(57)【要約】  本発明は、流体３から基板１７へ流体３に浮遊した細胞２を移送する装置１に関する。装置１は、外部面９と、内部キャビティ１０と、外部面９側の第１の端部１２とキャビティ１０に流体５で連結した第２の端部１３とを各々有し移送すべき細胞２の予め規定されたサイズの直径を各々が有する複数の通路１１とを有する移送装置８を有する。本装置はさらに、各通路１１の第１の端部１２と第２の端部１３とに圧力差を作るようキャビティ１０の圧力を調整することの可能な圧力調整装置１４と、流体３を含む収容部４と、流体３に接触したときに外部面９にわたり流体３を流れさせることができるフロー装置７とを有する。通路直径、圧力差及び流体流速の適切な選択により、移送装置は、予め規定されたサイズ範囲内で細胞２を取り上げ移送するために用いることができる。本発明はさらに、このような装置１を用いることにより細胞２を移送する方法に関する。
2010510802.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
流体から基板へ流体に浮遊した細胞を移送するための装置であって、
・前記流体を含み容れるための収容部と、
・外部面と、内部キャビティと、前記外部面における第１の端部と前記キャビティと流体連結する第２の端部とを各々が有しかつ移送すべき細胞の予め規定されたサイズに対応する直径を各々が有する複数の通路と、を有する移送装置と、
・各通路の前記第１の端部と前記第２の端部との圧力差を確立するように前記キャビティの圧力を調整することの可能な圧力調整装置と、
・前記流体に接しているときに前記外部面にわたり前記流体が流れるようにすることの可能なフロー装置と、
を有する装置。
【請求項２】
請求項１に記載の装置であって、前記移送装置は、
・前記通路の前記第１の端部が前記収容部において前記流体と流体連結した状態にあるところであり、前記圧力差又は前記外部面にわたる流体流動の少なくとも一方が前記通路の前記第１の端部に対して前記予め規定されたサイズを有する細胞を貯留するよう制御可能である第１のポジションと、
・前記細胞が前記通路から放出され前記基板に付着されるように前記圧力差が制御可能であるところの第２のポジションと、
を有する、装置。
【請求項３】
請求項２に記載の装置であって、
・通路が細胞により塞がれる時期を検出するための検出器と、
・前記第２のポジションに前記移送装置を動かすためのコントローラと、
をさらに有する装置。
【請求項４】
請求項１に記載の装置であって、付着された細胞の平均的位置の近くにおける前記収容部における前記流体の速度Ｖは、
０．１Ｖchar＜Ｖ＜１０Ｖchar
の範囲にあり、当該特性速度は、
Ｖchar＝Ｄpassage・Δｐ／１２η
であり、Ｄpassageは、前記通路の直径であり、Δｐは、前記収容部と前記キャビティとにおける流体の圧力差であり、ηは、当該流体の動的速度である、
装置。
【請求項５】
請求項１に記載の装置であって、前記移送装置は、前記細胞が前記基板に付着される前に前記通路の前記第１の端部が上に向くように方向づけされることが可能である、装置。
【請求項６】
請求項１に記載の装置であって、各通路の前記第１の端部と前記第２の端部との圧力差は、個別に又はグループ毎に制御可能とされ、細胞を選択的に放出するようにすることができる、装置。
【請求項７】
請求項１に記載の装置であって、前記移送装置は、移送される細胞において１つ又は複数の細胞へもたらされるべき１つ又は複数の材料を含む物質を付与するためにも用いることができる、装置。
【請求項８】
請求項１に記載の装置であって、前記移送装置は、移送される細胞に電位を印加することができる電極をさらに有する、装置。
【請求項９】
請求項８に記載の装置であって、前記電極は、１つ又は複数の細胞の選択的なエレクトロポレーションを行うよう前記電位が印加されることを可能にするパターンを形成する、装置。
【請求項１０】
請求項１に記載の装置を用いて流体から基板へ細胞を移送するための方法であって、
・前記流体と前記外部面との間の接触を確立するステップと、
・前記第１の端部と前記第２の端部とに前記圧力差を確立するステップと、
・前記予め規定されたサイズよりも大きい細胞が前記通路の第１の端部に抗して保持されないように前記外部面にわたり流体流動を確立するステップと、
・前記通路の前記第１の端部及び前記基板が互いに接近するようにするステップと、
・前記細胞が前記基板に付着するよう前記圧力差を変化させるステップと、
