(57)【要約】生体分子を捕捉および延伸するためのシステム。より具体的には、ＤＮＡ分子を捕捉および延伸するためのシステムに関する。マイクロ流体デバイスは、狭い中心領域でＴ型接点を形成する対称チャネルと、中心領域の外側の３つのより広い部分とを含む。少なくとも１つの電源供給装置が提供され、Ｔ型接点を横断する電位を発生させ、接点内によどみ点を有する局所平面伸張場を生成し、それによって、マイクロ流体デバイス内に導入される生体分子は、よどみ点において捕捉され、伸張場によって延伸される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体分子を捕捉および延伸するためのシステムであって、
狭い中心領域でＴ型接点を形成する対称チャネルと、前記中心領域の外側の３つのより広い部分とを含む、マイクロ流体デバイスと、
前記Ｔ型接点を横切る電位を発生させ、前記接点内によどみ点を有する局所平面伸張場を生成し、それによって、前記マイクロ流体デバイス内に導入される生体分子は、前記よどみ点において捕捉され、前記伸張場によって延伸されるための少なくとも１つの電源供給装置と、
を備える、システム。
【請求項２】
前記対称接点は、垂直アームと、２つの水平アームとを含み、前記３つのアームは、実質的に等しい長さを有し、前記垂直アームの幅は、前記水平アームの幅の約２倍である、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
２つの別個のＤＣ電源供給装置を含み、前記よどみ点の場所を調節する、請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
前記中心領域の角は、円唇化されている、請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
前記垂直アームおよび前記２つの水平アームは、均一電場を含有する、請求項２に記載のシステム。
【請求項６】
前記伸張場は、実質的に均質である、請求項１に記載のシステム。
【請求項７】
前記生体分子は、ＤＮＡである、請求項１に記載のシステム。
【請求項８】
前記ＤＮＡは、Ｔ４  ＤＮＡである、請求項７に記載のシステム。
【請求項９】
前記ＤＮＡ分子は、０．５を超える電気的デボラ数を有する、請求項７に記載のシステム。
【請求項１０】
前記生体分子は、ＤＮＡ、細胞、タンパク質、ウイルス、および生体高分子から成る群から選択される、請求項１に記載のシステム。
【請求項１１】
前記生体高分子は、アクチンである、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１２】
前記垂直アームは、側方注入部を含む、請求項２に記載のシステム。
【請求項１３】
前記垂直アームは、それと連通する２つの集束チャネルを含む、請求項２に記載のシステム。
【請求項１４】
生体分子を捕捉および延伸するためのシステムであって、
接点を包含する、完全十字スロットチャネルを含む、マイクロ流体デバイスと、
前記接点を横切る電位を発生させ、前記接点内によどみ点を有する局所平面伸張場を生成し、それによって、前記マイクロ流体デバイス内に導入される生体分子は、前記よどみ点において捕捉され、前記伸張場によって延伸されるための少なくとも１つの電源供給装置と、
を備える、システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００７年４月５日に出願された仮特許出願第６０／９１０，３３５号に対する優先権を主張する。仮特許出願第６０／９１０，３３５号の内容は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
本発明は、ＮＩＥＨＳ契約番号Ｐ３０ＥＳ００２１０９の結果として生じた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、生体分子を延伸するためのシステムに関し、より具体的には、ＤＮＡ分子を捕捉および延伸するためのシステムに関する。
【背景技術】
【０００４】
