(57)【要約】  本発明は、ＴＮＦスーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ）サイトカイン、又は三量体化ドメインと融合させたそれらの受容体結合ドメインを含有する融合タンパク質、及び該融合タンパク質をコードする核酸分子に関する。該融合タンパク質は、三量体化合物として、又はそれらのオリゴマーとして存在し、かつ治療、診断、及び／又は研究の用途に適している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ＴＮＦ−スーパーファミリーサイトカイン又はそれらの受容体結合ドメイン、
（ｉｉ）構成成分（ｉ）と（ｉｉｉ）との間の可撓性リンカー要素、及び
（ｉｉｉ）フィブリチン三量体化ドメイン
を含有する融合タンパク質。
【請求項２】
構成成分（ｉ）が、ＣＤ９５Ｌ、ＴＲＡＩＬ、ＴＮＦα、またはそれらの受容体結合ドメインから選択される、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
構成成分（ｉ）が、ＣＤ９５Ｌ又はそれらの受容体結合ドメインである、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
構成成分（ｉ）が、ヒトＣＤ９５Ｌ（配列番号３０）の１４２〜２８１又は１４４〜２８１のアミノ酸を含有する、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
構成成分（ｉ）が、ＴＲＡＩＬ又はそれらの受容体結合ドメインである、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
構成成分（ｉ）が、ヒトＴＲＡＩＬ（配列番号３４）の１１６〜２８１、１１８〜２８１又は１２０〜２８１のアミノ酸を含有する、請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
構成成分（ｉｉ）が、５〜２０のアミノ酸、特に６、９、１２、１５又は１８のアミノ酸の長さを有する、請求項１から６までのいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
構成成分（ｉｉ）が、グリシン／セリンリンカーである、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
構成成分（ｉｉ）が、アミノ酸配列（ＧＳＳ）a（ＳＳＧ）b（ＧＳ）c（Ｓ）dを有し、その際ａ、ｂ、ｃ、ｄが、それぞれ０、１、２、３、４、又は５である、請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
構成成分（ｉｉｉ）が、バクテリオファージフィブリチン三量体化ドメインである、請求項１から９までのいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
構成成分（ｉｉｉ）が、バクテリオファージＴ４フィブリチン三量体化ドメインである、請求項１０に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
構成成分（ｉｉｉ）が、アミノ酸配列（Ｇ）ＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱ ＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶ ＬＬＳＴＦＬ（配列番号２３の４５８〜４８４又は４５９〜４８４のアミノ酸）、又はそれに対して少なくとも７０％の同一性を有する配列を含有する、請求項１１に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
構成成分（ｉｉｉ）が、バクテリオファージＲＢ６９フィブリチン三量体化ドメインである、請求項１０に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
構成成分（ｉｉｉ）が、アミノ酸配列Ｇ）ＹＩＥＤＡＰＳＤＧＫＦＹＶＲＫＤＧＡＷＶＥＬＰＴＡ（配列番号２４の４５５〜４８０又は４５６〜４８０のアミノ酸）、又はそれに対して少なくとも７０％の同一性を有する配列を含有する、請求項１３に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
構成成分（ｉ）が、構成成分（ｉｉｉ）のＮ−末端に位置する、請求項１から１４までのいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
構成成分（ｉｉｉ）が、構成成分（ｉ）のＮ−末端に位置する、請求項１から１４までのいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
プロテアーゼ開裂部位を含有してよい、Ｎ−末端シグナルペプチドドメインを付加的に含有する、請求項１から１６までのいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
認識／精製ドメインを有する、かつ／又は該ドメインに連結してよい、Ｃ−末端可撓性成分を付加的に含有する、請求項１から１７までのいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１９】
三量体複合体又は三量体複合体のオリゴマーとして存在する、請求項１から１８までのいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
前記の複合体が、３個の同一の融合タンパク質からなる、請求項１９に記載の融合タンパク質。
【請求項２１】
請求項１から１８までのいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子。
【請求項２２】
配列番号２、配列番号２１、又は配列番号２２の配列を含む、請求項２１に記載の核酸分子。
【請求項２３】
発現調節配列と作動的に連結する、請求項２１又は２２に記載の核酸タンパク質。
【請求項２４】
ベクター上に位置する、請求項２１から２３までのいずれか１項に記載の核酸タンパク質。
【請求項２５】
請求項２１から２４までのいずれか１項に記載の核酸分子で形質転換又は形質移入された細胞。
【請求項２６】
原核細胞である、請求項２５に記載の細胞。
【請求項２７】
真核細胞、有利には、哺乳動物細胞、及びより有利にはヒト細胞である、請求項２５に記載の細胞。
【請求項２８】
請求項２１から２４までのいずれか１項に記載の核酸分子で形質転換又は形質移入された非ヒト生物。
【請求項２９】
