(57)【要約】  本発明は、差別的にラベリングする異なるタンパク質の試料に適切な同位体の及び等圧のラベル構成成分の両方を備えた二重のラベリング試薬を記載する。個々のタンパク質の試料のラベリングの後に、全ての試料は、貯留される。貯留された試料からのペプチドは、各々の差別的に二重にラベリングされたポリペプチドの相対的な濃度を決定するために質量分光測定法によって単離されると共に分析される。バランス基
2010509567.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドの質量分光測定法の分析用のラベリング試薬のセットであって、
各々のラベリング試薬は、
−  気圧変化のラベル構成成分、
−  タンパク質／ペプチドに反応性の基、並びに
−  レポーター基（ＲＰ）及びバランス基（ＢＧ）を含む等圧のラベル構成成分
：を含む、ラベリング試薬のセット。
【請求項２】
請求項１に記載のラベリング試薬のセットにおいて、
前記気圧変化のラベル構成成分は、同位体のラベル構成成分である、ラベリング試薬のセット。
【請求項３】
請求項１に記載のラベリング試薬のセットにおいて、
前記気圧変化のラベル構成成分は、前記等圧のラベルのレポーター及び／又はバランス基内に含まれたものである、ラベリング試薬のセット。
【請求項４】
請求項１に記載のラベリング試薬のセットにおいて、
前記タンパク質／ペプチドに反応性の基は、タンパク質又はポリペプチドにおけるシステインと反応する、ラベリング試薬のセット。
【請求項５】
請求項１に記載のラベリング試薬のセットにおいて、
各々のラベリング試薬は、親和性タグをさらに含む、ラベリング試薬のセット。
【請求項６】
請求項５に記載のラベリング試薬のセットにおいて、
前記親和性タグは、開裂可能なものである、ラベリング試薬のセット。
【請求項７】
請求項５に記載の試薬において、
前記親和性タグは、ビオチンである、試薬。
【請求項８】
異なる試料における官能基を含む一つの又はより多くのポリペプチドの存在を同時に分析するための方法であって、
ａ）各々の試料が、差別的な二重のラベリング試薬のセットの一つで、前記ラベリング試薬が前記試料における前記一つの又はより多くのポリペプチド又はそれから発生させられたペプチドの官能基と反応することを可能にすることによって、ラベルされるところのラベリングステップ；
前記ラベリングステップにおいて、前記セットされた差別的な二重のラベリング試薬が、同じ又は本質的に同じ化学的な構造を有すると共に気圧変化の及び等圧のラベル構成成分を含むこと、並びに、
前記ラベリングステップにおいて、各々のラベリング試薬が、気圧変化の及び等圧のラベル構成成分の独特の組み合わせを含むこと、
ｂ）ポリペプチドの試料のミックスを得るために前記異なる試料を貯留すること、
ｃ）前記ポリペプチドの試料のミックスから前記二重のラベリングされたポリペプチド又はペプチドを選択的に単離すること；並びに
ｄ）質量分光分析法によって前記単離されたラベリングされたポリペプチド又はペプチドの相対的な出現を分析すること
：のステップを含む、方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法において、
前記気圧変化のラベリング構成成分は、同位体のラベリング構成成分である、方法。
【請求項１０】
請求項８に記載の方法において、
前記ラベリング試薬のセットのラベリング試薬は、親和性タグを含む、方法。
【請求項１１】
請求項８に記載の方法であって、ステップ（ａ）の後にペプチドへと前記タンパク質を開裂させることのステップをさらに含む、方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法において、
前記開裂は、トリプシンで行われる、方法。
【請求項１３】
請求項８に記載の方法において、
ステップｃ）において、前記ポリペプチド又はペプチドは、前記ラベリングされたポリペプチド又はペプチドに存在する前記親和性タグに基づいて選択的に単離される、方法。
【請求項１４】
請求項８に記載の方法において、
前記官能基は、チオールである、方法。
【請求項１５】
請求項８に記載の方法において、
それから発生させられた前記ポリペプチド又はペプチドの官能基は、別の官能基の修飾の結果として存在するものである、方法。
【請求項１６】
請求項８に記載の方法において、
ステップ（ｃ）は、電気泳動又はクロマトグラフィーによって前記貯留されたポリペプチドからのラベリングされたポリペプチド又はペプチドのフラクションを単離することのステップを含む、方法。
【請求項１７】
請求項８に記載の方法において、
ステップ（ｄ）は、ステップ（ｃ）において得られた前記単離されたラベリングされたポリペプチド又はペプチドのフラクションにおける異なる質量の相対的な量をＭＳで決定することのステップを含む、方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法において、
ステップ（ｄ）は、衝突で誘起された解離（ＣＩＤ）に前記単離されたラベリングされたポリペプチドのフラクションをかけること及びそれにおける異なる等圧的にラベリングされたポリペプチドの相対的な量を決定することのステップをさらに含む、方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法において、
前記異なる等圧的にラベリングされたポリペプチドの相対的な量は、ＣＩＤの後に前記等圧のラベルから解放されたレポーター基の相対的な量を決定することによって決定される、方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、
前記ポリペプチドの配列を決定することのステップをさらに含む、方法。
【請求項２１】
等圧の及び気圧変化のラベル構成成分を有する請求項１に記載のラベリング試薬でポリペプチド試料をラベリングするための方法であって、
前記試料におけるポリペプチドにおける官能基と前記ラベリング試薬を反応させることのステップを含む、方法。
【請求項２２】
対照のタンパク質の試料及び一つの又はより多くの実験的な又は疾患のタンパク質の試料の間で差別的に表現されるところのタンパク質を同定するための請求項８乃至２１のいずれかに記載の方法の使用。
【請求項２３】
ポリペプチド又はペプチドの混合物であって、
各々は、同位体のラベル構成成分及び等圧のラベル構成成分を含むと共に、
前記ラベルは、前記ポリペプチド又はペプチドにおける官能基を通じて前記ポリペプチド又はペプチドへ連結されてしまってある、ポリペプチド又はペプチドの混合物。
【請求項２４】
請求項２３に記載のポリペプチド又はペプチドの混合物において、
前記官能基は、
−  Ｎ末端における又はリシンにおける第一級アミン、
−  アスパラギン酸、グルタミン酸、又はＣ末端におけるカルボキシル基、及び
−  システインにおけるチオール基
：からなる群より選択されたものである、ポリペプチド又はペプチドの混合物。
【請求項２５】
請求項２３に記載のペプチドの混合物であって、
タンパク質のトリプシンのペプチドであるところのペプチドを含む、ペプチドの混合物。
【請求項２６】
請求項２３に記載の混合物において、
前記ポリペプチド又はペプチドに存在する異なるラベルの数は、少なくとも４個である、混合物。
【請求項２７】
四つの又はより多くのラベリング試薬を含むキットであって、
各々のラベリング試薬は、等圧のラベル構成成分、気圧変化のラベル構成成分、及びタンパク質／ペプチドに反応性の基を含むと共に、
前記キットにおける各々のラベリング試薬は、同じ又は本質的に同じ化学的な構造を有すると共に、
前記キット内における各々のラベリング試薬は、前記気圧変化の及び前記等圧のラベル構成成分の独特の組み合わせを含む、キット。
【請求項２８】
請求項２７に記載のキットにおいて、
前記ラベリング試薬は、親和性タグを含む、キット。
【請求項２９】
これらのものの貯留された混合物における同じアミノ酸配列を備えた個々のポリペプチド又はペプチドの相対的な量を決定するための方法であって、
各々の個々のポリペプチド又はペプチドは、貯留することに先立ち、差別的な二重のラベリング試薬のセットの一つでラベリングされてしまってあると共に、それによって前記差別的な二重のラベリング試薬のセットが、同じ又は本質的に同じ化学的な構造を有すると共に同位体の及び等圧のラベル構成成分を担持すると共に、
各々のラベリング試薬は、異なる同位体の及び等圧のラベル構成成分の独特の組み合わせを含む、方法において、
ａ）自由選択で、同じアミノ酸配列を有する前記個々のポリペプチド又はペプチドを含む単離されたフラクションを得るために、液体クロマトグラフィーによって前記ポリペプチド又はペプチドを単離すること、
ｂ）第一のＭＳによって、異なる質量を備えたポリペプチド又はペプチドのさらなるフラクションへと前記貯留された混合物又はステップ（ａ）において得られたポリペプチドの単離されたフラクションにおける前記ペプチド又はポリペプチドを分離すること及び異なる質量を備えた各々のペプチドのフラクションの相対的な量を決定すること、
ｃ）前記個々のポリペプチドの等圧のラベル構成成分がフラグメントにされるところの条件の下で、第二のＭＳにステップ（ｂ）において得られたペプチドをかけること及び前記ペプチドのフラクション内における前記個々のペプチドのフラグメントにされた等圧のラベル構成成分の各々の量を決定すること、
ｄ）ステップ（ｃ）において決定された前記当方のラベル構成成分の各々の量から、ステップ（ｂ）において得られたペプチドのフラクション内における前記個々のペプチドの相対的な量を決定すること、
ｅ）ステップ（ｂ）において決定された異なる質量を備えた各々のフラクションの相対的な量から、及び、ステップ（ｄ）において決定された前記個々のペプチドの相対的な量から、前記貯留された混合物に存在する同じアミノ酸配列を有する各々の個々のポリペプチドの相対的な量を計算すること
：のステップを含む、方法。
【請求項３０】
タンパク質の試料の多重のラベリング及び分析のためのデバイスであって、
試料の少なくとも二つの源、
ラベリングユニット、並びに、
−  気圧変化のラベル構成成分、
−  タンパク質／ペプチドに反応性の基、並びに
−  レポーター基（ＲＰ）及びバランス基（ＢＧ）を含む等圧のラベル構成成分
：を含むラベリング試薬を各々が含む対応するラベル源
を含むと共に、
分離ユニット、
質量分光計ユニット、及び
データ分析ユニット
をさらに含む、デバイス。
【請求項３１】
請求項３０に記載のデバイスであって、
試料分離ユニット、タンパク質開裂ユニット、及び親和性精製ユニットからなる群より選択された一つの又はより多くの要素をさらに含む、デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、質量分光測定法のアプローチによるターゲットのスクリーニングのための方法及びツールを提供する。より詳しくは、当該発明の方法及びツールは、同位体の及び等圧のペプチドをラベリングする手順の組み合わせを使用するものである液体クロマトグラフィー質量分光分析法を使用することで多重の試料の並行のスクリーニングを可能にする。
【背景技術】
【０００２】
［発明の背景］
高度に複雑な混合物からのタンパク質の分析及び同定は、はなはだしい分解能を要望する。このような混合物を分解するために一般的に使用された二つの方法は、２次元のゲル電気泳動（２Ｄ−ＧＥ）及び（２次元の）液体クロマトグラフィー（（２Ｄ）−ＬＣ）である。
【０００３】
高分解能２Ｄ−ＧＥは、Ｋｌｏｓｅ（１９７５）Ｈｕｍａｎｇｅｎｅｔｉｋ  ２６，２３１−２４３及びＯ’Ｆａｒｒｅｌｌ（１９７５），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５０，４００７−４００２１によって導入された。２Ｄ−ＧＥは、分解能（＞５０００個のタンパク質）において卓越したものであるが、しかし、自動化及び再現性の欠如を欠点としてもつ。さらには、疎水性の膜タンパク質、塩基性のタンパク質、酸性のタンパク質、非常に大きい又は非常に小さいタンパク質のようなタンパク質は、不十分に分解される。
【０００４】
ゲル電気泳動を使用する同定を逃れるところの多数の有望な疾患のマーカーのために、２Ｄ−ＬＣは、複雑なタンパク質の混合物の高分解能の分離を可能にする、良好な代案を提供する［Ｈａｎａｓｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  ４２２，２２６−２３２；Ｌｉｐｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９，１１０４９−１１０５４］。２Ｄ−ＬＣのアプローチは、より小さいタンパク質を分離するためには２Ｄ−ＧＥと比べてより適切なものであると共に、自動化及びスループットは、顕著により良好なものである。キャピラリー電気泳動（ＣＥ）、逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣ、及び２次元の液体クロマトグラフィーを包含する、液体クロマトグラフィーによってタンパク質／ペプチドの消化物を分離するための数個の技術は、記載されてきたものである。
【０００５】
典型的には、２Ｄ−ＧＥ又は２Ｄ−ＬＣによって単離されたペプチド及びタンパク質は、質量分光測定法によって又はアミノ酸の組成／及び又はアミノ酸配列を決定することによって、同定される。
【０００６】
質量分光測定法の技術によって異なる試料（疾患対対照）の間における統計的に顕著なタンパク質の表現の差異を決定する際の最も関連性のある問題は、異なる試料からのＭＳ信号の相対的な定量化である。従って、可能な限り多くの異なる試料の間における技術的な変動性を低減する為には、並行における多重の試料のプロセシングを可能にするところの、方法論を開発することは、高度に望ましいことである。
【０００７】
近年では、二つのアプローチは、これを達成するために導入されてきたものである。第一の技術は、同位体でコード化された親和性タグ（ＩＣＡＴ）技術と呼ばれたものであると共に、関連させられたタンパク質の混合物の差別的な同位体のタグ付けに基づいた定量的なプロテオーム解析を可能にするものである［Ｇｙｇｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７，９９４−９９９］。記載されたＩＣＡＴの試薬は、三つの機能的な要素：還元されたシステイン残基の選択的なラベリングのためのチオールに反応性の基、システインでラベリングされたペプチドの選択的な単離を可能にするためのビオチン親和性タグ、及び、二つの同位体の形態、“軽い”（非同位体の）又は（２Ｈ又は１３Ｃを利用する）“重い”形態で合成されるところの、同位体のタグ、を使用する。適度な数の発生させられたペプチドのみが、それの一次配列にシステインを含有すると、消化された親和性の精製された試料の複雑さは、劇的に減少する。二つの個々にラベリングされたペプチドの試料（“軽い”対“重い”）は、それらが、ＭＳの同定が後に続けられた液体クロマトグラフィー（図１）と同様の分離の技術に適用される前に、組み合わせられる。
【０００８】
代案の方法は、相対的な及び絶対的な定量化のための等圧のタグ（ｉＴＲＡＱ）と称された等圧的にラベリングされた試薬の使用をなすものである。Ｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４），ＭｏＩ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ３，１１５４−１１６９によって記載されたこの技術は、四つの異なるｉＴＲＡＱの試薬を提供するが、各々が、レポーター基、バランス基、及び第一級アミンの基と反応するところのペプチドに反応性の基を含有するものである（図３）。レポーター基は、各々の試薬における１２Ｃ／１３Ｃ及び１６Ｏ／１８Ｏの差別的な同位体の組み合わせに依存することで、１１４、１１５、１１６、又は１１７Ｄａの質量を備えた基である。バランス基は、レポーター基及びバランス基の組み合わせられた質量が、四つの試薬について一定の（１４５Ｄａ）もののままであることを保証するために、３１から２８Ｄａまでの質量において変動する。それに応じて、（レポーター及びバランス基における異なる同位体の特異的な組み合わせを含む）これらの試薬の各々での同じペプチドのラベリングは、等圧のもの及び液体クロマトグラフィーにおける共溶出液であると共にその結果としてクロマトグラフィー的に区別できないものであるところのペプチドに帰着する。ＭＳ／ＭＳ分析の間に、レポーター基のイオンは、ペプチドからのフラグメントになると共に、１１４から１１７Ｄａまでの明瞭な質量を表示するものである。これらのフラグメントの強度を、個々のペプチドの定量化のために使用することができる。それに応じて、四つの異なる試料における特定のペプチドの存在を、異なるｉＴＲＡＱの試薬での試料の各々をラベリングすることによって、差別的に決定することができる。ｉＴＲＡＱのラベルは、ＭＳ／ＭＳスペクトルから絶対的なペプチドの存在量のみならず相対的なものを定量化するために使用されると共に、単一の実験内における四つまでの異なる試料のラベリングを可能にする。加えて、ラベリングされたペプチドは、等圧のものであると共に、ＭＳにおいて観察されるところの及びＣＩＤに使用されるところの一つのイオン種に全て寄与する。これは、特に低い存在比を備えた分子について、増加させられた信号強度及び正しいペプチドの同定の増加させられた確率に帰着するが、それは、多数の生物学的に有意なタンパク質の特徴的なものである。最近では、商業的に入手可能なＩＴＲＡＱの試薬のセットは、八個まで成長してきたものであるが、１１３、１１８、１１９、及び１２１の質量を備えたレポーター基を包含するものである。
