(57)【要約】  ａ）式（１）（式中、Ｂはヘテロ環塩基であり、ラジカルＲ２、Ｒ３およびＲ５は本明細書に定義されたとおりである）を有するヒドロキシル含有化合物を提供する工程と；  ｂ）式Ｉ（活性剤Ｉ）（式中、Ｒ＝アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアルキル、ヘテロアリール；Ｒ１、Ｒ２＝Ｈまたは一緒に５〜６員の環を形成する；Ｘ１、Ｘ２＝独立してＮまたはＣＨ；Ｙ＝ＨまたはＳｉ（Ｒ４）３、ここで、Ｒ４＝アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアルキル、ヘテロアリール；Ｂ＝脱プロトン化酸）を有する活性剤の存在下で前記化合物をホスフィチル化剤と反応させ、ホスフィチル化化合物を調製する工程と、  ｃ）イミダゾール、イミダゾリウム塩およびそれらの混合物の群から選択される活性剤ＩＩの存在下で、単離されていない前記ホスフィチル化化合物を式（１）（式中、Ｒ５、Ｒ３、Ｒ２、Ｂは、独立して選択されるが、上記と同じ定義を有する）を有する第２の化合物と反応させる工程とを含むオリゴヌクレオチドを調製する方法。【化１】2010527945.tif 000017【選択図】図１
2010527945.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）式：
【化１】
2010527945.tif 000012
（式中、
Ｂはヘテロ環塩基であり、
ｉ）Ｒ2は、Ｈ、保護２’−ヒドロキシル基、Ｆ、保護アミノ基、Ｏ−アルキル基、Ｏ−置換アルキル、置換アルキルアミノまたはＣ４’−Ｏ２’−メチレン結合であり、
Ｒ3は、ＯＲ’3、ＮＨＲ’’3、ＮＲ’’3Ｒ’’’3であり、ここで、Ｒ’3はヒドロキシル保護基、保護ヌクレオチドまたは保護オリゴヌクレオチドであり、Ｒ’’3、Ｒ’’’3は独立してアミン保護基であり、
Ｒ5はＯＨであり、
あるいは、
ｉｉ）Ｒ2は、Ｈ、保護２’−ヒドロキシル基、Ｆ、保護アミノ基、Ｏ−アルキル基、Ｏ−置換アルキル、置換アルキルアミノまたはＣ４’−Ｏ２’メチレン結合であり、
Ｒ3はＯＨであり、
Ｒ5はＯＲ’5であり、Ｒ’5は、ヒドロキシル保護基、保護ヌクレオチドまたは保護オリゴヌクレオチドであり、
あるいは、
ｉｉｉ）Ｒ2はＯＨであり、
Ｒ3は、ＯＲ’3、ＮＨＲ’’3、ＮＲ’’3Ｒ’’’3であり、ここで、Ｒ’3はヒドロキシル保護基、保護ヌクレオチドまたは保護オリゴヌクレオチドであり、Ｒ’’3、Ｒ’’’3は独立してアミン保護基であり、
Ｒ5はＯＲ’5であり、Ｒ’5は、ヒドロキシル保護基、保護ヌクレオチドまたは保護オリゴヌクレオチドである）
を有するヒドロキシル含有化合物を提供する工程と、
ｂ）式Ｉ
【化２】
2010527945.tif 000013
（式中、
Ｒ＝アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアルキル、ヘテロアリールであり、
Ｒ1、Ｒ2＝Ｈまたは一緒に５〜６員の環を形成する、
Ｘ1、Ｘ2＝独立してＮまたはＣＨ、
Ｙ＝ＨまたはＳｉ（Ｒ4）3、ここで、Ｒ4＝アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアルキル、ヘテロアリールであり、
Ｂ-＝脱プロトン化酸である）
を有する活性剤（活性剤Ｉ）の存在下で前記化合物をホスフィチル化剤と反応させ、ホスフィチル化化合物を調製する工程と、
ｃ）イミダゾール、イミダゾリウム塩およびそれらの混合物の群から選択される活性剤ＩＩの存在下で、単離されていない前記ホスフィチル化化合物を式
【化３】
2010527945.tif 000014
（式中、Ｒ5、Ｒ3、Ｒ2、Ｂは、独立して選択されるが、上記と同じ定義を有する）
を有する第２の化合物と反応させる工程と
を含むオリゴヌクレオチドを調製する方法。
【請求項２】
前記式Ｉの活性剤が、
【化４】
2010527945.tif 000015
（式中、
Ｙは請求項１におけるように定義され、
Ｒは、メチル、フェニルまたはベンジルである）
からなる群から選択される式を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ホスフィチル化剤が式ＩＩ
【化５】
2010527945.tif 000016
（式中、Ｚは脱離基を表し、Ｒ1およびＲ2は独立して第二級アミノ基である）
