(57)【要約】  本明細書では、自己免疫疾患の診断に関する新規のバイオマーカーパネル、並びに、自己免疫疾患を有することが疑われる個体試料中において、これらのバイオマーカーを検出する方法及びキットが提供される。また、自己免疫疾患の進行をモニターする方法、並びに、自己免疫疾患に対する治療の有効性及び副作用をモニターする方法も提供される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己免疫疾患を有することが疑われる個体の検査試料中において１つ又は複数の標的抗体を検出する方法であって、
ａ）個体に由来する検査試料を、その各々が表１の自己抗原又は標的抗体により認識されるエピトープを含むそのフラグメントを含む、１つ又は複数の標的抗原と接触させるステップと、
ｂ）１つ又は複数の標的抗原に対する、検査試料中における１つ又は複数の抗体の結合を検出し、これにより、検査試料中における１つ又は複数の標的抗体の存在を検出するステップと
を含む方法。
【請求項２】
１つ又は複数の標的抗原が、固体支持体上に固定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
検査試料を、表１の２つ以上の標的抗原又はエピトープを含むそのフラグメントと接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
検査試料を、表１の２０以上の標的抗原又はエピトープを含むそのフラグメントと接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
検査試料を、表１の５０以上の標的抗原又はエピトープを含むそのフラグメントと接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
検査試料を、表１の１００以上の標的抗原又はエピトープを含むそのフラグメントと接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
検査試料を、表１のすべての標的抗原又はエピトープを含むそのフラグメントと接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
検査試料が、個体に由来する細胞、組織、又は体液を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
検査試料が、個体に由来する血液、血清、血漿、滑液、脳脊髄液、細胞溶解物、又は唾液を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
検査試料中における１つ又は複数の標的抗原に結合した１つ又は複数の抗体の量を検出するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
検査試料中における１つ又は複数の抗体に対する１つ又は複数の標的抗原の結合が、イムノアッセイを用いて決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
検査試料に由来する１つ又は複数の抗体が、１つ又は複数の標的抗原の少なくとも１０に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
検査試料に由来する１つ又は複数の抗体が、１つ又は複数の標的抗原の少なくとも２０に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
検査試料に由来する１つ又は複数の抗体が、１つ又は複数の標的抗原の少なくとも５０に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
個体における関節リウマチを診断する方法であって、
ａ）個体に由来する検査試料を、その各々が表２の自己抗原又はエピトープを含むそのフラグメントを含む、１つ又は複数の標的抗原と接触させるステップと、
ｂ）検査試料中における１つ又は複数の抗体に対する１つ又は複数の標的抗原の結合を検出するステップと
を含み、１つ又は複数の標的抗原に対して結合した１つ又は複数の抗体の存在が関節リウマチを示す方法。
【請求項１６】
１つ又は複数の標的抗原が、固体支持体上に固定される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
検査試料を、表２の２つ以上の標的抗原又はエピトープを含むそのフラグメントと接触させる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
検査試料を、表２の１０以上の標的抗原又はエピトープを含むそのフラグメントと接触させる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
検査試料を、表２の２０以上の標的抗原又はエピトープを含むそのフラグメントと接触させる、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
検査試料を、表２のすべての標的抗原又はエピトープを含むそのフラグメントと接触させる、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
検査試料が血清試料である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
検査試料に由来する１つ又は複数の抗体が、１つ又は複数の標的抗原の少なくとも１０に結合する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
検査試料に由来する１つ又は複数の抗体が、１つ又は複数の標的抗原の少なくとも２０に結合する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
１つ又は複数の標的抗原が、白血球受容体クラスターメンバー１２を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
個体における全身性エリテマトーデスを診断する方法であって、
ａ）個体に由来する検査試料を、その各々が表３の自己抗原又はエピトープを含むそのフラグメントを含む、１つ又は複数の標的抗原と接触させるステップと、
ｂ）検査試料中における１つ又は複数の抗体に対する１つ又は複数の標的抗原の結合を検出するステップと
を含み、１つ又は複数の標的抗原に対して結合した１つ又は複数の抗体の存在が全身性エリテマトーデスを示す方法。
【請求項２６】
１つ又は複数の標的抗原が、固体支持体上に固定される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
検査試料を、表３の２つ以上の標的抗原又はエピトープを含むそのフラグメントと接触させる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
検査試料を、表３の２０以上の標的抗原又はエピトープを含むそのフラグメントと接触させる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
検査試料を、表３の５０以上の標的抗原又はエピトープを含むそのフラグメントと接触させる、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
検査試料を、表３のすべての標的抗原又はエピトープを含むそのフラグメントと接触させる、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
検査試料が血清試料である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
検査試料に由来する１つ又は複数の抗体が、１つ又は複数の標的抗原の少なくとも１０に結合する、請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】
検査試料に由来する１つ又は複数の抗体が、１つ又は複数の標的抗原の少なくとも２０に結合する、請求項２５に記載の方法。
【請求項３４】
検査試料を、その各々が表４の自己抗原又はそのフラグメントを含む、１つ又は複数の標的抗原と接触させる、請求項２５に記載の方法。
【請求項３５】
個体における抗好中球細胞質抗体関連疾患を診断する方法であって、
ａ）個体に由来する検査試料を、その各々が表５の自己抗原又はエピトープを含むそのフラグメントを含む、１つ又は複数の標的抗原と接触させるステップと、
ｂ）検査試料中における１つ又は複数の抗体に対する１つ又は複数の標的抗原の結合を検出するステップと
を含み、１つ又は複数の標的抗原に対して結合した１つ又は複数の抗体の存在が抗好中球細胞質抗体関連疾患を示す方法。
【請求項３６】
１つ又は複数の標的抗原が、固体支持体上に固定される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
検査試料を、表５の２つ以上の標的抗原又はエピトープを含むそのフラグメントと接触させる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
検査試料を、表５の２０以上の標的抗原又はエピトープを含むそのフラグメントと接触させる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
検査試料を、表５の５０以上の標的抗原又はエピトープを含むそのフラグメントと接触させる、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
検査試料を、表５のすべての標的抗原又はエピトープを含むそのフラグメントと接触させる、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
検査試料が血清試料である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４２】
検査試料に由来する１つ又は複数の抗体が、１つ又は複数の標的抗原の少なくとも１０に結合する、請求項３５に記載の方法。
【請求項４３】
検査試料に由来する１つ又は複数の抗体が、１つ又は複数の標的抗原の少なくとも２０に結合する、請求項２５に記載の方法。
【請求項４４】
検査試料を、その各々が表６の自己抗原又はそのフラグメントを含む、１つ又は複数の標的抗原と接触させる、請求項３５に記載の方法。
【請求項４５】
自己免疫疾患を有すると診断された個体に由来する検査試料中における１つ又は複数の標的抗体をモニターする方法であって、
ａ）個体に由来する第１の検査試料を、１つ又は複数の標的抗原の第１のセットと接触させるステップと、
ｂ）１つ又は複数の標的抗原に対する、検査試料中における１つ又は複数の抗体の結合を検出し、これにより、第１の検査試料中における１つ又は複数の標的抗体の存在を検出するステップと、
ｃ）個体に由来する第２の検査試料を、１つ又は複数の標的抗原の第２のセットと接触させるステップと、
ｄ）１つ又は複数の標的抗原に対する、検査試料中における１つ又は複数の抗体の結合を検出し、これにより、第２の検査試料中における１つ又は複数の標的抗体の存在を検出するステップと、
ｅ）第１の検査試料に由来する１つ又は複数の抗体の存在を、第２の検査試料に由来する１つ又は複数の抗体の存在と比較するステップと
を含み、１つ又は複数の標的抗原の各々が、表１の自己抗原又はエピトープを含むそのフラグメントを含む方法。
【請求項４６】
第２の検査試料が、第１の検査試料よりも後に個体から採取される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
ａ）第１の検査試料及び第２の検査試料中における１つ又は複数の標的抗原に結合した１つ又は複数の抗体の量を検出するステップと、
ｂ）第１の検査試料に由来する結合した抗体の量を、第２の検査試料に由来する結合した抗体の量と比較するステップと
をさらに含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
１つ又は複数の標的抗原の各々が、表２の自己抗原又はエピトープを含むそのフラグメントを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
１つ又は複数の標的抗原の各々が、表３の自己抗原又はエピトープを含むそのフラグメントを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
１つ又は複数の標的抗原の各々が、表５の自己抗原又はエピトープを含むそのフラグメントを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項５１】
自己免疫疾患に対する治療を受ける個体に由来する検査試料中における１つ又は複数の標的抗体をモニターする方法であって、
ａ）個体に由来する第１の検査試料を、１つ又は複数の標的抗原の第１のセットと接触させるステップと、
ｂ）１つ又は複数の標的抗原に対する、第１の検査試料中における１つ又は複数の抗体の結合を検出し、これにより、第１の検査試料中における１つ又は複数の標的抗体の存在を検出するステップと、
ｃ）個体に自己免疫疾患に対する治療を実施するステップと、
ｄ）治療の実施後、個体に由来する第２の検査試料を、１つ又は複数の標的抗原の第２のセットと接触させるステップと、
ｅ）１つ又は複数の標的抗原に対する、第２の検査試料中における１つ又は複数の抗体の結合を検出し、これにより、第２の検査試料中における１つ又は複数の標的抗体の存在を検出するステップと、
ｆ）第１の検査試料に由来する１つ又は複数の抗体の存在を、第２の検査試料に由来する１つ又は複数の抗体の存在と比較するステップと
を含み、１つ又は複数の標的抗原の各々が、表１の自己抗原又はエピトープを含むそのフラグメントを含む方法。
【請求項５２】
自己免疫疾患が関節リウマチである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５３】
１つ又は複数の標的抗原の各々が、表２の自己抗原又はエピトープを含むそのフラグメントを含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
治療が個体への薬剤の投与を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
薬剤がインフリキシマブである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
治療が継続的である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５７】
第１の検査試料が、任意の治療が個体に実施される前に個体から採取される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５８】
個体に由来する１つ又は複数の後続の検査試料を、１つ又は複数の標的抗原の追加のセットと接触させるステップと、
ｅ）１つ又は複数の標的抗原に対する、１つ又は複数の後続の検査試料中における１つ又は複数の抗体の結合を検出し、これにより、後続の検査試料中における１つ又は複数の標的抗体の存在を検出するステップと、
ｆ）後続の検査試料に由来する１つ又は複数の抗体の存在を、第１及び第２の試料に由来する１つ又は複数の抗体の存在と比較するステップと
をさらに含み、１つ又は複数の標的抗原の各々が、表１の自己抗原又はエピトープを含むそのフラグメントを含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５９】
ａ）第１の検査試料及び第２の検査試料中における１つ又は複数の標的抗原に結合した１つ又は複数の抗体の量を検出するステップと、
ｂ）第１の検査試料に由来する結合した抗体の量を、第２の検査試料に由来する結合した抗体の量と比較するステップと
をさらに含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項６０】
自己免疫疾患を診断するキットであって、
ａ）その各々が表１の自己抗原又はエピトープを含むそのフラグメントを含む、１つ又は複数の標的抗原と、
ｂ）１つ又は複数の標的抗原に対する、検査試料中における１つ又は複数の分子の結合を検出する手段と
を含むキット。
【請求項６１】
１つ又は複数の標的抗原に対する対照抗体をさらに含む、請求項６０に記載のキット。
【請求項６２】
２つ以上の標的抗原を含む、請求項６０に記載のキット。
【請求項６３】
２０以上の標的抗原を含む、請求項６０に記載のキット。
【請求項６４】
５０以上の標的抗原を含む、請求項６０に記載のキット。
【請求項６５】
１つ又は複数の標的抗原の各々が、表２の自己抗原又はエピトープを含むそのフラグメントを含む、請求項６０に記載のキット。
【請求項６６】
１つ又は複数の標的抗原の各々が、表３の自己抗原又はエピトープを含むそのフラグメントを含む、請求項６０に記載のキット。
【請求項６７】
１つ又は複数の標的抗原の各々が、表５の自己抗原又はエピトープを含むそのフラグメントを含む、請求項６０に記載のキット。
【請求項６８】
１つ又は複数の標的抗原が、固体支持体上に固定される、請求項６０に記載のキット。
【請求項６９】
１つ又は複数の標的抗原が、高密度タンパク質アレイの一部である、請求項６０に記載のキット。
【請求項７０】
１つ又は複数の標的抗原が、複数の固体支持体上に固定される、請求項６０に記載のキット。
【請求項７１】
固体支持体が平面又はビーズである、請求項７０に記載のキット。
【請求項７２】
１，０００未満のポリペプチドを含む、請求項６０に記載のキット。
【請求項７３】
１００未満のポリペプチドを含む、請求項６０に記載のキット。
【請求項７４】
ポリペプチドの少なくとも７５％が、表１の自己抗原又はエピトープを含むそのフラグメントを含む、請求項６０に記載のキット。
【請求項７５】
ポリペプチドの少なくとも９０％が、表１の自己抗原又はエピトープを含むそのフラグメントを含む、請求項６０に記載のキット。
【請求項７６】
ａ）その各々が表１の自己抗原又はエピトープを含むそのフラグメントを含む、１つ又は複数の標的抗原と、
ｂ）自己免疫疾患を有することが疑われる個体に由来する検査試料と
を含む混合物。
【請求項７７】
１つ又は複数の標的抗原に対する対照抗体をさらに含む、請求項７６に記載の混合物。
【請求項７８】
表１の２つ以上の標的抗原又はエピトープを含むそのフラグメントをさらに含む、請求項７６に記載の混合物。
【請求項７９】
表１の２０以上の標的抗原又はエピトープを含むそのフラグメントをさらに含む、請求項７６に記載の混合物。
【請求項８０】
表１の５０以上の標的抗原又はエピトープを含むそのフラグメントをさらに含む、請求項７６に記載の混合物。
【請求項８１】
表１の１００以上の標的抗原又はエピトープを含むそのフラグメントをさらに含む、請求項７６に記載の混合物。
【請求項８２】
表１のすべての標的抗原又はエピトープを含むそのフラグメントをさらに含む、請求項７６に記載の混合物。
【請求項８３】
検査試料が、個体に由来する細胞、組織、又は体液を含む、請求項７６に記載の混合物。
【請求項８４】
検査試料の１つ又は複数の抗体が、１つ又は複数の標的抗原に結合する、請求項７６に記載の混合物。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
[001]本出願は、本開示との齟齬が生じない程度において、参照により、その全体において本明細書に組み込まれる、２００６年１１月２２日に出願の米国特許仮出願第６０／８６７，０２２号の利益を主張する。
【発明の背景】
【０００２】
[002]本発明は、全般に、自己免疫疾患、具体的に、関節リウマチ（ＲＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、及び抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連疾患に関連するバイオマーカー、並びに、自己免疫疾患の診断、予後診断、及び進行のモニタリングのための方法、組成物及びキットに関する。
【０００３】
[003]自己抗体の発現は、自己免疫障害及び多数の癌において観察される。このため、自己抗体が標的とするタンパク質（本明細書では、「自己抗原」と称する）は、有効なバイオマーカーであり、潜在的な診断アッセイ及び予後診断アッセイの他、疾患の進行及び治療への応答をモニターする手法の基盤を形成する。しかし、これらに適用される自己抗原バイオマーカーの効果的な使用は、しばしば、１つではなく多数のバイオマーカーの同定を条件とする。これは、任意の所与のタンパク質に対する自己抗体の発現が、通例では、一部の患者においてのみ見られるという観察（Ａ．Ｆｏｓｓａら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ、第５９巻、４４０〜７頁、２００４年６月１日；Ｓ．Ｓ．Ｖａｎ  Ｒｈｅｅら、Ｂｌｏｏｄ、第１０５巻、３９３９〜４４頁、２００５年）の結果である。自己抗原の現行の同定法は、厄介で技術的に困難であり、感度が低く、再現性に乏しい。したがって、疾患を診断及び治療するステップを容易としうる、疾患特異的マーカーのパネルを同定することは、厄介で時間がかかる。
【０００４】
