(57)【要約】本発明は、試料においてエンドグリコシダーゼ活性、特にヘパラナーゼ型のものを決定する方法に関し、また、エンドグリコシダーゼ、特にヘパラナーゼ型のエンドグリコシダーゼの活性を調節する化合物を検出する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンドグリコシダーゼ酵素活性を決定する方法であって、以下の工程：
ｉ．エンドグリコシダーゼ基質を、エンドグリコシダーゼ含有試料と、エンドグリコシダーゼによる基質の分解に十分な条件下で接触させる工程、
ｉｉ．非分解又は部分的に分解した基質を固相結合ヘパリン硫酸結合タンパク質に、好ましくはポリカチオン性タンパク質プロタミンに結合させることによって、該非分解又は部分的に分解した基質から分解生成物を分離する工程、
ｉｉｉ．試料中のエンドグリコシダーゼ活性に関連する無処理基質の減少を測定する工程
を含み、
該基質がリガンド／レセプター対の第１メンバーにより直接的又は間接的に標識されており、該無処理基質の量が、リガンド／レセプター対の第２メンバーに結合している検出系により発信される信号を測定することにより決定される
方法。
【請求項２】
リガンド／レセプター対の第１メンバーがビオチンであり、リガンド／レセプター対の第２メンバーが、検出系の一部として酵素に結合しているアビジン又はストレプトアビジンであるか、又はリガンド／レセプター対が、ハプテン／抗体対：ＤＮＰ／抗ＤＮＰ抗体、ＧＳＴ／抗ＧＳＴ抗体、６ＨＩＳ／抗６ＨＩＳ抗体；ｃ−ｍｙｃ／抗ｃ−ｍｙｃ抗体；ＦＬＡＧ（登録商標）／抗ＦＬＡＧ（登録商標）抗体；ＨＡ／抗ＨＡ抗体から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試料が、組織又は細胞の抽出物、全血、血清、血漿、脳脊髄液などである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
エンドグリコシダーゼ酵素活性を調節することができる化合物を検出する請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法であって、追加的に、以下の工程：
ｉｖ．試験化合物の不在下で測定した結合基質の量と、試験化合物の存在下で測定したものとの変化を比較する工程
を含む方法。
【請求項５】
エンドグリコシダーゼが、組み換えヘパラナーゼ、精製ヘパラナーゼ及び非精製ヘパラナーゼから選択されるヘパラナーゼ型の酵素であり、好ましくは酵素が、少なくとも部分的に精製された形態で提供される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
基質が、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、細胞外マトリックス関連ヘパラン硫酸、ヘパリン及びヘパラン硫酸又はこれらの対応する誘導体から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ヘパラン硫酸結合タンパク質が、プロタミン又はヒストンファミリーのアルギニン豊富プロタミン様タンパク質のファミリーの他のメンバーから選択され、これらの結合タンパク質が、天然タンパク質、異なる種の精液から精製されたもの、これらのタンパク質の低分子量形態、例えばタンパク質分解性切断により誘導されたもの、ペプチド、又は組み換えタンパク質である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
基質が、リガンド／レセプター対の第１メンバーに共有結合しており、第２メンバーが検出系の一部として酵素に結合している、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
リガンド／レセプター対の第２メンバーが、蛍光、化学発光又は電気化学発光標識により標識されている、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
基質が、蛍光、化学発光又は電気化学発光化合物に共有結合しており、ヘパラン硫酸結合タンパク質に結合している基質の蛍光又は発光信号が直接測定される、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項１１】
請求項４に記載のヘパラナーゼ型の酵素活性を調節することができる化合物を検出する方法であって、前記化合物が、抗ヘパラナーゼ抗体、天然生成物、合成生成物、コンビナトリアル化学により得られる化合物のライブラリーからの生成物、ペプチド及びタンパク質から選択される方法。
【請求項１２】
以下の成分：
（ａ）ヘパラナーゼ型の活性を有する酵素により切断されうる基質、特に、好ましくはレセプター／リガンド対の第１メンバーにより標識されているＨＳ−（ＧＡＧ）又はペプチド−ＨＳ（ＧＡＧ）、
（ｂ）ヘパラナーゼ、好ましくは、組み換えヘパラナーゼ、精製ヘパラナーゼ又は非精製ヘパラナーゼ、
（ｃ）酵素、好ましくはアビジン−ペルオキシダーゼ又はストレプトアビジン−ペルオキシダーゼおよび適切な基質に結合しているレセプター／リガンド対の第２メンバーを含む検出系、
（ｄ）好ましくは固相に結合しているヘパラン硫酸結合タンパク質
を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法を実施するためのキット。
【請求項１３】
−ヘパラン硫酸、好ましくはビオチンで標識されているペプチド−ＨＳと、
−ペルオキシダーゼに結合しているアビジン又はストレプトアビジン及びペルオキシダーゼ基質と、
−プロタミン被覆固相、好ましくはマイクロプレートと
を含む、請求項１２に記載のヘパラナーゼ活性を測定するためのキット。
【請求項１４】
−ヘパラン硫酸、好ましくはビオチンで標識されているペプチド−ＨＳと、
−ペルオキシダーゼ基質及びペルオキシダーゼに結合しているアビジン又はストレプトアビジンと、
−組み換えヘパラナーゼ、精製ヘパラナーゼ及び非精製ヘパラナーゼから選択されるヘパラナーゼと、
−プロタミン被覆固相、好ましくはマイクロプレートと
を含む、請求項１２又は１３に記載のヘパラナーゼ活性の潜在的モジュレーターを試験するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料においてエンドグリコシダーゼ酵素活性、特にヘパラナーゼ型のものを決定する方法に関し、一つの好ましい実施態様では、エンドグリコシダーゼの活性、特にヘパラナーゼ型の活性を有するエンドグリコシダーゼの活性を調節することができる化合物を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エンドグリコシダーゼは、グリコシド鎖内で切断反応を触媒することができる酵素である。
【０００３】
ヘパラナーゼは、例えばヘパラン硫酸グリコサミノグリカン（ＨＳ−ＧＡＧ又はＨＳ）のようなグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）単位を含むポリマーを切断することができる酵素である。
