(57)【要約】  ペプチド、代謝物物質又は他の物質のペアとなる同位体群を見つけ出す技術は、特徴を同定する必要なしに、実行される。適切な同位体標識技術、例えばＳＩＬＡＣ又はＩＣＡＴが使用できる。当該技術は単一同位体に基づく重軽標識ペプチドをペアとすることにより同位体ペアを同定できる。技術は、ユーザーによって調節可能な所定許容範囲内で保持時間および質量／電荷を有する同位体群を検索する。多様な標識サイトは逆標識と同様に支持され、バイアスを抑制又は減らす。多様な複製は、合成画像にマージされ得る。
2010529459.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的サンプルにおいてペアとなる特徴を見いだす方法であって、
特徴ある核酸配列を同定する必要なしに、コントロールサンプルと前記コントロールサンプルに追跡関係を有する処理サンプルとが調製サンプルとしてまとめられる実験から、合成画像を形成するステップと、
前記合成画像から興味ある特徴のペアを見つけるステップであって、興味ある特徴の１つのペアの１つのメンバが前記追跡関係に従って前記ペアの他のメンバに関連しており、前記追跡関係は前記合成画像上の前記ペアの両メンバを見つける制約条件を記載している、ステップと
を備えることを特徴とする方法。
【請求項２】
非放射性の安定同位体の原子質量単位のいくつかの数で、前記処理サンプルの事例を同位体標識することにより、前記追跡関係が生成される一方で、前記コントロールサンプルの事例が同位体標識を経ないことを特徴とする請求項１の方法。
【請求項３】
前記コントロールサンプルの事例は、処理サンプルの同位体標識で使ったものと同一の原子質量単位の数からなる同位体標識で逆標識することにより、前記追跡関係が生成される一方で、前記処理サンプルの事例が同位体標識を経ないことを特徴とする請求項２の方法。
【請求項４】
代謝実験における１つまたは複数の分子の添加又は減失を追跡することにより、前記追跡関係が生成されることを特徴とする請求項１の方法。
【請求項５】
興味ある特徴のペアを見いだすことは同位体群を見いだすことを含み、同位体群の各々はコントロールサンプル又は処理サンプルを表し、興味ある特徴のペアを見いだすことは興味ある特徴のペアを検索するために共通の同位体ピークの数を決定することを含むことを特徴とする請求項１の方法。
【請求項６】
比率の自然対数を計算することをさらに含み、前記比率は被除数および除数からなり、前記被除数は処理サンプルを表示するペアのメンバとしての１つの同位体群の同位体ピークの強度の合計であり、前記除数はコントロールサンプルを表示するペアのメンバとしての他の同位体群の同位体ピークの強度の合計であることを特徴とする請求項１の方法。
【請求項７】
前記比率の自然対数の比率のエラーを計算して該比率のｐ値を生成することをさらに含み、該ｐ値が処理サンプルの特異性発現レベルを示すことを特徴とする請求項６の方法。
【請求項８】
コンピュータに、生物学的サンプルにおいてペアとなる特徴を見いだす方法を実行させるためのコンピュータ実行可能命令を格納するコンピュータ読み取り可能な記憶媒体であって、
前記方法は、
特徴ある核酸配列を同定する必要なしに、コントロールサンプルと前記コントロールサンプルに追跡関係を有する処理サンプルとが調製サンプルとしてまとめられる実験から、合成画像を形成するステップと、
前記合成画像から興味ある特徴のペアを見つけるステップであって、興味ある特徴の１つのペアの１つのメンバが前記追跡関係に従って前記ペアの他のメンバに関連しており、前記追跡関係は前記合成画像上の前記ペアの両メンバを見つける制約条件を記載している、ステップと
を備えることを特徴とするコンピュータ読み取り可能な記憶媒体。
【請求項９】
非放射性の安定同位体の原子質量単位のいくつかの数で、前記処理サンプルの事例を同位体標識することにより、前記追跡関係が生成される一方で、前記コントロールサンプルの事例が同位体標識を経ないことを特徴とする請求項８のコンピュータ読み取り可能な記憶媒体。
【請求項１０】
前記コントロールサンプルの事例は、処理サンプルの同位体標識で使ったものと同一の原子質量単位の数からなる同位体標識で逆標識することにより、前記追跡関係が生成される一方で、前記処理サンプルの事例が同位体標識を経ないことを特徴とする請求項９のコンピュータ読み取り可能な記憶媒体。
【請求項１１】
代謝実験における１つまたは複数の分子の添加又は減失を追跡することにより、前記追跡関係が生成されることを特徴とする請求項８のコンピュータ読み取り可能な記憶媒体。
【請求項１２】
興味ある特徴のペアを見いだすことは同位体群を見いだすことを含み、同位体群の各々はコントロールサンプル又は処理サンプルを表し、興味ある特徴のペアを見いだすことは興味ある特徴のペアを検索するために共通の同位体ピークの数を決定することを含むことを特徴とする請求項８のコンピュータ読み取り可能な記憶媒体。
【請求項１３】
比率の自然対数を計算することをさらに含み、前記比率は被除数および除数からなり、前記被除数は処理サンプルを表示するペアのメンバとしての１つの同位体群の同位体ピークの強度の合計であり、前記除数はコントロールサンプルを表示するペアのメンバとしての他の同位体群の同位体ピークの強度の合計であることを特徴とする請求項８のコンピュータ読み取り可能な記憶媒体。
【請求項１４】
前記比率の自然対数の比率のエラーを計算して該比率のｐ値を生成することをさらに含み、該ｐ値が処理サンプルの特異性発現レベルを示すことを特徴とする請求項１３のコンピュータ読み取り可能な記憶媒体。
【請求項１５】
興味あるペアとなる特徴を見いだすシステムであって、
コントロールサンプルおよび処理サンプルが処理のために一緒に従属される調製サンプルを受容する１つのまとまりのクロマトグラフィ機器および質量分析機器と、
前記調製サンプルから合成画像を生成しかつ処理して、特徴を抽出しかつ特性を計算する画像処理パイプラインと、
特徴ある核酸配列をまず同定する必要なしに、前記合成画像から特徴を処理して、関係に従って互いに関連している興味ある特徴のペアを見いだすペア特徴処理器と
を含むことを特徴とするシステム。
