(57)【要約】感染性Ｃ型肝炎ウイルスの産生のための組織培養系を記述する。特に、本発明は、野生型ＨＣＶ２ａ型株ＪＦＨ１の産生のためのコンストラクトと、株ＪＦＨ１由来のＨＣＶタンパク質および第２のＨＣＶ分離株（例えば、１ａ型Ｈ７７、１ｂ型Ｃｏｎ１、または３ａ型ＮＺ１もしくは４５２）を有するキメラウイルスの産生のためのコンストラクトとを含むウイルスの産生のための組換えモノシストロン性ゲノムコンストラクトおよびバイシストロン性ゲノムコンストラクトを提供する。本発明のコンストラクトは、また、培養物中のＲＮＡ複製およびウイルス感染力の測定を容易にするレポーター遺伝子を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）モノシストロン性ゲノムコンストラクトであって、５’から３’の順に
ａ）ＨＣＶ５’非翻訳領域またはその機能的な部分と、
ｂ）ＪＦＨ１コアタンパク質のＮ末端フラグメントのコード配列を含むポリヌクレオチドであって、該Ｎ末端フラグメントが該ＪＦＨ１コアタンパク質の少なくとも最初の１２の残基から最大最初の１８の残基までを含み、該ＪＦＨ１コアタンパク質の該Ｎ末端フラグメントの該コード配列がレポーター遺伝子に結合される、ポリヌクレオチドと、
ｃ）口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａプロテアーゼのコード配列と、
ｄ）ユビキチンプロテアーゼ切断部位のコード配列と、
ｅ）ＨＣＶ株またはＪＦＨ１以外の分離株由来のコア、Ｅ１、Ｅ２、およびｐ７領域；ＨＣＶ株またはＪＦＨ１以外の分離株由来のＮＳ２のＮ末端部分およびＪＦＨ１由来のＮＳ２のＣ末端部分を有するキメラＮＳ２領域；ならびにＪＦＨ１由来のＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ、およびＮＳ５ｂの領域を含むＨＣＶポリタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、
ｆ）ＨＣＶ３’非翻訳領域またはその機能的な部分と、
を含む組換えＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）モノシストロン性ゲノムコンストラクト。
【請求項２】
請求項１に記載の組換えＨＣＶゲノムコンストラクトであって、
ａ）配列番号８のヌクレオチド７からヌクレオチド１０９５３までの連続した配列を含むポリヌクレオチドと、
ｂ）配列番号９のヌクレオチド７からヌクレオチド１０９５３までの連続した配列を含むポリヌクレオチドと、
ｃ）配列番号１０のヌクレオチド７からヌクレオチド１０９７１までの連続した配列を含むポリヌクレオチドと、
ｄ）配列番号１６のヌクレオチド３５からヌクレオチド９７２３までの連続した配列を含むポリヌクレオチドと、
ｅ）ａ）乃至ｄ）のポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドと、
ｆ）ａ）乃至ｅ）のＲＮＡ相当物と、
からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む、組換えＨＣＶゲノムコンストラクト。
【請求項３】
前記ＨＣＶ株またはＪＦＨ１以外の分離株がＨＣＶ１ａ型、１ｂ型、２ａ型、２ｂ型、３ａ型、３ｂ型、４型、５型、および６型からなる群から選択される、請求項１に記載の組換えＨＣＶゲノムコンストラクト。
【請求項４】
前記ＨＣＶ株または分離株がＨ７７Ｃ、Ｃｏｎ１、ＮＺ１、もしくは４５２である、請求項３に記載の組換えＨＣＶゲノムコンストラクト。
【請求項５】
前記レポーター遺伝子がホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、または緑色蛍光タンパク質をコードする、請求項１に記載の組換えＨＣＶゲノムコンストラクト。
【請求項６】
請求項１に記載の組換えＨＣＶゲノムコンストラクトを含む、ベクター。
【請求項７】
配列番号８乃至１０および配列番号１６からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
ＨＣＶポリタンパク質をコードするポリヌクレオチドに作動可能に結合されたＴ７プロモーターをさらに含む、請求項６に記載のベクター。
【請求項９】
請求項１乃至５のいずれかに記載の組換えＨＣＶゲノムコンストラクトを含む、ＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物。
【請求項１０】
感染性ＨＣＶ粒子の産生のための組織培養系であって、請求項９に記載のＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物をトランスフェクトした、ＨＣＶ感染を支持することが可能な細胞を含む、組織培養系。
【請求項１１】
前記細胞が肝細胞である、請求項１０に記載の組織培養系。
【請求項１２】
ＲＮＡサイレンシング抑制因子をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１０または１１に記載の組織培養系。
【請求項１３】
前記ＲＮＡサイレンシング抑制因子がウイルス粒子の収量を増加させるインフルエンザウイルスのＮＳ１ポリペプチドまたはその機能的フラグメントである、請求項１２に記載の組織培養系。
【請求項１４】
前記ＮＳ１ポリペプチドがウイルス粒子の収量を増加させる配列番号１５のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを含む、請求項１３に記載の組織培養系。
【請求項１５】
前記ＲＮＡサイレンシング抑制因子をコードする前記ポリヌクレオチドが、配列番号１１乃至１４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１３に記載の組織培養系。
【請求項１６】
ＣＤ８１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１０または１１に記載の組織培養系。
【請求項１７】
前記肝細胞がヒト組織に由来する、請求項１１に記載の組織培養系。
【請求項１８】
前記肝細胞が肝細胞癌の細胞である、請求項１７に記載の組織培養系。
【請求項１９】
前記肝細胞がＨｕｈ７、Ｈｕｈ７．５、Ｓｉｅｎａ８、Ｈｕｈ７Ｃ、およびＴ７−１１からなる群から選択される細胞系に由来する、請求項１７に記載の組織培養系。
【請求項２０】
前記肝細胞がインターフェロンで治癒されている、請求項１１に記載の組織培養系。
【請求項２１】
前記ＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物の複製が、該ＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物が前記細胞に導入されてから少なくとも１０日間維持される、請求項１１に記載の組織培養系。
【請求項２２】
前記ＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物の複製が、該ＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物が前記細胞に導入されてから少なくとも２０日間維持される、請求項２１に記載の組織培養系。
【請求項２３】
前記ＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物の複製が、該ＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物が前記細胞に導入されてから少なくとも３０日間維持される、請求項２２に記載の組織培養系。
【請求項２４】
前記ＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物から産生されるウイルスの感染力が、該ＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物が前記細胞に導入されてから少なくとも９日間維持される、請求項１１に記載の組織培養系。
【請求項２５】
前記ＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物から産生されるウイルスの感染力が、該ＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物が前記細胞に導入されてから少なくとも１５日間維持される、請求項２４に記載の組織培養系。
【請求項２６】
組織培養でＨＣＶを生成するための方法であって、請求項９に記載のＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物を細胞にトランスフェクトすることと、該組換えＨＣＶゲノムコンストラクトの複製およびに感染性ウイルス粒子の培養培地への分泌に適した条件下で、該培養培地で該細胞を増殖させることとを含む、方法。
【請求項２７】
前記ＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物を前記細胞にトランスフェクトする前に、ＲＮＡサイレンシング抑制因子をコードするポリヌクレオチドを該細胞にトランスフェクトすることをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＲＮＡサイレンシング抑制因子がウイルス粒子の収量を増加させるインフルエンザウイルスのＮＳ１ポリペプチドまたはその機能的フラグメントである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＮＳ１ポリペプチドがウイルス粒子の収量を増加させる配列番号１５のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＲＮＡサイレンシング抑制因子をコードする前記ポリヌクレオチドが配列番号１１乃至１４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
ＣＤ８１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞がヒト組織に由来する肝細胞である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
前記肝細胞が肝細胞癌の細胞である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記肝細胞がＨｕｈ７、Ｈｕｈ７．５、Ｓｉｅｎａ８、Ｈｕｈ７Ｃ、およびＴ７−１１からなる群から選択される細胞系に由来する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記肝細胞がインターフェロンで治癒されている、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
請求項２６乃至３５に記載の方法のいずれかによって産生される、キメラＣ型肝炎ウイルス。
【請求項３７】
請求項９に記載のＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物を含む、キメラＣ型肝炎ウイルス。
【請求項３８】
ＨＣＶ感染を支持することができる細胞および請求項７に記載のベクターを含む、キット。
【請求項３９】
ＨＣＶ感染を支持することができる細胞および請求項９に記載のＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物を含む、キット。
【請求項４０】
前記細胞が前記ＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物をトランスフェクトした肝細胞である、請求項３９に記載のキット。
【請求項４１】
ＲＮＡサイレンシング抑制因子をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項３８乃至４０のいずれかに記載のキット。
【請求項４２】
前記細胞が、ＲＮＡサイレンシング抑制因子をコードする前記ポリヌクレオチドをトランスフェクトされる、請求項４１に記載のキット。
【請求項４３】
前記ＲＮＡサイレンシング抑制因子がウイルス粒子の収量を増加させるインフルエンザウイルスのＮＳ１ポリペプチドまたはその機能的フラグメントである、請求項４２に記載のキット。
【請求項４４】
前記ＮＳ１ポリペプチドがウイルス粒子の収量を増加させる配列番号１５のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを含む、請求項４３に記載のキット。
【請求項４５】
前記ＲＮＡサイレンシング抑制因子をコードする前記ポリヌクレオチドが配列番号１１乃至１４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項４３に記載のキット。
【請求項４６】
ＣＤ８１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項３９に記載のキット。
【請求項４７】
前記細胞が、ＣＤ８１ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドをトランスフェクトされる、請求項３９に記載のキット。
【請求項４８】
前記肝細胞がヒト組織に由来する、請求項３９に記載のキット。
【請求項４９】
前記肝細胞が肝細胞癌の細胞である、請求項４８に記載のキット。
【請求項５０】
前記肝細胞がＨｕｈ７、Ｈｕｈ７．５、Ｓｉｅｎａ８、Ｈｕｈ７Ｃ、およびＴ７−１１からなる群から選択される細胞系に由来する、請求項４８に記載のキット。
【請求項５１】
前記肝細胞がインターフェロンで治癒されている、請求項４８に記載のキット。
【請求項５２】
抗ＨＣＶ活性を有する化合物を同定する方法であって、
ａ）化合物で請求項１０に記載の組織培養系を処理することと、
ｂ）該化合物で処理した該組織培養系におけるＨＣＶ複製、ＨＣＶタンパク質の発現、またはウイルス感染力を、該化合物で処理しない該組織培養系と比較することとを含み、該化合物で処理した該組織培養系におけるＨＣＶ複製、ＨＣＶタンパク質の発現、またはウイルス感染力のレベルの減少が抗ＨＣＶ活性を有する化合物を示している、方法。
【請求項５３】
抗ＨＣＶ活性を有する抗体を同定する方法であって、
ａ）該抗体で請求項１０に記載の組織培養系を処理することと、
ｂ）該抗体で処理した該組織培養系におけるＨＣＶ複製、ＨＣＶタンパク質の発現、またはウイルス感染力を、該抗体で処理しない該組織培養系と比較することと、
を含み、該抗体で処理した該組織培養系におけるＨＣＶ複製、ＨＣＶタンパク質の発現、またはウイルス感染力のレベルの減少が抗ＨＣＶ活性を有する抗体を示している、方法。
【請求項５４】
組織培養でＨＣＶを生成する方法であって、請求項９に記載のＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物を細胞にトランスフェクトすることと、該ＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物の複製および感染性ウイルス粒子の培養培地への分泌に適した条件下で、該培養培地で該細胞を増殖させることとを含み、該トランスフェクトした細胞がＣＤ８１およびインフルエンザのＮＳ１ポリペプチドを発現する、方法。
【請求項５５】
前記ＮＳ１ポリペプチドがウイルス粒子の収量を増加させる配列番号１５のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記トランスフェクトした細胞が配列番号１１乃至１４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記細胞が肝細胞であり、かつヒト組織に由来する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
前記肝細胞が肝細胞癌の細胞である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記肝細胞がＨｕｈ７、Ｈｕｈ７．５、Ｓｉｅｎａ８、Ｈｕｈ７Ｃ、およびＴ７−１１からなる群から選択される細胞系に由来する、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記肝細胞がインターフェロンで治癒されている、請求項５７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、米国特許法§１１９（e）の下、200６年８月２２日に出願された、仮出願第６0/８３９，６０８号の利益を主張する。この出願は、その全体が参考として本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は、感染性Ｃ型肝炎ウイルスの産生のための組織培養系に関する。
【背景技術】
【０００３】
C型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、１０年以上前に同定され、現在では非Ａ型肝炎および非Ｂ型肝炎の主な原因であることが知られている（Ｃｈｏｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  （１９８９）  ２４４：３５９−３６２；Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  （２０００）  ３１：７７７）。ＨＣＶは、世界人口のおよそ３％、すなわち推定２億の人々を感染させている（Ｃｏｈｅｎ，  Ｊ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （１９９９）  ２８５：２６）。米国では毎年、新たに約３万の後天性ＨＣＶ感染症が発生している。さらに、発展途上国ではＨＣＶ感染症が高発生率で存在する。免疫応答がＨＣＶ感染を排除することが可能であるが、感染症の大多数は、慢性化する。急性感染症の大部分は無症候のまま経過し、肝疾患は、通常、数年の慢性感染症からのみ発症する。
【０００４】
この配列を取得する方法が公知であるように、ＨＣＶのウイルスゲノム配列は公知である。例えば、特許文献１、特許文献２および特許文献３を参照。ＨＣＶは、９．５ｋｂのプラスセンス、一本鎖ＲＮＡゲノムを有し、ウイルスのフラビウイルス科の一種である。系統発生解析に基づいて、少なくとも６種類の異なるが、関連するＨＣＶ遺伝子型が同定されている（Ｓｉｍｍｏｎｄｓら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）  ７４：２３９１−２３９９）。このウイルスは、約３０００アミノ酸残基を有する単一のポリタンパク質をコードする（Ｃｈｏｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  （１９８９）  ２４４：３５９−３６２；  Ｃｈｏｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  （１９９１）  ８８：２４５１−２４５５；  Ｈａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  （１９９１）  ８８：１７１１−１７１５）。
【０００５】
特に、いくつかのタンパク質は、ＨＣＶゲノムによってコードされる。ＨＣＶポリタンパク質の切断産物の順序および命名法は、以下の通りである。すなわち、ＮＨ２−Ｃ−Ｅ１−Ｅ２−ｐ７−ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４ａ−ＮＳ４ｂ−ＮＳ５ａ−ＮＳ５ｂ−ＣＯＯＨ。別のタンパク質（Ｆ）も同定されており、Ｃ遺伝子内の翻訳フレームシフトの結果起こる。Ｂｒａｎｃｈら、Ｓｅｍｉｎ．Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓ．（２００５）  ２５：１０５−１１７。ポリタンパク質の最初の切断は、３つの構造タンパク質、Ｎ末端ヌクレオカプシドタンパク質（コアと称される）、および２つのエンベロープ糖タンパク質（ｇｐＥ１（Ｅとしても公知である）およびｇｐＥ２（Ｅ２／ＮＳ１としても公知である））、ならびにウイルス酵素および他の活性をコードする非構造（ＮＳ）タンパク質を遊離させる宿主プロテアーゼによって触媒される。ＮＳ領域は、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４、およびＮＳ５と称される。ＮＳ２は、タンパク質分解活性を有する膜内在性タンパク質であり、ＮＳ３と組み合わせてＮＳ２−ＮＳ３接合部を切断する。そのＮＳ４ａ補助因子とともにＮＳ３プロテアーゼは、残存するポリタンパク質をプロセシングするのに役立つ。これらの反応において、ＮＳ３は、１つのＮＳ３補助因子（ＮＳ４ａ）、２つのタンパク質（ＮＳ４ｂおよびＮＳ５ａ）、ならびにＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＮＳ５ｂ）を遊離させる。ポリタンパク質成熟の完了は、ＮＳ３−ＮＳ４ａ接合部での自己触媒的切断によって開始され、ＮＳ３セリンプロテアーゼによって触媒される。
【０００６】
