(57)【要約】試料中のＰｒＰＳｃを検出するためのアッセイが記載される。詳細には、病原性プリオンＥＬＩＳＡが記載される。このアッセイは、ＰｒＰＳｃを捕捉するための病原性プリオン特異的試薬、および試料中に存在することがある非病原性プリオンタンパク質による干渉量を減少させるための、部位特異的プロテアーゼ、例えばトリプシンまたはＳＶ−８プロテアーゼによる消化を利用する。本発明の別の態様では本明細書に記載の検出方法のいずれかによって、対象由来の生体試料中の病原性プリオンの存在を検出することにより、前記対象のプリオン関連疾患を診断する方法を提供する。
2010523978.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
病原性プリオンおよび非病原性プリオンを含有する疑いのある試料中の病原性プリオンの存在を検出するための方法であって、該方法は、
（ａ）存在する場合には病原性プリオン特異的試薬と該病原性プリオンとの結合を可能にする条件下で、該試料を該試薬と接触させて、第１の複合体を形成する工程、
（ｂ）該非病原性プリオンが部位特異的プロテアーゼによって実質的に消化される条件下で、該第１の複合体を該プロテアーゼと接触させる工程、
（ｃ）プロテアーゼ阻害剤を添加して、該部位特異的プロテアーゼによるさらなる切断を妨害する工程、
（ｄ）該第１の複合体を、任意の未結合の試料および切断された非病原性プリオンから分離する工程、
（ｅ）該病原性プリオンを該第１の複合体から解離させることにより、解離した病原性プリオンを得る工程、
（ｆ）該病原性プリオンと第１の抗プリオン抗体との結合を可能にする条件下で、該解離した病原性プリオンを該第１の抗プリオン抗体と接触させて第２の複合体を形成する工程、および
（ｇ）該第２の複合体を、任意選択で標識された第２の抗プリオン抗体と接触させることにより、該第２の複合体の形成を検出する工程
を含み、
該第１の抗プリオン抗体は、該プリオンタンパク質中の第１のエピトープを認識し、該第２の抗プリオン抗体は、該プリオンタンパク質中の第２のエピトープを認識し、該第１のエピトープと該第２のエピトープは、同一ではなく、該部位特異的プロテアーゼの少なくとも１つの切断部位によって分離され、該部位特異的プロテアーゼに対する該少なくとも１つの切断部位は、該プリオンタンパク質のプロテイナーゼＫ耐性コア領域に位置する、方法。
【請求項２】
前記部位特異的プロテアーゼがトリプシンまたはＳＶ８を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記病原性プリオン特異的試薬が固体支持体に結合される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記固体支持体が磁気ビーズである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の抗プリオン抗体が固体支持体に結合される、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記第１の抗プリオン抗体がマイクロタイタープレートに結合される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記解離する工程が、前記第１の複合体を高ｐＨまたは低ｐＨに曝露することによって実施される、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記解離する工程の後に前記高ｐＨまたは前記低ｐＨを中和する工程をさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記解離した病原性プリオンがさらに変性される、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１の抗体または前記第２の抗体が前記プリオンタンパク質のオクタリピート領域のエピトープを認識する、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記オクタリピート領域のエピトープを認識する抗体がＰＯＭ２およびＳＡＦ−３２からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１および第２の抗体の一方が前記プリオンタンパク質のオクタリピート領域のエピトープを認識し、他方の抗体が該プリオンタンパク質のプロテイナーゼ耐性コア領域のエピトープを認識する、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記プロテイナーゼＫ耐性コア領域のエピトープを認識する抗体が、３Ｆ４、ＰＯＭ１７およびＰＯＭ１９からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記プロテアーゼ阻害剤がフッ化フェニルメチルスルホニルである、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
非病原性プリオンタンパク質も含む試料中の病原性プリオンタンパク質を検出するための方法において、該非病原性プリオンタンパク質が実質的に消化される条件下で該試料を部位特異的プロテアーゼで処理する工程を含む改良方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本開示は、試料中の病原性プリオンタンパク質を検出するためのアッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
ヒトでは、プリオン病、別名「伝染性海綿状脳症」（ＴＳＥ）には、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群（ＧＳＳ）、致死性家族性不眠症およびクールー病が含まれる（例えば、Ｉｓｓｅｌｂａｃｈｅｒら編（１９９４年）、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，  Ｉｎｃ．；Ｍｅｄｏｒｉら（１９９２年）Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．３２６巻：４４４〜９頁を参照）。動物では、ＴＳＥには、ヒツジスクレーピー、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）、伝染性のミンク脳症、ならびに捕えられたミュールジカおよびヘラジカの慢性消耗病が含まれる（Ｇａｊｄｕｓｅｋ、（１９９０年）、Ｓｕｂａｃｕｔｅ  Ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ  Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｉｅｓ：Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ  Ｃｅｒｅｂｒａｌ  Ａｍｙｌｏｉｄｏｓｅｓ  Ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  Ｕｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  Ｖｉｒｕｓｅｓ、掲載書Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、Ｆｉｅｌｄｓ編、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｌｔｄ．（２２８９〜２３２４頁））。伝染性海綿状脳症は、同じ特質を特徴とする：霊長類、齧歯動物およびトランスジェニックマウスを含む研究用動物に実験的に接種した場合に、疾患を媒介するプリオンタンパク質の異常な（βに富み、プロテイナーゼＫ耐性の）立体構造の存在。
【０００３】
近年、ＢＳＥが急速に拡大し、それがヒトにおけるＴＳＥの発生の増加と関連していることにより、ヒト以外の哺乳動物におけるＴＳＥの検出に対する関心が高まった。これらの疾患の偶然の伝搬の悲劇的な結果（例えば、Ｇａｊｄｕｓｅｋ、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ａｍｙｌｏｉｄｓ，  ａｎｄ  Ｐｒｕｓｉｎｅｒ  Ｐｒｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、Ｆｉｅｌｄｓら編Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｉｎ，  Ｐｕｂ．（１９９６年）；ＢｒｏｗｎらＬａｎｃｅｔ、３４０巻：２４〜２７頁（１９９２年）を参照）、汚染除去の困難（Ａｓｈｅｒら（１９８６年）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓａｆｅｔｙ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ、Ｍｉｌｌｅｒ編（５９〜７１頁）Ａｍ．  Ｓｏｃ．  Ｍｉｃｒｏ．）、およびＢＳＥに対する懸念（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｍｅｄ．  Ｊ．（１９９５年）３１１巻：１４１５〜１４２１頁）は、ＴＳＥを有するヒトおよび動物を特定するであろう診断検査を有することの緊急性の根拠をなす。
【０００４】
プリオンは、細菌、ウイルスおよびウイロイドとはかなり異なる。支配的な仮説は、他のすべての感染性病原体と異なり、感染がプリオンタンパク質の異常な立体構造に起因するというものであり、その立体構造は鋳型として働き、正常なプリオン立体構造を不規則で異常な立体構造に変換する。プリオンタンパク質は、１９８０年代初期に最初に特定された。（例えば、Ｂｏｌｔｏｎ、ＭｃＫｉｎｌｅｙら（１９８２年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２１８巻：１３０９〜１３１１頁；Ｐｒｕｓｉｎｅｒ、Ｂｏｌｔｏｎら（１９８２年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２１巻：６９４２〜６９５０頁；ＭｃＫｉｎｌｅｙ、Ｂｏｌｔｏｎら（１９８３年）Ｃｅｌｌ３５巻：５７〜６２頁を参照）。完全なプリオンタンパク質をコードする遺伝子がその後クローニングされ、配列決定され、トランスジェニック動物で発現された。（例えば、Ｂａｓｌｅｒ、Ｏｅｓｃｈら（１９８６年）Ｃｅｌｌ４６巻：４１７〜４２８頁を参照）。
【０００５】
プリオン病の重要な特徴は、正常な形態のプリオンタンパク質（細胞性または非病原性またはＰｒＰＣ）からの、異常な形状のタンパク質（ＰｒＰＳｃ）の形成である。（例えば、Ｚｈａｎｇら（１９９７年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３６巻（１２号）：３５４３〜３５５３頁；Ｃｏｈｅｎ  ＆  Ｐｒｕｓｉｎｅｒ（１９９８年）Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７巻：７９３〜８１９頁；Ｐａｎら（１９９３年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ９０巻：１０９６２〜１０９６６頁；Ｓａｆａｒら（１９９３年）Ｊ  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２６８巻：２０２７６〜２０２８４頁を参照）。ＰｒＰＣの主にα螺旋に折り畳まれた無病の形態と比較して、ＰｒＰＳｃの実質的なβ−シート構造が、光学分光学および結晶学研究によって明らかにされている。（例えば、Ｗｉｌｌｅら（２００１年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ９９巻：３５６３〜３５６８頁；Ｐｅｒｅｔｚら（１９９７年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．２７３巻：６１４〜６２２頁；Ｃｏｈｅｎ＆Ｐｒｕｓｉｎｅｒ、（１９９９年）５巻：Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、掲載書Ｐｒｉｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｓ．  Ｐｒｕｓｉｎｅｒ編Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ．（１９１〜２２８頁）を参照）。構造上の変化に続いて、生化学的性状の変化が起こるようである：ＰｒＰＣは非変性洗浄剤に溶解性であり、ＰｒＰＳｃは不溶性であり；ＰｒＰＣはプロテアーゼによって容易に消化されるが、ＰｒＰＳｃは部分的に耐性であり、「ＰｒＰｒｅｓ」（Ｂａｌｄｗｉｎら（１９９５年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ２７０巻：１９１９７頁；Ｔａｔｅｉｓｈｉら（２００２年）Ｎａｔｕｒｅ３７６巻：４３４頁）、「ＰｒＰ  ２７−３０」（２７〜３０ｋＤａ）、または「ＰＫ耐性」（プロテイナーゼＫ耐性）形態として知られる、アミノ末端がトランケーションされた断片の形成をもたらす。プロテアーゼ感受性の差は、ＰｒＰＳＣとＰｒＰＣの形態を区別するために用いられてきた。（Ｐｒｕｓｉｎｅｒ（１９９８年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．９５巻：１３３６３頁；Ａｇｕｚｚｉ（２００６年）Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．９７巻：１７２６頁を参照）。５０μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫは３０分でプリオンタンパク質のＰｒＰＣの形態を完全に分解するが、ＰｒＰＳＣの形態は同じ条件の下でプロテアーゼ耐性のコアを維持する。ＰｒＰＳＣのこのプロテアーゼ耐性コアは、残基約８９または９０から残基約２３１のアミノ酸を含む。プロテイナーゼＫにより利用可能であるＰｒＰＳＣの形態のＮ末端領域は、プロテイナーゼＫ処理によって一般的に除去される。ＰｒＰＳＣはプロテアーゼ消化にかなり耐性であるが、プロテイナーゼＫの長期曝露および／または高い濃度は、ＰｒＰＳＣのより完全な消化をもたらす。ＰｒＰＳＣのプロテアーゼ感受性形態が報告されている（Ｓａｆａｒら（１９９８年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．４巻：１１５７頁）。
