(57)【要約】高眼圧および正常眼圧緑内障や開放隅角緑内障などの緑内障を含めて、眼内圧に関連した病態においてグレムリンを抑制するためのＲＮＡ干渉が提供される。本発明は、ＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡ発現を停止させ、それによって、骨形態形成タンパク質に及ぼすグレムリンの拮抗効果を除去する干渉ＲＮＡであって、このタンパク質がＩＯＰの上昇を伴う少なくともいくつかの因子（ＴＧＦβなど）を遮断する、干渉ＲＮＡを提供する。したがって、ＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡ発現を停止することによって、ＩＯＰに関連した病態の患者において眼内圧が低下される。
2010501188.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＯＰに関連した病態の治療を必要とする患者においてＩＯＰに関連した病態を治療する方法であって、ＲＮＡ干渉によりＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡの発現を減弱する干渉ＲＮＡ分子を患者に投与することを含む方法。
【請求項２】
前記干渉ＲＮＡ分子が二本鎖であり、各鎖が独立に、約１９〜約２７ヌクレオチド長である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
各鎖が独立に、約１９ヌクレオチド長〜約２５ヌクレオチド長である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
各鎖が独立に、約１９ヌクレオチド長〜約２１ヌクレオチド長である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
センス鎖とアンチセンス鎖がリンカーで結合されて、患者においてＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡの発現を減弱することができるｓｈＲＮＡを形成する、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記干渉ＲＮＡ分子が平滑末端を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記干渉ＲＮＡ分子の少なくとも一方の鎖が３’突出を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記３’突出が約１〜約６個のヌクレオチドを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記３’突出が２個のヌクレオチドを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記干渉ＲＮＡ分子が、エアゾール、口腔内、皮膚、皮内、吸入、筋肉内、鼻腔内、眼内、肺内、静脈内、腹腔内、経鼻、経眼、経口、経耳、非経口、貼付剤、皮下、舌下、局所、または経皮経路で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記干渉ＲＮＡ分子が、前記干渉ＲＮＡ分子を発現することができる発現ベクターからインビボ発現によって投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記患者が、ＩＯＰに関連した病態を有するかまたは発症するリスクがある、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＩＯＰに関連した病態が緑内障である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記干渉ＲＮＡ分子が、配列番号２および配列番号１３〜配列番号９８のいずれかに対応するＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡの一部分を認識する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記干渉ＲＮＡ分子が、ＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡの一部分を認識し、前記一部分が、配列番号１のヌクレオチド４０２、４０３、４０４、４０７、４１０、４２５、４４９、４５５、４８５、６４２、６４３、６８６、７８４、１２３０、１５１６、１５５４、１８１１、２１０１、２１８５、２２１２、２２２３、２３６８、２３７０、２４０１、２４１２、２４１３、２６１７、２６９２、２６９３、２８６２、２８８９、３０８４、３７３３、３７４３、３７５２、３７７３、３８４６、４００４、４０９９、２１６、２３５、２３６、２６５、２６７、２７３、２７９、２８０、２８１、３８９、３９１、４０１、４１６、４２６、４２７、４３９、４４０、４５９、４６１、４７１、４７２、４９１、４９７、５２０、５４５、５４６、５７５、５８１、５８７、５９２、５９５、５９６、５９８、５９９、６２４、６２６、６４０、６４６、６５０、６５２、６５７、６５９、６７３、６７６、６７８、６７９、６８８、または６８９を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記干渉ＲＮＡ分子が、少なくとも１つの修飾を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記干渉ＲＮＡ分子が、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
前記干渉ＲＮＡ分子が、局所、硝子体内、経強膜、眼周囲、結膜、テノン嚢下、前房内、網膜下、結膜下、眼球後方、または小管内経路で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
患者の眼においてＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡの発現を減弱する方法であって、ＲＮＡ干渉によりＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡの発現をダウンレギュレートする干渉ＲＮＡ分子を患者の眼に投与することを含む方法。
【請求項２０】
前記干渉ＲＮＡ分子が二本鎖であり、各鎖が独立に、約１９〜約２７ヌクレオチド長である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
各鎖が独立に、約１９ヌクレオチド長〜約２５ヌクレオチド長である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
各鎖が独立に、約１９ヌクレオチド長〜約２１ヌクレオチド長である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
センス鎖とアンチセンス鎖がリンカーで結合されて、患者においてＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡの発現を減弱することができるｓｈＲＮＡを形成する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記干渉ＲＮＡ分子が平滑末端を有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記干渉ＲＮＡ分子の少なくとも一方の鎖が３’突出を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記３’突出が約１〜約６個のヌクレオチドを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記３’突出が２個のヌクレオチドを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記干渉ＲＮＡ分子が、エアゾール、口腔内、皮膚、皮内、吸入、筋肉内、鼻腔内、眼内、肺内、静脈内、腹腔内、経鼻、経眼、経口、経耳、非経口、貼付剤、皮下、舌下、局所、または経皮経路で投与される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
前記干渉ＲＮＡ分子が、前記干渉ＲＮＡ分子を発現することができる発現ベクターからインビボ発現によって投与される、請求項１９に記載の方法。
【請求項３０】
前記患者が、ＩＯＰに関連した病態を有するかまたは発症するリスクがある、請求項１９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＩＯＰに関連した病態が緑内障である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記干渉ＲＮＡ分子が、配列番号２および配列番号１３〜配列番号９８のいずれかに対応するＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡの一部分を認識する、請求項１９に記載の方法。
【請求項３３】
前記干渉ＲＮＡ分子がＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡの一部分を認識し、前記一部分が、配列番号１のヌクレオチド４０２、４０３、４０４、４０７、４１０、４２５、４４９、４５５、４８５、６４２、６４３、６８６、７８４、１２３０、１５１６、１５５４、１８１１、２１０１、２１８５、２２１２、２２２３、２３６８、２３７０、２４０１、２４１２、２４１３、２６１７、２６９２、２６９３、２８６２、２８８９、３０８４、３７３３、３７４３、３７５２、３７７３、３８４６、４００４、４０９９、２１６、２３５、２３６、２６５、２６７、２７３、２７９、２８０、２８１、３８９、３９１、４０１、４１６、４２６、４２７、４３９、４４０、４５９、４６１、４７１、４７２、４９１、４９７、５２０、５４５、５４６、５７５、５８１、５８７、５９２、５９５、５９６、５９８、５９９、６２４、６２６、６４０、６４６、６５０、６５２、６５７、６５９、６７３、６７６、６７８、６７９、６８８、または６８９を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項３４】
前記干渉ＲＮＡ分子が、局所、硝子体内、経強膜、眼周囲、結膜、テノン嚢下、前房内、網膜下、結膜下、眼球後方、または小管内経路で投与される、請求項１９に記載の方法。
【請求項３５】
前記干渉ＲＮＡ分子が、少なくとも１つの修飾を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項３６】
干渉ＲＮＡ分子が、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡである、請求項１９に記載の組成物。
【請求項３７】
約１９〜約４９ヌクレオチド長の干渉ＲＮＡ分子であって、前記干渉ＲＮＡ分子は、
（ａ）配列番号２および配列番号１３〜配列番号９８のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端の最後から２番目の１３個のヌクレオチドと少なくとも９０％の配列相補性または少なくとも９０％の配列同一性をもつ少なくとも１３個の隣接するヌクレオチドの領域、
（ｂ）配列番号２および配列番号１３〜配列番号９８のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端の最後から２番目の１４個のヌクレオチドと少なくとも８５％の配列相補性または少なくとも８５％の配列同一性をもつ少なくとも１４個の隣接するヌクレオチドの領域、あるいは
（ｃ）配列番号２および配列番号１３〜配列番号９８のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端のそれぞれ最後から２番目の１５個、１６個、１７個、もしくは１８個のヌクレオチドと少なくとも８０％の配列相補性または少なくとも８０％の配列同一性をもつ少なくとも１５個、１６個、１７個、もしくは１８個の隣接するヌクレオチドの領域
を含む、干渉ＲＮＡ分子。
【請求項３８】
前記干渉ＲＮＡ分子が、配列番号２および配列番号１３〜配列番号９８のいずれかに対応するＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡの一部分を認識する、請求項３７に記載の干渉ＲＮＡ分子。
【請求項３９】
前記干渉ＲＮＡ分子がＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡの一部分を認識し、前記一部分が、配列番号１のヌクレオチド４０２、４０３、４０４、４０７、４１０、４２５、４４９、４５５、４８５、６４２、６４３、６８６、７８４、１２３０、１５１６、１５５４、１８１１、２１０１、２１８５、２２１２、２２２３、２３６８、２３７０、２４０１、２４１２、２４１３、２６１７、２６９２、２６９３、２８６２、２８８９、３０８４、３７３３、３７４３、３７５２、３７７３、３８４６、４００４、４０９９、２１６、２３５、２３６、２６５、２６７、２７３、２７９、２８０、２８１、３８９、３９１、４０１、４１６、４２６、４２７、４３９、４４０、４５９、４６１、４７１、４７２、４９１、４９７、５２０、５４５、５４６、５７５、５８１、５８７、５９２、５９５、５９６、５９８、５９９、６２４、６２６、６４０、６４６、６５０、６５２、６５７、６５９、６７３、６７６、６７８、６７９、６８８、または６８９を含む、請求項３７に記載の干渉ＲＮＡ分子。
【請求項４０】
前記干渉ＲＮＡ分子が、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡである、請求項３７に記載の組成物。
【請求項４１】
前記干渉ＲＮＡ分子が、少なくとも１つの修飾を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
前記干渉ＲＮＡ分子が二本鎖であり、前記干渉ＲＮＡ分子の少なくとも一方の鎖が３’突出を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４３】
前記３’突出が約１〜約６個のヌクレオチドを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記３’突出が２個のヌクレオチドを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記干渉ＲＮＡ分子が二本鎖であり、前記干渉ＲＮＡ分子が平滑末端を有する、請求項３７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００６年８月２４日に出願された米国仮特許出願第６０／８３９，８２６号の利益を主張し、米国仮特許出願第６０／８３９，８２６号の本文は本明細書中に特に参考として援用される。
【０００２】
本発明は、眼内圧（ＩＯＰ）に関連した病態、具体的には高眼圧、ならびに正常眼圧緑内障および開放隅角緑内障を含めて緑内障においてタンパク質であるグレムリン（ｇｒｅｍｌｉｎ）の発現を阻害するための干渉ＲＮＡ組成物の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
緑内障は、ある種の臨床的特徴を共有する視神経症の異質な一群である。緑内障における視力喪失は、視野の特性変化、神経線維層欠損、および進行性視神経乳頭（ＯＮＨ）陥凹によって臨床診断される神経網膜中の網膜神経節細胞の選択的死が原因である。緑内障発症の主な危険因子の１つに、高眼圧（眼内圧亢進）の存在がある。眼の形状を維持するため、かつ無血管性角膜および水晶体への房水の流動を可能にする圧勾配をもたらすためには、適度な眼内圧が必要である。ＩＯＰレベルは、ＩＯＰを降下させる薬物療法から利益を得る患者によって明らかなように、正常眼圧緑内障（ＮＴＧ）の発生に関与することもあり得る。ＮＴＧ患者におけるＩＯＰ示度に対して中心角膜厚の調節が行われると、これらの患者の多くは高眼圧であることがわかり得る。
【０００４】
緑内障を伴うＩＯＰ亢進は、前眼房の虹彩−角膜の隅角に位置する小さな特殊組織である線維柱帯網（ＴＭ）における房水流出の抵抗の増大が原因である。ＴＭの緑内障性変化としては、ＴＭ細胞の減少、ならびにタンパク質性プラーク様物質を含めて、細胞外破片の沈着および蓄積が挙げられる。さらに、緑内障性ＯＮＨにおいて起こる変化もある。緑内障眼においては、ＯＮＨグリア細胞の形態および移動性の変化がみられる。ＩＯＰ亢進および／または一過性虚血侵襲に応答して、ＯＮＨ細胞外マトリックスの組成の変化、ならびにグリア細胞および網膜神経節細胞の軸索の形態の変化がみられる。
