(57)【要約】  ナノ構造、ナノ構造の調製方法、対象における標的の検出方法、および対象における疾患の治療方法を開示する。特に、ナノ構造の実施形態には、金属性金表面増強ラマン散乱ナノ粒子、ラマンレポーター、および保護構造が含まれる。この保護構造には、標的特異的プローブに結合することができるチオール−ポリエチレングリコールを含み得る。
2010523983.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コア金属ナノ粒子と、
前記コアの表面に配置されたラマンレポーター分子と、
前記コアおよび前記レポーター分子の表面上に配置されたカプセル化保護層
とを含む表面増強ラマン分光活性複合体ナノ構造であって、カプセル化レポーター分子が測定可能な表面増強ラマン分光特性を有するナノ構造。
【請求項２】
前記ラマンレポーター分子が、イソチオシアナート色素、多重含硫有機色素、多重ヘテロ含硫有機色素、ベンゾトリアゾール色素、またはそれらの組合せから選択される、請求項１に記載のナノ構造。
【請求項３】
前記レポーター分子が、チアシアニン色素、ジチアシアニン色素、チアカルボシアニン色素、またはジチアカルボシアニン色素から選択される、請求項１に記載のナノ構造。
【請求項４】
前記レポーター分子が、マラカイトグリーンイソチオシアナート、テトラメチルローダミン−５−イソチオシアナート、Ｘ−ローダミン−５−イソチオシアナート、Ｘ−ローダミン−６−イソチオシアナート、または３，３’−ジエチルチアジカルボシアニンヨージドから選択される、請求項１に記載のナノ構造。
【請求項５】
前記コア金属ナノ粒子が金である、請求項３に記載のナノ構造。
【請求項６】
前記コアの直径が約２００ナノメートル未満である、請求項１に記載のナノ構造。
【請求項７】
カプセル化物質がチオール−ポリエチレングリコールである、請求項１に記載のナノ構造。
【請求項８】
細胞上の標的に選択的に結合する標的特異的プローブをさらに含む、請求項１に記載のナノ構造。
【請求項９】
前記標的特異的プローブが、抗体、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、薬剤分子、阻害剤化合物、およびそれらの組合せからなる群から選択され、ターゲティングプローブが、標的細胞表面上のマーカーに親和性を有する、請求項８に記載のナノ構造。
【請求項１０】
前記標的特異的プローブが免疫グロブリンまたはその断片である、請求項９に記載のナノ構造。
【請求項１１】
前記プローブが、疎水性保護構造上に配置されている、請求項８に記載のナノ構造。
【請求項１２】
前記プローブが腫瘍ターゲティングリガンドである、請求項８に記載のナノ構造。
【請求項１３】
金属ナノ粒子を提供するステップと、
前記金属ナノ粒子をラマンレポーターに導入するとすぐに前記ラマンレポーターが前記ナノ粒子の表面上に配置されてナノ粒子−レポーター複合体を形成するステップと、
前記ナノ粒子−レポーター複合体の表面上に保護構造層を配置するステップ
とを含むナノ構造の調製方法であって、レポーター分子が測定可能な表面増強ラマン分光特性を有する方法。
【請求項１４】
前記保護構造層に細胞標的特異的プローブを付着させるステップをさらに含み、前記プローブが、抗体、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、薬剤分子、阻害剤化合物、またはそれらの組合せから選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記コア金属ナノ粒子がコロイドである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記コア金属ナノ粒子が金である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
ラマンレポーター分子が、イソチオシアナート色素、多重含硫有機色素、多重ヘテロ含硫有機色素、ベンゾトリアゾール色素、またはそれらの組合せから選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記レポーター分子が、チアシアニン色素、ジチアシアニン色素、チアカルボシアニン色素、またはジチアカルボシアニン色素から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記レポーター分子が、マラカイトグリーンイソチオシアナート、テトラメチルローダミン−５−イソチオシアナート、Ｘ−ローダミン−５−イソチオシアナート、Ｘ−ローダミン−６−イソチオシアナート、または３，３’−ジエチルチアジカルボシアニンヨージドから選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
カプセル化物質がチオール−ポリエチレングリコールである、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも１つのナノ構造を培養細胞または動物もしくはヒト対象に送達するステップであって、前記ナノ構造がコア金ナノ粒子と、前記コア表面上に配置されたラマンレポーター分子と前記コアおよび前記レポーター分子に配置されたカプセル化保護層とを含み、カプセル化レポーター分子が測定可能な表面増強ラマン分光特性を有するステップと、
前記ナノ構造を標的指向生物学的細胞または組織と接触させるステップと、
照射源でレポーター分子を励起するステップと、
前記レポーター分子に対応するナノ構造の表面増強ラマン分光スペクトルを測定し、それによって標的指向細胞または組織中の前記ナノ構造の存在を検出するステップ
とを含む、生物学的試料の画像化方法。
【請求項２２】
前記ナノ構造が標的特異的プローブをさらに含み、ターゲティングプローブが前記ナノ粒子を標的指向細胞に選択的に結合させ、それによって前記標的指向細胞の検出を可能にする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
標的細胞が動物またはヒト対象の組織中にある、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
標的細胞が動物またはヒト対象の癌細胞である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記標的特異的プローブが、抗体、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、薬剤分子、阻害剤化合物、またはそれらの組合せからなる群から選択され、ターゲティングプローブが、標的細胞表面上のマーカーに親和性を有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記標的特異的プローブが腫瘍ターゲティングリガンドである、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００７年４月２日出願の米国仮特許出願第６０／９０９，６５６号、表題「癌バイオマーカーのｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ検出のための表面増強ラマン散乱に基づく新種のナノ粒子タグ」に基づく優先権を主張し、参照することによりその全体を本明細書に組み込む。
【０００２】
（政府支援の研究または開発に関する陳述）
本発明は、アメリカ合衆国政府の米国国立衛生研究所により付与されたＮＩＨ助成金第Ｒ０１ＣＡ１０８，４６８号に基づいて政府支援により実施された。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
（技術分野）
本開示は一般的に、表面増強ラマン分光ナノ粒子およびそれらの細胞検出用途に関する。
【背景技術】
【０００４】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける分子画像化および標的指向治療のための生体適合性ナノ粒子の開発は、いくつかの科学、工学および生物医学の領域にわたって、近年かなり興味の持たれている分野である。ナノメートルの大きさの粒子は、離散した分子またはかさ高い物質では得られない機能的および構造的な特性を有するというのが基本的な理論的根拠である。モノクローナル抗体、ペプチドまたは低分子などの生体分子ターゲティングリガンドと結合させると、これらのナノ粒子は、高い特異性および親和性で悪性腫瘍を標的とするために使用することができる。１０から１００ｎｍの範囲の直径の「メゾスコピックな」大きさでは、ナノ粒子はまた、多種の診断物質（例えば、光学物質、放射性同位体、または磁性物質）および治療物質（例えば、抗癌剤）に結合させるための大きな表面積を有する。最近の進歩によって、薬物送達のための生分解性ナノ構造、核磁気共鳴画像法のための酸化鉄ナノ結晶、多重分子診断およびｉｎ  ｖｉｖｏにおける画像化のための量子ドット、ならびに低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）送達のためのナノスケール担体の開発が進められてきた。
【０００５】
コロイド状金は、半世紀の間、関節リウマチの治療に安全に使用されてきており、最近の研究では、ペグ化金ナノ粒子（ポリエチレングリコールまたはＰＥＧの保護層でコーティングされたコロイド状金）は、全身注射すると優れたｉｎ  ｖｉｖｏ体内分布および薬物動態特性を表すことが示されている。カドミウムを含有する量子ドットおよびその他の有毒なナノ粒子または免疫原性のあるナノ粒子とは対照的に、金コロイドはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて長期毒性およびその他の有害作用をほとんどまたは全く有さない。単一分子および単一ナノ粒子の表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）の発見は、増強機構の基礎的研究のために、ならびに超高感度の光学的検出および分光法に適用できる可能性のために、少なからず関心が持たれている。多数の研究者によって、その増強係数は１０１４〜１０１５と大きく、蛍光有機色素に相当するか、またはそれよりもさらに大きいラマン散乱断面をもたらすことが示された。非常に大きく増強されるので、室温で単一ナノ粒子の表面または２個の粒子の結合部に位置する単一分子の分光学的な検出および同定が可能である。１分子ＳＥＲＳの構造学的側面および機構的側面の両方に関しては進歩したが、この大きな増強効果を分析化学、分子生物学、または医療診断学における用途にどのように役立てることができるのかは、未だに不明である。１つの大きな問題は、粗面化金属表面に吸着する分子を必要とするＳＥＲＳ固有の界面特性である。ペプチド、タンパク質、および核酸などの生物学的分子では、表面増強ラマンのデータを得ることは特に困難で、解釈も難しく、再現することはほとんど不可能である。
【発明の概要】
【０００６】
超高感度表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）分光法に基づいた新たな細胞画像化技術の実施形態は、診断手段および治療手段として開発された。本開示の実施形態は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて適用するための、耐久性のある多用途な保護コーティングに内在的に組み込まれたＳＥＲＳナノタグに関する。画像の明るさを測定すると、ＳＥＲＳナノタグが量子ドットタグよりも少なくとも２桁大きいことを示すことができる。２官能性ポリエチレングリコールポリマーは、金ナノ粒子コアとナノ構造に結合させたターゲティング物質または治療物質との間のリンカーとして働く。
【０００７】
ナノ粒子、その調製法、およびナノ粒子の実施形態を使用した標的分子の検出方法を開示する。例示したナノ粒子の一実施形態には、特に、表面増強ラマン分光活性複合体ナノ構造が含まれる。表面増強ラマン分光活性複合体ナノ構造には、コア、レポーター分子、およびカプセル化物質が含まれる。レポーター分子は、コアに結合される。レポーター分子は、イソチオシアナート色素、多重含硫有機色素（multi-sulfur organic dye）、多重ヘテロ含硫有機色素（multi-heterosulfur organic dye）、ベンゾトリアゾール色素、およびそれらの組合せから選択されるが、それらだけに限られない。カプセル化物質は、コアおよびレポーター分子上に配置される。カプセル化されたレポーター分子は、測定可能な表面増強ラマン分光特性を有する。
【０００８】
簡単に述べると、本開示の実施形態は特に、ナノ構造、ナノ構造の調製方法、ならびに細胞、組織または動物もしくはヒト全体の表面または内部の特定の標的に本開示のナノ構造を送達することによって画像化する方法を包含する。本開示は、金属ナノ粒子コア、ラマンレポーター、およびそれらに配置された保護層を含むナノ構造を包含する。
【０００９】
したがって、本開示の一態様は、コア金属ナノ粒子、コアの表面に配置されたラマンレポーター分子、ならびにコアおよびレポーター分子の表面に配置されたカプセル化保護層を含む表面増強ラマン分光活性複合体ナノ構造を包含し、このカプセル化レポーター分子は測定可能な表面増強ラマン分光特性を有する。
【００１０】
本開示の実施形態において、ラマンレポーター分子は、イソチオシアナート色素、多重含硫有機色素、多重ヘテロ含硫有機色素、ベンゾトリアゾール色素、およびそれらの組合せから選択される。
【００１１】
本開示の実施形態において、レポーター分子は、チアシアニン色素、ジチアシアニン色素、チアカルボシアニン色素、およびジチアカルボシアニン色素から選択される。その他の実施形態では、レポーター分子は、マラカイトグリーンイソチオシアナート、テトラメチルローダミン−５−イソチオシアナート、Ｘ−ローダミン−５−イソチオシアナート、Ｘ−ローダミン−６−イソチオシアナート、および３，３’−ジエチルチアジカルボシアニンヨージドから選択される。
【００１２】
本開示の一実施形態では、コアは金であり、約２００ナノメートル未満の直径を有することができる。
【００１３】
本開示のナノ構造の実施形態では、カプセル化物質はチオール−ポリエチレングリコールであることができる。
【００１４】
本開示のその他の実施形態では、ナノ構造はさらに、細胞上の標的に選択的に結合できる標的特異的プローブを含むことができる。
【００１５】
これらの実施形態では、標的特異的プローブは、抗体、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、薬剤分子、阻害剤化合物、およびそれらの組合せからなる群から選択することができ、このターゲティングプローブは、標的細胞表面上の少なくとも１つのマーカーに親和性を有する。
【００１６】
