(57)【要約】本発明は、血友病Ｂの補充療法及び遺伝子治療に代わるものとなる活性の高い分子へと第ＩＸ因子を変えることを目的とする。組み換え技法を用いると、位置８６、２７６、２７７及び３３８に置換を有する第ＩＸ因子は、組み換え野生型第ＩＸ因子よりも良好な凝血活性を示す。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
８６、２７６、２７７及び３３８から成る群から選択されたアミノ酸位置にＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７のアミノ酸残基の置換を有し、ただしアミノ酸位置３３８での単置換は除外される組み換えヒト第ＩＸ因子タンパク質。
【請求項２】
前記残基が、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、アルギニン又はリシンから選択される、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
前記残基がアラニンである、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項４】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、２、３、４、５又は６である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項５】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６である、請求項４に記載のタンパク質。
【請求項６】
野生型第ＩＸ因子タンパク質より２〜１４倍高い凝血活性を有する、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項７】
補因子である第ＶＩＩＩａ因子に対する増強された親和性を有する、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項８】
０．１〜０．５ｎＭのＫｄ値を有する、請求項５に記載のタンパク質。
【請求項９】
３２〜１２８ｎＭのＫＭ値を有する、請求項５に記載のタンパク質。
【請求項１０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．９、１０、１１、１２、１３又は１４に示される核酸配列を有する、組み換えヒト第ＩＸ因子タンパク質をコードする単離核酸。
【請求項１１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４である、請求項１０に記載の核酸。
【請求項１２】
（ａ）請求項１で請求のヒト第ＩＸ因子タンパク質と、（ｂ）薬学的に許容可能な担体、賦形剤又は希釈剤とを含む医薬組成物。
【請求項１３】
インビボで請求項１で請求のヒト第ＩＸ因子タンパク質を産生させるための方法であって、（ａ）前記ヒト第ＩＸ因子タンパク質をコードする核酸を担持するベクターを構築し、（ｂ）前記ベクターを哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項１４】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記核酸が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．９、１０、１１、１２、１３又は１４に示される配列を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記投与がベクター、プラスミド、リポソーム、ＤＮＡ注射、エレクトロポレーション又は遺伝子銃を介する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記投与法が静脈注射又は肝動脈注入である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
血友病を治療するための方法であって、このような治療を必要とする患者に、有効量の請求項１で請求のタンパク質を投与することを含む方法。
【請求項１９】
前記投与が注射による投与である、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組み換えヒト第ＩＸ因子タンパク質及びこのタンパク質をコードする核酸配列に関する。本発明は、血友病を治療するための方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
先進国において、血友病患者を治療するにあたっての現在の治療上の選択肢には、血漿由来又は組み換え凝固因子濃縮製剤（Ｌｉｐｐｅｒｔ Ｂ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌ． Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ． ２００５；１６：４７７−４８５）を用いた予防的及び出血時補充療法がある（Ｌｏｆｑｖｉｓｔ Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｎｔｅｒｎ． Ｍｅｄ． １９９７；２４１：３９５−４００）。血友病の標準的な治療法は、タンパク質濃縮物の注入による欠損した凝固因子の補充である。注入量は、出血の重症度、出血部位、患者の体のサイズに依存する。重症型血友病の患者には、定期的な予防的投与を行う。治療と止血管理を行うことにより転帰は良好であることから、殆どの血友病患者が、比較的普通の生活を送ることができる。しかしながら、組み換えタンパク質は高コストで入手が困難なことから、血友病の治療において、凝固因子の投与は極めて重要な課題となっている。加えて、血漿由来の製剤には、ＨＩＶやＢ型、Ｃ型肝炎への感染のリスクがある上、患者に注入したタンパク質の半減期は短いため、かなり頻繁に注入を行う必要がある（Ｗｈｉｔｅ Ｇ．Ｃ． ｅｔ ａｌ．， Ｔｒａｎｓｆｕｓ． Ｓｃｉ． １９９８；１９：１７７−１８９）
【０００３】
遺伝子治療、組織の移植等のその他の治療も、考えられ得る治療として研究中である（Ｈｏｕｇｈ Ｃ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｔｈｒｏｍｂ． Ｈａｅｍｏｓｔ．， ２００５；３：１１９５−１２０５）。血友病患者への遺伝子治療の臨床試験では、送達ビヒクルに対する抗体の産生により、凝固因子の発現が治療により一時的にしか増大しないことが示された（Ｍａｎｎｏ Ｃ．Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ２００６；１２：３４２−３４７）。従って、遺伝子治療はまだ研究段階にあり、血友病の治療として普及させる前に克服すべき多くの問題を抱えている。
【０００４】
血友病Ｂは、血液の凝固特性に影響する、第ＩＸ因子と称される血漿タンパク質の欠乏によって引き起こされる。この疾患は、Ｘ連鎖性劣性遺伝によって引き起こされ、Ｘ染色体上に欠陥遺伝子がある。このため、この疾患は主に男性に発症する。血友病Ｂは、男性３００００人に対して約１人に起こる。
【０００５】
ヒト第ＩＸ因子は、ビタミンＫ依存性チモーゲンであり、血液の凝固において重要な役割を果たす。第ＩＸ因子は、分子質量５５０００ダルトンの４１５アミノ酸１本鎖チモーゲンとして循環し、正常な血漿中に約５μｇ／ｍｌ存在する。
【０００６】
