(57)【要約】  インフルエンザに対するペプチドベースの抗インフルエンザ製剤が開示される。ペプチドは、インフルエンザベースのエピトープに由来する。製剤は、特定の残基にて可変性が存在するように製剤され得るペプチド混合物に基づく。製剤を使用して、インフルエンザ、特にトリインフルエンザを予防するためのワクチンを調製することができる。【選択図】  図２１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜４９６及びそれらの類似体からなる群より選択される少なくとも１つのペプチドを含むペプチドベースの抗インフルエンザ製剤。
【請求項２】
配列番号１〜２４８及びそれらの類似体からなる群より選択される少なくとも１つのペプチドを含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
配列番号２４９〜４９６及びそれらの類似体からなる群より選択される少なくとも１つのペプチドを含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項４】
配列番号１〜２１２からなる群より選択される少なくとも１つのペプチドを含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項５】
配列番号２４９〜４６０からなる群より選択される少なくとも１つのペプチドを含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項６】
ａ）配列番号１〜２１２、及びｂ）配列番号２４９〜４６０からなる群より選択されるペプチドを含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項７】
ａ）配列番号２１３〜２４８、及びｂ）配列番号４６１〜４９６からなる群より選択されるペプチドを含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項８】
ａ）配列番号１〜２４８、及びｂ）配列番号２４９〜４９６からなる群より選択されるペプチドを含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項９】
ａ）配列番号１〜４０、及びｂ）配列番号２４９〜２８８からなる群より選択されるペプチドを含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項１０】
以下の群：
ａ）配列番号１〜２４；
ｂ）配列番号２５〜４０；
ｃ）配列番号４１〜６４；
ｄ）配列番号６５〜８８；
ｅ）配列番号８９〜１２０；
ｆ）配列番号１２１〜１４４；
ｇ）配列番号１４５〜１７６；
ｈ）配列番号１７７〜２１２；
ｉ）配列番号２４９〜２７２；
ｊ）配列番号２７３〜２８８；
ｋ）配列番号２８９〜３１２；
ｌ）配列番号３１３〜３３６；
ｍ）配列番号３３７〜３６８；
ｎ）配列番号３６９〜３９２；
ｏ）配列番号３９３〜４２４；又は
ｐ）配列番号４２５〜４６０
の少なくとも１つ由来の少なくとも１つのペプチドを含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項１１】
以下の群：
ａ）配列番号１〜２４；
ｂ）配列番号２５〜４０；
ｃ）配列番号４１〜６４；
ｄ）配列番号６５〜８８；
ｅ）配列番号８９〜１２０；
ｆ）配列番号１２１〜１４４；
ｇ）配列番号１４５〜１７６；
ｈ）配列番号１７７〜２１２；
ｉ）配列番号２４９〜２７２；
ｊ）配列番号２７３〜２８８；
ｋ）配列番号２８９〜３１２；
ｌ）配列番号３１３〜３３６；
ｍ）配列番号３３７〜３６８；
ｎ）配列番号３６９〜３９２；
ｏ）配列番号３９３〜４２４；又は
ｐ）配列番号４２５〜４６０
の少なくとも１つ由来の２ｎ個のペプチドを含む、請求項１に記載の製剤（ここで、ｎは１〜４である）。
【請求項１２】
配列番号２１３〜２４８、又は配列番号４６１〜４９６由来の少なくとも１つのペプチドをさらに含む、請求項１０に記載の製剤。
【請求項１３】
配列番号２１３〜２４８、又は配列番号４６１〜４９６由来の少なくとも１つのペプチドをさらに含む、請求項１１に記載の製剤。
【請求項１４】
請求項１に記載の製剤を、医薬的に許容される希釈剤又は担体とともに含むワクチン。
【請求項１５】
アジュバントをさらに含む、請求項１４に記載のワクチン。
【請求項１６】
前記アジュバントがミョウバンである、請求項１５に記載のワクチン。
【請求項１７】
必要とする動物においてインフルエンザを予防又は治療するためのワクチンの調製のための、請求項１に記載の製剤の使用。
【請求項１８】
前記インフルエンザが、トリインフルエンザである、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
インフルエンザを予防又は治療するための、請求項１４に記載のワクチンの使用。
【請求項２０】
前記インフルエンザが、トリインフルエンザである、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
必要とする動物に、請求項１４に記載のワクチンを有効量投与するステップを含む、前記動物においてインフルエンザを予防又は治療する方法。
【請求項２２】
配列番号１〜２１２又はその類似体由来のペプチドを調製する方法であって、
ａ）トリインフルエンザウイルスタンパク質の不連続エピトープの１次配列を表す直鎖状配列を決定するステップであり、前記エピトープが、前記タンパク質が折り畳まれた立体配置にあるときに互いに近傍にあるステップと、
ｂ）前記直鎖状配列を表すペプチドを合成するステップと
を含む方法。
【請求項２３】
配列番号１〜２１２又はその類似体由来の任意の２つのペプチド配列を含むペプチド混合物を調製する方法であって、
ａ）トリインフルエンザウイルスタンパク質の不連続エピトープの１次配列を表す直鎖状配列を決定するステップであり、前記エピトープが、前記タンパク質が折り畳まれた立体配置であるときに互いに近傍にあり、前記不連続エピトープが可変残基を含むステップと、
ｂ）可変残基にて少なくとも２つの異なるアミノ酸を含むペプチド混合物を合成するステップと
を含む方法。
【請求項２４】
単離ペプチドの混合物を含む抗ウイルス製剤であって、前記混合物が、トリインフルエンザウイルスＨＡタンパク質の可変領域に基づいて製剤され、前記単離ペプチドの混合物が、ＨＡ又はＨＡ１タンパク質の可変領域の変異体を表し、前記可変領域のそれぞれが、複数の可変アミノ酸残基を含み、前記可変アミノ酸残基の少なくとも１つが２つ以上のアミノ酸により表される抗ウイルス製剤。
【請求項２５】
前記複数の可変アミノ酸残基が、３つ以上の残基を含む、請求項２４に記載の抗ウイルス製剤。
【請求項２６】
前記トリインフルエンザタンパク質の少なくとも１つが、ＨＡである、請求項２４に記載の抗ウイルス製剤。
【請求項２７】
前記トリインフルエンザタンパク質の少なくとも１つが、ＨＡ１である、請求項２４に記載の抗ウイルス製剤。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、全般的に、抗ウイルス製剤に関し、特に、ペプチドベースのインフルエンザワクチン製剤、より具体的にはトリインフルエンザペプチドベースワクチン製剤に関する。
【０００２】
［発明の背景］
トリインフルエンザは、インフルエンザウイルスのＡ型株により引き起こされる鳥の感染性疾患である。１００年以上前にイタリアで最初に同定されたこの疾患は、世界中で発生している。インフルエンザウイルスの１６種の亜型が鳥に感染することが知られており、鳥の集団の中で潜在的に循環するインフルエンザウイルスの大きな保有体となっている。今日までに、病原性が高い形の全ての既知の大発生は、亜型Ｈ５及びＨ７のインフルエンザＡウイルスにより引き起こされている。
【０００３】
１６種のトリインフルエンザウイルス亜型のうち、Ｈ５Ｎ１は、いくつかの理由から特に懸念される。Ｈ５Ｎ１は迅速に変異し、ウイルスから遺伝子を獲得する傾向があることが証明されており、このことにより他の種の動物への感染が促進される。実際に、ヒトにおいて重大な疾患を引き起こすその能力が現在では証明されている。実験室の研究により、このウイルスからの単離株が高い病原性を有し、ヒトにおいて死を引き起こし得ることが示されている。
【０００４】
他の２種のトリインフルエンザウイルス：Ｈ７Ｎ７及びＨ９Ｎ２が、最近、ヒトにおいて疾病を引き起こすことが見出されている。
【０００５】
