(57)【要約】本発明は、細胞ライセート内またはタンパク質の混合物中のタンパク質、特に注目する特異的タンパク質を標識、分離および分析するための方法および組成物を提供する。当該タンパク質は、アミン反応性またはチオール反応性蛍光色素、またはそのタンパク質上に存在するアミン基と反応した際に蛍光性となるアミン反応性蛍光発生性試薬で標識される。標識する工程の後、この混合物内のタンパク質は、分離および分析することができる。さらなる実施形態では、タグ化タンパク質上に存在するタグに結合することができるタグ結合蛍光発生性試薬が加えられ、その注目するタンパク質が特異的に標識される。2010528268.tif 000019
2010528268.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質の混合物を蛍光標識する工程を含むタンパク質分析のための方法であって、該標識する工程が、
ａ）該タンパク質の混合物を、
ｉ）ｐＨ  ８〜ｐＨ  １０の間のｐＨを有する第１のバッファーと、
ｉｉ）アミン反応性蛍光発生性試薬と、
ｉｉｉ）アセトンシアノヒドリン、ニトリル、またはシアン化アルカリと
を含む組成物と混合することによって第１の反応混合物を形成する工程と、
ｂ）該第１の反応混合物を、第１の温度で第１のインキュベーション時間の間インキュベーションする工程と、
ｃ）ｐＨ  ６〜ｐＨ  ９の間のｐＨを有する第２のバッファーを該第１の反応混合物と混合することによって、第２の反応混合物を形成する工程と、
ｄ）第２の温度で第２のインキュベーション時間の間インキュベーションする工程と、
ｅ）該蛍光標識されたタンパク質を分離し、可視化する工程と
を含む、方法。
【請求項２】
前記組成物がアセトンシアノヒドリンまたはマンデロニトリルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組成物がシアン化アルカリを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記シアン化アルカリがシアン化ナトリウムまたはシアン化カリウムである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記アミン反応性蛍光発生性試薬がアロイル−２−キノリン−カルボキシアルデヒド試薬である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記アロイル−２−キノリン−カルボキシアルデヒド試薬が３−（４−カルボキシベンゾイル）キノリン−２−カルボキシアルデヒドまたは３−（２−フロイル）キノリン−２−カルボキシアルデヒド）である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記アロイル−２−キノリン−カルボキシアルデヒド試薬が３−（２−フロイル）キノリン−２−カルボキシアルデヒド）である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記組成物がさらにアニオン性界面活性剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記アニオン性界面活性剤が、アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキルスルホン酸塩、アルキルスルホコハク酸塩、アルキルリン酸塩、アルキル硫酸塩、アルキルカルボン酸塩、アルキルエーテルベンゼンスルホン酸塩、アルキルエーテルスルホン酸塩、アルキルエーテルスルホコハク酸塩、アルキルエーテルリン酸塩、アルキルエーテル硫酸塩またはアルキルエーテルカルボン酸塩である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記アニオン性界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウム、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム、オレイン酸ナトリウム、パルミチン酸ナトリウム、ミリスチン酸ナトリウムまたはステアリン酸ナトリウムである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記アニオン性界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウムまたはドデシル硫酸リチウムである、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１のバッファーが、炭酸塩、炭酸水素塩、リン酸塩、ホウ酸塩、ビス−トリスプロパン、およびビシンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第２のバッファーが、リン酸塩、グリシン、クエン酸、酢酸、ＭＥＳ、カコジル酸、炭酸、ビス−トリス、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、イミダゾール、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＡＭＰＳＯ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳＯおよびトリエタノールアミンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記第２のバッファーが前記第１のバッファーよりも大きい緩衝能を有し、これにより前記第２の反応混合物のｐＨをｐＨ  ６〜ｐＨ  ９の間に維持する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記組成物がさらに糖類または糖アルコールを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記糖類がショ糖である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記糖アルコールがグリセロールである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１のインキュベーション時間が１分間〜１５分間の間である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１のインキュベーション時間が５分間〜１５分間の間である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１のインキュベーション時間が１０分間〜１５分間の間である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記第１のインキュベーション温度が室温または常温である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１のインキュベーション温度が２５℃〜７０℃である、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記第２のインキュベーション時間が１分間〜１５分間の間である、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記第２のインキュベーション時間が５分間〜１５分間の間である、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記第２のインキュベーション時間が１０分間〜１５分間の間である、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記第２のインキュベーション温度が２５℃〜８０℃の間である、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記第２のインキュベーション温度が３５℃〜８０℃の間である、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記第２のインキュベーション温度が５０℃〜８０℃の間である、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記第２のインキュベーション温度が７０℃である、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記第１のインキュベーション時間が５分間〜１０分間の間であり、前記第２のインキュベーション時間がおよそ１０分間である、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
還元剤を前記第２の反応混合物に加える工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
トリアルキルホスフィン化合物、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール、亜硫酸水素ナトリウム、チオグリコール酸、メルカプトエタンスルホン酸、グルタチオンまたはこれらの組合せからなる群から選択される還元剤を前記第２の反応混合物に加える工程をさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記トリアルキルホスフィン化合物がトリ−ｎ−ブチルホスフィン（ＴＢＰ）またはトリス［２−カルボキシエチル］ホスフィン（ＴＣＥＰ）である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記組成物がアルキル化剤をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記蛍光標識されたタンパク質が電気泳動により分離される、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
前記蛍光標識されたタンパク質がスラブゲル電気泳動を使用して分離される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記蛍光標識されたタンパク質がキャピラリーゲル電気泳動を使用して分離される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記蛍光標識されたタンパク質がクロマトグラフィにより分離される、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
前記蛍光標識されたタンパク質を可視化する工程が撮像する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
前記可視化する工程が前記蛍光標識されたタンパク質の前記分離の間に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４１】
前記可視化する工程が前記蛍光標識されたタンパク質の前記分離後に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４２】
前記蛍光標識されたタンパク質が、使い捨てのカセット内に備えられるスラブゲル上で分離される、請求項１に記載の方法。
【請求項４３】
前記可視化する工程が前記使い捨てのカセット内のスラブゲルを用いて行われる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
可視化する工程が前記蛍光標識されたタンパク質の前記分離の間に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４５】
可視化が前記蛍光標識されたタンパク質の前記分離後に行われる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記方法が１時間未満で完結する、請求項１に記載の方法。
【請求項４７】
前記方法が３０分間未満で完結する、請求項１に記載の方法。
【請求項４８】
前記方法が２０分間未満で完結する、請求項１に記載の方法。
【請求項４９】
前記方法が１０分間未満で完結する、請求項１に記載の方法。
【請求項５０】
前記タンパク質の混合物がタグ化タンパク質を含み、前記第２のバッファーがさらに前記タグ化タンパク質上のタグに結合するタグ結合蛍光発生性試薬を含み、前記アミン反応性蛍光発生性試薬が第１の発光波長を有し、前記タグ結合蛍光発生性色素が第２の発光波長を有し、かつ前記第１の発光波長および前記第２の発光波長が異なる、請求項１に記載の方法。
【請求項５１】
前記タグ結合蛍光発生性が二ヒ素フルオロフォアである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記二ヒ素フルオロフォアがフルオレセインまたはレゾルフィンの二ヒ素誘導体である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記二ヒ素フルオロフォアが４’−５’−ビス（１，３，２−ジチオアルソラン−２−イル）フルオレセイン−（２，２−エタンジチオール）２または４’−５’−ビス（１，３，２−ジチオアルソラン−２−イル）レゾルフィン−（２，２−エタンジチオール）２である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
さらに、前記第１の発光波長および前記第２の発光波長を比較する工程を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５５】
前記タグ化タンパク質上の前記タグが、少なくとも４つのシステイン部分を含むペプチドを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５６】
前記ペプチドがＣｙｓ−Ｃｙｓ−Ｘｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ部分を含み、式中、各Ｘが独立に、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンまたはバリンから選択されるアミノ酸であり、かつｎが２〜２０の整数である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５７】
前記ペプチドがＣｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５８】
前記ペプチドがＣｙｓ−Ｃｙｓ−Ｘｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ部分を含み、式中、各Ｘが独立に、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンまたはバリンから選択されるアミノ酸であり、かつｎが２〜２０の整数である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５９】
前記ペプチドがＣｙｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓである、請求項５０に記載の方法。
【請求項６０】
タグ化タンパク質を含むタンパク質の混合物を蛍光標識する工程を含むタンパク質分析のための方法であって、前記標識する工程が、
ａ）前記タンパク質の混合物を、
ｉ）ｐＨ  ８〜ｐＨ  １０の間のｐＨを有する第１のバッファーと、
ｉｉ）アミン反応性蛍光色素、または前記タグ化タンパク質上のタグに結合するタグ結合蛍光発生性試薬と
を含む第１の組成物と混合することによって、第１の反応混合物を形成する工程と、
ｂ）前記第１の反応混合物を、第１の温度で第１のインキュベーション時間の間インキュベーションする工程と、
ｃ）第２の組成物を前記第１の反応混合物と混合することによって、第２の反応混合物を形成する工程であって、前記第２の組成物は、
ｉ）ｐＨ  ６〜ｐＨ  １０の間のｐＨを有する第２のバッファーと、
ｉｉ）アミン反応性蛍光色素、またはタグ結合蛍光発生性試薬（ただし、前記第１の組成物がアミン反応性蛍光色素を含む場合、前記第２の組成物はタグ結合蛍光発生性試薬を含み、前記第１の組成物がタグ結合蛍光発生性試薬を含む場合、前記第２の組成物はアミン反応性蛍光色素を含む）と、
ｉｉｉ）少なくとも１つの還元剤と
を含む工程と、
ｄ）前記第２の反応混合物を、第２の温度で第２のインキュベーション時間の間インキュベーションする工程と、
ｅ）前記蛍光標識されたタンパク質を分離し、可視化する工程と
を含み、前記第１のバッファーは一級または二級アミンを含まず、前記アミン反応性蛍光色素は第１の発光波長を有し、前記タグ結合蛍光発生性色素は第２の発光波長を有し、かつ前記第１の発光波長および前記第２の発光波長は異なる、方法。
【請求項６１】
さらに、前記第１の発光波長および前記第２の発光波長を比較する工程を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記アミン反応性蛍光色素がフルオレセイン部分、ローダミン部分、アクリジン部分、クマリン部分、インドール部分、イソインドール部分、インドリジン部分、キノリン部分、イソキノリン部分、クロメン部分、キサンテン部分、ナフタレン部分、ピレン部分、ビマン部分およびＢＯＤＩＰＹ部分からなる群から選択される蛍光性部分を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記アミン反応性蛍光色素がさらに、アシルアジド、カルボニルアジド、イソチオシアネート、イソシアネート、スクシンイミジルエステル、カルボン酸エステル、カルボン酸、スクシンイミジルエステル、スルホスクシンイミジルエステル、ＳＴＰエステル、テトラフルオロフェニルエステル、塩化スルホニル、酸ハロゲン化物、アルデヒド、カルボキシアルデヒド、ジクロロトリアジン、ＮＢＤ塩化物、またはＮＢＤフッ化物からなる群から選択される反応性部分を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
前記アミン反応性蛍光色素が、７−ヒドロキシ−９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）スクシンイミジルエステル（ＤＤＡＯ−ＳＥ）、Ｂｏｄｉｐｙ  ＴＲ−Ｘ−スクシンイミジルエステル、およびＢｏｄｉｐｙ  ６５０／６６５−スクシンイミジルエステルからなる群から選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６５】
前記第１のバッファーが、炭酸塩、炭酸水素塩、リン酸塩、ホウ酸塩、ビス−トリスプロパン、およびビシンからなる群から選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６６】
前記第２のバッファーが、リン酸塩、グリシン、クエン酸、酢酸、ＭＥＳ、カコジル酸、炭酸、ビス−トリス、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、イミダゾール、ＢＥＳ、ＡＭＰＳＯ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳＯおよびトリエタノールアミンからなる群から選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６７】
前記第１の組成物がさらにアニオン性界面活性剤を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６８】
前記アニオン性界面活性剤が、アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキルスルホン酸塩、アルキルスルホコハク酸塩、アルキルリン酸塩、アルキル硫酸塩、アルキルカルボン酸塩、アルキルエーテルベンゼンスルホン酸塩、アルキルエーテルスルホン酸塩、アルキルエーテルスルホコハク酸塩、アルキルエーテルリン酸塩、アルキルエーテル硫酸塩またはアルキルエーテルカルボン酸塩である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記アニオン性界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウム、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム、オレイン酸ナトリウム、パルミチン酸ナトリウム、ミリスチン酸ナトリウムまたはステアリン酸ナトリウムである、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
前記アニオン性界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウムまたはドデシル硫酸リチウムである、請求項６７に記載の方法。
【請求項７１】
前記第１の組成物がさらに、糖類または糖アルコールを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項７２】
前記糖類がショ糖である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記糖アルコールがグリセロールである、請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
前記第１のインキュベーション時間が１分間〜１５分間の間である、請求項６０に記載の方法。
【請求項７５】
前記第１のインキュベーション時間が５分間〜１５分間の間である、請求項６０に記載の方法。
【請求項７６】
前記第１のインキュベーション時間が１０分間〜１５分間の間である、請求項６０に記載の方法。
【請求項７７】
前記第１のインキュベーション温度が室温である、請求項６０に記載の方法。
【請求項７８】
前記第１のインキュベーション温度が常温である、請求項６０に記載の方法。
【請求項７９】
前記第１のインキュベーション温度が２５℃〜７０℃である、請求項６０に記載の方法。
【請求項８０】
前記第２のインキュベーション時間が１分間〜１５分間の間である、請求項６０に記載の方法。
【請求項８１】
前記第２のインキュベーション時間が５分間〜１５分間の間である、請求項６０に記載の方法。
【請求項８２】
前記第２のインキュベーション時間が１０分間〜１５分間の間である、請求項６０に記載の方法。
【請求項８３】
前記第２のインキュベーション温度が２５℃〜８０℃である、請求項６０に記載の方法。
【請求項８４】
前記第２のインキュベーション温度が３５℃〜８０℃である、請求項６０に記載の方法。
【請求項８５】
前記第２のインキュベーション温度が５０℃〜８０℃である、請求項６０に記載の方法。
【請求項８６】
前記第２のインキュベーション温度が７０℃である、請求項６０に記載の方法。
【請求項８７】
前記第１のインキュベーション時間が５分間〜１０分間の間であり、前記第２のインキュベーション時間がおよそ１０分間である、請求項６０に記載の方法。
【請求項８８】
前記還元剤が、トリアルキルホスフィン化合物、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール、亜硫酸水素ナトリウム、チオグリコール酸、メルカプトエタンスルホン酸、グルタチオンまたはこれらの組合せから選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項８９】
前記タグ化タンパク質上の前記タグに結合する前記蛍光発生性色素が二ヒ素フルオロフォアである、請求項６０に記載の方法。
【請求項９０】
前記二ヒ素フルオロフォアがフルオレセインまたはレゾルフィンの二ヒ素誘導体である、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記二ヒ素フルオロフォアが４’−５’−ビス（１，３，２−ジチオアルソラン−２−イル）フルオレセイン−（２，２−エタンジチオール）２または４’−５’−ビス（１，３，２−ジチオアルソラン−２−イル）レゾルフィン−（２，２−エタンジチオール）２である、請求項８９に記載の方法。
【請求項９２】
前記タグ化タンパク質上の前記タグが、少なくとも４つのシステイン部分を含むペプチドを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項９３】
前記ペプチドがＣｙｓ−Ｃｙｓ−Ｘｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ部分を含み、式中、各Ｘが独立にアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンまたはバリンから選択されるアミノ酸であり、かつｎが２〜２０の整数である、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記ペプチドがＣｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓである、請求項９２に記載の方法。
【請求項９５】
前記ペプチドがＣｙｓ−Ｃｙｓ−Ｘｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ部分を含み、式中、各Ｘが独立にアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンまたはバリンから選択されるアミノ酸であり、かつｎが２〜２０の整数である、請求項９２に記載の方法。
【請求項９６】
前記ペプチドがＣｙｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓである、請求項９２に記載の方法。
【請求項９７】
タグ化タンパク質を含むタンパク質の混合物を蛍光標識するためのキットであって、
ａ）ｐＨ  ８〜ｐＨ  １０の範囲のｐＨを有するバッファーと、アミン反応性蛍光発生性試薬またはアミン反応性蛍光色素と、糖類または糖アルコールと、アニオン性界面活性剤とを含む第１の組成物と、
ｂ）ｐＨ  ６〜ｐＨ  １０の範囲の第２のバッファーと、任意にタグ結合蛍光発生性試薬とを含む第２の組成物と
を含む、キット。
【請求項９８】
前記第１の組成物がアミン反応性蛍光発生性試薬を含み、さらにアセトンシアノヒドリン、ニトリルまたはシアン化アルカリのいずれかを含む、請求項９７に記載のキット。
【請求項９９】
前記第１の組成物がアセトンシアノヒドリンまたはマンデロニトリルのいずれかを含む、請求項９８に記載のキット。
【請求項１００】
前記組成物がシアン化アルカリを含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０１】
前記シアン化アルカリがシアン化ナトリウムまたはシアン化カリウムである、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記アミン反応性蛍光発生性試薬がアロイル−２−キノリン−カルボキシアルデヒド試薬である、請求項９７に記載のキット。
【請求項１０３】
前記アロイル−２−キノリン−カルボキシアルデヒド試薬が、３−（４−カルボキシベンゾイル）キノリン−２−カルボキシアルデヒドまたは３−（２−フロイル）キノリン−２−カルボキシアルデヒド）である、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記アロイル−２−キノリン−カルボキシアルデヒド試薬が３−（２−フロイル）キノリン−２−カルボキシアルデヒド）である、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記第１の組成物が、フルオレセイン部分、ローダミン部分、アクリジン部分、クマリン部分、インドール部分、イソインドール部分、インドリジン部分、キノリン部分、イソキノリン部分、クロメン部分、キサンテン部分、ナフタレン部分、ピレン部分、ビマン部分およびＢＯＤＩＰＹ部分からなる群から選択される蛍光性部分を含むアミン反応性蛍光色素を含む、請求項９７に記載のキット。
【請求項１０６】
前記アミン反応性蛍光色素がさらに、アシルアジド、カルボニルアジド、イソチオシアネート、イソシアネート、スクシンイミジルエステル、カルボン酸エステル、カルボン酸、スクシンイミジルエステル、スルホスクシンイミジルエステル、ＳＴＰエステル、テトラフルオロフェニルエステル、塩化スルホニル、酸ハロゲン化物、アルデヒド、カルボキシアルデヒド、ジクロロトリアジン、ＮＢＤ塩化物、またはＮＢＤフッ化物からなる群から選択される反応性部分を含む、請求項１０５に記載のキット。
【請求項１０７】
前記第２の組成物がさらに、少なくとも４つのシステイン部分に結合するタグ結合蛍光発生性試薬、および少なくとも１つの還元剤を含み、前記アミン反応性蛍光発生性試薬または蛍光色素が第１の発光波長を有し、前記タグ結合蛍光発生性色素が第２の発光波長を有し、かつ前記第１の発光波長および前記第２の発光波長が異なる、請求項９７に記載のキット。
【請求項１０８】
前記タグ結合蛍光発生性試薬がフルオレセインまたはレゾルフィンの二ヒ素誘導体である、請求項１０７に記載のキット。
【請求項１０９】
前記二ヒ素フルオロフォアが４’−５’−ビス（１，３，２−ジチオアルソラン−２−イル）フルオレセイン−（２，２−エタンジチオール）２または４’−５’−ビス（１，３，２−ジチオアルソラン−２−イル）レゾルフィン−（２，２−エタンジチオール）２である、請求項１０８に記載のキット。
【請求項１１０】
ｐＨ  ８〜ｐＨ  １０の範囲のｐＨを有するバッファーと、タグ結合蛍光発生性色素と、アニオン性界面活性剤と、糖類または糖アルコールと、追跡用色素と、１以上の還元剤と、炭酸水素塩とを含む組成物。
【請求項１１１】
前記１以上の還元剤が、トリアルキルホスフィン化合物、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール、亜硫酸水素ナトリウム、チオグリコール酸、メルカプトエタンスルホン酸またはグルタチオンから選択される、請求項１１０に記載の組成物。
【請求項１１２】
前記トリアルキルホスフィン化合物がトリ−Ｎ−ブチルホスフィン（ＴＢＰ）またはトリス［２−カルボキシエチル］ホスフィン（ＴＣＥＰ）である、請求項１１１に記載の組成物。
【請求項１１３】
前記タグ結合蛍光発生性色素が二ヒ素フルオロフォアである、請求項１１０に記載の組成物。
【請求項１１４】
前記二ヒ素フルオロフォアがフルオレセインの二ヒ素誘導体である、請求項１１３に記載の組成物。
【請求項１１５】
前記二ヒ素フルオロフォアが４’−５’−ビス（１，３，２−ジチオアルソラン−２−イル）フルオレセイン−（２，２−エタンジチオール）２である、請求項１１４に記載の組成物。
【請求項１１６】
前記二ヒ素フルオロフォアがレゾルフィンの二ヒ素誘導体である、請求項１１４に記載の組成物。
【請求項１１７】
前記二ヒ素フルオロフォアが４’−５’−ビス（１，３，２−ジチオアルソラン−２−イル）レゾルフィン−（２，２−エタンジチオール）２である、請求項１１６に記載の組成物。
【請求項１１８】
前記アニオン性界面活性剤が、アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキルスルホン酸塩、アルキルスルホコハク酸塩、アルキルリン酸塩、アルキル硫酸塩、アルキルカルボン酸塩、アルキルエーテルベンゼンスルホン酸塩、アルキルエーテルスルホン酸塩、アルキルエーテルスルホコハク酸塩、アルキルエーテルリン酸塩、アルキルエーテル硫酸塩またはアルキルエーテルカルボン酸塩である、請求項１１０に記載の組成物。
【請求項１１９】
前記アニオン性界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウム、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム、オレイン酸ナトリウム、パルミチン酸ナトリウム、ミリスチン酸ナトリウムまたはステアリン酸ナトリウムである、請求項１１８に記載の組成物。
【請求項１２０】
前記アニオン性界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウムまたはドデシル硫酸リチウムである、請求項１１８に記載の組成物。
【請求項１２１】
前記糖類がショ糖である、請求項１１０に記載の組成物。
【請求項１２２】
前記糖アルコールがグリセロールである、請求項１１０に記載の組成物。
【請求項１２３】
前記追跡用色素がブロモフェノールブルーである、請求項１１０に記載の組成物。
【請求項１２４】
前記バッファーが炭酸塩、炭酸水素塩、リン酸塩、ホウ酸塩、ビス−トリスプロパン、およびビシンからなる群から選択される、請求項１１０に記載の組成物。
【請求項１２５】
前記組成物がさらにタグ化タンパク質を含む、請求項１１０に記載の組成物。
【請求項１２６】
前記組成物がさらにアミン反応性蛍光色素を含む、請求項１２５に記載の組成物。
【請求項１２７】
前記アミン反応性蛍光色素が、フルオレセイン部分、ローダミン部分、アクリジン部分、クマリン部分、インドール部分、イソインドール部分、インドリジン部分、キノリン部分、イソキノリン部分、クロメン部分、キサンテン部分、ナフタレン部分、ピレン部分、ビマン部分およびＢＯＤＩＰＹ部分からなる群から選択される蛍光性部分を含む、請求項１２６に記載の組成物。
【請求項１２８】
前記アミン反応性蛍光色素がさらに、アシルアジド、カルボニルアジド、イソチオシアネート、イソシアネート、スクシンイミジルエステル、カルボン酸エステル、カルボン酸、スクシンイミジルエステル、スルホスクシンイミジルエステル、ＳＴＰエステル、テトラフルオロフェニルエステル、塩化スルホニル、酸ハロゲン化物、アルデヒド、カルボキシアルデヒド、ジクロロトリアジン、ＮＢＤ塩化物、またはＮＢＤフッ化物からなる群から選択される反応性部分を含む、請求項１２７に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００７年５月１８日出願の米国仮出願第６０／９３８，９７３号の利益を主張する。この仮出願は、その全体を、本開示と不整合性がない程度まで参照により本願明細書に援用したものとする。
【０００２】
発明の背景
本発明は、タンパク質を標識すること、ならびに電気泳動およびクロマトグラフィによる方法を含めた分離技術を使用した、かかる標識されたタンパク質の分析に関する。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、タンパク質、特に細胞ライセート内またはタンパク質の混合物中の注目する特異的タンパク質を標識、分離および分析するための方法および組成物を提供する。１つの実施形態では、このタンパク質（１種または複数種）はアミン反応性またはチオール反応性の蛍光色素で標識される。別の実施形態では、このタンパク質（１種または複数種）は、当該タンパク質上に存在するアミン基に反応した際に蛍光性となるアミン反応性蛍光発生性試薬で標識される。標識する工程の後、この混合物内のタンパク質は分離して分析することができる。さらなる実施形態では、蛍光色素または蛍光発生性試薬であってよい第１の標識化合物は、当該混合物中のすべてのタンパク質を標識するために使用され、第２の標識化合物、つまりタグ化タンパク質に結合することができる蛍光発生性試薬は、注目するタンパク質を特異的に標識するために使用される。