【０００９】
ＭＳ信号の絶対的な及び相対的な定量化は、質量分光測定法のアプローチに基づいた技術によるバイオマーカーの発見における未解決の問題点である。しかしながら、異なる試料、例．（異なる疾患の群、疾患の異なる進行のステージ、疾患対対照／健康的なもの）の間における関連性のある表現の差異の同定は、関連性のあるバイオマーカーを、たくさんの測定から誘導することができるのみであると、高度に再現可能な技術を必要とする。
【００１０】
上に記載されたＩＣＡＴ及びｉＴＲＡＱの技術は、２個（ＩＣＡＴ）又は４個若しくは８個まで（ｉＴＲＡＱ）のいずれかの個々の試料の多重化を可能にすると共に、それらを同時に加工することを可能にするが、それによって技術的な変動性を最小化する。にもかかわらず、両方のこれらのアプローチは、顕著な限界を有する。ＩＣＡＴのアプローチは、二つの異なる試料又は二つの疾患の群の調査を可能にするのみであるが、それは、通常では、疾患に関連した群（例．疾患の進行の異なるステージ）の十分なスペクトルを表現するものではない。従って、２個と比べてより多い群の調査を可能にするところの、利用可能な技術を有することは、非常に好都合なことであるであろう。ｉＴＲＡＱの技術は、多重の試料の分析を可能する一方で、それが、レポーター信号の相対的な定量化のための（ラベリングされてない及びラベリングされたペプチドの両方についての）各々のＭＳの信号においてＭＳ／ＭＳスキャンを行うことを要求するという明りょうな不都合を有する。実際には、これは、分析が、非常に時間を消費するものであることになる際には、出発材料が、ヒトの血清又は他の体液のような高い複雑さのものであるとき、実行可能ではないものである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｋｌｏｓｅ（１９７５）Ｈｕｍａｎｇｅｎｅｔｉｋ  ２６，２３１−２４３
【非特許文献２】Ｏ’Ｆａｒｒｅｌｌ（１９７５），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５０，４００７−４００２１
【非特許文献３】Ｈａｎａｓｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  ４２２，２２６−２３２
【非特許文献４】Ｌｉｐｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９，１１０４９−１１０５４
【非特許文献５】Ｇｙｇｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７，９９４−９９９
【非特許文献６】Ｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４），ＭｏＩ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ３，１１５４−１１６９
【発明の概要】
【００１２】
［発明の概要］
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、一つの単一のラベリング試薬において同位体のラベル構成成分及び等圧のラベル構成成分を組み合わせることによって、先行技術の技術の限定された多重化を克服する。使用することができるところのより大きい数の差別的なラベリング試薬を発生させることによって、組み合わせられた試料の検出の多重化は、増加させられる。
【００１４】
本発明に従ったラベリングのツール及び方法は、差別的にラベリングされたペプチドを、ＭＳにおいて簡単に同定することができるという利点を有すると共に、それによって、分析を関心のあるペプチドに限定する。
【００１５】
本発明の二重のラベリングの方法の使用は、それらのペプチドのみが、ペプチドの差別的な表現が異なる試料の間で観察されるところのＭＳ／ＭＳによって分析されることを必要とするので、質量分光測定法による分析時間が、顕著に低減されるという利点を有する。
【００１６】
本発明のラベリングの方法の使用をなすツール及び方法は、タンパク質の試料の多重のスクリーニングについて関心のあるものである。より詳しくは、それらは、異なるタンパク質の試料におけるタンパク質の定量的な及び／又は定性的な差異を同時に決定することを可能なものとする。これは、表現のレベルにおける差異を決定するために使用されることができると共に、また、例．疾患の事情において、異なるタンパク質の試料の間におけるタンパク質分解性のプロセシングにおける差異を決定することを可能にする。この点において、本発明は、例．疾患の異なるステージ及び／又は異なる疾患の形態の比較において、直接的に比較することができるところの異なる試料の多重のスクリーニングのための方法を提供する。
【００１７】
本発明のラベリング試薬は、ものにラベルをつけているステップだけが用いられる多重化ラベリング実験を実行するために許す。差別的にラベルをつけられたタンパク質の全ての最終的な同定がＭＳ／ＭＳに確実にされると共に、同位元素ラベルの違いに対応する質量の違いについては、彼らが異なった分離されたピークとして現れるにつれて、タンパク質又はペプチドの同位体ラベルの存在はＭＳスペクトルの差別的にラベルをつけられたペプチドの全ての同定を許す。これは、ＭＳステップで差別的に表されると確認されたそれらのペプチドに、更なるＭＳ／ＭＳ分析の限定を許す。加えて、親和性ラベルの存在は、効果的にラベルをつけられたペプチドに第１のＭＳ分析の付加的限定事項を許す。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
特定で好適な本発明の態様は、添付のインディペンデント及び従属クレームにおいてならべられる。従属クレームからの特集は、独立クレームの特徴によって、そして、他の従属クレームの特徴によって結合されることができる適当な、そして、請求項において述べられて明確に単に。
【００１９】
本発明の第１の態様は、ポリペプチド、レポーター基（ＲＰ）から成る気圧変化のラベル構成成分、タンパク質／ペプチド反応性の基及び等圧のラベル構成成分から成る各々のラベリング試薬及びバランス基（ＢＧ）の質量分析のための一組のラベリング試薬に関する。
【００２０】
一つの実施形態において、気圧変化のラベル構成成分は同位体ラベル構成成分である。そして、それはラベリング試薬の等圧のラベル構成成分の範囲内で成られない。あるいは、気圧変化のラベル構成成分は、レポーター及び／又はラベリング試薬の等圧のラベルのバランス集まり内で成られる。
【００２１】
本発明のラベリング試薬の一つの実施形態において、タンパク質／ペプチド反応性の基は、タンパク質又はポリペプチドのシステイン残基と反応する。
【００２２】
本発明の具体例は上記の通りに試薬にラベルをつけることを提供する。そして、親和性タグから更に成る。そして、それは任意に開裂可能なものである。更なる具体例において、親和性タグはビオチンである、又は、分子はそこから由来した。
【００２３】
本発明の更なる態様は方法を同時に異なる試料の官能基から成る一つ以上のポリペプチドの存在を分析するために提供する。そして、それはラベリングステップを含む。そこにおいて、各々の試料は同じこと又は基本的に同じ化学構造を有する本発明によって試薬にラベルをつけていて、気圧変化で等圧のラベル構成成分から成っている一組の差別的なダブルのうちの１杯についてのラベルがついている。ラベリングステップは、ラベリング試薬のタンパク質反応性の基が試料の一つ以上のポリペプチド又はそこから発生する（その結果例えばタンパク質分解裂開の中で）ペプチドの官能基と反応することができることによって確実にされる。本発明の本態様による方法の更なるステップはポリペプチド・試料混合物（二重の選択的な隔離がポリペプチド・試料混合物及び質量分光法による単離されたラベルをつけられたポリペプチド又はペプチドの相対的な発生の分析（４）からのポリペプチド又はペプチドと分類した（３））を得るために異なる試料をプールする（２）ことを含むが、これに限定されるものではない。
【００２４】
そして、典型的には本発明の方法で使用する試薬にラベルをつけることの一組は気圧変化で等圧のラベル構成成分のユニークな組合せから成る。一つの実施形態によれば、気圧変化のラベリング構成要素は、構成要素にラベルをつけて同位体である。
【００２５】
具体例によれば、上記の方法で使用するラベリング試薬は、親和性タグから成る。
【００２６】
一つの実施形態によれば、ステップ（ａ）の後、本発明の方法は、更に含む；割れているステップ（試料のタンパク質又はポリペプチドがペプチドに切断されるそれによって）。
具体例において、この切断することは、トリプシンによって実行される。
【００２７】
本発明の本態様の具体例によれば、ステップｃ）は、ラベルをつけられたポリペプチド又はペプチドに存在する親和性タグに基づいて選択的にポリペプチド又はペプチドを分離することから成る。
【００２８】
この方法の具体例において、基が試料のポリペプチド又はペプチドに示す、そして、ラベリング試薬のタンパク質反応性の基によって反応する汎関数は、チオールである。
【００２９】
この方法、ポリペプチドに存在する官能基又はタンパク質と反応する試料のペプチドの他の実施例によれば、ラベリング試薬の反応性の基は、他の官能基の変更態様の結果として、ある。したがって、本発明の方法は任意に追加的な変更態様処置を含む。そこにおいて、試料のポリペプチド又はペプチドは本願明細書において記載されているにつれて、一組のラベリング試薬のタンパク質反応性の基によって反応することに適している官能基を得るために修正される。
【００３０】
本発明の本態様の方法の一つの実施形態によれば、ステップ（ｃ）は、加えて、又はあるいは、電気泳動又はクロマトグラフィーによってラベルをつけられたポリペプチド又はペプチド分数をこれらのプールされたポリペプチドから分離するステップを含む。
【００３１】
本発明の本態様の方法の一つの実施形態によれば、ステップ（ｄ）は、単離されたラベルをつけられたポリペプチド又はペプチド分数の異なる多数の相対的な量がステップ（ｃ）において得たＭＳによって決定するステップを含む。任意に、本発明の本態様の方法で、ステップ（ｄ）は、この単離されたラベルをつけられたポリペプチド分数を衝突−誘発された解離（ＣＩＤ）に従属させて、その中の異なる等圧的にラベルをつけられたポリペプチドの相対的な量を決定するステップを更に含む。特定実施例において、異なる等圧的にラベルをつけられたポリペプチドの相対的な量は、ＣＩＤの後で等圧のラベルから自由にされるレポーター基の相対的な量を決定することによって決定される。
【００３２】
一つの実施形態によれば、本発明の本態様の方法は、このポリペプチドの配列を決定するステップをさらに含む。
【００３３】
本発明の更なる態様は、このラベリング試薬を試料のポリペプチド上の官能基と作用するステップを含んでいる等圧で気圧変化のラベル構成成分を有する本発明の第１の態様にて説明したように、ラベリング試薬を有するポリペプチド・試料にラベルをつける方法に関する。
【００３４】
異なる主題を異なる生物学的であるか実験的なタンパク質試料において差別的に表されるタンパク質、例えば制御個人及び異なる疾患状況（異なる疾患段階）の一つ以上のタンパク質試料を同定するための上で記載されているか又は同じ疾患があると思われるにつれて、本発明の更なる態様は方法の活用法に関する．．．その他。
【００３５】
まだ、本発明の更なる態様は異なる試料（特定の試料からの各々のｐｏｌｙｅｐｔｉｄｅ又はペプチドが同位体ラベル構成成分及び等圧のラベル構成成分から成るラベルから成る）から生じているポリペプチド又はペプチドの混合物を提供する。そして、どのラベルがポリペプチド又はペプチドの官能基によるポリペプチド又はペプチドにリンクされた。
【００３６】
実施例において、ラベルが連結された本発明の混成のポリペプチド又はペプチドの官能基は、Ｎ末端上の又はＬｙｓイン上の主要なアミン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はＣ末端上のカルボキシル基及びシステイン上のチオール・基からなる群から選択される官能基である。
【００３７】
特定の実施例では、ペプチドのこの混成は、タンパク質試料のトリプシンの消化から生じている生物学的タンパク質のトリプシンのペプチドの混成である。
【００３８】
特定の実施例では、ペプチドに存在する異なるラベル又は本発明の本態様の混成のポリペプチドの数は、少なくとも４である。
【００３９】
本発明の更なる態様は等圧のラベル構成成分、気圧変化のラベル構成成分及びタンパク質／ペプチド反応性の基から成る４つ以上のラベリング試薬から成るキットを提供する。そこにおいて、このキットの各々のラベリング試薬は同じこと又は基本的に同じ化学構造を有する、そして、各々のラベリング試薬は気圧変化で等圧のラベル構成成分のユニークな組合せから成る。
【００４０】
実施例において、このキットのラベリング試薬は、親和性タグから成る。
【００４１】
次のステップから成る、本発明の更なる態様は方法を一組の差別的な二重にラベルをつけている試薬のうちの１つについてのラベルがついて、水たまりになることより前のこれらのポリペプチド又はペプチド（異なる試料からの各々のポリペプチド又はペプチドがある）のプールされた混成の範囲内で、同じアミノ酸配列を有する異なる試料の個々のポリペプチド又はペプチドの相対的な量を決定するために提供する、使用する差別的な二重にラベルをつけている試薬の一組は同じこと又は基本的に同じ化学構造を有して、試薬が成る同位体で等圧のラベル構成成分及び各々の標識化をもたらすそれによってユニークな組合せの異なる同位体、そして、等圧のラベル構成成分ａ）が任意に液体クロマトグラフィーによるポリペプチド又はペプチドとラベルをつけられる全てを分離して、同じアミノ酸配列を有する前記個々のポリペプチド又はペプチドから成る単離された分数を得るために、ポリペプチド又はペプチドの単離された分数を切り離しているｂ）は、ポリペプチドの更なる分数又は各々異なる質量を有するペプチドにステップ（ａ）で行われていた、ステップ（ｃ）において決定される各々の等圧のラベル構成成分の相対的な量から、ステップ（ｂ）で得られたポリペプチド又はペプチド分数の範囲内の個々のペプチド及び各々のポリペプチド又はペプチドの相対的な量から算出しているｅ）の相対的な量を決定している第１のＭＳ及び決定することによって親類が異なる質量を有する各々の分数の中で達すること。等圧のラベル構成成分（そして、任意にポリペプチド又はペプチド）が断片的である状況の下で第２のＭＳに対するステップ（ｂ）で得られたペプチド分数を従属させていて、各々の断片的な等圧のラベル構成成分の量を決定しているｃ）。ｄ）異なる質量を有する分数はステップ（ｂ）で決定した、そして、ステップ（ｄ）で得られたペプチド分数の範囲内の個々のペプチドの相対的な量から、各々の相対的な量は同じアミノ酸配列（前記プールされた混合に存在する）を有する個々のポリペプチドにラベルをつけた。
【００４２】
それでも、本発明の更なる態様は、多重標識化の装置（１００）及び少なくとも２つの各々レポーター基（ＲＧ）及びバランス基（ＢＧ）から成る気圧変化のラベル構成成分、タンパク質／ペプチド反応性の基及び等圧のラベル構成成分から成るラベリング試薬から成っていて、分離装置（１０７）、質量分析計装置（１０８）及びデータ分析装置（１０９）から更に成っている試料（１０１）、標識化装置（１０３）及び対応するラベル・ソース（１０４）源から成るタンパク質試料の分析に関する。
