(57)【要約】  本発明は、本明細書に記載される化合物の使用方法、例えば、神経前駆細胞を有効量の本明細書に記載される化合物と接触させることによる、インビトロにおけるニューロン新生を含む、ニューロン新生の促進；神経性化合物での治療を必要とする被験体の治療；および／または海馬の損傷に関連する疾患または病状の治療方法などに関する。被験体はヒトまたは獣動物でありうる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経性化合物を用いて、それを必要とする被験体を治療する方法であって、
式Ｉの化合物、式ＩＩの化合物、式ＩＩＩの化合物、式ＩＶの化合物、式Ｖの化合物、式ＶＩの化合物、およびそれらの薬学的に許容される塩、およびそれらの代謝産物からなる群より選択される化合物を、有効量で、前記被験体に投与する工程を有してなり、
【化１】
2010518164.tif 000018
ここで、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5およびＲ6は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシル、−ＯＣＨ3、Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ3、Ｏ−没食子酸およびＯ−糖からなる群より選択され、ここで、糖はグルコース、マルトース、ガラクトースおよび果糖からなる群より選択され；
【化２】
2010518164.tif 000019
ここで、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5およびＲ6は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシル、−ＯＣＨ3、Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ3、Ｏ−没食子酸およびＯ−糖からなる群より選択され、ここで、糖はグルコース、マルトース、ガラクトースおよび果糖からなる群より選択され；
【化３】
2010518164.tif 000020
ここで、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5およびＲ6は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシル、−ＯＣＨ3、Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ3、Ｏ−没食子酸およびＯ−糖からなる群より選択され、ここで、糖はグルコース、マルトース、ガラクトースおよび果糖からなる群より選択され；
【化４】
2010518164.tif 000021
ここで、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5およびＲ6は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシル、−ＯＣＨ3、Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ3、Ｏ−没食子酸およびＯ−糖からなる群より選択され、ここで、糖はグルコース、マルトース、ガラクトースおよび果糖からなる群より選択され；
【化５】
2010518164.tif 000022
ここで、
Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシル、−ＯＣＨ3、Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ3、Ｏ−没食子酸およびＯ−糖からなる群より選択され、ここで、糖はグルコース、マルトース、ガラクトースおよび果糖からなる群より選択され； 
【化６】
2010518164.tif 000023
ここで、
Ｒ1、Ｒ2およびＲ6 は、それぞれ独立して、水素、−ＯＣＨ3、Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ3、Ｏ−没食子酸およびＯ−糖からなる群より選択され、ここで、糖はグルコース、マルトース、ガラクトースおよび果糖からなる群より選択され、
Ｒ3、Ｒ4およびＲ5 は、それぞれ独立して、水素、Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ3、Ｏ−没食子酸およびＯ−糖からなる群より選択され、ここで、糖はグルコース、マルトース、ガラクトースおよび果糖からなる群より選択され； 
前記被験体がヒトまたは獣動物であることを特徴とする、
方法。
【請求項２】
前記被験体がヒトであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記化合物が、運動と組み合わせて投与されることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記ヒトが、神経変性疾患に罹患しているヒト以外であることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項５】
前記ヒトが、神経変性疾患に罹患しているヒト以外であることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項６】
前記ヒトが、高齢者であることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項７】
前記ヒトが、高齢者であることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項８】
前記高齢者が、健康な高齢者であることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項９】
前記高齢者が、健康な高齢者であることを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項１０】
前記ヒトが初期段階のアルツハイマー病に罹患していることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項１１】
前記ヒトが、海馬の損傷に関連する疾患または病状を患っていることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項１２】
前記化合物が、運動負荷なしに投与されることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項１３】
ニューロン新生を促進する方法であって、
神経前駆細胞を、有効量の、式Ｉの化合物、式ＩＩの化合物、式ＩＩＩの化合物、式ＩＶの化合物、式Ｖの化合物、式ＶＩの化合物、およびそれらの薬学的に許容される塩、およびそれらの代謝産物からなる群より選択される化合物と接触させる工程を有してなり、
【化７】
2010518164.tif 000024
ここで、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5およびＲ6は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシル、−ＯＣＨ3、Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ3、Ｏ−没食子酸およびＯ−糖からなる群より選択され、ここで、糖はグルコース、マルトース、ガラクトースおよび果糖からなる群より選択され；
【化８】
2010518164.tif 000025
ここで、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5およびＲ6は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシル、−ＯＣＨ3、Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ3、Ｏ−没食子酸およびＯ−糖からなる群より選択され、ここで、糖はグルコース、マルトース、ガラクトースおよび果糖からなる群より選択され；
【化９】
2010518164.tif 000026
ここで、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5およびＲ6は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシル、−ＯＣＨ3、Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ3、Ｏ−没食子酸およびＯ−糖からなる群より選択され、ここで、糖はグルコース、マルトース、ガラクトースおよび果糖からなる群より選択され；
【化１０】
2010518164.tif 000027