【０００４】
標識後、かかる標識されたタンパク質および／またはタンパク質断片は、電気泳動手法、クロマトグラフィ手法、免疫ブロット法、質量分析、およびこれらの組合せが挙げられる（これらに限定されない）手法を使用して、分離、検出および分析を受ける。かかる方法は、タンパク質試料、例えば酸性タンパク質、塩基性タンパク質、精製したタンパク質またはライセートの試料を標識および分析するために使用することができる。この方法は、広い線形検出範囲を有して非常に高感度である。かかる方法は再現性がありかつ迅速であり、バックグラウンド染色および他の非特異的なアーチファクトが減少し、かつ電気泳動による泳動、クロマトグラフィによる溶出または試料タンパク質の分離に対して何らの視覚的に検出できる影響を及ぼさない。
【０００５】
１つの実施形態は、タンパク質標識および分析のための方法であって、タンパク質の混合物を、ｐＨ  ８〜ｐＨ  １０の間のｐＨを有する第１のバッファーと、アミン反応性蛍光発生性試薬と、アセトンシアノヒドリン、ニトリルまたはシアン化アルカリのいずれかとを含む組成物と混合することによって、第１の反応混合物を形成する工程を含む方法を提供する。この反応混合物は、第１の温度で第１のインキュベーション時間の間インキュベーションされ、次いで第２のバッファーと混合され、第２の反応混合物を形成する。この第２のバッファーは、ｐＨ  ６〜ｐＨ  ９の間のｐＨを有し、かつ任意に第１のバッファーより大きい緩衝能を有し、このためこの第２の反応混合物のｐＨはｐＨ  ６〜ｐＨ  ９の間である。次いでこの第２の反応混合物は、第２のインキュベーション時間（これは、第１のインキュベーション時間と同じであってもよいし、異なっていてもよい）の間、第２の温度（これも、第１の温度と同じであってもよいし、異なっていてもよい）でインキュベーションされる。次いで蛍光標識されたタンパク質は、分離され、可視化される。この第１の反応混合物はまた、任意にアニオン性界面活性剤、糖類もしくは糖アルコール、またはアルキル化剤をも含む。この第２の反応混合物は、任意に１以上の還元剤をも含む。
【０００６】
さらなる実施形態では、タンパク質の混合物はさらに、タグ化されている注目するタンパク質を含み、第２のバッファーはさらに、このタグ化タンパク質上のタグに結合するタグ結合蛍光発生性試薬を含む。このアミン反応性蛍光発生性試薬は第１の発光波長を有し、タグ結合蛍光発生性試薬は第２の発光波長を有する。これらの発光波長は異なり、このためこれらの波長を比較分析することができる。
【０００７】
別の実施形態は、タンパク質標識および分析のための方法であって、タンパク質の混合物を、ｐＨ  ８〜ｐＨ  １０の間のｐＨを有する第１のバッファーと、アミン反応性蛍光色素またはタグ結合蛍光発生性試薬のいずれかとを含む第１の組成物と混合することによって第１の反応混合物を形成する工程を含む方法を提供する。この反応混合物は、第１の温度で第１のインキュベーション時間の間インキュベーションされ、次いで第２の組成物と混合され、第２の反応混合物を形成する。この第２の組成物は、ｐＨ  ６〜ｐＨ  １０の間のｐＨを有する第２のバッファーと、少なくとも１つの還元剤と、アミン反応性蛍光色素またはタグ結合蛍光発生性試薬のいずれかとを含む。第１の組成物がアミン反応性蛍光色素を含む場合、この第２の組成物はタグ結合蛍光発生性試薬を含み、第１の組成物がタグ結合蛍光発生性試薬を含む場合、この第２の組成物はアミン反応性蛍光色素を含む。次いでこの第２の反応混合物は、第２のインキュベーション時間（これは、第１のインキュベーション時間と同じであってもよいし、異なっていてもよい）の間、第２の温度（これも、第１の温度と同じであってもよいし、異なっていてもよい）でインキュベーションされる。次いで蛍光標識されたタンパク質は分離され、可視化される。このアミン反応性蛍光色素は第１の発光波長を有し、タグ結合蛍光発生性試薬は第２の発光波長を有する。これらの発光波長は異なり、このためこれらの波長を比較分析することができる。
【０００８】
他の実施形態は、タンパク質の混合物を含む試料を沈殿させ、次いで本願明細書に記載される標識溶液中でその試料を再構成する工程を含む。この沈殿工程は、最初の試料中に存在した邪魔する可能性がある化学成分または求められていない化学成分を取り除き得る。あるいは、またはこの沈殿工程に加えて、タンパク質またはタンパク質の混合物は、標識に対する何らかの還元剤の負の影響を排除するために、標識する前にアルキル化されてもよい。
【０００９】
別の実施形態は、タンパク質を蛍光標識するためのキットであって、ａ）ｐＨ  ８〜ｐＨ  １０の範囲のｐＨを有するバッファーと、アミン反応性蛍光発生性試薬またはアミン反応性蛍光色素のいずれかと、糖類または糖アルコールと、アニオン性界面活性剤とを有する第１の組成物と、ｂ）ｐＨ  ６〜ｐＨ  １０の範囲のｐＨを有する第２のバッファーを含む第２の組成物とを含むキットを提供する。第１の組成物がアミン反応性蛍光発生性試薬を含むさらなる実施形態では、この第１の組成物はまた、アセトンシアノヒドリン、ニトリル、またはシアン化アルカリのいずれか、好ましくはマンデロニトリルなどのニトリルも含む。さらなる実施形態では、この第１の組成物はアミン反応性蛍光色素を含む。さらなる実施形態では、この第２の組成物はさらに、少なくとも４つのシステイン部分に結合するタグ結合蛍光発生性試薬と、少なくとも１つの還元剤とを含み、上記アミン反応性蛍光発生性試薬または蛍光色素は第１の発光波長を有し、上記タグ結合蛍光発生性色素は第２の発光波長を有し、かつこの第１の発光波長および第２の発光波長は異なる。
【００１０】
例示的な実施形態では、スラブゲル電気泳動を使用するタンパク質分析のための本願明細書に記載される方法および組成物によって、そのゲルを染色および撮像するためにゲルを取り扱う必要性、または電気泳動カセットを開く必要性なしに、迅速なリアルタイム分析が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】アミン反応性蛍光発生性試薬を使用する本願明細書に記載される全タンパク質標識および分析のための方法のある実施形態を示す概略図である。
【図２】アミン反応性蛍光発生性試薬を使用する本願明細書に記載される全タンパク質標識および分析のための方法のある１つの実施形態の概略図である。
【図３】本願明細書に記載される標識および分析方法を使用するタンパク質発現分析のための方法のある実施形態を示す概略図である。
【図４】本願明細書に記載される標識および分析を使用するタンパク質発現分析のための方法のある１つの実施形態の概略図である。
【図５】図５Ａは本願明細書に記載される方法を使用して標識されたタンパク質およびタンパク質スタンダードのゲル画像であり、他方、図５Ｂは、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色した後の図５Ａに示されたゲルの画像である。
【図６】本願明細書に記載されるタンパク質標識方法を使用して得られる検出感度を示す図である。図６Ａは本願明細書に記載される方法を使用して標識されたタンパク質のゲル画像であり、他方、図６ＢはＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色した後の図６Ａに示されたゲルの画像である。
【図７】２つの異なる検出機器を用いて本願明細書に記載されるタンパク質標識方法を使用して得られた検出感度を比較した図である。図７Ａは、４７７ｎｍ  ＥＰＩ光源、５２０〜６４０ｎｍのバンドパスフィルターおよび６０秒の露光時間を用いて、富士フイルム（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）のＬＡＳ−１０００を使用して、本願明細書に記載される方法を使用して標識されたＢＳＡのゲル画像である。図７Ｂは、８秒の露光時間で、Ｓａｆｅ  Ｉｍａｇｅｒ（商標）トランスイルミネーター（約４７０ｎｍ光源）およびコダック（Ｋｏｄａｋ）  ＤＣ２９０デジタルカメラ（２．１  ＭＰ）を使用して得られた画像である。図７Ｃは、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎを使用した全タンパク質染色後の図７Ａおよび図７Ｂに示されたゲルの画像である。
【図８】３つの異なる標識時間で本願明細書に記載される方法を使用した、Ｅ．ｃｏｌｉライセートの標識を示す図である。図８Ａは、４７７ｎｍ  ＥＰＩ光源、５２０〜６４０ｎｍバンドパスフィルターおよび３０秒の露光時間を用いて、富士フイルムのＬＡＳ−１０００を使用して得られたＥ．ｃｏｌｉライセート（還元したもの）の蛍光ゲル画像である。図８Ｂは、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色した後の図８Ａに示されたゲルの画像である。
【図９】本願明細書に記載される方法を使用した様々なタンパク質の標識を比較した図である。図９Ａは、レーン１の標識されたリゾチーム（還元したもの）およびレーン２のＳｅｅＢｌｕｅ（登録商標）Ｐｌｕｓ２  着色済みスタンダード（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ））の（蛍光およびＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）染色後の）ゲル画像であり、他方、図９Ｂは、レーン１のＳｅｅＢｌｕｅ（登録商標）Ｐｌｕｓ２  着色済みスタンダード（インビトロジェン、カールスバッド）およびレーン３のラット肝臓ライセートの（蛍光およびＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）染色後の）ゲル画像であり、レーン２には何もない。蛍光画像は、４７７ｎｍ  ＥＰＩ光源、５２０〜６４０ｎｍバンドパスフィルターおよび３０秒の露光時間を用いて、富士フイルムのＬＡＳ−１０００を使用して得られた。
【図１０】ｈ−ＩｇＧ、ミオグロビンおよびＢＳＡの未変性標識を示す。図１０ＡはＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）Ｓａｆｅ  Ｓｔａｉｎで染色した後のゲル画像であり、他方、図１０Ｂは本願明細書に記載される方法を使用して標識されたｈ−ＩｇＧ、ミオグロビンおよびＢＳＡのゲル画像である。蛍光画像は、４７７ｎｍ  ＥＰＩ光源、５２０〜６４０ｎｍバンドパスフィルターおよび１分間の露光時間を用いて、富士フイルムのＬＡＳ−１０００を使用して得られた。
【図１１】標識反応において存在したＬＤＳおよびショ糖を伴う変性条件下でのｈ−ＩｇＧ、ミオグロビン、ＢＳＡ、およびＥ．ｃｏｌｉライセートの標識後の蛍光を示す図である。上側のゲル画像はＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）Ｓａｆｅ  Ｓｔａｉｎで染色した後に得られたものであり、他方、下側の画像は本願明細書に記載される方法を使用して標識されたｈ−ＩｇＧ、ミオグロビン、ＢＳＡ、およびＥ．ｃｏｌｉライセートの蛍光ゲル画像である。蛍光画像は４７７ｎｍ  ＥＰＩ光源、５２０〜６４０ｎｍバンドパスフィルターおよび１分間の露光時間を用いて、富士フイルムのＬＡＳ−１０００を使用して得られた。
【図１２】本願明細書に記載される方法を使用してＢＳＡを標識するための反応物質濃度および標識時間の関数としてバンドのシャープさおよびシグナル強度を示す図である。上側のゲル画像は、本願明細書に記載されるようにして標識されたＢＳＡからの蛍光画像であり、他方、下側の画像は、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）Ｓａｆｅ  Ｓｔａｉｎで染色した後のゲルである。これらの蛍光画像は、４７７ｎｍ  ＥＰＩ光源、５２０〜６４０ｎｍバンドパスフィルターおよび１分間の露光時間を用いて、富士フイルムのＬＡＳ−１０００を使用して得られた。
【図１３】高い温度でタンパク質を標識することに対する蛍光過飽和、高温での標識、および低ｐＨへの標識されたタンパク質の曝露の効果を示す図である。
【図１４】本願明細書に記載される方法で使用される電気泳動ゲルカセットの１つの実施形態の図である。
【図１５】本願明細書に記載される方法で使用される電気泳動ゲルカセット１つの実施形態の断面図である。
【図１６】本願明細書に記載される方法で使用されるある電気泳動ゲルカセットについての開口部およびウェルの配置の実施形態を示す図である。
【図１７】４７３ｎｍ励起および５２０ｎｍ発光を使用して得られたゲルカセット画像であり、Ｅ．ｃｏｌｉライセート中の注目するタンパク質に対する、二ヒ素試薬を用いた標識の特異性を示す。
【図１８】５３２ｎｍ励起および５８０ｎｍ発光を使用して得られたゲルカセット画像であり、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ−Ｘ  ＳＥを用いたＥ．ｃｏｌｉライセートの全タンパク質標識を示す。
【図１９】６３３ｎｍ励起および６７５ｎｍ発光を使用して得られたゲルカセット画像であり、ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５  ＳＥを用いたＥ．ｃｏｌｉライセートの全タンパク質標識を示す。
【図２０】４７３ｎｍ励起および５２０ｎｍ発光を使用して得られた画像であり、Ｅ．ｃｏｌｉライセート中の注目するタンパク質に対する、二ヒ素試薬を用いた標識の特異性を示す。
【図２１】５３２ｎｍ励起および５８０ｎｍ発光を使用して得られた画像であり、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ−Ｘ  ＳＥを用いたＥ．ｃｏｌｉライセート、哺乳動物細胞ライセート、タンパク質スタンダードセットおよびタンパク質ラダーの全タンパク質標識を示す。
【図２２】６３３ｎｍ励起および６７５ｎｍ発光を使用して得られた画像であり、ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５  ＳＥを用いたＥ．ｃｏｌｉライセート、哺乳動物の細胞ライセート、タンパク質スタンダードセットおよびタンパク質ラダーの全タンパク質標識を示す。
【００１２】
本発明の方法および組成物の特徴および利点は、本発明の方法、組成物、装置（ｄｅｖｉｃｅ）および装置（ａｐｐａｒａｔｕｓ）の原理が利用される例示となる実施形態を示す以下の詳細な説明、ならびに添付の図面を参照して、よりよく理解されるであろう。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
定義
別段の定義がされない限り、本願明細書中で使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が共通に理解するのと同じ意味を有する。一般に、本願明細書中で使用される名称は当該技術分野で周知であり、一般に用いられる。「上向き」および「下向き」、「頂部」および「底部」、「〜の上に」および「〜の下に」または「上側」または「下側」などの方向付けの用語は、装置の使用中における部分の方向付けを指す。ある用語が単数形で提示される場合、本発明者らはその用語の複数形も企図している。参照により援用される引用文献で使用される用語および定義において不一致が存在する場合、本願で使用される用語は、本願明細書で提示される定義を有するものとする。本開示全体で用いられる場合、以下の用語は、特に示されない限り、以下の意味を有すると理解されるものとする。
【００１４】
本願明細書で使用する場合の用語「常温」は、約２０℃〜約２５℃の範囲の温度を指す。本願明細書で使用する場合の用語「室温」は、約２０℃〜約２５℃の範囲の温度を指す。
【００１５】
用語「タンパク質（１種または複数種）」は、本願明細書で使用する場合、全長タンパク質、タンパク質断片、未変性の状態のタンパク質または変性されたタンパク質を含む。タンパク質の混合物は、全長タンパク質の混合物、タンパク質断片の混合物、または全長タンパク質およびタンパク質断片の混合物であってよい。タンパク質は酸性のものであってもよいし、塩基性のものであってもよく、細胞ライセート由来の混合物として精製することができる。
【００１６】
用語「ペプチド」は、本願明細書で使用する場合、２以上のアミノ酸を含む化合物を指す。これらのアミノ酸は一緒に連結しペプチド鎖を形成する。ペプチドの生物学的産生には２０種の異なる天然に存在するアミノ酸が関係し、任意の数のそれらアミノ酸を任意の順序で連結して、ペプチド鎖を形成することができる。ペプチドの生物学的産生で用いられる天然に存在するアミノ酸はすべてＬ−配置を有する。合成ペプチドは、従来の合成方法を用いて、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸またはこの２つの異なる配置のアミノ酸の種々の組み合わせを用いて調製することができる。一部のペプチド鎖は数個のアミノ酸単位のみを含む。例えば１０個未満のアミノ酸単位を有する短いペプチド鎖は「オリゴペプチド」と呼ばれることがあり、この接頭辞「オリゴ」は「数個の」を表す。他のペプチド鎖は例えば、１００個までまたはこれより多くの非常に多くのアミノ酸単位を含み、「ポリペプチド」と呼ばれる。ここで、接頭辞「ポリ」は「多くの」を表す。一定数のアミノ酸単位を含むさらなる他のペプチド鎖は、鎖中の単位の一定数を表す接頭辞を用いて呼ばれる。例えば、オクタペプチドでは、接頭辞「オクタ」は８を表す。慣例として、「ポリペプチド」は３以上のアミノ酸を含む任意のペプチド鎖と考えることができ、一方、「オリゴペプチド」は、通常は特定の種類の「短い」ポリペプチド鎖と考えられる。従って、本願明細書で使用する場合、「ポリペプチド」と言うときはいつも、オリゴペプチドも含むことを理解されたい。さらに、「ペプチド」と言うときはいつもポリペプチド、オリゴペプチドを含む。アミノ酸の各々異なる配置によって、異なるポリペプチド鎖が形成される。特定の限定を意図しない例では、このポリペプチドは４０〜４０００個のアミノ酸、５０〜３０００個のアミノ酸、または７５〜２０００個のアミノ酸を含む。
【００１７】
「蛍光性部分」の用語「フルオロフォア」は、本願明細書で使用する場合、本質的に蛍光性である化合物、化学基、または組成物を指す。フルオロフォアは、フルオロフォアの溶解性、スペクトル特性または物理的特性を変える置換基を含むことができる。多数のフルオロフォアは、当業者に公知であり、クマリン、シアニン、ベンゾフラン、キノリン、キナゾリノン、インドール、フラン、ベンズアゾール、ボラポリアザインダセンおよびキサンテン（フルオレセイン、ローダミンおよびロドールを含む）、ならびにＲＩＣＨＡＲＤ  Ｐ．  ＨＡＵＧＬＡＮＤ、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＢＥＳ  ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ  ＰＲＯＢＥＳ  ＡＮＤ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ（第９版、ＣＤ−ＲＯＭ、２００２年９月）に記載されている他のフルオロフォアが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１８】
本願明細書で使用する場合の用語「蛍光発生性」は、プロトン化または生物学的化合物もしくは金属イオンへの結合、または酵素による代謝の際に蛍光性となるかまたは蛍光の変化を呈する化合物、化学基、または組成物を指す。蛍光発生性化合物、基または組成物はまた、反応性基に共有結合で連結した際にも蛍光性となる。
【００１９】
用語「標識の均一性」は、本願明細書で使用する場合、当該タンパク質またはタンパク質断片上の利用可能な反応性部位の標識の程度（ｄｅｇｒｅｅ  ｏｆ  ｌａｂｅｌｉｎｇ）を指す。
【００２０】
用語「反応性基」は、本願明細書で使用する場合、適切な反応条件下で別の化学基と反応して共有結合を形成することができる、すなわち共有結合形成反応性であり、かつ一般に別の物質の結合点を表す基を指す。反応性基には、一般に求核剤、求電子剤および光活性化可能な基が含まれる。反応性基の例としては、オレフィン、アセチレン、アルコール、フェノール、エーテル、オキシド、ハロゲン化物、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、エステル、アミド、シアネート、イソシアネート、チオシアネート、イソチオシアネート、アミン、ヒドラジン、ヒドラゾン、ヒドラジド、ジアゾ、ジアゾニウム、ニトロ、ニトリル、メルカプタン、スルフィド、ジスルフィド、スルホキシド、スルホン、スルホン酸、スルフィン酸、アセタール、ケタール、無水物、スルフェート、スルフェン酸、イソニトリル、アミジン、イミド、イミデート（ｉｍｉｄａｔｅ）、ニトロン、ヒドロキシルアミン、オキシム、ヒドロキサム酸、チオヒドロキサム酸、アレン、オルトエステル、スルファイト（ｓｕｌｆｉｔｅ）、エナミン、イナミン、尿素、プソイド尿素（ｐｓｅｕｄｏｕｒｅａ）、セミカルバジド、カルボジイミド、カルバメート、イミン、アジド、アゾ化合物、アゾキシ化合物、およびニトロソ化合物が挙げられるが、これらに限定されない。反応性官能基としては、バイオコンジュゲートを調製するために使用されるもの、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、マレイミドなども挙げられる。これらの官能基の各々を調製するための方法は、当該技術分野で周知であり、特定の目的のためにそれらを適用することまたは修正することは、当業者の能力の範囲内である（例えば、ＳａｎｄｌｅｒおよびＫａｒｏ編、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｒｏｕｐ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、１９８９を参照）。
【００２１】
本願明細書で使用する場合の用語「検出可能な応答」とは、観察または計測のいずれかによって直接または間接的に検出可能なシグナルの発生または変化を指す。典型的には、検出可能な応答は、吸光度もしくは蛍光の波長分布パターンまたは強度の変化、あるいは光散乱、蛍光寿命、蛍光偏光、あるいはこれらのパラメータの組合せの変化をもたらす光学応答である。
【００２２】
本願明細書で使用する場合の用語「色素」とは、光を発して観察可能な検出可能なシグナルを生成する化合物を指す。
【００２３】
本願明細書中で使用する場合の用語「キット」とは、関連する構成成分、通常は１以上の化合物または組成物のパーケージ化されたセットを指す。
【００２４】
用語「標識」は、本願明細書中で使用する場合、標的または化合物に付けられて本発明の方法で使用したときに、（例えば、スペクトル特性、コンホメーションまたは活性に起因して）直接的にまたは間接的に検出可能な化学的部分またはタンパク質を指し、これにはレポーター分子、固体支持体および担体分子が含まれる。本願明細書で使用する場合、標識は総称してレポーター分子、固体支持体または担体分子を指す。この標識は、直接検出可能（フルオロフォア）であってもよいし、間接的に検出可能（ハプテンまたは酵素）であってもよい。かかる標識としては、放射線計測装置を用いて測定することができる放射活性標識；視覚的に観察することができるか、または分光光度計を用いて測定することができる色素（ｐｉｇｍｅｎｔ）、色素（ｄｙｅ）または他の色原体；スピン標識分析器を用いて測定することができるスピン標識；および蛍光標識（フルオロフォア）が挙げられるが、これらに限定されない。これらの場合、出力シグナルは適切な分子付加体の励起によって生成され、そしてそれは、その色素が吸収する光を用いて励起することにより可視化することができるし、または例えば標準的な蛍光光度計または撮像システムを用いて測定することができる。この標識は、化学発光物質（この場合、出力シグナルはシグナル化合物の化学修飾により生成される）、金属含有物質、または酵素（この場合は、シグナルの酵素依存性二次生成（例えば無色の基質からの着色生成物の生成）が起こる）であってもよい。用語「標識」はまた、接合分子を基質とともに後に添加した場合に、接合分子が検出可能なシグナルを生成するために使用されるようにその接合分子に選択的に結合することができる「タグ」またはハプテンをも指す。例えば、タグとしてビオチンを使用し、次いでこのタグに結合するために西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）のアビジン接合体またはストレプトアビジン接合体を使用し、次いで発色基質（例えばテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ））または蛍光発生性基質（例えばＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ試薬（モレキュラープローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．））を使用してＨＲＰの存在を検出することができる。多数の標識が当業者には公知であり、粒子、フルオロフォア、ハプテン、酵素、およびそれらの発色基質、蛍光発生基質、化学発光基質ならびにＲＩＣＨＡＲＤ  Ｐ．  ＨＡＵＧＬＡＮＤ、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＢＥＳ  ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ  ＰＲＯＢＥＳ  ＡＮＤ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＰＲＯＤＵＣＴＳ（第１０版，ＣＤ−ＲＯＭ，２００５年９月）（前出）に記載される他の標識が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２５】
本願明細書で使用する場合、用語「迅速な標識」は、２時間未満で、より好ましくは１時間未満で完結することができる方法を使用してタンパク質を蛍光標識することを指す。ある実施形態では、本願明細書に記載されるタンパク質標識方法は、３０分未満、好ましくは２０分未満、さらにより好ましくは１０分未満で完結する。ある実施形態では、本願明細書に記載されるタンパク質標識方法は、１〜５分未満で完結する。
【００２６】
概して、本発明の理解を容易にするために、全タンパク質標識および発現タグ標識が最初に詳細に説明され、次いでこれらの標識が使用される多くの変更された方法が説明され、次に例示となる使用方法が説明される。
【００２７】
タンパク質を標識するための方法
タンパク質分析のための方法および組成物であって、注目するタンパク質を含むタンパク質の混合物がアミン反応性蛍光色素もしくはチオール反応性蛍光色素と接触、または別の様式で混合され、これによりこのタンパク質を蛍光標識し、存在する全タンパク質の測定が可能となる方法および組成物が、本願明細書で開示される。加えて、この混合物は、注目するタンパク質に付けられたタグに結合する第２の蛍光性部分と接触、または別の様式で混合され、これにより注目するタンパク質の測定値が得られる。この第２の蛍光性部分は、注目するタンパク質に付けられたタグに結合する蛍光色素、または注目するタンパク質に付けられたタグに結合した後に蛍光性となる蛍光発生性試薬である。次いでかかる標識されたタンパク質は、電気泳動による方法、クロマトグラフィによる方法、またはこれらの組合せなどの手法を使用して分離される。この２つの蛍光性部分は、異なる発光特性を有し、これにより二重の蛍光測定が可能になる。この方法はさらに、２つの蛍光測定値を比較して、その混合物中に存在する他のタンパク質に対する注目するタンパク質の測定値を得る工程を含む。ある実施形態では、かかる方法は、タンパク質発現分析のために使用され、その２つの蛍光測定結果の比較から注目するタンパク質の発現のレベルの測定値が得られる。
【００２８】
タンパク質分析のための方法であって、注目するタンパク質を含むタンパク質の混合物が、当該タンパク質上のアミン基またはチオール基と反応した後に蛍光性となるアミン反応性蛍光発生性試薬と接触、または別の様式で混合され、これにより当該タンパク質を蛍光標識して、存在する全タンパク質の測定が可能になる方法もまた、本願明細書に開示される。加えて、この混合物は、注目するタンパク質に付けられたタグに結合する第２の蛍光性部分と接触または別の様式で混合され、これにより注目するタンパク質の測定値が得られる。この第２の蛍光性部分は、注目するタンパク質に付けられたタグに結合する蛍光色素、または注目するタンパク質に付けられたタグに結合した後に蛍光性となる蛍光発生性試薬である。次いでかかる標識されたタンパク質は、電気泳動による方法、クロマトグラフィによる方法、またはこれらの組合せなどの手法を使用して分離される。この２つの蛍光性部分は異なる発光特性を有し、これにより二重の蛍光測定が可能になる。この方法はさらに、この２つの蛍光測定値を比較して、その混合物中に存在する他のタンパク質に対する注目するタンパク質の測定値を得る工程を含む。ある実施形態では、かかる方法は、タンパク質発現分析のために使用され、その２つの蛍光測定結果の比較から注目するタンパク質の発現のレベルの測定値が得られる。
【００２９】
かかる方法における２つの蛍光性部分は同じ励起源から生じる同じ励起波長で励起することができ、またはこの２つの蛍光性部分は異なる励起源から生じる異なる励起波長で励起することができる。加えて、この２つの蛍光性部分は異なる励起源から生じる同じ励起波長で励起することができ、またはこの２つの蛍光性部分は１つの励起源から生じる異なる励起波長で励起することができる。
【００３０】
タンパク質分析のための方法であって、タンパク質、タンパク質断片またはタンパク質の混合物が当該タンパク質、タンパク質断片またはタンパク質の混合物上のアミン基と反応した後に蛍光性となるアミン反応性蛍光発生性試薬と接触、または別の様式で混合される方法が、さらに本願明細書に開示される。次いでかかる標識されたタンパク質は、電気泳動による方法、クロマトグラフィによる方法、またはこれらの組合せを使用して分離される。かかるタンパク質分析方法で使用されるタンパク質を蛍光標識するための方法によって、変性条件下での分析のためのタンパク質を還元しつつも蛍光発生性試薬を使用する効率的なタンパク質の標識が可能になる。変性条件下での分析のために使用される手法としては、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析が挙げられるが、これに限定されない。
【００３１】
他の実施形態は、注目するタンパク質を含みうるタンパク質の混合物を含む試料を沈殿させ、次いで本願明細書に記載される標識溶液中でその試料を再構成する工程を含む。このさらなる沈殿工程は、最初の試料中に存在した邪魔する可能性がある化学成分または求められていない化学成分を取り除き得る。あるいは、またはこの沈殿工程に加えて、そのタンパク質またはタンパク質の混合物は、標識に対する何らかの還元剤の負の影響を排除するために、標識する前にジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ）などの当該技術分野で公知のアルキル化剤を使用してアルキル化されてもよい。
【００３２】
本願明細書に記載される方法を使用して標識されるタンパク質、タンパク質断片またはタンパク質の混合物は、改善された標識効率を有し、標識の均一性は７０％〜１００％とすることができる。ある実施形態では、標識の均一性は７５％〜１００％である。他の実施形態では、標識の均一性は８０％〜１００％である。他の実施形態では、標識の均一性は８５％〜１００％である。他の実施形態では、標識の均一性は９０％〜１００％である。ある実施形態では、標識の均一性は９５％〜１００％である。他の実施形態では、標識の均一性は９８％より大きい。標識の均一性は、同一のタンパク質が標識されていない場合に得られるバンド幅に対して、かかる標識されたタンパク質がスラブゲル電気泳動を使用して分離された場合の、最小限のバンドの広がりの存在によって特徴付けられる。加えて、標識の均一性は、同一のタンパク質が標識されていない場合に得られるバンドの広がりに対して、かかる標識されたタンパク質がキャピラリー電気泳動を使用して分離された場合の、最小化されたバンドの広がりによって特徴付けられる。加えて、改善された標識の均一性は、あるタンパク質が標識されていない場合に得られる泳動に対する、その同一のタンパク質が標識された後のそのタンパク質の泳動に対する最小の影響によって特徴付けられる。
【００３３】
本願明細書に記載される標識方法のある実施形態では、標識されたタンパク質を未標識のタンパク質と比較した場合、バンド幅またはバンドの移動において視覚的に観察できる差異はない。ある実施形態では、ゲルの画像上のバンドを数値化し、数値として測定し、未標識のタンパク質について得られるバンドと比較した場合に、標識されたタンパク質のバンド幅またはバンドの移動の差異は±２０％である。ある実施形態では、ゲルの画像上のバンドを数値化し、数値として測定し、未標識のタンパク質について得られるバンドと比較した場合に、標識されたタンパク質のバンド幅またはバンドの移動の差異は±１０％である。ある実施形態では、ゲルの画像上のバンドを数値化し、数値として測定し、未標識のタンパク質について得られるバンドと比較した場合に、標識されたタンパク質のバンド幅またはバンドの移動の差異は±５％である。かかる実施形態では、分離されたタンパク質のバンドの厚さおよび見かけの分子量は蛍光発生性色素の存在によっては影響を受けない。
【００３４】
本願明細書に記載される標識および分析方法では、タンパク質またはタンパク質の混合物は分離の前に標識され、これによりあらゆる後標識または染色のプロセスの必要性が取り除かれる。その結果、かかる方法によって、試料中に存在するタンパク質発現および全タンパク質の迅速な分析が可能になる。例えば、本願明細書に記載される標識方法は、免疫ブロット法（すなわち、ウエスタンブロッティング／転写（トランスファー））と適合しており、感度の著しい（１０倍もの）増加にもつながり得る。標識後の他の応用としては、質量分析を挙げることもできる。加えて、本願明細書に記載される方法によって、ゲルの乾燥なしに、ブロッティングなしに、および高価で複雑な設備なしに、タンパク質、タンパク質断片またはタンパク質の混合物のインゲル（ｉｎ−ｇｅｌ）検出が可能になる。
【００３５】
全タンパク質標識についてのアミン反応性蛍光発生性試薬を使用するタンパク質分析