【０００６】
プリオンタンパク質の病的形態と正常細胞の形態との間の一部の物理的特性の差にもかかわらず、生体対象および生体対象から得られる試料中のプリオンタンパク質の病原性アイソフォームの検出は、困難であることが判明した。これの１つの理由は、一般的に、プリオンペプチドに対して生成される抗体は、変性したＰｒＰＳＣおよびＰｒＰＣの両方を認識するが、感染性の（未変性の）ＰｒＰＳＣを選択的に認識することができないというものである。（例えば、Ｍａｔｓｕｎａｇａら（２００１年）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ４４巻：１１０〜１１８頁を参照）。したがって、対象の死亡前のこれらの伝染性のアミロイドを含有する状態の確定診断および姑息的治療は、実質的に未解決の難題である。脳生検材料の組織病理学的検査は対象にとって危険であり、病変およびアミロイド沈着は、生検試料がどこから採取されるかによって見逃されることがある。また、動物、患者および医療従事者にとっても、生検に伴うリスクがある。さらに、動物の脳検査の結果は、動物が食物供給品に入るまで通常得られない。
【０００７】
それでも、ＴＳＥのためのいくつかの死後の検査が利用可能である（Ｓｏｔｏ，Ｃ．（２００４年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２巻：８０９頁、Ｂｉｆｆｉｇｅｒら（２００２年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．１０１巻：７９頁；Ｓａｆａｒら（２００２年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０巻：１１４７頁、ＳｃｈａｌｌｅｒらＡｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．（１９９９年）９８巻：４３７頁、Ｌａｎｅら（２００３年）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４９巻：１７７４頁を参照）。しかし、これらのすべては脳組織試料を利用し、死後の検査として適するだけである。これらの多くは試料のプロテイナーゼＫ処理も必要とし、それは時間がかかることがあり、ＰｒＰＣの不完全な消化は偽陽性結果に至ることがあり、また、ＰＫ感受性ＰｒＰＳｃの消化は偽陰性結果を生じることがある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、様々な試料、例えば生体対象から得られる試料、血液供給品、畜産動物、ならびに他のヒトおよび動物用の供給食品中の病原性プリオンタンパク質の存在を検出するための組成物および方法が依然として必要とされている。本開示は、これらならびに他の重要な目的を対象とする。
【０００９】
本開示は、最近報告された、プリオンタンパク質の存在を検出するための方法の改良方法に関する。これらの検出方法は、本明細書、および共同所有される出願、２００４年８月１３日に出願の米国特許出願第１０／９１７，６４６号；２００５年２月１１日に出願の米国特許出願第１１／０５６，９５０号；２００６年９月８日に出願の米国特許出願第１１／５１８，０９１号；および、２００６年１月１３日に出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００１４３３号に記載され、これらの出願のすべては参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。これらの検出方法は、とりわけ、（例えば、ヒトまたはヒト以外の動物対象の）プリオン関連疾患を診断するための方法、実質的にＰｒＰＳｃを含まない血液供給品、血液製品供給品または食物供給品を確保するための方法、移植のための器官および組織の試料を分析するための方法、手術道具および機器の汚染除去をモニタリングするための方法に関連して、ならびに、病原性プリオンの有無についての知識が重要である任意の他の状況で用いることができる。これらの検出方法は、プリオン特異的試薬と病原性プリオンアイソフォームとの優先相互作用を利用する。一般に、プリオン特異的試薬は、米国特許出願第１０／９１７，６４６号および米国特許出願第１１／０５６，９５０号に記載のペプチド試薬、米国特許出願第１１／５１８，０９１号および国際公開第２００７／０３０８０４号に記載のペプトイド試薬、または、国際公開第０３／０８５０８６号、国際公開第０３／０７３１０６号もしくは国際公開第０２／０９７４４４号に様々に記載の他の試薬であってもよくプリオンタンパク質の病原性型に特異的に結合させるために使用され、結果として、試料中に存在し得るプリオンタンパク質の非病原性型のほとんどまたはすべてを含む残りの試料から分離することができる複合体が得られる。プリオンタンパク質の非病原性型のすべてが除去されると、プリオンタンパク質の残りの病原性型を検出することができ、例えば、プリオンタンパク質の病原性型をプリオン特異的試薬との複合体から解離させ、変性させ、変性プリオンタンパク質に対する抗体を用いて検出することができる。この方法の特異性は、病原性プリオン型を非病原性プリオン型から分離する能力を利用する。一般的に、ＰｒＰＳＣ−プリオン特異的試薬複合体の単純な洗浄（米国特許出願第１０／９１７，６４６号；米国特許出願第１１／０５６，９５０号、米国特許出願第１１／５１８，０９１号および国際公開第２００７／０３０８０４号に記載）は、任意の非病原性プリオンタンパク質を除去するのに十分である。しかし、本発明者らは、試料、特に血液試料のわずかな割合が、単純な洗浄によって不完全に除去され得る非常に高いレベルの非病原性プリオンタンパク質を含むことを発見した。このように非病原性プリオンタンパク質の除去が不完全であると、シグナルのバックグラウンドレベルが高くなり、偽陽性の結果が得られるか、真の陽性シグナルを不明確にする可能性がある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（要旨）
本発明は、以前に報告された、ＰｒＰＣのレベルが異常に高いためにこのわずかな割合の試料で発生するバックグラウンドシグナルを減少させる検出方法の改良方法を提供する。本発明者らは、本明細書でさらに記載のように、部位特異的プロテアーゼで複合体を処理する工程を追加することが、病原性プリオンタンパク質からのシグナルにあまり影響を及ぼすことなく、単純な洗浄によって不完全に除去され得る非病原性プリオンタンパク質によるバックグラウンドシグナルレベルを減少させることを見出した。
【００１１】
したがって、本明細書において、試料中の病原性プリオンの存在を検出する方法が提供され、これは（ａ）存在する場合には病原性プリオンと病原性プリオン特異的試薬の結合を可能にする条件下で、この試料をこの試薬と接触させて第１の複合体を形成する工程、（ｂ）非病原性プリオンタンパク質が部位特異的プロテアーゼによって実質的に消化される条件下で、第１の複合体をこのプロテアーゼと接触させる工程、（ｃ）前記消化された非病原性プリオンおよび任意の未結合の試料を第１の複合体から除去する工程、（ｄ）病原性プリオンを第１の複合体から解離させることにより、解離した病原性プリオンを得る工程、（ｅ）病原性プリオンと抗プリオン抗体の結合を可能にする条件下で、解離した病原性プリオンを第１の抗プリオン抗体と接触させて第２の複合体を形成する工程、および（ｆ）病原性プリオンの存在を示す、第２の複合体の形成を検出する工程による。本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、病原性プリオン特異的試薬は、好ましくは、ペプチド試薬（米国特許出願第１０／９１７，６４６号および同１１／０５６，９５０号に記載）またはペプトイド試薬（米国特許出願第１１／５１８，０９１号に記載）である。
【００１２】
ある実施形態では、この方法は、第２の（任意選択で検出可能に標識された）抗プリオン抗体を用いて第２の複合体を検出することをさらに含む。
【００１３】
本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、非特異的に結合した非病原性プリオンは、第１の複合体を部位特異的プロテアーゼで処理することによって除去することができる。部位特異的プロテアーゼは、好ましくは、オクタリピート領域内の部位でプリオンタンパク質を切断しないものである。ある実施形態では、非病原性プリオンタンパク質を第１の複合体から除去するために使用されるプロテアーゼは、トリプシンまたはＳＶ−８を含む。非病原性プリオンが部位特異的プロテアーゼによって実質的に消化されると、プロテアーゼが除去、不活性化または阻害されることにより、さらなるプロテアーゼ消化（例えば、他のタンパク質成分の消化）が妨害される。一般的に、プロテアーゼ活性は、第１の複合体の追加の洗浄、および／またはプロテアーゼ阻害剤の添加、または当技術分野で公知である他の方法によって除去、不活性化または阻害することができる。
【００１４】
ある実施形態では、病原性プリオンを第１の複合体から解離させる工程は、複合体を高ｐＨまたは低ｐＨに曝露し、任意選択で、前記解離の後に前記高ｐＨまたは前記低ｐＨを中和することによって実施される。解離した病原性プリオンは、変性させることもできる。
【００１５】
ある実施形態では、病原性プリオン特異的試薬および／または第１の抗プリオン抗体は、固体支持体に結合される。ある実施形態では、病原性プリオン特異的試薬は磁気ビーズに結合され、および／または、第１の抗プリオン抗体はマイクロタイタープレートに結合される。
【００１６】
したがって、一実施形態では、本発明は、病原性および非病原性のプリオンを含有する疑いのある試料中の病原性プリオンの存在を検出するための方法であって、
（ａ）前記試料を病原性プリオン特異的試薬と、存在する場合には、前記試薬の前記病原性プリオンへの結合を可能にする条件下で接触させて、第１の複合体を形成する工程、
（ｂ）前記非病原性プリオンが部位特異的プロテアーゼによって実質的に消化される条件下で、前記第１の複合体を前記プロテアーゼと接触させる工程、
（ｃ）前記部位特異的プロテアーゼによるさらなる切断を妨害する工程、
（ｄ）前記第１の複合体を任意の未結合の試料および切断された非病原性プリオンから分離する工程、
（ｅ）前記病原性プリオンを前記第１の複合体から解離させることにより、解離した病原性プリオンを得る工程、
（ｆ）前記病原性プリオンと第１の抗プリオン抗体の結合を可能にする条件下で、前記解離された病原性プリオンを第１の抗プリオン抗体と接触させて第２の複合体を形成する工程、および
（ｇ）前記第２の複合体を、任意選択で標識された第２の抗プリオン抗体と接触させることにより、前記第２の複合体の形成を検出する工程
を含み、
前記第１の抗プリオン抗体は、前記プリオンタンパク質中の第１のエピトープを認識し、前記第２の抗プリオン抗体は前記プリオンタンパク質中の第２のエピトープを認識し、前記第１のエピトープと前記第２のエピトープは、同一ではなく、部位特異的プロテアーゼの少なくとも１つの切断部位によって分離され、前記部位特異的プロテアーゼの前記少なくとも１つの切断部位は、前記プリオンタンパク質のプロテイナーゼＫ耐性コア領域に位置する、方法を提供する。
【００１７】
さらに、本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、試料は、生体試料、すなわち、生きている生物または死後の生物から得られるかまたはそれらに由来する試料、例えば臓器、全血、血液分画、血液成分、血漿、血小板、血清、脳脊髄液（ＣＳＦ）、脳組織、神経系組織、筋肉組織、骨髄、尿、涙、非神経系組織、臓器および／または生検材料もしくは剖検材料であってもよい。好ましい実施形態では、生体試料は血液、血液分画または血液成分を含む。試料は、非生体試料であってもよい。
