(57)【要約】  本明細書に記載されているように、生細胞システムにおける抗体機能を態様を測定するシステム及び方法を開示する。かかるシステム及び方法は、生細胞若しくは生細胞モデルにおける抗体治療候補物質に関する予防上若しくは治療上の態様を測定する方法をも提供する。
2010537195.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生細胞の抗体機能を特性化する方法であって、
生細胞が自身の表面に固定されたバイオセンサを設けるステップと、
選択された細胞ターゲットに対する抗体に当該固定された細胞を所定期間だけ接触せしめるステップと、
固定されて前記抗体に接触せしめられ且つ前記選択された細胞ターゲットを有する細胞を、一組のマーカに同時又は順次に接触せしめるステップと、
前記第１マーカ若しくは第２マーカのうちの一方によって誘起された前記細胞ターゲットの細胞信号伝達に与える前記抗体の接触効果を、前記バイオセンサによって検出するステップと、
前記抗体が存在する場合と存在しない場合における前記細胞ターゲットの前記細胞信号伝達に関する前記バイオセンサの信号を比較するステップと、を含む方法。
【請求項２】
前記期間は、約数秒から約数分の期間、約数分から約数時間の期間、約数日から約数週間の期間、及びそれらの組み合わせの期間のグループから選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記一組のマーカは、前記細胞ターゲットを直接活性化する少なくとも１つのリガンドを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記一組のマーカは、活性化、トランス活性化、又はその双方によって前記細胞ターゲットに対して間接的に作用する少なくとも１つのリガンドを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記一組のマーカは、前記細胞ターゲットに直接結合し且つ前記細胞ターゲットを活性化する第１マーカと、細胞の配列若しくは信号伝達経路を介して前記細胞ターゲットを間接的にトランス活性化する第２マーカと、を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記固定された細胞を抗体に接触せしめるステップは、
前記細胞の表面を前記抗体に接触せしめるステップ、前記細胞の細胞内に前記抗体を接触せしめるステップ、又はそれら組み合わせ、を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞ターゲットは、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、イオンチャンネル、受容体チロシンキナーゼ、上皮成長因子受容体（ＥＦＧＲ）、サイトカイン受容体、免疫受容体、インテグリン受容体、イオントランスポータのうちの少なくとも１つ、又はそれら組み合わせ、を含む特徴体を前記細胞の表面上に含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞ターゲットは、酵素、キナーゼ、ホスファターゼのうちの少なくとも１つ、又はそれら組み合わせ、を含む細胞内ターゲットを有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞ターゲットは、モノマー受容体、ダイマー受容体、オリゴマー受容体、又はそれら組み合わせ、を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞ターゲットは、同種の受容体複合体若しくは異種のオリゴマー受容体複合体を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記バイオセンサは、インピーダンスセンサー、エバネセント波センサ、又はそれら組み合わせ、を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
対象となる少なくとも１つの細胞ターゲットを有する生細胞が表面に固定されたバイオセンサを設けるステップと、
抗体を含むタンパク質トランスフェクション複合体を用いて当該固定された生細胞を培養することによって、前記抗体が前記細胞内に取り入れられて、その後に、対象となる前記細胞ターゲットに作用するようにせしめるステップと、
刺激によって当該固定された生細胞を刺激するステップと、
前記刺激に対する前記細胞の応答に関する前記バイオセンサのシグネチャを観測するステップと、を含む方法。
【請求項１３】
前記タンパク質トランスフェクション複合体は、リポソーム又はタンパク質トランスダクション物質を含む抗体を含むことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
生細胞における上皮成長因子受容体（ＥＦＧＲ）細胞ターゲットに対する抗体機能を特性化する方法であって、
少なくとも１つのＥＦＧＲターゲットを有する生細胞が表面に固定されたバイオセンサを設けるステップと、
当該固定された生細胞を上皮成長因子受容体に対する抗体に所定期間だけ接触せしめるステップと、
前記抗体に接触せしめられかつ固定された細胞を、マーカに接触せしめるステップと、
前記マーカによって誘起された前記ＥＦＧＲ細胞ターゲットの細胞信号伝達に与える前記抗体の接触の効果を、前記バイオセンサを用いて検出するステップと、
前記抗体が存在する場合と存在しない場合における前記ＥＦＧＲ細胞ターゲットの細胞信号伝達に関する前記バイオセンサの測定値を比較するステップと、を含む方法。
【請求項１５】
前記マーカは、１つのマーカ、２つのマーカ、又は３つ以上の異なるマーカを含むことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
上皮成長因子（ＥＧＦ）、メチル‐β‐シクロデキストリン、前記上皮成長因子受容体をトランス活性化するＧタンパク質共役型受容体リガンドのうちの少なくとも１つ又はそれら組合せを含むことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記マーカはＥＧＦであることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記期間は、約数秒から約数分の期間、約数分から約数時間の期間、約数日から約数週間の期間、及びそれらの組み合わせの期間のグループから選択されることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗体は自己抗体であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書で引用された全ての公報、特許、及び特許出願に関する全ての開示が、参考として組み込まれている。
【０００２】
本開示は、バイオセンサを用いた抗体の機能的マッピングに関し、特に、抗体の機能と細胞の応答とをバイオセンサの生細胞によって検出する方法に関する。
【発明の概要】
【０００３】
本開示は、細胞環境において、光学バイオセンサ等のバイオセンサを使用して、特定の細胞内ターゲットに対する１つ以上の抗体の機能を調べる方法を提供する。本開示は細胞表面の抗体ターゲット、細胞内の抗体ターゲット、又はその双方に適した方法を提供する。本開示は、例えば、リガンド依存モード、リガンド独立モード、又はその双方のモードにおいて遂行され得る抗体機能のマッピング方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１Ａ】図１Ａは、本開示の実施形態における、様々な抗上皮成長因子受容体（抗ＥＧＦＲ）に対する３２ｎＭのＥＧＦによって誘起された静的Ａ４３１細胞のリアルタイム動的応答性を示す図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本開示の実施形態における、様々な抗上皮成長因子受容体（抗ＥＧＦＲ）に対する３２ｎＭのＥＧＦによって誘起された静的Ａ４３１細胞のリアルタイム動的応答性を示す図である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、本開示の実施形態における、様々な抗上皮成長因子受容体（抗ＥＧＦＲ）に対する３２ｎＭのＥＧＦによって誘起された静的Ａ４３１細胞のリアルタイム動的応答性を示す図である。
【図１Ｄ】図１Ｄは、本開示の実施形態における、様々な抗上皮成長因子受容体（抗ＥＧＦＲ）に対する３２ｎＭのＥＧＦによって誘起された静的Ａ４３１細胞のリアルタイム動的応答性を示す図である。
【図１Ｅ】図１Ｅは、本開示の実施形態における、様々な抗上皮成長因子受容体（抗ＥＧＦＲ）に対する３２ｎＭのＥＧＦによって誘起された静的Ａ４３１細胞のリアルタイム動的応答性を示す図である。
【図１Ｆ】図１Ｆは、本開示の実施形態における、様々な抗上皮成長因子受容体（抗ＥＧＦＲ）に対する３２ｎＭのＥＧＦによって誘起された静的Ａ４３１細胞のリアルタイム動的応答性を示す図である。
【図２Ａ】図２Ａは、本開示の実施形態における、様々な濃度の抗ＥＧＦＲ（５２８）に対する３２ｎＭのＥＧＦによって誘起された静的Ａ４３１細胞の投与依存性リアルタイム動的応答性を示す図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、本開示の実施形態における、抗ＥＧＦＲ（５２８）の濃度の関数とした負の動的質量再分布（Ｎ−ＤＭＲｓ）の規格化された振幅を示す図である。
【図３Ａ】図３Ａは、本開示の実施形態における、様々な濃度の単クローン性抗ＥＧＦＲ（クローンＣ１１）に対する５ｍＭのメチル−β−シクロデキストリンによって誘起された静的Ａ４３１細胞の投与量依存リアルタイム動的応答性を示す図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、本開示の実施形態における、様々な濃度の単クローン性抗ＥＧＦＲ（クローンＣ１１）に対する５ｍＭのメチル−β−シクロデキストリンによって誘起された静的Ａ４３１細胞の投与量依存リアルタイム動的応答性を示す図である。
【図４Ａ】図４Ａは、本開示の実施形態における、様々な濃度の単クローン性抗ＥＧＦＲ（クローン９Ｇ６）に対する５ｍＭのメチル−β−シクロデキストリンによって誘起された静的Ａ４３１細胞の投与量依存リアルタイム動的応答性を示す図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、本開示の実施形態における、様々な濃度の単クローン性抗ＥＧＦＲ（クローン９Ｇ６）に対する５ｍＭのメチル−β−シクロデキストリンによって誘起された静的Ａ４３１細胞の投与量依存リアルタイム動的応答性を示す図である。
【図５】図５は、本開示の実施形態における例示的な構造ドメインを有する上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の概略図であり、抗体の相互作用に関する潜在的な細胞外ポイント（細胞表面）及び細胞内ポイントを示している。
【図６】図６は、本開示の実施形態における、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の細胞外領域等の細胞ターゲットに対して生じ得る例示的な抗体相互作用と結果を示す概略図である。
【図７】図７は、本開示の実施形態における、６４ｎＭのＥＧＦを用いた刺激に応答する静的Ａ４３１細胞のリアルタイム動態を示す図である。
【図８Ａ】図８Ａは、本開示の実施形態における、６４ｎＭのＥＧＦによる誘起される前にそれぞれ約２時間と２４時間、抗ＥＧＦＲ（Ｒ１クローン）の異なる濃度において前処理された静的Ａ４３１細胞のリアルタイム動態を示す図である。
【図８Ｂ】図８Ｂは、本開示の実施形態における、６４ｎＭのＥＧＦによる誘起される前にそれぞれ約２時間と２４時間、抗ＥＧＦＲ（Ｒ１クローン）の異なる濃度において前処理された静的Ａ４３１細胞のリアルタイム動態を示す図である。
【図９Ａ】図９Ａは、本開示の実施形態における、６４ｎＭのＥＧＦによって誘起された様々なＤＭＲ事象に関する振幅に与える異なる投与量の抗ＥＧＦＲ（Ｒ１クローン）を用いたＡ４３１細胞の短期間（２時間）前処理の効果を示している。
【図９Ｂ】図９Ｂは、本開示の実施形態における、６４ｎＭのＥＧＦによって誘起された様々なＤＭＲ事象に関する振幅に与える異なる投与量の抗ＥＧＦＲ（Ｒ１クローン）を用いたＡ４３１細胞の短期間（２時間）前処理の効果を示している。
【図９Ｃ】図９Ｃは、本開示の実施形態における、６４ｎＭのＥＧＦによって誘起された様々なＤＭＲ事象に関する振幅に与える異なる投与量の抗ＥＧＦＲ（Ｒ１クローン）を用いたＡ４３１細胞の短期間（２時間）前処理の効果を示している。
【図１０Ａ】図１０Ａは、本開示の実施形態における、６４ｎＭのＥＧＦによって誘起された様々なＤＭＲ事象に関する振幅に与える異なる投与量の抗ＥＧＦＲ（Ｒ１クローン）を用いたＡ４３１細胞の長時間（２４時間）前処理の効果を示している。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、本開示の実施形態における、６４ｎＭのＥＧＦによって誘起された様々なＤＭＲ事象に関する振幅に与える異なる投与量の抗ＥＧＦＲ（Ｒ１クローン）を用いたＡ４３１細胞の長時間（２４時間）前処理の効果を示している。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、本開示の実施形態における、６４ｎＭのＥＧＦによって誘起された様々なＤＭＲ事象に関する振幅に与える異なる投与量の抗ＥＧＦＲ（Ｒ１クローン）を用いたＡ４３１細胞の長時間（２４時間）前処理の効果を示している。
【発明の詳細な説明】
【０００５】
本発明の様々な実施形態が、添付の図面を参照して詳細に説明されるであろう。様々な実施形態に対する説明は、本発明の範囲を制限するものではなく、本発明は、添付した請求の範囲によってのみ限定される。さらに、本明細書に述べられたいかなる実施例も、限定することを目的とはしていないし、特許請求の範囲に記載された発明の多くの実施形態の内、いくつかについて説明しているにすぎない。
【０００６】
定義
「分析（ａｓｓａｙ）」、「分析する（ａｓｓａｙｉｎｇ）」等の用語は、例えば、刺激（stimulus）を用いて、接触若しくは刺激に対する細胞の光学応答又はバイオインピーダンス応答の存在の有無、量、程度、動的特性、形態を決定する分析を意味する。かかる刺激は、抗体、偽抗体、リガンド候補化合物、ウイルス粒子、病原体等の例えば、外因性刺激若しくは内因性刺激である。
