(57)【要約】  プロペプチドのＣ末端にそのＮ末端で結合したＩＧＦ−Ｉを含む融合タンパク質をコードする核酸を含有する発現ベクターを含む原核宿主細胞を培養すること（これにより、プロペプチドが、アミノ酸−Ｙ−ＰｒｏでそのＣ末端が終止し、ここで、Ｙが、Ｐｒｏ、Ｐｒｏ−Ａｌａ、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ｔｈｒ、Ａｌａ−Ｐｒｏ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、Ｔｈｒ−Ｐｒｏ、Ａｒｇ−Ｐｒｏ、またはＰｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏからなる群より選択される）、該融合タンパク質を回収してＩｇＡプロテアーゼで切断すること、および該ＩＧＦ−Ｉを回収することを特徴とする、ＩＧＦ−Ｉの製造方法。ＩＧＦ−Ｉは、アルツハイマー病のような神経変性疾患の治療に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）プロペプチドのＣ末端にそのＮ末端で結合したＩＧＦ−Ｉを含む融合タンパク質をコードする核酸を含有する発現ベクターを含む原核宿主細胞を培養すること、
ｂ）それによって、該プロペプチドが、アミノ酸−Ｙ−ＰｒｏでそのＣ末端が終止し、ここで、Ｙが、Ｐｒｏ、Ｐｒｏ−Ａｌａ、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ｔｈｒ、Ａｌａ−Ｐｒｏ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、Ｔｈｒ−Ｐｒｏ、Ａｒｇ−Ｐｒｏ、またはＰｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏからなる群より選択されること、
ｃ）該融合タンパク質を回収し、そして該融合タンパク質をＩｇＡプロテアーゼで切断すること、および
ｄ）該ＩＧＦ−Ｉを回収すること
を特徴とする、ＩＧＦ−Ｉの製造方法。
【請求項２】
前記ＩＧＦ−Ｉが、ＩＧＦ−Ｉ（配列番号１）、Ｃ末端切断型ＩＧＦ−Ｉ（３〜６個のアミノ酸）、Ｒ３６Ａ、Ｒ３７Ａからなる群より選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＩＧＦ−Ｉが、ＩｇＧ由来のヒトＦｃにそのＣ末端で結合することを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記プロペプチドが、式：
Ｍｅｔ−Ｘ１−Ｈｉｓｎ−Ｘ２−Ｙ−Ｐｒｏ−
によって示され、式中、
Ｍｅｔが、メチオニンを示し、
Ｘ１が、結合、セリンまたはアスパラギンであり、
Ｈｉｓが、ヒスチジンであり、
ｎが、０〜６の数であり、
Ｘ２が、ペプチド配列番号６〜１０からなる群より選択されるリンカーペプチドであり、
Ｐｒｏが、プロリンであり、および
Ｙが、Ｐｒｏ、Ｐｒｏ−Ａｌａ、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ｔｈｒ、Ａｌａ−Ｐｒｏ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、Ｔｈｒ−Ｐｒｏ、Ａｒｇ−Ｐｒｏ、またはＰｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏからなる群より選択される
ことを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
プロペプチドが、アミノ酸−Ｙ−ＰｒｏでそのＣ末端が終止し、ここで、Ｙが、Ｐｒｏ、Ｐｒｏ−Ａｌａ、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ｔｈｒ、Ａｌａ−Ｐｒｏ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、Ｔｈｒ−Ｐｒｏ、Ａｒｇ−Ｐｒｏ、またはＰｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏからなる群より選択されることを特徴とする、プロペプチドのＣ末端に結合したＩＧＦ−Ｉを含む融合タンパク質。
【請求項６】
前記プロペプチドが、３０個までのアミノ酸長を有することを特徴とする、請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
式：
Ｍｅｔ−Ｘ１−Ｈｉｓｎ−Ｘ２−Ｙ−Ｐｒｏ−［ＩＧＦ−Ｉ］
を特徴とし、式中、
Ｍｅｔが、メチオニンを示し、
Ｘ１が、結合、セリンまたはアスパラギンであり、
Ｈｉｓが、ヒスチジンであり、
ｎが、０〜６の数であり、
Ｘ２が、ペプチド配列番号６〜１０からなる群より選択されるリンカーペプチドであり、
Ｐｒｏが、プロリンであり、および
Ｙが、Ｐｒｏ、Ｐｒｏ−Ａｌａ、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ｔｈｒ、Ａｌａ−Ｐｒｏ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、Ｔｈｒ−Ｐｒｏ、Ａｒｇ−Ｐｒｏ、またはＰｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏからなる群より選択される、