活性剤として、請求項１から２０までのいずれか１項に記載の融合タンパク質、もしくは請求項２１から２４までのいずれか１項に記載の核酸分子、又は請求項２５から２７までのいずれか１項に記載の細胞を含有する、医薬組成物。
【請求項３０】
活性剤として、請求項１から２０までのいずれか１項に記載の融合タンパク質、もしくは請求項２１から２４までのいずれか１項に記載の核酸分子、又は請求項２５から２７までのいずれか１項に記載の細胞を含有する、診断組成物。
【請求項３１】
療法における使用のための、請求項１から２０までのいずれか１項に記載の融合タンパク質、もしくは請求項２１から２４までのいずれか１項に記載の核酸分子、又は請求項２５から２７までのいずれか１項に記載の細胞。
【請求項３２】
ＴＮＦサイトカインの機能不全によって生じる、ＴＮＦサイトカインの機能不全に関連する、及び／又はＴＮＦサイトカインの機能不全に附随する疾患、特に腫瘍のような増殖性疾患、例えば充実性腫瘍又はリンパ腺腫瘍；感染症；炎症性疾患；代謝疾患；自己免疫異常、例えばリウマチ及び／又は関節疾患；変性疾患、例えば多発性硬化症のような神経組織変性疾患；アポトーシス関連性疾患、又は移植拒絶反応の予防及び／又は治療における医薬組成物の製造のための、請求項１から２０までのいずれか１項に記載の融合タンパク質、もしくは請求項２１から２４までのいずれか１項に記載の核酸分子、又は請求項２５から２７までのいずれか１項に記載の細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＮＦスーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ）サイトカイン、又は三量体化ドメインと融合させたそれらの受容体結合ドメインを含有する融合タンパク質、及び該融合タンパク質をコードする核酸分子に関する。該融合タンパク質は、三量体化合物として、又はそれらのオリゴマーとして存在し、かつ治療、診断、及び／又は研究の用途に適している。
【０００２】
技術水準
ＴＮＳＦサイトカイン、例えばＣＤ９５リガンド（ＣＤ９５Ｌ）の三量体化は、効率的な受容体結合及び活性を要求することが公知である。しかしながら、ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインの三量体複合体は、組換え単量体単位からの製造が難しい。
【０００３】
ＷＯ ０１／４９８６６号及びＷＯ ０２／０９０５５号は、ＴＮＦサイトカイン及び多量体化構成成分、特にＣ１ｑタンパク質群からのタンパク質又はコレクチンを含有する組換え融合タンパク質を開示している。しかしながら、これら融合タンパク質の欠点は、通常三量体化ドメインが大きな分子量を有すること、かつ／又は三量体化がむしろ非効率的であることである。
【０００４】
Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８７（１９８９）、１２０５〜１２１３）は、ＴＮＦサイトカインの三量体が、Ｎ−末端に位置する安定化モチーフによって安定化されることを記載している。ＣＤ９５Ｌにおいて、ＣＤ９５Ｌ−受容体結合ドメイン三量体の安定化は、おそらく、細胞膜の近くに位置するＮ−末端アミノ酸ドメインによって生じる。
【０００５】
Ｓｈｉｒａｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ３２２（２００４）、１９７〜２０２）は、ＣＤ９５Ｌの受容体結合ドメインが、Ｎ−末端に位置する人工のα−ヘリックスのコイルドコイル（ロイシンジッパー）モチーフによって安定化されてよいことが記載されている。しかしながら、お互いにポリペプチド鎖の配向、例えば平行又は逆行性の配向を、ほとんど予測できないことが見出された。さらに、コイルドコイルのジッパーモチーフにおける７残基の繰り返しの最適数は、決定することが難しい。加えて、コイルドコイル構造は、ｐＨ及び／又はイオン強度の変更後に、高分子凝集物を形成する傾向を有する。
【０００６】
本発明の目的は、良好な三量体の特性を兼ねた効率的な組換え型の製造を可能にするＴＮＦサイトカイン又はそれらの受容体結合ドメインを含有する融合タンパク質を提供することである。
【０００７】
発明の概要
本発明は、
（ｉ）ＴＮＦ−スーパーファミリーサイトカイン又はそれらの受容体結合ドメイン、
（ｉｉ）構成成分（ｉ）と（ｉｉｉ）との間の可撓性リンカー要素、及び
（ｉｉｉ）フィブリチン（ｆｉｂｒｉｔｉｎ）三量体化ドメイン
を含有する融合タンパク質に関する。
【０００８】
さらに本発明は、本明細書において記載されている融合タンパク質をコードする核酸分子に、及び本明細書において記載されている核酸分子で形質転換又は形質移入させた細胞又は非ヒト生物に関する。
【０００９】
本発明は、活性剤として、本明細書において記載されている融合タンパク質、核酸分子、又は細胞を含有する医薬又は診断組成物にも関する。
【００１０】
本発明は、療法における使用、例えばＴＮＦサイトカインの機能不全によって生じる、ＴＮＦサイトカインの機能不全に関連する、及び／又はＴＮＦサイトカインの機能不全に附随する疾患、特に腫瘍のような増殖性疾患、例えば充実性腫瘍又はリンパ腺腫瘍；感染症；炎症性疾患；代謝疾患；自己免疫異常、例えばリウマチ及び／又は関節疾患；変性疾患、例えば多発性硬化症のような神経組織変性疾患；アポトーシス関連性疾患、又は移植拒絶反応の予防及び／又は治療における医薬組成物の製造のための本明細書において記載されている融合タンパク質、核酸分子、又は細胞の使用のための、本明細書において記載されている融合タンパク質、核酸分子、又は細胞にも関する。
【００１１】
図面の説明
図１：Ａ）ストレプタクチンアフィニティー精製ｈｓ９５Ｌ−ＡＴ４のＳＥＣ分析：固定化ストレプタクチンからデスチオビオチンによって溶離されたアフィニティー精製タンパク質を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム上に置いた。ＳＥＣ作業のタンパク質溶離分布を、ＯＤ２８０で測定した。それぞれのｈｓ９５Ｌ−ＡＴ４のピークの保持体積及び画分数を示す。
Ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色によるｈｓ９５Ｌ−ＡＴ４のＳＥＣ画分の分析：Ａにおいて示されたＳＥＣ画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そして次に銀染色によって分析した。画分数及び標準タンパク質の分子量（ｋＤａ）を示す。
【００１２】
図２：ｈｓ９５Ｌ−ＡＴ４の天然の見かけの分子量の決定