【請求項１６】
前記画像処理パイプラインは、データ補間、画像位置合せ、画像ノイズフィルタリング、バックグラウンド補正、および合成画像形成を実行する合成画像生成器を含むことを特徴とする請求項１５のシステム。
【請求項１７】
前記画像処理パイプラインは、ピーク、同位体群および電荷群を含む特徴を抽出し、かつ、特徴特性を計算する合成画像処理器を含むことを特徴とする請求項１６のシステム。
【請求項１８】
前記ペア特徴処理器は、優先順位処理のために最初に最も強いシグナルの特性を有する特徴を序列する特徴序列器を含むことを特徴とする請求項１５のシステム。
【請求項１９】
前記ペア特徴処理器は、合成画像を検索することによって関係に従って興味ある特徴のペアを見つけ出すペア特徴検出器を含むことを特徴とする請求項１８のシステム。
【請求項２０】
前記ペア特徴処理器は、比率の自然対数のエラーを獲得することからｐ値を生成するペア特徴特性処理器を含み、前記比率の各々は被除数および除数からなり、被除数は処理サンプルを表示するペアのメンバとしての１つの同位体群の同位体ピークの強度の合計であり、除数はコントロールサンプルを表示するペアのメンバとしての他の同位体群の同位体ピークの強度の合計であることを特徴とする請求項１９のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的サンプルにおいてペアとなる特徴を見いだす方法およびそのためのシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
同位体標識（isotopic labeling）は、様々な分子又は原子レベルで生物学的サンプルを観察するために同位体を使用する２つの技術のうちの１つである。一方の技術は放射性同位体を利用する。他方の技術は、多少の非放射性同位体又は安定同位体を使用する。観察は、分析される生物学的サンプルにおける様々な安定同位体の相対量を決定する装置である例えば質量分析計などの機器を用いた安定同位体の相対存在率の測定によってなされる。
【発明の概要】
【０００３】
この概要は、詳細な説明において詳述する概念の選択を単純化した形態で導入するために提供される。この概要は特許請求の範囲に記載される主題事項の重要な特徴を特定することを意図されておらず、特許請求の範囲に記載される主題事項の範囲を決定する補助として使用されることも意図されていない。
【０００４】
本発明に従って、方法、コンピュータ可読媒体およびシステムが提供される。本発明の１つの方法形態は、生物学的サンプルにおいてペアとなる特徴を見いだす方法を含む。該方法は、特徴ある核酸配列を同定する必要なく、コントロールサンプルとコントロールサンプルに追跡関係を有する処理サンプルとが調製サンプルとしまとめられる実験から、合成画像を形成することを含む。該方法は、合成画像から興味ある特徴のペア（興味ある特徴の１つのペアの１つのメンバが追跡関係に従ってペアの他のメンバに関連している）を見いだすことを更に含み、追跡関係は合成画像上のペアの両メンバを見つける制約条件を記載している。
【０００５】
本発明の他の態様に従って、本発明のコンピュータ可読媒体形態は、生物学的サンプルにおいてペアとなる特徴を見いだす方法を実行するために、その上に格納されるコンピュータ実行可能命令を有するコンピュータ可読媒体を含む。該方法は、特徴ある核酸配列を同定する必要なく、コントロールサンプルとコントロールサンプルに追跡関係を有する処理サンプルとが調製サンプルとしてまとめられる実験から、合成画像を形成することを含む。該方法は、合成画像から興味ある特徴のペア（興味ある特徴の１つのペアの１つのメンバが追跡関係に従ってペアの他のメンバに関連している）を見いだすことを更に含み、追跡関係は合成画像上のペアの両メンバを見つける制約条件を記載している。
【０００６】
本発明の他の態様に従って、本発明のシステム形態は、興味あるペアとなる特徴を見いだすシステムを含む。該システムは、コントロールサンプルおよび処理サンプルが処理のために一緒に従属される調製サンプルを受容するための１つのまとまりのクロマトグラフィ機器および質量分析機器を含む。該システムは、調製サンプルから合成画像を生成しかつ処理して、特徴を抽出しかつ特徴を計算する画像処理パイプラインをさらに含む。該システムは、特徴ある核酸配列をまず同定する必要なく、合成画像から特徴を処理して、関係に従って互いに関連している興味ある特徴のペアを見いだすペア特徴処理器をさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
本発明の前述の態様および付随する利点の多くは、添付の図面を参照しながら、以下の詳細な説明を参照することで、より理解され、さらに容易に評価されるであろう。
【図１】ペアとなる特徴のペア形成を定義する関係を有する生物学的サンプルのペアとなる特徴を見つけるための典型的なシステムを例示しているブロック図である。
【図２】ペアとなる特徴のペア形成を定義する関係を有する生物学的サンプルのペアとなる特徴を見つけるための典型的なペア特徴処理器を例示しているブロック図である。
【図３】保持時間を表示しているｘ軸および質量／電荷を表示しているｙ軸を有する標識によって分離される同位体群の典型的なグラフを例示している画像の線図である。
【図４Ａ】本発明の様々な実施例による同位体標識に連結したバイアスおよびその抑制又は減少を示す典型的なグラフを例示している画像の線図である。
【図４Ｂ】本発明の様々な実施例による同位体標識に連結したバイアスおよびその抑制又は減少を示す典型的なグラフを例示している画像の線図である。
【図４Ｃ】本発明の様々な実施例による同位体標識に連結したバイアスおよびその抑制又は減少を示す典型的なグラフを例示している画像の線図である。
【図５Ａ】関係による生物学的サンプルの興味あるペアとなる特徴を見つけるための典型的な方法を例示しているプロセス図である。
【図５Ｂ】関係による生物学的サンプルの興味あるペアとなる特徴を見つけるための典型的な方法を例示しているプロセス図である。
【図５Ｃ】関係による生物学的サンプルの興味あるペアとなる特徴を見つけるための典型的な方法を例示しているプロセス図である。