【００１８】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載の検出方法のいずれかによって、対象由来の生体試料中の病原性プリオンの存在を検出することにより、前記対象のプリオン関連疾患を診断する方法を提供する。
【００１９】
別の態様では、試料中の病原性プリオンの存在を検出するための様々なキットが提供され、このキットは、病原性プリオンと優先的に相互作用する１つまたは複数の試薬（すなわち、病原性プリオン特異的試薬）、および／またはこれらの試薬の１つまたは複数、抗プリオン抗体および他の必要な試薬、ならびに任意選択で陽性および陰性の対照を含む固体支持体のいずれかを含む。ある実施形態では、キットは、適切な部位特異的プロテアーゼ、および任意選択でプロテアーゼ阻害剤も含む。
【００２０】
これらの実施形態および他の実施形態は、本明細書の開示に照らして、当分野の技術者ならば容易に思いつく。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ＰｒＰＳＣを含む血漿試料のＥＬＩＳＡの結果（ＲＬＵ）を示すグラフである。トリプシンで処理した試料は、濃い灰色（右の棒）で示している。トリプシンで処理していない試料は、薄い灰色（左の棒）で示している。
【図２】本発明の改善した方法の模式図である。単線は、プリオンタンパク質を表し、巻線部分は、ＰｒＰＳＣのプロテアーゼ耐性コアを表し、波状部分は、ＰｒＰＣおよびイソ型ＰｒＰＳＣの多数のαへリックス部分を表している。長方形は、抗プリオン抗体によって認識されるエピトープ領域を表し、三角形は、プロテアーゼ切断部位を表している。
【図３Ａ】オクタリピート領域（二重下線）、プロテイナーゼ耐性コア領域（カッコ）、および潜在トリプシンプロテアーゼ切断部位（下線、太字）を表している数種のプリオンタンパク質の配列アラインメントを示す図である。トリプシンは、切断部位を隠すＰｒｏがカルボキシル側に近接している場合を除き、ＬｙｓおよびＡｒｇ残基のカルボキシル側で切断する。
【図３Ｂ】オクタリピート領域（二重下線）、プロテイナーゼ耐性コア領域（カッコ）、および潜在トリプシンプロテアーゼ切断部位（下線、太字）を表している数種のプリオンタンパク質の配列アラインメントを示す図である。トリプシンは、切断部位を隠すＰｒｏがカルボキシル側に近接している場合を除き、ＬｙｓおよびＡｒｇ残基のカルボキシル側で切断する。
【図４Ａ】オクタリピート領域（二重下線）、プロテイナーゼ耐性コア領域（カッコ）、および潜在ＳＶ−８プロテアーゼ切断部位（下線、太字）を表している数種のプリオンタンパク質の配列アラインメントを示すである。ＳＶ−８は、ＧｌｕおよびＡｓｐ残基を切断する。
【図４Ｂ】オクタリピート領域（二重下線）、プロテイナーゼ耐性コア領域（カッコ）、および潜在ＳＶ−８プロテアーゼ切断部位（下線、太字）を表している数種のプリオンタンパク質の配列アラインメントを示すである。ＳＶ−８は、ＧｌｕおよびＡｓｐ残基を切断する。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
（詳細な説明）
本発明の実施は、他に規定がない限り、当技術分野内の化学、生化学、分子生物学、免疫学、および薬理学の通常の方法を用いる。そのような技術は、文献で十分に説明されている。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版（Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０年）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．  ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．  Ｋａｐｌａｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．）；およびＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．  ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６年、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９年）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｂｉｒｄｉ，  Ｋ．Ｓ．編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９７７年）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４版（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９９年、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：  Ａｎ  Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ（Ｒｅａｍら編、１９９８年、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）；ＰＣＲ（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｓｅｒｉｅｓ）、第２版（Ｎｅｗｔｏｎ  ＆  Ｇｒａｈａｍ編、１９９７年、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ）；ＰｅｔｅｒｓおよびＤａｌｒｙｍｐｌｅ、Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（第２版）、Ｆｉｅｌｄｓら（編）、Ｂ．Ｎ．  Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹを参照されたい。
【００２３】
本明細書に引用されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、全体として参照により本明細書に組み込まれている。
【００２４】
定義
以下の選んだ用語は、本明細書に用いられる文脈において考察される。用語の複数形および単数形の両方が、考察される形に関わらず、含まれる。
【００２５】
「プリオン」、「プリオンタンパク質」、「ＰｒＰタンパク質」、および「ＰｒＰ」は、病原性プリオンタンパク質型（スクレイピータンパク質、病原性タンパク質型、病原性アイソフォーム、病原性プリオン、およびＰｒＰＳＣとも呼ばれる）および非病原性プリオン型（細胞タンパク質型、細胞アイソフォーム、非病原性アイソフォーム、非病原性プリオンタンパク質、およびＰｒＰＣとも呼ばれる）の両方、加えて、病原性立体構造も正常な細胞立体構造のいずれも有していない可能性があるプリオンタンパク質の変性型および様々な組換え型を示すために交換可能に用いられる。
【００２６】
用語「プリオン」、「プリオンタンパク質」、「ＰｒＰタンパク質」、「ＰｒＰ」、または「コンフォメーション病タンパク質」の使用は、本明細書に記載されたものと全く同一の配列を有するポリペプチドに限定されることを意図されない。その用語が、同定された、または同定されていない種（例えば、ヒト、ウシ）または疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病など）のいずれの由来のコンフォメーション病タンパク質も含むことは容易に明らかである。全体として参照により本明細書に組み込まれている、共同所有する米国特許出願公開第２００５／０１１８６４５号および第２００６／００３５２４２号、ならびに国際公開第０６／０７６６８７号も参照されたい。本開示および当技術分野の教示を鑑みれば、当業者は、例えば、配列比較プログラム（例えば、基本的局所整列検索ツール（ＢＬＡＳＴ））または構造特性もしくはモチーフの同定および整列を用いて、任意の他のプリオンタンパク質において、本明細書に開示された配列に対応する領域を決定することができる。
【００２７】
「病原性」とは、そのタンパク質が実際に疾患を引き起こす、またはそのタンパク質が疾患に関連しており、それゆえに、疾患が存在する場合、そのタンパク質が存在することを意味する。したがって、本明細書における病原性タンパク質は、必ずしも、疾患の特定の原因物質であるタンパク質とは限らない。タンパク質の病原性型は、感染性であっても感染性でなくてもよい。病原性コンフォメーション病タンパク質の例はＰｒＰＳｃである。したがって、用語「非病原性」は、通常、疾患を引き起こさない、または疾患を引き起こすことに、通常、関連していないタンパク質を記載する。非病原性コンフォメーション病タンパク質の例はＰｒＰＣである。
【００２８】
タンパク質、例えば、タンパク質断片と相互作用する試薬（例えば、ペプチドまたはペプトイド）に関する「相互作用する」とは、試薬が、プリオンタンパク質に、特異的に、非特異的に、または特異的結合および非特異的結合のいくらかの組合せで、結合することを意味する。試薬は、それが、非病原性アイソフォームに対してより病原性型により高い親和性および／またはより高い特異性で結合する場合には、病原性プリオンタンパク質と「優先的に相互作用する」と言われる。したがって、病原性プリオンタンパク質と優先的に相互作用する試薬はまた、「病原性プリオン特異的試薬」と本明細書で呼ばれる。いくつかの実施形態では、親和性および／または特異性の増大は、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約５００倍、または少なくとも約１０００倍である。優先的な相互作用は、必ずしも、各ペプチドの特定のアミノ酸、またはアミノ酸置換残基および／もしくはモチーフの間での相互作用を必要としない。例えば、いくつかの実施形態では、試薬は、病原性アイソフォームと優先的に相互作用するが、それでもなお、非病原性アイソフォームを、弱いがまだ検出可能なレベル（例えば、対象となるポリペプチドに対して示される結合の１０％以下）で結合する能力を有することができる。典型的には、弱い結合またはバックグラウンド結合は、例えば、適切な対照を用いて、対象となる化合物またはポリペプチドとの優先的相互作用から容易に識別可能である。一般的に、本明細書に記載の検出方法に用いられる試薬は、１０６倍過剰量の非病原性型の存在下で病原性プリオンを結合する。プリオンタンパク質の病原性型と優先的に相互作用するペプチド試薬およびペプトイド試薬は、米国特許出願第１０／９１７，６４６号；米国特許出願第１１／０５６，９５０号、米国特許出願第１１／５１８，０９１号、およびＷＯ２００７／０３０８０４に詳細に記載されている。
【００２９】
コンフォメーション病タンパク質と相互作用する試薬に関する「親和性」または「結合親和性」とは、結合の強さを示し、解離定数（Ｋｄ）として定量的に表現することができる。結合親和性は、当業者によく知られた技術を用いて決定することができる。
【００３０】
「プリオン関連疾患」は、病原性プリオンタンパク質（例えば、ＰｒＰＳｃ）によって全部または一部、引き起こされる疾患、例えば、非限定的ではあるが、スクレイピー、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）、狂牛病、ネコ海綿状脳症、クールー、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、新変異型クロイツフェルト・ヤコブ病（ｎｖＣＪＤ）、慢性消耗病（ＣＷＤ）、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病（ＧＳＳ）、および致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）がある。
【００３１】
用語「変性させる」または「変性した」は、タンパク質構造に適用される場合の通常の意味をもち、タンパク質がその天然の二次および三次構造を失っていることを意味する。病原性プリオンタンパク質に関して、「変性した」病原性プリオンタンパク質はもはや、天然の病原性立体構造を保持せず、したがって、そのタンパク質はもはや、「病原性」ではない。変性した病原性プリオンタンパク質は、変性した非病原性プリオンタンパク質と類似した、または同一の立体構造を有する。しかし、本明細書において明快さを期するために、用語「変性した病原性プリオンタンパク質」とは、病原性アイソフォームとして試薬によって捕捉され、かつその後、変性している病原性プリオンタンパク質を示すように用いるものとする。
【００３２】
「生理的関連ｐＨ」とは、約５．５〜約８．５；または約６．０〜約８．０；または通常には、約６．５〜約７．５のｐＨを示す。
【００３３】