全てのＡ型インフルエンザウイルスは、遺伝子が変わりやすく、宿主防御を逃れるようにうまく適合する。インフルエンザウイルスは、複製の間に生じる誤りの「校正」及び修復のための機能を欠く。これらの修正されない誤りの結果として、ウイルスの遺伝子組成が、ヒト及び動物において複製するにつれて変化し、新しい抗原性変異株が出現する。インフルエンザＡウイルスの抗原性組成におけるこれらの一定で永遠でかつ通常小さい変化は、抗原「ドリフト」として知られている。
【０００６】
インフルエンザウイルスは、比較的安定な細胞内核タンパク質及びエンベロープ関連マトリクスタンパク質に基づいてＡ型又はＢ型に分類される。ウイルスの亜型は、ウイルスエンベロープの２つのタンパク質、ヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）に基づき、これらは定常的に抗原性変化を受ける。ＨＡの１６個の異なる亜型と、ＮＡの９つの亜型がインフルエンザＡウイルスについて認識されている。新しい亜型の突然の出現（抗原シフト）は、前世紀に３つの主な世界的流行、１９１８年（スペイン風邪、Ｈ１Ｎ１）、１９５７年（アジア風邪、Ｈ２Ｎ２）及び１９６８年（香港風邪、Ｈ３Ｎ２）を引き起こしている。
【０００７】
インフルエンザウイルスは、公衆衛生上の懸念が大きい２つ目の特徴を有する。インフルエンザＡウイルスは、任意の種の亜型の間で遺伝要素を交換又は「再組み合わせ」でき、新規な亜型をもたらす。抗原「シフト」として知られるこの再組み合わせプロセスは、ヒトにおいて世界的な世界的流行をもたらしている。
【０００８】
インフルエンザの世界的流行は、ヒトからヒトへ容易に伝染する新しいウイルス亜型が出現したときに、平均的に、各世紀に３〜４回発生している。２０世紀には、世界的に推定４０００万〜５０００万の死者を生じさせた１９１８〜１９１９年の大規模なインフルエンザの世界的流行に続いて、１９５７〜１９５８年及び１９６８〜１９６９年の世界的流行があった。専門家は、別のインフルエンザ世界的流行は避けられず、今にも起こる可能性があると推測する。インフルエンザウイルスの予測不可能な挙動に鑑みて、次の世界的流行の時期もその重篤さも、全く確実には予測できない。
【０００９】
７つの可変Ｂ細胞エピトープと、１つの可変Ｔ細胞エピトープは、インフルエンザＡ（Ｈ５亜型）のヘマグルチニンＨＡ１タンパク質上で見出される抗原ドリフト部位を一括して表す。それぞれのＢ細胞可変エピトープは、立体構造的エピトープを代表し、それらの４つは、２つの不連続アミノ酸ストレッチからなる。ＨＡ１タンパク質上には２つの伸長抗原部位があり、それらのそれぞれは、２つの独特なペプチド配列で表わされる。人工的に連結されて不連続のエピトープを表す隣接していないセグメント（アミノ酸のストレッチ）は、Ａ／ｄｕｃｋ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／３／９７ヘマグルチニン（ＰＤＢ  ＩＤコード：１ＪＳＭ）の３次元構造を用いて選択される。結晶学的データの使用は、タンパク質の天然の立体構造的エピトープを模倣できる直鎖状ペプチドを設計する助けとなる。Ｔ細胞エピトープは、脂質付加されていてもよい直鎖状ペプチド配列により表わされる。
【００１０】
現在までに、トリインフルエンザンに対する有効なペプチドベースのワクチンは、市販されていない。
【００１１】
現在の抗ウイルス療法は、健康な成人及び子供においてはインフルエンザＡウイルス株に対して臨床的に有効であり得る。しかし、これらの療法は、限界を有する。これらの薬剤のいくつかは高価であり、供給が制限されている。ワクチン組成物は、また、抗原ドリフトのために、集団内で循環するウイルスの変化を原因として、毎年変更されなければならない。著しい量の新しい有効なワクチンを製造するためには、少なくとも４か月の開発時間が必要である。
【００１２】
免疫原性ペプチド混合物の調製方法は、本明細書に参照により組み込まれる米国特許第７，１１８，８７４号において、及びＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＣＡ０６／０００８９１号においてＴｏｒｒｅｓにより記載されている。これらの方法の１つに従って、病原体の免疫原性エピトープ配列の可変性が評価される。ペプチド混合物は、選択されたエピトープの可変残基で異なるアミノ酸が見出される頻度を表す複数のペプチドを含んで合成される。
【００１３】
つまり、トリインフルエンザの多種の亜型及び多種の変異株に対して有効なワクチン製剤を開発する必要性が存在する。
【００１４】
［発明の概要］
本発明の目的は、従来のインフルエンザワクチン製剤の少なくとも１つの短所を回避するか、又は緩和することである。
【００１５】
第１の態様において、本発明は、配列番号１〜４９６及びそれらの類似体からなる群より選択される少なくとも１つのペプチドを含むペプチドベースの抗インフルエンザ製剤を提供する。特に、本発明は、配列番号１〜２４８及びそれらの類似体からなる群より選択される少なくとも１つのペプチドを含むペプチドベースの抗インフルエンザ製剤を提供する。さらに、本発明は、配列番号２４９〜４９６及びそれらの類似体からなる群より選択される少なくとも１つのペプチドを含む製剤を提供する。例示的な実施形態において、本発明は、配列番号１〜２１２からなる群より選択される少なくとも１つのペプチドを含む製剤、配列番号２４９〜４６０からなる群より選択される少なくとも１つのペプチドを含む製剤、ａ）配列番号１〜２１２、及びｂ）配列番号２４９〜４６０からなる群より選択されるペプチドを含む製剤；ａ）配列番号２１３〜２４８、及びｂ）配列番号４６１〜４９６からなる群より選択されるペプチドを含む製剤；ａ）配列番号１〜２４８、及びｂ）配列番号２４９〜４９６からなる群より選択されるペプチドを含む製剤；又はａ）配列番号１〜４０、及びｂ）配列番号２４９〜２８８からなる群より選択されるペプチドを含む製剤を提供する。
【００１６】
本発明の別の例示的な実施形態において、製剤は、以下の群：ａ）配列番号１〜２４；ｂ）配列番号２５〜４０；ｃ）配列番号４１〜６４；ｄ）配列番号６５〜８８；ｅ）配列番号８９〜１２０；ｆ）配列番号１２１〜１４４；ｇ）配列番号１４５〜１７６、ｈ）配列番号１７７〜２１２；ｉ）配列番号２４９〜２７２；ｊ）配列番号２７３〜２８８；ｋ）配列番号２８９〜３１２；ｌ）配列番号３１３〜３３６；ｍ）配列番号３３７〜３６８；ｎ）配列番号３６９〜３９２；ｏ）配列番号３９３〜４２４；又はｐ）配列番号４２５〜４６０の少なくとも１つ由来の少なくとも１つのペプチド配列を含む。
【００１７】
本発明のさらに別の例示的な実施形態において、製剤は、以下の群：ａ）配列番号１〜２４；ｂ）配列番号２５〜４０；ｃ）配列番号４１〜６４；ｄ）配列番号６５〜８８；ｅ）配列番号８９〜１２０；ｆ）配列番号１２１〜１４４；ｇ）配列番号１４５〜１７６、ｈ）配列番号１７７〜２１２、ｉ）配列番号２４９〜２７２；ｊ）配列番号２７３〜２８８；ｋ）配列番号２８９〜３１２；ｌ）配列番号３１３〜３３６；ｍ）配列番号３３７〜３６８；ｎ）配列番号３６９〜３９２；ｏ）配列番号３９３〜４２４；又はｐ）配列番号４２５〜４６０の少なくとも１つ由来の２ｎ個のペプチド配列を含み、ここでｎは１〜４である。
【００１８】
製剤は、配列番号２１３〜２４８、又は配列番号４６１〜４９６由来の少なくとも１つのペプチド配列をさらに含み得る。
【００１９】
本発明のさらなる態様において、配列番号１〜４９６及びそれらの類似体からなる群より選択される少なくとも１つのペプチドを、医薬的に許容される希釈剤又は担体とともに含む製剤を含むワクチンが提供される。ワクチンは、アジュバントをさらに含み得る。一例において、アジュバントはミョウバンである。
【００２０】
抗ウイルス製剤は、抗インフルエンザ製剤であり得る。より具体的には、抗インフルエンザ製剤は、鳥類の抗インフルエンザ製剤であり得る。
【００２１】
本発明のさらなる態様において、配列番号１〜４９６及びそれらの類似体からなる群より選択される少なくとも１つのペプチドを含む製剤の、ワクチンの調製のための使用が提供される。ワクチンは、必要とする動物においてインフルエンザを予防又は治療するために用い得る。例示的な一実施形態において、インフルエンザはトリインフルエンザである。本発明は、ヒト又は動物において免疫応答を誘導し、トリインフルエンザ又はトリインフルエンザに由来するインフルエンザの新規な亜型に対する防御を与える方法であって、ヒト又はその他の動物に本明細書で記載されるペプチドベースのワクチンを投与するステップを含む方法にさらに関する。
【００２２】