精製されたｈｓ９５Ｌ−ＡＴ４の見かけの分子量を、ゲル濾過標準タンパク質（Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＧｍｂＨ、Ｍｕｅｎｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）でのＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムの較正をもとに決定した。較正標準の溶離体積を、それぞれの分子量の対数と対照してプロットして、較正曲線を作成した。ｈｓ９５Ｌ−ＡＴ４の見かけのＭｗは、それぞれの溶離体積１３．８５ｍｌに基づいて算出された。表は、ＳＥＣ分析の結果を要約する。
【００１３】
図３：Ｊｕｒｋａｔ細胞においてアポトーシスを誘発するＳＥＣ画分の電位によるｈｓ９５Ｌ−ＡＴ４のＳＥＣ画分（図１で示される）の分析。ＳＥＣ画分のタンパク質含量は、カスパーゼ活性を誘発するそれらの能力と合致する。
【００１４】
図４：ＡＰＧ１０１によるｈｓ９５Ｌ−ＡＴ４誘発性アポトーシスの阻害
ｈｓ９５Ｌ−ＡＴ４を、ＡＰＧ１０１の種々の量で３０分間インキュベートし、Ｊｕｒｋａｔ細胞に添加し、そして次にアポトーシスを、カスパーゼ活性の分析によって測定した。グラフは、ｈｓＣＤ９５−ＡＴ４誘発性アポトーシスに対して投与量に依存するＡＰＧ１０１の拮抗作用を示す。
【００１５】
図５：Ａ）ストレプタクチンアフィニティー精製ｈｓ９５Ｌ−Ａ６９のＳＥＣ分析：固定化ストレプタクチンからデスチオビオチンによって溶離されたアフィニティー精製タンパク質を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム上に置いた。ＳＥＣ作業のタンパク質溶離分布を、ＯＤ２８０で測定した。それぞれのｈｓ９５Ｌ−Ａ６９のピークの保持体積及び画分数を示す。
Ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色によるＳＥＣ画分の分析：Ａにおいて示されたＳＥＣ画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そして次に銀染色によって分析した。画分数及び標準タンパク質の分子量（ｋＤａ）を示す。
Ｃ）Ｊｕｒｋａｔ細胞においてアポトーシスを誘発するＳＥＣ画分の電位によるｈｓ９５Ｌ−Ａ６９のＳＥＣ画分（Ａで示される）の分析。ＳＥＣ画分のタンパク質含量は、カスパーゼ活性を誘発するそれらの能力と合致する。
【００１６】
図６：Ａ）ストレプタクチンアフィニティー精製ｈｓＴＲＡＩＬ−ＡＴ４のＳＥＣ分析：固定化ストレプタクチンからデスチオビオチンによって溶離されたアフィニティー精製タンパク質を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム上に置いた。ｈｓＴＲＡＩＬ−ＡＴ４のピークのタンパク質溶離分布、及び画分数を示す。
Ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色によるｈｓＴＲＡＩＬ−ＡＴ４のＳＥＣ画分の分析：Ａにおいて示されたＳＥＣ画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そして次に銀染色によって分析した。画分数及び標準タンパク質の分子量（ｋＤａ）を示す。
Ｃ）Ｊｕｒｋａｔ細胞においてアポトーシスを誘発するＳＥＣ画分の電位によるｈｓＴＲＡＩＬ−ＡＴ４のＳＥＣ画分（Ａで示される）の分析。ＳＥＣ画分のタンパク質含量は、カスパーゼ活性を誘発するそれらの能力と合致する。
【００１７】
発明の詳細な説明
従って、本発明は、
（ｉ）ＴＮＦ−スーパーファミリーサイトカイン又はそれらの受容体結合ドメイン、
（ｉｉ）構成成分（ｉ）と（ｉｉｉ）との間の可撓性リンカー要素、及び
（ｉｉｉ）フィブリチン三量体化ドメイン
を含有する融合タンパク質に関する。
【００１８】
前記融合タンパク質は、単量体タンパク質又は多量体タンパク質であってよい。有利には、該融合タンパク質は、同一又は異なってよい３個の単量体単位からなる三量体複合体として存在する。有利には、三量体複合体は、３個の同一の融合タンパク質からなる。該三量体複合体は、それ自体、生物学的活性を示す。しかしながら三量体複合体のオリゴマーは、例えば基本となる三量体構造が、２、３又は４倍である複合体を定義し、かつ生物学的活性も有することが見出された。
【００１９】
該融合タンパク質の構成成分（ｉ）は、ＴＮＦスーパーファミリーのサイトカイン又はそれらの受容体結合ドメインである。有利には、構成成分（ｉ）は、対立遺伝子の突然変異体及び／又はそれらの誘導体を含む哺乳動物の、特にヒトのサイトカイン又はそれらの受容体結合ドメインである。さらに、ＴＮＦサイトカインは、対応するサイトカイン受容体へ結合できる、及び有利にはアポトーシス又は増殖性の活性を生じてよい受容体活性の可能性がある受容体結合ドメインであることが好ましい。該サイトカインは、例えば、ＴＮＦスーパーファミリーの構成要素、例えば表１において示されたヒトＴＮＦＳＦ−１〜−１８から、有利には、ＬＴＡ（配列番号２５）、ＴＮＦα（配列番号２６）、ＬＴＢ（配列番号２７）、ＯＸ４０Ｌ（配列番号２８）、ＣＤ４０Ｌ（配列番号２９）、ＣＤ９５Ｌ（配列番号３０）、ＣＤ２７Ｌ（配列番号３１）、ＣＤ３０Ｌ（配列番号３２）、ＣＤ１３７Ｌ（配列番号３３）、ＴＲＡＩＬ（配列番号３４）、ＲＡＮＫＬ（配列番号３５）、ＴＷＥＡＫ（配列番号３６）、ＡＰＲＩＬ １（配列番号３７）、ＡＰＲＩＬ ２（配列番号３８）、ＢＡＦＦ（配列番号３９）、ＬＩＧＨＴ（配列番号４０）、ＴＬ１Ａ（配列番号４１）、ＧＩＴＲＬ（配列番号４２）、ＥＤＡ−Ａ１（配列番号４３）、ＥＤＡ−Ａ２（配列番号４４）、又はそれらの受容体結合ドメインから選択されてよい。それぞれのタンパク質の好ましい受容体結合ドメインは、表１（ＮＨ2−ａａ〜ＣＯＯＨ−ａａ）において示され、かつ例えばＬＴＡ（配列番号２５）の５９〜２０５又は６０〜２０５、ＴＮＦα（配列番号２６）の８６〜２３３、ＬＴＢ（配列番号２７）の８２〜２４４又は８６〜２４４、ＯＸ４０Ｌ（配列番号２８）の５２〜１８３又は５５〜１８３、ＣＤ４０Ｌ（配列番号２９）の１１２〜２６１又は１１７〜２６１、ＣＤ２７Ｌ（配列番号３１）の５１〜１９３又は５６〜１９３、ＣＤ３０Ｌ（配列番号３２）の９７〜２３４、９８〜２３４又は１０２〜２３４、ＣＤ１３７Ｌ（配列番号３３）の８６〜２５４、ＲＡＮＫＬ（配列番号３５）の１６１〜３１７、ＴＷＥＡＫ（配列番号３６）の１０３〜２４９、１０４〜２４９又は１０５〜２４９、ＡＰＲＩＬ １（配列番号３７）の１１２〜２４７、ＡＰＲＩＬ ２（配列番号３８）の１１２〜２５０、ＢＡＦＦ（配列番号３９）の１４０〜２８５、ＬＩＧＨＴ（配列番号４０）の９１〜２４０、ＴＬ１Ａ（配列番号４１）の９１〜２５１又は９３〜２５１、ＧＩＴＲＬ（配列番号４２）の５２〜１７７、ＥＤＡ−Ａ１（配列番号４３）の２４５〜３９１、ＥＤＡ−Ａ２（配列番号４４）の２４５〜３８９のアミノ酸を含有する。