ここで、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5およびＲ6 は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシル、−ＯＣＨ3、Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ3、Ｏ−没食子酸およびＯ−糖からなる群より選択され、ここで、糖はグルコース、マルトース、ガラクトースおよび果糖からなる群より選択され；
【化１１】
2010518164.tif 000028
ここで、
Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3 は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシル、−ＯＣＨ3、Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ3、Ｏ−没食子酸およびＯ−糖からなる群より選択され、ここで、糖はグルコース、マルトース、ガラクトースおよび果糖からなる群より選択され；
【化１２】
2010518164.tif 000029
ここで、
Ｒ1、Ｒ2およびＲ6 は、それぞれ独立して、水素、−ＯＣＨ3、Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ3、Ｏ−没食子酸およびＯ−糖からなる群より選択され、ここで、糖はグルコース、マルトース、ガラクトースおよび果糖からなる群より選択され、
Ｒ3、Ｒ4およびＲ5 は、それぞれ独立して、水素、Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ3、Ｏ−没食子酸およびＯ−糖からなる群より選択され、ここで、糖はグルコース、マルトース、ガラクトースおよび果糖からなる群より選択される、
方法。
【請求項１４】
前記ヒトが、うつ病および／または心的外傷後ストレス障害を患っていることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項１５】
前記ヒトが、前向性健忘症および／または逆向性健忘症を患っていることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項１６】
前記ヒトが、ナビゲーション見当識障害を患っていることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項１７】
前記ヒトが、軍人または戦闘員であることを特徴とする請求項２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の権利の説明】
【０００１】
本願は、一部には助成金番号ＤＡＡＤ−１９−０２−１−０２６７として米国国防総省国防高等研究事業局（ＤＡＲＰＡ）から提供された資金を通じて開発された。米国連邦政府は、本発明について権利を有する場合がある。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、神経性化合物を含む組成物、および神経性化合物の使用方法、例えばニューロン新生の促進；神経性化合物での治療を必要とする被験体の治療；および／または海馬の損傷に関連する疾患または病状の治療方法などに関する。
【背景技術】
【０００３】
海馬は脳の一部であり、側頭葉の内側に位置している（人間は脳の両側に１つずつ、２つの海馬を有する）。海馬は辺縁系の一部を形成し、記憶およびナビゲーションの役割を果たす。
【０００４】
海馬は、個人的に経験した事象についての新しい記憶（エピソードまたは自伝的記憶）の形成過程、および空間記憶における重要な役割を担う。エピソード記憶（自伝的記憶とも称される）は、時間、場所、および関連する感情を含む、事象の顕在記憶として定義される。それは、人に、特定の時間および場所で個人的に経験した事象を思い出させる。このエピソード記憶は、さまざまな形態の記憶喪失（前向性および逆行性）の影響を受けることが非常に多い。空間記憶は、空間的情報の貯蔵および処理に関する記憶として定義される。それは、ナビゲーションの役割を果たし、海馬内に限局されている。海馬は、より大きい側頭葉の記憶システムの一環として、一般的な陳述記憶（例えば、エピソード記憶に加える事実の記憶などを含む、はっきりと言葉で表現されうる記憶）にも関与しうる。これらの記憶形態は一生の間保たれることが多いが、海馬は硬化する時期を経た後に記憶の保持における重要な機能を停止してしまうという、いくつかの証拠が存在する。
【０００５】
海馬の損傷は、通常、新しい記憶の形成に深刻な問題を生じ（前向性健忘症）、通常は損傷前の記憶へのアクセスにも影響を及ぼす。逆行性の影響は、通常、脳損傷前の数年にわたり、一部の事例では、より古い記憶が残るが、これは、非常に長期にわたる期間、長期記憶内に符号化されている情報は、もはや海馬の介在を必要としないことを示唆している。海馬の損傷は、例えば外傷性障害、酸素欠乏（無酸素症）および脳炎などさまざまな要因の結果として生じうる。例えば、海馬萎縮（ここで萎縮とは海馬体積の減少のことをいう）などの海馬の損傷は、特定の種類の痴呆とも関連する。しかしながら、海馬の損傷は、新しい技能を学習する能力（例えば楽器の演奏）など、ある態様の記憶には影響を及ぼさず、これは、このような能力が、異なる種類の記憶（手続記憶）および異なる脳領域によって決まることを示唆している。例えば、癲癇の治療で側頭葉内側部の両側を除去された患者は、依然として新しい意味記憶を形成することができる、という証拠が存在する。
【０００６】
証拠は、空間的情報の貯蔵および処理についても、海馬が関与していることを示している。完全に機能している海馬を除いて、人は自身が行った場所および行こうとしている場所への行き方について首尾良く思い出すことができない場合がある。研究者は、海馬が、近道、および精通している場所どうしの間の新しい経路を見つけるのに特に重要な役割をしていると考えている。一部の人々は、他の人々に比べてこの種のナビゲーションに優れた技量を示し、脳撮像は、これらの個人が、ナビゲーションする際に、より活性な海馬を有することを示している。
【０００７】
海馬がうつ病に関連するという証拠も存在する。長期間の臨床的うつ病を患う人の海馬は、うつ病になったことのない人の海馬よりも２０％も小さい場合がある。長期の抗うつ剤治療（少なくとも２、３週間）および運動の両方が、海馬のニューロン新生を増加させ、以前の体積損失を補うことができ、このことから、ニューロン新生の増大がうつ病の症状を改善することを暗示している。抗うつ剤治療に関連して、薬物をわずか２、３日しか与えない場合には、この効果は生じない。
【０００８】
海馬のニューロン新生を促進しうる要因には、身体的活動、脳に対する刺激が豊かな環境、セロトニン濃度の上昇、電撃ショック、および／またはカロリー制限が含まれる。しかしながら、年齢、セロトニン濃度の減少、ストレス、鎮静剤、アンフェタミン、および／または糖質コルチコイドは、海馬のニューロン新生を減少させる逆効果を有する場合がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、神経性化合物を含む組成物、および神経性化合物の使用方法、例えばニューロン新生の促進；神経性化合物での治療を必要とする被験体の治療；および／または海馬の損傷に関連する疾患または病状の治療方法などに関する。
【００１０】
１つの態様では、本発明は、本発明にかかる化合物を含む医薬品、食品、食品添加物、または栄養補助食品などの組成物に関する。組成物に追加の治療薬または健康増進薬を含めてもよく、あるいは、別の治療薬または健康増進薬と組み合わせて投与してもよい。パッケージ化された製品は、ニューロン新生の促進、神経性化合物での治療を必要とする被験体の治療、および／または海馬の損傷に関連する疾患または病状の治療のための上記組成物および、ラベルおよび／または使用説明書を含む。
【００１１】
別の態様では、本発明は、ニューロン新生の促進、神経性化合物での治療を必要とする被験体の治療、および／または海馬の損傷に関連する疾患または病状の治療の方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】自発走させたマウスの４分割における交差回数を示す、モリス水迷路のプローブ試行の結果。図は、アピゲニンで処理したマウスが、他のすべての４分割した領域よりも頻繁に、目標とする４分割の領域に入ったことを実証している。
【図１Ｂ】非自発走マウスの４分割における交差回数を示す、モリス水迷路のプローブ試行の結果。図は、アピゲニンで処理したマウスが、他のすべての４分割した領域よりも頻繁に、目標とする４分割の領域に入ったことを実証している。
【図１Ｃ】自発走させたマウスの４分割した総滞在時間を示す、モリス水迷路のプローブ試行の結果。図は、アピゲニンで処理したマウスが、他のすべての４分割した領域よりも頻繁に、目標とする４分割の領域に入ったことを実証している。
【図１Ｄ】非自発走マウスの４分割した総滞在時間を示す、モリス水迷路のプローブ試行の結果。図は、アピゲニンで処理したマウスが、他のすべての４分割した領域よりも頻繁に、目標とする４分割の領域に入ったことを実証している。