一実施形態では、標的特異的プローブは免疫グロブリンまたはその断片であり、本開示の実施形態では、このプローブは疎水性保護構造上に配置することができる。一実施形態では、このプローブは腫瘍ターゲティングリガンドである。
【００１７】
本開示の他の態様は、金ナノ粒子を提供するステップと、この金ナノ粒子をラマンレポーターに導入するとすぐにラマンレポーターがこのナノ粒子の表面上に配置されてナノ粒子−レポーター複合体を形成するステップと、ナノ粒子−レポーター複合体の表面上に保護構造層を配置するステップとを含み、このレポーター分子が測定可能な表面増強ラマン分光特性を有する、本開示によるナノ構造の調製方法を包含する。
【００１８】
本開示のこの態様の一実施形態では、この方法はさらに、細胞標的特異的プローブを保護構造層上に付着させるステップを含むことができ、このプローブは抗体、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、薬剤分子、阻害剤化合物、またはそれらの組合せから選択される。
【００１９】
本開示のさらに他の態様は、少なくとも１つのナノ構造を培養細胞または動物もしくはヒト対象に送達するステップであって、このナノ構造がコア金属およびコア金のナノ粒子、コア表面上に配置されたラマンレポーター分子、ならびにコアおよびレポーター分子に配置されたカプセル化保護層を含み、このカプセル化レポーター分子が測定可能な表面増強ラマン分光特性を有するステップと、このナノ構造を標的指向生物学的細胞または組織と接触させるステップと、照射源でレポーター分子を励起するステップと、レポーター分子に対応するナノ構造の表面増強ラマン分光スペクトルを測定し、それによって標的指向細胞もしくは組織中のナノ構造の存在を検出するステップとを含む、生物試料の画像化方法を包含する。
【００２０】
本開示のこの態様の一実施形態では、ナノ構造はさらに、標的特異的プローブを含むことができ、このターゲティングプローブはナノ粒子を標的指向細胞に選択的に結合させ、それによって標的指向細胞の検出を可能にする。
【００２１】
本開示の他の実施形態では、標的細胞は動物またはヒト対象の組織中にある。
【００２２】
本開示のこの態様の実施形態では、標的細胞は動物またはヒト対象の癌細胞であることができ、標的特異的プローブは、抗体、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、薬剤分子、阻害剤化合物、およびそれらの組合せからなる群から選択することができ、このターゲティングプローブは、標的細胞表面上のマーカーに親和性を有する。
【００２３】
本開示の一実施形態では、標的特異的プローブは腫瘍ターゲティングリガンドである。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
本開示のさらなる態様は、添付した図面と併せて、以下に説明した様々な実施形態の詳細な説明を検討することによってより容易に理解されよう。
【図１Ａ】図１Ａは、元の金コロイド、ラマンレポーターでコード化された粒子、およびチオール−ポリエチレングリコール（チオール−ＰＥＧ）の層で安定化された粒子の調製順序ならびに模式的構造を示した図である。約１．４〜１．５×１０４個のレポーター分子（例えば、マラカイトグリーン）が６０ｎｍの各金粒子に吸着し、さらに３．０×１０４個のチオール−ＰＥＧ分子によって安定化されている。
【図１Ｂ】図１Ｂは、図１Ａで示した元の金ナノ粒子、ラマンでコード化された金ナノ粒子、およびＰＥＧで安定化された金ナノ粒子から得られた光吸収を示した図である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、図１Ａで示した元の金ナノ粒子、ラマンでコード化された金ナノ粒子、およびＰＥＧで安定化された金ナノ粒子から得られた透過型電子顕微鏡による観察（ＴＥＭ）を示した図である。
【図１Ｄ】図１Ｄは、図１Ａで示した元の金ナノ粒子、ラマンでコード化された金ナノ粒子、およびＰＥＧで安定化された金ナノ粒子から得られた動的光散乱の大きさのデータを示した図である。
【図２Ａ−２Ｆ】図２Ａ〜２Ｆは、６５０〜７５０ｎｍのスペクトル領域におけるペグ化ＳＥＲＳナノ粒子と近赤外線放射量子ドットとの比較を示した図である。
【００２５】
図２Ａおよび２Ｂは、同一実験条件下におけるＳＥＲＳナノ粒子（図２Ａ）およびＱＤ７０５（図２Ｂ）の光吸収スペクトルおよび放射スペクトルを示した図である。
【００２６】
図２Ｃおよび図２Ｄは、ガラススライドに分散させ、同一条件下（ＥＭ−ＣＣＤカメラ、励起６３３±３ｎｍ、ロングパス放射６５５ｎｍ）における単一金ナノ粒子（図２Ｃ）および単一量子ドット（図２Ｄ）のＳＥＲＳおよび蛍光画像を示した図である。図２Ｄに示されたスペックルは、低いレベルの光で認識することができる光の干渉による縞である。
【００２７】
図２Ｅおよび図２Ｆは、ＳＥＲＳナノ粒子と量子ドットとの間の輝度の違いについての折れ線グラフ（図２Ｅ）および統計学的分析（図２Ｆ）を示した図である。ラマンおよび量子ドット信号のＳ．Ｄ．はエラーバーによって示す。
【図３Ａ．３Ｂ】図３Ａおよび図３Ｂは、抗体結合ＳＥＲＳナノ粒子を使用した癌細胞ターゲティングおよび分光学的検出を示した図である。
【００２８】
図３Ａは、ＳＨ−ＰＥＧおよびヘテロ官能性ＰＥＧ（ＳＨ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ）の混合物を使用した標的指向ＳＥＲＳナノ粒子の調製を示した図である。抗ＥＧＦＲ特異的ｓｃＦｖ抗体断片の共有結合がヘテロ官能性ＰＥＧの露出した末端で生じる。
【００２９】
図３Ｂは、対照データおよび標準タグスペクトルと一緒に、ＥＧＦＲ陽性癌細胞（Ｔｕ６８６）およびＥＧＦＲ陰性癌細胞（ヒト非小細胞肺癌ＮＣＩ−Ｈ５２０）から得られたＳＥＲＳスペクトルを示した図である。スペクトルはすべて７８５ｎｍでレーザー励起した細胞懸濁液において得たものであり、ナノタグ染色細胞のスペクトルから未処理細胞のスペクトルを差し引くことによって補正した。ラマンレポーター分子は、ジエチルチアトリカルボシアニン（ＤＴＴＣ）であり、その特有のスペクトル特性は波数（ｃｍ−１）によって示す。
【図４】図４は、生きた動物の皮下および筋肉深部に注射したペグ化金ナノ粒子から得られたｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＳＥＲＳスペクトルを示した図である。注射部位およびレーザー光の位置は、動物上の丸によって示す。
【図５Ａ−５Ｃ】図５Ａ〜図５Ｃは、腫瘍バイオマーカーＥＧＦＲを認識するｓｃＦｖ抗体結合金ナノ粒子を使用したｉｎ  ｖｉｖｏにおける癌ターゲティングおよび表面増強ラマン検出を示した図である。
【００３０】
図５Ａおよび図５Ｂは、標的指向（図５Ａ）および非標的指向（図５Ｂ）ナノ粒子を使用した腫瘍位置および肝臓位置から得られたＳＥＲＳスペクトルを示した図である。ヒト頭頚部扁平上皮癌（Ｔｕ６８６）異種移植腫瘍（直径３ｍｍ）を有する２匹のヌードマウスに、９０μｌのｓｃＦｖ  ＥＧＦＲ結合ＳＥＲＳタグまたはペグ化ＳＥＲＳタグ（４６０ｐＭ）を投与した。粒子は、尾静脈から１回注射することによって投与した。ＳＥＲＳスペクトルは、注射して５時間後に得た。
【００３１】
図５Ｃは、腫瘍部位または解剖学的な肝臓位置に焦点を当てたレーザー光を示した写真である。ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＳＥＲＳスペクトルは、２-ｓの信号積分および７８５ｎｍにおける励起で腫瘍部位および肝臓部位から得られた。スペクトルはバックグラウンドを差し引き、より見やすくするためにシフトさせた。ラマンレポーター分子はマラカイトグリーンで、特有のスペクトル特性は図５Ａおよび５Ｂで表示した通りである。レーザー出力は約２０ｍＷである。
【図６】図６は、誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ）によって測定した、注射して５時間後の主要臓器における標的指向および非標的指向金ナノ粒子の生体分布データを示した図である。標的指向ナノ粒子と非標的指向ナノ粒子との間で腫瘍における蓄積に差があることに注意されたい。ｓ．ｄ．エラーバーは、各実験群の動物４匹（ｎ＝４）に基づいて算出した。
【図７Ａ．７Ｂ】図７Ａおよび図７Ｂは、コーティングしていないＡｕ−ＭＧＩＴＣ複合体（左列）およびＰＥＧ−ＳＨでコーティングしたＡｕ−ＭＧＩＴＣ複合体（右列）の安定性の比較を示した図である。上図は、水（実線の曲線）およびＰＢＳ（波線の曲線）中におけるコーティングしていないＡｕ−ＭＧＩＴＣ（左）およびコーティングしたＡｕ−ＭＧＩＴＣ（右）のＵＶ−ｖｉｓ吸収スペクトルであり、中央の図は、ＰＢＳ中におけるコーティングしていないＡｕ−ＭＧＩＴＣ（左）およびコーティングしたＡｕ−ＭＧＩＴＣ（右）のＴＥＭ画像であり、下図は、ＰＢＳ中におけるコーティングしていないＡｕ−ＭＧＩＴＣ（左）およびコーティングしたＡｕ−ＭＧＩＴＣ（右）のＤＬＳサイズ分布である。ＭＧＩＴＣは、マラカイトグリーンイソチオシアナート（ＩＴＣ）の略語である。
【図８】図８は、単一癌細胞のＳＥＲＳスペクトルおよび相関する表面プラズモン画像を示した図である。上図：ｓｃＦｖ結合金ナノ粒子でタグ付けされた生Ｔｕ６８６細胞（ＥＧＦＲ陽性）およびＨ５２０６細胞（ＥＧＦＲ陰性）の反射型の暗視野画像。画像は、Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｑ−Ｃｏｌｏｒ５ＣＣＤカメラで、２５０ミリ秒の露出時間で撮影した。下図：矢印で示した単一細胞から得られたＳＥＲＳスペクトル。ラマンレポーター色素は、ジエチルチアトリカルボシアニン（ＤＴＴＣ）であった。
【図９】図９は、大きさを一致させた非特異的タンパク質（２７−ＫＤの組換えＧＦＰ）と結合させた単純ＰＥＧコーティングナノ粒子およびＰＥＧナノタグについて、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける分布および腫瘍の取り込みデータを比較した図である。データは、注射して５時間後に金元素の誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ）によって得られた。
【図１０】図１０は、ＥＧＦＲ標的指向金ナノ粒子の腫瘍による取り込み、エンドソームなどの細胞内小器官におけるクラスター形成および局在を示した透過型電子顕微鏡写真である。挿入図は、細胞内小器官における金ナノ粒子の拡大図である。Ｎｕは細胞核である。
【図１１】図１１は、初期および後期エンドソームに局在した主に単一な金ナノ粒子（矢印で示す）を示した、肝臓のクッパー細胞による金ナノ粒子の非特異的取り込みを示す透過型電子顕微鏡写真である。
【図１２】図１２は、能動的腫瘍ターゲティングおよび受動的腫瘍ターゲティングに関与するペグ化ＳＥＲＳナノ粒子の概略図である。対照ナノ粒子および標的指向ナノ粒子はいずれも、ＥＰＲ効果（透過および保持の増強効果）によって腫瘍内に蓄積することができるが、標的指向ナノ粒子のみがＥＧＦＲ陽性癌細胞を認識し、受容体媒介エンドサイトーシスによってこれらの細胞に迅速に侵入することができる。
【図１３】図１３は、開示したＳＥＲＳナノ構造と量子ドットＱＤ７０５の光安定性を比較した図である。
【図１４】図１４は、６０ｎｍの金表面に結合させたチオール−ポリエチレングリコールの数に対するＳＥＲＳシグナルの強度を示した図である。
【図１５】図１５は、ＰＥＧ−ＳＨ層による金ナノ粒子カプセル化の「ロックアウト効果」を示した図である。（ｉ）ＰＥＧ−ＳＨコーティングなし；（ｉｉ）１ナノ粒子当たり３０，０００個のＰＥＧ−ＳＨ；（ｉｉｉ）１ナノ粒子当たり３００，０００個のＰＥＧ−ＳＨ；および（ｉｖ）レポーター色素を添加する前にＰＥＧ−ＳＨを結合させると、ナノ粒子からロックアウトされた。
【図１６】図１６は、ＰＥＧコーティングが、ナノ粒子に結合させたレポーター分子とＰＥＧ層の外面の色素との間のクロストークを防御することを示した図である。（ａ）Ａｕ−ＭＧＩＴＣ単独；（ｂ）ＡＵ−ＲＢＩＴＣ単独；（ｃ）ＲＢＩＴＣロックアウト；および（ｄ）ナノ粒子上に共吸着させた２種類の色素。
【図１７】図１７は、ＰＥＧコーティング粒子の長期安定性を示した図である。
【図１８】図１８は、（図ａ）純水、（図ｂ）１０×ＰＢＳ、（図ｃ）ｐＨ１２水性溶液、（図ｄ）ｐＨ水性溶液、（図ｅ）エタノール、（図ｆ）メタノール、（図ｇ）ＤＭＳＯに再分散させ、その後に水に戻したＡｕ−ＭＧＩＴＣ−ＰＥＧ−ＳＨのＳＥＲＳスペクトルを示した図である。レポーター色素は、表示したような特有のスペクトル特性を備えたマラカイトグリーンイソチオシアナート（ＭＧＩＴＣ）である。励起波長：６３３ｎｍ、レーザー出力：５ｍＷ。
【００３２】
本開示の方法および系のいくつかの例示的実施形態の詳細は、以下の説明において記載する。本開示のその他の特色、目的および利点は、以下の説明、図面、実施例および特許請求の範囲を検討すれば当業者には明らかであろう。このようなさらなる系、方法、特色および利点はすべて、この説明内に含まれ、本開示の範囲内であり、添付の特許請求の範囲によって保護されるものとする。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
（詳細な説明）
本開示をより詳細に説明する前に、本開示は記載した特定の実施形態に限定されず、もちろん、それ自体変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用した用語は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、限定することを意図するものではないことも理解されたい。
【００３４】
数値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限の間に入る各値（その文脈が他に明確に規定しない限り、下限の単位の１０分の１まで）、および記載した範囲内のその他の記載された値または間に入る値は、本開示の範囲内に包含されるものと理解される。記載した範囲内で具体的に除外された限界に従って、これらのより小さい範囲の上限および下限は独立してより小さい範囲に含まれてよく、また本開示内に包含される。記載された範囲が、その上限および下限の一方または両方を含む場合、含まれるそれらの上限および下限のいずれかまたは両方を除外する範囲もまた、本開示に含まれる。
【００３５】
他に規定しなければ、本明細書で使用した技術用語および科学用語はすべて、本開示が属する業界の当業者によって通常理解されるのと同様の意味を有する。本明細書で記載したものと同様または同等のいかなる方法および材料も本開示の実施または試験で使用することができるが、好ましい方法および材料をここで説明する。