を有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ホスフィチル化剤が２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイトである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記脱プロトン化酸が、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、ｏ−クロロフェノラートからなる群に由来する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記反応がアセトンの存在下である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ホスフィチル化剤が、１．０〜１．２モル／ヒドロキシル含有化合物中ヒドロキシル基のモルで使用される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ホスフィチル化剤が、３〜５モル／ヒドロキシル含有化合物中ヒドロキシル基のモルで使用される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ポリマーアルコールが、請求項１に記載の工程ｂ）後に添加される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリマーアルコールが、ポリビニルアルコールである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記脱プロトン化酸が、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸（トリフラート）、ｏ−クロロフェノラートおよびそれらの混合物からなる群に由来する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記反応がアセトンの存在下である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記反応媒体の少なくとも９５％（Ｗ／Ｗ）がアセトンである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記反応混合物が、工程ｃ）の前記第２の化合物のモル当たり０．５モル未満のテトラゾールまたはテトラゾール誘導体を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記反応混合物が、工程ｃ）の前記第２の化合物のモル当たり０．１モル未満のテトラゾールまたはテトラゾール誘導体を含むかあるいはテトラゾールまたはテトラゾール誘導体を全く含まない、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴヌクレオチドを調製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
オリゴヌクオチドは、様々な分野で重要な役割を有する生命科学において主要な化合物である。それらは、例えば、遺伝子発現分析の分野でプローブとして、ＰＣＲにおけるプライマーとしてまたはＤＮＡ配列決定のために使用されている。
さらに、いくつかの潜在的な治療用途も存在し、すなわち、アンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。
より多くの用途は、より多量のオリゴヌクレオチドを必要とし、したがって、改良された合成方法の開発が継続して必要である。
一般的な概要としては、例えば、「アンチセンス−技術から治療へ」（“Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ−Ｆｒｏｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｔｏ  Ｔｈｅｒａｐｙ”）、ブラックウェル  サイエンス（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）（オックスフォード（Ｏｘｆｏｒｄ）、１９９７）を参照されたい。
【０００３】
