させる、方法。
【請求項６４】
癌の治療および予防のいずれかまたは両方のための薬学的組成物の製造における、QKGIGEFF/配列番号：46を含むポリペプチド、該ポリペプチドと機能的に同等なポリペプチド、またはそれらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用であって、該ポリペプチドが、配列番号：40から成るペプチドの生物学的機能を欠損させる、使用。
【請求項６５】
QKGIGEFF/配列番号：46含むポリペプチド、または該ポリペプチドと機能的に同等なポリペプチド、および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物であって、該ポリペプチドが、配列番号：40からなるペプチドの生物機能を欠損させる、組成物。
【請求項６６】
QKGIGEFF/配列番号：46を含むポリペプチド、または該ポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドのアミノ酸配列であって、該ポリペプチドが、配列番号：40からなるペプチドの生物機能を欠損させる、ポリペプチド。
【請求項６７】
生物学的機能が、細胞増殖活性である、請求項66記載のポリペプチド。
【請求項６８】
ポリペプチドが、8から30個の残基から成る、請求項66記載のポリペプチド。
【請求項６９】
ポリペプチドが、アミノ酸配列VRPTPKWQKGIGEFFRLSPK/配列番号：44またはTPKWQKGIGEFFRLSP/配列番号：45を含む、請求項66記載のポリペプチド。
【請求項７０】
ポリペプチドが、アミノ酸配列VRPTPKWQKGIGEFFRLSPK/配列番号：44またはTPKWQKGIGEFFRLSP/配列番号：45から成る、請求項66記載のポリペプチド。
【請求項７１】
ポリペプチドが、細胞膜透過性物質で修飾されている、請求項66記載のポリペプチド。
【請求項７２】
次の一般式、[R]-[D]  を有するポリペプチドであって、式中、[R]が、細胞膜透過性物質を表し、[D]が、QKGIGEFF/配列番号：46を含む断片配列のアミノ酸配列、または当該断片配列を含むポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドのアミノ酸配列を表し、該ポリペプチドが、配列番号：40から成るペプチドの生物学的機能を欠損させる、請求項71記載のポリペプチド。
【請求項７３】
細胞膜透過性物質が、以下のものからなる群より選択されるいずれか1つである、請求項72記載のポリペプチド：
ポリアルギニン；
Tat/RKKRRＱRRR/配列番号：47；
ペネトラチン（Penetratin）/RQIKIWFQNRRMKWKK/配列番号：48；
ブフォリンII（Buforin II）/TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK/配列番号：49；
トランスポータン（Transportan）/GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL/配列番号：50；
MAP（両親媒性ペプチド）/KLALKLALKALKAALKLA/配列番号：51；
K-FGF/AAVALLPAVLLALLAP/配列番号：52；
Ku70/VPMLK/配列番号：53；
Ku70/PMLKE/配列番号：61；
プリオン/MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP/配列番号：54；
pVEC/LLIILRRRIRKQAHAHSK/配列番号：55；
Pep-1/KETWWETWWTEWSQPKKKRKV/配列番号：56；
SynB1/RGGRLSYSRRRFSTSTGR/配列番号：57；
Pep-7/SDLWEMMMVSLACQY/配列番号：58；および
HN-1/TSPLNIHNGQKL/配列番号：59。
【請求項７４】
ポリアルギニンが、Arg 11（RRRRRRRRRRR/配列番号：60）である、請求項73記載のポリペプチド。
【請求項７５】
以下の段階を含む、対象における癌の化学-放射線治療抵抗性を診断する方法：
（a）患者由来の生物学的試料において、REG4遺伝子の発現レベルを検出する段階；
（b）検出された発現レベルを対照レベルと比較する段階；および、
（c）検出された発現レベルが、正常な対照レベルに対して増加されている場合、対象が、化学-放射線治療抵抗性の癌に罹患している、または、化学-放射線治療抵抗性のリスクがあると決定する段階。
【請求項７６】
癌が膵癌である、請求項75記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2006年8月18日に出願された米国仮特許出願第60/838,649号および2006年8月18日に出願された米国仮特許出願第60/838,749の恩典を主張し、その各開示全体は、全ての目的のために参照によりここに組み入れられる。
【０００２】
本発明は生物科学の分野、より詳しくは癌研究の分野に関する。特に、本発明は、例えば膵臓癌、前立腺癌、乳癌および膀胱癌といった癌の治療および予防する方法に関する。特に、本発明は、REG4およびKIAA0101をコードしている遺伝子の発現を阻害できる核酸を含む組成物に関する。ある実施態様において、化合物は、これらの遺伝子の配列に対応する低分子干渉RNA（siRNA）である。
【０００３】
あるいは、本発明はまた、REG4によってコードされるタンパク質に結合する抗体またはその断片の薬学的に有効な量を対象に投与する段階を含む、対象における膵臓癌、特に膵管腺癌（PDAC）を治療または予防する方法に関する。さらに、本発明は、PCNAとKIAA0101の相互作用を阻害するペプチドを含む組成物に関する。ある実施態様において、組成物は、PCNA結合モチーフ（PIPボックス）を保存している細胞透過性ドミナントネガティブペプチドである。
【背景技術】
【０００４】
膵管腺癌（PDAC）は、西欧世界において、癌死の第4の主要な原因であり、5年生存率がわずか4％である、一般的な悪性腫瘍の中で最悪の死亡率を示す（DiMagno EP, et al. Gastroenterology 1999; 117: 1464-84., Wray CJ, et al. Gastroenterology 2005; 128: 1626-41.)。2006年に、おおよそ33,730の新たな症例が米国において膵臓癌と診断され、そのうちの32,300は本疾患で死亡するであろうと推定されている（Jemal A, et al. Cancer statistics, 2006. CA Cancer J Clin 2006; 56: 106-130.)。PDAC患者の大多数がそれらの進行期で診断されるため、疾患を治療するための有効な治療法は現在のところない。放射線を併用もしくはしない5-ＦＵまたはゲムシタビンを含む化学療法と手術を併用するいくつかの手法は、患者の生活の質を改善することができる（DiMagno EP, et al. Gastroenterology 1999; 117: 1464-84., Wray CJ, et al. Gastroenterology 2005; 128: 1626-41.）、しかし、その極めて進行性が強く、化学療法抵抗性のある性質のため、それらの治療は、PDAC患者の長期生存にとって非常に限られた効果を有するのみである。
【０００５】
PDACの極めて不良な予後は、初期段階でのPDACの検出の困難性を含むいくつかの理由から生じる（DiMagno EP, et al. Gastroenterology 1999; 117: 1464-84., Wray CJ, et al. Gastroenterology 2005; 128: 1626-41.)。内視鏡超音波（ＥＵＳ）や磁気共鳴胆管膵グラフィー（ＭＲＣＰ）などのような画像診断技術の改良にもかかわらず、（DiMagno EP, et al. Gastroenterology 1999; 117: 1464-84., Wray CJ, et al. Gastroenterology 2005; 128: 1626-41.）、疾患の経過が末期になるまで症状がないため、多くの患者はイメージング手法（撮像法）を受けない。前立腺癌のためのＰＳＡ（前立腺特異抗原）のような正確および簡便な血清試験は、初期のPDACを容易に検出することができ、PDACの集団検診のために適用することができる。早期の段階のPDACの外科切除は、5年の生存が50-60％といった、比較的好ましい予後を提供できる（Wray CJ, et al. Gastroenterology 2005; 128: 1626-41.)。したがって、PDACの生物学的な進行性および化学療法に対する抵抗を考慮すると、この致命的疾患の予後を改善する現実的な戦略のうちの1つとしては、非侵襲性血清試験により早期の段階でPDACをスクリーニングすることである。
【０００６】
現在、ＣＡ19-9は、PDACのための市販で利用できる唯一の血清マーカーであるが、それは、理想的な腫瘍マーカーから遠い。その理由として、（i）ルイス抗原状況のため個人の約10-15％しかＣＡ19-9を分泌しないこと、（ii） それは、膵臓癌に特異的でなく、良性の状態においても上昇すること、そして、（iii） それは、通常早期の段階の患者において、正常な範囲の中にあることである。（Sawabu N, et al. Pancreas 2004; 28: 263-7., Pleskow DK, et al. Ann Intern Med 1989; 110: 704-9.)。それ故、PDACにより特異的でより感受性の高い新規腫瘍マーカーの開発を通したスクリーニングの方法の確立は、緊急に必要とされる。
【０００７】
REG4は、REGファミリーの新しい一員であり（Hartupee JC, et al. Biochim Biophys Acta 2001; 1518: 287-93.）、PDACの腫瘍マーカーとして報告された。REG（REGenerating islet-derived）ファミリーに属している分子は、消化器官において、組織再生および炎症において働く分泌タンパク質である（Hartupee JC, et al. Biochim Biophys Acta 2001; 1518: 287-93., Watanabe T, et al. J Biol Chem 1990; 265: 7432-9., Uno M, et al. Adv Exp Med Biol 1992; 321: 61-6.)。本メンバーの発現レベルは、いくつかの胃腸癌で上方制御されること、ならびに、癌において、栄養性または抗アポトーシスの因子として機能することが報告された（Unno M, et al. Adv Exp Med Biol 1992; 321: 61-6., Sekikawa A, et al. Gastroenterology 2005; 128: 642-53.)。
【０００８】
cDNAマイクロアレイ技術は、実施者が正常および悪性細胞において、遺伝子発現の包括的なプロファイルを得、悪性および対応する正常な細胞において遺伝子発現を比較することを可能にした（Okabe et al., (2001) Cancer Res 61:212937; Kitahara et al., (2001) Cancer Res 61: 3544-9; Lin et al., (2002) Oncogene 21:4120-8; Hasegawa et al., (2002) Cancer Res 62:7012-7）。この手法は、癌細胞の複雑な性質の解明を可能とし、発癌機構を理解するのを助ける。腫瘍において脱制御された遺伝子の同定は、個々の癌のより精密で正確な診断や、新規治療標的の開発へと導くであろう（Bienz and Clevers, (2000) Cell 103:311-20）。
【０００９】
例えば、近年、遺伝子に特異的なsiRNAを用いる癌治療の新しい手法は、臨床研究において試行された（Bumcrot D et al., Nat Chem Biol 2006 Dec, 2(12): 711-9)。RNAiは、主要技術基盤の中で地位をすでに獲得していると考えられている（Putral LN et al., Drug News Perspect 2006 Jul-Aug, 19(6): 317-24; Frantz S, Nat Rev Drug Discov 2006 Jul, 5(7): 528-9; Dykxhoorn DM et al., Gene Ther 2006 Mar, 13(6): 541-52)。それにも関わらず、RNAiを臨床用途に適用できるまでには、いくつかの課題に取り組む必要がある。これらの課題には、インビボでのRNAの安定性の欠如（Hall AH et al., Nucleic Acids Res 2004 Nov 15, 32(20): 5991-6000, Print 2004; Amarzguioui M et al., Nucleic Acids Res 2003 Jan 15, 31(2): 589-95）、薬剤としての毒性の減少（Frantz S, Nat Rev Drug Discov 2006 Jul, 5(7): 528-9）、送達様式、用いるsiRNAまたはshRNAの正確な配列、および細胞タイプの特異性が含まれる。インタ-フェロン応答を活性化することによる、部分的に相同な遺伝子のサイレンシングまたは普遍的遺伝子抑制の誘導に関連して生じ得る毒性があることは、周知の事実である（Judge AD et al., Nat Biotechnol 2005 Apr, 23(4): 457-62, Epub 2005 Mar 20; Jackson AL & Linsley PS, Trends Genet 2004 Nov, 20(11):521-4）。したがって、有害な副作用を持たない癌特異的遺伝子を標的とする二本鎖分子が、抗癌剤の開発には必要である。
【００１０】
以前に、本発明者らは、癌細胞集団を純化するためにレーザーマイクロダイセクションと、約27,000の遺伝子からなる広域ゲノムcDNAマイクロアレイを用いて、膵臓癌の詳細で正確な発現プロファイルの解析を行った（Nakamura et al., (2004) Oncogene, 23: 2385-400)。本発明者らが膵臓癌細胞において、トランス活性化されるとして同定した遺伝子の中で（ＷＯ2004/031412）、癌治療のための標的分子として、本発明者らはKIAA0101に注目した。
【００１１】
PCNA（増殖細胞核抗原）は、いくつかの細胞周期タンパク質と相互作用を通して細胞周期進行に影響するだけでなく、DNA複製およびDNA修復にとって重要である（Prelich et al., (1987) Nature, 326: 471-5; Wyman and Botchan (1995) Curr Biol, 5: 334-7; Warbrick et al., (2000) Bioessays, 22: 997-1006)。その結晶構造は、PCNAが環状の同一三量体タンパク質で、例えばDNAポリメラーゼ、DNAリガーゼ等のように、DNA合成または代謝に関係するDNAタンパク質を動員するために必要なクランピング基盤として機能することを示した（Krishna et al., (1994) Cell, 79: 1233-43)。PCNAは多数のDNA複製/修復酵素と相互に作用し、いくつかのタンパク質はPCNAと相互作用するための保全されたPCNA結合モチーフ（PIPボックス、QXXL/I/MXXF/Y）を有する（Jonsson et al., (1998) EMBO J, 17: 2412-25)。PCNAの過剰発現は細胞増殖の特徴であり、臨床PCNAは、特にKi67/MIB-1と同様に腫瘍発生の予後において、一般的な増殖マーカーとして有用である（Haitel et al., (1997) Am J Clin Pathol, 107: 22935)。
【００１２】
KIAA0101は、酵母ツ-ハイブリッド・スクリーニングによってPCNAタンパク質と結合するp15PAF（PCNA関連の要因）として同定され（Yu et al., (2001) Oncogene 20: 484-9）、PCNAと相互作用できる保全されたPIPボックスを有する。しかし、その機能は解明されておらず、KIAA0101-PCNA相互作用が細胞増殖または癌進行の様式は依然として不明である（Yu et al., (2001) Oncogene, 20: 484-9; Simpson et al., (2006) Exp Cell Res. 312: 73-85)。
【発明の概要】
【００１３】
本発明者らは、RT-PCRおよび免疫組織化学的解析と同様に広域ゲノムcDNAマイクロアレイ解析に基づき、癌細胞（例えば、PDAC細胞において、）における、REGファミリーの新しいメンバーであるREG4、および/またはKIAA0101の過剰発現をここに報告する。さらに、本発明者らは、siRNAを用いて癌（例えば、PDAC）細胞株における内因性のREG4および/またはKIAA0101の発現をノックダウンすることにより劇的な細胞生存を減少させることを発見した。一致して、組換えREG4および/またはKIAA0101の培地への添加により、用量依存的に癌（例えば、PDAC細胞株の増殖を増強した。REG4および/またはKIAA0101に対するモノクローナル抗体は、増殖促進効果を中和して、著しく癌（例えば、PDAC細胞）の成長を減衰させた。これらの所見は、REG4およびKIAA0101が、PDACを含む早期の段階の癌をスクリーニングするための有望な腫瘍マーカーであること、そして、REG4および/またはKIAA0101の例えば、抗体を用いた中和、阻害性ポリペプチドまたは阻害性ポリヌクレオチド（例えば、siRNA）は、異常な（すなわち、異常に高い）REG4および/またはKIAA0101過剰発現および/または細胞内情報伝達により引き起こされるPDACを含む癌に対して有効な予防または治療の方法を提供する。
【００１４】
本発明の目的は、異常な（すなわち、異常に高い）REG4および/またはKIAA0101過剰発現および/または細胞内情報伝達により引き起こされる癌の治療および/または予防に有用な化合物を提供することである。あるいは、本発明の目的は、その化合物を用いて、例えば、膵臓癌、前立腺癌、乳癌または膀胱癌といった癌の治療または予防、もしくはその両方のための方法および医薬品組成物を提供することである。
【００１５】
本発明者らは、例えばsiRNAを用いたREG4またはKIAA0101発現の抑制が、癌増殖の抑制を成し遂げることができることを確認する。したがって、本発明の目的は、REG4の発現を阻害する低分子干渉RNA（siRNA）を含む組成物を対象に投与することを含む、対象において、膵臓癌を治療または予防するための方法を提供することである。さらなる態様において、本発明は、KIAA0101の発現を阻害するsiRNAを含む組成物を前記対象に投与することを含む、異常な（すなわち、異常に高い）KIAA0101過剰発現および/または細胞内情報伝達により媒介される、例えば、膵臓癌、前立腺癌、乳癌または膀胱癌といった癌を対象において治療または予防することを提供することである。
【００１６】
本発明はまた、活性成分としてREG4の発現を阻害する低分子干渉RNA（siRNA）の薬学的に有効な量および薬学的に許容される担体を含む膵臓癌を治療または予防するための医薬化合物を提供する。本発明は、さらに、活性成分としてKIAA0101の発現を阻害するsiRNAの薬学的に有効な量を含む、例えば、膵臓癌、前立腺癌、乳癌または膀胱癌といった異常な（すなわち、異常に高い）KIAA0101過剰発現および/または細胞内情報伝達によって媒介される癌を治療または予防するための医薬化合物を提供する。
【００１７】
本発明は、さらに、膵臓癌を治療または予防するための医薬品組成物を製造するためのREG4の発現を阻害する低分子干渉RNA（siRNA）の使用、および異常な（すなわち、異常に高い）KIAA0101の過剰発現および/または細胞内情報伝達による癌（例えば、膵臓癌、前立腺癌、乳癌または膀胱癌）を治療または予防するための医薬品組成物を製造するためのKIAA0101の発現を阻害する低分子干渉RNA（siRNA）の使用を提供する。ある実施態様において、好ましいsiRNAは、配列番号：5または配列番号：32のヌクレオチド配列を標的配列として含む。
【００１８】
本発明は、センス鎖とアンチセンス鎖を含む二重鎖分子に関連し、センス鎖は配列番号：5または配列番号：32の標的配列に対応するリボヌクレオチド配列を含み、アンチセンス鎖は該センス鎖に相補的なリボヌクレオチド配列を含み、該センス鎖と該アンチセンス鎖は該二重鎖分子を形成するために互いにハイブリダイズし、REG4遺伝子またはKIAA0101遺伝子を発現する細胞に導入した場合、該二重鎖分子は該遺伝子の発現を阻害する。
【００１９】
加えて、REG4がオ-トクリンまたはパラクリン成長因子および仲介のAkt情報伝達経路として機能することが確認されている。さらに、本発明者らは、抗REG4抗体が膵臓癌細胞の増殖を減衰させるためにREG4の細胞増殖活性を中和することを見出す。
【００２０】
したがって、REG4の活性を中和する抗REG4抗体またはその断片を対象に投与することを含む対象において、膵臓癌を治療または予防するための方法を提供することは、本発明の目的である。本発明はまた、活性成分としてREG4の活性を中和する抗REG4抗体またはその断片の薬学的有効量と薬学的に許容される担体とを含む組成物つまり膵臓癌を治療または予防するための医薬品組成物を提供する。本発明は、さらに膵臓癌を治療または予防するための医薬品組成物を製造するために、REG4の活性を中和する抗REG4抗体またはその断片の使用を提供する。ある実施態様において、抗REG4抗体は、モノクローナル抗体である。ある実施態様において、抗REG4抗体は、VHおよびVL鎖を含み、各VHおよびVL鎖は、フレームワークアミノ酸配列によって分離されたCDR1、CDR2およびCDR3と称されるCDRアミノ酸配列を含み、各VHおよびVL鎖における、各CDRのアミノ酸配列は、以下の通りである：
VH  CDR1：SYWMH（配列番号：20),
VH  CDR2：NIYPGSGSTNYD（配列番号：21),
VH  CDR3：GGLWLRVDY（配列番号：22),
VL  CDR1：SASSSVSYMH（配列番号：23),
VL  CDR2：DTSKLAS（配列番号：24)、および
VL  CDR3：QQWSSNPF（配列番号：25)。
【００２１】
本発明はまた、各VHおよびVL鎖を含む抗体を投与する段階を含む膵臓癌の治療および/または予防のための方法に関し、フレームワークアミノ酸配列によって分離されたCDR1、CDR2およびCDR3と称されるCDRアミノ酸配列を含み、各VHおよびVL鎖における、各CDRのアミノ酸配列は、以下の通りである：
VH  CDR1：SYWMH（配列番号：20),
VH  CDR2：NIYPGSGSTNYD（配列番号：21),
VH  CDR3：GGLWLRVDY（配列番号：22),
VL  CDR1：SASSSVSYMH（配列番号：23),
VL  CDR2：DTSKLAS（配列番号：24)、そして、
VL  CDR3：QQWSSNPF（配列番号：25)。
【００２２】
加えて、本発明は、QKGIGEFF（配列番号：46) を含む阻害性ポリペプチドを提供する。ある望ましい態様において、アミノ酸配列は、VRPTPKWQKGIGEFFRLSPK（配列番号：44）またはTPKWQKGIGEFFRLSP（配列番号：45）である。本発明は、さらに癌の治療および/または予防のためにこれらの阻害性ポリペプチドを用いた医薬品または方法を提供する。
【００２３】
本発明はまた、QKGIGEFF（配列番号：46)を含む阻害性ポリペプチド（例えば、少なくともVRPTPKWQKGIGEFFRLSPK（配列番号：44)、TPKWQKGIGEFFRLSP（配列番号：45）のアミノ酸配列の断片、またそれをコードしているポリヌクレオチドを有する阻害性ポリペプチド）を投与する段階を含む癌の治療および/または予防のための方法にに関する。さらに、本発明は、癌の治療および/または予防のための医薬組成物を製造することにおいて、本発明のポリペプチドの使用またはそれをコードするヌクレオチドの使用に関する、
【００２４】
以下の詳細な説明が、添付した図および実施例と共に読まれるとき、発明のこれらおよび他の目的ならびに特徴が、より完全に明らかになるであろう。しかし、前述の発明の概要および以下の詳細な説明が、好ましい態様であることは理解されるべきであり、本発明または本発明の他の具体例に限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】PDAC細胞におけるREG4のｍRNAおよびタンパク質の発現レベル。(A) マイクロダイセクトされた正常膵臓管上皮細胞（NPD）および心臓、肺、肝臓、腎臓および脳を含む正常重要臓器と比較したマイクロダイセクトしたPDAC細胞（レーン1-9）におけるREG4および定量対照としてのTUBAのRT-PCR解析。（B、C、D）抗REG4抗体を用いた免疫組織化学的実験において、強染色が、PDAC細胞において観察された。REG4の陽性染色は、REG4の分泌を示唆する細胞質顆粒（B）、および細胞質膜（C）で観察された。正常な膵組織において、腺房細胞は、非常にわずかな染色を示したが、正常な管上皮細胞および膵島細胞では示さなかった（D）。
【図２】siRNAによるREG4発現のノックダウンにより、膵臓癌細増殖の減弱が生じた。(A) REG4の転写物のノックダウン効果は、REG4に対するsiRNA発現ベクター（REG4-si2）および陰性対照ベクター（siEGFP）をトランスフェクションされた細胞を用いて、半定量的RT-PCRにより確認された。β2-ＭＧは、RNAを定量化するために用いた。EGFPsiはREG4転写産物のレベルに対するいかなる効果も示さなかったが、REG4-si2は強いノックダウン効果を示した。（B、C）SUIT-2へのREG4-si2ベクターのトランスフェクションでは、MTTアッセイ（B）およびコロニー形成数（C）により測定した生細胞の数が、REG4に対するいかなるノックダウン効果を示さないEGFPsiベクターをトランスフェクションした細胞と比較して、劇的な減少を引き起こした。MTTアッセイ（B）では、棒グラフは、ジェネテシン用いた7日の培養の後の3回の実験から吸光度の平均であり、バーは、SD値を、*はp < 0.01（スチューデントのｔ検定）を示す。
【図３】PDAC細胞でのrhREG4の成長促進効果。(A) 生理活性rhREG4タンパク質は、哺乳動物細胞（FreeStyle（商標）293）により生成された。rhREG4は精製され、クーマシー染色（左）によるSDS-PAGEおよびREG4に特異的抗体を用いたウエスタンブロット（右）により分析された。(B) PK45P細胞は、1％FBSを添加した0、0.1、1および10nMのrhREG4でインキュベートされた。rhREG4処理は、用量依存的にPK45P細胞の細胞増殖を促進した。データポイントは、サンプル0日と比較して3回の実験からの吸光度の平均比率、バーは、SD値を、*は p < 0.01（スチューデントｔ検定）を示す。(C) Akt（Ser473）のリン酸化は、0、0.1、1および10nMのrhREG4でPK45P細胞を処理により、用量依存的に増強された。リン酸化されたAktはリン酸化されたAkt（Ser473）に特異的な抗体を用いたウエスタンブロットにより検出され、ブロットはAktの総レベルを評価するためにAktに対する抗体用いて再検出された。
【図４】抗REG4モノクローナル抗体の中和および増殖抑制効果。(A) 抗REG4抗体の結合能は免疫沈降を用いているSUIT-2培地を用いて、抗REG4pAbによるウエスタンブロットにより評価された。抗REG4mAbおよびpAbは、高親和性によりREG4をSUIT-2培地から免疫沈降させた。(B) 抗REG4mAb処理は、rhREG4の増殖促進効果を停止した。PK45Pは、抗REG4mAbの存在下または非存在下において、10nMのrhREG4により刺激された。棒グラフは、（-）培地における培養サンプルと比較した3回の実験からの吸光度の平均比であり、バーは、SD値を、*はp < 0.01（スチューデントｔ検定）を示す。(C) SUIT-2（REG4-陽性）およびMIAPaCa-2（REG4陰性）の成長における抗REG4mAbの各種濃度の効果。各細胞株は、各種濃度の抗REG4mAbの存在下でインキュベートされた。抗REG4mAb処理は、全くREG4を発現しなかったMIAPaCa-2の細胞成長に影響を及ぼさなかったが、用量依存的にSUIT-2細胞成長を抑制した。データポイントは、（-）培地における培養サンプルと比較した3回の実験からの吸光度の平均比であり、バーは、SD値、*はp < 0.01（スチューデントｔ検定）を示す。(D) 抗REG4mAb処理は、rhREG4により刺激されたAktのリン酸化を停止した。PK45P細胞は、抗REG4mAbの存在下または非存在下において、10nMのrhREG4で処理された。Aktのリン酸化はリン酸化Akt（Ser473）に特異的な抗体を用いているウエスタンブロットにより評価され、ブロットはAktの総レベルを評価するためにAktに対する抗体用いて再検出された。1、非刺激：2、10nMのrhREG4：3、10nMのrhREG4＋抗REG4mAb。
【図５】抗REG4抗体処理により、インビボでの膵臓癌細胞成長を抑制した。(A) ヌードマウスに接種された腫瘍容積は、抗REG4抗体（34-1mAb、n=8）の処理の間に、1週当たりの2回（300μg/マウス  i.p..）または、対照抗体（正常マウスIgG、n=9）で評価された。34-1mAbの処理（黒丸および太線）は、対照IgGと比較して、腫瘍容積の有意な減少をもたらした（P=0.0598）。(B) 腫瘍は、抗REG4抗体（34-1mAb）または対照抗体の初期処理の後、30日に重量測定された。34-1mAbの処理（黒ボックス）は、対照抗体と比較して腫瘍重量の有意な減少をもたらした（P=0.0489）。
【図６】REG4の過剰発現は、膵臓癌のガンマ線への抵抗に関与した。(A) pCAGGSnHC-REG4-HAは、REG4を発現しなかった膵臓癌細胞株PK45Pへトランスフェクションした。ジェネテシン抵抗性細胞の選択の後、細胞株での組換え型REG4の発現は、ウエスタンブロッティング法により確認された。(B) 48時間のプレーンキュベ-ションの後、REG4発現クローン（C1-6、C2-6およびC10）または対照クローン（M1、M3およびM6）は、60コバルト源を用いるて、1、5、10、または30Gyでガンマ線照射された。48時間後に、生細胞は細胞集計を用いて測定され、吸光度（各照射）/吸光度（非照射）の相対比は評価された。(C) 0、1または5Gyのガンマ照射の後、ガンマ線誘導アポトーシスは、フローサイトメーターを用いてサブG1画分を検出することにより評価された。
【図７】REG4過剰発現は、膵臓癌のゲムシタビン抵抗に関与した。(A) 48時間のプレインキュベーションの後、REG4発現クローン（C1-6、C2-6、C10）または対照クローン（M1、M3、M6）は、48時間の0.1-100,000nMのゲムシタビンで処理された。インキュベーション後、生細胞は細胞集計することで測定され、吸光度（各処理）/吸光度（非治療対照）の相対比は評価された。(B) 48時間の10nMまたは50nMのゲムシタビン処理の後、アポトーシスは、フローサイトメーターを用いてサブG1画分を検出することにより評価された。
【図８】neo-ＣＲＴを受けている膵腺癌検体におけるREG4の免疫染色。(A),(B) ネオアジュバント化学放射線療法治療（neo-CRT）感受性膵腺癌検体は、REG4の低発現または発現していないことを示した。(C),(D) neo-CRTに不感受性膵腺癌検体は、REG4の強い発現を示した。
【図９】膵臓癌細胞におけるKIAA0101の過剰発現の結果。(A) 半定量RT-PCRにより、KIAA0101の発現が、マイクロダイセクトされた正常膵管細胞および正常な膵組織と比較してマイクロダイセクトされた膵臓癌細胞で上方制御されたことが確認された。TUBAの発現は、定量対照として用いた。(B) ノーザンブロット解析では、心臓、肺、肝臓、腎臓および脳を含む重要臓器（レーン7-11）での発現は観察されなかったが、膵臓癌細胞株（レーン1-6）において、KIAA0101の強い発現が示された。(C)抗KIAA0101抗体を用いた免疫組織化学的実験。正常な膵組織での腺房細胞および正常な管上皮は染色を示さなかったが、強染色が、膵臓癌細胞の核で観察された（矢頭ｘ400）。
