(57)【要約】   本発明は、カスパーゼ阻害剤として用いることができるピリダジノン誘導体、その製造方法、及びそれを含有するカスパーゼ阻害用医薬組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）： 
【化０１５】
2010509318.tif 000017
（式中の、
Ｉ）Ｒ１はＨ、Ｃ１−Ｃ５−アルキル、Ｃ３−Ｃ１０−シクロアルキル、アリール、または全ての天然アミノ酸の側鎖残基を表し、
ＩＩ）Ｒ２はＨ、Ｃ１−Ｃ５−アルキル、Ｃ３−Ｃ１０−シクロアルキル、アリール、または全ての天然アミノ酸の側鎖残基を表し、
ＩＩＩ）Ｒ３はＨ、Ｃ１−Ｃ５−アルキル、アリール、ヒドロキシ、Ｃ１−Ｃ５−アルコキシ、またはハロゲンを表し、
ＩＶ）Ｒ４はＨ、Ｃ１−Ｃ５−アルキル、Ｃ３−Ｃ１０−シクロアルキル、またはアリールを表し、
Ｖ）Ｒ５はＨ、Ｃ１−Ｃ５−アルキル、Ｃ３−Ｃ１０−シクロアルキル、またはアリールを表し、
ＶＩ）Ｒ６及びＲ７はそれぞれ互いに独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ５−アルキル、Ｃ３−Ｃ１０−シクロアルキル、またはアリールを表し、そして
ＶＩＩ）Ｘは−ＣＨ２ＯＲ９（Ｒ９はＣ１−Ｃ５−アルキル、Ｃ３−Ｃ１０−シクロアルキル、またはアリールである）、−ＣＨ２ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ１０（Ｒ１０はＣ１−Ｃ５−アルキル、Ｃ３−Ｃ１０−シクロアルキル、またはアリールである）、または−ＣＨ２−Ｗ（Ｗはハロゲンである）を表す）：
の化合物または薬学的に許容されるその塩。
【請求項２】
Ｒ５が、置換されていてもよいＣ３−Ｃ１０−シクロアルキルまたは置換されていてもよいアリールで置換されているＣ１−Ｃ５−アルキルを表すか；または置換されていてもよいアリールを表す、請求項１に記載の化合物または薬学的に許容されるその塩。
【請求項３】
Ｒ５が、Ｃ１−Ｃ５−アルキル、ヒドロキシ、Ｃ１−Ｃ５−アルコキシ及びハロゲンからなる群から選択された一つ以上の置換基でそれぞれ置換されていてもよいＣ３−Ｃ１０−シクロアルキルまたはアリールで置換されているＣ１−Ｃ５−アルキルを表すか；またはＣ１−Ｃ５−アルキル、ヒドロキシ、Ｃ１−Ｃ５−アルコキシ及びハロゲンからなる群から選択された一つ以上の置換基で置換されていてもよいアリールを表す、請求項２に記載の化合物または薬学的に許容されるその塩。
【請求項４】
Ｉ）Ｒ１が全ての天然アミノ酸の側鎖残基を表し、
ＩＩ）Ｒ２がＣ１−Ｃ５−アルキルを表し、
ＩＩＩ）Ｒ３がＨ、Ｃ１−Ｃ５−アルキル、アリール、Ｃ１−Ｃ５−アルコキシ、またはハロゲンを表し、
ＩＶ）Ｒ４がＨを表し、
Ｖ）Ｒ５がＣ１−Ｃ５−アルキル、ヒドロキシ、Ｃ１−Ｃ５−アルコキシ及びハロゲンからなる群から選択された一つ以上の置換基でそれぞれ置換されていてもよいＣ３−Ｃ１０−シクロアルキルまたはアリールで置換されているＣ１−Ｃ５−アルキルを表すか；またはＣ１−Ｃ５−アルキル、ヒドロキシ、Ｃ１−Ｃ５−アルコキシ及びハロゲンからなる群から選択された一つ以上の置換基で置換されていてもよいアリールを表し、
ＶＩ）Ｒ６及びＲ７がそれぞれ互いに独立して、Ｈを表し、
ＶＩＩ）Ｘが−ＣＨ２ＯＲ９（Ｒ９はＣ１−Ｃ５−アルキル、Ｃ３−Ｃ１０−シクロアルキル、またはアリールである）、−ＣＨ２ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ１０（Ｒ１０はＣ１−Ｃ５−アルキル、Ｃ３−Ｃ１０−シクロアルキル、またはアリールである）、または−ＣＨ２−Ｗ（Ｗはハロゲンである）を表す、請求項１に記載の化合物または薬学的に許容されるその塩。
【請求項５】
Ｉ)Ｒ１が−ＣＨ２ＣＯＯＨを表し、
ＩＩ)Ｒ２がＣ１−Ｃ５−アルキルを表し、
ＩＩＩ）Ｒ３がＨ、Ｃ１−Ｃ５−アルキル、アリール、Ｃ１−Ｃ５−アルコキシ、またはハロゲンを表し、
ＩＶ）Ｒ４がＨを表し、
Ｖ）Ｒ５が、Ｃ１−Ｃ５−アルキル、ヒドロキシ、Ｃ１−Ｃ５−アルコキシ及びハロゲンからなる群から選択された一つ以上の置換基でそれぞれ置換されていてもよいＣ３−Ｃ１０−シクロアルキルまたはアリールで置換されているＣ１−Ｃ５−アルキルを表すか；またはＣ１−Ｃ５−アルキル、ヒドロキシ、Ｃ１−Ｃ５−アルコキシ及びハロゲンからなる群から選択された一つ以上の置換基で置換されていてもよいアリールを表し、
ＶＩ）Ｒ６及びＲ７がそれぞれ互いに独立して、Ｈを表し、
ＶＩＩ）Ｘが−ＣＨ２Ｏ−（２，３，５，６−テトラフルオロフェニル）、−ＣＨ２Ｏ−（２，６−ジクロロベンゾイル）、または−ＣＨ２−Ｆを表す、請求項１に記載の化合物または薬学的に許容されるその塩。
【請求項６】
（Ｓ）−３−{２−［５−（２−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−６−オキソ−６Ｈ−ピリダジン−１−イル］−ブチリルアミノ}−４−オキソ−５−（２，３，５，６−テトラフルオロ−フェノキシ）−ペンタン酸。
【請求項７】
薬学的に許容される担体と共に、請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物または薬学的に許容されるその塩を活性成分として含有するカスパーゼ阻害用医薬組成物。
【請求項８】
炎症及びアポトーシスの予防用である、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
認知症、脳卒中、ＡＩＤＳによる脳損傷、糖尿病、胃潰瘍、肝炎による脳損傷、肝炎による肝疾患、急性肝炎、劇症肝不全、敗血症、臓器移植拒絶反応、関節リウマチ、虚血性心臓疾患による心臓細胞壊死、または肝硬変の治療または予防用である、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
急性肝炎または肝硬変の治療用である、請求項７に記載の医薬組成物。  
【請求項１１】
関節リウマチの治療用である、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
カスパーゼを阻害するための、請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物または薬学的に許容されるその塩の使用。
【請求項１３】
患者に、請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物または薬学的に許容されるその塩の治療的有効量を投与することを含む、患者における炎症及びアポトーシスを予防する方法。
【請求項１４】
患者に、請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物または薬学的に許容されるその塩の治療的有効量を投与することを含む、認知症、脳卒中、ＡＩＤＳによる脳損傷、糖尿病、胃潰瘍、肝炎による脳損傷、肝炎による肝疾患、急性肝炎、劇症肝不全、敗血症、臓器移植拒絶反応、関節リウマチ、虚血性心臓疾患による心臓細胞壊死、または肝硬変を治療または予防する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カスパーゼ−１［インターロイキン−１β−変換酵素、ＩＣＥ］、カスパーゼ−３［アポパイン（apopain）／ＣＰＰ−３２］、カスパーゼ−８及びカスパーゼ−９を含む各種カスパーゼに対する阻害剤としてのピリダジノン誘導体または薬学的に許容されるその塩、及びそれを含むカスパーゼ阻害用医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
カスパーゼは、最近１０余年の間に発見されたα２β２テトラマー形態の新しい種類のシステインプロテアーゼである。現在までに、約１４種類のカスパーゼが知られている。それらの中の一つであるカスパーゼ−１（ＩＣＥ）は、サイトカインの一種であり、生物学的に不活性なプロインターロイキン−１βを活性なインターロイキン−１βへ変換することに関与する。インターロイキン−１は、インターロイキン−１αとインターロイキン−１βとからなり、両方ともに単核細胞（monocytes）で３１ＫＤａの前駆物質の形態に合成される。その中で、プロインターロイキン−１βのみがＩＣＥによって活性化される。カスパーゼ−１によって加水分解される位置は、Ａｓｐ２７−Ｇｌｙ２８とＡｓｐ１１６−Ａｌａ１１７である。後者の位置が加水分解されると、インターロイキン−１βが得られる。インターロイキン−１βは、炎症発生において重要なメディエーターとして作用すると報告されている（非特許文献１，非特許文献５〜９）。カスパーゼ−１は１９８９年に初めて発見され、その３次元構造が、２つの独立した研究グループによってＸ線結晶学的方法で明らかにされた。
【０００３】
カスパーゼ−３（ＣＰＰ−３２）は、その役割または作用機序について広く研究されており、その３次元構造は１９９６年に明らかになった（非特許文献２〜４）。プロカスパーゼ−３から活性化されたカスパーゼ−３（アポパイン）は（Ｐ４）Ａｓｐ−Ｘ−Ｘ−Ａｓｐ（Ｐ１）モチーフの位置で加水分解され、公知の基質としては、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ、Ｕ１ ７０，０００Ｍｒの核内低分子リボヌクレオタンパク質及び４６０，０００ＭｒのＤＮＡ−依存性プロテインキナーゼの触媒的サブユニットなどが挙げられる。カスパーゼ−７のＸ線構造はカスパーゼ−３の構造とよく似ていると報告されている（非特許文献１０）。
【０００４】
カスパーゼ−８及び９はカスパーゼ−３、６、７の上流に存在し、このカスパーゼはいずれもアポトーシスカスケードに関与することが知られている。カスパーゼ−８のＸ線構造は１９９９年に明らかになっており（非特許文献１１、１２）、特に、その阻害剤はアポトーシスと関連した疾患を治療するのに有利に使用することができる。
【０００５】
カスパーゼ阻害剤とは、カスパーゼの活性を阻害して、カスパーゼ活性によって誘発される炎症やアポトーシスなどの症状を制御する化合物を意味する。この阻害剤を投与して治療または緩和しうる疾患または症状としては、たとえば、認知症、脳卒中、ＡＩＤＳによる脳損傷、糖尿病、胃潰瘍、肝炎ウィルスによる脳損傷、肝炎による肝疾患、急性肝炎、劇症肝不全、敗血症、臓器移植拒絶反応、関節リウマチ、虚血性心臓疾患、及び肝硬変が挙げられる（非特許文献１３〜３０）。
【０００６】
現在までに知られているカスパーゼ阻害剤の中で、最も知られている不可逆的阻害剤は次の化合物である：
【０００７】
【化００１】
2010509318.tif 000002
【０００８】
上記の二つの阻害剤は、酵素を不可逆的に不活性化して細胞アポトーシスを抑制する共通の機序に基づいてそれらの活性を阻害する（不可逆、広域スペクトル阻害剤）。不可逆的な阻害剤は可逆的阻害剤よりもずっと効果的な阻害活性を持っていると報告されている（非特許文献３１）。ＩＤＮ−１９６５（IDUN社製）とＭＸ−１０１３（Maxim社製）は、いずれも肝損傷関連細胞アポトーシスモデルで活性を示すことと報告されている（非特許文献３２、３３）。これらの化合物は現在、前臨床研究の段階にある。
【０００９】
不可逆的阻害剤であるＩＤＮ−６５５６は、Ｃ型肝炎患者への肝臓保護薬として臨床試験のフェーズIIの段階にある（非特許文献３４、２８）。
【００１０】
【化００２】
2010509318.tif 000003
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates, 2nd ed., ed by Gallin, Goldstein and Snyderman. Raven Press Ltd., New York. 1992, pp211-232; Blood, 1996, 87(6), 2095-2147.
