(57)【要約】  本発明は、出血性疾患の治療及び予防的処置における血管外投与のための、フォンビルブラント因子（ＶＷＦ）製剤、又は凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）との組み合わせのＶＷＦ製剤の使用に関する。
2010529155.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
精製フォンビルブラント因子（ＶＷＦ）及び第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）を含む、フォンビルブラント病（ＶＷＤ）及び／又は血友病Ａの治療における血管外投与に適した組成物であって、ここでＶＷＦ：Ａｇ対ＦＶＩＩＩ：Ｃの比が５：１より大きい組成物。
【請求項２】
フォンビルブラント因子がヒト血漿から誘導され、組み換えによって生産される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ＶＷＦが非複合である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
血管外投与する場合の、ＶＷＤ及び／又は血友病Ａを治療する薬剤を製造するための請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項５】
ＶＷＤ及び／又は血友病Ａを処置する薬剤を製造するためのＶＷＦの使用であって、ここでＦＶＩＩＩの前記薬剤組成物が、同じ濃度、用量で、そして同じ様式の血管外投与であるがＶＷＦなしで投与される場合のそれぞれのパラメータと比較して、ＦＶＩＩＩの薬物製剤との血管外共投与後の、
ａ）注射後血漿中のＦＶＩＩＩ活性を少なくとも０.０１Ｕ／ｍｌ高める期間が延長される；又は、
ｂ）血漿中のＦＶＩＩＩ活性の最大濃度が増加する；又は、
ｃ）ＦＶＩＩＩ活性のデータ曲線下面積（ＡＵＤＣ）が増加する；
のいずれかである、使用。
【請求項６】
請求項５に記載のＶＷＦの使用であって、ここでＦＶＩＩＩの前記薬剤組成物が、同じ濃度、用量で、そして同じ様式の血管外投与であるがＶＷＦなしで投与される場合のそれぞれのパラメータと比較して、ＦＶＩＩＩの薬物製剤との血管外共投与後の、
ａ）注射後血漿中のＦＶＩＩＩ活性を少なくとも０.０１Ｕ／ｍｌ高める期間が少なくとも３倍延長される；又は、
ｂ）血漿中のＦＶＩＩＩ活性の最大濃度が少なくとも３倍増加する；又は、
ｃ）ＦＶＩＩＩ活性のデータ曲線下面積（ＡＵＤＣ）が少なくとも５倍増加する；
のいずれかである、使用。
【請求項７】
ＶＷＤ及び／又は血友病Ａを処置する薬剤を製造するためのＶＷＦの使用であって、ここでＦＶＩＩＩの薬物製剤による血管外共投与後に、ＦＶＩＩＩの前記薬剤組成物が、同じ濃度、用量で、そして同じ様式の血管外投与であるがＶＷＦなしで投与される場合と比較して、ＦＶＩＩＩに対する阻害抗体の生成がより少ない、使用。
【請求項８】
請求項７に記載の使用であって、ここでＶＷＦ製剤がＦＶＩＩＩの薬物製剤と血管外共投与される場合、ＦＶＩＩＩの前記薬剤組成物が、同じ濃度、用量で、そして同じ様式の血管外投与であるがＶＷＦなしで投与される場合と比較して、阻害抗体の生成が少なくとも１５％少なく、ここで阻害抗体のタイターはベセズダ分析で測定される、使用。
【請求項９】
ＶＷＤ及び／又は血友病Ａを処置する薬剤を製造するためのＶＷＦの使用であって、ここで投与されるＶＷＦが血管外投与され、そして１：０.３５より小さいＶＷＦ：ＲＣｏＦ／ＶＷＦ：Ａｇ比を有する、使用。
【請求項１０】
ＶＷＤ及び／又は血友病Ａを処置する薬剤を製造するためのＶＷＦの使用であって、ここで投与されるＶＷＦが血管外投与され、そして１：１.０５に等しいか又はそれより小さいＶＷＦ：ＲＣｏＦ／ＶＷＦ：Ａｇ比を有する、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、出血性疾患の治療及び予防的処置における血管外投与のための、フォンビルブラント因子（ＶＷＦ）製剤、又は凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）との組み合わせのＶＷＦ製剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＶＷＦは、哺乳動物の血漿に存在する多量体接着性糖タンパク質であり、多様な生理機能を有する。一次止血中、ＶＷＦは血小板表面の特異的受容体及びコラーゲンなどの細胞外マトリックス成分間のメディエータとして作用する。ＧＰＩＩｂＩＩＩａ受容体を経由して、ＶＷＦは、また、血小板−血小板相互作用を促進することを介して止血にも寄与する。更に、ＶＷＦは、凝固促進ＦＶＩＩＩの担体及び安定化タンパク質としての機能を果たす。ＶＷＦは、内皮細胞及び巨核球内で２８１３アミノ酸前駆体分子として合成される。その前駆体ポリペプチドのプレ−プロ−ＶＷＦは、成熟血漿ＶＷＦに認められる２２残基シグナルペプチド、７４１残基プロペプチド及び２，０５０残基ポリペプチドから成る（非特許文献１）。血漿中に分泌されると、ＶＷＦは種々の分子サイズを有する多様な種の形態で循環する。これらのＶＷＦ分子は、２，０５０アミノ酸残基の成熟サブユニットのオリゴマー及びマルチマーから成る。ＶＷＦは、通常、１つのダイマーから５０〜１００個のダイマーから成るマルチマーまでの形態として血漿中に認めることができる（非特許文献２）。ヒト循環系におけるヒトＶＷＦのインビボ半減期は、おおよそ１２〜２０時間である。
【０００３】
ヒトの最も高頻度の遺伝性出血性疾患はフォンビルブラント病（ＶＷＤ）であり、これは血漿又は組み換え起源のＶＷＦを含有する濃縮液を用いる代償療法によって処置し得る。
【０００４】
ＶＷＦは、例えば特許文献１に記載のようにヒト血漿から調製することができる。特許文献２は、組み換えＶＷＦを分離する方法を記載している。
【０００５】
ＶＷＦはインビボでＦＶＩＩＩを安定化することが知られ、従って、血漿レベルのＦＶＩＩＩを調節する重要な役割を担い、そしてその結果として、一次及び二次止血を調節する主要因子となる。また、ＶＷＦ含有薬物製剤をＶＷＤ患者へ静脈内投与した後、２４時間で内因性ＦＶＩＩＩ：Ｃが１〜３単位／ｍｌ増加することを観察することができ、ＦＶＩＩＩに対するＶＷＦのインビボ安定化効果を示すことが知られている。
【０００６】
ＦＶＩＩＩは、哺乳動物の肝臓で産生される約２６０ｋＤａ分子質量の血漿糖タンパク質である。これは血液凝固をもたらす凝固反応のカスケードの必須成分である。このカスケード内には、第ＩＸａ因子（ＦＩＸａ）が、ＦＶＩＩＩと連動して第Ｘ因子（ＦＸ）を活性型のＦＸａに変換するステップがある。ＦＶＩＩＩはこのステップの補因子として作用し、ＦＩＸａの活性にはカルシウムイオン及びリン脂質が必須である。最も一般的な血友病性疾患は、機能的ＦＶＩＩＩの欠乏によって引き起こされ、血友病Ａと呼ばれる。
【０００７】
血友病Ａの処置の重要な進歩は、ヒトＦＶＩＩＩの完全な２，３５１アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡクローンの単離であり(特許文献３)、並びにヒトＦＶＩＩＩ遺伝子ＤＮＡ配列及びその生産のための組み換え法の提供であった。
【０００８】
クローン化ｃＤＮＡから決定されたヒトＦＶＩＩＩの推定一次アミノ酸配列分析の結果
は、それが大きな前駆体ポリペプチドからプロセシングされたヘテロダイマーであることを示す。このヘテロダイマーは、約２１０ｋＤａのＮ末端重鎖フラグメントと金属イオン依存的に会合した約８０ｋＤａのＣ末端軽鎖から成る（非特許文献３の総説を参照）。ヘテロダイマーの生理的活性化は、トロンビンによるタンパク質鎖のタンパク質分解的切断を介して起こる。トロンビンは、重鎖を９０ｋＤａタンパク質に切断し、次いで５４ｋＤａ及び４４ｋＤａフラグメントに切断する。トロンビンは、また、８０ｋＤａ軽鎖を７２ｋＤａタンパク質に切断する。それは、後者のタンパク質でありそしてカルシウムイオンにより一緒に保持される、活性ＦＶＩＩＩを構成する２つの重鎖フラグメント（上記５４ｋＤａ及び４４ｋＤａ）である。不活性化は、７２ｋＤａ及び５４ｋＤａタンパク質が、トロンビン、活性化タンパク質Ｃ又はＦＸａによって更に切断される場合に起こる。血漿中では、このＦＶＩＩＩ複合体は、上述のようにＦＶＩＩＩのタンパク質分解的破壊を阻害するように見える、５０倍過剰のＶＷＦタンパク質（「ＶＷＦ」）と結びつくことにより安定化される。
【０００９】
ＦＶＩＩＩのアミノ酸配列は、３つの構造ドメイン：３３０アミノ酸の三重Ａドメイン、９８０アミノ酸の単一Ｂドメイン、及び１５０アミノ酸の二重Ｃドメインで構成されている。Ｂドメインは他のタンパク質と相同性を有さず、そして本タンパク質の２５の可能性あるアスパラギン（Ｎ）結合グリコシル化部位のうち１８を与える。Ｂドメインは明らかに凝固における機能はなく、そして尚凝固促進活性を有するＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩ分子で欠失され得る。
【００１０】
ＦＶＩＩＩに対するＶＷＦの安定化作用も、ＣＨＯ細胞中のＶＷＦの組み換体の発現を補助するのに使用されている（非特許文献４）。
【００１１】
今日まで、血友病Ａ及びＶＷＤの標準治療は、ヒトドナー血漿から誘導したＦＶＩＩＩ及びＶＷＦ濃縮物の製剤、又はＦＶＩＩＩの場合、組み換えＦＶＩＩＩに基づく薬物製剤の頻回静脈内注射を含む。これらの代償療法は、一般的に、例えば予防的処置を受ける重度血友病Ａの患者に有効であるが、第ＶＩＩＩ因子は、約１２時間の第ＶＩＩＩ因子の短い血漿中半減期のために、週当たり約３回静脈内投与（ｉ.ｖ.）する必要がある。健常非血友病患者のＦＶＩＩＩ活性の１％を超えるレベルに、例えば０．０１Ｕ／ｍｌずつのＦＶＩＩＩのレベル上昇により既に到達している場合、重度血友病Ａは中等度血友病Ａに変わる。予防的処置では、投与計画は、ＦＶＩＩＩのトラフレベルが、健常非血友病患者のＦＶＩＩＩ活性の２〜３％レベルを下回らないように設計される。それぞれのｉ.ｖ.投与は疼痛を伴って扱いにくく、そして特に投与が主に血友病Ａと診断された患者自身又は小児の親による在宅処置で行われるために、感染のリスクを伴う。加えて、頻回ｉ.ｖ.注射は必然的に瘢痕形成をもたらし、以後の注入を妨げる。重度血友病の予防的処置は、若年、しばしば２歳未満の小児で開始されることから、そのような小さな患者の静脈に週当り３回ＦＶＩＩＩを注射することは、尚更困難である。限られた期間、ポートシステムの移植は代替法を提供し得る。反復性感染症が発生し、そしてポートが運動時に不便を引き起こす可能性があるという事実にもかかわらず、それらはそれでも一般的に静脈内注射に比べて好ましいと考えられている。