生体高分子を捕捉および延伸する能力は、単一分子ＤＮＡマッピング１から高分子物理学の基礎研究２の範囲に及ぶ、いくつかの用途において重要である（上付き数字は、本明細書に添付の参考を指し、その全体の内容は、参照することによって本明細書に組み込まれる）。光または磁気ピンセットを使用して、単一ＤＮＡ分子を捕捉および延伸可能であるが、それらは、ＤＮＡ末端３の特異的修飾に依存する。代替として、ＤＮＡの一端は、固定したまま保持され、電場４または流体力学的流動５によって延伸可能である。拘束されていない遊離ＤＮＡは、ナノチャネル内に駆動され、分子を部分的に延伸可能である６，７。十字スロット幾何学形状内で発生する流体力学的平面伸張流動を使用して、遊離ＤＮＡ８が延伸されているが、よどみ点において、長時間、分子を捕捉することは、瑣末ではない９。分子は、障害物を越えて、縮合物１４内へ、または十字スロットデバイス１５を通して、電気泳動するため１１-１３、電場を使用して、流体チャネル内の小領域内に閉じ込められる１０、あるいは部分的に延伸されている。分子は有限滞留時間を有するため１４、部分的延伸は、これらの上述の電気泳動デバイスにおいて生じる。現在、ＤＮＡまたは他の荷電生体分子を捕捉および延伸するための単純な方法は存在しない。
【０００５】
ＤＮＡは、半屈曲性Ｂｒｏｗｎｉａｎストリングに沿って分布される一連の電荷として、物理的に想定され得る。分子は、ＤＮＡの長さスケールにわたって変動する電場勾配によって、電気泳動的に延伸可能である。ＤＮＡの変形は、電場の運動学の詳細に依存するであろう１２，１６。電場は、純粋に伸張的であるという点において非常に独特である１２，１５，１６。
【０００６】
したがって、本発明の目的は、電場勾配を使用して、生体分子を捕捉および延伸可能なマイクロ流体デバイスを提供することである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一側面では、本発明は、Ｔ型接点を形成する対称チャネルと、狭い中心領域と、中心領域の外側の３つのより広い部分とを有する、マイクロ流体デバイスを含む、生体分子を捕捉および延伸するためのシステムである。少なくとも１つの電源供給装置は、Ｔ型接点を横切る電位を発生させ、接点内によどみ点を有する局所平面伸張場を生成する。マイクロ流体デバイス内に導入されるＤＮＡ等の生体分子は、よどみ点において捕捉され、伸張場によって延伸される。好ましい実施形態では、対称接点は、垂直アームと、２つの水平アームとを含み、３つのアームは、実質的に等しい長さを有し、垂直アームの幅は、水平アームの幅の約２倍である。
【０００８】
好ましい実施形態では、システムは、２つの別個のＤＣ電源供給装置を含み、よどみ点の場所を調節する。また、マイクロ流体デバイスの中心領域内の角は、円唇化されていることが好ましい。垂直アームおよび２つの水平アームは、好ましくは、実質的に均一電場を含有する。別の好ましい実施形態では、伸張場は、実質的に均質である。好ましい実施形態では、生体分子は、Ｔ４  ＤＮＡ等のＤＮＡである。また、電位は、０．５を超えるデボラ数を有することが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１ａ】本発明のある実施形態のチャネル幾何学形状を示す、概略図である。
【図１ｂ】均一／伸張場の場所およびよどみ点を示す、本発明のある実施形態の概略図である。
【図１ｃ】Ｔ接点の拡大図を示す、概略図である。
【図１ｄ】本発明のある実施形態のチャネルの類比として機能する回路図である。
【図２】図２ａは、有限要素計算から導出されるＴ接点領域内の無次元電場強度を示す、グラフである。図２ｂは、無次元電場強度および軌跡のひずみ速度を示す、グラフである。
【図３】図３ａは、よどみ点において捕捉されるＴ４  ＤＮＡ分子の延伸を示す、顕微鏡写真である。図３ｂは、Ｔ４  ＤＮＡ分子の定常挙動を示す、顕微鏡写真である。図３ｃは、Ｔ４  ＤＮＡの平均定常分別伸張対デボラ数を示す、グラフである。
【図４】Ｔ型チャネル内のλ-ＤＮＡ  １０-ＭＥＲの延伸を示す、顕微鏡写真である。
【図５ａ】電場特性解析のための３４のλ-ＤＮＡ電気泳動の軌跡のグラフである。
【図５ｂ】均質伸張領域を交差する図５ａに示される１５の軌跡の半対数（ｔ）トレースを示す、グラフである。
【図５ｃ】同一の１５の軌跡の半対数（ｔ）トレースを示す、グラフである。
【図６】２μｍ高ＰＤＭＳチャネルにおけるＴ４  ＤＮＡの平均二乗分別伸張を示す、グラフである。
【図７】異なる角円唇化方法を使用するチャネル幾何学形状を示す、概略図である。