【００２０】
さらに有利には、構成成分（ｉ）は、ＣＤ９５Ｌ、ＴＲＡＩＬもしくはＴＮＦα、又はそれらの受容体結合ドメインから選択される。特に好ましい一実施態様において、構成成分（ｉ）は、膜ドメインを有さない受容体結合ドメインを含むＴＮＦサイトカインの細胞外タンパク質を含有する。特に好ましい一実施態様において、組換え融合タンパク質の構成成分（ｉ）は、ヒトＣＤ９５Ｌ、特に配列番号３０の１４２〜２８１又は１４４〜２８１のアミノ酸、又はヒトＴＲＡＩＬ、特に配列番号３４の１１６〜２８１、１１８〜２８１又は１２０〜２８１のアミノ酸から選択される。
【００２１】
本発明のさらに好ましい一実施態様において、本明細書において記載されている融合タンパク質の、ＴＮＦスーパーファミリーのサイトカイン又はそれらの受容体結合ドメイン、例えばＴＲＡＩＬは、ＴＲＡＩＬ受容体１（ＴＲＡＩＬＲ１）及び／又はＴＲＡＩＬ受容体２（ＴＲＡＩＬＲ２）を結合する、かつ／又は活性化するＴＮＦスーパーファミリーのサイトカイン又はそれらの受容体結合ドメインの突然変異体を含む。該突然変異体の結合及び／又は活性化は、例えばｖａｎ ｄｅｒ Ｓｌｏｏｔ ｅｔ ａｌ．（ＰＮＡＳ、２００６、１０３：８６３４〜８６３９）、Ｋｅｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００５、２８０：２２０５〜２２１５）、又はＭａｃＦａｒｌａｎｅ ｅｔ ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、２００５、６５：１１２６５〜１１２７０）において開示されているアッセイによって決定されてよい。
【００２２】
該突然変異体は、あらゆる技術によって生成されてよく、かつ当業者によって公知であり、例えばａｎ ｄｅｒ Ｓｌｏｏｔ ｅｔ ａｌ．（ＰＮＡＳ、２００６、１０３：８６３４〜８６３９）、Ｋｅｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００５、２８０：２２０５〜２２１５）、又はＭａｃＦａｒｌａｎｅ ｅｔ ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、２００５、６５：１１２６５〜１１２７０）において記載されている技術は、あらゆるタイプの構造変異体、例えばアミノ酸の置換、欠失、重複及び／又は挿入を含んでよい。好ましい一実施態様は、置換の発生である。該置換は、本明細書において記載されているＴＮＦスーパーファミリーのサイトカイン又はそれらの受容体結合ドメインの少なくとも１つのアミノ酸に影響を及ぼしてよい。好ましい一実施態様において、該置換は、ＴＲＡＩＬ、例えばヒトＴＲＡＩＬ（例えば配列番号３４）の少なくとも１つのアミノ酸に影響を及ぼしてよい。これに関連する好ましい置換は、配列番号３４のヒトＴＲＡＩＬのアミノ酸：Ｒ１３０、Ｇ１６０、Ｙ１８９、Ｒ１９１、Ｑ１９３、Ｅ１９５、Ｎ１９９、Ｋ２０１、Ｙ２１３、Ｔ２１４、Ｓ２１５、Ｈ２６４、Ｉ２６６、Ｄ２６７、Ｄ２６９の少なくとも１つに影響を及ぼす。配列番号３４のヒトＴＲＡＩＬの好ましいアミノ酸置換は、次の置換：Ｒ１３０Ｅ、Ｇ１６０Ｍ、Ｙ１８９Ａ、Ｙ１８９Ｑ、Ｒ１９１Ｋ、Ｑ１９３Ｓ、Ｑ１９３Ｒ、Ｅ１９５Ｒ、Ｎ１９９Ｖ、Ｎ１９９Ｒ、Ｋ２０１Ｒ、Ｙ２１３Ｗ、Ｔ２１４Ｒ、Ｓ２１５Ｄ、Ｈ２６４Ｒ、Ｉ２６６Ｌ、Ｄ２６７Ｑ、Ｄ２６９Ｈ、Ｄ２６９Ｒ、又はＤ２６９Ｋの少なくとも１つである。
【００２３】
アミノ酸置換は、ＴＲＡＩＬ、例えばヒトＴＲＡＩＬと、ＴＲＡＩＬＲ１又はＴＲＡＩＬＲ２のどちらかとの結合、及び／又どちらかに対する活性に影響を及ぼしてよい。代わりに、該アミノ酸置換は、ＴＲＡＩＬ、例えばヒトＴＲＡＩＬと、ＴＲＡＩＬＲ１及びＴＲＡＩＬＲ２の双方との、又は双方での、結合並びに／又は活性に影響を及ぼしてよい。ＴＲＡＩＬＲ１及び／又はＴＲＡＩＬＲ２の結合及び／又は活性は、積極的に、すなわちより強い、前記受容体のより選択的又は特異的な結合及び／又はより活性化に影響されてよい。代わりに、ＴＲＡＩＬＲ１及び／又はＴＲＡＩＬＲ２の結合及び／又は活性は、消極的に、すなわちより弱い、前記受容体のより少ない選択的又は特異的な結合及び／又はより小さい活性化に影響されてよい。
【００２４】
ＴＲＡＩＬＲ１とＴＲＡＩＬＲ２との双方の結合及び／又は活性に影響を及ぼす本発明のアミノ酸置換を有するＴＲＡＩＬの突然変異体の例は、例えばＭａｃＦａｒｌａｎｅ ｅｔ ａｌ．（前記参照）の表１において見出されてよく、かつ次の配列番号３４の２個のアミノ酸置換Ｙ２１３Ｗ及びＳ２１５Ｄ、又は次の１個のアミノ酸置換Ｙ１８９Ａを有するヒトＴＲＡＩＬ突然変異体を含有してよい。
【００２５】
ＴＲＡＩＬＲ１の結合及び／又は活性に影響を及ぼす本発明のアミノ酸置換を有するＴＲＡＩＬの突然変異体の例は、例えばＭａｃＦａｒｌａｎｅ ｅｔ ａｌ．（前記参照）の表１において見出されてよく、かつ次の配列番号３４の４個のアミノ酸置換Ｎ１９９Ｖ、Ｋ２０１Ｒ、Ｙ２１３Ｗ及びＳ２１５Ｄを有する、もしくは次の５個のアミノ酸置換Ｑ１９３Ｓ、Ｎ１９９Ｖ、Ｋ２０１Ｒ、Ｙ２１３Ｗ及びＳ２１５Ｄを有するヒトＴＲＡＩＬ突然変異体を含有してよく、又はＫｅｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（前記参照）の表２において見出されてよく、かつ次の６個のアミノ酸置換Ｙ２１３Ｗ、Ｓ２１５Ｄ、Ｙ１８９Ａ、Ｑ１９３Ｓ、Ｎ１９９Ｖ、及びＫ２０１Ｒを有する、もしくはＹ２１３Ｗ、Ｓ２１５Ｄ、Ｙ１８９Ａ、Ｑ１９３Ｓ、Ｎ１９９Ｒ、及びＫ２０１Ｒを有するヒトＴＲＡＩＬ突然変異体を含有してよい。
【００２６】
ＴＲＡＩＬＲ２の結合及び／又は活性に影響を及ぼす本発明のアミノ酸置換を有するＴＲＡＩＬの突然変異体の例は、例えばＭａｃＦａｒｌａｎｅ ｅｔ ａｌ．（前記参照）の表１において、もしくはＫｅｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（前記参照）の表２において見出されてよく、かつ次の配列番号３４の６個のアミノ酸置換Ｙ１８９Ｑ、Ｒ１９１Ｋ、Ｑ１９３Ｒ、Ｈ２６４Ｒ、Ｉ２６６Ｌ、及びＤ２６７Ｑを有するヒトＴＲＡＩＬ突然変異体を含有してよく、又はｖａｎ ｄｅｒ Ｓｌｏｏｔ ｅｔ ａｌ．（前記参照）の表２において見出されてよく、かつ次の１個のアミノ酸置換Ｄ２６９Ｈを有する、次の２個のアミノ酸置換Ｄ２６９Ｈ及びＥ１９５Ｒを有する、もしくはＤ２６９Ｈ及びＴ２１４Ｒを有するヒトＴＲＡＩＬ突然変異体を含有してよい。
【００２７】
従って好ましい一実施態様は、本明細書において記載されている融合タンパク質であり、その際構成成分（ｉ）は、ＴＲＡＩＬＲ１及び／又はＴＲＡＩＬＲ２を結合かつ／又は活性化するＴＲＡＩＬの又はそれらの受容体結合ドメインの突然変異体を含有する。