[004]自己抗原同定に広く用いられる一手法は、ＳＥＲＥＸ法：ｃＤＮＡ発現ライブラリーの血清学的解析である。この手法は、癌の自己抗原同定に最も適切であり、腫瘍特異的なラムダＧＴ１１  ｃＤＮＡ発現ライブラリーの作製の後、患者の血清を用いるプラークリフトの免疫学的スクリーニングを伴う。ＳＥＲＥＸ法は、ＮＹ−ＥＳＯ−１を過剰発現する患者の約２０〜５０％において自己抗原性のタンパク質である、癌の自己抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１を同定することに用いられて成功した（Ｙ．Ｔ．Ｃｈｅｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、第９４巻、１９１４〜８頁、１９９７年）。しかし、明らかに有用ではあるが、ＳＥＲＥＸ法は、ハイスループットの手法ではなく、高価で、労力集約型であり、洗練された分子生物学の手法における習熟を要し、通例では偽陽性率が高く、細菌性タンパク質の発現に依存するため、翻訳後修飾を要する自己抗原を同定することができない（Ｕ．Ｓａｈｉｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、第９２巻、１１８１０〜３頁、１９９５年）。より近年では、結腸癌及び肺癌の自己抗原を同定するのに、逆相タンパク質マイクロアレイ法が用いられている（Ｍ．Ｊ．Ｎａｍら、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、第３巻、２１０８〜１５頁、２００３年；Ｆ．Ｍ．Ｂｒｉｃｈｏｒｙら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、第９８巻、９８２４〜９頁、２００１年）。これらのアレイは、癌細胞ホモジネートを画分化することにより作製し、これらをマイクロアレイ上のスポットに配列し、患者の血清によりこれらをプローブし、抗体の結合を検出する。その後、質量分析法に基づく技法を用いて、実際の自己抗原を同定するが、この工程は時間がかかり、単調となりうる。
【０００５】
[005]機能的タンパク質のマイクロアレイ法は、バイオマーカーを同定するのに用いうる別の方法である。これらのタンパク質マイクロアレイ法は、血清試料をプロファイリングするための規定の高タンパク質含量により、研究者が自己抗原バイオマーカーを同定できるようにする。ヒトタンパク質マイクロアレイは、ニトロセルロースでコートしたスライドガラス上に固定された、１８００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１００，０００、５００，０００、又は１、０００，０００以上もの精製されたヒトタンパク質を含有しうる。タンパク質マイクロアレイは、罹患した個体に由来する血清によりプローブして、疾患の潜在的なバイオマーカーである反応性タンパク質を同定することができる。昆虫細胞中で発現させたタンパク質を含有するヒトタンパク質マイクロアレイは、適切な翻訳後修飾を含有すると予測される。すべてのタンパク質は、天然の条件下で精製されるので、固定されたタンパク質は、天然の立体構造を維持すると予測される（Ｂ．Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ、Ｐ．Ｐｒｅｄｋｉ、Ｍ．Ｓｎｙｄｅｒ、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、第３巻、２１９０〜９頁、２００３年）。
【０００６】
[006]自己免疫疾患は、体内固有の細胞及び組織に対する過剰活性の免疫応答に起因する。今日では、多数のヒト疾患が明確な自己免疫疾患又は推定自己免疫疾患として分類されており、顕著な例は、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、及び関節リウマチである。自己免疫疾患の原因は、未知であることが多く、前兆又は明確な原因なしに症状が生じうる。症状が人によって大きく異なり、他の障害と混同しやすいため、自己免疫疾患の診断は困難でありうる。自己免疫障害の診断は、日常的な臨床検査で観察される異常と組み合わせた、患者の正確な既往歴及び身体所見に大きく依存する。いくつかの全身性障害では、特定の自己抗体を検出しうる血清学的アッセイを用いることができる。しかし、現行の検査は最終的なものではなく、不正確であることが多い。自己免疫疾患と関連する多数のバイオマーカーについて患者をスクリーニングする能力は、疾患の診断及び治療を改善するであろう。
【０００７】
[007]関節リウマチ（ＲＡ）は、免疫系に関節を攻撃させる、慢性の炎症性自己免疫疾患である。それは、疼痛及び関節破壊に起因する実質的な運動性の喪失をもたらしうる、身体に障害をもたらす疼痛の激しい炎症性状態である。該疾患はまた、皮膚、血管、心臓、肺、及び筋肉を含む全身の関節以外の多数の組織に影響を及ぼすことも多いため、全身性でもある。関節リウマチは、診断が困難でありうる。症状は人によって異なり、ある人々においては他の人々よりも重度でありうる。同じ人の内部でも、あらゆる種類の症状が経時的に発症することがあり、初期段階で存在する症状は少数のみでありうる。また、症状は、他の種類の関節炎及び関節状態の症状と類似することがあり、他の状態を除外するのに一定の時間を要する場合がある。加えて、該疾患に関する単一の検査は存在しない。ＲＡを診断する一助として用いられる一般的な一検査は、該疾患の大半の患者の血液中に最終的には存在する抗体であるリウマチ因子に関するものである。しかし、とりわけ、疾患の初期においては、ＲＡ患者のすべてがリウマチ因子陽性と判定されるわけではない。また、リウマチ因子陽性と判定されるが、該疾患を発症しない人もいる。別の検査では、抗シトルリン化タンパク質（ＡＣＰ）抗体の存在を評価する。他の一般的な臨床検査は、白血球数、貧血症に関する血液検査、及び体内の炎症を測定する、赤血球沈降速度検査を含む。
【０００８】
[008]全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ又はループス）は、免疫系が体内の細胞及び組織を攻撃し、炎症及び組織損傷をもたらす、慢性の、潜在的に衰弱性又は致死性の自己免疫疾患である。ＳＬＥは、体内の任意の部分に影響を及ぼしうるが、心臓、関節（リウマチ性）、皮膚、腎臓、肺、血管、及び脳／神経系を害することが多い。該疾患の最も一般的な症状は、極度の疲労、関節の疼痛又は腫脹（関節炎）、原因不明の発熱、皮疹、及び腎臓問題を含むが、ループスの症例で同様のものは２つと存在しない。徴候及び症状は、人によって著明に異なり、突然発症することもあればゆっくりと発症することもあり、軽度の場合もあれば重度の場合もあり、一過性の場合もあれば持続性の場合もある。該疾患にその名称を与える特徴的な皮疹さえも、あらゆる症例で生じるわけではない。加えて、該疾患と関連する問題は、経時的に変化し、他の多くの障害の問題と重複する。これらの理由で、医師は、当初、徴候及び症状がより明白となるまでは、ループスを考慮しないことがある。その場合でも、ほとんどすべてのループス患者が疾患活性の変動を経験するので、ループスを診断することは困難でありうる。現在のところこの疾患に治癒は存在しないが、ループスは、薬剤、主に、免疫抑制剤により有効に治療することができる。
【０００９】
[009]現在のところ、単一の検査で被験者がループスを有するかどうかを判定することはできないが、いくつかの臨床検査は医師が診断を下す一助となりうる。例えば、抗核抗体（ＡＮＡ）検査は、細胞核の成分に対して反応する自己抗体を探索するのに一般的に用いられる。ループス患者の大半はＡＮＡ陽性と判定されるが、ループス以外にも、感染症、他の自己免疫疾患を含む他の多数のＡＮＡ陽性の原因が存在し、場合によって、ＡＮＡ陽性は健常個体においても見出されることがある。このように、ＡＮＡ検査はループスに関して決定的ではなく、診断を下すのに用いられる多数の考慮事項の１つにすぎない。診断された後にループス又はその症状の進行をモニターするには、他の臨床検査が用いられる。全血球計算、尿検査、血液化学検査、及び赤血球沈降速度（ＥＳＲ）検査は、該疾患の段階又は進行に関する貴重な情報を提供しうる。別の一般的な検査は、補体系タンパク質の血中レベルを測定する。ループス患者は、特に、疾患の増悪時において、高ＥＳＲレベル及び低補体レベルを有することが多い。
【００１０】
[0010]抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）は、好中球の顆粒球及び単球のリソソームの細胞質内分子に対する抗体である（Ｎｉｌｅｓら、Ａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ、第１５６巻、４４０〜５頁、１９９６年）。これらは多数の自己免疫障害において検出されるが、特に、全身性血管炎と関連する。ＡＮＣＡと関連する血管炎は、成人において生じる、もっとも一般的な原発性全身性小血管血管炎である（Ｉ．Ｍａｎｓｉ、Ａ．Ｏｐｒａｎ、及びＦ．Ｒｏｓｎｅｒ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ、第６５巻、１６１５〜２０頁、２００２年）。ＡＮＣＡと関連する小血管血管炎は、顕微鏡的多発性血管炎、ヴェゲナー肉芽腫症、チャーグ−シュトラウス症候群、及び薬剤誘導性血管炎を含む。器官への致死性の傷害が急速に発症することが多く、免疫抑制治療により劇的に緩和されるので、ＡＮＣＡ関連疾患の迅速な診断は極めて重要である。臨床的及び病理学的に同一の疾患を有する患者のうちでＡＮＣＡを有さないのは１０％未満であり、ヴェゲナー肉芽腫症、顕微鏡的多発性血管炎、及びチャーグ−シュトラウス症候群患者の少なくとも９０％が、ＭＰＯ−ＡＮＣＡ又はＰＲ３−ＡＮＣＡを有する（Ｒ．Ｆａｌｋ及びＪ．Ｃ．Ｊｅｎｎｅｔｔｅ、Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ、第１３巻、１９７７〜１９７９頁、２００２年）。このように、ＡＮＣＡ力価と疾患活性との間には緩やかな相関が存在するが、これらの研究はＡＮＣＡアッセイ自体の不正確さにより妨げられる場合がある。一般に、糸球体腎炎、肺出血、特に、肺腎症候群、全身症状を伴う皮膚血管炎、多発単神経炎又は他の末梢性神経障害、遷延性副鼻腔炎又は耳炎、声門下気管狭窄症、及び眼窩後腫瘤を有する患者には、ＡＮＣＡに関する血清学的検査が推奨される。
【００１１】
[0011]自己免疫疾患と関連する多数のバイオマーカーについて患者をスクリーニングする能力は、疾患の診断及び治療を改善するであろう。しかし、個別の単一のマーカーがこの役割を達成しうるとは思われない。自己免疫疾患患者及び癌患者によるアッセイ試験は、全血清を特徴づけて健常個体と罹患個体とを差別化するには、単一の抗原では不十分であることを示した。血清学的検査をもたらす可能な限り多くの自己免疫バイオマーカーを同定しうる手法は、患者に、その抗原プロファイルに関する正確な情報に基づく治療を選択しうるために有益である。当技術分野では、例えば、個体における自己免疫疾患の検出、診断、病期分類、及びモニタリングに多数のバイオマーカーを用いる、非侵襲性、正確、迅速で高感度のアッセイの開発による、自己免疫疾患のケア及び管理において用いうる新規のバイオマーカーの同定に対する必要が存在する。
【発明の概要】
【００１２】
[0012]本発明は、自己免疫疾患に関する信頼できる検査、並びに、特に、ＲＡ、ＳＬＥ、及びＡＮＣＡを検出しうる侵襲性が最小の検査に対する必要を認める。
【００１３】
[0013]本発明は、部分的に、ＲＡ、ＳＬＥ、及びＡＮＣＡの検出、診断、予後診断、病期分類、及びモニタリングに関する自己抗体バイオマーカーコレクションの発見に基づく。本発明は、自己免疫疾患に関するバイオマーカー、特に、自己抗体バイオマーカー、及びバイオマーカー検出パネルを提供する。さらに、本発明は、個体の検査試料中において本発明のバイオマーカーを検出することにより、ＲＡ、ＳＬＥ、及びＡＮＣＡを検出、診断、予後診断、病期分類、及びモニタリングする方法を提供する。
【００１４】
[0014]本発明では、個体における自己免疫疾患の検出、診断、病期分類、及びモニタリングに有用な多数のバイオマーカーを同定する。個体における自己免疫疾患の存在又は不在の決定は、同定されたすべての抗原バイオマーカーに対する抗体が存在又は不在であることを必ずしも必要としない。同様に、個体における自己免疫疾患の存在又は不在の決定は、すべての標的抗原バイオマーカーの存在量が増加又は減少することを必要としない。当技術分野で認識された統計学的方法を用いて、複数の列挙された抗原バイオマーカーに対する抗体の特異的パターンの有意性、又は、バイオマーカー量の増加又は減少の特異的パターンの有意性を決定することができる。
【００１５】
[0015]本発明の一態様では、バイオマーカーとして用いられる何千ものヒトタンパク質を含有するヒトタンパク質マイクロアレイに対して、ＲＡ、ＳＬＥ、及びＡＮＣＡを有すると診断された患者並びに健常患者に由来する血清をプロファイリングした。アレイ上の多数のタンパク質には、ＲＡ、ＳＬＥ、及びＡＮＣＡを有すると診断された患者に由来する抗体が結合したが、健常患者に由来する抗体は結合しなかった。多くのタンパク質は、ＲＡ、ＳＬＥ、又はＡＮＣＡ抗体に対して選択的で、他の疾患群の１つ又は両方においてはほとんど又はまったく結合を示さなかった。加えて、自己免疫疾患を治療するのに用いられる薬剤による治療前後において、ＲＡを有すると診断された患者に由来する血清を、ハイスループットのヒトタンパク質マイクロアレイに対してプロファイリングした。複数のタンパク質において、治療前の標的タンパク質に対する抗体レベルと比較して、治療後の患者抗体レベルが変化した。
【００１６】
[0016]本発明の一実施形態は、個体に由来する検査試料を、その各々が表１（以下に示す）の自己抗原又はエピトープを含むそのフラグメントを含む、１つ又は複数の標的抗原と接触させるステップと、１つ又は複数の標的抗原の結合を検出するステップとにより、自己免疫疾患を有することが疑われる個体に由来する検査試料中の自己抗体を検出する方法であって、１つ又は複数の標的抗原の結合が、検査試料中における１つ又は複数の抗体の存在を検出する方法である。さらなる実施形態では、検査試料に由来する１つ又は複数の抗体が、標的抗原の少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９５％に結合する。本発明の検出法及び診断法で用いられる試料は、任意の種類の試料でありうるが、唾液試料或いは血液試料、又は、血漿若しくは血清など、その画分であることが好ましい。
【００１７】
[0017]別の実施形態は、個体におけるＲＡを診断する方法であって、個体に由来する検査試料を、１つ又は複数の標的抗原に接触させるステップと、検査試料中における１つ又は複数の抗体に対する１つ又は複数の標的抗原の結合を検出するステップとを含み、１つ又は複数の標的抗原に対する１つ又は複数の抗体の存在が関節リウマチを示し、１つ又は複数の標的抗原が表２（以下に示す）又はエピトープを含むそのフラグメントを含む群から選択される方法である。
【００１８】
[0018]別の実施形態は、個体におけるＳＬＥを診断する方法であって、個体に由来する検査試料を、１つ又は複数のバイオマーカーに接触させるステップと、検査試料中における１つ又は複数の抗体に対する１つ又は複数のバイオマーカーの結合を検出するステップとを含み、１つ又は複数のバイオマーカーに対する１つ又は複数の抗体の存在がＳＬＥを示し、１つ又は複数のバイオマーカーが表３（以下に示す）又はエピトープを含むそのフラグメントを含む群から選択される方法である。
【００１９】
[0019]別の実施形態は、個体におけるＡＮＣＡを診断する方法であって、個体に由来する検査試料を、１つ又は複数の標的抗原に接触させるステップと、検査試料中における１つ又は複数の抗体に対する１つ又は複数の標的抗原の結合を検出するステップとを含み、１つ又は複数の標的抗原に対する１つ又は複数の抗体の存在がＡＮＣＡを示し、１つ又は複数の抗原が表５（以下に示す）又はエピトープを含むそのフラグメントを含む群から選択される方法である。
【００２０】
[0020]本発明の別の実施形態は、自己免疫疾患を有する個体に由来する１つ又は複数のヒト抗体を含む組成物であって、その各々が表１の自己抗原又はエピトープを含むそのフラグメントを含む、１つ又は複数の標的抗原に各抗体が結合する組成物である。標的抗原は、固体支持体上に固定してもよく、タンパク質マイクロアレイの一部であってもよい。本発明の別の実施形態は、その各々が表１の自己抗原又はエピトープを含むそのフラグメントを含む２つ以上の標的抗原を含む固体支持体、及び、ヒト抗体対照が免疫検出法に対する陽性対照である、固定ヒト抗体対照である。
【００２１】
[0021]本発明はまた、本明細書で提供される１つ若しくは複数の検査抗原を含むキット、又は、本明細書で提供される１つ若しくは複数の標的抗原も提供する。キットは、試料に由来する抗体の結合を検出する、１つ又は複数の試薬を含む。一部の実施形態において、１つ若しくは複数の検査抗原、又は、キットの１つ若しくは複数の標的抗原は、固体支持体に結合させて提供される。本発明は、標的抗原を１つ又は複数の固体支持体に結合させたバイオマーカー検出パネルを含む、本発明のバイオマーカー検出パネルを含むキットを含む。キットの一部の実施形態において、キットは、検出パネルの標的抗原をチップ又はアレイに結合させた、バイオマーカー検出パネルを提供する。
【００２２】
[0022]一部の実施形態において、本発明は、ＲＡ、ＳＬＥ、又はＡＮＣＡなど、自己免疫疾患の診断指標として同定された１つ又は複数のバイオマーカーを検出する組成物、キット、及び方法を提供する。本発明のさらなる使用は、とりわけ、１）疾患を有する患者の治療に適切な治療手法を選択するツールとして同定された、１つ又は複数の抗原バイオマーカーの検出、２）ワクチン候補物質又は治療標的として検出された、１つ又は複数のバイオマーカーの使用、３）抗体を含む新規治療剤の開発において用いるスクリーニングツールとして同定された、１つ又は複数のバイオマーカーの使用、４）インフリキシマブ（レミケード（登録商標））治療前に患者を層別化するツールとして同定された、１つ又は複数のバイオマーカーの検出、５）インフリキシマブ治療を受けるＲＡ患者におけるＳＬＥ様応答の発現に対する早期の同定用に同定された、１つ又は複数のバイオマーカーの検出、６）改善された抗ＴＮＦ治療の開発に関して観察された、抗ＴＮＦα自己抗体の検出、７）インフリキシマブ療法に対する患者の免疫応答をモニターする代用マーカーとして観察された、抗ＴＮＦα自己抗体応答の検出を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ニトロセルロースでコートしたスライドガラス上にデュプリケートで配列された、５，０００を超える精製したヒトタンパク質を含む、タンパク質マイクロアレイを示す図である。アレイフィーチャーは、その各々が固有のヒトタンパク質及び共通の対照エレメントを含む、４８の異なるサブアレイ中に配列される。個々のサブアレイを右パネルに示す。
【図２】（図２Ａ）３つの希釈液における、図１の５，０００のタンパク質によるマイクロアレイ上でプロファイリングされた、健常ドナー、並びに、ループス患者、ＡＮＣＡ患者、及び関節リウマチ患者に由来する血清を含む１２試料のパネル、並びに評価されたシグナルの分布を示す図である。シグナル強度は、特定の範囲内のシグナルをもたらすフィーチャー数の関数としてプロットされる。（図２Ｂ）各希釈液に対してプロットされた、バックグラウンドの平均シグナルを示す図である。
【図３】タンパク質マイクロアレイデータの３部からなる統計学的解析を示す図である。四分位により規格化したデータに適用されたＭ統計（図３Ａ）、非規格化データに適用されたボルカノ解析（図３Ｂ）、及び四分位により規格化したデータに適用された倍数変化の計算（図３Ｃ）を含む、３つの独立した統計学的手法を用いて、バックグラウンドを差し引いたシグナル強度データを評価した。各解析手段に対して開発された表示の閾値に基づいて、バイオマーカー候補物質を選択した。各統計学的手法を用いて同定された、自己抗原候補物質中の重複を示す。
【図４】Ｍ統計又はボルカノ解析（分類用統計）に基づいて、ＳＬＥ集団又は健常集団において同定された免疫反応性タンパク質から得られたシグナルを示す。カスタムアレイアッセイにおいて上位１００にランク付けされるタンパク質を、元の５，０００タンパク質によるアレイデータに対して評価し、免疫反応性シグナルの再現性を評価した。ｐ値の計算値＜０．０１又は使用シグナル間の差＞１５００を有する、フォーカスアレイ上に含められたタンパク質数を示す（黒色バー）。カスタムアレイデータから計算された値を用いてランク順位を生成し、ｐ値又は使用シグナル間の差のいずれかにより並べ替えた、カスタムアレイ上で上位１００中にランク付けされるタンパク質を、ハッチングを掛けたバーにより示した。（いずれかの測定基準により）カスタムアレイ上における上位１００中にも入る、元のアッセイと同様に有意であると同定されたタンパク質の百分率を示す。
【図５】主成分分析を用いる、集団の分離を示す図である。主成分分析は、全５，０００のヒトタンパク質に由来する非規格化シグナル強度データ（左パネル）、注記された１０のＳＬＥ自己抗原セット（中パネル）、又は１８の自己抗原候補物質セット（右パネル）に対して実施した。最初の３つの主成分の３次元表示を示す。データの正確な記録を確保するため、各プロットは、平面上における２回の１８０度回転として表わす。黒色スポットは、正常試料に対応し、赤色スポットは、ＳＬＥ試料に対応する。奥行のキューは、色の強度（黒色〜灰色及び赤色〜ピンク色）における変化により与えられる。
【図６】ルミネックス（登録商標）法を用いる免疫学的プロファイリングを示す図である。（図６Ａ）ヤギ抗ＧＳＴ抗体と結合させた４つの色彩領域に由来するルミネックス（登録商標）ビーズを示す図である。濃度を上昇させる、精製された組換えＧＳＴとの個別の反応に、１つの色彩領域に由来する抗ＧＳＴ抱合ビーズをインキュベートした。次いで、全４領域に由来するビーズを共に混合し、蛍光標識した第２の抗ＧＳＴ抗体と共にインキュベートした。各ビーズ領域からシグナルを得て、ＧＳＴ濃度の関数としてプロットした。（図６Ｂ）１８の色彩領域に由来するルミネックス（登録商標）ビーズを、ヤギ抗ＧＳＴ抗体に結合させたことを示す図である。ＧＳＴタグを付した、精製組換え自己抗原候補物質との個別の反応に、すべての色彩領域に由来する抗ＧＳＴ抱合ビーズをインキュベートした。次いで、すべての領域に由来するビーズを共に混合し、希釈率の上昇する血清試料と共にデュプリケートでインキュベートした。蛍光標識した抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて、ＧＳＴタグを付したタンパク質に結合した血清ＩｇＧを検出した。すべての血清希釈率を通じて、１つの代表的なタンパク質に対する蛍光強度中央値データをプロットする。エラーバーは、二つ組の解析を通じて計算された標準偏差を示す。（図６Ｃ）カスタムアレイ上での免疫学的プロファイリングにより生成された、バックグラウンドを差し引いたシグナル強度データに対して、実験５により生成された蛍光強度中央値データから計算されたピアソン相関係数を示す図である。