【０００４】
ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳ−ＰＧ）は、ヒト及び非ヒト由来の多種多様な組織及び細胞の細胞表面又は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）と関連する複雑な巨大分子である（非特許文献１〜７）。
【０００５】
ＨＳ−ＰＧの主要構造は、コアタンパク質からなり、それに、１つ又は幾つかのヘパラン硫酸鎖が共有的に結合している。線状の多糖鎖は、一般に、Ｌ−イズロン酸（あるいはグルクロン酸）及びグルコサミンから構成される反復二糖サブユニットからなる。これらの二糖は、Ｎ−及びＯ−結合硫酸塩基、並びにＮ−結合アセチル残基により多様な程度で置換されている。多様な酵素（例えば、Ｃ５−エピメラーゼ、２−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ、６−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ、３−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ、Ｎ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼなど）の活性の結果による置換パターンは、少なくとも部分的には非ランダム様式で、成長因子、ケモカインなどのような多数のリガンドとの特異的な相互作用を可能にするＨＳ鎖内におけるドメイン構造の形成をもたらす（非特許文献８〜１０）。ＨＳ鎖は、多様な数の二糖単位に起因し、それらの配列（ドメイン構造をもたらす異なる置換の結果によって生じる）に起因して著しい多様性を示すことができ、これは鎖毎に異なることができる。ヘパリンは、ＨＳと比べると同じ基本的な二糖構造を有するが、より高度に硫酸化され、より多くの異性体変種のイズロン酸を含有する点においてＨＳと異なっている（非特許文献１〜９）。
【０００６】
多様な組織のＥＣＭは、多様なマトリックスタンパク質、例えば異なる種類のコラーゲンなど、及び異なるプロテオグリカンから構成されており、複雑な組織構造をもたらす。
【０００７】
基底膜（基底層）は、網状構造（ｎｅｔｗｏｒｋ）に包埋された異なるヘパラン硫酸プロテオグリカンの高度に荷電されたＨＳ鎖と相互作用する、異なる種類のラミニン、ナイドジェン及びＩＶ型コラーゲンの複雑な網状構造から構成される（非特許文献１１〜１６）。
【０００８】
ＨＳ−ＰＧは、器官形成及び増殖制御、細胞接着及び移動、信号伝達、炎症、創傷治癒、血管形成、腫瘍侵入及び転移を含む多くの生物学的機能に関わっている（非特許文献１〜１０）。
【０００９】
エンドグリコシダーゼ、例えばヘパラナーゼ型の活性を有する酵素によるＧＡＧ切断は、上記の［０００８］に記載された全てのプロセスにおいて局所分解及びＥＣＭの再構築に関わっている。これらのプロセスの一つの重要な機構は、特にＨＳ型のＧＡＧ鎖の切断によるＨＳ結合サイトカイン、ケモカイン、成長因子などの放出である（非特許文献１７および１８）。
【００１０】
例えば血小板、炎症性細胞又は腫瘍細胞により産生されるヘパラナーゼは、基底膜の局所分解に寄与する可能性があり、したがって、細胞が血管壁を横切って移動及び通過することを促進する可能性がある（非特許文献１７および１８）。このプロセスにおいて、マトリックスメタロプロテイナーゼのような他の酵素が関与することもある。通常は、この機構は好中球のような炎症性細胞が組織内の炎症性部位に到達することを可能にするが、同じ機構は、腫瘍細胞により転移巣を生じるために使用される。
【００１１】
エンドグリコシダーゼによるＧＡＧの切断は、基底膜の通過に限定されず、例えば、腫瘍細胞による組織侵入の主要なプロセスである（非特許文献１９〜２１）。
【００１２】
ヘパラナーゼ活性は、肝臓、胎盤、活性化Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、好中球及び単球、血小板、線維芽細胞及び臍帯静脈内皮細胞を含む、幾つかの組織及び細胞型において報告されている（非特許文献１９〜２３）。
【００１３】
ヘパラナーゼは、異なる研究グループによって、ヒト血小板のような幾つかの供給源から単離及び精製されている（非特許文献１９〜２３）。
【００１４】
ヘパラナーゼは、異なる研究グループにより幾つかの供給源からクローン化されている（非特許文献２４〜２７）。例えば、ヒトヘパラナーゼはヒト胎盤及びヒト肝細胞癌細胞株からクローン化された（非特許文献２４）。単一機能性ヘパラナーゼの同定は、薬剤開発において大きな重要性がある（非特許文献１９〜２１、および２４〜２８）。
【００１５】
精製及びクローン化された酵素の特徴決定によって、ヘパラナーゼは、タンパク質分解性切断を受ける６５ｋＤａの不活性前駆体として合成され、ヘテロ二量体化して活性酵素を形成する８及び５０ｋＤａのタンパク質サブユニットを生じることを示した（非特許文献２３および２９）。
【００１６】
ヘパラナーゼは、ヒト腫瘍に優先的に発現し、腫瘍細胞における過剰発現は、実験動物において侵入性表現型をもたらす。ヘパラナーゼの上方制御は、腫瘍血管分布の増大及び癌患者の不十分な術後生存と相関している（非特許文献２９〜３３）。
【００１７】
ヘパラナーゼ活性は、黒色腫細胞株の転移能と関連することが示されている。例えば、ヒト及びネズミ線維肉腫及び黒色腫細胞系統の転移能は、これらの細胞のヘパラナーゼ活性と相関している（非特許文献３４および３５）。
【００１８】
ヘパリンのようなヘパラナーゼのインヒビター、並びにｓｉＲＮＡによるヘパラナーゼの遺伝子サイレンシングは、実験モデルにおいて腫瘍の転移及び血管形成を阻害することができる（非特許文献３０）。
【００１９】
現在、ヘパラナーゼが、抗癌のみならず、抗炎症性薬剤の開発において有望な標的であるという証拠がますます増えてきている（非特許文献１９〜２１、２４〜２８、および３０〜３３）。
【００２０】
増殖制御、細胞接着及び移動、信号伝達、炎症、創傷治癒及び血管形成のような他の生物学的機能におけるヘパラナーゼの重要な役割によると（非特許文献２８）、エンドグリコシダーゼ活性のモジュレーター、特にヘパラナーゼ酵素活性のモジュレーターは、慢性炎症、自己免疫、創傷修復及び血管形成のような他の領域においても潜在能力を有する。
【００２１】
幾つかのグループは、特に、例えば癌患者において転移を阻害するために使用されうる新規化合物を単離する目的で、ヘパラナーゼ活性を決定するアッセイを開発した。
【００２２】
これまでは、ヘパラナーゼ活性をアッセイするために開発されたほとんどの方法が、ヘパラン硫酸のような基質を放射標識すること、及び酵素ヘパラナーゼを含有する試料と共にインキュベートした後に生成したフラグメントを分析することに基づいている。
３５−Ｓ又は３−Ｈのような放射性同位体は、細胞を適切な放射性前駆体の存在下で培養することによってＨＳ（ＧＡＳ）に組み込まれうる。次に放射標識ＨＳ（ＧＡＧ）は基質として使用される。