を有する方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、
・前記移送装置の通路及びキャビティを空にして洗浄するステップと、
・１つ又は複数の細胞にもたらされるべき１つ又は複数の材料を含む物質を前記通路及び前記キャビティに充填するステップと、
・前記通路の前記第１の端部が前記基板における前記細胞の近傍となるところの位置に前記基板又は前記移送装置を移動させるステップと、
・１つ又は複数の細胞に前記物質を付与するステップと、
・エレクトロポレーションを行うよう電極に電位を印加するステップと、
をさらに有する方法。
【請求項１２】
請求項１０に記載の方法であって、
・前記基板、又は１つ又は複数の細胞にもたらされるべき１つ又は複数の材料を有する物質を含む通路を有する１つ又は複数の付加的移送装置を、前記通路が前記基板における前記細胞の近傍にあるところの位置へ移動させるステップと、
・前記物質を１つ又は複数の細胞に付与するステップと、
・エレクトロポレーションを行うために電位を電極に印加するステップと、
をさらに有する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞アレイ及びマトリクスアセンブリに関し、特に、流体に浮遊している細胞の当該流体から基板への移送に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子治療及び創薬の分野における調査研究での重要なステップは、基板上のアレイ又はマトリクスにおける細胞の配備である。これは、通常、液体における或る特定の濃度の細胞を含むサンプルを用意しその後に針から供給することにより行われる。所望の細胞サイズを確保するため、濾過は当該サンプルの用意における一ステップとなる場合がある。この技術の限界の１つは、アレイ又はマトリクスを構築することのできる速度である。もう１つの限界は、確実に懸濁液から個別に細胞を供給することが難しいことである。パッチクランプ法においては、ガラスプレートにおける細胞より小さいサイズの孔のアレイは、低圧力により細胞を結合するために用いることができる。例えば、Fertig氏らのBiophysics Journal, June 2002, 82(6), p. 3056を参照されたい。
【０００３】
遺伝子治療及び創薬の分野における研究は、しばしば、例えばＤＮＡのような物質の細胞への導入のために用いられるエレクトロポレーションに絡むものである。これは、通常、当該物質の小滴を各細胞に堆積させ当該細胞膜の浸透性を一時的に増加させる電界を印加することによって行われる。
【０００４】
よって、流体から基板への細胞の移送をなすためのより効率的な技術が有利となると目されるものであり、特に、細胞の先立つ濾過処理を不必要なものとする技術は有利となると目される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、本発明は、好ましくは、上述した不利な点の１つ又は複数を単独で又は組み合わせの態様で緩和し、軽減し又は排除することを狙いとするものである。特に、本発明の目的としては、基板上におけるセルのアレイ又はマトリクスを形成するよう細胞が浮遊している流体から細胞が移送されることのできる効率を向上させることを確認することができる。本発明の他の目的としては、予め規定されたサイズ範囲内の細胞の移送を可能にすることを確認することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
これらの目的及び他の幾つかの目的は、流体から基板へ流体に浮遊した細胞を移送するための装置であって、・前記流体を含み容れるための収容部と、・外部面と、内部キャビティと、前記外部面における第１の端部と前記キャビティと流体連結する第２の端部とを各々が有しかつ移送すべき細胞の予め規定されたサイズに対応する直径を各々が有する複数の通路と、を有する移送装置と、を有し、さらに、・各通路の前記第１の端部と前記第２の端部との圧力差を確立するように前記キャビティの圧力を調整することの可能な圧力調整装置と、・前記流体に接しているときに前記外部面にわたり前記流体が流れるようにすることの可能なフロー装置と、を有する装置を提供することによって、本発明の第１の態様において達成される。
【０００７】