組み換え第ＩＸ因子製品により、ＨＩＶやＢ型、Ｃ型肝炎への感染のリスクが大幅に低下する。凝血活性が増強された組み換え第ＩＸ因子を第ＩＸ因子ＤＮＡの遺伝子操作により産生することができたなら、凝固因子のコストが下がるだけでなく、血友病患者の止血管理におけるその用量も低下する。更に、この方法は、血友病患者の遺伝子治療の臨床試験にとってより効率的なツールにもなる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｌｏｆｑｖｉｓｔ Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｎｔｅｒｎ． Ｍｅｄ． １９９７；２４１：３９５−４００
【非特許文献２】Ｌｉｐｐｅｒｔ Ｂ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌ． Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ． ２００５；１６：４７７−４８５
【非特許文献３】Ｗｈｉｔｅ Ｇ．Ｃ． ｅｔ ａｌ．， Ｔｒａｎｓｆｕｓ． Ｓｃｉ． １９９８；１９：１７７−１８９
【非特許文献４】Ｈｏｕｇｈ  Ｃ.  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ.  Ｔｈｒｏｍｂ.  Ｈａｅｍｏｓｔ．，２００５；３：１１９５−１２０５
【非特許文献５】Ｍａｎｎｏ  Ｃ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ.  Ｍｅｄ．  ２００６；１２：３４２−３４７
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、８６、２７６、２７７及び３３８から成る群から選択されたアミノ酸位置にＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７のアミノ酸残基の置換を有する組み換えヒト第ＩＸ因子タンパク質を提供する。ただし、アミノ酸位置３３８での置換は除外される。
【０００９】
本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．９、１０、１１、１２、１３又は１４に示される核酸配列を有する、組み換えヒト第ＩＸ因子タンパク質をコードする単離核酸を更に提供する。
【００１０】
本発明は、（ａ）本発明のヒト第ＩＸ因子タンパク質と、（ｂ）薬学的に許容可能な担体、賦形剤又は希釈剤とを含む医薬組成物を更に提供する。
【００１１】
本発明は、インビボで本発明のヒト第ＩＸ因子タンパク質を産生させるための方法を更に提供し、本方法は、（ａ）ヒト第ＩＸ因子タンパク質をコードする核酸を担持するベクターを構築し、（ｂ）このベクターを哺乳動物に投与することを含む。
【００１２】
本発明は、血友病を治療するための方法を更に提供し、本方法は、このような治療を必要とする患者に、有効量の本発明のタンパク質を投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】精製した組み換え第ＩＸ因子のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。野生型（ＩＸ−７）及び変異体ＩＸ−１、ＩＸ−２、ＩＸ−８、ＩＸ−３、ＩＸ−４、ＩＸ−５、ＩＸ−６から得た精製タンパク質（４μｇ／レーン）をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気永動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供した。試料は、非還元条件下で分析に供された。第ＩＸ因子タンパク質のバンドをクマシーブルー染色により可視化した。アフィニティ精製した組み換え野生型及びアラニン置換第ＩＸ因子の濃度を、ウシγ−グロブリン（カタログ番号２３２１２、Ｐｉｅｒｃｅ社）を用いてＢＣＡＴＭタンパク質定量キット（Ｐｉｅｒｃｅ社、ロックフォード、イリノイ州、米国）により求めて、タンパク質濃度を計算するための検量線を作成した。
【図２】ｐＢＳ−ＨＣＲＨＰ１−Ａ−ＦＩＸでのハイドロダイナミック法による治療後２４時間での血友病Ｂのマウスにおけるヒト第ＩＸ因子のレベルを示す（「方法」を参照のこと）。雄の血友病Ｂマウス（体重２０ｇ）を、６〜８秒後に２ｍｌの５０μｇのＤＮＡを尾静脈に注射することにより流体力学的なショックに供した。注射から２４時間後にマウスを回収、屠殺し、凝血活性及び酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）によりタンパク質レベル（ＩＸ：Ａｇ）を求めるために血漿を回収した。各バーは、個々のマウスのデータを表す。ＥＬＩＳＡ及び凝血活性についての検量線は、２０人の健康なドナーからプールした正常な血漿の段階希釈物から並列実験で導いた。プール血漿における第ＩＸ因子タンパク質レベル及び凝血活性は、５μｇ／ｍｌと想定した。
【図３】血友病Ｂマウスへのアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）媒介遺伝子導入による、第ＩＸ因子発現の結果を示す。それぞれＩＸ−６、ＩＸ−７を担持するｒＡＡＶ２／８ベクターの構築は「方法」に記載した。ホモ接合の雌の血友病Ｂマウス（ｎ＝６、８〜１４週齢、体重１６〜１８ｇ）に、図示のように、ＩＸ−６、ＩＸ−７を担持したｒＡＡＶ２／８ビヒクルをそれぞれ（ａ）４ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇ、（ｂ）４ｘ１０１１ｖｇ／ｋｇ及び８ｘ１０１０ｖｇ／ｋｇ静脈注射した。注射から２週間後に血液を採取し、第ＩＸ因子タンパク質レベル及び凝血活性を測定した。各マウス群は、週齢に従って番号がつけられた。パーセンテージで表された特異的凝血活性を、各試料で測定された凝血活性をＥＬＩＳＡで測定されたその質量（ＩＸ：Ａｇ）で割ったものとして定義した。ＥＬＩＳＡ及び凝血活性についての検量線は、２０人の健康なドナーからプールした正常な血漿の段階希釈物から並列実験で導いた。正常なプール血漿における第ＩＸ因子タンパク質レベル及び凝血活性は、５μｇ／ｍｌと想定した。
【図４】２つのＥＧＦドメイン及び触媒ドメイン（１ＲＦＮ．ＰＤＢ）から成る第ＩＸａ因子のリボン図である。残基８６、２７７、３３８は、側鎖込みで図示されている。活性部位に結合したインヒビターも、側鎖と共に図示されている。提案される第ＶＩＩＩａ因子結合部位及び活性化ペプチド領域も標識した。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、野生型第ＩＸ因子よりも活性が高い組み換え第ＩＸ因子を提供し、治療レベルに達するまで血友病患者に注射するタンパク質の量を野生型因子よりも少なくすることが可能になる。
【００１５】
本発明は、ウィルスベクター等の様々な手段により動物に送達した場合に、野生型第ＩＸ因子を発現するＤＮＡ配列よりも高い凝血活性を有する第ＩＸ因子タンパク質を発現する、新規の第ＩＸ因子ＤＮＡ配列を提供する。
【００１６】
組み換え技術を用いると、位置８６、２７６、２７７及び３３８に二重又は三重のアラニン置換を同時に有する第ＩＸ因子は、野生型組み換え第ＩＸ因子（ＩＸ−７）より２〜１４倍良好な凝血活性を示した。これらの第ＩＸ因子変異体の凝血活性の上昇に寄与している原因を解明するための試みにおいて、幾つかの機能パラメータを求めた。表１は、凝血活性の上昇が第ＶＩＩＩａ因子に依存しており、かつ第ＩＸ因子の第ＶＩＩＩ因子への親和性の上昇及び第Ｘ因子についてのｋｃａｔの上昇、ＫＭの低下に起因していることを実証している。
【００１７】
従って、本発明は、８６、２７６、２７７及び３３８から成る群から選択されたアミノ酸位置にＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７のアミノ酸残基の置換を有する組み換えヒト第ＩＸ因子タンパク質を提供する。ただし、アミノ酸位置３３８での単置換は除外される。本発明のタンパク質は、野生型第ＩＸ因子のアミノ酸配列にアラニン残基置換を有し、置換は８６、２７６、２７７及び３３８から成る群から選択されたアミノ酸位置にて起こる。
