(57)【要約】本発明は、金属結合部分とターゲッティング部分とを組み合わせて用いる、メタロヒドロラーゼのスクリーニング方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
【化１】
2010512303.tif 000002
2010512303.tif 000003
2010512303.tif 000004
2010512303.tif 000005
からなる群から選択される式を有し、
上式で、
Ｌｎはリンカーであり；
ｎは０又は１であり；
ＭＢＭは金属結合部分である、
ＰＤＥ４酵素の阻害剤。
【請求項２】
【化２】
2010512303.tif 000006
【化３】
2010512303.tif 000007
【化４】
2010512303.tif 000008
からなる群から選択される式を有し、
上式で、
Ｌｎはリンカーであり；
ｎは、０又は１であり；
ＭＢＭは金属結合部分である、
ＰＤＥ４酵素の阻害剤。
【請求項３】
【化５】
2010512303.tif 000009
からなる群から選択される式を有し、
上式で、
Ｌｎはリンカーであり；
ｎは、０又は１であり；
ＭＢＭは金属結合部分である、
アデノシンデアミナーゼ酵素の阻害剤。
【請求項４】
【化６】
2010512303.tif 000010
2010512303.tif 000011
2010512303.tif 000012
2010512303.tif 000013
からなる群から選択される式を有し、
上式で、
Ｌｎはリンカーであり；
ｎは０又は１であり；
ＭＢＭは金属結合部分である、
アンジオテンシン変換酵素の阻害剤。
【請求項５】
【化７】
2010512303.tif 000014
2010512303.tif 000015
からなる群から選択される式を有し、
上式で、
Ｌｎはリンカーであり；
ｎは、０又は１であり；
ＭＢＭは金属結合部分である、
カルシニューリン酵素の阻害剤。
【請求項６】
【化８】
2010512303.tif 000016
2010512303.tif 000017
2010512303.tif 000018
2010512303.tif 000019
（Ｒ１、Ｒ２は以下の組合せ
【表１】
2010512303.tif 000020
【化９】
2010512303.tif 000021
【化１０】
2010512303.tif 000022
【化１１】
2010512303.tif 000023
からなる群から選択される式を有し、
上式で、
Ｌｎはリンカーであり；
ｎは、０又は１であり；
ＭＢＭは金属結合部分である、
メタロ−β−ラクタマーゼ酵素の阻害剤。
【請求項７】
【化１２】
2010512303.tif 000024
からなる群から選択される式を有し、
上式で、
Ｌｎはリンカーであり；
ｎは０又は１であり；
ＭＢＭは金属結合部分である、
ＰＤＥ３酵素の阻害剤。
【請求項８】
【化１３】
2010512303.tif 000025
2010512303.tif 000026
からなる群から選択される式を有し、
上式で、
Ｌｎはリンカーであり；
ｎは０又は１であり；
ＭＢＭは金属結合部分である、
ＰＤＥ５酵素の阻害剤。
【請求項９】
【化１４】
2010512303.tif 000027
からなる群から選択される式を有し、
上式で、
Ｌｎはリンカーであり；
ｎは０又は１であり；
ＭＢＭは金属結合部分である、
腎臓ジペプチダーゼ酵素の阻害剤。
【請求項１０】
【化１５】
2010512303.tif 000028
からなる群から選択される式を有し、
上式で、
Ｌｎはリンカーであり；
ｎは０又は１であり；
ＭＢＭは金属結合部分である、
ウレアーゼ酵素の阻害剤。
【請求項１１】
ＭＢＭが、スルホニル部分、カルボニル部分、硫黄含有部分、窒素含有部分、リン含有部分、１個のヘテロ原子を含む５員芳香環、２個のヘテロ原子を含む５員芳香環、３個のヘテロ原子を含む５員芳香環、４個のヘテロ原子を含む５員芳香環、１個のヘテロ原子を含む５員非芳香環、２個のヘテロ原子を含む５員非芳香環、ヘテロ原子を含まない６員芳香環、１個のヘテロ原子を含む６員芳香環、２個のヘテロ原子を含む６員芳香環、３個のヘテロ原子を含む６員芳香環、１個のヘテロ原子を含む６員非芳香環及び２個のヘテロ原子を含む６員非芳香環からなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれかに記載の阻害剤。
【請求項１２】
ＭＢＭが、
【化１６】
2010512303.tif 000029
2010512303.tif 000030
2010512303.tif 000031
2010512303.tif 000032
からなる群から選択され、
上式で、
Ｒは、任意選択のリンカー又はＭＢＭとの結合点であり；
Ｘは、任意選択の置換基である、
請求項１、３〜１０のいずれかに記載の阻害剤。
【請求項１３】
ＭＢＭが、
【化１７】
2010512303.tif 000033
2010512303.tif 000034
2010512303.tif 000035
2010512303.tif 000036
からなる群から選択され、
上式で、
Ｒは、任意選択のリンカー又はＭＢＭとの結合点であり；
Ｘは、任意選択の置換基である、
請求項２に記載の阻害剤。
【請求項１４】
リンカーがＣ１−Ｃ６アルキル部分である、請求項１、３〜１３のいずれかに記載の阻害剤。
【請求項１５】
Ｃ１−Ｃ６アルキル部分が置換されたアルキル部分である、請求項１４に記載の阻害剤。
【請求項１６】
リンカーがＣ３−Ｃ６の直鎖状又は分枝状のアルキル部分である、請求項２に記載の阻害剤。
【請求項１７】
Ｃ３−Ｃ６アルキル部分が置換されたアルキル部分である、請求項１６に記載の阻害剤。
【請求項１８】
請求項１〜１３のいずれかに記載の阻害剤と薬学的担体とを含む、医薬組成物。
【請求項１９】
メタロヒドララーゼ阻害剤のスクリーニング方法であって、
ａ）ｉ）ターゲティング部分；
ii）金属結合部分（ＭＢＭ）；及び
iii）リンカー
を含む候補阻害剤を提供することと、
ｂ）前記阻害剤候補を前記メタロヒドロラーゼと接触させることと、
ｃ）前記メタロヒドロラーゼの活性を判定することと
を含む方法。
【請求項２０】
メタロヒドロラーゼを阻害する方法であって、前記メタロヒドロラーゼを請求項１〜１３のいずれかに記載の阻害剤と接触させることを含む方法。
【請求項２１】
メタロヒドロラーゼ関連障害を治療する方法であって、請求項１〜１３のいずれかに記載の組成物、そのプロドラッグ又は塩を投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国特許法第１１９（ｅ）条に基づき、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、どちらも２００６年６月１２日に出願の米国特許出願第６０／８１３，１０５号明細書及び６０／８１３，１１７号明細書の権益を主張する。
【０００２】
本発明は、金属結合部分をターゲティング部分と組み合わせて用いるメタロヒドロラーゼ阻害剤のスクリーニング方法を対象とする。
【背景技術】
【０００３】
ヒドロラーゼは、様々な化学結合の加水分解を触媒する。それらは、ＥＣ番号分類ではＥＣ３と分類される。ヒドロラーゼの１つの群は、少なくとも１つの金属イオンを含むメタロヒドロラーゼ類である。この群のいくつかの例示的な酵素は、アデノシンデアミナーゼ、アンジオテンシン変換酵素、カルシニューリン、メタロβラクタマーゼ、ＰＤＥ３、ＰＤＥ４、ＰＤＥ５、腎臓ジペプチダーゼ及びウレアーゼである。
【０００４】
アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ、Adenosine deaminase）は、それぞれ、イノシン及びデオキシイノシンへのアデノシン及びデオキシアデノシンの不可逆的脱アミノを触媒するプリン代謝における鍵酵素である。ＡＤＡはすべての哺乳動物細胞に存在し、多種多様な微生物、植物及び無脊椎動物でも見出された。ＡＤＡは、リンパ系の正常な発達のために必要とされる。ＡＤＡの欠乏は、重度の複合免疫不全（ＳＣＩＤ、Severed Combined Immunodeficiency）など様々な程度の免疫不全をもたらす。Cristalli at al., Medical Research Review. 21: 105-28 (2001)。免疫不全の代謝的基礎は、ＡＤＡ基質アデノシン及び２’−デオキシアデノシンの蓄積に対するリンパ球の感受性と関係する可能性が高い。Blackburn and Kellems, Advance in Immunology. 86: 1-41 (2005)。さらに、ＡＤＡ阻害剤は、毛様細胞性白血病で有益であることが示された（ペントスタチン；Ann Pharmacother. 1992 Jul-Aug; 26(7-8): 939-47を参照）
【０００５】
アンジオテンシンＩ変換酵素（ＡＣＥ、Angiotensin-I-converting enzyme）は、デカペプチドアンジオテンシンＩのカルボキシル末端からジペプチドを切断して強力な昇圧剤（血管収縮剤）アンジオテンシンＩＩを生成する、塩化物依存性金属酵素である。それは、２つのカルボキシ末端ジペプチドの連続除去によって、血管拡張剤ブラジキニンの不活性化もする。ヒトでは単一遺伝子によってコードされる２つの形態のＡＣＥ、即ち、体性ＡＣＥ（ｓＡＣＥ、somatic ACE）及び胚又は精巣のＡＣＥ（ｇＡＣＥ、germinal or testicular ACE）がある。ＡＣＥ遺伝子の構造は、遺伝子重複の結果であり、Ｎ及びＣ領域は、配列が類似している。各領域は、コンセンサス亜鉛結合モチーフ（一文字のアミノ酸コードでHEXXHであり、Ｘは任意のアミノ酸である）及び同じく亜鉛と結合するカルボキシル末端により近いグルタミンを特徴とする触媒活性部位を含む。ＡＣＥ及びその同族体は、したがって、Ｍ２グルジンシン（ｇｌｕｚｉｎｃｉｎ）ファミリーを構成する。ＡＣＥ同族体は、チンパンジー、ウシ、ウサギ、マウス、ニワトリ、キンギョ、デンキウナギ、イエバエ、カ、ツノサシバエ、カイコ、キイロショウジョウバエ及び線虫を含む他の動物種、並びに細菌キサントモナス（Xanthomonas）属の種及びShewanella oneidensisでも見出されている。ＡＣＥの１つのヒト同族体ＡＣＥ２が同定され、心機能の必須の調節因子であることが示された。単一の亜鉛結合性触媒領域を含み、カルボキシ末端の疎水性又は塩基性の残基を好むカルボキシペプチダーゼであり、ＡＣＥ阻害剤によって影響されないという点で、それはＡＣＥとは異なる。アンジオテンシンＩ及びII、並びに他の多数の生物活性ペプチドはＡＣＥ２の基質であるが、ブラジキニンはそうではない。Riordan, Genome Biology. 4: 225 (2003)。
【０００６】
カルシニューリンは、セリン／スレオニンタンパク質ホスファターゼファミリーのメンバーであるカルシウム／カルモジュリン依存性のセリン／スレオニンタンパク質ホスファターゼであり、マウス、ラット、ウシ及びヒトなどの哺乳動物、並びに酵母虫、ショウジョウバエ及びカエルなどの他の多くの下等真核生物種で見出されている。それは、２つのサブユニット、ＣｎＡ及びＣｎＢからなるヘテロダイマーである。ＣｎＡは触媒サブユニットであり、触媒領域、ＣｎＢ結合領域並びに、カルモジュリン結合領域及び自己抑制性領域からなるＣ末端調節領域からなる。ＣｎＡは、１個のＺｎ２＋及び１個のＦｅ３＋を含む。ＣｎＢはＣａ２＋結合調節サブユニットであり、４個のＣａ２＋を含む。Rothermel TCM. 13: 15-21(2003)、Chan et al., PNAS. 102: 13075-080 (2005)。カルシニューリンは、Ｃａ２＋依存性真核シグナル伝達経路での主要なプレーヤーであり、Ｔ細胞活性化、シナプス可塑性、ニューロンのアポプトーシス、発達、骨格及び筋肉の遺伝子調節、並びに心肥大などの多くの生理過程に関与する。細胞内カルシウムの変化は、カルシニューリンへのカルシウムとカルモジュリンの結合を促進してそれを活性化する。活性化カルシニューリンは活性化Ｔ細胞核内因子（ＮＦＡＴ、nuclear factor of activated T cell）を脱リン酸化し、細胞質から核へのその移動を促進し、そこでＮＦＡＴは他の転写因子の発現を調節する。大部分はそれが２つの重要な免疫抑制剤、ＦＫ５０６及びシクロスポリンＡ（ＣｓＡ、cyclosporine A）の標的であるという画期的な発見のために、カルシニューリンが１９７９年に最初に単離されて以来、それについて熱心な研究がなされた。ＦＫ５０６及びＣｓＡは、特定の細胞イムノフィリン（それぞれ、ＦＫ５６０結合タンパク質（ＦＫＢＰ、FK 560 binding protein）及びサイクロフィリンＡ（ＣｙｐＡ、cyclophilin A））と錯体を形成し、次にカルシニューリン上の複数の部位と結合することによって機能する。ＣｙｐＡ−ＣｓＡ又はＦＫＢＰ−ＦＫ５０６の結合はカルシニューリンによる活性化Ｔ細胞核内因子（ＮＦＡＴ）のカルシウム依存性脱リン酸を抑制し、このように、Ｔ細胞受容体によって媒介されるサイトカイン転写及びＴ細胞活性化をブロックする。しかし、ＣｙｐＡ−ＣｓＡ又はＦＫＢＰ−ＦＫ５０６と錯体を形成したカルシニューリンの結晶構造は、活性部位残基Ａｒｇ１２２がイムノフィリン及び免疫抑制成分のいずれからも少なくとも１０Ａである、ＣｎＢの部分露出触媒部位を明らかにする。Chan et al., PNAS 2005, 102: 13075-080を参照。このように、錯体は、カルシニューリン基質が活性部位に結合することを立体配置的に阻止することによって、カルシニューリン活性を阻害している。Griffith et al., Cell, 82: 507-522 (1995)。
【０００７】
βラクタマーゼは、ペニシリン、セファロスポリン及びカルバペネムなどのβ−ラクタム抗生物質のβ−ラクタム環の開放及び加水分解を触媒し、効果的に抗生物質の活性を破壊し、これらの薬剤の存在下での細菌の生存を可能にする。これは、グラム陰性菌におけるβ−ラクタム抗生物質に対する耐性の主要なメカニズムである。配列、基質特異性及び動態力学的挙動に従ってＡ、Ｂ、Ｃ及びＤに分類される４群があり、分類群Ａ（ペニシリナーゼ型）が最も一般的である。βラクタマーゼの遺伝子は細菌に広く分布し、グラム陰性生物ではしばしば伝達性プラスミド上に位置するが、同等の染色体遺伝子が２、３の種で見出されている。分類群Ａ、Ｃ及びＤのβラクタマーゼは、セリンを利用するヒドロラーゼである。分類群Ｂの酵素はその代わりに触媒亜鉛中心を利用し、それらの活性のために１つ又は２つの亜鉛イオンを必要とする。Sandanayaka and Prashad, Current Medicinal Chemistry, 9: 1145-65 (2002)；Daidmon et al., J. Biol. Chem., 278: 29240-51 (2003)。
【０００８】
サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）は、第２メッセンジャー環状ＡＭＰ及び環状ＧＭＰを、対応する５’ヌクレオチドモノホスファートに加水分解する金属酵素である。ＰＤＥ酵素の役割は、ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰの細胞内レベルを調節することである。特定された１１個のＰＤＥ酵素ファミリー（ＰＤＥ１〜ＰＤＥ１１）がある。これらは同義遺伝子から誘導することができ、多くはいくつかのアイソフォームを生み出すことができるので、現在、５０個を超える既知のＰＤＥ酵素が存在する。これらの酵素はホモダイマーとして存在し、異なるファミリー間で構造類似性が存在する。しかし、それらは、環状ヌクレオチドに対する選択性、阻害剤及び活性化因子に対する感受性、生理的役割及び組織分布を含むいくつかの点で異なる。
【０００９】
ＰＤＥ３環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼはｃＡＭＰ及びｃＧＭＰを加水分解し、それによってｃＡＭＰ及びｃＧＭＰによって媒介されるシグナル伝達を調整する。Shakur et al., J. Biol. Chem. 275: 38749-61 (2000)。これらの酵素は、心臓及び血管の筋細胞の収縮及び弛緩の調節で、主要な役割を果たす。細胞内のｃＡＭＰ及びｃＧＭＰ含量を高くするＰＤＥ３阻害剤は、心臓の筋細胞でのｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫ−Ａ、cAMP-dependent protein kinase）の活性化に起因する変力効果、及び、血管の筋細胞でのｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫ-Ｇ、cGMP-dependent protein kinase）の活性化に起因する血管拡張効果を有する。Shakur et al., Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 66: 241-77 (2000)。ＰＤＥ３は、心臓及び血管の筋細胞の収縮及び弛緩、血小板凝集、脂肪細胞でのインスリンに対する抗脂肪分解性反応、膵臓β細胞によるインスリン分泌並びに卵母細胞の成熟の調節に関与する。２つのＰＤＥ３遺伝子、ＰＤＥ３Ａ及びＰＤＥ３Ｂがある。ＰＤＥ３Ａは、心臓及び血管の筋細胞並びに血小板で主に発現される。ＰＤＥ３Ｂは、主に脂肪細胞、肝細胞及び膵細胞で（しかし、血管の筋細胞でも）発現され、選択的スプライシングに起因する３つのアイソフォームを有する。ＰＤＥ３Ａ１はヒト心筋からクローニングされ、ＰＤＥ３Ａの１６個のエキソンをすべて含む。ＰＤＥ３Ａ２は大動脈筋細胞からクローニングされ、エキソン１の開始部位から転写される。ＰＤＥ３Ａ３は胎盤からクローニングされ、エキソン３及び４の間の開始部位から転写される。本明細書でその全体が明示的に組み込まれる米国特許出願公開第２００３０１５８１３３号明細書。
【００１０】
ＰＤＥ４酵素はｃＡＭＰを選択的に加水分解し、非常に低いｃＧＭＰ親和性を有する。ＰＤＥ４の４つの遺伝子生成物（ＰＤＥ４Ａ〜ＰＤＥ４Ｄ）が存在し、複数のスプライス変異体を有する。ＰＤＥ４Ａ、ＰＤＥ４Ｂ及びＰＤＥ４Ｄは、Ｔ細胞及びＢ細胞、単球、マクロファージ、好中球並びに好酸球を含む多くの種類の炎症性及び免疫性の細胞で特に豊富である。ＰＤＥ４Ａ、ＰＤＥ４Ｂ及びＰＤＥ４Ｄは、ほとんどの炎症性細胞で支配的なｃＡＭＰ加水分解性ＰＤＥであり、一般に、ｃＡＭＰの細胞内増加は広範囲の抗炎症効果と関連している。Banner and Trevethick, Trends in Pharmacological Science 25: 8 (2004)を参照。
【００１１】
ＰＤＥ５はｃＧＭＰ特異ＰＤＥであり、近年、重要な治療標的であると認められた。それは、ｃＧＭＰの切断を触媒する保存されたＣ末端の亜鉛含有触媒領域、及び、２つのＧＡＦ領域リピートを含むＮ末端調節部分で構成される。各ＧＡＦ領域はｃＧＭＰ結合部位を含み、１つは高親和性であり、他はより低い親和性である。ＰＤＥ５活性は、高親和性及び低親和性のｃＧＭＰ結合部位へのｃＧＭＰの結合と、続いて起こる、両部位が塞がっている場合だけ起こるリン酸化を通して調節される。Thomas et al. J, Biol. Chem. 265, 14971-14978 (1990)。ＰＤＥ５は、血小板、血管及び内臓の平滑筋並びに骨格筋を含むいくつかの組織で、様々な濃度で見られる。このタンパク質は、勃起性の海綿体組織の平滑筋におけるｃＧＭＰレベルの重要な調節因子である。勃起の生理機構には、性的刺激の間の、海綿体内での一酸化窒素（ＮＯ）の放出が含まれる。ＮＯは、次に、酵素グアニル酸シクラーゼを活性化し、そのことはｃＧＭＰレベルの増加をもたらし、海綿体の平滑筋の弛緩を引き起こし、血液を流入させる。ＰＤＥ５の阻害はｃＧＭＰの分解を阻害し、ｃＧＭＰのレベルの維持、したがって、平滑筋の弛緩の維持を可能にする。Corbin & Francis, J. Biol. Chem. 274: 13729-32 (1999)。バイアグラ（登録商標）の有効成分でありＰＤＥ５の強力な阻害剤であるシルデナフィル（ＵＫ−０９２４８０）は、男性の勃起不全の効果的な治療のために広く注目を集めた。
【００１２】
腎臓ジペプチダーゼ（ＲＤＰ、renal dipeptidase）は、グリコシルホスファチジルイノシトールによって固定される酵素である。その主要な発現部位は、腎臓の近位尿細管の上皮細胞である。ヒト腎臓ジペプチダーゼの結晶構造は、それが、各サブユニットが３６９個のアミノ酸残基のペプチド（４２ｋＤａ）からなるホモダイマーであることを明らかにした。ＲＤＰは、カルボキシル位置にデヒドロアミノ酸を有するジペプチド基質を好む、亜鉛含有加水分解酵素である。ＲＤＰは、正常な結腸上皮と比較して良性及び悪性の腫瘍で過剰発現されることが発見された。本明細書でその全体が明示的に組み込まれる米国特許出願公開第２００５０２７１５８６号明細書。
【００１３】
ウレアーゼ（尿素アミドヒドロラーゼ）は、尿素の加水分解を触媒してアンモニア及びカルバメートを生成する。後者の化合物は自発的に分解して、アンモニア及び炭酸の他の分子を生成する。ウレアーゼ表現型は細菌界全域に広く分布し、この酵素をコードする遺伝子クラスターは多数の細菌種からクローニングされた。ウレアーゼ合成は窒素で調節することができ、尿素で誘導することができ、又は構成的である。ウレアーゼは、いくつかのヒト病原体、例えばプロテウス・ミラビリス（P. mirabilis）及びヘリコバクター・ピロリ（H. pylori）の病原性に重要である。尿路でのプロテウス・ミラビリスによる尿素加水分解は、尿石症（石の形成）に直接つながり、急性腎盂腎炎の発達に寄与する。ヘリコバクター・ピロリのウレアーゼは、胃炎の実験動物モデルでは胃粘膜への定着のために必要であり、ヒトの胃炎及び消化性潰瘍疾患の主要な抗原及び診断マーカーの役目を果たす。さらに、Y. enterocoliticaのウレアーゼは、感染誘発性の反応性関節炎の発達における関節炎原性因子としての関係が示唆されている。Mobley et al., Microbiol. Rev. 59: 451-480 (1995)。ウレアーゼは、Ｎｉ酵素である。Klebsiella aerogenesからの原型的な細菌ウレアーゼの研究から、Ｎｉは、ＵｒｅＤ、ＵｒｅＦ及びＵｒｅＧの作用を必要とするＧＴＰ依存性過程でアポタンパク質（ＵｒｅＡＢＣ）に挿入され、Ｎｉを送達する推定上のメタロシャペロンであるＵｒｅＥによって促進される。ｕｒｅＥの同族体はほとんどすべてのウレアーゼ生産微生物で保存され、部分的ｕｒｅＥ欠失を有する細胞はウレアーゼ特異活性の減少を示し、Ｎｉ化学量の減少した精製酵素を生成する。Mulrooney et al., J Bacteriol. 187: 3581-85 (2005)。
【００１４】
ヒドロラーゼの多くが様々な疾患との関係を示唆されているので、それらは薬剤開発の標的として熱心に研究されてきた。そのような薬剤開発の手法の１つは、異なる種類のヒドロラーゼの阻害剤を開発することである。そのような例の１つは、ＰＤＥ４阻害剤の探索である。
【００１５】
触媒領域ＰＤＥ４の結晶構造分析は、２つの金属結合部位、即ち、それぞれ１つのＺｎ２＋イオン及び１つのＭｇ２＋と結合する高親和性部位及び低親和性部位を特定する。ＰＤＥの間での二価金属の結合ための２つのヒスチジン及び２つのアスパラギン酸の残基の絶対的保存は、触媒におけるこれらのアミノ酸の重要性を示唆する。Ke, Implications of PDE4 structure on inhibitor selectivity across PDE families, International Journal for Impotence Research, 16, Suppl. 1: S24-27 (2004)。両金属イオンは、ｃＡＭＰ加水分解で役割を果たす。Qing et al., Biochemistry. 42: 13220-13226 (2003)。
【００１６】
それらの酵素の阻害剤が強力な抗うつ薬及び抗炎症剤であることが知られているので、ＰＤＥ４ファミリーも広く調査されている。例えば、ＴＮＦ−αは多くの炎症誘発作用を有し、ＰＤＥ４阻害剤は、マクロファージ、単球及びＴ細胞からのＴＮＦ−αを含む多くのサイトカインの放出の強力なサプレッサーである。
【００１７】
ＰＤＥ４阻害剤の役割は、炎症性疾患、例えば喘息、慢性閉塞性肺疾患及び乾癬の治療並びに、うつ病を治療し、向知性薬の役目を果たすことを含む様々な治療的適用で、現在調査されている。Houslay et al., Drug Discovery Today, 10: 1503-19 (2005)。
【００１８】
治療的に用いられる第１のＰＤＥ阻害剤は、テオフィリンである。それは、３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、アロフィリン、ドキソフィリン及びシパムフィリンを含む、キサンチン誘導体ファミリーに属する弱い非選択的ＰＤＥ阻害剤である。多くのキサンチン誘導体が開発され、その一部は臨床試験中（アロフィリン）であるか又は開始されている（ドキソフィリン）が、そのような阻害剤は一般的に非選択的であり、ＰＤＥ４の比較的弱い阻害剤である。Houslay et al., Drug Discovery Today, 10: 1503-19 (2005)。
【００１９】
評価中のＰＤＥ４選択的阻害剤もある。これらの阻害剤の一部、例えばロリプラム、ザルダベリン（Zardaverine）、フィラミナスト（Filaminast）、メソプラム（Mesopram）、ＩＣ−４８５及びピクラミラスト（Piclamilast）の臨床試験は、嘔吐及び吐き気などの副作用を原因とする狭い治療ウインドウのために、期待外れであることが判明した。アチゾラム（Atizoram）、ＣＣ−１０８８及びＯＮＯ−６１２６を含む、現在臨床試験中のいくつかの追加の阻害剤がある。２つの阻害剤、トリアルシロミラスト（trialscilomilast）及びロフルミラスト（roflumilast）は、第三相臨床試験を完了し、喘息及び慢性閉塞性肺疾患の治療薬として、規制審査中である。Houslay et al., Drug Discovery Today, 10: 1503-19 (2005)。
【００２０】
臨床試験中の他のＰＤＥ４阻害剤は、大塚製薬株式会社製のＯＰＣ−６５３５（テトミラスト（tetomilast））である（Zovocio, Drug & Market Development, August: 609-615 (2004)）。ルイジアナ州ニューオリンズで開催されたDigestive Disease Week 2004（５月１５〜１９日）での発表によると、Otsuka Maryland Research Institute社（ＯＭＲＩ）は、潰瘍性大腸炎の治療におけるその安全性及び効果を判定するために、化合物ＯＰＣ−６５３５に関する第三相臨床試験を２００３年に開始した。潰瘍性大腸炎は慢性消化障害であり、Crohn's and Colitis Foundation of Americaによると、約５００，０００人のアメリカ人が罹患している。潰瘍性大腸炎は、結腸（大腸）及び直腸の内膜に炎症を起こす。症状には、軽度のものから重度のものまであり、持続的な下痢、腹痛、直腸出血、発熱、体重減少、皮膚又は目の刺激、並びに小児の生育及び性成熟の遅延が含まれる。
【００２１】
臨床試験されたか又は試験中の他のＰＤＥ４阻害剤には、現在喘息の第二相試験中のインドール化合物であるＡＷＤ−１２−２８；第一相臨床試験の後に中止されたピリドピリミジノン誘導体であるＹＭ＿９７６；臨床開発中のインダゾール誘導体であるトフィミラスト（Tofimilast）；アジア市場で喘息制御剤として広く用いられているピラゾロピリジン化合物であるイブジラスト；及び喘息の第二相臨床試験の後に中止されたベンゾフラン誘導体であるリリミラスト（Lirimilast）が含まれる。Houslay et al.、前掲。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２２】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００３０１５８１３３号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００５０２７１５８６号明細書
【非特許文献】
【００２３】
【非特許文献１】Cristalli at al., Medical Research Review. 21: 105-28 (2001)
【非特許文献２】Blackburn and Kellems, Advance in Immunology. 86: 1-41 (2005)
【非特許文献３】Ann Pharmacother. 1992 Jul-Aug; 26(7-8): 939-47
【非特許文献４】Riordan, Genome Biology. 4: 225 (2003)
【非特許文献５】Rothermel TCM. 13: 15-21(2003)
【非特許文献６】Chan et al., PNAS. 102: 13075-080 (2005)
【非特許文献７】Griffith et al., Cell, 82: 507-522 (1995)
【非特許文献８】Sandanayaka and Prashad, Current Medicinal Chemistry, 9: 1145-65 (2002)
【非特許文献９】Daidmon et al., J. Biol. Chem., 278: 29240-51 (2003)
【非特許文献１０】Shakur et al., J. Biol. Chem. 275: 38749-61 (2000)
【非特許文献１１】Shakur et al., Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 66: 241-77 (2000)
【非特許文献１２】Banner and Trevethick, Trends in Pharmacological Science 25: 8 (2004)
【非特許文献１３】Thomas et al. J, Biol. Chem. 265, 14971-14978 (1990)
【非特許文献１４】Corbin & Francis, J. Biol. Chem. 274: 13729-32 (1999)
【非特許文献１５】Mobley et al., Microbiol. Rev. 59: 451-480 (1995)
【非特許文献１６】Mulrooney et al., J Bacteriol. 187: 3581-85 (2005)