【０００５】
原発緑内障は、解剖学的または生理学的根拠がある眼内液の流れの障害に起因する。続発緑内障は、眼の傷害もしくは外傷、または既存の疾患の結果として起こる。慢性または単純緑内障とも呼ばれる原発開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ）は、すべての原発緑内障の大部分を代表する。ＰＯＡＧは、眼からの排液に対する異常に高い抵抗をもたらす線維柱帯網の変性を特徴とする。このような抵抗の結果は、眼によって正常に産生された液体が増大した抵抗を超えて推進するのに必要とされるＩＯＰの上昇である。
【０００６】
２００３年７月１０日に特許文献１として公開された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０２／３５２５１号は、緑内障の早期診断法、緑内障の治療法、およびそのために有用な化合物の同定法に関する。その中で、ＢＭＰ２アゴニスト、ＢＭＰ４アゴニスト、ＢＭＰ５アゴニスト、ＢＭＰ７アゴニスト、Ｓｍａｄ  １−５アゴニスト、コーディンアンタゴニスト、グレムリンアンタゴニスト、およびフォリスタチンアンタゴニストからなる群から選択された少なくとも１つの化合物からなる配列を含む組成物が、それを必要とする患者に投与される緑内障を治療する方法が提供される。特許文献１では、干渉ＲＮＡの使用は教示または示唆されていない。
【０００７】
現在の抗緑内障療法としては、房水生成抑制薬もしくはぶどう膜強膜流出を増強させる作用剤の使用によるＩＯＰの低下、レーザー線維柱帯形成術、または排液を改善するための濾過手術である線維柱帯切除術が挙げられる。抗緑内障薬剤による手法では、様々な望ましくない副作用が現れた。例えば、ピロカルピンなどの縮瞳薬は、視野のぼやけおよび他のネガティブな視覚副作用を引き起こすおそれがある。炭酸脱水酵素阻害薬（ＣＡＩ）の全身投与も、悪心、消化不良、疲労、および代謝性アシドーシスを引き起こすおそれがある。さらに、ある種のβ遮断薬は、肺組織におけるβ−２受容体に及ぼす効果に起因すると考えられる肺の重篤な副作用をますます伴うようになっている。交感神経興奮薬は、頻脈、不整脈、および高血圧を引き起こす。このようなネガティブな副作用は、服薬遵守の低下または治療の中止を招くことがある。さらに、現在のＩＯＰ低下療法の有効性は、相対的に短時間しか続かず、各日中繰返し投与が必要であり、場合によっては、有効性が経時的に低下する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第０３／０５５４４３号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
緑内障における高眼圧の重大性、および従来の治療方法の欠点を考えると、高眼圧の治療方法を改良し、その進行の根底にある原因に対処すれば望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、ＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡ発現を停止させ、それによって、骨形態形成タンパク質に及ぼすグレムリンの拮抗効果を除去する干渉ＲＮＡであって、このタンパク質がＩＯＰの上昇を伴う少なくともいくつかの因子（ＴＧＦβなど）を遮断する、干渉ＲＮＡを提供する。したがって、ＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡ発現を停止することによって、ＩＯＰに関連した病態の患者において眼内圧が低下される。本発明の干渉ＲＮＡは、高眼圧、および正常眼圧緑内障や開放隅角緑内障などの緑内障を含めて、ＩＯＰに関連した病態の患者を治療するのに有用である。
【００１１】
本発明は、対象においてＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡの発現を減弱する方法も提供する。一態様では、本方法は、有効量の１９〜４９ヌクレオチド長の干渉ＲＮＡおよび薬剤として許容される担体を含む組成物を対象に投与することを含む。別の態様では、投与は、ヒトにおいてＧＲＥＭ１の発現を減弱するために対象の眼に対して行われる。
【００１２】
一態様では、本発明は、対象の眼においてＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡの発現を減弱する方法であって、ＧＲＥＭ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１３３７２）をコードするセンスｃＤＮＡ配列である、配列番号１に対応するｍＲＮＡの一部分を認識することができる領域を含む干渉ＲＮＡを対象の眼に投与し、それによってＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡの発現が減弱されることを含む方法を提供する。さらに、本発明は、ＩＯＰに関連した病態の治療を必要とする対象においてＩＯＰに関連した病態を治療する方法であって、配列番号１の一部分に対応するｍＲＮＡの一部分を認識することができる領域を含む干渉ＲＮＡを対象の眼に投与し、それによってＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡの発現が減弱されることを含む方法を提供する。
【００１３】
いくつかの態様では、本発明の干渉ＲＮＡは、配列番号１の一部分に対応するｍＲＮＡを標的にするように設計され、その一部分は、配列番号１のヌクレオチド４０２、４０３、４０４、４０７、４１０、４２５、４４９、４５５、４８５、６４２、６４３、６８６、７８４、１２３０、１５１６、１５５４、１８１１、２１０１、２１８５、２２１２、２２２３、２３６８、２３７０、２４０１、２４１２、２４１３、２６１７、２６９２、２６９３、２８６２、２８８９、３０８４、３７３３、３７４３、３７５２、３７７３、３８４６、４００４、４０９９、２１６、２３５、２３６、２６５、２６７、２７３、２７９、２８０、２８１、３８９、３９１、４０１、４１６、４２６、４２７、４３９、４４０、４５９、４６１、４７１、４７２、４９１、４９７、５２０、５４５、５４６、５７５、５８１、５８７、５９２、５９５、５９６、５９８、５９９、６２４、６２６、６４０、６４６、６５０、６５２、６５７、６５９、６７３、６７６、６７８、６７９、６８８、または６８９を含む。特定の態様では、「配列番号１の一部分」は、約１９〜約４９ヌクレオチド長である。
【００１４】
いくつかの態様では、本発明の干渉ＲＮＡは、約１９〜約４９ヌクレオチド長である。他の態様では、干渉ＲＮＡは、センスヌクレオチド鎖およびアンチセンスヌクレオチド鎖を含み、各鎖は、他方の鎖と少なくともほぼ完全な隣接する相補性をもつ少なくとも１９個のヌクレオチドの領域を有し、アンチセンス鎖は、配列番号１の一部分に対応するＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡの一部分を認識することができ、ＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡの一部分と少なくともほぼ完全な隣接する相補性をもつ少なくとも１９個のヌクレオチドの領域を有する。センス鎖とアンチセンス鎖はリンカー配列で結合されることが可能であり、センス鎖とアンチセンス鎖が相互にハイブリダイズできるようになり、それによって本明細書に記載されたヘアピンループ構造が形成される。
【００１５】
さらに他の態様では、本発明の干渉ＲＮＡは一本鎖干渉ＲＮＡであり、一本鎖干渉ＲＮＡは、配列番号１の一部分に対応するｍＲＮＡの一部分を認識する。いくつかの態様では、干渉ＲＮＡは、配列番号１の一部分に対応するｍＲＮＡの一部分と少なくともほぼ完全な隣接する相補性をもつ少なくとも１９個のヌクレオチドの領域を有する。他の態様では、配列番号１の一部分は、配列番号１の４０２、４０３、４０４、４０７、４１０、４２５、４４９、４５５、４８５、６４２、６４３、６８６、７８４、１２３０、１５１６、１５５４、１８１１、２１０１、２１８５、２２１２、２２２３、２３６８、２３７０、２４０１、２４１２、２４１３、２６１７、２６９２、２６９３、２８６２、２８８９、３０８４、３７３３、３７４３、３７５２、３７７３、３８４６、４００４、４０９９、２１６、２３５、２３６、２６５、２６７、２７３、２７９、２８０、２８１、３８９、３９１、４０１、４１６、４２６、４２７、４３９、４４０、４５９、４６１、４７１、４７２、４９１、４９７、５２０、５４５、５４６、５７５、５８１、５８７、５９２、５９５、５９６、５９８、５９９、６２４、６２６、６４０、６４６、６５０、６５２、６５７、６５９、６７３、６７６、６７８、６７９、６８８、または６８９を含む。
【００１６】
さらに他の態様では、本発明の干渉ＲＮＡは、（ａ）配列番号２および配列番号１３〜配列番号９８のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端の最後から２番目の１３個のヌクレオチドと少なくとも９０％の配列相補性または少なくとも９０％の配列同一性をもつ少なくとも１３個の隣接するヌクレオチドの領域、（ｂ）配列番号２および配列番号１３〜配列番号９８のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端の最後から２番目の１４個のヌクレオチドと少なくとも８５％の配列相補性または少なくとも８５％の配列同一性をもつ少なくとも１４個の隣接するヌクレオチドの領域、あるいは（ｃ）配列番号２および配列番号１３〜配列番号９８のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端のそれぞれ最後から２番目の１５個、１６個、１７個、もしくは１８個のヌクレオチドと少なくとも８０％の配列相補性または少なくとも８０％の配列同一性をもつ少なくとも１５個、１６個、１７個、もしくは１８個の隣接するヌクレオチドの領域を含み、それらによって、ＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡの発現は減弱される。
【００１７】
別の態様では、本発明の干渉ＲＮＡまたは本発明の干渉ＲＮＡを含む組成物は、局所、硝子体内、経強膜、眼周囲、結膜、テノン嚢下、前房内、網膜下、結膜下、眼球後、または小管内経路で対象に投与される。干渉ＲＮＡまたは組成物は、例えば干渉ＲＮＡ発現ベクターからインビボ発現によって投与することができる。いくつかの態様では、干渉ＲＮＡまたは組成物は、エアゾール、口腔内、皮膚、皮内、吸入、筋肉内、鼻腔内、眼内、肺内、静脈内、腹腔内、経鼻、経眼、経口、経耳、非経口、貼付剤、皮下、舌下、局所、または経皮経路で投与することができる。
【００１８】
一態様では、本発明の干渉ＲＮＡ分子は単離される。「単離された」という用語は、干渉ＲＮＡがその全くの自然環境の外にあることを意味する。
【００１９】
本発明は、さらにＩＯＰに関連した病態の治療を必要とする対象においてＩＯＰに関連した病態を治療する方法であって、ＲＮＡ干渉によりＧＲＥＭ１遺伝子の発現を減少させる二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を含む組成物を対象に投与することを含み、ｓｉＲＮＡ分子の各鎖が独立に、約１９〜約２７ヌクレオチド長であり、ｓｉＲＮＡ分子の一方の鎖が、ＧＲＥＭ１遺伝子に対応するｍＲＮＡと実質的な相補性をもつヌクレオチド配列を含み、したがってｓｉＲＮＡ分子がＲＮＡ干渉によるｍＲＮＡの切断を指示する方法を提供する。いくつかの態様では、ｓｉＲＮＡ分子は、エアゾール、口腔内、皮膚、皮内、吸入、筋肉内、鼻腔内、眼内、肺内、静脈内、腹腔内、経鼻、経眼、経口、経耳、非経口、貼付剤、皮下、舌下、局所、または経皮経路で投与される。
【００２０】
本発明は、第１の干渉ＲＮＡに加えて、さらに第２の干渉ＲＮＡを対象に投与することも行う。第２の干渉ＲＮＡは、第１の干渉ＲＮＡと同じｍＲＮＡ標的遺伝子を標的にすることができ、または異なる遺伝子を標的にすることができる。さらに、第３、第４、または第５などの干渉ＲＮＡを、同様の方式で投与してもよい。
【００２１】
本明細書に記載された実施形態のいずれかの、ＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡの発現を減弱するための医薬品の調製における使用も、本発明の実施形態である。
【００２２】
本発明の具体的な好ましい実施形態は、下記のいくつかの好ましい実施形態のより詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】グレムリンｓｉＲＮＡ＃１、＃２、＃３、および＃４をそれぞれ１０ｎＭ、１ｎＭ、および０．１ｎＭでトランスフェクトされたＧＴＭ−３細胞におけるグレムリンｍＲＮＡ発現のｑＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す図である。
【図２】グレムリンｓｉＲＮＡ＃１、＃２、＃３、および＃４をそれぞれ１０ｎＭ、１ｎＭ、および０．１ｎＭでトランスフェクトされたＧＴＭ−３細胞におけるグレムリンタンパク質発現のウエスタンブロット解析の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本明細書で示される詳細は、例にすぎず、また本発明の好ましい実施形態の考察を例示するためにすぎず、本発明の様々な実施形態の原則および概念的態様の最も有用で容易に理解される説明であると思われるものを提供するために記載されている。この点に関しては、本発明を根本的に理解するために必要な記述より詳細に本発明の構造細部を示す試みはなされておらず、図面および／または実施例を用いた説明によって、本発明のいくつかの形態を実施し得る方法が当業者に明らかになる。
【００２５】
下記の定義および説明は、下記の実施例においてはっきりとした明白な修正のない限り、あるいは意味の適用によって、いずれかの解釈が無意味になるまたは本質的に意味になる場合、今後のいずれの解釈においても支配的であることを意味および意図する。用語の解釈によって、無意味になるまたは本質的に無意味になる場合、定義はＷｅｂｓｔｅｒ’ｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ，  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、または当業者に周知の辞書、具体的にはＯｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｄ．  Ａｎｔｈｏｎｙ  Ｓｍｉｔｈ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  ２００４）から引用されるべきである。
【００２６】
本明細書では、百分率はすべて、別段の記載のない限り重量百分率である。本明細書では、別段の示唆のない限り、「ａ」および「ａｎ」という用語は、「１つ」、「少なくとも１つ」、または「１つまたは複数」を意味するように使用されている。文脈によってそうでないことが必要とされていない限り、本明細書で使用される単数形の用語は複数を含めるものとし、複数形の用語は単数を含めるものとする。
【００２７】
いくつかの実施形態では、本発明は、干渉ＲＮＡのグレムリン（ＧＲＥＭ１）ｍＲＮＡの発現を阻害するための使用に関する。グレムリンは、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）アンタゴニストのＣＡＮファミリーのメンバーである。このファミリーのメンバーはすべて、８員環シスチンノットを含む。ＢＭＰ、ＴＧＦβ、およびＰＤＧＦを含めて、いくつかの増殖因子受容体リガンドも、シスチンノットスーパーファミリーに属する。ＢＭＰ２、４、５、および７；ＢＭＰ受容体Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、およびＲ２；ならびにＢＭＰアンタゴニストであるグレムリン、バンビ（ｂａｍｂｉ）、およびコーディンは、線維柱帯網（ＴＭ）において発現される（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０２／３５２５１号、同上；Ｗｏｒｄｉｎｇｅｒら、Ｍｏｌ．  Ｖｉｓｉｏｎ  ２００２，  ８：２４１−２５０）。ＢＭＰシグナリングは、ＩＯＰの上昇を伴う、ＴＧＦβによって誘導されるＴＭ機能の変化の少なくとも一部（例えば、フィブロネクチン分泌の増大）を遮断する。グレムリンは、このＢＭＰのＴＧＦβシグナリングに及ぼす効果に拮抗する。さらに、グレムリン発現は、緑内障性ＴＭ細胞において亢進され（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０２／３５２５１号、同上）、グレムリンは、培養ヒト眼においてＩＯＰを上昇させる。したがって、グレムリン発現を停止させることは、高血圧および緑内障に関係した眼疾患の治療においてＩＯＰを低下させる有効な方法として本明細書に記載される。