【非特許文献２】Wilson, K. P. et al., Nature, 1994, 370. 270.
【非特許文献３】Walker, N. P. C. et al., Cell, 1994, 78, 343.
【非特許文献４】Nature Structural Biology, 1996, 3(7), 619.
【非特許文献５】Thornberry, N. A. et al., Nature, 1992, 356, 768.
【非特許文献６】Nature Biotechnology, 1996, 14, 297.
【非特許文献７】Protein Science, 1995, 4, 3.
【非特許文献８】Nature, 1995, 376(July 6), 37.
【非特許文献９】Protein Science, 1995, 4, 2149.
【非特許文献１０】Wei, Y. et al, Chemistry and Biology, 2000, 7, 423.
【非特許文献１１】Blanchard H. et al, Structure, 1999, 7, 1125.
【非特許文献１２】Blanchard H. et al, J. of Mol. Biol., 2000, 302, 9.
【非特許文献１３】カスパーゼ関連疾患の文献；  認知症：Arch Neurol 2003 Mar;60(3):369-76, Caspase gene expression in the brain as a function of the clinical progression of Alzheimer disease. Pompl PN, Yemul S, Xiang Z, Ho L, Haroutunian V, Purohit D, Mohs R, Pasinetti GM.
【非特許文献１４】カスパーゼ関連疾患の文献；脳卒中：Proc Natl Acad Sci USA 2002 Nov 12;99(23):15188-93, Caspase activation and neuroprotection in caspase-3-deficient mice after in vivo cerebral ischemia and in vitro oxygen glucose deprivation. Le DA, Wu Y, Huang Z, Matsushita K, Plesnila N, Augustinack JC, Hyman BT, Yuan J, Kuida K, Flavell RA, Moskowitz MA.
【非特許文献１５】カスパーゼ関連疾患の文献；ＡＩＤＳによる脳損傷：J Neurosci 2002 May 15;22(10):4015-24, Caspase cascades in human immunodeficiency virus-associated neurodegeneration. Garden GA, Budd SL, Tsai E, Hanson L, Kaul M, D'Emilia DM, Friedlander RM, Yuan J, Masliah E, Lipton SA.
【非特許文献１６】カスパーゼ関連疾患の文献；糖尿病：Diabetes 2002 June;51(6):1938-48, Hyperglycemia-induced apoptosis in mouse myocardium: mitochondrial cytochrome C-mediated caspase-3 activation pathway. Cai L, Li W, Wang G, Guo L, Jiang Y, Kang YJ.
【非特許文献１７】カスパーゼ関連疾患の文献；  胃潰瘍：J Physiol Pharmacol 1998 Dec;49(4):489-500, Role of basic fibroblast growth factor in the suppression of apoptotic caspase-3 during chronic gastric ulcer healing. Slomiany BL, Piotrowski J, Slomiany A.
【非特許文献１８】カスパーゼ関連疾患の文献；  肝炎ウィルスによる脳損傷：J Viral Hepat 2003 Mar;10(2):81-6, Cerebral dysfunction in chronic hepatitis C infection. Forton DM, Taylor-Robinson SD, Thomas HC.
【非特許文献１９】カスパーゼ関連疾患の文献；  劇症肝不全：Gastroenterology 2000 Aug;119(2):446-60, Tumor necrosis factor alpha in the pathogenesis of human and murine fulminant hepatic failure. Streetz K, Leifeld L, Grundmann D, Ramakers J, Eckert K, Spengler U, Brenner D, Manns M, Trautwein C.
【非特許文献２０】カスパーゼ関連疾患の文献；  敗血症：Nat Immunol 2000 Dec;1(6):496-501, Caspase inhibitors improve survival in sepsis: a critical role of the lymphocyte. Hotchkiss RS, Chang KC, Swanson PE, Tinsley KW, Hui JJ, Klender P, Xanthoudakis S, Roy S, Black C, Grimm E, Aspiotis R, Han Y, Nicholson DW, Karl IE.
【非特許文献２１】カスパーゼ関連疾患の文献；  臓器移植拒絶反応：Xenotransplantation 2001 May;8(2):115-24, In vitro prevention of cell-mediated xeno-graft rejection via the Fas/FasL-pathway in CrmA-transducted porcine kidney cells. Fujino M, Li XK, Suda T, Hashimoto M, Okabe K, Yaginuma H, Mikoshiba K, Guo L, Okuyama T, Enosawa S, Amemiya H, Amano T, Suzuki S.
【非特許文献２２】カスパーゼ関連疾患の文献；  関節リウマチ：Prog Med Chem 2002;39:1-72, Caspase inhibitors as anti-inflammatory and antiapoptotic agents. Graczyk PP.
【非特許文献２３】カスパーゼ関連疾患の文献；  虚血性心臓疾患：Am J Physiol Heart Circ Physiol 2002 Sep;283(3):H990-5, Hypoxia-induced cleavage of caspase-3 and DFF45/ICAD in human failed cardiomyocytes. Todor A, Sharov VG, Tanhehco EJ, Silverman N, Bernabei A, Sabbah HN.
【非特許文献２４】カスパーゼ関連疾患の文献；  抗炎症：J Immunol 2003 Mar 15;170(6):3386-91, A broad-spectrum caspase inhibitor attenuates allergic airway inflammation in murine asthma model. Iwata A, Nishio K, Winn RK, Chi EY, Henderson WR Jr, Harlan JM.
【非特許文献２５】カスパーゼ関連疾患の文献；  肝炎による肝疾患：i) J Viral Hepat. 2003 Sep;10(5):335-42. Apoptosis in hepatitis C. Kountouras J, Zavos C, Chatzopoulos D.
【非特許文献２６】カスパーゼ関連疾患の文献；  肝炎による肝疾患：ii) Apoptosis 2003 Dec;8(6):655-63. Apoptosis participates to liver damage in HSV-induced fulminant hepatitis. Pretet JL, Pelletier L, Bernard B, Coumes-Marquet S, Kantelip B, Mougin C.
【非特許文献２７】カスパーゼ関連疾患の文献；  肝炎による肝疾患：iii) Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Jun 24; 100(13):7797-802. Caspase 8 small interfering RNA prevents acute liver failure in mice. Zender L, Hutker S, Liedtke C, Tillmann HL, Zender S, Mundt B, Waltemathe M, Gosling T, Flemming P, Malek NP, Trautwein C, Manns MP, Kuhnel F, Kubicka S.
【非特許文献２８】カスパーゼ関連疾患の文献；肝硬変：i) J Pharmacol Exp Ther. 2004 Mar;308(3):1191-6, The caspase inhibitor Idn-6556 attenuates hepatic injury and fibrosis in the bile duct ligated mouse. Canbay A., Fledstein A., Baskin-Bey E., Bronk FS.  Gores GJ.
【非特許文献２９】カスパーゼ関連疾患の文献；肝硬変：ii) Hepatology. 2004 Feb; 39(2): 273-8, Apoptosis: the nexus of liver injury and fibrosis. Canbay A, Friedman S, Gores GJ.
【非特許文献３０】カスパーゼ関連疾患の文献；肝硬変：iii) Hepatology. 2003 Nov; 38(5): 1188-98, Kupffer cell engulfment of apoptotic bodies stimulates death ligand and cytokine expression. Canbay A, Feldstein AE, Higuchi H, Werneburg N, Grambihler A, Bronk SF, Gores GJ.
【非特許文献３１】Wu J. et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 1999, 17, 320.
【非特許文献３２】Hoglen N. C. et al, J. of Pharmacoloy and Experimental Therapeutics, 2001, 297, 811.
【非特許文献３３】Jaeschke H. et al, Toxicology and Applied Pharmacology, 2000, 169, 77.