アミン反応性蛍光発生性試薬を使用する全タンパク質分析のための方法の１つの態様では、当該タンパク質、タンパク質断片またはタンパク質の混合物は、最初に、約ｐＨ  ８〜約ｐＨ  １０の間のｐＨを有する第１のバッファーと、アミン反応性蛍光発生性試薬と、シアン化アルカリと、任意にアニオン性界面活性剤とを含む組成物と混合される。任意に、このシアン化アルカリは、アセトンシアノヒドリンまたはニトリル（マンデロニトリルなど）などのより無毒な代替物で置き換えることができる。この最初の工程で使用される第１のバッファーは、一級または二級アミン部分を有するバッファー化合物または添加剤を含まない。しかしながら、本願明細書に記載される方法は、当該タンパク質試料の中にすでに存在している可能性がある低レベルのアミンは許容できる。次いでこの第１の反応混合物は、第１のインキュベーション温度で第１のインキュベーション時間インキュベーションされ、その後、第１のバッファーよりも大きい緩衝能を有する第２のバッファーと混合され、これにより約ｐＨ  ６〜約ｐＨ  ９の間のｐＨが維持される。第２のバッファーの添加後に還元剤が任意に加えられてもよく、そして得られた混合物は第２のインキュベーション温度で第２のインキュベーション時間インキュベーションされる。当該タンパク質、タンパク質断片またはタンパク質の混合物は蛍光標識されたことになり、電気泳動による方法、クロマトグラフィによる方法、またはこれらの組合せを使用して分離することができる。
【００３６】
第２のバッファーの緩衝能は、第１のバッファーの緩衝能の１×〜２０×の範囲にあるようにできる。ある実施形態では、当該第２のバッファーの緩衝能は第１のバッファーの緩衝能の少なくとも２×、少なくとも３×、少なくとも４×、少なくとも５×、少なくとも６×、少なくとも７×、少なくとも８×、少なくとも９×、少なくとも１０×、少なくとも１１×、少なくとも１２×、少なくとも１３×、少なくとも１４×、少なくとも１５×、少なくとも１６×、少なくとも１７×、少なくとも１×、少なくとも１９×または少なくとも２０×である。ある実施形態では、当該第２のバッファーの緩衝能は、第１のバッファーの緩衝能の２×〜２０×の間、３×〜２０×の間、４×〜２０×の間、５×〜２０×の間、６×〜２０×の間、７×〜２０×の間、８×〜２０×の間、９×〜２０×の間、１０×〜２０×の間、１５×〜２０×の間、および１０×〜２５×の間である。
【００３７】
図１は、本願明細書に記載されるアミン反応性蛍光発生性試薬を使用する全タンパク質標識および分析のための方法の概略図を示す。かかる方法は、変性剤を存在させずにタンパク質をその「未変性の」状態で標識することを含むか、または変性されたタンパク質が本願明細書に記載されるかかる方法を使用して標識される。加えて、この標識された未変性のタンパク質または標識された変性されたタンパク質は、それぞれＮａｔｉｖｅ  ＰＡＧＥまたはＳＤＳ  ＰＡＧＥ電気泳動方法を使用する分離の前に、任意に還元されてもよい。
【００３８】
図２は、アミン反応性蛍光発生性試薬を使用するタンパク質標識および分析方法の実施形態の概略図を示す。かかる実施形態では、炭酸塩バッファー（ｐＨ  約９）中のＡＴＴＯ−ＴＡＧ  ＦＱ（商標）（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）、カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ））、マンデロニトリルの混合物がタンパク質試料（０．１〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度範囲）に加えられる。ＬＤＳおよびショ糖は、任意にこの混合物に加えられる。この反応混合物は室温（ＲＴ）で０〜３０分間インキュベーションされ、次いでこの反応混合物のｐＨを約ｐＨ  ６．５まで下げるためにビス−トリスバッファーが加えられる。この実施形態では、ビス−トリス（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）バッファーは上記炭酸塩バッファーの３倍の緩衝能を有する。タンパク質還元剤（１種または複数種）が任意に加えられ、次いでその反応混合物は７０℃で０〜２０分間加熱される。この混合物は電気泳動カセットに備えられる電気泳動ゲル中の試料ウェルにロードされ、次いで、この標識されたタンパク質は分離され蛍光撮像検出を使用して可視化される。
【００３９】
かかる標識方法は、タンパク質、タンパク質ラダーおよび／またはタンパク質スタンダードを標識するために使用することができる。例えば、１つの実施形態では、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびリゾチーム、およびＢｅｎｃｈＭａｒｋ（商標）タンパク質ラダー（インビトロジェン、カールスバッド）およびＭａｒｋ１２（商標）未着色スタンダード（インビトロジェン、カールスバッド）スタンダード／ラダーがアミン反応性蛍光発生性試薬で標識された。しかしながら、かかる方法を使用して任意のタンパク質、ラダーまたはスタンダードを標識することができる。
【００４０】
かかる標識方法は、細胞ライセートを標識するために使用することができる。図８は、本願明細書に記載される方法を使用してアミン蛍光発生性試薬で種々の時間、Ｅ．ｃｏｌｉライセートを標識した後に得られたゲル画像を示す。他のライセート（ラット肝臓、ＨｅＬａ細胞、および他の哺乳動物の細胞ライセートが挙げられるが、これらに限定されない）を、かかる方法を使用して標識することができる。図９は、ラット肝臓ライセートを標識した後に得られたゲル画像を示す。
【００４１】
かかる標識方法は、細胞タンパク質をその「未変性の」状態で標識するために使用することができる。図１０は、変性剤（ＳＤＳまたはＬＤＳなど）の非存在下でウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ミオグロビン、ｈ−ＩｇＧおよびＥ．ｃｏｌｉライセートを標識した後に得られたゲル画像を示す。あるいは、かかる標識方法は、細胞タンパク質をその「変性された」状態で標識するために使用することができる。図１１は、変性剤（ＳＤＳまたはＬＤＳなど）の存在下でウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ミオグロビン、ｈ−ＩｇＧおよびＥ．ｃｏｌｉライセートを標識した後に得られたゲル画像を示す。
【００４２】
本願明細書に記載されるアミン反応性蛍光発生性試薬を使用するタンパク質標識方法が、ゲル電気泳動で観察されたとおり、シャープなバンドをもたらすことが観察された。バンドのシャープさの効果は、種々の反応物質濃度および標識時間を使用して、本願明細書に記載される方法を使用してアミン反応性蛍光発生性試薬でウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を標識することによって示された（図１２）。これは、８〜１０のｐＨの１種の標識バッファーのみを使用する標準的な標識方法を使用して観察されるバンドのシャープさとは対照的である。
【００４３】
本願明細書に記載される方法を使用してアミン反応性蛍光発生性試薬でタンパク質を標識することは、図１３に示されるような分析としてのタンパク質消化について使用してもよく、この場合、標識されたＢＳＡは分解され、得られた消化混合物が分析される。
【００４４】
アミン反応性蛍光色素を用いた蛍光発生性タグ結合試薬を使用するタンパク質発現分析
タンパク質分析（タンパク質発現分析を含む）のために、アミン反応性蛍光色素と組み合わせてタグ結合蛍光発生性試薬／色素を使用する方法の１つの態様では、タグ化された注目するタンパク質を含むタンパク質の混合物を、約ｐＨ  ８〜約ｐＨ  １０の間のｐＨを有する第１のバッファーとアミン反応性蛍光色素とを含む組成物と混合することによって第１の反応混合物が形成される。この最初の工程で使用される第１のバッファーは、一級または二級アミン部分を有するバッファー化合物または添加剤を含まない。しかしながら、本願明細書に記載される方法は、当該タンパク質試料の中にすでに存在している可能性がある低レベルのアミンは許容できる。次いでこの第１の反応混合物は、第１のインキュベーション温度で第１のインキュベーション時間インキュベーションされ、これによってアミン反応性蛍光色素を用いたタンパク質の混合物（タグ化された注目するタンパク質を含む）の標識が生じ、これによりタンパク質混合物中に存在する全タンパク質の測定値が得られる。この第１の反応混合物はさらに、約ｐＨ  ７〜約ｐＨ  １０の間のｐＨを有する第２のバッファー、注目するタンパク質に付けられたタグに結合する蛍光発生性試薬／色素、少なくとも１つの還元剤、および任意のアニオン性界面活性剤と混合され、これにより第２の反応混合物が形成される。次いでこの第２の反応混合物は、第２のインキュベーション温度で第２のインキュベーション時間インキュベーションされ、これにより蛍光発生性試薬／色素は、注目するタンパク質上のタグに結合した際に蛍光性となる。この標識方法は、当該タンパク質の混合物（タグ化された注目するタンパク質を含む）が（アミン蛍光色素に由来する）１つの蛍光性部分で標識され、かつ注目するタンパク質がまた（蛍光発生性試薬に由来する）第２の蛍光性部分でも標識されるということをもたらす。
【００４５】
その結果、当該タンパク質混合物中の一群のタンパク質は、両方の蛍光性部分で蛍光標識された状態となり、他方でその混合物中の残りのタンパク質はアミン反応性蛍光色素のみで標識される。タンパク質混合物を標識することに加えて、かかるタンパク質分析方法はさらに、電気泳動による方法、クロマトグラフィによる方法、またはこれらの組合せを使用してこの蛍光標識されたタンパク質混合物を分離する工程、および蛍光撮像手法を使用して分離されたタンパク質の蛍光を可視化／測定する工程を含む。上記アミン反応性蛍光色素は、注目するタンパク質上のタグに結合した蛍光性部分とは異なるスペクトル発光特性を有し、それゆえ得られた蛍光測定値は、タンパク質混合物中に存在する全タンパク質に対する注目するタンパク質の測定値を得るために比較される。上記アミン反応性蛍光色素および上記タグに結合する蛍光発生性試薬は、同じ励起源によって励起されてもよいし、またはそれらは異なる励起源によって励起されてもよい。かかるタンパク質分析方法のある実施形態では、第１のバッファーは少なくとも１つの還元剤を含み、第２のバッファーは還元剤を含まず、他方、他の実施形態では、第１のバッファーおよび第２のバッファーの両方が少なくとも１つの還元剤を含む。ある実施形態では、かかるタンパク質分析方法はタンパク質発現分析のために使用され、その２つの蛍光性部分の蛍光測定値の比較によって注目するタンパク質のタンパク質発現のレベルの測定値が得られる。
【００４６】
図３は、かかるタンパク質標識および分析方法の１つの実施形態の概略図を示す。この実施形態では、炭酸水素塩バッファー（ｐＨ  ９．５）中のＤＤＡＯ−ＳＥ（商標）（インビトロジェン社、カールスバッド）の混合物が、同様にテトラシステイン部分を有するペプチドタグでタグ化された注目するタンパク質を含む細胞ライセートに加えられる。この反応混合物は室温（ＲＴ）で１０分間反応に供され、次いでトリス（Ｔｒｉｓ）バッファー（ｐＨ  ８．６）、ＦｌＡｓＨ−ＥＤＴ２（Ｌｕｍｉｏ（商標）Ｇｒｅｅｎ、インビトロジェン社、カリフォルニア州、カールスバッド）、グリセロール、ＳＤＳおよび少なくとも１つの還元剤を含むバッファーが加えられる。追跡用色素および／または標識されたタンパク質スタンダードが任意に加えられ、次いでこの混合物は電気泳動カセットに備えられる電気泳動ゲル中の試料ウェルにロードされ、そこで当該標識されたタンパク質は分離され、蛍光撮像検出を使用して可視化される。
【００４７】
タンパク質分析（タンパク質発現分析を含む）のためにアミン反応性蛍光色素と組み合わせてタグ結合蛍光発生性試薬／色素を使用する方法では、タグ化された注目するタンパク質を含むタンパク質の混合物を、約ｐＨ  ８〜約ｐＨ  １０の間のｐＨを有する第１のバッファーと、注目するタンパク質に付けられたタグに結合するタグ結合蛍光発生性試薬／色素と、少なくとも１つの還元剤と、任意のアニオン性界面活性剤とを含む組成物と混合することによって第１の反応混合物が形成される。この最初の工程で使用される第１のバッファーは、一級または二級アミン部分を有するバッファー化合物または添加剤を含まない。しかしながら、本願明細書に記載される方法は、当該タンパク質試料の中にすでに存在している可能性がある低レベルのアミンは許容できる。次いでこの第１の反応混合物は、第１のインキュベーション温度で第１のインキュベーション時間インキュベーションされ、これによってタグ化された注目するタンパク質の標識が生じ、これによりタンパク質混合物中に存在する注目するタンパク質の測定値が得られる。第１の反応混合物はさらに、約ｐＨ  ８〜約ｐＨ  １０の間のｐＨを有する第２のバッファー、およびアミン反応性蛍光色素と混合され、これにより第２の反応混合物が形成される。次いでこの第２の反応混合物は、第２のインキュベーション温度で第２のインキュベーション時間インキュベーションされ、これによりタンパク質の混合物（タグ化された注目するタンパク質を含む）の標識が生じ、これにより存在する全タンパク質の測定値が得られる。この標識方法は、当該タンパク質の混合物（タグ化された注目するタンパク質を含む）が（アミン蛍光色素に由来する）１つの蛍光性部分で標識され、かつ注目するタンパク質がまた（蛍光発生性試薬に由来する）第２の蛍光性部分でも標識されるということをもたらす。
【００４８】
その結果、当該タンパク質混合物中の一群のタンパク質は、両方の蛍光性部分で蛍光標識された状態となり、他方でその混合物中の残りのタンパク質はアミン反応性蛍光色素のみで標識される。タンパク質混合物を標識することに加えて、かかるタンパク質分析方法はさらに、電気泳動による方法、クロマトグラフィによる方法、またはこれらの組合せを使用してこの蛍光標識されたタンパク質混合物を分離する工程、および蛍光撮像手法を使用して分離されたタンパク質の蛍光を可視化／測定する工程を含む。上記アミン反応性蛍光色素は、注目するタンパク質上のタグに結合した蛍光性部分とは異なるスペクトル発光特性を有し、それゆえ得られた蛍光測定値は、タンパク質混合物中に存在する全タンパク質に対する注目するタンパク質の測定値を得るために比較される。上記アミン反応性蛍光色素および上記タグに結合する蛍光発生性試薬は、同じ励起源によって励起されてもよいし、またはそれらは異なる励起源によって励起されてもよい。かかるタンパク質分析方法のある実施形態では、第１のバッファーは少なくとも１つの還元剤を含み、第２のバッファーは還元剤を含まず、他方、他の実施形態では、第１のバッファーおよび第２のバッファーの両方が少なくとも１つの還元剤を含む。ある実施形態では、かかるタンパク質分析方法はタンパク質発現分析のために使用され、その２つの蛍光性部分の蛍光測定値の比較によって注目するタンパク質のタンパク質発現のレベルの測定値が得られる。
【００４９】
タンパク質分析（タンパク質発現分析を含む）のためにアミン反応性蛍光色素と組み合わせてタグ結合蛍光発生性試薬／色素を使用する方法の別の態様では、タグ化された注目するタンパク質を含むタンパク質の混合物を、約ｐＨ  ７〜約ｐＨ  １０の間のｐＨを有する第１のバッファーと、存在する注目するタンパク質に付けられたタグに結合するタグ結合蛍光発生性試薬／色素と、少なくとも１つの還元剤と、任意のアニオン性界面活性剤とを含む組成物と混合することによって第１の反応混合物が最初に形成される。次いでこの第１の反応混合物は、第１のインキュベーション温度で第１のインキュベーション時間インキュベーションされる。結合した際に、このタグ結合蛍光発生性試薬は蛍光性となり、これにより注目するタンパク質が蛍光標識される。次いでこの第１の混合物は、アミン反応性蛍光色素と混合され、第２のインキュベーション温度で第２のインキュベーション時間インキュベーションされ、これにより当該混合物中のすべてのタンパク質（注目するタンパク質を含む）が標識される。このアミン反応性色素は水溶液またはバッファー、非水系溶媒を含む水溶液、または非水系溶媒中にあってよい。この標識方法は、当該タンパク質の混合物（タグ化された注目するタンパク質を含む）が（アミン蛍光色素に由来する）１つの蛍光性部分で標識され、かつ注目するタンパク質がまた（蛍光発生性試薬に由来する）第２の蛍光性部分でも標識されるということをもたらす。
【００５０】
その結果、当該タンパク質混合物中の一群のタンパク質は、両方の蛍光色素で蛍光標識された状態となり、他方でその混合物中の残りのタンパク質はアミン反応性蛍光色素のみで標識される。次いでこの標識されたタンパク質を含む第２の反応混合物は、電気泳動による方法、クロマトグラフィによる方法、またはこれらの組合せを使用して分離される。当該タンパク質分析方法はさらに、当該分離されたタンパク質の蛍光を、蛍光撮像手法を使用して可視化する工程、およびその２つの蛍光性部分に由来する蛍光を比較する工程を含む。上記アミン反応性蛍光色素は、注目するタンパク質上のタグに結合した蛍光性部分とは異なるスペクトル発光特性を有し、それゆえ得られた蛍光測定値は、タンパク質混合物中に存在する全タンパク質に対する注目するタンパク質の測定値を得るために比較される。上記アミン反応性蛍光色素および上記タグに結合する蛍光発生性試薬は、同じ励起源によって励起されてもよいし、またはそれらは異なる励起源によって励起されてもよい。ある実施形態では、かかるタンパク質分析方法はタンパク質発現分析のために使用され、その２つの蛍光性部分の蛍光測定値の比較によって注目するタンパク質のタンパク質発現のレベルの測定値が得られる。かかるタンパク質分析方法のある実施形態では、第２のバッファーは、少なくとも１つの還元剤を含み、第１のバッファーは還元剤を含まず、他方、他の実施形態では、第１のバッファーおよび第２のバッファーの両方が少なくとも１つの還元剤を含む。ある実施形態では、かかるタンパク質分析方法は、分離工程の前に第２の反応混合物を、約ｐＨ  ７〜約ｐＨ  １０の間のｐＨを有する第２のバッファーと混合する工程を含むことができる。
【００５１】
図４は、かかるタンパク質標識および分析方法の概略図を示す。この図では、ローディングバッファーがタグ化された注目するタンパク質を含むライセートに加えられ、その合物は７０℃で３分間インキュベーションされる。インキュベーション後、アミン反応性蛍光色素が加えられ、この混合物は、スラブゲル電気泳動に先立ってさらに室温で１０分間インキュベーションされる。あるいは、ローディングバッファーを用いて再懸濁されたペレット化された細胞が７０℃で３分間インキュベーションされ、次いでアミン反応性蛍光色素が加えられ、スラブゲル電気泳動に先立ってさらに室温で１０分間インキュベーションされる。ある実施形態では、上記ローディングバッファーは、リン酸塩バッファー（ｐＨ  ８．５）中のＦｌＡｓＨ−ＥＤＴ２（Ｌｕｍｉｏ（商標）Ｇｒｅｅｎ、インビトロジェン社、カリフォルニア州、カールスバッド）、グリセロール、ＳＤＳ、追跡用色素および少なくとも１つの還元剤の混合物であり、上記アミン反応性蛍光色素はＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ−Ｘ  ＳＥまたはＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５  ＳＥである。
【００５２】
図１７〜１９は、かかる方法を使用して標識されたＧＦＰテトラシステインタグを有するタンパク質を含むＥ．ｃｏｌｉライセートについて得られたゲル画像を示す。図１７は４７３ｎｍ励起および５２０ｎｍ発光を使用して得られた画像を示し、注目するタンパク質に対する、二ヒ素試薬、ＦｌＡｓＨ−ＥＤＴ２（Ｌｕｍｉｏ（商標）Ｇｒｅｅｎ、インビトロジェン社、カリフォルニア州、カールスバッド）を用いた標識の特異性を示す。図１８は５３２ｎｍ励起および５８０ｎｍ発光を使用して得られた画像を示し、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ−Ｘ  ＳＥを用いた全タンパク質標識を示す。図１９は６３３ｎｍ励起および６７５ｎｍ発光を使用して得られた画像を示し、ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５  ＳＥを用いた全タンパク質標識を示す。
【００５３】
図２０〜２２は、ＧＦＰテトラシステインタグを有するタンパク質を含むＥ．ｃｏｌｉライセート、およびＣＦＰテトラシステインタグを有するタンパク質を含む哺乳動物の細胞ライセートについて得られたゲル画像を示す。これらの各々は上記の方法を使用して標識されたものである。図２０は、４７３ｎｍ励起および５２０ｎｍ発光を使用して得られた画像を示し、注目するタンパク質に対する、二ヒ素試薬、ＦｌＡｓＨ−ＥＤＴ２（Ｌｕｍｉｏ（商標）Ｇｒｅｅｎ、インビトロジェン社、カリフォルニア州、カールスバッド）を用いた標識の特異性を示す。図２１は、５３２ｎｍ励起および５８０ｎｍ発光を使用して得られた画像を示し、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ−Ｘ  ＳＥを用いた全タンパク質標識を示す。図２２は、６３３ｎｍ励起および６７５ｎｍ発光を使用して得られた画像を示し、ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５  ＳＥを用いた全タンパク質標識を示す。
【００５４】
アミン反応性蛍光発生性試薬を用いたタグ結合蛍光発生性試薬／色素を使用するタンパク質発現分析
タンパク質分析（タンパク質発現分析を含む）のためにアミン反応性蛍光発生性試薬と組み合わせてタグ結合蛍光発生性試薬／色素を使用する本願明細書に記載される方法の１つの態様では、タグ化された注目するタンパク質を含むタンパク質の混合物を、約ｐＨ  ８〜約ｐＨ  １０の間のｐＨを有する第１のバッファーと、アミン反応性蛍光発生性試薬と、シアン化アルカリ（またはアセトンシアノヒドリンまたはニトリル（マンデロニトリルなど）などのより毒性の低い代替物）と、任意のアニオン性界面活性剤とを含む組成物と混合することによって、第１の反応混合物が形成される。アセトンシアノヒドリンおよびニトリルはシアン化アルカリよりも好ましい場合がある。なぜなら、それらは著しく低い毒性を有するからである。この最初の工程で使用される第１のバッファーは、一級または二級アミン部分を有するバッファー化合物または添加剤を含まない。しかしながら、本願明細書に記載される方法は、当該タンパク質試料の中にすでに存在している可能性がある低レベルのアミンは許容できる。次いでこの第１の反応混合物は、第１のインキュベーション温度で第１のインキュベーション時間インキュベーションされ、その後、約ｐＨ  ６〜約ｐＨ  ９の間のｐＨを有する第２のバッファーを混合することによって第２の反応混合物が形成される。この第２のバッファーは第１のバッファーよりも大きい緩衝能を有し、これにより第２の反応混合物のｐＨが約ｐＨ  ６〜約ｐＨ  ９に維持される。この第２のバッファーはまた、タンパク質の混合物中に存在する注目するタンパク質に付けられたタグに結合する蛍光発生性試薬／色素、第１のバッファーで使用されるアニオン性界面活性剤と同じであってもよく異なっていてもよい任意のアニオン性界面活性剤、および少なくとも１つの還元剤を含む。この得られる混合物は、第２のインキュベーション温度で第２のインキュベーション時間インキュベーションされ、これにより蛍光発生性試薬は、注目するタンパク質上のタグに結合した際に蛍光性となる。この標識方法は、当該タンパク質の混合物（タグ化された注目するタンパク質を含む）が（アミン蛍光発生性試薬に由来する）１つの蛍光性部分で標識され、注目するタンパク質がまた（タグ結合蛍光発生性試薬に由来する）第２の蛍光性部分でも標識されるということをもたらす。
【００５５】
その結果、当該タンパク質混合物中の一群のタンパク質は、２つの蛍光性部分で蛍光標識された状態となり、他方で当該混合物中の残りのタンパク質はアミン反応性蛍光試薬に由来する１つの蛍光性部分で標識される。タンパク質混合物を標識することに加えて、かかるタンパク質分析方法はさらに、電気泳動による方法、クロマトグラフィによる方法、またはこれらの組合せを使用してこの蛍光標識されたタンパク質混合物を分離する工程、および蛍光撮像手法を使用して分離されたタンパク質の蛍光を可視化／測定する工程を含む。上記アミン反応性蛍光発生性試薬から形成される蛍光性部分は、注目するタンパク質上のタグに結合した蛍光性部分とは異なるスペクトル発光特性を有し、それゆえ得られた蛍光測定値は、タンパク質混合物中に存在する全タンパク質に対する注目するタンパク質の測定値を得るために比較される。上記アミン反応性蛍光発生性試薬から形成される蛍光性部分およびタグに結合する蛍光発生性試薬は、同じ励起源によって励起されてもよいし、またはそれらは異なる励起源によって励起されてもよい。かかるタンパク質分析方法のある実施形態では、上記第１のバッファーは少なくとも１つの還元剤を含み、第２のバッファーは還元剤を含まず、他方、他の実施形態では、第１のバッファーおよび第２のバッファーの両方が少なくとも１つの還元剤を含む。ある実施形態では、かかるタンパク質分析方法はタンパク質発現分析のために使用され、その２つの蛍光性部分の蛍光測定値の比較によって注目するタンパク質のタンパク質発現のレベルの測定値が得られる。
【００５６】
あるいは、タンパク質分析（タンパク質発現分析を含む）のためにアミン反応性蛍光発生性試薬と組み合わせてタグ結合蛍光発生性色素を使用する本願明細書に記載される方法では、タグ化された注目するタンパク質を含むタンパク質の混合物を、約ｐＨ  ８〜約ｐＨ  １０のｐＨを有する第１のバッファーと、タグ結合蛍光発生性色素と、アミン反応性蛍光発生性試薬と、シアン化アルカリまたはアセトンシアノヒドリンまたはニトリルと、任意のアニオン性界面活性剤とを含む組成物と混合することによって、第１の反応混合物が形成される。この最初の工程で使用される第１のバッファーは、一級または二級アミン部分を有するバッファー化合物または添加剤を含まない。しかしながら、本願明細書に記載される方法は、当該タンパク質試料の中にすでに存在している可能性がある低レベルのアミンは許容できる。次いでこの第１の反応混合物は、第１のインキュベーション温度で第１のインキュベーション時間インキュベーションされ、その後、約ｐＨ  ６〜約ｐＨ  ９のｐＨを有する第２のバッファーと混合することによって第２の反応混合物が形成される。この第２のバッファーは第１のバッファーよりも大きい緩衝能を有し、これによりこの第２の反応混合物のｐＨが約ｐＨ  ６〜約ｐＨ  ９に維持される。この第２のバッファーは任意に少なくとも１つの還元剤を含み、またはこの還元剤（１種または複数種）は、この第２の反応混合物を形成した後に加えてもよい。次いでこの第２の混合物は、第２のインキュベーション温度で第２のインキュベーション時間インキュベーションされる。この標識方法では、当該タグ結合蛍光発生性試薬は、注目するタンパク質上のタグに結合した際に蛍光性となり、当該アミン反応性蛍光発生性試薬は、当該タンパク質上のアミン基と反応した際に蛍光性となる。この標識方法は、タンパク質の混合物（タグ化された注目するタンパク質を含む）がアミン反応性蛍光発生性試薬に由来する蛍光性部分で標識され、注目するタンパク質がまた当該タグ結合蛍光発生性試薬に由来する第２の蛍光性部分でも標識されるということをもたらす。
【００５７】
その結果、当該タンパク質混合物中の一群のタンパク質は、２つの蛍光性部分で蛍光標識された状態となり、他方でその混合物中の残りのタンパク質はアミン反応性蛍光色素に由来する１つの蛍光性部分で標識される。タンパク質混合物を標識することに加えて、かかるタンパク質分析方法はさらに、電気泳動による方法、クロマトグラフィによる方法、またはこれらの組合せを使用してこの蛍光標識されたタンパク質混合物を分離する工程、および蛍光撮像手法を使用して分離されたタンパク質の蛍光を可視化／測定する工程を含む。当該アミン反応性蛍光発生性試薬から形成される蛍光性部分は、注目するタンパク質上のタグに結合した蛍光性部分とは異なるスペクトル発光特性を有し、それゆえ得られた蛍光測定値は、タンパク質混合物中に存在する全タンパク質に対する注目するタンパク質の測定値を得るために比較される。当該アミン反応性蛍光発生性試薬から形成される蛍光性部分およびタグに結合する蛍光発生性試薬は、同じ励起源によって励起されてもよいし、またはそれらは異なる励起源によって励起されてもよい。かかるタンパク質分析方法のある実施形態では、第１のバッファーは少なくとも１つの還元剤を含み、第２のバッファーは還元剤を含まず、他方、他の実施形態では、第１のバッファーおよび第２のバッファーの両方が少なくとも１つの還元剤を含む。ある実施形態では、かかるタンパク質分析方法はタンパク質発現分析のために使用され、その２つの蛍光性部分の蛍光測定値の比較によって注目するタンパク質のタンパク質発現のレベルの測定値が得られる。
【００５８】
材料および方法
本願明細書に記載される標識および分析方法で使用される蛍光発生性試薬は、タンパク質、タンパク質断片またはタンパク質の混合物との反応前は非蛍光性であり、当該タンパク質、タンパク質断片またはタンパク質の混合物と反応した後にのみ蛍光標識を形成する。かかる反応としては、当該タンパク質に付けられたタグとの結合、または当該タンパク質上のアミン基との反応が挙げられるが、これらに限定されない。その結果、かかる試薬を使用するタンパク質標識方法は、より低いバックグラウンド蛍光を有することができ、タンパク質検出においてより高い感度を可能にし得る。さらに、かかる方法は、タンパク質を標識するために使用される非蛍光発生性色素について可能であるとおり、いかなる未反応の色素も除去するための徹底的な洗浄を必要としない場合がある。タンパク質を標識するために使用される多くの蛍光色素について、洗浄は、当該ゲル中、特に低分子量領域のバックグラウンド蛍光を減少させるために行われる。
【００５９】
ある実施形態では、本願明細書に記載されるタンパク質標識方法の感度は、少なくとも０．２ｎｇのタンパク質である。他の実施形態では、本願明細書に記載されるタンパク質標識方法の感度は、少なくとも０．１ｎｇのタンパク質である。他の実施形態では、本願明細書に記載されるタンパク質標識方法の感度は、少なくとも０．０５ｎｇのタンパク質である。他の実施形態では、本願明細書に記載されるタンパク質標識方法の感度は、０．０１ｎｇのタンパク質〜０．２ｎｇのタンパク質である。他の実施形態では、本願明細書に記載されるタンパク質標識方法の感度は、０．０５ｎｇのタンパク質〜０．２ｎｇのタンパク質である。他の実施形態では、本願明細書に記載されるタンパク質標識方法の感度は、０．１ｎｇのタンパク質〜０．２ｎｇのタンパク質である。
【００６０】
本願明細書に記載されるタンパク質標識方法を使用して得られる検出の感度は図６および図７に示されており、ここでは種々の濃度の標識されたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびリゾチームが電気泳動により分離され検出された。両方の図は、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎでの染色を使用して得られた画像と比較して、本願明細書に記載される方法を使用して得られた蛍光画像を示す。
【００６１】
本願明細書に記載されるタンパク質標識方法で使用される蛍光発生性試薬（アミン反応性蛍光発生性試薬およびタグ結合蛍光発生性試薬）の濃度は、５０ｎＭ〜１００ｍＭの範囲にある。ある実施形態では、この濃度は、５０ｎＭ〜５０ｍＭの範囲にある。他の実施形態では、この濃度は、５０ｎＭ〜２５ｍＭの範囲にある。ある実施形態では、この濃度は、５０ｎＭ〜１０ｍＭの範囲にある。ある実施形態では、この濃度は、５０ｎＭ〜５ｍＭの範囲にある。ある実施形態では、この濃度は、１００ｎＭ〜１０ｍＭの範囲にある。ある実施形態では、この濃度は、１００ｎＭ〜５ｍＭの範囲にある。ある実施形態では、この濃度は、２００ｎＭ〜５ｍＭの範囲にある。ある実施形態では、この濃度は、５０ｎＭ〜１００μＭの範囲にある。ある実施形態では、この濃度は、１μＭ〜１００μＭの範囲にある。ある実施形態では、かかる濃度は、１００ｎＭ〜２００ｍＭの範囲の濃度を有する蛍光発生性試薬の原液の希釈により得られる。ある実施形態では、この原液の濃度は、１００ｍＭである。ある実施形態では、この原液の濃度は、５０ｍＭである。ある実施形態では、この原液の濃度は、２０ｍＭである。ある実施形態では、この原液の濃度は、１０ｍＭである。ある実施形態では、この原液の濃度は、１ｍＭである。ある実施形態では、この原液の濃度は、５００μＭである。ある実施形態では、この原液の濃度は、１０μＭ〜５００μＭである。ある実施形態では、この原液の濃度は、１μＭ〜１００μＭである。ある実施形態では、この原液の濃度は、１０μＭである。ある実施形態では、この原液の濃度は、１００μＭ〜２００μＭである。
【００６２】
本願明細書に記載されるタンパク質標識方法で使用されるアミン反応性蛍光発生性試薬としては、アロイル−２−キノリン−カルボキシアルデヒド型試薬が挙げられるが、これらに限定されない。かかる試薬は、米国特許第５，４５９，２７２号および同第５，６３１，３７４号に記載されており、これらの各々を、参照によりその全体を本願明細書に援用したものとする。例としてのみ示すと、本願明細書に記載される全タンパク質分析方法で使用されるアロイル−２−キノリン−カルボキシアルデヒド試薬は、３−（４−カルボキシベンゾイル）キノリン−２−カルボキシアルデヒドまたは３−（２−フロイル）キノリン−２−カルボキシアルデヒド）である。ある実施形態では、このアミン反応性蛍光発生性試薬は３−（２−フロイル）キノリン−２−カルボキシアルデヒド）であり、他方、他の実施形態では、このアミン反応性蛍光発生性試薬は３−（４  カルボキシベンゾイル）−キノリン−２−カルボキシアルデヒドである。
【００６３】
本願明細書に記載される蛍光色素は、当該タンパク質上の官能基（アミン基またはチオール基が挙げられるが、これらに限定されない）への接合の結果として、直接的にまたは間接的に、当該試料に検出可能なシグナルをもたらすためのレポーター分子としての機能を果たす。これは、一般に当該試料の全タンパク質のサブセットの検出と組み合わせて、試料中の全タンパク質を検出する能力をもたらす。かかる例では、この全タンパク質標識は、当該試料中の全タンパク質のサブセットを標識する色素と区別して、検出可能である。
【００６４】
この検出可能な応答が蛍光応答である場合、それは、典型的には蛍光の変化、例えば強度、励起波長もしくは発光波長、蛍光の分布、蛍光寿命、蛍光偏光、またはこれらの組み合わせの変化である。
【００６５】