【図５Ｄ】関係による生物学的サンプルの興味あるペアとなる特徴を見つけるための典型的な方法を例示しているプロセス図である。
【図５Ｅ】関係による生物学的サンプルの興味あるペアとなる特徴を見つけるための典型的な方法を例示しているプロセス図である。
【図５Ｆ】関係による生物学的サンプルの興味あるペアとなる特徴を見つけるための典型的な方法を例示しているプロセス図である。
【図５Ｇ】関係による生物学的サンプルの興味あるペアとなる特徴を見つけるための典型的な方法を例示しているプロセス図である。
【図５Ｈ】関係による生物学的サンプルの興味あるペアとなる特徴を見つけるための典型的な方法を例示しているプロセス図である。
【図５Ｉ】関係による生物学的サンプルの興味あるペアとなる特徴を見つけるための典型的な方法を例示しているプロセス図である。
【図５Ｊ】関係による生物学的サンプルの興味あるペアとなる特徴を見つけるための典型的な方法を例示しているプロセス図である。
【図５Ｋ】関係による生物学的サンプルの興味あるペアとなる特徴を見つけるための典型的な方法を例示しているプロセス図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
これから明らかにするように、本発明の様々な実施例は、実験的又は生物学的関係により関連する特徴あるペアを発見する前に、例えば正確なタンパク質配列を決定するなど、特徴を同定する問題を認識する。また、本発明の様々な実施例は、よりよくノイズを減らしかつ弱い発現を有する特徴のより良好な検出のため、調製サンプルとしてＬＣ／ＭＳ機器に付託された多様なサンプルから、又は多様な複製から形成される合成画像を使用する。さらに、本発明の様々な実施例は、逆転された同位体標識が同位体標識プロセスに関連するバイアス（bias）を抑制又は減少できる。
【０００９】
興味あるペアとなる特徴が生物学的サンプルから発見されるシステム１００は、図１に示される。一般的に、実験は、コントロールのものおよび処理されたもの、非病気のものおよび病気のもの、健康のものおよび罹患のもの、等々２つのものの間の比較とすることができる。プロテオミクス実験において、科学者はタンパク質が導かれた条件に関して異なってふるまうかどうかについて知ることを望んでいる。代謝実験においては、科学者は代謝物が導かれた条件に関して異なってふるまうかどうかについて知ることを望んでいる。薬物治療、治療的な結果および毒性リスクをよりよく理解するために最適に本発明の様々な実施例に影響を及ぼすことができる多くの他のタイプの実験がある。
【００１０】
本発明の様々な実施例によっては、最初に特徴を同定しなければならないことなく、生物学的サンプルのペアとなる特徴が発見されるようにできる。ペアとした後、様々な実施例によっては、特異に又は非特異に発現された特徴が目標とされた同定へ進むようにできる。今、ペアとされたそれらの特徴は、以前に同定されなかった場合でも、ペプチド（又はタンパク質）配列又は代謝物の同定のためのタンデム型質量分析又は他の一連の機器に送り出され得る。ペプチド、タンパク質又は代謝物の同定（又は他の生物学的同定）の後、これらの特徴は、ペプチド配列、タンパク質配列又は代謝物の情報（又は他の生物学的情報）によってアノテーションが行われ得る。
【００１１】
図１に戻ると、コントロールサンプル１０２Ａは保存される。処理された処理サンプル１  １０４Ａは、処理条件を経たコントロールサンプルの事例である。さらに、処理サンプル１  １０４Ａに添加又はその中で認識されることは、追跡されるべきそのコントロールサンプル１０２Ａとの関係を許容する追跡である。１つの適切な追跡は、適切な同位体標識技術、例えばＳＩＬＡＣ又はＩＣＡＴを使用している標識の添加である。原子質量単位の選択された数、例えば６ダルトンは、処理サンプル１  １０４Ａに標識をつけるために用いる。この選択された数又は標識は、それらが合成画像上にて見つかる特徴あるペアとして表示されるときに、コントロールサンプル１０２Ａおよび処理サンプル１  １０４Ａの関係を追跡するために後にシステム１００で使われるであろう。ペアとなる特徴の一方のメンバはおそらくコントロールサンプル１０２Ａから由来して、ペアとなる特徴の他方のメンバはおそらく処理サンプル１  １０４Ａから由来する。図１にて示したように、処理サンプル１  １０４Ａを標識するために用いた標識は、「標識Ａ」と称される。
【００１２】
コントロールサンプル１０２Ａおよび処理サンプル１  １０４Ａ（標識Ａ）は、システム１００に単一の実行として付託される調製サンプル１０６として調製され得る。コントロールサンプル１０２Ａおよび処理サンプル１  １０４Ａ（標識Ａ）が１つの調製サンプル１０６としてシステム１００に入ることができることによって、本発明の様々な実施例は、実験に偽（falsity）を入れる機器依存変動を抑制又は減らすことができる。抑制又は減少する機器依存変動については、発見された特徴は、コントロールサンプル１０２Ａおよび処理サンプル１  １０４Ａ（標識Ａ）に原因があるとすることができる。例えば、処理サンプル１  １０４Ａ（標識Ａ）の発現レベルがコントロールサンプル１０２Ａと比べて差異がある場合、差は処理条件に原因があるとすることができ、かならずしも機器依存変動によらないとすることができる。
【００１３】
いくつかの同位体標識技術、例えばＳＩＬＡＣは、実験に偽を入れる標識依存バイアスを加える。本発明の様々な実施例は、標識反転実験プロトコルをサポートすることによって標識依存バイアスを抑制又は減らす。例えば、コントロールサンプル１０２Ａは、処理サンプル１  １０４Ａを標識するために以前に使われた選択された原子質量単位の数、例えば６ダルトンによって、標識（標識Ａ）され得る。他方において、処理サンプル１  １０４Ａは標識されない。標識されたコントロールサンプルは現在コントロールサンプル１０２Ｂとして参照され、そして、非標識の処理サンプルは現在処理サンプル１  １０４Ｂとして参照される。コントロールサンプル１０２Ｂ（標識Ａ）および処理サンプル１  １０４Ｂは、システム１００に単一の実行として付託される調製サンプル１０６として、コントロールサンプル１０２Ａおよび処理サンプル１  １０４Ａ（標識Ａ）と共に調製され得る。両方のコントロールサンプル１０２Ａ、１０２Ｂ（標識Ａ）および処理サンプル１  １０４Ａ（標識Ａ）、１０４Ｂが１つの調製サンプル１０６としてシステム１００に入ることを許すことによって、標識反転実験的プロトコルは実行され、そして、標識バイアスが抑制され又は減少される。