【図２】歯状回における新しく分裂した細胞（ＢｒｄＵ＋）の総数を示す。アピゲニンは自発走マウス群および非自発走マウス群の両方においてＢｒｄＵ標識を増大させた。*ｐ＜０．０５で対照自発走マウスとの有意差あり；**ｐ＜０．０１で他のすべての非自発走マウスとの有意差あり。ｐ＜０．０５で自発走マウス群との有意差あり。
【図３】歯状回におけるＢｒｄＵ＋ＮｅｕＮで共標識化された細胞の総数を表す。アピゲニン（２５ｍｇ／ｋｇ）を自発走と組み合わせた結果、他のすべての群と比較して、ニューロン新生が大幅に増大した。*ｐ＜０．０５で他のすべての群との有意差あり。
【図４】歯状回における新しく分裂した細胞（ＢｒｄＵ＋）の総数を表す。アピゲニン注入および食品の両方が、他のすべての群と比較して、ＢｒｄＵ標識を増大させた。*ｐ＜０．０５でアピゲニンとの有意差あり。
【図５】さまざまな条件下で２日間処理後の相対的ＮｅｕｒｏＤ発光酵素活性の定量化を表す。グラフ左側は、最初に、細胞を、ＲＡ＋ＦＳＫ、アピゲニン、またはＮ２単独で増殖させた。グラフ右側は、細胞を、直接、ＲＡ＋ＦＳＫ、アピゲニン、またはＮ２のみを含むＮ２培地に入れた。
【図６Ａ】アピゲニンで処理したニューロンの免疫組織学的分析の結果。成熟神経前駆細胞を分離し、ＦＧＦ２を含むＮ２培地またはＮ２のみの培地に入れた（グラフ左側）。細胞は、ＲＡ＋ＦＳＫ、アピゲニン、またはＮ２のみで処理後さらに４日間増殖させ、次いで固定し、細胞系列特異的標識（Ｔｕｊ１）で染色した。カウント数はすべて、陽性細胞全体（ＤＡＰＩ）に対する標識陽性細胞である。エラーバーは標準偏差を表す。
【図６Ｂ】アピゲニンで処理した星状細胞の免疫組織学的分析の結果。成熟神経前駆細胞を分離し、ＦＧＦ２を含むＮ２培地またはＮ２のみの培地に入れた（グラフ左側）。細胞は、ＲＡ＋ＦＳＫ、アピゲニン、またはＮ２のみで処理後さらに４日間増殖させ、次いで固定し、細胞系列特異的標識（ＧＦＡＰ）で染色した。カウント数はすべて、陽性細胞全体（ＤＡＰＩ）に対する標識陽性細胞である。エラーバーは標準偏差を表す。
【図６Ｃ】アピゲニンで処理した乏突起膠細胞の免疫組織学的分析の結果。成熟神経前駆細胞を分離し、ＦＧＦ２を含むＮ２培地またはＮ２のみの培地に入れた（グラフ左側）。細胞は、ＲＡ＋ＦＳＫ、アピゲニン、またはＮ２のみで処理後さらに４日間増殖させ、次いで固定し、細胞系列特異的標識（ＲＩＰ）で染色した。カウント数はすべて、陽性細胞全体（ＤＡＰＩ）に対する標識陽性細胞である。エラーバーは標準偏差を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書に引用されるすべての特許、特許出願、および参考文献は、参照することにより本明細書に取り込まれる。矛盾する場合には、本開示が適用される。
【００１４】
本発明は、神経性化合物を含む組成物、および神経性化合物の使用方法、例えばニューロン新生の促進；神経性化合物での治療を必要とする被験体の治療；および／または海馬の損傷に関連する疾患または病状の治療方法などに関する。
【００１５】
本明細書では、「神経性化合物」という用語は、神経性の特性を示す、すなわち、インビトロおよび／またはインビボにおいてニューロンの増殖を促進する化合物のことをいう。この定義の目的では、このような作用は、例えば、それぞれ参照することにより本明細書に取り込まれる、ＳｈａｈらのQuantitation of neurite growth parameters in explant cultures using a new image processing program, J. Neurosci. Methods, 136(2): 123-31 (2004)、およびＲｏｎｎらのA simple procedure for quantification ofneurite outgrowth based on stereological principles, J. Neurosci. Methods, 100(l-2):25-32 (2000)に記載されるようにインビトロで、または、海馬体積の磁気共鳴映像法および／または大脳血液量の変化の測定を使用してインビボでなどの例に記載されるように、当技術分野で周知の方法で測定されうる。
【００１６】
本発明は、下記式Ｉを有する化合物、それらの薬学的に許容される塩、またはそれらの代謝産物、および該化合物を有効量で含む組成物に関し：
【化１】
2010518164.tif 000002
【００１７】
ここで、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5およびＲ6は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシル、−ＯＣＨ3、Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ3、Ｏ−没食子酸およびＯ−糖からなる群より選択され、ここで、糖はグルコース、マルトース、ガラクトースおよび果糖からなる群より選択される。
【００１８】
特定の実施の形態では、本発明は、式Ｉの化合物に関し、ここでＲ1および／またはＲ3はヒドロキシルである。
【００１９】
例えば、本発明は、下記式Ｉを有する化合物、それらの薬学的に許容される塩、またはそれらの代謝産物、および該化合物を有効量で含む組成物にも関し：
【化２】
2010518164.tif 000003
【００２０】
ここで、
Ｒ1、Ｒ3、およびＲ5は、それぞれ独立して、水素、−ＯＣＨ3、Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ3、Ｏ−没食子酸およびＯ−糖からなる群より選択され、ここで、糖はグルコース、マルトース、ガラクトースおよび果糖からなる群より選択され；
Ｒ2およびＲ4は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシル、−ＯＣＨ3、Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ3、Ｏ−没食子酸およびＯ−糖からなる群より選択され、ここで、糖はグルコース、マルトース、ガラクトースおよび果糖からなる群より選択され；
Ｒ6は、Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ3、Ｏ−没食子酸およびＯ−糖からなる群より選択され、ここで、糖はグルコース、マルトース、ガラクトースおよび果糖からなる群より選択される。
【００２１】
式Ｉの化合物の例としては、アピゲニン、ルテオリン、バイカレイン、アメントフラボン、ケンフェロール、クリシン、クリセリオール（chryseriol）、ジオスメチン、イソラムネチン、およびアカセチンが挙げられる。特定の実施の形態では、本発明は、式Ｉの化合物に関し、ここで、Ｒ1および／またはＲ3はヒドロキシルである。
【００２２】
上記式Ｉの化合物の代謝産物は、グリコシル化（例えばグルクロン酸化）、硫酸化、および／またはメチル化された代謝産物でありうる。例えば、グリコシル化は、例えば、アピゲニン−７−Ｏ−グルクロニド（アピゲニン−７−Ｏ−βグルクロニド）、アピゲニン−７−Ｏ−グルコシド、ルテオリン−７−Ｏ−グルコシド、アピゲニン−４'−Ｏ−グルクロニド（アピゲニン−７−Ｏ−βグルクロニド）、アピゲニン−４'−Ｏ−サルフェート−７−Ｏ−グルクロニドなど、Ｃ７および／またはＣ４'の炭素位置で生じうる。
【００２３】
式Ｉの２つの単量体が８→３’結合を介して結合しているような上記式Ｉの２量体も、本発明の範囲内にある。
【００２４】
他の実施の形態では、本発明は、下記式ＩＩを有する化合物、それらの薬学的に許容される塩、またはそれらの代謝産物、および該化合物を有効量で含む組成物に関し：
【化３】
2010518164.tif 000004
【００２５】
ここで、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5およびＲ6は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシル、−ＯＣＨ3、Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ3、Ｏ−没食子酸およびＯ−糖からなる群より選択され、ここで、糖はグルコース、マルトース、ガラクトースおよび果糖からなる群より選択される。
【００２６】
式ＩＩの化合物の例としては、ゲラルドール（geraldol）、ケルセチンおよびフィセチン（fisetin）の水和物が挙げられる。特定の実施の形態では、本発明は式ＩＩの化合物に関し、ここで、Ｒ1および／またはＲ3はヒドロキシルであり；さらに他の実施の形態では、本発明は、式ＩＩの化合物に関し、ここで、Ｒ5および／またはＲ6は、ヒドロキシルである。
【００２７】
上記式ＩＩの化合物の代謝産物は、グリコシル化（例えばグルクロン酸化）、硫酸化、および／またはメチル化された代謝産物でありうる。例えば、ケルセチン−３−Ｏ−グルクロニド（ケルセチン−３−Ｏ−βグルクロニド）、ケルセチン−３，４'−ジ−グルコシド、ケルセチン−４'−Ｏ−グルコシド、ケルセチン−３−グルコシド、ケルセチン−３−サルフェート、ケルセチン グルコシドサルフェート、３'−メチルケルセチン３−Ｏ−グルクロニドなどが挙げられる。