【図８】本発明の別の実施形態による、完全十字スロットチャネルの概略図である。
【図９】余剰側方注入部を含む、本発明のある実施形態の概略図である。
【図１０】界面動電集束部を含む、本発明の別の実施形態の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
図１（ａ）に示されるように、中心に狭いＴ型部１２と、外側に３つの等しい幅広部１４、１６、および１８とを備える、対称チャネル１０内のＤＮＡ分子の延伸を調査した。Ｔ接点の垂直部および水平部は、同一長ｌ２を有する一方、垂直部の幅は、水平部の幅の２倍である（ｗ２＝２ｗ３）。故に、Ｔ接点は、十字スロットチャネルの半分に相当する。本調査において使用される寸法は、ｌ１＝１ｍｍ、ｌ２＝３ｍｍ、ｗ１＝８０μｍ、ｗ２＝４０μｍ、およびｗ３＝２０μｍであった。局所電場強度極大値を抑制するために、Ｔ接点１２の２つの角２０および２２は、半径Ｒ＝５μｍを有する弧を使用して円唇化した（図１（ｃ））。図１（ｂ）に示されるように、対称電位がチャネル１０に印加されると、よどみ点２４を有する局所平面伸張電場が、Ｔ接点１２内で、均一電場が、３つの直線アーム内で得られ得る。Ｅ１およびＥ２を使用して、それぞれ、均一領域１ならびに均一領域２内で得られる均一電場を表す。
【００１１】
ｌ１、ｌ２＞＞ｗ３であるため、図１（ｄ）に示されるように、単純回路２６を使用して、このチャネルを類比可能である。中心Ｔ接点領域１２は、無視され、チャネルの各直線部は、ｌ／ｗに比例する抵抗を有する抵抗器によって表される。図１（ｄ）に示される各点における電位は、分析的に解明可能である。均一領域１および２内の結果として生じる電場強度は、以下によって求められる。
【００１２】
【化１】
2010523121.tif 000002
その結果、Ｔ接点１２内の結果として生じる伸張場は、ほぼ均質である。電気泳動ひずみ速度は、ｋ
【００１３】
【数１】
2010523121.tif 000003
によっておおよそ求められ、式中、μは、電気泳動移動度である。残りの分析に対しては、以下のように変数を無次元化する。
【００１４】
【化２】
2010523121.tif 000004
図２（ａ）では、Ｔ接点１２の周囲の領域内の無次元電場強度
【００１５】
【数３２】
2010523121.tif 000005
の有限要素計算を示す。チャネル壁の絶縁境界条件を想定する。白色線は、電場線である。角は円唇化されているが、依然として、角における電場強度に小極値が存在する。図２（ｂ）は、接点１２内の無次元電場強度およびひずみ速度を示す。対称性のため、
【００１６】
【数２】
2010523121.tif 000006
および
【００１７】
【数３】
2010523121.tif 000007
に沿ったデータは、重複する。任意の末端効果を伴わない理想的なＴチャネルの電場およびひずみ速度は、点線によって示される。入口（または、出口）領域は、Ｔ接点の入口（または、出口）前の長さｗ３の約３０％から開始し、均一直線領域へとｗ３の全長にわたる。Ｔ接点１２内では、均質伸張場が存在するが、入口／出口効果のため、ひずみ速度は、
【００１８】
【数４】
2010523121.tif 000008
である。電場運動学は、粒子追跡法１７を使用して実験的に検証した。
【００１９】
ソフトリソグラフィ１８を使用して、２μｍ高ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）マイクロチャネルを構築する。本研究では、Ｔ４  ＤＮＡ（１６５．６キロ塩基対、Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ）およびλ-ＤＮＡコンカタマー（末端間ライゲーションによる４８．５キロ塩基対の整数の倍数、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用した。ＤＮＡは、ＹＯＹＯ-１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）によって、４：１  ｂｐ：色素分子で染色し、４  ｖｏｌ  ％  β-メルカプトエタノールによって、５倍のＴＢＥ（０．４５  Ｍ  Ｔｒｉｓ-Ｂｏｒａｔｅ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）に希釈した。染色された輪郭長は、Ｔ４  ＤＮＡに対し７０μｍであって、λ-ＤＮＡコンカタマーに対し２１μｍの整数の倍数であった。下の２つの電極は、２つの別個のＤＣ電源供給装置に接続され、上の電極は、接地した。分子は、蛍光ビデオ顕微鏡法１３を使用して観察した。