【図１０】膵臓癌細胞増殖におけるsiRNAｓによるKIAA0101ノックダウンの効果の結果。(A) KIAA0101転写物に特異的な2つのsiRNA発現ベクター（#759si）および陰性対照としてのEGFP  siRNA発現ベクター（EGFPsi）は、KLM-1細胞にトランスフェクションされた。KIAA0101転写物に対するノックダウン効果は、定量的対照としてβ2ＭＧの発現用いて、RT-PCRにより確認された。EGFPsiはKIAA0101転写物レベルにおいていかなる効果も示さなかったが、#759siを用いたトランスフェクションでは強いノックダウン効果を示した。(B) #759siベクターのトランスフェクションは、KIAA0101にノックダウン効果を示さないsiRNA発現ベクター用いたトランスフェクションと比較して、コロニー-数形成によって測定された生細胞の数の劇的な減少をもたらした。(C) #759siベクターのトランスフェクションは、MTTアッセイで測定された生細胞の数の劇的な減少をもたらした。MTTアッセイでのY軸上のABSは、マイクロプレートリーダーにより測定された490nmと参照としての630nmでの平均吸光度を意味する。
【図１１】癌細胞増殖促進およびNIH3T3の形質転換をもたらすKIAA0101の外因性過剰発現の結果。(A) 恒常的に外因性KIAA0101を発現している6つのPK45P由来細胞（クローン1-6）および偽ベクター（モック1-4）をトランスフェクションした同細胞のウエスタンブロット解析。外因性KIAA0101発現誘導は、抗HAタグ抗体を用いて確認された。ACTBは、添加対照として用いた。(B) MTTアッセイによる増殖測定は、6個のKIAA0101クローン（1-6、実線）は、2個の偽クローン（1-4、破線）より著しく急速に増殖したことを示した。X軸およびY軸は、播種後の日数および、対照として1日目の吸光度値との比較により直径の吸光度で算出された相対成長率を示す。各平均値は、標準誤差を表すエラーバーとともにプロットされる。これらの実験は、全て三度行われた。(C) 3個のKIAA0101の過剰発現クローンおよび3個の偽クローンは、内因性KIAA0101マウス相同体を発現していないNIH3T3より樹立された。3個のKIAA0101過剰発現NIH3T3クローン（1-3）および偽NIH3T3クローンは、それぞれ8週齢のヌードマウスの左右の横腹に接種をされた。4週後に、KIAA0101過剰発現NIH3T3細胞のみ、ヌードマウスの右側で腫瘤を形成した。(D) 各腫瘍は抗KIAA0101抗体によって免疫染色され、外因性KIAA0101発現を示した。
【図１２】KIAA0101タンパク質は、いくつかのDNA複製タンパク質と結合した。(A)銀染色法が続くSDS-PAGEゲルで分離された免疫沈降画分により、対照サンプルの結果と比較して、いくつかのタンパク質が癌細胞溶解液のKIAA0101タンパク質と免疫沈降したことが示された。各差次的バンドは、ゲル中でのトリプシン消化の後、ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦシステムにより分析された、それらは、PCNA、POLD1（ポリメラーゼδp125サブユニット）およびFEN1（flap endonuclease-1）として同定された。(B) これらの相互作用は、免疫沈降実験により確認された。これらのタンパク質の全てはDNA複製に含まれ、KIAA0101と同様にPOLD1およびFEN1もまた、PCNAにを結合する。
【図１３】細胞透過性ドミナントネガティブペプチドによるKIAA0101とPCNA間の相互作用の阻害。(A) PIPボックス（括弧内に示される{q}KG{i}GE{ff}/配列番号：21）を含む2つのドミナントネガティブペプチド（PIP20、PIP16）および、そのアラニンで置換された保存されたPIPボックス（括弧内に示される{a}KG{a}GE{aa}/配列番号：37）を有する変異体ペプチド（PIP20mt、PIP16mt）が、設計され、細胞透過性促進のためのアルギニン（Ｒ）リピートを接合された。(B) インビトロ実験において、免疫沈降は、PIP20処理によるPCNAとKIAA0101の間の相互作用の抑制を確認したが、PIP20mtおよびスクランブルペプチドはPCNAとKIAA0101の間の相互作用に影響を及ぼさなかった。(C) PIP20mutおよびスクランブルペプチドでは細胞増殖抑制は示さなかったが、PIP20処理では、KIAA0101発現用量依存的にKIAA0101の細胞増殖を抑制した。一方、PIP20は、ヒトKIAA0101のホモログを発現しないマウス正常細胞株NIH3T3細胞の成長に影響を及ぼさなかった。(D)短いPIPペプチド（PIP16およびPIP16mt）は、維持されたPIPボックスモチーフでのＮおよびC末端の4つの残基を削除により設計され、PIP16処理は強力に癌細胞増殖を抑制したが、一方で、PIP16はまた、NIH3T3の増殖にも影響を及ぼした。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
好ましい具体例の詳細な説明
低分子干渉RNA：
本発明は、REG4および/またはKIAA0101に選択的な低分子干渉RNA（siRNA）が、膵癌、前立腺癌、乳癌および膀胱癌を含む、様々な癌細胞の細胞増殖の阻害に有効であるという驚くべき発見に一部基づいている。特に、PDACがREG4遺伝子の阻害により阻害または抑制されうることは、驚くべき発見であった。本明細書において述べられる発明は、これらの発見に一部基づいている。
【００２７】
本発明は、細胞増殖を阻害する方法を提供する。提供される方法の中には、細胞とREG4またはKIAA0101の発現（例えば、転写または翻訳）を阻害する低分子干渉RNA（siRNA）を含む組成物を接触させる段階を含む方法がある。本発明はまた、対象における腫瘍細胞増殖を阻害する方法を提供する。このような方法は、REG4またはKIAA0101の配列に特異的にハイブリダイズする低分子干渉RNA（siRNA）を含む組成物を対象に投与することを含む。本発明の別の局面は、生物学的試料の細胞におけるREG4またはKIAA0101遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。
【００２８】
遺伝子の発現は、REG4またはKIAA0101遺伝子の発現を阻害するのに十分な量の二本鎖リボ核酸(RNA)分子を細胞に導入することによって阻害されてもよい。本発明の別の局面は、例えば、提供される方法において有用な、核酸配列およびベクターを含む生成物ならびにこれらを含む組成物に関する。提供される生成物の中には、REG4遺伝子またはKIAA0101遺伝子を発現している細胞に導入されるとREG4またはKIAA0101遺伝子の発現を阻害する特性を有するsiRNA分子がある。このような分子の中には、センスおよびアンチセンス鎖を含み、センス鎖がREG4またはKIAA0101標的配列に対応するリボヌクレオチド配列を含み、かつアンチセンス鎖がセンス鎖に相補的なリボヌクレオチド配列を含む分子がある。分子のセンスおよびアンチセンス鎖は互いにハイブリダイズして、二本鎖分子を形成する。
【００２９】
本明細書で使用する用語「生物」は、少なくとも1つの細胞からなる任意の生き物を意味する。生物は、例えば、真核単細胞のような単純なものでもよく、ヒトを含む哺乳動物のような複雑なものでもよい。
【００３０】
本明細書で使用する用語「生物学的試料」は、生物全体、またはその組織、細胞、もしくは構成部分 (例えば、これらに限定されないが、血液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、臍帯血、尿、膣液、および精液を含む体液)を意味する。「生物学的試料」は、さらに、生物全体またはその細胞、組織、もしくは構成部分から調製されたホモジネート、溶解産物、抽出物、細胞培養物、または組織培養物、あるいはその画分または一部を意味する。最後に、「生物学的試料」は、タンパク質または核酸分子などの細胞成分を含む、生物を増殖させた栄養培地またはゲルなどの培地を意味する。
【００３１】
本発明は、細胞増殖を阻害する方法を特徴とする。細胞増殖は、細胞とREG4またはKIAA0101の低分子干渉RNA（siRNA）の組成物を接触させることによって阻害される。さらに、細胞はトランスフェクション促進剤と接触させられる。細胞は、インビトロ、インビボ、またはエクスビボで提供される。対象は、哺乳動物(例えば、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシ)である。細胞は膵管細胞である。または、細胞は、例えば、癌細胞または腺癌細胞などの腫瘍細胞(すなわち、癌細胞)である。例えば、細胞は、膵癌細胞、特に膵管腺癌細胞、前立腺癌細胞、乳癌細胞または膀胱癌細胞である。細胞増殖の阻害とは、処置された細胞が未処置細胞より低速で増殖するか、または生存度が低下することを意味する。細胞増殖は、当技術分野において周知の増殖アッセイによって測定される。
【００３２】
「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、もし特に示されなければ、本願明細書において、互換的に用いられ、それらの一般的に受け入れられている単一文字コードによって表される。本用語は、一つ以上の核酸がエステル結合によりつながれている核酸（ヌクレオチド）ポリマーを意味する。ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、DNA、RNAまたはそれらの組み合わせから成り得る。
【００３３】
本明細書で使用する「二重鎖分子」という用語は、例えば、低分子干渉RNA（siRNA、例えば、二本鎖のリボ核酸（dsRNA）または低分子ヘアピンRNA（shRNA））および低分子干渉DNA/RNA（siD/RNA、例えばDNAおよびRNAのキメラ二本鎖（dsD/RNA）または低分子ヘアピンDNAおよびRNAのキメラ（shD/RNA））を含む標的遺伝子の発現を阻害する核酸分子を意味する。
【００３４】
「siRNA」という用語は、標的ｍRNAの翻訳を阻止する二本鎖RNA分子を意味する。RNAを転写する鋳型がDNAである技法を含め、細胞にsiRNAを導入する標準的な技法が用いられる。siRNAは、センスREG4またはKIAA0101核酸配列、アンチセンスREG4またはKIAA0101核酸配列、またはその両方を含む。siRNAは、2つの相補的な分子を含む、または1つの転写物が、例えば、ある実施態様においてマイクロRNA（miRNA）の産生を誘導するヘアピンのように標的遺伝子に由来するセンスおよび相補的アンチセンス配列の両方を有するように構築される。siRNAは、dsRNAまたはshRNAでもよい。
【００３５】
本明細書で使用する「dsRNA」という用語は、互いに相補的な配列を含み、相補的配列を介して互いにアニーリングして二本鎖RNA分子を形成している2つのRNA分子の構築物を意味する。二つの鎖のヌクレオチド配列は、標的遺伝子配列のタンパク質をコードする配列から選択される「センス」または「アンチセンス」RNAだけでなく、標的遺伝子の非コード領域から選択されるヌクレオチド配列を有するRNA分子も含んでよい。
【００３６】
本明細書で使用する「shRNA」という用語は、互いに相補的な第一領域と第二領域（すなわちセンス鎖とアンチセンス鎖）を含み、ステムループ構造を有するsiRNAを意味する。領域の相補性と配向性の程度は、領域間で塩基が対を形成するのに十分であり、第一領域と第二領域はループ領域によって連結され、ループはループ領域内のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）間の塩基対形成の欠如をもたらす。shRNAのループ領域とは、センス鎖とアンチセンス鎖の間に介在する一本鎖領域であり、「介在性一本鎖」と称されることもある。
【００３７】
本明細書で用いる場合、「siD/RNA」という用語は、RNAとDNAの両方で構成され、RNAおよびDNAのハイブリッドおよびキメラを含み、標的mRNAの翻訳を阻止する二本鎖ポリヌクレオチド分子を意味する。本明細書において、ハイブリッドは、DNAで構成されたポリヌクレオチドおよびRNAで構成されたポリヌクレオチドが互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成している分子を指す。一方キメラは、二本鎖分子を構成する鎖の一方または両方がRNAおよびDNAを含み得ることを示す。siD/RNAを細胞に導入する標準的な技術が用いられる。siD/RNAは、CXセンス核酸配列（「センス鎖」とも称される）、CXアンチセンス核酸配列（「アンチセンス鎖」とも称される）、または両方を含む。siD/RNAは、単一の転写産物が、例えば、ヘアピンのように標的遺伝子に由来するセンスおよび相補的なアンチセンス核酸配列の両方を有するように構築されてもよい。siD/RNAは、dsD/RNAまたはshD/RNAのいずれかであってもよい。
【００３８】
本明細書で使用する「dsD/RNA」という用語は、互いに相補的な配列を含み、相補的配列を介して互いにアニ-リングして二本鎖ポリヌクレオチド分子を形成している2つの分子の構築物を意味する。二つの鎖のヌクレオチド配列は、標的遺伝子配列のタンパク質をコードする配列から選択される「センス」または「アンチセンス」ポリヌクレオチド配列だけでなく、標的遺伝子の非コード領域から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドも含んでよい。dsD/RNAを構成する2つの分子の一方または両方が、RNAとDNAの両方から構成される（キメラ分子）か、またはそうでなければ、分子の一方が、RNAで構成され、他方がDNAで構成される（ハイブリッド二本鎖）。
【００３９】
本明細書で使用する「shD/RNA」という用語は、互いに相補的な第一領域と第二領域（すなわちセンス鎖とアンチセンス鎖）を含み、ステムループ構造を有するsiD/RNAを意味する。領域の相補性と配向性の程度は、領域間で塩基が対を形成するのに十分であり、第一領域と第二領域はループ領域によって連結され、ループはループ領域内のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）間の塩基対形成の欠如をもたらす。shD/RNAのループ領域とは、センス鎖とアンチセンス鎖の間に介在する一本鎖領域であり、「介在性一本鎖」と称されることもある。
【００４０】
本方法は、例えば、細胞の悪性形質転換のように、REG4またはKIAA0101の発現が異常な上方制御している細胞での遺伝子の発現を変化させるために使用される。標的細胞においてREG4またはKIAA0101転写物にsiRNAが結合すると、細胞によるREG4またはKIAA0101の産生が減少する。オリゴヌクレオチドの長さは少なくとも約10ヌクレオチドであり、天然のREG4またはKIAA0101転写物と同じ位の長さであってもよい。好ましくは、オリゴヌクレオチドは約75、約50、または約25ヌクレオチド長未満である。最も好ましくは、オリゴヌクレオチドは約19〜約25ヌクレオチド長である。哺乳動物細胞におけるREG4またはKIAA0101の発現を阻害するREG4またはKIAA0101のsiRNAオリゴヌクレオチドの例には、標的配列、例えばそれぞれ配列番号：5もしくは32のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドが含まれる。
【００４１】
標的細胞における遺伝子発現を阻害する能力を有する二本鎖RNAを設計する方法は公知である。(例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6,506,559号を参照されたい)。例えば、siRNAを設計するコンピュ―タプログラムは、Ambionのウェブサイトwww.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)から利用することができる。Ambion, Inc.より利用可能なコンピュ-タプログラムは、以下の手順に基づいてsiRNA合成のためのヌクレオチド配列を選択する。
【００４２】
siRNA標的部位の選択
1. 転写物のAUG開始コードンから開始して、AAジヌクレオチド配列について下流方向にスキャンする。潜在的siRNA標的部位として、各AAおよび3’に隣接する19ヌクレオチドの出現を記録する。Tuschlら、Genes Dev 13(24): 3191-7 (1999)は、5'および3'非翻訳領域(UTR)ならびに開始コドン近傍の領域(75塩基内)には制御タンパク質結合部位が豊富である可能性があるため、siRNAを設計しないよう推奨している。UTR結合タンパク質および/または翻訳開始複合体は、siRNAエンドヌクレアーゼ複合体の結合を妨げる可能性がある。
2. 潜在的標的部位を適切なゲノムデータベース(ヒト、マウス、ラットなど)と比較し、他のコード配列と有意な相同性を有するいかなる標的配列も検討から除外する。www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/のNCBIサーバーに見出される、BLASTを用いることが提唱される。
3. 合成するための適格な標的配列を選択する。評価するために、遺伝子の長さに沿っていくつかの標的配列を選択することが典型的である。
【００４３】
標的配列、例えば、配列番号：5または32のヌクレオチドの核酸配列を含む単離された核酸分子、または配列番号：5および32のヌクレオチドの核酸配列に相補的な核酸分子も本発明に含まれる。本明細書で使用する「単離された核酸」とは、元の環境(例えば、天然のものであれば自然環境)から取り出された核酸であり、したがって、その天然状態から人工的に変化した核酸である。本発明において、単離された核酸には、DNA、RNA、およびそれらの誘導体が含まれる。単離された核酸がRNAまたはその誘導体である場合には、ヌクレオチド配列において塩基「t」は「u」に置換される。
【００４４】
本明細書で使用する「相補的な」という用語は、核酸分子のヌクレオチド単位間のワトソン-クリック型塩基対またはフーグスティーン型塩基対形成を意味し、「結合する」という用語は、2つの核酸もしくは化合物、または関連する核酸もしくは化合物、またはそれらの組み合わせ間の物理的または化学的相互作用を意味する。ポリヌクレオチドが、修飾された核酸および/または非リン酸ジエステル結合を含む場合には、これらのポリヌクレオチドは同様の方式のように互いに結合しうる。一般的に、相補的な核酸配列は適切な条件下でハイブリダイズして、ミスマッチをほとんど、または全く含まない安定した二重鎖を形成する。本発明の目的に関して、5個またはそれ未満のミスマッチを有する2つの配列は相補的であると見なされる。さらに、本発明の単離されたヌクレオチドのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、ハイブリダイゼーションによって二本鎖ヌクレオチドまたはヘアピンループ構造を形成し得る。
【００４５】
好ましい態様において、このような二重鎖は、10個の一致ごとにミスマッチを1つより多く含まない。二重鎖の鎖が完全に相補的である特に好ましい態様においては、そのような二重鎖はミスマッチを含まない。REG4に関して、核酸分子は1518ヌクレオチド長未満であり、KIAA0101に関して、核酸分子は1508ヌクレオチド長未満である。例えば、核酸分子は約500、約200、または約75ヌクレオチド長未満である。本明細書に記載の核酸の1つまたは複数を含むベクター、およびそのベクターを含む細胞もまた本発明に含まれる。本発明の単離された核酸は、REG4またはKIAA0101に対するsiRAN、またはsiRNAをコードするDNAに有用である。核酸をsiRNAまたはそれをコードするDNAに使用する場合、センス鎖は好ましくは約19ヌクレオチドより長く、より好ましくは21ヌクレオチドより長い。
【００４６】
本発明の二本鎖分子は、1つまたは複数の修飾ヌクレオチドおよび/または非リン酸ジエステル結合を含んでもよい。当技術分野で周知の化学修飾は、二本鎖分子の安定性、有効性、および/または細胞取り込みを高めることができる。当業者は、本分子に組み入れることのできる他のタイプの化学修飾も承知しうる（WO03/070744号；WO2005/045037号）。1つの態様において、修飾は、分解に対する抵抗性の改善または取り込みの改善を与えるために用いることができる。このような修飾の例には、ホスホロチオエート結合、2'-O-メチルリボヌクレオチド（特に二本鎖分子のセンス鎖上）、2'-デオキシ-フルオロリボヌクレオチド、2'-デオキシリボヌクレオチド、「ユニバーサル塩基（universal base）」ヌクレオチド、5'-C-メチルヌクレオチド、および逆方向脱デオキシ塩基残基の組み入れ（inverted deoxyabasic residue incorporation）（US20060122137号）が含まれる。
【００４７】
もう1つの態様において、修飾は、二本鎖分子の安定性を向上させるため、またはそのターゲティング効率を高めるために用いることができる。修飾には、二本鎖分子の2つの相補鎖間の化学的架橋、二本鎖分子の1つの鎖の3'または5'末端の化学修飾、糖修飾、核酸塩基修飾および/または骨格修飾、2-フルオロ修飾されたリボヌクレオチドおよび2'-デオキシリボヌクレオチド（WO2004/029212号）が含まれる。もう1つの態様において、修飾は、標的mRNA中および/または相補的二本鎖分子鎖中の相補的ヌクレオチドに対する親和性を高めるかまたは低下させるために用いることができる（WO2005/044976号）。例えば、修飾されていないピリミジンヌクレオチドを2-チオ、5-アルキニル、5-メチル、または5-プロピニルピリミジンによって置換することができる。加えて、修飾されていないプリンを7-デザ（deza）、7-アルキル、または7-アルケニループリンによって置換することができる。もう1つの態様において、二本鎖分子が3'突出を有する二本鎖分子である場合には、3'末端ヌクレオチド突出性ヌクレオチドをデオキシリボヌクレオチドによって置き換えることができる（Elbashir SM et al., Genes Dev 2001 Jan 15, 15(2): 188-200）。より詳細には、US20060234970号などの公開文書から入手することができる。本発明はこれらの例には限定されず、結果として得られる分子が標的遺伝子の発現を阻害する能力を保持している限り、任意の公知の化学修飾を本発明の二本鎖分子に対して用いることができる。
【００４８】
さらに、本発明の二本鎖分子は、DNAおよびRNAの両方、例えばdsD/RNAまたはshD/RNAを含んでもよい。具体的には、DNA鎖とRNA鎖とのハイブリッド型ポリヌクレオチドまたはDNA-RNAキメラ型ポリヌクレオチドは安定性の増大を示す。DNAとRNAの混合、すなわちDNA鎖（ポリヌクレオチド）およびRNA鎖（ポリヌクレオチド）からなるハイブリッド型二本鎖分子、一本鎖（ポリヌクレオチド）のいずれかまたは両方にDNAおよびRNA両方を含むキメラ型二本鎖分子などを、二本鎖分子の安定性を向上させるために形成させることもできる。DNA鎖とRNA鎖とのハイブリッドは、標的遺伝子を発現する細胞に導入された場合にその遺伝子の発現を阻害する活性を有する限り、センス鎖がDNAであってアンチセンス鎖がRNAであることまたはその反対であるハイブリッドであってよい。好ましくは、センス鎖ポリヌクレオチドはDNAであり、アンチセンス鎖ポリヌクレオチドはRNAである。また、キメラ型二本鎖分子も、標的遺伝子を発現する細胞に導入された場合にその遺伝子の発現を阻害する活性を有する限り、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方がDNAおよびRNAで構成されるもの、またはセンス鎖およびアンチセンス鎖の一方がDNAおよびRNAで構成されるもののいずれかであってよい。
【００４９】
二本鎖分子の安定性を向上させるためには、分子はできるだけ多くのDNAを含むことが好ましいが、一方、標的遺伝子の発現の阻害を誘導するためには、分子は発現の十分な阻害を誘導する範囲内でRNAであることが求められる。キメラ型二本鎖分子の好ましい一例としては、二本鎖分子の上流部分領域（すなわち、センスまたはアンチセンス鎖の内部の標的配列またはその相補配列に隣接する領域）はRNAである。好ましくは、上流部分領域とは、センス鎖の5'側（5'末端）およびアンチセンス鎖の3'側（3'末端）のことを表す。すなわち、好ましい態様において、アンチセンス鎖の3'末端に隣接する領域、またはセンス鎖の5'末端に隣接する領域およびアンチセンス鎖の3'末端に隣接する領域の両方は、RNAからなる。例えば、本発明のキメラ型またはハイブリッド型の二本鎖分子は、以下の組み合わせを含む。
センス鎖：      5'-[DNA]-3'
3'-(RNA)-[DNA]-5'：アンチセンス鎖、
センス鎖：5'-(RNA)-[DNA]-3'
3'-(RNA)-[DNA]-5'：アンチセンス鎖、および
センス鎖：5'-(RNA)-[DNA]-3'
3'-(RNA)-5'：アンチセンス鎖。
上流部分領域は、好ましくは、二本鎖分子のセンスまたはアンチセンス鎖の内部の標的配列またはそれに対する相補配列の末端から数えて9〜13ヌクレオチドからなるドメインである。さらに、上記キメラ型二本鎖分子の好ましい例には、鎖の長さが19〜21ヌクレオチドであって、ポリヌクレオチドの少なくとも上流半分の領域（センス鎖では5'側領域、アンチセンス鎖では3'側領域）がRNAであり、残りの半分がDNAであるものが含まれる。このようなキメラ型二本鎖分子において、標的遺伝子の発現を阻害する効果は、アンチセンス鎖全体がRNAである場合にはるかに高くなる（US20050004064号）。
【００５０】
本発明において、二本鎖分子が、短鎖ヘアピンRNA（shRNA）、ならびにDNAおよびRNAからなる短鎖ヘアピン（shD/RNA）といったヘアピンを形成してもよい。shRNAまたはshD/RNAは、RNA干渉を介した遺伝子発現のサイレンシングのために用いることが可能な、堅固なヘアピンターンを生じるRNAまたはRNAとDNAの混合物の配列である。shRNAまたはshD/RNAは、一つの一本鎖上にセンス標的配列およびアンチセンス標的配列を含み、これらの配列はループ配列によって隔たれている。一般的に、ヘアピン構造は細胞機構によって切断されてdsRNAまたはdsD/RNAとなり、それが続いてRNA誘導サイレンシング複合体（RISC）と結合する。この複合体は、dsRNAまたはdsD/RNAの標的配列に合致するmRNAと結合してそれを切断する。
【００５１】
本発明は部分的に、REG4をコードする遺伝子が、非癌性膵組織と比較して膵管腺癌(PDACa)において過剰発現している発見、およびをKIAA0101コードする遺伝子が、非癌性組織と比較して膵癌、前立腺癌細胞、肺癌細胞および膀胱癌細胞において過剰発現しているという発見に基づく。REG4（Genbank登録番号：AY126670）のcDNAは、1518ヌクレオチド長である。一方、KIAA0101（Genbank登録番号：NM_014736）のcDNAは、1508ヌクレオチド長である。REG4の核酸およびポリペプチド配列は、それぞれ、配列番号：1および2で示され、KIAA0101では、配列番号：39および40に示される。
【００５２】
本発明は、PDAC細胞株の増殖阻害をもたらす配列番号：5を含むsiRNAのトランスフェクション、さらに膵癌細胞株の増殖阻害をもたらす配列番号：32を含むsiRNAのトランスフェクションを開示する。
【００５３】
細胞増殖を阻害する方法。
本発明は、REG4またはKIAA0101の発現を阻害することにより、細胞増殖、すなわち癌細胞増殖を阻害することに関する。REG4またはKIAA0101の発現は、例えば、REG4遺伝子またはKIAA0101遺伝子を特異的標的とする低分子干渉RNA（siRNA）によって阻害される。REG4の標的は、例えば、配列番号：5のヌクレオチドを含み、KIAA0101の標的は配列番号：32のヌクレオチドを含む。
【００５４】
本明細書の阻害性ポリヌクレオチドおよびポリペプチドにおける「特異的に阻害する」という用語は、REG4および/またはKIAA0101の発現または生物学的機能を阻害するための薬剤または配位子の能力を意味する。特異的な阻害は、典型的には、REG4および/またはKIAA0101の発現（例えば、転写もしくは翻訳）または測定可能な生物学的機能（例えば、細胞成長または増殖、アポトーシスの阻害、REG4からの細胞内シグナル、例えば、REG4に関するEGFレセプター/Akt/AP-1シグナル経路、KIAA0101に関するPCNAまたは他の細胞内プロテインとの結合）の阻害が、少なくとも背景の約2倍、好ましくは約10倍、より好ましくは、約100倍である。発現レベルおよび/または生物学的機能は、処理および未処置の細胞、処理の前後の細胞集団を含む構成で測定されてもよい。ある態様において、REG4および/またはKIAA0101の発現または生物学的機能は完全に阻害される。典型的には、特異的な阻害は、適切な統計テストを用いて、REG4/KIAA0101の発現または生物学的機能の統計的に有意な減少である（例えば、p ≦0.05）。
【００５５】
非哺乳動物細胞において、二本鎖RNA(dsRNA)は遺伝子発現に対して強力かつ特異的なサイレンシング効果を及ぼすことが示されており、これはRNA干渉(RNAi)と呼ばれる(Sharp PA. Genes Dev. 1999;13(2):139-41.)。dsRNAは、RNアーゼIIIモチーフを含む酵素によって、低分子干渉RNA(siRNA)と呼ばれる20〜23ヌクレオチドのdsRNAへと処理される。siRNAは、多成分ヌクレアーゼ複合体と共に、相補的mRNAを特異的な標的にする(Hammond SM et. al., Nature. 2000; 404(6775):293- 6；Hannon GJ. Nature. 2002;418(6894):244-51.)。哺乳動物細胞において、19の相補的ヌクレオチド、および3'末端非相補的チミジンまたはウリジン二量体を有する、20または21-mer dsRNAから構成されるsiRNAは、遺伝子発現の全体的な変化を誘導することなく、遺伝子特異的ノックダウン効果を有することが示されている(Elbashir SM et al., Nature. 2001;411(6836):494-8.)。
【００５６】
細胞増殖は、細胞をREG4またはKIAA0101のsiRNAを含む組成物と接触させることによって阻害される。細胞をトランスフェクション剤とさらに接触させる。適切なトランスフェクション剤は、当技術分野において公知である。細胞増殖の阻害とは、組成物に曝露していない細胞と比較して、細胞がより低い速度で増殖するか、または生存率が減少することを意味する。細胞増殖は、MTT細胞増殖アッセイ法などの当技術分野で公知の方法によって測定される。
【００５７】
REG4またはKIAA0101のsiRNAは、それぞれ、REG4遺伝子配列またはKIAA0101遺伝子配列の単一の標的を対象とする。または、siRNAは、REG4またはKIAA0101遺伝子配列の複数の標的を対象とする。例えば、組成物は、REG4またはKIAA0101の2つ、3つ、4つ、もしくは5つ、またはそれ以上の標的配列を対象とするREG4またはKIAA0101のsiRNAを含む。REG4またはKIAA0101標的配列とは、REG4遺伝子またはKIAA0101遺伝子の一部と同一であるヌクレオチド配列（すなわち、siRNAに相補的で長さの等しいREG4またはKIAA0101遺伝子内のポリヌクレオチド）を意味する。標的配列は、ヒトREG4またはKIAA0101遺伝子の5'非翻訳(UT)領域、オープンリーディングフレーム(ORF)、または3'非翻訳領域を含み得る。または、siRNAは、REG4またはKIAA0101遺伝子発現の上流または下流モジュレーターと相補的な核酸配列である。上流または下流モジュレーターの例には、REG4またはKIAA0101遺伝子プロモーターと結合する転写因子、REG4またはKIAA0101ポリペプチドと相互作用するキナーゼまたはホスファターゼ、REG4またはKIAA0101のプロモーターまたはエンハンサーが含まれる。
【００５８】
標的mRNAとハイブリダイズするREG4またはKIAA0101のsiRNAは、直鎖状に一本鎖のmRNA転写産物と結合し、それにより翻訳を妨げ、タンパク質の発現を妨げることにより、REG4またはKIAA0101遺伝子によってコードされるREG4またはKIAA0101ポリペプチド産物の産生を減少させるかまたは阻害する。したがって、本発明のsiRNA分子は、ストリンジェントな条件下において、REG4またはKIAA0101遺伝子由来のmRNAまたはcDNAと特異的にハイブリダイズする能力によって定義され得る。