【非特許文献１７】Ke, Implications of PDE4 structure on inhibitor selectivity across PDE families, International Journal for Impotence Research, 16, Suppl. 1: S24-27 (2004)
【非特許文献１８】Qing et al., Biochemistry. 42: 13220-13226 (2003)
【非特許文献１９】Houslay et al., Drug Discovery Today, 10: 1503-19 (2005)
【非特許文献２０】Zovocio, Drug & Market Development, August: 609-615 (2004)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
これらの候補のいくつかは展望を示すが、ＰＤＥ４、デアミナーゼ、アンジオテンシン変換酵素、カルシニューリン、メタロ−β−ラクタマーゼ、ＰＤＥ３、ＰＤＥ５、腎臓ジペプチダーゼ及びウレアーゼなどのメタロヒドロラーゼの新規選択的阻害剤が必要である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
[図１〜１５]いくつかの金属結合部分及び結合点、並びに任意選択の誘導体を表す図である。図１〜１５のすべてにおいて、Ｒは、本明細書で記載される任意選択のリンカーによる、本発明の阻害剤の他の成分、例えばターゲティング部分への結合を表す。本明細書で概説するように、Ｘは任意選択の個々に選択される置換基を表す。Ｚは、酸素、窒素及び硫黄の群から選択されるヘテロ原子である。当分野の技術者によって理解されるように、場合により、Ｘ基は水素であって一般に表されない。さらに、非水素のＸ置換基を用いる場合、１つだけのＸ基が一般に好ましい。場合により、及び本明細書中のすべての構造に関して、下記で概説するように、２つの隣接したＸ基を合わせて環状構造（芳香族を含めて、１つ又は複数の環式及び／又は複素環式の構造を含む）を形成することができる。
【００２６】
【図１−１】[図１Ａ〜１ＡＧ]スルホニルベースの金属結合部分を表す図である。スルホニルベースの金属結合部分のクラスは、本明細書で挙げるすべてのクラスに関して、そのクラスの任意のメンバーを個々に含むか又は排除することができる。例えば、図１の多数のスルホニルベースの金属結合部分の記述は、例えば「スルホンアミド以外のスルホニルベースの金属結合部分」のように、任意のメンバーを排除するように変更することができる。各メンバーは、特異的に及び独立して含めること又は排除することができる。
【図１−２】[図１Ａ〜１ＡＧ]スルホニルベースの金属結合部分を表す図である。スルホニルベースの金属結合部分のクラスは、本明細書で挙げるすべてのクラスに関して、そのクラスの任意のメンバーを個々に含むか又は排除することができる。例えば、図１の多数のスルホニルベースの金属結合部分の記述は、例えば「スルホンアミド以外のスルホニルベースの金属結合部分」のように、任意のメンバーを排除するように変更することができる。各メンバーは、特異的に及び独立して含めること又は排除することができる。
【図１−３】[図１Ａ〜１ＡＧ]スルホニルベースの金属結合部分を表す図である。スルホニルベースの金属結合部分のクラスは、本明細書で挙げるすべてのクラスに関して、そのクラスの任意のメンバーを個々に含むか又は排除することができる。例えば、図１の多数のスルホニルベースの金属結合部分の記述は、例えば「スルホンアミド以外のスルホニルベースの金属結合部分」のように、任意のメンバーを排除するように変更することができる。各メンバーは、特異的に及び独立して含めること又は排除することができる。
【図１−４】[図１Ａ〜１ＡＧ]スルホニルベースの金属結合部分を表す図である。スルホニルベースの金属結合部分のクラスは、本明細書で挙げるすべてのクラスに関して、そのクラスの任意のメンバーを個々に含むか又は排除することができる。例えば、図１の多数のスルホニルベースの金属結合部分の記述は、例えば「スルホンアミド以外のスルホニルベースの金属結合部分」のように、任意のメンバーを排除するように変更することができる。各メンバーは、特異的に及び独立して含めること又は排除することができる。
【図２−１】[図２Ａ〜２ＡＧ]カルボニルベースの金属結合部分を表す図である。
【図２−２】[図２Ａ〜２ＡＧ]カルボニルベースの金属結合部分を表す図である。
【図２−３】[図２Ａ〜２ＡＧ]カルボニルベースの金属結合部分を表す図である。
【図２−４】[図２Ａ〜２ＡＧ]カルボニルベースの金属結合部分を表す図である。
【図３−１】[図３Ａ〜３Ｖ]その他の金属結合部分を表す図である。図３Ａ〜Ｂは、ボロン酸ベースの金属結合部分を表す。一部の例では、３Ａは好ましくない点に留意する必要がある。図３Ｃ〜Ｅは、硫黄ベースの金属結合部分を表す。図３Ｆ〜３Ｎは、窒素ベースの金属結合部分を表す。図３Ｏ〜３Ｖは、リンベースの金属結合部分を表す。
【図３−２】[図３Ａ〜３Ｖ]その他の金属結合部分を表す図である。図３Ａ〜Ｂは、ボロン酸ベースの金属結合部分を表す。一部の例では、３Ａは好ましくない点に留意する必要がある。図３Ｃ〜Ｅは、硫黄ベースの金属結合部分を表す。図３Ｆ〜３Ｎは、窒素ベースの金属結合部分を表す。図３Ｏ〜３Ｖは、リンベースの金属結合部分を表す。
【図３−３】[図３Ａ〜３Ｖ]その他の金属結合部分を表す図である。図３Ａ〜Ｂは、ボロン酸ベースの金属結合部分を表す。一部の例では、３Ａは好ましくない点に留意する必要がある。図３Ｃ〜Ｅは、硫黄ベースの金属結合部分を表す。図３Ｆ〜３Ｎは、窒素ベースの金属結合部分を表す。図３Ｏ〜３Ｖは、リンベースの金属結合部分を表す。
【図４】１個のヘテロ原子を含む５員芳香族ヘテロ環をベースにするいくつかの金属結合部分を表す図である。
【図５】２個のヘテロ原子を含む５員芳香族ヘテロ環をベースにするいくつかの金属結合部分を表す図である。Ｒ及びＸは、本明細書で記載される通りである。
【図６−１】３個のヘテロ原子を含む５員芳香族ヘテロ環をベースにするいくつかの金属結合部分を表す図である。Ｒ及びＸは、本明細書で記載される通りである。
【図６−２】３個のヘテロ原子を含む５員芳香族ヘテロ環をベースにするいくつかの金属結合部分を表す図である。Ｒ及びＸは、本明細書で記載される通りである。
【図７】４個のヘテロ原子を含む５員芳香族ヘテロ環をベースにするいくつかの金属結合部分を表す図である。Ｒ及びＸは、本明細書で記載される通りである。
【図８】１個のヘテロ原子を含む５員非芳香環を表す図である。
【図９】２個のヘテロ原子を含む５員非芳香環を表す図である。
【図１０】ヘテロ原子を含まない６員芳香族ヘテロ環をベースにするいくつかの金属結合部分を表す図である。
【図１１】１個のヘテロ原子を含む６員芳香族ヘテロ環をベースにするいくつかの金属結合部分を表す図である。
【図１２】２個のヘテロ原子を含む６員芳香族ヘテロ環をベースにするいくつかの金属結合部分を表す図である。
【図１３】３個のヘテロ原子を含む６員芳香族ヘテロ環をベースにするいくつかの金属結合部分を表す図である。
【図１４】１個のヘテロ原子を含む６員非芳香環を表す図である。
【図１５−１】２個のヘテロ原子を含む６員非芳香環を表す図である。
【図１５−２】２個のヘテロ原子を含む６員非芳香環を表す図である。
【図１６】ＡＤＡに対するターゲティング部分として有用な阻害剤を表す図である。
【図１７−１】ＡＣＥに対するターゲティング部分として有用な阻害剤を表す図である。
【図１７−２】ＡＣＥに対するターゲティング部分として有用な阻害剤を表す図である。
【図１７−３】ＡＣＥに対するターゲティング部分として有用な阻害剤を表す図である。
【図１８−１】カルシニューリンに対するターゲティング部分として有用な阻害剤を表す図である。
【図１８−２】カルシニューリンに対するターゲティング部分として有用な阻害剤を表す図である。
【図１９−１】β−ラクタマーゼに対するターゲティング部分として有用な阻害剤を表す図である。
【図１９−２】β−ラクタマーゼに対するターゲティング部分として有用な阻害剤を表す図である。
【図１９−３】β−ラクタマーゼに対するターゲティング部分として有用な阻害剤を表す図である。
【図１９−４】β−ラクタマーゼに対するターゲティング部分として有用な阻害剤を表す図である。
【図１９−５】β−ラクタマーゼに対するターゲティング部分として有用な阻害剤を表す図である。
【図１９−６】β−ラクタマーゼに対するターゲティング部分として有用な阻害剤を表す図である。
【図１９−７】β−ラクタマーゼに対するターゲティング部分として有用な阻害剤を表す図である。
【図１９−８】β−ラクタマーゼに対するターゲティング部分として有用な阻害剤を表す図である。
【図１９−９】β−ラクタマーゼに対するターゲティング部分として有用な阻害剤を表す図である。
【図２０】ＰＤＥ３に対するターゲティング部分として有用な阻害剤を表す図である。
【図２１−１】ＰＤＥ４に対するターゲティング部分として有用な阻害剤を表す図である。
【図２１−２】ＰＤＥ４に対するターゲティング部分として有用な阻害剤を表す図である。
【図２１−３】ＰＤＥ４に対するターゲティング部分として有用な阻害剤を表す図である。
【図２１−４】ＰＤＥ４に対するターゲティング部分として有用な阻害剤を表す図である。
【図２１−５】ＰＤＥ４に対するターゲティング部分として有用な阻害剤を表す図である。
【図２１−６】ＰＤＥ４に対するターゲティング部分として有用な阻害剤を表す図である。
【図２２−１】ＰＤＥ５に対するターゲティング部分として有用な阻害剤を表す図である。
【図２２−２】ＰＤＥ５に対するターゲティング部分として有用な阻害剤を表す図である。
【図２３】腎臓ジペプチダーゼに対するターゲティング部分として有用な阻害剤を表す図である。
【図２４】ウレアーゼに対するターゲティング部分として有用な阻害剤を表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
一般に、メタロヒドロラーゼ活性に対する金属イオンの重要性にもかかわらず、ヒドロラーゼ阻害剤の現在の評価及び開発では、一般的に、阻害剤の設計において金属イオンの活性が無視されている。例えば、いくつかの阻害剤とのＰＤＥ４酵素の共晶構造の調査は、約２５個の阻害剤のうち、１つだけが金属イオンと直接的に相互作用することが判明したことを示す。Houslay et al., Drug Discovery Today, 10: 1503-19 (2005)。
【００２８】
本発明は、メタロヒドロラーゼを抑制する、２つのプロング（prong）手法を対象とする。メタロヒドロラーゼは金属酵素であることから、本発明は、任意選択でリンカーを通して連結される、金属結合部分（ＭＢＭ、metal binding moiety）とターゲティング部分（ＴＭ、targeting moiety）との組合せを目的とする。したがって、本発明は、金属タンパク質の、異なるけれども近接する２つの部位の親和性及び特異性を組み合わせることによって、より有効な阻害剤をもたらす。
【００２９】
このように、結合親和性及び結合特異性を含む、相加的及び相乗的な結合効果を利用することができる。当分野の技術者によって理解されるように、これは様々な異なる方法で作用することができる。ヒドロオキサメートなどの一部の金属結合部分は、例えば亜鉛イオンと強く結合する。しかし、これらの阻害剤は傾向としてあまり特異的ではなく、様々な金属タンパク質の亜鉛と結合することから、毒作用を示す可能性がある。本発明は、より優れたターゲティング及び非特異的結合による毒性の低減を実現するために、金属結合部位に近接する金属タンパク質の領域に対して特異性を用いることによって、強固な金属結合部分の「追加の」特異性を提供する。同様に、低親和性及び／又は低特異性である２つの部分の付加により、高親和性及び／又は高特異性の阻害剤を生成することができる。したがって、「優れている」及び「劣っている」金属結合部分の任意の組合せは、「優れている」か又は「劣っている」ターゲティング部分と連結して「優れている」阻害剤を生成することができる。
【００３０】
本発明は様々な態様を提供する。一実施形態では、本発明は、金属結合部分及びターゲティング部分、並びに前記のように任意選択でリンカーを含む阻害剤を提供する。さらなる態様では、本発明は、金属結合部分をターゲティング部分及び任意選択のリンカーと組み合わせて用いるメタロヒドロラーゼ阻害剤のスクリーニング方法を提供する。
【００３１】
メタロヒドロラーゼ阻害剤
本発明は、１つ又は複数の金属結合部分、ターゲティング部分及び任意選択でリンカーを含む、メタロヒドロラーゼ阻害剤を提供する。
【００３２】
「阻害剤」は、本明細書で、メタロヒドロラーゼを抑制することができる分子を意味する。本明細書で、「阻害」は、阻害剤がない場合の活性と比較して、メタロヒドロラーゼの活性を低減させることを意味する。この場合、「阻害」は、一般に活性の少なくとも５〜２０〜２５％の低下であり、５０〜７５％以上が有用であり、一部の実施形態では、活性の９５〜９８〜１００％の低下が同様に有用である。各メタロヒドロラーゼの活性は異なることができ、本明細書でより詳細に記載される。個々の活性を測定するためのアッセイを、下記に記載する。
【００３３】
金属結合部分
「金属結合部分（ＭＢＭ）」は、本明細書で、ＭＢＭの１つ又は複数の配位原子を通して金属イオンと結合して、配位原子へのその金属の配位結合／共有結合を生成することができる部分を意味する。一般に、これは少なくとも１対の不対電子に起因する。当分野の技術者によって理解されるように、配位結合の性質として共有結合的特性を有することができるが、一般に「配位」結合又は「配位／共有」結合と呼ばれる。
【００３４】
一部の実施形態では、金属結合部分は、ＰＤＥ４分子の亜鉛イオンなどのメタロヒドロラーゼの金属イオンとの結合のための単一の配位原子を提供する。他の実施態様では、金属結合部分によって２個以上の配位原子が提供される。２個以上の配位原子が金属結合部分によって提供される場合、金属結合部分は「キレート剤」又は「リガンド」と呼ぶことができる。配位部位の数は、結合する金属に固有の特性である。金属への２つの結合を形成するために２つの異なる原子を用いる分子は、二座であると言われる。用語三座、四座、五座などは、それゆえ、それぞれ３つ、４つ及び５つの原子を用いて同数の結合を形成する金属結合部分を指す。
【００３５】
一般に、配位原子の性質は、結合する金属によって決まる。一般に、配位原子用の有用なヘテロ原子には、窒素、酸素及び硫黄が含まれる。
【００３６】
当分野の技術者によって理解されるように、多種多様の適当な金属結合部分を用いることができる。金属結合部分の構造は、大環状でも非大環状でもよい。この場面では、「大環状」は、しばしばヘテロ原子を含み、環内部で金属と結合し、一般に平面である、環状構造の少なくとも１２個の原子を含む。
【００３７】
多くの実施形態では、金属結合部分は大環状ではないが、環状構造を有することができる。
【００３８】
適当な金属結合部分の１つのクラスは、少なくとも１つのヘテロ原子を含む５員環の環構造であり、芳香族でも非芳香族でもよい。このクラスのサブクラスには、それらに限定されないが、１個のヘテロ原子を含む５員芳香環（５Ａ１ＨＡ）及び１個のヘテロ原子を含む５員非芳香環（５ＮＡ１ＨＡ）を含む１個のヘテロ原子を含む５員環（５１ＨＡ）；２個のヘテロ原子を含む５員環（前と同じく、芳香族又は非芳香族：５Ａ２ＨＡ及び５ＮＡ２ＨＡ）；３個のヘテロ原子を含む５員環（芳香族又は非芳香族、５Ａ３ＨＡ及び５ＮＡ３ＨＡ）並びに４個のヘテロ原子を含む５員芳香環（５Ａ４ＨＡ）が含まれる。上で概説されるように、各クラス又はサブクラスは、そのクラス又はサブクラスの任意のメンバーを個々に含めること又は排除することができる。さらに、各ヘテロ原子も、同様に、独立して及び個々に含めること又は排除することができる。例えば、１個のヘテロ原子を含む５員芳香環は、ヘテロ原子としての窒素を排除することができる。
【００３９】
適当な金属結合部分の他のクラスは、ヘテロ原子を含まないか又は少なくとも１つを含む６員環の環構造であり、芳香族でも非芳香族でもよい。このクラスのサブクラスには、それらに限定されないが、ヘテロ原子を含まない６員芳香環（６Ａ）、１個のヘテロ原子を含む６員芳香環（６Ａ１ＨＡ）及び１個のヘテロ原子を含む６員非芳香環（６ＮＡ１ＨＡ）を含む１個のヘテロ原子を含む６員環（６１ＨＡ）；２個のヘテロ原子を含む６員環（前と同じく、芳香族又は非芳香族：６Ａ２ＨＡ及び６ＮＡ２ＨＡ）；３個のヘテロ原子を含む６員環（芳香族又は非芳香族、６Ａ３ＨＡ及び６ＮＡ３ＨＡ）が含まれる。上で概説されるように、各クラス又はサブクラスは、そのクラス又はサブクラスの任意のメンバーを個々に含めること又は排除することができる。さらに、５員環構造については、各ヘテロ原子も、同様に独立して含めること又は排除することができる。
【００４０】
隣接する置換基が環状構造を形成する場合には、実際の金属結合部分は５員環又は６員環をベースにすることができるが、追加の環構造物を含むことができる点に留意する必要がある。
【００４１】
図で表されるように、適当な金属結合部分の１つの群はスルホニルベースの金属結合部分のクラスであり、例としては、それらに限定されないが、スルホン酸、スルホンアミド、チオスルホン酸、スルホニルヒドラジド、スルホニルヒドロキシルアミン、Ｎ−メトキシ−スルホンアミド、Ｎ−アルキルアミノ−スルホンアミド、Ｎ−アセチルスルホニルヒドラジド、Ｎ−カルボキサミドスルホニルヒドラジド、Ｎ−シアノスルホンアミド、シアノメチル−スルホンアミド、Ｎ−アセチルスルホンアミド、ウリドスルホンアミド（uridosulfonamide）、チオウレド−スルホンアミド（thiouredosulfonamide）、グアニジルスルホンアミド、スルホニル−チオアセタミド、スルホニルアセタミド、スルホニルメチルホスホン酸、メチルシアノスルホンアミド、スルホニルグリシンアミド、スルホニルカルボキシイミダミド、Ｏ−アセチルスルホニルヒドロキシルアミン、スルホニルイミダゾール、スルホニルピラゾール、スルホニル−１，２，４−トリアゾール、スルホニル−１，２，３−トリアゾール、スルホニルピロリジン−２−オン、スルホニルイミダゾリジオン、スルホニルヒダントイン、スルホニル、スルホニルピペラジン、スルホニルモルホリンがある。
【００４２】
図で表されるように、適当な金属結合部分の１つの群はカルボニルをベースとし、例としては、それらに限定されないが、カルボン酸、アミド、チオカルボン酸、チオアミド、カルボキサミジン、オキシム、亜硝酸塩、ヒドロキサム酸、Ｎ−アルキルヒドロキサム酸、Ｏ−アルキルヒドロキサム酸、Ｎ，Ｏ−ジアルキルヒドロキサム酸、カルボキシミダミド、カルボキシヒドラジン、置換カルボヒドラジド、Ｎ−ヒドロキシカルボキシヒドラジド、Ｎ−アシルカルボキサミド、カルボキシピロリジノン、Ｎ−シアノカルボキサミド、カルボキシウレア、カルボキシチオウレア、Ｎ−アミジノカルボキシアミド、カルボキシミダゾリジン、カルボキシ−チオイミダゾリン、アシルアセタミド、カルボキシ−メチルホスホン酸、カルバモブル（carbamovl）メチルエステル、グリシンアミド、カルボン酸カルボキシメチルエステル、Ｎ−シアノメチルカルボキサミド、アシルピペラジン、アシルピペラジン−３−オンがある。
【００４３】
図で表されるように、金属結合部分の１つの群はホウ素をベースとし、例としては、それに限定されないがボロン酸がある。
【００４４】
図で表されるように、金属結合部分の１つの群は硫黄をベースとし、例としては、それらに限定されないが、チオール、１，３−ジチオラン及び１，３−ジチオランがある。
【００４５】
図で表されるように、金属結合部分の１つの群は窒素をベースとし、例としては、それらに限定されないが、Ｎ−アセチル−Ｎ−ヒドロキシアミン、アセトヒドロキサム酸メチルエステル、カルバメート、尿素、グアニジン、２−オキソチアゾリジン、ヒドロキシウレアがある。
【００４６】
図で表されるように、金属結合部分の１つの群はリンをベースとし、例としては、それらに限定されないが、ホスホン酸、チオホスホン酸、リン酸、ホスフェート、チオホスフェート、ホスホノアミン、リンアミド及びチオリンアミドがある。
【００４７】
図で表されるように、金属結合部分の１つの群は５員環１ヘテロ芳香族化合物であり、例としては、それらに限定されないが、ピロール、フラン及びチオフェンがある。
【００４８】
一部の実施形態では、５員環１ヘテロ芳香族化合物のヘテロ原子は、酸素でない。
【００４９】
一部の実施形態では、５員環１ヘテロ芳香族化合物のヘテロ原子は、窒素でない。
【００５０】
一部の実施形態では、５員環１ヘテロ芳香族化合物のヘテロ原子は、硫黄でない。
【００５１】
図で表されるように、金属結合部分の１つの群は５員環２ヘテロ芳香族化合物であり、例としては、それらに限定されないが、Ｎ−アルキルイミダゾール、Ｎ−アルキル置換イミダゾール、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、Ｎ置換ピラゾール、ピラゾール、イソキサゾール及びイソチアゾールがある。
【００５２】
一部の実施形態では、５員環２ヘテロ芳香族化合物のヘテロ原子の１つは、酸素でない。
【００５３】
一部の実施形態では、５員環２ヘテロ芳香族化合物のヘテロ原子は、いずれも酸素でない。
【００５４】
一部の実施形態では、５員環２ヘテロ芳香族化合物のヘテロ原子の１つは、窒素でない。
【００５５】
一部の実施形態では、５員環２ヘテロ芳香族化合物のヘテロ原子は、いずれも窒素でない。
【００５６】
一部の実施形態では、５員環２ヘテロ芳香族化合物のヘテロ原子の１つは、硫黄でない。
【００５７】
一部の実施形態では、５員環２ヘテロ芳香族化合物のヘテロ原子は、いずれも硫黄でない。
【００５８】
ヒドロラーゼがＨＩＶプロテアーゼである場合、場合によっては、非置換のチアゾールは金属結合部分として好ましくなく、場合によっては、チアゾールは好ましくない。
【００５９】
ヒドロラーゼがＰＤＥ４、ＰＤＥ５、ＡＣＥ、カスパーゼ又はカルボキシペプチダーゼである場合、場合によっては、金属結合部分はＮ置換ピラゾールでない。
【００６０】
ヒドロラーゼがＰＤＥ４、ＰＤＥ５、ＡＣＥ、カスパーゼ又はカルボキシペプチダーゼである場合、場合によっては、金属結合部分は非置換Ｎ置換ピラゾールでない。
【００６１】
図で表されるように、金属結合部分の１つの群は５員環３ヘテロ芳香族化合物であり、例としては、それらに限定されないが、１，２，３−トリアゾール、置換された１，２，４−トリアゾール、１，２，４−オキサジアゾール、１，２，４−チアゾール、１，３，４−オキサジアゾール、１，３，４−チアジアゾール、Ｎ置換１，２，３−トリアゾール、１，２，３−トリアゾール、１，２，３−オキサジアゾール、１，２，３−チアジアゾール、２，１，３−オキサジアゾール及び２，１，３−チアジアゾールがある。
【００６２】
一部の実施形態では、５員環３ヘテロ芳香族化合物のヘテロ原子の１つは、酸素でない。
【００６３】
一部の実施形態では、５員環３ヘテロ芳香族化合物のヘテロ原子の２つは、酸素でない。
【００６４】
一部の実施形態では、５員環３ヘテロ芳香族化合物のヘテロ原子は、いずれも酸素でない。
【００６５】
一部の実施形態では、５員環３ヘテロ芳香族化合物のヘテロ原子の１つは、窒素でない。
【００６６】
一部の実施形態では、５員環３ヘテロ芳香族化合物のヘテロ原子の２つは、窒素でない。
【００６７】
一部の実施形態では、５員環３ヘテロ芳香族化合物のヘテロ原子は、いずれも窒素でない。
【００６８】
一部の実施形態では、５員環３ヘテロ芳香族化合物のヘテロ原子の１つは、硫黄でない。
【００６９】
一部の実施形態では、５員環３ヘテロ芳香族化合物のヘテロ原子の２つは、硫黄でない。
【００７０】
一部の実施形態では、５員環３ヘテロ芳香族化合物のヘテロ原子は、いずれも硫黄でなくはない。
【００７１】
図で表されるように、金属結合部分の１つの群は５員環４ヘテロ芳香族化合物であり、例としては、それらに限定されないが、１，２，３，４−テトラゾール、１，２，３，４−オキサトリアゾール及び１，２，３，４−チアトリアゾールがある。
【００７２】
一部の実施形態では、５員環４ヘテロ芳香族化合物のヘテロ原子の１つは、酸素でない。
【００７３】
一部の実施形態では、５員環４ヘテロ芳香族化合物のヘテロ原子の２つは、酸素でない。
【００７４】
一部の実施形態では、５員環４ヘテロ芳香族化合物のヘテロ原子の３つは、酸素でない。
【００７５】
一部の実施形態では、５員環４ヘテロ芳香族化合物のヘテロ原子は、いずれも酸素でない。
【００７６】
一部の実施形態では、５員環４ヘテロ芳香族化合物のヘテロ原子の１つは、窒素でない。
【００７７】
一部の実施形態では、５員環４ヘテロ芳香族化合物のヘテロ原子の２つは、窒素でない。
【００７８】
一部の実施形態では、５員環４ヘテロ芳香族化合物のヘテロ原子の３つは、窒素でない。
【００７９】
一部の実施形態では、５員環４ヘテロ芳香族化合物のヘテロ原子は、いずれも窒素でない。
【００８０】
一部の実施形態では、５員環４ヘテロ芳香族化合物のヘテロ原子の１つは、硫黄でない。
【００８１】
一部の実施形態では、５員環４ヘテロ芳香族化合物のヘテロ原子の２つは、硫黄でない。
【００８２】
一部の実施形態では、５員環４ヘテロ芳香族化合物のヘテロ原子の３つは、硫黄でない。
【００８３】
一部の実施形態では、５員環４ヘテロ芳香族化合物のヘテロ原子は、いずれも硫黄でない。
【００８４】
図で表されるように、金属結合部分の１つの群は６員環０ヘテロ芳香族化合物であり、例としては、それに限定されないが、オルソ置換ベンゼンがある。
【００８５】
図で表されるように、金属結合部分の１つの群は６員環１ヘテロ芳香族化合物であり、例としては、それに限定されないが、ピリジンがある。
【００８６】
図で表されるように、金属結合部分の１つの群は６員環２ヘテロ芳香族化合物であり、例としては、それらに限定されないが、ピリダジン、ピリミジン及びピラジンがある。
【００８７】
図で表されるように、金属結合部分の１つの群は６員環３ヘテロ芳香族化合物であり、例としては、それらに限定されないが、１，２，４−トリアジン及び１，３，５−トリアジンがある。
【００８８】
図で表されるように、金属結合部分の１つの群は５員環１ヘテロ非芳香族化合物であり、例としては、それらに限定されないが、ピロリジノン、３−ヒドロキシピロリジノン、スクシンイミド、マレイミド、Ｎ−ヒドロキシピロリジノン、ブチロラクトン、３−ヒドロキシブチロラクトン、チオブチロラクトン及び３−ヒドロキシブチロラクトンがある。
【００８９】
一部の実施形態では、５員環１ヘテロ非芳香族化合物のヘテロ原子は、酸素でない。
【００９０】
一部の実施形態では、５員環１ヘテロ非芳香族化合物のヘテロ原子は、窒素でない。
【００９１】
一部の実施形態では、５員環１ヘテロ非芳香族化合物のヘテロ原子は、硫黄でない。
【００９２】
図で表されるように、金属結合部分の１つの群は５員環２ヘテロ非芳香族化合物であり、例としては、それらに限定されないが、ピラゾロン、イミダゾリジン、ヒダントイン、チアゾロノン、チアゾリジニン、オキサゾリドン及びオキサゾリドイン（oxazolidoine）−２，４−ジオンがある。
【００９３】
一部の実施形態では、５員環２ヘテロ非芳香族化合物のヘテロ原子の１つは、酸素でない。
【００９４】
一部の実施形態では、５員環２ヘテロ非芳香族化合物のヘテロ原子は、いずれも酸素でない。
【００９５】
一部の実施形態では、５員環２ヘテロ非芳香族化合物のヘテロ原子の１つは、窒素でない。
【００９６】
一部の実施形態では、５員環２ヘテロ非芳香族化合物のヘテロ原子は、いずれも窒素でない。
【００９７】
一部の実施形態では、５員環２ヘテロ非芳香族化合物のヘテロ原子の１つは、硫黄でない。
【００９８】
一部の実施形態では、５員環２ヘテロ非芳香族化合物のヘテロ原子は、いずれも硫黄でない。
【００９９】
図で表されるように、金属結合部分の１つの群は６員環１ヘテロ非芳香族化合物であり、例としては、それらに限定されないが、Ｎ−ヒドロキシピリジン及び３−ヒドロキシピリジンがある。
【０１００】
一部の実施形態では、６員環１ヘテロ非芳香族化合物のヘテロ原子は、酸素でない。
【０１０１】
一部の実施形態では、６員環１ヘテロ非芳香族化合物のヘテロ原子は、窒素でない。
【０１０２】
一部の実施形態では、６員環１ヘテロ非芳香族化合物のヘテロ原子は、硫黄でない。
【０１０３】
図で表されるように、金属結合部分の１つの群は６員環２ヘテロ非芳香族化合物であり、例としては、それらに限定されないが、ピリダジン−３（２Ｈ）−オン、ジオキソピリダジン、グルタルイミド、２，６−ジオキソピリミジン、３−オキソピペラジン、モルホリノン、２，３−ジオキソピペラジン及び２，５−ジオキソピペラジンがある。
【０１０４】
一部の実施形態では、６員環２ヘテロ非芳香族化合物のヘテロ原子の１つは、酸素でない。
【０１０５】
一部の実施形態では、６員環２ヘテロ非芳香族化合物のヘテロ原子は、いずれも酸素でない。
【０１０６】
一部の実施形態では、６員環２ヘテロ非芳香族化合物のヘテロ原子の１つは、窒素でない。
【０１０７】
一部の実施形態では、６員環２ヘテロ非芳香族化合物のヘテロ原子は、いずれも窒素でない。
【０１０８】
一部の実施形態では、６員環２ヘテロ非芳香族化合物のヘテロ原子の１つは、硫黄でない。
【０１０９】
一部の実施形態では、６員環２ヘテロ非芳香族化合物のヘテロ原子は、いずれも硫黄でない。
【０１１０】
図で示すように、金属結合部分は、一般に「Ｒ」で表される結合部位を有し、それは、下記に記載のターゲティング部分を、任意選択でリンカーを用いて結合するために用いられる。
【０１１１】
図で表されるように、結合部位に加えて、金属結合部分の多くは、例えば「Ｘ」置換基を用いて表されるように、任意選択で誘導体化することができる。場合によっては、これらのＸ基は、追加の配位原子を提供することができる。適当な置換基は当技術分野で公知であり、例としては、それらに限定されないが、水素、リンカー（本明細書では通常、「Ｌ」又は「Ｌｎ」で表され、ｎは０又は１である）、アルキル、アルコール、芳香族、アミノ、アミド、カルボニル、カルボキシル、シアノ、ニトロ、エーテル、エステル、アルデヒド、スルホニル、シリコン部分、ハロゲン原子、硫黄含有部分、リン含有部分及びエチレングリコールなどがある。本明細書で表される構造では、その位置が非置換の場合、Ｘは水素である。一部の位置は２つの置換基Ｘ及びＸ’を許容することができ、その場合、Ｘ及びＸ’基は同じであっても異なってもよい点に留意する必要がある。一般に、一部の実施形態では、単一の水素以外のＸ基だけが、任意の特定の位置に結合される。即ち、好ましくは各位置のＸ基の少なくとも１つは水素である。したがって、Ｘがアルキル又はアリール基である場合、本明細書で必ずしも表されていないが、一般に、その炭素に追加の水素が結合している。さらに、隣接する炭素上のＸ基と合わせて環構造（ヘテロ環、アリール及びヘテロアリールを含む）を形成することができ、それらは、本明細書で概説するように、さらに誘導体化することができる。