【０００７】
「付着する（ａｔｔａｃｈ）」、「付着（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）」、「付着する（ａｄｈｅｒｅ）」、「付着された（ａｄｈｅｒｅｄ）」、「固定された（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ）」等の用語は、例えば、本開示の表面改質性物質、相溶剤、細胞、リガンド候補化合物等を、物理吸着、化学結合等のプロセス若しくはこれらの組み合わせのプロセスによって、表面に固定若しくは固着することを意味する。特に、「細胞の付着（ｃｅｌｌ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）」、「細胞の付着（ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ）」等の用語は、細胞固定材料（例えば、細胞外マトリックス、結合複合体等）、相溶剤（例えば、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミン、ゼラチン、ポリリジン等）、又は、その双方を用いて培養し又は相互作用させることによって、表面との細胞の相互作用若しくは表面への結合を意味する。
【０００８】
「付着性細胞」は、基板の外部表面に関連付けられ、基板の外部表面上に固定され、又は特定の接触を維持する原核生物の細胞又は真核性細胞等の細胞、細胞株又は細胞システムを意味する。培養した後のかかるタイプの細胞は、洗浄媒質交換処理、すなわち、多くの細胞ベースの分析に必須である処理に対して抵抗力を有し、耐性を有し得る。「弱付着性細胞」とは、細胞培養中に、基板の外部表面と弱く相互作用し、基板の外部表面と弱く関連し、基板の外部表面と弱く接触する原核生物の細胞又は真核性細胞等の細胞、細胞株又は細胞システムを意味する。しかしながら、これらのタイプの細胞、例えば、人間の胎児性腎臓（ＨＥＫ）細胞は、洗浄液若しくは培地の交換等の物理的阻害により、基板の表面から容易に解離する傾向がある。「懸濁細胞」とは、望ましくは、培地で培養される細胞又は細胞株を意味し、細胞は、培養中に、基板の表面に付着若しくは固着しない。「細胞の培養」又は「細胞培養」とは、原核生物細胞若しくは真核性細胞が一定条件下で培養される処理を意味する。「細胞の培養」とは、多細胞の真正核細胞から得られた細胞、特に動物細胞の培養だけではなく、複合生体組織及び臓器の培養をも意味する。
【０００９】
「細胞」等の用語は、１つ以上の細胞核と他の多種の細胞小器官を任意で含む半透明の細胞膜によって外的に結合された通常小なる微小質量の原形質を意味し、生命の基本的な機能を単独で実行し又は生命の基本的な機能を実行する他の同等の集団と相互作用することができる１つ以上の細胞核と他の多種の細胞小器官を任意で含み、合成細胞構造体、細胞モデルシステム、人工の細胞システムを含む独立的に機能することができる生物の最小構造ユニットを形成する。
【００１０】
「細胞システム」等の用語は、互いに相互作用する１より多いタイプの細胞（又は単一タイプの細胞の異なる形態）の集合を意味し、生物学的病態生理学的機能又は生理的病態生理学的機能を発揮する。かかる細胞システムは器官、生体組織、幹細胞、分化した肝細胞等のシステムを含む。
【００１１】
「抗体」、「Ａｂ」等の用語は、通常Ｙ形状を有し、脊椎動物の血液若しくは他の体液中に見出されるタンパク質生物分子又は生物分子擬態を一般に意味し、可溶性の形態、細胞膜結合された形態、細胞膜‐遊離の形態等、及び単クローンの形態、ポリクローナルの形態、天然の形態、合成の形態、設計され形態等を含む。抗体は、免疫システムによって使用されて、表面抗原による凝集反応によって、バクテリアやウイルス等の異物又は病原菌を特定し且つ中和する。本明細書に使用されるように、ＥＧＦＲ抗体等の抗体は、例えば、抗ＥＧＦＲ（分枝系ＸＸ）、抗ＥＧＦＲ（ｃｌ．ＸＸ）、抗ＥＧＦＲ（ＸＸ）等として指定され得る。
【００１２】
「マーカ」等の用語は、分子、生物分子、又は少なくとも１つの細胞ターゲットの活性を調節することができる生体試料（例えば、Ｇｑ−共役受容体、Ｇｓ−共役受容体、Ｇｉ−共役受容体、Ｇ１２／１３−共役受容体、イオンチャンネル、受容体チロシンキナーゼ、トランスポータ、ナトリウム‐プロトン交換体、細胞核受容体、セルキナーゼ、細胞性蛋白質、等）を意味し、バイオセンサによって、信頼性の高い出力が得られ若しくは信号が測定可能となる。目的とする細胞ターゲットの種類及び後に生ずるセル事象に依存して、マーカは、例えば、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ：Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ：ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ）、イオンチャネル、細胞核受容体、細胞酵素アデニールサイクラーゼ等のマーカに対して、例えば、作用薬、部分的作用薬、逆作用薬等の活性体であり得る。マーカは、例えば、特定のターゲットに結合し且つ活性化するリガンド、又は、特定のターゲットを順番にトランス活性化する別の異なるターゲットに結合し且つ活性化する分子であり得る。
【００１３】
「検出する」、「検出」、「検出」等の用語は、バイオセンサを有するマーカによって誘起された細胞ターゲットの細胞信号伝達に関して抗体の相互作用を発見し且つ探知する本開示の装置及び方法の能力を意味する。
【００１４】
「治療候補化合物」、「治療候補物質」、「予防候補物質」、「予防的物質」、「リガンド候補」等の用語は、バイオセンサに付着された細胞と相互作用するようなその潜在能力の対象となる自然に生ずる分子又は材料若しくは合成分子又は材料を意味する。
【００１５】
治療候補物質又は予防候補物質は、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、イオン、脂質、生細胞等の構造体若しくは要素等の細胞ターゲット又は病原菌ターゲットのうち少なくとも１つと特に結合し又は相互作用し得る例えば化合物、生物学的分子、ペプチド、タンパク質、生物試料、薬物候補の小分子、薬物候補の生物学的分子、薬物候補の小分子‐生物の置換体及び同様の材料、又は実在の分子、又はそれら組み合わせを含む。
【００１６】
「バイオセンサ」等の用語は、生物学的要素を物理化学的検出構成要素に結合せしめる検体を検出するデバイスを意味する。バイオセンサは、 （生体組織、微生物、病原体、細胞、又はこれらの組合せ等の）生物学的構成部又は要素、（例えば、光学的、圧電的、熱測定、若しくは磁気的な物理化学的手法で動作する）検出要素と、双方の構成部に関連付けられたトランスデューサの３つの部分から通常構成される。生物学的構成部若しくは生物学的要素は、例えば生体細胞、病原体、又はそれらの組合せを含み得る。実施形態において、光学的バイオセンサは、例えば、生体細胞、病原体、若しくはそれらの組合せの分子認識事象又は分子刺激事象を定量化可能な信号に変換する光学変換装置を含み得る。
【００１７】
「上皮成長因子」又は「ＥＧＦ」は、細胞の成長、培養、及び分化の規則において重要な役割を果たす成長因子を意味する。人間のＥＧＦは、５３のアミノ酸残基と３つの分子内ジスルフィド結合を有する６，０４５Ｄａタンパク質である。ＥＧＦは、高親和性により細胞表面のＥＧＦＲに結合し且つ受容体の本質的なタンパク質‐チロシンキナーゼ活性を刺激することによって、作用する。チロシンキナーゼ活性は、信号伝達カスケードを順次生じせしめ、かかる信号伝達カスケードによって、糖の分解の増大及びタンパク質の合成等、細胞内におけるさまざまな生化学的変化を生ぜしめて、特定の遺伝子の発現を増大させる。かかつ特定の遺伝子は、最終的にＤＮＡを合成せしめ且つ細胞を増殖せしめるＥＧＦＲに対する遺伝子を含む。
【００１８】
「上皮成長因子受容体」又は「ＥＧＦＲ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）」とは、その特定のリガンドの結合によって活性化され得る細胞の表面上にある特定の受容体を意味し、ＥＧＦ及びトランスフォーミング成長因子α（ＴＧＦα：ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  α）を含む。ＥＧＦ受容体は、ＥｒｂＢ受容体群のうちの１つである。４つの密接に関連した受容体チロシンキナーゼの副群として、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ−１）、ＨＥＲ２／ｃ−ｎｅｕ（ＥｒｂＢ−２）、Ｈｅｒ３（ＥｒｂＢ−３）、及びＨｅｒ４（ＥｒｂＢ−４）がある。関連するＥｒｂＢ−３及びＥｒｂＢ−４受容体は、ニューレグリン（ＮＲＧｓ：ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎｓ）によって活性化される。ＥｒｂＢ−２は、周知の直接的活性リガンドを全く有しておらず、構成的には活性状態にあってもよい。前もって形成された不活性ダイマーが、リガンドの結合前に存在し得るという証拠があるものの、その成長因子リガンドによる活性化に際して、ＥＧＦＲは、不活性モノメリック形態から活性ホモダイマに転位する。リガンドの結合後にホモダイマーを形成することに加えて、ＥＧＦＲは、ＥｒｂＢ２／Ｈｅｒ２／ｎｅｕ等のＥｒｂＢ受容体群の別のメンバと対となることができ、活性化されたホモダイマを形成する。活性ＥＧＦＲｓのクラスタ化が活性化自体に対して重要であるか否かは不明確のままであり、個々のダイマーの活性化の後に生ずるものの、活性ＥＧＦＲｓのクラスタが形成するということを示す証拠もある。
【００１９】
「トランス活性」等の用語は、別の異なる細胞受容体（例えば、ＧＰＣＲ）に結合し且つそれを活性化するリガンドによって誘起された受容体（例えば、ＥＧＦＲ）の活性化を意味する。細胞の調節機構の結果として、前者の受容体はトランス活性化されるようになる。かかるトランス活性は、異なる細胞信号伝達システム間における伝達において一般的な原理である。かかる異なる細胞信号伝達システムによって、細胞はその環境からの多数の信号を統合することが可能となる。例えば、ＥＧＦＲのトランス活性は、ＧＰＣＲｓとＲＴＫｓとの間のクロストークに対するパラダイムを表している（例えば、Gschwind, A., et al., ”Cell Communication Networks:Epidermal Growth Factor Receptor Transactivation as the Paradigm for Interreceptor Signal Transmission,” Oncogene, (2001), 20 (13), 1594-1600を参照されたい。）。別の実施例は、カルバコールを有するＨＥＫ２９３細胞、ＧＰＣＲ筋性受容体リガンドのＫｖ１．２カリウムイオンチャンネルのトランス活性である。トランス活性するリガンド、トランス活性するマーカするか、又はトランス活性する分子とは、ターゲット受容体に直接結合し且つ活性化するというよりも、恐らくは細胞内調整機構又は信号機構を介して、対象となるターゲット受容体を間接的に活性化し得るリガンド、マーカ、又は分子を意味する。
【００２０】
当業者にはよく知られている簡略が使用され得る（例えば、時間又は（複数の）時間に対して「ｈ」若しくは「ｈｒ」、グラムに対して「ｇ」若しくは「ｇｍ」、ミリリットルに対して「ｍＬ」、室温に対して”ｒｔ”、ナノメータに対して「ｎｍ」、等の簡略）。
【００２１】
”含む（Ｉｎｃｌｕｄｅ）”、”含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）”等は、含んで（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）を意味するがこれに限定されない。
【００２２】
本開示の実施形態を説明するのに使用された例えば、組成、濃度、堆積、処理温度、処理時間、収量、流速、圧力等の値の量、及びその範囲を変更する「約」という用語は、例えば、生じうる数量における変分を意味する。かかる生じうる数量は、例えば、組成、構成、濃度、使用製剤に対して使用された通常の計測と処置により生じ、これら手法における偶発的な誤差により生じ、方法を実行するのに使用される製造方法、ソース、又は出発物質若しくは成分の純度における差等により生ずる。また、「約」という用語は、以下の総量を包含する。すなわち、特定の初期濃度若しくは混合物を有する組成若しくは製剤の経年変化に帰属して異なる総量、及び、特定の初期濃度若しくは混合物を有する組成若しくは製剤の混合若しくは処理に帰属して異なる総量を包含する。「約」という用語によって変更された本明細書に添付された特許請求の範囲は、これら量の均等値を含む。
【００２３】
実施形態において「〜本質的に成る（Ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」とは、例えば、抗体機能を特性化する方法を意味する。かかる方法は、例えば、２以上のマーカ等のマーカが存在する場合と存在しない場合において、細胞ターゲットに対する抗体の相互作用を調べ又は決定する方法である。かかるマーカは、任意で１つより多くのマーカ、デバイス、又は装置を含むバイオセンサの表面の細胞構造物を含む構成を含む。方法は、特許請求の範囲に記載された構成要素又はステップと、他の構成要素又はステップと、を含み得る。他の構成要素又はステップとは、例えば、特定の反応物質、特定の添加物または成分、特定の物質、特定の細胞若しくは細胞株、特定の表面修飾剤または条件、特定のリガンド候補物質、可変選択された同等の構造、材料、又は処理である。
【００２４】
特に指定しない限り、本明細書で使用された不定冠詞“ａ”“ａｎ”、又は対応する定冠詞“ｔｈｅ”は、少なくとも１つ、又は１つ以上を意味する。
【００２５】
要素、成分、添加剤、細胞の種類、抗体等、及びそれらの範囲に関して開示された特定の値又は好ましい値は、例示する目的のためにあるに過ぎない。すなわち、それらは他の画定された値又は一定範囲内の他の値を除外しない。
【００２６】
本開示の構成、装置、及び方法は、いかなる値をも有するこれらを含み、或いは、本明細書に記載された値、特定の値、より特定の値、及び好ましい値のいかなる組合せも有するこれらを含む。
【００２７】