当該蛍光色素は、当業者に公知の任意のフルオロフォアであってよい。本願明細書に記載される全タンパク質標識に適切であり得る実に様々なフルオロフォアは、すでに当該技術分野で公知である（ＲＩＣＨＡＲＤ  Ｐ．ＨＡＵＧＬＡＮＤ、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＢＥＳ  ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ  ＰＲＯＢＥＳ  ＡＮＤ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＰＲＯＤＵＣＴＳ（２００２））。本願明細書に記載される方法および組成物で使用される蛍光色素は、２８０ｎｍより長波長側で吸収極大を示す任意の化学部分である。かかる化学部分としては、ピレン、スルホン化ピレン、スルホン化クマリン、スルホン化カルボシアニン、スルホン化キサンテン、アントラセン、ナフタレン、アクリジン、スチルベン、インドール、イソインドール、インドリジン、ベンゾインドール、オキサゾールまたはベンゾキサゾール、チアゾールまたはベンゾチアゾール、４−アミノ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＮＢＤ）、カルボシアニン、カルボスチリル、ポルフィリン、サリチレート、アントラニレート（ａｎｔｈｒａｎｉｌａｔｅ）、アズレン、ペリレン、ピリジン、キノリン、イソキノリン、クロメン、ボラポリアザインダセン（ｂｏｒａｐｏｌｙａｚａｉｎｄａｃｅｎｅ）、キサンテン、フルオレセイン、ロサミン（ｒｏｓａｍｉｎｅ）、ローダミン、ローダミン、ベンゾフルオレセインまたはジベンゾフルオレセイン、セミナフトフルオレセイン、ナフトフルオレセイン、ビマン（ｂｉｍａｎｅ）、オキサジンまたはベンゾオキサジン、カルバジン（ｃａｒｂａｚｉｎｅ）、フェナレノン、クマリン、ベンゾフラン、ベンゾフェナレノン）およびこれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。本願明細書で使用する場合、オキサジンには、レゾルフィン、アミノオキサジノン、ジアミノオキサジン、およびそれらのベンゾ置換類似体が含まれる。
【００６６】
１つの態様では、上記蛍光色素は、１以上の芳香族環または複素芳香族環を含み、これは、ハロゲン、ニトロ、スルホ、シアノ、アルキル、ペルフルオロアルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールアルキル、アシル、アリールまたはヘテロアリール環系、ベンゾ、または当該技術分野で公知の発色団もしくはフルオロフォア上に典型的に存在する他の置換基を含めた（これらに限定されない）様々な置換基によって１回以上任意に置換されている。１つの態様では、このフルオロフォアは１以上のジュロリジン（ｊｕｌｏｌｉｄｉｎｅ）環を含むキサンテンである。
【００６７】
例示となる実施形態では、上記色素は、水素、ハロゲン、アミノ、置換アミノ、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、スルホ、反応性基、固体支持体および担体分子からなる群から選択される置換基によって独立に置換される。別の実施形態では、本発明のキサンテン色素は、キサンテンの中央環の炭素原子上で、キサンテン系色素で典型的に見出される置換基（フェニルおよび置換フェニル部分など）によって置換された化合物および置換されていない化合物の両方を含む。最も好ましい色素は、ローダミン、フルオレセイン、ボラポリアザインダセン、インドールおよびこれらの誘導体である。
【００６８】
ある実施形態では、上記全タンパク質標識および発現タグ標識（タグ結合蛍光発生性試薬）は化学的に反応性であり、少なくとも１つの反応性基によって置換されている。この反応性基は、タンパク質上のアミン基またはタンパク質上の発現タグなどのように、別の部分に対する結合部位として機能し、この場合、この反応性基は当該タンパク質上の適切な反応性または官能基と化学反応する。
【００６９】
例示となる実施形態では、全タンパク質標識および発現タグ標識は、アクリルアミド、カルボン酸の活性化エステル、カルボン酸エステル、アシルアジド、アシルニトリル、アルデヒド、ハロゲン化アルキル、無水物、アニリン、アミン、ハロゲン化アリール、アジド、アジリジン、ボロナート、ジアゾアルカン、ハロアセトアミド、ハロアルキル、ハロトリアジン、ヒドラジン、イミドエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ホスホロアミダイト、光活性化可能な基、反応性白金錯体、ハロゲン化シリル、ハロゲン化スルホニル、およびチオールから選択されるメンバーである反応性基をさらに含む。特定の実施形態では、この反応性基は、カルボン酸、カルボン酸のスクシンイミジルエステル、ヒドラジド、アミンおよびマレイミドからなる群から選択される。この反応性基は、標識上の任意の適切な部位に付けられてよい。典型的には、この反応性基と全タンパク質標識または発現タグ標識との間の接合反応によって、当該反応性基の１以上の原子が、この全タンパク質標識および発現タグ標識を当該タンパク質に付ける新しい結合に組み込まれるということが生じる。求電子性基および求核性基の反応で共有結合が得られる官能基および結合の選択された例が表１に示されている。
【００７０】
（表１）有用な共有結合へのいくつかの経路の例
2010528268.tif 000003
2010528268.tif 000004
【００７１】
この全タンパク質標識または発現タグ標識を接合されるべきタンパク質に付けるために使用される反応性基は、典型的には、接合されるべき物質上の反応性基または官能基および所望の共有結合の種類または長さに依存して、選択される。有機物質または無機物質（生体分子または非生体分子）上に典型的に存在する官能基の種類としては、アミン、アミド、チオール、アルコール、フェノール、アルデヒド、ケトン、ホスフェート、イミダゾール、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、二置換アミン、ハロゲン化物、エポキシド、ハロゲン化シリル、カルボン酸エステル、スルホン酸エステル、プリン、ピリミジン、カルボン酸、オレフィン結合、またはこれらの基の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。タンパク質では、様々な部位が存在することがあり、その例としてはアミン、チオール、アルコールおよびフェノールが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７２】
反応性基を含む全タンパク質標識は、配列非依存的蛍光色素または配列非依存的蛍光発生性色素とも呼ばれることがある。
【００７３】
典型的には、上記反応性基はアミン、チオール、アルコール、アルデヒドまたはケトンと反応するであろう。１つの実施形態では、この反応性基はアクリルアミド、カルボン酸の活性化エステル、アシルアジド、アシルニトリル、アルデヒド、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化シリル、無水物、アニリン、ハロゲン化アリール、アジド、アジリジン、ボロナート、ジアゾアルカン、ハロアセトアミド、ハロトリアジン、ヒドラジン（ヒドラジドを含む）、イミドエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ホスホロアミダイト、ハロゲン化スルホニル、またはチオール基である。
【００７４】
１つの態様では、当該化合物はアミン基と選択的に反応する少なくとも１つの反応性基を含む。このアミン反応性基は、スクシンイミジルエステル、ハロゲン化スルホニル、テトラフルオロフェニルエステルおよびイソチオシアネートからなる群から選択される。従って、１つの態様では、当該全タンパク質標識および発現タグ標識は、タンパク質中のアミン含有分子と共有結合を形成する。別の態様では、当該化合物は、チオール基と選択的に反応する少なくとも１つの反応性基を含む。このチオール反応性基は、マレイミド、ハロアルキルおよびハロアセトアミドからなる群から選択される。
【００７５】
上記反応性基が、カルボン酸のスクシンイミジルエステルなどのカルボン酸の活性化エステル、ハロゲン化スルホニル、テトラフルオロフェニルエステルまたはイソチオシアネートである場合、得られた化合物はタンパク質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはハプテンの接合体を調製するのに特に有用である。上記反応性基がマレイミド、ハロアルキルまたはハロアセトアミドである場合、得られた化合物はチオール含有物質への接合に特に有用である。上記反応性基がヒドラジドである場合、得られた化合物は、過ヨウ素酸塩で酸化された糖質および糖タンパク質への接合に特に有用である。
【００７６】
例としてのみ示すと、本願明細書に記載されるタンパク質標識方法で使用されるアミン反応性蛍光色素としては、ピレン、スルホン化ピレン、スルホン化クマリン、スルホン化カルボシアニン、スルホン化キサンテン、アントラセン、ナフタレン、アクリジン、スチルベン、インドール、イソインドール、インドリジン、ベンゾインドール、オキサゾールまたはベンゾキサゾール、チアゾールまたはベンゾチアゾール、４−アミノ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＮＢＤ）、カルボシアニン、カルボスチリル、ポルフィリン、サリチレート、アントラニレート、アズレン、ペリレン、ピリジン、キノリン、イソキノリン、クロメン、ボラポリアザインダセン、キサンテン、フルオレセイン、ロサミン、ローダミン、ローダミン、ベンゾフルオレセインまたはジベンゾフルオレセイン、セミナフトフルオレセイン、ナフトフルオレセイン、ビマン、オキサジンまたはベンゾオキサジン、カルバジン、フェナレノン、クマリン、ベンゾフラン、ベンゾフェナレノン）およびこれらの誘導体を含む色素が挙げられる。本願明細書で使用する場合、オキサジンには、レゾルフィン、アミノオキサジノン、ジアミノオキサジン、およびこれらのベンゾ置換類似体が含まれる。かかるアミン反応性色素としては、アシルアジド、カルボニルアジド、イソチオシアネート、イソシアネート、スクシンイミジルエステル、カルボン酸エステル、カルボン酸、スクシンイミジルエステル、スルホスクシンイミジルエステル、ＳＴＰエステル、テトラフルオロフェニルエステル、塩化スルホニル、酸ハロゲン化物、アルデヒド、カルボキシアルデヒド、ジクロロトリアジン、ＮＢＤ塩化物、またはＮＢＤフッ化物から選択される反応性部分も挙げられる。
【００７７】
本願明細書に記載されるタンパク質標識方法で使用されるかかるアミン反応性蛍光色素としては、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４０５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５１４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６１０−Ｘ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７９０、ＡＭＣＡ−Ｘ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＲ−Ｘ、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ（登録商標）、ジニトロフェニル、フルオレセイン、ＨＥＸ、ＪＯＥ、Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ（登録商標）、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）４８８、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）５１４、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ（商標）、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｏｒａｎｇｅ（商標）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ（商標）、ＱＳＹ（登録商標）７、ＱＳＹ（登録商標）９、ＱＳＹ（登録商標）２１、ＱＳＹ（登録商標）３５、ＲＯＸ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｒｅｄ（商標）、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡ、テトラメチルローダミン、ＦＡＭ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）および７−ヒドロキシ−９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）スクシンイミジルエステル（ＤＤＡＯ−ＳＥ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７８】
本願明細書に記載されるタンパク質標識方法で使用されるアミン反応性蛍光色素の濃度は５０ｎＭ〜１００ｍＭの範囲にある。ある実施形態では、この濃度は、５０ｎＭ〜５０ｍＭの範囲にある。他の実施形態では、この濃度は、５０ｎＭ〜２５ｍＭの範囲にある。ある実施形態では、この濃度は、５０ｎＭ〜１０ｍＭの範囲にある。ある実施形態では、この濃度は、５０ｎＭ〜５ｍＭの範囲にある。ある実施形態では、この濃度は、１００ｎＭ〜１０ｍＭの範囲にある。ある実施形態では、この濃度は、１００ｎＭ〜５ｍＭの範囲にある。ある実施形態では、この濃度は、２００ｎＭ〜５ｍＭの範囲にある。ある実施形態では、この濃度は、５０ｎＭ〜１００μＭの範囲にある。ある実施形態では、この濃度は、１μＭ〜１００μＭの範囲にある。ある実施形態では、かかる濃度は、１００ｎＭ〜２００ｍＭの範囲の濃度を有する上記蛍光発生性試薬の原液の希釈によって得られる。ある実施形態では、この原液の濃度は、１００ｍＭである。ある実施形態では、この原液の濃度は、５０ｍＭである。ある実施形態では、この原液の濃度は、２０ｍＭである。ある実施形態では、この原液の濃度は、１０ｍＭである。ある実施形態では、この原液の濃度は、１ｍＭである。ある実施形態では、この原液の濃度は、５００μＭである。ある実施形態では、この原液の濃度は、１０μＭ〜５００μＭである。ある実施形態では、この原液の濃度は、１μＭ〜１００μＭである。ある実施形態では、この原液の濃度は、１０μＭである。ある実施形態では、この原液の濃度は、１００μＭ〜２００μＭである。
【００７９】
本願明細書に記載されるタンパク質標識方法で使用されるタンパク質に付けられたタグに結合する蛍光発生性試薬／色素は二ヒ素フルオロフォアであり、その例としてはフルオレセインの二ヒ素誘導体（例としてのみ示すと、ＦｌＡｓＨ−ＥＤＴ２（４’−５’−ビス（１，３，２−ジチオアルソラン−２−イル）フルオレセイン−（２，２−エタンジチオール）２）（Ｌｕｍｉｏ（商標）Ｇｒｅｅｎ、インビトロジェン社、カリフォルニア州、カールスバッド）など）、またはレゾルフィンの二ヒ素誘導体（例としてのみ示すと、ＲｅＡｓｈ−ＥＤＴ２（Ｌｕｍｉｏ（商標）Ｒｅｄ、インビトロジェン社、カリフォルニア州、カールスバッド）など）が挙げられ、またはこれらの代わりに酸化された誘導体（ＣｈｏＸＡｓＨ−ＥＤＴ２またはＨｏＸＡｓＨ−ＥＤＴ２など）であってもよい。加えて、この二ヒ素フルオロフォアは、本願明細書に記載されるモレキュラープローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）（オレゴン州、ユージーン（Ｅｕｇｅｎｅ））から市販されているＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒシリーズ（例としてのみ示すと、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６６３およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６６０など）が挙げられるがこれらに限定されない、他の公知のフルオロフォアの二ヒ素誘導体であってもよい。
【００８０】
この二ヒ素フルオロフォアは、少なくとも約１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、１００μＭまたはこれより高い濃度、かつ約５００μＭ、４００μＭ、３００μＭ、２００μＭ、１００μＭ、９０μＭ、８０μＭ、７０μＭ、６０μＭ、５０μＭ、４０μＭ、３０μＭ、２０μＭ、１５μＭ、１０μＭ、５μＭ、４μＭ、３μＭ、２μＭまたは１μＭ以下の濃度で存在してよい。
【００８１】
かかる蛍光発生性色素が結合するタンパク質に付けられたタグは、テトラシステインペプチドモチーフ、ｃｙｓ−ｃｙｓ−Ｘｎ−ｃｙｓ−ｃｙｓ（配列番号１）（式中、各Ｘは任意の天然アミノ酸、非天然アミノ酸またはこれらの組み合わせであり、かつｎは２〜１００の整数である）である。ある実施形態では、ｎは２〜９０の整数であり、他方、他の実施形態ではｎは２〜８０の整数である。ある実施形態では、ｎは２〜７０の整数であり、他方、他の実施形態ではｎは２〜６０の整数である。ある実施形態では、ｎは２〜５０の整数であり、他方、他の実施形態ではｎは２〜４０の整数である。ある実施形態では、ｎは２〜３０の整数であり、他方、他の実施形態ではｎは２〜２０の整数である。ある実施形態では、ｎは２〜１０の整数であり、他方、他の実施形態ではｎは２〜５の整数である。かかるモチーフの天然アミノ酸としては、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンが挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態では、上記テトラシステインタグは、配列ＣＣＰＧＣＣ（配列番号２）を有する。他の実施形態では、テトラシステインモチーフを含む１２アミノ酸のペプチドが使用され、その例としては、アミノ酸配列、ＡＧＧＣＣＰＧＣＣＧＧＧ（配列番号３）が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、当該タンパク質は単一のテトラシステインタグで標識されていてもよく、または当該タンパク質は複数のテトラシステインタグ（２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０のテトラシステインタグが挙げられるが、これらに限定されない）で標識されていてもよい。かかるタグは、当該タンパク質の一次アミノ酸配列内で互いから離れていてもよいし、またはコンカテマーとして一列に並んで直接多量体を形成してもよい。
【００８２】
ある実施形態では、このテトラシステインペプチドは、配列ｃｙｓ−ｃｙｓ−Ｘｎ−ｃｙｓ−Ｘ−ｃｙｓ−Ｘ（配列番号４）（式中、各Ｘは任意の天然アミノ酸、非天然アミノ酸またはこれらの組み合わせであり、ｎは２〜１００の整数である）を有する。ある実施形態では、ｎは２〜９０の整数であり、他方、他の実施形態ではｎは２〜８０の整数である。ある実施形態では、ｎは２〜７０の整数であり、他方、他の実施形態ではｎは２〜６０の整数である。ある実施形態では、ｎは２〜５０の整数であり、他方、他の実施形態ではｎは２〜４０の整数である。ある実施形態では、ｎは２〜３０の整数であり、他方、他の実施形態ではｎは２〜２０の整数である。ある実施形態では、ｎは２〜１０の整数であり、他方、他の実施形態ではｎは２〜５の整数である。かかるモチーフの天然アミノ酸としては、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンが挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態では、このテトラシステインタグは配列ＣＣＧＧＫＧＮＧＧＣＧＣ（配列番号５）を有する。
【００８３】
このテトラシステインペプチドタグ（１種または複数種）は、標識することが所望されるタンパク質配列内のＮ末端、Ｃ末端、またはインフレーム（ｉｎ  ｆｒａｍｅ）のいずれかで当該タンパク質に組み換え的に融合されてもよく、テトラシステイン融合組換えタンパク質を作製するための発現ベクターは、当業者に公知の手法を使用して容易に構築することができる。ある実施形態では、このテトラシステインタグ化タンパク質は、宿主細胞中（細菌性宿主細胞中、真菌性宿主細胞中、昆虫細胞中、植物細胞中、または哺乳動物細胞中が挙げられるが、これらに限定されない）で、組み換え的に発現される。かかる細菌性宿主細胞としては、任意の属のグラム陰性菌およびグラム陽性菌が挙げられるが、これらに限定されず、例としてのみ示すと、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）の菌種（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）の菌種、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の菌種、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）の菌種、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）の菌種、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）の菌種、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の菌種（例えば、バチルス・セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびバチルス・メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ））、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）の菌種、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の菌種（例えば、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）およびシュードモナス・シリンゲ（Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ））およびサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の菌種（例えば、チフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉ）およびネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ））が挙げられる。適切な菌株および本発明に適した血清型としては、Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｋ、Ｂ、Ｃ、およびＷを挙げることができる。典型的な細菌性宿主はＥ．ｃｏｌｉ菌株Ｋ−１２である。真菌性宿主細胞としては、例としてのみ示すと、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞が挙げられ、他方、哺乳動物細胞としては、例としてのみ示すと、ヒト細胞が挙げられる。かかる実施形態では、注目するタンパク質を含むタンパク質試料は、宿主細胞のライセートであり、これは、本願明細書に記載される方法を使用する標識および分析に先立って、未精製であってもよく、部分的に精製されていてもよく、または実質的に精製されていてもよい。
【００８４】
注目するタンパク質を含むタンパク質試料が、翻訳（および、任意に、転写）が実施される無細胞抽出液、またはその部分的に精製されたかもしくは精製された分画である他の実施形態では、このテトラシステインタグ化タンパク質は、生体外で発現される。この抽出液が単一の無細胞抽出液中で共役した転写および翻訳を許容する実施形態（Ｅ．ｃｏｌｉベースのＥｘｐｒｅｓｓｗａｙまたはＥｘｐｒｅｓｓｗａｙ  Ｐｌｕｓシステム（インビトロジェン社、カリフォルニア州、カールスバッド）など）では、当該試料は、転写および翻訳が一般的に行われる無細胞抽出液、またはその分画である。あるいは、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）テクノロジー（インビトロジェン社、カリフォルニア州、カールスバッド）は、注目する遺伝子をＥ．ｃｏｌｉ中で発現するために使用することができる汎用のクローニング技術である。
【００８５】
本願明細書に記載される二ヒ素色素を使用して標識されることになるタンパク質は、テトラシステインモチーフを有する任意のタンパク質であってよい。このテトラシステインタグ（１種または複数種）が融合または接合されているタンパク質は、天然に存在するかまたは天然に存在しないかのいずれかの、標識することが所望される任意のタンパク質であってよい。天然に存在するタンパク質は公知の生物機能を有していてもよくまたはいなくてもよく、発現されることが公知であるかまたはゲノム配列から予想されるに過ぎないものであってもよい。このタンパク質は、天然に存在するものである場合、完全なタンパク質であってもよく、またはその断片のみであってもよい。従って、このテトラシステインタグ化タンパク質は、動物タンパク質（ヒトタンパク質または非ヒト哺乳動物のタンパク質など）、真菌性タンパク質、細菌性タンパク質（真正細菌および古細菌のタンパク質を含む）、植物タンパク質、昆虫タンパク質またはウイルスタンパク質であってよい。
【００８６】
このテトラシステインタグに加えて、他のタンパク質配列を、標識することが所望されるタンパク質に組み換え的に付属させることが有用である場合がある。かかる付加的なタンパク質配列には、リンカーおよび／または短いタグ（エピトープタグが有用である）（ＦＬＡＧタグ、またはｍｙｃタグなど）、または精製に有用な他の配列（ポリヒスチジン（例えば、６×ｈｉｓ）タグなど）がある。
【００８７】
あるいは、上記テトラシステインタグ（１種または複数種）は、上記のとおりのごく一般的な（ａｒｔ−ｒｏｕｔｉｎｅ）接合化学を使用して、標識されるべきタンパク質に化学的に接合することができる。
【００８８】
本願明細書に記載される方法で使用されるインキュベーション温度は、室温、常温、または室温より上の温度、例えば例としてのみ示すと、少なくとも約２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、４０℃，５０℃、６０℃、７０℃、８０℃などであってよく、９０℃、９５℃、９６℃、９７℃、９８℃、９９℃または１００℃であってもよい。本願明細書に記載される方法で使用される第１のインキュベーション温度および第２のインキュベーション温度は、同じであってもよく異なっていてもよい。１つの実施形態では、この第１のインキュベーション温度は２０℃〜８０℃、より好ましくは２５℃〜３０℃、さらにより好ましくは常温または室温である。１つの実施形態では、この第２のインキュベーション温度は、２０℃〜８０℃、より好ましくは６５℃〜７５℃、さらにより好ましくはおよそ７０℃である。別の実施形態では、この第２のインキュベーション温度は常温または室温である。
【００８９】
本願明細書に記載される方法で使用されるインキュベーション時間としては、少なくとも３０秒間、少なくとも１分間、少なくとも２分間、３分間、４分間、５分間、６分間、７分間、８分間、９分間、１０分間、１５分間、２０分間、３０分間、４０分間、５０分間、少なくとも１時間、またはこれらのうちの任意の範囲が挙げられるが、これらに限定されない。本願明細書に記載される方法で使用される第１のインキュベーション時間および第２のインキュベーション時間は、同じであってもよく異なっていてもよい。１つの実施形態では、第１のインキュベーション時間は、０〜６０分間、好ましくは５〜１０分間、さらにより好ましくは室温で５〜１０分間である。１つの実施形態では、第２のインキュベーション時間は、０〜２０分間、より好ましくはおよそ１０分間、さらにより好ましくはおよそ７０℃でおよそ１０分間である。
【００９０】
本願明細書に記載される方法の任意の試料還元工程は、室温、常温、または室温より上の温度、例えば少なくとも約２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃の温度、さらには９０℃、９５℃、９６℃、９７℃、９８℃、９９℃または１００℃という高さの温度で実施することができる。かかる還元工程は、少なくとも３０秒間、少なくとも１分間、少なくとも２分間、３分間、４分間、５分間、６分間、７分間、８分間、９分間、１０分間、１５分間、２０分間、３０分間、４０分間、５０分間、または少なくとも１時間進行し得る。
【００９１】
本願明細書に記載される方法のある実施形態では、並行反応で、または標識することが所望されるタンパク質から容易に分離可能である場合は、同じ反応に含めるかのいずれかによって、標識の有効性をモニターするために、対照タンパク質（１種または複数種）が標識されてもよい。
【００９２】
本願明細書に記載される方法のある実施形態では、標識された試料のタンパク質は、一連の蛍光分子量スタンダードと並行して有用に分離することができる。有用なことに、このスタンダードは、当該タンパク質を標識するために使用される少なくとも１つのフルオロフォアに、スペルトル的に適合している。かかるスペクトルの適合は、例えば、当該タンパク質試料を標識するために使用されたのと同じ二ヒ素フルオロフォアと並行して標識されたテトラシステインタグ化タンパク質スタンダードを使用することにより、または当該試料タンパク質を標識するために使用された二ヒ素フルオロフォアまたは他のフルオロフォアにスペルトル的に適合している蛍光性部分を有するスタンダードを使用することにより成し遂げることができる。ある実施形態では、本発明の実施において有用なタンパク質スタンダード（これは、ある態様ではタンパク質ラダーである）としては、組換えタンパク質、組換えタンパク質断片（１種または複数種）、ならびにこれらから誘導される融合タンパク質および多量体の組を含むスタンダードが挙げられる。本発明の実施において有用なスタンダードの例としては、タンパク質スタンダードのＢｅｎｃｈｍａｒｋ（商標）ファミリー（インビトロジェン社、カリフォルニア州、カールスバッド）およびＭａｒｋ１２（商標）未着色スタンダード（インビトロジェン、カールスバッド）が挙げられる。
【００９３】
本願明細書に記載される方法および組成物は、試料中に存在する蛍光標識されたタンパク質の量を定量するためにも使用することができる。ある実施形態では、本願明細書に記載される方法はさらに、上記二ヒ素フルオロフォアからの蛍光量を定量する工程を含む。ある実施形態では、本願明細書に記載される方法はさらに、上記アミン反応性蛍光色素からの蛍光量を定量する工程を含む。ある実施形態では、本願明細書に記載される方法はさらに、上記アミン反応性蛍光発生性試薬に由来する蛍光性部分からの蛍光量を定量する工程を含む。この定量は、そのタンパク質試料中に存在するタンパク質の分離なしに、あるいはそのタンパク質が電気泳動（ＰＡＧＥ、２Ｄ−ＰＡＧＥ、もしくはＩＥＦなど）またはクロマトグラフィまたはこれらの組合せによって部分的にもしくは完全に分離された後に、行うことができる。
【００９４】
本願明細書に記載されるタンパク質標識方法で使用されるアニオン性界面活性剤としては、アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキルスルホン酸塩、アルキルスルホコハク酸塩、アルキルリン酸塩、アルキル硫酸塩、アルキルカルボン酸塩、アルキルエーテルベンゼンスルホン酸塩、アルキルエーテルスルホン酸塩、アルキルエーテルスルホコハク酸塩、アルキルエーテルリン酸塩、アルキルエーテル硫酸塩、アルキルエーテルカルボン酸塩またはこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。本願明細書に記載される方法のある実施形態では、このアニオン性界面活性剤はドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウム、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム、オレイン酸ナトリウム、パルミチン酸ナトリウム、ミリスチン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウムまたはこれらの混合物である。ある実施形態では、このアニオン性界面活性剤はドデシル硫酸ナトリウムであり、他方、他の実施形態では、このアニオン性界面活性剤はドデシル硫酸リチウムである。
【００９５】
本願明細書に記載されるタンパク質標識方法で使用されるアニオン性界面活性剤の濃度は、０．１％（重量／体積）〜１０％（重量／体積）の範囲にある。ある実施形態では、当該濃度は０．１％（重量／体積）〜５％（重量／体積）の範囲にある。他の実施形態では、当該濃度は０．５％（重量／体積）〜１０％（重量／体積）の範囲にある。ある実施形態では、当該濃度は０．５％（重量／体積）〜５％（重量／体積）の範囲にある。ある実施形態では、当該濃度は１％（重量／体積）〜１０％（重量／体積）の範囲にある。ある実施形態では、当該濃度は１％（重量／体積）〜５％（重量／体積）の範囲にある。ある実施形態では、かかる濃度は、１％（重量／体積）〜２０％（重量／体積）の範囲の濃度を有する当該アニオン性界面活性剤の原液の希釈によって得られる。ある実施形態では、この原液の濃度は１０％（重量／体積）である。ある実施形態では、この原液の濃度は５％（重量／体積）である。ある実施形態では、この原液の濃度は２％（重量／体積）である。
【００９６】
本願明細書に記載されるタンパク質標識方法で使用されるシアン化アルカリとしては、シアン化リチウム、シアン化カリウム、シアン化ナトリウム、シアン化ルビジウム、シアン化セシウム、またはこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態では、このシアン化アルカリはシアン化カリウムであり、他方、他の実施形態では、このシアン化アルカリはシアン化ナトリウムである。ある実施形態では、このシアン化アルカリはシアン化リチウムであり、他方、他の実施形態では、このシアン化アルカリはシアン化セシウムである。シアン化アルカリ化合物の毒性効果に起因して、より毒性が低い代替物（アセトンシアノヒドリンまたはニトリルなど）が好ましい場合がある。例えば、シアン化ナトリウムのＬＤ５０値は６．４４であり、他方、アセトンシアノヒドリンのＬＤ５０値は１８．６５であり、マンデロニトリルのＬＤ５０値は１１６である（これは、マンデロニトリルはシアン化ナトリウムのおよそ１８倍毒性が低いことを意味する）。
【００９７】
本願明細書に記載されるタンパク質標識方法で使用されるシアン化アルカリ、アセトンシアノヒドリンまたはニトリルの濃度は５０ｎＭ〜２００ｍＭの範囲にある。ある実施形態では、この濃度は、５０ｎＭ〜１００ｍＭの範囲にある。他の実施形態では、この濃度は、５０ｎＭ〜５０ｍＭの範囲にある。ある実施形態では、この濃度は、５０ｎＭ〜２５ｍＭの範囲にある。ある実施形態では、この濃度は、５０ｎＭ〜１０ｍＭの範囲にある。ある実施形態では、この濃度は、５０ｎＭ〜５ｍＭの範囲にある。ある実施形態では、この濃度は、１００ｎＭ〜１０ｍＭの範囲にある。ある実施形態では、この濃度は、１００ｎＭ〜５ｍＭの範囲にある。ある実施形態では、この濃度は、２００ｎＭ〜５ｍＭの範囲にある。ある実施形態では、かかる濃度は、１００ｎＭ〜２００ｍＭの範囲の濃度を有する上記蛍光発生性試薬の原液の希釈によって得られる。ある実施形態では、この原液の濃度は、１００ｍＭである。ある実施形態では、この原液の濃度は、５０ｍＭである。ある実施形態では、この原液の濃度は、２０ｍＭである。ある実施形態では、この原液の濃度は、１０ｍＭである。