【００４３】
具体例において、この装置は、試料準備装置（１０２）、タンパク質裂開装置（１０５）及び親和性浄化装置（１０６）からなる群から選択される一つ以上の要素から更に成る。
【００４４】
本発明の上記で他の特徴、特徴及び効果は以下の詳細な説明から明らかになる。そして、添付の図面とともに必要とされる。そして、それは、例えば、本発明の原則を例示する。本発明の範囲を制限せずに、この説明は、実施例だけのために与えられる。下記を引用される参照図は、添付の図面を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
［図面の簡単な説明］
【図１】図１は、（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）ＭｏＩ．ＣｅＩ．Ｐｒｏｔｅｏｍ．２，１１９８−１２０４から取られた）開裂可能なＩＣＡＴの試薬でのタンパク質のプロフィールの定量的な分析のためのプロテオームのフローチャートを示す。
【図２】図２は、先行技術の開裂可能なＩＣＡＴの試薬の概略的な構造を示す。
【図３】図３は、ｉＴＲＡＱラベル（Ａ）及びそれでラベリングされたペプチド（Ｂ）の例示的な構造を示す。ラベルは、１１４から１１７Ｄａまでの範囲にわたる質量を備えたレポーター基及び３１から２８Ｄａまでの範囲にわたる質量を備えたバランス基からなる。
【図４】図４は、当該発明の特定の実施形態に従って、それによって同位体のラベル構成成分が、即ち、硫黄（図４Ｂ）でバランス基における酸素原子（図４Ａ）を取り替えることによって、等圧のラベル構成成分内に導入されるところのラベルを示す。図４Ｃにおいて、同位体のラベル構成成分は、等圧のラベル構成成分のレポーター基のピペラジン基のプロピル側鎖に導入される。
【図５】図５は、本発明の特定の実施形態に従って、ラベリング試薬の概略的な表現の例の限定するものではないセットを示す。
【図６】図６は、本発明の特定の実施形態に従って、同位体の及び等圧のラベル構成成分の両方を含むラベリング試薬を使用するものである多重の試料の同時の分析を立証する。
【図７】図７は、本発明の特定の実施形態に従って、少なくとも二つの試料源（１０１）、試料調製ユニット（１０２）、ラベリング試薬源（１０４）を備えたラベリングユニット（１０３）、タンパク質開裂ユニット（１０５）、親和性−精製ユニット（１０６）（例．アビジンの親和性クロマトグラフィーシステム）、二つの連続的に結合させられた分離システム（１１０７）及び（２１０７）を含む分離ユニット（１０７）、質量分光計ユニット（１０８）、並びに、読み出しシステム（１１０）へ連結させられた制御及び分析回路部品及びデータ分析ユニット（１０９）を含む、８個のタンパク質試料（１００）の多重化分析用のデバイスを示す。  異なる図において、同じ参照符号は、同じ又は類似の要素を指す。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
［実施形態の詳細な説明］
本発明は具体例に関して、そして、特定の図面に関して記載されている、しかし、本発明はそれに対してでなく、しかし、請求項によってだけ制限される。請求項のいかなる参照符号も、範囲を制限するものとして解釈されない。記載されている図面は、模式的で、非制限するだけである。図において、いくつかの要素の寸法は、誇張されることができて、説明の便宜上スケールに引き寄せられることができない。「成り立っている」用語が現在の説明及び請求項において使われる所で、それは他の要素又はステップを除外しない。不明確であるか確かな物品が使われて例えば単数名詞に記載のとき、ほかのことが特に定まっていない限り、これはその名詞の複数形を含む。
【００４７】
最初に、第２に、期間、さらにまた、第３など説明の、そして、請求項の、類似した要素とを区別するために、そして、必ずしも経時的であるか年代順の命令を記載するためにでない使用する。非常に使用する条件が適当な状況の下で交換可能である、そして、本願明細書において記載されている本発明の実施例が記載されているか又は本願明細書において例示されるより別のシーケンスの動作ができると理解されることになっている。
【００４８】
次の期間又は定義は、本発明の理解の援助だけに、単に提供される。これらの定義は、当業者によって理解されるより範囲を有しないために、解釈されてはならない。
【００４９】
本願明細書において使われるように、用語「ポリペプチド」又は「タンパク質」はペプチド結合を経て接続される複数の天然であるか修正されたアミノ酸に関連する。ポリペプチドの長さは、２から数千アミノ酸（用語は、このようにまた、オリゴペプチドと一般に呼ばれるあることを含む）まで変化することができる。グリコシル化、リン酸化、その他のような生体内翻訳後変更態様によって修正される一つ以上のアミノ酸から成っていて及び／又はタンパク質を修正している薬品（例えば、薬品をアルキル化しているか又はアセチル化する）を有するｖｉｔｒｏにおいて修正された一つ以上のアミノ酸から成っているポリペプチドは、この範囲の中で含む。
【００５０】
用語「ポリペプチド断片」又は「ペプチド」本願明細書において使用するタンパク質又はポリペプチドの裂開の後、得られたアミノ酸配列に関連するために用いる。ポリペプチド断片又はペプチドは、サイズ又は自然において制限されない。
【００５１】
条件「内臓」（ペプチドに記載のタンパク質又はポリペプチドのペプチドの対応する位置に関連するために本願明細書において使われるときに「アミノ」「端末」及び「カルボキシ」「端末」）。例えば、タンパク質ＮＨ２−Ｘｉ−Ｋ−Ｘ２−Ｒ−Ｘ３−Ｋ−Ｘ４−ＣＯＯＨ（Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４は、どこでリシン（Ｋ）かＡｒｇｉｎｉｎｅ（Ｒ）のない普通の長さのペプチド配列であるか）のトリプシンの裂開で、アミノ終端のペプチドはＮＨ２−Ｘｉ−Ｋ−ＣＯＯＨである、内部ペプチドはＮＨ２−Ｘ２−Ｒ−ＣＯＯＨ及びＮＨ２−Ｘ３−Ｋ−ＣＯＯＨである、そして、カルボキシ終端のペプチドはＮＨ２−Ｘ４−ＣＯＯＨである。
【００５２】
用語「タンパク質裂開」本願明細書において使用するポリペプチドの２つのアミノ酸間のペプチド結合の加水分解に関する。これは、両方の化学であるか酵素の加水分解を含む。
【００５３】
用語「断片化」本願明細書において使用するタンデム質量分光測定法（ＭＳ）又はＭＳ／ＭＳ分析の衝突によって誘発された解離（ＣＩＤ）によって例えば得られるにつれて、一つ以上の化学結合及び分子の一つ以上の一部の次の発散の破壊に関連する。特定の実施例において、結合はペプチド結合である、しかし、それはそれに対して制限されない。
【００５４】
用語は、「ラベルをつける」本願明細書において使用するペプチド又はポリペプチドに共有結合して結合される合成物に関連する、そして、それ、その特定の所有物に基づいて質量分析計に検出可能である。ラベルがペプチド又はポリペプチドに共有結合したありえる所で、これはタンパク質／ペプチド反応性の基（ＰＲＧ）によって確実にされる。本発明によれば、１枚のラベルは、複数の「ラベル構成成分」（すなわちその特定の特性に基づく差別的に検出可能である複数の構成要素）を含むことができる。通常、ポリペプチド又はペプチドに存在する様に、用語「ラベル」は分子に関連するために用いる、そして、「試薬にラベルをつけている」用語はまだすなわち、フリーなタンパク質／ペプチド反応性の基から成って、タンパク質又はペプチドを有する反応の前に、解放されたラベル（又はタンパク質又はペプチドのラベルの存在を確実にするために使用する合成物の組合せ）に関連するために用いる。
【００５５】
条件「二重ラベル」及び「二重にラベルをつけている試薬」本願明細書において使用する気圧変化（例えば同位体）で等圧のラベル構成成分から成るラベル又は試薬に関連する。したがって、ペプチド又はタンパク質に関連することが両方ともから成るラベルの存在に関連する用語「ラベルをつけられる二重」は、ペプチド又はタンパク質上の構成要素にラベルをつける。
【００５６】
用語「同位体ラベル」本願明細書において使用する原子の一つ以上の同位元素から成るラベルに関連する。
【００５７】
用語「気圧変化のラベル構成成分」本願明細書において使用する基本的に、質量の違いを生成するために一つ以上の原子において異なること以外の、電気泳動及びクロマトグラフィーの同一方法の同一構造及びふるまうことに関する一組の分子に関連する、そして、いずれが、ラベル（分かれる）として使われることができるか。したがって、一組の気圧変化のラベル構成成分から成る一組のラベリング試薬又はラベルは、質量において異なる。
一つ以上の原子の違いがラベル構成成分が同じ原子の異なる同位元素から成るという事実に対応する所で、参照は「同位体ラベル構成成分」になされる。
【００５８】
用語「同位体ラベル構成成分」本願明細書において使用する基本的に、質量の違いを生成するために一つ以上の同位元素において異なること以外の、電気泳動及びクロマトグラフィーの同一方法の同一構造及びふるまうことに関する一組の分子に関連する、そして、いずれが、ラベル（分かれる）として使われることができるか。各々、同じこと又は基本的に同じ化学式を有するラベル構成成分から成っているが、同じ原子（数又は活字のどちらでも）の異なる同位元素の存在に基づいて質量において異なっているラベルについてのラベルがついている同一のペプチドは、ＭＳにおいて各々を区別されることができる。
【００５９】
用語「等圧のラベル構成成分」本願明細書において使用する同一構造及び等圧のラベル構成成分の範囲内の同位元素の差別的な配布のための同じ質量（断片化のそれは一組で異なる等圧のラベル構成成分間の質量において異なる同一構造を有する特定の断片をリリースする）を有する一組の分子に関連する。等圧のラベル構成成分典型的にはは、レポーター基（ＲＧ）及びバランス基（ＢＧ）と、いずれが分割に応じて切り離されるかと、いずれが同位元素の差別的な配布を示すかとを備えている。一組の等圧のラベル構成成分の「合わせた質量」は、レポーター基の総量及びバランス基に等圧のラベル構成成分のその一組について問い合わせる。
【００６０】
用語「レポーター基（ＲＧ）」はＣＩＤに断片イオンを生成する等圧のラベル構成成分の一部に関連する。そして、それは、一つ以上の同位元素の差別的な発生の結果として、一組の等圧のラベル構成成分の範囲内で個々に質量において異なる。例えば、一組の等圧のラベル構成成分の範囲内の異なるレポーター基は、Ｃ／Ｃの差別的な発生及び／又はレポーター基のＯ／Ｏによって特徴づけられる。レポーター基の発散に応じて発生する典型的断片は、等圧のラベル構成成分から成るラベルについてのラベルがついている使い古したｑｕａｎｔｉｔａｔｅａポリペプチド又はペプチドである。典型的には、レポーター基の断片イオンはＭＳスペクトルの低質量の領域に現れる。ここで、他の断片イオンは一般に見つからない。
【００６１】
用語は、「基（ＢＧ）を釣り合わせる」本願明細書において用いられる等圧のラベル構成成分（レポーター基及びバランス基の混合性質量が異なる等圧のラベル構成成分のために一定のことを確実にするために特定の補償数の同位元素を含む）の一部に関連する。バランス基は、ＣＩＤにラベルから自由にされることができるか又は自由にされることができない。
【００６２】
用語「官能基」本願明細書において使用するアミノ酸（化合物と結合する（一般に、共有結合締め具）ために使われることができる）上の化学機能に関連する。官能基は、アミノ酸の側鎖に又はポリペプチド又はペプチドのアミノ終点又はカルボキシ終点に存在することがありえる。用語は、ペプチド又はポリペプチドに自然に存在する官能基及び例えばタンパク質を修正している薬品を使用している化学反応を経て導かれるそれらを含む。
【００６３】
用語「タンパク質／ペプチド反応性の基（ＰＲＧ）」本願明細書において使用する‖アミノ酸にこの種の合成物の締め具（共有結合であるか共有結合ｎｏｎ−）に結果としてなっているタンパク質又はペプチドのアミノ酸上の官能基と反応することができる合成物（例えばラベリング試薬）上の化学機能に関連する。
【００６４】
本発明は同位体で等圧のラベル構成成分から成る異なるタンパク質試料の比較ために、試薬にラベルをつけることに関する。それによって、１つのプールされたポリペプチド又はペプチド混合の中で異なる起源の類似したペプチドの分化に差別的なラベルのよりかなりの数の生成を見込む。本発明の差にラベルをつけている試薬を使用して、タンパク質又はプールされた試料のペプチドの存在及び相対的な量を同定することは、さらに可能である。
【００６５】
したがって、本発明の方法及びツールは、相当する分析が興味がある一組の試料の分析法で特に興味がある。この種の一組の試料は、ありえる、しかし、限られていない、異なる時間位置、疾患の異なる臨床バージョンの試料、異なる患者の試料などで…を持っていかれる患者から試料をとる。本発明は、このように方法及びツールを疾患進行の、鑑別診断のための、そして、さらに生化学であるか生理的分析の多重分析のための標識を同定するために提供する。
【００６６】
本発明の方法及びツールは、タンパク質試料の分析に関する。期間、本願明細書において使われるように、試料をとる本発明の方法を実行する前に必然的にいかなる処理段階も含むか又は除外することを意図する。試料は、粗い未処理の試料、抽出されたタンパク質断片、精製されたタンパク質断片などでありえる．．．上記のように、タンパク質は、試料において現れる。一つの実施形態によれば、タンパク質試料は、質量のタンパク質の免疫減少によって前処理される。
【００６７】
本発明のラベリング試薬及び方法を有する分析に適しているタンパク質試料はウィルスものの試料を含む、原核生物、細菌、単調で、真核生物（菌類の）は発酵する無脊椎で、脊椎動物で、哺乳類で、人間の起源。試料の準備は、有機体（調査される組織又は器官）に従い異なる標準的方法が、通常利用できる、そして、専門家にとって公知である。哺乳類で人間のタンパク質試料に関してそれが培養細胞の隔離に適用されること、レーザーマイクロは、細胞、体組織、体液又は興味がある他の関連した試料を解剖した。試料のタンパク質の分別に関して、細胞溶解は、細胞分別及びタンパク質浄化における第１のステップである。多くの技術は細胞の混乱に利用できる。そして、物理的で、酵素で、洗剤ベースの方法を含む。歴史的に、物理的な溶解は、細胞混乱のための選択の余地の方法であった；しかしながら、それは、しばしば高価な、扱いにくい器材を必要として、時々、装置（例えば堅い部品均質化乳棒と比較してゆるい）の変わりやすさのために繰り返すのが困難であるプロトコルを含む（均質化、浸透圧性溶解、超音波細胞混乱）。近年、ベースの溶解が有する洗剤は、使いやすさ、低コスト及び効果的なプロトコルのために非常に普及しているようになる。
【００６８】
哺乳動物細胞は、原形質膜（細胞内容を細胞外環境から切り離しているバリアを形成するタンパク質−脂質二分子層）がある。原形質膜から成る脂質は、閉二分子シートを形成するために自発的に結びつく、両親媒性の、有している親水性で疎水性半分である。膜タンパク質は脂質二分子層に埋められる。そして、恐水症の核にわたっている一つ以上の領域によって適所に保たれる。加えて、周縁タンパク質は、二分子層の内側であるか外側の表層を統合された膜タンパク質を有する相互作用によって又は極地の脂質頭部基によって縛る。脂質及び蛋白質含有量の性質は、細胞種によって異なる。明らかに、物理的であるか洗剤に基づくにせよ、細胞の混乱のために選択される技術は調べられている細胞又は組織の起源及び固有の楽又はそれらの外側の層（ｓ）を崩壊させることの困難を考慮に入れなければならない。加えて、方法は、加工される材料の量及び意図された下流のアプリケーションと互換性を持たなければならない。
【００６９】
具体例において、タンパク質予備摘出を含む。そして、細胞タンパク質の分別が異なる区画（例えば細胞外タンパク質、膜タンパク質、細胞基質のタンパク質、核タンパク質、ミトコンドリア・タンパク質）から発明される。他の前分別方法は、物理的性質（例えば等電点、充電及び分子量）上のタンパク質を分離する。
【００７０】
具体例によれば、試薬又はプロテアーゼへの最適化された接近のためのタンパク質を変性させるために、試料は標識化又は裂開の前に前もって処理される。そして、適切なエージェント（例えばグアニジニウム塩化物、尿素、酸（例えば三フッ素の０，１  ％酸性である）、ベース（例えば５０％のピリシン）及びイオンであるか非イオン洗剤）を使用する。
