(57)【要約】Ｇタンパク質共役受容体（副甲状腺ホルモン受容体など）のＧタンパク質経路よりもβ−アレスチン経路を選択的に調節するための組成物および方法が開示される。本明細書において示される（Ｄ−Ｔｒｐ１２、Ｔｙｒ３４）−ＰＴＨ（７−３４）は、Ｇタンパク質の結合についてのインバースアゴニストとして作用するが、一方でβ−アレスチン依存性のＥＲＫ１／２の活性化を刺激する。さらに、完全なＰＴＨ１ＲアゴニストであるＰＴＨ（１−３４）およびβ−アレスチン選択的なアゴニストである（Ｄ−Ｔｒｐ１２、Ｔｙｒ３４）−ＰＴＨ（７−３４）は、初代骨芽細胞における転写活性化の異なるプロフィールを誘発する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
７回膜貫通受容体を偏ったリガンドと接触させる工程を含む、７回膜貫通受容体を調節する方法であって、該７回膜貫通受容体が、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）／ＰＴＨ関連タンパク質受容体（ＰＴＨ１Ｒ）を含む、方法。
【請求項２】
前記偏ったリガンドが、前記ＰＴＨ１Ｒのβ−アレスチン経路を選択的に活性化し得る、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）／ＰＴＨ関連タンパク質受容体（ＰＴＨ１Ｒ）がＩ型受容体である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＰＴＨ１Ｒの活性化により、ＯＰＧの増大およびＲＡＮＫＬの減少が生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＰＴＨ１Ｒのβ−アレスチン経路が、該ＰＴＨ１ＲのＧタンパク質経路よりも活性化される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記偏ったリガンドが、同化的な骨形成を誘発する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記偏ったリガンドが、生物における骨ミネラル密度を増大させる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記偏ったリガンドが、骨梁の形成を増大させる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記偏ったリガンドが、対照と比較して骨芽細胞の活性を増大させるが、一方で、ほぼ同時に、破骨細胞の活性は増大させない、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記偏ったリガンドが、破骨細胞形成の増大のマーカーの産生を増大させることなく、骨芽細胞による骨形成のマーカーを増大させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記偏ったリガンドが、対照と比較して破骨細胞の動員を増大させない、請求項１３に記載の方法。
【請求項１２】
前記偏ったリガンドが、対照と比較して破骨細胞の分化を増大させない、請求項１３に記載の方法。
【請求項１３】
前記偏ったリガンドが、（Ｄ−Ｔｒｐ１２、Ｔｙｒ３４）−ＰＴＨ（７−３４）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記偏ったリガンドが、ＰＴＨと比較して、ＥＲＫ１／２の活性化を増大させるが、ヘテロ三量体Ｇタンパク質の活性化を増大させない、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ＰＴＨ１Ｒの調節を必要とする対象を同定する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記対象が骨障害を有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項１７】
前記骨障害が骨粗しょう症である、請求項２０に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＰＴＨ１Ｒの調節が、偏ったリガンドの調節を示すマーカーについて前記対象の生体流体を分析する工程によってモニターされる、請求項１９に記載の方法。
【請求項１９】
前記生体流体が尿である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２０】
前記生体流体が血清である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記マーカーがオステオカルシンである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記マーカーが対照と比較して増大している、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記マーカーがデオキシピリジノリン（ＤＰＤ）である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記マーカーが、偏っていないリガンドを用いた活性化を含む対照と比較して増大していない、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記偏っていないリガンドがＰＴＨを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
組成物の活性を分析する方法であって、ａ）該組成物をＰＴＨ１Ｒと接触させる工程、ｂ）該ＰＴＨ１Ｒの第１のシグナル変換経路の活性化を決定し、第１の活性化の結果を生じさせる工程、ｃ）該ＰＴＨ１Ｒの第２のシグナル変換経路の活性化を決定し、第２の活性化の結果を生じさせる工程を含み、該第１の活性化の結果および該第２の活性化の結果が、該組成物の活性プロフィールを生成する、方法。
【請求項２７】
前記第１のシグナル変換経路がＧタンパク質経路である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記第１のシグナル変換経路の活性化を決定する工程が、ｃＡＭＰの活性化をアッセイすることを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記第２のシグナル変換経路がβ−アレスチン経路である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記第２のシグナル変換経路の活性化を決定する工程が、β−アレスチンの動員をアッセイすることを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記第２のシグナル変換経路の活性化を決定する工程が、ＥＲＫ１／２の活性化をアッセイすることを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
ｄ）前記ＰＴＨ１Ｒと前記対照とを接触させる工程、ｅ）該ＰＴＨ１Ｒの第１のシグナル変換経路の活性化を決定し、第１の活性化の対照の結果を生じさせる工程、ｆ）該ＰＴＨ１Ｒの第２のシグナル変換経路の活性化を決定し、第２の活性化の対照の結果を生じさせる工程をさらに含み、該第１の活性化の対照の結果および該第２の活性化の対照の結果が、該組成物の活性プロフィールを生成する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記第１の活性化の結果と前記第１の活性化の対照の結果とを比較する工程をさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記第２の活性化の結果と前記第２の活性化の対照の結果とを比較する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
所望の活性化プロフィールに基づいて組成物を選択する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
前記所望の活性化プロフィールが、β−アレスチン経路の活性化および前記Ｇタンパク質経路の活性化の低減を含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２００７年４月２日に出願された、表題「Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  Ｂｏｎｅ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ」の米国仮出願第６０／９０７，４３９号の利益を主張する。この出願は、その教示の全てに関して、その全体が参考として本明細書に援用される。
【０００２】
この研究は、ＮＩＨ／ＮＩＤＤＫ  Ｒ０１  ＤＫ６４３５３、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ  Ａｗａｒｄ、Ｒ０１  ６４３５３、Ｒ０１  ＨＬ１６０３７−３３−３７、およびＫ１２ＨＤ０４３４４６により一部援助されたものである。アメリカ合衆国政府は、本明細書において開示される発明においてある程度の権利を有し得る。
【背景技術】
【０００３】
（Ｉ  背景）
７回膜貫通受容体（７ＴＭＲ）の生物学における新たなパラダイムは、Ｇタンパク質およびβ−アレスチンの両方が独立して受容体シグナルを伝達し得ること、ならびに偏ったリガンドがこれらの異なる経路を選択的に活性化し得ることである。β−アレスチンを活性化し得るがＧタンパク質のシグナル伝達は活性化し得ない、Ｉ型副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）／ＰＴＨ関連タンパク質受容体（ＰＴＨ１Ｒ）に対する、ＰＴＨ−βａｒｒなどの本明細書において示されるβ−アレスチンに偏ったリガンドは、両方のメカニズムを活性化させるＰＴＨ（１−３４）がそうであるように、マウスにおける同化的な骨形成を誘発する。ＰＴＨ（１−３４）により引き起こされる骨ミネラル密度（ｂｏｎｅ  ｍｉｎｅｒａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ）の増大は、ＰＴＨ−βａｒｒに対するそれが除去されているβ−アレスチン２ｎｕｌｌマウスにおいては弱まっている。β−アレスチン２依存性の経路は、骨梁（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ  ｂｏｎｅ）の形成に主に寄与し、測定すると、骨吸収（のマーカー）を刺激しない。現在用いられている抗吸収療法は、骨折のリスクの低減に役立つ。しかし、これらの療法は、骨梁の構造の再生には十分ではない。したがって、骨芽細胞介在性の骨形成を標的とする同化的作用物質を同定するための取り組みが必要である。本方法および本組成物は、一部には、骨形成、骨梁形成を促進する方法を提供し、この方法は、例えば骨粗しょう症の治療において用いることができる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（ＩＩ  概要）
ＰＴＨ１Ｒなどの７回膜貫通受容体の、Ｇタンパク質に対するものとは異なる、β−アレスチン経路の調節に関する方法および組成物が開示される。
【０００５】
本明細書に組み込まれ、かつ本明細書の一部を構成する、添付の図面は、いくつかの実施形態を図解し、記載と共に、開示される組成物および方法を図解するものである。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１は、（Ｄ−Ｔｒｐ１２、Ｔｙｒ３４）−ＰＴＨ（７−３４）（ＰＴＨ−βａｒｒ）は、初代骨芽細胞（ＰＯＢ）におけるｃＡＭＰの蓄積についてのインバースアゴニストである。ＰＴＨ（１−３４）およびＰＴＨ−βａｒｒに応じた、内因性のＰＴＨ受容体のｃＡＭＰの刺激を、β−アレスチン２−／−マウスおよびＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスから単離したＰＯＢにおいて測定した。細胞は、１００ｎＭのＰＴＨ（１−３４）（ＰＴＨ）または１μＭのＰＴＨ−βａｒｒで処理した。ＷＴおよびβ−アレスチン２−／−のマウスから単離したＰＯＢにおいて、ＰＴＨはｃＡＭＰの強い増大を刺激する。ＰＴＨ−βａｒｒは、そのインバースアゴニスト活性と一致して、ＷＴのＰＯＢにおいてｃＡＭＰを刺激することができず、β−アレスチン２−／−のＰＯＢにおける基底ｃＡＭＰレベルを低減させる。ｃＡＭＰの値は、ホルスコリン誘発性のレベルに標準化した。データは、４回の独立した実験から得られた平均±ＳＥＭに対応する。（＊＊＊：未刺激のＷＴのＰＯＢと比較してｐ＜０．００１、＋＋＋：未刺激のβ−アレスチン２−／−のＰＯＢと比較してＰ＜０．００１、＋＋：Ｐ＜０．０１）。
【図２】図２は、ＰＴＨ−βａｒｒは、β−アレスチン介在性のＥＲＫ１／２の活性化を刺激する。ＰＴＨ−βａｒｒ刺激性のＥＲＫ１／２の活性化を、β−アレスチン２−／−マウスおよびＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスから単離されたＰＯＢにおいて評価した。ＰＯＢは、１００ｎＭのＰＴＨ（１−３４）（ＰＴＨ）または１μＭのＰＴＨ−βａｒｒで５分間処理した。ＰＴＨまたはＰＴＨ−βａｒｒで処理したＷＴのｏｂｓは、ＥＲＫ１／２  ＭＡＰキナーゼを強く活性化した。ＷＴのｏｂｓにおけるＥＲＫ１／２の活性化に対するＰＴＨ−ｂａｒｒの刺激の効果は、β−アレスチン２−／−のｏｂｓにおいては見られなかった。示されている値は、未刺激の対照に対する、ＥＲＫ１／２のリン酸化の倍増である。データは、４回の独立した実験から得られた平均±ＳＥＭに相当する。（＊＊：未刺激のＷＴのＰＯＢと比較してｐ＜０．０１、＋＋：未刺激のβ−アレスチン２−／−のＰＯＢと比較してＰ＜０．０１）。
【図３】図３は、ＰＴＨ−βａｒｒは、腰椎の骨ミネラル密度を増大させる。４週間および８週間後の、骨ミネラル密度に対する、媒体、ＰＴＨ（１−３４）（ＰＴＨ）、またはＰＴＨ−βａｒｒの毎日の投与の効果を、（ａ）ＷＴマウスの腰椎、（ｂ）β−アレスチン２−／−の腰椎、（ｃ）ＷＴマウスの大腿骨骨幹部、および（ｄ）β−アレスチン２−／−マウスの大腿骨骨幹部において測定した。これらの結果は、ＰＴＨ−βａｒｒの同化的効果が、大腿骨において見られる皮質骨とは対照的に、ＷＴ動物の、腰椎に代表される骨梁において存在していたことを示す。ＰＴＨ−βａｒｒで処理したＷＴマウスにおいて見られる骨ミネラル密度の増大は、β−アレスチン２−／−マウスにおいては見られず、このことは、観察されたＰＴＨ−βａｒｒの同化的効果がβ−アレスチン依存性のものであることを示している。データは、少なくとも７回の独立したマウスでの測定の平均±ＳＥＭに相当する。（＊：媒体で処理した対照と比較してＰ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１）。
【図４】図４は、β−アレスチン２依存性のシグナル伝達は、骨梁の増大に寄与するが、皮質骨の増大には寄与しない。腰椎の定量的マイクロＣＴを用いて、媒体、ＰＴＨ（１−３４）（ＰＴＨ）、またはＰＴＨ−ｂａｒｒの、処理の８週間後のＷＴマウスおよびβ−アレスチン２−／−マウスにおける（ａ）骨梁（Ｔｂ）密度（ＢＶ／ＴＶ）、（ｂ）Ｔｂの厚さ、および（ｃ）Ｔｂの数に対する効果を決定した。ＰＴＨおよびＰＴＨ−βａｒｒはＷＴ処理動物においてｔｂの密度、ｔｂの厚さ、およびｔｂの数を増大させた。ＰＴＨ−βａｒｒの効果は、β−アレスチン２−／−動物においては見られず、このことは、同化的な骨形成のｂ−アレスチン介在性のメカニズムと一致していた。データは、少なくとも７回の独立したマウスでの測定の平均±ＳＥＭに相当する。（＊＊＊：媒体で処理したＷＴマウスと比較してＰ＜０．００１、＊＊：ｐ＜０．０１、＊：Ｐ＜０．０５、＋＋：媒体で処理したβ−アレスチン２−／−マウスと比較してＰ＜０．０１、＋：Ｐ＜０．０５）。
【図５】図５は、ＰＴＨ−βａｒｒは、血清オステオカルシンを増大させ、尿デオキシピリジノリン（ＤＰＤ）の排出に対する効果を有さない。（ａ）骨形成の生化学マーカーである血清オステオカルシンを、媒体、ＰＴＨ（１−３４）（ＰＴＨ）、またはＰＴＨ−βａｒｒで処理した４週間後にＷＴマウスおよびβ−アレスチン２−／−マウスにおいて測定した。これらの結果は、ＰＴＨおよびＰＴＨ−βａｒｒが、ＷＴの処理マウスにおけるプラセボと比較して、血清オステオカルシンレベルを顕著に増大させることを示す。プラセボと比較して、ＰＴＨ−βａｒｒで処理したβ−アレスチン２−／−マウスにおいて、血清オステオカルシンに増大はなかった。これらの結果は、図３および図４に示される骨梁形成の増大と一致し、骨に対するＰＴＨ−βａｒｒの同化的効果がβ−アレスチン依存性であることと一致するものである。（ｂ）骨分解および骨吸収のマーカーである２４時間の尿ＤＰＤもまた、媒体、ＰＴＨ、またはＰＴＨ−βａｒｒで処理した４週間後にＷＴマウスおよびβ−アレスチン２−／−マウスにおいて測定した。これらの結果は、ＰＴＨ−βａｒｒが、プラセボと比較して、ＷＴマウスまたはβ−アレスチン２−／−マウスにおける骨吸収に対して顕著な効果を有さないことを示す。ＰＴＨで処理したβ−アレスチン２−／−マウスにおける尿ＤＰＤの排出の増大は、骨吸収が主にＧタンパク質依存性のメカニズムを介して仲介され得ることを示す。データは、少なくとも７回の独立したマウスでの測定の平均±ＳＥＭに相当する。（＊＊＊：媒体で処理したＷＴマウスと比較してＰ＜０．００１、＊：Ｐ＜０．０５、＋＋＋：媒体で処理したβ−アレスチン２−／−マウスと比較してＰ＜０．００１、＋＋：Ｐ＜０．０１）。
【図６】図６は、異なるβ−アレスチン依存性経路およびＧタンパク質依存性経路が、骨調節タンパク質のＰＴＨ受容体刺激性の遺伝子発現に寄与する。骨調節タンパク質のＰＴＨ受容体刺激性の転写に対する、β−アレスチン介在性のシグナル伝達の寄与を決定するために、媒体、ＰＴＨ（１−３４）（ＰＴＨ）、またはＰＴＨ−βａｒｒで処理したＷＴマウスおよびβ−アレスチン２−／−マウスの頭蓋冠からＲＮＡを単離した。遺伝子発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲによって分析した。（ａ）骨形成と一致して、ＰＴＨおよびＰＴＨ−βａｒｒはＷＴの頭蓋冠におけるオステオカルシンの発現を増大させた。β−アレスチン２−／−マウスにおいて、ＰＴＨはオステオカルシンの発現の顕著な増大を誘発し、このことは、Ｇタンパク質介在性の骨形成と一致するものである。β−アレスチン２−／−マウスにおいて、ＰＴＨ−βａｒｒはオステオカルシンの発現を低減させ、このことは、ＰＴＨ−βａｒｒがβ−アレスチン依存性のメカニズムを介してオステオカルシンの発現を誘発し、一方でさらに内因性ＰＴＨのＧタンパク質のシグナル伝達を阻害することを裏付けるものである。（ｂ）および（ｃ）。ＰＴＨ−βａｒｒは、破骨細胞の動員のＲＡＮＫＬ調節因子またはＯＰＧ調節因子の発現に作用しない。データは、６回の独立した実験から得られた平均±ＳＥＭに相当する。（＊＊＊：媒体で処理したＷＴマウスと比較してＰ＜０．００１、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊：Ｐ＜０．０５、＋＋＋：媒体で処理したβ−アレスチン２−／−マウスと比較してＰ＜０．００１、＋：Ｐ＜０．０５）。
【図７】図７は、１型ＰＴＨ／ＰＴＨｒｐ受容体の概略図である。予想されるアミノ酸配列を、膜貫通ドメインの予想される位置と共に示す。大きなＮ末端を図面の一番上に示す。三角形は、２３個のアミノ酸からなるシグナル配列の切断部位を示す。黒い丸は、Ｎ結合グリコシル化部位に相当する。
【図８】図８は、骨芽細胞と破骨細胞との間の関係の概略図である。骨芽細胞が活性化されると、ＲＡＮＫＬおよびＯＰＧが生産および分泌される。ＲＡＮＫＬは前破骨細胞を活性化させ、骨芽細胞に変化させる。ＯＰＧはＲＡＮＫＬを阻害する。オステオカルシンは、骨芽細胞が活性化されていることの指標であり、ＤＰＤは、破骨細胞の活性が活性化されていることを示すマーカーである。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
（ＩＶ  詳細な説明）
本化合物、本組成物、本品目、本装置、および／または本方法が開示および記載される前には、これらは、別段の規定がない限り、特定の合成方法もしくは特定の組換えバイオテクノロジー法には限定されないか、または、別段の規定がない限り特定の試薬には限定されず、当然のことながら、それ自体変化し得ることを理解されたい。また、本明細書において用いられる用語は特定の実施形態を記載することのみを目的としたものであり、限定されることを意図したものではないことも理解されたい。
【０００８】
本明細書において示される（Ｄ−Ｔｒｐ１２、Ｔｙｒ３４）−ＰＴＨ（７−３４）は、Ｇタンパク質の結合についてのインバースアゴニストとして作用するが、一方でβ−アレスチン依存性のＥＲＫ１／２の活性化を刺激する。さらに、完全なＰＴＨ１ＲアゴニストであるＰＴＨ（１−３４）およびβ−アレスチン選択的なアゴニストである（Ｄ−Ｔｒｐ１２、Ｔｙｒ３４）−ＰＴＨ（７−３４）は、初代骨芽細胞における転写活性化の異なるプロフィールを誘発する。さらに、インビボでは、（Ｄ−Ｔｒｐ１２、Ｔｙｒ３４）−ＰＴＨ（７−３４）での処理は野生型における骨梁密度を増大させるが、β−アレスチン２−／−マウスにおいては増大させず、このことは、β−アレスチンシグナル伝達経路の活性化が、同化的応答を生じさせるために十分であることを示している。また、インビボでは、（Ｄ−Ｔｒｐ１２、Ｔｙｒ３４）−ＰＴＨ（７−３４）は、破骨細胞の数、ＲＡＮＫＬリガンド、または骨吸収を増大させることなく、骨芽細胞の数、オステオカルシンおよびＯＰＧの合成を顕著に増大させる。
【０００９】
Ａ．Ｇタンパク質共役型受容体
Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）は、哺乳動物ゲノムにおける細胞表面受容体の最大のおよび最も多様なスーパーファミリーを構成する。機能的ＧＰＣＲをコードする約８００の異なる遺伝子が、ヒトゲノムの１％超を構成している（Ｌａｎｄｅｒ、２００１年；Ｖｅｎｔｅｒ、２００１年）。選択的スプライシングにより、１０００から２０００の個別の受容体タンパク質が発現し得ると推定されている。このような進化的な多様性により、神経伝達物質およびペプチドホルモンから臭気物質および光子までの、細胞外刺激の極めて広大なアレイを検出する受容体が生じる。神経伝達におけるＧＰＣＲの機能は、生理学的ホメオスタシスおよび再生の神経内分泌制御を指示し、血行動態および中間代謝を調節し、かつ、複数の細胞型の成長、増殖、分化、および死に影響する。臨床使用されている全ての薬剤の半分超は、ＧＰＣＲを標的とすると推定され、内因性ＧＰＣＲリガンドを模倣して受容体へのリガンドの接近を遮断するか、またはリガンドの生産を調節するために作用する（Ｆｌｏｗｅｒ、１９９９年）。
【００１０】
配列類似性、水治療法のプロット、ならびに大量の生化学的データおよび突然変異原性のデータは、全てのＧＰＣＲが共通の７回膜貫通ドメイン構造を有しているという結論を裏付けるものである。膜貫通ドメインは、最も高い程度の配列保存を共有しているが、細胞内および細胞外ドメインは、サイズおよび複雑性において広範な多様性を示す。受容体の細胞外領域および膜貫通領域はリガンドの結合に関与するが、細胞内ドメインは、シグナル伝達および受容体機能のフィードバック調節に重要である。Ｎ−グリコシル化の１つまたは複数の部位はＮ末端内に存在するか、または、頻度は低いが、細胞外ループ内に存在する。ほとんどのＧＰＣＲは共通して、正常なタンパク質のフォールディングに必須なｅ１とｅ２との間のジスルフィド架橋に由来する２つのＣｙｓ残基、およびパルミトイル化部位として役立つＣ末端ドメインにおける別のＣｙｓ残基を有している。この脂質修飾により、推定上の第４の細胞内ループが形成される。
【００１１】
ＧＰＣＲをそれらのリガンドまたは配列類似性に基づいて分類するいくつかの分類系が考案されている。広く用いられているＫｏｌａｋｏｗｓｋｉのＡからＦの分類系（Ｋｏｌａｋｏｗｓｋｉ、１９９４年）は、例えば、ＧＰＣＲを６つのファミリーに分け、そのうちの３つ（ファミリーＡ、Ｂ、およびＣ）は既知のヒト受容体の大部分を含む。この系において、ファミリーＡは、ロドプシン関連受容体を構成し、生体アミンおよび他の小さな非ペプチドリガンド、ケモカイン、オピオイドおよび他の小ペプチド、プロテアーゼ応答性受容体、ならびに糖タンパク質ホルモンの受容体を含む、飛びぬけて最大の群である。２番目に大きな群であるファミリーＢのＧＰＣＲは、グルカゴン、カルシトニン、および副甲状腺ホルモンなどの高分子量ペプチドホルモンに結合する受容体を含む。最も小さい群であるファミリーＣは、代謝型グルタミン酸受容体、ＧＡＢＡＢ受容体、およびカルシウム感知受容体を含む。
【００１２】
多くの種から得られたゲノムワイドのデータが利用可能になっているため、ＧＰＣＲの系統発生をより詳細に形にすることが可能になっている。多くのＧＰＣＲの染色体位置および配列のフィンガープリントの分析により、ＦｒｅｄｒｉｋｓｓｏｎらはＧＲＡＦＳ分類系を提案し、この系において、受容体は５つのファミリー、すなわちグルタミン酸、ロドプシン、Ａｄｈｅｓｉｏｎ、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／Ｔａｓｔｅ２、およびセクレチンに分類される（Ｆｒｅｄｒｉｋｓｓｏｎ、２００３年）。ＧＲＡＦＳファミリーにおけるＧＰＣＲは、共通の祖先から生じ、遺伝子複製およびエキソンシャッフリングを介して進化した。ＧＲＡＦＳ系は、ヘテロ三量体Ｇタンパク質を介してシグナル伝達するとは通常は考えられないＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体と、味覚受容体のＴＡＳ２群との間の提示された関連などの、いくつかの驚くべき関係を含む。このような系統発生上の関連は、「Ｇタンパク質共役型受容体」という用語が、多様なシグナル伝達メカニズムを用いる７回膜貫通受容体のスーパーファミリーに対しては部分的な誤称であり得ることを示唆する。
【００１３】
全てのＧＰＣＲは、ヘテロ三量体Ｇタンパク質に対するリガンド応答性グアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）として機能する。受容体の細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインに「第１メッセンジャー」ホルモンが結合すると、立体構造の変化が引き起こされ、それが細胞内受容体ドメインを介して伝達され、受容体とその同族Ｇタンパク質との間の結合が促進される。受容体は、Ｇαサブユニット上でのＧＴＰからＧＤＰへの交換を触媒することによるＧタンパク質の活性化、およびＧβγサブユニットヘテロ二量体からのＧＴＰ結合型Ｇαサブユニットの解離を刺激する。解離すると、遊離したＧα−ＧＴＰおよびＧβγサブユニットは、アデニル酸シクラーゼ、ホスホリパーゼのＣβアイソフォーム、およびイオンチャネルなどの、酵素エフェクターの活性を調節し、小分子の「第２メッセンジャー」を生じさせる。第２メッセンジャーは、次に、中間代謝に関与する主要な酵素を調節するプロテインキナーゼの活性を制御する。シグナル伝達は、Ｇαサブユニットの固有のＧＴＰａｓｅ活性がＧタンパク質を不活性なヘテロ三量体の状態に戻すまで継続する。
【００１４】
１．ＧＰＣＲタンパク質−タンパク質相互作用およびＧＰＣＲシグナル伝達
ＧＰＣＲシグナル伝達の従来のパラダイムは、受容体の活性化に対する迅速な細胞の応答のほとんどを説明するのに十分であるが、他のタンパク質−タンパク質相互作用は、本明細書に記載されるようなＧＰＣＲ活性の多様性を説明するものである。（Ｆｒｅｅｄｍａｎ、１９９６年；Ｈａｌｌ、２００２年；Ｂｒａｄｙ、２００２年；Ｍａｕｄｓｌｅｙ、２００５年；Ｌｕｔｔｒｅｌｌ、２００５年；Ｌｕｔｔｒｅｌｌ、２００６年；Ｍｉｌｌｉｇａｎ、２００１年；Ａｎｇｅｒｓ、２００２年；Ｓｅｘｔｏｎ、２００１年；Ｆｏｏｒｄ、１９９９年、Ｅｌ  Ｆａｒ、２００２年；Ｂｏｃｋａｅｒｔ、２００３年）。これらのタンパク質−タンパク質相互作用には、ＧＰＣＲ二量体の形成、ＧＰＣＲと受容体活性修飾タンパク質（ＲＡＭＰ）との相互作用、ならびに、受容体の細胞内ループおよびＣ末端へのＰＤＺドメイン含有足場タンパク質および非ＰＤＺドメイン足場タンパク質の結合が含まれる。これらの相互作用は、ＧＰＣＲの薬理および輸送を変化させ、受容体を特定の細胞内ドメインに局在化させ、シグナル伝達を決定前の経路に限定し、かつ効率的な活性化のために下流のエフェクターを準備する。細胞膜の面内における受容体、Ｇタンパク質、およびエフェクターのランダムな衝突の結果生じるよりもむしろ、ＧＰＣＲのシグナル伝達は、多タンパク質の「シグナルソーム」に高度に事前組織化される。
【００１５】
本明細書において論じられるように、ＧＰＣＲから生じる２つの広範なシグナル伝達の枝は、β−アレスチン枝およびＧタンパク質枝である。Ｇタンパク質枝よりもβ−アレスチン枝を選択的に活性化させる組成物および方法、ならびにβ−アレスチン枝よりもＧタンパク質枝を選択的に活性化させる組成物および方法が開示される。本明細書において示されるこの選択的な活性化は、特定の生物学的活性をもたらし、疾患状態および疾患の治療に関連するものである。