本発明のさらなる態様において、本明細書に記載される抗ウイルス製剤のような抗ウイルス製剤を調製する方法が提供される。一実施形態によると、配列番号１〜２１２由来のペプチドを調製する方法であって、トリインフルエンザウイルスタンパク質の不連続エピトープの１次配列を表す直鎖状配列を決定するステップであり、そのエピトープが、そのタンパク質が折り畳まれた立体配置にあるときに互いに近傍にあるステップと、直鎖状配列を表すペプチドを合成するステップとを含む方法が提供される。別の実施形態において、配列番号１〜２１２由来の任意の２つのペプチド配列を含むペプチド混合物を調製する方法であって、トリインフルエンザウイルスタンパク質の不連続エピトープの１次配列を表す直鎖状配列を決定するステップであって、そのエピトープが、そのタンパク質が折り畳まれた立体配置であるときに互いに近傍にあり、その不連続エピトープが可変残基を含むステップと、可変残基にて少なくとも２つの異なるアミノ酸を含むペプチド混合物を合成するステップとを含む方法が提供される。
【００２３】
さらに別の態様において、本発明は、インフルエンザウイルスの少なくとも１つのヘマグルチニン（ＨＡ）抗原を含有するペプチドの混合物を含む抗インフルエンザワクチンに全般的に関する。ヘマグルチニン（ＨＡ）は、有効な免疫原であり、ウイルス中和抗体は、ＨＡの可変領域に対して誘導される。単離ペプチド混合物は、ヘマグルチニンの多種の可変領域の変異体を表す。つまり、本発明の一態様によると、単離ペプチドの混合物を含む抗ウイルス製剤であって、その混合物が、トリインフルエンザウイルスＨＡタンパク質の可変領域に基づいて製剤され、その単離ペプチドの混合物が、ＨＡ又はＨＡ１タンパク質の可変領域の変異体を表し、その可変領域のそれぞれが、複数の可変アミノ酸残基を含み、それらの少なくとも１つが２つ以上のアミノ酸により表わされる抗ウイルス製剤が提供される。
【００２４】
一実施形態において、抗ウイルス製剤中の複数の可変アミノ酸残基は、３つ以上の残基を含む。１又は複数の上記のトリインフルエンザタンパク質は、ＨＡ又はＨＡ１であり得る。
【００２５】
本発明の他の態様及び特徴は、付随する図面と併わせて本発明の具体的な実施形態の以下の記載を参照すると、当業者に明らかになるであろう。
本発明の実施形態を、ここで、添付の図面を参照して、ほんの一例として記載する。添付の図面は、以下のとおりである。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】未精製のＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ１ペプチド配列（配列番号２４９〜２７２に相当）の分析ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図２】未精製のＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ２ペプチド配列（配列番号２７３〜２８８に相当）の分析ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図３】未精製のＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ３ペプチド配列（配列番号２８９〜３１２に相当）の分析ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図４】未精製のＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ４ペプチド配列（配列番号３１３〜３３６に相当）の分析ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図５】未精製のＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ５ペプチド配列（配列番号３３７〜３６８に相当）の分析ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図６】未精製のＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ６ペプチド配列（配列番号３６９〜３９２に相当）の分析ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図７】未精製のＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ７ペプチド配列（配列番号３９３〜４２４に相当）の分析ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図８】未精製のＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ８ペプチド配列（配列番号４２５〜４６０に相当）の分析ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図９】未精製のＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ１ペプチド配列（配列番号２４９〜２７２に相当）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す図である。
【図１０】未精製のＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ２ペプチド配列（配列番号２７３〜２８８に相当）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す図である。
【図１１】未精製のＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ３ペプチド配列（配列番号２８９〜３１２に相当）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す図である。
【図１２】未精製のＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ４ペプチド配列（配列番号３１３〜３３６に相当）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す図である。
【図１３】未精製のＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ５ペプチド配列（配列番号３３７〜３６８に相当）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す図である。
【図１４】未精製のＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ６ペプチド配列（配列番号３６９〜３９２に相当）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す図である。
【図１５】未精製のＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ７ペプチド配列（配列番号３９３〜４２４に相当）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す図である。
【図１６】未精製のＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ８ペプチド配列（配列番号４２５〜４６０に相当）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す図である。
【図１７】未精製の脂質付加ＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ８ペプチド配列（配列番号４６１〜４９６に相当）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す図である。
【図１８Ａ】（ａ）〜（ｈ）は、コンセンサス配列の下に可変残基を伴う、本発明の異なるバリオサイト（ｖａｒｉｏｓｉｔｅ）ペプチド配列を示す図である。図１８（ａ）はＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ１であり；図１８（ｂ）はＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ２であり；図１８（ｃ）はＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ３であり；図１８（ｄ）はＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ４であり；図１８（ｅ）はＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ５であり；図１８（ｆ）はＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ６であり；図１８（ｇ）はＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ７であり：図１８（ｈ）はＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ８である。  図１８（ｉ）は、図１８（ｈ）中のコンセンサス配列に基づく異なる脂質付加バリオサイトペプチド配列を示す図である。