【００２８】
本明細書において記載されているＴＲＡＩＬの又は受容体結合ドメインの突然変異体を含有する融合タンパク質の好ましい一実施態様は、構成成分（ｉ）が、少なくとも１つのアミノ酸置換を含有する融合タンパク質である。
【００２９】
かかるアミノ酸置換は、次のヒトＴＲＡＩＬ（配列番号３４）のアミノ酸の位置：Ｒ１３０、Ｇ１６０、Ｙ１８９、Ｒ１９１、Ｑ１９３、Ｅ１９５、Ｎ１９９、Ｋ２０１、Ｙ２１３、Ｔ２１４、Ｓ２１５、Ｈ２６４、Ｉ２６６、Ｄ２６７、Ｄ２６９の少なくとも１つに影響を及ぼす。
【００３０】
かかるアミノ酸置換は、Ｒ１３０Ｅ、Ｇ１６０Ｍ、Ｙ１８９Ａ、Ｙ１８９Ｑ、Ｒ１９１Ｋ、Ｑ１９３Ｓ、Ｑ１９３Ｒ、Ｅ１９５Ｒ、Ｎ１９９Ｖ、Ｎ１９９Ｒ、Ｋ２０１Ｒ、Ｙ２１３Ｗ、Ｔ２１４Ｒ、Ｓ２１５Ｄ、Ｈ２６４Ｒ、Ｉ２６６Ｌ、Ｄ２６７Ｑ、Ｄ２６９Ｈ、Ｄ２６９Ｒ、又はＤ２６９Ｋの少なくとも１つである。
【００３１】
構成成分（ｉｉ）は、構成成分（ｉ）と（ｉｉｉ）との間に位置する可撓性リンカー要素である。有利には、該可撓性リンカー要素は、長さ５〜２０のアミノ酸、特に長さ６、９、１２、１５又は１８のアミノ酸を有する。該リンカー要素は、有利には、グリシン／セリンリンカー、すなわち実質的にアミノ酸のグリシン及びセリンからなるペプチドリンカーである。特に好ましい一実施態様において、該リンカーは、アミノ酸配列（ＧＳＳ）a（ＳＳＧ）b（ＧＳ）c（Ｓ）dを有し、その際ａ、ｂ、ｃ、ｄは、それぞれ０、１、２、３、４、又は５である。特定のリンカー配列の例は、ＧＳＳ ＧＳＳ ＧＳＳ ＧＳ（ａ＝３ ｂ＝０，ｂ＝０，ｃ＝１；ｄ＝０）（配列番号１９の１６１〜１７１のアミノ酸、もしくは配列番号２０の１８２〜１９２のアミノ酸を参照）、又はＳＳＧ ＳＳＧ ＳＳＧ Ｓ（ａ＝０；ｂ＝３，ｃ＝０；ｄ＝１）である。ＴＮＦスーパーファミリーのサイトカイン又はそれらの受容体結合ドメインが、Ｇ、例えばヒトＴＲＡＩＬ（配列番号３４）で既に終了する場合においては、かかるＧが、リンカー配列（ＧＳＳ）a（ＳＳＧ）b（ＧＳ）c（Ｓ）d（配列番号２０のアミノ酸１８２を参照）における該リンカーの最初のＧを形成してよいことが、当業者に明らかである。
【００３２】
構成成分（ｉｉｉ）は、フィブリチン三量体化ドメイン、特にバクテリオファージのフィブリチン三量体化ドメイン、よりいっそう詳述すればバクテリオファージＴ４、又は関連したバクテリオファージ、例えばＴ（表２において示されるバクテリオファージ又はファージＲＢ６９もしくはファージＡＲ１でさえも）からのフィブリチン三量体化ドメインである。Ｔ４フィブリチン三量体化ドメインは、例えば、ＵＳ ６，９１１，２０５号又はＷＯ ０１／１９９５８号の、本明細書において参照によって組み込まれる内容において記載されており、かつ配列番号２３の配列を有する。ＲＢ６９フィブリチン三量体化ドメインは、配列番号２４の配列を有する。
【００３３】
より好ましくは、構成成分（ｉｉｉ）は、アミノ酸配列（Ｇ）ＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱ ＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶ ＬＬＳＴＦＬ（配列番号８、又は配列番号２３の４５８〜４８４もしくは４５９〜４８４のアミノ酸）、又はそれらに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する配列変異体を含有する。好ましい配列変異体の例は、表３において示されている。
【００３４】
より好ましくは、構成成分（ｉｉｉ）は、アミノ酸配列（Ｇ）ＹＩＥＤＡＰＳＤＧＫＦＹＶＲＫＤＧＡＷＶＥＬＰＴＡ（配列番号９、又は配列番号２４の４５５〜４８０もしくは４５６〜４８０のアミノ酸）、又はそれらに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する配列変異体を含有する。
【００３５】
さらに、構成成分（ｉｉｉ）は、２０から３０までのアミノ酸の長さを有することが好ましい。
【００３６】
本発明の融合タンパク質において、構成成分（ｉ）は、構成成分（ｉｉｉ）のＮ−末端に位置することが好ましい。しかしながら、本発明は、構成成分（ｉｉｉ）が、構成成分（ｉ）のＮ−末端に位置する実施態様にも関する。前記の構成成分（ｉ）及び（ｉｉｉ）は、互いに直接側面に位置してよく、又は例えば本明細書において記載されている（例えば配列番号１９及び２０を参照）リンカー配列によって分けられてよい。
【００３７】
前記の融合タンパク質は、好適な宿主細胞中の処理、例えば細胞外分泌物を可能にする、Ｎ−末端シグナルペプチドドメインを付加的に含有してよい。有利には、Ｎ−末端シグナルペプチドドメインは、プロテアーゼ、例えばシグナルペプチダーゼ開裂部位を含有し、かつ従って発現後又は発現中に除去されて、成熟タンパク質を得てよい。さらに、該融合タンパク質は、認識／精製ドメイン、例えばＦＬＡＧドメイン、Ｓｔｒｅｐ−タグドメイン及び／又はポリ−Ｈｉｓドメインを含んでよい、又は該ドメインに連結してよい、例えば１〜５０、有利には１０〜３０のアミノ酸の長さを有する、Ｃ−末端可撓性要素を付加的に含有してよい。
【００３８】
本発明の特定の融合タンパク質の例は、配列番号１、１９、及び２０である。
【００３９】
本発明の他の側面は、本発明において記載されている融合タンパク質をコードする核酸分子に関する。該核酸分子は、ＤＮＡ分子、例えば二本鎖もしくは一本鎖ＤＮＡ分子、又はＲＮＡ分子であってよい。該核酸分子は、有利には融合タンパク質のＮ−及び／又はＣ−末端に位置する分泌又は精製のための単独の配列又は他の異形アミノ酸タンパク質を含有してよい、融合タンパク質又はそれらの前駆体、例えば融合タンパク質のプロ体又はプロプレ体をコードしてよい。異形アミノ酸タンパク質は、プロテアーゼ開裂部位、例えば第Ｘa因子、トロンビン又はＩｇＡプロテアーゼ開裂部位を介して最初の及び／又は二番目のドメインに連結されてよい。
【００４０】
本発明の特定の核酸配列の例は、配列番号２、２１、及び２２である。
【００４１】
前記核酸分子は、発現調節配列、例えば所望の宿主細胞中で核酸分子の発現を可能にする発現調節配列に作動的に連結されてよい。該核酸分子は、ベクター、例えばプラスミド、バクテリオファージ、ウイルス性ベクター、染色体組込みベクター等の上に置かれてよい。好適な発現調節配列及びベクターの例は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、又はそれらの最新版によって記載されている。
【００４２】