【００９８】
本願明細書に記載される方法を使用して標識されたタンパク質またはタンパク質断片の濃度は０．０１ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬの範囲にある。ある実施形態では、当該濃度は０．１ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬの範囲にある。他の実施形態では、当該濃度は０．１ｍｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬの範囲にある。ある実施形態では、当該濃度は０．１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬの範囲にある。ある実施形態では、当該濃度は０．２ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬの範囲にある。ある実施形態では、当該濃度は０．２ｍｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬの範囲にある。ある実施形態では、当該濃度は０．２ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬの範囲にある。ある実施形態では、当該濃度は０．３ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬの範囲にある。ある実施形態では、当該濃度は０．４ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬの範囲にある。ある実施形態では、当該濃度は０．５ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬの範囲にある。
【００９９】
本願明細書に開示されるタンパク質またはタンパク質の混合物についての標識方法は、２時間未満で完結することができる迅速なタンパク質標識方法である。ある実施形態では、本願明細書に記載されるタンパク質標識方法は１時間未満で完結する。ある実施形態では、本願明細書に記載されるタンパク質標識方法は３０分間未満で完結する。ある実施形態では、本願明細書に記載されるタンパク質標識方法は２０分間未満で完結する。ある実施形態では、本願明細書に記載されるタンパク質標識方法は１０分間未満で完結する。ある実施形態では、本願明細書に記載されるタンパク質標識方法は５分間未満で完結する。ある実施形態では、本願明細書に記載されるタンパク質標識方法は４分間未満で完結する。ある実施形態では、本願明細書に記載されるタンパク質標識方法は３分間未満で完結する。ある実施形態では、本願明細書に記載されるタンパク質標識方法は２分間未満で完結する。ある実施形態では、本願明細書に記載されるタンパク質標識方法は１分間未満で完結する。
【０１００】
第１のバッファー
本願明細書に記載されるタンパク質標識方法の第１の工程で使用されるバッファー（本願明細書において第１のバッファーとも呼ばれる）は、常温で約ｐＨ  ８〜約ｐＨ  １０のｐＨを有する。ある実施形態では、当該第１のバッファーは２５℃で約ｐＨ  ８〜約ｐＨ  １０のｐＨを有する。加えて、この第１のバッファーは一級または二級アミン部分を有するバッファー化合物または添加剤を含まない。しかしながら、本願明細書に記載される方法は、当該タンパク質試料の中にすでに存在している可能性がある低レベルのアミンは許容できる。例としてのみ示すと、この第１のバッファーとしては、炭酸塩、炭酸水素塩、リン酸塩、ホウ酸塩、ビス−トリスプロパン、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（ビシン（Ｂｉｃｉｎｅ））、Ｎ−（１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル）−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳＯ）またはこれらの組合せを挙げることができる。
【０１０１】
本願明細書で開示される方法で使用される第１のバッファーの濃度は、約１０ｍＭ〜約１Ｍである。ある実施形態では、当該濃度は約２０ｍＭ〜約５００ｍＭであり、他の実施形態では、当該濃度は約５０ｍＭ〜約３００ｍＭである。ある実施形態では、当該濃度は約１０ｍＭ〜約５００Ｍｍである。ある実施形態では、当該濃度は約１０ｍＭ〜約４００ｍＭである。ある実施形態では、当該濃度は約１０ｍＭ〜約３００ｍＭである。ある実施形態では、当該濃度は約１０ｍＭ〜約２００ｍＭである。ある実施形態では、当該濃度は約１０ｍＭ〜約１００ｍＭである。ある実施形態では、当該濃度は約１０ｍＭ〜約５０ｍＭである。
【０１０２】
第２のバッファー
本願明細書に記載されるタンパク質標識方法の第２の工程で使用されるバッファー（本願明細書において第２のバッファーとも呼ばれる）は、常温で約ｐＨ  ２〜約ｐＨ  ８のｐＨを有し、かつ第１のバッファーよりも大きい緩衝能を有する。ある実施形態では、当該第２のバッファーは、２５℃で約ｐＨ  ２〜約ｐＨ  ８のｐＨを有し、かつ第１のバッファーよりも大きい緩衝能を有する。
【０１０３】
本願明細書で開示される方法で使用される第２のバッファーは任意の電気泳動バッファーであってよく、例としては双性イオンのバッファーが挙げられるが、これに限定されない。かかる方法で使用される第２のバッファーは、常温で約２〜約９のｐＫａを有する少なくとも１つの化合物を含む。ある実施形態では、当該第２のバッファーは常温で約３〜約８の間のｐＫａを有する化合物を含む。ある実施形態では、当該第２のバッファーは常温で約４〜約８の間のｐＫａを有する化合物を含む。ある実施形態では、当該第２のバッファーは常温で約５〜約８の間のｐＫａを有する化合物を含む。ある実施形態では、当該第２のバッファーは常温で約６〜約８の間のｐＫａを有する化合物を含む。ある実施形態では、当該第２のバッファーは常温で約７〜約８の間のｐＫａを有する化合物を含む。ある実施形態では、当該第２のバッファーは常温で約６〜約７の間のｐＫａを有する化合物を含む。ある実施形態では、かかる方法で使用される第２のバッファーは、２５℃で約２〜約８のｐＫａを有する少なくとも１つの化合物を含む。ある実施形態では、当該第２のバッファーは２５℃で約３〜約８の間のｐＫａを有する化合物を含む。ある実施形態では、当該第２のバッファーは２５℃で約４〜約８の間のｐＫａを有する化合物を含む。ある実施形態では、当該第２のバッファーは２５℃で約５〜約８の間のｐＫａを有する化合物を含む。ある実施形態では、当該第２のバッファーは２５℃で約６〜約８の間のｐＫａを有する化合物を含む。ある実施形態では、当該第２のバッファーは２５℃で約７〜約８の間のｐＫａを有する化合物を含む。ある実施形態では、当該第２のバッファーは２５℃で約６〜約７の間のｐＫａを有する化合物を含む。
【０１０４】
本願明細書で開示される方法で使用される第２のバッファーとしては、リン酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、カコジル酸塩、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、２−（Ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＰＩＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ビス−（ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）−プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−トリス−（ヒドロキシメチル）−２−エタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチル−ピペラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−（Ｎ−トリス−（ヒドロキシメチル）メチルアミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、３−（Ｎ，Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］アミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＨＥＰＰＳＯ）、Ｎ−（１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル）−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳＯ）、ビス［２−ヒドロキシエチル］イミノトリス［ヒドロキシメチル］メタン（ビストリス（ＢｉｓＴｒｉｓ））、またはこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０５】
ある実施形態では、第２のバッファーは、リン酸塩、グリシン、クエン酸、酢酸、２−（Ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、カコジル酸、炭酸、ビス［２−ヒドロキシエチル］イミノトリス［ヒドロキシメチル］メタン（ビストリス（ＢｉｓＴｒｉｓ））、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、イミダゾール、Ｎ，Ｎ−ビス−（ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）−プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−トリス−（ヒドロキシメチル）−２−エタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチル−ピペラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＨＥＰＰＳＯ）およびトリエタノールアミンからなる群から選択することができる。ある実施形態では、この第２のバッファーはビス［２−ヒドロキシエチル］イミノトリス［ヒドロキシメチル］メタン（ビストリス）である。
【０１０６】
ある実施形態では、この第２のバッファーは、第１のバッファー、蛍光発生性試薬、シアン化アルカリ（あるいはアセトンシアノヒドリンまたはニトリル（マンデロニトリルなど））、およびアニオン性界面活性剤を含む最初の反応混合物に加えられ、これにより最終混合物の（常温での）ｐＨが約ｐＨ  ５〜約ｐＨ  ９に維持される。ある実施形態では、当該最終混合物は常温でｐＨ  ６〜８を有する。ある実施形態では、当該最終混合物は常温でｐＨ  ６〜７を有する。ある実施形態では、当該最終混合物は２５℃でｐＨ  ５〜８を有する。ある実施形態では、当該最終混合物は２５℃でｐＨ  ６〜８を有する。ある実施形態では、当該最終混合物は２５℃でｐＨ  ６〜７を有する。
【０１０７】
本願明細書で開示される方法で使用される第２のバッファーの濃度は、約１０ｍＭ〜約１Ｍである。ある実施形態では、当該濃度は約２０ｍＭ〜約５００ｍＭであり、他の実施形態では、当該濃度は約５０ｍＭ〜約３００ｍＭである。ある実施形態では、当該濃度は約１０ｍＭ〜約５００Ｍｍである。ある実施形態では、当該濃度は約１０ｍＭ〜約４００ｍＭである。ある実施形態では、当該濃度は約１０ｍＭ〜約３００ｍＭである。ある実施形態では、当該濃度は約１０ｍＭ〜約２００ｍＭである。ある実施形態では、当該濃度は約１０ｍＭ〜約１００ｍＭである。ある実施形態では、当該濃度は約１０ｍＭ〜約５０ｍＭである。
【０１０８】
分離方法
タンパク質を分析するために本願明細書に記載される方法で使用されるクロマトグラフィ手法としては、液体クロマトグラフィ、高性能液体クロマトグラフィ、環状クロマトグラフィ（ａｎｎｕｌａｒ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、サイズ排除クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィおよびイムノアフィニティークロマトグラフィが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０９】
ある実施形態では、当該標識されたタンパク質または標識されたタンパク質の混合物は、電気泳動手法、クロマトグラフィ手法、またはこれらの組合せを使用して分離される前には、未反応の蛍光発生性試薬から精製されない。他の実施形態では、標識されたタンパク質または標識されたタンパク質の混合物は、電気泳動手法、クロマトグラフィ手法、またはこれらの組合せを使用して分離される前に、未反応の蛍光発生性試薬から精製される。他の実施形態は、タンパク質またはタンパク質の混合物を含む試料を沈殿させ、次いで本願明細書に記載される標識溶液中でその試料を再構成することを含む。あるいは、またはこの沈殿工程に加えて、そのタンパク質またはタンパク質の混合物は、標識に対する何らかの還元剤の負の影響を排除するために、標識する前にアルキル化されてもよい。
【０１１０】
標識されたタンパク質を分析するために本願明細書に記載される方法で使用される電気泳動手法としては、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）、キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）、スラブゲル電気泳動、等電点ゲル電気泳動、等電点電気泳動および２Ｄ電気泳動手法が挙げられるが、これらに限定されない。当該タンパク質を分離するためのプロセスとしては、サイズによる分離、電荷による分離、またはサイズおよび電荷の組み合わせによる分離が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態では、当該蛍光標識されたタンパク質は、本願明細書に記載される使い捨てのカセット内に備えられるスラブゲルを使用して、電気泳動により分離される。
【０１１１】
ゲル電気泳動によるサイズ分画については、当該標識されたタンパク質は、２−（Ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸（ＭＥＳ）または３−（Ｎ−モルホリノ）−プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）バッファーのいずれかで泳動させるスラブゲル中での電気泳動によって分離することができ、スラブゲルとしては、１０％  ビス−トリスゲル、４−１２％  ビス−トリスゲル、または１２％  ビス−トリスゲル（例としてのみ示すと、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ビス−トリスゲル（インビトロジェン社、カリフォルニア州、カールスバッド）などが挙げられる）が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態では、当該標識されたタンパク質は、トリス−アセテート（ＴＡ）ゲル（７％または３〜８％  濃度勾配トリス−アセテートゲル、例としてのみ示すと、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）トリス  アセテートゲル（インビトロジェン社、カリフォルニア州、カールスバッド）などが挙げられるが、これらに限定されない）で分離することができる。ある他の実施形態では、当該標識されたタンパク質は、トリス−グリシン（ＴＧ）ゲル（４％  ＴＧゲル、６％  ＴＧゲル、８％  ＴＧゲル、１０％  ＴＧゲル、１２％  ＴＧゲル、１４％  ＴＧゲル、１６％  ＴＧゲル、および１８％  ＴＧゲルが挙げられるが、これらに限定されない）で分離することができる。ある他の実施形態では、当該標識されたタンパク質は、濃度勾配トリス−グリシン（ＴＧ）ゲル（４〜１２％、４〜２０％、８〜１６％、１０〜２０％などの濃度勾配を有するＴＧゲル、例としてのみ示すと、インビトロジェン社（カリフォルニア州、カールスバッド）から入手できるＴＧゲルが挙げられるが、これらに限定されない）で分離することができる。さらなる実施形態では、当該標識されたタンパク質は、１０％  トリシンゲル、１６％  トリシンゲル、および１０〜２０％濃度勾配トリシンゲルなどのトリシンゲルで分離することができる。なおさらなる実施形態では、当該標識されたタンパク質は、標準的なＬａｅｍｍｌｉゲルで分離することができる。
【０１１２】
本発明の方法のゲルベースの電気泳動の実施形態は、任意の適切な物理的形式のゲル中で、例えば標準的なサイズのスラブゲル中で、ミニゲルスラブゲル中で、ストリップ（ｓｔｒｉｐ）で、キャピラリー中のゲルで、マイクロタイタープレートとともに使用するように設計されたゲル中で、および他の高スループット応用例で実施することができる。
【０１１３】
ある実施形態では、本願明細書に記載される方法に従って標識された９６個までのタンパク質試料を、Ｅ−ＰＡＧＥ（商標）９６ゲルシステム（インビトロジェン社、カリフォルニア州、カールスバッド）で同時に分離することができる。このＥ−ＰＡＧＥ（商標）９６ゲルは、使い捨てのＵＶに対して透明なカセット内部にパッケージ化されたゲルマトリクスおよび電極を含む自蔵式のプレキャストゲルである。各Ｅ−ＰＡＧＥ（商標）９６ゲルは、９６個の試料レーンおよび８個のマーカーレーンをジグザグのウェル形式で含む。
【０１１４】
等電点に基づく分離のために、当該標識されたタンパク質は、単独の分離工程として、または上記の方法、システムおよびゲルを使用するサイズ分画の準備の工程として（２Ｄ−ＰＡＧＥの第１の工程として、が挙げられるが、これに限定されない）のいずれかで等電点電気泳動法（ＩＥＦ）を使用して分離することができる。ある実施形態では、当該標識されたタンパク質は、溶液相等電点電気泳動法を使用して分離することができる。ある実施形態では、標識されたタンパク質は、インビトロジェン社（カリフォルニア州、カールスバッド）から入手できるＺＯＯＭ（登録商標）ＩＥＦ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｏｒ、溶液相等電点電気泳動法装置を使用して分離することができる。かかる実施形態では、当該タンパク質は、本願明細書に記載される蛍光発生性試薬および方法を使用して、溶液相ＩＥＦを用いた分画の前後のいずれかで標識することができる。他の実施形態では、当該標識されたタンパク質は、スラブゲル中、チューブゲル中、または、固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ストリップ中のいずれかでゲルベースの等電点電気泳動法を使用して分離することができる。
【０１１５】
当該標識されたタンパク質の電気泳動による分離は、定電圧、パルス状電圧、定電流、パルス状電流、定電力またはパルス状電力を使用して成し遂げることができる。続いて、本願明細書で開示される方法で使用される電場（Ｖ／ｃｍ）は、一定またはパルス状であってよい。以下に提示される電場範囲を実現するために印加される電圧、印加される電流または印加される電力の大きさは、電気泳動装置（キャピラリーまたはスラブゲル）の寸法およびバッファーの電気伝導度に応じて変わるであろうということを理解されたい。例としてのみ示すと、印加される電圧は５Ｖ〜１０，０００Ｖの範囲であってよい。ある実施形態では、印加される電圧は５Ｖ〜２，０００Ｖの範囲であってよく、ある実施形態では、印加される電圧は５Ｖ〜１，０００Ｖ、５Ｖ〜５００Ｖ、５Ｖ〜２５０Ｖ、または５Ｖ〜１００Ｖの範囲であってよい。例としてのみ示すと、印加される電流は５ｍＡ〜４００ｍＡの範囲であってよく、ある実施形態では、印加される電流は５ｍＡ〜２００ｍＡ、５ｍＡ〜１００ｍＡ、５ｍＡ〜５０ｍＡ、または５ｍＡ〜２５ｍＡの範囲であってよい。１つの実施形態では、印加される電流は６０ｍＡであってよい。例としてのみ示すと、印加される電力は５ｍＡ〜４００ｍＡの範囲であってよく、ある実施形態では、印加される電流は２５ｍＷ〜４００Ｗ、２５ｍＷ〜１００Ｗ、２５ｍＷ〜５０Ｗ、または２５ｍＷ〜２５Ｗの範囲であってよい。１つの実施形態では、印加される電流は４．５Ｗであってよい。加えて、印加される電圧（一定またはパルス状）の極性は正であってもよくまたは負であってもよく、印加される電流（一定またはパルス状）の極性は正であってもよくまたは負であってもよい。
【０１１６】
ある実施形態では、印加される定電場の大きさは１Ｖ／ｃｍ〜１００Ｖ／ｃｍである。ある実施形態では、印加される定電場の大きさは１Ｖ／ｃｍ〜５０Ｖ／ｃｍである。ある実施形態では、印加される定電場の大きさは１Ｖ／ｃｍ〜２５Ｖ／ｃｍである。ある実施形態では、印加される定電場の大きさは１Ｖ／ｃｍ〜１５Ｖ／ｃｍである。ある実施形態では、印加される定電場の大きさは１Ｖ／ｃｍ〜１０Ｖ／ｃｍである。
【０１１７】
このパルス状電場のプロファイルは、方形波、三角波または正弦波であってよく、かかるプロフィールは、対称的であってもよく非対称的であってもよい。パルス状電場は一定のベースライン電場に印加され、このベースライン電場の大きさは０Ｖ／ｃｍ〜１００Ｖ／ｃｍである。ある実施形態では、このベースライン電場の大きさは０Ｖ／ｃｍ〜５０Ｖ／ｃｍである。このベースライン電場の大きさは０Ｖ／ｃｍ〜２５Ｖ／ｃｍである。このベースライン電場の大きさは０Ｖ／ｃｍ〜１０Ｖ／ｃｍである。ある実施形態では、このベースライン電場に加えて印加されるパルス状電場の大きさは１Ｖ／ｃｍ〜１００Ｖ／ｃｍである。ある実施形態では、このベースライン電場に加えて印加されるパルス状電場の大きさは１Ｖ／ｃｍ〜５０Ｖ／ｃｍである。ある実施形態では、このベースライン電場に加えて印加されるパルス状電場の大きさは１Ｖ／ｃｍ〜２５Ｖ／ｃｍである。ある実施形態では、このベースライン電場に加えて印加されるパルス状電場の大きさは１Ｖ／ｃｍ〜１０Ｖ／ｃｍである。
【０１１８】
対称的方形波であるパルス状電場については、ベースライン電場に加えてパルス状電場が印加される時間（ＯＮ）は、そのパルス状電場が印加されない時間（ＯＦＦ）と同じである。ある実施形態では、このＯＮおよびＯＦＦの時間は、１ｍｓ〜６０秒間である。非対称的な方形波のパルス状電場であるパルス状電場については、そのパルス状電場が印加されない時間（ＯＦＦ）と同じではない、ベースライン電場に加えてパルス状電場が印加される時間（ＯＮ）を有する。ある実施形態では、このＯＮ時間は独立に１ｍｓ〜６０秒間であり、このＯＦＦ時間は独立に１ｍｓ〜６０秒間である。
【０１１９】
対称的三角波であるパルス状電場については、印加される最大電場まで上がる電圧ランプ速度（Ｖ／ｓ）は、印加されるベースライン電場まで下がる電圧ランプ速度（Ｖ／ｓ）と同じである。ある実施形態では、上昇時の電圧ランプおよび下降時の電圧ランプは、１０ｍＶ／ｓ〜１００Ｖ／ｓである。非対称的三角波であるパルス状電場については、印加される最大電場まで上がる電圧ランプ速度（Ｖ／ｓ）は、印加されるベースライン電場まで下がる電圧ランプ速度（Ｖ／ｓ）と同じではない。ある実施形態では、上昇時の電圧ランプは独立に１０ｍＶ／ｓ〜１００Ｖ／ｓであり、下降時の電圧ランプは独立に１０ｍＶ／ｓ〜１００Ｖ／ｓである。
【０１２０】
対称的正弦波であるパルス状電場については、周期および周波数は一定であり、その正弦波の最小電場は印加されるベースライン電場と同じである。非対称的正弦波であるパルス状電場については、周期および周波数は変調され、その正弦波の最小電場は印加されるベースライン電場と同じである。
【０１２１】
ある実施形態では、この電場は、Ｅ−Ｇｅｌ（登録商標）Ｐｏｗｅｒｂａｓｅ（商標）（インビトロジェン  カールスバッド）、Ｅ−Ｇｅｌ（登録商標）ｉ−Ｂａｓｅ（商標）（インビトロジェン  カールスバッド）およびＥ−Ｂａｓｅ（登録商標）（インビトロジェン  カールスバッド）を使用して印加される。
【０１２２】
ある実施形態では、標識されたタンパク質または標識されたタンパク質の混合物は、スラブゲル電気泳動の手法を使用して分離される。かかる実施形態では、本願明細書に記載される標識方法で使用される第１のバッファーは、糖類、糖アルコール、またはこれらの組合せをも含む。他の実施形態では、本願明細書に記載される標識方法で使用される第２のバッファーは、糖類、糖アルコール、またはこれらの組合せをも含む。あるいは、他の実施形態では、糖類、糖アルコール、またはこれらの組合せが最終反応混合物に加えられる。ある実施形態では、第１のバッファーに加えられる糖類はショ糖である。他の実施形態では、第１のバッファーに加えられる糖アルコールはグリセロールである。ある実施形態では、第２のバッファーに加えられる糖類はショ糖である。他の実施形態では、第２のバッファーに加えられる糖アルコールはグリセロールである。ある実施形態では、最終反応混合物に加えられる糖類はショ糖である。他の実施形態では、最終反応混合物に加えられる糖アルコールはグリセロールである。
【０１２３】
本願明細書に記載されるタンパク質標識方法で使用される糖類または糖アルコールの濃度は、約１％（重量／体積）〜約３０％（重量／体積）である。ある実施形態では、本願明細書に記載されるタンパク質標識方法で使用される糖類または糖アルコールの濃度は、約１％（重量／体積）〜約２５％（重量／体積）である。ある実施形態では、当該濃度は約１％（重量／体積）〜約２０％（重量／体積）であり、他の実施形態では、当該濃度は約１％（重量／体積）〜約１５％（重量／体積）である。ある実施形態では、当該濃度は約１％（重量／体積）〜約１０％（重量／体積）であり、他の実施形態では、当該濃度は約５％（重量／体積）〜約２５％（重量／体積）である。他の実施形態では、当該濃度は約５％（重量／体積）〜約２０％（重量／体積）である。
【０１２４】
標識されたタンパク質またはタンパク質の混合物は、分離工程の前に還元剤で処理されてもよい。かかる還元剤としては、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール（β−メルカプトエタノールとしても公知）、亜硫酸水素ナトリウム、チオグリコール酸、メルカプトエタンスルホン酸、グルタチオンおよびトリアルキルホスフィン化合物またはこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。かかるトリアルキルホスフィン化合物としては、トリ−ｎ−ブチルホスフィン（ＴＢＰ）またはトリス［２−カルボキシエチル］ホスフィン（ＴＣＥＰ）が挙げられるが、これらに限定されない。還元剤、または還元剤の組み合わせは、第２のバッファーの添加に先立って上記第１のバッファーに加えられてもよく、あるいは還元剤、または還元剤の組み合わせは、上記第１のバッファーへの第２のバッファーの添加に先立って第２のバッファーに加えられてもよい。
【０１２５】
本願明細書に記載される方法で使用される還元剤の濃度としては、少なくとも約１０μＭ、少なくとも約１００μＭ、少なくとも約１ｍＭ、少なくとも約２ｍＭ、少なくとも約２．５ｍＭ、少なくとも約３ｍＭ、少なくとも約３．７５ｍＭ、少なくとも約４ｍＭ、少なくとも約５ｍＭ、少なくとも約１０ｍＭ、少なくとも約１５ｍＭ、少なくとも約２０ｍＭ、少なくとも約２５ｍＭ、少なくとも約３０ｍＭ、少なくとも約３５ｍＭ、少なくとも約４０ｍＭ、少なくとも約４５ｍＭ、少なくとも約５０ｍＭ、少なくとも約５５ｍＭ、少なくとも約６０ｍＭ、少なくとも約６５ｍＭ、少なくとも約７０ｍＭ、少なくとも約７５ｍＭ、少なくとも約８０ｍＭ、少なくとも約８５ｍＭ、少なくとも約９０ｍＭ、少なくとも約９５ｍＭ、少なくとも約１００ｍＭ、少なくとも約２００ｍＭ、少なくとも約３５０ｍＭ、または少なくとも約５００ｍＭが挙げられるが、これらに限定されない。本願明細書に記載される方法で使用される還元剤の濃度としては、１０μＭ、１００μＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、２．５ｍＭ、３ｍＭ、３．７５ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、５５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、９５ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ、３５０ｍＭ、または５００ｍＭが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２６】
ある実施形態では、本願明細書で開示される方法で使用される電気泳動ゲルは、アクリルアミド（例としてのみ示すと、約２．５％〜約３０％、または約５％〜約２０％の濃度のアクリルアミドが挙げられる）を含む。ある実施形態では、かかるポリアクリルアミド電気泳動ゲルは、１％〜１０％  架橋剤（ビスアクリルアミドが挙げられるが、これに限定されない）を含む。ある実施形態では、本願明細書で開示される方法で使用される電気泳動ゲルは、アガロース（例としてのみ示すと、約０．１％〜約５％、または約０．５％〜約４％、または約１％〜約３％の濃度のアガロースが挙げられる）を含む。ある実施形態では、本願明細書で開示される方法で使用される電気泳動ゲルは、アクリルアミドおよびアガロースを含む（例としてのみ示すと、約２．５％〜約３０％  アクリルアミドおよび約０．１％〜約５％  アガロース、または約５％〜約２０％  アクリルアミドおよび約０．２％〜約２．５％  アガロースを含む電気泳動ゲルが挙げられる）。ある実施形態では、かかるポリアクリルアミド／アガロース電気泳動ゲルは１％〜１０％  架橋剤（ビスアクリルアミドが挙げられるが、これに限定されない）を含む。
【０１２７】
本願明細書で開示される方法のある実施形態では、上記電気泳動カセット中の電気泳動ゲルは濃度勾配ゲルである。本願明細書で開示される方法の他の実施形態では、電気泳動カセット中の電気泳動ゲルは高度に架橋されたゲルである。
【０１２８】
ある実施形態では、本願明細書で開示される方法で使用される電気泳動カセットおよび電気泳動ゲルは、Ｅ−ＰＡＧＥ（商標）カセット／ゲル（インビトロジェン、カールスバッド）およびＥ−Ｇｅｌ（登録商標）カセット／ゲル（インビトロジェン  カールスバッド）である。ある実施形態では、このＥ−ＰＡＧＥ（商標）（インビトロジェン、カールスバッド）カセット／ゲルは、横２列のウェルを有し、１つの横列のウェルはローディングウェルであり、他方の横列のウェルは回収ウェルである。他の実施形態では、Ｅ−Ｇｅｌ（登録商標）カセット／ゲル（インビトロジェン  カールスバッド）は横２列のウェルを有していて、横２列のウェルを有し、１つの横列のウェルはローディングウェルであり、他方の横列のウェルは回収ウェルである。ある実施形態では、横２列のウェル（横１列のローディングウェルおよび横１列の回収ウェル）を備える０．８％  Ｅ−Ｇｅｌ（登録商標）（インビトロジェン  カールスバッド）カセット／ゲルが使用される。他の実施形態では、横２列のウェル（横１列のローディングウェルおよび横１列の回収ウェル）を有する２％  Ｅ−Ｇｅｌ（登録商標）カセット／ゲル（インビトロジェン  カールスバッド）が使用される。
【０１２９】
本願明細書で開示される方法の電気泳動ゲルは、ゲルを形成する任意の物質を含むことができ、その例としては、合成ポリマー、天然ポリマーおよびこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。かかる合成ポリマーの例としては、直鎖状ポリアクリルアミド、架橋ポリアクリルアミド、ポリビニルピロリドンおよびこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。かかる天然ポリマーの例としては、アガロース、カラゲナン、およびキトサンなどの多糖類が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態では、このゲルは、アガロース、ポリアクリルアミド、またはアガロースおよびポリアクリルアミドの組み合わせを含むことができる。ある実施形態では、このゲルはポリアクリルアミドゲルであり、他方、他の実施形態ではこのゲルはアガロースゲルである。さらに他の実施形態では、このゲルは、アクリルアミドおよびアガロースの両方を含む。ある実施形態では、このゲルは、架橋ポリアクリルアミドを含み、他方、他の実施形態ではこのゲルは、非架橋ポリアクリルアミド（本願明細書において直鎖状ポリアクリルアミドとも呼ばれる）を含む。
【０１３０】
本願明細書に記載される方法で使用されるゲルは、変性ゲルであってよく、このゲルは、界面活性剤（１種または複数種）、カオトロピック剤（１種または複数種）またはこれらの組合せを含む。カオトロピック剤としては、トリフルオロ酢酸ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、尿素、塩化グアニジンおよびグアニジンイソチオシアネートが挙げられるが、これらに限定されない。変性界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）およびドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ）が挙げられるが、これらに限定されない。本願明細書に記載される方法で使用される変性ゲルとしては、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルおよびＳＤＳ直鎖状ポリアクリルアミドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３１】
加えて、本願明細書に記載される方法で使用されるゲルは、未変性のゲル（本願明細書において非変性ゲルとも呼ばれる）であってもよい。本願明細書で開示される方法で使用される未変性ゲルまたは非変性ゲルは、ゲル中またはランニングバッファー（１種または複数種）中に変性剤（例えば、タンパク質変性界面活性剤またはカオトロープなど）を伴わずに流される。いくつかの実施形態では、本願明細書に記載される方法で使用される電気泳動ゲルは濃度勾配ゲルである。
【０１３２】
本願明細書に記載される方法で使用される電気泳動ゲルは、水平にまたは鉛直に泳動される。
【０１３３】
本願明細書で開示される方法で使用される電気泳動ゲルは、分離ゲルの本体を含み、任意にスタッキングゲルを含む。この分離ゲルおよびスタッキングゲルは、ゲルを形成する同じ物質から構成されていてもよいし、またはこの分離ゲルおよびスタッキングゲルは、ゲルを形成する異なる物質から構成されていてもよい。この分離ゲルおよびスタッキングゲルのある実施形態は、ポリアクリルアミドゲルであり、このスタッキングゲルもまた直鎖状ポリアクリルアミドを含む。この分離ゲルおよびスタッキングゲルの他の実施形態は、分離ゲルも直鎖状ポリアクリルアミドを含むポリアクリルアミドゲルである。この分離ゲルおよびスタッキングゲルのある実施形態は、分離ゲルおよびスタッキングゲルの両方が直鎖状ポリアクリルアミドを含むポリアクリルアミドゲルである。本願明細書で開示される方法で使用される電気泳動ゲルは、直鎖状アクリルアミドがスタッキングゲル中にのみ存在し、分離ゲル中には存在しないスタッキングゲルおよび分離ゲルを含むことができる。ある実施形態では、かかるスタッキングゲルおよび分離ゲルはともにポリアクリルアミドを含むが、スタッキングゲルのみが直鎖状アクリルアミドを含む。