ＨＣＶ感染症に対する抗ウイルス剤およびワクチンの開発は、ＨＣＶ複製のための適切な動物モデルまたは細胞培養系が欠けていることによって妨げられてきた。ＨＣＶは細胞培養では十分に増殖しないことが分っており、培養細胞でより効率的に増殖するサブゲノムレプリコンを使用することよっても感染性ウイルス粒子の生成に失敗している（Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒら、（２０００）  Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８１：１６３１−１６４８；  Ｌｏｈｍａｎｎら、（１９９９）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：１１０−１１３；  Ｉｋｅｄａら、（２００２）  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：２９９７−３００６；  Ｐｉｅｔｓｃｈｍａｎｎら、（２００２）  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：４００８−４０２１）。さらに、既存する複製系は、一部の抗ウイルス戦略を試験するには不十分であることが分っている。非構造ウイルスタンパク質を発現させるだけである自己複製のサブゲノムレプリコンに基づく複製系は、抗ウイルス介入に向けられ得るＨＣＶウイルスのライフサイクルのすべての手順を模倣しない。ＨＣＶ前駆体を安定にトランスフェクトされるが、ＨＣＶのＲＮＡ複製が不可能である細胞系を用いて、ウイルスＲＮＡ複製を遮断する抗ウイルス剤をスクリーニングすることはできない。１つのシストロン上にＨＣＶ２ａ型株ＪＦＨ１からの配列および第２のＨＣＶ株からの配列を含み、別のシストロン上に転写および感染をモニタリングするレポーター遺伝子を含むキメラコンストラクトを利用することによって、細胞培養中のバイシストロン性人工ＨＣＶゲノムコンストラクトから感染性ウイルスが産生され得ることを、最近、Ｐｉｅｔｓｃｈｍａｎｎらは実証した（ＰＮＡＳ  （２００６）  １０３：７４０８−７４１３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第８９／０４６６９号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９０／１１０８９号パンフレット
【特許文献３】国際公開第９０／１４４３６号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、ＨＣＶの産生のための改善された組織培養系の必要性、および抗ウイルス治療法の試験において用いられることが可能な感染性ＨＣＶ粒子を費用対効果が高くかつ効率的に産生することのできる組織培養系の開発の必要性が依然として残っている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、感染性ＨＣＶ粒子の産生のための確実な細胞培養系の開発に基づく。特に、本発明は、ＨＣＶ（例えば、肝細胞または他の肝臓由来の一次細胞または腫瘍細胞系）に感染することが可能な細胞において野生型ＨＣＶウイルスおよびキメラＨＣＶウイルスを増殖させる方法を提供する。本方法は、野生型ＨＣＶ２ａ型株ＪＦＨ１の産生のためのコンストラクトおよびキメラウイルス（株ＪＦＨ１由来のＮＳ３〜ＮＳ５ｂおよびＮＳ２のＣ末端部分を含む）の産生のためのコンストラクトを含むウイルスの産生のための組換えモノシストロン性およびバイシストロン性のゲノムコンストラクトと、第２のＨＣＶ分離株（例えば、１ａ型Ｈ７７Ｃ、１ｂ型Ｃｏｎ１、または３ａ型ＮＺ１もしくは４５２）由来のＮＳ２のコア〜ｐ７およびＮ末端部分とを利用する。本発明のコンストラクトは、培養物中のＲＮＡ複製およびウイルス感染力の測定を容易にするレポーター遺伝子も含み得る。細胞培養系は、ウイルスの複製または感染力を向上させる種々の因子（例えば、宿主防御経路を抑制するＲＮＡサイレンシング抑制因子（例えばインフルエンザウイルスのＮＳ１ポリペプチド）または宿主細胞へのウイルス侵入を容易にするＣＤ８１）も含み得る。さらに、細胞培養で増殖させたＨＣＶを用いる中和アッセイを記述する。このアッセイによって測定される中和力価は、ワクチン接種された動物においてＨＣＶ感染の予防効果と十分に関連することが判明している。
【００１０】
従って、主題の発明は、以下の実施形態によって表されるが、これらに限定されない。
【００１１】
一態様において、本発明は、ＪＦＨ１コアタンパク質の任意の数の残基（例えば、ＪＦＨ１コアタンパク質の１〜１２、１〜１３、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１７、１〜１８残基）を含み、少なくとも最初の１２残基から最大最初の１８残基までを有するＪＦＨ１コアタンパク質のＮ末端フラグメントのコード配列を有する第１のシストロンを有する組換えＨＣＶバイシストロン性ゲノムコンストラクトを含む。ここで、ＪＦＨ１コアタンパク質のＮ末端フラグメントのコード配列は、レポーター遺伝子を有するフレームに結合してフレーム内で翻訳され、単一のポリペプチド融合産物を生成する。レポーター遺伝子の後には、第２のシストロンの翻訳のための内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）が続く。第２のシストロンは、コア、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ、およびＮＳ５ｂの領域のための読み取り枠を有するＨＣＶポリタンパク質のコード配列を含む。ここで、ＨＣＶポリタンパク質のＮＳ２のＣ末端部分、ならびにＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ、およびＮＳ５ｂの領域はＪＦＨ１に由来し、コア、Ｅ１、Ｅ２、およびｐ７の領域、ならびにＮＳ２のＮ末端部分は第２のＨＣＶ分離株に由来する。第２の分離株は、ＪＦＨ１と同一または異なるサブタイプであってもよい。好ましくは、第２の分離株は、ＪＦＨ１と異なるサブタイプである。非ＪＦＨ１株または分離株は、ＨＣＶ１ａ型、１ｂ型、２ａ型、２ｂ型、３ａ型、３ｂ型、４型、５型、または６型であり得る。ある実施形態において、非ＪＦＨ１株または分離株は、Ｈ７７Ｃ、Ｃｏｎ１、ＮＺ１、または４５２である。コンストラクトは、また、２つのシストロンに隣接して、５’ＨＣＶ非翻訳領域、またはその機能的な部分、および３’ＨＣＶ非翻訳領域、またはその機能的な部分を含む。典型的なＨＣＶバイシストロン性ゲノムコンストラクトは、配列番号２〜５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００１２】
ある実施形態において、ＨＣＶＮＳ２遺伝子はキメラ遺伝子であり、ＪＦＨ１由来のＥ１、Ｅ２、およびｐ７のタンパク質、ならびにＮＳ２のカルボキシ部分をコードするように、同一のＨＣＶ株または分離株由来のＮＳ２のアミノ部分をコードする。ＮＳ２遺伝子のアミノ部分とカルボキシ部分との間の適切な接合部は、Ｐｉｅｔｓｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（２００６）１０３：７４０８−７４１３、これを参照することによって本明細書に援用する）に記述されている。ある実施形態において、ＮＳ２のアミノ部分とカルボキシ部分との間の接合部は、８７１〜８７７からなる群から選択される残基に生じる。
【００１３】
ある実施形態において、組換えＨＣＶバイシストロン性ゲノムコンストラクトは、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、または緑色蛍光タンパク質をコードするレポーター遺伝子を含む。
【００１４】
一実施形態において、組換えＨＣＶバイシストロン性ゲノムコンストラクトは、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）ＩＲＥＳを含む。
【００１５】
別の態様において、本発明は、ＨＣＶポリタンパク質のコア、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ、およびＮＳ５ｂの領域のコート配列を有する組換えＨＣＶモノシストロン性ゲノムコンストラクトを含む。ある実施形態において、ＨＣＶモノシストロン性ゲノムコンストラクトは、キメラＨＣＶポリタンパク質をコードし、ここで、ＨＣＶポリタンパク質のＮＳ２Ｃ末端部分、ならびにＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ、およびＮＳ５ｂの領域はＪＦＨ１に由来し、かつコア、Ｅ１、Ｅ２、およびｐ７の領域、ならびにＮＳ２のＮ末端部分は第２のＨＣＶ分離株に由来する。第２の分離株は、ＪＦＨ１と同一または異なるサブタイプであってもよい。好ましくは、第２の分離株はＪＦＨ１と異なるサブタイプである。非ＪＦＨ１株または分離株は、ＨＣＶの１ａ型、１ｂ型、２ａ型、２ｂ型、３ａ型、４型、５型、または６型であり得る。ある実施形態において、非ＪＦＨ１株または分離株は、Ｈ７７Ｃ、Ｃｏｎ１、ＮＺ１、または４５２である。コンストラクトは、また、コンストラクトの両端に５’ＨＣＶ非翻訳領域、またはその機能的な部分、および３’ＨＣＶ非翻訳領域、またはその機能的な部分を含む。
【００１６】
一部の実施形態において、ＨＣＶ  ＮＳ２遺伝子はキメラ遺伝子であり、ＪＦＨ１型由来のＥ１、Ｅ２、およびＰ７のタンパク質ならびにＮＳ２のカルボキシ部分をコードするように、同一のＨＣＶ株または型由来のＮＳ２のアミノ部分をコードする。ＮＳ２遺伝子のアミノ部分とカルボキシ部分との間の適切な接合部位は、Ｐｉｅｔｓｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（上掲）に記述されている。ある実施形態において、ＮＳ２のアミノ部分とカルボキシ部分との間の接合部は、８７１〜８７７からなる群から選択される残基に生じる。
【００１７】
ある実施形態において、組換えＨＣＶモノシストロン性ゲノムコンストラクトは、レポーター遺伝子に結合したＪＦＨ１コアタンパク質のＮ末端フラグメントのコード配列を含み、ここで、ＪＦＨ１コアタンパク質のＮ末端フラグメントは、ＪＦＨ１コアタンパク質の任意の数の残基（例えば、ＪＦＨ１コアタンパク質の１〜１２、１〜１３、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１７、１〜１８の残基）を含む少なくとも最初の１２残基から最大最初の１８残基までを含み、ＪＦＨ１コアタンパク質のＮ末端フラグメントのコード配列は、レポーター遺伝子を有するフレームに結合してフレーム内で翻訳される。ある実施形態において、レポーター遺伝子は、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、または緑色蛍光タンパク質をコードする。組換えＨＣＶモノシストロン性ゲノムコンストラクトは、発現したレポーター遺伝子産物をＨＣＶポリタンパク質から分離させる切断部位のコード配列も含むことがある。一実施形態において、組換えＨＣＶモノシストロン性ゲノムコンストラクトは、レポーター遺伝子の後にＦＭＤＶ  ２Ａプロテアーゼのコード配列を含む。さらに、組換えＨＣＶモノシストロン性コンストラクトは、ユビキチンプロテアーゼ切断部位のコード配列をさらに含むことがある。
【００１８】
ある実施形態において、本発明は、５’から３’の順に以下を有する組換えＨＣＶモノシストロン性ゲノムコンストラクトを含む。すなわち、
ａ）ＨＣＶ  ５’非翻訳領域、またはその機能的な部分、
ｂ）ＪＦＨ１コアタンパク質のＮ末端フラグメントのコード配列を含むポリヌクレオチド、ここで、該フラグメントは、ＪＦＨ１コアタンパク質の少なくとも最初の１２残基から最大最初の１８残基までを含み、ＪＦＨ１コアタンパク質のＮ末端フラグメントのコード配列は、レポーター遺伝子に結合される。
ｃ）口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａプロテアーゼのコード配列、
ｄ）ユビキチンプロテアーゼ切断部位のコード配列、
ｅ）ＨＣＶ株由来もしくはＪＦＨ１以外の分離株由来のコア、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７の領域と、ＨＣＶ株由来もしくはＪＦＨ１以外の分離株由来のＮＳ２のＮ末端部分およびＪＦＨ１由来のＮＳ２のＣ末端領域を有するキメラＮＳ２領域と、ＪＦＨ１由来のＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ、およびＮＳ５ｂの領域とを含むＨＣＶポリタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および
ｆ）ＨＣＶ  ３’非翻訳領域、またはその機能的な部分。
【００１９】
典型的な組換えＨＣＶモノシストロン性ゲノムコンストラクトは、以下からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む。すなわち、
ａ）配列番号８のヌクレオチド７からヌクレオチド１０９５３までの連続した配列を含むポリヌクレオチド、
ｂ）配列番号９のヌクレオチド７からヌクレオチド１０９５３までの連続した配列を含むポリヌクレオチド、
ｃ）配列番号１０のヌクレオチド７からヌクレオチド１０９７１までの連続した配列を含むポリヌクレオチド、
ｄ）配列番号１６のヌクレオチド３５からヌクレオチド９７２３までの連続した配列を含むポリヌクレオチド、
ｅ）ａ）〜ｄ）のポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチド、および
ｆ）ａ）〜ｅ）のＲＮＡ相当物。
【００２０】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載の任意のバイシストロン性もしくはモノシストロン性の組換えＨＣＶゲノムコンストラクトを有するベクターを含む。ある実施形態において、ベクターは、配列番号２〜５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するバイシストロン性コンストラクトを含む。他の実施形態において、ベクターは、配列番号６〜１０および配列番号１６からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するモノシストロン性コンストラクトを含む。ある実施形態において、ベクターは、ＤＮＡ鋳型からＲＮＡ転写物を生成することが可能なゲノムコンストラクトに作動可能に結合されたプロモーターをさらに含む。一実施形態において、プロモーターはＴ７プロモーターである。
【００２１】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載の任意のバイシストロン性もしくはモノシストロン性の組換えＨＣＶゲノムコンストラクトを有するＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物を含み、ここで、ＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物を適切な宿主細胞にトランスフェクトすることで、感染性ＨＣＶ粒子を産生することができる。
【００２２】
別の態様において、本発明は、本発明の組換えＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物をトランスフェクトしたＨＣＶ複製を支持することが可能な細胞を有する感染性ＨＣＶ粒子の産生のための組織培養系を含む。
【００２３】
ある実施形態において、組織培養系は、ヒト組織に由来するＨＣＶ複製を支持することが可能な細胞を含む。ある実施形態において、組織培養系は、肝細胞癌の細胞を含む。ある実施形態において、組織培養系は、Ｈｕｈ７、Ｈｕｈ７．５、Ｓｉｅｎａ８、およびＴ７−１１からなる群から選択される細胞系に由来するＨＣＶ複製を支持することが可能な細胞を含む。ある実施形態において、ＨＣＶ複製を支持することが可能な細胞は、インターフェロンで治癒されている。１つの好ましい実施形態において、ＨＣＶ複製を支持することが可能な細胞は、肝細胞または肝細胞由来の細胞である。
【００２４】
ある実施形態において、組織培養系は、インターフェロンアンタゴニストまたはＲＮＡサイレンシング抑制因子として作用する二本鎖ＲＮＡ結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。二本鎖ＲＮＡ結合タンパク質は、インフルエンザウイルスのＮＳ１タンパク質であり得る。ある実施形態において、そのＮＳ１ポリペプチドは、ウイルス粒子の収量を増加させる配列番号１５のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを含む。ある実施形態において、ＲＮＡサイレンシング抑制因子をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１１〜１４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００２５】
ある実施形態において、組織培養系は、宿主細胞へのウイルス侵入を容易にするＣＤ８１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。
【００２６】
ある実施形態において、ＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物の複製は、ＨＣＶ複製を支持することの可能な細胞にＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物を導入してから少なくとも１０日間、組織培養系で維持される。ある実施形態において、ＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物の複製は、ＨＣＶ複製を支持することの可能な細胞にＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物を導入してから少なくとも２０日間、組織培養系で維持される。ある実施形態において、ＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物の複製は、ＨＣＶ複製を支持することの可能な細胞にＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物を導入してから少なくとも３０日間、組織培養系で維持される。一部の好ましい実施形態において、ＨＣＶ複製を支持することの可能な細胞は、肝細胞または肝細胞由来の細胞である。
【００２７】
ある実施形態において、ＨＣＶゲノムコンストラクトから産生されるウイルスの感染力は、ＨＣＶ感染を支持することの可能な細胞にＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物を導入してから少なくとも９日間、組織培養系で維持される。ある実施形態において、ＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物から産生されるウイルスの感染力は、ＨＣＶ感染を支持することの可能な細胞にＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物を導入してから少なくとも１５日間、組織培養系で維持される。
【００２８】
別の態様において、本発明は、ＨＣＶ感染を支持することの可能な細胞に本発明の組換えＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物をトランスフェクトすることと、ＨＣＶゲノムＲＮＡの複製および感染性ウイルス粒子の培養培地への分泌に適した条件下で、培養培地で細胞を増殖させることとを含む、組織培養で感染性ＨＣＶ粒子を生成する方法を含む。
【００２９】
ある実施形態において、該方法は、ＨＣＶゲノム転写物をトランスフェクトする前に、ＨＣＶ複製を支持することの可能な細胞に、ＲＮＡサイレンシング抑制因子をコードするポリヌクレオチドをトランスフェクトする手順をさらに含む。ＲＮＡサイレンシング抑制因子は、インフルエンザウイルスのＮＳ１タンパク質であり得る。ある実施形態において、細胞は、ウイルス粒子の収量を増加させる配列番号１５のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有するＮＳ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをトランスフェクトされる。ある実施形態において、ＲＮＡサイレンシング抑制因子をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１１〜１４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００３０】
ある実施形態において、ＨＣＶ複製を支持することの可能な細胞は、ヒト組織に由来する。ある実施形態において、ＨＣＶ複製を支持することの可能な細胞は、肝細胞癌の細胞である。一部の実施形態において、細胞は肝細胞である。ある実施形態において、肝細胞は、Ｈｕｈ７、Ｈｕｈ７．５、Ｈｕｈ７Ｃ、Ｓｉｅｎａ８、およびＴ７−１１からなる群から選択される細胞系に由来する。ある実施形態において、肝細胞はインターフェロンで治癒されている。
【００３１】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載の任意の方法によって組織培養系で生成したキメラＣ型肝炎ウイルスを含む。組織培養系では、組換えＨＣＶゲノムコンストラクトは、配列番号３〜５、８〜１０、および１６のゲノム配列からなる群から選択されるゲノム配列を含み、それらのゲノム配列はゲノムＨＣＶコンストラクトおよびプラスミド配列を含む。
【００３２】
別の態様において、本発明は、ＨＣＶ複製を支持することが可能な細胞と、本明細書に記載の任意の組換えＨＣＶゲノムコンストラクト（すなわち、感染させるためのＲＮＡ転写物および／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によるウイルスＲＮＡを生成するためのＤＮＡベクター）とを含有するキットを含む。ある実施形態において、キットは、組換えＨＣＶゲノムコンストラクトをトランスフェクトされる細胞を含む。キットは、ＲＮＡサイレンシング抑制因子をコードするポリヌクレオチドをさらに含むこともある。ある実施形態において、キットは、ＲＮＡサイレンシング抑制因子をコードするポリヌクレオチドをトランスフェクトされる細胞を含む。ある実施形態において、ポリヌクレオチドは、ウイルス粒子の収量を増加させる配列番号１５のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを含むＮＳ１ポリペプチドをコードする。ある実施形態において、ＲＮＡサイレンシング抑制因子をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１１〜１４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００３３】