【００２８】
本発明によれば、ＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡの発現を効果的に阻害することによって、グレムリンの作用が低下する。さらに、外因的に供給されたまたは内因的に発現された本明細書に記載される干渉ＲＮＡは、ＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡを停止するのに特に有効である。
【００２９】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を使用して、遺伝子発現を停止させる過程である。特定の理論に拘泥するものではないが、ＲＮＡｉは、リボヌクレアーゼＩＩＩ様酵素であるダイサーによる、より長いｄｓＲＮＡの低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）への切断で始まる。ｓｉＲＮＡは、通常約１９〜２８ヌクレオチド長、または２０〜２５ヌクレオチド長、または２１〜２２ヌクレオチド長であり、多くの場合２−ヌクレオチド３’突出、ならびに５’ホスフェートおよび３’ヒドロキシル末端を含むｄｓＲＮＡである。一方のｓｉＲＮＡ鎖が、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれるリボ核タンパク質複合体に組み込まれる。ＲＩＳＣは、このｓｉＲＮＡ鎖を使用して、組み込まれたｓｉＲＮＡ鎖に少なくとも部分的に相補であるｍＲＮＡ分子を同定し、次いでこれらの標的ｍＲＮＡを切断し、またはそれらの翻訳を阻害する。したがって、ＲＩＳＣに組み込まれたｓｉＲＮＡ鎖は、ガイド鎖またはアンチセンス鎖と呼ばれる。パッセンジャー鎖またはセンス鎖と呼ばれる他方のｓｉＲＮＡ鎖は、ｓｉＲＮＡから取り除かれ、標的ｍＲＮＡと少なくとも部分的に相同である。原理的に、ｓｉＲＮＡはどちらの鎖でもＲＩＳＣに組み込まれ、ガイド鎖として機能できることを当業者は理解されよう。しかし、ｓｉＲＮＡ設計（例えば、ｓｉＲＮＡ二本鎖の所望のガイド鎖の５’末端における安定性の低下）は、所望のガイド鎖をＲＩＳＣに組み込むことに有利であり得る。
【００３０】
ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖がＲＩＳＣに組み込まれ、したがってＲＩＳＣがアンチセンスｓｉＲＮＡ鎖に少なくとも部分的に相補である標的ｍＲＮＡを同定し、切断または翻訳抑制できるようになるという点で、ｓｉＲＮＡの活性なガイド鎖である。ガイド鎖に少なくとも部分的に相補である配列を有するｍＲＮＡのＲＩＳＣによって媒介された切断は、そのｍＲＮＡ、およびこのｍＲＮＡによってコードされた対応するタンパク質の定常状態レベルの低下を招く。あるいは、ＲＩＳＣは、標的ｍＲＮＡを切断することなく翻訳抑制によって、対応するタンパク質の発現を低減することもできる。
【００３１】
本発明の干渉ＲＮＡは、標的ｍＲＮＡを切断するために触媒のように機能するようである。すなわち、干渉ＲＮＡは、化学量論量以下で標的ｍＲＮＡの阻害を行うことができる。このような切断条件下で治療効果をもたらすには、アンチセンス療法に比べて大幅に少ない干渉ＲＮＡしか必要でない。
【００３２】
いくつかの実施形態では、本発明は、干渉ＲＮＡを使用して、ＧＲＥＭ１標的ｍＲＮＡの発現を阻害し、したがってＩＯＰに関連した病態の患者においてＧＲＥＭ１レベルを低減する方法を提供する。本発明によれば、外因的に提供されたまたは内因的に発現された干渉ＲＮＡは、眼組織においてＧＲＥＭ１発現を停止する。
【００３３】
本明細書では「ｍＲＮＡの発現を低減すること」というフレーズは、所定量の干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）を投与または発現して、ｍＲＮＡの切断または翻訳の直接阻害により、標的ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を低減することを意味する。本明細書では「阻害する」、「停止すること」、および「減弱すること」という用語は、標的ｍＲＮＡまたは対応するタンパク質の発現が、本発明の干渉ＲＮＡの非存在下での標的ｍＲＮＡまたは対応するタンパク質の発現に比べて、測定可能なほど低下していることを意味する。標的ｍＲＮＡまたは対応するタンパク質の発現の低下は一般的に「ノックダウン」と呼ばれ、非ターゲティング対照ＲＮＡ（例えば、非ターゲティング対照ｓｉＲＮＡ）の投与または発現の後に存在するレベルに比べて報告されている。５０％および１００％を含む５０％〜１００％の発現のノックダウン量が、本明細書の実施形態で考えられている。しかし、本発明ではこのようなノックダウンレベルを実現する必要はない。
【００３４】
ノックダウンは一般的に、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）増幅法でｍＲＮＡレベルを測定することによって、またはウエスタンブロットもしくは酵素結合性免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）でタンパク質レベルを測定することによって評価される。タンパク質レベルを分析することによって、ｍＲＮＡ切断と翻訳阻害の両方の測定が行われる。さらなるノックダウン測定技法としては、ＲＮＡ溶液ハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼプロテクション、ノーザンハイブリダイゼーション、マイクロアレイを用いた遺伝子発現モニタリング、抗体結合、放射性免疫測定、および蛍光活性化細胞分析が挙げられる。
【００３５】
本発明の干渉ＲＮＡ分子によってＧＲＥＭ１の発現を減弱することは、ヒトまたは他の哺乳類において、例えば眼内圧の改善、視野障害の改善、または視神経乳頭変化の改善などＩＯＰに関連した症状の改善を観察することによって、推測することができる。
【００３６】
例えば、ＨｅＬａ細胞において内因性標的遺伝子発現のレベルをノックダウンする干渉ＲＮＡの能力は、以下の通りインビトロで評価することができる。ＨｅＬａ細胞を、トランスフェクションの２４時間前に標準増殖培地（例えば、１０％ウシ胎仔血清を補充したＤＭＥＭ）に蒔く。トランスフェクションは、例えばＤｈａｒｍａｆｅｃｔ  １（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、米国コロラド州ラファイエット）を製造業者の指示書に従って使用して、干渉ＲＮＡ濃度０．１ｎＭ〜１００ｎＭで行う。ｓｉＣＯＮＴＲＯＬ（商標）非ターゲティングｓｉＲＮＡ  ＃１およびｓｉＣＯＮＴＲＯＬ（商標）シクロフィリンＢ  ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）をそれぞれ、負および正の対照として使用する。標的ｍＲＮＡレベルおよびシクロフィリンＢ  ｍＲＮＡ（ＰＰＩＢ、ＮＭ＿０００９４２）レベルは、トランスフェクションの２４時間後に、例えば標的部位に好ましくは重なるＴＡＱＭＡＮ（登録商標）  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国カリフォルニア州フォスターシティー）を使用して、ｑＰＣＲによって評価される。正の対照ｓｉＲＮＡは、トランスフェクション効率が１００％であるときシクロフィリンＢ  ｍＲＮＡの本質的に完全なノックダウンを与える。したがって、標的ｍＲＮＡノックダウンは、シクロフィリンＢ  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトされた細胞におけるシクロフィリンＢ  ｍＲＮＡレベルを参照することにより、トランスフェクション効率で補正される。標的タンパク質レベルは、例えばウエスタンブロット法で、トランスフェクションの約７２時間（タンパク質代謝回転速度に依存している実際の時間）後に評価されてもよい。培養細胞からＲＮＡおよび／またはタンパク質を単離する標準技法は、当業者によく知られている。非特異的なオフターゲット効果の可能性を低下させるために、標的遺伝子発現において所望のノックダウンレベルをもたらすできる限り最低の濃度の干渉ＲＮＡを使用する。ヒト角膜上皮細胞または他のヒト眼細胞系も、干渉ＲＮＡの内因性標的遺伝子レベルをノックダウンさせる能力の評価に使用することができる。
【００３７】
一実施形態では、ＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡを標的にする単一の干渉ＲＮＡを投与して、ＧＲＥＭ１レベルを低減する。他の実施形態では、ＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡを標的にする２つ以上の干渉ＲＮＡを投与して、ＧＲＥＭ１レベルを低減する。
【００３８】
ＧｅｎＢａｎｋデータベースには、ＧＲＥＭ１のＤＮＡ配列は受託番号ＮＭ  ０１３３７２で収録され、「配列表」に配列番号１として記載されている。配列番号１は、グレムリンをコードするｍＲＮＡに対応するＤＮＡのセンス鎖配列（「Ｕ」塩基に代わる「Ｔ」塩基を除く）を提供する。ＧＲＥＭ１のコード配列は、ヌクレオチド１６０〜７１４に由来する。
【００３９】
上記に引用されたＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡ配列の等価体は、その選択的スプライシング形、対立形、アイソザイム、または同族体である。同族体は、配列番号１と相同（すなわち、オルソログ）である別の哺乳類種に由来するグレムリンｍＲＮＡである。
【００４０】
いくつかの実施形態では、ＩＯＰに関連した病態の治療を必要とするまたはＩＯＰに関連した病態を発症するリスクがある「対象」は、グレムリンの望まれないまたは不適切な発現または活性を伴うＩＯＰに関連した病態を有するまたはＩＯＰに関連した病態を有するリスクがあるヒトまたは他の哺乳類である。このような障害を伴う眼構造は、例えば眼、網膜、脈絡膜、水晶体、角膜、線維柱帯網、虹彩、視神経、視神経乳頭、強膜、前眼部もしくは後眼部、または毛様体を含むことができる。対象は、眼細胞、細胞培養物、器官、または生体外器官もしくは組織もしくは細胞とすることもできる。
【００４１】
本明細書では「ＩＯＰに関連した病態」は、高眼圧、ならびに眼内圧亢進（ＩＯＰ）を伴う眼疾患、具体的には正常眼圧緑内障および開放隅角緑内障を含めて、緑内障を包含する。
【００４２】
本明細書では「ｓｉＲＮＡ」という用語は、別段の注記のない限り二本鎖干渉ＲＮＡを意味する。通常、本発明のｓｉＲＮＡは、２本のヌクレオチド鎖を含む二本鎖核酸分子であり、各鎖は、約１９〜約２８個のヌクレオチド（すなわち、約１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、または２８個のヌクレオチド）を有する。二本鎖干渉ＲＮＡを述べるとき「１９〜４９ヌクレオチド長の干渉ＲＮＡ」というフレーズは、アンチセンス鎖およびセンス鎖が独立に、約１９〜約４９ヌクレオチド長であることを意味し、リンカー分子でセンス鎖とアンチセンス鎖が結合されている干渉ＲＮＡ分子を包含する。
【００４３】
ｓｉＲＮＡ分子に加えて、他の干渉ＲＮＡ分子およびＲＮＡ様分子は、ＲＩＳＣと相互に作用し、遺伝子発現を停止することができる。ＲＩＳＣと相互に作用することができる他の干渉ＲＮＡ分子の例としては、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、一本鎖ｓｉＲＮＡ、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、およびダイサー−基質２７マー二本鎖が挙げられる。ＲＩＳＣと相互に作用することができるＲＮＡ様分子の例としては、１つもしくは複数の化学修飾ヌクレオチド、１つもしくは複数の非ヌクレオチド、１つもしくは複数のデオキシリボヌクレオチド、および／または１つもしくは複数の非ホスホジエステル結合を含むｓｉＲＮＡ、一本鎖ｓｉＲＮＡ、ミクロＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡ分子が挙げられる。ＲＩＳＣと相互に作用し、ＲＩＳＣによって媒介された遺伝子発現の変化に関与することができるＲＮＡまたはＲＮＡ様分子はすべて、本明細書では「干渉ＲＮＡ」または「干渉ＲＮＡ分子」を意味する。したがって、ＳｉＲＮＡ、一本鎖ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびダイサー−基質２７マー二本鎖は、「干渉ＲＮＡ」または「干渉ＲＮＡ分子」のサブセットである。
【００４４】
一本鎖干渉ＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡより効率が低いが、ｍＲＮＡ停止を行うことがわかった。したがって、本発明の実施形態は、配列番号１の一部分と少なくともほぼ完全な隣接する相補性をもつ領域を有する一本鎖干渉ＲＮＡの投与も行う。一本鎖干渉ＲＮＡは、上記に引用された二本鎖干渉ＲＮＡの場合と同様に約１９〜約４９ヌクレオチド長である。一本鎖干渉ＲＮＡは５’ホスフェートを有し、または５’位においてインサイツもしくはインビボでリン酸化されている。「５’リン酸化」という用語を使用して、例えばエステル結合で砂糖（例えば、リボース、デオキシリボース、またはそれらの類似体）のＣ５ヒドロキシルに結合しているホスフェート基をポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの５’末端に有するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを記載する。
【００４５】
一本鎖干渉ＲＮＡは、二本鎖干渉ＲＮＡを参照して、化学的にまたはインビトロ転写によって合成することができ、あるいは本明細書に記載されたベクターまたは発現カセットから内因的に発現されることができる。５’ホスフェート基はキナーゼを介して付加してもよく、または５’ホスフェートはＲＮＡのヌクレアーゼ切断の結果でもよい。ヘアピン型干渉ＲＮＡは、ステムループ型またはヘアピン型構造の干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡ）のセンス鎖とアンチセンス鎖とを含む単一分子（例えば、単一オリゴヌクレオチド鎖）。例えば、ｓｈＲＮＡは、センス干渉ＲＮＡ鎖をコードするＤＮＡオリゴヌクレオチドが逆相補性アンチセンス干渉ＲＮＡ鎖をコードするＤＮＡオリゴヌクレオチドに短いスペーサで結合されているＤＮＡベクターから発現させることができる。選択された発現ベクターのために必要である場合には、３’末端のＴ、および制限部位を形成するヌクレオチドを付加してもよい。得られたＲＮＡ転写物は、それ自体の上に折り返して、ステムループ型構造を形成する。
【００４６】
本明細書に引用された核酸配列は、別段の示唆のない限り５’から３’の方向で記載される。本明細書では「核酸」という用語は、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはそのＤＮＡ（アデニン「Ａ」、シトシン「Ｃ」、グアニン「Ｇ」、チミン「Ｔ」）もしくはＲＮＡ（アデニン「Ａ」、シトシン「Ｃ」、グアニン「Ｇ」、ウラシル「Ｕ」）に存在するプリン塩基もしくはピリミジン塩基を含む修飾形を意味する。ＲＮＡにおいて「Ｔ」塩基が天然に生じない場合でさえ、本明細書に記載された干渉ＲＮＡは、具体的には３’末端に「Ｔ」塩基を含むことができる。「核酸」は、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」という用語を包含し、一本鎖の分子または二本鎖の分子を意味することができる。二本鎖の分子は、Ａ塩基とＴ塩基、Ｃ塩基とＧ塩基、およびＡ塩基とＵ塩基のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ型塩基対合によって形成される。二本鎖の分子の鎖は、相互に部分的に、実質的に、または完全に相補であってよく、二本鎖ハイブリッドを形成し、その結合の強さは、塩基配列の相補性の特性および程度に依存する。