ヘパラナーゼ活性は、例えば、放射能の減少又は標識分子の分子量の低減のいずれかを測定することによって決定される。後者の場合では、基質は、電気泳動又はクロマトグラフィーにより分析される。
【００２３】
これらの方法は、放射性元素の使用に関連する、特に放射線保護に関する全ての問題及び制限を有する。更に、この種類の定量的方法は、例えば、基質の大きさの減少をゲル浸透クロマトグラフィー、画分の収集及び液体シンチレーションカウントを使用して測定する場合には、非常に労力を要し、時間がかかる。したがって、これらの方法は、ルーチン的な試験又はハイスループットスクリーニングには適していない。特許文献１および２は、そのような方法の例である。
【００２４】
特許文献１は、分離工程、及びセファロースカラムに固定したＨＳ結合タンパク質ニワトリヒスチジン豊富糖タンパク質への天然又は部分的に分解している放射標識ＨＳの結合に基づいて、ヘパラナーゼ酵素活性をアッセイする方法を記載している。
【００２５】
特許文献３は、グリコシダーゼ活性を決定する方法、特に抗癌及び抗炎症性剤をスクリーニングする方法を記載する。この方法は、ＨＳ型の基質の存在下でヘパラナーゼ活性に対する試験作用物質の効果を研究することに基づいている。
ヘパラナーゼ活性は、比色アッセイ、特に基質の切断の際に形成された還元糖を検出する比色カルバゾールアッセイ又はジメチルメチレンブルーに基づいたアッセイを使用する、電気泳動又はカラムクロマトグラフィーによる切断基質のフラグメントの分離のいずれかにより決定される。
これらの方法の大きな欠点は、感度が乏しいことであり、例えば、マイクロタイタープレートの１ウエルあたり０．２５〜４μｇほどの部分的に精製された組み換えヘパラナーゼ及び５０μｇまでのヘパラン硫酸を使用する必要がある。したがって、このアッセイは著しく高価でもある。更に、１７時間までの長時間のインキュベーションがこれらの方法において必要である。したがって、これらの方法は、ルーチン的な試験又はハイスループットスクリーニングには適していない。
【００２６】
特許文献４は、試験試料に存在する酵素ヘパラナーゼによる標識基質の切断により誘導されるＨＳ（ＧＡＧ）フラグメントの検出に基づいたヘパラナーゼ活性をアッセイする方法を開示する。
ＨＳ（ＧＡＧ）基質を、最初に固体支持体に結合させ（過ヨウ素酸塩での処理による基質ＨＳ（ＧＡＧ）の酸化の後）、次に、基質を例えばビオチンで標識する。その後、細胞レギュレーター（例えば、ＨＳ（ＧＡＧ）に結合することができる増殖因子）を、ビオチン標識基質ＨＳ（ＧＡＧ）に結合させる。
試験試料（ヘパラナーゼ及び／又はヘパラナーゼ活性のモジュレーターを含有）と共にインキュベートした後、切断フラグメントを、アビジン／ストレプトアビジンで被覆されている第２固体支持体への基質のビオチン標識フラグメントの特異的結合により固定化する。このように分離したフラグメントは、例えば、結合基又は増殖因子に特異的な標識抗体を使用して、比色又は蛍光技術により検出することができる。測定される信号は、試料におけるヘパラナーゼ活性に依存する。
【００２７】
上記に記載された放射能法及び比色アッセイ（特許文献３）と比較すると、特許文献４に記載されたアッセイは、より感度があり、取り扱いが容易である。しかし、このアッセイは依然として大きな欠点を有する。
第１には、この方法は複雑であり、基質を生成するために幾つかの修飾及び結合工程を必要とする。第２には、これらの反応及び結合工程の幾つかによって、基質が固相に結合することにより、基質のヘパラナーゼ切断部位の少なくとも一部が破壊されるか、遮蔽される（例えば結合した増殖因子により）可能性がある又は酵素には利用不可能になる。したがって、このアッセイを使用すると、ヘパラナーゼ活性の一部しか測定されない。第３には、このアッセイは、複雑であり、時間がかかる。第４には、このアッセイは、増殖因子、増殖因子の抗体などの使用によって、比較的高価である。したがって、このアッセイは、ルーチン的な試験、特にハイスループットスクリーニング手順にとっては大きな欠点を有する。
【００２８】
特許文献５は、エンドグリコシダーゼ酵素活性、特にヘパラナーゼ型のものを、酵素の基質に結合している２つの化合物の間の近接移動（ＦＲＥＴ）によりもたらされる信号を測定することによって決定する方法を開示する。
しかし、このアッセイは幾つかの欠点を有する。第１には、ＨＳは、グリコシド単位の配列及び鎖の長さの両方に関して多大な異質性を示し、例えば、化学的な局所官能化は、ＨＳの構造が分子毎に変わるので達成することが困難である。したがって、ドナー及びアクセプター化合物による基質の正確な標識付けは困難である。第２には、これらの困難さのために、試薬は比較的高価になる。更に、この型のアッセイは、高価な技術装置を必要とする。第３には、感度は十分ではあるかもしれないが、アッセイは、長時間（約６時間）のインキュベーションを必要とする。したがって、このアッセイは、ルーチン的な試験、特にハイスループットスクリーニング手順にとっては大きな欠点を有する。
【００２９】
特許文献６は、ヘパラナーゼ活性の潜在的なインヒビターを試験する方法を開示し、ここで酵素の標記基質は、固体支持体に固定化されている線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）に結合している。この基質は、フルオレセイン（フルオレセインイソチオシアネートＦＩＴＣ若しくはＦ２−ＦＩＴＣ）又はランタニドキレート（ユーロピウム）のいずれかにより標識される。ヘパラナーゼ酵素溶液と固定化標識基質の、試験される作用物質の存在下又は不在下での相互作用によって、基質からの標識フラグメントの放出をもたらし、それは、固体支持体から離れた溶液中で検出される。
このアッセイは、特許文献５に記載されたものと共通している幾つかの特徴を有する、すなわち蛍光標識を使用することはそのアッセイと比較して幾つかの利点を有する。例えば、近接エネルギー移動に必要な、基質の複雑で困難な二重標識化を回避することができる。更に、このアッセイはあまり時間がかからない。
しかし、このアッセイは、依然として大きな欠点を有し、例えば、（ｉ）固定化は、特異的ヘパラン硫酸結合タンパク質、すなわちＦＧＦにより達成される。ＦＧＦへの結合ドメインは、異質基質、すなわちヘパラン硫酸内では均一に分布しておらず、分子毎に変わっている。（ｉｉ）標識基質における酵素ヘパラナーゼへの切断部位は、ＦＧＦに結合することより少なくとも部分的にブロックされている。（ｉｉｉ）さらに重要なことは、酵素反応が、溶液中の基質ではなく、むしろ固相結合基質により実施されることである。したがって、基質のヘパラナーゼ切断部位の利用可能性は、結合ＦＧＦのみならず、固相の立体障害によっても損なわれている。７．５：１（ＦＩＴＣ標識）から１：１（ユーロピウム標識）の範囲である、この型のアッセイに必要な高い酵素／基質比（重量に基づく）は、これらの問題が存在することを強く示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００３０】