【００２８】
下記式ＩＩＩを有する化合物、それらの薬学的に許容される塩、またはそれらの代謝産物、および該化合物を有効量で含む組成物に関し：
【化４】
2010518164.tif 000005
【００２９】
ここで、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5およびＲ6は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシル、−ＯＣＨ3、Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ3、Ｏ−没食子酸およびＯ−糖からなる群より選択され、ここで、糖はグルコース、マルトース、ガラクトースおよび果糖からなる群より選択される。
【００３０】
式ＩＩＩの化合物の例としては、ゲニステインが挙げられる。特定の実施の形態では、本発明は式ＩＩＩの化合物に関し、ここで、Ｒ1および／またはＲ3はヒドロキシルである。
【００３１】
上記式ＩＩＩの化合物の代謝産物は、グリコシル化（例えばグルクロン酸化）、硫酸化、および／またはメチル化された代謝産物でありうる。例えば、ゲニステインの硫酸抱合体（genistein sulfate）（例えば、ゲニステイン−７−サルフェート）、ゲニステイン・グルクロニド（例えば、ゲニステイン−７−グルクロニド、ゲニステイン−４'−Ｏ−グルクロニド）、ゲニステイン・スルホグルクロニドなどが挙げられる。
【００３２】
他の実施の形態では、本発明は、下記式ＩＶを有する化合物、それらの薬学的に許容される塩、またはそれらの代謝産物、および該化合物を有効量で含む組成物に関し：
【化５】
2010518164.tif 000006
【００３３】
ここで、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5およびＲ6は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシル、−ＯＣＨ3、Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ3、Ｏ−没食子酸およびＯ−糖からなる群より選択され、ここで、糖はグルコース、マルトース、ガラクトースおよび果糖からなる群より選択される。
【００３４】
式ＩＶの化合物の例としては、レスベラトロルが挙げられる。特定の実施の形態では、本発明は式ＩＶの化合物に関し、ここで、Ｒ2、Ｒ4およびＲ6はヒドロキシルである。
【００３５】
さらなる実施の形態では、本発明は、下記式Ｖを有する化合物、それらの薬学的に許容される塩、またはそれらの代謝産物、および該化合物を有効量で含む組成物に関し：
【化６】
2010518164.tif 000007
【００３６】
ここで、
Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシル、−ＯＣＨ3、Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ3、Ｏ−没食子酸およびＯ−糖なる群より選択され、ここで、糖はグルコース、マルトース、ガラクトースおよび果糖からなる群より選択される。
【００３７】
式Ｖの化合物の例としては、ピペルロングミン（piperlongumine）が挙げられる。特定の実施の形態では、本発明は式Ｖの化合物に関し、ここで、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3は−ＯＣＨ3である。
【００３８】
さらなる実施の形態では、本発明は、下記式ＶＩを有する化合物、それらの薬学的に許容される塩、またはそれらの代謝産物、および該化合物を有効量で含む組成物に関し：
【化７】
2010518164.tif 000008
【００３９】
ここで、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5およびＲ6は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシル、−ＯＣＨ3、Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ3、Ｏ−没食子酸およびＯ−糖からなる群より選択され、ここで、糖はグルコース、マルトース、ガラクトースおよび果糖からなる群より選択される。
【００４０】
特定の実施の形態では、本発明は、下記式ＶＩを有する化合物、それらの薬学的に許容される塩、またはそれらの代謝産物、および該化合物を有効量で含む組成物に関し：
【化８】
2010518164.tif 000009
【００４１】
ここで、
Ｒ1、Ｒ2およびＲ6は、それぞれ独立して、水素、−ＯＣＨ3、Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ3、Ｏ−没食子酸およびＯ−糖からなる群より選択され、ここで、糖はグルコース、マルトース、ガラクトースおよび果糖からなる群より選択され、
Ｒ3、Ｒ4およびＲ5は、それぞれ独立して、水素、Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ3、Ｏ−没食子酸およびＯ−糖からなる群より選択され、ここで、糖はグルコース、マルトース、ガラクトースおよび果糖からなる群より選択される。
【００４２】
式ＶＩの化合物の例としては、（−）−没食子酸エピカテキンおよび（−）−没食子酸エピガロカテキンが挙げられる。特定の実施の形態では、本発明は、式ＶＩの化合物に関し、ここで、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4および／またはＲ5はヒドロキシルであり、Ｒ6はＯ−没食子酸である。
【００４３】
本発明の化合物は、当業者に知られているように調製されて差し支えない。例えば、それらは、カモミールおよびパセリ（アピゲニン）、タマネギ（ケルセチン）、ブロッコリーおよびアーティチョーク（ルテオリン）、または中国の薬草（バイカレイン）などの天然起源から採取して構わない。例えば、それぞれ参照することにより本明細書に取り込まれる、ＡｖａｌｌｏｎｅらのPharmacological profile of apigenin, a flavonoid isolated from Matricaria chamomilla, Biochem. Pharmacol. 59(11): 1357-94 (2000)；ＪａｎｓｓｅｎらのEffects of the flavonoids quercetin and apigenin on homeostasis in healthy volunteers, Am. J. Clin. Nutr. 67(2):255-62 (1998)；ＭｉｅａｎらのFlavonoid (myricetin, quercetin, kaempferol, luteolin, and apigenin) content of edible tropical plants, J. Agric. Food Chem. 49(6):3106-12 (2001)；ＢｒｏｗｎらのLuteolin -rich artichoke extract protects low density lipoprotein from oxidation in vitro, Free Radic. Res., 29(3):247-55 (1998)；ＳｕｋらのFlavonoid baicalein attenuates activation-induced cell death of brain microglia, J. Pharmacol. Exp. Ther. 305(2):638-45 (2003)を参照のこと。化合物はまた、例えばSigma, Aldrich, and Intercontinental Chemicals (ICC)社を通じてなど、購入用に市販されている。
【００４４】
化合物は「単離および精製」して差し支えない。すなわち、汚染化合物および／または不純物の濃度が化合物の有効性に著しく影響を及ぼすか、または有効性を減じさせるような場合、天然に存在する物から化合物を分離して差し支えなく（例えば化合物が天然起源のものである場合）、あるいは「合成的に調製」してもよい。このような化合物は、特に医薬用途に適している。一部の実施の形態では、本発明の化合物は少なくとも８０％の純度、少なくとも８５％の純度、少なくとも９０％の純度、少なくとも９５％の純度、少なくとも９８％の純度、または少なくとも９９％の純度である。このような化合物は、特に医薬用途に適している。本明細書に記載される化合物を含む、もっと純度の低い植物抽出物の使用もまた、本発明の範囲内にあり、このような抽出物は食品および栄養補助食品に適しているであろう。
【００４５】
使用方法
本明細書に記載される任意の化合物および／または組成物を使用して、本願に記載される方法を実施しうる。
【００４６】