【図１８Ｂ】（ａ）〜（ｈ）は、コンセンサス配列の下に可変残基を伴う、本発明の異なるバリオサイト（ｖａｒｉｏｓｉｔｅ）ペプチド配列を示す図である。図１８（ａ）はＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ１であり；図１８（ｂ）はＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ２であり；図１８（ｃ）はＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ３であり；図１８（ｄ）はＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ４であり；図１８（ｅ）はＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ５であり；図１８（ｆ）はＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ６であり；図１８（ｇ）はＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ７であり：図１８（ｈ）はＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ８である。  図１８（ｉ）は、図１８（ｈ）中のコンセンサス配列に基づく異なる脂質付加バリオサイトペプチド配列を示す図である。
【図１９】免疫化後の本発明のワクチンによる体液性免疫の誘導を示すグラフである。青色のバー（上のバー）＝ＡｖｉＦｌｕワクチンＩＮＦＡ−０２Ｌ＋ミョウバン；赤色のバー（上から２つ目のバー）＝アジュバントなしのＡｖｉＦｌｕワクチンＩＮＦＡ−０２Ｌ；紫色のバー（真ん中のバー）＝ＡｖｉＦｌｕワクチンＩＮＦＡ−０２Ｐ＋モンタニド；緑色のバー（下から２つ目のバー）＝ＡｖｉＦｌｕワクチンＩＮＦＡ−０２Ｐ＋ミョウバン；黒色のバー（下のバー）＝対照。
【図２０】Ｈ５Ｎ１の曝露に対するワクチン接種されたマウスの生存プロットを示すグラフである。上からの凡例：黒色＝対照；緑色＝ＩＮＦＡ−０２Ｐ＋ミョウバン；紫色＝ＩＮＦＡ−０２Ｐ＋モンタニド；赤色＝アジュバントなしのＩＮＦＡ−０２Ｌ；青色＝ＩＮＦＡ−０２Ｌ＋ミョウバン。
【図２１】ＨＡＩ力価により測定される、マウスにおけるワクチン接種後のＩＮＦＡ−０２Ｐ（ＩＮＦＡ−ＨＡ−１−（Ｖ１〜Ｖ８））による体液性免疫の誘導に対する、ＩＮＦＡ−０１Ｐ（ＩＮＦＡ−ＨＡ−１−（Ｖ１〜Ｖ２））による体液性免疫の誘導を示すグラフである。青色のバー（下のバー）＝ＩＮＦＡ−０１Ｐ＋モンタニド；紫色のバー（真ん中のバー）＝ＩＮＦＡ−０２Ｐ＋モンタニド；黒色のバー（上のバー）＝対照。
【図２２】Ｈ５Ｎ１の曝露に対する、ＩＮＦＡ−０１Ｐ（ＩＮＦＡ−ＨＡ−１−（Ｖ１〜Ｖ２））をワクチン接種されたマウスの生存プロットを示す。上からの凡例：黒色＝対照；青色−ＩＮＦＡ−０１Ｐ＋モンタニド。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
全般的に、本発明は、抗インフルエンザ製剤、より具体的には鳥類の亜型を含むインフルエンザＡに対するワクチンを提供する。
【００２８】
第１の態様において、本発明は、配列番号１〜４９６及びそれらの類似体からなる群より選択される少なくとも１つのペプチドを含むペプチドベースの抗インフルエンザ製剤を提供する。特に、本発明は、配列番号１〜２４８及びそれらの類似体からなる群より選択される少なくとも１つのペプチドを含むペプチドベースの抗インフルエンザ製剤を提供する。また、本発明は、配列番号２４９〜４９６及びそれらの類似体からなる群より選択される少なくとも１つのペプチドを含む製剤を提供する。例示的な実施形態において、本発明は、配列番号１〜２１２からなる群より選択される少なくとも１つのペプチドを含む製剤、配列番号２４９〜４６０からなる群より選択される少なくとも１つのペプチドを含む製剤、ａ）配列番号１〜２１２、及びｂ）配列番号２４９〜４６０からなる群より選択されるペプチドを含む製剤；ａ）配列番号２１３〜２４８、及びｂ）配列番号４６１〜４９６からなる群より選択されるペプチドを含む製剤；ａ）配列番号１〜２４８、及びｂ）配列番号２４９〜４９６からなる群より選択されるペプチドを含む製剤；又はａ）配列番号１〜４０、及びｂ）配列番号２４９〜２８８からなる群より選択されるペプチドを含む製剤を提供する。
【００２９】
本発明の別の例示的な実施形態において、製剤は、以下の群の少なくとも１つ由来の少なくとも１つのペプチド配列を含む：ａ）配列番号１〜２４；ｂ）配列番号２５〜４０；ｃ）配列番号４１〜６４；ｄ）配列番号６５〜８８；ｅ）配列番号８９〜１２０；ｆ）配列番号１２１〜１４４；ｇ）配列番号１４５〜１７６、ｈ）配列番号１７７〜２１２；ｉ）配列番号２４９〜２７２；ｊ）配列番号２７３〜２８８；ｋ）配列番号２８９〜３１２；ｌ）配列番号３１３〜３３６；ｍ）配列番号３３７〜３６８；ｎ）配列番号３６９〜３９２；ｏ）配列番号３９３〜４２４；又はｐ）配列番号４２５〜４６０。
【００３０】
本発明のさらに別の例示的な実施形態において、製剤は、以下の群の少なくとも１つ由来の２ｎ個のペプチド配列を含む：ａ）配列番号１〜２４；ｂ）配列番号２５〜４０；ｃ）配列番号４１〜６４；ｄ）配列番号６５〜８８；ｅ）配列番号８９〜１２０；ｆ）配列番号１２１〜１４４；ｇ）配列番号１４５〜１７６、ｈ）配列番号１７７〜２１２、ｉ）配列番号２４９〜２７２；ｊ）配列番号２７３〜２８８；ｋ）配列番号２８９〜３１２；ｌ）配列番号３１３〜３３６；ｍ）配列番号３３７〜３６８；ｎ）配列番号３６９〜３９２；ｏ）配列番号３９３〜４２４；又はｐ）配列番号４２５〜４６０、ここで、ｎは１〜４である。
【００３１】
製剤は、配列番号２１３〜２４８又は配列番号４６１〜４９６由来の少なくとも１つのペプチド配列をさらに含み得る。
【００３２】
本発明のさらなる態様において、配列番号１〜４９６及びそれらの類似体からなる群より選択される少なくとも１つのペプチドを、医薬的に許容される希釈剤又は担体とともに含む製剤を含むワクチンが提供される。ワクチンは、アジュバントをさらに含み得る。一例において、アジュバントはミョウバンである。
【００３３】
抗ウイルス製剤は、抗インフルエンザ製剤であり得る。より具体的には、抗インフルエンザ製剤は、鳥類の抗インフルエンザ製剤であり得る。
【００３４】
本発明のさらなる態様において、配列番号１〜４９６及びそれらの類似体からなる群より選択される少なくとも１つのペプチドを含む製剤の、ワクチンの調製のための使用が提供される。ワクチンは、必要とする動物でインフルエンザを予防又は治療するために用い得る。例示的な一実施形態において、インフルエンザはトリインフルエンザである。本発明は、ヒト又は動物において免疫応答を誘導し、トリインフルエンザ又はトリインフルエンザに由来するインフルエンザの新規な亜型に対する防御を与える方法であって、ヒト又はその他の動物に本明細書で記載されるペプチドベースのワクチンを投与するステップを含む方法にさらに関する。
【００３５】
本発明の別の態様において、本明細書に記載される抗ウイルス製剤のような抗ウイルス製剤を調製する方法が提供される。一実施形態によると、配列番号１〜２１２由来のペプチドを調製する方法であって、トリインフルエンザウイルスタンパク質の不連続エピトープの１次配列を表す直鎖状配列を決定するステップであり、そのエピトープが、そのタンパク質が折り畳まれた立体配置にあるときに互いに近傍にあるステップと、その直鎖状配列を表すペプチドを合成するステップとを含む方法が提供される。別の実施形態において、配列番号１〜２１２由来の任意の２つのペプチド配列を含むペプチド混合物を調製する方法であって、トリインフルエンザウイルスタンパク質の不連続エピトープの１次配列を表す直鎖状配列を決定するステップであり、そのエピトープが、そのタンパク質が折り畳まれた立体配置であるときに互いに近傍にあり、その不連続エピトープが可変残基を含むステップと、可変残基にて少なくとも２つの異なるアミノ酸を含むペプチド混合物を合成するステップとを含む方法が提供される。
【００３６】