【００１８】
本明細書中で使用する用語「アミノ酸」とは、アミン及びカルボキシル官能基の両方を含む分子である。生化学において、この用語は、一般式Ｈ２ＮＣＨＲＣＯＯＨを有するαアミノ酸を意味しており、Ｒは有機置換基である。αアミノ酸において、アミノ及びカルボキシル基は、α炭素と称される同じ炭素に結合している。多様なαアミノ酸は、そのα炭素に結合している側鎖（Ｒ基）によって異なっている。一般に、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、アルギニン又はリシン等の標準的なアミノ酸を、置換アミノ酸として用いることができる。好ましい実施形態において、置換アミノ酸残基はアラニンである。
【００１９】
より好ましい実施形態において、本発明のタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、２、３、４、５又は６を有する。最も好ましい実施形態において、本発明のタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６を有する。
【００２０】
置換により、野生型第ＩＸ因子タンパク質の凝血活性より２〜１４倍高い活性を示す非天然のヒト第ＩＸ因子が得られる（表１）。このタンパク質は、補因子である第ＶＩＩＩａ因子に対して増強された親和性を有している。ある実施形態において、組み換えヒト第ＩＸ因子タンパク質は、０．１〜０．５ｎＭのＫｄ値を有する。ある実施形態において、組み換えヒト第ＩＸ因子タンパク質は、３２〜１２８ｎＭ、好ましくは３２〜５６ｎＭのＫＭ値を有する（表２）。
【００２１】
本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．９、１０、１１、１２、１３又は１４に示される核酸配列を有する、組み換えヒト第ＩＸ因子タンパク質をコードする単離核酸も提供する。好ましい実施形態において、核酸はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１１、１２又は１３を有する。より好ましい実施形態において、核酸はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４を有する。
【００２２】
（表１）精製第ＩＸ因子ａの特異的凝血活性
2010527581.tif 000002
ａ：組み換え第ＩＸ因子は、安定的に移入されたＨＥＫ２９３細胞の０．５〜１リットルの培養上清から精製された。精製された第ＩＸ因子濃度を、図１の説明文に記載のようにビウレット法（ＢＣＡタンパク質定量キット、Ｐｉｅｒｃｅ社）により求め、５μｇ／ｍｌに希釈した。凝血活性を、ａＰＴＴアッセイにより求めた。段階希釈されたヒトの正常なプール血漿を用いて、検量線を作成した。プール血漿中の第ＩＸ因子濃度を、５μｇ／ｍｌと推定した。試料の特異的凝血活性を、凝血活性を濃度で表したその質量で割ったものと定義し、パーセンテージで表した。実験は２回繰り返した。
【００２３】
（表２）
第ＶＩＩＩａ因子の不在及び存在下における第Ｘａ因子産生の動力学的パラメータ
2010527581.tif 000003
ａ：第ＩＸａ−ＶＩＩＩａ因子複合体の濃度は、実験条件及び観察されたＫｄから導かれた。
ｂ：ｋｃａｔ＝Ｖmax／［酵素］。単位は、Ｍ  ＦＸａ、Ｍ−１ＦＩＸａ（又はＦＩＸａ−ＦＶＩＩＩａ）、ｓ−１
ｃ：反応を０．４ｎＭの第ＶＩＩＩａ因子及び０．２５ｎＭの第ＩＸａ因子と共にインキュベートし、０．５ｍＭのＳｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ  ＦＸａ、４０μＭのＰＣＰＳ及び５ｍＭのＣａ２＋の存在下で０〜２００ｎＭの第Ｘ因子を活性化させた。
＃ＮＤ：もとめず
【００２４】
本発明は、（ａ）本発明のヒト第ＩＸ因子タンパク質と、（ｂ）薬学的に許容可能な担体、賦形剤又は希釈剤とを含む医薬組成物を更に提供する。
【００２５】
インビトロでの発現及びその生物学的特性の分析に加えて、本発明は、アラニン変異体の潜在的な役割を評価するためにマウスモデルを用いることにも関する。血友病Ｂマウスは、これらの変異第ＩＸ因子の生理学的な役割の研究を可能にするモデルとなる。第ＩＸ因子の分解経路を推測するために、これらのヒト第ＩＸ因子タンパク質を、血友病マウスの尾静脈に注射し、これらの変異タンパク質の特性を観察する。
【００２６】
ネイキッドプラスミドＤＮＡの肝臓へのハイドロダイナミック法での送達により、マウス内で治療的血漿レベルの導入遺伝子産物を産生させることができる。この技術を用いて、野生型及び変異第ＩＸ因子遺伝子をコードするＤＮＡを血友病Ｂマウスに送達する。
【００２７】
ウィルスベクターによる治療用導入遺伝子の全身への送達により、長期にわたって導入遺伝子が発現する可能性がある（Ｍｉａｏ Ｃ．Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ． ２００１；３：９４７−９５７）。しかしながら、肝細胞への遺伝子導入の効率は良くない。組み換えＡＡＶ送達系は、血友病Ｂ動物モデルでの初期の前臨床試験において効力を実証した際に強い支持を得た（Ｄａｖｉｄｏｆｆ Ａ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ． ２００５；１１：８７５−８８８）。２つの臨床試験を、第ＩＸ因子を直接的な筋肉注射により筋肉に（Ｍａｎｎｏ Ｃ．Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ． ２００３；１０１：２９６３−２９７２）及び肝動脈注入により肝臓に送達するために、ＡＡＶ血清型２ベクターを用いて開始した（Ｍａｎｎｏ Ｃ．Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ２００６；１２：３４２−３４７）。筋肉での臨床試験において、第ＩＸ因子の血漿レベルは概して１％を超えなかったのに対し、ＡＡＶベクターの肝動脈注入の処置を受けた患者の血漿においては、最高１２％のレベルが検出された。しかしながら、この上昇の後、恐らくは形質導入細胞をターゲットとしたＡＡＶカプシドタンパク質への既存の宿主免疫能により、血清トランスアミナーゼレベルが一時的に上昇し、第ＩＸ因子発現が消失した。組み換えＩＸ−６は、本発明のマウスモデルにおいて野生型（ＩＸ−７）よりも高い活性を有しているため、ウィルス粒子の注射量を減らしても同じ第ＩＸ因子活性を得ることが可能となり得る。
【００２８】
従って、本発明は、本発明のヒト第ＩＸ因子タンパク質をインビボで産生させるための方法も提供し、本方法は、
（ａ）ヒト第ＩＸ因子タンパク質をコードする核酸を担持するベクターを構築し、
（ｂ）このベクターを哺乳動物に投与することを含む。
【００２９】
好ましい実施形態において、この哺乳動物はヒトである。
【００３０】
本明細書中で使用の用語「投与」は、以下に限定するものではないが、ベクター、プラスミド、リポソーム、ＤＮＡ注射、エレクトロポレーション、遺伝子銃、静脈注射、肝動脈注入を介したものを含む。
【００３１】
本発明は、血友病を治療するための方法を更に提供し、本方法は、このような治療を必要とする患者に有効量の本発明のタンパク質を投与することを含む。
【００３２】
本発明を当業者がそれを調製し使用するに十分な詳細さでもって説明し、例を挙げてきたが、本発明の精神及び範囲から逸脱することのない様々な代替案、改変、改良は明白である。
【００３３】