実施形態において、本開示は、共鳴導波グレーティング（ＲＷＧ）バイオセンサ又は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサ等のバイオセンサを提供し、例えば、免疫システム異状、感染、処置、防止、又は同様のアプリケーション等の細胞システムにおける生細胞抗体相互作用及び分析のための方法を提供する。本開示は、抗体管理方法及び治療効果を特定するのに利用され得るバイオセンサベースの方法をも提供する。抗体管理方法及び治療効果は、刺激又は抑制のための抗体、細胞受容体の自己分泌信号伝達を中和する中和抗体、又は抗体治療物質等である。抗体治療物質は、例えば、抗体の活性化を調節できる治療若しくは予防化合物若しくは物質、抗炎症性物質、自己免疫性物質である。自己分泌信号伝達は、信号伝達の１つの形態であり、かかる態様において、細胞が同一細胞に信号伝達する（自己分泌物質と呼ばれる）化学的メッセンジャーを分泌する。
【００２８】
実施形態において、本開示は、生細胞環境において、光学バイオセンサ等のバイオセンサを利用して、特定の細胞内ターゲットに関する抗体の機能を決定する方法を提供する。
【００２９】
実施形態において、本開示は、生細胞環境における特定の細胞内ターゲットに関する抗体の機能を制御する方法を提供する。
【００３０】
実施形態において、開示は、生細胞環境における細胞環境における特定の細胞ターゲットに関する抗体群等の１つ以上の抗体の抗体機能を調節する方法を提供する。
【００３１】
実施形態において、本開示は、細胞環境において、光学バイオセンサ等のバイオセンサを使用して、特定の細胞内ターゲットに対する抗体の機能をマップする方法を提供する。
【００３２】
実施形態において、本開示は、抗体機能をマップする方法を提供し、かかる方法は、例えば、リガンド依存モード、リガンド独立モード、又はその双方のモードにおいて、遂行され得る。
【００３３】
実施形態において、本開示は、細胞表面抗体ターゲット及び細胞内抗体ターゲットのうちの一方又は双方に対して適している。
【００３４】
実施形態において、本開示は、生細胞の抗体機能を特性化する方法を提供し、かかる方法は、生細胞が表面に固定されたバイオセンサを設けるステップと、選択された細胞ターゲットに対する抗体に前記固定された細胞を所定期間だけ接触せしめるステップと、前記抗体に接触せしめられかつ固定されて前記選択された細胞ターゲットを有する細胞を、一組のマーカに接触せしめるステップと、接触せしめるステップは同時又は順次実行され、前記第１マーカ若しくは第２マーカのうちの一方によって誘起された前記細胞ターゲットの細胞信号伝達に及ぼす前記抗体の接触の効果を、バイオセンサを用いて検出するステップと、前記抗体が存在する場合と存在しない場合における前記細胞ターゲットの前記細胞信号伝達に関する前記バイオセンサの出力信号を比較するステップと、を含む。
【００３５】
実施形態において、抗体は、例えば、自己抗体であり得る。身体の免疫システムは、ウイルス、バクテリア、および他の異物に対して身体を保護することを目的として、抗体を通常形成する。これらの異物は抗原と呼ばれる。ループス等の自己免疫異常において、免疫システムは、外来性物質とそれ自身の細胞及び生体組織を区別することができない。そして、免疫システムは、それ自身に対して指向された抗体を作る。
【００３６】
「自己抗体（ａｕｔｏ−ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」（ａｕｔｏは’自己’を意味する）と呼ばれるこれらの抗体は、免疫複合体を形成するべく「自己」抗原と反応する。免疫複合体は、組織内で増え、例えば炎症、生体組織に対する損傷、及び疼痛を生じせしめ得る。
【００３７】
所定期間は、例えば、約数秒から約数分の期間、約数分から約数時間の期間、約数日から約数週間の期間、及びそれらの組み合わせの期間であり、例えば、細胞信号伝達に関する相互作用動態、細胞ターゲット、抗体、細胞の種類及び状態等に依存する。
【００３８】
実施形態において、前記一組のマーカは、例えば、前記細胞ターゲットを直接活性化する少なくとも１つのリガンドを含み得る。
【００３９】
実施形態において、前記一組のマーカは、例えば、活性化、又はその双方によって前記細胞ターゲットに対して間接的に作用する少なくとも１つのリガンドとを含み得る。
【００４０】
実施形態において、前記一組のマーカは、例えば、前記細胞ターゲットに直接結合し且つ前記細胞ターゲットを活性する第１マーカと、細胞調節経路若しくは細胞信号伝達経路を介して前記細胞ターゲットを間接的にトランス活性化せしめる第２マーカとを含み得る。前記マーカは、例えば１つのマーカ、２つのマーカ、又は３つ以上の異なるマーカを含み得る。前記マーカは、例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）、メチル‐β‐シクロデキストリン、前記上皮成長因子受容体をトランス活性するＧタンパク質共役型受容体リガンドのうち少なくとも１つ又はそれらの組合せを含み得る。
【００４１】
実施形態において、前記固定された生細胞を抗体に接触せしめるステップは、例えば、前記細胞表面を前記抗体に接触せしめるステップ、前記細胞の細胞内に前記抗体に接触せしめるステップ、又はそれら組み合わせを含む。
【００４２】
実施形態において、細胞ターゲットは、例えば、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、イオンチャンネル、受容体チロシンキナーゼ、上皮成長因子受容体（ＥＦＧＲ）、サイトカイン受容体、免疫受容体、インテグリン受容体、イオントランスポータ等のうち少なくとも１つ又はそれらの組み合わせ含む細胞の表面の特徴体を含み得る。細胞ターゲットは、例えば、酵素、キナーゼ、ホスファターゼのうち少なくとも１つを含む細胞内ターゲット又はそれらの組み合わせを含み得る。細胞ターゲットは、例えば、モノマー受容体、ダイマー受容体、オリゴマー受容体、又はそれらの組み合わせを含み得る。細胞ターゲットは、例えば、同種の受容体複合体若しくは異種のオリゴマー受容体複合体を含み得る。
【００４３】
実施形態において、バイオセンサは、例えば、インピーダンセンサー、エバネッセント波バイオセンサ、又はそれらの組み合わせを含み得る。
【００４４】
実施形態において、本開示は、バイオセンサ表面に固定され且つ対象となる少なくとも１つの細胞ターゲットを有する生細胞を有するバイオセンサを設けるステップと、前記抗体が前記細胞内に取り入れられて、その後に、対象となる前記細胞ターゲットに作用するように抗体を含むタンパク質トランスフェクション複合体を用いて前記固定された生細を培養するステップと、刺激によって前記固定された生細胞を刺激するステップと、前記刺激に対する前記細胞の応答に関する前記バイオセンサのサインを観測するステップとを含む方法を提供する。タンパク質トランスフェクション複合体は、例えば、リポソーム、タンパク質トランスダクション物質、又はそれらの組み合わせを含む抗体を、例えば含み得る。
【００４５】
実施形態において、本開示は、生細胞における上皮成長因子受容体（ＥＦＧＲ）細胞ターゲットに対する抗体機能を特性化する方法を提供し、かかる方法は、バイオセンサ表面に固定され且つ少なくとも１つのＥＦＧＲターゲットを有する生細胞を有するバイオセンサを設けるステップと、所定期間、前記固定された生細胞を上皮成長因子受容体に対する抗体に接触せしめるステップと、前記抗体に接触せしめられた固定された細胞を、マーカに接触せしめるステップと、前記マーカによって誘起された前記ＥＦＧＲ細胞ターゲットの細胞信号伝達に与える前記抗体の接触の効果を、前記バイオセンサを用いて検出するステップと、前記抗体が存在する場合と存在しない場合における前記ＥＦＧＲ細胞ターゲットの細胞信号伝達に関する前記バイオセンサの測定値を比較するステップと、を含む。
【００４６】
リガンド‐依存モード
実施形態において、本開示は、リガンド依存モードを使用して、受容体に対する抗体の機能的マッピングすることを提供する。受容体は、神経伝達物質、ホルモン、又は他の物質等の特定の分子（リガンド）に結合し且つリガンドに対する細胞応答を生じせしめる例えば細胞膜上に見出されたタンパク質又は細胞内、すなわち、細胞質又は細胞核内において見出されたタンパク質である。リガンドによって誘起された受容体のタンパク質の振る舞いの変化によって、リガンドの生物作用を構成する生理学的変化が生ずる。受容体を有する細胞に対してリガンドを用いて刺激を与えることによって、バイオセンサ出力信号が測定可能となるとき、受容体に対する抗体の機能的活性が、リガンド誘起のバイオセンサ出力信号を調節する能力によって、評価され得る。
【００４７】
実施形態において、リガンドは、望ましくは、例えば、全的作用薬、部分的作用薬、又は逆作用薬であり得る。全的作用薬は受容体を活性することができるし、全的作用薬により、生物学的応答性が最大となる。天然のリガンドのほとんどが全的作用薬である。部分作用物質は受容体を最高に活性化することができないので、完全作用物質に比べて、部分的な生物反応しか得られない。逆作用物質は、その基礎活性を低減させることによって、受容体の活性を抑えることができる。拮抗薬が任意で使用されて、作用物質若しくは逆作用物質の活性又は効果が変更され得る。
【００４８】
実施形態において、リガンド誘起の細胞応答を調節するために、抗体は異なる分子率（すなわち、濃度）のリガンドと混合され、その混合物は細胞を刺激するのに使用され得る。抗体が存在する場合と存在しない場合においてリガンドによって誘起されたバイオセンサの出力信号（すなわち、測定値）の差は、受容体に対する抗体の機能性に関して、１つの指標となる。
【００４９】
実施形態において、抗体は、細胞を前処理するのに使用され得る。そして、抗体で処理された細胞はリガンドを用いて刺激され得る。前処理が実行された場合とされない場合において、細胞内のリガンドによって誘起されたバイオセンサの出力信号（すなわち、測定値）の差は、受容体に対する抗体の機能性に関する１つの指標となる。自己分泌であるか又は自己分泌でない細胞内の受容体の性質に依存して、抗体を用いた細胞の前処理は、短時間とすることもできるし（例えば、１分、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、又は５時間）、又は長時間とすることもできる（すなわち、例えば、１６時間、１日、２日間、５日間にまで延長される）。受容体が自己分泌であるとき、抗体を用いた細胞の前処理は、望ましくは長いかまたは延長される。実施形態において、本開示は、生細胞株における中和等の細胞‐抗体相互作用の効果を観察する方法を提供する。かかる方法は、例えば、リガンド依存モードにおけるＣｏｒｎｉｎｇ登録商標Ｅｐｉｃ登録商標バイオセンサシステムを用いた質量再分布細胞分析技術（ＭＲＣＡＴ：Ｍａｓｓ  Ｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用している。
【００５０】
リガンド‐独立モード
実施形態において、本開示は、リガンド独立モードを使用して、受容体に対する抗体の機能的マッピングすることを提供する。自身のリガンドによって直接活性化されることの代わりに、受容体は、受容体に直接的に結合しない別のリガンド、マーカ、又は分子によってトランス活性化され得るが、例えば、細胞内調整機構又は信号機構を介して、受容体をトランス活性化し得る。多くのトランス活性の例がある。例えば、ＥＧＦＲは、多種のＧＰＣＲリガンドによってトランス活性化され得る。かかる多種のＧＰＣＲリガンドは例えば、エンドセリン−１，トロンビン、ブラジキニン、ボンベシン、カルバコール、アンギオテンシンＩＩ、多種類の細胞内の物質Ｐ若しくはＬＰＡ（オレオイル−Ｌ−α−リゾホスファチジン酸）等である。別の実施例は、コレステロール減少物質、すなわち、メチル−β−シクロデキシトリンによってトランス活性化されたＥＧＦＲである（Y.Fang, Y., et al., ”Cellular functions of cholesterol probed with optical biosensors.”Biochim.Biophys.Acta, 2006, 1763(2), 254-261, and ”Non-invasive optical biosensor for assaying endogenous G protein-coupled receptors in adherent cells,” J. Pharmacol.Toxicol.Methods, 2007, 55, 314-322を参照されたい。）。別のクラスのトランス活性体は、例えば、恐らくは双方の受容体のダイマー化を介して、同じ細胞内の別のＧＰＣＲに結合するリガンドによって活性化され得るＧＰＣＲである。
【００５１】
抗体が存在する場合と存在しない場合においてトランス活性するリガンドによって誘起されたバイオセンサ出力信号を比較することによって、ターゲット受容体に対する抗体の機能性が調べられ得る。
【００５２】
本開示はバイオセンサ、特に、光学バイオセンサに関し、生細胞検出法に対して、共鳴導波グレーティング（ＲＷＧ）バイオセンサと表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）を含む。
【００５３】
実施形態において、本開示は、例えば、生細胞環境において、無標識バイオセンサ及び無操作バイオセンサを使用して、特定の（複数の）ターゲットに対する抗体の機能性を決定する方法を提供する。本方法は、付随して生ずる動的質量再分布（ＤＭＲ）信号に基づいて、抗体が細胞ターゲットに結合する等の抗体結合事象を測定することができる。これらＤＭＲ信号は、ターゲットの活性化を介してさらに調節(mediate)され得る。ターゲットは、その対応するリガンドによって、リガンドに依存して活性化され得るし、又は、リガンドとは独立してトランス活性化され得る。本開示方法は、細胞表面ターゲットに与える抗体の影響に基づいて、抗体の機能的決定に適切である。細胞表面ターゲットは、例えば、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、イオンチャンネル、受容体チロシンキナーゼ、サイトカイン受容体、免疫受容体、インテグリン受容体、イオントランスポータ、及び同様のターゲットである。これら受容体は、細胞表面上に通常見出され、抗体の相互作用に直接利用可能であるからである。また、本開示は細胞内ターゲットに対する抗体の機能的決定を目的とする方法を提供する。抗体は、物理的手法又は移動的手法を使用して、細胞内に搬送され得る。例えば、抗体は、リポソーム又はタンパク質トランスダクション／トランスフェクション物質を用いて再形成され得るので、細胞は抗体を取り込むことができる。かかる取り込みに続いて、抗体は、細胞内のターゲットに結合し、ターゲットと相互作用し得る。細胞内の方法の実施例は、米国特許第7,105,347号を参照されたい。