【００７１】
さらに、下で詳述されるように、標識化薬品のタンパク質反応性基のタイプに従い、本発明の標識化方法の前に、本発明の方法は官能基がタンパク質変更態様エージェントと不可逆的に又は可逆的に修正されると想定する。実施例はブロックされたアミノ終点の発散である。そして、システインに対するシステインの減少が、システインの機能的なチオール群をブロックして、リシン、などのアミン群をアセチル化する、．．．．
本発明の方法は任意にこのように試料の前処理を含む。そして、それは上で一覧を示す試料準備方法の一つ以上から成る処理前のステップで実行されることができる。したがって、本発明の方法に適している装置は、任意に、試料準備（例えば超音波処理装置、クロマトグラフィー・システム（親和性、ゲル濾過）、限外濾過装置、遠心分離機、バッファの交付システムを有する温度制御反応バイアル、酵素、洗剤など）に適している一つ以上の装置を備えた試料準備装置から成る．．．
本発明によれば、ものにラベルをつけているステップだけを有する多数の標識化を可能にするツール及び方法は、提供される。ものにラベルをつけている試薬において、これはＭＳの差別的な検出に適している２種類のラベル構成成分を結合することによって本発明によれば確実にされる。それによって、ラベル構成成分の組合せに基づいて試薬にラベルをつけている一組の差を確実にする。
【００７２】
一つの実施形態によれば、本発明のラベリング試薬は、一組の等圧の（同じ質量）ラベル構成成分からある１つのラベル構成成分及び一組の気圧変化の（異なる多数）ラベル構成成分からあるものから成る。
【００７３】
本発明（ラベリング試薬の気圧変化のラベル構成成分）によれば構成要素であるそれ、それらから成るラベリング試薬が質量において異なる結果として、各々から質量において異なる。したがって、これらの構成要素は、異なる質量をそれらが縛られているペプチド／タンパク質に貢献させる。にもかかわらず、本発明の気圧変化のラベル構成成分は、基本的に、それらが縛られているペプチド又はタンパク質のクロマトグラフィーであるか電気泳動的な性質に、同じ影響を及ぼす。
【００７４】
一つの実施形態によれば、気圧変化のラベル構成成分は基本的に同じ化学構造を有する構成要素である、しかし、そこにおいて、ラベルの構造が最小限修正されるというような方法で、１つの原子はもう一方と交換される。したがって、この種の気圧変化のラベル構成成分から成る一組のラベリング試薬を有する同一のペプチドの標識化は、いずれがＭＳ分析の前に例えばクロマトグラフィーであるか電気泳動的な挙動において異ならないかという質量（それは、このようにＭＳにおいて同定されることができる）のわずかな（予め定められた）違いを有するペプチドに結果としてなる。
【００７５】
別の実施例によれば、本発明のラベリング試薬の気圧変化のラベル構成成分は同位体ラベル構成成分である。そして、すなわち差別的な同位元素合成によってセットの異なる試薬間の質量の違いを確実にする。
【００７６】
したがって、本実施例において、本発明のラベリング試薬は、同位体ラベル構成成分、等圧のラベル構成成分及びタンパク質反応性の基から成る。任意には、ラベリング試薬は、親和性タグから更に成る。通常、同位体ラベル構成成分及び等圧のラベル構成成分は、ラベリング試薬の２つの別々の一部を形成する。しかしながら、後述さているように、同位体ラベル構成成分はまた、等圧のラベル構成成分の範囲内で組み込まれることができる。
【００７７】
本発明のラベリング試薬の異なる同位体で等圧のラベル構成成分の組合せは、すなわち試料の中で水たまりになった後にそれによって試料に差動にラベルをつけるために、試料の起源を課されるものの範囲内の差にラベルをつけている試薬のより高い数が同定されることができると認める。例えば。ここで異なる同位体ラベル構成成分の数は２である、そして、等圧のラベル試薬の数は４（ラベル構成成分の２ｘ４＝８組合せの合計）である、そして、このように差別的な標識化の中で、試薬は作られることができる。この例では、試薬にラベルをつけることの一組は４つのラベリング試薬の２つの群から成る。それによって、２つの基は各々と質量（差別的な同位体標識化による）において異なる、そして、それによって各々の基内で、４つのラベリング試薬は等圧である。そして、すなわち同一の質量を有するが、ＭＳ／ＭＳにおいて、異なる質量をもつレポーター基を生成する。したがって、試薬にラベルをつけることのこの一組についてのラベルがついている異なる起源の同一のペプチドは、ＭＳにおいて最初で、同位元素的にラベルをつけられたペプチドの２つの群に対応する２つのピークと確認されることができる。そして、それは更にＭＳ／ＭＳにおいて分析されるときに、４つのピークを各々更に生成する。そして、等圧のラベル構成成分の差別的なレポーター基に対応する。
【００７８】
一つの実施形態によれば、同位体ラベル構成成分（本発明の複合同位体／等圧のラベリング試薬において使用する）は、同じ化学式を有する一つ以上の合成物を生成するために、同位体ラベル構成成分の原子の一つ以上が安定同位元素によって置換される、しかし、質量のそれらの違いに基づいて同位元素的に同定可能である構造から成る。
例えば、それぞれ、同位体ラベル構成成分の水素、窒素、酸素又は硫黄原子のいかなる一つ以上も、それらの同位元素的に安定同位元素２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７０、１８Ｏ又は３４Ｓと交換されることができる。例えば、水素は重水素によって置換される、又は、カーボンは１２Ｃ、１３Ｃによって置換される。上記の同位元素、２、３、４、５、６、７、８又は同位体ラベル構成成分のさらにより高い数のうちの更に１つを使用する、各々上述した異なるＡｓ氏を有する以外同一構造を有して、違いを発生することができる氏これらのラベル構成成分（異なる試料の同一のポリペプチド上の各々のラベリング試薬の締め具の）の結果として生じるものにおいて反映する氏そこから発生するポリペプチド又はペプチドの。
【００７９】
一つ以上の同位元素の差別的な導入によって同位体ラベル構成成分として機能することができる基の実施例は、エーテル、ポリエーテル、エーテル・ジアミン、ポリエーテル・ジアミン、ジアミン、アミド、ポリアミド類、ポリ・チオ・エーテル、二硫化物、シリルエーテル、アルキル又はアルケニル鎖（直鎖は、分岐した又は周期的である部分を有する）、アリール、ジアリール又はアルキル・アリール基を含むが、これに限定されるものではない。具体例において、本発明のラベリング試薬の同位体構成要素に存在するアリール基は、一つ以上のヘテロ原子（例えばＮ、Ｏ又はＳ原子）を含む。
【００８０】
具体例によれば、ラベリング試薬の同位体ラベル構成成分は、それが（ＭＳ）ｎ分析の間、ペプチドのような断片化を受けないようなものである。イオン化（同位体ラベル構成成分及び特にその中の同位体・基）を促進することは、酸性であるか基本的基（例えばＣＯＯＨ、ＳＯ３Ｈ、主要であるか、第２であるか、第三期のアミノ基、窒素複素環、エーテル又はこれらの基の組合せ）のような基又は半分を含むことができる。具体例において、同位体ラベル構成成分は、永久弾薬（例えばホスホニウム・基、第四級アンモニウム基、スルホニウム基、キレート化された金属イオン、テトラアルキル又はテトラアリールホウ酸塩又は安定カルボアニオン）を有する基を含む。
【００８１】
一つの実施形態によれば、本発明のラベリング試薬の同位体ラベル構成成分の構造は、一般式−Ｂ１−Ｘ１−（ＣＨ２）ｎ［Ｘ２−（ＣＨ２）ｍ］ｘ−Ｘ３−（ＣＨ２）ｐ−Ｘ４−Ｂ２に対応する  −  そこにおいて：  Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４は、それぞれに互いの中で、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、ＮＲ、ＮＲＲ＞＋、ＣＯ、ＣＯＯ、ＣＯＳ、ＳＳ、ＳＯ、ＳＯ２、ＣＯＮＲから選ばれる、ＣＳ−ＮＲ、Ｓｉ−Ｏ、アリール又はジアリールは集まる。（Ｒはアルキル（アルケニル）であるアルキニル、アルコキシル基の又はアリール基、そして、Ｒ、水素（アルキル）はアルコキシル基でアルケニル（アルキニル）である又はアリール基）。
【００８２】
具体例において、Ｘ１−Ｘ４は、不在である、しかし、典型的に少なくとも一つのＸ１−Ｘ４は、ある。ｎ、ｍ、ｐ及びｑは、Ｏ乃至約１００からの値を有する整数である。
ｎの具体例一つにおいて、ｍ、ｐ又はｑは０でない、そして、ｘはまた、ｎ＋ｘｍ＋ｐ＋ｑの合計が約１００未満である０の乃至約１００から、そして、約２０未満のより多くの具体例において変動している整数である；
そして、Ｂ１及びＢ２は、それぞれに互いの中で、同位体ラベル構成成分にラベリング試薬（例えば親和性タグ又は後述するタンパク質／ペプチド反応性の基）の他の一部の中で接着するのを容易にする、又は、それらのリンカーの望まれていない裂開に対して同位体ラベル構成成分を妨げて、例えば、ＣＯＯ、ＣＯ、ＣＯＮＲから選ばれる任意の半分である、ＣＳ−ＮＲ、そして、任意に単独で又は他の基と協力した一つ以上のＣＨ２基を含む、例えば、具体例（上で記載されている構造を有する同位体ラベル構成成分のＣＨ２基の一つ以上）において（ＣＨ２）ｑ−ＣＯＮＲ（（ＣＨ２）ｑ−ＣＳ−ＮＲ又は（ＣＨ２）ｑ）は、小さい（Ｃｉ−Ｃ６）アルキル（アルケニル又はアルコキシル基の基）によって、任意に置換されるアリール基は又はイオン化を促進する官能基、例えば酸性であるか基本的基又は永続的な陽であるか負の負担を担持している基によって置換する。
【００８３】
具体例において、リンカーのＣＨ２基を接続している一つ以上の単結合は、二重又は三重結合と交換される。具体例ＲとＲアルキルにおいて、アルケニル、アルキニル又はアルコキシル基の基は、１〜約６つの炭素原子を有して小さい。
【００８４】
具体例によれば、本発明の同位体ラベル構成成分は、１、２の原子から成り立つどのアールどちらか、組み込む又は、等圧のラベル構成成分の最も特に、ラベリング試薬の他の一部の側鎖。この実施例は、より以下に詳細に記載されている。
【００８５】
本発明のラベリング試薬は、上で記載されている気圧変化であるか同位体ラベル構成成分に加えて、等圧のラベル構成成分から更に成る。
【００８６】
一つの実施形態によれば、等圧のラベル構成成分はレポーター基（ＲＰ）及びバランス基（ＢＧ）から成る。それによって、レポーター基の量は各々の等圧のラベル構成成分（試薬にラベルをつけることの一組の中で）に特有である、そして、レポーター基の全体の量及び異なる等圧のラベル構成成分のバランス群は一定に保たれる。
【００８７】
具体例によれば、等圧のラベル部品の一般の構造は、一般の公式ＲＰＸ’−ＢＧ−Ｙ’−によって表されることができる。それによって、レポーター基（ＲＰ）は、等圧のラベル構成成分の、そして、典型的にまた、ラベリング試薬（下記参照）の終端の一部である。
Ｘ及びＹは、両方とも結合又は関連を表す。別の実施例によれば、レポーター基は等圧のラベル構成成分の内臓である、そして、ラベリング試薬の範囲内の等圧のラベル部品の一般の構造は一般の公式−Ｘ’−ＲＰ−Ｘ’−ＢＧ−Ｙ’−によって表されることができる。
【００８８】
等圧の標識化の概念は、図３において例証される。図３Ａは、等圧のラベル構成成分の実施例を提供する。本実施例において、等圧のラベル構成成分は、ＪＶ−メチル・ピペラジンを主成分としたレポーター基及びカルボニルである質量のバランス基から成る。図３Ｂにおいて、等圧のラベル構成成分は、直接、ＮＨＳエステルであるペプチド反応性の基によるペプチドに密接に結びつく。レポーター基の量がセットの中で各々の等圧のラベル構成成分に特有である間、レポーター基の全体の量及び異なる等圧のラベル構成成分のバランス群は一定に保たれる。
【００８９】
強化を含んでいる重水素置換によって見られるクロマトグラフィー分離に関する課題を回避するために、示されるように、具体例によれば、一組のラベリング試薬の異なる等圧のラベル構成成分のレポーター基の差別的な量は１３Ｃ、１５Ｎ及び１８Ｏ原子を有する差別的な同位体強化を用いて確実にされる。異なる等圧のラベル部品の同一の構造からみて、数及びリングの豊かな中心の位置は、クロマトグラフィー又はＭＳ挙動に影響を及ぼさない。
【００９０】
等圧のラベル構成成分は、このように直接、ペプチドに又はアミド結合による同位体・基に縛られていることがありえる。図３において、等圧のラベル構成成分はタンパク質反応性の基が側面に並んでいること、反応性のアミン特性である基。反応性のアミン特性の反応にペプチドを有するこのラベリング試薬の中で基、ラベルは、アミン官能基（Ｎ末端又はリシンのアミン群）に、アミド結合を経て接続される。ＣＩＤに従属するときに、これらのアミド結合は背骨ペプチド結合に同じように分解する。断片ペプチドに対する他の適切な方法はＣＡＤ（衝突的に動作中の解離）（ＥＴＤ（電子転送解離））を含むＥＣＤ（電子捕獲解離）、ＩＲＭＰＤ（赤外線の多光子解離）、そして、ＢＩＲＤ（放射する黒体赤外線解離。ＣＩＤに従属するときに、アミド結合の分裂後の、バランス（カルボニル）半分は失われる（中立不偏の損失）。その一方で、充電はレポーター基断片によって保持される。
【００９１】
図３Ａにおいて、括弧の数は、分子の各々の部分の豊かな中心の数を示す。図３のパートＢは、標識化を４つの異なるレポーター基多数から成る４つの等圧の組合せで例示する。
各々複合セットの１つの部材についてのラベルがついている４つの同一のペプチドの混成は、ＭＳ（同一のｍ／ｚ）の単一の、未解決の前駆体イオンとして現れる。ＣＩＤ後の、４つのレポーター基イオンは、異なった多数（１１４−１１７のＤａ）として現れる。他の全てのシーケンス有益な断片イオン（ｂ、ｙ−、その他）は等圧のままである、そして、それらの個々のイオン電流信号（信号強度）は添加物である。ペプチドの相対的な濃度は、このように対応するレポーター・イオンの相対的強度から推論されることができる。
本発明のラベリング試薬を使用するときに、定量化はこのようにＭＳにおいてよりむしろＭＳ／ＭＳ段階で実行される。
【００９２】
上記のように、等圧のラベル構成成分のレポーター基ＲＰは、決定されることができるユニークな質量（又は充電比率に対する質量）を有する基である。
したがって、一組の等圧のラベル構成成分（又は対応するラベリング試薬）の各々のレポーター基は、ユニークな質量を有する。具体例において、一組の等圧のラベル構成成分の各々のレポーター基は、ユニークな質量を達成するために、一つ以上の重い原子同位元素から成る。例えば、炭素（１２Ｃ、１３Ｃ及び１４Ｃ）、窒素（１４Ｎ及び１５Ｎ）、酸素（１６Ｏ及び１８Ｏ）又は水素（水素、重水素及びトリチウム）の同位元素が、異なっているレポーター基の準備において用いられることができる。レポーター基ために、適切な安定「重い」原子同位元素の実施例は、１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ及び重水素を含む。他の軽くて重い原子同位元素がまた、レポーター基の編入に適しているにつれて、これらは制限しない。軽くて重い原子同位元素から成るレポーター基を準備することに適している基本的開始材料は、さまざまな商業的なソース（例えばケンブリッジＩｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ及びＩｓｏｔｅｃ）から入手可能である。一つの実施形態によれば、レポーター基はｍ／ｚ  １１４．１〜１１７．１から質量において変動する。その一方で、バランス基は２８から３１のＤａまで質量において変動する。そうすると、合わせた質量は各々の４つの試薬のために一定の（１４５．１のＤａ）ままである。
【００９３】
本発明によれば、本発明のラベリング試薬の等圧のラベル構成成分のユニークなレポーター基は、異なる試料のペプチドを同定して、数量化するために用いる。特定の実施例では、ユニークなレポーター基は、試料の一つ又は多数のポリペプチドのラベルの一部としてあるままである。このような方法で、レポーター基に関する情報は、試料のラベルをつけられたポリペプチドに関する情報と関係している。
【００９４】
あるいは、しかしながら、実施例において上記した様に、レポーター基はその同定の前にラベルをつけられたポリペプチドから取り除かれる。このように、レポーターが決定されるときに、レポーター基は現在（ボリエステル繊維）ペプチドに物理的にリンクされる必要はない。
【００９５】