本発明は、本明細書に記載される化合物の使用方法に関し、例えば、神経前駆細胞を本明細書に記載される有効量の化合物と接触させることによる、インビトロでのニューロン新生を含む、ニューロン新生の促進；神経性化合物での治療を必要とする被験体の治療；および／または海馬の損傷に関連する疾患または病状の治療方法などである。被験体は、ヒトまたは獣動物であって差し支えない。
【００４７】
当業者は、本明細書に記載される治療方法の利益を受けうる被験体を想定することができよう。例えば、このような被験体としては、限定はしないが、海馬に損傷を有する被験体；酸素欠乏および／または無酸素症を患う、またはその危険性のある被験体；脳炎を患う被験体；癲癇を患う被験体；気分障害（例えば、うつ病または心的外傷後ストレス障害）を患う被験体；記憶機能障害を患う被験体（すなわち、個人的に経験した事象についての新しい記憶を形成できないこと、例えば、エピソード記憶に関する障害、および／または、前向性健忘症または逆向性健忘症を患う被験体などのように損傷前の記憶へのアクセスに関する障害を有する被験体など）；海馬に関連した学習の増加を必要とする被験体、ナビゲーション機能障害を患う被験体（例えば、見当識障害、行ったことのある場所、およびその場所への行き方を思い出すことができない被験体）； ナビゲーションを必要とする専門的職業を有する被験体；睡眠不足に悩む、または睡眠不足の危険性のある被験体（例えば、睡眠不足を含む専門的職業を有する被験体、軍人または戦闘員）、ストレスに晒される被験体（例えば、長期ストレス、高度のストレス、軍人または戦闘員）； 身体的または精神的労作に晒される被験体（例えば、軍人または戦闘員）、高齢の被験体（例えばアルツハイマー病などの神経変性疾患と診断されていない被験体など、健康な高齢の被験体）；セロトニン濃度が減少している／低い被験体；海馬のニューロン新生を減少させる／海馬のニューロン新生に影響を及ぼす薬剤の投与を受ける被験体、アンフェタミンの投与を受ける被験体（例えば、メチルフェニデート）；鎮静剤の投与を受ける被験体；糖質コルチコイド濃度の上昇を体験する被験体などが挙げられる。一部の実施の形態では、被験体は、神経変性疾患以外の上記病状のいずれかを患うか、患う危険性がある。神経変性疾患を患う被験体に関しては、本発明の化合物がその病状自体の治療に使用されるのではなく、したがって、これらの患者の特定の一部の者のみが本明細書に記載される方法の利益を受けうるものと理解されよう。このような被験体は当業者には明らかであろうが、例えば、初期段階のアルツハイマー病を患う被験体が挙げられる。
【００４８】
本明細書では、「高齢の被験体」という用語は、６５歳以上の年齢の被験体のことをいう。本明細書では、「健康な高齢の被験体」という用語は、神経変性疾患に罹患していない、および／または臨床的に神経変性疾患と診断されていない高齢の被験体のことをいう。
【００４９】
本明細書では、「治療」は、例えば、疾患の進行の遅延、寿命の長期化、致死の危険性の低減、疾患のパラメータの顕著な改善、および／または高齢者における老化の遅延などにより、存在する病状を改善することを意味する。認知機能障害に関しては、「治療」は、次の少なくとも１つの顕著な改善のことをいう：見当識障害、記憶障害（エピソード記憶、自伝的記憶、陳述記憶、前向性健忘症、および逆向性健忘症を含む）、睡眠不足の症状または悪影響、およびうつ病。本明細書では、「うつ病の治療」は、うつ病の症状のうち少なくとも１つを改善することをいう。
【００５０】
本明細書では、「運動／労作」は、ヒトまたは獣動物による身体的労作を必要とする活動のことをいう。
【００５１】
したがって、本発明は、有効量の下記式Ｉの化合物、およびそれらの薬学的に許容される塩またはそれらの代謝産物を、単独で、または身体的労作（例えば運動負荷）と組み合わせて、ニューロン新生を促進する（インビボおよび／またはインビトロ）；神経性化合物を使用した治療を必要とする被験体を治療する；および／または海馬の損傷に関連する疾患または病状を治療する方法に関し：
【化９】
2010518164.tif 000010
【００５２】
ここで、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5およびＲ6は、それぞれ独立して、 水素、ヒドロキシル、−ＯＣＨ3、Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ3、Ｏ−没食子酸およびＯ−糖からなる群より選択され、ここで、糖はグルコース、マルトース、ガラクトースおよび果糖からなる群より選択される。
【００５３】
例えば、本発明は、下記式Ｉを有する化合物、それらの薬学的に許容される塩、またはそれらの代謝産物、および該化合物を有効量で含む組成物に関し：
【化１０】
2010518164.tif 000011
【００５４】
ここで、
Ｒ1、Ｒ3、およびＲ5は、それぞれ独立して、水素、−ＯＣＨ3、Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ3、Ｏ−没食子酸およびＯ−糖からなる群より選択され、ここで、糖はグルコース、マルトース、ガラクトースおよび果糖からなる群より選択され；
Ｒ2、およびＲ4は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシル、−ＯＣＨ3、Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ3、Ｏ−没食子酸およびＯ−糖からなる群より選択され、ここで、糖はグルコース、マルトース、ガラクトースおよび果糖からなる群より選択され；
Ｒ6は、Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ3、Ｏ−没食子酸 およびＯ−糖からなる群より選択され、ここで、糖はグルコース、マルトース、ガラクトースおよび果糖からなる群より選択される。
【００５５】
他の実施の形態では、本方法は、下記式ＩＩの化合物、それらの薬学的に許容される塩、またはそれらの代謝産物を投与することにより実施され: 
【化１１】
2010518164.tif 000012
【００５６】
ここで、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5およびＲ6は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシル、−ＯＣＨ3、Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ3、Ｏ−没食子酸およびＯ−糖からなる群より選択され、ここで、糖はグルコース、マルトース、ガラクトースおよび果糖からなる群より選択される。
【００５７】
さらに別の実施の形態では、上記方法は、下記式ＩＩＩの化合物、それらの薬学的に許容される塩、またはそれらの代謝産物を投与することにより実施され: 
【化１２】
2010518164.tif 000013
【００５８】
ここで、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5およびＲ6は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシル、−ＯＣＨ3、Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ3、Ｏ−没食子酸およびＯ−糖からなる群より選択され、ここで、糖はグルコース、マルトース、ガラクトースおよび果糖からなる群より選択される。
【００５９】
さらに別の実施の形態では、上記方法は、下記式ＩＶの化合物、それらの薬学的に許容される塩、またはそれらの代謝産物を投与することにより実施され: 
【化１３】
2010518164.tif 000014
【００６０】
ここで、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシル、−ＯＣＨ3、Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ3、Ｏ−没食子酸およびＯ−糖からなる群より選択され、ここで、糖はグルコース、マルトース、ガラクトースおよび果糖からなる群より選択される。
【００６１】
さらに別の実施の形態では、上記方法は、下記式Ｖの化合物、それらの薬学的に許容される塩、またはそれらの代謝産物を投与することにより実施され: 
【化１４】
2010518164.tif 000015
【００６２】
ここで、
Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシル、−ＯＣＨ3、Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ3、Ｏ−没食子酸およびＯ−糖からなる群より選択され、ここで、糖はグルコース、マルトース、ガラクトースおよび果糖からなる群より選択される。
【００６３】
さらに別の実施の形態では、上記方法は、下記式ＶＩの化合物、それらの薬学的に許容される塩、またはそれらの代謝産物を投与することにより実施され: 
【化１５】
2010518164.tif 000016
【００６４】