【００４７】
本明細書では「ＤＮＡ標的配列」というフレーズは、本発明の干渉ＲＮＡを誘導するために使用されるＤＮＡ配列を意味する。本明細書では「ＲＮＡ標的配列」、「干渉ＲＮＡ標的配列」、および「ＲＮＡ標的」というフレーズは、本発明の干渉ＲＮＡによって認識することができるＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡまたはＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡ配列の一部分を意味し、それによって干渉ＲＮＡは、本明細書に記載されたようにＧＲＥＭ１遺伝子発現を停止することができる。「ＲＮＡ標的配列」、「ｓｉＲＮＡ標的配列」、および「ＲＮＡ標的」は、一般的にＤＮＡ配列の一部分に対応するｍＲＮＡ配列である。ｍＲＮＡ配列は、対応するＤＮＡ配列の配列から容易に推定される。例えば、配列番号１は、ＧＲＥＭ１のためのｍＲＮＡに対応するＤＮＡのセンス鎖配列を提供する。ｍＲＮＡ配列は、「Ｔ」塩基が「Ｕ」塩基で置換された、ＤＮＡセンス鎖配列と同一である。したがって、ＧＲＥＭ１のｍＲＮＡ配列は、配列番号１から知られている。配列番号１に対応するｍＲＮＡにおける標的配列は、ｍＲＮＡの５’または３’非翻訳領域およびｍＲＮＡのコード領域に存在してもよい。
【００４８】
いくつかの実施形態では、標的ｍＲＮＡ配列内の干渉ＲＮＡ標的配列（例えば、ｓｉＲＮＡ標的配列）は、利用可能な設計ツールを使用して選択される。次いで、ＧＲＥＭ１標的配列に対応する干渉ＲＮＡを、本明細書に記載されたように標的ｍＲＮＡを発現する細胞のトランスフェクションと、その後に続くノックダウンの評価によってインビトロで試験する。干渉ＲＮＡはさらに、本明細書に記載されたように動物モデルを用いてインビボで評価することができる。
【００４９】
ｓｉＲＮＡのための標的配列を選択する技法は、例えばＲｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙウェブサイト上で入手可能であるＴｕｓｃｈｌ，  Ｔ．ら、「ｓｉＲＮＡ  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ」、２００４年５月６日改訂；Ａｍｂｉｏｎウェブサイト上のＴｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ＃５０６、「ｉＲＮＡ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ」、Ａｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ．；および例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、またはＰｒｏｌｉｇｏのウェブサイト上の他のウェブベースの設計ツールによって提供される。初期のサーチパラメータには、Ｇ／Ｃ含量：３５％〜５５％、およびｓｉＲＮＡ長さ：１９〜２７個のヌクレオチドが含まれ得る。標的配列は、ｍＲＮＡのコード領域または５’もしくは３’非翻訳領域に位置していてもよい。標的配列を使用して、本明細書に記載するものなどの干渉ＲＮＡ分子を誘導することができる。
【００５０】
表１は、本発明のｓｉＲＮＡが上記に記載する方式で設計される配列番号１のＧＲＥＭ１  ＤＮＡ標的配列の例を示す。ＧＲＥＭ１は、上記に指摘したようにグレムリンをコードする。
【００５１】
【表１Ａ】
2010501188.tif 000003
【００５２】
【表１Ｂ】
2010501188.tif 000004
【００５３】
【表１Ｃ】
2010501188.tif 000005
【００５４】
【表１Ｄ】
2010501188.tif 000006
上記の例に引用されたように、当業者は、表１に記載された標的配列情報を使用して、配列番号１における配列位置を参照し、かつ配列番号１に相補であるまたはほぼ相補であるヌクレオチドを付加または欠失させることによって、表１に記載された配列より短いまたは長い長さの干渉ＲＮＡを設計することができる。
【００５５】
例えば、配列番号２は、１９−ヌクレオチドＤＮＡ標的配列の一例を表す。というのは、ＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡが配列番号１のヌクレオチド４０２〜４２０に存在するからである。
【００５６】
５’−  ＧＣＡＴＧＴＧＡＣＧＧＡＧＣＧＣＡＡＡ  −３’      配列番号２．
配列番号２の対応するｍＲＮＡ配列を標的にし、２１−ヌクレオチド鎖および２−ヌクレオチド３’突出を有するための本発明のｓｉＲＮＡは、下記である。
【００５７】
５’−  ＧＣＡＵＧＵＧＡＣＧＧＡＧＣＧＣＡＡＡＮＮ  −３’      配列番号３
３’  −ＮＮＣＧＵＡＣＡＣＵＧＣＣＵＣＧＣＧＵＵＵ  −５’        配列番号４
「Ｎ」残基はそれぞれ、任意のヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ｔ）または修飾ヌクレオチドとすることができる。３’末端は、１、２、３、４、５、および６個を含む１〜６個のいくつかの「Ｎ」残基を有することができる。いずれの鎖の「Ｎ」残基も、同じ残基（例えば、ＵＵ、ＡＡ、ＣＣ、ＧＧ、またはＴＴ）とすることができ、あるいは異なる（例えば、ＡＣ、ＡＧ、ＡＵ、ＣＡ、ＣＧ、ＣＵ、ＧＡ、ＧＣ、ＧＵ、ＵＡ、ＵＣ、またはＵＧ）こともできる。３’突出は同じでも異なってもよい。一実施形態では、両鎖は３’ＵＵ突出を有する。
【００５８】
配列番号２の対応するｍＲＮＡ配列を標的にし、各鎖に２１−ヌクレオチド鎖および３’ＵＵ突出を有する本発明のｓｉＲＮＡの一例は、下記である。
【００５９】
５’−  ＧＣＡＵＧＵＧＡＣＧＧＡＧＣＧＣＡＡＡＵＵ  −３’      配列番号５
３’−  ＵＵＣＧＵＡＣＡＣＵＧＣＣＵＣＧＣＧＵＵＵ  −５’        配列番号６
干渉ＲＮＡは、複数のヌクレオチドの５’突出も有することができ、または平滑末端を有することができる。配列番号２の対応するｍＲＮＡ配列を標的にし、１９−ヌクレオチド鎖および平滑末端を有する本発明のｓｉＲＮＡの一例は、下記である。
【００６０】
５’−  ＧＣＡＵＧＵＧＡＣＧＧＡＧＣＧＣＡＡＡ  −３’      配列番号７
３’−  ＣＧＵＡＣＡＣＵＧＣＣＵＣＧＣＧＵＵＵ  −５’      配列番号８
二本鎖干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）の鎖は結合して、ヘアピン型またはステムループ型構造（例えば、ｓｈＲＮＡ）を形成することができる。配列番号２の対応するｍＲＮＡ配列を標的にし、１９ｂｐの二本鎖のステム領域および３’ＵＵ突出を有する本発明のｓｈＲＮＡの一例は、下記である。
【００６１】
【化１】
2010501188.tif 000007
Ｎは、ヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、または当業者によって知られている修飾形である。ループ中のヌクレオチドＮの数は、３および２３を含む３〜２３、または５および１５を含む５〜１５、または７および１３を含む７〜１３、または４および９を含む４〜９、または９および１１を含む９〜１１の数であり、あるいはヌクレオチドＮの数は９である。ループ中のヌクレオチドの一部は、ループ中の他のヌクレオチドと塩基対相互作用に関与することができる。ループを形成するために使用することができるオリゴヌクレオチド配列の例としては、５’−ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ−３’（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，  Ｔ．Ｒ．ら、（２００２）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：  ５５０）および５’−ＵＵＵＧＵＧＵＡＧ−３’（Ｃａｓｔａｎｏｔｔｏ，  Ｄ．ら、（２００２）  ＲＮＡ  ８：１４５４）が挙げられる。得られた一本鎖オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡｉの機構と相互作用することができる二本鎖領域を含むステムループ型またはヘアピン型構造を形成することは、当業者によって理解されよう。
【００６２】
上記で同定されたｓｉＲＮＡ標的配列は、３’末端において延長して、ダイサー−基質２７マー二本鎖の設計を容易にすることができる。例えば、ＧＲＥＭ１  ＤＮＡ配列（配列番号１）において同定された１９−ヌクレオチドＤＮＡ標的配列（配列番号２）が６個のヌクレオチドで延長されると、配列番号１のヌクレオチド４０２〜４２６に存在する２５−ヌクレオチドＤＮＡ標的配列が得られる。
【００６３】
５’−  ＧＣＡＴＧＴＧＡＣＧＧＡＧＣＧＣＡＡＡＴＡＣＣＴＧ  −３’      配列番号１０．
配列番号１０の対応するｍＲＮＡ配列を標的にするための本発明のダイサー−基質２７マー二本鎖の一例は、下記である。
【００６４】
５’−  ＧＣＡＵＧＵＧＡＣＧＧＡＧＣＧＣＡＡＡＵＡＣＣＵＧ  −３’        配列番号１１
３’  −ＵＵＣＧＵＡＣＡＣＵＧＣＣＵＣＧＣＧＵＵＵＡＵＧＧＡＣ  −５’      配列番号１２．
センス鎖の３’末端の２個のヌクレオチド（すなわち、配列番号１２０のＧＵヌクレオチド）は、プロセシングを改善するためデオキシリボヌクレオチドであってもよい。本明細書に記載されたものなど、１９〜２１ヌクレオチド標的配列に由来するダイサー−基質２７マー二本鎖の設計は、さらにＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）ウェブサイトおよびＫｉｍ，  Ｄ．  −Ｈ．ら、（２００５年２月）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３：２；  ２２２−２２６で述べられている。
【００６５】
ｓｉＲＮＡおよび干渉ＲＮＡの他の形によって導かれた標的ＲＮＡ切断反応は、極めて配列特異的である。例えば、一般に、ｓｉＲＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡの一部分と配列が同一であるセンスヌクレオチド鎖、およびｍＲＮＡ発現の阻害のための標的の一部分に正確に相補であるアンチセンスヌクレオチド鎖を含む。しかし、干渉ＲＮＡが標的ｍＲＮＡを認識し、かつＧＲＥＭ１遺伝子の発現を停止することができる限り、本発明を実施するには、アンチセンスｓｉＲＮＡ鎖と標的ｍＲＮＡまたはアンチセンスｓｉＲＮＡ鎖とセンスｓｉＲＮＡ鎖の配列が１００％相補である必要はない。したがって、例えば、本発明は、干渉ＲＮＡ分子の活性に影響を及ぼさないヌクレオチド置換を含めて、アンチセンス鎖と標的ｍＲＮＡおよびアンチセンス鎖とセンス鎖の配列多様性、ならびに標的ｍＲＮＡに対するアンチセンス鎖の認識を妨げない、遺伝子突然変異、株多型性、または進化的分岐のため予想することができる多様性を可能にする。
【００６６】
本発明の一実施形態では、本発明の干渉ＲＮＡはセンス鎖およびアンチセンス鎖を有し、センス鎖およびアンチセンス鎖は、少なくともほぼ完全な隣接する相補性をもつ少なくとも１９個のヌクレオチドの領域を含む。本発明の別の一実施形態では、本発明の干渉ＲＮＡはセンス鎖およびアンチセンス鎖を有し、それぞれアンチセンス鎖は、ＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡの標的配列と少なくともほぼ完全な隣接する相補性をもつ少なくとも１９個のヌクレオチドの領域を含み、センス鎖は、ＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡの標的配列と少なくともほぼ完全な隣接する同一性をもつ少なくとも１９個のヌクレオチドの領域を含む。本発明の別の一実施形態では、干渉ＲＮＡは、ｍＲＮＡ内の対応する標的配列の３’末端の最後から２番目のそれぞれ１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、もしくは１８個のヌクレオチドと様々な百分率の配列相補性または様々な百分率の配列同一性をもつ少なくとも１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、もしくは１８個の隣接するヌクレオチドの領域を含む。干渉ＲＮＡの各鎖は、約１９〜約４９ヌクレオチド長を含み、約１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、または４９ヌクレオチド長を含むことができる。
【００６７】
いくつかの実施形態では、本発明の干渉ＲＮＡのアンチセンス鎖は、標的ｍＲＮＡと少なくともほぼ完全な隣接する相補性をもつ少なくとも１９個のヌクレオチドを有する。本明細書では「ほぼ完全な」は、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が標的ｍＲＮＡの少なくとも一部分「と実質的に相補的」であり、ｓｉＲＮＡのセンス鎖が標的ｍＲＮＡの少なくとも一部分「と実質的に同一である」ことを意味する。当業者によって知られている「同一性」は、配列間でヌクレオチドの順序および同一性を照合することによって確定した、ヌクレオチド配列間の配列関連性の程度である。一実施形態では、標的ｍＲＮＡ配列と８０％、および８０％から１００％までの相補性、例えば８５％、９０％、または９５％の相補性をもつｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、ほぼ完全に相補であるとみなされ、本発明で使用してもよい。「完全な」隣接する相補性は、隣接塩基対の標準的Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ型塩基対合である。「少なくともほぼ完全な」隣接する相補性は、本明細書で使用される「完全な」相補性を包含する。同一性または相補性を確定するコンピュータ方法、例えばＢＬＡＳＴＮは、ヌクレオチド配列の最大一致度を同定するように設計されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．Ｆ．ら、（１９９０）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−４１０）。
【００６８】
「同一性（パーセント）」という用語は、第２の核酸分子において同じ長さの１組の隣接するヌクレオチドの場合と同じである、第１の核酸分子において隣接するヌクレオチドの百分率を表す。「相補性（パーセント）」という用語は、第２の核酸分子において１組の隣接するヌクレオチドとＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ型で塩基対合することができる、第１の核酸分子において隣接するヌクレオチドの百分率を表す。
【００６９】
標的ｍＲＮＡとｓｉＲＮＡ鎖の一方の鎖（センス鎖）との関係は、同一性の関係である。ｓｉＲＮＡのセンス鎖が存在する場合それは、パッセンジャー鎖とも呼ばれる。標的ｍＲＮＡとｓｉＲＮＡの他方の鎖（アンチセンス鎖）との関係は、相補性の関係である。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、ガイド鎖とも呼ばれる。
【００７０】
アンチセンスｓｉＲＮＡ鎖の配列番号１の一部分に相補でない領域は、１つまたは複数あってもよい。非相補領域は、相補領域の３’末端、５’末端、もしくは両末端に、または２つの相補領域間に存在してもよい。領域は、１つまたは複数の塩基とすることができる。
【００７１】