実際、この実施例によれば、ラベルをつけられた（ボリエステル繊維）ペプチドのイオンが（ボリエステル繊維）ペプチド及び検出可能なレポーター基の娘断片イオンを生産するために断片的だったあと、レポーターのユニークな多数は、例えば、直列型の質量のアナライザの第２の大規模な分析法で決定される。特定のレポーター基は、特定の（ボリエステル繊維）ペプチドが始まった試料を同定するために用いる。更に、ユニークなレポーター基の決定された量は、他のレポーター基の量と関連して較正標準（例えば特定のレポーター基についてのラベルがついているポリペプチド）と関連して、試料又は試料のポリペプチドの類縁体又は絶対の量（しばしば、集中及び／又は量として表される）を決定するために任意に用いる。従って、各々の特定の試料にラベルをつけるために使用する各々のラベリング試薬の等圧の構成要素に存在するレポーター基は、情報（例えば特定の試料の一つ以上のポリペプチドの量）の異なるタイプを提供する。
【００９６】
レポーター基は、固定料金から成るか、イオン化されることができる。したがって、等圧のラベル構成成分から成るラベリング試薬は、塩又は両性イオンの形の反応性のポリペプチドにラベルをつけるために用いる。
【００９７】
レポーターのイオン化は、質量分析計のその決定を容易にする。したがって、具体例で、レポーター基は、イオン（時々「署名イオン」と称する）として決定される。イオン化されるときに、レポーターは一つ以上の正味の肯定又は負電荷から成る。例えば、レポーター基は、一つ以上の基本的窒素原子（正電荷）又は一つ以上のイオン化可能な酸性の基（例えばカルボン酸基、スルホン酸基又はリン酸基（負電荷））から成る。基本的窒素から成る基が置換されて含むレポーター又は置換されてないものであるモルホリン（ピペリシン又はピペラジン）の実施例を制限するものではない。
【００９８】
具体例において、レポーター基は、Ｎをアルキル化するリング窒素原子から成る５つか、６つか、７つの幾つかの部分から成る複素環式リングであるを有する置換する又はポリペプチドがＮ−アルキル酢酸半分（各々の異なる等圧のラベルが一つ以上の重い原子同位元素を含む）のカルボニル・カーボンで結合される酢酸半分を置換されてないものである。この複素環式リングは、置換されるか又は置換されてないものである。複素環式リングは、脂肪族であるか、芳しい。複素環式半分の可能な置換分は、アルキル（アルコキシル基の及びアリール・基）を含む。置換分は被保護であるか保護されていない基（例えばアミン、水酸基又はチオール・基）から成る。そして、ポリペプチドとサポートを関連づけることに適している。具体例において、複素環式リングは、添加されたヘテロ原子（例えば一つ以上の窒素、酸素又は硫黄原子）から成る。
【００９９】
具体例において、それがポリペプチド（例えば電気泳動又はクロマトグラフィー）の分析のために典型的状況の下で実質的に下位断片をしないように、レポーター基は選ばれる。少なくとも質量分析計のラベルをつけられたポリペプチドの一部の選択されたイオンの中で他の具体例において、それが両方の結合Ｘの分裂を引き起こすために印加される分離性エネルギーの状態の下で、実質的に下位断片をしないために、レポーター基は選択される』、そして、Ｙ。任意には、レポーター基の最終的な断片が難しいかバックグラウンド・ノイズを使用しているＭＳ分析より上に検出するのが不可能であるように、レポーター基は選択される。具体例において、レポーター基の量は、決定されようとするポリペプチドの質量又はポリペプチドの予想される断片のいずれかと比較して異なるのに故意に選ばれる。例えば、レポーターの質量は、いかなる自然に起こっているアミノ酸も又はペプチドと比較して異なるために選ばれるか、又はそれの断片を予想した。ポリペプチドに従い、同じ一致する質量を有する試料のいかなる可能な構成要素もの不足が信頼をいかなる分析もの結果に加えた時から、これはポリペプチドの決定を容易にする。
【０１００】
本発明のラベリング試薬の具体例において、等圧のラベル構成成分のレポーター基は、非重合である小さい分子である。更なる具体例において、レポーターの多数は、２５０ダルトン未満である。この種の小さい分子は第２の大規模な分析法で容易に決定される。そして、第１の大規模な分析の同じ一致する質量を有する試料の他の構成要素から自由である。この文脈において、第１の大規模な分析法で決定される選択されたイオンに、第２の大規模な分析は、直列型の質量分析計において典型的には実行される。充電比率に対する特定の質量のイオンがありうる分割及び更なる大規模な分析のための第１の大規模な分析から特に選ばれるので、第１の大規模な分析からの非選択されたイオンは第２の大規模な分析に進められなくて、従って、第２の大規模な分析の範囲を汚染しない。さらにまた、質量分析計及び探知器（定量化のために）の線形の感度は、この低い質量の範囲において全く強い。加えて、質量分析計技術の現在の様相は、この質量の範囲の１人未満のドルトンの基線質量解答を考慮に入れる。
【０１０１】
本発明のラベリング試薬の等圧のラベル構成成分において、バランス基（ＢＧ）は、レポーター基を同位体ものは構成要素と分類するどちらにでも又はタンパク質反応性の基にリンクする。両方の結合Ｘときある、具体例において、バランス基は中立不偏の種を生産するのに選ばれる、そして、Ｙ断片的である（すなわち、両方の結合Ｘの分裂に、中立不偏の損失を受ける、そして、Ｙ）。具体例において、バランス基は、非常に小さい半分（例えばカルボニル又はチオ・カルボニル基）である。例えば、バランス基は少なくとも一つの重い原子同位元素から成って、公式−ＣＨ２−ＣＯ−ＣＨ２−（ＣＨ２−ＣＳ−ＣＨ２−、ＣＨ２−ＣＮＨ−ＣＨ２−又はＣＨ２−ＣＨＲ１−ＣＨ２−）から成る。そして、Ｒ１は同じことであるか異なって、任意にヘテロ原子を含む、１〜８つの炭素原子から成るアルキル基である又は置換する又はアルキル及びアリール基の炭素原子がそれぞれに結合された水素、重水素及び／又はフッ素原子から成るアリール基を置換されていなもであった。具体例において、バランス基は、より大きい半分である。例えば、バランス基は、ポリマー又は生物高分子である。具体例において、このことによりバランス基の中立不偏の断片だけを生産するために断片化をｓｕｂ−を含む分離性エネルギー準位に従属させるときに、バランス基は下位断片に設計される。
【０１０２】
典型的には、セットの各々の等圧のラベル構成成分のための同一の質量を得るために、その質量がレポーター・基間の質量の違いを補償するように、本発明のラベリング試薬の等圧のラベル構成成分のバランス群は一つ以上の重い原子同位元素から成る。集積された質量の（すなわち全体としてされる質量）、レポーター／バランスの中で、基の組合せは、各々の等圧のラベル構成成分のための同じこと及びこのように同一のポリペプチド又はペプチドの質量である、異なる試料から生じていて、そして、構成要素がある等圧のラベルから成る本発明による一組で異なるラベリング試薬を有するラベルをつけられる同じこと。
【０１０３】
同一のペプチド又は同じ同位体ラベル構成成分から成る同一セットの試薬にラベルをつけることについてのラベルがついているポリペプチド、しかし、異なる等圧のラベル構成成分は、等圧線である、すなわち、同じ重量を有する。このように、１が、プールされた試料混合物の初期質量分析から、特定の質量のイオンを質量分析計の比率に託すのに選ぶ場合、試料混合物のそれらのそれぞれの集中及び／又は量に対応する割合で、この選択されたイオンは同じ同位体ラベルから成るラベリング試薬についてのラベルがついていたプールされた試料混合物のそれらの試料から同一のポリペプチドを含む。
【０１０４】
バランス基が等圧のラベル構成成分のレポーターのための質量のバランスとして作用するので、レポーター基／バランス基の組合せの集積された質量が一組又はキットの試薬にラベルをつけている全てのための同じことであるように、バランス（そして、レポーター）基の原子でより麻痺したより大きいほど、それがそうすることができる可能な数の異なる異性体／等圧のラベル構成成分はより大きい生成する、すなわち、より大きいほど得られることができる同位体ラベル構成成分との組合せでより麻痺した。そして、一組及び／又はキットの範囲内で試薬にラベルをつけることの増加した数に結果としてなる。通常、レポーター基は、制限因子でない、そして、より大きいほどバランス基が成る原子でより麻痺した、同位元素が最もこのことにより一組の異性体を生産するバランス基又はバランス基部がレポーター部の異なっている多数を相殺して、このことにより一組のレポーター／バランス基異性体をつくるために用いるバランス基部又は等圧線のいかなる位置でも置換されることができた時から、潜在的レポーター／バランス基の組合せのより大きな数が存在する。試薬に構成要素とラベルをつけることのこの種の多様なセットは、同じ及び／又は異なる試料のポリペプチドの多重分析に、特によく適している。
【０１０５】
本発明による同位体／等圧のラベリング試薬の組合せを生成するために用いることができる異なる等圧のラベル構成成分の総数は、以上２、３、４、５、６、７、８、９、１０ある。本発明の二重にラベルをつけている試薬が等圧で同位体（又は気圧変化の）ラベル構成成分の異なっている組合せから成るにつれて、セットの試薬にラベルをつける総数はセットの中で異なるラベル構成成分の数の製品で測定される。同位体ラベル構成成分でより麻痺したものは制限されて、通常典型的には２である。このように、等圧のラベル構成成分の二重の数の一組の中で二重にラベルをつけている試薬の総数に結果としてなる。等圧のラベル構成成分の多様性は、レポーター及びバランス基半分の原子の数、軽い同位元素と置換することができる重い原子同位元素及び同位元素が合成されることができるさまざまな合成構成で測定される。上述のごとく、多数の同位元素的に強化基本的開始材料は、製造業者（例えばケンブリッジＩｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ及びＩｓｏｔｅｃ）から、直ちに入手可能である。この種の同位元素的に強化基本的開始材料が、等圧で異性体ラベル構成成分のセットを生じるか又は等圧で異性体ラベル構成成分のセットを生じるために使用する合成方法で用いられる同位元素的に強化開始材料を生産するために、使用する合成方法で用いられる。本発明による等圧のラベル構成成分の準備は、部分的に少なくとも、ＷＯ２００４０７０３５２の実施例において開示される等圧のラベリング試薬の準備に対応する。
【０１０６】
本発明の複合等圧の／同位体ラベリング試薬において、Ｘと称する結合によって、レポーター基及び等圧のラベル構成成分のバランス群は、各々に、そして、任意に同位体ラベル構成成分及び／又はタンパク質／ペプチド反応性の基に接続している、そして、Ｙ、そこにおいて、Ｘレポーター基の原子及びバランスの原子間の結合が、基及びＹである』、バランス基の原子及び同位体ラベル構成成分及び／又はタンパク質／ペプチドの原子間の結合は、反応性の基のラベリング試薬である。試薬がそうであるさまざまな等圧の標識化の中で具体例結合Ｘにおいて、そして、Ｙ分離性エネルギー準位に従属するときに、分離する。従って、本発明の方法の具体例で、それが両方ともＸを結合するように、分離性エネルギー準位は質量分析計において調整される、そして、Ｙ等圧的にラベルをつけられたポリペプチド又はペプチドの最も少なく一部の選択されたイオンで中で分離する。レポーター基が終末にラベリング試薬（結合Ｘの分裂）に配置される所で、レポーターがペプチド又はポリペプチドからそれぞれに検出可能であるために、レポーター基をポリペプチドから自由にする。バランス基が結合Ｙによるポリペプチド又はペプチドに接続している所で』、結合Ｙの分裂』はポリペプチドからレポーター基／バランス基の組合せをポリペプチド又はペプチド又はバランス基から自由にする。そして、Ｘを結合するのであるにせよ、載って従属するすでに断片的である。
【０１０７】
等圧のラベルのレポーター基は、通常、本発明の二重にラベルをつけている試薬の終端の一部としてある。この場合、レポーター及びバランス基間の１つの結合（Ｘ）だけは、レポーターを解放するために崩壊することを必要とする。しかしながら具体例で、レポーター基は本発明の二重にラベルをつけている試薬の内部分子である。それによって、側面を接している結合はそれらがＣＩＤの後でラベリング試薬からレポーター基の発散を可能にするようなものである。
【０１０８】
本発明の二重にラベルをつけている試薬の具体例の等圧のラベル構成成分の配布が一致するために構想される同じ方法において、等圧のラベリング試薬、それによってレポーター基及びバランス基の古典的設計に対するどちらでも、各々に隣接して配置される。例えば同位体ラベル構成成分によって、本発明の二重にラベルをつけている摂政の別の実施例は、二重にラベルをつけている試薬の他の一部によって各々から切り離されるレポーター及びバランス基から成る。しかしながら実施例の全てにおいて、バランス基の量は、レポーター基の量に補償する。
【０１０９】
具体例結合Ｙにおいて、結合Ｘより変化しやすい。他の具体例結合Ｘにおいて、結合Ｙより変化しやすくありえる。これまでに他の具体例（結合Ｘ）において、そして、Ｙ、同じ相対的な不安定を有する。具体例（結合Ｘの相対的な不安定）において、そして、Ｙアミド（ペプチド）結合に関して調整する。Ｘを結合して、Ｙを結合する又は両方の結合Ｘ、そして、Ｙこのような場合典型的アミド（ペプチド）結合と比較してより多くであるか、等しく変化しやすいか、より変化しやすくない。例えば、分離性エネルギーの状態の下で、Ｘを結合する及び／又はＹを結合するＺ−プロ二量体又はＺ−Ａｓｐ二量体（Ｚがアミノ酸及びプロ及びＡｓｐがそれぞれプロリン及びアスパラギン酸であるのは当然のいずれでもある）のペプチド結合と比較した断片化に、よりうつ伏せでない。いくつかの実施形態では、Ｘを結合する、そして、Ｙ、典型的アミド結合と同じほぼ分離性エネルギーのレベルを有する断片は、そうする。いくつかの実施形態では、Ｘを結合する、そして、Ｙ、典型的アミド結合と比較した分離性エネルギーのより大きなレベルを有する断片は、そうする。
【０１１０】
そして、逆もまた同じであるが、他の具体例（結合Ｘ）において、そして、Ｙ結合Ｙのこの種のその分裂に選ぶ結合Ｘの分裂を誘発するポリペプチド又はペプチドの相当な量又はそれの娘断片イオンが部分的なラベルを第２の大規模な分析法に含まないように、このような方法で、両方の結合Ｘ及びＹは基本的に同時に分解する。ポリペプチドの相当な量は２５％未満及び１０％未満にさえ関連する。そして、部分的に、ＭＳ／ＭＳスペクトルにおいて決定されるポリペプチドと分類される。はっきりした境界があることができる、間の第２の大規模な分析（ＭＳ／ＭＳ）の範囲のポリペプチドの断片をラベルをつけて、そして、ラベリングされてないものでした、この特徴は、娘断片イオン・スペクトルのコンピュータ支援分析に基づいて、ポリペプチドの同定を単純化する。ポリペプチドの断片イオンがそうであるので、実施例によってはさらに完全にラベルをつけて又はレポーター／バランス基半分を有するラベリングされてないものでした（しかし、部分的にでなく、ラベルをつけられる）、横切って折れた結合が例えばある同位体配布によって生じる娘断片イオンの質量のほとんど散乱がない。そして、同位元素が通常部分的にラベルをつけられたポリペプチドの単一の変化しやすい結合の両側に存在したケースは第２の大規模な分析法で決定した。
【０１１１】
本発明及びタンパク質のラベリング試薬間の反応又はラベルをつけられるペプチドは、タンパク質／ペプチド反応性の基の存在下で、確実にされる。ラベリング試薬上のタンパク質／ペプチド反応性の基（ＰＲＧ）は、選択的に特定のタンパク質又はペプチド官能基と反応するか又は興味がある酵素の基板である基である。適切なタンパク質／ペプチド反応性基の実施例及びそれらが反応する官能基は、下で形成される：
チオール反応性基は、システインの側鎖と反応する。チオール反応性基は、エポキシド、α−ハロ・アシル基、ニトリル類、スルホン化されたアルキル又はアリール・チオール、ハロゲン化アルキル、アリール・アミド及びマレイミドを含む。特定の実施例は、ヨードアセトアミド又はそれの誘導剤である。
【０１１２】
アミノ反応性基は、リシンの側鎖のεアミン群によって反応するか又はポリペプチドのＮ末端で、アミンと反応する。アミノ反応性基はタンパク質のアミノ基にタグを付けて、スルホニル基ハロゲン化物、イソシアン酸塩、等チオ・シアン賭け金、活性エステル類を含む。そして、テトラフルオロフェニルエステル類、ペンタ・フルオロ・フェニル・エステル類、Ｎ−ｈヒドロキシスクシンイミジルエステル類、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジルエステル類、２−ニトロフェニル・エステル類、Ａ−ニトロフェニル・エステル類、２，４−ジニトロ・フェニル・エステル類及び２，４−ジ・ハロ・フェニル・エステル類、酸性ハロゲン化物及び酸性の酸無水物及び混合無水酸を含む。加えて、アミノ反応性基は、アルデヒド又はケトン類を有無ＯｆＮａＢＨ４又はＮａＣＮＢＨ３に含む。