当業者なら、本発明が、目的を実行し、本来のものに加えて上記の結果及び利点を得るのに良く適していることを容易に理解できる。これらを得るための胚、動物、プロセス及び方法は、好ましい実施形態を代表するものであり、模範例であり、本発明の範囲を制限することを意図するものではない。当業者による改変及びその他の使用も起こり得る。これらの改変は本発明の精神に含まれ、請求項の範囲によって定義される。
【実施例】
【００３４】
以下の実施例は非限定的であり、本発明の様々な態様及び特徴を代表しているにすぎない。
【００３５】
材料
精製ヒト第ＶＩＩａ、ＸＩａ、Ｘａ及びＸ因子並びにヤギ・ポリクローナル抗ヒト第ＩＸ因子抗体（カタログ番号ＧＡＦＩＸ−ＡＰ）を、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＥＲＬ、サウスベンド、インディアナ州、米国）から購入した。無血清培地で用いるフォスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）及びＩＴＳ（インシュリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウム）培地補充物は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（セントルイス、ミズーリ州、米国）のものであった。組織因子及びＰＣＰＳリン脂質の調製は、過去に記載されている（Ｃｈａｎｇ ＹＪ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９９９：１０９４０−１０９４８）。第ＩＸ因子欠乏血漿、Ｓｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ  ＦＸａ及びＳｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ  ＦＩＸａは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ社（グリーンウィッチ、コネチカット州、米国）から購入した。全ての制限エンドヌクレアーゼ及びポリメラーゼは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社（ビバリー、マサチューセッツ州、米国）の製品であった。ジェネティシン（Ｇ４１８）は、ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ社（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ社、ダルムシュタット、ドイツ）のものであった。熱制御装置を備えたＶｍａｘマイクロタイタープレート読取装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社、メンロパーク、カリフォルニア州、米国）を、全ての分光光度分析に用いた。ＱＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ５０及びＲｅｓｏｕｒｃｅ  ＱはＡｍｅｒｓｈａｍ社（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＢｉｏＴｅｃｈ、ＵＫ、バックス、英国）からのものであった。
【００３６】
方法
インビトロでの第ＩＸ因子の変異誘発、発現及び精製
部位特異的な変異誘発を、ＰＣＲをベースとした方法（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、ボストン、米国）により、残基８６、２７７又は３３８のコドンをアラニンのコドンに置換するためのプライマー対を用いて、ヒト第ＩＸ因子ｃＤＮＡに行った。プライマーの配列は、残基８６を置き換えるためのＩＸ８６Ｔ７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１８）と対を成すＩＸ８６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１７）、残基２７７を置き換えるためのＩＸ２７７−２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２０）と対を成すＩＸ２７７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１９）、残基３３８を置き換えるためのＩＸ３３８Ｄ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２２）と対を成すＩＸ３３８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２１）である。これらのプライマー対を用いて、７つの異なる第ＩＸ因子ｃＤＮＡを作成し、完全に配列決定し、野生型第ＩＸ因子（ＩＸ−７）と共にｐＣＲ３ＴＭ−Ｕｎｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州、米国）にサブクローニングして、サイトメガロウィルスの制御下でヒト２９３細胞において発現させた。７つの組み換え第ＩＸ因子変異体のうち、３つは残基８６、２７７又は３３８にアラニン置換を有する単置換変異体であり（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８）、別の３つは、８６と２７７とに（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３）、８６と３３８とに（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４）、２７７と３３８とに（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５）アラニン置換を有する二重置換変異体であり、残りは８６、２７７及び３３８で全てアラニンによって置換された三重置換変異体である（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６）。組み換えタンパク質を発現する細胞クローンの同定は、第ＩＸ因子に特異的な市販の抗体を用いてＥＬＩＳＡ（以下を参照のこと）により行った。無血清培地での正しい細胞クローンの大量増殖及び組み換えタンパク質の精製は、過去に記載されたように行われた。簡単に説明すると、１リットルの培養上清を５ｍＭのベンズアミジン及び４ｍＭのＥＤＴＡに調整し、４３５０ｒｐｍでの遠心分離（ＨＡ６０００、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ−３Ｃ  Ｐｌｕｓ、デュポン社）に３０分間、４℃で供した。細胞片を除去し、上清を、ＴＢＳ／ＥＤＴＡ（２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ／４ｍＭのＥＤＴＡ）で平衡化したＱＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ５０カラム（３０ｍｌ、５ｘ２．５ｃｍ）に通した。カラムを５ｍＭのベンズアミジンを含有する１リットルのＴＢＳで洗浄した後、第ＩＸ因子をＴＢＳ／１ｍＭのベンズアミジン中の０〜３０ｍＭのＣａＣｌ２でグラジエント溶出した。第ＩＸ因子を含有する画分を、ＥＬＩＳＡ（以下を参照のこと）により同定し、プールし、１００倍の過剰体積の５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）に対して透析し、０．２２μｍシリンジフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、コーク、アイルランド）を通して濾過した。約１００ｍｌのＱＡＥ溶離液をＲｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑカラム（１ｍｌ、Ａｋｔａ  ＦＰＬＣ精製装置、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）にロードした。５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）を含有する緩衝液中で洗浄した後、カラムを、５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）中のＮａＣｌ（０〜１Ｍ）でグラジエント溶出した。第ＩＸ因子は、約２５０ｍＭのＮａＣｌの画分で溶出された。精製された組み換え第ＩＸ因子タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びそれに続くクマシーブルーでの染色により検証した。
