(57)【要約】本発明は、ｆａｔｓｏ（ＦＴＯ）遺伝子中の一連のＳＮＰに属する、あるいは関連する核酸バイオマーカーの検出に基づいて、ヒトにおける肥満及び/あるいは２型糖尿病のリスク評価及び/あるいは診断及び/あるいは予後のための手段及び方法を提供する。本発明は、また、ヒトにおける肥満及び/あるいは２型糖尿病への罹患性に関連するＳＮＰハプロタイプの特定、ヒトにおける肥満及び/あるいは２型糖尿病を予防及び/あるいは治療するのに役立つ薬剤の選択、ヒトにおけるｆａｔｓｏ（ＦＴＯ）遺伝子をハプロタイプする手段及び方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者における肥満及び/あるいは２型糖尿病のリスク評価及び/あるいは診断及び/あるいは予後のインビトロ方法であって、
ａ）前記被験者からの核酸試料において、ＦＴＯ遺伝子に関連した少なくとも一つのバイオマーカーを検出する工程と、
ｂ）工程ａ）で前記被験者から取得したバイオマーカーのデータを、健常者及び／または疾患患者からのバイオマーカーのデータと比較して、前記被験者における肥満及び／あるいは２型糖尿病のリスク評価及び／あるいは診断及び／あるいは予後を行う工程と、
を少なくとも含む方法。
【請求項２】
請求項１に記載された方法において、前記バイオメーカーの少なくとも一つが表２、表３、及び表６乃至９のいずれかにリストされている一塩基多型（ＳＮＰ）のグループから選択されている方法。
【請求項３】
請求項１に記載された方法において、前記バイオマーカーの少なくとも一つが表２、表３、及び表６乃至９のいずれかにリストされているグループから選択されたＳＮＰの少なくとも一つに関連している多型部位である方法。
【請求項４】
請求項１に記載された方法において、前記バイオマーカーの少なくとも一つが表２、表３、及び表６乃至９のいずれかにリストされているグループから選択されたＳＮＰの少なくとも一つと完全連鎖不平衡の状態にある多型部位である方法。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれかに記載された方法において、前記方法が、肥満及び/あるいは２型糖尿病を発症するリスクがある、被験者を特定するためのものである方法。
【請求項６】
請求項１乃至４のいずれかに記載された方法において、前記方法が、被験者において肥満及び/あるいは２型糖尿病を診断するためのものである方法。
【請求項７】
請求項１乃至４のいずれかに記載された方法において、前記方法が、肥満及び/あるいは２型糖尿病を持つ被験者にとって効率が良く安全な療法を選択するためのものである方法。
【請求項８】
請求項１乃至４のいずれかに記載された方法において、前記方法が、肥満及び/あるいは２型糖尿病を持つ被験者に施された療法の効果をモニタリングするためのものである方法。
【請求項９】
請求項１乃至４のいずれかに記載された方法において、前記方法が、肥満及び/あるいは２型糖尿病の治療を必要とする被験者を治療するために施されたその療法の効果を予測するためのものである方法。
【請求項１０】
請求項１乃至４のいずれかに記載された方法において、前記方法が、肥満及び/あるいは２型糖尿病を発症するリスクのある被験者に施す効率が良く安全な予防療法を選択するためのものである方法。
【請求項１１】
請求項１乃至４のいずれかに記載された方法において、前記方法が、肥満及び/あるいは２型糖尿病を発症するリスクのある被験者に施された予防療法の効果をモニタリングするためのものである方法。
【請求項１２】
請求項１乃至４のいずれかに記載された方法において、前記方法が、リスクのある被験者における肥満及び/あるいは２型糖尿病を予防する療法の効果を予測するためのものである方法。
【請求項１３】
請求項１乃至１２のいずれかに記載された方法において、表２、表３、表６乃至表９のいずれかにリストされている前記ＳＮＰの少なくとも一つがｒｓ９９４０１２８、ｒｓ１４２１０８５、ｒｓ１１２１９８０、ｒｓ１７８１７４４９、ｒｓ３７５１８１２、ｒｓ１１０７５９９０、ｒｓ９９４１３４９、ｒｓ７２０６７９０、ｒｓ８０４７３９５、ｒｓ１０８５２５２１、ｒｓ１４７７１９６、及びｒｓ４７８３８１９から選択されている方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載された方法において、表２、表３、表６乃至表９のいずれかにリストされている前記ＳＮＰの少なくとも一つがｒｓ９９４０１２８、ｒｓ１４２１０８５、ｒｓ１１２１９８０、ｒｓ３７５１８１２、ｒｓ７２０６７９０、ｒｓ８０４７３９５、及びｒｓ１７８１７４４９から選択されている方法。
【請求項１５】
請求項１乃至１４のいずれかによるインビトロ方法に使用されるテストキットであって、
ａ）被験者からの核酸試料中のＦＴＯ遺伝子と関連のある少なくとも一つのバイオマーカーのタイプ及び/あるいはレベルを評価する手段と、
ｂ）手段ａ）で評価された前記被験者からのバイオマーカーのデータを健常者及び/あるいは疾患患者からのバイオマーカーのデータと比較し、前記被験者の肥満及び/あるいは２型糖尿病のリスク評価及び/あるいは診断及び/あるいは予後を行う手段と、
を適切な手段として含むテストキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトにおける肥満及び/あるいは２型糖尿病を診断、予後、治療及び/あるいは予防する手段に関する。
【０００２】
より正確に言えば、本発明は、ｆａｔｓｏ（ＦＴＯ）遺伝子内の一連のＳＮＰ（“ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ”  −  一塩基多型）に属する、あるいは関連する核酸バイオマーカーの検出に基づき、ヒトにおける肥満及び/あるいは２型糖尿病のリスク評価及び/あるいは診断及び/あるいは予後する手段あるいは方法を提供する。
【０００３】
本発明は、また、ヒトにおける肥満及び/あるいは２型糖尿病の罹患性に関連するＳＮＰハプロタイプを特定するための手段及び方法、ならびにヒトにおける肥満及び/あるいは２型糖尿病の予防及び/あるいは治療に効果のある薬剤の選択手段及び方法を提供する。
【背景技術】
【０００４】
肥満は、ヒトあるいは他の哺乳動物の脂肪組織に保存される自然エネルギー蓄積が、特定の症状あるいは死亡率の増加に結びつく段階まで増大された状態である。
【０００５】
肥満は、個人的な臨床症状であるが、段々と深刻な公共衛生問題としてもみなされるようになっている。過度の体重により、様々な疾患、特に循環器疾患、睡眠時無呼吸、骨関節炎、２型（真性）糖尿病などの発症の可能性が高まることが現在では一般的に知られている。より正確に言うと、肥満、特に中心性肥満（男性型あるいは内蔵型肥満）は「メタボリック症候群」（シンドロームX）の重要なリスク要因である。メタボリック症候群は、多数の疾患及び循環器疾患の発症性を極度に高めるリスク要因が集合したものであり、これらのリスク要因には、２型（真性）糖尿病、高血圧、高コレステロール値（血液中）、高トリグリセリド（複合型高脂血症）などがある。上記症状とあいまってアテローム性動脈硬化症の多発に関与するとされている炎症状態も存在し、血栓形成促進性は、循環器系疾患のリスクをさらに増大する可能性がある。
【０００６】
臨床の場において、肥満は通常ＢＭＩ（肥満度指数）や胴囲を測定し、また、リスク要因及び併存疾患の存在を見きわめることにより診断される。疫学研究においては、ＢＭＩ単独で、肥満の罹患および発生の指標として使用されている。ＢＭＩは、被験者の体重（キログラムを単位にして）を、被験者の身長（メートルを単位にして）の２乗で割ることにより計算される。
ＢＭＩ=(ｋｇ/ｍ2）またはＢＭＩ=[体重（ポンド）]×703／身長（インチ）2]
通常は、以下のように考えられる：
−  ＢＭＩ１８．５未満は過少体重
−  ＢＭＩ１８．５〜２４．９は普通体重
−  ＢＭＩ２５．０〜２９．９は過体重
−  ＢＭＩ３０．０〜３９．９は肥満
−  ＢＭＩ４０．０以上は、重度の（病的な）肥満
−  また、ＢＭＩ３５．０以上で、最低他に１つ重大な併存疾患が存在する場合、通常病的な肥満に分類される。
【０００７】
肥満発生に寄与すると言われている要素は、過食のみならず、以下のものも含まれる。
−  遺伝因子およびいくつかの遺伝性疾患（例：プラダーウィリ症候群）
−  基礎疾患（例：甲状腺機能低下症）