【００１２】
それ故、ＶＷＦ又はＦＶＩＩＩを静脈内注入する必要性を避けるための、大きな医学的ニーズがある。
ＦＶＩＩＩは非常に大きくそして不安的な分子であるため、皮下、筋肉内又は皮内、即ち血管外に投与した場合、不十分な吸収及び激しい分解に因り非常に低いバイオアベイラビリティを示す。
【００１３】
特許文献４には、１，０００ＩＵ／ｍｌ以上濃度のＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩのＦＶＩＩＩ製剤が、皮下、筋肉内又は皮内投与に好適であって、サルにｓ.ｃ.投与後、活性（Ｆ
ＶＩＩＩ：Ｃ）−時間曲線下面積を測定して、５〜１０％のバイオアベイラビリティが記載されている。
【００１４】
特許文献５には、有機添加物と共に少なくとも５００ＩＵ／ｍｌの濃度のＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩを含むＦＶＩＩＩ製剤は、皮下投与した場合、６時間より長時間の間、正常なＦＶＩＩＩレベルの少なくとも１.５％のＦＶＩＩＩ血漿レベルに導くことができることが記載されている。有機添加物として加水分解したゼラチン又はダイズ油乳剤、及び１，１００ＩＵ／ｍｌの濃度及び１０，０００ＩＵ／ｋｇの用量のＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩを用いて、活性（ＦＶＩＩＩ：Ｃ）−時間曲線下面積で測定して５０％以上のバイオアベイラビリティがカニクイザルで見られた。
【００１５】
特許文献６には、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ（比活性度１５，０００ＩＵ／ｍｇ；用量２，５００ＩＵ／ｋｇ）を皮下投与した場合の５.３％のバイオアベイラビリティだが、一方ＦＶＩＩＩのＰＥＧ化接合体では、カニクイザルでそれぞれ２２％及び１９％のバイオアベイラビリティを達成したことが記載されている。
【００１６】
特許文献７及び６には、ＰＥＧ化Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩのバイオアベイラビリティの増加が記載され、そして更に、ＶＷＦ及び／又は接合によるＦＶＩＩＩとＶＷＦの組み合わせを安定化し、血友病Ａ又はＶＷＤを処置するための皮下、筋肉内又は皮内投与のそれぞれを可能にすることを提案している。
【００１７】
特許文献８は、静脈内、筋肉内、又は腹腔内注射など、注射により投与できるＶＷＦのＰＥＧ化を教示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】欧州特許第０５５０３９９１号
【特許文献２】欧州特許第０７８４６３２号
【特許文献３】米国特許第４７５７００６号
【特許文献４】欧州特許第０７１０１１４号
【特許文献５】欧州特許第０７７２４５２号
【特許文献６】欧州特許第１２５８４９７号
【特許文献７】欧州特許第０８７１６４９号
【特許文献８】国際公開公報第２００６／０７１８０１号
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Fischer et al., FEBS Lett. 351: 345-348, 1994
【非特許文献２】Ruggeri et al. Thromb. Haemost. 82: 576-584, 1999
【非特許文献３】Kaufman, Transfusion Med. Revs. 6:235 (1992)
【非特許文献４】Kaufman et al. 1989, Mol Cell Biol
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２０】
今回驚くべきことに、並みはずれて大きい分子（ＶＷＦマルチマーは、１ＭＤａ〜２０ＭＤａの範囲にわたる）ではあるが、ＶＷＦは、いかなる共有結合修飾がなくても、免疫反応のリスク増加を伴い得る血管外投与により血流中に取込み得ること、そしてＶＷＦは、ＦＶＩＩＩと非静脈内で共投与した（co-administered）場合、ＦＶＩＩＩの取込みを増強するのに使用し得ることを見出した。
【００２１】
本発明は、このようにフォンビルブラント因子（ＶＷＦ）を含む、フォンビルブラント
疾患（ＶＷＤ）及び／又は血友病Ａの治療における、血管外投与に適した組成物に関する。
【００２２】
当然のことながら本発明の意味では、ＶＷＦ対ＦＶＩＩＩ（VWF over FVIII）の比は、ＶＷＦ抗原単位対ＦＶＩＩＩ活性単位の比である。
【００２３】
ＶＷＦ抗原（ＶＷＦ：Ａｇ）は種々の免疫分析により定量化し得るが、そのうちローレル（Laurell）ロケット電気泳動法、電気免疫分析（electroimmunoassay）及び固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）[Dalton & Savidge, 1989]が最も汎用されている。Seghatchian MJ & Savidge GF (eds):「第ＶＩＩＩ因子−フォンビルブラント因子（Factor VIII - von Willebrand Factor）」, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida 1989, Vol. I, pp.129-145の中の、Dalton RG, Savidge GF., 「ｖＷｆ方法の進歩とＶＷＤとの関連性（Progress in vWf methodology and its relevance in VWD）」。全てのこれらに基準として同じ標準を適用しており、全ての市販の試験は本質的に同一の結果を生ずる。
【００２４】
第ＶＩＩＩ因子活性は、一般法（１つの単一反応ステップでフィブリン形成時間を測定する（Bloom 編集、「血友病（The Hemophilias）」、NY Churchill Livingston 1992）の中の、Rizza et al. 1982．「ＦＶＩＩＩ：Ｃ及びＦＩＸａの凝固分析（Coagulation assay of FVIII:C and FIXa）」））、又は発色分析（酵素が形成する速度を、発色基質の開裂酵素を用いることにより測定する（S. Rosen, 1984. Scand J Haematol 33: 139-145, suppl.）により定量し得る。両方法は本質的に同じ所見を生じ、そしてまた、全く同じにＦＶＩＩＩ：Ｃと名前が付けられている。
【００２５】
ＶＷＦ：Ａｇ及びＦＶＩＩＩ：Ｃの両方に対して、１つの国際単位（ＩＵ）が世界保健機構によって確立された現在の国際標準で規定されており、１ＩＵのＦＶＩＩＩ：Ｃ又はＶＷＦ：Ａｇは、新鮮プールヒト血漿の１．０ｍＬ中に認められるＦＶＩＩＩ又はＶＷＦのレベルにほぼ等しい。
【００２６】
本発明の別の実施態様は、フォンビルブラント因子（ＶＷＦ）、又はＦＶＩＩＩ及びＶＷＦを含む薬剤組成物を含む、フォンビルブラント病（ＶＷＤ）及び／又は血友病Ａの治療における、血管外投与に適した薬剤組成物の使用であって、ここでＶＷＦ抗原対ＦＶＩＩＩ活性の比が２：１より大きい、使用である。血管外投与する場合のＶＷＤ及び／又は血友病Ａを処置する薬剤を製造するためである。
【００２７】
非限定的な一例として、ＶＷＦ抗原対ＦＶＩＩＩ活性の比は、２：１より大きく、好ましくは３：１より大きく、更に好ましくは５：１より大きく、尚更に好ましくは１５：１より大きく、そして最も好ましくは２５：１より大きくてよい。
【００２８】
また、ＶＷＤ及び／又は血友病Ａを処置する薬剤を製造するためのＶＷＦの使用であって、ここでＦＶＩＩＩの前記薬剤組成物が、同じ濃度、用量で、そして同じ様式の血管外投与であるがＶＷＦなしで投与される場合のそれぞれのパラメータと比較して、ＦＶＩＩＩの薬物製剤との血管外共投与後の、
ａ）注射後、血漿中のＦＶＩＩＩ活性を、少なくとも０．０１Ｕ／ｍｌ高める期間が、好ましくは３倍、より好ましくは５倍、最も好ましくは１０倍延長される；又は、
ｂ）血漿中のＦＶＩＩＩ活性の最大濃度が、好ましくは３倍、より好ましくは１０倍、最も好ましくは２０倍増加する；又は、
ｃ）ＦＶＩＩＩ活性のデータ曲線下面積（ＡＵＤＣ）が、好ましくは５倍、より好ましくは１５倍、最も好ましくは３０倍増加する；
のいずれかである、使用も、本発明に包含される。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
好ましくは精製ＶＷＦが使用される。本発明の意味する精製ＶＷＦは、血漿中濃度に比べて、少なくとも２０倍、好ましくは少なくとも７５倍、より好ましくは少なくとも１５０倍高い濃度で、ＶＷＦ：Ａｇが液体で又は凍結保存の場合は注射前の再構成後に液体で存在するＶＷＦ組成物を包含する。好ましくは再懸濁クリオプレシピテート及び他の低純度製剤のＶＷＦは使用されず、そして精製ＶＷＦは、クリオプレシピテート中より高純度に濃縮される。好ましくは１ＵのＶＷＦ：Ａｇ／ｍｇ総タンパク質（安定化タンパク質無添加）より大きい純度のＶＷＦ、より好ましくは１０ＵのＶＷＦ：Ａｇ／ｍｇ総タンパク質（安定化タンパク質無添加）より高い純度のＶＷＦ、更により好ましくは２５ＵのＶＷＦ：Ａｇ／ｍｇ総タンパク質（安定化タンパク質無添加）より高い純度のＶＷＦが使用される。
【００３０】
好ましくは精製ＦＶＩＩＩが使用される。本発明の意味する精製ＦＶＩＩＩは、血漿中濃度に比べて、少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも３０倍、より好ましくは少なくとも７０倍で、ＦＶＩＩＩ：Ｃが液体で又は凍結保存の場合は注射前の再構成後に液体で存在するＦＶＩＩＩ組成物を包含する。望ましくは再懸濁クリオプレシピテートは使用されず、そして精製ＦＶＩＩＩは、クリオプレシピテート中のＦＶＩＩＩより高純度に濃縮される。好ましくは、１ＩＵ／ｍｇの、又はより好ましくは５ＩＵ／ｍｇより大きい、又は更により好ましくは１０ＩＵ／ｍｇより大きい比活性（安定化タンパク質無添加のＦＶＩＩＩ：Ｃ／ｍｇ総タンパク質）のＦＶＩＩＩが使用される。
【００３１】
好ましくは、ＶＷＦ又はＦＶＩＩＩと組み合わせのＶＷＦを含む製剤は皮下投与される。しかしながら、全ての他の血管外投与方法、例えば筋肉内又は皮内投与も包含される。
限定されないが一例として、ＶＷＦの濃度は、１５０Ｕ（ＶＷＦ：Ａｇ）／ｍＬ以上、好ましくは４５０Ｕ（ＶＷＦ：Ａｇ）／ｍＬ以上、最も好ましくは１，５００Ｕ（ＶＷＦ：Ａｇ）／ｍＬ以上である。