【００１４】
システム１００は、また、１つの調製サンプル１０６としてシステム１００に入れるためにコントロールサンプル１０２Ａ、１０２Ｂ（標識Ａ）および処理サンプル１  １０４Ａ（標識Ａ）、１０４Ｂと共に集められ得る追加の実験を適応させることができる。例えば、同じコントロールサンプルを使用することに関する他の実験において、コントロールサンプル１０２Ａと同一であるコントロールサンプル１０２Ｃが提供される。処理サンプル２  １０４Ｃは、処理サンプル１  １０４Ａ（標識Ａ）が従属した処理条件と異なる他の処理条件を経たコントロールサンプル１０２Ｃの事例のサンプルである。処理サンプル２  １０４Ｃは、類似した同位体標識技術を使用するが、異なる原子質量単位の数、例えば１２ダルトン（標識Ｂ）を使用して標識される。
【００１５】
標識依存バイアスを抑制又は減らすために、コントロールサンプル１０２Ｃおよび処理サンプル２  １０４Ｃ（標識Ｂ）は、また、標識反転実験プロトコルに従属させることができる。例えば、コントロールサンプル１０２Ｃは、処理サンプル２  １０４Ｃを標識するために以前に使われた選択された原子質量単位の数、例えば１２ダルトンによって、標識（標識Ｂ）され得る。他方において、処理サンプル２  １０４Ｃは標識されない。標識されたコントロールサンプルは現在コントロールサンプル１０２Ｄとして参照され、そして、非標識の処理サンプルは現在処理サンプル２  １０４Ｄとして参照される。コントロールサンプル１０２Ｄ（標識Ｂ）および処理サンプル２  １０４Ｄは、システム１００に単一の実行として付託される調製サンプル１０６として、コントロールサンプル１０２Ａ−１０２Ｃおよび処理サンプル１  １０４Ａ−１０２Ｃと共に調製され得る。両方のコントロールサンプル１０２Ａ−１０２Ｄおよび処理サンプル１  １０４Ａ−１０４Ｄが１つの調製サンプル１０６としてシステム１００に入ることを許すことによって、標識反転実験的プロトコルは実行され、そして、標識バイアスが抑制され又は減少される。
【００１６】
調製サンプル１０６は、ＬＣ／ＭＳ機器１０８  １１０に付託される。ＬＣ／ＭＳ機器１０８  １１０は、生物学的特徴、例えばペプチドを２次元（保持時間と質量／電荷）で分離され得る。所定の保持時間において、１次元連続体が興味ある質量／電荷範囲で得られることが可能である。生物学的特徴は連続体中の同位体ピークとして示される。ピーク強度は、興味ある生物学的特徴と関連する非放射性の安定同位体の相対的な存在率に対し比例すると想定される。結局、ｘ軸として参照されている保持時間およびｙ軸として参照されている質量／電荷については、順番に集められた１次元の質量分析計の連続体は、２次元のデータセットを形成する。
【００１７】
画像処理パイプライン１１２は、ＬＣ／ＭＳ機器１０８  １１０から得られた２次元のデータセットから、特徴特性および発現プロファイルを含む特徴リストを作り出す。画像処理パイプライン１１２は、いくつかの関係によって他の特徴と関連する特徴が更なる科学的研究のためのペアとされるように、特徴抽出を容易にする。画像処理パイプライン１１２のいくつかのコンポーネント（図示せず）は、画像前処理（データ補間、画像位置合せ、画像ノイズフィルタリング、バックグラウンド補正、および合成画像形成）を実行する合成画像生成器と、画像特徴抽出（ピーク、同位体群および電荷群）を実行して、特徴特性を計算する合成画像処理器とを含む。画像処理パイプライン１１２の出力は、特徴およびそれらの特性のリストを含む。
【００１８】
特徴とそれらの特性のリストは、ペア特徴処理器１１８に提供される。同位体標識を使用して、ペア特徴処理器１１８は、特徴の１つのペアの一方のメンバが原子質量単位の数によって特徴あるペアの他方のメンバに関係するかどうか調査する。（もちろん、関係の他のタイプが使われる場合、原子質量単位の数においてでなく他の指標によって、関係は発見され得る。）言い換えれば、所定の保持時間にて、必然的に時間内ではないが、特徴あるペアは、初めに原子質量単位の数によって分離されるように発見されるはずである。合成画像のｙ軸が質量／電荷を参照するとすると、特徴あるペアは所定の保持時間の間にｙ軸に沿って、垂直に見つけられ得る。例えば、所定の同位体ピークがコントロールサンプル、例えばコントロールサンプル１０２Ａの発現を表示する場合、人は、原子質量単位の数、例えば６ダルトンで分離された処理サンプル１  １０４Ａ（標識Ａ）の発現を表示する他の同位体ピークを見つけると予想するだろう。結局は、ペア特徴処理器１１８が特徴あるペアを集め、特性計算を実行し、例えば更なる特異の又は非特異の解析のために強度の比率を決定する。例えば、特徴あるペアおよびそれらの特性は、異なる医薬品供与量下のタンパク質発現が異なる処理条件１０２Ａ−１０２Ｄ、１０４Ａ−１０４Ｄの異なる実験のために発生するかどうか、について明かりをともす助けになり得る。
【００１９】
図２は、画像処理パイプライン１１２が合成画像生成器２０２から成ることを示す。合成画像生成器２０２は、合成画像２０４を生成する。本技術分野では、画像を一緒に合成画像にマージすることが、ノイズを減らし生物学上重要であるが弱く発現する特徴を保持することを認識していなかった。前に議論したように、この合成画像の興味ある領域は、そのいくつかは逆標識された（標識Ａ、Ｂ）であるコントロールサンプル１０２Ａ−１０２Ｄから特徴を表示することができ、そして、そのいくつかは標識された（標識Ａ、Ｂ）である処理サンプル１、２  １０４Ａ−１０４Ｄから特徴を表示できる。合成画像処理器２０６は、特徴のリスト、例えば同位体ピーク、同位体群および電荷群を見つけるために合成画像２０４を処理する。合成画像処理器２０６も、これらの特徴の特性およびプロファイルを算出する。
【００２０】