ある実施形態において、ＨＣＶ感染を支持することが可能な細胞は、肝細胞であり、さらに他の実施形態において、前記肝細胞は、ヒト組織に由来するである。ある実施形態において、肝細胞は肝細胞癌の細胞である。ある実施形態において、肝細胞は、Ｈｕｈ７、Ｈｕｈ７．５、Ｈｕｈ７Ｃ、Ｓｉｅｎａ８、およびＴ７−１１からなる群から選択される細胞系に由来する。ある実施形態において、肝細胞はインターフェロンで治癒されている。
【００３４】
別の態様において、本発明は、抗ＨＣＶ活性を有する化合物を同定する方法を含み、該方法は以下を含む。すなわち、
ａ）本明細書に記載のＨＣＶ組織培養系を化合物で処置すること、
ｂ）前記化合物で処理した前記組織培養系におけるＨＣＶ複製、ＨＣＶタンパク質の発現、またはウイルス感染力から少なくとも１つを前記化合物で処理されていない前記組織培養系と比較することとを含む。この手順において、前記化合物で処理した組織培養系におけるＨＣＶ複製、ＨＣＶタンパク質の発現、またはウイルス感染力のレベルの減少は、抗ＨＣＶ活性を有する化合物を示している。
【００３５】
一実施形態において、抗ＨＣＶ活性を有する化合物は、ＨＣＶ感染力を抑制する化合物であり得る。一実施形態において、ＨＣＶ感染力を抑制する化合物は抗体であり、抗体は、一部の実施形態において中和抗体であり得る。
【００３６】
別の実施形態において、抗ＨＣＶ活性を有する化合物は、ＨＣＶ複製を抑制する化合物であり得る。
【００３７】
本発明のこれらおよび他の実施形態は、本明細書の開示を考慮して、当業者にとって容易に達成される。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】組換え野生型およびキメラＪＦＨ１ゲノムバイシストロン性コンストラクトの模式図を示す。バイシストロン性コンストラクトは、ＲＮＡ複製、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）をモニターするためのルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）レポーター遺伝子に結合したＪＦＨ１コアタンパク質の最初の１７のアミノ酸をコードする第１のシストロンと、野生型またはキメラＪＦＨ１ポリタンパク質をコードする第２のシストロンとを含んだ。キメラコンストラクトは、ＨＣＶ２ａ型株ＪＦＨ１由来のＮＳ３〜ＮＳ５ｂコード領域と、異なるＨＣＶ分離株（コンストラクトＬｕｃＨＪ１：ＨＣＶ１ａ型株Ｈ７７Ｃ由来のコア〜ｐ７領域、コンストラクトＬｕｃＣＪ１：ＨＣＶ１ｂ型株Ｃｏｎ１由来のコア〜ｐ７領域、およびコンストラクトＬｕｃＮＪ１：ＨＣＶ３ａ型株ＮＺ１由来のコア〜ｐ７領域）由来のコア〜ｐ７コード領域と、ＬｕｃＣＪ１コンストラクトおよびＬｕｃＨＪ１コンストラクトの場合はＮＳ２の残基８７１に、およびＬｕｃＮＪ１コンストラクトの場合はＮＳ２の残基８７７に遺伝子間接合部を有するキメラＮＳ２コード領域とを含有した。
【図２】組換え野生型およびキメラＪＦＨ１モノシストロン性コンストラクトの模式図を示す。モノシストロン性コンストラクトは、ＲＮＡ複製をモニターするための緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはウミシイタケルシフェラーゼ（ＲＬｕｃ）レポーター遺伝子に結合したＪＦＨ１コアタンパク質の最初の１２のアミノ酸をコードする領域と、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａプロテアーゼのコード配列と、ユビキチンプロテアーゼ切断部位のコード配列と、野生型またはキメラＪＦＨ１ポリタンパク質のコード領域とを含んだ。キメラコンストラクトは、ＨＣＶ２ａ型株ＪＦＨ１由来のＮＳ３〜ＮＳ５ｂコード領域と、異なるＨＣＶ分離株（ＲＬＦ２ＡＵｂＨＪ１コンストラクト：ＨＣＶ１ａ型株Ｈ７７Ｃ由来のコア〜ｐ７領域、ＲＬＦ２ＡＵｂＣＪ１コンストラクト：ＨＣＶ１ｂ型株Ｃｏｎ１由来のコア〜ｐ７領域、およびＲＬＦ２ＡＵｂＮＪ１コンストラクト：ＨＣＶ３ａ型株ＮＺ１由来のコア〜ｐ７領域）由来のコア〜ｐ７コード領域と、ＲＬＦ２ＡＵｂＣＪ１コンストラクトおよびＲＬＦ２ＡＵｂＨＪ１コンストラクトの場合はＮＳ２の残基８７１に、ＲＬＦ２ＡＵｂＮＪ１コンストラクトの場合はＮＳ２の残基８７７に遺伝子間接合部を有するキメラＮＳ２コード領域とを含有した。
【図３】Ｈｕｈ７細胞におけるモノシストロン性ＲＬＦ２ＡＵｂＪＦＨ−１ゲノムコンストラクトと、バイシストロン性ＬｕｃＪＦＨ１野生型ＪＦＨｌゲノムコンストラクトとの複製効率を比較する。細胞内ＲＮＡレベルを、Ｈｕｈ７細胞の電気穿孔（ｅＶ）後の時間の関数としてルシフェラーゼ発光に基づいて測定した。
【図４】モノシストロン性ＲＬＦ２ＡＵｂＪＦＨ−１コンストラクトをトランスフェクトしたＨｕｈ７細胞におけるＪＦＨ１感染価を、電気穿孔後の時間の関数として示す。
【図５】Ｈｕｈ７細胞におけるモノシストロン性ＲＬＦ２ＡＵｂＪＦＨ−１コンストラクトのＲＮＡ複製のレベルを、組換えウイルスに感染後の時間の関数として示す。実施例６に記述するように、ナイーブＨｕｈ７細胞に、ＲＬＦ２ＡＵｂＪＦＨ−１コンストラクトをトランスフェクトした細胞の培養上清由来のウイルスを接種した。細胞内ＪＦＨ１ＲＮＡを、Ｈｕｈ７細胞の感染から２４日間、ＲＬｕｃアッセイによって測定した。
【図６】モノシストロン性コンストラクトＲＬＦ２ＡＵｂＪＦＨ−１によって産生された野生型ＪＦＨ１の感染力と、モノシストロン性コンストラクトＲＬＦ２ＡＵｂＨＪ１、ＲＬＦ２ＡＵｂＣＪ１、およびＲＬＦ２ＡＵｂＮＪ１によって産生されたキメラウイルスの感染力とを比較する。
【図７】Ｈｕｈ７細胞におけるＲＬＦ２ＡＵｂＪＦＨ−１、ＲＬＦ２ＡＵｂＨＪ１、ＲＬＦ２ＡＵｂＣＪ１、およびＲＬＦ２ＡＵｂＮＪ１のモノシストロン性コンストラクトのＲＮＡ複製効率を比較する。
【図８】３種類の細胞系（Ｓｉｅｎａ８、Ｔ７−１１、およびＨｕｈ７）におけるＪＦＨ−１コンストラクトＲＬＦ２ＡＵｂＪＦＨ１のＲＮＡ複製効率を比較する。細胞を、１μｇまたは４μｇのコンストラクトのいずれかをトランスフェクトさせた。
【図９】インフルエンザのＮＳ１の模式図を示す。完全長ＮＳ１タンパク質は、インターフェロン誘導性のｄｓＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼ（ＰＫＲ）およびＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を抑制する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）結合ドメインと、ｍＲＮＡ前駆体スプライシングおよびｍＲＮＡの核外輸送を抑制する際に機能するエフェクタードメインとを含む。ｄｓＲＮＡ結合ドメインおよびエフェクタードメインは、それぞれアミノ酸残基の１〜８２および１３８〜１４７に存在する。さらに、ＮＳ１タンパク質は、２つの核移行シグナル（ＮＬＳ１およびＮＬＳ２）と、切断・ポリアデニル化特異性因子（ＣＰＳＦ）結合部位と、ポリアデニル化結合タンパク質ＩＩ（ＰＡＢＩＩ）結合部位とを含む。完全長野生型（ｗｔ）ＮＳ１（残基１〜２３０）；ｄｓＲＮＡ結合ドメインを含む切断型ＮＳ１タンパク質であるＮＳ８２（残基１〜８２）；ｄｓＲＮＡ結合ドメインおよびエフェクタードメインを含むより長い切断型ＮＳ１タンパク質であるＮＳ１８０；および残基５０〜８４の欠失を含むｄｓＲＮＡ結合ドメイン内の不完全な変異ＮＳ１タンパク質を含む、４種類のＲＳＳコンストラクトを示す。
【図１０】Ｈｕｈ７細胞におけるモノシストロン性ＲＬＦ２ＡＵｂＪＦＨ−１コンストラクトの複製への完全長野生型コンストラクトおよびＮＳ８２コンストラクトの影響を示す。
【図１１】Ｈｕｈ７細胞におけるモノシストロン性ＲＬＦ２ＡＵｂＪＦＨ−１コンストラクトから産生されたウイルスの感染力への完全長野生型コンストラクトおよびＮＳ８２コンストラクトの影響を示す。
【図１２】本発明のゲノムコンストラクトを作製するために用いた制限酵素消化部位を含むＪＦＨ１ウイルスゲノムの遺伝子構成の模式図を示す。
【図１３】ＪＦＨ１ゲノムの部分を第２のＨＣＶ分離株のそれと置き換えるために用いた制限酵素部位を含むキメラＨＣＶゲノムコンストラクトがどのように産生されるかを示す模式図である。
【図１４】ＨＣＶ組織培養系を用いて行ったウイルス中和アッセイの模式図を示す。
【図１５】ウイルス感染の間に、細胞上にＳＲＢ１およびＣＤ８１を有するウイルスエンベロプ上のＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２複合体の相互作用を示す、ＨＣＶ細胞付着および侵入のモデルを表す。
【図１６】間接蛍光抗体アッセイ法（ＩＦＡ）によって測定したＨｕｈ７．５細胞中のＪＦＨ１感染力を示す。
【図１７】ＲＬＦ２ＡＵｂＪＦＨ１（ＲＪ１）：ＨＣＶ２ａ型株ＪＦＨ１由来のコア〜ＮＳ５ｂ、ＲＬＦ２ＡＵｂＨＪ１（ＲＨＪ１）：ＨＣＶ１ａ型株Ｈ７７Ｃ由来のコア〜ｐ７領域およびＮＳ２のＮ末端部分、ＲＬＦ２ＡＵｂＣＪ１（ＲＣＪ１）コンストラクト：ＨＣＶ１ｂ型株Ｃｏｎ１由来のコア〜ｐ７領域およびＮＳ２のＮ末端部分、およびＲＬＦ２ＡＵｂ４５２ＪＦＨ１（Ｒ４５２Ｊ１）コンストラクト：ＨＣＶ３ａ型株４５２由来のコア〜ｐ７領域およびＮＳ２のＮ末端部分、ならびにＲＨＪ１、ＲＣＪ１、およびＲ４５２Ｊ１のコンストラクトの残基８７１に遺伝子間接合部を有するキメラＮＳ２コード領域を含む組換え野生型モノシストロン性コンストラクトおよびキメラＪＦＨ１モノシストロン性コンストラクトの模式図を示す。
【図１８】Ｈｕｈ７およびＨｕｈ７．５細胞中のＪＦＨ１の感染力へのＣＤ８１の影響を示す。
【図１９】ＨＣＶ組織培養系を用いて測定したように、ＨＣＶ２ａ型、１ｂ型、および１ａ型に対する中和抗体力価を示す。
【図２０】Ｅ１Ｅ２をワクチン接種されたチンパンジーのＨＣＶ１ａ型に対する防御免疫を比較する。ＨＣＶ１ａ型のパーセント抑制、中和抗体力価、ＣＤ８１遮断抗体力価、および抗Ｅ１Ｅ２抗体力価を、細胞培養アッセイ法を用いて測定した。
【図２１】細胞培養アッセイ法を用いて測定したように、チンパンジーのＨＣＶ１ａ型および２ａ型の交差中和を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
配列の簡単な説明
配列番号１は、ＪＦＨ１ゲノムを含むプラスミド由来のｐＵＣ−１８の配列である。
【００４０】
配列番号２は、ルシフェラーゼ遺伝子をさらに有するＪＦＨ１ゲノムを含むプラスミド由来のｐＵＣの配列である。
【００４１】
配列番号３は、バイシストロン性配置にルシフェラーゼ遺伝子をさらに有するＪＦＨ１／Ｈ７７Ｃキメラゲノムを含むプラスミド由来のｐＵＣの配列である。
【００４２】
配列番号４は、バイシストロン性配置にルシフェラーゼ遺伝子をさらに有するＪＦＨ１／Ｃｏｎ１キメラゲノムを含むプラスミド由来のｐＵＣの配列である。
【００４３】
配列番号５は、バイシストロン性配置にルシフェラーゼ遺伝子をさらに有するＪＦＨ１／ＮＺ１キメラゲノムを含むプラスミド由来のｐＵＣの配列である。
【００４４】
配列番号６は、モノシストロン性配置にルシフェラーゼ遺伝子をさらに有するＪＦＨ１ゲノムを含むプラスミド由来のｐＵＣの配列である。
【００４５】
配列番号７は、モノシストロン性配置に緑色蛍光タンパク質遺伝子をさらに有するＪＦＨ１ゲノムを含むプラスミド由来のｐＵＣの配列である。
【００４６】
配列番号８は、モノシストロン性配置にルシフェラーゼ遺伝子をさらに有するＪＦＨ１／Ｈ７７Ｃキメラゲノムを含むプラスミド由来のｐＵＣの配列である。キメラＨＣＶゲノムコンストラクトは、配列番号８の約７ヌクレオチド〜約１０９５３ヌクレオチドを含む。
【００４７】
配列番号９は、モノシストロン性配置にルシフェラーゼ遺伝子をさらに有するＪＦＨ１／Ｃｏｎ１キメラゲノムを含むプラスミド由来のｐＵＣの配列である。キメラＨＣＶゲノムコンストラクトは、配列番号９の約７ヌクレオチド〜約１０９５３ヌクレオチドを含む。
【００４８】
配列番号１０は、モノシストロン性配置にルシフェラーゼ遺伝子をさらに有するＪＦＨ１／ＮＺ１キメラゲノムを含むプラスミド由来のｐＵＣの配列である。キメラＨＣＶゲノムコンストラクトは、配列番号１０の約７ヌクレオチド〜約１０９７１ヌクレオチドを含む。
【００４９】
配列番号１１は、ｐＣＭＶプラスミドに挿入されたインフルエンザＮＳ１遺伝子の配列である。
【００５０】
配列番号１２は、ｐＣＭＶプラスミドに挿入されたインフルエンザＮＳ１遺伝子の一部分の配列である。
【００５１】
配列番号１３は、ｐＣＭＶプラスミドに挿入されたインフルエンザＮＳ１遺伝子の一部分の配列である。
【００５２】
配列番号１４は、ＮＳ１遺伝子の内部部分が除去されたｐＣＭＶプラスミドに挿入されたインフルエンザＮＳ１遺伝子の配列である。
【００５３】
配列番号１５は、インフルエンザ由来のＮＳ１のアミノ酸配列である。
【００５４】
配列番号１６は、モノシストロン性配置にルシフェラーゼ遺伝子をさらに有するＪＦＨ１／４５２キメラゲノムを含むプラスミド由来のｐＵＣの配列である。このキメラＨＣＶゲノムコンストラクトは、配列番号１６の約３５ヌクレオチド〜約９７２３ヌクレオチドを含む。
【００５５】
本発明の実施は、特に表示しない限り、当該技術分野内のウイルス学、化学、生化学、組換えＤＮＡの技術、および免疫学の分野の従来からの方法を用いる。そのような技術は、文献で十分に説明されている。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，  ｅｄｓ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌｓ．Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  ｅｄｓ．，  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  （Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  １９９３）；Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｉｎｃ．，  ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｄｄｉｔｉｏｎ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  １９８９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  （Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ  ａｎｄ  Ｎ．Ｋａｐｌａｎ  ｅｄｓ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．）を参照。
【００５６】
上掲または下掲に関わらず本明細書に引用する刊行物、特許、および特許出願のすべては、それら全体を参照することによって本明細書に援用する。
【００５７】
以下のアミノ酸略語は、本文全体にわたって使用される。すなわち、
アラニン：:Ａｌａ（Ａ）              アルギニン：Ａｒｇ（Ｒ）
アスパラギン：Ａｓｎ（Ｎ）          アスパラギン酸：Ａｓｐ（Ｄ）
システイン：Ｃｙｓ（Ｃ）            グルタミン：Ｇｌｎ（Ｑ）
グルタミン酸：Ｇｌｕ（Ｅ）          グリシン：Ｇｌｙ（Ｇ）
ヒスチジン：Ｈｉｓ（Ｈ）            イソロイシン：Ｉｌｅ（Ｉ）
ロイシン：Ｌｅｕ（Ｌ）              リシン：Ｌｙｓ（Ｋ）
メチオニン：Ｍｅｔ（Ｍ）            フェニルアラニン：Ｐｈｅ（Ｆ）
プロリン：Ｐｒｏ（Ｐ）              セリン：Ｓｅｒ（Ｓ）
スレオニン：Ｔｈｒ（Ｔ）            トリプトファン：Ｔｒｐ（Ｗ）
チロシン：Ｔｙｒ（Ｙ）              バリン：Ｖａｌ（Ｖ）
１．定義
本発明を説明する際に、以下の用語を使用し、かつ以下に示すように定義することを目的とする。
【００５８】
本明細書および添付する特許請求の範囲で用いるように、内容が明らかに指示しない限り、単数形は複数の参照を含む。従って、例えば、「ＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物（単数形）」への言及は、２つ以上のそのような転写物の混合物を含む。同様に、１つのＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物を１つの細胞にトランスフェクトすることは、複数の細胞が複数のゲノムＲＮＡ転写物をトランスフェクトされる状況を含むことを意味する。
【００５９】
用語「Ｃ型肝炎ウイルス」（ＨＣＶ）とは、非Ａ型、非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢＨ）の原因病原体をいう。ＨＣＶの核酸配列および推定アミノ酸配列は、米国特許第５，８５６，４３７号および第５，３５０，６７１号に記述されている。ＨＣＶに起因する疾患は、Ｃ型肝炎と呼ばれ、正式にはＮＡＮＢＨと呼ばれる。本明細書で用いるように、用語ＨＣＶは、ＮＡＮＢＨの原因になる病原性株、ならびに弱毒化株またはそれらに由来する欠陥干渉粒子のウイルス種を表す。
【００６０】
ＨＣＶは、ウイルス系統群のフラビウイルス科のメンバーである。フラビウイルス粒子の形態および組成は公知であり、Ｒｅｅｄら、Ｃｕｒｒ．Ｓｔｕｄ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｂｌｏｏｄ  Ｔｒａｎｓｆｕｓ．（１９９８），  ６２：１−３７，ＨＥＰＡＴＩＴＩＳ  Ｃ  ＶＩＲＵＳＥＳ  ＩＮ  ＦＩＥＬＤＳ  ＶＩＲＯＬＯＧＹ  （Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ，  Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，  Ｐ．Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙ，  ｅｄｓ．）（３ｄ  ｅｄ．１９９６）に考察されている。ＨＣＶゲノムの部分がペスチウイルスとも相同であることが最近見出されている。一般に、形態に関しては、フラビウイルスは脂質二重層によって囲まれた中心ヌクレオカプシドを含んでいる。ウイルス粒子は球状であり、かつ約４０〜５０ｎｍの球径を有する。ウイルス粒子のコアは、直径約２５〜３０ｎｍである。ウイルス粒子エンベロープの外面に沿って、直径約２ｎｍの末端小頭部を有する約５〜１０ｎｍ長の突起がある。
【００６１】
ＨＣＶゲノムはＲＮＡを含む。ウイルスを含むＲＮＡは、自然突然変異の相対的に高い割合を有することが知られている。従って、ＨＣＶクラスまたは種内で病原性または非病原性であり得る複数の株が存在し得る。コア、非構造タンパク質、およびエンベロープタンパク質の翻訳完全長を含むＨＣＶのＯＲＦは、米国特許第５，８５６，４３７号および第５，３５０，６７１号に示されている。
【００６２】
用語「ＨＣＶゲノムコンストラクト」は、ＨＣＶの構造タンパク質および非構造タンパク質のすべてのコード配列を含む全ＨＣＶゲノムを有するＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかの核酸をいう。ＨＣＶゲノムコンストラクトを含むＤＮＡベクターを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によるＨＣＶ  ＲＮＡを生成することが可能である。ＨＣＶゲノムコンストラクトを含むＲＮＡ転写物を用いて、感染性ＨＣＶウイルス粒子を生成するために細胞をトランスフェクトすることが可能である。
【００６３】
用語「ＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物」は、細胞に存在する場合、感染性ＨＣＶウイルス粒子を複製し産生することができるＨＣＶゲノムコンストラクトを含むＲＮＡ転写物をいう。本明細書に記載するようにＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物は、本発明に従って肝細胞に導入される。肝細胞は、さらに、付加的な核酸、遺伝子、もしくはタンパク質を有するまたは発現させる付加的なウイルスレプリコンおよび／またはプラスミドを含むことができる。１つ以上の他の付加遺伝子および／または調節領域は、ＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物をトランスフェクトした細胞内に随意的に存在して発現されることもできる。付加遺伝子またはタンパク質は、当該技術分野で周知の種々の手法を用いて、ＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物上にもたらされることができ、または宿主細胞ゲノムに安定的もしくは一時的にトランスフェクトされることができる。付加遺伝子またはタンパク質は、例えば、細胞生存のマーカーとして用いられることも可能である。さらに、付加遺伝子またはタンパク質は、ＨＣＶ複製、発現、および／またはウイルスもしくはウイルス様粒子の産生（例えばＮＳ１、ＣＤ８１）を向上させるまたは可能にする補助機能を備え得る。
【００６４】
本明細書で用いるように、用語「付加遺伝子」とは、タンパク質を発現させまたは細胞内で調節機能をもたらす遺伝子または他の核酸を包含することを意味する。付加遺伝子はＨＣＶおよび宿主細胞と非相同であり得、かつＨＣＶまたは宿主細胞ゲノム由来であってもよい。従って、本明細書で用いるように、この用語は、宿主細胞ゲノムにすでに存在するが、エピソーム因子としてもたらされる、もしくはその通常の位置と異なる（あるいは通常の位置に加えて）宿主細胞ゲノム上の部位に組み込まれる付加遺伝子としてもたらされる宿主細胞遺伝子を意味する。
【００６５】