【０１１２】
「アルキル基」又は文法上の同等物は、本明細書で、直鎖又は分岐鎖のアルキル基を意味し、直鎖アルキル基が好ましい。分枝状である場合、それは、１つ又は複数の位置で、及び、指定なき場合は任意の位置で分枝することができる。この文脈での「アルキル」には、アルケニル及びアルキニルが、並びに、単結合、二重結合及び三重結合の任意の組合せが含まれる。アルキル基は約１〜約３０個の炭素原子（Ｃ１−Ｃ３０）の範囲であることができ、好ましい実施形態では約１〜約２０個の炭素原子（Ｃ１−Ｃ２０）を利用し、約Ｃ１から約Ｃ１２−約Ｃ１５が好ましく、Ｃ１−Ｃ５が特に好ましいが、一部の実施形態ではアルキル基はずっと大きくてもよい。アルキル基の定義には、Ｃ５環及びＣ６環などのシクロアルキル基、及び窒素、酸素、硫黄又はリンを含む複素環式の環、並びに、不飽和結合を含むシクロアルキル及びヘテロシクロアルキル基も含まれる。アルキルにはヘテロアルキルも含まれ、硫黄、酸素、窒素及びシリコーンのヘテロ原子が好ましい。アルキルには、置換されたアルキル基が含まれる。本明細書で「置換されたアルキル基」は、本明細書で定義される１つ又は複数の置換部分「Ｘ」をさらに含む、本明細書で定義されるアルキル基を意味する。
【０１１３】
「アミノ基」又は文法上の同等物は、本明細書で、−ＮＨ２、−ＮＨＸ及び−ＮＸ２基を意味し、Ｘは本明細書で定義される通りである。
【０１１４】
「ニトロ基」は、本明細書で−ＮＯ２基を意味する。
【０１１５】
本明細書で、「硫黄含有部分」は硫黄原子を含む化合物、例としては、それらに限定されないが、チア−、チオ−及びスルホ化合物、チオール（−ＳＨ及び−ＳＸ）並びにスルフィド（−ＸＳＸ−）を意味する。本明細書で、「リン含有部分」はリンを含む化合物、例としては、それらに限定されないが、ホスフィン及びホスフェートを意味する。本明細書で、「シリコン含有部分」はシリコンを含む化合物を意味する。
【０１１６】
「エーテル」は、本明細書で−Ｏ−Ｘ基を意味する。好ましいエーテルにはアルコキシ基が含まれ、−Ｏ−（ＣＨ２）２ＣＨ３及び−Ｏ−（ＣＨ２）４ＣＨ３が好ましい。
【０１１７】
本明細書で、「エステル」は、カルボキシル基を含む−ＣＯＯＸ基を意味する。本明細書で、「カルボキシル」は、−ＣＯＯＨ基を意味する。
【０１１８】
本明細書で、「ハロゲン」は臭素、ヨウ素、塩素又はフッ素を意味する。好ましい置換アルキルは、ＣＦ３などの部分的に又は完全にハロゲン化されたアルキルである。
【０１１９】
本明細書で、「アルデヒド」は−ＸＣＯＨ基を意味する。
【０１２０】
本明細書で、「アルコール」は−ＯＨ基を、及びアルキルアルコール−ＸＯＨを意味する。
【０１２１】
本明細書で、「アミド」は−ＸＣＯＮＨ−又はＸＣＯＮＸ−基を意味する。
【０１２２】
本明細書で、「エチレングリコール」又は「（ポリ）エチレングリコール」は、−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ−基を意味するが、エチレン基の各炭素原子は一重に又は二重に置換されてもよく、即ち、−（Ｏ−ＣＸ２−ＣＸ２）ｎ−においてＸは前記の通りである。酸素の代わりに他のヘテロ原子を有するエチレングリコール誘導体（即ち、−（Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ−若しくは−（Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ−、又は置換基を有するもの）も、有用である。
【０１２３】
本明細書で、「アリール基」又は文法上の同等物は、一般に、５〜１４個の炭素原子（より大きな多環式環構造の作製も可能である）を含む芳香族の単環式又は多環式炭化水素部分、及びその任意の炭素環式ケトン又はチオケトン誘導体を意味し、遊離原子価を有する炭素原子は芳香環のメンバーである。芳香族の基には、２つを超える原子が除去されたアリーレン基及び芳香族の基が含まれる。本出願のために、芳香族はヘテロアリールを含む。「ヘテロアリール」は、示される炭素原子の１〜５個が、窒素、酸素、硫黄、リン、ホウ素及びシリコンから選択されるヘテロ原子によって置換される芳香族の基を意味し、遊離原子価を有する原子は芳香環並びにその任意の複素環ケトン及びチオケトン誘導体のメンバーである。したがって、ヘテロアリールには、例えば、ピロリル、ピリジル、チエニル又はフラニル（単環、単一のヘテロ原子）；オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル又はイミダゾリル（単環、複数のヘテロ原子）；ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル又はベンズイミダゾリル（多環、複数のヘテロ原子）；キノリル、ベンゾフラニル又はインドリル（多環、単一のヘテロ原子）が含まれる。「アリール」には、本明細書で定義される１つ又は複数のＸ基で置換されたアリール基及びヘテロアリール基も含まれる。
【０１２４】
Ｘ置換基は、候補阻害剤の溶解性を修飾するために、又は金属結合部分の電子環境を変化させるために用いることができる。例えば、追加の選択される環置換基は、水性溶媒又は有機溶媒で生じる候補阻害剤の溶解性を変化させるために利用される。一般的に、アルキル、アルコキシ、ペルフルオロアルキル、ＣＮ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、カルボキシの１−（アシロキシ）アルキルエステル、アリール又はヘテロアリールの金属結合部分への置換は、無極性溶媒でより溶解性である候補阻害剤をもたらす。或いは、置換は「水可溶化基」、即ちスルホン酸、スルホン酸塩、アミンの塩、カルボキシ、カルボキシアルキル、カルボキシアルコキシ、カルボキシアルキルアミノ、又はカルボキシアルキルチオ、又は、水溶液でより溶解性である候補阻害剤をもたらす他の置換基による。同様に、通常水溶性を高める荷電基又はイオン化基を有する候補阻害剤で最終候補阻害剤の溶解性を修飾するために、念入りに選択されたリンカー及びターゲティング部分のアイデンティティも用いられる。
【０１２５】
或いは、候補阻害剤を下でより詳しく概説されている担体又は基質に結合するように候補阻害剤をさらに修飾する反応性部位として、環置換基が用いられる。
【０１２６】
いくつかの適当な金属結合部分を、図で表す。
【０１２７】
ターゲティング部分
金属結合部分に加えて、本発明の阻害剤はターゲティング部分を含む。本明細書で、「ターゲティング部分」は、特定の場所又は結合を阻害剤の標的又は目標にする役目を果たす、官能基を意味する。したがって例えば、ターゲティング部分は、ＰＤＥ４酵素などのメタロヒドロラーゼの機能に必須である金属イオンの近くに金属結合部分を持ってくるために用いることができる。即ち、金属結合部分が金属イオンと結合することができるように、ターゲティング部分は、好ましくは金属結合部位に近接するＰＤＥ４酵素に結合親和性及び／又は結合特異性を有する。下記のように、適切な間隔を提供するためにリンカーを用いてもよい。
【０１２８】
一般に、適当なターゲティング部分の１つのクラスは本発明のメタロヒドロラーゼの阻害剤であることが証明されるもの又は証明されたものであり、そのいくつかを図に記載又は表示する。図の多くのターゲティング部分の基礎は、ヒドロラーゼと共晶化した阻害剤である点に留意する必要があり、阻害剤のある部分は任意選択のリンカー及び金属結合部分で置換された。
【０１２９】
さらに、基質及び修飾基質を用いることもできる。一部の場合では、メタロヒドロラーゼへの本発明の組成物の動員のための基質の使用は、基質が切断される場合でも、金属結合による阻害を可能にする。
【０１３０】
一般に、これらのターゲティング部分は、結合リンカー及び金属結合部分を含む少なくとも１つの置換基を有する。一般に、当業技術者は適当な置換場所を判定することができる。例えば、環成分の置換が可能である。飽和炭素原子を置換することもできる。同様に、ターゲティング部分の活性に関与しない官能基（例えばアミノ、カルボキシ、ヒドロキシなど）は、結合場所として用いることができる。下記のものは、メタロヒドロラーゼの一部及びそれらの特定の阻害剤である。
【０１３１】
アデノシンデアミナーゼ
アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ、adenosine deaminase）（ＥＣ３．５．４．４、別名アデノシンアミンヒドロラーゼ及びデオキシアデノシンデアミナーゼ））は、８つのβ鎖及び８つの末梢ａ螺旋を有するα／βバレル構造モチーフを有する。Sharff et al. J. Mol. Biol. 226: 917-21(1992)。α螺旋は、ｂ鎖によってβαβ配置に連結される。ＡＤＡの活性部位は、長方形状のポケット内のβバレルのＣ末端に位置し、ポケットの最深部にはＺｎ２＋コファクターが埋設されている。Wang and Quiocho Biochemistry 37: 8314-24 (1998)。ＨＤＰＲ（６（Ｒ）−ヒドロキシル−１，６−ジヒドロプリンリボヌクレオシド、6(R)-hydroxyl-1,6-dihydropurine ribonucleoside）は、活性部位で結合するリガンドである。Wilson et al. Biochemistry, 32: 1689-94 (1993)。ＨＤＰＲは、ほとんど理想的な遷移状態類似体と考えられる。Wang and Quiocho、前掲。
【０１３２】
Ｚｎ２＋は、Ｈｉｓ１５、Ｈｉｓ１７、Ｈｉｓ２１４、Ａｓｐ２９５の側鎖及びＨＤＰＲの６−ヒドロキシに五配位結合される。Wilson et al.、前掲。Ｚｎ２＋配位結合残基のすべては、他の相互作用にも関与する。Ｈｉｓ１５とＧｌｕ２６０、Ｈｉｓ１７とＨＤＰＲ、Ｈｉｓ２１４とＡｓｐ１８１、及び、Ａｓｐ２９５とＳｅｒ２６５との間で水素結合が形成される。Wang and Quiocho、前掲。ＡＤＡ及びＨＤＰＲ間の相互作用は、Ｇｌｕ２１７及びＡｓｐ２９６が通常予想されるよりも高いｐＫａ値を有することを明らかにした。高いｐＫａ値の１つの説明は、周囲の環境中でのＬｅｕ５８、Ｐｈｅ６１、Ｐｈｅ６２及びＰｈｅ６５の疎水性である。残基のイオン化状態も、触媒機構で役割を果たす。Sharff et al.、前掲。
【０１３３】
ＡＤＡ触媒反応は、Ｇｌｕ２１７、Ｈｉｓ２３８、Ａｓｐ２９５及びＺｎ２＋の関与を含む。反応は、基質のＣ６への最初の立体特異的水酸化物の付加により移行状態中間体を生成すること、及び最終的なアンモニア除去によりイノシン生成物を産することを含む、２つの段階を含む。Wang and Quiocho、前掲。Ｌｅｕ１０６はＡＤＡの基質と直接的に相互作用する能力を有するが、Ｔｙｒ９７はＡＤＡの活性部位から約２０オングストローム離れている。したがって、Ｔｙｒ９７が活性部位の基質と直接接触することは不可能である。しかし、荷電したＧｌｕ９９、Ａｒｇ２３５及びＧｌｕ２６０の存在により、Ｔｙｒ９７をＡＤＡの活性部位に連結する塩橋が構築される。架橋はｂバレルの中央に完全に埋め込まれ、酵素によって触媒される反応で主要な役割を果たす。Jiang et la., Human Molecular Genetics 6: 2271-78 (1997)。
【０１３４】
ヒト、マウス、ウシ、大腸菌及びマイコバクテリウムで、ＡＤＡ構造を比較した。２０個のアミノ酸のうちの１５個が、これらの５つの構造全部で、同じ場所で見出された。これらのアミノ酸には、プロリン、ヒスチジン、スレオニン、ロイシン、アラニン、グルタミン酸、チロシン、アスパラギン酸、セリン、システイン、グリシン、バリン、アルギニン、アスパラギン及びフェニルアラニンが含まれる。ヒト、マウス及びウシの構造だけを比較した場合、２０個すべてのアミノ酸がこれらの３つの構造全部で、同じ場所で見出された。Wilson et al.によると、各哺乳動物のＡＤＡは、それらの基質特異性、活性及び様々な化合物による阻害剤への感受性で類似点を有する。ヒトＡＤＡはマウスＡＤＡより１１残基長いだけであり、重ねた両構造の配列にギャップは存在しない。ヒト及びマウスのＡＤＡの配列は非常に類似し、重ねた残基の８３％が同一の側鎖を有している。アミノ酸で見られる差は本来保存的であり、活性に影響を及ぼさない。マウスＡＤＡの結合部位と直接的又は間接的に結合する残基は、ヒトのＡＤＡ配列の同じ残基に重ね合わされる。ヒトＡＤＡの点突然変異を経る残基も、マウスＡＤＡの残基と同一である。
【０１３５】
多種多様の適当なターゲティング部分が存在する。試験されたＡＤＡ阻害剤には、それらに限定されないが、ペントスタチン（毛様細胞性白血病；参照により組み込まれるAnn Pharmacother. 1992 Jul-Aug;26(7-8): 939-47を参照）；時々アラビノフラノシルアデニンと併用されるデオキシコホルマイシン（急性白血病患者；Recent Results Cancer Res. 1982;80: 323-30を参照）；コホルマイシン及び類似体（Hosmane R.、Modified Nucleosides, Synthesis, and Applications, Loakes, D, Ed., Transworld Research Network, Trivendrum, 2002; pp.133-151）；４−アミノピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン（ＡＰＰ、4-aminopyrazolo[3,4-d]pyrimidine）核のいくつかの１−及び２−アルキル誘導体（J Med Chem. 2005 Aug 11;48(16): 5162-74を参照）；抗ウイルス活性の複素環式誘導体（J Infect Dis. 1975 Jun;131(6): 673-7を参照）が含まれ、これらのすべては参照により明示的に組み込まれ、特にそれらが開示する化合物については、本明細書でターゲティング部分として有用である。
【０１３６】
図は臨床試験したいくつかのＡＤＡ阻害剤を表し、それらは、本発明でターゲティング部分として用いるのに適当である。図は、これらの既知の阻害剤の構造を、リンカー及び金属結合部分（「Ｒ」）の可能な結合部位とともに、並びに可能な誘導体を示す。
【０１３７】
これらのターゲティング部分に加えて、下記で概説するスクリーニングによって特定されたか又はＡＤＡに結合することが判明した他の既知のターゲティング部分を用いることができる。したがって、適当なターゲティング部分には、それらに限定されないが、既知の薬剤及び薬剤候補を含む有機小分子、多糖類、脂肪酸、ワクチン、ポリペプチド、タンパク質（本明細書で記載のペプチドを含む）、核酸、炭水化物、脂質、タンパク性及びステロイド系のホルモンを含むホルモン、成長因子、受容体リガンド、抗原、抗体並びに酵素（下記で概説するように、「候補剤」が含まれる）などが含まれる。
【０１３８】
ＡＤＡ活性は、確立されている方法を用いて測定することができる。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Guisti G, Galanti B: Adenosine deaminase: calorimetric method、Methods of Enzymatic Analysis. 5th edition. Edited by: Bergmeyer HU. Weinheim (Germany): Verlag Chemie; 1984: 315-323；Murphy et al., Anal. Biochemistry 122, 328-337；及びTrotta et al., PNAS, 73: 104-108 (1976)を参照。
【０１３９】
アンジオテンシン変換酵素
メタロペプチダーゼアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ、ＥＣ５．４．１５．１、別名ペプチジル−ジペプチダーゼＡ、キニナーゼＩＩ、ジペプチジルカルボキシペプチダーゼＩ；ペプチダーゼＰ；カルボキシカテプシン；ジペプチドヒドロラーゼ；ペプチジルジペプチダーゼ；アンジオテンシン変換酵素；キニナーゼＩＩ；アンジオテンシンＩ変換酵素；カルボキシカテプシン；ジペプチジルカルボキシペプチダーゼ；ペプチジルジペプチダーゼＩ；ペプチジル−ジペプチドヒドロラーゼ；ペプチジルジペプチドヒドロラーゼ；内皮細胞ペプチジルジペプチダーゼ；ペプチジルジペプチダーゼ４；ペプチジルジペプチダーゼＡ；ＰＤＨ；ペプチジルジペプチドヒドロラーゼ；ＤＣＰ））は、高血圧症、心臓、腎臓及び肺の疾患の治療のための重要な薬剤標的である。１９８０年代から、アンジオテンシン変換酵素阻害剤（ＡＣＥ阻害剤）は、高血圧、心不全、冠状動脈疾患及び腎不全を含む心血管疾患の最も重要な療法として大成功を収めた。これらの降圧剤はＡＣＥの三次元構造の知識に基づいて設計されたものではなく、その構造が既に公知であったカルボキシペプチダーゼＡとの仮定上の機構的相同性に基づいたものである。しかし、現在のＡＣＥ阻害剤の長期投与は、持続的な乾性咳、頭痛及びめまいなどのいくつかの望ましくない副作用をもたらす。人体には体細胞性及び精巣性の２つのＡＣＥアイソフォームが存在する。体細胞性ＡＣＥは体のほとんどの細胞に存在し、体細胞性ＡＣＥの半分のサイズである精巣性ＡＣＥは、精巣だけで認められる。両方とも不活性のアンジオテンシンＩを、血管収縮を刺激するその活性型アンジオテンシンＩＩに変換する。また、両形態のＡＣＥは、血管拡張を刺激するブラジキニンを不活性化する。三次元構造は、ＡＣＥが大部分ａ螺旋で構成され、１つの亜鉛イオン及び２つの塩化物イオンを組み込むことを示す。実際、それは、活性部位亜鉛結合モチーフを除いて、カルボキシペプチダーゼＡにほとんど似ていない。代わりに、それらの２つのタンパク質とアミノ酸配列類似性をほとんど共有していないにもかかわらず、それは、ラット神経溶解素及びPyrococcus furiosusのカルボキシペプチダーゼに似ている。この類似性は、分子を２つのサブドメインに分割する、深くて幅が狭いチャンネルからなる活性部位に広がる。分子の上部には、活性部位裂け目に対して小さなペプチド基質（２５３０個のアミノ酸）のアクセスだけを許容するようであるアミノ末端の「ふた」が存在し、このことは、大きな、折り畳まれた基質をＡＣＥが加水分解することができないことを説明する。Natesh et al., Nature 421: 551-54 (2003)。
【０１４０】
多種多様の適当なターゲティング部分が存在し、例としては、それらに限定されないが、アラセプリル（セタプリル、Dainippon社製）、ベナゼプリル；カプトプリル；シラザプリル；デラプリル；エナラプリル；フォシノプリル；イミダプリル；リシノプリル；モエキシプリル；ペリンドプリル（コベルサル）；キナプリル（アクプリル）；ラミプリル；トランドラプリル（トロドプリル）；スピラプリル；及びエナラプリラートがある。図は、本発明でターゲティング部分として用いるのに適当であるいくつかのアンジオテンシン変換酵素阻害剤を表し、これらの既知の阻害剤の構造を、リンカー及び金属結合部分の可能な結合部位とともに、並びに可能な誘導体を示す。
【０１４１】
これらのターゲティング部分に加えて、下記で概説するスクリーニングによって特定されたか又はアンジオテンシン変換酵素に結合することが判明した他の既知のターゲティング部分を用いることができる。したがって、適当なターゲティング部分には、それらに限定されないが、既知の薬剤及び薬剤候補を含む有機小分子、多糖類、脂肪酸、ワクチン、ポリペプチド、タンパク質（本明細書で記載のペプチドを含む）、核酸、炭水化物、脂質、タンパク性及びステロイド系のホルモンを含むホルモン、成長因子、受容体リガンド、抗原、抗体並びに酵素（下記で概説するように、「候補剤」が含まれる）などが含まれる。
【０１４２】
ＡＤＡ活性は、確立されている方法を用いて測定することができる。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Kapiloff et al., Anal Biochem, 140: 293-302 (1984)；Friedland and Silverstein, Am J Clin Pathol. 66: 416-424 (1976)；及びKasahara et al., Clin Chem. 27: 1922-1925 (1981)を参照。
【０１４３】
カルシニューリン
Ｃａ２＋／カルモジュリンの支配下の唯一のセリン／スレオニンホスファターゼであるカルシニューリン（タンパクホスファターゼ２Ｂ、ＥＣ３．１．３．１６）はシグナル伝送で重要な媒介物質であり、Ｃａ２＋依存性のシグナル伝達を多種多様の細胞応答に接続する。
【０１４４】
カルシニューリンの基質として、ＮＦＡＴファミリーの転写因子はリンパ球活性化で必須の役割を果たし、したがって、それらの機能もＣｓＡ及びＦＫ５０６によって抑制される。これらの薬剤の使用は臓器移植の成功のために重要であるが、それらの治療的使用は重度の副作用と関連する。したがって、より優れた、毒性のより低い免疫抑制剤を開発する必要性がある。Martinez-Martinez, and Redondo, Inhibitors of the calcineurin/NFAT pathway, Current Medicinal Chemistry, 11: 997-1007 (2004)。
【０１４５】
ＣｓＡ及びＦＫ５０６などの周知の阻害剤の他に、カルシニューリン及び他のセリン／スレオニンタンパクホスファターゼの強力な阻害剤であるいくつかの天然生成物が単離された。Rusnak and Mertz, Calcineurin: form and function, Physiological Review, 80: 1483-1521 (2000)を参照。多種多様の適当なターゲティング部分が存在する。オカダ酸は強力で特異的なＰＰ２Ａ阻害剤であり、より高い濃度でカルシニューリンを抑制することができ；ミクロシスチンＬＲは環状ペプチドで、比較的強力なカルシニューリン阻害剤であり；ジベフリンは、カルシニューリンに対してささやかな阻害活性を有する真菌代謝産物である。さらに、カルシニューリン及び他のホスファターゼの相応な阻害剤であることがわかった合成化合物も存在する。
【０１４６】
１つの群は、エンドタール誘導体である。エンドタールは、ＰＰ１及びＰＰ２Ａの強力な阻害剤でありカルシニューリンの弱い阻害剤であるブリスター甲虫の天然防御毒素、カンタリジンに構造的に関連する。コンピュータモデリングは、エンドタール及びカンタリジン誘導体の連結されたジカルボン酸部分及び橋頭酸素原子が、活性部位の複核金属中心と相互作用することを示す。特に開示される構造及びその誘導体について参照により本明細書で組み込まれる、Tatlock et al., Structure-based design of novel calcineurin (PP2B) inhibitors, Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 7: 1007-1012 (1997)を参照。
【０１４７】
他のカルシニューリン阻害剤には、４−（フルオロメチル）フェニルホスフェート（ＦＭＰＰ）、Born et al., JBC, 270: 25651-5 (1995)、カンタリジン類似体、Baba et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry, 13: 5164-70 (2005)、Baba et al., JACS 125: 9740-9 (2003)が含まれる。
【０１４８】
カルシニューリンに適したターゲティング部分には、アルカリホスファターゼ及び紫色酸性ホスファターゼとしての阻害剤として追加のチオール又はカルボキシラート基を含む様々なアルキルホスホン酸誘導体も含まれる。特に開示される構造及びその誘導体について参照により本明細書に組み込まれる、Myers JK et al., Motifs for metallo-phosphatase inhibition. Journal of American Chemical Society, 199: 3163-3164 (1997)。
【０１４９】
本発明でターゲティング部分として有用なカルシニューリン阻害剤の他の群は、ペプチドのカルシニューリン阻害剤である。そのようなペプチドの１つは、カルシニューリンホスファターゼ活性の比較的強力な阻害剤であるカルシニューリンＡサブユニットの自己抑制領域の配列に基づく、２５残基のペプチドである。特に開示される構造及びその誘導体について参照により本明細書に組み込まれる、Hashimoto, et al., J. Biol. Chem., 265: 1924-1927 (1990)。
【０１５０】
I-T-S-F-E-E-A-K-G-L-D-R-I-N-E-R-M-P-P-R-R-D-A-M-P（配列番号ＸＸＸ）
【０１５１】
他の１６アミノ酸ペプチド（ＶＩＶＴ）が、ＮＦ−ＡＴのカルシニューリンドッキングモチーフに基づいて結合性ペプチドライブラリから選択された。このペプチドは、カルシニューリンホスファターゼ活性を破壊することなく、カルシニューリン−ＮＦ−ＡＴ相互作用を選択的に妨害する。特に開示される構造及びその誘導体について参照により本明細書に組み込まれる、Aramburu J. et al., Affinity-driven peptide selection of an NFAT inhibitor more selective than cyclosporine A, Science 285: 2129-2133 (1999)。
【０１５２】
M-A-G-P-H-P-V-I-V-I-T-G-P-H-E-E（配列番号ＸＸＸＸ）
【０１５３】
他の適当なターゲティング部分PD 144795は、カルシニューリンの用量依存的抑制を有することが判明したベンゾチオフェン誘導体である。特に開示される構造及びその誘導体について参照により本明細書に組み込まれる、Gualberto et al., J Biol Chem 273: 7088-7093 (1998)。
【０１５４】
カルシプレッシン１又はダウン症候群クリティカル領域１（ＤＳＣＲ１、Down Syndrome Critical Region 1）などのタンパク質も、カルシニューリン阻害剤であることが見出された。Chan et al., PNAS 102: 13075-80 (2005)。
【０１５５】
図は、本発明でターゲティング部分として用いるのに適当である臨床試験されたいくつかのカルシニューリン阻害剤を表し、これらの既知の阻害剤の構造を、リンカー及び金属結合部分の可能な結合部位とともに、並びに可能な誘導体を示す。
【０１５６】
これらのターゲティング部分に加えて、下記で概説するスクリーニングによって特定されたか又はカルシニューリンに結合することが判明した他の既知のターゲティング部分を用いることができる。したがって、適当なターゲティング部分には、それらに限定されないが、既知の薬剤及び薬剤候補を含む有機小分子、多糖類、脂肪酸、ワクチン、ポリペプチド、タンパク質（本明細書で記載のペプチドを含む）、核酸、炭水化物、脂質、タンパク性及びステロイド系のホルモンを含むホルモン、成長因子、受容体リガンド、抗原、抗体並びに酵素（下記で概説するように、「候補剤」が含まれる）などが含まれる。
【０１５７】
カルシニューリン活性は、確立されている方法を用いて測定することができる。カルシニューリンはホスファターゼであり、その活性は異なる基質を用いて測定することができる。基質は、タンパク質又はペプチドでよい。一例は、リン酸化されたｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼ（ＰＫＡ）のＲＩＩサブユニットの一部である。本明細書で参照により組み込まれる、Fruman et al., Measurement of calcineurin phosphatase activity in cell extracts, Methods: a companion to methods in enzymology 9: 146-154 (1996)を参照。基質は、小分子でもよい。カルシニューリンは、カルシニューリンアッセイで汎用されている色素生産性小分子化合物である、ｐ−ニトロフェノールホスフェート（ｐＮＰＰ、p-nitrophenol phosphate）を加水分解することができる。小さなｐＮＰＰ分子は、カルシニューリンの活性部位に直接結合してｐ−ニトロフェノール（ＰＮＰ、p-nitrophenol）に加水分解され、それは、分光光度計を用いて容易に監視することができる。本明細書で参照により組み込まれる、Sagoo, et al., Competitive inhibition of calcineurin activity by its autoinhibitory domain, Biochem. J. 320: 879-884 (1996)を参照。
【０１５８】
メタロ−β−ラクタマーゼ
β−ラクタム抗生物質に対する微生物耐性の最も重要な機構の１つは、β−ラクタマーゼ（ＥＣ３．５．２．６）による加水分解である。カルバペネムは他のβ−ラクタム抗生物質よりも広い抗微生物スペクトルを有し、多くの臨床上関連するセリンβ−ラクタマーゼによって加水分解されないので、カルバペネムの医療的使用は増加すると予想される。しかし、ペニシリン及びセファロスポリンに加えてカルバペネムを優先的に加水分解する、いくつかのカルバペネム加水分解β−ラクタマーゼが存在する。活性部位に亜鉛原子を有するクラスＢ  ＭＢＬは、そのようなカルバペネム加水分解酵素の群であり、タゾバクタムなどのβ−ラクタマーゼ阻害剤によって最小限にしか抑制されない。また、広く使われているセリンβ−ラクタマーゼ阻害剤は、クラスＢのβ−ラクタマーゼの基質として挙動する。Nagano et al., Antimicrob Agents Chemother. 43: 2497-503 (1999)。ＭＢＬに対して臨床上利用可能な阻害剤は存在しない。セファロスポリンβ−ラクタム抗生物質の加水分解はジヒドロチアジンを生成し、それは、Ｃ−Ｓ結合の切断及びチオールの介在を通して、その後Ｃ６位置の異性化を経る。これらのチオールはバシラス・セレウス（Bacillus cereus）からのベータラクタマーゼによって捕らえることができ、酵素の阻害を引き起こす。ＮＭＲ研究は阻害を引き起こすチオールの構造を特定し、さらに、チオールが亜鉛イオンと結合し、それは次に金属結合ヒスチジンを撹乱することを示す。チオールが酸化されるか又はさらなる分解を受けるに従い、阻害は徐々に取り除かれる。セファロチンから生成されるチオール中間体は、徐々に結合する阻害剤である。Badarau et al., Biochemistry 44: 8578-89 (2005)。
【０１５９】