「ペプチド」は、一般的に、天然に存在するまたは合成の、アミノ酸またはアミノ酸様分子のポリマーを含む任意の化合物を示すように用いられ、それらには、それだけに限らないが、アミノ分子および／またはイミノ分子だけを含む化合物が挙げられる。用語「ペプチド」は、「オリゴペプチド」および「ポリペプチド」と交換可能に用いられる。これらの用語を用いてどの特定のサイズも意味することはない。その定義内には、例えば、天然および非天然（例えば、合成）の両方の、１個または複数のアミノ酸の類似体（例えば、非天然アミノ酸などが挙げられる）を含むペプチド、結合の置換および当技術分野において知られた他の改変を有するペプチドが含まれる。したがって、合成ペプチド、二量体、多量体（例えば、タンデムリピート、多重抗原ペプチド（ＭＡＰ）型、直線連結型ペプチド）、環化分子、分岐分子などがその定義内に含まれる。
【００３４】
「ペプトイド」は、一般的に、少なくとも１個、好ましくは２個以上の、アミノ酸代替物、好ましくはＮ−置換グリシンを含むペプチドミミックを示すように用いられる。ペプトイドは、とりわけ、米国特許第５，８１１，３８７号に記載されている。
【００３５】
用語「標識」、「標識された」、「検出可能な標識」、および「検出可能に標識された」とは、検出できる分子を示し、それらには、それだけに限らないが、放射性同位元素、蛍光剤、発光剤、化学発光剤、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤、発色団、色素、金属イオン、金属ゾル、リガンド（例えば、ビオチンまたはハプテン）、蛍光ナノ粒子、金ナノ粒子などが挙げられる。用語「蛍光剤」は、フルオロフォアなどの検出可能な範囲で蛍光を示す能力がある物質またはその部分を示す。用いることができる標識の具体的な例には、それだけに限らないが、フルオレセイン、ローダミン、ダンシル、ウンベリフェロン、テキサスレッド、ルミノール、アクリジニウムエステル、ＮＡＤＰＨ、β−ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびウレアーゼが挙げられる。標識は、エピトープタグ（例えば、Ｈｉｓ−Ｈｉｓタグ）、抗体、または増幅可能な、そうでなければ検出可能なオリゴヌクレオチドでもよい。
【００３６】
「病原性プリオン特異的試薬」または「ＰＳＲ」とは、ＰＳＲが非病原性プリオン型に対してよりも病原性プリオン型により高い親和性および／またはより高い特異性で結合することを意味する、病原性プリオンタンパク質と優先的に相互作用する試薬、一般的にはペプチドまたはペプトイドを示す。ＰＳＲは、米国特許出願第１０／９１７，６４６号；第１１／０５６，９５０号；および第１１／５１８，０９１号で十分に記載の他の追加の物理的特性を有する。本発明の方法に関連して用いる好ましいＰＳＲには、上記の参照出願に記載されたもの、特に、配列番号１２〜１３２、特に、２００４年８月１３日に出願されたＵＳ１０／９１７，６４６（その開示は、参照により本明細書に組み込まれている）の配列番号６６、６７、６８、７２、８１、９６、９７、９８、１０７、１０８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１４、３５、３６、３７、４０、５０、５１、７７、８９、１００、１０１、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、５６、５７、６５、８２、または８４を含む、またはそれらに由来するペプチド試薬、および２００６年９月８日に出願された米国特許出願第１１／５１８，０９１号（その開示は、参照により本明細書に組み込まれている）の配列番号２３０、２３７、２３８、２３９、もしくは２４０、または化合物Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩａ、ＸＩｂ、ＸＩＩａ、ＸＩＩｂ、もしくはＸＩＩＩを含む、またはそれらに由来するペプトイド試薬が挙げられる。
【００３７】
「部位特異的プロテアーゼ」とは、タンパク質において１つの型または少数の異なるアミノ酸残基でペプチド結合を切断する酵素（プロテアーゼ）を示す。例えば、トリプシンは、Ｌｙｓ残基およびＡｒｇ残基のみで切断する部位特異的プロテアーゼである。部位特異的プロテアーゼは、（すべての脂肪族、芳香族、および疎水性残基で切断する）プロテイナーゼＫおよび（カルボキシ末端から始めて、順次、すべての残基を切断する）カルボキシペプチダーゼＹのような非特異的プロテアーゼとは区別される。
【００３８】
「実質的に消化された」とは、タンパク質が、すべての利用可能なプロテアーゼ切断部位の少なくとも９０％、好ましくは９９％においてプロテアーゼに切断されていることを意味する。「利用可能なプロテアーゼ切断部位」とは、プロテアーゼによって切断部位として認識されるアミノ酸配列を有し、かつタンパク質の立体構造においてプロテアーゼと接触することができる部位を意図される。例として、プリオンタンパク質のプロテイナーゼＫ耐性コア内に存在するプロテアーゼ切断部位は、一般的に、プリオンタンパク質がＰｒＰＳＣ立体構造であるとき、プロテアーゼ消化に利用できない。
【００３９】
「オクタリピート領域」とは、これまで同定されたすべての種由来の成熟プリオンタンパク質のＮ末端の近くで見出される反復配列領域を示す。オクタリピートは、一般的に、ＧＱＰＨＧＧ（Ｇ／Ｓ）（−／Ｇ）Ｗ（配列番号１１）として通常、書かれる８個（または９個）のアミノ酸配列の３つ〜５つの間、通常４つのコピーを含む。この配列は、高度に保存されており（この配列はリピートの一部においてわずかに異なる場合があるが）、一般的に、約５８〜９１位残基内に存在する。オクタリピート領域は、通常、プロテイナーゼＫ耐性コア領域に隣接し、かつそのＮ末端側に近接している。
【００４０】
プリオンタンパク質の「プロテイナーゼＫ耐性コア」（時々、「プロテアーゼ耐性コア」と呼ばれる）は、ＰｒＰＣ型におけるプリオンタンパク質を実質的に消化するのに十分である条件下でのＰｒＰＳＣのプロテイナーゼＫへの曝露後、残存するＰｒＰＳＣ立体構造におけるプリオンタンパク質の領域によって定義される。一般的に、プリオンタンパク質のほとんどの種について、プロテイナーゼＫ耐性コア領域は、およそアミノ酸９０位からおよそアミノ酸２３１位までの領域を含む。図３および図４は、１０個の異なる種由来のプリオンタンパク質の整列を示し、それらの図中、囲まれた領域は、プロテイナーゼＫ耐性領域を示す。
【００４１】
「プリオン結合性試薬」は、ある立体構造におけるプリオンタンパク質に結合する試薬であり、例えば、プリオン結合性試薬は、１つまたは複数の変性型プリオンタンパク質、ＰｒＰＣ型（非病原性アイソフォーム）またはＰｒＰＳＣ（病原性アイソフォーム）に結合することができる。いくつかのそのようなプリオン結合性試薬は、これらのプリオンタンパク質型のうちの１つより多くに結合する。したがって、プリオン結合性試薬には、それだけに限らないが、病原性プリオンと優先的に相互作用するＰＳＲが挙げられる。プリオン結合性試薬は、いかなる型であってもプリオンに特異的に結合する。プリオン結合性試薬は記載されており、例えば、抗プリオン抗体（とりわけ、Ｐｅｒｅｔｚら、１９９７年、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２７３巻、６１４頁；Ｐｅｒｅｔｚら、２００１年、Ｎａｔｕｒｅ、４１２巻、７３９頁；Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎら、１９９８年、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、７２巻、９４１３頁；Ｐｏｌｙｍｅｎｉｄｏｕら、Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ、２００５年、４巻、８０５頁；米国特許第４，８０６，６２７号；米国特許第６，７６５，０８８号；および米国特許第６，５３７５４８号に記載されている）、モチーフグラフト化ハイブリッドポリペプチド（ＷＯ０３／０８５０８６参照）、特定の陽イオン性または陰イオン性ポリマー（ＷＯ０３／０７３１０６参照）、「伝播触媒」である特定のペプチド（ＷＯ０２／０９７４４４参照）、プリオン特異的ペプチド試薬（例えば、ＷＯ２００６／０７６６８７およびＵＳ２００６００３５２４２参照）、およびプラスミノーゲンを含む。プリオン結合性試薬を利用する方法のすべてにおいて、好ましいプリオン結合性試薬は抗プリオン抗体である。
【００４２】
「エピトープ」は、特定のＢ細胞および／またはＴ細胞が応答する抗原上の部位であり、そのようなエピトープを含む分子に免疫学的反応を誘発する能力、または生体試料中に存在する抗体と反応する能力を与える。その用語はまた、「抗原決定基」または「抗原決定部位」と交換可能に用いられる。エピトープは、３個以上のアミノ酸をそのエピトープに固有の空間的立体構造で含むことができる。一般的に、エピトープは、少なくとも５個のそのようなアミノ酸からなり、より通常には、少なくとも８〜１０個のそのようなアミノ酸からなる。アミノ酸の空間的立体構造を決定する方法は当技術分野において知られており、それらには、例えば、Ｘ線結晶学および二次元核磁気共鳴が挙げられる。さらに、所定のタンパク質におけるエピトープの同定は、疎水性研究の利用による、および部位特異的血清学によるなど、当技術分野においてよく知られた技術を用いて容易に達成される。Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ（１９８４年）８１巻、３９９８〜４００２頁（所定の抗原において免疫原性エピトープの位置を決定するためにペプチドを迅速に合成する一般的な方法）；米国特許第４，７０８，８７１号（抗原のエピトープを同定し、かつ化学的に合成するための方法）；およびＧｅｙｓｅｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９８６年）２３巻、７０９〜７１５頁（所定の抗体に対して高親和性を有するペプチドを同定するための技術）も参照されたい。同じエピトープを認識する抗体は、別の抗体と標的抗原の結合をブロックする抗体の能力を示す、単純なイムノアッセイにおいて同定することができる。
【００４３】
全体的概観
病原性プリオンタンパク質と優先的に相互作用する試薬（ペプチドおよびペプトイド）の発見は、何桁も多いＰｒＰＣを含む生体試料におけるＰｒＰＳＣの検出を可能にした。米国特許出願公開第２００５／０１１８６４５号および第２００６／００３５２４２号；国際公開第０６／０７６６８７号参照。記載された方法は、試料を前処理するためのプロテイナーゼＫの使用を必要としない。これらの刊行物に記載されているように、１つのそのような検出アッセイは、病原性プリオン特異的試薬でコーティングされた磁気ビーズを使用すること、ならびに試薬含有ビーズと病原性型の結合を可能にする条件下で、ＰｒＰＣおよびＰｒＰＳＣを含有する疑いのある試料とビーズを接触させて、複合体を形成することを含む。ＰｒＰＳＣを捕捉および洗浄した後、典型的には、高ｐＨまたは低ｐＨへの曝露による変性によって、ＰｒＰＳＣをビーズから解離させ、中和し、単純なＥＬＩＳＡにより、または好ましくは、サンドイッチＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）により検出する。このプロトコールは、プリオン疾患で死亡したことが知られているヒト由来の１０％脳ホモジネートの１００万倍希釈で添加（ｓｐｉｋｅ）されたヒト血漿試料においてＰｒＰＳＣを検出する。
【００４４】
しかし、本発明者らは、ＰｒＰＣが試薬コーティングビーズに非特異的に結合することができ、ビーズから完全に除去されない場合には、これらの方法を用いるＰｒＰＳＣの検出に干渉する可能性があることを見出した。典型的には、非特異的に結合したＰｒＰＣは、単純な洗浄によってビーズから除去することができる。しかし、本発明者らはまた、ＰｒＰＣの量が、当然ながら、異なる試料間で大きく異なり、かなりの量で存在する場合、単純な洗浄（または繰り返し洗浄）によって除去されない可能性があり、偽陽性結果を示すことにより、または高バックグラウンドのために真の陽性シグナルをマスクすることにより、ＰｒＰＳｃの検出に干渉することができることも見出している。
【００４５】
したがって、本明細書に記載された方法は、ＰｒＰＳＣのＥＬＩＳＡ検出の前に非特異的に結合したＰｒＰＣを除去することにより病原性プリオン特異的試薬で捕捉されたＰｒＰＳＣの検出の特異性を増大することができる向上に関する。好ましい実施形態では、（非特異的に結合したＰｒＰＣも含む可能性がある）病原性プリオン特異的試薬−ＰｒＰＳＣ複合体を、オクタリピート領域内では切断しないが、（ＰｒＰＳＣ型におけるＰＫ耐性コアに対応する）９０〜２３１残基領域内でＰｒＰＣを切断する部位特異的プロテアーゼで処理することにより、ＰｒＰＣを除去する。ＰｒＰＳＣアイソフォームが、ＰＫ耐性コア領域内（なぜなら、その領域におけるＰｒＰＳＣ構造が潜在的切断部位を利用できないようにさせているため）、オクタリピート領域内、またはこれらの２つの領域間でプロテアーゼにより切断されないように、部位特異的プロテアーゼは選択される。部位特異的プロテアーゼでの処理後、オクタリピートにおけるエピトープを認識するものと、ＰＫ耐性コア領域内においてＰＫ耐性コア領域における部位特異的プロテアーゼについての少なくとも１つの認識部位の後にある（すなわち、そのカルボキシ末端側に近接している）エピトープを認識するものである、２つの異なる抗プリオン抗体を用いるサンドイッチＥＬＩＳＡ技術でＰｒＰＳＣを検出することができる。図２は、プリオンアイソフォームにおける部位特異的プロテアーゼについての利用可能（白色三角形）および利用不可能（縞模様の三角形）の両方の潜在的切断部位の関係、ＥＬＩＳＡに用いられる抗プリオン抗体により認識されるエピトープ（四角形）、ＰｒＰＳＣのプロテイナーゼ耐性コア領域（コイル状線）、α−ヘリックス領域（波線）、ならびにオクタリピート配列（実線バー）を示す概略図を提供する。