請求項５または６に記載の融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インスリン様増殖因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）の製造方法、医薬組成物、および使用方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒトインスリン様増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ）は、インスリンと構造的に関連した循環ホルモンである。ＩＧＦ−Ｉは、末梢組織に及ぼす増殖ホルモンの作用の主要介在物質であると伝統的に考えられている。ＩＧＦ−Ｉは、７０個のアミノ酸からなり、ソマトメジンＣとも呼ばれ、SwissProt No. P01343によって定義される。用途、活性および産生は、例えば、le Bouc, Y., et al., FEBS Lett. 196 (1986) 108-112； de Pagter-Holthuizen, P., et al., FEBS Lett. 195 (1986) 179-184； Sandberg Nordqvist, A.C., et al., Brain Res. Mol. Brain Res. 12 (1992) 275-277； Steenbergh, P.H., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 175 (1991) 507-514； Tanner, J.M., et al., Acta Endocrinol. (Copenh.) 84 (1977) 681-696； Uthne, K., et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 39 (1974) 548-554；欧州特許第0 123 228号；欧州特許第0 128 733号；米国特許第5,861,373号；米国特許第5,714,460号；欧州特許第0 597 033号；WO02/32449；WO93/02695に記載される。
【０００３】
ＩＧＦ−Ｉの機能の制御は、非常に複雑である。循環において、ＩＧＦ−Ｉのたった０．２％が、遊離形態で存在するのに対し、大部分は、ＩＧＦに対して非常に高い親和性を有しかつＩＧＦ−Ｉの機能を調節するＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）へ結合する。因子は、プロテアーゼによるＩＧＦＢＰのタンパク質分解等のＩＧＦ−Ｉを放出するメカニズムによって局所的に遊離され得る。
【０００４】
ＩＧＦ−Ｉは、発達中のおよび成熟した脳においてパラクリンの役割を担う（Werther, G.A., et al., Mol. Endocrinol. 4 (1990) 773-778）。インビトロでの研究では、ＩＧＦ−Ｉが、ドーパミン作動性ニューロン（Knusel, B., et al., J. Neurosci. 10(1990) 558-570）およびオリゴデンドロサイト（McMorris, F.A., および Dubois-Dalcq, M., J. Neurosci. Res. 21 (1988) 199-209、McMorris, F.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 822-826、Mozell, R.L.,および McMorris, F.A., J. Neurosci. Res. 30 (1991) 382-390)）を含む中枢神経系（ＣＮＳ）におけるニューロンのいくつもの種類に関する強力な非選択的栄養剤であることが示されている（Knusel, B., et al., J. Neurosci. 10(1990) 558-570、Svrzic, D., および Schubert, D., Biochem. Biophys. Res. Commun. 172 (1990) 54-60）。米国特許第５，０９３，３１７号には、コリン作動性ニューロン細胞の生存が、ＩＧＦ−Ｉの投与によって増強することが記載されている。ＩＧＦ−Ｉが、末梢神経の再生を刺激し（Kanje, M., et al., Brain Res. 486 (1989) 396-398）、およびオルニチンデカルボキシラーゼ活性を亢進する（米国特許第5,093,317号）ことがさらに公知である。米国特許第5,861,373号およびWO93/02695には、患者の中枢神経系においてＩＧＦ−Ｉおよび／またはそのアナログの活性濃度を高めることによって、グリア細胞および／または非コリン作動性ニューロン細胞に主に影響する、中枢神経系に対する損傷または中枢神経系の疾病を治療する方法が記載されている。WO02/32449は、哺乳動物の鼻腔へ、ＩＧＦ−Ｉまたはその生物活性のあるものを治療有効量含む医薬組成物を投与することによって、哺乳動物の中枢神経系において虚血性損傷を軽減または予防するための方法に関する。