−  特定の薬物（例：非定型抗精神病薬）
−  座りがちな生活習慣、他。
肥満はよく、遺伝的および非遺伝的因子の組み合わせによるものであるとされる。この点において、原因遺伝子はまだ特定されていない。
【０００８】
今日、肥満は先進国および新興国が直面している、最も大きな健康問題と考えられている。
【０００９】
肥満に対抗するために使えるようになったあらゆる手段の中でも、肥満（症治療）手術の実施が増加している。この方法は、シリコンリングを胃の上部辺りに装着させることから成り、一回あたりの摂食量を制限するのに役立つ。いずれかの消化管の切開や、またはルートを変更するなど、他にもっと侵襲的な手術方法も同様に使用されている。しかしながら、これらの手術はすべて、患者にとって危険性が伴い、また、体重減少、疾病率及び死亡率低下を保証するものではない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】明細書末尾の一覧表を参照のこと。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
そのため、肥満に対抗するために本当に効果があるであろう新薬に向けた技術に対する需要が存在する。この点において、肥満発症に関与する遺伝子、つまり治療標的の有望な候補となる遺伝子を特定することは、科学者および医療関係者にとってより重要な関心事の一つである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、これまでに報告済みの遺伝要因と肥満の間の最も重要な関連性を開示することにより、この需要を満たそうとするものである。実際に、本発明は、肥満（ＦＴＯ）遺伝子座におけるいくつかのＳＮＰ（一塩基多型）が、ヨーロッパ母集団における早期発症および重度の肥満及び肥満に関連した２型糖尿病に大いにならびに有意に関連しているという発見に基づいている。
【００１３】
ＳＮＰは、最もよく見られる遺伝的変異型の一つを表す。これらの多型は、ゲノムにおける単一ヌクレオチドが変形（例えば、置換、付加あるいは欠失を通じて）した際に現れる。多型部位に関する配列の各変形は、多型部位の「対立遺伝子(allele)」と呼ばれる。ＳＮＰは、世代から世代へと進化的に安定している傾向があり、そのため、母集団を通じて特定の遺伝的異常を研究する目的で使用することが可能である。ＳＮＰがタンパク質コード領域で発生した場合、遺伝的疾患の発生につながる恐れのあるタンパク質の変異形の、時として欠陥のある、タンパク質の発現につながる可能性がある。ＳＮＰの中には非コード領域で発生するものもあるが、その場合でも、特異なあるいは欠損したスプライシング、または変異タンパク質の発現レベルになる可能性がある。ＳＮＰはそれゆえに、遺伝的疾患の有効な指標としての機能を果たすことができる。ＳＮＰは同様に、疾病素因のある個体を識別し、疾患を患っている個体の遺伝子型を決定し、また、発症プロセスにおける標的タンパク質の役割に関して明らかになった識見に基づく薬品開発を促進するための、診断ツールとして使用することも可能である。
【００１４】
錯誤を回避するために詳述すると、本発明の方法に、人体で行われる診断は含まれない。本発明の方法は、個体から事前に除去された試料で行われるのが好ましい。以下に記載される本発明のキットには、個体からの試料を摘出する手段も含まれる可能性がある。
【００１５】
本発明の方法により、肥満及び/あるいは２型糖尿病発症時あるいはそれ以前におけるそれらの症状による健康のリスクを正確に評価することができ、それにより、肥満及び/あるいは２型糖尿病による悪影響が減少あるいは最小化する。特に、本発明により、肥満及び/あるいは２型糖尿病のリスクをより良く予知することができ、そのため、後の合併症をより良く予知することができる。本発明の方法は、肥満及び/あるいは２型糖尿病の臨床的症状及び徴候が無い者、肥満及び/あるいは２型糖尿病を既に持つ者、肥満及び/あるいは２型糖尿病の家族歴を持つ者、あるいは肥満及び/あるいは２型糖尿病のリスク要因のレベルが高い者に適用することができる。
【００１６】
本発明において、「バイオマーカー」（「マーカー」とも呼ばれる）は、ヒトにおける肥満及び/あるいは２型糖尿病を示す遺伝子マーカーであり、つまり肥満及び/あるいは２型糖尿病発症に特異的にそして有意的に関わる核酸配列である。本発明において、かかるマーカーは「肥満及び/あるいは２型糖尿病リスクＳＮＰマーカー」あるいは「リスクＳＮＰマーカー」あるいは「リスクマーカー」あるいは「ＳＮＰマーカー」と呼ばれることもある。
【００１７】
本発明で主として使用される遺伝子マーカーは肥満及び/あるいは２型糖尿病に関連する「多型部位」における特定の対立遺伝子である。母集団において、ゲノム内で一つ以上のヌクレオチド配列が可能な位置を「多型部位」と呼ぶ。多型部位は長さが単一ヌクレオチドである場合、当該部位は、一般に「ＳＮＰ」と呼ばれる。例えば、ある特定の染色体位置において、母集団の一要素がアデニン、同母集団の他の要素が同位置にチミンを持つ場合、当該位置は多型部位であり、より具体的には、多型部位はＳＮＰである。多型部位は、例えば、挿入、欠失、転換、置換、重複、あるいは転座によりヌクレオチド数個分の長さを持つ場合がある。多型部位における各配列は、多型部位の「対立遺伝子」と呼ばれる。このため、前の例で言えば、ＳＮＰはアデニン対立遺伝子とチミン対立遺伝子の両方を持つことができる。これらの対立遺伝子は「変異形」対立遺伝子である。ヌクレオチド配列変異体は、コーディング領域でもあるいは非コーディング領域でも、コードされたポリペプチドの配列を変化させることができ、かくしてそれらの属性に影響を与えることがある（活動の変化、分布の変化、安定性の変化など）。あるいは、ヌクレオチド配列変異体は、コーディング領域でもあるいは非コーディング領域でも、遺伝子の転写あるいはｍＲＮＡの翻訳に影響を与える変化が起こる場合がある。すべての場合において、その変化は定性的、定量的、あるいは両方の場合がある。
【００１８】
当業者は、個体の核酸中の、本発明において開示されているＳＮＰマーカーの一つあるいはそのいくつかに存在するヌクレオチドの分析は、多型部位に存在するヌクレオチドを限定することができるいずれの方法あるいは技術を用いてもできることが容易に分かるであろう。例えば、本発明の方法において、シーケンス、ミニ・シーケンス、ハイブリダイゼーション、制限断片解析、オリゴヌクレオチドライゲーション定量、アリール特異的ＰＣＲ、あるいはそれらの組み合わせを行うことによりバイオマーカーを検出することができる。勿論、このリストは単なる例であり、限定的ではない。当業者は、かかる検出達成のため適切な方法をどれでも使用することができる。
【００１９】
当該技術において明白なように、ＳＮＰマーカーに存在するヌクレオチドは、どちらかの核酸ストランドあるいは両方のストランドにより限定されることができる。
【００２０】
本発明において使用されるバイオマーカーは、ＦＴＯ遺伝子に「関連があり」、つまり、当該バイオマーカーは、構造的にＦＴＯ遺伝子と関連している。例えば、バイオマーカーは、ＦＴＯ遺伝子座、あるいはその近辺にあり、そして/あるいは前記バイオマーカーはＦＴＯ遺伝子と機能的に関連している。例えば、バイオメーカーは、ＦＴＯ遺伝子又はその発現産物と反応するか影響を与える。
【００２１】
本発明の方法及びキットで使用されるバイオマーカーは、下記の表２、表３、表６乃至表９（下記の例のパートII参照）のいずれかにリストしてある一塩基多型（ＳＮＰ）のグループから選択するのが好ましい。また、表２、表３、表６乃至表９のいずれかにリストしてあるＳＮＰで極めて大きな予測価値のものはｒｓ９９４０１２８、ｒｓ１４２１０８５、ｒｓ１１２１９８０、ｒｓ１７８１７４４９、ｒｓ３７５１８１２、ｒｓ１１０７５９９０、ｒｓ９９４１３４９、ｒｓ７２０６７９０、ｒｓ８０４７３９５、ｒｓ１０８５２５２１、ｒｓ１４７７１９６、ｒｓ４７８３８１９から選択するのが更に好ましい。このグループ中では、ｒｓ９９４０１２８、ｒｓ１４２１０８５、ｒｓ１１２１９８０、ｒｓ３７５１８１２、ｒｓ７２０６７９０、ｒｓ８０４７３９５、ｒｓ１７８１７４４９のＳＮＰが特に関心があるものである。ｒｓ１４２１０８５あるいはｒｓ１７８１７４４９のＳＮＰを少なくとも一つ使用することがより好ましい。
【００２２】