以前では、本技術分野はペアとなる特徴を見つける前に特徴の序列を決定することによって全ての特徴を同定しようとしていた。本技術分野は、特徴を同定するステップが興味あるペアとなる特徴とわかる前に起こす必要はないと認識していなかった。時々、低い発現レベルを有する、又は、処理条件が発現を抑制するそれらの特徴を同定することは可能ではない。その上、何千もの特徴があり得、その全部を同定することは能率が悪い。したがって、ペアのメンバでなく、生物学的重要な関係を有することができないそれらの特徴のために、それらが同定される必要はない。ペア形成前に全ての特徴を同定する試みは、科学的な発見を遅くするかもしれない。
【００２１】
ペア特徴処理器１１８は、図２でより詳細に示される。ペア特徴処理器１１８は特徴序列器２０８から成り、それは合成画像処理器２０６によって生成される特徴のリストをとって、特徴のリストをランキングする。ランキングは、最も強いシグナルの特性を有するそれらの特徴が優先順位処理を持たせるような序列に、特徴を配置する。例えば、ランキングは、それらが最初に処理されるように、最大ピーク強度および／又は最大質量／電荷を有する特徴が最初にリストされる降順においてなされ得る。このような方法で、本発明の様々な実施例は、興味ある特徴のペアを示し、誤った道に解析を導くノイズが多い特徴を避ける可能性のあるそれらの特徴に、初期リソースを集中させる。
【００２２】
ペア特徴検出器２１０は、ランキングされた特徴のリストを受信して、興味あるペアとなる特徴を見つける。前述のように、各々のペアは、コントロールサンプル１０２Ａ−１０２Ｄから由来する特徴と、処理サンプル１０４Ａ−１０４Ｄから由来する他の特徴とで構成される。興味ある特徴のペアが見つけられた後、情報、例えばタンパク質配列を同定することが欠如しているそれらの特徴のために、目標の同定は進めることができる。タンデム質量分析計又は他の同定装置は、それらの特徴のための核酸配列又はアミノ酸配列を得られるようにブレークダウンが生じる特定の特徴上にトリガーをセットされ得る。再び、前の議論のように、生物学的理由のために、時々、生物学上重大である特徴は、システム１００による実行において現れることはなかった。全部をマージする合成画像の使用は一緒に進行し、たとえ特徴が順方向に標識されたものでは現れず、失敗で逆方向に標識されたものでは現れ成功する場合であっても、これらの特徴が合成画像に現れ、いくつかの関係によって関連する興味ある特徴のペアが発見され得る。生物学上有意特徴が次の解析のために捕らえられる限り、特徴が現れる本発明の様々な実施例は重要ではない。
【００２３】
特徴序列器２０８は、ペア特徴検出器２１０に、リストの最も弱い特徴に最も強い特徴を提供する。ペア特徴検出器２１０は最も強い特徴で開始し、関係、例えば原子質量単位の数（重みによる関係）を原因として生じるので、特徴のリストを解析してペア形成のための候補である対応する特徴を決定する。例えば、原子質量単位の数が６ダルトンである場合、ペア形成のための候補特徴はユーザー定義可能な許容差の範囲内で、約６ダルトンのように見えるはずであり、所定の保持時間の間、ユーザー定義可能な他の許容差の範囲内の最も強い特徴から離れている。１つの実施例において、保持時間許容範囲は、１０秒にデフォルト設定する。ユーザーは、質量／電荷許容範囲と同様に保持時間許容範囲が機器変化を適応させるように調整できる。
【００２４】
興味ある特徴の１つのペアを発見した後に、ペア特徴検出器２１０は、特徴の序列されたリストからペアを除去する。ペア特徴検出器２１０は、特徴の序列されたリストの次の最も強い特徴に集中して、それらをペアにするための最も強い特徴と一致する他の特徴を発見しようと試みる。ペア特徴検出器２１０は最も強い特徴でペア形成のための候補であるいくつかの数の特徴を見つけることが可能である。これが起こるときに、ペア特徴検出器２１０は、特徴の序列されたリストの最も強い特徴に関して、最大の質量かつ最も近い保持時間を有する他の全ての候補特徴から候補特徴を選ぶ。ペア特徴検出器２１０が候補特徴を見つけるために使用できる計算リソースを制限するために、保持時間許容範囲は、ペア特徴検出器２１０が候補特徴を見つけることを敢行できる範囲を定義する。同様に、質量／電荷許容範囲は、ペア特徴検出器２１０が候補特徴を見つけることができる範囲を定義するために用いる。１つの実施例において、質量／電荷方向のデフォルトの許容範囲は、０．１ｐｐｍであって、機器およびそのオペレーティングモードに依存する。
【００２５】
特徴序列器２０８によって受信される１つのタイプの特徴は、同位体群である。多様な同位体群があり得る。１つの同位体群はいくつかの同位体ピークを有することができ、そして、他の同位体群は異なるいくつかの同位体ピークを有することができる。多数の同位体群があり得る。ペア特徴検出器２１０はユーザーが選択可能なしきい値、デフォルトで４、によって興味ある特徴のペアのための検索を制限する。換言すれば、ペア形成のための候補であってもよい同位体ピークのための第４の同位体群に注目した後に、ペア特徴検出器２１０は、追加の候補を見つけるために他の同位体群を越えて危険を冒さない。
【００２６】
ペア特徴検出器２１０は、２つの同位体群間の共通の同位体ピークの数を決定して、共通な数に集中して、共通の同位体ピークの数の部分でない余分な同位体ピークを無視する。例えば、第１の同位体群は、最も低い多数／電荷を有する同位体ピークから始まっている３つの同位体ピークを有する。ペア特徴検出器２１０はペアとなる特徴を第２の同位体群で見つけることができたが、しかし、この第２の同位体群は５つの同位体ピークを有する。１つの実施例において、共通の同位体ピークの数をつくるために、ペア特徴検出器２１０は、第２の同位体群の最も高い質量／電荷の同位体ピークを無視すると共に、第１の同位体群の３つの最も低い質量／電荷の同位体ピーク並びに第２の同位体群の３つの最も低い質量／電荷の同位体ピークの使用を選ぶことができる。もう１つの実施例では、共通の同位体ピークの数は、最も大きい強度を有する同位体ピークから選ばれることができる。例えば、ペア特徴検出器２１０は、両方の第１および第２の同位体群の最も大きい強度を有する３つの同位体ピークを使用するほうを選ぶことができる。