【非特許文献３４】Hoglen N.C. et al, J. Pharmacol Exp. Ther., 2004, 309(2):634. Characterization of IDN-6556 (3-[2-(2-tert-butyl-phenylaminooxalyl)-amino]-propionylamino]-4-oxo-5-(2,3,5,6-tetrafluoro-phenoxy)-pentanoic acid): a liver-targeted caspase inhibitor.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明者らは、カスパーゼに対して、効果的で、且つ高い選択性を有する阻害剤として使用しうる新しい化合物をデザインするために鋭意研究を行った。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記の目的を達成するために、本発明者らは様々な化合物を合成して、カスパーゼに対するそれらの結合能及び阻害活性を測定した。その結果、下記式（１）の化合物がこのような条件を満たすことを見出し、本発明に到った。
【００１４】
【化００３】
2010509318.tif 000004
【００１５】
式中の、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＸは下記の定義と同義である。
従って、本発明はカスパーゼに対して効果的な阻害活性を有する式（１）の新規なピリダジノン誘導体または薬学的に許容されるその塩を提供する。
【００１６】
また、薬学的に許容される担体と共に、式（１）の化合物または薬学的に許容されるその塩を活性成分として含有している、カスパーゼを阻害する医薬組成物、具体的には炎症及びアポトーシスを予防する医薬組成物を提供することが本発明の他の目的である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明に係る式（１）の化合物はカスパーゼに対して優れた阻害活性を有し、そしてカスパーゼが介在する様々な疾患及び症状の治療に有利に使用することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
まず第１に、本発明における重要用語は下記のように定義される。
ａ）Ｃ１−Ｃ５−アルキル：１〜５個の炭素原子を有する直鎖状または分枝状の炭化水素であって、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｔ−ブチルなどを包含するが、これらに限定されない。
【００１９】
ｂ）Ｃ３−Ｃ１０−シクロアルキル：３〜１０個の炭素原子を有する環状炭化水素であって、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどを包含するが、これらに限定されない。
【００２０】
ｃ）アリール：アリール基は芳香族基とヘテロ芳香族基及びその部分還元誘導体を全て含む。芳香族基は単一または縮合された５〜１５員環の不飽和炭化水素である。ヘテロ芳香族基は酸素、硫黄及び窒素からなる群から選択された１〜５個のヘテロ原子を有する芳香族基である。アリール基はフェニル、ナフチル、インドリル、キノリニル、イソキノリル、イミダゾリニル、イソオキサゾリル、オキサゾリル、チアゾリルなどを包含するが、これらに限定されない。
【００２１】
上記Ｃ１−Ｃ５−アルキル、Ｃ３−Ｃ１０−シクロアルキルまたはアリール基中の一つ以上の水素は、下記から選択された基で置換されていてもよい：アシル、アミノ、カルボアルコキシ、カルボキシ、カルボキシアミノ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、チオ、アルキル、シクロアルキル、アルコキシ、アリール、アリールオキシ、スルホキシ及びグアニド基。
【００２２】
ｄ）天然アミノ酸は下記のものを含む：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、プロリン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン。
【００２３】
また、本明細書には下記の略語が含まれる。
ＮＢＳ：Ｎ−ブロモスクシンイミド
ＨＡＴＵ：Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＤＭＦ ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ ：ジメチルスルホキシド
ＮＭＭ ：Ｎ−メチルモルホリン
ＡＩＢＮ： ２，２'−アゾビス（２−メチルプロピオニトリル）
ＴＥＭＰＯ：２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシ、フリーラジカル
ＬｉＨＭＤＳ：リチウムビス（トリメチルシリル）アミド
ＨＥＰＥＳ：Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ'−（２'−エタンスルホン酸）
ＣＨＡＰＳ：３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアミノ］−１−プロパンスルホネート
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸
ＤＴＴ：ジチオスレイトール
【００２４】
以下、本発明をより具体的に説明する。本発明の一態様はカスパーゼに対する阻害剤として有用な、下記式（１）のピリダジノン誘導体または薬学的に許容されるその塩に関する。
【００２５】
【化００４】
2010509318.tif 000005
【００２６】
式中の、
Ｉ）Ｒ１はＨ、Ｃ１−Ｃ５−アルキル、Ｃ３−Ｃ１０−シクロアルキル、アリール、または全ての天然アミノ酸の側鎖残基を表し、
ＩＩ）Ｒ２はＨ、Ｃ１−Ｃ５−アルキル、Ｃ３−Ｃ１０−シクロアルキル、アリール、または全ての天然アミノ酸の側鎖残基を表し、
ＩＩＩ）Ｒ３はＨ、Ｃ１−Ｃ５−アルキル、アリール、ヒドロキシ、Ｃ１−Ｃ５−アルコキシ、またはハロゲンを表し、
ＩＶ）Ｒ４はＨ、Ｃ１−Ｃ５−アルキル、Ｃ３−Ｃ１０−シクロアルキル、またはアリールを表し、
Ｖ）Ｒ５はＨ、Ｃ１−Ｃ５−アルキル、Ｃ３−Ｃ１０−シクロアルキル、またはアリールを表し、
ＶＩ）Ｒ６及びＲ７はそれぞれ互いに独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ５−アルキル、Ｃ３−Ｃ１０−シクロアルキル、またはアリールを表し、
ＶＩＩ）Ｘは−ＣＨ２ＯＲ９（Ｒ９はＣ１−Ｃ５−アルキル、Ｃ３−Ｃ１０−シクロアルキル、またはアリールである）、−ＣＨ２ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ１０（Ｒ１０はＣ１−Ｃ５−アルキル、Ｃ３−Ｃ１０−シクロアルキル、またはアリールである）、または−ＣＨ２−Ｗ（Ｗはハロゲンである）を表す。
【００２７】
本発明に係る式（１）の化合物において、Ｒ１は、好ましくは全ての天然アミノ酸の側鎖残基、より好ましくは−ＣＨ２ＣＯＯＨを表す。式（１）の化合物は、Ｒ１基によってＲ１が結合した炭素が立体中心になるとき、２種の立体異性体、またはそれらの混合物（ジアステレオマー混合物）を含んでいてもよい。Ｒ１がカルボキシル部分を含むアミノ酸の側鎖残基であるとき、式（１）の化合物はエステル形態（−ＣＯ２Ｙ１、ここで、Ｙ１はＣ１−Ｃ５−アルキルである）、スルホンアミド形態（−ＣＯＮＨＳＯ２Ｙ２、ここで、Ｙ２はＣ１−Ｃ５−アルキルである）、及び薬学的に許容される塩形態を含んでいてもよく；または式（１）の化合物は、Ｒ１が塩基部分を含むアミノ酸の側鎖残基であるとき、薬学的に許容される塩の形態で存在していてもよい。
【００２８】
本発明の化合物（式（１ａ））は、Ｒ１が−ＣＨ２ＣＯＯＨであるとき、環状ケタールの形態（式（１ｂ））で存在できるので、当業者であれば環状ケタール（式（１ｂ））も本発明に含まれることを理解することができる。
【００２９】
【化００５】
2010509318.tif 000006
【００３０】
また、上記化合物の平衡形態には、それらの互変異性形態が含まれることを理解しなければならない。
【００３１】
Ｒ２は、好ましくはＣ１−Ｃ５−アルキルを表し、より好ましくはメチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、またはｔ−ブチルを表す。式（１）の化合物は、Ｒ２基によってＲ２が結合した炭素が立体中心になるとき、２種の立体異性体、またはそれらの混合物（ジアステレオマー混合物）を含んでいてもよい。式（１）の化合物は、Ｒ２がカルボキシル部分を含むアミノ酸の側鎖残基であるとき、エステル形態（−ＣＯ２Ｙ１、ここで、Ｙ１はＣ１−Ｃ５−アルキルである）、スルホンアミド形態（−ＣＯＮＨＳＯ２Ｙ２、ここで、Ｙ２はＣ１−Ｃ５−アルキルである）、及び薬学的に許容される塩の形態を含んでいてもよく；または式（１）の化合物は、Ｒ２が塩基部分を含むアミノ酸の側鎖残基であるとき、薬学的に許容される塩の形態で存在していてもよい。
【００３２】
Ｒ３は、好ましくはＨ、Ｃ１−Ｃ５−アルキル、アリール、Ｃ１−Ｃ５−アルコキシ、またはハロゲンを表し、より好ましくはＨ、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、またはｔ−ブチル、メトキシ、エトキシ、フルオロ、またはクロロを表す。
Ｒ４は、好ましくはＨを表す。
【００３３】
Ｒ５は、好ましくはそれぞれが置換されていてもよいＣ３−Ｃ１０−シクロアルキルまたはアリールによって置換されたＣ１−Ｃ５−アルキルを表すか；または置換されていてもよいアリールを表す。Ｒ５は、より好ましくはＣ１−Ｃ５−アルキル、ヒドロキシ、Ｃ１−Ｃ５−アルコキシ及びハロゲンからなる群から選択された一つ以上の置換基でそれぞれが置換されていてもよいＣ３−Ｃ１０−シクロアルキルまたはアリールによって置換されたＣ１−Ｃ５−アルキル；またはＣ１−Ｃ５−アルキル、ヒドロキシ、Ｃ１−Ｃ５−アルコキシ及びハロゲンからなる群から選択された一つ以上の置換基で置換されていてもよいアリールを表す。例えば、Ｒ５は、フェニル、ナフチル、インドリル、キノリニル、イソキノリル、イミダゾリニル、イソオキサゾリル、オキサゾリル、またはチアゾリルであるか、またはそれぞれがメチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｔ−ブチル、メトキシ、エトキシ、トリハロメチル、及びハロゲンからなる群から選択された一つ以上の置換基で置換されていてもよいフェニル、ナフチル、インドリル、キノリニル、イソキノリル、イミダゾリニル、イソオキサゾリル、オキサゾリル、チアゾリルまたはシクロヘキシルで置換されたメチルである。
【００３４】
Ｒ６及びＲ７は、それぞれ、好ましくは、Ｈを表す。
Ｒ９は、好ましくは一つ以上のハロゲンによって置換されたアリール、より好ましくは一つ以上のフッ素によって置換されたフェニル、最も好ましくは２，３，５，６−テトラフルオロフェニルを表す。
Ｒ１０は、好ましくは一つ以上のハロゲンによって置換されたアリール、より好ましくは一つ以上の塩素によって置換されたフェニル、最も好ましくは２，６−ジクロロフェニルを表す。
Ｗは、好ましくはＦを表す。
【００３５】
最も好ましい化合物は下記群から選択された化合物である。
３−｛２−［５−（２−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−３−メチル−６−オキソ−６Ｈ−ピリダジン−１−イル］−ブチリルアミノ｝−５−フルオロ−４−オキソ−ペンタン酸（１）;