あるいは、バイオマーカーは、下記表２、表３、表６乃至表９のいずれかにリストされているグループから選択された少なくとも一つのＳＮＰに関連のある多型部位でも良い。上記で定義されているように、「関連のある」というのは、前記バイオマーカーが前記ＳＮＰに構造的及び/あるいは機能的に関連のあることを意味する。より具体的には、「関連のある」という用語は、前記バイオマーカーが前記ＳＮＰと高度の連鎖不平衡にあることを意味する。つまり、それらは、HapMapの欧州のデータセット及び/あるいは本発明者によって下記のように試験的に分析された母集団における前記ＳＮＰと、ｒ2が0.6以上及び/あるいはＤ’が0.5の相関関係を示す。
【００２３】
さらに、バイオマーカーは、下記表２、表３、表６乃至表９のいずれかにリストされているグループから選択されたＳＮＰの少なくとも一つと完全連鎖不平衡にある多型部位の場合もある。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１Ａ】ＦＴＯ領域における連鎖不平衡構造及び相関。
【図１Ｂ】ＦＴＯ領域における連鎖不平衡構造及び相関。
【図２】ヒト組織におけるＦＴＯ遺伝子発現。
【図３】ＦＴＯ遺伝子における推定原因場所の位置の事後確立分布の分布。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
このように、本発明の第一の態様は、人体実験の被験者における肥満及び/あるいは２型糖尿病のリスク評価及び/あるいは診断及び/あるいは予後のインビトロ方法に関するもので少なくとも次の工程を含む。
ａ）前記人体実験の被験者からの核酸試料において、ＦＴＯ遺伝子に関連した少なくとも１つのバイオマーカーを検出する工程、
ｂ）前記人体実験の被験者における肥満及び／または２型糖尿病のリスク評価及び／または診断及び／または予後をするために、工程ａ）で前記人体実験の被験者から取得したバイオマーカーのデータを、健常者及び／または疾患患者からのバイオマーカーのデータとを比較する工程。
【００２６】
「リスク評価」とは、ここでは本発明により人体実験の被験者が肥満及び/あるいは２型糖尿病を発症するリスクを推定、あるいは評価することを可能にすることを意味する（「疾病素質あるいは罹患性評価」とも呼ばれる）。この点において、肥満及び/あるいは２型糖尿病の「リスクがある」個体とは、少なくとも一つのリスク対立遺伝子あるいは一つ以上の「肥満及び/あるいは２型糖尿病リスクＳＮＰマーカー」を持つハプロタイプを持つ者である。更に、「リスクがある」個体は、下記のような肥満及び/あるいは２型糖尿病発症に寄与することで知られているリスク要因のうち少なくとも一つを持つこともありえる。
−  肥満及び/あるいは２型糖尿病の家族歴
−  遺伝性疾患（例：プラダーウィリ症候群）
−  基礎疾患（例：甲状腺機能低下症）
−  高血圧及び血圧高騰
−  摂食障害
−  特定の医薬品（例：非定型抗精神病薬）
−  座ることの多いライフスタイル
−  高グリセミック指数食（食後血糖値の高い食事）
−  ダイエットを繰り返し試みることによる体重ヨーヨー現象
−  ストレスを感じやすい性格
−  睡眠不足
−  禁煙、その他。
【００２７】
リスクの推定は、通常、リスクが増加あるいは減少したことを示唆する。
【００２８】
本発明において使用できる核酸試料のタイプには制限はない。この意味において、例えば、ＤＮＡ試料、ゲノムＤＮＡ試料、ＲＮＡ試料、ｃＤＮＡ試料、ｈｎＲＮＡ試料、あるいはｍＲＮＡ試料などを使用することができる。
【００２９】
本発明の方法における「疾患患者」は肥満及び/あるいは２型糖尿病に罹患している人々をさす。
【００３０】
様々な実施形態によれば、上記記載の方法は以下の目的に役立つ。
−  肥満及び/あるいは２型糖尿病を発症するリスクのある人体実験の被験者の特定。
−  人体実験の被験者の肥満及び/あるいは2型糖尿病の診断。
−  肥満及び/あるいは２型糖尿病を持つ人体実験の被験者のための安全で効率の良い療法の選択。
−  肥満及び/あるいは２型糖尿病を持つ人体実験の被験者に施された療法の効力のモニタリング。
−  肥満及び/あるいは２型糖尿病の治療を必要とする、人体実験の被験者に対する療法の有効性の予知。
−  肥満及び/あるいは２型糖尿病を発症するリスクのある、人体実験の被験者に対する安全で効率の良い予防法の選択。
−  肥満及び/あるいは２型糖尿病を発症するリスクのある、人体実験の被験者に施された予防法の効果のモニタリング。
−  リスクのある人体実験の被験者に対して肥満及び/あるいは２型糖尿病を予防する療法の有効性の予知。
【００３１】
「治療」及び「療法」という用語は、肥満及び/あるいは２型糖尿病に関連する症状を改善することを表わすだけではなく、疾患発症を防止あるいは遅延し、そして/あるいは疾患の症状の程度あるいは頻度を減少させ、そして/あるいは疾患の再発を防止あるいは遅延させることを表わす。
【００３２】
本発明の第二の態様は、人体実験の被験者における肥満及び/あるいは２型糖尿病罹患性に関連するＳＮＰハプロタイプを特定するためのインビトロ方法に関するもので、前記方法は、少なくとも次の工程を含む。
ａ）前記人体実験の被験者からの核酸試料において、ＦＴＯ遺伝子に関連した少なくとも一つのＳＮＰを検出する工程であって、その少なくとも一つのＳＮＰは肥満及び/あるいは２型糖尿病の罹患性を示す工程、および、
ｂ）前記人体実験の被験者における前記ＳＮＰハプロタイプを特定する工程であって、前記ＳＮＰハプロタイプは工程ａ）で検出した前記ＳＮＰを少なくとも一つ含む工程。
【００３３】
該技術分野で周知のように、「ハプロタイプ」は、遺伝子マーカーのいかなる組み合わせも表わす。ハプロタイプは、二つ以上の対立遺伝子を含むことができる。ここに記述されているハプロタイプ（あるいは「リスクのあるハプロタイプ」）は、肥満及び/あるいは２型糖尿病リスクがない個体よりも、肥満及び/あるいは２型糖尿病リスクがある個体においての方が、より頻繁かつ有意的に発見される。そのため、これらのハプロタイプは、個体における肥満及び/あるいは２型糖尿病リスク、あるいは肥満及び/あるいは２型糖尿病罹患性を検出する予測価値を持つ。「リスクのあるハプロタイプ」は、肥満及び/あるいは２型糖尿病と有意で高い相関関係を示すマーカー上に表わされた一つのハプロタイプあるいはハプロタイプの組み合わせを包含するものである。
【００３４】
ハプロタイプ検出は、該技術分野周知の多型部位における配列検出のための方法を用いて達成することができる。
【００３５】
工程ａ）で検出されるＳＮＰは、下記表２、表３、表６乃至表９のいずれかにリストされているグループから選択することが好ましい。
【００３６】
本発明の第三の態様は、人体実験の被験者における肥満及び/あるいは２型糖尿病のリスク評価及び/あるいは診断及び/あるいは予後を行うインビトロ方法に用いられるテストキットを提供することであり、前記テストキットは以下工程のための適切な手段を含む。
ａ）前記人体実験の被験者からの核酸試料中のＦＴＯ遺伝子に関連するバイオマーカーのうち少なくとも一つのタイプ及び/あるいはレベルを評価する工程、および、
ｂ）前記人体実験の被験者からの工程ａ）で評価されたバイオマーカーのデータを健常者及び/あるいは疾患患者からのバイオマーカーのデータと比較する工程であって、前記人体実験の被験者における肥満及び/あるいは２型糖尿病のリスク評価及び/あるいは診断及び/あるいは予後を行う工程。
【００３７】
本発明の第四の態様は、前記人体実験の被験者における肥満及び/あるいは２型糖尿病罹患性に関連するＳＮＰハプロタイプを特定するためのインビトロ方法に使用されるテストキットに関するもので、以下の工程のための適切な手段を含む。
ａ）前記人体実験の被験者からの核酸試料中のＦＴＯ遺伝子の少なくとも一つのＳＮＰを検出する工程であって、少なくとも一つの前記ＳＮＰは肥満及び/あるいは２型糖尿病罹患性を示す工程、および、
ｂ）前記人体実験の被験者のＳＮＰハプロタイプを特定する工程であって、前記ＳＮＰハプロタイプはａ）で検出された少なくとも一つの前記ＳＮＰを含む工程。
【００３８】
「テストキット」及び「キット」という用語は同義語であり、互換性がある。
【００３９】