【００３６】
本明細書で引用した出版物および特許文献はすべて、あたかも個々の出版物または特許文献がそれぞれ具体的かつ個別に参照により組み込まれことが示されているように、参照することにより本明細書に組み込まれ、その出版物が関連して引用された方法および／または材料を開示および説明するために、参照することにより本明細書に組み込まれる。いかなる出版物の引用も、出願日に先行する開示についてであり、本開示が、先行する開示を理由として、このような出版物を回避する権利がないと認めるものであると解釈されるべきではない。さらに、提供された出版物の日付は、実際の出版日とは異なっている可能性があり、独立して確認することが必要となり得る。
【００３７】
本開示を読むことによって当業者には明らかなように、本明細書で記載し、例示した個々の実施形態はそれぞれ、本開示の範囲または精神を逸脱することのないその他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離できるか、または一緒にすることができる別個の構成要素および特徴を備えている。任意の列挙した方法は、列挙した事象の順番で、または論理的に可能なその他の任意の順番で実施することができる。
【００３８】
本開示の実施形態は、特に他に指示しない限り、当技術分野の範囲内である医薬、有機化学、生化学、分子生物学、薬理学などの技術を使用する。このような技術は、文献に完全に説明されている。
【００３９】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用したように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈で特に明確に規定していなければ、複数の指示対象を含むことに注意されたい。したがって、例えば、「支持体」について言及する場合は、複数の支持体を含む。本明細書および以下の特許請求の範囲では、反対の意図が明らかでない限り、以下の意味を有することが定義されたいくつかの用語を参照する。
【００４０】
本明細書で使用したように、以下の用語は特に指定しない限り、それらのものと認められる意味を有する。本開示では、「含む」、「含んでいる」、「含有している」および「有する」などは、米国特許法でそれらのものと認められる意味を有することができ、かつ「備える」、「備えている」などを意味することができ、「本質的に構成している」または「本質的に構成する」などは、本開示に包含される方法および組成物に適用する場合、本明細書で開示されているが、さらなる構造群、組成物成分または方法段階（または前述したようなそれらの類似体または誘導体）を含有し得るもののような組成物を意味する。しかし、このようなさらなる構造群、組成物成分または方法段階などは、本明細書で開示した対応する組成物または方法と比較して、組成物または方法の基本的な、および新規の特性に実質的には影響を及ぼさない。「本質的に構成している」または「本質的に構成する」などは、本開示に包含される方法および組成物に適用する場合、米国特許法で認められている意味を有し、その用語は非限定的であり、列挙したものの基本的な、または新規の特性が引用したもの以外の存在によって変化しない限り、列挙したもの以外の存在が可能であるが、先行技術の実施形態は除外する。
【００４１】
様々な実施形態を記載する前に、以下の定義を提供し、特に他に指示しない限り使用されるものである。
【００４２】
（定義）
本明細書で使用したような「ラマン光散乱」という用語は、ある分子が照射されたとき、光子を保持した分子のごく一部が、保持した光子を放出した後、元の振動レベルには戻らないが、異なる振動レベルの基底電子状態まで下降することを意味する。したがって、これらの分子から放射される放射物は、エネルギーが異なり、したがって波長も異なる。このことをラマン散乱という。
【００４３】
分子がより高い振動レベルの基底電子状態まで下降すると、放出される光子は吸収されたものよりもエネルギーが低く、波長が長い。このことをストークスシフトラマン散乱という。光子を吸収する前に、分子が既により高い振動状態にある場合、放出された光子にこの余分なエネルギーを与え、それによって基底状態に戻ることができる。この場合、放射された放射物のエネルギーは高く（波長は短く）、反ストークスシフトラマン散乱と呼ばれる。通常の条件下の分子であれば、基底状態の分子の数は励起された状態のものよりも常にずっと多く、したがって、励起された分子と相互作用し、衝突時に有するエネルギーよりも大きなエネルギーで散乱する入射光子の確率は非常に小さい。したがって、入射光子よりも高い振動数の光子散乱（反ストークス振動）は、入射光子よりも低い振動数の光子散乱（ストークス振動）と比較して少ない。したがって、通常分析されるのはストークス振動である。
【００４４】
本明細書で使用した「表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）」という用語は、分子がある金属表面に近接するようになったとき（接触する必要はない）観察することができるラマン光散乱の強度の著しい増加を意味する。金属表面は「粗面」であるか、または微小な金属粒子でコーティングされている必要がある。
【００４５】
金属コロイドはまた、この信号増強効果を示す。強度の増加は、数百万倍以上の規模であり得る。ＳＥＲＳ効果の原因は完全には理解されていないが、ＳＥＲＳには少なくとも２個の別個の要素が関与することが最近の考察では考えられている。まず、金属表面は微小な不規則性を含んでいる。これらの不規則性は、球（コロイド状の場合には、球状またはそれに近い）として考えることができる。入射光の波長の約１０分の１の直径を有するそのような粒子は、その効果に非常に大きく関与すると考えられた。入射光子は、非常に移動しやすい電子を有する、金属のような粒子全体に、場を誘導する。
【００４６】
金属表面または粒子のある種の形態では、表面電子群は、与えられた振動電磁場に応答して集団的に振動するようになり得る。このような集団的振動電子の群は「プラズモン」と呼ばれる。入射光子は、この振動電磁場を供給する。入射光による分子の振動双極子モーメントの誘導が、ラマン散乱を引き起こす。表面プラズモンの共鳴振動効果は、金属表面近傍の電磁場強度の大きな増加を引き起こす。これが、散乱分子で誘導される振動双極子の増強を引き起こし、したがって、ラマン散乱光の強度を増加させる。この効果は、粒子近傍の入射光の強度を見かけ上増加させることである。
【００４７】
ＳＥＲＳ効果に関与すると考えられる第２の要因は分子画像化である。金属表面に近接している双極子モーメントを有する分子は、反対の極性の表面上にそれ自体の画像（すなわち、プラズモン上に「影」の双極子）を誘導する。その画像が接近していると、散乱光への分子の出力を増強すると考えられる。この分子の共役が、表面プラズモンに対して、誘導された双極子モーメントまたは歪んだ双極子モーメントを有し、これが、励起の確立を著しく増加させる。その結果が、表面吸着分子によって散乱したラマン光効果の非常に大きな増加である。
【００４８】
ＳＥＲＳ効果は、共鳴ラマン効果と組み合わせることによって増強することができる。表面増強ラマン散乱効果は、励起光の振動が照射された分子の主要な吸収帯と共鳴すると、さらにより強くなる。得られた表面増強共鳴ラマン散乱（ＳＥＲＲＳ）効果は、７桁以上のラマン散乱信号強度の増強を引き起こすことができる。
【００４９】
本明細書で使用した「ラマンレポーター」という用語は、ラマン分光レポーターとして以前に使用されたチオフェノール、メルカプト安息香酸、およびビスピリジンなどの低分子有機化合物を意味し得る。これらの分子は、単純なラマンスペクトルを生じるが、可視励起波長では共鳴ラマン増強を実現することが困難であるか、または不可能であった。結果として、レポーターの濃度が高くても（ミリモル）、記録されたＳＥＲＳ強度は比較的低い。イソチオシアナート（−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ）基または複数の硫黄原子を有する有機色素はコア粒子に強く吸着し、カプセル化に適合することができる。例えば、強いＳＥＲＳスペクトルが（ｂ）マラカイトグリーンイソチオシアナート（ＭＧＩＴＣ）、（ｃ）テトラメチルローダミン−５−イソチオシアナート（ＴＲＩＴＣ）、（ｄ）Ｘ−ローダミン−５−（および−６）−イソチオシアナート（ＸＲＩＴＣ）、ならびに（ａ）３，３’−ジエチルチアジカルボシアニンヨージド（ＤＴＤＣ）から得られた。これらの分子のうち３種類がイソチオシアナート基を含有し、４番目の分子は環構造内に２個の硫黄原子を有する。
【００５０】
イソチオシアナート基または硫黄原子は、金表面に結合するための「親和性タグ」を形成し、安定な硫黄−金結合を生じる。クリスタルバイオレットおよびローダミン６Ｇなどのこのような親和性タグを有さない分子では、強いＳＥＲＳスペクトルを認めることはできるが、例えば、シリカでコーティングした後に信号が消失した。さらに、これらの色素のほとんどが可視スペクトル中で強い電子遷移を有し、したがって共鳴ラマン増強は、信号強度をさらに増加させるために使用することができる。厳密な意味では、これらの分子は、チオフェノールおよびその他の非共鳴ラマンレポーターと区別するために、「共鳴ラマンレポーター」と呼ぶべきである。ほとんどの場合、共鳴ラマンは、表面増強単独に対して約２〜３桁の大きさのさらなる増強をもたらす。蛍光放射は金粒子によって効果的に消光するが、ラマン測定を妨害しないので、蛍光色素および非蛍光色素はいずれも、共鳴ラマンレポーターとして使用することができる。一連のベンゾトリアゾール色素は、多数の窒素原子が存在するため、表面増強共鳴ラマン散乱にとって優れており、これらの分子は、分光学的コード化および多様な応用のために新種の共鳴ラマンレポーターとなることができる。
【００５１】
本明細書で使用した「保護層」という用語は、全体的に、または部分的にナノ粒子をカプセル化することができ、それによって粒子の凝集を防御する層のことである。生体適合層には、基礎をなすナノ粒子に対してチオール基がポリマーを結合させる、チオール−ポリエチレングリコールポリマーが含まれる（がそれだけに限られない）。ポリマーの遠位末端は、標的特異的リガンドを結合させることができる反応基を有することができる。保護層は、全体的に、または部分的に、金属ナノ粒子およびレポーターナノ構造の表面上またはその周辺に配置する、すなわち、位置させるかまたは付着させることができる。
【００５２】
本明細書で使用した「量子ドット」（ＱＤ）という用語は、半導体ナノ結晶または人工原子のことであり、１００個から１０００個の間のいずれかの数の電子を含有し、約２〜１０ｎｍの範囲である半導体結晶である。ＱＤの中には、直径が約１０〜２０ｎｍの間であることができるものもある。ＱＤは高い量子収率を有し、光学的適用に特に有用である。ＱＤは、励起子を形成することによって蛍光を発するフルオロフォアであり、従来のフルオロフォアの励起状態と考えることができるが、最長２００ナノ秒のより長い寿命を有する。この特性により、ＱＤは光退色しにくい。
【００５３】
本明細書で使用した「ポリペプチド」または「タンパク質」という用語は、自然から単離された、ウイルス、細菌、植物、もしくは動物（例えば、ヒトなどの哺乳類）由来の、または合成されたタンパク質、糖タンパク質、ポリペプチド、ペプチドなど、およびそれらの断片を包含するものである。好ましいタンパク質またはその断片には、抗原、抗原のエピトープ、抗体、または抗体の抗原反応性断片が含まれる（がそれらだけに限られない）。
【００５４】
本明細書で使用した「核酸」という用語は、自然から単離された、ウイルス、細菌、植物、もしくは動物（例えば、ヒトなどの哺乳類）由来の、合成された、１本鎖、２本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡを意味し、天然型もしくは非天然型のヌクレオチドまたは化学的に修飾されたものが含まれる。
【００５５】
本明細書で使用した「癌」という用語は、通常の意味が与えられ、異常な細胞が無制御に分裂する疾患の一般名称である。癌細胞は、隣接する組織に浸潤することができ、血流およびリンパ系を通って身体のその他の部分に拡散することができる。
【００５６】
癌にはいくつかの主要な種類があり、例えば、癌腫は皮膚で、または内部器官の内側を覆うかもしくは被覆する組織で発症する癌である。肉腫は、骨、軟骨、脂肪、筋肉、血管、またはその他の結合組織もしくは支持組織で発症する癌である。白血病は、骨髄などの血液形成組織で発症し、大量の異常な血液細胞を産生して血流に進入させる原因となる癌である。リンパ腫は、免疫系の細胞で発症する癌である。
【００５７】
正常な細胞が特異的で、制御された、調和した単位として機能する能力を失うとき、腫瘍が形成される。一般的に、固形腫瘍は、通常嚢胞または液体領域を含有しない組織の異常な塊である（いくつかの脳腫瘍は嚢胞、および中心に液体で満たされた壊死領域を有する）。単一の腫瘍は、誤った状態になった異なるプロセスを内部に備えた様々な細胞集団さえも有することができる。固形腫瘍は、良性（非癌性）または悪性（癌性）であってよい。様々な種類の固形腫瘍は、それらを形成する細胞の種類によって命名されている。固形腫瘍の例には、肉腫、癌腫およびリンパ腫がある。白血病（血液の癌）は一般的に固形腫瘍を形成しない。
【００５８】
代表的な癌には、膀胱癌、乳癌、結腸癌、子宮内膜癌、頭頚部癌、白血病、肺癌、リンパ腫、黒色腫、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、子宮癌、子宮頚癌が含まれる（がそれらだけに限られない）。
【００５９】
本明細書で使用したような循環器疾患は通常の意味を与えられており、高血圧、糖尿病、冠動脈疾患、心臓弁膜症、先天性心臓疾患、不整脈、心筋症、ＣＨＦ、アテローム性動脈硬化、炎症性または不安定性プラーク関連疾患、再狭窄、梗塞、血栓症、術後凝固性障害、および脳卒中が含まれる（がそれらだけに限られない）。
【００６０】
本明細書で使用した炎症性疾患は、通常の意味が与えられており、関節炎、関節リウマチ、多発性硬化症、全身性エリテマトーデスなどの自己免疫疾患、喘息、乾癬、炎症性腸疾患などのその他の疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、血管性認知症などの神経変性疾患、ならびにてんかん、偏頭痛、脳卒中および心的外傷などのその他の病的状態が含まれる（がそれらだけに限られない）。
【００６１】
（説明）
