(57)【要約】（ｉ）孔を有し、ポリマー例えばアルギネートまたはキトサン並びに発泡体の少なくとも一部を通して分配しているゲル形成イオン例えばストロンチウムイオン、カルシウムイオンを含む発泡体；（ｉｉ）ゲル化部位を有する多糖例えばアルギネート、ペクチン、カラギーナンまたはヒアルロネートを含み、発泡体の孔内で形成かつ配置されそして発泡体と相互作用するゲル；および（ｉｉｉ）ゲル化部位を有する多糖およびゲル形成イオン例えばカルシウムイオン、ストロンチウムイオン、トリホスフェートイオンまたはホスフェートイオンを含み、該発泡体の外側の表面を完全にカバーするコーティングを含む複合物に関し、例えば創傷治療、組織工学、組織再生および細胞固定化のような用途に好適な製品の提供。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）孔を有し、ポリマーおよび発泡体の少なくとも一部を通して分配しているゲル形成イオンを含む発泡体；
（ｉｉ）ゲル化部位を有する多糖を含み、発泡体の孔内で形成かつ配置されそして発泡体と相互作用するゲル；および
（ｉｉｉ）ゲル化部位を有する多糖およびゲル形成イオンを含み、該発泡体の外側の表面を完全にカバーするコーティング
を含むことを特徴とする複合物。
【請求項２】
該ポリマーが、アルギネート、ペクチン、カラギーナン、ヒアルロネート、キトサン、細胞接着配列変性アルギネート、ＲＧＤ変性アルギネートおよびこれらの組み合わせからなる群から選ばれる請求項１の複合物。
【請求項３】
該発泡体中の該ゲル形成イオンが、ストロンチウムイオン、バリウムイオン、カルシウムイオンおよびこれらの組み合わせからなる群から選ばれ、該多糖が、アルギネート、ペクチン、カラギーナン、ヒアルロネートおよびこれらの組み合わせからなる群から選ばれるか；または該発泡体および該コーティング中の該ゲル形成イオンが、独立してそれぞれトリホスフェートイオン、ホスフェートイオン、シトレートイオンおよびこれらの組み合わせからなる群から選ばれ、該多糖がキトサンを含む請求項１または２の複合物。
【請求項４】
該発泡体中の該ゲル形成イオンが、該ゲルの該多糖の該ゲル化部位の少なくとも５％に等しいモル量で存在する請求項１−３の何れか１つの項の複合物。
【請求項５】
該ゲル中の該多糖が、アルギネート、キトサン、カラギーナン、ヒアルロネート、ペクチン、細胞接着配列変性アルギネート、ＲＧＤ変性アルギネートおよびこれらの組み合わせからなる群から選ばれる、および／または該コーティングが、ヒアルロネート、アルギネート、キトサン、細胞接着配列変性アルギネートまたはＲＧＤ変性アルギネートを含む請求項１−４の何れか１つの項の複合物。
【請求項６】
多糖が、約２０−約８０％のグルロネート（Ｇ）含量を有するアルギネート、および／または少なくとも２０％のマンヌロネート（Ｍ）含量を有するアルギネート、および／または約１以上のマンヌロネート対グルロネートの比を含む請求項１−５の何れか１つの項の複合物。
【請求項７】
多糖が、約４−約３００ｋＤ、約１５０−約２５０ｋＤおよび約７５−約１５０ｋＤからなる群から選ばれる重量平均分子量を有するアルギネートを含む請求項１−６の何れか１つの項の複合物。
【請求項８】
該コーティング中の該多糖が、該コーティングの約０．２−約１０％；該コーティングの約１−約８％；該コーティングの約２−約７％；該コーティングの約３−約６％からなる群から選ばれる範囲で存在する請求項１−７の何れか１つの項の複合物。
【請求項９】
発泡体が、水、生理学的溶液、可溶性の多糖溶液および機能性成分を含む多糖溶液からなる群から選ばれた液体をその重量の１−３０倍吸収する；および／またはアルギネートを含み、さらに製薬上活性な剤および／または抗接着剤から選ばれる機能性成分を含む、および／またはさらにメッシュを含む請求項１−８の何れか１つの項の複合物。
【請求項１０】
複合物の弾性モジュラスが０．１−１０００ｋＰａである請求項１−９の何れか１つの項の複合物。
【請求項１１】
フレーバー、香料、微粒子、細胞、多細胞凝集物、治療剤、組織再生剤、成長因子、栄養剤およびこれらの組み合わせからなる群から選ばれる機能性成分をさらに含む請求項１−１０の何れか１つの項の複合物。
【請求項１２】
該ゲルが、膵島細胞、肝臓細胞、神経細胞、血管内皮細胞、上皮小体細胞、甲状腺細胞、副腎細胞、胸腺細胞、間葉幹細胞および卵巣細胞をさらに含む請求項１−１１の何れか１つの項の複合物。
【請求項１３】
所望により細胞を含み、
（ａ）（ｉ）該発泡体中の該ポリマーが、アルギネート、細胞接着配列変性アルギネートおよびこれらの組み合わせであり；（ｉｉ）該発泡体中の該ゲル形成イオンが、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、バリウムイオンおよびこれらの組み合わせからなる群から選ばれ；（ｉｉｉ）該ゲル中の該多糖が、アルギネート、細胞接着配列変性アルギネートおよびこれらの組み合わせからなる群から選ばれ；（ｉｖ）該コーティング中の該ゲル形成イオンが、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、バリウムイオンおよびこれらの組み合わせからなる群から選ばれる複合物；
（ｂ）（ｉ）該発泡体中の該ポリマーがアルギネートであり；（ｉｉ）該発泡体中の該ゲル形成イオンが、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、バリウムイオンおよびこれらの組み合わせからなる群から選ばれ；（ｉｉｉ）該ゲル中の該多糖がアルギネートであり；（ｉｖ）該コーティングがアルギネートを含み、（ｖ）該コーティング中の該ゲル形成イオンが、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、バリウムイオンおよびこれらの組み合わせからなる群から選ばれる複合物；
（ｃ）（ｉ）該発泡体中の該ポリマーがアルギネートであり；（ｉｉ）該発泡体中の該ゲル形成イオンが、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、バリウムイオンおよびこれらの組み合わせからなる群から選ばれ；（ｉｉｉ）該ゲル中の該多糖がＲＧＤ変性アルギネートであり；（ｉｖ）該コーティングがアルギネートを含み、（ｖ）該コーティング中の該ゲル形成イオンが、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、バリウムイオンおよびこれらの組み合わせからなる群から選ばれる複合物；
（ｄ）（ｉ）該発泡体中の該ポリマーがアルギネートであり；（ｉｉ）該発泡体中の該ゲル形成イオンが、カルシウムイオン、ストロンチウムイオンおよびこれらの組み合わせからなる群から選ばれ；（ｉｉｉ）該ゲル中の該多糖がＲＧＤ変性アルギネートであり；（ｉｖ）該コーティングがアルギネートを含み、（ｖ）該コーティング中の該ゲル形成イオンが、カルシウムイオン、ストロンチウムイオンおよびこれらの組み合わせからなる群から選ばれる複合物；
（ｅ）（ｉ）該発泡体中の該ポリマーがアルギネートであり；（ｉｉ）該発泡体中の該ゲル形成イオンがカルシウムイオンであり；（ｉｉｉ）該ゲル中の該多糖がＲＧＤ変性アルギネートであり；（ｉｖ）該コーティングがアルギネートを含み、（ｖ）該コーティング中の該ゲル形成イオンがカルシウムイオンである複合物；
からなる群から選ばれる請求項１の複合物。
【請求項１４】
該孔の平均孔サイズが直径約２５−約１０００μｍである請求項１−１３の何れか１つの項の複合物。
【請求項１５】
固体の支持構造物をさらに含む請求項１−１４の何れか１つの項の複合物。
【請求項１６】
発泡体が、メッシュである固体の支持構造物を含む請求項１５の複合物。
【請求項１７】
（ｉ）第１の液体成分と孔を有する発泡体とを接触させ、ここで該第１の液体成分は該イオンと接触するとゲルを形成できるゲル化部位を有しそれにより該ゲル形成イオンと接触するとゲルが形成される多糖を含む、
（ｉｉ）該発泡体の外側の表面上でコーティングを形成し、
（ｉｉｉ）所望により、該コーティングの該形成後、該複合物とストロンチウムイオンおよびカルシウムイオンの溶液とを接触させ、
その場合、該発泡体は、ゲル形成イオンを含み、該イオンは発泡体の少なくとも一部を通して分配され、そして
該コーティングが、ゲル化部位を有する多糖およびゲル形成イオンを含み、該コーティングが該発泡体の外側の表面を完全にカバーする
ことを含むことを特徴とする請求項１−１６の何れか１つの項の複合物を形成する方法。
【請求項１８】
該コーティングの該形成が、
（ｉ）ゲル化部位を有する多糖を含む第２の液体成分を発泡体の外側の表面へ適用し；
（ｉｉ）該適用後、該第２の液体成分とゲル形成イオンの溶液とを接触させて該コーティングを形成する
ことを含む請求項１７の方法。
【請求項１９】
該第１の液体成分が、約０．２−約１０％ｗ／ｖの該多糖、約０．５−約５％ｗ／ｖの該多糖または約０．１−約１．０％ｗ／ｖの該多糖を含む、および／または該第２の液体成分が、約０．２−約１０％ｗ／ｖのアルギネート、変性アルギネートまたはこれらの組み合わせを含む、または約２−約７％ｗ／ｖのアルギネート、変性アルギネートまたはこれらの組み合わせを含む請求項１７または１８の方法。
【請求項２０】
生細胞に対して中性の浸透圧に調節した溶液により複合物を洗浄し、該溶液がゲル形成イオンを含むことを特徴とする請求項１−１６の何れか１つの項の複合物における細胞の増殖をコントロールする方法。
【請求項２１】
回収剤を含む水溶液と、多糖を含むゲルとを接触させ、該ゲルは細胞を含み、該水溶液が調節されて生細胞に対して中性の浸透圧を有することを含むことを特徴とする請求項１−１６の何れか１つの項の複合物から細胞を回収する方法。
【請求項２２】
生体外組織培養の応用および／または生体内組織工学の応用における細胞の固定化および／または増殖のためのマトリックスとして、および／またはさらに治療剤を含んでヒトまたは動物の身体中への活性剤の生体内のコントロールされた放出をもたらす複合物として、および／またはさらに創傷の治療に使用される化合物を含んで生体内創傷治療をもたらす複合物として用いることを特徴とする請求項１−１６の何れか１つの項の複合物の用途。
【請求項２３】
請求項１−１６の何れか１つの項の複合物を組織へ適用して、組織と隣接する組織との間にバリヤーをもたらすことを特徴とする隣接する組織への組織の接着を防ぐ方法。
【請求項２４】
その必要のある患者に請求項１−１６の何れか１つの項の該１つ以上の複合物を移植することを特徴とする患者へ１つ以上の複合物を投与する方法。
【請求項２５】
該ゲルが膵島細胞を含み、該患者が糖尿病の治療または血糖のレベルの制御を必要としている請求項２４の方法。
【請求項２６】
糖尿病を治療する方法または血糖のレベルを下げる方法に使用されることを特徴とする請求項１−１６の何れか１つの項の複合物の用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発泡体の孔内にゲル化された多糖、および多糖のコーティング、複合物の製法およびその用途に関する。この複合物は、例えば細胞培養基および移植のような生物医学的利用、コントロールされた放出伝達システム、食品の利用、工業的利用並びにパーソナルケアの利用（化粧品および口腔衛生品を含む）に特に有用である。
【背景技術】
【０００２】
例えば創傷治療、組織工学、組織再生および細胞固定化のような用途に好適な製品の提供が求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、例えば創傷治療、組織工学、組織再生および細胞固定化のような用途に好適な製品を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
１つの側面では、本発明は、（ｉ）少なくとも一部の発泡体を通って分配されたゲル形成イオンを含む有孔の発泡体、（ｉｉ）発泡体の孔内に配置されそして発泡体と相互作用するゲル化部位を有する多糖を含むゲル、さらに（ｉｉｉ）発泡体の外側の表面を完全にカバーし、ゲル化部位およびゲル形成イオンを有する多糖を含むコーティングを含む複合物を提供する。
他の側面では、本発明は、複合物の発泡体の孔中にあるゲル内のセルをさらに含む複合物を提供する。
【０００５】
他の側面では、本発明は、本発明の複合物の任意のものを製造する方法をさらに提供し、複合物は、本明細書に記載された種々の複合物の態様およびこれらの態様の組み合わせを含み、製造方法は、ｉ）第１の液体成分と孔を有する発泡体とを接触させ、該第１の液体成分は、該イオンと接触するとゲルを形成できる部位を有し、それにより該ゲルが該ゲル形成イオンと接触すると形成され、そしてｉｉ）該発泡体の外側の表面上に該コーティングを形成することを含み、その場合該発泡体は、ポリマーおよびゲル形成イオンを含み、該イオンは発泡体の少なくとも一部を通って分配され、そして該コーティングは、ゲル化部位をもつ多糖およびゲル形成イオンを含み、該コーティングは該発泡体の外側の表面を完全にカバーする。
【０００６】
他の側面では、本発明は、本発明の方法に従って製造される複合物の方法および用途を提供する。複合物は、医学上の利用例えば創傷の治療、組織工学および組織再生並びに細胞固定に使用されて特に適している。
【０００７】
本発明は、その必要にある患者へ１つ以上の複合物を投与する方法を提供し、それは該患者に１つ以上の複合物を移植することからなる。
本発明は、さらに、療法によりヒトおよび動物の身体を治療する方法に使用するための本明細書で記載された複合物を提供する。いくつかの態様では、複合物は、糖尿病の治療または血糖のレベルを低下させる方法で使用される。
【０００８】
本発明は、さらに、その必要のある患者へ１つ以上の複合物を移植するキットを提供し、それは、本発明の１つ以上の複合物を含む。
本発明は、さらに、本明細書に記載された複合物における細胞増殖を促進する方法を提供し、それは、生細胞に対して中性の浸透圧に調節されそしてゲル形成イオンを含む溶液により該複合物を洗浄することを含む。
【０００９】
本発明は、さらに、細胞の増殖を阻害する方法を提供し、それは、本発明の方法により複合物を形成し、その場合液体成分は細胞を含み、該多糖は発泡体の孔内でゲル化され、ゲル形成イオンはストロンチウムイオンを含む。
本発明は、さらに、本明細書で記載した複合物から細胞を回収する方法を提供し、それは、回収剤を含む水溶液と可溶性の多糖を含むゲルとを接触させるものであり、該水溶液は生細胞に対して中性の浸透圧をもたらすように調節されている。
【００１０】
本発明は、さらに、細胞の成長を促進する方法を提供し、それは本明細書で記載した複合物を移植し、その場合発泡体は、細胞の成長を確立する目的でのヒトまたは動物の身体中へのアルギネートを含む。
本発明は、さらに、隣接する組織への組織の接着を防ぐ方法を提供し、それは組織へ本明細書に記載された複合物を適用し、それが組織と隣接する組織との間にバリヤーをもたらす。
【００１１】
本発明は、さらに、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）の組織培養の利用または生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）の組織工学の利用のための細胞の固定および／または増殖用のマトリックスとしての本明細書で記載された複合物の用途を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】細胞がゲルの一部である発泡体複合物の態様の図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（定義）
本明細書で使用されるとき、用語「約」は、値のプラスまたはマイナス１０％を意味する。
本明細書で使用されるとき、用語「アルギネート」は、アルギン酸の塩および変性アルギネートを意味する。海藻から単離されるアルギン酸は、２つのウロン酸；Ｄ−マンヌロン酸およびＬ−グルロン酸からなるポリウロン酸である。マンヌロン酸およびグルロン酸の比は、海藻の種、植物の齢、およびその海藻の部分（例えば茎、葉）のようなファクターにより変化する。アルギン酸は、水中に実質的に不溶である。それは、アルカリ金属例えばナトリウム、カリウム、およびリチウム；マグネシウム；アンモニウム；および低級アミンから誘導された置換アンモニウムカチオン例えばメチルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミンおよびトリエタノールアミンと水溶性の塩を形成する。この塩は、ｐＨ４より高い水性媒体に可溶であるが、ｐＨが約ｐＨ４より低いときにはアルギン酸に転換される。熱不可逆性の水不溶性アルギネートゲルは、ゲル形成イオン、例えばカルシウム、バリウム、ストロンチウム、亜鉛、銅（＋２）、アルミニウムおよびこれらの混合物の存在下適切な濃度で形成される。アルギネートゲルは、可溶性のカチオンまたはゲル形成イオン用のキレート剤例えばＥＤＴＡ、クエン酸塩などの溶液中に浸漬させることにより可溶化できる。
【００１４】
主なカチオンがカルシウムである水不溶性のアルギネート塩は、Ｐｈａｅｏｐｈｙｃｅａｅ綱の海藻の葉状体および茎に見いだされ、それらの例は、Ｆｕｃｕｓ  ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ、Ｆｕｃｕｓ  ｓｐｉｒａｌｉｓ、Ａｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｎｏｄｏｓｕｍ、Ｍａｃｒｏｃｙｓｔｉｓ  ｐｙｒｉｆｅｒａ，Ａｌａｒｉａ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ、Ｅｃｌｏｎｉａ  ｍａｘｉｍａ、Ｌｅｓｓｏｎｉａ  ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ、Ｌｅｓｓｏｎｉａ  ｔｒａｂｅｃｕｌａｔａ、Ｌａｍｉｎａｒｎｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ、Ｄｕｒｖｉｌｌｅａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ、Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｈｙｐｅｒｂｏｒｅａ、Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｌｏｎｇｉｃｒｕｒｉｓ、Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｄｉｇｉｔａｔａ、Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｓａｃｃｈａｒｉｎａ，Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｃｌｏｕｓｔｏｎｉおよびＳａｒａｇａｓｓｕｍ  ｓｐ．である。天然源からのアルギン酸およびその水溶性塩特にアルギン酸ナトリウムの回収方法は周知であり、そして例えばＧｒｅｅｎ、ＵＳ２０３６９３４およびＬｅ  Ｇｌｏａｈｅｃ、ＵＳ２１２８５５１に記載されている。好適なアルギネートは、ＰＲＯＮＯＶＡ  ＵＰおよびＳＬＭシリーズ（ＮｏｖａＭａｔｒｉｘ、ＦＭＣ  Ｃｏｒｐ．オルソー、ノルウエイ）を含むが、これらに限定されない。
【００１５】
本明細書で用いられるとき、「キトサン」は、β−（１→４）結合２−アセトアミド−２−デキソイ−Ｄ−グルコピラノース（ＧｌｃＮＡｃ）および２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノース（ＧｌｃＮ）および変性キトサンを意味する。キトサンは、キチンのＮ−脱アセチル化誘導体であり、キチンは、β−（１→４）結合２−アセトアミド−２−デキソイ−Ｄ−グルコピラノース（ＧｌｃＮＡｃ）から殆ど完全に構成される。市販のキトサンは、キチンのアルカリ性Ｎ−脱アセチル化により製造される。不溶性の化合物の除去と組み合わされた不均一な脱アセチル化プロセスは、ポリマー鎖に沿ってＧｌｃＮＡｃおよびＧｌｃＮ−単位の不規則な分配を有する。キトサン中のアミノ基は、約６．５の見かけのｐＫａ値を有し、そしてこの値より下のｐＨで、遊離のアミノ基はプロトン化され、溶液中に溶解するキトサン塩は正の電荷を帯びる。従って、キトサンは、負に電荷した成分と反応でき、それはキトサンの正の電荷密度の直接的な機能である。
【００１６】
有利には、キトサンのカチオン性の性質は、生体接着の性質をもたらす。さらに、キトサンは、それらの負の電荷のために赤血球を沈殿させ、血餅を形成し治癒中フィブリンのレベルを減らす利点を生じさせて、瘢痕性組織の形成を減少させる。キトサンは、哺乳動物の身体例えばヒトの身体に生ずるリゾチームおよび他の関連する酵素により分解される。使用にあたり、本発明の発泡体中のキトサンは、唾液、涙、血清および間質液中で哺乳動物に見いだされるリゾチームによって好適に分解される。キトサンの発泡体を有する複合物は、有利には、生体接着剤としておよびヒトまたは動物の身体における他の応用として創傷の治療に使用できる。キトサンの分解生成物は、グルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンであり、それらは哺乳動物で無毒である。リゾチームによる移植されたキトサンの発泡体の生分解の速度は、アセチル化が酵素の分解からポリマーを保護することから、キトサンの脱アセチル化の程度を変化することによって改変できる。高度の脱アセチル化度を有するキトサンは、また、正の電荷の保護作用によって、酸加水分解によるランダム解重合により抵抗性を有する。
【００１７】
本発明で使用するのが好適なキトサンは、キトサン塩基、水溶性のキトサン塩または変性キトサンの形をとる。キトサン塩基は、例えば１重量％の酢酸のような希酸を溶解するのに必要とする。キトサンは、酸性のｐＨで水性媒体中に可溶であり、その場合多糖は高度に正の電荷をとる。モノマー単位のランダムな分配および４０−６０％の脱アセチル化度（ＤＡ）をもつ高分子量のキトサンは、中性のｐＨで可溶である。キトサンは、ｐＨ値が上がりＤＡが下がるにつれて溶解度が上がる。また、６０％より上のＤＡを有するキトサンを解重合することにより、中性のｐＨ値でのそれらの水溶解度も増大する。
【００１８】
一般に、キトサンは、溶解について酸性の環境を要する。適切な酸中にキトサンを溶解することにより、キトサン塩は乾燥することにより得られる。好適なキトサン塩は、塩化キトサン、キトサングルタメート、キトサンラクテート、キトサンマレエート、キトサンマレート、キトサンマロネート、キトサンサクシネート、キトサンホルメート、キトサンアスパルテート、キトサンアセテート、キトサンプロピオネート、キトサンナイトレートおよびキトサンアジペートを含む。例えば、キトサングルタメートは、グルタミン酸中にキトサンを溶解することによりグルタメート塩の形へ転換されたキトサンである。グルタミン酸は、ＧｌｃＮ単位の数に対して化学量論的量で存在する。塩化キトサンは、ＧｌｃＮ単位の数に対して化学量論的量の塩酸塩を含む。
【００１９】
キトサンの塩は、一般に、水に可溶であり、キトサン塩の１％溶液のｐＨは、典型的な例では、４−６である。キトサンの官能性は、脱アセチル化度および分子量および分子量の分配により影響される。好適には、アセチル化度は４０−１００％、好ましくは５０−１００％に及ぶ。いくつかの態様では、アセチル化度は、好ましくは８０−９９％、より好ましくは８０−９５％である。好適な分子量は、１０−１０００ｋＤａの範囲にある。
【００２０】
好適な変性されたキトサンは、例えばペプチド結合キトサンのようなキトサンに共有結合的に結合した部分を含む。変性されたキトサンは、変性されるキトサン中の部分およびそれらの濃度の選択により調整できて、キトサンの性質または官能性、例えば架橋結合の容量、溶解度、例えば特定の細胞、薬品またはペプチドを結合する能力の生分解の速度を付加、変性または変更できる。
酵素による分解は、生成物がその機能を果たし次に分解により身体から除かれる方法で発泡体をデザインすることを可能にする。好適なキトサンは、Ｐｒｏｔａｓａｎシリーズ（ＮｏｖａＭａｔｒｉｘ，ＦＭＣ  Ｃｏｒｐ．オスロー、ノルウエイ）を含むが、これらに限定されない。
【００２１】
本明細書で使用されるとき、「ペクチン」は、種々の植物の根、茎、葉および果実、特に柑橘類例えばライム、レモン、グレープフルーツおよびオレンジの果皮に見いだされる天然の多糖である。ペクチンは、Ｄ−ガラクチュロン酸から誘導されるポリマー性単位を含む。市販の製品は、高メトキシペクチンおよび低メトキシペクチン（そして例えばアミド化ペクチンのような誘導体）を含み、Ｄ−ガラクチュロン酸から誘導された単位の２０−６０％は、ペクチンの源に応じて、メチル基によりエステル化される。ペクテート（ペクチネート）は、Ｄ−ガラクチュロン酸から誘導される単位の２０％まで完全に脱エステル化されたペクチンである。
【００２２】