【００１６】
２．β−アレスチンは、ＧＰＣＲシグナル伝達のための、アゴニスト調節性足場Ｂとして機能する。
【００１７】
アレスチンは、同種のＧＰＣＲの脱感作および隔離のプロセスにおいて中心的な役割を担う４つのＧＰＣＲ結合タンパク質のファミリーである（Ｌｕｔｔｒｅｌｌ、２００５年；Ｆｅｒｇｕｓｏｎ、２００１年）。２つのアレスチンアイソフォームである視覚アレスチン（アレスチン１；Ｓｈｉｎｏｈａｒａ、１９８７年；Ｙａｍａｋｉ、１９８７年）および錐体アレスチン（Ｍｕｒａｋａｍｉ、１９９３年；Ｃｒａｆｔ、１９９４年）は、網膜においてほぼ排他的に発現し、主に光受容体の機能を調節するために存在する。非視覚アレスチンであるβ−アレスチン１（アレスチン２；Ｌｏｈｓｅ、１９９０年）およびβ−アレスチン２（アレスチン３；Ａｔｔｒａｍａｎｄａｌ、１９９２年）は、ゲノム内の他の６００個以上のＧＰＣＲのほとんどの活性を調節する。アレスチンは、Ｇタンパク質共役型受容体キナーゼ（ＧＲＫ）によってＣ末端のＳｅｒ／Ｔｈｒ残基のクラスター上でリン酸化されているＧＰＣＲを強固におよび特異的に結合し（Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ、１９９３年ａ）、さらなるＧタンパク質の活性化を立体的に妨げる。そして当然のことながら、現在の臨床使用における全ての薬剤の半分超はＧＰＣＲを標的とすると推定され、内因性ＧＰＣＲリガンドを模倣して受容体へのリガンドの接近を遮断するか、またはリガンドの生産を調節するために作用する。
【００１８】
アレスチンの結合はまた、ＧＰＣＲのエンドサイトーシスまたは隔離も制御する。ほとんどのＧＰＣＲはアゴニスト誘発性の隔離を受け、ほとんどの場合、そのプロセスはクラスリン被覆ピットを介したダイナミン依存性のエンドサイトーシスを伴う（Ｚｈａｎｇ、１９９６年）。視覚アレスチンを除く２つのβ−アレスチンは、Ｃ末端調節ドメインにおいて、クラスリンおよびＡＰ−２複合体のβ２アダプチンサブユニットにそれぞれ関連し、クラスリン被覆ピットにおける受容体のクラスタリングをもたらす、ＬＩＥＦ／ＬモチーフおよびＲｘＲモチーフを含む（Ｋｒｕｐｎｉｃｋ、１９９７年；Ｌａｐｏｒｔｅ、１９９９年）。内在化すると、ＧＰＣＲ−アレスチン複合体は、初期エンドソームに標的化され、そこで前記複合体は、再感作と細胞膜への再利用とのいずれかのために分類されるか、または分解に標的化される。受容体−β−アレスチン相互作用の持続期間は、内在化受容体の運命の主要な決定要因であり、エンドサイトーシスの際にβ−アレスチンから解離する受容体は迅速に再利用される傾向があるが、安定な受容体−β−アレスチン複合体に由来する受容体はゆっくりと再利用されるか、またはリソソームに標的化され分解される（Ｏａｋｌｅｙ、１９９９年）。
【００１９】
触媒性のＧＰＣＲ−Ｇタンパク質相互作用とは異なり、β−アレスチンは安定な二分子複合体におけるＧＰＣＲを結合し、ここでそれらは、エンドサイトーシス機構に受容体を物理的に結合しているアダプターとして機能する。アレスチン結合型受容体は、従来のＧＰＣＲ−Ｇタンパク質の「三重複合体」（Ｇｕｒｅｖｉｃｈ、１９９９年；Ｈｏｌｓｔ、２００１年）に類似している、高いアゴニスト親和性の状態にあり、前記三重複合体は、それにより、何人かの著者が受容体−アレスチン複合体のことを「選択的三重複合体」であると記載することになるものである（Ｇｕｒｅｖｉｃｈ、１９９９年）。この複合体がそれ自体ＧＰＣＲシグナル伝達物質であるということは発見であり、この発見により、β−アレスチンがＧＰＣＲ隔離の状況においてのみではなく細胞のシグナル伝達系への活性ＧＰＣＲの結合においてもアダプターとして作用するという仮定が導かれている（Ｌｕｔｔｒｅｌｌ、２００５年ａ；Ｌｕｔｔｒｅｌｌ、２００５年ｂ；Ｍｉｌｌｅｒ、２００１年；Ｐｅｒｒｙ、２００２年ａ；Ｌｕｔｔｒｅｌｌ、２００２年ａ；Ｓｈｅｎｏｙ、２００３年；Ｓｈｅｎｏｙ、２００５年ａ；Ｓｈｅｎｏｙ、２００５年ｂ；Ｓｈｅｎｏｙ、２００５年ｃ８）。触媒活性を有する多くのタンパク質が、β−アレスチンを結合し、アゴニストに占有されたＧＰＣＲへのβ−アレスチン依存性の動員を受けることが示されている。これらには、Ｓｒｃファミリーのチロシンキナーゼ（Ｌｕｔｔｒｅｌｌ、１９９９年ａ；ＤｅＦｅａ、２０００年ａ；Ｂａｒｌｉｃ、２０００年）、細胞外シグナル調節キナーゼ１および２（ＥＲＫ１／２）とｃ−ＪｕｎのＮ末端キナーゼ３のマイトジェン応答性タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼとのカスケードの構成要素（ＭｃＤｏｎａｌｄ、２０００年；ＤｅＦｅａ、２０００年ｂ；Ｌｕｔｔｒｅｌｌ、２００１年；Ｔｏｈｇｏ、２００２年；Ｔｏｈｇｏ、２００３年；Ｗｅｌ、２００３年；Ｃａｕｎｔ、２００６年；Ｇｅｓｔｙ−Ｐａｌｍｅｒ、２００６年；Ｊａｆｒｉ、２００６年）、Ｅ３ユビキチンリガーゼであるＭｄｍ２（Ｓｈｅｎｏｙ、２００１年）、ならびにｃＡＭＰホスホジエステラーゼであるＰＤＥ４Ｄ３／５（Ｐｅｒｒｙ、２００２年ｂ）がある。
【００２０】
いくつかのシグナル伝達タンパク質、例えばＥＲＫ１／２が、β−アレスチンアイソフォームの両方に明らかに結合する一方で、他のもの、例えばＪＮＫ３は選択的に結合し、アイソフォーム選択的なシグナル伝達の可能性を生じさせることに注意されたい。
【００２１】
１．アゴニストが結合したＧＰＣＲは２つのシグナル経路を活性化させる
ＧＰＣＲへのアゴニストの結合は、２つのアンタゴニストプロセスを同時に開始させ、すなわち、ヘテロ三量体Ｇタンパク質の活性化によりＧタンパク質依存性のシグナル生成が生じ、受容体の脱感作により受容体−Ｇタンパク質の結合が弱まり、経時的なシグナル強度が徐々に弱まる（Ｆｒｅｅｄｍａｎ、１９９６年；Ｌｕｔｔｒｅｌｌ、２００５年ａ）。β−アレスチンの結合は受容体とＧタンパク質とを切り離すため、Ｇタンパク質依存性およびβ−アレスチン依存性のシグナルの伝達は、少なくとも個別の受容体のレベルでは相互排他的である。
【００２２】
本明細書において、多タンパク質のシグナルソーム複合体のβ−アレスチン依存性の形成により、受容体が脱感作されエンドサイトーシス経路に入ると開始されるＧＰＣＲシグナル伝達の異なる第２の経路が開始されることが開示される。実際、ヘテロ三量体Ｇタンパク質の活性化から生じるＥＲＫ１／２活性化の経過と、アンジオテンシンＡＴ１ａ、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、Ｉ型副甲状腺ホルモン（ＰＨＴ）、およびβ２アドレナリン受容体（β２−ＡＲ）に対するＥＲＫ１／２活性化複合体のβ−アレスチン依存性の形成から生じるＥＲＫ１／２活性化の経過とを比較すると、β−アレスチン依存性のＥＲＫ１／２活性化の開始は、Ｇタンパク質のシグナル伝達が徐々に弱まることと同時であり、受容体が内在化すると持続することが示される（Ｌｕｔｔｒｅｌｌ、２００１年；Ａｈｎ、２００４年；Ａｚｚｉ、２００３年；Ｇｅｓｔｙ−Ｐａｌｍｅｒ、２００５年；Ｓｈｅｎｏｙ、２００６年）。
【００２３】
２．ＧＰＣＲはＥＲＫ１／２活性を調節するためにいくつかのメカニズムを用いる。
【００２４】
ＧＰＣＲがＥＲＫ１／２  ＭＡＰキナーゼカスケードを活性化させる能力は、それらによる細胞の増殖、分化、および走化性移動の調節の中心である（ｖａｎ  Ｂｉｅｓｅｎ、１９９６年；Ｇｕｔｋｉｎｄ、１９９８年；Ｌｕｔｔｒｅｌｌ、１９９９年ｂ；Ｌｕｔｔｒｅｌｌ、２００２年ｂ）。ＭＡＰキナーゼは、連続的にリン酸化し下流の構成要素を活性化させる３つのキナーゼでそれぞれ構成されている、一連の並列的なキナーゼカスケードを介して調節される。ＥＲＫ１／２カスケードにおいて、例えば、近接したキナーゼであるｃＲａｆ−１およびＢ−Ｒａｆは、ＭＥＫ１およびＭＥＫ２をリン酸化および活性化させる。ＭＥＫ１およびＭＥＫ２は、二機能性のスレオニン／チロシンキナーゼであり、これらは次に、ＥＲＫ１／２のリン酸化および活性化を行う（Ｐｅａｒｓｏｎ、２００１年）。現在では、複数のシグナルがＧＰＣＲ刺激性のＥＲＫ１／２の活性化に寄与することが明らかになっている。これらには、従来の第２のメッセンジャー依存性経路、例えば、小さなＧタンパク質であるＰａｐ１の、Ｇタンパク質依存性、アデニリルシクラーゼ依存性、ならびにＰＫＡ依存性およびＥＰＡＣ依存性の活性化（Ｖｏｓｓｌｅｒ、１９９７年；Ｇｒｅｗａｌ、２０００年）と、ｃ−Ｒａｆ１のプロテインキナーゼＣ依存性の活性化（Ｈａｗｅｓ、１９９５年）と、焦点接着キナーゼであるＰｙｋ２のカルシウムおよび細胞接着依存性の活性化（Ｌｅｖ、１９９５年；Ｄｉｋｉｃ、１９９６年）とが含まれる。ＧＰＣＲはまた、ＥＧＦ（Ｄａｕｂ、１９９７年；Ｐｒｅｎｚｅｌ、１９９９年）および血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）受容体（Ｈｅｅｎｅｍａｎ、２０００年；Ｌｉｎｓｅｍａｎ、１９９５年）などの受容体チロシンキナーゼを「転写活性化」することにより、Ｒａｓ依存性のＥＲＫ１／２の活性化を引き起こし得る。さらに、プロテアーゼ応答性受容体であるＰＡＲ２、ＡＴ１ＡＲ、β２ＡＲ、ＰＴＨ１Ｒ、およびニューロキニンＮＫ−１、ならびにバソプレッシンＶ２受容体を含む、いくつかのＧＰＣＲは、受容体結合型β−アレスチンをリガンド調節性足場として用いることによりＥＲＫ１／２を活性化することが示されている（ＤｅＦｅａ、２０００年ｂ；Ｌｕｔｔｒｅｌｌ、２０００年；Ｔｏｈｇｏ、２００２年；Ｔｏｈｇｏ、２００３年；Ｗｅｉ、２００３年；Ｃａｕｎｔ、２００６年；Ｇｅｓｔｙ−Ｐａｌｍｅｒ、２００６年；Ｊａｆｒｉ、２００６年）。両方のβ−アレスチンアイソフォームは、ＥＲＫ１／２カスケードの構成要素キナーゼと複合体を形成し、前記アイソフォームと配列相同性を有していないＳ．ｃｅｒｖｉｓｉａｅの足場タンパク質であるＳＴＥ５ｐ（Ｅｌｉｏｎ、２００１年）に機能的に類似した態様でリガンド調節性足場として作用すると考えられている。この多様性を考慮すると、ほとんどの細胞型においてＧＰＣＲがＥＲＫ１／２を活性化するために２つ以上のメカニズムを用い得ること、または１つもしくは複数の主要なメカニズムが受容体および細胞型によって変化することは当然のことである。おそらく、驚くべきことは、ＥＲＫ１／２の機能が活性化のメカニズムによって決定され、いくつかのシグナルが核移行を促進し、他のシグナルが細胞質によるＥ��Ｋ１／２の保持を促進することであると考えられる。
【００２５】
Ｃ．副甲状腺ホルモン
ＰＴＨ（副甲状腺ホルモン）は、カルシウムおよびリン酸塩のホメオスタシスの主要な調節因子であるが、副甲状腺ホルモン関連ペプチド（ＰＴＨｒＰ）は重要な発達上の役割を有する。両ペプチドは、同一の受容体であるＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ受容体、すなわち１型副甲状腺ホルモン受容体を介してシグナル伝達を行う。それは、骨芽細胞介在性の骨形成を直接的に刺激すること、ならびに破骨細胞の分化および機能を促進するＲＡＮＫＬなどの可溶性因子の生産を上方調節することにより骨吸収を間接的に刺激することが知られている。その結果、骨代謝に対するＰＴＨ投与の正味の効果は、これらの２つの反対のプロセスの相対的な活性化によって決定される。連続的に暴露させると、骨吸収は新たな骨形成を上回り、その結果、骨軟化症が生じるが、断続的に暴露させると、正味の骨形成が刺激される。骨芽細胞−破骨細胞の結びつきにより強いられる制限にも関わらず、ＰＴＨアゴニストペプチドであるＰＴＨ（１−３４）の断続的な投与は、重篤な骨粗しょう症の治療のための現在の同化的療法の基礎を形成するものである。
【００２６】
ＰＴＨは、８４個のアミノ酸からなる循環ホルモンである。それは副甲状腺で生産され、主に骨および腎臓に作用して細胞外カルシウムレベルを正常範囲内に維持する。ＰＴＨは、まず低い細胞外カルシウムに応じて副甲状腺の主細胞から分泌されるが、細胞外リン酸塩の上昇にも応じて分泌される。ＰＴＨは、腺により生産され、その後血流を介して移動してその標的組織で作用するという点で、真性ホルモンである。ＰＴＨおよびＰＴＨｒＰのＮ末端の３４個のアミノ酸は、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ受容体の効率的な活性化に十分である。腎臓においては、ＰＴＨは、遠位尿細管におけるカルシウムの再吸収を増大させることにより、カルシウムの排出を低減させる。ＰＴＨはさらに、近位尿細管の刷子縁膜に双方とも局在化する、２つの異なるリン酸ナトリウム共輸送体であるＮＰＴ−２ａおよびＮＰＴ−２ｃの発現レベルに主に作用することにより、リン酸塩の再吸収を阻害する。骨においては、ＰＴＨの効果は等しく複雑であり、基質から血液内へのカルシウムおよびリン酸塩の正味の放出をもたらす。（Ｇｅｎｓｕｒｅ  ＲＣ、Ｇａｒｄｅｌｌａ  ＴＪ、Ｊｕｅｐｐｎｅｒ  Ｈ．  Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ａｎｄ  ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ，  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ３２８巻：６６６〜６７８頁、２００５年を参照されたい）。
【００２７】
ＰＴＨ１Ｒリガンドの例示的な配列を配列番号２〜３に示す。
【００２８】
１．副甲状腺ホルモン類似体
副甲状腺ホルモンについての構造−活性の関係が、様々なペプチド断片および／または修飾副甲状腺断片類似体を用いて広く研究されている（Ｐｏｔｔｓ、２００５年）。β−アレスチン依存性のシグナル伝達の現象は、この研究の大部分が実施されたときには認められていなかったため、ほとんどのＰＴＨ由来ペプチドは、Ｇタンパク質依存性のｃＡＭＰ生成またはＧｑ／１１依存性のホスファチジルイノシトールの生産についてのアゴニストまたはアンタゴニストであるとしか特徴付けられていなかった。
【００２９】
少なくとも２つのＰＴＨ断片、すなわちｈＰＴＨ（１−３４）および（Ｌｅｕ２７）シクロＧｌｕ２２−Ｌｙｓ２６ｈＰＴＨ（１−３１）ＮＨ２が、骨粗しょう症の治療のために開発されている。これらのうちの１つである組換え（ｒ）ｈＰＴＨ（１−３４）は、重篤な骨粗しょう症の治療についてＦＤＡの認可を受けており、Ｆｏｒｔｅｏという商品名で市販されている。（Ｌｅｕ２７）シクロＧｌｕ２２−Ｌｙｓ２６ｈＰＴＨ（１−３１）ＮＨ２は、Ｏｓｔａｂｏｌｉｎ−Ｃという商品名で、第ＩＩ相臨床試験におけるものである。さらに、天然のホルモンであるｈＰＴＨ（１−８４）も臨床試験を完了している（Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ、２００６年）。全ての３つのこれらのペプチドは、骨の成長を刺激し、エストロゲンの欠乏により弱められる骨の微細構造を強化し、かつさらなる骨折を低減させるが、ｈＰＴＨ（１−３４）およびｈＰＴＨ（１−８４）は、本明細書において論じられるようなβ−アレスチンに偏った特定のリガンドではないが、（Ｌｅｕ２７）シクロＧｌｕ２２−Ｌｙｓ２６ｈＰＴＨ（１−３１）ＮＨ２は、それが偏ったリガンドであるかを明らかにするための試験が行われていない。
【００３０】
Ｇタンパク質シグナル伝達またはβ−アレスチンシグナル伝達の選択的な関連の特性に関する偏ったアゴニズム（偏ったリガンド）に関して、副甲状腺ホルモン類似体（Ｄ−Ｔｒｐ１２、Ｔｙｒ３４）ＰＴＨ（７−３４）は、ＰＴＨ１受容体−Ｇタンパク質の結合についてインバースアゴニストとして作用し、一方で、アレスチン依存性の隔離を促進する（Ｇａｒｄｅｌｌａ、１９９６年；Ｓｎｅｄｄｏｎ、２００４年）。Ｔｒｐ１−ＰＴＨｒＰ（１−３６）は、β−アレスチンの動員または脱感作を誘発することなくＧタンパク質結合およびｃＡＭＰの生産を促進する、反対の活性プロフィールを有する（Ｂｉｓｅｌｌｏ、２００２年）。β−アレスチン選択的な偏ったアゴニストである（Ｄ−Ｔｒｐ１２、Ｔｙｒ３４）ＰＴＨ（７−３４）は、インビトロでβ−アレスチン依存性のＥＲＫ１／２の活性化を誘発するが、ＰＴＨ１Ｒ介在性のｃＡＭＰ生産のインバースアゴニスト（阻害剤）として機能することが示されている（Ｇｅｓｔｙ−Ｐａｌｍｅｒ、２００６年）。
【００３１】
Ｄ．１型副甲状腺ホルモン受容体（ＰＴＨ１Ｒ）
ＰＴＨおよびＰＴＨｒＰは、クラスＢのＧタンパク質共役型受容体である、共通の受容体であるＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ受容体を介して作用する（図７）。このファミリーの受容体には、セクレチン、血管作動性腸管ペプチド、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、成長ホルモン放出ホルモン、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド、胃抑制ペプチド、カルシトニン、およびわずかな他のペプチドホルモンに対する受容体が含まれる。
【００３２】
インビトロでＰＴＨを結合する第二の受容体であるＰＴＨ２受容体は、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ受容体に最も近く関連するものである（５１％のアミノ酸同一性）。ＰＴＨはヒトＰＴＨ２受容体でアゴニストとして作用するが、ラットまたは魚のこの受容体のホモログではアゴニズムをほとんど示さないかまたは全く示さない。ＰＴＨｒＰは、既知のＰＴＨ２受容体のいずれにおいてもアゴニズムを示さない。ラットＰＴＨ２受容体によるＰＴＨへの応答の欠如、および視床下部へのこの受容体の主要な局在化は、カルシウムのホメオスタシスの調節とは異なる生理学的役割を示唆するものである。実際、さらなる研究により、この受容体への天然のリガンドであると考えられる、ＰＴＨおよびＰＴＨｒＰに構造的に関連する、３９個のアミノ酸からなるペプチドであるＴＩＰ３９が発見された。ＴＩＰ３９およびＰＴＨ２受容体についての仮定される生物学的活性には、痛覚が含まれ、また、下垂体ホルモンの分泌の調節も含まれる可能性がある。（Ｇｅｎｓｕｒｅ  ＲＣ、Ｇａｒｄｅｌｌａ  ＴＪ、Ｊｕｐｐｎｅｒ  Ｈ．  Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ａｎｄ  ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ，  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ３２８巻：６６６〜６７８頁、２００５年を参照されたい）。
【００３３】
ＰＴＨ活性は、腎臓および骨において高度に発現する７回膜貫通受容体（７ＴＭＲ）であるＩ型ＰＴＨ／ＰＴＨ関連ペプチド受容体（ＰＴＨ１Ｒ）を介して仲介される。ＰＴＨ１Ｒ受容体によって活性化される細胞内シグナル伝達経路には、Ｇタンパク質介在性のアデニル酸シクラーゼ−ｃＡＭＰ−ＰＫＡシグナル伝達経路およびＧｑ／１１介在性のＰＬＣβ−イノシトール１，４，５−トリスリン酸（ＩＰ３）−ＰＫＣシグナル伝達経路が含まれる。さらに、ＰＴＨは、細胞特異的なおよびＧタンパク質依存性の態様で、ＰＫＡおよびＰＫＣの両方を介して、Ｒａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫのＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）カスケードを活性化させる。
【００３４】
本明細書において、Ｇタンパク質シグナル伝達に対する負の調節効果をもたらすことに加え、Ｓｒｃ、Ｒａｓ、ｒａｆ、ＥＲＫ１／２、ＪＮＫ３、およびＭＡＰＫキナーゼ４（ＭＫＫ４）、ならびにＪＮＫ３などのアクセサリーエフェクター分子との足場形成複合体の形成を介したシグナル伝達物質としても作用する、β−アレスチンが開示される。ＰＴＨ１ＲのＰＴＨ刺激は、細胞膜へのβ−アレスチン１およびβ−アレスチン２の両方の移行、β−アレスチンとの受容体の関連、受容体／β−アレスチン複合体の内在化、およびＥＲＫ１／２の活性化を促進する。本明細書において、ＧＰＣＲのβ−アレスチン活性化経路をＧタンパク質経路よりも活性化させる組成物が開示される。
【００３５】
Ｅ．ＧＰＣＲ関連疾患
１．骨障害
骨障害は、本明細書において論じられるβ−アレスチンに偏ったリガンドを用いて治療することができる。例えば、加齢に起因する骨粗しょう症（老人性骨粗しょう症）、性腺機能低下症（女性における更年期後の、または男性におけるアンドロゲン低下による）、内因性または外因性の副腎皮質ホルモン過剰（臨床上のプレドニゾン投与）が全て、偏ったリガンドを用いて治療され得る。
【００３６】
骨折修復（外傷性骨折）または移植片の固定（骨移植）は、本明細書において開示される偏ったリガンドを用いて治療または増強することができる。例えば、本明細書に開示される偏ったリガンドを、骨折を有する対象、または、移植片が骨に固定するように置かれている、移植片を有する対象に投与することにより、偏ったリガンドを投与しない場合または対照よりも、対象の骨折はより早く治癒し得、移植片はより早く固定し得る。
【００３７】
骨粗しょう症は、重要な臨床上の健康への脅威である。アメリカ合衆国においては、約１０００万人がこの疾患を有していると推定され、約３４００万人以上が、骨量が少なく、そのため骨粗しょう症を発現するリスクが増している状態である。
【００３８】
骨粗しょう症は主に、骨芽細胞介在性の骨形成と破骨細胞介在性の骨吸収との間の正味の不均衡により生じる。この不均衡により、骨量が低下し、微細構造が破壊され、それにより、骨が脆弱化して骨折しやすくなり、かつ罹患および死亡が増大する。関連する医療費は毎年１８０億ドルを超えている。
【００３９】
しかし、骨に対するＰＴＨの作用は複雑である。ＰＴＨは骨に対する同化的効果および異化的効果の両方を有することが知られている。骨の再構築におけるＰＴＨ介在性シグナルの重要性を裏付けるデータにもかかわらず、これらの効果についての基本メカニズムはほとんど知られていない。
【００４０】
２．ＧＰＣＲ関連疾患および偏ったリガンド
開示される偏ったリガンドで治療することが可能なＧＰＣＲ関連疾患には、肺および心血管の疾患、アレルギー／アレルギー性疾患、免疫疾患、精神障害、心理障害、皮膚疾患、神経疾患、自律神経疾患、炎症性疾患、内分泌または代謝疾患（例えば糖尿病および肥満）、泌尿生殖器障害、ならびに眼の疾患（例えば緑内障）が含まれる。
【００４１】
ａ）Ｇタンパク質選択的な偏ったアゴニスト
Ｇタンパク質を活性化させるが対照ほどにはβ−アレスチンを動員しない薬剤は、脱感作を用いることなくＧＰＣＲ活性を維持することが望ましい状況において有利であり得る。例には、気管支ぜんそく（気管支拡張を促進するための、長時間作用型のβ２−アドレナリン受容体アゴニスト）、アレルギー性鼻炎（鼻づまりの再発を生じさせずに鼻づまりを緩和するα１−アドレナリン受容体アゴニスト）が含まれる。心原性ショックまたは敗血性ショックの治療における短期間の非経口使用のための変力薬、例えば、タキフィラキシーを生じさせないα−アドレナリン受容体アゴニストは、現在の作用物質よりも優れている可能性がある。
【００４２】
３．ＰＴＨ１Ｒは２つの異なるシグナル伝達経路を有する
Ｇタンパク質依存性およびβ−アレスチン依存性のシグナル伝達は、２つの異なる、かつ薬理学的に分離したメカニズムである。ＰＴＨ１Ｒを刺激すると、一方はＧタンパク質依存性経路であり他方はβ−アレスチン依存性である２つの時間的に異なるメカニズムによってＥＲＫ１／２  ＭＡＰキナーゼが活性化すること、およびＰＴＨ１Ｒシグナル伝達のこれらの２つのメカニズム（Ｇタンパク質対β−アレスチン）が、受容体のＧタンパク質共役型立体構造とβ−アレスチン共役型立体構造との間を区別するＰＴＨ類似体の使用を介して選択的に刺激され得ることが示されている。
【００４３】
β−アレスチン２は、マウスモデルにおいて、骨の再構築および断続的なＰＴＨ（１−３４）の投与の同化的効果に影響することが示されている。Ｆｅｒｒａｒｉらにより、ＰＴＨ（１−３４）を断続的に投与すると、β−アレスチン２−／−マウスにおいて骨のミネラル含有量および骨梁の体積が増大しなかったことが報告された。この効果は、Ｇタンパク質共役型シグナル伝達の従来のβ−アレスチンの脱感作の低下、ｃＡＭＰの増大および維持に起因するものであった。本明細書において、骨形成を誘発するβ−アレスチン経路に偏ったリガンドおよびこれらの偏ったリガンドの使用方法が開示される。
【００４４】
Ｆ．リガンド
１．アゴニスト、アンタゴニスト、インバースアゴニスト、偏ったリガンド、偏ったアゴニスト
ａ）ＧＰＣＲ機能の三重複合体モデル
ＧＰＣＲは、ヘテロ三量体Ｇタンパク質に対するリガンド応答性のグアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）として機能することにより、細胞内でシグナルを伝達する。Ｇタンパク質の活性化は、細胞内膜貫通ループおよびカルボキシル末端に伝達される、膜貫通７らせん受容体核の三次構造におけるホルモン誘導性の変化を介して開始される。これらの立体構造の変化は、受容体が細胞内Ｇタンパク質と相互作用し、ヘテロ三量体Ｇタンパク質のアルファサブユニット上のＧＤＰのＧＴＰへの変化を触媒する能力を変化させる。ＧＴＰ結合型アルファサブユニットは、その同族な下流のエフェクター、例えばアデニル酸シクラーゼまたはホスホリパーゼＣを刺激し、細胞外刺激の存在についての情報を細胞内環境に伝える。
【００４５】
多くのＧＰＣＲを伴うこれまでの研究により、受容体が、Ｇタンパク質を活性化させる能力に違いのある２つの立体構造（活性：Ｒ＊、不活性：Ｒ）の間で自然に平衡しているという仮説が確認されている（Ｓａｍａｍａら、１９９３年）。天然の状態では、受容体は、膜貫通らせんの束内における細胞内相互作用によって主にＲ立体構造に維持されており、すなわち、自然な平衡は不活性なＲ状態に大きく傾いている。アゴニストの結合または選択的な突然変異生成は、これらの制約を軽減し、Ｇタンパク質の結合を可能にするＲ＊立体構造に受容体が「緩む」ことを可能にする。これらの現象を説明するために開発された、拡張された三重複合体モデルにより、リガンドの固有の有効性が、ＲとＲ＊との間の平衡を変化させるその能力を反映していることが提示されている（Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚら、１９９３年）。
【００４６】
ｂ）多状態モデルに対する３つの状態
三重複合体モデルは、アゴニズム、アンタゴニズム、部分的アゴニズム、およびインバースアゴニズムの特性を十分に説明し得るが、このモデルは、機能的受容体の２つの状態のみの存在にしか適応しないという点で依然として限定されている。２状態モデルにおいて、すなわち単一のＲ＊立体構造のみが存在している場合には、受容体のアゴニスト薬理は、測定されている応答に関わらず同一でなくてはならない。しかし、アゴニストの相対的有効性の矛盾した逆転が、５ＨＴ２ｃ受容体（Ｂｅｒｇら、１９９８年）、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）受容体（Ｓｐｅｎｇｌｅｒら、１９９３年）、ドーパミンＤ２受容体（Ｍｅｌｌｅｒら、１９９２年）、およびニューロキニンＮＫ−１受容体（Ｓａｇａｎら、１９９９年）を含む、２つ以上の刺激−応答エレメントを活性化させるいくつかのＧＰＣＲについて記載されている。異なる刺激経路の活性化は、メカニズムのシグナル型の強さを介して、すなわち、高度に有効なアゴニストが２つの経路を活性化させ得る一方で弱いアゴニストはより感受性の高い経路のみを活性化させ得ることを介して生じ得るが、同一の受容体に作用する異なるアゴニストの相対的有効性の逆転は、２状態モデルに基づいては説明することができない。
【００４７】
ＧＰＣＲがリガンド特異的な活性化状態を示すという実証により、同一の受容体の２つ以上の活性状態が存在し得ることが提示された。これらの３状態または多状態モデルにおいて、アゴニストは、結合に関与する細胞内ドメインの領域を異なるＧタンパク質プールに差異的に晒すことにより、受容体の異なる「活性な」立体構造を誘発すると予想される。実際、α２−アドレナリン受容体の多Ｇタンパク質共役型状態は、様々なグアニンヌクレオチド類似体を用いて区別することができる（Ｓｅｉｆｅｒｔら、１９９９年）。同様に、いくつかの受容体突然変異が、受容体により通常活性化されるシグナル伝達経路のうちの１つのシグナル伝達経路に制限される構成的活性を生じさせることが記載されている（Ｐｅｒｅｚら、１９９６年）。これらの突然変異はおそらく、受容体の立体構造の異性化を、特定のＧタンパク質結合立体構造を促進する特定のサブセットに制限する。突然変異受容体の挙動は、その野生型の対応物に対して先験的に推定することはできないが、これらのデータは、異なるアゴニストリガンドを結合する際に生じ得るような、Ｇタンパク質結合ドメインの外側の受容体構造におけるわずかな変化が、Ｇタンパク質の選択性を変化させ得ることを明らかに示している（Ｋｅｎａｋｉｎ、２００２年）。
【００４８】