ＩＧＦ−Ｉは、鼻腔を通じて吸収され、虚血事象と関連した虚血性損傷を軽減または予防するのに効果的な量で、哺乳動物の中枢神経系中へと輸送される。欧州特許第０８７４６４１号は、エイズ関連認知症、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病、ピック病、ハンチントン病、肝性脳症、皮質基底神経節症候群（cortical- basal ganglionic syndrome）、進行性認知症、痙性不全対麻痺を有する家族性認知症、進行性核上麻痺、多発性硬化症、シルダーの脳性硬化症（cerebral sclerosis of Schilder）または急性壊死性出血性脳脊髄炎による中枢神経系におけるニューロン損傷を治療または予防するための医薬の製造のためのＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩの使用であって、ここで、該医薬は、血液脳関門または血液脊髄関門の外側での該ＩＧＦの有効量の非経口的投与のための形態にある、使用を特許請求している。
【０００５】
遊離ＩＧＦ−Ｉの脳レベルおよび血清レベルの低下は、ＡＤの散発性形態および家族性形態の病変形成と関連付けられてきた。さらに、ＩＧＦ−Ｉは、Ａβ誘発性神経毒性に対してニューロンを保護する（Niikura, T., et al., J. Neurosci. 21 (2001) 1902-1910、Dore, S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997) 4772-4777、Dore, S., et al., Ann. NY Acad. Sci. 890 (1999) 356-364）。近年、末梢投与されたＩＧＦ−Ｉが、ラットおよびマウスにおいて脳Ａβレベルを低下できることが示された（Carro, E., et al., Nat. Med. 8 (2002) 1390-1397）。さらに、その研究は、トランスジェニックＡＤマウスモデルにおいて、長期化したＩＧＦ−Ｉ治療が、脳アミロイドプラーク負荷を有意に低下させることを示した。これらのデータより、ＩＧＦ−Ｉが、脳からＡβを除去することによって、脳Ａβレベルを低下させることができ、およびプラークが関連する脳の認知症を軽減できるという見解が強力に支持される。
【０００６】
ＩｇＡプロテアーゼの認識部位は、Ｙａａ−Ｐｒｏ．！．Ｘａａ−Ｐｒｏと記載される。Ｙａａは、Ｐｒｏ（またはまれにＡｌａ、ＧｌｙもしくはＴｈｒとの組み合わせのＰｒｏ、すなわち、Ｐｒｏ−Ａｌａ、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ、もしくはＰｒｏ−Ｔｈｒ）を表す。Ｘａａは、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＡｌａを表す（Pohlner, J. et al., Bio/Technology 10 (1992) 799-804、Pohlner, J. et al., Nature 325 (1987) 458-462および米国特許第5,427,927号）。天然の切断部位は、Wood, S.G. and Burton, J., Infect Immun. 59 (1991) 1818-1822によって同定された。ナイセリア・ゴノレー（Neisseria gonorrhoeae）（２型）由来の免疫グロブリンＡ１プロテアーゼのための合成ペプチド基質は、自己タンパク質分解部位Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ．！．Ｓｅｒ−Ｐｒｏ、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ．！．Ｓｅｒ−Ｐｒｏ、Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ．！．Ａｌａ−Ｐｒｏ、Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ．！．Ｓｅｒ−Ｐｒｏ、Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ．！．Ｔｈｒ−ＰｒｏならびにＩｇＡ１切断部位Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ．！．Ｓｅｒ−ＰｒｏおよびＳｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ．！．Ｔｈｒ−Ｐｒｏである。
【０００７】
WO2006/066891には、インスリン様増殖因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）と１個または２個のポリ（エチレングリコール）基とからなる結合体が開示されている。この結合体は、該ＩＧＦ−Ｉが、野生型ＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列のアミノ酸位置２７、３７、６５、６８の３個まで位置でアミノ酸変化を有し、それにより該アミノ酸の１個または２個がリジンであり、アミノ酸２７が極性アミノ酸であるがリジンではなく、該リジンの第一級アミノ基を介してポリ（エチレングリコール）基と結合し、そして全体的な分子量が２０〜１００ｋＤａであることを特徴とする。このような結合体は、アルツハイマー病のような神経変性疾患の治療に有用である。