本発明において、テストキットが参照された場合、<<適切な手段>>とは、指し示された目的を達成するために役立つ技術的手段のいずれかをさす。かかる適切な手段の非限定的な例として、試薬及び/あるいは材料及び/あるいはプロトコル及び/あるいは指示及び/あるいはソフトウェアなどを挙げることができる。本発明のすべてのキットは、適切なパッケージング及びここにおいて開示される方法の使用方法を含む場合がある。キットは更に、適切なバッファ及び熱安定性ポリメラーゼ（例：Ｔａｑポリメラーゼ）のようなポリメラーゼを含む場合がある。かかるキットはコントロールプライマー及び/あるいはプローブも含む場合がある。
【００４０】
好ましい実施形態によれば、本発明のテストキットは少なくとも以下のものを含む場合がある。
ａ）関心のある核酸を特に増幅するための、前進プライマーと後退プライマーを含む一つの独立ＰＣＲプライマー及び/あるいは
ｂ）関心のある核酸を特に伸長させるための独立のプライマー及び/あるいは
ｃ）関心のある核酸に特に結合する独立の核酸プローブ及び/あるいは
ｄ）関心のある核酸によってコードされたタンパク質を特に結合させる独立の抗体及び/あるいは
ｅ）上記ａ）乃至ｄ）のうちの少なくとも一つを含むマイクロアレイあるいは多重井戸型プレート。
【００４１】
「関心のある核酸」とは、ここにおいては、肥満及び/あるいは２型糖尿病を示すバイオマーカーを含む核酸領域あるいはセグメントを意味する。この意味において、関心のある核酸とは、バイオマーカーより大きい場合も、バイオマーカーに限られる場合もある。
【００４２】
「プローブ」と「プライマー」は、核酸分子の相補鎖と塩基特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。「塩基特異的」とは、二つの配列が、プライマーあるいはプローブがハイブリダイズするために十分なヌクレオチド相補性を持つ必要があることを意味する。従って、プライマーあるいはプローブ配列はテンプレートの配列に完全に相補する必要はない。非相補塩基あるいは修飾塩基をプライマーあるいはプローブに散在させることができるが、それは塩基代用がハイブリダイゼーションを抑制する場合を除く。
【００４３】
プローブあるいはプライマーは通常、核酸テンプレートの少なくとも８個、好ましくは約１０個、１２個、１５個、更に好ましくは約２０個、２５個、３０個、３５個、そして時によっては約４０個、５０個、６０個、７０個の連続核酸とハイブリダイズする核酸領域を含む。
【００４４】
プライマー及びプローブは通常、隣接あるいは相補核酸配列（これが「テンプレート」である）と少なくとも７０％同一である。同一性は、少なくとも８０％、９０％、９５％が好ましいが、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％がより好ましい。
【００４５】
有利なことに、プライマー及びプローブは、さらにラベル、例えば、ラジオアイソトープ、蛍光物質、酵素、あるいは酵素補因子を含む。
【００４６】
本発明の第五の態様は、人体実験の被験者における肥満及び/あるいは２型糖尿病の予防及び/あるいは治療に役立つ薬剤を選択する方法に向けられており、少なくとも以下の工程を含む。
ａ）ヒトのＦＴＯ遺伝子を包含するモデル生体系に候補薬剤を投与する工程、
ｂ）前記候補薬剤の、前記ＦＴＯ遺伝子及び/あるいはその発現産物に関わる生体メカニズムへの効果を判定する工程、および、
ｃ）前記生体メカニズムへの変更効果を持つ薬剤を選択する工程であって、選択された薬剤は人体実験の被験者における肥満及び/あるいは２型糖尿病の予防及び/あるいは治療に役立つとみなされる工程。
【００４７】
「薬剤」は、生物由来薬剤、化学薬剤、あるいは両方をさす。ただし、それらは人体実験の被験者における肥満及び/あるいは２型糖尿病の予防及び/あるいは治療に役に立つとみなされなければならない。生物由来薬剤の例は、ｓｉＲＮＡを含む核酸、毒素を含むポリペプチド、酵素、抗体（ポリクローナルあるいはモノクローナル）、核酸とポリペプチドの組み合わせなどである。化学薬剤の例は、化学分子、化学分子錯体、化学部分など（例：ラジオアイソトープ他）である。
【００４８】
本発明の第六の態様は、肥満及び/あるいは２型糖尿病に関する病態生理学及び/あるいは分子メカニズム研究のためにヒトの遺伝子を含むモデル生体系を使用することに関する。
【００４９】
ここにおける「モデル生体系」は、非人間トランスジェニック動物、あるいは培養微生物、昆虫、あるいは哺乳類細胞、あるいは哺乳類組織あるいは器官を意味することが好ましい。前記モデル生体系は、ヒトのＦＴＯ遺伝子を発現あるいは過剰発現することがより好ましい。
【００５０】
本発明の第七の態様は、人体実験の被験者におけるＦＴＯ遺伝子をハプロタイプするためのインビトロ方法に関するもので、少なくとも以下の工程を含む。
ａ）前記人体実験の被験者からの核酸試料中で、「肥満及び/あるいは２型糖尿病罹患性ハプロタイプ」の各対立遺伝子位置に存在するヌクレオチドを検出する工程であって、ハプロタイプは表２、表３、表６乃至表９のいずれかにリストされているＳＮＰ、あるいはそれらと連鎖不平衡にある遺伝子を少なくとも一つ含む工程、および
ｂ）工程ａ）において検出されたヌクレオチドに従って、前記人体実験の被験者に対して特定のハプロタイプを割当てる工程。
【００５１】
好ましい実施形態においては、本方法は、工程ｂ）で割当てられた特定ハプロタイプに従い、前記人体実験の被験者が肥満及び/あるいは２型糖尿病を発症するリスクを判定する工程をさらに含む。
【００５２】
各対立遺伝子位置に存在するヌクレオチドは、上記方法の工程a）において適切な、どの技術を用いても検出することができる。例えば、当該検出は前記核酸試料の酵素増幅（ポリメラーゼ連鎖反応あるいは対立遺伝子特異的増幅など）を使用して行ってもよい。あるいは、前記検出は、シーケンスによっても実施できる。
【００５３】
さらに、ここで開示されるＳＮＰ及びハプロタイプにより患者層別化が可能である。特に、特定の薬剤を用いた療法に最も適する患者を特定するのに遺伝子多型の知識が使用される標的臨床試験プログラムや薬理遺伝学療法のため、肥満及び/あるいは２型糖尿病発症のリスクが高い、あるいは低いと特定された個体のサブグループを使用することができる。
【００５４】
ここにおいて記述されているＳＮＰ及びハプロタイプは、例えば、アイデンティティ、疾患の発症/進行に対する罹患性、あるいは特定薬剤を使用した治療に対する感受性などに関して個体を特徴づけるのに役立つ貴重な情報源を提供する。
【００５５】
そのため、本発明の第八の態様は、肥満及び/あるいは２型糖尿病を治療及び/あるいは予防するための療法の効能を評価するための臨床試験に参加する人体実験の被験者を選択するための方法に向けられており、少なくとも以下の工程を含む。
ａ）各人体実験の被験者が属する特定のＦＴＯ遺伝子ハプロタイプに従って人体実験の被験者をグループに分ける工程、および、
ｂ）前記臨床試験に含めるため、工程ａ）で取得されたハプロタイプの少なくとも一つのグループから少なくとも一人の人体実験の被験者を選択する工程。
【００５６】
本方法において、有利なことに、特定のＦＴＯ遺伝子ハプロタイプは、各人体実験の被験者からの核酸試料中の、「肥満及び/あるいは２型糖尿病罹患性ハプロタイプ」の各対立遺伝子位置に存在するヌクレオチドを検出することによって、インビトロで判定することができる。ここにおけるハプロタイプは表２、表３、表６乃至表９のいずれかにリストされているＳＮＰの少なくとも一つあるいはそれらと連鎖不平衡にある遺伝子多型を含む。
【００５７】
本発明の第九の態様は、上記方法に従って人体実験の被験者におけるＦＴＯ遺伝子をインビトロでハプロタイプするためのテストキットを提供し、前記テストキットは以下の工程のための適切な手段を含む。
ａ）各人体実験の被験者からの核酸試料中の、「肥満及び/あるいは２型糖尿病罹患性ハプロタイプ」の各対立遺伝子位置に存在するヌクレオチドを検出する工程であって、ハプロタイプは表２、表３、表６乃至表９のいずれかにリストされているグループから選択されたＳＮＰの少なくとも一つあるいはそれらと連鎖不平衡にある遺伝子多型を含む工程、および、
ｂ）工程ａ）で検出されたヌクレオチドに従って、前記人体実験の被験者に特定のハプロタイプを割当てる工程。
【００５８】
更に、本発明の第十の態様は、テストキットを上記のように使用して、人体実験の被験者を特定のハプロタイプ・グループに層別化することに関する。
【００５９】