本明細書で使用されるとき、「カラギーナン」は、紅藻から抽出されるスルフェート化ガラクタンの群を意味する。カラギーナンは、交互の（１→３）α−Ｄおよび（１→４）β−Ｄ−グリコシド結合を結合したＤ−ガラクトピラノシル単位の線状の鎖である。カラギーナンは、部分的に、硫酸化の程度および位置により区別できる。殆どの糖の単位は、炭素Ｃ−２またはＣ−６でヒドロキシル基へエステル化される１つまたは２つのサルフェート基を有する。好適なカラギーナンは、カッパカラギーナン、イオタカラギーナンおよびカッパＩＩカラギーナンおよびこれらのブレンドを含む。ナトリウムカラギーナンは、室温で可溶である。カラギーナンは、周知の技術により低い含量のゲル形成性イオンを製造できる。カラギーナンのゲルは熱可逆性である。高いレベルのゲル形成性イオンは、ゲルが溶融できる温度を上昇させる。カッパカラギーナンは、強い剛いゲルを形成し、一方イオタカラギーナンは弾性がありコンプライアンスを有する。カッパおよびイオタのコポリマーであるカッパＩＩカラギーナンは、弱いゲルを形成する。特定のカラギーナン用のゲル形成性イオンは、当業者に周知であり、そしてカリウムおよびカルシウムを含む。ラムダカラギーナンは、水中でゲルを形成しないが、ブレンドで有用であり、例えば得られるゲルの機械的性質を変性する。好ましいカラギーナンはイオタカラギーナンである。イオタカラギーナンは、Ｄ−ガラクトース−４−スルフェート−３，６−アンヒドロ−Ｄ−ガラクトース−２−スルフェートの繰り返し単位を有し、約２５−３４％のスルフェートエステル含量をもつ。
【００２３】
本明細書で使用されるとき、「ヒアルロン酸」は、ヒアルロン酸（ＨＡ）、その塩および変性ヒアルロネートを意味する。ナトリウムヒアルロネートは、すべての高級動物の皮膚、関節、眼および殆どの器官および組織の細胞外マトリックスに見いだされる豊富なグリコサミノグリカンである。非動物誘導ＨＡは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓの発酵により得られる。非動物源からのヒアルロン酸が、本発明での使用に好ましい。ヒアルロン酸は、（β−１，４）結合Ｄ−グルキュロネート（Ｄ）および（β−１，３）−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（Ｎ）からなる線状のコポリマーである。ヒアルロネートのコイル状の構造は、その重量の約１０００倍の水を捉える。これらの特徴は、有利な物理化学的性質および際だった生物学的機能を分子に与え、そして薬剤の伝達、組織工学および粘性向上における生体適合性および生体相互作用性の材料用の構築ブロックとして使用するのに望ましい。
【００２４】
ヒアルロン酸またはヒアルロネートは、哺乳動物の器官の天然の成分であり、ヒアルロニダーゼにより酵素的に生分解される。内皮組織中のヒアルロネートの半減期は、１日以内であり、そして成人中のポリマーの天然のターンオーバーは、１日あたり約７ｇである。ヒアルロナンの穏やかから中程度の共有結合変性は、数日から数ヶ月または１年に及ぶ生体内の安定性および保持時間を増加する。
【００２５】
好適な変性されたヒアルロネートは、ヒアルロネートへ共有結合で結合した部分を含むものを含み、例えばペプチド結合ヒアルロネートを含む。好ましい変性されたヒアルロネートは、好適には、それぞれＤモノマー単位およびＮモノマー単位に共有結合で変性されたカルボキシル基および／またはヒドロキシル基を有する。変性されたヒアルロネートは、変性されたヒアルロネート中の部分およびそれらの濃度を選択して、ヒアルロネートの性質または機能性、例えば架橋結合の容量、溶解度、そして例えば特定の細胞、薬品またはペプチドを結合する能力の生分解の速度を加え、変性しまたは変更することによって調整できる。
【００２６】
ヒアルロン酸は、結合組織の治癒および瘢痕のない新生児創傷の治癒の初期の段階に重要な役割をはたすものと思われ、そして細胞の可動性、接着および増殖を制御するものと思われ、そして組織工学および組織再生への応用に特に有用である。
本明細書で使用されるとき、用語「相互作用」は、例えばゲルおよび発泡体の物理的な包合により孔中に維持されることによって、ゲルが発泡体と物理的に接触していることを意味する。これとは別に、相互作用は、例えば「橋」を形成するゲル形成イオンにより発泡体と多糖との間の結合によって、化学的であってもよい。
【００２７】
本明細書で使用されるとき、用語「配置される」は、ゲルが発泡体の孔中に実質的に配置される、例えば５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上または９９．９％以上の該ゲルが発泡体の孔中に配置されることを意味する。
本明細書で使用されるとき、用語「発泡体の少なくとも一部を通って分配された」は、ゲル形成イオンが、ゲル中の多糖の少なくとも一部とゲルを形成するのに十分な量で発泡体の一部に存在することを意味する。好ましくは、ゲル形成イオンは、実質的にそして一様に分配されている。好ましくは、ゲル形成イオンは、表面の孔のみよりもむしろ発泡体の内部の孔の少なくともいくつかに存在する。ゲル形成イオンは、好ましくは、発泡体中に実質的に平均して分配されている。
【００２８】
本明細書で使用されるとき、用語「ゲル化部位」は、ゲルの形成を助けるために、イオン性結合を経てゲル形成イオンと相互作用できるゲル、コーティングまたは第１の液体成分の多糖上の官能基を意味する。例えば、アルギネートは、ゲル形成イオン例えばカルシウムイオンと相互作用できるカルボキシレート基であるゲル化部位を有する。
本明細書で使用されるとき、用語「変性アルギネート」は、有機部分またはペプチドへ共有結合で結合したアルギネートを含む。例えば、アルギネートは、有機部分例えばエチレンオキシドまたはプロピレンオキシドのようなアルキレンオキシドと反応してグリコールアルギネートを形成する。グリコールは、カルボキシル基を経てアルギネートへ結合する。典型的な例では、アルギネートは、プロピレンオキシドと反応してプロピレングリコールアルギネート（ＰＧＡ）を形成する。プロピレングリコールアルギネートの製造は、Ｓｔｒｏｎｇ，ＵＳ３９４８８８１、Ｐｅｔｔｉｔｔ、ＵＳ３７７２２６６およびＳｔｅｉｎｅｒ、ＵＳ２４２６１２５に開示されている。好ましくは、プロピレングリコールアルギネートは、約４０−約９５％、より好ましくは約７０−約９５％のエステル化度を有する。異なる分子量のプロピレングリコールアルギネートの混合物は、また使用できる。アルミニウムイオンが、グリコールアルギネートをゲル化するのに好適である。
【００２９】
本明細書で使用されるとき、用語「細胞接着配列変性多糖」は、１つ以上の細胞接着配列を含む少なくとも１つのペプチドへ共有結合で結合する多糖を意味する。例えば、ペプチド結合多糖は、当業者に周知の手段により製造される。例えば、変性アルギネートは、ＵＳ６６４２３６３（Ｍｏｏｎｅｙ）に開示されている。ペプチド結合多糖は、例えば固定化細胞で使用するのに好ましく、細胞の増殖および細胞の分化を促進する。ペプチド結合多糖は、好ましくは、非変性多糖と組み合わされて使用される。
【００３０】
本明細書に参考として引用される、ＵＳ４９８８６２１，４７９２５２５、５９６５９９７、４８７９２３７、４７８９７３４および６６４２３６３は、細胞の接着配列のペプチドの多数の例を開示している。好適なペプチドは、約１０以下のアミノ酸を有するペプチドを含むが、これらに限定されない。いくつかの態様では、細胞付着ペプチドは、ＲＧＤ、ＹＩＧＳＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、ＩＫＶＡＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、ＲＥＤＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、ＤＧＥＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、ＶＧＶＡＰＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、ＧＲＧＤＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、ＬＤＶ，ＲＧＤＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、ＰＤＳＧＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）、ＲＹＶＶＬＰＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、ＬＧＴＩＰＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、ＬＡＧ，ＲＧＤＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）、ＲＧＤＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）、ＨＨＬＧＧＡＬＱＡＧＤＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、ＶＴＣＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、ＳＤＧＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）、ＧＲＥＤＶＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、ＧＲＧＤＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、ＧＲＧＤＳＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）、ＶＡＰＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）、ＧＧＧＧＲＧＳＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）、およびＧＧＧＧＲＧＤＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）およびＦＴＬＣＦＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）を含む。いくつかの態様では、細胞付着ペプチドは、ＲＧＤ，ＹＩＧＳＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、ＩＫＶＡＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、ＲＥＤＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、ＤＧＥＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、ＶＧＶＡＰＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、ＧＲＧＤＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、ＬＤＶ，ＲＧＤＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、ＰＤＳＧＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）、ＲＹＶＶＬＰＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、ＬＧＴＩＰＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、ＬＡＧ，ＲＧＤＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）、ＲＧＤＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）、ＨＨＬＧＧＡＬＱＡＧＤＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、ＶＴＣＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、ＳＤＧＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）、ＧＲＥＤＶＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、ＧＲＥＤＶＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、ＧＲＧＤＳＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）、ＶＡＰＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）、ＧＧＧＧＲＧＤＳＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）およびＧＧＧＧＲＧＤＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）およびＦＴＬＣＦＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）を含み、さらに追加のアミノ酸例えば１−１０の追加のアミノ酸（ＮまたはＣ末端での１−１０Ｇ残基を含むがこれらに限定されない）を含む。例えば、好適なペプチドは、式（Ｘａａ）ｎ−ＳＥＱ−（Ｘａａ）ｎ（ただし、Ｘａａは独立してそれぞれ任意のアミノ酸であり、ｎは０−７であり、ＳＥＱ−は、ＲＧＤ、ＹＩＧＳＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、ＩＫＶＡＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、ＲＥＤＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、ＤＧＥＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、ＶＧＶＡＰＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、ＧＲＧＤＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、ＬＤＶ，ＲＧＤＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、ＰＤＳＧＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）、ＲＹ��ＶＬＰＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、ＬＧＴＩＰＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、ＬＡＧ，ＲＧＤＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）、ＲＧＤＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）、ＨＨＬＧＧＡＬＱＡＧＤＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、ＶＴＣＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、ＳＤＧＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）、ＧＲＥＤＶＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、ＧＲＧＤＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、ＧＲＧＤＳＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）、ＶＡＰＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）、ＧＧＧＧＲＧＳＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）、およびＧＧＧＧＲＧＤＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）およびＦＴＬＣＦＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）からなる群から選ばれるペプチド配列であり、アミノ酸の合計数は２２より少なく、好ましくは２０より少なく、好ましくは１８より少なく、好ましくは１６より少なく、好ましくは１４より少なく、好ましくは１２より少なく、好ましくは１０より少ない）を有することができる。いくつかの態様では、細胞付着ペプチドは、ＲＧＤ，ＹＩＧＳＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、ＩＫＶＡＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、ＲＥＤＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、ＤＧＥＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、ＶＧＶＡＰＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、ＧＲＧＤＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、ＬＤＶ，ＲＧＤＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、ＰＤＳＧＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）、ＲＹＶＶＬＰＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、ＬＧＴＩＰＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、ＬＡＧ，ＲＧＤＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）、ＲＧＤＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）、ＨＨＬＧＧＡＬＱＡＧＤＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、ＶＴＣＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、ＳＤＧＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）、ＧＲＥＤＶＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、ＧＲＥＤＶＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、ＧＲＧＤＳＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）、ＶＡＰＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）、ＧＧＧＧＲＧＤＳＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）およびＧＧＧＧＲＧＤＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）およびＦＴＬＣＦＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）からなる。細胞接着または他の細胞の相互作用のための生物学的に活性な分子は、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ｂ−ＦＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ、ＴＧＦ−βまたはプロテオグリカンを含むことができる。ＲＧＤを含む細胞付着ペプチドは、いくつかの態様で、長さが３，４，５，６，７，８，９または１０のアミノ酸である。その例は、ＲＧＤ、ＧＲＧＤＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、ＲＧＤＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、ＲＧＤＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）、ＲＧＤＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）、ＧＲＧＤＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、ＧＲＧＤＳＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）、ＧＧＧＧＲＧＤＳＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）およびＧＧＧＧＲＧＤＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）を含むが、これらに限定されない。ＲＧＤを含む好適な細胞接着ペプチドは、ＮＯＶＡＴＡＣＨＲＧＤ（ＮｏｖａＭａｔｒｉｘ、ＦＭＣ  ＢｉｏＰｏｌｙｍｅｒ，オスロー、ノルウエイ）およびＵＳ６６４２３６３（本明細書において参考として引用する）に開示されたものを含むが、これらに限定されない。ペプチド合成サービスは、多数の企業により利用でき、リッチモンド、バージニ��、米国のＣｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．を含む。アルギネート骨格へのペプチドの結合のための化学的技術は、ＵＳ６６４２３６３に見いだされる。
【００３１】
本明細書で使用されるとき、用語「細胞接着配列変性アルギネート」は、１つ以上の細胞接着配列を含む少なくとも１つのペプチドへ共有結合で結合したアルギネートを意味する。
本明細書で使用されるとき、用語「細胞接着配列変性キトサン」は、１つ以上の細胞接着配列を含む少なくとも１つのペプチドへ共有結合で結合したキトサンを意味する。
【００３２】
本明細書で使用されるとき、用語「細胞接着配列変性ヒアルロン酸」は、１つ以上の細胞接着配列を含む少なくとも１つのペプチドへ共有結合で結合したヒアルロン酸を意味する。
本明細書で使用されるとき、用語「ＲＧＤ変性多糖」は、１つ以上のＲＧＤ配列を含む少なくとも１つのペプチドへ共有結合で結合した多糖を意味する。
【００３３】
本明細書で使用されるとき、用語「ＲＧＤ変性アルギネート」は、ＲＧＤを含むペプチドへ共有結合で結合したアルギネートを意味する。好適なＲＧＤペプチド結合アルギネートは、ＮＯＶＡＴＡＣＨ  ＲＧＤ（ＮｏｖａＭａｔｒｉｘ、ＦＭＣ  ＢｉｏＰｏｌｙｍｅｒ、オスロー、ノルウエイ）およびＵＳ６６４２３６３（本明細書で参考として引用される）に開示されたものを含むが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、用語「ＲＧＤ変性キトサン」は、ＲＧＤを含むペプチドへ共有結合で結合したキトサンを意味する。
【００３４】
本明細書で使用されるとき、用語「ＲＧＤ変性ヒアルロネート」は、ＲＧＤを含むペプチドへ共有結合で結合したヒアルロネートを意味する。
本明細書で使用されるとき、用語「重量平均分子量」は、多角レーザー光散乱検出を有するサイズ排除クロマトグラフィーにより測定された分子量を意味する。
本明細書で使用されるとき、用語「複合物」は、各成分が同じまたは異なる材料である組成物を意味する。
【００３５】
本明細書で使用されるとき、第１の液体成分に関連する用語「低粘度溶液」は、約２％ｗ／ｖより低い多糖の濃度を意味する。
発泡体中のゲル形成イオンに関連して本明細書で使用されるとき、用語「ゲル形成イオン」は、多糖とゲルを形成できるイオン、またはゲルの多糖と可溶性の塩を形成しないイオンを意味する。これらのゲル形成イオンは好ましくは二価または三価のイオンである。
【００３６】
コーティングにおけるゲル形成イオンに関連して本明細書で使用されるとき、用語「ゲル形成イオン」は、アルギネート、変性アルギネートまたはこれらの組み合わせとゲルを形成できるイオン、またはアルギネート、変性アルギネートまたはこれらの組み合わせと可溶性の塩を形成しないイオンを意味する。これらのゲル形成イオンは、好ましくはカルシウム、ストロンチウムまたはバリウムのイオンである。
【００３７】
本明細書で使用されるとき、用語「完全にカバーする」は、適用範囲に肉眼で認められるギャップが存在しないように、または複合物の免疫原性に損失がないように、コーティングが表面をカバーすることを意味する。すなわち、発泡体内のゲルが、複合物を移植するとき個体の免疫系から分離される程度に、発泡体は完全に被覆される。いくつかの態様では、コーティングはヒドロゲルである。