【００３２】
通常用量は、２２５Ｕ（ＶＷＦ：Ａｇ）／ｋｇ以上又は７５Ｕ（ＶＷＦ：Ａｇ）／ｋｇ以上、又は１５Ｕ（ＶＷＦ：Ａｇ）／ｋｇ以上であり得る。
限定されないが一例として、ＦＶＩＩＩに対する通常用量は、７５Ｕ／ｋｇ以上又は２５Ｕ／ｋｇ以上又は５Ｕ／ｋｇ以上であり得る。
【００３３】
ＶＷＦ又はＦＶＩＩＩ源は重要ではなく、例えば、ヒト血漿から誘導し又は組み換えで生産し得る。
【００３４】
ＦＶＩＩＩが組み換えの場合、完全長型か又は好ましくはその欠失誘導体であり得る。更に好ましくは、欠失誘導体は、組み換え第ＶＩＩＩ因子ＳＱ（ｒ−ＶＩＩＩＳＱ）である。欠失誘導体は、本発明ではＢドメインの全部又は一部が欠落している凝固第ＶＩＩＩ因子を意味する。加えて、第ＶＩＩＩ因子分子、及び特にｒ−ＶＩＩＩＳＱ分子は、インビボでの分子の安定性を向上させるために、例えばＰＥＧ化、共有結合した糖質又はポリペプチドにより化学修飾され得る。
【００３５】
本発明は、更に本出願に記載の修飾ＶＷＦ又はＦＶＩＩＩをコードするポリヌクレオチドに関する。用語「ポリヌクレオチド」は、一般的に非修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又は修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡであってもよい任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを意味する。ポリヌクレオチドは一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ、一本鎖又は二本鎖ＲＮＡであってよい。本明細書で使用される用語「ポリヌクレオチド」は、また、１つ又はそれ以上の修飾塩基及びイノシンなどの特異塩基を含むＤＮＡ又はＲＮＡをも含む。当然のことながら、当業者に公知の多くの有用な目的にかなう様々な修飾を、ＤＮＡ及びＲＮＡに対して行ない得る。本明細書で用いられる用語「ポリヌクレオチド」は、ポリ
ヌクレオチドのそのような化学的、酵素的又は代謝的修飾型、並びにウイルス、及び例えば単純型及び複合型細胞を含む、細胞に特徴的なＤＮＡ及びＲＮＡの化学型を包含する。
【００３６】
当業者には当然のことながら、遺伝コードの縮重に因り、所定のポリペプチドは異なるポリヌクレオチドによりコード化され得る。これらの「変異体」は本発明に包含される。
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは精製ポリヌクレオチドである。用語「精製」ポリヌクレオチドは、他の染色体及び染色体外のＤＮＡ及びＲＮＡなどであるがそれらに限定されない、他の核酸配列を実質的に含まないポリヌクレオチドを意味する。精製ポリヌクレオチドは宿主細胞から精製してもよい。精製ポリヌクレオチドを得るために、当業者に知られた従来の核酸精製法を使用してもよい。この用語は、また、組み換えポリヌクレオチド及び化学合成ポリヌクレオチドをも含む。
【００３７】
本発明の更に別の側面は、本発明のポリヌクレオチドを含むプラスミド又はベクターである。好ましくは、プラスミド又はベクターは発現ベクターである。特定の実施態様では、ベクターはヒト遺伝子治療に使用する導入ベクターである。
【００３８】
本発明の尚別の側面は、本発明のポリヌクレオチド又は本発明のプラスミド若しくはベクターを含む宿主細胞である。
【００３９】
本発明の宿主細胞は、本発明の一部である組み換えＶＷＦ及び／又は組み換えＦＶＩＩＩを生産する方法において使用し得る。その方法は：
ａ）ＶＷＦ及び／又はＦＶＩＩＩが発現するような条件下で本発明の宿主細胞を培養すること；及び
ｂ）場合により、宿主細胞又は培地からＶＷＦ及び／又はＦＶＩＩＩを選択的に回収すること；を含む。
【００４０】
グリコシル化又は他の翻訳後修飾の程度及び位置は、選択した宿主細胞及び宿主細胞環境の特性により変動し得る。特異的なアミノ酸配列に関する場合、そのような配列の翻訳後修飾は、本出願に包含される。
【００４１】
本出願で使用される「ＦＶＩＩＩ」は、不活性型（ＦＶＩＩＩ）から成る生産物を意味する。本発明で使用される「ＦＶＩＩＩ」及び「ＶＷＦ」は、それぞれ天然のヒトＦＶＩＩＩ及びＶＷＦのアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。それは、また、それらのタンパク質が、それぞれ実質的にＦＶＩＩＩ又はＶＷＦの活性を保持する限り、若干修飾したアミノ酸配列を有するタンパク質、例えばＮ末端アミノ酸欠失又は付加を含む修飾Ｎ末端を有するタンパク質をも含む。上記の定義内の「ＦＶＩＩＩ」及び「ＶＷＦ」は、また、個体ごとに存在し、生じる可能性のある天然の対立遺伝子変異をも含む。上記の定義内の「ＦＶＩＩＩ」又は「ＶＷＦ」は、更にＦＶＩＩＩ又はＶＷＦの変異体をも含む。そのような変異体は、１つ又はそれ以上のアミノ酸残基において野生型配列と異なる。そのような相異の例は、１つ又はそれ以上のアミノ酸残基（例えば、１〜１０のアミノ酸残基）によるＮ−及び／又はＣ−末端のトランケーション、又はＮ−及び／又はＣ−末端での１つ又はそれ以上の過剰残基の付加、例えばＮ末端でのメチオニン残基の付加、並びに保存アミノ酸置換、即ち類似の特性を有するアミノ酸群、例えば（１）小型アミノ酸、（２）酸性アミノ酸、（３）極性アミノ酸、（４）塩基性アミノ酸、（５）疎水性アミノ酸、（６）芳香族アミノ酸の中で行われる置換を含んでもよい。そのような保存置換の例は以下の表に示される。
【００４２】
【表１】
2010529155.tif 000003
【００４３】
用語「組み換え」とは、例えば、変異体が遺伝子工学技術により宿主生物中に生産されることを意味する。本発明のＦＶＩＩＩ又はＶＷＦ変異体は、通常は組み換え変異体である。
【００４４】
提案変異体の発現：
好適な宿主細胞における高レベルの組み換えタンパク質の生産は、当業者に知られた方法により種々の発現系中で成長し得る、組み換え発現ベクターにおける好適な調節要素と共に、効率的な転写単位への上記修飾ｃＤＮＡの集合を必要とする。好適には、シミアンウイルス４０、アデノウイルス、ＢＫポリオーマウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、若しくはラウス肉腫ウイルスの長末端反復由来のプロモーター−エンハンサー組み合わせ、又はβアクチン若しくはＧＲＰ７８のように動物細胞中で強力な構成的転写遺伝子を含むプロモーター−エンハンサー組み合わせが使用できる。ｃＤＮＡから転写された安定で高レベルのｍＲＮＡを達成するために、転写ユニットは、転写終結−ポリアデニル化配列をコードするＤＮＡ領域をその３′−近位部に含有しなければならない。好適には、この配列は、シミアンウイルス４０初期転写領域、ウサギβグロビン遺伝子、又はヒト組織プラスミノーゲンアクチベータ遺伝子から誘導される。
【００４５】
次いで、ｃＤＮＡは、ＦＶＩＩＩ又はＶＷＦの発現のために適した宿主細胞のゲノム中に組み込まれる。正しい折畳み、Ｇｌａドメイン合成、ジスルフィド結合形成、アスパラギン結合グリコシル化、Ｏ結合グリコシル化、及び他の翻訳後修飾、並びに培養培地への分泌を確実にするために、好ましくは、この細胞系は脊椎動物起源の動物細胞系であるべきである。他の翻訳後修飾の例は、新生ポリペプチド鎖のヒドロキシル化及びタンパク質分解プロセシングである。使用できる細胞系の例は、サルＣＯＳ細胞、マウスＬ細胞、マウスＣ１２７細胞、ハムスターＢＫＨ−２１細胞、ヒト胚腎臓２９３細胞、及びハムスターＣＨＯ細胞である。
【００４６】
対応するｃＤＮＡをコードする組み換え発現ベクターは、幾つかの異なる方法で動物細胞系へ導入し得る。例えば、組み換え発現ベクターは、異なる動物ウイルスに基づくベクターから作製し得る。これらの例は、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、及び好ましくはウシパピローマウイルスに基づくものである。
【００４７】
対応するＤＮＡをコードする転写単位は、また、別の組み換え遺伝子と併せて動物細胞へ導入でき、組み換えＤＮＡをそれらのゲノムへ統合している特異的細胞クローンの分離を促進するために、これらの細胞中で優性選択可能なマーカーとして機能し得る。このタイプの優性選択可能なマーカー遺伝子の例は、ゲネチシン（Ｇ４１８）に耐性を付与する
Ｔｎ５アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンに耐性を付与するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、ピューロマイシンに耐性を付与するピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼである。このような選択可能なマーカーをコードする組み換え発現ベクターは、所望のタンパク質をコードするベクターと同じベクター上に残り得るか、又はそれは宿主細胞のゲノムに同時に導入され組み込まれて、高頻度に異なる転写単位間で緊密な物理的連結をもたらす、分離ベクター上にコードされ得る。
【００４８】
所望のタンパク質のｃＤＮＡと併せて使用し得る他のタイプの選択可能なマーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）をコードする種々の転写単位に基づいている。内因性ｄｈｆｒ活性を欠如している細胞、好ましくはＣＨＯ細胞（ＤＵＫＸ−Ｂ１１、ＤＧ−４４）へこのタイプの遺伝子を導入した後、これらをヌクレオシド欠乏培地で生育させることができる。このような培地の例は、ヒポキサンチン、チミジン、及びグリシンのないＨａｍＦ１２である。これらのｄｈｆｒ遺伝子は、同じベクター上か又は異なるベクター上で連結して、凝固因子ｃＤＮＡ転写単位と併せて上記タイプのＣＨＯ細胞に導入され、このようにして組み換えタンパク質を生産するｄｈｆｒ陽性細胞系を作出し得る。
【００４９】
上記細胞系が細胞毒性ｄｈｆｒ阻害剤メトトレキサートの存在下に生育する場合、メトトレキサートに耐性を有する新しい細胞系が出現する。これらの細胞系は、連結ｄｈｆｒ及び所望のタンパク質の転写単位の数の増幅に因り、組み換えタンパク質を速度を増大して生産し得る。メトトレキサートの濃度を増加させて（１〜１０，０００ｎＭ）これらの細胞系を成長させる場合、非常に高い率で所望のタンパク質を生産する新しい細胞系を得ることができる。
【００５０】