【００３７】
酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）及び凝血活性アッセイ
培養上清及びマウス血漿中の野生型及びアラニン置換ヒト第ＩＸ因子（ｈＦＩＸ）のタンパク質質量を、ヒト第ＩＸ因子へのポリクローナル抗体を用いてＥＬＩＳＡにより求めた。抗体は種特異的なポリクローナル抗ｈＦＩＸ抗体であり、マウスの第ＩＸ因子とは交差反応しない。少なくとも２０人の健康な個体からのプール血漿を、並列実験において段階希釈で用い、第ＩＸ因子のレベルを計算するための検量線を作成した。プール血漿から得た検量線を、精製血漿第ＩＸ因子（ＩＭＭＵＮＩＮＥ、Ｂａｘｔｅｒ  ＡＧ社、ウィーン、オーストリア）から得た検量線と比較した。
【００３８】
組み換え第ＩＸ因子タンパク質の機能は、一段階活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）アッセイにおけるその凝血活性によって求められた。段階希釈された正常なプール血漿を、アッセイの基準として用いた。凝血活性アッセイの検量線を、精製血漿第ＩＸ因子（ＩＭＭＵＮＩＮＥ）及び組み換え第ＩＸ因子（ＢｅｎｅＦＩＸ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国）から導いた検量線と比較する。試料の特異的凝血活性を、凝血活性をその質量で割ったものと定義した。正常なヒトのプール血漿における第ＩＸ因子タンパク質の質量及び凝血活性を、５μｇ／ｍｌと想定した。
【００３９】
第ＸＩａ因子及び第ＶＩＩａ因子と組織因子との複合体（ＶＩＩａ・ＴＦ）による第ＩＸ因子の活性化
ＴＢＳ／５ｍＭのＣａＣｌ２の存在下での第ＸＩａ因子による第ＩＸ因子の活性化を、酵素・基質比１：２００で行った。反応混合物のアリコートを時間を置いて抜き出し、１％のＳＤＳ及び２ｍＭのＥＤＴＡを含有する溶液中に入れ、反応を停止させ、ゲルローディング緩衝液（最終濃度：５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ６．８、２ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＳＤＳ、８％のグリセロール、０．０２５％のブロモフェノールブルー）中で調整し、続いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に供した。第ＶＩＩａ・ＴＦ複合体による第ＩＸ因子の活性化を、酵素・基質比１：８０でＴＢＳ／５ｍＭのＣａＣｌ２中で行った。反応混合物のアリコートを時間を置いて抜き出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により分離した。
【００４０】
第ＩＸａ因子と第Ｘ因子との相互作用
第ＩＸａ因子を、上記のように第ＸＩａ因子での活性化により調製した。第ＩＸａ因子分子の濃度は、過去に記載のように（Ｃｈａｎｇ ＹＪ， ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ２００２；２７７：２５３９３）、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）による滴定により求めた。第ＩＸａ因子と第Ｘ因子との相互作用を、第ＶＩＩＩａ因子の不在下及び存在下で第ＩＸａ因子によって生成された活性化第Ｘ因子によるＳｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ  ＦＸａの加水分解を動力学的にモニタすることにより分析した。簡単に説明すると、第ＶＩＩＩａ因子が不在の場合、異なる濃度の第Ｘ因子（０〜１μＭ）及び０．５ｍＭのＳｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ  ＦＸａを添加する前に、第ＩＸａ（１０ｎＭ）をＰＣＰＳと共に室温にて５分間にわたってインキュベートした。反応を、インキュベーション時間に沿って、混合物の吸光変化として記録した。最終体積は１００μｌであり、反応は、ＴＢＳ／５ｍＭのＣａＣｌ２中に０．０１％のＢＳＡ及び４０μＭのＰＣＰＳを含有する緩衝液中（ＴＢＳ／ＣａＣｌ２／ＢＳＡ／ＰＣＰＳ）で３７℃にて行った。第ＩＸａ因子と第Ｘ因子との第ＶＩＩＩａ因子の存在下での相互作用は、（新たに調製した）２５μｌの第ＶＩＩＩａ因子の、ＴＢＳ／ＣａＣｌ２／ＢＳＡ／ＰＣＰＳで希釈、プレインキュベートされた同体積のＦＩＸａとのインキュベーションにより行われ、ＰＣＰＳ、Ｓｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ  ＦＸａ及び第Ｘ因子を含有する５０μｌの反応混合物を続いて添加した。混合物中で第ＩＸａ因子・第ＶＩＩＩａ因子複合体（内因性テナーゼ活性）によって生まれた第Ｘａ因子活性を、マイクロタイタープレート読取装置上で動力学的に検出した。最終濃度は、野生型又は変異第ＩＸａ因子について０．２５ｎＭ、第ＶＩＩＩａ因子について０．４ｎＭ、ＰＣＰＳについて４０μＭ、第Ｘ因子について０〜２００ｎＭ、Ｓｐｅｃｒｏｚｙｍｅ  ＦＸａについて０．５ｍＭであった。第ＩＸａ因子の活性を、過去に記載されたように、以下の方程式を用いて計算した。吸光度（Ａ４０５）＝ａｔ２＋ｂｔ＋ｃ
【００４１】
第ＩＸａ因子と第ＶＩＩＩａ因子との相互作用
限定された濃度の第ＶＩＩＩａ因子での内因性テナーゼ活性をモニタすることにより、結合実験を行った。２５μｌの新しく調製した第ＶＩＩＩａ因子（０．４ｎＭ）を、２５μｌの異なる濃度の野生型又は変異第ＩＸａ因子（０〜２０ｎＭ）と共にインキュベートし、内因性テナーゼ複合体を生成した。次に、第ＶＩＩＩａ因子の第ＩＸａ因子への結合により生成された内因性テナーゼ複合体の活性を、ＴＢＳ／Ｃａ／ＰＣＰＳ／ＢＳＡを含有する反応緩衝液における第Ｘ因子とＳｐｅｃｒｔｏｚｙｍｅ  ＦＸａとの混合物５０μｌの添加により測定した。最終濃度は、第ＶＩＩＩａ因子が０．１ｎＭ、ＰＣＰＳが４０μＭ、第Ｘ因子が１００ｎＭ、Ｓｐｅｃｒｏｚｙｍｅ  ＦＸａが０．５ｍＭ、第ＩＸａ因子が０〜１５ｎＭであった。３つの独立した反応について、実験を２重に行い、全てのデータポイントを用いて検量線を適合させた。Ｋｄ値は、過去に記載されたように（Ｃｈａｎｇ ＹＪ， ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ２００２；２７７：２５３９３）、以下の方程式に従った計算により導かれた。
【００４２】
（式１）
2010527581.tif 000004
【００４３】
第ＩＸ因子とアンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）との相互作用