生物物理学的な証拠もまた、異なるＧＰＣＲリガンドが受容体の微細立体構造の異なる集団を誘発するという概念を裏付けるものである（Ｇｈａｎｏｕｎｉら、２００１年）。Ｃｙｓ２６５で蛍光標識されたβ２アドレナリン受容体の蛍光寿命分光分析は、受容体の立体構造における連続的な変動を反映する、プローブについての環境のガウス分布を明らかにしている。アゴニストまたはアンタゴニストを加えると、リガンドは受容体の立体構造の分布を変化させ、これは立体構造の特定のサブセットの安定化を反映している。さらに、異なるアゴニストは、受容体の立体構造の異なるアレイを選択し、これは、リガンド選択的な活性状態の誘発と一致している。
【００４９】
複数の活性受容体の立体構造の存在は、アゴニストが受容体活性化の程度だけでなく「質」も変化させ得ることに説得力を持たせるものである。受容体上の細胞質ループの異なる領域が異なるＧタンパク質を活性化することは知られている（Ｗａｄｅら、１９９９年）。したがって、受容体の異なる三次立体構造を生じさせるアゴニストが、これらの異なるＧタンパク質活性化配列を晒して、差異的な、または「偏った」Ｇタンパク質の活性化を生じさせ得ることは予想可能である。このＧＰＣＲ活性化の多状態モデルは、「受容体シグナル伝達のアゴニスト特異的な輸送」とも呼ばれるシグナル伝達選択的なアゴニズムの概念についての理論的基礎をもたらすものである（Ｋｅｎａｋｉｎ、１９９５年ｂ；Ｋｅｎａｋｉｎ、１９９５年ｃ）。
【００５０】
したがって、ＧＰＣＲは、Ｇタンパク質経路およびβアレスチン経路などの様々な経路を介して、下流のシグナル伝達を活性化させない状態と下流のシグナル伝達を活性化させる状態との間で自然に平衡している。さらに、複数のシグナル伝達経路が存在するため、変化すると下流のシグナル伝達事象を生じさせ得る、２つ以上の平衡が存在する。Ｍａｕｄｓｌｅｙ，  Ｓ．、Ｍａｒｔｉｎ，  Ｂ．  およびＬｕｔｔｒｅｌｌ，  Ｌ．Ｍ．  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ：  Ｔｈｅ  ｏｒｉｇｉｎｓ  ｏｆ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｉｎ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｅｘｐ．  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．  ３１４巻：４８５〜４９４頁、２００５年を参照されたい。
【００５１】
立体構造状態に関する定義は以下の通りである。アゴニストは、ＧＰＣＲなどの受容体に結合し、リガンド結合していない（結合していない）状態と比較してシグナル伝達活性の増大を促進する１つまたは複数の受容体立体構造を安定化させるリガンドである。リガンドは、インビボでの受容体活性を調節する１つまたは複数の天然に存在する化合物の結合に関与する、全てまたは一部の受容体構造と相互作用する。この用語には、リガンド結合ポケットの外側の受容体領域とは相互作用するがリガンドに対する受容体の応答を変化させるような様式で受容体構造を変化させる化合物である、アロステリック調節因子は含まれない。
【００５２】
アンタゴニストは、１つまたは複数の活性状態と不活性状態との間の受容体の自然な平衡に測定可能に作用することなく、ＧＰＣＲなどの受容体に結合するリガンドである。それは、リガンド結合していない状態と比較して、受容体立体構造の自然な平衡に対して測定可能な効果を有さない。アンタゴニストは結合について競合し、「活性化」リガンドの効力を低下させるため、その存在は、立体構造の平衡を変化させるリガンドが同時に存在する場合にのみ検出することができる。ニュートラルアンタゴニストは、「インバースアゴニスト」の効力を、アゴニストの効力と同様になるように低減させる。
【００５３】
インバースアゴニストは、ＧＰＣＲに結合し、受容体の不活性な立体構造を安定化させて、リガンド結合していない状態と比較して、受容体の基底シグナル伝達活性を低減させるリガンドである。基底活性が低い条件下では、インバースアゴニストは、シグナル伝達の有効性の従来の測定を用いてアンタゴニストから区別することができない。
【００５４】
偏ったリガンドは、受容体の考えられる下流のシグナル伝達活性の一部に対して、アゴニスト、アンタゴニスト、またはインバースアゴニストとして作用するあらゆるリガンドである。
【００５５】
偏ったアゴニストは、ＧＰＣＲなどの受容体に結合し、受容体の考えられる活性な立体構造のサブセットを安定化させて、リガンド結合していない状態と比較して、完全な応答プロフィールの一部のみを生じさせる、偏ったリガンドである。異なる受容体の立体構造を反映する複数の活性状態の概念において具体化されているように、偏ったアゴニストは、測定されるシグナル伝達出力に依存して、異なるアゴニスト、アンタゴニスト、またはインバースアゴニストの特性を示す。
【００５６】
偏ったリガンドは、アゴニスト、アンタゴニスト、またはインバースアゴニストとしてのその特徴付けが、測定されるシグナル伝達出力に依存して異なることを意味する、真の「有効性の逆転」を生じさせる。例えば、１型ＰＴＨ受容体の偏ったアゴニストである（Ｄ−Ｔｒｐ１２、Ｔｙｒ３４）−ＰＴＨ（７−３４）は、ｃＡＭＰの生産の活性化に関してはインバースアゴニストとして挙動する（リガンド結合していない状態と比較して基底活性を低下させる）が、アレスチン依存性の受容体内在化またはシグナル伝達の活性化に関してはアゴニストとして挙動する（リガンド結合していない状態と比較して、受容体の内在化およびＥＲＫ１／２の活性を増大させる）。
【００５７】
Ｇ．定義
明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる場合、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」という単数形態には、文脈上そうでないことが明らかでない限り、複数形の指示対照が含まれる。したがって、例えば、「１つの薬学的担体」という記載には、２つ以上のそのような担体の混合およびそれに類似したものが含まれる。
【００５８】
本明細書においては対照が用いられている。特定の実施形態において、対照は、アゴニスト、アンタゴニスト、インバースアゴニスト、または偏ったリガンドなどの参照リガンドであり得る。参照リガンドとは、ＧＰＣＲなどの特定の受容体に対する既知の活性プロフィールを有するあらゆるリガンドを意味する。特定の実施形態において、対照とは、あらゆる比較的状態を言い、例えば、活性化状態に対する、不活性化状態である対照状態である。例えば、対照は、ｃＡＭＰの生産またはＥＲＫ１／２のリン酸化の特定のアッセイにおいて未刺激のものであり得る。あるいは、対照は、β−アレスチンの発現が下方調節されている条件下におけるＥＲＫ１／２リン酸化アッセイの実施などの、シグナル伝達経路における下流のエレメントが遺伝的に欠失している条件下において実施される比較であり得る。対照は当技術分野においてよく理解されており、特段の記載がない場合、対照は、それが用いられる状況によって理解され得るものである。
【００５９】
同化的な骨形成は、骨量の正味の増大を生じさせる、骨吸収を上回る新たな骨形成の速度の増大である骨形成である。それは、骨形成を刺激しないが破壊の速度を遅くする、骨量の増大の純粋な抗吸収アプローチから区別されるという点で、同化的である。
【００６０】
本明細書において、範囲は、「おおよその」１つの特定の値から、および／または「おおよその」別の特定の値までとして表され得る。このような範囲が表される場合、別の実施形態には、１つの特定の値から、および／または他の特定の値までが含まれる。同様に、値が先行詞「約」を用いて近似値として表される場合、特定の値が別の実施形態を形成することが理解されよう。それぞれの範囲の終点が、他の終点と関連して、また他の終点から独立して、重要であることがさらに理解されよう。また、本明細書には多くの値が開示されていること、およびそれぞれの値が本明細書において、その値自体に加えて「おおよその」特定の値としても開示されていることが理解される。例えば、値「１０」が開示されている場合、「約１０」も開示されている。また、当業者に適切に理解されるように、値がその値「未満または等しい」と開示されている場合、「その値を超えるかまたは等しい」およびその値の間の可能性のある範囲もまた開示されていることも理解される。例えば、値「１０」が開示されている場合、「１０未満のまたは等しい」および「１０を超えるかまたは等しい」も開示されている。また、本出願を通して、データが多くの異なる形式で示されており、このデータが終点および開始点ならびにデータポイントのあらゆる組み合わせについての範囲に相当することも理解される。例えば、特定のデータポイント「１０」および特定のデータポイント１５が開示されている場合、１０および１５を超える、１０および１５を超えるかまたは等しい、１０および１５未満の、１０および１５未満のまたは等しい、ならびに１０および１５に等しいが、１０から１５と同様に開示されていると考えられる。
【００６１】
組成物または品目における特定のエレメントまたは構成要素の重量部についての、明細書および最終的な特許請求の範囲における記載は、重量部を表記する組成物または品目におけるそのエレメントまたは構成要素と、あらゆる他のエレメントまたは構成要素との間の重量の関係を示す。したがって、２重量部の構成要素Ｘと５重量部の構成要素Ｙとを含む化合物において、ＸおよびＹは、２：５の重量比で存在しており、追加の構成要素が組成物に含まれているかに関わらずこのような比率で存在している。
【００６２】
別段の記載がない限り、構成要素の重量パーセントは、その構成要素が含まれる製剤または組成物の総重量に基づくものである。
【００６３】
この明細書および以下の特許請求の範囲において、以下の意味を有すると定義される多くの用語が記載される。
【００６４】
「任意選択の」または「任意選択により」は、その次に記載されている事象または状況が生じても生じなくてもよく、その記載が、前記事象または状況が生じる場合および生じない場合を含むことを意味する。
【００６５】
この出願を通して、様々な文献が参照されている。これらの文献の全体の開示は、この出願が関連する技術の背景をより完全に記載するために、参照することにより、本明細書によってこの出願に組み込まれる。開示される参考文献はまた、参照の理由となる文において論じられている、参考文献に含まれる材料について、参照することにより本明細書に個別にかつ特異的に組み込まれる。
【００６６】
Ｈ．組成物
開示する組成物を調製するために使用した構成要素、および本明細書で開示する方法内で使用した組成物自体を開示する。これらおよび他の物質を本明細書で開示し、これらの物質の組合せ、部分集合、相互作用、群などを開示するとき、かつ一方で、これらの化合物のそれぞれの様々な個別的および全体的組合せおよび順列の、具体的な言及が明確に開示されない可能性があるとき、それぞれは本明細書で具体的に企図され記載されることは理解されよう。例えば、特定の偏ったリガンドを開示し論じ、かつ偏ったリガンドを含めた幾つかの分子に施すことができる幾つかの修飾を論じる場合、具体的に企図されるのは、それに反することが具体的に示されない限り、偏ったリガンドのそれぞれおよび個々の組合せおよび順列ならびに可能である修飾である。したがって、１クラスの分子Ａ、Ｂ、およびＣを開示し、かつ１クラスの分子Ｄ、Ｅ、およびＦならびに組合せ分子の一例、Ａ−Ｄを開示する場合、ひいてはそれぞれが個別に列挙されない場合でさえ、それぞれは個別的および全体的に組合せを意味すると企図され、Ａ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−Ｅ、およびＣ−Ｆが開示されると考えられる。同様に、これらの任意のサブセットまたは組合せも開示される。したがって、例えば、Ａ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、およびＣ−Ｅの部分集合が開示されると考えることが可能である。この概念は、開示する組成物を作製および使用する方法中の工程だけには限られないが、それらを含めた、本出願の全ての態様に適用する。したがって、実施することができる様々な追加的工程が存在する場合、これらの追加的工程のそれぞれは、開示する方法の任意の特異的実施形態または実施形態の組合せで実施することができることは理解されよう。
【００６７】
１．配列類似性
本明細書で論じるように、用語相同性および同一性の使用は、類似性と同じことを意味することは理解されよう。したがって、例えば、語句相同性の使用を２つの非天然配列間で使用する場合、これは必ずしもをこれら２配列間の進化的関係を示さず、そうではなくてそれらの核酸配列間の類似性または関連性に着目していることは理解されよう。２つの進化的関係がある分子間の相同性を決定するための方法の多くは、配列類似性を測定する目的で、それらは進化的関係があるかまたはそうではないかとは無関係に、任意の２つ以上の核酸またはタンパク質に通常適用される。
【００６８】
一般に、本明細書で開示する遺伝子およびタンパク質の、任意の既知の変異体および誘導体、または生じる可能性がある変異体および誘導体を定義するための１つの方法は、特定の既知の配列との相同性の観点で、変異体および誘導体を定義することによる方法であることは理解されよう。本明細書で開示する特定の配列のこの同一性は、本明細書の他の箇所でも論じる。一般に、本明細書で開示する遺伝子およびタンパク質の変異体は、言及する配列または天然配列と、少なくとも約７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９パーセントの相同性を典型的に有する。当業者は、２つのタンパク質または遺伝子などの核酸の相同性の決定の仕方を容易に理解する。例えば、相同性がその最高レベルであるように２つの配列にアラインメントをとらせた後に、相同性を計算することができる。
【００６９】
相同性を計算する別の方法は公開アルゴリズムによって実施することができる。比較用の配列の最適アラインメントは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ  Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１年）の局所的相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．ＭｏＬ  Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０年）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４（１９８８年）の類似性検索法によって、これらのアルゴリズム（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ中）のコンピュータによる実行によって、または綿密な調査によって実施することができる。
【００７０】
例えば核酸アラインメントと関係がある最小限の物質に関する参照によって本明細書に組み込む、Ｚｕｋｅｒ、Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４：４８〜５２頁、１９８９年、Ｊａｅｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：７７０６〜７７１０頁、１９８９年、Ｊａｅｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｅ．１８３：２８１〜３０６頁、１９８９年中に開示されたアルゴリズムによって、同じ型の相同性を核酸に関して得ることができる。任意のこれらの方法を典型的に使用することができること、および特定の幾つかの場合、これらの様々な方法の結果は異なる可能性があるが、当業者は、これらの方法の少なくとも１つで同一性が見られる場合、配列は言及する同一性を有し、かつ本明細書で開示されると言えることを理解していることは理解されよう。
【００７１】
例えば、本明細書で使用するように、別の配列と特定の相同率を有するとして列挙する配列は、前に記載した任意の１つまたは複数の計算法によって計算した列挙済みの相同性を有する配列を指す。例えば、Ｚｕｋｅｒの計算法を使用して、第一の配列が第二の配列と８０パーセントの相同性を有すると計算した場合、任意の他の計算法により計算して、第一の配列が第二の配列と８０パーセントの相同性を有していない場合でさえ、第一の配列は本明細書で定義するように、第二の配列と８０パーセントの相同性を有する。別の例として、Ｚｕｋｅｒの計算法とＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの計算法の両方を使用して、第一の配列が第二の配列と８０パーセントの相同性を有すると計算した場合、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの計算法、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈの計算法、Ｊａｅｇｅｒの計算法、または任意の他の計算法により計算して、第一の配列が第二の配列と８０パーセントの相同性を有していない場合でさえ、第一の配列は本明細書で定義するように、第二の配列と８０パーセントの相同性を有する。さらに別の例として、それぞれの計算法を使用して、第一の配列が第二の配列と８０パーセントの相同性を有すると計算した場合、第一の配列は本明細書で定義するように、第二の配列と８０パーセントの相同性を有する（ただし、実際、異なる計算法は異なる計算上の相同率をもたらすことが多いはずである）。
【００７２】
２．ハイブリダイゼーション／選択的ハイブリダイゼーション
用語ハイブリダイゼーションは、プライマーまたはプローブおよび遺伝子などの、少なくとも２つの核酸分子間の配列誘導型相互作用を典型的には意味する。配列誘導型相互作用は、ヌクレオチド特異的に２つのヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体またはヌクレオチド誘導体の間で起こる相互作用を意味する。例えば、ＧとＣの相互作用またはＡとＴの相互作用は配列誘導型相互作用である。典型的には配列誘導型相互作用は、ヌクレオチドのＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ面またはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ面で起こる。２つの核酸のハイブリダイゼーションは、当業者に知られている幾つかの条件およびパラメータによって影響を受ける。例えば、反応の塩濃度、ｐＨ、および温度はいずれも、２つの核酸分子がハイブリダイズするかどうかに影響を与える。
【００７３】
２つの核酸分子間の選択的ハイブリダイゼーションに関するパラメータは、当業者によく知られている。例えば、幾つかの実施形態では、選択的ハイブリダイゼーション条件はストリンジェントハイブリダイゼーション条件として定義することができる。例えば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション工程と洗浄工程の片方または両方の温度と塩濃度の両方によって制御される。例えば、選択的ハイブリダイゼーションを得るためのハイブリダイゼーションの条件は、Ｔｍ（半数の分子がそれらのハイブリダイゼーションパートナーから解離する融解温度）より約１２〜２５℃低い温度での高イオン強度溶液（６×ＳＳＣまたは６×ＳＳＰＥ）中でのハイブリダイゼーション、次に洗浄温度がＴｍより約５℃〜２０℃低いように選択した温度と塩濃度の組合せでの洗浄を含み得る。温度および塩条件は、その中でフィルタに固定した参照ＤＮＡのサンプルを対象とする標識核酸とハイブリダイズさせ、次いで異なるストリンジェンシーの条件下で洗浄する予備実験において、実験によって容易に決定される。ハイブリダイゼーション温度は典型的には、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションに関してより高い。これらの条件を前に記載したように使用して、または当技術分野で知られているように使用して、ストリンジェンシーを得ることができる（核酸のハイブリダイゼーションと少なくとも関係がある物質に関する参照によって本明細書に組み込む、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９年；Ｋｕｎｋｅｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８７年：１５４：３６７、１９８７年）。ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションに関する好ましいストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、約６８℃（水溶液中）、６×ＳＳＣまたは６×ＳＳＰＥ中、次に６８℃での洗浄であり得る。ハイブリダイゼーションおよび洗浄のストリンジェンシーは、望ましい場合、望ましい相補性の度合いが低下するとき、およびさらに、変動性を検索する任意の領域のＧ−ＣまたはＡ−Ｔの豊富度に応じて、然るべく低減させることが可能である。同様に、いずれも当技術分野で知られているように、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のストリンジェンシーは、望ましい場合、望ましい相同性が増大するとき、およびさらに、高い相同性が望ましい任意の領域のＧ−ＣまたはＡ−Ｔの豊富度に応じて、然るべく増大させることが可能である。
【００７４】
選択的ハイブリダイゼーションを定義するための別の方法は、他の核酸と結合した核酸の１つの量（割合）に着目することによる方法である。例えば、幾つかの実施形態では、選択的ハイブリダイゼーション条件は、少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００パーセントの制限核酸が非制限核酸と結合するときである可能性がある。典型的には、非制限プライマーは例えば、１０または１００または１０００倍過剰である。この型のアッセイは、制限プライマーと非制限プライマーの両方が、例えばそれらのｋｄの１０倍または１００倍または１０００倍未満である、または核酸分子の１つのみが１０倍または１００倍または１０００倍である、または核酸分子の片方もしくは両方がそれらのｋｄを超える条件下で実施することができる。
【００７５】
選択的ハイブリダイゼーションを定義するための別の方法は、望ましい酵素による操作を促進するためにハイブリダイゼーションが必要とされる条件下で、酵素による操作を受けるプライマーの割合に着目することによる方法である。例えば、幾つかの実施形態では、選択的ハイブリダイゼーション条件は、少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００パーセントのプライマーが、酵素による操作を促進する条件下で酵素により操作されるときである可能性があり、例えば酵素による操作がＤＮＡの延長である場合、したがって選択的ハイブリダイゼーション条件は、少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００パーセントのプライマー分子が延長されるときである可能性がある。好ましい条件は、操作を実施する酵素に適しているとして、製造者によって示される条件または当技術分野で示される条件も含む。
【００７６】
相同性と同様に、２つの核酸分子間のハイブリダイゼーションのレベルを決定するために本明細書で開示する、様々な方法が存在することは理解されよう。これらの方法および条件は２つの核酸分子間の異なる割合のハイブリダイゼーションをもたらす可能性はあるが、他に示さない限り、これらの方法のいずれかのパラメータの適合が十分であり得ることは理解されよう。例えば８０％のハイブリダイゼーションが必要とされ、かつハイブリダイゼーションがこれらの方法のいずれか１つにおいて必要とされるパラメータ内で起こる限り、それは本明細書に開示されると考えられる。
【００７７】
組成物または方法が、集合的または単独のいずれかで、ハイブリダイゼーションを決定するためのこれらの基準のいずれか１つを満たす場合、それは本明細書に開示する組成物または方法であることを、当業者が理解していることは理解されよう。
【００７８】
３．核酸
例えばＰＴＨおよび本明細書に開示する任意の他のタンパク質またはペプチドを例えばコードする核酸、ならびに様々な機能核酸を含む核酸系である、本明細書に開示する様々な分子が存在する。開示する核酸は、例えばヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、またはヌクレオチド置換体で構成される。これらおよび他の分子の非制限的な例は本明細書で論じる。例えばベクターが細胞中で発現されるとき、発現されるｍＲＮＡは典型的にはＡ、Ｃ、Ｇ、およびＵで構成され得ることは理解されよう。同様に、例えばアンチセンス分子を、例えば外因性送達によって細胞または細胞環境に導入する場合、アンチセンス分子は、細胞環境中でアンチセンス分子の分解を低減するヌクレオチド類似体で構成されることが有利であることは理解されよう。
【００７９】
ａ）ヌクレオチドおよび関連分子
ヌクレオチドは、塩基部分、糖部分およびリン酸塩部分を含有する分子である。ヌクレオチドは、それらのリン酸塩部分および糖部分によって１つに連結させ、ヌクレオシド間連結を生成することが可能である。ヌクレオチドの塩基部分は、アデニン−９−イル（Ａ）、シトシン−１−イル（Ｃ）、グアニン−９−イル（Ｇ）、ウラシル−１−イル（Ｕ）、およびチミン−１−イル（Ｔ）であってよい。ヌクレオチドの糖部分は、リボースまたはデオキシリボースである。ヌクレオチドのリン酸塩部分は５価リン酸である。ヌクレオチドの非制限的な例は、３’−ＡＭＰ（３’−アデノシン一リン酸）または５’−ＧＭＰ（５’−グアノシン一リン酸）であり得る。
【００８０】
ヌクレオチド類似体は、塩基、糖、またはリン酸塩部分のいずれかに対する幾つかの型の修飾を含有するヌクレオチドである。ヌクレオチドに対する修飾は当技術分野でよく知られており、例えば５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、および２−アミノアデニン、ならびに糖またはリン酸塩部分における修飾を含み得る。
【００８１】
ヌクレオチド置換体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などの、ヌクレオチドと同様の機能性を有するがリン酸塩部分を含有しない分子である。ヌクレオチド置換体は、Ｗａｔｓｏｎ−ＣｒｉｃｋまたはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ形式で核酸を認識し得るが、リン酸塩部分以外の部分を介して１つに連結する分子である。ヌクレオチド置換体は、適切な標的核酸と相互作用するとき、二重らせん型構造に適合することができる。
【００８２】
他の型の分子（コンジュゲート）とヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を連結させて、例えば細胞内への取り込みを高めることも可能である。コンジュゲートは、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体と化学的に連結させることが可能である。このようなコンジュゲートには、コレステロール部分などの脂質部分があるが、これらだけには限られない（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８９年、８６、６５５３〜６５５６頁）。
【００８３】
Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ相互作用は、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、またはヌクレオチド置換体のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ面との少なくとも１つの相互作用である。ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、またはヌクレオチド置換体のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ面は、プリン系ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、またはヌクレオチド置換体のＣ２、Ｎ１、およびＣ６位置、およびピリミジン系ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、またはヌクレオチド置換体のＣ２、Ｎ３、Ｃ４位置を含む。
【００８４】
Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ相互作用は、二本鎖ＤＮＡの主溝中の露出した、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体のＨｏｏｇｓｔｅｅｎ面で起こる相互作用である。Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ面は、プリンヌクレオチドのＮ７位置およびＣ６位置の反応基（ＮＨ２またはＯ）を含む。
【００８５】
ｂ）配列