干渉ＲＮＡ分子におけるセンス鎖およびアンチセンス鎖は、他方の鎖と塩基対を形成しないヌクレオチドも含むことができる。例えば、一方または両方の鎖は、これらの鎖がハイブリダイズされたときバルジまたはミスマッチが生成されるように、追加のヌクレオチド、または他方の鎖のその位置におけるヌクレオチドと対を形成しないヌクレオチドを含むことができる。したがって、本発明の干渉ＲＮＡ分子は、ミスマッチ、Ｇ−Ｕゆらぎ、またはバルジを有するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含むことができる。ミスマッチ、Ｇ−Ｕゆらぎ、およびバルジは、アンチセンス鎖とその標的の間で生じることもあり得る（例えば、Ｓａｘｅｎａら、２００３，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７８：４４３１２−９を参照のこと）。
【００７２】
二本鎖干渉ＲＮＡの一方または両方の鎖は、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチド、またはそれらの混合物であってもよい１〜６個のヌクレオチドの３’突出を有することができる。突出のヌクレオチドは、塩基対合されない。本発明の一実施形態では、干渉ＲＮＡは、ＴＴまたはＵＵの３’突出を含む。本発明の別の一実施形態では、干渉ＲＮＡは、少なくとも１つの平滑末端を含む。これらの末端は、通常５’ホスフェート基または３’ヒドロキシル基を有する。他の実施形態では、アンチセンス鎖は５’ホスフェート基を有し、センス鎖は５’ヒドロキシル基を有する。さらに他の実施形態では、これらの末端は、さらに他の分子または官能基の共有結合付加によって修飾されている。
【００７３】
二本鎖ｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、上述された２本の一本鎖からなる二本鎖形成体でもよく、あるいは相補性の領域が塩基対合され、リンカー分子で共有結合されて、それらの領域が相互にハイブリダイズされたときヘアピンループが形成される一本鎖の分子であってもよい。ヘアピンはダイサーと呼ばれるタンパク質によって細胞内で切断されて、２つの個々の塩基対合ＲＮＡ分子の干渉ＲＮＡを形成すると考えられる。リンカー分子は、特定のヌクレアーゼによってインビボまたはインビトロで切断することができる制限部位を含むように設計することもできる。
【００７４】
一実施形態では、本発明は、ＤＮＡ標的に対応するｍＲＮＡの３’末端の最後から２番目の１３個のヌクレオチドと少なくとも９０％の配列相補性または少なくとも９０％の配列同一性をもつ少なくとも１３個の隣接するヌクレオチドの領域を含み、領域内で１つのヌクレオチド置換が可能になる干渉ＲＮＡ分子を提供する。２つのヌクレオチド置換（すなわち、１１／１３＝８５％  同一性／相補性）は、このフレーズには含まれない。別の一実施形態では、本発明は、ＤＮＡ標的に対応するｍＲＮＡの３’末端の最後から２番目の１４個のヌクレオチドと少なくとも８５％の配列相補性または少なくとも８５％の配列同一性をもつ少なくとも１４個の隣接するヌクレオチドの領域を含む干渉ＲＮＡ分子を提供する。２つのヌクレオチド置換（すなわち、１２／１４＝８６％  同一性／相補性）は、このフレーズに含まれる。別の一実施形態では、本発明は、ＤＮＡ標的に対応するｍＲＮＡの３’末端の最後から２番目の１４個のヌクレオチドと少なくとも８０％の配列相補性または少なくとも８０％の配列同一性をもつ少なくとも１５個、１６個、１７個、もしくは１８個の隣接するヌクレオチドの領域を含む干渉ＲＮＡ分子を提供する。３つのヌクレオチド置換は、このようなフレーズに含まれる。
【００７５】
５’から３’の方向で記載された核酸配列において最後から２番目の塩基は、最後の塩基の隣の塩基、すなわち３’塩基の隣の塩基である。５’から３’の方向で記載された核酸配列の最後から２番目の１３個の塩基は、３’塩基の隣でかつ３’塩基を含まない配列の最後の１３個の塩基である。同様に、５’から３’の方向で記載された核酸配列の最後から２番目の１４個、１５個、１６個、１７個、または１８個の塩基はそれぞれ、３’塩基の隣でかつ３’塩基を含まない配列の最後の１４個、１５個、１６個、１７個、または１８個の塩基である。
【００７６】
干渉ＲＮＡは、化学的合成によって、インビトロ転写によって、またはより長い二本鎖ＲＮＡをダイサーもしくは同様の活性をもつ別の適切なヌクレアーゼで切断することによって、外因的に産生することができる。通常のＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を使用して、保護されたリボヌクレオシドホスホラミダイトから産生された化学合成干渉ＲＮＡは、Ａｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ．（米国テキサス州オースティン）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（米国カリフォルニア州カールスバッド）、またはＤｈａｒｍａｃｏｎ（米国コロラド州ラファイエット）など商業用の供給業者から得ることができる。干渉ＲＮＡは、例えば溶媒または樹脂による抽出、沈澱、電気泳動、クロマトグラフィー、またはそれらの組合せによって精製することができる。あるいは、干渉ＲＮＡは、試料プロセシングによる損失を避けるために、精製をする場合でもほとんど精製をすることなく使用してもよい。
【００７７】
干渉ＲＮＡを化学的合成で生成するとき、一方または両方の鎖（存在する場合）の５’末端におけるヌクレオチドの５’位のリン酸化によって、ｓｉＲＮＡ有効性、および結合したＲＩＳＣ複合体の特異性を向上することができるが、リン酸化は細胞内で起こり得るので必要でない。
【００７８】
干渉ＲＮＡは、プラスミドもしくはウイルス発現ベクターから、または最小限の発現カセット、例えば１つもしくは複数のプロモーターおよび干渉ＲＮＡに適切な１つもしくは複数の鋳型を含むＰＣＲ生成断片から内因的に発現させることもできる。ｓｈＲＮＡ用の市販プラスミド系発現ベクターの例としては、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒシリーズのメンバー（Ａｍｂｉｏｎ、米国テキサス州オースティン）およびｐＣｐＧ−ｓｉＲＮＡ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、米国カリフォルニア州サンディエゴ）が挙げられる。干渉ＲＮＡの発現用のウィルスベクターは、アデノウィルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ、ＦＩＶ、およびＥＩＡＶ）、およびヘルペスウイルスを含めて、種々のウィルスに由来するものでもよい。ｓｈＲＮＡ発現用の市販ウィルスベクターの例としては、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒアデノ（Ａｍｂｉｏｎ、米国テキサス州オースティン）およびｐＬｅｎｔｉ６／ＢＬＯＣＫ−ｉＴ（商標）−ＤＥＳＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州カールスバッド）が挙げられる。ウィルスベクターの選択、ベクターから干渉ＲＮＡを発現させる方法、およびウィルスベクターを送達する方法は、当業者の通常の技術の範囲内である。ＰＣＲ生成ｓｈＲＮＡ発現カセットを作製するためのキットの例としては、Ｓｉｌｅｎｃｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ａｍｂｉｏｎ、米国テキサス州オースティン）およびｓｉＸｐｒｅｓｓ（Ｍｉｎｉｓ、米国ウィスコンシン州マディソン）が挙げられる。
【００７９】
いくつかの実施形態では、第１の干渉ＲＮＡは、第１の干渉ＲＮＡを発現することができる第１の発現ベクターからインビボ発現によって投与することができ、第２の干渉ＲＮＡは、第２の干渉ＲＮＡを発現することができる第２の発現ベクターからインビボ発現によって投与することができ、あるいは両方の干渉ＲＮＡは、両方の干渉ＲＮＡを発現することができる単一の発現ベクターからインビボ発現によって投与することができる。追加の干渉ＲＮＡは、同様の方式で（すなわち、別々の発現ベクター、または複数の干渉ＲＮＡを発現することができる単一の発現ベクターによって）投与することができる。
【００８０】
干渉ＲＮＡは、Ｕ６もしくはＨ１プロモーターなどのポルＩＩＩ型プロモーター、またはサイトメガロウイルスプロモーターなどのポルＩＩ型プロモーターを含めて、当業者に知られている種々の真核生物プロモーターから発現されてもよい。当業者は、これらのプロモーターを、干渉ＲＮＡの誘導性発現が可能になるように適合させることもできることを理解されよう。
【００８１】
本発明のいくつかの実施形態では、干渉ＲＮＡのアンチセンス鎖は、インビボでＲＩＳＣ複合体の一部分としてｍＲＮＡとハイブリダイズする。
【００８２】
「ハイブリダイゼーション」は、相補的またはほぼ相補的塩基配列を有する一本鎖の核酸が相互と作用して、ハイブリッドと呼ばれる水素結合した複合体を形成する過程を意味する。ハイブリダイゼーション反応は、鋭敏でかつ選択的である。インビトロでは、ハイブリダイゼーションの特異性（すなわち、ストリンジェンシー）は、例えばプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション溶液中の塩またはホルムアミドの濃度、ならびにハイブリダイゼーション温度によって制御される。このような手順は当技術分野でよく知られている。具体的には、ストリンジェンシーは、塩の濃度を下げ、ホルムアミドの濃度を上げ、またはハイブリダイゼーション温度を上げることによって増大する。
【００８３】
例えば、ストリンジェンシーの高い条件は、約５０％のホルムアミド、３７℃〜４２℃で生じることができる。ストリンジェンシーの低下した状態は、約３５％〜２５％のホルムアミド、３０℃〜３５℃で生じることができる。ハイブリダイゼーションのためのストリンジェンシー条件の例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，  １９８９，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．に記載されている。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のさらなる例としては、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、４０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ（ｐＨ  ６．４）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０℃または７０℃、１２〜１６時間、続いて洗浄、あるいはＩＸＳＳＣ中７０℃またはＩＸＳＳＣ中５０℃、５０％ホルムアミドでハイブリダイゼーション、続いて０．３ＸＳＳＣ中７０℃で洗浄、あるいは４ＸＳＳＣ中７０℃または４ＸＳＳＣ中５０℃、５０％ホルムアミドでハイブリダイゼーション、続いてＩＸＳＳＣ中６７℃で洗浄が挙げられる。ハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融点（Ｔｍ）より約５〜１０℃低い。ここで、１９〜４９塩基対長のハイブリッドのＴｍは、次の計算式を用いて求められる。Ｔｍ℃＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％  Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）、式中、Ｎはハイブリッド中の塩基の数であり、［Ｎａ＋］はハイブリダイゼーション緩衝液中ナトリウムイオンの濃度である。
【００８４】
上記のインビトロハイブリダイゼーションアッセイは、候補ｓｉＲＮＡと標的の結合が特異的であるかどうかを予測する方法をもたらす。しかし、ＲＩＳＣ複合体の状況では、標的の特異的切断は、インビトロでのハイブリダイゼーション用の高ストリンジェンシーを示さないアンチセンス鎖の場合でも起こり得る。
【００８５】
干渉ＲＮＡは、１つまたは複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換、または修飾によって、天然のＲＮＡとは異なることができる。非ヌクレオチド材料は、５’末端、３’末端、または内部で干渉ＲＮＡに結合していてもよい。このような修飾は、一般的に干渉ＲＮＡのヌクレアーゼ耐性を増大し、細胞取り込みを改善し、細胞ターゲティングを改善し、干渉ＲＮＡの追跡を助け、安定性をさらに改善し、またはインターフェロン経路の活性化の電位を低下させるように設計されている。例えば、干渉ＲＮＡは、突出の末端においてプリンヌクレオチドを含むことができる。例えば、ピロリジンリンカーによってコレステロールをｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖の３’末端に結合させると、ｓｉＲＮＡの安定化ももたらされる。
【００８６】
さらなる修飾としては、例えば３’末端のビオチン分子、細胞透過性を有することが知られているペプチド、ナノ粒子、ペプチド模倣物、蛍光染料、またはデンドリマーが挙げられる。
【００８７】
ヌクレオチドは、その塩基部分、その糖部分、または分子のホスフェート部分において修飾され、本発明の実施形態において機能することがある。修飾としては、例えばアルキル基、アルコキシ基、アミノ基、デアザ基、ハロ基、ヒドロキシル基、チオール基、またはそれらの組合せによる置換が挙げられる。ヌクレオチドは、リボヌクレオチドをデオキシリボヌクレオチドによって置換すること、または例えば２’アミノ基、２’Ｏ−メチル基、２’メトキシエチル基、もしくは２’−Ｏ，４’−Ｃメチレン架橋による２’ＯＨ基の置換などの糖修飾を有することなど、より安定性の高い類似体で置換されていてもよい。ヌクレオチドのプリンまたはピリミジン類似体の例としては、キサンチン、ヒポキサンチン、アザプリン、メチルチオアデニン、７−デアザ−アデノシン、ならびにＯ−およびＮ−修飾ヌクレオチドが挙げられる。ヌクレオチドのホスフェート基は、ホスフェート基の酸素の１つまたは複数を窒素または硫黄で置換することによって修飾してもよい（ホスホロチオエート類）。修飾は、例えば機能を改善し、安定性もしくは透過性を改善し、または局在化もしくはターゲティングを指示するのに有用である。
【００８８】
いくつかの実施形態では、本発明の干渉分子は、上述された修飾の少なくとも１つを含む。
【００８９】
いくつかの実施形態では、本発明は、本発明の干渉ＲＮＡ分子を含む医薬組成物（本明細書では「組成物」とも呼ばれる）を提供する。医薬組成物は、水、緩衝液、生理食塩水、グリシン、ヒアルロン酸、マンニトールなど以下に記載するものを含めて、生理学的に許容される担体媒体と混合させた、最高９９重量％の本発明の干渉ＲＮＡまたはその塩を含む製剤である。
【００９０】
本発明の干渉ＲＮＡは、溶液、懸濁液、または乳濁液として投与される。下記は、本発明の方法で使用することができる医薬組成物製剤の例である。
【００９１】
【化２】
2010501188.tif 000008
【００９２】
【化３】
2010501188.tif 000009
【００９３】
【化４】
2010501188.tif 000010
【００９４】
【化５】
2010501188.tif 000011
本明細書では「有効量」という用語は、哺乳類において治療効果をもたらすと判断された干渉ＲＮＡまたは干渉ＲＮＡを含む医薬組成物の量を意味する。このような治療上有効量は、本明細書に記載された方法で当業者によって容易に確認される。
【００９５】
一般に、有効量の本発明の干渉ＲＮＡによって、標的細胞の表面における細胞外の濃度が１００ｐＭ〜１０００ｎＭ、または１ｎＭ〜４００ｎＭ、または５ｎＭ〜約１００ｎＭ、または約１０ｎＭになる。この局所濃度を実現するのに必要とされた用量は、送達方法、送達部位、送達部位と標的細胞または組織の間の細胞層数、局所送達かそれとも全身送達であるかなどを含めて、いくつかの要因によって変わる。送達部位における濃度は、標的細胞または組織の表面における濃度よりはるかに高くてもよい。局所用組成物は、臨床医のルーチンな裁量に従って、１回〜４回／日、または長期送達スケジュール、具体的には毎日、毎週、隔週、毎月、もしくはそれ以上で、眼などの標的器官の表面に送達され得る。製剤のｐＨは、約ｐＨ  ４．０〜約ｐＨ  ９．０、または約ｐＨ  ４．５〜約ｐＨ  ７．４である。
【００９６】