【発明の詳細な説明】
【００２４】
[0029]本発明は、自己免疫疾患に関する自己抗原の同定に基づく。健常個体の他、ＲＡ、ＳＬＥ、及びＡＮＣＡなどの自己免疫疾患を有する患者に由来する血清試料を、ＰｒｏｔｏＡｒｒａｙ（商標）ヒトタンパク質マイクロアレイ（カリフォルニア州、カールスバード、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）上でプロファイリングし、多数の疾患特異的バイオマーカーを同定した。低存在量のタンパク質、天然の立体構造、及び昆虫細胞由来の翻訳後修飾を含む高含量のアレイにより、ＲＡ、ＳＬＥ、及び／又はＡＮＣＡと関連することがかつては知られていなかったバイオマーカーの同定が可能となった。
【００２５】
[0030]自己免疫疾患を有すると診断された患者に由来する血清から得られる抗体が結合した抗原バイオマーカー（ＰｒｏｔｏＡｒｒａｙ（商標）ヒトタンパク質マイクロアレイを用いてプロファイリングした）のリストを、表１に示す。ＲＡ、ＳＬＥ、及びＡＮＣＡ患者に由来する抗体は結合したが、正常な健常個体においては存在しなかったタンパク質を、それぞれ表２、３、及び５に示す。これらのバイオマーカーを含有するマイクロアレイ、又は他のアッセイフォーマットは、該バイオマーカーに結合する患者試料中における抗体の存在を検出する能力を有し、疾患の診断及びモニタリングを可能とする。マイクロアレイ又は他のアッセイは、特定の疾患に対する抗体検出用の、表２におけるＲＡと関連するバイオマーカーなどの特定のバイオマーカー又は特定のバイオマーカー群を含有しうる。
【００２６】
[0031]本発明の一実施形態は、自己免疫疾患を有することが疑われる個体の検査試料中において１つ又は複数の標的抗体を検出する方法であって、ａ）個体に由来する検査試料を、その各々が表１の自己抗原又はエピトープを含むそのフラグメントを含む、１つ又は複数の標的抗原と接触させるステップと、ｂ）１つ又は複数の標的抗原の結合を検出するステップとを含み、１つ又は複数の標的抗原の結合が、検査試料中における１つ又は複数の標的抗体の存在を検出する方法である。さらなる実施形態では、検査試料を、表１の自己抗原又はエピトープを含むそのフラグメントの２つ以上、１０以上、２０以上、５０以上、又はすべてと接触させる。さらなる実施形態では、各バイオマーカーに結合する抗体量が定量的に決定される。
【００２７】
[0032]さらなる実施形態において、自己免疫疾患の存在を示すには、検査試料に由来する抗体が、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、１０、２０、３５、５０、７５、１００、１５０、又は２００の抗原バイオマーカーに結合しなければならない。
【００２８】
[0033]ＲＡ、ＳＬＥ、及びＡＮＣＡを含む自己免疫疾患は、他の自己免疫疾患と複数の自己抗原を共有する。自己免疫疾患はまた、その特定の自己免疫疾患に対して選択的な抗原も有する。患者の検査試料に由来する抗体による、表１からの１つ又は複数の自己抗原に対する結合は、自己免疫疾患の存在を示す。しかし、どの自己免疫疾患が存在するかを決定するには、特定の自己免疫疾患に対して選択的な、１つ又は複数の特異的な自己抗原の結合を要する場合がある。
【００２９】
[0034]本発明の別の実施形態は、個体における関節リウマチを診断する方法であって、ａ）個体に由来する検査試料を、その各々が表２の自己抗原又はエピトープを含むそのフラグメントを含む、１つ又は複数の標的抗原と接触させるステップと、ｂ）検査試料中における１つ又は複数の抗体に対する１つ又は複数の標的抗原の結合を検出するステップとを含み、１つ又は複数の標的抗原に対して結合した１つ又は複数の抗体の存在が関節リウマチを示す方法である。さらなる実施形態では、検査試料を、表２の自己抗原又はエピトープを含むそのフラグメントの２つ以上、１０以上、２０以上、又はすべてと接触させる。さらなる実施形態では、各抗原に結合する抗体量が決定される。
【００３０】
[0035]さらなる実施形態では、検査試料に由来する抗体が、ＲＡ抗原の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、１０、２０、又は３５に結合して、関節リウマチの存在を示す。１つの自己抗原である白血球受容体クラスターメンバー１２（ＢＣ０３３１９５）は、ＲＡには選択的であるが、ＳＬＥ又はＡＮＣＡには選択的でない。さらなる実施形態において、ＲＡを診断するキット及び方法は、１つ又は複数の自己抗原に検査試料を接触させるステップを含み、バイオマーカーの１つが、白血球受容体クラスターメンバー１２である。
【００３１】
[0036]本発明の別の実施形態は、個体における全身性エリテマトーデスを診断する方法であって、ａ）個体に由来する検査試料を、その各々が表３の自己抗原又はエピトープを含むそのフラグメントを含む、１つ又は複数の標的抗原と接触させるステップと、ｂ）検査試料中における１つ又は複数の抗体に対する１つ又は複数の標的抗原の結合を検出するステップとを含み、１つ又は複数の標的抗原に対して結合した１つ又は複数の抗体の存在が全身性エリテマトーデスを示す方法である。さらなる実施形態では、検査試料を、表３の自己抗原の２つ以上、１０以上、２０以上、５０以上、又はすべてと接触させる。さらなる実施形態では、各抗原に結合する抗体量が決定される。
【００３２】
[0037]さらなる実施形態では、検査試料に由来する抗体が、ＳＬＥ抗原の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、１０、２０、３５、５０、７５、１００、又は１５０に結合して、全身性エリテマトーデスの存在を示す。さらなる実施形態において、ＳＬＥを診断するキット及び方法は、１つ又は複数の抗原に検査試料を接触させるステップを含み、自己抗原の１つ又は複数が、表４の自己抗原又はエピトープを含むそのフラグメントから選択される。
【００３３】
[0038]本発明の別の実施形態は、個体における抗好中球細胞質抗体関連疾患を診断する方法であって、ａ）個体に由来する検査試料を、その各々が表５の自己抗原又はエピトープを含むそのフラグメントを含む、１つ又は複数の標的抗原と接触させるステップと、ｂ）検査試料中における１つ又は複数の抗体に対する１つ又は複数の標的抗原の結合を検出するステップとを含み、１つ又は複数の標的抗原に対して結合した１つ又は複数の抗体の存在が抗好中球細胞質抗体関連疾患を示す方法である。さらなる実施形態では、検査試料を、表５の自己抗原の２つ以上、１０以上、２０以上、５０以上、又はすべてと接触させる。さらなる実施形態では、各抗原に結合する抗体量が決定される。
【００３４】
[0039]さらなる実施形態では、検査試料に由来する抗体が、ＡＮＣＡ自己抗原の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、１０、２０、３５、５０、７５、又はすべてに結合して、抗好中球細胞質抗体関連疾患の存在を示す。さらなる実施形態において、ＡＮＣＡを診断するキット及び方法は、１つ又は複数の抗原に検査試料を接触させるステップを含み、自己抗原の１つ又は複数が、表６の自己抗原又はエピトープを含むそのフラグメントから選択される。
【００３５】
[0040]疾患の進行又は寛解は、異なる時点において個体から採取された検査試料を抗原パネルと接触させることによりモニターすることができる。例えば、第２の検査試料は、第１の検査試料の数日後又は数週間後に、患者から採取し、抗原パネルと接触させる。或いは、第２の検査試料又はその後の検査試料は、毎日、毎週、毎月、季節ごと、半年ごと、又は毎年など、定期的な間隔で患者から採取し、抗原パネルに対して検査することができる。異なる時点における患者の検査試料を検査することにより、抗体の存在、及びしたがって、疾患の段階を比較することができる。本発明のさらなる実施形態は、自己免疫疾患を有すると診断された個体に由来する検査試料中における１つ又は複数の標的抗体をモニターする方法であって、ａ）個体に由来する第１の検査試料を、１つ又は複数の標的抗原の第１のセットと接触させるステップと、ｂ）１つ又は複数の標的抗原の結合が、第１の検査試料中における１つ又は複数の標的抗体の存在を検出する、１つ又は複数の標的抗原の結合を検出するステップと、ｃ）個体に由来する第２の検査試料を、１つ又は複数の標的抗原の第２のセットと接触させるステップと、ｄ）１つ又は複数の標的抗原の結合が、第２の検査試料中における１つ又は複数の標的抗体の存在を検出する、１つ又は複数の標的抗原の結合を検出するステップと、ｅ）第１の検査試料に由来する、１つ又は複数の標的抗原に対して結合した１つ又は複数の抗体の存在を、第２の検査試料に由来する、１つ又は複数の標的抗原に対して結合した１つ又は複数の抗体と比較するステップとを含み、１つ又は複数の標的抗原の各々が、表１の自己抗原又はエピトープを含むそのフラグメントを含む方法である。本発明の他の実施形態において、１つ又は複数の標的抗原は、表２、表３又は表５の自己抗原又はエピトープを含むそのフラグメントを含む。
【００３６】
[0041]疾患の進行は、自己抗原に結合する抗体量を定量的に比較することによって、さらにモニターされる。したがって、本発明の別の実施形態は、第１の検査試料及び第２の検査試料中において、１つ又は複数の抗原に対する１つ又は複数の抗体の量を検出するステップと、第１の検査試料に由来する１つ又は複数の抗体の量を、第２の検査試料に由来する１つ又は複数の抗体の量と比較するステップとをさらに含む。
【００３７】
[0042]本発明の別の実施形態は、その各々が表１の自己抗原又はエピトープを含むそのフラグメントを含む、１つ又は複数の標的抗原と、自己免疫疾患を有することが疑われる個体に由来する検査試料とを含む混合物である。該混合物は、場合によって、１つ又は複数の標的抗原に対する対照抗体をさらに含む。さらなる実施形態において、該混合物は、表１の自己抗原又はエピトープを含むそのフラグメントの２つ以上、１０以上、２０以上、５０以上、１００以上、又はすべてを含む。検査試料は、個体に由来する細胞、組織、又は体液を含むがこれらに限定されない。
【００３８】
[0043]本発明では、ＲＡ、ＡＮＣＡ、又はＳＬＥ患者の血清中における抗体により選択的に認識され、潜在的な診断マーカー又は治療標的の新規の候補物質の重要なプールを表す、＞３００のタンパク質を同定する。本発明では、インフリキシマブ（レミケード（登録商標））治療後のＲＡ患者において自己抗体応答の上昇又は低下を示し、患者の層別化及び治療有効性のモニタリングに有用な新規バイオマーカーの重要な群を表す、抗原パネルをさらに同定する。これらのタンパク質によってもまた、インフリキシマブ誘導型ＳＬＥ様症候群へと進行する患者の早期の同定が容易となりうる。
【００３９】
[0044]インフリキシマブ（レミケード（登録商標））は、クローン病、潰瘍性大腸炎、乾癬性関節炎、及び関節リウマチなどの自己免疫疾患を治療するのに用いられる注射用抗体である。該薬剤は、活性ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子アルファ）に結合し、それが細胞表面上におけるＴＮＦ−α受容体にシグナル伝達することを阻止することによって、体内の活性ＴＮＦ−α量を低下させる。サイトカインである腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）に対して向けられた自己抗体は、インフリキシマブ治療の２０週間後における患者に対する、統計学的に最も有意な未治療ＲＡ患者の差別化因子を含む。抗ＴＮＦ−α自己抗体応答の検出は、抗ＴＮＦ抗体に基づく療法に対する改善用のツール、この応答を緩和することを目的とするアジュバント療法の開発ツールとしての他、インフリキシマブに対する宿主応答をモニターするマーカーとしても役立つ。
【００４０】
[0045]インフリキシマブはまた、従来の療法に応答しない若年性関節リウマチの関節炎症、強直性脊椎炎、ブドウ膜炎、乾癬の軽減、及びサルコイドーシスに有用であることも報告されている。インフリキシマブによる治療は、ある種の癌又は自己免疫疾患（ループス様の症候群など）を発症する危険性を増大させる場合がある。
【００４１】
[0046]本発明の別の実施形態は、自己免疫疾患に対する治療を受ける個体に由来する検査試料中における１つ又は複数の標的抗体をモニターする方法であって、ａ）個体に由来する第１の検査試料を、１つ又は複数の標的抗原の第１のセットと接触させるステップと、ｂ）１つ又は複数の標的抗原に対して結合した１つ又は複数の抗体の存在が１つ又は複数の標的抗体を検出する、第１の検査試料中における１つ又は複数の抗体に対する１つ又は複数の標的抗原の結合を検出するステップと、ｃ）個体に自己免疫疾患に対する治療を実施するステップと、ｄ）治療の実施後、個体に由来する第２の検査試料を、１つ又は複数の標的抗原の第２のセットと接触させるステップと、ｅ）１つ又は複数の標的抗原に対して結合した１つ又は複数の抗体の存在が１つ又は複数の標的抗体を検出する、第２の検査試料中における１つ又は複数の抗体に対する１つ又は複数の標的抗原の結合を検出するステップと、ｆ）第１の検査試料に由来する、１つ又は複数の標的抗原に対する１つ又は複数の抗体の存在を、第２の検査試料に由来する、１つ又は複数の標的抗原に対する１つ又は複数の抗体と比較するステップとを含み、１つ又は複数の標的抗原の各々が、表１の自己抗原又はエピトープを含むそのフラグメントを含む方法である。
【００４２】
[0047]１つ又は複数の抗原に対する抗体の結合レベルは、治療の結果として上昇又は低下しうる。一実施形態では、表７Ａの自己抗原に対する結合レベルの低下が、患者における自己免疫疾患の存在を示す。別の実施形態では、表７Ｂの自己抗原に対する結合レベルの上昇が、自己免疫疾患の存在を示す。
【００４３】
[0048]治療を実施するとは、患者に薬剤を経口投与又は静脈内投与するステップを含むがこれに限定されず、患者に投与されて自己免疫疾患を緩和する任意の治療剤、治療手段、又はこれらの組合せを包含することを意味する。自己免疫疾患が関節リウマチである場合、治療は薬剤インフリキシマブを患者に静脈内投与するステップを含んでよい。治療は継続的でありうる、即ち、定期的な間隔で患者に投与されうる。治療経過中においては、患者から複数の検査試料を採取することができる。第１の検査試料は、治療が開始される前に患者から採取されることが好ましい。
【００４４】
[0049]さらなる実施形態では、各検査試料中における１つ又は複数の抗原に対する１つ又は複数の抗体の量が検出され、第１の検査試料に由来する１つ又は複数の抗体の量が、第２の検査試料に由来する１つ又は複数の抗体の量と比較される。
【００４５】
[0050]一実施形態において、治療は関節リウマチに対するものであり、１つ又は複数の標的抗原は、各々、表２の自己抗原又はエピトープを含むそのフラグメントを含む。治療は、患者に対するインフリキシマブ投与であることが好ましい。
【００４６】
[0051]本発明はまた、個体における自己免疫疾患を病期分類する方法も提供する。この方法は、自己免疫疾患を有するヒト患者を同定するステップと、こうしたヒト患者に由来する細胞、組織、又は体液を、本発明の自己免疫疾患に関連するバイオマーカーについて同定するステップとを含む。次いで、バイオマーカーの存在又はレベルを、健常な対照個体の同じ細胞、組織、若しくは体液種別中におけるバイオマーカーレベル、又は、少なくとも１例の健常な対照個体から得られたバイオマーカーレベルの基準範囲と比較する。自己免疫疾患患者において高量で存在すると同定されたバイオマーカータンパク質に対する免疫反応性レベルの上昇は、対照又は基準範囲と比較するとき、検査個体中における自己免疫疾患の存在と関連する。自己免疫疾患患者において低量で存在すると同定されたバイオマーカータンパク質に対する免疫反応性レベルの低下は、対照又は基準範囲と比較するとき、検査個体中における自己免疫疾患の存在と関連する。
【００４７】
定義
[0052]本明細書で用いられる「約」という用語は、基礎パラメータの１０％以内（即ちプラス１０％又はマイナス１０％）の値を指し、場合によって、基礎パラメータの５％以内（即ちプラス５％又はマイナス５％）の値、基礎パラメータの２．５％以内（即ちプラス２．５％又はマイナス２．５％）の値、又は基礎パラメータの１％以内（即ちプラス１％又はマイナス１％）の値、及び、場合によって、変動を有さないパラメータを指す。こうして、「約２０ヌクレオチド長」の距離は、一部の実施形態において、１９若しくは２１ヌクレオチド長の距離（即ち、５％以内の変動）、又は２０ヌクレオチド長の距離（即ち、変動なし）を含む。
【００４８】
[0053]本明細書で用いる「ａ」又は「ａｎ」という冠詞は、それが前置される１つ又は複数の要素を指す（例えば、タンパク質マイクロアレイ［ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ］の場合、タンパク質［“ａ”ｐｒｏｔｅｉｎ］は、１つのタンパク質配列又は複数のタンパク質配列を含みうる）。
【００４９】
[0054]「又は」という用語は、それが指し示す一方又は他方の用語のみに限ることを意味しない。例えば、それは、「Ａ又はＢ」という構造の表現において用いられる通り、Ａのみ、Ｂのみ、又はＡ及びＢの両方を示しうる。
【００５０】
[0055]「バイオマーカー」とは、疾患若しくは状態の進行、又は、疾患若しくは状態に対する治療効果を検出、診断、予後診断、直接に治療、又は測定するのに用いうる生化学的特性物質を意味する。バイオマーカーは、個体における疾患の存在と関連する、核酸、タンパク質、炭水化物、若しくは抗体、又はこれらの組合せを含むがこれらに限定されない。本発明は、ＲＡ、ＳＬＥ、及びＡＮＣＡを有すると診断された対象の血清中に存在する抗体である、ＲＡ、ＳＬＥ、及びＡＮＣＡのバイオマーカーを提供する。本発明におけるバイオマーカー抗体は、その存在量の増大の結果として、自己免疫疾患を有する個体中において反応性の上昇を示す可能性が最も高い自己抗体である。自己抗体は、自己抗原、特に抗体が結合するヒトタンパク質により検出することができる。バイオマーカーは、疾患個体の大半において発現されて臨床値を有するとは限らないことが重要である。受容体チロシンキナーゼＨｅｒ２が過剰に発現されるのは、全乳癌の約２５％であるであることが知られる（Ｊ．Ｓ．Ｒｏｓｓら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、第３巻、３７９〜９８頁、２００４年４月）が、疾患の進行並びに特異的な治療選択肢の臨床的に重要な指標である。
【００５１】
[0056]「生体分子」とは、生体由来の有機分子、例えば、ステロイド、脂肪酸、アミノ酸、ヌクレオチド、糖、ペプチド、ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、複合炭水化物又は脂質を指す。
【００５２】
[0057]「異なって存在する」という表現は、自己免疫疾患を有さない患者（例えば、正常又は健常な患者）から採取した同等の試料と比較した、自己免疫疾患を有する患者から採取した試料中に存在する生体分子（抗体など）の量の差を指す。生体分子は、一方の試料中におけるポリペプチド量が、他方の試料中におけるポリペプチド量と著明に異なる場合、生体分子は２つの試料間で異なって存在する。例えば、他方の試料中に存在するよりも少なくとも約１５０％多い量若しくは少ない量、少なくとも約２００％多い量若しくは少ない量、少なくとも約５００％多い量若しくは少ない量、少なくとも約１０００％多い量若しくは少ない量（例えば、濃度、質量、モル量など）存在する、又は、一方の試料中では検出される（バックグラウンド又は陰性対照よりも著明に大きなシグナルを与える）が他方の試料中では検出されない場合、ポリペプチドは、２つの試料間で異なって存在する。自己免疫疾患を有さない対象と比較して、自己免疫疾患患者から採取された試料中に異なって存在する任意の生体分子を、バイオマーカーとして用いることができる。
【００５３】
[0058]「抗体」とは、１つ若しくは複数の免疫グロブリン遺伝子又はこれらのフラグメントにより実質的にコードされ、エピトープ（例えば、抗原）に特異的に結合しこれを認識するポリペプチドリガンドを指す。認識された免疫グロブリン遺伝子は、カッパ及びラムダ軽鎖定常領域遺伝子、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、及びミュー重鎖定常領域遺伝子、並びに、多種多様な免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。抗体は、例えば、完全な免疫グロブリン、又は、各種のペプチダーゼを伴う消化により産生される多数の十分に特徴づけられたフラグメントとして存在する。これは、例えば、Ｆａｂ’フラグメント、及びＦ（ａｂ）’２フラグメントを含む。本明細書で用いられる「抗体」という用語はまた、全抗体の改変により産生された抗体フラグメント、又は、組換えＤＮＡ法を用いて新規に合成された抗体フラグメントも含む。それはまた、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は単鎖抗体も含む。抗体の「Ｆｃ」部分は、１つ又は複数の重鎖定常領域ドメインであるＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含むが、重鎖可変領域は含まない免疫グロブリン重鎖の一部を指す。「自己抗体」とは、宿主自身のタンパク質又は他の分子に対して向けられた抗体である。本発明では、ハイスループットのマイクロアレイ法を用いて、正常な患者においては存在しないのが通例である、ＲＡ、ＳＬＥ、及びＡＮＣＡ患者に由来する自己抗体を検出した。
【００５４】