有利なことに、本テストキットは、更に、肥満及び/あるいは２型糖尿病の治療及び/あるいは予防のための療法の効能を評価するための臨床試験に含めるために、少なくとも一つのハプロタイプ・グループから少なくとも一人の人体実験の被験者を選択するのに使用される。
【００６０】
本発明の第十一の態様は、ヒトＦＴＯ遺伝子中の、表２、表３、表６乃至表９のいずれかにリストされているグループから選択された少なくとも一つのＳＮＰのアイデンティティをインビトロで判定するためのテストキットに関するもので、かかる判定のための適切な手段を含む。
【００６１】
本発明は、以下の図によって説明されるが、これらの図により制約されるものではない。
【００６２】
図１：ＦＴＯ領域における連鎖不平衡構造及び相関。
Ａ）連鎖不平衡を２ｘ２のマトリックスとして表わしている。濃グレーは高度な連鎖不平衡（ｒ2）を示し、白はＳＮＰ間に相関関係が存在しないことを示す。
Ｂ）各ＳＮＰにおいて、肥満度III（８８０人）のｐ値のｌｏｇ10対コントロール（２７００）分析を表わす
【００６３】
図２：ヒト組織におけるＦＴＯ遺伝子発現。
脂肪組織(ＢｉｏＣｈａｉｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  ＵＳＡ）、膵島、ＦＡＣＳ分離ベータセル（Ｈｕｍａｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ提供（フランスのリル市大学病院））、多組織ｃＤＮＡパネル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からのヒトｃＤＮＡにおけるＦＴＯ発現、ここで１：ＦＴＯネガティブコントロール、２：ＧＡＰＤＨ、３：ＧＡＰＤＨネガティブコントロール、４：ＧＡＰＤＨ＋ＦＴＯ、５：ＧＡＰＤＨ＋ＦＴＯネガティブコントロール、６：分子重量マーカー５０ｂｐ、１５０ｂｐ、３００ｂｐ、５００ｂｐ、７５０ｂｐ、１ｋｂ、７：脂肪組織、８：脂肪組織ＲＴマイナスコントロール、９：膵島、１０：膵島ＲＴマイナスコントロール、１１：心臓、１２：脳、１３：胎盤、１４：肺、１５：肝臓、１６：骨格筋、１７：腎臓、１８：膵臓、１９：膵ベータ細胞。インターナル・コントロールとしてグリセルアルデヒド-３-リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）が使用された。ベータ細胞の純度は、免疫化学（９８％インスリン陽性細胞）及びＰＣＲ（外分泌細胞に対して特異的なキモトリプシン・プライマーによって増幅なし、ベータ細胞に対して特異的なＰｄｘ１プライマーによって増幅あり）によって確認された。使用されたＦＴＯプライマーは５’−ＴＧＣＣＡＴＣＣＴＴＧＣＣＴＣＧＣＴＣＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１）及び５’-ＴＧＧＧＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＴＣＡＣＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２）。これらの二つのプライマーは、高性能液体クロマトグラフィーにより精製された。１μｇの脂肪組織、膵島及びベータ細胞ＲＮＡは指示に従い、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ，  ＵＳＡ）を使用して無作為に逆転写された。ＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ・キット（ロッシュ、ドイツ）を使用して、１．２５ｍｍｏｌ/ｌのＭｇＣｌ2、各プライマー０．４μmol/ｌ、５μｌ単鎖ｃＤＮＡで、ホット・スタート法により、指示に従いＰＣＲがなされた。ホット・スタート法は以下のように修正された。９５℃で４分、９５℃で３０秒を４０サイクル、６８℃で２分、その後６８℃で３分。ＰＣＲ産物は、２％（重量/容量）のアガロースゲル上で分離され、臭化エチジウムとＵＶトランスイルミネーションを使用して、可視化された。
【００６４】
図３：ＦＴＯ遺伝子における推定原因場所の遺伝子座の事後確立分布の分布。位置は染色体１６上にｋｂで示されている。ドットは、単ＳＮＰ相関ｐ値のｌｏｇ10を表わす。線は、９５％、９０％、７５％の信頼区間の境界を表わす。
【００６５】
本発明の他の実施形態及び利点は、以下の例を読むことにより理解されるであろう。
【実施例】
【００６６】
Ｉ.材料及び方法：
Ｉ．１：統計的分析
ａ）相関テスト：乗法的モデルのケースコントロールにおける相関の検定にはロジスティック回帰検定が、一般相関モデルにはピアソンのカイ二乗検定が使用された。
肥満の子供及び成人におけるｒｓ１４２１０８５及びｒｓ１７８１７４４９のＳＮＰのそれぞれの対立遺伝子Ｃ及びＧの頻度増加に関する特定の仮説を検定するためのレプリケーションのｐ値は片側の値である。
【００６７】
家族に基づくコーホートにおける両方のＳＮＰの関連テストは、ヘテロ接合親から罹病している子供への、リスクのある対立遺伝子の伝達数を、その予想と比較するＴＤＴ検定を用いて行われた。マクネマー・カイ二乗検定は有意性を評価する。
【００６８】
異なる検定のｐ値の統合にはフィッシャー検定が使用され、ここにおいてｎ個のｐ値の自然対数の負の和の２倍が、自由度２ｎのカイ二乗分布に従う。
【００６９】
ｂ）遺伝的モデル。我々の家族性疾病研究母集団（フランスの肥満の子供の両親）の成人創始者とリープジッグ・コホートからの子供において説明されたＢＭＩ変動の比率が推定された。ＢＭＩは、正規化され、ＳＤＳで表わされた。
【００７０】
定量的罹患度特性Ｌ（全母集団での平均０、ＳＤ１）及び閾値Ｔ（閾値以上の値を持つ個体は、罹患していると分類される）を持つＱＬＴ罹患度閾値モデルが使用された。特性Ｌは三つの正規分布Ｎ(μg,σR）の混合に従う。μgは遺伝子型特異的なL平均（−ａ０、ａの値をとる）で、σ2Rは、遺伝子座に左右されない残差分散の比率である。肥満は、一定の閾値以上のＢＭＩを持つものと定義されているため、肥満の特性Ｌは、ＢＭＩによって特定することができる。
【００７１】
これらのパラメータにより、疾病リスクは、遺伝子型リスク率  ＧＲＲi=Ｐ(罹患者/Ｇ＝ｉ）/Ｐ(罹患者/Ｇ＝０）  によって表わすことができた。研究における、遺伝子座による変動は、ａ値及びｆ値、母集団におけるリスクのある対立遺伝子の頻度：
σ2α＝２．ｆ．（１−ｆ）．ａ2(式１）
から直接導いた。分散（σ2α）によって説明される変動のパーセンテージは、式１を逆にして、線形回帰モデルから導いた。そして、普通の肥満に用いられる有病率１０％に対応するＧＲＲを反復計算により求めた。
【００７２】
I.2：ジェノタイピング
最初のケース・コントロール・ジェノタイピングは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＳＮＰｌｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ により、オリゴヌクレオチドライゲーション定量（ＯＬＡ）とマルチプレックスＰＣＲ標的増幅を組み合わせることによりなされた(http://www.appliedbiosystems.com）。分析の化学は、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｃｏｒｅ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｋｉｔのセットとＳＮＰ特異のライゲーション・プローブのセットに依存し、ユニークな試料の４８のＳＮＰのマルチプレックス・ジェノタイピングを同時に行うことができる。品質コントロール対策は、分析の各工程のための特別なインターナル・コントロールを使用することにより（製造者の指示による）、含まれていた。対立遺伝子差別化は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７３０ｘｌＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ及びＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ  ３．７ソフトウェアを使用して、キャピラリー電気泳動分析によって行われた。複製試料は、１００％の一致率で分析された。
【００７３】