当然のことながら、用語「ゲノムコンストラクト」、「ＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物」、および「遺伝因子」は、ウイルスＲＮＡのセンス鎖、またはセンス鎖（ウイルスゲノムＲＮＡ）に変えられることが可能でありかつ複製に必要なウイルスタンパク質に翻訳可能な任意の相補配列（例えば、ｃＤＮＡ逆転写物または相補的ＲＮＡ）を包含する。ｃＤＮＡゲノムコンストラクトは、当該技術分野で周知のように二本鎖ＤＮＡを含むことが可能である。代替コンストラクトが所望の目標（例えば、ウイルスゲノムの部分もしくは全体をクローン化すること、二本鎖ｃＤＮＡ鋳型からＲＮＡウイルス転写物を発現させること、およびウイルス産物を生成すること）に依存して使用可能であることを、当業者は理解する。
【００６６】
さらに当然のことながら、典型的なゲノムコンストラクトの記述は、本発明の趣旨から逸脱することなくゲノム配列または他の挿入断片の境界が容易に修飾または変化できるので、正確な境界に関して「約」を含む配列の点から言及される。従って、ＨＣＶゲノムコンストラクトは、選択された制限酵素部位を用いるクローニングの周知のアーチファクトに依存して、付加的なヌクレオチドの配列を含み得る。
【００６７】
本明細書で用いるように「中和抗体」は、宿主細胞を感染させるＨＣＶの能力を防御するまたは減少させる抗体をいうことを意味する。用語「抗体」は単数および複数を含むことを意味し、当該技術分野で公知のようにかつモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体の調製、一本鎖抗体、抗体ＦａｂおよびＦ（ａｂ）２のフラグメント、ならびにキメラ抗体およびヒト化抗体も言及する。
【００６８】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーをいい、かつその産物の最小長を限定しない。従って、ペプチド、オリゴペプチド、二量体、多量体等は、この定義の範囲に含まれる。完全長タンパク質およびそのフラグメントの両方は、この定義によって包含される。これらの用語は、また、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化等を含む。さらに、本発明の目的で、「ポリペプチド」は、タンパク質が所望の活性を維持する限り、例えば、欠失、添加、および置換の未変性の配列への修飾（通常、本来保存的である）を含むタンパク質をいう。これらの修飾は、例えば部位特異的な変異原性を介して意図的であり得、または例えばタンパク質を生成する宿主の変異を介してもしくはＰＣＲ増幅によるエラー等偶発的であり得る。
【００６９】
用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」、および「核酸分子」は、任意の長さのヌクレオチドの重合体型（リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドのいずれか）を含むように本明細書では用いる。この用語は、分子の一次構造だけをいう。従って、この用語は、三本鎖、二本鎖、および一本鎖のＤＮＡ、ならびに三本鎖、二本鎖、および一本鎖のＲＮＡを含む。この用語は、例えば、メチル化および／またはキャップ形成による修飾、およびポリヌクレオチドの非修飾形態も含む。さらに特定すれば、用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」、および「核酸分子」は、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有する）；ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含有する）；プリン塩基もしくはピリミジン塩基のＮ−もしくはＣ−グリコシドであるポリヌクレオチドの任意の他の型；および非ヌクレオチド骨格（例えば、ポリアミド（例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）およびポリモルホリノ（Ａｎｔｉ−Ｖｉｒａｌｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｃｏｒｖａｌｌｉｓ，  ＯｒｅｇｏｎからＮｅｕｇｅｎｅとして市販されている）ポリマー）を含有する他のポリマー；ならびに塩基対合および塩基スタッキング（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡで見出される）を可能にする配置で核酸塩基を含有するポリマーをもたらす他の配列特異的合成核酸ポリマーを含む。用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」、および「核酸分子」の間には長さにおいて意図された区別はなく、かつこれらの用語は互換的に用いられる。従って、これらの用語は、例えば、３’−デオキシ−２’，５’−ＤＮＡ、オリゴデオキシリボヌクレオチドＮ３’Ｐ５’ホスホロアミド酸、２’−Ｏ−アルキル−置換ＲＮＡ、二本鎖および一本鎖ＤＮＡ、ならびに二本鎖および一本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド、ならびにＰＮＡとＤＮＡもしくはＲＮＡとのハイブリッドを含む。また、公知の種類の修飾（例えば、当該技術分野で公知の標識；メチル化；「キャップ」；１つ以上の天然のヌクレオチドの類似体との置換；ヌクレオチド間の修飾（例えば、非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミダート、カルバメート）、負荷電結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート）、正荷電結合（例えば、アミノアルキルホスホルアミダート、アミノアルキルホスホトリエステル）による修飾）；懸垂部分（例えば、タンパク質（ヌクレアーゼ、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リシン））を含有する修飾；挿入剤（例えば、アクリジン、ソラレン）による修飾；キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属）を含有する修飾；アルキル化剤を含有する修飾、修飾結合（例えば、α−アノマー核酸）による修飾；ならびにポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの非修飾形態）を含む。特に、ＤＮＡはデオキシリボ核酸である。
【００７０】
指定された配列に「由来する」ポリヌクレオチドは、指定されたヌクレオチド配列の領域に対応する（すなわち、同一または相補的な）おおよそ少なくとも約６のヌクレオチド、好ましくは少なくとも約８のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１０〜１２のヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも約１５〜２０のヌクレオチドの連続した配列を含むポリヌクレオチド配列をいう。由来するポリヌクレオチドは、必ずしも目的のヌクレオチド配列に物理的に由来するわけではないが、ポリヌクレオチドが由来する領域の塩基配列によってもたらされる情報に基づいて化学合成、複製、逆転写、または転写を含むがこれらに限定されない任意の方法で生成され得る。そのようなものとして、それは、元のポリヌクレオチドのセンスまたはアンチセンス方向のいずれかを表すこともある。
【００７１】
核酸分子を記述するために本明細書で用いるように、「組換え型」とは、その起源または操作によってそれが本来関連するポリヌクレオチドの全体または部分と関連しないゲノム起源、ｃＤＮＡ起源、ウイルス起源、半合成起源、または合成起源のポリヌクレオチドを意味する。タンパク質またはポリペプチドに関連して用いる用語「組換え型」とは、組み換えポリヌクレオチドの発現によって生成されるポリペプチドを意味する。通常、以下にさらに記述するように、目的の遺伝子はクローン化され、次いで形質転換された生物内で発現される。宿主生物は、発現条件下で外来遺伝子を発現させて、タンパク質を生成する。
【００７２】
単細胞実体として培養された微生物または高等真核生物細胞系を示す「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞系」、「細胞培養物」、および他のそのような用語は、組換えベクターまたは移入ＤＮＡのレシピエントとして用いられることが可能な細胞、または用いられている細胞をいい、トランスフェクトされた起源細胞の最初の子孫を含む。
【００７３】
選択されたポリペプチドを「コードする」「コード配列」または配列は、適切な調節配列の制御下（または「調節素子」）で配置される場合、ｉｎ  ｖｉｖｏでポリペプチドに転写される（ＤＮＡの場合）および翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸分子である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端で開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端で翻訳終止コドンによって決定され得る。コード配列としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない。すなわち、ウイルス由来のｃＤＮＡ、原核ｍＲＮＡまたは真核ｍＲＮＡ、ウイルスＤＮＡもしくは原核ＤＮＡ由来のＤＮＡ配列、さらに合成ＤＮＡ配列である。転写終結配列は、３’からコード配列に位置していることもある。
【００７４】
典型的な「調節素子」としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない。すなわち、転写プロモーター、転写エンハンサー要素、転写終結シグナル、ポリアデニル化配列（３’から翻訳終止コドンに位置する）、翻訳開始を最適化するための配列（５’からコード配列に位置する）、および翻訳終結配列である。
【００７５】
「作動可能に結合された」とは、そのように記述される成分がそれらの通常の機能を実行するように形成される、要素の配置をいう。従って、コード配列に作動可能に結合された所定のプロモーターは、適切な酵素が存在すると、コード配列の発現をもたらすことが可能である。発現とは、ＤＮＡ鋳型もしくはＲＮＡ鋳型からｍＲＮＡもしくはウイルスＲＮＡのいずれか１つ以上の転写を含むことを意味し、かつｍＲＮＡ鋳型からタンパク質の翻訳をさらに含む。プロモーターは、その発現を方向付けるよう機能する限り、コード配列と近接する必要はない。従って、例えば、翻訳されていないが転写された配列を介入することは、プロモーター配列とコード配列との間に存在することが可能であり、かつプロモーター配列は、依然としてコード配列に「作動可能に結合された」とみなされ得る。
【００７６】
「によってコードされる」とは、核酸配列によってコードされるポリペプチド由来の少なくとも３〜５のアミノ酸、より好ましくは少なくとも８〜１０のアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも１５〜２０のアミノ酸からなるアミノ酸配列を含有するポリペプチド配列またはその一部をコードする核酸配列をいう。
【００７７】
用語「トランスフェクション」を用いて、細胞による外来ＤＮＡの取り込みをいう。細胞は、外来ＤＮＡがその細胞内に導入されたときに「トランスフェクトされる」。いくつかのトランスフェクション技術が一般的に当該技術分野で公知である。例えば、Ｇｒａｈａｍら、（１９７３）  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ５２：４５６，  Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｄａｖｉｓら、（１９８６）  Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，およびＣｈｕら、（１９８１）  Ｇｅｎｅ  １３：１９７を参照。そのような技術を用いて、１つ以上の外来ＤＮＡ部分を適切な宿主細胞に導入することができる。この用語は、遺伝子物質の安定な取り込みおよび一時的な取り込みの両方をいい、ペプチド結合ＤＮＡまたは抗体結合ＤＮＡの取り込みを含む。
【００７８】
本明細書に示すように、組成物または薬剤についての用語「有効量」または「薬学的有効量」は、所望の応答（例えば、ＨＣＶ  ＲＮＡ複製の抑制、発現、および／またはウイルス感染力）と、任意に対応する治療効果とをもたらすために組成物の無毒量だが十分な量をいう。個々の症例における適切な「有効」量は、日常の実験を用いて当業者によって決定可能である。
【００７９】
本明細書で用いるように、「生物試料」は、被験者から単離される組織または体液の試料をいい、例えば以下が挙げられるがこれらに限定されない。すなわち、血液、血漿、血清、糞便、尿、骨髄、胆汁、脊髄液、リンパ体、皮膚の試料、外分泌物（皮膚、呼吸管、腸管、および尿生殖路からの）、涙、唾液、乳汁、血球細胞、器官、生検組織である。また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養成分の試料としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない。すなわち、培養培地での細胞および組織の増殖（例えば組換え細胞）に由来する条件培養培地、ならびに細胞成分である。
【００８０】
２．本発明の実施様式
本発明を詳細に記述する前に、当然のことながら変化する可能性があるため、本発明は特定の製剤またはプロセスパラメータに限定されないことを理解すべきである。また、本明細書で用いる用語法は、本発明の特定の実施形態だけを記述する目的のためであり、限定することを意図しないことを理解すべきである。
【００８１】
本明細書で記述されるものと類似するまたは相当するいくつかの方法および物質は、本発明の実施で用いられることが可能であるが、好ましい物質および方法は本明細書に記載される。
【００８２】
Ａ．ＨＣＶ組織培養系
本発明は、感染性ＨＣＶウイルス粒子の産生のための組織培養系を提供する。組織培養系は、レポーター遺伝子を包含する組換えＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物を含有する肝細胞を含む。肝細胞は、ＨＣＶゲノムの複製および発現に関連したレポーター遺伝子（例えば、ホタルルシフェラーゼ遺伝子、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子、または緑色蛍光タンパク質遺伝子）を含むウイルスタンパク質および非ウイルスタンパク質の発現を支持するＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物をトランスフェクトされる。ＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物を肝細胞に導入してから、レポーター遺伝子は、ＨＣＶ  ＲＮＡの複製、発現、またはウイルス粒子の産生が測定されるのを可能にする。種々の実施形態に従って、ＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物の増殖および／または安定性に適応したヒト由来細胞を用いてもよい。ＨＣＶ組織培養系を用いて、ウイルスを生成することも可能であり（例えば、ワクチン等の免疫原性組成物のために）、またはＨＣＶ抗ウイルス化合物の潜在活性（中和抗体の存在もしくは非存在の決定を含む）を評価することも可能である。
【００８３】
レポーター遺伝子活性は、種々のウイルス活性をモニターするために、種々の手段で測定できる。例えば、細胞は、レポーター遺伝子を含むゲノムＲＮＡ転写物をトランスフェクトされ、次いで増殖されて、溶解される。細胞可溶化物中のレポーター遺伝子の活性量は、アッセイされて、トランスフェクトされた細胞集団の内部で生じるウイルス複製のレベルの尺度を提供する。
【００８４】
あるいは、または上記のアッセイに加えて、ＨＣＶを支持することの可能なナイーブ細胞の第１の集団をトランスフェクトさせて、ある期間の間増殖させ、次いで分泌されるウイルス粒子を含有する上清を収集してもよい。次いで上清を用いて、ＨＣＶ複製を支持するナイーブ細胞の第２の集団を感染させる。次いで、感染したナイーブ細胞を増殖させ、溶解させて、レポーター活性を測定する。この測定は、第１の細胞集団を感染させるために用いられるウイルスの感染力の表れである。
【００８５】
組織培養系のいくつかの利点は、以下の通りである。すなわち、組織培養系は、動物モデルの使用を必要としない；組換えＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物は、培養細胞中で効率的に複製して、感染性ウイルス粒子を産生する；および抗ウイルス介入の標的となり得るＨＣＶウイルスのライフサイクルのすべての手段が再生される。従って、組織培養系は、ウイルスの産生および有望な抗ＨＣＶ治療薬のスクリーニングと検出のための簡便で対費用効果の高い手段を提供する。
【００８６】
ＨＣＶ組織培養系で用いる細胞は、ＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物を複製すること、および感染性ウイルスを生産することが可能な任意の細胞でもよいが、好ましくは、不死化ヒト由来細胞であり、一実施形態において、ヒト肝細胞腫Ｈｕｈ７細胞またはＨｕｈ７由来細胞である。一部の実施形態において、由来細胞を、レプリコンの細胞を治癒させるインターフェロンαで処置したサブゲノムレプリコンを用いて増殖させ、次いでインターフェロンαに対する抵抗性が増大したものを選択する。
【００８７】
本発明のＨＣＶゲノムコンストラクトは、ＨＣＶ構造タンパク質（コア、Ｅ１、およびＥ２）ならびにＨＣＶ非構造タンパク質（ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ、およびＮＳ５ｂ）を含むポリタンパク質としての全ＨＣＶゲノムを発現させる。ある実施形態において、レポーター遺伝子は、ＨＣＶゲノムコンストラクト内に含有され、かつＨＣＶゲノムコンストラクトが複製されるときに複製される。レポーター遺伝子の存在によって、組織培養系でＲＮＡ複製およびウイルス感染力をモニターするためにレポーター活性を測定することが可能になる。ある実施形態において、レポーターは、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、または緑色蛍光タンパク質である。
【００８８】
レポーター遺伝子は、モノシストロン性ＲＮＡ、バイシストロン性ＲＮＡ、またはトリシストロ性ＲＮＡのいずれかとして、ＨＣＶタンパク質をコードする遺伝子と同時発現され得る。バイシストロン性配置において、ゲノムコンストラクト内の１つ以上の遺伝子は、ゲノムコンストラクトにも存在する他の遺伝子の発現を調節しない別個の遺伝因子の翻訳調節下にある。１つの付加遺伝子または複数の付加遺伝子は、（１）ＨＣＶタンパク質と共に、（２）レポーター遺伝子と共に、または（３）ゲノムコンストラクトに含有されるさらに別の別個の翻訳調節因子（すなわち、「トリシストロン性」配置）の制御下で発現され得る。さらに、ＨＣＶタンパク質は、ＨＣＶポリタンパク質として共に発現可能であり、または上述のようにレポーター遺伝子および任意の付加遺伝子のための別個の遺伝因子の発現下にあり得る。あるいは、複製は、レポーター遺伝子のタンパク質発現なしで、例えばレポーター特異的核酸配列をコードする核酸の相対的な存在または非存在をアッセイすることによって検出可能である。
【００８９】
１つの好ましい実施形態において、本発明は、ＨＣＶポリタンパク質の５’領域でコードされるルシフェラーゼ遺伝子を有するモノシストロン性ゲノムＨＣＶレプリコンに、ＨＣＶポリタンパク質およびレポーター遺伝子の間に切断部位を与える。
【００９０】
遺伝子の翻訳を調節する遺伝因子は、当業者にとって周知であり、例えば内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）が挙げられる。適切なＩＲＥＳ配列としては、ポリオウイルス、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）、およびＨＣＶそれ自体に由来する配列が公知である。ある実施形態において、ＨＣＶゲノムコンストラクトは、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含む。図１は、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳを含む典型的なバイシストロン性ゲノムコンストラクト（配列番号１〜５にも記述される）を示す。これらのバイシストロン性ゲノムコンストラクトは、実施例２に記述するように、ルシフェラーゼレポーター遺伝子（Ｌｕｃ）および野生型ＪＦＨ１またはキメラウイルスのゲノムを含む。ＥＭＣＶ配列は、ＨＣＶポリタンパク質の上流にあり、該ポリタンパク質の発現を促進する。ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳは、３’末端で３’非コード領域（ＮＣＲ）によって隣接されるＮＳ５ｂ領域にコアの翻訳を指示する。
【００９１】
ＨＣＶゲノムコンストラクトに含有されるレポーター遺伝子がモノシストロン性配置でもたらされるとき、レポーター遺伝子はＨＣＶゲノムコンストラクトによって産生されるポリタンパク質の一部として発現される。レポーター遺伝子は、レポーター遺伝子産物の両境界（または、レポーター遺伝子産物がポリタンパク質のアミノ末端またはカルボキシル末端である場合、１つの境界で）で切断認識部位をもたらすことによってポリタンパク質から切断できる。切断部位は、その部位で特異的に切断するプロテアーゼ（例えばＨＣＶプロテアーゼ）によって認識される。あるいは、ＣＨＹＳＥＬ配列（シス作用ヒドロラーゼエレメント）（例えば口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ配列）を用いて、ＨＣＶポリタンパク質からレポーター遺伝子産物を放出させることができる（Ｆｅｌｉｐｅ  （２００４）  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２：１３）。別の代替物において、レポーター遺伝子は、切断部位なして構築可能であり、従ってＨＣＶタンパク質の１つに融合した融合タンパク質として発現可能である。ゲノムコンストラクトでは、レポーター遺伝子が融合タンパク質の一部として発現されるとき、レポーター遺伝子は構造タンパク質のコード配列（すなわち、コアもしくはエンベロープ）またはそのフラグメントに結合できる。一実施形態において、ＪＦＨ１コアタンパク質の少なくとも最初の１２残基から最大最初の１８残基まで（例えば、ＪＦＨ１コアタンパク質の１〜１２、１〜１３、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１７、または１〜１８の残基の間で任意の残基数）を含むＪＦＨ１コアタンパク質のＮ末端フラグメントのコード配列は、レポーター遺伝子に結合される。レポーター遺伝子が常にタンパク質を発現しなければならないことは、不必要である。一部の実施形態において、レポーターは、そのレポーターに特異的な核酸配列の相対的な存在または非存在を検出することによって検出可能である。