通路直径、圧力差及び流体流速の適切な選択によって、移送装置は、予め規定されたサイズ範囲内で細胞を抽出するために用いることができる。通路の直径よりも小さい細胞は、当該通路を通じて吸い上げられ、非常に大きい細胞は、これら細胞における過度に大きな流体薬剤が原因で通路の第１の端部に抗して保持されない。したがって、本発明による装置の使用によって、生物学的なサンプルから目標細胞タイプを選択するための複雑なサンプル準備ステップを、簡単化することができ、又は省略さえも可能である。さらに細胞は、細胞が移送される基板における細胞アレイ又はマトリクスが各分離位置において１つしか細胞を有しないように個別に取り扱われる。この移送装置は、例えば、プリンタにおいて用いられるようなインクジェットヘッドに対応するものとしてもよく、或いは一方の側に圧力がかけられることのできるノズルのアレイを備えたフラット基板とすることができる。
【０００８】
本発明による装置は、細胞により通路がブロックされる時期を検出するための検出器と、細胞が通路から放出され基板に付着することになるように圧力差が制御可能な第２の位置に移送装置を移動させるためのコントローラとを有するようにしてもよい。例えば、細胞が移送される前に、通路のうちの予め規定された部分がブロックされることが要求されるようにしてもよい。
【０００９】
付着された細胞の平均位置の近くにおける当該収容部における流体の速度Ｖは、０．１Ｖchar＜Ｖ＜１０Ｖcharの範囲にあることが好ましい。ここで、当該特性（char）速度は、
Ｖchar＝Ｄpassage・Δｐ／１２η
である。Ｄpassageは、通路の直径であり、Δｐは、当該収容部における流体と当該キャビティの流体との圧力差であり、ηは、当該流体の動的速度である。但し、パラメータと速度範囲との間の他の関係は、本発明の範囲によりカバーされる。
【００１０】
本移送装置はまた、移送された細胞における１つ又は複数の細胞へ持ち込むべき１つ又は複数の材料を含む物質の処理のためにも有用である。このような物質は、例えば、遺伝子治療又は創薬の分野における調査の下でＤＮＡ、アンチセンス剤又は薬剤を有してもよい。
【００１１】
本発明の実施例において、本移送装置はさらに、移送される細胞に電位をかけることができる電極を有する。これは、例えば、エレクトロポレーション及びトランスフェクションを行うために用いることができるが、電位を印加する目的は、本発明の範囲内で可能である。電極は、１つ又は複数の細胞の選択的エレクトロポレーションを行うよう電位が印加されることを可能にするパターンを形成するのが好ましい。この結果として、例えば、選択された細胞限定のトランスフェクションの効果を研究すること、又は時間依存性の効果を研究するよう或る特定の時間間隔でエレクトロポレーションを行うことができることになる。
【００１２】
本発明の他の態様は、上述したような装置を用いて流体から基板へ細胞を移送するための方法により提供される。この方法は、・前記流体と前記外部面との間の接触を確立するステップと、・前記第１の端部と前記第２の端部とに前記圧力差を確立するステップと、・前記予め規定されたサイズよりも大きい細胞が前記通路の第１の端部に抗して保持されないように前記外部面にわたり流体流動を確立するステップと、・前記通路の前記第１の端部及び前記基板が互いに接近するようにするステップと、・前記細胞が前記基板に付着するよう前記圧力差を変化させるステップと、を有する。
【００１３】
電位の印加によりエレクトロポレーションを行うことができる本発明の実施例において、電極は、基板に配置されるようにしてもよく、移送装置について説明したように、こうした電極は、１つ又は複数の細胞の選択的なエレクトロポレーションを可能にするパターンを形成することができる。また、本発明の範囲内で、移送装置及び基板の双方において電極を有することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
以下、本発明を、次の添付図面に基づいて専ら例示によって説明する。
【図１】流体に浮遊する細胞を抽出する移送装置の概略図。
【図２】基板上にマトリクスを形成するように細胞を放出する移送装置の一部の概略図。
【図３】基板に付着される細胞における物質の付与の概略図。これら図の描写は一律の尺度によるものではない。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明による装置１は、生物学的サンプルから細胞２のアレイ又はマトリクスを構築することを可能にするものである。細胞２は、図１において概略的に示されるように入口５及び出口６を有する収容部４に入れられている流体３において最初は浮遊させられている。収容部４は、流体３の流れを確立することのできるフロー装置７に接続される。このようなフロー装置７は、例えば電気ポンプとすることができる。本発明の実施例において、流体３は、収容部４に再循環され、これにより、流体３及び細胞２の総量を最小に維持することができる。図は、外部面９、内部キャビティ１０及び複数の通路１１を有する移送装置８を概略的に示している。通路１１は、外部面９における第１の端部１２と、キャビティ１０との流体連結した第２の端部１３とを有する。