【００５９】
本発明において、「ハイブリダイズする」または「特異的にハイブリダイズする」という用語は、2つの核酸分子が「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」下においてハイブリダイズする能力を指すために用いられる。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という語句は、典型的には複雑な核酸混合物中で、核酸分子がその標的配列とハイブリダイズするが、他の配列とは検出可能にハイブリダイズしない条件を意味する。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、様々な状況において異なる。配列が長いほど、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸ハイブリダイゼーションの広範な手引きは、Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, 「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays」 (1993)に見出される。一般的に、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度、pHにおいて、特定の配列に対する熱融点(Tm)より約5〜10℃低くなるよう選択される。Tmとは、平衡状態で、標的に相補的なプローブの50%が標的配列とハイブリダイズする(所定のイオン強度、pH、および核酸濃度における)温度である(標的配列が過剰に存在する場合、Tmでは、平衡状態でプローブの50%が占有される)。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤を添加することによって達成してもよい。選択的または特異的ハイブリダイゼーションに関して、陽性シグナルはバックグラウンドの少なくとも2倍、好ましくはバックグラウンドハイブリダイゼーションの10倍である。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、以下のようなものであってよい：50%ホルムアミド、5x SSC、および1% SDS、42℃でのインキュベ-ション、または5x SSC、1% SDS、65℃でのインキュベ-ション、ならびに0.2x SSCおよび0.1 %SDS中、50℃での洗浄。
【００６０】
本発明のsiRNAは、約500、約200、約100、約50、または約25ヌクレオチド長未満である。好ましくは、siRNAは約19〜約25ヌクレオチド長である。REG4siRNAを生成するための例示的な核酸配列には、標的配列としての配列番号：5のヌクレオチド配列が含まれる。同様に、KIAA0101siRNAを生成するための例示的な核酸配列には、標的配列としての配列番号：32のヌクレオチド配列が含まれる。さらに、siRNAの阻害活性を増強するために、標的配列のアンチセンス鎖の3'末端にヌクレオチド「u」を付加することができる。付加する「u」の数は少なくとも約2個であり、一般的には約2〜約10個であり、好ましくは約2〜約5個である。付加された「u」は、siRNAのアンチセンス鎖の3'末端で一本鎖を形成する。
【００６１】
細胞は、REG4またはKIAA0101を発現または過剰発現する任意の細胞である。細胞は、膵管細胞などの上皮細胞である。または、細胞は、癌腫、腺癌、芽腫、白血病、骨髄腫、または肉腫などの腫瘍細胞である。細胞は膵癌細胞、特に膵管腺癌細胞、前立腺癌細胞、乳癌細胞および膀胱癌細胞である。
【００６２】
REG4またはKIAA0101のsiRNAは、mRNA転写物に結合し得る形態で細胞に直接導入する。または、REG4またはKIAA0101のsiRNAをコードするDNAがベクター中に存在する。
【００６３】
ベクターは、例えば、REG4またはKIAA0101標的配列を、両鎖の発現が(DNA分子の転写により)可能となるように、REG4またはKIAA0101配列に隣接する機能的に連結された制御配列を有する発現ベクターにクローニングすることによって作製する(Lee, N.S., et al., (2002) Nature Biotechnology 20: 500-5)。REG4またはKIAA0101のmRNAにアンチセンスであるRNA分子は、第1プロモーター(例えば、クローニングされたDNAの3'側にあループロモーター配列)によって転写され、REG4またはKIAA0101のmRNAのセンス鎖であるRNA分子は、第2プロモーター(例えば、クローニングされたDNAの5'側にあループロモーター配列)によって転写される。センス鎖とアンチセンス鎖はインビボでハイブリダイズして、REG4またはKIAA0101遺伝子をサイレンシングするためのsiRNA構築物が作製される。または、2つの構築物を利用して、siRNA構築物のセンスおよびアンチセンス鎖を作製する。クローニングされたREG4またはKIAA0101は、単一の転写物が標的遺伝子由来のセンスおよび相補的アンチセンス配列の両方を有する、例えばヘアピンなどの二次構造を有する構築物をコードしてもよい。
【００６４】
ヘアピンループ構造を形成するために、任意のヌクレオチド配列からなるループ配列をセンスとアンチセンス配列との間に配置することができる。したがって、本発明はまた、一般式5'-[A]-[B]-[A']-3'を有するsiRNAを提供し、式中、[A]は、REG4またはKIAA0101由来のmRNAまたはcDNAと特異的にハイブリダイズする配列に対応するリボヌクレオチド配列である。好ましい態様において、[A]は、配列番号：5または32のヌクレオチドの配列に対応するリボヌクレオチド配列である。
[B]は、3〜23ヌクレオチドからなるリボヌクレオチド配列であり、かつ
[A']は、[A]の相補配列からなるリボヌクレオチド配列である。
領域[A]は[A']とハイブリダイズし、次いで領域[B]からなるループが形成される。  
【００６５】
ループ配列は、好ましくは約3から約23ヌクレオチド長であってよい。ループ配列は、例えば、次の配列からなる群より選択され得る(http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_506.html)。さらに、23ヌクレオチドからなるループ配列もまた、活性のあるsiRNAを提供する(Jacque, J.M. et al., (2002) Nature 418: 435-8.)。
CCC、CCACC、またはCCACACC：Jacque, J.M. et al., (2002) Nature, 418: 435-8.
UUCG：Lee, N.S. et al., (2002) Nature Biotechnology 20 : 500-5；Fruscoloni, P. et al., (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100(4): 1639-44.
UUCAAGAGA：Dykxhoorn, D. M. et al., (2003) Nature Reviews Molecular Cell Biology 4: 457-67.
【００６６】
例として、本発明のヘアピンループ構造を有する好ましいsiRNAを以下に示す。以下の構造において、ループ配列は、CCC、UUCG、CCACC、CCACACC、およびUUCAAGAGAからなる群より選択され得る。好ましいループ配列はUUCAAGAGA(DNAでは「ttcaagaga」)である。
5’-GACAGAAGGAAGAAACTCA-[B]-TGAGTTTCTTCCTTCTGTC-3’ (配列番号：5の標的配列の場合)
【００６７】
REG4またはKIAA0101配列に隣接する制御配列は、それらの発現が独立して、または時間的もしくは空間的に調節され得るように、同一であるかまたは異なる。siRNAは、REG4またはKIAA0101遺伝子鋳型を、例えば核内低分子RNA(snRNA) U6由来のRNAポリメラーゼIII転写単位またはヒトH1 RNAプロモーターを含むベクターにクローニングすることにより、細胞内で転写される。ベクターを細胞に導入するために、トランスフェクション促進剤を用いることができる。FuGENE(Roche Diagnostices)、Lipofectamine 2000(Invitrogen)、Oligofectamine(Invitrogen)、およびNucleofector(和光純薬工業)は、トランスフェクション促進剤として有用である。
【００６８】
REG4またはKIAA0101 mRNAの様々な部分のオリゴヌクレオチド、およびそれらの様々な部分に相補的なオリゴヌクレオチドを、腫瘍細胞において(例えば、膵癌細胞株または膵管腺癌(PDAC)細胞株などの膵細胞株を用いて)REG4またはKIAA0101の産生を減少させる能力について、標準的な方法に従ってインビトロで試験した。候補組成物の非存在下で培養した細胞と比較して、候補siRNA組成物と接触させた細胞においてREG4またはKIAA0101遺伝子産物が減少していることを、REG4またはKIAA0101の特異的抗体またはその他の検出方法を用いて検出する。次いで、インビトロの細胞アッセイまたは無細胞アッセイにおいてREG4またはKIAA0101の産生を減少させる配列を、細胞増殖に対するその阻害効果について試験する。インビトロ細胞アッセイにおいて細胞増殖を阻害する配列をラットまたはマウスにおいてインビボで試験して、REG4またはKIAA0101産生の減少、および悪性新生物を有する動物における腫瘍細胞増殖の減少を確認する。
【００６９】
悪性腫瘍を治療する方法
REG4またはKIAA0101の過剰発現を特徴とする腫瘍を有する患者は、それぞれ、REG4またはKIAA0101のsiRNAを投与することによって治療される。例えば、膵癌、とくに膵管腺癌 (PDAC)、前立腺癌細胞、乳癌細胞、および膀胱癌細胞に罹患しているか、または発症するリスクのある患者におけるREG4またはKIAA0101の発現を阻害するために、siRNA療法が用いられる。このような患者は、特定の腫瘍型の標準的な方法によって特定される。膵癌、膵管腺癌 (PDAC)、前立腺癌細胞、乳癌細胞、および膀胱癌細胞は、例えば、CT、MRI、ERCP、MRCP、コンピュ-タ-断層撮影、または超音波によって診断される。治療によって、対象におけるREG4またはKIAA0101発現の減少、または腫瘍の大きさ、蔓延度、もしくは転移能の減少などの臨床的有益性がもたらされるならば、その治療は有効である。治療が予防的に行われる場合、「有効な」とは、治療によって、腫瘍の形成が遅延するかもしくは妨げられる、または腫瘍の臨床症状が妨げられるかもしくは軽減されることを意味する。有効性は、特定の腫瘍型を診断または治療する任意の公知の方法により決定される。
【００７０】
siRNA療法は、本発明のsiRNAをコードする標準的なベクター、および/または合成siRNA分子の送達によるような遺伝子送達システムにより、患者にsiRNAを投与することによって行われる。典型的には、合成siRNA分子は、インビボでのヌクレアーゼ分解を妨げるために化学的に安定化される。化学的に安定化されたRNA分子を調製する方法は、当技術分野において周知である。典型的には、そのような分子は、リボヌクレアーゼの作用を妨げるために修飾された骨格およびヌクレオチドを含む。その他の修飾も可能であり、例えば、コレステロール結合siRNAは、薬理学的特性の改善が示されている(Song et al. Nature Med. 9:347-351 (2003))。
【００７１】
適切な遺伝子送達システムには、リポソーム、受容体媒介送達システム、またはとりわけヘルペスウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスのようなウイルスベクターが含まれ得る。治療用核酸組成物は、薬学的に許容される担体中に製剤化される。治療用組成物はまた、上記の遺伝子送達システムを含んでもよい。薬学的に許容される担体とは、動物への投与に適した生物学的に適合する賦形剤、例えば生理食塩水である。化合物の治療有効量とは、治療動物において、REG4またはKIAA0101遺伝子産物の産生の減少、細胞増殖、例えば増殖の減少、または腫瘍増殖の減少など、医学的に望ましい結果を生じ得る量である。
【００７２】
静脈内、皮下、筋肉内、および腹腔内送達経路などの非経口投与を用いて、REG4またはKIAA0101のsiRNA組成物を送達することができる。膵臓、前立腺、乳、および膀胱腫瘍の治療には、組織または癌の近傍への直接注入が有用である。
【００７３】
任意の患者への投与量は、患者の体格、体表面積、年齢、投与しようとする特定の核酸、性別、投与時間および投与経路、全身の健康状態、ならびに同時に投与するその他の薬物を含む、多くの要因に依存する。核酸を静脈内投与する場合の投与量は、核酸分子約106〜1022コピーである。
【００７４】
ポリヌクレオチドは、筋肉もしくは皮膚などの組織の間隙への注射、循環もしくは体腔への導入、または吸入もしくは注入といった、標準的な方法で投与する。ポリヌクレオチドは、薬学的に許容される液体担体、例えば水溶性または部分的に水溶性の液体担体と共に動物に注射するか、または送達する。ポリヌクレオチドは、リポソーム(例えば、陽イオン性または陰イオン性リポソーム)と結合させる。ポリヌクレオチドは、プロモーターなどの、標的細胞による発現に必要な遺伝情報を含む。
【００７５】
抗REG4抗体および抗原に結合するタンパク質：
抗体
本発明者は、REG4に対するモノクローナル抗体がREG4の増殖促進効果を中和し、PDAC細胞の成長を有意に減衰させたことを示した。例えば、膵癌のように、REG4を発現している細胞に関連した疾患の治療が、REG4に結合する抗体を用いて都合よく行われることを結果として示した。
【００７６】
本発明は、膵癌を含むREG4の異常な過剰発現により引き起こされる癌を治療または予防するための医薬品組成物に関する。該組成物は、活性成分として、薬学的に有効量のREG4をコードするタンパク質に結合する抗体、またはその断片、または抗原に結合するタンパク質および薬学的に許容される担体を含む。本発明はまた、膵癌を治療または予防するための医薬品組成物を生産するために抗REG4抗体または抗原に結合するタンパク質を用いることに関する。本発明の医薬品組成物は、抗REG4抗体または抗原に結合するタンパク質および薬学的に許容される担体を含む。
【００７７】
「単離された」または「精製された」ポリペプチドとは、タンパク質が由来する細胞もしくは組織源からの糖質、脂質、または他の夾雑タンパク質などの細胞材料が実質的に含まないか、または、化学的に合成した場合には化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まないポリペプチドである。「細胞材料を実質的に含まない」という用語は、ポリペプチドが、ポリペプチドが単離されるまたは組換え技術により産生される細胞の細胞成分より分離される、ポリペプチドの調製物を含む。
【００７８】
したがって、細胞材料を実質的に含まないポリペプチドは、約30％、20％、10％、または5％（乾燥重量で）未満の異種タンパク質（本明細書において「夾雑タンパク質」を指す）を有するポリペプチドの調製物を含む。ポリペプチドを組換え技術により産生する場合、ポリペプチドはまた、好ましくは培地を実質的に含まず、タンパク質調製物の体積の約20％、10％、または5％未満の培地を有するポリペプチドの調製物を含む。ポリペプチドを化学合成によって産生する場合、ポリペプチドは好ましくは化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まず、タンパク質調製物の体積の約30％、20％、10％、5％（乾燥重量で）未満の、タンパク質合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質を有するポリペプチドの調製物を含む。特定のタンパク質調製物が単離されたまたは精製されたポリペプチドを含むことは、例えば、タンパク質調製物のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）-ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびゲルのクーマシーブリリアントブルー染色の後に単一のバンドが出現することによって示され得る。好ましい態様において、本発明の抗体またはその断片は、単離されているかまたは精製されている。
【００７９】
「単離された」または「精製された」核酸分子とは、核酸分子の天然源に存在する他の核酸分子から分離されている核酸分子である。cDNA分子のような「単離された」または「精製された」核酸分子は、組換え技術により産生した場合は他の細胞材料もしくは培地を実質的に含み得ず、または、化学的に合成した場合は化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含み得ない。好ましい態様において、本発明の抗体またはその断片をコードする核酸分子は、単離されているかまたは精製されている。
【００８０】
「抗体」および「免疫グロブリン」とは、同じ構造特性を有する糖タンパク質である。抗体が特異抗原に対して結合特異性を示すのに対して、免疫グロブリンは、抗原特異性が規定されていない抗体および他の抗体様分子の両方を含む。後者の種類のポリペプチドは、例えば、リンパ系によって低いレベルで、およびミエローマによって増加したレベルで産生される。
【００８１】
「天然の抗体および免疫グロブリン」とは、通常、2本の同一の軽（L）鎖および2本の同一の重（H）鎖を含む約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は1つの共有ジスルフィド結合によって重鎖と連結するが、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間のジスルフィド結合の数は異なる。各重鎖および軽鎖は、規則的間隔の鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、一方の末端に可変ドメイン（VH）を有し、続いて多数の定常ドメイン（CH）を有する。各軽鎖は、一方の末端に可変ドメイン（VL）、およびもう一方の末端に定常ドメイン（CL）を有し；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列する。特定のアミノ酸残基が、軽鎖および重鎖可変ドメインとの間の界面を形成すると考えられている（Chothia et al., (1985) J Mol Biol.; 186: 651-63; Novotny and Haber, (1985) Proc Natl Acad Sci USA.; 82: 4592-6）。
【００８２】
「可変」という用語は、可変ドメインのある部分が、抗体間で配列が大幅に異なる事実を意味し、かつ特定の抗原に対する各特定の抗体の結合および特異性において有用である。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメイン全体に均等に分布しているわけではない。軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメイン両方に存在する相補性決定領域（CDR）または超可変領域と呼ぶ3個のセグメントに、可変性が集中している。可変ドメインの、より高度に保存されている部分を、フレームワーク（FR)と呼ぶ。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、主としてβシート配置を取って3個のCDRにより連結されている4個のフレームワーク領域を含み、この3個のCDRは連結ループを形成し、ある場合にはβシート構造の一部を形成する。各鎖におけるCDRはフレームワーク領域によって互いに極めて接近して保持され、もう一方の鎖由来のCDRと共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md.）。定常ドメインは、抗原に対する抗体の結合には直接関与しないが、抗体依存性細胞毒性への抗体の関与などの様々なエフェクター機能を示す。
【００８３】
抗体のパパイン消化によって、それぞれ単一の抗原結合部位を有する「Fab」断片と呼ばれる2個の同一の抗原結合断片、および残りの「Fc」断片が生成される。ペプシン処理によっては2個の抗原結合部位を有するF(ab')2断片が生じる。「Fv」とは、完全な抗原を認識および結合部位を含む最小抗体断片である。この領域は、1個の重鎖可変ドメインおよび1個の軽鎖可変ドメインの、堅固な非共有結合性会合の二量体からなる。この配置において、各可変ドメインの3個のCDRがVH-VL二量体の表面上で抗原結合部位を規定するように相互作用する。共同で、6個のCDRが抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（または、抗原に対して特異的な3個のCDRのみを含む、Fvの一方）であっても、全結合部位より低い親和性ではあるものの、抗原を認識して結合する能力を有する。
【００８４】
Fab断片はまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第一定常ドメイン（CH-1）を含む。Fab'断片は、重鎖CH-1ドメインのC末端における、抗体ヒンジ領域由来の一つまたは複数のシステインを含む数個の残基の付加によって、Fab断片とは異なる。Fab'-SHは本明細書において、定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を有するFab'を示す。F(ab')2抗体断片は、元々、断片の間にヒンジシステインを有するFab'断片のペアとして産生された。他の抗体断片の化学的結合もまた公知である。
【００８５】
任意の脊椎動物種由来の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいてκ（カッパ）およびλ（ラムダ）と呼ばれる、2種類の明らかに異なるタイプの一つに割り当てることができる。
【００８６】
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは異なるクラスに割り当てることができる。5個の主要な免疫グロブリンのクラス：IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMが存在し、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2にさらに分類することができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元配置は周知である。
【００８７】
本明細書において使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質の抗体の集団から取得される抗体を指し、すなわち、集団を含む個々の抗体は、少量で存在する可能性がある潜在的な天然の変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、非常に特異的であり、単一の抗原部位に指向される。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含む通常の（ポリクローナル）抗体調製物と対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対して指向される。特異性に加えて、ハイブリドーマ培養によって合成でき、他の免疫グロブリンが夾雑し得ない点で、モノクローナル抗体は有利である。したがって、「モノクローナル」という修飾語句は、実質的に均質の抗体集団から取得されるような抗体の特性を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするように解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Kohler and Milstein, (1975) Nature;256:495-7によって最初に記載されたハイブリドーマ法、または、組換えDNA法（Cabilly et al., (1984) Proc Natl Acad Sci USA.;81:3273-7）によって作製することができる。
【００８８】
本明細書におけるモノクローナル抗体は、所望の生物学的活性を提示する限り、「キメラ」抗体または免疫グロブリンを明確に含み、「キメラ」抗体または免疫グロブリンにおいて、重鎖および/または軽鎖の一部は、特定の種に由来するかまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同であるが、鎖の残りの部分は、別の種に由来するかまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同である（Cabilly et al.,前記; Morrison et al., (1984) Proc Natl Acad Sci USA.;81:6851-5）。最も典型的には、キメラ抗体または免疫グロブリンは、ヒトおよびマウスの抗体断片、一般的にはヒト定常領域およびマウス可変領域を含む。
【００８９】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化された」形態とは、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列に由来する特別なキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはその断片である。そのような断片は、Fv、Fab、Fab'、F(ab')2、または抗体の他の抗原結合サブ配列も含む。大部分について、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（CDR）由来の残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有する、マウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト種（ドナ-抗体）のCDR由来の残基によって置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。
【００９０】
場合によっては、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク残基が対応する非ヒト残基によって置換されていてもよい。本発明において、ヒト化抗体におけるフレームワークの数個、2個、または好ましくは1個が非ヒト残基によって置換されていてもよい。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも移入されたCDRまたはフレームワーク配列にも見出されない残基を含み得る。抗体の性能をさらに洗練して最適化するために、これらの修飾を行う。一般に、ヒト化抗体は、CDR領域のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのCDR領域に対応し、かつ、フレームワーク領域のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のフレームワーク領域である、少なくとも1個、および典型的には2個の可変ドメインの実質的にすべてを含んでもよい。
【００９１】
任意で、ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Fc）、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。さらなる詳細については、Jones et al., (1986) Nature;321:522-5; Riechmann et al., (1988) Nature;332:323-7; Presta, (1992) Curr Opin Struct Biol. 2:593-6を参照されたい。
【００９２】
「一本鎖Fv」または「sFv」抗体断片は、抗体のVHおよびVLドメインを含み、これらのドメインは一本鎖ポリペプチド鎖中に存在している。好ましくは、Fvポリペプチドは、VHとVLドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含み、それによってsFvが抗原結合のために望ましい構造を形成することが可能になる。自然に凝集するが化学的には分離している抗体V領域由来の軽鎖および重鎖ポリペプチドを、抗原結合部位の構造と実質的に類似した三次元構造へ折りたたむと考えられるsFv分子へと変換するための化学構造を識別するために、多くの方法が記載されている（米国特許第5,091,513号、第5,132,405号、および第4,946,778号；Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)）。
【００９３】
抗原結合タンパク質
本発明はまた、REG4またはKIAA0101へ特異的に結合する抗原結合タンパク質または非抗体結合タンパク質（例えば、配位子）を含む。非抗体配位子は、以下により詳細に記述するような、アドネクチン、アビマー、単鎖タンパク質結合分子および抗体様結合ペプチド模倣体を含む、非免疫グロブリンタンパク質骨格を用いた抗体模倣体を含む。
【００９４】
抗体と同様の方法で標的とするおよび標的に結合する他の化合物が開発されてきた。ある種のこれらの「抗体模倣体」は、抗体の可変領域の代替的タンパク質フレームワークとして、非免疫グロブリンタンパク質骨格を使用する。
【００９５】
例えば、Ladnerら(U.S. Patent No. 5,260,203)は、凝集状であるが、分子的には分離している抗体可変領域の軽鎖および重鎖に類似した結合特異性を有する単鎖ポリペプチド結合分子を記載している。単鎖結合分子は、ペプチドリンカーによって結合された抗体の重鎖および軽鎖可変領域双方の抗原結合部位を含み、二ペプチド抗体と類似した構造に折り畳まれている。単鎖結合分子は、通常の抗体よりも、分子サイズ、より高い安定性を含む幾つかの点で優れており、より容易に改変される。
【００９６】
Kuら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92(14):6552-6556 (1995)）は、シトクロームb562に基づく抗体の代替物を記載している。Kuら（1995）は、シトクロームb562の2つのループがランダム化され、ウシ血清アルブミンに対する結合性で選択されるライブラリーを作成した。
【００９７】
Lipovsekら（U.S. Patent Nos. 6,818,418 and 7,115,396）は、フィブロネクチン又はフィブロネクチン様のタンパク質骨格と少なくとも1つの可変ループを特徴とする抗体模倣体を開示している。アデノクチンとして知られるように、これらのフィブロネクチンに基づく抗体模倣体は、天然又は加工抗体と同じ性質を多く示し、そのような性質には、高親和性および標的リガンドに対する特異性が含まれる。新規の又は改良された結合タンパク質を進化させるための如何なる技術も、これらの抗体模倣体に用いることができる。
【００９８】
これらのフィブロネクチンに基づく抗体模倣体の構造は、IgG重鎖の可変領域の構造に類似している。それゆえ、これらの模倣体は、性質および親和性において、天然抗体に類似した抗原結合性を示す。さらに、これらのフィブロネクチンに基づく抗体模倣体は、抗体および抗体フラグメントを超えたある利点を提示する。例えば、これらの抗体模倣体は、自然の折り畳み安定性をジスフィルド結合に依存しないため、通常は抗体を破壊するような条件下でも安定である。さらに、これらのフィブロネクチンに基づく抗体模倣体の構造は、IgG重鎖の構造と類似しているため、ループのランダム化およびシャッフリングの過程は、インビボでの抗体の親和性成熟化の過程と同様に、インビトロで行うことができる。
【００９９】