グラム陰性菌の間での抗生物質耐性の増加は、臨床上のケアについて気が重くなるような難題となっており、ＭＢＬはグラム陰性菌の耐性機構で重要な役割を演ずる。一般的なレビューについては、本明細書で明示的にその全体が参照により組み込まれる、Wash et al., Clinical Microbiology Review, 19: 306-25 (2005)を参照。
【０１６０】
いくつかのＭＢＬの構造はＸ線回折によって解決されており、活性部位での２つの可能な亜鉛イオン結合部位が明らかになる。亜鉛リガンドは、ＭＢＬの異なるサブクラスの間で完全には保存されていない。Ｂ．セレウス酵素ＢｃＩＩなどのサブクラスＢ１酵素では、部位１の亜鉛は、３つのヒスチジン残基及び溶媒分子のイミダゾール環によって配位結合される。部位２では、金属はヒスチジン、アスパラギン酸、システイン及び１、２の溶媒分子によって配位結合される。２つの金属イオンは互いに比較的近いが、それらの間の見かけの距離は、ＢｃＩＩ及びＣｃｒＡ（バクテロイデス・フラジリス（Bacteroides fragilis））酵素の異なる構造で３．４〜４．４Åの範囲である。ＣｃｒＡ酵素のいくつかの構造は、水酸化イオンであることが示唆される、２つの金属の間の架橋リガンドを示す。しかし、架橋溶媒分子は、この酵素の構造に普遍的には存在しない。ｐＨ７．５で判定される２つの亜鉛イオンを有するＢｃＩＩの構造では、類似した架橋溶媒分子が見られるが、より低いｐＨでのこの酵素の構造では、この溶媒分子は部位２のそれよりも部位１の亜鉛にずっと緊密に結合する。部位２の第２の溶媒分子はカーボネート又は水であるが、１つの構造（並びに阻害剤が結合した構造）では欠落している。金属イオンの配位はしたがってかなり変化しやすく、おそらく、ＭＢＬの間の基質プロフィール及び亜鉛親和性で観察された差のいくつかに寄与する。架橋水酸化イオン又は水分子が、ベータラクタム加水分解で役割を担う求核体であると提唱されているが、触媒における２つの金属の正確な役割は不明なままである。部位Ｉだけが触媒で直接的な役割を担う機構、又は、２つの亜鉛イオンの両方が二核中心として関与する機構が提案されている。ＢｃＩＩ酵素は、異なる動態学的特性で結合した１つ又は２つの亜鉛イオンで活性である。Daldmon et al., J. Biol. Chem., 278: 29240-51 (2003)。
【０１６１】
ＭＢＬのすべてのメンバーが近接した２つの亜鉛結合部位を示すので、阻害剤の開発は二核酵素をまだ重視している。しかし、単核ＭＢＬだけが生理的に重要かもしれないことが示された。これらの知見は、二核酵素の阻害剤を発見する戦略が唯一適切なものであるかどうかという問題を提起する。これらの阻害剤が薬学的に重要であるためには、亜鉛が少ない場合でさえ病原性細菌からのすべてのＭＢＬの阻害定数が低いことを確認する必要がある。そのような条件下で、単核酵素は支配的な形態である。Heinz et al., J. Biol. Chem., 278: 20659-66 (2003)。
【０１６２】
ＭＢＬ阻害剤のいくつかのクラスが報告され、例としては、フェナジン、チオール、アミノ酸由来のヒドロオキサメート、Walter et al., Bioorg. Chem. 27: 35-40 (1999)、並びにｄ−及びｌ−カプトプリルがある。上記阻害剤は特定のＭＢＬに対して優れた活性を有することが報告されたが、ある種のチオール（例えばSB 264218）だけが広域性ＭＢＬ阻害を示す。Toney et al., J. Biol Chem. 276: 31913-18 (2001); Heinz et al., J. Biol. Chem., 278: 20659-66 (2003)。
【０１６３】
これらの酵素の、報告されているさらなる阻害剤は、ベンジロキシカルボニルメチル−６−アミノペニシラン酸の２つのエステル、Van Hove et al., Tetrahedron Lett. 36: 9313-9316 (1995)、α−アミド−トリフルオロメチルアルコール及びケトンの群、Walter et al, Tetrahedron 53: 7275-7290 (1997)、Walter et al, Bioinorg. Med. Chem. Lett. 6: 2455-2458 (1996)、メルカプト酢酸及びメルカプトフェニル酢酸の一連のチオールエステル誘導体、Greenlee et., Bioinorg. Med. Chem. Lett. 9: 2549-2554 (1999)、Hammond et al., FEMS Microbiol. Lett. 179: 289-296 (1999)、Payne et al., FEMS Microbiol. Lett. 157: 171-175 (1997)、Payne et al., Antimicrob. Agents Chemother. 41: 135-140 (1997)及びβ−メチルカルバペネムの誘導体（１１）である。より最近、システイニルペプチドの誘導体も試験された。Navarro et al., Antimicrob Agents Chemother, 48: 1058-1060 (2004)。
【０１６４】
ビフェニルテトラゾール（ＢＰＴ、biphenyl tetrazole）は、スクリーニングを通して特定され、酵素構造の分子モデリングを用いて予測される、ＭＢＬの強力な競合的阻害剤の構造的なクラスである。阻害剤のテトラゾール部分は活性部位の２つの亜鉛原子の１つと直接的に相互作用して、金属と結合した水分子を置換する。Toney et al., Chem. Biol. 5, 185-196 (1998)；Toney et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 9, 2741-2746 (1999)。
【０１６５】
他のＭＬＢ阻害剤には、ペニシリンのペナマルディック（penamaldic）誘導体が含まれる。Navarro et al., Antimicrob Agents Chemother, 48: 1058-1060 (2004)。
【０１６６】
ｂ−グリコシド結合によって４−ヒドロキシ−５−ヒドロキシメチルプロリン環に連結するスルホン化Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンユニットであるブルゲシンＡは、二核メタロ−ｂ−ラクタマーゼの新規型の阻害剤である。Simm et al., Biochem. J. 387: 585-590 (2005)。
【０１６７】
ＭＢＬをコードするＩＭＰ−１遺伝子がプラスミドで特定され、日本では、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）、セラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）及び腸内細菌科の他のメンバーなどの臨床分離株間で移動している。さらに、ＩＭＰ−１に関係のあるＭＢＬを発現するカルバペネム耐性の臨床分離株が、シンガポール、イタリア及び香港で同定された。そのようなプラスミド媒介性のイミペネム耐性の報告は、耐性細菌でカルバペネムの活性を回復することができるＩＭＰ−１阻害剤の必要性を鮮明にする。一連の２，３−（Ｓ，Ｓ）−二置換のコハク酸が、ＩＭＰ−１の強力な阻害剤として特定された。Toney et al., J. Biol Chem. 276: 31913-18 (2001。Ｃ−２位置にベンゾチエニルチオ、ジチオカルバメート又はピロリジニルチオ部分を有する３種類の１β−メチルカルバペネムもあり、ＭＢＬの１つであるＩＭＰ−１メタロ−β−ラクタマーゼに対して優れた阻害活性を示した。Nagano et al., Antimicrob Agents Chemother. 43: 2497-503 (1999)。
【０１６８】
チオマンデル酸は、ＭＢＬの単純で、広域スペクトルの適度に強力な阻害剤である。ＮＭＲデータは、チオマンデレートが、そのチオレート硫黄を通してＭＢＬの両亜鉛イオンと結合することを示唆する。Mollard et al., J. Biol. Chem., 276: 45015-45023 (2001)；Daldmon et al., J. Biol. Chem., 278: 29240-51 (2003)。
【０１６９】
したがって、多種多様の適当なターゲティング部分が存在する。図は、本発明でターゲティング部分として用いるのに適当である臨床試験されたいくつかのベータラクタマーゼ阻害剤を表し、これらの既知の阻害剤の構造を、リンカー及び金属結合部分の可能な結合部位とともに、並びに可能な誘導体を示す。
【０１７０】
これらのターゲティング部分に加えて、下記で概説するスクリーニングによって特定されたか又はＭＢＬに結合することが判明した他の既知のターゲティング部分を用いることができる。したがって、適当なターゲティング部分には、それらに限定されないが、既知の薬剤及び薬剤候補を含む有機小分子、多糖類、脂肪酸、ワクチン、ポリペプチド、タンパク質（本明細書で記載のペプチドを含む）、核酸、炭水化物、脂質、タンパク性及びステロイド系のホルモンを含むホルモン、成長因子、受容体リガンド、抗原、抗体並びに酵素（下記で概説するように、「候補剤」が含まれる）などが含まれる。
【０１７１】
ＭＢＬ活性は、確立されている方法を用いて測定することができる。例えば、１つのアッセイでは、メタロ−β−ラクタマーゼ調製物の活性は、各段階で、１００μＭ  ＺｎＣｌ２を含有する１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で１００μＭイミペネム（２９９ｎｍでΔε＝９．０４ｍＭ−１・ｃｍ−１）の加水分解を３０℃で監視することによって測定される。１単位のβ−ラクタマーゼ活性は、３０℃で１分間に１μモルのイミペネムを加水分解した酵素の量と定義される。例えば、本明細書で参照により組み込まれる、Nagano et al., Antimicrob Agents Chemother. 43: 2497-503 (1999)を参照。他のアッセイでは、活性は、色素生産性基質ニトロセフィンを用いて評価した。本明細書で参照により組み込まれるToney et al., J. Biol Chem. 276: 31913-18 (2001)を参照。
【０１７２】
ＰＤＥ３
ＰＤＥ３Ａ阻害剤と結合するための大半の残基は、すべての哺乳動物のＰＤＥ（ＥＣ３．１．４．１７）でよく保存されている。しかし、阻害剤を区別するのに２、３の異なるアミノ酸で十分であることができ、特定の阻害剤の特異性の判定には異なる型のＰＤＥ中の特異なアミノ酸が重要である。例えば、ＰＤＥ３Ａでの保存されていないアミノ酸Ｔ８４４のＡｌａへの突然変異は、シロスタゾールのＫｉでは２５倍の増加をもたらすが、この研究では、ミルリノン若しくはｃＧＭＰのＫｉ又はｃＡＭＰのＫｍには影響を及ぼさない。Ｔ８４４は、シロスタゾールに対するＰＤＥ３Ａの選択性で、決定的な役割を果たすこともできる。他方、ＰＤＥの活性部位は、阻害剤の結合のために様々な配位を提供するだけでなく、各ＰＤＥファミリーで微妙な異なる高次構造を所有することもできる。立体配置的な差は、したがって、キーロック機構で、各ＰＤＥファミリーの阻害剤を識別及び選択することができる。Zhang et al., Molecular Pharmacology, 62: 514-520 (2002)。
【０１７３】
２つのＰＤＥ３型選択性阻害剤が、実際の医療で用いられてきた。シロスタゾールは抗血小板、抗血栓及び血管拡張性の効果を有し、間欠跛行患者の治療のために、並びに、短期及び中期の血管閉塞並びに冠内ステント術の後の遅発性再狭窄の予防のために承認された。ミルリノンは、心臓細胞内のｃＡＭＰレベルの上昇に起因する変力性／血管拡張性効果を通して、心不全の血行力学状態を改善する。ミルリノンは、術中の重度の心不全又はうっ血心不全の著しい悪化の治療のために用いられる。Zhang et al., Molecular Pharmacology, 62: 514-520 (2002)。他の既知の特異的ＰＤＥ３阻害剤には、オルプリノン及びアムリノンが含まれる。Adachi et al., Eur J Pharmacol. 528: 137-43 (2005)。
【０１７４】
市場に出される他の阻害剤は、アナグレリド、エノキシモン（１，３−ジヒドロ−４−メチル−５−（４−（メチルチオ）ベンゾイル）−２Ｈ−イミダゾール−２−オン）、ピモベンダン及びオルプリオンである。第三相試験中のピロキシモン及びＥ−５５１０（Eisai社製）もある。
【０１７５】
多種多様の適当なターゲティング部分が存在する。図は、本発明でターゲティング部分として用いるのに適当であるいくつかのＰＤＥ３阻害剤を表し、これらの既知の阻害剤の構造を、リンカー及び金属結合部分の可能な結合部位とともに、並びに可能な誘導体を示す。
【０１７６】
これらのターゲティング部分に加えて、下記で概説するスクリーニングによって特定されたか又はＰＤＥ３に結合することが判明した他の既知のターゲティング部分を用いることができる。したがって、適当なターゲティング部分には、それらに限定されないが、既知の薬剤及び薬剤候補を含む有機小分子、多糖類、脂肪酸、ワクチン、ポリペプチド、タンパク質（本明細書で記載のペプチドを含む）、核酸、炭水化物、脂質、タンパク性及びステロイド系のホルモンを含むホルモン、成長因子、受容体リガンド、抗原、抗体並びに酵素（下記で概説するように、「候補剤」が含まれる）などが含まれる。
【０１７７】
ＰＤＥ３活性は、確立されている方法を用いて測定することができる。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Thompson et al., Assay of cyclic nucleotide phosphodiesterase and resolution of multiple molecular forms of the enzyme. Adv Cyclic Nucleotide Res; 10: 69-92 (1979)及びLugnier, Phosphodiesterase Methods and Protocols (Humana Press, 2005)を参照。
【０１７８】
ＰＤＥ４
「ＰＤＥ４」、「ＰＤＥ４タンパク質」、「ＰＤＥ４遺伝子」又は文法上の同等物は、本明細書で、ＰＤＥ４Ａ、ＰＤＥ４Ｂ、ＰＤＥ４Ｃ及びＰＤＥ４Ｄを含む任意のホスホジエステラーゼ４酵素を意味する。
【０１７９】
多くのＰＤＥ４アイソフォームがあり、そのうち約２０個が知られている。形態ＰＤＥ４ファミリー（Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ）によって生成される個々のアイソフォームは、各々特異なＮ末端領域を特徴とする。これらのファミリーは、異なる細胞内部位及びシグナル伝達複合体に対するアイソフォーム特異ターゲティングを付与することにおいて、主要な役割を果たす。本明細書で明示的に参照により組み込まれる、Houslay et al., Biochem. J. 370: 1-18 (2003)。
【０１８０】
好ましい実施形態では、ＰＤＥ４タンパク質は脊椎動物、より好ましくは齧歯動物（ラット、マウス、ハムスター、モルモットなど）、霊長類、畜産動物（ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマなどを含む）を含む哺乳動物からのものであり、好ましい実施形態ではヒトからのものである。しかし、他の生物体からのＰＤＥ４タンパク質を用いることもできる。
【０１８１】
異なるＰＤＥ４遺伝子のＤＮＡ及びタンパク質両方の配列は、その両方ともアメリカ国立衛生研究所のNational Center for Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）によって維持されている、Ｅｎｔｒｅｚヌクレオチドデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ、ＲｅｆＳｅｑ及びＰＤＢを含むいくつかのソースからの配列のコレクション）及びＥｎｔｒｅｚタンパク質データベース（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢ及びＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑの注釈付コード領域からの翻訳を含む様々なソースから編集されたもの）などの様々なリソースを通して直ちに利用することができ、そのすべては本明細書で明示的に参照により組み込まれる。以下、言及する受託番号は、ＮＣＢＩデータベースによって用いられる受託番号である。
【０１８２】
各ＰＤＥ４酵素をコードする遺伝子に対して複数の登録が可能である。この理由は、各遺伝子に対して多くのスプライシング変異体（又は、転写変異体、アイソフォーム、スプライシングアイソフォーム）が存在するからである。さらに、同じ遺伝子をクローニングすることができ、いく度か報告することができた。これらの登録の配列のいずれも、本発明で用いることができた。ヒトＰＤＥ４遺伝子の一部の例示的な登録を以下に示す：ＰＤＥ４Ａ（受託番号ＢＣ０３８２３４、ＢＣ０１９８６４、ＮＭ_００６２０２）、ＰＤＥ４Ｂ（受託番号ＢＣ１０５０４０、ＮＭ_００１０３７３４１、ＮＭ_００２６００）、ＰＤＥ４Ｃ（ＢＣ１０９０６７、Ｕ８８７１２、Ｕ６６３４７）、ＰＤＥ４Ｄ（ＮＭ_００６２０３、ＡＹ２４５８６７、ＢＴ００７３９８）、これらはすべて本明細書で参照により組み込まれる。
【０１８３】
ＰＤＥ４で公知のように、ターゲティング部分の結合に適当ないくつかの領域が存在する。一般に、触媒領域は、ヌクレオチド認識の役割を担う３つの機能基に分割することができる（ＰＤＥ４Ｄ２（受託番号ＡＡＣ０００７０）の番号付けを用いてＮ３２１、Ｙ３２９、Ｐ３７２及びＱ３６９、疎水性のクランプ（Ｉ３３６及びＦ３７２）、並びに加水分解（Ｄ３１８、Ｈ１６４、Ｄ２０１及びＨ１６０）；Houslayの記事を参照、図２。活性部位は３つのサブポケット、即ち、プリン選択性グルタミン及び疎水性クランプを有するポケット（Ｑ）、溶媒充填サイドポケット（Ｓ）及び両金属イオンを含有する金属結合ポケット（Ｍ）に分割され、ＱサブポケットはさらにＱ１、Ｑ２及びＱｐ領域に分割される。一部の実施形態では、金属結合部分をＭポケットに近接させるために、ターゲティング部分はＱ及びＳポケットを対象とする。一部の実施形態では、ターゲティング部分は、「疎水性クランプ」を形成する一対の疎水性残基によって活性部位に保持される平面環構造を有し、ヌクレオチド選択性に必須である不変のグルタミン残基とのＨ−結合相互作用が存在する。
【０１８４】
多種多様の適当なターゲティング部分が存在する。図は、本発明でターゲティング部分としての使用に適当であるいくつかのＰＤＥ４阻害剤を表し、その多くは、本明細書で概説されるように成分が除去されている。図は、これらの既知の阻害剤の構造を、リンカー及び金属結合部分の可能な結合部位とともに、並びに可能な誘導体を示す。
【０１８５】
他のＰＤＥ４阻害剤が記載されており、多くは、米国特許第６，５６９，８９０号；第６，９０９，００２号；第５，６６５，７５４号；第６，９９８，４１６号；第６，７４７，０３５号；第６，７０，６６６号；第６，９９８，４１６号；第５，６６５，７５４号；第６３６２２１３号；第６５６９８９０号；第６５８９９５１号；第６６７７３５１号；第６７４００６６号；第６６９９８９０号；第６５６９８８５号；第６５４５１５８号；第６５２５０５５号；第６４９８１６０号；第６４９２３６０号；第６４８６１８６号；第６４５８７８７号；第６４５５５６２号；第６４４４６７１号；第６４２３７１０号；第６３７２７７７号；第６３６５６０６号；第６３５８９７３号；第６３２９３７０号；第６２６２０４０号；第６２９４５４１号；第６２９４５６１号；第６２９７２４８号；第６３０３７８９号；第６２３９１３０号；第６１５３６３０号；第６１０３７４９号；第６０７５０１６号；第６０５４４７５号；第６０４３２６３号；第５９２２７５１号；第５８５２１９０号；第４９２１８６２号明細書で具体的に示され、そのすべては、特に本明細書で記載の化合物並びに本明細書で記載のものなどの誘導体（例えばカルボキシル基の除去物並びに任意選択のリンカー及び金属結合部分の付加物など）について、本明細書で組み込まれる。
【０１８６】
他の既知のＰＤＥ阻害剤は、国際公開第２００６／０５０２３６号パンフレット、国際公開第２００６／０５００５４号パンフレット及び国際公開第２００６／０５００５３号パンフレットで開示され、そのすべては本明細書でその全体が参照により組み込まれる。具体的には、国際公開第２００６／０５０２３６号パンフレットの式（１）〜（１６）、国際公開第２００６／０５００５４号パンフレットの式（１）〜(２０)、及び国際公開第２００６／０５００５３号パンフレットの式（１）〜（７７）で表される構造は参照により組み込まれ、ＭＢＭは、そこで表されるホウ酸の代わりに任意選択のリンカー（Ｌｎ、ｎは０又は１）を通して窒素に連結することができる。
【０１８７】
これらのターゲティング部分に加えて、下記で概説するスクリーニングによって特定されたか又はＰＤＥ４に結合することが判明した他の既知のターゲティング部分を用いることができる。したがって、適当なターゲティング部分には、それらに限定されないが、既知の薬剤及び薬剤候補を含む有機小分子、多糖類、脂肪酸、ワクチン、ポリペプチド、タンパク質（本明細書で記載のペプチドを含む）、核酸、炭水化物、脂質、タンパク性及びステロイド系のホルモンを含むホルモン、成長因子、受容体リガンド、抗原、抗体並びに酵素（下記で概説するように、「候補剤」が含まれる）などが含まれる。
【０１８８】
ＰＤＥ４活性は、確立されている方法を用いて測定することができる。それについては、下記でさらに詳細に説明する。
【０１８９】
ＰＤＥ５
環状ＧＭＰ結合ｃＧＭＰ特異ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ５）は、近年、重要な治療標的と認識された。それは、肺、血小板、胃腸上皮細胞、小脳のプルキンエ細胞及び血管平滑筋におけるｃＧＭＰ分解で、顕著な役割を果たす。ＰＤＥ５は、ｃＧＭＰの切断を触媒する保存されたＣ末端の亜鉛含有触媒領域、及び、２つのＧＡＦ領域リピートを有するＮ末端調節部分で構成される。各ＧＡＦ領域はｃＧＭＰ結合部位を有し、１つは高親和性のもの、他はより低い親和性のものである。ＰＤＥ５活性は、高親和性及び低親和性のｃＧＭＰ結合部位とのｃＧＭＰの結合と、その後の、両部位が塞がっているときのみ起こるリン酸化を通して調節される。ＰＤＥ５は、血小板、血管及び内臓の平滑筋並びに骨格筋を含むいくつかの組織において、様々な濃度で見られる。タンパク質は、勃起性の海綿体組織の平滑筋中のｃＧＭＰレベルの、重要な調節因子である。勃起の生理的機構は、性的刺激の間の、海綿体内への一酸化窒素（ＮＯ）の放出を含む。ＮＯは、次に、酵素グアニル酸シクラーゼを活性化し、それはｃＧＭＰレベルの増加をもたらし、海綿体の平滑筋弛緩を引き起こして血液を流入させる。ＰＤＥ５の阻害はｃＧＭＰの分解を抑制して、ｃＧＭＰのレベルの維持、したがって平滑筋弛緩の維持を可能にする。米国特許出願公開第２００５０２０２５４９号明細書。
【０１９０】
ＰＤＥ５はシルデナフィル（Viagra（商標））、タダラフィル（Cialis（商標））及びバルデナフィル（Levitra（商標））の標的であり、そのすべては血管疾患と関連する疾患の治療のために使用されている。Zoraghi et al., J. Biol. Chem., 280: 12051-63 (2005)。市場に出された他の阻害剤は、ジピリダモール、ウデナフィルであり、臨床試験中のものにはＵＫ−３５７９０３（Pfizer社製）、ＵＫ−３６９００３（Pfizer社製）、アバナフィル、パラグレリル、ＯＳＩ−４６１及びＥ−４０２１（Eisai社製）が含まれる。
【０１９１】
Ｃ−８プレニル化フラボノールであるソホフラベセノールは、強力な阻害活性ＰＤＥ５であることが判明した。Shin et al., Bioorg Med Chem Lett. 12: 2313-16 (2002)。
【０１９２】
四環系のグアニンは、ｃＧＭＰ加水分解酵素ＰＤＥ１及びＰＤＥ５の強力で選択的な阻害剤であることが判明した。Ahn et al., J Med Chem. 40: 2196-210 (1997)。
【０１９３】
ＰＤＥ５阻害剤の他の例は、本明細書でその全体が明示的に組み込まれる、米国特許出願公開第２００４０１３２７３１号明細書に記載されている。
【０１９４】
多種多様の適当なターゲティング部分が存在する。図は、本発明でターゲティング部分として用いるのに適当であるいくつかのＰＤＥ５阻害剤を表し、これらの既知の阻害剤の構造を、リンカー及び金属結合部分の可能な結合部位とともに、並びに可能な誘導体を示す。
【０１９５】
これらのターゲティング部分に加えて、下記で概説するスクリーニングによって特定されたか又はＰＤＥ５に結合することが判明した他の既知のターゲティング部分を用いることができる。したがって、適当なターゲティング部分には、それらに限定されないが、既知の薬剤及び薬剤候補を含む有機小分子、多糖類、脂肪酸、ワクチン、ポリペプチド、タンパク質（本明細書で記載のペプチドを含む）、核酸、炭水化物、脂質、タンパク性及びステロイド系のホルモンを含むホルモン、成長因子、受容体リガンド、抗原、抗体並びに酵素（下記で概説するように、「候補剤」が含まれる）などが含まれる。
【０１９６】
ＰＤＥ５活性は、確立されている方法を用いて測定することができる。例えば、Movesian et al., J Clin Invest., 88: 15-19 (1991); Rybalkin et al., EMBO J. 22: 469-478 (2003); Champion et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 102: 1661-1666 (2005)を参照。
【０１９７】
腎臓ジペプチダーゼ
腎臓ジペプチダーゼ（ＲＤＰ、renal dipeptidase）（ＥＣ３．４．１３．１９、別名膜ジペプチダーゼ（ＭＤＰ、membrane dipeptidase）；デヒドロペプチダーゼＩ（ＤＰＨ  Ｉ、dehydropeptidase I）；ジペプチダーゼ；アミノジペプチダーゼ；ジペプチドヒドロラーゼ；ジペプチジルヒドロラーゼ；非特異的ジペプチダーゼ；グリコシル−ホスファチジルイノシトール固定腎臓ジペプチダーゼ）は、その触媒機構及び種々の合成阻害剤による阻害動態に関して広く分析された。ＲＤＰは、ＣＯＯＨ末端のパートナーがＤ−アミノ酸であるアミン結合を切断することができるという点で、ジペプチダーゼの中でも特異である。ＲＤＰは、カルボキシル位置にデヒドロアミノ酸を有するジペプチド基質を好む、亜鉛含有加水分解酵素である。さらに、それは、その位置でＤ−又はＬ−アミノ酸を有する基質に適応することができ、インビボでのその検出のための特異プローブの開発のための優れた機会を提供する。
【０１９８】
天然のα−アミノカルボン酸のリン類似体であるα−アミノホスフィン酸に対して、医学及び有機合成化学で関心が高まっている。ＲＤＰ−シラスタチン複合体の結晶構造から、シラスタチンのジペプチジル部分が、負及び正に荷電した側壁の間に挟まれていることが証明された。その部分の両端は、疎水性相互作用によって固く固定される。あるアミノホスフィン酸誘導体は、ジペプチドに類似したＲＤＰの活性部位に結合する。その切れやすいカルボキサミドがＰＯ（ＯＨ）ＣＨ２基で置換されたデヒドロペプチド類似体は、亜鉛プロテアーゼデヒドロジペプチダーゼ１（ＤＨＰ−１腎臓ジペプチダーゼ、ＥＣ３．４．１３．１１）の強力な阻害剤であることが見出された。疎水性側鎖を有するα−アミノホスフィン酸は、１０−７のモル範囲でＡＰＮを抑制することが見出された。ホスフィナート類似体は、ＶａｎＸの酵素活性の阻害が報告されている。米国特許出願公開第２００５０２７１５８６号明細書、本明細書で明示的にその全体が組み込まれる。
【０１９９】
ＲＤＰは融通のきく基質特異性を示し、ジペプチド及びデヒドロペプチドだけでなく、イミペネムなどのトランス構造のβ−ラクタム抗生物質も加水分解する。チエナマイシン及び関係するカルバペネム抗生物質は、一般にデヒドロペプチダーゼとも呼ばれるものによって、ヒトにおいてインビボで急速に加水分解及び不活性化される。シラスタチン（ＭＫ０７９１；｛Ｚ−Ｓ−［６−カルボキシ−６−（２，２−ジメチル−（Ｓ）−シクロプロピル）カルボキシ）−アミノ−５−ヘキセニル］−Ｌ−システイン｝）は、イミペネム及びデヒドロペプチドの切れやすい結合の間の構造類似性に基づいて、ＲＤＰの可逆的、競合的阻害剤（５０%阻害濃度５  ０．１ｍＭ）として開発された。Keynan et al., Antimicrobial Agents And Chemotherapy, 39: 1629-1631 (1995)。
【０２００】
多種多様の適当なターゲティング部分が存在する。図は、本発明でターゲティング部分として用いるのに適当であるいくつかの腎臓ジペプチダーゼ阻害剤を表し、これらの既知の阻害剤の構造を、リンカー及び金属結合部分の可能な結合部位とともに、並びに可能な誘導体を示す。
【０２０１】
これらのターゲティング部分に加えて、下記で概説するスクリーニングによって特定されたか又は腎臓ジペプチダーゼに結合することが判明した他の既知のターゲティング部分を用いることができる。したがって、適当なターゲティング部分には、それらに限定されないが、既知の薬剤及び薬剤候補を含む有機小分子、多糖類、脂肪酸、ワクチン、ポリペプチド、タンパク質（本明細書で記載のペプチドを含む）、核酸、炭水化物、脂質、タンパク性及びステロイド系のホルモンを含むホルモン、成長因子、受容体リガンド、抗原、抗体並びに酵素（下記で概説するように、「候補剤」が含まれる）などが含まれる。
【０２０２】
ＲＤＰ活性は、確立されている方法を用いて測定することができる。例えば、Keynan et al,, Antimicrobial Agent and Chemotherapy, 39: 1629-31 (1995)を参照。
【０２０３】
ウレアーゼ
ニッケル依存性ウレアーゼ（尿素アミドヒドロラーゼ、ＥＣ３．５．１．５）は、様々な細菌、真菌類及び高等植物から単離された。環境中のそれらの主要な役割は、生物体が、外部の及び内部生成された尿素を窒素源として用いることを可能にすることである。植物では、尿素は多分、組織的窒素輸送経路にも関与し、おそらく、毒防御タンパク質として作用する。最も特徴が明らかになった細菌性ウレアーゼは、クレブシェラ・アエロゲネス（Klebsiella aerogenes）からのものである。本来の酵素は３つのサブユニット、α（６０．３ｋＤ、ＵｒｅＣ）、β（１１．７ｋＤ、ＵｒｅＢ）及びγ（１１．１ｋＤ、ＵｒｅＡ）を有し、報告によると（αβ２γ２）２の化学量と関連する。それは、三角配置の固く結合した（αβγ）単位の三量体である。２つのニッケル部位は、３．５Ａ離れている。Ｎｉ−１は、３つのリガンドによって配位結合される。Ｎｉ−２は、５つのリガンドによって配位結合される。Jabri et al., Science 268: 998-1004 (1995)。