【００４６】
したがって、本明細書に記載の方法は、ＥＬＩＳＡ技術と組み合わされた、病原性プリオン型と優先的に相互作用するペプチド試薬およびペプトイド試薬を用いる、試料における病原性プリオンの検出の向上を可能にする。
【００４７】
このように、本発明は、病原性および非病原性のプリオンを含むと疑われる試料中の病原性プリオンの存在を検出するための方法であって、
（ａ）存在する場合には前記病原性プリオンと病原性プリオン特異的試薬の結合を可能にする条件下で、前記試料を前記試薬と接触させて第１の複合体を形成する工程、
（ｂ）前記非病原性プリオンが部位特異的プロテアーゼによって実質的に消化される条件下で、前記第１の複合体を前記プロテアーゼと接触させる工程、
（ｃ）前記部位特異的プロテアーゼによるさらなる切断を妨害する工程、
（ｄ）前記第１の複合体を、任意の未結合の試料および消化された非病原性プリオンから分離する工程、
（ｅ）前記病原性プリオンを前記第１の複合体から解離させることにより、解離した病原性プリオンを得る工程、
（ｆ）前記病原性プリオンと第１の抗プリオン抗体の結合を可能にする条件下で、前記解離した病原性プリオンを前記第１の抗プリオン抗体と接触させて第２の複合体を形成する工程、および
（ｇ）前記第２の複合体を、任意選択で標識された第２の抗プリオン抗体と接触させることにより、前記第２の複合体の形成を検出する工程
を含み、
前記第１の抗プリオン抗体は、前記プリオンタンパク質中の第１のエピトープを認識し、前記第２の抗プリオン抗体は、前記プリオンタンパク質中の第２のエピトープを認識し、前記第１のエピトープと前記第２のエピトープは、同一ではなく、前記部位特異的プロテアーゼの少なくとも１つの切断部位によって分離され、前記部位特異的プロテアーゼにに対する前記少なくとも１つの切断部位は、前記プリオンタンパク質のプロテイナーゼＫ耐性コア領域内に位置する、方法を提供する。
【００４８】
病原性プリオン特異的試薬
本明細書に記載のアッセイは、病原性プリオン型と優先的に相互作用する試薬を利用する。特に好ましい実施形態では、病原性プリオン特異的試薬は、米国特許出願公開第２００５／０１１８６４５号および第２００６／００３５２４２号；ならびにＰＣＴ／ＵＳ２００６／０３５２２６（ＷＯ２００７／０３０８０４）に記載されているような、ペプチド試薬またはペプトイド試薬である。本発明の方法に関連して用いる好ましいＰＳＲには、上記の参照出願に記載されたもの、特に、配列番号１２〜１３２、特に、２００４年８月１３日に出願されたＵＳ１０／９１７，６４６（その開示は、参照により本明細書に組み込まれている）の配列番号６６、６７、６８、７２、８１、９６、９７、９８、１０７、１０８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１４、３５、３６、３７、４０、５０、５１、７７、８９、１００、１０１、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、５６、５７、６５、８２、または８４を含む、またはそれらに由来するペプチド試薬、および２００６年９月８日に出願された米国特許出願第１１／５１８，０９１号（その開示は、参照により本明細書に組み込まれている）の配列番号２３０、２３７、２３８、２３９、もしくは２４０、または化合物Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩａ、ＸＩｂ、ＸＩＩａ、ＸＩＩｂ、もしくはＸＩＩＩを含む、またはそれらに由来するペプトイド試薬が挙げられる。
【００４９】
本明細書に記載の方法に用いられる病原性プリオン特異的試薬は、好ましくは、固体支持体に付着している。これらの試薬は、試料に接触させる前に、固体支持体上に供給することができ、または病原性プリオン特異的試薬は、試料に接触させ、その中のいかなる病原性プリオンにも結合させた後の、（例えば、ビオチン化試薬、およびアビジンまたはストレプトアビジンを含む固体支持体を用いることによる）固体支持体への結合に適応することができる。
【００５０】
適切な固体支持体には、不溶性マトリックスであり、病原性プリオン特異試薬を連結または結び付けできる、剛直または半剛直な表面を有する任意の材料が含まれる。例示的な固体支持体には、それだけに限らないが、ニトロセルロース、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリスチレン、ラテックス、ポリカーボネート、ナイロン、デキストラン、キチン、砂、シリカ、軽石、アガロース、セルロース、ガラス、金属、ポリアクリルアミド、シリコン、ゴム、多糖類、ポリフッ化ビニル；ジアゾ紙；活性化ビーズ、磁気応答ビーズ、ならびに固相合成、親和性分離、精製、ハイブリッド形成反応、免疫アッセイおよび他のそのような応用に汎用される任意の材料が挙げられる。該支持体は、粒状でもよく、または連続表面の形態を採ってもよく、それには膜、メッシュ、板、ペレット、スライド、円板、キャピラリー、中空繊維、針、ピン、チップ、中実繊維、ゲル（例えば、シリカゲル）およびビーズ（例えば、多孔ガラスビーズ、シリカゲル、場合によりジビニルベンゼンで架橋したポリスチレンビーズ、グラフト化コポリビーズ、ポリアクリルアミドビーズ、ラテックスビーズ、場合によりＮ−Ｎ’−ビス−アクリロイルエチレンジアミンで架橋したジメチルアクリルアミドビーズ、酸化鉄磁気ビーズ、ならびに疎水性ポリマーをコートしたガラス粒子などの基質が挙げられる。好ましい実施形態では、病原性プリオン特異的試薬は、磁気ビーズに付着している。
【００５１】
本明細書に記載の病原性プリオン特異的試薬は、標準的技術を用いて固体支持体に容易に結合させることができる。支持体への固定化は、最初に試薬をタンパク質に結合させることにより増強する場合がある（例えば、そのタンパク質がより良い固相結合性を有する場合）。適した結合タンパク質には、それだけに限らないが、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含めた血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、イムノグロブリン分子、チログロブリン、オボアルブミン、および当業者に周知の他のタンパク質などの高分子が挙げられる。分子を支持体に結合させるのに用いることができる他の試薬には、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合体アミノ酸、アミノ酸コポリマーなどが挙げられる。これらの分子をタンパク質に結合させるそのような分子および方法は、当業者によく知られている。例えば、Ｂｒｉｎｋｌｅｙ，  Ｍ．Ａ．、（１９９２年）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、３巻、２〜１３頁；Ｈａｓｈｉｄａら、（１９８４年）Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６巻、５６〜６３頁；ならびに  ＡｎｊａｎｅｙｕｌｕおよびＳｔａｒｏｓ、（１９８７年）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊ．  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．、３０巻、１１７〜１２４頁を参照されたい。
【００５２】
必要に応じて、病原性プリオン特異的試薬は、容易に、スチレン部分またはアクリレート部分を生じるように官能基をもたせて、ポリスチレン、ポリアクリレート、またはポリイミド、ポリアクリルアミド、ポリエチレン、ポリビニル、ポリジアセチレン、ポリフェニレンビニレン、ポリペプチド、多糖、ポリスルホン、ポリピロロール、ポリイミダゾール、ポリチオフェン、ポリエーテル、エポキシ、石英ガラス、シリカゲル、シロキサン、ポリリン酸、ヒドロゲル、アガロース、セルロースなどなどの他のポリマーへのその分子の組み入れを可能にすることができる。
【００５３】
病原性プリオン特異的試薬（ＰＳＲ）はまた、結合ペアの分子の相互作用を通して固体支持体に付着することもできる。そのような結合ペアはよく知られており、例は本明細書の他の箇所で記載されている。結合ペアの一方のメンバーは、上記の技術により固体支持体に結合しており、結合ペアの他方のメンバーは、ＰＳＲに（合成前、合成中、または合成後）付着している。このように修飾されたＰＳＲを、試料と接触させることができ、病原性プリオンが存在する場合には、それとの相互作用は溶液中で起こることができ、その後、固体支持体を、そのペプチド試薬（またはペプチド−プリオン複合体）と接触させることができる。この実施形態についての好ましい結合ペアとしては、ビオチンとアビジン、およびビオチンとストレプトアビジンが挙げられる。
【００５４】
したがって、本明細書に記載の方法において、試料中の病原性プリオン型は、病原性型に優先的に結合するＰＳＲ（例えば、ペプチド試薬またはペプトイド試薬）を用いて捕捉される。
【００５５】
部位特異的プロテアーゼ
本発明において有用である部位特異的プロテアーゼは、特定の別々のアミノ酸残基のペプチド結合を切断するプロテアーゼである。一般的に、部位特異的プロテアーゼは、１つの型または少数の特定のアミノ酸残基でタンパク質を切断し、したがって、プリオンタンパク質の切断における予測性を可能にする。そのような部位特異的プロテアーゼの例は以下である：Ａｒｇ残基またはＬｙｓ残基のカルボキシル側で切断する部位特異的プロテアーゼであるトリプシン、およびＡｓｐ残基またはＧｌｕ残基のカルボキシル側で切断するＳｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｕｓ  ａｕｒｅａｓ由来の部位特異的プロテアーゼであるＳＶ−８。トリプシンおよびＳＶ−８のどちらも様々な供給業者（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）から市販されている。他のそのような部位特異的プロテアーゼは、本明細書の記載に基づいて当業者によって容易に選択することができる。加えて、本発明において有用であるためには、プリオンタンパク質における、ＥＬＩＳＡに用いられる２つの抗体によって認識されるエピトープ間の領域に部位特異的プロテアーゼの少なくとも１つの切断部位がある必要があり、かつその少なくとも１つのプロテアーゼ切断配列は、ＰＫ耐性コア領域（プリオンタンパク質のおよそアミノ酸９０〜２３１位）内にある。この部位は、プリオンタンパク質がＰｒＰＣ型であるときのみ部位特異的プロテアーゼによって切断され、プリオンタンパク質がＰｒＰＳＣ型であるときは切断されない。さらに、その２つのエピトープ間の領域にＰｒＰＳＣアイソフォームにおける切断に利用可能な潜在的切断部位がない。好ましくは、そのエピトープの少なくとも１つは、プリオンタンパク質のＰＫ耐性コア領域内にある。好ましくは、他方のエピトープは、プリオンタンパク質のオクタリピート領域内にある。好ましくは、部位特異的プロテアーゼは、プリオンタンパク質のオクタリピート領域内の部位で切断しない。オクタリピート領域のコア反復配列は、ＧＱＰＨＧＧ（Ｇ／Ｓ）（−／Ｇ）Ｗ（配列番号１１）であり、それは、異なる種由来のプリオンにおいてわずかに異なり得る（オクタリピート配列を示す１０個の異なるプリオンタンパク質の配列についての図３および図４参照）。図２は、オクタリピート領域、例示的なエピトープ部位、および例示的な部位特異的プロテアーゼ切断部位を示すＰｒＰＣ型およびＰｒＰＳＣ型の概略図を示す。部位特異的プロテアーゼは、ＥＬＩＳＡに用いられる抗プリオン抗体により認識されるエピトープ間の少なくとも１つの部位でＰｒＰＣ型を切断する。したがって、ＰｒＰＣ型はＥＬＩＳＡで検出されない。しかし、ＰｒＰＳＣ型は、その２つのエピトープ間の領域で部位特異的プロテアーゼによって切断されず、なぜなら、このアイソフォームの立体構造が、その部位をプロテアーゼ切断に利用できないようにさせているからである。したがって、ＰｒＰＳＣはＥＬＩＳＡにおいて検出可能である。
【００５６】
プロテアーゼ処理