【００９２】
図２および１７は、野生型ＪＦＨ１もしくはキメラウイルスゲノムおよびウミシイタケルシフェラーゼ（ＲＬｕｃ）もしくは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のレポーター遺伝子を含む典型的なモノシストロン性ゲノムコンストラクトを示す（実施例３ならびに配列番号６〜１０および１６を参照）。さらに、これらのコンストラクトは、レポーター遺伝子の下流にユビキチン（Ｕｂ）プロテアーゼ切断部位をコードする配列を伴うＦＭＤＶ２Ａプロテアーゼをコードする配列を含む。これらのコンストラクトは、共に、外来性アミノ酸のない天然Ｎ末端を有するＨＣＶポリタンパク質の産生を可能にする。発現したＦＭＤＶ  ２ａプロテアーゼは、そのＣ末端で最後から２番目のアミノ酸で自己切断を起こし、それによって残存するポリタンパク質融合に結合したＣ末端ＦＭＤＶ  ２ａアミノ酸を残して、ＨＣＶポリタンパク質からレポーター遺伝子産物を分離させる。そのＣ末端で宿主内在性ユビキチンに特異的なプロテアーゼによるユビキチン切断の切断によって、その正確な未変性Ｎ末端を有するＨＣＶポリタンパク質産物を放出する。
【００９３】
一部の実施形態において、ゲノムコンストラクトは選択可能なマーカーを発現させる。選択可能なマーカーは、ゲノムコンストラクトを内部に持つ細胞の選択を可能にさせる。一部の実施形態において、Ｇ４１８による選択のためのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Ｎｅｏ）が用いられる。薬物耐性に基づく他のマーカーの例としては、ａａｄ、ｂｌｅ、ｄｈｆｒ、ｈｐｔ、ｎｐｔＩＩ、ａｐｈＩＩ、ｇａｔ、およびｐａｃが挙げられる。他のマーカーは、抗生物質（例えば、Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ、Ｚｅｏｃｉｎ、またはＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）を用いる選択を可能にし得るが、当業者は、ゲノムコンストラクトを内部に持つ細胞の選択を可能にする当該技術分野で公知の任意のマーカー遺伝子を用いてもよいことを理解する。完全長ゲノムコンストラクトにおいて、ネオ遺伝子は、通常、存在しない。
【００９４】
ある実施形態において、ゲノムコンストラクトは、１つ以上の細胞適応変異株を有することもある。これらの変異株は、ＨＣＶ産生に対して非許容状態であるかさもなければ効率的でない細胞においてＨＣＶ複製を向上させるか可能にすることができる。Ｈｕｈ７細胞が用いられる一実施形態において、ゲノムコンストラクトは、以下の細胞適応変異株を有することが可能である。すなわち、ＮＳ３領域でＥ１２０２Ｇ、Ｔ１２８０Ｉ、およびＮＳ４ｂ領域でＫ１８４６Ｔ（Ｎｉｃｏｌｅ  Ｋｒｉｅｇｅｒ，  Ｖｏｌｋｅｒ  Ｌｏｈｍａｎｎ，  ａｎｄ  Ｒａｌｆ  Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ，  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ＲＮＡ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ−ａｄａｐｔｉｖｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．２００１，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ７５（１０）：４６１４−４６２４；  Ｖｏｌｋｅｒ  Ｌｏｈｍａｎｎ，  Ｓａｎｄｒａ  Ｈｏｆｆｍａｎｎ，  Ｕｌｒｉｋｅ  Ｈｅｒｉａｎ，  Ｆｒａｎｃｏｉｓ  Ｐｅｎｉｎ，  ａｎｄ  Ｒａｌｆ  Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ，  Ｖｉｒａｌ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ＲＮＡ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ．２００３，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ７７（５）：３００７−３０１９）。しかし、一部の細胞は、細胞培養で適応することなくＨＣＶ複製を支持することできるので（例えば、ＨＣＶ−ＮまたはＪＦＨ−１）、そのような細胞適応変異株は必ずしも必要ではない。本発明の組織培養系は、これらの変異株の有無にかかわらずＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物の複製を支持することができる。
【００９５】
ＨＣＶゲノムコンストラクトは、種々のウイルス株および遺伝子型に由来することが可能である。ＨＣＶゲノムは、任意の型（例えば、１、２、３、４、５、６）のキメラまたはＨＣＶのサブタイプ（例えば、１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ、１ｅ、１ｆ、１ｇ、１ｈ、１ｉ、１ｊ、１ｋ、１ｌ、１ｍ、２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｅ、２ｆ、２ｇ、２ｈ、２ｉ、２ｋ、２ｌ、２ｍ、３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ、３ｅ、３ｆ、３ｇ、３ｈ、３ｉ、３ｋ、４ａ、４ｃ、４ｄ、４ｅ、４ｆ、４ｇ、４ｈ、４ｋ、４ｌ、４ｍ、４ｎ、４ｏ、４ｐ、４ｑ、４ｒ、４ｓ、４ｔ、５ａ、６ａ、６ｂ、６ｄ、６ｆ、６ｇ、６ｈ、６ｉ、６ｊ、６ｋ、６ｌ、６ｍ、６ｎ）のキメラであり得る。ＮＩＡＩＤ  Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）配列データーベース［ｈｃｖ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｈｃｖ−ｄｂ／ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ／ｇｅｎｏｔａｂｌｅ．ｈｔｍｌ］によって設定されたように、この命名法は現在の標準である。この命名法では、以前の遺伝子型７〜９は、６型のサブタイプとして再分類されている（Ｓｉｍｍｏｎｄｓら、（１９９６）  Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７７：３０１３−３０２４）。従って、新しい分類は、以前の分類Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、４α、４β、７ａ、７ｂ、７ｃ／ＮＧＩＩ／ＶＩＩ、７ｄ、ＮＧＩ、８ａ、８ｂ、９ａ、９ｂ、９ｃ、１０ａ／ＴＤ３、および１１ａを含む。
【００９６】
例えば、いくつかのＨＣＶ−１分離株の完全な配列が報告されている。例えば、ＮＣＢＩ受入番号ＡＢ０１６７８５、ＡＢ０４９０８７、ＡＢ０４９０８８、ＡＢ０４９０８９、ＡＢ０４９０９０、ＡＢ０４９０９１、ＡＢ０４９０９２、ＡＢ０４９０９３、ＡＢ０４９０９４、ＡＢ０４９０９５、ＡＢ０４９０９６、ＡＢ０４９０９７、ＡＢ０４９０９８、ＡＢ０４９０９９、ＡＢ０４９０１００、ＡＢ０４９０１０１、ＡＢ０８０２９９、ＡＢ１１９２８２、ＡＢ１５４１７７、ＡＢ１５４１７８、ＡＢ１５４１７９、ＡＢ１５４１８０、ＡＢ１５４１８１、ＡＢ１５４１８２、ＡＢ１５４１８３、ＡＢ１５４１８４、ＡＢ１５４１８５、ＡＢ１５４１８６、ＡＢ１５４１８７、ＡＢ１５４１８８、ＡＢ１５４１８９、ＡＢ１５４１９０、ＡＢ１５４１９１、ＡＢ１５４１９２、ＡＢ１５４１９３、ＡＢ１５４１９４、ＡＢ１５４１９５、ＡＢ１５４１９６、ＡＢ１５４１９７、ＡＢ１５４１９８、ＡＢ１５４１９９、ＡＢ１５４２００、ＡＢ１５４２０１、ＡＢ１５４２０２、ＡＢ１５４２０３、ＡＢ１５４２０４、ＡＢ１５４２０５、ＡＢ１５４２０６、ＡＢ１９１３３、ＡＦ００９６０６、ＡＦ０１１７５１、ＡＦ０１１７５２、ＡＦ０１１７５３、ＡＦ０５４２４７、ＡＦ０５４２４８、ＡＦ０５４２４９、ＡＦ０５４２５０、ＡＦ１３９５９４、ＡＦ１６５０４５、ＡＦ１６５０４６、ＡＦ１６５０４７、ＡＦ１６５０４８、ＡＦ１６５０４９、ＡＦ１６５０５０、ＡＦ１６５０５１、ＡＦ１６５０５２、ＡＦ１６５０５３、ＡＦ１６５０５４、ＡＦ１６５０５５、ＡＦ１６５０５６、ＡＦ１６５０５７、ＡＦ１６５０５８、ＡＦ１６５０５９、ＡＦ１６５０６０、ＡＦ１６５０６１、ＡＦ１６５０６２、ＡＦ１６５０６３、ＡＦ１６５０６４、ＡＦ１７６５７３、ＡＦ２０７７５２、ＡＦ２０７７５３、ＡＦ２０７７５４、ＡＦ２０７７５５、ＡＦ２０７７５６、ＡＦ２０７７５７、ＡＦ２０７７５８、ＡＦ２０７７５９、ＡＦ２０７７６０、ＡＦ２０７７６１、ＡＦ２０７７６２、ＡＦ２０７７６３、ＡＦ２０７７６４、ＡＦ２０７７６５、ＡＦ２０７７６６、ＡＦ２０７７６７、ＡＦ２０７７６８、ＡＦ２０７７６９、Ｆ２０７７７０、ＡＦ２０７７７１、ＡＦ２０７７７２、ＡＦ２０７７７３、ＡＦ２０７７７４、ＡＦ２０８０２４、ＡＦ２７１６３２、ＡＦ２９０９７８、ＡＦ３１３９１６、ＡＦ３３３３２４、ＡＦ３５６８２７、ＡＦ４８３２６９、ＡＦ５１１９４８、ＡＦ５１１９４９、ＡＦ５１１９５０、ＡＪ０００００９、ＡＪ１３２９９６、ＡＪ１３２９９７、ＡＪ２３８７９９、ＡＪ２３８８００、ＡＪ２７８８３０、ＡＹ０４５７０２、ＡＹ０５１２９２、ＡＹ４６０２０４、ＡＹ５８７０１６、Ｄ１０９３４、Ｄ１１１６８、Ｄ１１３５５、Ｄ１３５５８、Ｄ１４４８４、Ｄ１４８５３、Ｄ３０６１３、Ｄ４５１７２、Ｄ５０４８０、Ｄ５０４８１、Ｄ５０４８２、Ｄ５０４８３、Ｄ５０４８４、Ｄ５０４８５、Ｄ６３８５７、Ｄ８５５１６、Ｄ８９８１５、Ｄ８９８７２、Ｄ９０２０８、Ｌ０２８３６、Ｍ５８３３５、Ｍ６２３２１、Ｍ６７４６３、Ｍ８４７５４、Ｍ９６３６２、ＮＣ＿００４１０２、Ｓ６２２２０、Ｕ０１２１４、Ｕ１６３６２、Ｕ４５４７６、Ｕ８９０１９、Ｘ６１５９６を参照。
【００９７】
同様に、いくつかのＨＣＶ−２分離株の完全な配列が報告されている。例えば、ＮＣＢＩ受入番号ＡＢ０３０９０７、ＡＢ０３１６６３、ＡＢ０４７６３９、ＡＢ０４７６４０、ＡＢ０４７６４１、ＡＢ０４７６４２、ＡＢ０４７６４３、ＡＢ０４７６４４、ＡＢ０４７６４５、ＡＦ１６９００２、ＡＦ１６９００３、ＡＦ１６９００４、ＡＦ１６９００５、ＡＦ１７７０３６、ＡＦ２３８４８１、ＡＦ２３８４８２、ＡＦ２３８４８３、ＡＦ２３８４８４、ＡＦ２３８４８５、ＡＦ２３８４８６、ＡＹ２３２７３０、ＡＹ２３２７３１、ＡＹ２３２７３２、ＡＹ２３２７３３、ＡＹ２３２７３４、ＡＹ２３２７３５、ＡＹ２３２７３６、ＡＹ２３２７３７、ＡＹ２３２７３８、ＡＹ２３２７３９、ＡＹ２３２７４０、ＡＹ２３２７４１、ＡＹ２３２７４２、ＡＹ２３２７４３、ＡＹ２３２７４４、ＡＹ２３２７４５、ＡＹ２３２７４６、ＡＹ２３２７４７、ＡＹ２３２７４８、ＡＹ２３２７４９、ＡＹ５８７８４５、ＡＹ７４６４６０、Ｄ００９４４、Ｄ１０９８８、Ｄ５０４０９を参照。本発明で用いる１つの適切なＨＣＶ株は、遺伝子型２ａ株ＪＦＨ１（Ｋａｔｏら、（２００３）  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．６４：３３４−３３９）である。
【００９８】
いくつかのＨＣＶ−３分離株の完全な配列も報告されている。例えば、ＮＣＢＩ受入番号ＡＦ０４６８６６、Ｄ１７７６３、Ｄ２８９１７、Ｄ４９３７４、Ｄ６３８２１、Ｘ７６９１８を参照。ＨＣＶ−４分離株の完全な配列も公知である。例えば、ＮＣＢＩ受入番号ＹＩ１６０４を参照。ＨＣＶ−５分離株の完全な配列は公知である。例えば、ＮＣＢＩ受入番号ＡＦ０６４４９０およびＹ１３１８４を参照。ＨＣＶ−６分離株の完全な配列も公知である。例えば、ＮＣＢＩ受入番号ＡＹ８５９５２６、ＡＹ８７８６５０、Ｄ６３８２２、Ｄ８４２６２、Ｄ８４２６３、Ｄ８４２６４、Ｄ８４２６５、Ｙ１２０８３を参照。
【００９９】
付加的な配列は以下の通りである。分離株ＨＣＶＪ１．１は、以下に記述されている。すなわち、Ｋｕｂｏら、（１９８９）  Ｊａｐａｎ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：１０３６７−１０３７２；Ｔａｋｅｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ｇｅｎｅ  ９１：２８７−２９１；  Ｔａｋｅｕｃｈｉら、（１９９０）  Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７１：３０２７−３０３３；およびＴａｋｅｕｃｈｉら、（１９９０）  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：４６２６。２つの非依存的分離株（ＨＣＶ−ＪおよびＢＫ）の完全なコード配列は、それぞれ、以下によって記述されている。すなわち、Ｋａｔｏら、（１９９０）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：９５２４−９５２８およびＴａｋａｍｉｚａｗａら、（１９９１）  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：１１０５−１１１３。ＨＣＶ-１分離株は、以下によって記述されている。すなわち、Ｃｈｏｏら、（１９９０）  Ｂｒｉｔ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．４６：４２３−４４１；Ｃｈｏｏら、（１９９１）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：２４５１−２４５５およびＨａｎら、（１９９１）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１７１１−１７１５。ＨＣＶ分離株ＨＣ−Ｊ１およびＨＣ−Ｊ４は、Ｏｋａｍｏｔｏら、（１９９１）  Ｊａｐａｎ  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．６０：１６７−１７７に記述されている。ＨＣＶ分離株ＨＣＴ１８、ＨＣＴ２３、Ｔｈ、ＨＣＴ２７、ＥＣ１、およびＥＣ１０は、Ｗｅｉｎｅｒら、（１９９１）  Ｖｉｒｏｌ．１８０：８４２−８４８に記述されている。ＨＣＶ分離株Ｐｔ−１、ＨＣＶ−Ｋ１、およびＨＣＶ−Ｋ２は、Ｅｎｏｍｏｔｏら、（１９９０）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７０：１０２１-１０２５に記述されている。ＨＣＶ分離株Ａ、Ｃ、Ｄ、およびＥは、Ｔｓｕｋｉｙａｍａ−Ｋｏｈａｒａら、（１９９１）  Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ  ５：２４３−２５４に記述されている。
【０１００】
ある実施形態において、ＨＣＶゲノムコンストラクトは、複数のウイルス株または遺伝子型に由来する配列を含むキメラである。そのようなキメラコンストラクトは、キメラＨＣＶポリタンパク質をコードする。一実施形態において、キメラポリタンパク質は、ＮＳ２のＣ末端部分と、ＪＦＨ１由来のＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ、およびＮＳ５ｂの領域と、コア、Ｅ１、Ｅ２、およびｐ７領域と、第２のＨＣＶ分離株由来のＮＳ２のＮ末端部分とを含む。第２の分離株は、ＪＦＨ１と同じまたは異なるサブタイプであってもよい。好ましくは、第２の分離株は、ＪＦＨ１と異なるサブタイプである。ある実施形態において、非ＪＦＨ１株または分離株は、ＨＣＶの１ａ型、１ｂ型、２ａ型、２ｂ型、３ａ型、３ｂ型、４型、５型、または６型である。ある実施形態において、非ＪＦＨ１株または分離株は、Ｈ７７Ｃ、Ｃｏｎ１、ＮＺ１、または４５２である。
【０１０１】
ある実施形態において、ＨＣＶ  ＮＳ２遺伝子は、ＪＦＨ１由来のＥ１、Ｅ２、およびｐ７のタンパク質ならびにＮＳ２のカルボキシ部分をコードするのと同じＨＣＶ株または分離株由来のＮＳ２のアミノ部分をコードするキメラ遺伝子である。ＮＳ２遺伝子のアミノ部分およびカルボキシ部分の間の適切な接合部の部位は、Ｐｉｅｔｓｃｈｍａｎｎ  ｔ  ａｌ  （Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（２００６）  １０３：７４０８−７４１３。これを参照することによって本明細書に援用する）に記述されている。ある実施形態において、ＮＳ２のアミノ部分およびカルボキシ部分の間の接合部は、８７１〜８７７からなる群から選択される残基で生じる。
【０１０２】
典型的なバイシストロン性キメラコンストラクトおよびモノシストロン性コンストラクトを図１、２、および１７に示す。代表的な組換えＨＣＶモノシストロン性ゲノムコンストラクトは、配列番号８のヌクレオチド７からヌクレオチド１０９５３まで連続した配列を含むポリヌクレオチドと、配列番号９のヌクレオチド７からヌクレオチド１０９５３まで連続した配列を含むポリヌクレオチドと、配列番号１０のヌクレオチド７からヌクレオチド１０９７１まで連続した配列を含むポリヌクレオチドと、配列番号１６のヌクレオチド３５からヌクレオチド９７２３まで連続した配列を含むポリヌクレオチドと、またはそれらのＲＮＡ相当物とからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む。これらのバイシストロン性またはモノシストロン性の組換えＨＣＶゲノムコンストラクトのいずれかを含むＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物を用いて、適切な宿主細胞をトランスフェクトさせて、感染性ＨＣＶ粒子を生成することが可能である。
【０１０３】
ＨＣＶゲノム由来のＲＮＡを用いて、相補ＤＮＡのコピーを作製することができる。ＤＮＡコピーを、逆転写（ＲＴ）によって作製することができる。あるいは、ＤＮＡコピーまたはそのフラグメントを合成手段によって全体的に、または部分的に作製することができる。一旦ＲＮＡゲノムのＤＮＡコピーが利用できるようになれば、それを二本鎖ＤＮＡに変えることができ、次いで、ベクター（例えばプラスミド）にクローン化できる。そのプラスミドを用いて、ウイルスＲＮＡが転写可能なＤＮＡ鋳型を作製することができる。別の方法として、そのＤＮＡを用いて、ベクターを使用せずにウイルスＲＮＡを生成することが可能である。この場合、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの適切なプロモーターを、ウイルスゲノムの開始点の上流に導入する。適切なプロモーターとしては、Ｔ７、Ｔ３、およびＳＰ６のプロモーターが挙げられ、これらはｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（「ＩＶＴ」）反応で使用される。ウイルスのＤＮＡコピーは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて場合により増幅できる。
【０１０４】
別の方法として、ウイルス転写物は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（例えばＱβレプリカーゼ）を用いて、ＲＮＡ鋳型から作製可能である。転写媒介増幅（「ＴＭＡ」）反応を用いて、ＲＮＡを増幅することも可能である。
【０１０５】
ＨＣＶ配列を含有するプラスミドは、当該技術分野で周知の任意の方法によって構築可能である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｆｒｉｔｓｃｈ，  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ  （２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）  １９８９  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｄａｖｉｄ  Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，  Ｊｏｅ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２０００、またはＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  １９９９，  ｅｄ．Ｍ．Ｉｎｎｉｓ，  Ｄ．Ｇｅｌｆａｎｄ  ａｎｄ  Ｊ．Ｓｎｉｎｓｋｙ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓを参照。図１２および１３に示すレプリコンＬｕｃＪＦＨ１は、ｐＪＦＨ１由来のＡｇｅ１−ＮｏｔＩフラグメントをＬｕｃ−ＪＦＨ１由来のＡｇｅ１−Ｎｏｔ１フラグメントと置き換えることによって構築され得る。ＪＦＨ１の一部および種々の他のＨＣＶ血清型の構造タンパク質遺伝子の一部を含有するキメラコンストラクトを除いて、本発明のゲノムコンストラクトを、図面および添付の本文に記述するように、ホスホジエステル合成を使用して人工的に合成し、ｐＵＣプラスミドにクローン化した。