【０００８】
WO2006/074390は、ＩＧＦ−Ｉ変異体、およびＩＧＦ−Ｉ変異体と特定の融合構成要素とを含む融合タンパク質を参照する。WO2006/074390は、特定のＩＧＦ−Ｉ変異体を参照する。
【０００９】
融合タンパク質を介したＩＧＦ−Ｉの組換え製造の方法は、例えば、欧州特許第0155655号および米国特許第5,158,875号から公知である。しかしながら、組換えで製造されたＩＧＦ−Ｉのミクロヘテロジェニティー（microheterogenity）が、しばしば見出される（Forsberg, G. et. al., Biochem. J. 271 (1990) 357-363）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、高い純度および収量をともなう、原核生物における、そのＮ末端にメチオニンが付着していないＩＧＦ−Ｉの組換え製造の方法を提供する。本発明は、
ａ）プロペプチドのＣ末端にそのＮ末端で結合したＩＧＦ−Ｉを含む融合タンパク質をコードする核酸を含有する発現ベクターを含む原核宿主細胞を培養すること、
ｂ）それによって、該プロペプチドが、アミノ酸−Ｙ−ＰｒｏでそのＣ末端が終止し、ここで、Ｙが、Ｐｒｏ、Ｐｒｏ−Ａｌａ、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ｔｈｒ、Ａｌａ−Ｐｒｏ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、Ｔｈｒ−Ｐｒｏ、Ａｒｇ−Ｐｒｏ、またはＰｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏからなる群より選択されること、
ｃ）該融合タンパク質を回収し、そして該融合タンパク質をＩｇＡプロテアーゼで切断すること、および
ｄ）該ＩＧＦ−Ｉを回収すること
を特徴とする、ＩＧＦ−Ｉの製造方法を含む。回収されたＩＧＦ−Ｉは、Ｎ末端に結合するメチオニン残基を含まない。
【００１１】
本発明の好ましい実施態様は、配列番号２〜５に示されるペプチドからなる群より選択されるプロペプチドである。
【００１２】
本発明のさらなる実施態様は、プロペプチドのＣ末端にそのＮ末端で結合したＩＧＦ−Ｉを含む融合タンパク質であり、ここで、該プロペプチドは、アミノ酸−Ｙ−ＰｒｏでそのＣ末端が終止し、ここで、Ｙが、Ｐｒｏ、Ｐｒｏ−Ａｌａ、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ｔｈｒ、Ａｌａ−Ｐｒｏ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、Ｔｈｒ−Ｐｒｏ、Ａｒｇ−Ｐｒｏ、またはＰｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏからなる群より選択されることを特徴とする。−Ｙ−Ｐｒｏ配列によって、プロペプチドは、該ＩＧＦ−ＩからＩｇＡプロテアーゼ処理によって分離されることが可能である。
【００１３】
好ましくは、本発明による融合タンパク質は、式Ｍｅｔ−Ｘ１−Ｈｉｓｎ−Ｘ２−Ｙ−Ｐｒｏ−［ＩＧＦ−Ｉ］を特徴とし、式中、
Ｍｅｔが、メチオニンを示し、
Ｘ１が、結合、セリンまたはアスパラギンであり、
Ｈｉｓが、ヒスチジンであり、
ｎが、０〜６の数であり、
Ｘ２が、ペプチド配列番号６〜１０からなる群より選択されるリンカーペプチドであり、
Ｐｒｏが、プロリンであり、および
Ｙが、Ｐｒｏ、Ｐｒｏ−Ａｌａ、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ｔｈｒ、Ａｌａ−Ｐｒｏ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、Ｔｈｒ−Ｐｒｏ、Ａｒｇ−Ｐｒｏ、またはＰｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏからなる群より選択される。
【００１４】
好ましくは、プロペプチドは、式Ｍｅｔ−Ｘ１−Ｈｉｓｎ−Ｘ２−Ｙ−Ｐｒｏ−によって示され、式中、
Ｍｅｔが、メチオニンを示し、
Ｘ１が、結合、セリンまたはアスパラギンであり、
Ｈｉｓが、ヒスチジンであり、
ｎが、０〜６の数であり、
Ｘ２が、ペプチド配列番号６〜１０からなる群より選択されるリンカーペプチドであり、
Ｐｒｏが、プロリンであり、および
Ｙが、Ｐｒｏ、Ｐｒｏ−Ａｌａ、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ｔｈｒ、Ａｌａ−Ｐｒｏ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、Ｔｈｒ−Ｐｒｏ、Ａｒｇ−Ｐｒｏ、またはＰｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏからなる群より選択される。
【００１５】