【００５４】
抗体、結合タンパク質、輸送タンパク質、酵素、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の生物に影響を与える高分子は、細胞のライフサイクルに重要な役割を果たす。治療処理方法における生物に影響を与える高分子の使用は、製薬業界で出現する主要なパラダイムシフトである。例えば、細胞質分裂、成長因子、及びホルモン等の細胞性受容体を活性化する分泌タンパク質と、天然のリガンドによって細胞表面受容体の活性化を防ぐモノクローン性抗体と、を含む治療のための生物製剤又はタンパク質製薬品は、着実に市場が増大し続けている。モノクローン性抗体は、特に、医薬品市場において最も急速な成長を示している。タンパク質の治療法の発見における継続的成功に関して、重要な一面は、工業的研究及び製造に関して高まる需要に合う高処理形態を有する医学関連の分析の開発にある。
【００５５】
抗体は、侵入する微生物の表面上等にある外的分子に応答する免疫システムによって生成されたフレキシブルなタンパク質分子の種類を意味する。何百万もの異なる抗体分子が人間の免疫システムにおいて存在している。しかしながら、個々の抗体は、標的分子の特定の抗原性に関する特異度を示す。外因性の分子に対しでなく内因性の分子に対する抗体形成によって生じる免疫システムの障害は、自己免疫疾患と称されている。かかる抗体は自己抗体と称されている。高血圧症、心発作、不整脈、拡張性心筋症等の多くの心血管系の合併症が自己抗体の存在に関連しており、心臓の膜の受容体に与えるその作用は、これら自己免疫性心臓病の主な原因となり得る。現在、特に、生細胞環境において、これら自己抗体の存在を検出するのに利用可能であり且つ高感度及び高選択度性能を有する自動化された分析手段はない。
【００５６】
所定の細胞のタンパク質ターゲットに対して、各々が特定のエピトープを認識するいくつかの抗体が人工的に生産され得る。エピトープは、免疫システム、特に、抗体、Ｂ−細胞、若しくは細胞傷害性Ｔ細胞によって認識される高分子の一部である。しかしながら、目的とするターゲットの生物学的機能に与える抗体の影響となる生成された抗体の機能は、大部分が未知であり、それほど理解されていない。細胞環境において生物学的に活性な高分子を検出することには、高選択性及び高感度が通常必要とされ、その態様は、例えば、放射性同位元素若しくは蛍光色素を有する対象分子の結合相手に標識を付けることによって、通常、遂行され得る。一般的な分析手段として、一般に大きな労働力を要し且つ手間がかかる処理手段である酵素ベースのＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）がある。分光学的技術及び分光技術によって、はるかに迅速な検知が可能となるものの、感度及び選択度が限定され若しくは不十分である。近年、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）及び共鳴導波グレーティング（ＲＷＧ）を含む光学バイオセンサ技術の注目が高くなりつつある。これは、従来技術に対して感度と選択度の双方に関してはるかに向上していることが要因となっている。
【００５７】
実施形態において、本開示は、生体高分子の存在を検知するバイオセンサを使用し、且つ細胞環境内におけるそれら生物学的な機能を評価する方法を提供する。例えば、インピーダンスベースの電気バイオセンサ、エバネッセント波ベースの光学バイオセンサ、又は、同様のバイオセンサを含むバイオセンサは、無標識で且つ無操作の形態において、細胞活性を検出することができる。さらに、生体高分子を検出するのにバイオセンサを利用すると、ターゲット分子の機能をリアルタイムに読み出しすることができ、同時に、ターゲット分子について明確的な機能評価と有効濃度の正確な測定が可能となる。この手法を使用して、高選択度及び高感度を有する検出が遂行され得る。特定されない結合からの寄与が重要ではなくなるからである。不特定の結合はアフィニティー分析において歴史的に問題となっていた。本開示は、例えば、生物薬剤学的なスクリーニング、医用診断、及び同様のアプリケーションに対して、優れた基盤を提供する。
【００５８】
バイオセンサ技術
バイオセンサは、分子認識イベントを定量可能な信号に変換する特定のトランスデューサを含む。トランスデューサの特性に基づいて、バイオセンサは、熱量測定トランスデューサ、音響トランスデューサ、電気化学トランスデューサ、磁気トランスデューサ、光学バイオセンサ、又は同様のセンサ等のバイオセンサに分類され得る。バイオセンサは、無標識手段によって分子の認識又は分子の相互作用を調べる際に、広く使用できることが分かっている。通常、生体試料（例えば、リガンド、機能性タンパク質、又は抗体）は、バイオセンサの表面によって接触せしめられ、生物学的な層を形成する。ターゲット検体と生体試料の層との間の相互作用によって、トランスデューサの物理特性における変化が生成される。かかる変化は、トランスデューサによって検出されて、サンプルの標的分子の結合を直接的に定量化するのに使用され得る。いくつかのタイプのバイオセンサ技術、主としてインピーダンスベースの電気バイオセンサ、及びエバネッセント波ベースの光学バイオセンサは、最近、生理学的な条件化下で、ある細胞の活性を調べるのに使用されてきた。
【００５９】
インピーダンスベースの細胞分析
電気インピーダンスバイオセンサは、刺激に応答して生ずる細胞層のインピーダンス（デルタＺまたはｄＺ）変化を測定する。細胞は電極を含む基板にシードされる。システムは、例えば、２４の異なった測定周波数において、２秒毎に小電圧をこれら電極に印加する。低周波数において、これら電圧により、層内に存在する個々の細胞周囲に流れる細胞外電流が誘起される。高周波数において、電圧により、細胞膜に侵入する細胞内電流が誘起される。各サンプルに対して測定された電流に対する印加電圧の比が、オームの法則により説明されるように、インピーダンス（Ｚ）となる。細胞が受容体リガンド等の刺激にさらされるとき、例えば、細胞の密着性、細胞の形態、及び体積、細胞間相互作用における変化、及び同様な変化を生じせしめるアクチン細胞骨格の調節等の複雑な細胞事象につながる信号変換事象が、活性化される。これら細胞の変化は、細胞外電流及び細胞内電流の流れに対して個別的又は集団的に影響を与え、これにより、測定されたインピーダンスの強度及び特性に作用する。
【００６０】
エバネセント波ベースの細胞分析
過去数１０年の間、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、共鳴導波グレーティング（ＲＷＧ）、及び共鳴ミラーを含むさまざまな光学バイオセンサが開発されてきた。フォニック結晶バイオセンサはＲＷＧタイプのバイオセンサである。それらの内、ＳＰＲ及びＲＷＧは最も一般的なものである。双方の技術は、エバネセント波を利用して、センサ表面における生物学的な層又はセンサ表面近傍における生物学的な層の分子相互作用又は変質を特性化する。エバネセント波は、溶液‐表面界面における光の全反射によって形成された電磁場であり、その電磁場は短い距離、例えば、バイオセンサの表面から溶液までの約数百ナノメートルまで、侵入深さ若しくは検出ボリュームと称される特性距離をともなって、延在する。
【００６１】
ＳＰＲは、電気伝導性を有する金属膜（例えば、金）を有する平面ガラス基板に偏光のウェッジを指向させて、表面プラズモンを励起するプリズムに依存している。得られたエバネセント波は、金の層内の自由電子雲と相互作用し、且つかかる自由電子雲によって吸収され、電子電荷密度波（すなわち、表面プラズモン）を生成し且つ反射光の強度の低減を生じせしめる。この強度が最小となる共鳴角度は、センサ表面の反対表面上の金層近傍にある溶液の屈折率の関数となる。対照的に、ＲＷＧバイオセンサは、回折格子を用いて、導波部に対する光の共鳴結合を利用している。種々の入射波長を有する偏光が、導波部を照明するのに直接使用される。特定波長の光は導光路内に結合され、導波導光路に沿って伝播する。最大結合率が得られる共鳴角度は、バイオセンサ表面における又はセンサ表面の近傍における局所的な屈折率の関数となる。
【００６２】
細胞ベースの分析において、孤立した受容体よりむしろ生細胞は、接触せしめられ若しくは移動せしめられて、通常、培養を介して、バイオセンサの表面と相互作用する。細胞の付着は、局所性接触、近接性接触、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）接触の３つのタイプの接触を介して調整され得る。各接触は、表面からの独自の離間距離を有する。細胞内の生体高分子の大部分はフィラメントネットワークのマトリックスによって良好に組織化され、且つ、それら位置は非常に規則的であるので、細胞は、例えば、特定且つ有効なタンパク質相互作用を生じせしめ、タンパク質の活性化機構及び非活性化機構を空間的に分離し、特定の細胞機能及び反応を決定することができることが知られている。刺激の際、細胞のタンパク質が大きく再配置されて、動的、方向的、指向的質量再分布が生じ、その質量再分布は、集合的に、動的質量再分布（ＤＭＲ：ｄｙｎａｍｉｃ  ｍａｓｓ  ｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）と称されている。ＤＭＲは、検出ボリューム内で生ずる際に光学バイオセンサによって検出され得る。得られたＤＭＲは生細胞に固有の生理学的信号であり得る。その信号は、受容体の活性を観測し、受容体のシステム細胞生物学を研究し、薬物候補に関するシステム細胞薬理学を調べ、同様のアプリケーションに対して、有益であり得る。本開示のバイオセンサベースの細胞分析方法は、ＧＰＣＲ、受容体チロシンキナーゼ、イオンチャンネル、キナーゼ、ターゲット等を含む広範囲の細胞及び細胞ターゲットに適用可能である。
【００６３】
細胞表面タンパク質に対する抗体の機能的マッピング
実施形態において、本開示は、細胞環境において、バイオセンサを使用して、特定の細胞表面ターゲットに対する抗体を機能的にマップする方法を提供する。実施形態において、抗体の機能的マッピングは、バイオセンサのサインに与える抗体の作用に対して、遂行され且つ断定され得る。その作用は細胞ターゲットの活性化を介して調節され得る。ターゲットは、そのリガンドによって直接活性化され、または、特定のターゲットのタンパク質又は上流経路を活性化する刺激を介して、トランス活性化される。実施形態において、選択されたバイオセンサは、表面プラズモン共鳴若しくは共鳴導波グレーティングバイオセンサ等の電気インピーダンスベースのバイオセンサ又はエバネッセント波ベースのバイオセンサであり得る。例えば、細胞を、所望の好ましい密集度になるまで培養することによって、センサの表面上に付着され又は固定される。密集度は、例えば、細胞の種類、時間、温度、養分レベル、基板等の培養条件、同様の事項に依存し得る。
【００６４】
実施形態において、本開示された方法の能力は、Ａ４３１細胞（すなわち、人間の上皮性癌細胞株）の人間の上皮成長因子（ＥＧＦＲ：Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）受容体のモノクローン性抗体について存在を検出し且つその機能を評価することによって、例証された。Ａ４３１細胞は、密集するまで、９６ウェル又は３８４ウェルのＥｐｉｃ登録標章プレート内で培養された。そして、細胞は、一夜、無血清培地において培養され、ＨＢＳＳ（２０ｍＭのＨＥＰＥＳを有するＨａｎｋｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）緩衝液を用いて洗浄された。そして、得られたＡ４３１細胞は、分析の前に、３時間選択された温度において、様々な濃度の抗ＥＧＦＲ抗体を用いて培養された。そして、ＥＧＦＲは、ＥＧＦ又はメチル−β−シクロデキストリンを用いて活性化され、得られたＤＭＲ信号が記録された。
【００６５】
抗ＥＧＦＲ（クローンＲ１）は、ＥＧＦＲの細胞外領域ＩＩを認識することが以前報告され、ＥＧＦＲに結合するＥＧＦに対する効果は全くない（Ｈ．Ｃ．  Ｇｏｏｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｓｃｉ．Ｒｅｐｏｒｔｓ，  １９８５，  ５，  ８３−９４）。その結果、この抗体は、異なる濃度（図１Ｃ、表１）を用いたＥＧＦ誘起の細胞応答に対する検出において、抑制とはならなかった。クローン２Ｅ９やクローン２９．１等の他のモノクローン性抗ＥＧＦＲの抑制機能は、本開示のＥｐｉｃ登録商標細胞ベースの分析を使用しても評価された。実施例１の表１及び図１に示されているように、観測された結果は、代替の分析手段によって決定された文献の結果と一致した。
【００６６】
図面を参照すると、図１Ａは、抗ＥＧＦＲ（２９．１）に対して３２ｎＭのＥＧＦによって誘起された静的Ａ４３１細胞のリアルタイム動的応答性を示している。抗体は、Ａ４３１細胞を前処理するのに使用され、図示された動的特徴は、それぞれＥＧＦを用いた刺激の前に及び刺激の後に対するものである。抗ＥＧＦＲ（２９．１）の濃度は、２００ｎＭ、１０５であり、０ｎＭ、１００における制御と比較された。抗ＥＧＦＲ（２９．１）は、３２ｎＭのＥＧＦによって誘起された静的Ａ４３１細胞の細胞応答に対してほとんど若しくは全く作用せず、又はかかる細胞応答に対して全く抑制することはない。
【００６７】
図１Ｂは、抗ＥＧＦＲ（２Ｅ９）に対して３２ｎＭのＥＧＦによって誘起された静的Ａ４３１細胞のリアルタイム動的応答性を示している。抗体は、Ａ４３１細胞を前処理するのに使用され、図示された動的な特徴は、それぞれＥＧＦを用いた刺激の前に及び刺激の後に対するものである。抗ＥＧＦＲ（２Ｅ９）の濃度は、１３３ｎＭ、１１５であり、０ｎＭ、１１０における制御と比較された。抗ＥＧＦＲ（２Ｅ９）は、３２ｎＭのＥＧＦによって誘起された静的Ａ４３１細胞の細胞応答を減衰せしめる。図１Ａと図１Ｂの双方が、Ｃｏｒｎｉｎｇ登録商標Ｅｐｉｃ商標波長送受観測（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ）システムを使用して、取得された。公表されている単位は、ピコメートルの波長シフトである。１００ｐｍは、図１Ｃ乃至図１Ｆに示されているように、Ｃｏｒｎｉｎｇ登録商標Ｅｐｉｃ商標角度送受観測（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ）システムを使用して測定された約１ユニットに等しい。
