(57)【要約】パパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）又はパパイヤモザイクウイルスに由来するウイルス様粒子（ＶＬＰ）と併用される１つ以上の抗原を含む抗原提示系（ＡＰＳ）が提供される。特に、１つ以上のウイルス抗原を含むＡＰＳが提供される。ＡＰＳは、例えばインフルエンザに対するワクチンとして使用することができる。ＡＰＳに含まれる１つ以上の抗原は、ＰａｐＭＶ又はＰａｐＭＶ  ＶＬＰのコートタンパク質に結合することができ、又は結合しなくてもよい（すなわちＰａｐＭＶ又はＰａｐＭＶ  ＶＬＰと分離していてもよい）。結合は、例えばコートタンパク質との遺伝子融合によって、又は共有結合、非共有結合又は親和力手段を通しての結合であり得る。
2010508860.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
パパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）又はＰａｐＭＶコートタンパク質を含むＶＬＰと併用される１つ以上のインフルエンザウイルス抗原を含む抗原提示系。
【請求項２】
前記ＶＬＰが、前記ＶＬＰを形成するように自己組織化することができる修飾ＰａｐＭＶコートタンパク質を含む、請求項１に記載の抗原提示系。
【請求項３】
前記１つ以上のインフルエンザウイルス抗原が前記ＰａｐＭＶ又は前記ＶＬＰのコートタンパク質に結合している、請求項１又は２に記載の抗原提示系。
【請求項４】
前記１つ以上のインフルエンザウイルス抗原が前記ＰａｐＭＶ又はＶＬＰに結合していない、請求項１又は２に記載の抗原提示系。
【請求項５】
前記系がＶＬＰを含み、かつ前記１つ以上のインフルエンザウイルス抗原がＶＬＰの前記コートタンパク質に遺伝子的に融合している、請求項３に記載の抗原提示系。
【請求項６】
前記１つ以上のインフルエンザウイルス抗原が、前記ＰａｐＭＶ又は前記ＶＬＰの前記コートタンパク質に共有結合している、請求項３に記載の抗原提示系。
【請求項７】
前記インフルエンザウイルス抗原の少なくとも１つがＭ２タンパク質に由来する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗原提示系。
【請求項８】
前記インフルエンザウイルス抗原の少なくとも１つがＭ２ｅペプチド又はそのフラグメントである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗原提示系。
【請求項９】
前記抗原提示系がＶＬＰを含み、前記ＶＬＰが、配列番号１又は３に示される配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するＰａｐＭＶコートタンパク質を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗原提示系。
【請求項１０】
前記抗原提示系がＶＬＰを含み、前記ＶＬＰが、配列番号４、４７及び４８のいずれか１つに示される配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するＰａｐＭＶコートタンパク質を含む、請求項１〜３及び５のいずれか一項に記載の抗原提示系。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗原提示系を１つ以上含有する、インフルエンザワクチン組成物。
【請求項１２】
１つ以上のインフルエンザウイルス抗原に融合したパパイヤモザイクウイルスコートタンパク質を含むポリペプチド。
【請求項１３】
前記ポリペプチドが、配列番号４、４７及び４８のいずれか１つに示される配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１２又は１３に記載のポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド。
【請求項１５】
動物においてインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導するための抗原提示系の使用方法であって、前記抗原提示系が、パパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）又はＰａｐＭＶコートタンパク質を含むＶＬＰと併用される１つ以上のインフルエンザウイルス抗原を含む使用方法。
【請求項１６】
前記ＶＬＰが、前記ＶＬＰを形成するように自己組織化することができる修飾ＰａｐＭＶコートタンパク質を含む、請求項１５に記載の使用方法。
【請求項１７】
前記１つ以上のインフルエンザウイルス抗原が前記ＰａｐＭＶ又は前記ＶＬＰのコートタンパク質に結合している、請求項１５又は１６に記載の使用方法。
【請求項１８】
前記１つ以上のインフルエンザウイルス抗原が前記ＰａｐＭＶ又はＶＬＰに結合していない、請求項１５又は１６に記載の使用方法。
【請求項１９】
前記系がＶＬＰを含み、かつ前記１つ以上のインフルエンザウイルス抗原がＶＬＰの前記コートタンパク質に遺伝子的に融合している、請求項１７に記載の使用方法。
【請求項２０】
前記１つ以上のインフルエンザウイルス抗原が、前記ＰａｐＭＶ又は前記ＶＬＰの前記コートタンパク質に共有結合している、請求項１７に記載の使用方法。
【請求項２１】
前記インフルエンザウイルス抗原の少なくとも１つがＭ２タンパク質に由来する、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項２２】
前記インフルエンザウイルス抗原の少なくとも１つがＭ２ｅペプチド又はそのフラグメントである、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項２３】
前記抗原提示系がＶＬＰを含み、前記ＶＬＰが、配列番号１又は３に示される配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するＰａｐＭＶコートタンパク質を含む、請求項１５〜２２のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項２４】
前記抗原提示系がＶＬＰを含み、前記ＶＬＰが、配列番号４、４７及び４８のいずれか１つに示される配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するＰａｐＭＶコートタンパク質を含む、請求項１５〜１７及び１９のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項２５】
前記免疫応答が体液性応答を含む、請求項１５〜２４のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項２６】
前記動物がヒトである、請求項１５〜２５のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項２７】
前記動物が非ヒト動物である、請求項１５〜２５のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項２８】
動物においてインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導するための、抗原提示系、及びアジュバント又はオプソニンを含む組成物の使用方法であって、前記抗原提示系が、パパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）又はＰａｐＭＶコートタンパク質を含むＶＬＰと併用される１つ以上のインフルエンザウイルス抗原を含む使用方法。
【請求項２９】
前記組成物がアジュバントを含む、請求項２８に記載の使用方法。
【請求項３０】
前記アジュバントがＰａｐＭＶ又はＰａｐＭＶ  ＶＬＰを含む、請求項２９に記載の使用方法。
【請求項３１】
前記ＶＬＰが、前記ＶＬＰを形成するように自己組織化することができる修飾ＰａｐＭＶコートタンパク質を含む、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項３２】
前記１つ以上のインフルエンザウイルス抗原が前記ＰａｐＭＶ又は前記ＶＬＰのコートタンパク質に結合している、請求項２８〜３１に記載の使用方法。
【請求項３３】
前記１つ以上のインフルエンザウイルス抗原が前記ＰａｐＭＶ又はＶＬＰに結合していない、請求項２８〜３１に記載の使用方法。
【請求項３４】
前記系がＶＬＰを含み、かつ前記１つ以上のインフルエンザウイルス抗原がＶＬＰの前記コートタンパク質に遺伝子的に融合している、請求項３２に記載の使用方法。
【請求項３５】
前記１つ以上のインフルエンザウイルス抗原が、前記ＰａｐＭＶ又は前記ＶＬＰの前記コートタンパク質に共有結合している、請求項３２に記載の使用方法。
【請求項３６】
前記インフルエンザウイルス抗原の少なくとも１つがＭ２タンパク質に由来する、請求項２８〜３５のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項３７】
前記インフルエンザウイルス抗原の少なくとも１つがＭ２ｅペプチド又はそのフラグメントである、請求項２８〜３５のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項３８】
前記抗原提示系がＶＬＰを含み、前記ＶＬＰが、配列番号１又は３に示される配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するＰａｐＭＶコートタンパク質を含む、請求項２８〜３７のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項３９】
前記抗原提示系がＶＬＰを含み、前記ＶＬＰが、配列番号４、４７及び４８のいずれか１つに示される配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するＰａｐＭＶコートタンパク質を含む、請求項２８〜３２及び３４のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項４０】
前記免疫応答が体液性応答を含む、請求項２８〜３９のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項４１】
前記動物がヒトである、請求項２８〜４０のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項４２】
前記動物が非ヒト動物である、請求項２８〜４０のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項４３】
薬剤の製造における、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗原提示系の使用方法。
【請求項４４】
前記薬剤が、動物においてインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導するためのものである、請求項４３に記載の使用方法。
【請求項４５】
前記免疫応答が体液性応答を含む、請求項４４に記載の使用方法。
【請求項４６】
前記動物がヒトである、請求項４４又は４５に記載の使用方法。
【請求項４７】
前記動物が非ヒト動物である、請求項４４又は４５に記載の使用方法。
【請求項４８】
前記薬剤がアジュバント又はオプソニンをさらに含む、請求項４３〜４７のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項４９】
前記アジュバントがＰａｐＭＶ又はＰａｐＭＶ  ＶＬＰを含む、請求項４８に記載の使用方法。
【請求項５０】
インフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導する方法であって、前記方法は、１つ以上の抗原提示系を含有する有効量の組成物を動物に投与する工程を含み、前記抗原提示系の各々が、パパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）又はＰａｐＭＶコートタンパク質を含むＶＬＰと併用される１つ以上のインフルエンザウイルス抗原を含む方法。
【請求項５１】
前記ＶＬＰが、前記ＶＬＰを形成するように自己組織化することができる修飾ＰａｐＭＶコートタンパク質を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記１つ以上のインフルエンザウイルス抗原が前記ＰａｐＭＶ又は前記ＶＬＰのコートタンパク質に結合している、請求項５０又は５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記１つ以上のインフルエンザウイルス抗原が前記ＰａｐＭＶ又はＶＬＰに結合していない、請求項５０又は５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記系がＶＬＰを含み、かつ前記１つ以上のインフルエンザウイルス抗原がＶＬＰの前記コートタンパク質に遺伝子的に融合している、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記１つ以上のインフルエンザウイルス抗原が、前記ＰａｐＭＶ又は前記ＶＬＰの前記コートタンパク質に共有結合している、請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
前記インフルエンザウイルス抗原の少なくとも１つがＭ２タンパク質に由来する、請求項５０〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記インフルエンザウイルス抗原の少なくとも１つがＭ２ｅペプチド又はそのフラグメントである、請求項５０〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記抗原提示系がＶＬＰを含み、前記ＶＬＰが、配列番号１又は３に示される配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するＰａｐＭＶコートタンパク質を含む、請求項５０〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記抗原提示系がＶＬＰを含み、前記ＶＬＰが、配列番号４、４７及び４８のいずれか１つに示される配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するＰａｐＭＶコートタンパク質を含む、請求項５０〜５２及び５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記免疫応答が体液性応答を含む、請求項５０〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記動物がヒトである、請求項５０〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記動物が非ヒト動物である、請求項５０〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
インフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導する方法であって、前記方法は、アジュバント又はオプソニン及び１つ以上の抗原提示系を含有する有効量の組成物を動物に投与する工程を含み、前記抗原提示系の各々が、パパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）又はＰａｐＭＶコートタンパク質を含むＶＬＰと併用される１つ以上のインフルエンザウイルス抗原を含む抗原提示系からなる方法。
【請求項６４】
前記組成物がアジュバントを含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６５】
前記アジュバントがＰａｐＭＶ又はＰａｐＭＶ  ＶＬＰを含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記ＶＬＰが、前記ＶＬＰを形成するように自己組織化することができる修飾ＰａｐＭＶコートタンパク質を含む、請求項６３〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記１つ以上のインフルエンザウイルス抗原が前記ＰａｐＭＶ又は前記ＶＬＰのコートタンパク質に結合している、請求項６３〜６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記１つ以上のインフルエンザウイルス抗原が前記ＰａｐＭＶ又はＶＬＰに結合していない、請求項６３〜６６に記載の方法。
【請求項６９】
前記系がＶＬＰを含み、かつ前記１つ以上のインフルエンザウイルス抗原がＶＬＰの前記コートタンパク質に遺伝子的に融合している、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
前記１つ以上のインフルエンザウイルス抗原が、前記ＰａｐＭＶ又はＶＬＰの前記コートタンパク質に共有結合している、請求項６７に記載の方法。
【請求項７１】
前記インフルエンザウイルス抗原の少なくとも１つがＭ２タンパク質に由来する、請求項６３〜７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記インフルエンザウイルス抗原の少なくとも１つがＭ２ｅペプチド又はそのフラグメントである、請求項６３〜７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記抗原提示系がＶＬＰを含み、前記ＶＬＰが、配列番号１又は３に示される配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するＰａｐＭＶコートタンパク質を含む、請求項６３〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記抗原提示系がＶＬＰを含み、前記ＶＬＰが、配列番号４、４７及び４８のいずれか１つに示される配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するＰａｐＭＶコートタンパク質を含む、請求項６３〜６７及び６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記免疫応答が体液性応答を含む、請求項６３〜７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記動物がヒトである、請求項６３〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記動物が非ヒト動物である、請求項６３〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ワクチン製剤及びアジュバントの分野、特に植物ウイルス粒子に基づくインフルエンザワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザウイルスには３つの属、Ａ、Ｂ及びＣ型があり、Ｃ型ウイルスは軽度の呼吸器系疾病を引き起こすだけであるが、これら３つの属は、それらのヌクレオキャプシド及び基質タンパク質の抗原性の相違によって同定され得る。一般に、インフルエンザＡ型株は、ヒト、家畜、海洋哺乳動物及び様々な鳥類を含む多くの脊椎動物に感染することができる。しかし、インフルエンザＢ及びＣ型は、主としてヒトに限定されるが、インフルエンザＢ型感染はブタにおいて、及びインフルエンザＣ型感染はアザラシにおいても認められてきた。インフルエンザＡ型及びＢ型はヒトにおいて最も有病率の高い型であり、米国だけで年間３６，０００人の死亡と１１４，０００人の入院を引き起こす。最も近代的なインフルエンザワクチンはＡ型又はＢ型ウイルスを標的とし、大部分がＡ型を標的とする。
【０００３】
すべてのインフルエンザＡ型ウイルスの物理的構造は類似する。ウイルス粒子はエンベロープを持ち、球状及び糸状形態のいずれかであり得る。インフルエンザＡ型ウイルスはＲＮＡウイルスであり、そのゲノムは、８分節の一本鎖ＲＮＡ：ヘマグルチニンをコードするＨＡ、ノイラミニダーゼをコードするＮＡ、核タンパク質をエンコードするＮＰ、２つの基質タンパク質（Ｍ１及びＭ２）をコードするＭ、２つの非構造タンパク質（ＮＳＩ及びＮＥＰ）をコードするＮＳ、ＲＮＡポリメラーゼをコードするＰＡ、ＲＮＡポリメラーゼとＰＢ１−Ｆ２タンパク質をエンコードするＰＢＩ、及びもう１つのＲＮＡポリメラーゼをコードするＰＢ２からなる。インフルエンザウイルスゲノムのこの分節性は、遺伝子全体がウイルスの異なる株の間で交換されることを可能にし、それが新しい毒性株の出現を導き、それ故予防及び／又は治療に対する課題を与える。インフルエンザウイルス株の多様性は、世界保健機構によって毎年決定される、その時点でより流行している株に従った毎年のワクチン接種の必要性をもたらす。
【０００４】
既存のヒトワクチンは３つの死滅又は弱毒化ウイルス株を含み、１つはＡ型（Ｈ３Ｎ２）ウイルス、１つはＡ型（Ｈ１Ｎ１）ウイルス、及び１つはＢ型ウイルスである。ウイルスの表面の接触可能な大型糖タンパク質である、ヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質は、感染における免疫応答の主要標的であり、免疫応答は、次に、これらのタンパク質のドリフト及びシフトを誘導する（非特許文献１）。表面糖タンパク質への免疫系の選択圧は、効率良く増殖し、新しい流行病を引き起こす突然変異したウイルスの出現を促進する。新たに出現した株は通常、その次のワクチンの成分として選択されるが、これは６〜８か月後まで市場に出回らないことがある。この期間中、循環ウイルスは進化する時間があり、それがワクチンの不完全な効果を生じさせる。ブタ及び鳥類の保有宿主におけるウイルスの再組合せ（ｒｅａｓｓｏｒｔｍｅｎｔ）がサイクルを複雑にし、パンデミックの供給源となり得る。
【０００５】
Ｈ９Ｎ２インフルエンザウイルスは、例えば、過去２０年間にわたって種々のアジア諸国の陸生家禽において定着し、同時にユーラシア大陸の多数の国々で様々な種類の陸生家禽における地方病となった（非特許文献２）。最近、種々の種類の家禽におけるＨ５Ｎ１の長期的な共循環が、Ｈ９Ｎ２及びＨ５Ｎ１インフルエンザウイルスにおける大きな遺伝的多様性の原因である頻繁な再組合せ現象を促進してきたことが明らかにされた。この状況は、パンデミックの潜在的可能性を有するインフルエンザウイルスの出現を促進する（非特許文献２）。そのため、家禽のワクチン接種はＨ９Ｎ２株の伝播を予防する上で有効であると考えられ、ヒトにおいても有毒であり得る新しいウイルスの出現の危険性を低下させ得る。
【０００６】
インフルエンザの生弱毒化経鼻ワクチン（Ｍｅｄｌｍｍｕｎｅ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ社製のＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標））は、ウイルス粒子の内部で認められる高度に保存されたタンパク質に対する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の誘導を通してインフルエンザの他の株に対するある程度のレベルの交差保護を提供し得る（非特許文献３）。インフルエンザ株に対する免疫防御を提供するワクチンを創製するためのもう一つのアプローチは、いくつかの普遍的インフルエンザ抗原を標的とすることである。２５アミノ酸長のペプチドであるイオンチャネルタンパク質Ｍ２ｅのエクトドメインは一つの可能な標的である（非特許文献４）。Ｍ２ｅペプチドは、その安定性と免疫原性を高めるために、キーホールリンペットヘモシアニン及び髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｉｇｉｔｉｄｉｓ）外膜タンパク質を含む様々な担体に結合され、インフルエンザ感染に対して部分的な防御を与えることが示された（非特許文献５）。Ｍ２ｅペプチドの防御能力は部分的でしかないと考えられ、そのため、各年のインフルエンザワクチン中に追加成分として含め得ることが提案されている（非特許文献３）。しかし、脂質複合体への組込みのために疎水性タンパク質へのＭ２ｅペプチドの化学的架橋が用いられており、生じたリポソームベースのワクチンは、様々なインフルエンザウイルス株での抗原投与に対してマウスを防御する上で成功を収めた（非特許文献６）。
【０００７】
ミョウバン（非特許文献７）、市販のコレラ毒素（非特許文献８）又はモノホスホリル脂質Ａのような市販のアジュバントの添加は、アジュバントを含まないＭ２媒介性防御と比較して、罹病率（体重減少、体温低下）及び認められる症状を軽減した（非特許文献４）。
【０００８】
万能インフルエンザワクチンへのもう一つのアプローチは、ＨＡ及びＮＡに対する中和抗体ではなく、ＣＴＬに基づく免疫を惹起するために基質タンパク質（Ｍ１）又はヌクレオキャプシド（ＮＰ）のような保存された内部タンパク質を使用することである。ＣＴＬは、ＭＨＣクラスＩ複合体に負荷されたインフルエンザペプチドの特異的認識によって感染細胞を排除する。感染細胞の表面に位置するＭＨＣクラスＩ複合体は、Ｍ１やＮＰのような高度に保存されたタンパク質に由来するペプチドを効率良く提示する。精製ＮＰ又はＭ１の注入が単独で防御的ＣＴＬ応答を開始させる可能性は低く、標的タンパク質が、アジュバント又は、アデノウイルスベクター（非特許文献９及び１０）及びＤＮＡワクチン（非特許文献１１及び１２）のような、保存されたエピトープに対するＣＴＬ応答を発現することを目的とした送達システムと結合しなければならない。しかし、アデノウイルスベクターは、ＡＰＣへのそれらの侵入を阻害する抗体によって中和され得（非特許文献１３）、またＤＮＡワクチンは大型動物において免疫原性でなく、それらの免疫原性を高めるためにＣｐＧのようなアジュバントの添加を必要とする（非特許文献１４）。
【０００９】
ワクチン開発のための数多くの新しいアプローチの中で、ウイルスのヌクレオキャプシドで作られたウイルス様粒子（ＶＬＰ）が有望な方策として浮上してきた。これまでに、２つのＶＬＰワクチン、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）及びヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）がヒトにおいて効率的に機能することが示された（非特許文献１５及び１６）。ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）主要キャプシドタンパク質Ｌ１から作製されるＶＬＰは、例えば、女性において子宮頸癌の発症に対し１００％の防御を与えることが示された（非特許文献１６及び１７、また特許文献１も参照のこと）。バクテリオファージＱβ（非特許文献１８）、ウイルスコアタンパク質で作製されるＢ型肝炎ウイルスＶＬＰ（非特許文献１９及び２０）、及びパルボウイルスＶＬＰ（非特許文献２１及び２２）などのプラットフォームも、エピトープを担持し、強力な抗体応答を誘導する能力を示した。
【００１０】
外因性抗原と共にマウスに独立して投与したときブタパルボウイルス（ＰＰＶ）ＶＬＰがアジュバントとして働く能力も記述されている（非特許文献２３）。
インフルエンザウイルスＶＬＰも当技術分野において記述されている（特許文献２〜４参照）。Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）（非特許文献２４）又はヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）（非特許文献２５）へのＭ２ｅペプチドの化学的架橋及びＨＢＶコートタンパク質とＭ２ｅペプチドのインフレーム融合（非特許文献４及び２４、及び特許文献５）はすべて、インフルエンザウイルスでの抗原投与に対してマウスを防御することに成功した。インフルエンザウイルスヘマグルチニン又は核タンパク質エピトープに融合した酵母レトロトランスポゾンＴｙ  ｐ１タンパク質から作製されたキメラＶＬＰも記述されている（特許文献６）。
【００１１】
エピトープ提示系としての植物ウイルスからのＶＬＰの使用方法が述べられている。植物ウイルスは、主として高度に免疫原性であるタンパク質からなり、複雑で反復的な結晶性機構を有する。加えて、それらは動物免疫系とは系統発生的に異なり、そのことが植物ウイルスをワクチン開発のための良好な候補物質にしている。例えばササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）及びアルファルファモザイクウイルス（ＡＩＭＶ）は、対象とするエピトープの提示のために改変された（非特許文献２６及び２７）。特許文献７は、例えばペプチドエピトープの提示のために使用できる、コートタンパク質及び非ウイルスタンパク質を含むキメラウイルス様粒子について記載している。特許文献８は、植物ウイルスコートタンパク質、特に、病原性微生物のエピトープを含み得る、リンカーによってＮ末端で対象ポリペプチドに融合されたトバモウイルスコートタンパク質を述べる。特許文献９は、外来性ペプチド、特にニューカッスル病ウイルス又はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）エピトープに融合したジャガイモＹウイルスコートタンパク質及びトランケート型インゲンマメ黄斑モザイクウイルスコートタンパク質のいずれかを含むワクチンを記述する。また、特許文献１０は、アルファルファモザイクウイルス又はイラルウイルスキャプシドタンパク質と病原体エピトープのようなポリペプチドの融合物を、免疫応答を惹起するために動物に投与する方法について記載している。
【００１２】
パパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）のコートタンパク質に由来するＶＬＰ及び免疫増強剤としてそれらの使用方法が記述されている（特許文献１１）。大腸菌におけるＰａｐＭＶの発現は、反復的及び結晶性に組織された数百のＣＰサブユニットからなるＶＬＰの自己組織化を導く（非特許文献２８）。ＰａｐＭＶ  ＣＰ欠失構築物の発現及び精製の試験は、ＣＰサブユニットの自己組織化（又は多量体化）が機能のために重要であることをさらに示す（非特許文献２９）。
【００１３】
ＨＩＶ（ｇｐ４１又はｇｐｌ２０）、ＨＣＶ（ＮＳ３、Ｅ１又はＥ２）、ＥＢＶ（ＥＢＮＡ−３Ａ、３Ｂ又は３Ｃ）又はインフルエンザウイルス（基質タンパク質又はヘマグルチニン）からの抗原決定基を担持するジャガイモＸウイルス（ＰＶＸ）に由来するＶＬＰについて記載されている（特許文献１２）。ＨＩＶエピトープを担持するＰＶＸ  ＶＬＰが、体液性及び細胞媒介性経路によってマウスにおける抗体産生を誘導する能力。付加的なアジュバントが、この作用を増強するためにＰＶＸ  ＶＬＰと共に使用された。
【００１４】
Ｂ型肝炎コアタンパク質又はパルボウイルスＶＬＰは、それらが遺伝情報を担持せず、陥入した細胞内で活発に複製することができないときでさえもＣＴＬ応答を誘導することが報告された（非特許文献３０及び３１）。リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）又はニワトリ卵アルブミンからのエピトープを担持するそのようなＶＬＰのインビボでの樹状細胞による交差提示も記述されている（非特許文献３０及び３２）。ＬＣＭＶからのエピトープを担持するＢ型肝炎コアタンパク質ＶＬＰがＣＴＬ応答をプライミングする能力も記述されているが、このＶＬＰは、単独で投与したときＣＴＬ応答を誘導することができず、ウイルス抗原投与からの有効な防御を媒介することができなかった。有効なＣＴＬ応答は、ＶＬＰを抗ＣＤ４０抗体又はＣｐＧオリゴヌクレオチドと共に使用したときにのみ誘導された（非特許文献３３）。それよりも早期の報告は、ＬＣＭＶからのペプチドを担持するブタパルボウイルス様粒子（ＰＰＭＶ）が、致死的なＬＣＭＶ抗原投与からマウスを防御できることを示した（非特許文献３４）。
【００１５】
親和性ペプチドに融合したパパイヤモザイクウイルスＶＬＰが、真菌性疾患の検出におけるモノクローナル抗体の代替物として提案されている（非特許文献３５）。ネコブカビ（プラスモジオフォラ・ブラシカ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｏｐｈｏｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ））胞子に高い結合活性で結合することができるＶＬＰが開発され、１つの構築物の胞子への結合がポリクローナル抗体と同等のレベルであることが明らかにされた。
【００１６】
この背景情報は、出願人が本発明に関連する可能性があると考える情報を明らかにするために提供するものである。前記情報のいずれかが本発明に対する先行技術を構成することの承認を必ずしも意図せず、またそのように解釈されるべきではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／１８７０１号（国際公開第０２／０４００７号パンフレット）
【特許文献２】国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２２００１号（国際公開第２００５／０２０８８９号パンフレット）
【特許文献３】米国特許出願第２００５／０１８６６２１号明細書
【特許文献４】米国特許出願第２００５／０００９００８号明細書
【特許文献５】米国特許出願第２００３／０２０２９８２号明細書
【特許文献６】米国特許第６０６００６４号明細書
【特許文献７】国際特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ９７／０１０６５号（国際公開第９７／３９１３４号パンフレット）
【特許文献８】国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／０７３５５号（国際公開第０１／６６７７８号パンフレット）
【特許文献９】国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／２０２７２号（国際公開第０２／００１６９号パンフレット）
【特許文献１０】米国特許第６０４２８３２号明細書
【特許文献１１】国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＡ０３／００９８５号（国際公開第２００４／００４７６１号パンフレット）
【特許文献１２】欧州特許出願第１１６７５３０号明細書
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Ｆｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １０３：１７３−１７６