本明細書で例示し広く説明したように、本開示の目的に従って、本開示の実施形態は、表面増強ラマン分光（ＳＥＲＳ）活性複合体ナノ構造、これらのナノ構造の製造方法、およびこれらのナノ構造の使用方法を包含する。ＳＥＲＳ活性複合体ナノ構造は、区別することが可能で、個々に検出することができる。この点に関して、ＳＥＲＳ活性複合体ナノ構造は、ＳＥＲＳ活性複合体ナノ構造がある種の標的分子と相互作用し、標的分子の検出を可能にするように修飾することができる。さらに、ＳＥＲＳ活性複合体ナノ構造は、コード化システムならびに多重化システムで使用することができる。ＳＥＲＳ活性複合体ナノ構造は、多くの領域、例えば、フローサイトメトリー、化学アレイシステム、生体分子アレイシステム、バイオセンシング、バイオ標識、高速スクリーニング、遺伝子発現研究、タンパク質研究、医療診断、診断用ライブラリー、およびマイクロ流体システムで使用することができる（がそれらだけに限られない）。
【００６２】
本開示によって形成されるＳＥＲＳ活性複合体ナノ構造には、コア、コアに配置されたレポーター分子、およびカプセル化保護物質もしくは層が含まれる（がそれらだけに限られない）。一実施形態では、コア物質は金属である。一実施形態では、コアは金または銀である。一実施形態では、コアは金である。レポーター分子は、コア上に配置（結合）される一方、カプセル化物質はコアおよびレポーター分子を被覆して保護する。本開示によるＳＥＲＳナノ構造の親水性保護表面上には、誘導体化することができ、診断薬および治療薬の両方または標的特異的プローブの結合を可能にし得る多数の官能基が存在することができる。合成有機分子、短鎖オリゴヌクレオチドおよびペプチドなどの低分子リガンドでは、多くの同一リガンドコピーが単一のナノ粒子に結合することができ、多価のＳＥＲＳナノ粒子−標的の結合を引き起こす。
【００６３】
このようなナノ粒子はそれぞれ、金属表面に近接したＳＥＲＳ活性金属ナノ粒子、準単層、単層、または多層の分光学的活性種、およびカプセル化保護シェルを含むことができる。これは金属ナノ粒子とカプセル物質との界面に分光学的活性分子（「レポーター」）を配置する。典型的で有利な実施形態では、ＳＥＲＳナノ構造は（ｉ）金属ナノ粒子コア（例えば、金または銀）、（ｉｉ）特有の振動特性を与えるラマン活性レポーター、および（ｉｉｉ）所定の位置にレポーター分子を「固定し」、一方で生体適合性の高い表面も提供する保護カプセル化物質を含む。本質的にＳＥＲＳ不活性である保護コーティングはまた、凝集に対して粒子を安定化し、所望しない種の競合的吸着を防ぐ。
【００６４】
特定の理論に拘束されることを意図しないが、コアはＳＥＲＳスペクトルを光学的に増強する一方、レポーター分子は特有の分光学的ＳＥＲＳ特性をもたらす。コアおよびレポーター分子上にカプセル化物質を配置することは、レポーター分子の分光学的ＳＥＲＳ特性に実質的に影響を与えず、一方でコアおよびレポーター分子を保護する。その他のＳＥＲＳ粒子とは異なり、本開示で記載したＳＥＲＳ活性複合体ナノ構造は、強いＳＥＲＳ強度（約１秒間に１ｍＷのレーザー出力で約１０，０００カウントを上回る）を有する。いくつかの実施形態では、ＳＥＲＳ活性複合体ナノ構造は、測定可能な表面増強共鳴ラマン分光特性を有する。
【００６５】
ＳＥＲＳの効率が高く、本明細書で開示したコアシェルコロイド状ナノ粒子の種類（例えば、ＳＥＲＳ活性複合体ナノ構造）は、多重検出、および単一粒子レベルでの分光法に適している。ほぼ最適化された金コアおよび保護シェルによって、本開示のＳＥＲＳ活性複合体ナノ構造は、水性電解質および有機溶媒の両方において安定で、強い単一粒子ＳＥＲＳスペクトルを生じる。点滅または強度変調がまだ認められ、このことから、ＳＥＲＳ信号はコアとシェルとの界面の単一分子から生じ得ることが示唆される。驚くべき発見は、イソチオシアナート（−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ）基または多数の硫黄原子を有する有機色素は、カプセル化プロセスに適合しており、豊富な振動スペクトルならびに表面増強および共鳴増強の一体化のため優れたラマンレポーター群であることである。
【００６６】
以前のＳＥＲＳ研究とは対照的に、本明細書で報告した表面増強ラマン信号は標的分子からは生じず、ＳＥＲＳ活性複合体ナノ構造に包埋されたレポーター色素から生じる。この設計によって、とりわけ、表面吸着、基質変化、およびデータ再現性の不足といった問題が回避される。この開発によって、ラマン活性化フローサイトメトリーおよび細胞分類を含む、単一細胞および組織標本における多数のバイオマーカーの分光学的標識にＳＥＲＳを使用する新たな可能性が開かれた。蛍光色素および半導体量子ドットなどのその他の生体標識と比較して、ＳＥＲＳ活性複合体ナノ構造は、信号を増強するために一体型機構を含有し、周囲条件における豊富な分光学的情報を提供する。さらに、ラマン散乱の極めて短い寿命は、光退色、エネルギー移動、または励起状態の停止を防ぐ。
【００６７】
ナノ粒子コアは、当業界で知られている金属ナノ粒子である。本明細書で使用したように、「ナノ粒子」、「ナノ構造」、「ナノ結晶」、「ナノタグ」、および「ナノ成分」という用語は、カプセル化保護層などの他の層を備えているかまたは備えていない金属粒子を意味するために互換可能に使用されており、一方の寸法が約１ｎｍと１，０００ｎｍとの間の任意の整数を含む約１ｎｍから１，０００ｎｍである。いくつかの実施形態では、金属ナノ粒子コアは約２０〜２００ｎｍの直径の球状またはほぼ球状の粒子である。いくつかの実施形態では、その範囲は約２ｎｍから５０ｎｍであり、いくつかの実施形態ではその範囲は約２０ｎｍから５０ｎｍである。異等方性ナノ粒子は、長さと幅を備えている。いくつかの実施形態では、異等方性ナノ粒子の長さは、ナノ粒子が生成された開口部に平行な寸法である。異等方性ナノ粒子の場合、いくつかの実施形態では、ナノ粒子の直径（幅）は約３５０ｎｍ以下であってよい。その他の実施形態では、ナノ粒子の直径は約２５０ｎｍ以下であってよく、いくつかの実施形態ではその直径は約１００ｎｍ以下であってよい。いくつかの実施形態では、幅は約１５ｎｍから３００ｎｍであってよい。いくつかの実施形態では、ナノ粒子の長さは約１０〜３５０ｎｍであってよい。
【００６８】
ナノ粒子は等方性または異等方性であってよい。ナノ粒子には、コロイド状金属の中空もしくは充填ナノ棒、磁性、常磁性、伝導性、または絶縁性のナノ粒子、合成粒子、ヒドロゲル（コロイドもしくは棒）などが含まれる。当業者であれば、ナノ粒子は、球、棒、円盤、三角錐、立方体、円柱、ナノらせん、ナノバネ、ナノ環、棒状ナノ粒子、矢印状ナノ粒子、涙滴状ナノ粒子、四脚状ナノ粒子、プリズム状ナノ粒子、および多数のその他幾何学的および非幾何学的形状を含む（がそれらだけに限られない）様々な形状で存在できることを理解するであろう。
【００６９】
レポーター分子には、イソチオシアナート基を有する有機色素分子（以下「イソチオシアナート色素」とする）、２つ以上の硫黄原子を有する有機色素分子（以下「多硫黄有機色素」とする）、それぞれ硫黄原子を組み込んだ２つ以上の複素環を有する有機色素分子（以下「多ヘテロ硫黄有機色素」とする）、およびベンゾトリアゾール色素などの分子を含めることができる（がそれらだけに限られない）。さらに、このレポーター分子には、可視スペクトル中に強い電子遷移を有し、したがって信号強度をさらに増幅させるために共鳴ラマン増強を使用することができる共鳴ラマンレポーターを含めることができる。共鳴ラマンレポーターには、有機色素、生体分子、ポルフィリン、および金属ポルフィリンが含まれる（がそれらだけに限られない）。特に、共鳴ラマンレポーターには、マラカイトグリーンイソチオシアナート、テトラメチルローダミン−５−イソチオシアナート、Ｘ−ローダミン−５−イソチオシアナート、Ｘ−ローダミン−６−イソチオシアナート、３，３’−ジエチルチアジカルボシアニンヨージド、およびそれらの組合せを含めることができる（がそれらだけに限られない）。特に有利なレポーター分子は、マラカイトグリーンである。
【００７０】
さらに、レポーター分子には、チアシアニン色素、ジチアシアニン色素、チアカルボシアニン色素（例えば、チアカルボシアニン色素、チアジカルボシアニン色素、およびチアトリカルボシアニン色素）、ジチアカルボシアニン色素（例えば、ジチアカルボシアニン色素、ジチアジカルボシアニン色素、およびジチアトリカルボシアニン色素）、ならびにそれらの組合せを含めることができる（がそれらだけには限られない）。
【００７１】
さらに、レポーター分子には、３，３’−ジエチル−９−メチルチアカルボシアニンヨージド、１，１’−ジエチル−２，２’−キノトリカルボシアニンヨージド、３，３’−ジエチルチアシアニンヨージド、４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸二ナトリウム塩、ベンゾフェノン−４−イソチオシアナート、４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロスチルベン−２，２’−ジスルホン酸二ナトリウム塩、４，４’−ジイソチオシアナートスチルベン−２，２’−ジスルホン酸二ナトリウム塩、Ｎ−（４−（６−ジメチルアミノ−２−ベンゾフラニル）フェニルイソチオシアナート、７−ジメチルアミノ−４−メチルクマリン−３−イソチオシアナート、エオシン−５−イソチオシアナート、エリトロシン−５−イソチオシアナート、フルオレセイン−５−イソチオシアナート、（Ｓ）−１−ｐ−イソチオシアナートベンジルジエチレントリアミン５酢酸、オレゴングリーン（登録商標）４８８ イソチオシアナート、テトラメチルローダミン−５−イソチオシアナート、テトラメチルローダミン−６−イソチオシアナート、テトラメチルローダミン−５−（および−６）−イソチオシアナート、Ｘ−ローダミン−５−（および−６）−イソチオシアナート、ならびにそれらの組合せを含めることができる。
【００７２】
ベンゾトリアゾール色素には、アゾベンゾトリアゾイル−３，５−ジメトキシフェニルアミンおよびジメトキシ−４−（６’−アゾベンゾトリアゾリル）フェノール含めることができる（がそれらだけに限られない）。
【００７３】
前述のように、レポーター分子は、結合剤およびカプセル化物質の付着に対して安定な硫黄−金結合を形成することが可能なイソチオシアナート基または２つ以上の硫黄原子を有することができる（例えば、イソチオシアナート色素、多硫黄有機色素、および多ヘテロ硫黄有機色素）。さらに、これらのレポーター分子は、可視スペクトルおよび近赤外線スペクトル（約４００〜８５０ｎｍ）内に強い電子遷移を有し、したがって共鳴ラマン増強はシグナル強度を増加させるために使用することができる。
【００７４】
ＳＥＲＳ活性複合体ナノ構造は好都合には、約２５０ナノメートル（ｎｍ）未満、約１０から１５０ｎｍ、および約３０から９０ｎｍの直径の球状または実質的に球状であってよい。コアの直径は、約１０から２００ｎｍ、約２０から１００ｎｍ、および約４０から８０ｎｍであってよい。カプセル化物質の厚さは、約１から５０ｎｍ、約２から５０ｎｍ、および約５から１０ｎｍであってよい。一般的に、カプセル化物質の直径が大きいほど、実現される保護が向上する。しかし、直径が増加すると、ＳＥＲＳ活性複合体ナノ構造の全体の大きさが増加する。適切な寸法の選択は、特定の用途に基づいて決定することができる。
【００７５】
一般的に、レポーター分子はコアの表面の約１から７５％（例えば、レポーター分子がコア粒子表面の約１から７５％に吸着する）、コア１２の表面の約１５から５０％、コア１２の表面の約１５から３０％、およびコア１２の表面の約２０から２５％を覆うことができる。
【００７６】
結合剤を含む実施形態では、結合剤はコアの表面の約１から１００％、コア１２の表面の約４０から６０％、およびコアの表面の約４５から５０％を覆うことができる。一実施形態では、レポーター分子はコアの表面の約１から７５％、コア１２の表面の約１５から５０％、コア１２の表面の約１５から３０％、およびコアの表面の約２０から２５％を覆うことができる。
【００７７】
ＳＥＲＳ活性複合体ナノ構造は、１種または複数の方法により調製することができる。例えば、ＳＥＲＳ活性複合体ナノ構造は、レポーター分子がコアに結合するような条件の下において、コアをレポーター分子と混合することにより調製することができる。具体的には、コアは、約２．５×１０−８Ｍから１．２５×１０−７Ｍまで、および約７．５×１０−８Ｍの濃度を有するレポーター分子と、約１から３０分間混合することができる。その後、一実施形態では、結合剤をレポーター分子が配置されたコアと混合する。具体的には、結合剤は約２．５×１０−７Ｍの最終濃度まで、約１から３０分間かけて添加してよい。その後、レポーター分子が配置された（およびいくつかの実施形態では、結合剤が配置された）コアは、約９から１１のｐＨにおいて約２４から９６時間かけてカプセル化物質と混合してよい。ＳＥＲＳ活性複合体ナノ構造の調製に関するさらなる詳細は、本明細書で示した実施例で説明する。
【００７８】
本開示は、コア−ラマンレポーター複合体の表面に配置された保護カプセルの使用を包含する。様々な物質がコア−レポーターのカプセル化に使用できることが企図される。保護層がチオール−ポリエチレングリコールを含み、それによって、ポリマーがチオール基を用いて、基礎をなすコアに結合することが最も有利である。ポリマーの遠位末端は、免疫グロブリンもしくはその断片（それだけに限られない）などの標的特異的単位への結合を形成することができるカルボキシル基またはアミン基（それだけに限られない）などの活性基を含むことができる。
【００７９】
ＳＥＲＳ活性複合体ナノ構造は、プローブ分子に結合させることができる。ＳＥＲＳ活性複合体ナノ構造はまた、（例えば、アッセイにおいて）構造物に結合させるか、または（例えば、マイクロ流体システムもしくはフローサイトメトリーにおいて）自由に浮遊させることができる。プローブ分子は、ＳＥＲＳ活性複合体ナノ構造に直接的に、またはリンカーを介して間接的に結合させることができる任意の分子である。例えば、標的特異的プローブは、チオール−ポリエチレングリコールなどの保護カプセル化物質に結合させることができる。プローブ分子は、安定な物理的および／または化学的結合によってＳＥＲＳ活性複合体ナノ構造に結合させることができる。
【００８０】
本開示の実施形態で使用するために企図された有利な標的特異的プローブ分子は、検出が所望される１種または複数種の標的分子に親和性を有することができる。例えば、標的分子が核酸配列であるならば、標的およびプローブのハイブリダイゼーションが生じるように、プローブ分子は標的分子配列に実質的に相補的であるように選択すべきである。「実質的に相補的」という用語は、プローブ分子が、選択した反応条件下でハイブリダイズするために標的配列に十分相補的であることを意味する。
【００８１】