さらに別の態様において、本発明は、インフルエンザウイルスの少なくとも１つのヘマグルチニン（ＨＡ）抗原を含有するペプチドの混合物を含む抗インフルエンザワクチンに全般的に関する。ヘマグルチニン（ＨＡ）は、有効な免疫原であり、ウイルス中和抗体は、ＨＡの可変領域に対して誘導される。単離ペプチド混合物は、ヘマグルチニンの多種の可変領域の変異体を表す。つまり、本発明の一態様によると、単離ペプチドの混合物を含む抗ウイルス製剤であって、その混合物が、トリインフルエンザウイルスＨＡタンパク質の可変領域に基づいて製剤され、その単離ペプチドの混合物が、ＨＡ又はＨＡ１タンパク質の可変領域の変異体を表し、その可変領域のそれぞれが、複数の可変アミノ酸残基を含み、それらの少なくとも１つが２つ以上のアミノ酸により表わされる抗ウイルス製剤が提供される。
【００３７】
一実施形態において、抗ウイルス製剤中の複数の可変アミノ酸残基は、３つ以上の残基を含む。１又は複数の上記のトリインフルエンザタンパク質は、ＨＡ又はＨＡ１であり得る。
【００３８】
ワクチンは、各ペプチドについての特定の残基での変動を示す又は示さない状態で製剤することができる。変動が示されない場合、形成されるペプチドは、本明細書において、ディスコトープ（Ｄｉｓｃｏｔｏｐｅ）（商標）構築物という。ディスコトープ構築物は、不連続エピトープを構成する１次配列区間の位置を近似する直鎖状配列合成構築物である。個々の区間は、元の完全なタンパク質で見出される不連続エピトープを認識する免疫応答を惹起するように順次構築される。
【００３９】
不連続エピトープは、正しく折り畳まれたときに一緒になり、特定の抗体により結合される、タンパク質の１次配列の２つ以上のセグメントから構成される。これらは、２次構造が失われ、それにより連続的な直鎖状ペプチドとして表わされなくなると、抗体により認識されない。
【００４０】
その特定の病原体についての異なる配列に従って表わされる異なるアミノ酸を有することが知られている特定の残基に変動が存在する場合、製剤は、いくつかのペプチドを含み、これは集合的に、本明細書でディスコサイト（Ｄｉｓｃｏｓｉｔｅ）（商標）構築物と称することができる。
【００４１】
エピトープの設計
ヘマグルチニンは、インフルエンザウイルスの主要表面糖タンパク質であり、これに対してウイルス中和抗体が誘導される有効な免疫原である。我々は、ＨＡの抗原部位上で不連続Ｂ細胞エピトープ及びＴ細胞エピトープを模倣する８つのペプチドを設計した。これらのペプチドの配列は、ペプチドエピトープを決定する、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質の結晶構造の解析に基づいて決定される。ヘマグルチニンは、インフルエンザウイルスの主要表面糖タンパク質であり、これに対してウイルス中和抗体が誘導される有効な免疫原である。カクテル中の直鎖状ペプチドエピトープは、ＨＡタンパク質表面上の不連続エピトープを模倣する。何千ものヒトインフルエンザ単離株由来のＨＡタンパク質の抗原変異を分析するバイオインフォマティクスソフトウェアを用いて、これらのエピトープに基づく縮重ペプチドカクテルを、これらのエピトープ内でＨＡの抗原変異を示すものとして調製できる。つまり、本発明のインフルエンザワクチン製剤は、ＨＡタンパク質の主要エピトープを表すペプチドのカクテルを含む。
【００４２】
ＨＡは、インフルエンザウイルスの主要エンベロープ糖タンパク質であり、ウイルスの宿主細胞内への侵入を媒介する。天然ＨＡは、ウイルスの感染性の前提条件として、アミノ末端ＨＡ１とカルボキシ末端ＨＡ２とに酵素的に切断される３つのＨＡモノマーの会合により形成される。ＨＡ１の３次元構造に基づいて、抗原部位は、抗原変異体のアミノ酸変化を決定することによりマッピングされている。抗原変異は、抗体が近づくことができない受容体結合ポケットの周りの残基を含んで、ＨＡの受容体結合領域の周囲に最もよく見られた。これらの抗原部位に対するモノクローナル抗体は、全く同じ配列が存在する場合に、インフルエンザウイルスの感染性を中和する。Ｔ及びＢ細胞エピトープはともに、これらの部位で見出される。
【００４３】
ＭＡＢ又はその他の方法により選択されたウイルスエスケープ変異体において文書化されているすべてのアミノ酸の変化を、分析した。タンパク質を整列させ、これらのアミノ酸の位置を、ヘマグルチニンＨ５の３Ｄ構造上にマッピングした。エピトープの位置を、免疫圧を受けるアミノ酸の周囲の領域として、ヘマグルチニンＨ５において大まかに予測した。抗原部位を、次いで、抗原決定基が、Ｂ細胞抗体について自由に近づくことができ、同じエピトープの異なるセグメントが互いに近傍に（例えば２０Ａ以内）存在するはずであるとの意味で、Ａ／ｄｕｃｋ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／３／９７ヘマグルチニン（ＰＤＢ  ＩＤコード：１ＪＳＭ）の３次元構造を用いて再評価した。
【００４４】
構築されたエピトープ内の可変部位でのアミノ酸の出現は、２００５年６月２８日現在のＬｏｓ  Ａｌａｍｏｓデータベースから入手可能なインフルエンザＡ（亜型Ｈ５）ウイルスのヘマグルチニンＨＡ１株を分析することにより評価した。全ての宿主由来の４６０個又は３８個のみのヒトヘマグルチニンＨＡ１株のいずれかを、分析に用いた。可変残基は、その位置での最も頻度が高いアミノ酸の出現が、調べた全てのウイルス配列のうちの８５％未満である位置として定義した。
【００４５】
複数の可変アミノ酸残基は、３つ以上の残基を含んでよく、それぞれの可変位置に２つ以上の異なるアミノ酸を含んでよい。
【００４６】
インフルエンザワクチンを含むペプチドの一部又は全ては、脂質付加されてよい。
【００４７】
不連続エピトープは、天然で３次元の立体配置のときに非常に近傍に存在する、タンパク質の１次配列の２つ以上のセグメントで構成される。これらは、２次又は３次構造が失われると、抗体により認識されない。したがって、直鎖状ペプチドは、伝統的に、不連続エピトープを示すために用いることができない。インフルエンザヘマグルチニンからの結晶学的データを用いて、少なくとも５つの立体配置のエピトープを示す直鎖状配列を設計した。
【００４８】
それぞれの可変エピトープから、ペプチドの長さを選択し、そのペプチド内で、複数の可変残基を選択する。それぞれの可変残基は、ウイルスの配列決定されたバージョンに天然に出現することが見出された少なくとも２つの任意選択のアミノ酸を有する。このようにして、高い程度の可変性が示される。例えば、３又は４つの可変残基が、ペプチド混合物中で示され、それぞれが、インフルエンザ変異体についての配列決定されたデータベースの記録に示される２つ以上の異なるアミノ酸を有することができる。２つの可変残基が可変領域に出現する場合、２２個の異なるペプチドが、その特定の領域を示す混合物中で用いられるだろう。３又は４つの可変残基が超可変領域に示される場合、得られる混合物中のペプチドの数は、それぞれ２３及び２４個である。一般に、可変領域が、それぞれの部位でａ、ｂ、ｃ…個の異なるアミノ酸を有するＡ、Ｂ、Ｃ…個の可変領域からなる場合、ペプチドの総数は、Ａａ×Ｂｂ×Ｃｃ…であろう。
【００４９】
タンパク質、可変エピトープ、ペプチドの長さ、及び可変残基が一旦選択されると、ペプチド混合物の合成が、ペプチド合成の任意の利用可能な方法に従って行われる。
【００５０】
ペプチド混合物は、ほぼ等モル量で示されるそれぞれ異なるペプチド配列を有して合成される。しかし、それぞれのペプチドの等モル量を用いることは要求されない。
【００５１】
ペプチドの脂質付加は、当業者には知られているであろうが、任意の通常の又は利用可能な経路により行ってよい。ペプチドは、脂質付加される必要はないが、パルミチン酸のような任意の許容される脂質を用いて脂質付加することにより、ペプチドが細胞膜を通過することを可能にすることが、あるペプチドにとって有利であることがある。脂質を組み込んだペプチドは、Ｃ末端にＫＳＳモチーフを配置することが有利であり得る。脂質を組み込んだペプチドは、ペプチド１個当たり１つ又は複数の脂質部分、例えば２つの脂質部分を含有してよい。脂質付加されたペプチドを用いる免疫化は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答の増進をもたらすことがある。
【００５２】