【０２０４】
ミルシノール（myrsinol）型骨格を有する１つのジテルペンエステルがユーフォービア・デシピエンス（Euphorbia decipiens）から単離され、ウレアーゼ酵素の阻害剤であることが示された。Ahmad et al., Chem Pharm Bull (Tokyo), 56: 719-23.2003。他の阻害剤には、アセトヒドロキサム酸（ＡＨＡ、acetohydroxamic acid）、フェニルホスホロジアミダート（ＰＰＤＡ、phenylphosphorodiamidate）、Ｎ−（ｎ−ブチル）チアホスホリックトリアミド（ＮＢＰＴ、N-(n-butyl) thiophosphoric triamide）、Ludden et al., Journal of Animal Science, 78;181-7 (2000)；フルオロファミド［Ｎ−（ジアミノホスフィニル）−４−フルオロベンゼン］（ＦＦＡ、fluorofamide [N-(diaminophosphinyl)-4-fluorobenzene]）、Pope et al., Digestive Disease Sciences, 43: 109-19 (1998)；ＹＪＡ２０３７９、Woo et al., Arch Pharm Res. 21: 6-11 (1998)；エカベトナトリウム、Ito et al., Biol Pharm Bull., 18: 850-3 (1995)、及びラベプラゾール、Park et al., Biol Pharm Bull. 19: 182-7 (1996)が含まれる。
【０２０５】
非常に多様な２５量体の組合せライブラリ及び固相ヘリコバクター・ピロリウレアーゼホロエンザイム上のランダム６量体ペプチドライブラリのスクリーニングにより、ヘリコバクター・ピロリから精製されたウレアーゼと結合してその活性を抑制することができる２つのペプチド、２４量体TFLPQPRCSALLRYLSEDGVIVPS及び６量体YDFYWWが特定された。Houimel et al., Eur. J. Biochem. 262, 774-780 (1999)。
【０２０６】
多種多様の適当なターゲティング部分が存在する。図は、本発明でターゲティング部分として用いるのに適当であるいくつかのウレアーゼ阻害剤を表し、これらの既知の阻害剤の構造を、リンカー及び金属結合部分の可能な結合部位とともに、並びに可能な誘導体を示す。
【０２０７】
これらのターゲティング部分に加えて、下記で概説するスクリーニングによって特定されたか又はウレアーゼに結合することが判明した他の既知のターゲティング部分を用いることができる。したがって、適当なターゲティング部分には、それらに限定されないが、既知の薬剤及び薬剤候補を含む有機小分子、多糖類、脂肪酸、ワクチン、ポリペプチド、タンパク質（本明細書で記載のペプチドを含む）、核酸、炭水化物、脂質、タンパク性及びステロイド系のホルモンを含むホルモン、成長因子、受容体リガンド、抗原、抗体並びに酵素（下記で概説するように、「候補剤」が含まれる）などが含まれる。
【０２０８】
ウレアーゼ活性は、確立されている方法を用いて測定することができる。例えば、Houimel et al., Eur. J. Biochem. 262, 774-780 (1999)及びStingl et al., Infection and immunity, 69: 1178-1180, (2001)；Clemens et al., J Bacteriol., 177: 5644-5652 (1995)及びBreitenbach and Hausinger, Biochem. J. 250: 917-920 (1988)を参照。
【０２０９】
リンカー
本発明の阻害剤は、リンカーを含んでいてもよい。即ち、一部の例では、ターゲティング部分は、金属結合部分に直接連結される。任意選択で、少なくとも１つの原子を含むリンカーを用いることができる。「リンカー」は、本明細書で、金属結合部分とターゲティング部分の間の共有結合を提供する、少なくとも１つの原子を意味する。リンカーは図では一般に「Ｌｎ」と表され、ｎは０（例えば、リンカーは存在せず、ターゲティング部分とＭＢＭとの間に共有結合がある）又は１（例えば、リンカーが存在する）である。場合によっては、例えば阻害剤が一般式ＭＢＭ−リンカー−ＴＭ又はＴＭ−リンカー−ＭＢＭを有する場合のように、単一のリンカーを用いることができる。或いは、例えば、１つを超える金属結合部分又は１つを超えるターゲティング部分を用いる場合、ＭＢＭ１−リンカー−ＭＢＭ２−リンカー−ＴＭ、ＭＢＭ１−リンカー−ＴＭ−リンカー−ＭＢＭ２などのように、いくつかのリンカーを用いることができよう。１つを超えるＭＢＭを用いる場合、１つ又は複数のリンカーを用いてもよい。
【０２１０】
リンカーの選択は、一般に、公知の分子モデリング技術を用いてなされる。さらに、最適結果を達成するために、リンカーの長さ及び組成が重要なことがある。例えば、多くの実施形態は、高い自由度を有するリンカー、例えば、一般に非置換であるＣ１−Ｃ６及び時々Ｃ３−Ｃ６などの短い直鎖状アルキル鎖を利用するが、一部の実施形態ではより小さな置換基が有用である。同様に、場合によっては、より強固なリンカーを用いることができる。一般に、好ましいリンカーの長さ及び組成は、メタロプロテアーゼの結晶構造を用いてモデル化することができる。好ましいリンカーには、本明細書で概説するように、置換されたアルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル及びシクロヘテロアルキル基を含むアルキル若しくはアリール基、並びに置換されたアリール及びヘテロアリール基が含まれるが、それらに限定されるものではない。一部の実施形態では、フェニルなどのアリール基を含むリンカーは好ましくない。
【０２１１】
場合によっては、金属結合部分及びターゲティング部分は、公知の化学作用を用いて共有結合される。多くの場合、本明細書で概説するように、金属結合部分及びターゲティング部分の両方は、本発明の成分を一緒に加えるために用いられる化学官能基を含む。したがって、一般に、本発明の成分は、その後結合のために用いることができるそれぞれの上の官能基を用いることにより結合される。結合のための好ましい官能基は、アミノ基、カルボキシ基、オキソ基及びチオール基である。これらの官能基は、次に、リンカーを用いることにより直接又は間接的に結合することができる。リンカーは当技術分野で公知である。例えば、ホモ又はヘテロの二機能リンカーが公知である（参照により本明細書で組み込まれる、1994 Pierce Chemical Company社カタログの架橋剤に関する技術セクション、１５５〜２００頁を参照）。或いは、２つの部分を合わせるのではなく、段階的に全分子が合成される。
【０２１２】
本発明の阻害剤
本明細書で記載するように、本発明の阻害剤は、１つ又は複数のターゲティング部分及び１つ又は複数の金属結合部分を含む。当分野の技術者が理解するように、本発明の特異阻害剤は、本明細書で概説される金属結合部分、例えば図に示すもののいずれかと任意選択のリンカーで結合されている、本明細書で概説されるターゲティング部分のいずれかを含む。したがって、図１Ａの構造物は、図２４（１）構造物などと結合することができる。さらに、Ｋｉなどの特定の酵素化学的性質を試験する阻害剤を生成するために、ターゲティング部分のいずれかを、金属結合部分のクラス及び／又はサブクラスと結合することができる。
【０２１３】
したがって、例えば、図に記載される任意の独立して選択される金属結合部分、又は金属結合部分のクラス若しくはサブクラスは、任意の独立して選択されるターゲティング部分に加えることができる。例えば、ヘテロ原子を有する５員芳香環は、図２１に表す任意の独立して選択されるＰＤＥ４阻害剤に加えることができる。任意のサイズの任意の及びすべての組合せ及び下位組合せが、企図される。
【０２１４】
ヒドロラーゼの生成
本発明のヒドロラーゼタンパク質は、ＮＣＢＩデータベースに記載のタンパク質配列よりも短くても長くてもよい。したがって、好ましい実施形態では、すべて本明細書で明示的に参照により組み込まれる、ＮＣＢＩデータベースに記載の配列の一部又は断片が、ヒドロラーゼタンパク質の定義に含まれる。ヒドロラーゼタンパク質の一部又は断片がヒドロラーゼタンパク質とみなされるのは、ａ）それらが少なくとも１つの抗原エピトープを共有するか；又は、ｂ）少なくとも指示される相同性を有するか；又は、ｃ）好ましくはヒドロラーゼ生物活性、例えば、それがＰＤＥ４であるならば、それに限定されないが例えばホスホジエステラーゼ活性を有する場合；及び、ｄ）それがＰＤＥ４である場合、好ましくはｃＡＭＰを選択的に加水分解する場合である。
【０２１５】
一般に、阻害剤を試験するために用いられるヒドロラーゼ酵素は、組換え体である。「組換えタンパク質」は、組換え技術を用いて、即ち、上で表される組換え核酸の発現を通して作製されるタンパク質である。組換えタンパク質は、少なくとも１つ又は複数の特性によって天然のタンパク質から区別される。例えば、このタンパク質は、その野生型宿主内では通常関連しているタンパク質及び化合物の一部又は全部から単離又は精製することができ、したがって実質的に純粋であることができる。例えば、単離したタンパク質は、その天然の状態においてそれが通常関連している物質の少なくとも一部を伴わず、好ましくは所与の試料中の総タンパク質の少なくとも約０．５重量％、より好ましくは少なくとも約５重量％を構成する。実質的に純粋なタンパク質は、総タンパク質の少なくとも約７５重量％を含み、少なくとも約８０％が好ましく、少なくとも約９０％が特に好ましい。定義には、異なる生物体又は宿主細胞の１生物体からのヒドロラーゼタンパク質の生成が含まれる。或いは、タンパク質は、より高い濃度レベルで生成されるように、誘導可能なプロモーター又は高発現プロモーターを用いることにより、通常見られるよりも相当高い濃度で生成することができる。或いは、下記で述べるように、タンパク質は、エピトープ標識の付加、又はアミノ酸の置換、挿入及び欠失の場合のように、通常自然には見られない形態であることができる。
【０２１６】
本発明のヒドロラーゼタンパク質の定義の中には、アミノ酸配列変異体も含まれる。これらの変異体は、３つのクラス、即ち置換型、挿入型又は欠失型の変異体の１つ又は複数に該当する。これらの変異体は、変異体をコードするＤＮＡを生成するために、当技術分野で公知のカセット又はＰＣＲ突然変異生成又は他の技術を用いて、ヒドロラーゼタンパク質をコードするＤＮＡ内のヌクレオチドの部位特異的突然変異によって通常調製され、その後、上で概説されるように、細胞培養内で組換えＤＮＡを発現させる。しかし、最高約１００〜１５０個の残基を有する変異体ヒドロラーゼタンパク質断片は、確立された技術を用いてインビトロ合成によって調製することができる。アミノ酸配列変異体は、変異の所定の性質によって特徴づけられ、それは、ヒドロラーゼタンパク質アミノ酸配列の天然の対立遺伝子又は種間変異形態から区別される特徴である。変異体は一般的に、天然の類似体と同じ定性的生物活性を示すが、下記でより完全に概説されるように、修正された特性を有する変異体を選択することもできる。
【０２１７】
アミノ酸配列の変異を導入するための部位又は領域は前もって決定されるが、突然変異自体は前もって決定する必要はない。例えば、所与の部位で突然変異の能力を最適化するために、標的のコドン又は領域でランダムな突然変異を生成することができ、発現されるヒドロラーゼ変異体を所望の活性の最適な組合せについてスクリーニングすることができる。既知の配列を有するＤＮＡの所定部位で置換突然変異を起こさせる技術は公知であり、例えば、Ｍ１３プライマー突然変異生成及びＰＣＲ突然変異生成がある。突然変異体のスクリーニングは、ヒドロラーゼタンパク質活性のアッセイを用いて実施される。
【０２１８】
アミノ酸置換は、一般的に単一の残基のものである。挿入は通常約１〜２０個程度のアミノ酸であるが、かなりより大きな挿入も許容される。欠失は約１〜約２０個の残基に及ぶが、場合によっては、欠失は相当より大きくてもよい。
【０２１９】
最終的な誘導体に到達するために、置換、欠失、挿入又はその任意の組合せを用いることができる。一般に、分子の変更を最小にするために、これらの変更は２、３のアミノ酸に加えられる。しかし、ある状況ではより大きな変更が許容され得る。ヒドロラーゼタンパク質の特性の小さな変更が所望の場合、一般に、以下のチャートに従って置換が加えられる。
チャートＩ
元の残基    例示的な置換
Ａｌａ      Ｓｅｒ
Ａｒｇ      Ｌｙｓ
Ａｓｎ      Ｇｌｎ、Ｈｉｓ
Ａｓｐ      Ｇｌｕ
Ｃｙｓ      Ｓｅｒ
Ｇｌｎ      Ａｓｎ
Ｇｌｕ      Ａｓｐ
Ｇｌｙ      Ｐｒｏ
Ｈｉｓ      Ａｓｎ、Ｇｌｎ
Ｉｌｅ      Ｌｅｕ、Ｖａｌ
Ｌｅｕ      Ｉｌｅ、Ｖａｌ
Ｌｙｓ      Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ
Ｍｅｔ      Ｌｅｕ、Ｉｌｅ
Ｐｈｅ      Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ
Ｓｅｒ      Ｔｈｒ
Ｔｈｒ      Ｓｅｒ
Ｔｒｐ      Ｔｙｒ
Ｔｙｒ      Ｔｒｐ、Ｐｈｅ
Ｖａｌ      Ｉｌｅ、Ｌｅｕ
【０２２０】
機能又は免疫学的アイデンティティの相当な変更は、チャートＩで示すものよりも保存的でない置換を選択することによって加えられる。例えば、変更領域のポリペプチド骨格の構造、例えばα螺旋又はβシート構造；標的部位の分子の電荷又は疎水性；或いは側鎖の大半により著しく影響を及ぼす置換を加えることができる。ポリペプチドの特性に最も大きな変化を起こさせることが一般に予想される置換は、（ａ）親水性残基、例えばセリル若しくはスレオニルが、疎水性残基、例えばロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル若しくはアラニルに対して（又はそれらによって）置換されるもの；（ｂ）システイン若しくはプロリンが、任意の他の残基に対して（又はそれによって）置換されるもの；（ｃ）電気陽性の側鎖を有する残基、例えばリジル、アルギニル若しくはヒスチジルが、電気陰性の残基、例えばグルタミル若しくはアスパルチルに対して（又はそれらによって）置換されるもの；又は、（ｄ）大きな側鎖を有する残基、例えばフェニルアラニンが、側鎖を有していない残基、例えばグリシンに対して（又はそれによって）置換されるものである。
【０２２１】
変異体は一般的に天然の類似体と同じ定性的生物活性を示し、同じ免疫応答を引き出すが、変異体は、必要に応じてヒドロラーゼタンパク質の特性を修飾するためにも選択される。或いは、ヒドロラーゼタンパク質の生物活性を変更するように、変異体を設計することができる。例えば、アッセイの開発のために、グリコシル化部位を変更若しくは除去すること、又は、膜貫通領域を除去することができる。
【０２２２】
ヒドロラーゼポリペプチドの共有結合性修飾は、本発明の範囲に含まれる。共有結合性修飾の１つの型は、ヒドロラーゼポリペプチドの標的アミノ酸残基を、選択される側鎖又はヒドロラーゼポリペプチドのＮ末端若しくはＣ末端の残基と反応することができる有機誘導体化剤と反応させることを含む。二機能性剤による誘導体化は、より完全に下記に記載するように、例えば、抗ヒドロラーゼ抗体を精製する方法又はスクリーニングアッセイで用いるために、ヒドロラーゼを水不溶性支持体マトリックス若しくは表面に架橋させるために有用である。通常用いられる架橋剤には、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル、３，３−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）などのジスクシンイミジルエステルを含むホモ二機能性イミドエステル、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなどの二機能性マレイミド及びメチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートなどの剤が含まれる。
【０２２３】
他の修飾には、それぞれ対応するグルタミル及びアスパルチル残基へのグルタミニル及びアスパラギニル残基のアミド分解、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリル若しくはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン及びヒスチジン側鎖のアミノ基のメチル化［T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)］、Ｎ末端アミンのアセチル化及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が含まれる。
【０２２４】
本発明の範囲に含まれるヒドロラーゼポリペプチドの共有結合性修飾の他の型は、ポリペプチドの本来のグリコシル化パターンを変化させることを含む。「本来のグリコシル化パターンを変化させること」は、本明細書で、本来の配列ヒドロラーゼポリペプチドで見られる１つ又は複数の炭化水素部分を削除すること、及び/又は本来の配列ヒドロラーゼポリペプチドに存在しない１つ又は複数のグリコシル化部位を追加することを意味するものとする。
【０２２５】
ヒドロラーゼポリペプチドへのグリコシル化部位の付加は、そのアミノ酸配列を変化させることによって達成することができる。変更は、例えば、本来の配列ヒドロラーゼポリペプチドへの１つ又は複数のセリン若しくはスレオニン残基の付加又はそれらによる置換（Ｏ結合グリコシル化部位のために）によって加えることができる。特に、所望のアミノ酸に変換されるコドンが生成されるように、ヒドロラーゼポリペプチドをコードするＤＮＡをあらかじめ選択された塩基で変異させることによって、ヒドロラーゼアミノ酸配列を、ＤＮＡレベルでの変更を通して変化させてもよい。
【０２２６】
ヒドロラーゼポリペプチド上の炭化水素部分の数を増加させる他の手段は、ポリペプチドへのグリコシドの化学的又は酵素的結合によるものである。そのような方法は、当技術分野で、例えば、１９８７年９月１１日に公開の国際公開第８７／０５３３０号パンフレット及びAplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)に記載されている。
【０２２７】
ヒドロラーゼポリペプチド上に存在する炭化水素部分の除去は、化学的若しくは酵素的に、又は、グリコシル化の標的の役目をするアミノ酸残基をコードするコドンの変異的置換によって達成することができる。化学的脱グリコシル化技術は当技術分野で公知であり、例えば、Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys., 259: 52 (1987)及びEdge et al., Anal. Biochem., 118: 131 (1981)によって記載されている。ポリペプチド上の炭化水素部分の酵素切断は、Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138: 350 (1987)に記載されているように、様々なエンド−及びエキソ−グリコシダーゼを用いて達成することができる。
【０２２８】
ヒドロラーゼの共有結合性修飾の他の型は、米国特許第４，６４０，８３５号；第４，４９６，６８９号；第４，３０１，１４４号；第４，６７０，４１７号；第４，７９１，１９２号又は第４，１７９，３３７号明細書に記載の形で、ヒドロラーゼポリペプチドを様々な非タンパク重合体、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール又はポリオキシアルキレンの１つに連結させることを含む。
【０２２９】
本発明のヒドロラーゼポリペプチドは、他の異種ポリペプチド若しくはアミノ酸配列と融合させたヒドロラーゼポリペプチドを含むキメラ分子を形成する方法で、修飾することもできる。一実施形態では、そのようなキメラ分子は、ヒドロラーゼポリペプチドと、抗標識抗体が選択的に結合することができるエピトープを提供する標識ポリペプチドとの融合を含む。エピトープ標識は、一般に、ヒドロラーゼポリペプチドのアミノ末端又はカルボキシル末端に置かれる。ヒドロラーゼポリペプチドのそのようなエピトープ標識形態の存在は、標識ポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープ標識の提供は、抗標識抗体又はエピトープ標識と結合する他の種類の親和性マトリックスを用いて、ヒドロラーゼポリペプチドを親和性精製によって容易に精製することを可能にする。代わりの実施形態では、キメラ分子は、免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定の領域とのヒドロラーゼポリペプチドの融合を含むことができる。二価形態のキメラ分子については、そのような融合はＩｇＧ分子のＦｃ領域に対してであることが可能であろう。
【０２３０】
様々な標識ポリペプチド及びそれらのそれぞれの抗体は、当技術分野で公知である。例には、ポリ−ヒスチジン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ）若しくはポリ−ヒスチジン−グリシン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）標識；インフルエンザＨＡ標識ポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５［Field et al., Mol. Cell. Biol., 8: 2159-2165 (1988)］；ｃ−ｍｙｃ標識及びその８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体［Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5: 3610-3616 (1985)］；並びに、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）標識及びその抗体［Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6): 547-553 (1990)］が含まれる。他の標識ポリペプチドには、フラグ−ペプチド［Hopp et al., BioTechnology, 6: 1204-1210 (1988)］；ＫＴ３エピトープペプチド［Martin et al., Science, 255: 192-194 (1992)］；チューブリンエピトープペプチド［Skinner et al., J. Biol. Chem., 266: 15163-15166 (1991)］；及び、Ｔ７遺伝子１０タンパク質ペプチド標識［Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6393-6397 (1990)］が含まれる。
【０２３１】
本発明のヒドロラーゼタンパク質をコードする核酸は、当技術分野で公知であるように作製することができる。同様にこれらの核酸を使用して、様々な発現ベクターが作製される。発現ベクターは、自己複製型の染色体外ベクター又は宿主ゲノムに組み込まれるベクターであることができる。一般に、これらの発現ベクターは、ヒドロラーゼタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結されている、転写及び翻訳の調節核酸を含む。用語「制御配列」は、作動可能に連結されたコード配列の特定の宿主生物体での発現に必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好適な制御配列は、プロモーター、任意選択でオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
【０２３２】
核酸は、それが他の核酸配列と機能的関係に置かれる場合、「作動可能に連結される」。例えば、プレ配列又は分泌リーダーのためのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するタンパク質前駆体として発現される場合、そのポリペプチドのためのＤＮＡに作動可能に連結され；プロモーター又はエンハンサーは、それが配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結され；或いは、リボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように配置される場合、コード配列に作動可能に連結される。一般に、「作動可能に連結される」は、連結されているＤＮＡ配列が連続していること、及び、分泌リーダーの場合、連続し、且つリーディング相にあることを意味する。しかし、エンハンサーは連続する必要はない。連結は、都合のよい制限部位での連結によって達成される。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを慣行に従って利用する。転写及び翻訳の調節核酸は、当分野の技術者が理解するように、一般に、ヒドロラーゼタンパク質を発現するために用いられる宿主細胞に適当である。例えば、バシラスからの転写及び翻訳の調節核酸配列は、好ましくは、バシラスでヒドロラーゼタンパク質を発現するために用いられる。様々な宿主細胞のための多種類の適当な発現ベクター及び適する調節配列が、当技術分野で公知である。
【０２３３】
一般に、転写及び翻訳の調節配列は、それらに限定されないが、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始及び終止配列、翻訳開始及び終止配列、並びに、エンハンサー又はアクティベーター配列を含むことができる。好ましい実施形態では、調節配列はプロモーター並びに転写開始及び終止配列を含む。
【０２３４】
プロモーター配列には、構成的及び誘導可能なプロモーター配列が含まれる。プロモーターは、天然のプロモーター、ハイブリッド又は合成のプロモーターであることができる。複数のプロモーター要素を組み合わせるハイブリッドプロモーターも当技術分野で公知であり、本発明で有用である。
【０２３５】
さらに、発現ベクターは追加の要素を含むことができる。例えば、発現ベクターは２つの複製系を有することができ、このように、２つの生物体で、例えば発現のためには哺乳動物又は昆虫の細胞で、及びクローニング及び増幅のためには原核生物の宿主でそれが維持されることを可能にする。さらに、発現ベクターを組み込むために、発現ベクターは宿主細胞のゲノムと相同的な少なくとも１つの配列を、好ましくは、発現構築物に連なる２つの相同配列を含む。組み込まれるベクターは、ベクター内に含ませるために適当な相同配列を選択することによって、宿主細胞の特定の遺伝子座に向けることができる。ベクターを組み込むための構築物及び適当な選択及びスクリーニングプロトコルは当技術分野で公知であり、例えば、Mansour et al., Cell, 51: 503 (1988)及びMurray, Gene Transfer and Expression Protocols, Methods in Molecular Biology, VoL 7 (Clifton: Humana Press, 1991)に記載されている。
【０２３６】
さらに、好ましい実施形態では、発現ベクターは、発現ベクターを含む形質転換宿主細胞の選択を可能にするために選択遺伝子を含み、特に哺乳動物細胞の場合には、ベクターを含まない細胞は一般に死滅するので、ベクターの安定性を確保する。選択遺伝子は当技術分野で公知であり、用いる宿主細胞によって異なる。「選択遺伝子」は、本明細書で、選択剤に対する耐性を付与する遺伝子生成物をコードする任意の遺伝子を意味する。適する選択剤には、それらに限定されないが、ネオマイシン（又はその類似体Ｇ４１８）、ブラスチシジンＳ、ヒスチニドールＤ、ブレオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシンＢ及び他の薬剤が含まれる。
【０２３７】
好ましい実施形態では、遺伝子発現レベルを増加させるために、発現ベクターは、発現させる遺伝子の上流又は下流にＲＮＡスプライシング配列を含む。Barret et al., Nucleic Acids Res. 1991；Groos et al., Mol. Cell. Biol. 1987及びBudiman et al., Mol. Cell. Biol. 1988を参照。
【０２３８】
好ましい発現ベクター系は、それらのすべては本明細書で明示的に参照により組み込まれる、Mann et al., Cell, 33: 153-9 (1993)；Pear et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90(18): 8392-6 (1993)；Kitamura et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 92: 9146-50 (1995)；Kinsella et al., Human Gene Therapy, 7: 1405-13；Hofmann et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 93: 5185-90；Choate et al., Human Gene Therapy, 7: 2247 (1996)；ＰＣＴ／ＵＳ９７／０１０１９及びＰＣＴ／ＵＳ９７／０１０４８、並びにそれらの引用文献で一般に記載されているようなレトロウイルスベクター系である。
【０２３９】
本発明のヒドロラーゼタンパク質は、ヒドロラーゼタンパク質をコードする核酸を含む核酸、好ましくは発現ベクターで形質転換した宿主細胞を、ヒドロラーゼタンパク質の発現を誘導するか又は引き起こすのに適当な条件下で培養することによって生成される。ヒドロラーゼタンパク質の発現に適当な条件は、発現ベクター及び宿主細胞の選択によって異なり、常用の実験を通して当分野の技術者によって容易に確認される。例えば、発現ベクターでの構成的プロモーターの使用は宿主細胞の成長及び増殖の最適化を必要とするが、誘導可能なプロモーターの使用は誘導のために適当な成長条件を必要とする。さらに、一部の実施形態では、採取のタイミングが重要である。例えば、昆虫細胞の発現で用いられるバキュロウイルス系は溶菌ウイルスであり、したがって、採取時期の選択が生成物収率のために重要となる可能性がある。
【０２４０】