ここで、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5およびＲ6 は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシル、−ＯＣＨ3、Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ3、Ｏ−没食子酸およびＯ−糖からなる群より選択され、ここで、糖はグルコース、マルトース、ガラクトースおよび果糖からなる群より選択される。
【００６５】
例えば、本発明は、下記式ＶＩを有する化合物、それらの薬学的に許容される塩、またはそれらの代謝産物、および該化合物を有効量で含む組成物に関し：
【化１６】
2010518164.tif 000017
【００６６】
ここで、
Ｒ1、Ｒ2、およびＲ6は、それぞれ独立して、水素、−ＯＣＨ3、Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ3、Ｏ−没食子酸およびＯ−糖からなる群より選択され、ここで、糖はグルコース、マルトース、ガラクトースおよび果糖からなる群より選択され；
Ｒ3、Ｒ4およびＲ5 は、それぞれ独立して、水素、Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ3、Ｏ−没食子酸およびＯ−糖からなる群より選択され、ここで、糖はグルコース、マルトース、ガラクトースおよび果糖からなる群より選択される。
【００６７】
本明細書に記載される方法に使用するための式Ｉ〜ＶＩの化合物、およびその代謝産物の例は、上述のとおりである。
【００６８】
本化合物は、本明細書に列挙される疾患または病状の治療の用途に適した他の化合物との併用療法に使用して差し支えない。このような薬剤の例は、当業者にとって明らかであろうが、例えば、カンナビノイド類、抗うつ剤（例えばフルオキセチン）、脳由来神経親和性因子（ＢＤＮＦ）、またはインスリン様増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ）が挙げられる。
【００６９】
上述のとおり、本発明の方法は、ヒトまたは獣動物に使用して差し支えない。本明細書では、「獣動物（veterinary animal）」とは、獣医が面倒を見る、または獣医が手当てをする任意の動物のことをいい、イヌ、ネコ、および／または馬などの愛玩動物（ペット）および家畜を含む。
【００７０】
上記方法に使用するための有効量は、本明細書に提供される指針および当技術分野における一般的知識を使用して、当業者によって決定されて差し支えない。
【００７１】
本発明の化合物は、約１ｍｇ／日〜約２０００ｍｇ／日の量で投与されて差し支えなく、約１００ｍｇ／日〜約１０００ｍｇ／日が好ましく、約２５０ｍｇ／日〜約５００ｍｇ／日が最も好ましい。しかしながら、上記の量より多い量も使用されうる。
【００７２】
本化合物は、急性投与されてもよく、または治療投与は、投与計画として、すなわち、例えば、毎日、毎月、２ヶ月毎、半年毎、１年毎、または他の何らかの投与計画でなど、必要とされる期間、熟練した開業医によって決定されるような有効期間の間、継続されて差し支えない。投与は、少なくとも、治療効果が示されるのに必要とされる期間、継続されうる。本組成物は、哺乳動物の体内における化合物の有効濃度を維持するため、毎日投与されることが好ましく、例えば朝晩など１日２〜３回投与されることが最も好ましい。最も有益な結果をもたらすためには、組成物は、少なくとも約３０日、または少なくとも約６０日投与されうる。これらの投与計画は、周期的に繰り返されて差し支えない。本明細書に提示される指針および問う技術分野における一般的知識に基づいて、当業者は急性および／または慢性投与に適した化合物を選択することができる。したがって、このような投与に適合した投薬形態（例えば、急性、慢性）は、本発明の範囲内にある。
【００７３】
所定の身体的運動は、ニューロン新生および認知能力を促進するのに十分な代謝速度、細胞呼吸、および血流を増大させることが示されている。身体的運動と本発明の化合物との組合せは、本発明の範囲内にある。
【００７４】
上記治療方法に使用するための治療に最低限必要とされる投薬量、または最適な投薬量もまた、本発明の範囲内にある。実施例に記載される方法、または本明細書に列挙される被験体を治療するために化合物の有効性を予測する既知の任意の他の用量反応法を使用してもよい。本明細書に記載される化合物をこのようなアッセイで試験してもよい。少なくとも治療に有効な量、または最適な量を送達するのに適合した投薬形態は、本発明の範囲内にある。
【００７５】
組成物および製剤
本発明の化合物は、医薬品、食品、食品添加物、または栄養補助食品として投与されうる。
【００７６】
本明細書では、「医薬品（pharmaceutical）」は、医療用薬剤（medicinal drug）である。メリアム・ウェブスター・カレッジ英英辞典第１０版（１９９３年）を参照のこと。医薬品は、「薬物（medicament）」とも称されうる。「食品」は、成長、修復、および生活過程を維持するため、およびエネルギーを供給するために有機体の体内で使用される、タンパク質、炭水化物、および／または脂質を含む物質である。食品は、例えばミネラル、ビタミン、および薬味など、補充物質も含みうる。メリアム・ウェブスター・カレッジ英英辞典第１０版（１９９３年）を参照のこと。食品という用語は、ヒトまたは動物の消費に適合した飲料を含む。「食品添加物」は、米国食品医薬品局の２１Ｃ.Ｆ.Ｒ.１７０３(ｅ)(ｌ)によって定義され、直接添加物および間接添加物を含む。「栄養補助食品」は、食餌を補うことを意図する製品であり（タバコを除く）、下記食物材料の１種類以上を含む：ビタミン、ミネラル、ハーブまたは他の植物性物質、アミノ酸、１日の全摂取量を増加させることにより食餌を補うため、ヒトが使用するための食物物質、または濃縮物、代謝産物、構成物質、抽出物、またはこれら材料の組合せ。本明細書では、「食品組成物」は、食品、栄養補助食品、および／または食品添加物を含む。これら組成物は当技術分野で知られるように調製されて差し支えない。
【００７７】
本発明の化合物を含む医薬品は、随意的に別の化合物（例えば、神経性化合物）を組み合わせて、経口、舌下、口腔内（bucally）、経鼻、直腸、静脈、非経口および局所など、さまざまな方法で投与されうる。当業者は、本発明の化合物、および随意的に保護剤の送達を最大限にするため適切なタイプの投与を決定することが可能であろう。したがって、各タイプの投与に適合した投薬形態は、本発明の範囲内にあり、錠剤、カプセル、ゼラチンカプセル（ジェルキャップ）、バルクまたは単位用量の粉末または顆粒、エマルション、懸濁液、ペースト、クリーム、ゲル、泡またはゼリーなど、固体、液体および半固体の剤形を含む。持続放出性の剤形もまた、本発明の範囲内にある。適切な薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤は、一般に当技術分野で知られており、当業者によって容易に決定することができる。例えば、錠剤は、有効量の本発明の化合物、および、随意的に、ソルビトール、乳糖、セルロース、または第二リン酸カルシウムなどの賦形剤を含みうる。
【００７８】
本明細書に記載される化合物、および随意的に別の神経保護剤を含む食品は、ヒトまたは獣動物用途に適合させて差し支えなく、ペットフードも含まれる。本発明の化合物の１日の有効量は、一人分（single serving）で提供されて差し支えなく（食品の場合）、または１回分の投薬形態で提供されてもよい（医薬品または栄養補助食品の場合）。
【００７９】
さらには、本発明の化合物、および、本発明の化合物が存在する、またはその含量が強化されたことを示唆する、および／または本明細書に記載される方法のための組成物の使用を教示するラベルを含む、パッケージ化された製品などの製造品（例えば、食品、栄養補助食品、医薬品）も本発明の範囲内にある。少なくとも１つの容器および少なくとも１つの本発明の化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩を含む、併用療法に使用するために適合された製造品（パッケージ化された製品またはキット）も提供される。製造品は、さらに、少なくとも１つの追加の薬剤、神経性薬剤または治療薬剤（すなわち、本発明の化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩以外）をさらに含めてもよく、このような薬剤は、別の容器で提供されるか、あるいは本発明の化合物と混合して提供されて差し支えない。
【００８０】
本発明はまた、本明細書に記載される任意の組成物を含む製造品を製造し、該組成物をパッケージ化して製造品を得て、本明細書に記載される任意の用途のための前記組成物／製造品の使用について指示し、誘導し、または推進する方法にも関する。このような指示、誘導、または推進には、広告・宣伝も含まれる。
【実施例】
【００８１】
本発明を、下記の非限定的な実施例においてさらに説明する。
【００８２】
実施例１：アピゲニンの長期注入試験