一実施形態では、プローブ分子は、検出（例えば、容器（身体）内での存在および／または近位部位の決定）が所望される１種または複数種の標的分子（例えば、癌細胞）に親和性を有する。例えば、標的分子が核酸配列であるならば、標的およびプローブのハイブリダイゼーションが生じるように、プローブ分子は標的分子配列に実質的に相補的であるように選択すべきである。「実質的に相補的」という用語は、プローブ分子が、選択した反応条件下でハイブリダイズするために標的配列に十分相補的であることを意味する。
【００８２】
プローブ分子および標的分子には、ポリペプチド（例えば、抗体（モノクローナルもしくはポリクローナル）（それだけに限られない）などのタンパク質）、核酸（モノマーおよびオリゴマーの両方）、多糖類、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、薬剤（例えば、低分子薬剤）、リガンド、またはそれらの組合せを含めることができる（がそれらだけに限られない）。有利には、プローブは、癌細胞（それだけに限られない）などの細胞の表面上の標的分子と適合し、結合することができる抗体またはリガンドであってよい。
【００８３】
本開示のナノ構造には、例えば、いずれもある種の細胞を標的とするターゲティングプローブである少なくとも２種類のプローブを含めることができる。
【００８４】
本開示は、試料または対象（例えば、哺乳類、ヒト、ネコ、イヌ、ウマなど）における１種または複数種の標的細胞を標的とする方法を提供する。例えば、ナノ構造は、本開示によるナノ構造を使用して、動物中の腫瘍細胞を検出するために使用することができる。
【００８５】
ナノ構造は、１種または複数種の標的（例えば、癌）、癌、腫瘍、新生物疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、代謝疾患、神経学的および神経変性疾患、ウイルス疾患、皮膚疾患、心臓血管疾患、感染症、およびそれらの組合せ（それらだけに限られない）などの症状ならびに／または疾患の検出のため、治療の一部（例えば、薬物送達）として、それらへの送達の指標として、またはそれらの組合せのために使用できることにも注意されたい。
【００８６】
細胞は、ナノ構造および／または微小構造を用いて予め標識（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて）することができることに注意されたい。例えば、細胞は、免疫染色、吸着、微量注入、細胞による取り込みなどによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてナノ粒子−ブロックコポリマー微小構造で標識することができる。次に、細胞は、トレーサーとしてのナノ粒子、蛍光、磁気、それらの組合せなどによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてモニターするか、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて追跡することができ、一方、遺伝子の発現は、ＳＥＲＳナノ構造の外面に結合したプローブによって修飾することができる。
【００８７】
本開示は、試料中における１種または複数種の標的分子の検出方法を提供する。この方法には、（例えば、標的特異的プローブ分子を介して）標的分子をナノ構造に結合させるステップ、およびナノ構造のＳＥＲＳスペクトルを測定するステップが含まれ、レポーター分子に特異的なＳＥＲＳスペクトルの検出がプローブ分子に特異的な標的分子の存在を示す。ＳＥＲＳ活性複合体ナノ構造は、化学アレイシステムおよび生体分子アレイシステムにおいて１種または複数種の標的分子の存在を検出するために使用することができる。さらに、ＳＥＲＳ活性複合体ナノ構造は、様々な種類のシステムにおいてコード化および多重化する能力を増強するために使用することができる。
【００８８】
一実施形態では、フローサイトメトリーは、１種または複数種のＳＥＲＳ活性複合体ナノ構造を使用して１種または複数種の標的分子を検出するための多重アッセイ方法で使用することができる。フローサイトメトリーは、粒子の光学的特性に基づいて流体混合物中の特定の粒子（例えば、ＳＥＲＳ活性複合体ナノ構造）を分析する光学的技術である。フローサイトメーターは、ＳＥＲＳ活性複合体ナノ構造が実質的に一列で流れを通り実験区画を通過するように、水力学的にＳＥＲＳ活性複合体ナノ構造の流体懸濁液を細い流れに集中させる。レーザー光などの集束光線は、ＳＥＲＳ活性複合体ナノ構造が実験区画を流れるときに照射する。フローサイトメーター内の光学検出器は、光がＳＥＲＳ活性複合体ナノ構造と相互作用するときに、光の特定の特性を測定する。通常使用されるフローサイトメーターは、１または複数の波長でＳＥＲＳ活性複合体ナノ構造の放射を測定することができる。
【００８９】
１種または複数種の標的分子は、ＳＥＲＳ活性複合体ナノ構造および１種または複数種の標的分子に親和性を有する１種または複数種のプローブを使用して検出することができる。ＳＥＲＳ活性複合体ナノ構造はそれぞれ、プローブに対応するレポーター分子を備える。フローサイトメーターに導入する前に、ある種の標的分子に特異的なＳＥＲＳ活性複合体ナノ構造を、１種または複数種の標的分子を含みうる試料と混合する。ＳＥＲＳ活性複合体ナノ構造は、プローブが親和性を有する対応する標的分子と相互作用（例えば、結合またはハイブリダイズ）する。
【００９０】
次に、ＳＥＲＳ活性複合体ナノ構造は、フローサイトメーターに導入される。前述したように、フローサイトメーターは、ＳＥＲＳ活性複合体ナノ構造を第一のエネルギーに曝露した後で検出することが可能である。特定のレポーター分子に対応する特定のラマンスペクトルの検出は、標的分子が試料中に存在することを示す。
【００９１】
ラマンスペクトル情報を含有する細胞の画像は、いくつかの方法によって得ることができる。対象の完全な画像を得ることができるように、顕微鏡にＣＣＤカメラを装着することができる。次いで、試料とカメラとの間に、モノクロメーターまたは液晶可変フィルターなどの波数フィルター装置を挿入する。フィルター装置は、各時点で狭いバンド幅の散乱放射線のみをカメラに到達させる。それぞれが狭いスペクトル範囲の散乱放射線を対象とする多重画像が収集される。画像の各点からのスペクトルをソフトウェアで組み立てる。その他の極端な場合では、画像の１点からの光をモノクロメーターによって分散させ、その点の完全なスペクトルをアレイ検出器で取得することができる。次に、画像の各点が別々に取得されるように、対象を走査する。次に、ラマン画像をソフトウェアで組み立てる。他のやり方では、１本の放射線で試料を励起する線走査計測器を構築することができる。この線はＣＣＤカメラの１軸に沿って空間的画像を形成し、同時に直交軸に沿ってスペクトル分散される。カメラのそれぞれの読み出しにより、この線の各空間画素の完全なスペクトルが取得される。画像を完全にするために、試料全体をこの線で走査する。
【００９２】
したがって、本開示では、細胞小集団に発現している細胞表面抗原性受容体に結合できる抗体で調製した抗体結合ＳＥＲＳナノ構造を使用することによって、細胞または細胞集団を同定することができる。
【００９３】
本開示によるＳＥＲＳナノ構造はまた、細胞内標的を検出するために使用することができる。ＳＥＲＳナノ構造は、ＰＥＰ−１などの両親媒性ペプチドの使用、リポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などのカチオン脂質をベースにした試薬の使用、ならびにトランスフェリン、マンノース、ガラクトース、およびＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）などのミセルおよび形質移入試薬、ならびにデンドリマーをベースにした試薬ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）などのその他の試薬の使用を含むマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、エンドサイトーシスが媒介する方法によって細胞に導入することができる。
【００９４】
細胞内での間接法を使用して、所望する標的に粒子が結合することを証明することができる。プローブの特異性を示す最も簡単な方法は、免疫蛍光法を使用してＳＥＲＳナノ構造の位置を確認することである。生細胞内で細胞構造物（例えば、ミトコンドリア、ゴルジ体、および小胞体）を標識するために有用な市販の蛍光プローブは多数ある。同一構造物を標的とする抗体を結合することによって、粒子のどの画分が標的を能動的に標識するか、何割が非特異的な結合であるかを決定することができる。ＳＥＲＳナノ構造の位置を確認するための他の方法は、ＧＦＰおよびその類似体などの蛍光タンパク質融合物を使用することである。
【００９５】
したがって、本開示は、医療診断において重要な特性を表す造影剤を対象とするナノ構造を包含する。より具体的には、本開示は、ＳＥＲＳナノ構造を含む造影剤を対象とする。本開示の造影剤は、一般的に患者の画像化において、かつ／または患者の疾患組織の存在の特異的診断において有用である。組成物を選択することによって、ＳＥＲＳナノ構造の励起および放射が約６３３ｎｍと１，０００ｎｍとの間、すなわち組織による吸収および散乱にとって最小限の領域で生じるように調整することができる。画像化のプロセスは、開示の造影剤を患者に投与し、次にスペクトル画像化を実施することができる任意のシステム（例えば、点走査型共焦点顕微鏡、線走査システム、および光干渉断層システム）を使用して、患者を走査することによって実施できる。本開示のＳＥＲＳナノ構造はまた、単一の波長バンドのみを検出する任意の画像化システム、上記に列記したもの、ならびに励起光源およびフィルター画像検出を備えた任意の蛍光画像化システムによって見ることができる。時間領域法、例えば、動的光散乱分光法および断層法、飛行時間型画像化、準弾性光散乱分光法、光子相関分光法、ドップラー分光法、ならびに拡散波分光法も含まれる。これらの技術はいずれも、光子とそれらの時間特性に基づいた場所とを区別できる。ＳＥＲＳナノ構造は蛍光物などとは異なる時間特性を有するので、これらの方法で組織およびその他の標識と区別することができる。有用な計測器パラメータは、変調光源および時間感受性型検出器である。変調はパルス式または連続式であってよい。
【００９６】
走査によって、患者の内部領域および／またはその領域の任意の疾患組織のスペクトルまたは画像が得られる。患者の領域とは、患者全体または患者の特定の領域もしくは部位を意味する。造影剤は、脈管構造、心臓、肝臓、および脾臓の画像を形成するために使用でき、胃腸領域またはその他の体腔の画像化において、あるいは組織の特徴付け、血液プールの画像化などの当業者に容易に理解されるようなその他の方法において使用することができる。
【００９７】
本開示はまた、異常な病理に関連した分子を標的とする複数のＳＥＲＳナノ構造を異常な病理に接触する体液に導入するステップであって、ＳＥＲＳナノ構造が異常な病理に関連した分子と結合するようになるステップと、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて結合したＳＥＲＳナノ構造を画像化するステップとを含む、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける異常な病理の診断方法を提供する。この方法は一般的に、プローブが接近できる任意の器官、例えば、胃腸管、心臓、肺、肝頚部、乳房などに適用できる。いくつかの実施形態では、ＳＥＲＳナノ構造は、大腸内視鏡検査の場合のように内視鏡もしくは針によって導入でき、または使い捨てチップもしくはスリーブと共に使用できる。その他の実施形態では、ＳＥＲＳナノ構造は画像化プローブ自体によって直接導入することができる。例えば、個々の光ファイバーまたは光ファイバーの束は、画像化のために生体に導入することができ、神経、脳、微小管、細胞を画像化し、ならびに体内分布を特徴付けることが立証されてきた。ゲルでコーティングされた光ファイバーはセンサーの文献では非常によく知られている。ＳＥＲＳナノ構造をこのゲルに非共有結合的に結合させ、導入することによって関連組織内に拡散させることができる。ファイバーが接触する液相にＳＥＲＳナノ構造が拡散するように、ＳＥＲＳナノ構造をファイバーの外面に固定するための様々なその他の方法を想定することができる。
【００９８】
本開示はまた、ＳＥＲＳナノ構造を動物に導入するステップを含む、動物をＳＥＲＳナノ構造で標識するための方法を提供する。ＳＥＲＳナノ構造は、任意の適切な手段、例えば、皮下埋込または静脈内導入によって動物に導入することができ、適切な装置を使用して検出することができる。本開示はまた、動物を確認するために獣皮または皮膚の下に埋め込んだＳＥＲＳナノ構造を利用した、家畜またはペットなどの動物の確認システムおよび関連方法を提供する。
【００９９】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける条件下で、本開示によるナノ構造は、受動的ターゲティング機構および能動的ターゲティング機構の両方によって腫瘍に送達させることができる。受動的な形態では、高分子およびナノメートルの大きさの粒子は、増強された透過保持（ＥＰＲ）効果によって腫瘍部位に選択的に蓄積する。この効果は、二つの要因、すなわち（ａ）腫瘍に関連した新脈管構造を超透過性にし、循環する高分子および小粒子の漏出を引き起こす血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を産生する血管新生腫瘍、ならびに（ｂ）腫瘍は効率的なリンパ排液系を欠如し、その結果高分子またはナノ粒子の蓄積を引き起こすことから生じると考えられる。
【０１００】
したがって、開示の一態様は、コア金属ナノ粒子（有利には金ナノ粒子）、このコアの表面に配置されたラマンレポーター分子、ならびにコアおよびレポーター分子の表面に配置されたカプセル化保護層を含む表面増強ラマン分光活性複合体ナノ構造であって、カプセル化レポーター分子が測定可能な表面増強ラマン分光特性を有するナノ構造である。
【０１０１】
本開示の実施形態では、ラマンレポーター分子は、イソチオシアナート色素、多重含硫有機色素、多重ヘテロ含硫有機色素、ベンゾトリアゾール色素、またはそれらの組合せから選択され得る。
【０１０２】
本開示の実施形態では、レポーター分子は、チアシアニン色素、ジチアシアニン色素、チアカルボシアニン色素、またはジチアカルボシアニン色素から選択される。その他の実施形態では、レポーター分子は、マラカイトグリーンイソチオシアナート、テトラメチルローダミン−５−イソチオシアナート、Ｘ−ローダミン−５−イソチオシアナート、Ｘ−ローダミン−６−イソチオシアナート、または３，３’−ジエチルチアジカルボシアニンヨージドから選択される。
【０１０３】