プロペプチドは、ＩＧＦ−ＩのＮ末端（グリシン）にそのＣ末端で結合する。プロペプチドは好ましくは、３０個までのアミノ酸長を有する。好ましくは、Ｘ１は結合である。好ましくはｎは、０または６である。好ましくはＸ２は、ペプチド配列番号７である。好ましくはＹは、Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏである。
【００１６】
本発明はさらに、本発明によるＩＧＦ−Ｉを、好ましくは医薬的に許容しうる担体とともに含有する医薬組成物を含む。
【００１７】
本発明はさらに、本発明によるＩＧＦ−Ｉを含有する医薬組成物の製造方法を含む。
【００１８】
本発明はさらに、ＡＤの治療のための医薬の製造のための本発明によるＩＧＦ−Ｉの使用を含む。
【００１９】
本発明はさらに、アミノ反応性ＩＧＦ−Ｉの医薬有効量を、ＡＤの治療を必要とする患者へ、好ましくは１週間に１〜２回の適用において投与することを特徴とする、ＡＤの治療のための方法を含む。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
驚くべきことに、ＩｇＡプロテアーゼ、好ましくはナイセリア・ゴノレー由来のＩｇＡプロテアーゼが、アミノ酸配列Ｙ−Ｐｒｏ．！．Ｇｌｙ−Ｐｒｏを切断できることが見出された。Ｙは、Ｐｒｏ、Ｐｒｏ−Ａｌａ、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ｔｈｒ、Ａｌａ−Ｐｒｏ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、Ｔｈｒ−Ｐｒｏ、Ａｒｇ−Ｐｒｏ、またはＰｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏからなる群より選択される。好ましくはＰｒｏ−Ｐｒｏ．！．Ｇｌｙ−ＰｒｏまたはＰｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ．！．Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（配列番号１１）が切断部位として有用である（．！．：切断位置）。本発明による処理のためのＩｇＡプロテアーゼ切断部位は、アミノ酸コンセンサス配列Ｙ−Ｐｒｏ．！．Ｇｌｙ−Ｐｒｏを有し、それにより、Ｇｌｙ−Ｐｒｏは、ＩＧＦ−Ｉの最初の２個のアミノ酸である。Ｙは好ましくは、アミノ酸Ｐｒｏ、Ｐｒｏ−Ａｌａ、Ａｒｇ−ＰｒｏまたはＰｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏで終止するアミノ酸配列を表す。このようなＹアミノ酸配列、特にＰｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏは、例えば、Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ（配列番号１２）またはＰｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ（配列番号１３）にあるようなさらなるＡｌａ基またはＰｒｏ−Ａｌａ基によって伸長されることが可能である。特に好ましいのは、切断アミノ酸配列Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ．！．Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（配列番号１１）、Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ．！．Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（配列番号１４）、Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−．！．Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（配列番号１５）、Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ．！．Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（配列番号１６）またはＰｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ．！．Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（配列番号１７）である。
【００２１】
本発明によると、「ＩｇＡプロテアーゼ」という用語には、ＩｇＡを特異的に切断し、例えばナイセリア・ゴノレー（２型）由来のＩｇＡ１プロテアーゼなど、Kornfeld, S.J. and Plaut, A.G., Rev. Infekt. Dis. 3 (1981) 521-534に記載されるプロテアーゼが含まれる。独国特許第36 22 221(A)号、Koomey, J.M., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982) 7881- 7885、Bricker, J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983) 2681- 2685、Pohlner, J., Nature 325 (1987) 458- 462、およびHalter, R., et al., EMBO J. 3 (1984) 1595-1601において記載されているような組換えＩｇＡプロテアーゼも、まさに適している。好ましくは、該ＩｇＡプロテアーゼは、ナイセリア・ゴノレー由来のＩｇＡプロテアーゼである。好ましくは、該ナイセリア・ゴノレー（２型）由来のＩｇＡ１プロテアーゼは、配列番号２１を有する。