【非特許文献２】Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８１：１０３８９−１０４０１
【非特許文献３】Ｋａｉｓｅｒ，２００６，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１２：３８０−３８３
【非特許文献４】Ｎｅｉｒｙｎｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ５：１１５７−１１６３
【非特許文献５】Ｆａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２２：２９９３−３００３
【非特許文献６】Ｅｒｎｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２４：５１５２−５１５８
【非特許文献７】Ｄｅ  Ｆｉｌｅｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３３７：１４９−１６１
【非特許文献８】Ｄｅ  Ｆｉｌｅｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２４：５４４−５５１
【非特許文献９】Ｂａｎｇａｒｉ  ａｎｄ  Ｍｉｔｔａｌ，２００６，Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ６：２１５−２２６
【非特許文献１０】Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １３３：９−２９
【非特許文献１１】Ｌａｄｄｙ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｅｒ，２００６，Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２５：９９−１２３
【非特許文献１２】Ｓｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｏｎｃｌ  Ｃｌｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ  ２０：６１３−６３６
【非特許文献１３】Ｐａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ  １０５：１８３−１９４
【非特許文献１４】Ｋｌｉｎｍａｎ  Ｄ．Ｍ．，（２００６）Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５；１３５−１５４
【非特許文献１５】Ｆａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ，２１：４９−５６
【非特許文献１６】Ｈａｒｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｌａｎｃｅｔ，３６４：１７５７−１７６５
【非特許文献１７】Ａｕｌｔ，Ｋ．Ａ．，２００６，Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｓｕｒｖ．６１：Ｓ２６−Ｓ３１
【非特許文献１８】Ｍａｕｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３５：２０３１−２０４０
【非特許文献１９】Ｍｉｈａｉｌｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２４：４３６９−４３７７
【非特許文献２０】Ｐｕｍｐｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４５：２４−３２
【非特許文献２１】Ａｎｔｏｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２４：５４８１−５４９０
【非特許文献２２】Ｏｇａｓａｗａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  ２０：３１９−３２４
【非特許文献２３】Ｂｉｏｓｇｅｒａｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７４：３４３２−３４３９
【非特許文献２４】Ｊｅｇｅｒｌｅｈｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０：３１０４−３１１２
【非特許文献２５】Ｉｏｎｅｓｃｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．９５：７０−７９
【非特許文献２６】Ｃａｎｉｚａｒｅｓ，Ｍ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８３：２６３−２７０
【非特許文献２７】Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．１７：１５−  ２６
【非特許文献２８】Ｔｒｅｍｂｌａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，ＦＥＢＳ  Ｊ  ２７３：１４
【非特許文献２９】Ｌｅｃｏｕｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，４７：２７３−２８０
【非特許文献３０】Ｒｕｅｄｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２；８１８−８２５
【非特許文献３１】Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３０５；４２８−４３５
【非特許文献３２】Ｍｏｒｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：２２４２−２２５０
【非特許文献３３】Ｓｔｏｒｎｉ，ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８：２８８０−２８８６
【非特許文献３４】Ｓｅｄｌｉｋ，ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：５７６９−５７７５
【非特許文献３５】Ｍｏｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２８：４２３−４３４［２００６年１０月２６日の印刷に先立つ電子出版］
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明の目的は、パパイヤモザイクウイルスに基づくインフルエンザ用ワクチンを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明の一つの態様に従って、パパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）又はＰａｐＭＶコートタンパク質を含むＶＬＰと併用される１つ以上のインフルエンザウイルス抗原を含む抗原提示系が提供される。
【００２１】
もう一つの態様に従って、本発明の１つ以上の抗原提示系を含有するインフルエンザワクチン組成物が提供される。
本発明のもう一つの態様に従って、１つ以上のインフルエンザウイルス抗原に融合したパパイヤモザイクウイルスコートタンパク質を含むポリペプチドが提供される。
【００２２】
もう一つの態様に従って、本発明のポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドが提供される。
本発明のもう一つの態様に従って、動物においてインフルエンザウイルス免疫応答を誘導するための抗原提示系の使用方法が提供され、前記抗原提示系は、パパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）又はＰａｐＭＶコートタンパク質を含むＶＬＰと併用される１つ以上のインフルエンザウイルス抗原を含む。
【００２３】
本発明のもう一つの態様に従って、動物においてインフルエンザウイルス免疫応答を誘導するための、抗原提示系及びアジュバント又はオプソニンを含有する組成物の使用方法が提供され、前記抗原提示系は、パパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）又はＰａｐＭＶコートタンパク質を含むＶＬＰと併用される１つ以上のインフルエンザウイルス抗原を含む。
【００２４】
もう一つの態様に従って、薬剤の製造における本発明の抗原提示系の使用方法が提供される。
本発明のもう一つの態様に従って、インフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導する方法が提供され、前記方法は、１つ以上の抗原提示系を含有する組成物の有効量を動物に投与することを含み、前記抗原提示系の各々は、パパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）又はＰａｐＭＶコートタンパク質を含むＶＬＰと併用される１つ以上のインフルエンザウイルス抗原を含む。
【００２５】
本発明のもう一つの態様に従って、インフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導する方法が提供され、前記方法は、アジュバント又はオプソニン及び１つ以上の抗原提示系を含有する組成物の有効量を動物に投与する工程を含み、前記抗原提示系の各々は、パパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）又はＰａｐＭＶコートタンパク質を含むＶＬＰと併用される１つ以上のインフルエンザウイルス抗原を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
本発明のこれら及び他の特徴は、添付の図面を参照する以下の詳細な説明においてより明らかになる。
【図１】（Ａ）パパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）コートタンパク質についてのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿０４４３３４．１；配列番号１）、（Ｂ）ＰａｐＭＶコートタンパク質をエンコードするヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＣ＿００１７４８（ヌクレオチド５８８９−６５３６）；配列番号２）、（Ｃ）突然変異型ＰａｐＭＶコートタンパク質ＣＰΔＮ５のアミノ酸（配列番号３）、（Ｄ）そのＣ末端でインフルエンザウイルス株Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９）からのＭ２ｅペプチド（下線部）に融合し、６×Ｈｉｓタグを含む、突然変異型ＰａｐＭＶコートタンパク質ＣＰΔＮ５−ＳＭのアミノ酸配列（配列番号４）、（Ｅ）（Ｄ）に示されるタンパク質をエンコードするヌクレオチド配列（配列番号５）、（Ｆ）Ｃ末端に制限部位Ｓｐｅ）−ＭｌｕＩを含む突然変異型ＰａｐＭＶコートタンパク質ＣＰΔＮ５（ＣＰΔＮ５−ＳＭ）のアミノ酸配列（配列番号４６）、（Ｇ）そのＣ末端でインフルエンザウイルス株Ｈ９Ｎ２からのＭ２ｅペプチド（下線部）に融合し、６×Ｈｉｓタグを含む、突然変異型ＰａｐＭＶコートタンパク質ＣＰΔＮ５−ＳＭのアミノ酸配列（配列番号４７）、（Ｈ）そのＣ末端でインフルエンザウイルス株Ｈ９Ｎ２からのＭ２ｅペプチド（下線部）に融合し、コートタンパク質配列とＭ２ｅペプチド配列の間に挿入されたグリシンスペーサ（太字）を有しており、同時に６×Ｈｉｓタグを含む、ＰａｐＭＶコートタンパク質ＣＰΔＮ５−ＳＭのアミノ酸配列（配列番号４８）、（Ｉ）そのＣ末端でインフルエンザウイルス株Ｈ３Ｎ８からのＭ２ｅペプチドに融合し、６×Ｈｉｓタグを含む、ＰａｐＭＶコートタンパク質をエンコードするヌクレオチド配列（配列番号５６）、（Ｊ）図１Ｉに示される配列によってエンコードされるアミノ酸配列（配列番号５７）、Ｈ３Ｎ８  Ｍ２ｅペプチド配列に下線を付している、（Ｋ）そのＣ末端でインフルエンザウイルス株Ｈ５Ｎ１からのＭ２ｅペプチドに融合し、６×Ｈｉｓタグを含む、ＰａｐＭＶコートタンパク質ＣＰΔＮ５−ＳＭをコードするヌクレオチド配列（配列番号５８）、（Ｌ）図１Ｋに示される配列によってコードされるアミノ酸配列（配列番号５９）、Ｈ５Ｎ１  Ｍ２ｅペプチド配列に下線を付している、及び（Ｍ）（Ｆ）に示すＣＰΔＮ５−ＳＭのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号４９）を示す。
【図２】野生型（ＷＴ）ＰａｐＭＶ及び組換え突然変異型ＰａｐＭＶコートタンパク質ＣＰΔＮ５、Ｅ１２８Ａ又はＫ９７Ａを含むＰａｐＭＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）の円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルを示す；（Ａ）は、ＷＴウイルス（黒色の線）、ＣＰΔＮ５（点線）及びＥ１２８Ａ  ＶＬＰ（灰色の線）の遠紫外スペクトルを示し、（Ｂ）は、酢酸法によるＷＴウイルスからの単離ディスク（黒色の線）及びＣＰΔＮ５タンパク質（ディスク）の高速上清（点線）の遠紫外スペクトルを示し、（Ｃ）は、ＣＰΔＮ５タンパク質（ディスク）（点線）及びＫ９７Ａタンパク質（灰色の線）の遠紫外スペクトルを示し、（Ｄ）は、２５０〜３５０ｎｍの間のＣＰΔＮ５及びＥ１２８Ａ  ＶＬＰの遠紫外スペクトルを示し、及び（Ｅ）は、２５０〜３５０ｎｍの間のＣＰΔＮ５及びＫ９７Ａディスクの遠紫外スペクトルを示す。
【図３】組換え突然変異型ＰａｐＭＶコートタンパク質、ＣＰΔＮ５及びＫ９７Ａのゲルろ過分析の結果を示す；（Ａ）は、ＣＰΔＮ５精製タンパク質（黒色の線；灰色の線：分子量マーカー）についてのタンパク質溶出プロファイルを表し、（Ｂ）は、ＣＰΔＮ５精製タンパク質（黒色の線）及びＫ９７Ａ精製タンパク質（灰色の線）についてのタンパク質溶出プロファイルを表す。
【図４】組換え突然変異型及び野生型（ＷＴ）ＰａｐＭＶコートタンパク質についての円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルの温度誘導性変性曲線を示す；（Ａ）は、ＣＰΔＮ５及びＥ１２８Ａ突然変異型ＶＬＰ及びＷＴウイルスについてのプロファイルを示し、及び（Ｂ）は、ＣＰΔＮ５及びＷＴディスクについてのプロファイルを示す。スペクトルは平均残基楕円率の単位で示されている。変性を、２２２ｎｍの［Ｑ］を温度の関数として記録することによって観測した。示されているすべてのＣＤスペクトルは、１０ｍＭ  ＮａＰ緩衝液、ｐＨ７．２中１ｍｇ／ｍｌの濃度のタンパク質に関して生成された。
【図５】（Ａ）ＰａｐＭＶコートタンパク質（ＰａｐＭＶ）と、インフルエンザＭ１タンパク質（５７〜６５位；ＰａｐＭＶ  Ｆｌｕと称する）又はｇｐ１００（２１０位のＭを含む２０９〜２１７位；ＰａｐＭＶ  ｇｐ１００と称する）からのＨＬＡ−Ａ＊０２０１制限エピトープを含む修飾ＰａｐＭＶ構築物のＣ末端配列のアラインメント、及び（Ｂ）組換え自己組織化ＰａｐＭＶ試料の各々の電子顕微鏡画像を示す。
【図６】合成から２か月後及び７か月後の、組換えＰａｐＭＶコートタンパク質（ＰａｐＭＶ）及びコートタンパク質融合物（ＰａｐＭＶ−ｇｐ１００及びＰａｐＭＶ−Ｆｌｕ）の安定性についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。７か月目の古いタンパク質製剤を２３℃又は３７℃でさらに７日間インキュベートした場合、及びプロテイナーゼＫで５分間処理した後に負荷緩衝液を添加し、沸騰水中でインキュベートした場合の結果も示されている。
【図７】２つの異なるソースのＡＰＣにパルスされたとき、両方の抗原からのＭＨＣクラスＩエピトープが交差提示され得ることを示す。ＣＤ４０活性化Ｂリンパ球及びＤＣをＨＬＡ−Ａ＊０２０１ドナーから調製し、指示されている様々な濃度の試料を１８時間パルスした。パルスした細胞を洗浄し、ｇｐ１００（Ａ）又はＦＬＵ（Ｂ）特異的Ｔ細胞をさらに１８時間添加した。Ｔ細胞活性化の証拠が、ＥＬＩＳＡアッセイにより測定されたＩＦＮ−γ分泌によって明らかにされた。
【図８】（Ａ）ＰａｐＭＶ  Ｆｌｕ又はＰａｐＭＶ  ｇｐ１００をパルスした、ＨＬＡ−Ａ＊０２陽性又は陰性ドナーから調製されたＣＤ４０活性化Ｂリンパ球を、ＦＬＵ（左のパネル）又はｇｐ１００（右のパネル）特異的Ｔ細胞と共培養すること、及び（Ｂ）ＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋及びｇｐ１００＋黒色腫系統又はＰａｐＭＶ  ＦｌｕをパルスしたＨＬＡ−Ａ＊０２＋  ＣＤ４０活性化Ｂ細胞を、ＭＨＣクラスＩ、クラスＩＩ又はＨＬＡ−ＤＲ抗原をブロックする抗体と共にインキュベートすることによる結果を示す。その後ＦＬＵ又はｇｐ１００特異的Ｔ細胞を添加した。結果はＩＦＮ−γ分泌アッセイに基づく認識のパーセンテージとして示されており、１００％は陽性対照によって分泌される量に相当する。
【図９】ＰａｐＭＶによって媒介されるＭＨＣクラスＩ交差提示がプロテアソーム非依存性であることを示す。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋及びｇｐ１００＋黒色腫系統又はＰａｐＭＶ  ＦｌｕをパルスしたＨＬＡ−Ａ＊０２＋  ＣＤ４０活性化Ｂ細胞を、ＭＨＣクラスＩ、クラスＩＩ又はＨＬＡ−ＤＲ抗原をブロックする抗体と共にインキュベートした。次にＦＬＵ又はｇｐ１００特異的Ｔ細胞を添加した。結果はＩＦＮ−γ分泌アッセイに基づく認識のパーセンテージとして示されており、１００％は陽性対照によって分泌される量に相当する。
【図１０】ＰａｐＭＶ  ＦｌｕをパルスしたＡＰＣによるインフルエンザＭ１タンパク質からのＨＬＡ−Ａ＊０２０１エピトープに特異的なＴリンパ球の増殖の分析を示す。（Ａ）ＨＬＡ−Ａ２＋正常ドナーからのＰＢＭＣを、自家ＣＤ４０活性化Ｂ細胞（モック）又はＰａｐＭＶ、ＰａｐＭＶ  Ｆｌｕ又はＰａｐＭＶ  ｇｐ１００のいずれかをパルスしたＣＤ４０活性化Ｂ細胞と共培養した。培養した細胞を７日目に再刺激し、ＩＬ−２を種々の時点で添加した。増殖した細胞の特異性を、１５日目にＦｌｕ又はｇｐ１００からのＨＬＡ−Ａ＊０２０１ペプチドをパルスしたＴ２細胞との共培養によって評価した。ＩＦＮ−γ分泌細胞の頻度をＥＬＩＳＰＯＴによって測定した。（Ｂ）増殖した培養Ｔ細胞をパルスしたＣＤ４０活性化Ｂリンパ球と共培養した。
【図１１】図１０のように処理した増殖Ｔ細胞のＩＦＮ−γ分泌の分析の結果を示す。
【図１２】図１２は、（Ａ）ＰａｐＭＶコートタンパク質（ＰａｐＭＶ）、及びＭ２ｅエピトープと融合した修飾ＰａｐＭＶコートタンパク質（インフルエンザウイルス株Ｈ１Ｎ１  Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９；ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅと称する）のＣ末端配列、及び（Ｂ）ＰａｐＭＶ及びＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰの電子顕微鏡画像を示す。
【図１３】ＰａｐＭＶ  ＶＬＰ、ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰ、ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅディスク又はＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰ＋ＩｇＧ（ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰで２回免疫したマウスのプールから単離した血清０．５μｌをＶＬＰに添加して、抗体でタンパク質をオプソニン化した）１００μｇを２回（０日目と１５日目）皮下注射したＢａｌｂ／Ｃマウスにおける抗体応答を示す。各々のマウスについてのＩｇＧ力価を示す。各処置につき２０匹のマウスを免疫した。
【図１４】インフルエンザウイルス株Ｈ１Ｎ１  Ａ／ＷＳＮ／３３（３×ＬＤ５０）に対する保護アッセイの結果を示す。ＰａｐＭＶ  ＶＬＰ、ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰ、ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅディスク又はＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰ＋ＩｇＧ（ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰで２回免疫したマウスのプールから単離した血清０．５μｌをＶＬＰに添加し、抗体でタンパク質をオプソニン化した）１００μｇを用いて、２週間の間隔を置いて（−３０日目と−１５日目）皮下注射によりマウスに２回ワクチン接種した。
【図１５】ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰ（Ａ）又はＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰ＋ＩｇＧ（Ｂ）でワクチン接種したマウスにおいて測定したＩｇＧ２ａとＩｇＧ２ｂのレベルの間の相関及びインフルエンザウイルス株Ｈ１Ｎ１（Ａ／ＷＳＮ／３３）の３×ＬＤ５０の抗原投与を生き延びるそれらの能力を示す。感染を生き延びた動物を囲みのない点として示す。
【図１６】インフルエンザウイルス株Ｈ１Ｎ１（Ａ／ＷＳＮ／３３）の３×ＬＤ５０の抗原投与を生き延びたワクチン接種マウスについての体重減少データを示す。抗原投与を生き延びた、ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰでワクチン接種した９匹の動物及びＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰ＋ＩｇＧでワクチン接種した１６匹の動物の体重を２、５、６、７、８、９、１０、１２及び２０日目にプールした。
【図１７】ＣＤ−１マウスにおいて惹起した、背側空気嚢におけるＰａｐＭＶＣＰ及びＬＰＳの炎症前応答の比較を示す。データは５匹のマウスの平均±ＳＥＭを表す。結果は２回の同一の独立した実験を代表する。
【図１８】多量体ＰａｐＭＶＣＰ−Ｅ２（ＶＬＰ）、単量体対応物（ＰａｐＭＶＣＰ２７−２１５−Ｅ２）、ＨＣＶ  Ｅ２ペプチド単独、又はＰＢＳ（ＥＬＩＳＡプレートをＰａｐＭＶ−ＣＰ又はＰａｐＭＶ２７−２１５で被覆した）を皮下注射したＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスにおけるＰａｐＭＶキャプシドタンパク質に特異的なＩｇＧ抗体応答を示す。データは４匹のマウスからの抗体価の平均を表す。これらの結果は、２回の同一の独立した実験を代表する。グラフ上の黒い矢印は１５日目のブースター注射を示す。
【図１９】植物から単離した精製ＰａｐＭＶが、０日目に抗原単独、抗原＋ＰａｐＭＶ、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）又は大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４からのＬＰＳで免疫したＢＡＬＢ／ｃマウス（各群につき３匹）において、モデル抗原である（Ａ）ニワトリ卵白リゾチーム（ＨＥＬ）及び（Ｂ）オボアルブミン（ＯＶＡ）に対する抗体応答を増強する能力を示す。２回の実験からの代表的結果を示す。免疫動物から収集した血清の抗体を、モデル抗原（ＨＥＬ又はＯＶＡ）に関するＥＬＩＳＡによって（Ｃ）ＩｇＧ１、（Ｄ）ＩｇＧ２ａ及び（Ｅ）ＩｇＧ２ｂにアイソタイプ分類した。
【図２０】ＰａｐＭＶコートタンパク質（ＣＰ）親和性ペプチド融合物を含む標識ＶＬＰのネコブカビ胞子への結合の蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）分析を示す（融合物を含まないＰａｐＭＶ  ＶＬＰ（ＣＰ）；陰性対照ペプチドに融合したＰａｐＭＶ  ＶＬＰ（ＣＰ−Ｎｅｇ）；ペプチドＡに融合したＰａｐＭＶ  ＶＬＰ（ＣＰ−Ａ）；ペプチドＢに融合したＰａｐＭＶ  ＶＬＰ（ＣＰ−Ｂ）；ペプチドＣに融合したＰａｐＭＶ  ＶＬＰ（ＣＰ−Ｃ））。
【図２１】ＦＡＣＳ分析を用いて、ＰａｐＭＶコートタンパク質（ＣＰ）親和性ペプチド融合物を含む標識ＶＬＰのネコブカビ胞子への結合の結合活性の改善を明らかにする。（Ａ）ＣＰのＣ末端とペプチドＡの間に一続きの３つのグリシンを付加すると（ＣＰ−ＧｌｙＡ）、ＣＰ−Ａと比較してネコブカビの休止胞子に対する結合活性の改善をもたらし、（Ｂ）ＣＰ−ＡＡを生成するペプチドＡの重複は、ＣＰ−Ａと比較して結合活性を改善した。
【図２２】（Ａ）組換えＰａｐＭＶコートタンパク質（ＰａｐＭＶＣＰ）及びＭ２ｅペプチドに融合した組換えＰａｐＭＶコートタンパク質（ＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（左のパネル）及び抗ＰａｐＭＶＣＰ抗体を用いたウエスタンブロット法（右のパネル）、及び（Ｂ）ＰａｐＭＶＣＰウイルス様粒子（ＶＬＰ）（左のパネル）、ＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅディスク（中央のパネル）及びＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰ（右のパネル）の電子顕微鏡写真を示す。バーは２００ｎｍである。
【図２３】（Ａ）ＰＢＳ、ＰａｐＭＶＣＰ  ＶＬＰ  １００μｇ、Ｍ２ペプチド１０μｇとＰａｐＭＶＣＰ  ＶＬＰ、又はＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰ単独で２回免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるインフルエンザＭ２エピトープに対するＩｇＧ及びＩｇＧ２ａ抗体価を示す。結果は、Ｏ．Ｄ．値がＢＡＬＢ／ｃマウスからの免疫前血清の１：５０希釈で得られたバックグラウンド値よりも３倍高い、抗体の終点力価として表されている。データは５匹のマウスの平均±ＳＥＭを表す。（Ｂ）ＥＬＩＳＡによって測定された、Ａ／ＷＳＮ／３３インフルエンザ株（Ｈ１Ｎ１）に感染させた細胞によるワクチン接種マウスからの血清の結合。非感染細胞を陰性対照として使用している。結果は２回の同一の独立した実験を代表する。
【図２４】Ａ／ＷＳＮ／３３インフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１）の１ＬＤ５０による感染（２８日目）の前に、ＰＢＳ、ＰａｐＭＶＣＰ  ＶＬＰ、ＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰ又はＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅディスクで２回（０日目と１４日目）免疫したマウスにおける（Ａ）インフルエンザＭ２エピトープに対するＩｇＧ及びＩｇＧ２ａ抗体価、及び（Ｂ）体重を示す。抗体価は、ＢＡＬＢ／ｃマウスからの免疫前血清の１：５０希釈から得られたバックグラウンド値よりも３倍高いＯ．Ｄ．値として定義される、抗体の終点力価として表されている。体重は感染後の８日目に測定し、初期体重のパーセンテージとして表されている。データは２０匹のマウスの平均±ＳＥＭを表す。
【図２５】ＰＢＳ、ＰａｐＭＶＣＰ  ＶＬＰ（ＰａｐＭＶＣＰ）、ＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰ（ＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅ）、又はＰａｐＭＶＣＰ（ＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅ／ＣＰ）又はミョウバン（ＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅ／Ａｌｕｍ）のいずれかのアジュバントを添加したＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰで３回（０、１４及び２８日目）免疫し、その後インフルエンザウイルスで抗原投与したＢＡＬＢ／ｃマウスからの（Ａ）３回の免疫後のインフルエンザＭ２ｅ抗体応答についてのＩｇＧアイソタイプ決定、（Ｂ）直腸温度測定、（Ｃ）体重、（Ｄ）生存率及びカプラン−マイヤー分析の結果、（Ｅ）肺ウイルス力価及び（Ｆ）気管支肺胞洗浄液における抗Ｍ２抗体価の結果を示す。体重及び肺における抗Ｍ２抗体価は、感染後７日目に測定された。３８日目に、マウスから採血し、血清抗体レベル（力価測定）を測定した。４２日目に、マウスをＡ／ＷＳＮ／３３インフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１）の４ＬＤ５０で感染させた。４９日目に、各群のマウスの半数（５／１０）を気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）及び肺ウイルス力価測定のために犠死させた。残りのマウス（５／１０）を生存率に関して分析した。抗体価の結果は、ＢＡＬＢ／ｃマウスからの免疫前血清の１：５０希釈から（Ａ）、又はＢＡＬＢ／ｃマウスからの免疫前ＢＡＬの１：５希釈から（Ｆ）得られたバックグラウンド値よりも３倍高いＯ．Ｄ．値として定義される、抗体の終点力価として表されている。データは、１０匹（Ａ−Ｃ）又は５匹（Ｄ−Ｆ）のマウスの平均±ＳＥＭを表す。
【図２６】ＰＢＳ、ＰａｐＭＶＣＰ  ＶＬＰ（ＰａｐＭＶＣＰ）、ＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰ（ＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅ）、抗ＰａｐＭＶＣＰモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、抗ＰａｐＭＶＣＰモノクローナル抗体（ｍＡｂ）でオプソニン化したＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰ（ＩＣ［ｍＡｂ／ＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅ］）、ポリクローナル抗ＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅ抗体（ｐＡｂ）、又は抗ＰａｐＭＶＣＰポリクローナル抗体（ｐＡｂ）でオプソニン化したＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰ（ＩＣ［ｐＡｂ／ＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅ］）で３回（０、１４及び２８日目）免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスにおける（Ａ）３回の免疫後のインフルエンザＭ２エピトープ抗体応答についてのＩｇＧアイソタイプ決定、（Ｂ）直腸温度測定、（Ｃ）体重、（Ｄ）生存率及びカプラン−マイヤー分析の結果、（Ｅ）肺ウイルス力価及び（Ｆ）肺抗Ｍ２抗体価の結果を示す。体重及び肺抗Ｍ２抗体価は、感染後７日目に測定された。３８日目に、血清抗体価測定のためにマウスから採血した。４２日目に、マウスをＡ／ＷＳＮ／３３インフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１）の４ＬＤ５０で感染させた。４９日目に、各群のマウスの半数（５／１０）を気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）及び肺ウイルス力価測定のために犠死させ、残りのマウス（５／１０）は生存率に関して分析された。データは、１０匹（Ａ−Ｃ）又は５匹（Ｄ−Ｆ）のマウスの平均±ＳＥＭを表す。抗体価の結果は、ＢＡＬＢ／ｃマウスからの免疫前血清の１：５０希釈（Ａ）、又はＢＡＬＢ／ｃマウスからの免疫前ＢＡＬの１：５希釈（Ｆ）に関して得られたバックグラウンド値よりも３倍高いＯ．Ｄ．値として定義される、抗体の終点力価として表されている。
【図２７】ＰＢＳ、ＰａｐＭＶＣＰ  ＶＬＰ（ＰａｐＭＶＣＰ）、又は超遠心していないＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅｍ  ＶＬＰとより低い分子量のタンパク質（ディスク、二量体及び単量体）の混合物（ＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅｍ）で３回（０、１４及び２８日目）免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスについての（Ａ）インフルエンザＭ２エピトープ抗体応答についてのＩｇＧアイソタイプ決定、（Ｂ）直腸温度測定、（Ｃ）体重、及び（Ｄ）生存率及びカプラン−マイヤー分析の結果を示す。体重は、抗原投与後８日目に測定された。３８日目に、血清抗体価測定のためにマウスから採血した。４２日目に、マウスをＡ／ＷＳＮ／３３インフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１）の１ＬＤ５０で感染させた。結果は、ＢＡＬＢ／ｃマウスからの免疫前血清の１：５０希釈に関して得られたバックグラウンド値よりも３倍高いＯ．Ｄ．値として定義される、抗体の終点力価として表されている。
【図２８】ＰＢＳ、ＰａｐＭＶＣＰ  ＶＬＰ（ＰａｐＭＶＣＰ）、ＶＬＰとより低い分子量のタンパク質（ディスク、二量体及び単量体）からなるＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅ混合物（ＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅｍ）、ＰａｐＭＶＣＰ（ＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅｍ／ＰａｐＭＶＣＰ）又はミョウバン（ＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅｍ／Ａｌｕｍ）のいずれかのアジュバントを添加したＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅｍで３回（０、１４及び２８日目）免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスについての（Ａ）インフルエンザＭ２エピトープ抗体応答についてのＩｇＧアイソタイプ決定、（Ｂ）直腸温度測定、（Ｃ）体重、及び（Ｄ）生存率及びカプラン−マイヤー分析の結果を示す。体重は、抗原投与後７日目に測定された。３８日目に、血清抗体価測定のためにマウスから採血した。４２日目に、マウスをＡ／ＷＳＮ／３３インフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１）の４ＬＤ５０で感染させた。結果は、ＢＡＬＢ／ｃマウスからの免疫前血清の１：５０希釈に関して得られたバックグラウンド値よりも３倍高いＯ．Ｄ．値として定義される、抗体の終点力価として表されている。データは、１０匹のマウス（Ｄ−Ｆ）の平均±ＳＥＭを表す。