本開示の一実施形態では、コアは金であり、約２００ナノメートル未満の直径を有することができる。
【０１０４】
本開示のナノ構造の実施形態では、カプセル化物質はチオール−ポリエチレングリコールである。
【０１０５】
本開示のその他の実施形態では、ナノ構造はさらに、細胞上の標的に選択的に結合できる標的特異的プローブを含むことができる。
【０１０６】
これらの実施形態では、標的特異的プローブは、抗体、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、薬剤分子、阻害剤化合物、およびそれらの組合せからなる群から選択することができ、このターゲティングプローブは、標的細胞表面上のマーカーに親和性を有する。
【０１０７】
一実施形態では、標的特異的プローブは免疫グロブリンまたはその断片であり、本開示の実施形態では、このプローブは疎水性保護構造上に配置することができる。一実施形態では、このプローブは腫瘍ターゲティングリガンドである。
【０１０８】
本開示の他の態様は、金ナノ粒子を提供するステップと、この金ナノ粒子をラマンレポーターに導入するとすぐラマンレポーターがこのナノ粒子の表面上に配置されてナノ粒子−レポーター複合体を形成するステップと、ナノ粒子−レポーター複合体の表面上に保護構造層を配置するステップとを含み、このレポーター分子が測定可能な表面増強ラマン分光特性を有する、本開示によるナノ構造の調製方法を包含する。
【０１０９】
本発明のこの態様の一実施形態では、本発明はさらに、細胞標的特異的プローブを保護構造層に付着させるステップを含むことができ、このプローブは抗体、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、薬剤分子、阻害剤化合物、またはそれらの組合せから選択される。
【０１１０】
本開示のこの態様の方法の一実施形態では、コア金属ナノ粒子はコロイドである。有利な実施形態では、コア金属ナノ粒子は金である。
【０１１１】
本開示のこの態様の実施形態において、ラマンレポーター分子は、イソチオシアナート色素、多重含硫有機色素、多重ヘテロ含硫有機色素、ベンゾトリアゾール色素、またはそれらの組合せから選択される。本開示のその他の実施形態において、レポーター分子は、チアシアニン色素、ジチアシアニン色素、チアカルボシアニン色素、またはジチアカルボシアニン色素から選択される。本開示のこの方法のさらに他の実施形態では、レポーター分子は、マラカイトグリーンイソチオシアナート、テトラメチルローダミン−５−イソチオシアナート、Ｘ−ローダミン−５−イソチオシアナート、Ｘ−ローダミン−６−イソチオシアナート、または３，３’−ジエチルチアジカルボシアニンヨージドから選択される。
【０１１２】
本開示の一実施形態では、カプセル化物質はチオール−ポリエチレングリコールである。
【０１１３】
本開示のさらに他の態様は、少なくとも１つのナノ構造を培養細胞または動物もしくはヒト対象に送達するステップであって、このナノ構造がコア金ナノ粒子、コア表面上に配置されたラマンレポーター分子、ならびにコアおよびレポーター分子に配置されたカプセル化保護層を含み、このカプセル化レポーター分子が測定可能な表面増強ラマン分光特性を有するステップと、このナノ構造を標的指向生物学的細胞または組織と接触させるステップと、照射源でレポーター分子を励起するステップと、レポーター分子に対応するナノ構造の表面増強ラマン分光スペクトルを測定し、それによって標的指向細胞もしくは組織中のナノ構造の存在を検出するステップとを含む、生物試料の画像化方法を包含する。
【０１１４】
本開示のこの態様の一実施形態では、ナノ構造は標的特異的プローブをさらに含むことができ、ターゲティングプローブはナノ粒子を標的指向細胞に選択的に結合させ、それによって標的指向細胞の検出を可能にする。
【０１１５】
本開示の他の実施形態では、標的細胞は動物またはヒト対象の組織中にある。
【０１１６】
本開示のこの態様の実施形態では、標的細胞は動物またはヒト対象の癌細胞であってよく、標的特異的プローブは、抗体、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、薬剤分子、阻害剤化合物、およびそれらの組合せからなる群から選択することができ、このターゲティングプローブは、標的細胞表面上のマーカーに親和性を有する。
【０１１７】
本開示の一実施形態では、標的特異的プローブは腫瘍ターゲティングリガンドである。
【０１１８】
以下の具体的な実施例は、単に例示するのみのものであって、いかなる方法においても本開示の残りの部分を制限するものではない。さらに詳述はしていないが、当業者であれば、本明細書の記載に基づいて、完全な範囲まで本開示を利用することができよう。本明細書で引用した出版物はすべて、参照することによりその全体を本明細書に組み込む。
【０１１９】
本開示の実施形態、特に、任意の「好ましい」実施形態は、単に実施の可能な例であり、本開示の本質の明確な理解のために記載されているにすぎない。本開示の精神および本質を実質的に逸脱することなく、多くの変更および改変を前述の本開示の実施形態に行うことができる。このような改変および変更はすべて、本明細書の本開示の範囲内に含まれるものとし、本開示は以下の特許請求の範囲で保護される。
【０１２０】
以下の実施例は、方法の実施方法、ならびに本明細書で開示し特許請求した組成物および化合物の使用方法についての完全な開示および説明を当業者に提供するために提示されている。数（例えば、量、温度など）に関しては確実に正確であるように努めたが、いくらかの誤りおよびずれは考慮されるべきである。特に他に記載しない限り、部は重量部であり、温度は℃であり、圧力はほぼ大気圧である。標準温度および圧力は２０℃および１気圧と定義される。
【実施例】
【０１２１】
（実施例１）
試薬：超純水（１８ＭΩｃｍ−１）が全操作を通じて使用された。以下の化学物質は商用供給源から入手し、さらに精製することなく使用した。１ミリリットル当たり２．６×１０１０粒子の濃度の６０ｎｍクエン酸安定化金粒子（Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ  Ｉｎｃ．）、近赤外線放射量子ドット（ＱＤ７０５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、マラカイトグリーンイソチオシアナート（ＭＧＩＴＣ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ジエチルチアトリカルボシアニンヨージド（ＤＴＴＣ）（Ｅｘｃｉｔｏｎ）、ｍＰＥＧ−ＳＨ（ＭＷ約５ｋＤａ）（Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＨＳ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ（ＭＷ約３ｋＤａ）（Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）。ヒト癌細胞系Ｔｕ６８６は、舌の基部の原発性腫瘍から確立された。ヒト癌細胞系ＮＣＩ−Ｈ５２０は、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から購入した。細胞培養培地、牛胎児血清、血球計数計、および細胞培養用品は、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。その他の試薬はすべて、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈの最高純度のものを購入した。
【０１２２】
（実施例２）
合成：約６０ナノメートルの標的直径を有する金コロイドは、文献の手順に従って合成された。ガラス製品はすべて厳密に洗浄され、使用前に水で濯いだ。５０ｍＬのガラスフラスコ内で、３０ｍＬの０．０１％ＨＡｕＣｌ４水溶液を磁石で撹拌しながら沸騰させた。沸騰したら、１８０μＬの１％クエン酸ナトリウムを迅速に注入した。数分以内に、淡黄色の溶液は濃紫色に変化し、直ちに赤色になった。コロイドは、確実に還元を完了するために約１５分間沸騰させ、室温まで冷却し、使用前に３０ｍＬに再構成した。
【０１２３】
ラマンレポーター（すなわちレポーター分子）が包埋されたＳＥＲＳ活性複合体ナノ構造を調製するために、新たに調製された金コロイドと共に約０．１ｇの混合床イオン交換樹脂を撹拌して過剰なイオンを除去した。この樹脂は、濾過または注意深くデカントすることのいずれかによって除去し、コロイドは等量の水で希釈した。ラマンレポーターは、約７．５×１０−８Ｍを超えない濃度まで、迅速に撹拌しながら添加し、約１５分間平衡にさせた。
【０１２４】
測定：走査型分光光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ、ＭＤ）は、ＵＶ−可視吸収スペクトルを得るために使用された。高倍率透過型電子顕微鏡写真は、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ＣＭ２００の電子顕微鏡を使用して撮影し、２ｋ ＣＣＤによってＴＶＩＰＳ ２ｋ上に記録した。バルクラマンスペクトルは、分散的ラマン分光システム（Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ６３３、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｌｉｍｉｔ、Ｌａｒａｍｉｅ、ＷＹ）を使用して記録した。単一粒子スペクトルは、６４７ｎｍでの励起のためにアルゴン／クリプトン混合ガスイオンレーザー（Ｌｅｘｅｌ ３５００、Ｆｅｒｍｏｎｔ、ＣＡ）を装備した反転光学顕微鏡（Ｄｉａｐｈｏｔ ２００、Ｎｉｋｏｎ、Ｍｅｌｖｉｌｌｅ、ＮＹ）で得た。
【０１２５】
対象となる領域は、最初に広視野照明によってスクリーニングし、ラマン活性粒子は、正面顕微鏡ポートに装着した映像速度増大ＣＣＤ（ＩＣＣＤ、ＰＴＩ、Ｉｎｃ．、Ｌａｗｒｅｎｃｅｖｉｌｌｅ、ＮＪ）によって位置決定した。その後、共焦点光学機器を使用して、個々のＳＥＲＳ活性複合体ナノ構造に焦点を当て、後方散乱ラマン信号は、顕微鏡対物レンズ（Ｐｌａｎ  １００×、油浸、ＮＡ＝１．２５）を通して収集した。三重帯域フィルター（Ｃｈｒｏｍａ  Ｔｅｃｈ、Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ、ＶＴ）を使用して、レーザー線および外部発生信号を遮断した。分光特性は、一段階分光計（モデル２７０Ｍ、Ｓｐｅｘ、Ｅｄｉｓｏｎ、ＮＪ）に装着されたＣＣＤ検出器（ＴＫＢ５１２、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｔｒｅｎｔｏｎ、ＮＪ）によって得られた。
【０１２６】
（実施例３）
ペグ化ＳＥＲＳナノ粒子の調製：新たに調製したレポーター溶液（３〜４μＭ）を、迅速に混合している金コロイドに１：６のレポーター溶液／コロイド体積比で滴下し、容易に、金粒子表面にレポーター分子を均等に分布させた。金粒子に対するレポーター分子のモル比は、ＳＥＲＳ強度を最大にし、コロイド凝集を最小限にするために最適化した。例えば、最適化された表面被覆値は、６０ｎｍの金粒子１個当たりマラカイトグリーンイソチオシアナート１４，０００分子であり、同じ大きさの金粒子１個当たりクリスタルバイオレット約１５，３００分子であった。上記のパラメータ（すなわち、レポーター保存溶液濃度、レポーター保存溶液の金ナノ粒子溶液に対する体積比、および金に対するレポーターの添加率）はすべて、生じるタグの凝集状態に影響を及ぼしたことに注意されたい。レポーター溶液を金コロイドに添加したとき、金をレポーターに添加したときよりも高いＳＥＲＳ信号が認められた。
【０１２７】
１０分後、チオール−ＰＥＧ溶液（１０μＭ）を、６０ｎｍの金粒子１個当たりＰＥＧ−ＳＨ３０，０００分子の最小比で、ラマンコード化コロイドに滴下した。この表面被覆は、金粒子表面上の完全なＰＥＧ単層に対応し、様々な条件下での凝集に対して金コロイドを安定化するために必要であった。簡単な幾何学計算によって、チオール−ＰＥＧ分子それぞれが金表面の０．３５ｎｍ２のフットプリント領域を占め、ＰＥＧ−ＳＨのブラシ構造を報告した文献データと一致することが示された。１０〜２０倍過剰量のＰＥＧ−ＳＨを添加しても、コロイドの安定性およびポリマーコーティング層の厚さには何ら変化をもたらさなかったことは重要である。
【０１２８】
（実施例４）
ナノ粒子の特徴付け：ＵＶ−Ｖｉｓ吸収スペクトルは、Ｓｈｉｍａｄｚｕ（ＵＶ−２４０１）分光計で、使い捨てポリアクリルキュベットを使用して記録した。透過型電子顕微鏡写真（ＴＥＭ）は、Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｈ７５００高倍率電子顕微鏡を使用して撮影した。静電気を減少させるためにＵＶ光で前処理した銅の２００メッシュの格子にナノ粒子試料（５μｌ）を滴下した。３０分後、濾紙で溶媒を吸い取り、リンタングステン酸染色溶液（１重量％、ｐＨ６に調整）を３０秒間適用した。新鮮な腫瘍組織標本を、２．５％グルタールアルデヒドを含有する０．１Ｍカコジル酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて４℃で固定した。組織を０．１Ｍカコジル酸緩衝液で１５分間、３回濯ぎ、１％ＯｓＯ４緩衝液で後固定し、その後脱水し、樹脂（Ｅｐｏｎ）に包埋した。超薄切片（約６０ｎｍ）をウルトラトーム機器で切り出し、ＴＥＭ画像化のために銅格子に戴置した。
【０１２９】
ＤＬＳデータは、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  ９０Ｐｌｕｓ粒径分析計器を使用して得た。各試料は、連続して３回測定した。ＳＥＲＳスペクトルは、小型ラマンシステムで、６３３ｎｍ（３ｍＷ）または７８５ｎｍ（４０ｍＷ）励起（Ａｄｖａｎｔａｇｅ  Ｒａｍａｎ  Ｓｅｒｉｅｓ、ＤｅｌｔａＮｕ）を使用して記録した。ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＳＥＲＳスペクトルは、持ち運び型ラマンシステム（Ｉｎｓｐｅｃｔｏｒ  Ｓｅｒｉｅｓ、ＤｅｌｔａＮｕ）で７８５ｎｍのレーザー励起を使用して収集した。レーザー光の直径は焦点で３５μｍであり、プローブ量は６３３ｎｍ励起で約２３ｎｌ、７８５ｎｍ励起で約１９ｎｌと概算された。ＳＥＲＳ強度は、光学的配列および機器応答における変動を修正するために、シクロヘキサンおよびポリスチレンのラマンスペクトルで正規化した。スペクトル分解能は、ＡｄｖａｎｔａｇｅラマンシステムおよびＩｎｓｐｅｃｔｏｒラマンシステムの両方とも約５ｃｍ−１であった。
【０１３０】