所望のタンパク質を生産する上記細胞系は、懸濁培養か又は種々の固体支持体上で、大規模に増殖し得る。これらの支持体の例は、デキストラン若しくはコラーゲンマトリックスによるマイクロキャリア、又は中空糸若しくは種々のセラミック材料の形態での固体支持体である。細胞懸濁培養で又はマイクロキャリアで増殖する場合、上記細胞系の培養は、槽培養としてか、又長期間にわたる馴化培地の連続的生産による潅流培養として行い得る。このように本発明に記載の上記細胞系は、所望の組み換えタンパク質生産の工業的方法の開発に好適である。
【００５１】
上記タイプの分泌細胞の培地に蓄積する組み換えタンパク質は、細胞培養培地中の所望のタンパク質と他の物質間の、サイズ、電荷、疎水性、溶解度、特異親和性等の差を利用する方法を含み、種々の生化学的及びクロマトグラフィー法により濃縮及び精製し得る。
【００５２】
そのような精製法の例は、固体支持体に固定化されたモノクローナル抗体への組み換えタンパク質の吸着である。脱着後、タンパク質は、上記性質に基づいて種々のクロマトグラフィー法により更に精製される。
【００５３】
本発明の生物活性ＦＶＩＩＩ又はＶＷＦは、≧８０％純度、より好ましくは≧９５％純度まで精製することが望ましく、そして夾雑高分子物質、特に他のタンパク質及び核酸に関して９９.９％純度より高く、且つ、感染及び発熱因子のない薬剤的に純粋な状態が特に好ましい。好ましくは、本発明の単離又は精製した生物活性ＦＶＩＩＩ又はＶＷＦは、ＦＶＩＩＩ及びＶＷＦと併用して投与される場合を除いて、実質的に他のポリペプチドを含まない。
【００５４】
本発明に記載の組み換えタンパク質は、治療上使用するための薬物製剤に製剤化し得る。精製タンパク質は、従来の生理的適合性の水性緩衝液に溶解され、場合により、薬学的賦形剤を添加して薬物製剤を得ることができる。
【００５５】
そのような薬剤用担体及び賦形剤、及び好適な薬物製剤は当業者によく知られている（例えば、「ペプチド及びタンパク質の医薬製剤開発（“Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins”）」, Frokjaer et al., Taylor & Francis (2000) 又は「医薬品賦形剤便覧（“Handbook of Pharmaceutical Excipients”）」, 3rd edition, Kibbe et al., Pharmaceutical Press (2000)を参照）。特に、本発明のポリペプチド変異体を含む薬剤組成物は、凍結乾燥又は安定な可溶形態に製剤化し得る。ポリペプチド変異体は、当業者によく知られた種々の手法により凍結乾燥し得る。凍結乾燥製剤は、注射用滅菌水又は滅菌生理食塩水などの１つ又はそれ以上の薬学的に許容される希釈剤の添加によって、使用前に再構成される。
【００５６】
組成物の製剤は、非静脈内投与の任意の薬剤的に適切な方法により個体に送達される。種々の送達システムが公知であり、そして任意の簡便な経路によって組成物を投与するために使用し得る。好ましくは本発明の組成物は、皮下、筋肉内、腹腔内、大脳内、肺内、鼻腔内又は経皮投与用に、最も好ましくは皮下、筋肉内又は経皮投与用に従来法により製剤化される。製剤は注入により、又はボーラス注入により連続的に投与し得る。特定の製剤としては、徐放システムを包含する。
【００５７】
本発明の修飾された生物活性ＦＶＩＩＩ及びＶＷＦポリペプチドは治療的有効用量で患者に投与されるが、治療的有効用量の意味するところは、所望の効果を生み出すのに十分で、耐えられない有害副反応をもたらす用量に到達することなしに、治療される病態又は適応症の重症度又は拡大を予防し又は軽減する用量である。的確な用量は、例えば適応症、製剤、投与方法のような多くの要素によって決まり、そしてそれぞれの適応症に対する前臨床及び臨床試験で決定されるべきである。
【００５８】
本発明の薬剤組成物は、単独で又は他の治療薬と併せて投与し得る。これらの薬剤は同じ薬剤の一部として組み込まれてもよい。
本発明の別の側面は、血液凝固障害を処置又は予防する薬剤を製造するための、本明細書に記載のＶＷＦ又はＦＶＩＩＩと組み合わせたＶＷＦ、本発明のポリヌクレオチド、本発明のプラスミド若しくはベクター、又は本発明の宿主細胞の使用である。血液凝固障害は、血友病Ａ及びＶＷＤ、又はＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａ欠乏症を含むが、これらに限定されるものではない。むしろこれらの疾患は、それぞれの凝固因子に対する自己抗体により引き起こされ、又は先天性型がそれにより悪化する。特定の実施態様では、処置しようとする患者は第ＦＶＩＩＩ因子に対するインヒビター抗体を有する。好ましくは、処置はヒト遺伝子療法を含む。
【００５９】
投与方法は、好ましくは皮下であるが、全ての血管外投与経路を包含する。このことは、表面投与、即ち静脈内注射と対照的な非血管内投与が、患者にとって最も好ましいことを意味する。大部分の表面投与は上皮表面を経て（皮膚に）投与されることになる。パッチ経由の投与は特に臨床的に有用である。この局所投与は、皮膚を介する取り込みを必要とし、これはしかしながら、表在びらんだけでなく無傷の皮膚も完全に選ばれ、そして点眼薬及び鼻内投与を含む。上皮表面を介する投与としては吸入が含まれ、タンパク質で覆われた異常に大きい表面のために好適であり、迅速取込み及び肝臓の迂回をもたらす。上皮表面への投与としては、口腔内又は舌下に保持される剤形、即ちバッカル又は舌下剤形が含まれ、チューインガムとしてさえも可能である。口内のｐＨは相対的に中性（酸性の胃環境と対照的）なので、これはＦＶＩＩＩなどの不安定なタンパク質に対して有利である。また、腟内及び直腸投与でさえも、また、直腸から水分を抜く静脈のいくつかが直接全身循環系へ至るので考慮することができる。一般的に、これは若い小児のように経口経路を経由して物質を取込むことができない患者に最も有用である。
【００６０】
皮内注射（皮膚内）はより侵襲的な投与方法であるが、介助又は経験者による実行さえない処置のために尚好適であり得る。皮内投与に続いて、皮下注射(皮膚直下)が行なわれる。一般的に取り込みは全く十分であり、そして注射部位を加温又はマッサージすることにより増加し得る。代わりに、血管収縮を起こすことができ、逆の挙動をもたらす、即ち吸着を低減するが効果を持続させることができる。
【００６１】
更により侵襲性の血管外投与としては、筋肉内送達（筋肉体内へ）が含まれる。これは脂肪組織を迂回することにより利点をもたらし得るが、しかし一般に皮下注射より痛みを伴い、そして特に注射で改善すべき欠乏凝固系によって特徴付けられる患者では、出血を引き起こす組織病変のリスクがある。
【００６２】
侵襲の程度に無関係に、ＶＷＦ：ＦＶＩＩＩ複合体は、上皮表面に高親和性を有するようにデザインし、そして吸着を改善するためにＶＷＦ：ＦＶＩＩＩ複合体を担持し得る、生分解性微粒子に担持させてもよい。
【００６３】
本発明は、また、血友病Ａ又はＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａ欠乏症などの血液凝固障害に罹患している個体を処置する方法に関し、好ましくはこれらの疾患は、それぞれの凝固因子に対する自己抗体により引き起こされ、又は先天性型はそれにより悪化する。この方法は、本明細書に記載の有効量のＶＷＦ又はＦＶＩＩＩと組み合わせたＶＷＦを含む薬剤組成物を、該個体に投与することを含む。別の実施態様においては、この方法は、有効量の本発明のポリヌクレオチド又は本発明のプラスミド若しくはベクターを、個体に投与することを含む。代わりに、この方法は、本明細書に記載の本発明の有効量の宿主細胞を個体に投与することを含んでもよい。
【００６４】
血友病Ａの治療における主要課題の１つは、ＦＶＩＩＩに対する中和抗体の発現である。これらの患者の約２５％は、ＦＶＩＩＩの活性を中和する阻害抗体を発現する。従って、ＦＶＩＩＩの補充は、患者の止血を補正するのにもはや役に立たない。そのような阻害抗体は一般的に最初の２、３の治療により発現するが、現時点ではどのような患者がこの合併症に罹るかを予測するのは非常に困難である。使用された特定のＦＶＩＩＩ濃縮物がこの役割を果たしているか否かが、科学文献において議論の的になっている。最大の免疫応答を達成するようにデザインされた他のタンパク質から、投与方法が重要な役割を果たす、即ち、静脈内注射が一般的には皮下注射よりも免疫原性が小さいことは、少なくとも明らかである。しかしながら、驚くべきことに、皮下注射で投与しても、ＦＶＩＩＩをＶＷＦと共に製剤化した場合、この製剤は、血友病Ａマウスにおいて、静脈内投与したＦＶＩＩＩよりも阻害抗体を生成するのが少なく、そしてＦＶＩＩＩの皮下投与よりも阻害抗体を生成するのが確実に少ないことを見出した。
【００６５】
従って、本発明の別の実施態様は、ＶＷＤ及び／又は血友病Ａを処置する薬剤を製造するためのＶＷＦの使用であって、ここでＦＶＩＩＩの薬物製剤による血管外共投与（co-administration）後に、ＦＶＩＩＩの該薬物製剤が同じ濃度、用量で、そして同じ様式の血管外投与であるがＶＷＦなしで投与する場合に比べて、ＦＶＩＩＩに対する阻害抗体の生成がより少ない使用である。
【００６６】
ＦＶＩＩＩの静脈内投与では、ＶＷＦとのＦＶＩＩＩの製剤が、ＦＶＩＩＩに対する阻害抗体の生成リスクを低減し得るかについての科学文献で議論が進行中である。本発明者らのデータ(実施例１０)は、ＶＷＦ配合ＦＶＩＩＩを投与した場合、ＦＶＩＩＩに対する阻害抗体の生成低下を示す。
【００６７】
本発明の好ましい実施態様では、ＶＷＦ製剤をＦＶＩＩＩの薬物製剤と血管外で共投与する場合、ＦＶＩＩＩの前記薬剤組成物を同じ濃度、用量で、そして同じ様式の血管外投
与であるがＶＷＦなしで投与する場合に比べて、阻害抗体の生成が少なくとも１５％少なく、ここで、阻害抗体のタイターはベセズダ（Bethesda）分析によって測定される（Goudemand J., Haemophilia, Vol. 13 Suppl. 5: 47-51, 2007; Ettingshausen C.E., Kreuz W., Haemophilia, Vol. 12 Suppl. 6: 102-106, 2006）。
【００６８】
好ましくは、ＶＷＦ製剤をＦＶＩＩＩの薬物製剤と血管外で共投与する場合、ＦＶＩＩＩの前記薬剤組成物を同じ濃度、用量で、そして同じ様式の血管外投与であるがＶＷＦなしで投与する場合に比べて、阻害抗体の生成が、２５％少なく、ここで、阻害抗体のタイターはベセズダ（Bethesda）分析によって測定される(Goudemand J., Haemophilia, Vol.