【００１６】
装置１は、圧力調整装置１４を有しており、この圧力調整装置を使用することにより、各通路１１の第１の端部１２と第２の端部１３との間、従ってキャビティ１０と収容部４における流体３との間において、圧力差を確立させることができる。移送装置８の外部表面９が流体３と接するとき、当該圧力差によって、流体３は、通路１１を介してキャビティ１０へと流動させられる。これにより、通路１１の直径よりも小さい細胞２は、吸い上げられキャビティ１０を通じて導き出されるのに対して、それより大きい細胞２は、通路１１の第１の端部１２に対してぶつかって保持される。キャビティ１０からは、流体３が第２の収容部（図示せず）に導かれることができる。図１に示される状況においては、通路１１の１つ以外全てが細胞２によりブロックされている。
【００１７】
移送装置８は、予め規定されたサイズ範囲内の細胞２を抽出するために用いることができる。これは、通路１１の直径の適切な選択により、そして上述したような収容部４における流体の流れの適用により、得られる。流体３の速度及び圧力差は、大きすぎる細胞２が通路１１の第１の端部１２にぶつかって保持されることができないものの収容部４の出口６を通じて押し流されるように調整可能である。したがって、本発明のこの実施例を用いることによって、流体３における細胞２のサンプルをフィルタ処理することは必要なくなり、当該処理を簡単化する。細胞２は、偶然に付着し合うこともある。これが生じると、細胞群は、それらの全体のより大きなサイズのために押し流されることになるか、或いは横断流により分離させられることになる。
【００１８】
理論的なモデル化は、与えられた用途のためのパラメータ設定の選択のための適切な関係性を判定するために用いられている。次の式を用いることができることが判明された。付着した細胞２の平均的位置の近くにある収容部４における流体３の速度Ｖは、０．１Ｖchar＜Ｖ＜１０Ｖcharの範囲にあるのが好ましく、当該特性速度は、
Ｖchar＝Ｄpassage・Δｐ／１２η
である。Ｄpassageは、通路１１の直径であり、Δｐは、収容部４における流体３とキャビティ１０における流体３との圧力差であり、ηは、流体３の動的速度である。但し、パラメータと速度範囲との間の他の関係性は、本発明の範囲によってカバーされる。細胞２が通路１１に付着するとき、Δｐは、細胞２にわたる圧力差、すなわち収容部４に面する細胞２の側における流体３と通路１１に面する他の側における流体３との圧力差である。
【００１９】
図１に示される実施例において、検出器１５は、通路１１の全て又は予め規定された部分が細胞２によりブロックされる時期を検出する。その後、コントローラ１６は、細胞２が他の処理のために付着する対象の基板１７（図２参照）のかなり近いところにおける位置に移送装置８を移動させる。かかる検出は、例えば、通路１１が益々ブロックされるときにキャビティ１０を出る減少した流体流動に関連したものとなりうる。或いは、当該圧力差を維持するために必要な圧力調整に関連したものとすることができる。
【００２０】
図２は、１行をなす細胞２を基板１７に一度に移送することによってどのようにして細胞２のマトリクスを構築することができるかを概略的に示している。本発明の他の実施例（図示せず）において、移送装置８は、より多くの行をなす細胞２が一度に移送可能なように２つ以上の行をなす通路１１を有する。細胞２は、圧力差、すなわちキャビティ１０における圧力不足状態を除去することにより、そして必要に応じて少し過剰な圧力をかけることによって移送装置８から放出される。
【００２１】
移送装置８を移動させることの代わりは、当該装置を固定位置に保ち収容部４及び基板１７を動かすことである。
【００２２】
必要に応じて、異なる行に対して異なる流速を用いることができるようにしてもよい。これにより、行と行との間の細胞２のサイズ範囲の上限を変えることができる。これは、例えば、セルサイズからの影響、又はこれに直接関係する他のパラメータが所与の調査研究における調査の下で可変である場合に関連したものとすることができる。