【０１１３】
カルボン酸−反応性基は、アスパラギン酸及びグルタミン酸の側鎖と反応するか又はポリペプチドのＣ末端と反応する。カルボン酸反応性基は、ジシクロヘキシルカルボジイミド又は２，３，５，６−テトラフルオロフェニル＝トリフルオロアセタートのような、そして、結合触媒（例えば４−ジメチル・アミノピリシン）の有無の結合薬品がある場合には、アミン又はアルコール類を含む；そして、遷移金属−ジアミンは、Ｃｕ（ＩＩ）フェナントロリンを含むことを複雑にする。
【０１１４】
−イミダゾール反応性基は、ヒスチジンと反応する。
【０１１５】
エステル反応性基は、例えば、ホモ・セリン・ラクトンと反応するアミンを含む。メチオニンは、ＣＮＢｒ裂開の間、ホモ・セリン・ラクトンに変わる。
【０１１６】
反応性基が反応するリン酸塩は、アミノ酸（例えば燐酸セリン、ホスホＴｈｒ及びホスホＴｙｒ）をリン酸化した。反応性基が含むリン酸塩は、例えば、金属が、実施例Ｆｅ（ＩＩＩ）又はＧａ（ＩＩＩ）のために、ニトリロ三酢酸又はイミノ二酢酸酸にキレート化される金属をキレート化した。これらの薬品は、ホスホリル化されたアミノ酸（例えばホスホセリン、ホスホスレオニン及びホスホチロシン）と反応する。
【０１１７】
アルデヒド又はケトン反応性基は、アルデヒド又はケトンを生成するために最初に炭水化物を過ヨウ素酸塩で処理した後に、ＮａＢＨ４又はＮａＣＮＢＨ３又はこれらの試薬に加えてアミンを含む。
【０１１８】
ヒドロキシ基を含む反応性基は、セリン及びトレオニンによって反応する。ヒドロキシ基を含む反応性基は、置換されるか置換されてないものであるトリチル−ハロゲン化物又はシリル−ハロゲン化物反応性の半分を含む。
【０１１９】
本発明という二重レッテルは、タンパク質又はペプチドの範囲内でラベリング試薬のタンパク質／ペプチド反応性の基及びある官能基の間の相互作用によって、タンパク質又はペプチドに密接に結びつく。任意にポリペプチドの隔離の後、試料において現れるか又はその上につくられることができるにつれて、この官能基はポリペプチドの中に先在していることができる。例えば、カルボン酸基は、水溶性カルボジイミドによって修正されることができる（例えば塩酸ｌ（３−ジメチル・アミノ・プロピル）−３−エチルカルボジイミド；ＥＤＣ）このことにより求核原子（例えばアミン・基）によって反応する求電子基を得ること。ＥＤＣを有するラベリング試薬のカルボン酸群の起動は、アミンがある場合には、実行されることができる。ＮＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２と結合するカルボジイミドを使う能力は、アミン・基にカルボキシル基の転換を許す。ＮＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＳＨと結合するＥＤＣの使用法は、チオール・基に一緒にカルボキシル基の転換を確実にする。
【０１２０】
ポリペプチド上の官能基を修正するか又は導くために適切である他の合成物の制限するリストは、チオール・基を還元剤開裂可能なアミン・基に変換するチオール反応性のアミノ化試薬である２−アミノエチル−２’−アミノエタンチオール−スルホン酸塩を含む；遊離したチオールを主要なアミン・基に変換するアミノエチル−８試薬；カルボキシル基にチオール・基を修正するＢＭＰＡ；潜在的なカルボキシル基（それは、アミンを被保護カルボキシルに変換する。カルボキシルが、リン酸塩バッファのｐＨ  ９．５でマスクを取られる）によってアミン−反応性のものであるＭＳＡ；加える一級アミンと反応するＳＡＴＡは、チオールを保護した；デブロッキングＳＡＴＡ及びＳＡＴＰのための非常に効果的試薬であるヒドロキシルアミンＨＣｌは、チオール・基を紹介するためにｐＨ  ７−１０で一級アミンと反応する水溶性試薬である遊離したチオール及びトラウトの試薬を生成するためにタンパク質を変更した。例えばピアスケミカルズ（ＩＬ、米国）から入手可能なこの種の試薬。
【０１２１】
また、一つ以上の官能基が保護基の除去によってペプチド又はポリペプチドにおいてつくられると想定される。従って、具体例で、ポリペプチドの官能基は、変わるか又は加えられる。具体例において、添加官能基は、自然にタンパク質で起こらない基である。
【０１２２】
試薬を本発明の前後関係において適切であると分類している二重の他の実施例において、ＰＲＧ基は、事実、酵素を修正している特定のｐｒｏｔｅｉｎ−のための基板である。この酵素は、生体内で、ポスト翻訳修正に関与している酵素でありえる。これらの酵素は、疾患状態又は先天性欠損症を伴う。この実施例は、酸性ホスファターゼ、アルカリホスファターゼ、アラニン・アミノトランスフェラーゼ、アミラーゼ、アンジオテンシン変換酵素、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、クレアチンキナーゼ、γ−グルタミルトランスフェラーゼ、リパーゼ、乳酸脱水素酵素及びブドウ糖６−リン酸塩デヒドロゲナーゼ（プロテアーゼ及びエステラーゼ）である。
【０１２３】
本発明のラベリング試薬の具体例によれば、同位体ラベル構成成分及び等圧のラベル構成成分はラベリング試薬の異なる一部を形成する。そして、結合によって切り離される。これらの実施例による適切な同位体で等圧のラベル部品は、上記している。
【０１２４】
しかしながら、試薬（特に同位元素の編入）の製造を単純化するために、同位体ラベル構成成分の同位元素は、レポーター基のそれのバランス基のラベリング試薬（特に等圧のものは構成要素と分類するｉｎ／ｏｎ）の他の部、統合されたｉｎ／ｏｎでありえる。
【０１２５】
具体例によって、等圧の基のバランス基が構造−Ｃ−ＣＯＣ−（図３を見る）（例えば市販の等圧のラベルのために）又は実施例−ＣＨ２−ＣＨＲ１−ＣＨ２−（Ｒ１が同じことであるか異なって、１〜８つの炭素原子から成るアルキル基である）のためのより大きな基（例えば上記したそれら）を有すること、任意にヘテロ原子である同位体ラベル構成成分から成る又は置換する又はアルキル及びアリール基の炭素原子がそれぞれに結合された水素、重水素及び／又はフッ素原子から成るアリール基を置換されてないものであった。また、同位体ラベル構成成分として機能する等圧のラベル構成成分のバランス基のために、ような−、ＣＨ２−ＣＨＲ１−ＣＨ２−基は、一方ではバランスにレポーター基を提供するために必須の数の同位元素を担持して、１セットにおいて異なるラベリング試薬の質量の違いを生成するために、一方では必須の数の同位元素代わりを含む。
【０１２６】
あるいは、すなわち、添付のラベルを問わず、電気泳動又はクロマトグラフィーの間、個人にラベルをつけている試薬の質量の違いは、このことにより、化学構造及びラベリング試薬の物理化学的な特徴がＭＳの前に差別的にラベルをつけられた同一のペプチドの基本的に同一の性質を確実にするために最小限変わることを確実にしている他の原子によってラベリング試薬の一つ以上の原子を変えることによって得られる。
【０１２７】
例えば、試薬にラベルをつけることがそうである８の一組はそこにおいて、４つのラベリング試薬の１セットが等圧のラベル構成成分を有すると想定した。そして、図３にて図示するように、酸素から成った。４つのラベリング試薬の他の一組において、等圧のラベル構成成分の酸素原子は硫黄と交換される（図４を参照、そして、均衡を保つことは３２Ｓを３４Ｓと交換することによって図３に示すように同様に得られる。これの等圧のラベル構成成分の量上の変更態様が表２において例示されるという結果。
【０１２８】
表２：等圧のラベルのバランス基の構造の修飾による質量の差の発生。
【０１２９】
【表１】
2010509567.tif 000003
ラベルの単一のカーボンを硫黄と交換することによって得られる二重のラベルが付いたペプチドのわずかな化学違いは、液体クロマトグラフィーのような分離システム上のこの種のペプチドの性質を限られた範囲だけに変える。カーボン及び硫黄の質量の違いは、それらの質量に基づいて２セットのラベルをつけられたペプチドの分離を許す。各々のこれらの２セット、異なるレポーター・基は、通常通りＭＳ／ＭＳにおいて発生する。
【０１３０】
本発明の他の実施例において、差にラベルをつけている試薬の質量の違いは、添加された同位元素を等圧のラベル構成成分のレポーター基に取り入れることによって得られる。図３にて図示するように、等圧のラベル構成成分において、添加された重水素原子はメチル・ピペラジン・基に取り入れられることができる。そして、図３というレッテルという同位体・レッテルを生成する。しかしながら、より高い多重化が３つ以上の異なる多数を有する試薬にラベルをつけることのセットを使用しているものと予想されるときに、メチル・ピペラジン・基は全てのこれらの添加された同位元素を収容しているにはあまりに小さくなる。このように、例えば、ラベリング試薬は、異なる重水素及び１３Ｃ同位元素が組み込まれるプロピル・ピペラジン・基（図４Ｃを見る）を備えている。
【０１３１】
表３はレポーターの多数及びプロピル・ピペラジン・基を有する一組の８つのラベリング試薬のためのバランス基を示す。そこにおいて、質量の違いは１３Ｃ  ２及び２つの２Ｈ同位元素をプロピル側鎖に取り入れることによって得られる。
【０１３２】
表３：等圧のラベルのレポーター基の修飾による質量の差の発生。
【０１３３】
【表２】
2010509567.tif 000004
ラベル（内部制御と同程度３がレポーター基の量がプールされた試料及びサーブのラベルをつけられたペプチドで各々ユニークである効果がある表に存在する）のこの設計。
【０１３４】
同様に、前述したようにバランス基のために、構造及び物理化学的な特性の変化が最小限であると仮定するならば、個人にラベルをつけている試薬間の質量の違いはまた、レポーター基の原子を他の原子と交換することによって得られることができる。
【０１３５】
同位元素の編入のためのラベリング試薬との別々の関係を設計する必要がないと要約すること。（レポーター基及び／又は従来の等圧のラベル構成成分のバランス集まり内で同位体ラベル構成成分を提供することによる）
具体例において、本発明の二重にラベルをつけている試薬は親和性タグ（Ａ）から成る。そして、それは選択的に孤立に、ラベリング試薬と反応したそれらのポリペプチドがすなわちラベルをつけられたと認める。親和性タグが原則として試薬のいかなる位置にも存在することがありえる間、それはそれがＣＩＤの後でレポーター基の発散のじゃまをしない位置に典型的に配置される。具体例において、親和性タグは、同位体ラベル構成成分の側鎖に置かれる。親和性タグが大きくありえるにもかかわらず、それらは開裂可能な基を有するラベリング試薬に縛られていることがありえる。通常、親和性タグは検出の前にポリペプチドのラベルから取り外される。そして、ラベルの傷だけを残す。
【０１３６】
上記（本発明の二重にラベルをつけている試薬の親和性タグの存在）がラベルをつけられたペプチド又はポリペプチドを選択的に結合することを許すことを示したように、共有結合して非共有結合的に、そして、捕捉試薬（ＣＲ）に対する高い親和性を有する。典型的には、それがいずれでも有する広範囲な及び／又は多数の洗濯物又はペプチドの除去を確実にする種々の溶液又は捕捉試薬に特に結合されるポリペプチドの組合せに抵抗するように、親和性タグを捕捉試薬に結合することは強い。典型的には、親和性タグは、ＭＳ分析の間、ペプチドのような断片化を受けない。
【０１３７】
親和性タグによるＣＲ行きのペプチド又はポリペプチドの除去は移動させているリガンド（ＤＬ）の追加によって確実にされることができる。そして、下で、又は温度又は溶解力がある状況を変えることによって記載されている。
【０１３８】
具体例によれば、更に分析のための試料の複雑さを減らしなさいという命令で、タンパク質又はペプチドとラベルをつけられるダブルを引き出すことが方法の前後関係及び本発明のツールで構想されると想定される。  これらの実施例の前後関係ために、親和性タグに結合されるペプチド又はポリペプチドに影響を及ぼさずに、それがそこから捕捉試薬（ＣＲ）及び任意に除去に選択的な締め具を許す限り、親和性タグの性質は決定的でない。
【０１３９】
したがって、親和性タグ（Ａ）の実施例及び対が含む捕捉試薬（ＣＲ）を限定するものではない：
ｄ−ビオチン又は１つの，２−ジヒドロキシ・エタン（ＨＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＯＨ）及びフェニルＢ（ＯＨ）のような周期的アルカン（例えばアルキル又はアリールボロン酸と結合する１，２−ジヒドロキシ・シクロヘキサン又はボロン酸のエステル類）のそれらを含む他の１つの，２−ジヒドロキシ・アルカンのようなｄ−イミノ・ビオチン（１，２−ジオールをアビジン／ストレプトアビジン（例えばストレプトアビジン−アガロース、オリゴマーアビジン−アガロース又は単量体アビジン−アガロースとして）に結合する）を含む構造的に修正されたビオチンに基づく試薬２又はヘキシルＢ（Ｏエチル）２（例えば、アガロースのようなサポートに、アルキル又はアリール基を経て付属した）−マルトースを結び付けるタンパク質と結合する；又は他の糖／糖質を結び付けるタンパク質の対又はよりいかなるリガンド／リガンドにも一般に親和性タグの上述した基準に従う結び付けるタンパク質一対。ハプテン（例えばジニトロフェニル・基）、それは、対応する反ハプテン抗体（例えば反ジニトロフェニルＩｇＧ）と結合する；−遷移金属ＣＲを遷移金属（例えばＮｉ（ＩＩ）に対するオリゴマ・ヒスチジン（いわゆる６ヒス−タグ）ひも）に結合するリガンドは、樹脂に結び付いたキレート化された遷移金属（例えばニトリロ三酢酸をキレート化されたＮｉ（ＩＩ）又はイミノ二酢酸酸をキレート化されたＮｉ（ＩＩ））の形で、使用する具体例においてある；グルタチオン−Ｓ−転移酵素と結合するグルタチオン。
【０１４０】
本発明の具体例において、ペプチド又はポリペプチドと分類される二重の親和性浄化は、ＭＳによって分析の前に実行される。したがって、縛られたペプチド又はポリペプチドが更なる分析のために必要であるにつれて、捕捉試薬からの除去又はペプチドからの親和性タグの解離は必要である。これは、異なる方法で確実にされることができる。
【０１４１】
具体例において、親和性タグはラベリング試薬から開裂可能なものである。そして、試薬の等圧で気圧変化の（同位体）ラベル構成成分を完全なままにする。上記のように、本発明のラベリング試薬上の親和性タグの位置は、決定的でない。このように、親和性タグは、化学的に又は酵素で開裂可能な結合を経由して、ラベリング試薬の同位体であるか等圧のラベル構成成分に縛られていることがありえる。
【０１４２】
具体例において、親和性タグは、開裂可能な結合（変化しやすいチオール、変化しやすいベース、変化しやすい過ヨウ素酸塩又はヒドロキシルアミン変化しやすい結合のような、しかし、変化しやすい酸に限られなくて）によって、二重にラベルをつけている試薬に接続している。
【０１４３】
更なる具体例において、親和性タグ及びラベリング試薬間の結合は、また、化学製品、サーマル又は光化学反応によって開裂可能なものでありえる。光開裂可能なものが分類する適切なものは、ｌ（２−ニトロフェニル）−エチルである。熱的に変化しやすい結合は、実施例、二本鎖核酸、ペプチド核酸を有する核酸の二本鎖又は加熱に応じて分離する二重鎖ペプチド核酸鎖のためにある。開裂可能な基もは、二硫化物結合、酸性の又はベース変化しやすい基、その中に含むこと、ジアリールメチル又はトリメチル・アリール・メチレン基、シリルエーテル、カルバミン酸塩、オキシ・エステル類、チ・エステル類、チオノエステルを有するそれらを有し、α−フッ化アミド及びエステル類を含む。酵素で開裂可能な基は、ヌクレアーゼ開裂可能なものであるか、グリコシダーゼ開裂可能なものである実施例、プロテアーゼに敏感なアミド又はエステル類、βラクタマーゼに敏感なβ−ラクタムの類似体及び結合のためにある。
【０１４４】
この実施例によれば、親和性タグは、ラベルをつけられたタンパク質の処理又は適切な試薬を有するペプチドによって取り外されることができる。親和性タグの除去は、また、例えばペプチドの分析の干渉を回避するために、例えばＭＳの他の理由にとって望ましくてもよい。典型的には、親和性タグは、ラベルをつけられたペプチド又はポリペプチドの親和性隔離の後、離れて切断される。