【特許文献１】ＵＳ６，２０７，４０２
【特許文献２】ＮＺ５０４４３８６
【特許文献３】ＷＯ００／０３３０６
【特許文献４】ＷＯ００／７７２４１
【特許文献５】ＵＳ２００６／０１２７９４５
【特許文献６】ＵＳ２００３／０１７０７４６
【非特許文献】
【００３１】
【非特許文献１】Ｄａｖｉｄ  Ｇ．米国実験生物学会連盟ジャーナル（ＦＡＳＥＢ  Ｊ．）７：１０２３〜１０３０、１９９３
【非特許文献２】Ｂｅｒｎｆｉｅｌｄ  Ｍ．ら、細胞生物学年次総説（Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．）８：３６５〜３９３、１９９２
【非特許文献３】Ｂｅｒｎｆｉｅｌｄ  Ｍ．ら、バイオ化学年次総説（Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．）６８：７２９〜７７７、１９９９
【非特許文献４】Ｄａｖｉｄ  Ｇ．ら、マトリックス生物学（Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌ．）１７：４６１〜４６３、１９９８
【非特許文献５】Ｋｊｅｌｌｅｎ  Ｌ．ら、バイオ化学年次総説（Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．）６０：４４３〜４７５、１９９１
【非特許文献６】Ｅｓｋｏ  Ｊ．ら、臨床試験（Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．）１０８：１６９〜１７３、２００１
【非特許文献７】Ｋｕｓｃｈｅｒｔ  Ｇ．Ｓ．ら、バイオ化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）３８：１２９５９〜１２９６８、１９９９
【非特許文献８】Ｅｓｋｏ  Ｊ．ら、バイオ化学年次総説（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．）７１：４３５〜４７１、２００２
【非特許文献９】Ｈａｎｄｅｌ  Ｔ．Ｍ．バイオ化学年次総説（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．）７４：３８５〜４１０、２００５
【非特許文献１０】Ｌｉｎｄａｈｌ  Ｕ．ら、生物化学ジャーナル（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．）２５９：１２３６８〜１２３７６、１９８４
【非特許文献１１】Ｐａｕｌｓｓｏｎ  Ｍ．生物化学分子生物学批評（Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．）２７：９３〜１０７、１９９２
【非特許文献１２】Ｔｉｍｐｌ  Ｒ．ら、マトリックス生物学（Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌ．）１４：２７５〜２８１、１９９４
【非特許文献１３】Ｔｉｍｐｌ  Ｒ．細胞生物学の最新見解（Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．）８：６１８〜６２４、１９９６
【非特許文献１４】Ｇｒｏｆｆｅｎ  Ａ．Ｊ．，腎臓病学、透析、移植（Ｎｅｐｈｒｏｌ．  Ｄｉａｌ．  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．）１４、２１１９〜２１２９、１９９９
【非特許文献１５】Ｙｕｒｃｈｅｎｋｏ  Ｐ．Ｄ．米国実験生物学会連盟ジャーナル（ＦＡＳＥＢ  Ｊ．）４：１５７７〜１５９０、１９９０
【非特許文献１６】Ｃｏｌｏｇｎａｔｏ  Ｈ．ら、細胞生物学ジャーナル（Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．）１４５、６１９〜３１、１９９９
【非特許文献１７】Ｒｏｂｅｒｔｓ  Ｒ．ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３３２、３７６〜３７８、１９８８
【非特許文献１８】Ｓａｋｓｅｌａ  Ｏ．ら、細胞生物学ジャーナル（Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．）１０７、７４３〜７５１、１９８８
【非特許文献１９】Ｖｌｏｄａｖｓｋｙ  Ｉ．ら、臨床試験ジャーナル（Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．）１０８：３４１〜３４７、２００１
【非特許文献２０】Ｐａｒｉｓｈ  Ｃ．Ｒ．ら、生化学、生物物理学公報（Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ）１４７１、９９〜１０８、２００１
【非特許文献２１】Ｖｌｏｄａｖｓｋｙ  Ｉ．ら、癌生物学（Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．）１２：１２１〜１２９、２００２
【非特許文献２２】Ｏｌｄｂｅｒｇ  Ａ．ら、バイオ化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）１９：５７５５〜５７６２、１９８０
【非特許文献２３】Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃ．ら、バイオ化学ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．）３３０：１３４１〜１３５０、１９９８
【非特許文献２４】Ｖｌｏｄａｖｓｋｙ  Ｉ．ら、ネイチャー医薬（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．）５：７９３〜８０２、１９９９
【非特許文献２５】Ｈｕｌｅｔｔ  Ｍ．Ｄ．、ネイチャー医薬（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．）５：８０３〜８０９、１９９９
【非特許文献２６】Ｋｕｓｓｉｅ  Ｐ．Ｈ．、生化学、生物理学研究通信（Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．）２６１：１８３〜１８７、１９９９
【非特許文献２７】Ｔｏｙｏｓｈｉｍａ  Ｍ．Ｔ．、生物化学ジャーナル（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．）２７４：２４１５３〜１６０、１９９９
【非特許文献２８】Ｚｃｈａｒｉａ  Ｅ．、米国実験生物学会連盟ジャーナル（ＦＡＳＥＢ  Ｊ．）１８：２１１〜２２１、２００５
【非特許文献２９】Ｂａｒｔｌｅｔｔ  Ｍ、ら、免疫学、細胞生物学（Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．）７３：１１３〜１２４、１９９５