オリゴヌクレオチドの合成における１つの卓越した種類のビルディングブロックは、ホスホロアミダイトである；例えば、Ｓ．Ｌ．ボケージ、Ｍ．Ｈ．カルーサーズ（Ｓ．Ｌ．Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｍ．Ｈ．Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）、テトラヘドロンレター（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ）１８５９（１９８１）２２を参照されたい。ヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシドおよびこれらの誘導体のこれらホスホロアミダイトは市販されている。通常の固相合成では、３’−Ｏ−ホスホロアミダイトが用いられるが、他の合成手順では、５’−Ｏ−および２’−Ｏ−ホスホロアミダイトも用いられる。これらのヌクレオシドホスホロアミダイトの調製における一工程は、その（保護）ヌクレオシドのホスフィチル化である。ホスフィチル化後、調製されたアミダイトは通常、コストがかなりかかる分離方法、例えば、クロマトグラフィーを用いて単離される。単離後、敏感なアミダイトは特別の条件（例えば、低温、水を含まない）に保存しなければならない。保存中に、アミダイトの品質はある程度の分解および加水分解によって低下し得る。両副反応が出現し得、その結果は検出できる。最も一般的には、ヌクレオシドに存在するヒドロキシル基およびアミノ基および他の官能基は、残りの３’−、５’−または２’−Ｏヒドロキシル基をホスフィチル化する前に保護される。
【０００４】
次いで、これらのホスホロアミダイトはヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのヒドロキシル基にカップリングされる。単離されたアミダイトを使用すると、アミダイトカップリングの間に部分加水分解ももたらし得る。
ホスホロアミダイトは高価な化合物である。デオキシアミダイトの通常価格はｇ当たり４０．００ユーロの範囲である。対応するＲＮＡビルディングブロックはさらにより高価である。
国際公開第２００６／０９４９６３号パンフレットには、活性剤Ｉの存在下でホスホロアミダイトを合成する工程および活性剤ＩＩの存在下でカップリングする工程を含むオリゴヌクレオチドを調製する方法が開示されている。活性剤ＩＩとして、テトラゾール誘導体、ピリジニウム塩および４，５−ジシアノイミダゾールが記載されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、従来技術の欠点の少なくとも一部を克服するオリゴヌクレオチドを調製する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本特許出願は、その内容が参照により本特許出願に組み込まれる特許出願国際公開第２００６／０９４９６３号パンフレットに開示された発明の改良に関する。
本発明は特に、改良された活性剤ＩＩで国際公開第２００６／０９４９６３号の請求項１に記載のオリゴヌクレオチドを調製する方法に関する。
【０００７】
一実施形態において、本発明では、
ａ）式：
【化１】
2010527945.tif 000003
（式中、
Ｂはヘテロ環塩基であり、
ｉ）Ｒ2は、Ｈ、保護２’−ヒドロキシル基、Ｆ、保護アミノ基、Ｏ−アルキル基、Ｏ−置換アルキル、置換アルキルアミノまたはＣ４’−Ｏ２’メチレン結合であり、
Ｒ3は、ＯＲ’3、ＮＨＲ’’3、ＮＲ’’3Ｒ’’’3であり、ここで、Ｒ’3はヒドロキシル保護基、保護ヌクレオチドまたは保護オリゴヌクレオチドであり、Ｒ’’3、Ｒ’’’3は独立してアミン保護基であり、
Ｒ5はＯＨであり、
あるいは、
ｉｉ）Ｒ2は、Ｈ、保護２’−ヒドロキシル基、Ｆ、保護アミノ基、Ｏ−アルキル基、Ｏ−置換アルキル、置換アルキルアミノまたはＣ４’−Ｏ２’メチレン結合であり、
Ｒ3はＯＨであり、
Ｒ5はＯＲ’5であり、Ｒ’5はヒドロキシル保護基、保護ヌクレオチドまたは保護オリゴヌクレオチドであり、
あるいは、
ｉｉｉ）Ｒ2はＯＨであり、
Ｒ3は、ＯＲ’3、ＮＨＲ’’3、ＮＲ’’3Ｒ’’’3であり、ここで、Ｒ’3はヒドロキシル保護基、保護ヌクレオチドまたは保護オリゴヌクレオチドであり、Ｒ’’3、Ｒ’’’3は独立してアミン保護基であり、
Ｒ5はＯＲ’5であり、Ｒ’5はヒドロキシル保護基、保護ヌクレオチドまたは保護オリゴヌクレオチドである）
を有するヒドロキシル含有化合物を提供する工程と、
ｂ）式Ｉ（活性剤Ｉ）
【化２】
2010527945.tif 000004