本発明の一態様に従うペプチド（すなわち、配列番号１〜２１２、及び配列番号２４９〜４６０に相当）は、ヘマグルチニン上のＨ５抗原部位に由来する８つの群を形成する。これらの群は、ＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ１、ＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ２、ＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ３、ＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ４、ＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ５、ＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ６、ＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ７及びＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ８と表わされる。これらの群は、以下の配列を含有する：
２４個のペプチド変異体からなる群ＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ１（配列番号１〜２４及び配列番号２４９−２７２）、ＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ３（配列番号４１〜６４及び配列番号２８９〜３１２）、ＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ４（配列番号６５〜８８及び配列番号３１３〜３３６）、及びＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ６（配列番号１２１〜１４４及び配列番号３６９〜３９２）；
３２個のペプチド変異体からなる群ＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ５（配列番号８９〜１２０及び配列番号３３７〜３６８）、及びＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ７（配列番号１４５〜１７６及び配列番号３９３〜４２４）；
１６個のペプチド変異体からなる群ＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ２（配列番号２５〜４０及び配列番号２７３〜２８８）；
３６個のペプチド変異体からなる群ＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ８（配列番号１７７〜２１２及び配列番号４２５〜４６０）。
【００５３】
ペプチド配列の典型的な調製の間に、付加的な残基（グリシン残基のような）を、配列の末端に付加してよい。付加的なグリシン残基を有するペプチドに相当する配列は、配列番号２４９〜４９６に示す。付加的なグリシン残基は、ペプチドの機能に本質的な影響を有さず、グリシン残基の存在は、単に、当業者によく理解されるであろうペプチド合成の産物である。さらに、このために、このようにして通常合成されるペプチドは、本発明の一態様に従う製剤の調製において用いられるペプチドの「類似体」（以下に記載されるとおり）の典型的な例を表す。
【００５４】
図１及び９は、ペプチド群ＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ１に関する。図１は、未精製のＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ１ペプチドの分析ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図９は、未精製のＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ１ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す。
【００５５】
図２及び１０は、ペプチド群ＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ２に関する。図２は、未精製のＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ２ペプチドの分析ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図１０は、未精製のＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ２ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す。
【００５６】
図３及び１１は、ペプチド群ＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ３に関する。図３は、未精製のＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ３ペプチドの分析ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図１１は、未精製のＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ３ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す。
【００５７】
図４及び１２は、ペプチド群ＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ４に関する。図４は、未精製のＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ４ペプチドの分析ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図１２は、未精製のＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ４ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す。
【００５８】
図５及び１３は、ペプチド群ＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ５に関する。図５は、未精製のＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ５ペプチドの分析ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図１３は、未精製のＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ５ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す。
【００５９】
図６及び１４は、ペプチド群ＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ６に関する。図６は、未精製のＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ６ペプチドの分析ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図１４は、未精製のＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ６ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す。
【００６０】
図７及び１５は、ペプチド群ＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ７に関する。図７は、未精製のＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ７ペプチドの分析ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図１５は、未精製のＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ７ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す。
【００６１】
図８及び１６は、ペプチド群ＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ８に関する。図８は、未精製のＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ８ペプチドの分析ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図１６は、未精製のＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ８ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す。