13 Suppl. 5: 47-51, 2007; Ettingshausen C.E., Kreuz W., Haemophilia, Vol. 12 Suppl. 6: 102-106, 2006)。
【００６９】
より好ましくは、ＶＷＦ製剤をＦＶＩＩＩの薬物製剤と血管外で共投与する場合、ＦＶＩＩＩの前記薬剤組成物を同じ濃度、用量で、そして同じ様式の血管外投与であるがＶＷＦなしで投与する場合に比べて、阻害抗体の生成が、５０％少なく、ここで、阻害抗体のタイターはベセズダ（Bethesda）分析によって測定される。
【００７０】
最も好ましくは、ＶＷＦ製剤をＦＶＩＩＩの薬物製剤と血管外で共投与する場合、ＦＶＩＩＩの前記薬剤組成物を同じ濃度、用量で、そして同じ様式の血管外投与であるがＶＷＦなしで投与する場合に比べて、阻害抗体の生成が、７５％少なく、ここで、阻害抗体のタイターはベセズダ（Bethesda）分析によって測定される。  
【００７１】
本発明の別の好ましい実施態様においては、ＦＶＩＩＩに対する阻害抗体の生成は、これまで未治療の血友病Ａ患者が受けるＦＶＩＩＩの初期投与量時に最も起こり易いことから、そのようなＶＷＦ配合ＦＶＩＩＩは、未治療患者に対して血管外投与される。
【００７２】
ＦＶＩＩＩをＶＷＦと組み合わせて血管外で投与する場合、本発明の更に別の好ましい実施態様においては、投与ＶＷＦは、１：０.３５より小さく、好ましくは１：１.０５と同等かそれより小さいＶＷＦ：ＲＣｏＦ／ＶＷＦ：Ａｇ比を有する。
【００７３】
本発明の別の好ましい実施態様は、ＶＷＤ及び／又は血友病Ａを処置する薬剤を製造するためのＶＷＦの使用であって、投与されるＶＷＦが血管外で投与され、そして１：０.３５より小さく、又は好ましくは１：１.０５より小さいＶＷＦ：ＲＣｏＦ／ＶＷＦ：Ａｇ比を有する使用である。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】図１は、静脈又は皮下注射した２００Ｕ／ｋｇのMonoclate-P（登録商標）の薬物動態（ｎ＝２／群；平均＋ＳＤ）である。
【図２】図２は、１００Ｕ／ｋｇのMonoclate-P（登録商標）の静脈内又は皮下、及び１，８００Ｕ／ｋｇの皮下後のＦＶＩＩＩノックアウト・マウスの血漿ＦＶＩＩＩ活性（平均＋ＳＤ；ｎ＝４〜５／時点）である。
【図３】図３は、１，８００Ｕ（ＦＶＩＩＩ：Ｃ）／ｋｇのMonoclate-P（登録商標）又はHaemate  P（登録商標） 後のＦＶＩＩＩノックアウト・マウスのＦＶＩＩＩ活性の血漿レベル（平均＋ＳＤ；ｎ＝４〜５／時点）である。
【図４】図４は、９００又は１，８００Ｕ（ＦＶＩＩＩ：Ｃ）／ｋｇのHaemate P（登録商標）の、皮下注射後２日までの平均ＦＶＩＩＩ活性＋ＳＤ（ｎ＝５／時点）である。
【図５】図５は、変化したＶＷＦ：Ａｇ／ＦＶＩＩＩ：Ｃ比で特徴付けられる、４００Ｕ（ＦＶＩＩＩ：Ｃ）／ｋｇのHaemate P（登録商標）の、皮下注射後２日までの平均ＦＶＩＩＩ活性±ＳＤ（ｎ＝５／時点）である。
【図６】図６は、標準及び増加したＶＷＦ：Ａｇ／ＦＶＩＩＩ：Ｃ比で特徴付けられる、２００Ｕ（ＦＶＩＩＩ：Ｃ）／ｋｇのHaemate P（登録商標）の、皮下注射後２日までの平均ＦＶＩＩＩ活性＋ＳＤの経時変化（ｎ＝５／時点）である。
【図７】図７は、ＶＷＦ：Ａｇ／ＦＶＩＩＩ：Ｃ比の増加によるＡＵＤＣ（ＦＶＩＩＩ）の増加である。
【図８】図８は、Haemate P（登録商標）の皮下注射後の、血餅形成時間（ＴＥＭで）（ｎ＝７〜２４；平均＋ＳＤ）である。
【図９】図９は、Haemate P（登録商標）の皮下注射後の、アルファ（ＴＥＭで）（ｎ＝７〜２４；平均＋ＳＤ）である。
【図１０】図１０は、１００Ｕ（ＦＶＩＩＩ：Ｃ）／ｋｇのHaemate P（登録商標） 又はHelixateの静脈内注射後のＦＶＩＩＩノックアウト・マウスにおける、ヒトＦＶＩＩＩ：Ａｇ薬物動態の比較（平均＋ＳＤ；ｎ＝３〜５／時点）である。
【図１１】図１１は、５０Ｕ（ＦＶＩＩＩ：Ｃ）／ｋｇのHaemate P（登録商標）又はMonoclate-Pの静脈内注射後のＶＷＦノックアウト・マウスにおける、ヒトＦＶＩＩＩ：Ａｇ薬物動態の比較（平均＋ＳＤ；ｎ＝５〜６／時点）である。
【図１２】図１２は、ＦＶＩＩＩノックアウト及びＶＷＦノックアウト・マウスに対する４００Ｕ（ＦＶＩＩＩ：Ｃ）／ｋｇのHaemate P（登録商標）の皮下注射後の、血漿中ＦＶＩＩＩ活性の比較（平均＋ＳＤ；ｎ＝４〜５／時点）である。
【図１３】図１３は、ウサギに２，３００Ｕ（ＶＷＦ：Ａｇ）／ｋｇのHaemate P（登録商標）の皮下注射後の、ＶＷＦ：Ａｇの経時変化（平均＋ＳＤ；ｎ＝４／時点）である。
【図１４】図１４は、５２３Ｕ（ＶＷＦ：Ａｇ）／ｋｇの皮下注射後３日までの、平均ＶＷＦ：Ａｇ、ＶＷＦ：ＲＣｏ及びＦＶＩＩＩ：Ｃ血漿レベルの経時変化（ｎ＝５／時点）である。
【図１５】図１５は、ＦＶＩＩＩの静脈内又は皮下投与後の、抗ＦＶＩＩＩ抗体及びＦＶＩＩＩ阻害抗体（ベセズダ（Bethesda）分析）の生成に対するＶＷＦの役割である。
【図１６】図１６は、異なるＶＷＦ：ＲＣｏ／ＶＷＦ：Ａｇ比によって特徴付けられる、５００Ｕ（ＦＶＩＩＩ：Ｃ）／ｋｇのHaemate P（登録商標）製剤の皮下注射後の平均ＦＶＩＩＩ活性血漿レベル±ＳＤの経時変化（ｎ＝４／時点）である。
【実施例】
【００７５】
［実施例１］
ウサギに皮下投与したMonoclate-P（登録商標）のバイオアベイラビリティの評価
２００Ｕ／ｋｇのＦＶＩＩＩ（Monoclate-P（登録商標））を、ｔ＝０に静脈内(耳介静脈)経路を介し、又はｔ＝０に皮下(頚部)経路を介して、約２.５〜３ｋｇの重量のＣＨＢウサギに単回注射で投与した。ＦＶＩＩＩ：抗原の測定のために、投薬前(ベースライン)及び５、１５、３０、４５分、１、２、４、６、８及び２４時間に、血液試料を耳介静脈（静脈内注射の場合は反対側の）から採血した（表１）。血液は１０％クエン酸血液で抗凝固処理した。ヒトＦＶＩＩＩ：Ａｇは、血液を遠心分離で処理し、市販のＥＬＩＳＡ；Cedarlane Laboratories Ltd. を用いて血漿で定量した。血漿は、分析前に−２０℃で保存した。図１に、皮下投与した高純度の血漿ＦＶＩＩＩの低いバイオアベイラビリティが例証される。皮下注射した微量のＦＶＩＩＩが血流に達していた。ピーク血漿レベルはおよそ０.０５Ｕ／ｍｌに達したが、それは０.０３Ｕ／ｍｌのベースライン値に近く、ウサギタンパク質に対するＥＬＩＳＡの交差反応に対応していた。ベースラインを補正したMonoclate-P（登録商標）の相対的ＡＵＤＣ（バイオアベイラビリティ）は低く、言い換えれば＜５％であった。
ＡＵＤＣは、血漿中濃度−時間データ曲線下面積（台形公式により計算した）であり、そしてバイオアベイラビリティは（ＡＵＤＣ（皮下）×用量（静脈））／ＡＵＤＣ（静脈）×用量（皮下））として計算される。
【００７６】
【表２】
2010529155.tif 000004
【００７７】
［実施例２］
血友病Ａモデルにおける皮下投与Monoclate-P（登録商標）のバイオアベイラビリティ評価（ＦＶＩＩＩノックアウト・マウス）
実施例１においてMonoclate-P（登録商標）の相対的バイオアベイラビリティを評価するモデルとして用いられた健常ウサギは、生理的に正常レベルの内因性ＦＶＩＩＩを有していた。この状況は、皮下注射後のMonoclate-P（登録商標）の再吸収を抑制し、その結果その相対的バイオアベイラビリティを過小評価すると考えられた。加えて、抗原に基づくアプローチは、ウサギモデルでは内因性と体外投与のヒトＦＶＩＩＩの差別化を可能にする特異的な定量法が必要とされた。しかしながら、抗原に基づく方法は、再吸収したＦＶＩＩＩの機能活性に関する結論をもたらさない。
【００７８】
これらの問題に対処するために、約２５ｇの重量のＦＶＩＩＩノックアウト・マウスを血友病Ａモデルとして使用した。これらのマウスは、ＦＶＩＩＩを発現しない（Bi L. et
al, Nature genetics, 1995, Vol 10(1), 119-121; Bi L. et al, Blood, 1996, Vol 88(9), 3446-3450）。このことが、ＦＶＩＩＩノックアウト・マウスの血漿中に実験的に投与したＦＶＩＩＩ活性の定量を可能にした。１００Ｕ／ｋｇ又は１，８００Ｕ／ｋｇのＦＶＩＩＩ（Monoclate-P（登録商標））を、単回注射によりｔ＝０で静脈内(尾静脈)経路で投与した。同じデザインにより、１００Ｕ／ｋｇのＦＶＩＩＩ（Monoclate-P（登録商標））を、皮下(頚部)経路で投与した。短時間麻酔下に、血液試料を眼窩後方で採取し、クエン酸カルシウムを用いて１０から２０％のクエン酸血液に抗凝固処理し、血漿に処理し、そしてＦＶＩＩＩ活性の定量のために−２０℃で保存した。静脈内注射でのサンプリング時間は：ベースライン時点、５、３０分、２、４、６及び２４時間とし、皮下注射では、追加試料をｔ＝８時間で採取した（表２）。血漿中のＦＶＩＩＩ活性の定量は、標準の、ａＰＴＴに基づく方法（Behring凝固タイマー）により実施した。
【００７９】
ＦＶＩＩＩノックアウト・マウスの結果を併せると、ウサギで得られた結果と一致した。１００Ｕ（ＦＶＩＩＩ：Ｃ）／ｋｇのMonoclate-P（登録商標）静脈内に対するＡＵＤＣ0-1dは約２７.８時間・Ｕ／ｍｌで、同じ用量の皮下投与では１.５時間・Ｕ／ｍｌとなり、約５％のバイオアベイラビリティに相当した。１，８００Ｕ／ｋｇまで殆ど２０倍皮下投与量を増加した場合、僅かに約２.５倍だけのＡＵＤＣ0-1dの上昇をもたらした（図２）。
【００８０】
【表３】
2010529155.tif 000005
【００８１】
［実施例３］
血友病Ａモデル(ＦＶＩＩＩノックアウト・マウス)における皮下投与Haemate P（登録商標）のバイオアベイラビリティ評価