（式中、
Ｒ＝アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、
Ｒ1、Ｒ2＝Ｈまたは一緒に５〜６員の環を形成する、
Ｘ1、Ｘ2＝独立してＮまたはＣＨ、
Ｙ＝ＨまたはＳｉ（Ｒ4）3、ここで、Ｒ4＝アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、
Ｂ-＝脱プロトン化酸）
を有する活性剤の存在下で前記化合物をホスフィチル化剤と反応させて、ホスフィチル化化合物を調製する工程と、
ｃ）イミダゾールおよびイミダゾリウム塩からなる群から選択される活性剤ＩＩの存在下で、単離されていない前記ホスフィチル化化合物を式
【化３】
2010527945.tif 000005
（式中、Ｒ5、Ｒ3、Ｒ2、Ｂは、独立して選択されるが、上記と同じ定義を有する）
を有する第２の化合物と反応させる工程と
を含むオリゴヌクレオチドを調製する方法が提供される。
【０００８】
「イミダゾール」は非置換ヘテロ環式化合物であり；そのＩＵＰＡＣ名は、１，３−ジアゾールまたは１，３−ジアゾシクロペンタ−２，４−ジエンである。
「イミダゾリム」は、上に定義されたイミダゾールのプロトン化した形態である。前述の活性剤ＩＩは、工程（ｃ）を開始するために極めて効率的であり、特に産業安全および環境保護に関する限り、国際公開第２００６／０９４９６３号パンフレットに具体的に開示された活性剤ＩＩに比べて有利である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明による反応スキームを示す。
【図２】イミダゾールに関する特に好ましい反応スキームを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明によれば、このホスフィチル化化合物は、好ましくはイミダゾールの誘導体である式Ｉを有する活性剤を用いて、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのヒドロキシル基をホスフィチル化することによって調製される。
精製または単離することなく、調製された敏感なホスホロアミダイトは、活性剤Ｉとは異なる活性剤ＩＩの存在下でヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのヒドロキシル基にカップリングされる。調製されたホスホロアミダイトの単離、活性剤Ｉからのアミダイトの分離はない。この反応は同じ反応容器中で続けられることが好ましい。活性剤ＩＩは、活性剤Ｉの存在下で使用され得る。
アミダイトカップリングのための従来技術の活性剤はアミダイト機能の活性化に対して高い反応性を有する。ホスフィチル化のためにこのような活性剤を用いると、ある程度の「過反応」（例えば、３’−３’−副生成物）も生じる。この問題および他の問題を克服するために、この活性剤の反応性は調節される。この場合、反応は、例えば、３’−３’−副生成物などの副生成物を実質的に含まないアミダイト濃度で選択的に停止する。この結果（アミダイトのインサイチュー（ｉｎ−ｓｉｔｕ）での生成）によってのみ、アミダイトカップリングで開始することによる全体の手法を続けることが可能になる。
【００１１】
活性剤ＩＩは、カップリング工程を誘導する能力を有する。活性剤ＩＩを添加後、アミダイトはアミダイトカップリングから開始する。活性剤化合物として、イミダゾールおよびイミダゾリウム塩、すなわち、イミダゾールと酸、好ましくは強酸との塩が好適である。好適な酸は、例えば、トリフルオロアセテート、トリフラート、ジクロロアセテート、メシル、トシル、ｏ−クロロフェノラートである。
４．５未満のｐＫａを有する酸が、イミダゾールと塩を構築するために好ましい。
【００１２】
一実施形態において、前記活性剤はプロトン化Ｎ−１−（Ｈ）イミダゾールである。対イオンは国際公開第２００６／０９４９６３号パンフレットに一般的に記載されている。トリフルオロアセテートは対イオンとして好ましい。イミダゾールに関する特に好ましい反応スキームは図２に示され、ここで、Ｒ１（ＣＨ2−ＯＨ）およびＲ２（ＣＨ2−ＯＨ）は、（オリゴ−）ヌクレオシドまたは（オリゴ−）ヌクレオチドを表す。
イミダゾールまたはイミダゾリウムは、他の活性剤ＩＩ、例えば、国際公開第２００６／０９４９６３号パンフレットに開示されたものと組み合わせて使用され得る。
【００１３】