【００２０】
典型的実験において、最初に、対称電位を印加し、ＤＮＡ分子をＴ接点領域内に電気泳動的に駆動し、次いで、局所伸張場のよどみ点において、１つの着目分子を捕捉した（図３（ａ））。２つの電源供給装置の適用によって、２つの電位を個々に調節し、したがって、よどみ点の位置を自由に移動させることが可能であった。このよどみ点制御能力によって、最初は、よどみ点に向かって移動しなかった場合でも、視野内の任意のＤＮＡ分子を捕捉することが可能となっ。さらに、また、捕捉される分子のばらつきを克服することができた。例えば、捕捉されるＤＮＡが右側リザーバに向かって浮遊を開始する場合、よどみ点の位置が浮遊分子の方向を反転するように、左側リザーバ内に印加される電位は増大し得る（図３（ｂ））。
【００２１】
図３のＴ４-ＤＮＡは、
【００２２】
【数５】
2010523121.tif 000009
の最大延伸を有し、Ｔ接点内の領域を僅かのみ越えて延在し、そこで均質電気泳動伸張が発生される。この領域内の延伸の程度を判断する無次元群は、デボラ数
【００２３】
【数６】
2010523121.tif 000010
であって、式中、
【００２４】
【数７】
2010523121.tif 000011
は、ＤＮＡの最長緩和時間（１．３±０．２秒として測定された１７）である。図３（ｃ）では、強度の延伸（Ｄｅ＞０．５）が一度生じているのが認められており、流体力学的流動８において観察されるものに類似する。図３（ｃ）内の各点は、平均１５から３０の分子を表す。
【００２５】
次に、２倍のｗ３（４０μｍ）よりも非常に大きい輪郭長を有する分子の延伸を試みた。図４では、輪郭長２１０μｍ（１０-ｍｅｒ、４８５キロ塩基対）を有するλ-ＤＮＡのコンカタマーの延伸を示す。分子がＴ接点に進入すると、旋回平均半径
【００２６】
【数８】
2010523121.tif 000012
１９を有するコイル状態となる。最初は、延伸は、小型のコイルサイズのため、Ｄｅによって支配される。しかしながら、ＤＮＡのアームが一定の電場領域内に及び始めると、延伸は、異なる機構によって生じる。延伸長＞＞２×ｗ３の場合、鎖は、均質電場内の一式の対称的に拘束される鎖（原鎖の半分の輪郭長を有する）に類似する。延伸は、依然として生じるが、ここでは、Ｐｅ＝μＥｌｐ／Ｄ１／２によって支配され、式中、μは、電気泳動移動度（１．３５±０．１４ｘ１０-４ｃｍ２／（ｓＶ））であって、ｌｐは、持続長
【００２７】
【数９】
2010523121.tif 000013
であって、Ｄ１／２は、原鎖の半分の輪郭長を有する鎖の拡散率である（この１０-ｍｅｒ１９に対し
【００２８】
【数１０】
2010523121.tif 000014
）。図４の分子は、輪郭長全体の９４％である最終定常伸張に到達する。
【００２９】
Ｔ接点内で発生する電場は、著しく変形しない条件下、ＤＮＡの質量中心を追跡することによって検証した。容易に追跡するために十分に大きいが、以下に使用される条件において、著しく変形しないように十分に小さいため、λ-ＤＮＡ（４８．５ｋｂｐ）を使用することを選択した。追跡は、印加電場｜Ｅ１｜＝｜Ｅ２｜＝３０Ｖ／ｃｍで実行した。３４のλ-ＤＮＡ分子の質量中心位置は、ＮＩＨソフトウェアを使用して追跡した。図５（ａ）は、Ｔ接点近傍内のこれらの分子の軌跡を示す。最初に、２つの均一領域内の集合平均電気泳動速度を
【００３０】
【数１１】
2010523121.tif 000015
であると判断した。次いで、λ-ＤＮＡの電気泳動移動度は、μ＝１．３５±０．１４ｘ１０-４ｃｍ２／（ｓＶ）であると判断可能である。有限要素計算の結果によると、伸張領域内のひずみ速度は、
【数１２】
2010523121.tif 000016
となるはずである。実験用緩衝剤（４ｖｏｌ％のβ-メルカプトエタノール、粘度
【００３１】
【数１３】
2010523121.tif 000017
の５倍のＴＢＥ）内のλ-ＤＮＡの緩和時間は、
【００３２】
【数１４】
2010523121.tif 000018