【非特許文献３０】Ｅｄｏｖｉｔｓｋｙ  Ｅ．米国国立癌研究所ジャーナル（Ｊ．  Ｎａｔｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．）９６：１２１９〜１２３０、２００４
【非特許文献３１】Ｔａｋａｏｋａ  Ｍ．ら、実験室試験（Ｌａｂ．  Ｉｎｖｅｓｔ．）８３：６１３〜６２２、２００３
【非特許文献３２】Ｎｏｂｕｈｉｓａ  Ｔ．ら、癌研究、臨床腫瘍学ジャーナル（Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．）１３１：２２９〜２３７、２００５
【非特許文献３３】Ｓｃｈｏｐｐｍｅｙｅｒ  Ｋ．膵臓学（Ｐａｎｃｒｅａｔｏｌｏｇｙ）５、５７０〜５７５、２００５
【非特許文献３４】Ｖｌｏｄａｖｓｋｙ  Ｉ．ら、癌研究（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．）１２：１１２〜１２７、１９８９
【非特許文献３５】Ｎａｋａｊｉｍａ  Ｍ．ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２２０：６１１〜６１３、１９８３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３２】
コンビナトリアル化学は、１０万を超える基質を含む化合物の大規模なライブラリーを生成することを可能にする。これらの分子を、エンドグリコシダーゼ又はヘパラナーゼ調節活性について妥当な時間及び妥当な費用の範囲内で試験するために、容易に自動化することができる、簡単で素早く信頼できる試験系を使用することが必要である。上記に概説されているように、ヘパラナーゼ活性をアッセイするために以前に開発された技術は、この目的に十分に適していない。
【課題を解決するための手段】
【００３３】
本発明は、これらの基準を全て満たすエンドグリコシダーゼ又はヘパラナーゼ活性のアッセイを提供し、例えば、このアッセイは、著しく感度及び信頼性がある。更に、このアッセイは、簡単であり、素早く、最小量の試薬及び試料しか必要としない。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】プロタミン被覆固相へのビオチン標識ＨＳの用量依存的結合を示す棒グラフである。
【図２】多形核好中球（ＰＭＮ）から単離されたヒトヘパラナーゼによるビオチン標識ヘパラン硫酸の用量依存的分解を示す棒グラフである。
【図３】ヘパリンによるヘパラナーゼ活性の用量依存的阻害を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明は、試料（例えば、組織又は細胞の抽出物、全血、血清、血漿、ＣＦＳなど）においてエンドグリコシダーゼ酵素活性、特にヘパラナーゼ型のものを決定する方法に関し、一つの好ましい実施態様では、エンドグリコシダーゼの活性、特にヘパラナーゼ型の活性を有するエンドグリコシダーゼの活性を調節することができる化合物を検出する方法に関する。
【００３６】
本発明は、特にヘパラナーゼのアッセイ（フォーマットａ）に関し、ここで基質は、リガンド−レセプター対の１つのメンバーにより標識される。リガンド−レセプター対の対応するメンバーは、測定される信号を直接的に又は間接的に（［００４３］および［００４４］を参照すること）生成する。方法の一つの好ましい実施態様において、ヘパラナーゼ調節活性について試験する化合物を、第１工程において、ヘパラナーゼ及び標識基質と一緒にインキュベートした。
【００３７】
このアッセイにおいて、溶液中の標識基質（［００６９］を参照すること）は、ヘパラナーゼにより用量依存的に切断される。得られるフラグメントの大きさに応じて、切断標識基質は、方法の好ましい実施態様ではポリカチオン性タンパク質プロタミンである固相支持体に固定されている結合タンパク質に結合しなくなる。ＨＳ結合タンパク質としてのプロタミンの使用は、サイトカイン、増殖因子などのような他のＨＳ結合タンパク質と比較して幾つかの利点を有する（［００７１］を参照すること）。このアッセイにおいて、プロタミンは、特に、サケ、ニシンなどのような異なる種の精子から精製されたプロタミン、組換えプロタミン、例えばプロタミンをタンパク質分解性切断した後に得られる低分子量プロタミン、又はプロタミンペプチドであることができる。更に、ヒストンファミリーに属するアルギニン豊富タンパク質の部類である異なるプロタミン様タンパク質を、このアッセイに使用することができる（Ｌｅｗｉｓ  Ｊ．Ｄ．ら、染色体（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ）１１１：４７３〜４８２、２００３）。
【００３８】
エンドグリコシダーゼ活性、特にヘパラナーゼ型の活性を阻害（又は活性化）する化合物の存在下において、測定される信号は、この化合物の不在下で測定される信号と比較して修飾されている。
【００３９】
エンドグリコシダーゼ酵素活性、特にヘパラナーゼ型の酵素活性についてのアッセイを開発するために、本発明者たちは、エンドグリコシダーゼ、特にヘパラナーゼ型のものをアッセイする場合に特に遭遇する技術的困難を克服する必要があった。
【００４０】
エンドグリコシダーゼ、特にパラナーゼ型のもの、すなわちＨＳの基質は、二糖単位の配列（及びそれらの対応する修飾）と、鎖の長さの両方に関して、著しい異質性を示す。このことは、特に、ＨＳが多数の特異的酵素により合成及び修飾されており（［０００５］を参照すること）、したがって、化学合成により生成することが困難であるという事実に起因している。ＨＳの構造が分子毎に変わりうるので、局所官能基を導入することが困難である。
【００４１】
本発明は、以下の工程：
ｉ．エンドグリコシダーゼの標識基質を、前記エンドグリコシダーゼと、エンドグリコシダーゼによる基質の分解に十分な条件下、溶液中で接触させる工程、
ｉｉ．非分解又は部分的に分解した基質（［００３７］を参照すること）を固相結合ＨＳ結合タンパク質に、好ましくはポリカチオン性タンパク質プロタミンに結合させることによって、非分解又は部分的に分解した基質から分解生成物を分離する工程、
ｉｉｉ．無処理標識基質の量の変化を測定する工程を含み、この基質の量の減少が試料におけるエンドグリコシダーゼ活性を表す
エンドグリコシダーゼ酵素活性を決定する方法に関する。
【００４２】
エンドグリコシダーゼによる、特にヘパラナーゼ型の酵素による標識基質の分解の後、分解された基質は、本方法の一つの好ましい実施態様では、固相結合ポリカチオン性タンパク質プロタミンである、結合タンパク質に結合しなくなる（［００３７］を参照すること）。非結合基質を洗浄により除去した後、結合標識基質を測定することができる。この方法において、基質は直接的に又は間接的に標識される。
【００４３】
用語「直接的標識付け」は、基質において又はリガンド／レセプター対のメンバーの少なくとも１つにおいて存在する、又は予め導入された又は生成された官能基への、標識、例えば蛍光標識の結合を意味することが意図される。スペーサーを、標識と、基質又はリガンド／レセプター対の少なくとも１つのメンバーとの間に導入することができる。
【００４４】