【０１３４】
本願明細書で開示される方法で使用されるポリアクリルアミドゲルは、単量体のアクリルアミドおよびビスアクリルアミドの混合物である「アクリルアミド」の溶液を使用して作製される。このアクリルアミドおよびビスアクリルアミドの重合は、架橋ポリアクリルアミドゲルを生成するための重合開始剤、および必要に応じて触媒を使用する。本願明細書で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法のポリアクリルアミドゲルを作製するための混合物で使用される単量体のビスアクリルアミドに対するアクリルアミドの比は、約１５：１〜約５０：１の範囲である。例としてのみ示すと、かかるポリアクリルアミドゲルにおける（単量体）アクリルアミド：ビスアクリルアミド比は、１５：１、１９：１、２４：１、２９：１、３７．５：１、４０：１、４５：１および５０：１であってよい。本願明細書で開示されるある実施形態では、タンパク質およびタンパク質複合体の分析のための（単量体）ビスアクリルアミドに対するアクリルアミドの比は、約１９：１〜約４５：１の範囲である。
【０１３５】
本願明細書で開示される方法で使用される電気泳動ゲルのある実施形態では、上記スタッキングゲルは、上記のとおりのアクリルアミドおよびビスアクリルアミドの混合物を使用して作製されるポリアクリルアミドを含む。ある実施形態では、このスタッキングゲルは、分離ゲルを作製するために使用されるアクリルアミド濃度より低いアクリルアミド濃度を用いて作製される。例としてのみ示すと、スタッキングゲルは、約２％〜約８％、約２．５％〜約７．５％  アクリルアミド、約３％〜約７％  アクリルアミド、約３．５％〜約６．５％  アクリルアミド、約４％〜約６％  アクリルアミド、約４．５％〜約５．５％  アクリルアミド、または約２．５％〜約６％  アクリルアミドの範囲の（重量／体積）アクリルアミド濃度を有することができる。例としてのみ示すと、スタッキングゲルは、２％〜８％、２．５％〜７．５％  アクリルアミド、３％〜７％  アクリルアミド、３．５％〜６．５％  アクリルアミド、４％〜６％  アクリルアミド、４．５％〜５．５％  アクリルアミド、または２．５％〜６％  アクリルアミドの範囲の（重量／体積）アクリルアミド濃度を有することができる。
【０１３６】
ある実施形態では、本願明細書で開示される方法で使用される電気泳動ゲルの分離ゲルおよびスタッキングゲルは（個々にまたは一緒に）直鎖状ポリアクリルアミドを含む。他の実施形態では、本願明細書で開示される方法で使用される電気泳動ゲルのポリアクリルアミド分離ゲルおよびポリアクリルアミドスタッキングゲルは（個々にまたは一緒に）、直鎖状ポリアクリルアミドを含む。かかるゲル中に含まれる直鎖状アクリルアミドの（重量／体積）濃度は、約０．００５％〜約１％、０．００５％〜約０．７５％、０．００５％〜約０．５％、０．００５％〜約０．１％、０．０１％〜約１％、０．０１％〜約０．７５％、０．０１％〜約０．５％、０．０１％〜約０．１％、０．０２％〜約１％、０．０２％〜約０．７５％、０．０２％〜約０．５％、０．０２％〜約０．２％、または０．０２％〜約０．１％の範囲であってよい。例示となる実施形態では、かかるゲル中に含まれる直鎖状アクリルアミドの（重量／体積）濃度は、０．００５％〜１％、０．００５％〜０．７５％、０．００５％〜０．５％、０．００５％〜０．１％、０．０１％〜１％、０．０１％〜０．７５％、０．０１％〜０．５％、０．０１％〜０．１％、０．０２％〜１％、０．０２％〜０．７５％、０．０２％〜０．５％、０．０２％〜０．２％、または０．０２％〜０．１％の範囲であってよい。
【０１３７】
加えて、かかるゲル中に含まれる直鎖状アクリルアミドの分子量は、約１，０００ダルトン〜約６，０００，０００ダルトン、約１，０００ダルトン〜約５，０００，０００ダルトン、約１，０００ダルトン〜約２，０００，０００ダルトン、約１，０００ダルトン〜約１，０００，０００ダルトン、約１，０００ダルトン〜約７５０，０００ダルトン、約１，０００ダルトン〜約５００，０００ダルトン、約１，０００ダルトン〜約３００，０００ダルトン、約１，０００ダルトン〜約２００，０００ダルトン、約１，０００ダルトン〜約１００，０００ダルトン、約１，０００ダルトン〜約５０，０００ダルトン、約１，０００ダルトン〜約２５，０００ダルトン、または約１，０００ダルトン〜約１０，０００ダルトンの範囲であってよい。加えて、かかるゲル中に含まれる直鎖状アクリルアミドの分子量は、１，０００ダルトン〜６，０００，０００ダルトン、１，０００ダルトン〜５，０００，０００ダルトン、１，０００ダルトン〜２，０００，０００ダルトン、１，０００ダルトン〜１，０００，０００ダルトン、１，０００ダルトン〜７５０，０００ダルトン、１，０００ダルトン〜５００，０００ダルトン、１，０００ダルトン〜３００，０００ダルトン、１，０００ダルトン〜２００，０００ダルトン、１，０００ダルトン〜１００，０００ダルトン、１，０００ダルトン〜５０，０００ダルトン、１，０００ダルトン〜２５，０００ダルトン、または１，０００ダルトン〜１０，０００ダルトンの範囲であってよい。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、本願明細書に記載される方法で使用される電気泳動ゲルは、上記ポリマーの濃度がゲル全体にわたって、一般にはゲル本体の頂部の低濃度からそのゲル本体の底部の高濃度まで変化する濃度勾配ゲルである。かかる濃度勾配分離ゲル中のポリマーの濃度範囲は、その用途、および特に分離されるべきタンパク質のサイズに依存する。ある実施形態では、本願明細書で開示される方法の電気泳動ゲルは、（重量／体積）アクリルアミド濃度が約２％〜約３０％、約２．５％〜２５％、約３％〜約２０％、約３％〜約８％、約４％〜約１６％、約３％〜約１２％、約４％〜約２０％、または約５％〜約２０％の範囲である濃度勾配を有する濃度勾配ポリアクリルアミドゲルであってよい。
【０１３９】
本願明細書で開示される方法で使用される電気泳動ゲルは、スタッキングゲルポリマーの濃度が濃度勾配分離ゲルで使用されるポリマーの最低濃度以下である、濃度勾配分離ゲルおよびスタッキングゲルの両方を含むことができる。ある実施形態では、この電気泳動ゲルは、ポリアクリルアミド濃度勾配分離ゲルおよびポリアクリルアミドスタッキングゲルをともに含み、スタッキングゲル中のアクリルアミドの濃度は濃度勾配分離ゲルで使用されるアクリルアミドの最低濃度以下である。他の実施形態では、この電気泳動ゲルは、ポリアクリルアミド濃度勾配分離ゲルおよびポリアクリルアミドスタッキングゲルの両方を含み、スタッキングゲル中のアクリルアミドの濃度は、濃度勾配分離ゲル中で使用されるアクリルアミドの最低濃度以下であり、かつこのスタッキングゲルは約０．００５％〜約１％、０．００５％〜約０．７５％、０．００５％〜約０．５％、０．００５％〜約０．１％、０．０１％〜約１％、０．０１％〜約０．７５％、０．０１％〜約０．５％、０．０１％〜約０．１％、０．０２％〜約１％、０．０２％〜約０．７５％、０．０２％〜約０．５％、０．０２％〜約０．２％または０．０２％〜約０．１％（重量／体積）濃度の直鎖状ポリアクリルアミドを含む。他の実施形態では、この電気泳動ゲルは、ポリアクリルアミド濃度勾配分離ゲルおよびポリアクリルアミドスタッキングゲルの両方を含み、スタッキングゲル中のアクリルアミド濃度は、濃度勾配分離ゲル中で使用されるアクリルアミドの最低濃度以下であり、かつこのスタッキングゲルは、０．００５％〜１％、０．００５％〜０．７５％、０．００５％〜０．５％、０．００５％〜０．１％、０．０１％〜１％、０．０１％〜０．７５％、０．０１％〜０．５％、０．０１％〜０．１％、０．０２％〜１％、０．０２％〜０．７５％、０．０２％〜０．５％、０．０２％〜０．２％または０．０２％〜０．１％の（重量／体積）濃度の直鎖状ポリアクリルアミドを含む。別の実施形態では、本願明細書で開示される方法で使用される電気泳動ゲルは、４％〜１６％のポリアクリルアミド濃度を含むスラブ濃度勾配ポリアクリルアミド分離ゲル、および３％  ポリアクリルアミドおよび０．０５％（重量／体積）の直鎖状ポリアクリルアミドの濃度を有するポリアクリルアミドスタッキングゲルを含むことができる。
【０１４０】
本願明細書で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法で使用される電気泳動ゲルの濃度勾配分離ゲルは、約０．００５％〜約１％、０．００５％〜約０．７５％、０．００５％〜約０．５％、０．００５％〜約０．１％、０．０１％〜約１％、０．０１％〜約０．７５％、０．０１％〜約０．５％、０．０１％〜約０．１％、０．０２％〜約１％、０．０２％〜約０．７５％、０．０２％〜約０．５％、０．０２％〜約０．１％、または０．０２％〜約０．１％の（重量／体積）濃度で存在する直鎖状アクリルアミドをも含むことができる。ある実施形態では、かかる濃度勾配分離ゲルは、０．００５％〜１％、０．００５％〜０．７５％、０．００５％〜０．５％、０．００５％〜０．１％、０．０１％〜１％、０．０１％〜０．７５％、０．０１％〜０．５％、０．０１％〜０．１％、０．０２％〜１％、０．０２％〜０．７５％、０．０２％〜０．５％、０．０２％〜０．１％、または０．０２％〜０．１％の（重量／体積）濃度で存在する直鎖状アクリルアミドを含む。ある実施形態では、かかる濃度勾配分離ゲルは、（重量／体積）アクリルアミド濃度が約２％〜約３０％、約２．５％〜約２５％、約３％〜約２０％、約３％〜約８％、約４％〜約１６％、約３％〜約１２％、約４％〜約２０％、または約５％〜約２０％の範囲である濃度勾配を有するポリアクリルアミド濃度勾配分離ゲルである。ある実施形態では、かかる濃度勾配分離ゲルは、（重量／体積）アクリルアミド濃度が２％〜３０％、２．５％〜２５％、３％〜２０％、３％〜８％、４％〜１６％、３％〜１２％、４％〜２０％、または５％〜２０％の範囲である濃度勾配を有するポリアクリルアミド濃度勾配分離ゲルである。
【０１４１】
本願明細書で開示される方法で使用される電気泳動ゲルは、変性ゲルである分離ゲルおよびスタッキングゲルの両方を含むことができる。ある実施形態では、かかる変性作用を有する分離ゲルおよびスタッキングゲルは直鎖状ポリアクリルアミドを含み、他方、他の実施形態では、かかる変性作用を有する分離ゲルおよびスタッキングゲルはポリアクリルアミド分離ゲルおよびスタッキングゲルであり、このスタッキングゲルは直鎖状ポリアクリルアミドを含む。他の実施形態では、かかる変性作用を有する分離ゲルおよびスタッキングゲルは、直鎖状ポリアクリルアミドを含むポリアクリルアミド分離ゲルおよびスタッキングゲルである。他の実施形態では、本願明細書で開示される方法で使用される電気泳動ゲルは、スタッキングゲルを含まない変性ポリアクリルアミドゲルである。
【０１４２】
本願明細書に記載される方法の分離工程で使用されるゲルは、任意の電気泳動バッファー（双性イオンバッファーが挙げられるが、これに限定されない）であってよいゲルバッファー（１種または複数種）を含む。ある実施形態では、当該ゲルバッファーは、常温でｐＨ  ５〜９を有する。ある実施形態では、当該ゲルバッファーは、常温でｐＨ  ６〜８．５を有する。ある実施形態では、当該ゲルバッファーは、常温でｐＨ  ６〜８を有する。ある実施形態では、当該ゲルバッファーは、常温でｐＨ  ６〜７を有する。ある実施形態では、当該ゲルバッファーは、常温でｐＨ  ７〜８を有する。ある実施形態では、当該ゲルバッファーは、２５℃でｐＨ  ５〜９を有する。ある実施形態では、当該ゲルバッファーは、２５℃でｐＨ  ６〜８．５を有する。ある実施形態では、当該ゲルバッファーは、２５℃でｐＨ  ６〜８を有する。ある実施形態では、当該ゲルバッファーは、２５℃でｐＨ  ７〜８を有する。ある実施形態では、当該ゲルバッファーは、２５℃でｐＨ  ６〜７を有する。
【０１４３】
ある実施形態では、本願明細書に記載される方法の分離工程で使用されるバッファー（１種または複数種）（ゲルバッファー（１種または複数種）を含む）は、常温で約５〜約８．５のｐＫａを有する化合物を含む。ある実施形態では、かかるバッファーは、常温で約６〜約８．５のｐＫａを有する化合物を含む。ある実施形態では、かかるバッファーは、常温で約６〜約８のｐＫａを有する化合物を含む。ある実施形態では、かかるバッファーは、常温で約６〜約７のｐＫａを有する化合物を含む。ある実施形態では、かかるバッファーは、常温で約７〜約８のｐＫａを有する化合物を含む。ある実施形態では、かかるバッファーは、２５℃で約５〜約８．５のｐＫａを有する化合物を含む。ある実施形態では、かかるバッファーは、２５℃で約６〜約８．５のｐＫａを有する化合物を含む。ある実施形態では、かかるバッファーは、２５℃で約６〜約８のｐＫａを有する化合物を含む。ある実施形態では、かかるバッファーは、２５℃で約６〜約７のｐＫａを有する化合物を含む。ある実施形態では、かかるバッファーは、２５℃で約７〜約８のｐＫａを有する化合物を含む。
【０１４４】
本願明細書に記載される方法の分離工程で使用されるバッファー（１種または複数種）（ゲルバッファー（１種または複数種）を含む）としては、コハク酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩、マレイン酸塩、カコジル酸塩、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、２−（Ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＰＩＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ビス−（ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）−プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−トリス−（ヒドロキシメチル）−２−エタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチル−ピペラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−（Ｎ−トリス−（ヒドロキシメチル）メチルアミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、３−（Ｎ，Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］アミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＨＥＰＰＳＯ）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンプロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、Ｎ−［トリス−（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（トリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ））、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（ビシン（Ｂｉｃｉｎｅ））、（２−ヒドロキシ−１，１−ビス（ヒドロキシメチル）エチル）アミノ］−１−プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ−（１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル）−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳＯ）、トリス−（ヒドロキシメチル）アミノ−メタン（トリス）、トリス−アセテート−ＥＤＴＡ（ＴＡＥ）、グリシン、ビス［２−ヒドロキシエチル］イミノトリス［ヒドロキシメチル］メタン（ビストリス）、またはこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。加えて、かかるゲルバッファーとしては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を挙げることができる。
【０１４５】
本願明細書に記載される方法で使用されるバッファー（１種または複数種）の濃度は、約１０ｍＭ〜約１．５Ｍであってよい。ある実施形態では、当該濃度は約１０ｍＭ〜約１Ｍであってよい。ある実施形態では、当該濃度は約２０ｍＭ〜約５００ｍＭであってよく、他の実施形態では、当該濃度は約５０ｍＭ〜約３００ｍＭである。ある実施形態では、当該濃度は約１０ｍＭ〜約２００ｍＭであってよく、他の実施形態では、当該濃度は約１０ｍＭ〜約５００ｍＭである。ある実施形態では、当該濃度は約５０ｍＭ〜約２００ｍＭであってよく、他の実施形態では、当該濃度は約５０ｍＭ〜約５００ｍＭである。ある実施形態では、当該濃度は約５ｍＭ〜約２００ｍＭであってよく、他の実施形態では、当該濃度は約５ｍＭおよび約５００ｍＭである。ある実施形態では、当該濃度は約５ｍＭ〜約１Ｍであってよい。ある実施形態では、本願明細書に記載される方法で使用されるバッファー（１種または複数種）の濃度は、１０ｍＭ〜１．５Ｍであってよい。ある実施形態では、当該濃度は１０ｍＭ〜１Ｍであってよい。ある実施形態では、当該濃度は２０ｍＭ〜５００ｍＭであってよく、および他の実施形態では、当該濃度は５０ｍＭ〜３００ｍＭである。ある実施形態では、当該濃度は１０ｍＭ〜２００ｍＭであってよく、他の実施形態では、当該濃度は１０ｍＭ〜５００ｍＭである。ある実施形態では、当該濃度は５０ｍＭ〜２００ｍＭであってよく、他の実施形態では、当該濃度は５０ｍＭ〜５００ｍＭである。ある実施形態では、当該濃度は５ｍＭ〜２００ｍＭであってよく、他の実施形態では、当該濃度は５ｍＭ〜５００ｍＭである。ある実施形態では、当該濃度は５ｍＭ〜１Ｍであってよい。
【０１４６】
可視化
標識されたタンパク質の分離は、その分離プロセスの間または分離後にモニターするまたは他の様式で可視化することができる。電気泳動手法またはクロマトグラフィ手法で使用するための当業者に公知の任意の検出システムが、本願明細書に記載される方法で使用することができる。例としてのみ示すと、レーザー誘導蛍光検出システム、撮像システム、ＣＣＤベースのシステム、吸光度ベースのシステム、ＰＭＴを利用するシステム、および質量分析ベースの検出が挙げられる。
【０１４７】
電気泳動ゲルにおける試料バンドの可視化は、適切な波長（１種または複数）を有する光で電気泳動ゲルを照射して、色素、染料、または試料バンドと関連した他の指示薬の観察を可能にすることによって、成し遂げることができる。この電気泳動ゲルは、それ自体で可視化されてもよいし、またはそのゲルは電気泳動カセット内またはキャピラリー内にあってもよい。
【０１４８】
可視化のために使用される光は、単色光であってもよいし、多色光であってもよい。例としてのみ示すと、多色光は白色光、ＵＶ光または赤外光であってよく、他方、単色光はレーザーまたは発光ダイオード（ＬＥＤ）を使用して、または白色光、ＵＶ光または赤外光などの光源の特異的スペクトルフィルタリング（ｓｐｅｃｔｒａｌ  ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ）によって実現することができる。かかる単色光の所望の波長が使用される色素または染料の特異的スペクトルフィルタリング特性に依存することは理解されるであろう。そして当業者なら、かかる単色光を得る方法を知っているであろう。
【０１４９】
可視化は、蛍光標識されたタンパク質の電気泳動による分離の間または分離の後に、電気泳動ゲルまたはゲルを含む電気泳動カセットが置かれる自立型の「ライトボックス」中で実施することができる。かかる「ライトボックス」では、電気泳動ゲルまたはゲルを含む電気泳動カセットが、電気泳動による分離の間置かれると、当該可視化が連続的または間欠的のいずれかで行われる。あるいは、そのゲルは分離後に可視化される。かかるライトボックスでは、電気泳動カセットを、上からまたは下から照射することができる。モニタリングは、ＣＣＤカメラもしくはビデオカメラを使用して、または使用者の直接観察によって成し遂げることができる。かかる可視化方法の他の実施形態では、モニタリング手段（ＣＣＤカメラまたはビデオカメラ、または直接観察による）および電場（１種または複数種）を印加するための手段が１つの装置に組み合わせられている電気泳動／モニタリング装置が使用される。加えて、他の実施形態では、電気泳動の間その電気泳動カセットを冷却するための手段が組み込まれている。かかる冷却は、冷却された気体（例として挙げれば、液体窒素）の流れ、ファンまたはペルチエ冷却器によって成し遂げることができる。
【０１５０】
ある実施形態では、可視化は、Ｄａｒｋ  Ｒｅａｄｅｒ（登録商標）（クレア・ケミカルズ（Ｃｌａｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、ドロレス（Ｄｏｌｏｒｅｓ））またはＳａｆｅ  Ｉｍａｇｅｒ（商標）（インビトロジェン、カールスバッド）を使用して成し遂げられる。ある実施形態では、可視化は、電気泳動ゲルを含む電気泳動カセットがＤａｒｋ  Ｒｅａｄｅｒ（登録商標）（クレア・ケミカルズ、ドロレス）に接続されてその上に置かれているＥ−Ｇｅｌ（登録商標）Ｐｏｗｅｒｂａｓｅ（商標）（インビトロジェン  カールスバッド）を使用して成し遂げられる。ある実施形態では、可視化は、Ｅ−ＰＡＧＥ（商標）またはＥ−Ｇｅｌ（登録商標）カセット（インビトロジェン  カールスバッド）がＤａｒｋ  Ｒｅａｄｅｒ（登録商標）（クレア・ケミカルズ、ドロレス）に接続されてその上に置かれているＥ−Ｇｅｌ（登録商標）Ｐｏｗｅｒｂａｓｅ（商標）（インビトロジェン  カールスバッド）を使用して成し遂げられる。ある実施形態では、可視化は、電気泳動ゲルを含む電気泳動カセットがＳａｆｅ  Ｉｍａｇｅｒ（商標）（インビトロジェン、カールスバッド）に接続されてその上に置かれているＥ−Ｇｅｌ（登録商標）Ｐｏｗｅｒｂａｓｅ（商標）（インビトロジェン  カールスバッド）を使用して成し遂げられる。ある実施形態では、可視化は、Ｅ−ＰＡＧＥ（商標）またはＥ−Ｇｅｌ（登録商標）カセット（インビトロジェン  カールスバッド）がＳａｆｅ  Ｉｍａｇｅｒ（商標）（インビトロジェン、カールスバッド）に接続されてその上に置かれているＥ−Ｇｅｌ（登録商標）Ｐｏｗｅｒｂａｓｅ（商標）（インビトロジェン  カールスバッド）を使用して成し遂げられる。
【０１５１】
ある実施形態では可視化は、電気泳動ゲルを含む電気泳動カセットがＤａｒｋ  Ｒｅａｄｅｒ（登録商標）（クレア・ケミカルズ、ドロレス）に接続されてその上に置かれているＥ−Ｇｅｌ（登録商標）ｉＢａｓｅ（商標）（インビトロジェン  カールスバッド）を使用して成し遂げられる。ある実施形態では、可視化は、Ｅ−ＰＡＧＥ（商標）またはＥ−Ｇｅｌ（登録商標）カセット（インビトロジェン  カールスバッド）がＤａｒｋ  Ｒｅａｄｅｒ（登録商標）（クレア・ケミカルズ、ドロレス）に接続されてその上に置かれているＥ−Ｇｅｌ（登録商標）ｉＢａｓｅ（商標）（インビトロジェン  カールスバッド）を使用して成し遂げられる。ある実施形態では、可視化は、電気泳動ゲルを含む電気泳動カセットがＳａｆｅ  Ｉｍａｇｅｒ（商標）（インビトロジェン、カールスバッド）に接続されてその上に置かれているＥ−Ｇｅｌ（登録商標）ｉＢａｓｅ（商標）（インビトロジェン  カールスバッド）を使用して成し遂げられる。ある実施形態では、可視化は、Ｅ−ＰＡＧＥ（商標）またはＥ−Ｇｅｌ（登録商標）カセット（インビトロジェン  カールスバッド）がＳａｆｅ  Ｉｍａｇｅｒ（商標）（インビトロジェン、カールスバッド）に接続されてその上に置かれているＥ−Ｇｅｌ（登録商標）ｉＢａｓｅ（商標）（インビトロジェン  カールスバッド）を使用して成し遂げられる。
【０１５２】
ある実施形態では、可視化は、電気泳動ゲルを含む電気泳動カセットが接続されているＥ−Ｂａｓｅ（登録商標）（インビトロジェン  カールスバッド）を使用して成し遂げられかつ落射照明を使用して蛍光標識されたタンパク質がモニターされる。ある実施形態では、可視化は、Ｅ−ＰＡＧＥ（商標）またはＥ−Ｇｅｌ（登録商標）カセット（インビトロジェン  カールスバッド）が接続されているＥ−Ｂａｓｅ（登録商標）（インビトロジェン  カールスバッド）を使用して成し遂げられ、かつ落射照明を使用して蛍光標識されたタンパク質がモニターされる。上で提示されたかかる実施形態では、この落射照明は、本願明細書に提示される光源（白色光、所望の波長を得るための適切な光学フィルターを用いた白色光、青色光、レーザー、発光ダイオード（ＬＥＤ）および青色発光ダイオード（ＬＥＤ）が挙げられるが、これらに限定されない）を使用して成し遂げられ得る。
【０１５３】
他の実施形態では、電気泳動を実行するための電力供給および可視化システムの両方を単一の統合されたユニットへと組み合わせるシステムを使用して可視化が成し遂げられる。例としてのみ示すと、ある実施形態では、可視化は、本願明細書に開示される可視化システムに統合されたＥ−Ｇｅｌ（登録商標）ｉＢａｓｅ（商標）を使用して成し遂げられる。
【０１５４】
本願明細書で開示される方法で使用される電気泳動ゲルカセットの限定を意図しない例、およびかかるカセットを使用することができる装置の限定を意図しない例は、米国特許第５，５８２，７０２号、同第５，８６５，９７４号、および同第６，５６２，２１３号に開示されており、これらの各々を、参照によりその全体を本願明細書に援用したものとする。
【０１５５】
ある例示となる実施形態では、本願明細書で開示される方法で使用される電気泳動カセットは、閉鎖型電気泳動カセットである。閉鎖型電気泳動ゲルカセットは少なくとも４つの壁を有し、これらの壁は密閉されてこれらの壁に囲まれた分離チャンバを形成し、そしてこの分離チャンバは、少なくとも２つのウェルが中に形成されている電気泳動ゲルマトリクスを含む。加えて、かかるカセットの少なくとも１つの壁は、このカセットの外部から分離チャンバ中に含まれる電気泳動ゲル中に形成されたウェルにアクセスするための、またはこのカセットの外部からカセット内部の空の分離チャンバへのアクセスのための一列の開いた部分（本願明細書において開口部とも呼ばれる）を有する。かかる閉鎖型カセットは、電気泳動分離を実行するために、およびある実施形態では、分離された試料バンドの可視化を可能にするために必要とされるすべての化合物をも含む。加えて、かかる閉鎖型カセットは使い捨てのものであってもよい。ある実施形態では、この電気泳動ゲルは、社外販売業者によって分離チャンバの中に置かれ、他方、他の実施形態では、この分離チャンバは、最終使用者がその電気泳動カセットを使用する前にその電気泳動ゲルを分離チャンバに置くまでは、電気泳動ゲルを含まない。
【０１５６】
図１４および図１５は、本願明細書で開示される方法で使用される閉鎖型カセットの１つの実施形態を示す。図１４は外面図であり、図１５は図１４のＩＶ−−ＩＶに沿った断面図として見られる。カセット１０は、底面壁１９、側壁１２および１４、および上面壁１８を有する３次元的な分離チャンバを備え、これらの壁の各々は特定の厚さを有する。カセット１０は壁１２、１４、１６、および１９によって取り囲まれているという点では、カセット１０は実質的に閉鎖型であるが、それは本願明細書で開示されるであろうような開口部３６をも備え、任意の排気孔（３４および／または３２）も備えることができる。壁の厚さは０．１〜１０ｍｍの範囲であってよく、ある実施形態ではこの厚さは１．５ｍｍである。他の実施形態では、この厚さは９ｍｍ、８ｍｍ、７ｍｍ、６ｍｍ、５ｍｍ、４ｍｍ、３ｍｍ、２ｍｍまたは１ｍｍである。
【０１５７】
カセット１０の長さは５０〜２００ｍｍの範囲であってよく、カセット１０の幅は５０〜１５０ｍｍの範囲であってよく、カセット１０の高さは１〜１０ｍｍの範囲であってよい。１つの実施形態では、カセット１０の長さ、幅および高さは、それぞれ１６０ミリメートル（ｍｍ）、１００ｍｍおよび６ｍｍである。別の実施形態では、カセット１０の長さ、幅および高さは、それぞれ１３０ｍｍ、１３０ｍｍおよび６ｍｍである。別の実施形態では、カセット１０の長さ、幅および高さは、それぞれ１００ｍｍ、８０ｍｍおよび６ｍｍである。別の実施形態では、カセット１０の長さ、幅および高さは、それぞれ１０８ｍｍ、１３５ｍｍおよび６．７ｍｍである。
【０１５８】
上記のとおり、カセット１０は、任意に、電気泳動の間に電極２３および２１での電気化学反応によって発生する可能性がある気体状分子（例えば、酸素および／または水素）の逃散を可能にするための排気孔３２および３４を含んでもよい。ある実施形態では、排気孔は直径０．５〜２ｍｍの範囲に及び、他方、他の実施形態では、この排気孔は直径０．５〜１ｍｍの範囲に及ぶ。他の実施形態では、排気孔は直径１〜２ｍｍの範囲に及び、１つの実施形態では、この排気孔は直径１ｍｍである。
【０１５９】
図１５Ａおよび図１５Ｂの断面図に示されるとおり、当該分離チャンバは電気泳動ゲルマトリクス１６を含み、このゲルマトリクスは本願明細書に記載される任意の適切な電気泳動ゲルマトリクスであってよい。この分離チャンバは、外部直流（ＤＣ）電力源に接続されたときに、電気泳動分離を実行するために必要とされる電場を提供する、２１および２３と参照番号が付された２つの導電性電極をも含む。図１４および図１５に図示された実施形態では、電極２１はカソードであり、電極２３はアノードであるが、しかしながら他の実施形態では、電極２１はアノードであり、電極２３はカソードである。
【０１６０】
この分離チャンバは、任意に、２０および２２と参照番号が付されたイオン交換マトリクスを含んでいてよい。図１５Ａおよび図１５Ｂに図示された実施形態では、電極２１はカソードであり、電極２３はアノードであり、マトリクス２０はカチオン交換マトリクスであり、マトリクス２２はアニオン交換マトリクスであるが、しかしながら他の実施形態では、電極２１はアノードであり、電極２３はカソードであり、マトリクス２０はアニオン交換マトリクスであり、マトリクス２２はカチオン交換マトリクスである。
【０１６１】
この分離チャンバは任意に内部容積２９および３０をも備えていてよく、これらの内部容積は、互いに独立に、占有されていなくてもよく、電気泳動ゲルマトリクスに占有されていてもよく、またはバッファーに占有されていてもよい。占有されていない場合、内部容積２９または３０は、電気泳動の間に生成される気体が蓄積してよい容積として使用される。あるいは、上記のとおり、カートリッジ１０は、任意に、容積２９および／または３０に蓄積した気体を排出するための少なくとも２つの排気孔３２および３４を含んでいてよい。カセット１０が排気孔３２および３４を含む場合は、それらは電気泳動が始まる直前に開かれ、その試験が完結した後には汚染の可能性を実質的に減少させるために閉じられるということは分かるであろう。
【０１６２】
加えて、カートリッジ１０は、電極２１を支持することができる傾斜台２７を含んでいてよい。この傾斜台は、電極２１と、電極２１の上に存在するイオン交換マトリクス２２の表面との連続的な接触を容易にし、これにより電極２１の近傍で生成した気泡の放出が空の容積３０に向けられる。ある実施形態では、傾斜台２７は、カートリッジ１０の一体化部分として形成され、底面壁１９に対して約４５°の角度で傾いている。
【０１６３】
電気泳動ゲルマトリクス１６に形成されるウェル３８が、同様に図１５Ａおよび図１５Ｂの断面図に示されている。かかるウェルは、開口部３６の下に配置されている。図１４に示される開口部３６、および対応するウェル３８は、電気泳動による分離を受けることになるタンパク質またはタンパク質断片の試料を導入するために使用される。しかしながら、本願明細書で開示される方法で使用される開口部およびウェルの構成は１つの横列に限定されず、本願明細書で論じられる種々の形式のアレイなどの他の構成を含んでよい。１つの実施形態では、カートリッジ１０は複数の開口部および複数のウェルを含み、この複数の開口部および複数のウェルは１〜２００個の開口部および１〜２００個のウェルに及ぶ。別の実施形態では、この複数の開口部および複数のウェルは１〜１００個の開口部および１〜１００個のウェルに及ぶ。別の実施形態では、この複数の開口部および複数のウェルは１〜５０個の開口部および１〜５０個のウェルに及ぶ。ある実施形態では、カートリッジ１０は９６個の開口部および９６個のウェルを含み、他方、ある実施形態では、カートリッジ１０は４８個の開口部および４８個のウェルを含む。開口部３６および３７ならびにウェル３８および３９の寸法が本願明細書で論じられるが、しかしながら１つの実施形態では、ウェル３８および３９は幅０．５〜５ｍｍ、長さ１〜５ｍｍ、および深さ３〜５ｍｍの寸法を有する。
【０１６４】
このウェルは、当該電気泳動ゲルマトリクスがまだ液体状態にあるときに、電気泳動ゲルマトリクスの組立ての間にその分離チャンバ内の電気泳動ゲルマトリクスの中に「くし」を導入することによって、などの任意の適切な方法によって形成してもよい。この「くし」は突き出た歯を有し、この歯が上面壁１８にある開口部を介して電気泳動ゲルマトリクスに突き出るように配置される。このウェルは、くしの外形のまわりでゲル状態へと上記マトリクスが固化するときに、電気泳動ゲルマトリクス中に形成される。このくしがその電気泳動ゲルマトリクスおよび開口部から外に引き出されると、そのウェルは、試料、バッファー、または水などの液体のローディングのために利用できる。このくしはローディング直前に取り除かれてよく、またはそのくしは、例えばローディングの５秒〜１日前、またはローディングの１０秒〜１２時間前、またはローディングの１０秒〜３０分間前などの範囲のローディング前のある時期に取り除かれてよい。あるいは、このくしは電気泳動ゲルマトリクスおよび開口部から外に引き出され、カセット（開口部および対応するウェルを含む）の頂部はテープで覆われ、これにより、得られたウェルは汚染の可能性から封鎖される。次いでこの封鎖用テープは、ローディング直前に取り除かれ、またはその封鎖用テープは、ローディングの５秒〜１日前、またはローディングの１０秒〜１２時間前などの範囲のローディング前のある時期に取り除かれてもよい。
【０１６５】