レプリケーション試料におけるｒｓ１４２１０８５及びｒｓ１７８１７４４９変異体のハイスループット・ジェノタイピングが、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＳＮＰ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  Ｃａｌｉｆ．  ＵＳＡ）を使用して行われた。ＰＣＲプライマーとＴａｑＭａｎプローブはＰｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓの設計によるもので、製造者のプロトコルにより最適化された。
【００７４】
すべてのＳＮＰはハーディー・ワインベルグ平衡にあった（Ｐ＞０．０５）。コール率は、スイス人の肥満の個体を除いては、すべての母集団におけるすべてのケースグループとコントロールグループにおいて９５％を超えた。
コール率及びＨＷＥ検定ｐ値は下記表１に示されている。
【００７５】
【表１】
2010523097.tif 000002
ｐＨＷＥ：ハーディー・ワインベルグ不平衡検定のｐ値。
不在：ジェノタイプ失敗のパーセンテージ
ＣＣ，ＣＴ及びＴＴ（ｒｓ１４２１０８５のＳＮＰ）、ＧＧ、ＧＴ、及びＴＴ（ｒｓ１７８１７４４９）のジェノタイプ・カウントは上記表１に示されている。
【００７６】
ジェノタイプ不在率が一番高いコントロール試料であるスイス人研究におけるコントロールにおいて、Ｃ及びＧ対立遺伝子の異常に高い頻度が観測された。これは、この匿名提供者の試料中に非検出の肥満個体が存在するためであるか、コール率と対立遺伝子頻度の間に相関があることを示すかどちらかである（差異コール率）。しかしながら、最高のコール率を持ち、ケースとコントロールの間に不在率の差を示さない試料（フランス人成人肥満とドイツ人子供肥満）は、通常の範囲の対立遺伝子頻度差異（０．４１から０．５１）を示した。したがって、観測された関連は、ケースとコントロールにおけるジェノタイプ依存的コール率差異によることはありそうもない。
【００７７】
通常の複製の他に、５３５名の肥満の子供及び３２９名の肥満度IIIの肥満成人がケース‐コントロール及び家族性疾病研究の両方においてジェノタイプされた。これら二つのジェノタイプ技術の一致率は、両方の研究の両方のＳＮＰについて１００％であった。
【００７８】
I.3:その他の実験手順
ａ）ジェノタイプ：
６８３３名の個体における３９のＳＮＰがジェノタイプされた。これらは、位置５２３４７９０ｋｂ（ｒｓ１８６１８６８）から位置５２３８６６９６ｋｂ（ｒｓ１３３３７６９６）にわたる領域において、ＭＡＦ(Ｍｉｎｏｒ  Ａｌｌｅｌｅ  Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）が１％より高いＳＮＰを１００％捕らえる。
個体（Ｎ＝５０３７）の７３％は３９のＳＮＰが、そして８８％（６０３０名の個体）は少なくとも３８のＳＮＰが首尾よくジェノタイプされた。コール率の平均は９９％であった。
【００７９】
ｂ）フェノタイプ
ＢＭＩが計算され、ＢＭＩのｚ-スコアがＣｏｌｅの方法（Ｃｏｌｅ  ｅｔ．ａｌ，  １９９０）によって決定された。
【００８０】
ｃ）統計的解析：
・モデル選択：
疾患の状況を予測することに関して、一番有益で簡潔なハプロタイプ形状を選択するため、１からｋの遺伝子多型の、可能性のあるすべての組み合わせの系統的解析が行われた。ＳＮＰは強い連鎖不平衡（ＬＤ）にあるため、1つを上回る遺伝子多型の組み合わせの尤度を、ハプロタイプ解析から推定した。ＴＨＥＳＩＡＳというプログラムによって生成された尤度は、各ハプロタイプモデル毎にＢａｙｅｓｉａｎ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  （ＢＩＣ）値に変換され、すべての研究したモデルにおいて、各モデルについて得られた最小ＢＩＣ値を引き、各ハプロタイプモデルに基準を変更したＢＩＣ値を与えた。基準変更後のＢＩＣ−２を持つモデルは一番益効なモデルとみなされ、これらのモデルのうち、遺伝子多型の数が一番少ない一番簡潔なモデルが最高のモデルとみなされる。
【００８１】
・ハプロタイプ・クラスタリング
推定リスク増加変異体の近辺において類似のハプロタイプのケースが豊富なクラスターの確率的探索のため、ＨａｐＣｌｕｓｔｅｒが使用された。クラスター内のハプロタイプはリスク増加対立遺伝子を持つことが予測されている。アルゴリスムは原因変異体の証拠を要約するためベイズ因子と、その場所の事後分布からの試料をもたらす。最新版は、www.daimi.au.dk/~mailund/HapCluster/において自由に入手でき、相加効果に適する対立遺伝子モデルが可能であり、相分離されていないジェノタイプ・データも受容する。Ｗａｌｄｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ（２００６）に記述されているこれらのアルゴリスムへの改善が適用された。
【００８２】
II.      結果：
II.1:肥満研究の結果
II.1.A：最初の実験結果と例
フランス人白人のケース‐コントロール肥満データセットにおける中性ＳＮＰ分布を推定するため、まず異なる遺伝子間領域の４８のＳＮＰが選択された。驚くべきことには、染色体１６ｑ１２．２に位置するｒｓ１１２１９８０ＳＮＰは、肥満度IIIの重度の（ＢＭＩ＞４０ｋｇ/ｍ2）成人肥満に大きく関連していることがわかった（OR＝１．５５[１．３９−１．７３]、ｐ値＝５．３ｘ１０-16）。
【００８３】
このＳＮＰはヒトの中に９つの予測されたエキソンを持ち、ＮＣＢＩ３６．１のヒトゲノムアセンブリ上で、大きな４１０，５０７ｂｐゲノム領域を包含するｆａｔｓｏあるいはＦＴＯと呼ばれる新たに記載された遺伝子（Ｐｅｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９）の最初のイントロン内に実際に位置するように見えた。追加のＳＮＰは、ｒｓ１１２１９８０があるＬＤブロックにわたる６０ｋｂ領域（このＳＮＰの各側における３０ｋｂ）において検定された。この領域は、ＦＴＯ遺伝子の最初のイントロンの一部、二番目のエキソン、及び二番目のイントロンの最初の部分を包含する。ｒ2＞０．７のすべての頻度マーカーに付いているＳＮＰ（ＭＡＦ＞０．０５）及び機能的である可能性のある要素（転写因子の結合部位あるいは他の調節要素及び種間保存領域）内に、そして最初のｒｓ１１２１９８０のＳＮＰがあるｒ2＞０．８内に位置したＳＮＰが選択された。結局は２５のＳＮＰが選択され、２３が首尾よくジェノタイプされた。ケース・コントロール試料は８９６名の肥満度IIIの肥満の成人（ＢＭＩ＞４０ｋｇ/ｍ2）と２７００名の非肥満のフランス人白人コントロール（ＢＭＩ＜２７ｋｇ/ｍ2）を含んだ。肥満の成人個体とコントロール両方とも以前に説明されている（Ｍｅｙｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）。
【００８４】
結果は下記表２に示されている。いくつかのＳＮＰと肥満度IIIの肥満（１．９ｘ１０-16＜ｐ＜５ｘ１０-9）との強い関連が発見された。興味深いことに、最も有意的に関連のある５つのうち３つのＳＮＰ(ｒｓ１７８１７４４９、ｒｓ３７５１８１２、ｒｓ１４２１０８５）は、１１の脊椎種について計算したＰｈａｓｔＣｏｎｓ保存スコア（Ｓｉｅｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）及び７種について計算した潜在的調節スコア（Ｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）の両方に基づくと、推定機能的であった。ジェノタイプされたＳＮＰに関する情報は、下記表２と表３に示されている。
【００８５】
【表２】
2010523097.tif 000003
ＭＡＦ：マイナー対立遺伝子頻度
N11、N12、及びN22は、それぞれ高頻度対立遺伝子ホモ接合体、ヘテロ接合体、及び稀対立遺伝子ホモ接合体のジェノタイプ頻度である。
一般：一般検定モデル検定の結果、ケース及びコントロールにおけるジェノタイプ頻度の比較を行う自由度２のピアソンカイ二乗検定。
相加：リスクのある対立遺伝子数に関するケース-コントロールのステータスのロジスティック回帰の結果。
【００８６】
【表３】
2010523097.tif 000004
【００８７】