種々の発現ベクター／宿主細胞形は、本発明の融合タンパク質をコードする核酸配列を発現するために使用されてよい。好適な宿主細胞は、制限されることなく、バクテリア、例えば大腸菌のような原核細胞、酵母菌、昆虫細胞、植物細胞、又は動物細胞、有利には哺乳動物細胞、及びより有利にはヒト細胞のような真核宿主細胞を含む。
【００４３】
さらに、本発明は、前記に記載されている核酸分子で形質転換又は形質移入された非ヒト生物に関する。かかる遺伝子導入生物は、相同組換えを含む遺伝子導入の公知の方法によって生成されてよい。
【００４４】
全て本明細書において記載されている、前記の融合タンパク質、そのためにコードするそれぞれの核酸、形質転換又は形質移入された細胞、並びに三量体複合体又は三量体複合体のオリゴマーは、医薬の、診断の及び／又は研究の用途のために使用されてよい。
【００４５】
本発明の他の側面は、活性剤として、全て明細書において記載されている、少なくとも１つの融合タンパク質、そのためにコードする少なくとも１つのそれぞれの核酸分子、少なくとも１つの形質転換又は形質移入された細胞、並びに少なくとも１つの三量体複合体又は三量体複合体のオリゴマーを含有する、医薬又は診断組成物に関する。
【００４６】
全て明細書において記載されている、少なくとも１つの融合タンパク質、そのためにコードする少なくとも１つのそれぞれの核酸分子、少なくとも１つの形質転換又は形質移入された細胞、並びに少なくとも１つの三量体複合体又は三量体複合体のオリゴマーは、療法において、例えばＴＮＦサイトカインの機能不全によって生じる、ＴＮＦサイトカインの機能不全に関連する、及び／又はＴＮＦサイトカインの機能不全に附随する疾患、特に腫瘍のような増殖性疾患、例えば充実性腫瘍又はリンパ腺腫瘍；感染症；炎症性疾患；代謝疾患；自己免疫異常、例えばリウマチ及び／又は関節疾患；変性疾患、例えば多発性硬化症のような神経組織変性疾患；アポトーシス関連性疾患、又は移植拒絶反応の予防及び／又は治療において、使用されてよい。
【００４７】
本明細書において使用される"ＴＮＦサイトカインの機能不全"という用語は、ＴＮＦサイトカインの通常の機能又は発現、例えばＴＮＦ遺伝子又はタンパク質の過剰発現、前記ＴＮＦサイトカインの通常の生理学的発現レベルと比較してＴＮＦサイトカイン遺伝子又はタンパク質の低減又は破壊させた発現、前記ＴＮＦサイトカインの通常の生理学的発現レベルと比較して、ＴＮＦサイトカインの増強させた活性、ＴＮＦサイトカインの低減又は破壊させた活性、ＴＮＦサイトカインとあらゆる結合相手との、例えば受容体、特にＴＲＡＩＬ受容体又は他のサイトカイン分子との増強させた結合、ＴＮＦサイトカインとあらゆる結合相手との、例えば受容体、特にＴＲＡＩＬ受容体又は他のサイトカイン分子との低減又は破壊させた結合から逸脱するＴＮＦサイトカインのあらゆる機能又は発現として理解されるべきである。
【００４８】
前記の組成物は、単剤療法として、又は他の薬剤、例えば細胞増殖抑制剤もしくは化学療法薬、コルチコステロイド及び／又は抗生物質との併用療法として投与されてよい。
【００４９】
前記融合タンパク質は、特定の条件の治療のために好適な手段による十分な投与量で、それらを必要とする被験者、特にヒトの患者に投与される。例えば、該融合タンパク質は、製剤学的に認容性のキャリヤー、希釈液及び／又は補助剤と共に医薬組成物として配合されてよい。治療の有効性及び毒性は、標準のプロトコルによって決定されてよい。該医薬組成物は、全身的に、例えば腹膜内に、筋肉内に、もしくは静脈内に、又は局所的に、例えば鼻腔内に、皮下に、もしくはクモ膜下に投与されてよい。静脈内投与が好ましい。
【００５０】
投与される融合タンパク質の投与量は、もちろん、被験者の体重、病気のタイプ及び重さ、投与方法、及び処方医の判断に対して、治療されるべき被験者に依存する。融合タンパク質の投与のために、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇの日用量が好適である。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１−Ａ】ストレプタクチンアフィニティー精製ｈｓ９５Ｌ−ＡＴ４のＳＥＣ分析を示す図。
【図１−Ｂ】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色によるｈｓ９５Ｌ−ＡＴ４のＳＥＣ画分の分析を示す図。
【図２】ｈｓ９５Ｌ−ＡＴ４の天然の見かけの分子量の決定を示す図。
【図３】Ｊｕｒｋａｔ細胞においてアポトーシスを誘発するＳＥＣ画分の電位によるｈｓ９５Ｌ−ＡＴ４のＳＥＣ画分の分析を示す図。
【図４】ＡＰＧ１０１によるｈｓ９５Ｌ−ＡＴ４誘発性アポトーシスの阻害を示す図。
【図５】Ａは、ストレプタクチンアフィニティー精製ｈｓ９５Ｌ−Ａ６９のＳＥＣ分析を示す図。Ｂは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色によるＳＥＣ画分の分析を示す図。Ｃは、Ｊｕｒｋａｔ細胞においてアポトーシスを誘発するＳＥＣ画分の電位によるｈｓ９５Ｌ−Ａ６９のＳＥＣ画分（Ａで示される）の分析を示す図。
【図６】Ａは、ストレプタクチンアフィニティー精製ｈｓＴＲＡＩＬ−ＡＴ４のＳＥＣ分析を示す図。Ｂは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色によるｈｓＴＲＡＩＬ−ＡＴ４のＳＥＣ画分の分析を示す図。Ｃは、Ｊｕｒｋａｔ細胞においてアポトーシスを誘発するＳＥＣ画分の電位によるｈｓＴＲＡＩＬ−ＡＴ４のＳＥＣ画分（Ａで示される）の分析を示す図。
【００５２】
実施例
１．融合タンパク質の製造
次において、本発明の組換えタンパク質の基本的な構造を、ヒトのＣＤ９５リガンドの受容体結合ドメインのための例として示す。
【００５３】
１．１ ポリペプチド構造
Ａ）アミノ酸Ｍｅｔ１〜Ｇｌｙ２０
アミノ酸Ｇｌｙ２０とＧｌｕ２１との間のシグナルペプチダーゼ開裂部位を呈する、ＩｇＫａｐｐａ−シグナルペプチド
Ｂ）アミノ酸Ｇｌｕ２１〜Ｌｅｕ１６０
ヒトＣＤ９５リガンドの受容体結合ドメイン（ＣＤ９５Ｌ；配列番号３０の１４２〜２８１のアミノ酸）
Ｃ）アミノ酸Ｇｌｙ１６１〜Ｓｅｒ１７１
ＣＤ９５Ｌと三量体化ドメインとの間の３０Åまでの距離を提供する可撓性リンカー要素
Ｄ）アミノ酸Ｇｌｙ１７２〜Ｌｅｕ１９８
バクテリオファージＴ４−フィブリチンの三量体化ドメイン（配列番号２３の４５８〜４８４のアミノ酸）
Ｅ）アミノ酸Ｓｅｒ１９９〜Ｌｙｓ２２２
６ｘＨｉｓ−ＳｔｒｅｐタグＩＩモチーフを有する可撓性成分。
【００５４】
得られたタンパク質を、ｈｓ９５Ｌ−ＡＴ４とした。
【００５５】
2010501191.tif 000002
【００５６】
１．２ ポリペプチドをコードする遺伝子カセット