【００２２】
本発明によるＩＧＦ−Ｉとは、ソマトメジンＣとも呼ばれ、SwissProt No. P01343によって定義される、７０個のアミノ酸からなるヒトタンパク質を指す。用途、活性および産生は、例えば、le Bouc, Y., et al., FEBS Lett. 196 (1986) 108-112、de Pagter-Holthuizen, P., et al., FEBS Lett. 195 (1986) 179-184、Sandberg Nordqvist, A.C., et al., Brain Res. Mol. Brain Res. 12 (1992) 275-277、Steenbergh, P.H., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 175 (1991) 507-514、Tanner, J.M., et al., Acta Endocrinol. (Copenh.) 84 (1977) 681-696、Uthne, K., et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 39 (1974) 548-554、欧州特許第0 123 228号、欧州特許第0 128 733号、米国特許第5,861,373号、米国特許第5,714,460号、欧州特許第0 597 033号、WO02/32449、WO93/02695に記載される。
【００２３】
本発明によるＩＧＦ−Ｉは、ＩＧＦ−Ｉ、Ｃ末端切断型ＩＧＦ−Ｉ（３〜６個のアミノ酸の欠失）、Ｒ３６Ａ（位置３６でのアラニンによるアルギニンの置換）、Ｒ３７Ａからなる群より選択されるＩＧＦ−Ｉを含む。好ましくは、該ＩＧＦ−Ｉは、ＩｇＧ由来の、好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ４由来のヒトＦｃにそのＣ末端で結合する。
【００２４】
Ｃ末端切断型ＩＧＦ−Ｉ（３〜６個のアミノ酸の欠失）とは、Ｃ末端で３〜６個のアミノ酸の欠失した配列番号１のＩＧＦ−Ｉを示す。
【００２５】
Ｒ３６Ａとは、アミノ酸位置３６でアルギニンがアラニンによって置換された配列番号１のＩＧＦ−Ｉを示す。
【００２６】
Ｒ３７Ａとは、アミノ酸位置３７でアルギニンがアラニンによって置換された配列番号１のＩＧＦ−Ｉを示す。
【００２７】
融合タンパク質をコードする遺伝子は、好ましくは、融合タンパク質が、必要条件に従って産生されることが可能であるよう、適切な（好ましくは誘導可能な）発現シグナルの調節下に置かれる。適切な原核細胞または真核（植物および動物）細胞は、タンパク質融合の産生のための宿主細胞として使用可能であるが、無細胞系も可能である。
【００２８】
本発明による方法の好ましい実施態様は、宿主細胞が、組換えＤＮＡまたは組換えベクターで形質転換され、ここで、該ＤＮＡまたはベクターは、本発明による融合タンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つのコピーを含有し、そして形質転換された細胞は、適切な培地中で培養され、融合タンパク質をコードする遺伝子は、該形質転換された細胞中で発現し、融合タンパク質はＩｇＡプロテアーゼで切断され、そしてＩＧＦ−Ｉが単離されることを特徴とする。
【００２９】
本発明による融合タンパク質の発現は、例えば、リジンを含まないβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の断片との融合によってＤＮＡレベルで改良されることが可能であり、すなわち、Ｙは、リジンを含まないβ−ガラクトシダーゼタンパク質の一部を含有する。融合タンパク質の発現を亢進させるための他の代替例は、当業者に公知である。発現産物の精製および分離は、他のポリペプチド、特に高電荷のポリペプチドもしくはタンパク質（例えば、ポリ（Ｌｙｓ，Ａｒｇ））または高い親和性で特定の物質へ結合することが可能なポリペプチドもしくはタンパク質（例えば、ストレプトアビジン）との融合によって容易になり得る（例えば、欧州特許第0 089 626(A)号、欧州特許第0 306 610(A)号）。特に好ましいリンカーペプチドは、好ましくはＮ末端側でＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号１８）、ＮＨＨＨＨＨＨ（配列番号１９）またはＨＨＨＨＨＨ（配列番号２０）が先行するペプチド配列番号６〜１０である。
【００３０】
本発明は、本発明による融合タンパク質をコードし、およびＩｇＡプロテアーゼ切断部位が、プロペプチドとＩＧＦ−Ｉとの間の接合領域中に組み込まれる（組換え）核酸も提供する。
【００３１】