【００２３】
本発明の実施例（図示せず）において、移送装置８は、細胞２が放出される前に通路１１の第１の端部１２が上に向くように方向づけられる。これにより、起こりうる流体３の残りが通路１１を出ないことを保証することができる。
【００２４】
本発明の実施例において、移送装置８は、上述したように細胞２のアレイ又はマトリクスを構築するためだけでなく、後続のエレクトロポレーション及びトランスフェクションを行うためにも用いられる。当該アレイ又はマトリクスが構築された後、移送装置８の通路１１及びキャビティ１０は、空にされ、洗浄され、そしてＤＮＡ，アンチセンス剤、薬剤、又は１つ若しくは複数の細胞２に持ち込むことを予定する他の物質１８が充填される。そして、移送装置８は、通路１１の第１の端部１２が基板１７における細胞２の近くにあるところの位置へ移動させられ、物質１８は、細胞２の１つ又は複数に付与される。図３は、細胞２における物質１８の付与の概略的な図である。基板１７は、５０°よりも大きい接触角を有するような疎水性のものとすることが好ましい。これは、物質１８の層の厚さが良好に規定されるように細胞２の近くに当該付与物質１８を維持することになる。
【００２５】
その後、エレクトロポレーションを、電位を細胞２へ印加することによって行うことができる。この電位は、移送装置８若しくは基板１７又はこれら双方に電極１９を介して印加可能である。図３は、移送装置８における電極１９の配置の例を示している。電位は、通常、移送装置８と基板１７との間の距離に応じて、数ボルトから数１００ボルトのオーダとなる。電極パターンに応じて、シングル又はマルチセルエレクトロポレーションを行うことができる。電位の印加は、通路１１を出る物質１８の小滴を引き抜くために用いることも可能である。
【００２６】
細胞及び物質１８の双方の移送のために同じ移送装置８を用いることの代替えは、細胞２を移送するために用いられるもの以外の、物質１８を付与するための１つ又は複数の移送装置（図示せず）を用いることである。この代替例は、作業速度を向上させ、流体３及び物質１８の無駄を最小化し、流体３及び物質１８の残りの不要な混合に起因した汚染のリスクを最小化することができる。このような他の移送装置は、例えばキャビティ１０及び圧力調整装置１４を有しなくともよいので、細胞２を移送するために用いられるものとは異なる構成を有することができる。
【００２７】
上述した全ての実施例において、細胞２が予め規定された位置において基板１７に付着されること、及び細胞２にもたらされるべき材料を有する物質１８が細胞２に精密に付与されることを確実することは大抵は重要である。この目的のための適切なアライメント技術の選択は、当業者には自明となる。
【００２８】
通路１１は、１つ又は複数のグループの細胞２が一度に放出されることができるように別個のキャビティ（図示せず）に各々が接続されるグループに分割されるようにしてもよい。ここで、例えば、移送装置８の通路１１の位置により形成されるものとは異なるパターンで基板１７に細胞２を置くことが可能となる。この実現性は、例えばインクジェットプリンタのインクジェットヘッドから知られる圧電機能を用いることによって代替え的に得られうる。これらのオプションはまた、細胞２のうちの幾つかにだけ物質１８を適用するために用いることもできる。
【００２９】
以上、本発明を特定の実施例について説明してきたが、ここで記載した特定の形態に限定されることを意図するものではない。むしろ、本発明の範囲は、添付の請求項によってのみ限定されるものである。請求項において、「有する」なる文言は、その他の要素又はステップの存在を排除しない。また、個々の特徴は異なる請求項に含まれうるものであるが、これらは、有利な形で組み合わせられうるものであり、異なる請求項における包含は、特徴の組み合わせが実現可能なもの及び／又は有利なものでないことを意味していない。また、単数の引用は複数を排除するものではない。したがって、「１つの」、「１の」、「第１の」、「第２の」などの記載は、複数を排除するものではない。さらに、請求項における参照符号は、当該範囲を限定するものと解釈してはならない。
【図１】
2010510802.tif 000003
【図２】
2010510802.tif 000004
【図３】
2010510802.tif 000005
【国際調査報告】
2010510802.tif 000006
2010510802.tif 000007
2010510802.tif 000008