【００６８】
図１Ｃは、抗ＥＧＦＲ（Ｒ１）に対して３２ｎＭによって誘起された静的Ａ４３１細胞のリアルタイム動的応答性を示している。抗体は、Ａ４３１細胞を前処理するのに使用され、図示された動的特徴は、それぞれＥＧＦを用いた刺激の前に及び刺激の後に対するものである。抗ＥＧＦＲ（Ｒ１）の濃度は、２６７ｎＭ、１２５であり、０ｎＭ、１２０における制御と比較された。抗ＥＧＦＲ（Ｒ１）は、３２ｎＭのＥＧＦによって誘起された静的Ａ４３１細胞の細胞応答をほとんど若しくは全く抑制することはない。
【００６９】
図１Ｄは、抗ＥＧＦＲ（５２８）に対して３２ｎＭのＥＧＦによって誘起された静的Ａ４３１細胞のリアルタイム動的応答性を示している。抗体は、Ａ４３１細胞を前処理するのに使用され、図示された動的な特徴は、それぞれＥＧＦを用いた刺激の前に及び刺激の後に対するものである。広範囲の濃度領域が、図２Ａ及び２Ｂに与えられており図示されている。抗ＥＧＦＲ（５２８）の濃度は、３６．２ｎＭ、１３５であり、０ｎＭ、１３０における制御と比較された。抗ＥＧＦＲ（５２８）は、３２ｎＭのＥＧＦによって誘起された静的Ａ４３１細胞の細胞応答に対して抑制効果を与える。
【００７０】
図１Ｅは、抗ＥＧＦＲ（クローンＣ１１）に対して３２ｎＭのＥＧＦによって誘起された静的Ａ４３１細胞のリアルタイム動的応答性を示している。抗ＥＧＦＲ（クローンＣ１１）の濃度は、４０ｎＭ、１４５であり、０ｎＭ、１４０における制御と比較された。抗ＥＧＦＲ（クローンＣ１１）は、３２ｎＭのＥＧＦによって誘起された静的Ａ４３１細胞の細胞応答に対して阻害効果を与えた。抗体は、Ａ４３１細胞を前処理するのに使用され、図示された動的な特徴は、それぞれＥＧＦを用いた刺激の前に及び刺激の後に対するものである。
【００７１】
図１Ｆは、抗Ｈｅｒ２（クローン９Ｇ６）に対して３２ｎＭのＥＧＦによって誘起された静的Ａ４３１細胞のリアルタイム動的応答性を示している。抗Ｈｅｒ２（クローン９Ｇ６）の濃度は、２６７ｎＭ、１５５であり、０ｎＭ、１５０における制御と比較された。抗Ｈｅｒ２（９Ｇ６）は、３２ｎＭのＥＧＦによって誘起された静的Ａ４３１細胞の細胞応答をほとんど若しくは全く阻害しなかった。抗体は、Ａ４３１細胞を前処理するのに使用され、図示された動的な特徴は、それぞれＥＧＦを用いた刺激の前に及び刺激の後に対するものである。
【００７２】
ＥＧＦＲは核拡散、運動性、及び分化を含む多くの細胞プロセスを調整する。ＥＧＦＲに対して指向された単クローン抗体は、ＥＧＦがＥＧＦＲに結合するのを妨げ又はＥＧＦＲが開くのを妨げて、ＥＧＦＲの活性形態の形成を阻止することによって、リガンド（ＥＧＦ）誘起された受容体の活性化と下流の信号伝達を調節し得る。抗ＥＧＦＲ（クローン５２８）は、ＥＧＦＲの細胞外ドメインＩＩＩに結合し、ＥＧＦがＥＧＦＲ上のその結合部位に侵入することを阻止することが示されている。その結果、この単クローン抗体はＥＧＦ誘起の細胞応答を抑制し得る。本開示の実施形態において、かかる抑制が、抗ＥＧＦＲ（５２８）の濃度増大とともに、Ｎ−ＤＭＲ（図２Ａ）のレベルが減少する振る舞いによって図示されているように、検知されている。Ｋｄ値が、報告された値（推定、Ｋｄ０．６〜３ｎＭ）と一致する抑制カーブ（図２Ｂ）からサブナノモル濃度（ｎＭ）レベルで見積もられた。このタイプの抗ＥＧＦＲの強い抑制作用によって、Ｅｐｉｃ登録商標細胞ベースの分析技術をもちいて、０．１ｎＭ程度のサブナノモル濃度レベルにおいて、かかる抗体の存在の検出が可能となる。
【００７３】
図２Ａは、３２ｎＭのＥＧＦによって誘起された静的Ａ４３１細胞の例示的な投与量依存リアルタイム動的応答性を示しており、細胞は異なる投与量の抗ＥＧＦＲ（５２８）を用いて前処理された。
【００７４】
図２Ｂは、本開示の実施形態における抗ＥＧＦＲ（５２８）の濃度の関数としてプロットされたＮ−ＤＭＲｓについての規格化された振幅を示している。
【００７５】
図２Ａにおいて、以下に示す参照番号は単クローン性抗体ＥＧＦＲ（クローン５２８）の濃度を示している。０．５７ｎＭ、２００、１．１３ｎＭ、２０５、２．２７ｎＭ、２１０、４．５３ｎＭ、２１５、及び、９．０６ｎＭ、２２０。ＥＧＦ誘起のＤＭＲ信号を参照すると、参照番号２２５は観測されたＰ−ＤＭＲ事象及びその振幅を示し、参照番号２３０は観測されたＮ−ＤＭＲ事象及びその振幅を示し、参照番号２３５は観測された回復期のＰ−ＤＭＲ事象及びその振幅を示している。抗ＥＧＦＲ（５２８）は、３２ｎＭのＥＧＦによって誘起された静的Ａ４３１細胞の細胞応答を阻害する。
【００７６】
図３Ａ及び３Ｂは、様々な濃度の単クローン性抗ＥＧＦＲ（クローンＣ１１）に対する５ｍＭのメチル−β−シクロデキストリンによって誘起された静的Ａ４３１細胞の投与量依存リアルタイム動的応答性を示している。図３Ｂは、抗ＥＧＦＲ（Ｃ１１）の濃度の関数としてＰ−ＤＭＲｓの規格化された振幅を示している。以下の付随の参照番号は単クローン抗体ＥＧＦＲ（Ｃ１１）の濃度を示している。１２０ｎＭ、３２０、８０ｎＭ、３１５、４０ｎＭ、３１０、２０ｎＭ、３０５、抑制０ｎＭ、３００。抗ＥＧＦＲ（Ｃ１１）は、５ｍＭのメチルβシクロデキストリンによって誘起された静的Ａ４３１細胞の細胞応答性を抑制するようである。
【００７７】
図４Ａは、様々な濃度の単クローン性抗ＥＧＦＲ（クローン９Ｇ６）に対する５ｍＭのメチル−β−シクロデキストリンによって誘起された静的Ａ４３１細胞の投与量依存リアルタイム動的応答性を示している。図４Ｂは、対応する抗Ｈｅｒ２（９Ｇ６）の濃度の関数としてＰ−ＤＭＲｓの規格化された振幅を示している。以下の付随の参照番号は単クローン性抗Ｈｅｒ２（９Ｇ６）の濃度を示している。４０ｎＭ、４０５、８０ｎＭ、４１０、１２０ｎＭ、４１５、１６０ｎＭ、４２０、抑制０ｎＭ、４００。抗Ｈｅｒ２（９Ｇ６）は、禁止するのではなく、メチル−β−シクロデキストリンによって誘起された静的Ａ４３１細胞の細胞応答を抑制するのではなく、むしろ刺激するようである。
【００７８】
図５は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ：Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）５００の概略図であり、主要なドメインと、抗体相互作用に関する潜在的細胞表面及び細胞外ポイントを示している。細胞膜５０５によって設けられた膜貫通型受容体チロシンキナーゼ膜貫通型ＥＧＦＲ５００は、潜在的な相互作用サイトを有するドメインを提供する。そのドメインは、システインリッチな細胞外のドメイン５１０（リガンド結合部位）、膜貫通ドメイン５１５，キナーゼドメイン５２０，内面化ドメイン５２５，及び（自己リン酸化したチロシン残留物を含む）細胞質内ドメイン５３０を含む。
【００７９】
図６は上皮成長因子受容体等のターゲット受容体６１０（ＥＧＦＲ）を有する例示的な抗体の相互作用と結果の概略図である。実施形態において、膜貫通型受容体６１０（例えば、ＥＧＦＲ）等の受容体を有する細胞膜５０５は、抗体６３０に結合し得る。かかる結合事象によって、結合のみがもたらされ得る。
【００８０】
対照的に、異なる受容体エピトープにおいて受容体６１０に結合する異なる抗体６５０によって、例えば、細胞内経路の抑制若しくはブロッキング６５５，活性化６６０という結果が得られ得る。あるいは若しくはさらに、抗体６６５は間接的に受容体と相互作用し得る。かかる相互作用は、例えば、上皮成長因子受容体をトランス活性化するＧタンパク質共役型受容体リガンド等のリモートトランス活性マーカ（図示せず）によって、細胞内経路の抑制６５５又は刺激６６０を順番に同様に生成する間接的な信号又はメッセージ６６６を生成することによって、生ずる。経路の抑制又は刺激等のかかる抗体の改質効果は、本開示の方法を用いて、実施形態において検出され且つ測定され得る。また、抗ＥＧＦＲはリガンドと独立した活性化に影響を及ぼし得る。本開示の実施形態において、メチル‐β‐シクロデキストリンは、自然のリガンドＥＧＦが存在しない際にＥＧＦＲをトランス活性化するのに使用された。
【００８１】
メチル‐β‐シクロデキストリンは細胞膜からコレステロールを抽出し、脂質ラフトを分離せしめ、膜内のＥＧＦＲの再配列を生じせしめて、大なる受容体クラスタを形成することが信じられている。その結果、かかるクラスタ化はＥＧＦＲの活性化及びその川下の信号伝達を誘発せしめる。したがって、ＥＧＦＲに関してリガンドと独立した活性化若しくはトランス活性化によって、ＥＧＦが存在しない場合において、ＥＧＦＲのオリゴマ化のモジュレータとしての抗ＥＧＦＲの機能的役割を評価する方法が提供される。抗ＥＧＦＲ（クローンＣ１１）は、ＥＧＦＲの細胞外ドメインＩＶの部分的なペプチド配列から得られる。この分野の就業者は、ドメインＩＶがＥＧＦＲの別の分子とのドメイン‐ドメイン相互作用を介して、ＥＧＦＲのダイマー化に関連し得ると推測している（例えば、Jorissen R.N., et al., ”Epidermal growth factor receptor: mechanisms of activation and signaling,” Experimental Cell Research, 2003; 284, 31-53.を参照されたい）。
【００８２】
ＥＧＦＲへの抗ＥＧＦＲ（Ｃ１１）の結合によって、別のＥＧＦＲに対するそのドメインＩＶのアクセスを、後に阻止して、ダイマー化する恐れが阻止され、その後のＥＧＦＲ活性化が抑制されることが想像できる。細胞応答に対するかかる効果は、抗ＥＧＦＲ（Ｃ１１）の濃度の関数としてＰ−ＤＭＲｓの振幅に与える予期された抑制効果として、Ｅｐｉｃ登録商標細胞ベースの分析（図３）を使用して検出された。同様に、トランス活性化された細胞応答（図４）に与える抗Ｈｅｒ２（クローン９Ｇ６）の刺激的効果は、抗Ｈｅｒ２（９Ｇ６）がＥＧＦＲのダイマー化を容易にせしめ得ることを提案している。Ｈｅｒ２はＥＧＦＲ（Ｈｅｒ１）の別の形態であり、それはＥＧＦＲを有する異種ダイマーを形成する傾向がある。したがって、抗Ｈｅｒ２は、オリゴマの形態のＥＧＦＲを認識し且つ安定させて、その結果、ＥＧＦＲの活性化を促進し得る。抗ＥＧＦＲ（Ｃ１１）と抗Ｈｅｒ２（９Ｇ６）の双方の正確な細胞機能はこれまで知られていなかった。
【００８３】
Ｅｐｉｃ登録商標細胞ベースの分析装置と方法は、他の抗ＥＧＦＲ機能を検出し且つ調べることができる。その他の抗ＥＧＦＲ機能とは、例えば、特定のりん酸化反応パターンを直接誘因し、特定の細胞信号伝達経路に通し、または、他のクラスの受容体（例えば、ＧＰＣＲｓ）でＥＧＦＲの相互作用とそのシグナリングカスケードを介在せしめる機能である。
【００８４】
細胞内ターゲットに対する抗体の機能的マッピング
実施形態において、本開示は、生細胞環境でバイオセンサを使用して、特定の細胞内ターゲットに対する抗体の機能をマップする方法を提供する。実施形態において、抗体の機能的マッピングは、ターゲットの活性化を介して、バイオセンサのサインに及ぼす抗体の影響に基づいて、例証され得る。ターゲットは、例えば、直接リガンドのうちいずれによっても活性化され、または、特定のターゲットのタンパク質又は上流経路を活性化する刺激を介して、トランス活性化される。例えば、バイオセンサは、表面プラズモン共鳴若しくは共鳴導波グレーティングバイオセンサ等の電気インピーダンスベースのバイオセンサ又はエバネッセント波ベースのバイオセンサであり得る。細胞は、主として培養を介して、センサの表面に付着する。細胞内への抗体の取り込みは達成され得る。これは、例えば、従来のタンパク質発送方法を使用するか、または逆の蛋白質送達を使用することによって遂行される。例えば米国特許番号７，１０５，３４７を参照されたい。
質量再分布細胞分析技術（ＭＲＣＡＴ：Ｍａｓｓ  Ｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）
【００８５】
共有の同時係属中の２００６年１２月１０日に発行された”Ｌａｂｅｌ−Ｆｒｅｅ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｓ，”  Ｙ．  Ｆａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１３５３９  （公開番号ＷＯ２００６／１０８１８３）において、質量再分布細胞分析技術（ＭＲＣＡＴ：Ｍａｓｓ  Ｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）非観血的であり無操作の細胞分析方法が、開示されている。ＭＲＣＡＴは、光学的バイオセンサ、特に共鳴導波グレーティング（ＲＷＧ：ｒｅｓｏｎａｎｔ  ｗａｖｅｇｕｉｄｅ  ｇｒａｔｉｎｇ）バイオセンサを使用して、付着細胞の最低部分内におけるリガンド誘起の動的質量再分布が観測される。細胞ターゲット若しくは分子集合に関してリガンドによって誘起された動的、指向的、指向性の再分布から生じた取得されたＤＭＲ信号は、積分された細胞応答を表している。ＭＲＣＡＴによって、信号伝達又はそのネットワーク相互作用等の細胞活性の研究が可能となり、また、内因性の受容体または言い表され過ぎる受容体に対して設計された細胞または細胞ラインでリガンド候補化合物の高スループットスクリーニングを可能にすることができる。
【００８６】
光学的バイオセンサは典型的な短エバネセント波を利用して、細胞の活性化及び信号伝達を調べるので、細胞は、一般に、バイオセンサの表面と接触するように移動されるべきである。これは、いくつかの方法によって達成され得る。付着性細胞に対して、細胞はバイオセンサの表面上で直接培養され得る。弱い付着性細胞に対して、細胞はバイオセンサの表面上で直接培養され得る。そのバイオセンサの表面は細胞の固定を支持する材料（例えば、フィブロネクチン、ラミン、コラーゲン、ゼラチン等の細胞外マトリクス材料、又は、ポリリジン等のポリマ性材料。）から成る。懸濁細胞に対して、細胞は、一般に、（細胞表層蛋白質と対話して、その結果表面に細胞を連結するアミン反応性高分子、または特に細胞表層蛋白質と対話して、その結果センサの表面に細胞を据えつける抗体等の）反応性部分からなるバイオセンサの表面と接触するように移動せしめられ得る。
【００８７】