【図２９】ＰＢＳ、ＰａｐＭＶＣＰ  ＶＬＰ（ＰａｐＭＶＣＰ）、ＶＬＰとより低い分子量のタンパク質（ディスク、二量体及び単量体）からなるＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅ混合物（ＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅｍ）、抗ＰａｐＭＶＣＰモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、抗ＰａｐＭＶＣＰモノクローナル抗体（ｍＡｂ）でオプソニン化したＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅｍ（ＩＣ［ｍＡｂ／ＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅｍ］）、ポリクローナル抗ＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅ抗体（ｐＡｂ）、又は抗ＰａｐＭＶＣＰポリクローナル抗体（ｐＡｂ）でオプソニン化したＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅｍ  ＶＬＰ（ＩＣ［ｐＡｂ／ＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅ］）で３回（０、１４及び２８日目）免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスについての（Ａ）３回の免疫後のインフルエンザＭ２エピトープ抗体応答についてのＩｇＧアイソタイプ決定、（Ｂ）直腸温度測定、（Ｃ）体重、（Ｄ）生存率及びカプラン−マイヤー分析の結果を示す。体重は感染後７日目に測定された。３８日目に、血清抗体価測定のためにマウスから採血した。４２日目に、マウスをＡ／ＷＳＮ／３３インフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１）の４ＬＤ５０の投与で感染させた。４９日目に、マウスを生存率に関して分析した。データは１０匹のマウスの平均±ＳＥＭを表す。抗体価の結果は、ＢＡＬＢ／ｃマウスからの免疫前血清の１：５０希釈（Ａ）に関して得られたバックグラウンド値よりも３倍高いＯ．Ｄ．値として定義される、抗体の終点力価として表されている。
【図３０】ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰ  ２５μｇで３回ワクチン接種したフェレットにおける（Ａ）Ｍ２ｅペプチド又は（Ｂ）ウイルス感染細胞に対する血清ＩｇＧ抗体応答、及び同じ動物においてＰＲ８／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａワクチン混合物の１０５感染用量での鼻内抗原投与後に認められた臨床徴候、（Ｃ）体温及び（Ｄ）体重を示す。ワクチン接種した動物を黒色で示し、対照動物を灰色で示す。
【図３１】ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰ  ２５μｇで２回、及び３回目はＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰ  ２５０μｇでワクチン接種し、続いて１０５ＴＣＩＤ５０インフルエンザウイルス株Ａ／ＵＳＳＲ／７７で鼻内抗原投与したフェレットにおける、（Ａ）Ｍ２ペプチドに対する血清ＩｇＧ抗体価、（Ｂ）ウイルス感染細胞に対する血清ＩｇＧ抗体価、（Ｃ）体温、（Ｄ）体重、及び（Ｅ）鼻洗浄液におけるウイルス力価（最初の４日間は毎日、その後は１日おきに限界希釈によって測定した）を示す。ワクチン接種した動物を黒色で示し、対照動物を灰色で示す。
【図３２】（Ａ）ＰａｐＭＶ  ＣＰとＨ９Ｎ２  Ｍ２ｅの間に挿入されたグリシンスペーサ（下線部）を含む（Ｈ９Ｎ２  ＰａｐＭＶ−３ＧＬＭ２ｅ）又は含まない（Ｈ９Ｎ２  ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ）、ＰａｐＭＶ  ＣＰとタンパク質のＣ末端に位置する６×Ｈｉｓタグ（６Ｈｉｓ）の間に融合されたＨ９Ｎ２  Ｍ２ｅペプチド（太字）を含むＰａｐＭＶコートタンパク質のＣ末端配列、（Ｂ）精製Ｈ９Ｎ２  ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ及びＨ９Ｎ２  ＰａｐＭＶ−３ＧＬＭ２ｅタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（レーン：１．分子量マーカー、２．ＩＰＴＧによるタンパク質Ｈ９Ｎ２  ＰａｐＭＶ−３Ｍ２ｅの発現の誘導前の全細菌溶解産物、３．ＩＰＴＧによるタンパク質Ｈ９Ｎ２  ＰａｐＭＶ−３Ｍ２ｅの発現の誘導後の全細菌溶解産物、４．２番目のゲル上の、分子量マーカー、５．ニッケルカラムでの親和性による組換え精製Ｈ９Ｎ２  ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅタンパク質、６．３番目のゲル上の、分子量マーカー、７．ＩＰＴＧによるタンパク質Ｈ９Ｎ２  ＰａｐＭＶ−３ＧＬＭ２ｅの発現の誘導前の全細菌溶解産物、８．ＩＰＴＧによるタンパク質Ｈ９Ｎ２  ＰａｐＭＶ−３ＧＬＭ２ｅの発現の誘導後の全細菌溶解産物、９．精製Ｈ９Ｎ２  ＰａｐＭＶ−３ＧＬＭ２ｅタンパク質）、（Ｃ）精製Ｈ９Ｎ２  ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ及びＨ９Ｎ２  ＰａｐＭＶ−３ＧＬＭ２ｅ  ＶＬＰのＦＰＬＣプロファイル、及び（Ｄ）ＰａｐＭＶ  ＶＬＰ、Ｈ９Ｎ２  ＰａｐＭＶ−３ＧＬＭ２ｅ  ＶＬＰ及びＨ９Ｎ２  ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰの電子顕微鏡写真（バーは１００ｎｍである）を示す。
【図３３】Ａ）指示されているＨ９Ｎ２  ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ製剤で２週間の間隔を置いて３回注射したマウスからの血清のＥＬＩＳＡ分析の結果（各々のマウスは点で表されている。基線は、免疫前血清で得られたバックグラウンドレベルを表す。）、及びＢ）処置したマウスにおけるＰａｐＭＶ  ＣＰ及びＨ９Ｎ２  Ｍ２ｅペプチドに対するＩｇＧ力価を示す。
【図３４】Ａ）Ｈ９Ｎ２  ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  １００μｇで２週間の間隔を置いて３回注射し、１回目の注射後１４０日間にわたってＭ２ｅペプチドに良好に反応した２匹のマウスについての総ＩｇＧレベル、Ｂ）同じ期間にわたる（Ａ）と同じ血清中のＩｇＧ１  ＩｇＧアイソタイプのレベル、及びＣ）同じ期間にわたる（Ａ）と同じ血清中のＩｇＧ２ａ  ＩｇＧアイソタイプの量を示す。２番目のマウスについては（菱形）、１４０日目に収集した血清だけを使用した。
【図３５】Ｈ９Ｎ２  ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  １００μｇで２週間の間隔を置いて３回注射し、異なる株のインフルエンザウイルスからのＭ２ｅペプチドに対して良好に反応したマウスから得たＨ９Ｎ２  ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ抗血清のＥＬＩＳＡの結果を示す。結果は、参照Ｈ９Ｎ２ペプチド［配列番号４０］での反応性のパーセンテージとして示されている。
【図３６】（Ａ）野生型ＰａｐＭＶコートタンパク質及びコートタンパク質配列と６×Ｈｉｓタグ（６Ｈｉｓ）の間に融合されたＨ３Ｎ８  Ｍ２ｅペプチド（太字）を含むＰａｐＭＶコートタンパク質のＣ末端配列、（Ｂ）組換えタンパク質の精製を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（レーン：１．分子量マーカー、２．ＩＰＴＧによるＰａｐＭＶコートタンパク質の発現の誘導前の細菌の全細菌溶解産物、３．ＩＰＴＧによるＰａｐＭＶコートタンパク質の発現の誘導後の全細菌溶解産物、４．精製全ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  Ｈ３Ｎ８タンパク質、５．精製ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  Ｈ３Ｎ８タンパク質のＶＬＰを含む高速ペレット、６．２番目のゲル上の、分子量マーカー、７．タンパク質ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  Ｈ３Ｎ８の発現の誘導前の全細菌溶解産物、８．ＩＰＴＧによるタンパク質ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  Ｈ３Ｎ８の発現の誘導後の細菌の全細菌溶解産物、９．精製ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  Ｈ３Ｎ８タンパク質のＶＬＰを含む高速ペレット）、（Ｃ）精製ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  Ｈ３Ｎ８  ＶＬＰのＦＰＬＣプロファイル、及び（Ｄ）ＰａｐＭＶウイルス（左のパネル）、ＰａｐＭＶ組換えウイルス様粒子（ＶＬＰ）（中央のパネル）及びＨ３Ｎ８  ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰ（右のパネル）の電子顕微鏡写真を示す。
【図３７】（Ａ）野生型ＰａｐＭＶコートタンパク質及びコートタンパク質配列と６×Ｈｉｓタグ（６Ｈｉｓ）の間に融合されたＨ５Ｎ１  Ｍ２ｅペプチド（太字）を含むＰａｐＭＶコートタンパク質のＣ末端配列、（Ｂ）組換えタンパク質の精製を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（レーン：１．分子量マーカー、２．ＩＰＴＧによるタンパク質ＰａｐＭＶ  ＶＬＰの発現の誘導前の細菌の全細菌溶解産物、３．ＩＰＴＧによるタンパク質ＰａｐＭＶ  ＶＬＰの発現の誘導後の細菌の全細菌溶解産物、４．精製全ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  Ｈ５Ｎ１タンパク質、５．精製ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  Ｈ５Ｎ１タンパク質のＶＬＰを含む高速ペレット、６．もう１つのゲル上の、分子量マーカー、７．タンパク質ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  Ｈ５Ｎ１の発現の誘導前の全細菌溶解産物、８．ＩＰＴＧによるタンパク質ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  Ｈ５Ｎ１の発現の誘導後の細菌の全細菌溶解産物、９．精製ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  Ｈ５Ｎ１タンパク質のＶＬＰを含む高速ペレット）、及び（Ｃ）ＰａｐＭＶウイルス（左のパネル）、ＰａｐＭＶ組換えウイルス様粒子（ＶＬＰ）（中央のパネル）及びＨ５Ｎ１  ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰ（右のパネル）の電子顕微鏡写真を示す。
【図３８】マウスにおいてＦｌｕｖｉｒａｌ（登録商標）インフルエンザワクチンに単離ＰａｐＭＶをアジュバントとして添加した結果を示す図表である。Ｆｌｕｖｉｒａｌ（登録商標）ワクチン又はＰａｐＭＶ  ＷＴウイルスをアジュバントとして添加したＦｌｕｖｉｒａｌ（登録商標）ワクチンでマウスを免疫した。免疫後５日目（Ａ）、１０日目（Ｂ）又は１４日目（Ｃ）にマウスから採血した。
【図３９】免疫後１４日目にＦｌｕｖｉｒａｌ（登録商標）ワクチン又はＰａｐＭＶ  ＷＴウイルスをアジュバントとして添加したＦｌｕｖｉｒａｌ（登録商標）ワクチンで免疫したマウスにおけるＩｇＧ２ａ（Ａ）及びＩｇＧ１（Ｂ）抗体アイソタイプの量を示す。
【図４０】Ｆｌｕｖｉｒａｌ（登録商標）ワクチン又はＰａｐＭＶ  ＷＴをアジュバントとして添加したＦｌｕｖｉｒａｌ（登録商標）ワクチンで免疫したマウスの、組換えＮＰタンパク質に対する免疫応答を示すＥＬＩＳＡの結果である：（Ａ）は、免疫後１４日目のマウス血清における総ＩｇＧ力価を示し、（Ｂ）はＩｇＧ２ａ力価を示す。
【図４１】（Ａ）インフルエンザウイルス株Ａ／ＷＳＮ／３３からのＮＰタンパク質をエンコードするヌクレオチド配列［配列番号６３］、及び（Ｂ）（Ａ）で提供される配列によってエンコードされるＮＰタンパク質のアミノ酸配列［配列番号６４］を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
パパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）又はパパイヤモザイクウイルスに由来するＶＬＰと併用される１つ以上の抗原を含む抗原提示系（ＡＰＳ）が提供される。本発明の一つの実施形態に従って、ＡＰＳは、動物において体液性免疫応答、細胞性免疫応答、又はその両方を誘導することができる。ＡＰＳは、それ故、免疫系のこれらの２つの分枝の一方又は両方の積極的な関与を必要とし得るワクチンとしての使用に適する。
【００２８】
本発明の一つの実施形態では、ＡＰＳは１つ以上のインフルエンザウイルス抗原を含み、インフルエンザ用のワクチンとしての使用に適する。
異なる定義が為されない限り、本明細書で使用されるすべての技術及び学術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【００２９】
本明細書で使用される、「約」という用語は、所与の数値から約±１０％の変動を指す。そのような変動は、特に言及されているか否かにかかわらず、本明細書で提供される所与の数値に常に包含される。
【００３０】
本明細書で使用される、「アジュバント」という用語は、動物において免疫応答を上昇させる、刺激する、作動させる、増強する及び／又は調節する物質を指す。アジュバントは、それ自体で免疫応答に作用を及ぼしてもよく又は及ぼさなくてもよい。
【００３１】
本明細書で使用される、「キメラタンパク質」は、通常２つの別々のタンパク質又はタンパク質フラグメントをコードする２つ又はそれ以上の遺伝子を、それら２つのタンパク質の各々の全部又は部分の組合せであるタンパク質（「キメラタンパク質」）をエンコードするポリヌクレオチドを提供するために、自然に又はヒトの介入の結果として、組み換えたときに作製されるタンパク質である。本発明に関して、「融合タンパク質」は「キメラタンパク質」であるとみなされる。
【００３２】
「融合コートタンパク質」という表現は、融合物中のタンパク質の１つがＰａｐＭＶコートタンパク質である融合タンパク質を指すために本明細書で使用される。
本明細書で使用される、「免疫応答」という用語は、抗原又は抗原性物質に応答した動物の免疫系の反応性の変化を指し、抗体産生、細胞媒介性免疫の誘導、補体活性化、免疫学的寛容の発現、又はそれらの組合せを含み得る。
【００３３】
本明細書で使用される、「有効な免疫防御応答」及び「免疫防防御」という用語は、ワクチン接種された動物において疾患及び／又は病原体による感染に対して防御するために１つ以上の抗原に対して向けられる免疫応答を意味する。本発明の目的ために、疾患及び／又は病原体による感染に対する防御は、疾患又は感染の絶対的予防だけではなく、ワクチン接種していない感染動物又は疾患動物と比較したときのワクチン接種動物における疾患又は感染の程度又は症状の何らかの検出可能な軽減、若しくは疾患の重症度又は病原体による感染から生じる何らかの症状又は状態の重症度の何らかの検出可能な軽減も包含する。有効な免疫防御応答は、これまでに該疾患に罹患したことがない、これまでに該病原体に感染したことがない及び／又はワクチン接種の時点で該疾患又は感染を有していない動物において誘導され得る。有効な免疫防御応答はまた、ワクチン接種の時点で既に該疾患に罹患している又は該病原体に感染している動物においても誘導され得る。免疫防御は、体液性及び／又は細胞性免疫を含む、１つ以上の機構の結果であり得る。
【００３４】
本明細書で交換可能に使用される「免疫刺激」及び「免疫刺激」という用語は、動物の病原体又は疾患に無関係な、ＰａｐＭＶ又はＰａｐＭＶ  ＶＬＰのような分子が、該感染又は疾患に応答するように免疫系を刺激する及び／又は応答する免疫系の能力を改善することによって病原体による感染又は疾患に対する防御を与える能力を指す。免疫刺激は、予防作用、治療作用、又はそれらの組合せを有し得る。
【００３５】
「組換えウイルス」は、天然に生じるウイルスの遺伝物質が他の遺伝物質と結合したものである。
物体に適用されるとき、本明細書で使用される「天然に生じる」は、物体が自然界において見出され得るという事実を指す。例えば、生物（ウイルスを含む）、又は自然界のソースから単離されることができ、実験室においてヒトによって意図的に改変されていない、生物内に存在するポリペプチド又はポリヌクレオチド配列は、天然に生じるものである。
【００３６】
本明細書で使用される「ポリペプチド」又は「ペプチド」という用語は、ペプチド結合によって連結された少なくとも４つのアミノ酸が存在する分子を意味することが意図されている。
【００３７】
本明細書で使用される「ウイルス核酸」という表現は、ウイルスのゲノム（又はその大部分）、又は塩基配列においてそのゲノムに相補的な核酸分子であり得る。ウイルスＲＮＡに相補的なＤＮＡ分子も、塩基配列においてウイルスＤＮＡに相補的であるＲＮＡ分子と同様に、ウイルス核酸とみなされる。
【００３８】
本明細書で使用される「ウイルス様粒子（ＶＬＰ）」という用語は、ウイルス粒子と類似の物理的外観を有する自己組織化粒子を指す。ＶＬＰはウイルス核酸を含んでもよく又は含まなくてもよい。ＶＬＰは一般に複製することができない。
【００３９】
本明細書で使用される「偽ウイルス」という用語は、プラスミド形態の核酸を包含するＤＮＡ又はＲＮＡのような核酸配列を含むＶＬＰを指す。偽ウイルスは一般に複製することができない。
【００４０】
本明細書で使用される「ワクチン」という用語は、免疫応答を生じさせることができる物質を指す。
本明細書で使用される「免疫原」及び「抗原」という用語は、単独で又はアジュバントとの併用により、被験者において免疫応答を誘導することができる全細胞及び組織までを含む、１つの分子、複数の分子、分子の一部又は複数の部分、又は分子の組合せを指す。免疫原／抗原は、１個のエピトープを含み得るか又は複数のエピトープを含み得る。それ故この用語は、ペプチド、炭水化物、タンパク質、核酸、及びウイルス、細菌及び寄生生物を含む、全体的又は部分的な、様々な微生物を包含する。ハプテンも、本明細書で使用される「免疫原」及び「抗原」の用語に包含されるとみなされる。
【００４１】
「免疫」及び「ワクチン接種」という用語は、免疫応答を惹起するための被験者へのワクチンの投与を指すために本明細書では交換可能に使用され、予防作用、治療作用、又はそれらの組合せを有し得る。免疫は、腹腔内注射（ｉ．ｐ．）、静脈内注射（ｉ．ｖ．）、筋肉内注射（ｉ．ｍ．）、経口投与、鼻内投与、噴霧投与及び液浸を含むがこれらに限定されない、治療される被験者に依存する様々な方法を用いて達成され得る。
【００４２】
本明細書で使用されるように、疾患又は病原体に関して使用されるときの「治療する」、「治療される」又は「治療すること」という用語は、疾患又は病原体による感染に対する被験者の抵抗性を上昇させる（すなわち被験者が疾患に罹患する又は病原体に感染する可能性を低下させる）治療、並びに疾患又は感染に対抗する（例えば疾患又は感染を軽減する、排除する、改善する又は安定化させる）ための、被験者が疾患に罹患した又は病原体に感染した後の治療を指す。
【００４３】
本明細書で使用される、「プライミングする」という用語及びその文法的変形は、抗原によるブースターワクチン接種を投与する前に動物において抗原に対する免疫応答を刺激する及び／又は作動させることを意味する。
【００４４】
本明細書で使用される「被験者」又は「患者」という用語は、治療を必要とする動物を指す。
本明細書で使用される「動物」という用語は、哺乳動物、鳥類及び魚類を含むがこれらに限定されない、ヒト及び非ヒト動物の両方を指し、例えばウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ又は他の有蹄動物、イヌ、ネコ、ニワトリ、アヒル、非ヒト霊長動物、モルモット、ウサギ、フェレット、ラット、ハムスター及びマウスのような、家畜、動物園の動物、実験動物及び野生動物を包含する。
【００４５】
核酸又はアミノ酸配列に関して本明細書で使用される「実質的に同一」という用語は、例えば以下で述べる方法を使用して、最適に整列されたとき、核酸又はアミノ酸配列が、規定される２番目の核酸又はアミノ酸配列（又は「参照配列」）と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を共有することを指す。「実質的に同一」は、完全長配列、機能性ドメイン、コード及び／又は調節配列、プロモーター及びゲノム配列のような、配列の様々な型及び長さを指すために使用され得る。２つのアミノ酸又は核酸配列の間の同一性パーセントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ（Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍ．Ｓ．Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １４７：１９５−７）；ＧｅｎｅＭａｔｃｈｅｒ  Ｐｌｕｓ（商標）に組み込まれている“ＢｅｓｔＦｉｔ”（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ，４８２−４８９（１９８１）），Ｓｃｈｗａｒｚ  ａｎｄ  Ｄａｙｈｏｆ  （１９７９）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｄａｙｈｏｆ，Ｍ．Ｏ．，Ｅｄ  ｐｐ  ３５３−３５８；ＢＬＡＳＴプログラム（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，Ｗ．Ｇｉｓｈ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３−１０）、及びＢＬＡＳＴ−２、ＢＬＡＳＴ−Ｐ、ＢＬＡＳＴ−Ｎ、ＢＬＡＳＴ−Ｘ、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２、ＣＬＵＳＴＡＬ及びＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを含むそれらの変法のような公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して、当業者の技術範囲内である様々な方法で決定され得る。加えて、当業者は、比較する配列の長さにわたって最大アラインメントを達成するために必要とされるアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。一般に、アミノ酸配列については、比較配列の長さは少なくとも１０アミノ酸である。当業者は、実際の長さが比較する配列の全体的長さに依存し、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０又は少なくとも２００アミノ酸であり得るか、又はアミノ酸配列の全長であり得ることを理解する。核酸については、比較配列の長さは一般に少なくとも２５ヌクレオチドであるが、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも５００、少なくとも５５０又は少なくとも６００ヌクレオチドであり得るか、又は核酸配列の全長であり得る。
【００４６】
「に対応する」という用語は、核酸配列が参照核酸配列の全部又は一部と同一であることを指す。対照的に、「相補的」という用語は、本明細書では核酸配列が参照核酸配列の相補鎖の全部又は一部と同一であることを指すために使用される。説明のために、核酸配列「ＴＡＴＡＣ」は参照配列「ＴＡＴＡＣ」に対応し、参照配列「ＧＴＡＴＡ」に相補的である。
【００４７】
抗原提示系（ＡＰＳ）
本発明の抗原提示系（ＡＰＳ）は、パパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）又はＰａｐＭＶコートタンパク質に由来するＶＬＰと併用される１つ以上の抗原を含む。「に由来する」とは、ＶＬＰが、野生型コートタンパク質の配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するコートタンパク質を含み、場合により、以下でより詳細に述べるように、コートタンパク質に結合した１つ以上の抗原を含み得ることを意味する。ＰａｐＭＶコートタンパク質は、野生型コートタンパク質の配列又はＶＬＰを形成するように多量体化し、自己組織化することができるその修飾型を含み得る。本発明の一つの実施形態では、以下で詳述するように、ＡＰＳはインフルエンザウイルスからの１つ以上の抗原を含む。
【００４８】
ＡＰＳに含まれる１つ以上の抗原は、ＰａｐＭＶ又はＰａｐＭＶ  ＶＬＰのコートタンパク質に結合し得るか、又は非結合であり得るか（すなわちＰａｐＭＶ又はＰａｐＭＶ  ＶＬＰと分離している）、又はＡＰＳは結合抗原と非結合抗原の両方を含み得る。後者に関して、非結合抗原は追加単離抗原（ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎｓ、ＡＩＡ）と称される。ＡＩＡは結合抗原と同じであってもよく又は異なっていてもよい。結合は、例えばコートタンパク質との遺伝子融合によるか、又は共有結合的、非共有結合的又は親和力手段を通しての結合であり得る。
【００４９】
ＡＰＳに含まれるＰａｐＭＶ又はＰａｐＭＶ  ＶＬＰは、それ故、動物において免疫応答を増強することができる免疫増強剤として、及び場合によりＡＰＳに含まれる抗原のための担体として働く。本発明の一つの実施形態に従って、ＡＰＳは動物において体液性及び／又は細胞性免疫応答を誘導することができ、それ故ワクチンとして、例えばインフルエンザワクチンとしての使用に適する。
【００５０】
パパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）及びＰａｐＭＶ  ＶＬＰ
本発明のＡＰＳは、ＰａｐＭＶ及びＰａｐＭＶ  ＶＬＰのいずれかを含む。ＰａｐＭＶ  ＶＬＰは、ＶＬＰを形成するように多量体化し、自己組織化した組換えＰａｐＭＶコートタンパク質から形成される。組織化したとき、各々のＶＬＰはコートタンパク質サブユニットの長いらせん配列を含む。野生型ウイルスは１２００超のコートタンパク質サブユニットを含み、約５００ｎｍの長さである。野生型ウイルスより短い又は長いＰａｐＭＶ  ＶＬＰも、しかしながら、有効であり得る。本発明の一つの実施形態では、ＶＬＰは少なくとも４０個のコートタンパク質サブユニットを含む。もう一つの実施形態では、ＶＬＰは約４０〜約１６００個のコートタンパク質サブユニットを含む。選択的実施形態では、ＶＬＰは少なくとも４０ｎｍの長さである。もう一つの実施形態では、ＶＬＰは約４０ｎｍ〜約６００ｎｍの長さである。
【００５１】
本発明のＶＬＰは、組織化したときに最終的なＶＬＰが同一のコートタンパク質サブユニットを含むように、同一アミノ酸配列を有する複数の組換えコートタンパク質から作製され得るか、又はＶＬＰは、組織化したときに最終的なＶＬＰがそのコートタンパク質サブユニット内に変異を含むように、異なるアミノ酸配列を有する複数の組換えコートタンパク質から作製され得る。
【００５２】
ＶＬＰを形成するために使用されるコートタンパク質は、ＰａｐＭＶコートタンパク質全体又はその部分であり得るか、又は、コートタンパク質が、ＶＬＰへと多量体化し、組織化する能力を保持することを条件として、例えば１つ以上のアミノ酸欠失、挿入、置換等を含む、遺伝子的に修飾された型のＰａｐＭＶコートタンパク質であり得る。野生型ＰａｐＭＶコート（又はキャプシド）タンパク質のアミノ酸配列は当技術分野において既知であり（Ｓｉｔ，ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：２３２５−２３３１、及びＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿０４４３３４．１参照）、配列番号１としてここで提供される（図１Ａ参照）。ＰａｐＭＶコートタンパク質のヌクレオチド配列も当技術分野において既知であり（Ｓｉｔ，ｅｔ  ａｌ．、同上及びＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＣ＿００１７４８（ヌクレオチド５８８９−６５３６）参照）、配列番号２としてここで提供される（図１Ｂ参照）。
【００５３】
上述したように、ＶＬＰに含まれる組換えＰａｐＭＶコートタンパク質のアミノ酸配列は、親（野生型）配列に厳密に対応する必要はない、すなわち「変異配列」であり得る。例えば、組換えタンパク質は、その部位の残基が親（参照）配列に対応しないように１つ以上のアミノ酸残基の置換、挿入又は欠失によって突然変異誘発され得る。当業者は、しかし、そのような突然変異が広範囲ではなく、多量体化してＶＬＰへと組織化する組換えコートタンパク質の能力に劇的な影響を及ぼさないことを了解する。多量体及びＶＬＰへと組織化する変異型のＰａｐＭＶコートタンパク質の能力は、例えばここで提供される実施例において示される例示的方法のような標準手法に従って、電子顕微鏡検査によって評価され得る。
【００５４】
多量体化してＶＬＰへと組織化する能力を保持する野生型タンパク質のフラグメントである（すなわち「機能的」フラグメントである）組換えコートタンパク質も、それ故、本発明によって考慮される。例えばフラグメントは、タンパク質のＮ末端、Ｃ末端又は内部又はそれらの組合せからの１つ以上のアミノ酸の欠失を含み得る。一般に、機能的フラグメントは少なくとも１００アミノ酸長である。本発明の一つの実施形態では、機能的フラグメントは、少なくとも１５０アミノ酸、少なくとも１６０アミノ酸、少なくとも１７０アミノ酸、少なくとも１８０アミノ酸及び少なくとも１９０アミノ酸長である。タンパク質のＮ末端で為される欠失は、タンパク質が多量体化する能力を保持するために一般に２５未満のアミノ酸を欠失させるべきである。
【００５５】
本発明に従って、組換えコートタンパク質が変異配列を含むとき、変異配列は参照配列と少なくとも約７０％同一である。一つの実施形態では、変異配列は参照配列と少なくとも約７５％同一である。他の実施形態では、変異配列は参照配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％及び少なくとも約９７％同一である。特定の実施形態では、参照アミノ酸配列は配列番号１である。
【００５６】
本発明の一つの実施形態では、ＶＬＰは、遺伝子的に修飾された（すなわち変異体）型のＰａｐＭＶコートタンパク質を含む。もう一つの実施形態では、ＰａｐＭＶコートタンパク質は、タンパク質のＮ末端又はＣ末端からアミノ酸を欠失させるように及び／又は１つ以上のアミノ酸置換を含むように遺伝子的に修飾されている。さらなる実施形態では、ＰａｐＭＶコートタンパク質は、タンパク質のＮ末端又はＣ末端から約１〜約１０個のアミノ酸を欠失させるように遺伝子的に修飾されている。
【００５７】
特定の実施形態では、ＰａｐＭＶコートタンパク質は、タンパク質のＮ末端の近位で生じる（すなわち配列番号１の１位と６位）２個のメチオニンコドンの１個を除去して、翻訳を開始させ得るように遺伝子的に修飾されている。翻訳開始コドンの１個の除去は、タンパク質の均一な集団が生産されることを可能にする。選択されたメチオニンコドンは、例えばコドンがメチオニン以外のアミノ酸をコードするように又はナンセンスコドンになるように、コドンを構成するヌクレオチドの１又はそれ以上を置換することによって除去され得る。あるいは、コドンの全部又は一部、又は選択コドンを含むタンパク質をエンコードする核酸の５’領域を欠失させ得る。本発明の特定の実施形態では、ＰａｐＭＶコートタンパク質は、タンパク質のＮ末端から１〜５個のアミノ酸を欠失させるように遺伝子的に修飾されている。さらなる実施形態では、遺伝子的に修飾されたＰａｐＭＶコートタンパク質は、配列番号３と実質的に同一のアミノ酸配列を有する。さらなる実施形態では、ＰａｐＭＶコートタンパク質は、１つ以上の特異的制限酵素部位のコードヌクレオチド配列への組込みから生じるＣ末端の追加アミノ酸（例えば約１〜約８個のアミノ酸）を含むように遺伝子的に修飾されている。特定実施形態では、ＰａｐＭＶコートタンパク質は、配列番号４６と実質的に同一のアミノ酸配列を有する。
【００５８】
組換えコートタンパク質が、１つ以上のアミノ酸置換を含む変異配列を含むとき、これらは「保存的」置換又は「非保存的」置換であり得る。保存的置換は、１個のアミノ酸残基の、類似の側鎖特性を有するもう１つの残基による置換を含む。当技術分野で既知のように、２０個の天然に生じるアミノ酸は、それらの側鎖の物理化学的性質に従って分類され得る。適切な分類は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニン及びトリプトファン（疎水性側鎖）；グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミン（極性・無電荷側鎖）；アスパラギン酸及びグルタミン酸（酸性側鎖）；及びリシン、アルギニン及びヒスチジン（塩基性側鎖）を含む。アミノ酸のもう１つの分類は、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン（芳香族側鎖）である。保存的置換は、１個のアミノ酸の、同じ群からのもう１つのアミノ酸による置換を含む。非保存的置換は、１個のアミノ酸残基の、異なる側鎖特性を有するもう１つの残基による置換、例えば酸性残基の、中性又は塩基性残基による置換、中性残基の、酸性又は塩基性残基による置換、疎水性残基の親水性残基による置換等を含む。
【００５９】