第２の態様において、前記活性剤はテトラゾールをあまり含まない。「テトラゾール」は、特に、国際公開第２００６／０９４９６３号パンフレットに開示されたテトラゾール化合物を意味すると理解される。テトラゾールをあまり含まないとは、国際公開第２００６／０９４９６３号パンフレットの請求項１に記載されたとおり、溶液中のテトラゾールの量が、ヒドロキシル含有化合物のモル当たり１モル未満であることをいう。この量は、好ましくはヒドロキシル含有化合物のモル当たり０．５モル未満、より好ましくはヒドロキシル含有化合物のモル当たり０．１モル未満である。この態様において、前記活性剤は好ましくは、テトラゾールを実質的に含まないかまたは完全に含まない。第２の態様における好ましい活性剤は、第１の態様による活性剤である。
【００１４】
両方の態様における好ましい溶媒は、Ｃ−Ｈ酸性溶媒、特に、カルボニル基を含むものである。このような溶媒は、例えば、酢酸エチルまたはアセト酢酸エチルなどのエステルおよびケトンから選択され得る。アセトンが好ましい。
【００１５】
本発明は、国際公開第２００６／０９４９６３号パンフレットの請求項１に記載の方法にとりわけ及び、ここで、活性剤ＩＩはＮ0−Ｈ結合を有するイミダゾールである。
好ましくは、このイミダゾールはプロトン化Ｎ−１−（Ｈ）イミダゾールである。
本発明は、国際公開第２００６／０９４９６３号パンフレットの請求項１に記載の方法にさらに及び、ここで、活性剤ＩＩはテトラゾールをあまり含まない。
好ましくは、この活性剤ＩＩは、Ｎ0−Ｈ結合を有するイミダゾール、好ましくはプロトン化Ｎ−１−（Ｈ）イミダゾールである。
【００１６】
カップリング後に、通常、酸化（ＰＯ形成）または硫酸化（ＰＳ形成）が用いられる。ＰＯ形成のために、過酸化物手法が好ましい。いずれの抽出工程も行わずにこの反応を行うことができる（ヨウ素酸化はいくつかの抽出工程を必要とする）。
硫酸化の場合、硫酸化のための知られている全ての反応剤（すなわち、ＰＡＤＳ、Ｓ−Ｔｅｔｒａ、ｂｅａｕｃａｇｅ）を用いることができる。ＰＳ形成のための好ましい反応剤は硫黄である。製造コストの差は硫黄の使用に有利である。
一実施形態において、この反応はアセトンの存在下であり得る。
ホスフィチル化剤は、ヒドロキシル含有化合物のヒドロキシル基と比較して、多かれ少なかれ等モル比で使用され得る。
【００１７】
さらなる実施形態において、これは、過剰、例えば、３〜５モル／ヒドロキシル含有化合物中ヒドロキシル基のモルで使用され得る。
さらに好ましい一実施形態において、ポリマーアルコールが請求項１に記載の工程ｂ）後に添加される。好適なポリマーアルコールには、Ｍｅｒｃｋ、ＤａｒｍｓｔａｄｔからＰＶＡ１４５０００として市販されているポリビニルアルコール（ＰＶＡ）が含まれる。粒径＞１２０μｍ（８０％）を有するマクロポーラスＰＶＡが好ましい。また、ヒドロキシル基を有する膜またはエノールを形成することができる他の化合物も好適である。
【００１８】
活性剤Ｉは、化学量論的に、触媒的に（３〜５０モル％、好ましくは１０〜３０モル％）または過剰に使用され得る。
好ましい実施形態において、活性剤Ｉは、
【化４】
2010527945.tif 000006
（式中、
ＹはＨまたはＳｉ（Ｒ4）3であり、ここで、Ｒ4＝アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、
Ｂ＝脱プロトン化酸、
Ｒはメチル、フェニルまたはベンジルである）
からなる群から選択される式を有する。
これらの活性剤の調製は、例えば、ハヤカワ（Ｈａｙａｋａｗａ）ら、米国化学協会誌（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ）、１２３（２００１）８１６５−８１７６に記載されている。
【００１９】
一実施形態において、活性剤は添加剤と組み合わせて使用される。添加剤は、式Ｉを有する非プロトン化形態の化合物および他のヘテロ環塩基、例えば、ピリジンから選択され得る。活性剤と添加剤との間の好適な比は、１：１〜１：１０である。
好ましい一実施形態において、活性剤は、「インサイチュー」での手順に従って調製され得る。この場合、活性剤は単離されず、これは反応の改良された結果をもたらした。標的分子の加水分解または分解は抑制される。
オリゴヌクレオチド（２量体、３量体、４量体、５量体、６量体、７量体および８量体）の３’−および／または５’−位における高い収率のホスフィチル化のために、活性剤のインサイチューでの調製および添加剤との組合せが好ましい。