[0059]本明細書で用いられる「抗原」又は「検査抗原」という用語は、自己抗体の存在する対象から得られた検査試料をスクリーニングするのに標的として用いられるタンパク質又はポリペプチドを指す。「自己抗原」とは、個体試料中において抗体の存在が検出された抗原を指すのに用いられる。これらの抗原、検査抗原、又は自己抗原は、そのように同定されたタンパク質の任意のフラグメント、特に、免疫学的に検出されるフラグメントを含むことが意図される。これらはまた、免疫学的に検出されるタンパク質分解の産物の他、マーカーのプロセシングされた形態、例えば、「プレ」形態、「プロ」形態、若しくは「プレプロ」形態マーカーなど、翻訳後修飾された形態、又は、除去されて成熟マーカーを形成する「プレ」形態、「プロ」形態、若しくは「プレプロ」形態のフラグメントの他、抗原、検査抗原、及び自己抗原の対立遺伝子変異体及びスプライシング変異体を含むことも意味する。抗原、検査抗原、及び自己抗原の同定又は列挙はまた、これらのアミノ酸配列変異体、例えば、同定された抗原タンパク質、検査抗原タンパク質、及び自己抗原タンパク質と免疫反応性を共有する、フラグメント、ドメイン、又はエピトープを含む配列変異体も含む。同様に、「自己抗原」とは、タンパク質など、自己抗体によって認識される、宿主に対して内因性の分子を指す。
【００５５】
[0060]「エピトープ」とは、本明細書に開示の自己抗原など、抗体によって認識される抗原上の部位である。
【００５６】
[0061]本明細書で用いられる「タンパク質」という語は、全長タンパク質、タンパク質の一部、又はペプチドを指す。タンパク質は、より大型のタンパク質のフラグメント化を介して産生されるか、又は、化学的に合成されうる。タンパク質は、例えば、細菌、酵母、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞などであるがこれらに限定されない種における組換え過剰発現により調製してよい。本発明のタンパク質マイクロアレイ内に置かれるタンパク質は、例えば、融合タンパク質、例えば、精製及び／又は固定において一助となる少なくとも１つの親和性タグを有する融合タンパク質でありうる。本発明の特定の態様では、その一方を用いて精製における一助とし、他方を用いて固定の一助とすることが可能な、少なくとも２つのタグがタンパク質上に存在する。特定の例示的な態様において、タグはＨｉｓタグ、ＧＳＴタグ、又はビオチンタグである。タグがビオチンタグである場合、タグは、市販の試薬（カリフォルニア州、カールスバード、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、タンパク質と会合させることができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてタグがタンパク質と会合する態様では、Ｂｉｏｅａｓｅタグ（カリフォルニア州、カールスバード、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いることができる。
【００５７】
[0062]本明細書で用いられる「ペプチド」、「オリゴペプチド」、及び「ポリペプチド」という用語は、本明細書では、タンパク質と互換的に用いられ、ペプチド結合により連結された隣接するアミノ酸配列を指す。本明細書で用いられる「タンパク質」という用語はまた、タンパク質のアミノ酸修飾を含む翻訳後修飾も含む可能性があり、アミノ酸ベースでない化学基又は生体分子の付加も含みうるポリペプチドを指す。該用語は、１つ又は複数のアミノ酸残基が、対応する自然発生アミノ酸の類似体又は模倣体であるアミノ酸ポリマーの他、自然発生のアミノ酸ポリマーにも該当する。ポリペプチドは改変することができ、例えば、炭水化物残基の付加により糖タンパク質を形成することができる。「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、糖タンパク質の他、非糖タンパク質も含む。
【００５８】
[0063]本明細書で用いられるポリペプチド又はタンパク質の「変異体」とは、基準のポリペプチド又はタンパク質に対して、１つ又は複数のアミノ酸により変更されるアミノ酸配列を指す。本発明では、ポリペプチドの変異体は、基準タンパク質の抗原性又は抗体結合特性を保持する。本発明の好ましい態様において、ポリペプチド又はタンパク質の変異体には、基準タンパク質に結合する能力を有する自己抗体の同じ集団が結合しうる。ポリペプチドの変異体は、少なくとも１５アミノ酸の配列にわたり、基準タンパク質に対する少なくとも６０％の同一性を有することが好ましい。ポリペプチドの変異体は、少なくとも１５アミノ酸の配列にわたり、基準タンパク質に対して少なくとも７０％の同一性を有することがより好ましい。タンパク質の変異体は、例えば、少なくとも１５アミノ酸の配列にわたり、基準タンパク質に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は、少なくとも９９％同一でありうる。本発明のタンパク質の変異体は、例えば、少なくとも２０アミノ酸の配列にわたり、基準ポリペプチドに対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は、少なくとも９９％同一でありうる。変異体は、置換されたアミノ酸が類似の構造的又は化学的特性を有する「保存的」変化（例えば、イソロイシンによるロイシンの置換）を有してよい。変異体はまた、「非保存的」変化（例えば、トリプトファンによるグリシンの置換）も有することがある。類似のわずかな変異はまた、アミノ酸の欠失若しくは挿入、又はその両方も含みうる。免疫学的反応性を消失させることなく、どのアミノ酸残基を置換、挿入、又は欠失させうるかを決定する指針は、当技術分野でよく知られたコンピュータプログラム、例えば、ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアを用いて見出しうる。
【００５９】
[0064]本発明のタンパク質アレイにおいて用いられるタンパク質バイオマーカーは、全タンパク質又は全タンパク質のフラグメントでありうる。タンパク質のフラグメントは、該フラグメントが、抗体により認識されるエピトープを含有する限りにおいて、タンパク質アレイの一部として用いるのに適する。所与の全タンパク質に必要なエピトープは、タンパク質マイクロアレイ法を用いて、及び、ＥＬＩＳＰＯＴ法又はＥＬＩＳＡ法によりマップすることができる。本発明により提供される抗原バイオマーカーは、全タンパク質の他、エピトープを含むそのフラグメントも包含することを意味することが理解される。適切なタンパク質フラグメントは、全長タンパク質アミノ酸配列の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、又は少なくとも５０％を含むのが通例である。本発明の一実施形態において、標的自己抗原のタンパク質フラグメントは、全長タンパク質の少なくとも６つの隣接するアミノ酸、少なくとも１０の隣接するアミノ酸、少なくとも２０の隣接するアミノ酸、少なくとも５０の隣接するアミノ酸、少なくとも１００の隣接するアミノ酸、少なくとも２００の隣接するアミノ酸を含有する。
【００６０】
[0065]本明細書で用いる「バイオマーカー検出パネル」又は「バイオマーカーパネル」とは、バイオマーカーのセット（パネル）に対する検出値に基づく、疾患又は状態の検出、診断、予後診断、病期分類、又はモニタリング用にまとめて提供されるバイオマーカーのセットを指す。
【００６１】
[0066]本発明の方法は、自己免疫疾患を有することが疑われる個体、及び、疾患を有すると診断された個体を含む患者に由来する検査試料に対して実施される。本明細書において用いられる「検査試料」は、好ましくは動物に由来する、最も好ましくはヒトに由来する、細胞若しくは組織試料、又は体液試料など、任意の種類の試料でありうる。試料は、綿棒標本若しくは塗布標本などの組織試料、又は、腫瘍組織を含む、組織の病理試料又は生検試料でありうる。試料はまた、例えば、組織生検物質又は組織剖検物質からの組織抽出物でもありうる。試料はまた、血液、血漿、血清、痰、精液、滑液、脳脊髄液、尿、肺吸引液、乳頭吸引液、涙液、又は洗浄液などであるがこれらに限定されない体液試料でありうる。試料はまた、例えば、ホモジネートなどの細胞抽出物又は組織抽出物、患者から得られる細胞溶解物又は溶解化された組織も含みうる。好ましい試料は、血液試料又は血清試料である。
【００６２】
[0067]「血液」とは、全血液、血漿、血清、又は血液の任意の派生物を含むことを意味する。血液試料は、例えば、血清であってよい。
【００６３】
[0068]「患者」とは、疾患を有すると診断を受けた、又は、疾患の存在について検査を受けた個体である。疾患について検査を受けた患者は、疾患状態の１つ又は複数の指標を有しうるか、又は、疾患状態の任意の指標の不在により疾患の存在についてスクリーニングされうる。本明細書で用いる、疾患を有することが「疑われる」個体は、疾患状態の１つ又は複数の指標を有しうるか、又は、疾患状態の任意の指標の不在により疾患について日常的にスクリーニングされうる集団の一部でありうる。
【００６４】
[0069]自己免疫疾患とは、体内固有の細胞及び組織に対する免疫反応を特徴とする疾患である。関節リウマチ（ＲＡ）は、免疫系に関節を攻撃させる慢性の炎症性自己免疫疾患である。全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ又はループス）は、免疫系が体内の細胞及び組織を攻撃して炎症及び組織損傷をもたらす、慢性で潜在的に衰弱性又は致死性の自己免疫疾患である。ＡＮＣＡは、小血管血管炎などであり、顕微鏡的多発性血管炎、ヴェゲナー肉芽腫症、チャーグ−シュトラウス症候群、及び薬剤誘導性血管炎を含むがこれらに限定されない、抗好中球細胞質抗体の存在を特徴とする任意の自己免疫疾患を指す。
【００６５】
[0070]「自己免疫疾患を有することが疑われる個体」とは、ＲＡ、ＳＬＥ、若しくはＡＮＣＡなどの自己免疫疾患を有すると診断を受けた個体、或いは自己免疫疾患の少なくとも１つの指標を有する個体、或いは年齢的因子、環境的因子、及び／若しくは栄養的因子、又は遺伝的因子のために自己免疫疾患を発症する危険性が高い個体を意味する。
【００６６】
[0071]本明細書で用いられる「アレイ」という用語は、基質上のパターン中における実体の配列を指す。パターンは、２次元的なパターンが通例であるが、パターンはまた、３次元的パターンでもありうる。タンパク質アレイにおいて、実体はタンパク質である。特定の実施形態において、アレイは、マイクロアレイ又はナノアレイでありうる。「ナノアレイ」とは、個別の実体を、０．１ｎｍ〜１０μｍ、例えば、１ｎｍ〜１μｍずつ隔てるアレイである。「マイクロアレイ」とは、アレイ上の実体の密度が少なくとも１００／ｃｍ２であるアレイである。マイクロアレイ上において、個別の実体は、例えば、１μｍを超えて隔てることができる。
【００６７】
[0072]本明細書で用いられる「タンパク質アレイ」という用語は、タンパク質アレイ、タンパク質マイクロアレイ、又はタンパク質ナノアレイを指す。タンパク質アレイは、例えば、「ＰｒｏｔｏＡｒｒａｙ（商標）」、タンパク質高密度アレイ（カリフォルニア州、カールスバード、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、インターネットのサイトＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍで入手できる）を含むがこれに限定されない。ＰｒｏｔｏＡｒｒａｙ（商標）高密度タンパク質アレイは、血清などの複合生体混合物をスクリーニングし、ヒトタンパク質に対して向けられた自己抗体の存在についてアッセイするのに用いることができる。或いは、ヒトタンパク質に対して向けられた自己抗体の存在についてアッセイするのに、本明細書で提供される自己抗原などの自己抗原を含む、自己抗体バイオマーカー検出用のカスタムタンパク質アレイを用いることができる。自己免疫疾患及び癌を含む特定の疾患状態において、自己抗体は、健常個体において観察されるレベルと比較して異なるレベルで発現される。
【００６８】
[0073]「タンパク質チップ」という用語は、本出願では、タンパク質アレイ又はタンパク質マイクロアレイと同義に用いられる。
【００６９】
[0074]本明細書で用いられる「診断」という表現は、患者が所与の疾患又は状態に罹患しているかどうかを当業者が評価及び／又は判定しうる方法を指す。当業者は、１つ又は複数の診断的指標、即ち、その存在、不在、若しくは量が、状態、身体的特徴（組織内又は組織上におけるしこり又は堅い領域）を示すマーカー、又は、生検若しくは試料採取された組織若しくは細胞に対する組織学的又は生化学的解析、或いはこれらの組合せに基づいて、診断を下すことが多い。
【００７０】
[0075]同様に、予後診断は、患者（又は患者から得られた試料）におけるその存在又は量が、所与の経過又は転帰が生じる可能性の徴候となる１つ又は複数の「予後診断指標」を検証することにより決定されることが多い。例えば、１つ又は複数の予後診断指標が、こうした患者から得られた試料中において十分な高レベルに達する場合、該レベルは、患者がより低いマーカーレベルを示す同様の患者と比較して疾患又は状態を有する可能性が高いことの徴候となる場合がある。罹患率又は死亡率の上昇と関連する予後診断指標レベル又は同レベルの変化は、患者における「有害な転帰に対する素因の増加と関連する」と称する。例えば、好ましい予後診断マーカーにより、表１の１つ又は複数の標的抗体を有する患者における自己免疫疾患の発症、又は、自己免疫疾患を有すると診断された患者における該疾患の段階の進行を予測することができる。
【００７１】
[0076]診断指標及び予後診断指標の使用との関係で本明細書において用いられる「相関させる」という用語は、患者における該指標の存在又は量を、所与の状態に罹患することが知られるか、若しくは、所与の状態の危険性を有することが知られる被験者、又は所与の状態を有さないことが知られる被験者における指標の存在又は量と比較することを指す。上述の通り、患者試料中のマーカーレベルは、自己免疫疾患と関連することが知られるレベルと比較することができる。試料のマーカーレベルは、診断と相関するといわれる、即ち、当業者は、マーカーレベルを用いて、患者が自己免疫疾患を有し、これに応じて応答するかどうかを判定することができる。或いは、試料のマーカーレベルを、良好な転帰（例えば、自己免疫疾患の不在など）と関連することが知られるマーカーレベルと比較することができる。好ましい実施形態において、マーカーレベルのプロファイルは、ＲＯＣ曲線を用いると、全般的な可能性又は特定の転帰と相関する。
【００７２】
[0077]本明細書で用いられる「予後診断を決定する」という表現は、当業者が、患者における状態の経過又は転帰を予測しうる方法を指す。「予後診断」という用語は、１００％の精度で状態の経過若しくは転帰、又はさらに、所与の経過若しくは転帰が起こりやすいかどうかを予測することのできる能力を指すわけではない。これよりもむしろ、当業者は、「予後診断」という用語が、特定の経過又は転帰が生じる可能性が高いこと、即ち、所与の状態を示さない個体と比較するとき、経過又は転帰が該状態を示す患者において生じる可能性がより高いことを指すと理解する。例えば、該状態を示さない個体において、所与の転帰の可能性は約３％でありうる。好ましい実施形態において、予後診断は所与の転帰の約５％の可能性、約７％の可能性、約１０％の可能性、約１２％の可能性、約１５％の可能性、約２０％の可能性、約２５％の可能性、約３０％の可能性、約４０％の可能性、約５０％の可能性、約６０％の可能性、約７５％の可能性、約９０％の可能性、約９５％の可能性である。この文脈における「約」という用語は、＋／−１％を指す。
【００７３】
[0078]「診断的」とは、病理的状態の存在又は性質を同定することを意味する。診断法は、その感度及び特異性において異なる。特定の診断法が、状態に対する決定的な診断を提供しなくとも、該方法が、診断において一助となる肯定的な示唆を提供するならば十分である。
【００７４】
[0079]「感度」とは、対象バイオマーカーが検出される罹患個体（自己免疫疾患を有する個体）の百分率（真の陽性数／総罹患者数×１００）として定義される。検査により罹患と診断された非罹患個体は「偽陽性」である。
【００７５】
[0080]「特異性」とは、対象のバイオマーカーが検出されない非罹患個体の百分率（真の陰性／総非罹患者数×１００）として定義される。アッセイによって検出されない罹患個体は「偽陰性」である。非罹患でアッセイにおいて陰性と判定される対象は「真の陰性」と称する。
【００７６】
[0081]マーカーの「診断量」とは、自己免疫疾患の診断と符合する対象試料中におけるマーカー量を指す。診断量は、絶対量（例えば、Ｘナノグラム／ｍｌ）又は相対量（例えば、シグナルの相対強度）でありうる。
【００７７】
[0082]マーカーの「検査量」とは、検査された試料中に存在するマーカー量を指す。検査量は、絶対量（例えば、Ｘナノグラム／ｍｌ）又は相対量（例えば、シグナルの相対強度）でありうる。
【００７８】
[0083]マーカーの「対照量」は、マーカーの検査量に対して比較すべき任意の量又は量範囲でありうる。例えば、マーカーの対照量は、自己免疫疾患患者又は正常患者におけるマーカー（例えば、精子塩基性タンパク質）の量でありうる。対照量は、絶対量（例えば、Ｘナノグラム／ｍｌ）又は相対量（例えば、シグナルの相対強度）でありうる。
【００７９】
[0084]「検出する」とは、検出すべき対象の存在、不在、又は量を同定することを指す。
【００８０】
[0085]「標識」又は「検出可能部分」とは、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、又は化学的手段により検出される組成物を指す。例えば、有用な標識は、３２Ｐ、３５Ｓ、又は１２５Ｉなどの放射性標識、蛍光染料、クロモフォア、高電子密度試薬、検出可能なシグナルを生成する酵素（例えば、ＥＬＩＳＡ法で一般的に用いられる）、又はスピン標識を含む。標識又は検出可能部分は、試料中において結合した検出可能部分の量を定量化するのに用いうる、放射性シグナル、発色性シグナル、又は蛍光性シグナルなどの測定可能なシグナルを有する又は生成する。検出可能部分は、共有結合的に、又はイオン結合、ファンデルワールス結合、若しくは水素結合を介してプライマー又はプローブ内に取り込む、又はこれらに付着させる、例えば、放射性ヌクレオチド、又は、ストレプトアビジンにより認識されるビオチニル化したヌクレオチドの取り込みでありうる。標識又は検出可能部分は、直接的又は間接的に検出することができる。間接的な検出は、検出可能部分に対する、第２の直接的又は間接的な検出可能部分の結合でありうる。例えば、検出可能部分は、ストレプトアビジンに対する結合パートナーであるビオチン、又は、それが特異的にハイブリダイズしうる相補的配列に対する結合パートナーであるヌクレオチド配列など、結合パートナーのリガンドでありうる。結合パートナーは、それ自体、直接的に検出可能である、例えば、抗体は、それ自体、蛍光性分子により標識することができる。結合パートナーはまた、間接的にも検出することができる、例えば、相補的なヌクレオチド配列を有する核酸は、他の標識された核酸分子とのハイブリダイゼーションを介して検出可能な分枝型ＤＮＡ分子の一部でありうる（例えば、Ｐ．Ｄ．Ｆａｈｒｌａｎｄｅｒ及びＡ．Ｋｌａｕｓｎｅｒ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第６巻、１１６５頁、１９８８年を参照されたい）。シグナルの定量化は、例えば、シンチレーションカウンティング、密度測定、又はフローサイトメトリーにより達成される。
【００８１】
[0086]そのすべての文法的形態における「測定する」とは、定量化の場合における絶対量によるか、又は、同等の物理的実体又は化学的組成物に対する相対量により、物理的実体又は化学的組成物の量（モル量を含む）、濃度、又は質量を検出、定量化、又は定性化するステップを指す。
【００８２】
[0087]「イムノアッセイ」とは、抗体が抗原に特異的に結合して、抗体又は抗原の検出及び／又は定量化を与えるアッセイである。イムノアッセイは、抗原を単離する、標的化する、及び／又は定量化する特定の抗体の特異的な結合特性の使用を特徴とする。
【００８３】
[0088]抗体に対して「特異的に（又は選択的に）結合する」又は、タンパク質若しくはペプチドを指す場合の「〜と特異的に（又は選択的に）免疫反応性である」という表現は、タンパク質及び他の生体物質の不均質な集団中におけるタンパク質の存在を決定する結合反応を指す。したがって、所定のイムノアッセイ条件下において、特定の抗体は、特定のタンパク質に対してバックグラウンドよりも少なくとも２倍強く結合し、試料中に存在する他のタンパク質に対して事実上著明な量では結合しない。こうした条件下における抗体に対する特異的な結合は、特定のタンパク質に対するその特異性について選択された抗体を必要とする場合がある。例えば、ラット、マウス、又はヒトなど特定の種に由来する精子塩基性タンパク質に対して生成されるポリクローナル抗体を選択して、精子塩基性タンパク質と特異的に免疫反応性であるが、精子塩基性タンパク質の多型変異体及び多型対立遺伝子の場合を除く他のタンパク質とは免疫反応性でないポリクローナル抗体のみを得ることができる。この選択は、他の種に由来する精子塩基性タンパク質分子と交差反応する抗体を除外することにより達成することができる。各種のイムノアッセイフォーマットを用いて、特定のタンパク質と特異的に免疫反応性である抗体を選択することができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイは、タンパク質と特異的に免疫反応性である抗体を選択するのに日常的に用いられる（特定の免疫反応性を決定するのに用いうるイムノアッセイのフォーマット及び条件の説明については、例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、１９８８年を参照されたい）。特異的又は選択的な反応は、バックグラウンドシグナル又はノイズの少なくとも２倍であるのが通例であり、バックグラウンドの１０〜１００倍を超えるのがより通例である。
【００８４】
[0089]本明細書で用いられる「免疫反応性」とは、１つ又は複数の標的抗原に対する試料中の１つ又は複数の抗体或いは自己抗体の結合の存在又はレベルを意味する。「免疫反応性のパターン」とは、複数の標的抗原に対する試料中における抗体の結合プロファイルを指す。