Besteら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(5):1898-1903 (1999)）は、リポカリン骨格に基づく抗体模倣体（Anticalin（登録商標））を開示している。リポカリンは、タンパク質の末端に4つの超可変ループを備えたβ-バレルから構成される。Beste （1999）は、ループに、ランダム突然変異を誘発させて、例えばフルオレセインとの結合性で選択した。3つの変異体は、フルオレセインとの特異的結合性を示し、そのうちの1つの変異体は、抗フルオレセイン抗体のものと同様の結合性を示した。さらなる解析は、ランダム化された位置の全てが、可変的であることを明らかにし、Anticalin（登録商標）が、抗体の代替物として用いるのに適していることを示した。
【０１００】
Anticalin（登録商標）は、典型的には160〜180残基の低分子の単鎖ペプチドであり、抗体と比較して、生産コストの低減化、貯蔵時の安定性向上および免疫反応の低減化を含む幾つかの利点を有している。
【０１０１】
Hamilton ら（U.S. Patent No. 5,770,380）は、結合部位として用いられる複数の可変ペプチドループを結合した、カリックスアレーンの強固な非ペプチド有機骨格を使用した、合成抗体模倣体を開示している。ペプチドループは全て、互いに、カリックスアレーンから幾何学的に同じ側から突出する。この幾何学的な確証のため、全てのループが結合に利用可能であり、リガンドに対する結合親和性が増大する。しかしながら、他の抗体模倣体と比較して、カリックスアレーンを基礎とする抗体模倣体は、ペプチドのみから構成されているわけではないため、プロテアーゼ酵素による攻撃を受けにくい。ペプチド、DNA又はRNAから純粋に構成される骨格のいずれでもないことは、この抗体模倣体が、極限環境条件下で比較的安定であり、長寿命を有することを意味する。さらに、カリックスアレーンに基づく抗体模倣体は、比較的小さいため、免疫反応が生じる可能性が低い。
【０１０２】
Muraliら（Cell. Mol. Biol. 49(2):209-216 (2003)）は、抗体をより小さいペプチド模倣体に小さくする方法論を論じており、「抗体様結合ペプチド模倣体」（ABiP）と呼んでいる。それは抗体の代替物として利用することもできる。
【０１０３】
Silvermanら（Nat. Biotechnol. (2005), 23: 1556-1561）は、「アビマー（avimers）」と呼ばれる複数のドメインを含む単鎖ポリペプチドである融合タンパク質を開示している。アビマーは、インビトロ・エクソンシャッフリングとファージディスプレイによってヒト細胞外受容体ドメインから開発されたものであり、様々な標的分子に対する親和性および特異性という点で、抗体と幾分類似した結合タンパク質の1クラスである。結果として生じたマルチドメインタンパク質は、複数の独立した結合ドメインを含むことができ、それらのドメインは、単独エピトープ結合タンパク質と比較して、改善された親和性（時としてサブ-ナノモラー）と特異性を示し得る。アビマーの構築および使用の方法に関するさらなる詳細は、例えば、米国公開特許第20040175756号、第20050048512号, 第20050053973号、第20050089932号および第20050221384号に開示されている。
【０１０４】
非免疫グロブリンタンパク質フレームワークに加えて、抗体特性は、RNA分子および非天然オリゴマー（例えば、プロテアーゼ阻害剤、ベンゾジアゼピン、プリン誘導体およびβ-ターン模倣体）を含む化合物においても模倣されており、これらの全ては、本発明での使用に適している。
【０１０５】
中和活性：
病原体の感染力および毒素の活性を奪う機能を有する抗体および非抗体結合タンパク質を提示する。抗体媒介中和は、抗原性可変領域の抗原への結合により達成され得るか、または補体の介在を必要とする場合がある。例えば、抗ウイルス抗体は、ウイルスの感染力を奪うために補体の介在を必要とする場合がある。補体の関与には、Fc領域が不可欠である。したがって、このような抗体は、ウイルスおよび細胞の中和のためにFcを必要とするエフェクター機能を含む。
【０１０６】
本発明は、抗REG4抗体および非抗体結合タンパク質がREG4に特異的に結合し、細胞、特に異常な高REG4発現または細胞内シグナルを媒介する性質を有する癌細胞の増殖を促進するREG4の活性を中和する所見に一部を基く。
【０１０７】
抗体もしくは非抗体結合タンパク質の項における「特異的に結合する」または「特異的な結合」または「付加した」または「付加する」という用語は、細胞または組織に発現するREG4に結合する他の薬剤または配位子と結合または競合する標的エピトープ（例えばREG4）と、薬剤または配位子との全部または一部での優先的な会合を意味する。もちろん、非特異的相互作用の特定の程度が、抗体と非標的エピトープの特異的な認識を介して識別され得る。それにもかかわらず、特異的な結合は、標的エピトープの特異的な認識を介して媒介される結合として、区別され得る。典型的には、特異的な結合は、標的エピトープを欠く実体（例えば、アッセイウエルまたは細胞）と結合抗体間より、標的抗体を有する実体（例えば、アッセイウエルまたは細胞）と送達分子とのより強固な会合となる。特異的な結合は、標的エピトープを欠く細胞または組織と比較して、標的エピトープ（すなわちREG4）を有する細胞または組織に結合する薬剤または配位子の量（単位時間当たり）において、典型的には、少なくとも背景より約2倍の増加、好ましくは約10倍以上、およびより好ましくは100倍を超える増加となる。2つの実体間の特異的な結合は、一般的に、少なくとも106M-1の親和性を意味する。108M-1またはそれ以上の親和力が好ましい。特異的な結合は、タンパク質薬剤および配位子と同様に核酸に対してに決定され得る。核酸剤に対する特異的な結合は、これらに限定されないが、ノーザンブロット、ゲルシフトアッセイおよびインサイチューハイブリダイゼイションを含む当業者に周知のアッセイを用いて決定される。タンパク質薬剤および配位子に対する特異的な結合は、これらに限定されないが、ゲル電気泳動、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリーおよび免疫組織化学を含む
【０１０８】
本発明はまた、REG4発現細胞の細胞増殖を抑制する方法に関すし、該方法は以下段階を含む：
1)抗REG4抗体または抗REG4非抗体結合タンパク質とREG4発現細胞を接触させること、および
2)REG4の細胞増殖活性を中和すること。
【０１０９】
本発明の方法または医薬品組成物において、REG4発現細胞は、抑制され得る。例えば、膵癌細胞は、本発明のREG4発現細胞として好ましい。これらのうち、膵癌または細胞は、好ましい。
【０１１０】
細胞と抗体（または非抗体結合タンパク質）は、インビボまたはインビトロで接触され得る。REG4発現細胞として癌細胞をインビボで標的とする場合、本発明の方法は、実際に癌の治療方法または防止方法である。具体的には、本発明は、以下段階を含む、癌の治療法を提供する：
1) 癌患者にREG4に特異的に結合する抗体または非抗体結合タンパク質を投与すること、および
2) REG4に結合する抗体または非抗体結合タンパク質の機能を使用して癌細胞増殖を抑制すること、ここで、該機能は、REG4の細胞増殖活性を中和することである。
【０１１１】
本発明において、抗REG4抗体または非抗体結合タンパク質の機能を中和することは、REG4発現細胞の細胞増殖促進するREG4の活性を抑制することを意味する。例えば、本発明者らは、REG4がオートクリンまたはパラクリン増殖因子として機能し、Aktシグナル経路を媒介することを確認している。したがって、本発明の好ましい実施態様において、抗REG4抗体または非抗体結合タンパク質は、REG4オートクリン/パラクリン経路を遮断して、続くAktリン酸化を防御する。本発明者らはまた、中和機能を用いてREG4発現細胞、特に膵癌細胞の細胞増殖を効果的に抑制することを確認した。本発明者らは、さらに、REG4が、高率で膵癌細胞で高発現することも確認した。加えて、正常組織でのREG4の発現レベルは低い。この情報を共に考慮し、抗REG4抗体が投与される膵臓癌治療の方法は、副作用の危険がほとんどない、効果的な方法であり得る。
【０１１２】
しかしながら、本発明の抗体および非抗体結合タンパク質は、所望の中和機能を含む限り制限されない。Fc部位への変異体、類似体または誘導体は、例えば、残基または配列の変異、置換により構築され得る。
【０１１３】
変異体（または誘導体）ポリペプチドは、挿入変異体を含む。ここで、Fcアミノ酸配列に１つまたはそれ以上のアミノ酸残基を補充してもよい。挿入は、タンパク質の片方もしくは両方の末端に配置されるか、もしくはFcアミノ酸の挿入領域内に配置され得る。片方もしくは両方の末端に付加残基を有する挿入変異体は、例えば、アミノ酸タグまたはラベルを含む融合タンパク質およびタンパク質を含む。例えば、特に分子が、例えば大腸菌のような細菌細胞において、組換え的に発現される場合、Fc分子はＮ末端Metを任意に含み得る。
【０１１４】
Fc欠損変異体において、Fcポリペプチドにおける１つまたはそれ以上のアミノ酸残基は、除去される。欠損は、Fcポリペプチドの１つまたは両方の末端で、もしくはFcアミノ酸配列内の１つまたはそれ以上の残基の除去で遂行され得る。欠損変異体は、従って、Fcポリペプチド配列のすべての断片を含む。
【０１１５】
Fc欠損変異体において、Fcポリペプチドの１つまたはそれ以上のアミノ酸残基は、除去され、代替残基で置き換えられる。１つの態様において、置換が自然に保存的であるが、本発明は、非保存的である置換を許容する。
【０１１６】
好ましくは、親ポリペプチドFc領域は、ヒトFc領域、例えば、天然配列のヒトFc領域ヒトIgG1（Aおよび非Aアロタイプ）またはヒトIgG3のFc領域である。１つの態様において、ADCCが改良された変異体は、天然配列のIgG1またはIgG3を有する抗体のFc領域、および変異体の抗原結合領域よりも、ADCCを実質的により効果的に媒介する。好ましくは、変異体は、Fc領域の298位、333位、および334位の残基のうちの2つまたは3つの置換を含むか、または本質的にそれらからなる。免疫グロブリン重鎖における残基の付番方式は、Kabatら（前記）におけるようなEUインデックス（EU index）のそれであり、これは参照により本明細書に明確に組み入れられる。298位、333位、および334位の残基が（例えば、アラニン残基によって）置換されていることがより好ましい。さらに、ADCC活性が改良されたFc領域変異体を作製するために、ADCCを媒介するための重要なFcRであると考えられているFcγRIIIに対する結合親和性が改良されたFc領域変異体が一般に作られる。例えば、そのような変異体を作製するために、親Fc領域に、アミノ酸位置256、290、298、312、326、330、333、334、360、378、または430のうちの任意の1つまたはそれ以上においてアミノ酸修飾（例えば、挿入、欠失、または置換）を導入してもよい。FcγRIIIに対する結合親和性が改良された変異体がさらに、FcγRIIに対する結合親和性の低下、特にFcγRIIb受容体の阻害に対する親和性の低下を有してもよい。
【０１１７】
いずれにせよ、いかなる変異アミノ酸の挿入、欠失および/または置換（1〜50アミノ酸、好ましくは1〜25アミノ酸、より好ましくは1〜10アミノ酸）が、意図され、本発明の範囲内にある。保存的アミノ酸置換は、一般的に好ましい。  
【０１１８】
さらに、改変は、D-アミノ酸などの改変アミノ酸の形態にあってもよい。
したがって、これらのクラスに属するヒト由来抗体は、本発明において好ましい。ヒト抗体は、ヒトから得られた抗体産生細胞、またはヒト抗体遺伝子を移植したキメラ動物を用いて獲得することができる(Ishida I, et al., (2002) Cloning and Stem Cells., 4：91-102)。
【０１１９】
さらに、抗体Fc領域は任意の可変領域に接合することができる。具体的には、異なる動物種の可変領域にヒトの定常領域を結合したキメラ抗体が当技術分野において公知である。あるいは、ヒト由来の可変領域に任意の定常領域を結合して、ヒト-ヒトキメラ抗体を得ることもできる。さらに、ヒト抗体の可変領域に対応する相補性決定領域(CDR)を異種抗体のCDRで置換する技術であるCDR移植技術も公知である(「Immunoglobulin genes」, Academic Press (London), pp260-274, 1989; Roguska MA, et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91：969-73)。
【０１２０】
CDRの置換により、抗体の結合特異性が置換される。すなわち、ヒトREG4結合抗体のCDRを移植されたヒト化抗体は、ヒトのREG4を認識する。移植された抗体は、ヒト化抗体とも呼ばれる。このようにして得られ、エフェクター機能に不可欠なFc領域を備えた抗体は、可変領域の由来に関わらず、本発明の抗体として用いることができる。例えば、可変領域が、他のクラスまたは他の種の免疫グロブリンに由来するアミノ酸配列を含んでいる場合であっても、ヒトIgGのFcを含む抗体は、本発明において好ましい。
【０１２１】
あるいは、それらが所望の中和機能を有する限り、Fc領域を欠く抗体断片が、用いられる。例えば、本発明において、Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2または抗体の他の抗原結合配列が、抗体として用いられ得る。ある実施態様において、中和効果を増強する薬剤は、抗体またはその断片と結合され得る。
【０１２２】
本発明の抗体のVHおよびVLドメインは、フレームワーク領域によって分離されたCDR1、CDR2およびCDR3として設計された各３つのCDRを含む。CDRのアミノ酸配列は、抗体がREG4に特異的に結合する限り、制限されない。
CDRアミノ酸配列の好ましい例は、以下の通りである：
VH  CDR1：SYWMH（配列番号：20),
VH  CDR2：NIYPGSGSTNYD（配列番号：21),
VH  CDR3：GGLWLRVDY（配列番号：22),
VL  CDR1：SASSSVSYMH（配列番号：23),
VL  CDR2：DTSKLAS（配列番号：24),
VL  CDR3：QQWSSNPF（配列番号：25)。
【０１２３】
より好ましい態様では、VHは、配列番号：18のアミノ酸配列を含み、VLは、配列番号：19のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、VHは、配列番号：18の全長に、少なくとも約90％、95％、98％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、VLは、配列番号：1９の全長に、少なくとも約90％、95％、98％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。配列同一性は、例えば、BLASTまたはALIGNなどの公知技術で利用可能なソフトウェアの初期設定を用いて測定され得る。
【０１２４】
本発明において、抗体は、モノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であってもよい。ヒトに投与する場合であっても、上記のヒトの抗体遺伝子を移植された動物を用いて、ヒトポリクローナル抗体を得ることができる。あるいは、ヒト化抗体、ヒト-非ヒトキメラ抗体、およびヒト-ヒトキメラ抗体などの遺伝子工学的技術によって構築された免疫グロブリンを用いることもできる。さらに、ヒト抗体産生細胞をクローニングすることによって、ヒトモノクローナル抗体を得る方法も公知である。
【０１２５】
本発明の抗体を得るために、REG4またはその部分ペプチドを含む断片を免疫原として利用することができる。本発明において、REG4は、任意の種、好ましくは、例えばヒト、マウス、またはラットなどの哺乳動物、より好ましくはヒトに由来し得る。ヒトREG4のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は当技術分野において公知である。REG4のcDNAヌクレオチド配列を、配列番号：1に記載し、そのヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列を配列番号：2(Genbankアクセッション番号AY126670)に記載した。当業者は、示されたヌクレオチド配列を含有する遺伝子を慣例的に単離し、必要に応じて配列の断片を調製し、標的アミノ酸配列に対応するタンパク質を得ることができる。
【０１２６】
例えばREG4タンパク質またはその断片をコードする遺伝子を、公知の発現ベクターに挿入し、宿主細胞を形質転換するために使用することができる。所望のタンパク質またはその断片は、宿主細胞の内外から任意の標準的な方法により回収することができ、抗原として使用することもできる。加えて、タンパク質、その溶解物、および化学的に合成されたタンパク質を、抗原として使用することができる。さらに、REG4タンパク質またはその断片を発現する細胞そのものを免疫原として利用することができる。
【０１２７】
REG4免疫原としてペプチド断片を用いる場合、特に細胞外領域であると予測される領域を含むアミノ酸配列を選択することが好ましい。シグナルペプチドの存在は、REG4のN末端において1〜25と推定される。したがって、例えばN末端のシグナルペプチド(25アミノ酸残基)を除く領域は、本発明の抗体を得るための免疫原として好ましい。あるいは、REG4の細胞外領域に結合する抗体は、本発明の抗体として好ましい。
【０１２８】
したがって、本発明における好ましい抗体は、エフェクター機能に不可欠なFcと細胞外REG4領域に結合することができる可変領域とを備えた抗体である。ヒトに投与することを目的とする場合、IgGのFcを備えることが望ましい。
【０１２９】
任意の哺乳動物をこのような抗原で免疫化することができる。しかし、細胞融合において用いる親細胞との適合性を考慮することが好ましい。一般に、げっ歯類、ウサギ目、または霊長類が好ましい。
【０１３０】
げっ歯類には、例えばマウス、ラット、およびハムスターが含まれる。ウサギ目には、例えばウサギが含まれる。霊長類には、例えばカニクイザル(Macaca fascicularis)、アカゲザル(Macaca mulatta)、マントヒヒ、およびチンパンジーなどの狭鼻猿類(旧世界)のサルが含まれる。
【０１３１】
動物を抗原で免疫化する方法は、当技術分野で周知である。抗原の腹腔内注射または皮下注射は、哺乳動物を免疫化する標準的な方法である。具体的には、抗原は適量のリン酸緩衝食塩水(PBS)、生理食塩水などで希釈および懸濁することができる。所望ならば、抗原懸濁物を、フロイント完全アジュバントなどの適量の標準的なアジュバントと混合し、乳化した後、哺乳動物に投与することができる。これに続いて、適量のフロイント不完全アジュバントと混合した抗原を、4〜21日毎に複数回投与することが好ましい。適切な担体を、免疫化に使用することもできる。上記のように免疫化を行った後に、標準的な方法は、所望の抗体レベルへの増加のため血清を調べることがされる。
【０１３２】
REG4タンパク質に対するポリクローナル抗体は、所望の抗体の増加について血清を調べられた免疫化哺乳動物から調製することができる。これは、これらの動物から血液を採取することによって、またはそれらの血液から血清を単離する任意の通常の方法によって達成される。ポリクローナル抗体は、ポリクローナル抗体を含有する血清、および血清から単離されたポリクローナル抗体を含有する画分を含む。IgGおよびIgMは、REG4タンパク質を認識する画分から、例えば、REG4タンパク質を結合させたアフィニティカラムを用いて、次いでこの画分をプロテインAまたはプロテインGのカラムでさらに精製することにより、調製することができる。本発明において、抗血清は、ポリクローナル抗体のまま用いることもできる。あるいは、精製されたIgG、IgMなどを用いることもできる。
【０１３３】
モノクローナル抗体を調製するため、抗原で免疫化した哺乳動物から免疫細胞を収集し、(上記のように)血清中の所望の抗体レベルの増加を調べ、細胞融合に適用してもよい。細胞融合に使用する免疫細胞は、好ましくは脾臓から得られる。上記の免疫原と融合される他の好ましい親細胞には、例えば、哺乳動物のミエローマ細胞、およびより好ましくは、薬剤によって融合細胞を選択するための性質を獲得したミエローマ細胞が含まれる。
【０１３４】
上記の免疫細胞およびミエローマ細胞は、公知の方法、例えばMilsteinらの方法(Galfre, G. and Milstein, C., (1981) Methods. Enzymol. : 73, 3-46)を用いて融合することができる。
【０１３５】
細胞融合によって産生されるハイブリドーマを、HAT培地(ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含む培地)などの標準的な選択培地で培養することにより、選択することができる。HAT培地における細胞培養は、通常、数日から数週間、所望のハイブリドーマを除く他の全ての細胞(融合していない細胞)を死滅させるのに十分な期間、継続する。次いで、標準的な限界希釈を行い、所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞のスクリーニングおよびクローニングを行う。
【０１３６】
非ヒト動物は上記方法におけるハイブリドーマを調製するために抗原で免疫化することができる。さらに、EBウイルスなどに感染した細胞由来のヒトリンパ球は、タンパク質、タンパク質を発現する細胞、またはその懸濁物を用いて、インビトロで免疫化することができる。次いで、免疫化されたリンパ球を、無制限に分裂可能なヒト由来のミエローマ細胞(U266など)と融合させてもよく、それにより、タンパク質に結合可能な所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマが得られる(公開特許公報(JP-A)昭63-17688)。
【０１３７】
得られたハイブリドーマを、続いてマウスの腹腔に移植して腹水を抽出する。得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、プロテインAもしくはプロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、または本発明のタンパク質を結合させたアフィニティカラムを用いて精製することができる。本発明の抗体は、本発明のタンパク質の精製および検出だけでなく、本発明のタンパク質のアゴニストおよびアンタゴニストの候補として使用することもできる。これらの抗体を、本発明のタンパク質に関連する疾患の抗体療法に応用することもできる。得られた抗体をヒトの身体に投与する場合(抗体療法)、ヒト抗体またはヒト化抗体は、免疫原性が低いため好ましい。
【０１３８】
例えば、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを含有するトランスジェニック動物を、タンパク質、タンパク質発現細胞、またはこれらの懸濁物より選択される抗原で免疫化することができる。次いで抗体産生細胞を、該動物から回収し、ハイブリドーマを得るため、ミエローマ細胞と融合させ、これらのハイブリドーマから抗タンパク質ヒト抗体を調製することができる(国際公開公報第92-03918号、第94-02602号、第94-25585号、第96-33735号、および第96-34096号を参照されたい)。
【０１３９】
あるいは、抗体を産生する免疫化されたリンパ球などの免疫細胞を、癌遺伝子を用いて不死化させ、モノクローナル抗体の調製に使用することができる。
【０１４０】
このようにして得られたモノクローナル抗体は、遺伝子工学の方法を用いて調製することができる(例えばBorrebaeck, C.A.K. and Larrick, J.W., (1990) Therapeutic Monoclonal Antibodies, MacMillan Publishers, UKを参照されたい)。例えば、組換え抗体は、抗体を産生する免疫化されたリンパ球またはハイブリドーマのような免疫細胞から抗体をコードするDNAをクローニングし、これらのDNAを適切なベクターに挿入し、宿主細胞に導入して、調製され得る。上述のように調製された組換え抗体もまた本発明において意図される。
【０１４１】
抗体は、ポリエチレングリコール(PEG)などの様々な分子との結合によって修飾することができる。このように修飾された抗体も、本発明に利用することができる。修飾抗体は、抗体を化学的に修飾することにより得られる。このような修飾法は、当技術分野で通常のものである。抗体を他のタンパク質によって修飾することもできる。タンパク質分子で修飾された抗体は、遺伝子工学によって産生することができる。すなわち、抗体遺伝子と修飾タンパク質分子をコードする遺伝子との融合により、標的タンパク質を発現させることができる。
【０１４２】
あるいは、該抗体は、非ヒト抗体由来の可変領域およびヒト抗体由来の定常領域を含有するキメラ抗体として、または非ヒト抗体由来の相補性決定領域(CDR)、ヒト抗体由来のフレームワーク領域(FR)、および定常領域を含有するヒト化抗体として得ることができる。このような抗体は、公知の手法で産生することができる。
【０１４３】
分子生物学の標準的な手法を用いて、キメラおよびCDR移植産物をコードするDNA配列を調製してもよい。関心対象の抗体のCDRをコードする遺伝子は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて抗体産生細胞のRNAから可変領域を合成することによって調製することができる（例えば、Larrick et al., “Methods: a Companion to Methods in Enzymology", vol. 2: page 106 (1991); Courtenay-Luck, “Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies" in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application; Ritter et al. (eds.), page 166 (Cambridge University Press, 1995)およびWard et al., “Genetic Manipulation and Expression of Antibodies" in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications; Birch et al. (eds.), page 137 (Wiley-Liss, Inc., 1995)を参照）。
【０１４４】
キメラおよびCDR移植産物をコードするDNA配列は、オリゴヌクレオチド合成法を用いて完全にまたは部分的に合成することができる。部位指定突然変異誘発およびポリメラーゼ連鎖反応法を、適宜用いてもよい。例えば、Jones et al.,(1986) Nature.;321:522-5によって記載されたようなオリゴヌクレオチド指定合成を用いてもよい。また、例えば、Verhoeyen et al.,(1988)Science.;239:1534-6またはRiechmann et al.,（前記）に記載されたような、既存の可変領域のオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発を用いてもよい。また、例えば、Queen et al.,(1989) Proc Natl Acad Sci USA.;86:1002933; PCT公報WO 90/07861によって記載されたような、T4 DNAポリメラーゼを用いた、ギャップを有するオリゴヌクレオチドにおける酵素的充填を用いてもよい。
【０１４５】
任意の適した宿主細胞/ベクター系を、CDR移植重鎖および軽鎖をコードするDNA配列の発現のために用いてもよい。例えば大腸菌などの細菌系、および他の微生物系を、特にFAbおよび（Fab'）2断片などの抗体断片、とりわけFv断片および一本鎖抗体断片、例えば一本鎖Fvsの発現のために用いてもよい。、例えば、哺乳動物のような真核生物宿主細胞発現系を、特に、完全な抗体分子を含む、より大きなCDR移植抗体産物の産生のために用いてもよい。好適な哺乳動物宿主細胞には、CHO細胞および骨髄腫細胞株またはハイブリドーマ細胞株が含まれる。
【０１４６】
上述のように得られた抗体を均一になるまで精製することができる。例えば、抗体は、タンパク質を精製および分離する一般的な方法に従って精製および分離することができる。例えば抗体は、アフィニティクロマトグラフィー、濾過、限外濾過、塩析、透析、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動などを含むが、これらに限定されないカラムクロマトグラフィーを、適切に選択し組み合わせることによって、分離および単離することができる(Antibodies：A Laboratory Manual, Harlow and David, Lane (編), Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)。
【０１４７】
プロテインAカラムおよびプロテインGカラムをアフィニティカラムとして使用することができる。使用される例示的なプロテインAカラムには、Hyper D、POROS、およびSepharose FF(Pharmacia)が含まれる。
【０１４８】
例示的なクロマトグラフィー(アフィニティクロマトグラフィーを除く)には、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、および吸着クロマトグラフィーが含まれる(「Strategies for Protein Purification and Characterization：A Laboratory Course Manual」 Daniel R. Marshak et al., (1996) Cold Spring Harbor Laboratory Press)。クロマトグラフィーは、HPLCまたはFPLCなどの液相クロマトグラフィーの手順に従って実施することができる。
【０１４９】
例えば、吸光度の測定、酵素結合免疫吸着アッセイ法(ELISA)、酵素免疫アッセイ法(EIA)、放射免疫アッセイ法(RIA)、および/または免疫蛍光法を用いて、本発明の抗体の抗原結合活性を測定することができる。ELISAでは、本発明の抗体を典型的にプレート上に固定し、本発明のタンパク質をプレート上に添加し、次いで抗体を産生する細胞の培養上清または精製抗体などの所望の抗体を含有する試料を添加する。次に、一次抗体を認識しアルカリホスファターゼなどの酵素でタグ付加された二次抗体を添加し、プレートをインキュベーションする。洗浄後、p-ニトロフェニルリン酸などの酵素基質をプレートに添加し、吸光度を測定して、試料の抗原結合活性を評価する。タンパク質の断片(C末端またはN末端の断片など)を、タンパク質と同様に使用することができる。BIAcore(Pharmacia)を用いて、該抗体の結合活性を評価することができる。
【０１５０】
さらに、REG4の活性を阻害する１つまたはそれ以上の抗REG4抗体は、本発明の方法および組成物のために用いられる。本発明において、好ましい抗REG4抗体は、膵癌の細胞増殖を促進させるREG4の活性を中和する。抗REG4抗体の中和機能は、インビトロで、またはインビボで評価されることができる。例えば、抗REG4抗体の中和機能は、REG4発現細胞の増殖に対して抗体の効果を観察することにより評価される。具体的には、この技術分野における周知の方法を用いて測定したときに、抗体が細胞増殖を検出可能な程度に抑制をする場合、中和機能が認められる。あるいは、当該機能はまた、Aktシグナル経路の抑制により確認される(Sekikawa A, et al. Gastroenterology 2005; 128: 642-53., Bishnupuri KS, et al. Gastroenterology 2006; 130: 137-49.)。
【０１５１】
本発明において、ヒトまたは他の動物に薬剤として、抗REG4抗体および非抗体結合タンパク質を投与することができる。本発明において、抗体を投与するヒト以外の動物には、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サル、ヒヒ、およびチンパンジーが含まれ得る。抗体および非抗体結合タンパク質は、対象に直接投与することができ、さらに公知の薬学的調製法を用いて投与剤型に製剤化することができる。例えば必要に応じて、水または他の任意の薬学的に許容される液体を用いて滅菌溶液もしくは懸濁液のような注射可能な形状で非経口的に投与することができる。例えば、このような化合物は、許容される担体または溶媒、具体的には滅菌水、生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、溶剤、保存剤、結合剤などと共に、薬剤としての使用に不可欠な一般に許容される単位用量へと混合することができる。