上記表３には、各ＳＮＰの、ＮＣＢＩアセンブリーＢｕｉｌｄ３５を使用して、１１の脊椎種について計算したＰｈａｓｔＣｏｎｓ保存スコア、及び７種について計算した潜在的調節スコアが、物理的な位置（ｂｐを単位にして）の上に、報告されている。ＳＮＰが転写因子の結合部位を挿入あるいは削除する（Ｇｅｎｏｍａｔｉｘ  Ｓｕｉｔｅのインスペクター・ツールを用いて）ときは、星印が追加されている。太文字で記された三つのＳＮＰは一番高いスコアを持ち、そのため、一番機能的である可能性がある。
【００８８】
全領域で観測された関連が、一つの独特な徴候を反映しているものなのか、あるいは他のＳＮＰ又はハプロタイプもそれ自体の関連を表わすのかどうか試験がなされ、リスクのある対立遺伝子はほとんど完全にお互いの代用となるという結論に達した。従って、少なくともこれら三つのＳＮＰは、ハプロタイプがコントロールにおいて４０％の頻度で誘導対立遺伝子（ＮＣＢＩから）を結合するものであるという一つのユニークな関連を反映する可能性がある。
【００８９】
最近、概説されたとおり（Ｏｔｔ，２００４）、特に事前研究において遺伝子関与の見込みが低い場合（ｆａｔｓｏもそうであるが）、誤りの結論を除外するため追加試料における関連データのレプリケーションが必要である。ｒｓ１４２１０８５及びｒｓ１７８１７４４９のＳＮＰは非常に高い関連の証拠を示すと共に推定機能的であるため、これらの解析を行うため選択された。これらの解析において、すべてのｐ値は片側の値であった。
【００９０】
最初、１０１０名の非肥満のフランス人の個体（Ｈｅｒｃｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）（ＳＵＶＩＭＡＸコホート、ＢＭＩ＜２７ｋｇ/ｍ2）から選択されたＳＮＰの対立遺伝子頻度を７３６名の肥満の子供(平均年齢＝１１歳、ＢＭＩ＞第９７パーセンタイル）と比較し、肥満早期発症との有意的な関連を発見した（ｒｓ１４２１０８５及びｒｓ１７８１７４４９はそれぞれＯＲ＝１．２８［１．１１−１．４７］ｐ＝２ｘ１０-5及びＯＲ＝１．２５［１．０９−１．４４］ｐ＝５ｘ１０-4）。それから５３２名の非肥満のフランス人の若い成人（Ｖｕ−Ｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）（Ｈａｇｕｅｎａｕコホート、平均年齢＝２１歳、ＢＭＩ＜２５ｋｇ/ｍ2）及びセントビンセント・ドゥ・ポール病院からの５０５名のフランス人の肥満の子供（ＢＭＩ＞第９７パーセンタイル）(Ｌｅ  Ｆｕｒ  ｅｔ  ａｌ，  ２００２）が解析された。再び、早期発症肥満との類似の関連が発見された（ｒｓ１４２１０８５及びｒｓ１７８１７４４９はそれぞれＯＲ＝１．４７［１．２３−１．７５］ｐ＝１．１７ｘ１０-5及びＯＲ＝１．５２［１．２８−１．８１］ｐ＝１．８２ｘ１０-6）。最後に７００名の贅肉のない子供（平均年齢＝１１．７歳、ＢＭＩは第１６パーセンタイルと第８５パーセンタイルの間）及び２８３名の肥満の子供（平均年齢＝１１．７歳、ＢＭＩ＞第９０パーセンタイル）がジェノタイプされた。両方ともドイツ人白人の血統を持つ者であった（Ｋｏｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）。両方のＳＮＰに関して関連が再び確認された（ｒｓ１４２１０８５及びｒｓ１７８１７４４９はそれぞれＯＲ＝１．６９［１．３８−２．０６］ｐ＝３．４６ｘ１０-7及びＯＲ＝１．６５［１．３５−２．０１］ｐ＝１．２３ｘ１０-6）。下記表４は、効果量推定を表わす。
【００９１】
【表４】
2010523097.tif 000005
ｍＺＢＭＩ：標準偏差で表わしたＢＭＩの平均
ｍＡｇｅ：研究母集団における平均年齢
ａ：リスクのある対立遺伝子数に対してＺＢＭＩの回帰スロープにより推定された相加効果。
σ2a：遺伝的変異（ここでは相加モデルからの逸脱なしと想定している）。全変異は１であるから、遺伝的変異は遺伝率に等しい。
ＧＲＲ1：野生型ホモ接合体とヘテロ接合体の浸透度の間のジェノタイプリスク率
ＰＡＲ：母集団寄与リスク
【００９２】
５５７名のスイス人の肥満度IIIの成人と５４１名のスイス人の匿名提供者もジェノタイプされ、更にｆａｔｓｏと肥満の間の最初の関連が再現された（ｒｓ１４２１０８５及びｒｓ１７８１７４４９はそれぞれＯＲ＝１．２６［１．０７−１．４９］ｐ＝０．００３２及びＯＲ＝１．２１［１．０２−１．４３］ｐ＝０．０１）。注意したいことは、スイス人の肥満の被験者の対立遺伝子頻度は、フランス人の肥満の被験者(ＭＡＦ=０．５０）の最初の観測と一致したが、肥満テストを受けていないスイス人血液提供者コホートは、より高い対立遺伝子頻度（ｆ＝０．４６対０．４１）を示した。これはこの匿名個体グループにおける肥満の存在によって説明できる可能性がある。
【００９３】
各ステータスにおいて、各独立解析のｐ値を統合するフィッシャーの方法を用いて、全体的な有意性が評価された。ＳＮＰの間の相関関係を説明する一方、複数の試験を修正するため、各工程においてそれぞれ１６．７２回及び１．２回の有効試験（Ｎｙｈｏｌｔ，  ２００４）が使用された。肥満の関連の証拠を統合するメタ分析は高い有意性を示す結果が得られた（ｒｓ１４２１０８５及びｒｓ１７８１７４４９ＳＮＰそれぞれに対してｐ値＝１．６７ｘ１０-26及びｐ値＝１．０７ｘ１０-24）。
【００９４】
非検出の潜在的層別化効果を除外するため、これら二つのＳＮＰはフランス人の肥満の子供及び肥満度IIIの肥満の成人両方の両親及び兄弟姉妹においてジェノタイプされた。ｒｓ１４２１０８５及びｒｓ１７８１７４４９のＳＮＰの肥満「リスクのある」それぞれＣ及びＧ対立遺伝子が肥満の子供及び成人へ過伝達することが観測された（肥満の子供のｒｓ１４２１０８５及びｒｓ１７８１７４４９に対してそれぞれ伝達％＝５７％、ｐ値＝１ｘ１０-4、及び伝達％＝６６％、ｐ値＝０．０００４５、そして肥満成人のｒｓ１４２１０８５及びｒｓ１７８１７４４９に対してそれぞれ伝達％＝５７％、ｐ値＝２．５ｘ１０-4及び伝達％＝６２％、ｐ値＝０．００５）。スエーデン系人で、肥満の重度が一致しない家族（少なくとも一人が肥満度IIIの肥満で、一人の兄弟姉妹が贅肉がない）１５４を含む追加のコホートが更に解析され、同対立遺伝子の肥満の子供への過伝達が同様に観測された（両方のＳＮＰに対して伝達％＝６１％、ｐ値＝０．０５）。これらの、家族を基盤とした三つの研究を統合した全体的有意性は２．８ｘ１０-6である。
【００９５】
更に、フランス人の子供時代の肥満の家族データセットの創始者において、両方のＳＮＰに対して年齢と性別を加味したＢＭＩとの非常に強い関連が発見された（ｒｓ１４２１０８５及びｒｓ１７８１７４４９に対してそれぞれβ＝０．１９［０．０９−０．２９］、ｐ＝８ｘ１０-5及びβ=０．１７［０．０７−０．２７］、ｐ＝４ｘ１０-4）。すべてのレプリケーション結果は下記表５に示され、ジェノタイプカウントは上記表１に示されている。
【００９６】
【表５】
2010523097.tif 000006
各コホートの、ケース‐コントロール及び家族を基盤とする解析結果は上記表５のセクションＡ，Ｂ，及びＤに示されている。関連解析は、肥満及び非肥満個体のジェノタイプ頻度を、ロジスティック回帰を使用して比較した。ＯＲは、リスクのある対立遺伝子数によるリスク増加である。
セクションＣにおいては、すべての成人と子供のケース‐コントロール研究を統合したメタ解析の有意性が示されている。各ｐ値は、フィッシャー検定統計に加えられる前に、ＬＤマトリックスで推測された効果試験の数を使用して修正されている。
セクションＤは、三つの家族性試料における伝達（Ｔｒ）及び非伝達（Ｎｏｎ  Ｔｒ．）対立遺伝子の数を示す。
*ｐ値は、最初の試料を除きすべて片側の値である。
**最初の子供時代の肥満研究の祖父母と両親のトリオを含む。
【００９７】
ＩＩ．１．Ｂ：他の実験結果及び例：
ハプロタイプ・クラスタリング方法（Ｍｏｌｉｔｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）を使用して、根本原因変異体の局所化を制限するため、精細マッピング解析がなされた。２４４６名のコントロール及び１９３５名の肥満の成人及び子供を含む６９３３名の個体において、４７ｋｂの隣接ブロックを含む１００ｋｂにわたる３９のＳＮＰがジェノタイプされた（下記表６）。このデザインは、ｒ2＞０．８で、この領域において１％より高いＭＡＦを示すすべてのＨａｐＭａｐのＳＮＰを網羅する。