【００８５】
[0090]本明細書で用いられる「標的抗原」とは、対象に由来する試料中における抗体の存在、不在、又は量を決定するのに用いられるタンパク質、或いは該タンパク質の免疫反応性を有するその一部、フラグメント、変異体、アイソフォーム、プロセシング産物を指す。「検査抗原」とは、標的抗原としての使用について評価されるタンパク質である。したがって、検査抗原は、標的抗原候補物質、又は、検査集団の一部がそれに対して反応性である抗体を有するかどうかを決定するのに用いられるタンパク質である。「標的抗原」、「検査抗原」、「自己抗原」、及び単に「抗原」という用語の使用は、完全な野生型成熟タンパク質を含むことを意味するか、又は、標的抗原、検査抗原、若しくは抗原が、検査試料の１つ又は複数の自己抗体に対する基準タンパク質の特異的な結合特性を保持又は保有する、指示されたタンパク質の前駆体、プロセシングされた形態（タンパク質分解によりプロセシングされた形態、又は他の方法で切断された形態を含む）、プロセシングされない形態、翻訳後修飾を受けた形態、又は化学的修飾を受けた形態も指示しうる。例えば、タンパク質は、異常なプロセシング、切断又は分解、アミノ酸残基の酸化、通例でないグリコシル化パターンなどを含む、正常細胞によって産生されるタンパク質中では通例見出されることがない１つ又は複数の修飾を有しうる。「標的抗原」、「検査抗原」、「自己抗原」、又は「抗原」という用語の使用はまた、基準タンパク質のスプライスアイソフォーム又は対立遺伝子変異体も含むか、又は、「標的抗原」、「検査抗原」、「自己抗原」、又は「抗原」が、検査試料の１つ又は複数の自己抗体に対する基準タンパク質の免疫反応性を保持又は保有するという前提で、基準タンパク質の配列変異体でありうる。「標的抗原」、「検査抗原」、「自己抗原」、又は単に「抗原」という用語の使用は、基準タンパク質の抗体結合特異性を有する基準タンパク質のフラグメント（「抗原性フラグメント」）を特に包含する。
【００８６】
方法
[0091]本発明は、一態様において、個体に由来する検査試料中における１つ又は複数の標的抗体を検出する方法を提供する。該方法は、個体に由来する検査試料を、その各々が表１の自己抗原又は標的抗体により認識されるエピトープを含むそのフラグメントを含む、本発明の１つ又は複数の標的抗原と接触させるステップと、１つ又は複数の標的抗原に対する、検査試料中における１つ又は複数の抗体の結合を検出し、これにより、試料中における１つ又は複数の標的抗体の存在を検出するステップとを含む。標的抗原は、表１に提供される任意の標的抗原又はエピトープを含むそのフラグメントでありうる。さらに、標的抗原は、例えば、表１の２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１５、２０、２５、５０、又はすべての標的抗原を含む、標的抗原パネルでありうる。該方法は、事実上任意のイムノアッセイ法を用いて実施することができる。イムノアッセイ法の非限定的な例は、以下に提供される。
【００８７】
[0092]検査試料を採取される個体は、健常又は自己免疫疾患を有することが疑われる任意の個体である可能性があり、一部の実施形態では、ＲＡ、ＳＬＥ、又はＡＮＣＡについてスクリーニングされる個体である。
【００８８】
[0093]結合は、以下で詳細に記載される各種のフォーマットでありうるイムノアッセイを用いて検出されるのが通例である。特定の例示的な実施形態における結合の検出では、個体、通例ではヒト対象に由来する試料が適用される基質上において検査抗原が固定される、１つ又は複数の固体支持体を用いる。固定された抗原を伴う試料のインキュベーション後、又は場合によって、試料のインキュベーションと同時に、ヒト抗体に対して反応性である抗体（例えば、ヒト以外の種、例えば、ヤギ、ウサギ、ブタ、マウスなどに由来する抗ヒトＩｇＧ抗体）を、試料をインキュベートするのに伴う固体支持体に適用することができる。非ヒト抗体は、直接的又は間接的に標識される。非特異的に結合した抗体を除去した後、バックグラウンドレベルを著明に上回る標識からのシグナルが、固体支持体上における検査抗原に対する、試料に由来するヒト抗体の結合を示す。
【００８９】
[0094]本明細書で提供される方法において、試料は、細胞若しくは組織、又は体液による任意の試料でありうる。自己抗体は、血液中の循環物についてスクリーニングされ、血液試料中で十分に安定であるため、特定の例示的な実施形態において、検査試料は、血液、又は、例えば、血清など、その画分である。試料は、検査抗原との接触前に未加工であることもあり、１つ又は複数の加工ステップを経た試料であることもある。例えば、血液試料を加工して、赤血球を除去して血清を得ることができる。
【００９０】
[0095]検査試料を液相で提供される検査抗原と接触させることもでき、検査抗原を固体支持体に結合させて提供することもできる。好ましい実施形態において、検出は、以下でより詳細に説明されるイムノアッセイにより実施される。標的試料の検査抗原に対する結合の検出は、試料中における検査抗原に特異的に結合する自己抗体の存在を示す。個体に由来する試料中に存在する自己抗体を同定するステップを用いて、疾患若しくは状態のバイオマーカーを同定する、又は、疾患若しくは状態を診断することができる。
【００９１】
[0096]検出は、ビーズ、ディッシュ、プレート、ウェル、シート、メンブレン、スライド、チップ、又は、マイクロアレイ、及び、場合によって、高密度マイクロアレイでありうるタンパク質アレイなどのアレイなど、任意の固体支持体上で実施することができる。
【００９２】
[0097]検出法は、陽性／陰性の結合結果を提供することもでき、試料中における自己抗体バイオマーカーレベルの相対値又は絶対値でありうる値を与えることもできる。結果は、診断、予後診断を提供することもでき、診断又は予後診断をもたらす又はもたらさない、さらなる検査又は評価を実施するための指標として用いることもできる。
【００９３】
[0098]該方法は、個体に由来する試料中における複数の自己抗体を検出するステップを含み、ここで、自己抗体を検出するのに用いられる１つ又は複数の検査抗原は、表１の検査抗原である。
【００９４】
[0099]抗体により認識されるエピトープを含むフラグメントは、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、７５０、又は１０００アミノ酸の長さでありうる。該フラグメントはまた、１〜５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、又は２５０アミノ酸だけ自己抗原の全長よりも短い。こうしたエピトープは、所与の自己抗原に対する自己抗体が該エピトープを認識することが知られるよう、あらかじめ特徴づけられるのが通例である。エピトープマッピングの方法は、当技術分野でよく知られている。
【００９５】
[0100]一部の実施形態において、検出は、マイクロアレイでありえ、場合によって、少なくとも１００／ｃｍ２若しくは１０００／ｃｍ２、又は４００／ｃｍ２を超える濃度のタンパク質を含むマイクロアレイでありうる、タンパク質アレイ上で実施される。
【００９６】
[0101]検出法は、陽性／陰性の結合結果を提供することもあり、試料中における自己抗体バイオマーカーレベルの相対値又は絶対値でありうる値を与えることもある。
【００９７】
[0102]該方法を経時的に反復して、例えば、前疾患状態をモニターする、疾患の進行をモニターする、又は治療レジメンをモニターすることができる。検査抗原に対する患者試料の免疫反応性を判定する診断検査の結果を、より早期に行われた同じ診断検査の結果と比較することができる。免疫反応性の著明な経時的差は、自己免疫疾患の診断又は予後診断に寄与しうる。
【００９８】
[0103]好ましい一部の実施形態において、バイオマーカー検出パネルは、対象における正常状態と疾患状態とを差別化するのに、０．５５０以上、０．６００以上、０．６５０以上、０．７００以上、０．７５０以上、０．８００以上、０．８５０以上、又は０．９００以上のＲＯＣ／ＡＵＣを有する。
【００９９】
[0104]バイオマーカー検出パネルに存在する標的抗原は、標的抗原（例えば、表１、表２、表３、又は表５に列挙される標的抗原）と称するタンパク質など、タンパク質の完全成熟形態でもありえ、該タンパク質の修飾された形態、プロセシングされた形態、又はその変異体が、個体に由来する試料中に存在する自己抗原に結合する能力を有するならば、その前駆体、プロセシングされた形態、プロセシングされない形態、アイソフォーム、変異体、エピトープを含むそのフラグメント、又はその対立遺伝子変異体でもありうる。
【０１００】
[0105]一部の実施形態において、自己免疫疾患を検出するのに用いられるバイオマーカー検出パネルは、表１の１つ又は複数の標的抗原を含む。一部の実施形態において、自己免疫疾患を検出するのに用いられるバイオマーカー検出パネルは、表１の２つ以上の標的抗原を含む。一部の実施形態において、自己免疫疾患を検出するのに用いられるバイオマーカー検出パネルは、表１の３つ以上の標的抗原を含む。一部の実施形態において、自己免疫疾患を検出するのに用いられるバイオマーカー検出パネルは、表１の４つ以上の標的抗原を含む。一部の実施形態では、検査試料を、表１の５つ以上の標的抗原を含むバイオマーカー検出パネルと接触させる。一部の実施形態において、本発明の方法で用いられるバイオマーカー検出パネルは、表１の６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、又は１２の標的抗原を含む。一部の実施形態において、本発明の方法で用いられるバイオマーカー検出パネルは、表１の１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上の標的抗原を含む。一部の実施形態では、検査試料を、表１の２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０の抗原を含むバイオマーカー検出パネルと接触させる。バイオマーカー検出パネルは、表１の３０〜３５の抗原、表１の３５〜４０の抗原、表１の４０〜４５の抗原、表１の４５〜５０の抗原、表１の５０〜５５の抗原、表１の５５〜６０の抗原、表１の６０〜６５の抗原、表１の６５〜７０の抗原、表１の７０〜７５の抗原、表１の７５〜８０の抗原、表１の８０〜８５の抗原、表１の８５〜９０の抗原、表１の９０〜９５の抗原、表１の９５〜１００の抗原、表１の１００〜１０５の抗原、又は表１の１０５〜１０８の抗原を含みうる。前出のすべての実施形態において、バイオマーカー検出パネルに存在する表１の１つ又は複数の検査抗原は、表２、表３、又は表５の標的抗原でありうる。
【０１０１】
イムノアッセイ
[00106]当技術分野で知られる事実上任意のイムノアッセイ法を用いて、本発明の方法及びキットによる抗原に結合する抗体を検出することができる。こうしたイムノアッセイ法は、限定なしに、ラジオイムノアッセイ、免疫組織化学アッセイ、競合的結合アッセイ、ウェスタンブロット解析、ＥＬＩＳＡ法、サンドイッチアッセイ、二次元ゲル電気泳動（２Ｄ電気泳動）、及び、質量分析又はタンパク質相互作用プロファイリングなどの非ゲルベースの手法を含み、すべてが当業者に知られる。これらの方法は、当技術分野で知られる通り自動化された形で実施してよい。こうしたイムノアッセイ法はまた、標的抗原に対する試料中の抗体の結合を検出するのにも用いてよい。
【０１０２】
[00107]ＥＬＩＳＡ法の一例において、該方法は、試料を標的タンパク質と共にインキュベートするステップと、形成された反応産物を、標的タンパク質と会合して反応産物を形成した試料に由来する抗体に対する結合により反応産物に結合する、二次抗体などの結合パートナーと共にインキュベートするステップとを含む。これらが２つの個別のステップを含む場合もあれば、２つのステップが同時的であるか、又は、同一のインキュベーションステップ内で実施される場合もある。抗体に対する標的タンパク質の結合の検出法の例は、抗ヒトＩｇＧ（又は他の）抗体又はプロテインＡの使用である。この検出抗体は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼなどのペルオキシダーゼに連結してよい。
【０１０３】
[00108]イムノアッセイ用のタンパク質アレイを用いることにより、多数のタンパク質の同時的な解析が可能となる。例えば、標的抗原、又は、試料中に存在しうるバイオマーカーを認識する抗体を、マイクロアレイ上に固定する。次いで、バイオマーカー抗体又はタンパク質が、試料中に存在すれば、特異的な抗原−抗体間の相互作用を促進する条件下における、マイクロアレイを伴う試料のインキュベーションにより、アレイ上のコグネイトスポットにおいてキャプチャーされる。次いで、二次抗体又は他の結合標識、結合タンパク質、若しくは結合解析物を用いて、試料中のタンパク質又は抗体の結合を判定することができる。当技術分野で知られる任意の手段を用いて、２つ以上の異なる試料中で見出されるタンパク質又は抗体の比較を実施することができる。例えば、第１の試料を第１のアレイにおいて解析し、第２の試料を、第１のアレイの複製である第２のアレイにおいて解析することができる。
【０１０４】
[00109]「サンドイッチアッセイ」という用語は、抗原が、通例は抗体である２つの結合試薬の間に挟まれるイムノアッセイを指す。第１の結合試薬／抗体は表面に付着し、第２の結合試薬／抗体は検出可能部分又は標識を含む。検出可能部分の例は、例えば限定なしに、第２の結合試薬（例えば、第２の結合試薬／抗体がマウス抗体である場合、これは、蛍光標識された抗マウス抗体によって検出される）に結合する蛍光色素、酵素、エピトープ、例えば、抗原又はビオチンなどの結合対のメンバーを含む。表面は、本明細書に記載される通例のグリッド型アレイ（例えば、限定なしに、９６ウェルプレート及び平面型マイクロアレイ）の場合などにおける平面でもよく、ビーズの各「分子種」が、例えば、蛍光色素で標識された、コートビーズアレイ法（本明細書、並びに、米国特許第６，５９９，３３１号、同第６，５９２，８２２号、及び同第６，２６８，２２２号に記載のルミネックス法など）、又は量子ドット法（例えば、米国特許第６，３０６，６１０号に記載）などによる非平面でもよい。
【０１０５】
[00110]各種の異なる固相基質を用いて、試料中におけるタンパク質又は抗体を検出することもでき、試料中におけるタンパク質又は抗体の濃度を定量化又は決定することもできる。基質の選択は、便宜、費用、熟練度、又は他の考慮内容に基づき、当業者により容易になされうる。有用な基質は、限定なしに、ビーズ、ボトル、表面、基板、ファイバー、ワイヤー、枠付き構造、チューブ、フィラメント、プレート、シート及びウェルを含む。これらの基質は、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ガラス、プラスチック、金属、合金、セルロース、セルロース誘導体、ナイロン、コートされた表面、アクリルアミド若しくはその誘導体及びそのポリマー、アガロース又はラテックス、或いは、これらの組合せから作製される可能性がある。このリストは、悉皆的であるよりも例示的である。
【０１０６】
[00111]当技術分野で記載される、タンパク質の検出及び測定の他の方法も、同様に用いることができる。例えば、単一の抗体をビーズ又はマイクロウェルプレート中のウェルと結合させ、イムノアッセイにより定量化することができる。このアッセイフォーマットでは、各アッセイにおいて単一のタンパク質を検出することができる。多数の解析物に対する抗体により該アッセイを繰り返して、本発明の方法を用いて達成しうるのと基本的に同じ結果に到達することができる。その各々がある形で固有に標識される複数のビーズを用いることにより、ビーズアッセイを多重化することができる。例えば、各種のビーズは、あらかじめ選択した量のフルオロフォアを含有しうる。ビーズの種類は、ビーズが発する蛍光量（及び／又は波長）を決定することにより識別することができる。こうした蛍光標識されたビーズは、Ｌｕｍｉｎｅｘ社（テキサス州、オースチン；ｌｕｍｉｎｅｘｃｏｒｐ．ｃｏｍのインターネットアドレスを参照されたい）製の市販品を入手することができる。ルミネックスアッセイは、通例のサンドイッチ型ＥＬＩＳＡ法にきわめて類似するが、抗体又はタンパク質に抱合したルミネックスマイクロフォアを用いる（Ｖｉｇｎａｌｉ，Ｊ．、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、第２４３巻、２４３〜２５５頁、２０００年）。
【０１０７】
[00112]各種の抗体アッセイの方法及びステップは、当業者に知られている。さらなる情報は、例えば、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社、第１４章、１９８８年；Ｂｏｌｔｏｎ及びＨｕｎｔｅｒ、「Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ社、１９９６年；及び「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９３年において見出すことができる。
【０１０８】
[00113]前出のアッセイを実施するのに用いられる抗体は、前記のポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及びこれらのフラグメントを含みうる。モノクローナル抗体は、確立された方法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５年、Ｎａｔｕｒｅ、第２５６巻、４９５頁；並びにＨａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、１９８８年、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、ニューヨーク、Ｃ．Ｈ．Ｓ．Ｐ．社を参照されたい）により調製することができる。
【０１０９】
[00114]抗体は、完全な免疫グロブリン又は抗体フラグメントでありうる。本明細書で用いられる抗体フラグメントは、抗原に結合する能力を保持するフラグメントであることが通例である。抗体サブタイプは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、又はこれらのアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ又はＩｇＧ３）を含む。抗体の調製は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体によることができ、こうした抗体のキメラ異型、ヒト化異型、又は二特異性異型でありうる。抗体フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’２、Ｄａｂ、Ｆｖ及び単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）フラグメントを含むがこれらに限定されない。二特異性抗体は、２つの異なる結合特異性を単一の抗体鎖中に組み換えることにより構築する場合もあれば、各Ｆａｂ’領域が異なる抗体に由来するように２つのＦａｂ’領域を接合することにより構築する場合もある（例えば、米国特許第６，３４２，２２１号）。抗体フラグメントは、ＣＤＲ移植フラグメント又はヒト化フラグメントなど、組み換えられた領域を含むことが多い。抗体は、例えば、検出可能標識（例えば、染料、フルオロフォア、放射性同位元素、光散乱作用物質（例えば、銀、金））又は結合作用物質（例えば、ビオチン、ストレプトアビジン）などの機能性分子により誘導体化される。
【０１１０】
[00115]特定の実施形態では、１つ又は複数の自己抗体バイオマーカーなど、１つ又は複数の診断（又は予後診断）バイオマーカーが、（１つ又は複数の）バイオマーカーの存在又は不在により、状態又は疾患と相関する。他の実施形態では、（１つ又は複数の）診断又は予後診断バイオマーカーの（１つ又は複数の）閾値レベルを確立することができ、試料中における（１つ又は複数の）バイオマーカーレベルを、（１つ又は複数の）閾値レベルと単純に比較することができる。
【０１１１】
[00116]任意の特定のバイオマーカーについて理解される通り、疾患を有する対象及び有さない対象のバイオマーカーレベルの分布は、重複する可能性が高い。こうした条件下において、検査は、１００％の精度で疾患から正常を絶対的に差別化することはなく、重複領域は、検査が疾患から正常を差別化できない領域を示す。それを上回れば（又は、バイオマーカーが疾患と共にどのように変化するかに応じて、それを下回れば）検査が異常であり、それを下回れば検査が正常であると考えられる閾値を選択する。ＲＯＣ（受診者動作特性）曲線は、「正常」集団及び「疾患」集団中におけるその相対度数に対して変数値をプロットすることにより生成されるのが通例である。ＲＯＣ曲線下面積は、その尺度の理解により状態の正確な同定が可能となる確率の尺度である。ＲＯＣ曲線はまた、相対的結果、又はランク化された結果を用いても生成することができる。ＲＯＣ曲線の生成法及びその使用は、当技術分野でよく知られている。例えば、Ｈａｎｌｅｙら、Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ、第１４３巻、２９〜３６頁、１９８２年を参照されたい。
【０１１２】