【０１５２】
生理食塩水、グルコ-ス、およびアジュバント(D-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、および塩化ナトリウムなど)を含む他の等張性溶液を、注射用水溶液として使用することができる。これらはまた、アルコール、具体的にはエタノールおよびポリアルコール(例えばプロピレングリコールおよびポリエチレングリコール)、ならびに非イオン性界面活性剤(例えばPolysorbate 80(商標)またはHCO-50)などの適切な可溶化剤と共に使用することができる。
【０１５３】
ゴマ油またはダイズ油を、油性液体として用いることができ、可溶化剤として安息香酸ベンジルまたはベンジルアルコールを含んでもよい。緩衝液(リン酸緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など)、鎮痛薬(塩酸プロカインなど)、安定剤(ベンジルアルコール、フェノールなど)、および抗酸化剤を製剤に含むことができる。調製した注射液は、適切なアンプルに充填することができる。
【０１５４】
本発明において、抗REG4抗体および非抗体結合タンパク質は、患者に、例えば動脈内、静脈内、経皮内、鼻腔内、経気管支、局所、もしくは筋肉内に投与することができる。点滴または注射による血管内(静脈)投与は、膵癌患者に抗体を全身投与する一般的な方法の例である。さらに、動脈内カテーテルを癌細胞に栄養を供給する動脈付近まで挿入し、抗体薬剤のような抗癌剤を局所注入する方法は、膵癌の原発巣と同様に転移巣の局所制御治療としても有効である。
【０１５５】
用量および投与方法は、患者の体重および年齢ならびに投与方法に応じて変化するが、当業者により慣例的に決定することができる。さらに、抗体をコードするDNAを遺伝子治療用のベクターに挿入し、該ベクターを治療のために投与することができる。用量および投与方法は、患者の体重、年齢、および状態に応じて変化するが、当業者であればこれらを適切に選択することができる。通常、有効な効果が望ましくない副作用なしで成し遂げられるまで、低用量が最初に投与され、逐次増大される。
【０１５６】
抗REG4抗体および非抗体結合タンパク質は、REG4に対する中和機能が確認できる量で生体に投与することができる。例えば、症状によってある程度の差があるものの、抗REG4抗体の典型的な用量は、1日当たり、0.1mg〜250mg/kgの範囲である。通常、成人(体重60kg)1人当たりの投与量は、5 mg〜17.5 g/日、好ましくは5 mg〜10 g/日、およびより好ましくは100 mg〜3 g/日である。投与スケジュールは、2日〜10日間隔で1〜10回であり、例えば3〜6回の投与後、経過が観察される。
【０１５７】
あるいは、抗体、非抗体結合タンパク質をコードする配列を含む核酸配列またはその機能的誘導体を、REG4発現細胞と関連のある疾患、例えばPDACを含む膵癌を遺伝子治療によって治療または予防するために投与される。遺伝子治療とは、発現されたまたは発現可能な核酸を対象に投与することによって行われる治療法を指す。本発明のこの態様において、核酸は、それがコードする抗体または抗体断片を産生し、それらは予防的または治療的な効果を媒介する。
【０１５８】
当技術分野で利用可能な遺伝子治療の方法の任意のものを、本発明に従って用いることができる。例示的な方法を以下に記載する。
【０１５９】
遺伝子治療の方法の一般的な総説については、Goldspiel et al., (1993) Clin. Pharm.;12:488-505; Wu and Wu, (1991) Biotherapy.;3:87-95; Tolstoshev, (1993) Ann Rev Pharmacol Toxicol.;32:573-96; Mulligan, (1993) Science.;260:926-32; Morgan and Anderson, (1993) Ann Rev Biochem.;62:191-217; Clare Robinson Trends Biotechnol.;11(5):155-215を参照されたい。組換えDNA技術の分野で広く知られた利用可能な方法は、Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)に記載されている。
【０１６０】
好ましい局面において、本発明の組成物は、抗体または非抗体結合タンパク質をコードする核酸を含み、該核酸は、好適な宿主において抗体またはその断片もしくはキメラタンパク質もしくは重鎖もしくは軽鎖を発現する発現ベクターの一部である。特に、このような核酸は、抗体コード領域と機能的に連結されたプロモーター、好ましくは異種プロモーターを有し、該プロモーターは誘導性または恒常的であり、かつ任意で組織特異的である。他の特定の態様においては、抗体をコードする配列および任意の他の所望の配列が、ゲノム中の所望の部位で相同組換えを促す領域に隣接しており、それにより抗体をコードする核酸の染色体内発現をもたらす核酸分子が用いられる（Koller and Smithies, （1989） Proc Natl Acad Sci USA.;86:8932-5; Zijlstra et al., （1989） Nature.;342:435-8）。特定の態様において、発現される抗体分子は、一本鎖抗体である；あるいは、核酸配列は、抗体の重鎖および軽鎖の両方またはそれらの断片をコードする配列を含む。
【０１６１】
対象への核酸の送達は、対象が核酸もしくは核酸を有するベクターに直接曝露されるというように直接的でもよく、または細胞をインビトロでまず核酸によって形質転換し、続いて対象に移植するというように間接的でもよい。これらの2つのアプローチは、それぞれインビボまたはエクスビボの遺伝子治療として公知である。
【０１６２】
特定の態様において、核酸配列をインビボで直接投与することができ、ここで、該核酸配列は、コードする産物を産生するために発現される。これは、当技術分野で公知のさまざまな方法のうちの任意のものによって達成することができる：例えば、核酸配列を適切な核酸発現ベクターの一部として構築し、それらが細胞内にくるようにそれらを投与することによる；例えば、欠損もしくは弱毒化レトロウイルスベクターまたは他のウイルスベクターを用いた感染による（米国特許第4,980,286号を参照）；または裸のDNAの直接注射による；または微粒子照射（例えば、遺伝子銃；Biolistic, Dupont）の使用による；または脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクト剤によるコーティングによる；リポソーム、微粒子、もしくはマイクロカプセル中への封入による；または核に入ることが公知であるペプチドに連結して該核酸配列を投与することによる；受容体を介したエンドサイトーシス（例えば、Wu and Wu, (1987) J Biol Chem.;262:442932を参照）を受けるリガンドに連結して該核酸配列を投与する（これは該受容体を特異的に発現する細胞種の標的化のために用いることができる）などによって、達成することができる。
【０１６３】
他の態様においては、リガンドがエンドソームを破壊する膜融合性ウイルスペプチドを含み、核酸がリソソーム分解を回避することを可能にする、核酸-リガンド複合体を形成させることができる。さらに他の態様においては、特定のレセプターを標的とすることにより、細胞特異的な取り込みおよび発現のために核酸をインビボで標的にすることができる（例えば、PCT公報WO 92/06180、WO 92/22635、WO 92/20316、WO 93/14188、またはWO 93/20221を参照）。あるいは、核酸を細胞内に導入して、相同組換えによって発現用宿主細胞DNA内に取り込ませることもできる（Koller and Smithies, (1989) Proc Natl Acad Sci USA.;86:8932-5; Zijlstra et al., (1989) Nature.;342:435-8）。
【０１６４】
特定の態様において、本発明の抗体またはそれらの断片をコードする核酸配列を含有するウイルスベクターが用いられる。例えば、レトロウイルスベクターを用いることができる（Miller et al., (1993) Methods Enzymol.;217:581-99を参照）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムの正しいパッケージングおよび宿主細胞DNA内への組み込みのために必要な構成要素を含有する。遺伝子治療に用いようとする抗体または非抗体結合タンパク質をコードする核酸配列を、対象への遺伝子の送達を容易にする1つまたは複数のベクターにクローニングする。レトロウイルスベクターに関するさらなる詳細は、幹細胞の化学療法に対する耐性を高めるために、mdr 1遺伝子を造血幹細胞に送達するためのレトロウイルスベクターの使用を記載しているBoesen et al.,(1994)Biotherapy.;6:291-302に見出すことができる。遺伝子治療におけるレトロウイルスベクターの使用を例証している他の参考文献には以下のものがある：Clowes et al., (1994) J Clin Invest.;93:644-51; Kiem et al., (1994) Blood.;83:1467-73; Salmons and Gunzberg, (1993) Hum Gene Ther.;4:129-41; Grossman and Wilson, (1993) Curr Opin Genet Dev.;3:110-4。
【０１６５】
遺伝子治療に用いうるもう1つのウイルスベクターは、アデノウイルスである。アデノウイルスは、遺伝子を気道上皮に送達するために特に魅力的な媒体である。アデノウイルスはもともと気道上皮に感染し、そこで軽症疾患を引き起こす。アデノウイルスに基づく送達システムの他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞、および筋肉である。アデノウイルスには、非分裂性の細胞を感染させることができるという利点がある。Kozarsky and Wilson, (1993) Curr Opin Genet Dev.;3:499-503は、アデノウイルスに基づく遺伝子治療の総説を提示している。Bout et al., (1994) Hum Gene Ther.;5:3-10は、アカゲザルの気道上皮に遺伝子を移入するためのアデノウイルスベクターの使用を実証している。遺伝子治療におけるアデノウイルスの使用の他の例は、Rosenfeld et al., (1991) Science.;252:431-4; Rosenfeld et al., (1992) Cell.;68:143-55; Mastrangeli et al., (1993) J Clin Invest.;91:225-34; PCT公報WO 94/12649; Wang et al., (1995) Gene Ther.;2:775-83に見出すことができる。好ましい態様において、アデノウイルスベクターが用いられる。
【０１６６】
アデノ随伴ウイルス（AAV）も、遺伝子治療における使用が提案されている（Walsh et al., (1993) Proc Soc Exp Biol Med.;204:289-300; 米国特許第5,436,146号）。
【０１６７】
遺伝子治療のためのもう1つのアプロ-チは、電気穿孔、リポフェクション、リン酸カルシウムを介したトランスフェクション、またはウイルス感染などの方法によって、遺伝子を組織培養中の細胞に移入することを伴う。通常、移入の方法は、細胞への選択マーカーの移入を含む。続いて、移入遺伝子を取り込んで発現している細胞を単離するために、細胞を選択に供する。続いて、対象にそのような細胞を送達しうる。
【０１６８】
この態様において、核酸は、結果的に得られる組換え細胞のインビボ投与の前に細胞に導入される。このような導入は、トランスフェクション、電気穿孔、マイクロインジェクション、前記核酸配列を含有するウイルスベクターもしくはバクテリオファ-ジベクターによる感染、細胞融合、染色体を介した遺伝子移入、微小核体を介した遺伝子移入、スフェロプラスト融合などを含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知の任意の方法によって行うことができる。細胞への外来遺伝子の導入のための手法は当技術分野で数多く知られており（例えば、Loeffler and Behr, (1993) Methods Enzymol.;217:599-618; Cotton et al., 1993, Methods Enzymol.;217:618-44; Cline MJ. Pharmacol Ther. 1985;29(1):69-92を参照）、レシピエント細胞の必要な発達および生理的な機能が破壊されない限り、本発明に従って用いることができる。核酸が細胞によって発現され、好ましくはその細胞子孫に遺伝され発現されることが可能なように、手法には、細胞への核酸の安定的な移入が含まれるべきである。
【０１６９】
結果的に得られた組換え細胞は、当技術分野で公知のさまざまな方法によって対象に送達することができる。組換え血液細胞（例えば、造血幹細胞または前駆細胞）は、静脈内に投与されることが好ましい。使用が想定される細胞の量は、所望の効果、患者の状態などに依存し、当業者によって決定可能である。
【０１７０】
遺伝子治療を目的として核酸を導入することのできる細胞には、入手可能な任意の所望の細胞種が含まれ、これには上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋細胞、肝細胞；血液細胞、例えばTリンパ球、Bリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球など；さまざまな幹細胞または前駆細胞、特に造血幹細胞または前駆細胞、例えば、骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝臓などから得られるものが含まれるがこれらに限定されない。好ましい態様において、遺伝子治療のために用いられる細胞は対象にとって自家である。
【０１７１】
組換え細胞が遺伝子治療に用いられる態様において、抗体またはその断片をコードする核酸配列を、それらがその細胞またはその子孫によって発現されうるように細胞に導入することができ、続いて組換え細胞を治療効果のためにインビボで投与する。特定の態様において、幹細胞または前駆細胞が用いられる。インビトロで単離し維持することのできる任意の幹細胞および/または前駆細胞は、本発明のこの態様に従って用いることができる可能性がある（例えば、PCT公報WO 94/08598；Stemple and Anderson, (1992) Cell.;71:973-85; Rheinwald, (1980) Methods Cell Biol.;21A:229-54; Pittelkow and Scott, (1986) Mayo Clin Proc.;61:771-7を参照）。
【０１７２】
特定の態様において、遺伝子治療を目的として導入される核酸には、適切な転写誘導因子の有無を制御することによって核酸の発現を制御できるように、コード領域と機能的に連結された誘導性プロモーターが含まれる。
【０１７３】
さらに、本発明は、REG4もしくは免疫学的活性REG4断片、またはそれらを発現することができるDNAもしくは細胞を活性成分として含有する、REG4に対する中和機能を有する抗体を誘導するための免疫原性組成物を提供する。あるいは、本発明は、REG4に対する中和機能を有する抗体を誘導するための、REG4もしくは免疫学的活性REG4断片、またはそれらを発現することができるDNAもしくは細胞の、免疫原性組成物の生産における使用に関する。
【０１７４】
本発明において、オートクリン/パラクリン様式において、細胞増殖を促進するためにREG4の活性を中和することは、抗REG4抗体の投与によって、成し遂げられる。したがって、REG4抗体を、インビボで誘導することができれば、抗体の投与と同等の治療効果を達成することができる。抗原を含む免疫原性組成物を投与する場合、インビボで標的抗体を誘導することができる。したがって、本発明の免疫原性組成物は、REG4発現細胞に対するワクチン療法において特に有用である。したがって、本発明の免疫原性組成物は、例えば、膵癌治療のためのワクチン組成物として有用である。
【０１７５】
本発明の免疫原性組成物は、REG4または免疫学的活性REG4断片を活性成分として含み得る。免疫学的活性REG4断片は、REG4を認識する抗REG4抗体を誘導し得る断片を意味し、中和機能を含む。以下、REG4および免疫学的活性REG4断片を、免疫原性タンパク質として記載する。所与の断片が、標的抗体を誘導するかどうかは、実際に動物に免疫し、誘導される抗体の活性を確認することによって判定することができる。抗体の誘導およびその活性の確認は、例えば実施例に記載する方法を用いて実施することができる。
【０１７６】
本発明の免疫原性組成物は、有効成分である免疫原性タンパク質と同様に、薬学的に許容される担体を含有してもよい。必要に応じて、該組成物はまた、アジュバントと組み合わせることができる。アジュバントとして、結核死菌、ジフテリアトキソイド、サポニンなどを利用することができる。
【０１７７】
あるいは、免疫原性タンパク質をコードするDNA、またはそれらのDNAを発現可能な状態で保持している細胞を、免疫原性組成物として利用することもできる。標的抗原を発現するDNAを免疫原として用いる方法、いわゆるDNAワクチンは周知である。DNAワクチンは、REG4またはその断片をコードするDNAを適切な発現ベクターに挿入することにより、得ることができる。
【０１７８】
レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどは、適切なベクターの例である。さらに、免疫原性タンパク質をコードするDNAをプロモーターの下流に機能的に連結したDNAを裸のDNAとして直接細胞に導入し、発現させることも可能である。裸のDNAは、リポソームまたはウイルスエンベロープベクターに封入して細胞に導入することができる。
【０１７９】
上記のように、本発明は、REG4、免疫学的活性REG4断片、またはそれらを発現することができるDNAもしくは細胞を投与する段階を含む、REG4に対する中和機能を持つ抗体を誘導するための方法を提供する。本発明の方法によって、膵癌などのREG4発現細胞の増殖を抑制する中和機能を有する抗体が誘導される。その結果、膵癌などに対する治療効果を得ることができる。
【０１８０】
KIAA0101を阻害するドミナントネガティブタンパク質：
本発明は、QKGIGEFFを含む阻害性ポリペプチドに関する。いくつかの好ましい態様において、阻害性ポリペプチドには、QKGIGEFF（配列番号：46）；そのポリペプチドと機能的に同等なポリペプチド；またはそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが含まれ、ここで該ポリペプチドは、配列番号：40からなるペプチドの生物機能を欠損させる。配列番号：40に示されたアミノ酸配列は、ＷＯ2004/31412号に開示されている。癌細胞の増殖は、そのアミノ酸配列の発現を阻害することによって制御できることが知られている。しかし、上記のアミノ酸配列中に特定の変異を有する配列を含む断片が癌細胞の増殖を阻害することは、本発明者らによって証明された新規な知見である。
【０１８１】
本発明の選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドは、そのポリペプチドが癌細胞の増殖を阻害する限り任意の長さであってよい。具体的には、アミノ酸配列の長さは、8〜70残基、例えば、8〜50残基、好ましくは8〜30残基、より具体的には8〜20残基、さらにより具体的には8〜16残基の範囲であってよい。例えば、アミノ酸配列VRPTPKWQKGIGEFFRLSPK/配列番号：44は、上記の選択されたアミノ酸配列として好ましい。従って、アミノ酸配列TPKWQKGIGEFFRLSP/配列番号：45を含む、またはそれからなるポリペプチドは、本発明において、ポリペプチドの好ましい例である。アミノ酸配列QKGIGEFF/配列番号：46を含むことによって特徴づけられる本発明のポリペプチドはまた、「PIP結合モチーフ（PIPボックス）」として、意味されてもよい。
【０１８２】
本発明のポリペプチドは、2つまたはそれ以上の「選択されたアミノ酸配列」を含み得る。2つまたはそれ以上の「選択されたアミノ酸配列」は、同じアミノ酸配列でも異なるアミノ酸配列でもよい。さらに、「選択されたアミノ酸配列」は、直接連結することができる。または、それらの間に何らかの介在配列が配置されていてもよい。
【０１８３】
さらに、本発明は、QKGIGEFF/配列番号：46ポリペプチドに対して相同な（すなわち、配列同一性を有する）ポリペプチドに関する。本発明において、QKGIGEFF/配列番号：46ポリペプチドに対して相同なポリペプチドとは、1つまたは複数のアミノ酸残基の付加、欠失、置換、および挿入から選択される任意の変異を含み、QKGIGEFF/配列番号：46ポリペプチドと機能的に同等なもののことである。「QKGIGEFF/配列番号：46ポリペプチドと機能的に同等な」という語句は、KIAA0101のPCNAに対する結合を阻害する機能を有することを意味する。QKGIGEFF/配列番号：46配列は、好ましくは、QKGIGEFF/配列番号：46ポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを構成するアミノ酸配列が維持されている。そのため、本発明におけるQKGIGEFF/配列番号：46ペプチドと機能的に同等なポリペプチドは、QKGIGEFF/配列番号：46配列以外の部位にアミノ酸変異を有することが好ましい。本発明におけるQKGIGEFF/配列番号：46ペプチドと機能的に同等なポリペプチドのアミノ酸配列は、QKGIGEFF/配列番号：46配列を保存しており、「選択されたアミノ酸配列」に対して60％もしくはそれ以上、通常は70％もしくはそれ以上、好ましくは80％もしくはそれ以上、より好ましくは90％もしくはそれ以上、または95％もしくはそれ以上、およびさらにより好ましくは98％もしくはそれ以上の相同性を有する。アミノ酸配列の相同性は、当技術分野で周知のアルゴリズム、例えば、初期設定で設定されたBLASTまたはALIGNを用いて決定することができる。
【０１８４】
または、変異を受け得るアミノ酸の数は、QKGIGEFF/配列番号：46ペプチドの活性が維持される限り、特に限定されない。一般に、最大で約50アミノ酸、さらにより好ましくは最大で約30アミノ酸、さらに好ましくは最大で約10アミノ酸、よりさらに好ましくは最大で約3アミノ酸である。同様に、変異の部位も、変異がQKGIGEFF/配列番号：46ペプチドの活性の損失をもたらさない限り、特に限定されない。
【０１８５】
1つの好ましい態様において、QKGIGEFF/配列番号：46ペプチドの活性には、KIAA0101を発現する細胞、すなわち膵癌細胞、前立腺癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞、および膀胱癌細胞におけるアポトーシス誘導効果が含まれる。アポトーシスとは細胞それ自体によって引き起こされる細胞死を意味し、これは時にはプログラム細胞死と呼ばれる。アポトーシスを来している細胞では、核染色体の凝集、核の断片化、または細胞質の凝縮が観察される。アポトーシスを検出するための方法は周知である。例えば、TUNEL染色（末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼビオチン-dUTPニック末端標識；Gavrieli et al., (1992) J. Cell Biol. 119: 493-501, Mori et al., (1994) Anat. & Embryol. 190: 21-28）によって、アポトーシスを確かめてもよい。または、DNAラダーアッセイ、アネキシンV染色、カスパーゼアッセイ、電子顕微鏡検査、または核もしくは細胞膜上でのコンホメーション変化の観察を、アポトーシスの検出のために用いてもよい。アポトーシスによって誘導される細胞におけるこれらの挙動を検出するために任意の市販のキットを用いてもよい。例えば、そのようなアポトーシス検出キットは、以下の供給元から市販されている：
LabChem Inc.、
Promega、
BD Biosciences Pharmingen、
Calbiochem、
Takara Bio Company（CLONTECH Inc.）、
CHEMICON InteRNAtional, Inc、
Medical & Biological Laboratories Co., Ltd.、など。
【０１８６】
本発明のポリペプチドは、選択されたアミノ酸配列に基づいて任意の位置から化学合成することができる。通常のペプチド化学に用いられる方法を、ポリペプチドを合成する方法のために用いることができる。具体的には、これらの方法には、以下の文書および日本特許公報に記載されているものが含まれる：
Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966；The Proteins, Vol. 2, Academic Press Inc., New York, 1976；
Peputido gousei（Peptide Synthesis）, Maruzen（Inc.）, 1975；
Peputido gousei no kiso to jikken（Fundamental and Experimental Peptide Synthesis）, Maruzen（Inc.）, 1985；
Iyakuhin no kaihatsu（Development of Pharmaceuticals）, Sequel, Vol. 14: Peputido gousei（Peptide Synthesis）, Hirokawa Shoten, 1991；
国際特許公開第WO99/67288号。
【０１８７】
また、本発明のポリペプチドを、公知の遺伝子工学の手法によって合成することもできる。遺伝子工学の手法の一例は以下の通りである。具体的には、所望のペプチドをコードするDNAを適切な宿主細胞に導入して形質転換細胞を調製する。本発明のポリペプチドは、この形質転換細胞によって産生されたポリペプチドを回収することによって得ることができる。あるいは、所望のポリペプチドを、タンパク質合成のために必要な要素がインビトロで再構成されたインビトロ翻訳系で合成することもできる。
【０１８８】
遺伝子工学の手法を用いる場合には、本発明のポリペプチドを、異なるアミノ酸配列を有するペプチドとの融合タンパク質として発現させることができる。所望の融合タンパク質を発現するベクターは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、異なるペプチドをコードするポリヌクレオチドと、それらが同じリーディングフレーム中にあるように連結させて、続いて、結果として生じたヌクレオチドを発現ベクター中に導入することによって得ることができる。融合タンパク質は、結果として生じたベクターによって適切な宿主を形質転換することによって発現される。融合タンパク質の形成に用いられる異なるペプチドには、以下のペプチドが含まれる：
FLAG（Hopp et al., (1988) BioTechnology 6, 1204-10）、
6つのHis（ヒスチジン）残基からなる6xHis、10xHis、
インフルエンザ血球凝集素（HA）、
ヒトc-myc断片、
VSV-GP断片、
p18 HIV断片、
T7‐タグ、
HSV‐タグ、
E‐タグ、
SV40T抗原断片、
Lck‐タグ、
α-チュ-ブリン断片、
B-タグ、
プロテインC断片、
GST（グルタチオン-S-トランスフェラーゼ）、
HA（インフルエンザ血球凝集素）、
免疫グロブリン定常領域、
β-ガラクトシダ-ゼ、および
MBP（マルト-ス-結合タンパク質）。
【０１８９】
本発明のポリペプチドは、そのようにして産生された融合タンパク質を適切なプロテアーゼで処理し、続いて所望のポリペプチドを回収することによって得ることができる。ポリペプチドを精製するためには、融合タンパク質を、融合タンパク質と結合するアフィニティークロマトグラフィーによって前もって捕捉し、続いて捕捉された融合タンパク質をプロテアーゼで処理することができる。プロテアーゼ処理により、所望のポリペプチドがアフィニティークロマトグラフィーから分離され、高純度の所望のポリペプチドが回収される。
【０１９０】
本発明のポリペプチドには修飾ポリペプチドが含まれる。本発明において、「修飾された」という用語は、例えば、他の物質との結合のことを指す。したがって、本発明において、本発明のポリペプチドは、細胞膜透過性物質などの他の物質をさらに含み得る。他の物質には、ペプチド、脂質、糖類、および様々な天然性または合成性のポリマーなどの有機化合物が含まれる。本発明のポリペプチドは、KIAA0101のPCNAに対する結合を阻害する所望の活性を保っている限り、任意の修飾を有し得る。ある態様において、阻害性ポリペプチドは、KIAA0101のPCNAへの結合に対して直接競合することができる。また、修飾が本発明のポリペプチドに対して追加的な機能を付与することもできる。追加的な機能の例には、標的指向能力（targetability）、到達能力、および安定化が含まれる。
【０１９１】
本発明における修飾の好ましい例には、例えば、細胞膜透過性物質の導入が含まれる。通常、細胞内構造は細胞膜によって外界と遮断されている。このため、細胞外物質を細胞内に効率的に導入することは困難である。ポリペプチドを細胞膜透過性物質で修飾することにより、本発明のポリペプチドに細胞膜透過性を付与することができる。その結果として、本発明のポリペプチドを細胞と接触させることにより、このポリペプチドを細胞内に送達してそこで作用させることができる。
【０１９２】
「細胞膜透過性物質」とは、哺乳動物の細胞膜を透過して細胞質に入ることのできる物質のことを意味する。例えば、ある種のリポソームは細胞膜と融合して、その内容物を細胞内に放出する。その一方で、ある種のポリペプチドは、哺乳動物細胞の細胞質膜を透過して細胞の内側に入る。そのような細胞侵入活性を有するポリペプチドとして、本発明においては細胞質膜などが物質として好ましい。具体的には、本発明は、以下の一般式
[R]-[D]
を有するポリペプチドを含み、式中、[R]は細胞膜透過性物質を表し、[D]はQKGIGEFF/配列番号：46を含む断片配列を表す。上記の一般式において、[R]および[D]は直接的にも、またはリンカーを介して間接的にも連結させることができる。ペプチド、複数の機能的集団を有する化合物などをリンカーとして用いることができる。具体的には、-GGG-を含むアミノ酸配列をリンカーとして用いることができる。あるいは、細胞膜透過性物質と、選択された配列を含むポリペプチドとを、微小粒子の表面に結合させることもできる。[R]は、[D]の任意の位置に連結させることができる。具体的には、[R]を[D]のN末端もしくはC末端に、または[D]を構成するアミノ酸の側鎖に連結させることができる。さらに、複数の[R]分子を1つの[D]分子に連結させることもできる。[R]分子は、[D]分子の複数の異なる位置に導入することができる。あるいは、[D]を互いに連結した複数の[R]で修飾することもできる。
【０１９３】
例えば、細胞膜透過性を有する、様々な天然のまたは人工的に合成されたポリペプチドが報告されている（Joliot A. & Prochiantz A., Nat Cell Biol. 2004; 6: 189-96）。これらの公知の細胞膜透過性物質のすべてを、本発明においてポリペプチドを修飾するために用いることができる。本発明においては、例えば、以下の群から選択される任意の物質を上記の細胞透過性物質として用いることができる。
ポリ-アルギニン; Matsushita et al., (2003) J. Neurosci.; 21, 6000-7.