【００９８】
【表６】
2010523097.tif 000007
【００９９】
ＨａｐＣｌｕｓｔｅｒプログラム（Ｗａｌｄｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）を使用して得られた事後位置確率分布（図３）は、ｒｓ７２０６７９０、ｒｓ８０４７３９５、ｒｓ９９４０１２８、ｒｓ１４２１０８５をハイライトし、これらは又、有意性の高い関連の証拠を個別に示す（上記表６、２ｘ１０-12−５ｘ１０-16）。９５％信頼区間の長さは２０ｋｂ（ｃｈｒ１６：５２３５４４８０−５２３７４５０３）であるが、９０％及び７５％信頼区間は、関心のある領域をそれぞれ１６ｋｂ（ｃｈｒ１６：５２３５４４８０−５２３７０４５０）及び９ｋｂ（ｃｈｒ１６：５２３５４４８０−５２３６３４６４）に減少させる（図３）。
【０１００】
実際に、ヨーロッパ母集団において、ｒｓ１４２１０８５と高いＬＤｒ2＞０．７にある、ｃｈｒ１６：５２３４４４８０‐５２４００００の区間にあるすべてのマーカーは、本発明の状況において関心の対象となるように思われる（表７）。
【０１０１】
【表７】
2010523097.tif 000008
【０１０２】
このように、この領域におけるＬＤが非常に高いにも関わらず、肥満のステータスとの関連における有意差がこの領域に沿って発見された。事後確率分布は、ＨａｐＭａｐ（www.hapmap.org）から検索された精細再統合データと一致する（図３）。
【０１０３】
２０ｋｂ領域で９６の個体のシーケンスが行われた。これにより、新たな６６のＳＮＰが特定することができ（「単ヌクレオチド多型データベース」のｄｂＳＮＰには報告されていないが）、それらは下記表８Ａに、その位置によって記載されている。これらのＳＮＰが今までに特定されなかったのは、少なくともヒトゲノムシーケンスアセンブリーのために使用された個体の数が、すべての頻度の高い遺伝的変異を検出するための統計的検定力を確実にするほど大きくないためである。ここで９６の個体を使用することにより、初めて頻度の高いＳＮＰ（ＭＡＦ＞０．０５）を発見するのに十分な力を持つ事ができた。上記に記載された再シーケンスの手順を通して確認された６２のｄｂＳＮＰは下記表８Ｂにリストされている。上記に記載された再シーケンスの手順を通して発見されなかった２６のｄｂＳＮＰは下記表８Ｃにリストされている。
【０１０４】
これは、この領域において行われたシーケンス研究でも最大のものであるため（９６の個体）、発明者は、新たなＳＮＰ（つまりｄｂＳＮＰにもＨａｐＭａｐにもリストされていないもの）を特定することができたと共に、以前に特定されたＳＮＰ（ｄｂＳＮＰ，ＨａｐＭａｐ、あるいは他の公開データベースのどれかでのＳＮＰ）を確認（あるいは棄却）することができた。すべてのＳＮＰ（確認されたものあるいは新たなもの）は、明確にされたリスクのあるＳＮＰ（ｒｓ１４２１０８５を含む）と強い連鎖不平衡（高いｒ2及び/あるいはＤ’）にあるため、本発明の範囲内にあることは注目すべきことである。
【０１０５】
【表８Ａ】
2010523097.tif 000009
【０１０６】
【表８Ｂ】
2010523097.tif 000010
【０１０７】
【表８Ｃ】
2010523097.tif 000011
【０１０８】
ＩＩ．２：２型糖尿病研究の結果
下記表９は、２４００名のコントロール（上記で説明された肥満研究に使用されたコントロールの一部）及びフランス人白人の血統を持つ２２００名の２型糖尿病患者のケース・コントロール解析の結果を示す。
解析は、相加モデルのもとで行われた。
【０１０９】
【表９】
2010523097.tif 000012
【０１１０】
ＩＩＩ．      結論
ｆａｔｓｏ（ＦＴＯ）の機能は、ほとんど知られていない。ＦＴＯシンテニック合指症（Ｆｔ）のマイスヘテロ接合は、プログラム細胞死が影響を受けていることを示す前肢の部分的合指症と、巨大胸腺肥大症によって特徴づけられる。ホモ接合Ｆｔ/Ｆｔ胎芽は、妊娠中期において死亡し、頭蓋顔面構造の重大な奇形を示す。しかしながら、この物理的不活性は、同領域におけるいくつかの遺伝子が関与し、このためこれらのフェノタイプはＦＴＯ自体とは必ずしも関係していない。ヒトにおいて、小さな染色体複製が、ｆａｔｓｏ（ＦＴＯ）位置を含む大きな染色体１６ｑ１２．２領域において特定された（Ｓｔｒａｔａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）。知的障害、異形顔貌、及び指異常の他に、著者は一次的症状として肥満も報告している。ｆａｔｓｏ（ＦＴＯ）位置変異も、最近フランス系カナダ人の高血圧症の家族におけるメタボリック症候群と若干相関があることが報告されている（Ｓｅｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）。
【０１１１】
ＦＴＯ遺伝子発現は、いくつかのヒト組織、特に肥満に関して興味がある脳、脂肪組織などにおいて調査され、ヒトｆａｔｓｏ遺伝子は、図２で示したように、試験された１１のすべての組織で発現されていることが発見された。更に、マイクロアレイに基づく、Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＦｏｕｎｄａｔｉｏｎのＧｅｎｏｍｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ (“ＧＮＦ”/ＳｙｍＡｔｌａｓ）の遺伝子発現データベースは、ｆａｔｓｏはヒト視床下部、下垂体、副腎に大いに発現されていることを示し、これは体重規制に関与するとみられる視床下部‐下垂体-副腎軸（ＨＰＡ）で役割を果たしている可能性があることを示唆している（Ｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）（http://symatlas.gnf.org/SymAtlas/）。更に、タンパク質はその機能と生理的な役割を予知するのに役立つ特定された構造ドメインも（Ｐｅｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９）、他のタンパク質との、情報に基づくネットワークリンクも持たない（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  ソフトウェア・ツール）。
【０１１２】
ここで、ｆａｔｓｏ（ＦＴＯ）遺伝子座におけるいくつかの潜在機能的ＳＮＰはヨーロッパ母集団における肥満の早期発症及び重度の肥満に大いに関連していることが示されている。リスクのあるハプロタイプの高頻度によって説明される母集団寄与リスクの０．２２という計算結果は、母集団肥満への推定重要効果を示すものである。これは、これまで肥満について報告された関連の中で一番有意性が高いように思われる（Ｌｙｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）。又、同ＳＮＰが２型糖尿病と大いに関連していることがここで示されている。
【０１１３】
遺伝研究におけるほとんどの研究成果は偶然であるかもしれないが、最近事前研究の見込みが低い場合でも、強い関連の多重レプリケーションは、研究成果が真実であるという肯定的な予測価値を大いに増大することが示された（Ｍｏｏｎｅｓｉｎｇｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）。この点において、ｆａｔｓｏは、そのグルコースホメオスタシスにおける役割は未だ未知ではあるが、肥満及び２型糖尿病に強く関与する遺伝子であるように思われる。
【０１１４】
参考文献一覧
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【図１Ａ】
2010523097.tif 000013
【図１Ｂ】
2010523097.tif 000014
【図２】
2010523097.tif 000015
【図３】
2010523097.tif 000016
【配列表】
2010523097000001.xml
【国際調査報告】
2010523097.tif 000018
2010523097.tif 000019
2010523097.tif 000020
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