第ＩＸａ因子のＡＴＩＩＩによる阻害を、酵素・インヒビター複合体のゲル分析により行った。０．５３μＭの第ＩＸａ因子及び０．５３μＭのＡＴＩＩＩを、３７℃にて１００μｌのＴＢＳ／５ｍＭのＣａＣｌ２中で、０．０１単位／ｍｌのヘパリンを伴う又は伴うことなくインキュベートした。反応混合物のアリコート（２０μｌ）を、異なる時間間隔（０、５、１０、２０、３０分）で抜き出し、ゲルローディング緩衝液（最終濃度：５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ６．８、２ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＳＤＳ、８％のグリセロール、０．０２５％のブロモフェノールブルー）と混合し、ＳＤＳ／ＰＡＧＥにより展開し、次に銀で染色した。
【００４４】
動物実験
以下に記載の動物実験は全て、標準的な手順に従って行われた。動物は、台湾のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｔａｉｗａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙのガイドライン又は実験動物の取扱いに関する国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）のガイドライン及び米国シアトルのｔｈｅ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ａｎｄ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒのガイドラインに沿って扱われた。Ｃ５７ＢＬ／６系統的背景の血友病Ｂマウスは、元々はＤａｒｒｅｌ  Ｓｔａｆｆｏｒｄ博士（Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ、チャペルヒル、ノースキャロライナ、米国）及びＫａｔｈｅｒｉｎｅ  Ｈｉｇｈ博士（Ｔｈｅ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ペンシルバニア州、米国）から得た。
【００４５】
血友病Ｂマウスへのタンパク質注入
マウスに、２．５％のアベルチン（Ａｖｅｒｔｉｎ）で麻酔をかけ、０．２５μｇ／ｇ（体重）の組み換えタンパク質ＩＸ−６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６）、ＩＸ−７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７）及びＩＸ−８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８）を、マウスの総血漿体積が体重の１／１０であると推定し、仮説の血中濃度５μｇ／ｍｌに達するまで静脈注射した。注射から５分、１５分、２時間後、マウスを屠殺し、血液を下大静脈から３．８％のクエン酸ナトリウム中に回収した（９：１ｖ／ｖ）。血漿を、室温での１０分間にわたる８０００ｒｐｍの遠心分離（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社、５４１５Ｒ）により調製し、ＥＬＩＳＡによるタンパク質質量及びａＰＴＴアッセイによる凝血活性の分析に供した。
【００４６】
ハイドロダイナミック法による注入及び血友病Ｂマウスにおけるヒト第ＩＸ因子発現の測定
ヒト・アポリポタンパク質Ｅ／Ｃ−Ｉ遺伝子座調節領域、ヒトα−１アンチトリプシンプロモーター、より良好なタンパク質発現のための切断ヒト第ＩＸ因子イントロン１、ウシ成長ホルモンポリアデニル化信号配列の制御下にて、血友病Ｂマウスの肝臓における最適な発現のため、組み換え第ＩＸ因子（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９〜１６）をコードするｃＤＮＡを個別にｐＢＳ−ＨＣＲＨＰ１−Ａにサブクローニングした（Ｍｉａｏ Ｃ．Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ． ２００１：３：９４７−９５７）。マウスに２．５％のアベルチンで麻酔をかけ、これらの発現プラスミド（ｐＢＳ−ＨＣＲＨＰ１−Ａ−ＦＩＸ）のアリコート（５０〜１００μｇ）を２ｍｌのＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）中に溶解させ、体重１７〜２４ｇのマウスに６〜８秒かけて尾静脈から注射した。各プラスミドでの各実験を、時間を違えて調製した少なくとも２つの異なるバッチのプラスミドＤＮＡを用いて数回繰り返した。必要に応じて下大静脈から血液試料を採取し、３．８％のクエン酸ナトリウムでの１／１０（ｖ／ｖ）での希釈により血漿とした。マウスの血漿中に発現し存在するヒト第ＩＸタンパク質レベル及び凝血活性を、ＥＬＩＳＡ及びａＰＴＴによりそれぞれ測定した。肝臓組織も用意し、ＥＬＩＳＡにより第ＩＸ因子の発現を測定した。全肝臓（１〜１．７ｇ）を、５μｌ／ｍｌのプロテアーゼ・インヒビター・カクテル（Ｓｉｇｍａ社）を含有する２ｍｌのＴ−ＰＥＲ組織タンパク質抽出試薬（カタログ番号７８５１０、Ｐｉｅｒｃｅ社）の存在下でホモジナイズした。遠心分離後、抽出物の上清中の総タンパク質量は約３１．８±３．５ｍｇ／ｍｌであり、ヒト第ＩＸ因子レベルの測定のためにＥＬＩＳＡに供された。
【００４７】
偽型ｓｓＡＡＶ２／８ベクターを用いた遺伝子導入実験
ＩＸ−６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４）及びＩＸ−７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１５）ｃＤＮＡ（長さ１．４−ｋｂ、３’非翻訳領域ナシ）のコード配列をそれぞれｐＢＳ−ＨＣＲＨＰ１−Ａにサブクローニングし、続いて全発現カセット（エンハンサー、プロモーター、第ＩＸ因子コード領域及びイントロン１並びにウシ成長ホルモンポリアデニル化信号）を含有する４．３−ｋｂのＳｐｅＩフラグメントとして切断し、リンカーによる連結によりＸｂａＩに転換されたＮｏｔＩ部位にてｐＡＡＶ−ＭＣＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、ラ・ホヤ、カリフォルニア州）にサブクローニングした。得られたプラスミドは、ＡＡＶ２の逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接する全発現カセット（４．３−ｋｂ、ＳｐｅＩフラグメント）から成る。それぞれＩＸ−６、ＩＸ−７発現カセットを担持するｓｓＡＡＶ２／８ベクターを用いて、過去に記載されたように（Ｘｉａｏ Ｘ， ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ． １９９８；７２：２２２４−２２３２）、トリプルトランスフェクション法によりＡＡＶウィルス粒子を生成した。ベクター力価を、第ＩＸ因子特異的プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２８〜２９）を用いて、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社、マンハイム、ドイツ）により求め、ベクターゲノム（ｖｇ）／ｍｌとして表した。血友病Ｂマウスへのウィルス粒子の尾静脈投与は、ベクター用量４ｘ１０１２、４ｘ１０１１又は８ｘ１０１０ｖｇ／ｋｇ（体重）で行われた。ＡＡＶ粒子の尾静脈注射から２週間後にマウスを屠殺した。血漿を用意するために、血液試料を下大静脈から採取した。マウスの血漿中に発現し存在するヒト第ＩＸタンパク質レベル及び凝血活性を、ＥＬＩＳＡ及びａＰＴＴによりそれぞれ測定した。