毎日の自発的運動（自発走）の有無と連動させて、アピゲニンを２種類の異なる用量で、注射によってマウスに投与する、６週間の研究を行った。行動実験は、３０日の注射投与の後、モリスの水迷路および物体認識試験を使用して行った。
【００８３】
材料および方法
アピゲニンを［１０：９０］のＴｗｅｅｎ８０：０．９％ＮａＣｌに溶かした。すべての化合物は商業的供給源から購入した。等量のＴｗｅｅｎ８０：０．９％ＮａＣｌをインビボモデルの試験に使用した。
【００８４】
６４匹のマウス（７週齢）を４つの試験群に分け（各群１６匹）、次のいずれかを受けさせた：
０．９％ＮａＣｌ、
Ｔｗｅｅｎ８０／０．９％ＮａＣｌ、
アピゲニン１２．５ｍｇ／ｋｇ、または
アピゲニン２５ｍｇ／ｋｇ
【００８５】
注射は腹腔内注射で合計２４日間、行った。試験注射に加えて、最初の８日間、毎日、５−ブロモ−２−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）［１０ｍｇ／ｍｌ］の腹腔内注射を５０ｍｇ／ｍｌの用量で行った。
【００８６】
各試験群内で、８匹のマウスを無作為に選択し、自発走運動負荷を受けさせた。これら３２匹のマウス（注射群当たり８匹）は、毎日（研究第１日目〜４０日目）、１日２時間、通常の固定された収容場所から自動の自発走用の回転カゴに移された。非自発走マウスは研究の間を通じて固定されたケージ内に残された。
【００８７】
第３１日目に、すべてのマウスに対し、腹腔内注入の直後にモリスの水迷路の習得訓練を開始した。例えば、参照することにより本明細書に取り込まれる、Morris, Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat, J. Neurosci. Methods, 11(1) (1984)を参照のこと。マウスは連続して９日間訓練され、隠れたプラットフォームのパラダイムを用いて１日２回の試行を受けた。プラットフォームは水迷路の４分割の北西（ＮＷ）の区画に配置した。学習におけるアピゲニンの効果（運動負荷の有無による）を測定するため、各試行におけるプラットフォームへの到達時間（latency）を記録した。水迷路での毎日の訓練の後、非自発走マウスを通常の固定された収容場所に戻す一方で、自発走マウスを２時間、自発走用の回転かごに入れた。水迷路訓練の第９日目に、最後の試行の後、マウスに、４時間のプローブ試行を受けさせた。プローブ試行の間、プラットフォームは除去され、目標のＮＷ４分割の記憶の保持を記録した。
【００８８】
結果
水迷路試験の習得（訓練）段階の間、プラットフォームへの到達時間を記録した。統計的分析は、生理食塩水とＴｗｅｅｎ８０の試験群間では、行動上の差異が無いことを示した。したがって、これらの群のデータは自発走および非自発走条件の両方について、１つの対照群に統合した。一元配置分散分析（one-way ANOVA）試験は、各群間の有意差を示した（Ｆ(5, 58)＝２．９１５ ｐ＜０．０５）。フィッシャーのＰＬＳＤ法を使用した特定の比較は、アピゲニン１２．５ｍｇ／ｋｇ−自発走マウスおよびアピゲニン２５ｍｇ／ｋｇ−自発走マウスの両方が、それぞれの対照自発走マウスおよび対照非自発走マウスよりも、プラットフォームを見つけるのにかかる時間が有意に短いことを示した（ｐ＜０．０５）。加えて、特定の比較は、アピゲニン２５ｍｇ／ｋｇ−非自発走群では、対照自発走マウスとは顕著に異なっていたことを示した（ｐ＜０ ．０５）。アピゲニン１２．５ｍｇ／ｋｇ−非自発走マウスと対照マウスの間には有意な差異はなかった。
【００８９】
プローブ試行試験の間、目標とする４分割領域に侵入する頻度および目標とする４分割領域に滞在する合計持続時間の両方について測定した（図１Ａ〜Ｄ）。運動していないマウスおよび対照自発走マウスのいずれも、目標とする４分割領域に対する選好は見られなかった。しかしながら、アピゲニン１２．５ｍｇ／ｋｇ−自発走マウスは、頻度の測定における目標とする４分割領域に対する顕著な選好が見られた（ｐ＜０ ．００１）（図１Ａ）。図１Ａでは、統計的に有意ではないものの（ｐ＜０ ．０６）、アピゲニン２５ｍｇ／ｋｇ−自発走マウスは、他の４分割領域よりも頻繁に目標とする４分割領域に侵入することに対する強い選好があった。さらには、アピゲニン２５ｍｇ／ｋｇ−非自発走マウスは、頻度の測定において、目標とする４分割領域に対する顕著な選好が見られた（ｐ＜０ ．０５）（図１Ｂ）。有意ではないが、アピゲニン１２．５ｍｇ／ｋｇ−非自発走マウスも、同様に、頻度の測定において、目標とする４分割領域を好んで選択する有意差（ｐ＜０ ．０６）を示した（図１Ｂ）。プローブの間の４分割領域に滞在する合計持続時間の分析は、群の間に有意差は見られなかった（図１Ｃおよび１Ｄ）。
【００９０】
まとめると、運動負荷は、少ないアピゲニン用量において追加の利益を提供するが、アピゲニンは運動負荷の有無の両方において、学習能力を増大させる。
【００９１】
実施例２：物体認識試験
材料および方法
アピゲニン２５ｍｇ／ｋｇまたはＴｗｅｅｎ８０：０．９％ＮａＣｌ（対照）溶液のいずれかを受ける各マウスに、７日間、各薬物または対照のいずれかの腹腔内注入を行い、その後、視覚的一対比較課題（ＶＰＣ）行動試験について訓練し、試験した。パラダイムは、第１日目および２日目に、実験前に２時間、実験室に馴化させることで構成された。第１日目の馴化後、マウスを試験チャンバーに５分間曝露した後、２つの同一の物体を３０秒間探査させる（習熟訓練）。習熟訓練の２４時間後、マウスを再度、部屋および試験チャンバーにそれぞれ２時間および１分間馴化させた。再馴化の後、マウスを試験チャンバーに戻し、５分間、慣れた物体と新規の物体とに曝露させた。物体探査時間を、第１日目、２日目に、慣れた物体と新規の物体の両方について測定した。両方の物体は同一であるが、「新規」の物体は別の場所に置かれていた。
【００９２】
結果
両群は物体認識パラダイムを学習し、第２日目の新規物体の探査には、第１日目の見慣れた物体よりも多くの時間を費やした。Ｔ−試験分析は、対照およびアピゲニン群の両方で新規物体に対して顕著な選好を示した（それぞれｔ＝０．０３およびｔ＝０．０００８）。注射群間では新規試験の間に顕著な差異は見られなかった。
【００９３】
実施例３：脳組織の組織学的分析
実施例１の長期試験の後、およびすべての試験を行った後（４２日目）、マウスに４％のパラホルムアルデヒドを使用してかん流を行い、その脳組織を摘出した。脳組織をスライスし、分化した細胞をＢｒｄＵ／ＤＡＢ定量化用に染色した。第２の免疫蛍光検査染色液を、新しく分化した細胞の表現型の検査に使用した。脳切片を取り、Ｂｒｄｕ／ＮｅｕＮ／ＧＦＡＰで染色した。表現型分析を完了し、成熟ニューロンの同定に使用される標識であるＮｅｕＮで共標識された分化した細胞の重量百分率を決定した。その重量百分率を用いて、歯状回におけるＢｒｄＵ／ＮｅｕＮで共標識された細胞の総数を算出することができた。
【００９４】
結果
ＢｒｄＵ／ＤＡＢ染色された組織の定量化は、自発走マウスと非自発走マウスの間の分化した細胞において顕著な増加を示した（Ｆ(5, 34)＝１６．８５５  ｐ＜０．０００１）（図２）。対照非自発走マウス（ｐ＜０．０１）、およびアピゲニン１２．５ｍｇ／ｋｇ−非自発走マウス（ｐ＜０．０１）と比較した場合、アピゲニン２５ｍｇ／ｋｇ−非自発走マウスの分化した細胞数では顕著な増加が示された。アピゲニン２５ｍｇ／ｋｇ−自発走マウスも、対照自発走マウスと比較して、顕著により多くの分化した細胞を有していた（ｐ＜０ ．０５）。
【００９５】
ＢｒｄＵ／ＮｅｕＮ／ＧＦＡＰ染色に関しては、統計的分析は、群間におけるニューロン新生の顕著な増加を示した（Ｆ(5, 34)＝２０．９  ｐ＜０．０００１）（図３）。この後の分析はまた、自発走マウスが非自発走マウスと比較して、ニューロン新生における顕著な増加を示した（ｐ＜０．０１）。さらに重要なことに、アピゲニン２５ｍｇ／ｋｇ−自発走マウスは、試験における他のすべてのマウスよりも新しいニューロンの数が顕著に多かった（ｐ＜０ ．００１）。
【００９６】
データは、歯状回における分化した細胞の量、および分化した細胞のニューロンへの分化の両方の増加を示している。自発走とアピゲニンとの組合せでは、さらなるニューロン新生の増加を生じた。アピゲニン２５ｍｇ／ｋｇ−自発走マウスでは、他のすべての群よりも顕著に多くの新しいニューロンを有していた。水迷路試験の結果（実施例１）と比較して、最も優れていたのは、最もニューロン新生を生じさせたマウスであった。
【００９７】
実施例４：包括的アピゲニン試験（経口および腹腔内注射）
アピゲニンの経口投与の効果を注射におけるアピゲニンの効果と比較する、１０日間の食品試験を行った。エピカテキンを含む食品ペレットをアピゲニンと同時に試験した。
【００９８】
材料および方法
動物に、ピゲニン、エピカテキンまたは対照のペレットを含む食品を、２種類の用量：２５０ｐｐｍおよび５００ｐｐｍで給餌した。
【００９９】
等量のアピゲニンおよびエピカテキンを、［１０：９０］Ｔｗｅｅｎ８０：０．９％ＮａＣｌに溶かした。等量のＴｗｅｅｎ８０：０．９％ＮａＣｌを対照として使用した。
【０１００】
４０匹のマウス（７週齢）を３つの試験注射群（各群ｎ＝５）および５つの試験食品群（各群ｎ＝５）に分け、次の条件に供した：