適当な宿主細胞には、酵母、細菌、古細菌、真菌類並びに、哺乳動物の細胞を含む昆虫及び動物の細胞が含まれる。特に興味があるものは、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）細胞、酵母（Saccharomyces cerevisiae）及び他の酵母、大腸菌（E. coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、ＳＦ９細胞、Ｃ１２９細胞、２９３細胞、ニューロスポーラ属、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＣＯＳ及びＨｅＬａ細胞、線維芽細胞、Ｓｃｈｗａｎｏｍａ細胞系、不死化された哺乳動物の骨髄及びリンパの細胞系、ジャーカット細胞、肥満細胞並びに他の内分泌及び外分泌の細胞、及びニューロン細胞である。本明細書で明示的に参照により組み込まれる、ＡＴＣＣ細胞系カタログを参照。
【０２４１】
好ましい実施形態では、ヒドロラーゼタンパク質は、哺乳動物の細胞で発現される。哺乳動物の発現系も当技術分野で公知であり、レトロウイルス系が含まれる。哺乳動物のプロモーターは、哺乳動物のＲＮＡポリメラーゼと結合し、ｍＲＮＡへのヒドロラーゼタンパク質のコード配列の下流（３’末端）側の転写を開始することができる、任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、コード配列の５’末端の近位に通常置かれる転写開始領域及び、転写開始部位の２５〜３０塩基対上流に位置するＴＡＴＡボックスを有する。ＴＡＴＡボックスは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩに、正しい部位でＲＮＡ合成を開始することを指示すると考えられる。哺乳動物のプロモーターは上流プロモーター要素（エンハンサー要素）も含み、それは、一般的にＴＡＴＡボックスの１００〜２００塩基対上流の範囲内に位置する。上流プロモーター要素は転写が開始される速度を決定し、どちらの方向にでも作用することができる。哺乳動物のプロモーターとして特に有用なものは、哺乳動物のウイルス遺伝子からのプロモーターであるが、その理由は、ウイルス遺伝子はしばしば高度に発現され、広い宿主域を有するからである。例としては、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳癌ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、単純ヘルペスウイルスプロモーター及びＣＭＶプロモーターがある。
【０２４２】
一般的に、哺乳動物の細胞によって認識される転写終止及びポリアデニル化配列は、翻訳終止コドンの３’側に位置する調節領域であり、したがって、プロモーター要素と一緒にコード配列に連なる。成熟したｍＲＮＡの３’末端は、部位特異的な翻訳後の切断及びポリアデニル化によって形成される。転写ターミネーター及びポリアデニル化シグナルの例としては、ＳＶ４０から誘導されたものがある。
【０２４３】
哺乳動物の宿主、並びに他の宿主に外因性核酸を導入する方法は当技術分野で公知であり、用いる宿主細胞によって異なる。技術としては、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ウイルス感染、リポソーム内へのポリヌクレオチドの封入、及び核へのＤＮＡの直接微量注入がある。
【０２４４】
好ましい実施形態では、ヒドロラーゼタンパク質は、細菌系で発現される。細菌発現系は、当技術分野で公知である。
【０２４５】
適する細菌プロモーターは、細菌のＲＮＡポリメラーゼと結合し、ｍＲＮＡへのヒドロラーゼタンパク質のコード配列の下流（３’）側の転写を開始することができる、任意の核酸配列である。細菌プロモーターは、コード配列の５’末端の近位に通常置かれる、転写開始領域を有する。この転写開始領域は、一般的にＲＮＡポリメラーゼ結合部位及び転写開始部位を含む。代謝経路酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列をもたらす。例としては、ガラクトース、ラクトース及びマルトースなどの糖代謝酵素から導かれるプロモーター配列、並びにトリプトファンなどの生合成酵素から導かれる配列がある。バクテリオファージからのプロモーターを用いることもでき、当技術分野で公知である。さらに、合成プロモーター及びハイブリッドプロモーターも有用であり、例えば、ｔａｃプロモーターはｔｒｐ及びｌａｃプロモーター配列のハイブリッドである。さらに、細菌プロモーターには、細菌ＲＮＡポリメラーゼと結合して転写を開始する能力を有する、非細菌性起源の天然のプロモーターを含めることができる。
【０２４６】
機能性プロモーター配列に加えて、効率的なリボソーム結合部位が望まれる。大腸菌では、リボソーム結合部位はＳｈｉｎｅ−Ｄｅｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列と呼ばれ、開始コドン及び開始コドンの３〜１１ヌクレオチド上流に位置する長さが３〜９個のヌクレオチドの配列を含む。
【０２４７】
発現ベクターは、細菌でヒドロラーゼタンパク質の分泌を可能にするシグナルペプチド配列を含むこともできる。当技術分野で公知であるように、シグナル配列は、一般的に、細胞からのタンパク質の分泌を指示する疎水性アミノ酸で構成される、シグナルペプチドをコードする。そのタンパク質は、増殖培地（グラム陽性菌）中に、又は、細胞（グラム陰性菌）の内外の膜の間に位置するペリプラズム間隙に分泌される。
【０２４８】
細菌の発現ベクターは、形質転換された菌株の選択を可能にする選択可能なマーカー遺伝子を含むこともできる。適する選択遺伝子には、細菌を、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン、ネオマイシン及びテトラサイクリンなどの薬剤に耐性にする遺伝子が含まれる。選択マーカーには、ヒスチジン、トリプトファン及びロイシンの生合成経路でのものなどの、生合成遺伝子も含まれる。
【０２４９】
これらの成分は、発現ベクターに組み立てられる。細菌の発現ベクターは当技術分野で公知であり、例としては、とりわけ、枯草菌、大腸菌、ストレプトコッカス・クレモシル（Streptococcus cremoris）及びストレプトコッカス・リビダンス（Streptococcus lividans）のベクターが含まれる。
【０２５０】
細菌の発現ベクターは、塩化カルシウム処理、エレクトロポレーション及びその他などの当技術分野で公知の技術を用いて、細菌宿主細胞に形質転換される。
【０２５１】
一実施形態では、ヒドロラーゼタンパク質は昆虫細胞で生成される。昆虫細胞の形質転換のための発現ベクター、特にバキュロウイルスに基づく発現ベクターは当技術分野で公知であり、例えばO'Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual (New York: Oxford University Press, 1994)に記載されている。
【０２５２】
好ましい実施形態では、ヒドロラーゼタンパク質は酵母細胞で生成される。酵母発現系は当技術分野で公知であり、その例には、酵母菌、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）及びＣ．マルトーサ（C. maltosa）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、クルイヴェロマイシス・フラジリス（Kluyveromyces fragilis）及びＫ．ラクティス（K. lactis）、ピチア・ギレリモンジ（Pichia guillerimondii）及びＰ．パストリス（P. pastoris）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）並びにヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）のための発現ベクターが含まれる。酵母での発現のための好ましいプロモーター配列には、誘導可能なＧＡＬ１、１０プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼ、エノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース６リン酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素、ヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ及び酸性ホスファターゼ遺伝子からのプロモーターが含まれる。酵母の選択マーカーには、ツニカマイシンに対する耐性を付与するＡＤＥ２、ＨＩＳ４、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１及びＡＬＧ７；Ｇ４１８に対する耐性を付与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子；並びに、銅イオンの存在下で酵母の成長を可能にするＣＵＰ１遺伝子が含まれる。
【０２５３】
ヒドロラーゼタンパク質は、当技術分野で公知の技術を用いて、融合タンパク質として作製することもできる。したがって、例えば、モノクローナル抗体の作製のために、所望のエピトープが小さい場合、ヒドロラーゼタンパク質を担体タンパク質に融合させて免疫原を形成することができる。或いは、ヒドロラーゼタンパク質は、発現を向上させるため又は他の理由で、融合タンパク質として作製することができる。例えば、ヒドロラーゼタンパク質がヒドロラーゼペプチドである場合、発現目的のために、そのペプチドをコードする核酸を他の核酸に連結することができる。
【０２５４】
一実施形態では、本発明のヒドロラーゼ核酸、タンパク質及び抗体は、標識される。「標識された」は、本明細書で、本発明の核酸、タンパク質及び抗体が、本発明の核酸、タンパク質及び抗体の検出を可能にするために、結合された少なくとも１つの元素、同位体又は化合物を有することを意味する。一般に、標識は以下の３つのクラス、即ち、ａ）放射性又は重い同位体であってよい同位体標識；ｂ）抗体又は抗原であることができる免疫標識；及び、ｃ）有色又は蛍光色素に該当する。標識は、化合物の任意の位置に組み込むことができる。
【０２５５】
好ましい実施形態では、ヒドロラーゼタンパク質は発現後に精製又は単離される。ヒドロラーゼタンパク質は、試料中に他のどのような成分が存在するかによって、当業技術者に公知である様々な方法で単離又は精製することができる。標準の精製方法には、電気泳動技術、分子技術、免疫学的技術、並びに、イオン交換、疎水性、親和性及び逆相ＨＰＬＣのクロマトグラフィー並びにクロマトフォーカシングを含むクロマトグラフィー技術が含まれる。例えば、ヒドロラーゼタンパク質は、標準の抗ヒドロラーゼ抗体カラムを用いて精製することができる。タンパク質濃縮と併用される、限外ろ過及びダイアフィルトレーション技術も有用である。適する精製技術の一般的なガイダンスについては、Scopes, R., Protein Purification, Springer-Verlag, NY (1982)を参照。必要な精製度は、ヒドロラーゼタンパク質の使用によって異なる。一部の例では、精製を必要としない。
【０２５６】
発現され、必要に応じて精製されると、ヒドロラーゼタンパク質及び核酸はいくつかの用途で有用である。
【０２５７】
ヒドロラーゼ阻害剤のスクリーニング
スクリーニングは、ヒドロラーゼタンパク質と結合することができるターゲティング部分を見出すように設計することができ、次に、これらのターゲティング部分を金属結合部分に連結してヒドロラーゼ候補阻害剤を形成し、その後、ヒドロラーゼ生物活性を調節する候補阻害剤の能力を評価するアッセイで用いることができる。或いは、ターゲティング部分を金属結合部分に連結して先ずヒドロラーゼへの結合活性をスクリーニングし、次に、阻害活性をスクリーニングすること、又はその逆の順序で実施することができる。したがって、当分野の技術者が理解するように、実行可能ないくつかの異なるアッセイ、即ち、結合アッセイ及び活性アッセイが存在する。
【０２５８】
標的部分スクリーニング
好ましい実施形態では、方法はヒドロラーゼタンパク質及び候補ターゲティング部分を組み合わせて、ヒドロラーゼタンパク質へのターゲティング部分の結合を判定することを含む。一般に、本明細書で記載するように、アッセイは、ヒドロラーゼタンパク質を試験する１つ又は複数のターゲティング部分と接触させることによってなされる。
【０２５９】
ターゲティング部分は、多数の化学物質クラスを包含する。一実施形態では、標的部分は有機分子であり、好ましくは１００を超え約２，５００ダルトン未満の分子量を有する有機小化合物である。特に好ましいものは、１００を超え約２，０００ダルトン未満、より好ましくは約１５００ダルトン未満、より好ましくは約１０００ダルトン未満、より好ましくは５００ダルトン未満の分子量を有する有機小化合物である。ターゲティング部分は、タンパク質との構造的な相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含み、一般的に、少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシル又はカルボキシル基、好ましくは少なくとも２つの機能的化学基を含む。候補剤は、上の官能基の１つ又は複数で置換されている環式の炭素若しくは複素環式の構造物、及び／又は芳香族若しくは多芳香族の構造物をしばしば含む。ターゲティング部分は、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類似体又はそれらの組合せを含む生体分子の間でも見出される。
【０２６０】
ターゲティング部分は、合成又は天然の化合物のライブラリを含む多種多様の生成源から得られる。例えば、多種多様の有機化合物及び生体分子のランダム合成及び誘導合成のために、ランダムなオリゴヌクレオチドの発現を含む多数の手段が利用可能である。或いは、細菌、真菌、植物及び動物の抽出物の形の天然化合物のライブラリが利用できるか、又は容易に生成される。さらに、天然の又は合成によるライブラリ及び化合物は、従来の化学的、物理的及び生化学的手段を通して容易に修飾される。既知の薬剤は、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などの、誘導された又はランダムな化学修飾を受けさせ、構造類似体を生成することができる。
【０２６１】
好ましい実施形態では、ターゲティング部分は有機化学部分であり、その多種多様のものが文献で利用できる。
【０２６２】
好ましい実施形態では、ターゲティング部分は組合せ化学ライブラリから得られ、その多種多様のものが文献で利用できる。「組合せ化学ライブラリ」は、本明細書で、常にではないが一般に化学合成によって、既定の又はランダムな方法で生成される多様な化合物の集合を意味する。組合せ混合によって、何百万の化合物を合成することができる。
【０２６３】
好ましい実施形態では、ターゲティング部分は炭水化物である。「炭水化物」は、本明細書で、一般式Ｃｘ（Ｈ２Ｏ）ｙを有する化合物を意味する。単糖、二糖及びオリゴ糖又は多糖は、定義の中にすべて含まれ、グリコシド結合を通して連結する様々な糖分子の重合体を含む。特に好ましい炭水化物は、ガラクトース、マンノース、フコース、ガラクトサミン、（特にＮ−アセチルグルコサミン）、グルコサミン、グルコース及びシアル酸の単量体及びオリゴマーを含むグリコシル化されたタンパク質の炭水化物成分、特に、細胞表面受容体などのある受容体への結合を可能にするグリコシル化成分のすべて又は一部を含むものである。他の炭水化物は、グルコース、リボース、ラクトース、ラフィノース、フルクトース及び他の生物学的に意味のある炭水化物の単量体及び重合体を含む。細胞にＭＲＩ剤を送達するために、特に多糖類（それらに限定されないが、アラビノガラクタン、アラビアゴム、マンナンなどを含む）が用いられてきた；本明細書でそのすべてが参照により組み込まれる、米国特許第５，５５４，３８６号明細書を参照。
【０２６４】
好ましい実施形態では、ターゲティング部分は脂質である。本明細書で用いる「脂質」は、脂肪、脂肪油、ワックス、リン脂質、糖脂質、テルペン、脂肪酸及びグリセリド、特にトリグリセリドを含む。エイコサノイド、その一部はプロスタグランジンなどのホルモンでもあるステロイド及びステロール、アヘン剤並びにコレステロールも脂質の定義に含まれる。
【０２６５】
好ましい実施形態では、ターゲティング部分はタンパク質である。「タンパク質」は、本明細書で、少なくとも２つの共有結合で結合しているアミノ酸を意味し、それには、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド及びペプチドが含まれる。タンパク質は、天然のアミノ酸及びペプチド結合、又は合成のペプチド様構造物で構成することができる。したがって、本明細書で用いる「アミノ酸」又は「ペプチド残基」は、天然及び合成のアミノ酸の両方を意味する。例えば、ホモフェニルアラニン、シトルリン及びノルロイシンは、本発明ではアミノ酸とみなされる。「アミノ酸」には、プロリン及びヒドロキシプロリンなどのイミノ酸残基も含まれる。側鎖は、（Ｒ）又は（Ｓ）配置であることができる。好ましい実施形態では、アミノ酸は（Ｓ）又はＬ−配置である。非天然の側鎖を用いる場合、例えばインビボ分解を阻止するか又は遅らせるために、非アミノ酸置換基を用いることができる。ヒドロラーゼ酵素のペプチド阻害剤が、特に有用である。
【０２６６】
好ましい実施形態では、ターゲティング部分は天然のタンパク質又は天然のタンパク質の断片である。したがって、例えば、タンパク質を含有する細胞抽出物、又はタンパク性細胞抽出物のランダムな又は誘導された消化物を用いることができる。このように、本明細書で記載する系でのスクリーニングのために、原核及び真核生物のタンパク質のライブラリを作製することができる。この実施形態で特に好まれるものは、細菌、真菌、ウイルス及び哺乳動物のタンパク質のライブラリであり、後者が好ましく、ヒトタンパク質が特に好ましい。
【０２６７】
一部の実施形態では、候補剤はペプチドである。この実施形態では、提示構造を含むペプチド構築物を用いることが有用である可能性がある。「提示構造」又は文法上の同等物は、本明細書で、候補生体活性剤と融合させた場合に、候補剤に高次構造的に制限された形態を取らせる配列を意味する。タンパク質は、主に高次構造的に制約されたドメインを通して相互作用する。当技術分野で公知であるように自由回転するアミノ末端及びカルボキシル末端を有する小さなペプチドは強力な機能を有することができるが、そのようなペプチド構造物の薬理学的剤への変換は、ペプチド様物質の合成のために側鎖の位置を予測することが不可能なために困難である。したがって、高次構造的に制約された構造物でのペプチドの提示は、後の医薬の生成に有利であり、また、標的タンパク質とのペプチドのより高い親和性の相互作用をもたらすようである。この事実は、細菌性ファージ系で生物学的に生成された短いペプチドを用いて、組合せライブラリ生成系で認識された。幾人かの研究者が、ランダムなペプチド構造を提示することができるであろう、小さなドメイン分子を構築した。好ましい提示構造は、外部ループ上にそれを提示することによって、ペプチドへのアクセシビリティを最大にする。したがって、適する提示構造には、それらに限定されないが、ミニボディ構造、構造に重要でない残基がランダム化されたβシートターン及びコイルドコイルステム構造上のループ、ジンクフィンガードメイン、システイン連結（ジスルフィド）構造、トランスグルタミナーゼ連結構造、環状ペプチド、Ｂ−ループ構造、螺旋状のバレル若しくはバンドル、ロイシンジッパーモチーフなどが含まれる。参照により組み込まれる米国特許第６,１５３,３８０号明細書を参照。
【０２６８】
スクリーニングアッセイで特に有用なものは、ファージディスプレイライブラリである。例えば、ファージディスプレイ法及び構築物についてそのすべてが明示的に参照により完全に組み込まれている、米国特許第５，２２３，４０９号；第５，４０３，４８４号；第５，５７１，６９８号；及び第５，８３７，５００号明細書を参照。
【０２６９】
好ましい実施形態では、ターゲティング部分は、約５〜約３０個のアミノ酸のペプチドであり、約５〜約２０個のアミノ酸が好ましく、約７〜約１５個が特に好ましい。ペプチドは、上で概説したように天然のタンパク質の消化物、ランダムなペプチド又は「偏った」ランダムなペプチドであることができる。「ランダム化された」又は文法上の同等物は、本明細書で、各核酸及びペプチドが基本的にそれぞれランダムなヌクレオチド及びアミノ酸からなることを意味する。一般にこれらのランダムなペプチド（又は核酸、下記で述べる）は化学的に合成されるので、それらは任意のヌクレオチド又はアミノ酸を任意の位置に組み込むことができる。合成法は、配列の全長にわたって可能な組合せのすべて又はほとんどの形成を可能にし、このように、ランダム化されたターゲティング部分のライブラリを形成するために、ランダム化されたタンパク質又は核酸を生成するように設計することができる。
【０２７０】
一実施形態では、ライブラリは完全にランダム化され、いかなる位置にも配列の優先及び不変なものは存在しない。好ましい実施形態では、ライブラリは偏っている。即ち、配列の中の一部の位置は一定に保持されるか、又は、限定された数の可能性から選択される。例えば、好ましい実施形態では、ヌクレオチド又はアミノ酸残基は、例えば疎水性アミノ酸、親水性残基、立体配置的に偏った（小さいか大きい）残基の既定のクラス内で、架橋のためにシステインの生成に向けて、ＳＨ−３ドメインのためにプロリンの生成に向けて、リン酸化部位などのためにセリン、スレオニン、チロシン若しくはヒスチジンの生成に向けて、又は、プリンなどに向けて、ランダム化される。
【０２７１】
好ましい実施形態では、下でより詳しく概説するように、候補剤は、ｃＤＮＡライブラリ又はｃＤＮＡライブラリから導かれるライブラリ、例えば断片化されたもの（ランダムに分断されたｃＤＮＡライブラリを含む）のランダム化されたタンパク質（偏ったタンパク質又は融合パートナーを有するタンパク質を含む）又は発現生成物である。これらは、これらのタンパク質をコードする核酸として、細胞に加えられる。当分野の技術者が理解するように、これらのｃＤＮＡライブラリは完全長又は断片であることができ、インフレーム、アウトオブフレームであることができ、又は、アンチセンス鎖から読み取ることができる。
【０２７２】
好ましい実施形態では、ターゲティング部分は抗体である。用語「抗体」は、当技術分野で公知であるように抗体断片を含み、例としてはＦａｂ  Ｆａｂ２、一本鎖抗体（例えばＦｖ）、キメラ抗体などがあり、完全体抗体又は組換えＤＮＡ技術を用いてデノボで合成されたものの修飾によって生成される。
【０２７３】
好ましい実施形態では、本発明の抗体ターゲティング部分は、ヒト化抗体又はヒト抗体である。ヒト以外（例えば、マウス）の抗体のヒト化形態は、ヒト以外の免疫グロブリンから導かれる最小限の配列を有するキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はその断片（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２若しくは抗体の他の抗原結合部分配列）である。ヒト化抗体には、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有する、マウス、ラット又はウサギなどのヒト以外の種（供与体抗体）のＣＤＲからの残基によって置換されている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）が含まれる。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応するヒト以外の残基によって置換される。ヒト化抗体は、レシピエント抗体でもインポートされたＣＤＲ及びフレームワーク配列でも発見されない残基を含むこともできる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、一般的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、ＣＤＲ領域のすべて又は実質的にすべてはヒト以外の免疫グロブリンのそれらに対応し、ＦＲ領域のすべて又は実質的にすべてはヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のそれらである。ヒト化抗体は、最適には、免疫グロブリン定常部（Ｆｃ）、一般的にはヒト免疫グロブリンのそれの少なくとも一部も含む［Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986)；Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988)及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992)］。
【０２７４】
ヒト以外の抗体をヒト化する方法は、当技術分野で公知である。一般に、ヒト化抗体は、ヒト以外の生成源からそれに導入される、１つ又は複数のアミノ酸残基を有する。これらのヒト以外のアミノ酸残基は「インポート」残基としばしば呼ばれ、それらは、一般的に「インポート」可変ドメインからとられる。ヒト化は、基本的にWinter及び共同研究者［Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239: 1534-1536 (1988)］の方法に従い、齧歯動物のＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応配列と置換することによって実施することができる。したがって、そのような「ヒト化」抗体は、キメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号明細書）であって、実質的に無傷のヒト可変ドメイン未満がヒト以外の種からの対応配列によって置換されている。実際、ヒト化抗体は、一般的に、一部のＣＤＲ残基、及びおそらく一部のＦＲ残基が齧歯動物の抗体の類似部位からの残基によって置換されるヒト抗体である。
【０２７５】
ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリを含む、当技術分野で公知である様々な技術を用いて生成することもできる［Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581 (1991)］。ヒトモノクローナル抗体の調製に、Cole et al.及びBoemer et al.の技術も利用できる（Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)及びBoemer et al., J. Immunol. 147(1): 86-95 (1991)］。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をトランスジェニックの動物、例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的又は完全に不活性化されたマウスに導入することによって、作製することができる。抗原投与後、ヒト抗体産生が観察され、それは、遺伝子転位、アセンブリー及び抗体レパートリーを含むあらゆる点でヒトで見られるそれに極めて類似する。この手法は、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号；第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，６６１，０１６号明細書、及び以下の科学刊行物：Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992)；Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994)；Morrison, Nature 368: 812-13 (1994)；Fishwild et al., Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996)；Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)に記載されている。
【０２７６】
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有する、モノクローナルの、好ましくはヒト若しくはヒト化された抗体である。この場合は、結合特異性の１つは第１の標的分子に対するものであり、他の１つは第２の標的分子に対するものである。
【０２７７】
二重特異性抗体の作製方法は、当技術分野で公知である。伝統的に、二重特異性抗体の組換え生成は、２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の共発現に基づくものであって、２つの重鎖は異なる特異性を有する［Milstein and Cuello, Nature 305: 537-539 (1983)］。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のランダムな組合せのため、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は１０個の異なる抗体分子の可能な混合を生成し、その１つだけが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、通常、アフィニティークロマトグラフィー工程によって達成される。類似した方法は、１９９３年５月１３日に公開の国際公開第９３／０８８２９号パンフレット、及びTraunecker et al., EMBO J. 10: 3655-3659 (1991)に開示されている。
【０２７８】
所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体抗原結合部位）は、免疫グロブリンの定常ドメイン配列に融合することができる。融合は、好ましくは、ヒンジ領域、ＣＨ２及びＣＨ３領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリンの重鎖定常ドメインによる。融合の少なくとも１つに存在する軽鎖結合に必要な部位を含む、第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合及び、所望により、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは、別々の発現ベクターに挿入され、適する宿主生物体にコトランスフェクトされる。二重特異性抗体の生成のさらなる詳細については、例えばSuresh et al., Methods in Enzymology 121: 210 (1986)を参照。