[00117]１つ又は複数の検査抗原は、単独で考察する場合は、比較的低い診断的価値又は予後診断的価値を有しうるが、バイオマーカー検出用の他の試薬（他の検査抗原などであるがこれらに限定されない）を含むパネルの一部として用いる場合、こうした検査抗原は、具体的な診断又は予後診断を下すステップに寄与しうる。好ましい実施形態において、対象から得られたマーカーレベルのプロファイルが、具体的な診断又は予後診断を示すかどうかを判定するのに、バイオマーカー検出パネルにおける１つ又は複数の検査抗原に対する具体的な閾値には依存しない。むしろ、本発明では、例えば、具体的なバイオマーカー検出パネルの感度についてのＲＯＣ曲線をプロットすることにより、バイオマーカー検出パネルの全マーカープロファイルの評価を用いることができる。これらの方法において、個体試料に由来するバイオマーカー測定値のプロファイルをまとめて考察し、例えば、個体が、自己免疫疾患を有する全体的な可能性（数値スコア又は百分率による危険性として表わされる）を提供する。こうした実施形態では、バイオマーカーの特定のサブセット（１つ又は複数の自己抗体を含むバイオマーカーのサブセットなど）における上昇が、一患者における具体的な診断（又は予後診断）を示すのに十分でありうるのに対し、バイオマーカーの異なるサブセット（１つ又は複数の自己抗体を含むバイオマーカーのサブセットなど）における上昇は、別の患者における同じ又は異なる診断（又は予後診断）を示すのに十分でありうる。因子の重みづけもまた、検出される１つ又は複数のバイオマーカーに適用してよい。一例では、バイオマーカーが、具体的な診断又は予後診断を同定するのに特に高い有用性を有する場合、所与のレベルにおいて、それが単独で陽性診断を示すのに十分であるよう重みづけしてよい。別の例では、重みづけ因子が、具体的なマーカーの所与のレベルは陽性の結果を示すのに十分でなく、別のマーカーもまた解析に寄与する場合に限り結果を示すことを条件とする。
【０１１３】
[00118]好ましい実施形態において、マーカー及び／又はマーカーパネルを選択して、少なくとも７０％の特異性、より好ましくは、少なくとも８０％の特異性、さらにより好ましくは、少なくとも８５％の特異性、さらにより好ましくは、少なくとも９０％の特異性、及び、最も好ましくは、少なくとも９５％の特異性と組み合わせた、少なくとも７０％の感度、より好ましくは、少なくとも８０％の感度、さらにより好ましくは、少なくとも８５％の感度、さらにより好ましくは、少なくとも９０％の感度、及び、最も好ましくは、少なくとも９５％の感度を示す。特に好ましい実施形態では、感度及び特異性は共に、少なくとも７５％、より好ましくは、少なくとも８０％、さらにより好ましくは、少なくとも８５％、さらにより好ましくは、少なくとも９０％、及び、最も好ましくは、少なくとも９５％である。
【０１１４】
[00119]表１に提示した検査抗原の各種サブセットを用い、本発明は、個体に由来する試料中における自己抗体を検出する検査抗体、個体における自己免疫疾患を検出する抗体、並びに、自己免疫疾患、とりわけ、ＲＡ、ＳＬＥ及びＡＮＣＡを、高い感度及び特異性により検出及び／又は診断するのに用いうる、表１の検査抗原の組合せを含むバイオマーカー検出パネルを提供する。したがって、本明細書では、個体における前立腺癌の検出、診断、病期分類及びモニタリングに関する方法、組成物及びキットが提供される。
【０１１５】
[00120]本明細書の方法において用いられるシステムなど、イムノアッセイを実施する自動システムは、医療診断学において広く知られ用いられている。例えば、当技術分野で知られる通り、無作為モード又はバッチアナライザーによるイムノアッセイシステムを用いることができる。これらでは、磁気粒子若しくは非磁気粒子又は微粒子を用いることができ、例えば、蛍光又は化学発光によるリードアウトを用いることができる。非限定的な例として、自動システムは、自動マイクロアレイハイブリダイゼーションステーション、自動液体操作ロボット、Ｂｅｃｋｍａｎ社製ＡＣＣＥＳＳ常磁性粒子、化学発光イムノアッセイ、Ｂａｙｅｒ社製ＡＣＳ：１８０型化学発光イムノアッセイ又はＡｂｂｏｔｔ社製ＡｘＳＹＭ微粒子酵素イムノアッセイでありうる。こうした自動システムは、個々の抗原又は複数の抗原に関する本明細書で提供された方法を、多重的な使用者介入なしに実施するように設計することができる。
【０１１６】
バイオマーカー検出パネル
[00121]本発明はまた、バイオマーカー検出パネルが表１から選択された２つ以上の標的抗原を含み、検査パネルの少なくとも５０％のタンパク質が表１のタンパク質である、自己免疫疾患の診断、予後診断、モニタリング、又は病期分類用のバイオマーカー検出パネルを提供する。一部の好ましい実施形態において、バイオマーカー検出パネルのタンパク質は、パネルのタンパク質が結合する１つ又は複数の固体支持体上における少なくとも５０％のタンパク質が表１のタンパク質である、１つ又は複数の固体支持体上において提供される。バイオマーカー検出パネルのタンパク質は、ビーズ、マトリックス、ディッシュ、ウェル、プレート、スライド、シート、メンブレン、フィルター、ファイバー、チップ又はアレイの形態における固体支持体に結合させて提供することができる。一部の好ましい実施形態において、バイオマーカー検出パネルのタンパク質は、アレイ上の５０％以上のタンパク質が、バイオマーカー検出パネルの標的抗原であるタンパク質アレイ上において提供される。
【０１１７】
[00122]バイオマーカー検出パネル中のバイオマーカーのセットは、電子的、又は、好ましくは、物理的に関連付ける。例えば、バイオマーカー検出パネルの各バイオマーカーは、分離された形態において、まとめて販売及び／又は出荷される別個のチューブ内において、例えば、キットの一部として提供することができる。特定の実施形態において、分離されたバイオマーカーは、これらを同じ固体支持体に付着させることにより、検出パネルに形成される。バイオマーカーパネルのバイオマーカーはまた、同じ溶液中で共に混合することもできる。
【０１１８】
[00123]本発明はまた、検査パネルのタンパク質の少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％又は７５％が、それぞれ、表１、表２、表３又は表５のタンパク質である、表１、又は、特定の好ましい実施形態では、表２、表３又は表５から選択された２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０以上の標的抗原を含む、自己免疫疾患の診断、予後診断、モニタリング、又は病期分類用のバイオマーカー検出パネルも提供する。一部の好ましい実施形態において、バイオマーカー検出パネルのタンパク質は、パネルのタンパク質が結合する１つ又は複数の固体支持体上におけるタンパク質の少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％が、表１、表２、表３又は表５のタンパク質である、１つ又は複数の固体支持体上において提供される。一部の好ましい実施形態において、バイオマーカー検出パネルのタンパク質は、アレイ上におけるタンパク質の少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、又は７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％が、バイオマーカー検出パネルの標的抗原であるタンパク質アレイ上において提供される。
【０１１９】
[00124]一部の実施形態において、本発明の方法において用いられるバイオマーカー検出パネルは、表１の６、７、８、９、１０、１１又は１２の標的抗原を含む。一部の実施形態において、本発明の方法において用いられるバイオマーカー検出パネルは、表１の１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上の標的抗原を含む。一部の実施形態では、検査試料を、表１の２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０の抗原を含むバイオマーカー検出パネルと接触させる。バイオマーカー検出パネルは、表１の３０〜３５の抗原、表１の３５〜４０の抗原、表１の４０〜４５の抗原、表１の４５〜５０の抗原、表１の５０〜５５の抗原、表１の５５〜６０の抗原、表１の６０〜６５の抗原、表１の６５〜７０の抗原、表１の７０〜７５の抗原、表１の７５〜８０の抗原、表１の８０〜８５の抗原、表１の８５〜９０の抗原、表１の９０〜９５の抗原、表１の９５〜１００の抗原、表１の１００〜１０５の抗原又は表１の１０５〜１０８の抗原を含みうる。
【０１２０】
[00125]また、表１から選択された２つ以上の標的抗原を含み、２つ以上の標的抗原の少なくとも１つが個体試料に由来する自己抗体に結合する、自己免疫疾患の診断、予後診断、モニタリング、又は病期分類用のバイオマーカー検出パネルを含む組成物も、本発明に含まれる。本発明はまた、表１から選択された３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０以上の標的抗原を含み、２つ以上の標的抗原の少なくとも１つが個体試料に由来する自己抗体に結合する、自己免疫疾患の診断、予後診断、モニタリング、又は病期分類用のバイオマーカー検出パネルも含む。また、表２、表３又は表５から選択された２つ以上の標的抗原を含み、アレイの標的抗原の少なくとも１つが個体試料に由来する自己抗体に結合する、自己免疫疾患の診断、予後診断、モニタリング、又は病期分類用のバイオマーカー検出パネルを含む組成物も、本発明に含まれる。試料に由来する抗体を結合させたアレイは、アレイに結合したタンパク質の少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％が表１のタンパク質であるアレイでありうる。
【０１２１】
タンパク質抗原を合成する方法
[00126]本明細書で提供される方法、キット、及びシステムは、通例タンパク質抗原である自己抗原を含む。本明細書で提供される方法において用いられるタンパク質抗原を得るために、ハイスループット解析がしやすい容易に拡張可能なフォーマットにおいて、ウイルスタンパク質、原核生物タンパク質又は真核生物タンパク質を作製及び単離するのに知られた方法を用いることができる。例えば、方法は、自動化法に適合するアレイフォーマットにおいてタンパク質を合成及び精製するステップを含む。したがって、一実施形態では、本発明用のタンパク質マイクロアレイにおいて、真核生物タンパク質を作製及び単離する方法は、調節性配列に作動的に連結された異種配列を有するベクターにより形質転換された真核生物細胞を増殖させるステップと、調節性配列を異種配列によりコードされるタンパク質の発現を増強する誘導剤と接触させるステップと、細胞を溶解させるステップと、タンパク質と結合作用物質との間の複合体が形成されるよう、タンパク質を結合作用物質と接触させるステップと、細胞破砕物から該複合体を単離するステップと、複合体からタンパク質を単離するステップとを含み、各ステップは、９６ウェルフォーマット内で実施される。
【０１２２】
[00127]具体的な実施形態において、真核生物タンパク質は、９６アレイフォーマット（即ち、プロセシングが生じる固体支持体上における各部位が９６部位の１つである）、例えば、９６ウェルマイクロタイタープレート中で作製及び精製される。別の実施形態において、固体支持体は、タンパク質に結合しない（例えば、非タンパク質結合型マイクロタイタープレート）。
【０１２３】
[00128]特定の実施形態において、タンパク質は、当技術分野で一般的に知られる方法によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳により合成される。例えば、タンパク質は、コムギ胚芽、ウサギ網状赤血球、又はＥｘｐｒｅｓｓｗａｙなどの細菌抽出物を用いて発現させることができる。
【０１２４】
[00129]本発明の方法に従い、タンパク質合成を駆動する誘導性プロモーターを有する任意の発現構築物を用いることができる。発現構築物は、例えば、形質転換に用いられる細胞型に合わせて調整してよい。発現構築物と宿主細胞との間の適合性は、当技術分野で知られており、その変異体の使用もまた、本発明に包含される。
【０１２５】
[00130]具体的な実施形態において、融合タンパク質は、ＧＳＴタグを有し、該タンパク質をグルタチオンビーズと接触させることにより親和性精製される。さらなる実施形態において、融合タンパク質を付着させたグルタチオンビーズは、試料の取り扱いを容易にし、試料の交差汚染を防止するため、フィルタープレートを用いずに９６ウェルボックス内で洗浄することができる。
【０１２６】
[00131]加えて、融合タンパク質を、溶出緩衝液により結合化合物（例えば、グルタチオンビーズ）から溶出させ、所望のタンパク質濃度を提供することができる。具体的な実施形態では、３０μｌの溶出緩衝液により、グルタチオンビーズから融合タンパク質を溶出させ、所望のタンパク質濃度を提供することができる。
【０１２７】
[00132]最終的に顕微鏡スライド上にスポットされる精製タンパク質を得るには、精製タンパク質からグルタチオンビーズを分離する。一例では、すべてのグルタチオンビーズを除去して、固体支持体上へ精製タンパク質をスポットするのに用いられるマイクロアレイピンのブロッキングを回避する。一実施形態において、グルタチオンビーズは、例えば、非タンパク質結合型の固体支持体を含むフィルタープレートを用いて、精製タンパク質から分離される。精製タンパク質を含有する溶出液を濾過すれば、９０％を超えるタンパク質が回収されるであろう。
【０１２８】
[00133]溶出緩衝液は、例えば、高粘稠度の液体、例えば、１５％〜５０％のグリセロール、例えば、約２５％のグリセロールなどを含みうる。グリセロール溶液は、溶液中のタンパク質を安定化させ、マイクロアレイヤーを用いるプリンティングステップ中におけるタンパク質溶液の脱水化を防止する。
【０１２９】
[00134]精製タンパク質は、例えば、タンパク質を安定化させる媒体内に保管され、試料の乾燥を防止する。例えば、精製タンパク質は、高粘稠度の液体、例えば、１５％〜５０％のグリセロール、例えば、約２５％のグリセロール中などにおいて保管することができる。一例では、凍結／融解サイクルにより引き起こされるタンパク質活性の喪失を回避するため、精製タンパク質を含有する試料をアリコートしてよい。
【０１３０】
[00135]当業者は、精製プロトコールを調整して、所望のタンパク質純度レベルを制御することができる。一部の場合では、対象タンパク質と会合する分子の単離が望ましい。例えば、本明細書で提供される精製法、又はその変法を用いて、過剰産生された対象タンパク質を含む、二量体、三量体、又はより高次の同型又は異型の複合体を単離することができる。さらに、会合した分子は、当技術分野で知られた方法（例えば、質量分析法）を用いて、個別に単離及び同定することができる。
【０１３１】
[00136]産生されたタンパク質抗原は、「位置アドレスを指定できる」アレイの一部として、本明細書で提供されるバイオマーカーパネル、方法、及びキットにおいて用いることができる。該アレイは、各標的抗原が固体支持体上の異なる位置にある、複数の標的抗原を含む。アレイは、例えば、１、２、３、４、５、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００又は５００の異なるタンパク質を含みうる。アレイは、表１の１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、１００又はすべてのタンパク質を含みうる。一態様において、アレイ上の大半のタンパク質は、自己抗原バイオマーカー検出パネルとしてまとめて提供される場合、具体的な疾患又は状態に対する診断的価値を有しうる自己抗原として同定されるタンパク質を含む。
【０１３２】
[00137]一態様において、タンパク質アレイは、ビーズベースのアレイである。別の態様において、タンパク質アレイは、平面アレイである。接触プリンティング法などによりタンパク質アレイを作成する方法は、よく知られている。一部の実施形態において、検出は、マイクロアレイでありえ、場合によっては、少なくとも１００／ｃｍ２若しくは１０００／ｃｍ２、又は４００／ｃｍ２を超える濃度でタンパク質を含むマイクロアレイでありうるタンパク質アレイ上で実施される。
【０１３３】
キット
[00138]本発明の特定の実施形態では、キットが提供される。こうして、一部の実施形態では、表１で提供される１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０〜３４、３５〜３９、４０〜４４、４５〜４９、５０〜５４、５５〜５９、６０〜６４、６５〜６９、７０〜７４、７５〜７９、８０〜８４、８５〜８９、９０〜９４、９５〜１００、１００〜１０５又は１０６〜１０８の検査抗原タンパク質を含むキットが提供される。特定の態様において、キットは、表１の最大１０、５０、１００又は１０８の検査抗原タンパク質を含む。本発明のキットは、表１の２つ以上の検査抗原を含むバイオマーカーパネル、及び表２、表３、又は表５の２つ以上の検査抗原を含むバイオマーカーパネルを含むがこれらに限定されない、本明細書で開示される任意のバイオマーカー検出パネルを含みうる。
【０１３４】
[00139]一実施形態において、自己免疫疾患を診断するキットは、表１の１つ若しくは複数、２つ以上、１０以上、２０以上、５０以上又はすべての自己抗原、或いはエピトープを含むこれらのフラグメントと、検査試料中における１つ又は複数の分子が、１つ又は複数の抗原に結合するかどうかを検出する手段とを含む。一部の実施形態において、本発明のキット及びタンパク質アレイは、１，０００未満のポリペプチド又は１００未満のポリペプチドを含む。さらなる実施形態において、キットは、１つ又は複数の抗原に対する対照抗体をさらに含む。
【０１３５】
[00140]さらなる実施形態において、キットは、表２を含む群から選択された、１つ若しくは複数、２つ以上、１０以上、２０以上、５０以上又はすべての自己抗原、或いはエピトープを含むこれらのフラグメントを含む。関連の実施形態において、キットは、基本的に、表２を含む群から選択された、１つ若しくは複数、２つ以上、１０以上、２０以上、５０以上又はすべての自己抗原、或いはエピトープを含むこれらのフラグメントを含む。
【０１３６】
[00141]別の実施形態において、キットは、表３を含む群から選択された、１つ若しくは複数、２つ以上、１０以上、２０以上、５０以上又はすべての自己抗原、或いはエピトープを含むこれらのフラグメントを含む。関連の実施形態において、キットは、基本的に、表３を含む群から選択された、１つ若しくは複数、２つ以上、１０以上、２０以上、５０以上又はすべての自己抗原、或いはエピトープを含むこれらのフラグメントを含む。
【０１３７】
[00142]別の実施形態において、キットは、表５を含む群から選択された、１つ若しくは複数、２つ以上、１０以上、２０以上、５０以上又はすべての自己抗原、或いはエピトープを含むこれらのフラグメントを含む。関連の実施形態において、キットは、基本的に、表５を含む群から選択された、１つ若しくは複数、２つ以上、１０以上、２０以上、５０以上又はすべての自己抗原、或いはエピトープを含むこれらのフラグメントを含む。
【０１３８】
[00143]別の実施形態において、キットは、表３を含む群から選択された、１つ若しくは複数、２つ以上、１０以上、２０以上、５０以上又はすべての自己抗原、或いはエピトープを含むこれらのフラグメントと組み合わせた、表２を含む群から選択された、１つ若しくは複数、２つ以上、１０以上、２０以上、５０以上又はすべての自己抗原、或いはエピトープを含むこれらのフラグメントを含む。
【０１３９】
[00144]別の実施形態において、キットは、表５を含む群から選択された、１つ若しくは複数、２つ以上、１０以上、２０以上、５０以上又はすべての自己抗原、或いはエピトープを含むこれらのフラグメントと組み合わせた、表２を含む群から選択された、１つ若しくは複数、２つ以上、１０以上、２０以上、５０以上又はすべての自己抗原、或いはエピトープを含むこれらのフラグメントを含む。
【０１４０】
[00145]別の実施形態において、キットは、表５を含む群から選択された、１つ若しくは複数、２つ以上、１０以上、２０以上、５０以上又はすべての自己抗原、或いはエピトープを含むこれらのフラグメントと組み合わせた、表３を含む群から選択された、１つ若しくは複数、２つ以上、１０以上、２０以上、５０以上又はすべての自己抗原、或いはエピトープを含むこれらのフラグメントを含む。
【０１４１】
[00146]キットは、１つ若しくは複数の陽性対照、１つ若しくは複数の陰性対照、及び／又は１つ若しくは複数の規格化対照を含みうる。
【０１４２】
[00147]キットのタンパク質は、例えば、固体支持体又は表面上に固定してよい。タンパク質は、例えば、アレイに固定してよい。タンパク質マイクロアレイでは、ルミネックス法（テキサス州、オースチン、Ｌｕｍｉｎｅｘ社）などのビーズ法を用いてよい。検査タンパク質アレイは、少なくとも１００タンパク質／ｃｍ２を含む高密度タンパク質マイクロアレイであってもよく、そうでなくてもよい。キットは、アレイ上に固定された、本明細書に記載のバイオマーカー検出パネルを提供しうる。アレイ上に固定された少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は、少なくとも９５％のタンパク質が、バイオマーカー検査パネルのタンパク質でありうる。アレイは、アレイ上に固定した、１つ若しくは複数の陽性対照タンパク質、１つ若しくは複数の陰性対照、及び／又は１つ若しくは複数の規格化対照を含みうる。
【０１４３】
[00148]キットは、例えば、検出可能な標識に連結されたヒト抗体に結合する抗体など、ヒト抗体のタンパク質に対する結合を検出するレポーター試薬をさらに含みうる。キットは、ＥＬＩＳＡ法などの各種の免疫反応性アッセイ、又は、当業者に知られる他のイムノアッセイ法に有用な試薬をさらに含みうる。キット試薬を用いうるアッセイは、競合アッセイ、サンドイッチアッセイでありえ、標識は、ラジオイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ又は化学発光イムノアッセイに用いられる、よく知られた標識群から選択してよい。
【０１４４】
[00149]キットは、本明細書に記載の試薬を、任意の組合せにおいて含みうる。例えば、一態様において、キットは、固体支持体上に固定された、本明細書で提供されるバイオマーカー検出パネルと、溶液中における検出用の抗ヒト抗体とを含む。検出抗体は、標識を含みうる。
【０１４５】
[00150]キットはまた、本明細書で提供される方法を実施するキットを用いて実施された方法の結果を解析する、コンピュータで読み取り可能な形態におけるプログラムも含む。
【０１４６】