（Ｓ）−３−｛２−［５−（２−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−３−メチル−６−オキソ−６Ｈ−ピリダジン−１−イル］−ブチリルアミノ｝−４−オキソ−５−（２，３，５，６−テトラフルオロ−フェノキシ）−ペンタン酸（２）;
（Ｓ）−３−｛２−［５−（２−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−３−メチル−６−オキソ−６Ｈ−ピリダジン−１−イル］−プロピオニルアミノ｝−４−オキソ−５−（２，３，５，６−テトラフルオロ−フェノキシ）−ペンタン酸（３）;
（Ｓ）−３−｛２−［５−（２−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−３-メチル−６−オキソ−６Ｈ−ピリダジン−１−イル］−アセチルアミノ｝−４−オキソ−５−（２，３，５，６−テトラフルオロ-フェノキシ）−ペンタン酸（４）;
（Ｓ）−３−｛２−［５−（２−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−６−オキソ−６Ｈ−ピリダジン−１−イル］−ブチリルアミノ｝−４−オキソ−５−（２，３，５，６−テトラフルオロ-フェノキシ）−ペンタン酸（５）;及び
（Ｓ）−３−｛２−［３−（２−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−６−オキソ−６Ｈ−ピリダジン−１−イル］−ブチリルアミノ｝−４−オキソ−５−（２，３，５，６−テトラフルオロフェノキシ）−ペンタン酸（６）。
【００３６】
カスパーゼに対して阻害作用を示す式（１）の新規なピリダジノン誘導体を製造する方法を、下記反応式１〜３に表す。しかし、下記反応式に説明される方法は、本発明で用いる典型的な方法のみを表す。操作の順序、試薬、反応条件、溶媒などは制限無く変更できる。
【００３７】
（反応式１）
【化００６】
2010509318.tif 000007
【００３８】
上記反応式において、Ｒ５’はＣＨ２基を除いたＲ５を表す。
上記反応式１において、芳香族アルデヒドと６−アルキル−４，５−ジヒドロ−２Ｈ−ピリダジン−３−オンは塩基の存在下にエタノール中で反応して、ピリダジノン化合物（３）を得る。この化合物（３）を適切な溶媒及び塩基の存在下でα−ハロ−α−アルキルアセテートと反応させて、化合物（４）を得る。必要であれば、化合物（４）を加水分解して、脱保護されたカルボン酸誘導体（５）を得る。
【００３９】
（反応式２）
【化００７】
2010509318.tif 000008
【００４０】
上記反応式２及び下記反応式３において、Ｚは−ＯＲ９（ここで、Ｒ９はＣ１−Ｃ５−アルキル、Ｃ３−Ｃ１０−シクロアルキル、またはアリールである）、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ１０（ここで、Ｒ１０はＣ１−Ｃ５−アルキル、Ｃ３−Ｃ１０−シクロアルキル、またはアリールである）、または−Ｗ（Ｗはハロゲンである）を表す。
【００４１】
上記反応式２で示されるように、カルボン酸誘導体（５）をアスパラギン酸誘導体（１０）（下記反応式３を参照されたい）とカップリングして化合物（６）を得て、これをデス・マーチン(Dess−Martin)ペルヨージナン酸化反応させ、必要に応じて脱保護して所望の化合物（１）を得る。
【００４２】
反応式２で示した化合物（１）中の官能基Ｚは、反応式３の工程に従って所望のＺ基を既に有する化合物（１０）を最初に合成して、これをカルボン酸化合物（５）と反応させることにより形成できる（国際公開ＷＯ第００／２３４２１号公報を参照されたい）。または、カルボン酸化合物（５）とアスパラギン酸（β−ｔ−Ｂｕ）メチルエステルとを混合して加水分解した後、反応式３の工程に従って所望のＺ基を導入することができる。ＺがＦであるとき、公知の方法（Tetrahedron Letters,1994,35(52),9693-9696）によってラセミ化合物を製造することができる。
【００４３】
（反応式３）
【化００８】
2010509318.tif 000009
【００４４】
本発明に係る上記式（１）の化合物は、下記実験例の結果によって立証されるように、カスパーゼに対する広域スペクトルの阻害活性を有しており、これにより、炎症及びアポトーシスの予防効果を有している。従って、本発明は、薬学的に許容される担体と共に、式（１）の化合物または薬学的に許容されるその塩を活性成分として含有する、カスパーゼ阻害用医薬組成物、具体的には炎症及びアポトーシスを予防するための治療用組成物を提供する。さらに詳しくは、本発明に係る組成物は認知症、脳卒中、ＡＩＤＳによる脳損傷、糖尿病、胃潰瘍、肝炎による脳損傷、肝炎による肝疾患、急性肝炎、劇症肝不全、敗血症、臓器移植拒絶反応、関節リウマチ、虚血性心臓疾患による心臓細胞壊死、または肝硬変の治療または予防効果を有する。
【００４５】
また、本発明はカスパーゼ阻害用、特に炎症及びアポトーシス予防用の式（１）の化合物または薬学的に許容されるその塩の使用を提供する。さらに、本発明は患者に式（１）の化合物または薬学的に許容されるその塩の治療的有効量を投与することを含む、患者における炎症及びアポトーシスを予防する方法を提供する。さらに、本発明は、患者に式（１）の化合物または薬学的に許容されるその塩の治療的有効量を投与することを含む、認知症、脳卒中、ＡＩＤＳによる脳損傷、糖尿病、胃潰瘍、肝炎による脳損傷、肝炎による肝疾患、急性肝炎、劇症肝不全、敗血症、臓器移植拒絶反応、関節リウマチ、虚血性心臓疾患による心臓細胞壊死、または肝硬変の治療または予防方法を提供する。
【００４６】
本発明の式（１）の化合物は、投与目的のために様々な医薬品形態に剤形化することができる。本発明に係る医薬組成物を製造するために、式（１）の化合物または薬学的に許容されるその塩の有効量を、製造しようとする剤形に従って選択される薬学的に許容される担体と混合する。
【００４７】
カスパーゼ阻害化合物は適用目的によって注射用製剤、経皮用製剤または経口用製剤として剤形化できる。投与の容易性及び用量の均一性の側面から組成物を単位投与形態で剤形化するのが特に有利である。
【００４８】
経口用製剤の場合には、あらゆる通常の医薬用担体を使用することができる。例えば、懸濁液、シロップ剤、エリキシル及び溶液剤のような経口液体製剤に、水、グリコール、油、アルコールなどを使用することができ；散剤、丸剤、カプセル剤及び錠剤のような固体製剤に、でんぷん、糖類、カオリン、潤滑剤、結合剤、崩解剤などを使用することができる。投与の容易性によって、錠剤及びカプセル剤が最も便利な服用形態である。錠剤及び丸剤は腸溶性製剤に製剤化することが好ましい。
【００４９】
非経口製剤の場合には、担体としては通常、滅菌水を使用し、溶解助剤のような他の成分も使用できる。注射用製剤、例えば，滅菌注射用水性または油性懸濁液は公知の技術に従い、適切な分散剤、湿潤剤、または懸濁剤を用いて製造できる。注射用製剤の製造に用いられる溶媒としては、水、リンゲル液及びＮａＣｌ等張液があり、滅菌固定油も溶媒または懸濁媒体として有利に使用できる。モノ−またはジ−グリセリドを含む無刺激性固定油もこのような目的のために使用できる。また、オレイン酸のような脂肪酸も注射用製剤に使用できる。
【００５０】
経皮製剤の場合には、担体として浸透促進剤及び／又は適当な湿潤剤を、任意に皮膚に対して顕著な刺激性のない適当な添加剤と共に混合して使用することができる。この添加剤は皮膚を通して投与を促進及び／又は所望の組成物の製造を支援することができる。経皮製剤は経皮用パッチ、滴下式または軟膏のような様々な方式で投与される。
【００５１】
本発明のカスパーゼ阻害化合物を臨床の目的で用いる場合は、１日に、体重１ｋｇ当たり０．１〜１００ｍｇの範囲の量で対象患者に投与するのが好ましい。１日の全投与量を１回または数回にわたって投与することができる。しかし、個々の患者に対する固有の投与量は、使われる特定化合物、患者の体重、性別、健康状態、または食生活、薬剤の投与時期または投与方法、排泄率、薬剤の混合比及び治療する疾患の重症度などによって変わり得る。
【実施例】
【００５２】
本発明を、下記実施例によってより具体的に説明する。しかし、これらの実施例は本発明に対する理解を助けるためだけのものであり、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【００５３】
製造例１−１）
１−ブロモメチル−２−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンゼン
１−ｔｅｒｔ−ブチル−２−メチル−ベンゼン（９４０ｍｇ、６．３４ｍｍｏｌ）、ＮＢＳ（１．２４ｇ、１．１当量）及びＡＩＢＮ（２０ｍｇ、触媒量）に、ＣＣｌ４（１２ｍＬ）を加えて、混合物を１時間還流した。懸濁した粒子をろ去し、ＣＣｌ４で洗浄した。有機層を合わせ、減圧下で濃縮して、黄色液体（１．５ｇ）を化学量論的収率で得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．４６（ｍ，１Ｈ）， ７．３８（ｍ，１Ｈ），７．２２−７．２１（ｍ，２Ｈ），４．８３（ｓ，２Ｈ），１．４６（ｓ，９Ｈ）
【００５４】
製造例１−２）
２−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンズアルデヒド
製造例１−１）の化合物（１．００ｇ、４．４ｍｍｏｌ）に、ＮａＨＣＯ３（１．８５ｇ、５．０当量）及びＤＭＳＯ（１０ｍＬ）を加えて、混合物を１００℃で３０分間加熱した。反応混合物を酢酸エチル（１００ｍＬ×２）で抽出し、水（５０ｍＬ×３）及び塩化ナトリウム水溶液（５０ｍＬ×１）で洗浄し、乾燥（無水Ｎａ２ＳＯ４）して、減圧下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（５％酢酸エチル／ヘキサン）で精製して、表題化合物（７５０ｍｇ、収率９９％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１０．８５（ｓ，１Ｈ），７．９３（ｄ，１Ｈ），７．４９（ｍ，１Ｈ），７．３２（ｍ，１Ｈ），７．２５（ｍ，１Ｈ），１．５２（ｓ，９Ｈ）
【００５５】
製造例１−３）
４−（２−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−６−メチル−２Ｈ−ピリダジン−３−オン
製造例１−２）の化合物（３２４ｍｇ、２.０ｍｍｏｌ）に、６−メチル−４，５−ジヒドロ−２Ｈ−ピリダジン−３−オン（Aldrich社製、２２４ｍｇ、１．０当量）、ＫＯＨ（１６８ｍｇ、３．０当量）及びＥｔＯＨ（１０ｍＬ）を加えて、混合物を還流下で１８時間加熱した。反応混合物を１Ｎ塩酸水溶液（３．０ｍＬ）で中和して、減圧下で蒸留した。残渣を過剰の酢酸エチル（５０ｍＬ）に溶かし、塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、乾燥（無水Ｎａ２ＳＯ４）して、減圧下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（５０％酢酸エチル／ヘキサン）で精製して、表題化合物（２９２ｍｇ、収率５７％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１２．６６（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．４８（ｄ，１Ｈ），７．２６−７．２０（ｍ，２Ｈ），７．０２（ｄ，１Ｈ），６．４０（ｓ，１Ｈ），４．２２（ｓ，２Ｈ），２．１９（ｓ，３Ｈ），１．３４（ｓ，９Ｈ）