製剤の有効量は、例えば対象の年齢、人種、および性別、標的遺伝子転写／タンパク質代謝回転の速度、干渉ＲＮＡの効力、および干渉ＲＮＡの安定性などの要因に依存することができる。一実施形態では、干渉ＲＮＡは標的器官に局所送達され、ＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡを含む組織、具体的には線維柱帯網、網膜、または視神経乳頭に治療用量で到達し、それによってＧＲＥＭ１関連疾患過程を改善する。
【００９７】
ＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡに対して作製された干渉ＲＮＡを用いた患者の治療処置は、作用持続時間を延長し、それによって投与頻度の低減および服薬遵守の向上が可能になることによって、かつ標的特異性を高め、それによって副作用を低下することによって、低分子治療より有益であると予想される。
【００９８】
本明細書では「許容される担体」は、眼球刺激を最大でもほとんど引き起こさないか、全く引き起こさず、必要に応じて適当な保存をもたらし、１つまたは複数の本発明の干渉ＲＮＡを均一な用量で送達する担体を意味する。本発明の実施形態の干渉ＲＮＡを投与するための許容される担体としては、カチオン性脂質系トランスフェクション試薬であるＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）−ＴＫＯ（Ｍｉｎｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国ウィスコンシン州マディソン）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）、リポフェクタミン、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州カールスバッド）、またはＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、米国コロラド州ラファイエット）；ポリエチレンイミンなどのポリカチオン；Ｔａｔ、ポリアルギニン、またはＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ（Ａｎｔｐペプチド）などのカチオン性ペプチド；ナノ粒子；あるいはリポソームが挙げられる。リポソームは、標準ベシクル形成脂質、およびコレステロールなどのステロールから形成され、例えば細胞表面抗原への結合親和性を有するモノクローナル抗体などのターゲティング分子を含むことがある。さらに、リポソームはペグ化リポソームであってもよい。
【００９９】
干渉ＲＮＡは、溶液、懸濁液、または生体内分解性もしくは生体内非分解性送達装置で送達することができる。干渉ＲＮＡは、単独で、または輪郭の明確な共有結合したコンジュゲートの成分として送達させることができる。干渉ＲＮＡは、カチオン性脂質、カチオン性ペプチド、またはカチオン性ポリマーと複合体を形成し；核酸結合特性を有するタンパク質、融合タンパク質、またはタンパク質ドメインと複合体を形成し（例えば、プロタミン）；あるいはナノ粒子またはリポソームに入れることもできる。組織または細胞特異的送達は、抗体または抗体断片などの適切なターゲティング部分を含めることによって実現することができる。
【０１００】
干渉ＲＮＡは、例えばエアゾール、口腔内、皮膚、皮内、吸入、筋肉内、鼻腔内、眼内、肺内、静脈内、腹腔内、経鼻、経眼、経口、経耳、非経口、貼付剤、皮下、舌下、局所、または経皮投与で送達されてもよい。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、眼障害の干渉ＲＮＡ分子による治療は、干渉ＲＮＡ分子を眼に直接投与することによって行われる。眼への局所投与は、下記を含めて、いくつかの理由のため有利である：この用量を全身送達用の用量より少なくすることができ、また分子が眼以外の組織において遺伝子標的を停止する可能性はほとんどない。
【０１０２】
いくつかの研究は、好結果でかつ有効な干渉ＲＮＡ分子の眼へのインビボ送達を明らかにした。例えば、Ｋｉｍらは、ＶＥＧＦ経路遺伝子を標的にするｓｉＲＮＡの結膜下注射および全身送達によって、マウス眼において血管新生が阻害されたことを実証した（Ｋｉｍら、２００４，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．  １６５：２１７７−２１８５）。さらに、硝子体腔に送達されたｓｉＲＮＡは、眼全体に拡散することができ、注射後５日まで検出可能であることを明らかにした研究もある（Ｃａｍｐｏｃｈｉａｒｏ，  ２００６，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １３：５５９−５６２）。
【０１０３】
干渉ＲＮＡは、眼組織注射、具体的には眼周囲、結膜、テノン嚢下、前房内、硝子体内、眼内、網膜下、結膜下、眼球後、または小管内注射によって；カテーテルまたは他の留置装置、具体的には多孔質、非多孔質、もしくはゼラチン質材料を含む網膜ペレット、眼内インサート、坐薬、またはインプラントを使用した眼への直接適用；局所点眼剤または軟膏剤；あるいは結膜嚢におけるスローリリース装置、または強膜に隣接して（経強膜）、もしくは強膜（強膜内）に、もしくは眼内に埋め込まれたスローリリース装置によって、眼に直接送達してもよい。前房内注射は、薬剤が線維柱帯網に到達できるように、角膜を介して前眼房に行ってもよい。小管内注射は、シュレム管から排水させる静脈コレクターチャネル、またはシュレム管に行ってもよい。
【０１０４】
眼部への送達のため、干渉ＲＮＡを、眼用として許容される保存剤、共溶媒、界面活性剤、粘度増強剤、浸透増強剤、緩衝液、塩化ナトリウム、または水と組み合わせて、無菌水性眼用懸濁液または溶液を生成してもよい。溶液製剤は、干渉ＲＮＡを生理学的に許容される等張性緩衝水溶液に溶解することによって調製してもよい。さらに、溶液は、干渉ＲＮＡを溶解する際の助けとなるための許容される界面活性剤を含有してもよい。粘度上昇剤、具体的にはヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどを、本発明の組成物に添加して、化合物の保持を改善してもよい。
【０１０５】
無菌眼軟膏製剤を調製するために、干渉ＲＮＡを適切な媒体、具体的にはミネラルオイル、液状ラノリン、または白色ワセリン中で保存剤と組み合わせる。無菌眼ゲル製剤は、当技術分野で知られている方法に従って、例えばＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）−９４０（ＢＦ  Ｇｏｏｄｒｉｃｈ、米国ノースカロライナ州シャーロット）などの組合せから調製された親水性塩基に干渉ＲＮＡを懸濁することによって調製してもよい。ＶＩＳＣＯＡＴ（登録商標）（Ａｌｃｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．、米国テキサス州フォートワース）は、例えば眼内注射のために使用してもよい。本発明の他の組成物は、眼において干渉ＲＮＡの浸透性が低い場合に、浸透促進剤、具体的にはクレメホル（ｃｒｅｍｅｐｈｏｒ）およびＴｗｅｅｎ（登録商標）８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、米国ミズーリ州セントルイス）を含有してもよい。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、本発明は、細胞において本明細書に引用されたｍＲＮＡの発現を減弱するための試薬を含むキットも提供する。キットは、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ発現ベクターを含む。ｓｉＲＮＡおよび非ウイルス性ｓｈＲＮＡ発現ベクターのために、キットは、トランスフェクション試薬または他の適当な送達媒体も含有する。ウイルス性ｓｈＲＮＡ発現ベクターのために、キットは、ウィルスベクターおよび／またはウィルスベクター作製のための必要な成分（例えば、パッケージング細胞系、ならびにウィルスベクター鋳型を含むベクターおよびパッケージング用の追加のヘルパーベクター）を含むことができる。キットは、正および負の制御ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡ発現ベクター（例えば、非ターゲティング対照ｓｉＲＮＡまたは関連性のないｍＲＮＡを標的にするｓｉＲＮＡ）も含むことができる。キットはまた、所期の標的遺伝子のノックダウンを評価するための試薬（例えば、標的ｍＲＮＡを検出するための定量的ＰＣＲ用のプライマーおよびプローブ、ならびに／またはウエスタンブロット用の対応するタンパク質に対する抗体）を含有してもよい。あるいは、キットは、インビトロ転写によってｓｉＲＮＡを産生し、またはｓｈＲＮＡ発現ベクターを構築するために必要なｓｉＲＮＡ配列またはｓｈＲＮＡ配列、ならびに指示書および材料を含むことができる。
【０１０７】
さらに、容器手段を密接に閉じ込めて受けるように適合させた担体手段、および干渉ＲＮＡ組成物および許容される担体を含む第１の容器手段を組み合わせたパッケージとして含むキット形態の医薬組合せが提供される。このようなキットは、当業者に容易に明らかであるように、望むなら、様々な通常の医薬キット成分の１つまたは複数、具体的には例えば１つまたは複数の医薬として許容される担体を含む容器、追加の容器などをさらに含むことができる。成分の投与量を指示する添付文書もしくはラベルとしての印刷された指示書、投与のためのガイドライン、および／または成分を混合するためのガイドラインも、キットに含めることができる。
【０１０８】
当業者は、本開示を考慮に入れて、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、本明細書に開示する実施形態の自明な修正を行うことができることを理解するであろう。本明細書に開示する実施形態はすべて、本開示を考慮に入れて、過度の実験なしに行い、実施することができる。本発明の完全な範囲は、その開示および等価な実施形態に記載されている。本明細書は、本発明に与えられる保護の完全な範囲が不当に狭められるように解釈されるべきではない。
【０１０９】
本発明の特定の実施形態を示し、説明してきたが、多数の変形および代替実施形態が当業者に思い浮かぶであろう。したがって、本発明は、その趣旨または本質的な特性から逸脱することなく、他の具体的な形で実施することができる。記載された実施形態は、すべての点で例示にすぎず、限定するものではないとみなされるべきである。したがって、本発明の範囲は、上記の説明ではなく、添付の特許請求の範囲によって示される。特許請求の範囲の均等の意味および範囲内に入る、特許請求の範囲への変更はすべて、それらの範囲内に包含されるべきである。さらに、本明細書に記載された発行された文献、特許、および出願はすべて、それらの全体が記載されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１０】
実施された実験および実現された結果を含めて、下記の実施例は、例示の目的で提供されるものにすぎず、本発明を限定するものと解釈されるべきでない。
【実施例】
【０１１１】
ＧＴＭ−３細胞においてグレムリンを特異的に停止するための干渉ＲＮＡ
標準的インビトロ濃度（０．１〜１０ｎＭ）のグレムリンｓｉＲＮＡまたはｓｉＣＯＮＴＲＯＬ  ＲＩＳＣフリーｓｉＲＮＡ＃２、およびＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ（登録商標）＃１トランスフェクション試薬（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、米国コロラド州ラファイエット）を使用して、ＧＴＭ−３細胞のトランスフェクションを行った。すべてのｓｉＲＮＡを、１Ｘ  ｓｉＲＮＡ緩衝液である２０ｍＭ  ＫＣｌ、６ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ  ７．５）、０．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２の水溶液に溶解した。対照試料は、ｓｉＲＮＡの体積を等しい体積の１Ｘ  ｓｉＲＮＡ緩衝液で置換した緩衝液対照（ヌル）を含有した。グレムリンｓｉＲＮＡは、グレムリンｍＲＮＡ配列（配列番号１に由来）内に含まれる１９−ヌクレオチド配列に対して特異性を有する二本鎖干渉ＲＮＡである。ｓｉグレムリン＃１は配列番号６３を標的にし、ｓｉグレムリン＃２は配列番号９５を標的にし、ｓｉグレムリン＃３は配列番号８５を標的にし、ｓｉグレムリン＃４は配列番号５１を標的にした。グレムリンｍＲＮＡレベルは、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ａｓｓａｙｓ−Ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎキット、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、およびＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国カリフォルニア州フォスターシティー）を使用して、ｑＲＴ−ＰＣＲで確定した。グレムリンｍＲＮＡ発現は、ＰＰＩＢ３  ｍＲＮＡレベルに対して規準化し、非トランスフェクト細胞におけるグレムリン発現に比べて（ヌル）報告されている。グレムリンタンパク質発現は、抗グレムリン抗体（Ｏｒｂｉｇｅｎ、米国カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して、ウエスタンブロットで確定した。図１に示すように、ＲＩＳＣフリーの負の制御ｓｉＲＮＡのトランスフェクションによって、グレムリンｍＲＮＡ発現が２５〜５０％増加した。したがって、非トランスフェクト細胞におけるグレムリン発現に対する規準化によって、グレムリン特異的ｓｉＲＮＡのグレムリンｍＲＮＡ発現に及ぼす効果はおそらく過小評価された。試験した４つのｓｉＲＮＡのうち、ｓｉグレムリン＃２は、グレムリンｍＲＮＡ発現に及ぼす効果が最大であり、非トランスフェクト細胞に比べて、１０ｎＭで約６５％低下し、１ｎＭおよび０．１ｎＭで＜５０％低下した。図２に示すように、ｓｉグレムリン＃２は、ｑＲＴ−ＰＣＲデータと一致してグレムリンタンパク質発現を大幅に低下させた。
【０１１２】
上記の開示は、本発明のある特定の実施形態を強調していること、それらに等価なすべての修正形態または代替形態は、添付の特許請求の範囲に記載の本発明の趣旨および範囲内であることを理解されたい。
【図１】
2010501188.tif 000012
【図２】
2010501188.tif 000013
【配列表】
2010501188000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年4月21日(2009.4.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＯＰに関連した病態の治療を必要とする患者においてＩＯＰに関連した病態を治療するための組成物であって、ＲＮＡ干渉によりＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡの発現を減弱する干渉ＲＮＡ分子を含む組成物。
【請求項２】
前記干渉ＲＮＡ分子が二本鎖であり、各鎖が独立に、約１９〜約２７ヌクレオチド長である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
各鎖が独立に、約１９ヌクレオチド長〜約２５ヌクレオチド長である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
各鎖が独立に、約１９ヌクレオチド長〜約２１ヌクレオチド長である、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
センス鎖とアンチセンス鎖がリンカーで結合されて、患者においてＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡの発現を減弱することができるｓｈＲＮＡを形成する、請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
前記干渉ＲＮＡ分子が平滑末端を有する、請求項２に記載の組成物。