[00151]本発明のキットはまた、任意の数の個別の容器、パケット、チューブ、バイアル、マイクロタイタープレートなどにおける１つ又は複数の成分も含むことがあり、該成分を、こうした容器中の各種の組合せにおいて組み合わせることもある。
【０１４７】
[00152]本発明のキットはまた、本明細書に記載の１つ若しくは複数の方法を実施するための指示書、及び／或いは、本明細書に記載の１つ若しくは複数の組成物又は試薬の説明書も含みうる。指示書及び／又は説明書は、印刷された形態でよく、キットの添付文書中に含めてよい。キットはまた、こうした指示書又は説明書を提供するインターネットサイトに関する書面による記載を含みうる。
【実施例】
【０１４８】
[00153]以下に示す実施例は、本発明を例示するが限定はしない。
【０１４９】
実施例１
[00154]１０例の健常対照個体、レミケード（登録商標）治療の開始前及び開始後におけるＲＡを有する１２例の個体、ＳＬＥを有する２０例の個体、並びにＡＮＣＡを有する２０例の個体に由来する血清を、ハイスループットのヒトタンパク質アレイに対してプロファイリングした。血清試料を１：１５０に希釈し、ヒトＰｒｏｔｏＡｒｒａｙ（商標）をプローブするのに用いた。具体的には、アレイを１時間ブロックし、希釈血清溶液と共に９０分間インキュベートし、３×１０分間洗浄し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ６４７と抱合させた抗ヒトＩｇＧ抗体と共に９０分間インキュベートし、上記の通りに洗浄し、乾燥させ、スキャンした。スキャニングの後、専用ソフトウェアを用いてデータを取り込んだ。四分位による規格化戦略を用いて、各集団からのバックグラウンドを差し引いたシグナルを規格化した。試料集団の特定の対比較に関する可能な最低のｐ値と関連するＭ統計が同定されるＭ統計アルゴリズムを用いて、試験に組み入れたすべての試料群間において、可能なすべての対比較を実施した。
【０１５０】
[00155]自己免疫疾患患者に由来する血清中に存在する抗体との著明な相互作用物質として同定された対象タンパク質は、プロテイナーゼ−３、ミエロペルオキシダーゼ、ＣＣＰペプチド及びｓｓＤＮＡを含む多数の既知の自己抗原の他、多数の新規の自己抗原候補物質も含んだ。これらの自己抗原を表１に列挙し、対応する自己免疫疾患により、ＲＡ（表２）、ＳＬＥ（表３）、及びＡＮＣＡ（表５）とさらに分類する。レミケード（登録商標）治療前及び治療後の様々な時点においてＲＡバイオマーカー間で実施された対比較により、上記の通り（表７Ａ及び７Ｂ）に治療経過にわたり自己抗体応答の上昇又は低下が観察される、多数の既知及び新規の自己抗原が同定された。
【０１５１】
実施例２
[00156]健常個体の他、ＲＡ（関節リウマチ）、ＳＬＥ（全身性エリテマトーデス）、及びＡＮＣＡ（抗好中球細胞質抗体）を含む自己免疫疾患を有する個体に由来する血清を、実施例１に記載のＰｒｏｔｏＡｒｒａｙ（商標）ヒトタンパク質マイクロアレイ上でプロファイリングした。下記の計算を用い、自己免疫疾患に関する多数の潜在的な抗原バイオマーカーを同定した。これらのタンパク質は、重要な診断的指標又は予後診断的指標として役立つ潜在性を有する。何千又は何万ものタンパク質を含有するアッセイの代わりに、自己免疫疾患、又は特定の自己免疫疾患と関連する抗原のみを含有するアッセイに対して、検査試料をプロファイリングすることができる。以下の表では、ＲＡ、ＳＬＥ及びＡＮＣＡに関する自己抗原を同定する。
【０１５２】
[00157]表１〜７では、抗原をコードするヌクレオチド配列のＧｅｎｂａｎｋ  ＩＤ番号により、抗原を同定する。表１〜７の抗原は、ヌクレオチドＩＤ番号と関連するヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質又はそのフラグメントを指すことが理解される。表１では、ＲＡ、ＳＬＥ及びＡＮＣＡと関連する自己抗原を列挙する。表２、３及び５における自己抗原は、ＲＡ、ＳＬＥ及びＡＮＣＡとそれぞれ関連する自己抗原を個別に列挙し、その各々が、表１の自己抗原のサブセットである。
【０１５３】
[00158]表１は、健常個体に由来する抗体よりも、ＲＡ個体、ＳＬＥ個体及びＡＮＣＡ個体に由来する血清から得られた抗体が結合することの方が多かった自己抗原のリストである。
【０１５４】
【表１−１】
2010510528.tif 000002
【表１−２】
2010510528.tif 000003
【表１−３】
2010510528.tif 000004
【表１−４】
2010510528.tif 000005
【表１−５】
2010510528.tif 000006
【表１−６】
2010510528.tif 000007
【表１−７】
2010510528.tif 000008
【表１−８】
2010510528.tif 000009
【表１−９】
2010510528.tif 000010
【表１−１０】
2010510528.tif 000011
【表１−１１】
2010510528.tif 000012
【表１−１２】
2010510528.tif 000013
【表１−１３】
2010510528.tif 000014
【表１−１４】
2010510528.tif 000015
【０１５５】
[00159]表２は、健常個体に由来する血清中の抗体よりも、ＲＡを有する個体（インフリキシマブによる治療前）に由来する血清中の抗体が結合することの方が多かった自己抗原のリストである。正常カウント及びＲＡカウントは、対応するｐ値と共に示す。
【０１５６】
【表２−１】
2010510528.tif 000016
【表２−２】
2010510528.tif 000017
【表２−３】
2010510528.tif 000018
【０１５７】
[00160]表３は、健常個体に由来する血清中の抗体よりも、ＳＬＥを有する個体に由来する血清中の抗体が結合することの方が多かった自己抗原のリストである。正常カウント及びＳＬＥカウントは、対応するｐ値と共に示す。
【０１５８】
【表３−１】
2010510528.tif 000019
【表３−２】
2010510528.tif 000020
【表３−３】
2010510528.tif 000021
【表３−４】
2010510528.tif 000022
【表３−５】
2010510528.tif 000023
【表３−６】
2010510528.tif 000024
【表３−７】
2010510528.tif 000025
【０１５９】
[00161]表４に列挙した自己抗原は、ＳＬＥには選択的であるが、ＲＡ又はＡＮＣＡには選択的でない。表４は、ＳＬＥを有する個体に由来するが、健常患者、ＲＡ患者又はＡＮＣＡ患者には由来しない血清から得られた抗体が結合した自己抗原のリストである。
【０１６０】
【表４−１】
2010510528.tif 000026
【表４−２】
2010510528.tif 000027
【０１６１】
[00162]表５は、健常個体に由来する血清中の抗体よりも、ＡＮＣＡを有する個体に由来する血清中の抗体が結合することの方が多かった自己抗原のリストである。正常カウント及びＡＮＣＡカウントは、対応するｐ値と共に示す。
【０１６２】
【表５−１】
2010510528.tif 000028
【表５−２】
2010510528.tif 000029
【表５−３】
2010510528.tif 000030
【表５−４】
2010510528.tif 000031
【表５−５】
2010510528.tif 000032
【０１６３】
[00163]表６に列挙した自己抗原は、ＡＮＣＡには選択的であるが、ＲＡ又はＳＬＥには選択的でない。表６は、ＡＮＣＡを有する個体に由来するが、健常患者、ＲＡ患者、又はＳＬＥ患者には由来しない血清から得られた抗体が結合した自己抗原のリストである。
【０１６４】
【表６】
2010510528.tif 000033
【０１６５】
実施例３
[00164]インフリキシマブ（レミケード（登録商標））治療の開始前及び開始後におけるＲＡを有する１２例の個体に由来する血清を、実施例１に記載のハイスループットヒトタンパク質アレイに対してプロファイリングした。表７Ａは、ＲＡ患者の血清に由来する抗体が結合し、インフリキシマブ治療の２０週間後にカウントの減少を示した自己抗原のリストである。表７Ｂは、ＲＡ患者の血清に由来する抗体が結合し、インフリキシマブ治療の２０週間後にカウントの増大を示した自己抗原のリストである。
【０１６６】
【表７】
2010510528.tif 000034
【０１６７】
【表８】
2010510528.tif 000035
【０１６８】
実施例４
[00165]ＲＡ（関節リウマチ）、ＳＬＥ（全身性エリテマトーデス）及びＡＮＣＡ（抗好中球細胞質抗体）関連疾患を含む自己免疫疾患を有する個体に由来する血清を、実施例１に記載のＰｒｏｔｏＡｒｒａｙ（商標）ヒトタンパク質マイクロアレイ上でプロファイリングした。下記の計算を用い、各自己免疫疾患に関する抗原バイオマーカーを相互に比較して、各特定の疾患に対して選択的なバイオマーカー同定した。以下の表では、ＲＡ、ＳＬＥびＡＮＣＡなどの１つの自己免疫疾患に関して存在するが別の疾患に関して存在しない自己抗原を同定する。
【０１６９】
[00166]表８〜１３では、抗原をコードするヌクレオチド配列のＧｅｎｂａｎｋ  ＩＤ番号により、抗原を同定する。表８〜１３の抗原は、ヌクレオチドＩＤ番号と関連するヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質又はそのフラグメントを指すことが理解される。表８では、ＲＡ患者の血清に由来する抗体は結合したが、ＳＬＥ患者の血清に由来する抗体は結合しなかった抗原を列挙する。表９では、ＲＡ患者の血清に由来する抗体は結合したが、ＡＮＣＡ患者の血清に由来する抗体は結合しなかった抗原を列挙する。表１０では、ＳＬＥ患者の血清に由来する抗体は結合したが、ＲＡ患者の血清に由来する抗体は結合しなかった抗原を列挙する。表１１では、ＳＬＥ患者の血清に由来する抗体は結合したが、ＡＮＣＡ患者の血清に由来する抗体は結合しなかった抗原を列挙する。表１２では、ＡＮＣＡ患者の血清に由来する抗体は結合したが、ＳＬＥ患者の血清に由来する抗体は結合しなかった抗原を列挙する。表１３では、ＡＮＣＡ患者の血清に由来する抗体は結合したが、ＲＡ患者の血清に由来する抗体は結合しなかった抗原を列挙する。
【０１７０】
【表９−１】
2010510528.tif 000036
【表９−２】
2010510528.tif 000037
【表９−３】
2010510528.tif 000038
【０１７１】
【表１０−１】
2010510528.tif 000039
【表１０−２】
2010510528.tif 000040
【０１７２】
【表１１−１】
2010510528.tif 000041
【表１１−２】
2010510528.tif 000042
【表１１−３】
2010510528.tif 000043
【表１１−４】
2010510528.tif 000044
【表１１−５】
2010510528.tif 000045
【表１１−６】
2010510528.tif 000046
【表１１−７】
2010510528.tif 000047
【表１１−８】
2010510528.tif 000048
【表１１−９】
2010510528.tif 000049
【表１１−１０】
2010510528.tif 000050
【表１１−１１】
2010510528.tif 000051
【表１１−１２】
2010510528.tif 000052
【表１１−１３】
2010510528.tif 000053
【表１１−１４】
2010510528.tif 000054
【０１７３】
【表１２−１】
2010510528.tif 000055
【表１２−２】
2010510528.tif 000056
【表１２−３】
2010510528.tif 000057
【表１２−４】
2010510528.tif 000058
【表１２−５】
2010510528.tif 000059
【表１２−６】
2010510528.tif 000060
【表１２−７】
2010510528.tif 000061
【表１２−８】
2010510528.tif 000062
【表１２−９】
2010510528.tif 000063
【表１２−１０】
2010510528.tif 000064
【表１２−１１】
2010510528.tif 000065
【０１７４】
【表１３−１】
2010510528.tif 000066
【表１３−２】
2010510528.tif 000067
【表１３−３】
2010510528.tif 000068
【表１３−４】
2010510528.tif 000069
【表１３−５】
2010510528.tif 000070
【表１３−６】
2010510528.tif 000071
【表１３−７】
2010510528.tif 000072
【表１３−８】
2010510528.tif 000073
【表１３−９】
2010510528.tif 000074
【表１３−１０】
2010510528.tif 000075
【０１７５】
【表１４−１】
2010510528.tif 000076
【表１４−２】
2010510528.tif 000077
【表１４−３】
2010510528.tif 000078
【０１７６】
実施例５
[00167]本試験では、２５の知られた自己抗原を含む、５，０００を超えるヒトタンパク質を含む高含量タンパク質マイクロアレイを用いて、健常ドナー及び全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者に由来する血清試料パネルを通じた免疫学的プロファイルを評価した。
【０１７７】
[00168]マイクロアレイは、昆虫細胞発現システムから非変性条件下で精製した５，０００を超える組換えヒトタンパク質を含むよう設計された。タンパク質フィーチャーの大半は、Ｎ末端ＧＳＴタグを含むことで、タンパク質精製を促進する他、マイクロアレイ上におけるタンパク質の固定化を評価するよう設計された品質管理アッセイも容易とした。加えて、２５を超える既知の自己抗原が、アレイフィーチャーにより組み込まれた。これらは、他の臨床症状と組み合わせて、ＳＬＥに関して診断的であるとＡＲＡにより指定された自己抗原を含んだ（表１４ａ）。アレイは、４８の個別のサブアレイ中に配列された隣接するデュプリケートとしてタンパク質が配置され、各サブアレイがデータの取り込みを容易にし、アッセイ能力の指標として役立つよう設計された対照エレメントを含む、接触プリンティング法を用いてスポットされた（図１）。
【０１７８】
【表１５】
2010510528.tif 000079
【０１７９】
[00169]３つの統計学的手法を並行して適用して、ＳＬＥに関する２３０を超えるバイオマーカー候補物質を同定した（表１４ｂ）。検証試験において用いるカスタムタンパク質マイクロアレイを開発するために、これらの推定自己抗原の発現及び精製を個別に実施した。タンパク質にこれらが満たす特定の閾値基準の各々に対して点数を割り当てたスコアリングシステムを用いて、＞２３０のＳＬＥバイオマーカー候補物質に関して、全般的なランク付けスキームを開発した。Ｚ因子、Ｍ統計ｐ値、使用シグナル間の差、及び使用シグナル間の比率を含む、多数の統計学的パラメータ中でスコアリングの測定基準を因子化したところ、１８のタンパク質が最大スコアを生成した（表１５）（表１５中の１８のタンパク質が、表３に含まれることに注意されたい）。
【０１８０】
【表１６−１】
2010510528.tif 000080
【表１６−２】
2010510528.tif 000081
【０１８１】
【表１７】
2010510528.tif 000082
【０１８２】
[00170]これらの１８のＳＬＥ自己抗原候補物質を用いて、ルミネックス（登録商標）ビーズセットを検証試験用に調製した。疾患血清試料及び正常血清試料の同じセットをプローブとして用いた場合、マイクロアレイ及びルミネックスＸ−ＭＡＰ（登録商標）法プラットフォームの両方を通じて、約７０％のバリデーション率が観察された。ＳＬＥと関連する注記付き自己抗原に関してタンパク質マイクロアレイにより定義された、１８の新規のタンパク質から導かれたデータに主要成分分析を適用したところ、２つの集団の間における差別化の改善が観察された。サポートベクターマシンラーニングを用いるＬＯＯ（１つのみ取り出す）交差検証解析では、注記付きＳＬＥバイオマーカーに関して計算された１３．３％の分類誤差率に対して、アレイで定義されたバイオマーカー候補物質に関しては３．３％の誤差率が計算された。以上まとめると、本試験は、タンパク質マイクロアレイ法の、疾患バイオマーカー発見に関する免疫学的プロファイリング用ツールとしての採用を支持する実験的及び統計学的な枠組みを提供する。
【０１８３】
[00171]ＡＲＡにより指定されたＳＬＥ自己抗原の検出に方向づけられた診断的アッセイは、偽陽性シグナル及び偽陰性シグナルを最小化するため、１：１０〜１：１００の範囲の血清希釈率において実施されるのが通例である。自己抗原アレイに関するかつての研究では、このプラットフォームはより高感度でありうるので、最適のシグナル及び最大のダイナミックレンジをもたらすにはより大きな希釈率を要することが示唆された。この観察を確認するため、健常個体及びＳＬＥ患者に由来する血清を含む１２試料のパネルを、３つの希釈率：１：１５０、１：６４０、及び１：２５６０における高含量ヒトＰｒｏｔｏＡｒｒａｙ（登録商標）上で評価した。アッセイ後、各アレイに対して高解像度の画像が得られ、定義された円形フィーチャーの他、局所バックグラウンドにも対応するピクセル強度データが得られた。ダイナミックレンジ全体でバックグラウンドを差し引いたシグナル強度値が得られた頻度を表すヒストグラムが、各試料に関して作成された。１つのＳＬＥ試料に対応する、代表的なシグナル分布のプロットを、図２に示す。３つの希釈率すべてを通じて、シグナルの大半は、１０，０００相対蛍光単位（ＲＦＵ）を下回って観察されたが、２つのより高い希釈率に対し、１：１５０の希釈率において５，０００ＲＦＵを上回るシグナルをもたらすアレイフィーチャー数の著明な増加が観察されたことは、本アッセイでは、より高い希釈率が偽陰性の可能性を増大させることを示唆する。２０，０００ＲＦＵを上回って観察されたシグナルは、検査したすべての希釈率を通じた総体において少数であったが、１：１５０の希釈率では、著明により多数のアレイフィーチャーが、高強度のシグナルをもたらした（図２、右パネル）。検査した３つの希釈率を通じ、各アレイに関して局所バックグラウンドに対応するピクセル強度の中央値を計算し、すべてのアレイを通じたバックグラウンドの平均値を計算した。これらのアッセイにおいて用いたスキャナー上で測定可能な最大のシグナルは、６５，０００ＲＦＵである。検査した３つの希釈率を通じたバックグラウンドの平均値が４倍未満の差であったことは、同様のダイナミックレンジが用いられることを示唆する（図２Ｂ）。これらの結果に基づき、血清試料の拡張パネルのプロファイリングにおける使用には、１：１５０の希釈率を選択した。ＳＬＥ患者から採取した２０の血清試料、及び健常個体から採取した１０の血清を１：１５０に希釈し、５，０００タンパク質のマイクロアレイ上でプロファイリングした。蛍光マイクロアレイスキャナー上で高解像度画像を得、画像解析によりピクセル強度データをキャプチャーした。
【０１８４】
[00172]データに３つの統計学的手法を適用し、これらの解析の結果を比較した。タンパク質マイクロアレイデータの解析において用いた方法の１つでは、四分位により規格化したシグナル強度データに適用されたＭ統計を用いた。このアルゴリズムは、特定のタンパク質に対するシグナル値が、別の群におけるこのタンパク質に対して観察される最大のシグナル値よりも大きい、１つの群におけるアッセイ数に対応するカウントを与える（図３Ａ、赤楕円）。後続の計算により、このタンパク質から生じる、他の集団における２番目に大きなシグナルよりも大きなシグナルを有する１つの集団におけるアレイ数（図３Ａ、紫楕円）、３番目に大きな（以下略）を計算し、アレイ上のすべてのタンパク質に対するデータセット中を繰り返し進む。サイズｎｘの第ｘ群と比較したサイズｎｙの第ｙ群に対する「ｌ」次元のＭ統計は、
【数１】
2010510528.tif 000083
［式中、ｘ（ｉ）は、第ｘ群のｉ番目に大きな値であり、「ａｂｏｖｅ」及び「ｂｅｔｗｅｅｎ」は、計算パラメータである］により与えられる。ｐ値は、Ｍｉ以上のＭ値を有する確率として計算される。最小のｐ値を有するＭ統計を選択し、対応するｐ値を用いて、有意のバイオマーカー候補物質選択の閾値を確立した。ＳＬＥ抗体プロファイルを解析するのに用いられた第２の方法は、規格化されないシグナル強度データが、生物学的重要性及び統計学的有意性の次元に沿って配列される「ボルカノプロット」であった。第１の（水平の）次元が、２つの集団間における対数スケールによる倍数変化を表し、第２の（垂直の）軸が、試料間差のｔ検定に対するｐ値を表す。第１の軸は、変化の生物学的影響を示し、第２の軸は、変化の統計学的な証拠又は信頼性を示す。ＳＬＥ自己抗体及び健常自己抗体のプロファイリング実験から得られた、ピクセル強度によるマイクロアレイデータを、Ｍ統計を用いてｐ値を計算するボルカノプロット統計法において用いた。この解析により、ｐ値＜０．０５及びｌｏｇ２による倍数変化＞１をもたらす４８のタンパク質を同定した（図３Ｂ）。２試料によるｔ検定、Ｕ（マン−ホイットニー）統計、及びＭ統計を含む、一般的に用いられる統計学的手法を用いて計算されたｐ値により、アレイフィーチャーの大部分にわたり同様のランク順位がもたらされることが報告されている。第３の解析手法では、四分位で規格化したシグナル強度データから、バックグラウンドを差し引いたシグナル値（使用シグナル）の試料間差を計算し、１，５００ＲＦＵを超える差を示すバイオマーカー候補物質を、後続の検証試験への組み入れ用に選択した。これらの３つの統計学的手法を用いて同定されたＳＬＥバイオマーカー候補物質における重複を、図３Ｃに示す。
【０１８５】