上記のように、病原性プリオン特異的試薬と病原性プリオンの特異的相互作用により形成される複合体はまた、特に試料が自然に高レベルのＰｒＰＣを含む場合、非特異的に結合したＰｒＰＣを含む可能性がある。プロテイナーゼＫは、他の設定では、ＰｒＰＣ型を消化し、より耐性の高いＰｒＰＳＣ型をそのままにしておくために用いられている。しかし、ＰＫ処理が病原性型の感染力を低減するという事実により示されているように、高濃度のプロテイナーゼＫおよび／または長時間の曝露時間が用いられる場合には、ＰｒＰＳＣはタンパク分解に対して完全に耐性であるわけではない。ＭｃＫｉｎｌｅｙら、Ｃｅｌｌ、３５巻、５７〜６２頁、１９８３参照。さらに、ＰｒＰＳＣのいくつかの配座異性体は、プロテイナーゼＫに感受性がより高いことが示されており、そのような処理が検出の感度を低減する可能性がある（Ｓａｆａｒら、（１９９８年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．、４巻、１１５７頁）。
【００５７】
それゆえに、プロテイナーゼＫ処理は、ＰｒＰＣ型の完全な切断を与えるが、ＰｒＰＳＣ型の耐性コアを無傷のままにするためには注意深く制御されなければならない。少なすぎるプロテイナーゼＫ消化は、残留するＰｒＰＣ型を残し、それが検出相において偽陽性を生じるであろうし、多すぎるプロテイナーゼＫ消化は、ＰｒＰＳＣ耐性コアを切断し、検出相においてそれを検出不可能にさせるであろう。さらに、病原性型が複数の立体構造をとり得るため、ＰｒＰＳＣの特定のＰＫ消化部位（複数可）は様々であるが、ＰｒＰＳＣのＰＫ消化は、常に、約２３位残基から９０位残基までＮ末端アミノ酸を除去する（成熟プリオンタンパク質はアミノ酸２３位から始まる）。このＮ末端領域は、抗プリオン抗体の重要なエピトープであり得る配列、特にオクタリピート配列を有する。したがって、ＰｒＰＳＣのＰＫ消化は、この領域におけるエピトープに対して方向付けられた抗プリオン抗体の結合を低減または排除する可能性がある。Ｔｅｌｌｉｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４巻、２０７９〜２０８２頁、１９９６参照。
【００５８】
ＰＳＲおよび病原性プリオンを含む第１の複合体を、いかなる非病原性プリオンタンパク質も実質的に消化されるだろう条件下で、選択された部位特異的プロテアーゼと接触させる。当業者は適切な条件を決定する能力がある。実質的消化の条件は、組換えＰｒＰを用いる試験によって容易に決定することができる。部位特異的プロテアーゼとしてのトリプシンについて、典型的には、５０μｇ／ｍｌのトリプシン濃度、３７℃で１時間が、適切である。
【００５９】
部位特異的プロテアーゼは、第１の複合体が形成されたすぐ後に第１の複合体と接触させることができ、または第１の複合体を、結合していない試料から分離し、任意選択で洗浄し、その後、部位特異的プロテアーゼと接触させることができる。
【００６０】
非病原性プリオンタンパク質の実質的消化後、部位特異的プロテアーゼは、どのようなさらなるプロテアーゼ消化も、例えば、検出のために用いられることになっている抗プリオン抗体のプロテアーゼ消化を、妨害するために、除去、不活性化、または阻害されなければならない。プロテアーゼは、特に第１の複合体が固体支持体上にある場合、第１の複合体の単純な、または繰り返しの洗浄によって除去することができる。プロテアーゼはまた、１つまたは複数のプロテアーゼ阻害剤の添加によって阻害してもよい。プロテアーゼ阻害剤は、当技術分野においてよく知られており、それらには、とりわけ、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、アプロチニン、フルオロリン酸ジイソプロピル（ＤＦＰ）、および１−クロロ−３−トシルアミド−４−フェニル−２−ブタノン（ＴＬＣＫ）が挙げられる。あるいは、いくつかのプロテアーゼは、固定化型（例えば、アガロースマトリックス）で利用可能であり、それは、通常の手段（例えば、遠心分離、濾過など）によって反応から容易に除去することができる。典型的には、１〜２ｍＭのＰＭＳＦが、プロテアーゼ消化を停止するのに用いられる。
【００６１】
非特異的に結合したＰｒＰＣを選択的切断によって除去することにより、本明細書に記載の方法は、病原性プリオン型に優先的に結合する試薬を利用する病原性プリオンＥＬＩＳＡの特異性および再現性を増大させる。ＰｒＰＣの除去後、変性ＰｒＰＳＣのＮ末端におけるエピトープを認識するものを含めた抗プリオン抗体は、病原性プリオン特異的試薬によって捕捉された病原性プリオンの検出のためのＥＬＩＳＡに用いることができる。
【００６２】
ＥＬＩＳＡ
非病原性プリオンを除去するためのプロテアーゼ処理および洗浄段階後、病原性プリオンタンパク質を、国際公開第２００６／０７６６８７号パンフレットに記載されているように、病原性プリオン特異的試薬から解離させ、そのパンフレット内および下に記載された、いくつかのＥＬＩＳＡ形式で検出する。病原性プリオンは、典型的には、病原性プリオン特異的試薬からの解離過程で変性されるが、必ずしもそうとは限らない。高親和性抗プリオン抗体の大部分は、ＰｒＰの変性型を結合し、変性ＰｒＰに結合する多くの抗プリオン抗体が知られており、かつ市販されているため、ＥＬＩＳＡを行う前の捕捉されたＰｒＰＳＣの変性は好ましい。
【００６３】
病原性プリオンの解離および変性は、高濃度のカオトロピック剤、例えば、３Ｍ〜６Ｍの、チオシアン酸グアニジウムまたはグアニジウムＨＣｌなどのグアニジウム塩を用いて達成することができる。カオトロピック剤は、それが、ＥＬＩＳＡに用いられる抗プリオン抗体の結合に干渉するため、ＥＬＩＳＡを行う前に除去または希釈しなければならない。これは、追加の洗浄段階または大きな試料容量の発生をもたらし、そのどちらも迅速な高処理量のアッセイにとって望ましくない。
【００６４】
または、病原性プリオンタンパク質の試薬からの解離は、高ｐＨまたは低ｐＨを用いて達成することができる。病原性プリオンタンパク質は、ｐＨを１２より上へ増大させる成分（例えば、ＮａＯＨ）、または２より下に低下させる成分（例えば、Ｈ３ＰＯ４）を添加することにより、容易に試薬から解離し、変性される。さらに、ｐＨは、小容量の適切な酸または塩基の添加によって中性へ容易に再調整して、少しの追加の洗浄もなく、かつ試料容量を有意に増加させることなく、ＥＬＩＳＡに直接用いることを可能にすることができる。捕捉された病原性プリオンタンパク質（すなわち、第１の複合体中の病原性プリオン）を変性させるための高ｐＨまたは低ｐＨ処理の使用は、ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００１４３７および米国特許出願第１１／５１８，０９１号に、より詳細に記載されており、それらの特許出願の開示は、全体として本明細書に組み込まれている。
【００６５】
プリオン、特に、ＰｒＰＣまたは変性ＰｒＰに結合する抗体、修飾抗体、および他の試薬は記載されており、これらのいくつかは市販されている（例えば、Ｐｅｒｅｔｚら、１９９７年、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２７３巻、６１４頁；Ｐｅｒｅｔｚら、２００１年、Ｎａｔｕｒｅ、４１２巻、７３９頁；Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎら、１９９８年、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、７２巻、９４１３頁；Ｐｏｌｙｍｅｎｉｄｏｕら、２００５年、Ｌａｎｃｅｔ、４巻、８０５頁；米国特許第６，７６５，０８８号に記載された抗プリオン抗体を参照されたい）。これらを始めとするもののいくつかは、とりわけ、ＩｎＰｒｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ  ＭＩ；Ｐｒｉｏｎｉｃｓ  ＡＧ、Ｚｕｒｉｃｈから市販されている；また、修飾抗体の記載についてはＷＯ０３／０８５０８６を参照。本方法に用いるのに適した抗体としては、非限定的に、３Ｆ４（ＵＳ４，８０６，６２７）、Ｄ１８（Ｐｅｒｅｔｚら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、１９９７年、２７３巻、６１４頁）、Ｄ１３（Ｐｅｒｅｔｚ、１９９７年、前記）、６Ｈ４（Ｌｉｕら、Ｊ．  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．、２００３年、５１巻、１０６５頁）、ＭＡＢ５２４２（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、７Ｄ９（Ｋａｓｃｓａｋら、１９８７年、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、６１巻、３６８８頁）、ＢＤＩ１１５（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、ＳＡＦ３２、ＳＡＦ５３、ＳＡＦ８３、ＳＡＦ８４（ＳＡＦ抗体はＳＰＩ  Ｂｉｏ、Ｆｒａｎｃｅから入手可能）、１９Ｂ１０（ＷＯ２００４／４０３３６２８）、７ＶＣ（ＷＯ２００４／４０３３６２８）、１２Ｆ１０（ＳＰＩ  Ｂｉｏ）、ＰＲＩ３０８（ＳＰＩ  Ｂｉｏ）、３４Ｃ９（Ｐｒｉｏｎｉｃｓ  ＡＧ）、Ｆａｂ  ＨｕＭ−Ｐ（Ｐｅｒｅｔｚら、Ｎａｔｕｒｅ、２００１年、４１２巻、７３９頁）、ＰＯＭ  １〜ＰＯＭ  １９（Ｐｏｌｙｍｅｎｉｄｏｕら、２００５年、前記）、特に、オクタリピート領域内のエピトープを認識するＰＯＭ２、Ｆａｂ  ＨｕＭ−Ｒ１（Ｐｅｒｅｔｚ、１９９７年、前記）、およびＦａｂ  ＨｕＭ−Ｒ７２（Ｐｅｒｅｔｚ、１９９７年、前記）が挙げられる。他の抗プリオン抗体は、当技術分野においてよく知られている方法によって容易に作製することができる。
【００６６】
好ましい抗プリオン抗体は、変性型の病原性プリオンに結合するものである。特に好ましい第１の抗プリオン抗体は、プリオンタンパク質のＮ末端領域（例えば、オクタリピート領域）におけるエピトープを認識するものである。そのような抗体の例は、ＳＡＦ−３２、ＰＯＭ２、ＰＯＭ１１、ＰＯＭ１２、ＰＯＭ１４、３Ｂ５、４Ｆ２、１３Ｆ１０、ＳＡＦ−１５、ＳＡＦ−３１、ＳＡＦ−３２、ＳＡＦ−３３、ＳＡＦ−３４、ＳＡＦ−３５、およびＳＡＦ−３７である。（例えば、Ｐｏｌｙｍｅｎｉｄｏｕら、（２００５年）Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ．、４巻、８０５〜８１４頁；Ｋｒａｓｅｍａｎｎら、（１９９６年）Ｍｏｌ．  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２巻、７２５〜７３４頁；Ｆｒｅａｕｄｅｔら、（２００５年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２８０巻、１１２４７〜１１２５８頁；米国特許第７，０９７，９９７号Ｂ１参照。）好ましい第２抗プリオン抗体は、プロテイナーゼＫ耐性コア領域内のエピトープを認識するもの、例えば、およそアミノ酸１０９〜１１２位におけるエピトープを認識する３Ｆ４抗体、ＰＯＭ１７、またはＰＯＭ１９である。または、第１の抗プリオン抗体は、プロテイナーゼＫ耐性コア内のエピトープを認識する一群の抗体から選択することができ、第２抗プリオン抗体は、Ｎ末端領域における、特にオクタリピート領域内のエピトープを認識する。
【００６７】
第１および第２の抗プリオン抗体は、それらが、プロテイナーゼＫ耐性コア領域における部位特異的プロテアーゼの切断部位に隣接するエピトープを認識するように、選択されることを、当業者は本明細書における開示から十分理解しているであろう。このように、部位特異的プロテアーゼでの消化後、第１および第２の抗プリオン抗体により認識されるエピトープは、ＰｒＰＣの異なる断片上に存在する（それゆえに、ＥＬＩＳＡで検出することができない）が、これらのエピトープは、ＰｒＰＳＣの単一の断片上に存在する（それゆえに、ＥＬＩＳＡで検出可能である）。
【００６８】
１つまたは限られた数の動物種由来のプリオンタンパク質に特異的である抗プリオン抗体もあるし、多くの動物種由来のプリオンタンパク質を結合する能力があるものもある。分析される試料、および試験の目的に基づいて適切な抗プリオン抗体を選択することは明らかであると考えられる。
【００６９】
一実施形態では、病原性プリオン特異的試薬は、固体支持体、好ましくは磁気ビーズ、より好ましくは、ポリスチレン／酸化鉄ビーズ上で供給される。
【００７０】
ペプチドまたはペプトイド試薬を固体支持体上に付着させる方法は、当技術分野で常用され、本明細書の別の箇所で記載されており、タンパク質およびペプチドを様々な固体表面に付着させる周知の方法を含む。
【００７１】
典型的には、方法は、マイクロタイタープレートのウェル中、または小容量プラスチックチューブ中で行われるが、いかなる便利な容器でも適している。試料は、一般的に、液体試料または懸濁液であり、反応容器へ病原性プリオン特異的試薬の前に加えても後に加えてもよい。上で述べられているように、いったん第１の複合体が確立されたならば、非特異的に結合したＰｒＰＣを、結合していないいかなる試料材料も（すなわち、結合していないいかなる病原性プリオンタンパク質も含めた、病原性プリオン特異的試薬に結合しなかった試料のいかなる成分も）共に除去する。