[Tat / RKKRRQRRR] (配列番号：47) Frankel et al., (1988) Cell 55,1189-93.
Green & Loewenstein (1988) Cell 55, 1179-88.
[ペネトラチン（Penetratin） / RQIKIWFQNRRMKWKK] (配列番号：48)
Derossi et al., (1994) J. Biol. Chem. 269, 10444-50.
[ブフォリンII（Buforin II） / TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK] (配列番号：49)
Park et al., (2000) Proc. Natl Acad. Sci. USA 97, 8245-50.
[トランスポータン（Transportan） / GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL] (配列番号：50)
Pooga et al., (1998) FASEB J. 12, 67-77.
[MAP (model amphipathic peptide) / KLALKLALKALKAALKLA] (配列番号：51)
Oehlke et al., (1998) Biochim. Biophys. Acta. 1414, 127-39.
[K-FGF / AAVALLPAVLLALLAP] (配列番号：52)
Lin et al., (1995) J. Biol. Chem. 270, 14255-8.
[Ku70 / VPMLK] (配列番号：53)
Sawada et al., (2003) Nature Cell Biol. 5, 352-7.
[Ku70 / PMLKE] (配列番号：61)
Sawada et al., (2003) Nature Cell Biol. 5, 352-7.
[Prion / MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP] (配列番号：54)
Lundberg et al., (2002) Biochem. Biophys. Res. Commun. 299, 85-90. 
[pVEC / LLIILRRRIRKQAHAHSK] (配列番号：55)
Elmquist et al., (2001) Exp. Cell Res. 269, 237-44.
[Pep-1 / KETWWETWWTEWSQPKKKRKV] (配列番号：56)
Morris et al., (2001) Nature Biotechnol. 19, 1173-6.
[SynB1 / RGGRLSYSRRRFSTSTGR] (配列番号：57)
Rousselle et al., (2000) Mol. Pharmacol. 57, 679-86.
[Pep-7 / SDLWEMMMVSLACQY] (配列番号：58)
Gao et al., (2002) Bioorg. Med. Chem. 10, 4057-65.
[HN-1 / TSPLNIHNGQKL] (配列番号：59)
Hong & Clayman (2000) Cancer Res. 60, 6551-6
【０１９４】
本発明において、細胞膜透過性物質の一例として上記に挙げたポリ-アルギニンは、任意の数のアルギニン残基によって構成される。具体的には、例えば、それは連続した5〜20個のアルギニン残基によって構成される。アルギニン残基の好ましい数は11である（配列番号：60）。
【０１９５】
QKGIGEFF/配列番号：46を含む薬学的組成物
本発明のポリペプチドは癌細胞の増殖を阻害する。このため、本発明は、活性成分として、QKGIGEFF/配列番号：46を含むポリペプチド、またはそれをコードするポリヌクレオチドを含む、癌を治療および/または予防するための薬剤を提供する。あるいは、本発明は、本発明のポリペプチドを投与する段階を含む、癌を治療および/または予防するための方法に関する。さらに、本発明は、癌を治療および/または予防するための薬学的組成物の製造における本発明のポリペプチドの使用に関する。本発明によって治療または予防され得る癌は、KIAA0101の発現が癌細胞において上方制御される限りにおいて限定されない。例えば、本発明のポリペプチドは、膵癌、肺癌、前立腺癌、乳癌、膀胱癌、腎臓癌または精巣腫瘍を治療することに有用である。それらの中で、膵癌は、本発明において、特に治療または予防のための標的として好ましい。
【０１９６】
あるいは、本発明の阻害性ポリペプチドを、癌細胞のアポトーシスを誘導するために用いることもできる。このため、本発明は、活性成分として、QKGIGEFF/配列番号：46を含むポリペプチド、またはそれをコードするポリヌクレオチドを含む、細胞に対するアポトーシスを誘導する薬剤を提供する。本発明のアポトーシスを誘導する薬剤は、癌などの細胞増殖性疾患を治療するために用いてもよい。本発明によって治療または予防され得る癌は、KIAA0101の発現が癌細胞において上方制御される限り限定されない。例えば、本発明のポリペプチドは、膵癌、前立腺癌、乳癌、膀胱癌、肺癌、腎臓癌または精巣腫瘍を治療するために有用である。それらの中で、膵癌は、本発明において、特に治療または予防のための標的として好ましい。あるいは、本発明は、本発明のポリペプチドを投与する段階を含む、細胞のアポトーシスを誘導するための方法に関する。さらに、本発明は、細胞におけるアポトーシスを誘導するための薬学的組成物の製造における本発明のポリペプチドの使用に関する。
【０１９７】
本発明の阻害性ポリペプチドは、膵癌のようなKIAA0101発現細胞におけるアポトーシスを誘導する。その間、KIAA0101の発現は、ほとんどの正常組織で観察されない。ある正常組織において、KIAA0101の発現レベルは、癌組織と比較して相対的に低い。従って、本発明のポリペプチドは、癌細胞において特異的にアポトーシスを誘導し得る。
【０１９８】
本発明のポリペプチドを、癌を治療、または細胞におけるアポトーシスを誘導するために、ヒトおよび他の哺乳動物、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サル、ヒヒ、およびチンパンジーに対して調製された医用薬剤として投与する場合には、単離された化合物を直接投与することができ、または公知の医用薬剤調製法を用いて適切な剤形として製剤化することもできる。例えば、必要に応じて、医用薬剤を、糖衣錠、カプセル剤、エリキシル剤、およびマイクロカプセルとして経口投与することもでき、あるいは水もしくは他の任意の薬学的に許容される液体を用いた滅菌溶液もしくは懸濁液である注射用剤形で非経口的に投与することもできる。例えば、一般に許容される医用薬剤を製造するために必要な単位用量剤形中で、化合物を、薬理学的に許容される担体または溶媒、具体的には滅菌水、生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、溶媒剤、防腐剤、および結合剤と混合することができる。これらの製剤における有効成分の量に応じて、指定された範囲内にある適切な用量を決定することができる。
【０１９９】
錠剤およびカプセル剤中に混合してもよい添加剤の例には、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、およびアラビアゴムなどの結合剤；結晶性セルロ-スなどの媒体；コーンスターチ、ゼラチン、およびアルギン酸などの膨張剤；ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；ショ糖、乳糖、またはサッカリンなどの甘味剤；ならびに、ペパ-ミント、冬緑油、またはチェリーなどの香味剤がある。単位用量剤形がカプセルである場合には、上記の成分に油などの液体担体をさらに含めることができる。注射用の滅菌混合物は、通常の医用薬剤の実施に即して、注射用蒸留水などの媒体を用いて製剤化することができる。
【０２００】
注射用の水溶液としては、生理食塩水、グルコ-ス溶液、および、D-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、および塩化ナトリウムなどのアジュバントを含む他の等張液を用いることができる。それらは、適切な可溶化剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ならびにポリアルコール、例えばプロピレングリコールおよびポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート80（商標）およびHCO-50等と組み合わせて用いることができる。
【０２０１】
油性液としてはゴマ油または大豆油を用いることができ、可溶化剤としての安息香酸ベンジルまたはベンジルアルコールと組み合わせて用いることもできる。さらに、それらを、リン酸緩衝液および酢酸ナトリウム緩衝液などの緩衝剤；塩酸プロカインなどの鎮痛剤；ベンジルアルコールおよびフェノ-ルなどの安定化剤；ならびに酸化防止剤とともに製剤化することもできる。そのようにして調製された注射液は適切なアンプル中に充填する。
【０２０２】
本発明の薬学的化合物を患者に投与するためには、例えば、動脈内、静脈内、または皮下への注射による、さらには同様に鼻腔内投与、経気管支投与、筋肉内投与、または経口投与による、当業者に周知の方法を用いることができる。用量および投与方法は、患者の体重および年齢、ならびに投与方法によって様々である。しかしながら、当業者はそれらを慣習的に選択することができる。本発明のポリペプチドをコードするDNAは、遺伝子治療用のベクター中に挿入することができ、そのベクターを治療のために投与することができる。用量および投与方法は、患者の体重、年齢、および症状などによって様々であるが、当業者はそれらを適切に選択することができる。例えば、本発明のポリペプチドと結合して、その活性を調節する化合物の用量は、健常成人（体重60kg）に対して経口投与される場合には、症状によって幾分変わってくるものの、約0.1mg〜約100mg/日、好ましくは約1.0mg〜約50mg/日、より好ましくは約1.0mg〜約20mg/日である。
【０２０３】
化合物が健常成人（体重60kg）に対して注射剤形で非経口的に投与される場合には、患者、標的臓器、症状、および投与方法によって幾分変わってくるものの、約0.01mg〜約30mg/日、好ましくは約0.1mg〜約20mg/日、より好ましくは約0.1mg〜約10mg/日の用量を静脈内注射することが好都合である。同様に、化合物を、他の動物に対して、体重60kgでの用量から換算された量で投与することもできる。
【０２０４】
薬学的組成物：
したがって、本発明は、癌の予防および処置の一方もしくは両方に有用な薬剤および方法を含む。これらの薬剤および方法は、REG4またはKIAA0101の発現を阻害するsiRNA、REG4の活性を中和する抗体、QKGIGEFF/配列番号：46を含むポリペプチド、そのポリペプチドと機能的に同等なポリペプチド、またはこれらの本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、疾患細胞増殖の減弱化または停止を達成するのに有効な量で少なくとも1つを含む。より具体的には、本発明の明細書において、治療的に有効な量とは、治療対象の進行を防ぐのに、あるいはその既存の症状を改善するのに、有効な量を意味する。
【０２０５】
本発明の方法で処置される個体としては、例えば、膵癌、前立腺癌、乳癌および膀胱癌を含む癌に罹患した任意の個体が含まれる。このような個体は、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、またはヤギを含む哺乳動物などの脊椎動物、あるいは任意の他の動物、特に商業的に重要な動物または家畜化された動物でありうる。本発明の目的に関し、マーカータンパク質の発現の上昇とは、一方または両方のマーカータンパク質について、マーカータンパク質の正常細胞での平均濃度よりも、少なくとも10%、好ましくは15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、またはそれよりも多い、平均細胞マーカータンパク質濃度を意味する。
【０２０６】
本発明の明細書において、適した薬学的剤型には、口、直腸、鼻腔、局所（口腔および舌下を含む）、膣、または非経口（筋肉中、皮下および静脈中を含む）への投与のため、または吸入または吸引による投与のために適した剤型を含む。好ましくは、投与は静脈内である。剤型は、適宜、容量単位別に封入する。
【０２０７】
経口投与に適した薬学的剤型は、予め決められた量の活性成分を含むカプセル、カシェ剤、または錠剤を含む。適切な剤型はまた、粉末剤、顆粒剤、溶解剤、懸濁剤および乳化剤を含む。活性成分は、ボーラス舐剤またはペーストとして任意に投与される。経口投与のための錠剤およびカプセルは、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖類などの増量剤、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、イネデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および/またはポリビニルピロリドン（PVP）などのセルロース調製物、結合剤、潤滑剤、および/または加湿剤などの従来の賦形剤を含んでもよい。所望であれば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸またはアルギン酸ナトリウムのようなそれらの塩などの崩壊剤を加えてもよい。
【０２０８】
錠剤は、任意で1つもしくは複数の製剤成分を用いて、圧縮または成形により作製することができる。圧縮錠剤は、粉末または顆粒などの流動状の活性成分を、任意で結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、潤滑剤、表面活性剤、または分散剤と混合して適切な装置で圧縮することで調製することができる。成形錠剤は、適切な装置内で、不活性希釈液で湿らせた粉末状化合物の混合物を成形することで作製してもよい。錠剤は、当技術分野で周知の方法にしたがって被覆することができる。経口流体調製物は、例えば、水性もしくは油性懸濁液、溶液、乳濁液、シロップ、またはエリキシルの状態であってよく、または使用前に水もしくは他の適切な溶媒で再構成するための乾燥製品としてもよい。このような液体調製物は、懸濁剤、乳化剤、非水性溶媒（食用油を含む場合がある）、pH調節剤、および/または保存剤などの従来の添加剤を含む場合がある。錠剤は任意選択で、活性成分の緩やかな放出、すなわち徐放性を提供するように製剤化することができる。錠剤の包装は、月に1回服用される1個の錠剤を含む場合がある。
【０２０９】
非経口投与する製剤は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を対象レシピエントの血液と等張にする溶液などを任意で含む水性および非水性の無菌性注射溶液を含む；同様に懸濁剤および/または濃化剤を含みうる水性および非水性の滅菌済み懸濁液も含む。製剤は、単位用量または複数回投与用の容器中、例えば密封されたアンプルおよびバイアル中に入れることが可能であり、また使用直前に滅菌液体担体（例えば生理食塩水や注射用水）を添加するだけの凍結乾燥条件で貯蔵することができる。あるいは製剤を、持続注入用とすることができる。即時調合注射溶液および懸濁液は、既に説明した種類の滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製することができる。
【０２１０】
直腸投与用の製剤には、カカオバタ-やポリエチレーングリコールなどの標準的な担体を含む坐剤などがある。口腔への局所投与、例えば頬側または舌下に投与する製剤には、ショ糖およびアカシアなどの香味基剤またはトラガカントなどに活性成分を含むトローチ剤、ならびにゼラチン、グリセリン、ショ糖、またはアカシアなどの基剤中に活性成分を含む香錠が含まれる。活性成分を鼻内投与する場合、液体スプレー、または分散性粉末、または液滴状態を用いることができる。液滴は、1種類もしくは複数の分散剤、可溶化剤、または懸濁剤も含む、水性もしくは非水性の基剤で製剤化することができる。
【０２１１】
吸入投与では、組成物は、インサフレータ-、ネブライザー、加圧容器、または他の便宜なエアロゾルスプレー送達手段から適宜投与される。加圧容器は、適切な噴霧剤（ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、炭酸ガス、または他の適切なガス）を含む。加圧エアロゾルの場合、投与単位は、一定量を送達するバルブを提供することで決定することができる。
【０２１２】
あるいは、吸入もしくは吸引による投与では、組成物は、乾燥粉末組成物、例えば活性成分と、乳糖やデンプンなどの適切な粉末基剤からなる粉末混合体の形状をとる場合がある。粉末組成物は、吸入器または吸引器を利用して粉末を投与可能な、例えばカプセル、カートリッジ、ゼラチン、またはブリスター包装中の単位投与剤形とすることができる。
【０２１３】
他の製剤には、治療薬を放出する、移植可能な装置および粘着性パッチなどがある。
【０２１４】
所望する場合、活性成分が徐放性となるように適合した上記の製剤を使用することができる。薬学的組成物は、抗菌剤、免疫抑制剤、または保存剤などの他の活性成分を含む場合もある。
【０２１５】
上記で特に言及した成分に加えて、本発明の製剤は、当該製剤の種類に関して当技術分野で周知の他の薬剤を含みうることが理解されるべきである。例えば、経口投与に適した製剤は、香味剤を含み得る。
【０２１６】
例えば、投与経路、投与される試験化合物の濃度、または処置がタンパク質、試験化合物をコードする核酸、もしくは試験化合物を分泌することができる細胞を有効成分として含む薬剤を用いるかどうかによって、特定の添加物がより好ましい場合があることが当業者には明らかであろう。
【０２１７】
本発明の薬学的組成物は、それ自体公知の様式で、例えば、通常の混合、溶解、顆粒化、糖衣錠形成、研和、乳化、カプセル化、封入（entrapping）、または凍結乾燥プロセスによって、製造しうる。適正な製剤は、選択された投与経路に依存する。
【０２１８】
用量および日程
本発明の薬剤のための有効な用量範囲の決定は、特に本明細書に提供される詳述された開示を鑑みれば、十分に当業者の能力の範囲内である。試験化合物の治療に有効な用量は、まず細胞培養アッセイおよび/または動物モデルから推定できる。例えば、細胞培養で決定されるIC50（50%の細胞が所望の効果を示す用量）を含む循環濃度域へ到達するように、動物モデルにおける用量を算出することができる。また、試験化合物の毒性および治療有効性は、例えば、LD50（集団の50%に致死的な用量）およびED50（集団の50%に治療的に有効な用量）を決定するための、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比が、治療指数（すなわちLD50とED50の比）である。高い治療指数を示す化合物が好ましい。これら細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータを、ヒトに用いる用量範囲を定める際に用いうる。このような化合物の用量は、毒性がほとんどないかまたは全くないED50を含む循環濃度の範囲内に収まるであろう。用量は、使用される剤形および利用される投与経路に従い、この範囲内で変わりうる。的確な剤型、投与経路、および用量は、患者の状態を考慮して個別の医師によって選択されうる。例えばFingl et al., 1975, in "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 p1を参照されたい。用量および間隔は、所望の効果を維持するのに十分な活性試験化合物の血漿レベルを提供するように個別に調整しうる。
【０２１９】
特に、上述の各条件で、この組成物（例えばポリペプチドや有機化合物）は、約0.1〜約250 mg/kg/日の用量で経口または注射で投与できる。成人の用量範囲は一般に、約5 mg〜約17.5 g/日であり、好ましくは約5 mg〜約10 g/日であり、最も好ましくは約100 mg〜約3 g/日である。個別の単位で提供される錠剤または他の単位投与剤型は、適宜、同一単位量を複数回投与した量で有効性を示すような単位量、例えば約5 mg〜約500 mg、通常は約100 mg〜約500 mgを含む量を含む。
【０２２０】
使用される用量は、対象の年齢および性別、治療する正確な疾患、およびその重症度を含む、いくつかの因子に依存する。投与経路も、条件および重症度によって変動する場合がある。いずれにしても、上述した要因を考慮に入れて、適当かつ最適な投薬は当業者によって、日常的に算出されることができる。
【０２２１】
通常一つまたは複数のREG4またはKIAA0101阻害剤の有効または効果的な量は、まずREG4および/またはKIAA0101阻害剤の低用量または少量を投与し、次に、異常なREG4および/またはKIAA0101過剰発現または細胞内シグナルが媒介する癌を阻害または予防する所望の効果が、処方対象において、最小もしくは全く毒性のない副作用で観察されるまで、逐次投与された用量または投与量を増大させる、および/または必要に応じて第2のREG4および/またはKIAA0101阻害剤を加えることで決定される。本発明の薬学的組成物を投与するための適切な用量および投与日程を決める適切な方法は、例えば、Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 11th Ed., Brunton, et al., Eds., McGraw-Hill (2006)、およびRemington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., University of the Sciences in Philadelphia (USIP), Lippincott Williams & Wilkins (2005)に記載され、いずれも本願明細書に参照として取り入れられる。
【０２２２】
遺伝子治療
REG4またはKIAA0101の発現を阻害するsiRNA、REG4の活性を中和する抗体、KIAA0101/PCNAの間の相互作用を阻害する細胞透過性ドミナントネガティブペプチドは、癌を罹患した患者に遺伝子治療を用いて治療的に送達し得る。あるいは、中和抗体または本発明のQKGIGEFF/配列番号：46を含むポリペプチドは、REG4またはKIAA0101/PCNA間の活性を直接変化させるペプチドとして用いられる。ある局面において、遺伝子治療の態様は、本発明の同定された適切なペプチドをコードする核酸配列を含む。好ましい態様において、核酸配列は、標的細胞におけるペプチドの発現に必要な調節エレメントを含む。核酸は、標的細胞のゲノムに安定に挿入されるように準備され得る（例えば、、Thomas, K. R. and Capecchi, M. R. (1987) Cell 51:503の相同組換えカセットベクターの記載について参照されたい）。
【０２２３】
患者への核酸の送達は直接的でもよいし（この場合、患者は核酸または核酸を含むベクターに直接さらされる）、間接的でもよい（この場合、細胞が、まずインビトロで核酸によって形質転換されてから患者に移植される）。これら2つのアプローチはそれぞれインビボまたはエクスビボ遺伝子療法として知られている。
【０２２４】
遺伝子療法の方法の一般的概説については、Goldspiel et al., (1993) Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu and Wu, (1991) Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, (1993) Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 33:573-596; Mulligan, (1993) Science 260:926-932; および Morgan and Anderson, (1993) Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; May,(1993) TIBTECH 11(5):155-215を参照されたい。用いうる組換えDNA技術の分野で一般的に知られる方法は、Ausubel et al. (eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; および Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NYに記載されている。
【０２２５】
癌の化学-放射線治療抵抗性の診断
「診断する」という用語は、予測および可能性の解析を含むことを意味する。本方法は、癌の治療的な介入、疾患ステージなどの診断基準、および疾患モニタリングや経過観察を含む治療様式に係る意思決定において、臨床的に用いられることを目的とする。
【０２２６】
癌の化学-放射線治療抵抗性の診断方法
ｓREG4の発現は、外科的サンプルにおいて、化学-放射線治療抵抗性の膵癌患者で特異的に上昇することが認められた。従って、ここで同定されたREG4遺伝子は、その転写および翻訳産物も同様に、癌の化学-放射線治療的抵抗性のためのマーカーとしての診断的有用性を見出され、細胞サンプルにおけるREG4遺伝子の発現を測定することによって、癌の化学-放射線治療的抵抗性を診断することができる。
【０２２７】
具体的には、本発明は、対象におけるREG4の発現レベルを決定することによって、癌の化学-放射線治療的抵抗性を診断する以下の方法を提供する：
[1]  対象由来の生物学的試料におけるREG4遺伝子の発現レベルを測定する段階を含む対象における癌の化学-放射線治療抵抗性を診断する方法であって、該遺伝子の正常対象レベルと比較した発現レベルの増大が、該対象が化学-放射線治療抵抗性リスクもしくは化学-放射線治療抵抗性の癌に罹患していることを示す方法。
[2]  該発現レベルが正常対照レベルより少なくとも10％より大きい、〔1〕の方法。
[3]  該発現レベルは、以下の群から選択される方法で測定される、〔1〕の方法：
(a) 該遺伝子のｍRNAの検出、
(b) 該遺伝子によってコードされるタンパク質を検出、および
(c) 該遺伝子によってコードされるタンパク質の生物学的活性を検出。
[4]  該遺伝子の遺伝子転写物に対するプローブのハイブリダイゼーションを検出することによって測定される、〔3〕の方法。
[5]  ハイブリダイゼーションの段階が、DNAアレイで実施される、〔4〕の方法。
[6]  発現レベルが、遺伝子の発現レベルとしてREG4遺伝子によってコードされるタンパク質に対する抗体の結合を検出することにより測定される、〔3〕の方法。
[7]  生物学的試料が、生検、痰または血液を含む、〔1〕の方法。
[8]  該対象由来の生物学的試料が、上皮細胞を含む、〔1〕の方法。
[9]  該対象由来の生物学的試料が、癌細胞を含む、〔1〕の方法。
[10]  該対象由来の生物学的試料が、癌上皮細胞を含む、〔1〕の方法。
[11]  該癌が、膵癌である、〔1〕の方法。
【０２２８】
本方法により診断される対象は、好ましくは哺乳類である。例示的な哺乳類は、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマおよびウシを含むが、これに限定されるものではない。
【０２２９】
診断を行うために診断される対象から生物学的試料を集めることが、好ましい。いかなる生物学的材料も、目的のREG4の転写または翻訳産物を含む限り判定のために生物学的試料として、利用される。生物学的試料は、体組織、および血液、痰、ならびに尿などの体液が含まれるが、それらに限定されない。好ましくは、生物学的試料は、上皮細胞、より好ましくは癌上皮細胞、または癌であると疑われる組織由来の上皮細胞を含む細胞集団を含む。さらに、必要な場合には、細胞を得られた体組織および体液から精製し、その後生物学的試料として使用してもよい。
【０２３０】
本発明によれば、REG4遺伝子の発現レベルは、対象由来の生物学的試料において決定される。発現レベルは、当技術分野において公知の方法を用いて、転写(核酸)産物レベルで決定することができる。例えば、REG4遺伝子のmRNAは、ハイブリダイゼーション法(例えばノーザンハイブリダイゼーション)により、プローブを用いて定量してもよい。検出は、チップまたはアレイ上で実施してもよい。アレイの使用は、本発明のREG4遺伝子を含む複数の遺伝子(例えば、様々な癌特異的遺伝子)の発現レベルを検出するのに好ましい。当業者は、REG4遺伝子(配列番号：1；Genbankアクセッション番号AY126670)の配列情報を用いてこのようなプローブを調製することができる。例えば、REG4遺伝子のcDNAを、プローブとして使用してもよい。必要な場合には、プローブは、色素および同位元素など適した標識で標識してよく、遺伝子の発現レベルは、ハイブリダイズされた標識の強度として検出することができる。
【０２３１】
さらに、REG4遺伝子の転写産物は、増幅に基づく検出方法(例えばRT-PCR)により、プライマーを用いて定量することができる。このようなプライマーもまた、遺伝子の入手可能な配列情報に基づいて調製することができる。例えば、実施例において使用されるプライマー(配列番号：3および4)は、RT-PCRまたはノーザンブロットによる検出のために使用され得るが、本発明はそれらに限定されない。具体的には、本発明の方法のために使用されるプローブまたはプライマーは、ストリンジェントな条件、中程度にストリンジェントな条件、または低ストリンジェントな条件下で、REG4遺伝子のmRNAにハイブリダイズする。本明細書において使用される場合、「ストリンジェントな(ハイブリダイゼーション)条件」という語句は、「低分子干渉RNA」の項に示す。
【０２３２】
または、翻訳産物が本発明の診断のために検出され得る。例えば、REG4タンパク質の量を決定してもよい。翻訳産物としてのタンパク質の量を決定するための方法には、そのタンパク質を特異的に認識する抗体を使用するイムノアッセイ法が含まれる。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルでよい。さらに、抗体の任意の断片または改変体(例えば、キメラ抗体、scFv、Fab、F(ab')2、Fvなど)も、その断片がREG4タンパク質への結合能力を保持している限り、検出のために使用してもよい。タンパク質検出用のこれらの種類の抗体を調製する方法は、当技術分野において周知であり、かつ任意の方法を本発明において使用して、このような抗体およびそれらの等価物を調製することができる。