【００２７】
ペア特徴検出器２１０によって発見された興味あるペアとなる特徴は、ペア特徴特性処理器２１２に転送される。１つの処理された特性は、強度の比率を含む。ペア特徴特性処理器２１２は、処理サンプルを表示するペアのメンバとしての１つの同位体群の同位体ピークの強度を獲得して、当該強度を合計して被除数にする。ペア特徴特性処理器２１２は、それから、コントロールサンプルを表示するペアのメンバとしての他の同位体群の同位体ピークの強度を獲得して、当該強度を合計して除数にする。比率は、被除数および除数から生成される。ペア特徴特性処理器２１２は比率のセットを生成する。これらの比率から、ペア特徴特性処理器２１２は、発現情報が検索され得るためのプロファイリングパラメータを生成する。１つのプロファイリングパラメータは比率の常用対数を獲得することであり、その後、常用対数のエラーが算出され特徴あるペアの各々のためのｐ値を得る。
【００２８】
ｐ値は特異性検出のために使われる。ユーザーは、特異性しきい値をセットするためにペア特徴特性探索器２１４を使用できる。ペア特徴特性探索器２１４は特異性しきい値未満のｐ値を有するペアを集め、それらのペアをさらなる解析のためにユーザーに提示する。例えば、ペア特徴特性探索器２１４によって発見された特徴の１つのペアを近づいて見る際に、ユーザーはペアのメンバが情報を同定することを欠いていることがあると決定できる。ユーザーは、ペアのメンバを目標として機器にその核酸又はアミノ酸配列を決定させるためにタンデム型質量分析プロセスの特定の保持時間で、トリガーメカニズムをセットできる。これは、全ての特徴を同定する必要性を避け、そして、その代わりに、実験的又は生物学的関係を有するそれらの特徴が更なる発見のために焦点として前面に引き出される。
【００２９】
余談だが、ペア特徴特性処理器２１２は、規格化を実行することができる。強度の比率が規格化レベル未満の場合、比率は情報を加えることができず、比率は除去され得る。１つの規格化技術は、コントロールサンプルの平均を得るため、コントロールサンプルの全ての同位体ピークを合計すること、同位体ピークの数によって割ることを含む。同様に、処理サンプルの平均は、処理サンプルの全ての同位体ピークを合計し、同位体ピークの数によって割ることによって得られる。コントロールサンプルおよび処理サンプルの平均が類似していない場合、スケーリングプロセスが実行され、重大でない比率を取り除くため規格化レベルを生成する。
【００３０】
グラフ３００は、共通のサンプルおよび処理サンプルを表している興味ある特徴を含む合成画像を視覚的に説明する。図３を参照のこと。グラフ３００は質量／電荷次元の参照であるｙ軸と保持時間次元の参照であるｘ軸とを含む。特定の保持時間で、３つの同位体群特徴が現れる。３つの同位体群のうちの１つはコントロール同位体群３０４を含み、それはコントロールサンプルを表示する。コントロール同位体群３０４は、４つの同位体ピーク３０２を含む。４つの同位体ピーク３０２は、コントロールサンプルを処理サンプルと関係づけるペアのメンバであってもよい。
【００３１】
３つの同位体群の他の１つは、３つの同位体ピーク３０８を有する処理された同位体群Ａ３１０を含む。処理された同位体群Ａ３１０はコントロール同位体群３０４として類似した保持時間に沿って現れ、そして、３つの同位体ピーク３０８はコントロール同位体群３０４の同位体ピーク３０２とのペア形成のための候補であってもよい。処理された同位体群Ａ３１０は、いくつかの原子質量単位によって標識された処理サンプルを表すことができ、処理された同位体群Ａ３１０をコントロール同位体群３０４から、同位体標識において使用された原子質量単位の量、例えば６ダルトンにて離す。共通の同位体ピークの数は、同位体ピーク３０２および３０８の数の差を与えたペア特徴処理器１１８によって確立され得る。例えば、同位体ピーク３０８に３つの同位体ピークがあり、同位体ピーク３０２に４つの同位体ピークがある。この例では、共通の同位体ピークの数は、処理された同位体群Ａ３１０が３つの同位体ピーク３０８を有する事から、３つに指定され得る。
【００３２】
他の実験がＬＣ／ＭＳ機器１０８  １１０に付託される同じ調製サンプルの一部であった場合、処理された他のサンプルの表現は、５つの同位体ピーク３１４を有するグラフ３００、例えば処理された同位体群Ｂ３１６、に現れ得る。同じ共通のサンプルが使われた場合、処理された同位体群Ｂ３１６の５つの同位体ピーク３１４のいくつかはコントロール同位体群３０４の同位体ピーク３０２とのペアとされてもよい。共通の同位体ピークの数は決定され、それはこの場合４である。共通の同位体ピークを確立するための方式が同位体群３０４、３１０および３１６の最も低い同位体ピークに基づく場合、ライン３０６は３つの段階を有する。ライン３０６の最下段段階は、最も低い同位体ピーク３０２が中間の段階によって参照される最も低い同位体ピーク３０８とのペアであり得ることを示し、そして、さらに、ライン３０６の最上部段階によって参照されるように、最も低い同位体ピーク３０２は最も低い同位体ピーク３１４とのペアであり得る。残るライン３１２、３１８および３２０は、他のペア形成を示す。
【００３３】
グラフ３００は、本発明の様々な実施例上の焦点が、或る関係に従う互いに関連する特徴あるペアを発見することであることを示す。グラフ３００は、類似した保持時間に現れている同位体群を示し、そして、これらの同位体群は或る質量／電荷によって分離され、それは関係を定義することができる。これらの関係は、ペア特徴処理器１１８が興味ある特徴のペアを発見できる制約条件を定義する。いくつかの上記の例において、同位体標識は処理サンプルに添加された。他の例（図示せず）において、同位体標識を使用することの代わりに、ペア特徴処理器１１８は、他の制約条件、例えば特定の分子の存在、その他に基づく関係を見つけることができる。また他の例（図示せず）において、ペア特徴処理器１１８は、代謝物、例えば獲得した原子の存在又は原子の減失、その他に基づく関係を見つけることができる。
【００３４】