合成遺伝子を、好適な宿主細胞、例えば昆虫細胞又は哺乳動物細胞中で発現するためのそのコドン使用頻度を考慮して最適化してよい。
【００５７】
2010501191.tif 000003
【００５８】
１．３ ｈｓ９５Ｌ−ＡＴ４のクローニング法
前記の合成遺伝子を、Ｃｐｏ−Ｉ／Ｈｉｎｄ−ＩＩＩ加水分解によって導入プラスミドから切除し、かつ好適なベクター中にクローンを作る。
【００５９】
Ｃ−末端のＳｔｒｅｐタグ−ＩＩのための配列コードは、例えば平滑末端カッターのＥｃｏ４７−ＩＩＩ及びＯｌｉ−Ｉでの同時の加水分解、及びベクターの再連結によって削除してよい。従って、終止コドンを、６ｘＨｉｓｔａｇの下流で、制限酵素の半分の部位の融合によって導入する。
【００６０】
Ａ）Ｅｃｏ４７−ＩＩＩ及びＯｌｉ−Ｉでの加水分解前の前記カセットの３’末端
2010501191.tif 000004
【００６１】
Ｂ）加水分解及び再連結後の該カセットの３’末端
2010501191.tif 000005
【００６２】
合成遺伝子の配列：
2010501191.tif 000006
【００６３】
２．発現及び精製
ａ）ｈｓ９５Ｌ−ＡＴ４のクローニング、発現及び精製
１０％ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンで補足したＤＭＥＭ＋ＧｌｕｔａＭＡＸ（ＧｉｂＣｏ）中で成長させたＨｅｋ２９３Ｔ細胞を、ｈｓ９５Ｌ−ＡＴ４のための発現カセットを含むプラスミドで瞬間的に形質移入した。組換えｈｓ９５Ｌ−ＡＴ４を含む細胞培養液の上清を、形質移入の３日後に回収し、そして３００ｇで遠心分離して、引き続き０．２２μｍの滅菌フィルターを通して濾過することによって不純物を除去した。アフィニティー精製のために、ストレプタクチンセファロースを、カラム（ゲル層１ｍｌ）へ充填し、１５ｍｌの緩衝液Ｗ（１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ８．０）で平衡化し、そして細胞培養液の上清を、４ｍｌ／ｍｉｎの流速で該カラムに適用した。続いて、該カラムを、１５ｍｌの緩衝液Ｗで洗浄し、そして結合したｈｓ９５Ｌ−ＡＴ４を、７ｘ１ｍｌの緩衝液Ｅ（１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭデスチオビオチン ｐＨ８．０）の添加によって段階的に溶離した。溶離液の画分のタンパク質量を定量化し、そしてピークの画分を、限界濾過によって濃縮して、さらにサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって精製した。
【００６４】
ＳＥＣを、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム上でＡｋｔａクロマトグラフィーシステム（ＧＥ−ヘルスケア）を使用して実施した。該カラムを、リン酸緩衝食塩水で平衡化し、そして濃縮されたストレプタクチン精製ｈｓ９５Ｌ−ＡＴ４を、０．５ｍｌ／ｍｉｎの流速でＳＥＣカラム上に置いた。２８０ｎｍでの吸光度によって観測されたｈｓ９５Ｌ−ＡＴ４の溶離分布図は、１３．８５ｍｌで顕著なタンパク質のピークを示した（図１Ａ）。続いて、ピークの画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色による変性条件下で分析した（図１Ｂ）。標準タンパク質での較正に基づいて、ｈｓ９５Ｌ−ＡＴ４は、約３０ＫＤａで流れる。計算されたｈｓ９５Ｌ−ＡＴ４モノマーの理論的分子量は、２２．４ＫＤａである。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の約３０ＫＤａのより高い見かけの分子量は、有利には、ｈｓ９５Ｌ−ＡＴ４の炭水化物の改質による。
【００６５】
精製ｈｓ９５Ｌ−ＡＴ４の見かけの分子量の決定のために、天然の条件下で、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムを、公知の分子量の標準タンパク質で装填した。標準タンパク質の溶離体積に基づいて、較正曲線を求め、そして精製ｈｓ９５Ｌ−ＡＴ４の見かけの分子量を、ｈｓ９５Ｌ−ＡＴ４の安定した三量体構造を示す９０．３ＫＤａであること決定した（図２；表４）。
【００６６】
ｂ）ヒトＣＤ９５Ｌ−Ａ６９（ｈｓ９５Ｌ−Ａ６９）及びヒトＴＲＡＩＬ−ＡＴ４（ｈｓＴＲＡＩＬ−ＡＴ４）のクローニング、発現及び精製
ｈｓ９５Ｌ−Ａ６９−及びＴＲＡＩＬ−ＡＴ４−構成体のアミノ酸配列（配列番号１９及び配列番号２０）を、逆翻訳し、そしてそれらのコドン使用頻度を、哺乳動物の細胞を基礎とした発現のために最適化した。遺伝子合成を、ＥＮＴＥＬＥＣＨＯＮ ＧｍｂＨ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって行った。
【００６７】
最終的に、ｈｓ９５Ｌ−Ａ６９及びｈｓＴＲＡＩＬ−ＡＴ４−発現カセット（配列番号２１及び配列番号２２）を、プラスミドの特有のＨｉｎｄ−Ｉｌｌ−及びＮｏｔ−Ｉ−部位を使用して、ｐＣＤＮＡ４−ＨｉｓＭａｘ−主鎖（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）中にサブクローンした。
【００６８】
ｈｓ９５Ｌ−Ａ６９及びｈｓＴＲＡＩＬ−ＡＴ４タンパク質を、ｈｓＣＤ９５Ｌ−ＡＴ４に関して記載された（２ａを参照）、それぞれのｃＤＮＡ−構成体をコードするプラスミドで瞬間的に形質移入させたＨｅｋ２９３Ｔ細胞の組織培養液の上清から精製した。一時的に、組換え発現させたタンパク質を、ストレプタクチンアフィニティークロマトグラフィーを介して最初に精製した。二番目の工程において、アフィニティーピークの画分を、ＳＥＣを介してさらに精製及び分析した（図５Ａ及び６Ａ）。精製タンパク質の純度を調べるために、続いて、ＳＥＣ画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色によって分析した（図５Ｂ及び６Ｂ）。ＳＥＣからの記録を、加えて、それぞれのタンパク質の天然の見かけの分子量を決定するために使用した。
【００６９】
３．アポトーシスのアッセイ