【００４８】
結果
遺伝子組み換え第ＩＸ因子タンパク質は野生型第ＩＸ因子（ＩＸ−７）よりも高い凝血活性を示した
凝血機能が増強された第ＩＸ因子変異体を探すために、６つのアミノ酸位置２１３、２２８、２４０、２４７、２７６、２７７を選択し、別々にアラニンで置換した（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２３、２４、２５、２６、２７、２）。組み換えタンパク質の凝血活性は、野生型第ＩＸ因子とほぼ同じ又はそれより高かった（表３）。更に、ヒト第ＩＸ因子の３つのアミノ酸位置８６、２７７、３３８を選択し、単体又は組み合わせてアラニンで置換した。全部で７つのアラニン置換第ＩＸ因子変異体をヒト２９３腎細胞で発現させた。変異第ＩＸ因子の発現レベルは、野生型第ＩＸ因子（ＩＸ−７）の発現レベルと全く同じであり、約０．０８〜０．５μｇ／２４時間／１０６細胞であった。精製後、全ての組み換え第ＩＸタンパク質が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて単一バンドとして現れ、血漿由来の第ＩＸ因子のものと同様の移動度を有していた（表１）。組み換えタンパク質の正体を、各組み換え体の最初の５つの残基を明らかにするアミノ酸配列分析により検証、確認した（データ表示せず）。ＩＸ−７及びアラニン変異体の完全性を、組み換え第ＩＸ因子タンパク質の第ＸＩａ因子による及び第ＶＩＩａ因子と組織因子との複合体（ＶＩＩａ・ＴＦ）による活性化並びにヘパリンの存在下及び不在下でのアンチトロンビンＩＩＩによる阻害により更に調査した。これらの実験により、ＩＸ−７と７つ全てのアラニン組み換え体との間に明確な違いはないことが判明した（データ表示せず）。発明者は、位置８６、２７７及び３３８でのアラニン置換は第ＩＸ因子の全体構造を変えなかったと結論づけた。
【００４９】
（表３）
2010527581.tif 000005
【００５０】
精製第ＩＸ因子組み換え体の凝血活性を表１に示した。組み換えＩＸ−７は完全に活性であり、特異的凝血活性は９４％であった。全ての第ＩＸ因子変異体も機能しており、ＩＸ−７の１．１〜１３倍の凝血活性を有していた。中でも、第ＩＸ−６因子が最も活性が高く、ＩＸ−７の凝血活性よりも１３倍良好であった。
【００５１】
ＩＸ−６の向上した凝血活性は、第ＶＩＩＩａ因子へのその親和性と相関関係にあった
酵素動力学的パラメータを、第ＩＸａ組み換え体を用いて測定し、アラニン置換が第ＩＸａ因子の凝血機能に与える影響を調査した。因子のテナーゼ活性は、第ＶＩＩＩａ因子と複合している第ＩＸａ因子（ＦＩＸａ・ＦＶＩＩＩａ）の濃度に比例していると発明者は考えた。従って、第Ｘａ因子の産生を、第ＩＸａ因子の第ＶＩＩＩａ因子への結合親和性の目安としてのＦＩＸａ・ＦＶＩＩＩａ複合体によってモニタし、見かけの解離定数（Ｋｄ）を計算することができる。表２に示されるように、アラニン変異が１つの３つの変異体（ＩＸ−１、ＩＸ−２、ＩＸ−８）及び２つの変異を有する変異体の１つ（ＩＸ−３）についてのＫｄ（１．２０ｎＭ〜１．９５ｎＭ）は、ＩＸ−７（２．４４ｎＭ）のＫｄに近い（２．４４ｎＭ）。驚くべきことに、二重変異の変異体２つ（ＩＸ−４及びＩＸ−５）についてのＫｄ及び三重変異の変異体１つ（ＩＸ−６）についてのＫｄ（それぞれ０．４ｎＭ、０．３４ｎＭ、０．１９ｎＭ）は、ＩＸ−７又は３つの一重変異の変異体のＫｄよりも著しく低かった。ＩＸ−６とＩＸ−７とではＫｄにおいて１０倍の劇的な差がある。更に、ＩＸ−６と第ＶＩＩＩａ因子とは、ＩＸ−７と第ＶＩＩＩａと比較すると（０．０３３ｎＭ）、効率的な酵素複合体（０．１４４ｎＭ）を生成することができるようである。これらの結果が、ＩＸ−６と第ＶＩＩＩａ因子との間でのＩＸ−７と第ＶＩＩＩａ因子よりも高い親和性と共に、ＩＸ−６の凝血活性の向上を説明するようである。
【００５２】
第ＶＩＩＩａ因子の不在時、組み換え変異体及びＩＸ−７全てについての動力学的パラメータ、すなわちＫＭ及びｋｃａｔは非常によく似ており（表２）、ｋｃａｔ／ＫＭは２４０．５９〜７２６．８１Ｍ−１秒−１前後であった。この結果は、第ＶＩＩＩａ因子がないと、第ＩＸａ因子は第Ｘ因子の開裂において酵素としていささか不十分であることを示しており、このことは活性化されたＩＸ−７及び第ＩＸａ因子変異体についても観察されている。
【００５３】
組み換えＩＸ−６は、インビボでＩＸ−７よりも活性が高い
組み換え第ＩＸ因子のインビボでの有効性を評価するため、ＩＸ−６、ＩＸ−７、ＩＸ−８タンパク質を血友病Ｂマウスに注入し、時間を置いて血漿試料を分析することにより、これらのタンパク質のタンパク質レベル及び凝血機能を追跡した。表４に示されるように、約１μｇ／ｍｌのＩＸ−７タンパク質が、２０ｇの血友病Ｂマウスの血漿において、尾静脈への１０μｇの組み換えタンパク質の注射から５分後に検出された場合、タンパク質レベルは、１５分で初期レベルの７６％に低下し、２時間で初期レベルの１８％に低下した。各時点での循環因子ＩＸ−７の凝血活性は、１２１〜４８３％（タンパク質質量）前後であった。ＩＸ−６及びＩＸ−８での並列実験は、ＩＸ−８及びＩＸ−６を注入されたマウスにおいて各時点でＩＸ−７に匹敵するタンパク質レベルが検出された一方、組み換えＩＸ−８を注入されたマウスは、ＩＸ−７を注入されたマウスよりもそれぞれ２．４（５分後の試料）〜３．６７（２時間）倍高い凝血機能を示した。ＩＸ−６を用いたインビトロでの実験での発見と合致することに、ＩＸ−６を注入された血友病Ｂマウスは、ＸＩ−７の活性よりもずっと高い、ＩＸ−７の特異的凝血活性の約２．６〜７．５倍の活性を各時点で示した［一例としての５分後のデータについてのＩＸ−７対ＩＸ−６（２．９１／１．１５）対（１２．０５／０．７２）］。
【００５４】
（表４）
組み換え第ＩＸ因子タンパク質＊を注入されたマウスにおける血漿第ＩＸ因子レベルの経時変化研究
2010527581.tif 000006
＊約１０μｇの第ＩＸ因子を各マウスに注射して、仮説のタンパク質濃度５μｇ／ｍｌ（血漿）に到達させた。注射後、異なる時点で血液試料を採取し、ＥＬＩＳＡ及び凝血活性アッセイに供した。並列実験において、正常な血漿の段階希釈物から検量線を導いた。ＥＬＩＳＡ系は、コーティング抗体としてのＥＲＬ（Ｇａｆｉｘ−ＡＰ１６０）からのｐＡｂと、検出抗体としてのＥＲＬ  ｐＡｂ−ＨＲＰ（Ｇａｆｉｘ−ＨＲＰ）を用いた。正常な血漿第ＩＸ因子濃度を５μｇ／ｍｌと想定する。
【００５５】
ハイドロダイナミック注入法による血友病Ｂマウスへの遺伝子送達
血友病Ｂの治療における第ＩＸ因子変異体の効力も、主に肝臓で第ＩＸ因子変異体を発現させるための、個々のｃＤＮＡを担持している発現プラスミドの血友病Ｂマウスへのハイドロダイナミック注入により評価した。発現レベルを、ＤＮＡ注射から２４時間後に測定し、図２及び表５に示した。組み換えＩＸ−７及び全てのアラニン置換変異体（ＩＸ−６を除く）が発現し、タンパク質レベル０．７〜１．１７μｇ／ｍｌ、０．４６〜２．２６μｇ／ｍｌの凝血活性で血漿中に分泌された。ＩＸ−６は、ＩＸ−７及びその他全てのアラニン変異体よりも高いタンパク質レベル（３．２２±０．５８μｇ／ｍｌ、ｎ＝４）及び凝血活性（１２．３４±２．８７μｇ／ｍｌ、ｎ＝４）を再現性をもって有していた。興味深いことに、ＩＸ−６は、ＩＸ−８の６倍の凝血活性及び２倍の特異的凝血活性（すなわち凝血／ＩＸ：Ａｇ）も有していた。ＸＩ−７及びその他の変異体を注入されたマウスの場合よりも高い、ＩＸ−６のＤＮＡを注入されたマウスで見られた第ＩＸタンパク質レベルは、ＩＸ−７及びＩＸ−６が同様のレベルで合成されたことを示した細胞培養発現系では観察されなかった。ＩＸ−７のＤＮＡを注入されたマウスの場合よりも高い、ＩＸ−６を注入されたマウスにおける血漿第ＩＸ因子タンパク質レベルについて考えられ得る説明を調査するために、肝臓及び血漿において細胞内及び循環第ＩＸ因子をそれぞれ抽出し、定量化した。表５に示されるように、ほぼ同量の第ＩＸ因子が、ＩＸ−６及びＩＸ−７のＤＮＡで処理されたマウスの肝臓から抽出された（それぞれ１．１８及び１．３６μｇ／ｇ（肝臓）。ｐ＝０．４３）。これらのデータは、ＩＸ−６のＤＮＡ及びＩＸ−７のＤＮＡを注入されたマウスが、肝臓において同程度の量の細胞内第ＩＸ因子を有していることを示した。興味深いことに、ＩＸ−６のＤＮＡで処理されたマウスは、ＩＸ−７のＤＮＡで処理されたマウスよりも統計学的に多い循環第ＩＸ因子を有していた（１．５倍の差。ｐ＜０．０１、ｎ＝７〜１０）。より重要なことに、ＩＸ−６のＤＮＡで処理されたマウスの血漿凝血活性は、ＩＸ−７のＤＮＡで処理されたマウスの血漿凝血活性より１５倍高かった（４．８８±２．１２μｇ／ｍｌ対０．３１±０．１５μｇ／ｍｌ。表５）。