いくつかの実験は望まないバイアスを導く。例えば、処理サンプルに同位体標識を付ける際に、バイアスは導かれ得る。いくつかのペプチドは、一定の標識−依存比率のバイアスを呈する。これらのバイアスは、上昇調整、下降調整、あるいは、両方に向かう調整に現れ得る。処理サンプルの結果発現は、また、同じバイアスを含むことができる。本技術分野は、このバイアスが実験結果を強化するために取り除かれなければならないと認識していなかった。図４Ａ−図４Ｃにて図示したように、グラフ４０２−４０６は、逆標識実験プロトコルが実行された後のバイアスの除去を示す。全てのグラフ４０２−４０６において、ｙ軸は比率の自然対数を参照し、ｘ軸はペアとなる特徴の基準化された強度の自然対数を参照する。グラフ４０２（順方向標識された特徴を表示する）およびグラフ４０４（それは、逆方向標識された特徴を表示する）は、クラスタから離れてバイアスを示す。逆標識実験プロトコルを実行した後に、これらのバイアスは、グラフ４０６で示すように、消える。
【００３５】
図５Ａ−図５Ｋは、生物学的サンプルの興味あるペアとなる特徴を見つけるための方法５０００を例示する。開始ブロックから、方法５０００は、継続ターミナル（「ターミナルＡ」）および出口ターミナル（「ターミナルＢ」）の間で定義される一組の方法ステップ５００２へ進む。方法ステップ５００２のセットは、特徴特性（feature characteristic）の特徴抽出および計算のための合成画像を生成するため調製サンプルの生成およびその処理を記載する。
【００３６】
ターミナルＡ（図５Ｂ）から、方法５０００はブロック５００８へ進み、ここでコントロールサンプルが実験のために保存される。処理サンプルは、異なる表現型的又は処理条件の実験から生成される。ブロック５０１０を参照のこと。処理サンプルは、原子質量単位の特定数、例えば６ダルトンから構成された非放射性の安定同位体を使用する同位体トレーサを含むように標識される。ブロック５０１２を参照のこと。方法はそれから判断ブロック５０１４へ進み、ここで実験のプロトコルが標識反転を必要とするかどうか決定するためにテストが実行される。判断ブロック５０１４でのテストの解答がＹＥＳである場合、方法５０００は他の継続ターミナル（「ターミナルＡｌ」）へ進む。判断ブロックでのテストの解答がＮＯである場合、方法５０００は他の継続ターミナル（「ターミナルＡ２」）へ進む。
【００３７】
ターミナルＡｌ（図５Ｃ）から、コントロールサンプルの事例は、処理サンプルの標識で使ったものと同一の原子質量単位の数からなる同位体トレーサによって、標識される。ブロック５０１６を参照のこと。処理サンプルの事例は、同位体トレーサによって標識されずに保存される。ブロック５０１８を参照のこと。次に、判断ブロック５０２０で、テストは、異なる表現型的又は処理条件の他の実験があるかどうか決定するために実行される。判断ブロック５０２０でのテストの解答がＮＯである場合、方法は他の継続ターミナル（「ターミナルＡ３」）に続く。判断ブロック５０２０でのテストの解答がＹＥＳである場合、方法は、ブロック５０２２に続き、ここで新規な同位体トレーサが原子質量単位の他の数（他の標識）、例えば１２ダルトンで構成される非放射性の安定同位体を使用している標識として選ばれる。ステップ５００８−５０１８は、新規な実験のための新規な同位体トレーサを使用して繰り返される。ブロック５０２４を参照のこと。方法は、それからターミナルＡ２に続く。
【００３８】
ターミナルＡ３（図５Ｄ）から、方法５０００はブロック５０２６へ進み、ここで１以上の実験から標識された又は非標識された調製されたコントロールサンプルおよび処理サンプルが一緒に集められ、ＬＣ／ＭＳ機器に付託のための調製サンプルとして調製される。合成画像が、ｙ軸で質量／電荷、ｘ軸で保持時間、ｚ軸で同位体ピークの値の３次元の質量分析スペクトラムを含むように生成される。方法は、それから出口ターミナルＢに続く。
【００３９】
ターミナルＢ（図５Ａ）から、方法５０００は一組の方法ステップ５００４へ進み、ステップ５００４は、継続ターミナル（「ターミナルＣ」）および出口ターミナル（「ターミナルＤ」）の間で定義される。方法ステップ５００４のセットは、ペアとなる特徴、例えばペアとなる同位体ピーク又は特定の関係によって関連する他のペアを見つける。
【００４０】
ターミナルＣ（図５Ｅ）から、方法５０００はブロック５０３２へ進み、ここで同位体ピークの強度により降順にて、特徴が序列される。強度で序列された特徴は、同位体ピークの質量により降順にて、更に序列される。ブロック５０３４を参照のこと。方法５０００はそれから序列されたリストの第１の同位体ピークを選び、それは最も強い強度を有する最も高く序列された同位体ピークである。ブロック５０３８を参照のこと。方法は、第１の同位体ピークが帰属する同位体群（第１の同位体群）を決定する。ブロック５０４０を参照のこと。方法は、他の継続ターミナル（「ターミナルＣ３」）に続く。方法は、保持時間内および質量／電荷許容差の範囲内にて、第２の同位体群において、標識された同位体ピークを見つけるために序列されたリストを捜す。ブロック５０４２を参照のこと。方法は発見した同位体ピークを強調する（note）が、それは、潜在的候補又はペアとなる同位体群のメンバとして、原子質量単位の数、例えば６ダルトンで、第１の同位体ピークから間隔を置いて配置される。ブロック５０４４を参照のこと。方法は、他の継続ターミナル（「ターミナルＣｌ」）に続く。
【００４１】
ターミナルＣｌ（図５Ｆ）から、方法５０００は判断ブロック５０４６へ進み、ここで第２の同位体群の他の標識された同位体ピークがあるかどうか決定するためにテストが実行される。判断ブロック５０４６でのテストの解答がＮＯである場合、方法５０００は他の継続ターミナル（「ターミナルＣ４」）へ進む。判断ブロック５０４６でのテストの解答がＹＥＳである場合、方法５０００は他の判断ブロックへ進み、ここで、他の標識された同位体ピークが保持時間内および質量／電荷許容差の範囲内であるかどうか決定するための他のテストが実行される。判断ブロック５０４８でのテストの解答がＮＯである場合、方法はターミナルＣ４に続く。判断ブロック５０４８でのテストの解答がＹＥＳである場合、方法はターミナルＣ３に続く。
【００４２】