として以前に測定されている２０。したがって、λ-ＤＮＡのデボラ数は、
【００３３】
【数１５】
2010523121.tif 000019
であって、０．５よりも小さい。故に、λ-ＤＮＡは、伸張場内で有意に変形せず、トレーサとして機能するために十分であった。
【００３４】
実験的に観察可能なひずみ速度は、データから個別に抽出した。伸張場が認められた１５の分子を選択し、均質伸張領域内に位置するその軌跡の一部を切り取り、
【００３５】
【数１６】
2010523121.tif 000020
および
【００３６】
【数１７】
2010523121.tif 000021
データを、それぞれ、指数関数
【００３７】
【数１８】
2010523121.tif 000022
および
【００３８】
【数１９】
2010523121.tif 000023
に適合した。有限要素計算の結果に基づいて、フィッティング［０、０．８］の範囲の
【００３９】
【数２０】
2010523121.tif 000024
および
【００４０】
【数２１】
2010523121.tif 000025
の両方を有する軌跡の部分だけ選択した。図５では、限定ＤＮＡ軌跡を示す白丸と、フィッティングのために使用される部分を示す黒丸を使用して、フィッティングの実施列を示す。適合された集合平均ひずみ速度は、予測値１．４８±０．４秒-１と比べ、
【００４１】
【数２２】
2010523121.tif 000026
である。この結果は、Ｔ接点内の電場は、ほぼ均質であって、その規模は、予測と定量的に一致することを確認する。図５（ｂ）および（ｃ）は、１５の軌跡の
【００４２】
【数２３】
2010523121.tif 000027
および
【００４３】
【数２４】
2010523121.tif 000028
データの半対数プロットを示す。濃い黒線は、
【００４４】
【数２５】
2010523121.tif 000029
を使用するアフィンスケーリングである。
【００４５】
実験用緩衝剤および２μｍ高Ｔチャネル内のＴ４ＤＮＡの緩和時間は、よどみ点においてＤＮＡを電気泳動的に延伸し、電場を切断し、これらの緩和分子の伸張ｘｅｘ（ｔ）を追跡することによって、実験的に判断した。伸張データは、線形力領域内の関数
【００４６】
【数２６】
2010523121.tif 000030
に適合させ、式中、ｘｉは、初期延伸（線形領域に対し約３０％伸張される）であって、
【００４７】
【数２７】
2010523121.tif 000031
は、平衡状態で平均二乗コイルサイズに相当し、２μｍ-高チャネルにおいて２１μｍ２であった。図６は、１６のＴ４  ＤＮＡ分子（線）および集合平均（記号）の平均二乗伸張（
（
【００４８】
【数２８】
2010523121.tif 000032
）データを示す。結果として生じる緩和時間は、
【００４９】
【数２９】
2010523121.tif 000033
である。
【００５０】
次に、図７-１０と併せて、本発明の他の実施形態を説明する。最初に、図７を参照すると、チャネル１０は、伸張場から均一電場へと異なる種類の遷移をもたらす、種々の曲線を使用して円唇化された角２０および２２を含む。例えば、結果として生じるチャネルが、領域
【００５１】
【数３０】
2010523121.tif 000034
および
【００５２】
【数３１】
2010523121.tif 000035
内で均質伸張電場を提供するように、双曲線関数ｘｙ＝ｌｗ／２（ｗおよびｌは、図面に示される）を使用して、角を円唇化可能である。電場遷移は、即時であって、入口効果は、この種類のＴチャネル内でほぼ完全に抑制される。２ｌ未満の輪郭長を有するＤＮＡの延伸は、デボラ数Ｄｅによって純粋に支配される。また、図８に示されるように、完全十字スロットチャネル１０（上述のＴチャネルは、十字スロットチャネルの半分として想定可能である）は、生体分子捕捉および操作のために使用可能である。４つの直線アームは、等しい幅および長さを有し、角は、Ｔチャネルと同一方法で円唇化可能である。捕捉は、依然として、接点領域の中心に位置するよどみ点を有する局所平面伸張電場に依存する。十字スロットデバイスの動作原理は、上述のＴチャネル実施形態と同一である。
【００５３】