ＭＲＣＡＴは、バイオセンサの表面との細胞の相互作用又は接触から開始する。通常、細胞はＲＷＧバイオセンサの表面で直接培養される。外因性信号は、動的質量再分布（ＤＭＲ）と同等な細胞内容の動的再分布を生じせしめる多くの例において、特定の細胞の情報伝達の活性化を調節し得る。信号伝達が検出ボリューム（すなわち、エバネセント波の侵入深さ）内で生ずる場合、ＤＭＲはリアルタイムで、ＲＷＧバイオセンサによって検出且つ観測され得る。複数のパラメータ測定の性能が原因で、バイオセンサは細胞検出に対して情報が豊富な内容を提供し得る。これらパラメータは、例えば、共鳴ピークの角度シフト（最も一般的な出力）、強度、半値幅（ＰＷＨＭ）、面積、及びピーク形状を含む。センサ全体を横切る位置敏感な応答性は、細胞状態の均一性に関する付加的な有益情報を提供し得る。その細胞状態の均一性とは、例えば、密度、結合度、及びセンサ全体を横切る異なる位置に位置する細胞に対する細胞の応答性に関する均一性である。
【００８８】
ＤＭＲ信号によって、生体細胞の新規な生理反応に関する貴重な情報がもたらされる。細胞層に侵入するエバネッセント波のテールは指数関数的に減衰するので、ターゲット又は複合体がセンサの表面から遠い場所にあるときに比べて、ターゲット又は複合体がセンサの表面近傍にあるときには、特定の質量を有するターゲット又は複合体は、応答全体に寄与する。その上、センサの表面に向かうターゲット又は複合体の再配置によって、信号が増大するものの、センサの表面から離れるターゲット又は複合体の再配置によって、信号が低減する。特定のターゲットを介して伝えられたＤＭＲ信号は、固着度等の細胞の状態、並びに増殖及び静的状態等の細胞の状態に依存することがわかった。
【００８９】
ＲＷＧやＳＰＲ等の一般的に利用可能な光学バイオセンサにおいては、検出ボリュームが小さいので、バイオセンサベースの細胞分析は、センサの表面を有する細胞の近接性に依存する。さらに、細胞の固着、細胞の生長、又はその双方が、現細胞ベースのバイオセンサ及びその分析方法の成功において特筆すべき要因となり得る。実施形態において、本開示の修飾されたバイオセンサ表面は、種々の細胞株の付着及び成長に対して生物適合性があり、種々の細胞株の付着及び成長をサポートする。実施形態において、バイオセンサ表面に付着する細胞は、洗浄液や試薬調剤などの操作に対して耐性を有し得る。バイオセンサ表面に細胞を付着せしめる方法が、例えば、２００７年２月２８日に出願した同時係属中の仮出願USSN 60/904,129（"Surfaces and Methods for Biosensor Cellular Assays,"というタイトル、Fang, Y., et al.）に開示されている。
【００９０】
共鳴波長方法を採用する市販装置の例としては、例えば、温度制御環境、及び任意の液体処理システムを有するＲＷＧ検出器を含むＣｏｒｎｉｎｇ登録商標Ｅｐｉｃ商標システム（ｗｗｗ．ｃｏｒｎｉｎｇ．ｃｏｍ／ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）がある。
【００９１】
光学バイオセンサ測定
角度型送受観測システムにおいて、種々の入射角度を有する偏光が、導波管を照明するのに直接使用される。特定の角度における光は導波路内で結合され、導波路に沿って伝播する。最大結合率が得られる共鳴角度は、センサ表面における又はセンサ表面の近傍における局所的な屈折率の関数で表される。サンプル内のターゲット分子が生細胞システム内の細胞ターゲットに結合し細胞システムの層の又は生物学的システムの底部内において細胞の応答を誘発するとき、共鳴角度がシフトする。
【００９２】
垂直偏波又はｐ偏光ＴＭ０モードを有するコーニング社登録商標Ｅｐｉｃ登録商標の角度型送受観測システムが使用され得る。例えば、米国特許公開番号第２００４−０２６３８４１号、２００５−０２３６５５４、２００４年１２月２１日に出願された米国出願番号１１／０１９，４３９に係るシステムが使用された。培養後、細胞は、１×ＨＢＳＳ（１×ｒｅｇｕｌａｒ  Ｈａｎｋｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、２０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ  ７．０）を用いて２回洗浄され且つ維持された。その後、細胞を含むセンサーマイクロプレートは、光学システム内に載置され、細胞の応答が溶液を添加する前後において記録された。すべての研究が、温度変動と気化冷却の効果を最小化するべく、溶液が注入されたときに、短期間（約数秒）以外、室温でマイクロプレート“上”（数秒）のリッドで実行された。
【００９３】
本開示の細胞ベースの分析において、生細胞は、例えば培養を介して、バイオセンサの最適表面に接触され得る。細胞の付着は、例えば、局所性接触、近接性接触、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）接触の３つのタイプの接触を介して調節され得る。各接触のタイプは、表面から独自の離間距離を有する。その結果、細胞原形質膜は、基板面から約１０〜約１００ｎｍ離間されているので、比較的短い侵入深さを有する光学バイオセンサはバイオセンサ表面に近接した細胞の底部分を検知することができる。多くの刺激誘起の細胞反応に共通の現象として、ある細胞の内容物の動的移動又は再配置があり、そのいくつかかが、バイオセンサ表面に近接した細胞の底部分において生じ得る。細胞の内容物の動的移動又は再配置は、例えば、固着度の変化、細胞膜のラッフリング、表面における又は細胞の表面の近傍において活性化された受容体に対する細胞内タンパク質の補充、受容体エンドサイトーシス、及び同様の現象を含む。検出ボリューム内にある細胞の内容物の変化により、バイオセンサからの光学信号としてそれ自身を明示するセンサの表面の近くの局所的屈折率が変動する。
【００９４】
使用されたバイオセンサの構成と細胞の特性の特異性に基づいて、Ｃｏｒｎｉｎｇ登録商標Ｅｐｉｃ商標ＲＷＧバイオセンサマイクロプレートにおけるＴＭ０モードの侵入深さは、例えば、約１５０ｎｍである。かかる比較的短い侵入深さ又は検出ボリュームは、従来のＳＰＲ及びＲＷＧ（例えば、フォニック結晶バイオセンサ）を含むほとんどのタイプの無標識光学バイオセンサ技術において一般的であるので、本開示は他の光学バイオセンサベースの細胞検出に適切である。
【００９５】
理論分析は、波長若しくは角度シフトに関して検出された信号は、主として垂直の質量再分布に対して敏感であることを示している。その動的特性の故に、それは、動的質量再分布（ＤＭＲ：ｄｙｎａｍｉｃ  ｍａｓｓ  ｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）信号と呼ばれている。ＤＭＲ信号とは別に、バイオセンサは細胞内容物の水平方向における（すなわち、センサの表面に平行な）再分布を検出可能である。ジグザグ理論に基づく理論分析によれば、共鳴ピークのすべての形状変化は、主にセンサの表面に平行な細胞の内容物について、リガンドによって誘起された非均一の再分布に帰属する（Fang, Y., et al., ”Resonant Waveguide Grating Biosensor for Live Cell Sensing,” Biophys.J., 91, 1925-1940 (2006)を参照されたい）。さらに、ＤＭＲ信号は検出ボリューム内のすべての再分布事象の和である。これによれば、本開示のバイオセンサ方法を用いた全生細胞の検出は、固定された受容体に結合する分析物の量を直接測定する従来の親和性ベースの分析とは異なっている。
【００９６】
実施例
以下の実施例は、上述した開示を使用する手法をより完全に説明し、かつ本開示の種々の態様を実施するよう意図された最良の態様を説明することに用いている。これら実施例は、本開示の真の範囲を何等限定するものではなく、むしろ例示の目的で与えられるものと理解すべきである。
【００９７】
実施例１
角度型送受観測共鳴導波グレーティングバイオセンサを用いた抗ＥＧＦＲ抗体の機能的分析
上皮成長因子（ＥＧＦ：Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）受容体は、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ：ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ）群に属し、哺乳動物のほとんどすべての臓器において事実上表される。ＥＧＦ受容体は細胞成長と分化、および腫瘍の進行において複雑な役割を果たしている。ＥＧＦＲは他の信号伝達システムの重要な下流要素であり、ミトーゲン性Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲｓ）等の他の受容体とクロストークする。同族のリガンドによるＥＧＦＲの咬合は多くの細胞内信号を生成せしめる。ＥＧＦの結合は、受容体のダイマー化と、その後の細胞質ドメインのチロシン残基上の受容体の自動りん酸化と、を調節する。そして、信号伝達タンパク質の多くが、りん酸チロシンの特異的認識モチーフを介して活性化された受容体に補充される。受容体を有する信号伝達分子のこのモジュールの関連性は、一連の下流信号を活性化し且つ誘起せしめるこれらの信号伝達分子の活性化をもたらす。遺伝子発現と結局細胞の増殖を促進する１つの特定の経路は、シグナルタンパク質Ｓｈｃ、Ｇｒｂ２、Ｓｏｓ、Ras、Raf、ＭＥＫ、ＥＲＫ、及びERK／ＭＡＰＫを伴い、Ras／ＭＡＰＫ経路として知られている。
【００９８】
抗体は、体液で見つけられて、免疫システムによって使用される、例えば、バクテリアとウイルスによって提示されるように外国産の分子の侵襲を中和するタンパク質の種類である。個々の抗体は、標的分子の特定の抗原を認識し且つその抗原に結合する特異度を示す。さまざまな抗ＥＧＦ受容体単クローン抗体が、ＥＧＦ受容体（細胞外領域または細胞質内ドメインのどちらか）の選択された領域に対してハイブリドーマを上げることによって、開発された。これらのいくつかの抗体が、ＥＧＦＲへのリガンドの結合に与える作用を有することが知られており、他のものはＥＧＦＲエンドサイトーシス、トラフィッキング、およびデグラデーションに影響を与えるそれら能力によって認識される。抗ＥＧＦＲ抗体の機能性の評価のための利用可能な方法は、例えば、蛍光若しくはアイソトープ標識スキームを伴う例えば、長期の生化学的研究を含む。実施形態において、本開示は、バイオセンサベースの細胞分析技術、特に、ＭＲＣＡＴを使用することで抗体の機能を評価して、直接携帯電話環境における、抗体の生物学的機能を評価するために無標識、フォーマットをオプションで多重送信する。
【００９９】
材料及び方法
材料
ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ社（セントルイス、ミズーリー州）からＥＧＦ及びメチル−β−シクロデキストリンを購入した。Ｃｏｒｎｉｎｇ社登録商標Ｅｐｉｃ社登録商標の９６ウェルバイオセンサマイクロプレートをＣｏｒｎｉｎｇ社（コーニング、ニューヨーク州）から取得した。使用する前に高強度ＵＶ光（ＵＶＯクリーナー、Ｊｅｌｉｇｈｔ株式会社、ラグナヒル、カリフォルニア州）に６分間暴露することによって洗浄された。クローン５２８，Ｒ１，及び９Ｇ６を含む抗ＥＧＦＲを、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（サンタクルス（カリフォルニア州））から購入した。Ａｂｃａｍ社（ケンブリッジ（ＭＡ））から抗ＥＧＦＲ（２Ｅ９）を購入した。ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ社（セントルイス（ＭＯ））から抗ＥＧＦＲ（２９．１）を購入した。ＣｈｅｍｉｃｏｎＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ、カリフォルニア州）から抗ＥＧＦＲ（Ｃ１１）を購入した。
【０１００】
角度送受観測共鳴導波グレーティング（ＲＷＧ：ｒｅｓｏｎａｎｔ  ｗａｖｅｇｕｉｄｅ  ｇｒａｔｉｎｇ）バイオセンサ：
角度送受観測ＲＷＧバイオセンサ検出システムは、２００４年１２月３０日に刊行された公開番号第２００４−０２６３８４１号を有し、２００３年６月２４日に出願された米国特許出願番号第１０／６０２，３０４号及び２００４年１２月２１日に出願された米国出願番号第１１／０１９，４３９号に開示されており、その全てがバイオセンサ及びバイオセンサの使用に関する態様に参考として組み込まれている。かかるシステムは一連の光ビームを生成するための発光システムから構成されているので、それぞれが、これらセンサから反射された光ビームの角度によって示されるように、約２００μｍ×３，０００μｍのサイズを有するＲＷＧセンサと応答の全てを受信する受信システムを照明する。このシステムによって、７×７までのウェルセンサが３秒毎に同時にサンプリングされ得る。親和性スクリーニングのために、表面に結合された「受容体」に対して微調整される且つ一般に、絶え間なく生物学的検定溶液を与えるのに並流チャンバーを使用するＳＰＲと異なり、現行のシステムは、比較的静的状態を保ち、分析評価の間、オンボード液体処理システムを使用することで穏やかな溶液の導入を任意で可能とするので、それは細胞上の流体運動の不必要な効果を最小化する。固有の設計の故に、各センサは、データ収集、分析を目的として、多数セグメントに分割され得る共鳴バンドを生じせしめる。細胞を全く有しないセグメントは、全ての不要な効果をフィルターにかけるイントラウェル自己基準領域として機能し得る。
【０１０１】
ＲＷＧセンサは、熱に敏感であり、これは、複合溶液間の温度差及び細胞培地が細胞の反応を複雑し得ることを意味する。かかる効果を最小化し若しくは排除するために、細胞に印加される前にすべての溶液が、約３時間、温度制御検知システム内で通常平衡化された。さらに、すべての研究が、温度変動と気化冷却の効果を最小化するべく、室温において若しくは室温付近で実行された。
【０１０２】
細胞培養及びバイオセンサ細胞分析：