【０１４５】
あるいは、親和性タグは、非開裂可能な結合によって本発明のラベリング試薬に縛られていることがありえる。親和性精製されたペプチドが回復されることができることを確実にするために、捕捉試薬から分離されることができる親和性タグが、用いられる。
具体例において、ビオチン及びビオチン・ベースの親和性タグが、用いられる。事項の中で関心が構造的に修正されたビオチン（例えばｄ−イミノ・ビオチン）であること、それは、ＥＳＩ−ＭＳ分析（例えば１０−２０％の有機溶媒を含んでいる希酸）と互換性を持つ溶解力がある状況の下で、アビジン又はストレプトアビジンから柱を抜き取る。ｄ−イミノ・ビオチン・タグを付けられた合成物がｐＨ  ４の下で溶媒を中で抽出すると確認された。
【０１４６】
加えて、又はあるいは、置換リガンド（ＤＬ）は、親和性タグ（Ａ）（そして、ペプチド又はタンパク質は、それに対して結合した）を捕捉試薬（ＣＲ）から移すために用いる。最も少なく一部分のこのＤＬでＤＬによって抜き取ることが興味があるペプチドから成る溶離剤に存在する時。具体例において、本発明の方法は、ＭＳ分析の間、ペプチドのような断片化を受けない分子である、そして、試料の存在がタグを付けられたペプチド、基板又は反応製品同根語のイオン化をかなり抑制しないＤＬの使用を含むことができる。特に、置換リガンドは選択されることができるそれ自体質量分析の間、イオン化されて、最小限ある、そして、ＤＬから成るイオンの形成が集まることは最小限である。
【０１４７】
適切な置換リガンド（ＤＬ）の性質は、使用されるＡ及びＣＲに依存する。一般に、より好ましくは、２、３分又は最高１時間以内で以外、その加算の１週でほとんど、ＤＬは、Ａを合理的な時間的尺度のＣＲから移すのに選ばれる。ＣＲのためのＤＬの親和性は、相当しなければならないか、ＣＲのためのＡを含んでいるタグを付けられた合成物の親和性より強くなければならない。さらにまた、ＣＲから、ＤＬは、親和性タグＡを含んでいるタグを付けられた合成物の溶出の間、使用する溶媒に溶解しなければならない。具体例において、ＤＬは、無料の親和性タグＡ又は置換配位子の実施例がこのように含むＡ．、ｄ−ビオチン又はｄ−ビオチン誘導体の派生的であるか構造変更態様に対応する。
【０１４８】
本発明のラベリング試薬の一部を形成する同位体（ＩＴ）で等圧の（ＩＢ）ラベル構成成分、タンパク質反応性の基（ＰＲＧ）及び任意の親和性タグ（Ａ）は、異なる可能な構成に配置されることができる。可能な組合せの非制限するリストは、図５に示される。本願明細書において必要条件は、ラベリング試薬のＰＲＧがポリペプチド上の官能基と反応することができるということで、そして、等圧のラベル構成成分のレポーター基がＣＩＤにリリースされることができるということである。
【０１４９】
異なるパーツ（レポーター基の側面に位置しているそれらが熟練した人が利用できるいかなる適切な化学も経て各々に接続していることができるより別の）間の結合。例えば、同位体ものの化学構造は、前述の構成要素にラベルをつける、又は基Ｂｌ又はＢ２、そこにおいて、示すラベリング試薬で異なる一部を接続するために用いる。
【０１５０】
本発明の別の態様において、方法及び分析は提供される。そこにおいて、試料は本発明の二重にラベルをつけている試薬を使用して、差別的にラベルをつけられる。そして、ＭＳを有する同時分析を許す。
【０１５１】
したがって、本発明は、方法を同時に異なる試料の官能基から成る一つ以上のポリペプチドの存在を分析するために提供する。ラベリング試薬が試料の一つ以上のポリペプチド又はそこから発生するペプチドの官能基と反応することができることによって、本発明の方法は、各々の試料が試薬にラベルをつけている一組の差別的なダブルのうちの１杯についてのラベルがついている標識化ステップを含む。詳細に上記を解説するように、設定された差別的な二重にラベルをつけている試薬は同じこと又は基本的に同じ化学構造を有して、同位体で等圧のラベル構成成分を担持する。各々のラベリング試薬は、同位体で等圧のラベル構成成分のユニークな組合せを備えている。
【０１５２】
標識化後のステップにおいて、ラベルをつけられたペプチドは、分離されて、各々の試料のために分析される。
【０１５３】
理想的には、本発明の前後関係において想定される分析法で、標識化ステップは、試料のプロテオームの最大限の範囲を得るために、試料のほぼあらゆるタンパク質を目標とする。
【０１５４】
同時に、個々のタンパク質を考慮するときに、分析（試料のこのタンパク質から分析されるペプチドの数は、１だけ又は限定数だけである）の複雑さを減らすために、そのタンパク質の官能基の数は理想的に最低である。
【０１５５】
システイン標識化が最大限の範囲（試料のあらゆるタンパク質にラベルをつける）及び最小の複雑さ（一度だけ又は限定された数の時だけ、試料のあらゆるタンパク質にラベルをつける）の間の妥協を提供するので、システインが標識化のための官能基としてしばしば用いられる。システインは、ＧｅｎＢａｎｋの全てのタンパク質の約８５％に存在して、ポリペプチド配列の２％（各々の５０のアミノ酸の１）の周波数によって、平均して起こる。さらにまた、システイン反応性の試薬を有する標識化は、Ｌｙｓイン及びアミノ終点に起こる標識化アミン・基の例のように、又は両方のアスパラギン酸、グルタミン酸及びカルボキシ末端に起こるカルボキシル基にラベルをつけることの例のように、タンパク質の他の一部を修正しない。本発明の方法の一つの実施形態によれば、標識化は、このようにシステイン官能基によって実行される。具体例において、標識化ステップの前に、試料は、試料のタンパク質のシステイン上のアクセスできるチオール官能基の存在を確実にするために減少する。
【０１５６】
さらに、システインがＣ末端ペプチドか所与の酵素の消化のＮ末端ペプチドにおいて現れるという可能性は、タンパク質のこの種の酵素のための認識部位の数によって減少する。この数は、ポリペプチドの長さによって、比例して通常増加する。このように、システインがラベリング試薬の官能基として用いられる標識化方法は、試料のタンパク質の相対的な表現レベルを決定することに非常にかなり適している。
【０１５７】
具体例によれば、上記のように、本発明の方法は、標識化ステップの前に又はの後、ペプチドにタンパク質の割れているステップを含む。これは、通常、より小さいペプチド（十分に長いタンパク質よりむしろ）の分析を許すために実行される。ＬＣのような高いスループット・システム上のタンパク質よりペプチドを分離して、ＭＳ／ＭＳのペプチドからシーケンス・データを解釈することは、より容易である。
【０１５８】
タンパク質裂開のための適切な化学製品は、臭化シアン、ＢＮＰＳスカトール（２（２’−ニトロフェニルスルホニル）−３−メチル３−ブロモインドレニン）、ギ酸、ヒドロキシルアミン、ヨード安息香酸、ＮＴＣＢ  ＋  Ｎｉ（２つのニトロ５チオ・シアノ・ベンゾＩＤ酸）を含む。望ましいタンパク質分解酵素にはＡｓｐＮ  エンドペプチターゼ、カスパーゼ  １、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０、キモトリプシンが、含まれる。クロストリペイン、エンテロキナーゼ、Ｘａ因子、グルタミルエンドペプチターゼ、グランザイムＢ、ＬｙｓＣ  リシルｌエンドペプチターゼ、パパイン、ペプシン、プロリン−エンドペプチターゼ、プロテイナーゼＫ、ブドウ球菌ペプチダーゼ（サーモリシン）トロンビン（トリプシン）。
【０１５９】
タンパク質試料のタイプに従い、化学で酵素の裂開の組合せは実行される、又は、二重の酵素の消化は実行される。
【０１６０】
酵素及び化学製品の多様性にもかかわらず、トリプシンは、まだ最も高い特性（リシン及びアルギニン）及び効率を有する酵素のままである。脊椎動物において、リシンは、７，４％の頻度を有するタンパク質及び４，２  ％の頻度を有するアルギニンに起こる。トリプシンの消化はこのように９つのアミノ酸の平均長を有するペプチドに結果としてなるタンパク質を修正する、そして、２５の中で、リシンがあるアミノ酸はある程度は、それがもうトリプシン間の基板でないところを修正した。この種のペプチドは、クロマトグラフィー及びＭＳ技術にかなり適している。
【０１６１】
本発明の方法の具体例によれば、タンパク質の裂開は、標識化の後、実行される。これは、ラベルを官能基に載架するそれらのペプチドだけを分離することによって試料の複雑さを減らすために許す。
【０１６２】
ラベルをつけられる具体例によれば、タンパク質は、トリプシンによって消化される。トリプシンの消化が実行される前に、ラベルをつけられるより多くの具体例によれば、タンパク質はリシンの側鎖を修正するためにアセチル化している薬品で処理される。結果として、ポリペプチドのアミノ終点は、等しくアセチル化される。
【０１６３】
他の具体例によれば、ラベルをつけられたタンパク質は、リシン特定のプロテアーゼによって消化される。結果全部として、この種の消化から得られるペプチドは、それらのアミノ終点で、そして、カルボキシ終端のリシン（他のカルボキシ終端のアミノ酸を有することができるカルボキシ終端のペプチドを除いて）の側鎖でアミン・基を有する。
【０１６４】
標識化ステップでラベルをつけられる二重である、しかし、タンパク質切断部位から成らないタンパク質は、切断されたペプチドとしてこのように手順の剰余に参加することができる。
【０１６５】
本発明の方法の具体例によれば、使用するラベリング試薬は親和性タグから成る、そして、方法はタンパク質を試料に存在すると分類していて、タンパク質とラベルをつけられるダブルを切断していて、ペプチドのラベルに存在する親和性タグに基づいて二重のラベルが付いたペプチドを分離している二重のステップを含む。この親和性隔離は、更なる分析のための試料の複雑さの減少を考慮に入れる。タンパク質裂開が実行されるときに、官能基から成らなくて、このようにラベルをつけられなかったそれらのペプチドは除去される。
【０１６６】
本発明の方法は、第１及び第２の標識化ステップで差別的にラベルをつけられる２つ以上の試料をプールするステップを含む。異なる試料の中で水たまりになることによって、ポリペプチド・試料混合物は、得られる。これは、分析の異なる試料の即時の比較を可能にする。
【０１６７】
本発明の方法で使用するタンパク質試料が複雑な所で、プールされた試料は選択的に、ポリペプチドと分類される二重を分離するために一つ以上のペプチド分離技術に従属する、又は、ポリペプチド・試料からの同じアミノ酸配列を有するペプチドは混じる。
【０１６８】
本発明によれば、複合等圧の／同位体ラベルの化学構造は同じことであるか又は基本的に、試薬にラベルをつける１セットの範囲内の同じことである。そうすると、異なってラベルをつけられる同一のペプチドとの間に、それは（多次元）クロマトグラフィー技術の特性に関する有意差を生み出さない。多数の分数（二重のラベルが付いたペプチドの隔離の前後関係において）までの適切な分離技術（２以上に合成のタンパク質又はペプチド・試料の分離を可能にする）は、熟練した人にとって公知で、等電点電気泳動、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ、２次元のゲル電気泳動、サイズ−除外クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆転する位相ＨＰＬＣ、親和性クロマトグラフィーを含むが、これに限定されるものではない、…など。
【０１６９】
試料が成るとき、より大きなペプチド（両者間に例えば氏３０００、そして、１００．０００）２Ｄ  ＧＥが、使われることができる。ペプチド・試料（例えばタンパク質分解ジ処理から得られた）のために、２Ｄ  ＬＣ方法は分離、更にはオートメーションにより適している、そして、スループットはかなりより良好である。液体クロマトグラフィーによってタンパク質／ペプチド・消化を切り離すいくつかの技術は、記載されていた（逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣ及び２次元の液体クロマトグラフィー）。また、毛管の電気泳動（ＣＥ）は、分離ペプチドに適している方法である。
２Ｄ−ＬＣは、逆転する位相柱に連結して、一連のサイクルにおいて操作されて一般に、イオン交換カラム（通常、強い陽イオンは、交換する、ＳＣＸ）をオンラインで使用する。
各サイクルにおいて、逆転する位相システムにそれらのイオン負担に従ってペプチドを抽出するために、塩濃度は、イオン交換カラムにおいて増加する。本願明細書において、ペプチドは、例えばＣＨ３ＣＮを有する勾配によって、疎水性に分離される。
【０１７０】
多くのパラメータは、分解能力及びその後ＬＣ−ＭＳによって示されることができるタンパク質の数に影響する。通常、第１の寸法分離テクニック（ＳＣＸ）及び第２の寸法ＲＰＨＰＬＣ分離方法間のオンライン構成は、試料分別のために準備される。
イオン交換クロマトグラフィーは、塩濃度の増加と共に又は塩の勾配によって段階を追っての溶出によって実行されることができる。典型的には、ＳＣＸは実行される。そして、例えば３０％のアセトニトリルに上がっている。そして、ＳＣＸクロマトグラフィーの間、疎水的相互作用を最小化する。８桁例えばＣｌ上の逆相クロマトグラフィーの前に、アセトニトリルのような有機溶媒は、除去されるか、又は例えば蒸発によって強く減少した。
【０１７１】
したがって、任意に本発明の方法を実行することに適している装置は含む又は毛管の電気泳動（ＣＥ）計測器、逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣ計測器及び／又は多次元液体クロマトグラフィー計測器（…など）に限られなくて、クロマトグラフィー計測器を、例えば、一つ以上の適切な分離計測器（例えば電気泳動計測器）に接続する。
【０１７２】
本発明はツール及び方法を異なる試料のタンパク質の同時同定（ＭＳ／ＭＳによって）及び／又は定量化（ＭＳ又はＭＳ／ＭＳによって）に提供する。より詳しくは、本発明の方法は質量分光学によるポリペプチド又はペプチドとラベルをつけられる単離されたダブルの相対的な発生を分析することに関する。そして、ペプチドの同定が続く。
【０１７３】
したがって、本発明の方法を実行する装置は、一つ以上の質量分析計測器から成る。
【０１７４】
分光測定法による大規模な測定は、ガス位相に分析物のイオン化によって実行される。
典型的質量分析計測器は３つの構成要素、興味がある分子からイオンを生成するイオン・ソース、質量のアナライザから成る。そして、それはイオン化された分子の充電に対する質量比率（ｍ／ｚ）及び登録して、個々のｍ／ｚ値のためのイオンの数を計数する探知器を決定する。ＭＳスペクトルの各々の特徴はイオンの数上の２値、ｍ／ｚ及び計測によって定義される。そして、それは計測器の探知器に達した。
【０１７５】
分光計の大規模な分析のためのタンパク質又はペプチドのイオン化は、通常エレクトロスプレー・イオン化（ＥＳＩ）又はマトリックスによって援助されたレーザー脱着／イオン化（ＭＡＬＤＩ）によって実行される。
【０１７６】
ＥＳＩプロセスの間、分析物は溶液から直接イオン化される、そして、ＥＳＩは従って、液体クロマトグラフィー分離ツール（例えば、位相ＨＰＬＣを逆転させた）にしばしば直接連結する。ＭＡＬＤＩは、乾燥試料が方法をより効果的にするために桂皮酸のようなレーザー・エネルギーを吸収する小さい有機分子を混ぜ合わせたレーザパルスを経て蒸発する。質量のアナライザは、質量分析計のキー構成要素である；重要なパラメータは、感度、分解能及び質量の精度である。プロテオミクスにおいて現在使用する５種類の基本的質量のアナライザが、ある。これらは、イオントラップ、タイム・オブ・フライト（ＴＯＦ）、四重極、Ｏｒｂｉｔｒａｐを有し、フーリエ変換イオン・サイクロトロン（ＦＴＩＣＲ−ＭＳ）アナライザを含む。タンデムＭＳ又はＭＳ／ＭＳは遅れずに実行されることができる（イオントラップ）、そして、適所に本願明細書において詳述されるＡｓ、ポリペプチドの質量分析計に発生するスペクトル又は以前差別的にラベルをつけられた試料のプールから分離されたペプチドは異なる同位体ラベル構成成分（このポリペプチドが起こるタンパク質が試料のうちの１つの全てで表されるというわけではない場合、ピークの数はより少ない）の特性質量の違いを有する一組のピークを含む（例えば全ての複合型計測器（例えばＬＴＱ−ＦＴＩＣＲ、ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ、Ｑ−ＴＯＦ、ＴＯＦ−ＴＯＦ、３二重の四角形及び複合型３二重の四重極／線形のイオントラップ（ＱＴＲＡＰ））で）。