用語「間接的標識付け」は、リガンド／レセプター対の第２メンバーを介した、標識の基質への結合を意味することが意図される。標識は、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどのような酵素イムノアッセイに使用される酵素の群から、又は蛍光、化学発光、電気化学発光若しくは比色標識の群から選択される。
【００４５】
この方法の一つの好ましい実施態様において、基質は、ペプチド−ＨＳ（［００５２］を参照すること）のペプチドの切れ残りを介してビオチンにより間接的に標識され、ペルオキシダーゼに結合しているアビジンは、リガンドレセプター対の第２メンバーとして使用される。
【００４６】
この方法は、例えばヘパラナーゼのようなヘパラン硫酸を切断することができるエンドグリコシダーゼを測定するために使用できる。
【００４７】
上記に記載されたエンドグリコシダーゼ酵素活性を決定する方法は、酵素活性に対する影響を試験することが望ましい化合物により発揮される、この酵素活性の調節の効果を研究することを可能にする。
【００４８】
表現「酵素活性の調節」は、機構に関わりなく、この酵素活性の阻害又は活性化を意味することが意図される。
【００４９】
したがって、一つの好ましい実施態様において、本発明は、以下の工程：
ｉ．エンドグリコシダーゼの基質を、試験化合物の存在下又は不在下で、エンドグリコシダーゼと溶液中で接触させる工程、
ｉｉ．無処理基質の量の変化を経時的に測定する工程、及び
ｉｉｉ．試験化合物の不在下で測定した基質の量と、試験化合物の存在下で測定したものとの変化を経時的に比較する工程
を含む、エンドグリコシダーゼ型の酵素活性を調節することができる化合物を検出する方法に関する。
【００５０】
この方法において、エンドグリコシダーゼ基質及び／又は少なくとも１つの他の成分を、上記に記載されたように直接的に又は間接的に標識することができる（［００４３］〜［００４５］を参照すること）。
【００５１】
後者の方法において、使用されるエンドグリコシダーゼは、特に、組み換えヘパラナーゼ、精製ヘパラナーゼ及び非精製ヘパラナーゼ（例えば、血小板抽出物）から選択されるヘパラナーゼであることができる。酵素は、通常、少なくとも部分的に精製された形態で提供される。
【００５２】
前述の方法で使用される基質は、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳ−ＰＧ）、ヘパリン及びペプチド−ヘパラン硫酸（ペプチド−ＨＳ）又はこれらの誘導体から選択することができる。ペプチド−ＨＳは、例えばパパインによるコアタンパク質のタンパク質分解性の分解の後に、残留した短いペプチド切れ残りを有するＨＳ  ＧＡＧ鎖をもたらす、ＨＳ−ＰＧから誘導される。
【００５３】
基質誘導体は、酵素−基質認識を妨げない、例えば、これらに限定されないが、選択的脱硫酸化、段階的Ｎアセチル化又は還元的オキシアミノ化のような僅かな修飾を受けるＨＳ、ヘパリン又はＨＳ−ＰＧであることができ、すなわち、これらは、ヘパラナーゼ型の活性を有する酵素により切断されうる（Ｎａｇｇｉ  Ａ．ら、生物化学ジャーナル（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．）２８０：１２１０３〜１２１１３、２００５；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  Ｃ．ら、炭水化物研究（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．）３４１：１２５３〜１２６５、２００６；Ｓａｎｄｂaｃｋ−Ｐｉｋａｓ  Ｄ．ら、生物化学ジャーナル（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．）２７３：１８７７０〜１８７７７、１９９８；Ｒａｍｓａｙ  Ｓ．ら、炭水化物研究（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．）３３３：５９〜７１、２００１）。
【００５４】
本発明の方法は、多様なフォーマットを使用して実施することができる。以下のフォーマットが好ましいフォーマットである。
【００５５】
フォーマット〔ａ〕：基質はリガンド／レセプター対の第１メンバーに共有結合している。リガンド／レセプター対の他のメンバーは、ペルオキシダーゼ系のような酵素検出系に結合している。
【００５６】
フォーマット〔ｂ〕：基質はリガンド／レセプター対の第１メンバーに共有結合している。リガンド／レセプター対の他のメンバーは、例えば、蛍光標識により標識されている。
【００５７】
フォーマット〔ｃ〕：基質は、蛍光、化学発光又は電気化学発光標識に共有結合している。このフォーマットでは、固相に結合している標識基質からの信号が直接測定される。
【００５８】
「リガンド−レセプター対」は、２つの結合パートナー、例えば、ビオチン／アビジン；ビオチン／ストレプトアビジン；ＤＮＰ（ジニトロフェノール）／抗ＤＮＰ抗体、若しくはＨＡ（アミノ酸９個のインフルエンザ赤血球凝集素ペプチド）／抗ＨＡ抗体のようなハプテン／抗体系；ＧＳＴ（グルタチオンＳトランスフェラーゼ）／抗ＧＳＴ抗体；６ＨＩＳ（ヒスチジン６個からなるペプチド）／抗６ＨＩＳ抗体；ｃ−ｍｙｃ（ヒトｃ−ｍｙｃタンパク質のアミノ酸４１０〜４１９のペプチド）／抗ｃ−ｍｙｃ抗体、又はＦＬＡＧ（登録商標）（アミノ酸４個のペプチド）／抗ＦＬＡＧ（登録商標）抗体の対を意味する。当業者に既知の他のリガンド−レセプター対を使用することができる。
【００５９】
これらの「リガンド／レセプター」系は、当業者によく知られており、大部分は市販されている。
【００６０】
リガンド−レセプター対のメンバーを、ヒドロキシスクシンイミドエステル又はヒドロキシスルホスクシンイミドエステルのような多様な反応基を使用して、基質に共有結合させることができる。
【００６１】
ヘパラナーゼ型の酵素活性を調節することができる化合物を検出する方法によって、特に抗ヘパラナーゼ抗体、天然生成物、合成生成物、例えばペプチド及びタンパク質のコンビナトリアル化学により得られる化合物のライブラリーからの生成物であることができる生成物の大規模なライブラリーを、酵素活性を調節する能力についてスクリーニングすることが可能となる。
【００６２】
更に、本発明は、また、本発明の方法の実施態様を実施するために使用可能であるか又は必要である試薬、特に以下の成分：
−ヘパラナーゼ型の活性を有する酵素により切断されうる基質、特に、好ましくはレセプター／リガンド対の第１メンバーにより標識されているＨＳ−（ＧＡＧ）又はペプチド−ＨＳ（ＧＡＳ）、
−ヘパラナーゼ（すなわち、組み換えヘパラナーゼ、精製ヘパラナーゼ又は非精製ヘパラナーゼ）、
−レセプター／リガンド対の第２メンバーを含む検出系
を含む、キットに関する。
【００６３】
本発明の（ヘパラナーゼ活性を測定するための）キットは、好ましくは、下記：
−ビオチンにより（ペプチド切れ残りを介して）標識されている基質ヘパラン硫酸（ペプチド−ＨＳ）、