ターミナルＣ４（図５Ｇ）から、方法５０００はブロック５０５０へ進み、ここで、方法５０００が全ての候補又は潜在的メンバから、保持時間の第１の同位体ピークに最も近くて、原子質量単位の数（標識）に離間する最も近くのものを選ぶ。選択されたメンバはペアとなる同位体群のメンバになり、そして、他のメンバは第１の同位体ピークである。ブロック５０５２を参照のこと。選択されたメンバは、第２の同位体群の同位体ピークであり、かつ、第１の同位体群の第１の同位体ピークと対応し、序列されたリストから除去される。ブロック５０５４を参照のこと。テストは、追加の同位体群を検索するための制限に達したかどうか決定するために判断ブロック５０５６で実行される。判断ブロック５０５６でのテストの解答がＹＥＳである場合、方法５０００は他の継続ターミナル（「ターミナルＣ５」）に続く。判断ブロック５０５６でのテストの解答がＮＯである場合、方法５０００は、ブロック５０５８に続き、ここで、方法はペアとなる同位体ピークを含むことができる他の同位体群のための検索に、原子質量単位の他の数を使用する。方法はそれからターミナルＣ３へ進み、そしてブロック５０４２へ戻って進み、ここで上記の処理ステップが繰り返される。
【００４３】
ターミナルＣ５（図５Ｈ）から、方法５０００はブロック５０６０へ進み、ここで、第１の同位体群からの第１の同位体ピークが序列されたリストから除去される。テストは、ペアとなる同位体ピークのための更なる検索に種をまく（seed）制限に達したかどうか決定するために判断ブロック５０６２で実行される。判断ブロック５０６２でのテストの解答がＹＥＳである場合、方法は出口ターミナルＤへ進む。判断ブロック５０６２でのテストの解答がＮＯである場合、方法はブロック５０６４へ進み、ここで、方法５０００は、序列されたリストにおいて、最も強い強度を有する最も高く序列された同位体ピークである他の同位体ピークを選ぶ。そして、方法はターミナルＣ３に続き、そしてブロック５０４２へ戻って進み、ここで上記の処理ステップが繰り返される。
【００４４】
出口ターミナルＤ（図５Ａ）から、方法５０００は方法ステップ５００６のセットへ進み、ステップ５００６は、継続ターミナル（「ターミナルＥ」）および出口ターミナル（「ターミナルＦ」）の間で定義される。方法ステップのセットは、興味あるペアとなる特徴を発見するために実行される検索のためのペアとなる特徴特性の計算を記載する。
【００４５】
ターミナルＥ（図５Ｉ）から、方法５０００はブロック５０６６へ進み、ここで、方法は、各々の同位体群がコントロールサンプルからの同位体ピークと処理サンプルから他の同位体ピークとを含んでいる一組のペアとなる同位体群を発見する。１つの同位体群に帰属する１つのペアの全てのメンバの強度の合計が算出される。例えば、各々のペアがコントロールサンプルから由来するメンバを含んでいる３つのペアがある場合、コントロールサンプルから由来する３つのメンバのピーク強度が合計される。処理サンプルから由来する残りの３つのメンバのピーク強度が合計される。比率は、被除数として処理サンプルからの同位体ピークの強度の合計と除数としてコントロールサンプルからの同位体ピークの強度の合計とを取ることによって、各々のペアのために生成される。ブロック５０６８を参照のこと。常用対数は、各々の比率についてとられる。ブロック５０７０を参照のこと。各々の比率の各々の常用対数のエラーが算出される。ブロック５０７２を参照のこと。ペアとなる同位体群の他の特性は、方法によって算出される。ブロック５０７４を参照のこと。方法は、他の継続ターミナル（「ターミナルＥ１」）へ進む。
【００４６】
ターミナルＥ１（図５Ｊ）から、方法５０００はブロック５０７６へ進み、ここで、ｐ値が全てのペアとなる同位体群の比率の常用対数のために生成される。特異性検出のため、ユーザーが特異性しきい値を特定する。ブロック５０７８を参照のこと。テストは、ｐ値がしきい値より小さいかどうか決定するために実行される。判断ブロック５０８０を参照のこと。判断ブロック５０８０でのテストの解答がＮＯである場合、方法５０００はブロック５０８２へ進み、ここで、実験がしきい値によって特異に発現されなかったとする。方法は、他の継続ターミナル（「ターミナルＥ２」）に続く。判断ブロック５０８０でのテストの解答がＹＥＳである場合、方法５０００はブロック５０８４へ進み、ここで、しきい値未満のｐ値を有する特徴のリストがユーザーに提示される。方法は、出口ターミナルＦに続き、実行を終了する。
【００４７】
ターミナルＥ２（図５Ｋ）から、方法５０００はブロック５０８６へ進み、ここで、方法５０００が同定（identification）なしで特徴を同定する（identify）。テストは、ユーザーが目標とされた解析を実行することを望むかどうか決定するために判断ブロック５０８８で実行される。判断ブロック５０８８でのテストの解答がＮＯである場合、方法５０００は出口ターミナルＦへ進んで、実行を終了する。判断ブロック５０８８でのテストの解答がＹＥＳである場合、方法５０００はブロック５０９０へ進み、ここで、ユーザーが目標とされた解析のため、それらの特徴を選ぶために生成された特徴リストを使用する。タンデム型質量分析技術は、選択された特徴からのペプチド配列および他の情報を同定するために用いられる。ブロック５０９２を参照のこと。方法は、出口ターミナルＦに続き、実行を終了する。
【００４８】
明示の実施例が示され記載されると共に、様々な変更が本発明の精神と範囲から逸脱することなく、その中でされ得ることはいうまでもない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図５Ｉ】
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【図５Ｊ】
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【図５Ｋ】
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【国際調査報告】
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