Ｔｗｅｅｎ８０：０．９％ＮａＣｌ注射、
アピゲニン２５ｍｇ／ｋｇ注射、
エピカテキン ２０ｍｇ／ｋｇ注射、
対照食品、
アピゲニン食品 ２５０ｐｐｍ、
アピゲニン食品 ５００ｐｐｍ、
エピカテキン食品 ２５０ｐｐｍ、または
エピカテキン食品 ５００ｐｐｍ
【０１０１】
注射試験は、合計１０日間、腹腔内に行われた。食品試験は第１日目に撒き餌し、１０日間、マウスに自由に摂食させた。毎日のＢｒｄＵ［１０ｍｇ／ｍｌ］の腹腔内注射は、本試験の最初の８日間、すべての動物に対して５０ｍｇ／ｋｇの用量で行われた。
【０１０２】
１０日間の終わりに、すべてのマウスに対し、４％のパラホルムアルデヒドを使用してかん流し、脳組織を摘出した。脳組織をスライスし、分化した細胞のＢｒｄＵ／ＤＡＢ定量化用に染色した。
【０１０３】
結果
ＢｒｄＵ／ＤＡＢで染色された組織は、投与経路に関わらず、アピゲニンを与えられたマウスの歯状回における分化した細胞の数の顕著な増加を示した（ｐ＜０．０１）（図４）。エピカテキンと対照との間には顕著な差異は見られなかった。
【０１０４】
実施例５：アピゲニン誘発性ニューロン新生における塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ２）の効果
材料および方法
成熟神経前駆細胞を、２４時間、ＦＧＦ２含有Ｎ２培地に入れた。ＢｏｔｔｅｎｓｔｅｉｎらのGrowth of a rat neuroblastoma cell line in serum-free supplemented medium, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76(1) (1979) を参照のこと（Ｎ２培地の成分について記載されている）。
【０１０５】
細胞を新鮮なＮ２培地（ＦＧＦ２なし）に交換し、アピゲニンを加えた。すべての実験において、ＤＭＳＯに溶かした５ｍＭのアピゲニンを使用した。神経分化の陽性対照として、レチノイン酸（ＲＡ）およびホルスコリン（ＦＳＫ）を含むＮ２培地を使用した。陰性対照としては、Ｎ２培地および同量のＤＭＳＯまたはＮ２を使用した。ＮｅｕｒｏＤ発光酵素レポーターアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ社から購入、カタログ番号ｅ−１９８０、Dual-Luciferase Reporter 1000 Assay Sytem）を２日後に、免疫組織化学を４日後に行った。
【０１０６】
アピゲニン処理した細胞および対照細胞の免疫組織化学的分析を、系列特異的標識（ニューロンにはＴｕｊ１、星状細胞にはＧＦＡＰ、および乏突起膠細胞にはＲＩＰ）を用いて、４日後に細胞を固定し、染色することによって行った。Ｔｕｊ１は、新しいニューロンの標識として用いられる、特異型ＩＩＩβ−チューブリンである。ほぼ例外なく中枢神経系の星状細胞において発現される、中間フィラメント・タンパク質であるＧＦＡＰ（グリア細胞繊維性酸性タンパク質）は、新しい星状細胞の標識として使用される。ＲＩＰは乏突起膠細胞の増殖の初期の標識として用いられるモノクローナル抗体である。
【０１０７】
結果
ＮｅｕｒｏＤ発光酵素の結果は図５に報告されている。細胞を最初に２４時間ＦＧＦ２で増殖させた場合のＲＡ＋ＦＳＫによる活性化と比較して、アピゲニンによるＮｅｕｒｏＤの活性化は２倍も大きかった。
【０１０８】
免疫組織化学の結果は図６に報告されている。細胞を最初に２４時間ＦＧＦ２で増殖させた場合（陽性対照）のアピゲニン処理された細胞よりも、ＲＡ＋ＦＳＫで処理された細胞におけるＴｕｊ１陽性ニューロンの重量百分率（３０〜６０％）は高かった。興味深いことに、ＦＧＦ２を使用しないＮ２培地に直接入れた場合、アピゲニン処理された細胞におけるＴｕｊ１陽性ニューロンはさらに多く存在する（５〜３０％）。このことは意外であるが、ＮｅｕｒｏＤ発光酵素およびＲＡ＋ＦＳＫにおけるアピゲニンの効果を考慮すれば、本実験を何回も繰り返したが、ＦＧＦ２での前処理の有無のいずれかの条件でアピゲニン処理された細胞において、Ｔｕｊ１またはＭａｐ２ａｂ陽性ニューロンに顕著な差異はこれまで見られなかった。細胞をＦＧＦ２中で最初に増殖させる場合、星状細胞（ＧＦＡＰ）および乏突起膠細胞（ＲＩＰ）の分化におけるアピゲニンの効果は、低いと思われる（１〜５％）。このことは、成熟神経前駆細胞におけるアピゲニンの主な役割が、神経分化を誘発することであることを示唆している。
【０１０９】
実施例６：アピゲニンのシグナル伝達特異性のウェスタンブロット分析
（ａ）アピゲニンの下流シグナル伝達仲介因子の研究および（ｂ）神経前駆細胞の増殖、分化、および生存におけるアピゲニンの独立寄与の決定について研究を行った。
【０１１０】
材料および方法
成熟神経前駆細胞を、少なくとも２４時間、６ウェルのプレート内に、増殖条件（ＦＧＦ２含有Ｎ２培地）で増殖させた。細胞溶解物を回収する前に、培地を取り除き、２時間、ＤＭＥＭ／Ｆ１２に取り替えた（ＤＭＥＭ／Ｆ１２は、さまざまな細胞のシグナル伝達経路を誘発することが知られている２つの因子である、インスリンおよびＦＧＦ２を欠いた培地として定義される）。この重要な「飢餓」段階で、活性化されたさまざまな下流仲介因子を定常状態のレベルに戻した。
【０１１１】
細胞を２時間飢餓状態に置き、０時間のデータを回収した。次の１つを加え、溶解物をさまざまな時点で採取した：（１）Ｎ２のみまたは（−）ＤＭＳＯ（陰性対照）；（２）（＋）ＤＭＳＯ（陰性対照）；（３）アピゲニン； または（４）ＲＡ＋ＦＳＫ（陽性対照）。次いで２つの経時変化試験を行った。第１の実験は、０分、１０分、３０分、２時間、６時間、および２４時間の時点でのアピゲニンの急性効果を測定するための初期の経時変化試験であった。第２の実験は、０、１、２、３、および４日の時点におけるアピゲニンの長期効果を測定するための後期経時変化試験であり、この実験結果についてはここでは論じない。
【０１１２】
次に細胞溶解物を負荷し、ウェスタン−ブロットに移し、膜を、リン酸化および非リン酸化形態の各タンパク質に対する抗体とハイブリッドさせた。非リン酸化形態のタンパク質のデータ結果については、ここでは論じない。リン酸化タンパク質に関して論じたデータは、少なくとも３つの独立した実験の典型であり、これらのデータは非リン酸化の形態に正規化される（内部対照）。
【０１１３】
結果
どの経路がアピゲニンの存在に対して特異的であるかを決定するため、陽性対照（ＲＡ＋ＦＳＫ）および陰性対照［（−）ＤＭＳＯおよび（＋）ＤＭＳＯ］に対するアピゲニン処理した後のさまざまなシグナル伝達仲介因子の活性化状態を比較した。５種類の細胞経路（Ａｋｔ、ＥＲＫｓ、ＧＳＫ３ｂ、ｂ−カテニン、およびＣＲＥＢ）を、これらの経路がニューロン新生に関与しているという、文献および臨床検査値（laboratory evidence）に基づいて、選択した。これらの実験は、アピゲニンがＥＲＫｓ、ＧＳＫ３ｂ、ｂ−カテニン、およびＣＲＥＢのリン酸化反応に非特異的効果を有することを実証している。陰性対照はアピゲニンで処理された細胞と同一の結果を示している。
【０１１４】
興味深いことに、アピゲニン処理後のＡＫＴのリン酸化反応（６時間まで）を増加させる特異的効果が存在すると思われる。これは、陰性対照では生じず、ＤＭＳＯ処理のみではＡＫＴのリン酸化反応の減少が起こりうる。さらには、ＲＡ＋ＦＳＫもまた、リン酸化ＡＫＴ（ｐＡＫＴ）を増大させると思われる。これらの結果は、５ｍＭのアピゲニンが、リン酸化ＡＫＴ（ｐＡＫＴ）を特異的に活性化することを示唆している。
【０１１５】
実施例７：アピゲニンおよび他の化合物のＮｅｕｒｏＤ神経活性
材料および方法：
成熟神経前駆細胞を、下記を含む実施例に記載される、異なる濃度の神経性化合物で処理した：アピゲニン（５μＭ）（Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入）；アカセチン（１０μＭ）（ＩＣＣ社製）；ルテオリン （９８％）（．５（１．０）μＭ）（ＩＣＣ社製）；バイカレイン（２μＭ）（ＩＣＣ社製）；アメントフラボン（２ μＭ）（ＩＣＣ社製）；ゲニステイン（９９％＋）（５μＭ）（ＩＣＣ社製）；ケンフェロール（１０μＭ）（Ｓｉｇｍａ社製）；タキシホリン（１０μＭ）（ＩＣＣ社製）; ゲラルドール（１０μＭ）（ＩＣＣ社製）；クリソエリオール（１０μＭ）（ＩＣＣ社製）；レスベラトロル（２０μＭ）（Ｓｉｇｍａ社製）；（−）−没食子酸エピカテキン（５μＭ）（Ｓｉｇｍａ社製）；（−）−没食子酸エピガロカテキン（５μＭ）（Ｓｉｇｍａ社製）；およびピペルロングミン（９７％）（５μＭ）（ＩＣＣ社製）。細胞を採取し、実施例５に記載したように発光酵素活性についてアッセイを行った。
【０１１６】
結果
この調査報告期間内に２８種類の化合物について試験を行い、上に列記した１４種類の化合物が発光酵素活性の促進調節を示した。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【国際調査報告】
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