−ペルオキシダーゼに結合しているアビジン（又はストレプトアビジン）及びオルトフェニレンジアミン（ＯＰＯ）のような適切な基質、
−プロタミン被覆固相、例えばマイクロプレート
を含む。
【００６４】
別の実施態様において、本発明の（ヘパラナーゼ活性の潜在的なモジュレーターを試験する）キットは、好ましくは、下記：
−ビオチンにより（ペプチド切れ残りを介して）標識されている基質ヘパラン硫酸（ペプチド−ＨＳ）、
−ペルオキシダーゼに結合しているアビジン（又はストレプトアビジン）及びＯＰＯのような適切な基質、
−ヘパラナーゼ（組み換えヘパラナーゼ、精製ヘパラナーゼ又は非精製ヘパラナーゼから選択）、
−プロタミン被覆固相、例えばマイクロプレート
を含む。
【００６５】
本発明の方法は、従来技術の方法と比較して多くの利点を有し、特に下記である。
【００６６】
この方法は、非放射性アッセイである（［００２３］及び［００２４］を参照すること）。
【００６７】
このアッセイは、僅かな工程しか含まず、３時間未満で完了するので、実施するのが非常に簡単である。
【００６８】
この方法は高価な技術装置を必要としない。
【００６９】
エンドグリコシダーゼ、特にヘパラナーゼのものの、標識基質との酵素反応は、溶液中で実施され、固相に結合した基質により実施されない。したがって、立体障害及び酵素による基質の切断部位の利用可能性の欠如という問題が回避される（［００２９］を参照すること）。
【００７０】
ＧＡＧ鎖の化学処理又は修飾の必要がない。このアッセイフォーマットにおいて、（元のコアタンパク質の）ペプチド切れ残りのみが、小型リガンド、例えばビオチンにより標識される。したがって、ＨＳ（ＧＡＧ）のヘパラナーゼ切断部位は、上記に概説されているように、容易に利用可能である。
【００７１】
本発明の方法は、好ましくは、ＨＳ結合タンパク質として、ＨＳ（又はヘパリン）の他のリガンド、例えばｂＦＧＦ（［００２９］を参照すること）のような増殖因子の代わりに、ポリカチオン性タンパク質プロタミンを使用する。一般にＨＳ鎖に限定された発現パターンを有する、これらの特異的リガンドのための結合ドメインと対照的に、ＨＳとプロタミンとのイオン性相互作用を仲介するアニオン性基、例えば硫酸塩基は、ポリアニオン性ＨＳ鎖に均一に分布している。したがって、このアッセイは、特定の結合ドメインについて、より感度があり、基質の組成の変化によって損傷を受けることが少ない（［００４０］を参照すること）。
加えて、標識基質の特異的結合タンパク質としての増殖因子、サイトカインなどの使用は、アッセイを高価にする。
【００７２】
例えばヘパラナーゼ分子の異なるエピトープに対してモノクローナル抗体を使用するイムノアッセイと対照的に、本発明のアッセイでは、ヘパラナーゼ濃度の代わりに、試料中のヘパラナーゼの機能活性が測定される。対照的に、イムノアッセイは、アッセイ設計及び対応する抗体に応じて、不活性な又は分解したヘパラナーゼも検出する。したがって、イムノアッセイでは、エンドグリコシダーゼ活性のモジュレーターを分析することは可能ではない。
【００７３】
使用される容量は、非常に少量である（例４及び５において、１ウエルあたり５０μｌ）。しかし、このアッセイを（例えば、３８４ウエルプレートを使用して）更に小型化することができ、このことは、例えば試薬を節約することを可能にする。
【００７４】
１０ｎｇほどの基質が例４において使用される。しかし、このアッセイは、２ｎｇの標識基質（図示せず）によっても成功裏に実施されている。対照的に、出願ＵＳ２００６／０１２７９４５では、少なくとも３０ｎｇの基質、出願ＵＳ２００３／０１７０７４６では、１８．７５ｎｇ（ユーロピウム標識基質）から１５０ｎｇのフルオレセイン標識基質、出願ＷＯ００／０３０３６では、５〜５０μｇの基質が使用される。
【００７５】
同じことが、このアッセイに使用される酵素の量について言える。例４では、０．１μＵ（０．１５ｎｇと同等）未満の酵素ヘパラナーゼが使用されるが、出願ＷＯ００／０３０３６では、３μｇのヘパラナーゼ（２．１ｍＵに相当）が（最大２４時間のインキュベーション時間で）使用され、出願ＵＳ２００３／０１７０７４６では、少なくとも２０ｎｇの組み換えヘパラナーゼが使用された。対照的に、出願ＵＳ２００６／０１２７９４５では、エンドグリコシダーゼ活性を、ヘパラナーゼの代わりに、細菌酵素のヘパチリナーゼＩＩＩ（フラボバクテリウムヘパリヌム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈｅｐａｒｉｎｕｍ）のヘパリナーゼＩＩＩ）により試験し、したがって、直接比較することができない。
【００７６】
全ての工程においてインキュベーションの時間は、例４に示されているように短時間であり、すなわち酵素反応は、１時間のインキュベーションを必要とする（更に削減することができる）。対照的に、出願ＷＯ００／０３０３６では、酵素反応は、信号を得るためには、少なくとも４時間必要であり、出願ＵＳ２００６／０１２７９４５では、少なくとも５時間必要である。
【００７７】
したがって、本発明の方法は、試料においてヘパラナーゼ活性を決定すること、又はヘパラナーゼ活性を調節することができる分子のライブラリーを素早くスクリーニングすることを可能にする。
【００７８】
したがって、本発明の方法の実施態様において、インビトロ診断の分野のみならず、製薬産業でのハイスループットスクリーニングの分野にとって重要な用途が存在する。
【実施例】
【００７９】
以下の例は、本発明の方法の好ましい実施態様を非限定的に例示する。
【００８０】
実験セクション
次の略語が使用される：
ＨＳ：ヘパラン硫酸
ＮＨＳ：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
ＰＢＳ：リン酸緩衝食塩水
ＰＯＤ：ホースラディッシュペルオキシダーゼ
ＯＰＤ：オルトフェニレンジアミン
【００８１】
例では、基質は、ペプチド−ＨＳ（ペプチド−ＨＳは、精製ヘパラン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質をパパインのようなタンパク質分解性酵素により消化し、短いペプチド切れ残りを有するグリコサミノグリカン鎖をもたらすことによって生成される）のＮＨ2官能基を使用して官能化されている。
【００８２】
例１
ＨＳ−ビオチン基質の調製
使用される試薬
−ＨＳ溶液（Ｓｉｇｍａ  Ｈ９９０２）５ｍｇ／ｍｌ：ＨＳ  ５ｍｇ＋ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）１ｍｌ
−スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン溶液（ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン）２０ｍＭ：スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）１１ｍｇ＋ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）１ｍｌ