例えばＰＴＨ１Ｒおよび本明細書に開示しＧｅｎｂａｎｋで開示される任意の他のタンパク質と関係がある、様々な配列が存在し、これらの配列および他の配列は、それらの全容およびその中に含有される個々の部分列に関して参照によって本明細書に組み込む。
【００８６】
様々な配列を本明細書で与え、これらの配列および他の配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ中、ｗｗｗ．ｐｕｂｍｅｄ．ｇｏｖ．で見ることができる。当業者は、配列の不一致および差異の解明の仕方、および特定の配列、他の関連配列と関係がある組成物および方法の調節の仕方を理解している。本明細書に開示し当技術分野で知られている情報を考慮に入れて、プライマーおよび／またはプローブを任意の配列用に設計することができる。
【００８７】
ｃ）プライマーおよびプローブ
本明細書に開示する遺伝子と相互作用することができる、プライマーおよびプローブを含めた組成物を開示する。特定の実施形態では、プライマーを使用してＤＮＡ増幅反応をサポートする。典型的には、配列特異的にプライマーを延長させることが可能であり得る。配列特異的なプライマーの延長は、プライマーがハイブリダイズするかまたは他の場合は結合する核酸分子の配列および／または組成が、プライマーの延長によって生成する産物の組成または配列を誘導するかまたはそれに影響を与える任意の方法を含む。配列特異的なプライマーの延長は、したがって、ＰＣＲ、ＤＮＡ塩基配列決定、ＤＮＡ延長、ＤＮＡ重合、ＲＮＡ転写、または逆転写を含むが、これらだけには限られない。配列特異的にプライマーを増幅する技法および条件が好ましい。特定の実施形態では、ＰＣＲまたは直接的塩基配列決定などのＤＮＡ増幅反応にプライマーを使用する。特定の実施形態では、非酵素的技法を使用してプライマーを延長することもでき、この場合例えば、プライマーを延長するために使用するヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、それらが化学反応して配列特異的にプライマーを延長するように修飾されることは理解されよう。典型的には、開示するプライマーは核酸または核酸の領域とハイブリダイズし、あるいはそれらは、核酸の相補配列または核酸の領域の相補配列とハイブリダイズする。
【００８８】
ｄ）機能核酸
機能核酸は、標的分子との結合または特異的反応の触媒などの、特異的機能を有する核酸分子である。機能核酸分子は以下のカテゴリーに分けることができるが、それらが限定的であることは意味しない。例えば機能核酸には、アンチセンス分子、アプタマー、リボザイム、三重らせん形成分子、および外側ガイド配列がある。機能核酸分子は、標的分子によって処理される特異的活性の影響因子、阻害剤、調節物質、および刺激剤として作用することができ、あるいは機能核酸分子は、任意の他の分子と無関係にｄｅ  ｎｏｖｏ活性を有することができる。
【００８９】
機能核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、または炭水化物鎖などの任意の高分子と相互作用することができる。したがって、機能核酸は、ＰＴＨ１ＲのｍＲＮＡまたはＰＴＨ１ＲのゲノムＤＮＡと相互作用することができ、あるいは機能核酸は、ポリペプチドＰＴＨ１Ｒと相互作用することができる。しばしば機能核酸を設計して、標的分子と機能核酸分子の間の配列相同性に基づいて他の核酸と相互作用させる。他の状況では、機能核酸分子と標的分子の間の特異的認識は、機能核酸分子と標的分子の間の配列相同性に基づかず、そうではなくて特異的認識が起こるのを可能にする三次構造の形成に基づく。
【００９０】
アンチセンス分子を設計して、標準的または非標準的な塩基対形成のいずれかによって、標的核酸分子と相互作用させる。アンチセンス分子と標的分子の相互作用を設計して、例えばＲＮＡｓｅＨ介在性ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド分解によって、標的分子の破壊を促進する。代替的に、アンチセンス分子を設計して、転写または複製などの、通常標的分子上で生じ得るプロセシング機能を妨害する。アンチセンス分子は、標的分子の配列に基づいて設計することができる。標的分子の最もアクセス可能な領域を発見することによってアンチセンス効率を最適化するための、多数の方法が存在する。例示的な方法は、ＤＭＳおよびＤＥＰＣを使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの選択実験およびＤＮＡ修飾試験であり得る。アンチセンス分子は１０−６、１０−８、１０−１０、または１０−１２以下の解離定数（ｋｄ）で標的分子と結合することが好ましい。アンチセンス分子の設計および使用に役立つ方法および技法の代表的なサンプルは、米国特許第５，１３５，９１７号、同第５，２９４，５３３号、同第５，６２７，１５８号、同第５，６４１，７５４号、同第５，６９１，３１７号、同第５，７８０，６０７号、同第５，７８６，１３８号、同第５，８４９，９０３号、同第５，８５６，１０３号、同第５，９１９，７７２号、同第５，９５５，５９０号、同第５，９９０，０８８号、同第５，９９４，３２０号、同第５，９９８，６０２号、同第６，００５，０９５号、同第６，００７，９９５号、同第６，０１３，５２２号、同第６，０１７，８９８号、同第６，０１８，０４２号、同第６，０２５，１９８号、同第６，０３３，９１０号、同第６，０４０，２９６号、同第６，０４６，００４号、同第６，０４６，３１９号、および同第６，０５７，４３７号の以下の非制限的一覧において見ることができる。
【００９１】
アプタマーは、好ましくは特異的に、標的分子と相互作用する分子である。典型的にはアプタマーは、ステム−ループまたはＧ−カルテットなどの明確な二次および三次構造にフォールディングした、１５〜５０塩基長の範囲の小さな核酸である。アプタマーは、ＡＴＰ（米国特許第５，６３１，１４６号）およびテオフィリン（米国特許第５，５８０，７３７号）などの小分子、ならびに逆転写酵素（米国特許第５，７８６，４６２号）およびトロンビン（米国特許第５，５４３，２９３号）などの巨大分子と結合することができる。アプタマーは、１０−１２Ｍ未満のｋｄで標的分子と非常に強く結合することができる。アプタマーは、１０−６、１０−８、１０−１０、または１０−１２未満のｋｄで標的分子と結合することが好ましい。アプタマーは、非常に高度の特異性で標的分子と結合することができる。例えば、標的分子と他の分子の間の１００００倍を超える結合親和性の違いを有し分子上の１箇所のみで異なる、アプタマーが単離されている（米国特許第５，５４３，２９３号）。アプタマーは、バックグラウンド結合分子に関するｋｄＳより、少なくとも１０、１００、１０００、１０，０００、または１００，０００倍低い標的分子に関するｋｄを有することが好ましい。例えばポリペプチドに関する比較を行うとき、バックグラウンド分子は異なるポリペプチドであることが好ましい。例えば、ＰＴＨ１Ｒアプタマーの特異性を決定するとき、バックグラウンドタンパク質は血清アルブミンである可能性がある。様々な異なる標的分子と結合させるためのアプタマーの作製および使用の仕方の代表的な例は、米国特許第５，４７６，７６６号、同第５，５０３，９７８号、同第５，６３１，１４６号、同第５，７３１，４２４号、同第５，７８０，２２８号、同第５，７９２，６１３号、同第５，７９５，７２１号、同第５，８４６，７１３号、同第５，８５８，６６０号、同第５，８６１，２５４号、同第５，８６４，０２６号、同第５，８６９，６４１号、同第５，９５８，６９１号、同第６，００１，９８８号、同第６，０１１，０２０号、同第６，０１３，４４３号、同第６，０２０，１３０号、同第６，０２８，１８６号、同第６，０３０，７７６号、および同第６，０５１，６９８号の以下の非制限的一覧において見ることができる。
【００９２】
リボザイムは、分子内または分子間のいずれかで、化学反応を触媒することができる核酸分子である。したがってリボザイムは触媒核酸である。リボザイムは分子間反応を触媒することが好ましい。ハンマーヘッドリボザイム（例えば、以下の米国特許第５，３３４，７１１号、同第５，４３６，３３０号、同第５，６１６，４６６号、同第５，６３３，１３３号、同第５，６４６，０２０号、同第５，６５２，０９４号、同第５，７１２，３８４号、同第５，７７０，７１５号、同第５，８５６，４６３号、同第５，８６１，２８８号、同第５，８９１，６８３号、同第５，８９１，６８４号、同第５，９８５，６２１号、同第５，９８９，９０８号、同第５，９９８，１９３号、同第５，９９８，２０３号、Ｌｕｄｗｉｇ  ａｎｄ  ＳｐｒｏａｔによるＷＯ９８５８０５８、Ｌｕｄｗｉｇ  ａｎｄ  ＳｐｒｏａｔによるＷＯ９８５８０５７、およびＬｕｄｗｉｇ  ａｎｄ  ＳｐｒｏａｔによるＷＯ９７１８３１２があるが、これらだけには限られない）、ヘアピンリボザイム（例えば、以下の米国特許第５，６３１，１１５号、同第５，６４６，０３１号、同第５，６８３，９０２号、同第５，７１２，３８４号、同第５，８５６，１８８号、同第５，８６６，７０１号、同第５，８６９，３３９号、および同第６，０２２，９６２号があるが、これらだけには限られない）、およびテトラヒメナリボザイム（例えば、以下の米国特許第５，５９５，８７３号および同第５，６５２，１０７号があるが、これらだけには限られない）などの、天然系中で見られるリボザイムに基づいてヌクレアーゼまたは核酸ポリメラーゼ型反応を触媒する、幾つかの異なる型のリボザイムが存在する。天然系中には見られないが、遺伝子工学処理されてｄｅ  ｎｏｖｏ特異的反応を触媒する、幾つかのリボザイムも存在する（例えば、以下の米国特許第５，５８０，９６７号、同第５，６８８，６７０号、同第５，８０７，７１８号、および同第５，９１０，４０８号があるが、これらだけには限られない）。好ましいリボザイムはＲＮＡまたはＤＮＡ基質を切断し、およびより好ましくはＲＮＡ基質を切断する。リボザイムは典型的には、標的基質の認識および結合、ならびにその後の切断によって核酸基質を切断する。この認識は、大抵は標準的または非標準的な塩基対の相互作用に基づくことが多い。この性質によってリボザイムは核酸の標的特異的切断に関する特に優れた候補となる、何故なら、標的基質の認識は標的基質の配列に基づくからである。様々な異なる反応を触媒するリボザイムの作製および使用の仕方の代表的な例は、米国特許第５，６４６，０４２号、同第５，６９３，５３５号、同第５，７３１，２９５号、同第５，８１１，３００号、同第５，８３７，８５５号、同第５，８６９，２５３号、同第５，８７７，０２１号、同第５，８７７，０２２号、同第５，９７２，６９９号、同第５，９７２，７０４号、同第５，９８９，９０６号、および同第６，０１７，７５６号の以下の非制限的一覧において見ることができる。
【００９３】
三重らせん形成機能核酸分子は、二本鎖または一本鎖核酸のいずれかと相互作用することができる分子である。三重らせん分子が標的領域と相互作用するとき、Ｗａｔｓｏｎ−ＣｒｉｃｋとＨｏｏｇｓｔｅｅｎの両方の塩基対形成に応じて１つの複合体を形成するＤＮＡの３本の鎖がその中に存在する、三重らせんと呼ばれる構造が形成される。三重らせん分子が好ましい、何故ならそれらは、高い親和性および特異性で標的領域と結合することができるからである。三重らせん形成分子は、１０−６、１０−８、１０−１０、または１０−１２未満のｋｄで標的分子と結合することが好ましい。様々な異なる標的分子と結合する三重らせん形成分子の作製および使用の仕方の代表的な例は、米国特許第５，１７６，９９６号、同第５，６４５，９８５号、同第５，６５０，３１６号、同第５，６８３，８７４号、同第５，６９３，７７３号、同第５，８３４，１８５号、同第５，８６９，２４６号、同第５，８７４，５６６号、および同第５，９６２，４２６号の以下の非制限的一覧において見ることができる。
【００９４】
外側ガイド配列（ＥＧＳ）は複合体を形成する標的核酸分子と結合する分子であり、かつこの複合体は、標的分子を切断するＲＮａｓｅＰによって認識される。ＥＧＳを設計して、選択したＲＮＡ分子を特異的に標的化することができる。ＲＮａｓｅＰは、細胞内でトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）をプロセシングする際に役立つ。標的ＲＮＡ：ＥＧＳ複合体形成を引き起こして天然ｔＲＮＡ基質を模倣するＥＧＳを使用することによって、細菌のＲＮａｓｅＰを動員してほぼ任意のＲＮＡ配列を切断することができる（Ｙａｌｅ、ａｎｄ  Ｆｏｒｓｔｅｒ  ａｎｄ  ＡｌｔｍａｎによるＷＯ９２／０３５６６、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３８：４０７〜４０９頁（１９９０年））。
【００９５】
同様に、真核生物のＲＮＡのＥＧＳ／ＲＮＡｓｅＰ対象切断を利用して、真核細胞内の望ましい標的を切断することができる（Ｙｕａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：８００６〜８０１０頁（１９９２年）；ＹａｌｅによるＷＯ９３／２２４３４；ＹａｌｅによるＷＯ９５／２４４８９；Ｙｕａｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｍａｎ、ＥＭＢＯ  Ｊ１４：１５９〜１６８頁（１９９５年）、およびＣａｒｒａｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９２：２６２７〜２６３１頁（１９９５年））。様々な異なる標的分子の切断を容易にするためのＥＧＳ分子の作製および使用の仕方の代表的な例は、米国特許第５，１６８，０５３号、同第５，６２４，８２４号、同第５，６８３，８７３号、同第５，７２８，５２１号、同第５，８６９，２４８号、および同第５，８７７，１６２号の以下の非制限的一覧において見ることができる。
【００９６】
４．核酸送達
対象の細胞中への外因性ＤＮＡの投与および取り込み（すなわち、遺伝子導入またはトランスフェクション）を含む前に記載した方法において、当業者によって十分理解され得るように、開示する核酸は裸のＤＮＡまたはＲＮＡの形であってよく、あるいは核酸を細胞に送達するために核酸はベクター中に存在してよく、それによって抗体コードＤＮＡ断片はプロモーターの転写制御下にある。ベクターは、アデノウイルスベクター（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．Ｌａｖａｌ、Ｑｕｅｂｅｃ、Ｃａｎａｄａ）などの市販の調製物であってよい。細胞への核酸またはベクターの送達は、様々な機構による送達であってよい。一例として、送達は、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ、Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｉｎｃ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、および当技術分野で標準的な手順に従い開発された他のリポソームなどの市販のリポソーム調製物を使用した、リポソームによる送達であってよい。さらに、開示する核酸またはベクターは、そのための技術がＧｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ、Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から入手可能であるエレクトロポレーションによって、およびＳＯＮＯＰＯＲＡＴＩＯＮ機器（ＩｍａＲｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．、Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ）によってｉｎ  ｖｉｖｏにおいて送達することができる。
【００９７】
一例として、ベクター送達は、組換え体レトロウイルスゲノムをパッケージすることができるレトロウイルスベクター系などの、ウイルス系による送達であってよい（例えば、Ｐａｓｔａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：４４８６、１９８８；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８９５、１９８６を参照）。したがって組換え体レトロウイルスを使用して感染させ、それによって広義で中和的な抗体（またはその活性断片）をコードする核酸を感染細胞に送達することが可能である。哺乳動物細胞中に改変型核酸を導入する正確な方法は、当然ながら、レトロウイルスベクターの使用に限られない。アデノウイルスベクター（Ｍｉｔａｎｉら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、５：９４１〜９４８頁、１９９４年）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（Ｇｏｏｄｍａｎら、Ｂｌｏｏｄ８４：１４９２〜１５００頁、１９９４年）、レンチウイルスベクター（Ｎａｉｄｉｎｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２７２：２６３〜２６７頁、１９９６年）、偽型レトロウイルスベクター（Ａｇｒａｗａｌら、Ｅｘｐｅｒ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２４：７３８〜７４７頁、１９９６年）の使用を含めた、他の技法がこの手順に関して広く利用可能である。リポソーム送達および受容体介在性および他のエンドサイトーシス機構などの、物理的導入技法も使用することができる（例えば、Ｓｃｈｗａｒｔｚｅｎｂｅｒｇｅｒら、Ｂｌｏｏｄ８７：４７２〜４７８頁、１９９６年を参照）。この開示する組成物および方法は、これらまたは他の一般に使用される遺伝子導入法のいずれかと併せて使用することができる。
【００９８】
一例として、アデノウイルスベクター中の抗体コード核酸を対象の細胞に送達する場合、ヒトへのアデノウイルスの投与に関する用量は、注射当たり約１０７〜１０９プラーク形成単位（ｐｆｕ）の範囲であってよいが、注射当たり１０１２ｐｆｕほど高くてよい（Ｃｒｙｓｔａｌ、Ｈｕｍ、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８：９８５〜１００１頁、１９９７年；Ａｌｖａｒｅｚ  ａｎｄ  Ｃｕｒｉｅｌ、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８：５９７〜６１３頁、１９９７年）。対象は単回投与を受けることができ、または追加的な注射が必要とされる場合、無期限および／または治療の有効性が確定するまで、それらは６ヶ月間隔（または当業者によって決定される他の適切な時間間隔）で繰り返すことができる。
【００９９】
使用する場合、核酸またはベクターの非経口投与は、一般に注射によって特徴付けられる。注射剤は従来の形で、液体溶液または懸濁液のいずれか、注射前に液体に懸濁した懸濁液の溶液に適した固体系として、または乳濁液として調製することができる。非経口投与に関してより最近改定された手法は、一定用量が維持されるような徐放または持続放出系の使用を含む。例えば、参照によって本明細書に組み込む、米国特許第３，６１０，７９５号を参照。適切な製剤および治療用化合物の投与の様々な経路の追加的な考察に関しては、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（第１９版）ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ  １９９５を参照。
【０１００】
５．発現系
細胞に送達される核酸は、発現制御系を典型的には含有する。例えば、ウイルスおよびレトロウイルス系中に挿入される遺伝子は、所望の遺伝子産物の発現の制御を手助けするための、プロモーター、および／またはエンハンサーを通常含有する。プロモーターは一般に、転写開始部位に対して比較的固定された位置に存在するとき機能する、ＤＮＡの１つまたは複数の配列である。プロモーターはＲＮＡポリメラーゼと転写因子の基本的相互作用に必要とされるコアエレメントを含有し、かつ上流エレメントおよび応答エレメントを含有することができる。
【０１０１】
ａ）ウイルスプロモーターおよびエンハンサー
哺乳動物宿主細胞におけるベクターからの転写を制御する好ましいプロモーターは、様々な供給源、例えば、ポリオーマ、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、および最も好ましくはサイトメガロウイルスなどのウイルスのゲノムから、または異種哺乳動物プロモーター、例えばベータアクチンプロモーターから得ることができる。ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点も含有するＳＶ４０制限断片として都合よく得られる（Ｆｉｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ、２７３：１１３（１９７８年））。ヒトサイトメガロウイルスの即時型初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩＥ制限断片として都合よく得られる（Ｇｒｅｅｎｗａｙ、Ｐ．Ｊら、Ｇｅｎｅ１８：３５５〜３６０頁（１９８２年））。当然ながら、宿主細胞または関連種由来のプロモーターも、本明細書において有用である。
【０１０２】
エンハンサーは一般に、転写開始部位から不定距離で機能するＤＮＡの配列を指し、かつ転写単位に対して５’（Ｌａｉｍｉｎｓ、Ｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：９９３（１９８１年））または３’（Ｌｕｓｋｙ、Ｍ．Ｌら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．３：１１０８（１９８３年））のいずれかであってよい。さらに、エンハンサーはイントロン内（Ｂａｎｅｒｊｉ、Ｊ．Ｌら、Ｃｅｌｌ３３：７２９（１９８３年））、およびコード配列自体中（Ｏｓｂｏｒｎｅ、Ｔ．Ｆら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ、４：１２９３（１９８４年））に存在する可能性がある。それらは通常１０ｂｐ長と３００ｂｐ長の間であり、かつそれらはシスで機能する。エンハンサーは、近隣プロモーターからの転写を増大させるために機能する。エンハンサーはしばしば、転写の調節を仲介する応答エレメントも含有する。プロモーターも、転写の調節を仲介する応答エレメントを含有することができる。エンハンサーはしばしば、遺伝子の発現の調節を決定する。哺乳動物遺伝子（グロブリン、エラスターゼ、アルブミン、フェトプロテインおよびインシュリン）由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている一方で、典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーが一般的な発現用に使用され得る。好ましい例は、複製起点（ｂｐ１００〜２７０）の側面上のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の側面上のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーである。
【０１０３】
プロモーターおよび／またはエンハンサーは、それらの機能を誘発する光または特異的化学事象のいずれかによって、特異的に活性化させることが可能である。系はテトラサイクリンおよびデキサメタゾンなどの試薬によって調節することができる。ガンマ線照射などの照射、またはアルキル化化学療法剤への曝露によって、ウイルスベクター遺伝子の発現を高めるための幾つかの方法も存在する。
【０１０４】
特定の実施形態では、プロモーターおよび／またはエンハンサー領域を、構成的プロモーターおよび／またはエンハンサーとして作用させて、転写される転写単位の領域の発現を最大にすることが可能である。特定のコンストラクトでは、プロモーターおよび／またはエンハンサー領域は、それらが特定の時間で特定の型の細胞中でのみ発現される場合でさえ、全ての真核細胞型で活性がある。この型の好ましいプロモーターはＣＭＶプロモーター（６５０塩基）である。他の好ましいプロモーターは、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（完全長プロモーター）、およびレトロウイルスベクターＬＴＦである。
【０１０５】
あらゆる特異的な調節エレメントをクローニングして、メラノーマ細胞などの特定の細胞型中で選択的に発現される発現ベクターを構築するために、使用することができることが示されている。グリア起源の細胞中で遺伝子を選択的に発現させるために、グリア細胞繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターが使用されてきている。
【０１０６】
真核宿主細胞（酵母菌、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトまたは有核細胞）中で使用される発現ベクターは、ｍＲＮＡ発現に作用し得る転写の停止に必要な配列も含有することができる。これらの領域は、組織因子タンパク質をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分中のポリアデニル化セグメントとして転写される。３’非翻訳領域は転写停止部位も含む。転写単位は、ポリアデニル化領域をさらに含有することが好ましい。この領域の１つの利点は、転写単位がｍＲＮＡのようにプロセシングされ輸送され得る可能性をそれが増大させることである。発現コンストラクトにおけるポリアデニル化シグナルの同定および使用は十分確立している。相同的ポリアデニル化シグナルがトランス遺伝子コンストラクト中で使用されることが好ましい。特定の転写単位では、ポリアデニル化領域はＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナルに由来し、かつ約４００塩基からなる。転写単位が他の標準的な配列を単独または前述の配列と組合せて含有し、コンストラクトの発現形、または安定性を改善することも好ましい。
【０１０７】
ｂ）マーカー
ウイルスベクターは、マーカー産物をコードする核酸配列を含むことができる。このマーカー産物を使用して、遺伝子が細胞に送達され、かつ送達された後に発現されているかどうかを決定する。好ましいマーカー遺伝子は、β−ガラクトシダーゼ、および緑色蛍光タンパク質をコードする大腸菌ｌａｃＺ遺伝子である。
【０１０８】
幾つかの実施形態では、マーカーは選択可能なマーカーであってよい。哺乳動物細胞に適した選択可能なマーカーの例は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシン類似体Ｇ４１８、ヒドロマイシン、およびピューロマイシンである。このような選択可能なマーカーが哺乳動物宿主細胞中に首尾よく移動されるとき、選択圧下に置かれた場合において、形質転換された哺乳動物宿主細胞は生存することができる。選択レジメの２つの広く使用されている異なるカテゴリーが存在する。第一のカテゴリーは、細胞の代謝および補充培地と無関係に増殖する能力を欠く突然変異細胞系の使用に基づく。２つの例は、ＣＨＯ  ＤＨＦＲ細胞およびマウスＬＴＫ細胞である。これらの細胞は、チミジンまたはヒポキサンチンなどの栄養素の添加無しで増殖する能力を欠いている。これらの細胞は、完全なヌクレオチド合成経路に必要な特定の遺伝子を欠いているので、失われたヌクレオチドが補充培地に提供されない限り、これらの細胞は生存することができない。培地の補充に対する代替は、完全なＤＨＦＲまたはＴＫ遺伝子をそれぞれの遺伝子を欠く細胞に導入し、それによってそれらの増殖要件を改変することである。ＤＨＦＲまたはＴＫ遺伝子で形質転換しなかった個々の細胞は、非補充培地中で生存することができないであろう。
【０１０９】
第二のカテゴリーは、任意の細胞型で使用され突然変異細胞系の使用を必要としない選択スキームを指す優性選択である。これらのスキームは、宿主細胞の増殖を停止させるための薬剤を典型的に使用する。新規な遺伝子を有する細胞は薬剤耐性を伝達するタンパク質を発現する可能性があり、かつ淘汰を生存する可能性がある。このような優性選択の例は、薬剤ネオマイシン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｐ．ａｎｄ  Ｂｅｒｇ、Ｐ．、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７（１９８２年））、ミコフェノール酸（Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｒ．Ｃ．ａｎｄ  Ｂｅｒｇ、Ｐ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２０９：１４２２（１９８０年））またはヒグロマイシン、（Ｓｕｇｄｅｎ、Ｂら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４１０〜４１３頁（１９８５年））を使用する。この３つの例は、真核制御下で細菌遺伝子を利用して、適切な薬剤Ｇ４１８またはネオマイシン（ゲネチシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）またはヒグロマイシンに対する耐性をそれぞれ伝達する。他にはネオマイシン類似体Ｇ４１８およびピュラマイシンがある。