【０２７９】
ヘテロコンジュゲート抗体も、本発明の範囲内である。ヘテロコンジュゲート抗体は、共有結合する２つの抗体で構成される。そのような抗体は、例えば、望ましくない細胞を免疫系細胞の標的にするために［米国特許第４，６７６，９８０号明細書］、及び、ＨＩＶ感染症の治療のために［国際公開第９１／００３６０号パンフレット；国際公開第９２／２００３７３号パンフレット；欧州特許第０３０８９号明細書］提案された。抗体は、架橋剤を要する方法を含む合成タンパク質化学で既知の方法を用いて、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を用いるか、又はチオエーテル結合を形成することによって構築することができる。この目的に適する試薬の例には、イミノチオレート及びメチル−４−メルカプトブチルイミデート及び、例えば米国特許第４，６７６，９８０号明細書で開示されるものが含まれる。
【０２８０】
好ましい実施形態では、候補生体活性剤は核酸である。本明細書で、「核酸」又は「オリゴヌクレオチド」又は文法上の同等物は、共有結合でつながっている少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。本発明の核酸は一般にホスホジエステル結合を含むが、場合によっては、下記で概説するように、例えばリンアミド（Beaucage, et al., Tetrahedron, 49(10): 1925 (1993)及びその中の参考文献；Letsinger, J. Org. Chem., 35: 3800 (1970)；Sprinzl, et al., Eur. J. Biochem., 81: 579 (1977)；Letsinger, et al., Nucl. Acids Res., 14: 3487 (1986)；Sawai, et al., Chem. Lett., 805 (1984)、Letsinger, et al., J. Am. Chem. Soc., 110: 4470 (1988)；及びPauwels, et al., Chemica Scripta, 26: 141 (1986)）、ホスホロチオエート（Mag, et al., Nucleic Acids Res., 19: 1437 (1991)及び米国特許第５，６４４，０４８号明細書）、ホスホロジチオエート（Briu, et al., J. Am. Chem. Soc., 111: 2321 (1989)）、Ｏ−メチルホスホロアミダイト結合（Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Pressを参照）、並びに、ペプチド核酸骨格及び結合（そのすべては参照により組み込まれる、Egholm, J. Am. Chem. Soc., 114: 1895 (1992)；Meier, et al., Chem. Int. Ed. Engl., 31: 1008 (1992)；Nielsen, Nature, 365: 566 (1993)；Carlsson, et al., Nature, 380: 207 (1996)を参照）を含む、代わりの骨格を有することができる核酸類似体が含まれる。他の類似核酸としては、陽性の骨格を有するもの（Denpcy, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 6097 (1995)）；非イオン性骨格を有するもの（米国特許第５，３８６，０２３号；第５，６３７，６８４号；第５，６０２，２４０号；第５，２１６，１４１号及び第４，４６９，８６３号明細書；Kiedrowshi, et al., Angew. Chem. Intl. Ed. English, 30: 423 (1991)；Letsinger, et al., J. Am. Chem. Soc., 110: 4470 (1988)；Letsinger, et al., Nucleoside & Nucleotide, 13: 1597 (1994)；Chapters 2 and 3, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y.S. Sanghui and P. Dan Cook；Mesmaeker, et al., Bioorganic & Medicinal Chem. Lett., 4: 395 (1994)；Jeffs, et al., J. Biomolecular NMR, 34: 17 (1994)；Tetrahedron Lett., 37: 743 (1996)）、米国特許第５，２３５，０３３号及び第５，０３４，５０６号明細書、並びにChapters 6 and 7, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y.S. Sanghui and P. Dan Cookに記載のものを含む非リボース骨格を有するもの、並びにペプチド核酸がある。１つ又は複数の炭素環式の糖を含む核酸も、核酸の定義に含まれる（Jenkins, et al., Chem. Soc. Rev., (1995) pp. 169-176を参照）。いくつかの核酸類似体が、Rawls, C & E News, June 2, 1997, page 35に記載されている。これらの参考文献のすべては、本明細書で明示的に参照により組み込まれる。標識などの追加の部分の付加を容易にするため、又は、生理的環境中でのそのような分子の安定性及び半減期を向上させるために、リボース−リン酸骨格のこれらの修飾を行うことができる。さらに、天然の核酸及び類似体の混合物を作製することができる。或いは、異なる核酸類似体の混合物、及び天然の核酸及び類似体の混合物を作製することができる。核酸は、明記されるように、一本鎖若しくは二本鎖でよく、又は、二本鎖若しくは一本鎖の配列の一部を含むことができる。核酸は、ゲノム及びｃＤＮＡ、ＲＮＡ又はハイブリッドのＤＮＡであることができ、核酸は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドの任意の組合せ及び塩基の任意の組合せを含み、塩基の例とし��は、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチンヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニン、４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、シュードイソシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチル−アミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルシュードウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルケオシン、５−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、シュードウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、シュードウラシル、ケオシン、２−チオシトシン及び２，６−ジアミノプリンなどがある。
【０２８１】
一実施形態では、核酸はアプタマーである、本明細書で参照により組み込まれる、米国特許第５，２７０，１６３号、第５，４７５，０９６号、第５，５６７，５８８号、第５，５９５，８７７号、第５，６３７，４５９号、第５，６８３，８６７号、第５，７０５，３３７号明細書及び関連特許を参照。
【０２８２】
本発明との関連で、ヌクレオシド（リボース及び塩基）及びヌクレオチド（リボース、塩基及び少なくとも１つのリン酸）は、特に明記しない限り、本明細書で互換的に用いられる点に留意する必要がある。
【０２８３】
先にタンパク質について一般的に述べたように、核酸ターゲティング部分は、天然の核酸、ランダムな及び／若しくは合成の核酸又は「偏った」ランダムな核酸であることができる。例えば、原核生物又は真核生物のゲノムの消化物は、タンパク質について上で概説されているように用いることができる。
【０２８４】
好ましい実施形態では、異なるターゲティング部分のライブラリが用いられる。好ましくは、ライブラリは、特定の標的への結合を可能にするために蓋然論的に十分な範囲の多様性を達成するために、ランダム化された剤の構造的に十分多様な集団を提供するものでなければならない。したがって、相互作用ライブラリは、そのメンバーの少なくとも１つがそれに対して標的との親和性を与える構造を有するように、十分大きくなければならない。相互作用ライブラリの必要とされる絶対サイズを測定することは困難であるが、自然は免疫応答でヒントを提供する。１０７〜１０８個の異なる抗体の多様性は、生物体が遭遇するほとんどの可能な抗原と相互作用するために十分な親和性を有する少なくとも１つの組合せを提供する。公開されたインビトロ選択技術も、１０７〜１０８個のライブラリサイズが、標的との親和性を有する構造物を発見するのに十分であることを示した。本明細書で一般に提案されているような、長さ７〜２０アミノ酸のペプチドのすべての組合せのライブラリは、２０７（１０９）〜２０２０個をコードする能力を有する。したがって、１０７〜１０８個の異なる分子のライブラリで、本方法は７つのアミノ酸のための理論的に完全な相互作用ライブラリの「有効」サブセット及び２０２０個のライブラリのための形状のサブセットを可能にする。したがって、好ましい実施形態では、少なくとも１０６個、好ましくは少なくとも１０７個、より好ましくは少なくとも１０８個、最も好ましくは少なくとも１０９個の異なる配列が、本方法で同時に分析される。好ましい方法は、ライブラリサイズ及び多様性を最大にする。
【０２８５】
発現され、必要に応じて精製されると、ヒドロラーゼタンパク質は、金属結合部分及び、ヒドロラーゼタンパク質と結合してヒドロラーゼ活性を抑制するターゲティング部分を含む、ヒドロラーゼ候補阻害剤の特定のためのスクリーニングアッセイで用いられる。
【０２８６】
好ましい実施形態では、本明細書で概説するように、ターゲティング部分は先ず候補剤を用いることによりそれらの所望の特性についてスクリーニングされ、次に、本発明で提供する方法を用いるさらなるスクリーニングのためのヒドロラーゼ候補阻害剤を生成するために、金属結合部分と結合される。
【０２８７】
他の好ましい実施形態では、ターゲティング部分は予備スクリーニングされない。ターゲティング部分を金属結合部分に連結し、次に、本発明で提供する方法を用いるスクリーニングのために用いる。
【０２８８】
ターゲティング部分を、剤と標的との相互作用を有利にする反応条件下で、ヒドロラーゼタンパク質と接触させる。一般に、これは生理条件である。インキュベーションは、最適な活性を促進する任意の温度、一般的に４〜４０℃で実施することができる。インキュベーション期間は最適な活性のために選択されるが、速やかなハイスループットスクリーニングを促進するために最適化することもできる。一般的に、０．１〜１時間が十分である。固相アッセイの場合、過剰な試薬は一般に除去するか又は洗い流す。アッセイフォーマットについては、下記で述べる。
【０２８９】
他の様々な試薬が、アッセイに含まれてもよい。これらには、塩、中性タンパク質、例えばアルブミン、界面活性剤などの、最適ヒドロラーゼタンパク質とターゲティング部分との結合を促進すること、及び／又は非特異的な若しくはバックグラウンドの相互作用を減少させることのために用いることができる試薬が含まれる。また、他の方法でアッセイの効率を向上させる試薬、例えば、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗微生物性剤などを用いることができる。必要な結合を可能にする任意の順序で、成分の混合物を追加することができる。
【０２９０】
一実施形態では、溶液相結合アッセイが実施される。通常、この実施形態では、ターゲティング部分及びヒドロラーゼタンパク質の両方を、重複するスペクトルを有する異なる蛍光団で標識することによって、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ、fluorescence resonance energy transfer）アッセイが実施される。エネルギー転移は距離依存性であるので、結合がない場合、１波長での励起は発光スペクトルを生成しない。２つの標識が近接の場合だけ、例えば結合が起こっている場合、１波長での励起は第２の標識の所望の発光スペクトルをもたらす。
【０２９１】
一部の実施形態では、固相（不均質の）アッセイが実施される。この場合、ヒドロラーゼタンパク質又はターゲティング部分が不溶性固体支持体に非拡散的に結合される結合アッセイが実施され、検出は、下記のように、標識された他の成分を加えることによってなされる。
【０２９２】
不溶性支持体は、組成物を結合することができ、溶解性の物質から容易に分離され、さもなければスクリーニング法の全体と両立する任意の組成で作製することができる。そのような支持体の表面は、中実又は多孔性でよく、都合のよい任意の形状でよい。適する支持体の例には、マイクロタイタープレート、アレイ、膜及びビーズが含まれ、例えば、それらに限定されないが、ガラス及び修飾又は官能化されたガラス、プラスチック（アクリル、ポリスチレン及びスチレン及びその他の材料のコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、テフロン（登録商標）などを含む）、多糖類、ナイロン若しくはニトロセルロース、樹脂、シリカ若しくはシリカベースの物質、例えばシリコン及び修飾シリコン、炭素、金属、無機ガラス、プラスチック、セラミックス並びに他の様々なポリマーがある。一部の実施形態では、固体支持体は光検出を可能にし、それ自身はあまり蛍光を発しない。さらに、当技術分野で公知であるように、固体支持体は、デキストラン、アクリルアミド、ゼラチン、アガロースなどのポリマーを含む任意の数の材料でコーティングすることができる。例示的な固体支持体には、シリコン、ガラス、ポリスチレン及び他のプラスチック及びアクリルが含まれる。少量の試薬及び試料を用いて多数のアッセイを同時に実施することができるので、マイクロタイタープレート及びアレイは特に便利である。それが本発明の試薬及び全体の方法に適合し、組成物の活性を維持し、非拡散性である限り、組成物を結合する特定の方法は重要でない。
【０２９３】
好ましい実施形態では、ヒドロラーゼタンパク質を支持体に結合し、ターゲティング部分のライブラリをアッセイに加える。或いは、ターゲティング部分を支持体に結合し、ヒドロラーゼタンパク質を加える。固体支持体への結合は公知の方法を用いて達成され、結合する２つの物質の組成によって決まる。一般に、共有結合のために、その後結合のために用いることができる各成分上の官能基の利用を通して、結合リンカーが利用される。結合のための好ましい官能基は、アミノ基、カルボキシ基、オキソ基、ヒドロキシル基及びチオール基である。これらの官能基は、次に、リンカーを用いることにより直接又は間接的に結合することができる。リンカーは、当技術分野で公知である。例えば、ホモ又はヘテロの二機能リンカーが公知である（参照により本明細書で組み込まれる、1994 Pierce Chemical Company catalog, technical section on cross-linkers, pages 155-200を参照）。一部の実施形態では、吸収又はイオン相互作用が利用される。場合によっては、例えばマイクロスフェアの上で小分子候補剤を直接合成し、次に、それを本発明のアッセイで用いることができる。
【０２９４】
タンパク質又はターゲティング部分の結合の後、過剰な未結合の物質を洗浄によって除去する。次に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、bovine serum albumin）、カゼイン又は他の無害なタンパク質若しくは他の部分と一緒のインキュベーションを通して、表面をブロックすることができる。
【０２９５】
結合アッセイでは、ヒドロラーゼタンパク質、ターゲティング部分（又は、場合によっては、金属結合部分若しくは下記に記載のヒドロラーゼ酵素の基質）を標識する。「標識」は、本明細書で、化合物が、検出可能なシグナルを提供する標識、例えば放射性同位体、蛍光剤、酵素、抗体、磁性粒子などの粒子、化学発光体又は特異結合分子などで直接又は間接的に標識されることを意味する。特異結合分子には、ビオチンとストレプトアビジン、ジゴキシンと抗ジゴキシンなどの対が含まれる。特異結合メンバーについては、相補的メンバーは、上で概説するように、公知の手順に従って検出を可能にする分子で通常標識される。標識は、検出可能なシグナルを直接又は間接的に提供することができる。
【０２９６】
特異標識には、光学色素、例えば、それらに限定されないが、発色団、リン光体及び蛍光団が含まれ、後者が多くの例で特異的である。蛍光団は、先に述べたように、「小分子」蛍光団又はタンパク性蛍光団でよい。標識金属供与体（例えば、金属結合成分）は、本明細書で記載するように、それが金属イオンを放出するときに分光学的変化を経る化学プローブ（例えばＺｉｎｑｕｉｎ又はＺｉｎｂｏ５）であることができる。
【０２９７】
「蛍光標識」は、その固有の蛍光特性を通して検出することができる、任意の分子を意味する。適する蛍光標識には、それらに限定されないが、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチルクマリン、ピレン、マラカイトグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー、カスケードブルー、テキサスレッド、ＩＡＥＤＡＮＳ、ＥＤＡＮＳ、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＬＣレッド６４０、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ＬＣレッド７０５、オレゴングリーン、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ色素（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６８０）、カスケードブルー、カスケードイエロー及びＲ−フィコエリスリン（ＰＥ、phycoerythrin）（Molecular Probes社製、Eugene, OR）、ＦＩＴＣ、ローダミン、テキサスレッド（Pierce社製、Rockford, IL）、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（Amersham Life Science社製、Pittsburgh, PA）が含まれる。蛍光団を含む適する光学色素は、参照により本明細書で明示的に組み込まれる、Richard P. HauglandによるMolecular Probes Handbookに記載されている。
【０２９８】
一実施形態では、ヒドロラーゼタンパク質を支持体に結合し、標識ターゲティング部分を加え、過剰な試薬を洗い流し、標識が固体支持体上に存在するかどうか判定する。当技術分野で公知のように、種々のブロッキング及び洗浄工程を利用してもよい。
【０２９９】
一実施形態では、ターゲティング部分を支持体に固定し、標識ヒドロラーゼタンパク質を加えて結合を判定する。
【０３００】
活性アッセイは、当技術分野で公知の通りに実施される。
【０３０１】
ＰＤＥ４阻害剤のスクリーニング
例えば、ＰＤＥ４阻害剤をスクリーニングする場合、スクリーニングは、ＰＤＦＥ４酵素活性を抑制するＰＤＥ４候補阻害剤の能力を直接分析することによってなされる。ＰＤＥ４酵素の活性を分析するために用いることができるであろう、様々なアッセイが存在する。参照により本明細書で組み込まれる、Lugnier, Phosphodiesterase Methods and Protocols (Humana Press, 2005)を参照。
【０３０２】
一部の実施形態では、ＰＤＥ４候補阻害剤がＰＤＥ４酵素の生物活性を抑制するかどうかを試験するために、生物活性アッセイが実施される。結合アッセイに関しては、活性アッセイは溶液ベースでもよいし、又は、固体支持体上に固定化した成分の使用に依存してもよい。この場合、生物活性アッセイはＰＤＥ４酵素の生物活性に依存し、それに従って実行される。したがって、例えば、ｃＡＭＰ又はその誘導体などの一般に市販されている多種多様の基質を用いる、ＰＤＥ４酵素活性アッセイが公知である。一般に、様々な濃度に対する差別的な応答を得るために、ＰＤＥ４阻害剤候補の異なる濃度で複数のアッセイ混合物が平行して分析される。一般的に、これらの濃度の１つ、即ち、０濃度又は検出レベル未満の濃度は、陰性対照の役目を果たす。
【０３０３】
一実施形態では、本方法は候補阻害剤をＰＤＥ４酵素と接触させることを含む。候補阻害剤及びＰＤＥ４酵素は、同時に又は逐次的に加えることができる。
【０３０４】
一実施形態では、ＰＤＥ４酵素は天然のもので、ＰＤＥ４酵素を発現する細胞系によって発現される。他の好ましい実施形態では、ＰＤＥ４酵素は、宿主細胞に形質転換されたか又は移され、宿主細胞の染色体に組み込まれたか又は組み込まれていない、完全なＰＤＥ４遺伝子又はその一部を有する組換えベクターから発現させることもできよう。ＰＤＥ４酵素が宿主細胞から組換えタンパク質として生成される場合、それらは細胞中に存在すること、又は、細胞外に分泌されることができよう。
【０３０５】
好ましい一実施形態では、ＰＤＥ４酵素は精製されない。
【０３０６】
他の好ましい実施形態では、ＰＤＥ４酵素は、天然ＰＤＥ４酵素又は組換えＰＤＥ４酵素を有する生成源から精製若しくは部分精製される。
【０３０７】
好ましい実施形態では、ＰＤＥ４活性のアッセイは、ＰＤＥ４候補阻害剤を、天然の又は組換えのＰＤＥ４酵素を発現する細胞培養へ加えることによってなされる。
【０３０８】
他の好ましい実施形態では、ＰＤＥ４活性のアッセイは、ＰＤＥ４候補阻害剤を、精製されたＰＤＥ４酵素とインビトロで混合することによってなされる。
【０３０９】
他の様々な試薬が、スクリーニングアッセイに含まれてもよい。これらには、塩、中性タンパク質、例えばアルブミン、界面活性剤などの、最適なＰＤＥ４酵素活性を促進すること、及び／又は非特異的な若しくはバックグラウンドの作用を減少させることのために用いることができる試薬が含まれる。また、他の方法でアッセイの効率を向上させる試薬、例えば、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗微生物性剤などを用いることができる。必要なアッセイを可能にする任意の順序で、成分の混合物を追加することができる。
【０３１０】
陽性対照及び陰性対照を、アッセイで用いることができる。好ましくは、統計的に有意な結果を得るために、すべての対照及び試験試料を少なくとも３反復で実施する。すべての試料のインキュベーションは、ＰＤＥ４酵素が作用するために十分な時間である。インキュベーションの後、反応終結剤、例えばＥＤＴＡ又はＰＤＥ４酵素を不活性化する他の界面活性剤を添加することによってすべての反応を終了させる。加熱などの他の方法も、ＰＤＥ４酵素の不活性化のために用いることができよう。
【０３１１】
好ましい実施形態では、ＰＤＥ４酵素基質は、ＰＤＥ４酵素及び／又はＰＤＥ４候補阻害剤と接触する。
【０３１２】
好ましい実施形態では、試験アッセイのためには、好ましくはプレインキュベーション期間の後、ＰＤＥ４酵素及びＰＤＥ４候補阻害剤が先ず接触し、次に基質と接触し、対照アッセイのためには、ＰＤＥ４酵素は基質と直接接触する。他の好ましい実施形態では、ＰＤＥ４候補阻害剤は先ず基質と接触し、次にＰＤＥ４酵素と接触し、対照アッセイのためには、基質はＰＤＥ４酵素と直接接触する。
【０３１３】
好ましい実施形態では、アッセイの信頼性及び品質を制御するために、「陽性対照」及び／又は「陰性対照」を用いることができよう。ＰＤＥ４候補阻害剤が既知のＰＤＥ４阻害剤によって置換されること以外は、陽性対照は、ＰＤＥ４候補阻害剤の影響を試験するアッセイに基本的に同じアッセイである。既知のＰＤＥ４特異阻害剤の１つは、ロリプラムである。ＰＤＥ４候補阻害剤が既知のＰＤＥ４非阻害剤によって置換されること以外は、陰性対照は、ＰＤＥ４候補阻害剤の影響を試験するアッセイに基本的に同じアッセイである。他の好ましい実施形態では、複数の陽性対照及び／又は陰性対照が用いられる。
【０３１４】
ＰＤＥ４酵素の活性は、基質を触媒するその能力によって測定することができよう。本明細書で、「基質」は、ＰＤＥ４酵素が作用することができる分子を意味する。基質がＰＤＥ４酵素と接触する場合、ＰＥＤ４は、一般に基質の多少の変化をもたらすか、又は、好ましくは基質を異なる分子に変換する、基質を含む化学反応を触媒する。したがって、ＰＤＥ４酵素が、好ましくは選択的に作用することができるいかなる分子も基質である。公知のＰＤＥ４特異基質の１つは、ｃＡＭＰである。しかし、化学的又は生物学的修飾を通してのｃＡＭＰの多くの誘導体も特異基質であり得、本発明に適するであろう。基質は、ｃＡＭＰ、ｃＡＭＰ誘導体又はｃＡＭＰ類似体でもよい。好ましい一実施形態では、基質はｃＡＭＰである。
【０３１５】
好ましい実施形態では、ｃＡＭＰ若しくはその誘導体の１つなどの基質は、先に述べたように検出可能なシグナルを提供するために、直接又は間接的に標識される。例えば、放射性同位体（例えば３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ若しくは１２５Ｉ）、蛍光若しくは化学発光化合物（例えばフルオレセインイソチオシアネート、ローダミン若しくはルシフェリン）、酵素（例えばアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ若しくは西洋ワサビペルオキシダーゼ）、抗体、磁性粒子などの粒子又は特異結合分子など。特異結合分子には、ビオチンとストレプトアビジン、ジゴキシンと抗ジゴキシンなどの対が含まれる。特異結合メンバーについては、相補的メンバーは、上で概説するように、公知の手順に従って検出を可能にする分子で通常標識される。標識は、検出可能なシグナルを直接又は間接的に提供することができる。発蛍光団のより完全なリストは、ターゲティング部分のセクションで提供される。
【０３１６】
好ましい一実施形態では、基質は天然の又は合成されたものでよいｃＡＭＰである。
【０３１７】
ＰＤＥ４酵素によるｃＡＭＰの加水分解は、ｃＡＭＰの減少又は加水分解生成物ＡＭＰの増加で測定することができよう。これは、ＰＤＥ４酵素がＰＤＥ４候補阻害剤と接触するアッセイ（「試験アッセイ」）及びＰＤＥ４酵素がＰＤＥ４阻害剤と接触しないアッセイ（「対照アッセイ」）を比較することによって実施することができよう。後者は、対照と呼ぶこともできよう。本明細書で特に記載されない限り、試験アッセイ及び対照アッセイは同じ条件下で実施される。したがって、対照アッセイでのｃＡＭＰは対照アッセイに比較して減少するが、ＰＤＥ４酵素の活性によってもたらされるＡＭＰ又は他の分子の増加がある。対照的に、試験アッセイでは、ＰＤＥ４酵素の活性を抑制することができるＰＤＥ４候補阻害剤の存在のために、酵素を作用させる時間の経過後、対照アッセイでのｃＡＭＰは減少せず、ＰＤＥ４酵素による加水分解から生じるＡＭＰ又は他の分子の増加は認められない。
【０３１８】
好ましい実施形態では、ＰＤＥ４酵素の活性は、基質の減少によって測定される。これは、酵素を作用させる時間の前後にアッセイ試料中の基質の量を比較することによって実施することができよう。
【０３１９】
好ましい実施形態では、ＰＤＥ４酵素の活性は、ｃＡＭＰの減少によって測定される。これは、酵素を作用させる時間の前後にアッセイ試料中のｃＡＭＰの量を比較することによって実施することができよう。
【０３２０】
好ましい実施形態では、ＰＤＥ４酵素の活性は、ＰＤＥ４酵素加水分解生成物の増加によって測定される。本明細書で、「加水分解生成物」は、ＰＤＥ４酵素による基質の加水分解から生じる分子、又は、ＰＤＥ４酵素による基質の加水分解に続いて起こる１つ又は複数の下流反応から生じる分子を意味する。例えば、基質がｃＡＭＰである場合、加水分解生成物はＡＭＰ又は、さらに下流の反応によってＡＭＰから変換されるアデノシンである。
【０３２１】
好ましい一実施形態では、ＰＤＥ４酵素活性は、反応後のアデノシンの量によって判定される。この実施形態では、ＰＤＥ４酵素は、ＰＤＥ４候補阻害剤の存在下又は非存在下で、ＰＤＥ４酵素活性に適切な温度の緩衝液中で標識ｃＡＭＰとインキュベートされる。所望の時間の後、１００度などの高温で暫くの間、好ましくは３分間加熱してＰＤＥ４酵素を不活性化することによって、反応を停止させる。試料を冷却して温度を低下させた後に、ＡＭＰを異なる形態に変換することができる第２の剤を添加する。好ましい実施形態では、この剤はアルカリホスフェートである。剤は、酵素でもよいであろう。適切な温度で所望の時間の適切な緩衝液での他のインキュベーションの後、例えば高温で暫く加熱することによって、反応を停止する。次に、存在する場合は、当技術分野で公知である標準の方法を用いて、アデノシンをｃＡＭＰ及びＡＭＰから分離することができよう。好ましい実施形態では、親和性カラムを用いてアデノシンをｃＡＭＰ及びＡＭＰから分離する。そのような分離の後、ＰＤＥ４酵素の活性及びＰＤＥ４酵素活性を抑制するＰＤＥ４候補阻害剤の能力を判定するために、次にアデノシンの量を測定する。
【０３２２】
他の好ましい実施形態では、スクリーニングは競合アッセイによって実施される。そのようなアッセイでは、ロリプラムなどの既知のＰＤＥ４阻害剤が用いられる。ロリプラムは、ＰＤＥ４酵素活性を抑制するためにアッセイで用いられる。次に、平行したアッセイで、それ以外は同じアッセイにおいてロリプラムを置換することによって、ＰＤＥ４候補阻害剤をスクリーニングする。
【０３２３】
好ましい一実施形態では、混合物を形成するために複数のＰＤＥ４候補をマトリックスに従って組み合わせて用いることができ、混合物は、ＰＤＥ４酵素活性を抑制する能力を試験するために用いられる。例えば、１００個のＰＤＥ４候補阻害剤を、１０×１０のマトリックスに割り当てることができ、各列及び行を混合して、ＰＤＥ４酵素活性を抑制する能力を試験する。このように、合計２０個の試験試料がある。次に、試験結果をマトリックスに対してプロットし、マトリックスでダブルポジティブなものはＰＤＥ４候補阻害剤について陽性の結果である。このマトリックスは、したがってスクリーニング工程の速度を上げることができるであろう。それは、２次元を超えて、例えば３、４又は５次元に拡張することもできよう。