[00173]アレイのエレメントは、１２段階の２倍の希釈系列における隣接するデュプリケートとしてスポットし、結果として得られるマイクロアレイは、元の３０試料パネルによりプローブし、異なる統計学的手法の有効性を評価した。これらの検証用マイクロアレイを用いて、免疫プロファイリング実験からバックグラウンドを差し引いたピクセル強度値を抽出し、次いで、上記のＭ統計又はボルカノプロット解析を用いて、ＳＬＥ集団又は健常集団において免疫反応性の上昇を示すものとして各アレイフィーチャーを分類した。この集団割り当ての後、ｐ値又は使用シグナル間の差によりアレイフィーチャーをランク付けした。検証用マイクロアレイ上に存在するフィーチャー総数が相対的に少ないため、ｐ値の直接的な比較は不可能であったが、これらのアレイ上におけるシグナル強度データから計算された値を、元の高含量アレイデータと比較して免疫反応性シグナルの再現性を評価した。ｐ値の計算値＜０．０１又は使用シグナル間の差＞１５００を有する、検証用アレイ上に組み入れられたタンパク質数を図４（黒色バー）に示す。検証用アレイデータから計算されたｐ値及び使用シグナル間の差を用いてランク順位を生成し、いずれかの測定基準により並べ替えた、検証用アレイ上で上位１００中にランク付けされるタンパク質を、ハッチングを掛けたバーにより示す。いずれのランク付け統計によるカスタムアレイ上における上位１００中にも入る、元のアッセイ中で有意であると同定されたタンパク質の百分率を示す。この解析の結果から、ＳＬＥ集団における方が健常集団におけるよりも高度な免疫応答を誘発するタンパク質に関して、元のマイクロアレイ及び検証用マイクロアレイ上で観察された免疫反応性間における高度の検証が示された。ＳＬＥ集団における最大検証率が７２％であったのに対し、健常集団において観察された最大検証率は５８．６％であった。加えて、分類測定基準としてＭ統計を用いて集団に割り当てられたタンパク質の方が、ボルカノ解析を用いて特定の集団に割り当てられたタンパク質よりも高度の再現性を示した。Ｍ統計により分類されたタンパク質に対して観察された最大の検証率が７２％であったのに対し、ボルカノ解析により分類されたタンパク質に対して観察された最大の検証率はわずかに４０．８％であった。タンパク質にこれらが満たす特定の閾値基準の各々に対して点数を割り当てたスコアリングシステムを用いて、ＳＬＥバイオマーカー候補物質のリスト用に、全般的なランク付けスキームを開発した。Ｚ因子、Ｍ統計ｐ値、使用シグナル間の差、及び使用シグナル間の比率を含む、多数の統計学的パラメータ中でスコアリングの測定基準を因子化したところ、２３０を超えるタンパク質中１８のタンパク質が最大スコアをもたらした。興味深いことに、これらのタンパク質中１３のタンパク質が、元のデータセットに対して適用された３つのすべての統計学的手法によりＳＬＥバイオマーカーと同定され、３元重複領域中のタンパク質の５０％を占めた（図３Ｃ）。さらに、Ｍ統計を用いたところ、これらすべての１８の自己抗原候補物質がヒットとして定義されたのに対し、使用シグナル間の差及びボルカノ解析を用いたところ、１８の自己抗原中同定され��のは、それぞれ１６／１８（８９％）及び１３／１８（７２％）の自己抗原であった。以上まとめると、これらの結果は、Ｍ統計が、高含量タンパク質マイクロアレイのデータセットに由来する推定自己抗原の初期セットの同定に、頑健な解析手法を提供することを示唆する。
【０１８６】
[00174]主成分分析（ＰＣＡ）を用いて、ＳＬＥと関連することがかつて示された１０の自己抗原からなるパネル、又は、上記のスコアリング解析により定義された１８のＳＬＥバイオマーカー候補物質を用いる、２つの集団の分離可能性を定性的に評価した。図５に示した３次元プロットが、最初の３つの主成分を表し、本試験により定義された新規のＳＬＥバイオマーカーにより、１０報の文献により定義されたＳＬＥ抗原の主成分分析により達成された分離よりも改善された２つの集団の分離がもたらされた。
【０１８７】
[00175]上記に示した結果により、タンパク質マイクロアレイアッセイにより定義されたバイオマーカー候補物質は、元の実験において用いられたタンパク質とは別個に発現され精製されたタンパク質を含むアレイ上でプロファイリングされた場合も、再現可能な反応性を示すことが裏付けられた。しかし、直交法を用いてバイオマーカー候補物質を検証することが重要であった。ルミネックスＸ−ＭＡＰ（登録商標）法は、臨床的状況において多重的アッセイを実施するのに適する少数のプラットフォームの１つであるため、これらの実験用に選択した。ヤギ抗ＧＳＴ抗体を各ビーズ領域に抱合させ、ＧＳＴタグを付したタンパク質の後続の結合を可能とする、ビーズ結合戦略を用いた。結合後のビーズ間におけるＧＳＴタグを付したタンパク質の移動を評価するため、精製されたＧＳＴを、１つの色彩領域に由来する抗ＧＳＴ抱合ビーズと共にインキュベートし、次いで、他の色彩領域に由来する抗ＧＳＴ抱合ビーズと混合した。図６Ａに示す通り、５μｇ／ｍｌ未満のＧＳＴタンパク質濃度では、１つの抗ＧＳＴ抱合ビーズ領域から別の領域へのＧＳＴの移動は観察されなかった。上記の通り、１８の固有の色彩領域に対応するルミネックス（登録商標）ビーズをヤギ抗ＧＳＴ抗体に抱合させ、次いで、タンパク質マイクロアレイデータに適用されたスコアリング解析により同定された１８のＳＬＥバイオマーカー候補物質の各１μｇ／ｍｌずつと共に個別にインキュベートした。次いで、すべてのタンパク質が結合したビーズ領域を統合し、ＳＬＥ患者に由来する２０の試料及び健常対照集団に由来する１０の試料を含む、元の試験で用いられた各血清の希釈系列と共に、トリプリケートでインキュベートした。これらのアッセイは、再現可能な濃度依存的なシグナルを産生した（図６Ｂ）。検証マイクロアレイアッセイで観察されたシグナルとルミネックスアッセイで観察されたシグナルとの関係は、ピアソンの相関係数を用いて計算された。この実験では、１８タンパク質中１３（約７０％）に対するシグナルが、全試験試料を通じて＞０．５のピアソンの相関係数を産出し、個別のマイクロアレイ実験を通じて観察された検証率と同様であった（図６Ｃ）。注目すべきは、これら１３のタンパク質中９つが、元に高含量アレイ上で実施された並行する統計学的解析から得られる３元重複領域に由来した。これらの結果は、関連しない技法プラットフォームを用いる検証データを提供することにより、タンパク質マイクロアレイを用いて実施された自己免疫プロファイリングの知見を確認し拡張する。
【０１８８】
実施例６
[00176]Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のＰｒｏｔｏＡｒｒａｙ（登録商標）Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒソフトウェアは、免疫応答プロファイリング試験から結果として得られるデータを解析することを特に目的とする一連のアルゴリズムを含み、２つの集団を統計的に差別化するのに用いうるタンパク質を同定する目標を有する。過程の全般的な概要の他、特定のアルゴリズムの詳細な説明を以下に示す。
【０１８９】
[00177]免疫応答プロファイリング：データ解析で用いられる全般的な手法は、３ステップの過程：
単一のアレイ解析：各アレイ上の各タンパク質に対して、バックグラウンドを差し引いたシグナル、Ｚスコア、Ｚ因子、ＣＩ−Ｐ値、及び複製スポットの変動係数（ＣＩ−Ｐ値に関する詳細については、以下を参照されたい）を含む一連の値が計算される
群の特徴づけ：所与の集団に由来するすべての試料を通じて、各個別のタンパク質に対するシグナルを、ダウンストリームの解析用に整列する
治療された試料集団と治療されなかった試料集団との間の差を同定する：Ｍ統計を用いて、２つの集団の間の差別化シグナルが有意のｐ値をもたらすタンパク質を同定する
を用いる。
【０１９０】
ＣＩ−ｐ値の計算
[00178]ＣＩ−ｐ値という用語は、チェビシェフの不等式によるｐ値を表す。該値は、以下の仮説：
Ｈ０：このスポットは、陰性対照分布に由来する
Ｈａ：このスポットは、陰性対照分布に由来しない
を検定することにより導かれる。
【０１９１】
[00179]陰性対照分布についての仮定、したがって、所与の仮説を検定する、結果として得られるｐ値に対する仮定の影響を最小化する努力の中で、本発明者らは、Ｘがランダムな変数［式中、μ＝Ｅ（Ｘ）は平均、σ２＝Ｖａｒ（Ｘ）は分散］で、ｋ＞１であるならば、
【数２】
2010510528.tif 000084
であるとするチェビシェフの不等式を用いる。
【０１９２】
[00180]これは、帰無仮説下の確率に対する絶対限界である（これは、帰無仮説下では、これが最も控え目な推定ｐ値であることを意味する）。また一方で、帰無仮説下において、非対照スポットが、試料の平均及び試料の標準偏差は陰性対照に由来するシグナルから評価されるとみなす、陰性対照分布に由来すると仮定する。この不等式を用いて、
【数３】
2010510528.tif 000085
［式中、平均及び標準偏差は、陰性対照分布中で観察されたシグナルに由来する］を計算する。この計算において、Ｙはタンパク質のシグナルを表し、ｓは陰性対照の標準偏差であり、ｋはｋ番目のタンパク質であり、ここで、Ｙｋはｋ番目のタンパク質のシグナルである。本発明者らは、該分布に対して仮定を設けないので、これは、実際の確率に対する上限であることに注意されたい。
【０１９３】
群の命名と特徴づけ
[00181]このステップの目的は、特定のアッセイ群（例えば、「正常」個体に由来する）に対する試料名をＰｒｏｓｐｅｃｔｏｒソフトウェアに与え、これらの各アッセイに対して計算されるバックグラウンドを差し引いたシグナルを、単一のファイルに整列することである。この機能では、Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒにより計算された単一のマイクロアレイ結果を入力として取り込み、単一のアレイ解析結果ファイルの「使用シグナル」列からの値を整列し、結果として得られるスプレッドシートを単一の結果ファイルに書き込む。出力は、「群特徴づけの結果」で始まるファイル名を有する、タブで区切られたテキストファイルであり、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌで開くことができる。
【０１９４】
群の比較
[00182]アルゴリズムの最後のセットでは、２つの群を比較し、１つの群において別の群におけるよりもシグナル値の上昇を示すタンパク質を同定する。以下に説明するＭ統計値が記録される。加えて、１つの群において別の群におけるよりもシグナルの上昇がみられない確率を表す比較を通じて、各タンパク質に対するｐ値が計算される。
【０１９５】
[00183]解析パラメータは：
四分位による規格化（デフォルト＝オン）−比較されるアッセイを通じてシグナル値を規格化する、
シグナルは＿ＲＦＵを超えなければならない（デフォルトは５００）−Ｍ値計算用の追加のパラメータで、シグナル値が、指定されたバックグラウンド閾値を超えることを要求する、
シグナル差は＿ＲＦＵを超えなければならない（デフォルトは２００）−Ｍ値計算用の追加のパラメータで、２つのシグナル間の指定されたギャップが有意に異なると考えられることを要求する、
を含む。
【０１９６】
[00184]Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒは、指定された群特徴づけファイルを読み取り、要求された計算を完了し、結果として得られるスプレッドシートを単一の結果ファイルに書き込む。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌで開くことのできる、このタブで区切られたテキストファイルは、適用された解析パラメータの詳細を記すヘッダーを含む。結果ファイルは、以下の計算値の列：
第１群カウント−カットオフよりも大きいシグナルを伴う第１群中のアレイ数
第２群カウント−カットオフよりも大きいシグナルを伴う第２群中のアレイ数
第１群陽性率−第１群におけるマーカーの推定陽性率
第２群陽性率−第２群におけるマーカーの推定陽性率
Ｐ値−Ｍ統計による最大の有意差に対するＰ値
カットオフ−「ヒット」を決定するカットオフシグナル
規格化したシグナル値−規格化を選択すると、規格化したデータ（アレイ当たりのデータ）を有する列が、右側に付加される
を有するプローブのリストを伴う表を含む。
【０１９７】
計算
Ｍ統計
[00185]このアルゴリズムは、指定されたタンパク質に対するシグナル値が、別の群においてこのタンパク質に対して観察される最大のシグナル値よりも大きい１つの群におけるアッセイ数に対応するカウントを与える（小さな楕円）。続いて、ソフトウェアは、このタンパク質から生じる、別の集団における２番目に大きなシグナルよりも大きなシグナルを有する指定された集団におけるアレイ数（大きな楕円）、３番目に大きな（中略）を計算し、すべてのＰｒｏｔｏＡｒｒａｙ（登録商標）タンパク質に対するデータセット中を繰り返し進む。
【数４】
2010510528.tif 000086
【０１９８】
[00186]サイズｎｘの第ｘ群と比較したサイズｎｙの第ｙ群に対する「ｌ」次元のＭ統計は、
【数５】
2010510528.tif 000087
［式中、ｘ（ｉ）は、第ｘ群のｉ番目に大きな値であり、「ａｂｏｖｅ」及び「ｂｅｔｗｅｅｎ」は、計算パラメータである］により与えられる。
【０１９９】
[00187]ｐ値は、Ｍｉ以上のＭ値を有する確率として計算される。Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒは、最低のｐ値を有するＭ統計を選択し、このＭｍａｘ値及び順位の他、下記の対応するｐ値及び陽性率の推定値も以下に記載の通り記録する。
【０２００】
[00188]陽性率に関する無情報事前分布を用い（即ち、マーカーの未知の陽性率が０〜１であると仮定し）、二項式試料採取スキーム（即ち、ｎ個のアレイ中、マーカーの陽性率がｐで与えられ、入力されるＸ個のアレイを観察するというスキーム）を認めると、陽性率は、
【数６】
2010510528.tif 000088
として推定される。
四分位による規格化
【０２０１】
[00189]四分位による規格化は、２つ以上の１チャネルデータセットを合成アレイに規格化する、ノンパラメトリックの手順である。この方法は、シグナルの分布が、すべての試料中でほぼ同じであることを仮定する。各アレイに対する最大のシグナルは、最大シグナルの中央値で置換され、２番目に大きなシグナルは、２番目に大きなシグナルの中央値で置換されるなどである。
【０２０２】
統計学用語の定義
[00190]仮説の検定：２つの相互に排他的な仮説が与えられる場合、一方を帰無仮説と呼ぶことが通例であり、他方を対立仮説と呼ぶことが通例である。次いで、データを収集し、帰無仮説の妥当性を検定し、このデータを用いて、帰無仮説が棄却されるか否かを判定する。
【０２０３】
[00191]棄却の規則：これは、観察されたデータが、帰無仮説を棄却するか、又は、帰無仮説を棄却しない、統計学的な方法である。この規則が、「帰無仮説又は対立仮説を受容する」ことはなく、もっぱら棄却するための規則であることに注意することが重要である。帰無仮説の本質、及び、棄却の規則により決定される事柄に基づき、この手法には４つの可能な帰結が存在する。４つの帰結は、以下に示すことができる。
【表１８】
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【０２０４】
[00192]Ｈ０の本質が実際に知られることはないことに注意されたい。棄却の規則に対する実際の定式は、データの種類、及び、なされる一連の仮定に応じ、仮説の検定ごとに変化する。
【０２０５】
[00193]第Ｉ種の過誤：第Ｉ種の過誤の確率は、αで表記するのが通例である。一般に、これは、犯される最も重大な過誤であると考えられる。
【０２０６】
[00194]第ＩＩ種の過誤：第ＩＩ種の過誤の確率は、βで表記するのが通例である。これもまた過誤ではあるが、通常、第Ｉ種の過誤の確率を最小化しようと試みることにより制御される。
【０２０７】
[00195]精度：統計学的な用語法において、精度とは、第Ｉ種の過誤を犯さない確率として定義される。これは、真の陽性の確率であると考えることができる。したがって、これは、１−αと表記される。
【０２０８】
[00196]検定力：統計学的な用語法において、検定力とは、第ＩＩ種の過誤を犯さない確率として定義される。これは、真の陰性の確率であると考えることができる。したがって、これは、１−βと表記される。
【０２０９】
[00197]今や、明確な理解を目的とする例示及び例により、ある程度詳しく本発明のすべてを説明したので、本発明又はその任意の特定の実施形態の範囲に影響することなしに、本発明の広範且つ同等の範囲内の条件、定式、及び他のパラメータを改変又は変更することにより、同発明を実施することができ、こうした改変又は変更が、付属の特許請求の範囲の範囲内に含まれることを意図することは、当業者に明らかであろう。
【０２１０】
[00198]当業者は、不適切な実験に依存することなく、本発明の実施において、具体的に例示された以外の出発物質、試薬、精製法、材料、基質、機器のエレメント、分析法、アッセイ法、成分からなる混合物及び組成物を用いうることを理解するであろう。任意のこうした材料と方法の、当技術分野で知られたすべての機能的な同等物は、本発明に含まれることが意図される。用いられた用語及び表現は、説明用語として用いられ、限定用語としては用いられないので、こうした用語及び表現の使用において、示され説明されたフィーチャー又はその一部の任意の同等物を除外する意図は存在せず、主張される本発明の範囲内において、各種の改変が可能であることが認識される。したがって、本発明は、好ましい実施形態及び任意選択のフィーチャーにより具体的に開示されているが、当業者は、本明細書において開示された各種の概念の改変及び変更を行ってよく、こうした改変及び変更が、付属の特許請求の範囲により定義される本発明の範囲内にあると考えられることを理解されたい。
【０２１１】
[00199]本明細書で用いられる「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「〜を含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、又は「〜を特徴とする（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ｂｙ）」と同義であり、包含的又はオープンエンドであり、追加の列挙されなかったエレメント又は方法ステップを除外しない。本明細書で用いられる「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、特許請求の範囲のエレメントにおいて指定されない任意のエレメント、ステップ、又は成分を除外する。本明細書で用いられる「基本的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、本特許請求の範囲の基本的な特徴及び新規の特徴に実質的に影響を及ぼさない物質又はステップを除外しない。本明細書の各場合において、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「基本的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」、及び「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、他の２つの用語のいずれによっても置換することができる。
【０２１２】
[00200]本明細書において、物質、組成物、成分、又は化合物の一群が開示される場合、これらの群及びそのすべてのサブグループのすべての個々のメンバーは、個別に開示されることが理解される。本明細書においてマーカッシュ群又は他の群分けが用いられる場合、該群のすべての個々のメンバー及び該群の可能なすべての組合せ及び可能なすべての副次的組合せは、本開示に個別に含まれることを意図する。別段に述べない限り、本明細書において記載又は例示された成分の各定式又は組合せを用いて、本発明を実施することができる。本明細書において範囲、例えば、温度範囲、時間範囲、又は組成物範囲が与えられる場合はいつでも、すべての中間範囲及び部分範囲の他、所与の範囲中に含まれるすべての個々の値も、本開示中に含まれることを意図する。本開示及び特許請求の範囲において、「及び／又は」とは、付加的に又は代替的にを意味する。さらに、単数形における用語の任意の使用はまた、複数形も包含する。
【０２１３】
[00201]本明細書で引用されたすべての参考文献は、本明細書の開示との齟齬が存在しない程度において、その全体において、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で示される一部の参考文献は、参照により、出発物質の供給源、追加の出発物質、追加の試薬、追加の合成法、追加の分析法、追加の生体材料、追加の核酸、化学改変された核酸、追加の細胞、及び、本発明の追加の使用に関する詳細を示す目的で本明細書に組み込まれる。本明細書で用いられるすべての見出しは、便宜のみを目的とする。本明細書で言及されるすべての特許及び刊行物は、本発明が関連する当業者のレベルを示し、個々の刊行物、特許、又は特許出願が、参照により組み込まれることを具体的且つ個別に指示されたと仮定した場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で引用された参考文献は、参照により、その全体において本明細書に組み込まれ、その公表又は出願日現在の最新技術を示し、必要ならば、本明細書におけるこの情報を用いて、先行技術における特定の実施形態を除外することができるものとする。例えば、組成物が主張される場合、本明細書に引用される参考文献中においてそれを可能とする開示が提供される化合物を含む、本出願者の発明に先行する技術において知られ用いられる化合物は、本明細書において主張される組成物中に含まれることを意図しないことを理解されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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