ある実施形態では、この電気泳動カセットは、液体バッファーを含むカセット内の複数の領域に電極を有することができる。ある実施形態では、液体バッファーを含む領域は電気泳動ゲルと同じ平面にあり、他方、他の実施形態では、液体バッファーを含む領域は、電気泳動ゲルの平面の下または上に置かれる。他の実施形態では、この電極は、電場の印加を容易にするためのイオンを含むゲル（電気泳動ゲルなど）と直接接触しているが、液体バッファーについては不要である。他の実施形態では、この電極は、電場の印加を容易にするためのイオンを含むゲル（電気泳動ゲルなど）中に包埋されるが、液体バッファーについては不要である。他の実施形態では、この電極は、電場の印加を容易にするためのイオンを含むゲル（電気泳動ゲルなど）と間接的に接触しているが、液体バッファーについては不要であり、かかる間接的な接触は別のゲル物質を介したものであってもよいし、または単純な電気接点によるものであってもよい。
【０１６６】
あるいは、本願明細書に記載される方法で使用される分離技術は、電気泳動のスラブゲルを使用する開放系であり、このスラブゲルはランニングバッファーの中に浸漬されておらず、カセット内に備えられない。かかる方法では、このスラブゲルは上面および下面を備え、この上面は液体とは接触しておらず、すなわちスラブゲルは電気泳動による分離を実行するために使用されるランニングバッファーに浸漬されていない。かかる方法では、例としてのみ示すと、このスラブゲルは、直接的または間接的いずれかで電極と接触して置かれ、当該試料の電気泳動による泳動を実行するために電場が印加される。間接的な接触は、上記電極がバッファータンク中に置かれ、そのバッファータンクはスラブゲルとそのタンクとの間にウィッキング（ｗｉｃｋｉｎｇ）手段を有するウィッキング手法を使用して成し遂げることができるし、または間接的な接触は、電極とスラブゲルとの間に置かれたゲルマトリクスを使用して成し遂げることができる。加えて、かかる方法で使用されるスラブゲルは、上記電気泳動カセットについて本願明細書に開示されるローディングウェルおよび回収ウェルのアレイを含み、開口部は使用されないが、分離方法は上記電気泳動カセットについて本願明細書に開示される方法と同じである。
【０１６７】
あるいは、本願明細書に記載される方法で使用される分離技術は、電気泳動のスラブゲルを使用する開放系であり、このスラブゲルはランニングバッファー中に浸漬され、カセット内には備えられない。
【０１６８】
本願明細書で開示される方法で使用されるスラブゲルおよび電気泳動カセットは、１つだけの横列のウェルおよび開口部を有してもよく、またはかかるゲルおよびカセットはウェルおよび開口部の複数のアレイを有してもよい。ウェルおよび開口部のかかるアレイは、「ｒ×ｃ」アレイであるとして開示されることがあり、ここでｒは横列の数であり、ｃは縦列の数である。かかるアレイの横列の数、ｒ、および縦列の数、ｃ、は互いに独立であり、それゆえ本願明細書で開示される方法で使用されるウェルおよび開口部のアレイは、対称的アレイ（このときｒ＝ｃ）となり得るし、または非対称的アレイ（このときｒ≠ｃ）にもなり得る。ウェルおよび開口部のかかるアレイは、各々独立に少なくとも１の縦列、少なくとも２の縦列、少なくとも３の縦列、少なくとも４の縦列、少なくとも５の縦列、少なくとも６の縦列、少なくとも７の縦列、少なくとも８の縦列、少なくとも９の縦列、少なくとも１０の縦列、少なくとも１１の縦列、少なくとも１２の縦列、少なくとも１５の縦列、少なくとも２０の縦列、少なくとも５０の縦列、または少なくとも１００の縦列と組み合わせた、少なくとも１の横列、少なくとも２の横列、少なくとも３の横列、少なくとも４の横列、少なくとも５の横列、少なくとも６の横列、少なくとも７の横列、少なくとも８の横列、少なくとも９の横列、少なくとも１０の横列、少なくとも１１の横列、少なくとも１２の横列、少なくとも１５の横列、少なくとも２０の横列、少なくとも５０の横列、または少なくとも１００の横列を含むことができる。
【０１６９】
本願明細書で開示される方法で使用されるウェルおよび開口部のアレイの限定を意図しない例としては、ｒ×１アレイ、ｒ×２アレイ、ｒ×３アレイ、ｒ×４アレイ、ｒ×５アレイ、ｒ×６アレイ、ｒ×７アレイ、ｒ×８アレイ、ｒ×９アレイ、ｒ×１０アレイ、ｒ×１１アレイ、ｒ×１２、ｒ×１３アレイ、ｒ×１４アレイ、ｒ×１５アレイ、ｒ×１６アレイ、ｒ×１７アレイ、ｒ×１８アレイ、ｒ×１９アレイ、ｒ×２０アレイ、ｒ×２１アレイ、ｒ×２２アレイ、ｒ×２３アレイ、ｒ×２４アレイ、ｒ×２５、およびｒ×２６アレイ（ここでｒは２〜２６の整数である）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７０】
本願明細書で開示される方法で使用されるウェルおよび開口部のアレイの他の限定を意図しない例としては、１×ｃアレイ、２×ｃアレイ、３×ｃアレイ、４×ｃアレイ、５×ｃアレイ、６×ｃアレイ、７×ｃアレイ、８×ｃアレイ、９×ｃアレイ、１０×ｃアレイ、１１×ｃアレイ、１２×ｃ、１３×ｃアレイ、１４×ｃアレイ、１５×ｃアレイ、１６×ｃアレイ、１７×ｃアレイ、１８×ｃアレイ、１９×ｃアレイ、２０×ｃアレイ、２１×ｃアレイ、２２×ｃアレイ、２３×ｃアレイ、２４×ｃアレイ、２５×ｃ、および２６×ｃアレイ（ここで、ｃは２〜２６の整数である）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７１】
本願明細書で開示される方法で使用されるウェルのアレイにおけるウェルおよび開口部の配置は、１つの横列のウェルおよび開口部であってよい。あるいは、本願明細書で開示される方法で使用されるウェルのアレイにおけるウェルおよび開口部の配置としては、図１６に図示される配置が挙げられるが、これらに限定されない。かかる配置は、横列が交互のシグザグ形式で配置されている、図１６Ｅ〜図１６Ｆに示すような市松模様パターンであってよい。あるいは、ウェルおよび開口部の配置は、図１４Ａ−１４Ｄに示すようなパターンであってもよい。かかるアレイパターンにおけるウェルおよび開口部の数は、２〜２００、２〜１５０、２〜９６、２〜４８、２〜２４、または２〜１２であってよい。
【０１７２】
ある実施形態では、ウェルおよび開口部のアレイの横列のウェル間の間隔および開口部間の間隔は等距離であり、１つのウェルの中心から次のウェルまで測定した場合、５ｍｍ〜１０ｃｍの範囲とすることができる。ある実施形態では、ウェルおよび開口部のアレイの縦列のウェル間の間隔および開口部間の間隔は等距離であり、１つのウェルの中心から次のウェルまで測定した場合、５ｍｍ〜１０ｃｍの範囲とすることができる。
【０１７３】
ある実施形態では、ウェルおよび開口部のアレイの横列のウェル間の間隔および開口部間の間隔は、第１のウェルの中心から次のウェルまで測定した第１の間隔が５ｍｍ〜１０ｃｍの範囲にあり、かつ５ｍｍ〜１０ｃｍの範囲の増分量で、左から右へ線形的増分で増加することができる。あるいは、ある実施形態では、ウェルおよび開口部のアレイの横列のウェル間の間隔および開口部間の間隔は、１つのウェルの中心から次のウェルまで測定した場合、第１の間隔が５ｍｍ〜１０ｃｍの範囲にあり、かつ５ｍｍ〜１０ｃｍの範囲の増分量で、左から右へ線形的増分で減少することができる。
【０１７４】
ある実施形態では、ウェルおよび開口部のアレイの横列のウェル間の間隔および開口部間の間隔は、第１のウェルの中心から次のウェルまで測定した第１の間隔が５ｍｍ〜１０ｃｍの範囲にあり、かつ５ｍｍ〜１０ｃｍの範囲の増分量で、左から右へ非線形的増分で増加することができる。あるいは、ある実施形態では、ウェルおよび開口部のアレイの横列のウェル間の間隔および開口部間の間隔は、第１のウェルの中心から次のウェルまで測定した第１の間隔が５ｍｍ〜１０ｃｍの範囲にあり、かつ５ｍｍ〜１０ｃｍの範囲の増分量で、左から右へ非線形的増分で減少することができる。
【０１７５】
ある実施形態では、ウェルおよび開口部のアレイの縦列のウェル間の間隔および開口部間の間隔は、第１のウェルの中心から次のウェルまで測定した第１の間隔が５ｍｍ〜１０ｃｍの範囲にあり、かつ５ｍｍ〜１０ｃｍの範囲の増分量で、頂部から底部へ線形的増分で増加することができる。あるいは、ある実施形態では、ウェルおよび開口部のアレイの縦列のウェル間の間隔および開口部間の間隔は、第１のウェルの中心から次のウェルまで測定した第１の間隔が５ｍｍ〜１０ｃｍの範囲にあり、かつ５ｍｍ〜１０ｃｍの範囲の増分量で、頂部から底部へ線形的増分で減少することができる。
【０１７６】
ある実施形態では、ウェルおよび開口部のアレイの縦列のウェル間の間隔および開口部間の間隔は、第１のウェルの中心から次のウェルまで測定した第１の間隔が５ｍｍ〜１０ｃｍの範囲にあり、かつ５ｍｍ〜１０ｃｍの範囲の増分量で、頂部から底部へ非線形的増分で増加することができる。あるいは、ある実施形態では、ウェルおよび開口部のアレイの縦列のウェル間の間隔および開口部間の間隔は、第１のウェルの中心から次のウェルまで測定した第１の間隔が５ｍｍ〜１０ｃｍの範囲にあり、かつ５ｍｍ〜１０ｃｍの範囲の増分量で、頂部から底部へ非線形的増分で減少することができる。
【０１７７】
ウェルおよび開口部のアレイの各ウェルおよび開口部は、他とは独立に、円形、半円形、正方形、長方形、三角形、または卵形の形状をとることができる。異なる形状のウェルの寸法は以下のようにすることができる：
円形ウェル：直径２ｍｍ〜１５ｍｍ、および深さ１ｍｍ〜６ｍｍ；
半円形ウェル：半径１ｍｍ〜７．５ｍｍ、および深さ１ｍｍ〜６ｍｍ；
正方形ウェル、長さおよび幅２ｍｍ〜１５ｍｍ、および深さ１ｍｍ〜６ｍｍ；
長方形ウェル、長さ２ｍｍ〜１５ｍｍ、幅２ｍｍ〜１５ｍｍ、および深さ１ｍｍ〜６ｍｍ；
三角形ウェル、長さ２ｍｍ〜１５ｍｍ、高さ２ｍｍ〜１５ｍｍ、および深さ１ｍｍ〜６ｍｍ；
卵形ウェル、長さ２ｍｍ〜１５ｍｍ、高さ２ｍｍ〜１５ｍｍ、および深さ１ｍｍ〜６ｍｍ。
【０１７８】
当該ウェルは円形または卵形の形状をとっていてよいが、本発明のウェルは電気泳動の方向に実質的に平坦な壁を有して正方形、長方形、半円形または三角形をとることが好ましい。なぜなら、電気泳動の方向に平坦でない壁は電気泳動の間の試料バンドの形状に悪影響を及ぼす可能性があり、これにより試料構成成分の分離の分解能に影響を及ぼす可能性があるからである。加えて、このウェルの深さは、その電気泳動ゲルの厚さ未満であるべきであり、このウェルの底部は、電気泳動カセットの壁によってではなく、電気泳動ゲルによって形成される。
【０１７９】
ウェルのアレイの各ウェルは、他のウェルとは独立に、１５０ｎＬ〜１４ｍＬの範囲の容積を有することができる。ある実施形態では、各ウェルの容積は、他のウェルとは独立に５μＬ〜１０ｍＬの範囲であってよい。ある実施形態では、各ウェルの容積は、他のウェルとは独立に５μＬ〜１ｍＬの範囲であってよい。ある実施形態では、各ウェルの容積は、他のウェルとは独立に５μＬ〜５００μＬの範囲であってよい。ある実施形態では、各ウェルの容積は、他のウェルとは独立に５μＬ〜２００μｌの範囲であってよい。ある実施形態では、各ウェルの容積は、他のウェルとは独立に５μＬ〜１００μＬの範囲であってよい。より大きい容積のウェル（５００μＬ〜１４ｍＬの範囲の容積を有するウェルが挙げられるが、これらに限定されない）は、大きい試料体積からの注目する構成成分の分離、単離および回収のために使用することができる。
【０１８０】
本願明細書に記載される方法で使用されるゲルカセットのポリマー成分は、可視光に対して透明な、紫外光に対して透明な、赤外光に対して透明な、または可視光および紫外光の両方に対して透明なポリマーで作製されていてよい。本願明細書に開示されるゲルカセットを作製するために使用されるポリマーの限定を意図しない例は、スチレンアクリロニトリル、ポリカーボネート、ポリスチレン、アクリル系ポリマー、ポリメタクリル酸メチル、ポリエチレンテレフタラート、グリコール変性ポリエチレンテレフタラート、ポリプロピレン、アセタールおよびこれらのコポリマーである。そのゲルカセットのポリマー構成成分は、成形技術、熱エンボス加工法、成型プロセス、熱成形法、ステレオリソグラフィー（光造形）プロセス、機械加工法およびフライス加工プロセスを使用して製作してよい。さらなるまたは別の実施形態では、かかる成形技術としては、射出成形および圧縮成形が挙げられる。
【０１８１】
本願明細書に開示されるとおり、上記ゲルカセットは２つの電極、アノードおよびカソードをも含み、このときウェルおよび開口部のアレイは電極間に配置される。かかる電極は、試料の構成成分の電気泳動による泳動および分離を実行するために使用される電場を作り出すために使用される。上記電気泳動カセットの電極は、電気伝導性の金属材料または電気伝導性の非金属（白金、パラジウム、金、銅、鉛、アルミニウム、銀、ニッケル、鉄、ステンレス鋼、グラファイト、または炭素が挙げられるが、これらに限定されない）であってよい。あるいは、上記電気泳動カセットの電極は、電気伝導性の金属または非金属（白金、パラジウム、金、銅、鉛、アルミニウム、銀、ニッケル、鉄、ステンレス鋼、グラファイト、炭素またはこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない）でコーティングされている非伝導性材料を含むことができる。
【０１８２】
上記電気泳動ゲルカセットの開口部のアレイは、開口部を通して、ローディング開口部の下に置かれた対応するローディングウェルの中へと試料をロードできる少なくとも１つの横列または縦列のローディング開口部を有する。
【０１８３】
本願明細書で開示される方法で使用される電気泳動ゲルカセットはアノードと電気泳動ゲルとの間に置かれたカチオンイオン交換マトリクスを任意に有してもよく、カソードと電気泳動ゲルとの間に置かれたアニオンイオン交換マトリクスを有してもよい。当該ゲルカセットの中に組み込まれるカチオン交換材料の限定を意図しない例はＣＭ−２５−１２０  Ｓｅｐｈａｄｅｘであり、当該ゲルカセットの中に組み込まれるアニオン交換材料の限定を意図しない例はＷＡ−３０であり、これらはともに米国、セントルイスのシグマ社（Ｓｉｇｍａ  Ｉｎｃ．）から市販されている。
【０１８４】
本願明細書で開示される方法で使用される電気泳動ゲルカセットは、電気泳動ゲルがすでに上記分離チャンバの中に成型されており、ウェルが少なくとも１つのゲル用のくしによって任意に占有されていてもよい。このくし（１個または複数個）は取り除かれ、ローディングウェルおよび回収ウェルとして使用するために利用できるウェルが得られる。あるいは、本願明細書で開示される方法で使用される電気泳動ゲルカセットは、空であってもよく、電気泳動ゲルは、使用者によって適切なくしを使用して成型され、ローディングウェルおよび回収ウェルとして使用するために利用できるウェルのアレイが作製される。
【０１８５】
組成物
別の態様では、本願明細書に記載される方法の実施に有用な組成物が本願明細書に提示される。１つの実施形態は、二ヒ素フルオロフォアと、アミン反応性蛍光色素と、還元剤とを含む組成物である。別の実施形態は、アミン反応性蛍光発生性試薬と、シアン化アルカリ（あるいはアセトンシアノヒドリンまたはニトリル（マンデロニトリルなど））と、還元剤とを含むｐＨ  ６〜ｐＨ  ９のｐＨの組成物である。別の実施形態は、アミン反応性蛍光発生性試薬と、シアン化アルカリ（あるいはアセトンシアノヒドリンまたはマンデロニトリル）と、二ヒ素フルオロフォアと、還元剤とを含むｐＨ  ６〜ｐＨ  ９のｐＨの組成物である。
【０１８６】
別の態様は、ｐＨ  ８〜ｐＨ  １０の範囲のｐＨを有するバッファーと、タグ結合蛍光発生性色素と、アニオン性界面活性剤と、糖類または糖アルコールと、追跡用色素と、１以上の還元剤と、炭酸水素塩とを含む組成物である。
【０１８７】
ある実施形態では、かかる組成物の還元剤（１種または複数種）は、トリアルキルホスフィン化合物、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール、亜硫酸水素ナトリウム、チオグリコール酸、メルカプトエタンスルホン酸またはグルタチオンから選択され、ここでこのトリアルキルホスフィン化合物はトリ−Ｎ−ブチルホスフィン（ＴＢＰ）またはトリス［２−カルボキシエチル］ホスフィン（ＴＣＥＰ）である。
【０１８８】
ある実施形態では、かかる組成物のタグ結合蛍光発生性色素は二ヒ素フルオロフォアである。ある実施形態では、かかる組成物のタグ結合蛍光発生性色素はフルオレセインの二ヒ素誘導体である。ある実施形態では、かかる組成物のタグ結合蛍光発生性色素は４’−５’−ビス（１，３，２−ジチオアルソラン−２−イル）フルオレセイン−（２，２−エタンジチオール）２である。ある実施形態では、かかる組成物のタグ結合蛍光発生性色素はレゾルフィンの二ヒ素誘導体である。ある実施形態では、かかる組成物のタグ結合蛍光発生性色素は４’−５’−ビス（１，３，２−ジチオアルソラン−２−イル）レゾルフィン−（２，２−エタンジチオール）２である。
【０１８９】
ある実施形態では、かかる組成物のアニオン性界面活性剤は、アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキルスルホン酸塩、アルキルスルホコハク酸塩、アルキルリン酸塩、アルキル硫酸塩、アルキルカルボン酸塩、アルキルエーテルベンゼンスルホン酸塩、アルキルエーテルスルホン酸塩、アルキルエーテルスルホコハク酸塩、アルキルエーテルリン酸塩、アルキルエーテル硫酸塩またはアルキルエーテルカルボン酸塩である。ある実施形態では、かかる組成物のアニオン性界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウム、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム、オレイン酸ナトリウム、パルミチン酸ナトリウム、ミリスチン酸ナトリウムまたはステアリン酸ナトリウムである。ある実施形態では、かかる組成物のアニオン性界面活性剤はドデシル硫酸ナトリウムまたはドデシル硫酸リチウムである。
【０１９０】
ある実施形態では、かかる組成物のアニオン性界面活性剤はショ糖であり、他の実施形態では、上記糖アルコールはグリセロールである。ある実施形態では、追跡用色素はブロモフェノールブルーである。ある実施形態では、かかる組成物のバッファーは、炭酸塩、炭酸水素塩、リン酸塩、ホウ酸塩、ビス−トリスプロパン、およびビシンからなる群から選択される。ある実施形態では、かかる組成物はさらにタグ化タンパク質を含む。ある実施形態では、タグ化タンパク質はテトラシステイン含有ペプチドでタグ化されている。
【０１９１】
ある実施形態では、かかる組成物はさらにアミン反応性蛍光色素を含む。ある実施形態では、かかる組成物のアミン反応性蛍光色素は、フルオレセイン部分、ローダミン部分、アクリジン部分、クマリン部分、インドール部分、イソインドール部分、インドリジン部分、キノリン部分、イソキノリン部分、クロメン部分、キサンテン部分、ナフタレン部分、ピレン部分、ビマン部分およびＢＯＤＩＰＹ部分からなる群から選択される蛍光性部分を有する。ある実施形態では、かかる組成物のアミン反応性蛍光色素はさらに、アシルアジド、カルボニルアジド、イソチオシアネート、イソシアネート、スクシンイミジルエステル、カルボン酸エステル、カルボン酸、スクシンイミジルエステル、スルホスクシンイミジルエステル、ＳＴＰエステル、テトラフルオロフェニルエステル、塩化スルホニル、酸ハロゲン化物、アルデヒド、カルボキシアルデヒド、ジクロロトリアジン、ＮＢＤ塩化物、またはＮＢＤフッ化物からなる群から選択される反応性部分を含む。
【０１９２】
１つの実施形態では、当該組成物は、ｐＨ  ８〜ｐＨ  １０の範囲のｐＨを有するリン酸塩バッファー、４’−５’−ビス（１，３，２−ジチオアルソラン−２−イル）フルオレセイン−（２，２−エタンジチオール）２、ドデシル硫酸ナトリウム、グリセロール、ブロモフェノールブルー、トリス［２−カルボキシエチル］ホスフィン（ＴＣＥＰ）、メルカプトエタンスルホン酸および炭酸水素塩を含む。
【０１９３】
キット  別の態様では、タンパク質標識および分析のために使用されるキットが本願明細書で開示される。ある実施形態では、このキットは、本願明細書に記載されるアミン反応性蛍光発生性試薬と、本願明細書に記載されるシアン化アルカリ（あるいはアセトンシアノヒドリンまたはニトリル（マンデロニトリルなど））と、本願明細書に記載される第１のバッファーと、本願明細書に記載される第２のバッファーとを含む。このキットは、本願明細書に記載される還元剤、本願明細書に記載されるゲルカセット、本願明細書に記載されるアニオン性界面活性剤、アルキル化剤（ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ）および当該技術分野で公知の他のアルキル化剤、またはこれらの組合せなど）を任意に含むことができる。さらに、このキットは、１以上の追跡用色素（ブロモフェノールブルー、ブロモクレゾールグリーン、Ｓｅｒｖａ  ｂｌｕｅ  Ｇ２５０、またはＰｏｎｃｅａｕ  Ｓなど、しかしフェノールレッドではない）を含んでいてもよい、代替の非蛍光性ゲルローディングバッファーを任意に含むことができる。
【０１９４】
他の実施形態では、本願明細書に記載される二ヒ素フルオロフォアと、本願明細書に記載されるアミン反応性蛍光色素と、本願明細書に記載される第１のバッファーと、本願明細書に記載される第２のバッファーとを含むキットが本願明細書で開示される。このキットは、本願明細書に記載される還元剤、本願明細書に記載されるゲルカセット、本願明細書に記載されるアニオン性界面活性剤、アルキル化剤（ＤＭＡ）および当該技術分野で公知の他のアルキル化剤、またはこれらの組合せなど）を任意に含むことができる。
【０１９５】
ある実施形態は、
ａ）ｐＨ  ８〜ｐＨ  １０の範囲のｐＨを有するバッファーと、少なくとも４つのシステイン部分に結合する蛍光発生性色素と、少なくとも１つの還元剤と、アニオン性界面活性剤と、糖類または糖アルコールと、追跡用色素と、１以上の還元剤と、炭酸水素塩とを含む第１の組成物と、
ｂ）アミン反応性蛍光色素を含む第２の組成物と
を含む、キットである。かかるキットのある実施形態では、このアミン反応性蛍光色素は、フルオレセイン部分、ローダミン部分、アクリジン部分、クマリン部分、インドール部分、イソインドール部分、インドリジン部分、キノリン部分、イソキノリン部分、クロメン部分、キサンテン部分、ナフタレン部分、ピレン部分、ビマン部分およびＢＯＤＩＰＹ部分からなる群から選択される蛍光性部分を含む。かかるキットの他の実施形態では、上記アミン反応性蛍光色素はさらに、アシルアジド、カルボニルアジド、イソチオシアネート、イソシアネート、スクシンイミジルエステル、カルボン酸エステル、カルボン酸、スクシンイミジルエステル、スルホスクシンイミジルエステル、ＳＴＰエステル、テトラフルオロフェニルエステル、塩化スルホニル、酸ハロゲン化物、アルデヒド、カルボキシアルデヒド、ジクロロトリアジン、ＮＢＤ塩化物、またはＮＢＤフッ化物からなる群から選択される反応性部分を含む。かかるキットの他の実施形態では、アニオン性界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウム、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム、オレイン酸ナトリウム、パルミチン酸ナトリウム、ミリスチン酸ナトリウムまたはステアリン酸ナトリウムである。かかるキットの他の実施形態では、このアニオン性界面活性剤はドデシル硫酸ナトリウムまたはドデシル硫酸リチウムである。かかるキットの他の実施形態では、この還元剤は、トリアルキルホスフィン化合物、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール、亜硫酸水素ナトリウム、チオグリコール酸、メルカプトエタンスルホン酸、グルタチオンまたはこれらの組合せから選択される。かかるキットの他の実施形態では、このトリアルキルホスフィン化合物はトリ−Ｎ−ブチルホスフィン（ＴＢＰ）またはトリス［２−カルボキシエチル］ホスフィン（ＴＣＥＰ）である。かかるキットの他の実施形態では、この少なくとも４つのシステイン部分に結合する蛍光発生性色素は二ヒ素フルオロフォアである。かかるキットの他の実施形態では、この二ヒ素フルオロフォアはフルオレセインの二ヒ素誘導体である。かかるキットの他の実施形態では、この二ヒ素フルオロフォアは４’−５’−ビス（１，３，２−ジチオアルソラン−２−イル）フルオレセイン−（２，２−エタンジチオール）２である。かかるキットの他の実施形態では、この二ヒ素フルオロフォアはレゾルフィンの二ヒ素誘導体である。かかるキットの他の実施形態では、この二ヒ素フルオロフォアは４’−５’−ビス（１，３，２−ジチオアルソラン−２−イル）レゾルフィン−（２，２−エタンジチオール）２である。かかるキットの他の実施形態では、上記糖類はショ糖である。かかるキットの他の実施形態では、糖アルコールはグリセロールである。かかるキットの他の実施形態では、上記追跡用色素はブロモフェノールブルーである。かかるキットの他の実施形態では、上記バッファーは、炭酸塩、炭酸水素塩、リン酸塩、ホウ酸塩、ビス−トリスプロパン、およびビシンからなる群から選択される。
【０１９６】
１つの実施形態では、このキットは、ＤＭＳＯ中の６％  重量／体積  ＬＤＳ、３０％  重量／体積  ショ糖、１Ｍ  炭酸塩バッファー（およそｐＨ  ９．２）、５×  マンデロニトリル、およびＡＴＴＯ−ＴＡＧ  ＦＱを含む第１の組成物と、無蛍光バッファー（４×）を含む第２の組成物とを含む。
【０１９７】
本発明が本願明細書中上記に具体的に示され開示されたものに限定されないことは当業者なら分かるであろう。本発明は、以下の実施例を考慮することによりさらに明確になるであろう。以下の実施例は、純粋に本発明を例示することが意図されており、決してその範囲を限定することは意図されていない。以下の実施例は、本願明細書で開示される本発明を例証することが意図されているが、それを限定することは意図されていない。
【実施例】
【０１９８】
特に示さない限り、以下の物質およびストック試薬を実施例１〜９で使用した。
１Ｍ  炭酸塩／炭酸水素塩バッファー、ｐＨ＝９．２：
２．３ｍＬの水中の１Ｍ  炭酸水素ナトリウム（ジェイティー・ベーカー（ＪＴ．Ｂａｋｅｒ））
０．２ｍＬの水中の１Ｍ  炭酸ナトリウム（フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ））
５×  ＬＤＳ／ショ糖：
水中の１０％  重量／体積  ＬＤＳ（シグマ）および５０％  重量／体積  ショ糖（リサーチ・オーガニクス（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ））
３×  ビス−トリス：
水中の０．９０  ビス−トリス（リサーチ・オーガニクス）、６Ｎ  ＨＣｌ（ＶＷＲ）を使用してｐＨを６．５に調整した。
１×  ビス−トリス／ＬＤＳ／ショ糖（３００ｍＭ  ビス−トリス、２％  ＬＤＳ、および１０％  ショ糖）：
３×  ビス−トリスおよび５×  ＬＤＳ／ショ糖を適切な体積の超純水で希釈することによって調製した。
１×  ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）試料バッファー：
超純水を使用してＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＬＤＳ試料バッファー（４×）（インビトロジェン）を希釈することによって調製した。
２０ｍＭ  ＡＴＴＯ−ＴＡＧ（商標）ＦＱ（モレキュラープローブ、オレゴン州、ユージーン）：
９９５μＬ  メタノール（ジェイティー・ベーカー）を、５ｍｇの固体材料を含むバイアルに。
水中の１００ｍＭ  シアン化ナトリウム（フルカ（Ｆｌｕｋａ））、アセトンシアノヒドリンまたはマンデロニトリル。
【０１９９】
実施例１〜９で使用した「１０×」標識溶液は、下記の表１に従って調製した。
【０２００】
（表１）
2010528268.tif 000005
【０２０１】
「１０×」標識溶液の構成成分の濃度を下記の表２に列挙する。
【０２０２】
（表２）
2010528268.tif 000006
【０２０３】
実施例１〜９で使用した「１×」標識溶液を、上記１０×  溶液の１〜１０倍希釈によって調製した。この「１×」標識溶液の構成成分の濃度を下記の表３に列挙する。
【０２０４】
（表３）
2010528268.tif 000007
【０２０５】
実施例１〜９で使用したタンパク質ストック（１ｍｇ／ｍＬまたは１０ｍｇ／ｍＬのいずれか）は、１１ｍｇ／ｍｌ原液）として供給されたｈ−ＩｇＧの場合を除いて、固体物質（凍結乾燥したもの）を秤量し、次いで適切な体積の超純水を用いて溶解することによって調製した。実施例１〜９で使用したタンパク質は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ（シグマ）；ヒトＩｇＧ（ｈ−ＩｇＧ）（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ））；ニワトリ卵白由来のリゾチーム（シグマ）およびウマ心臓由来のミオグロビン（シグマ）であった。
【０２０６】
実施例１：タンパク質スタンダードおよび精製したタンパク質の標識
アミン反応性蛍光発生性試薬を用いた、タンパク質スタンダードおよび他のタンパク質（ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびリゾチームなど）の標識の１つの実施形態を図５に示す。最初に５μｌの１０×標識溶液を５μｌの１ｍｇ／ｍＬ  タンパク質原液または１０ｍｇ／ｍｌ  タンパク質ストックのいずれかに加え、そして室温で１０分間インキュベーションすることによって、ＢＳＡおよびリゾチームを微小遠心管中で標識した。次いで、２μｌの５×  ＬＤＳ／ショ糖、６μｌの０．９１Ｍ  ビス−トリス（ｐＨ  ６．５）および２μｌのＮｕＰＡＧＥ（登録商標）試料還元剤（１０×）（または、非還元試料については超純水）を加え、０．１２５ｍｇ／ｍｌまたは１．２５ｍｇ／ｍｌの濃度の各タンパク質を得て、次いでこの混合物を７０℃で１０分間インキュベーションした。インキュベーション後、１×  ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）試料バッファーまたは１×  ビス−トリス／ＬＤＳ／ショ糖のいずれかを使用してこの混合物をさらに希釈し、０．１ｍｇ／ｍｌまたは１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度を得た。ゲル電気泳動を使用する電気泳動による分離のために、使用したタンパク質濃度は０．１ｍｇ／ｍｌであり、それゆえ標識した試料をロードする前に、１×  ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）試料バッファーを用いて上記１ｍｇ／ｍｌ試料を１０倍に希釈した。
【０２０７】
５μｌの上記１０×標識溶液（上記５×  ＬＤＳ／ショ糖を同じ体積の超純水で置き換えた）を５μｌのＢｅｎｃｈＭａｒｋ（商標）タンパク質ラダー（インビトロジェン、カールスバッド）およびＭａｒｋ１２（商標）未着色スタンダード（インビトロジェン、カールスバッド）に加え、室温で１０分間インキュベーションすることによって、ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（商標）タンパク質ラダー（インビトロジェン、カールスバッド）およびＭａｒｋ１２（商標）未着色スタンダード（インビトロジェン、カールスバッド）の標識を行った。
【０２０８】
電気泳動による分離は、最終試料（ゲル中で２００ｎｇ  タンパク質となるように２μｌの０．１ｍｇ／ｍｌ調製物）をＮｕＰＡＧＥ（登録商標）４−１２％  ビス−トリスゲル（インビトロジェン）の中にロードし、１×  ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）２−（Ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸（ＭＥＳ）／ＳＤＳランニングバッファー（インビトロジェン）を使用して、ＸＣｅｌｌ  ＳｕｒｅＬｏｃｋ（商標）Ｍｉｎｉ−Ｃｅｌｌ（インビトロジェン）またはＸＣｅｌｌ４  ＳｕｒｅＬｏｃｋ（商標）Ｍｉｄｉ−Ｃｅｌｌ（インビトロジェン）のいずれかの中で２００ボルトで電気泳動にかけることによって成し遂げ、供給された取扱説明書に従ってＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎ（インビトロジェン）を使用して染色した。標識したＢｅｎｃｈＭａｒｋ（商標）タンパク質ラダー（インビトロジェン、カールスバッド）およびＭａｒｋ１２（商標）未着色スタンダード（インビトロジェン、カールスバッド）は、さらなる希釈または還元剤の添加なしに直接ロードした。
【０２０９】
蛍光標識したタンパク質スタンダード、標識したＢＳＡおよび標識したリゾチームの電気泳動による分離を、図５Ａに提供したゲル画像に示す。図５Ｂは、本願明細書に記載するアミン反応性蛍光発生性色素を使用する標識方法の有効性を示すためにＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色した後のものである。これらの標識した試料は、図５のゲル画像に提供した以下のゲルレーンに対応する。
【０２１０】
2010528268.tif 000008
【０２１１】
実施例２：検出の感度
本願明細書に記載されるアミン反応性蛍光発生性試薬でのタンパク質の標識を使用して得られる検出の感度を、種々の濃度の標識したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびリゾチームを検出することによって評価した。
【０２１２】
最初に５μｌの上記１０×  標識溶液を５μｌの１ｍｇ／ｍＬタンパク質原液に加え、室温で１０分間インキュベーションすることによって、ＢＳＡおよびリゾチームを微小遠心管中で標識した。次いで、２μｌの５×  ＬＤＳ／ショ糖、６μｌの０．９１Ｍ  ビス−トリス（ｐＨ  ６．５）および２μｌのＮｕＰＡＧＥ（登録商標）試料還元剤（１０×）（または非還元試料については超純水）を加え、０．１２５ｍｇ／ｍｌ濃度の各タンパク質を得て、次いでこの混合物を７０℃で１０分間インキュベーションした。インキュベーション後、１×  ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）試料バッファーまたは１×  ビス−トリス／ＬＤＳ／ショ糖のいずれかを使用してこの混合物をさらに希釈し、０．１ｍｇ／ｍｌ（ゲル中で２００ｎｇ  タンパク質）を得た。次いで、１×  ビス−トリス／ＬＤＳ／ショ糖を用いてこの溶液をさらに希釈し、２０ｎｇ  タンパク質、５ｎｇ  タンパク質、２ｎｇ  タンパク質、０．５ｎｇ  タンパク質および０．２ｎｇ  タンパク質の溶液を得た。
【０２１３】
電気泳動による分離は、２μｌの上記連続希釈液をＮｕＰＡＧＥ（登録商標）４−１２％  ビス−トリスゲル（インビトロジェン）の中にロードし、１×  ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）２−（Ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸（ＭＥＳ）／ＳＤＳランニングバッファー（インビトロジェン）を使用して、ＸＣｅｌｌ  ＳｕｒｅＬｏｃｋ（商標）Ｍｉｎｉ−Ｃｅｌｌ（インビトロジェン）またはＸＣｅｌｌ４  ＳｕｒｅＬｏｃｋ（商標）Ｍｉｄｉ−Ｃｅｌｌ（インビトロジェン）のいずれかの中で２００ボルトで電気泳動にかけることによって成し遂げ、供給された取扱説明書に従ってＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎ（インビトロジェン）を使用して染色した。