【００５６】
製造例１−４）
２−［５−（２−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−３−メチル−６−オキソ−６Ｈ−ピリダジン−１−イル］−酪酸エチルエステル
製造例１−３）の化合物（９０ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）とＣｓ２ＣＯ３（３４２ｍｇ、３．０当量）との混合物に、ＤＭＦ（７ｍＬ）及び２−ブロモ−酪酸エチルエステル（３４３ｍｇ、５．０当量）を加えて、混合物を窒素雰囲気下、室温で３時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮して、残渣を酢酸エチルで２回抽出（１００ｍＬ×２）した。抽出物を飽和炭酸水素ナトリウム溶液（ＮａＨＣＯ３、１００ｍＬ×２）及び塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、乾燥（無水Ｎａ２ＳＯ４）して、減圧下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（２０％酢酸エチル／ヘキサン）で精製して、表題化合物を化学量論的収率で得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．４６（ｄ，１Ｈ），７．２５−７．１８（ｍ，２Ｈ），７．０２（ｄ，１Ｈ），６．３３（ｓ，１Ｈ），５．４３（ｍ，１Ｈ），４．１９（ｍ，１Ｈ），４．１７（ｓ，２Ｈ），２．２４（ｍ，２Ｈ），２．１６（ｓ，３Ｈ），１．３３（ｓ，９Ｈ），１．２２（ｔ，３Ｈ），０．９１（ｔ，３Ｈ）
【００５７】
製造例１−５）
２−［５−（２−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−３−メチル−６−オキソ−６Ｈ−ピリダジン−１−イル］−酪酸
製造例１−４）の化合物（１２８ｍｇ）を溶媒混合物（６ｍＬ、テトラヒドロフラン：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝３：２：１）に溶かし、そこに、ＬｉＯＨ・Ｈ２Ｏ（２９ｍｇ、２．０当量）を加えて、混合物を室温で約２時間撹拌した。反応混合物を１Ｎ塩酸水溶液で中和して、減圧下で蒸留して大部分のテトラヒドロフランを除去した。残渣を過剰の酢酸エチル（５０ｍＬ）に溶かし、塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、乾燥（無水Ｎａ２ＳＯ４）して、減圧下で濃縮して、表題化合物を化学量論的収率で得た。この化合物はさらに精製することなく、次の反応で使用した。
【００５８】
製造例１−６）
３−｛２−［５−（２−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−３−メチル−６−オキソ−６Ｈ−ピリダジン−１−イル］−ブチリルアミノ｝−５−フルオロ−４−オキソ−ペンタン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
製造例１−５）で得られたカルボン酸誘導体（１２５ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）、３−アミノ−５−フルオロ−４−ヒドロキシ−ペンタン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（Tetrahedron Letters,1994,35（52）,9693-9696を参照されたい；８３ｍｇ、１.１当量）及びＨＡＴＵ（１７８ｍｇ、１．３当量）の混合物を０℃に冷却し、そこにＤＭＦ（５ｍＬ）溶媒中の、トリエチルアミン（０．２０ｍＬ、４．０当量）を加えて、混合物を室温で３時間反応した。溶媒を減圧下で蒸留した。残渣を酢酸エチルで抽出（３０ｍＬ×２）し、水、炭酸水素ナトリウム水溶液及び塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、乾燥（無水Ｎａ２ＳＯ４）して、減圧下で濃縮した。こうして得られた化合物とデス・マーチン試薬（３０５ｍｇ、２．０当量）に、無水ジクロロメタン（４ｍＬ）を加えて、混合物を室温で１時間撹拌した。イソプロピルアルコール（１ｍＬ）を加えて反応を中止させた。反応混合物を減圧下でセライトを通してろ過して固体を除去し、酢酸エチルで抽出（２０ｍＬ×２）した。抽出物を水、飽和炭酸水素ナトリウム溶液及び塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、乾燥（無水Ｎａ２ＳＯ４）して、減圧下で濃縮した。残渣をＰｒｅｐ−ＴＬＣ（３０〜４０％酢酸エチル／ヘキサン）で精製して、表題化合物（１２５ｍｇ、収率６７％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．４８−７．４２（ｍ，２Ｈ），７．２４（ｔ，１Ｈ），７．１８（ｔ，１Ｈ），６．９９（ｍ，１Ｈ），６．３６（ｓ，１Ｈ），５．４９（ｍ，１Ｈ），５．１８−４．９０（ｍ，２Ｈ），４．８３（ｍ，１Ｈ），４．１７（ｓ，２Ｈ），２．９８−２．６２（ｍ，２Ｈ），２．１９（ｔｗｏ ｓ，３Ｈ），２．２５−２．１２（ｍ，２Ｈ），１．３９（ｔｗｏ ｓ，９Ｈ），１．３２（ｓ，９Ｈ），０．９０（ｍ，３Ｈ）
【００５９】
実施例1
３−｛２−［５−（２−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−３−メチル−６−オキソ−６Ｈ−ピリダジン−１−イル］−ブチリルアミノ｝−５−フルオロ−４−オキソ−ペンタン酸
【００６０】
【化００９】
2010509318.tif 000010
【００６１】
製造例１−６）の化合物（１２０ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（４ｍＬ）に溶かして、０℃でトリフルオロ酢酸（２ｍＬ）を加えた。反応混合物を、ゆっくり室温に温めながら、１時間撹拌して、減圧下で濃縮した。残渣をＰｒｅｐ−ＴＬＣ（１０％メタノール／ジクロロメタン）で精製して、表題化合物（９０ｍｇ、収率８２％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．７０（ｔｗｏ ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．４６（ｄ，１Ｈ），７．２４（ｔ，１Ｈ），７．１８（ｔ，１Ｈ），６．９７（ｄ，１Ｈ），６．４６及び６．４３（ｔｗｏ ｓ，１Ｈ），５．３７（ｍ，１Ｈ），５．０５−４．７０（ｍ，３Ｈ），４．１４（ｓ，２Ｈ），３．１８−２．７２（ｍ，２Ｈ），２．２３（ｔｗｏ ｓ，３Ｈ），２．２５−２．１５（ｍ，２Ｈ），１．３２（ｓ，９Ｈ），０．９２（ｍ，３Ｈ）
【００６２】
製造例２−１）
（Ｓ）−３−ベンジルオキシカルボニルアミノ−４−ヒドロキシ−５−（２，３，５，６−テトラフルオロ―フェノキシ）−ペンタン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−β−ｔ−ブチルアスパラギン酸（１７．９３ｇ、５５．４６ｍｍｏｌ）及びＮＭＭ（６．７０ｍＬ、１．１０当量）に、無水テトラヒドロフラン(１５０ｍＬ）を窒素雰囲気下で加え、−１５℃に保持した。そこにイソブチルクロロホルメート（７．５６ｍＬ、１．０５当量）を加えて、反応混合物を約２０分間撹拌した。ジアゾメタン−エーテル溶液（２．０当量の１−メチル−３−ニトロ−１−ニトロソ-グアニジンから合成、６０ｍＬ）を加える間、反応物を０℃で保持し、０℃で３０分間撹拌し、ジアゾケトン誘導体を得た。そこに、３０％ＨＢｒ／ＡｃＯＨ（２２．６ｍＬ、２．０当量）を０℃で加えて、３０分間撹拌した。反応混合物を酢酸エチルで抽出し、水、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（２回）及び塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、乾燥（無水Ｎａ２ＳＯ４）し、減圧下で濃縮して、ブロモメチルケトン誘導体（２２．２ｇ）を化学量論的収率で得た。
【００６３】
ブロモメチルケトン誘導体（２２．２ｇ、５５，４５ｍｍｏｌ）及び２，３，５，６−テトラフルオロフェノール（１１．０５ｇ、１．２当量）をジメチルホルムアミド（１３０ｍＬ）に溶かし、ＫＦ（８．０５ｇ、２．５当量）を加えて、混合物を室温で２時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮した。残渣を酢酸エチルで抽出し、水、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（２回）及び塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、乾燥（無水Ｎａ２ＳＯ４）し、減圧下で濃縮して２，３，５，６−テトラフルオロフェノキシメチルケトン誘導体を得た。この化合物をメタノール（１５０ｍＬ）に溶かし、そこにＮａＢＨ４（４．１９ｇ、２．０当量）を０℃でゆっくり加えて、混合物を１時間撹拌した。飽和酢酸アンモニウム溶液を加えて反応を中止させて、反応混合物を減圧下で蒸留してメタノールを除去した。残渣を酢酸エチルで抽出（２００ｍＬ×２）し、水及び塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、乾燥（無水Ｎａ２ＳＯ４）して、減圧下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーで分離−精製（１０〜２０％酢酸エチル／ヘキサン）して、表題化合物（１９．６ｇ、収率７３％）を得た。
【００６４】
製造例２−２）
（Ｓ）−３−アミノ−４−ヒドロキシ−５−（２，３，５，６−テトラフルオロ−フェノキシ）ペンタン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
製造例２−１）の化合物（１９．６ｇ、４０．２ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（１３０ｍＬ）に溶かし、Ｐｄ／Ｃ（Aldrich社製、１０％、１．０ｇ）を加えて、混合物を水素雰囲気下で３時間撹拌した。反応混合物を、セライトを通してろ過してＰｄ／Ｃを除去し、ＭｅＯＨで洗浄した。ろ液を減圧下で蒸留して、表題化合物（１３．１７ｇ、収率９３％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．２（ｂｒ，２Ｈ），７．６−７．５（ｍ，１Ｈ），５．９（ｍ，１Ｈ），４．３−４．１（ｍ，３Ｈ），３．６（ｍ，１Ｈ），２．７（ｍ，１Ｈ），１．４（ｓ，９Ｈ）
【００６５】
製造例２−３）
（Ｓ）−３−｛２−［５−（２−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−３−メチル−６−オキソ−６Ｈ−ピリダジン−１−イル］−ブチリルアミノ｝−４−オキソ−５−（２，３，５，６−テトラフルオロ−フェノキシ）−ペンタン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