【００２０】
上記のとおり、ホスフィチル化はオリゴヌクレオチドおよびビルディングブロックホスホロアミダイトの合成に特に有用である。したがって、好ましい実施形態において、ヒドロキシル含有化合物は糖部分、例えば、ヌクレオシドまたはそれ由来のオリゴマーを含む。このようなヌクレオシドは、例えば、場合によって保護基を含む、アデノシン、シトシン、グアノシンおよびウラシル、デスオキシアデノシン、デスオキシグアノシン、デスオキシチミジン、デスオキシシトシンおよびそれらの誘導体である。
【００２１】
通常、それらは、それらのヘテロ環官能基において、およびホスフィチル化されるべき１つを除いたこれらヒドロシル基を有する基において適切に保護される。典型的には、ジメトキシトリチル、モノメトキシトリチルまたはｔ−ブチルジメチル−シリル（ＴＢＤＭＳ）が５’ＯＨ−基の保護基として用いられ、３’−ＯＨ基のホスフィチル化を可能にする。さらなる可能性のある基は、ホスフェートエステルおよびＨ−ホスホネートであり、例えば、
【化５】
2010527945.tif 000007
を参照されたい。
【００２２】
ホスフェートエステルおよびホスホジエステルに関して、Ｒはアルキル、アリール、アルキルアリールから選択され得る。フェニルが好ましい。
５’、３’および２’のためのさらなるヒドロキシル保護基は、当該技術分野でよく知られており、例えば、ＴＢＤＭＳである。
【００２３】
一般に、ホスフィチル化剤は、１−Ｈ−テトラゾールを用いるホスフィチル化反応におけるものと同じであり得る。
好ましい実施形態において、それは、式
【化６】
2010527945.tif 000008
（式中、Ｚは、脱離基、例えば、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＮ、−ＣＨ2ＣＨ2＝ＣＨＣＨ2ＣＮ、パラ−ＣＨ2Ｃ6Ｈ4ＣＨ2ＣＮ、−（ＣＨ2）2〜5Ｎ（Ｈ）ＣＯＣＦ3、−ＣＨ2ＣＨ2Ｓｉ（Ｃ6Ｈ5）2ＣＨ3、または−ＣＨ2ＣＨ2Ｎ（ＣＨ3）ＣＯＣＦ3であり、Ｒ1およびＲ2は、独立して第二級アミノ基Ｎ（Ｒ3）2であり、ここで、Ｒ3は１〜約６個の炭素を有するアルキルであり；あるいはＲ3は４〜７個の原子を含み、かつ窒素、硫黄、および酸素から選択される最大３個のヘテロ原子を有するヘテロシクロアルキル環またはヘテロシクロアルケニル環である）
を有する。
【００２４】
典型的なホスフィチル化剤は、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイトである。
他の好ましいホスフィチル化剤は、参照により組み込まれる、Ｎ．オーケー（Ｎ．Ｏｋ）ら、米国化学協会誌（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）、２００３、１２５、８３０７−８３１７に記載されるようなオキサザホスホリジン誘導体である。このホスフィチル化剤により、そのヌクレオチド間結合が立体選択的仕方でホスホロチオエートに変換され得るオリゴヌクレオチドの合成が可能になる。このようなジアステレオ選択的な合成ヌクレオチド間ホスホチオエート結合は、アンチセンス薬または免疫刺激薬としてのホスホロチオエートの使用に見込みのある影響を有する。
【００２５】
図１は、本発明による反応スキームを示す。
脱プロトン化酸Ｂ-の好適な例は、トリフルオロアセテート、トリフラート、ジクロロアセテート、メシル、トシル、ｏ−クロロフェノラートである。４．５未満のｐＫａを有する酸が好ましい。それらが低い求核性を有することが好ましい。
一実施形態において、この反応は、反応媒体を乾燥させるためにモレキュラーシーブの存在下で行われる。一般に、水は排除されるか、または反応中に媒体を乾燥させることによって固定されなければならない。
【００２６】
本発明の活性剤Ｉをホスフィチル化剤と組み合わせて、その後にヒドロキシル成分を添加することも可能である。また、活性剤Ｉをヒドロキシル含有化合物と組み合わせて、その後にホスフィチル化剤を添加することも可能である。
添加剤を用いる場合、活性剤はヒドロキシル成分と混合され、その後ホスフィチル化剤が添加される。
活性剤の「インサイチュー」での生成のために、選択された酸は、反応温度制御下に添加剤の添加後に添加されることが好ましい。
ホスフィチル化剤は、選択された酸の添加前またはその後に添加され得る。