【０１７７】
各々のこれらのピークは、異なってラベルをつけられたペプチドの同定及び更なる定量化のための等圧のラベル構成成分のレポーター基をリリースするために、タンデムＭＳによって更に分析される。に基づいて氏ポリペプチド（アミノ酸組成又は個々のペプチドのアミノ酸配列）の中でペプチドの同一性が決定されること。
【０１７８】
本発明の方法は、今後多くの標識化方式で例示される。
【０１７９】
異なる図示する標識化方式の詳細な上記で更なる明らかにされた将来として、ペプチドの分裂又は親和性タグの使用法が、本発明の全ての実施例にとって、重要であるというわけではない。
【０１８０】
タンパク質反応性の基（ＰＲＧ）によって、方式（図６を見る）にラベルをつけている以下は本発明の二重にラベルをつけている試薬を使用している８つのタンパク質試料の標識化の実施例を開示する。そして、それはシステイン反応性の基である。
【０１８１】
予め処理ステップにおいて、試料は、システイン上のアクセスできるチオール官能基の存在を確実にするために減少して、リシンの側鎖のアミンをブロックするためにアセチル化される。
【０１８２】
標識化方式の異なるステップは、以下から成る：
８つのタンパク質試料は各々試薬にラベルをつけている一組のダブルのうちの１杯についてのラベルがついている。そこにおいて、各々のラベリング試薬は同位体で等圧のラベルのユニークな組合せを有する、そして、ラベリング試薬はタグを付けられるビオチンであって、システイン反応性の基から成る。
【０１８３】
標識化の後、すでに現段階で、全ての試料はプールされて、１つの反応混合物とみなされる。そして、それは個々の試料の操作によるバリエーションを減少させる。
【０１８４】
−非常に得られたシステイン・ラベルをつけられた試料は、トリプシンによって消化される。
【０１８５】
更なる分析のためのペプチドの数を減らすために、二重のラベルをつけられたペプチドだけは、ラベルを使用している（ストレプト）アビジン親和性技術上のビオチン親和性タグを経て分離される。
【０１８６】
親和性ステップの後、各々のペプチドは、現在同位体で等圧のラベル構成成分を有するラベルを有する。従って、あらゆるペプチドは、ＭＳを経て分析に応じて有益である。
【０１８７】
方法は、そこにおいて、ステップを更に含む：
プールされたペプチドは、例えば液体クロマトグラフィーによって分離される。本願明細書において、同一である、しかし、異なる試料から生じて、このように異なってラベルをつけられるペプチドは、基本的に同一の方法でふるまう。異なる試料から各々のペプチドに存在する、同位体で等圧のラベル構成成分の異なる組合せにもかかわらず、セットされる各々のラベルの異なるラベルが同じ化学式又は基本的に同じ公式を有するにつれて、これはそれらの溶出に影響を及ぼさない。
【０１８８】
各々の分離されたペプチド分数は、異なる質量（「軽い」又は「重い」同位体ラベル構成成分の存在に対応する）をもつＭＳ（２つの信号を生成しなければならない）によって分析される。今後、異なる同位元素を有するペプチドが更にそうである各々は、それによって、基がペプチドの中で各々ある等圧のラベル構成成分から自由にされるレポーターを分解した。レポーターの相対的な量は、そのレポーターについてのラベルがついていたペプチドの相対的な量を示す。ＭＳデータは、ペプチドの配列を決定して、それが由来するタンパク質を同定するために更に用いる。ペプチド混合のペプチドとラベルをつけられる各々の相対的な量を決定することの理論上の実施例は、本願明細書において実施例１に示される。
【０１８９】
図示するように上の本発明の方法は、２つの異なる同位体ラベル構成成分及び４つの異なる等圧のラベル構成成分の組合せを有する一組のラベリング試薬を使用して、８の複雑さまで、異なるタンパク質試料の多重化を可能にする。付加的な等圧の及び／又は同位体ラベル部品が用いられるときに、これはさらなる多重化を考慮に入れる。多重性は、異なる同位体ラベル構成成分の番号かける異なる等圧のラベル構成成分の数の製品で測定される。
【０１９０】
上記した典型的な標識化プロトコルは、例えば表現の違いが内部ペプチドを使用している異なる試料の中間的な個々のタンパク質を平らにすると決定することに適している。
特定のアプリケーションに従い、異なる代わりのプロトコルは、想定される。
【０１９１】
概説された上記として最も多くの従来方法は、ペプチドの側鎖上の標識化を使用する。
典型的には、側鎖上の標識化は、システインに実行される。しかしながら上記したように、タンパク質データベースの約１５％のタンパク質は、システインを有しなくて、ラベルをつけられない。システインがタンパク質で起こらないという可能性は、タンパク質長の減少と共に増加する。これは、システイン以外のアミノ酸の側鎖で、標識化にとって等しく真実である。より短いタンパク質、より小さいアミノ酸の側鎖上の標識化のためにチャンス。
【０１９２】
低いタンパク質氏（二重にラベルをつけている試薬及び一級アミン又はカルボキシル基である官能基と相互に作用しているタンパク質／ペプチド反応性基が特に興味があるそれによって本発明の方法）を研究すること。実際、これらの基は、それぞれアミノ終点及びカルボキシ終点で常に各々のタンパク質で起こる。具体例によれば、本発明の方法は、ゲル濾過クロマトグラフィー又はサイズ除去術（透析又は限外濾過）を使用している一つ以上の低い分数氏の試料を分別するステップを含む。その後で、この種のタンパク質試料の限られたサイズが直接それらを液体クロマトグラフィー技術に適しているようにするにつれて、試料の低いタンパク質分数氏は、更なるタンパク質裂開なしでラベルをつけられる。本発明の方法のこの実施例において、それは親和性タグを使用するのに必要でない。−その理由は、次のことにある。低い分数氏のあらゆるタンパク質はラベルをつけられる。
【０１９３】
他の実施形態では、現在の方法の試薬は、特にＮ末端又はタンパク質のＣ末端ペプチドにラベルをつけるために用いる。
【０１９４】
Ｎ末端ペプチドの隔離のために、タンパク質（リシン及びＮ末端）上のアミン・基は、最初に修正される（例えば、アルキル化されるか又はアセチル化される）。
Ａｓｐ及びＧＩｕの側鎖は、また、修正される。その後で、タンパク質は切断される（例えばトリプシンによって）。そして、それによって、全てのペプチドはＮ末端ペプチドから離れて新しいアクセスできる反応性のアミン・基を得る。この基は、タンパク質反応性の親和性タグ（例えばＮＨＳ−ビオチン）と作用される。今後、内部及びＣ末端ペプチドは、親和性クロマトグラフィーを使用して分離される。残留するＮ末端ペプチドは、現在カルボキシル反応性の基を有するラベリング試薬を有するそのＣ末端に反応を起こす。興味があるペプチドが実際すでに以前に親和性を浄化したにつれて、この手順のために、ラベリング試薬上の親和性タグの必要がない。ラベリング試薬及び次の親和性浄化上のタグの使用は、適切にラベルをつけられたペプチドだけが更なる分析を受けることを確実にするために、まだ構想されることができる。この方法では、裂開より前のＡｓｐ及びＧＩｕの変更態様は、アミノ酸側鎖の標識化を回避するが、手順にとって重要でない。
【０１９５】
類似した方法はＣ末端ペプチドの隔離のために実行されることができる。そこにおいて、カルボキシル基は修正される、そして、裂開に発生するペプチドは親和性タグと作用される。そして、それはカルボキシル基の方へ反応性である基を担持する。ラベリング試薬はしたがって、タンパク質／ペプチド反応性の基から成る。そして、それは裂開に発生する新規なＮ末端によって反動的である。
【０１９６】
タンパク質のＮ末端かＣ末端ペプチドにラベルをつけることは、特定の効果がある。
【０１９７】
第一に、試料の全てのタンパク質は検出される。その一方で、アミノ酸の側鎖の標識化はその特定の汎関数が起こらないそれらのタンパク質を見渡す。第二に、ブロックされたＮ末端を有するタンパク質さえ、検出される。この方法を使用して、活発なものにおいても、全てのアミンの終点はブロックされる。
【０１９８】
そして、別の標識化方法にもよって、本発明の方法に従う典型的な標識化方式は試料のタンパク質（いわゆるデグラドミック）のタンパク質分解処理を研究するために例えば特に適切であるとみなされるものである。差別的なＮ末端処理の実施例は、アミノ酸４及び９がアルギニンであるＮ末端配列１−９を有する仮定的タンパク質のための表１に示される。タンパク質（ペプチドがクロマトグラフィーの後で１分数として抜き取る全８つの差別的にラベルをつけられたＮ末端）が加工されない、これらのＭＳ及び各々の成っている異なる同位体ラベルが更に生成する異なる分数に上へ分裂は、ＭＳ／ＭＳの等圧のラベル構成成分と異なる一組のレポーター基である。
【０１９９】
表１の下で概説されるように、状況において、被処理タンパク質のＮ末端ペプチドの標識化は４つの異なるＮ末端ペプチドにつながる。そして、それは高性能クロマトグラフィーの異なる位置でシステム（例えば逆転する位相ＨＰＬＣクロマトグラフィー）を抜き取る。したがって、この種のペプチドが同じ同位体ラベルを有するが、異なる等圧のラベルを担持するときに、この種のペプチド分数はＭＳ上の単峰形として現れさえすることができる。
【０２００】
表１：差別的なＮ末端のプロセシング
【０２０１】
【表３】
2010509567.tif 000005
にもかかわらず、あらゆる試料のために気にせずに処理の範囲、ペプチドがそれが由来したタンパク質の数部決定されるＮ−端末。
【０２０２】
本発明（すなわち官能基の性質が試料又は所望の結果の性質で測定されない所で）の一般の方法において、ポリペプチドに修正される官能基の選択は、異なる要因（例えば親和性の有無が利用できるラベリング試薬においてタグを付ける利用できるラベリング試薬に存在するタンパク質反応性基のタイプ）によって影響されることができる。
【０２０３】
例えば疾患の前後関係で、本発明の方法は、バイオ標識の検出に役立つ。試料に従い、多数のペプチドは、ＭＳ及びＭＳ／ＭＳによって分析される。この量は、数百と同じ程度の、さらに千を超えることがありえる。それらの多数のために、同じペプチドの差別的にラベルをつけられたバージョンの間に相対的な量は、試料の起源を問わず一定である。しかしながら、有意差は、特定の試料によって表されるにつれて、疾患の条件と相関している限定された数のペプチドのために観察される。これらのペプチドの分析は、それ自身、ペプチドが始まるタンパク質を決定することを可能にする。同じタンパク質からの異なるペプチドのために、同一の表現レベルが検出されると述べられるときに、分析はさらにより信頼性が高い。
【０２０４】
本発明の別の態様は、対応するラベル源（１０４）、分離装置（１０７）、質量分析計装置（１０８）及び制御回路及びデータ分析装置（１０９）を有する少なくとも２つの試料源（１０１）（標識化装置（１０３））から成るタンパク質試料（１００）の多重分析の装置に関する。具体例において分離装置（１０７）が２つの連続的に連結された分離システム（１１０７）及び（２１０７）から成ること、第１の分離システム（１１０７）は例えば２Ｄゲル電気泳動システム又は陽イオン交換クロマトグラフィーシステムである、そして、分離システム、そして、第２の分離システム（２１０７）は典型的にはＨＰＬＣ逆転する位相システムである。
【０２０５】
質量分析計要素１０８は同位体形を切り離すＭＳ／ＭＳ分光計である、そして、ＣＩＤに、等圧のラベルのレポーター基は差別的に検出される、そして、新たに、ペプチド塩基配列決定は実行されることができる。ＭＳ／ＭＳ分析は、２つの基本的に異なる計測器を使用してされることができる。計測器の第一型において、ＭＳ／ＭＳ分析がＭＳがある同じイオントラップにおいてされるイオントラップは作動した、しかし、ＭＳ／ＭＳは遅れずにされる（トラップは満たされる、全てのイオンは興味があるイオン（ｓ）以外は放出される、そして、ＣＩＤは実行される、そして、断片イオンは走査される）。第２の種類の計測器（複合型計測器（３二重の四角形、ｑ−ｔｏｆ、ｌｔｑ−ｆｔｍｓ、ｌｔｑ−ｏｒｂｉｔｒａｐ））は適所にＭＳ／ＭＳを切り離す、例えば、親のような選択は第１の質量のアナライザでされる、そして、断片は第２の質量のアナライザで走査される。
【０２０６】
装置は、多くのオプション・エレメント（例えばそこにおいて、試料準備装置（１０２）（例えば溶解及び免疫減少が選択的に、親和性タグ（例えばビオチン−アビジン親和性浄化）を担持しているラベルをつけられたポリペプチドを分離するために場所、タンパク質裂開装置（１０５）及び親和性浄化装置（１０６）に持っていく試料））から更に成ることができる。質量分析計装置及び分離装置としての本発明の装置への編入の適切な装置は、上記している。
【０２０７】
本発明の標識化方法がプロテオミクスにおいて適用できることはいうまでもない、タンパク質表現側面図を作る、バイオ標識発見、そして、目標発見。本発明の方法の高い多重化は、１の多くの異なる状況を分析することが実験を選び出すと認める。方法は、特に異なる疾患状態から得られる試料の表現側面を研究することに役立つ。反応しているか又は処理に、体の異なる一部において現れる障害を有する人から、処理の間と後にの前の人から、処理の異なる方法を受信している人から、そして、障害の一つ以上の症状を有するそれ以外は健常な人から反応していない人から、分析される試料は、健常な人の一つ以上、良性障害をもつ人、悪性障害（穏やかであるか強烈な）をもつ人に由来する。
本発明の前後関係において考慮される障害は、細菌性であるかウィルス性感染症、免疫学的障害、心血管障害及び癌を含む。
【０２０８】
本発明を実施しているシステム及び方法の他の配列は、当業者のために明らかである。
【０２０９】
好ましい実施例、特定の構造及び構成が、材料と同様に、本発明による装置のための本願明細書において述べられたにもかかわらず、形及び細部のさまざまな変化又は修正が本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、なされることができると理解されることになっている。
【０２１０】
［例］
例１：同位体の及び等圧のラベリングを使用するものである個々のペプチドの相対的な表現レベルの決定。
【０２１１】
等圧で同位体ラベル構成成分のユニークな組合せから成る試薬にラベルをつけることを使用して、異なる等圧で同位体標識化の組合せを有するラベルをつけられたペプチドの混成の範囲内で個々のペプチドの相対的な量を決定することは、可能である。これは、以下の理論上の実施例によって例証される。８が試料をとる（１〜８）内部ペプチド・同位体ラベルの組合せによってラベルをつける又はｂ及び等圧のラベルＡ（表４の計画通りのＢ、Ｃ及びＤ）。
【０２１２】
表４：混合物におけるラベリングされたポリペプチドの相対的な濃度の決定
【０２１３】
【表４】
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混合その後のラベルをつけられたポリペプチドの相対的な濃度の全ての試料がプールされて、ラベルをつけられたペプチドがペプチド上の特定の同位体／等圧のラベル構成成分の組合せから気にせずに同様にふるまうクロマトグラフィーに従属するという決定。ペプチドの異なってラベルをつけられたバージョンは、一体となって分数を抜き取る。分数は、それが高い同位元素を有する分数及び軽い同位元素を有する分数において分かれるＭＳに適用される。これらの２分数の中で、相対的な量は、算出されることができる。表４において、ｂ同位元素を有する更に５０％のペプチドは、測定されるを有する同位元素。その後、異なる同位体ラベルを有する２ペプチド分数は断片的である。そして、所与の同位体ラベル（表４に示す理論上の比率のもの）を有する各々のペプチド分数の範囲内で等圧のペプチドの相対的な比率を決定するために許す。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
2010509567.tif 000014
【図５Ｂ】
2010509567.tif 000015
【図５Ｃ】
2010509567.tif 000016
【図５Ｄ】
2010509567.tif 000017
【図５Ｅ】
2010509567.tif 000018
【図６】
2010509567.tif 000019
【図７】
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【国際調査報告】
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