【００６２】
図１７は、未精製の脂質付加ＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ８ペプチド配列（配列番号２１３〜２４８に相当）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す。配列番号２１３〜２４８は、配列番号１７７〜２１２の脂質付加バージョンである。
【００６３】
図１８は、可変アミノ酸残基を含む本発明のバリオサイトを示す。図１８（ａ）は、群ＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ１のペプチドを示す。図１８（ｂ）は、ＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ２のペプチドを示す。図１８（ｃ）は、ＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ３のペプチドを示す。図１８（ｄ）は、ＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ４のペプチドを示す。図１８（ｅ）は、ＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ５のペプチドを示す。図１８（ｆ）は、ＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ６のペプチドを示す。図１８（ｇ）は、ＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ７のペプチドを示す。図１８（ｈ）は、ＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ８のペプチドを示す。
【００６４】
ワクチン製剤の設計
本発明の関係において、ワクチン製剤は、インフルエンザワクチンの調製に用いられるペプチドのカクテルである。ワクチンは、ペプチドのカクテルと、含まれることが許容されることが見出されるはずである、当該技術分野において知られるその他の置換物とを含み得る。これらの置換物は、限定されないが、アジュバント、希釈剤及び／又は担体を含み得る。
【００６５】
本願において用いられる場合、ペプチド「類似体」は、１つ又は複数の残基が付加、欠失、挿入又は置換されているが、ペプチドの機能に対して本質的な影響がない変異体を含み得る。つまり、本発明の一態様によるペプチド類似体は、ＨＡに対する抗体又はＴ細胞応答を誘導し得るはずである。１つの残基（又は複数の残基）を、ペプチドのいずれかの末端に付加又はその末端から欠失させるか、ペプチド内から欠失させるか、ペプチド内に挿入するか、又はペプチド内の１つ若しくは複数の残基について置換してよい。当業者には理解されるであろうが、１つ又は複数のペプチド残基を、ペプチドの機能をなお維持しながら付加、欠失、挿入又は置換してよい。例えば、５つ以上もの多くの残基をペプチドのいずれかの末端に付加若しくはその末端から欠失させるか、又はペプチド内に挿入してよく、本発明の関係におけるペプチド類似体とみなしてよい。さらなる例において、ペプチド内の１つ又は複数の残基の同類置換は、ペプチド類似体をもたらし得る。当業者にはよく理解されるであろうが、同類置換は、１つのアミノ酸残基の、例えば極性、電荷、疎水性若しくは芳香性のような１つ又は複数の類似の化学的特性を有する別のアミノ酸残基での置換を含む。
【００６６】
本発明のワクチン製剤は、トリインフルエンザの治療におけるワクチンの調製に特に適する。しかし、ペプチド配列の任意の組み合わせ、又はこれらのペプチド配列を含む製剤を、他のインフルエンザ表現型に用いてよいことが認識される。
【００６７】
本発明のワクチンは、それぞれのペプチド内の特定の残基での変動を有するか又は有さないペプチド混合物から製剤してよい。変動が存在しない場合、形成されるペプチドは、本明細書において、コンセンサスエピトープという。その特定のウイルス変異株又は亜型についての異なる配列により示される別のアミノ酸を有することが知られている特定の残基にて変動が存在する場合、製剤は、集合的に可変エピトープ又は「バリオサイト」と称されるいくつかのペプチドを含む。
【００６８】
ペプチドワクチンは、ＨＡの３次元構造に含まれるエピトープを示す配列番号１〜２１２又は配列番号２４９〜４６０からの１つ又は複数のペプチド配列のプールを用いて調製できる。ワクチンは、配列番号２１３〜２４８又は配列番号４６１〜４９６からの１つ又は複数のペプチドを含む、１つ又は複数の脂質付加ペプチドをさらに含んでよい。ワクチンは、１つ若しくは複数のディスコトープ構築物（不変アミノ酸残基を含有するペプチド）又は１つ若しくは複数のディスコサイト構築物（可変アミノ酸残基を含有するペプチド）を含んでよい。本発明のディスコサイト構築物は、これらのエピトープの１つに由来する。つまり、ディスコサイト構築物製剤は、可変残基を含有するエピトープに由来する１つ又は複数のペプチド配列を含む。
【００６９】
本発明のそれぞれのディスコサイト構築物は、ｘ個の変動残基に基づいて、２ｘ個の可能性のあるペプチド配列を示す。例えば、３つ又は４つの可変残基を有するディスコサイト構築物は、２３＝８個又は２４＝１６個の配列をそれぞれ示す。よって、本発明の関係において、本明細書におけるディスコサイト構築物は、可変残基を含むエピトープ配列、及びそれに由来する１つ又は複数の可能性のある配列を含む。必要に応じて、さらなる配列を加えてもよいか、又は加えなくてもよいことが、当業者に認識されるであろう。
【００７０】
ワクチンは、当業者に許容される任意の方法により調製してよい。例えば、これらのペプチドをコードするオリゴヌクレオチドは、送達のためにウイルス又は非ウイルスベクターに挿入してよい。ペプチドは、個別に合成して、許容される製剤を得るために一緒に混合してよい。これらのペプチド抗原を調製できる種々の態様の任意の変動を、本発明で用いることが許容される。
【００７１】
亜型特異的なワクチンを製剤するために、選択されるタンパク質は、対象の亜型で見出される可変性に特徴的な選択された可変アミノ酸を有する可変領域を含んでよい。このことにより、ワクチンが亜型特異的になることが可能になり、このことは、前記亜型内の変異体の間で抗原変異をより良好に表すという利点を有することができる。亜型特殊性がより低いワクチンを製剤するために、最終のペプチド製剤は、異なる亜型特異的製剤を含んでよい。例えば、トリインフルエンザに対して製剤されたワクチンは、特に亜型Ｈ５配列に対する可変残基を標的にし得る。ヒトインフルエンザに対して製剤されたワクチンは、１型、２型及び／又は３型の亜型の配列に特徴的な可変残基を標的にし得る。
【００７２】
種特異的なワクチンを製剤するために、選択されるタンパク質は、対象の種で見出される可変性に特徴的な選択された可変アミノ酸を有する可変領域を含んでよい。このことにより、ワクチンが種特異的になることが可能になり、このことは、その種の変異体のうちで抗原変異をよりよく示すという利点を有することができる。例えば、トリインフルエンザに対して製剤されたワクチンは、特に鳥類Ｈ５配列に対する可変残基を標的にし得る。ヒトインフルエンザに対して製剤されたワクチンは、ヒト及び鳥類の両方のＨ５配列に特徴的な可変領域を標的にし得る。
【００７３】
具体例として、抗ＩＮＦワクチンは、以下の単離ペプチド：配列番号１〜４０、配列番号２４９〜２８８又はそれらのペプチド類似体を、医薬的に許容される担体との組み合わせで含んでよい。
【００７４】
例示的な抗ＩＮＦ製剤は、配列番号１〜２１２、配列番号２４９〜４６０又はそれらのペプチド類似体の１つ又は複数又は全てを、医薬的に許容される担体との組み合わせで含んでよい。製剤は、例えば配列番号２１３〜２４８又は配列番号４６１〜４９６の１つ又は複数のような配列番号１〜２１２又は配列番号２４９〜４６０の１つ又は複数の脂質付加ペプチドも含んでよい。
【００７５】