Ｊｕｒｋａｔ Ａ３の永久Ｔ細胞株での細胞アッセイを、種々のＣＤ９５リガンド（ＣＤ９５Ｌ）構成体の活性を含むアポトーシスを決定するために使用した。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、フラスコ中で、１０％ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンで補足させたＲＰＭＩ １６４０培地＋ＧｌｕｔａＭａｘ（ＧｉｂＣｏ）で育てた。アッセイの前に、１０００００個の細胞を、９６−ウェル微量定量プレート中へウェル毎に播いた。ウェルへＣＤ９５Ｌを種々の濃度で添加し、続いて３７℃で３時間インキュベートした。細胞を、溶解緩衝液（２５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ ＭｇＣＩ2、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、５％Ｔｒｉｔｏｎ−ｘ−１００、１００ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ ＡＥＢＳＦ、ｐＨ７．５）を添加することによって溶解し、そしてプレートを３０分間氷上に置いた。アポトーシスは、カスパーゼ３及びカスパーゼ７の増強させた活性によって平行する。従って、特定のカスパーゼ３／７基質Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣ（Ｂｉｏｍｏｌ）の開裂を、アポトーシスの限界を決定するために使用した。実際に、カスパーゼ活性は、ヨウ化プロピジウム及びＨｏｅｃｈｓｔ−３３３４２での細胞の染色後に形態学的に決定されたアポトーシスの細胞の百分率と関係がある。カスパーゼ活性のアッセイのために、細胞溶解産物２０μｌを、黒い６９−ウェル微量定量プレートへ移した。５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１％スクロース、０．１％ＣＨＡＰＳ、５０μＭ Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣ及び２５ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．５を含有する８０μｌ緩衝液の添加後に、該プレートを、Ｔｅｃａｎ ＧｅｎｉｏｓＰｒｏの微量定量プレートリーダーに移し、そして蛍光強度の増強を、観測した（励起波長４００ｎｍ、発光波長５０５ｎｍ）。例示的に、図３は、この細胞アポトーシスアッセイにおけるＣＤ９５リガンドｈｓ９５Ｌ−ＡＴ４のＳＥＣ画分のカスパーゼアッセイの導入を実証する。カスパーゼ活性の限界は、図１Ａ及び１Ｂにおいて示されているＳＥＣ画分のｈｓ９５Ｌ−ＡＴ４含量とよく一致する。
【００７０】
Ｊｕｒｋａｔ Ａ３の永久Ｔ細胞株での細胞アッセイを、ｈｓ９５Ｌ−Ａ６９及びｈｓＴＲＡＩＬ−ＡＴ４活性を含むアポトーシスを決定するためにも使用した。Ｊｕｒｋａｔ細胞（ウェル毎に１０００００細胞）を、リガンドで、３時間、３７℃でインキュベートした。細胞を溶解し、そしてアポトーシス導入を、特定のカスパーゼ３／７基質Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣの開裂の決定によって観測した。
【００７１】
これらの見かけの分子量に基づいて、ｈｓ９５Ｌ−Ａ６９及びｈｓＴＲＡＩＬ−ＡＴ４の双方の精製タンパク質を、発現し、そしてＪｕｒｋａｔ細胞上でアポトーシスを含む、安定した同一の三量体化タンパク質として精製した。第一級アミノ酸配列の塩基に対して計算された理論的分子量でＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＳＥＣによって決定された見かけの分子量を比較した要約を、表４に示す。
【００７２】
このアポトーシスアッセイを、ＡＰＧ１０１の生物学的活性の決定のためにも使用した。ＡＰＧ１０１は、ヒトＦｃでヒトＣＤ９５−受容体（ＣＤ９５リガンドの生体内での結合相手）の細胞外ドメインを含む融合タンパク質である。ＡＰＧ１０１は、リガンドと結合することによってＣＤ９５Ｌの効果を含むアポトーシスを拮抗する。ＣＤ９５ＬのＪｕｒｋａｔ細胞への添加の前に、一定の濃度でのＣＤ９５Ｌを、３０分間３７℃で、ＡＰＧ１０１の種々の濃度でインキュベートした。ＡＰＧ１０１の効果の例を、図４で示す。ＣＤ９５リガンドｈｓ９５Ｌ−ＡＴ４は、投与量依存法でカスパーゼ活性、ＡＰＧ１０１によって破壊された効果を含む。
【００７３】
【表１】
2010501191.tif 000007
【００７４】
【表２】
2010501191.tif 000008
【００７５】
【表３】
2010501191.tif 000009
【００７６】
【表４】
2010501191.tif 000010
【配列表フリーテキスト】
【００７７】
配列番号１：ｈｓ９５Ｌ−ＡＴ４
配列番号２：遺伝子カセット
配列番号３：合成構成物
配列番号４：加水分解前の３’末端
配列番号５：合成構成物
配列番号６：加水分解後の３’末端
配列番号７：合成遺伝子
配列番号８：Ｔ４ ｆｏｌｄｏｎ
配列番号９：腸内細菌ファージＲＢ６９
配列番号１０：ファージＡＲ１
配列番号１１：Ｔ４ ｆｏｌｄｏｎ突然変異タンパク質
配列番号１２：Ｔ４ ｆｏｌｄｏｎ突然変異タンパク質
配列番号１３：Ｔ４ ｆｏｌｄｏｎ突然変異タンパク質
配列番号１４：Ｔ４ ｆｏｌｄｏｎ突然変異タンパク質
配列番号１５：Ｔ４ ｆｏｌｄｏｎ突然変異タンパク質
配列番号１６：Ｔ４ ｆｏｌｄｏｎ突然変異タンパク質
配列番号１７：Ｔ４ ｆｏｌｄｏｎ突然変異タンパク質
配列番号１８：Ｔ４ ｆｏｌｄｏｎ突然変異タンパク質
配列番号１９：ｈｓ９５Ｌ−Ａ６９
配列番号２０：ｈｓＴＲＡＩＬ−ＡＴ４
配列番号２１：ｈｓ９５Ｌ−Ａ６９
配列番号２２：ｈｓＴＲＡＩＬ−ＡＴ４
配列番号２３：腸内細菌ファージＴ４
配列番号２４：腸内細菌ファージＲＢ６９
配列番号２５：ヒトＬＴＡ
配列番号２６：ヒトＴＮＦａ
配列番号２７：ヒトＬＴＡ及びヒトＬＴＢ
配列番号２８：ヒトＯＸ４０Ｌ
配列番号２９：ヒトＣＤ４０Ｌ
配列番号３０：ヒトＣＤ９５Ｌ
配列番号３１：ヒトＣＤ２７Ｌ
配列番号３２：ヒトＣＤ３０Ｌ
配列番号３３：ヒトＣＤ１３７Ｌ
配列番号３４：ヒトＴＲＡＩＬ
配列番号３５：ヒトＲＡＮＫＬ
配列番号３６：ヒトＴＷＥＡＫ
配列番号３７：ヒトＡＰＲＩＬ−１
配列番号３８：ヒトＡＰＲＩＬ−２
配列番号３９：ヒトＢＡＦＦ
配列番号４０：ヒトＬＩＧＨＴ
配列番号４１：ヒトＴＬ１Ａ
配列番号４２：ヒトＧＩＴＲＬ
配列番号４３：ヒトＥＤＡ−Ａ１
配列番号４４：ヒトＥＤＡ−Ａ２
【図１−Ａ】
2010501191.tif 000011
【図１−Ｂ】
2010501191.tif 000012
【図２】
2010501191.tif 000013
【図３】
2010501191.tif 000014
【図４】
2010501191.tif 000015
【図５】
2010501191.tif 000016
【図６】
2010501191.tif 000017
【配列表】
2010501191000001.app
【国際調査報告】
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