【請求項７】
前記干渉ＲＮＡ分子の少なくとも一方の鎖が３’突出を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項８】
前記３’突出が約１〜約６個のヌクレオチドを含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記３’突出が２個のヌクレオチドを含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
請求項１に記載の組成物であって、該組成物が、エアゾール、口腔内、皮膚、皮内、吸入、筋肉内、鼻腔内、眼内、肺内、静脈内、腹腔内、経鼻、経眼、経口、経耳、非経口、貼付剤、皮下、舌下、局所、または経皮経路で投与されることで特徴づけられる、組成物。
【請求項１１】
請求項１に記載の組成物であって、該組成物が、前記干渉ＲＮＡ分子を発現することができる発現ベクターからインビボ発現によって投与されることで特徴づけられる、組成物。
【請求項１２】
前記患者が、ＩＯＰに関連した病態を有するかまたは発症するリスクがある、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ＩＯＰに関連した病態が緑内障である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記干渉ＲＮＡ分子が、配列番号２および配列番号１３〜配列番号９８のいずれかに対応するＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡの一部分を認識する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記干渉ＲＮＡ分子が、ＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡの一部分を認識し、前記一部分が、配列番号１のヌクレオチド４０２、４０３、４０４、４０７、４１０、４２５、４４９、４５５、４８５、６４２、６４３、６８６、７８４、１２３０、１５１６、１５５４、１８１１、２１０１、２１８５、２２１２、２２２３、２３６８、２３７０、２４０１、２４１２、２４１３、２６１７、２６９２、２６９３、２８６２、２８８９、３０８４、３７３３、３７４３、３７５２、３７７３、３８４６、４００４、４０９９、２１６、２３５、２３６、２６５、２６７、２７３、２７９、２８０、２８１、３８９、３９１、４０１、４１６、４２６、４２７、４３９、４４０、４５９、４６１、４７１、４７２、４９１、４９７、５２０、５４５、５４６、５７５、５８１、５８７、５９２、５９５、５９６、
５９８、５９９、６２４、６２６、６４０、６４６、６５０、６５２、６５７、６５９、６７３、６７６、６７８、６７９、６８８、または６８９を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記干渉ＲＮＡ分子が、少なくとも１つの修飾を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記干渉ＲＮＡ分子が、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
請求項１に記載の組成物であって、該組成物が、局所、硝子体内、経強膜、眼周囲、結膜、テノン嚢下、前房内、網膜下、結膜下、眼球後方、または小管内経路で投与されることで特徴づけられる、組成物。
【請求項１９】
患者の眼においてＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡの発現を減弱するための組成物であって、ＲＮＡ干渉によりＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡの発現をダウンレギュレートする干渉ＲＮＡ分子を含む組成物。
【請求項２０】
前記干渉ＲＮＡ分子が二本鎖であり、各鎖が独立に、約１９〜約２７ヌクレオチド長である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
各鎖が独立に、約１９ヌクレオチド長〜約２５ヌクレオチド長である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
各鎖が独立に、約１９ヌクレオチド長〜約２１ヌクレオチド長である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２３】
センス鎖とアンチセンス鎖がリンカーで結合されて、患者においてＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡの発現を減弱することができるｓｈＲＮＡを形成する、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２４】
前記干渉ＲＮＡ分子が平滑末端を有する、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２５】
前記干渉ＲＮＡ分子の少なくとも一方の鎖が３’突出を含む、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２６】
前記３’突出が約１〜約６個のヌクレオチドを含む、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記３’突出が２個のヌクレオチドを含む、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
請求項１９に記載の組成物であって、該組成物が、エアゾール、口腔内、皮膚、皮内、吸入、筋肉内、鼻腔内、眼内、肺内、静脈内、腹腔内、経鼻、経眼、経口、経耳、非経口、貼付剤、皮下、舌下、局所、または経皮経路で投与されることで特徴づけられる、組成物。
【請求項２９】
請求項１９に記載の組成物であって、該組成物が、前記干渉ＲＮＡ分子を発現することができる発現ベクターからインビボ発現によって投与されることで特徴づけられる、組成物。
【請求項３０】
前記患者が、ＩＯＰに関連した病態を有するかまたは発症するリスクがある、請求項１９に記載の組成物。
【請求項３１】
前記ＩＯＰに関連した病態が緑内障である、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
前記干渉ＲＮＡ分子が、配列番号２および配列番号１３〜配列番号９８のいずれかに対応するＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡの一部分を認識する、請求項１９に記載の組成物。
【請求項３３】
前記干渉ＲＮＡ分子がＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡの一部分を認識し、前記一部分が、配列番号１のヌクレオチド４０２、４０３、４０４、４０７、４１０、４２５、４４９、４５５、４８５、６４２、６４３、６８６、７８４、１２３０、１５１６、１５５４、１８１１、２１０１、２１８５、２２１２、２２２３、２３６８、２３７０、２４０１、２４１２、２４１３、２６１７、２６９２、２６９３、２８６２、２８８９、３０８４、３７３３、３７４３、３７５２、３７７３、３８４６、４００４、４０９９、２１６、２３５、２３６、２６５、２６７、２７３、２７９、２８０、２８１、３８９、３９１、４０１、４１６、４２６、４２７、４３９、４４０、４５９、４６１、４７１、４７２、４９１、４９７、５２０、５４５、５４６、５７５、５８１、５８７、５９２、５９５、５９６、５９８、５９９、６２４、６２６、６４０、６４６、６５０、６５２、６５７、６５９、６７３、６７６、６７８、６７９、６８８、または６８９を含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項３４】
請求項１９に記載の組成物であって、該組成物が、局所、硝子体内、経強膜、眼周囲、結膜、テノン嚢下、前房内、網膜下、結膜下、眼球後方、または小管内経路で投与されることで特徴づけられる、組成物。
【請求項３５】
前記干渉ＲＮＡ分子が、少なくとも１つの修飾を含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項３６】
前記干渉ＲＮＡ分子が、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡである、請求項１９に記載の組成物。
【請求項３７】
約１９〜約４９ヌクレオチド長の干渉ＲＮＡ分子であって、前記干渉ＲＮＡ分子は、
（ａ）配列番号２および配列番号１３〜配列番号９８のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端の最後から２番目の１３個のヌクレオチドと少なくとも９０％の配列相補性または少なくとも９０％の配列同一性をもつ少なくとも１３個の隣接するヌクレオチドの領域、
（ｂ）配列番号２および配列番号１３〜配列番号９８のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端の最後から２番目の１４個のヌクレオチドと少なくとも８５％の配列相補性または少なくとも８５％の配列同一性をもつ少なくとも１４個の隣接するヌクレオチドの領域、あるいは
（ｃ）配列番号２および配列番号１３〜配列番号９８のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端のそれぞれ最後から２番目の１５個、１６個、１７個、もしくは１８個のヌクレオチドと少なくとも８０％の配列相補性または少なくとも８０％の配列同一性をもつ少なくとも１５個、１６個、１７個、もしくは１８個の隣接するヌクレオチドの領域
を含む、干渉ＲＮＡ分子。
【請求項３８】
前記干渉ＲＮＡ分子が、配列番号２および配列番号１３〜配列番号９８のいずれかに対応するＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡの一部分を認識する、請求項３７に記載の干渉ＲＮＡ分子。
【請求項３９】
前記干渉ＲＮＡ分子がＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡの一部分を認識し、前記一部分が、配列番号１のヌクレオチド４０２、４０３、４０４、４０７、４１０、４２５、４４９、４５５、４８５、６４２、６４３、６８６、７８４、１２３０、１５１６、１５５４、１８１１、２１０１、２１８５、２２１２、２２２３、２３６８、２３７０、２４０１、２４１２、２４１３、２６１７、２６９２、２６９３、２８６２、２８８９、３０８４、３７３３、３７４３、３７５２、３７７３、３８４６、４００４、４０９９、２１６、２３５、２３６、２６５、２６７、２７３、２７９、２８０、２８１、３８９、３９１、４０１、４１６、４２６、４２７、４３９、４４０、４５９、４６１、４７１、４７２、４９１、４
９７、５２０、５４５、５４６、５７５、５８１、５８７、５９２、５９５、５９６、５９８、５９９、６２４、６２６、６４０、６４６、６５０、６５２、６５７、６５９、６７３、６７６、６７８、６７９、６８８、または６８９を含む、請求項３７に記載の干渉ＲＮＡ分子。
【請求項４０】
前記干渉ＲＮＡ分子が、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡである、請求項３７に記載の干渉ＲＮＡ分子。
【請求項４１】
前記干渉ＲＮＡ分子が、少なくとも１つの修飾を含む、請求項３７に記載の干渉ＲＮＡ分子。
【請求項４２】
前記干渉ＲＮＡ分子が二本鎖であり、前記干渉ＲＮＡ分子の少なくとも一方の鎖が３’突出を含む、請求項３７に記載の干渉ＲＮＡ分子。
【請求項４３】
前記３’突出が約１〜約６個のヌクレオチドを含む、請求項４２に記載の干渉ＲＮＡ分子。
【請求項４４】
前記３’突出が２個のヌクレオチドを含む、請求項４３に記載の干渉ＲＮＡ分子。
【請求項４５】
前記干渉ＲＮＡ分子が二本鎖であり、前記干渉ＲＮＡ分子が平滑末端を有する、請求項３７に記載の干渉ＲＮＡ分子。
【請求項４６】
ＩＯＰに関連した病態の治療を必要とする患者においてＩＯＰに関連した病態を治療するための医薬の製造における干渉ＲＮＡ分子の使用であって、該干渉ＲＮＡ分子がＲＮＡ干渉によりＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡの発現を減弱する、使用。
【請求項４７】
前記干渉ＲＮＡ分子が二本鎖であり、各鎖が独立に、約１９〜約２７ヌクレオチド長である、請求項４６に記載の使用。
【請求項４８】
各鎖が独立に、約１９〜約２７ヌクレオチド長である、請求項４７に記載の使用。
【請求項４９】
各鎖が独立に、約１９ヌクレオチド長〜約２１ヌクレオチド長である、請求項４７に記載の使用。
【請求項５０】
センス鎖とアンチセンス鎖がリンカーで結合されて、患者においてＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡの発現を減弱することができるｓｈＲＮＡを形成する、請求項４７に記載の使用。
【請求項５１】
前記干渉ＲＮＡ分子が平滑末端を有する、請求項４７に記載の使用。
【請求項５２】
前記干渉ＲＮＡ分子の少なくとも一方の鎖が３’突出を含む、請求項４７に記載の使用。
【請求項５３】
前記３’突出が約１〜約６個のヌクレオチドを含む、請求項５２に記載の使用。
【請求項５４】
前記３’突出が２個のヌクレオチドを含む、請求項５２に記載の使用。
【請求項５５】
前記干渉ＲＮＡ分子が、エアゾール、口腔内、皮膚、皮内、吸入、筋肉内、鼻腔内、眼内、肺内、静脈内、腹腔内、経鼻、経眼、経口、経耳、非経口、貼付剤、皮下、舌下、局所、または経皮経路で投与される、請求項４６に記載の使用。
【請求項５６】
前記干渉ＲＮＡ分子が、前記干渉ＲＮＡ分子を発現することができる発現ベクターからインビボ発現によって投与される、請求項４６に記載の使用。
【請求項５７】
前記患者が、ＩＯＰに関連した病態を有するかまたは発症するリスクがある、請求項１４６に記載の使用。
【請求項５８】
前記ＩＯＰに関連した病態が緑内障である、請求項５７に記載の使用。
【請求項５９】
前記干渉ＲＮＡ分子が、配列番号２および配列番号１３〜配列番号９８のいずれかに対応するＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡの一部分を認識する、請求項４６に記載の使用。
【請求項６０】
前記干渉ＲＮＡ分子が、ＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡの一部分を認識し、前記一部分が、配列番号１のヌクレオチド４０２、４０３、４０４、４０７、４１０、４２５、４４９、４５５、４８５、６４２、６４３、６８６、７８４、１２３０、１５１６、１５５４、１８１１、２１０１、２１８５、２２１２、２２２３、２３６８、２３７０、２４０１、２４１２、２４１３、２６１７、２６９２、２６９３、２８６２、２８８９、３０８４、３７３３、３７４３、３７５２、３７７３、３８４６、４００４、４０９９、２１６、２３５、２３６、２６５、２６７、２７３、２７９、２８０、２８１、３８９、３９１、４０１、４１６、４２６、４２７、４３９、４４０、４５９、４６１、４７１、４７２、４９１、４９７、５２０、５４５、５４６、５７５、５８１、５８７、５９２、５９５、５９６、５９８、５９９、６２４、６２６、６４０、６４６、６５０、６５２、６５７、６５９、６７３、６７６、６７８、６７９、６８８、または６８９を含む、請求項４６に記載の使用。
【請求項６１】
前記干渉ＲＮＡ分子が、少なくとも１つの修飾を含む、請求項４６に記載の使用。
【請求項６２】
前記干渉ＲＮＡ分子が、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡである、請求項４６に記載の使用。
【請求項６３】
前記干渉ＲＮＡ分子が、局所、硝子体内、経強膜、眼周囲、結膜、テノン嚢下、前房内、網膜下、結膜下、眼球後方、または小管内経路で投与される、請求項４６に記載の使用。
【請求項６４】
患者の眼においてＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡの発現を減弱するための医薬の製造における干渉ＲＮＡ分子の使用であって、該干渉ＲＮＡ分子がＲＮＡ干渉によりＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡの発現をダウンレギュレートする、使用。