本発明の一つの実施形態では、変異配列は、１つ又はそれ以上の非保存的置換を含む。１個のアミノ酸の、異なる性質を有するもう１つのアミノ酸による置換は、コートタンパク質の性質を改善し得る。例えばここで述べるように、コートタンパク質の残基１２８の突然変異は、タンパク質のＶＬＰへの組織化を改善する。本発明の一つの実施形態では、それ故、コートタンパク質は、コートタンパク質の残基１２８に突然変異を含み、この位置のグルタミン酸残基が中性残基で置換されている。さらなる実施形態では、１２８位のグルタミン酸残基はアラニン残基で置換されている。
【００６０】
同様に、組換えコートタンパク質をエンコードする核酸配列は、親参照配列に厳密に対応する必要はないが、遺伝暗号の縮重によって及び／又は上述の変異アミノ酸配列をコードするように異なり得る。本発明の一つの実施形態では、それ故、組換えコートタンパク質をエンコードする核酸配列は、参照配列と少なくとも約７０％同一である。もう一つの実施形態では、組換えコートタンパク質をエンコードする核酸配列は、参照配列と少なくとも約７５％同一である。他の実施形態では、組換えコートタンパク質をエンコードする核酸配列は、参照配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％又は少なくとも約９０％同一である。特定実施形態では、参照核酸配列は配列番号２である。
【００６１】
ＰａｐＭＶ  ＶＬＰコートタンパク質は、以下でより詳細に述べるように、場合により１つ以上の抗原の結合を促進するために１つ以上の抗原、親和性ペプチド又は他の短いペプチド配列に遺伝子的に融合され得る。
【００６２】
抗原
本発明の一つの実施形態に従って、ＡＰＳは１つ以上のインフルエンザ抗原を含む。抗原は、インフルエンザウイルスに由来する免疫原、エピトープ、ミモトープ又は抗原決定基であり得、また例えばインフルエンザウイルスに由来するペプチド、タンパク質、核酸又はそれらの組合せであり得るか、又は不活化又は弱毒化型のウイルスであり得る。
【００６３】
ＡＰＳに含まれる１つ以上の抗原が非結合である本発明の一つの実施形態では、抗原は既知のインフルエンザワクチンの形態で提供され得る。市販のインフルエンザワクチンの例は、Ｆｌｕｖｉｒａｌ（登録商標）（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ社）、ＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標）（Ｍｅｄｌｍｍｕｎｅ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ社）、Ｆｌｕａｄ（登録商標）（Ｃｈｉｒｏｎ社）、Ｉｎｖｉｖａｃ（登録商標）（Ｓｏｌｖａｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社）、Ｆｌｕａｒｉｘ（登録商標）（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ社）及びビロソームに基づくＩｎｆｌｅｘａｌ  Ｖ（登録商標）（Ｂｅｒｎａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を含むが、これらに限定されない。他のインフルエンザワクチンは当技術分野において既知である。
【００６４】
本発明の一つの実施形態では、１つ以上の抗原は、インフルエンザウイルスに由来するタンパク質又はペプチドである。多くの抗原性インフルエンザウイルスタンパク質及びペプチドが当技術分野において既知であるが、当業者に理解されるように、適切な抗原はまた、当技術分野で既知の標準免疫学的手法を用いた、動物において免疫応答を誘導するそれらの能力に関する試験に基づきＡＰＳへの組込みのために選択され得る。適切な抗原性タンパク質の例は、膜タンパク質、ヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）、Ｍ２タンパク質の表面露出領域（すなわちＮ末端の２４アミノ酸又はＭ２ｅペプチド）又は細胞質領域（すなわちＣ末端の５４アミノ酸）、又は保存された内部核タンパク質（ＮＰ）又はＭ１タンパク質を含む。
【００６５】
当技術分野において既知のように、ある種のインフルエンザ株の宿主範囲は限定され得る。一般に、インフルエンザＡ型株は、ヒト、家畜、海洋哺乳動物及び様々な鳥類を含む多くの脊椎動物に感染することができる。インフルエンザＢ型は、これに対し、主としてヒト及びブタにに限定され、インフルエンザＣ型はヒト及びアザラシにおいて認められている。
【００６６】
ヒトは様々なインフルエンザＡ型株によって感染され、最も一般的な株はＨ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２及びＨ３Ｎ２である。ブタでは、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２及びＨ３Ｎ２株が一般的であり、ウマではＨ７Ｎ７及びＨ３Ｎ８株が多く見られる。家禽も、その多くがヒトにおいても報告されている、Ｈ１Ｎ７、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ８、Ｈ４Ｎ２、Ｈ４Ｎ８、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２、Ｈ５Ｎ９、Ｈ６Ｎ５、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ９Ｎ２、Ｈ１０Ｎ７、Ｈ１１Ｎ６、Ｈ１２Ｎ５、Ｈ１３Ｎ６及びＨ１４Ｎ５を含む多種多様な株に罹患する。Ｈ５Ｎ１、Ｈ９Ｎ２及びＨ７Ｎ７株は、人畜共通伝染性の潜在的汎流行株であるとみなされており、様々な脊椎動物に感染することができる。Ｈ５Ｎ１はペットのネコに感染することが報告され、Ｈ３Ｎ８はイヌにおいて報告されている。
【００６７】
様々なインフルエンザ株からのインフルエンザウイルスＨＡ、ＮＡ、Ｍ２、ＮＰ及びＭ１タンパク質の配列は当技術分野において既知であり、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）によって維持されるＧｅｎＢａｎｋデータベースから容易に入手可能である。例えばインフルエンザＡ型株Ａ／ＷＳＮ／３３からのＮＰタンパク質のアミノ酸配列を図４１Ｂ［配列番号６４］に示す。ＡＰＳに含めるための適切な抗原は、それ故、インフルエンザタンパク質の抗原領域の技術分野における知識に基づき、及び最終的ＡＰＳで免疫応答が惹起される動物を考慮に入れて、当業者によって容易に選択される。
【００６８】
上述したタンパク質の様々な抗原領域が同定されており、本発明のＡＰＳにおける使用に適する。本発明のＡＰＳに含まれる抗原は、完全長タンパク質又はその抗原性フラグメントであり得る。ヒトに関して、ＨＡ、ＮＰ及び基質タンパク質の抗原性フラグメントは、ヘマグルチニンエピトープ：ＨＡ  ９１−１０８、ＨＡ  ３０７−３１９及びＨＡ  ３０６−３２４（Ｒｏｔｈｂａｒｄ，１９８８，Ｃｅｌｌ  ５２：５１５−５２３）、ＨＡ  ４５８−４６７（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７，１５９（１０）：４７５３−６１）、ＨＡ  ２１３−２２７、ＨＡ  ２４１−２５５、ＨＡ  ５２９−５４３及びＨＡ  ５３３−５４７（Ｇａｏ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，２００６  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，８０：１９５９−１９６４）；核タンパク質エピトープ：ＮＰ  ２０６−２２９（Ｂｒｅｔｔ，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：９８４−９９１）、ＮＰ３３５−３５０及びＮＰ３８０−３９３（Ｄｙｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ，１９９３，Ｉｎ：Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｅｓｔｉｎｇ，ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｅｄ．：Ｒｉｃｋｗｏｏｄ，Ｄ．ａｎｄ  Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．）ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ｐ．２９２；Ｇｕｌｕｋｏｔａ  ａｎｄ  ＤｅＬｉｓｉ，１９９６，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１３：８１）、ＮＰ  ３０５−３１３（ＤｉＢｒｉｎｏ，１９９３，ＰＮＡＳ  ９０：１５０８−１２）；ＮＰ  ３８４−３９４（Ｋｖｉｓｔ，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：４４６−４４８）；ＮＰ  ８９−１０１（Ｃｅｒｕｎｄｏｌｏ，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎ．２４４：１６９−７）；ＮＰ  ９１−９９（Ｓｉｌｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  ３６０：３６７−３６９）；ＮＰ  ３８０−３８８（Ｓｕｈｒｂｉｅｒ，１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：１７１−１７３）；ＮＰ  ４４−５２及びＮＰ  ２６５−２７３（ＤｉＢｒｉｎｏ，１９９３、同上）；及びＮＰ  ３６５−３８０（Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，１９８６，Ｃｅｌｌ  ４４：９５９−９６８）；基質タンパク質（Ｍ１）エピトープ：Ｍ１  ２−２２、Ｍ１  ２−１２、Ｍ１  ３−１１、Ｍ１  ３−１２、Ｍ１  ４１−５１、Ｍ１  ５０−５９、Ｍ１  ５１−５９、Ｍ１  １３４−１４２、Ｍ１  １４５−１５５、Ｍ１  １６４−１７２、Ｍ１  １６４−１７３（すべてＮｉｊｍａｎ，１９９３，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：１２１５−１２１９によって記述されている）；Ｍ１  １７−３１、Ｍ１  ５５−７３、Ｍ１  ５７−６８（Ｃａｒｒｅｎｏ，１９９２，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２９：１１３１−１１４０）；Ｍ１  ２７−３５、Ｍ１  ２３２−２４０（ＤｉＢｒｉｎｏ，１９９３、同上）、Ｍ１  ５９−６８及びＭ１  ６０−６８（Ｃｏｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４，２４（３）：７７７−８０）；及びＭ１  １２８−１３５（Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６，２６（２）：３３５−３９）を含むが、これらに限定されない。
【００６９】
本発明の一つの実施形態では、ＡＰＳは、完全長抗原タンパク質、又は上記エピトープのいくつかを含むフラグメントを含有する。もう一つの実施形態では、ＡＰＳは、完全長Ｍ１又はＮＰタンパク質、又は複数のエピトープを含むＭ１又はＮＰのフラグメントを含有する。さらなる実施形態では、ＡＰＳは、複数の上記に列挙したエピトープを含むＭ１又はＮＰのフラグメントを含有する。
【００７０】
他の抗原領域及びエピトープは既知である。例えば、Ｍ２ｅペプチド（Ｍ２の細胞外ドメイン）を含む、イオンチャネルタンパク質（Ｍ２）のフラグメントは、本発明のＡＰＳに組み込むための抗原として使用できる。このペプチドの配列は、インフルエンザの種々の株にわたって高度に保存されている。Ｍ２ｅペプチド配列の一例を配列番号６として表１に示す。この配列の変異型が当技術分野で同定されており、一部を同じく表１に示す。
【００７１】
【表１】
2010508860.tif 000003
Ｍ２ｅ配列全体又は部分Ｍ２ｅ配列、例えばアミノ酸２〜１０によって定義される領域内のフラグメントのような、変異体全体にわたって保存されている部分配列、又は保存されたエピトープＥＶＥＴＰＩＲＮ［配列番号１１］（Ｍ２ｅ配列のアミノ酸６〜１３）が使用され得る。６〜１３エピトープは、ＧｅｎＢａｎｋで入手可能なヒトインフルエンザＡ型株の８４％において不変であることが認められた。同様に同定されたこの配列の変異型は、ＥＶＥＴＬＴＲＮ［配列番号１２］（９．６％）、ＥＶＥＴＰＩＲＳ［配列番号１３］（２．３％）、ＥＶＥＴＰＴＲＮ［配列番号１４］（１．１％）、ＥＶＥＴＰＴＫＮ［配列番号１５］（１．１％）及びＥＶＤＴＬＴＲＮ［配列番号１６］、ＥＶＥＴＰＩＲＫ［配列番号１７］及びＥＶＥＴＬＴＫＮ［配列番号１８］（各々０．６％）を含む（Ｚｏｕ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，５：６３１−６３５；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．２００５，Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，７：１７１−１７７）。
【００７２】
本発明の一つの実施形態では、ＡＰＳへの組込みのために選択される少なくとも１つの抗原は、Ｍ１、Ｍ２又はＮＰのような、遺伝的浮動によって実質的に影響されない保存されたタンパク質に由来する。本実施形態に従って、生じるＡＰＳはインフルエンザの様々な株に対して有効な防御を提供することができる。
【００７３】
一つの実施形態では、ＡＰＳはＭ２タンパク質に由来する抗原を含む。もう一つの実施形態では、少なくとも１つの抗原はＭ２ｅペプチドに由来する。さらなる実施形態では、ＡＰＳは、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３及び配列番号４４のいずれか１つに示される配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む少なくとも１つの抗原を含有する。もう一つの実施形態では、ＡＰＳは、配列番号１１に示すアミノ酸配列を含む少なくとも１つの抗原を含有する。さらなる実施形態では、ＡＰＳは、各々の抗原が、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３及び配列番号４４から選択される配列を有する、複数の抗原を含有する。
【００７４】
もう一つの実施形態では、選択される抗原は、ＨＡ及び／又はＮＡタンパク質のような、遺伝的浮動を受けやすいタンパク質に由来する。本実施形態に従って、ＰａｐＭＶプラットフォームは、表面糖タンパク質抗原を異なるサブタイプのＨＡ及び／又はＮＡで置換することができ、それによってこれらのタンパク質の新しい抗原変異体で製剤を最新化し得るので、新しい株の出現の原因となる選択抗原の迅速な調節を可能にする。これらの糖タンパク質の抗原変異体が同定されたとき、これらの変異体を含むようにＡＰＳを最新化することができる。従って、パンデミックの潜在的可能性を有するＨ１Ｎ１又はＨＡ／ＮＡの組合せのような危険な表面糖タンパク質でさえも、成分であるＰａｐＭＶ又はＰａｐＭＶ  ＶＬＰが動物において感染性でなく、疾患を伝播することができないので、本発明のＡＰＳに組み込むことができる。
【００７５】
選択される抗原の大きさは多様であり得、選択抗原の大きさは本発明の実施にとって決定的に重要ではない。抗原は、特異的であるか又はＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞及びマクロファージ上の表面構造、若しくはクラスＩ又はクラスＩＩのＡＰＣ関連細胞表面構造によって認識され得る。一つの実施形態では、本発明は、小さく脆弱な免疫原性抗原のために特に有用である。
【００７６】
上述したように、ＡＰＳに含まれる抗原は、全長タンパク質又はそのフラグメントであり得る。そこで、本発明のＡＰＳは、各々が特異的免疫応答の引き金を引くことができる１個のエピトープを有する、１つ以上の抗原を含有し得るか、又はＡＰＳは、各々の抗原が複数のエピトープを含む、１つ以上の抗原を含有し得る。ＡＰＳに含まれる抗原は、同じであるか又は異なっていてもよく、複数の抗原が存在するとき、それらは１個のタンパク質に由来するか又は複数のタンパク質に由来してもよい。それ故、タンパク質の同じ領域からであるが、異なるウイルス株で見られるタンパク質の変異型である抗原を含有するＡＰＳと同様に、インフルエンザ抗原タンパク質の組合せである抗原を含むＡＰＳも考慮される。インフルエンザ抗原タンパク質の組合せである抗原を含むＡＰＳの前者の実施形態の非限定的な例は、Ｍ２とＭ１、Ｍ２とＮＰ、又はＭ２、Ｍ１及びＮＰタンパク質に由来する複数の抗原を含むＡＰＳである。タンパク質の同じ領域からであるが、異なるウイルス株で見られるタンパク質の変異型である抗原を含有するＡＰＳの後者の実施形態の一例は、各々がＨＡ、ＮＡ又はＭ２タンパク質の同じ領域に由来するが、各々が異なるインフルエンザ株である複数の抗原を含むＡＰＳである。
【００７７】
抗原−ＰａｐＭＶ及び抗原ＰａｐＭＶ−ＶＬＰの組合せ
上記のように、ＡＰＳに組み込まれる１つ以上の抗原は、ＰａｐＭＶ  ＶＬＰのＰａｐＭＶのコートタンパク質に結合し得るか、又はそれらは非結合形態でＡＰＳ中に存在し得る（すなわち単にＰａｐＭＶ  ＶＬＰのＰａｐＭＶと組み合わされている）。結合は、例えばコートタンパク質との遺伝子的融合によってであるか、又は共有結合、非共有結合又は親和力手段を通しての結合であり得る。ＰａｐＭＶ又はＶＬＰと抗原の組合せは、しかし、宿主の免疫系による抗原の認識又はＰａｐＭＶ又はＶＬＰが免疫応答を増強する能力に干渉すべきではない。
【００７８】
本発明の一つの実施形態に従って、１つ以上の抗原は、ＰａｐＭＶ  ＶＬＰのコートタンパク質に結合される。ＶＬＰは自己組織化したコートタンパク質の多数のコピーを含むので、抗原をコートタンパク質に結合することは、ＶＬＰの表面で組織化された方法での抗原の提示を可能にする。本実施形態に従って、ＶＬＰは、１つ以上の抗原を含む第２の部分に結合した組換えＰａｐＭＶコートタンパク質である第１の部分を含む、コートタンパク質を含有する。抗原結合コートタンパク質は、他の融合コートタンパク質又は野生型コートタンパク質と会合して免疫原−担体ＶＬＰを形成する能力を保持する。
【００７９】
ＶＬＰの表面での抗原の提示を可能にし、抗原の免疫認識を高めるために、抗原は、好ましくはＶＬＰの外表面に配置されるコートタンパク質の領域に結合される。それ故抗原は、コートタンパク質のアミノ（Ｎ）又はカルボキシ（Ｃ）末端近くに挿入され得る又はそれらに結合され得るか、又はＶＬＰの外表面に配置されるコートタンパク質の内部ループに挿入され得る又は結合され得る。本発明の一つの実施形態では、抗原は、ＰａｐＭＶコートタンパク質のＣ末端に又はＣ末端の近位に存在する。
【００８０】
本発明の一つの実施形態に従って、ＡＰＳは、１つ以上の抗原に遺伝子的に融合されたＰａｐＭＶコートタンパク質を含む。抗原は、配列が隣接するようにコートタンパク質配列に直接融合し得るか、若しくは１つ以上のアミノ酸の「スペーサ」をコートタンパク質配列と抗原の配列との間に挿入し得る。例えば、脂肪族側鎖を有するもののような、１つ以上の中性アミノ酸を含むスペーサを、２つの配列の間に挿入することができる。中性アミノ酸の非限定的な例は、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン及びイソロイシンを含む。一つの実施形態では、スペーサの長さは多様であり得、１〜約１０アミノ酸、例えば２〜約１０、２〜約８、２〜約７、又は２〜約６アミノ酸であり得る。
【００８１】
もう一つの実施形態では、抗原は、例えば共有結合又は非共有結合（イオン結合、疎水結合、水素結合等のような）連結によってコートタンパク質に化学的に架橋される。抗原及び／又はコートタンパク質は、当技術分野で既知のように、例えばタンパク質及び／又は抗原への、例えばＣ又はＮ末端における又は内部位置における、官能基又は化学成分の付加によって、そのような架橋を促進するように修飾できる。例示的な修飾は、Ｓ−アセチルメルカプトコハク酸無水物（ＳＡＭＳＡ）又はＳ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）のような官能基の付加、又は１つ以上のシステイン残基の付加を含む。他の架橋試薬は当技術分野において既知であり、多くが市販されている（例えばＰｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社及びＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社からのカタログ参照）。例は、１，６−ジアミノヘキサン、１，３−ジアミノプロパン及び１，３−ジアミノエタンなどのジアミン；グルタルアルデヒドのようなジアルデヒド；エチレングリコール−ビス（コハク酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、グルタル酸ジスクシニミジル、スベリン酸ジスクシニミジル、Ｎ−（ｇ−マレイミドブチリルオキシ）スルホスクシンイミドエステル及びエチレングリコール−ビス（スクシニミジルスクシネート）などのスクシンイミドエステル；ヘキサメチレンジイソシアネートのようなジイソシアネート；１，４ブタンジイルジグリシジルエーテルのようなビスオキシラン；スクシニルジサリシレートのようなジカルボン酸；３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル等を含むが、これらに限定されない。上記架橋剤の多くは、抗原をＶＬＰから遠ざけるスペーサを組み込んでいる。他のスペーサの使用も本発明によって考慮される。様々なスペーサが当技術分野において既知であり、６−アミノヘキサン酸；１，３−ジアミノプロパン；１，３−ジアミノエタン；及び１〜５アミノ酸の、ポリグリシン配列のような短いアミノ酸配列を含むが、これらに限定されない。
【００８２】
ＶＬＰのコートタンパク質への１つ以上の抗原の共有結合を促進するため、コートタンパク質を、ＶＬＰの表面に露出されており、抗原の化学結合のための適切な部位を提供する、短いペプチド又はアミノ酸リンカーに遺伝子的に融合することができる。例えばシステイン残基、又は共有結合を形成することができる側鎖を有する他のアミノ酸残基（例えば酸性及び塩基性残基）又は当技術分野で既知のように共有結合を形成するように容易に修飾することができる他のアミノ酸残基を含む短いペプチド。アミノ酸リンカー又はペプチドは、例えば１〜約２０アミノ酸長であり得る。一つの実施形態では、コートタンパク質は、例えば上述したような適切な架橋剤の使用を通して抗原内のシステイン残基と共有結合によって連結され得る、１つ以上のリシン残基を含む短いペプチドと融合される。特定の実施形態では、コートタンパク質は、グリシン及びリシン残基の短いペプチド配列と融合される。もう一つの実施形態では、ペプチドは、配列：ＧＧＫＧＧを含む。
【００８３】
本発明のさらなる実施形態では、抗原は、コートタンパク質上に存在する親和性部分を通して結合される。本実施形態に従って、ＰａｐＭＶ  ＶＬＰは、自己組織化後のＶＬＰの表面に露出されており、抗原に特異的に結合することができる、ペプチドのような親和性部分を含む。親和性部分は、ＰａｐＭＶ又はＶＬＰに遺伝子的に融合され得るか（ペプチド又はタンパク質フラグメントの場合）、若しくは共有結合又は非共有結合によって連結され得る。親和性部分への抗原の結合は、宿主の免疫系による抗原の認識に干渉すべきではない。
【００８４】
適切な親和性部分の例は、抗体及び抗体フラグメント（Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、ダイアボディ、及び一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子など）、ストレプトアビジン（ビオチン標識抗原に結合する）、親和性ペプチド又は抗原に特異的に結合するタンパク質フラグメントを含むが、これらに限定されない。
【００８５】
親和性部分としての使用のための適切なペプチド又は抗体（抗体フラグメントを含む）は、ファージ又は酵母ディスプレイ手法のような、当技術分野で既知の手法によって選択され得る。ペプチドは、天然に生じるか、組換え、合成又はこれらの組合せであり得る。例えばペプチドは、天然に生じるタンパク質又はポリペプチドのフラグメントであり得る。ペプチドという用語はまた、ペプチド類似体、ペプチド誘導体及びペプチドミメティック化合物を包含する。そのような化合物は当技術分野において周知であり、例えばより大きな化学的安定性、タンパク質分解に対する高い抵抗性、強化された薬理的性質（半減期、吸収、効力及び効果など）及び／又は低い抗原性を含む、天然に生じるペプチドに比べて利点を有し得る。
【００８６】
ＡＰＳの調製
本発明は、ＰａｐＭＶ又は組換えＰａｐＭＶコートタンパク質に由来するＰａｐＭＶ  ＶＬＰを含むＡＰＳを提供する。本発明はさらに、コートタンパク質と遺伝子融合された１つ以上の抗原、又は親和性部分を含む組換えＰａｐＭＶ  ＶＬＰを提供する。これらの組換えコートタンパク質は、多量体化され、ＶＬＰに組織化することができる。抗原への結合のために抗原又は親和性ペプチドをコートタンパク質に遺伝子的に融合する方法は当技術分野において既知であり、その一部は以下で及び実施例で述べられている。様々な分子をタンパク質に化学的に架橋する方法は、当技術分野において周知であり、使用することができる。
【００８７】
パパイヤモザイクウイルス
ＰａｐＭＶは当技術分野において既知であり、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）よりＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＶ−２０４（商標）として入手できる。このウイルスは、標準プロトコールに従って（例えばＥｒｉｃｋｓｏｎ，Ｊ．Ｗ．＆  Ｂａｎｃｒｏｆｔ，Ｊ．Ｂ．，１９７８，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ９０：３６−４６参照）パパイヤ（Ｃａｒｉｃａ  ｐａｐａｙａ）及びキンギョソウ（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ  ｍａｊｕｓ）のような宿主植物で維持され、前記宿主植物から精製され得る。
【００８８】
ＰａｐＭＶ  ＶＬＰ
本発明のＶＬＰを作製するために使用される組換えコートタンパク質は、野生型タンパク質の配列が提供されれば、当業者により標準遺伝子工学手法によって容易に作製され得る。タンパク質を遺伝子操作する方法は、野生型ＰａｐＭＶコートタンパク質の配列（配列番号１及び２）と同様に、当技術分野において周知である（例えばＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４＆ｕｐｄａｔｅｓ）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照）。
【００８９】
野生型タンパク質をエンコードする核酸配列の単離とクローニングは、標準手法（例えばＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、同上参照）を用いて達成され得る。例えば、標準手法によってＲＮＡを抽出し、次にＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡを合成する（例えばＲＴ−ＰＣＲによって）ことにより、ＰａｐＭＶから核酸配列を直接入手できる。ＰａｐＭＶは、標準手法（例えばここで提供する実施例Ｉ参照）によってモザイク症状を示す感染植物葉から精製することができる。
【００９０】
コートタンパク質をエンコードする核酸配列を、次に、直接又は適切な発現ベクターへの１つ以上のサブクローニング工程後に挿入する。当業者は、使用される正確なベクターが本発明にとって決定的に重要ではないことを了解する。適切なベクターの例は、プラスミド、ファージミド、コスミド、バクテリオファージ、バキュロウイルス、レトロウイルス又はＤＮＡウイルスを含むが、これらに限定されない。コートタンパク質は、その後、以下でより詳細に述べるように発現させ、精製することができる。
【００９１】
あるいは、コートタンパク質をエンコードする核酸配列を、当技術分野で周知の標準インビトロ部位指定突然変異誘発手法によって、上述したような１つ以上の突然変異を導入するようにさらに操作することができる。突然変異は、コード配列を構成する適切なヌクレオチドの１つ以上の欠失、挿入、置換、逆位、又はそれらの組合せによって導入し得る。これは、例えばプライマーが１つ以上のヌクレオチドミスマッチ、挿入又は欠失を組み込むように設計されたＰＣＲに基づく手法によって達成され得る。突然変異の存在は、多くの標準手法によって、例えば制限分析によって又はＤＮＡ塩基配列決定によって確認され得る。
【００９２】
上述したように、コートタンパク質はまた、コートタンパク質に融合した１つ以上の抗原又は親和性ペプチドを含む融合タンパク質を生産するように操作され得る。融合タンパク質を作製するための方法は当業者に周知である。融合タンパク質をエンコードするＤＮＡ配列を、上記のように適切な発現ベクターに挿入することができる。
【００９３】
当業者は、コートタンパク質又は融合タンパク質をエンコードするＤＮＡを、エンコードされるタンパク質の活性に影響を及ぼすことなく様々な方法で変化させ得ることを認識する。例えばＤＮＡ配列の変異は、タンパク質を発現するために使用される宿主細胞におけるコドン選択を最適化するために使用され得るか、又は発現を促進する他の配列変化を含み得る。
【００９４】
当業者は、発現ベクターが、コートタンパク質又は融合タンパク質をエンコードするＤＮＡ配列の効率的な転写のために必要とされる、転写エレメントのような調節エレメントをさらに含み得ることを理解する。ベクターに組み込むことができる調節エレメントの例は、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター及びポリアデニル化シグナルを含むが、これらに限定されない。本発明は、それ故、遺伝子操作されたコートタンパク質をエンコードする核酸配列に作動可能に連結された調節エレメントを含むベクターを提供する。当業者は、適切な調節エレメントの選択が、遺伝子操作されたコートタンパク質の発現のために選択される宿主細胞に依存すること、及びそのような調節エレメントが、細菌、真菌、ウイルス、哺乳動物又は昆虫遺伝子を含む様々なソースに由来し得ることを認識する。
【００９５】
本発明に関して、発現ベクターは、発現されたタンパク質の精製を容易にする異種核酸配列を付加的に含み得る。そのような異種核酸配列の例は、金属アフィニティータグのような親和性標識、ヒスチジンタグ、アビジン／ストレプトアビジンエンコード配列、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）エンコード配列及びビオチンエンコード配列を含むが、これらに限定されない。核酸の発現に対応するアミノ酸は、当技術分野で既知の方法に従った使用の前に、発現されたコートタンパク質から除去することができる。あるいは、異種核酸配列の発現に対応するアミノ酸は、それらがその後のＶＬＰへの組織化に干渉しない場合は、コートタンパク質上に保持され得る。
【００９６】
本発明の一つの実施形態では、コートタンパク質はヒスチジン標識されたタンパク質として発現される。ヒスチジンタグは、コートタンパク質のカルボキシル末端又はアミノ末端に位置し得る。
【００９７】
発現ベクターは、当技術分野で既知の様々な方法の１つによって適切な宿主細胞又は組織に導入され得る。そのような方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（同上）において一般的に記述されていることが認められ、例えば安定した又は一過性のトランスフェクション、リポフェクション、電気穿孔、及び組換えウイルスベクターによる感染を含む。当業者は、コートタンパク質の発現のための適切な宿主細胞の選択が選択されるベクターに依存することを理解する。宿主細胞の例は、細菌、酵母、昆虫、植物及び哺乳動物細胞を含むが、これらに限定されない。使用される正確な宿主細胞は本発明にとって決定的に重要ではない。コートタンパク質は、原核生物宿主（例えば大腸菌、アエロモナス・サルモニシダ（Ａ．ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）又は枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））又は真核生物宿主（例えばサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）又はピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）；哺乳動物細胞、例えばＣＯＳ、ＮＩＨ  ３Ｔ３、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３又はＨｅＬａ細胞；又は昆虫細胞）において生産され得る。一つの実施形態では、コートタンパク質は原核細胞において発現される。
【００９８】
所望する場合、コートタンパク質は、当技術分野で既知の標準手法によって（例えばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｅｄ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ，Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ参照）宿主細胞から精製することができ、タンパク質の同一性を確認するために無傷タンパク質及びそのタンパク質分解フラグメントのいずれかを用いて標準ペプチド配列決定手法によって配列決定できる。
【００９９】
本発明の組換えコートタンパク質は、ＶＬＰに多量体化及び組織化することができる。一般に、組織化はコートタンパク質を発現する宿主細胞で起こる。ＶＬＰは、ここで提供する実施例の章で述べるような標準手法によって宿主細胞から単離され得る。一般に、宿主細胞から得られる単離物は、ＶＬＰ、ディスク、より組織化されていない形態のコートタンパク質（例えば単量体及び二量体）の混合物を含む。ＶＬＰは、実質的に純粋なＶＬＰ製剤を提供するために、例えば超遠心法又はゲルろ過クロマトグラフィー（例えばＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｇ−２００を使用して）によってその他のコートタンパク質成分から分離できる。これに関して、「実質的に純粋な」とは、製剤が７０％又はそれ以上のＶＬＰを含むことを意味する。あるいは、様々な形態のコートタンパク質の混合物が最終ワクチン組成物において使用できる。そのような混合物を使用するとき、ＶＬＰ含量は４０％又はそれ以上であるべきである。一つの実施形態では、５０％又はそれ以上のＶＬＰを含む製剤が最終ワクチン組成物において使用される。もう一つの実施形態では、６０％又はそれ以上のＶＬＰを含む製剤が最終ワクチン組成物において使用される。さらなる実施形態では、７０％又はそれ以上のＶＬＰを含む製剤が最終ワクチン組成物において使用される。もう一つの実施形態では、８０％又はそれ以上のＶＬＰを含む製剤が最終ワクチン組成物において使用される。