配列番号１〜２１２、又は配列番号２４９〜４６０の全てのペプチドを、組み合わせでペプチド製剤として用いてよいが、本発明により、これらのペプチドの部分群を一緒に用い得る。例えば、製剤は、以下の群の少なくとも１つ由来の少なくとも１つのペプチド配列を含んでよい：ａ）配列番号１〜２４；ｂ）配列番号２５〜４０；ｃ）配列番号４１〜６４；ｄ）配列番号６５〜８８；ｅ）配列番号８９〜１２０；ｆ）配列番号１２１〜１４４；ｇ）配列番号１４５〜１７６、ｈ）配列番号１７７〜２１２、ｉ）配列番号２４９〜２７２；ｊ）配列番号２７３〜２８８；ｋ）配列番号２８９〜３１２；ｌ）配列番号３１３〜３３６；ｍ）配列番号３３７〜３６８；ｎ）配列番号３６９〜３９２；ｏ）配列番号３９３〜４２４；又はｐ）配列番号４２５〜４６０。さらに、本発明のワクチンは、以下の群の少なくとも１つ由来の２ｎ個のペプチド配列を含む製剤を含んでよい：ａ）配列番号１〜２４；ｂ）配列番号２５〜４０；ｃ）配列番号４１〜６４；ｄ）配列番号６５〜８８；ｅ）配列番号８９〜１２０；ｆ）配列番号１２１〜１４４；ｇ）配列番号１４５〜１７６、ｈ）配列番号１７７〜２１２、ｉ）配列番号２４９〜２７２；ｊ）配列番号２７３〜２８８；ｋ）配列番号２８９〜３１２；ｌ）配列番号３１３〜３３６；ｍ）配列番号３３７〜３６８；ｎ）配列番号３６９〜３９２；ｏ）配列番号３９３〜４２４；又はｐ）配列番号４２５〜４６０、ここで、ｎは１〜４である。
【実施例】
【００７６】
ペプチド合成
ペプチドは、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）化学を用いる固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）により、パイオニア（Ｐｉｏｎｅｅｒ）（商標）自動ペプチド合成機で、記載されるように、あらかじめ装填したＦｍｏｃ保護ノバシン（ＮｏｖａＳｙｎ）（商標）ＴＧＴ樹脂（ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ）を用いて合成した。所定の位置にて可変性が所望される場合、２つのアミノ酸の混合物をその位置に配置する。これを、可変性が所望される全ての場所に、合成の間にその都度反復する。ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３テトラメチルウロニウム  テトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）及びＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）の１Ｍ溶液、並びにＯＭＦ中のジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）の１Ｍ溶液をアミノ酸のカップリングに用い、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンを合成の間のアミノ酸のブロッキングの解除に用いた。室温にて１時間、カップリングを行った。最後のアミノ酸がカップリングした後に、樹脂を合成機から取り出し、焼結ガラスろうと上でＯＭＦ、２−プロパノール、及びジクロロメチレン（ＤＣＭ）を用いて数回洗浄し、高真空で乾燥させた。ペプチド混合物を切断し、ＴＦＡ／水／フェノール／チオアニソール／ＥＤＴ／ＴＩＳ［８２：５：５：５：２：１］を含有する溶液の添加により脱保護した。樹脂を、室温にて４時間インキュベートした。切断混合物を、次いで、減圧下に、１０倍容量の冷エーテルを含有するフラスコ中に濾過した。樹脂も、ＴＦＡで２回、同じエーテル溶液中にすすぎ入れた。さらなる沈殿を補助するために冷凍庫で３０分間インキュベートした後に、試料を１，０００×ｇで５分間遠心分離して、エーテルを除去した。この抽出プロセスを３回繰り返した。最後のエーテル抽出の後に、残存有機溶媒を窒素ガスの下で蒸発させ、ペプチド混合物を水に再溶解し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて精製した。過剰の溶媒は、ロータリーエバポレータを用いて除去し、最後に凍結乾燥して乾燥粉末を得た。質量分析及びアミノ酸分析を、全てのディスコトープについて行って、それらが適切なペプチド成分を有することを確かめた。
【００７７】
脂質付加は、次のようにして行う。合成機で混合ペプチド製剤の合成が完了すると、樹脂をカラムから回収して、バイアルに入れる。１０等量のパルミチン酸、１０等量のＴＢＴＵ及び１０等量のＨＯＢＴ（全て樹脂に対して）を、ＤＭＦ（１０ｍｌ／０．１ｍｍｏｌ樹脂）中に溶解する。溶液を、バイアル中のペプチド付加樹脂に加える。２０等量（樹脂に対して）のＤＩＰＥＡを加える。ＤＩＰＥＡを滴下することによりｐＨを８〜９に調整する。バイアルをねじ蓋で密閉し、混合物を一晩振とうする（少なくとも１２時間）。
【００７８】
ワクチンの効力
本発明のペプチド配列を含むワクチン製剤を、マウスで試験した。用いたワクチンは、次のとおりである。
２つのバリオサイトであるＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ１及びＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ２（配列番号２４９〜２８８）からなる、ＡｖｉＦｌｕ−２（モンタニド）ともよばれるＩＮＦ−０１Ｐ。
８つのバリオサイトであるＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ１〜ＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ８（配列番号２４９〜４６０）からなり、ＡｖｉＦｌｕ−８（モンタニド）、ＡｖｉＦｌｕ（モンタニド）、ＡｖｉＦｌｕ（ミョウバン）ともよばれるＩＮＦ−０２Ｐ。
９つのバリオサイトであるＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ１〜ＩＮＦＡ−Ｈ５−１−Ｖ８Ｌ（配列番号２４９〜４９６）からなり、ＡｖｉＦｌｕ（脂質付加）、ＡｖｉＦｌｕ（脂質付加／ミョウバン）ともよばれるＩＮＦ−０２Ｌ。
【００７９】
図１９は、免疫化後の本発明のワクチンによる体液性免疫の誘導を示す。
【００８０】
図２０は、Ｈ５Ｎ１の曝露に対する本発明のワクチンをワクチン接種されたマウスの生存プロットを示す。
【００８１】
図２１は、ＨＡＩ力価により測定される、マウスにおけるワクチン接種後のＩＮＦＡ−０２Ｐ（ＩＮＦＡ−ＨＡ−１−（Ｖ１〜Ｖ８））による体液性免疫の誘導に対するＩＮＦＡ−０１Ｐ（ＩＮＦＡ−ＨＡ−１−（Ｖ１〜Ｖ２））による体液性免疫の誘導を示す。
【００８２】
図２２は、Ｈ５Ｎ１の曝露に対する、ＩＮＦＡ−０１Ｐ（ＩＮＦＡ−ＨＡ−１−（Ｖ１〜Ｖ２））をワクチン接種されたマウスの生存プロットを示す。
【００８３】
上記の本発明の実施形態は、例に過ぎないことを意図する。代替、改変及び変形形態は、添付の特許請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を逸脱することなく、当業者により、特定の実施形態に対して行うことができる。
【００８４】
参考文献：
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２．  Ｋａｖｅｒｉｎ，  Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  （２００２），  ８３，  ２４９７−２５０５．
３．  Ｈｉｏｅ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  （１９９０），  ６４（１２），  ６２４６−６２５１．
４．  Ｈａ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  ＵＳＡ  （２００１），  ９８，  １１１８１−１１１８６．
５．  Ｍａｃｋｅｎ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  ‘Ｔｈｅ  ｖａｌｕｅ  ｏｆ  ａ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｎ  ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ  ａｎｄ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．’  ｉｎ  Ｏｐｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ＩＶ．  Ａ．Ｄ．Ｍ．Ｅ．  Ｏｓｔｅｒｈａｕｓ，  Ｎ．  Ｃｏｘ  ＆  Ａ．Ｗ．  Ｈａｍｐｓｏｎ（Ｅｄｓ．）  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ：  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２００１，  １０３−１０６．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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