図９は、本発明のある実施形態を示すが、Ｔチャネルは、余剰側方注入部を有する。Ｔチャネルの上アーム上のそのような修正は、さらなる潜在的生物学的用途を可能にするであろう。ＤＮＡ分子（または、他の生体分子）がよどみ点において捕捉されると、他の生体分子（例えば、タンパク質）がこれらの注入チャネルを通して、接点内に挿入され得るように、１つ（または、それ以上）の側方注入チャネルを追加可能である。その結果、複数の分子間の相互作用が、視覚化および研究可能となる。図９は、１つの注入チャネルが追加されたＴチャネルを示す。ＤＮＡ分子は、末端Ａから装填され、電気泳動的に接点内に駆動および延伸される。その後、他の着目分子は、末端Ｂから注入可能である。本発明のさらに別の実施形態は、図１０に示される。等しい長さおよび幅を有する２つの集束チャネル４０および４２は、Ｔ接点の上流に追加される。対称電位が印加されると、これらの２つのチャネル４０および４２は、上アームの中心線内にＤＮＡを集束する助けをする。その結果、接点に進入するＤＮＡ分子の大部分は、よどみ点に向かって真っ直ぐに移動し、したがって、容易に捕捉および延伸され得る。２つの集束チャネル４０および４２は、捕捉プロセスに必要とされる制御量を低減させる。この種類のＴチャネルは、継続的プロセスを実行するための潜在性を有しており、図１０に実証されるように、分子は、接点内に送出され、捕捉され、延伸され、１つずつ解放される。
【００５４】
我々のＤＮＡを捕捉および延伸するデバイスは、他の方法と比べいくつかの利点を有する。電場は、印加、制御が非常に容易であって、その接続は、マイクロ／ナノチャネル内の流体力学的電場よりも遅延時間が少ない。さらに、電場の純粋な伸張運動学は、分子の延伸に有利である。また、電場境界条件は、均質な伸張領域を発生させるために、３つの接続チャネルのみ使用し、よどみ点を調節することによって分子の直接的な捕捉を可能とする。Ｔ接点を跨ぎ、対向する電場によるアーム上での綱引きのような分子によって、延伸は、伸張領域を越える場合でも生じ得る。また、加工は、ナノチャネルに比べて非常に単純であって、その設計によって、所望の分子の容易な捕捉、延伸、および解放が可能となる。
【００５５】
参考
【００５６】
【化３】
2010523121.tif 000036
【００５７】
【化４】
2010523121.tif 000037
本明細書に開示される本発明の修正および変形例は、当業者に明白となり、あらゆるそのような修正および変形例は、添付の請求項の範囲内に含まれるものと意図されることを理解されたい。
【図１ａ】
2010523121.tif 000038
【図１ｂ】
2010523121.tif 000039
【図１ｃ】
2010523121.tif 000040
【図１ｄ】
2010523121.tif 000041
【図２（ａ）】
2010523121.tif 000042
【図２（ｂ）】
2010523121.tif 000043
【図３】
2010523121.tif 000044
【図４】
2010523121.tif 000045
【図５（ａ）】
2010523121.tif 000046
【図５（ｂ）】
2010523121.tif 000047
【図５（ｃ）】
2010523121.tif 000048
【図６】
2010523121.tif 000049
【図７】
2010523121.tif 000050
【図８】
2010523121.tif 000051
【図９】
2010523121.tif 000052
【図１０】
2010523121.tif 000053
【手続補正書】
【提出日】平成21年12月2日(2009.12.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１ａ】
2010523121.tif 000054
【図１ｂ】
2010523121.tif 000055
【図１ｃ】
2010523121.tif 000056
【図１ｄ】
2010523121.tif 000057
【図２】
2010523121.tif 000058
【図３】
2010523121.tif 000059
【図４】
2010523121.tif 000060
【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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