【００８３】
ビオチン標識付け
５ｍｇ／ｍｌのＨＳ溶液（Ｓｉｇｍａ）１ｍｌを、２０ｍＭのスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン０．１ｍｌと混合する。混合物を３７℃で１８時間インキュベートする。過剰量のビオチンを、ＰＢＳで平衡にした５ｍｌのＺｅｂａ（商標）脱塩スピンカラム（Ｄｅｓａｌｔ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎ）（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して除去する。これによって、ビオチン化ＨＳ（以降、ビオチン−ＨＳと呼ぶ）を含有する１ｍｌの溶液を得た。
【００８４】
例２
最終モル比の決定
ビオチンをアッセイする
ビオチン濃度は、アビジンに結合するビオチン−ＨＳとＨＡＢＡ（４′−ヒドロキシアゾベンゼン−２−カルボン酸）との競合に基づいた光度アッセイを使用して測定する。ＨＡＢＡ／アビジン複合体の吸光度を５００ｎｍで測定する。続いて、ビオチン−ＨＳを加え、吸光度の減少を記録する。既知量のビオチン標識ＰＯＤを基準として使用して、ビオチンおよびＨＳのモル比を計算する。
【００８５】
例３
ビオチン標識ＨＳのプロタミン被覆固相への結合を試験する
使用される試薬
−ビオチン標識ＨＳ（上記の例１を参照すること）
−ニシンからの硫酸プロタミン、等級ＩＩＩ、Ｓｉｇｍａ  Ｐ４５０５
−アビジン−ＰＯＤ（Ｓｉｇｍａ  Ａ  ３１５１）
−ＰＢＳ／０．０１％ツイーン２０
−ＯＰＤ（Ｄａｋｏ  Ｓ  ２０４５３０）
【００８６】
固相、例えばマイクロタイタープレートを、１００μｌ／ウエルの０．００３％溶液の硫酸プロタミンと、３７℃で２４時間インキュベートすることによって、プロタミンにより被覆する。その後、プレートを蒸留水で３回洗浄し、暗所で保存した。
【００８７】
固相、例えばマイクロプレートのウエルの結合能を、増加量のビオチン標識ＨＳ（０．１〜１００ｎｇ／ｍｌ）により室温で６０分間インキュベートすることによって分析した。
【００８８】
プレートを緩衝液（ＰＢＳ／０．０１％ツイーン２０）で３回洗浄し、アビジン−ＰＯＤ（ＰＢＳ／５％ＢＳＡ中１μｇ／ｍｌ）を加えた。
【００８９】
１５分後、プレートを、クエン酸／リン酸緩衝液（ｐＨ６．２；３４．７ｍＭのクエン酸／６６．７ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4）で５回洗浄し、１００μｌのＯＰＤ溶液（０．６６７ｍｇ／ｍｌ）を加えた。
【００９０】
１５分後、反応を、１００μｌの０．５Ｍｏｌ  Ｈ2ＳＯ4の添加により停止させた。ＯＤを、マイクロプレートリーダーを使用して４９０ｎｍで測定した。
【００９１】
図１は、プロタミン被覆固相へのビオチン標識ＨＳの用量依存的結合を示す。
【００９２】
例４
ヘパラナーゼ型の活性をアッセイする
使用される試薬
−例３と同じ
−標準的なフィコール密度勾配手順を使用して抹消血から単離し、Ｖｌｏｄａｖｓｋｙのグループにより記載された方法（Ｍａｔｚｎｅｒ  Ｙ．ら、臨床試験ジャーナル（Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．）７６：１３０６〜１３１３、１９８５）に従って調製した、多形核好中球からのヘパラナーゼ。２０ｍＭのクエン酸／リン酸緩衝液（ｐＨ６．２）中のこのヘパラナーゼの溶液１０μｌは、０．１μＵ又は０．１５ｎｇの組み換え酵素ヘパラナーゼと等しい。
【００９３】
酵素反応は、５０μｌのビオチン標識ＨＳを０．２μｇ／ｍｌで増加量のヘパラナーゼ（０．５〜２０μｌのヘパラナーゼ、０．０１〜０．２μＵを表す）と混合することによって実施される。試料を、２０ｍＭのクエン酸／リン酸緩衝液（ｐＨ６．２）の添加により１００ｍｌの容量にした。
【００９４】
この混合物を室温で１時間放置した。
【００９５】
試料（５０μｌの試料）を、プロタミン被覆マイクロプレートに移し、室温で１時間インキュベートした。以下の工程は、例３（［００８８］〜［００９０］）に記載されたものと同一である。
【００９６】
結果を図２に表し、これは、酵素ヘパラナーゼの濃度の増加による信号の変化を示す。
【００９７】
信号の減少は、酵素活性、すなわちビオチン標識ＨＳ基質の切断の増加と完全に相関している。
【００９８】
例５
ヘパラナーゼ型の酵素活性のモジュレーター、例えばインヒビターの決定
使用される試薬
−例４と同じ
−ヘパリン（ナトリウム塩、ブタ腸粘膜からの未分画ヘパリン（等級Ｉａ、１７０ＵＳＰ／ｍｇ）（Ｓｉｇｍａ  Ｈ３３９３））
【００９９】
例４と同じ手順が実施されるが、増加量のモジュレーター、すなわちインヒビターを、ヘパラナーゼ（一定量）及びビオチン標識ＨＳ（一定量）の反応混合物に加えた。
【０１００】
この実験において、１０μｌのヘパラナーゼの量を用量依存性曲線（図２）から選択して、１時間後に約８０〜９０％のビオチン標識ＨＳがヘパラナーゼにより分解されるのを確実にする。このことは、曲線の直線部分におけるヘパリンのようなインヒビターの活性を検出することを可能にする。
【０１０１】
この実験において、ヘパリンをインヒビターとして０．１〜５ｎｇ／ｍｌの濃度で使用した。
【０１０２】
試験化合物（すなわち、インヒビター）による酵素の阻害（又は活性化）率は、試験化合物の存在下又は不在下で得られる結果を比較することにより決定する。
【０１０３】
阻害は、以下の式：
2010508035.tif 000002
に従って計算し、
ここでＯＤ(max*)は、ヘパラナーゼ及びインヒビターの不在下でのビオチン標識ＨＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）についてのＯＤ(490nm)である。ＯＤ(max*)は、ＯＤ(max)− ＯＤ(hep-10)に設定されており、ここでＯＤ(hep-10)は、１０μｌのヘパラナーゼによるビオチン標識ＨＳの分解後にもたらされるＯＤ(490nm)である。次にＯＤ(x)は、濃度ｘのインヒビターについて測定されたＯＤ(490nm)である。ＯＤ(x*)は、ＯＤ(x)− ＯＤ(hep-10)に設定されている。結果は、阻害率として提示される。
【０１０４】
結果を図３に表し、これは、インヒビター、すなわちヘパリンの濃度の増加による信号の変化を示す。
【０１０５】
したがって、例１〜５で使用されたフォーマット〔ａ〕（［００５５］を参照すること）は、エンドグリコシダーゼ酵素活性、特にヘパラナーゼ型のものを測定する方法ばかりでなく、この酵素活性のモジュレーターを試験するためにも完全に適切である。
【図１】
2010508035.tif 000003
【図２】
2010508035.tif 000004
【図３】
2010508035.tif 000005
【国際調査報告】
2010508035.tif 000006
2010508035.tif 000007
2010508035.tif 000008