【０１０６】
ＦＭＤＶ  ２Ａプロテアーゼのコード配列およびユビキチンプロテアーゼ切断部位を含有するＤＮＡフラグメントを、ｐＬｕｃＪＦＨ１モノシストロン性プラスミドの部分として人工合成した。
【０１０７】
種々の代替のクローニング戦略を用いて、本発明の範囲から逸脱することなく、本発明のゲノムウイルスコンストラクトを構築することが可能であることを当業者は、容易に認識する。
【０１０８】
制限酵素部位を利用して種々のキメラＨＣＶゲノムをｐＵＣプラスミドベクターにクローン化した。組換えウイルスゲノムコンストラクトの作製に成功した後、制限酵素部位を利用して、ゲノムコンストラクトを作製した。配列を、クローニングの後に標準配列決定法を用いて確認した。
【０１０９】
種々の方法を用いて、発現コンストラクトを細胞に送達することができる。そのような方法としては、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降、ポリリジンもしくはポリオルニチン媒介トランスフェクション、または他の不溶性無機塩類（例えば、リン酸ストロンチウム、ケイ酸アルミニウム（ベントナイトとカオリン、酸化クロム、ケイ酸マグネシウム、滑石等を含む））が挙げられる。他の有用なトランスフェクション方法としては、電気穿孔、ソノポレーション、プロトプラスト融合、リポソーム、ペプトイド送達、またはマイクロインジェクションが挙げられる。例えば、目的の細胞を形質転換する技法についての考察については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（上掲）を参照。遺伝子導入に有用な送達系の総説については、Ｆｅｌｇｎｅｒ，  Ｐ．Ｌ．，  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  （１９９０）  ５：１６３−１８７を参照。電気穿孔を用いるＤＮＡ送達方法は、例えば、米国特許第６，１３２，４１９号、第６，４５１，００２号、第６，４１８，３４１号、第６２３３，４８３号、米国特許公開第．２００２／０１４６８３１号、および国際公開第ＷＯ／００４５８２３号に記述されており、それら全体を参照することによりすべてを本明細書に援用する。
【０１１０】
レポーター遺伝子
本発明の組換えゲノムコンストラクトにレポーター遺伝子を包含することで、組織培養系において化合物の抗ＨＣＶ活性をリアルタイムでモニターすることを可能にする。さらに、抗ＨＣＶ活性は単一の時点でよりもむしろ繰り返して定量化されることが望ましく、かつレポーター遺伝子の存在はそのような観察を容易にする。
【０１１１】
好ましくは、レポーター遺伝子は、容易にアッセイされる。例えば、レポーター遺伝子は検出可能なシグナル（例えば可視シグナル）を生じさせることが可能である。レポーター遺伝子は、可視シグナル自体を生じさせるタンパク質、または反応を触媒するタンパク質、可視変化（例えば、蛍光タンパク質または酵素）を生じさせるタンパク質をコードすることが可能である。レポーター遺伝子は、例えば、βガラクトシダーゼまたはペルオキシダーゼの酵素をコードすることも可能である。これら両酵素は、通常、着色した基質および／または産物とともに使用される。レポーター遺伝子は、蛍光タンパク質（例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ））またはその蛍光誘導体（例えば、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、もしくはシアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ））をコードすることが可能である。レポーター遺伝子は、発光タンパク質（例えば、ホタルルシフェラーゼまたはウミシイタケルシフェラーゼ）をコードすることが可能である。レポーター遺伝子は、細胞においてＤＮＡ複製を促進することも可能であり、または薬剤抵抗性マーカーをコードすることも可能である。レポーター遺伝子は、抗原に特異的に結合する抗体を用いて検出できる抗原をコードすることも可能である。さらに、培養培地で測定可能である分泌タンパク質をコードするレポーター遺伝子が用いられることも可能である。そのようなレポーター遺伝子の例としては、分泌アルカリホスファターゼまたはヒト成長ホルモンをコードする遺伝子がある。レポーター遺伝子は、また、核酸ハイブリダイゼーション技術および／または増幅技術を利用して検出可能な独特の核酸配列であり得る。上記記載は、典型的なものであり、レポーター遺伝子のソースを限定するためではなく、さらに多くが当業者によって容易に想定できる。
【０１１２】
本発明で用途を見出され得るレポーター遺伝子としては、例えば、検出のため公知の抗体を有する抗原（例えば、ヒト成長ホルモンおよびヒト成長ホルモンに対する抗体）およびｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで検出可能な活性を有する酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質等）が挙げられる。さらに、上述のように、レポーター遺伝子をコードする核酸の存在を検出することによってモニタリングを行い、複製、発現、または粒子産生を決定することも可能となる。
【０１１３】
従って、本明細書で明らかにするように、レポーター遺伝子「活性」の検出は、レポーター遺伝子の産物の物理的存在または化学的活性の検出を含み、かつレポーター遺伝子に対して特異的な核酸配列のすべてまたは部分の検出も含む。レポーターシグナルは、ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞培養物中に検出可能であり、または細胞可溶化物からｉｎ  ｖｉｔｒｏで定量化可能である。
【０１１４】
細胞系
ＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物の複製を支持することが可能な任意の細胞系を用いてもよい。Ｈｕｈ７細胞系以外に、ヒト癌細胞系ＨｅＬａ、ネズミ肝癌Ｈｅｐａ１−６、ＨＥＫ２９３ヒト肝癌細胞系ＨｅｐＧ２およびＩＭＹ−Ｎ９（ヒト肝細胞およびＨｅｐＧ２細胞の融合に由来する細胞系）もＨＣＶレプリコン複製を支持することが知られている。従って、これらの腫瘍細胞系のいずれかまたはＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物の複製を支持する任意の他の細胞系は、組織培養系で用いてもよい。一部の実施形態において、細胞系はヒト細胞、好ましくはヒト肝癌細胞系Ｈｕｈ７に由来する。
【０１１５】
本発明で用いる１つの細胞系は、肝細胞癌、すなわち、「Ｈｕｈ７」（Ｎａｋａｂａｙａｓｈｉら、（１９８２）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４２：３８５８−６３）として公知のヒト肝癌細胞系に由来する。有用なＨｕｈ７由来細胞系は、完全長ＨＣＶレプリコンを支持する「２１−５」である（Ｐｉｅｔｓｃｈｍａｎｎら、（２００２）  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７６：４００８−２１）。他の適切な細胞系は、Ｈｕｈ−７の亜系統であるＨｕｈ−７．５およびＨｕｈ−７．８であり、これらは細胞培養で完全なＨＣＶ複製を支持し（Ｂｌｉｇｈｔら、（２００２）  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：１３００１−１４；国際公開第ＷＯ２００４／０４４１８２号）、Ｈｕｈ−７．５が好ましい。Ｈｕｈ７細胞（およびそれらの誘導体）の継代によって得られる細胞、ならびにα−インターフェロンおよび／またはγ−インターフェロンでＨｕｈ７を処置することによって得られる細胞も用いることが可能である。国際公開第ＷＯ２００４／０４４１８２号に記述されるように、ＨＣＶに許容状態の細胞系は、（ａ）ＨＣＶで感染させた細胞を培養することと、（ｂ）ＨＣＶの細胞を治癒させることと、（ｃ）ＨＣＶ複製に許容状態である治癒した細胞の亜系統を同定することとを含むプロセスによって調製され得る。
【０１１６】
ＨＣＶ複製のためにヒト由来細胞を使用することは、より正確なＨＣＶ複製のモデルおよびヒトにおける治療に対する反応を提供するために望ましい。一部の実施形態において、細胞が腫瘍細胞であることに注目すべきである。腫瘍細胞（例えば、Ｈｕｈ−７、ＨｅＬａ等）は、培養でより容易に継代可能である。しかし、本発明は、腫瘍細胞に限定されることなく、ＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物の複製を支持する任意の細胞または細胞系を用いて実施され得る。
【０１１７】
種々の実施形態に従って、細胞系は、培養で増殖速度の上昇またはＨＣＶ複製もしくは発現の増加に適応し得る（例えば、ルシフェラーゼレポーターを用いる場合、生物発光ルシフェラーゼシグナルによって測定される）。培養で増殖速度の上昇に適応しているおよび／またはＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物の安定性に適応している細胞系は、本明細書で適応細胞系と呼ぶこともある。
【０１１８】
一部の実施形態において、安定してＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物を内部に持つ細胞は、細胞上でルシフェラーゼ（または他のレポーター）アッセイを行うこと、次いで最も高いルシフェラーゼ（または他のレポーター）シグナルを発現する細胞を伸長させることによって単離可能である。
【０１１９】
増殖動態のための適応が最初に行われる実施形態において、増殖動態に適応した細胞は、ＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物を含まないこともある（例えば、継代中にＲＮＡ転写物が「治癒」されることもあり、または適応細胞は内部にＲＮＡ転写物を持たない細胞に由来することもある）。これらの場合、ルシフェラーゼ（または他のレポーター）アッセイを行う前に、細胞に、ＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物をトランスフェクトしてもよい。
【０１２０】
増殖および／または安定性のための適応は、一部の研究および細胞系にとって望ましいこともあるが、本発明は、また直接由来する（非適応）細胞系（例えば、ＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物をトランスフェクトされたＨｕｈ７細胞）を用いて行われ得ることに注目すべきである。
【０１２１】
培養培地
ＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物の細胞増殖および複製を支持することが可能な任意の培養培地を用いてもよい。一般に、Ｌｉｄｅｎｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ  （２００５）  ３０９：６２３−６２６；参照することによって本明細書に援用する）に記述されている方法を細胞培養で用いた。
【０１２２】
他の因子
さらに、組織培養系は、ウイルスの複製または感染力を向上させる種々の他の因子も含むことがある。例えば、組織培養系は、インターフェロンアンタゴニストまたはＲＮＡサイレンシング抑制因子として作用する二本鎖ＲＮＡ結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含むこともある。ウイルス価は、ウイルス複製を妨げる宿主抗ウイルスの防御機構を遮断することによって改善され得る。宿主防御機構の１つのトリガーは、ウイルス二本鎖ＲＮＡであり、これはウイルス複製の間に中間体として生成される。二本鎖ＲＮＡは、宿主インターフェロンおよびＲＮＡサイレンシング抗ウイルス反応を誘導する。インターフェロンおよびＲＮＡサイレンシング反応の抑制因子は、特定のウイルスによって生成される。例えば、インフルエンザウイルスのＮＳ１タンパク質は、宿主インターフェロン誘導されるｄｓＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼ（ＰＫＲ）およびＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の活性化を遮断する二本鎖ＲＮＡ結合タンパク質である。ＮＳ１は、効率的なインフルエンザウイルス複製に必要とされ、またＨＣＶ感染力を向上させる。
【０１２３】
従って、ある実施形態において、ＨＣＶゲノムＲＮＡによるトランスフェクションの前に、細胞は、ＲＮＡサイレンシング抑制因子をコードするポリヌクレオチドをトランスフェクトされる。任意のインフルエンザ株またはそのフラグメントに由来するＮＳ１をコードするポリヌクレオチドは、ＲＮＡサイレンシングを抑制し、本発明の実施に際して用いられることが可能である。完全長ＮＳ１タンパク質は、ＰＫＲおよびＲＮＡｉを抑制するｄｓＲＮＡ結合ドメイン、ｍＲＮＡ前駆体スプライシングおよびｍＲＮＡの核外輸送を抑制する際に機能するエフェクタードメインを含有する。代表的なＮＳ１遺伝子は、配列番号１５の配列を含む。ｄｓＲＮＡ結合ドメインおよびエフェクタードメインは、それぞれアミノ酸残基１〜８２ならびに１３８〜１４７に存在する。さらに、ＮＳ１タンパク質は、２つの核移行シグナル（ＮＬＳ１およびＮＬＳ２）、切断およびポリアデニル化特異的因子（ＣＰＳＦ）の結合部位、およびポリアデニル化結合タンパク質ＩＩ（ＰＡＢＩＩ）の結合部位を含む。
【０１２４】
ある実施形態において、ウイルス粒子の収量を増加させる配列番号１５のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを含むＮＳ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、本発明の実施に際して用いられる。ある実施形態において、ＮＳ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１１〜１４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【０１２５】
さらに、組織培養系は、ＣＤ８１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み得る。細胞の表面上でＣＤ８１受容体の発現が増加すると、細胞へのウイルス侵入が促進される（Ｐｉｌｅｒｉら、（１９９８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：９３８−９４１、参考として本明細書に援用する）。感染力を向上させるために、細胞に、ＨＣＶ  ＲＮＡをトランスフェクトしてから、ＣＤ８１発現プラスミドをトランスフェクトすることが可能である。
【０１２６】
B．応用
ＨＣＶ組織培養系を用いて、ＨＣＶゲノムＲＮＡ転写からレポーター遺伝子活性を検出することによってＨＣＶの複製、発現、または感染力をモニターすることができる。ＨＣＶ組織培養系は、また、組換えＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物を含有する細胞から生成されたＨＣＶウイルスに存在するレポーター遺伝子活性を検出またはモニタリングすることによって、ＨＣＶのライフサイクルにおける１つ以上の本質的な手順をモニタリングする手段を提供する。ウイルスライフサイクルは、ウイルスが細胞に侵入して、ウイルス粒子を産生し、他の細胞を感染させるためにその細胞から出るために必要な手順を含む。これらの手順は、細胞表面に結合する手順と、細胞表面上で受容体と相互作用して、細胞侵入を促進する手順と、ウイルス粒子を脱核してウイルスゲノムを放出し、次いでウイルスゲノムの複製および発現、ウイルスゲノムの粒子へのパッケージングを含む粒子成熟、細胞を介する放出の手順と、最終的に細胞およびウイルス前駆体の放出から出る手順とを含む（Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  （１９９６）  Ｃｈａｐｔｅｒ  １０：  Ｖｉｒｕｓ−Ｈｏｓｔ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  Ｄ．Ｋｎｉｐｅを参照）。
【０１２７】
別の態様において、組織培養系は、ＨＣＶ増殖側モデルを提供する。このモデルを用いて、薬物動態（ＰＫ）および薬力学（ＰＤ）の研究、毒性研究、ならびに抗ウイルスＨＣＶ候補化合物の迅速なスクリーニングのために、ＨＣＶ複製および感染の抑制剤を評価し、同定することが可能である。
【０１２８】
別の態様において、本発明は、抗ＨＣＶ活性を有する化合物（すなわち、ＨＣＶ複製のレベル、ＨＣＶタンパク質の発現、および／またはウイルス感染力を減少させまたは抑制する化合物）を同定する方法を提供する。化合物は、宿主細胞でＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物の複製を妨げることによって複製を直接的に調節することができ、または宿主細胞でＨＣＶ複製にとって必要であるＨＣＶタンパク質の発現を妨げることによって複製を間接的に調節することができる。あるいは、以下に考察するように、ＨＣＶ組織培養系は、複製または発現それ自体に対する影響を持たないが、その代わりにウイルス粒子の形成を減少させるまたは抑制する化合物を同定する方法を提供する。
【０１２９】
ＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物の複製および／またはウイルス感染価は、細胞培養物中のレポーター遺伝子活性を検出することによって測定され得る。一実施形態において、さらにレポーター遺伝子を含むＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物を含有する細胞を、１つ以上の試験化合物と接触させる。ＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物が複製される場合、レポーター遺伝子は、複製されるだけである。本明細書で考察するように、実施形態によって、レポーター遺伝子タンパク質の発現は、ＨＣＶポリタンパク質の発現に関連付けられる必要はないが、場合により関連付けてもよい。１つ以上の試験化合物に曝される細胞におけるＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物内に含有されるレポーター遺伝子の活性は、試験化合物と接触されてない細胞におけるＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物内に含有されるレポーター遺伝子の活性と比較される。ＲＮＡの複製、発現、および／またはウイルス感染力を減少させる化合物は、ヒトにおいてＨＣＶの複製、発現、および／または感染力を調節する薬物としての用途を有し得る化合物である。
【０１３０】
ＨＣＶ組織培養系を用いて、可能性があるＨＣＶ抗ウイルス化合物を評価してもよい。一実施形態において、組換えＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物をトランスフェクトした肝細胞は、ＨＣＶの複製および／もしくは粒子形成を減少させるまたは予防することが知られている化合物を用いて処置される。次いで該肝細胞は、第２の候補化合物を用いて処理され、該第２の候補化合物が、ＨＣＶ感染を減少させるまたは予防することで知られている化合物との相加効果もしくは相乗効果を有するかどうかを決定される。組織培養系を用いて、本明細書に記載の培養下でＨＣＶの複製、発現、および感染力を測定してもよい。
【０１３１】
抗ウイルス化合物のスクリーニング
本明細書に記載の組織培養系を用いて、抗ウイルス効果（例えば、培養下でＨＣＶの複製、発現、または産生を減少させる）を有する化合物を同定することもできる。さらに、複数の化合物を組み合わせて、相乗効果または相加効果を試験することもできる。
【０１３２】
本明細書で用いる「抗ウイルス剤」または「抗ウイルス化合物」は、哺乳類においてウイルスの形成および／もしくは複製を減少させるまたは抑制するのに有効である薬剤をいう。本明細書で用いるように抗ウイルス剤は、ウイルス生物に特異的に作用してウイルスの複製を減少させるまたは抑制する薬剤を含むように意図されている。抗ウイルス剤は、１つ以上のウイルス機能を妨げることを標的にする薬剤を含むことが可能であり、酵素活性、ウイルス結合、ウイルス侵入、ウイルスパッケージング、およびウイルス感染力に必要なウイルスまたは宿主細胞が挙げられるがこれらに限定されない。化合物のこの群は、小分子および抗体ならびに他の生物製剤を含み得る。
【０１３３】
抗ＨＣＶ剤の場合、ＨＣＶ感染性ウイルスの複製または粒子形成を抑制するどのような抗ウイルス剤でも、抗ウイルス剤および抗ＨＣＶ剤と見なされる。これは、哺乳類においてウイルスの形成および／または複製に必要な宿主機構またはウイルス機構のいずれかを妨げる薬剤を含む。抗ＨＣＶウイルス剤としては、例えば、リバビリン、アマンタジン、ＶＸ−４９７（メリメポジブ、Ｖｅｒｔｅｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＶＸ−４９８（Ｖｅｒｔｅｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、Ｌｅｖｏｖｉｒｉｎ、Ｖｉｒａｍｉｄｉｎｅ、Ｃｅｐｌｅｎｅ（マキサミン）、ＸＴＬ−００１およびＸＴＬ−００２（ＸＴＬ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＭＮ２８３−Ｖａｌｏｐｉｃｔｉｔａｂｉｎｅ（Ｉｄｅｎｉｘ）が挙げられる。抗ウイルス剤は、また、核酸（例えば、ｓｉＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡ）または小分子を含み得る。該小分子は、ウイルス複製およびパッケージングのために必要な１つ以上の酵素活性（例えば、プロテアーゼ、ヘリカーゼ、およびポリメラーゼの機能）を妨げ得る。抗ＨＣＶウイルス剤は、また、核酸（例えば、ｓｉＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡ）または小分子を含み得る。該小分子は、ＨＣＶ複製およびパッケージングのために必要な１つ以上の酵素活性（例えば、プロテアーゼ、ヘリカーゼ、およびポリメラーゼの機能）を妨げ得る。そのような核酸は、アンチセンス分子、二本鎖（二重鎖）ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ等の形で提供可能である。抗ウイルス剤は、免疫調節化合物（免疫系の非特異的修飾物質または特異的修飾物質としてのいずれか）を含み得る。抗ＨＣＶ剤は、また、ワクチン（例えば、ＨＣＶに対する治療ワクチンおよび予防ワクチン）およびＨＣＶ受容体結合を妨げる抗体または小分子を含み得る。