製造例１−５）で得られたカルボン酸誘導体（７０ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）、製造例２−２）で得られた化合物（７９ｍｇ、１．１当量）及びＨＡＴＵ（９９ｍｇ、１．３当量）の混合物を０℃に冷却し、そこに、ＤＭＦ（５ｍＬ）溶媒中の、トリエチルアミン（０．１１ｍＬ、４．０当量）を加えて、混合物を室温で１．５時間反応させた。溶媒を減圧下で蒸留した。残渣を酢酸エチルで抽出（３０ｍＬ×２）し、水、炭酸水素ナトリウム水溶液及び塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、乾燥（無水Ｎａ２ＳＯ４）して、減圧下で濃縮した。このようにして得られた化合物とデス・マーチン試薬（１７０ｍｇ、２．０当量）に、無水ジクロロメタン（４ｍＬ）を加えて、反応混合物を室温で１時間撹拌した。イソプロピルアルコール（１ｍＬ）を加えて反応を中止させた。反応混合物を減圧下でセライトを通してろ過して固体を除去し、酢酸エチルで抽出（２０ｍＬ×２）した。抽出物を水、飽和炭酸水素ナトリウム溶液及び塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、乾燥（無水Ｎａ２ＳＯ４）して、減圧下で濃縮した。残渣をＰｒｅｐ−ＴＬＣ（３０％酢酸エチル／ヘキサン）で精製して、表題化合物（１１０ｍｇ、収率８１％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．５４（ｍ，１Ｈ），７．４７（ｍ，１Ｈ），７．１９（ｔ，１Ｈ），７．００（ｔ，１Ｈ），６．７５（ｍ，１Ｈ），６．３７（ｍ，１Ｈ），５．５０（ｍ，１Ｈ），５．１６−４．９６（ｍ，２Ｈ），４．８６（ｍ，１Ｈ），４．１７（ｍ，２Ｈ），３．０３−２．６１（ｍ，２Ｈ），２．２０（ｔｗｏ ｓ，３Ｈ），２．２６−２．１５（ｍ，２Ｈ），１．３９及び１．３８（ｔｗｏ ｓ，９Ｈ），１．３３（ｓ，９Ｈ），０．９１（ｍ，３Ｈ）
【００６６】
実施例２
（Ｓ）−３−｛２−［５−（２−ｔｅｒｔ−ブチル-ベンジル）−３−メチル−６−オキソ−６Ｈ−ピリダジン−１−イル］−ブチリルアミノ｝−４−オキソ−５−（２，３，５，６−テトラフルオロ−フェノキシ）−ペンタン酸
【００６７】
【化０１０】
2010509318.tif 000011
【００６８】
製造例２−３）の化合物（１１０ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（４ｍＬ）に溶かして、そこに０℃でトリフルオロ酢酸（２ｍＬ）を加えた。反応混合物を、ゆっくり室温に温めながら、１時間撹拌して、減圧下で濃縮した。残渣をＰｒｅｐ−ＴＬＣ（６５％酢酸エチル／ヘキサン）で精製して、表題化合物（８５ｍｇ、収率９１％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．７５及び７．５５（ｔｗｏ ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．４５（ｍ，１Ｈ），７．２３（ｔ，１Ｈ），７．１７（ｍ，１Ｈ），６．９６（ｍ，１Ｈ），６．７４（ｍ，１Ｈ），６．４４（ｔｗｏ ｓ，１Ｈ），５．４３−５．３４（ｍ，１Ｈ），５．００−４．７０（ｍ，３Ｈ），４．１２（ｍ，２Ｈ），３．１１（ｍ，１Ｈ），２．７７（ｍ，１Ｈ），２．２０及び２．２１（ｔｗｏ ｓ，３Ｈ），２．２６−２．１６（ｍ，２Ｈ），１．３１及び１．３０（ｔｗｏ ｓ，９Ｈ），０．９２（ｍ，３Ｈ）
【００６９】
製造例３−１）
２−［５−（２−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−３−メチル−６−オキソ−６Ｈ−ピリダジン−１−イル］−プロピオン酸エチルエステル
製造例１−３）の化合物（２６ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）とＣｓ２ＣＯ３（６５ｍｇ、２．０当量）との混合物に、ＤＭＦ（５ｍＬ）と２−ブロモ−プロピオン酸エチルエステル（５３ｍｇ、３．０当量）とを加えて、混合物を窒素雰囲気下、室温で１時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮して、残渣を酢酸エチルで２回抽出（１００ｍＬ）した。抽出物を飽和炭酸水素ナトリウム溶液（ＮａＨＣＯ３、１００ｍＬ×２）と塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、乾燥（無水Ｎａ２ＳＯ４）して、減圧下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（３０％酢酸エチル／ヘキサン）で精製して、表題化合物（３０ｍｇ、収率８４％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．４６（ｄ，１Ｈ），７．２３（ｔ，１Ｈ），７．１８（ｔ，１Ｈ），７．００（ｄ，１Ｈ），６．３３（ｓ，１Ｈ），５．５５（ｑｔ，１Ｈ），４．２０（ｍ，２Ｈ），４．１６（ｓ，２Ｈ），２．１６（ｓ，３Ｈ），１．６８（ｄ，３Ｈ），１．３３（ｓ，９Ｈ），１．２３（ｔ，３Ｈ）
【００７０】
製造例３−２）
（Ｓ）−３−｛２−［５−（２−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−３−メチル−６−オキソ−６Ｈ−ピリダジン−１−イル］−プロピオニルアミノ｝−４−オキソ−５−（２，３，５，６−テトラフルオロ−フェノキシ）−ペンタン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
製造例３−１）の化合物（３０ｍｇ、０．０８４ｍｍｏｌ）を製造例１−５）と同様の方法で加水分解して、カルボン酸誘導体（２９ｍｇ、０．０８４ｍｍｏｌ）を得た。このカルボン酸誘導体、製造例２−２）の化合物（３５ｍｇ、１．１当量）及びＨＡＴＵ（４４ｍｇ、１．３当量）の混合物を０℃に冷却し、そこに、ＤＭＦ（５ｍＬ）溶媒中の、トリエチルアミン（０．０５ｍＬ、４．０当量）を加えて、混合物を室温で２時間反応させた。溶媒を減圧下で蒸留した。残渣を酢酸エチルで抽出（３０ｍＬ×２）し、水、炭酸水素ナトリウム水溶液及び塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、乾燥（無水Ｎａ２ＳＯ４）して、減圧下で濃縮した。このようにして得られた化合物とデス・マーチン試薬（７６ｍｇ、２．０当量）に、無水ジクロロメタン（４ｍＬ）を加えて、混合物を室温で１時間撹拌した。イソプロピルアルコール（１ｍＬ）を加えて反応を中止させた。反応混合物を減圧下でセライトを通してろ過して固体を除去し、酢酸エチルで抽出（２０ｍＬ×２）した。抽出物を水、飽和炭酸水素ナトリウム溶液及び塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、乾燥（無水Ｎａ２ＳＯ４）して、減圧下で濃縮した。残渣をＰｒｅｐ−ＴＬＣ（４０％酢酸エチル／ヘキサン）で精製して、表題化合物（３５ｍｇ、収率６０％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．４７（ｄ，１Ｈ），７．３７（ｔ，１Ｈ），７．２４（ｔ，１Ｈ），７．１８（ｔ，１Ｈ），６．９９（ｄ，１Ｈ），６．７３（ｍ，１Ｈ），６．３７（ｔｗｏ ｓ，１Ｈ），５．６５（ｍ，１Ｈ），５．１９−４．９６（ｍ，２Ｈ），４．８６（ｍ，１Ｈ），４．１７（ｓ，２Ｈ），３．０２−２．６２（ｍ，２Ｈ），２．１９及び２．１８（ｔｗｏ ｓ，３Ｈ），１．６８（ｔｗｏ ｄ，３Ｈ），１．３９（ｓ，９Ｈ），１．３３（ｓ，９Ｈ）
【００７１】
実施例３
（Ｓ）−３−｛２−［５−（２−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−３−メチル−６−オキソ−６Ｈ−ピリダジン−１−イル］−プロピオニルアミノ｝−４−オキソ−５−（２，３，５，６−テトラフルオロ−フェノキシ）−ペンタン酸
【００７２】
【化０１１】
2010509318.tif 000012
【００７３】
製造例３−２）の化合物（３４ｍｇ、０．０５１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン(４ｍＬ)に溶かして、０℃でトリフルオロ酢酸（２ｍＬ）を加えた。反応混合物を、ゆっくり室温に温めながら１時間撹拌して、減圧下で濃縮した。残渣をＰｒｅｐ−ＴＬＣ（１０％メタノール／ジクロロメタン）で精製して、表題化合物（２６ｍｇ、収率８４％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．６１（ｂｒ，１Ｈ），７．４６（ｄ，１Ｈ），７．２４（ｍ，１Ｈ），７．１８（ｍ，１Ｈ），６．９５（ｍ，１Ｈ），６．７６（ｍ，１Ｈ），６．４５（ｓ，１Ｈ），５．５１（ｍ，１Ｈ），４．８９（ｍ，３Ｈ），４．１２（ｓ，２Ｈ），３．１４−２．７３（ｍ，２Ｈ），２．２１（ｔｗｏ ｓ，３Ｈ），１．６７（ｔｗｏ ｄ，３Ｈ），１．３１（ｔｗｏ ｓ，９Ｈ）
【００７４】
製造例４−１）
［５−（２−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−３−メチル−６−オキソ−６Ｈ−ピリダジン−１−イル］−酢酸エチルエステル
製造例１−３）の化合物（９０ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）とＣｓ２ＣＯ３（２２８ｍｇ，２．０当量）との混合物に、ＤＭＦ（１０ｍＬ）と２−ブロモ酢酸エチルエステル（１１７ｍｇ、２．０当量）とを加えて、混合物を窒素雰囲気下、室温で２時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮して、残渣を酢酸エチルで２回抽出（１００ｍＬ）した。抽出物を飽和炭酸水素ナトリウム溶液（ＮａＨＣＯ３、１００ｍＬ×２）と塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、乾燥（無水Ｎａ２ＳＯ４）して、減圧下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（３０％酢酸エチル／ヘキサン）で精製して、表題化合物（１０４ｍｇ、収率８７％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．４６（ｄ，１Ｈ），７．２３（ｔ，１Ｈ），７．１９（ｔ，１Ｈ），７．０１（ｄ，１Ｈ），６．３５（ｓ，１Ｈ），４．８７（ｓ，２Ｈ），４．２４（ｑｔ，２Ｈ），４．１７（ｓ，２Ｈ），２．１６（ｓ，３Ｈ），１．３３（ｓ，９Ｈ），１．２８（ｔ，３Ｈ）
【００７５】
製造例４−２）
（Ｓ）−３−｛２−［５−（２−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−３−メチル−６−オキソ−６Ｈ−ピリダジン−１−イル］−アセチルアミノ｝−４−オキソ−５−（２，３，５，６−テトラフルオロ-フェノキシ）−ペンタン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