単一ＳＥＲＳナノ粒子および量子ドットの画像化のために、狭帯域レーザー励起フィルター（６３３±３ｎｍ）およびロングパス放射フィルター（６５５ＬＰ、Ｃｈｒｏｍａ  Ｔｅｃｈ）をＯｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７１倒立顕微鏡と共に使用した。画像は、７５０ｍｓの曝露時間で撮影し、電子顕微鏡に装着した電子増倍機能（ＥＭ）ＣＣＤカメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ、Ｃ９１００−１２モデル）を使用して平均５０枚の画像を撮影した。長い曝露時間および画像の平均化を使用することによって、単一ナノ粒子のいかなる信号の変動も消去した。ＳＥＲＳおよび量子ドット信号強度の定量的比較のために、波長依存要素は、ＣＣＤカメラ応答曲線を使用することによって修正した。
【０１３１】
（実施例５）
ｓｃＦｖリガンドとの結合：ヒトＥＧＦＲに特異的な抗体断片である、ｓｃＦｖＢ１０は、ＹＵＡＮ−ＦＣＣＣヒト未処理ファージディスプレイライブラリーから、確立された固相バイオパニング法を使用して単離した。大量のｓｃＦｖが、細菌抽出物から、天然の条件下で、Ｎｉ２＋ＮＴＡ−アガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製された。９５％を上回るタンパク質純度は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ＰＡＧＥを使用して測定した。ヘテロ官能性リンカーＨＳ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ（４３０μｌおよび１μＭ）は、ポリプロピレン試験管に入れた２．２ｍｌのＡｕ−ＭＧＩＴＣ（またはＡｕ−ＤＴＴＣＩ）溶液に、迅速に混合しながら滴下した。金粒子１個当たりのカルボキシ基の数は、使用したリンカー分子の量を変化させることによって、約５，０００個になるように調節した。１５分間混合した後、金ナノ粒子を大量のＰＥＧ−ＳＨ（１０μＭで１．６ｍｌ）に曝露して、ヘテロ官能性ＰＥＧによって被覆されていない領域を充填し、これにより、十分に遮蔽され、かつ安定な粒子表面を作製した。カルボン酸官能基にリガンドを共有結合させる前に、金粒子は、遠心分離（１，０００ｇ）およびＰＢＳへの再懸濁を３回行うことによって精製した。
【０１３２】
共有結合のために粒子表面の−ＣＯＯＨ基を活性化するために、新たに調製したエチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド（ＥＤＣ）溶液（４０ｍｇ／ｍｌの濃度で５μｌ）およびスルホ−ＮＨＳ（１１０ｍｇ／ｍｌで５μｌ）を２５℃で１５分間激しく混合した。過剰量のＥＤＣおよびスルホ−ＮＨＳは、Ｎａｎｏｓｅｐ  １０Ｋ  ＭＷＣＯ  ＯＭＥＧＡ膜（Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、遠心分離（１，０００ｇ）およびＰＢＳへの再懸濁を３回行うことによって活性化ナノ粒子から分離した。次に、活性化カルボキシル基を有する精製金粒子をｓｃＦｖ抗体（１１．２ｎｍｏｌ）と２５℃で２時間反応させ、反応混合物を４℃で一晩保存した。過剰なｓｃＦｖリガンドは、１００Ｋ  ＭＷＣＯ  ＯＭＥＧＡ膜を使用して、遠心分離およびＰＢＳへの再懸濁を３回行うことによって除去した。２８０ｎｍにおけるタンパク質の吸収測定値に基づいて、金粒子１個当たりｓｃＦｖ約６００個があることが推定された。この値はさらに、蛍光標識ｓｃＦｖリガンドを使用して、高感度で結合比を測定することによって確認された。完全に官能性を与えられたナノ粒子は、ＵＶ−Ｖｉｓ、ＴＥＭ、およびＤＬＳによって特徴付けられ、コロイドの安定性および光学的特性は、対照ナノ粒子タグと本質的に同一であった。
【０１３３】
（実施例６）
細胞ＳＥＲＳの研究：Ｔｕ６８６およびＨ５２０細胞はそれぞれ、１０％熱不活性化牛胎児血清および抗生物質（ストレプトマイシン、ペニシリンＧ、およびアンホテリシンＢ）を添加したＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２（１：１）およびＲＰＭＩ−１６４０で培養し、加湿したインキュベーター内で３７℃、５％ＣＯ２で維持した。細胞は、３５ｍｍの皿で集密になるまで増殖させた。細胞染色法は、卓上結合インキュベーターで、２５℃で無菌条件下において実施した。生細胞をｓｃＦｖ結合ＳＥＲＳナノ粒子（１５ｐＭ、ＰＢＳ溶液）と３０分間穏やかに混合し、次いで穏やかに掻き取って収集した。細胞は、氷冷ＰＢＳで４回洗浄を行い、ＳＥＲＳを測定する前に５００μｌのＰＢＳに再懸濁した。細胞の一部をペグ化対照ＳＥＲＳタグとインキュベーションし、非特異的結合および内部移行を評価した。バックグラウンドの細胞散乱を評価するために、対照ＳＥＲＳタグもＥＧＦＲ−ＳＥＲＳタグも付加していない細胞の一部をさらに対照として使用した。ＳＥＲＳスペクトルは、コールターカウンターで測定した細胞数に対して正規化した。
【０１３４】
定量的比較のために、純粋な細胞散乱スペクトルを差し引いて、図３における差スペクトルを得た。スペクトルはすべて、細胞懸濁液から得た。１ｍｌ当たり１×１０６細胞の細胞密度に基づいて、本発明者らは、レーザー検出量が約２０から３０個の標識細胞を含有すると推定した。未固定細胞試料で３日間に亘り繰り返し実験しても、またはホルムアルデヒド溶液で細胞固定しても、スペクトル特性にもスペクトル強度にも変化は認められなかった。これらの細胞懸濁液の測定によって、ナノ粒子タグ付けおよび細胞不均一性の問題は取り除かれ、高い再現性があることがわかった。
【０１３５】
（実施例７）
腫瘍異種移植片およびｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＳＥＲＳ：５０フェムトモルのペグ化ＳＥＲＳナノ粒子を、健康なヌードマウスの２箇所に投与した：（ｉ）皮下注射（皮膚の下１〜２ｍｍ）および（ｉｉ）筋肉の深部に注射（皮膚の下１ｃｍ）。ＮＩＲラマン分光計（Ｉｎｓｐｅｃｔｏｒ  Ｓｅｒｉｅｓ、ＤｅｌｔａＮｕ）を使用することによって、様々な位置を調べた。皮下ＳＥＲＳスペクトルは３秒で得られ、筋肉スペクトルは２１秒で得られ、（注射部位から離れた領域で得られた）対照スペクトルもまた、２１秒で得られた。
【０１３６】
Ｔｕ６８６細胞（５×１０６個）は、約６から８週齢の雌のヌードマウス（ＮＣ  ｒａｔｈｙｍｉｃ、ｎｕ／ｎｕ）の背側部領域に皮下注射した。マウスは、受動的および能動的ターゲティング研究のために、２つの群に分けた。腫瘍の大きさが直径３ｍｍに達したとき、ヌードマウスに尾静脈注射によって４５フェムトモルのｓｃＦｖ ＥＧＦＲ結合ＳＥＲＳタグおよびペグ化対照ＳＥＲＳタグをそれぞれ投与した。５時間後、マウスは、７０μｌのケタミンおよびキシラジン混合溶液を注射することによって麻酔状態にして、ラマン分光計を使用して、２０ｍＷのレーザー出力、７８５ｎｍで調べた。レーザー光は標的指向および非標的指向ＳＥＲＳナノ粒子の両方について、腫瘍または肝臓の解剖学的領域に焦点を当てた。約９ｍｍの焦点距離で、完全に非接触的で非侵襲的な方法でＳＥＲＳスペクトルを得た。結果は図５Ａ〜５Ｃに示す。分光学的データを取得した後、ＩＣＰ−ＭＳ生体分布分析用の主要な器官を採取するためにマウスを屠殺した。新鮮な組織試料それぞれの小部分もまた、ＴＥＭ薄切片を調製するために、０．１Ｍカコジル酸緩衝液中ですぐに固定した（図１０および１１）。
【０１３７】
簡単に説明すると、主要な器官組織はエタノールで３回濯ぎ、その後凍結乾燥し、酸消化のために清浄なバイアル中に計量した。強酸で２日間消化した後、試料を精製し、ＩＣＰ−ＭＳ（誘導結合プラズマ質量分析）によって分析するために３５倍に希釈した。実験は、統計学的分析のために、独立して５回実施した。実施毎に新たに調製したＳＥＲＳタグを有するマウス２匹を用い、１匹には能動的ターゲティングを行い、他方には受動的ターゲティングを行った。動物の１群は、長期毒性研究のために使用した。
【０１３８】
（実施例８）
ペグ化ＳＥＲＳナノタグの設計および特徴付け：図１Ａ〜１Ｄは、分光学的タグが包埋されたペグ化金ナノ粒子の設計および調製ならびにその概略構造を示す。光吸収スペクトル（図１Ｂ）、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）構造（図１Ｃ）、および流体力学的な大きさのデータ（図１Ｄ）も示す。元の金粒子（直径６０ｎｍ）は、ラマンレポーターでコード化され、チオール−ＰＥＧの層で安定化されている。以前の実験で、約６０〜８０ｎｍの大きさのコアを備えた金ナノ粒子が、赤（６３０〜６５０ｎｍ）および近赤外線（７８５ｎｍ）の励起でＳＥＲＳとして最も効率的であることが示された（Ｋｒｕｇら、（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１：９２０８〜９２１４）。
【０１３９】
このスペクトル領域は、ヘモグロビン（血球）および水の吸収スペクトルが最小限なので、光学画像化にとって「明るい窓（ｃｌｅａｒ  ｗｉｎｄｏｗ）」として知られている。ＳＥＲＳ効果だけでなく、６３３ｎｍまたは７８５ｎｍに電子遷移を有するレポーター分子を使用することによって、共鳴ラマン増強もまた達成された。金粒子が多数の分子（約１．４〜１．５×１０４）でコーティングされ、ＰＥＧ分子の層で安定化された場合であっても、金プラズモン共鳴スペクトルは本質的に不変なままであった（＜１ｎｍの赤シフト）（図１Ｂ）。本発明者らは、単一分子ＳＥＲＳは特定の活性部位または結合部でのみ生じ、腫瘍検出には必要ないことに言及する。実際に、多数のレポーター分子が粒子表面に吸着すると、単一分子ＳＥＲＳの信号強度を超える総信号強度が得られた。ＰＥＧコーティングは、ＴＥＭ陰性染色によって約５ｎｍの薄い白色の層として明瞭に観察され、一方、緩衝生理食塩水中における流体学的光散乱法（ＤＬＳ）によって測定すると、粒子の「湿潤した」流体力学的直径はペグ化後２０ｎｍ増加した。６０ｎｍのコア粒径では、金ナノ粒子１個当たり最小限３０，０００個のチオール−ＰＥＧ分子（ＭＷ＝５ｋＤａ）が、塩誘導性コロイド凝集に対する完全な防御を実現するために必要であった。この表面被覆はＰＥＧ分子当たり約０．３５ｎｍ２のフットプリント領域に対応し、他のグループによって報告されたコロイド状金に吸着したブラシ構造のチオール−ＰＥＧと一致した。この遮蔽層が完成した後、ＴＥＭおよびＤＬＳの両方で測定すると、他のチオール−ＰＥＧを１０倍、２０倍の過剰量になるまで使用しても、コーティングの厚さにほとんど影響を及ぼさなかった。
【０１４０】
（実施例９）
ペグ化金ナノ粒子の安定性は、濃縮塩（１〜２Ｍ）、強酸（０．１Ｍ  ＨＣｌ）、強塩基（１Ｍ  ＮａＯＨ）、および有機溶媒（メタノール、エタノール、およびジメチルスルホキシドすなわちＤＭＳＯ）を含む多種多様な条件下で、ＳＥＲＳ信号（振動数および強度の両方）を測定することによって研究した。図ＡおよびＢ。ＰＥＧ保護がないと、金ナノ粒子はこのような過酷な条件下では迅速に「壊れる」（すなわち、凝集し、沈殿する）。ＰＥＧ保護によって、金粒子およびそのＳＥＲＳスペクトルは完全に安定で、ｐＨ１〜２でも（金表面上のレポーター分子のプロトン付加および相対的方向の変化のために）ほんのわずかな相対的強度の変化があるだけである。
【０１４１】
チオール−ＰＥＧコーティングを用いて強いＳＥＲＳ信号が観察されたことは、粒子表面上のレポーター分子が（金上で単層を自発的に形成することが知られている）チオール化合物によって置換されることが予測されるので、直感に反するようである。また、驚くべきことに、クリスタルバイオレット、ナイルブルー、塩基性フクシン、およびクレシルバイオレットなどの一連のラマンレポーターは、固定するイソチオシアナート（−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ）基がなくても、チオール−ＰＥＧによって置換されなかった。実際に、クリスタルバイオレットおよびその他の色素のＳＥＲＳ信号は、チオール−ＰＥＧによって強く保護され、２５℃で＞１１ヶ月間安定であった。これらのレポーター色素の一般的特性は、正に荷電しており、非局在化したパイ電子を含有することである。対照的に、フルオレセインナトリウムなどの負に荷電した有機色素は、本研究で使用したクエン酸安定化金粒子（これもまた、負に荷電している）では、弱くて不安定なＳＥＲＳ信号しか生じなかった。したがって、チオール−ＰＥＧ吸着と競合しない金表面部位ではおそらく、静電的相互作用および非局在化したパイ電子の両方が強い色素吸着には重要であるものと考えられる。チオール−ＰＥＧ層が、立体的遮蔽および電子の相互作用によって、吸着されたレポーター色素を保護し安定化することも可能である。
【０１４２】
細胞およびｉｎ  ｖｉｖｏにおける画像化用途のために、ペグ化金ナノ粒子および近赤外線量子ドットの励起および放射スペクトル特性を比較した。金ナノ粒子はよりずっと豊富な分光学的情報を提供し、放射ピーク（半値全幅ＦＷＨＭ＝１〜２ｎｍ）は量子ドット（ＦＷＨＭ＝４０〜６０ｎｍ）よりも２０〜３０倍狭かった（図２Ａおよび２Ｂ）。同一の実験条件下では、ペグ化金粒子は６５０〜７５０ｎｍのスペクトル範囲における近赤外線放射量子ドットよりも＞２００倍明るかった（粒子対粒子に基づく）（図２Ｃおよび２Ｄの単一粒子画像ならびに図２Ｅおよび２Ｆの統計学的データを参照）。ペグ化金ナノ粒子の流体力学的大きさは約８０ｎｍ（直径）で、３〜６日間にわたって試験したとき、培養細胞に対して完全に無毒であった。表面増強ラマン信号がない場合、近赤外線金ナノシェルが近年、光干渉断層撮影のための、および腫瘍の光熱切除のためのコントラスト増強剤として使用されてきたが、この方法ではスペクトルのコード化または多重化のための分子特性は得られない。
【０１４３】
（実施例１０）