驚くべきことに、同じ用量のＦＶＩＩＩをＶＷＦ含有製品（Haemate P（登録商標））を用いてＦＶＩＩＩノックアウト・マウスに皮下投与した場合、血漿のＦＶＩＩＩ活性の明らかな上昇が認められた（図３）。実施例２と同じ研究デザインと方法を用いてのＡＵＤＣ0-2dは、同じ用量のMonoclate-P（登録商標）に比べて、Haemate P（登録商標）ではなんと約２倍も高かった（表３）：Haemate P（登録商標）で達成されたピーク血漿中濃度は約２.５〜３倍高く、１０倍までの最大差を示した。この差から、皮下腔からのＦＶＩＩＩの再吸収に対するＶＷＦの有益な役割についての確固たる結論を引き出すことができる。ＶＷＦの役割を更に検討するために、Haemate P（登録商標）の用量を、反復実験において９００Ｕ（ＦＶＩＩＩ：Ｃ）／ｋｇまで５０％減らした（表４；図４）。驚くべきことに、これはより小さいＡＵＤＣ0-1dをもたらさなかった（表５）。この結果の背景に対しては、このような高用量では再吸収メカニズムが飽和する可能性があると考えるのが妥当と考えられる。従って、ＶＷＦ含有溶液によって達成可能な改善を評価すると、達成し得るＦＶＩＩＩの血漿レベルの上昇を過小評価する。
【００８２】
【表４】
2010529155.tif 000006
【００８３】
【表５】
2010529155.tif 000007
【００８４】
【表６】
2010529155.tif 000008
【００８５】
［実施例４］
血友病ＡマウスのＦＶＩＩＩのバイオアベイラビリティに対するＶＷＦ：Ａｇ／ＦＶＩＩＩ：Ｃ比の役割の評価
ＶＷＦの影響の驚くべき所見を考慮して、投与溶液中のＶＷＦ：Ａｇ対ＦＶＩＩＩ：Ｃ比を系統的に変化させた。Haemate P（登録商標）中のＶＷＦ：Ａｇ／ＦＶＩＩＩ：Ｃ比は、一般的に約３：１の範囲である。次の段階として、０.９：１のＶＷＦ：Ａｇ／ＦＶＩＩＩ：Ｃ比を試験した（表６）。実施例２と同じ方法を用いた。図５は、４００Ｕ（ＦＶＩＩＩ：Ｃ）／ｋｇの用量レベルでは、ＦＶＩＩＩ：Ｃのベースラインレベルが、Haemate P（登録商標）（ＶＷＦ：Ａｇ／ＦＶＩＩＩ：Ｃ比３：１）に対して約４８時間後でも尚到達しなかったことを示す。「低いＶＷＦ：Ａｇ」溶液に対して、ＦＶＩＩＩ：Ｃレベルは、約３０時間後に殆どベースラインに戻った。さらに、ＶＷＦ：Ａｇ／ＦＶＩＩＩ：Ｃ比３：１では、ピークＦＶＩＩＩ血漿レベルは、０.９：１の比に比べて約２倍〜３倍高かった。３：１〜０.９：１のＶＷＦ：Ａｇ／ＦＶＩＩＩ：Ｃ比の減少により、３：１の比の製剤で達成されたＡＵＤＣ0-2dの丁度２２％ＡＵＤＣ0-2dが低減した。この用量レベルでのＶＷＦ：Ａｇ／ＦＶＩＩＩ：Ｃ比の増加は、ＡＵＤＣ及びＦＶＩＩＩのピーク血漿レベルを上昇させ、そして長期間血漿中のＦＶＩＩＩレベルの上昇をもたらすと結論し得る。更なる実験において、６.５：１のＶＷＦ：Ａｇ／ＦＶＩＩＩ：Ｃ比（表６）を２００Ｕ（ＦＶＩＩＩ：Ｃ）／ｋｇの用量レベルで試験した。驚くべきことに３：１から６.５：１へのＶＷＦ：Ａｇ／ＦＶＩＩＩ：Ｃ比の上昇は、同様に高いＦＶＩＩＩ：Ｃピークレベルをもたらしたが、しかしＦＶＩＩＩ：Ｃは、約２倍〜３倍長い期間血漿中に認められた（図６）。これに相応して、ＡＵＤＣ0-1dは約２.７倍上昇した。外見からみて、ＶＷＦ：Ａｇは、ＦＶＩＩＩ：Ｃのインビボ回復に影響を与えるだけでなく、ＦＶＩＩＩの高いピークレベル及び長期間のＦＶＩＩＩ：Ｃレベルの上昇をももたらし得る。
【００８６】
前記の実施例からのＦＶＩＩＩの用量補正ＡＵＤＣに関する結果を要約し補間すると、ＶＷＦ：Ａｇ／ＦＶＩＩＩ：Ｃ比と循環系に到達するＦＶＩＩＩの画分との明瞭な関係が導かれる(図７)。広い範囲にわたって、この関係はかなり直線性と思われる。この関係は、これまで試験したものよりも高いＶＷＦ：Ａｇ／ＦＶＩＩＩ：Ｃ比においても、循環系へ輸送されたＦＶＩＩＩの画分が更に増加し得るという確固たる結論を可能にする。この関係の直線性の急勾配に因り、少なくとも１０：１及び可能なら２０：１の比で、これまで試験した最大比の約２倍又は３倍で、皮下投与後のＡＵＤＣ（ＦＶＩＩＩ：Ｃ）の更なる増加が期待し得ると仮定することは妥当と考えられる。
【００８７】
【表７】
2010529155.tif 000009
【００８８】
［実施例５］
血友病Ａマウスの凝固の補正に必要な最小Haemate P（登録商標）用量（皮下）の決定
次の段階として、どの用量のHaemate P（登録商標）（一般的なＶＷＦ：Ａｇ／ＦＶＩＩＩ：Ｃ比３：１）がＦＶＩＩＩノックアウト・マウスの凝固障害の補正に必要とされるかという問題について検討した。このために、ＦＶＩＩＩノックアウト・マウスをHaemate P（登録商標）で皮下処置し、そして凝固の結果を標準トロンボエラストグラフィー装置で定量した。Roteg（登録商標）05アナライザーにより、全血を用いてin-TEM（登録商標）分析を実施した。血液を眼窩後方でサンプリングし、そしてサンプリング直後に分析し、in-TEM（登録商標）試薬を用いてトロンボエラストグラフィーを開始した；使用したプロトコールは、装置メーカー（Pentapharm, GmbH, Munich, Germany）から提供されたヒト血液分析の手引きを基本的に反映している。簡潔にいうと、反応は、ROTEG装置内において３７℃でインキュベートした血液試料にin-TEM（登録商標）試薬を加えることにより開始した。全体としてこの操作は、K. A. Landskroner et.al., Haemophilia (2005), 11, 346-352中の血友病Ａマウスについて記載された方法を反映している。in-TEM（登録商標）分析をＦＶＩＩＩ欠乏血液に適用すると、一般的に凝固時間、ＣＴ、及び血餅形成時間、ＣＦＴは延長し、α角（及び対応して最大速度、ｍａｘＶｅｌ)が増加し、最大速度の観測までの時間、ｔ−ＭａｘＶｅｌが増加した；仮に最小であっても、凝固曲線下積分面積（ＡＵＣ）にいくらかの変化が認められ、そして最大血餅硬度、ＭＣＦは正常のままであった。
【００８９】
１００、５０又は２５Ｕ（ＦＶＩＩＩ：Ｃ）／ｋｇのHaemate P（登録商標）の皮下注射は、ＦＶＩＩＩノックアウト・マウスのα角及び血餅形成時間（ＣＦＴ）の用量依存的逆転をもたらした（表７〜１０；図８及び９）。表１１は２５Ｕ（ＦＶＩＩＩ：Ｃ）／ｋｇのHaemate P（登録商標）の静脈内注射で得られた結果を詳述している。補正の度合は、静脈内注射の１００Ｕ（ＦＶＩＩＩ：Ｃ）／ｋｇのHaemate P（登録商標）の皮下注射にほぼ相当し、即ちＦＶＩＩＩのＶＷＦ含有製剤による皮下処置は、同レベルの止血の補正を達成するために、静脈内注射より丁度約４倍高い用量を必要とした。
【００９０】
Haemate P（登録商標）を用いた場合、５０Ｕ（ＦＶＩＩＩ：Ｃ）／ｋｇと同じ低用量が、約１日間で凝固障害の完全な補正に十分であった。止血の補正は、投与用量が高いほど一層長く持続した；即ち、１００Ｕ（ＦＶＩＩＩ：Ｃ）／ｋｇによって達成された補正は約２日間持続した。これに基づいて血友病Ａ患者において実質的に凝固を改善するのに必要な用量を推定するために、健常マウスは、健常ヒトに比べて約２倍〜３倍高い内因性ＦＶＩＩＩレベルを有することを考慮に入れなければならない。従って、５０Ｕ（ＦＶＩＩＩ：Ｃ）／ｋｇの用量は、ヒトでは約１５〜２５Ｕ（ＦＶＩＩＩ：Ｃ）／ｋｇと等量に
なる。これは、予防的処置時の血友病Ａ患者が、従来の治療法により静脈内投与を介して受けるＦＶＩＩＩの用量に対応する。これは、また、成人に対してさえも、皮下注射に対して十分好適な注射量に対応すると考えられる。加えて、この考え方は、ＶＷＦによる製剤に基づく完全長ＦＶＩＩＩの皮下注射によって達成される止血の、顕著な補正を説明するものである。これは、また、患者で達成されたＦＶＩＩＩ血漿レベルは、少なくとも予防的処置に十分であり−非静脈内注射の利便性が患者のクオリティ・オブ・ライフに対して主要な役割を果たしている状況であるという結論を示す。
【００９１】
【表８】
2010529155.tif 000010
【００９２】
【表９】
2010529155.tif 000011
【００９３】
【表１０】
2010529155.tif 000012
【００９４】
【表１１】
2010529155.tif 000013
【表１２】
2010529155.tif 000014
【００９５】
［実施例６］
皮下注射時にバイオアベイラビリティを増加させるＶＷＦ：Ａｇの有益な効果の位置としての筋肉内コンパートメントの排除
ＶＷＦは多機能タンパク質である。止血における直接的な役割に加えて、ＶＷＦは、また、循環系のＦＶＩＩＩを安定化し、そして保護する重要な役割を果たしている。ＶＷＦ：Ａｇが実質的に検出不能のＩＩＩ型ＶＷＦ病に罹った患者は、彼らがＦＶＩＩＩの二次欠乏も患っているように、明瞭にこのことを示す。この背景に対して、フォンビルブラント病患者では、非ＶＷＦ製剤化ＦＶＩＩＩのバイオアベイラビリティが、ＶＷＦ製剤化ＦＶＩＩＩと実際は異ならない可能性があると仮定することができる。第１の例では、ＦＶＩＩＩは循環系から正に迅速に排除されると考えられ、一方第２の例では、ＶＷＦにより循環系において安定化する。
【００９６】
この仮説を試験するために、ＦＶＩＩＩノックアウト・マウスに、１００Ｕ（ＦＶＩＩＩ：Ｃ）／ｋｇのHelixate又はHaemate P（登録商標）を、ｔ＝０、静脈内(尾静脈)単回処置で注射した。加えて、ＶＷＦノックアウト・マウスに、５０Ｕ（ＦＶＩＩＩ：Ｃ）／ｋｇのHelixate又はHaemate P（登録商標）を、ｔ＝０、静脈内(尾静脈)単回処置で注射した。これらのＶＷＦノックアウト・マウスは、エキソン４及び５を欠失しており、そして内因性ＶＷＦを発現しない（Denis C. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, Vol 95, 9524-9529）。血液試料を短時間麻酔下に眼窩後方で採取し、実施例２では更なる試料処理を行った。全試料について、市販の ＥＬＩＳＡ（Cedarlane Laboratories Ltd.