【０１００】
ＶＬＰは、夾雑宿主細胞タンパク質又はＬＰＳのような他の化合物を除去するために、クロマトグラフィーのような標準手法によってさらに精製することができる。本発明の一つの実施形態では、ＶＬＰはＬＰＳを除去するために精製される。
【０１０１】
本発明の一つの実施形態では、コートタンパク質は、宿主細胞において組換えウイルスを与えるように組織化し、核酸及び融合タンパク質を含む感染性ウイルス粒子を生産するために使用できる。これは、感染ウイルス粒子による隣接細胞の感染及びその中の融合タンパク質の発現を可能にし得る。本実施形態では、ウイルスを複製するために使用される宿主細胞は、ウイルスが複製することを可能にする植物細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞又は細菌細胞であり得る。細胞は、ウイルス様粒子が由来するウイルスについての天然宿主細胞であり得るが、これは必須ではない。宿主細胞は、初期感染のために使用されるウイルス核酸が複製でき、キメラタンパク質を有する全ウイルス粒子の生産を引き起こし得ることを条件として、粒子形態（すなわち核酸とタンパク質を含む組織化された棒状体）あるいは核酸形態（すなわちウイルスＲＮＡのようなＲＮＡ；ｃＤＮＡ又はｃＤＮＡから作製されるラン・オフ転写産物）のウイルスに初期感染され得る。
【０１０２】
組換えコートタンパク質の特徴
組換えコートタンパク質は、標準手法により、例えば電子顕微鏡によって精製組換えタンパク質を視覚化することにより（例えば実施例Ｉ参照）、多量体化してＶＬＰへと自己組織化するそれらの能力に関して分析することができる。ＶＬＰ形成も、超遠心法によって測定することができ、組換えタンパク質の二次構造を野生型（ＷＴ）ウイルスと比較するために円偏光二色性（ＣＤ）分光測光法が使用され得る（例えば実施例Ｉ参照）。
【０１０３】
ＶＬＰ及びＰａｐＭＶの安定性は、所望する場合、当技術分野で既知の手法によって、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びプロテイナーゼＫ分解分析によって測定できる（実施例ＩＩ参照）。本発明の一つの実施形態によれば、本発明のＰａｐＭＶ及びＰａｐＭＶ  ＶＬＰは高温で安定であり、室温で容易に保存できる。
【０１０４】
効果の評価
ワクチンとしての本発明のＡＰＳの効果を評価するために、抗原投与を実施することができる。そのような試験は、標準手法による試験動物（マウスなど）群への本発明のＡＰＳの接種を含む。非接種動物及び／又は市販のワクチンを摂取した動物又は他の陽性対照を含む対照群を並行して設定する。ワクチン接種後適切な期間を置いた後、動物をインフルエンザウイルスにより抗原投与する。接種前と接種後並びに抗原投与後に動物から採集した血液試料を、次に、ウイルスに対する抗体応答に関して分析する。抗体応答に関する適切な試験は、ウエスタンブロット分析及び酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）を含むが、これらに限定されない。動物はまた、例えば体温、体重等を含む、インフルエンザウイルスによる感染に関連する他の状態の発現に関しても観測され得る。インフルエンザの一部の株に関しては、生存率も適切なマーカーである。
【０１０５】
細胞性免疫応答も、本明細書で提供する実施例において述べられているものを含む、当技術分野で既知の手法によって評価できる。例えばインビトロ及びインビボでの樹状細胞によるＰａｐＭＶ  ＶＬＰ上で発現されるエピトープのプロセシング及び特異的Ｔリンパ球への交差提示を通して。細胞性免疫（Ｔリンパ球）の誘導を評価するための他の有用な手法は、例えばサイトカインの誘導を観測するためのＥＬＩＳＡによって、Ｔ細胞増殖及びＩＦＮ−γの分泌放出を観測することを含む（実施例ＩＩＩ参照）。
【０１０６】
感染の程度も、動物の犠死後に標準手法を使用した肺ウイルス力価の測定によって評価できる。
ＰａｐＭＶ又はＶＬＰのストックの産生
組換えＰａｐＭＶ又はＶＬＰのストックは標準手法によって作製できる。例えば、十分なＰａｐＭＶ又は組換えウイルスを採取できるように、ＰａｐＭＶ又は組換えウイルスをパパイヤ又はキンギョソウのような適切な宿主において増殖させることができる。
【０１０７】
ＰａｐＭＶ  ＶＬＰのストックは、ＶＬＰを構成する組換えコートタンパク質をエンコードする発現ベクターで形質転換又はトランスフェクトした大腸菌のような、適切な宿主細胞から作製できる。宿主細胞を、次に、当技術分野で既知のように、エンコードされるタンパク質の発現を促進する条件下で培養する。発現されたコートタンパク質は、宿主細胞において多量体化し、ＶＬＰへと組織化して、標準手法により、例えば細胞を破壊し、細胞溶解産物を１つ以上のクロマトグラフィー精製工程に供することにより、細胞から単離され得る。
【０１０８】
本明細書で提供する実施例において明らかにされるように、ＰａｐＭＶ  ＶＬＰは安定した構造であり、ＶＬＰのストックは、それ故、室温で又は冷蔵庫で容易に保存することができる。
【０１０９】
ワクチン組成物
本発明は、１つ以上の非毒性の医薬的に許容される担体、希釈剤及び／又は賦形剤と共に本発明の１つ以上のＡＰＳを含有するインフルエンザワクチンとしての使用に適する組成物を提供する。所望する場合は、他の有効成分、アジュバント及び／又は免疫増強剤が組成物に含まれていてもよい。
【０１１０】
組成物は、様々な経路による投与用に製剤され得る。例えば組成物は、経口、局所、直腸、経鼻又は非経口投与用若しくは吸入又は噴霧による投与用に製剤され得る。本明細書で使用される非経口という用語は、皮下注射、静脈内、筋肉内、クモ膜下腔内、胸骨内注射又は注入手法を含む。被験者への鼻内投与は、被験者の鼻道又は鼻腔の粘膜に医薬組成物を投与することを含む。本発明の一つの実施形態では、組成物は、局所、直腸又は非経口投与用若しくは、例えば鼻内経路による、吸入又は噴霧による投与用に製剤される。もう一つの実施形態では、組成物は非経口投与用に製剤される。
【０１１１】
組成物は、好ましくは本発明の１つ以上のＡＰＳの有効量を含有する。ここで使用される「有効量」という用語は、検出可能な免疫応答を誘導するために必要なＡＰＳの量を指す。所与の適応症のためのＡＰＳの有効量は、最初に、例えば細胞培養アッセイにおいて又は動物モデルにおいて、通常はげっ歯動物、ウサギ、イヌ、ブタ又は霊長動物において推定評価され得る。動物モデルはまた、適切な濃度範囲及び投与経路を決定するために使用され得る。そのような情報は、その後、ヒトを含む、治療される動物での有用な用量及び投与経路を決定するために使用され得る。本発明の一つの実施形態では、単位用量は、約１０μｇ〜約１０ｍｇのタンパク質を含む。もう一つの実施形態では、単位用量は、約１０μｇ〜約５ｍｇのタンパク質を含む。さらなる実施形態では、単位用量は、約４０μｇ〜約２ｍｇのタンパク質を含む。１つ以上の用量が動物を免疫するために使用され得、これらは同じ日に又は数日間又は数週間にわたって投与され得る。本発明の一つの実施形態では、組成物の２又はそれ以上の用量が治療される動物に投与される。もう一つの実施形態では、組成物の３又はそれ以上の用量が治療される動物に投与される。
【０１１２】
上記のように、本発明のＡＰＳは複数の抗原を含んでもよく、１つのＡＰＳは、それ故、多価ワクチン製剤を提供し得る。多価ワクチン製剤は、より高い原子価を有するワクチンに加えて、二価及び三価製剤を含む。各々のＡＰＳが異なる抗原に結合した、複数のＡＰＳを含有する多価ワクチン組成物も考慮される。多価ワクチンは、例えばインフルエンザの２つ以上の株に対する防御を提供するために有用である。本発明の一つの実施形態は多価ワクチンを提供する。本発明のもう一つの実施形態は、各々のＡＰＳが異なる抗原を含む、複数の（すなわち２つ又はそれ以上の）ＡＰＳを含有する多価ワクチンを提供する。
【０１１３】
本発明の特定の実施形態では、Ｍ２タンパク質からの抗原を含むＡＰＳと、異なるインフルエンザタンパク質からの抗原を含むＡＰＳを含有する多価ワクチンが提供される。本発明のもう一つの実施形態では、Ｍ２タンパク質からの第１の抗原を含むＡＰＳと、Ｍ２タンパク質からの第２の抗原を含むＡＰＳを含有する多価ワクチンが提供される。
【０１１４】
経口使用のための組成物は、例えば錠剤、トローチ、ロゼンジ、水性又は油性懸濁液、分散性粉末又は顆粒、乳剤、ハードカプセル又はソフトカプセル、若しくはシロップ又はエリキシルとして製剤され得る。そのような組成物は、医薬組成物の製造に関する技術分野で既知の標準方法に従って製造でき、医薬的に優れた（ｅｌｅｇａｎｔ）味の良い製剤を提供するために甘味料、香味料、着色剤及び防腐剤の群から選択される１つ以上の物質を含み得る。錠剤は、例えば炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム又はリン酸ナトリウムのような不活性希釈剤；トウモロコシデンプン又はアルギン酸のような造粒剤及び崩壊剤；デンプン、ゼラチン又はアラビアゴムのような結合剤；及びステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又は滑石のような潤滑剤を含む、適切な非毒性の医薬的に許容される賦形剤との混合物としてＡＰＳを含有する。錠剤は被覆されていなくてもよく、又は胃腸管における崩壊と吸収を遅延させ、それによってより長期間にわたる持続的作用を与えるために既知の手法によって被覆されていてもよい。例えばモノステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリルのような時間遅延物質が使用され得る。
【０１１５】
経口使用のための組成物は、ＡＰＳが不活性固体希釈剤、例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウム又はカオリンと混合されている硬ゼラチンカプセルとして、又は有効成分が水若しくは落花生油、流動パラフィン又はオリーブ油のような油性媒質と混合されている軟ゼラチンカプセルとして提供され得る。
【０１１６】
鼻投与用の組成物は、例えば鼻スプレー、点鼻薬、懸濁液、ゲル、軟膏、クリーム及び粉末を含み得る。組成物は、Ａｃｃｕｓｐｒａｙ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）のような適切な市販の鼻スプレー装置を通しての投与用に製剤され得る。鼻投与の他の方法は当技術分野において既知である。
【０１１７】
水性懸濁液として製剤される組成物は、１つ以上の適切な賦形剤、例えばカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、トラガカントゴム及びアラビアゴムのような懸濁化剤；天然に生じるホスファチド、例えばレシチン、又は脂肪酸とアルキレンオキシドの縮合物、例えばステアリン酸ポリオキシエチレン、又は長鎖脂肪アルコールとエチレンオキシドの縮合物、例えばヘプタ−デカエチレンオキシセタノール、又は脂肪酸とヘキシトールから誘導される部分エステルとエチレンオキシドの縮合物、例えばモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトール、又は脂肪酸とヘキシトール無水物から誘導される部分エステルとエチレンオキシドの縮合物、例えばモノオレイン酸ポリエチレンソルビタンのような分散剤又は湿潤剤との混合物としてＡＰＳを含有する。水性懸濁液はまた、１つ以上の防腐剤、例えばエチル又はｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエート、１つ以上の着色剤、１つ以上の香味料、若しくはスクロース又はサッカリンのような１つ以上の甘味料を含み得る。
【０１１８】
組成物は、ＡＰＳを植物油、例えば落花生油、オリーブ油、ゴマ油又はヤシ油に、又は流動パラフィンのような鉱物油に懸濁することによって油性懸濁液として製剤され得る。油性懸濁液は、増粘剤、例えば密ろう、固形パラフィン又はセチルアルコールを含み得る。上記で述べたような甘味料及び／又は香味料は、場合により、味の良い経口製剤を提供するために添加され得る。これらの組成物は、アスコルビン酸のような抗酸化剤の添加によって保存され得る。
【０１１９】
組成物は、その後水の添加によって水性懸濁剤を調製するために使用できる、分散性粉末又は顆粒として製剤され得る。そのような分散性粉末又は顆粒は、１つ以上の分散剤又は湿潤剤及び懸濁化剤及び／又は防腐剤との混合物としてＡＰＳを提供する。適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁化剤は、既に上述したものによって例示される。付加的な賦形剤、例えば甘味料、香味料、着色剤も、これらの組成物に含めることができる。
【０１２０】
本発明の組成物はまた、水中油型乳剤としても製剤され得る。油相は、植物油、例えばオリーブ油又は落花生油若しくは鉱物油、例えば流動パラフィンであり得るか、又はこれらの油の混合物であり得る。これらの組成物に含めるための適切な乳化剤は、天然に生じるゴム、例えばアラビアゴム又はトラガカントゴム；天然に生じるホスファチド、例えばダイズ、レシチン；若しくは脂肪酸及びヘキシトールに由来するエステル又は部分エステル、無水物、例えばモノオレイン酸ソルビタン、及びエチレンオキシドと前記部分エステルの縮合生成物、例えばモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンを含む。乳剤はまた、場合により甘味料及び香味料を含み得る。
【０１２１】
組成物は、１つ以上の甘味料、例えばグリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール又はスクロースとＡＰＳを組み合わせることによってシロップ又はエリキシルとして製剤され得る。そのような製剤ははまた、場合により１つ以上の粘滑剤、防腐剤、香味料及び／又は着色剤を含み得る。
【０１２２】
組成物は、当技術分野で既知の方法に従い、上記のような適切な１つ以上の分散剤又は湿潤剤及び／又は懸濁化剤を使用して、無菌注射用水性又は油性懸濁液として製剤され得る。無菌注射用製剤は、非毒性の非経口的に許容される希釈剤又は溶媒中の無菌注射用溶液又は懸濁液、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液であり得る。使用できる許容されるビヒクル及び溶媒は、水、リンガー溶液、乳酸加リンガー溶液及び等張塩化ナトリウム溶液を含むが、これらに限定されない。他の例は、溶媒又は懸濁媒質として従来より使用されている無菌の固定油、及び、例えば合成モノグリセリド又はジグリセリドを含む様々な無刺激性固定油を含む。オレイン酸のような脂肪酸も、注射剤の製造において使用できる。
【０１２３】
場合により本発明の組成物は、抗菌薬、抗酸化剤、キレート化剤及び不活性ガスのような防腐剤、及び／又は炭水化物（例えばソルビトール、マンニトール、デンプン、スクロース、グルコース又はデキストラン）、タンパク質（例えばアルブミン又はカゼイン）又はタンパク質含有物質（例えばウシ血清又は脱脂乳）のような安定剤を適切な緩衝液（例えばリン酸緩衝液）と共に含有し得る。組成物の様々な成分のｐＨ及び正確な濃度は、周知のパラメータに従って調整され得る。
【０１２４】
さらに、アジュバント活性を有する１つ以上の化合物が、場合によりワクチン組成物に添加され得る。適切なアジュバントは、例えばミョウバンアジュバント（水酸化、リン酸又は酸化アルミニウムなど）；油性乳剤（例えばＢａｙｏｌ  Ｆ（登録商標）又はＭａｒｃｏｌ５２（登録商標）の油性乳剤）；サポニン又はビタミンＥソリュビリゼート（ｓｏｌｕｂｉｌｉｓａｔｅ）を含む。ビロソームもアジュバント特性を有することが既知であり（Ａｄｊｕｖａｎｔ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｓｏｍｅｓ，Ｇｌuｃｋ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２：３９５−４００）、本発明のＡＰＳと共に使用できる。
【０１２５】
先に述べられ、ここで明らかにされるように、ＰａｐＭＶ及びＰａｐＭＶ  ＶＬＰはアジュバント特性を有する。従って、本発明の一つの実施形態では、ワクチン組成物は付加的なＰａｐＭＶ又はＰａｐＭＶ  ＶＬＰをアジュバントとして含有する。一部の実施形態では、ＰａｐＭＶ又はＰａｐＭＶ  ＶＬＰは、注射によって投与されたときＰａｐＭＶ又はＰａｐＭＶ  ＶＬＰが明らかな局所毒性を引き起こさないことが認められたことから（例えば実施例ＸＩ参照）、市販のアジュバントに比べて利点を提供し得る。
【０１２６】
オプソニン化ワクチン組成物、例えば以前にワクチン、抗原又はＰａｐＭＶ  ＶＬＰで免疫された動物又はヒトから単離された抗体を含むワクチン組成物も本発明に包含される。以前にワクチン、抗原又はＰａｐＭＶ  ＶＬＰで免疫された動物又はヒトから単離された抗体に基づく組換え抗体も、ワクチン組成物をオプソニン化するために使用できる。
【０１２７】
また、市販のインフルエンザワクチンと併用される本発明のＡＰＳを含有するワクチン組成物も本発明に包含される。
他の医薬組成物及び医薬組成物を製造する方法は当技術分野において既知であり、例えば「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」（以前の「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」）；Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ（２０００）に記載されている。
【０１２８】
適用及び使用方法
本発明は、本明細書で述べるＡＰＳの多くの適用及び使用方法を提供する。非限定的な例は、インフルエンザに対する及び／又はインフルエンザ抗原に対する免疫応答を増強するためのワクチンとしてのＡＰＳの使用方法、及びインフルエンザウイルスに対する抗体をスクリーニングするためのＡＰＳの使用方法を含む。本発明は、それ故また、動物においてインフルエンザ抗原に対する免疫応答を増強する及び／又は誘導するための方法を提供する。同様に、ワクチン及び／又は医薬組成物を含む、薬剤の製造のための本発明のＰａｐＭＶ、ＶＬＰ及びＡＰＳの使用方法は本発明の範囲内である。
【０１２９】
本発明のＡＰＳは、ＡＰＳへの組込みのために選択される抗原に依存して、インフルエンザウイルスの１つ又は２つ以上の株に対する免疫応答を誘導するために使用され得る。ＡＰＳは、ヒト並びに家畜を含む非ヒト動物における使用に適する。ＡＰＳについての投与レジームは、他の一般的に許容されるワクチン接種プログラムと異なる必要はない。有効な免疫応答を惹起するために十分量のＡＰＳの単回投与が使用され得るか、あるいは、ＡＰＳの初期投与とそれに続く抗原単独又はＡＰＳによる１回又は２回以上の追加免疫という他のレジームも使用され得る。同様に、ＡＰＳ又は抗原による追加免疫は、抗体価が許容レベルよりも低い場合に初期投与からかなり後の時点で行われ得る。本発明の一つの実施形態では、ＡＰＳについての投与レジームは、ＡＰＳの初期用量プラスＡＰＳの追加抗原量を含む。もう一つの実施形態では、ＡＰＳについての投与レジームは、ＡＰＳの初期用量プラスＡＰＳの２又はそれ以上の追加抗原量を含む。さらなる実施形態では、ＡＰＳについての投与レジームは、ＡＰＳの初期用量プラスＡＰＳの３又はそれ以上の追加抗原量を含む。適切な投与レジメンは、熟達した医師によって容易に決定され得る。
【０１３０】
ＡＰＳが非結合抗原を含むとき、ＡＰＳのＰａｐＭＶ又はＶＬＰ成分は、抗原と同時に投与され得るか、又は免疫応答を所望するヒト又は非ヒト動物の必要性に依存して、抗原の投与前又は投与後に投与され得る。
【０１３１】
本発明の一つの実施形態は、１つ以上の抗原が従来のインフルエンザワクチンの形態であるＡＰＳを含有するワクチンの使用方法を提供する。もう一つの実施形態は、従来のインフルエンザワクチンと共にＡＰＳを含有するワクチンの使用方法を提供する。本実施形態に従って、ＡＰＳワクチンは、従来のワクチンと同時に（例えば２つの組成物を組み合わせることによって）投与され得るか、又は従来のワクチンの投与前又は投与後に投与され得る。
【０１３２】
本発明の一つの実施形態は、ヒト用のインフルエンザワクチンとしてのＡＰＳの使用方法を提供する。本発明のもう一つの実施形態は、ヒト用のインフルエンザワクチンとしての、インフルエンザのＨ１Ｎ１及び／又はＨ３Ｎ２株からの１つ以上の抗原を含むＡＰＳの使用方法を提供する。本発明の特定の実施形態では、少なくとも１つのＭ２抗原を含むヒトインフルエンザワクチンとして使用するためのＡＰＳが提供される。もう一つの実施形態では、ヒトインフルエンザワクチンとして使用するための、配列番号６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、４０又は４４と実質的に同一のアミノ酸配列又はそのフラグメントを含む少なくとも１つのＭ２抗原を含有するＡＰＳが提供される。ワクチンは、場合により第１のＡＰＳ中のものとは異なる抗原、例えば配列番号６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、４０及び４４のいずれか１つに示される配列を含む抗原、若しくはＮＰ又はＭ１のような他のインフルエンザウイルスタンパク質からの抗原を含む、１つ以上の他のＡＰＳを含有し得る。
【０１３３】
本発明の選択的実施形態は、非ヒト用のインフルエンザワクチンとしてのＡＰＳの使用方法を提供する。もう一つの実施形態は、非ヒト用のインフルエンザワクチンとしての、インフルエンザのＨ３Ｎ８、Ｈ７Ｎ７、Ｈ９Ｎ２及び／又はＨ５Ｎ１株からの１つ以上の抗原を含むＡＰＳの使用方法を提供する。さらなる実施形態は、非ヒト哺乳動物用のインフルエンザワクチンとしてのＡＰＳの使用方法を提供する。もう一つの実施形態は、鳥類用のインフルエンザワクチンとしてのＡＰＳの使用方法を提供する。本発明のさらなる実施形態では、配列番号９、４１、４２及び４３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列又はそのフラグメントを含む少なくとも１つの抗原を含む、哺乳動物及び／又は鳥類用のインフルエンザワクチンとしてのＡＰＳの使用方法が提供される。本発明の特定実施形態では、配列番号９に示されるアミノ酸配列又はそのフラグメントを含む少なくとも１つの抗原を含有する、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、ニワトリ、ガチョウ及びヒメオウギワシ（ｃｒｅｓｔｅｄ  ｅａｇｌｅ）のためのインフルエンザワクチンとしての使用に適するＡＰＳが提供される。ワクチンは、場合により配列番号６、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、４０及び４４のいずれか１つに示される配列を含むもののような、インフルエンザの他の株で認められるＭ２ｅペプチドの変異体に由来する抗原を含む、１つ以上の他のＡＰＳを含有し得る。本発明のもう一つの実施形態では、配列番号９に示されるアミノ酸配列又はそのフラグメントを含む抗原を含む第１のＡＰＳ、及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列又はそのフラグメントを含む抗原を含む第２のＡＰＳを含有する、イヌ及び／又はウマのためのワクチンが提供される。さらなる実施形態では、配列番号４１又は４３に示されるアミノ酸配列又はそのフラグメントを含む少なくとも１つの抗原を含む、鳥類のためのインフルエンザワクチンとしての使用に適するＡＰＳが提供される。
【０１３４】
ここで明らかにされるように、ＰａｐＭＶ  ＶＬＰは、抗原に対する体液性応答とＣＴＬ応答の両方を増強することができる。従って、本発明の一つの実施形態では、体液性応答を生じさせるインフルエンザ抗原（Ｍ２タンパク質からの抗原など）を含む第１のＡＰＳ及びＣＴＬ応答を生じさせるインフルエンザ抗原（ＮＰ又はＭ１タンパク質からの抗原など）を含む第２のＡＰＳを含有するワクチンが提供される。
【０１３５】
本発明はまた、例えばインフルエンザに対する抗体をスクリーニングするための、スクリーニング剤としてのＡＰＳの使用方法を提供する。ＡＰＳは、酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）又はウエスタンブロット法のような従来の免疫学的手法に容易に適合させることができ、それ故診断及び研究の場において有用である。
【０１３６】
キット
本発明は、インフルエンザワクチンとして使用するための１つ以上のＡＰＳを含むキットをさらに提供する。キットの個々の成分は別々の容器内に包装され、及びそのような容器と共に、医薬品又は生物学的製品の製造、使用又は販売を規制する政府当局によって規定される形態の表示が存在し得るが、かかる表示は製造、使用又は販売の当局による認可を反映する。キットは、場合によりワクチンについての使用方法又は投与レジメンを概説する指示書又は説明書を含み得る。
【０１３７】
キットの１つ以上の成分が溶液として、例えば水溶液又は無菌水溶液として提供されるとき、容器手段は、それ自体、そこから溶液が被験者に投与され得る又はキットのその他の成分に適用され、混合され得る、吸入剤、注射器、ピペット、点眼瓶又は他のそのような同様の装置であり得る。
【０１３８】
キットの成分はまた、乾燥形態又は凍結乾燥形態で提供されてもよく、キットは、凍結乾燥成分の再溶解のために適切な溶媒を付加的に含み得る。容器の数又は種類にかかわらず、本発明のキットはまた、患者への組成物の投与を助けるための器具を含み得る。そのような器具は、吸入剤、鼻噴霧装置、注射器、ピペット、鉗子、計量スプーン、点眼瓶又は同様の医学的に承認されている送達ビヒクルであり得る。
【０１３９】
抗体検出における使用のための、本発明の１つ以上のＡＰＳを含むスクリーニングキットも提供される。キットは、研究のための１又は複数の診断キットであり得る。キットの個々の成分は別々の容器内に包装され、及びそのような容器と共に、生物学的製品の製造、使用又は販売を規制する政府当局によって規定される形態の表示が存在し得るが、かかる表示は生物学的製品の製造、使用又は販売の当局による認可を反映する。キットは、場合によりワクチンについての使用方法又は投与レジメンを概説する指示書又は説明書を含み得る。
【０１４０】
ここで述べる本発明のよりよい理解を得るために、以下の実施例を示す。これらの実施例は、本発明の例示的実施形態を説明することを意図されており、いかなる意味においても本発明の範囲を限定することを意図されていないことが了解される。
【実施例】
【０１４１】
（実施例Ｉ）
ＰａｐＭＶコートタンパク質のＲＮＡ結合及び自己組織化への突然変異の影響
２位にアラニンの挿入を保持し、Ｎ末端の５個のアミノ酸がＷＴ配列から欠失したＰａｐＭＶコートタンパク質（ＣＰΔＮ５；配列番号３に示す）を、Ｔｒｅｍｂｌａｙ，Ｍ−  Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，２００６，ＦＥＢＳ  Ｊ．，２７３：１４−２５に概説されている一連の突然変異体を創製するために使用した。ＰａｐＭＶ  ＣＰの１２８位に対応するアミノ酸は、大部分のポテクスウイルス（ｐｏｔｅｘｖｉｒｕｓ、ジャガイモＸウイルス）ではＡであるが、ＰａｐＭＶにおいてはＥであることを明らかにした、ＰａｐＭＶ  ＣＰのアミノ酸９０〜１６９の間の１９のポテクスウイルスＣＰのアミノ酸配列のアラインメント、及び荷電残基Ｒ１０４、Ｋ１３３、Ｋ１３７及びＲ１６１がゲノムＲＮＡとの相互作用に関与する可能性が高く、ウイルスゲノムの組織化とパッケージングにおいて重要な役割を果たすという報告（Ａｂｏｕｈａｉｄａｒ，＆  Ｌａｉ，１９８９，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７０，１８７１−５）に基づき、以下の突然変異を作製した：Ｅ１２８Ａ；Ｋ９７Ａ；Ｒ１０４Ｋ１０５Ｒ１０８／Ａ；Ｒ１１８Ｄ１２０Ｋ１２１／Ａ；Ｋ１３３Ｋ１３７／Ａ；Ｄ１４２Ｄ１４５／Ａ；Ｅ１４８Ａ；Ｒ１６１Ａ又はＥ１６６Ｅ１６８／Ａ。
【０１４２】
電子顕微鏡検査及び免疫金標識法
ＶＬＰ又はウイルスを１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８で希釈し、カーボン被覆したフォームバー（ｆｏｒｍｖａｒ）グリッドに３分間吸着させた。グリッドをＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍＬ）８ｍＬで３０秒間ブロックし、ＰＢＳで洗浄した。グリッドを、ＰＢＳで１：１０希釈したウサギ抗６×Ｈタグ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，ＵＳＡ）と共に室温で３０分間インキュベートした。次にグリッドをＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳで１：２０希釈した６ｎｍ金粒子結合ロバ抗ウサギ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ  Ｐｉｋｅ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ，ＵＳＡ）と共に室温で３０分間インキュベートした。その後グリッドを脱イオン水で洗浄し、上述したように染色した。
【０１４３】
円偏光二色性分光測光法
ＣＤスペクトルを２０℃でＯｌｉｓ  ＲＳＭ  １０００（Ｏｌｉｓ，Ｃｏｎｗａｙ  ＤｒｉｖｅＳｕｉｔｅｓ  Ａ＆Ｂ，Ｂｏｇａｒｔ，ＧＡ，ＵＳＡ）高速スキャナーモノクロメータに記録した。遠紫外ＣＤ（２６０〜１９０ｎｍ）のために、０．１ｃｍ光路長の恒温装置付き石英セルを使用した。平均残基楕円率（ｄｅｇ×ｃｍｚ×ｄｍｏｌ単位での［６］ｍＲＷ）を、方程式：［６］ＭＲＷ＝［６］＊ＭＲＷ／（１０×ｃ×１）、［式中、［６］は度（ｄｅｇｒｅｅ）単位での楕円率であり、ＭＲＷはタンパク質中の残基の平均分子量であり（この試験では１０８を使用した）、ｃはｇ／ｍｌ単位のタンパク質濃度であり、及び１はｃｍでの光路長である］を用いて算定した（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｗ．Ｃ．（１９９６）Ｃｉｒｃｕｌａｒ  Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｉｒｃｕｌａｒ  Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（Ｆａｓｍａｎ，Ｇ．Ｄ．，ｅｄ）ｐｐ．６３５−６５２，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）。
【０１４４】
近紫外領域のＣＤスペクトルは、Ｊａｓｃｏ  Ｍｏｄｅｌ  Ｊ−７１０装置（Ｊａｓｃｏ，Ｃｏｍｍｅｒｃｅ  Ｄｒ．Ｅａｓｔｏｎ，ＭＤ，ＵＳＡ）において室温で記録した（２５０〜３５０ｎｍ）。記録は石英キュベット（光路長０．１ｃｍ）を用いて実施した。スペクトルを、１００ｎｍ／分の割合で０．２ｎｍ刻みの１０回のスキャンから平均した。ロッド及びディスク試料はそれぞれ１．５ｍｇ／ｍｌ及び５．５ｍｇ／ｍｌの濃度であった。
【０１４５】
ＲＮＡ転写産物及び電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）
ＲＮＡプローブを、ＲｉｂｏＭＡＸ（商標）Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  ＲＮＡ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ−Ｔ７キット（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｐ１３００，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）及びＴ７プロモーターの前のＰａｐＭＶの５’末端側８０ヌクレオチドのクローンを使用して、インビトロでの転写によって作製した。インビトロ転写の前にクローンをＥｃｏＲＩで線状化した。ＲＮＡ転写産物を、ＤＮＡ／ＲＮＡ精製のためのＧ５０  Ｑｕｉｃｋ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｒｏｃｈｅ  １２７３  ９６５）で精製した。同じ方法を使用して、インビトロ組織化アッセイのためにＰａｐＭＶの５’末端側１８００ヌクレオチドの転写産物を作製した。ＲＮＡプローブを、エビアルカリホスファターゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ，Ｈａｎｏｖｅｒ，ＭＤ，ＵＳＡ，ＥＦＯ５１１）を用いて脱リン酸化し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ，Ｍ０２０１Ｓ）を用いてガンマ３２Ｐ−ＡＴＰで標識した。次にＧ−５０  Ｑｕｉｃｋ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎを前記のように使用してプローブを精製した。標識ＲＮＡを組換えタンパク質と共に室温で６０分間インキュベートした。ＲＮＡ  １６５ｆｏｍｌを各々の反応のために使用し、７．５ＵのＲＮアーゼ阻害剤（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２７−０８１６Ｏ１）を含むインビトロ組織化緩衝液中の様々な量の精製組換えタンパク質を使用した。反応物の最終容量は１０μＬであった；負荷染料２μＬを試料に添加した後、５％未変性ポリアクリルアミドゲルに負荷した。電気泳動を、０．５Ｘトリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ緩衝液中、１０ｍＡで９０分間実施した。ゲルを乾燥し、Ｋｏｄａｋ  ＢｉｏＭａｘ  ＭＳフィルム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｖ８３２６８８６）で１６時間のオートラジオグラフィーに供して、現像した。
【０１４６】
ＰａｐＭＶの精製とディスクの単離