酸およびホスフィチル化剤の添加に関連して、ヌクレオシド成分は、最後または最初に添加され得る。
【００２７】
好ましい実施形態において、対応する活性剤の塩基、ヒドロキシル含有化合物、およびホスフィチル化剤は混合され、そして酸が添加されて反応を開始させる。
次いで、ホスフィチル化化合物（ホスホロアミダイト）は、活性剤ＩＩの存在下でヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのヒドロキシル基にカップリングされる。
上記のとおり化合物を反応させた後、調製されたトリエステルは酸化される。酸化は、例えば、安定なホスフェートまたはトリホスフェート結合を調製するために用いられ得る。
【００２８】
本明細書で用いられるように、オリゴヌクレオチドはまた、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチド類似体、修飾オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド模倣体ならびにＲＮＡおよびＤＮＡの形態における同様のものにも及ぶ。一般に、これらの化合物は、それぞれの連結モノマーサブユニットがヘテロ環塩基部分に直接的または間接的に結合している連結モノマーサブユニットの骨格を含む。モノマーサブユニットを連結させる結合、モノマーサブユニットおよびヘテロ環塩基部分は構造が変わり得、得られる化合物に対して複数のモチーフを生じさせる。
【００２９】
本発明は、式Ｘnを有するオリゴヌクレオチドの合成に特に有用であり、ここで、それぞれのＸは、Ａ、ｄＡ、Ｃ、ｄＣ、Ｇ、ｄＧ、Ｕ、ｄＴから選択され、ｎ＝２〜３０、好ましくは２〜１２、より好ましくは２〜８または２〜６であり、その誘導体は保護基を含む。当該技術分野で知られている修飾は、ヘテロ環塩基、糖またはモノマーサブユニットを連結させる結合の修飾である。ヌクレオチド間結合の変形は、例えば、参照により組み込まれる国際公開第２００４／０１１４７４号パンフレット（１１頁の下部で始まる）に記載されている。
【００３０】
典型的な誘導体は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルおよびアルキルホスホネートならびにホスホノアセト誘導体である。
さらなる典型的な修飾はその糖部分においてである。そのリボースは異なる糖で置換されているか、または１個もしくは複数の位置がＦ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキルなどの他の基で置換されている。好ましい実施形態は、２’−メチルおよび２’−メトキシエトキシである。これらの修飾は全て、当該技術分野で知られている。
【００３１】
ヘテロ環塩基部分に関して、当該技術分野で使用されているいくつかの他の合成塩基、例えば、５−メチル−シトシン、５−ヒドロキシ−メチル−シトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−または２−アルキル誘導体、２−チオウラシルがある。このような修飾は、国際公開第２００４／０１１４７４号パンフレット（２１頁から始まる）にも開示されている。
合成で用いられる場合、これらの塩基は通常、保護基、例えば、Ｎ−６−ベンジルアデニン、Ｎ−４−ベンジルシトシンまたはＮ−２−イソブチリルグアニンを有する。一般に、さらなる反応で反応させることが意図されない反応性基の全て、特に糖のヒドロキシル基は保護されなければならない。
オリゴヌクレオチドの合成に関連した実施形態において、反応媒体としてまたは他の溶媒のための共溶媒として使用され得るアルデヒドまたはケトンの存在下で反応を行うことが有用である。
【００３２】
好適な化合物はエノールを形成し得るものである。通常の化合物は式Ｒ1Ｒ2Ｃ＝Ｏを有し、ここで、Ｒ1およびＲ2は、独立してＨであるか、または単独で環状構造を形成し得る１〜２０個の炭素からなるか、あるいはＲ1およびＲ2は両方のＲ1およびＲ2がＨであることはない環状系を一緒に形成する。非常に好ましいケトンはアセトンである。アセトンの存在により、ジイソプロピルアミン（ＤＩＰＡ）のような、任意の量のアミンの活性がクエンチされ、これはホスフィチル化工程の間に遊離される。これはより短いおよびより長いオリゴヌクレオチドのホスフィチル化に使用され得、同様の結果をもたらす（分解なし）。ＲxおよびＲyが独立してＣ1〜Ｃ6アルキルであるかまたは一緒にシクロアルキルを形成する式Ｒx−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒyを有する他のケトン化合物も、それらが、例えば、α位にＣＨ2−基を有するアミンの存在下でエノラートを形成することができる限り使用され得る。