【０２３３】
REG4遺伝子の発現レベルをその翻訳産物に基づいて検出するための別の方法として、染色の強度を、REG4タンパク質に対する抗体を用いた免疫組織化学的解析を介して観察してもよい。すなわち、強い染色が観察された場合、タンパク質の存在の増加、および同時にREG4遺伝子の高い発現レベルが示唆される。さらに、翻訳産物は、その生物活性に基づいて検出することもできる。
【０２３４】
生物学的試料中のREG4遺伝子の発現レベルは、REG4遺伝子の対照レベルから、例えば10％、25％、もしくは50％上昇もしくは低下する；または1.1倍超、1.5倍超、2.0倍超、5.0倍超、10.0倍超、もしくはそれ以上まで上昇する場合、上昇しているとみなすことができる。
【０２３５】
対照レベルは、疾患の状態(癌性または非癌性)が判明している対象から予め採取し保存しておいた試料を用いることにより、試験生物学的試料と同時に決定することができる。または、疾患の状態が判明している対象由来の試料中のREG4遺伝子の予め決定された発現レベルを解析することによって得られる結果に基づき、統計学的方法によって、対照レベルを決定してもよい。さらに、対照レベルは、予め試験された細胞由来の発現パターンのデータベースでもよい。さらに、本発明の局面によれば、生物学的試料中のREG4遺伝子の発現レベルは、複数の参照試料から決定された複数の対照レベルと比較してもよい。患者由来の生物学的試料の組織型と同様の組織型由来の参照試料から決定された対照レベルを使用することが好ましい。さらに、疾患の状態が公知である集団におけるREG4遺伝子の発現レベルの標準値を使用することが好ましい。標準値は、当技術分野において公知である任意の方法によって得てもよい。例えば、平均値±2S.D.または平均値±3S.D.の範囲を、標準値として使用してもよい。
【０２３６】
本発明の明細書において、癌性ではないことが判明している生物学的試料から決定された対照レベルは「正常対照レベル」と呼ばれる。他方、対照レベルが化学-放射線治療抵抗性の生物学的試料から決定される場合、これは「化学-放射線治療抵抗性対照レベル」と呼ばれる。
【０２３７】
REG4遺伝子の発現レベルが、正常対照レベルと比較して上昇しているか、または化学-放射線治療抵抗性対照レベルと同様である場合、その対象は化学-放射線治療抵抗性癌に罹患しているか、または化学-放射線治療抵抗性のリスクがあると診断され得る。
【０２３８】
試験生物学的試料の発現レベルと対照レベル間の差異は、細胞の癌性状態または非癌性状態によってその発現レベルが異ならないことが判明している対照核酸、例えばハウスキーピング遺伝子の発現レベルに対して標準化することができる。例示的な対照遺伝子には、β-アクチン、グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ、およびリボソームタンパク質P1が含まれるが、これらに限定されない。
【０２３９】
本発明の局面は、以下の実施例に記載されるが、それは請求項において記載される本発明の範囲を制限することを目的としない。
【０２４０】
別途定義されない限り、本明細書において、使用するすべての技術的および科学的な用語は、本発明が属する当業者によって共通に理解される同じ意味を有する。本明細書において記載されている類似または同等の方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、適切な方法および材料は以下に記載される。
【０２４１】
本発明は、さらに以下の実施例において記載されているが、請求項において、記載される本発明の範囲を制限しない。
【０２４２】
実施例1
1．一般的方法
臨床サンプル
手術前および手術後（治療的切除から3または4週後）の血清試料を、膵管腺癌の治療的切除を受けた7人の患者から、インフォームドコンセントと共に取得した。PDACの通常のパラフィン包埋組織切片はまた、同じセンターで切除された外科検体から得られた。31のPDAC組織および2つの内分泌の腫瘍組織が正副二つスポットされた組織マイクロアレイ試料は、ISU ABXIS（ソウル、韓国）から得られた。
【０２４３】
細胞株
PDAC細胞株、PK45PおよびSUIT-2は、バイオメディカルリサーチ用細胞資源センター、東北大学（仙台、日本）および九州医療センター（福岡、日本）により提供された。MIAPaCa-2は、American Type Culture Collection（ATCC、ロックビル、MD）から購入された。これらの細胞株は、10％のウシ胎児血清（Cansera InteRNAtional、オンタリオ、カナダ）および1％の抗生物質/抗菌溶液（Sigma-Aldrich）を含む、RPMI 1640（Sigma-Aldrich、セントルイス、ＭＯ）（PK45PおよびSUIT-2用）、Dulbecco's Modified Eagle's Medium（Sigma-Aldrich）（MIAPaCa-2用）において、増殖させた。細胞は、5％のCO2、加湿空気下において、37℃に維持された。FreeStyle（商標）293細胞（Invitrogen、カールズバッド、CA）は、FreeStyle（商標）293 Expression Medium（Invitrogen）に懸濁 させ、エルレンマイヤーフラスコ（Corning、NY）を用いて125回転/分で、軌道振盪機上で回転させ、増殖させた。細胞は、8％のCO2、加湿空気下において、37℃に維持された。Dulbecco's Modified Eagle's MediumまたはＲPMI1640（Sigma-Aldrich、セントルイス、MO）で増殖させた膵癌細胞株MIAPaCa-2およびPanc-1、および正常な齧歯動物細胞株NIH3T3はAmerican Type Culture Collection（ATCC、ロックビル、ＭＤ）から購入された。膵癌細胞株PK-59、KLM-1、PK45PおよびPK-1は、バイオメディカルリサーチ用細胞資源センター、東北大学（仙台、日本）より提供され、、ＲPMI1640（Sigma-Aldrich）において保存された。両方の培地は、10％のウシ胎児血清（Cansera InteRNAtional、オンタリオ、カナダ）および1％の抗生物質/抗菌溶液（Sigma-Aldrich）を添加された。細胞は、5％のCO2、加湿空気下において、37℃に維持された。
【０２４４】
2．REG4のための半定量的RT-PCR
PDAC細胞、膵癌細胞および正常膵管上皮細胞の純化は、以前に記載されていた（Nakamura T, et al. Oncogene 2004; 23: 2385-400.)。純化された細胞集団および、正常ヒト心臓、肺、肝臓、腎臓、脳、膵臓（BD Biosciences、パロアルト、CA）および正常膵管細胞からのRNAは、2度のT7-basedインビトロ転写（Epicentre Technologies、マディソン、ＷＩ）による増幅および続く一本鎖cDNAへの合成を行われた。ヒト膵癌細胞株からの全RNAを、製造元の推奨に従ってTrizol試薬（Invitrogen、カールズバッド、CA）を用いて抽出した。抽出されたRNAは、デオキシリボヌクレアーゼＩ（Roche、マンハイム、ドイツ）を用いて処理され、Superscript II逆転写酵素（Invitrogen）とoligo (dT)プライマーを用いて一本鎖のcDNAに逆転写された。本発明者らは、PCR増幅のために、定量対照としてα-tubulin（TUBA）により一本鎖cDNAの適切な希釈を調製した。
【０２４５】
プライマー配列は、
TUBA用として、
5’-AAGGATTATGAGGAGGTTGGTGT-3’（配列番号：9) および、
5’-CTTGGGTCTGTAACAAAGCATTC-3’（配列番号：10)；
REG4用として、
5’-CCAATTGCTATGGTTACTTCAGG-3’（配列番号：3)および、
5’-GAAAAACAAGCAGGAGTTGAGTG-3’（配列番号：4)、
KIAA0101（NM_014736、アミノ酸配列は、配列番号：39で表される核酸によってコードされる配列番号：40で表される）用として
5’-AGCTTTGTTGAACAGGCATTT-3’（配列番号：26）および、
5’-GGCAGCAGTACAACAATCTAAGC-3’（配列番号：27）、
β2ＭＧ用として、
5’-CACCCCCACTGAAAAAGAGA-3’（配列番号：28）および、
5’-TACCTGTGGAGCAAGGTGC-3’（配列番号：29）であった。
【０２４６】
すべての反応は、2分間、94℃での初期変性の後、94℃、30秒間、23サイクル（TUBA用）または28サイクル（REG4用）、および72℃、1分間を含む、もしくは、95℃、5分間の初期変性段階の後、95℃で30秒、55℃で30秒、72℃で30秒を23サイクル（β2ＭＧ）、または28サイクル（KIAA0101用）をGeneAmp PCR system 9700 (PE Applied Biosystems、フォスター、CA)で行った。
【０２４７】
3．REG4に対する抗体
Hisタグ全長ヒトREG4の発現ベクターを、293Ｔ細胞にトランスフェクションし、組換え型REG4（REG4-His）を、TALON精製キット（Clontech、サンディエゴ、CA）により培養液から精製した。REG4-Hisタンパク質は、フロイント完全アジュバントと共に該抗原溶液を乳化させ注射用に調製された。抗REG4ポリクローナル抗体（pAb）はREG4-Hisタンパク質に対してウサギ（医学生物学研究所、名古屋、日本）を用いて作成され、免疫血清は標準的なプロトコールに従ってアフィニティーカラムにより精製された。マウスモノクローナル抗体（mAb）は、フロインド完全アジュバントと共にBALB/CマウスにREG4-Hisに接種することにより作成された。リンパ球は、骨髄腫細胞P3U1と融合され、、単一クローンのハイブリッド細胞は標準的な技術により生成し評価された。
【０２４８】
4．抗体およびKIAA0101のための組換えタンパク質
全長KIAA0101（111のアミノ酸、NP_055551）（配列番号：15）をコードしているcDNA断片は、KOD-Plusポリメラーゼ（TOYOBO）を用いて生成され、pET21ベクター（Novagen）に入れクローン化した。COOH末端でポリヒスチジンタグと融合した組換え型KIAA0101タンパク質は、大腸菌、BL21 codon plus (Stratagene)で発現され、供給元のプロトコールに従って自然条件下でNi-NTA樹脂（QIAGEN）を用いて精製された。再精製は、MonoS HR 5/5（Amersham）を備えたHigh Performance Liquid Chromatography AKTA explorer (Amersham)を用いて行われた。タンパク質は、ウサギに免疫され、免疫血清は、組換え型KIAA0101タンパク質を結合したAffi-Gel 10 activated affinity media (Bio-Rad)を充填したアフィニティーカラムを用いて、基本的な方法に従って精製した。親和性精製された抗KIAA0101ポリクローナル抗体は、KIAA0101タンパク質の検出に用いた。
【０２４９】
5．REG4の免疫組織化学染色
切片は、クエン酸緩衝液、pH6.0中、108℃で15分間、オートクレーブされ、脱パラフィンされた。内因性ペルオキシダーゼ活性を、メタノールで希釈した0.33％の過酸化水素中、30分間のインキュベーションにより失活した。ブロッキングのためウシ胎児血清用いた培養の後、切片は、室温で1時間の抗REG4 pAb（1：1000）を用いてインキュベートされた。PBSで洗浄後、免疫検出は、ペルオキシダーゼ標識化抗マウス免疫グロブリン（Envision kit、 Dako Cytomation、カーピンテリア、CA）を用いて行われた。最後に、反応物は3, 3’-diaminobenzidine (Dako)で成熟され、細胞はヘマトキシリンで対比染色された。
【０２５０】
広域ゲノムcDNAマイクロアレイ解析で、本発明者らは、PDAC細胞において過剰発現した何十もの遺伝子を同定した（Hartupee JC, et al. Biochim Biophys Acta 2001; 1518: 287-93)。それらの中で、本発明者らは、RT-PCRにより、調査した9つのマイクロダイセクトしたPDAC細胞集団のうち7つにおいて本発明者らが過剰発現を確認したREG4に着目した（図1Ａ）。PDAC細胞において、そのｍRNAレベルは、正常膵臓および心臓、肺、腎臓および脳を含む重要臓器より明らかに高かった。
【０２５１】
他の一連のPDAC組織でのREG4に対するpAbを用いた免疫組織化学解析は、REG4杯状細胞様小胞（図1Ｂ）、または癌細胞の細胞表面（図1Ｃ）に強いシグナルを示したが、正常な膵臓の腺房細胞（図1Ｄ）では、REG4のわずかな染色を示し、管細胞および膵島細胞ではシグナルを示さなかった。心臓、肺、腎臓および脳を含む成体重要臓器は、染色を示さなかった（データを示さず）。加えて、他の一連の31のPDAC組織での組織マイクロアレイでは、31のPDACのうちの14でREG4の高レベルでの発現を示し、全64のPDAC中35（55％）で抗REG4抗体により、陽性染色を示した。高分化型PDAC（Ｇ1）は、未分化型（Ｇ2、Ｇ3およびＧ4）PDACより、高頻度でREG4の陽性染色を示した（ｐ＝0.0001、カイ2乗検定）。
【０２５２】
6．安定してREG4を発現している細胞の樹立
REG4発現ベクターを作成するために、REG4 cDNAの全コーディング配列は、制限酵素部位での次のプライマーペアを用いていてPCRにより増幅された；
5’-CGGAATTCATGGCTTCCAGAAGCATGC-3’（配列番号：63）および、
5’-ATAAGAATGCGGCCGCTGGTCGGTACTTGCACAGG-3’（配列番号：64）、
これらのプライマーは、最初および2番目の下線により示されたEcoRIおよびNotI制限サイトを含む。生成物は、HAタグたんぱく質を発現させるため、pCAGGSnHCのEcoRIおよびNotI部位に挿入された。プラスミドは、製造元に推奨された方法に従ってFuGENE6（Roche）を用いて、REG4陰性PDAC細胞株、PK45P細胞にトランスフェクションした。細胞集団は、0.5 mg/mlのジェネテシン（Invitrogen）を用いて選択され、クローンPK45P細胞を、限界希釈により、サブクローン化した。HAタグREG4発現のレベルを評価するために、いくつかのクローンを、50mMのTris-HCl、pH7.4、150mMのNaCl、0.25％デオキシコール酸、1％ＮＰ-40、1 mMＥＤＴＡ、0.1％プロテアーゼ阻害剤カクテルＩＩＩ（Calbiochem、サンディエゴ、CA）を含む溶解緩衝液で回収した。試料は、遠心分離され、沈殿物を除去した。上澄みのタンパク質の量は、ブラッドフォード法で測定された。10mg分は、15％のSDS-PAGEを行い、抗HA抗体（3F10）（Roche）を用いたウエスタンブロッティングにより検出された。各タンパク質の量は、抗β-アクチン抗体（Sigma-Aldrich）により標準化された。恒常的にREG4を発現した3個のクローンを樹立した（C1-6、C2-6、C10）。空のpCAGGSnHC-HAベクターをトランスフェクションした対照PK45P細胞もまた、樹立した（Ｍ1、Ｍ3、Ｍ6）。
【０２５３】
7．ガンマ線およびゲムシタビン抵抗性アッセイ
3,000細胞のREG4を発現している各クローン（C1-6、C2-6、C10）または対照クローン（Ｍ1、Ｍ3、Ｍ6）を、96穴培養ディッシュの各ウェルに播種し、10％FBSを含む培地で、インキュベートした。48時間のプレインキュベーションの後、細胞は、60コバルト源を用いて1、5、10、または30Gyのガンマ線照射、もしくは48時間の0.1〜100,000nMゲムシタビン処理された。48時間後、生細胞を、Cell counting kit-8（DOJINDO）を用いて測定した。パーセント阻害値を評価するため、吸光度（各処理）/吸光度（未処理対照）の相対比を、算出した。ＦＡＣＳ解析のため、48,000細胞/ウェルを、6穴プレートに播種し、48時間のプレインキュベーションの後、細胞に、60コバルト源を用いて0、1または5Gyのガンマ線照射、または48時間の10nMまたは50nMのゲムシタビン処理をした。48時間後、細胞を回収し、PBSで洗浄、冷70％のエタノールで固定後、プロピジウム・ヨウ化物（10mg/ml）とリボヌクレアーゼA（100mg/ml）で染色し、FACSCalibur（商標）Flow Cytometry System (BD)解析により細胞周期解析を行った。異数体細胞のパーセンテージは、細胞周期解析ソフトウェア（BD CELLQuest（商標））により算出された。
【０２５４】
8．KIAA0101の免疫組織化学的染色
膵癌組織の通常の切片は、適切なインフォームドコンセントの下で切除された外科標本から得られた。正常膵臓の切片を、Biochain（ヘイワード、CA）から購入した。切片を、15分間、Dako Cytomation Target Retrieval Solution High pH（Dako、カーピンテリア、CA）中、108℃でのオートクレーブを行い、脱パラフィンした。内因性ペルオキシダーゼおよびタンパク質のブロッキング後、切片を、30分間、室温で、抗KIAA0101抗体（1：200の希釈）とインキュベートした。PBS洗浄後、免疫検出を、ペルオキシダーゼ標識化抗ウサギ免疫グロブリン（Envision kit、Dako）で行った。最後に、反応物は、3、3’-ジアミノベンジジン（Dako）で成熟され、ヘマトキシリンで対比染色された。
【０２５５】
9．ノーザンブロット解析
本発明者らは、全RNAをTrizol試薬（Invitrogen、カールズバッド、CA）を用いていくつかの膵癌細胞株から抽出し、ノーザンブロット解析を行った。デオキシリボヌクレアーゼＩ（日本ジーン、大阪、日本）で処理後、製造元のプロトコールによりｍRNAを、Micro-FastTrack（Invitrogen）で精製した。正常ヒト成人心臓、肺、肝臓、腎臓、脳および膵臓（BD Biosciences、パロアルト、CA）から単離したｍRNAと同様に、膵癌細胞株から各ｍRNAの1μg分は、1％変性アガロースゲルで分離され、ナイロン膜にトランスファーされた。KIAA0101に特異的な702bpプローブは、次のプライマーセットを用いてPCRにより調製された：
フォワード、5’- AGCTTTGTTGAACAGGCATTT-3’（配列番号：1）、および、
リバース、5’-GGCAGCAGTACAACAATCTAAGC-3’（配列番号：2）。
【０２５６】
ランダム‐プライムドα32 P-dCTP標識化プローブ用いたハイブリダイゼーションを、Megaprime DNA labeling system（Amersham Biosciences、バッキンガムシャー、英国）の説明書に従って行った。プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションおよび洗浄は、供給元の推奨に従って行われた。ブロットを、10日間、−80℃で、増感紙を用てオートラジオグラフにより行った。
【０２５７】
10.  KIAA0101のノックダウンのための低分子干渉RNA（siRNA）発現構造物およびトランスフェクション
膵癌細胞において、内因性KIAA0101の発現をノックダウンするために、本発明者らは以前の記載のように、標的遺伝子に対して、ショートヘアピンRNA発現用psiU6BX3.0ベクターを用いた（Taniuchi et al., (2005) Cancer Res, 65: 105-12)。KIAA0101のsiRNA用の合成オリゴヌクレオチドの標的配列は、以下の通りであった：
#759si；5’-GCCATATTGTCACTCCTTCTA-3’（配列番号：7)および、
EGFPsi；5’-GAAGCAGCACGACTTCTTC-3’（配列番号：8) （陰性対照）。
【０２５８】
KIAA0101を高発現した膵癌細胞株、KLM-1およびMIA-PaCa2を10cmのプレート上へ播種し、KIAA0101に対するsiRNAを発現するように設計されたプラスミド8μgを、製造元の指示に従ってFuGENE6（Roche）を用いてトランスフェクションした。
【０２５９】
細胞を、5日間、ジェネテシン（Sigma-Aldrich）0.5 mg/ml（KLM-1用）または0.8 mg/ml（MIAPaCa-2用）により選択し、KIAA0101発現のノックダウン効果を分析するために回収した。コロニー形成アッセイのために、siRNAｓを発現しているトランスフェクタントは、ジェネテシンを含む培地中、14日間増殖させた。4％のパラホルムアルデヒドで固定後、コロニー形成を評価するために、形質転換細胞は、ギムザ溶液で染色された。細胞生存率を、Cell counting kit-8（DOJINDO、熊本、日本）を用いて定量化した。ジェネテシン含有培地中で、14日の培養後、溶液は、10％の最終濃度で加えられた。3時間、37℃での培養後、450nmでの吸光度を、Microplate Reader 550（Bio-Rad、ヘラクレス、CA）を用いて測定した。
【０２６０】
11．インビトロおよびインビボでの、外因性KIAA0101発現細胞の樹立と増殖
KIAA0101 cDNAは、コザック配列およびNotIリンカーを含んだフォワードプライマーおよびNotIリンカーを含むリバースプライマーを用いてPCR増幅により調製された。PCR産物は、哺乳類用発現ベクター、HAタグタンパク質発現用のpCAGGS/ＨＡのNotI部位に挿入された。pCAGGS-KIAA0101-ＨＡまたは空のpCAGGS/ＨＡ偽ベクターを、KIAA0101をわずかに発現するPK45P、および検出可能なマウスKIAA0101ホモログ（NP_080791）をほとんど発現しないNIH3T3細胞に、製造元のプロトコールによりFuGENE6（Roche）を用いてトランスフェクションした。
【０２６１】
次に、ジェネテシン耐性クローンを、ジェネテシンをNIH3T3用に0.9 mg/ml、およびPK45P用に0.5 mg/mlを含有する培地で選択した。各クローンでの外因性KIAA0101の発現を、抗ＦＬＡＧタグ抗体（Sigma-Aldrich）および抗β-アクチン抗体（Sigma-Aldrich）を用いてウエスタンブロット解析により確認した。増殖アッセイのため、KIAA0101発現クローン（PK45P-KIAA0101）または対照クローン（PK45P-Mock）各7,500細胞を、24穴培養ディッシュの各ウェルに播種し、10％FBS含有培地で、インキュベートした。細胞生存率は、MTTアッセイにより定量化された。実験は、少なくとも3回繰り返された。インビボでの形質転換のために、NIH3T3-KIAA0101の1つの安定クローンおよび1つのNIH3T3-Mockの5×106個の細胞を、8週間のヌードマウスの左右の横腹に、接種し、4週後に腫瘍を回収した。各腫瘍の重量を測定し、抗KIAA0101抗体により免疫染色した。
【０２６２】
12．KIAA0101会合複合体に対する免疫沈降および質量分光分析
KIAA0101タンパク質と結合したタンパク質を同定するために、本発明者らは、抗KIAA0101抗体を用いている免疫沈降実験を行った。KIAA0101を過剰発現した膵癌細胞株KLM-1およびPK59は、溶解緩衝液（50mM Tris-HCl pH8.0、150mM NaCl、0.5% NP-40、Protease Inhibitor Cocktail Set III （Calbiochem,、サンディエゴ、CA））中に、溶解させた。総タンパク質の等量を、2μgの抗KIAA0101ポリクローナル抗体またはウサギIgG（Santa Cruz Biotechnologies、サンタクルス、CA）と共に、1時間、40℃でインキュベートした。免疫複合体は、1時間、protein G Sepharose（protein G Sepharose、サウスサンフランシスコ、CA）とインキュベートし、溶解緩衝液により洗浄した。
【０２６３】
共沈タンパク質を、5〜20％の勾配SDS-PAGEで分離し、銀染色法キット（和光、大阪、日本）で染色した。抗KIAA0101ポリクローナル抗体での沈降タンパク質と対照IgGでのものと異なるバンドを摘出し、トリプシンでゲル内消化し、AXIMA-CFR MALDI-TOF質量分析器（島津製作所、筑波、日本）を用いて、ペプチド質量フィンガープリントで分析した。ペプチド質量を10ppm質量精度で検索し、タンパク質データベース検索をデータベース最適化プログラムIntelliMarque（Shimadzu）を用いて行われた。この方法により同定された結合タンパク質は、抗KIAA0101、抗PCNA抗体（Santa-Cruz）、抗POLD1抗体（Santa-Cruz）、および抗FEN1抗体（Santa-Cruz）を用いた免疫沈降により確認された。
【０２６４】
13．細胞透過性ペプチド処理およびKIAA0101-PCNA相互作用
ドミナントネガティブ方法で、KIAA0101とPCNA間の相互作用を阻害するために、本発明者らは、アルギニン（Ｒ）リピート細胞透過性ペプチド（Noguchi et al., (2004) Nat Med., 10: 305-9）に結合したKIAA0101のPIPボックスモチーフペプチドをを設計した。PIP20は、RRRRRRRRRRRGGG-VRPTPKW｛qKGiGEff｝RLSPKであった（配列番号：9) （PIPボックスモチーフは括弧内に示され、保存された残基は小文字で示される）。PIP20mutは、アラニンでPIPボックスモチーフの保存された残基を置き換えた：RRRRRRRRRRRGGG-VRPTPKW{aKGaGEaa}RLSPK（配列番号：10)。スクランブルペプチドもまた、ネガティブコントロールとして設計された；RRRRRRRRRRRGGG-IFKQWPRGETKPRVLSPKGF（配列番号：11)。さらに、本発明者らはまた、PIPボックスモチーフを含んでいるより短いペプチドを設計した：PIP16；RRRRRRRRRRRGGG-TPKW{qKGiGEff}RLSP（配列番号：12)、PIP16mut；RRRRRRRRRRRGGG-TPKW{aKGaGEaa}RLSP（配列番号：13)。それらは、Sigma-Aldrichによって合成され、95％以上の等級にＨＰＬＣにより純化された。KIAA0101を発現した癌細胞株KLM-1およびマウスKIAA0101ホモログを発現しない正常マウス細胞株NIH3T3を、これらの細胞透過性ペプチドの一連の濃度（5μＭ、10μＭおよび20μＭ）で処理した。1日目および3日目に、細胞は、それぞれのペプチドで接触され、5日目に、生細胞数は上記のMTTアッセイにより評価された。
【０２６５】
実施例2  
1．siRNA発現ベクターおよびコロニー形成アッセイ/MTTアッセイ
PDAC細胞での、内因性REG4の発現をノックダウンするために、本発明者らは、以前に記載されているように（Shimokawa T, et al. Cancer Res 2003; 63: 6116-20.)、標的遺伝子に対するショートヘアピンRNA発現用としてpsiU6BX3.0ベクターを用いた。
【０２６６】
REG4用のsiRNAのための合成オリゴヌクレオチドの標的配列は、以下の通りである：
REG4-si2；5’-GACAGAAGGAAGAAACTCA-3’（配列番号：5)および、
EGFPsi；5’-GAAGCAGCACGACTTCTTC-3’（配列番号：6) （陰性対照）。
【０２６７】
PDAC細胞株SUIT-2（REG4陽性）およびMIAPaCa-2（REG4陰性）を、6穴プレート上へ播種し、製造元の指示に従ってFuGENE6（Roche、バーゼル、スイス）を用いてsiRNA（10μg）を発現するように設計されたプラスミドをトランスフェクションした。siRNAを発現プラスミドは、二本鎖オリゴヌクレオチドをクローニングにより調製された。対のオリゴヌクレオチド配列は、次のようである；
5’-CACCGACAGAAGGAAGAAACTCATTCAAGAGATGAGTTTCTTCCTTCTGTC-3’（配列番号：11)および、
5’-AAAACTGTCTTCCTTCTTTGAGTAAGTTCTCTACTCAAAGAAGGAAGACAG-3’（配列番号：12) ：si2用。
【０２６８】
細胞は、7日間、ジェネテシン（Sigma-Aldrich）0.9ｍｇ/ｍｌ（SUIT-2用）または0.8ｍｇ/ｍｌ（MIAPaCa-2用）で選択され、その後、REG4発現に対するノックダウン効果を分析するために回収された。コロニー形成アッセイのために、siRNA発現トランスフェクタントを、7日間、ジェネテシン含有培地で、増殖させた。メタノール固定後、コロニー形成を評価するために、形質転換細胞を0.1％クリスタルバイオレット溶液で染色した。MTTアッセイにおいて、細胞生存率を、Cell counting kit-8（DOJINDO、熊本、日本）を用いて定量化した。ジェネテシン含有培地で7日の培養後、溶液は、最終濃度10％ので加えられた。1．5時間、37℃でのインキュベーションの後、吸光度は、Microplate Reader 550（Bio-Rad、ヘラクレス、CA）用いて、490nm、および参照としての630nmで測定された。
【０２６９】
PDAC細胞成長での、REG4過剰発現の役割を検討するために、本発明者らは、REG4に特異的なsiRNAを発現するように設計されたいくつかの発現ベクターを構築し、内因性REG4を高レベルで発現するPDAC細胞株SUIT-2にそれらをトランスフェクションさせた。本発明者らがSUIT-2細胞で試験した3つのプラスミドの中で、REG4-si2は内因性REG4転写物に対する有意なノックダウン効果を示し（図2Ａ）、このトランスフェクションは、MTTアッセイ（図2Ｂ）により測定した生細胞の減少を確認した、これと同様にコロニ-数（図2Ｃ）の減少も確認した。このとき、他のプラスミド（陰性対照のsiEGFP）のトランスフェクションでは、REG4発現に対するノックダウン効果ならびにSUIT-2の増殖に影響を及ぼさなかった。一方、REG4-si2は、REG4を発現しないMIAPaCa-2の細胞生存率には、影響を及ぼさなかったため、REG4-si2の「非特異性」効果の可能性は除去された（データ示さず）。このsiRNA発現ベクター（REG4-si2）の成長抑圧効果は、遺伝子サイレンシング効果によく相関しており、これらのデータは、膵癌細胞生存および/または増殖におけるREG4の重要な役割を示した。