ＰａｐＭＶを、モザイク症状を示したパパイヤの葉から分画遠心によって精製した。感染した葉（１００ｇ）を、市販の混合機において１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１００ｍＬ中で摩砕した。摩砕した葉をチーズクロスでろ過し、１％のトリトンＸ−１００をろ液に添加して、ろ液を静かに１０分間攪拌した。クロロホルムを、ろ液の容量の４分の１に等しい容量まで滴下して加えた。溶液を４℃でさらに３０分間攪拌し、１０，０００ｇで２０分間遠心分離して沈殿物を除去した。上清を１２０分間高速（１００，０００ｇ）遠心分離に供した。ウイルスペレットを懸濁し、スクロースクッション（３％スクロース）を通して１００，０００ｇで３時間半、さらなる高速遠心分離に供した。最終ウイルスペレットを５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）１０ｍＬに懸濁した。色が持続する場合は、クロロホルムによるさらなる清澄化を実施した。精製ウイルスを超遠心法によって収集した。酢酸分解法によるディスクの単離を以前に述べられているように（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９７６，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．７２，５１４−７）実施した。
【０１４７】
トリプシン消化
タンパク質１０μｇを、トリプシン０．２μｇ（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ，１４１８４７５）と１００ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．５中で１２０分間、５０μｌの容量にて３７℃でインキュベートした。５％ＳＤＳ、５ｍＭ  ＤＴＴ及び４０％グリセロールを含む追加の負荷染料１０μＬの添加によって反応を停止させた。試料を５分間煮沸した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに負荷した。タンパク質をクマシーブルー染色によって視覚化した。
【０１４８】
結果
ＰａｐＭＶは、ＣＰオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の１位と６位に２個のＭ残基を保持する。これらの開始コドンの両方がウイルスの複製の間に使用されるかどうかは明らかでない。しかし、精製ウイルスのＣＰの大きな割合がＮ末端のいくつかのアミノ酸を欠くことが示された（Ｚｈａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３４，８８５−７）。大腸菌において１つのオープンリーディングフレームだけの生産を確実にするため、Ｍ６が開始コドンとして働くようにＮ末端の５アミノ酸を除去した。ＮｃｏＩ部位への開始コドンの導入は、すべての構築物で認められる余分のＡを導入した。精製工程を容易にするために６×Ｈタグをタンパク質のＣ末端に負荷した。組換えタンパク質ＣＰΔＮ５は大腸菌ＢＬ２１（ｐＬｙｓＳ）において発現され、精製ウイルスから抽出されたＷＴ  ＣＰの分子量よりもわずかに大きな分子量（ＭＷ）を示した。２つのタンパク質の間で認められる相違は、おそらくＣ末端の６×Ｈタグ融合によって引き起こされる。Ｎｉ２＋カラムを用いて組換えタンパク質をアフィニティー精製し、１Ｍイミダゾールを用いて溶出した。精製組換えタンパク質の収率は４０〜５０ｍｇ／Ｌと推定された。ＷＴ  ＰａｐＭＶ  ＣＰに対して惹起した抗体を用いたウエスタンブロット分析により、精製タンパク質が実際にＰａｐＭＶ  ＣＰであることが確認された。
【０１４９】
１、２又は３個のＡ置換を保持する９つの異なる突然変異体を作製した。５つの突然変異体Ｒ１１８−Ｄ１２０−Ｋ１２１／Ａ、Ｋ１３３−Ｋ１３７／Ａ、Ｄ１４２−Ｄ１４５／Ａ、Ｒ１６１Ａ及びＥ１６６−Ｅ１６７−Ｒ１６８／Ａは、不安定なタンパク質を生産し、検出不能であるか又は非常に低いレベルで発現された。この保存された領域における突然変異誘発はＣＰの天然の折りたたみに影響を及ぼした可能性が高い。突然変異体Ｋ９７Ａ、Ｒ１０４Ｋ１０５Ｒ１０８／Ａ、Ｅ１２８Ａ及びＥ１４８Ａは、ＣＰΔＮ５と同様のレベルで発現され、ＣＰΔＮ５に関して示されたように６×Ｈタグを用いて容易に精製することができた。しかし、透析の間のイミダゾールの除去は突然変異体Ｒ１０４Ｋ１０５Ｒ１０８／Ａ及びＥ１４８Ａを凝集及び沈殿させ、突然変異がタンパク質の折りたたみに影響を及ぼしたと考えられる。
【０１５０】
構築物ＣＰΔＮ５は、精製組換えタンパク質の電子顕微鏡写真によって示されるように大腸菌においてＶＬＰへと自己組織化した。ＶＬＰは、形状及び粒径において天然ウイルス粒子と同様であった。ＶＬＰとして認められた精製タンパク質の割合を分析し、定量するため、ＶＬＰとより小さな凝集物を１００，０００ｇで２時間の超遠心によって分離した。ＣＰΔＮ５タンパク質の大部分（８０％）は上清中で認められた。ＶＬＰはペレット中で認められ、総精製組換えタンパク質の２０％を占める。しかし、精製タンパク質Ｋ９７Ａは超遠心後も上清中に残存した。逆に、組換えタンパク質Ｅ１２８Ａは、超遠心後は全面的にペレット中で認められた。
【０１５１】
電子顕微鏡検査は、高速ペレットから単離されたＥ１２８Ａ  ＶＬＰがＷＴウイルスに類似することを明らかにした。各々のＣＰΔＮ５及びＥ１２８Ａについての１５０ＶＬＰの長さを測定し、平均長を決定した。ＣＰΔＮ５  ＶＬＰは、予測されたように５００ｎｍの長さである天然ウイルスよりも１０倍短い（５０ｎｍ）と思われた。しかし、Ｅ１２８Ａ  ＶＬＰはＣＰΔＮ５  ＶＬＰより約３倍長く、この突然変異体が組織化の開始と伸長をより効率良く支持し得ることを示唆する。最後に、精製Ｋ９７Ａタンパク質の電子顕微鏡写真は、直径１５〜５０ｎｍの組織化されていない凝集物を明らかにした。凝集物の輪郭は不規則であり、このタンパク質が自らＶＬＰへと組織化することができないことを示した。
【０１５２】
Ｎｉ２＋カラムを用いたＶＬＰの精製は効率的であり、６×Ｈタグが表面に位置し、アフィニティーカラムとの相互作用のために使用可能であることを示唆した。この仮説を確認するため、抗６×Ｈｉｓタグウサギ抗血清抗体、続いて金粒子で標識したロバ抗ウサギ二次抗体を使用してＣＰΔＮ５  ＶＬＰに関する免疫金標識実験を実施した。予想されたように、ＶＬＰは金粒子で装飾され、それ故Ｃ末端へのペプチド（６×Ｈ）の融合が耐容され、ＶＬＰの表面に露出されることを示した。Ｃ末端融合ペプチドのこの表面露出は、免疫原を結合する適切な部位としてのＣ末端の適合性を明らかにする。
【０１５３】
ＷＴウイルスと組換えタンパク質の二次構造を比較するために円偏光二色性（ＣＤ）分光測光法を使用した。ＣＰΔＮ５の二次構造は４９％がαへリックス、１５％がランダムコイルであると推定された。ＣＰΔＮ５  ＶＬＰとＷＴウイルスのＣＤスペクトルはわずかに異なるプロファイルを示した（図２Ａ）。２０８ｎｍで測定されたＣＤシグナルは、ＣＰΔＮ５  ＶＬＰよりもＷＴウイルスについてより著明であった（図２Ａ）。興味深いことに、２０８ｎｍでＥ１２８Ａ  ＶＬＰに関して測定されたＣＤシグナルはＷＴウイルスと重なった（図２Ａ）。
【０１５４】
ＣＰΔＮ５の単離ディスク（精製タンパク質の高速上清）のＣＤシグナルは、酢酸法を用いて精製ウイルスからの単離ディスクと同じであった（図２Ｂ）。一般に２０８ｎｍでディスクに関して測定されたＣＤシグナルはＶＬＰほど著明ではなかった。この結果は、ディスクがＶＬＰに組織化したときαヘリックス中の含量が上昇することを示唆する。最後に、Ｋ９７Ａの精製タンパク質の折りたたみをＣＰΔＮ５の高速上清と比較した。２つのタンパク質は同じＣＤプロファイルを示した（図２Ｅ）。
【０１５５】
タンパク質中の芳香族残基及びトリプトファン残基の吸収を測定するために２５０〜３５０ｎｍのスペクトルも得た。それらの残基の環境の変化は記録されるシグナルに影響を及ぼし、三次構造の変動を示す。ＣＰΔＮ５及びＥ１２８ＡのＶＬＰは類似すると思われ（図２Ｄ）、両方のＶＬＰについて三次構造が同じであることを示した。ＣＰΔＮ５ディスク及びＫ９７Ａのスペクトルは非常に類似しており、両方のタンパク質が類似の三次構造を有することを示唆する（図２Ｅ）。試料間の曲線の強度のわずかな相違は、おそらくタンパク質濃度の小さな変動によるものであると思われた。
【０１５６】
精製組換えＣＰΔＮ５の８０％及びすべてのＫ９７Ａタンパク質が、超遠心後の上清中に多量体（ディスク）として認められた。これらのタンパク質の多量体化のレベルを測定するため、ＣＰΔＮ５の高速上清及び精製タンパク質Ｋ９７ＡをＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００を用いて分析した。ＣＰΔＮ５に関しては、タンパク質の大部分が、約２０サブユニット（タンパク質サブユニットの分子量は２３ｋＤａである）の多量体に対応する、４５０ｋＤａの高分子量複合体として溶出された（図３Ａ）。８１．２７ｍｌで溶出する２番目のピークを収集し、分離能を改善するためにＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）７５カラムに負荷した。タンパク質が３９ｋＤａタンパク質として溶出した。このピークからの試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＰΔＮ５の分解産物に対応するＣＰΔＮ５より小さい固有のバンドを示した。この分解されたタンパク質は高分子量複合体を形成することができず、溶液中に二量体として残存する可能性がある。
【０１５７】
Ｋ９７Ａの溶出プロファイルは３つの主要ピークに分けることができる（図３Ｂ）。２番目のピークは５０ｍｌで溶出され、ＣＰΔＮ５ディスクと重なり（図３Ａ）、おそらくディスク構造に対応する。１番目のピークは４１〜４３ｍｌで溶出し、７００ｋＤａを上回る大きさの凝集物に対応する。溶出パターンは幅が広く、この物質が均一ではなく、非特異的相互作用によって共に凝集したＫ９７Ａディスクの凝集物に対応し得ることを示唆するショルダーを示す。３番目のピークはさらに分析しなかったが、おそらくＣＰΔＮ５構築物に関して示されるようなトランケート型タンパク質に対応する。これらの結果から、Ｋ９７Ａは他のタンパク質サブユニットとディスクを形成することができるが、大腸菌においてＶＬＰへと組織化することはできないことが確認される。
【０１５８】
ＣＰΔＮ５ディスクをアフィニティークロマトグラフィーによって精製タンパク質の高速上清から単離し、インビトロ組織化アッセイのために使用した。直径１７ｎｍのディスクをゲルろ過によって単離した。１ｍｇ／ｍｌの濃度のＣＰΔＮ５ディスク５０ｍｌをＲＮＡ０．０５ｍｇと共に室温で３０分間インキュベートした。電子顕微鏡検査により、ＲＮＡとタンパク質が、インビトロ組織化アッセイに使用したＲＮＡの長さ（ＰａｐＭＶの５’側１８００ヌクレオチド）に対応する正常な長さ（１５０ｎｍ）のＶＬＰへと組織化されることが示された。この結果は、約２０サブユニットのディスクがインビトロでのＶＬＰの構築ブロックであることを明確に示す。精製Ｋ９７Ａ組換えタンパク質はこれらの条件下でＲＮＡをＶＬＰに組織化することができなかった。
【０１５９】
Ｋ９７Ａ及びＥ１２８Ａ突然変異はＰａｐＭＶ  ＣＰに対して全く反対の作用を示した。ＣＰΔＮ５及びＥ１２８Ａ  ＶＬＰがＲＮＡを含むかどうかを評価するため、種々のＶＬＰの２８０／２６０比を分光光度計で測定し、精製ウイルスのタンパク質と比較した（表２）。予想されたように、ＶＬＰは、それらのＲＮＡのレベルがより低いために、ディスクよりも小さい２８０／２６０比を示した。Ｅ１２８Ａ  ＶＬＰの２８０／２６０比は精製ウイルスと同等であった。興味深いことに、この比はＣＰΔＮ５  ＶＬＰに関して５０％高かった。ＣＰΔＮ５及びＫ９７Ａの単離ディスクの２８０／２６０比は、精製ウイルスの酢酸で抽出したディスクに匹敵した。
【０１６０】
【表２】
2010508860.tif 000004
ＶＬＰを作製する能力がＲＮＡに対するＣＰの親和性に直接関連するかどうかを評価するため、ＣＰΔＮ５及びＥ１２８Ａ突然変異体からのディスクを単離し、Ｋ９７Ａと比較した。ＣＰΔＮ５の高速上清を４５０ｋＤａ多量体（ディスク）の単離のために使用した。Ｅ１２８Ａ突然変異体は大腸菌においてＶＬＰだけを作製するので、酢酸処理を用いてこれらを破壊し、Ｅ１２８Ａディスクを単離した（Ａｂｏｕｈａｉｄａｒ＆Ｂａｎｃｒｏｆｔ，１９７８，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．９０，５４−９）。ＰａｐＭＶの５’非コード領域の８０ヌクレオチドの転写産物から作製した３２Ｐ標識ＲＮＡプローブ１６５ｆｍｏｌを含む１０μｌの容量中で種々の量のディスクをインキュベートした。タンパク質−ＲＮＡ複合体を電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）によって分離した。ＣＰΔＮ５のディスクはプローブと協働的に相互作用し、タンパク質５００ｎｇ（２２ｐｍｏｌ）のシフトを誘導した。この結果は、単離後ＲＮＡを含まないＣＰΔＮ５ディスクが、ＲＮＡの弱い親和性に対応する、１，０００のモル比（ディスク／ＲＮＡ）に達したときのみインビトロでＲＮＡと相互作用できることを示す。同様の実験を突然変異体Ｅ１２８Ａの単離ディスクと同じプローブで実施したとき、Ｅ１２８ＡディスクはＣＰΔＮ５よりも効率的にＲＮＡと結合した。５０ｎｇという少量のタンパク質は、タンパク質ＲＮＡ複合体を作製するために十分であった。同じ条件で精製Ｋ９７Ａタンパク質は、より高い濃度でも（１５００ｎｇまで）、タンパク質ＲＮＡ複合体の形成を誘導することができなかった。ＥＭＳＡを、先に述べたように標識したＣＰΔＮ５  ＶＬＰから抽出したＲＮＡで反復し、ＰａｐＭＶパッケージングシグナルを含まないこのＲＮＡに関して同じ結果を得た。
【０１６１】
ＶＬＰの安定性を評価し、棒状体構造へのディスクの組織化が複合体の安定性を改善するかどうかを測定するため、熱に対するそれらの抵抗性をＣＤ分光測光法によって観測した。ＣＰΔＮ５  ＶＬＰ及びウイルスの両方が、何らかの疲労の徴候を示すまで高温（６０℃以上）に耐える（図４Ａ）。精製ＰａｐＭＶは試験した最も安定な構造であり、１００℃に近い温度に耐え得る。ＰａｐＭＶについて報告されている不活化の温度は７０℃である。ＣＰΔＮ５  ＶＬＰは、おそらくＣ末端に位置する６×Ｈｉｓタグの存在の故にＷＴウイルスよりも感受性であった。Ｅ１２８Ａ  ＶＬＰは熱に対してより敏感であると思われ、４２℃で疲労の徴候を示した（図４Ａ）。ディスクは４０℃で速やかに変性した（図４Ｂ）。この結果は、棒状体構造へのディスクの詰込みが安定性をかなり改善することを示唆する。
【０１６２】
トリプシンでのＰａｐＭＶの処理は、おそらくＣ末端のアミノ酸１９８で、切断を生じさせる。これらの条件下で、残存するタンパク質はプロテアーゼに抵抗性であった。同様のアッセイを精製ビリオン及び組換えＶＬＰとディスクに関して実施し、ＰａｐＭＶはトリプシンによって影響を受けないと思われた。電子顕微鏡検査により、処理されたウイルスが外見上未処理ウイルスと同じであり、ＣＰΔＮ５とＣＰΔＮ５  ＶＬＰからの単離ディスクの両方がトリプシンに対して非常に敏感であり、分解されたフラグメントに対応するより低い分子量のいくつかのバンドが生成されたことが確認され、いくつかの正に荷電した残基がＶＬＰの表面で露出され、使用可能であることが示唆された。Ｅ１２８Ａはトリプシンに対してＷＴウイルスと同様の抵抗性を示した。
（実施例ＩＩ）
ＰａｐＭＶ  ｇｐ１００及びＰａｐＭＶ  Ｆｌｕ  ＶＬＰの生産及び工学的操作
ＰａｐＭＶ  ＣＰ遺伝子のクローニング
ＣＰΔＮ５  ＰａｐＭＶコートタンパク質（ＣＰ）遺伝子を使用し（実施例Ｉ参照）、Ｔｒｅｍｂｌａｙ，Ｍ−Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，２００６，ＦＥＢＳ  Ｊ．，２７３：１４−２５に述べられているように作製した。簡単に述べると、ＣＰ遺伝子を、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して単離ウイルスＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。
【０１６３】
フォワードＣＰΔＮ５プライマー：
５’−ＡＧＴＣＣＣＡＴＧＧＡＴＣＣＡＡＣＧＴＣＣＡＡＴＣＴＴＣＴＧ−３’［配列番号１９］
リバースＣＰΔＮ５プライマー：
５’−ＡＴＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＴＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＴＴＣＧＧＧＧＧＧＴＧＧＡＡＧ−３’［配列番号２０］
ＰＣＲ産物をＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで消化し、ベクターｐＥＴ−３ｄに挿入して、Ｎ末端の５アミノ酸がＷＴ配列から欠失したＣＰΔＮ５  ＰａｐＭＶ  ＶＬＰクローンを作製した。ＰａｐＭＶ  ＶＬＰはまた、組換えタンパク質の２位にアラニンの挿入を保持する。ＣＰΔＮ５  ＰａｐＭＶ  ＶＬＰクローンのアミノ酸配列を図１Ｃに示す［配列番号３］。
【０１６４】
ＰａｐＭＶ  ｇｐ１００及びＰａｐＭＶ  Ｆｌｕ構築物のクローニング及び工学的操作
広く定義されている腫瘍抗原ｇｐ１００から（ＩＭＤＱＶＰＦＳＶ；配列番号２１）及びインフルエンザＭ１タンパク質から（ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ；配列番号２２）の９量体ＨＬＡ−Ａ＊０２０１エピトープを選択した。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１エピトープは、プロテアソームによる天然プロセシングを促進するためにそれぞれの天然配列から５残基だけＮ末端側及びＣ末端側に隣接した（図５Ａ参照）。
【０１６５】
ＰａｐＭＶ  ｇｐ１００構築物を作製するため、以下のオリゴヌクレオチドを使用した：  
センスｇｐ１００オリゴヌクレオチド：
５’−ＣＴＡＧＴＴＣＴＴＣＴＧＣＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＡＴＧＧＡＣＣＡＧＧＴＴＣＣＧＴＴＣＴＣＴＧＴＴＴＣＴＧＴＴＴＣＴＣＡＧＣＴＧＡ−３’［配列番号２３］、及び
アンチセンスｇｐ１００オリゴヌクレオチド：
５’−ＣＴＡＧＴＣＡＧＣＴＧＡＧＡＡＡＣＡＧＡＡＡＣＡＧＡＧＡＡＣＧＧＡＡＣＣＴＧＧＴＣＣＡＴＧＡＴＧＧＴＧＡＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＡ−３’［配列番号２４］。
【０１６６】
これら２つのオリゴヌクレオチドをアニーリングし、ＳｐｅＩ及びＭｌｕＩ酵素で線状化したＣＰΔＮ５  ＰａｐＭＶ  ＣＰクローンのＳｐｅＩ及びＭｌｕＩ部位にクローニングした。
【０１６７】
ＰａｐＭＶ  ＦＬＵ構築物を作製するため、以下のオリゴヌクレオチドを使用した：
センスＦＬＵオリゴヌクレオチド：
５’−ＣＴＡＧＴＴＣＴＣＣＧＣＴＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＡＴＣＣＴＧＧＧＴＴＴＣＧＴＴＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＧＴＴＣＣＧＴＣＴＧＡＡＡ−３’［配列番号２５］、及び
アンチセンスＦＬＵオリゴヌクレオチド：
５’−ＣＴＡＧＴＴＴＣＡＧＡＣＧＧＡＡＣＧＧＴＣＡＧＧＧＴＧＡＡＡＡＣＧＡＡＡＣＣＣＡＧＧＡＴＡＣＣＴＴＴＧＧＴＣＡＧＣＧＧＡＧＡＡ−３’［配列番号２６］。
【０１６８】
これら２つのオリゴヌクレオチドをアニーリングし、ｇｐ１００構築物に関して上述したようにＣＰΔＮ５  ＰａｐＭＶ  ＣＰのＣ末端でクローニングした。
生じたＰａｐＭＶ  ｇｐ１００及びＰａｐＭＶ  ＦＬＵ構築物は、それらのＣ末端にそれぞれのペプチドの融合物を有するＰａｐＭＶ  ＣＰ遺伝子、次いで精製工程を容易にするための６×Ｈタグから構成された。ＰａｐＭＶクローンの配列をＤＮＡ塩基配列決定によって確認した。
【０１６９】
大腸菌におけるＰａｐＭＶ、ＰａｐＭＶ  ＦＬＵ及びＰａｐＭＶ  ｇｐ１００の発現
大腸菌発現株ＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を、上述した構築物の１つを含むプラスミドｐＥＴ−３ｄで形質転換し、アンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含む２×ＹＴ培地で維持した。細菌細胞を６００ｎｍで０．６の光学密度まで３７℃で増殖させ、１ｍＭイソプロピル−β−ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）でタンパク質発現を誘導した。誘導を２５℃で１６時間続けた。６０００  ｒｐｍで１５分間の遠心分離によって細菌を採集した。ペレットを氷冷溶解緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、２０μＭフッ化フェニルメタンスルホニル、１ｍｇ／ｍＬリゾチーム）に再懸濁し、フレンチプレスに１回通すことによって細菌を溶解した。溶解産物を１３，０００ｒｐｍで３０分間２回遠心分離して、細胞デブリを除去した。上清を、４℃で４時間、穏やかに攪拌しながらＮｉ−ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）１ｍＬと共にインキュベートした。溶解産物をカラムに負荷し、ビーズを、漸増濃度のイミダゾール（１０  ｍＭ、２０ｍＭ及び５０ｍＭ）を含む３×１５ｍＬ洗浄緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ）で洗浄した。次にビーズを作業緩衝液（１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８又は１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２）１５ｍＬで洗浄した。ＬＰＳ夾雑物を除去するために２回の洗浄工程を実施し、１回は１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、５０ｍＭイミダゾール、０．５％トリトンＸ１００、ｐＨ８で、もう１回は１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、５０ｍＭイミダゾール、１％両性洗浄剤（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ）、ｐＨ８で洗浄した。タンパク質を、１Ｍイミダゾールを含む作業緩衝液中で溶出した。溶出したタンパク質を、Ｂｅｃｋｍａｎ  ５０．２  ＴＩローターで１２０分間の高速超遠心（１００，０００ｇ）に供した。ＶＬＰペレットをエンドトキシン不含ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ社）に再懸濁した。最後に、０．４５ｕＭフィルターを用いてタンパク質溶液をろ過した。タンパク質濃度をＢＣＡタンパク質キット（Ｐｉｅｒｃｅ社）によって評価した。精製タンパク質中のＬＰＳのレベルを製造者（Ｃａｍｂｒｅｘ社）の指示に従いリムルス試験で評価したところ、０．００５エンドトキシン単位（ＥＵ）／μｇタンパク質以下であった。この手順により、細菌培養物１リットル当たり２０ｍｇ以上の精製ＶＬＰが生成された。
【０１７０】
電子顕微鏡検査及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ
タンパク質をＰＢＳで希釈し、カーボン被覆したフォームバーグリッドに３分間吸着させた。グリッドを脱イオン水で２回洗浄し、室温で１０分間、０．１％酢酸ウラニルで染色した。次にグリッドをＪｅｏｌ  ＪＥＭ２２０ＦＳ透過型電子顕微鏡で観察した。１００ＶＬＰの平均長をＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェアを用いて評価した。
【０１７１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）製のミニプロテアンシステム（ｍｉｎｉ−ｐｒｏｔｅａｎ  ｓｙｓｔｅｍ）を用いて当技術分野で記述されているように（Ｌｅｐａｇｅ  ａｎｄ  Ｌａｐｏｉｎｔｅ，２００６，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６６：２４２３−２４３２）実施した。タンパク質をクマシーブルー染色（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）によって明らかにした。一部の実験では、プロテイナーゼＫ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を１３μｇ／ｍｌの最終濃度で添加した。
【０１７２】
結果
大腸菌で生産された種々のＰａｐＭＶ  ＶＬＰの電子顕微鏡分析（図５Ｂ）により、長さが８０〜２００ｎｍの範囲で、直径がＰａｐＭＶ  ＶＬＰについては１５ｎｍ、操作したＰａｐＭＶ  ｇｐ１００及びＦｌｕ  ＶＬＰについては１６ｎｍの典型的な長い棒形構造が明らかになった。ＰａｐＭＶ  ＣＰは、大腸菌において、大きさ及び形状に関してＰａｐＭＶ  ＶＬＰと類似のＶＬＰへと自発的に組織化することができた。
【０１７３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、４℃のＰＢＳ中で新鮮なＶＬＰ及び７か月経過したＶＬＰ製剤に関して実施した。分解の証拠はゲル上で検出されなかった。さらに、製剤を室温で又は３７℃でさらに７日間インキュベートしたが、顕著な分解は認められなかった。最後に、ＰａｐＭＶ製剤を、分解についての陽性対照としてプロテイナーゼＫと共にインキュベートし、それにより、工学的に操作されたＰａｐＭＶ  ＶＬＰの速やかな分解が生じた。融合ペプチドを含まないＰａｐＭＶ  ＶＬＰはプロテイナーゼＫに対してより抵抗性であり、Ｃ末端の融合物がおそらくこの領域を局所的に不安定化し、この酵素に対する感受性を高めることを示唆した。
（実施例ＩＩＩ）
ＰａｐＭＶ  ＶＬＰ上で発現されるｇｐ１００及びインフルエンザＭ１エピトープのインビトロプロセシングと交差提示
ペプチド
ｇｐ１００及びＦｌｕペプチドは、ＧＬＢｉｏｃｈｅｍ  Ｓｈａｎｇａｉ社によって合成され、ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ社）に再懸濁された。
【０１７４】
培地及び細胞培養
Ｔリンパ球、樹状細胞（ＤＣ）及びＣＤ４０で刺激したＢリンパ球（ＣＤ４０−Ｂ）を、７．５％ヒト血清（熱不活化、正常ドナーから調製）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン及び１０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（最後の３つはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社及びＷｉｓｅｎｔ社より）を添加した完全培地（イスコフ改変ダルベッコ培地；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；及びＷｉｓｅｎｔ；  Ｓｔ−Ｂｒｕｎｏ，Ｑｕeｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）において当技術分野に記載されているように（Ｌａｐｏｉｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｃａｎ．Ｒｅｓ．６３：６５３−６６２）培養した。
【０１７５】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から、５００ｎｇ／ｍｌの可溶性三量体ＣＤ４０Ｌ（Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｓｅａｔｌｅ，ＷＡ）及び５００Ｕ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−４（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ；Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）の添加により、ＣＤ４０活性化Ｂ細胞を当技術分野で記述されているように（Ｌａｐｏｉｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：６５３−６６２；Ｌｅｐａｇｅ  ａｎｄ  Ｌａｐｏｉｎｔｅ，２００６，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６６：２４２３−２４３２）増殖させ、培養した。
【０１７６】
Ｓａｌｌｕｓｔｏ  ｅｔ  ａｌ，１９９４，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１１０９−１１１８が述べた最初のプロトコールを修正することにより、正常ドナーからのアフェレーシス製剤によって収集したＰＢＭＣからＤＣを作製した（Ｌａｐｏｉｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：３２９１−３２９８）。簡単に述べると、リンパ球分離培地（Ｗｉｓｅｎｔ社）での遠心分離によって血液からＰＢＭＣを濃縮した。組織培養フラスコ又はプレートにおいて３７℃で２時間後の接着後に単球を濃縮した（Ｔ−２５中３×１０７細胞、６穴平底プレート中１．５×１０７細胞／穴又は２４穴平底プレート中５×１０６細胞／穴、すべてＣｏｓｔａｒ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹより）。接着細胞をＰＢＳ（Ｗｉｓｅｎｔ社）で１回洗浄し、その後１００ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（１，０００Ｕ／ｍｌ）及び５００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４（１，０００Ｕ／ｍｌ）（どちらもＰｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪより）を添加した完全培地で培養した。ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を３日目と５日目に再び添加した。ＰａｐＭＶ  ＶＬＰ（実施例ＩＩで述べたように作製した）を６日目に添加し、認識及び増殖実験のために７日目に採集した。
【０１７７】
黒色腫細胞系１０８８ｍｅｌはＳｕｒｇｅｒｙ  Ｂｒａｎｃｈ（ＮＣＩ／ＮＩＨ）において樹立された。ＳＫ２３、Ｔ２及び乳癌細胞系ＭＤＡ２３１はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）より入手した。すべての腫瘍細胞系を、１０％熱不活化ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン及び１０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを添加したＲＰＭＩ  １６４０培地で培養した。
【０１７８】
ＰａｐＭＶをパルスしたＡＰＣからの交差提示
種々の標的細胞を、ｇｐ１００又はインフルエンザＭ１特異的Ｔ細胞による定義されたエピトープのＭＨＣクラスＩ提示に関して分析した。ｇｐ１００特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤの好意により提供され、２０９−２１７位の天然ＨＬＡ−Ａ＊０２０１制限エピトープ（ＩＴＤ  ＱＶＰ  ＦＳＶ；配列番号２７）及び２１０位にＭを有する修飾型（ＩＭＤ  ＱＶＰ  ＦＳＶ；配列番号２１）の両方に特異的であり、ペプチド／ＭＨＣ複合体の安定性を高めた。ｇｐ１００特異的Ｔ細胞を、Ｄｕｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ，１９９９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，２２：２８８−２９８によって記述された急速増殖プロトコールを用いて増殖させた。
【０１７９】
インフルエンザＭ１由来ＨＬＡ−Ａ＊０２０１制限エピトープ（５９−６７；ＧＩＬ  ＧＦＶ  ＦＴＬ；配列番号２２）に特異的なＴ細胞系を以下のように作製した。ＨＬＡ−Ａ＊０２＋正常ドナーからのＰＢＭＣを、特異的抗体（ＯｎｅＬａｍｂｄａ，Ｃａｎｏｇａ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）でのフローサイトメトリ（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）によって同定した。上述したように作製したＰＢＭＣを、４８穴プレートの多数のウェルにおいて上述した培地中の１μＭ合成ＦＬＵペプチドで刺激した。培養物を７日後に、ペプチドパルスした（１μＭで３時間、次いでＰＢＳ中で３回洗浄）自己ＰＢＭＣ又はＣＤ４０で刺激したＢリンパ球培養物のいずれかで再刺激した。その後インターロイキン（ＩＬ）−２（Ｃｈｉｒｏｎ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）を１５０ＩＵ／ｍｌで２〜３日ごとに添加し、培養物を２×１０６細胞／ｍｌに保持した。個々の培養物の特異性を、当技術分野で記述されているように（Ｌａｐｏｉｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：４７５８−４７６４）ペプチドパルスしたＴ２細胞との共培養後、結合抗体（Ｅｎｄｏｇｅｎ；Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）でのＥＬＩＳＡによるインターフェロン（ＩＦＮ）−γ分泌アッセイによって評価した。
【０１８０】
ＰａｐＭＶによって媒介される交差提示を評価するため、ＣＤ４０活性化Ｂ細胞又はＤＣに１０〜５０μｇ／ｍｌの様々な型の修飾ＰａｐＭＶ  ＣＰを２０時間パルスした。細胞を採集し、ＰＢＳで２回洗浄して、９６穴プレートの完全培地に接種した（４〜１０×１０４細胞／穴）。ｇｐ１００又はインフルエンザＭ１特異的Ｔ細胞を完全培地中２〜１０×１０４細胞／穴で２０時間添加した。培養上清を採集し、インターフェロン（ＩＦＮ）−γを当技術分野で記述されているように（Ｌｅｐａｇｅ  ａｎｄ  Ｌａｐｏｉｎｔｅ，２００６，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６６：２４２３−２４３２）ＥＬＩＳＡによって評価した。一部の実験では、ＡＰＣを５０〜７０μＭクロロキン（Ｓｉｇｍａ）又は２０〜２５μｇ／ｍｌラクタシスチン又は１．３〜３．３μＭ  ＭＧ−１３２（最後の２つはＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡより）で１時間、前処理した。細胞をＰＢＳで洗浄し、最初の阻害剤濃度の１／２０を含む培地に再懸濁した。処理した細胞に種々のＰａｐＭＶ変異体をパルスし、ＭＨＣクラスＩを介した提示の分析を上述したように実施した。