【００３８】
明瞭さのために別々の態様に関連して記載された本発明の或る特徴は、また単一の態様の組み合わせで提供されることも理解される。逆に、簡便さのために単一の態様に関連して記載された本発明の種々の特徴は、また別々にまたは任意の好適な小さい組み合わせで提供できる。
【００３９】
１つの側面では、本発明は、ｉ）少なくとも一部の発泡体を通って分配されたゲル形成イオンを含む有孔の発泡体、ｉｉ）発泡体の孔内に配置されそして発泡体と相互反応するゲル化部位を有する多糖を含むゲル、さらにｉｉｉ）発泡体の外側の表面を完全にカバーし、ゲル化部位およびゲル形成イオンを有する多糖を含むコーティング、を含む複合物を提供する。
【００４０】
好ましくは、本明細書で記載される複合物中のゲルは、目的とする用途に良好な構造上の完全さを有し、例えばゲルは望まない限り発泡体から漏れない。複合物は、機能的な成分例えば薬品および細胞群を運ぶために使用でき、そして望ましい伝達の特性例えば放出されるべき材料の放出をもたらす。放出は、任意の好適な方法、例えば溶媒との接触により、温度の変化によりまたは機械的な技術により開始できる。複合物は、細胞を固定化するのに有利に使用される。ヒトまたは動物の身体の治療のための本発明による複合物の成分は、望ましくは、生体適合性および任意に生分解性である。
【００４１】
ゲルは、ゲル形成多糖を含む添加された液体と、発泡体のゲル化部位およびゲル化イオンとの間の相互作用の結果として発泡体の孔の内側に形成される。（ｉ）における発泡体の孔中のゲル化イオンは、（ｉｉ）のゲル形成多糖のゲル化を誘導するために存在する。ゲルは、孔の内部に形成され、そしてゲル／発泡体の組み合わせの成分はコーティングによりカバーされて、免疫学的攻撃に対して保護するバリヤーを形成する。
【００４２】
いくつかの態様では、複合物の弾性モジュラスは、０．１−１０００ｋＰａである。
いくつかの態様では、複合物は、各側面が約１ｃｍ２の面積を有する２つの側面を有する。いくつかの態様では、複合物は、各側面が約０．５−約２ｃｍ２の面積を有する２つの側面を有する。いくつかの態様では、複合物は、幅約０．５−約３．０ｍｍを有する。いくつかの態様では、複合物は、幅約０．５−約２．０ｍｍを有し、発泡体は幅約１ｍｍを有する。いくつかの態様では、発泡体は幅約０．５−約２ｍｍを有する。いくつかの態様では、発泡体は幅約０．５−約３ｍｍを有する。
【００４３】
いくつかの態様では、発泡体はポリマーを含む。いくつかの態様では、発泡体はバイオポリマーを含む。いくつかの態様では、発泡体は多糖を含む。いくつかの態様では、発泡体は、アルギネート、ペクチン、カラギーナン、ヒアルロネート、キトサン、細胞接着配列変性多糖、ＲＧＤ変性アルギネートおよびこれらの組み合わせからなる群から選ばれるポリマーを含む。
【００４４】
好適な発泡体は、好ましくは、多糖を含む添加された液体成分を孔中に吸収できる、５−１０００ミクロン、２５−１０００ミクロン、より好ましくは２５−５００ミクロンの範囲の孔サイズを有する開放孔網状構造を有するものを含む。いくつかの態様では、発泡体の平均孔サイズは、直径約５０−約２５０μｍである。本発明で使用するのに好適な発泡体は、少なくとも１つの表面で開放された孔を有し、そして望ましくは少なくとも一部の相互に連絡した孔を有して、発泡体内で吸収された多糖の移動を可能にする、および／または発泡体により吸収できる液体の成分の体積を有効に増大させる。
【００４５】
発泡体は、好適には、膨潤可能であり、そして好ましくはその重量の３０倍までの液体例えば生理学的水溶液または多糖の溶液を吸収でき、さらに好ましくはその重量の１−２０倍の液体を吸収できる。発泡体は、孔のサイズの均一または不均一な分配を有する。すべての孔が液体成分を吸収する必要はない。
いくつかの態様では、発泡体は、水、生理学的溶液、可溶の多糖の溶液および機能性成分を含む多糖の溶液の群から選ばれる液体を、その重量の１−３０倍吸収する。
【００４６】
いくつかの態様では、複合物または発泡体は滅菌される。いくつかの態様では、発泡体は滅菌される。いくつかの態様では、滅菌は、γ−照射、Ｅ−ビーム、エチレンオキシド、オートクレーブ処理または液体成分の添加前のアルコールと発泡体との接触、またはＮＯｘガスとの接触、水素ガスプラズマ滅菌を含む。滅菌は、それが複合物、または複合物に含まれる機能成分に悪影響を与える場合、用いてはならない。
【００４７】
発泡体は、好ましくは、乾いた吸収発泡体である。開放した孔の網状構造および孔をもちそして次に添加される多糖溶液をゲル化するためのゲル形成イオンを含む乾いた吸収発泡体は、以下の方法により形成でき、その方法は、（ａ）多糖および発泡剤および所望により１つ以上の可塑剤、架橋剤およびｐＨ変性剤を含む水性の分散物または溶液から含湿発泡体を形成し、（ｂ）水性分散物から発泡体を、所望により機械的な攪拌により、混合し、（ｃ）所望により、１つ以上の（ｉ）発泡体を成型または成形する工程および（ｉｉ）発泡体から架橋した発泡体を形成する工程を行い、（ｄ）発泡体を乾燥して開放した孔を含む乾いた発泡体を形成し、そして（ｅ）工程（ａ）−（ｄ）の１つ以上でまたは工程（ｄ）の後でゲル形成イオンを添加することを含む。
【００４８】
特に好ましい態様では、ゲル形成イオンは、工程（ａ）で添加されて、発泡体全体に該ゲル形成イオンの実質的に均質な分配をもたらす。
ｐＨを上げたりまたは下げたりする周知のｐＨ変性剤および可塑剤、例えばＷＯ２００５０２３３２３に記載されているものも使用できる。
発泡体は、風乾により乾燥でき、そして所望により成型、成形または圧縮にかけられる。
【００４９】
発泡体は、好ましくは単一の発泡体を用いて、または別途種々の密度または孔のサイズの発泡体を含みそして発泡体と非発泡体との域をもつ発泡体を含む不均一な構造から製造できる。
発泡体中のポリマーは、イオン結合または共有結合で架橋できるが、ゲルの多糖が発泡体中のポリマーと、または発泡体の成分例えばゲル形成イオンと架橋できるならば、架橋できる必要はない。
【００５０】
いくつかの態様では、該発泡体のポリマーは、バイオポリマーである。好ましい態様では、発泡体は、植物または動物から誘導されるバイオポリマーから形成される。このような発泡体は、ＵＳ５８８８９８７（Ｈａｙｅｓ）またはＷＯ２００５０２３３２３（Ｇａｓｅｒｒｏｄ）、ＵＳ６２０３８４５（Ｑｉｎ）またはＵＳ６６５６９７４（Ｒｅｎｎ）（これらのそれぞれは、その全体を本明細書において参考として引用される）に記載されているような従来技術のプロセスに従って製造できる。
【００５１】
いくつかの態様では、発泡体マトリックスに使用されるポリマーは、ゲル形成イオンによりゲル化される多糖を含む。好ましい態様では、発泡体は、例えばＷＯ２００５０２３３２３に記載されているような発泡剤を任意に含む架橋したバイオポリマーを含む。
発泡体は、好ましくは、多糖および／または変性多糖を含む。
【００５２】
いくつかの態様では、発泡体中のポリマーは、アルギネート、ペクチン、カラギーナン、ヒアルロネート、キトサンおよびこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。いくつかの態様では、ポリマーは、アルギネート、キトサンおよびヒアルロネートからなる群から選ばれる。いくつかの態様では、ポリマーはアルギネートまたは変性アルギネートを含む。いくつかの態様では、ポリマーはアルギネートを含む。
【００５３】
いくつかの態様では、ポリマーは、細胞接着配列変性多糖である。いくつかの態様では、ポリマーは、細胞接着配列変性アルギネート、細胞接着配列変性キトサン、細胞接着配列変性ヒアルロネートおよびこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。いくつかの態様では、ポリマーは細胞接着配列変性多糖を含む。いくつかの態様では、ポリマーは、細胞接着配列変性アルギネートを含む。いくつかの態様では、ポリマーは、細胞接着配列変性キトサンである。いくつかの態様では、ポリマーは、細胞接着配列変性ヒアルロネートである。
【００５４】
いくつかの態様では、ポリマーは、ＲＧＤ変性多糖である。いくつかの態様では、ポリマーは、ＲＧＤ変性多糖、ＲＧＤ変性アルギネート、ＲＧＤ変性キトサン、細胞接着配列変性ヒアルロネートおよびこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。いくつかの態様では、ポリマーは、ＲＧＤ変性多糖である。いくつかの態様では、ポリマーは、ＲＧＤ変性アルギネートを含む。いくつかの態様では、ポリマーはＲＧＤ変性キトサンである。いくつかの態様では、ポリマーはＲＧＤ変性ヒアルロネートである。
【００５５】
いくつかの態様では、ポリマーは、約４−約３００ｋＤａの平均分子量を有する。いくつかの態様では、ポリマーは、約１０−約５００ｋＤａの平均分子量を有する。いくつかの態様では、ポリマーは、約５０−約３００ｋＤａの平均分子量を有する。
【００５６】
いくつかの態様では、ポリマーは、約４−約３００ｋＤａの平均分子量を有するアルギネートを含む。いくつかの態様では、ポリマーは、約１０−約５００ｋＤａの平均分子量を有するアルギネートを含む。いくつかの態様では、ポリマーは、約５０−約３００ｋＤａの平均分子量を有するアルギネートを含む。
いくつかの態様では、ポリマーは２０％より多いグルロネート（Ｇ）含量を有するアルギネートを含む。
【００５７】
いくつかの態様では、発泡体はアルギネートを含み、複合物はさらに製薬活性成分および／または抗接着剤から選ばれる機能性成分を含む。
いくつかの態様では、発泡体は、構造支持体、特に浸透可能な構造支持体例えば発泡体と接触しているメッシュをさらに含む。好適なメッシュ材料は、ポリエステルメッシュを含むが、これに限定されない。発泡体は、単層または二層の発泡体の構造に、いくつかの方法で配合できる。いくつかの態様では、メッシュは、ゲルを形成する前に、単層の構造の発泡体の表面上に置くことができる。ゲルは、メッシュを正しい位置に保持することを助ける。コーティング層の添加中構造物が形成される。いくつかの態様では、含湿発泡体は、型に置かれたメッシュの頂部に置かれ、そしてメッシュを乾かす。いくつかの態様では、メッシュは、乾燥前に含湿発泡体の頂部に置かれる。いくつかの態様では、含湿発泡体の層は成型され、メッシュを含湿発泡体の頂部に加えられ、そして次に含湿発泡体の他の層によりカバーされる。二層構造が使用されるとき、２つの発泡体組成物は同じかまたは異なる。二層の構造の２つの発泡体組成物は、同じでもまたは異なっても、互いに同じ孔サイズまたは異なる孔サイズを有する。別の方法では、構造支持体は、例えば発泡体の上のコーティングへの接着により、または発泡体へ接着した他の材料への接着により、発泡体と間接的に接触できる。
【００５８】
いくつかの態様では、メッシュは、約１０μｍから約１ｍｍのメッシュの開口を有する。いくつかの態様では、メッシュは、約２０−約５００μｍのメッシュの開口を有する。いくつかの態様では、メッシュは、約３００μｍのメッシュの開口を有する。
【００５９】
メッシュの包接は、発泡体マトリックスの構造の完全さを増大させ、そして移植を容易にさせそして移植後取り出しを容易にする。
孔を有する発泡体は、当業者に周知の方法により製造でき、ファイバーの機械的攪拌、凍結乾燥、織り、編みまたは積層を含むが、これらに限定されない。好ましくは、発泡体は、例えば他の成分例えばグリセリンおよびソルビトールのような可塑剤とともに発泡体を製造するために、好適にはミキサー例えばポリマーの水溶液に通気するのにワイヤ泡立てを備えたキッチンエイドミキサーを用いて製造される。
【００６０】
発泡剤は、水性分散物に含まれて発泡を助けることができる。存在すると、発泡剤は、好適には発泡の崩壊に抵抗する含湿発泡体を生成する。発泡剤は、発泡を助ける単一の材料または材料の混合物である。発泡剤は、ポリマー性発泡剤、界面活性剤またはこれらの混合物である。
【００６１】
ポリマー性発泡剤例えば界面活性ヒドロコロイドが、それらが界面活性剤よりも得られるゲル化した発泡体から溶脱されるのが困難であるので、ほとんどの生物学的な応用にとり一般に好ましい。界面活性ヒドロコロイドの例は、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、アルブミンおよびグリコールアルギネート例えばプロピレングリコールアルギネートを含む。いくつかの応用では、発泡剤に加えて、追加の多糖例えばセルロース誘導体例えばカルボキシメチルセルロースを添加するのが有利である。ポリマー性発泡剤は、好ましくは、均一なゲル化された発泡体が生成されるように、水に可溶である。好ましい水溶性の発泡剤は、それらが発泡体中に細かい孔を生ずる小さい泡を生成するので、アルブミンおよびヒドロキシプロピルメチルセルロースを含む。
【００６２】
高いレベルのカルシウムを含む乾いた架橋した発泡体は、水中に浸漬されたとき、発泡体構造は、典型的な例では、発泡体の高いレベルの架橋のために、崩壊しない。しかし、水溶性の発泡剤例えばヒドロキシプロピルメチルセルロースを含む発泡体中の可溶性の成分は、発泡体の外へ拡散する。発泡剤のこの損失は、例えば創傷の治癒の利用において、使用の条件下で可溶ではない発泡剤の使用により防ぐことができる。いくつかの発泡剤は、身体の温度でゲルを形成し、例えばメチルセルロースは３５℃より高い温度でゲルを形成する。発泡体が身体の温度での利用において発泡剤としてメチルセルロースを含む発泡体を使用するとき、そのメチルセルロースはゲルの状態にとどまり、発泡体中に維持されそして発泡体の含湿の強さに寄与する。
【００６３】
ポリマー性発泡剤例えばヒドロキシプロピルメチルセルロースが使用されるとき、水性分散物中のポリマー性発泡剤の濃度は、典型的な例では、約０．５−約６重量％、好ましくは約１−約４重量％、またはより好ましくは約１．５−約２重量％である。これは、水および任意の添加物または発泡体中に存在する添加物を除いて、ポリマー性発泡剤の約３−約３７重量％、好ましくは約６−約２５重量％、より好ましくは約６−約１２．５重量％を含む発泡体を生成する。
【００６４】
或る応用では、界面活性剤は、添加したポリマー発泡剤があってもまたはなくても、発泡剤として使用できる。界面活性剤は、当業者に周知であり、そして例えばＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ′ｓ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  ＥｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓおよびＬａｕｇｈｌｉｎ、ＵＳ３９２９６７８（これらのそれぞれは本明細書で参考としてその全部を引用する）に記載されている。非イオン性界面活性剤は、典型的な例では、疎水性有機脂肪族またはアルキル芳香族化合物と親水性エチレンオキシドおよび／またはプロピレンオキシドとの縮合生成物である。得られるポリエーテル鎖の長さは調節されて、疎水性と親水性との間の望ましいバランスを達成できる。非イオン性界面活性剤は、例えば直鎖または分枝鎖のアルキル基中に約８−１８炭素原子を含むアルキルフェノール例えばｔ−オクチルフェノールおよびｔ−ノニルフェノールと約５−３０モルのエチレンオキシドとのエトキシレート、例えば約９．５モルのエチレンオキシドと縮合されたノニルフェノール、約１２モルのエチレンオキシドと縮合されたジノニルフェノール、アルコール１モルあたり２−１００モルのエチレンオキシドおよび／またはプロピレンオキシドによるエトキシル化およびプロポキシル化アルコール、特にＣ１０−２０アルコール、特に約５−３０モルのエチレンオキシドによる直鎖または分枝鎖中に約８−１８炭素原子を含む第１級アルコールのエトキシレート、例えばデシルアルコール、セチルアルコール、ラウリルアルコールまたはミリスチリルアルコールのエトキシレート、５−３０モルのエチレンオキシドによる直鎖または分枝鎖の構造に８−１８炭素原子を含む第２級脂肪族アルコールのエトキシレート、約８−約２０炭素原子を含む脂肪族アルコールとエチレンオキシドおよびプロピレンオキシドとの縮合物、ポリエチレングリコールおよびポリエチレンオキシド、エトキシル化ひまし油（ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（商標）ＣＯ  ４０）、エトキシル化水素化ひまし油、エトキシル化ココナッツ油、エトキシル化ラノリン、エトキシル化トール油、エトキシル化タローアルコール、およびソルビタンエステルのエトキシレート例えばポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ＴＷＥＥＮ（商標）２０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート（ＴＷＥＥＮ（商標）４０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ＴＷＥＥＮ（商標）６０）、ポリエチレンソルビタンモノオレエート（ＴＷＥＥＮ（商標）８０）、およびポリオキシエチレンソルビタントリオレエート（ＴＷＥＥＮ（商標）８５）を含む。物理的な応用例えば創傷ドレッシングでは、界面活性剤が乾いたゲル化された発泡体中に含まれるとき、非イオン性界面活性剤例えばソルビタンエステルのエトキシレートが好ましい。アニオン性界面活性剤の例は、ソルビタンステアレート、ナトリウムセチルスルフェート、ナトリウムラウリルスルフェート、アンモニウムラウリルスルフェート，トリエタノールアミンラウリルスルフェート、ナトリウムミリスチルスルフェートおよびナトリウムステアリルスルフェート、トリエタノールアミンドデシルベンゼンスルホネート、ナトリウムドデシルベンゼンスルホネート、ナトリウムポリオキシエチレ���ラウリルエーテルスルフェート、およびアンモニウムポリオキシエチレンラウリルエーテルスルフェートである。好ましいアニオン性界面活性剤は、ナトリウムラウリルスルフェート（ナトリウムドデシルスルフェート）である。カチオン性界面活性剤は、例えば、第四級アンモニウム塩、例えばセチルトリメチルアンモニウムブロミド、ラウリルトリメチルアンモニウムクロリド、アルキルベンジルメチルアンモニウムクロリド、アルキルベンジルジメチルアンモニウムブロミド、セチルピリジニウムブロミドおよび第四級化ポリオキシエチルアルキルアミンのハライド塩を含む。両性イオン性界面活性剤も使用できる。
【００６５】
界面活性剤がポリマー性発泡剤とともに使用されるとき、有用な界面活性剤は、ソルビタンエステル例えばＴＷＥＥＮ（商標）２０界面活性剤である。界面活性剤例えばＴＷＥＥＮ（商標）２０界面活性剤がポリマー性発泡剤とともに使用されるとき、乾いたゲル化した発泡体は、約０．０５−１．０重量％、典型的な例では０．１−０．５重量％の界面活性剤を含む。しかし、或る応用例えば口腔ケアの利用（界面活性剤例えばナトリウムラウリルスルフェートがポリマー性発泡剤なしに使用される）では、乾いたゲル化した発泡体は、発泡体中に存在できる水および任意の添加物または添加物例えばシリカまたは他の研磨剤またはつや出し剤を除いて、約０．５−５．０重量％、典型的な例では１．５−３．０重量％の界面活性剤を含むことができる。
【００６６】
ゲルを形成するのに使用される好適な多糖は、溶媒に可溶なもの例えば水を含み、そしてゲル形成イオンとの相互作用によりゲル中に形成できる。好適な多糖は、多糖単独または他の多糖との混合物がゲルを形成する限り、アルギネート、ペクチン、カラギーナン、キトサン、ヒアルロネートおよびこれらの混合物を含む。アルギネートおよび変性アルギネートは、本発明で使用するのに好ましい多糖である。変性多糖は、多糖誘導体として知られているが、それらがゲル形成イオンと反応性を有する限り、本発明の用途に使用できる。
【００６７】
いくつかの態様では、該ゲル中の多糖は、アルギネート、キトサン、カラギーナン、ヒアルロネート、ペクチンおよびこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。いくつかの態様では、該ゲル中の多糖は、アルギネート、キトサンおよびヒアルロネートからなる群から選ばれる。
【００６８】
いくつかの態様では、該ゲル中の多糖は、細胞接着配列変性多糖である。いくつかの態様では、該ゲル中の多糖は、細胞接着配列変性アルギネート、細胞接着配列変性キトサン、細胞接着配列変性ヒアルロネートおよびこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。いくつかの態様では、該ゲル中の多糖は、細胞接着配列変性多糖である。いくつかの態様では、該ゲル中の多糖は、細胞接着配列変性アルギネートを含む。いくつかの態様では、該ゲル中の多糖は、細胞接着配列変性キトサンを含む。いくつかの態様では、該ゲル中の多糖は、細胞接着配列変性ヒアルロネートを含む。
【００６９】
いくつかの態様では、該ゲル中の多糖は、ＲＧＤ変性多糖である。いくつかの態様では、該ゲル中の多糖は、ＲＧＤ変性アルギネート、ＲＧＤ変性キトサン、細胞接着配列変性ヒアルロネートおよびこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。いくつかの態様では、該ゲル中の多糖は、ＲＧＤ変性多糖を含む。いくつかの態様では、該ゲル中の多糖は、ＲＧＤ変性アルギネートを含む。いくつかの態様では、該ゲル中の多糖は、ＲＧＤ変性キトサンを含む。いくつかの態様では、該ゲル中の多糖は、ＲＧＤ変性ヒアルロネートを含む。
【００７０】
いくつかの態様では、発泡体および／または該ゲルまたは該コーティング中の多糖は、低含量のエンドトキシンを有する超純粋多糖を含む。いくつかの態様では、発泡体および／または該ゲルまたは該コーティング中の多糖は、１００ＥＵ／ｇより低いエンドトキシン含量を有するアルギネートを含む。
いくつかの態様では、該ゲル中の多糖はアルギネートを含む。
【００７１】
いくつかの態様では、該ゲル中の多糖は、約２０−約８０％のＧ含量を有するアルギネートを含む。いくつかの態様では、該ゲル中の多糖は、少なくとも２０％のＭ含量を有するアルギネートを含む。
いくつかの態様では、該ゲル中の多糖は、約４−約１０００ｋＤ、約４−約５００ｋＤまたは約４−約３００ｋＤの平均分子量を有するアルギネートを含む。
【００７２】
いくつかの態様では、該ゲル中の多糖は、約１０−約２００ｍＰａｓの粘度を有するアルギネートを含む。いくつかの態様では、該ゲル中の多糖は、約２−約５００ｍＰａｓの粘度を有するアルギネートを含む。
いくつかの態様では、該ゲル中の多糖は、アルギネート、カラギーナン、ヒアルロネート、ペクチンおよびこれらの組み合わせから選ばれ、そして該発泡体中のゲル形成イオンは、カルシウムイオン、バリウムイオン、ストロンチウムイオンまたはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【００７３】
いくつかの態様では、該ゲル中の多糖はキトサンを含み、そして該発泡体中のゲル形成イオンはトリホスフェートイオン、ホスフェートイオン、シトレートイオンまたはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
複合物のコーティングは、発泡体の表面上の任意のゲルを含む発泡体の外側の表面がコーティングにより完全にカバーされるように存在する。どんな特定の理論により束縛されることを望むものではないが、コーティングが免疫防御でありそして線維化の可能性を減らすものと考えられる。
いくつかの態様では、コーティングの多糖は、キトサン、ヒアルロネートまたはアルギネートを含む。
【００７４】
いくつかの態様では、該コーティング中の多糖は、細胞接着配列変性多糖である。いくつかの態様では、該コーティング中の多糖は、細胞接着配列変性アルギネート、細胞接着配列変性キトサン、細胞接着配列変性ヒアルロネートおよびこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。いくつかの態様では、該コーティング中の多糖は、細胞接着配列変性多糖を含む。いくつかの態様では、該コーティング中の多糖は、細胞接着配列変性アルギネートを含む。いくつかの態様では、該コーティング中の多糖は、細胞接着配列変性キトサンを含む。いくつかの態様では、該コーティング中の多糖は、細胞接着配列変性ヒアルロネートを含む。
【００７５】
いくつかの態様では、該コーティング中の多糖は、ＲＧＤ変性多糖である。いくつかの態様では、該コーティング中の多糖は、ＲＧＤ変性アルギネート、ＲＧＤ変性キトサン、細胞接着配列変性ヒアルロネートおよびこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。いくつかの態様では、該コーティング中の多糖は、ＲＧＤ変性多糖を含む。いくつかの態様では、該コーティング中の多糖は、ＲＧＤ変性アルギネートを含む。いくつかの態様では、該コーティング中の多糖は、ＲＧＤ変性キトサンを含む。いくつかの態様では、該コーティング中の多糖は、ＲＧＤ変性ヒアルロネートを含む。
【００７６】