人間の表皮癌Ａ４３１細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ）が、１０％の牛胎児血清（ＦＢＳ）、４．５ｇ／リットルのグルコース、２ｍＭのグルタミン、及び抗生物質が添加さられたダルベッコ改質Ｅａｇｌｅの媒体（ＤＭＥＭ：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）内で培養された。１０％のＦＢＳを含む２００のマイクロリットルのＤＭＥＭ媒質に３〜５回浮遊された約３〜約７．５×１０４の細胞が、９６ウェルマイクロプレートの各々のウェル内に設けられた。同様に、５０マイクロリットルの培養培地内の約１〜約２Ｘ１０４の細胞が、３８４ウェルマイクロプレートの各々のウェル内に設けられた。細胞シード後に、細胞は、約９５％の細胞密集度が得られるまで（約１−２日）、３７℃で空気／５％ＣＯ２下で培養された。密集細胞は、無血清の媒質を用いて洗浄され、３７℃において、空気／５％ＣＯ２下で、２０時間同じ媒質内で培養された。分析の当日、細胞は、ＨＢＳＳ（２０ｍＭのＨＥＰＥＳを有するＨａｎｋｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）緩衝液を用いて洗浄された。そして、得られたＡ４３１細胞は、分析の前に、２−３時間選択された温度において、様々な濃度の抗ＥＧＦＲ抗体を用いて培養された。そして、ＥＧＦＲは、ＥＧＦ又はメチル−β−シクロデキストリンを用いて活性化され、得られたＤＭＲ信号が記録された。
【０１０３】
統計分析：
明確に言及しない限り、それぞれの化合物の測定に対して同じ動作が実行された。標準偏差がこれら測定値（ｎ＝２）から得られた。すべての投与量依存応答が、（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅの）ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いた非線型回帰法を使用して分析された。
【０１０４】
結果と議論
多くのモノクローナル性またはポリクローナル性抗体が過去３０年間でＥＧＦＲに対して開発された。ＥＧＦ結合を抑制する能力を含むそれらのいくつかが特性化され、細胞の機能が徹底的に調べられた。例えば、抗ＥＧＦＲ（クローン５２８）。この特定の単クローン性抗体は、ＥＧＦＲ活性化と下流シグナル経路に対する単クローン性抗体の機能をマップするＥｐｉｃ登録商標細胞ベースの分析技術を使用することに関して実現の可能性を例証するのに使われた。
【０１０５】
まず、ＨＢＳＳ分析緩衝液における一連の濃度の抗ＥＧＦＲ（５２８）が、室温で３時間、角度型送受観測ＲＷＧバイオセンサ検知システムにおいて、９６ウェルＥｐｉｃ登録商標プレートの静的Ａ４３１細胞を用いて培養され、それぞれのバイオセンサの安定したベースラインによって示された平衡状態が得られた。そして、ＥＧＦＲ信号伝達が、固定濃度のＥＧＦ（３２ｎＭ又は６４ｎＭ）の添加により各反応に対して開始され、それぞれの細胞応答は、２時間、観測され、記録された。
【０１０６】
光ビームの角度シフトによって表される細胞応答は３つの異なる連続的な相から構成される。すなわち、１）  信号（Ｐ−ＤＭＲ）が増大する正の相（図２Ａの２２５）と、２）  信号（Ｎ−ＤＭＲ）が低減する長期減衰相（図２Ａの２３０）と、３）  信号（ＲＰ−ＤＭＲ）が増大した後に平坦になる回復相（図２Ａの２３５）と、である。通常、Ｐ−ＤＭＲは、活性化されたＥＧＦＲ又は細胞の原形質の膜に対するタンパク質作用体の回復に主に関連する。Ｎ−ＤＭＲは主として受容体のエンドサイトーシスと細胞付着性に関連している細胞の形態変化の総合的な結果である。ＲＰ−ＤＭＲは、細胞が部分的に再付着する処理に主に対応している。
【０１０７】
抗ＥＧＦＲ（５２８）の濃度に対してプロットされたクローン５２８のＮ−ＤＭＲの振幅は、抗ＥＧＦＲ（５２８）の濃度増大とともに減少する振る舞いを示した。これは、ＥＧＦＲ信号伝達における抗ＥＧＦＲ（５２８）の抑制作用を明確にしている。ＩＣ５０値が、抑制カーブ（図２Ｂ）からサブナノモル濃度（ｎＭ）レベルで見積もられ、その値は、報告された値（０．６〜３ｎＭ）と一致した。Kawamoto T, et al., ”Growth stimulation of A431 cells by epidermal growth factor:identification of high-affinity receptors for epidermal growth factor by anti-receptor monoclonal antibody,” Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1983;80, 1337-1341.を参照されたい。また、抗ＥＧＦＲ（５２８）は、ＥＧＦＲの細胞外ドメインＩＩＩに結合し、ＥＧＦがＥＧＦＲ．Ｉｂｉｄ上のその結合部位に侵入することを阻止することが示されている。このタイプの抗ＥＧＦＲの強い抑制作用によって、本開示のＥｐｉｃ登録商標細胞ベースの分析方法を使用して、約０．１ｎＭ以下等のサブナノモル濃度レベルにおけるかかる抗体の存在の検出が可能となる。
【０１０８】
同様に、抗ＥＧＦＲ（クローンＲ１、クローン２Ｅ９、およびクローン２９．１）の抑制効果は評価され、その結果は、（図１Ａ〜Ｆ、および表１）における代替手法と一致した。また、クローンＣ１１はＥＧＦＲの活性化及び信号伝達に抑制効果を有することがわかった。かかる機能は、機能は、これまで完全に理解されて、明確に画定されていない。
【０１０９】
以下の表１は、Ｅｐｉｃ登録商標細胞ベースの分析に基づくＥＧＦＲ抗体機能の分類を表している。Ｅｐｉｃ登録商標細胞ベースの分析方法の結果は、文献で報告された代替法で得られた結果と一致した。
【０１１０】
表１：Ｅｐｉｃ登録商標光学バイオセンサ細胞ベースの分析に基づいたＥＧＦＲ抗体の機能の分類。
【０１１１】
【表１】
2010537195.tif 000003
【０１１２】
1. Gooi, H.C., et. al., ”The carbohydrate specificities of the monoclonal antibodies” 29.1, 455 and ”3C1B12 to the Epidermal Growth Factor receptor of A431 cells,” Biosci.Reports, 1985, 5:83-94.
2. Defize, L.H.K., et. al., ”Signal transduction by Epidermal Growth factor occurs through the subclass of high affinity receptors,” J Cell Biol., 1989, 109:2495-2507.
3. Gill, G.H., et. al.,. ”Monoclonal Anti-Epidermal Growth Factor receptor antibodies which are inhibitors of Epidermal Growth Factor binding and antagonists of Epidermal Growth Factor-stimulated tyrosine protein kinase activity,” J. Biol.Chem., 1984, 259(12):7755-7760.
4. N.D.-決定されていない。
【０１１３】
実施例２
波長送受観測システムに基づくリガンド独立及び無標識細胞分析を用いた抗ＥＧＦＲ抗体の機能分析
これまで、メチル‐β‐シクロデキストリンは、細胞膜から脂質コレステロールを抽出することができることが例証されており、脂質のラフト（ｒａｆｔ）の転位を誘起せしめ且つＥＧＦＲのラスタ化を引き起こすことを含む。Lambert S., et al., ”Ligand-independent activation of the EGFR by lipid raft disruption”.J. Investigative Dermatology, 2006;126, 954-962.を参照されたい。その結果、これによって、ＥＧＦＲのトランス活性と下流の信号伝達が可能となる。ＥＧＦＲのトランス活性に与える抗体の効果を調べることによって、ＥＧＦが存在しない場合において、メチル−β−シクロデキシトリンによって誘発されるＥＧＦＲのオリゴマ化のモジュレータとしての抗ＥＧＦＲの機能的役割が評価され得る。垂直偏波又はｐ偏光ＴＭ０モード（Ｘ方向スキャン）を有するＥｐｉｃ登録商標無標識波長送受観測システムが、先の実施例の角度型送受観測システムに代わってこの研究で使用された。
【０１１４】
材料及び方法
波長送受観測システム：
Ｅｐｉｃ登録商標システムは、標準ＳＢＳマイクロタイタープレート（主として３８４ウェルマイクロプレート）に統合されたＲＷＧバイオセンサの中心に置かれる。マイクロプレートのセンサの表面は、容易に修飾されて、親和性ベースの生化学分析を目的とする受容体の直接結合、細胞ベースの分析を目的とする適切な細胞の付着及び成長を可能にする。
【０１１５】
システムは、独立型とすることができ、温度制御ユニット、光学探知ユニット、及びロボティックスを有する任意のオンボード液体処理ユニットから構成され得る。温度制御ユニットは、必要に応じて温度変動を最小にするべく内蔵されている。ユニット内において、センサーマイクロプレートと化合物ソースプレートの双方を処理する２つの並列スタックがある。一度、温度が安定すると、センサーマイクロプレートは、検知システムの直上のプレートホルダに自動的に搬送され、一方、ソースプレートは適切なコンパートメントに移動されて、それはオンボード液体処理ユニットによって容易に処理可能である。
【０１１６】
検知ユニットが、統合されたファイバオプティクスの周囲に設けられ、生細胞内においてリガンドによって誘起されたＤＭＲに起因する共鳴波の波長シフトを測定する。マイクロプレートの底部を介した垂直入射によって、光ファイバとコリメータレンズを介して生成された広帯域の白色光源は、グレーティングの小領域を照明するのに使用される。反射光を記録する検出ファイバは照光ファイバを用いて１束にされる。一連の照光／検出ヘッドが直線的に配置されるので、反射スペクトルは、３８４ウェルのマイクロプレートの同じカラム内にあるサブセットのウェルから一度に収集される。プレート全体は照光／検出ヘッドによってスキャンされるので、各センサが複数回扱われ、各カラムは連続して扱われる。走査は、例えば、選択された分析の態様に依存して、連続的若しくは不連続的であり得る。反射光の波長は、分析目的のために収集且つ使用される。
【０１１７】
動的分析を目的として、まず、ベースラインの応答が所定期間記録される。その後、複合溶液が、オンボード液体処理システムを使用して、センサープレートに移され、細胞応答が別の期間に記録される。化合物が導入される際に、通常、センサーマイクロプレートのリッドは、短期間（例えば、約２分）を除いて、分析中、大部分の期間、維持された。プレートリッドは、ロボティクスによって自動的に処理され得る。かかる動的測定によって、ＧＰＣＲの信号伝達及びネットワーク化された相互作用について有益な情報が提供される。
【０１１８】
細胞培養及びバイオセンサ細胞分析：
人間の表皮癌Ａ４３１細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ）が、１０％の牛胎児血清（ＦＢＳ）、４．５ｇ／リットルのグルコース、２ｍＭのグルタミン、及び抗生物質が加えられたダルベッコ改質Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）内で培養された。１０％のＦＢＳを含む５０のマイクロリットルのＤＭＥＭ培地に３〜５回浮遊された約１．５〜約２×１０４の細胞が３８４ウェルマイクロプレートの各々のウェル内に設けられた。細胞シード後に、細胞は、約９５％の細胞密集度が得られるまで（約１−２日）、３７℃で空気／５％ＣＯ２下で培養された。密集細胞は、無血清培地を用いて洗浄され、３７℃において、空気／５％ＣＯ２下で、２０時間同じ培地内で培養された。分析の当日、細胞は、ＨＢＳＳ（２０ｍＭのＨＥＰＥＳを有するＨａｎｋｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）緩衝液を用いて洗浄された。そして、得られたＡ４３１細胞は、様々な濃度の抗ＥＧＦＲ抗体を用いて、２乃至３時間、選択された温度において、４０マイクロリットルの総体積にて、各ウェル内にて分析の前に培養された。ＥＧＦＲは、メチル−β−シクロデキシトリン（１０マイクロリットル、２５ｍＭ）の溶液を用いて活性化され、ＤＭＲ信号が記録された。すべての研究が被制御温度（２８℃）にて行われた。
【０１１９】
結果および討論
ＥＧＦＲの活性化及び信号伝達経路を介在する代替の方法は、ＥＧＦＲに対して指向された単クローン性抗体の幇助をともなって、ＥＧＦＲの受容体オリゴマ化を容易にし又は阻害させることである。この研究において、抗ＥＧＦＲ（Ｃ１１）と抗Ｈｅｒ２（９Ｇ６）の２つの単クローン性抗体は、メチル−β−シクロデキシトリンが存在する場合に、ＥＧＦＲトランス活性に与えるそれら効果を調べることによって、評価された。どちらの場合においても、５ｍＭのメチル−β−シクロデキシトリンの添加によって誘起されたＰ−ＤＭＲｓ（信号の第１の増大相）が、ＥＧＦＲ活性化に関連した。これらＰ−ＤＭＲ信号の振幅が抗体の濃度に対してプロットされた。抗ＥＧＦＲ（クローンＣ１１）は投与量に依存した抑制効果（図３Ａ及び３Ｂ）を示したものの、これに反して、抗ＥＧＦＲ（クローン９Ｇ６）は投与量に依存した刺激効果（図４Ａ及び４Ｂ）を示した。
【０１２０】
抗ＥＧＦＲ（Ｃ１１）と抗Ｈｅｒ２（９Ｇ６）の双方の細胞機能はこれまで定義されていない。しかしながら、ダイマー化のためにＥＧＦＲの別の分子と相互作用する際に伴われ得る抗ＥＧＦＲ（クローンＣ１１）がＥＧＦＲの細胞外のドメインＩＶに結合することが知られている。したがって、ＥＧＦＲ活性化に与える抗ＥＧＦＲ（Ｃ１１）の抑制効果は、別のＥＧＦＲへのＥＧＦＲのドメインＩＶのアクセス妨げることから生じ得る。対照的に、ＥＧＦＲと共にヘテロダイマを形成する傾向を有するＨｅｒ２受容体、ＥＧＦＲの別のＥＧＦ（Ｈｅｒ１）から抗Ｈｅｒ２（９Ｇ６）が得られた。したがって、抗Ｈｅｒ２（９Ｇ６）は、オリゴマの形態のＥＧＦＲを認識し且つ安定させて、その結果、ＥＧＦＲの活性化を促進し得る。
【０１２１】
実施例３
波長送受観測システムに基づいた無標識細胞分析を用いて長期培養した抗ＥＧＦＲ抗体の機能分析
本開示された方法の１つの潜在的応用は、高スループットシステム（ＨＴＳ）細胞アッセイフォーマットで中和抗体をスクリーニングすることである。実施形態において、ターゲット細胞に与える抗体の短期及び長期効果の双方が評価され、培養間の抗体の細胞毒性は、ターゲットとする細胞の選択に関して抗体の長時間培養を通常必要とする。この研究において、Ｅｐｉｃ登録商標細胞ベースの分析が、長期培養時間と短期培養時間の双方の場合において、抗体の機能を調べるのに使用された。