製造例４−１）の化合物（７５ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を製造例１−５）と同様の方法で加水分解して、カルボン酸誘導体（６０ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ、８７％）を得た。このカルボン酸誘導体、製造例２−２）の化合物（７４ｍｇ、１．１当量）及びＨＡＴＵ（９４ｍｇ，１．３当量）の混合物を０℃に冷却し、そこに、ＤＭＦ（５ｍＬ）溶媒中の、トリエチルアミン（０．１１ｍＬ、４．０当量）を加えて、混合物を室温で２時間反応させた。溶媒を減圧下で蒸留した。残渣を酢酸エチルで抽出(３０ｍＬ×２）し、水、炭酸水素ナトリウム水溶液及び塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、乾燥（無水Ｎａ２ＳＯ４）して、減圧下で濃縮した。このようにして得られた化合物とデス・マーチン試薬（１５７ｍｇ、２．０当量）に、無水ジクロロメタン（４ｍＬ）を加えて、混合物を室温で１時間撹拌した。イソプロピルアルコール（１ｍＬ）を加えて反応を中止させた。反応混合物を減圧下で、セライトを通してろ過して固体を除去し、酢酸エチルで抽出（２０ｍＬ×２）した。抽出物を水、飽和炭酸水素ナトリウム溶液及び塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、乾燥（無水Ｎａ２ＳＯ４）して、減圧下で濃縮した。残渣をＰｒｅｐ−ＴＬＣ（４０％酢酸エチル／ヘキサン）で精製して、表題化合物（１０５ｍｇ、収率８０％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．４７（ｄ，１Ｈ），７．３２（ｄ，１Ｈ），７．２５（ｔ，１Ｈ），７．１９（ｔ，１Ｈ），６．９９（ｄ，１Ｈ），６．７４（ｍ，１Ｈ），６．４０（ｓ，１Ｈ），５．２４−５．０３（ｍ，２Ｈ），４．９１（ｍ，１Ｈ），４．８５（ｓ，２Ｈ），４．１６（ｔｗｏ ｓ，２Ｈ），３．０４−２．６８（ｍ，２Ｈ），２．１８（ｓ，３Ｈ），１．４１（ｓ，９Ｈ），１．３３（ｓ，９Ｈ）
【００７６】
実施例４
（Ｓ）−３−｛２−［５−（２−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−３−メチル−６−オキソ−６Ｈ−ピリダジン−１−イル］−アセチルアミノ｝−４−オキソ−５−（２，３，５，６−テトラフルオロ−フェノキシ）−ペンタン酸
【００７７】
【化０１２】
2010509318.tif 000013
【００７８】
製造例４−２）の化合物（１００ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（４ｍＬ）に溶かして、そこに０℃でトリフルオロ酢酸（２ｍＬ）を加えた。反応混合物を、ゆっくり室温に温めながら、１時間撹拌して、減圧下で濃縮した。残渣をＰｒｅｐ−ＴＬＣ（６５％酢酸エチル／ヘキサン）で精製して、表題化合物（５９ｍｇ、収率６７％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．７１（ｂｒ，１Ｈ），７．４５（ｄ，１Ｈ），７．２３（ｔ，１Ｈ），７．１７（ｔ，１Ｈ），６．９５（ｄ，１Ｈ），６．７５（ｍ，１Ｈ），６．４６（ｓ，１Ｈ），５．０６−４．８２（ｍ，５Ｈ），４．１１（ｓ，２Ｈ），３．１９−２．８１（ｍ，２Ｈ），２．２０（ｓ，３Ｈ），１．３１（ｓ，９Ｈ）
【００７９】
製造例５−１)
４−（２−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−２Ｈ−ピリダジン−３−オン及び６−（２−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−２Ｈ−ピリダジン−３−オン
公知の方法（J. Amer. Chem. Soc., 1945, 67, 60-62 及び J. Org. Chem., 1961, 26, 1854-1856）で得られた４，５−ジヒドロ−２Ｈ−ピリダジン−３−オン（１９２ｍｇ、１．９５ｍｍｏｌ）、製造例１−２）で得られた２−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンズアルデヒド（３１６ｍｇ、１．０当量）及びＫＯＨ（２２０ｍｇ、２．０当量）に、ＥｔＯＨ（３０ｍＬ）を加えて、混合物を還流下で６時間加熱した。反応混合物を１Ｎ塩酸水溶液で中和して、減圧下で蒸留して大部分のテトラヒドロフランを除去した。残渣を過剰の酢酸エチル（５０ｍＬ）に溶かし、塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、乾燥（無水Ｎａ２ＳＯ４）して、減圧下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（５０％酢酸エチル／ヘキサン、１０％メタノール／ジクロロメタン）で精製して、表題化合物４−（２−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−２Ｈ−ピリダジン−３−オン（７６ｍｇ）と６−（２−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−２Ｈ−ピリダジン−３−オン(１６７ｍｇ）を得た。
４−（２−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−２Ｈ−ピリダジン−３−オン：
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１１．７３（ｓ，１Ｈ），７．６５（ｄ，１Ｈ），７．４７（ｄ，１Ｈ），７．２４（ｔ，１Ｈ），７．２０（ｔ，２Ｈ），７．０１（ｄ，１Ｈ），６．５０（ｍ，１Ｈ），４．２１（ｓ，２Ｈ），１．３４（ｓ，９Ｈ）
６−（２−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−２Ｈ−ピリダジン−３−オン：
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１０．６０（ｓ，１Ｈ），７．６１（ｓ，１Ｈ），７．４５（ｄ，１Ｈ），７．２５（ｔ，１Ｈ），７．１８（ｔ，２Ｈ），６．９７（ｄ，１Ｈ），６．４４（ｓ，１Ｈ），４．１５（ｓ，２Ｈ），１．４０（ｓ，９Ｈ）
【００８０】
製造例５−２)
２−［５−（２−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−６−オキソ−６Ｈ−ピリダジン−１−イル］−酪酸エチルエステル
製造例５−１）で得られた４−（２−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−２Ｈ−ピリダジン−３−オン（７６ｍｇ、０．３１４ｍｍｏｌ）とＣｓ２ＣＯ３（３０７ｍｇ，３．０当量）との混合物に、ＤＭＦ（４ｍＬ）と２−ブロモ酪酸エチルエステル（３０６ｍｇ，５．０当量）を加えて、混合物を窒素雰囲気下、室温で２時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮して、残渣を酢酸エチルで２回抽出（１００ｍＬ）した。抽出物を飽和炭酸水素ナトリウム溶液（ＮａＨＣＯ３、１００ｍＬ×２）と塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、乾燥（無水Ｎａ２ＳＯ４）して、減圧下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（１０〜２０％酢酸エチル／ヘキサン）で精製して、表題化合物（１００ｍｇ、収率８９％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．６９（ｄ，１Ｈ），７．５１（ｄ，１Ｈ），７．３０−７．２２（ｍ，２Ｈ），７．０７（ｄ，１Ｈ），６．５０（ｍ，１Ｈ），５．５６（ｄｄ，１Ｈ），４．２５（ｍ，４Ｈ），２．３５−２．２１（ｍ，２Ｈ），１．３８（ｓ，９Ｈ），１．２８（ｔ，３Ｈ），０．９８（ｍ，３Ｈ）
【００８１】
製造例５−３)
（Ｓ）−３−｛２−［５−（２−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−６−オキソ−６Ｈ−ピリダジン−１−イル］−ブチリルアミノ｝−４−オキソ−５−（２，３，５，６−テトラフルオロ−フェノキシ）−ペンタン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
製造例５−２）の化合物（９４ｍｇ、０．２６３ｍｍｏｌ）を製造例１−５）と同様の方法で加水分解して、カルボン酸誘導体（８６ｍｇ、０．２６３ｍｍｏｌ、１００％）を得た。このカルボン酸誘導体、製造例２−２）の化合物（１０２ｍｇ、１．１当量）及びＨＡＴＵ（１３０ｍｇ、１．３当量）の混合物を０℃に冷却し、そこに、ＤＭＦ（５ｍＬ）溶媒中の、トリエチルアミン（０．１５ｍＬ、４．０当量）を加えて、混合物を室温で２時間反応させた。溶媒を減圧下で蒸留した。残渣を酢酸エチルで抽出（３０ｍＬ×２）し、水、炭酸水素ナトリウム水溶液及び塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、乾燥（無水Ｎａ２ＳＯ４）して、減圧下で濃縮した。このようにして得られた化合物とデス・マーチン試薬（２２３ｍｇ，２．０当量）に、無水ジクロロメタン（４ｍＬ）を加えて、混合物を室温で１時間撹拌した。イソプロピルアルコール(１ｍＬ）を加えて反応を中止させた。反応混合物を減圧下、セライトを通してろ過して固体を除去し、酢酸エチルで抽出（２０ｍＬ×２）した。抽出物を水、飽和炭酸水素ナトリウム溶液及び塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、乾燥（無水Ｎａ２ＳＯ４）して、減圧下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（２０〜３０％酢酸エチル／ヘキサン）で精製して、表題化合物（１５０ｍｇ、収率８６％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．７０（ｍ，１Ｈ），７．４６（ｄ，１Ｈ），７．３４（ｍ，１Ｈ），７．２４（ｔ，１Ｈ），７．１８（ｔ，１Ｈ），７．００（ｍ，１Ｈ），６．７５（ｍ，１Ｈ），６．４９（ｍ，１Ｈ），５．５１（ｍ，１Ｈ），５．１８−４．９４（ｍ，２Ｈ），４．８７（ｍ，１Ｈ），４．１８（ｍ，２Ｈ），３．０２−２．６４（ｍ，２Ｈ），２．２８−２．１５（ｍ，２Ｈ），１．３９（ｔｗｏ ｓ，９Ｈ），１．３２（ｓ，９Ｈ），０．９２（ｍ，３Ｈ）
【００８２】
実施例５）
（Ｓ）−３−｛２−［５−（２−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−６−オキソ−６Ｈ−ピリダジン−１−イル］−ブチリルアミノ｝−４−オキソ−５−（２，３，５，６−テトラフルオロ−フェノキシ）−ペンタン酸
【００８３】
【化０１３】
2010509318.tif 000014
【００８４】
製造例５−３）の化合物（１４６ｍｇ、０．２２１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（４ｍＬ）に溶かして、そこに０℃でトリフルオロ酢酸（２ｍＬ）を加えた。反応混合物を、ゆっくり室温に温めながら、１時間撹拌して、減圧下で濃縮した。残渣をＰｒｅｐ−ＴＬＣ（６５％酢酸エチル／ヘキサン）で精製して、表題化合物（１１６ｍｇ、収率６７％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．８０（ｍ，２Ｈ），７．４５（ｄ，１Ｈ），７．２４（ｍ，１Ｈ），７．１８（ｍ，１Ｈ），６．９６（ｍ，１Ｈ），６．７６（ｍ，１Ｈ），６．５７（ｍ，１Ｈ），５．４１−５．０５（ｍ，２Ｈ），４．９１（ｍ，１Ｈ），４．４０（ｍ，１Ｈ），４．１５（ｓ，２Ｈ），３．２５−２．６４（ｍ，２Ｈ），２．２２（ｍ，２Ｈ），１．３０（ｔｗｏ ｓ，９Ｈ），０．９４（ｍ，３Ｈ）