【００３３】
本発明は、以下の非限定的な実施例によってさらに説明される。
【実施例】
【００３４】
実施例１
５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル）−Ｎ−イソブチリル−２’−デスオキシグアノシン（ｄ−Ｇ−ＯＨ）およびＮ−メチルイミダゾリウムトリフルオロアセテート（ＭＩＴ）をアセトンおよびジクロロメタン（１：１）に溶解させ、モレキュラーシーブを添加した。この懸濁液を、激しい撹拌とともにジクロロメタン中ＢｉｓＰｈｏｓの溶液に室温で添加した。アセトンおよびジクロロメタン（１：１）中に溶解させた、３’−Ｏ−レブリニル−Ｎ−イソブチリル−２’−デスオキシグアノシン（ＨＯ−Ｇ−Ｉ）、エチルチオテトラゾール（ＥＴＴ）またはイミダゾリウムトリフルオロアセテート（ＩＴ、ＣＨＫ３４６／０６）およびＮＭＩの溶液を添加した。この反応後にＲＰ−ＨＰＣＬを行い、完全な変換後、Ｃｕｒｏｘ  Ｍ４００を添加した。この反応後にＲＰ−ＨＰＬＣを行い、完全な変換後、ろ過工程でモレキュラーシーブを除去し、その後アセトン／ジクロロメタン（１：１）で洗浄工程を行った。この溶液をＭＴＢＥ中に移し、反応生成物を沈殿させた。沈殿物をろ過し、ＭＴＢＥで洗浄し、減圧において４０℃で乾燥させた。
【００３５】
【表１】
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【００３６】
実施例２
５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル）−Ｎ−イソブチリル−２’−デスオキシグアノシン（ｄ−Ｇ−ＯＨ）およびＮ−メチルイミダゾリウムトリフルオロアセテート（ＭＩＴ）をアセトンおよびジクロロメタン（１：１）に溶解させ、モレキュラーシーブを添加した。室温で激しい撹拌下、ＢｉｓＰｈｏｓを添加し、アセトンおよびジクロロメタン（１：１）中に溶解させた３’−Ｏ−レブリニル−Ｎ−イソブチリル−２’−デオソキシグアノシン（ＨＯ−Ｇ−Ｉ）、イミダゾールおよびＮＭＩの溶液ならびにジクロロメタン中に溶解させたＴＦＡを一滴ずつ添加した。この反応後にＲＰ−ＨＰＬＣを行った。完全な変換後に、Ｃｕｒｏｘ  Ｍ４００を添加した。再度、反応後にＲＰ−ＨＰＬＣを行った。完全な変換後に、この溶液をろ過し、モレキュラーシーブを除去し、アセトン／ジクロロメタン（１：１）で洗浄し、ＭＴＢＥに移し、生成物を沈殿させた。生成物をろ過し、ＭＴＢＥで洗浄し、減圧において４０℃で乾燥させた。
【００３７】
【表２】
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【００３８】
実施例３
５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル）−Ｎ−イソブチリル−２’−デスオキシグアノシン（ｄ−Ｇ−ＯＨ）およびＮＭＩをアセトンおよびジクロロメタン（１：１）に溶解させ、モレキュラーシーブを添加した。室温で、ＢｉｓＰｈｏｓを一滴ずつ添加し、ジクロロメタン中ＴＦＡの溶液も一滴ずつ添加した。この反応後にＲＰ−ＨＰＬＣを行い、完全な変換後に、アセトンおよびジクロロメタン（１：１）中に溶解させた、３’−Ｏ−レブリニルチミジン（ＨＯ−Ｔ−Ｉ）およびイミダゾールの溶液を添加した。さらに、ジクロロメタン中ＴＦＡの溶液を一滴ずつ添加した。この反応後にＲＰ−ＨＰＬＣを行い、完全な変換後に、Ｃｕｒｏｘ  Ｍ４００を添加した。再度、反応後にＲＰ−ＨＰＬＣを行った。完全な変換後に、これをろ過してモレキュラーシーブを除去し、アセトン／ジクロロメタン（１：１）で洗浄し、ＭＴＢＥに移して生成物を沈殿させた。沈殿物をろ過し、ＭＴＢＥで洗浄し、減圧下４０℃で乾燥させた。
【００３９】
【表３】
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【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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