【請求項６５】
前記干渉ＲＮＡ分子が二本鎖であり、各鎖が独立に、約１９〜約２７ヌクレオチド長である、請求項６４に記載の使用。
【請求項６６】
各鎖が独立に、約１９ヌクレオチド長〜約２５ヌクレオチド長である、請求項６５に記載の使用。
【請求項６７】
各鎖が独立に、約１９ヌクレオチド長〜約２１ヌクレオチド長である、請求項６５に記載の使用。
【請求項６８】
センス鎖とアンチセンス鎖がリンカーで結合されて、患者においてＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡの発現を減弱することができるｓｈＲＮＡを形成する、請求項６５に記載の使用。
【請求項６９】
前記干渉ＲＮＡ分子が平滑末端を有する、請求項６５に記載の使用。
【請求項７０】
前記干渉ＲＮＡ分子の少なくとも一方の鎖が３’突出を含む、請求項６５に記載の使用。
【請求項７１】
前記３’突出が約１〜約６個のヌクレオチドを含む、請求項７０に記載の使用。
【請求項７２】
前記３’突出が２個のヌクレオチドを含む、請求項７１に記載の使用。
【請求項７３】
前記干渉ＲＮＡ分子が、エアゾール、口腔内、皮膚、皮内、吸入、筋肉内、鼻腔内、眼内、肺内、静脈内、腹腔内、経鼻、経眼、経口、経耳、非経口、貼付剤、皮下、舌下、局所、または経皮経路で投与される、請求項６４に記載の使用。
【請求項７４】
前記干渉ＲＮＡ分子が、前記干渉ＲＮＡ分子を発現することができる発現ベクターからインビボ発現によって投与される、請求項６４に記載の使用。
【請求項７５】
前記患者が、ＩＯＰに関連した病態を有するかまたは発症するリスクがある、請求項６４に記載の使用。
【請求項７６】
前記ＩＯＰに関連した病態が緑内障である、請求項７５に記載の使用。
【請求項７７】
前記干渉ＲＮＡ分子が、配列番号２および配列番号１３〜配列番号９８のいずれかに対応するＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡの一部分を認識する、請求項６４に記載の使用。
【請求項７８】
前記干渉ＲＮＡ分子がＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡの一部分を認識し、前記一部分が、配列番号１のヌクレオチド４０２、４０３、４０４、４０７、４１０、４２５、４４９、４５５、４８５、６４２、６４３、６８６、７８４、１２３０、１５１６、１５５４、１８１１、２１０１、２１８５、２２１２、２２２３、２３６８、２３７０、２４０１、２４１２、２４１３、２６１７、２６９２、２６９３、２８６２、２８８９、３０８４、３７３３、３７４３、３７５２、３７７３、３８４６、４００４、４０９９、２１６、２３５、２３６、２６５、２６７、２７３、２７９、２８０、２８１、３８９、３９１、４０１、４１６、４２６、４２７、４３９、４４０、４５９、４６１、４７１、４７２、４９１、４９７、５２０、５４５、５４６、５７５、５８１、５８７、５９２、５９５、５９６、５９８、５９９、６２４、６２６、６４０、６４６、６５０、６５２、６５７、６５９、６７３、６７６、６７８、６７９、６８８、または６８９を含む、請求項６４に記載の使用。
【請求項７９】
前記干渉ＲＮＡ分子が、局所、硝子体内、経強膜、眼周囲、結膜、テノン嚢下、前房内、網膜下、結膜下、眼球後方、または小管内経路で投与される、請求項６４に記載の使用。
【請求項８０】
前記干渉ＲＮＡ分子が、少なくとも１つの修飾を含む、請求項６４に記載の使用。
【請求項８１】
干渉ＲＮＡ分子が、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡである、請求項６４に記載の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
本発明の具体的な好ましい実施形態は、下記のいくつかの好ましい実施形態のより詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
ＩＯＰに関連した病態の治療を必要とする患者においてＩＯＰに関連した病態を治療する方法であって、ＲＮＡ干渉によりＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡの発現を減弱する干渉ＲＮＡ分子を患者に投与することを含む方法。
（項目２）
前記干渉ＲＮＡ分子が二本鎖であり、各鎖が独立に、約１９〜約２７ヌクレオチド長である、項目１に記載の方法。
（項目３）
各鎖が独立に、約１９ヌクレオチド長〜約２５ヌクレオチド長である、項目２に記載の方法。
（項目４）
各鎖が独立に、約１９ヌクレオチド長〜約２１ヌクレオチド長である、項目２に記載の方法。
（項目５）
センス鎖とアンチセンス鎖がリンカーで結合されて、患者においてＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡの発現を減弱することができるｓｈＲＮＡを形成する、項目２に記載の方法。
（項目６）
前記干渉ＲＮＡ分子が平滑末端を有する、項目２に記載の方法。
（項目７）
前記干渉ＲＮＡ分子の少なくとも一方の鎖が３’突出を含む、項目２に記載の方法。
（項目８）
前記３’突出が約１〜約６個のヌクレオチドを含む、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記３’突出が２個のヌクレオチドを含む、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記干渉ＲＮＡ分子が、エアゾール、口腔内、皮膚、皮内、吸入、筋肉内、鼻腔内、眼内、肺内、静脈内、腹腔内、経鼻、経眼、経口、経耳、非経口、貼付剤、皮下、舌下、局所、または経皮経路で投与される、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記干渉ＲＮＡ分子が、前記干渉ＲＮＡ分子を発現することができる発現ベクターからインビボ発現によって投与される、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記患者が、ＩＯＰに関連した病態を有するかまたは発症するリスクがある、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記ＩＯＰに関連した病態が緑内障である、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記干渉ＲＮＡ分子が、配列番号２および配列番号１３〜配列番号９８のいずれかに対応するＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡの一部分を認識する、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記干渉ＲＮＡ分子が、ＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡの一部分を認識し、前記一部分が、配列番号１のヌクレオチド４０２、４０３、４０４、４０７、４１０、４２５、４４９、４５５、４８５、６４２、６４３、６８６、７８４、１２３０、１５１６、１５５４、１８１１、２１０１、２１８５、２２１２、２２２３、２３６８、２３７０、２４０１、２４１２、２４１３、２６１７、２６９２、２６９３、２８６２、２８８９、３０８４、３７３３、３７４３、３７５２、３７７３、３８４６、４００４、４０９９、２１６、２３５、２３６、２６５、２６７、２７３、２７９、２８０、２８１、３８９、３９１、４０１、４１６、４２６、４２７、４３９、４４０、４５９、４６１、４７１、４７２、４９１、４９７、５２０、５４５、５４６、５７５、５８１、５８７、５９２、５９５、５９６、５９８、５９９、６２４、６２６、６４０、６４６、６５０、６５２、６５７、６５９、６７３、６７６、６７８、６７９、６８８、または６８９を含む、項目１に記載の方法。
（項目１６）
前記干渉ＲＮＡ分子が、少なくとも１つの修飾を含む、項目１に記載の方法。
（項目１７）
前記干渉ＲＮＡ分子が、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡである、項目１に記載の組成物。
（項目１８）
前記干渉ＲＮＡ分子が、局所、硝子体内、経強膜、眼周囲、結膜、テノン嚢下、前房内、網膜下、結膜下、眼球後方、または小管内経路で投与される、項目１に記載の方法。
（項目１９）
患者の眼においてＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡの発現を減弱する方法であって、ＲＮＡ干渉によりＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡの発現をダウンレギュレートする干渉ＲＮＡ分子を患者の眼に投与することを含む方法。
（項目２０）
前記干渉ＲＮＡ分子が二本鎖であり、各鎖が独立に、約１９〜約２７ヌクレオチド長である、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
各鎖が独立に、約１９ヌクレオチド長〜約２５ヌクレオチド長である、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
各鎖が独立に、約１９ヌクレオチド長〜約２１ヌクレオチド長である、項目２０に記載の方法。
（項目２３）
センス鎖とアンチセンス鎖がリンカーで結合されて、患者においてＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡの発現を減弱することができるｓｈＲＮＡを形成する、項目２０に記載の方法。
（項目２４）
前記干渉ＲＮＡ分子が平滑末端を有する、項目２０に記載の方法。
（項目２５）
前記干渉ＲＮＡ分子の少なくとも一方の鎖が３’突出を含む、項目２０に記載の方法。
（項目２６）
前記３’突出が約１〜約６個のヌクレオチドを含む、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記３’突出が２個のヌクレオチドを含む、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記干渉ＲＮＡ分子が、エアゾール、口腔内、皮膚、皮内、吸入、筋肉内、鼻腔内、眼内、肺内、静脈内、腹腔内、経鼻、経眼、経口、経耳、非経口、貼付剤、皮下、舌下、局所、または経皮経路で投与される、項目１９に記載の方法。
（項目２９）
前記干渉ＲＮＡ分子が、前記干渉ＲＮＡ分子を発現することができる発現ベクターからインビボ発現によって投与される、項目１９に記載の方法。
（項目３０）
前記患者が、ＩＯＰに関連した病態を有するかまたは発症するリスクがある、項目１９に記載の方法。
（項目３１）
前記ＩＯＰに関連した病態が緑内障である、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記干渉ＲＮＡ分子が、配列番号２および配列番号１３〜配列番号９８のいずれかに対
応するＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡの一部分を認識する、項目１９に記載の方法。
（項目３３）
前記干渉ＲＮＡ分子がＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡの一部分を認識し、前記一部分が、配列番号１のヌクレオチド４０２、４０３、４０４、４０７、４１０、４２５、４４９、４５５、４８５、６４２、６４３、６８６、７８４、１２３０、１５１６、１５５４、１８１１、２１０１、２１８５、２２１２、２２２３、２３６８、２３７０、２４０１、２４１２、２４１３、２６１７、２６９２、２６９３、２８６２、２８８９、３０８４、３７３３、３７４３、３７５２、３７７３、３８４６、４００４、４０９９、２１６、２３５、２３６、２６５、２６７、２７３、２７９、２８０、２８１、３８９、３９１、４０１、４１６、４２６、４２７、４３９、４４０、４５９、４６１、４７１、４７２、４９１、４９７、５２０、５４５、５４６、５７５、５８１、５８７、５９２、５９５、５９６、５９８、５９９、６２４、６２６、６４０、６４６、６５０、６５２、６５７、６５９、６７３、６７６、６７８、６７９、６８８、または６８９を含む、項目１９に記載の方法。
（項目３４）
前記干渉ＲＮＡ分子が、局所、硝子体内、経強膜、眼周囲、結膜、テノン嚢下、前房内、網膜下、結膜下、眼球後方、または小管内経路で投与される、項目１９に記載の方法。
（項目３５）
前記干渉ＲＮＡ分子が、少なくとも１つの修飾を含む、項目１９に記載の方法。
（項目３６）
干渉ＲＮＡ分子が、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡである、項目１９に記載の組成物。
（項目３７）
約１９〜約４９ヌクレオチド長の干渉ＲＮＡ分子であって、前記干渉ＲＮＡ分子は、
（ａ）配列番号２および配列番号１３〜配列番号９８のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端の最後から２番目の１３個のヌクレオチドと少なくとも９０％の配列相補性または少なくとも９０％の配列同一性をもつ少なくとも１３個の隣接するヌクレオチドの領域、
（ｂ）配列番号２および配列番号１３〜配列番号９８のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端の最後から２番目の１４個のヌクレオチドと少なくとも８５％の配列相補性または少なくとも８５％の配列同一性をもつ少なくとも１４個の隣接するヌクレオチドの領域、あるいは
（ｃ）配列番号２および配列番号１３〜配列番号９８のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端のそれぞれ最後から２番目の１５個、１６個、１７個、もしくは１８個のヌクレオチドと少なくとも８０％の配列相補性または少なくとも８０％の配列同一性をもつ少なくとも１５個、１６個、１７個、もしくは１８個の隣接するヌクレオチドの領域
を含む、干渉ＲＮＡ分子。
（項目３８）
前記干渉ＲＮＡ分子が、配列番号２および配列番号１３〜配列番号９８のいずれかに対応するＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡの一部分を認識する、項目３７に記載の干渉ＲＮＡ分子。
（項目３９）
前記干渉ＲＮＡ分子がＧＲＥＭ１  ｍＲＮＡの一部分を認識し、前記一部分が、配列番号１のヌクレオチド４０２、４０３、４０４、４０７、４１０、４２５、４４９、４５５、４８５、６４２、６４３、６８６、７８４、１２３０、１５１６、１５５４、１８１１、２１０１、２１８５、２２１２、２２２３、２３６８、２３７０、２４０１、２４１２、２４１３、２６１７、２６９２、２６９３、２８６２、２８８９、３０８４、３７３３、３７４３、３７５２、３７７３、３８４６、４００４、４０９９、２１６、２３５、２３６、２６５、２６７、２７３、２７９、２８０、２８１、３８９、３９１、４０１、４１６、４２６、４２７、４３９、４４０、４５９、４６１、４７１、４７２、４９１、４
９７、５２０、５４５、５４６、５７５、５８１、５８７、５９２、５９５、５９６、５９８、５９９、６２４、６２６、６４０、６４６、６５０、６５２、６５７、６５９、６７３、６７６、６７８、６７９、６８８、または６８９を含む、項目３７に記載の干渉ＲＮＡ分子。
（項目４０）
前記干渉ＲＮＡ分子が、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡである、項目３７に記載の組成物。
（項目４１）
前記干渉ＲＮＡ分子が、少なくとも１つの修飾を含む、項目３７に記載の方法。
（項目４２）
前記干渉ＲＮＡ分子が二本鎖であり、前記干渉ＲＮＡ分子の少なくとも一方の鎖が３’突出を含む、項目３７に記載の方法。
（項目４３）
前記３’突出が約１〜約６個のヌクレオチドを含む、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記３’突出が２個のヌクレオチドを含む、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記干渉ＲＮＡ分子が二本鎖であり、前記干渉ＲＮＡ分子が平滑末端を有する、項目３７に記載の方法。
【国際調査報告】
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