【０１２２】
材料及び方法
人間の表皮癌Ａ４３１細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ）が、１０％の牛胎児血清（ＦＢＳ）、４．５ｇ／リットルのグルコース、２ｍＭのグルタミン、及び抗生物質が加えられたダルベッコ改質Ｅａｇｌｅの媒体（ＤＭＥＭ：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）内で培養された。１０％のＦＢＳを含む５０のマイクロリットルのＤＭＥＭ培地に３〜５回浮遊された約1.5〜約２×１０４の細胞が、３８４ウェルマイクロプレートの各々のウェル内に設けられた。細胞シード後に、細胞は、約９５％の細胞密集度が得られるまで（約１−２日）、３７℃で空気／５％ＣＯ２下で培養された。密集細胞は、無血清培地を用いて洗浄され、３７℃で空気／５％ＣＯ２下で２０時間同じ培地中で所望の抗体を用いて培養された。分析の当日、無血清ＤＭＥＭ培地の各抗体溶液が、分析前に各ウェルに４０マイクロリットルの総体積を入れた状態で分析緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１％ＢＳＡを有するHanks Balanced Salt溶液）内の同濃度の抗体と置換された。ベースラインが安定するように被制御温度（２８℃）において２時間培養した後に、ＥＧＦＲは、分析緩衝液中のＥＧＦ（１０マイクロリットル）の溶液を用いて活性化され、ＤＭＲ信号が記録された。
【０１２３】
結果および討論
図７は、６４ｎＭのＥＧＦによって誘起されたＡ４３１細胞内のＥＧＦＲ活性及び信号伝達に関するＤＭＲ信号を表示したものを示している。動的特性は、ＥＧＦの付加の前に細胞の基底反応（７００）から構成される。すなわち、信号（Ｐ−ＤＭＲ）が増大する正の相（７１０）と、信号（Ｎ−ＤＭＲ）が低減する長期減衰相（７２０）と、信号（ＲＰ−ＤＭＲ）が増大した後に平坦になる回復相（７３０）と、から構成される。
【０１２４】
図８Ａは、６４ｎＭのＥＧＦによって誘起された静的Ａ４３１細胞の投与量依存リアルタイム動的応答性を示している。細胞は、抗ＥＧＦＲ（Ｒ１）を用いて、２８℃、２時間、誘起前に培養された。観測されたカーブは以下の通りであった。すなわち、抗ＥＧＦＲ（クローンＲ１）なし（８１０）、１００ｎＭの抗ＥＧＦＲ（クローンＲ１）（８２０）、及び２００ｎＭの抗ＥＧＦＲ（クローンＲ１）（８３０）である。
【０１２５】
図８Ｂは、６４ｎＭのＥＧＦによって誘起された静的Ａ４３１細胞の投与量依存リアルタイム動的応答性を示している。細胞は、抗ＥＧＦＲ（Ｒ１）を用いて、３７℃、２４時間、誘起前に培養された。観測されたカーブは以下の通りであった。すなわち、抗ＥＧＦＲ（クローンＲ１）なし（８５０）、１００ｎＭの抗ＥＧＦＲ（クローンＲ１）（８６０）、及び２００ｎＭの抗ＥＧＦＲ（クローンＲ１）（８７０）である。
【０１２６】
図９Ａ乃至９Ｃは、抗ＥＧＦＲ（Ｒ１）の濃度の関数として６４ｎＭによって誘起された静的Ａ４３１細胞のリアルタイム動的応答性を示している。細胞は、抗ＥＧＦＲ（Ｒ１）を用いて、２８℃、２時間、培養された。データは、非線型回帰曲線フィッティングを用いてフィッティングされた。図９Ａは、Ｐ−ＤＭＲｓに基づく細胞の応答性を示している。図９Ｂは、Ｎ−ＤＭＲｓに基づく細胞の応答性を示している。図９Ｃは、ＲＰ−ＤＭＲｓに基づく細胞の応答性を示している。分析結果が、以下の表２にまとめられている。
【０１２７】
図１０Ａ乃至１０Ｃは、抗ＥＧＦＲ（Ｒ１）の濃度の関数として６４ｎＭによって誘起された静的Ａ４３１細胞の投与量依存リアルタイム動的応答の振幅を示している。細胞は、抗ＥＧＦＲ（Ｒ１）を用いて、３７℃、２４時間、培養された。データは、非線型回帰とカーブフィッティングされた。図１０Ａは、Ｐ−ＤＭＲｓに基づく細胞応答を示している。図１０Ｂは、Ｎ−ＤＭＲｓに基づいた細胞の応答性を示している。図１０Ｃは、ＲＰ−ＤＭＲｓに基づいた細胞の応答性を示している。
【０１２８】
表２は、６４ｎＭのＥＧＦ誘起のＤＭＲ信号に与える２時間若しくは２４時間抗体を用いたＡ４３１細胞の前処理の影響を比較している。ここで、％変化は、非線回帰法を使用して作成された投与量依存の応答性に関して、終点（ｌｏｇＭ＝−６．７１）及び開始点（ｌｏｇＭ＝−９）の差に基づいて、計算された。ｌｏｇＭは分析に使用されるモル単位の抗体濃度の対数（１０）である。
【０１２９】
表２：Ｅｐｉｃ登録商標細胞ベースの分析を使用してＥＧＦ誘起のＤＭＲ信号に与える、各抗体を用いたＡ４３１細胞の２つの異なる前処理の影響の比較。
【０１３０】
【表２】
2010537195.tif 000004
【０１３１】
「効果なし」は、20%未満である%変化として定義された。その定義は、抗体溶液の高濃度に、より際立ったバルク屈折率変化の考慮に基づいている。（「−」）の記号は抑制効果を示し、(「+」)の記号は刺激的効果を示し、(「〜」)の記号は「約」を意味し、「N.D.」は「決定されない」ことを示している。
【０１３２】
この研究において、Ａ４３１細胞に与える５つの抗体（クローン２９．１、２Ｅ９、Ｒ１、５２８、及びＣ１１）の長期的効果が分析前に３７℃で２４時間の培養により調べられた。５つの抗体の全てが、各抗体の濃度の増大とともに、Ｐ−ＤＭＲ応答の低減によって関係せしめられているように、ＥＧＦＲ活性に対して抑制を示した。しかしながら、ＥＧＦＲ下流シグナル及び結果として生ずるエンドサイトーシスに与えるこれら抗体の作用及び形態変化の作用が変動した。いくつかは抑制効果を示したものの、他は、抗体価測定の範囲にわたってＮ−ＤＭＲｓ及びＲＰ−ＤＭＲｓの正の％変化によって明確にされる刺激効果を示した。
【０１３３】
或るものは抑制効果を表示したが、他のものはＮ−ＤＭＲｓとＲＰ−ＤＭＲの正の％変化によって滴定の範囲の上明らかにされた刺激的効果を示した。
【０１３４】
同時に比較すると、短期間の培養（２８℃で２時間）による分析評価は、長期間の培養のものとは異なる一連の結果となった。長期間の培養で抑制を示す抗体のいくつかが全く効果を示さなかったか又は相反効果を示した。かかる結果は、抗体のスクリーニングにおいて抗体に関する細胞の影響について全スペクトルを調べる重際の重要さを示している。
【０１３５】
本開示は、種々の特定の実施形態及び技術を参照して説明されてきた。しかしながら、本開示の精神及び範囲内において多くの変更及び改良を行うことができることが理解されるはずである。
【０１３６】
参照
１．  Fang Y, et al., ”Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing”, Biophys J., 2006;91, 1925-1940.
２．  Fang Y, et al., ”Characteristics of dynamic mass redistribution of EGF receptor signaling in living cells measured with label free optical biosensors”, Anal.Chem., 2005;77:5720-5725.
３．  Fang Y, et al., ”Cellular functions of cholesterol probed with optical biosensors”, Biochim Biophys Acta, 2006;1763, 254-261.
４．  Fang, Y., et al., ”Non-invasive optical biosensor for assaying endogenous G protein-coupled receptors in adherent cells”, J. Pharmacol.Toxicol.Methods, 55 (2007) 314-220.
５．  Fang, Y. ”Label-free cell-based assays with optical biosensors in drug discovery”, Assays and Drug Development Technologies, 2006, 4(5), 583-595.
６．  US 7,105,347 B2, to Fang, Y., et al., assigned to Corning Inc., entitled ”Method and Device for Protein Delivery into Cells.”
【図１Ａ】
2010537195.tif 000005
【図１Ｂ】
2010537195.tif 000006
【図１Ｃ】
2010537195.tif 000007
【図１Ｄ】
2010537195.tif 000008
【図１Ｅ】
2010537195.tif 000009
【図１Ｆ】
2010537195.tif 000010
【図２Ａ】
2010537195.tif 000011
【図２Ｂ】
2010537195.tif 000012
【図３Ａ】
2010537195.tif 000013
【図３Ｂ】
2010537195.tif 000014
【図４Ａ】
2010537195.tif 000015
【図４Ｂ】
2010537195.tif 000016
【図５】
2010537195.tif 000017
【図６】
2010537195.tif 000018
【図７】
2010537195.tif 000019
【図８Ａ】
2010537195.tif 000020
【図８Ｂ】
2010537195.tif 000021
【図９Ａ】
2010537195.tif 000022
【図９Ｂ】
2010537195.tif 000023
【図９Ｃ】
2010537195.tif 000024
【図１０Ａ】
2010537195.tif 000025
【図１０Ｂ】
2010537195.tif 000026
【図１０Ｃ】
2010537195.tif 000027
【手続補正書】
【提出日】平成22年4月19日(2010.4.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生細胞の抗体機能を特性化する方法であって、
生細胞が自身の表面に固定されたバイオセンサを設けるステップと、
選択された細胞ターゲットに対する抗体に当該固定された細胞を所定期間だけ接触せしめるステップと、
固定されて前記抗体に接触せしめられかつ前記選択された細胞ターゲットを有する細胞を、一組のマーカには同時に又は順次に接触せしめるステップと、
前記第１マーカ若しくは第２マーカのうちの一方によって誘起された前記細胞ターゲットの細胞信号伝達に与える前記抗体の接触効果を、前記バイオセンサを用いて検出するステップと、
前記抗体が存在する場合と存在しない場合における前記細胞ターゲットの前記細胞信号伝達に関する前記バイオセンサの信号を比較するステップと、を含む方法。
【請求項２】
前記期間は、約数秒から約数分の期間、約数分から約数時間の期間、約数日から約数週間の期間、及びそれらの組み合わせの期間のグループから選択され、
前記一組のマーカは、
前記細胞ターゲットを直接活性化する少なくとも１つのリガンドを含むか若しくは、
活性化、トランス活性化、又はその双方によって前記細胞ターゲットに対して間接的に作用する少なくとも１つのリガンドを含み、又は、
前記細胞ターゲットに直接結合し且つ前記細胞ターゲットを活性化する第１マーカ及び細胞の配列若しくは信号伝達経路を介して前記細胞ターゲットを間接的にトランス活性化せしめる第２マーカ、を含み、
前記固定された生細胞を抗体に接触せしめるステップは、前記細胞表面を前記抗体に接触せしめるステップ、前記細胞の細胞内を前記抗体に接触せしめるステップ、又はその組み合わせ、を含み、
前記細胞ターゲットは、
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、イオンチャンネル、受容体チロシンキナーゼ、上皮成長因子受容体（ＥＦＧＲ）、サイトカイン受容体、免疫受容体、インテグリン受容体、イオントランスポータのうち少なくとも１つ、若しくはそれら組み合わせ、を前記細胞の表面上で含む特徴体、
酵素、キナーゼ、ホスファターゼのうち少なくとも１つ、若しくはそれら組み合わせ、を含む細胞内ターゲット、
モノマー受容体、ダイマー受容体、オリゴマー受容体、若しくはそれら組み合わせ、又は
同種の受容体複合体若しくは異種のオリゴマー受容体複合体、を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１つの細胞ターゲットを有する生細胞が自身の表面に固定されたバイオセンサを設けるステップと、
抗体を含むタンパク質トランスフェクション複合体を用いて前記固定された生細を培養することによって、前記抗体が前記細胞内に取り入れられて、その後に、対象となる前記細胞ターゲットと相互作用するようにせしめるステップと
刺激によって前記固定された生細胞を刺激するステップと、
前記刺激に対する前記細胞の応答に関する前記バイオセンサのサインを観測するステップを含む方法。
【請求項４】
生細胞における上皮成長因子受容体（ＥＦＧＲ）細胞ターゲットに対する抗体機能を特性化する方法であって、
少なくとも１つのＥＦＧＲターゲットを有する生細胞が表面に固定されたバイオセンサを設けるステップと、
当該固定された生細胞を上皮成長因子受容体に対する抗体に所定期間だけ接触せしめるステップと、
前記抗体に接触せしめられかつ固定された細胞を、マーカに接触せしめるステップと、
前記マーカによって誘起された前記ＥＦＧＲ細胞ターゲットの細胞信号伝達に与える前記抗体の接触効果を、前記バイオセンサを用いて検出するステップと、
前記抗体が存在する場合と存在しない場合における前記ＥＦＧＲ細胞ターゲットの細胞信号伝達に関する前記バイオセンサの測定値を比較するステップと、を含む方法。
【請求項５】
前記マーカは、上皮成長因子（ＥＧＦ）、メチル‐β‐シクロデキストリン、前記上皮成長因子受容体をトランス活性化するＧタンパク質共役型受容体リガンドのうちの少なくとも１つ又はそれらの組合せ含み、
前記期間は、約数秒から約数分の期間、約数分から約数時間の期間、約数日から約数週間の期間、及びそれらの組み合わせの期間のグループから選択されることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【国際調査報告】
2010537195.tif 000028
2010537195.tif 000029
2010537195.tif 000030