本発明による組換えＤＮＡは、分子生物学の分野の当業者に公知の方法で得ることができる。このために、ＩＧＦ−Ｉのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を含有するベクターは通常、この遺伝子の５’末端の領域中の制限エンドヌクレアーゼで切断され、所望の配列を含有するオリゴヌクレオチドと再度結合される。
【００３２】
さらに、本発明は、本発明による組換えＤＮＡの少なくとも１つのコピーを含有する組換えベクターも提供する。原核生物におけるタンパク質発現のためのベースとして適切なベクターは、当業者に公知である。このベクターは好ましくは、本発明による組換えＤＮＡの高い発現が可能となるベクターである。ベクター上の組換えＤＮＡは好ましくは、誘導可能な発現シグナルの調節下にある（例えば、λ、ｔａｃ、ｌａｃまたはｔｒｐプロモーター）。
【００３３】
本発明によるベクターは、染色体外に存在し得（例えば、プラスミド）、および宿主生物体（例えば、λバクテリオファージ）のゲノム中に組み込まれ得る。本発明によるベクターは、好ましくはプラスミドである。各場合において、特定の宿主生物体における遺伝子発現に適しているベクターは、分子生物学の分野の当業者に公知である。前記ベクターは、真核ベクターであり得るが、好ましくは原核ベクターである。原核生物における本発明によるＤＮＡの発現に適したベクターの例は、例えば、市販のｐＵＣベクターおよびｐＵＲベクターである。
【００３４】
本発明は、本発明による組換えＤＮＡでおよび／または本発明による組換えベクターで形質転換された細胞、好ましくは原核細胞、特に好ましくは大腸菌（E.coli）細胞も提供する。
【００３５】
融合タンパク質が、原核生物中で発現する場合、不活性のやや溶け難い凝集体（屈折体、封入体）が形成される。したがって、融合タンパク質は、その活性型形態へと形質転換されなければならない。当業者になじみのある手法を使用して（例えば、欧州特許第0 219 874(A)号、欧州特許第0 114 506(A)号、WO84/03711参照）、まず、変性剤の添加によって可溶化が実施された後、再生および所望の場合さらなる精製工程が実施される。
【００３６】
ＩｇＡプロテアーゼで切断されるべきＩＧＦ−Ｉ融合タンパク質の処理に必要な条件は、重要ではない。しかしながら、この過程において、ＩＧＦ−Ｉ融合タンパク質とＩｇＡプロテアーゼとの重量比が１：１〜１００：１であることが好ましい。反応は好ましくは、ｐＨ６．５〜８．５のバッファー水溶液中で行う。バッファー濃度は好ましくは、５０〜５００mmolの範囲にあり、所望の場合、０〜１００mmol／Lの塩化ナトリウムを添加する。切断は好ましくは、室温で少なくとも６０分間から５日まで、好ましくは２４〜７２時間実施される。
【００３７】
可溶化、再生およびＩｇＡプロテアーゼによる切断の後、このように得られた切断産物は好ましくは、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび／またはサイズによる分画によって精製される。このように生じたＩＧＦ−Ｉは、位置−１においてメチオニンを含まない。
【００３８】
医薬製剤
ＩＧＦ−Ｉは、混合物として、または例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーもしくはサイズ排除クロマトグラフィーによって分離される異なる種として投与されることが可能である。本発明の化合物は、当業者に公知である、医薬組成物の製造方法に従って処方されることが可能である。このような組成物の製造のために、本発明によるＩＧＦ−Ｉは、医薬的に許容しうる担体との混合物中で、好ましくは医薬組成物の所望の成分を含有する水溶液に対する透析または透析濾過によって組み合わされる。このような許容しうる担体は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, 1990, Mack Publishing Company, Oslo et al.編集（例えばｐ．１４３５〜１７１２）に記載される。典型的な組成物は、本発明に従った物質の有効量、例えば約０．１〜１００mg／mLを、適切な量の担体とともに含有する。組成物は、非経口的に投与され得る。本発明によるＩＧＦ−Ｉは、好ましくは腹腔内、皮下、静脈内または鼻内適用を介して投与される。
【００３９】
本発明による医薬製剤は、当該分野で公知の方法に従って調製されることが可能である。通常、ＩＧＦ−Ｉの溶液は、医薬組成物中で使用されるよう企図されたバッファーに対して透析または透析濾過され、所望のタンパク質終濃度は、濃縮または希釈によって調整される。
【００４０】
以下の例および配列は、本発明の理解を助けるために提供され、本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に示される。変更が、本発明の精神から逸脱することなく、記載の手法においてなされ得ることが理解される。アミノ酸の名称は、１文字コード（例えば、Ｒ）または３文字コード（例えば、Ａｒｇ）のいずれかを使用して略記される。Ｒ３６Ａとは、アミノ酸アルギニン３６がアラニンによって置換されているＩＧＦ−Ｉ変異体を意味する。
【００４１】
配列表