いくつかの態様では、コーティングは、約４−約３００ｋＤの平均分子量を有するアルギネートを含む。いくつかの態様では、コーティングは、約５０−約３００ｋＤの平均分子量を有するアルギネートを含む。いくつかの態様では、コーティングは、約１５０−約２５０ｋＤの平均分子量を有するアルギネートを含む。いくつかの態様では、コーティングは、約７５−約１５０ｋＤの平均分子量を有するアルギネートを含む。いくつかの態様では、ポリマーは、約５０−約３００ｋＤ、約１５０−約２５０ｋＤまたは約７５−約１５０ｋＤの重量平均分子量を有する。
【００７７】
いくつかの態様では、コーティングは、１または約１以上のマンヌロネート対グルロネートの比を有するアルギネートを含む。
いくつかの態様では、コーティングは，ｍａｃｒｏｃｙｓｔｉｔｉｓ  ｐｕｒｉｆｅｒａから誘導されたアルギネートを含む。
いくつかの態様では、コーティングは、ＰＲＯＮＯＶＡ  ＳＬＭ１００またはＳＬＭ２０（ＮｏｖａＭａｔｒｉｘ、ＦＭＣ  Ｃｏｒｐ．オスロー、ノルウエイ）からなる群から選ばれたアルギネートを含む。
【００７８】
いくつかの態様では、コーティングは変性アルギネートであって、該変性アルギネートは、１つ以上のＲＧＤ配列を含む少なくとも１つの細胞付着ペプチドを共有結合によりそれに結合している少なくとも１つのアルギネート鎖部分を含む。
望まれるゲル形成イオンまたはゲル形成イオンの混合物をもたらす塩または塩の組み合わせは、ゲル形成イオンとして使用できる。ゲルまたはコーティングを形成するための好適なゲル形成イオンは、１価および多価のイオン、好ましくは２価および／または３価のイオン、または多糖とゲルを形成できるかまたは多糖と可溶性の塩を形成しないイオンの混合物を含む。特定の多糖に対するゲル形成イオンは、文献から明らかである。アルギネートでは、好適な多価カチオンは、例えばカルシウム（２＋）、バリウム（２＋）、ストロンチウム（２＋）、鉄（２＋）、亜鉛（２＋）、銅（２＋）およびアルミニウム（３＋）を含む。好ましいカチオンは、２価の金属カチオンであり、より好ましくはカルシウム（２＋）カチオンである。１価のカチオン例えばカリウムは、カリウムアルギネートが可溶なアルギネート塩であることから、アルギネート用のゲル化イオンであると考えられないと思われるが、しかし、カリウムカチオンはカッパカラギーナンまたはカッパＩＩカラギーナンにとり好適なゲル化イオンであろう。例えばキトサンのように多糖の塩が正の電荷をもつとき、負に帯電したゲル形成イオン例えばホスフェートまたはシトレートが使用できる。いくつかの態様では、ゲル形成イオンは、ゲル中の多糖がキトサンである場合、ホスフェートまたはシトレートのイオンを含む。
【００７９】
いくつかの態様では、該コーティング中の多糖は、アルギネート、ヒアルロネートおよびこれらの組み合わせから選ばれ、そして該発泡体中のゲル形成イオンは、カルシウムイオン、バリウムイオン、ストロンチウムイオンおよびこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。いくつかの態様では、該コーティング中の多糖は、アルギネート、ヒアルロネートおよびこれらの組み合わせから選ばれ、そして該コーティング中のゲル形成イオンは、独立してそれぞれ、ストロンチウムイオン、バリウムイオン、カルシウムイオンおよびこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。いくつかの態様では、該コーティング中の多糖は、アルギネート、ヒアルロネートおよびこれらの組み合わせから選ばれ、そして該コーティング中のゲル形成イオンは、独立してそれぞれ、ストロンチウムイオン、カルシウムイオンおよびこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【００８０】
いくつかの態様では、該コーティング中の多糖はアルギネートであり、該発泡体中のゲル形成イオンは、カルシウムイオン、バリウムイオン、ストロンチウムイオンまたはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。いくつかの態様では、該コーティング中の多糖はアルギネートであり、そして該コーティング中のゲル形成イオンは、独立してそれぞれ、ストロンチウムイオン、バリウムイオン、カルシウムイオンおよびこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。いくつかの態様では、該コーティング中の多糖は、アルギネート、ヒアルロネートおよびこれらの組み合わせから選ばれ、そして該コーティング中のゲル形成イオンは、独立してそれぞれ、ストロンチウムイオン、カルシウムイオンおよびこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【００８１】
いくつかの態様では、該コーティング中の多糖はキトサンを含み、該発泡体中のゲル形成イオンは、トリホスフェートイオン、ホスフェートイオン、シトレートイオンまたはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
いくつかの態様では、コーティングは、ゲル化部位を有する多糖を約０．２−約１０％ｗ／ｖ、約０．５−約１０％ｗ／ｖ、１−約８％ｗ／ｖ、約２−約７％ｗ／ｖ、約３−約６％ｗ／ｖまたは約２−約６％ｗ／ｖを含む。いくつかの態様では、該第２の液体成分の多糖は、ゲル化部位を有する多糖を約３％ｗ／ｖ含む。いくつかの態様では、コーティングは、ゲル化部位を有する多糖を約５％ｗ／ｖ含む。いくつかの態様では、コーティングは、ＰＲＯＮＯＶＡ  ＳＬＭ２０（ＮｏｖａＭａｔｒｉｘ、ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ、ノルウエイ）を約５％ｗ／ｖ含む。いくつかの態様では、コーティングは、ＰＲＯＮＯＶＡ  ＳＬＭ１００（ＮｏｖａＭａｔｒｉｘ、ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ、ノルウエイ）を約５％ｗ／ｖ含む。
【００８２】
いくつかの態様では、コーティングは、アルギネート、細胞配列変性アルギネートまたはこれらの組み合わせを約０．２−約１０％ｗ／ｖ、約０．５−約１０％ｗ／ｖ、１−約８％ｗ／ｖ、約２−約７％ｗ／ｖ、約３−約６％ｗ／ｖまたは約２−約６％ｗ／ｖを含む。いくつかの態様では、該第２の液体成分の多糖は、アルギネート、細胞配列変性アルギネートまたはこれらの組み合わせを約３％ｗ／ｖを含む。いくつかの態様では、コーティングは、アルギネート、細胞配列変性アルギネートまたはこれらの組み合わせを約５％ｗ／ｖ含む。いくつかの態様では、コーティングは、ＰＲＯＮＯＶＡ  ＳＬＭ２０（ＮｏｖａＭａｔｒｉｘ、ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ、ノルウエイ）を約５％ｗ／ｖ含む。いくつかの態様では、コーティングは、ＰＲＯＮＯＶＡ  ＳＬＭ１００（ＮｏｖａＭａｔｒｉｘ、ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ、ノルウエイ）を約５％ｗ／ｖ含む。
【００８３】
ゲル形成イオンは、発泡体のポリマーおよび／または多糖とゲルを形成できる。ゲル形成イオンは、発泡体と可溶性の多糖との間に結合を形成できる。好ましくは、発泡体中の「ゲル形成イオン」は、多糖に作用し、そして多糖のゲル化部位の少なくともいつかが液体成分の発泡体との接触により占められるようなレベルで発泡体中に存在する。好適には、ゲル形成イオンは、添加されるべき多糖中のゲル化部位の少なくともいくつかを占めるのに十分なゲル形成イオンが存在するならば、ゲル形成イオンを結合するために発泡体中の部位に関して化学量論レベルより下のレベル、化学量論レベルまたは化学量論レベルより上のレベルで発泡体中に存在できる。
【００８４】
１つの態様では、ゲル形成イオンは、発泡体のポリマーとゲルを形成できない。
他の側面では、発泡体は、可溶性の多糖中のゲル化部位に関連してゲル形成イオンを過剰に含む。ゲル形成イオンの少なくともいくつかは、可溶性多糖の添加前に発泡体中に配合でき、多糖は次に発泡体構造内のゲル形成イオンとの相互作用によりゲルになる。いくつかの態様では、発泡体は可溶性の多糖中のゲル化部位に関して過剰のゲル形成イオンを含まない。
【００８５】
発泡体またはコーティング中のゲル形成イオンの濃度は、得られるゲルまたはコーティングが、ゲル形成イオンと完全に反応しないゲル化部位をもつ多糖またはアルギネートを含む、すなわちゲル形成イオンまたはゲル形成イオンの混合物は、多糖のゲル化部位の１００％を飽和するのに必要であるのより少ないモルの量で存在する。例えば、すべての利用可能なゲル化部位（例えば、アルギネートの場合Ｌ−グルロン酸単位、ペクチン基質の場合Ｄ−ガラクチュロン酸単位）と反応するのに十分なゲル形成イオン例えばカルシウムイオンが存在するとき、ゲル形成多糖またはアルギネートは１００％飽和される。例えばアルギネートのゲル化部位を完全に飽和するのに必要なカチオンの量は、２価のカチオンのみまたは３価のカチオンのみがゲル化に使用されるとき、アルギネートのＬ−グルロン酸２モルあたり１モルの２価のカチオン、またはアルギネートのＬ−グルロン酸３モルあたり１モルの３価のカチオンであると考えられる。２価の単数または複数のカチオンおよび３価の単数または複数のカチオンの混合物が使用されるとき、アルギネートを飽和するのに必要な量は、２価のカチオンが２つのゲル化部位を占めそして３価のカチオンが３つのゲル化部位を占めることから、アルギネートを飽和するのに必要な量を求めることができる。従って、これより少ない任意の量が、アルギネートのゲル化部位を完全に飽和するのに必要なそれより少ない量であると考えられる。好適には、発泡体中に存在するゲル形成イオンは、多糖のゲル化部位の約５−２５０％、より好適には５−２００％、好ましくは約３５−１５０％、さらに好ましくは約５０−１００％飽和するのに十分なものである。
【００８６】
発泡体それ自体は、多糖を用いて製造でき、そしてまたゲル形成イオンを必要とする。発泡体および多糖の両者が同じゲル形成イオンに依存する場合、発泡体のみは、例えば製造されたとき１５０％の最初の飽和度を有するが、追加の多糖が液体として添加されそして発泡体の孔中に吸収されるとき、若干量のゲル形成イオンが使用されて添加の多糖をゲル化する。この場合、添加された多糖の飽和度は、発泡体中の多糖および孔中のゲルを形成する添加された多糖の両者について、ゲル形成イオンの全量およびゲル化部位の全量に基づいて計算される。
【００８７】
いくつかの態様では、該発泡体中のゲル形成イオンは、該ゲルの該多糖の該ゲル化部位の少なくとも１０％に等しいモル量で存在する。いくつかの態様では、該発泡体中のゲル形成イオンは、該ゲルの該多糖の該ゲル化部位の５−２５０％に等しいモル量で存在する。いくつかの態様では、該発泡体中のゲル形成イオンは、カルシウムイオンを含み、そして該ゲルの該多糖の該ゲル化部位の５−２００％に等しいモル量で存在する。いくつかの態様では、該発泡体中のゲル形成イオンはストロンチウムイオンを含み、該ゲルの該多糖の該ゲル化部位の少なくとも５−２００％に等しいモル量で存在する。いくつかの態様では、該発泡体中のゲル形成イオンはバリウムイオンを含み、該ゲルの該多糖の該ゲル化部位の少なくとも５−２００％に等しいモル量で存在する。
【００８８】
アルギネートでは、アルギネートと多価カチオンとの反応により形成されるゲルの強さは、アルギネートの分子量、アルギネートのグルロン酸含量（「Ｇ含量」）およびポリマー鎖のグルロン酸およびマンニュロン酸の配列に関連がある。さらに、孔のサイズおよび発泡体の厚さ、アルギネートの濃度、ゲル形成イオンのレベルおよび使用されるイオンのタイプも強さに寄与する。ゲルに関するアルギネートのＧ含量は、好適には、少なくとも約３０％、好ましくは約４０−約９０％そしてより好ましくは約５０−約８０％である。例えばＬｅｓｓｏｎｉａ  ｔｒａｂｅｃｕｌａｔａからおよびＬａｍｉｎａｒｉａ  ｈｙｐｅｒｂｏｒｅａの茎から誘導されるアルギネートは、高いＧ含量を有し、そして好ましくは本発明のゲル化した発泡体を形成するのに使用される。高いＧ含量をもつ完全に飽和されたアルギネートは、最高の機械的強さを有するゲルを生ずる。
【００８９】
これらのＧ−ブロックと化学量論的に反応するのに必要な２価のカチオン例えばカルシウムの量は、２つのグルロン酸単位プラス１つの２価のカチオンが１つのイオン性架橋を生ずるのに必要であると考えることによって、各アルギネートタイプについて計算できる。１％のナトリウムアルギネート溶液の化学量論的な飽和に必要なカルシウムの量は、以下の表に示される。
【００９０】
【表１】
2010529998.tif 000002
【００９１】
種々の市販のアルギネート、それらの性質およびそれらの源のリストは、Ｓｈａｐｉｒｏ，ＵＳ６３３４９６８、表１、１６欄、４９行から１７欄、１８行に見いだされ、それは本明細書においてその全部を参考として引用される。アルギネートの混合物またはブレンド、例えば異なる分子量および／またはＧ含量のアルギネートは、ゲル形成ポリマーとして使用できる。
【００９２】
ゲル化部位の完全な飽和（１００％飽和）は、組成物がＬ−グルロン酸単位２モルあたり１モルの２価のカチオンを含むとき、生ずる。例えば、カルシウムイオンの約１５ｍＭ溶液が、Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｈｙｐｅｒｂｏｒｅａの茎から抽出されたナトリウムアルギネートの１％溶液を１００％飽和するのに必要とされ、約１２ｍＭのカルシウム溶液が、Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｈｙｐｅｒｂｏｒｅａの葉（葉状体）から抽出されるナトリウムアルギネートの１％溶液を１００％飽和するのに必要とされ、そして約１４ｍＭのカルシウムイオン溶液が、Ｌｅｓｓｏｎｉａ  ｔｒａｂｅｃｕｌａｔａから抽出されたナトリウムアルギネートの１％溶液を１００％飽和するのに必要とされる。従って、アルギネートがゲル形成またはコーティング形成のポリマーとして使用されるとき、ゲル形成組成物は、好ましくは、アルギネート中に存在するＬ−グルロン酸単位２ｍＭあたり０．２−０．９ｍＭの２価のカチオン、好ましくは２０−９０％のカルシウム（２＋）イオンを含む。ゲル形成イオンとして僅かに溶ける塩を使用するとき、架橋度は、ゲル形成中に存在する、ゲル化剤例えば炭酸カルシウムの量および／または溶解剤例えばｐＨ変性剤例えばグルコノデルタラクトンの量の何れかをコントロールすることによりコントロールできる。好ましくは、実質的にすべてのゲル形成イオンが利用できるように、ｐＨ変性剤とゲル化剤との間に化学量論的関係が存在すべきである。
【００９３】
それぞれゲルおよびコーティングの多糖またはアルギネートのすべてのゲル化部位がゲル形成イオンにより飽和されていない場合、残った部位は非架橋イオンにより占められる。もし所望ならば、活性イオン例えばＡｇ（１＋）カチオンが、残りの部位のいくつかまたはすべてを占めるのに使用される。Ｓｃｈｅｒｒ、ＵＳ２００３００２１８３２Ａ１は、銀アルギネートが、火傷、創傷、潰瘍病変および関連する病理学的状態の治療に使用できることを開示している。
【００９４】
多糖を含むゲルまたは第１の液体成分は、さらに好適に多糖ゲルに配置例えば捕捉された機能性成分を含む。任意の機能性成分は、第１の液体成分が発泡体中に吸収されることをそれが妨げないかまたは多糖がゲルを形成することをそれが妨げない限り、添加できる。機能性成分は、液体または固体であるか、またはもし不溶ならば、液体中の細かい粒子として分散される。ゲル中に配置される望ましい成分は、有利な剤例えばフレーバー、香料、薬品および動物薬、酵素、成長変性剤およびプロバイオティック、生細胞（植物細胞、動物細胞およびヒト細胞を含む）、酵母、細菌などを含む。薬品、微粒子、細胞、多細胞凝集物、組織などの配合は、多糖好ましくはアルギネートの溶液中の緩やかな混合を要する。成分は、もし所望ならば後でゲルから放出できる感熱性材料例えば細胞、医薬、フレーバーまたは香料を含むことができる。
【００９５】
いくつかの態様では、ゲルは、さらに機能性成分を含む。いくつかの態様では、機能性成分は、フレーバー、香料、微粒子、細胞、多細胞凝集物、治療剤、組織再生剤、成長因子、栄養剤およびこれらの組み合わせを含む群から選ばれる。いくつかの態様では、ゲルは該機能性成分に不活性であるか、またはそれを安定化する。
【００９６】
いくつかの態様では、ゲルはさらに細胞を含む。本発明の複合物に使用するのに適切な広範囲の細胞は、細胞移植の技術の当業者により容易に理解されるだろう。適切な細胞（自己由来、同種、異種）は、例えば、肝細胞、すべてのタイプの幹細胞、インスリン生産細胞（任意の起源の幹細胞から由来する細胞を含む（例えば膵島細胞、単離された膵ベータ細胞、島細胞腫細胞など）、内分泌ホルモン生産細胞（例えば上皮小体、甲状腺、副腎など）および治療剤を分泌する任意の遺伝子工学による細胞例えば疾患または他の症状を治療するための蛋白またはホルモン、並びに診断剤を分泌する遺伝子工学による細胞を含む。いくつかの態様では、ゲルは、膵島細胞、肝細胞、神経細胞、血管内皮細胞、上皮小体細胞、甲状腺細胞、副腎細胞、胸腺細胞、間葉幹細胞、および卵巣細胞を含む。いくつかの態様では、ゲルは、膵島細胞、間葉幹細胞、上皮小体細胞および甲状腺細胞からなる群から選ばれる細胞を含む。いくつかの態様では、ゲルは、膵島細胞および上皮小体細胞からなる群から選ばれる細胞を含む。いくつかの態様では、ゲルは膵島細胞を含む。いくつかの態様では、ゲルは、成長因子または凝固因子ＶＩＩＩを発現するように遺伝子的に変性された間葉幹細胞を含む。いくつかの態様では、ゲルは間葉幹細胞を含む。いくつかの態様では、ゲルは、細胞が胚子幹細胞でない限り、さらに細胞を含む。いくつかの態様では、第１の液体成分は、本明細書で記載された細胞の任意のものの組織を含む。
【００９７】
いくつかの態様では、ゲルはさらに膵島細胞を含む。いくつかの態様では、ゲルは、ヒト、成熟したブタまたはブタ新生児から由来する膵島細胞を含む。いくつかの態様では、ゲルは、さらに約２００００−約４００００の膵島細胞を含む。
【００９８】
いくつかの態様では、細胞はヒトまたはブタからの細胞を含む。いくつかの態様では、細胞は、ヒト、ブタ新生児または成熟したブタからの細胞を含む。いくつかの態様では、細胞は、ヒトからの細胞を含む。いくつかの態様では、細胞はブタ新生児または成熟したブタからの細胞を含む。いくつかの態様では、細胞はブタ新生児からの細胞を含む。いくつかの態様では、細胞は成熟したブタからの細胞を含む。いくつかの態様では、膵島細胞は、ヒトまたはブタからの細胞を含む。いくつかの態様では、膵島細胞は、ヒト、ブタ新生児または成熟したブタからの細胞を含む。いくつかの態様では、膵島細胞はヒトからの細胞を含む。いくつかの態様では、膵島細胞はブタ新生児からの細胞を含む。いくつかの態様では、膵島細胞は成熟したブタからの細胞を含む。
【００９９】
存在するとき、機能性成分は、複合物の目的とする用途に従って選ばれる。
いくつかの態様では、（ｉ）該発泡体中の該ポリマーは、アルギネート、細胞接着配列変性アルギネートおよびこれらの組み合わせからなる群から選ばれ、（ｉｉ）該発泡体中の該ゲル形成イオンは多価カチオンを含み、（ｉｉｉ）該ゲル中の該多糖は、アルギネート、細胞接着配列変性アルギネートおよびこれらの組み合わせからなる群から選ばれ、そして（ｉｖ）該コーティング中の該ゲル形成イオンは多価カチオンを含む。
【０１００】
いくつかの態様では、（ｉ）該発泡体中の該ポリマーは、アルギネート、細胞接着配列変性アルギネートおよびこれらの組み合わせからなる群から選ばれ、（ｉｉ）該発泡体中の該ゲル形成イオンは、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、バリウムイオンおよびこれらの組み合わせからなる群から選ばれ、（ｉｉｉ）該ゲル中の該多糖は、アルギネート、細胞接着配列変性アルギネートおよびこれらの組み合わせからなる群から選ばれ、そして（ｉｖ）該コーティング中の該ゲル形成イオンは、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、バリウムイオンおよびこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【０１０１】
いくつかの態様では、（ｉ）該発泡体中の該ポリマーは、アルギネートであり、（ｉｉ）該発泡体中の該ゲル形成イオンは、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、バリウムイオンおよびこれらの組み合わせからなる群から選ばれ、（ｉｉｉ）該ゲル中の該多糖は、アルギネートであり、（ｉｖ）該コーティング中の該多糖はアルギネートを含み、そして（ｖ）該コーティング中の該ゲル形成イオンは、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、バリウムイオンおよびこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【０１０２】
いくつかの態様では、（ｉ）該発泡体中の該ポリマーは、アルギネートであり、（ｉｉ）該発泡体中の該ゲル形成イオンは、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、バリウムイオンおよびこれらの組み合わせからなる群から選ばれ、（ｉｉｉ）該ゲル中の該多糖は、ＲＧＤ変性アルギネートであり、（ｉｖ）該コーティング中の該多糖はアルギネートを含み、そして（ｖ）該コーティング中の該ゲル形成イオンは、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、バリウムイオンおよびこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【０１０３】
いくつかの態様では、（ｉ）該発泡体中の該ポリマーは、アルギネートであり、（ｉｉ）該発泡体中の該ゲル形成イオンは、カルシウムイオン、ストロンチウムイオンおよびこれらの組み合わせからなる群から選ばれ、（ｉｉｉ）該ゲル中の該多糖は、ＲＧＤ変性アルギネートであり、（ｉｖ）該コーティング中の該多糖はアルギネートを含み、そして（ｖ）該コーティング中の該ゲル形成イオンは、カルシウムイオン、ストロンチウムイオンおよびこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【０１０４】
いくつかの態様では、（ｉ）該発泡体中の該ポリマーは、アルギネートであり、（ｉｉ）該発泡体中の該ゲル形成イオンは、カルシウムイオンであり、（ｉｉｉ）該ゲル中の該多糖は、ＲＧＤ変性アルギネートであり、（ｉｖ）該コーティング中の該多糖はアルギネートを含み、そして（ｖ）該コーティング中の該ゲル形成イオンは、カルシウムイオンである。
【０１０５】
いくつかの態様では、（ｉ）該発泡体中の該ポリマーは、アルギネート、細胞接着配列変性アルギネートおよびこれらの組み合わせからなる群から選ばれ、（ｉｉ）該発泡体中の該ゲル形成イオンは多価カチオンを含み、（ｉｉｉ）該ゲル中の該多糖は、アルギネート、細胞接着配列変性アルギネートおよびこれらの組み合わせからなる群から選ばれ、そして（ｉｖ）該コーティング中の該ゲル形成イオンは多価カチオンを含み、そして（ｖ）ゲルはさらに細胞を含む。
【０１０６】
いくつかの態様では、（ｉ）該発泡体中の該ポリマーは、アルギネート、細胞接着配列変性アルギネートおよびこれらの組み合わせからなる群から選ばれ、（ｉｉ）該発泡体中の該ゲル形成イオンは、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、バリウムイオンおよびこれらの組み合わせからなる群から選ばれ、（ｉｉｉ）該ゲル中の該多糖は、アルギネート、細胞接着配列変性アルギネートおよびこれらの組み合わせからなる群から選ばれ、（ｉｖ）該コーティング中の該ゲル形成イオンは、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、バリウムイオンおよびこれらの組み合わせからなる群から選ばれ、そして（ｖ）ゲルはさらに細胞を含む。
【０１０７】
いくつかの態様では、（ｉ）該発泡体中の該ポリマーは、アルギネートであり、（ｉｉ）該発泡体中の該ゲル形成イオンは、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、バリウムイオンおよびこれらの組み合わせからなる群から選ばれ、（ｉｉｉ）該ゲル中の該多糖は、アルギネートであり、（ｉｖ）該コーティング中の該多糖はアルギネートを含み、（ｖ）該コーティング中の該ゲル形成イオンは、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、バリウムイオンおよびこれらの組み合わせからなる群から選ばれ、そして（ｖｉ）ゲルはさらに細胞を含む。
【０１０８】