【０２７０】
実施例3  
1．生物活性組換えヒトREG4の作成
REG4の生物活性型を作成するため、REG4 cDNAの全コード配列は、制限酵素部位を有するプライマー対を用いてPCRにより増幅された；
5’-CG{GAATTC}ATGGCTTCCAGAAGCATGC-3’（フォワード）、（配列番号：7）および、
5’- ATAAGAAT{GCGGCCGC}TGGTCGGTACTTGCACAGG-3’（リバース）、（配列番号：8) 、これらは、それぞれ括弧内に示されるEcoRIおよびNotI制限サイトを含む。産物は、HAタグタンパク質を発現するため、pCAGGSのEcoRIおよびNotI部位に挿入された。FreeStyle（商標）293細胞は、30ml培地に、1.5×105細胞/mlで播種された。取扱書にしたがって、REG4-ＨＡ/pCAGGSベクターは、FuGene 6を用いて細胞へトランスフェクションされた。培地は、48時間後に回収され、組換えヒトREG4（rhREG4）はＨＡアガロース（Sigma-Aldrich）で純化された。
【０２７１】
2．免疫沈降
10ｃｍディッシュで培養されたSUIT-2細胞は、洗浄され、無血清培地で、2日間さらに培養された。4℃で15分間、10,000xgでの遠心後、上澄みを4℃で、1時間の、プロテインＧセファロース（Zymed Laboratories、サンフランシスコ、CA）の処理をした。次に、前処理された上澄みを、抗REG4 mAbでプレインキュベートしたプロテインＧセファロースの混合物に加えた。インキュベーションは、2度の洗浄後、4℃で4時間、穏やかに回転させて行った。結合タンパク質を、15％SDS-PAGEで分離、溶出した。電気泳動分離後、タンパク質は、ニトロセルロ-ス膜（Amersham）へトランスファーされ、抗REG4  pAbで調べられた。タンパク質のバンドは、化学発光検出システム（ECL、Amersham）によって、視覚化された。
【０２７２】
3．Aktリン酸化
リン酸化されたAktのレベルを評価するため、PK45P細胞を、6時間、0、0.1、1または10nMのrhREG4および100μg/mlの抗REG4 mAbの存在下または非存在下で処理した。処理後、細胞を、冷PBS用で洗浄し、50mMのHEPES、pH7.5、200 mMのNaCl、2.5mMのEDTA、2.5mMのEGTA、10mMのNaF、1mMのNa3VO4、0.5％のTriton X-100、0.5mMの1,4-dithiothreitol、0.1％のprotease inhibitor cocktail III（Calbiochem、サンディエゴ、CA）を含む溶解緩衝液で回収した。サンプルを遠心分離し、沈殿を除去した。上澄みのタンパク質量を、Bradford方法で測定した。20μg分は、10％SDS-PAGEへ供し、抗ｐSer473  Akt抗体（Abcam、ケンブリッジ、ＭＡ）を用いたウエスタンブロッティングにより検出された。Aktタンパク質の総量は、抗Akt抗体（Santa Cruz Biotechnology、CA）により評価された。
【０２７３】
膵癌細胞増殖における分泌REG4の効果を検討するため、本発明者らは、哺乳類のシステム（FreeStyle（商標）293-F）（図3Ａ）を用いることにより生物活性rhREG4タンパク質を生成し、REG4の低発現を示すPK45P細胞を、rhREG4のいくつかの濃度（0-10nM）で処理することにより、細胞増殖アッセイを行った。図4Ｂは、培地中のREG4タンパク質の存在によって、用量依存的に細胞増殖を明らかに促進させることを示ている。このことは、分泌REG4が、細胞外で、オートクリン/パラクリン様式で細胞増殖を促進させる機能を有することを示ている。REGファミリーの下流標的の1つとして、Aktシグナル経路があることは報告された（Sekikawa A, et al. Gastroenterology 2005; 128: 642-53., Bishnupuri KS, et al. Gastroenterology 2006; 130: 137-49.)。rhREG4が、PDAC細胞において、Aktシグナル経路を活性化できるか否かを検討するため、PK45P細胞を、一連の用量のrhREG4の存在下でインキュベートし、リン酸化Aktを、セリン473に特異的なリン酸化Akt抗体を用いてウエスタンブロット解析により検出した。rhREG4処理は、明らかに、Aktのリン酸化を増大させることを示し（図3Ｃ）、一方、Aktの総発現レベルは、rhREG4の処理により変化しなかった。
【０２７４】
これらのデータは、REG4が、PDAC細胞でのAktシグナル経路を介して細胞増殖を刺激することを示した。
【０２７５】
抗REG4 mAbの治療的素質を評価するため、本発明者らは、抗REG4 mAbを用いてPDAC細胞を処理することによる、細胞増殖アッセイを行った。まず、本発明者らは、細胞培地を用いた免疫沈降により、いくつかの抗REG4 mAbの結合親和力を確認した。図4Ａは、1つの抗REG4 mAb（34-1）が、SUIT-2培地内の内因性REG4タンパク質へ高い親和力で結合することを示している。PK45Pを用いてた中和アッセイにより、抗REG4 mAbクローン34-1が、rhREG4処理による増殖促進効果を完全に停止させることを示したが、対照抗体は中和活性を示さなかった（図4Ｂ）。高レベルで内因性REG4を発現しているSUIT-2細胞を用いた増殖アッセイにより、抗REG4 mAb処理が、用量依存的にSUIT-2細胞増殖を阻害することを示した（図4Ｃ）。一方、抗REG4 mAbは、REG4を発現しないMIAPaCa-2の細胞増殖には影響を及ぼさなかった。
【０２７６】
さらに、本発明者らはまた、rhREG4および抗REG4 mAbを用いて、PK45P細胞を処理することによって、Aktリン酸化への影響を検討したところ、抗REG4 mAb処理は、rhREG4処理により誘導されたPDAC細胞のAktリン酸化を抑制した（図4Ｄ）。これにより、抗REG4 mAbが、分泌REG4を中和し、オートクリン/パラクリン経路を遮断することで、PDAC細胞でのAktシグナル経路を阻害し得ることを示した。従って、これらのデータは、抗REG4抗体がREG4により促進される細胞増殖に対し中和活性を有することを示唆した。
【０２７７】
抗REG4 mAbの治療能力を評価するため、本発明者らは、抗REG4 mAbを用いて、PDAC細胞を接種されたマウスを処理することによる腫瘍増殖アッセイを行った。5×106細胞のREG4発現PDAC細胞株SUIT-2を、8週齢ヌードマウスの横腹に接種し、腫瘍の長径（L）および短径（S）を、週に2回計測した。腫瘍容積は、L×L×S×0.52により算出された。抗REG4マウスmAb  34-1（300μg/マウスi.p.）での抗体治療は、腫瘍容積が100-200mm3に到達したときに開始された。抗体は、腹腔内に1週間当たり2回処理され、対照として、非特異性マウスIgG（Acris）を、同じ日程で処理した。図5Ａに示すように、34-1mAb治療により、腫瘍増殖（Ｐ＝0.0598）を抑制した。30日目に、腫瘍は回収され、重量測定された。34-1mAb治療は、有意に腫瘍重量を抑制した（図5Ｂ、Ｐ＝0.0489）。
【０２７８】
実施例4  
1．インビトロでの化学-放射線治療抵抗性PDACでのREG4の発現
REG4の発現が、化学-放射線治療に対するPDACの抵抗性にいかに関与するかについて調査するため、REG4陰性PDAC細胞から恒常的にREG4を発現する3個のクローンを作成し、インビトロでガンマ線照射またはゲムシタビンでこれらのクローンを処理した。C1-6、C2-6およびC10クローンでの外因性REG4の発現および偽クローンでの非発現を、ウエスタンブロット解析により確認した（図6Ａ）。非照射と比較して、ガンマ線照射は、REG4発現細胞および偽細胞の細胞生存率を抑制した。しかし、図6Ｂに示すように、REG4発現細胞は、ガンマ線照射に対して感度が低く、30Gyガンマ線照射後のREG4発現細胞（C1-6、C10、C2-6）の生存率は、非照射に比較して、60％まで抑制されたが、偽細胞の生存率は40％未満まで抑制された（P<0.001）。ガンマ線照射後のFACS解析は、1-Glyガンマ線照射では、偽細胞のサブG1集団（アポトーシス細胞）を28.7%まで誘導したが、REG4発現細胞では、わずか10.73%であったことを示した（図6Ｃ）。さらに、5-Glyガンマ線照射は、偽細胞のサブG1集団（アポトーシス細胞）を46.47%まで誘導したが、REG4発現細胞では、わずか24.68%であった（図6Ｃ）。これらの知見は、PK45P細胞でのREG4発現が、ガンマ線照射に対する抵抗性に強く寄与することが示された。
【０２７９】
次に、REG4陽性または陰性細胞を、一連の濃度のゲムシタビンで処理し、それらの生存率を評価した。図7Ａに示すように、REG4発現細胞（C1-6、C10、C2-6）は、偽細胞と比較して、ゲムシタビンへの感受性が低かった。REG4発現細胞に対するゲムシタビンのＩＣ50は、C1-6およびC10では、約100nM（図6Ａ）、およびC1-6およびC10よりREG4の発現が少ないC2-6では約50nMであったが、偽細胞に対するIC50は、約30nMであった。しかし、この差は、優性ではない。さらに、ＦＡＣＳ解析では、REG4発現細胞が50nMのゲムシタビン処理後、アポトーシス細胞が少ないことを示す傾向を示したが、統計的に有意でない（図7Ｂ）。ゲムシタビンの高濃度処理は、アポトーシス細胞の有意差を示さなかった。これらの知見は、PK45P細胞でのREG4の発現が、ゲムシタビンに対する抵抗性へいくらかの寄与を有する可能性を示したが、その寄与は、あまり強くない。それ故、PDAC細胞において、REG4の発現は、ゲムシタビンを基礎とする化学療法よりも放射線耐性に寄与し得る。
【０２８０】
2．ネオアジュバント化学-放射線治療抵抗性患者でのREG4発現
REG4の発現と膵癌の治療抵抗性の間の関連を評価するため、ネオアジュバント化学-放射線療法治療（neo-CRT）を受けた患者の手術標本が、調査された。それらは3Ｄコンフォーカル放射線治療（計50Gy）、および並行してゲムシタビン（1ｇ/ｍ2/週を3週）で治療され、8週間の追跡治療が続いた。19の手術標本は、抗REG4抗体で免疫染色され、REG4発現およびneo-CRTに対する病理学的応答が評価された。
【０２８１】
19のneo-CRT標本中、9のサンプルはneo-CRTに組織学的応答を示したが、10は示さなかった。REG4の発現に関して、9人のうち2人の応答者は腫瘍細胞において、REG4の発現を示した（図8ＡおよびＢ）が、10人のうち7人の不応答者はREG4の発現を示した（図8ＣおよびＤ）。このREG4発現は、neo-CRTへの応答と有意に関連した（カイ二乗検定、Ｐ＝0.0028）。このことは、REG4の発現が、化学療法および放射線治療のような細胞障害性治療下で、癌細胞を生存させることを意味する。
【０２８２】
実施例5
膵癌細胞でのKIAA0101の過剰発現
広域ゲノムcDNAマイクロアレイ分析（Nakamura T., Oncogene, 23: 2385-400, 2004.）による膵癌細胞での過剰発現の遺伝子の中で、本発明者らは、本研究でKIAA0101に着目した。本発明者のマイクロアレイデータは、本発明者らが検討した膵癌細胞の全ての有益な症例においてKIAA0101の過剰発現を示し（14例の有益な症例中14例が、発現シグナルにおいて10倍以上を示した）、その過剰発現は、RT-PCRにより、検討された9つのマイクロダイセクトした膵癌細胞集団のうちの8つにおいて確認された（図9Ａ）。プローブとしてKIAA0101 cDNA断片を用いたノーザンブロット解析は、本発明者らが検討したすべての癌細胞株において、約1.2ｋｂの高発現された転写物を同定した；
発現は、肺、心臓、肝臓および腎臓を含むいかなる重要臓器においても観察されなかった（図9Ｂ）。KIAA0101に対するポリクローナル抗体を用いた免疫組織化学解析は、5人の患者の膵癌組織切片の全てにおいて、膵癌細胞の核での強いシグナルを示した（図9Ｃ）。染色は、正常な膵臓上皮および腺房細胞（図9Ｃ）、および肺、心臓、肝臓および腎臓を含む重要な正常器官では観察されなかった。
【０２８３】
実施例6
膵癌細胞の増殖でのsiRNAｓによるKIAA0101ノックダウンの効果
癌細胞でのKIAA0101過剰発現の生物学的重要性および癌治療のための分子標的として可能性を調査するため、本発明者らは、KIAA0101ｍRNA配列に特異的ないくつかのsiRNA発現ベクターを構築し、KIAA0101ｍRNAを高レベルで内因的に発現するKLM-1およびMIAPaCa-2にトランスフェクションさせた。本発明者らによる#759si構築物を用いた場合、ノックダウン効果は、RT-PCRにより確認された（図10Ａ）。ノックダウン効果がないことが明らかであるEGFPsiと比較して、KLM-1を用いたコロニー形成アッセイ（図10Ｂ）およびMTTアッセイ（図10Ｃ）は、#759siをトランスフェクションした細胞数を劇的に減少させることを明らかにした。類似の効果は、MIA-PaCa2細胞株においても得られた。これらの所見はKIAA0101が癌細胞増殖で重要な役割を果たし、KIAA0101機能の抑制は癌治療のための新規分子標的としての可能性を有することを示した。
【０２８４】
実施例7
KIAA0101の外因性の過剰発現は、癌細胞増殖を促進し、NIH3T3を形質転換した
さらにKIAA0101の潜在的な腫瘍形成の特性を探索するため、本発明者らは、外因性KIAA0101を、恒常的に発現するPK45P由来細胞株、PK45P-KIAA0101のいくつかのクローンを樹立した。本発明者らはまた、偽ベクター（PK45P-Mock）をトランスフェクションした対照PK45P細胞を調製し、それらの増殖速度を比較した。ウエスタンブロット解析により、6個のクローンにおいて、外因性KIAA0101の発現を確認した（図11Ａ）。MTTアッセイで測定された増殖曲線は、PK45P-KIAA0101（実線）の6個のクローン、4個のPK45P-偽クローン（破線、図11Ｂ）が、有意に急速に増殖することを示し、KIAA0101の発現が、癌細胞の増殖を促進させることを示した。
【０２８５】
本発明者らが検討した細胞株の中で、正常マウスNIH3T3細胞株のみが、KIAA0101ホモログの発現を示さなかった。そこで、本発明者らは、NIH3T3にKIAA0101を強制発現させ、インビボでKIAA0101の過剰発現がNIH3T3を形質転換するかを調べた。図11Ｃに示すように、NIH3T3-KIAA0101の3個のクローンが、ヌードマウスの右側で腫瘍を形成したが、NIH3T3-偽は、左側で形成しなかった、そして、これらの腫瘍の免疫組織化学的染色は、腫瘍細胞の核でKIAA0101の陽性染色を示した（図11Ｄ）。これらの結果は、KIAA0101が正常細胞を腫瘍細胞に形質転換させる能力を有することを意味した。
【０２８６】
実施例8
KIAA0101タンパク質の複合体としのPCNA、POLD1、FEN1の同定
さらにKIAA0101の生物学的機能を調査するため、本発明者らはKIAA0101タンパク質の複合体を同定するために、KIAA0101に対するポリクローナル抗体を用いた免疫沈降を実施した。SDS-PAGEゲルで分離され、銀染色された免疫沈降分画により、いくつかのタンパク質が、対照サンプルの結果と比較して、癌細胞溶解液からKIAA0101タンパク質と免疫沈降することが示された（図12A）。各タンパク質は、ゲル内トリプシン消化の後、MALDI-TOFシステムにより分析された； PCNA、POLD1（ポリメラーゼδ125サブユニット）およびFEN1（flap endonuclease-1）として同定された。これらの相互作用は、図12Bに示した免疫沈降実験により確認された。これらのタンパク質の全ては、DNA複製/修復に関与し、POLD1およびFEN1はまた、KIAA0101と同様にPCNAと結合する（Jonsson et al., (1998) EMBO J. Apr 15;17(8):2412-25, Zhang et al., (1999) J Biol Chem. Sep 17;274(38):26647-53; Bruning & Shamoo (2004) Structure. Dec;12(12):2209-19.）、このことは、KIAA0101が、PCNAとの相互作用を通してDNA複製に関与していることを示唆している。
【０２８７】
実施例9
細胞透過性ドミナントネガティブペプチドによる、KIAA0101とPCNA間の相互作用の阻害
KIAA0101のPIPボックスモチーフを介したKIAA0101とPCNA間の相互作用を阻害するため、本発明者らは、このPIPボックスを含むドミナントネガティブペプチドを設計し、細胞透過性を容易にするために、アルギニン（Ｒ）リピートを結合させた（図13Ａ）。インビトロ研究において、本発明者らは、免疫沈降によって、PCNAとKIAA0101間の相互作用の抑制を確認した。PIP20の存在下において、PCNAはKIAA0101と免疫沈降しなかったが、保存残基をアラニンにより置き換えらたPIP20mut（図13Ａ）およびスクランブル（図13Ｂ）は相互作用に影響を及ぼさなかった。次に、本発明者らは、癌細胞および正常線維芽細胞NIH3T3細胞をこれらのペプチドで処理することにより、これらのペプチドが、癌細胞増殖を阻害するか否かを評価した。マウスKIAA0101（NP_080791）は、ヒトと高い相同性があり、ヒトKIAA0101でのドミナントネガティブペプチドの標的領域はマウスKIAA0101のものと100％同一であった。図13Ｃは、PIP20により用量依存的に癌細胞増殖を抑制するが、PIP20mutおよびスクランブルペプチドは抑制しないことを証明した。一方、PIP20は、ヒトKIAA0101のホモログを発現しないマウス正常細胞株NIH3T3細胞の増殖に影響を及ぼさなかった。これらの所見は、PIP20がKIAA0101を標的とすることによって、特異的に細胞増殖を阻害することを示した。
【０２８８】
次に、本発明者らは、維持されたPIPボックスモチーフと共にN末およびC末へ続く領域のいくつかの残基を欠損させ、短いPIPペプチド（図13Ａに示されるPIP16およびPIP16mut）を設計し、癌細胞株およびNIH3T3細胞を処理した。PIP16の処理は、癌細胞増殖を強く抑制したが、PIP16は、NIH3T3の増殖へも影響を及ぼし、その増殖抑制効果は、PIP20と同様にアラニンでPIPボックスモチーフの保存残基を置き換えることによって失われた（図13Ｄ）。これらの所見は、PIP16の効果が、KIAA0101に特異的でなく、PIP16がPCNAと他のDNA複製タンパク質の間の相互作用に影響を及ぼすことを示唆した。
【０２８９】
考察
本発明は、PDAC治療のための分子標的としてのその可能性を示した。膵癌の発生または進行における分泌REG4の役割または機能を発明するため、本発明者らは、PDAC細胞株においてsiRNAにより内因性REG4発現をノックダウンし、組換え型REG4を用いて癌細胞を暴露した。本実験からの所見は、REG4がオートクリン/パラクリン増殖因子として機能し、未知の受容体を介してAktシグナル経路に伝達することを示した。しかし、いかにREG4がAktシグナル経路を伝達するかは未知であり、REG4受容体の同定に加えて、さらなる研究により調査されなければならない問題である（Kobayashi S, et al. J Biol Chem 2000; 275: 10723-6.)。
【０２９０】
近年の研究は、REG4および他のファミリーメンバーであるREG1が、Akt経路を介して、大腸癌または胃癌の抗アポトーシス因子として機能し得ると報告している（Sekikawa A, et al. Gastroenterology 2005; 128: 642-53., Bishnupuri KS, et al. Gastroenterology 2006; 130: 137-49.）。そこで、本研究では、分泌REG4による活性化経路およびAktシグナル経路が、癌の増殖または抗アポトーシスに関与するREGファミリーシグナルの下流経路であることを評価した。REGファミリーは、組織再生過程または組織損傷で発現される、または組織再生において重要な役割を果たすと考えられている（Unno M, et al. Adv Exp Med Biol 1992; 321: 61-6., Zhang YW, et al. World J Gastroenterol 2003; 9: 2635-41.)。REG4および他のREGメンバーによるAktシグナル経路活性化を考慮すると、それらは癌の化学療法または放射線治療への感度と関係していてもよく、インビトロまたはインビボでREG4発現と化学-放射線治療の効果との間の関連性を調査することは興味深い。
【０２９１】
REG4に特異的なモノクローナル抗体が、インビトロで培地中の分泌REG4を中和し、そして、これらの中和抗体の処理が、REG4のオートクリン/パラクリン経路を遮断すること、およびそれに引き続くAktリン酸化を防御することにより、有意にPDAC細胞増殖を抑制することは注目に値する。これらの所見は、REG4を標的とする中和抗体治療の実現可能性を示す。VEGFに対するヒト化モノクローナル抗体であるベバシズマブは、転移性結腸直腸癌の第一次選択治療のため、静脈内5-フルオロウラシル含有療法との組み合わせで、現在承認されている。抗血管新生因子抗体に加えて、例えばＨＧＦ（Burgess T, et al. Cancer Res. 2006; 66: 1721-9.)およびIL-6、（Trikha M, et al. Clin Cancer Res 2003; 9: 4653-65.）のような血中配位子に対する抗体が、、抗癌剤として審査下にあり、REG4標的中和抗体治療もまた、PDACおよびREG4を発現する他の癌に対する新規治療法として提供されてもよい。
【０２９２】
結論として、本発明者らは、PDACの血清診断マーカーおよびPDAC治療のための分子標的としてREG4の有望な実現可能性を示し、他のスクリーニング法または他の抗癌治療法と共にREG4を標的とした新規方法を組み合わせることによって、現在のPDACの悲惨な予後を好転させる可能性がある。
【０２９３】
さらに、本発明者らは、膵癌細胞において過剰発現する遺伝子の1つとして、KIAA0101を同定した。本発明者の様々なヒト癌におけるマイクロアレイ解析の情報およびいくつかの報告（Peiwen et al., (2001) Oncogene, 20: 484-9; Mizutani et al., (2005) Cancer, 103: 1785-90）によれば、RNAレベルで、多くの他の癌細胞もまた、KIAA0101を過剰発現し、その発現は、高度な増殖細胞において、広く観察されている。抗KIAA0101抗体を用いた免疫組織化学的解析は、KIAA0101が、癌細胞および増殖細胞が存在する正常な腸粘膜クリプトおよびリンパ節の胚中心において高度に発現していることを示した。そして、KIAA0101の発現は、細胞周期に依存しており、その発現は、DNA複製が最も活性されているＳ期において、最も高く（データ示さず）、このことは、KIAA0101の発現が細胞増殖に関与することを強く意味する。実際、本発明におけるsiRNAによるKIAA0101のノックダウンは、癌細胞の細胞増殖を抑制し、そして、以前の報告において、KIA0101が、酵母ツーハイブリシステムによりPCNA結合タンパク質として同定されていた（Yu et al., (2001) Oncogene, 20: 484-9)。
【０２９４】
PCNAは、DNA鋳型にそってスライドするクランプ基盤として働き、DNA合成または代謝酵素と相互作用するDNA複製およびDNA修復の過程に必須の補助タンパク質である（Wyman and Botchan, (1995) Curr Biol., 5: 334-7; Warbrick, (2000) Bioessays, 22: 997-1006; Krishna et al., (1994) Cell, 79: 1233-43)。本発明者らは、KIAA0101はまた、その保存されたPIPボックスモチーフを介してPCNAに直接結合し、KIAA0101は、PCNAとの結合によりPCNAの機能を制御する、または、p21のような他のPCNA結合パートナーと競合することを示した。（Waga et al., (1994) Nature 369: 574-8; Chen et al., (1996) Nucl Acid Res 24: 1727-33; Kontopidis et al., (2005) PNAS, 102: 1871-6)。本発明において、本発明者らは、このPIPボックスのモチーフに着目し、PCNAとKIAA0101間の相互作用を特異的に阻害するために、細胞浸透性アルギニンリピート（Noguchi et al., (2004) Nat Med., 10: 305-9）と結合したドミナントネガティブペプチドを設計した。PIP20mutは、癌細胞成長を抑制しなかったが、PIP20は用量依存的に癌細胞成長を抑制し、PIP20は、KIAA0101を発現しないNIH3T3の増殖には影響を及ぼさなかった。これは、その高い特異性を示唆している。
【０２９５】
興味深いことに、本発明者らは、PIP20より癌細胞の増殖を強く抑制するさらに短いペプチドであるPIP16およびPIP16を設計するため、PIPボックスを保持したままPIP20の隣接領域でいつくかの残基を欠損させた。しかし、KIAA0101-PCNAの相互作用に対するその特異性を失うと思われた。PCNAは、PIPボックスモチーフを介した多数のタンパク質と相互作用しており（Wyman and Botchan, (1995) Curr Biol., 5: 334-7; Warbrick, (2000) Bioessays, 22: 195-1006; Krishna et al., (1994) Cell, 79: 1233-43; Chen et al., (1996) Nucl Acid Res  24: 1727-33; Kontopidis et al. (2005) PNAS, 102: 1871-6）、PIP16が、PCNAと細胞増殖に重要な役割を果たし広範に発現している他の多数のタンパク質間の相互作用を阻害することができることを可能としている。PIP20の隣接残基は、KIAA0101とPCNA間の特異的な抑制に重要である可能性がある。同様に、PCNAと相互作用するｐ21のPIPボックス由来のペプチドは、癌細胞の抑制と殺傷を可能とし、PCNA依存的なDNA複製の阻害は、癌治療法に対する有望な方法である（Chen et al., (1996) Nucl Acid Res  24: 1727-33; Kontopidis et al. (2005) PNAS, 102: 1871-6)。
【０２９６】
細胞内のタンパク質-タンパク質間相互作用は、多くのシグナル伝達経路において、主要な制御ポイントを構成するが、広域で、浅く、疎水性であるタンパク質接合面を反映して、低分子化合物の標的としては、難しいことが多数証明されいる（Walensky et al., (2004) Science, 305: 1446-70)。ペプチドは、安定または不安定なタンパク質-タンパク質間相互作用に対する魅力的な候補であるが、インビボでの試薬としての有効性は、二次構造の損失、タンパク質分解に対する感受性および未処理細胞への透過困難性により、非常に欠陥がある。しかし、ペプチドの修飾についての最近の報告は、医薬用標的としてその実現可能性を示し（Walensky et al., (2004) Science, 305: 1446-70）、標的とされたタンパク質-タンパク質相互作用の更なる構造解析（Kontopidis et al., (2005) PNAS, 102: 1871-6）または、ＤＤＳ改良により、医薬品開発により多くの魅力を有し、医薬品開発に有望な実現可能性をもたらすタンパク質-タンパク質相互作用を阻害するペプチドを提供し得る。
【０２９７】
産業上の利用可能性：
発明者らは、REG4遺伝子またはKIAA0101遺伝子を特異的な標的とする低分子干渉RNA（siRNA）により細胞増殖を抑制することを示した。したがって、この新規siRNAは、抗癌医薬品の開発のための標的をして有用である。例えば、REG4の発現を阻止する、またはその活性を阻害する薬剤は、抗癌剤、特に、膵管腺癌（PDAC）のような膵癌の治療用抗癌剤として治療用途が見出される。同様に、KIAA0101の発現を阻止する、またはその活性を阻害する薬剤は、膵癌、前立腺癌、乳癌および膀胱癌の治療用抗癌剤として治療用途が見出される。
【０２９８】
発明者らはまた、REG4に対するモノクローナル抗体がその増殖促進効果を中和して、有意にPDAC細胞の増殖を減衰させたことを示した。したがって、例えば、膵癌のような、REG4発現細胞に関与する疾患の治療は、REG4と結合する抗体を用いて、適宜、執り行われる。
【０２９９】
発明者らはまた、KIAA0101がPCNAと相互作用すること、そして、その相互作用の抑制が、癌細胞の細胞増殖の抑制につながることを示した。したがって、PCNAとKIAA0101の相互作用間での結合を阻害する、およびその活性を阻害する薬剤は、抗癌剤として治療用途を有する。
【０３００】
本発明は、したがって、癌を治療または予防に有用な新規ポリペプチドおよび他の化合物を提供する。本発明のポリペプチドは、QKGIGEFF/配列番号：46を含むアミノ酸配列から成る。本発明のポリペプチドは、癌細胞の増殖を抑制するため、あるいは、アポトーシスを誘導するために投与され得る。本発明のポリペプチドは、多様な癌に対して細胞増殖阻害効果を示すと予想される。特に、本発明のポリペプチドは、膵癌の細胞増殖阻害効果を有することが確認された。
【０３０１】
膵癌は、有効な治療方法が、提供されることが依然として望ましい重要な癌である。従って、本発明は、膵癌を治療および/または予防する効果的な方法を提供するという点で、重要である。
【０３０２】
本発明が、その特異的な実施態様に対して参照され、詳細に記載されているが、多様な改変と修正が、本発明の意思と範囲から逸脱することなくなされることは当業者にとって明らかである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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