【００８５】
製造例６−１）
２−［３−（２−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−６−オキソ−６Ｈ−ピリダジン−１−イル］−酪酸エチルエステル
製造例５−１）で得られた６−（２−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−２Ｈ−ピリダジン−３−オン（１６７ｍｇ、０．６８９ｍｍｏｌ）とＣｓ２ＣＯ３（６７３ｍｇ、３．０当量）との混合物に、ＤＭＦ（４ｍＬ）と２−ブロモ酪酸エチルエステル（６７２ｍｇ、５．０当量）を加えて、混合物を窒素雰囲気下、室温で２時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮して、残渣を酢酸エチルで２回抽出（１００ｍＬ）した。抽出物を飽和炭酸水素ナトリウム溶液（ＮａＨＣＯ３、１００ｍＬ×２）と塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、乾燥（無水Ｎａ２ＳＯ４）して、減圧下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（２０％酢酸エチル／ヘキサン）で精製して、表題化合物（１８９ｍｇ、収率７７％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．７０（ｄ，１Ｈ），７．５０（ｄ，１Ｈ），７．２７（ｔ，１Ｈ），７．２１（ｔ，１Ｈ），７．０４（ｄ，１Ｈ），６．４９（ｄ，１Ｈ），５．４６（ｄｄ，１Ｈ），４．２５−４．１９（ｍ，４Ｈ），２．３１−２．１５（ｍ，２Ｈ），１．４３（ｓ，９Ｈ），１．２７（ｔ，３Ｈ），０．９３（ｍ，３Ｈ）
【００８６】
製造例６−２）
（Ｓ）−３−｛２−［３−（２−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−６−オキソ−６Ｈ−ピリダジン−１−イル］−ブチリルアミノ｝−４−オキソ−５−（２，３，５，６−テトラフルオロフェノキシ）−ペンタン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
製造例６−１）の化合物（１８５ｍｇ、０．５１９ｍｍｏｌ）を製造例１−５）と同様の方法で加水分解して、カルボン酸誘導体（１６６ｍｇ、９８％）を得た。このカルボン酸誘導体（８７ｍｇ、０．２６３ｍｍｏｌ）、製造例２−２）の化合物（１０２ｍｇ、１．１当量）及びＨＡＴＵ（１３０ｍｇ、１．３当量）の混合物を０℃に冷却し、そこに、ＤＭＦ（５ｍＬ）溶媒中のトリエチルアミン（０．１５ｍＬ、４．０当量）を加えて、混合物を室温で２時間反応させた。溶媒を減圧下で蒸留した。残渣を酢酸エチルで抽出（３０ｍＬ×２）し、水、炭酸水素ナトリウム水溶液及び塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、乾燥（無水Ｎａ２ＳＯ４）して、減圧下で濃縮した。このようにして得られた化合物とデス・マーチン試薬（２２３ｍｇ、２．０当量）に、無水ジクロロメタン（４ｍＬ）を加えて、混合物を室温で１時間撹拌した。イソプロピルアルコール（１ｍＬ）を加えて反応を中止させた。反応混合物を減圧下で、セライトを通してろ過して固体を除去し、酢酸エチルで抽出（２０ｍＬ×２）した。抽出物を水、飽和炭酸水素ナトリウム溶液及び塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、乾燥（無水Ｎａ２ＳＯ４）して、減圧下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（２５〜３０％酢酸エチル／ヘキサン）で精製して、表題化合物（１５０ｍｇ、収率８６％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．７１（ｄ，１Ｈ），７．４５（ｄ，１Ｈ），７．３０（ｔ，１Ｈ），７．２２（ｔ，１Ｈ），７．１６（ｍ，１Ｈ），６．９７（ｄ，１Ｈ），６．７５（ｍ，１Ｈ），６．４６（ｄ，１Ｈ），５．３６（ｍ，１Ｈ），５．１４−４．９５（ｍ，２Ｈ），４．８５（ｍ，１Ｈ），４．１５（ｍ，２Ｈ），３．００−２．６３（ｍ，２Ｈ），２．２６−２．１２（ｍ，２Ｈ），１．３９（ｔｈｒｅｅ ｓ，１８Ｈ），０．９０（ｍ，３Ｈ）
【００８７】
実施例６）
（Ｓ）−３−｛２−［３−（２−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−６−オキソ−６Ｈ−ピリダジン−１−イル］−ブチリルアミノ｝−４−オキソ−５−（２，３，５，６−テトラフルオロフェノキシ）−ペンタン酸
【００８８】
【化０１４】
2010509318.tif 000015
【００８９】
製造例６−２）の化合物（１４２ｍｇ、０．２１５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（４ｍＬ）に溶かして、０℃でトリフルオロ酢酸（２ｍＬ）を加えた。反応混合物を、ゆっくり室温に温めながら、１時間撹拌して、減圧下で濃縮した。残渣をＰｒｅｐ−ＴＬＣ（６５％酢酸エチル／ヘキサン）で精製して、表題化合物（１１１ｍｇ、収率８５％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．７７（ｄ，１Ｈ），７．６０（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．４５（ｄ，１Ｈ），７．２２（ｔ，１Ｈ），７．１６（ｔ，１Ｈ），６．９５（ｄ，１Ｈ），６．７６（ｍ，１Ｈ），６．５１（ｓ，１Ｈ），５．２８（ｍ，１Ｈ），５．０５−４．４０（ｂｒ ｓ，２Ｈ），４．８７（ｍ，１Ｈ），４．１８（ｍ，２Ｈ），３．１０−２．６８（ｍ，２Ｈ），２．２４−２．１２（ｍ，２Ｈ），１．３７（ｔｗｏ ｓ，１８Ｈ），０．９１（ｍ，３Ｈ）
【００９０】
実験例１
カスパーゼ阻害効果の試験
公知の方法（Thornberry, N. A. et al., Nature, 1992, 356, 768; Thornberry, N. A. Methods in Enzymology, 1994, 244, 615; Walker, N. P. C. et al., Cell, 1994, 78, 343）を改変して、α２β２形態のシステインプロテアーゼとして知られているカスパーゼ−１とカスパーゼ−８を発現、精製及び活性化し、カスパーゼ−９も同様の方法で精製して、それらに対する阻害活性をテストした。簡略に説明すると、ｐ１０とｐ２０サブユニット（Thornberry, N. A. et al, Nature, 1992, 356, 768）を大腸菌で発現させ、ニッケルカラムとアニオン交換クロマトグラフィーで精製して、カスパーゼ−１、カスパーゼ−８及びカスパーゼ−９を得た。このようにして得られたカスパーゼ−１に対しては蛍光基質ＡｃＹＶＡＤ−ＡＦＣを、カスパーゼ−８に対してはＡｃＤＥＶＤ−ＡＦＣを、そしてカスパーゼ−９に対してはＡｃＬＥＨＤ−ＡＦＣを用いて、合成された阻害剤の比活性度を測定した。酵素反応は、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５０）、１０％（ｗ／ｖ）のスクロース、０．１％（ｗ／ｖ）のＣＨＡＰＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、及び１０ｍＭのＤＴＴを含む緩衝溶液中、１０ｎＭのカスパーゼ−１に対しては５０μＭのＡｃＹＶＡＤ−ＡＦＣ、２．１ｎＭのカスパーゼ−８に対しては５０μＭのＡｃＤＥＶＤ−ＡＦＣ、及び２００ｎＭのカスパーゼ−９に対しては１５０μＭのＡｃＬＥＨＤ−ＡＦＣの存在下で、様々な濃度の阻害剤を用いて２５℃で遂行した。阻害剤の阻害定数であるＫｉ及びＫｏｂｓの値は蛍光スペクトロメータを用いて反応速度を経時的に測定して初期速度定数を求めることで決定した。Ｋｉはラインウィーバーバークプロット（Lineweaver Burk Plot）から算出し、Ｋｏｂｓは下記数式１から算出した。
【００９１】
（数式１）
Ｋｏｂｓ＝−ｌｎ（１−Ａｔ／Ａｏｏ）／ｔ
式中の、
Ａｔはｔ時点での開裂率（％）を意味し、そして
Ａｏｏは最大開裂率（％）を意味する。
【００９２】
Ｓｐｅｃｔｒａ ＭＡＸ ＧｅｍｉｎｉＸＳ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｓｐｅｃｔｒｏ-ｍｅｔｅｒ（モレキュラーデバイス社（Molecular Device Co.)製）を、励起波長４０５ｎｍ、発光波長５０５ｎｍで用いた。
【００９３】
阻害剤のインビボ阻害活性は、ジャーカット細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１５２）をＦａｓ抗体（Upstate Biotech 05-201）でアポトーシスさせ、該細胞を阻害剤で処理時に生きているジャーカット細胞量を観察するために、公知方法のＷＳＴ−１（Francoeur A.M. and Assalian A. (1996) Biochemica 3, 19-25）によって色の変化を測定して決定した。Ｓｐｅｃｔｒａ  ＭＡＸ  ３４０  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（モレキュラーデバイス社製）を吸光波長４４０ｎｍで用いた。
【００９４】
【表０１】
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【００９５】
実験例２
マウスにおけるＦａｓ抗体による肝損傷に対する治療効果
工程１）血液サンプルの製造
雄性Ｂａｌｂ／ｃマウス（６週齢、Charles River Laboratory、大阪、日本）を２２℃及び５５％の相対湿度下で１２時間ずつ明／暗を変えながら飼育した。この時、食料と水は不断給餌した。発熱物質フリーのホスフェート緩衝液に、Ｆａｓ抗体（Jo2; BD Pharmingen、San Diego, California）を溶かし、それを０．１５ｍｇ／ｋｇの量で各マウスの尾静脈に注射した。Ｆａｓ抗体を注射した直後に、試験化合物が溶解しているビヒクル（ＰＥＧ４００：エタノール＝２：１からなる混合物をホスフェート緩衝液で２０倍に希釈）またはビヒクル単独を実験動物に経口投与した。薬物投与から６時間後、心臓から血液サンプルを得た。
【００９６】
工程２）血漿アミノトランスフェラーゼ活性の試験
工程１で得た血液サンプルに対して血漿ＡＬＴ活性を、ＡＬＴ試験キット（Asan Pharm. Co. Seoul, Korea）を使用して、製造者の説明書に従って測定した。その結果、Ｆａｓ抗体投与により血漿内ＡＬＴ活性が急激に上昇して、試験化合物が上昇した酵素活性を用量−依存的に阻害することが分かった。これらの結果に基づいて、試験化合物のＥＤ５０値をＰｒｉｓｍソフトウェア（GraphPad社製）を用いて算出して、０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇの値を得た。
【産業上の利用可能性】
【００９７】
上記実験例の結果から明らかなように、本発明に係る式（１）の化合物は優れたカスパーゼ阻害活性を有しており、特に、Ｆａｓ抗体による肝損傷動物モデルで治療効果を示す。従って、式（１）の化合物は、カスパーゼが介在する様々な疾患及び症状の治療または予防のために効果的に使用することができる。
【国際調査報告】
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