【０１３４】
候補化合物
本発明のすべてのスクリーニング方法で用いる代表的な候補化合物としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない。すなわち、ププチド、ペプトイド、タンパク質、脂質、金属、有機小分子、ＲＮＡアプタマー、抗生物質医薬品および他の公知の医薬品、ポリアミン、抗体もしくは抗体誘導体（例えば、抗原結合フラグメント、ｓｃＦｖｓ等を含む一本鎖抗体）、ならびにそれらの組み合わせまたは誘導体である。有機小分子は、約５０ダルトン以上、約２，５００ダルトン未満、最も好ましくは約３００〜約８００ダルトンの重さの分子である。候補化合物は、合成または天然化合物の多数のライブラリーに由来し得る。例えば、合成化合物ライブラリーは、ＭａｙＢｒｉｄｇｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｒｅｖｉｌｌｅｔ，  Ｃｏｒｎｗａｌｌ，  ＵＫ）またはＡｌｄｒｉｃｈ  （Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，  ＷＩ）から市販されている。あるいは、細菌、菌類、植物、および動物からの抽出物の形での天然化合物のライブラリーを用いてもよい。さらに、候補化合物は、個別の化合物として、または混合物としてのコンビナトリアルケミストリーを用いて合成的に生成されることも可能である。化合物としては、抗体または抗体の抗原結合能を保持する抗体のフラグメントを含み得る。
【０１３５】
薬理学的研究
本発明の組織培養系は、潜在的抗ウイルス化合物の薬物動態研究、薬力学研究、および毒物学研究ならびにプロトコルで使用してもよい。組織培養系を用いて、ＨＣＶ複製の過程をモニターすることも可能であり、および医薬品作用機序を決定することも可能である。
【０１３６】
組織培養系を用いて、ＨＣＶ複製を抑制する化合物またはプロトコルを同定して、評価することも可能である。組織培養系を用いて、ウイルスのライフサイクルにおける他の手段を抑制し得る抗ウイルス化合物（例えば、ウイルスパッケージングまたは細胞からの放出を抑制する化合物）を同定することも可能である。
【０１３７】
組織培養系は、候補化合物によって、または候補プロトコルを用いて処置される。あるいは、組織培養系は、すでに公知の化合物またはＨＣＶに対して有効な免疫調節剤であると決定された化合物（例えばインターフェロン−α）の組み合わせで処置される。抗ウイルス活性は、定量化されて、対照または非処置の組織培養系と比較されることもあり、あるいは定量化されて、複数の候補化合物の相対的順位を決定するために用いられることもある。投与スケジュールは、各候補化合物に対して個別に決定され得る。投与スケジュールを選択して、数日の間、試験化合物の有効量を維持してもよい。
【０１３８】
抗ウイルス活性はいくつかの方法で測定可能である。第１の方法は、上述の１つ以上のレポーター遺伝子を用いること（例えばルシフェラーゼアッセイ技法）である。レポーター遺伝子活性（すなわちレポータータンパク質の量）は、ＨＣＶレプリコン複製の量と相関する。レポータータンパク質のレベルを測定することに加えて、候補化合物またはプロトコルの有効性は、ＨＣＶ  ＲＮＡのレベルまたはウイルスタンパク質のレベルを測定することによって決定され得る。用量依存反応および／または時間依存反応の曲線（例えば、ＥＣ５０、ＩＣ５０）は、候補化合物およびプロトコルに対して決定され得る。
【０１３９】
一部の実施形態において、第２のレポーター遺伝子は、安定してまたは一時的に細胞にトランスフェクトされることもあり、細胞の生存能を評価することを可能にする。試験化合物が標的細胞を死滅させ、次いで第１のレポーター遺伝子の発現が現れない場合、これは、何らかの抗ウイルス活性のためよりもむしろ細胞死のためである。従って、第２のレポーター遺伝子は、ＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物を含有する細胞の生存能のマーカーとして作用する。
【０１４０】
適切な第２のレポーター遺伝子の１つは、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子である。これを決定する別の方法は、ＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物上のＨＣＶ遺伝子および肝細胞（例えばＨｕｈ７またはＨｕｈ７．５）に含有されるヒト遺伝子の遺伝子コピー数を定量化することである。このようにして、細胞におけるＨＣＶ遺伝子コピー数対ヒト遺伝子コピー数の比率を比較することによって、ＨＣＶ抑制剤による処置がＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物の複製を抑制しているかどうか（ＨＣＶ遺伝子対ヒト遺伝子のコピー数の比率の低下）、または化合物がヒト細胞の増殖を抑制しているか、もしくはＨＣＶゲノムＲＮＡ転写物を内部に有する細胞において細胞死が誘発されているかどうか（ＨＣＶ遺伝子対ヒト遺伝子のコピー数の比率が相対的に一定である）を決定することが可能である。細胞におけるＨＣＶ遺伝子およびヒト遺伝子のコピー数は、０日目にベースラインに対して、その後ある時点でもしくは複数の時点で定量化される。
【０１４１】
キット
上述のようにＨＣＶウイルスを生成するために、組換えＨＣＶゲノムコンストラクト、肝細胞、およびトランスフェクション試薬を含む上述の組織培養系は、適切な説明書および他の必要な試薬とともにキットで提供可能である。該キットには、通常、組換えＨＣＶゲノムコンストラクトの組み合わせ（例えば、感染のためのＲＮＡ転写物および／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によるウイルスＲＮＡの産生のためのＤＮＡベクター）および肝細胞（すでにトランスフェクトした肝細胞または分離肝細胞のいずれか）が別々の容器に入っている。組織培養でウイルスを増殖させるための説明書（例えば、文書、テープ、ＶＣＲ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ）は、通常、キットに含まれる。キットは、また、パックされた試薬および材料（すなわち、トランスフェクション試薬、ＲＮＡサイレンシング抑制因子および／またはＣＤ８１をコードするポリヌクレオチド、抗ウイルス化合物、緩衝剤、培養培地等）を含有する。例えば上述のような野生型ＪＦＨ１ウイルスおよびキメラウイルスは、これらのキットを用いて培養で増殖可能である。
【０１４２】
実験
以下は、本発明を実施するための特定の実施形態の例である。これらの実施例は、例示を目的としてのみ提示され、かつ本発明の範囲を何ら限定することを意図しない。
【０１４３】
使用した数量（例えば、量、温度）に関しては正確を確保するよう努力したが、一部の実験誤差および偏差は、言うまでもなく認められるべきである。
【実施例】
【０１４４】
実施例１  一般的材料および方法
細胞
Ｈｕｈ−７
ヒト肝細胞腫細胞系Ｈｕｈ−７（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ４２：３８５８−６３）を、高グルコース、１０％ウシ胎仔血清、Ｌ−グルタミン、および非必須アミノ酸を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ変法イーグル培養培地（ＤＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）で、３７℃、５％ＣＯ２で維持した。特に示さない限り、ＨＣＶ存在下のすべての細胞培養を、本明細書に記載し、ならびに参考として行った。
【０１４５】
Ｈｕｈ７Ｃ
Ｋａｎａｚａｗａら、（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２００４）  ７８：９７１３−９７２０）によってすでに記述されているように、インターフェロン治癒したＨｕｈ７（Ｈｕｈ７Ｃ）細胞を、サブゲノムレプリコンを含有するＨｕｈ７細胞を１００Ｕ／ｍｌ（培養培地）濃度のインターフェロン−αで１４日間処理することによって調製した。手短に言えば、レプリコンを除去してある治癒したＨｕｈ７細胞を、Ｈｕｈ７／Ｒｅｐ−Ｎｅｏ細胞を１００ＵのＩＮＦ−α／ｍｌで１４日間処理することで確立した。レプリコンＲＮＡの排除を、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）およびＧ４１８に対する抵抗消失によって確認した。
【０１４６】
Ｔ７−１１
０．２ｍｌのＨａｎｋ平衡緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ）中にサブゲノムレプリコンを含有するＨｕｈ７由来の５００万の細胞を、細胞移植の前に照射（３Ｇｙ）された雌Ｃ．Ｂ１７ＳＣＩＤマウスの皮下に移植した。２７日後、強い生物発光を放出する腫瘍を切除し、腫瘍の生物発光部分を０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８の存在下でｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養した。Ｇ４１８耐性コロニーのルシフェラーゼ発現を、ＸｅｎｏｇｅｎＩＶＩＳ（登録商標）イメージングシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ａｌａｍｅｄａ，  ＣＡ）を使用して評価した。高発現を有する１つのコロニーを伸長させ、サブゲノムレプリコンを治癒させて細胞系Ｔ７−１１を作製した。
【０１４７】
Ｓｉｅｎａ８
サブゲノムレプリコンを保有するＨｕｈ５．２細胞（Ｌｏｈｍａｎｎら、（１９９９）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５（５４２４）：１１０−１１３）を、１００ＩＵ／ｍｌのインターフェロン−αで３週間処置して、ＨＣＶ  ＲＮＡを治癒させて、個別のコロニーを分離してＳｉｅｎａ８細胞を作製した。細胞を、上述のＨｕｈ７と同じ条件下で維持した。
【０１４８】
ＲＮＡ調製
ＲＮＡ転写物を、ＭＥＧＡＳＣＲＩＰＴキット（Ａｍｂｉｏｎ，  Ａｕｓｔｉｎ，  ＴＸ）を使用して調製した。ＲＮＡを抽出して、製造者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）の説明書に従ってＴＲＩＺＯＬ試薬を用いて精製した。
【０１４９】
ＲＮＡトランスフェクション
サブコンフルエントな細胞をトリプシン処理し、完全ＤＭＥＭで１回洗浄し、無血清ＤＭＥＭ−Ｆ１２培養培地で１回洗浄した。細胞ペレットを、無血清ＤＭＥＭ−Ｆ１２培養培地中で１０細胞／ｍｌの密度で再懸濁させた。電気穿孔キュベット（０．２ｃｍのギャップ、ＢＴＸ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆ．）中の２００ｍｌの細胞懸濁液に、１〜１０ｍｇのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡを加えた。細胞を、２００Ｖおよび１，０００ｍＦに設定したＥＣＭ６３０装置（ＢＴＸ）で直ちに電気穿孔した。電気穿孔の後、細胞懸濁液を室温で５分間保持し、次いで１０％ウシ胎仔血清および非必須アミノ酸を補充したＤＭＥＭに希釈して、直径１０ｃｍのペトリ皿に播種した。
【０１５０】
実施例２  組換えＪＦＨ１ゲノムバイシストロン性コンストラクト
いくつかの野生型ＪＦＨ１ゲノムコンストラクトおよびキメラＪＦＨ１ゲノムコンストラクトを調製した（図１参照）。配列番号１の配列に示すように、ｐＵＣ１８プラスミド内に含有される組換え野生型ＪＦＨ１ゲノムコンストラクトを、すでに記述されているように（Ｗａｋｉｔａら、（２００５）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １１：７９１−７９６、全体として参照することによって本明細書に援用する）調製した。このコンストラクトは、５’および３’の非翻訳領域に隣接したＨＣＶタンパク質コア、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ、およびＮＳ５ｂのオープンリディングフレーム、およびＴ７プロモーターを含む。
【０１５１】
さらに、配列番号２の配列を含むバイシストロン性野生型ＪＦＨ１ゲノムコンストラクト（ＬｕｃＪＦＨ１）を、ウイルス感染およびＲＮＡ複製をモニターするためのルシフェラーゼレポーター遺伝子に結合したＪＦＨ１コアタンパク質の最初の１７のアミノ酸をコードする第１のシストロンを含み、生成した。このバイシストロン性コンストラクトは、野生型ＪＦＨ１ポリタンパク質をコードした第２のシストロンの発現のための脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）の内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）も含んでいた。
【０１５２】
いくつかのバイシストロン性キメラコンストラクトを、また、ＪＦＨ１および第２のＨＣＶ分離株に由来する配列を含むキメラＨＣＶポリタンパク質をコードすることで調製した。すべてのバイシストロン性コンストラクトは、ルシフェラーゼレポーター遺伝子に結合したＪＦＨ１コアタンパク質の最初の１７のアミノ酸をコードする第１のシストロンと、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳと、ＮＳ２の残基８７１（ＬｕｃＣＪ１およびＬｕｃＨＪ１）または残基８７７（ＬｕｃＮＪ１）に遺伝子間接合部を有するキメラＮＳ２によって結合されたキメラポリタンパク質（株ＪＦＨ１由来のＮＳ３〜ＮＳ５ｂの領域および第２のＨＣＶ分離株由来のコア〜ｐ７領域を含む）をコードする第２のシストロンとを含有した。キメラコンストラクトは、以下を含んでいた。すなわち、（ａ）配列番号３の配列に含有され、ＨＣＶ２ａ型株ＪＦＨ１および１ａ型株（Ｈ７７分離株由来のＨＪ１フラグメント）由来の配列を含有するＬｕｃＨＪ１、（ｂ）配列番号４の配列に含有され、ＨＣＶ２ａ型株ＪＦＨ１および１ｂ型株（Ｃｏｎ１分離株由来のＣＪ１フラグメント）由来の配列を含有するＬｕｃＣＪ１、および（ｃ）配列番号５の配列に含有され、ＨＣＶ２ａ型株ＪＦＨ１および１ｂ型株（ＨＮＺ１分離株由来のＮＪ１フラグメント）由来の配列を含有するＬｕｃＮＪ１。
【０１５３】
実施例３  組換えＪＦＨ１ゲノムモノシストロン性コンストラクト
いくつかのモノシストロン性野生型ゲノムコンストラクトおよびキメラＪＦＨ１ゲノムコンストラクトも調製した（図２参照）。モノシストロン性コンストラクトは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはウミシイタケルシフェラーゼ（ＲＬｕｃ）レポーター遺伝子に結合したＪＦＨ１コアタンパク質の最初の１２のアミノ酸をコードする領域と、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａプロテアーゼのコード配列と、ユビキチンプロテアーゼ切断部位のコード配列と、野生型ＪＦＨ１またはキメラポリタンパク質のコード領域とを含んだ。これらのキメラコンストラクトの一部では、ポリタンパク質コード領域は、ＮＳ２の残基８７１（ＲＬＦ２ＡＵｂＣＪ１およびＲＬＦ２ＡＵｂＨＪ１）または残基８７７（ＲＬＦ２ＡＵｂＮＪ１）に遺伝子間接合部を有するキメラＮＳ２コード領域によって結合された、株ＪＦＨ１由来のＮＳ３〜ＮＳ５ｂ配列と、第２のＨＣＶ分離株由来のコア〜ｐ７配列とを含んだ。モノシストロン性コンストラクトは、以下のように本発明のキメラＤＮＡコンストラクトをコードするプラスミドを含んだ。すなわち、（ａ）配列番号６にあるように、野生型ＪＦＨ１ゲノムおよびＲＬｕｃレポーター遺伝子を含有するＲＬＦ２ＡｕｂＪＦＨ−１、（ｂ）野生型ＪＦＨ１ゲノム配列および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーター遺伝子配列およびｐＵＣプラスミド配列を含有する配列番号７の配列を含むＧＦＰＦ２ＡＵｂＪＦＨ−１、（ｃ）ＨＣＶ２ａ型株ＪＦＨ１配列および１ａ型株ＨＪ１配列およびＲＬｕｃレポーター遺伝子配列およびｐＵＣプラスミド配列に由来する配列を含有する配列番号８の配列を含み、該配列の約７ヌクレオチド〜約１０９５３ヌクレオチドを有するＲＬＦ２ＡＵｂＨＪ１、（ｄ）ＨＣＶ２ａ型株ＪＦＨ１配列および１ｂ型株ＣＪ１配列およびＲＬｕｃレポーター遺伝子配列およびプラスミド配列に由来する配列を含有する配列番号９の配列を含み、該配列の約７ヌクレオチド〜約１０９５３ヌクレオチドを有するＲＬＦ２ＡＵｂＣＪ１、および（ｅ）ＨＣＶ２ａ型株ＪＦＨ１配列および１ｂ型株ＮＪ１配列およびＲＬｕｃレポーター遺伝子配列およびプラスミド配列に由来する配列を含有する配列番号１０の配列を含み、該配列の約７ヌクレオチド〜約１０９７１ヌクレオチドを有するＲＬＦ２ＡＵｂＮＪ１。
【０１５４】
Ｐｉｅｔｓｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．は、ＮＳ２タンパク質の第１および第２の推定膜貫通ドメインの間に遺伝子間接合部を有するＮＳ２融合タンパク質を含有するバイシストロン性キメラコンストラクトが増殖性ウイルス粒子を産生することを示した（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（２００６）１０３：７４０８−７４１３）。
【０１５５】
図１２および１３は、記述した組換えＨＣＶゲノムコンストラクトを作製するために使用された制限酵素部位を示す。特に、図１２は、ホスホジエステル合成を用いて合成した２つの組換えＨＣＶゲノム、ＪＦＨ−１およびＬｕｃ  ＪＦＨ−１を示す。ＨＣＶゲノムコンストラクトを、プラスミドｐＵＣ１８のＥｃｏＲ１／Ｘｂａ１制限酵素部位にクローン化した。クローニングを、これらの図および添付した本文に記述するように大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で行った。
【０１５６】
ここで、図１３を参照すると、ＪＦＨ−１株ならびに各ＨＣＶゲノム由来の適合性制限酵素フラグメントが示されている。ＨＣＶゲノムはルシフェラーゼ遺伝子を含有する。適合性フラグメントをｐＵＣベクターにクローン化して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に転換した。上述のように、完全長ＪＦＨ１、およびレポーター遺伝子ゲノムコンストラクトを有するＪＦＨ１をｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成して、ｐＵＣ１８のＥｃｏＲ１／Ｘｂａ１部位にクローン化した。キメラコンストラクトを、図１〜３、１２、および１３に示す制限部位を利用して、従来の制限酵素消化、連結、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）形質転換を用いてクローン化した。示したそれぞれのゲノムコンストラクトにおいて、ゲノムコンストラクトはＥｃｏＲ１部位およびＸｂａ１部位によって隣接されている。他のいずれの内部ＥｃｏＲ１部位またはＸｂａ１部位は、いずれの対応する産物の発現を変えることなく除去可能である。
【０１５７】
実施例４  ウミシイタケルシフェラーゼアッセイ
組換えゲノムＲＮＡ転写物から生成されたウイルスＲＮＡの複製を、ウミシイタケルシフェラーゼ（ＲＬｕｃ）アッセイ（例えば、Ｓｒｉｋａｎｔｈａら、（１９９６）  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：１２１−１２９；Ｌｉｕら、（１９９９）  Ｇｅｎｅ  ２３７：１５３−１５９；Ｈａａｎら、（２００４）  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：６０４８−６０５４；Ｋｉｅｌら、（２００３）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：５６５９−５６６８を参照。これらを参照することによって本明細書に援用する）を用いることによって測定することができる。発光を、ルミノメーターを用いて４８０ｎｍで測定する。光の放出を１０〜３０秒間取り入れる。ＲＬｕｃアッセイを用いて、細胞可溶化物中の細胞内ＨＣＶ  ＲＮＡおよび培養培地の感染性ウイルス価を測定した。細胞中のＨＣＶ複製のレベルを測定するために、Ｒｌｕｃ活性を、細胞可溶化物を用いて測定した。培養上清中に存在する感染性ウイルス価の力価を測定するために、トランスフェクトした細胞または感染させた細胞に由来する条件培養培地をナイーブＨｕｈ７細胞に接種して、感染させた細胞からのＲｌｕｃ活性を測定した。
【０１５８】
実施例５  モノシストロン性およびバイシストロン性の組換え野生型ＪＦＨ１ゲノムＲＮＡ転写物のＲＮＡ複製効率の比較
モノシストロン性およびバイシストロン性の野生型ＪＦＨ１ゲノムＲＮＡ転写物のＲＮＡ複製効率を比較した。ＲＬＦ２ＡＵｂＪＦＨ−１ゲノムＲＮＡ転写物およびＬｕｃＪＦＨ１ゲノムＲＮＡ転写物を、電気穿孔によって別々のＨｕｈ７細胞培養物に導入した。電気穿孔から３３日間、ＲＮＡレベルをルシフェラーゼレポーターからの発光を定量化することによって測定した。
【０１５９】