【０１１０】
６．ペプチド
ａ）タンパク質変異体
本明細書で論じるように、知られており本明細書で企図するＰＴＨ１Ｒタンパク質の多数の変異体が存在する。知られている機能的ＰＴＨ１Ｒ菌株変異体以外に、開示する方法および組成物中でも機能するＰＴＨ１Ｒタンパク質の誘導体が存在する。タンパク質変異体および誘導体は当業者に十分理解されており、アミノ酸配列の修飾を含む可能性がある。例えば、アミノ酸配列の修飾は、３つのクラス：置換、挿入または欠失変異体の１つまたは複数に典型的には分類される。挿入は、アミノおよび／またはカルボキシル末端融合、ならびに１つまたは多数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。挿入は通常、アミノまたはカルボキシル末端融合、例えば約１〜４個の残基の挿入より小規模な挿入であり得る。実施例中に記載した誘導体などの、免疫原性融合タンパク質誘導体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの架橋または融合体をコードするＤＮＡで形質転換した組換え体細胞培養による、標的配列に免疫原性を与えるほど十分大きなポリペプチドの融合によって作製する。欠失は、タンパク質配列からの１つまたは複数のアミノ酸残基の除去によって特徴付けられる。典型的には、約２〜６個を超えない残基が、タンパク質分子内の任意の１つの部位で欠失する。これらの変異体は通常、タンパク質をコードするＤＮＡ中のヌクレオチドを部位特異的突然変異誘発し、それによって変異体をコードするＤＮＡを生成し、およびその後組換え体細胞培養においてＤＮＡを発現させることによって調製される。知られている配列を有するＤＮＡ中の所定部位に置換型突然変異を施すための技法、例えばＭ１３プライマー突然変異誘発およびＰＣＲ突然変異誘発はよく知られている。アミノ酸置換は典型的には一種の残基の置換であるが、一度に数ヵ所の異なる位置で生じる可能性があり、挿入は通常約１〜１０個のアミノ酸残基であり、かつ欠失は約１〜３０残基の範囲であり得る。欠失または挿入は隣接ペアに施されること、すなわち２残基の欠失または２残基の挿入が好ましい。置換、欠失、挿入またはこれらの任意の組合せを組合せて、最終的なコンストラクトにたどり着くことができる。突然変異はリーディングフレーム外の配列に施してはならず、二次ｍＲＮＡ構造を生成する可能性がある相補的領域は作製しないことが好ましい。置換型変異体は、その中で少なくとも１つの残基が除去され異なる残基がその位置に挿入されている変異体である。このような置換は一般に以下の表１および２に従って施され、保存的置換と呼ぶ。
【０１１１】
【表１−１】
2010523585.tif 000002
【０１１２】
【表１−２】
2010523585.tif 000003
【０１１３】
【表２】
2010523585.tif 000004
機能または免疫学的同一性の実質的変化は、表２中の置換より保存性が低い置換を選択することによって、すなわち（ａ）例えばシートまたはらせん立体構造としての、置換の領域中のポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性または（ｃ）側鎖の大部分の維持に対するそれらの影響がより著しく異なる残基を選択することによって施される。タンパク質の性質の最大の変化を生み出すと一般に予想される置換は、その中で（ａ）親水性残基、例えばセリルまたはトレオニルが、疎水性残基、例えばロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルまたはアラニルと（あるいはそれによって）置換される、（ｂ）システインまたはプロリンが、任意の他の残基と（あるいはそれによって）置換される、（ｃ）電気的に陽性の側鎖を有する残基、例えばリシル、アルギニル、またはヒスチジルが、電気的に陰性の残基、例えばグルタミルまたはアスパルチルと（あるいはそれによって）置換される、または（ｄ）多量の側鎖を有する残基、例えばフェニルアラニンが、側鎖を有さない残基、この場合例えばグリシンと（あるいはそれによって）置換される、（ｅ）硫酸化および／またはグリコシル化の部位の数を増大させることによる置換であり得る。
【０１１４】
例えば、１つのアミノ酸残基と生物学的および／または化学的に類似した他のアミノ酸残基の交換は、保存的置換として当業者に知られている。例えば、保存的置換は、１つの疎水性残基と他の残基、または１つの極性残基と他の残基の交換であり得る。置換は、例えばＧｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；およびＰｈｅ、Ｔｙｒなどの組合せを含む。それぞれの明確に開示する配列のこのような保存的置換された変形は、本明細書で提供するモザイクポリペプチド内に含まれる。
【０１１５】
置換または欠失突然変異誘発を利用して、Ｎ−グリコシル化（Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ）またはＯ−グリコシル化（ＳｅｒまたはＴｈｒ）の部位を挿入することができる。システインまたは他の不安定な残基の欠失も望ましい可能性がある。考えられるタンパク質分解部位、例えばＡｒｇの欠失または置換は、例えば塩基性残基の１つの欠失によって、またはグルタミニルまたはヒスチジル残基による１つの塩基の置換によって実施される。
【０１１６】
特定の翻訳後誘導体化は、発現されるポリペプチドに対する組換え体宿主細胞の作用の結果である。グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、対応するグルタミルおよびアスパリル残基に翻訳後脱アミド化されることが多い。あるいは、これらの残基は弱酸性条件下でアミド化される。他の翻訳後修飾には、プロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリルまたはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のｏ−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ７９〜８６ページ［１９８３年］）、Ｎ末端アミンのアセチル化および、幾つかの場合、Ｃ末端カルボキシルのアミド化がある。
【０１１７】
本明細書で開示するタンパク質の変異体および誘導体を定義するための１つの方法は、特定の既知の配列との相同性／同一性の観点で、変異体および誘導体を定義することによる方法であることは理解されよう。例えば、配列番号１はＰＴＨ１Ｒの特定の配列を示す。具体的に開示するのは、言及する配列と少なくとも約７０％または７５％または８０％または８５％または９０％または９５％の相同性を有する、本明細書で開示するこれらのタンパク質および他のタンパク質の変異体である。当業者は、２つのタンパク質の相同性の決定の仕方を容易に理解する。例えば、相同性がその最高レベルであるように２つの配列にアラインメントをとらせた後に、相同性を計算することができる。
【０１１８】
相同性を計算する別の方法は公開アルゴリズムによって実施することができる。比較用の配列の最適アラインメントは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ  Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１年）の局所的相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．ＭｏＬ  Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０年）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４（１９８８年）の類似性検索法によって、これらのアルゴリズム（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ中）のコンピュータによる実行によって、または綿密な調査によって実施することができる。
【０１１９】
例えば核酸アラインメントと関係がある最小限の物質に関する参照によって本明細書に組み込む、Ｚｕｋｅｒ、Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４：４８〜５２頁、１９８９年、Ｊａｅｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：７７０６〜７７１０頁、１９８９年、Ｊａｅｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｅ．１８３：２８１〜３０６頁、１９８９年中に開示されたアルゴリズムによって、同じ型の相同性を核酸に関して得ることができる。
【０１２０】
変異が保存的突然変異である特定の配列と少なくとも７０％の相同性を有する実施形態など、保存的突然変異と相同性の記載を任意の組合せで１つに組合せることができることは理解されよう。
【０１２１】
開示する組成物中に取り込ませることが可能である、多数のアミノ酸およびペプチド類似体が存在することは理解されよう。例えば、多数のＤアミノ酸、または表１および表２中に示すアミノ酸と異なる機能的置換を有するアミノ酸が存在する。天然に存在するペプチドの正反対の立体異性体、およびペプチド類似体の立体異性体を開示する。これらのアミノ酸は、ｔＲＮＡ分子に選択したアミノ酸を与えること、および例えばアンバーコドンを利用して遺伝子コンストラクトを工学処理して、部位特異的にペプチド鎖中に類似体アミノ酸を挿入することによって、ポリペプチド鎖中に容易に取り込ませることが可能である（Ｔｈｏｒｓｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．７７：４３〜７３頁（１９９１年）、Ｚｏｌｌｅｒ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３：３４８〜３５４頁（１９９２年）；Ｉｂｂａ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＆  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｒｅｖｉｅｗｓ１３：１９７〜２１６頁（１９９５年）、Ｃａｈｉｌｌら、ＴＩＢＳ、１４（１０）：４００〜４０３（１９８９年）；Ｂｅｎｎｅｒ、ＴＩＢ  Ｔｅｃｈ、１２：１５８〜１６３頁（１９９４年）；Ｉｂｂａ  ａｎｄ  Ｈｅｎｎｅｃｋｅ、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１２：６７８〜６８２頁（１９９４年）、これらはいずれもアミノ酸類似体と関係がある物質に関して少なくとも参照によって本明細書に組み込む）。
【０１２２】
ペプチドと似ているが、天然ペプチド結合によって結合しない分子を生成することができる。例えば、アミノ酸またはアミノ酸類似体に関する結合は、ＣＨ２ＮＨ−−、−−ＣＨ２Ｓ−−、−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ＝ＣＨ−−（シスおよびトランス）、−−ＣＯＣＨ２−−、−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−および−−ＣＨＨ２ＳＯ−−を含むことができる（これらおよび他は、Ｓｐａｔｏｌａ、Ａ．Ｆ．ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ、ｅｄｓ．、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２６７頁（１９８３年）；Ｓｐａｔｏｌａ、Ａ．Ｆ．、Ｖｅｇａ  Ｄａｔａ（１９８３年３月）、Ｖｏｌ．１、Ｉｓｓｕｅ３、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ（一般評論）；Ｍｏｒｌｅｙ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ（１９８０年）４６３〜４６８頁；Ｈｕｄｓｏｎ、Ｄら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｐｒｏｔ  Ｒｅｓ１４：１７７〜１８５頁（１９７９年）（−−ＣＨ２ＮＨ−−、ＣＨ２ＣＨ２−−）；Ｓｐａｔｏｌａら、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ３８：１２４３〜１２４９頁（１９８６年）（−−ＣＨＨ２−−Ｓ）；Ｈａｎｎ  Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．Ｉ３０７〜３１４頁（１９８２年）（−−ＣＨ−−ＣＨ−−、シスおよびトランス）；Ａｌｍｑｕｉｓｔら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２３：１３９２〜１３９８頁（１９８０年）（−−ＣＯＣＨ２−−）；Ｊｅｎｎｉｎｇｓ−Ｗｈｉｔｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ２３：２５３３（１９８２年）（−−ＣＯＣＨ２−−）；Ｓｚｅｌｋｅら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ａｐｐｌｎ、ＥＰ４５６６５ＣＡ（１９８２年）：９７：３９４０５（１９８２年）（−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−）；Ｈｏｌｌａｄａｙら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ．Ｌｅｔｔ２４：４４０１〜４４０４頁（１９８３年）（−−Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２−−）；およびＨｒｕｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ３１：１８９〜１９９頁（１９８２年）（−−ＣＨ２−−Ｓ−−）中で見ることができ、これらのそれぞれは参照によって本明細書に組み込む）。特に好ましい非ペプチド結合は−−ＣＨ２ＮＨ−−である。例えばｂ−アラニン、ｇ−アミノ酪酸などの、ペプチド類似体は、結合原子間に２つ以上の原子を有することができることは理解されよう。
【０１２３】
アミノ酸類似体および類似体およびペプチド類似体は、より経済的な生成、増大した化学安定性、改善された薬理学的性質（半減期、吸収、効能、有効性など）、改変された特異性（例えば、広域の生物活性）、低減した抗原性、およびその他などの、改善された性質または望ましい性質を有することが多い。
【０１２４】
Ｄ−アミノ酸を使用してより安定したペプチドを生成することができる、何故ならＤアミノ酸は、ペプチダーゼなどによって認識されないからである。同じ型のＤアミノ酸（例えば、Ｌ−リシンの代わりにＤ−リシン）とコンセンサス配列の１つまたは複数のアミノ酸の系統的置換を使用して、より安定したペプチドを生成することができる。システイン残基を使用して、２つ以上のペプチドを１つに環化または結合させることが可能である。これはペプチドを特定の立体構造に制約するのに有用である可能性がある。（Ｒｉｚｏ  ａｎｄ  Ｇｉｅｒａｓｃｈ  Ａｎｎ．Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３８７（１９９２年）、参照によって本明細書に組み込む）。
【０１２５】
７．抗体
（１）一般的抗体
用語「抗体」は本明細書において広義に使用し、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方を含む。完全な免疫グロブリン分子に加えて、これらの免疫グロブリン分子の断片またはポリマー、およびヒトまたはヒト化型の免疫グロブリン分子またはその断片も、本明細書で論じるようにＰＴＨ１ＲがＧタンパク質経路よりβ−アレスチン経路を活性化するように、ＰＴＨ１Ｒと相互作用するそれらの能力に関してそれらが選択される限り、用語「抗体」に含まれる。抗体は本明細書に記載するｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを使用して、または類似の方法によって、それらの望ましい活性に関して試験することができ、その後それらのｉｎ  ｖｉｖｏ治療および／または予防活性を、知られている臨床試験法に従い試験する。
【０１２６】
本明細書で使用する用語「モノクローナル抗体」は、実質的に相同な集団の抗体から得られる抗体を指す、すなわち、その集団内の個々の抗体は、抗体分子の小さな部分集合中に存在し得るおそらく天然の突然変異以外は同一である。本明細書のモノクローナル抗体は、その中で重鎖および／または軽鎖の部分が、特定種に由来するかあるいは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同であり、一方（１つまたは複数の）の鎖の残り部分が、別種に由来するかあるいは別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同である「キメラ」抗体、およびこのような抗体の断片を、それらが所望のアンタゴニスト活性を示す限り、具体的には含む（米国特許第４，８１６，５６７号およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８５１〜６８５５頁（１９８４年）を参照）。
【０１２７】
開示するモノクローナル抗体は、モノクローナル抗体を産生する任意の手順を使用して作製することができる。例えば、開示するモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５（１９７５年）によって記載されたハイブリドーマ法などの、ハイブリドーマ法を使用して調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウスまたは他の適切な宿主動物を典型的には免疫剤で免疫処置して、免疫剤と特異的に結合し得る抗体を産生するかまたは産生することができるリンパ球を誘発する。あるいは、例えば本明細書に記載するようにＰＴＨ１Ｒなどの７ｔｍｒｓを含有する細胞を使用して、リンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫処置することができる。
【０１２８】
モノクローナル抗体は、米国特許第４，８１６，５６７号（Ｃａｂｉｌｌｙら）中に記載された方法などの、組換えＤＮＡ法によって作製することもできる。従来の手順を使用して（例えば、ネズミ抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、開示するモノクローナル抗体をコードするＤＮＡを容易に単離および塩基配列決定することができる。例えば、Ｂｕｒｔｏｎらへの米国特許第５，８０４，４４０号およびＢａｒｂａｓらへの米国特許第６，０９６，４４１号中に記載されたように、ファージディスプレイ技法を使用して、抗体または活性抗体断片のライブラリーを作製およびスクリーニングすることもできる。
【０１２９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法は一価抗体を調製するのにも適している。抗体断片、特にＦａｂ断片を生成するための抗体の消化は、当技術分野で知られる通常の技法を使用して実施することができる。例えば、パパインを使用して消化を実施することができる。パパインによる消化の例は、１９９４年１２月２２日に公開されたＷＯ９４／２９３４８および米国特許第４，３４２，５６６号中に記載されている。抗体のパパインによる消化は、それぞれが１つの抗原結合部位を有するＦａｂ断片と呼ばれる２つの同一抗原結合断片、および残留Ｆｃ断片を典型的に生成する。ペプシン処理によって、２つの抗原結合部位を有しさらに抗原と架橋することができる断片が生じる。
【０１３０】
断片は、他の配列と結合していても結合していなくても、非修飾抗体または抗体断片と比較して、抗体または抗体断片の活性が著しく改変または低下しないという条件で、特定領域または特異的アミノ酸残基の挿入、欠失、置換、または他の選択的修飾も含むことができる。ジスルフィド結合を形成することができるアミノ酸の除去／付加などの、これらの修飾は幾つかの追加的な性質をもたらして、その生物学的寿命を増大すること、その分泌特性を改変することなどができる。いずれの場合も、抗体または抗体断片は、その同族抗原との特異的結合などの、生物活性の性質を有していなければならない。抗体または抗体断片の機能または活性領域は、タンパク質の特異的領域の突然変異誘発、次に発現、および発現したポリペプチドの試験によって同定することができる。このような方法は当業者には容易に明らかであり、抗体または抗体断片をコードする核酸の部位特異的突然変異誘発を含むことができる。（Ｚｏｌｌｅｒ、Ｍ．Ｊ．Ｃｕｒｅ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：３４８〜３５４頁、１９９２年）。
【０１３１】
本明細書で使用する用語「１つの抗体」または「複数の抗体」は、ヒト抗体および／またはヒト化抗体を指すこともできる。多くの非ヒト抗体（例えば、マウス、ラット、またはウサギ由来の抗体）はヒト中では本来抗原であり、したがってヒトに投与すると望ましくない免疫応答をもたらす可能性がある。したがって、方法中でのヒトまたはヒト化抗体の使用は、ヒトに投与する抗体が望ましくない免疫応答を引き起こし得る可能性を減らすのに役立つ。
【０１３２】
（２）ヒト抗体
開示するヒト抗体は、任意の技法を使用して調製することができる。ヒトモノクローナル抗体産生のための技法の例には、Ｃｏｌｅら（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、７７頁、１９８５年）によって記載された技法、およびＢｏｅｒｎｅｒら（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４７（１）：８６〜９５頁、１９９１年）によって記載された技法がある。ヒト抗体（およびその断片）は、ファージディスプレイライブラリーを使用して産生することもできる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１、１９９１年；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１、１９９１年）。
【０１３３】
開示するヒト抗体は、トランスジェニック動物から得ることもできる。例えば、免疫処置に応答して、完全なレパートリーのヒト抗体を産生することができるトランスジェニック、突然変異マウスが記載されている（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：２５５１〜２５５頁（１９９３年）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３６２：２５５〜２５８頁（１９９３年）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７：３３（１９９３年）を参照）。具体的には、これらのキメラおよび生殖細胞系突然変異マウス中の抗体重鎖接合領域（Ｊ（Ｈ））遺伝子のホモ接合性欠失は、内因性抗体産生の完全な阻害をもたらし、このような生殖細胞系突然変異マウスへのヒト生殖細胞系抗体遺伝子アレイの首尾よい導入は、抗原攻撃時のヒト抗体の産生をもたらす。本明細書に記載するようにＥｎｖ−ＣＤ４−コレセプター複合体を使用して、所望の活性を有する抗体を選択する。
【０１３４】
（３）ヒト化抗体
抗体ヒト化技法は一般に、組換えＤＮＡ技法を使用して、抗体分子の１つまたは複数のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ配列を操作することを含む。したがって、ヒト化型の非ヒト抗体（またはその断片）は、ヒト（レシピエント）抗体のフレームワークに組み込まれた非ヒト（ドナー）抗体由来の抗原結合部位の一部分を含有する、キメラ抗体または抗体鎖（またはその断片、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’など、または抗体の他の抗原結合部分）である。
【０１３５】
ヒト化抗体を作製するために、レシピエント（ヒト）抗体分子の１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基を、所望の抗原結合特性（例えば、標的抗原に対する確かなレベルの特異性および親和性）を有することが知られているドナー（非ヒト）抗体分子の１つまたは複数のＣＤＲ由来の残基と交換する。幾つかの場合、ヒト抗体のＦｖフレームワーク（ＦＲ）残基を、対応する非ヒト残基と交換する。ヒト化抗体は、レシピエント抗体または導入ＣＤＲまたはフレームワーク配列のいずれにおいても見られない残基も含有する可能性がある。一般にヒト化抗体は、非ヒトである供給源由来の抗体に導入された１つまたは複数のアミノ酸残基を有する。実際、ヒト化抗体は典型的には、その中で幾つかのＣＤＲ残基およびおそらく幾つかのＦＲ残基が、げっ歯類抗体中の類似部位由来の残基によって置換されているヒト抗体である。ヒト化抗体は一般に、抗体定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分、典型的にはヒト抗体の少なくとも一部分を含有する（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２〜５２５頁（１９８６年）、Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３〜３２７頁（１９８８年）、およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、２：５９３〜５９６頁（１９９２年））。
【０１３６】
非ヒト抗体をヒト化するための方法は当技術分野でよく知られている。例えば、ヒト化抗体は、げっ歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列とヒト抗体の対応する配列を置換することによって、Ｗｉｎｔｅｒおよび同僚の方法に従って（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２〜５２５頁（１９８６年）、Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３〜３２７頁（１９８８年）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４〜１５３６頁（１９８８年））作製することができる。ヒト化抗体を産生するために使用することができる方法は、米国特許第４，８１６，５６７号（Ｃａｂｉｌｌｙら）、米国特許第５，５６５，３３２号（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら）、米国特許第５，７２１，３６７号（Ｋａｙら）、米国特許第５，８３７，２４３号（Ｄｅｏら）、米国特許第５，９３９，５９８号（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉら）、米国特許第６，１３０，３６４号（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら）、および米国特許第６，１８０，３７７号（Ｍｏｒｇａｎら）中にも記載されている。
【０１３７】
（４）抗体の投与
抗体の投与は、本明細書で開示するように行うことができる。抗体送達のための核酸手法も存在する。広義で中和性の抗ＰＴＨ１Ｒ抗体および抗体断片を、患者または対象の独自の細胞が核酸を取り込み、コードされた抗体または抗体断片を産生および分泌するように、抗体または抗体断片をコードする核酸調製物（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）として患者または対象に投与することも可能である。核酸の送達は、例えば本明細書で開示するような任意の手段による送達であってよい。
【０１３８】
８．医薬担体／医薬品の送達
前に記載したように、組成物は薬剤として許容される担体でｉｎ  ｖｉｖｏにおいて投与することもできる。「薬剤として許容される」によって、生物学的または他に望ましくないわけではない物質を意味する、すなわちその物質は、任意の望ましくない生物学的影響の発生、またはそれが含有されている医薬組成物の任意の他の構成要素との有害的な相互作用無しで、核酸またはベクターと共に対象に投与することができる。当業者によく知られているように、活性成分の任意の分解を最小にするため、および対象中の任意の悪い副作用を最小にするために、担体は本来選択され得る。
【０１３９】