いくつかの態様では、（ｉ）該発泡体中の該ポリマーは、アルギネートであり、（ｉｉ）該発泡体中の該ゲル形成イオンは、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、バリウムイオンおよびこれらの組み合わせからなる群から選ばれ、（ｉｉｉ）該ゲル中の該多糖は、ＲＧＤ変性アルギネートであり、（ｉｖ）該コーティング中の該多糖はアルギネートを含み、そして（ｖ）該コーティング中の該ゲル形成イオンは、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、バリウムイオンおよびこれらの組み合わせからなる群から選ばれ、そして（ｖｉ）ゲルはさらに細胞を含む。
【０１０９】
いくつかの態様では、（ｉ）該発泡体中の該ポリマーは、アルギネートであり、（ｉｉ）該発泡体中の該ゲル形成イオンは、カルシウムイオン、ストロンチウムイオンおよびこれらの組み合わせからなる群から選ばれ、（ｉｉｉ）該ゲル中の該多糖は、ＲＧＤ変性アルギネートであり、（ｉｖ）該コーティング中の該多糖はアルギネートを含み、（ｖ）該コーティング中の該ゲル形成イオンは、カルシウムイオン、ストロンチウムイオンおよびこれらの組み合わせからなる群から選ばれ、そして（ｖｉ）ゲルはさらに細胞を含む。
【０１１０】
いくつかの態様では、（ｉ）該発泡体中の該ポリマーは、アルギネートであり、（ｉｉ）該発泡体中の該ゲル形成イオンは、カルシウムイオンであり、（ｉｉｉ）該ゲル中の該多糖は、ＲＧＤ変性アルギネートであり、（ｉｖ）該コーティング中の該多糖はアルギネートを含み、そして（ｖ）該コーティング中の該ゲル形成イオンは、カルシウムイオンであり、そして（ｖｉ）ゲルはさらに細胞を含む。
【０１１１】
いくつかの態様では、（ｉ）該発泡体中の該ポリマーは、アルギネートであり、（ｉｉ）該発泡体中の該ゲル形成イオンは、カルシウムイオン、ストロンチウムイオンおよびこれらの組み合わせからなる群から選ばれ、（ｉｉｉ）該ゲル中の該多糖は、アルギネートであり、（ｉｖ）該コーティング中の該多糖はアルギネートを含み、（ｖ）該コーティング中の該ゲル形成イオンは、カルシウムイオン、ストロンチウムイオンおよびこれらの組み合わせからなる群から選ばれ、そして（ｖｉ）ゲルはさらにメッシュを含む。
【０１１２】
いくつかの態様では、（ｉ）該発泡体中の該ポリマーは、アルギネートであり、（ｉｉ）該発泡体中の該ゲル形成イオンは、カルシウムイオンであり、（ｉｉｉ）該ゲル中の該多糖は、アルギネートであり、（ｉｖ）該コーティング中の該多糖はＲＧＤ変性アルギネートを含み、そして（ｖ）該コーティング中の該ゲル形成イオンは、カルシウムイオンであり、そして（ｖｉ）ゲルはさらにメッシュを含む。
【０１１３】
いくつかの態様では、（ｉ）該発泡体中の該ポリマーは、アルギネートであり、（ｉｉ）該発泡体中の該ゲル形成イオンは、カルシウムイオン、ストロンチウムイオンおよびこれらの組み合わせからなる群から選ばれ、（ｉｉｉ）該ゲル中の該多糖は、アルギネートであり、（ｉｖ）該コーティング中の該多糖はアルギネートを含み、（ｖ）該コーティング中の該ゲル形成イオンは、カルシウムイオン、ストロンチウムイオンおよびこれらの組み合わせからなる群から選ばれ、そして（ｖｉ）ゲルはさらに膵島細胞を含む。
【０１１４】
いくつかの態様では、（ｉ）該発泡体中の該ポリマーは、アルギネートであり、（ｉｉ）該発泡体中の該ゲル形成イオンは、カルシウムイオンであり、（ｉｉｉ）該ゲル中の該多糖は、ＲＧＤ変性アルギネートであり、（ｉｖ）該コーティング中の該多糖はアルギネートを含み、そして（ｖ）該コーティング中の該ゲル形成イオンは、カルシウムイオンであり、そして（ｖｉ）ゲルはさらに膵島細胞を含む。
【０１１５】
いくつかの態様では、（ｉ）該発泡体中の該ポリマーは、アルギネートであり、（ｉｉ）該発泡体中の該ゲル形成イオンは、カルシウムイオン、ストロンチウムイオンおよびこれらの組み合わせからなる群から選ばれ、（ｉｉｉ）該ゲル中の該多糖は、アルギネートであり、（ｉｖ）該コーティング中の該多糖はアルギネートを含み、該アルギネートは該コーティングの約０．５−約７％を占め、（ｖ）該コーティング中の該ゲル形成イオンは、カルシウムイオン、ストロンチウムイオンおよびこれらの組み合わせからなる群から選ばれ、そして（ｖｉ）ゲルはさらに膵島細胞を含む。
【０１１６】
いくつかの態様では、（ｉ）該発泡体中の該ポリマーは、アルギネートであり、（ｉｉ）該発泡体中の該ゲル形成イオンは、カルシウムイオン、ストロンチウムイオンおよびこれらの組み合わせからなる群から選ばれ、（ｉｉｉ）該ゲル中の該多糖は、ＲＧＤ変性アルギネートであり、（ｉｖ）該コーティング中の該多糖はアルギネートを含み、該アルギネートは該コーティングの約０．５−約７％を占め、（ｖ）該コーティング中の該ゲル形成イオンは、カルシウムイオン、ストロンチウムイオンおよびこれらの組み合わせからなる群から選ばれ、そして（ｖｉ）ゲルはさらに膵島細胞を含む。
【０１１７】
いくつかの態様では、複合物は、約１．８ｍＭのカルシウムの溶液中で平衡している。いくつかの態様では、複合物は、生理学的濃度のカルシウムイオンを含む溶液中で平衡している。
いくつかの態様では、発泡体はアルギネートを含み、複合物はさらに製薬上活性のある剤および／または抗接着剤から選ばれる機能性成分を含む。
【０１１８】
いくつかの態様では、発泡体は、その重量の１−３０倍の水、生理学的溶液、可溶性の多糖溶液および機能性成分含有多糖溶液からなる群から選ばれる液体を吸収する。
（複合物の製法）
本発明は、本発明の任意の複合物を製造する方法をさらに提供し、それは、本明細書に記載された種々の複合物の態様およびこれらの態様の組み合わせを含み、それは（ｉ）第１の液体成分を孔を有する発泡体と接触させ、その場合該第１の液体成分は、ゲル形成イオンと接触するとゲルを形成できるゲル化部位を有する多糖を含み、それにより該イオンと接触するとゲルが形成され、そして（ｉｉ）該発泡体の外側の表面に該イオンを含む該コーティングを形成し、該イオンは発泡体の少なくとも一部を通して分配され、そして該発泡体の外側の表面を完全にカバーする該コーティングはゲル化部位をもつ多糖およびゲル形成イオンを含む。
【０１１９】
いくつかの態様では、コーティングの形成は、（ｉ）ゲル化部位を有する多糖を含む第２の液体成分を発泡体の外側の表面へ適用し、そして（ｉｉ）該適用後、該第２の液体成分をゲル形成イオンの溶液と接触して該コーティングを形成することからなる。
【０１２０】
本明細書で記載された方法は、本明細書で記載された複合物の態様の任意のもの、またはこれらの態様の組み合わせを製造するのに使用できる。
いくつかの態様では、発泡体はさらにポリマーを含む。
方法は、好適には、多糖を含む第１の液体成分を孔を有しかつゲル形成イオンを配合された発泡体中に吸収させ、そして多糖を発泡体の孔内でゲル化する。第１の液体成分中の多糖は、好適には、ゲルを形成するように、発泡体中のゲル形成イオンと反応する。
【０１２１】
発泡体は、ゲル形成イオンを含み、多糖を含む第１の液体を添加すると、多糖は有利には発泡体中の孔およびチャンネルを通して発泡体の内部へ浸透し、そしてゲル形成イオンと反応して複合物を形成する。この方法で、ゲルは、発泡体の内部の少なくとも一部を経て形成される。ゲル形成イオンの配合前の発泡体への多糖の添加は、該イオンを添加すると、反応が発泡体の表面上またはその付近で生じ勝ちであり、発泡体の内部への該イオンの浸透を妨げるゲル層を形成する点において有利である。その上、ゲルおよび複合物は、不均一であって望ましくない。好ましい態様では、複合物は実質的に均一なゲルを含む。
【０１２２】
多糖を含む第１の液体成分と反応するゲル形成イオンは、発泡体の製造中配合されるか、または好ましくは液体成分の添加前に発泡体へ添加される。ゲル形成イオンは、含湿発泡体中へ混合物の形成前に混合物好ましくはバイオポリマー混合物内に分散されることにより配合されるか、または形成された発泡体へ添加される。任意に、追加のゲル形成イオンは、発泡体を含む複合物および添加された多糖を含むゲルへ添加される。ゲル形成イオンは、例えば発泡体を溶解しないゲル化イオン溶液により発泡体を洗浄または浸漬することにより、発泡体を製造するために発泡体または混合物中に配合できる。過剰な溶液は、圧縮により除かれる。
【０１２３】
多糖を含む液体成分の導入前に発泡体にゲル形成イオンを用意することにより、多糖を含む液体成分の添加にあたって、ゲルは、発泡体の内部の少なくとも一部そして好ましくは実質的にすべてにわたって形成される。多糖を含む液体成分の添加前に発泡体に十分なゲル形成イオンを用意することにより、複合物の少なくとも一部にわたって形成されたゲルを有する複合物が確保される。
【０１２４】
多糖発泡体用の典型的な洗浄溶液は、約３０−約２００ｍＭより好ましくは５０−１００ｍＭの水溶性ゲル化塩例えば塩化カルシウム、塩化バリウムまたは塩化ストロンチウムを有する。好適には、ゲル化の速度は、それらが徐々に可溶化されるｐＨ条件下で僅かに可溶な塩を使用することにより、または金属イオン封鎖剤と組み合わせた可溶のゲル形成イオンを使用することにより、コントロールされてゲル化を遅らす。洗浄または浸漬は、複合物の性質を変性するのに使用され、追加のゲル形成イオンは添加されて複合物を強化または硬化し、また細胞の増殖をコントロールし、一方他の処置例えば金属イオン封鎖剤または非ゲル形成イオンは複合物を弱体化または溶解するのに使用される。アルギネートのゲルは、シトレート、ＥＤＴＡまたはヘキサメタホスフェートの水溶液の添加によって溶解できる。生細胞とともに使用される洗浄処置は、等張性でなければならない。複合物の性質は、従って所望により調整される。
【０１２５】
ゲルの形成は、ゲル形成イオン、多糖の性質例えば組成および分子量および吸収に関する液体成分の性質例えば固体の濃度および粘度、並びに利用できる孔の体積に対する液体の相対的な性質に依存する。いくつかの態様では、液体は吸収され、多糖はゲルになり始め、そしてゲルは孔を満たす。他の態様では、例えば、多糖の実質的な部分は、液体が吸収されるにつれ、孔の壁上のコーティングとしてゲルになる。
【０１２６】
第１の液体成分の吸収速度および多糖のゲル化の速度は、複合物の構造に影響する。液体成分の吸収速度および吸収容量は、発泡体の特徴例えば孔のサイズおよび体積、多糖の特徴例えば組成および分子量、そして吸収に関する液体成分の性質例えば固体の濃度および粘度に依存する。第１の液体成分の粘度が、発泡体中に急速に吸収されるその能力に影響するとき、アルギネートのより低い濃度を用いること、またはより低分子量のアルギネートを使用することは好適である。
【０１２７】
ゲルの機械的な強さに影響する因子は、多糖の濃度、多糖の分子量、化学的組成、適切なものとして異なる多糖の成分のブレンド、例えばＭの多いおよびＧの多いアルギネートの比、ゲル形成イオンおよびゲルの他の成分のタイプおよびレベルを含む。ゲルの強さは、目的とする応用に従ってこれらのパラメーターを操作することにより調整できる。
【０１２８】
発泡体へ添加するのが好適な第１の液体成分は、溶媒典型的な例では水に溶解した多糖を含む。
好適には、第１の液体成分の粘度は、約５−約１０００ｍＰａｓ、より典型的には約８−６００ｍＰａｓ，より好ましくは約１０−２００ｍＰａｓである。液体成分は、好ましくは、発泡体の一部のみ例えば発泡体の表面上にゲル層を生成することが望ましいのでなければ、発泡体の孔中に完全に吸収される。液体は、十分にゲル化されねばならず、孔を被覆するに過ぎないことが望ましいのでなければ、未ゲル化または部分的にゲル化された材料が発泡体の外に漏れることを避けるためにそれは孔中に保持される。
【０１２９】
いくつかの態様では、該第１の液体成分は低粘度溶液である。
いくつかの態様では、第１の液体成分は、約５％ｗ／ｖより少ない多糖を含む。いくつかの態様では、第１の液体成分は、約０．２−約１０％ｗ／ｖより少ない多糖を含む。いくつかの態様では、第１の液体成分は、約０．５−約５％ｗ／ｖより少ない多糖を含む。いくつかの態様では、第１の液体成分は、約０．１−約１．０％ｗ／ｖより少ない多糖を含む。
【０１３０】
いくつかの態様では、発泡体は、該ゲルの該形成後そして該コーティングの該形成前に洗浄される。
いくつかの態様では、第２の液体成分は、ゲル化部位を有する多糖を、約０．２−約１０％ｗ／ｖ、約０．５−約１０％ｗ／ｖ、約１−約８％ｗ／ｖ、約２−約７％ｗ／ｖ、約３−約６％ｗ／ｖ、または約２−約６％ｗ／ｖ含む。いくつかの態様では、該第２の液体成分の多糖は、ゲル化部位を有する多糖を約３％ｗ／ｖ含む。いくつかの態様では、第２の液体成分は、ゲル化部位を有する多糖を約５％ｗ／ｖ含む。いくつかの態様では、第２の液体成分は、ＰＲＯＮＯＶＡ  ＳＬＭ２０（ＮｏｖａＭａｔｒｉｘ、ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ、ノルウエイ）を約５％ｗ／ｖ含む。いくつかの態様では、第２の液体成分は、ＰＲＯＮＯＶＡ  ＳＬＭ１００（ＮｏｖａＭａｔｒｉｘ、ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ、ノルウエイ）を約５％ｗ／ｖ含む。
【０１３１】
いくつかの態様では、第２の液体成分は、アルギネート、細胞配列変性アルギネートまたはこれらの組み合わせを、約０．２−約１０％ｗ／ｖ、約０．５−約１０％ｗ／ｖ、約１−約８％ｗ／ｖ、約２−約７％ｗ／ｖ、約３−約６％ｗ／ｖ、または約２−約６％ｗ／ｖ含む。いくつかの態様では、該第２の液体成分の多糖は、アルギネート、細胞配列変性アルギネートまたはこれらの組み合わせを約３％ｗ／ｖ含む。いくつかの態様では、第２の液体成分は、アルギネート、細胞配列変性アルギネートまたはこれらの組み合わせを約５％ｗ／ｖ含む。いくつかの態様では、第２の液体成分は、ＰＲＯＮＯＶＡ  ＳＬＭ２０（ＮｏｖａＭａｔｒｉｘ、ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ、ノルウエイ）を約５％ｗ／ｖ含む。いくつかの態様では、第２の液体成分は、ＰＲＯＮＯＶＡ  ＳＬＭ１００（ＮｏｖａＭａｔｒｉｘ、ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ、ノルウエイ）を約５％ｗ／ｖ含む。
【０１３２】
いくつかの態様では、ゲル形成イオンの溶液は、約５０−約２００ｍＭのカルシウムイオンを含む。いくつかの態様では、ゲル形成イオンの溶液は、約１００ｍＭのカルシウムイオンを含む。
いくつかの態様では、方法は、さらに、該コーティングの該形成後、複合物とストロンチウムイオンおよびカルシウムイオンの溶液とを接触することを含む。いくつかの態様では、ストロンチウムイオンおよびカルシウムイオンの濃度は、それぞれ独立して約２−約８ｍＭ、または約５ｍＭである。いくつかの態様では、この工程は得られる複合物の機械的な強さを増大させる。
【０１３３】
いくつかの態様では、方法は、さらに、複合物を洗浄することを含み、該コーティングの該形成後、約１．８ｍＭのカルシウムイオンを含む溶液中で平衡させられる。いくつかの態様では、方法は、さらに、複合物を洗浄することを含み、該コーティングの該形成後、ほぼ生理学的濃度のカルシウムイオンを含む溶液中で平衡させられる。いくつかの態様では、この工程は、カルシウムイオンの濃度が生理学的濃度であるため、得られた複合物の生体適合性を増大させる。
【０１３４】
いくつかの態様では、第１の液体成分は、さらに、機能性成分を含む。いくつかの態様では、機能性成分は、フレーバー、香料、微粒子、細胞、多細胞凝集物、治療剤、組織再生剤、成長因子、栄養剤およびこれらの組み合わせを含む群から選ばれる。いくつかの態様では、第１の液体成分は、さらに細胞を含む。
【０１３５】
いくつかの態様では、第１の液体成分は、膵島細胞、肝細胞、神経細胞、血管内皮細胞、上皮小体細胞、甲状腺細胞、副腎細胞、胸腺細胞、間葉幹細胞、および卵巣細胞を含む。いくつかの態様では、第１の液体成分は、膵島細胞、間葉幹細胞、上皮小体細胞および甲状腺細胞からなる群から選ばれる細胞を含む。いくつかの態様では、第１の液体成分は、膵島細胞および上皮小体細胞からなる群から選ばれる細胞を含む。いくつかの態様では、ゲルは膵島細胞を含む。いくつかの態様では、第１の液体成分は、成長因子または凝固因子ＶＩＩＩを発現するように遺伝子的に変性された間葉幹細胞を含む。いくつかの態様では、第１の液体成分は、胚子幹細胞を含む。いくつかの態様では、第１の液体成分は、間葉幹細胞を含む。
【０１３６】
いくつかの態様では、第１の液体成分は、さらに膵島細胞を含む。いくつかの態様では、第１の液体成分は、ヒトまたはブタから由来する膵島細胞を含む。いくつかの態様では、第１の液体成分は、ヒト、成熟したブタまたはブタ新生児から由来する膵島細胞を含む。いくつかの態様では、第１の液体成分は、さらに約２００００−約４００００の膵島細胞を含む。
【０１３７】
コーティングは、当業者に周知の種々の方法により製造できる。いくつかの態様では、コーティングは、少量の多糖を容器に置き、次に発泡体の表面と溶液とを接触させ、さらに多糖の溶液とゲル形成イオンの溶液とを接触させることにより形成される。多糖の溶液は、また当業者に周知の他の方法、例えば浸漬、噴霧またはドローダウンの方法により適用できる。いくつかの態様では、コーティングは、多糖と自己ゲル化組成物例えば本明細書でその全部を参考として引用されるＵＳ２００６／０１５９８２３に記載されたものとを接触させることにより形成される。
【０１３８】
温度感受性材料は、複合物が好適には周囲温度またはその付近でのプロセスにより形成されるため、好適には、複合物中に配合される。本発明の方法は、高温度または低温度での乾燥工程例えば凍結乾燥工程を含む必要なないが、もし所望ならばこれを含むこともできる。特に高温度での複合物の乾燥を避ける選択肢は、有利には、複合物の製造を可能にし、その場合配合された温度感受性材料は均一に分配しそして不活性化または変更されない。
本発明は、さらに本発明の方法により製造される製品を提供する。
【０１３９】
（組成物の用途および使用方法）
他の側面では、本発明は、本発明の方法により製造される複合物の方法および用途を提供する。複合物は、医学的な応用例えば創傷の治療、組織工学および組織再生および細胞固定化で使用するのが特に好適である。
【０１４０】
本明細書に記載された用途および方法は、本明細書に記載された複合物の任意のもの、本明細書で記載された方法の生成物、または記載された態様の組み合わせを含むこれらの態様で使用できる。
【０１４１】
本発明は、さらに、本明細書に記載された複合物中の細胞の増殖を促進する方法を提供し、それは、生細胞に中性の浸透圧に調節されそしてゲル形成イオンを含む溶液により複合物を洗浄することを含む。いくつかの態様では、ゲル形成イオンは、洗浄工程が複合物の機械的性質を変性するように選ばれる。いくつかの態様では、複合物を洗浄するのに使用される溶液は、約５−約２００ｍＭの濃度のカルシウム塩、バリウム塩およびストロンチウム塩から選ばれる塩を含む。
【０１４２】
本発明は、さらに、本明細書で記載された方法による複合物を形成することを含む細胞増殖を阻害する方法を提供し、それは、第１の液体成分が細胞を含み、該多糖が発泡体の孔内でゲル化され、ゲル形成イオンはストロンチウムイオンを含む。
【０１４３】
本発明は、さらに、本明細書に記載された複合物から細胞を回収する方法を提供し、それは、回収剤を含む水溶液と多糖を含むゲルとを接触させ、該水溶液は生細胞に中性の浸透圧をもたらすように調節される。いくつかの態様では、回収剤は、クエン酸ナトリウムまたはクエン酸の他の可溶性の塩、ナトリウムＥＤＴＡまたはＥＤＴＡの他の可溶性の塩またはヘキサメタホスフェートを含む。
【０１４４】
本発明は、さらに、本明細書で記載された複合物を移植することを含む細胞の成長を促進する方法を提供し、その方法では、細胞の成長を確立する目的でヒトまたは動物の身体中にアルギネートを含む発泡体を移植する。
本発明は、さらに、隣接する組織への組織の接着を防ぐ方法が提供され、それは、それが組織と隣接する組織との間にバリヤーをもたらすように、組織へ本明細書に記載された複合物を適用する。
【０１４５】
本発明は、さらに、細胞固定化のためのマトリックスおよび／または生体外の組織培養の応用または生体内の組織工学の応用のための増殖としての、本明細書に記載された複合物の用途を提供する。
本発明は、１つ以上の複合物をその必要のある患者へ投与する方法を提供し、それは該１つ以上の複合物を該患者に移植することを含む。いくつかの態様では、１つ以上の複合物は、皮下に移植される。いくつかの態様では、３−４の複合物は、患者へ移植される。いくつかの態様では、複合物のゲルは、膵島細胞を含み、そして患者は糖尿病の治療または血糖のレベルの制御を必要とする。
【０１４６】
いくつかの態様では、治療に有効な数の細胞が移植される。特定の異常の治療を要する細胞の数は、治療される特定の異常の１つ以上、個体のサイズ、年齢および応答のパターン、１つ以上の異常の程度、通っている医師の判断、投与の方法および投与の目的例えば予防または治療に応じて変化する。用語「有効量」は、研究者、動物医師、医師または他の臨床医により求められている組織、系、動物、個体、患者またはヒトにおける生物学的または医学的な応答を導き出す細胞の数を意味する。望ましい生物学的または医学的な応答は、個体における異常の予防（例えば、異常にかかりやすいが、まだ経験していなかまたは疾患の病理学的または症候学的な徴候を示す個体における異常の予防）を含む。望ましい生物学的または医学的な応答は、また異常の病理学的または症候学的な徴候を経験または示しつつある個体の異常の阻害（すなわち、病理学的および／または症候学的なさらなる伸展の阻止または減速）を含む。望ましい生物学的または医学的な応答は、また疾患の病理学的または症候学的な徴候を経験または示しつつある個体における異常の緩和（すなわち、病理学的または症候学的な徴候の逆転）を含む。
【０１４７】
１つ以上の複合物は、患者に移植されて、細胞が治療的に有効な量に達する。いくつかの態様では、ゲルは、独立して、約５０００以上の細胞を含む。いくつかの態様では、ゲルは約５０００−約３０００００の細胞、約５０００−約２０００００の細胞、約５０００−約１０００００の細胞、約１００００−約１０００００の細胞、約５０００−約６００００の細胞、約１００００−約６００００の細胞、約２００００−約６００００の細胞または約２００００−約４００００の細胞を含む。
【０１４８】
本発明は、さらに、本明細書で記載された方法の用途を提供する。本発明は、さらに、治療によりヒトまたは動物の身体の治療方法における用途について本明細書に記載された複合物を提供する。いくつかの態様では、複合物は、糖尿病の治療または血糖のレベルを下げる方法に使用される。
【０１４９】
本発明は、さらに、その必要のある患者に１つ以上の複合物を移植するためのキットを提供し、それは本発明の複合物を１つ以上含む。いくつかの態様では、キットは、さらに、患者に該複合物を移植するための使用説明書を含む。
いくつかの態様では、複合物は、使用にあたって成分を放出する、機能性成分のための担体として働く。複合物は、特に機能性成分が薬品である場合、特定の方法で成分を放出するように調整される。成分の「放出プロフィル」は、所望に応じて、即時の迅速な放出、コントロールされた放出または脈動性放出である。
【０１５０】
いくつかの態様では、複合物は、さらに、治療剤を含み、ヒトまたは動物の身体への活性剤の生体内のコントロールされた放出をもたらす。いくつかの態様では、複合物は、さらに、創傷の治療に用いられる成分を提供して、生体内で創傷を治療する。
いくつかの態様では、ゲルから捕捉された成分を放出することが望ましい。放出は、ゲルの物理的な摩擦、ゲルからの抽出、またはゲルの溶解またはゲルからの簡単な拡散または漏れにより達成できる。成分を放出するために選ばれるプロセスは、放出されるべき成分の応用および性質に依存し、そして機械的または音響のエネルギー、温度の適用またはｐＨの変化、または「脱ゲル化」剤例えばキレート剤の添加を含むことができるだろう。
【０１５１】
いくつかの態様では、複合物は、組織の成長および組織工学において有用であり、その場合機能性組織は、新しい組織の成長を導くテンプレートをもたらしそして栄養物を細胞に確実に到達させそして廃物を取り出す３次元のスカホールド上に接種される細胞を用いて生成される。いくつかの態様では、複合物は、コントロール可能なかつ予想可能な方法で、所望の内部成長を助けかつ分解を行うように、加工される。例えば、新しく進展した組織は複合物を通って拡大し、複合物は好適には分解しそして新しい組織の形成に空間をもたらす。いくつかの態様では、複合物は、例えば骨、神経、皮膚および軟骨の再生のために、細胞相互作用分子および成長因子を例えば放出することにより、複合物が移植される領域の細胞および／または固定化細胞との特定の相互作用を刺激するようにデザインできる。いくつかの態様では、複合物は、成長因子を放出して、所望の幾何学的構造に基づいて細胞の内部成長を促進させそしてインプラントのコントロールされた分解は再生された骨の組織が負荷に耐えることを可能にする。いくつかの態様では、複合物は、それぞれゲル形成イオンとしてカルシウムイオンまたはストロンチウムイオンを使用することにより、適切なように、細胞の増殖を促進または阻害するようにデザインされる。
【０１５２】