【００７２】
上記のように、結合していない試料材料を除去し、非特異的に結合したいかなるＰｒＰＣも除去し、かつ任意選択的にいかなる洗浄でもした後に、結合した病原性プリオンタンパク質を第１の複合体から解離させる。この解離は、いくつかの方法で達成することができる。一実施形態では、カオトロピック剤、好ましくはグアニジウム化合物、例えば、チオシアン酸グアニジウムまたはグアニジウム塩酸を、３Ｍ〜６Ｍの間の濃度まで加える。これらの濃度でのカオトロピック剤の添加は、病原性プリオンタンパク質を試薬から解離させ、かつまた、病原性プリオンタンパク質を変性させる。
【００７３】
別の実施形態では、解離は、ｐＨを１２以上（「高ｐＨ」）へ上昇させるか、またはｐＨを２以下（「低ｐＨ」）へ低下させるかのいずれかにより、達成される。ｐＨ解離／変性技術の詳細は、ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００１４３７および米国特許出願第１１／５１８，０９１号に記載されている。第１の複合体の高ｐＨかまたは低ｐＨのいずれかへの曝露は、病原性プリオンタンパク質の試薬からの解離を生じ、病原性プリオンタンパク質を変性させる。この実施形態では、第１の複合体の高ｐＨへの曝露が好ましい。１２．０〜１３．０の間のｐＨが一般的に十分である；好ましくは、１２．５〜１３．０の間のｐＨが用いられる；より好ましくは１２．７〜１２．９のｐＨ；最も好ましくは、１２．９のｐＨが用いられる。または、第１の複合体の低ｐＨへの曝露を、病原性プリオンタンパク質を試薬から解離させ、かつ変性させるのに用いることができる。この代替法について、１．０〜２．０の間のｐＨが十分である。第１の複合体の高ｐＨかまたは低ｐＨのいずれかへの曝露は、短時間のみ、例えば、６０分間、好ましくはたった１５分間、より好ましくはたった１０分間、行われる。これより長い曝露は、病原性プリオンタンパク質の構造の有意な劣化を生じ得、検出段階に用いられる抗プリオン抗体により認識されるエピトープが破壊される。病原性プリオンタンパク質を解離させるのに十分な時間での曝露後、ｐＨは、酸性試薬（高ｐＨ解離条件が用いられた場合）かまたは塩基性試薬（低ｐＨ解離条件が用いられた場合）のいずれかの添加によって容易に中性（すなわち、約７．０〜７．５の間のｐＨ）へ再調整することができる。当業者は、適切なプロトコールを容易に決定することができ、例は本明細書に記載されている。
【００７４】
一般的に、高ｐＨ解離条件をもたらすために、ＮａＯＨの約０．０５Ｎ〜約０．２Ｎの濃度までの添加が十分である。好ましくは、ＮａＯＨを、０．０５Ｎ〜０．１５Ｎの間の濃度まで添加する；より好ましくは、０．１Ｎ  ＮａＯＨが用いられる。いったん病原性プリオンの病原性プリオン特異的試薬からの解離が達成されたならば、ｐＨを、適切な量の酸性溶液、例えば、リン酸、リン酸二水素ナトリウムの添加により中性（すなわち、約７．０〜７．５の間）へ再調整することができる。
【００７５】
一般的に、低ｐＨ解離条件をもたらすために、Ｈ３ＰＯ４の約０．２Ｍ〜約０．７Ｍの濃度までの添加が十分である。好ましくは、Ｈ３ＰＯ４を、０．３Ｍ〜０．６Ｍの間の濃度まで添加する；より好ましくは、０．５Ｍ  Ｈ３ＰＯ４が用いられる。いったん病原性プリオンの試薬からの解離が達成されたならば、ｐＨを、適切な量の塩基性溶液、例えば、ＮａＯＨまたはＫＯＨの添加により中性（すなわち、約７．０〜７．５の間）へ再調整することができる。
【００７６】
その後、解離した病原性プリオンタンパク質を、病原性プリオン特異的試薬を含む固体支持体から分離する。この分離は、結合していない材料（その時点では、解離した病原性プリオンタンパク質）を含む部分が保持されて、かつ固体支持体材料部分が捨てられる点を除き、上記の結合していない試料材料の除去と類似した様式で達成することができる。
【００７７】
解離した病原性プリオンタンパク質は、抗プリオン抗体を用いて検出することができる。いくつかの抗プリオン抗体が記載され、多くは市販されており、例えば、Ｆａｂ  Ｄ１８（Ｐｅｒｅｔｚら、（２００１年）Ｎａｔｕｒｅ、４１２巻、７３９〜７４３頁）、３Ｆ４（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ  ＭＯから入手可能；また、米国特許第４，８０６，６２７号参照）、ＳＡＦ−３２（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ  ＭＩ）、６Ｈ４（Ｐｒｉｏｎｉｃ  ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；また、米国特許第６，７６５，０８８号参照）、ＰＯＭ１〜１９（Ｐｏｌｙｍｅｎｉｄｏｕら、Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ、２００５年、４巻、８０５頁）、ならびに上記および当技術分野において周知の他のものがある。解離した病原性プリオンタンパク質を、好ましくは、より十分に下に記載されている、直接ＥＬＩＳＡかまたは抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ型アッセイのいずれかとして、ＥＬＩＳＡ型アッセイで検出する。用語「ＥＬＩＳＡ」は、抗プリオン抗体での検出を記載するために用いられるが、そのアッセイは、抗体が「酵素結合型」であるものに限定されない。検出抗体は、本明細書に記載された、およびイムノアッセイ分野においてよく知られた検出可能な標識のいずれかで標識することができる。
【００７８】
方法の好ましい実施形態では、解離した病原性プリオンタンパク質を、抗体サンドイッチ型ＥＬＩＳＡを用いて検出する。この実施形態では、解離したプリオンタンパク質を、第１の抗プリオン抗体を含む第２の固体支持体上に「再捕捉」する。再捕捉されたプリオンタンパク質を有する第２固体支持体を、任意選択で、洗浄して、結合していないいかなる材料も除去し、その後、第２抗プリオン抗体と、第２抗プリオン抗体が再捕捉されたプリオンタンパク質に結合するのを可能にする条件下で、接触させる。
【００７９】
この実施形態では、第１の固体支持体は、好ましくは、磁気ビーズである；第２固体支持体は、好ましくは、マイクロタイタープレートまたは磁気ビーズである；第１および第２の抗プリオン抗体は、好ましくは、異なる抗体である；第１および第２の抗体は、好ましくは、変性プリオンタンパク質に結合する；好ましくは、第１または第２の抗プリオン抗体の少なくとも１つは、プリオンタンパク質のオクタリピート領域におけるエピトープを認識する。いくつかの実施形態では、第２抗プリオン抗体は、検出可能に標識されている；さらなる実施形態では、第２抗プリオン抗体は酵素標識されている。
【００８０】
本明細書における上記の病原性プリオンの検出方法のいずれも、任意の試料においてプリオン関連疾患を診断するための方法に用いることができる。
【００８１】
本明細書に記載された方法に用いるのに、試料は、病原性プリオンタンパク質を含むことが知られている、またはそれを含有する疑いのある任意のものであることができる。試料は、生体試料（すなわち、生きている、または死後の生物体から調製された試料）または非生体試料であることができる。適した生体試料には、それだけに限らないが、器官、全血、血液画分、血液成分、血漿、血小板、血清、脳脊髄液（ＣＳＦ）、脳組織、神経系組織、筋肉組織、骨髄、尿、涙、非神経系組織、器官、および／または生検もしくは剖検材料が挙げられる。好ましい生体試料としては、全血、血液製剤、血漿、血小板、および赤血球が挙げられる。
【００８２】
適切な対照もまた、本明細書に記載されたアッセイに用いることができる。例えば、ＰｒＰＣの陰性対照をアッセイに用いることができる。ＰｒＰＳｃ（またはＰｒＰｒｅｓ）の陽性対照もまたアッセイに用いることができる。そのような対照は、任意選択で、検出可能に標識することができる。
【００８３】
キット
病原性プリオン特異的試薬、部位特異的プロテアーゼ、プロテアーゼ阻害剤、変性剤、抗プリオン抗体などを含めた上記のアッセイ試薬は、上記のように検出アッセイを行うために、適切な使用説明書および他の必要な試薬と共にキットにして提供することができる。病原性プリオン特異的試薬を固体支持体上で用いる場合、キットは、追加として、または代わりとして、１つまたは複数の固体支持体上のそのような試薬を含んでもよい。キットはさらに、上記のように、適切な陽性および陰性対照を含んでもよい。キットはまた、用いられる特定の検出アッセイに依存して、適切な標識ならびに他のパックされた試薬および材料（すなわち、洗浄緩衝液など）も含むことができる。
【実施例】
【００８４】
以下は、本開示を実施するための特定の実施形態の実施例である。これらの実施例は、単なる例示目的であり、本開示の範囲を一切限定するものではない。
【００８５】
使用する数字（例えば、量や温度など）には正確を期したが、当然、ある程度の実験の誤差や偏差は許容されるべきものである。
【００８６】
（実施例１）
ＰｒＰＣを含むヒト血漿試料のプロテアーゼ処理
トリプシンが、ＰｒＰＣを十分に消化して我々のＥＬＩＳＡでＰｒＰＣが検出されなくなるか否かを調べるために、１０ｎｇ／ｍＬ  ＰｒＰＣを含むヒト血漿（１０μＬ）を、表１に示すように様々な濃度（逓増）のトリプシンで処理した。１〜２ｍＭ  フェニルメチルスルフォニルフルオライド（ＰＭＳＦ）（プロテアーゼインヒビター）を添加して、トリプシン消化を停止させ、捕捉抗体として３Ｆ４（Ｓｉｇｎｅｔ社から入手）を用い、かつ光検出用の化学発光基質を用いるアルカリホスファターゼ（ＡＰ）に結合したＰＯＭ２抗体（上記のＰｏｌｙｍｅｎｉｄｏｕらを参照）で検出するサンドイッチＥＬＩＳＡによってＰｒＰＣの存在について試料を検査した。測定単位は、相対発光量（ＲＬＵ）とした。予想通り、トリプシンがＰｒＰＣを消化し、ＰｒＰＣを検出できなかった。予想通り、トリプシンがＰｒＰＣを消化し、ＰｒＰＣを検出できなかった。トリプシン濃度が４００μｇ／ｍＬ以上で、ＰｒＰＣのシグナルがバックグラウンドレベルに低下し、ＰｒＰＣが完全に消化されたことを示唆している。
【００８７】
【表１】
2010523978.tif 000003
（実施例２）
ＰｒＰＣおよびＰｒＰＳｃを含むヒト血漿試料のプロテアーゼ処理
次の一連の実験の目的は、ＷＯ２００７／０３０８０４に記載されているようにＰＳＲで被覆された磁気ビーズを用いるＰｒＰＳＣのプルダウンアッセイにおいてＰｒＰＣ汚染を除去するトリプシンの効果を調べることであった。磁気ビーズは、ペプトイド試薬で被覆し、１０ｎＬ／ｍＬ  １０％ｖＣＪＤ脳ホモジネートを添加した、または添加していない様々な血漿調製物と共にインキュベートした。１０％ｖＣＪＤ脳ホモジネートを、最終濃度１０ｎＬ／ｍＬの様々な正常（すなわち、非ｖＣＪＤ）ヒト血漿２００μＬに添加した。この実験では、２群の血漿を試験した。第１の群（Ｎ９１８３５およびプール７〜１１）は、バックグラウンドが低く（０．８〜２．９相対発光量（ＲＬＵ））、ＰｒＰＣのレベルが低いことを示しており、第２の群は、ＰｒＰＣのレベルが高く、バックグラウンドシグナル（１５〜１１４ＲＬＵ）が著しく高い。これらのバックグラウンドシグナルは、以前の実験で決定されており、磁気ビーズに非特異的に付着したＰｒＰＣのレベルを反映している。１０ｎＬ／ｍＬ  １０％ｖＣＪＤ脳ホモジネートを添加すると、ＰｒＰＣに加えてＰｒＰＳＣも検出されるため、ＲＬＵが増大した。３７℃で１時間混合してから、磁気ビーズを磁石で収集して洗浄した。磁気ビーズを、３７℃で１時間、５０μｇ／ｍＬ  トリプシンで処理し、１ｍＭ  ＰＭＳＦを室温で１０分かけて添加して、タンパク分解を停止させた。磁気ビーズを再度洗浄してから、複合体中のＰｒＰＳＣを、ＰＣＴ／ＵＳ０６／００１４３７およびＷＯ２００７／０３０８０４に開示されているようにＮａＯＨで変性させた。ＰｒＰのレベルを、実施例１に記載したようにＥＬＩＳＡで測定した。この結果を表２に示す。
【００８８】
分析感度を決定するために、正常血漿に添加したｖＣＪＤの比率（シグナル／カットオフ（Ｓ／ＣＯ））を算出した。９９．７％の統計的信頼性を得るために、カットオフを、正常血漿の平均値に標準偏差の３倍を加えた値とし、１．００を超える比率を陽性とみなした。例えば、血漿Ｎ９１８３５の場合、カットオフが、２．１＋３×０．３＝３と算出され、平均ｖＣＪＤ添加物が１０．９ＲＬＵであったため、試料は、３．８のＳ／ＣＯで検出可能とみなした。ＰｒＰＣ汚染のレベルが高い試料のＳ／ＣＯは、０．８〜１．４であり、境界検出を示唆しているが、バックグラウンドの低い試料のＳ／ＣＯは、２．２〜８．３とかなり高い。ビーズを、３７℃で１時間、５０μｇ／ｍＬ  トリプシンで処理すると、ＰｒＰＳＣシグナルが維持されたまま、汚染負荷がバックグラウンドレベルまで低下した。結果として、Ｓ／ＣＯシグナルが２．３〜５と数倍に増大した。また、平均して１ＲＬＵの低いとみなされる試料の場合、バックグラウンド測定値が低下すると、Ｓ／ＣＯ比率が増大することを確認した。したがって、トリプシンでの処理により、非添加血漿のバックグラウンドが、２１．３±３１．６から１．３±０．６ＲＬＵ（平均±ＳＤ）に低下した。