組成物は、経口、非経口（例えば、静脈内）、筋肉内注射によって、腹腔内注射によって、経皮、体外、局所鼻腔内投与または吸入による投与を含めて局所などに投与することができる。本明細書で使用する「局所鼻腔内投与」は、鼻孔の一方または両方を介した鼻および鼻腔への組成物の送達を意味し、スプレー作用もしくは液滴作用による送達、または核酸またはベクターのエアロゾル化による送達を含むことができる。吸入による組成物の投与は、スプレー作用もしくは液滴作用による送達による鼻または口を介した投与であってよい。送達は挿管による呼吸系（例えば肺）の任意の領域への直接的な送達であってもよい。必要とされる組成物の正確な量は、対象の種類、年齢、体重および一般的状態、治療するアレルギー障害の重度、使用する個々の核酸またはベクター、その投与形態などに応じて、対象毎に変わり得る。したがって、それぞれの組成物に関する正確な量を特定することはできない。しかしながら、適切な量は、本明細書の教示を考慮し、ごく日常的な実験を使用して、当業者によって決定することができる。
【０１４０】
組成物の非経口投与は、使用する場合、一般に注射によって特徴付けられる。注射剤は従来の形で、液体溶液または懸濁液のいずれか、注射前に液体に懸濁した懸濁液の溶液に適した固体系として、または乳濁液として調製することができる。非経口投与に関してより最近改定された手法は、一定用量が維持されるような徐放または持続放出系の使用を含む。例えば、参照によって本明細書に組み込む、米国特許第３，６１０，７９５号を参照。
【０１４１】
物質は（例えば、ミクロ粒子、リポソーム、または細胞に取り込まれた）溶液、懸濁液中に存在してよい。これらは、抗体、受容体、または受容体リガンドを介して特定の細胞型を標的化することが可能である。以下の参照文献は、特異的タンパク質を腫瘍組織に標的化するための、この技術の使用の例である（Ｓｅｎｔｅｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、２：４４７〜４５１頁、（１９９１年）；Ｂａｇｓｈａｗｅ、Ｋ．Ｄ．、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、６０：２７５〜２８１頁、（１９８９年）；Ｂａｇｓｈａｗｅら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、５８：７００〜７０３頁、（１９８８年）；Ｓｅｎｔｅｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、４：３〜９頁、（１９９３年）；Ｂａｔｔｅｌｌｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、３５：４２１〜４２５頁、（１９９２年）；Ｐｉｅｔｅｒｓｚ  ａｎｄ  ＭｃＫｅｎｚｉｅ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｒｅｖｉｅｗｓ、１２９：５７〜８０頁、（１９９２年）；およびＲｏｆｆｌｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、４２：２０６２〜２０６５頁、（１９９１年））。「ステルス」および他の抗体結合リポソームなどの媒体（結腸癌への脂質介在性薬剤標的化含む）、細胞特異的リガンドを介したＤＮＡの受容体介在性標的化、リンパ球対象腫瘍標的化、およびｉｎ  ｖｉｖｏでのネズミグリオーマ細胞の非常に特異的な治療用レトロウイルス標的化。以下の参照文献は、特異的タンパク質を腫瘍組織に標的化するための、この技術の使用の例である（Ｈｕｇｈｅｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、４９：６２１４〜６２２０頁、（１９８９年）；およびＬｉｔｚｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ、１１０４：１７９〜１８７頁、（１９９２年））。一般に受容体は、構成的またはリガンド誘導型のいずれかのエンドサイトーシスの経路と関係がある。これらの受容体はクラスリン被覆ピットに群がり、クラスリン被覆小胞を介して細胞に入り、酸性エンドソームを通過し、その中で受容体が選別され、および次いで細胞表面にリサイクルされるか、細胞内に保存された状態になるか、またはリソソームで分解されるかのいずれかである。内在化経路は、栄養摂取、活性化タンパク質の除去、高分子のクリアランス、ウイルスおよび毒素の日和見侵入、リガンドの解離および分解、および受容体レベルの調節などの様々な機能を果たす。多くの受容体は、細胞型、受容体濃度、リガンドの型、リガンド価、およびリガンド濃度に応じて、２つ以上の細胞内経路をたどる。分子および細胞の受容体介在性エンドサイトーシス機構は総説されている（Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｅ、ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ１０：６、３９９〜４０９頁（１９９１年））。
【０１４２】
ａ）薬剤として許容される担体
抗体を含む組成物は、薬剤として許容される担体と組合せて治療上使用することができる。
【０１４３】
適切な担体およびそれらの製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（第１９号）ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ１９９５年中に記載されている。典型的には、適切な量の薬剤として許容される塩を製剤中に使用して製剤を等張にする。薬剤として許容される担体の例には、生理食塩水、リンガー溶液およびデキストロース溶液があるが、これらだけには限られない。溶液のｐＨは、好ましくは約５〜約８、およびより好ましくは約７〜約７．５である。さらなる担体には、抗体を含有する固形疎水性ポリマーの半透性マトリクスなどの徐放性調製物があり、これらのマトリクスは、造形品、例えばフィルム、リポソームまたはミクロ粒子の形である。例えば投与の経路および投与する組成物の濃度に応じて、特定の担体がより好ましい可能性があることは、当業者には明らかであろう。
【０１４４】
医薬担体は当業者に知られている。これらは、最も典型的には、滅菌水、生理食塩水、生理的ｐＨの緩衝溶液などの溶液を含めた、ヒトへの薬剤の投与に関する標準的な担体であり得る。組成物は筋肉内または皮下に投与することができる。他の化合物は、当業者によって使用される標準的な手順に従い投与され得る。
【０１４５】
医薬組成物は、選択した分子に加えて、担体、増粘剤、希釈剤、バッファー、防腐剤、表面活性剤などを含むことができる。医薬組成物は、例えば抗菌剤、抗炎症剤、麻酔薬などの、１つまたは複数の活性成分も含むことができる。
【０１４６】
医薬組成物は、局部または全身治療が望ましいか、および治療する領域に応じて、幾つかの方法で投与することができる。投与は、局所（眼、経膣、直腸、鼻腔含む）、経口、吸入、または非経口、例えば静脈内点滴、皮下、腹腔内または筋肉内注射による投与であってよい。開示する抗体は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内、または経皮投与することができる。
【０１４７】
非経口投与用の調製物には、滅菌水溶液または非水溶液、懸濁液、および乳濁液がある。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性担体には、生理食塩水および緩衝培地を含めて、水、アルコール／水溶液、乳濁液または懸濁液がある。非経口賦形剤には、塩化ナトリウム溶液、リンガーのデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンガー、または固定油がある。静脈内賦形剤には、液体および栄養補充剤、電解質補充剤（リンガーのデキストロースに基づく補充剤）などがある。例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどの、防腐剤および他の添加剤が存在してもよい。
【０１４８】
局所投与用の製剤は、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐薬、スプレー、液体および粉末を含むことができる。従来の医薬担体、水性、粉末または油性基剤、増粘剤などが必要であるかまたは望ましい可能性がある。
【０１４９】
経口投与用の組成物には、粉末または顆粒、水または非水性培地中の懸濁液または溶液、カプセル、サシェ、または錠剤がある。増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤または結合剤が望ましい可能性がある。
【０１５０】
組成物の幾つかは、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、およびリン酸などの無機酸、およびギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、およびフマル酸などの有機酸との反応によって、または水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムなどの無機塩基、およびモノ−、ジ−、トリアルキルおよびアリールアミンおよび置換エタノールアミンなどの有機塩基との反応によって形成される、薬剤として許容される酸または塩基付加塩としておそらく投与することができる。
【０１５１】
ｂ）治療的使用
組成物を投与するのに有効な用量およびスケジュールは経験的に決定することができ、かつこのような決定を行なうことは当技術分野の技術内にある。組成物の投与に関する用量範囲は、障害の症状に作用する所望の効果を生み出すほど十分広い範囲である。用量は、例えば望ましくない交差反応、アナフィラキシー反応などの、悪い副作用を引き起こすほど多量であってはならない。一般に、用量は患者の年齢、状態、性別および疾患の程度、投与の経路、他の薬剤がレジメン中に含まれるかどうかの有無によって変わり、かつ当業者によって決定され得る。用量は任意の禁忌の場合、それぞれの医師によって調節することができる。用量は変わる可能性があり、かつ１または７日間、毎日１回または複数回の用量投与で施すことができる。所与のクラスの医薬品の適切な用量に関する文献中で、ガイダンスを見つけることができる。例えば、抗体の適切な用量を選択する際のガイダンスは、抗体の治療的使用に関する文献、例えばＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｆｅｒｒｏｎｅら、ｅｄｓ．、Ｎｏｇｅｓ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐａｒｋ  Ｒｉｄｇｅ、Ｎ．Ｊ．、（１９８５年）ｃｈ．２２および３０３〜３５７頁；Ｓｍｉｔｈら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｈａｂｅｒら、ｅｄｓ．、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７７年）３６５〜３８９頁中で見つけることができる。単独で使用する抗体の典型的な毎日の用量は、前に述べた要因に応じて、１日当たり約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇまで／体重１ｋｇ以上の範囲であってよい。
【０１５２】
開示する組成物および方法は、例えば様々なＧＰＣＲ関連疾患用の新しい薬剤候補を単離および試験するためのツールとして使用することもできる。
【０１５３】
９．開示する組成物／コンビナトリアルケミストリーを用いたスクリーニングによって同定した組成物
ａ）コンビナトリアルケミストリー
開示する組成物を任意のコンビナトリアル技法の標的として使用して、望ましい形式で開示する組成物と相互作用する分子または高分子状分子を同定することができる。本明細書で開示する核酸、ペプチド、および関連分子は、コンビナトリアル手法の標的として使用することができる。配列番号１で開示する組成物またはその一部分をコンビナトリアルまたはスクリーニングプロトコルにおける標的として使用する、コンビナトリアル技法またはスクリーニング技法によって同定される組成物も開示する。
【０１５４】
コンビナトリアル技法またはスクリーニング法において開示する組成物を使用すると、標的分子の機能の阻害または刺激などの特定の望ましい性質を有する、高分子状分子などの分子が同定され得ることは理解されよう。ＰＴＨ１Ｒなどの開示する組成物を使用したときに同定および単離した分子も開示する。したがって、ＰＴＨ１Ｒなどの開示する組成物に関するコンビナトリアルまたはスクリーニング手法を使用して生成した産物も、本明細書に開示されると考えられる。
【０１５５】
例えば、ＰＴＨ１ＲとＰＴＨの間の相互作用を阻害する分子を同定するための開示する方法は、高スループット手段を使用して実施することができることは理解されよう。例えば、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を使用して推定阻害剤を同定して、相互作用迅速に同定することができる。これら技法の根本的な理論は、２つの分子が空間で隣接している、すなわちバックグラウンドを超えるレベルで相互作用するとき、１つのシグナルが生成する、または１つのシグナルが消える可能性があるということである。したがって、例えば推定阻害剤の添加を含む、様々な実験を実施することができる。阻害剤が２つのシグナル伝達分子間の相互作用と競合する場合、使用するシグナルの型に応じて、シグナルは空間内で互いから除去され、これはシグナルの低下または増大を引き起こし得る。このシグナルの低下または増大は、推定阻害剤の存在または不在と相関関係がある可能性がある。任意のシグナル伝達手段を使用することができる。例えば、第一の分子と第二の分子を推定阻害剤の存在下で一緒に接触させることであって、第一の分子または第二の分子が蛍光ドナーを含み、第一の分子または第二の分子、典型的にはドナーを含まない分子が蛍光アクセプターを含むこと、ならびに、推定阻害剤の存在下および推定阻害剤の不在下で蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を測定することであって、その不在下でのＦＲＥＴ測定値と比較した推定阻害剤の存在下でのＦＲＥＴの低下が、推定阻害剤が２分子間の結合を阻害することを示すことを含む、任意の２つの開示する分子間の相互作用の阻害剤を同定する方法を開示する。この型の方法は細胞系を用いて実施することもできる。
【０１５６】
コンビナトリアルケミストリーは、典型的には反復プロセスで、小分子または他の高分子のいずれかと結合することができる小分子または高分子を単離するための全ての方法だけには限られないが、これらを含む。タンパク質、オリゴヌクレオチド、および糖類は高分子の例である。例えば、所与の機能、触媒またはリガンド結合性を有するオリゴヌクレオチド分子を、「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ遺伝学」と呼ばれている遺伝学（Ｓｚｏｓｔａｋ、ＴＩＢＳ１９：８９、１９９２年）で、ランダムなオリゴヌクレオチドの複合混合物から単離することができる。ランダムおよび明確な配列を有する大量の分子を合成し、その複合混合物、例えば１００μｇの１００ヌクレオチドＲＮＡ中に約１０１５個の個々の配列を数回の選択および濃縮プロセスに施す。カラムにおけるリガンドと結合した分子の親和性クロマトグラフィーとＰＣＲ増幅の反復サイクルによって、Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ（１９９０年）は、１０１０個のＲＮＡ分子中の１個が、小分子色素と結合するようにフォールディングしたと推定した。このようなリガンド結合挙動を有するＤＮＡ分子も単離されている（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ、１９９２年；Ｂｏｃｋら、１９９２年）。当業者に知られている有機小分子、タンパク質、抗体および他の高分子に関して、同様の目的を果たすための技法が存在する。有機小分子ライブラリー、オリゴヌクレオチド、または抗体のいずれかに基づく所望の活性に関する一連の分子のスクリーニングは、コンビナトリアルケミストリーと広義に呼ばれる。コンビナトリアル技法は、分子間の結合相互作用の定義、および、高分子が核酸であるときアプタマーと呼ばれることが多い、特異的結合活性を有する分子の単離に特に適している。
【０１５７】
ｄｅ  ｎｏｖｏ活性または修飾活性のいずれかを有するタンパク質を単離するための、幾つかの方法が存在する。例えば、特異的標的と相互作用する多数のペプチドを単離するために、ファージディスプレイライブラリーが使用されている（例えば、少なくともファージディスプレイと関係があるそれらの物質およびコンビナトリアルケミストリーと関係がある方法に関して、参照によって本明細書に組み込む、米国特許第６，０３１，０７１号、同第５，８２４，５２０号、同第５，５９６，０７９号、および同第５，５６５，３３２号を参照）。
【０１５８】
所与の機能を有するタンパク質を単離するのに好ましい方法は、Ｒｏｂｅｒｔｓ  ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ（Ｒｏｂｅｒｔｓ  Ｒ．Ｗ．ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ  Ｊ．Ｗ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４（２３）１２９９７〜３０２頁（１９９７年）によって記載される。このコンビナトリアルケミストリー法は、タンパク質の機能性と核酸の遺伝性を結びつける。ピューロマイシン分子がＲＮＡ分子の３’末端と共有結合した、ＲＮＡ分子を作製する。この修飾ＲＮＡ分子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳は、ＲＮＡによってコードされ翻訳される正確なタンパク質をもたらす。さらに、ピューロマイシン、延長することができないペプチジル受容体の結合のために、増大するペプチド鎖はＲＮＡと結合したピューロマイシンと結合する。したがって、タンパク質分子は、それをコードする遺伝物質と結合する。現在、通常のｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択手順を行なって機能ペプチドを単離することができる。ペプチド機能に関する選択手順が終了した後、伝統的な核酸操作手順を実施して、選択した機能ペプチドをコードする核酸を増幅させる。遺伝物質の増幅後、新たなＲＮＡが３’末端においてピューロマイシンと共に転写され、新たなペプチドが翻訳され、選択の別の機能ラウンドが実施される。したがって、タンパク質選択は、核酸選択技法と同様に反復式に実施することができる。翻訳されるペプチドは、ピューロマイシンと結合したＲＮＡの配列によって制御される。この配列は最適な翻訳（すなわち、停止コドン無しなど）のために工学処理したランダムな配列由来の任意の配列であってよく、あるいはこの配列は、知られているペプチドの改善または改変された機能を検索するために、知られているＲＮＡ分子の縮重配列であってよい。核酸増幅およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳に関する条件は当業者によく知られており、Ｒｏｂｅｒｔｓ  ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ（Ｒｏｂｅｒｔｓ  Ｒ．Ｗ．ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４（２３）１２９９７〜３０２頁（１９９７年））中と同様に実施することが好ましい。
【０１５９】
ペプチドを単離するために設計したコンビナトリアル法の別の好ましい方法は、Ｃｏｈｅｎら（Ｃｏｈｅｎ  Ｂ．Ａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５（２４）：１４２７２〜７頁（１９９８年））中に記載される。この方法は２ハイブリッド技術を利用し、それを改変する。酵母２ハイブリッド系は、タンパク質：タンパク質相互作用の検出および分析に有用である。酵母Ｓａｃｃｌｒａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて最初に記載された２ハイブリッド系は、対象とするタンパク質に特異的な新たな調節分子を同定するための強力な分子遺伝学的技法である（Ｆｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  Ｓｏｎｇ、Ｎａｔｕｒｅ３４０：２４５〜６頁（１９８９年））。Ｃｏｈｅｎらは、選択した分子と結合する合成または工学処理ペプチド配列間の新規な相互作用を同定することができるように、この技術を改変した。この型の技術の利点は、選択を細胞内環境で行うことである。この方法は、酸性活性化ドメインと結合したペプチド分子のライブラリーを利用する。選択したペプチド、例えばＰＴＨ１Ｒの細胞外部分は、Ｇａｌ４などの転写活性化タンパク質のＤＮＡ結合ドメインと結合する。この型の系で２ハイブリッド技法を実施することによって、ＰＴＨ１Ｒの細胞外部分と結合する分子を同定することができる。
【０１６０】
様々なコンビナトリアルライブラリーと組合せて、当業者によく知られている方法を使用して、所望の標的と結合または相互作用する小分子または高分子を、単離および特徴付けることができる。これらの化合物の相対的な結合親和性を比較することができ、当業者によく知られている競合的結合試験を使用して最適な化合物を同定することができる。
【０１６１】
コンビナトリアルライブラリーを作製し、コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングして所望の標的と結合する分子を単離するための技法は、当業者によく知られている。代表的な技法および方法は、米国特許
【０１６２】
【表３】
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だけには限られないが、これらの中で見つけることができる。
【０１６３】
コンビナトリアルライブラリーは、幾つかの異なる合成技法を使用して広範囲の分子から作製することができる。例えば、縮合２，４−ピリミジンジオン（米国特許第６，０２５，３７１号）、ジヒドロベンゾピラン（米国特許第６，０１７，７６８号および同第５，８２１，１３０号）、アミドアルコール（米国特許第５，９７６，８９４号）、ヒドロキシ−アミノ酸アミド（米国特許第５，９７２，７１９号）、炭水化物（米国特許第５，９６５，７１９号）、１，４−ベンゾジアゼピン−２，５−ジオン（米国特許第５，９６２，３３７号）、環状化合物（米国特許第５，９５８，７９２号）、ビアリールアミノ酸アミド（米国特許第５，９４８，６９６号）、チオフェン（米国特許第５，９４２，３８７号）、三環系テトラヒドロキノリン（米国特許第５，９２５，５２７号）、ベンゾフラン（米国特許第５，９１９，９５５号）、イソキノリン（米国特許第５，９１６，８９９号）、ヒダントインおよびチオヒダントイン（米国特許第５，８５９，１９０号）、インドール（米国特許第５，８５６，４９６号）、イミダゾール−ピリド−インドールおよびイミダゾール−ピリド−ベンゾチオフェン（米国特許第５，８５６，１０７号）、置換２−メチレン−２，３−ジヒドロチアゾール（米国特許第５，８４７，１５０号）、キノリン（米国特許第５，８４０，５００号）、ＰＮＡ（米国特許第５，８３１，０１４号）を含有する、タグ（米国特許第５，７２１，０９９号）、ポリケチド（米国特許第５，７１２，１４６号）、モルホリノ−サブユニット（米国特許第５，６９８，６８５号および同第５，５０６，３３７号）、スルファミド（米国特許第５，６１８，８２５号）、およびベンゾジアゼピン（米国特許第５，２８８，５１４号）を含有するライブラリー。
【０１６４】
本明細書で使用するコンビナトリアル法およびライブラリーは、従来のスクリーニング法およびライブラリー、ならびに反復プロセスで使用する方法およびライブラリーを含んでいた。
【０１６５】
ｂ）コンピュータ支援の薬剤設計
開示する組成物を任意の分子モデリング技法の標的として使用して、開示する組成物の構造を同定すること、または開示する組成物と所望の方法で相互作用する小分子などの、潜在的または実分子を同定することのいずれかが可能である。
【０１６６】
開示する組成物をモデリング技法において使用すると、標的分子の機能の阻害または刺激などの特定の望ましい性質を有する、高分子状分子などの分子が同定され得ることは理解されよう。ＰＴＨ１Ｒなどの開示する組成物を使用したときに同定および単離した分子も開示する。したがって、ＰＴＨ１Ｒなどの開示する組成物に関する分子モデリング手法を使用して生成した産物も、本明細書に開示されると考えられる。
【０１６７】
したがって、選択した分子と結合する分子を単離するための１つの方法は、合理的設計による方法である。これは構造情報およびコンピュータモデリングによって実施される。コンピュータモデリング技術は、選択した分子の三次元原子構造の可視化、およびその分子と相互作用し得る新たな化合物の合理的設計を可能にする。三次元構築は典型的に、選択した分子のＸ線結晶構造解析またはＮＭＲイメージングからのデータに依存する。分子動力学は力場のデータを必要とする。コンピュータグラフィクスシステムは、どのようにして新たな化合物が標的分子と結合するかを予想することができ、かつ結合特異性を完全にするための化合物および標的分子の構造の実験操作を可能にする。一方または両方にわずかな変化を施すとき分子−化合物の相互作用はどのようなものかの予想は、分子設計プログラムとユーザーの間の、ユーザーフレンドリーな、メニュー形式のインターフェイスと通常結びついた、分子力学用ソフトウェアおよびコンピュータ集約型コンピュータを必要とする。
【０１６８】
分子モデリングシステムの例は、ＣＨＡＲＭｍおよびＱＵＡＮＴＡプログラム、Ｐｏｌｙｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡである。ＣＨＡＲＭｍは、エネルギー最小化および分子動力学機能を実行する。ＱＵＡＮＴＡは、分子構造の構築、グラフィックモデリングおよび分析を実行する。ＱＵＡＮＴＡは、分子の互いの相互作用的構築、修飾、可視化、および挙動の分析を可能にする。
【０１６９】
Ｒｏｔｉｖｉｎｅｎら、１９８８年  Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ  Ｆｅｎｎｉｃａ９７、１５９〜１６６頁；Ｒｉｐｋａ、Ｎｅｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ５４〜５７頁（１９８８年６月１６日）；ＭｃＫｉｎａｌｙ  ａｎｄ  Ｒｏｓｓｍａｎｎ、１９８９年、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｉｏｌ．２９、１１１〜１２２頁；Ｐｅｒｒｙ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｅｓ、ＯＳＡＲ：Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ１８９〜１９３頁（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．１９８９年）；Ｌｅｗｉｓ  ａｎｄ  Ｄｅａｎ、１９８９年Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．２３６、１２５〜１４０頁および１４１〜１６２頁；および、核酸構成要素のモデル酵素に関して、Ａｓｋｅｗら、１９８９  Ｊ  Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１、１０８２〜１０９０頁などの、幾つかの論説は、特異的タンパク質と相互作用する薬剤のコンピュータモデリングを論評する。化学物質をスクリーニングしグラフによって示す他のコンピュータプログラムは、ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ、Ｉｎｃ．、Ｐａｓａｄｅｎａ、ＣＡ．、Ａｌｌｅｌｉｘ、Ｉｎｃ、Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ、およびＨｙｐｅｒｃｕｂｅ、Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｏｎｔａｒｉｏなどの企業から入手可能である。これらは主に特定のタンパク質に特異的な薬剤への適用のために設計されているが、それらはＤＮＡまたはＲＮＡの特異的領域と特異的に相互作用する分子の設計に、その領域を同定した後に適合させることが可能である。
【０１７０】
結合を改変する可能性がある化合物の設計および作製に関して前に記載したが、天然産物または合成化学物質、およびタンパク質を含めた生物活性物質を含む既知の化合物のライブラリーを、基質結合または酵素活性を改変する化合物に関してスクリーニングすることもできる。
【０１７１】
１０．キット