いくつかの態様では、組成物中で固定化された細胞は、動物中に移植され、その場合ゲルおよびコーティングは、免疫バリヤーとして働き、そして免疫系による検出を防ぎ、それにより異種移植片の移植を可能にする。いくつかの態様では、ストロンチウムは、動物細胞がインプラント（異種移植片）に望まれるとき、ゲル形成イオンとして使用できる。それは、このタイプの人工器官を使用するとき、細胞が移植された複合物の外に成長することがなくそして免疫系に曝されるようになるからである。いくつかの態様では、複合物は、また例えばガンの研究のために、動物における細胞、腫瘍および組織の異種移植片を確立するのに有用である。複合物中の多細胞凝集物例えば膵島ランゲルハンスの固定化は、該多細胞凝集物を、免疫の拒絶なしに動物またはヒト中に移植させ、そしてこのような移植された細胞凝集物は、次に例えばインスリンを生成する人工器官として機能できる。
【０１５３】
細胞培養物は、多くの生物学的材料、例えば酵素、ホルモン、免疫生物学的物質（例えばモノクローナル抗体、インターロイキン、リンホカイン）および抗ガン剤を製造するのに使用できる。細胞は、本発明による複合物中で培養されて、細胞の全数を増やす。例えば、患者から単離された細胞は、本発明の複合物中で培養されて、細胞の数を増やし、細胞は次に複合物から回収されそして組織工学の応用に使用される。本発明による複合物中の細胞の培養物は、また細胞の分化および成長を開発し、その性質を調べそして特定して組織様の構造物を生成する。例えば、細胞は外側の組織により影響され、そして複合物（ゲル／発泡体）の弾性の変性は、遺伝子の発現に影響する。
【０１５４】
複合物中で生体外で生成する細胞は、好適には、回収剤を用いて培養物から回収できる。好適な回収剤は、クエン酸ナトリウムまたはクエン酸の他の可溶性の塩、ナトリウムＥＤＴＡまたはＥＤＴＡの他の可溶性の塩およびヘキサメタホスフェートを含む。
どんな理論にも束縛されることを望まないが、細胞が固定化される複合物およびゲルの剛性が、細胞の成長にとり重要な因子であると考えられる。それは、ゲルの機械的な性質が増殖を制御するものと思われ、そして分化は細胞のタイプに基づいて観察されているからである。細胞がその上に付着するゲルの剛性（例えば弾性モジュラスにより測定されるとき）は、後で生ずる細胞の拡がりの程度および外骨格から生ずる力の大きさを決定する。アルギネートゲルの性質は、アルギネートの濃度、ゲル形成イオンの飽和およびゲル形成イオンのタイプにより変化する。さらに、アルギネートは、化学的に変性されて、細胞の接着に関するペプチド配列例えば細胞接着ペプチド配列例えばＲＧＤトリペプチドを加える。
【０１５５】
いくつかの態様では、複合物は、ヒトまたは動物の身体の治療に使用されて、組織間の接着を防ぐ。手術による介入は、例えば筋肉間、筋肉と腱または神経または他の組織との間に、組織の癒着または一緒の成長を生じさせる。この望ましくない組織の成長を防ぐために、いくつかの態様では、抗接着層が筋肉間、筋肉と腱または神経との間に挿入されて創傷をカバーし、そして治癒過程中手術後の接着の形成を防ぐ。いくつかの態様では、複合物は、細胞の成長および抗接着層中への侵入を遅らせるかまたは防ぎ、それにより治癒の間組織間の接着を避ける材料例えば複合物中のヒアルロネート発泡体およびゲル化イオンの選択により、抗接着層として使用されるために考えだされる。いくつかの態様では、複合物は、（架橋イオンの量、ポリマーのタイプ、ポリマーの濃度を適切に変えることにより）創傷が治るにつれて溶解する生分解可能な材料から製造され、そして分解されるかまたは身体から排出される。
【０１５６】
処方物の性質に応じて、いくつかの態様では、複合物は、種々の時間にわたって分解し、それにより固定化された材料例えば治療剤または組織再生剤を放出するように処方される。本発明の好ましい用途は、組織修復であり、その場合有機または無機の材料は、複合物内で固定化されそして組織再生のためのスカホールドとして働く。１つのこのような例は、発泡体内のゲル中にヒドロキシアパタイトが含まれ、次に発泡体／ゲル複合物中への骨再生を誘導するために、骨の欠損中に移植される。他のこのような例は、複合物内に化学歩性または細胞誘引剤を含み、次に組織再生を促進するために組織損傷部位中に複合物を移植する。
【０１５７】
複合物が例えば医薬品、成長因子、栄養剤、フレーバーまたは香料のコントロールされた伝達の応用として使用しようとするとき、機械的および化学的な性質は、所望の環境中の適切な放出のために変性できる。
発泡体は、所望により使用前または使用中成形できる。発泡体は、ファスナー例えば縫合により基体へ確保され、そして可溶な多糖が次に発泡体へ添加されて下コーティングを生成し、そして複合物を形成する。所望により、複合物が形成され、次にファスナー例えば縫合により基体へ確保される。
開示された本発明が、より有効に理解されるために、以下に実施例が示される。これらの実施例が説明の目的のみに示されそして決して本発明を制限するものと考えてはならないことを理解すべきである。
【０１５８】
（用語解説）
アルブミン：ウシアルブミン、フラクションＶ、約９９％（Ａ−３０５９）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ、ドイツ）。
Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ：Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ溶液（０７１０）ＧＩＢＣＯ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，米国）。
Ｃ２Ｃ１２：マウス筋芽細胞ライン（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７７２）。
ＣａＣｌ２：塩化カルシウム２水和物、Ｐｈ．Ｅｕｒ．（Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ  Ｈａｅｎ，Ｓｅｅｌｚｅ、ドイツ）。
ＣａＣｌ２：塩化カルシウム２水和物、（１．０２３８２．１０００）（Ｍｅｒｋ  ＫｇａＡ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，ドイツ）。
ＣａＣＯ３：Ｅｓｋａｌ  ５００、炭酸カルシウム、粒子サイズ〜５．２μｍ（ＫＳＬ  Ｓｔａｕｂｔｅｃｈｎｉｋ、Ｌａｕｎｉｎｇｅｎ、ドイツ）。
ＣａＣＯ３：ＨｕｂｅｒＣＡＬ  ５００  Ｅｌｉｔｅ、炭酸カルシウム、粒子サイズ〜４．２μｍ（Ｈｕｂｅｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、Ｈａｍｉｎａ，フィンランド）。
ＣａＣＯ３：ＨｕｂｅｒＣＡＬ  ２５０  Ｅｌｉｔｅ、炭酸カルシウム、粒子サイズ〜８．７μｍ（Ｈｕｂｅｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、Ｈａｍｉｎａ，フィンランド）。
カルセイン：Ｃａｌｃｅｉｎ，ＡＭ、１ｍｇ／ｍＬ（Ｃ３０９９）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、オレゴン、米国）。
シトレート：クエン酸ナトリウム２水和物、Ａ．Ｃ．Ｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ、ドイツ）。
ＦＢＳ：ウシ胎児血清、ＧＩＢＣＯ（商標）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ、ドイツ）。
蛍光デキストラン１０ｋＤａ：デキストラン、フルオレセン、１００００Ｍｗ、アニオン性（Ｄ−１８２１）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，オレゴン、米国）。
蛍光デキストラン７０ｋＤａ：デキストラン、フルオレセン、７００００Ｍｗ、アニオン性（Ｄ−１８２２）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，オレゴン、米国）。
ＧＤＬ：グルコノ  δ−ラクトン（Ｒｏｑｕｅｔｔｅ、Ａｌｅｓｓａｎｄｒｉａ、イタリー）。
グリセリン：グリセリン、Ｐｈ．Ｅｕｒ．（ＶＷＲ  Ｐｒｏｌａｂｏ，Ｌｅｕｖｅｎ、ベルギー）。
成長培地：Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓのイーグル培地、軟骨細胞のために変性（Ｄ−ＭＥＭ）。
軟骨細胞：（６１９６５−０２６）ＧＩＢＣＯ（商標）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ、ドイツ）、１０％熱不活性化ＦＢＳ（５６℃で２０分間）、１％Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃおよび１％ピルビン酸ナトリウム添加。
成長培地：Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓのイーグル培地、Ｃ２Ｃ１２のために変性（Ｄ−ＭＥＭ）。
【０１５９】
Ｃ２Ｃ１２細胞：（Ｄ−７７７７）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．セントルイス、米国）、１０％熱不活性化ＦＢＳ（５６℃で２０分間）、３．７ｇ／ＬのＮａＨＣＯ３、１０ｍＬ／Ｌの非必須アミノ酸、１０ｍＬ／Ｌのペニシリン−ストレプトマイシンの溶液、１．４ｍｇ／ＬのプロマイシンおよびＭＱ−水を添加。
成長培地：ＭＤＣＫ細胞（Ｍ０６４３）用の最低必須培地イーグル（ＭＥＭ）。
ＭＤＣＫ細胞：（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．セントルイス、米国）、１０％熱不活性化ＦＢＳ（５６℃で２０分間）、１０ｍＬ／Ｌのペニシリン−ストレプトマイシンの溶液、２．２ｇ／ＬのＮａＨＣＯ３およびＭＱ−水を添加。
ＧＤＬ：グルコノ  δ−ラクトン（Ｒｏｑｕｅｔｔｅ、Ａｌｅｓｓａｎｄｒｉａ、イタリー）。
グリセリン：グリセリン、Ｐｈ．Ｅｕｒ．（ＶＷＲ  Ｐｒｏｌａｂｏ，Ｌｅｕｖｅｎ、ベルギー）。
Ｈａｎｋｓ′：Ｈａｎｋｓ′バランスされた塩溶液、変性；ＮａＨＣＯ３により、フェノールレッド、塩化カルシウムおよび塩化マグネシウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ、ドイツ）なし。
ＨＰＭＣ：Ｐｈａｒｍａｃｏａｔ  ６０３、置換タイプ２９１０、Ｈｙｐｒｏｍｅｌｌｏｓｅ  ＵＳＰ（ヒドロキシプロピルメチルセルロース）（信越化学、日本）。
Ｉｓｏｔｏｎ  ＩＩ：ＣＯＵＬＴＥＲ（商標）ＩＳＯＴＯＮ（商標）ＩＩ  Ｄｉｌｕｅｎｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｋｒｅｆｅｌｄ、ドイツ）。
生存／死滅テストキット：動物細胞用の生存可能性／細胞毒性のキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、オレゴン、米国）。
マンニトール：Ｄ−マンニトール９８％（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ、ドイツ）。
ＭＤＣＫ：Ｍａｄｉｎ  Ｄａｒｂｙイヌ腎細胞ライン（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−３４）。
ＭＱ−水：ＭｉｌｉＱ水。
ＮａＣｌ：塩化ナトリウム、ｐ．ｓ．（Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）。
ＮａＨＣＯ３：重炭酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ、ドイツ）。
【０１６０】
ＮａＨＰＯ４：リン酸水素二ナトリウム、ａｒｔ：３０４２７（Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ  Ｈａｅｎ，Ｓｅｅｌｚｅ、ドイツ）。
Ｎａ−三リン酸：５塩基性三リン酸ナトリウム（Ｔ５８８３−５００Ｇ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ、ドイツ）。
ＮＯＶＡＴＡＣＨ  ＲＧＤ：ペプチド結合ＰＲＯＮＯＶＡ  ＵＰ  ＭＶＧアルギネート、バッチ：ＣＢＩＦＭＣ０１Ａ０２１２００５、滅菌濾過および凍結乾燥、ペプチド配列：ＧＲＧＤＳＰ、ペプチド：アルギネート比９．１１：１。
ＮＯＶＡＴＡＣＨ  ＶＡＰＧ：ペプチド結合ＰＲＯＮＯＶＡ  ＵＰ  ＭＶＧアルギネート、バッチ：ＣＢＩＦＭＣ０２Ａ０２１２２６０５、滅菌濾過および凍結乾燥、ペプチド配列：ＶＡＰＧ、ペプチド：アルギネート比１３．５：１。
ペニシリン−ストレプトマイシン：ペニシリン−ストレプトマイシン溶液（Ｐ０７８１）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ、ドイツ）。
Ｐｒｏｔａｎａｌ（商標）ＬＦ２００Ｓ：ナトリウムアルギネート、薬品グレード、粘度（１重量％の水溶液、２０℃）＝３０２ｍＰａｓ（ＦＭＣ、フィラデルフィア、米国）。
ＰＲＯＮＯＶＡ  ＵＰ  ＭＶＧ：ナトリウムアルギネート、バッチ；７０１−２５６−１１、粘度（１重量％の水溶液、２０℃）＝３８５ｍＰａｓ（ＮｏｖａＭａｔｒｉｘ、オスロー、ノルウエイ）。
ＰＲＯＮＯＶＡ  ＵＰ  ＬＶＧ：ナトリウムアルギネート、粘度（１重量％の水溶液、２０℃）＝５０ｍＰａｓ（ＮｏｖａＭａｔｒｉｘ、オスロー、ノルウエイ）。
ＰＲＯＮＯＶＡ  ＳＬＧ  １００：滅菌ナトリウムアルギネート、粘度（１重量％の水溶液、２０℃）＝１６６ｍＰａｓ（ＮｏｖａＭａｔｒｉｘ、オスロー、ノルウエイ）。
ＰＲＯＮＯＶＡ  ＳＬＧ  ２０：滅菌ナトリウムアルギネート、粘度（１重量％の水溶液、２０℃）＝３７．５ｍＰａｓ（ＮｏｖａＭａｔｒｉｘ、オスロー、ノルウエイ）。
【０１６１】
ＰＲＯＮＯＶＡ  ＳＬＭ  ２０：滅菌ナトリウムアルギネート、粘度（１重量％の水溶液、２０℃）＝９．０ｍＰａｓ（ＮｏｖａＭａｔｒｉｘ、オスロー、ノルウエイ）。
ＰＲＯＮＯＶＡ  ＳＬＭ  ２０：滅菌ナトリウムアルギネート、粘度（１重量％の水溶液、２０℃）＝９２ｍＰａｓ（ＮｏｖａＭａｔｒｉｘ、オスロー、ノルウエイ）。
ＰＲＯＮＯＶＡ  ＵＰ  ＬＶＧ：ナトリウムアルギネート、粘度（１重量％の水溶液、２０℃）＝２５ｍＰａｓ（ＮｏｖａＭａｔｒｉｘ、オスロー、ノルウエイ）。
ＰＲＯＮＯＶＡ  ＵＰ  ＬＶＧ：超純粋ナトリウムアルギネート、バッチ；２２１１０５，粘度（１重量％の水溶液、２０℃）＝３５ｍＰａｓ（ＮｏｖａＭａｔｒｉｘ、オスロー、ノルウエイ）。
ＰＲＯＮＯＶＡ  ＵＰ  ＬＶＧ：超純粋ナトリウムアルギネート、バッチ；ＦＰ−５０２−０４，粘度（１重量％の水溶液、２０℃）＝５０ｍＰａｓ（ＮｏｖａＭａｔｒｉｘ、オスロー、ノルウエイ）。
ＰＲＯＮＯＶＡ  ＵＰ  ＬＶＧ：ナトリウムアルギネート、粘度（１重量％の水溶液、２０℃）＝９２ｍＰａｓ（ＮｏｖａＭａｔｒｉｘ、オスロー、ノルウエイ）。
ＰＲＯＮＯＶＡ  ＵＰ  ＭＶＧ：超純粋ナトリウムアルギネート、バッチ；ＦＰ−３１０−０１，粘度（１重量％の水溶液、２０℃）＝２９６ｍＰａｓ（ＮｏｖａＭａｔｒｉｘ、オスロー、ノルウエイ）。
ＰＲＯＮＯＶＡ  ＵＰ  ＭＶＧ：超純粋ナトリウムアルギネート、バッチ；ＦＰ−３１２−０３，粘度（１重量％の水溶液、２０℃）＝２４８ｍＰａｓ（ＮｏｖａＭａｔｒｉｘ、オスロー、ノルウエイ）。
ＰＲＯＮＯＶＡ  ＵＰ  ＭＶＧ：超純粋ナトリウムアルギネート、バッチ；７０１−２５６−１１，粘度（１重量％の水溶液、２０℃）＝３８５ｍＰａｓ（ＮｏｖａＭａｔｒｉｘ、オスロー、ノルウエイ）。
ＰＲＯＴＡＳＡＮ  ＣＬ  ２１０（２１４）：キトサンクロリド、バッチ；７０８−７８３−０１、脱アセチル化；９４．５％、ｐＨ＝５．３、粘度（１重量％の水溶液、２０℃）＝７７ｍＰａｓ（ＮｏｖａＭａｔｒｉｘ、オスロー、ノルウエイ）。
【０１６２】
ＰＲＯＴＡＳＡＮ  ＣＬ  ２１３：超純粋キトサンクロリド、バッチ；ＦＰ−１０４−０２、脱アセチル化；８６％、ｐＨ＝５．３、粘度（１重量％の水溶液、２０℃）＝７４ｍＰａｓ（ＮｏｖａＭａｔｒｉｘ、オスロー、ノルウエイ）。
Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅ：（Ｐ４１７０）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．セントルイス、米国）。
プロマイシン：プロマイシン２塩酸塩（Ｐ７２５５）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．セントルイス、米国）。
ナトリウムヒアルロネート：薬品グレート８０，バッチ；１７０５３Ｐ、分子量；１．０８＊１０６ｇ／モル（Ｎｏｖａｍａｔｒｉｘ、紀文フードケミファ、鴨川、日本）。
ピルビン酸ナトリウム：ピルビン酸ナトリウム１００ｍＭ溶液（Ｓ−８６３６）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．セントルイス、米国）。
ソルビトール：生化学用Ｄ（−）ソルビトール、ドライ、１００％（（Ｍｅｒｋ  ＫｇａＡ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，ドイツ）。
ソルビトールスペッシアル：７０％ソルビトール溶液（ＳＰＩ  Ｐｏｌｙｏｌｓ，ニューキャッスル、ＤＥ，米国）。
ＳｒＣｌ２：塩化ストロンチウム６水和物  ９９％、Ａ．Ｃ．Ｓ．試薬（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ、ドイツ）。
ＳｒＣＯ３：炭酸ストロンチウム  ９９．９＋％（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ、ドイツ）。
【実施例１】
【０１６３】
この実施例は、発泡体の硬さまたは弾性が、ゲル形成イオンによる飽和および温度の関数として、いかに変化するかを示す。
テストされる３つの異なる発泡体に関する含湿処方物を表２に示す。処方物は、カルシウムイオンがそれぞれ６６％、１１１％および１５５％アルギネートのゲル化部位を飽和するのに十分なように、炭酸カルシウムが変化する。
【０１６４】
【表２】
2010529998.tif 000003
【０１６５】
アルギネートの水溶液がつくられた。別に、炭酸カルシウムを、混合鉢中で水中に分散した（表２に示される量よりも２５ｇ少ない量）。グリセリン、ソルビトールスペシャル、アルギネート水溶液およびＨＰＭＣを同じ鉢に添加し、そして分散物を、１分間中程度の速度でワイヤーの泡立てを備えたＨｏｂａｒｔキッチンエイドミキサーでブレンドして均一にした。新しく混合したＧＤＬ溶液（すなわち、ＧＤＬプラス２５ｇの水）の添加前に、混合を高速度でさらに７分間続け、さらに１分間高速度で混合し、０．２５ｇ／ｍＬの含湿発泡密度（１００ｍＬ容の容器を満たすのに必要な含湿発泡体の重量から計算する）を得た。発泡体を発泡体に向かってポリエチレンの側面を有するＶｅｒｓｉ−Ｄｒｙベンチプロテクター（Ｎａｌｇｅｎｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ＮＹ、米国）を被覆した高さ２ｍｍの型に注型し、そして３０分間乾燥オーブンで８０℃で乾燥する前に、室温で６０分間カバーすることなく放置した。複数の発泡体の乾燥したシートは孔のサイズおよび厚さが異なるので、それらは幾分異なるように見えた。含湿発泡体材料のゲル化速度はゲル形成イオンによる飽和と相関しているため、孔の合体は、飽和が最低の発泡体について、最もよく生ずる。
【０１６６】
直径２．１ｃｍの円形のパッチを乾燥した発泡体のシートから打ち抜いた。１１１％飽和した発泡体からの発泡体のパッチのいくつかは、２０分間１２１℃でオートクレーブした。
直径３．５ｃｍのペトリ皿に発泡体のパッチを置きそして４ｍＬのモデルの生理学的溶液（２．５ｍＭのＣａＣｌ２および９ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ）を添加することにより、機械的テスト用の発泡体を作った。発泡体を５分間この溶液中に維持し、次にＢｏｈｌｉｎ  ＣＶＯ  １２０  Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｒｈｅｏｍｅｔｅｒに移した。発泡体を、振動測定前に、５００μｍのギャップを有する鋸歯状の刻み目をもつプレート（ＰＰ２５）の間に置いた。応力掃引は、０．５−５０Ｐａの適用されたせん断応力で行われた。周波数を１Ｈｚに設定した。掃引は、それぞれの発泡体のハッチについて３回行われた。線状の粘弾性域（Ｇｌｉｎ）で読み取られる弾性モジュラスＧ′は、表３に示される。テストは、２つの異なる温度で行われた。添加された生理学的溶液の温度、膨潤中および測定中の温度は、２０℃かまたは３７℃の何れかであった。
【０１６７】
【表３】
2010529998.tif 000004
【０１６８】
データは、ゲル形成イオンの量の増加の関数として弾性モジュラスが増えることを示す。オートクレーブの条件は、１１１％飽和で弾性モジュラスに影響しなかったように思われる。
【実施例２】
【０１６９】
この実施例は、ゲル形成イオンが、どのように発泡体から添加したアルギネート溶液へ拡散し、それによりゲル化を誘導するかを示す。弾性モジュラスは、アルギネート溶液が添加された後時間の関数として測定されて、ゲル化の動力学および材料の弾性における増加を示した。コーティングは、このテストには加えられなかった。
【０１７０】
複合物は、発泡体の頂部の表面へピペットからの滴下により溶液を均一に分配することによって、実施例１で製造された同じ６６％および１１１％飽和の発泡体および２５０μＬの１％ＰＲＯＮＯＶＡ  ＵＰ  ＬＶＧ（９９ｍＰａｓ）からの乾いた発泡体円板（直径２．１ｃｍ）から製造された。添加されたアルギネート溶液のすべては吸収され、そしてそれは発泡体を通して孔を満たした。６６％および１１１％飽和の発泡体に存在するカルシウムイオンは、複合物中のアルギネートの全量の４３％および７１％を飽和した。複合物を、アルギネート溶液の添加５分後にレオメーターに移した。ギャップを３００μｍに設定し、周波数およびひずみを、それぞれ１Ｈｚおよび０．００１に保った。時間の関数としての複合物の弾性モジュラスＧは、表４に示される。
【０１７１】
【表４】
2010529998.tif 000005
【０１７２】
結果は、両方の発泡体について時間の関数としての弾性モジュラスの増加を示し、それはアルギネート発泡体から添加したアルギネート溶液へのゲル形成イオンの拡散および得られるゲル化を指示する。Ｇの値は速やかに増加しそして１１１％飽和発泡体では６０分後に一定に達する。６６％飽和発泡体では、Ｇ値はより低く、より遅く増加し、そして結果は、拡散がテストによる１０５分内では完成しなかったことを示す。
【実施例３】
【０１７３】
この実施例は、種々の量のゲル形成イオンを含む発泡体の使用により、そして異なるＧ含量および分子量を有するアルギネート溶液を添加することにより、弾性が、どのように変性されるかを示す。コーティングはこのテストでは加えられなかった。
【０１７４】
テストされた発泡体は、１１１％飽和発泡体、実施例１からオートクレーブされた１１１％飽和発泡体、および実施例１と同様に製造されたが但しＣａＣＯ３の半分が大きな直径のＣａＣＯ３（ＨｕｂｅｒＣＡＬ  ２５０  Ｅｌｉｔｅ，８．７μｍ）により置換された炭酸カルシウムのブレンドを用いた新しい１５５％飽和発泡体であった。この発泡体は、実施例１からの１５５％飽和発泡体より幾分大きな孔を有し、そしてより高い粘度をもつアルギネート溶液をより多く吸収できた。１５５％飽和発泡体の含湿密度は０．２４ｇ／ｍＬであった。発泡体円板（直径２．１ｃｍ）は、実施例１と同じく、ペトリ皿に置かれそしてピペットの使用により２５０μＬのアルギネート溶液をその頂部表面に添加された。添加されたアルギネート溶液のすべては吸収されそしてそれは発泡体を通して孔を満たした。添加されたアルギネート溶液を有する発泡体を含む円板を６０分間室温に保ち、次に４ｍＬのモデルの生理学的溶液を添加した。５分後、円板をレオメーターへ移しそして応力掃引を実施例１に記載したように行ったが、但しギャップを３００μｍに設定した。これらのサンプルについて測定されたＧ′ｌｉｎは、表５に示される。ＰＲＯＮＯＶＡ  ＵＰ  ＬＶＧのＧ含量は約６７％（高いＧ）であるが、一方ＰＲＯＮＯＶＡ  ＳＬＭ  ２０は約４３％Ｇ（高いＭ）を含む。より低い粘度をもつアルギネートのサンプルは、１２１℃で２０分間、それぞれＰＲＯＮＯＶＡ  ＳＬＭ  ２０およびＰＲＯＮＯＶＡ  ＵＰ  ＬＶＧの１％および２％の溶液をオートクレーブにかけることによりアルギネートの分子量の低下によって製造された。
【０１７５】
【表５】
2010529998.tif 000006
【０１７６】
【表６】
2010529998.tif 000007
【０１７７】
データは、１．０％および０．５％の添加されたアルギネートの両者での最高の弾性モジュラスが、添加された高いＧアルギネートを有する１５５％飽和発泡体であったことを示す。アルギネートの分子量は、弾性モジュラスＧ′ｌｉｎが粘度の低下とともに低下するので、高いＧおよび高いＭのアルギネートの両者にとり重要であるが、但し同様な結果が得られる高いＧアルギネートについて０．７５％以下のアルギネート濃度を除く。一般に、弾性モジュラスＧ′ｌｉｎは、１５５％および１１１％飽和の発泡体の両者および４つの異なるアルギネートについて、添加されたアルギネートの濃度が低下するにつれて、低下した。例外は、最低の濃度での低粘度のアルギネートについて観察された。複合物の弾性モジュラスＧ′ｌｉｎは、発泡体をオートクレーブにかけても変更されなかった。