【０１８１】
Ｔ細胞増殖
ＣＤ４０活性化Ｂ細胞又はＤＣに様々な型のＰａｐＭＶ  ＣＰ（上記実施例ＩＩで述べたような）を２０時間パルスした。細胞を採集し、ＰＢＳで２回洗浄した。パルスしたＡＰＣ（２〜５×１０５）を、４８穴プレートの個々の穴において、完全培地５００μｌ中２×１０６細胞で自己ＰＢＭＣと共培養した。培地が黄色になったときは、培地２００μｌを除去し、新鮮な完全培地４００μｌを添加した。７日目から１０日目まで、新鮮ＰａｐＭＶをパルスしたＡＰＣ（５×１０５；２０時間パルスし、ＰＢＳで２回洗浄した）を個々の培養物に添加した。次にＩＬ−２を１００ＩＵ／ｍｌで３日ごとに添加した。
【０１８２】
その後１５日目から２０日目までＴ細胞の特異性を評価した。簡単に述べると、増殖させた細胞を、当技術分野で記述されているように（Ｌａｐｏｉｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：４７５８−４７６４）ペプチドパルスしたＴ２細胞と、又はＰａｐＭＶをパルスしたＡＰＣと共培養した。次に、当技術分野で記述されているように（Ｌｅｐａｇｅ  ａｎｄ  Ｌａｐｏｉｎｔｅ，２００６、同上）結合抗体（Ｅｎｄｏｇｅｎ；Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）でのＥＬＩＳＡによってＩＦＮ−γ分泌を評価した。あるいは、抗原特異的Ｔ細胞の頻度を、製造者の指示に従って結合抗体（ＭＡＢＴＥＣＨ）を使用して、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって評価した。スポットを自動計数器（ＣＴＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）で数えた。
【０１８３】
結果
ＤＣは、当技術分野では最適ＡＰＣと定義され、今回の実験で及び当技術分野において、ＣＤ４０刺激後に増殖したＢリンパ球は効率的なＡＰＣであることが明らかにされた。これらのＡＰＣにＰａｐＭＶ  ＶＬＰ、ＰａｐＭＶ  ｇｐ１００及びＰａｐＭＶ  Ｆｌｕをパルスし、ｇｐ１００及びインフルエンザＭ１タンパク質からのＭＨＣクラスＩエピトープに特異的な定義されたＴ細胞と共培養した。図７Ａに示すように、ＰａｐＭＶ  ｇｐ１００をパルスしたＡＰＣだけがｇｐ１００特異的Ｔ細胞クローンによって認識された。反対に、ＰａｐＭＶ  ＦｌｕをパルスしたＡＰＣだけがインフルエンザＭ１特異的Ｔ細胞によって認識された（図７Ｂ）。各々のＴ細胞培養物の特異性は、各エピトープに対応する合成ペプチドをＣＤ４０活性化Ｂ細胞にパルスすることによって確認された。また、特異的Ｔ細胞へのＰａｐＭＶ  Ｆｌｕの添加は、それらを刺激してＩＦＮ−γを分泌させることができず、ＡＰＣがペプチド認識のために必須であることを示した。
【０１８４】
ＨＬＡ−Ａ＊０２がペプチド提示に関与する制限要素であることを確認するため、２個体のさらなるＨＬＡ−Ａ＊０２ドナー及びこの対立遺伝子に関して陰性の他の２個体から作製したＡＰＣに関して同様の実験を実施した。図８Ａに示されるように、ＦＬＵ特異的Ｔ細胞は、主としてＨＬＡ−Ａ＊０２ドナーにパルスされたＰａｐＭＶ−Ｆｌｕと反応性であった（左のパネル）。ドナー番号３との弱い反応性は、ＦＬＵ  Ｔ細胞系が不均一であったという事実によって説明でき、もう１つのＭＨＣクラスＩ対立遺伝子によって潜在的に提示される、ペプチドに特異的なＴ細胞が培養物中に存在し得る。さらに、ｇｐ１００特異的Ｔ細胞クローンはＰａｐＭＶ  ｇｐ１００をパルスされたＨＬＡ−Ａ＊０２＋ＡＰＣとのみ反応性であり（図８Ａ；右のパネル）、関連制限エレメントを発現するＡＰＣが抗原提示のために必要であることをさらに確認した。最後に、ＭＨＣクラスＩによる提示は、当技術分野で実施されたように（Ｌａｐｏｉｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：２８３６−２８４３；Ｌａｐｏｉｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：４７５８−４７６４）、ＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩ又はＨＬＡ−ＤＲ提示をブロックする抗体を用いて制御された。対照として、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１とｇｐ１００の両方を発現する黒色腫細胞系をｇｐ１００特異的Ｔ細胞クローンと共培養したところ、予想されたように、ＭＨＣクラスＩ提示をブロックする抗体だけが認識を無効にした（図８Ｂ；右の部分）。ＨＬＡ−Ａ＊０２−／ｇｐ１００＋又は＋／−又は−／−系統とｇｐ１００特異的Ｔ細胞クローンの共培養は、当技術分野で明らかにされたように（Ｄｕｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２２：２８８−２９８；Ｌａｐｏｉｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：４７５８−４７６４）ＩＦＮ−γ分泌を誘発することができなかった。ブロッキング抗体のパネルをＰａｐＭＶ  ＦｌｕをパルスしたＡＰＣに適用したとき、抗ＭＨＣクラスＩだけが特異的Ｔ細胞系による認識を低下させた（図８Ｂ；左の部分）。これら最後のデータは、ＰａｐＭＶ−Ｆｌｕに由来するＦＬＵペプチドがＭＨＣクラスＩ、特にＨＬＡ−Ａ＊０２によって提示されたことを明らかにしている。
【０１８５】
ＰａｐＭＶ  ＶＬＰのプロセシングがプロテアソームによって媒介されるかどうかを調べるため、２つの異なるプロテアソーム阻害剤、すなわちラクタシスチンとＭＧ−１３２を利用し、それらの活性を、黒色腫細胞系によるｇｐ１００からのＨＬＡ−Ａ＊０２０１エピトープの古典的ＭＨＣクラスＩ提示をブロックすることによって制御した（図９；右の部分）。ＰａｐＭＶ  ＦｌｕをパルスしたＡＰＣを使用したとき、Ｍ１ペプチドの提示は両阻害剤によって影響されなかった（図９；左の部分）。エンドソームのｐＨを中和するクロロキンでの前処理はＦＬＵエピトープの交差提示に弱い負の作用を及ぼしたが、一方、予想されたように、同様の処理は黒色腫細胞の古典的ＭＨＣクラスＩ提示を変化させなかった。全体として、これらのデータは、ＰａｐＭＶ  ＶＬＰによって媒介されるＭＨＣクラスＩ交差提示がプロテアソーム非依存性であることを示唆する。
【０１８６】
また、ＰａｐＭＶ  ＶＬＰをパルスしたＡＰＣが、ＰＢＭＣからの不均一なＴ細胞集団から抗原特異的Ｔリンパ球を増殖させる能力を有するかどうかも評価した。ＤＣ及びＣＤ４０活性化Ｂリンパ球をＰａｐＭＶ  ＶＬＰでパルスし、パルスしたＡＰＣを上述したプロトコールに従って自己ＰＢＭＣと共培養した。特異的増殖Ｔ細胞の頻度を最初にＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって評価した。図１０Ａに示されるように、ＰａｐＭＶ  ＦｌｕをパルスしたＡＰＣをＰＢＭＣと共に使用したときＨＬＡ−Ａ＊０２０１インフルエンザＭ１ペプチドに特異的な細胞が生成され、もしくはＰａｐＭＶ又はＰａｐＭＶ  ｇｐ１００をパルスした細胞は、予想されたように、Ｆｌｕ特異的Ｔ細胞を生成することができなかった。黒色腫を有していない健常ドナーに関して予想されたように、ｇｐ１００特異的Ｔ細胞は生成されなかった。増殖したＴ細胞を、次に、様々なパルスしたＡＰＣに対する反応性に関して評価し、ＦＬＵペプチド及びＰａｐＭＶ  ＦｌｕのいずれかをパルスしたＡＰＣで増殖させたＴ細胞をＴ細胞増殖のために使用したとき、ＩＦＮ−γ分泌は等しく高いと思われた（＞５０００；図１０Ｂ）。ＰａｐＭＶ、ＰａｐＭＶ  ｇｐ１００及びＰａｐＭＶ  ＦｌｕのいずれかをパルスしたＡＰＣは、ＰａｐＭＶ  ＣＰに特異的なＴ細胞を生成することができず、ＰａｐＭＶ  ＣＰへの細胞性プレ免疫は最小限であることを示唆した。最後に、増殖したＴ細胞を、種々の量のＨＬＡ−Ａ＊０２０１インフルエンザＭ１ペプチドをパルスしたＴ２細胞と共に共培養した（図１１）。２つの独立した実験において、Ｔ細胞は０．１及び０．０１ｎＭのペプチドをパルスしたＴ２細胞を認識する能力を有するので、高い結合活性を有する高度反応性Ｔ細胞が生成された。分泌は大部分が＞１００，０００ｐｇ／ｍｌと非常に高く、インフルエンザＭ１ペプチドをパルスしたＡＰＣで惹起されるＴ細胞は概して結合活性がより低かった。これらの実験から、ＰａｐＭＶをパルスしたＡＰＣは、高い結合活性を有する特異的Ｔ細胞を増殖させる能力を有していたと結論される。興味深いことに、ＰａｐＭＶ  ＣＰに対する既存の細胞性プレ免疫の証拠は存在しない。
（実施例ＩＶ）
Ｈ１Ｎ１  Ｍ２ｅインフルエンザ抗原を含むＰａｐＭＶ  ＶＬＰの生産及び工学的操作
ＰａｐＭＶコートタンパク質のクローニング及び工学的操作
ＰａｐＭＶ  ＣＰ遺伝子を、以下のプライマーを使用して単離したウイルスＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによって増幅した：
５’−ＡＧＴＣＣＣＡＴＧＧＣＡＴＣＣＡＣＡＣＣＣＡＡＣＡＴＡＧＣＣＴＴＣ−３’［配列番号２８］、及び
５’−ＧＡＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＴＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＣＧＣＧＴＧＧＴＡＣＴＡＧＴＴＴＣＧＧＧＧＧＧＴＧＧＡＡＧＧＡＡＴＴＧＧＡＴＧＧＴＴＧＧ−３’［配列番号２９］。
【０１８７】
ＰＣＲ産物をＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩフラグメントとしてｐＥＴ  ３Ｄ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）にクローニングして、トランケート型コートタンパク質ＣＰΔＮ５を作製した。ＣＰΔＮ５のＣ末端におけるＭ２ｅペプチドの融合を促進するため、ＳｐｅＩ及びＭｌｕＩ制限部位を、配列番号２８と以下のプライマーを用いたＰＣＲによってタンパク質のＣ末端に導入した：
５’−ＧＡＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＴＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＣＧＣＧＴＧＧＴＡＣＴＡＧＴＴＴＣＧＧＧＧＧＧＴＧＧＡＡＧＧＡＡＴＴＧＧＡＴＧＧＴＴＧＧ−３’［配列番号４５］。
【０１８８】
ＰＣＲ産物をＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩフラグメントとしてｐＥＴ  ３Ｄ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）にクローニングした。生じたクローン、ＣＰΔＮ５−ＳＭをすべてのＭ２ｅ構築物のクローニングと融合のために使用した。ＣＰΔＮ５−ＳＭのアミノ酸配列を図１Ｆに示し（配列番号４６）、ヌクレオチド配列を図１Ｍ（配列番号４９）に示す。
【０１８９】
ＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅ構築物を作製するため、以下のオリゴヌクレオチドを使用した：
Ｍ２ｅフォワード：
５’−ＣＴＡＧＴＴＣＣＣＴＧＣＴＧＡＣＣＧＡＡＧＴＧＧＡＡＡＣＣＣＣＧＡＴＴＣＧＣＡＡＣＧＡＡＴＧＧＧＧＣＴＧＣＣＧＣＴＧＣＡＡＣＧＡＴＴＣＣＴＣＣＧＡＴＡ−３’［配列番号３０］、及び
Ｍ２ｅリバース：
５’−ＣＧＣＧＴＡＴＣＧＧＡＧＧＡＡＴＣＧＴＴＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＣＣＣＡＴＴＣＧＴＴＧＣＧＡＡＴＣＧＧＧＧＴＴＴＣＣＡＣＴＴＣＧＧＴＣＡＧＣＡＧＧＧＡＡ−３’［配列番号３１］。
【０１９０】
これら２つのオリゴヌクレオチドを一緒にアニーリングし、ＳｐｅＩとＭｌｕＩで消化した後、ＳｐｅＩ／ＭｌｕＩで線状化したＣＰΔＮ５−ＳＭクローンに連結した。ＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅクローンのＤＮＡ配列を確認し、図１Ｅ［配列番号５］に示す。ＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅクローンによってコードされるアミノ酸配列を図１Ｄ［配列番号４］に示す。
【０１９１】
ＰａｐＭＶ及びＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅの発現と精製
ＰａｐＭＶＣＰ構築物の発現と精製を、わずかな修正を加えて先に述べられているように（Ｔｒｅｍｂｌａｙ  ｅｔ  ａｌ．２００６，ＦＥＢＳ  Ｊ．２７３：１４）実施した。簡単に述べると、フレンチプレスを通して細菌を溶解し、その後Ｎｉ２＋カラムに負荷して、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、５０ｍＭイミダゾール、０．５％トリトンＸ１００、ｐＨ８で洗浄し、次に１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、５０ｍＭイミダゾール、１％両性洗浄剤、ｐＨ８で洗浄してエンドトキシン汚染を除去した。ＶＬＰを単離するため、溶出したタンパク質をＢｅｃｋｍａｎ  ５０．２  ＴＩローターで１２０分間の高速遠心（１００，０００ｇ）に供した。ペレット中で認められたＶＬＰをエンドトキシン不含ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ社）に再懸濁した。超遠心の上清からＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅディスクを得た。ディスクの緩衝液交換は、エンドトキシン不含ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ社）に対する透析によって実施された。ＥＬＩＳＡのために使用したＭ２ペプチドは、ＧＬＢｉｏｃｈｅｍ  Ｓｈａｎｇａｉ社によって合成され、エンドトキシン不含ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ社）に再懸濁された。使用前に０．４５μＭフィルターを用いてタンパク質溶液をろ過した。ＢＣＡタンパク質キット（Ｐｉｅｒｃｅ社）を使用してタンパク質の量を評価した。精製タンパク質中のＬＰＳのレベルを、製造者（Ｃａｍｂｒｅｘ社）の指示に従ってリムルス試験で評価したところ、０．００５エンドトキシン単位（ＥＵ）／μｇタンパク質以下であった。
【０１９２】
電子顕微鏡検査
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び電気ブロッティングを、先に述べられているように（Ｔｒｅｍｂｌａｙ，ｅｔ  ａｌ．，２００６、同上）実施した。タンパク質をＰＢＳで希釈し、カーボン被覆したフォームバーグリッドに３分間吸着させた。グリッドを脱イオン水で２回洗浄し、室温で１０分間、０．１％酢酸ウラニルで染色した。次にグリッドをＪｅｏｌ  ＪＥＭ２２０ＦＳ透過型電子顕微鏡で観察した。Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェアを使用し、１００ＶＬＰを測定することによって平均ＶＬＰ長を評価した。
【０１９３】
結果
インフルエンザウイルス株Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９）のＭ２（イオンチャネル）に由来する普遍的Ｍ２ｅを本実施例において使用した。このペプチドはまた、ヒトに感染するインフルエンザウイルス株の８５％以上で認められる。ペプチドをＰａｐＭＶ  ＣＰのＣ末端、次いで６×Ｈタグに融合させた（図１２Ａ）。大腸菌でのＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅの発現は、ＰａｐＭＶ−ＶＬＰに類似する約１００ｎｍ長のＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰ（図１２Ｂ）及びＣＰサブユニットの２０サブユニットで構成されるディスクの生産を生じさせた。ＶＬＰ及びディスクは、組換えタンパク質のＣ末端に位置する６×Ｈタグ及び  Ｎｉ２＋カラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて容易に精製することができた。それらの形態の各々の精製は、ＶＬＰをペレットから単離し、ディスクを上清から単離する、超遠心（１００，０００ｇで９０分間）を通して容易に実施できる。
（実施例Ｖ）
Ｍ２ｅインフルエンザ抗原を含むＰａｐＭＶ  ＶＬＰによるマウスの免疫
ＰａｐＭＶ  ＶＬＰ及びＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰを実施例ＩＶで述べたように作製した。
【０１９４】
マウスの免疫
５匹の４〜８週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）に、ＰａｐＭＶ  ＶＬＰ、ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰ又はＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰ＋ＩｇＧ  １００μｇを皮下注射した。３番目の群で使用したＩｇＧは、ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰでワクチン接種したマウスから単離したポリクローナル血清０．５μｌを指す。初回免疫に続いて、２週間後に１回の追加接種を実施した。種々の時点で血液試料を採取し、分析まで−２０℃で保存した。
【０１９５】
ＥＬＩＳＡ定量
Ｃｏｓｔａｒ  Ｈｉｇｈ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ９６穴プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，ＵＳＡ）を、０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３緩衝液、ｐＨ９．６中で１μｇ／ｍｌ濃度に希釈したＭ２ペプチド（ＳＳＬＬＴＥＶＥＴＰＩＲＮＥＷＧＣＲＣＮＤＳＳＤ；配列番号６）１００μｌ／穴で、４℃にて一晩被覆した。プレートをＰＢＳ／０．１％トゥイーン−２０／２％ＢＳＡ（１５０μｌ／穴）により３７℃で１時間ブロックした。ＰＢＳ／０．１％トゥイーン−２０で３回洗浄した後、血清を１：５０から始まる２倍段階希釈に添加し、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを３回洗浄し、ＰＢＳ／０．１％トゥイーン−２０／２％ＢＳＡ中１／１０，０００希釈のペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ（すべてＪａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ社より）、ＩｇＧ３（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社）１００μｌと共に３７℃で１時間インキュベートした。３回の洗浄後、ＩｇＧの存在を、製造者の指示に従ってＴＭＢ−Ｓ  １００μｌで検出した；０．１８ｍＭ  Ｈ２ＳＯ４  １００μｌを添加することによって反応を停止させ、４５０ｎｍでＯＤを読み取った。結果は、ＯＤ値がＰＢＳマウスからの血清の１：５０希釈で得られたバックグラウンド値の３倍であるときに測定された、抗体終点力価として表されている。
【０１９６】
ウイルスの増殖、力価測定及び防御アッセイ
インフルエンザウイルス（Ａ／ＷＳＮ／３３、Ｈ１Ｎ１サブタイプ）を、先に述べられているように（Ａｂｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ａｎｔｉｖｉｒ．Ｔｈｅｒ．９：５７７−５８１）増殖させ、精製し、力価測定した。肺ウイルス力価及び中和力価を、先に述べられているように（Ａｂｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、同上）メイディン‐ダービー（Ｍａｒｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ）イヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞に関して定量した。マウスを、ＰＢＳで希釈したウイルス１００μｌに鼻内感染させた（致死的感染、３０００ＰＦＵ／マウスの生ウイルス又は３ＬＤ５０）。症状の発現を感染後２、５、６、７、８、９、１０、１２及び２０日目に観測した。
【０１９７】
結果
ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰ又はディスクが免疫応答を誘導する能力を検討するため、２０匹のＢａｌｂ／Ｃマウスに組換えＶＬＰ又はディスク１００μｇを皮下注射した。各々の用量中に存在するＭ２ｅペプチドの量は８μｇと推定される。初回免疫の１５日後に追加接種を実施した。マウス血清を、注射後２３日目に抗Ｍ２ｅ抗体に関して検定した（図１３）。免疫応答の分析は、ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅディスクが弱い免疫原性であるか又は全く免疫原性でないことを明らかにする。しかし、ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰは、処置した２０匹のマウスのうち１１匹において高い力価に達する体液性応答を誘発することができた（＞ｌ／１６００；図１３に示す対数スケール（２×５０）で８）。残りのマウス（９／２０）も、力価はより低かったが、ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅに応答する抗体を示した。総ＩｇＧ応答の間には大きな変動が認められた（図１３）。
【０１９８】
ＶＬＰの免疫原性を改善するため、ワクチン接種したマウスからの血清でＶＬＰをオプソニン化した。抗体の免疫調節特性は以前に明らかにされているが、免疫応答を刺激する上で能動的な役割を果たすことが示された（総説についてはＢｒａｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，７５：６７１−６７８参照）。５匹のワクチン接種マウスのプールから単離した血清０．５μｌを、高力価を示したＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰ（ＶＬＰ  １００μｇを含む）の２００μｌ容量に添加し、皮下経路で投与した。２０匹のマウスのうち１９匹が抗体の高力価の生産を生じたことから、ＶＬＰ単独と比較して改善は著明であった（図１３）。
【０１９９】
インフルエンザでの抗原投与に対する防御アッセイ
マウスを、２８日目に３×１０３ｐｆｕ（３ＬＤ５０）のインフルエンザＨ１Ｎ１株Ａ／ＷＳＮ／３３で抗原投与した。この株は、マウスにおいて増殖し、高いビルレンスを示すように適合された（Ｆｒａｎｃｉｓ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ，１９４０，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．７２，７１７−７２８）。症状の発現を毎日追跡した。動物が２５％以上の体重減少を示したら犠死させた。結果から、ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰがマウスの４５％（２０匹のうち９匹）に感染に対する防御を与え得ることが明確に示された（図１４）。ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰでワクチン接種したマウスのプールから単離した血清によるＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰのオプソニン化（上述したような）は、抗原投与に対する防御を有意に改善し、マウスの８０％が防御された。これらの結果は、オプソニン化ＶＬＰで認められた抗体価の改善（図１４）が、感染に対する防御の改善として表れたことを示唆する。
【０２００】
ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰ及びＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰ＋ＩｇＧでワクチン接種したマウスの各々のＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂの力価を評価した。サブタイプ分類された抗体のレベルと防御のレベルの間の相関を調べるために結果をプロットした（図１５）。結果から、ＩｇＧａ及びＩｇＧｂの高力価を示すマウスは抗原投与に対しても最良の防御を示すことが明確に実証された。一部の防御された動物はサブタイプ分類されたＩｇＧの１つのみを示すことが認められたが（２０匹のうち２匹）、これらの結果は、一般に、ＩｇＧａ及びＩｇＧｂ抗体アイソタイプの両方がインフルエンザによる感染に対する防御において重要であったことを示している。
【０２０１】
ＩｇＧの力価及び防御のレベルは、ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰ＋ＩｇＧでワクチン接種された動物において改善された。抗原投与を生き延びた動物は、一般に、オプソニン化された粒子でワクチン接種されたとき感染のより軽い症状を示すことが認められた。この所見を確認するため、ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰ＋ＩｇＧでのワクチン接種を生き延びた動物（９匹の動物）の体重減少をプロットし、オプソニン化ＶＬＰで処置した動物（１６匹の動物）の体重と比較した（図１６）。グラフは、オプソニン化粒子でワクチン接種されたマウスは体重減少の程度がより小さく、ＶＬＰ単独でワクチン接種されたマウスよりも良好な適応度を示したことを明瞭に示している。
（実施例ＶＩ）
ＰａｐＭＶＣＰ−Ｅ２及びＰａｐＭＶＣＰ２７−２１５−Ｅ２の生産及び工学的操作
本実施例は、ＰａｐＭＶコートタンパク質の多量体化がＰａｐＭＶ  ＶＬＰの免疫原性にとって必須であることを明らかにする。
【０２０２】
ＰａｐＭＶコートタンパク質のクローニング及び工学的操作
ＰａｐＭＶ  ＣＰΔＮ５−ＳＭ遺伝子を実施例ＩＶで述べたようにクローニングした。ＰａｐＭＶＣＰ−Ｅ２構築物を作製するため、以下のオリゴヌクレオチドを使用した：
５’−ＧＡＴＣＡＣＴＡＧＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＧＴＡＣＣＡＣＣＧＡＴＣＧＴＡＧＣＧＧＴＧＣＧＣＣＧＡＣＣＴＡＣＡＧＣＴＧＧＧＧＴＧＣＧＡＡＣＧＡＴＡＣＧＣＧＴＣＡＴＧ−３’［配列番号３２］、及び
５’−ＣＡＴＧＡＣＧＣＧＴＡＴＣＧＴＴＣＧＣＡＣＣＣＣＡＧＣＴＧＴＡＧＧＴＣＧＧＣＧＣＡＣＣＧＣＴＡＣＧＡＴＣＧＧＴＧＧＴＡＣＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＡＣＴＡＧＴＧＡＴＣ−３’［配列番号３３］。
【０２０３】
これら２つのオリゴヌクレオチドを一緒にアニーリングし、ＳｐｅＩとＭｌｕＩで消化した後、ＳｐｅＩ／ＭｌｕＩで線状化したＰａｐＭＶ  ＣＰΔＮ５−ＳＭクローンに連結した。
【０２０４】
トランケート型コートタンパク質−Ｅ２融合物、ＰａｐＭＶＣＰ２７−２１５−Ｅ２のための発現ベクターを、ＰａｐＭＶ  ＣＰの最初の２６アミノ酸を欠失するように設計した２つのオリゴヌクレオチド（ＮｃｏＩ制限部位を含む）を最初に作製することによってＰａｐＭＶＣＰ−Ｅ２プラスミドから構築した。これらのオリゴヌクレオチドを、トランケート型コートタンパク質をＰＣＲ増幅するために使用した：
フォワードプライマー：
５’−ＡＧＴＣＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＴＣＣＡＡＣＧＴＣＣＡＡＴＣＴＴＣＴＧ−３’［配列番号３４］、及び
リバースプライマー：
５’−ＡＣＧＴＣＣＡＴＧＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＡＡＧ−３’［配列番号３５］。
【０２０５】
次にＰＣＲ産物を自己連結させた。ＰａｐＭＶＣＰ２７−２１５のための発現ベクターは、ＰａｐＭＶＣＰ２７−２１５−Ｅ２クローンの構築と同じ手順に従ってＰａｐＭＶＣＰプラスミドから誘導された。すべてのＰａｐＭＶクローンの配列をＤＮＡ塩基配列決定によって確認した。
【０２０６】
ＰａｐＭＶＣＰ−Ｅ２及びＰａｐＭＶＣＰ２７−２１５−Ｅ２の発現と精製
ＰａｐＭＶＣＰ構築物の発現と精製を実施例ＩＶで述べたように実施した。Ｅ２ペプチドは、ＧＬＢｉｏｃｈｅｍ  Ｓｈａｎｇａｉ社によって合成され、エンドトキシン不含ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）に再懸濁された。使用前に０．４５μＭフィルターを用いてタンパク質溶液をろ過した。ＢＣＡタンパク質キット（Ｐｉｅｒｃｅ社）を使用してタンパク質の量を評価した。精製タンパク質中のＬＰＳのレベルを、製造者（Ｃａｍｂｒｅｘ社）の指示に従ってリムルス試験で評価したところ、０．００５エンドトキシン単位（ＥＵ）／μｇタンパク質以下であった。
【０２０７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、電気ブロッティング及び電子顕微鏡検査
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び電気ブロッティングを先の実施例で述べたように実施した。タンパク質をＰＢＳで希釈し、カーボン被覆したフォームバーグリッドに３分間吸着させた。グリッドを脱イオン水で２回洗浄し、室温で１０分間、０．１％酢酸ウラニルで染色した。次にグリッドをＪｅｏｌ  ＪＥＭ２２０ＦＳ透過型電子顕微鏡で観察した。Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェアを使用し、１００ＶＬＰを測定することによって平均ＶＬＰ長を評価した。
【０２０８】
免疫化
５匹の４〜８週齢のＣ３Ｈ／ＨｅＪマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）に、ＰａｐＭＶＣＰ−Ｅ２、ＰａｐＭＶＣＰ２７−２１５−Ｅ２  ２５μｇ又は当量のＥ２ペプチド（２μｇ）又はエンドトキシン不含ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ社）を皮下注射した。初回免疫に続いて、２週間後に１回の追加接種を実施した。種々の時点で血液試料を採取し、分析まで−２０℃で保存した。すべての実験プロトコールはラヴァル大学動物保護委員会によって承認された。
【０２０９】
ＥＬＩＳＡ定量
Ｃｏｓｔａｒ  Ｈｉｇｈ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ９６穴プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，ＵＳＡ）を、０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３緩衝液、ｐＨ９．６中で１μｇ／ｍｌ濃度に希釈したＰ３、Ｐ３Ｅ２、ＰａｐＭＶＣＰ、ＰａｐＭＶＣＰ２７−２１５又はＰａｐＭＶＣＰ−Ｅ２  １００〜２００μｌ／穴で、４℃にて一晩被覆した。プレートをＰＢＳ／０．１％トゥイーン−２０／２％ＢＳＡ（１５０μｌ／穴）により３７℃で１時間ブロックした。ＰＢＳ／０．１％トゥイーン−２０で３回洗浄した後、血清を１：５０から始まる２倍段階希釈に添加し、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを３回洗浄し、ＰＢＳ／０．１％トゥイーン−２０／２％ＢＳＡ中１／１０，０００希釈のペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ（すべてＪａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ社より）、ＩｇＧ３（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社）１００μｌと共に３７℃で１時間インキュベートした。３回の洗浄後、ＩｇＧの存在を、製造者の指示に従ってＴＭＢ−Ｓ  １００μｌで検出した；０．１８ｍＭ  Ｈ２ＳＯ４  １００μｌを添加して反応を停止させ、４５０ｎｍでＯＤを読み取った。結果は、ＯＤ値がＰＢＳマウスからの血清の１：５０希釈で得られたバックグラウンド値の３倍であるときに測定された、抗体終点力価として表されている。
【０２１０】
ヒト血清における抗体レベルの測定のために、二次抗体としてペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧを１／８０，０００の希釈で使用したことを除き、同じ条件を適用した。感染ＨＣＶ患者からの血清はＢ．Ｗｉｌｌｅｍｓ（Ｈｏｐｉｔａｌ  Ｓａｉｎｔ  Ｌｕｃ，  ＣＨＵＭ）より提供された。結果は、ＯＤ値が、１５名の非感染患者からの血清のプールからの血清の１：２５希釈で得られたバックグラウンド値の３倍であるときと定義された、抗体終点力価として表されている。
【０２１１】
脾細胞の再刺激
ＣＤ−１（２２週齢）を０、１５、３０及び４５日目にＰａｐＭＶＣＰ−Ｅ２（２５μｇ）で免疫した後、６５日目に犠死させた。秘蔵を切除し、ＤＭＥＭ（２×１０５細胞／穴）に懸濁した。赤血球を高張性塩化アンモニウム溶液で除去した。脾細胞を洗浄し、９６穴平底マイクロプレート（Ｃｏｓｔａｒ社）においてＤＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ［ＨｙＣｌｏｎｅ］、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム及び５０μＭ  β−メルカプトエタノールを添加したＤＭＥＭ）２００μｌ中に２．５×１０５細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。試料を２５μｇ／ｍｌのＰａｐＭＶＣＰ又はＰａｐＭＶＣＰ−Ｅ２  ＶＬＰと共に４日間インキュベートした。コンカバリンＡ（Ｃｏｎｃａｖａｌｉｎ  Ａ）（ＣｏｎＡ−１０μｇ／ｍｌ）とＰＢＳを陽性及び陰性対照として使用した。細胞培養上清を収集し、液体マウス１０サイトカインキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてサイトカインを測定した。