【０３２４】
一実施形態では、候補阻害剤は、特異性について他の酵素、特に他のＰＤＥ酵素に対しても試験される。
【０３２５】
一実施形態では、本明細書で概説するアッセイのいずれも、ハイスループットスクリーニングのためにロボットシステムを利用することができる。多くのシステムは一般に９６（又はより多くの）ウェルマイクロタイタープレートの使用に向けられているが、当分野の技術者が理解するように、任意の数の異なるプレート又は構成を用いることができる。さらに、本明細書で概説する工程のいずれか又は全部を自動化することができる。したがって、例えば、システムを完全に又は部分的に自動化することができる。
【０３２６】
当分野の技術者が理解するように、使用可能な多種多様の構成要素、例えば、それらに限定されないが、１つ又は複数のロボットアーム；マイクロプレートの位置決めのためのプレートハンドラー；非交差汚染プレート上のウェルのためにふたを取り除き、交換するための自動化リッドハンドラー；使い捨て式チップによる試料分配のためのチップアセンブリー；試料分配のための可洗式チップアセンブリー；９６穴ローディングブロック；冷却試薬ラック；マイクロタイタープレートピペット位置（任意選択で冷却される）；プレート及びチップのためのスタッキングタワー；及び、コンピュータシステムがある。
【０３２７】
完全にロボット化されたか又は微流動システムは、スクリーニング適用の全工程を実施するためのハイスループットピペット操作を含む、自動化された液体、粒子、細胞及び生物体の取扱いを含む。これには、液体、粒子、細胞及び生物体の操作、例えば吸引、分注、混合、希釈、洗浄、正確な容積の移動；ピペットチップの回収及び廃棄；並びに、単一の試料吸引からの複数の送達のための同一量の反復ピペット操作が含まれる。これらの操作は、交差汚染のない、液体、粒子、細胞及び生物体の移動である。この機器は、フィルタ、膜及び/又は娘プレートへのマイクロプレート試料、高密度移動、フルプレート連続希釈並びに高容量操作の自動反復を実行する。
【０３２８】
好ましい実施形態では、アッセイ構成要素への特異性を有する、化学的に誘導体化された粒子、プレート、試験管、磁性粒子又は他の固相マトリックスが用いられる。無極性表面、強極性表面、共有結合を促進する修飾デキストランコーティング、抗体コーティング、融合タンパク質若しくはペプチドと結合する親和性媒体、組換えプロテインＡ若しくはＧなどの表面固定タンパク質、ヌクレオチド樹脂若しくはコーティング、及び他の親和性マトリックスを含む、マイクロプレート、試験管又は任意の固相マトリックスの結合表面が本発明で有用である。
【０３２９】
好ましい実施形態では、マルチウェルプレート、マルチチューブ、ミニ試験管、ディープウェルプレート、ミクロチューブ、クリオバイアル、四角ウェルプレート、フィルタ、チップ、光ファイバ、ビーズ及び他の固相マトリックスのためのプラットホーム、又は、様々な容積のプラットホームが、さらなる能力のためにアップグレード可能なモジュラープラットホーム上に収容される。このモジュラープラットホームは、源試料、試料及び試薬希釈溶液、アッセイプレート、試料及び試薬リザーバ、ピペットチップ及び活性洗浄ステーションのために、可変速環状振とう機、エレクトロポレータ及びマルチポジションワークデッキを含む。
【０３３０】
好ましい実施形態では、制御ブロック又はプラットホームなどの熱交換器の温度を安定させて試料を４℃〜１００℃でインキュベートする正確な温度調節を可能にするために、サーモサイクラー及び温度調節システムを用いる。
【０３３１】
一部の好ましい実施形態では、機器は検出器を含み、それは、標識及びアッセイに従って、各種の異なる検出器であることができる。好ましい実施形態では、有用な検出器には、複数の蛍光チャンネルを有する顕微鏡（複数可）；単一及び二重の波長エンドポイント及び動態能力で蛍光、紫外線、可視分光光度的検出を提供するプレートリーダー、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）、ＳＰＲシステム、発光、失活、二光子励起及び強度再分配；データ及び画像を捕捉して、定量化可能なフォーマットに転換するＣＣＤカメラ；並びに、コンピュータワークステーションが含まれる。これらは、細胞、組織及び生物体の上の特定のマーカーの大きさ、増殖及び形質発現のモニタリング；標的の検証；主要な最適化；公開及び私有のデータベースによるハイスループットスクリーニングのデータ分析、採掘、組織化及び組込みを可能にする。
【０３３２】
これらの機器は滅菌の層流若しくは換気フードにはめ込むことができるか、又は、必要に応じて、封入された、自己内蔵型システムである。磁性ビーズ及び他のビーズ、粒子、細胞及び生物体の個々の捕捉のために、フローサイトメトリー又は毛細管電気泳動フォーマットを用いることができる。
【０３３３】
柔軟なハードとソフトは、複数の用途のために機器の適応性を可能にする。ソフトウェアプログラムモジュールは、方法の生成、修飾及び実行を可能にする。システム診断モジュールは、機器の整列、正しい接続及び動作を可能にする。カスタマイズされた道具、実験器具、液体、粒子、細胞及び生物体の移動パターンは、異なる適用の実施を可能にする。データベースは、方法及びパラメータの記憶を可能にする。ロボット及びコンピュータのインターフェースは、機器間の通信を可能にする。
【０３３４】
好ましい実施形態では、ロボットワークステーションは、１つ又は複数の加熱又は冷却の構成要素を含む。反応及び試薬に従い、冷却又は加熱が必要とされることがあり、それは、ペルティエシステムを含む、任意数の公知の加熱冷却システムを用いて実施することができる。
【０３３５】
好ましい実施形態では、ロボット装置は、バスを通してメモリ及び一組の入力／出力装置（例えば、キーボード、マウス、モニター、プリンターなど）と通信する中央処理装置を含む。中央処理装置、メモリ、入力／出力装置及びバスの間の一般的な相互作用は、当技術分野で公知である。したがって、実行する実験に従って、様々な異なる手順がＣＰＵメモリに記憶される。
【０３３６】
医薬組成物及び治療方法
前に述べたように、本発明の阻害剤は、メタロプロテアーゼの活性を阻害する。これらの作用の結果として、特にメタロプロテアーゼ活性が疾患状態との関係を示唆される場合、本発明の活性化合物は、活性を阻害するために様々なインビトロ、インビボ及びエキソビボの場面で用いることができる。
【０３３７】
そのような疾患を治療又は予防するために用いる場合、活性化合物は単独で、１つ又は複数の活性化合物の混合物として、又は、そのような疾患及び／又はそのような疾患と関連する症状を治療するために有用な他の剤と混合して、若しくは組み合わせて投与することができる。活性化合物は、他の障害を治療するために有用な剤と混合して、又は組み合わせて投与することもできる。活性化合物はそれ自体をプロドラッグの形で、又は、活性化合物又はプロドラッグを含む医薬組成物として投与することができる。
【０３３８】
本発明の活性化合物（又はそのプロドラッグ）を含む医薬組成物は、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠化すりつぶし、乳化、封入、混入又は凍結乾燥処理の手段によって製造することができる。組成物は、薬学的に用いることができる調製物への活性化合物の加工を促進する１つ又は複数の生理的に許容される担体、希釈剤、賦形剤又は補助剤を用いて、従来の方法で製剤化することができる。
【０３３９】
前述の通り、活性化合物又はプロドラッグは、医薬組成物自体に、又は、水和物、溶媒和物、Ｎ−オキシド若しくは薬学的に許容される塩の形で製剤化することができる。一般的に、そのような塩は対応する遊離の酸及び塩基よりも水溶液に溶解性であるが、対応する遊離の酸及び塩基よりも低い溶解性を有する塩を形成することもできる。
【０３４０】
本発明の医薬組成物は、例えば、局所、眼、経口、口内、全身、経鼻、注射、経皮、直腸、膣などを含む、実質的にいかなる投与様式に適する形態、又は、吸入若しくはガス注入による投与に適する形態をとることができる。
【０３４１】
局所投与のためには、当該分野で周知のように、活性化合物又はプロドラッグは、溶液、ゲル、軟膏、クリーム、懸濁液などに製剤化することができる。
【０３４２】
全身投与製剤には、注射による投与、例えば、皮下、静脈内、筋肉内、髄腔内又は腹腔内注入のために設計されたもの、並びに経皮、経粘膜経口又は肺投与のために設計されたものが含まれる。
【０３４３】
有用な注射可能な製剤には、水性媒体又は油性媒体中の、活性化合物の滅菌懸濁液、溶液又はエマルションが含まれる。組成物は製剤化剤、例えば懸濁剤、安定剤及び／又は分散剤を含有することもできる。注射のための製剤は、例えば、アンプル又は多回用量容器中に単位剤型で提供することができ、添加保存料を含むことができる。
【０３４４】
或いは、注射可能な製剤は、使用前に適する媒体、例えば、それらに限定されないが、発熱性物質除去滅菌水、緩衝液、デキストロース溶液などで再調製する散剤の形態で提供することができる。このために、活性化合物は、凍結乾燥などの当技術分野で公知の任意の技術によって乾燥させ、使用前に再調製することができる。
【０３４５】
経粘膜投与用には、透過すべきバリヤーに適する浸透剤を製剤中に使用する。そのような浸透剤は、当技術分野で公知である。
【０３４６】
経口投与のためには、医薬組成物は、例えば、薬学的に許容される賦形剤、例えば、結合剤（例えばアルファ化されたトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン若しくはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶性セルロース若しくはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク若しくはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプン若しくはナトリウムグリコール酸デンプン）；又は湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）により従来の手段によって調製される、ロゼンジ、錠剤又はカプセルの形態をとることができる。錠剤は当分野周知の方法によって、例えば、糖又は腸溶コーティングで被覆されてもよい。
【０３４７】
経口投与のための液体製剤は、例えば、エリキシル、溶液、シロップ剤若しくは懸濁液の形態をとることができ、又は、それらは使用前に水又は他の適する媒体で調製するための乾燥品として提供することができる。そのような液体製剤は、薬学的に許容される添加剤、例えば懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体若しくは水素化食用脂）；乳化剤（例えば、レシチン若しくはアカシア）；非水性媒体（例えば、アーモンドオイル、油性エステル、エチルアルコール若しくは精留植物油）；及び、防腐剤（例えば、メチル若しくはプロピルｐヒドロキシベンゾアート又はソルビン酸）により、従来の手段によって調製することができる。製剤は、緩衝塩、防腐剤、風味料、着色剤及び甘味剤を適宜含むこともできる。
【０３４８】
経口投与のための製剤は、適切には、周知のように、活性化合物又はプロドラッグの制御放出を提供するように製剤化することができる。
【０３４９】
口内投与のためには、組成物は従来の方法で製剤化される錠剤又はロゼンジの形態をとることができる。
【０３５０】
直腸及び膣の投与経路のために、活性化合物は、カカオ脂又は他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を含む、溶液（停留浣腸のために）坐薬又は軟膏として製剤化することができる。
【０３５１】
経鼻投与又は吸入若しくはガス注入による投与のために、活性化合物又はプロドラッグは、適する噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、フルオロカーボン、二酸化炭素又は他の適するガスを用いて、加圧パック又は噴霧器からのエアゾールスプレーの形で都合よく送達することができる。加圧式エアゾールの場合、用量単位は、計量した量を送達するためのバルブを備えることにより決定することができる。吸入器又は吹入器に用いるカプセル及びカートリッジ（例えば、ゼラチンからなるカプセル及びカートリッジ）は、化合物とラクトース又はデンプンなどの適する粉状基材との粉末混合を含むように製剤化することができる。
【０３５２】
市販の鼻内噴霧装置を用いる経鼻投与に適する水性懸濁液製剤の具体例は、以下の成分を含む：活性化合物又はプロドラッグ（０．５〜２０ｍｇ／ｍｌ）；塩化ベンザルコニウム（０．１〜０．２ｍｇ／ｍＬ）；ポリソルベート８０（TWEEN（登録商標）８０；０．５〜５ｍｇ／ｍｌ）；カルボキシメチルセルロースナトリウム又は微結晶性セルロース（１〜１５ｍｇ／ｍｌ）；フェニルエタノール（１〜４ｍｇ／ｍｌ）；及び、デキストロース（２０〜５０ｍｇ／ｍｌ）。最終懸濁液のｐＨは、約ｐＨ５〜ｐＨ７に調節することができ、約ｐＨ５．５が一般的である。
【０３５３】
眼の投与のために、活性化合物又はプロドラッグは、眼への投与に適する溶液、エマルション、懸濁液などに製剤化することができる。化合物を眼に投与するために適する様々な媒体は、当技術分野で公知である。それには限定されない具体例は、米国特許第６，２６１，５４７号；米国特許第６，１９７，９３４号；米国特許第６，０５６，９５０号；米国特許第５，８００，８０７号；米国特許第５，７７６，４４５号；米国特許第５，６９８，２１９号；米国特許第５，５２１，２２２号；米国特許第５，４０３，８４１号；米国特許第５，０７７，０３３号；米国特許第４，８８２，１５０号；及び米国特許第４，７３８，８５１号明細書に記載されている。
【０３５４】
長期送達のために、活性化合物又はプロドラッグは、移植又は筋肉内注射による投与のためのデポー製剤として製剤化することができる。有効成分は、適する重合体又は疎水性の物質で（例えば、許容される油中のエマルションとして）、又はイオン交換樹脂で、又は、やや溶けにくい誘導体、例えばやや溶けにくい塩として製剤化することができる。或いは、付着ディスクとして製造される経皮送達系、又は、経皮吸収のために徐々に活性化合物を放出するパッチを用いることができる。このためには、活性化合物の経皮浸透を促進するために浸透エンハンサーを用いることができる。適する経皮パッチは、例えば、米国特許第５，４０７，７１３号；米国特許第５，３５２，４５６号；米国特許第５，３３２，２１３号；米国特許第５，３３６，１６８号；米国特許第５，２９０，５６１号；米国特許第５，２５４，３４６号；米国特許第５，１６４，１８９号；米国特許第５，１６３，８９９号；米国特許第５，０８８，９７７号；米国特許第５，０８７，２４０号；米国特許第５，００８，１１０号；及び、米国特許第４，９２１，４７５号明細書に記載されている。
【０３５５】
或いは、他の医薬用の送達系を使用することができる。リポソーム及びエマルションは、活性化合物又はプロドラッグを送達するために用いることができる送達媒体の周知の例である。通常、より強い毒性を犠牲にするが、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などのある有機溶媒を利用することもできる。
【０３５６】
医薬組成物は、所望により、活性化合物を含有する１つ又は複数の単位用量剤形を含むことができる、パック又はディスペンサー装置で提供することができる。パックは、例えば、ブリスターパックなどの、金属又はプラスチックのホイルを含むことができる。パック又はディスペンサー装置は、投与の指示書を伴うことができる。
【０３５７】
一般に、本発明の活性化合物若しくはプロドラッグ、又はその組成物は、意図する結果を達成するために有効な量で、例えば治療する特定の疾患の治療又は予防に有効な量で用いられる。化合物は、治療的な利点を達成するために治療的に投与すること、又は予防的な利点を達成するために予防的に投与することができる。治療的な利点は、患者がその基礎疾患にまだ苦しんでいるとしても患者が気分又は状態の改善を報告するように、治療する基礎疾患の根絶若しくは改善、及び／又は基礎疾患と関連する１つ又は複数の症状の根絶若しくは改善を意味する。例えば、アレルギーで苦しむ患者への化合物の投与は、根底にあるアレルギー応答が根絶又は改善されるときだけでなく、アレルゲンへの曝露に続くアレルギー関連の症状の重症度又は持続時間の低減を患者が報告するときも、治療的な利点を提供する。他の例として、喘息との関連で治療的な利点には、喘息発作の開始後の呼吸の改善、又は喘息発症の頻度若しくは重症度の減少が含まれる。治療的な利点には、改善の実現の有無を問わず、疾患の進行を停止させること又は遅らせることも含まれる。
【０３５８】
予防投与のために、化合物は前述の疾患の１つを発症する危険のある患者に投与することができる。例えば、患者が特定の薬剤に対してアレルギーであるかどうかが不明の場合、薬剤に対するアレルギー応答を回避又は改善するために、薬剤投与の前に化合物を投与することができる。或いは、基礎疾患を診断された患者でその発症を回避するために、予防投与を適用することができる。例えば、予想されるアレルゲンへの曝露の前に、アレルギー患者に化合物を投与することができる。発症を予防するために、上記疾患の１つに知られている因子に繰り返し曝露する健康な個人に、化合物を予防的に投与することもできる。例えば、個人がアレルギーを発症することを予防するために、ラテックスなどのアレルギーを誘導することが知られているアレルゲンに繰り返し曝露する健康な個人に、化合物を投与することができる。或いは、喘息の発症の重症度を低減するか又はまったく回避するために、喘息発作を誘発する活動に加わる前に喘息で苦しむ患者に化合物を投与することができる。
【０３５９】
投与する化合物の量は、例えば、治療する特定の適応症、投与様式、所望の利点が予防的又は治療的であるか、治療する適応症の重症度、患者の年齢及び体重、並びに特定の活性化合物の生物学的利用能などを含む、様々な因子によって決まる。有効薬量の判定は、十分に当業技術者の能力の範囲内である。
【０３６０】
有効薬量は、最初、インビトロアッセイから推定することができる。例えば、動物に用いる初期用量は、インビトロアッセイ、例えばインビトロのＣＨＭＣ若しくはＢＭＭＣ及び実施例のセクションで記載する他のインビトロアッセイで測定した、特定の化合物のＩＣ５０値かそれ以上である活性化合物の循環血液濃度又は血清濃度を達成するように処方することができる。特定の化合物の生物学的利用能を考慮しながらそのような循環血液濃度又は血清濃度を達成する投薬量を計算することは、十分に当業者の能力の範囲内である。ガイダンスについては、Fingl & Woodbury, "General Principles", Goodman and Gilman's The Pharmaceutical Basis of Therapeutics, Chapter 1, pp. 1-46, latest edition, Pagamonon Press及びそこで引用される参考文献を参照。
【０３６１】
初期用量は、動物モデルなどのインビボデータから推定することもできる。上記の様々な疾患を治療又は予防する化合物の効力を試験するために有用な動物モデルは、当技術分野において周知である。
【０３６２】
投薬量は、一般的に約０．０００１又は０．００１又は０．０１ｍｇ／ｋｇ／日から約１００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であるが、中でも、化合物の活性、その生物学的利用能、投与様式及び上記各種因子に従って上下させることができる。投薬量及び間隔は、治療的又は予防的効果を維持するのに十分である化合物の血漿レベルを提供するために、個々に調節することができる。限局性局所投与などの局所投与又は選択的な取り込みの場合には、活性化合物の有効な局所濃度は血漿中濃度に関係がなくてもよい。当業者は、過度の実験をせずに、有効な局所投薬量を最適化することができる。
【０３６３】
化合物は、中でも治療する適応症及び処方医師の判断によって、１日に１回、１日に２、３回若しくは数回、又は１日に多数回投与することができる。
【０３６４】
好ましくは、化合物は実質的な毒性を引き起こすことなく、治療的又は予防的な利点を提供する。化合物の毒性は、標準の薬学的手順を用いて判定することができる。毒性と治療的（又は予防的）効果との間の用量比は、治療指数である。高い治療指数を示す化合物が、好ましい。
【図１−１】
2010512303.tif 000037
【図１−２】
2010512303.tif 000038
【図１−３】
2010512303.tif 000039
【図１−４】
2010512303.tif 000040
【図２−１】
2010512303.tif 000041
【図２−２】
2010512303.tif 000042
【図２−３】
2010512303.tif 000043
【図２−４】
2010512303.tif 000044
【図３−１】
2010512303.tif 000045
【図３−２】
2010512303.tif 000046
【図３−３】
2010512303.tif 000047
【図４】
2010512303.tif 000048
【図５】
2010512303.tif 000049
【図６−１】
2010512303.tif 000050
【図６−２】
2010512303.tif 000051
【図７】
2010512303.tif 000052
【図８】
2010512303.tif 000053
【図９】
2010512303.tif 000054
【図１０】
2010512303.tif 000055
【図１１】
2010512303.tif 000056
【図１２】
2010512303.tif 000057
【図１３】
2010512303.tif 000058
【図１４】
2010512303.tif 000059
【図１５−１】
2010512303.tif 000060
【図１５−２】
2010512303.tif 000061
【図１６】
2010512303.tif 000062
【図１７−１】
2010512303.tif 000063
【図１７−２】
2010512303.tif 000064
【図１７−３】
2010512303.tif 000065
【図１８−１】
2010512303.tif 000066
【図１８−２】
2010512303.tif 000067
【図１９−１】
2010512303.tif 000068
【図１９−２】
2010512303.tif 000069
【図１９−３】
2010512303.tif 000070
【図１９−４】
2010512303.tif 000071
【図１９−５】
2010512303.tif 000072
【図１９−６】
2010512303.tif 000073
【図１９−７】
2010512303.tif 000074
【図１９−８】
2010512303.tif 000075
【図１９−９】
2010512303.tif 000076
【図２０】
2010512303.tif 000077
【図２１−１】
2010512303.tif 000078
【図２１−２】
2010512303.tif 000079
【図２１−３】
2010512303.tif 000080
【図２１−４】
2010512303.tif 000081
【図２１−５】
2010512303.tif 000082
【図２１−６】
2010512303.tif 000083
【図２２−１】
2010512303.tif 000084
【図２２−２】
2010512303.tif 000085
【図２３】
2010512303.tif 000086
【図２４】
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【配列表】
2010512303000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年2月23日(2009.2.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
【化１】
2010512303.tif 000088
2010512303.tif 000089
2010512303.tif 000090
からなる群から選択される式を有し、
上式で、
Ｌｎはリンカーであり；
ｎは０又は１であり；
ＭＢＭは金属結合部分である、
ＰＤＥ４酵素の阻害剤。
【請求項２】
【化２】
2010512303.tif 000091
【化３】
2010512303.tif 000092
【化４】
2010512303.tif 000093
からなる群から選択される式を有し、
上式で、
Ｌｎはリンカーであり；
ｎは、０又は１であり；
ＭＢＭは金属結合部分である、
ＰＤＥ４酵素の阻害剤。
【請求項３】
【化５】
2010512303.tif 000094
からなる群から選択される式を有し、
上式で、
Ｌｎはリンカーであり；
ｎは、０又は１であり；
ＭＢＭは金属結合部分である、
アデノシンデアミナーゼ酵素の阻害剤。
【請求項４】
【化６】
2010512303.tif 000095
2010512303.tif 000096
からなる群から選択される式を有し、
上式で、
Ｌｎはリンカーであり；
ｎは０又は１であり；
ＭＢＭは金属結合部分である、
アンジオテンシン変換酵素の阻害剤。
【請求項５】
【化７】
2010512303.tif 000097
2010512303.tif 000098
からなる群から選択される式を有し、
上式で、
Ｌｎはリンカーであり；
ｎは、０又は１であり；
ＭＢＭは金属結合部分である、
カルシニューリン酵素の阻害剤。
【請求項６】
【化８】
2010512303.tif 000099
2010512303.tif 000100
2010512303.tif 000101
2010512303.tif 000102
（Ｒ１、Ｒ２は以下の組合せ
【表１】
2010512303.tif 000103
から選択される）
【化９】
2010512303.tif 000104
【化１０】
2010512303.tif 000105
【化１１】
2010512303.tif 000106
2010512303.tif 000107
2010512303.tif 000108
【表２】
2010512303.tif 000109
からなる群から選択される式を有し、
上式で、
Ｌｎはリンカーであり；
ｎは、０又は１であり；
ＭＢＭは金属結合部分である、
メタロ−β−ラクタマーゼ酵素の阻害剤。
【請求項７】
【化１２】
2010512303.tif 000110
からなる群から選択される式を有し、
上式で、
Ｌｎはリンカーであり；
ｎは０又は１であり；
ＭＢＭは金属結合部分である、
ＰＤＥ３酵素の阻害剤。
【請求項８】
【化１３】
2010512303.tif 000111
2010512303.tif 000112
からなる群から選択される式を有し、
上式で、
Ｌｎはリンカーであり；
ｎは０又は１であり；
ＭＢＭは金属結合部分である、
ＰＤＥ５酵素の阻害剤。
【請求項９】
【化１４】
2010512303.tif 000113
からなる群から選択される式を有し、
上式で、
Ｌｎはリンカーであり；
ｎは０又は１であり；
ＭＢＭは金属結合部分である、
腎臓ジペプチダーゼ酵素の阻害剤。
【請求項１０】
【化１５】
2010512303.tif 000114
からなる群から選択される式を有し、
上式で、
Ｌｎはリンカーであり；
ｎは０又は１であり；
ＭＢＭは金属結合部分である、
ウレアーゼ酵素の阻害剤。
【請求項１１】
ＭＢＭが、スルホニル部分、カルボニル部分、硫黄含有部分、窒素含有部分、リン含有部分、１個のヘテロ原子を含む５員芳香環、２個のヘテロ原子を含む５員芳香環、３個のヘテロ原子を含む５員芳香環、４個のヘテロ原子を含む５員芳香環、１個のヘテロ原子を含む５員非芳香環、２個のヘテロ原子を含む５員非芳香環、ヘテロ原子を含まない６員芳香環、１個のヘテロ原子を含む６員芳香環、２個のヘテロ原子を含む６員芳香環、３個のヘテロ原子を含む６員芳香環、１個のヘテロ原子を含む６員非芳香環及び２個のヘテロ原子を含む６員非芳香環からなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれかに記載の阻害剤。
【請求項１２】
ＭＢＭが、
【化１６】
2010512303.tif 000115
2010512303.tif 000116
2010512303.tif 000117
2010512303.tif 000118
2010512303.tif 000119
2010512303.tif 000120
からなる群から選択され、
上式で、
Ｒは、任意選択のリンカー又はＭＢＭとの結合点であり；
Ｘは、任意選択の置換基であり；
Ｚは、Ｏ又はＳである、
請求項１、３〜１０のいずれかに記載の阻害剤。
【請求項１３】
ＭＢＭが、
【化１７】
2010512303.tif 000121
2010512303.tif 000122
2010512303.tif 000123
2010512303.tif 000124
2010512303.tif 000125
からなる群から選択され、
上式で、
Ｒは、任意選択のリンカー又はＭＢＭとの結合点であり；
Ｘは、任意選択の置換基であり；
Ｚは、Ｏ又はＳである、
請求項２に記載の阻害剤。
【請求項１４】
リンカーがＣ１−Ｃ６アルキル部分である、請求項１、３〜１３のいずれかに記載の阻害剤。
【請求項１５】
Ｃ１−Ｃ６アルキル部分が置換されたアルキル部分である、請求項１４に記載の阻害剤。
【請求項１６】
リンカーがＣ３−Ｃ６の直鎖状又は分枝状のアルキル部分である、請求項２に記載の阻害剤。
【請求項１７】
Ｃ３−Ｃ６アルキル部分が置換されたアルキル部分である、請求項１６に記載の阻害剤。
【請求項１８】
請求項１〜１３のいずれかに記載の阻害剤と薬学的担体とを含む、医薬組成物。
【請求項１９】
メタロヒドララーゼ阻害剤のスクリーニング方法であって、
ａ）ｉ）ターゲティング部分；
ii）金属結合部分（ＭＢＭ）；及び
iii）リンカー
を含む候補阻害剤を提供することと、
ｂ）前記阻害剤候補を前記メタロヒドロラーゼと接触させることと、
ｃ）前記メタロヒドロラーゼの活性を判定することと
を含む方法。
【請求項２０】
メタロヒドロラーゼを阻害する方法であって、前記メタロヒドロラーゼを請求項１〜１３のいずれかに記載の阻害剤と接触させることを含む方法。
【請求項２１】
メタロヒドロラーゼ関連障害を治療する方法であって、請求項１〜１３のいずれかに記載の組成物、そのプロドラッグ又は塩を投与することを含む方法。