【０２１４】
蛍光標識したタンパク質スタンダード、標識したＢＳＡおよび標識したリゾチームの電気泳動による分離を、図６Ａに提供したゲル画像に示す。図６Ｂは、本願明細書に記載するアミン反応性蛍光発生性色素を使用する標識方法の有効性を示すためにＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色した後のものである。ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎはＢＳＡに対しておよそ２０ｎｇの検出感度を有し、これは、この量またはより少ないタンパク質の量では（図６Ｂに示すように）ほとんどまたはまったく画像が生成されないであろうということを意味する。対照的に、本発明の標識方法は、これらのタンパク質レベルに対して示差的な画像を提供することができる（図６Ａ）。これらの標識した試料は、図６のゲル画像に提供した以下のゲルレーンに対応する。
【０２１５】
2010528268.tif 000009
【０２１６】
実施例３：検出の感度
本願明細書に記載される方法に係るアミン反応性蛍光発生性試薬で標識したタンパク質を測定するために異なる撮像機器を使用して得た検出の感度を、種々の濃度の標識したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて評価した。
【０２１７】
最初に５μｌの上記１０×標識溶液を５μｌの１０ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ原液に加え、室温で１０分間インキュベーションすることによって、このＢＳＡを微小遠心管中で標識した。次いで、２μｌの５×  ＬＤＳ／ショ糖、６μｌの０．９１Ｍ  ビス−トリス（ｐＨ  ６．５）および２μｌのＮｕＰＡＧＥ（登録商標）試料還元剤（１０×）を加え、１．２５ｍｇ／ｍｌ濃度のＢＳＡを得た。次いでこの混合物を、７０℃で１０分間インキュベーションした。インキュベーション後、１×  ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）試料バッファーまたは１×  ビス−トリス／ＬＤＳ／ショ糖のいずれかを使用してこの混合物をさらに希釈し、１ｍｇ／ｍｌ（ゲル中で２０００ｎｇ  タンパク質）を得た。次いで、１×  ビス−トリス／ＬＤＳ／ショ糖を用いてこの溶液をさらに希釈し、５００ｎｇ  ＢＳＡ、２００ｎｇ  ＢＳＡ、５０ｎｇ  ＢＳＡ、２０ｎｇ  ＢＳＡ、５ｎｇ  ＢＳＡ、２ｎｇ  ＢＳＡ、０．５ｎｇ  ＢＳＡ、０．２ｎｇ  ＢＳＡおよび０．０５ｎｇ  ＢＳＡの溶液を得た。
【０２１８】
電気泳動による分離は、２μｌの上記連続希釈液をＮｕＰＡＧＥ（登録商標）４−１２％  ビス−トリスゲル（インビトロジェン）の中にロードし、１×  ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）２−（Ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸（ＭＥＳ）／ＳＤＳランニングバッファー（インビトロジェン）を使用して、ＸＣｅｌｌ  ＳｕｒｅＬｏｃｋ（商標）Ｍｉｎｉ−Ｃｅｌｌ（インビトロジェン）またはＸＣｅｌｌ４  ＳｕｒｅＬｏｃｋ（商標）Ｍｉｄｉ−Ｃｅｌｌ（インビトロジェン）のいずれかの中で２００ボルトで電気泳動にかけることによって成し遂げ、供給された取扱説明書に従ってＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎ（インビトロジェン）を使用して染色した。
【０２１９】
蛍光標識したＢＳＡおよび標識済みスタンダード（ＳｅｅＢｌｕｅ（登録商標）Ｐｌｕｓ２タンパク質スタンダード（インビトロジェン、カールスバッド））の電気泳動による分離を、図７Ａおよび７Ｂに提供したゲル画像に示す。図７Ａは、４７７ｎｍ  ＥＰＩ光源、５２０〜６４０ｎｍバンドパスフィルターおよび６０秒の露光時間を用いて、富士フイルム（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）  ＬＡＳ−１０００を使用して得た標識したＢＳＡ（還元したもの）のゲル画像である。図７Ｂは、Ｋｏｄａｋ  ＤＣ２９０デジタルカメラ（２．１  ＭＰ）および８秒の露光時間を用いて得たＳａｆｅ  Ｉｍａｇｅｒ（約４７０ｎｍ光源）画像を使用して得た画像である。図７Ｃは、本願明細書に記載するアミン反応性蛍光発生性色素を使用する標識方法の有効性を示すためにＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色した後のものである。これらの標識した試料は、図７のゲル画像に提供した以下のゲルレーンに対応する。
【０２２０】
2010528268.tif 000010
【０２２１】
実施例４：細胞ライセートの標識
本願明細書に記載される方法を使用するアミン蛍光発生性試薬での種々の時間における細胞ライセートの標識を、Ｅ．ｃｏｌｉライセートを標識することによって実証した。
【０２２２】
最初に５μｌの上記１０×標識溶液を５μｌのＥ．ｃｏｌｉライセートに加え、室温で１０分間、３０分間および１時間インキュベーションすることによって、Ｅ．ｃｏｌｉライセートを微小遠心管中で標識した。次いで、各試料について、２μｌの５×  ＬＤＳ／ショ糖、６μｌの０．９１Ｍ  ビス−トリス（ｐＨ  ６．５）および２μｌのＮｕＰＡＧＥ（登録商標）試料還元剤（１０×）を加え、この混合物を７０℃で１０分間インキュベーションした。インキュベーション後、１×  ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）試料バッファーまたは１×  ビス−トリス／ＬＤＳ／ショ糖のいずれかを使用してこの混合物を希釈し、得た。
【０２２３】
当該電気泳動による分離は、２μｌの上記標識したＥ．ｃｏｌｉライセート（１レーンあたり１０μｇ）をＮｕＰＡＧＥ（登録商標）４−１２％  ビス−トリスゲル（インビトロジェン）の中にロードし、１×  ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）２−（Ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸（ＭＥＳ）／ＳＤＳランニングバッファー（インビトロジェン）を使用して、ＸＣｅｌｌ  ＳｕｒｅＬｏｃｋ（商標）Ｍｉｎｉ−Ｃｅｌｌ（インビトロジェン）またはＸＣｅｌｌ４  ＳｕｒｅＬｏｃｋ（商標）Ｍｉｄｉ−Ｃｅｌｌ（インビトロジェン）のいずれかの中で２００ボルトで電気泳動にかけることによって成し遂げ、供給された取扱説明書に従ってＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎ（インビトロジェン）を使用して染色した。
【０２２４】
上記蛍光標識したＥ．ｃｏｌｉライセートおよび標識済みスタンダード（ＳｅｅＢｌｕｅ（登録商標）Ｐｌｕｓ２  タンパク質スタンダード（インビトロジェン、カールスバッド））の電気泳動による分離を、図８Ａに提示するゲル画像に示す。この画像は、４７７ｎｍ  ＥＰＩ光源、５２０〜６４０ｎｍ  バンドパスフィルターおよび３０秒の露光時間を用いて富士フイルム  ＬＡＳ−１０００を使用して得た。図８Ｂは、当該標識方法の有効性を示すためにＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色した後のものである。これらの標識した試料は、図８のゲル画像に提供した以下のゲルレーンに対応する。
【０２２５】
2010528268.tif 000011
【０２２６】
実施例５：細胞ライセートの標識
本願明細書に記載される方法を使用するアミン蛍光発生性試薬での細胞ライセートの標識を、ラット肝臓ライセートを標識することによって実証した。タンパク質リゾチームも比較として標識した。
【０２２７】
最初に５μｌの上記１０×標識溶液を５μｌのラット肝臓ライセートに加え、室温で１０分間インキュベーションすることにより、ラット肝臓ライセートを微小遠心管中で標識した。次いで、各試料について、２μｌの５×  ＬＤＳ／ショ糖、６μｌの０．９１Ｍ  ビス−トリス（ｐＨ  ６．５）および２μｌのＮｕＰＡＧＥ（登録商標）試料還元剤（１０×）を加え、この混合物を７０℃で１０分間インキュベーションした。インキュベーション後、１×  ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）試料バッファーまたは１×  ビス−トリス／ＬＤＳ／ショ糖のいずれかを使用してこの混合物を希釈し、得た。
【０２２８】
最初に５μｌの上記１０×標識溶液を５μｌの１ｍｇ／ｍＬ  リゾチーム原液に加え、室温で１０分間インキュベーションすることによって、リゾチームを微小遠心管中で標識した。次いで、２μｌの５×  ＬＤＳ／ショ糖、６μｌの０．９１Ｍ  ビス−トリス（ｐＨ  ６．５）および２μｌのＮｕＰＡＧＥ（登録商標）試料還元剤（１０×）を加え、０．１２５ｍｇ／ｍｌ  濃度のタンパク質を得て、次いでこの混合物を７０℃で１０分間インキュベーションした。インキュベーション後、１×  ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）試料バッファーまたは１×  ビス−トリス／ＬＤＳ／ショ糖のいずれかを使用してこの混合物をさらに希釈し、０．１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度を得た。
【０２２９】
上記標識したライセート、リゾチームおよび標識済みタンパク質スタンダードの電気泳動による分離は、２μｌの上記標識したラット肝臓ライセート（１レーンあたり２０μｇ）および２μｌの上記リゾチーム（１レーンあたり１μｇ）をＮｕＰＡＧＥ（登録商標）４−１２％  ビス−トリスゲル（インビトロジェン）にロードし、１×  ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）２−（Ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸（ＭＥＳ）／ＳＤＳ  ランニングバッファー（インビトロジェン）を使用してＸＣｅｌｌ  ＳｕｒｅＬｏｃｋ（商標）Ｍｉｎｉ−Ｃｅｌｌ（インビトロジェン）またはＸＣｅｌｌ４  ＳｕｒｅＬｏｃｋ（商標）Ｍｉｄｉ−Ｃｅｌｌ（インビトロジェン）のいずれかの中で２００ボルトで電気泳動にかけることによって成し遂げ、供給された取扱説明書に従ってＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎ（インビトロジェン）を使用して染色した。
【０２３０】
図９は、本願明細書に記載される方法を使用する様々なタンパク質の標識を例証する。図９Ａは、標識したリゾチーム（還元したもの、レーン１）およびＳｅｅＢｌｕｅ  Ｐｌｕｓ２（レーン２、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  Ｓａｆｅ  Ｓｔａｉｎで染色したもの）のゲル画像であり、他方、図９ＢはＳｅｅＢｌｕｅ  Ｐｌｕｓ２（レーン１、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  Ｓａｆｅ  Ｓｔａｉｎで染色したもの）および標識したラット肝臓ライセート（レーン３）のゲル画像であり、レーン２は空である。蛍光画像は、４７７ｎｍ  ＥＰＩ光源、５２０〜６４０ｎｍ  バンドパスフィルターおよび３０秒の露光時間を用いて、富士フイルム  ＬＡＳ−１０００を使用して得た。
【０２３１】
実施例６：未変性条件下での標識
図１０は、本願明細書に記載される方法が未変性条件下でアミン反応性蛍光発生性試薬を用いてタンパク質を標識するために使用することができることを示す。ここでこのタンパク質は異なる分子量および反応性基（例えば、リジン残基）の数を有する。図１０はまた、存在する標識したタンパク質の量に蛍光シグナルが比例すること、および還元プロセスを通して蛍光シグナル強度を維持するために本願明細書に記載される標識方法を使用することを例証する。標識したタンパク質はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ミオグロビン、ｈ−ＩｇＧおよびＥ．ｃｏｌｉライセートであった。
【０２３２】
このウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ミオグロビン、ｈ−ＩｇＧおよびＥ．ｃｏｌｉライセートの標識および電気泳動による分離は、上記の実施例に記載したとおりであった。
【０２３３】
図１０ＡはＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色した後のゲル画像であり、他方、図１０Ｂは本願明細書に記載される方法を使用して標識したｈ−ＩｇＧ、ミオグロビン、およびＢＳＡのゲル画像である。標識した試料を以下のゲルレーンで分離した。
【０２３４】
2010528268.tif 000012
【０２３５】
実施例７：様々な濃度の反応物質を用いた、変性条件下での標識
ｈ−ＩｇＧ、ミオグロビン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびＥ．ｃｏｌｉライセートを上記の実施例で記載したアミン反応性蛍光発生性試薬で標識することによって、変性条件下でのタンパク質標識および標識したタンパク質の蛍光強度に対する反応物質濃度の効果を得た。反応物質濃度の効果を実証するために、上記１０×標識溶液または上記１×標識溶液のいずれかを使用してタンパク質を標識した。
【０２３６】
種々の標識条件の結果を図１１のゲル画像に示す。ここでは、標識反応で存在したＬＤＳおよびショ糖を用いてｈ−ＩｇＧ、ミオグロビン、ＢＳＡおよびＥ．ｃｏｌｉライセートを標識した。上側のゲル画像はＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色したゲルであり、他方、下側のゲル画像は蛍光標識したｈ−ＩｇＧ、ミオグロビン（Ｍｙｏｇｌｏｂｉ）、ＢＳＡおよびＥ．ｃｏｌｉライセートのゲル画像である。加えて、標識していないタンパク質スタンダード（Ｍａｒｋ１２（商標）未着色スタンダード（インビトロジェン、カールスバッド））を上記標識したタンパク質と並べて電気泳動にかけた。標識した試料は、図１１のゲル画像に提示した以下のゲルレーンに対応する。
【０２３７】
2010528268.tif 000013
【０２３８】
2010528268.tif 000014
【０２３９】
実施例８：反応物質濃度および標識時間の影響としての標識したタンパク質のバンドのシャープさおよび蛍光強度
本願明細書に記載するアミン反応性蛍光発生性試薬を使用するタンパク質標識方法は、ゲル電気泳動で観察したとおり、シャープなバンドをもたらす。バンドのシャープさの効果は、種々の反応物質濃度および標識時間を使用して、本願明細書に記載する方法を使用してアミン反応性蛍光発生性試薬でウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を標識することによって示された。加えて、このＢＳＡの標識から、かかる標識方法では、標識したタンパク質の還元によって蛍光シグナルの減少が引き起こされないことが示された。上記の手順を使用してＢＳＡを標識したが、反応物質濃度は、上記１０×標識溶液または上記１×標識溶液のいずれかを使用することによって変え、標識時間を１５分間または１時間のいずれかとした。次いで、標識した様々な濃度のＢＳＡを、上記の実施例に記載したようにして分離した。図１２は、バンドのシャープさは種々の反応条件によって影響を受けないことを示す。上側のゲル画像は、標識したＢＳＡの蛍光画像であり、他方、下側の画像はＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色した後のそのゲルである。比較のために、未標識のタンパク質スタンダード（Ｍａｒｋ１２（商標）未着色スタンダード（インビトロジェン、カールスバッド））を含めた。この蛍光画像は、４７７ｎｍ  ＥＰＩ光源、５２０〜６４０ｎｍバンドパスフィルターおよび１分間の露光時間を用いて、富士フイルムのＬＡＳ−１０００を使用して得た。この標識した試料を以下のゲルレーンで分離した。
【０２４０】
2010528268.tif 000015
【０２４１】
実施例９：タンパク質の標識および消化
本願明細書に記載される方法を使用するアミン反応性蛍光発生性試薬でのタンパク質の標識した後のこの標識したタンパク質の消化を、高い温度でウシ血清アルブミンを標識し、この標識した混合物を任意に還元し、次いでこの混合物を電気泳動により分離することによって実証した。上記の実施例で記載したようにして、ＢＳＡを室温および７０℃で標識した。図１３（パネル１）は、高い温度で標識すると、ゲルの下端の標識した小さいタンパク質断片がこの検出器を「過飽和」にし、それほど蛍光強度が強くない標識タンパク質の可視化を妨げることを示す。そのゲルの下端を取り除くこと（切り取ること）で、このゲル中の他の標識したタンパク質またはタンパク質断片の可視化が可能になる（図１３（パネル２））。パネル２には、標識の際の、高温での当該タンパク質の消化に起因するタンパク質断片の存在が示されている。また図１３（パネル３および４）は、低ｐＨで可逆的にこの蛍光を消光すること、および高ｐＨで完全な蛍光回復を成し遂げることができることも示す。それゆえ、アミン反応性蛍光発生性試薬について本願明細書に記載する標識方法を使用して得られる蛍光シグナルは、ｐＨ依存的である。蛍光画像は、４７７ｎｍ  ＥＰＩ光源、５２０〜６４０ｎｍバンドパスフィルターおよび１分間の露光時間を用いて、富士フイルムのＬＡＳ−１０００を使用して得た。このゲルのレーン１は、蛍光標識したタンパク質を含むＳｅｅＢｌｕｅ  Ｐｌｕｓ  ２（インビトロジェン）着色済みスタンダードである。残りのゲルレーンは、下記に記載する試料のセットである。
【０２４２】
2010528268.tif 000016
【０２４３】
実施例１０：タンパク質発現分析：Ｅ．ｃｏｌｉライセート
Ｃ末端でタグ化したテトラシステインタグ（ＴＣ）タグ化ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）プラスミド構築物でＥ．ｃｏｌｉを形質転換した。この細胞を、ルリア−ベルターニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）（ＬＢ）／抗生物質中で振盪しながら３７℃で一晩、０．８〜１．０のＯＤ６００まで増殖させた。各試料を取り出し、残りを１ｍＭ  ＩＰＴＧ（イソプロピル  β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）で誘導し、振盪しながら３０分間インキュベーションした。この細胞をアリコートにわけ、４，０００×ｇで１０分間遠心分離にかけ、この培地を吸引し、このペレットを−２０℃で保存した。
【０２４４】
各実験について、ペレット化した細胞のアリコートを室温まで戻し、１％  ＳＤＳ中で再懸濁させてこの細胞を溶解させ、ボルテックスにかけ、７０℃まで加熱し、再度ボルテックスにかけ、１４，０００×ｇで５分間遠心分離にかけて、この細胞破片をペレット化した。上清を実験用ライセートとして使用した。注目するタンパク質がＰＢＳに可溶である場合、１×  ＰＢＳも細胞ペレットを再懸濁させるために使用し、超音波を用いて細胞を溶解させた。
【０２４５】
ペレット化した細胞の１本のチューブを室温まで戻し、１００μｌの１％  ＳＤＳ中で再懸濁させ、ボルテックスにかけ、７０℃で１０分間加熱し、再度ボルテックスにかけ、１４，０００×ｇで１０分間遠心分離にかけた。ペレット化した細胞の第２のチューブを１００μｌの１×  ＰＢＳの中で再懸濁させ、超音波処理し、１４，０００×ｇで１０分間遠心分離にかけた。
【０２４６】
（２×  バッファーとして）４％  ＳＤＳ、２０％  グリセロール、１２０ｍＭ  リン酸カリウムバッファー  ｐＨ  ８．５、０．４ｍｇ／ｍＬ  ブロモフェノールブルー、５０ｍＭ  メルカプトエタンスルホン酸、２ｍＭ  トリス［２−カルボキシエチル］ホスフィン（ＴＣＥＰ）、２０μＭ  ４’−５’−ビス（１，３，２−ジチオアルソラン−２−イル）フルオレセイン−（２，２−エタンジチオール）２（ＦｌＡｓＨ）および３３３μＭ  ＮａＨＣＯ３を含むローディングバッファー（ＦｌＡｓＨバッファーとも呼ぶ）を使用して、このＴＣタグ化タンパク質を標識した。各チューブについて、６μｌのローディングバッファー（ＦｌＡｓＨバッファー）を４μｌのライセートに加えた。対照試料を同様に調製した。しかしながら、全タンパク質染色がＦｌＡｓＨに依存しないこと、およびこのＴＣタグ化タンパク質はこのＦｌＡｓＨ試薬の存在下でのみ検出されることを示すために、ＦｌＡｓＨ試薬なしの（水で置き換えた）ローディングバッファーを使用した。各試料をボルテックスにかけ、素早く沈降させ、次いで７０℃で３分間インキュベーションした。３分後、この試料を室温に置き、２μｌのＤＭＳＯ中のアミン反応性色素を全タンパク質測定のために加えた。いくつかの試料では、使用したアミン反応性色素はＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ−Ｘ  ＳＥであり、他方、他の試料ではアミン反応性色素はＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５  ＳＥであった。ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ−Ｘ  ＳＥの最終濃度は１２５μＭの原液から得た１２．５μＭであり、ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５  ＳＥの最終濃度は１０μＭの原液から得た１０μＭであった。全タンパク質色素を含まない対照試料には２μｌのＤＭＳＯを加えた。すべての試料をボルテックスにかけ、室温で１０分間インキュベーションし、次いで各々１０μｌをＮｕＰａｇｅ  ４−１２％  ビス−トリス  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびＮｏｖｅｘ  ４−２０％  トリス−グリシンゲル上にロードし、対応するゲル手順に従って電気泳動にかけた。このＮｕＰａｇｅゲルは、３−（Ｎ−モルホリノ）−プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）ランニングバッファー中で泳動させ、ＮｏｖｅｘゲルはＮｏｖｅｘランニングバッファー中で泳動させた。両方とも、２００Ｖで１時間泳動させた。
【０２４７】
電気泳動が完結した後、これらのゲルをそれらのカセット中で、蛍光撮像装置（Ｆｕｊｉ  ＦＬＡ３０００）上に置き、４７３ｎｍ励起レーザーおよび５２０ｎｍ発光フィルターを用いて撮像し、ＦｌＡｓＨで標識したＴＣタグ化ＧＦＰタンパク質を検出した。次いで、どのアミン反応性タンパク質色素をその試料に加えたかに応じて、（ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ−Ｘの検出について）５３２ｎｍ励起レーザーおよび５８０ｎｍ発光フィルターまたは（ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５の検出について）６３３ｎｍ励起レーザーおよび６７５ｎｍ発光フィルターのいずれかを用いてこのカセットを撮像し、全タンパク質ライセートプロファイルを検出した。図１７〜１９は、得られたゲル画像を示す。下記のとおり、第１のチューブからの上清から得られた試料をレーン１〜１２で使用し、第２のチューブからの上清から得られた試料をレーン１３〜１５（Ｎｏｖｅｘゲルについて）または１３〜１７（ＮｕＰａｇｅゲルについて）で使用した。これらのゲルに、以下のように処理した試料をロードした。
【０２４８】
2010528268.tif 000017
【０２４９】
４７３ｎｍ励起および５２０ｎｍ発光を用いて得た画像では（図１７）、当該ＴＣタグ化タンパク質ＧＦＰは、レーン５〜１０で目に見えた。ＦｌＡｓＨローディングバッファーを用いなかったレーン（２〜４、１１〜１２および１６〜１７）では、このＴＣタグ化タンパク質は目に見えなかった。５３２ｎｍ励起および５８０ｎｍ発光を用いて得た画像では（図１８）、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ−Ｘ  ＳＥで標識したライセートからの全タンパク質プロファイルは目に見えた（レーン８〜１２）。６３３ｎｍ励起および６７５ｎｍ発光を用いて得た画像では（図１９）、ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５  ＳＥで標識したライセートからの全タンパク質プロファイルは目に見えた（レーン１３〜１７）。全タンパク質プロファイルは、ローディングバッファー中にＦｌＡｓＨ試薬を含まないレーン（レーン１１〜１２および１６〜１７）でも同様に目に見えた。このことは、ＴＣタグ化タンパク質のＦｌＡｓＨ標識とＢＯＤＩＰＹ  ＳＥ色素を用いた全タンパク質標識との間の独立性を示す。
【０２５０】
実施例１１：タンパク質発現分析：哺乳動物細胞ライセートおよびタンパク質ラダー
実施例１０に記載した手順およびローディングバッファーを、タンパク質ラダーおよび哺乳動物の細胞ライセートに対しても実施した。
【０２５１】
Ｃ末端でタグ化したテトラシステインタグ（ＴＣ）タグ化ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）プラスミド構築物でＥ．ｃｏｌｉを形質転換した。この細胞を、ルリア−ベルターニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）（ＬＢ）／抗生物質中で振盪しながら３７℃で一晩、０．８〜１．０のＯＤ６００まで増殖させた。各試料を取り出し、残りを１ｍＭ  ＩＰＴＧ（イソプロピル  β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）で誘導し、振盪しながら３０分間インキュベーションした。この細胞をアリコートにわけ、４，０００×ｇで１０分間遠心分離にかけ、この培地を吸引し、このペレットを−２０℃で保存した。
【０２５２】
Ｃ末端でタグ化したテトラシステインタグ（ＴＣ）タグ化ＣＦＰ（シアン蛍光タンパク質）プラスミド構築物で哺乳動物細胞を形質転換した。この細胞を、ルリア−ベルターニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）（ＬＢ）／抗生物質中で振盪しながら３７℃で一晩、０．８〜１．０のＯＤ６００まで増殖させた。各試料を取り出し、残りを１ｍＭ  ＩＰＴＧ（イソプロピル  β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）で誘導し、振盪しながら３０分間インキュベーションした。この細胞をアリコートにわけ、４，０００×ｇで１０分間遠心分離にかけ、この培地を吸引し、このペレットを−２０℃で保存した。
【０２５３】
各実験について、ペレット化した細胞のアリコートを室温まで戻し、１％  ＳＤＳ中で再懸濁させてこの細胞を溶解させ、ボルテックスにかけ、７０℃まで加熱し、再度ボルテックスにかけ、１４，０００×ｇで５分間遠心分離にかけて、この細胞破片をペレット化した。上清を実験用ライセートとして使用した。注目するタンパク質がＰＢＳに可溶である場合、１×  ＰＢＳも細胞ペレットを再懸濁させるために使用し、超音波を用いて細胞を溶解させた。
【０２５４】
ペレット化したＥ．ｃｏｌｉ細胞の１本のチューブを室温まで戻し、１００μｌの１％  ＳＤＳ中に再懸濁させ、ボルテックスにかけ、７０℃で１０分間加熱し、再度ボルテックスにかけ、１４，０００×ｇで１０分間遠心分離にかけた。ペレット化した哺乳動物細胞の第２のチューブを１００μｌの１×  ＰＢＳの中に再懸濁させ、超音波処理し、１４，０００×ｇで１０分間遠心分離にかけた。この哺乳動物の細胞中で発現したＴＣタグ化ＣＦＰは完全ではなく、むしろ分解していることが後で判明した。この哺乳動物の細胞を溶解させるために１％  ＳＤＳを使用した場合でさえも、このＴＣタグ化ＣＦＰは検出されなかった。
【０２５５】
（２×  バッファーとして）４％  ＳＤＳ、２０％  グリセロール、１２０ｍＭ  リン酸カリウムバッファー  ｐＨ  ８．５、０．４ｍｇ／ｍＬ  ブロモフェノールブルー、５０ｍＭ  メルカプトエタンスルホン酸、２ｍＭ  トリス［２−カルボキシエチル］ホスフィン（ＴＣＥＰ）、２０μＭ  ４’−５’−ビス（１，３，２−ジチオアルソラン−２−イル）フルオレセイン−（２，２−エタンジチオール）２（ＦｌＡｓＨ）および３３３μＭ  ＮａＨＣＯ３を含むローディングバッファー（ＦｌＡｓＨバッファーとも呼ぶ）を使用して、このＴＣタグ化タンパク質を標識した。各チューブについて、６μｌのローディングバッファー（ＦｌＡｓＨバッファー）を４μｌのライセート（Ｅ．ｃｏｌｉおよび哺乳動物）に加えた。各試料をボルテックスにかけ、素早く沈降させ、次いで７０℃で３分間インキュベーションした。３分後、この試料を室温に置き、２μｌのＤＭＳＯ中のアミン反応性色素を全タンパク質測定のために加えた。いくつかの試料では、使用したアミン反応性色素はＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ−Ｘ  ＳＥであり、他方、他の試料ではアミン反応性色素はＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５  ＳＥであった。ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ−Ｘ  ＳＥの最終濃度は１．２５ｍＭの原液から得た１２５μＭであり、ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５  ＳＥの最終濃度は１０μＭの原液から得た１０μＭであった。一緒に混合したときには全タンパク質色素も機能することも判明した。
【０２５６】
２μｌのＤＭＳＯ中のアミン反応性色素（ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ−Ｘ  ＳＥ、ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５  ＳＥまたは両方）をタンパク質ラダー溶液に加えることにより、アミン反応性蛍光色素でタンパク質ラダー  ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（商標）タンパク質ラダー（インビトロジェン、カールスバッド）およびＭａｒｋ１２（商標）未着色スタンダード（インビトロジェン、カールスバッド）を標識した。
【０２５７】
すべての試料をボルテックスにかけ、室温で１０分間インキュベーションし、次いで各々１０μｌをＮｕＰａｇｅ  ４−１２％  ビス−トリス  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびＮｏｖｅｘ  ４−２０％  トリス−グリシンゲル上にロードし、対応するゲル手順に従って電気泳動にかけた。このＮｕＰａｇｅゲルは、３−（Ｎ−モルホリノ）−プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）ランニングバッファー中で泳動させ、ＮｏｖｅｘゲルはＮｏｖｅｘランニングバッファー中で泳動させた。両方とも、２００Ｖで１時間泳動させた。
【０２５８】
電気泳動が完結した後、これらのゲルをそれらのカセット中で、蛍光撮像装置（Ｆｕｊｉ  ＦＬＡ３０００）上に置き、４７３ｎｍ励起レーザーおよび５２０ｎｍ発光フィルターを用いて撮像し、ＦｌＡｓＨで標識したＴＣタグ化ＧＦＰタンパク質およびＴＣタグ化ＣＦＰタンパク質を検出した。次いで、どのアミン反応性タンパク質色素をその試料に加えたかに応じて、（ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ−Ｘの検出について）５３２ｎｍ励起レーザーおよび５８０ｎｍ発光フィルターまたは（ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５の検出について）６３３ｎｍ励起レーザーおよび６７５ｎｍ発光フィルターのいずれかを用いて、このカセットを撮像し、全タンパク質ライセートプロファイルを検出した。図２０〜２２は、得られたゲル画像を示す。標識したＢｅｎｃｈＭａｒｋ（商標）タンパク質ラダー（インビトロジェン、カールスバッド）についての試料をレーン３〜５にロードし、Ｅ．ｃｏｌｉの上清から得た試料をレーン６〜９で使用し、哺乳動物の細胞の上清から得た試料をレーン１０〜１２で使用し、標識したＭａｒｋ１２（商標）未着色スタンダード（インビトロジェン、カールスバッド）についての試料をレーン１３〜１５で使用した。
【０２５９】
2010528268.tif 000018
【０２６０】
図２０〜２２に示した画像は、ＴＣ様領域を有する、哺乳動物のライセート中に存在するタンパク質は当該ＦｌＡｓＨローディングバッファーを用いて検出でき、その相対的存在量は全タンパク質標識によって示されるということも示す。
【０２６１】
上記の説明は本発明を例示するためだけのものであることを理解されたい。見出しは便宜上のものに過ぎず、見出しの下に含まれる開示をその見出しのみに限定することは意図されていない。当業者は、本発明から逸脱せずに種々の代替態様および修正態様を工夫することができる。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲の範囲に入るすべてのかかる代替態様、修正態様および変更態様を包含することが意図されている。
【０２６２】
本発明を好ましい実施形態に関連して説明してきたが、それらが本発明をその実施形態に限定することは意図されていないということは理解されるであろう。逆に、本発明は、添付の特許請求の範囲によって画定される本発明の範囲内に含まれ得る代替態様、修正態様、および均等物を網羅することが意図されている。
【０２６３】
本願明細書中で言及したすべての刊行物、特許および特許出願は、参照により、あたかも各個別の刊行物、特許または特許出願が具体的かつ個別に本願明細書中に援用されると示されたのと同程度にその全体を援用したものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年1月26日(2010.1.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2010528268000001.app
【国際調査報告】
2010528268.tif 000044