【００５６】
（表５）
プラスミド＊をハイドロダイナミック注入されたマウスにおける第ＩＸ因子のレベル
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*第ＩＸ因子発現プラスミドの血友病Ｂマウスへのハイドロダイナミック法による送達。２０μｇの雄の血友病Ｂマウスを、６〜８秒後に２ｍｌの１００μｇのＤＮＡを尾静脈に注射することにより流体力学的なショックに供した。注射から２４時間後にマウスを回収、屠殺し、ａＰＴＴによる凝血活性アッセイ及びＥＬＩＳＡによるタンパク質レベル測定（ＩＸ：Ａｇ）のために血漿を採取した。ＥＬＩＳＡ系については、プレートをＥＲＬ（Ｇａｆｉｘ−ＡＰ１６０）のｐＡｂでコーティングし、ＥＲＬ  ｐＡｂ−ＨＲＰ（Ｇａｆｉｘ−ＨＲＰ）を検出抗体として用いた。検量線は、正常な血漿の段階希釈物から導いた。正常な血漿第ＩＸ因子濃度を５μｇ／ｍｌと想定する。
【００５７】
偽型ｓｓＡＡＶ２／８ベクターを用いた遺伝子導入実験
遺伝子治療におけるＩＸ−６の効力を、ウィルスベクターを用いて更に調査した。血友病Ｂマウスに、それぞれＩＸ−６、ＩＸ−７を担持している組み換えアデノ随伴ウィルスベクター（ｒＡＡＶ２／８）を用量４ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇで静脈注射した。注射から２週間後、ＩＸ−７を担持しているｒＡＡＶ２／８によって発現した血漿第ＩＸ因子タンパク質のレベルは、約２．３〜７．８μｇ／ｍｌ（ｎ＝５）であった（図３ａ）。ＩＸ−７と比較すると、ＩＸ−６を担持しているｒＡＡＶ２／８によって発現した第ＩＸ因子のレベルは、１．５８〜４．２３μｇ／ｍｌ（ｎ＝６）に達した。ＩＸ−６を担持しているｒＡＡＶ２／８は、ＩＸ−７を担持しているものよりも、マウス血漿における第ＩＸ因子タンパク質レベルが低いように見える。対照的に、ＩＸ−６の特異的凝血活性（４９５±１０９％）は、ＩＸ−７の特異的凝血活性の５倍高かった（９４±３４％）。低用量のウィルスベクター（それぞれ４ｘ１０１１ｖｇ／ｋｇ及び８ｘ１０１０ｖｇ／ｋｇ）で送達した場合のＩＸ−６の効力も評価した。図３ｂに示されるように、ＩＸ−６を担持しているｒＡＡＶ２／８を注射されたマウスで測定された特異的凝血活性は、２種類の用量について、１２３６±４１８％（４ｘ１０１１ｖｇ／ｋｇ）及び１１２９±４７９％（８ｘ１０１０ｖｇ／ｋｇ）に達し、ＩＸ−７を担持しているｒＡＡＶ２／８を注射されたマウスで測定された特異的凝血活性は、約１９２±２４％（４ｘ１０１１ｖｇ／ｋｇ）及び２４６±１１６％（８ｘ１０１０ｖｇ／ｋｇ）である。最低用量では、ＩＸ−６を注射されたマウスの１匹は正常な凝血活性の３８％を有し、４匹のマウス全てが、治療レベルの１０％を超える又はほぼ越える。対照的に、ＩＸ−７を注射されたマウスは、正常な凝血活性の５．６％及び７．４％しか有していなかった。この結果は、抗ウィルス抗体の生成を軽減するために低用量のウィルスベクターが好ましい場合、ＩＸ−６が有効な試薬となり得ることをも実証した。
【００５８】
図４によると、残基２７７は、第ＩＸａ因子触媒ドメインの表面の反対側に位置している。Ｈａｍａｇｕｃｈｉらによると（Ｈａｍａｇｕｃｈｉ Ｎ,  ｅｔ  ａｌ．，  ｂｌｏｏｄ  １９９４；８４：１８３７−１８４２）、位置Ｅ２７７は、第ＩＸ因子の表面上に８９．２Å２（ＤＳＳＰを用いて計算）の水接触可能領域と共にあり、（１１０．８Å２の水接触可能領域を有する）別の表面分子Ｄ２７６に隣接している。位置Ｄ２７６をモノクローナル抗体マッピング実験により研究したところ、ＦＩＸａの第ＶＩＩＩａ因子への結合を阻害した抗第ＩＸ因子抗体であるＦＸＣ００８が、Ｄ２７６を強力なエピトープとして認識したことを示した（Ｆｒａｚｉｅｒ  Ｄ, ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ.  １９８９；７４：９７１−９７７）。更に、Ｅ２７７の主鎖の酸素が、同じくＦＸＣ００８の結合にとって重要な残基であるＡｒｇ２４８の側鎖と水素結合を形成することが観察された。ＦＩＸが構造変化を起こすこと及びＦＩＸのＦＩＸａへの活性化が、第ＶＩＩＩａ因子へのその結合に先立って必要とされることが知られている（Ｈａｍａｇｕｃｈｉ Ｎ,  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ.  １９９３；３２：６３２４−６３２９）。従って、活性化ペプチドの放出時に溶媒接触可能となる触媒ドメインが、第ＶＩＩＩａ因子への結合において重要な役割を果たす。Ｄ２７６及びＥ２７７が、ＦＩＸの活性化で構造変化を起こす領域に位置している又はこれらが、ＦＩＸ活性化の後の、重鎖のその他の部分における正常な構造変化にとって重要な領域に位置している場合があるため、ＦＸＣ００８のＤ２７６（及び恐らくはＥ２７７）への結合は、重鎖表面のその他の部分の近く又はその他の部分で起こる正常な構造変化を乱し得る（Ｈａｍａｇｕｃｈｉ  Ｎ,  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ.  １９９３；３２：６３２４−６３２９）。更に発展させ、発明者は、位置Ｅ２７７をアラニンで置き換えることにより、位置Ｒ３３８付近での立体構造を直接的又は間接的にサポートできると考えている。或いは、Ｄ２７６（及び／又はＥ２７７）での変異が、第ＶＩＩＩａ因子結合時の第ＩＸａの構造変化をサポートし得る。更に、第ＶＩＩＩａ因子結合第ＩＸａ因子が構造変化すると、その結果として、活性部位から脂質表面への距離が、ＦＩＸチモーゲンのものより短くなることが示唆されている。Ｍｕｔｕｃｕｍａｒａｎａらは、膜結合酵素の活性部位におけるドナー染料と、膜表面の受容体染料との間の距離が、活性化の前後では１０Åを越えて異なることを測定した（Ｍｕｔｕｃｕｍａｒａｎａ  ＶＰ,  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ.  １９９２；２６７：１７０１２−１７０２１）。このことが起こるには、第ＩＸａ因子のヒンジ領域が関与した構造変化があったと思われる。Ｒ３８８を含む提案の第ＶＩＩＩａ結合領域はＥ２７７とは反対に位置しているため、この全体的な変化が、Ｅ２７７を新しい方向へと押出す電位的なヒンジの動きを伴うと想像するのは妥当である。この位置の電荷を除去することにより動きを促して、第ＶＩＩＩａ因子結合を促進することができる。上記は本発明の説明であるが、本発明を限定すると捉えられるべきではない。本発明は以下の請求項によって定義され、請求項の同等物も本発明に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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