【００８９】
この一連の実験により、トリプシンが、磁気ビーズに付着したＰＳＲに結合したＰｒＰＳｃのレベルに影響を与えずに、磁気ビーズを汚染しているＰｒＰＣ分子を効果的に消化できることが実証された。この処理は、すべての試料のＰｒＰＣ汚染を、１〜３ＲＬＵの一様に低いバックグラウンドレベルに低下させ、結果として検出信頼性を高める。
【００９０】
【表２】
2010523978.tif 000004
（実施例３）
ＰｒＰＣおよびＰｒＰＳＣを含むヒト脳ホモジネートのプロテアーゼ処理
トリプシン消化がＰｒＰＳＣからの信号を著しく低減するか否かを確認するために、様々なＣＪＤ試料に対するトリプシンの影響を検査した。３人の散発性ＣＪＤ患者からの脳ホモジネート（赤色、緑色、および黄色に標識）、２人のｖＣＪＤ患者からの脳ホモジネート（白色および青色）、および正常コントロールを、英国の国立生物学的製剤研究所（ＮＩＢＳＣ）から入手した。この６種の脳ホモジネートを、最終濃度１０ｎＬ／ｍＬで正常ヒト血漿（ＮＨＰ  プール１１、すなわちＰｒＰＣのバックグラウンドレベルが低いことを既に示した血漿）２００μＬに添加し、ＷＯ２００７／０３０８０４に開示されているようにペプトイド試薬で被覆した磁気ビーズを添加した。３７℃で１時間混合してから、磁気ビーズを洗浄し、３７℃で１時間、トリプシン（５０μｇ／ｍＬ）と共にインキュベートした。１ｍＭ  ＰＭＳＦを室温で１０分かけて添加して、トリプシン消化を停止させた。磁気ビーズを再度洗浄してから変性させ、実施例１および２に記載したように捕捉用の３Ｆ４と検出用のＰＯＭ２を用いるサンドイッチＥＬＩＳＡで検出を行った。
【００９１】
図１に示すように、ＰｒＰＳＣは、すべてのＣＪＤホモジネートで検出され、トリプシン処理後も検出に変化が見られなかったため、ヒトＰｒＰＳｃが、一般にトリプシン消化に対して耐性であることを示唆している。
【００９２】
（実施例４）
ＰｒＰＣおよびＰｒＰＳｃを含むヒツジ血漿試料のプロテアーゼ処理
ヒツジＰｒＰ（図３および図４に示している配列番号：５）中のＰｒＰＳＣの検出に対するプロテアーゼ処理による消化の影響を検査した。
【００９３】
血漿試料を、様々な濃度（逓増）のＳ−Ｖ８、トリプシン、またはプロテイナーゼＫ（ＰＫ）で処理した。血漿試料には、（１）ＰｒＰＣのレベルが低い正常（すなわち、スクレイピーに感染していない）ヒツジからの血漿（ＩＮＲ＃１、５ＲＬＵ）、（２）ＰｒＰＣのレベルが高い正常ヒツジ血漿（２２４Ｌ、３０ＲＬＵ）、（３）スクレイピーに感染しているヒツジからの脳ホモジネートで添加した血漿（ＢＨ、４５ＲＬＵ）を用いた。実施例２に記載したように血漿試料を処理した。簡単に述べると、病因プリオン特異的ペプトイド（ＰＳＲ１）で被覆した磁気ビーズを、異なる試料（ＩＮＲ＃１、２２４Ｌ、またはＢＨ）に添加した。３７℃で１時間混合してから、磁気ビーズを洗浄し、３７℃で１時間、３種類のプロテアーゼ（トリプシン、ＳＶ−８、またはＰＫ）のうちの１つと共にインキュベートした。すべての試料にＰＭＳＦを室温で１０分かけて１ｍＭになるまで添加して、プロテアーゼ消化を停止させた。磁気ビーズを再度洗浄してから変性させ、捕捉用のＰＯＭ１９と検出用のＰＯＭ２を用いるサンドイッチＥＬＩＳＡで検出を行った。ＰＯＭ１９は、ヒツジプリオン配列のカルボキシ末端のエピトープを認識する。
【００９４】
表３に示すように、ＩＮＲ＃１を３種類のプロテアーゼで処理しても、未処理の試料に比べて測定値が低下しなかった。しかし、２２４Ｌをトリプシンで処理すると、測定値が３０ＲＬＵからバックグラウンドレベルの４．７ＲＬＵに低下したが、ヒツジ脳ＰｒＰＳｃで添加した血漿を１００μｇ／ｍＬ  トリプシンで消化してもシグナルが低下しなかった。ＰＫ消化は、０．１μｇ／ｍＬの濃度では、ＰｒＰＣと５０％低減されたスクレイピーシグナルにより、バックグラウンドの低減に効果的ではなかった。
【００９５】
【表３】
2010523978.tif 000005
（実施例５）
ＰｒＰＣを除去するＰＫ処理
近年の研究報告は、プロテイナーゼＫでの緩やかな処理により、ＰｒＰＳｃのすべてまたは一部のオクタリピートエピトープを維持したまま、ＰｒＰＣを効果的に除去することができ、これにより検出が向上することを示唆している（米国特許第７，０９７，９９７号を参照）。部位特異的プロテアーゼの使用とＰＫ処理の効果を比較するために、以下の実験を行った。
【００９６】
ＰＳＲ被覆磁気ビーズを、高レベルのＰｒＰＣを含む様々な血漿調製物と共にインキュベートした。１０％ｖＣＪＤ脳ホモジネートを、最終濃度４０ｎＬ／ｍＬで低バックグラウンド血漿試料に添加した。ペプトイド（ＰＳＲ１）で被覆した磁気ビーズを各試料に添加した。３７℃で１時間混合してから、磁気ビーズを洗浄し、３７℃で１時間、ＰＫ（０、１μｇ／ｍＬ、および２μｇ／ｍＬ）と共にインキュベートした。２ｍＭ  ＰＭＳＦを室温で１０分かけて添加して、消化を停止させた。磁気ビーズを再度洗浄し、次いで実施例２に記載されているように変性させ、捕捉抗体用の３Ｆ４と検出用のアルカリリン酸塩（ＡＰ）に結合したＰＯＭ２抗体を用いるサンドイッチＥＬＩＳＡによって検出を行った。
【００９７】
高ＰｒＰＣ血漿のＰｒＰＣのバックグラウンドレベルは、４〜３５ＲＬＵ（６〜２６行目）であるが、低ＰｒＰＣ血漿のＰｒＰＣのバックグラウンドレベルは、わずか１．２ＲＬＵ（１行目）である。低ＰｒＰＣ血漿を４０ｎＬ／ｍＬ  １０％ｖＣＪＤ脳ホモジネートで添加すると、このｖＣＪＤ脳ホモジネート中にＰｒＰＳｃが存在するため、ＲＬＵが１．２（１行目）から９（２行目）に増大した。高ＰｒＰＣ血漿のバックグラウンドシグナルを、低ＰｒＰＣ血漿で認められるバックグラウンドシグナルに低下させようと、ビーズを、３７℃で１時間、低濃度のＰＫ（１μｇ／ｍＬおよび２μｇ／ｍＬ）で処理した。
【００９８】
分析感度を決定するために、バックグラウンドに対するシグナルの比率を算出した（Ｓ／ＣＯ）。９９．７％の統計的信頼性を得るために、カットオフを、正常血漿の平均値に標準偏差の３倍を加えた値とし（１行目）、１．００を超える比率を陽性とみなした。カットオフが、１．２＋３×０．８＝３．６と算出され、平均ｖＣＪＤ添加物が９．３ＲＬＵであったため、試料は、２．６のＳ／ＣＯで検出可能とみなした。汚染レベルが高い試料のＳ／ＣＯは、１〜１０であり、偽陽性検出を示唆している。磁気ビーズを、３７℃で１時間、１μｇ／ｍＬ  ＰＫで処理しても、ｖＣＪＤの検出には影響が及ばず、高いバックグラウンドレベルも低下しなかった。２μｇ／ｍＬ  ＰＫでの処理では、大多数の試料（８、１１、１４、１７、２３、および２６行目）のバックグラウンドシグナルのレベルが低下せず、Ｓ／ＣＯ値が同一か１よりも大きい値に維持された。加えて、この低濃度のＰＫ処理でも、真陽性シグナルの検出（２〜４行目のｖＣＪＤ試料）が９ＲＬＵから６ＲＬＵ、Ｓ／ＣＯが２．８から１．８に低下し、検出が３５％減となった。
【００９９】
【表４】
2010523978.tif 000006
次の一連の実験では、ＰＫの濃度を４μｇ／ｍＬおよび８μｇ／ｍＬに高めた（表５）。ＰＫ濃度を４μｇ／ｍＬに高めると、高ＰｒＰＣ血漿からのシグナルのレベルが、１．７〜３ＲＬＵのバックグラウンドレベルに十分に低下した。これらの実験は、ＰＫ濃度を４μｇ／ｍｌまたは８μｇ／ｍｌにした点を除き、上記の通り行った。
【０１００】
【表５】
2010523978.tif 000007
濃度４μｇ／ｍＬのＰＫでのＰＳＲビーズの処理が、ＰｒＰＣ汚染のレベルを低下させるのに有効であることを確認するために、この処理を、ＰＳＲビーズに付着したｖＣＪＤ  ＰｒＰＳＣに対して実施した（表６）。この実験では、様々な量（逓増）の１０％ｖＣＪＤ脳ホモジネート（ＢＨ）を血漿に添加し、ＰＳＲ被覆ビーズと混合した。これらのビーズを、ＰＫを用いてまたは用いずに処理し、タンパク質を実施例２および３に記載したようにＮａＯＨを用いて変性させ、実施例２および３に記載したようにサンドイッチＥＬＩＳＡでＰｒＰを検出した。予想通り、ｖＣＪＤ  ＢＨの濃度が増大すると、０μｇ／ｍＬ  ＰＫで検出シグナルが高くなった（１〜５行目）。４μｇ／ｍＬ  ＰＫでＰＳＲビーズを処理すると、ＲＬＵが１／２〜１／４に低下し、バックグラウンドに対するシグナル（Ｓ／ＣＯ）も同様に低下し、ＰｒＰＳＣの検出感度が著しく低下することを示唆している。
【０１０１】
【表６】
2010523978.tif 000008
次の一連の実験では、ｖＣＪＤのＰｒＰＳＣの検出に対するＰＫの影響を、２種類の異なる検出抗体、すなわちＰＯＭ２（オクタリピート領域エピトープ）およびＰＯＭ１７（エピトープは、プロテアーゼ耐性断片９０〜２３１位残基内に存在する）を用いて調べた（Ｐｏｌｙｍｅｎｉｄｏｕら、Ｌａｎｃｅｔ、第４巻、８０４〜８１４頁、２００５年）。表７は、この実験の結果を示している。上記の実験から分かるように、ＰＯＭ２を検出に用いた場合、４μｇ／ｍＬ  ＰＫでの処理により、感度が約１／４に低下し、ＰＫ濃度をさらに高めると、感度がさらに低下した。同様のＰＫ濃度で、ＰＯＭ１７を検出に用いた場合は、９０〜２３１領域がＰＫに対して比較的耐性を有するため、感度の低下が小さかった。これらの結果は、ＰｒＰＳＣのプロテアーゼ耐性特性についての既知の事実および予想と一致しており、ＰｒＰＳｃの９０〜２３１位残基が穏やかなプロテアーゼ消化に対して耐性があるため、この領域内のエピトープを認識する抗体で検出することができ、一方、Ｎ末端の２３〜９０位残基がＰＫに対して感受性であるため、オクタリピート領域に結合する抗体は、結合部位を失ってしまう。この実験はまた、様々な濃度（逓増）のＰＫで処理すると、９０〜２３１位残基も分解されるため、たとえＰＯＭ１７を検出に用いた場合でも、ＲＬＵレベルが約１６から１０に低下することを実証した。
【０１０２】
（実施例６）
ヒツジＰｒＰＳＣの検出におけるトリプシン濃度の影響
ＥＬＩＳＡプレート（Ｍｉｃｒｏｌｉｔｅ  ２＋）を、４℃で一晩、０．１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４．Ｈ２Ｏに溶解したＰＯＭ１９（３．３μｇ／ｍＬ、ｐＨ６）１５０μＬで被覆し、３７℃で１時間、ＴＢＳＴに溶解した０．０２％カゼインでブロックした。
【０１０３】
正常ヒツジ血漿を２５０ｎＬ／ｍＬ  １０％スクレイピー脳ホモジネートを用いてまたは用いずに添加した。Ｇｒｅｉｎｅｒプレートの各ウェルで、血漿試料７０μＬおよび３．３×ＴＢＳＴＴ（ＴＢＳ、１％Ｔｗｅｅｎ２０、および１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）３０μＬを、３７℃で２時間、７５０ｒｐｍで振盪しながら、ＰＳＲビーズ（３０ｍｇ  ＰＳＲ／ｍＬ）３μＬと共にインキュベートした。ＰＳＲビーズをＴＢＳＴ（ＴＢＳおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で４回洗浄した。次いで、トリプシンの濃度が異なるＴＢＳＴ  １００μＬを各ウェルに添加した。プレートを、３７℃で３０分間、７５０ｒｐｍで振盪しながらインキュベートした。ＰＭＳＦ（最終濃度１ｍＭ）を添加し、室温で１０分間、７５０ｒｐｍで振盪しながらインキュベートした。ビーズを上記のように再度洗浄してから、室温の０．１Ｎ  ＮａＯＨ  ７５μＬを各ウェルに添加し、１０分間、７５０ｒｐｍで振盪した。室温の０．３Ｎ  ＮａＨ２ＰＯ４  ３０μＬを添加し、５分間、７５０ｒｐｍで振盪して、この反応を中和した。ＰＯＭ１９被覆ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに対して、ビーズから溶出した試料１５０μＬを添加し、３７℃で１時間、３００ｒｐｍで振盪しながらインキュベートした。
【０１０４】
０．００１×カゼイン−ＴＢＳＴに溶解したＰＯＭ２−ＡＰ（０．０１μｇ／ｍＬ）を検出抗体として用い、３７℃で１時間インキュベートした。基質（Ｌｕｍｉ−Ｐｈｏｓ  Ｐｌｕｓおよびエンハンサー）を３７℃で３０分間インキュベートし、Ｌｕｍｉｎｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔによって検出した。この結果を表８に示す。この実施例は、１００μｇ／ｍＬもの高濃度のトリプシンであっても、ＰｒＰＳｃの検出シグナルを低下させないことを実証した。
【０１０５】
【表７】
2010523978.tif 000009
【０１０６】
【表８】
2010523978.tif 000010
好適な実施形態をかなり詳細に説明したが、本明細書に明示した開示の精神および範囲から逸脱することなく、自明の変更形態が可能であることを理解されたい。
【図１】
2010523978.tif 000011
【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2010523978.tif 000014
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【国際調査報告】
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