図３は、モノシストロン性ＲＬＦ２ＡＵｂＪＦＨ−１ＲＮＡ転写物の複製効率が、バイシストロン性ＬｕｃＪＦＨ１ＲＮＡ転写物よりも優れていたことを示す。バイシストロン性ＲＮＡ転写物の複製は、初めはモノシストロン性ＲＮＡ転写物と同程度であったが、９日後に複製は減退したが、一方モノシストロン性ＲＮＡ転写物は３３日間、高レベルで複製を維持した。
【０１６０】
実施例６  モノシストロン性組換えゲノムＲＮＡ転写物によって産生されたＨＣＶウイルスの感染力およびＲＮＡ複製効率
モノシストロン性ＨＣＶゲノムコンストラクトを、感染性ウイルス粒子を産生し、Ｈｕｈ７細胞でウイルスＲＮＡを複製するそれらの能力について評価した。トランスフェクトしたＨｕｈ７細胞において組換えゲノムＲＮＡ転写物によって産生されたウイルスの感染力をトランスフェクトした細胞培養物の上清に放出されたウイルスをナイーブＨｕｈ７細胞に接種することによって決定した。感染性ウイルス価およびＲＮＡ複製のレベルを、実施例４に記述するようにＲＬｕｃアッセイによって決定した。
【０１６１】
Ａ．組換え野生型ＪＦＨ１ゲノムモノシストロン性コンストラクト
組換え野生型ＪＦＨ１ゲノムモノシストロン性ＲＬＦ２ＡＵｂＪＦＨ−１ＲＮＡ転写物を、電気穿孔によってＨｕｈ７細胞に導入した。電気穿孔後、次いで、培養上清中に存在するウイルスを用いて、５×１０４ナイーブＨｕｈ７細胞に感染させ、次いで感染性ウイルス価を、電気穿孔から２８日間、ＲＬｕｃアッセイによって測定した。図４に示すように、ＲＬＦ２ＡＵｂＪＦＨ−１ＲＮＡ転写物は、Ｈｕｈ７細胞から分泌され、ナイーブＨｕｈ７細胞に感染したウイルス粒子を産生した。
【０１６２】
ＲＬＦ２ＡＵｂＪＦＨ−１のＲＮＡ複製のレベルも、組換えウイルスによる感染後の時間の関数として、Ｈｕｈ７細胞で測定した。ナイーブＨｕｈ７細胞（５×１０４）を、電気穿孔から１０日後にトランスフェクトした細胞の培養上清由来のウイルスで接種した。細胞内ＪＦＨ１ＲＮＡを、Ｈｕｈ７細胞の感染から２４日間、ＲＬｕｃアッセイによって測定した。図５に示すように、ＲＮＡは、２日目までに検出可能となり、２４日間持続した。
【０１６３】
Ｂ．組換えキメラゲノムモノシストロン性コンストラクト
野生型ＪＦＨ１ウイルス（モノシストロン性コンストラクトＲＬＦ２ＡＵｂＪＦＨ−１によって産生された）ならびにキメラウイルス（モノシストロン性コンストラクトＲＬＦ２ＡＵｂＨＪ１、ＲＬＦ２ＡＵｂＣＪ１、およびＲＬＦ２ＡＵｂＮＪ１によって産生された）を感染力について比較した。ナイーブＨｕｈ７細胞の培養物を、ゲノムＲＮＡ転写物による電気穿孔後にトランスフェクトした細胞の培養上清由来の各ウイルスで別々に接種した。ウイルス価をＲＬｕｃアッセイによって測定した。図６は、モノシストロン性ＲＬＦ２ＡＵｂＪＦＨ−１ＲＮＡ転写物から産生された組換え野生型ＪＦＨ１ウイルス、およびＲＬＦ２ＡＵｂＣＪ１ＲＮＡ転写物から産生されたキメラウイルスがＨｕｈ７細胞において感染性ウイルスを産生したことを示す。
【０１６４】
野生型ＪＦＨ１ゲノムモノシストロン性コンストラクトおよびキメラゲノムモノシストロン性コンストラクトのＲＮＡ複製効率も比較した。ＲＬＦ２ＡＵｂＪＦＨ−１、ＲＬＦ２ＡＵｂＨＪ１、ＲＬＦ２ＡＵｂＣＪ１、およびＲＬＦ２ＡＵｂＮＪ１のＲＮＡ転写物を、電気穿孔によって別々のＨｕｈ７細胞培養物に導入した。Ｈｕｈ７細胞の培養物を、電気穿孔から３日目および１２日目に分割し、ＲＮＡレベルを、電気穿孔から２１日間ＲＬｃアッセイによって測定した。複製無能ＪＦＨ１変異（Ｗａｋｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．（上掲）にすでに記述されているＪＦＨ１／ＧＮＤ変異）を比較の陰性対照として使用した。
【０１６５】
図７に示すように、すべての組換えコンストラクトはＨｕｈ７細胞で複製し、かつ培養希釈後も複製し続けた。キメラＲＬＦ２ＡＵｂＣＪ１およびＲＬＦ２ＡＵｂＮＪ１のコンストラクトの複製効率は、野生型ＲＬＦ２ＡＵｂＪＦＨ−１コンストラクトとほとんど同じように高かった。しかし、キメラＲＬＦ２ＡＵｂＨＪ１コンストラクトは、他の組換えコンストラクトよりも有意に低い複製レベルを示した。
【０１６６】
実施例７  異なる細胞系におけるＨＣＶウイルスのＲＮＡ複製効率
３種類の細胞系（Ｓｉｅｎａ８、Ｈｕｈ７Ｃ、およびＨｕｈ７）におけるＪＦＨ−１のＲＮＡ複製効率を比較した（図８）。５×１０６細胞に、１μｇまたは４μｇのいずれかのゲノムＲＮＡ転写物ＲＬＦ２ａＵｂＪＦＨ−１をトランスフェクトした。Ｒｌｕｃを、電気穿孔から３日後に細胞可溶化物中で測定した。
【０１６７】
実施例８  ＲＮＡサイレンシング抑制のためのインフルエンザウイルスのＮＳ１コンストラクト
ＪＦＨ１は、細胞培養で感染性ウイルスを効率的に複製して、産生する２ａ型ウイルスである。Ｈｕｈ７．５細胞におけるＪＦＨ１の感染価は、約１０４／ｍｌに制限され、および２ａ型以外の遺伝子型を含むキメラウイルスの力価は、有意に低い（約１０３／ｍｌ）。ウイルス価を、ウイルス複製を妨げる宿主抗ウイルスの防御機構を遮断することによって向上させることができる。
【０１６８】
宿主防御機構の１つのトリガーは、ウイルス複製の間に中間体として生成されるウイルス二本鎖ＲＮＡである。二本鎖ＲＮＡは、宿主インターフェロンおよびＲＮＡサイレンシング抗ウイルス反応を誘導する。インターフェロンおよびＲＮＡサイレンシング反応の抑制因子は、特定のウイルスによって産生される。例えば、インフルエンザウイルスのＮＳ１タンパク質は、インターフェロンによって誘導されるｄｓＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼ（ＰＫＲ）およびＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の活性を遮断する二本鎖ＲＮＡ結合タンパク質である。ＮＳ１は、インフルエンザウイルスの効率的な複製に必要とされる。従って、ＨＣＶ感染価も向上させるＮＳ１の能力を検査した。
【０１６９】
完全長かつ切断型のＮＳ１を含むいくつかのＲＮＡサイレンシング抑制因子を構築した（図９）。代表的なＮＳ１遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＡ４３５３６に見られる。他の入手可能なインフルエンザ株またはそのフラグメントを、本発明の実施に際して用いることも可能である。完全長ＮＳ１タンパク質は、ＰＫＲおよびＲＮＡｉを抑制するｄｓＲＮＡ結合ドメインと、ｍＲＮＡ先駆体のスプライシングおよびｍＲＮＡの核外輸送を抑制する際に機能するエフェクタードメインとを含む。ｄｓＲＮＡ結合ドメインおよびエフェクタードメインは、それぞれアミノ酸残基の１〜８２および１３８〜１４７に存在する。さらに、ＮＳ１タンパク質は、２つの核移行シグナル（ＮＬＳ１およびＮＬＳ２）と、切断・ポリアデニル化特異性因子（ＣＰＳＦ）結合部位と、ポリアデニル化結合タンパク質ＩＩ（ＰＡＢＩＩ）結合部位とを含む。
【０１７０】
以下の４種類のコンストラクトを調製した。すなわち、（ｉ）配列番号１１の約２０３３ヌクレオチド〜約２７２３ヌクレオチドを含む完全長の野生型（ｗｔ）ＮＳ１（残基１〜２３０）、（ｉｉ）ｄｓＲＮＡ結合ドメイン（配列番号１５の残基１〜８２）を有する切断型ＮＳ１タンパク質であるＮＳ８２、（ｉｉｉ）配列番号１５の残基１〜１８０を含むｄｓＲＮＡ結合ドメインおよびエフェクタードメインを含むより長い切断型ＮＳ１タンパク質であるＮＳ１８０、および（ｉｖ）配列番号１５の残基５０〜８４の欠失を含むｄｓＲＮＡ結合ドメイン内の不完全な変異ＮＳ１タンパク質。コンストラクトを、発現のためにｐＣＭＶベクターにそれぞれクローン化した。これらのコンストラクトを配列番号１１〜１４に示す。
【０１７１】
実施例９  ＪＦＨ１の複製へのインフルエンザウイルスのＮＳ１およびＮＳ８２の影響
Ｈｕｈ７細胞においてＪＦＨ１複製へのＮＳ１およびＮＳ８２の発現の影響を検査した。インターフェロン治癒したＨｕｈ７細胞を、ｐＣＭＶ−ＮＳ１またはｐＣＭＶ−ＮＳ８２をトランスフェクトし、続いてモノシストロン性ＪＦＨ１ＲＮＡを用いて電気穿孔した。電気穿孔処理した細胞においてＪＦＨ１ＲＮＡ複製のレベルを、細胞可溶化物上でＲＬｕｃアッセイによって測定した。図１０に示すように、ＪＦＨ１複製のレベルは、電気穿孔から３日目に最大に達した。ＮＳ１をトランスフェクトした細胞において複製のレベルは、偽トランスフェクトした細胞のそれよりも約３倍高かった。高レベルのＪＦＨ１複製は、ＮＳ８２をトランスフェクトした細胞において電気穿孔から５日目まで維持され、一方、野生型ＮＳ１をトランスフェクトした細胞において複製レベルは低下した。
【０１７２】
実施例１０  ＪＦＨ１の感染力へのインフルエンザウイルスのＮＳ１およびＮＳ８２の影響
ＪＦＨ１を、最初にｐＣＭＶ−ＮＳ１（配列番号１１）またはｐＣＭＶ−ＮＳ８２（配列番号１２）で細胞をトランスフェクトし、次いでモノシストロン性ＲＬＦ２ＡＵｂＪＦＨ−１ＲＮＡを用いて細胞を電気穿孔処理することによってインターフェロン治癒したＨｕｈ細胞から生成した。電気穿孔処理した細胞のウイルス複製を測定した。次いで、培養上清に存在するウイルスを用いて、ナイーブＨｕｈ７細胞を感染させ、感染性ウイルス価のレベルを、ＲＬｕｃアッセイによって測定した。図１１に示すように、ＩＦＮ治癒した細胞のＪＦＨ１電気穿孔の前に、ＮＳ８２（１８μｇのｐＣＭＶ−ＮＳ８２をトランスフェクトした）の発現よって、感染性ＪＦＨ１力価は約８倍増加した。ＮＳ１遺伝子を、Ａｓｃ１−Ｎｏｔ１フラグメントとして、ｐＣＭＶプラスミドにクローン化した。
【０１７３】
実施例１１  インターフェロン治癒したＨｕｈ７細胞およびナイーブＨｕｈ７細胞におけるＪＦＨ１の複製および感染力へのＣＤ８１の影響
ＪＦＨ１複製および感染力へのＮＳ１の影響を、インターフェロン治癒したＨｕｈ７細胞（Ｈｕｈ７Ｃ）と、ナイーブＨｕｈ７細胞とで比較した。ウイルスＲＮＡトランスフェクションの前に、ナイーブＨｕｈ７細胞と比較してＮＳ１のコード領域の部分発現によって、Ｈｕｈ７Ｃ細胞の感染性ＪＦＨ１力価に有意な増加がもたらされた。Ｈｕｈ７Ｃ細胞は、ナイーブＨｕｈ７細胞と比較して、ＪＦＨ１複製に対してより許容状態であったが、Ｈｕｈ７Ｃ細胞においてＪＦＨ１の感染力は大幅に損なわれた。
【０１７４】
Ｈｕｈ７Ｃ細胞表面のＣＤ８１レベルは、Ｈｕｈ７細胞のそれの約１／１０であった。ＣＤ８１の役割を検証して、ＪＦＨ１感染力を向上させるために、Ｈｕｈ７に由来する種々の細胞系を、ＣＤ８１発現プラスミド（Ｐｉｌｅｒｉら、（１９９８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：９３８−９４１、参照することにより本明細書に援用する）でトランスフェクトした。ＣＤ８１は感染に必要であり、ＪＦＨ１感染力を向上させた。しかし、閾値を超えたＣＤ８１の過剰発現は、ＪＦＨ１複製を抑制した。Ｈｕｈ７Ｃは複製を支持するために最適であったが、感染力アッセイでは最適以下であった。Ｈｕｈ７は感染にとって最適であった。
【０１７５】
実施例１２  細胞培養で産生されたＨＣＶを用いるアッセイ
培養培地
Ｈｕｈ７．５細胞を、４．５ｇ／ｌのピルビン酸ナトリウム不含グルコースおよびＬ−グルタミン（Ｃｅｌｌｇｒｏカタログ番号１０−０１７−ＣＮ）、１０ｍｌのペニシリン−ストレプトマイシン溶液（１０，０００Ｉ．Ｕ．ペニシリン／ｍｌおよび１０，０００μｇストレプトマイシン／ｍｌ、Ｃｅｌｌｇｒｏカタログ番号３０−００２−ＣＩ）、１０ｍｌの非必須アミノ酸（Ｃｅｌｌｇｒｏカタログ番号２５−０２５−ＣＩ）、および１００ｍｌの非透析ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含んだ１リットルのＤｕｌｂｅｃｃｏ変法イーグル培養培地（ＤＭＥＭ）を含有する培養培地で、増殖させた。
【０１７６】
感染および中和
０日目：
８×１０４〜１０×１０４のＨｕｈ７．５細胞（ルシフェラーゼアッセイ用）または５×１０４Ｈｕｈ７．５細胞（間接蛍光抗体アッセイ用）を２４ウェルプレートのウェルごとに添加した。
【０１７７】
１日目：
Ｈｕｈ７．５細胞にＨＣＶウイルスを感染させた。ウェルに添加する前に、ウイルス培養培地を３７℃まで暖めた。ウェル内の培養培地を、ウェルあたり約２００μｌのウイルス培養培地と交換し、次いで２４ウェルプレートをＣＯ２インキュベーター内に設置して一晩インキュベートした。
【０１７８】
抗体中和を調べるために、抗ＨＣＶ抗体または抗ＨＣＶ抗体含有血清を必要に応じて希釈して、ウイルス培養培地に添加した。混合物を３７℃で１時間インキュベートし、次いでウェルあたり２００μｌを細胞に添加した。細胞をＣＯ２インキュベーター内で５時間（ＲＪ１もしくはＪＦＨ１の場合）、あるいは一晩（ＲＣＪ１もしくはＨＪ１の場合）インキュベートした。場合によっては（例えばＲＪ１を使用した場合）、ウイルス培養培地を除去し、新鮮な培養培地を用いて２回洗浄し、次いでウェルあたり５００μｌの新鮮な培養培地と交換した。
【０１７９】
２日目：
ウイルス培養培地を除去し、２回洗浄して、５００μｌの新鮮な培養培地と交換した。
【０１８０】
３日目：
培養培地を新鮮な培養培地と交換した。
【０１８１】
４日目：
細胞培養で産生されたＨＣＶ（ＨＣＶｃｃ）に対してルシフェラーゼアッセイおよびＩＦＡアッセイを行った。細胞培養で増殖させたＨＣＶ感染肝細胞のウイルス中和のアッセイについての模式図は、図１４を参照。
【０１８２】
ルシフェラーゼアッセイ
ルシフェラーゼを、ウミシイタケルシフェラーゼアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｅ２８２０）を用いて行った。２４ウェルプレートを、ウェルあたり５００μｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を用いて２回洗浄し、次いでＰＢＳを可能な限り除去した。ウェルあたり２００μｌの１×溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加し、次いでウェルプレートを室温で１時間以上振盪させた。ウミシイタケルシフェラーゼアッセイ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）と混合させたルシフェラーゼアッセイ緩衝液の１００μｌアリコートを、ルミノメーターキュベットに添加した。５０μｌの可溶化液を、各キュベット内の１００μｌのアッセイ緩衝液に添加して、混合させた。ルシフェラーゼ活性を、ＭＯＯＮＬＩＧＨＴ  ３０１０ルミノメーターで測定した。
【０１８３】
間接蛍光抗体アッセイ
間接蛍光抗体（ＩＦＡ）アッセイを、細胞の固定化および透過化のためのＣＹＴＯＦＩＸ／ＣＹＴＯＰＥＲＭキットならびに免疫蛍光染色（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５４７１４）を用いて行った。ウェルプレートを、各ウェルあたり５００μｌのＰＢＳを用いて２回洗浄した。ＰＢＳを除去して、１×細胞固定化／透過化溶液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と交換し、一晩固定化させた。ウェルプレートを、ＰＢＳまたは１×細胞洗浄／透過化溶液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて３回洗浄した。遮断試薬を含有する１×細胞洗浄／透過化溶液を添加して、室温で約３０分〜１時間インキュベートした。遮断試薬を除去し、ウェルあたり１５０〜２００μｌの一次抗体（１×細胞洗浄／透過化溶液で１：１０００に希釈したウサギ抗ＮＳ５Ａ）を添加した。ウェルプレートを室温で１時間インキュベートし、次いで１×細胞洗浄／透過化溶液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて３回洗浄してから、二次抗体（ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ４８８、１×細胞洗浄／透過化溶液で１：１０００に希釈したヤギ抗ウサギ結合型抗体）を添加した。ウェルプレートを室温で約１時間インキュベートし、次いでＰＢＳを用いて２回洗浄した。ＰＢＳを除去し、次いでウェルを部分的に空気乾燥させて、密封した。ウェルプレートを、蛍光顕微鏡下での観察まで、−２０℃で保存した。
【０１８４】
実施例１３  Ｈｕｈ７．５細胞におけるＨＣＶ感染のＩＦＡアッセイ
実施例１２に記述するように、ＩＦＡアッセイを、ＪＦＨ１を感染させたＨｕｈ７．５細胞で行った。Ｈｕｈ７．５細胞に、２μｇまたは４μｇのいずれかのＲＬＦ２ＡＵｂＪＦＨ−１ＲＮＡゲノム転写物を電気穿孔によってトランスフェクした。ＪＦＨ１による感染から３日目または１６日目に、細胞を固定して、抗ＮＳ５ａ抗体で免疫染色した。電気穿孔から２５日間、ウイルス価を測定した。図１６に示すように、合成ＪＦＨ１ゲノムはＨｕｈ７．５細胞内で複製し、高ウイルス価で感染性ウイルス粒子を分泌した。電気穿孔から１６日目までに、Ｈｕｈ７．５細胞の約９０％がウイルスに感染した。
【０１８５】
実施例１４  Ｈｕｈ７細胞およびＨｕｈ７．５細胞におけるＪＦＨ１の感染力へのＣＤ８１の影響
ＪＦＨ１感染力へのＣＤ８１の影響を、Ｈｕｈ７細胞およびＨｕｈ７．５細胞で比較した。ＣＤ８１は、細胞表面でＣＤ８１受容体の発現を増加させることで細胞へのウイルス侵入を容易にして、感染力を向上させると予想される。ウイルスＲＮＡトランスフェクションに先立ち、Ｈｕｈ７細胞およびＨｕｈ７．５細胞にＣＤ８１発現プラスミド（Ｐｉｌｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．、上掲）をトランスフェクトした。図１８に示すように、ナイーブ細胞と比較して、Ｈｕｈ７およびＨｕｈ７．５の両細胞は、ＣＤ８１の存在下で感染性ＪＦＨ１力価において有意な増加を示した。
【０１８６】
実施例１５  細胞培養系を用いる抗ＨＣＶ抗体の選択
ＨＣＶ細胞培養系を用いて、ＨＣＶに対する中和抗体を選択した。ＨＣＶウイルスを、細胞培養において、ＲＨＪ１（１ａ型Ｈ７７Ｃ：２ａ型ＪＦＨ１キメラ）、ＲＣＪ１（１ｂ型Ｃｏｎ１：２ａ型ＪＦＨ１キメラ）、およびＲＪ１（２ａ型ＪＦＨ１）のＲＮＡゲノム転写物から生成した（図１７参照）。前述の実施例１２に記述するように、抗ＨＣＶヒトモノクローナル抗体（ＨＣＥ６もしくはＳ３．１）を中和アッセイで検査した。感染に先立ち、抗体をウイルス培養培地と混合させて、５０μｇ、１０μｇ、２μｇ、０．５μｇ、または０．１μｇ／ｍｌの濃度で細胞に添加した。図１９に示すように、ＨＣＥ６モノクローナル抗体は、Ｓ３．１と比較して検査したすべてのＨＣＶウイルスに対して優れたＨＣＶ中和を示した。高抗体濃度（すなわち、１０μｇおよび５０μｇ／ｍｌ）で、ＪＦＨ１および１ａ型Ｈ７７Ｃ：２ａ型ＪＦＨ１キメラに対してほぼ１００％のＨＣＶ中和に達し、高抗体濃度（すなわち、５０μｌ／ｍｌ）で、１ｂ型Ｃｏｎ１：２ａ型ＪＦＨ１キメラに対して約９０％のＨＣＶ中和に達した。
【０１８７】
実施例１６  細胞培養アッセイにおける抗体中和と、動物モデルにおけるＨＣＶ感染からの防御との相互関係
すでに記述されているように（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９４）  ９１：１２９４−１２９８、参照することによって本明細書に援用する）、ＨＣＶ−１  Ｅ１およびＥ２タンパク質をワクチン接種された４頭のチンパンジー（Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ；Ｌ３５７、Ｌ５３４、Ｌ５５９、およびＬ４７０）から、血漿試料を採取した。ワクチン接種された３頭のチンパンジー（Ｌ３５７、Ｌ５３４、およびＬ５５９）は、それに続くＨＣＶ感染から完全に防御された。１頭のチンパンジー（Ｌ４７０）は、部分的な防御（すなわち、ワクチン接種は感染および疾患の発症を有意に遅延した）を示した。５頭目の非ワクチン接種されたチンパンジーから採取された血漿試料を、対照として使用した。
【０１８８】
血漿試料を、実施例１２に記述する細胞培養アッセイを用いて、中和抗体の存在について検査した。図２０において、細胞培養で増殖させた１ａ型Ｈ７７Ｃ：２ａ型ＪＦＨ１キメラウイルスの中和についての結果を示す。防御されたチンパンジー（Ｌ３５７、Ｌ５３４、およびＬ５５９）からの血漿は、ウイルスの８０％〜８８％が中和され、一方部分的に防御されたチンパンジー（Ｌ４７０）からの血漿は、ウイルスの４６％が中和されたことを示した。対照に対して、中和は検出不能であった。これらの結果は、細胞培養アッセイにおいてウイルス中和がＨＣＶ感染の予防効果と十分に関連することを示す。比較のために、ＨＣＶ１ａ型偽粒子（ＨＣＶｐｐ）、ＣＤ８１遮断抗体力価、および抗Ｅ１Ｅ２抗体力価に対して以前にアッセイした際の同じチンパンジーの血漿の中和力価についての研究結果も示す。
【０１８９】
図２１において、細胞培養で増殖させた２ａ型ＪＦＨ１ウイルスの中和についての結果を示す。防御されたチンパンジー（Ｌ３５７、Ｌ５３４、およびＬ５５９）からの血漿は、ウイルスの５３％〜６９％が中和され、一方、部分的に防御されたチンパンジー（Ｌ４７０）からの血漿は、ウイルスの２８％が中和されたことを示した。このように、中和力価は１ａ型ウイルスよりも２ａ型ウイルスに対して低い。細胞培養アッセイの結果は、ＨＣＶ１ａ型および２ａ型で観察された交差予防と関連する。
【０１９０】
このように、野生型ＪＦＨ１およびキメラのそれぞれのモノシストロン性ゲノムコンストラクトおよびバイシストロン性ゲノムコンストラクト、ならびに組織培養でのＨＣＶ産生のためのこれらのコンストラクトを用いる方法を記述する。さらに、細胞培養で増殖させたＨＣＶを用いる中和アッセイを記述する。このアッセイによって測定された中和力価は、ワクチン接種された動物においてＨＣＶ感染の予防効果と十分に関連があることが判明した。本発明の好ましい実施形態は、多少詳細に記述されているが、明白な変化が本明細書に定義するように本発明の趣旨および範囲から逸脱することなくなされ得ると理解される。本明細書に引用するすべての参考文献は、それら全体を参照することによって本明細書に援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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