）を用いてそれらのヒトＦＶＩＩＩ：Ａｇ濃度を定量した。
【００９７】
図１０は、ＦＶＩＩＩノックアウト・マウスに静脈内注射後の、高純度ＦＶＩＩＩ及びＶＷＦ製剤化ＦＶＩＩＩ医薬品の殆ど同一の薬物動態を例証する。これは、ヒトＦＶＩＩＩが、循環系において安定化のためにマウスではヒトＶＷＦを必要としないことを示す。しかしながら、循環系においてヒトＦＶＩＩＩを安定化する内因性ＶＷＦが存在しない場合、根本的な相違がある（図１１）：循環系に内因性ＶＷＦをもたないマウス（ＶＷＦノックアウト・マウス）では、高純度ＦＶＩＩＩ製品（Monoclate-P（登録商標））の回復は、ＶＷＦ製剤化製品（Haemate P（登録商標））に比べて低く、むしろ迅速に消失する。
【００９８】
ＦＶＩＩＩノックアウト・マウスの結果（図１０）を総合すれば、これは、また、ヒトＦＶＩＩＩがヒトＶＷＦに比べて動物の異種ＶＷＦにより同等に安定化されることを示す。循環系における明らかに追加的なヒトＶＷＦ：Ａｇは、ＦＶＩＩＩノックアウト・マウスに静脈投与後、ヒトＦＶＩＩＩ：Ｃを更には安定化しないことから、皮下投与後のＶＷＦ：Ａｇ含有製剤によるＦＶＩＩＩ：Ｃの安定化は、血管系とは異なるコンパートメントに介在していなければならない。これらの結果をまとめると、十分なＶＷＦ：Ａｇが循環系に存在している限り、ＶＷＦ：Ａｇ製剤化ＦＶＩＩＩの皮下注射後に認められるバイオアベイラビリティの向上は、循環系におけるＦＶＩＩＩ：Ｃを安定化する結果ではなく、循環系への到達に関与している過程に従っていると結論することができる。これらの過程は、循環系に到達する前にタンパク質を分解するプロテアーゼからのＦＶＩＩＩの保護を包含していると考えられる。バイオアベイラビリティの向上は、また、潜在的に活性な輸送メカニズムの結果を表わすと考えられる。それらはＶＷＦに対してより効率的に作用し、ＶＷＦは、次いで受動的にＦＶＩＩＩを共輸送する、又はそれらは、ＦＶＩＩＩ単独よりもＶＷＦ−ＦＶＩＩＩ複合体に更に効率的に作用する可能性がある。
【００９９】
【表１３】
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【０１００】
［実施例７］
皮下注射によるフォンビルブラント病関連ＦＶＩＩＩ欠乏症の治療−ＶＷＦ：Ａｇ製剤化ＦＶＩＩＩ溶液の利点
減少したＶＩＩＩ：Ｃレベルは、血友病Ａにおける出血表現型の原因であるばかりでなく、フォンビルブラント病（ＶＷＤ）において重要な役割を果たしている。実施例７で詳述したように、減少したＦＶＩＩＩ：Ｃレベルは、ＶＷＦによる安定化障害に起因する。ＶＷＦ：Ａｇ製剤化ＦＶＩＩＩは血友病Ａへの皮下投与に好適であることが示されたので、ＦＶＩＩＩ：ＣレベルがＶＷＤでも増加するかどうかについて試験した（表１３）。４００Ｕ（ＦＶＩＩＩ：Ｃ）／ｋｇのHaemate P（登録商標）をＶＷＦノックアウト及びＦＶＩＩＩノックアウト・マウスに皮下注射し、そしてそれらの血漿のＦＶＩＩＩ：Ｃ活性
を分析した。実施例２と同じ研究デザインと方法を用いた。約３Ｕ／ｍＬの内因性ＦＶＩＩＩ：Ｃレベルを有する健常対照マウスと比べて、ＦＶＩＩＩ：Ｃベースラインレベルの減少は、ＶＷＦノックアウト及びＦＶＩＩＩノックアウト・マウスの両方に共通であったが、ＶＷＦノックアウト・マウスは、更にそれらの内因性ＶＷＦが欠如していた。従って、皮下投与ＶＷＦ：Ａｇの有益な役割は、循環系に到達するＦＶＩＩＩに関与する過程が、皮下投与ＶＷＦ：Ａｇに完全に利用可能であると考えられることから、これらのマウスにおいて最も顕著であると考えられる。図１２は、実際にＦＶＩＩＩ：Ｃの上昇は、ＦＶＩＩＩノックアウト・マウスに比べてＶＷＦノックアウト・マウスで一層顕著なことを示す。ベースラインを調整すると、ピークレベルは６倍まで高く、そしてＡＵＤＣはＶＷＦノックアウト・マウスでは少なくとも３倍高かった。このことは、ＶＷＦ：Ａｇは２倍の効果、即ち、ａ）皮下投与したＦＶＩＩＩの取り込みの安定化／増強、及びｂ）いったん血漿に到達した場合、ＦＶＩＩＩのその後の安定化、を有するので、ＶＷＤにおいては、患者は、血友病Ａ患者よりも潜在的にはるかに多く、ＶＷＦ：Ａｇ製剤化ＦＶＩＩＩ製品を用いた皮下治療からも利益を得る可能性があることを示唆する。
【０１０１】
【表１４】
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【０１０２】
［実施例８］
ＶＷＦ：Ａｇの皮下注射後のフォンビルブラント病におけるＶＷＦ欠乏症の治療
実施例８では、ＶＷＤにおけるＦＶＩＩＩ欠乏症の、皮下注射による潜在的治療を示すデータをまとめた。ＶＷＦ欠乏症がＶＷＦ製品の皮下注射で治療できるかどうかを試験するために、ＣＨＢウサギに皮下経路経由で２，３００Ｕ／ｋｇのＶＷＦ：Ａｇ（Haemate(R) P）を、単回注射によりｔ＝０で注射した。ウサギの重量は約２.５〜３ｋｇであった。ヒトＶＷＦ：Ａｇの測定のために、血液試料を投薬前(ベースライン)及び処置後１、２、４、６、２４、３０時間、２及び３日に、耳介静脈を経て採取した（表１４）。血液を１０％クエン酸血液として抗凝固処理した。ヒトＶＷＦ：Ａｇを血漿で定量し、市販ＥＬＩＳＡ；Roche Diagnosticsを用いて遠心分離により血液から処理した。血漿は分析前に−２０℃で保存した。驚くべきことに、ＦＶＩＩＩより大きくても、ＶＷＦがまた、循環系に入り、これがまたＶＷＦ：Ａｇの皮下投与に基づくフォンビルブラント病治療の選択肢を提供することを見出した（図１３）。
【０１０３】
【表１５】
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【０１０４】
血漿試料のヒトＶＷＦ：Ａｇを、市販ＥＬＩＳＡキット(ＶＷＦ：Ａｇ、Roche Diagnostics)を用いて分析した。驚くべきことに、ＦＶＩＩＩより大きくても、ＶＷＦも、また、循環系に入り、ＶＷＦ：Ａｇの皮下投与に基づいてフォンビルブラント病治療の選択肢
となることが見出された。
【０１０５】
［実施例９］
ＶＷＤノックアウト・マウスにおけるＦＶＩＩＩなしＶＷＦ：Ａｇの皮下投与
高純度ＶＷＦを、５２３Ｕ（ＶＷＦ：Ａｇ）／ｋｇの用量でＶＷＦノックアウト・マウスに皮下注射した(表１５)。ヒトＶＷＦ：Ａｇの測定のために、血液試料を、投薬前(ベースライン)及び前投与、並びに処置後２、４、６、１６時間、１、２及び３日に、眼窩後方で採取した。血液を１０％クエン酸血液として抗凝固処理した。ヒトＶＷＦ：Ａｇを血漿で定量し、市販ＥＬＩＳＡ；Roche Diagnosticsを用いて遠心分離により血液から処理した。血漿は分析前に−２０℃で保存した。ＶＷＦ：Ａｇ血漿レベルは、この処置後約０.１〜０.２Ｕ（ＶＷＦ：Ａｇ）／ｍＬのピークレベルに上昇した(図１４)。ＶＷＦ：ＲＣｏの経時変化はやや急であり、血漿への輸送とそこからの消失の組み合わせを反映していた。このＶＷＤモデルにおける血漿への輸送のヒトＶＷＦの評価に加えて、血漿(ヒト)ＶＷＦレベルのこの上昇が、内因性ＦＶＩＩＩ：Ｃの安定化の回復に因り、血漿中の内因性ＦＶＩＩＩ：Ｃレベルの二次的上昇をもたらすかどうかが、同時点で分析された。実際に、血漿中のＦＶＩＩＩ：Ｃレベルの上昇が認められ、これはＶＷＦの経時変化にやや遅れて起こった。このことは、皮下投与ＶＷＦは血漿に輸送されるだけでなく、ＶＷＦ：ＲＣｏレベルで示されるように機能活性並びに内因性ＦＶＩＩＩ：Ｃを安定化するその機能を更に保持するという結論を示す。しかしながら、ＦＶＩＩＩの上昇は実施例７に認められるほど顕著ではなく、従って、ＶＷＦ製剤化ＦＶＩＩＩ溶液の皮下注射後のＦＶＩＩＩ：Ｃの上昇は、皮下腔からのＦＶＩＩＩの輸送並びに内因性ＦＶＩＩＩの安定化の両者をもたらす。
【０１０６】
【表１６】
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【０１０７】
［実施例１０］
血友病Ａモデル（ＦＶＩＩＩノックアウト・マウス）におけるＶＷＦ製剤化ＦＶＩＩＩの免疫原性の評価
ＦＶＩＩＩに対する中和抗体の高頻度の生成は、重度血友病Ａ患者の処置に対する主要な問題である。これらの患者の約２５％は、ＦＶＩＩＩの活性を中和するこれらの阻害抗体を生成する。従って、ＦＶＩＩＩの補充はもはや患者の止血の補正に役立たない。そのような阻害抗体は、一般的に最初の数回の処置により生成するものであって、例えば、未治療患者（ＰＵＰ）では、現時点でどんな患者がこの合併症に罹るかを予測するのは非常に困難である。使用した特定のＦＶＩＩＩ濃縮物がこれに関与しているかどうかは、科学文献において論争中の話題である。最大の免疫反応を達成するようにデザインされた他のタンパク質から、投与方法が重要な役割を果たすこと、即ち、少なくとも、静脈内注射が一般的には皮下注射よりも免疫原性が少ないことは、明らかである。