【実施例４】
【０１７８】
この実施例は、複合物材料の粘度が、どのようにして追加のゲル形成イオンを含む溶液中で複合物を洗浄することにより影響されるかを示す。コーティングはこのテストでは加わらなかった。
実施例１の１１１％飽和発泡体からの乾いた発泡体円板（直径約２．１ｃｍ）をペトリ皿に置き、２５０マイクロＬの１％ＰＲＯＮＯＶＡ  ＵＰ  ＬＶＧ（９９ｍＰａｓ）を発泡体の頂部の表面に加え、そして６０分間室温に保持した。次に、複合物を，４ｍＬのＣａＣｌ２の５０ｍＭ溶液またはＳｒＣｌ２の５０ｍＭ溶液の何れか中にインキュベートした。５分後に、余分のゲル形成イオンを含む溶液をモデルの生理学的溶液により置き換え、さらに５分後、実施例１に記載したようにＧ′ｌｉｎを測定した。添加した余分のゲル形成イオンを全く加えなかった他のサンプルに、アルギネートが添加された６０分後にモデルの生理学的溶液を添加し、５分の膨潤後にＧ′ｌｉｎを測定した。結果を表７に示す。
【０１７９】
【表７】
2010529998.tif 000008
【０１８０】
データは、それぞれカルシウムまたはストロンチウムのイオンを含む溶液により複合物を洗浄することにより、弾性モジュラスＧ′ｌｉｎが４倍からほぼ６倍以上増加することを示す。より高い値は、ストロンチウムイオンを含む溶液で洗浄した複合物について得られ、それはカルシウムイオンで洗浄した複合物よりも剛いゲルの網状構造を生成した。
【実施例５】
【０１８１】
この実施例は、アルギネート中で固定化されたＭＤＣＫ（Ｍａｄｉｎ  Ｄａｒｂｙイヌ腎）の増殖および生存可能性が、どのようにしてアルギネート発泡体のカルシウムイオンを変えることにより影響されるか、そして細胞の固定化後複合物に対する添加された追加のゲル形成イオンの影響を示す。コーティングは、このテストでは加えられなかった。
アルギネートのゲル化部位の１００％および２００％を飽和するのに十分なカルシウムイオンを有する２つの異なるアルギネート発泡体が製造された。含湿発泡体の処方物は表８に示される。
【０１８２】
【表８】
2010529998.tif 000009
【０１８３】
アルギネートの水溶液が製造された。次に、混合鉢中でＣａＣＯ３を上述のように水（但し２５ｇを除く）中に分散した。グリセリン、ソルビトールスペシャル、アルギネート水溶液およびＨＰＭＣを同じ鉢に添加し、分散物を、１分間中程度の速度でワイヤー泡立てを備えたＨｏｂａｒｔキッチンエイドミキサーによりブレンドして、均一にした。１００％飽和発泡体について、混合を高速度で３分間続けた。ＧＤＬを次に残りの２５ｇの水に溶解し、含湿発泡体へ添加した。分散物を３０秒間高速度でさらに混合した。１００％発泡体の得られた含湿密度は０．２３ｇ／ｍＬであった。２００％飽和発泡体について、ＧＤＬ添加前に高速度の混合時間は３．５分であった。次に、さらに１５秒の高速度の混合を行った。２００％の発泡体は、０．２６ｇ／ｍＬの含湿密度を有した。両方の発泡体は、高さ１ｍｍのテフロン被覆の型に注がれ、そしてカバーすることなく室温で１５分間保持され、次に３０分間乾燥オーブン中で８９℃で乾燥された。
円板（直径３．６ｃｍ）を、メスにより乾燥した発泡体のシートから切り出し、別々に包装した。発泡体の円板を次に２０分間１２１℃でオートクレーブにかけた。
【０１８４】
滅菌アルギネート（ＰＲＯＮＯＶＡ  ＳＬＧ  １００）を細胞成長媒体（ＭＥＭ）に溶解して１％のアルギネート溶液をつくった。成長培地中のアルギネート溶液およびＭＤＣＫ細胞の懸濁物をブレンドして、０．８％のアルギネートおよび２０００００細胞／ｍＬの最終濃度にした。アルギネート発泡体の円板を６穴プレート（Ｎｕｎｃｌｏｎ（商標）、Ｎａｌｇｅｎｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）の穴へ移し、そこでそれらは穴のサイズにちょうど適合した。１０ｍＬのアルギネート細胞懸濁物をピペットで発泡体のそれぞれへ滴下して加え、そしてアルギネート複合物を２０分間３７℃でインキュベートした。１００％および２００％飽和の発泡体中に存在するカルシウムイオンは、それぞれアルギネートの全量のゲル部位の６７％および１３３％を飽和するのに十分であった。サンプルの半分を、次にそれらを約５ｍＬの５０ｍＭのＣａＣｌ２および１０４ｍＭのＮａＣｌを含む水溶液へ添加することにより、洗浄後処理にかけた。１０分後、塩の溶液を細胞成長培地により置換した。残りのサンプルに細胞成長培地をインキュベーションの２０分後添加した。固定化細胞を有するアルギネート複合物を３７℃に保ち、成長培地を１週３回変えた。
【０１８５】
細胞の増殖および生存可能性の定量は、固定化後異なる時間後に測定された。固定化細胞は、アルギネート複合物を、約８ｍＬの等張性シトレート溶液（５０ｍＭのクエン酸三ナトリウム２水和物および１０４ｍＭのＮａＣｌ）を含む遠心分離管へ移すことにより単離した。複合物が２−１０分内に溶解するまで管を規則的に緩く回転させ、次に５分間１３０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を取り出しそして細胞を含むペレットを１．０ｍＬの２５０ｍＭのマンニトールに再懸濁した。再懸濁したペレットの１００ミクロＬ、８０ミクロＬおよび５０ミクロＬのそれぞれの３つのサンプルを次に９６穴プレート（Ｎｕｎｃｌｏｎ（商標）、Ｎａｌｇｅｎｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）の穴へ移した。次に、零、２０ミクロＬおよび５０ミクロＬのマンニトールをそれぞれ添加し（すなわち、合計１００ミクロＬへ各穴を満たす）、次にさらなる１００ミクロＬの生存／死滅試薬を添加した。生存／死滅試薬は、５ｍＬのマンニトール溶液（２５０ｍＭ）、２０ミクロＬのエチジウム溶液（２ｍＭ）および５μＬのＣａｌｃｅｉｎ溶液（４ｍＭ）から作られた。標準曲線を０−１０６細胞の範囲内の生存しかつエタノール固定細胞から作られた。
【０１８６】
細胞の増殖および生存可能性は、Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒミクロプレートリーダーの使用により測定された。Ｃａｌｃｅｉｎについて使用されるフィルターは４８５ｎｍ（励起）および５３０ｎｍ（発光）であり、エチジウムでは５３０ｎｍ（励起）および６２０ｎｍ（発光）であった。
【０１８７】
【表９】
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【０１８８】
表９のデータは、余分のカルシウムイオンを添加する洗浄工程（より剛いゲル網状構造をもたらす）が細胞の増殖を促進することを示す。細胞の数が時間の経過とともに増大するので、細胞の生存可能性の低下が観察された。
生存／死滅試薬中に浸漬後の蛍光顕微鏡による複合物の調査は、洗浄された複合物のサンプルがより多い細胞の拡がりを有することを示した。
【実施例６】
【０１８９】
この実施例は、マウスからの早く成長する筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２細胞）の増殖および生存可能性が、どのようにして細胞の固定化後の洗浄工程により影響されるか、そして洗浄溶液中のゲル形成イオンのタイプの影響を示す。コーティングはこのテストには加えられなかった。
アルギネート発泡体は、アルギネートを１５５％飽和するのに十分な量でゲル形成イオンとしてカルシウムにより作られた。含湿発泡体処方物は表１０に示される。
【０１９０】
【表１０】
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【０１９１】
含湿発泡体を実施例５に記載された通りに製造されたが、但し水の全量の内３０ｇ中に溶解したＧＤＬの添加前に７分間高速度の混合を行い、次に３０秒の高速度の混合をさらに行った。得られた含湿発泡体の密度は０．２ｇ／ｍＬであり、発泡体は深さ２ｍｍの型（発泡体に向かってポリエチレンの側面を有するＶｅｒｓｉ−Ｄｒｙベンチプロテクターにより被覆されている）に注がれた。発泡体を次にカバーされないまま１時間周囲温度に保ち、次にそれを３０分間８０℃で乾燥オーブン中で乾燥した。
【０１９２】
円板（直径＝２．１ｃｍ）を乾いた発泡体のシートから打ち抜き、そして別々に包装した。発泡体の円板を次に２０分間１２１℃でオートクレーブにかけた。滅菌アルギネート発泡体を１２穴プレート（Ｎｕｎｃｌｏｎ（商標）、Ｎａｌｇｅｎｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）の穴へ移し、それらは穴のサイズに密に適合した。２５０００細胞を含む１％アルギネート溶液（ＰＲＯＮＯＶＡ  ＳＬＧ  ２０）３００μＬをピペットにより発泡体へ滴下して加えた。発泡体に存在するカルシウムは、複合物中のアルギネートの全量の９７％を飽和するのに十分であった。成長培地（Ｄ−ＭＥＭ）を発泡体の３分の１へ添加した。約３ｍＬの等張性カルシウム溶液（５０ｍＭのＣａＣｌ２および２５０ｍＭのマンニトール）を残りの発泡体の半分へ添加し、一方残りの発泡体の他の半分に等張性ストロンチウム溶液（５０ｍＭのＳｒＣｌ２および２５０ｍＭのマンニトール）を加えた。ゲル化溶液は、約２．５分後成長培地により置換された。固定化細胞を含む発泡体を３７℃に保ち、そして成長培地を１週３回変えた。
【０１９３】
細胞の増殖および生存可能性の定量は、固定化後１日および１０週で２回測定された。固定化細胞は、実施例５に記載されたように単離されたが、但し異なる脱ゲル化剤が１日および１０週のテストについて用いられた。細胞固定化後１日でテストされた発泡体を、５０ｍＭのシトレートおよび２５０ｍＭのマンニトールを含む溶液１０ｍＬに溶解した。細胞固定化１０週間後のテストされる発泡体を、添加された５０ｍＭのシトレートを含むＨａｎｋｓ′溶液１０ｍＬに溶解した。回収された細胞のペレットを、１ｍＬの生存／死滅試薬（４ｍＬのＩｓｏｔｏｎ  ＩＩ、１ｍＬのＰｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅ（８５μｇ／ｍＬ）および２０μＬのＣａｌｃｅｉｎ（１ｍｇ／ｍＬ）から製造された）に分散した。蛍光顕微鏡で細胞を数えるために２滴をＢｕｒｋｅｒ計数チェンバーに加え、一方残りの細胞の分散物を６０μｍのナイロンメッシュにより濾過し、次に再懸濁５分後、細胞をＣｏｕｌｔｅｒ  ＥＰＩＣＳ  Ｅｌｉｔｅフローサイトメーターの使用により分析した。
【０１９４】
【表１１】
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【０１９５】
結果は、３つの複合物のすべてにおいて全細胞数の増加を示す。Ｃ２Ｃ１２細胞の増殖は、細胞固定化後追加のカルシウムイオンを含む溶液により洗浄された複合物中の細胞固定化について最も高く促進される。成長の最も遅い細胞は、細胞固定化後ストロンチウムイオンを含む溶液により洗浄された複合物中で固定化された細胞であった。
【０１９６】
蛍光顕微鏡による複合物の検討は、カルシウムイオンにより洗浄された複合物中の固定化された細胞が、構造の上でそしてそれを通って伸長しそして成長することを示した。ストロンチウムイオンにより洗浄された発泡体中の固定化された細胞は、単一の細胞または小さいクラスターとして見ることができた。
【実施例７】
【０１９７】
この実施例は、ヒトの軟骨細胞の増殖および生存可能性が、どのようにしてアルギネート発泡体中のゲル形成イオンの源を変えることにより影響されるか、そして細胞の固定化後の洗浄工程および洗浄溶液中の異なるゲル形成イオンの影響を示す。コーティングは、このテストには加えられなかった。
アルギネート発泡体は、それぞれアルギネートを１５５％および１０５％飽和するのに十分なゲル化イオンとしてカルシウムまたはストロンチウムの何れかによりつくられた。含湿発泡体処方物は表１２に示される。
【０１９８】
【表１２】
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【０１９９】
含湿発泡体は、実施例６に記載したのと同じように製造されたが、但し水全量の内３０ｇの水に溶解したＧＤＬの添加前に高速度混合を８分間行い、そして最終の高速度の混合を４５秒間行った。得られた含湿発泡体の密度は、０．３０ｇ／ｍＬでありそして発泡体を、Ｖｅｒｓｉ−Ｄｒｙベンチプロテクターにより被覆された深さ２ｍｍの型に注いだ。発泡体を次にカバーすることなく１時間周囲温度に保ち、次にそれらを３０分間８０℃で乾燥オーブン中で乾燥した。
【０２００】
滅菌アルギネート発泡体の円板の製造および発泡体への細胞の添加を実施例７に記載されたように行ったが、但し１９５０００細胞／ｍＬを有する１％アルギネート溶液（ＰＲＯＮＯＶＡ  ＳＬＧ  ２０）３００μＬを発泡体へ添加した。存在するゲル形成イオンは、カルシウムイオンでゲル化した発泡体およびストロンチウムでゲル化した発泡体について、それぞれ９７％および６３％アルギネート中のＧモノマーの全量を飽和するのに十分な量であった。
【０２０１】
細胞の増殖および生存可能性の定量は、カルシウムイオンによりゲル化されたアルギネート発泡体（Ｃａ−発泡体）中の細胞の固定化後２週および１１週で２回、そしてストロンチウムカルシウムイオンによりゲル化されたアルギネート発泡体（Ｓｒ−発泡体）では細胞の固定化後１３週で１回測定され、そしてこれらのデータは表１３に示される。固定化された細胞は、実施例６に記載されたように単離されるが、但し１５ｍＬの脱ゲル化溶液（５０ｍＭのシトレートを含むＨａｎｋｓ′）をＳｒ−発泡体について使用した。細胞の定量化用のサンプルの作成およびフローサイトメーターの使用は、実施例６に記載された通りであった。
【０２０２】
【表１３】
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【０２０３】
表１３に記載された結果は、カルシウムイオン溶液により洗浄された複合物中のアルギネートマトリックスが、１１週後他の複合物に比べて少なくとも２倍の細胞を有したことを示す。これは、追加のカルシウムイオンおよび／またはより剛いゲルマトリックスを生ずるその作用による促進された細胞の増殖を示す。結果は、またストロンチウムイオン溶液で洗浄された複合物中のマトリックス中で固定化された細胞に関する阻害された細胞の増殖を示す。同様な傾向は、ストロンチウム発泡体について観察された。カルシウムイオンにより洗浄されたストロンチウム発泡体は、ストロンチウム発泡体のシリーズの最大の細胞の成長を示した。洗浄されない、またはストロンチウムを含む溶液により洗浄されたストロンチウム発泡体は、全細胞数がほとんどまたは全く増加しなかった。増加した細胞の死滅は、細胞が増殖するにつれ、時間の経過とともに観察された。生存細胞の最高の％は、成長が最も遅い細胞を含む複合物について観察された。蛍光顕微鏡による複合物の観察は、カルシウム洗浄複合物中に固定化された細胞が構造の上およびそれを通って延伸しそして成長したことを示した。ストロンチウムイオンにより洗浄された複合物中に固定化された細胞は、単一の細胞または小さいクラスターとして見ることができた。
【実施例８】
【０２０４】
テストされたアルギネート発泡体は、実施例１で得たのと同じであり、そしてアルギネートのゲル化部位の１１１％を飽和させるのに十分なように配合されたカルシウムイオンを有した。直径１．０ｃｍの発泡体円板は、コルクボーラーにより抜き出された。１．１％のアルギネート水溶液は、ＰＲＯＮＯＶＡ  ＵＰ  ＬＶＧ（ＦＰ−５０２−０４）から製造された。このアルギネート溶液をＭＱ−水および蛍光デキストラン（６．２５ｍｇ／ｍＬ）含有溶液により希釈して、表１４に示されるアルギネートの異なる濃度および蛍光デキストランの異なるタイプを有する４つの異なる溶液を得た。アルギネートおよび蛍光デキストランを含む溶液８０μＬをアルギネート発泡体の円板上にピペットで移し、そして１０分後溶液は発泡体中に完全に吸収された。アルギネート発泡体中に存在するカルシウムは、溶液および発泡体中のアルギネートの全量のゲル化部位を６２％飽和させるのに十分であった。発泡体のそれぞれへ添加される蛍光デキストランの量は４５．６３μｇであった。発泡体の円板は、光を避けるためにアルミナフォイルによりカバーされただけで室温に維持された。発泡体の円板のそれぞれは、次に別々に１０ｍＬのＨａｎｋｓ′を含む管中に移された。管を約２０ｒｐｍで水平に攪拌し、そして１００μＬのサンプルを、複合物から漏れてくるかもしれない蛍光デキストランの定量のために集めた。集めたサンプルおよび標準溶液（Ｈａｎｋｓ′中で希釈された１０ｋＤａおよび７０ｋＤａの蛍光デキストラン）中の蛍光デキストランの濃度は、Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒミクロプレートリーダーの使用により分析された。使用されたフィルターは、４８５ｎｍ（励起、バンド幅２０ｎｍ）および５３０ｎｍ（発光、バンド幅２５ｎｍ）であった。標準曲線は、０ｍｇ／ｍＬから０．０１ｍｇ／ｍＬの範囲で５つの平行線を有する両方のタイプの蛍光デキストランから作成された。曲線のあてはめは、１０ｋＤａおよび７０ｋＤａについてそれぞれ相関係数Ｒ２＝０．９９８およびＲ２＝０．９７９をもたらした。
【０２０５】
円板がＨａｎｋｓ′溶液に移された後５，１５、３０、４５、６０、９０、１２０および１５０分に、サンプルを集めた。１５０分後、測定される値は一定に達した。ｆ（ｔ）＝１００−１００ｅ−ｋｔ（ｋ：速度定数、ｔ：時間）により示される非線形フィットカーブおよびＧｒａＦｉｔ  Ｗｏｒｋｓｐａｃｅにおける計算プログラムの使用により、ハーフタイムが決定された。結果は表１４に示される。結果は、蛍光デキストランの２つの分子量の間で放出速度が顕著に異なることを示す。結果は、またより低い濃度のアルギネートで固定化された両方のデキストランのより早い放出を示す。
【０２０６】
【表１４】
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【実施例９】
【０２０７】
この実施例で用いられるアルギネート発泡体は、アルギネートの１２５％を飽和するのに十分なカルシウムが添加された。含湿発泡体消泡物は表１５に示される。
【０２０８】
【表１５】
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【０２０９】
発泡体は、実施例１に記載されたように作られたが、但し含湿密度は０．２４ｇ／ｍＬであり、発泡体は、テフロンにより被覆された高さ２ｍｍの型で注型された。使用された装置は、４時間２５０℃での加熱処理により脱発熱物質処理をされたか、または１ＭのＮａＯＨで洗浄されたかの何れかで処理された。乾いた発泡体は、ガンマ照射（照射量：２９．５ｋＧｙ）により滅菌された。
【０２１０】
滅菌発泡体の円板（直径＝２．１ｃｍ）をコークボーラーの使用により打ち抜き、１２穴プレートの穴に移した。表１６は、製造されたアルギネートおよび細胞（Ｃ２Ｃ１２）の３つの異なるブレンドを示す。細胞を成長培地（ＤＭＥＭ）に懸濁し、そしてＢｕｒｋｅｒ細胞計数チェンバーの使用により定量した。標準のアルギネート（ＰＲＯＮＯＶＡ  ＳＬＧ  ２０、バッチ：２２１１０５）をＤＭＥＭに溶解し、一方ペプチド結合アルギネート（ＮＯＶＡＴＡＣＨ  ＶＡＰＧおよびＮＯＶＡＴＡＣＨ  ＲＧＤ）を２５０ｍＭの万トールに溶解した。アルギネートに結合したペプチドの密度は、ＮＯＶＡＴＡＣＨ  ＶＡＰＧおよびＮＯＶＡＴＡＣＨ  ＲＧＤについてそれぞれ０．０４５μモル／ｍｇの固体および０．０３１μモル／ｍｇの固体であると測定された（アミノ酸法により測定）。
【０２１１】
【表１６】
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【０２１２】
それぞれの懸濁物は、１．０％の全アルギネート濃度を有する。２５０μＬの表１６に示された懸濁物は、各発泡体の円板へ添加され、異なる懸濁物は異なる円板へ加えられた。発泡体中のカルシウムは、アルギネートの全量のＧモノマーを７７％飽和するのに十分な量である。各円板のペプチド濃度は０．０２５μモルであり、細胞の量は１円板あたり２５０００であった。懸濁物は、ピペットの使用により発泡体の上へ注がれた。発泡体は添加された溶液のすべてを吸収し、水和後の厚さは約１．２ｍｍであった。発泡体は、細胞の懸濁物の添加後、インキュベーターへ移され、そして２０分間３７℃に保持された。次に、発泡体の円板の半分に約２．５ｍＬのＤＭＥＭを添加し、一方他の半分に約２．５ｍＬの等張性溶液（５０ｍＭのＣａＣｌ２および２５０ｍＭのマンニトール）を加えた。約５分後、カルシウムイオン含有溶液を添加された発泡体は、この溶液をＤＭＥＭで置換した。
【０２１３】
２日後、細胞を実施例５に記載したように単離したが、但し発泡体の円板を、５０ｍＭのクエン酸三ナトリウムおよび２５０ｍＭのマンニトールを含む溶液に溶解した。遠心分離後の細胞のペレットを６００μＬの２５０ｍＭのマンニトールに再懸濁した。再懸濁されたペレットの１００μＬおよび８０μＬのそれぞれの３つのサンプルを次に９６穴プレートの穴へ移した。次に、零および２０μＬのマンニトールをそれぞれ加え（すなわち各穴を満たして合計１００μＬとした）、次にさらなる１００μＬの生存／死滅試薬を添加した。生存／死滅試薬は、５ｍＬのマンニトール溶液（２５０ｍＭ）、２０μＬのエチジウム溶液（２ｍＭ）および５μＬのＣａｌｃｅｉｎ溶液（４ｍＭ）から作られた。標準曲線は、０−１０５細胞の範囲内の生存しかつエタノール固定細胞から作られた。曲線のフィッティングは、生存および死滅の細胞についてそれぞれ相関係数Ｒ２＝０．９８８およびＲ２＝０．９８４とした。
【０２１４】
各発泡体円板から単離された生存細胞の定量は、実施例５に記載したようにＣｙｔｏｆｌｕｏｒミクロプレートリーダーの使用により測定された。結果は、表１７に示される。死滅細胞に関するシグナルは、すべてのサンプルについてほぼブランク値であり、そのためこれらのデータは示されていない。
【０２１５】
【表１７】
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【実施例１０】
【０２１６】
この実施例は、キトサン発泡体の製法および密度および吸収に関するそれらの特性を示す。
４％のキトサン塩を含む水溶液は、ＰＲＯＴＡＳＡＮ  ＣＬ  ２１０（２１４）を用いて製造された。７７．０ｇのＭＱ−水および１４．０ｇのソルビトール（ドライ）を混合鉢に加え、ソルビトールを鉢を緩くゆすることにより溶解した。１００ｇのキトサン溶液、６．０ｇのグリセリンおよび３．０ｇのＨＰＭＣを同じ混合鉢へ加えた。１分間中程度の速度でワイヤー泡立てを備えたＨｏｂａｒｔキッチンエイドミキサーにより分散物をブレンドして、均一性を確実なものにした。混合を２．５分間高速度で続けた。含湿密度は、０．２３ｇ／ｍＬ（１００ｍＬ容容器を満たすのに必要な含湿発泡体の重量から測定）であると測定された。含湿発泡体は、テフロンにより被覆された高さ２ｍｍおよび４ｍｍの型に注ぎ、次にそれぞれ３０分間および６０分間８０℃で乾燥オーブンに入れた。
【０２１７】
他の発泡体は、上記のように製造されたが、但し含湿発泡体は深さ８ｍｍの型で成型された。発泡体を１時間８０℃で乾燥し次に４０℃で３時間乾燥した。
得られた乾いた発泡体は、可撓性であり柔らかく、開放した孔の網状構造を有した。水を発泡体に添加したとき、それは直ぐに吸収され、そして発泡体は顕著に膨張した。水和された発泡体はその形状を保持したが、含湿発泡体が、その１つの隅を持って取り上げるとき、一体になったものとして移すことができなかったことから比較的弱かった。水和前の乾いた発泡体の圧縮は、発泡体の吸収速度または吸収容量に認められるほど影響しなかった。
【０２１８】
吸収容量を測定するために、発泡体の片をメスを使用して３．５ｃｍ×３．５ｃｍに切断した。発泡体の片の重量を計り、そしてメッシュ（直径０．７１ｍｍ）の上に置き、そしてモデルの生理学的溶液としてＨａｎｋｓ′Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎをピペットを用いて添加した。過剰の液体を添加しそして発泡体は透明になった。発泡体の片からの滴りが観察されなくなったとき、含湿発泡体の重量を測定した。３つの異なる発泡体に関する乾燥密度および吸収容量を計り、そして結果を表１８に示す。
【０２１９】
【表１８】
2010529998.tif 000019
【実施例１１】
【０２２０】
この実施例は、第１の層としてアルギネート発泡体そしてアルギネート発泡体へ付着した第２の層としてキトサン発泡体を含む２層の発泡体材料を示す。このタイプの複合物は、キトサン発泡体の一体性、強さ、生分解および吸収容量を変性するのに使用できる。
【０２２１】