本明細書で開示する方法を実施する際に使用することができる試薬が含まれるキットを、本明細書で開示する。これらのキットは、本明細書で論じるかあるいは開示する方法を実施する際に必要または有用であると理解され得る、任意の試薬または試薬の組合せを含むことができる。例えば、これらのキットは、方法の特定の実施形態で論じる増幅反応を実施するためのプライマー、ならびに意図するプライマーを使用するのに必要とされるバッファーおよび酵素を含み得る。
【０１７２】
Ｉ．作製方法
本明細書において開示される組成物、および開示される方法を実施するために必要な組成物は、別段の記載がない限り、特定の試薬または化合物が当業者に知られている、あらゆる方法を用いて作製することができる。
【０１７３】
１．核酸合成
例えば、プライマーとして用いるためのオリゴヌクレオチドなどの核酸は、標準的な化学合成法を用いて作製することができるか、または酵素法もしくはあらゆる他の既知の方法を用いて生産することができる。このような方法は、標準的な酵素消化およびその後のヌクレオチド断片の単離（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．、１９８９年）５、６章を参照されたい）から、例えばＭｉｌｌｉｇｅｎまたはＢｅｃｋｍａｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  １Ｐｌｕｓ  ＤＮＡ合成装置（例えば、Ｍｉｌｌｉｇｅｎ−Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡのモデル８７００自動合成機、またはＡＢＩモデル３８０Ｂ）を用いたシアノエチルホスホラミダイト法による純粋合成法まで、様々であり得る。オリゴヌクレオチドの作製に有用な合成法はまた、Ｉｋｕｔａら、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３巻：３２３〜３５６頁（１９８４年）（ホスホトリエステルおよび亜リン酸トリエステル法）およびＮａｒａｎｇら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、６５巻：６１０〜６２０頁（１９８０年）（ホスホトリエステル法）によっても記載されている。タンパク質の核酸分子は、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．  Ｃｈｅｍ．５巻：３〜７頁（１９９４年）に記載されたものなどの既知の方法を用いて作製することができる。
【０１７４】
２．ペプチド合成
配列番号３などの開示されるタンパク質を生産する１つの方法は、タンパク質化学技術によって２つ以上のペプチドまたはポリペプチドを共に結合することである。例えば、ペプチドまたはポリペプチドは、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）またはＢｏｃ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボノイル）化学を用いて、現在利用可能な実験設備を用いて化学的に合成することができる。（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）。当業者には、開示されたタンパク質に対応するペプチドまたはポリペプチドを、例えば標準的な化学反応によって合成することができることが容易に理解され得る。例えば、ペプチドまたはポリペプチドを合成し、かつその合成樹脂から切断しないようにすることができるが、一方で、ペプチドまたはタンパク質の他の断片を合成し、その後樹脂から切断して、それにより他の断片上では機能的に遮断されている末端基を暴露させることができる。ペプチド縮合反応によって、これらの２つの断片を、それぞれ、それらのカルボキシル末端およびアミノ末端でのペプチド結合を介して共有結合させ、抗体またはその断片を形成させることができる（Ｇｒａｎｔ  ＧＡ（１９９２年）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：  Ａ  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ．  Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，  Ｎ．  Ｙ．（１９９２年）、Ｂｏｄａｎｓｋｙ  ＭおよびＴｒｏｓｔ  Ｂ．編（１９９３年）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｉｎｃ．，  ＮＹ（少なくともペプチド合成に関連する材料について、参照することにより本明細書に組み込まれる）。あるいは、ペプチドまたはポリペプチドは、本明細書において記載されるように、インビボにおいて独立して合成される。単離されると、これらの独立したペプチドまたはポリペプチドは、類似のペプチド縮合反応を介して結合して、ペプチドまたはそれらの断片を形成し得る。
【０１７５】
例えば、クローニングされたペプチドまたは合成ペプチドのセグメントの酵素的ライゲーションにより、比較的短いペプチド断片が結合して、より大きなペプチド断片、ポリペプチド、または全タンパク質ドメインを生じさせることが可能になる（Ａｂｒａｈｍｓｅｎ  Ｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０巻：４１５１頁（１９９１年））。あるいは、合成ペプチドの天然の化学的ライゲーションを用いて、短いペプチド断片から大きなペプチドまたはポリペプチドを合成的に構築することができる。この方法は、２工程の化学反応からなる（Ｄａｗｓｏｎら、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  Ｎａｔｉｖｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６６巻、７７６〜７７９頁（１９９４年））。第１の工程は、保護されていない合成ペプチドであるチオエステルと、アミノ末端のＣｙｓ残基を含む別の保護されていないペプチドセグメントとの化学選択的反応であり、最初の共有結合生成物としてチオエステル共役型中間体をもたらすものである。反応条件の変化を伴わずに、この中間体は、自然の、迅速な細胞内反応を受け、ライゲーション部位での天然のペプチド結合を形成する（Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ  Ｍら（１９９２年）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３０７巻：９７〜１０１頁；Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ  Ｉら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６９巻：１６０７５頁（１９９４年）；Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ  Ｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０巻：３１２８頁（１９９１年）；Ｒａｊａｒａｔｈｎａｍ  Ｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３３巻：６６２３〜３０頁（１９９４年））。
【０１７６】
あるいは、保護されていないペプチドセグメントは、化学的ライゲーションの結果生じたペプチドセグメントの間で形成される結合が非天然の（非ペプチド）結合である場合、化学的に結合される（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ，  Ｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６巻：２２１頁（１９９２年））。この技術は、タンパク質ドメインの類似体、および完全な生物学的活性を有する大量の比較的純粋なタンパク質を合成するために用いられている（ｄｅＬｉｓｌｅ  Ｍｉｌｔｏｎ  ＲＣら、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＩＶ．  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２５７〜２６７頁（１９９２年））。
【０１７７】
３．組成物を作製するためのプロセスクレーム
組成物を作製するためのプロセスおよび組成物をもたらす中間体を作製するためのプロセスが開示される。合成化学法および標準的な分子生物学法などの、これらの組成物を作製するために用いられ得る様々な方法が存在する。これらのおよび他の開示される組成物を作製する方法が特に開示されることが理解される。
【０１７８】
あらゆる開示された核酸で細胞を形質転換するプロセスによって生産される細胞が開示される。あらゆる天然に存在しない開示された核酸で細胞を形質転換するプロセスによって生産される細胞が開示される。
【０１７９】
あらゆる開示された核酸を発現させるプロセスによって生産される、あらゆる開示されたペプチドが開示される。あらゆる開示された核酸を発現させるプロセスによって生産される、あらゆる天然に存在しない開示されたペプチドが開示される。あらゆる天然に存在しない開示された核酸を発現させるプロセスによって生産される、あらゆる開示されたペプチドが開示される。
【０１８０】
本明細書において開示されるあらゆる核酸分子で動物内の細胞をトランスフェクトするプロセスによって生産される動物が開示される。本明細書において開示されるあらゆる核酸分子で動物内の細胞をトランスフェクトするプロセスによって生産される動物が開示され、ここで、動物は哺乳動物である。また、本明細書において開示されるあらゆる核酸分子で動物内の細胞をトランスフェクトするプロセスによって生産される動物が開示され、ここで、哺乳動物は、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、または霊長類動物である。
【０１８１】
また、本明細書において開示されるあらゆる細胞を動物に加えるプロセスによって生産される動物が開示される。
【０１８２】
Ｊ．方法
同化的な骨成長を促進する方法が開示される。本方法は、Ｇタンパク質介在性のシグナル伝達に依存しないβ−アレスチン介在性のシグナル伝達を刺激し得るＰＴＨ１受容体に対する偏ったアゴニストを、それを必要とする患者に投与することを含む。偏ったアゴニストは、骨成長の促進をもたらすために十分な量で投与される。
【０１８３】
治療は、これまでに、ＰＴＨ（１−３４）およびＰＴＨ（１−８４）などのアゴニストを含む、ＰＴＨ１受容体の刺激を介した同化的な骨成長を生じさせることを示した。本明細書において開示される偏ったアゴニストとは対照的に、先行技術のアゴニストはＰＴＨ１受容体を結合し、アデニル酸シクラーゼのＧタンパク質介在性の活性化およびイノシトール−１，４，５−トリスリン酸（ＩＰ３）の生産を刺激する（Ｄｕｎｌａｙら、Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８５巻（２号）：Ｆ２２３〜２３１頁（１９９０年）；Ｇｕｏら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３６巻（９号）：３８８４〜３８９１頁（１９９５年））。
【０１８４】
本発明における使用に適したＰＴＨ１受容体に対する偏ったアゴニストは、骨梁構造の生成を含む、同化的な骨形成をもたらすシグナル伝達特性を有する。本明細書において開示される偏ったアゴニストは、［Ｄ−Ｔｒｐ（１２）、Ｔｙｒ（３４）］ｂＰＴＨ（７−３４）アミド（ＰＴＨ−ＩＡ）であり、ＰＴＨ１受容体のインバースアゴニストである（Ｇｏｌｄｍａｎら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｇｙ、１２３巻（５号）：２５９７〜２５９９頁（１９８８年）；ＵＳＰ４，９６８，６６９；Ｂａｃｈｅｍ）。
【０１８５】
ＰＴＨ−ＩＡの薬理学的作用は、インビトロで、Ｇタンパク質介在性のメカニズムを介してではなく、β−アレスチンによって仲介されることが示されている（Ｇｅｓｔｙ−Ｐａｌｍｅｒら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２８１巻：１０８５６頁（２００６年））。マウスにおける同化的な骨形成に対する、インビボでのＰＴＨ−ＩＡの投与の効果もまた研究されており、結果は、ＰＴＨ−ＩＡが、Ｇタンパク質非依存性で、β−アレスチン依存性のメカニズムを介して骨梁形成を刺激し得ることを示している。（以下の実施例を参照されたい。）さらに、ＰＴＨ−１Ａは、ＰＴＨ１受容体刺激性の骨吸収からＰＴＨ１受容体の刺激の同化的効果を切り離すと考えられる。利用可能なデータにより、ＰＴＨ刺激性の骨吸収はＧタンパク質依存性のプロセスであり得ることが示唆される。β−アレスチン介在性の骨形成を特異的に刺激する、ＰＴＨ−ＩＡなどの、本明細書において開示される偏ったアゴニストは、代謝的骨疾患の治療のために生物学的特異性および安全性のプロフィールを顕著に向上させると期待され得る。
【０１８６】
また、ＰＴＨ−ＩＡの誘導体、および、さらに、ＰＴＨ１受容体の他の偏ったアゴニストをまた、骨成長を促進する本方法において用いることができることが開示される。例としては、ヒトＰＴＨ（７−３４）、［Ｌｅｕ（１１）−Ｄ−Ｔｒｐ（１２）］ｈＰＴＨｒＰ（７−３４）−アミド、［Ｄ−Ｔｒｐ（１２）］ｂＰＴＨ（７−３４）−アミド、および［Ｂｐａ（２）、Ｉｌｅ（５）、Ｔｒｐ（２３０、Ｔｙｒ（３６）］ＰＴＨｒＰ−（１−３６）−アミドが挙げられる。また、他の適切な偏ったアゴニスト（例えば、ＰＴＨ１受容体のインバースアゴニストである他のＰＴＨ類似体）を同定する方法も開示される。適切なβ−アレスチンに偏ったリガンドを同定する方法には、β−アレスチンの動員および刺激の有効性を評価するための、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に基づいた、および生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）に基づいたアッセイが含まれる。他の方法には、受容体／β−アレスチン共免疫沈降、受容体／β−アレスチン架橋、受容体／β−アレスチン生体分子断片化相補性、受容体／β−アレスチン移行画像化、受容体内在化、受容体リン酸化、およびマイトジェン応答性タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼのβ−アレスチン関連リン酸化が含まれる。
【０１８７】
また、適切な担体を用いて製剤される、偏ったアゴニストを含む組成物も開示される。例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、（１９８５年）に記載されているような、当技術分野において知られている製剤技術を用いることができる。組成物は、例えば、溶液（例えば滅菌溶液）または懸濁液として存在し得る。組成物は、用量単位形態（例えば、錠剤またはカプセルとして）として存在し得る。製剤の性質は、例えばアゴニストおよび投与形態に応じて変化し得る。
【０１８８】
代表的な送達レジメンには、限定はしないが、経口、非経口（皮下、経皮、筋肉内、および静脈内を含む）、直腸、口腔（舌下を含む）、経真皮、および鼻腔内が含まれる。現在ＦＤＡによって認可されているＰＴＨ（１−３４）ペプチドのように、本発明の偏ったアゴニストは注射（例えば皮下注射（ｈｔｔｐ：／／ｐｉ．ｌｉｌｌｙ．ｃｏｍ／ｕｓ／ｆｏｒｔｅｏ−ｐｉ．ｐｄｆを参照されたい））によって投与することができるが、適切に製剤された偏ったアゴニストの鼻腔内投与も好ましい場合がある。
【０１８９】
通常、偏ったアゴニストなどの組成物またはその塩は、１日当たり約０．０１から１０μｇ／体重ｋｇの量で投与することができ、好ましくは、１日当たり約０．０５から約２．５μｇ／体重ｋｇで投与することができる。７０ｋｇのヒトの女性では、ＰＴＨ−ＩＡの毎日の用量は、例えば、約３．５μｇ／ｋｇから約１７５μｇ／ｋｇであり得、好ましくは約５μｇ／ｋｇから約１５０μｇ／ｋｇであり得る。用量は、所望の結果を達成するための必要に応じて、単回投与により、多回適用により、または制御放出を介して送達され得る。
【０１９０】
最適な投与レジメンは、当業者が容易に決定することができ、偏ったアゴニスト、患者、および所望の効果で変化し得る。
【０１９１】
開示される偏ったアゴニストは、骨量の損失に特徴を有する様々な哺乳動物の状態の予防および治療において用いることができる。例えば、偏ったアゴニストは、骨粗しょう症および骨減少症の予防および治療処置に用いることができる。偏ったアゴニストはまた、副甲状腺機能高進症およびそれに関連する骨疾患の治療処置にも用いることができ、かつ、軟骨異形成症および高カルシウム血症を形成する。本明細書において開示される方法は、ヒトならびにヒト以外の動物（例えばウマおよびウシ）の治療において用いることができる。
【０１９２】
Ｇｅｓｔｙ−Ｐａｌｍｅｒら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８１巻（１６号）：１０８５６頁（２００６年）、ならびにＵＳＰ７，１６９，５６７、ＵＳＰ７，１５３，９５１、ＵＳＰ７，１５０，９７４、ＵＳＰ７，０２２，８５１、ＵＳＰ４，９６８，６６９、および米国出願公開第２００６０２２９２４０号（限定はしないが、これらの特許文献における製剤／投与の詳細および治療的適用の開示を含む）も参照されたい。
【０１９３】
１．偏ったリガンドをスクリーニングする方法。
【０１９４】
ＧＰＣＲの活性化を決定するために用いることができる様々なアッセイが存在する。例えば、２つの経路を活性化についてアッセイすることができる。
【０１９５】
Ｇタンパク質の活性は、リガンド（または候補リガンド）の存在下および不存在下で、カルシウム、ｃＡＭＰ、ジアシルグリセロール、またはイノシトール三リン酸のレベルを決定することによりアッセイすることができる。Ｇタンパク質の活性はまた、リガンド（または候補リガンド）の存在下および不存在下で、例えば、ホスファチジルイノシトールの代謝回転、ＧＴＰ−γ−Ｓのロード、アデニル酸シクラーゼの活性、ＧＴＰの加水分解などを決定することによりアッセイすることができる。（例えば、Ｋｏｓｔｅｎｉｓ，  Ｃｕｒｒ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  １２巻（１４号）：１７０３〜１７１５頁（２００６年）を参照されたい）。
【０１９６】
β−アレスチンの活性化については、リガンド（または候補リガンド）の存在下および不存在下で、ＧＰＣＲへのβ−アレスチンの動員またはＧＰＣＲの内在化をアッセイすることができる。有利には、リガンド（または候補リガンド）の存在下および不存在下でのβ−アレスチン機能を、共鳴エネルギー移動、生体分子蛍光、酵素相補性、視覚的移行、共免疫沈降、細胞画分化、またはβ−アレスチンと天然に存在する結合パートナーとの相互作用を用いて測定する。（例えば、Ｖｉｏｌｉｎら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｓｃｉ．  ２８巻（８号）：４１６〜４２７頁（２００７年）；Ｃａｒｔｅｒら、Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｅｘｐ．  Ｔｈｅｒ．  ２巻：８３９〜８４８頁（２００５年）を参照されたい。）
ＧＲＫ活性は、β−アレスチン機能の代用として用いることができ、リガンド（または候補リガンド）に応じてＧＰＣＲによって仲介されるβ−アレスチン機能は、したがって、受容体の内在化またはリン酸化の変化によっても明らかであるように、ＧＲＫ活性における変化に反映され得る。
【０１９７】
ＧＰＣＲに作用する、偏ったリガンドまたは候補リガンドなどの所与のリガンドに対するＧタンパク質の活性およびβ−アレスチンの機能についての相対的な有効性を、真核細胞（例えば、哺乳動物細胞（例えばヒト細胞）、昆虫細胞、トリ細胞、または両生類細胞、有利には哺乳動物細胞）におけるアッセイによって決定することができる。適切なアッセイは、原核細胞において、再構築された膜において、およびインビトロで精製タンパク質を用いても実施することができる。このようなアッセイの例には、限定はしないが、ＧＲＸによる精製受容体のインビトロでのリン酸化、細胞または組織から得られた精製膜へのＧＴＰ−γ−Ｓのロード、およびリガンド（または候補リガンド）を添加した際の精製受容体への精製β−アレスチンのインビトロでの結合（反応にＧＲＸが存在するかまたはしない状態で）が含まれる。（例えば、Ｐｉｔｃｈｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５７巻：１２６４〜１２６７頁（１９９２年）；Ｚａｍａｈら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２７７巻：３１２４９〜３１２５６頁（２００２年）；Ｂｅｎｏｖｉｃら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．８４巻：８８７９〜８８８２頁（１９８７年）を参照されたい）。
【０１９８】
特定の実施形態において、Ｇタンパク質の活性化についてのアッセイおよびβ−アレスチンについてのアッセイを行うことができ、その後、例えば、Ｇタンパク質およびβ−アレスチンの活性化の相対的活性を比較することができる。これにより、偏ったリガンドのタイプを決定することができる。この状況は、様々な活性倍増の比較を用いて、活性倍増として比較することができる。例えば、対照と比較して、リガンドは、Ｇタンパク質経路に関して．５倍の活性を有し得、β−アレスチン経路に関して１．５倍の活性を有し得る。そして、このリガンドは、Ｇタンパク質経路と比較して、３倍のβ−アレスチンに偏ったリガンドを有すると分類され得る。この実施例から、対照と比較した、個別の経路についての相対的な活性が得られること、および偏ったリガンドを特徴付けるために２つ以上の経路の活性が比較され得ることが明らかである。リガンドが、少なくとも（ｒｅｆ２）であるかまたはそれ未満であるかまたはそれに等しい、および、それ未満であるかまたはそれに等しい、それを超えるかまたはそれに等しいことが理解される。
【０１９９】
ＰＴＨ受容体などのＧＰＣＲの偏ったリガンドを同定する方法が開示される。このような方法は、ｉ）ＧＰＣＲ介在性のＧタンパク質活性に対する試験化合物の効果を決定する工程、およびｉｉ）ＧＰＣＲ介在性のβ−アレスチン機能に対する試験化合物の効果を決定する工程を含み得、ここで、ＧＰＣＲ介在性のＧタンパク質活性およびＧＰＣＲ介在性のβ−アレスチン機能の両方に対する参照アゴニストと比較して、ＧＰＣＲ介在性のＧタンパク質活性に対してよりもＧＰＣＲ介在性のβ−アレスチン機能に対して大きな正の効果を有する試験化合物は、偏ったリガンドである。このような方法は、生理学的プロセスを調節する（例えば刺激する（増強する）または阻害する）ために用いられ得る候補治療物質を同定するために用いることができる。
【０２００】
例えば、候補治療物質は、ｉ）生理学的プロセスに関連する、ＧＰＣＲにより仲介されるＧタンパク質活性に対する試験化合物の効果を決定する工程、およびｉｉ）ＧＰＣＲにより仲介されるβ−アレスチン機能に対する試験化合物の効果を決定する工程により同定することができ、ここで、ＧＰＣＲにより仲介されるＧタンパク質活性およびβ−アレスチン機能の両方に対する参照アゴニストと比較して、ＧＰＣＲにより仲介されるＧタンパク質活性に対するよりもβ−アレスチン機能に対して大きな正の効果を有する試験化合物は、そのような候補治療物質である。本発明のこの態様には、心血管疾患／障害（高血圧、心不全、冠動脈疾患、肺高血圧、末梢血管疾患、または不整脈を含む）、ならびに肺疾患／障害（ぜんそく、慢性閉塞性気道疾患、および肺線維症など）、眼の疾患／障害（緑内障など）、血液疾患／障害（血栓溶解障害を含む）、内分泌または代謝疾患／障害（例えば、糖尿病および肥満）、神経または心理疾患／障害（パーキンソン病またはアルツハイマーを含む）、ならびに以下に記載されるものを含む他の疾患／障害の治療における使用に適した作用物質を同定する方法が含まれる。
【０２０１】
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に基づいたアッセイを用いて、β−アレスチン／Ｇタンパク質経路の活性化を評価することができる。β−アレスチン／Ｇタンパク質経路の活性化は、リガンドに応じた受容体へのβ−アレスチンの動員の速度として測定することができ、ここで、受容体／β−アレスチン相互作用は、ＦＲＥＴまたは生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）によって測定される。例えば、定量化可能な速度でアゴニストを加えた後に、β２ＡＲ−ｍＣＦＰおよびβ−アレスチン−ｍＹＦＰをＦＲＥＴに供す。このＦＲＥＴの速度の増大は、β−アレスチンの機能を調節する、リガンド刺激性のＧＲＫ活性の評価基準であり、したがって、リガンドのβ−アレスチン／ＧＲＫの有効性を定量化するものである。この方法は、β−アレスチン／ＧＲＫに偏ったリガンドについての迅速なスクリーニングをもたらし得る、アゴニストおよびアンタゴニストをハイスループットスクリーニングするための蛍光プレートリーダーとの使用に適用し得る。β−アレスチン／ＧＲＫ機能は、７ＴＭＲの全様式、例えば１型ＰＴＨ受容体について測定することができる。
【０２０２】
β−アレスチンの機能を測定するために用いることができる他のアッセイには、受容体／β−アレスチン共免疫沈降、受容体／β−アレスチン架橋、受容体／β−アレスチンＢＲＥＴ、受容体／β−アレスチン生体分子断片化相補性、受容体／β−アレスチン移行画像化、受容体内在化、受容体リン酸化、およびβ−アレスチン関連リン酸化ＥＲＫが含まれる（Ｖｉｏｌｉｎら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｓｃｉ．２８巻（８号）：４１６〜４２２頁（２００７年））。上述したように、Ｇタンパク質介在性のシグナル伝達の機能を測定するために用いることができるアプローチには、アデニル酸シクラーゼおよび／または環状ＡＭＰの蓄積についてのアッセイ（ＩＣＵＥ（ＤｉＰｉｌａｔｏら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０１巻：１６５１３頁（２００４年））、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＧＴＰａｓｅアッセイ、ＧＴＰガンマＳローディングアッセイ、細胞内カルシウム蓄積アッセイ、ホスホチジルイノシトール加水分解アッセイ、ジアシルグリセロール生産アッセイ（例えば、液体クロマトグラフィー、ＦＲＥＴに基づいたＤＡＧＲアッセイ（Ｖｉｏｌｉｎら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １６１巻：８９９頁（２００３年））、受容体−Ｇタンパク質のＦＲＥＴアッセイ、受容体の立体構造の変化の測定、受容体／Ｇタンパク質共免疫沈降、ＥＲＫの活性化、ホスホリパーゼＤの活性化、イオンチャネルの活性化（電気生理学的方法を含む）、および環状ＧＭＰの変化が含まれる。（例えば、Ｔｈｏｍｓｅｎら、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６巻：６５５〜６６５頁（２００５年）を参照されたい。）
アッセイ、すなわち、ｃＡＭＰの生産などの選択されたあらゆるアッセイによって、リガンドのあらゆるセットを順位付けることができる。例えば、ＰＴＨ１ＲからのｃＡＭＰの活性化について１００個の組成物または化合物を試験し、その組成物または化合物を、対照と比較してｃＡＭＰ経路を活性化させるそれらの能力に基づいて、１から１００までランク付けすることができる。このプロセスは、例えばアレスチンの動員などの１つまたは複数の異なるアッセイについて反復することができ、これにより、異なるランク付けがされる。この方法において、所与の化合物または組成物が様々なアッセイにおいて機能する能力に相当する、その化合物または組成物についてのプロフィールを得ることができる。
【０２０３】
特定の実施形態において、分子は、β−アレスチンアゴニストであるがＧタンパク質の活性化についてのアンタゴニストまたはインバースアゴニストではないものが選択され、このことは、ｃＡＭＰの形成および／または膜を介したカルシウム流出のアッセイを低減させるが、ＥＲＫ１／２の活性化および／または受容体へのβ−アレスチンの動員を増大させることを意味している。
【０２０４】
特定の実施形態において、受容体が２３位でヒスチジンおよびアルギニンの突然変異を有するようになる、天然に存在する突然変異である、突然変異ＰＴＨ１Ｒ受容体であるＨ２３ＲＰＴＨＲが用いられるが、それは、この受容体が基底レベルで部分的に活性化されており、インバースアゴニストが見られ得るからである。
【０２０５】