配列番号１  ヒトＩＧＦ−Ｉのアミノ酸配列（SwissProt P01343由来のアミノ酸４９〜１１８）
配列番号２  好ましいプロペプチドのアミノ酸配列
配列番号３  好ましいプロペプチドのアミノ酸配列
配列番号４  好ましいプロペプチドのアミノ酸配列
配列番号５  好ましいプロペプチドのアミノ酸配列
配列番号６〜１０  リンカー
配列番号１１〜１７  切断配列
配列番号１８〜２０  その他
配列番号２１  ナイセリア・ゴノレー（２型）由来のＩｇＡ１プロテアーゼのアミノ酸配列
【実施例】
【００４２】
実施例１
有用な発現ベクターおよびE. coli株は、欧州特許第0 972 838号に記載されている。E. coliクローンから、発現している融合タンパク質が選択的寒天プレート上で増殖し、１個の接種ループを（１００mLの）選択培地へ移し、３７℃で１３時間、光学密度（５７８nm）が２〜４になるまで培養する。この培養物を氷上でさらに６時間保存した後、主要培養物の自動接種を３７℃で実施する。ＩＧＦ−Ｉ変異体の発現は、１．０mM  ＩＰＴＧの添加とともに５０の光学密度（５７８nm）で開始する。全体的な発酵は、１６時間まで持続する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の産物のタンパク質バンドの容積測定強度をＩＧＦ標準物質のバンドと比較することによって、タンパク質の量を濃度測定で測定する。培養ブロスを遠心分離によって回収する。
【００４３】
精製された封入体（ＩＢ）材料を得るために、標準物質の発酵から回収されたバイオマスを次の手法で処理する。０．３ｇ／１００ｇ生物乾燥重量のリゾチームおよび５Ｕ／ｌｇ生物乾燥重量のベンゾナーゼを２０分間インキュベートし、ホモジナイズする。３０Ｕ／ｌｇ生物乾燥重量のベンゾナーゼを添加し、３７℃で６０分間インキュベートする。０．５Ｌ／ＬのＢｒｉｊバッファーを添加し、室温で３０分間インキュベートする。遠心分離後、３００mLのTris−ＥＤＴＡ−バッファー／１００ｇ生物湿重量（精製されたＩＢ湿重量）中にペレットを再懸濁し、室温で３０分間インキュベートし、遠心分離する。６．８Ｍグアニジン−ＨＣｌ、０．１Ｍ  TrisＨＣｌ、０．１Ｍ  ＤＴＴ、ｐＨ８．５中で１ｇ／ＬのＩＢを室温で一晩可溶化する。濁った溶液を６．８Ｍグアニジン−ＨＣｌ、０．１Ｍ  TrisＨＣｌ、ｐＨ８．０に対して透析する。透析後、遠心分離によって不溶性成分を除去する。プロＩＧＦ−Ｉ溶液を０．８Ｍアルギニン、０．１Ｍ  TrisＨＣｌ、０．１Ｍグアニジン−ＨＣｌ、１mM  ＧＳＨ、１mM  ＧＳＳＨ、ｐＨ８．５中へ室温で５０倍希釈することによって、フォールディングを実施する。２時間後、溶液に２Ｍ塩化ナトリウムを補充し、濾過し、２Ｍ  ＮａＣｌ、０．８Ｍアルギニン、０．１Ｍ  TrisＨＣｌ、０．１Ｍグアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ８．５を含有するバッファーで室温で平衡化したＨＩＣカラム（Butyl Sepharose 4 Fast Flow; GE, Amersham Biosciences）へ、１０mL／分の流速で適用する。ベースラインに到達するまでカラムを平衡化バッファーで洗浄した後、平衡化バッファーで開始し、０．１Ｍ  TrisＨＣｌ、５％エチレングリコール、ｐＨ８．５を含有するバッファーで終了する直線勾配の１０カラム容積で溶出する。逆相高速クロマトグラフィー（ｒｐＨＰＬＣ）によって、溶出した画分を分析する。正確に形成されたＳＳ架橋を有するタンパク質を含有する画分をプールした。反応混合物にナイセリア・ゴノレー（２型）由来のＩｇＡ１プロテアーゼを補充し（重量比１：５０）、室温で一晩インキュベートする（図２参照）。反応混合物を５０mM酢酸（ｐＨ４．５）で１：２に希釈した後、５０mM酢酸で平衡化された陽イオンＩＥＣカラム（MacroCap SP support; GE, Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden）へ適用するか、またはＳＥＣ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００（General Electric）へ適用する。ベースラインに到達するまでカラムを洗浄した後、５０mM酢酸で開始し、１Ｍ塩化ナトリウムを補充された５０mM酢酸で終了する直線勾配の２０カラム容積で溶出する。溶出した画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ＩＧＦ−Ｉの分子サイズを有する単一バンドを含有する画分をＩＧＦ−１としてプールする。静的光散乱検出を有する分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、トリプシン消化のＭＳ分析、Ａｓｐ−Ｎ消化のＭＳ分析および分析用陽イオンＩＥＣまたはＳＥＣによって、ＩＧＦ−Ｉの同一性を確認する。
【配列表】
2010501606000001.app
【国際調査報告】
2010501606.tif 000002
2010501606.tif 000003
2010501606.tif 000004
2010501606.tif 000005