【０１０８】
本実施例では、重度血友病Ａ患者を顕わす動物モデルにおいて、ＶＷＦ製剤によるＦＶＩＩＩバイオアベイラビリティの増加がＦＶＩＩＩの免疫原性増加と対応しているかという問題に取り組んだ。
【０１０９】
抗ＦＶＩＩＩ総タイターを、Helixate（登録商標）でコーティングしたＥＬＩＳＡプレートを用いて測定した。簡潔に述べると、第１の免疫反応は、マイクロタイターウェル上
にコーティングしたヒトＦＶＩＩＩに対する血漿試料中の抗体の結合であった。洗浄工程に続いて、これらの捕捉抗体はペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ、即ち、第２の免疫反応で検出された。ペルオキシダーゼ活性は、テトラメチルベンジジンを加えた後、０.５Ｎ硫酸により所定の時間後に反応を停止して光度測定法で定量した。
【０１１０】
以下の手順によりベセズダ(Bethesda)分析を実施した。簡潔に述べると、１ＢＵを、３７℃で２時間インキュベーションした後、ＦＶＩＩＩの総活性の５０％を阻害する、試験血漿の希釈の逆数と定義した。血漿試料希釈液及び健常ヒト対照血漿を混合して３７℃で２時間インキュベートした。残存ＦＶＩＩＩ活性をインキュベーション後に定量した。従って、データはベセズダ(Bethesda)単位（ＢＵ）として報告し、そして直接比較を可能にするために抗ＦＶＩＩＩの最大総タイターに標準化した。
【０１１１】
表１７にまとめたデータは、静脈内注射後、ＶＷＦ製剤化ＦＶＩＩＩ（Haemate P(登録商標)））がＶＷＦ無しＦＶＩＩＩ製品（Helixate(登録商標)）よりわずかに低い抗ＦＶＩＩＩタイターを生んだことを示す。このような観察は科学文献での傾向と一致しており、ＶＷＦ製剤化製品による阻害抗体の生成に対し潜在的に低いリスクを示唆する（Goudemand J., Haemophilia, Vol. 13 Suppl. 5: 47-51, 2007; Ettingshausen C.E., Kreuz W., Haemophilia, Vol. 12 Suppl. 6: 102-106, 2006）。その比較が全抗ＦＶＩＩＩ抗体に基づくか又はより特異的にＦＶＩＩＩ活性を阻害するものに基づくかについて、実質的な差異はなかった。
【０１１２】
完全フロイントアジュバント（ｃＦＡ）と併用したＶＷＦ製剤化又はＶＷＦ無しＦＶＩＩＩのいずれかで、そしてわずかに異なるスケジュールで皮下処置した群において、免疫反応は予想通り静脈群より高かった。しかしながら、更に重要なこととして、皮下注射のためにＦＶＩＩＩをＶＷＦで製剤化した場合、免疫反応は、ＶＷＦで製剤化しなかったＦＶＩＩＩの皮下注射よりかなり低かった。
【０１１３】
これは、抗ＦＶＩＩＩ総タイター並びに阻害剤両方の場合であった。この驚くべき観察が、アジュバント並びに処置スケジュールの免疫賦活効果の妨害に因ることを排除するために、静脈比較について、アジュバントなしに同一処置スケジュールで実験を反復した。アジュバントとの併用の結果に一致して、Helixate（登録商標）（図１）の皮下注射後の高いタイターが、Helixate（登録商標）の静脈内注射に比べて認められた。その結果は、わずかに異なるデザインでも、ＶＷＦ製剤は、ＶＷＦで製剤化しなかったＦＶＩＩＩに比べて皮下注射後ＦＶＩＩＩへの免疫反応を低下させることを確認した。これを２用量レベルで評価した。１００Ｕ（ＦＶＩＩＩ：Ｃ）／ｋｇ用量のHaemate P（登録商標）を選択して、それらの皮下投与後に、２００Ｕ（ＦＶＩＩＩ：Ｃ）／ｋｇのHelixate（登録商標）で達成される血漿レベルに類似した血漿中ＦＶＩＩＩレベルを達成した。観察された免疫反応のレベルに欠かせないと考えられる両コンパートメントで、即ち、低用量による循環系で又は高用量による皮下腔で、類似したＦＶＩＩＩレベルを達成するために、２００Ｕ（ＦＶＩＩＩ：Ｃ）／ｋｇ用量のHaemate P（登録商標）を選択して、Helixate（登録商標）によるのと同じＦＶＩＩＩ用量を局所的に適用した。用量並びに免疫反応を定量する方法とは無関係に、ＶＷＦ製剤化ＦＶＩＩＩ（Haemate P(登録商標)）に対する反応は、Helixate（登録商標）に比べてそれほど顕著ではなかった。Helixate（登録商標）の特異的ＦＶＩＩＩ活性はHaemate P（登録商標）に比べてかなり高かったものの、免疫反応はなお不活性化ＦＶＩＩＩにも同様に向けられる筈であるので、ＶＷＦの有益な効果は本実施例では過小評価されているようである。
【０１１４】
これらのデータを総合すると、驚くべきことに、皮下投与時に抗ＦＶＩＩＩ抗体形成の最小化を達成し、そして特異的に抗ＦＶＩＩＩ抗体を阻害するというＶＷＦ製剤の大きな利点があり、これは静脈投与後よりもかなり大きいことが実証される。このことは、Haem
ate P（登録商標）の高用量皮下群の血漿レベルが、ＶＷＦ製剤による高いバイオアベイラビリティのために、Helixate（登録商標）の皮下投与で達成される血漿レベルより高いということを背景にして、更に驚くべきことでさえあった。
【０１１５】
【表１７】
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【０１１６】
【表１８】
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【０１１７】
［実施例１１］
皮下投与後のＶＷＦ及びＦＶＩＩＩ：Ｃ（ＶＷＦで製剤化）のバイオアベイラビリティに対するＶＷＦ：Ａｇ／ＶＷＦ：ＲＣｏ比の役割
これまでの実施例は、皮下投与ＶＷＦが驚くべきことに循環系に達することを示している。加えて、ＶＷＦでのＦＶＩＩＩ製剤が、皮下投与後にＦＶＩＩＩノックアウト・マウスにおいてＦＶＩＩＩ：Ｃのバイオアベイラビリティを増加させることが実証された。本実施例では、この点に関してＶＷＦマルチマーパターンの潜在的役割を調べた。このテーマを検討するために、２群のＦＶＩＩＩノックアウト・マウスを、同じＦＶＩＩＩ：Ｃ用量（５００Ｕ／ｋｇ）及び本質的に同じＶＷＦ：Ａｇ用量（５００又は５２０Ｕ／ｋｇ）で皮下処置した。しかしながら、それらのＶＷＦ：ＲＣｏ用量は約３倍異なった。これは、異なるＶＷＦパターンによって特徴付けられる、即ち小さいか又は大きいマルチマーからなるかのいずれか、主に小さいか又は大きいマルチマーかのいずれかのＶＷＦ液剤を用いることによって達成された。ＶＷＦ：ＲＣｏ／ＶＷＦ：Ａｇ比は、１：１.０５〜１：０．３５まで対応して変動した(表１８)。非処置ＦＶＩＩＩノックアウト・マウスによる追加群が、対照として含まれた。スケジュール、経路及び注射量を全群同じにして、即ち、投与はｔ＝０において、０.２ｍＬ／２０ｇ体重の注射量で皮下により実施した。
【０１１８】
【表１９】
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【０１１９】
２及び３群を同じＦＶＩＩＩ：Ｃ用量及び本質的に同じＶＷＦ：Ａｇ用量で処置したが、血漿中のＦＶＩＩＩ：Ｃ濃度にかなりの差が認められた(図１６)。ＶＷＦ：Ａｇ用量には有意差は見られなかったが、驚くべきことにベースラインを超えるＦＶＩＩＩ：Ｃ血漿レベルの増加は、「マルチマー」製剤で処置した群に比べて、Haemate P（登録商標）の「モノマー」製剤で処置した群において約２倍高かった。これと一致して、「モノマー」製剤で認められたＦＶＩＩＩの上昇は、同等の用量のHaemate P（登録商標）で達成されるよりも高いＦＶＩＩＩ：Ｃ血漿レベルをもたらしたようであった(図５)。止血における役割と対照的に、マルチマーを含有する、即ち、約１：０.３５のＶＷＦ：ＲＣｏ／ＶＷＦ：Ａｇ比を有する多くのＶＷＦ製剤は、多くのモノマーを含有するＶＷＦ製剤によって達成される高くて長く持続するＦＶＩＩＩの増加に比べて、皮下投与した場合にＦＶＩＩＩのバイオアベイラビリティ低下をもたらすと結論される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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