アルギネート発泡体は、先ず４％のアルギネート（ＰＲＯＮＯＶＡ  ＵＰ  ＭＶＧ）を含む水溶液を製造することにより作られた。１１１．２ｇのアルギネート溶液を混合鉢へ移した。同じ鉢に、６．０ｇのグリセリン、１８．０ｇのソルビトールスペシャル３．０ｇのＨＰＭＣ、０．８５ｇのＣａＣＯ３（アルギネートのグルロン残基を１２５％飽和するのに十分な量）および３３．３ｇのＭＱ−水を添加した。分散物を１．５分間中程度の速度でワイヤー泡立てを備えたＨｏｂａｒｔキッチンエイドミキサーによりブレンドして均一性を確実なものにした。混合を７分間高速度で続け、次に２．６９ｇのＧＤＬおよび２５．０ｇのＭＱ−水の新たに混合されたＧＤＬ溶液を添加した。混合を１分間高速度で続けると、０．２３ｇ／ｍＬの含湿密度を有する発泡体を得た。含湿発泡体を、発泡体に向かってポリエチレンの側面を有するＶｅｒｓｉ−Ｄｒｙベンチプロテクターにより被覆されている高さ４ｍｍおよび２ｍｍの型（Ｎａｌｇｅｎｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ＮＹ、米国）に注いた。発泡体を次にカバーされないまま１時間周囲温度に保った。
【０２２２】
次に、含湿キトサン発泡体を、厚さ２ｍｍおよび４ｍｍのゲル化したアルギネート発泡体の頂部へ、それぞれ２ｍｍおよび４ｍｍの層として（型の高さを増すことにより）ゲル化した含湿アルギネート発泡体の頂部に加えた。キトサン発泡体を実施例１０に記載したように作ったが、但し１８．０ｇのソルビトールスペシャルを乾燥ソルビトールの代わりに使用し、そして７３．０ｇのＭＱ−水をこの発泡体へ添加した。中程度の速度での混合時間は２分間であり、次に３分間の高速度の混合を行い、０．２２ｇ／ｍＬの含湿密度をもつ発泡体を得た。２つの層の発泡体をもつ型を次に１．５時間８０℃で乾燥オーブンに入れ、次にそれを３７℃のオーブンに移し、乾燥を１晩続けた。
【０２２３】
得られた乾燥発泡体は、柔らかくかつ可撓性であり、開放した孔の網状構造を有した。アルギネート発泡体の部分の孔は、キトサンから作られた発泡体のより小さかった。乾燥後２つの発泡体のタイプを分離することはできなかった。各発泡体の層は、水を急速に吸収し（始めに添加された滴の吸収時間は、キトサン発泡体について１秒より短くそしてアルギネート発泡体について約３秒であった）、そしてそれらは水和後付着したままであった。水和された発泡体の水和されたアルギネートの部分は、高い引張強さを有するが、一方水和されたキトサンの部分は非常に弱かった。指がキトサン発泡体の側面を押したとき、またはキトサン発泡体が逆（アルギネート発泡体）の側面を押すことによって引っ張られたとき、水和されたキトサン発泡体の片は壊れた。その壊れは剥離ではなかった。
【実施例１２】
【０２２４】
この実施例は、生分解に関連してそれをより安定にしそしてより高い含湿一体性をもたらす、キトサン発泡体を架橋する方法を述べる。
キトサン発泡体は、実施例１１に記載されたように作られたが、但し混合時間は、中程度の速度および高速度の速度でそれぞれ１．５分間および４．５分間であった。得られた含湿発泡体の密度は０．２０ｇ／ｍＬであった。含湿発泡体は、深さ２ｍｍおよび４ｍｍの型に注いだ。次に、Ｎａトリホスフェートの１００ｍＭ溶液を、細かい小滴を生ずるように調節されたノズルを付けた噴霧瓶に満たした。Ｎａトリホスフェート溶液を、２ｍｍのものおよび４ｍｍのものへそれぞれ約５０ｍＬおよび１００ｍＬで含湿発泡体の上に噴霧した。含湿発泡体は、噴霧された溶液のいくらかを吸収し、そして添加は数回、それぞれの添加の間隔が１分より短い時間で行われた。含湿発泡体を、次に２ｍｍの型および４ｍｍの型に注型された発泡体について、それぞれ１時間および２時間で８０℃で乾燥オーブンにより乾燥した。
【０２２５】
乾いた発泡体は、柔らかくかつ可撓性であり、開放した孔の網状構造を有した。発泡体は、水を直ちに吸収しそしてそれらは水和して変形することが少なく、そして実施例１０の非架橋キトサン発泡体より強かった。
【実施例１３】
【０２２６】
この実施例は、ゲル化イオンを含むキトサン発泡体が、その場で外部から添加されたキトサン溶液のゲル化を誘導する能力を有することを示す。
【０２２７】
発泡体の円板（直径２．１ｃｍ）を、実施例１２に示される高さ４ｍｍの型の発泡体の注型物からコルクボーラーを用いて打ち抜いた。発泡体の円板を次に前の実施例で使用したのと同じレオメーター上の鋸歯状のプレートの上に置いた。円板に次にＭＱ−水またはキトサン（ＰＲＯＴＡＳＡＮ  ＵＰ  ＣＬ  ２１３）の１．０％溶液の何れかの過剰を添加した。上方のプレート（ＰＰ２５）を５００μｍのギャップへ下げ、そして応力掃引は０．５−５０Ｐａの適用されたせん断応力で行った。振動測定は、溶液の添加約３分後に開始された。周波数は１Ｈｚに設定された。掃引は、それぞれの発泡体のパッチについて２回行われた。弾性モジュラスＧ′は、線形の粘弾性域（Ｇ′ｌｉｎ）で読み取られ、そして位相角は表１９に報告される。
【０２２８】
【表１９】
2010529998.tif 000020
弾性モジュラスおよび位相角の両者に基づいて、表では、キトサン溶液の添加後発泡体のゲル様性質が示される。
【実施例１４】
【０２２９】
この実施例は、混合時間およびキトサン発泡体中に注入される空気の量が、どのようにして異なる発泡体の性質に影響していることを示す。
【０２３０】
キトサン発泡体は、実施例１０に記載されたように製造されたが、但し異なる混合時間が使用されて異なる発泡体の密度を得た。含湿発泡体を生成するためのすべての成分は、１．５分間中程度の速度で混合された。次に、高速度での混合は１分間続けられ、０．４５ｇ／ｍＬの含湿密度を得た。発泡体のほぼ半分を高さ４ｍｍおよび２ｍｍの型に注いだ。次に、残りの発泡体をさらに１分間高速度で混合した。得られた含湿密度は０．２９ｇ／ｍＬであり、発泡体の残りを上記のように注型した。上記と同様な方法を繰り返したが、但し高速度での混合時間は先ず４５秒であり第２のものは４分４５秒であった。含湿密度は、それぞれ０．５２ｇ／ｍＬおよび０．１８ｇ／ｍＬであった。最高の含湿密度をもつ２つの発泡体は、型に対する表面で生成される薄いフィルムになった。これは、発泡体がその底付近でより徐々に乾燥されるときの孔の合同による。乾燥発泡体の密度は、高さ４ｍｍの型に注型された発泡体から、コルクボーラーを用いて１ｃｍの直径を有する円板を打ち抜きそしてそれを秤量することによって測定された。異なる発泡体の密度およびカリパスで測定された厚さは、表１９に示される。発泡体は、また実施例１０で記載したのと同じレオメーターの設定であるが、但し適用する応力の範囲が０．５−１８Ｐａでありそして各発泡体の片の３つの掃引が行われた弾性モジュラスＧ′ｌｉｎを特徴とした。結果は、表２０に含まれ、１ｃｍの直径をもつ３つの異なる発泡体について２つの最後の掃引の平均値を示す。発泡体の片を約５分間２ｍＬのＨａｎｋｓ′の溶液に保持し、次にそれらをレオメーターへ移した。乾いた発泡体の引張強さをＳＭＳ  Ｔｅｘｔｕｒｅ  ＡｎａｌｙｚｅｒおよびＡ／ＴＧ引張グリップを使用して測定した。破壊されるまで０．５ｍｍ／ｓで発泡体を引っ張ることに必要な力を読み取り、そしてそれが破裂するときの最大の力および距離を表２０に示す。発泡体の片を、メスを用いて骨状に切断した。大きさは、長さ３．１５ｃｍ、幅１．７５ｃｍ（末端）および１．２５ｃｍ（中心）で、末端から１ｃｍのところから狭くなっていた。発泡体をこの形状に切断して、発泡体の中心での破壊を確実に生じさせ、グリップに付着しているところでは破壊が起きないものとした。発泡体の片の各末端の約０．３ｃｍを使用してそれをグリップに固定した。
【０２３１】
【表２０】
2010529998.tif 000021
【０２３２】
表は、最高の含湿密度を有する発泡体が、ほとんど合同という理由によって破壊されることを示す。また、発泡体が含湿密度の増大により孔のサイズを増大させることも観察された。引張強さおよび弾性モジュラスは、空気の量の増加により低下した。また、材料が破裂する前に引っ張られうる長さとして示される材料の弾性は、含湿密度を低下させることにより減少した。３つのより密度の低い材料は、ほぼ同じ弾性を有した。
【実施例１５】
【０２３３】
この実施例は、カルシウムイオンを含むヒアルロン酸（ＨＡ）の製造を述べる。また、外部に添加されたアルギネート溶液のゲル化を誘導するためにこれらのイオンを用いる発泡体の能力が示される。
【０２３４】
２．５％のＨＡを含む水溶液を作った。別に、４９．６５ｇのＭＱ−水、２．３５ｇのＣａＣｌ２２Ｈ２Ｏおよび１０．５ｇのソルビトール（ドライ）を混合鉢に加え、鉢を緩やかに回すことにより乾いた成分を溶解した。１３０ｇのＨＡ溶液、４．５ｇのグリセリンおよび３．０ｇのＨＰＭＣを同じ混合鉢へ添加した。分散物を次に２分間中程度の速度でワイヤー泡立てを備えたＨｏｂａｒｔキッチンエイドミキサーでブレンドして均一性を確保した。混合を高速度の速度で３分５０秒続けた。含湿密度を測ると０．２１ｇ／ｍＬであった（１００ｍＬ容の容器を満たすのに必要な含湿発泡体の重量から測定）。含湿発泡体をテフロンにより被覆された高さ２ｍｍおよび４ｍｍの型に注ぎ、次に５０分間８０℃で乾燥オーブンに入れた。
【０２３５】
コルクボーラーを用いて発泡体の円板（直径２．１ｃｍ）を、高さ４ｍｍの型の発泡体の注型物から打ち抜いた。１．０％および０．５％のアルギネート溶液を、ＭＱ−水の添加によりＰＲＯＮＯＶＡ  ＳＬＧ  ２０（バッチ：２２１１０５）から製造した。乾いた発泡体の円板を、鋸歯状のプレート（ＰＰ２５）の間でＢｏｈｌｉｎ  ＣＶＯ  １２０  Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｒｈｅｏｍｅｔｅｒに置いた。次に、３５０μＬのアルギネート溶液をペピットを使用して加えた。発泡体の円板中のカルシウム含量は、１．０％および０．５％の溶液について、添加されたアルギネートのゲル化残基をそれぞれ１２４％および２４８％飽和するのに十分な量であった。１分後、アルギネート溶液を吸収させそして発泡体を完全に近く水和した。上方のプレートを次に下げて５００μｍのギャップにし、弾性モジュラスＧ′の測定を開始した。周波数、ひずみおよび温度を、それぞれ１Ｈｚ，０．００１および２０℃に設定した。結果を表２１に示す。
【０２３６】
【表２１】
2010529998.tif 000022
【０２３７】
アルギネート溶液の添加直後数分のＧ′の増加は、ゲル化イオンの寄与を確証させ、そしてゲル化反応が開始した。３つの溶液間のＧ′値の相違は、ゲルが生成しつつありそして最強のゲルが最も濃縮されたアルギネート溶液から生成することを確証する。
この実施例は、ホスフェートイオンを配合されたＨＡ発泡体の製造を述べる。また、外部に添加されたキトサン溶液のゲル化を誘導するのにこれらのイオンが寄与している発泡体の能力が示される。
【実施例１６】
【０２３８】
この実施例は、ホスフェートイオンが配合されたＨＡ発泡体の製造を述べる。また、外部に添加されたキトサン溶液のゲル化を誘導するためにこれらのイオンが寄与する発泡体の能力が示される。
【０２３９】
ＨＡ発泡体は、実施例１５に記載されたように作られたが、但しカルシウム源は２．２７ｇのＮａ２ＨＰＯ４により置換しそして使用される水の量は４９．７ｇであった。高速度での混合時間は３分間であって、０．１７ｇ／ｍＬの含湿密度を得た。２ｍｍおよび４ｍｍの型に注型された発泡体を、それぞれ４５分間および７５分間８０℃で乾燥オーブンで保持した。
【０２４０】
実施例Ａに記載されたのと同じレオロージー測定のためのパラメーターを用いた。水および１．０％のキトサン溶液を過剰の量で添加した。弾性モジュラスＧ′および位相角を示す値は、表２２に示される値で一定になった。
【０２４１】
【表２２】
2010529998.tif 000023
結果は、キトサン溶液を添加された発泡体がよりゲル状の挙動を示しそしてＭＱ−水を添加された発泡体より硬いことを示す。
【実施例１７】
【０２４２】
この実施例は、カルシウムイオンを含むキトサン発泡体の製造を述べる。キトサン発泡体中に固定化されたカルシウムは、それが乾いたキトサン発泡体により吸収されたとき、アルギネート溶液のその場のゲル化を誘導した。このような構造物は、細胞の固定化のための生医学の適用に有用であるか、または固定化された医薬、酵素、ホルモンなどのコントロールされた放出をもたらす。
【０２４３】
実施例１１と同じ量および成分を含むが但し２．３５ｇのＭＱ−水が２．３５ｇのＣａＣｌ２２Ｈ２Ｏ（８０ｍＭ）により置換されたキトサン発泡体が作られた。０．２０ｇ／ｍＬの含湿密度を有する含湿発泡体は、それぞれ１．５分および６分の中程度の速度および高速度での混合により作られた。含湿発泡体を、前記のように高さ２ｍｍおよび４ｍｍの型で注型した。次に、それらを１．５時間８０℃の乾燥オーブンに入れた。乾いた発泡体は柔らかくかつ可撓性であり、開放した孔の網状構造を有しそして０．０３９±０．００１ｇ／ｍＬの乾燥密度を有した。発泡体は、水を直ぐに吸収し、実施例１０の同じ厚さの発泡体に似た含湿一体性を有した。実施例１０からの発泡体と比べて、Ｈａｎｋｓ′溶液がこの発泡体へ添加されたときこの発泡体の膨張は小さかった。この発泡体に関するＨａｎｋｓ′溶液の吸収容量は、１６．８±１．９ｇ／発泡体ｇ（３つのサンプルの平均値±ＳＤ）であると測定された。この発泡体の孔は、実施例１０の厚さ４ｍｍの発泡体よりやや大きく、これは、溶液のイオン性強度によるキトサンの粘度の低下のためのより多い合同によって説明できる。
【０２４４】
高さ４ｍｍのトレーで成型された発泡体からの２．１ｃｍの直径をもつ発泡体の円板は、コルクボーラーを使用して打ち抜かれた。乾いた発泡体の円板を鋸歯状のプレート（ＰＰ２５）の間でＢｏｈｌｉｎ  ＣＶＯ  １２０  Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｒｈｅｏｍｅｔｅｒに置いた。次に、５００μＬのアルギネート溶液（ＰＲＯＮＯＶＡ  ＵＰ  ＬＶＧ）をペピットを使用して加えた。発泡体の円板中のカルシウム含量は、添加されたアルギネートのゲル化残基を９６％飽和するのに十分な量であった。１分後、アルギネート溶液が吸収されそして発泡体を完全に近く水和した。上方のプレートを次に下げて１０００μｍのギャップにし、弾性モジュラスＧ′の測定を開始した。周波数、ひずみおよび温度を、それぞれ１Ｈｚ，０．００１および２０℃に設定した。結果を表２３に示す。
【０２４５】
【表２３】
2010529998.tif 000024
アルギネート溶液を添加された発泡体の円板に関するＧ′の高い値、およびアルギネート溶液の添加直後数分中のＧ′の増加は、キトサン発泡体からの添加されたアルギネート溶液へのゲル形成イオンの寄与を確証する。
【実施例１８】
【０２４６】
実施例２−９、１３および１６の方法に従って、コーティングのない複合物を製造する。次に、ＰＲＯＮＯＶＡ  ＳＬＭ２０の５％ｗ／ｖ溶液１ｍＬ（発泡体１ｃｍ２あたり）を発泡体複合物の１つの面上に置き、そして適用された溶液を、５分間ＭＯＰＳ  ＩＸ洗浄緩衝溶液（Ｉｎｏｔｅｃｈ  ＡＧ、Ｄｏｔｔｉｋｏｎ、スイス）中のＣａＣｌ２の１００ｍＭ溶液と接触させる。複合物を次に２回４分間カルシウムのないＭＯＰＳ  ＩＸ緩衝液により洗浄する。次に発泡体の反対の面にＰＲＯＮＯＶＡ  ＳＬＭ２０の５％ｗ／ｖ溶液１ｍＬ（発泡体１ｃｍ２あたり）を適用し、次に適用された溶液とＭＯＰＳ  ＩＸ洗浄緩衝溶液中のＣａＣｌ２の１００ｍＭ溶液とを５分間接触させることにより、複合物の他の面を被覆する。複合物を次に２回４分間カルシウムのないＭＯＰＳ  ＩＸ緩衝液により洗浄する。
【実施例１９】
【０２４７】
成熟したブタドナーからの膵尾を、「Ｔｈｅ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｉｓｌｅｔｓ  ｆｒｏｍ  ｍａｒｋｅｔ  ｗｅｉｇｈｔ  ｐｉｇｓ」Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２００１、１０：２３５−２４６（その全部を本明細書において参考として引用する）に記載されているような改変された静的消化法により消化される。膵臓に、変性ＵＷ−Ｍ溶液に溶解された２−３倍の体積（ｍＬ／ｇ）のＬｉｂｅｒａｓｅ  ＰＩ（Ｒｏｃｈｅ／Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、０．５ｍｇ／ｍＬ）を注入する。適切な拡張を達成するために膵臓に注入し、滅菌１Ｌ容Ｎａｌｇｅｎｅジャーに入れ、そして５０分間３７℃で静的インキュベーションにより消化する。消化は、腺の肉眼による検査に基づいてＨａｍ−Ｆ１０＋２０％ＮＣＳの添加により止められる。細胞の懸濁物を１０００ｐｍの孔のサイズをもつステンレス鋼メッシュを通して濾過し、そしてＨａｍ−Ｆ１０＋２０％ＮＣＳで希釈する。ヒトの膵島の単離で得られた以前のデータに従って、消化した組織を６ｍｍのガラスビーズのベッドおよび５００ステンレス鋼メッシュスクリーンを通す。組織流出液を、２５０ｍＬ容の円錐管中の３−４Ｌの冷Ｈａｍ−Ｆ１０＋２０％ＮＣＳにより集め、そして４℃で７００ｒｐｍで遠心分離する。予備遠心分離カラム（平均８管）後集めた膵島、細胞および血液成分屑を次に４℃で遠心分離する（３分間６３０ｇ）。すべての細胞状のペレットを１つの管にプールし、そして２００ｍＬのＨａｍ−Ｆ１０培地に懸濁する。この懸濁物から、１００μＬの一部を取り出してジチゾン染色後消化の結果を評価する（単離の結果参照）。細胞を次に４℃（５分間２８０ｇ）で遠心分離し、上清を取り出しそして細胞を、勾配管（ｎａｌｇ３１２２−０２５０；ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｌｅｕｖｅｎ、ベルギー）における精製のために７５ｍＬのＦｉｃｏｌｌ  Ｅｕｒｏｃｏｌｌｉｎｓ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、Ｈｅｍｄｏｎ、米国）溶液に懸濁する。
【０２４８】
静的方法により単離された膵島を、不連続Ｆｉｃｏｌｌ  Ｅｕｒｏ−Ｃｏｌｌｉｎｓ勾配で４℃で精製する。７５ｍＬのＦｉｃｏｌｌ  Ｅｕｒｏ−Ｃｏｌｌｉｎｓ溶液（密度＝１．１ｇ／ｃｍ３）に懸濁した消化後の細胞状ペレットを平底管に入れる。Ｆｉｃｏｌｌの低い勾配を次に連続して添加する（５０ｍＬの１０９６ｇ／ｃｍ３；５０ｍＬの１０６０ｇ／ｃｍ３および２０ｍＬのＨａｍ−Ｆ１０培地）。１７分間８５６ｇで勾配管の遠心分離後、膵島を１．１／１．０９６および１．０９６／１．０６０のインターフェースから集める。各インターフェースからの膵島を５０ｍＬのＨａｍ−Ｆ１０＋２０％ＮＣＳ血清を含む２つの管に懸濁する。管を３分間２８０ｇで遠心分離し、上清を取り出しそして細胞を１５０ｍＬのＨａｍ−Ｆ１０培地で洗浄する。この方法を３回繰り返し、そして最後に膵島を単離の結果の検討のために２００ｍＬのＨａｍ−Ｆ１０培地に懸濁する。
【０２４９】
実施例６の方法に従って、発泡体の円板（直径２．１ｃｍ）を作る。発泡体の円板を１２穴プレート（Ｎｕｎｃｌｏｎ（商標）、Ｎａｌｇｅｎｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）の穴へ移すと、それらは穴のサイズに密に適合する。３００μＬの０．５％ｗ／ｖ  ＮＯＶＡＴＡＣＨ  ＲＧＤ溶液（成熟したブタの膵臓の細胞３００００を含む）をピペットで発泡体へ滴下して広げる。発泡体を次に３７℃で２０分間インキュベートする。
【０２５０】
次に、ＰＲＯＮＯＶＡ  ＳＬＭ２０の５％ｗ／ｖ溶液またはＰＲＯＮＯＶＡ  ＳＬＭ１００の３％溶液のアルギネートマトリックスの溶液を、１ｍＬの注射器を用いて発泡体複合物の１つの表面の上に適用し、そして適用された溶液を、ＭＯＰＳ  ＩＸ洗浄緩衝溶液（Ｉｎｏｔｅｃｈ  ＡＧ、Ｄｏｔｔｉｋｏｎ、スイス）中のＣａＣｌ２の１００ｍＭ溶液と５分間接触させる。複合物を次に２回４分間カルシウムのないＭＯＰＳ  ＩＸ緩衝液により洗浄する。培養後、発泡体の反対の面にわたって１ｍＬの注射器を用いてＰＲＯＮＯＶＡ  ＳＬＭ２０またはＰＲＯＮＯＶＡ  ＳＬＭ１００の１％ｗ／ｖの溶液を適用し、次に適用された溶液とＭＯＰＳ  ＩＸ洗浄緩衝溶液中のＣａＣｌ２の１００ｍＭ溶液とを５分間接触させることによって発泡体の他の面を被覆する。複合物を次に４分間カルシウムのないＭＯＰＳ  ＩＸ緩衝液により洗浄する。
【実施例２０】
【０２５１】
アルギネート発泡体は、アルギネート、可塑剤、発泡剤および徐々に加水分解する酸の水溶液のゲル化剤分散物（例えばＣａＣＯ３）を機械的に攪拌することにより製造される。ｐＨのゆるやかな低下の結果、カルシウムイオンは粒子から放出され、それによりアルギネート発泡体の構造物のコントロールされた架橋を誘導する。含湿アルギネート発泡体は、攪拌後、ポリエステルメッシュを含む平らな型中に注がれる。ゲル化が完了した後、メッシュを含む発泡体を３５−８０℃のオーブンで風乾する。発泡体を次に約１ｃｍ２の面積を有する円または正方形に切断し、そしてオートクレーブまたは照射により滅菌される前に、シールされた包装に入れられる。
【０２５２】
移植前日に膵島を、ドナー動物またはヒトから精製し、そしてピペットを用いて０．８％のＮＯＶＡＴＡＣＨ  ＲＧＤを含む懸濁物としてペトリ皿の発泡体へ注意深く適用する。これは、膵島を発泡体−ゲル形成構造物に捕捉させることを可能にする。数分後、高含量のマンヌロン酸を有する選択されたアルギネート（ＰＲＯＮＯＶＡ  ＳＬＭ２０）を、５％の濃度で、ペトリ皿に数滴として注意深く加える。膵島を含む発泡体は、粘度の高いアルギネート溶液の頂部に置かれ、そしてそれが完全に被覆されるまで、さらに数滴を発泡体構造物の頂部へ添加する。ＭＯＰＳ緩衝液中の１００ｍＭのＣａＣｌ２溶液を、次に発泡体−ゲルが溶液により完全にカバーされるまで、注意深くペトリ皿へ満たし、それによりゲル−構造物をゲル化イオンにより完全に飽和させる。約５分後、ＣａＣｌ２溶液を、５ｍＭのＣａＣｌ２および５ｍＭのＳｒＣｌ２を含む膵島に適合された培養培地により置換する。これは、発泡体−ゲル構造物がさらに再調整されそして安定化されることを可能にする。約２時間後、培地を、追加のカルシウムまたはストロンチウムのない細胞培地へ再び変える。装置は、皮下の移植が次の日に糖尿病の霊長類の動物で行われるまで、ＣＯ２インキュベーターで貯蔵される。装置は、数ヶ月身体のインスリンを制御するようにデザインされ、そして後ほど同様な装置により置換できる。
【０２５３】
本明細書に記載したものに加えて、本発明の種々の改変は、当業者にとって前述から明らかであろう。このような改変は、また請求の範囲の範囲内に入ることを目的としている。本出願で引用されたすべての特許、特許出願および文献を含むそれぞれの参考文献は、その全体を参考として引用される。
【実施例２１】
【０２５４】
この実施例で用いられるアルギネートは、アルギネートの７５％を飽和するのに十分なカルシウムが添加された。含湿発泡体処方物は、表２４に示される。
【０２５５】
【表２４】
2010529998.tif 000025
【０２５６】
発泡体は、実施例１に記載したように製造されたが、但し高速度の混合時間は、ＧＤＬ溶液の添加前では６分であり、その後では１．５分であった。発泡体の得られた含湿密度は０．２２ｇ／ｍＬであった。発泡体を次にテフロンにより被覆された高さ２ｍｍの型に注いだ。次に、円形のマクロ細孔フィルター（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｍｅｓｈマクロ細孔フィルター、直径５５ｍｍ、メッシュの開口３００μｍ、オープン面積４４％、厚さ２５８μｍ、ａｒｔ．１４８３００、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．Ｒａｎｃｈｏ  Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ、ＣＡ，米国）を発泡体の頂部に置き、そして型の高さが、追加のフレームを加えることにより２ｍｍ高くなり、そして含湿発泡体の層がフィルターの頂部へ加えられた。多層の材料を次にカバーされることなくゲル化中１時間周囲温度に保持し、次にそれを１時間８０℃で乾燥した。別に、含湿発泡体を、テフロンと発泡体との間に置かれたフィルターを有するかまたは有しないテフロン被覆型（高さ２ｍｍ）の頂部へ注いだ。発泡体を次に１時間ゲル化し、そしてそれらを重ね、フィルターを間にはさむ発泡体を得た。発泡体を次に１時間８０℃で乾燥した。乾燥した発泡体の両者は同じように見えたが、始めに記載した方法が、最も容易なため好ましかった。
【０２５７】
ＳｉＬｉビーズ（商標）（タイプ：ＺＹ  Ｐｒｅｍｉｕｍ（焼結したジルコニアビーズ、イットリウム安定化）、０．１−０．２ｍｍ、ａｒｔ．：９７０１５、Ｓｉｇｍｕｎｄ  Ｌｉｎｄｎｅｒ  ＧｍｂＨ、Ｗａｒｍｅｎｓｔｅｉｎａｃｈ、ドイツ）を次に０．６％のアルギネート溶液（ＰＲＯＮＯＶＡ  ＵＰ  ＬＶＧ、ＦＰ−５０２−０４）中に懸濁しそしてピペットを用いて発泡体の上に注いだ。１０分後、発泡体を光学顕微鏡を用いて調査し、ビーズが種々のレベルで発泡体を通して分配されているのを見た。ＳｉＬｉビーズは、いくつかの細胞のサイズに対する同様なサイズの粒子が、発泡体の上に次に注がれるアルギネート溶液中の懸濁物として添加されるとき、発泡体内に分配されているかどうかを決めるために選ばれた。
【図１】
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【国際調査報告】
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