癌細胞の分光学的検出：癌細胞検出のために、標的指向金ナノ粒子は、チオール−ＰＥＧ（約８５％）およびヘテロ官能性ＰＥＧ（ＳＨ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ）（約１５％）の混合物を使用することによって調製した。図３Ａで概略を示したように、ヘテロ官能性ＰＥＧは、高い特異性および親和性でＥＧＦＲに結合するリガンドであるｓｃＦｖ抗体（ＭＷ＝２５ｋＤａ）に共有結合した。ＵＶ−Ｖｉｓ吸収および蛍光データによって、約６００コピーのｓｃＦｖリガンドが各金ナノ粒子に結合することが示された。図３Ｂは、ｓｃＦｖ結合金ナノ粒子とヒト癌細胞とをインキュベーションすることによって得られる細胞結合およびＳＥＲＳスペクトルを示す。ヒト頭頚部癌細胞（Ｔｕ６８６）は、ＥＧＦＲ陽性であり（細胞１個当たり１０４〜１０５個の受容体）、強いＳＥＲＳ信号によって検出された。対照的に、ヒト非小細胞肺癌（ＮＣＩ−Ｈ５２０）はＥＧＦＲを発現せず、ＳＥＲＳ信号をほとんどまたは全く示さなかった。ターゲティングの特異性を確認するために、Ｔｕ６８６癌細胞を１０倍過剰量の遊離ｓｃＦｖ ＥＧＦＲ抗体中で予めインキュベーションし、その後競合的結合の研究のためにＥＧＦＲ標識ＳＥＲＳナノ粒子を添加した。３回洗浄した後、細胞はごくわずかなＳＥＲＳ信号を示した。２部位サンドイッチ様式で第２抗体に結合したＳＥＲＳナノ粒子の結合特異性もまた、試験して確認した。対照癌細胞（ＥＧＦＲ陰性）および対照ナノ粒子（単純なＰＥＧコーティングナノタグ、および非特異的ＩｇＧ抗体で機能化したＰＥＧナノタグ）では、スペクトルは図３Ｂに示したように、弱いが再現性のあるバックグラウンドを示した。バックグラウンドが低いのはおそらく、細胞単離の最中に完全に除去されなかった混合溶液中に残存するＳＥＲＳナノ粒子が原因であったが、非特異的結合またはナノ粒子内部移行も関与する可能性があった。赤外色素（ジエチルチアトリカルボシアニンすなわちＤＴＴＣ）は分光学的レポーターとして使用され、７８５ｎｍの励起で表面増強共鳴ラマン散乱（ＳＥＲＲＳ）を実現した。この共鳴状態は、吸着した色素が金属粒子への効率的なエネルギー移動によって光分解から保護されているので、光退色を引き起こさなかった。共鳴効果はさらに、表面増強ラマン信号を１０から１００倍高めることができ、これは、単一癌細胞のラマン分子プロファイリング研究に十分な感度である（図８）。この感受性は、手術によって取り出された癌組織標本、および末梢血試料から捕捉された循環腫瘍細胞の不均一な性質を調べるのに重要である。単一細胞のプロファイリング研究は、ＥＧＦＲがモノクローナル抗体、およびタンパク質キナーゼをベースにした治療の有効なタンパク質標的であるので、臨床的に非常に重要である。
【０１４４】
（実施例１１）
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍ターゲティングおよび検出：ｉｎ  ｖｉｖｏにおける光学的画像化および分光法についての重大な難題は、動物組織において光が散乱し吸収されるために、透過深度が限られることである。ＳＥＲＳスペクトルが、動物組織に埋め込まれたペグ化金ナノ粒子から得られるかどうかを測定するために、小用量のナノ粒子を生きた動物の皮下および筋肉深部に注射した。図４に示したように、高い解像度のＳＥＲＳ信号が皮下および筋肉注射によって得られた。
【０１４５】
健康なヌードマウスは、５０μｌのＳＥＲＳナノ粒子タグ（１ｎＭ）を皮下（皮膚の１〜２ｍｍ下）または筋肉（皮膚の約１ｃｍ下）に注射することによって投与された。皮下スペクトルは３秒で得られ、筋肉スペクトルは２１秒で、（注射部位から離れた領域で得られた）対照スペクトルもまた、２１秒で得られた。参照スペクトルは、ＰＢＳ溶液中でＳＥＲＳナノ粒子から０．１秒で得られた。スペクトル強度は、指示した倍数（×１、×３０、または×２１０）で比較するために調節した。ラマンレポーター分子はマラカイトグリーンで、スペクトル特性は４２７、５２５、７２７、７９８、９１３、１，１６９、１，３６２、１，５８１、および１，６１３ｃｍ−１であった。これらの特徴は、動物の皮膚のラマン信号と明確に区別できる（皮膚スペクトル参照）。励起波長：７８５ｎｍ、レーザー出力：２０ｍＷ。
【０１４６】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＳＥＲＳスペクトルは、絶対強度は１〜２桁弱まるが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（生理食塩水溶液）で得られたものと同一であった。高い信号対雑音比に基づいて、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＳＥＲＳ腫瘍検出のために実現可能な透過深度は、約１〜２ｃｍであると推定された（深部組織注射研究によっても確認された）。
【０１４７】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍ターゲティングおよび分光法のために、ｓｃＦｖ抗体と結合した金ナノ粒子を、ヒト頭頚部腫瘍（Ｔｕ６８６）を有するヌードマウスに（尾静脈から）全身注射した。図５Ａおよび５Ｂは、近赤外線の７８５ｎｍレーザー光を腫瘍部位またはその他の解剖学的位置（例えば、肝臓または脚部）に焦点を当てることによって、ナノ粒子を注射してから５時間後に得られたＳＥＲＳスペクトルを示す。腫瘍信号強度における実質的な差が、標的指向ナノ粒子と非標的指向ナノ粒子との間で認められた一方、非特異的な肝臓取り込みによるＳＥＲＳ信号は同じであった。この結果は、ｓｃＦｖ結合金ナノ粒子がｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＥＧＦＲ陽性腫瘍を標的とすることができることを示している。時間依存性ＳＥＲＳデータはさらに、ナノ粒子が４〜６時間で徐々に腫瘍内に蓄積し、蓄積した粒子のほとんどが腫瘍内に＞２４〜４８時間停滞することを示している。
【０１４８】
（実施例１２）
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるナノ粒子の分布および細胞内局在：誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ）を使用した定量的生体分布研究によって、図６に示したように、標的指向金ナノ粒子は非標的指向粒子よりも１０倍効率よく腫瘍内に蓄積することが明らかになった。ＩＣＰ−ＭＳデータによってまた、肝臓および脾臓による非特異的粒子の取り込みが確認されたが、脳、筋肉、またはその他の主要な臓器ではほとんどまたは全く蓄積せず、健康なマウス３１に注射した金ナノシェルで報告された生体分布データと同様であった。超微細構造ＴＥＭ研究によってさらに、ＳＥＲＳナノ粒子がＥＧＦＲ陽性腫瘍細胞によって取り込まれ、図１０および１１で示したようにエンドソームおよびリソソームなどの細胞内小器官に局在することが明らかになった。ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてエンドサイトーシスされたナノ粒子は、結晶構造およびファセット構造をしており、これは、ほとんど同一のＳＥＲＳスペクトルがｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいてコード化金ナノ粒子から得られたという発見と一致した。ペグ化金粒子は、体循環において、ならびに細胞内小器官に取り込まれた後でも、完全なまま安定であるようである。金粒子注射の２〜３ヶ月後の動物では、毒性もその他の生理学的合併症も認められなかった。
【０１４９】
（実施例１３）
過酷な条件下でのペグ化ＳＥＲＳナノ粒子の安定性：４回の独立した方法によって、濃縮ＰＢＳ溶液中におけるＡｕ−ＭＧＩＴＣ−ＰＥＧ−ＳＨの高い安定性が確認された。ＰＥＧ−ＳＨコーティングした、およびコーティングしていないＡｕ−ＭＧＩＴＣ複合体を、図７Ａおよび７Ｂで示したように、ＵＶ−ｖｉｓ吸収分光法、ＴＥＭ、ＤＬＳ、および視覚的観察によって調べた。コーティングしていないＡｕ−ＭＧＩＴＣにＰＢＳを添加すると、ＵＶ−ｖｉｓ吸収スペクトルでの劇的なスペクトル変化、ＴＥＭにおける大きな凝集、および６００〜１，０００ｎｍの水力学的直径の粒子の特有の集団の出現からわかるように、コロイドがすぐに凝集して沈殿し、ピンクから透明に明らかに色が変化した。対照的に、ＰＢＳで処理したＰＥＧ−ＳＨコーティングＡｕ−ＭＧＩＴＣは、６０ｎｍの金の特徴的なプラズモン共鳴ピークが保存されており、ＴＥＭによって過半数が単一粒子であり（溶媒留去のため少数のクラスターを含む）、ＤＬＳでは粒子は単一モードの狭いサイズ分布をしており、ピンク色をしていることが示された。生体結合および細胞標識手順で直面する広範囲の条件の影響は、ＰＥＧ−ＳＨコーティングＳＥＲＳタグのスペクトル特性に対する影響について調べた。
【０１５０】
Ａｕ−ＭＧＩＴＣ−ＰＥＧ−ＳＨは、遠心分離によってペレット状にして、新たな溶媒に再分散し、ＳＥＲＳ分光法によって調べた。Ａｕ−ＭＧＩＴＣ−ＰＥＧ−ＳＨを１０倍濃縮ＰＢＳ（１．３７Ｍ  ＮａＣｌ）、塩基性の水（ｐＨ１２）、酸性の水（ｐＨ２）、エタノール、およびメタノールに再分散したとき、水に溶かしたＡｕ−ＭＧＩＴＣの参照スペクトルと比較して有意なスペクトル変化はなかった（図１８）。おそらくＡｕ表面のＭＧＩＴＣの相対的な方向変化のため、ｐＨ２において１，６１５、１，３６５、および１，１７２ｃｍ−１におけるラマンバンドの相対的ピーク強度に少し変化が見られたが、５ｃｍ−１の機器分解能では振動周波数にシフトは認められなかった。
【０１５１】
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）にＡｕ−ＭＧＩＴＣ−ＰＥＧ−ＳＨを再分散すると、ＤＭＳＯの強いラマン断面のため、レポーターのスペクトル特性を遮蔽した。興味深いことに、元のＭＧＩＴＣスペクトル特性は、ＤＭＳＯ溶媒和タグを周囲条件下で６０日間保存し、その後水に再分散した後に回復した（図１８、パネル「ｇ」）。コーティングされていないＡｕ−ＭＧＩＴＣは５回の遠心分離で合体したが、ＰＥＧ−ＳＨコーティングＳＥＲＳタグは、試験した上記条件のいずれにおいても凝集を形成しなかった。
【０１５２】
（実施例１４）
単一癌細胞のＳＥＲＳスペクトルおよび相関プラズモン画像化：Ｔｕ６８６およびＨ５２０細胞は、８チャンバーガラススライドで集密になるまで増殖させた。１５ｐＭの濃度のｓｃＦｖ結合ＳＥＲＳタグを２００μＬの細胞培養培地に導入し、その後３０分間穏やかに混合した。インキュベーション時間後、細胞をＰＢＳで６回徹底的に洗浄して、画像化の前に遊離の金ナノ粒子を除去した。反射型暗視野画像は、ＥｘａｍｉｎｅＲ顕微鏡（ＤｅｌｔａＮｕ、Ｌａｒａｍｉｅ、Ｗｙｏｍｉｎｇ）で、２０×対物レンズを使用して得た。暗視野コンデンサを使用して、白色光の細いビームをタングステンランプから試料に照射した。この方法で、細胞膜にＳＥＲＳナノタグで染色した細胞は、金ナノ粒子の高い分散特性によって明るい金色を示した。ＥＧＦＲ陰性Ｈ５２０細胞は、大部分が暗いバックグラウンドを示した。Ｔｕ６８６ ＥＧＦＲ陽性細胞は、高レベルのＥＧＦＲ受容体結合を示したが、一方Ｈ５２０ ＥＧＦＲ陰性細胞は、限られたＥＧＦＲ発現を有するのみであった。単一細胞ＳＥＲＳスペクトルは、顕微鏡を７８５ｎｍレーザー励起のラマンモードに変えることによって得られた。２０×対物レンズを使用したレーザースポットの大きさは、焦点面で５×１０μｍであった。図８では、ＥＧＦＲ陽性細胞およびＥＧＦＲ陰性細胞それぞれについて矢印で示した領域から記録されたＳＥＲＳスペクトルを示した。各スペクトルは、１０秒の曝露時間で得られた。
【０１５３】
（実施例１５）
非標的指向（対照）ＳＥＲＳナノ粒子の生体分布研究：生きた動物におけるＳＥＲＳナノ構造標的特異的抗体結合プローブの動きを調べるために、以下のこと、すなわち特異的取り込みおよび滞留、バックグラウンドまたは非特異的取り込み、血中クリアランス、ならびに器官分布を調べた。図９に示したように、非特異的ナノ構造の取り込みおよび滞留は主に肝臓および脾臓で起こり、脳、心臓、腎臓、または肺ではＳＥＲＳナノ粒子の蓄積はほとんどまたは全くなかった。ｉｎ  ｖｉｖｏにおける器官の取り込みおよび分布のこのパターンは、デキストランコーティング磁気酸化鉄ナノ粒子と同様であった。過剰なＣＯＯＨ基を有するポリマーカプセル化ＳＥＲＳナノ粒子では、腫瘍ターゲティングは認められず、非特異的な器官による取り込みおよび迅速な血中クリアランスが示された。表面ＰＥＧ基を有するポリマーカプセル化ＳＥＲＳナノ粒子では、器官による取り込みの速度は減少し、血液循環の長さが改善され、腫瘍中のナノ粒子のゆっくりした蓄積が引き起こされる。図６に示したように、ＰＥＧによってカプセル化され、かつ抗ＥＧＦＲ抗体を生体結合したナノ粒子では、ナノ粒子は腫瘍の異種移植によって輸送され保持されるが、非特異的な肝臓および脾臓による取り込みがまだ認められた。
【０１５４】
（実施例１６）
透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）による細胞内における局在の研究：腫瘍、肝臓、脾臓、および腎臓は、細胞および組織の取り込みの後にどこで金ナノ粒子が付着されるかを決定するために、ＴＥＭで調べた。図１０は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて腫瘍ターゲティングするためにＥＧＦＲ標的指向金ナノ粒子を全身的に注射したときの腫瘍組織断片の代表的なＴＥＭ画像を示す。このデータは、金ナノ粒子が（たいていが受容体媒介エンドサイトーシスを介して）腫瘍細胞に内部移行し、エンドソームおよびリソソームなどの細胞内小器官に局在することを明らかに示している。
【０１５５】
ナノ粒子の肝臓による取り込みを調べるために、図１１は、初期および後期エンドソームにおいて金ナノ粒子を捕捉したクッパー細胞（肝類洞表面の内側を覆うマクロファージ）を示している。クッパー細胞によって非特異的に取り込まれたナノ粒子は、腫瘍細胞内のクラスター構造とは対照的に、しばしば孤立した構造であることに注意されたい。著しい数の金ナノ粒子がまた、脾臓マクロファージ細胞内で確認されている。その他の全器官では、金粒子は非常に低い密度でのみ発見されている。全体的に見て、高倍率ＴＥＭ研究では、ペグ化金ナノ粒子はｉｎ  ｖｉｖｏ条件下で細胞内小器官に取り込まれるが、形状および形態は完全なままであることがわかった。
【０１５６】
（実施例１７）
ＳＥＲＳナノ粒子タグの腫瘍への受動的蓄積 対 能動的ターゲティング：図１２参照。
【０１５７】
本開示の上述した実施形態は、単に可能な実施の例であり、本開示の本質の明確な理解のために記載されているにすぎない。本開示の精神および本質から実質的に逸脱することなく、多くの変更および改変を前述の実施形態に行うことができる。このような改変および変更はすべて、本開示の範囲内で本明細書に含まれ、以下の特許請求の範囲によって保護されるものとする。
【図１Ａ】
2010523983.tif 000003
【図１Ｂ】
2010523983.tif 000004
【図１Ｃ】
2010523983.tif 000005
【図１Ｄ】
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【図２Ａ．２Ｂ】
2010523983.tif 000007
【図２Ｃ−２Ｆ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ−５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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