骨密度および骨量を測定することができる。骨の単位体積当たりのカルシウムヒドロキシアパタイトの量の定量的測定は、二重エネルギーＸ線吸収法（ＤＥＸＡ）によって行うことができる。ＤＥＸＡは、２つの異なるエネルギーのＸ線を用いて、典型的には腰椎、臀部、または上腕のＸ線を撮る方法である。これらの２つの異なるＸ線の組織透過を比較し、その比率により、３次元領域にわたる骨ミネラルの２次元投影が得られる。骨密度もまた、高解像度のＣＴスキャンによって決定することができ、このスキャンはまた、骨の体積ならびに骨梁の数および厚さ、または皮質骨の外周および厚さなどの微細構造情報も提供するものである。
【０２０６】
骨梁は、海面骨の髄腔を占める骨板の多孔質のネットワークからなり、最少重量で、体重を支える強度をもたらすものである。皮質骨は、体重を支える四肢に強度をもたらす、骨の密度の高い外層である。骨粗しょう症では、骨梁の損失があり、その結果、骨梁が減少し薄くなり、圧縮強度および弾力性が低減し、かつ、中でも腰椎、骨盤、および大腿骨頚の、骨折の傾向が増す。骨の微細構造、例えば、骨の体積、骨梁の数、骨梁の厚さ、皮質骨の外周、および皮質骨の厚さを、高解像度のＣＴスキャンで測定することができる。
【０２０７】
骨の形成および代謝回転は、血液および尿の試料において骨芽細胞による骨形成および破骨細胞による骨分解のマーカーを測定することにより、臨床的状況において推定することができる。骨形成の速度は、オステオカルシン、骨のアルカリホスファターゼ、プロコラーゲン１のＣ末端およびＮ末端のプロペプチドなどの、骨芽細胞活性のマーカーをアッセイすることにより測定される。骨分解の速度は、デオキシピリドリン架橋（ＤＰＤ）、コラーゲン１のＣ末端およびＮ末端のテロペプチドなどの、破骨細胞活性のマーカーを測定することにより評価される。これらの測定値は、治療に対する応答の代替マーカーとして臨床的に用いられることが多い。
【０２０８】
７回膜貫通受容体を偏ったリガンドと接触させる工程を含む、７回膜貫通受容体を調節する方法が開示される。
【０２０９】
また、偏ったリガンドが７回膜貫通受容体のβ−アレスチン経路を選択的に活性化し得る方法も開示される。
【０２１０】
また、７回膜貫通受容体が副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）／ＰＴＨ関連タンパク質受容体（ＰＴＨ１Ｒの効果）を含む方法も開示される。
【０２１１】
また、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）／ＰＴＨ関連タンパク質受容体（ＰＴＨ１Ｒ）がＩ型受容体である方法も開示される。
【０２１２】
また、ＰＴＨ１Ｒの活性化によりＯＰＧの増大およびＲＡＮＫＬの低減が生じる方法も開示される。
【０２１３】
また、ＰＴＨ１Ｒの活性化がＤＰＤ生産の増大を生じさせない方法も開示される。
【０２１４】
また、７回膜貫通受容体のβ−アレスチン経路が７回膜貫通受容体のＧタンパク質経路よりも活性化される方法も開示される。
【０２１５】
また、偏ったリガンドが同化的な骨形成を誘発する方法も開示される。
【０２１６】
また、偏ったリガンドが生物の骨ミネラル密度を増大させる方法も開示される。
【０２１７】
また、偏ったリガンドが骨梁形成を増大させる方法も開示される。
【０２１８】
また、偏ったリガンドが、対照と比較して骨芽細胞の活性を増大させるが、一方で、ほぼ同時に、破骨細胞の活性は増大させない方法も開示される。
【０２１９】
また、偏ったリガンドが骨芽細胞および破骨細胞の活性を結びつけない方法も開示される。
【０２２０】
また、偏ったリガンドが、破骨細胞形成の増大のマーカーの産生を増大させることなく、骨芽細胞による骨形成のマーカーを増大させる方法も開示される。
【０２２１】
また、偏ったリガンドが対照と比較して破骨細胞の動員を増大させない方法も開示される。
【０２２２】
また、偏ったリガンドが対照と比較して破骨細胞の分化を増大させない方法も開示される。
【０２２３】
偏ったリガンドが（Ｄ−Ｔｒｐ１２、Ｔｙｒ３４）−ＰＴＨ（７−３４）を含む方法も開示される。
【０２２４】
また、偏ったリガンドがＰＴＨと比較して、ＥＲＫ１／２の活性化を増大させるが、ヘテロ三量体Ｇタンパク質の活性化を増大させない方法も開示される。
【０２２５】
また、偏ったリガンドがＰＴＨと比較して、ＭＡＰキナーゼの活性化を増大させるが、ヘテロ三量体Ｇタンパク質の活性化を増大させない方法も開示される。
【０２２６】
また、７回膜貫通受容体の調節を必要とする対象を同定する工程をさらに含む方法も開示される。
【０２２７】
また、対象が骨障害を有する方法も開示される。
【０２２８】
また、骨障害が骨粗しょう症である方法も開示される。
【０２２９】
また、７回膜貫通受容体の調節が、偏ったリガンドの調節を示すマーカーについて対象の生体流体を分析する工程によってモニターされる方法も開示される。
【０２３０】
また、生体流体が尿である方法も開示される。
【０２３１】
また、生体流体が血清である方法も開示される。
【０２３２】
また、マーカーがオステオカルシンである方法も開示される。
【０２３３】
また、マーカーが対照と比較して増大する方法も開示される。
【０２３４】
また、マーカーがデオキシピリジノリン（ＤＰＤ）である方法も開示される
また、マーカーが、偏っていないリガンドを用いた活性化を含む対照と比較して増大していない方法も開示される。
【０２３５】
また、偏っていないリガンドがＰＴＨを含む方法も開示される。
【０２３６】
組成物の活性を分析する方法であって、ａ）組成物をＧＰＣＲと接触させる工程、ｂ）ＧＰＣＲの第１のシグナル変換経路の活性化を決定し、第１の活性化の結果を生じさせる工程、ｃ）ＧＰＣＲの第２のシグナル変換経路の活性化を決定し、第２の活性化の結果を生じさせる工程を含み、第１の活性化の結果および第２の活性化の結果が、組成物の活性プロフィールを生成する方法が開示される。
【０２３７】
また、ＧＰＣＲがＰＴＨ１Ｒである方法も開示される。
【０２３８】
また、第１のシグナル変換経路がＧタンパク質経路である方法も開示される。
【０２３９】
また、第１のシグナル変換経路の活性化を決定する工程がｃＡＭＰの活性化をアッセイすることを含む方法も開示される。
【０２４０】
また、第２のシグナル変換経路がβ−アレスチン経路である方法も開示される。
【０２４１】
また、第２のシグナル変換経路の活性化を決定する工程がβ−アレスチンの動員をアッセイすることを含む方法も開示される。
【０２４２】
また、第２のシグナル変換経路の活性化を決定する工程がＥＲＫ１／２の活性化をアッセイすることを含む方法も開示される。
【０２４３】
また、ｄ）ＧＰＣＲを対照と接触させる工程、ｅ）ＧＰＣＲの第１のシグナル変換経路の活性化を決定し、第１の活性化の対照の結果を生じさせる工程、ｆ）ＧＰＣＲの第２のシグナル変換経路の活性化を決定し、第２の活性化の対照の結果を生じさせる工程をさらに含み、第１の活性化の対照の結果および第２の活性化の対照の結果が、組成物の活性プロフィールを生成する方法も開示される。
【０２４４】
また、第１の活性化の結果と第１の活性化の対照の結果とを比較する工程をさらに含む方法も開示される
また、第２の活性化の結果と第２の活性化の対照の結果とを比較する工程をさらに含む方法も開示される
また、所望の活性化プロフィールに基づいて組成物を選択する工程をさらに含む方法も開示される。
【０２４５】
また、所望の活性化プロフィールがβ−アレスチン経路の活性化およびＧタンパク質経路の活性化の低減を含む方法も開示される。
【０２４６】
また、対象が開示された組成物で治療される方法も開示される。また、対象が、本明細書において開示される１つまたは複数の障害について治療を必要とすると診断され、かつ／または治療プロセスの前もしくはその一部として障害について試験される方法も開示される。
【実施例】
【０２４７】
以下の実施例は、本明細書において特許請求される化合物、組成物、物品、装置、および／または方法がいかにして実施および評価されるかについての完全な開示および記載を当業者に提供するために提示されるものであり、そして純粋に例示的であることを意図したものであり、開示を限定することを意図したものではない。数（例えば、量、温度など）に関する正確性を確実にするよう努めているが、ある程度の誤差および偏差が説明される。別段の指示がない限り、部分は重量部であり、温度は℃であるかまたは周囲温度であり、圧力は大気圧であるかまたはそれに近いものである。
【０２４８】
（実施例１）
ａ）結果
（１）（Ｄ−Ｔｒｐ１２、Ｔｙｒ３４）−ＰＴＨ（７−３４）（ＰＴＨ−βａｒｒ）は、骨芽細胞における、Ｇタンパク質のシグナル伝達に依存しない、β−アレスチン介在性のＥＲＫ１／２の活性化を刺激する。
【０２４９】
ＰＴＨ−βａｒｒが天然の条件下で偏った応答を示すかどうかを試験するために、マウス初代骨芽細胞（ＰＯＢ）における、内因性ＰＴＨ１ＲのＰＴＨ（１−３４）およびＰＴＨ−βａｒｒによる刺激に応じたｃＡＭＰの蓄積（図１ａ）を試験した。ＷＴおよびβ−アレスチン２−／−のＣ５７ＢＬ／６マウスから単離したコンフルエントなＰＯＢ培養物において、β−アレスチン２−／−のＰＯＢにおける基底ｃＡＭＰレベルは、ＷＴのＰＯＢと比較して顕著に高かった。β−アレスチン２−／−細胞における基底ｃＡＭＰの増大は、ＰＴＨ１Ｒおよび／または他のＧタンパク質共役型７ＴＭＲのβ−アレスチン介在性の脱感作の低下に起因すると考えられる。
【０２５０】
ＷＴおよびβ−アレスチン２−／−の細胞の両方を１００ｎＭのＰＴＨ（１−３４）で５分間処理すると、ｃＡＭＰが強く増大した。５分間では、ＷＴおよびβ−アレスチン２−／−のＰＯＢの間で、生成されたｃＡＭＰに顕著な差はなかった。インバースアゴニストの活性と一致して、ＷＴのＰＯＢを１μＭのＰＴＨ−βａｒｒで処理するとｃＡＭＰは増大しなかったが、β−アレスチン２−／−のＰＯＢの処理は、上昇した基底ｃＡＭＰレベルを顕著に低減した（図１Ａ）。ＰＯＢ培養物をＰＴＨ（１−３４）またはＰＴＨ−βａｒｒで刺激すると、Ｇｑ／１１  ＰＩの加水分解を活性化しなかった（データは示していない）。
【０２５１】
ＰＴＨ（１−３４）およびＰＴＨ−βａｒｒで刺激されたＥＲＫ１／２  ＭＡＰキナーゼの活性化を、１００ｎＭのＰＴＨ（１−３４）または１μＭのＰＴＨ−βａｒｒで５分間処理した後に、ＷＴおよびβ−アレスチン２−／−のＰＯＢで評価した（図１ｂ）。ＷＴのＰＯＢにおいて、両方の作用物質はＥＲＫ１／２のリン酸化を基底に対して約３倍増大させた。β−アレスチン２−／−のＰＯＢはＷＴのＰＯＢと同程度にＰＴＨ（１−３４）に応答し、このことは、完全なアゴニストペプチドが、β−アレスチン２の不存在下で古典的なＧタンパク質依存性経路を介してＥＲＫ１／２を活性化し得ることを示している。対照的に、ＰＴＨ−βａｒｒはβ−アレスチン２−／−のＰＯＢにおいてＥＲＫ１／２を活性化することができず（図１Ｂ）、このことは、ＷＴのＰＯＢにおけるＰＴＨ−βａｒｒによるＥＲＫ１／２の活性化がβ−アレスチン介在性であり、Ｇタンパク質のシグナル伝達に依存していないことを示している。
【０２５２】
（２）β−アレスチン経路の断続的な活性化は、インビボで骨密度を増大させる。
【０２５３】
β−アレスチン２−／−マウスは、繁殖能力を有し、甚だしい表現型上の異常を有さない。さらに、骨格の形態またはサイズにおいて、６匹のＷＴマウスと比較して、β−アレスチン２−／−マウスのｘ線分析によって検出される甚だしい変化はなかった（データは示していない）。骨に対するＰＴＨの同化的効果の調節に対する、β−アレスチン介在性のシグナル伝達の寄与を試験するために、９週齢のＷＴマウスおよびβ−アレスチン２−／−マウスを、ＰＴＨ（１−３４）（４０ｍｇ／ｋｇ／日）、β−アレスチンに偏ったアゴニストであるＰＴＨ−βａｒｒ（４０ｍｇ／ｋｇ／日）（通常のｍｇ／ｋｇ／日である）、または媒体を断続的に（すなわち１日１回）ＩＰ注射することにより処置した。骨ミネラル密度（ＢＭＤ）の測定を、ベースラインで、および４から８週間にわたり連続的に得た（図２）。ベースラインでは、９週齢のβ−アレスチン２−／−マウスは、９週齢のＷＴマウスと比較して、顕著に低い腰椎ＢＭＤを有していた（ＷＴ  ０．０６７８ｇ／ｃｍ２±０．０００８、β−アレスチン２−／−０．０６４８ｇ／ｃｍ２±０．０００９、ｐ＝０．０１２）。ＷＴマウスまたはβ−アレスチン２−／−マウスの間で、全身のＢＭＤまたは大腿骨のＢＭＤに顕著な差はなかった。予想された通り、４週目および８週目に、ＰＴＨ（１−３４）で処置したＷＴマウスは、媒体で処置したマウスと比較して、腰椎および大腿骨のＢＭＤにおいて顕著な増大を示した（図２ＡおよびＣ）。初期の報告と一致して、ＢＭＤにおけるこれらの増大は、ＰＴＨ（１−３４）で処置したβ−アレスチン２−／−マウスにおいては見られなかった（図２ＢおよびＤ）。ＰＴＨ−βａｒｒ（４０ｍｇ／ｋｇ／日）、β−アレスチンに偏ったアゴニスト、およびＧタンパク質のシグナル伝達の阻害剤で処置したＷＴマウスもまた、腰椎においてＢＭＤの顕著な増大を示した（図２Ａ）。ＰＴＨ−βａｒｒでの処置は、ＷＴ動物における大腿骨のＢＭＤには顕著に影響しなかった（図２Ｃ）。β−アレスチン２−／−マウスにＰＴＨ−βａｒｒを投与すると、腰椎および大腿骨のＢＭＤの両方が低減した（図２Ｄ）。ヘテロ三量体Ｇタンパク質の活性化とは関係なく、ＰＴＨ−βａｒｒはＷＴにおいてＰＴＨ１Ｒシグナルのサブセットを生じさせるがβ−アレスチン−／−細胞において生じさせないため、これらのデータは、β−アレスチンへのＰＴＨ１Ｒ受容体の「結合」により伝達される骨代謝におけるＰＴＨ−βａｒｒ誘発性の変化と一致する。ＰＴＨ−βａｒｒで処置したβ−アレスチン２−／−マウスにおけるＢＭＤの低減は、Ｇタンパク質介在性のシグナル伝達の阻害およびβ−アレスチン２介在性のシグナル伝達の不存在に起因すると考えられる。これらの結果をまとめると、骨梁におけるＰＴＨ１Ｒで刺激された同化的効果が、個別のβ−アレスチン介在性の構成要素およびＧタンパク質介在性の構成要素を有していることが示される。
【０２５４】
（３）骨梁の量および微細構造に対するＰＴＨ１Ｒで刺激されたβ−アレスチン介在性シグナル伝達の寄与。
【０２５５】
腰椎の定量的なマイクロＣＴ（ｑＣＴ）測定を、媒体、ＰＴＨ（１−３４）、またはＰＴＨ−βａｒｒで処置した８週間後に、ＷＴおよびβ−アレスチン２−／−のマウスから得た。媒体で処置したＷＴマウスとβ−アレスチン２−／−マウスとの間で、全体的な骨梁密度（ＢＶ／ＴＶ）に顕著な差はなかった（図３Ａ）。しかし、骨梁の微細構造に関しては、媒体で処置した８週間後、β−アレスチン２−／−マウスはＷＴマウスと比較して骨梁の厚さが顕著に大きく（図３Ｂ）、ＷＴマウスと比較して骨梁（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ）の数が顕著に少なかった（図３ｃ）。偽処置した動物における骨梁の構造におけるこれらの差は、１）β−アレスチン介在性のシグナル伝達の低下、および２）β−アレスチンの脱感作の低下によるＧタンパク質のシグナル伝達の増大という、２つの潜在的に寄与するプロセスを反映している。
【０２５６】
腰椎のマイクロｑＣＴ分析により、８週間にわたりＰＴＨ（１−３４）を毎日投与して処置したＷＴマウスが、媒体で処置した動物と比較して、顕著に増大した腰椎の骨梁密度を有することが示された（図３Ａ）。とりわけ、ＰＴＨ（１−３４）は、骨梁の厚さ（図３Ｂ）および骨梁の数（図３Ｂ）の顕著な増大を誘発した。８週間後、Ｇタンパク質介在性のシグナル伝達を阻害するがβ−アレスチン介在性のシグナル伝達を活性化させる偏ったアゴニストであるＰＴＨ−βａｒｒは、媒体で処置した動物と比較して、ＷＴマウスにおいて腰椎の骨梁密度の顕著な増大を誘発した（図３Ａ）。さらに、ＰＴＨ−βａｒｒはまた、ＷＴマウスにおいて、骨梁の厚さ（図３Ｂ）および骨梁の数（図３Ｃ）の顕著な増大を誘発した。
【０２５７】
骨梁形成に対するＰＴＨ−βａｒｒの同化的効果がβ−アレスチン介在性のシグナル伝達メカニズムの活性化を必要とするかどうかを試験するために、β−アレスチン２−／−マウスをまた、ＰＴＨ（１−３４）およびＰＴＨ−βａｒｒで処置した。ＰＴＨ（１−３４）で処置したβ−アレスチン２−／−マウスは、媒体で処置したβ−アレスチン２−／−マウスと比較して、骨梁密度の正味の増大を示した。しかし、ＰＴＨ（１−３４）で処置したβ−アレスチン２−／−マウスにおける骨梁密度のパーセントの増大（１７％）は、ＷＴ処置マウスにおけるもの（３８％）よりも少なかった（図３Ａ）。ＰＴＨ（１−３４）で処置したβ−アレスチン２−／−マウスは、媒体で処置したβ−アレスチン２−／−マウスと比較して、骨梁の厚さが顕著に増大したが（図３Ｂ）、骨梁の数は顕著に増大しなかった（図３Ｃ）。ＰＴＨ（１−３４）は、Ｇタンパク質／ｃＡＭＰ依存性およびβ−アレスチン依存性のシグナルの両方を誘発することが知られている。したがって、β−アレスチン２−／−マウスの骨梁の微細構造に対するＰＴＨ（１−３４）での刺激の効果は、ＰＴＨ（１−３４）で刺激されたおよび／または過剰なＧタンパク質シグナル伝達の低下に起因し得る。
【０２５８】
ＷＴ動物におけるＰＴＨ−βａｒｒの同化的効果は、ＰＴＨ−βａｒｒで処置したβ−アレスチン２−／−マウスにおいては消失した。媒体で処置したβ−アレスチン２−／−マウスと比較して、ＰＴＨ−βａｒｒで処置したマウスは、骨梁の体積（図３Ａ）および骨梁の厚さ（図３Ｂ）の顕著な減少を示した。ＰＴＨ  βａｒｒで処置したＷＴマウスにおいて見られる骨梁の数の増大もまた、β−アレスチン２−／−マウスにおいては見られなかった（図３ｃ）。β−アレスチン２−／−マウスにおける同化的効果の不存在は、ＰＴＨ−βａｒｒの効果がβ−アレスチン依存性であることを示している。さらに、骨梁密度および骨梁の厚さの減少は、ノックアウト動物におけるβ−アレスチン依存性のシグナル伝達の低下と、ＰＴＨ−βａｒｒによる内因性のＰＴＨで刺激されたＧタンパク質依存性のシグナル伝達事象の阻害との両方によって説明することができる。
【０２５９】
最後に、皮質骨に対するＰＴＨ（１−３４）およびＰＴＨ−βａｒｒの効果を、大腿骨中央の骨幹部のｑＣＴで試験した（図３ＤおよびＥ）。媒体で処置した動物を８週間後に比較すると、ＷＴマウスとβ−アレスチン２−／−マウスとの間で骨膜の外周において差は示されなかった。しかし、β−アレスチン２−／−マウスは、媒体で処置したＷＴマウスよりも大きな骨幹中央部の皮質骨の厚さを有していた。ＰＴＨ（１−３４）の８週間後、ＷＴマウスは大腿骨の骨膜の外周の増大および皮質骨の厚さの増大を示した。偏ったアゴニストであるＰＴＨ−βａｒｒは、ＷＴマウスにおけるこれらの皮質骨の指数に影響を有さなかった。β−アレスチン２−／−マウスにおいては、ＰＴＨ（１−３４）は、骨膜の外周または皮質骨の厚さに対して顕著な効果を有さなかったが、ＰＴＨ−βａｒｒは、骨膜の外周および皮質骨の厚さを顕著に減少させた。ＷＴまたはβ−アレスチン−／−の骨内膜性の骨表面に対するＰＴＨ（１−３４）またはＰＴＨ−βａｒｒの顕著な効果はなかった（データは示していない）。
【０２６０】
（４）β−アレスチン２介在性のシグナル伝達により誘発される組織形態計測指数の変化
動的な組織形態計測データは、骨梁の形態のｑＣＴと一致した。８週間後、媒体で処置したβ−アレスチン２−／−マウスは、媒体で処置したＷＴよりも大きな骨芽細胞表面を有していたが（図４Ａ）、破骨細胞表面および類骨表面は、これらの２つの群において顕著には異ならなかった（図４ＢおよびＣ）。β−アレスチン介在性のシグナル伝達の選択的活性化により生じる同化的な骨形成と一致して、腰椎切片の定量的な組織形態計測分析は、ＰＴＨ（１−３４）またはＰＴＨ−βａｒｒで処置したＷＴマウスが、媒体で処置したそれらの対応物と比較して、増大した骨芽細胞表面（図４Ａ）および類骨（図４Ｃ）を有していたことを示す。予想された通り、ＰＴＨ（１−３４）で処置した動物において、破骨細胞表面が増大した。興味深いことに、ＰＴＨ−βａｒｒでの処置は、破骨細胞の動員に影響を有さなかった。ＰＴＨ−βａｒｒはＷＴマウスにおいて骨芽細胞活性を増大させるが、ＰＴＨ（１−３４）はβ−アレスチン２の不存在下における破骨細胞形成を促進し、ＰＴＨ−ｂａｒｒはそうではないという所見は、β−アレスチン依存性のシグナル伝達が骨芽細胞による骨形成を刺激するために十分であり得るが、骨芽細胞−破骨細胞の結びつきがＧタンパク質活性化を必要とするということを示す。
【０２６１】
（５）骨代謝の血清マーカーおよび尿マーカーに対するβ−アレスチン介在性のシグナル伝達の効果。
【０２６２】
ＷＴおよびβ−アレスチン２−／−のマウスにおけるＰＴＨ（１−３４）およびＰＴＨ−βａｒｒの投与の、代謝的効果に寄与する細胞メカニズムを明らかにするため、骨の代謝回転の血清マーカーおよび尿マーカーを評価した。骨形成の生化学的マーカーである基底血清オステオカルシンは、ＷＴとβ−アレスチン２−／−との間で顕著には異ならなかった（ＷＴ、１８４．０±９．０３８；β−アレスチン２−／−、２１０．６±１１．３６；ｐ＝０．０６８）。オステオカルシンは、媒体で処置したマウスと比較して、ＰＴＨ（１−３４）またはＰＴＨ−βａｒｒのいずれかで処置したＷＴマウスにおいて顕著に増大した（図５Ａ）。血清オステオカルシンはまた、媒体と比較して、ＰＴＨ（１−３４）で処置したβ−アレスチン２−／−マウスにおいて増大した。しかし、ＰＴＨ−βａｒｒで処置したβ−アレスチン２−／−マウスにおいては血清オステオカルシンに顕著な変化はなく、これによりさらに、骨に対するＰＴＨ−βａｒｒの同化的効果はβ−アレスチン依存性であるという考えが支持される。
【０２６３】
骨分解および骨吸収のマーカーである、２４時間の尿デオキシピリジノリン（ＤＰＤ）も測定した。媒体で処置したβ−アレスチン２−／−マウスは、媒体で処置したＷＴ対応物よりも顕著に高い尿ＤＰＤを有しており、このことは、ｂ−アレスチン２の不存在下での優れたベースラインの破骨細胞活性と一致する。尿ＤＰＤは、媒体で処置した動物と比較して、ＰＴＨ（１−３４）で処置したＷＴおよびβ−アレスチン２−／−のマウスの両方において顕著に増大した（図５Ｂ）。しかし、ＰＴＨ−βａｒｒは、媒体と比較して、ＷＴまたはβ−アレスチン２−／−のマウスにおいて、骨吸収の尿ＤＰＤマーカーに対して顕著な効果を有していなかった。ＷＴと比較した、ＰＴＨ（１−３４）で処置したβ−アレスチン２−／−マウスにおける尿ＤＰＤの排出の増大は、骨芽細胞−破骨細胞の結びつきが主に、β−アレスチン２の不存在下において脱阻害されるＧタンパク質依存性のメカニズムを介して仲介されるという仮説をさらに支持するものである。
【０２６４】
（６）異なるβ−アレスチン依存性およびＧタンパク質依存性の経路が、骨調節タンパク質遺伝子のＰＴＨ受容体に刺激された発現に寄与する。
【０２６５】
骨調節タンパク質のＰＴＨ１Ｒに刺激された転写に対するβ−アレスチン介在性のシグナル伝達の寄与を決定するために、頭蓋冠のＲＮＡを、ＰＴＨ（１−３４）、ＰＴＨ−βａｒｒ、または媒体で処置したＷＴおよびβ−アレスチン２−／−のマウスから単離した。オステオカルシンの遺伝子発現、ならびに、破骨細胞による骨吸収をそれぞれ活性化および阻害する、核因子κＢリガンドの受容体活性化因子（ＲＡＮＫＬ）およびオステオプロテグリン（ＯＰＧ）の遺伝子発現を、定量的ＲＴＰＣＲによって分析した（図６Ａ〜Ｃ）。
【０２６６】
媒体で処置した動物において、オステオカルシンのｍＲＮＡの発現は、ＷＴマウスと比較して、β−アレスチン２−／−マウスにおいて高く、このことは、ＷＴと比較してβ−アレスチン２−／−マウスにおいてＯｂ／Ｂｓが顕著に高いことを示す組織形態計測の結果と一致するものであった。骨形成で予想されたように、ＰＴＨ（１−３４）およびＰＴＨ−βａｒｒの両方が、ＷＴの処置動物において、媒体で処置したそれらの対応物と比較して、オステオカルシンのｍＲＮＡの発現の増大を誘発した（図６Ａ）。ＰＴＨ処置はまた、β−アレスチン２−／−マウスにおいてオステオカルシンの発現を顕著に増大させたが、ＰＴＨ−βａｒｒは、オステオカルシンの発現の減少を誘発した。
【０２６７】
破骨細胞活性の調節因子に関しては、ＲＡＮＫＬおよびＯＰＧのｍＲＮＡの発現が、ＷＴマウスと比較して、媒体で処置したβ−アレスチン２−／−マウスにおいて高かった。ＲＡＮＫＬのｍＲＮＡの存在度の増大は、ＷＴと比較して、媒体で処置したβ−アレスチン２−／−マウスにおいて観察された顕著に高い尿ＤＰＤと一致するものであった。ＰＴＨ（１−３４）のみが、ＷＴの処置動物において、媒体で処置したそれらの対応物と比較して、ＲＡＮＫＬおよびＯＰＧのインビボでの発現の増大を誘発した（図６Ａ）。ＰＴＨでの処置もＰＴＨ−βａｒｒでの処置も、β−アレスチン２−／−マウスにおいてＲＡＮＫＬまたはＯＰＧの発現に対して顕著な効果を有さなかった。
【０２６８】
（実施例２）
骨に対するＰＴＨ１ＲのＰＴＨ（１−３４）での刺激の同化的効果はまた、古典的なＧタンパク質−ｃＡＭＰシグナル伝達により仲介され、また、β−アレスチンにより仲介される、Ｇタンパク質の動員に依存しない異なるメカニズムが示された。さらに、ＰＴＨ１Ｒ刺激の骨吸収効果は、主にＧタンパク質依存性のメカニズムであり、β−アレスチン依存性ではないと考えられる。
【０２６９】
ＥＲＫ１／２への、Ｇタンパク質非依存性／β−アレスチン依存性の７ＴＭＲシグナル伝達を選択に刺激することが可能なリガンドはまた、合成アンジオテンシンアゴニストペプチドである［Ｓａｒ１、Ｉｌｅ４、Ｉｌｅ８］ＳＩＩを用いたＡＴ１Ａアンジオテンシン受容体系において記載されている。さらに、β２−アドレナリン受容体に対するカルベジロールおよびインバースアゴニストＩＣＩ１１８５５１、ならびにＶ２バソプレッシン受容体に対するＳＲ１２１４６３Ｂなどのアンタゴニストとして元々分類されているリガンドもまた、足場の組み立ておよびβ−アレスチン介在性のＭＡＰＫ活性化を促進することが示されている。これらの所見は、β−アレスチンの動員が７ＴＭＲのＧタンパク質の活性化に限られているわけではないことを示している。ここで示されるデータは、ＰＴＨ−βａｒｒが、骨芽細胞において、Ｇタンパク質依存性のシグナル伝達を阻害し得るがアレスチン依存性のシグナル伝達のＥＲＫ１／２リン酸化を活性化させる、ＰＴＨ１Ｒに対する偏ったアゴニズムを示している。
【０２７０】
しかしながら、β−アレスチン介在性シグナル伝達を優先的に活性化するが、同時にＧタンパク質の動員を阻害するＰＴＨ１Ｒリガンドを使用して、古典的なＧタンパク質シグナル伝達メカニズムが、ＰＴＨへのβ−アレスチン−／−マウスの骨格の応答の全体的に十分な原因となってはいないことを実証した。それどころか、β−アレスチンは、ＰＴＨ１Ｒ刺激に対する骨の同化反応に固有に寄与する、Ｇタンパク質刺激に依存しない、異なるシグナル伝達メカニズムを開始する。したがって、β−アレスチン−／−マウスで報告された、骨同化における弱化した応答は、実際には、過剰なＧタンパク質シグナル伝達ではなく、このβ−アレスチン介在性シグナル伝達事象の喪失に起因し得る。
【０２７１】
ＰＴＨ１Ｒに刺激されたＧタンパク質介在性のメカニズムおよびＧタンパク質非依存性／β−アレスチン介在性メカニズムは、骨代謝の異なる構成要素に異なって寄与し得る。β−アレスチン介在性シグナル伝達事象は、骨梁における同化的骨形成（特に、骨梁の数および厚さの増大）に主として関するが、ＰＴＨ１Ｒ刺激の骨吸収効果には寄与しないことが示される。
【０２７２】
Ｇタンパク質活性化に依存せずに、β−アレスチン介在性シグナル伝達を選択的に活性化する能力を有する、ＰＴＨ１Ｒに対する偏ったアゴニストであるＰＴＨ−βａｒｒが本明細書で開示され、これは、独特な生理学的プロフィールを有する。さらに、化合物は、Ｇタンパク質介在性経路を優先的に活性化するが、同時にβ−アレスチン依存性シグナル伝達経路に拮抗するＰＴＨ−ｂａｒｒとは反対の方向に偏り得る。
【０２７３】
【数１】
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【０２７４】
【数２】
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【０２７５】
【数３】
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【０２７６】
【数４】
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【０２７７】
【数５】
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【０２７８】
【数６】
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【０２７９】
【数７】
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【０２８０】
【数８】
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Ｍ．配列
【０２８１】
【化１】
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【０２８２】
【化２】
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【０２８３】
【化３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年12月10日(2009.12.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2010523585000001.app
【国際調査報告】
2010523585.tif 000025
2010523585.tif 000026