【０２１２】
マウスにおける気嚢
１０〜１２週齢のＣＤ−１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）において空気嚢を惹起した。空気嚢は、０日目と３日目に無菌空気３ｍｌを皮下注射することによって背部に惹起した。７日目に、１ｍｌの組換えＰａｐＭＶＣＰ（１〜１０μｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）又はＰＢＳを空気嚢に注入した。処置の６時間後、ＣＯ２を用いた窒息によってマウスを屠殺した。空気嚢をＰＢＳ−５ｍＭ  ＥＤＴＡ  １ｍｌで１回洗浄し、ＰＢＳ−５ｍＭ  ＥＤＴＡ  ２ｍｌで２回洗浄して、滲出液を室温にて５００×ｇで５分間遠心分離した。アセティックブルー（ａｃｅｔｉｃ  ｂｌｕｅ）染色後に血球計で細胞を計数した。
【０２１３】
骨髄細胞抽出及びＡＰＣの分別
骨髄前駆細胞をＢＡＬＢ／ｃマウスの大腿骨から得て、樹状細胞分化骨髄培地（５％Ｘ６３−ＧＭ−ＣＳＦ上清培地培養物を添加した、１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含む９５％ＲＰＭＩ；Ｘ６３−ＧＭ２４７  ＣＳＦ細胞系は、Ｂ．Ｌｕｄｅｗｉｇ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，Ｋａｎｔｏｎａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｓｔ．Ｇａｌｌｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）内で、６日間培養した。培地を２日目と４日目に部分的に交換した。６日目に、培地を、ＬＸ６３馴化培地を含まない培地と交換した。７日目に、ＦＩＴＣ抗ＣＤ１１ｃ及びＰＥ−Ｃｙ５．５抗ＣＤ１１ｂ表面マーカー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用したフローサイトメトリによってＡＰＣの冨化を確認した。試料は２５％のＣＤ１１ｃ＋Ｃｄ１１ｂ＋細胞、８０％を上回るＣＤ１１ｂ＋細胞を含んだ。この試料を「ＡＰＣ」と称する。
【０２１４】
フローサイトメトリ
ＡＰＣへのＰａｐＭＶＣＰ−Ｅ２及びＰａｐＭＶＣＰ２７−２１５−Ｅ２のインターナリゼーションを評価するため、ＡＰＣに由来する１００万骨髄細胞をＰａｐＭＶＣＰ−Ｅ２及びＰａｐＭＶＣＰ２７−２１５−Ｅ２のいずれか２５μｇと共に３７℃で２時間インキュベートした。簡単に述べると、細胞を４℃で１５分間、ＰＢＳ１０％ＦＢＳ及び抗ＣＤ１６／ＣＤ３２（１μｇ／１００万細胞）でブロックした。ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞を室温で１０分間、ＰＢＳ／２％パラホルムアルデヒドで固定した。透過処理緩衝液（ＰＢＳ、１０％ＦＢＳ、０．２％トリトンＸ−１００）で２回洗浄した後、細胞を、透過処理緩衝液で１／２００希釈したウサギポリクローナル抗体と共に４℃で４５分間インキュベートした。透過処理緩衝液での２回の洗浄後、細胞を、透過処理緩衝液で１／５０００希釈した二次抗体（ウサギ抗ＩｇＧアレクサ４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社））と共に４℃で４５分間インキュベートした。ＰＢＳでの洗浄後、細胞を直ちにＥＰＩＣＳ−ＸＬサイトフルオロメーターで分析した。データ解析はＷＩＮＭＤＩ２．８を用いて実施した。検出のために使用したウサギポリクローナルＡｂは発明者の施設で生産した：ウサギ免疫前血清を陰性対照として使用した。
【０２１５】
共焦点顕微鏡検査
ＡＰＣを、先に述べたのと同じ分別プロトコールに従って、底部に無菌スライドガラスを含む１２穴プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，ＵＳＡ）で増殖させた（２００，０００細胞／穴）。抗原インターナリゼーション試験のために、抗原５μｇ／２００，０００細胞を使用した。固定、透過処理、及び一次抗体と二次抗体のインキュベーション工程はフローサイトメトリに関して述べた通りであった。スライドガラスを、×６０油浸対物レンズを備えたＦｌｕｏｖｉｅｗ  Ｆｖ３００共焦点顕微鏡で直ちに分析した。非特異的チャネル緩衝を回避するため連続的に及びｘ−ｚ切断によって蛍光画像を取得した。画像をその後Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアでデジタル処理した。
【０２１６】
統計解析
ノンパラメトリッククラスタル‐ワリス（Ｋｒｕｓｔａｌ−Ｗａｌｌｉｓ）及びダン（Ｄｕｎｎ）の多重比較検定法を統計解析のために使用した。Ｐ＜０．０５の値を統計的に有意とみなした。統計解析をＰＲＩＳＭ  ３．０３プログラムで実施した。
【０２１７】
結果
精製組換えタンパク質は、ＰａｐＭＶＣＰ及びＰａｐＭＶＣＰ−Ｅ２に関して２３ｋＤａ（ＰａｐＭＶＣＰ２７−２１５−Ｅ２）と２６ｋＤａの予想された分子量を示し、エンドトキシンレベルは常に０．００５ＥＵ／μｇタンパク質を下回った。電子顕微鏡検査（ＥＭ）により、ＰａｐＭＶＣＰのＣ末端におけるＥ２ペプチドの付加が、組換えＰａｐＭＶＣＰ  ＶＬＰに類似したＶＬＰへと自己組織化するタンパク質の能力に影響を及ぼさないことが確認された。予想されたように、ＰａｐＭＶＣＰ２７−２１５−Ｅ２はＶＬＰを形成することができず、先に示されているように単量体形態のままであった（Ｌｅｃｌｅｒｃ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７３：２９０１５−２１）。ＶＬＰの長さは多様であり、２０１±８０ｎｍのサイズ範囲内であった。２０１ｎｍ長のタンパク質は、Ｅ２ペプチドを反復的及び結晶性に提示するＣＰの５６０のコピーである。
【０２１８】
ＰａｐＭＶＣＰ  ＶＬＰのプロ炎症性特性を試験するため、マウス空気嚢モデルを使用した。非常に低いＬＰ含量（＜０．００５ＥＵ／μｇ）を有するＰａｐＭＶＣＰ  ＶＬＰ  １０μｇの注射は、処置の６時間後にＣＤ１マウスの空気嚢への白血球の動員を誘導することができなかった。これに対し、１，０００及び１ＥＵの用量のＬＰＳの注射は白血球の動員を誘導する上で非常に有効であった（図１７）。この結果は、ＰａｐＭＶＣＰ  ＶＬＰが６時間後にプロ炎症性ではないこと及びＰａｐＭＶＣＰタンパク質試料中の非常に低いレベルのＬＰＳはその後の実験においていかなる著明な免疫原性作用も及ぼさないことを示唆する。
【０２１９】
単量体（ＰａｐＭＶＣＰ２７−２１５−Ｅ２）及び多量体（ＰａｐＭＶＣＰ−Ｅ２）形態が，骨髄由来の樹状細胞（ＢＭＤＤＣ）中で冨化された骨髄由来ＡＰＣにインターナリゼーションされる能力を試験した。フローサイトメトリ分析は、ＡＰＣが多量体及び単量体形態の両方によって効率的に免疫標識されることを示した（ＰａｐＭＶＣＰ−Ｅ２  ＶＬＰについては９５．３％及びＰａｐＭＶＣＰ２７−２１５−Ｅ２  ＶＬＰについての９２．６％）。組換えタンパク質とＡＰＣの相互作用を視覚化するため、処理したＡＰＣを共焦点顕微鏡によって観察した。どちらの場合も、免疫標識されたＰａｐＭＶＣＰシグナルは明らかに小胞性であり、細胞質内及び核周囲に存在した。両方の組換えタンパク質がＡＰＣによって効率良くインターナリゼーションされた。
【０２２０】
ＰａｐＭＶＣＰ  ＶＬＰが免疫応答を誘導する能力を調べるため、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスに組換えＶＬＰ（ＰａｐＭＶＣＰ−Ｅ２）２５μｇ又は単量体形態（ＰａｐＭＶＣＰ２７−２１５−Ｅ２）２５μｇを皮下注射した。各々の用量中に存在するＥ２ペプチドの量は２μｇと推定される。初回免疫の１５日後に追加接種を実施した。マウス血清を抗ＰａｐＭＶＣＰ、ＰａｐＭＶＣＰ２７−２１５及び抗Ｅ２ペプチド抗体に関して検定した。抗ＣＰ  ＩｇＧは、１２日目にＰａｐＭＶＣＰ−Ｅ２で免疫したマウスにおいて明確に検出され、一方ＰａｐＭＶＣＰ２７−２１５−Ｅ２でワクチン接種したマウスの血清では、１５日目の追加免疫後でさえも、弱いレベルの抗ＣＰしか検出されなかった（図１８）。
（実施例ＶＩＩ）
ＰａｐＭＶのアジュバント作用
ＰａｐＭＶの精製
ＰａｐＭＶを実施例Ｉで述べたように精製した。
【０２２１】
抗原
ＬＰＳ不含のＯＶＡグレードＶＩをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ．より購入した。ニワトリ卵白リゾチーム（ＨＥＬ）はＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ  Ｉｎｃ．Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨより購入した。大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４からのＬＰＳはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯより購入した。
【０２２２】
免疫
６−８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスから採血し、マウスをＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，Ｆａｃｕｌｔｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｅｘｉｃｏ（ＵＮＡＭ）の動物施設の下で保持して、医薬品安全性試験実施基準に従って飼育した。アジュバントの作用を調べるため、マウスの群を０日目にＯＶＡ又はＨＥＬ  ２ｍｇ単独で、又はＰａｐＭＶ、ＣＦＡ  １：１（ｖ／ｖ）３０ｍｇと共に、又は大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４からのＬＰＳ  ５ｍｇ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）と共にｉ．ｐ．免疫した。対照マウスには食塩水だけを注射した。血液試料を、図１９に示されているように、様々な時点で眼窩後洞から収集した。個々の血清試料を分析まで−２０℃で保存した。３匹のマウスを各々の実験で使用した。
【０２２３】
ＥＬＩＳＡによる抗体価の測定
高結合９６穴ポリスチレンプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標），Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）を０．１Ｍ炭酸−重炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）中１ｍｇ／ｍＬのＰａｐＭＶ、１００ｍｇ／ｍＬのＨＥＬ又は１５０ｍｇ／ｍＬ  ＯＶＡで被覆した。プレートを３７℃で１時間、次に４℃で一晩インキュベートした。翌朝、使用前にプレートを、０．０５％トゥイーン−２０を含むＰＢＳ（ｐＨ７．２）（ＰＢＳ−Ｔ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）で３回洗浄した。非特異的結合を、ＰＢＳに希釈した５％脱脂粉乳（ＰＢＳ−Ｍ）により３７℃で１時間ブロックした。洗浄後、マウス血清をＰＢＳ−Ｍで１：４０希釈し、２倍段階希釈をウェルに添加した。プレートを３７℃で１時間インキュベートし、次にＰＢＳ−Ｔで４回洗浄した。ペルオキシダーゼ結合ウサギ抗マウスＩｇＭ（最適希釈１：１０００）、ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ抗体（Ｚｙｍｅｄ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）又はＩｇＧ３（最適希釈ｌ：３０００）（Ｒｏｃｋｌａｎｄ，Ｇｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ，ＰＡ）を添加し、プレートを３７℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。３０％過酸化水素を含む０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５．６）中のオルトフェニレンジアミン（０．５ｍｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を酵素基質として使用した。反応を２．５Ｎ  Ｈ２ＳＯ４で停止させ、自動ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｄｙｎｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＭＲＩＩ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ，ＵＳＡ）をＢＩＯＬＩＮＸ  ２．２２ソフトウェアと共に使用して４９０ｎｍで吸光度を測定した。陽性力価は、陰性対照の平均値を３ＳＤ上回るものと定義された。
【０２２４】
結果
アジュバントを免疫原性の低いワクチンと同時投与したとき、自然免疫応答の抗体応答への転換が認められる。アジュバントは、抗原に対する抗体応答又は細胞性免疫応答を増強させる又は上昇させることができる物質である。ＰａｐＭＶが他の抗原に対する長時間持続性抗体応答を促進するアジュバントとしての機能を果たすことができるかどうかを調べるため、ＢＡＬＢ／ｃマウスをＯＶＡ又はＨＥＬ単独で、又は以下のアジュバント：ＰａｐＭＶ、ＣＦＡ又はＬＰＳと共に免疫した。ＯＶＡ又はＨＥＬに特異的なＩｇＧ抗体価を、示されている時点でＥＬＩＳＡによって測定した（図１９Ａ及び図１９Ｂ）。ＰａｐＭＶについてのアジュバント作用が、免疫動物におけるのＯＶＡ及びＨＥＬに対する総ＩｇＧ応答で認められた。ＰａｐＭＶによって誘導されるアジュバント作用は、免疫後３０日目にＨＥＬに関して認められ、この時点で抗体価は、ＨＥＬ単独によって誘導される抗体価と比較して８倍上昇していた。この抗体価の差は１２０日目まで維持されたが、４００日目までには低下していた（図１９Ａ）。ＬＰＳは免疫後最初の３０日間のみアジュバント作用を誘導したが、ＣＦＡは、免疫後８日目から４００日目の実験終了時まで最も強いアジュバント作用を示した（図１９Ａ）。ＯＶＡでの免疫に関しては、総ＩｇＧ抗体価へのアジュバント作用が最初の免疫後１２０日目まで認められ、その後抗体価は経時的に低下し、４００日目にはＯＶＡ単独と比較して４倍高かった（図１９Ｂ）。いずれのＩｇＧサブクラスが、ＯＶＡ及びアジュバントと共免疫したＯＶＡ（ＰａｐＭＶは総ＩｇＧ応答へのアジュバント作用を示さなかった）によって誘導されるかを同定するため、さらなる分析を２０日目に実施した。ＰａｐＭＶ、ＬＰＳ及びＣＦＡはＯＶＡ特異的ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂ抗体価を誘導したが、ＯＶＡ単独ではＩｇＧ１特異的抗体化だけを誘導した（図１９Ｃ〜図１９Ｅ）。ＯＶＡを使用したアジュバントのいずれかと共免疫したとき、ＩｇＧ１に対するアジュバント作用は認められなかった。
【０２２５】
これらの結果は、ＰａｐＭＶ、ＬＰＳ及びＣＦＡがＯＶＡに対するＩｇＧサブクラス応答へのアジュバント作用を誘導することを示す。さらに、ＰａｐＭＶは、モデル抗原に対する特異的抗体価の長時間持続性上昇を誘導するアジュバント特性を示す。合わせて考慮すると、これらのデータから、ＰａｐＭＶが、自然応答の、認められた抗原特異的長時間持続性抗体応答への転換を媒介したと考えられる内因性アジュバント特性を有することが明らかである。
（実施例ＶＩＩＩ）
親和性ペプチドを含むＰａｐＭＶ  ＶＬＰの作製及び工学的操作
以下の実施例は、選択した親和性ペプチドが工学的に操作されたコートタンパク質から形成されるＶＬＰの表面で発現され、標的分子に結合するために使用できるように、親和性ペプチドを選択する方法及びＰａｐＭＶコートタンパク質の工学的操作を示す。この概念は、インフルエンザウイルスエピトープ／抗原に結合し、それによってＡＰＳを形成するために使用できる、その表面にペプチド又は抗体フラグメントを発現するＶＬＰの生産に容易に適用される。
【０２２６】
細菌株
Ｐｈ．Ｄ．−７ファージディスプレイペプチドライブラリーキット（Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｋｉｔ）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）と共に提供される、大腸菌株ＥＲ２７３８をファージの増幅のために使用した。大腸菌株ＤＨ５α（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）をプラスミド増殖のために使用し、大腸菌ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（登録商標）（ＤＥ３）−ＲＩＬ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を組換えタンパク質の生産のために使用した。
【０２２７】
ペプチドのスクリーニング
ネコブカビ休止胞子（Ｈｏｒｔｉ−Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ社）に対する特異的ペプチドを、Ｐｈ．Ｄ．−７ファージディスプレイペプチドライブラリーキット（（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）を使用して、製造者のプロトコールに従って「パニング」として知られるインビトロ選択工程によって選択した。簡単に述べると、２×１０１１ファージを１０６休止胞子に添加し、室温で１時間静かに混合した。胞子と結合ファージを１３，０００ｒｐｍで１分間の遠心分離によってペレット化した。胞子ペレットを各々の回につき洗浄緩衝液（５０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）１ｍｌで１０回洗浄した。ファージを、室温で１０分間インキュベートすることにより、２００ｍＭグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．２）で溶出した。次に、溶出したファージを増幅し、結合配列に関してプールを濃縮するためにさらなる結合／増幅（パニング）サイクルを通して採取した。洗浄緩衝液は、１回目のパニングについては０．１％のトゥイーン２０を含み、その後の回については０．５％に上昇させた。上清を中和し、ファージの死滅を回避するため、１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．１）１５０μｌを添加した。選択したファージを、パニングの各々の回の間に大腸菌株ＥＲ２７３８において増幅した。最も高い親和性を有するペプチドを有するペプチドを選択するためにサイクルを３回反復した。
【０２２８】
ネコブカビ休止胞子に特異的でないと考えられるファージを排除するため、〜１０７胞子と一般的な土壌真菌（上記）の菌糸体フラグメントの混合物で、２回の間に増幅を行わずに、２回の除去工程を実施した。
【０２２９】
最後に、４回目のパニングを、０．５％トゥイーン２０を含む洗浄緩衝液の存在下で、ネコブカビの休止胞子に関して実施した。溶出したファージはプレーティングの前に増幅しなかった。２７クローンを単離し、増幅して、選択ペプチドの配列を決定した。
【０２３０】
修飾ＰａｐＭＶ  ＣＰの生産、精製及び特性決定
４つの親和性ペプチドと１つの陰性対照ペプチドを選択し、対応するＤＮＡ配列をＣＰΔＮ５  ＰａｐＭＶコートタンパク質のＣ末端（実施例ＩＩ参照）及び単量体形態のＣＰΔＮ５でクローニングした（Ｌｅｃｏｕｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ４７：２７３−２８０）。それぞれ５’及び３’末端のＮｃｏＩ及びＢａｍＨ１についての制限部位を、大腸菌における発現のために選択ＤＮＡ配列をベクターｐＥＴ−３Ｄに導入するために使用した。ペプチドがＰａｐＭＶ  ＣＰとインフレームであることを確認するためにクローンを配列決定した。
【０２３１】
修飾ＰａｐＭＶ  ＣＰを、先に述べられているように（Ｔｒｅｍｂｌａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，ＦＥＢＳＪ．２７３：１４−２５；Ｌｅｃｏｕｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６、同上）大腸菌ＢＬ２１  ＲＩＬで発現させた。十分な透析によってイミダゾールを除去した。６Ｍ塩酸グアニジウム及び２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．５での希釈後、ブラッドフォードアッセイを用いてタンパク質濃度を測定した。
【０２３２】
蛍光色素標識のために、精製タンパク質を透析して緩衝液をＰＢＳ（ｐＨ７．４）に交換した。タンパク質を、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８又はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３タンパク質標識キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）のプロトコールに述べられているように標識した。標識の程度を、２８０ｎｍでのタンパク質の吸光度及びＡｌｅｘａ  ４８８については４７４ｎｍ、又はＡｌｅｘａ  ６３３については６３２ｎｍでの蛍光色素の吸光度を測定することによって評価した。
【０２３３】
生産されたＶＬＰの平均長を推定するため、標識タンパク質を０．５％ＴＢＳＴに希釈し、緩衝液で洗浄して、作製したグリッド（Ｃｕ  ４００メッシュカーボンフォームバー）を、２％酢酸ウラニルのろ過溶液で陰性染色した。１つの電子顕微鏡画像において認められるすべてのＶＬＰ（〜５０）を測定した。
【０２３４】
ネコブカビ及び一般土壌真菌への標識タンパク質又は抗ネコブカビ抗体の結合
ペプチドの選択のために使用した方法を適合させることにより、結合をフローサイトメトリによって分析した。基本的には、１０６（異なる指示がない限り）胞子を、最初に、ＰａｐＭＶ  ＣＰを試験する場合は０．５％ＴＢＳＴ中のＣＰΔＮ５  ５０μｇ、又は抗体を使用する場合はブロッキング緩衝液（０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３、５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）で１時間ブロックした。Ａｌｅｘａ標識タンパク質１０μｇ又はラット抗ネコブカビ１μｌを胞子に添加し、わずかに攪拌しながら室温で１時間結合させた。抗体については、０．５％ＴＢＳＴ  １ｍｌでの５回の洗浄後、ブロッキング緩衝液中のＰＥヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）５μｌ（Ｃｅｄａｒｌａｎｅｓ）と共に室温で１時間インキュベートした。すべての標識胞子を最後に０．５％ＴＢＳＴ  １ｍｌで５回洗浄し、胞子ペレットを分析のために０．５％ＴＢＳＴ  ５００μｌに再懸濁した。フローサイトメーターを使用して１０，０００のゲートされた胞子からの読取り値を収集した。
【０２３５】
Ａｌｅｘａ  ６３３標識ネコブカビ休止胞子を、共焦点顕微鏡による観察のためにスライドガラス上に置いた；０．５％ＴＢＳＴ中３×１０５胞子をスライドガラス上にて２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。スライドガラスを３０分間乾燥し、カバーガラスを所定位置に保持するためにＰＢＳを添加した。スライドガラスを密封し、遮光して、４℃で一晩インキュベートした。
【０２３６】
結果
ネコブカビ休止胞子に対する３つのペプチド及び胞子に結合しない陰性対照ペプチドを選択するためにファージディスプレイを使用した。ペプチドの配列は以下のとおりである：
ペプチドＡ：ＤＰＡＰＲＰＲ（配列番号３６）
ペプチドＢ：ＬＬＮＳＨＡＶ（配列番号３７）
ペプチドＣ：ＮＨＡＨＳＴＰ（配列番号３８）：
陰性対照ペプチド：ＫＡＬＧＤＮＧ（配列番号３９）。
【０２３７】
選択したペプチドＡ、Ｂ及びＣをＰａｐＭＶのＣ末端でクローニングした。２つのＰａｐＭＶ  ＣＰ構築物をプラットフォームとして使用した：以前に大腸菌においてＶＬＰへと自己組織化することが示された（Ｔｒｅｍｂｌａｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６、同上）、ＣＰΔＮ５（本明細書では「ＣＰ」と称する）、及び細菌において自己組織化することができず、単量体形態として残存する（Ｌｅｃｏｕｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６同上）単量体形態のＣＰΔＮ２６（ここでは「ＣＰｍ」と称する）。
【０２３８】
すべて、組換えタンパク質の精製を容易にするためにＣ末端に６×Ｈｉｓタグを有する、９つの異なる構築物を作製した。ＣＰ−Ｎｅｇは陰性対照ペプチドの融合物を含む。ＣＰ−Ａ、−Ｂ及び−Ｃは、それぞれファージディスプレイによって選択された３つのペプチドの各々と融合したＣＰ構築物に対応する。ＣＰ−ＧｌｙＡはＣＰのＣ末端とペプチドＡの間に３個のＧｌｙ残基の追加挿入を有し、ＣＰ−ＡＡはＣ末端にペプチドＡの重複を有し、最後にＣＰｍ−ＡはペプチドＡと融合したＣＰの単量体形態である。
【０２３９】
すべての構築物を大腸菌において発現させ、タンパク質をＮｉ２＋カラムでのアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。すべてのＣＰ構築物について培地５００ｍｌから３０〜４０ｍｇまでの精製タンパク質を得ることができた。ＣＰｍの生産はより効率が低かったが、まだ５ｍｇ／ｍｌを生成した。
【０２４０】
ＶＬＰの形成を電子顕微鏡によって観測した。組換えタンパク質ＣＰ、ＣＰ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ、−Ｎｅｇ、−ＧｌｙＡ及び−ＡＡは大腸菌においてＶＬＰに自己組織化した。予測されたように、構築物ＣＰｍ及びＣＰｍ−Ａは単量体形態として残存し、ＶＬＰを生じなかった。各構築物について５０ＶＬＰの長さを測定し、すべてのＶＬＰについての平均長は７０ｎｍと推定された。異なる構築物から組織化されたＶＬＰの間で有意差は認められなかった。
【０２４１】
種々のＶＬＰのネコブカビ休止胞子への特異的結合をフローサイトメトリによって評価した。種々の組換えタンパク質の標識化は、標識化の一様性を確実にし、種々のＶＬＰの間での直接比較を可能にするために同じ条件下で実施した。結果は、標識ＣＰ  ＶＬＰ単独は休止胞子に非特異的に結合するが、ＣＰ−Ｎｅｇ  ＶＬＰよりもわずかに効率的であることを示した（図２０Ａは、胞子の天然自己蛍光と比べた曲線の右側への移動を比較する）。しかし、ＣＰ−ＢとＣＰ−Ｃ  ＶＬＰはどちらも休止胞子に対して改善された結合活性を示したが、曲線の最も有意な移動はＣＰ−Ａに関して見られ、ＣＰ−Ａは休止胞子に対して高い結合活性を示した（図２０Ｂ）。
【０２４２】
ＣＰ及びＣＰ−Ａの休止胞子への結合を共焦点顕微鏡によっても視覚化した。サイトメトリアッセイのために使用した波長での胞子の自然蛍光の故に、ＣＰ−Ａは、遠赤外領域で励起できる異なる染料（Ａｌｅｘａ  ６３３）で標識してこの実験におけるバックグラウンドを低下させたが、休止胞子は遠赤外領域でバックグランドを示さなかった。非常にわずかな蛍光だけがＣＰ  ＶＬＰとのインキュベーション後に観察され、胞子は明らかに標識ＣＰ−Ａ  ＶＬＰで装飾された。この実験により、ＣＰ−ＡがＣＰと比較して改善された効率で休止胞子の表面に結合することが確認された。さらに、この結果は、ＣＰ−Ａ  ＮＬＰの特異的標的が休止胞子の表面全体にわたって位置することを示している。
【０２４３】
ラットにおいて産生されたポリクローナル抗体のネコブカビ休止胞子に対する特異性をＣＰ−ペプチドＶＬＰの特異性と比較した。７つの異なる真菌（アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｓｐ．）、アルテルナリア・アルテルナタ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ａｌｔｅｒｎａｔａ）、クラドスポリウム属（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐ．）、フザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ）、プラスモジオフォラ・ブラシカ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｏｐｈｏｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐ．）、トリコテシウム・ロゼウム（Ｔｒｉｃｈｏｔｅｃｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、バーティシリウム・ダリア（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｉｕｍ  ｄａｈｌｉａｅ））の休止胞子を試験した。心筋胞子に対して惹起したポリクローナル抗体はネコブカビ休止胞子に対して強い結合を示したが、同時に、おそらく試験したすべての胞子上の共通特徴の認識の故に、試験したすべての胞子に対して非特異的結合を示した。これに対し、ＣＰ−Ａ  ＶＬＰは試験したすべての胞子のうちでネコブカビ休止胞子に対して非常に特異的であった。ＣＰ−Ｂ及びＣＰ−Ｃ  ＶＬＰも非常に特異的であったが、ＣＰ−Ａ  ＶＬＰより低い結合活性で結合した。
【０２４４】
ＣＰ−Ａが異種胞子の混合物の中でネコブカビ休止胞子を検出できるかどうかを試験するため、他の土壌真菌（アクレモニウム属、アルテルナリア・アルテルナタ、クラドスポリウム属、フザリウム・ソラニ、プラスモジオフォラ・ブラシカ、トリコデルマ属、トリコテシウム・ロゼウム、バーティシリウム・ダリア）の６×１０６胞子と混合したネコブカビの１０６休止胞子に関するフローサイトメトリ分析を実施した。ネコブカビの検出のために蛍光ＣＰ−Ａを使用したとき、分析において１つのピークだけが認められ、異種胞子の混合物中のネコブカビ休止胞子の非常に特異的な検出を示した。
【０２４５】
ＶＬＰにおけるペプチドの多量体化は改善された結合活性のために必要である
標識ＣＰｍ−Ａ及びＣＰｍ対照（どちらもＰａｐＭＶ  ＣＰの単量体形態に基づく）を使用したフローサイトメトリ分析は、単量体形態がネコブカビの休止胞子に効率良く結合できないことを示した。予想されたように、ＣＰ構築物によって組織化されたＶＬＰの表面のペプチドの多量体化は、ペプチドの結合活性を改善するために重要である（図２０）。それ故、予測されたように、単量体形態は標的への結合を示さなかった。
【０２４６】
ＣＰ−Ａの結合活性の改善
ＣＰ−Ａ  ＮＬＰの表面の親和性ペプチドＡの運動の自由度を改善するため、及びＰａｐＭＶ  ＣＰのＣ末端によって引き起こされる立体障害を低減するために、一続きの３  Ｇｌｙ残基をＣＰのＣ末端と親和性ペプチドＡの間に付加した（ＣＰ−ＧｌｙＡ）。加えて、ＣＰ−ＡＡを作製するためにＣＰ−ＡのＣ末端のＡペプチドを重複させた。両方のタンパク質を、上述したように生産し、精製して、フローサイトメトリ結合アッセイにおいて使用した。シグナルをＣＰ−Ａのシグナルと比較した。ＣＰ−ＧｌｙＡ及びＣＰ−ＡＡの両方が、休止胞子に対する結合活性の改善を示した（図２１Ａ〜図２１Ｂ）。ペプチドＡの重複は、最も高い結合活性を有するＶＬＰを生成した（図２１Ｂ）。
（実施例ＩＸ）
Ｍ２ｅＨ１Ｎ１インフルエンザ抗原に融合したＰａｐＭＶコートタンパク質の生産及び工学的操作
ＰａｐＭＶＣＰ及びＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅの発現及び精製
ＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅ構築物を実施例ＩＶで述べたように作製した。タンパク質の発現及び精製は、ＶＬＰの単離を除き、実施例ＩＶで述べたように実施した。ＶＬＰは２つの方法のいずれか一方により単離した。
【０２４７】
１．超遠心：管の底部の高度濃縮スクロース相を使用して、超遠心工程後にＶＬＰを単離した。次にペレットを滅菌ＰＢＳに再懸濁した。ペレットと上清（ディスクとより組織化されていないタンパク質形態の混合物を含む）を実施例ＩＶで述べたように透析した。
【０２４８】
２．Ｍａｃｒｏｓｅｐ（登録商標）単離：ＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅタンパク質の混合物（ＶＬＰ、ディスク及びより組織化されていない形態）を含む溶出緩衝液を、１０００ｋＤａのカットオフ値を有するＭａｃｒｏｓｅｐ（登録商標）遠心分離装置（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＮＹ）を用いて濃縮した。
【０２４９】
生成されたタンパク質の各バッチをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって純度に関して体系的に検査した。各々のＰａｐＭＶ形態（ＶＬＰ、ディスク、二量体、単量体及び分解形態）の正確な割合を、先に述べられているように（Ｔｒｅｍｂｌａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｆｅｂｓ  Ｊ  ２７３：１４−２５；Ｌｅｃｏｕｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，４７：２７３−２８０）タンパク質溶液をゲルろ過カラムＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００に通すことによって確認した。
【０２５０】
カラムは、ディスク（４００〜６００ｋＤａ）及びより組織化されていない形態（二量体、単量体及び分解形態）を含む低分子量タンパク質（ＬＭＷＰ）から高分子量タンパク質（ＨＭＷＰ＞６５０ｋＤａ）を区別する。ＰａｐＭＶＣＰ及びＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅ（超遠心によって作製される）と称される組成物は、それぞれ８０％及び９０％のＨＭＷＰを含んでいた。これに対し、Ｍａｃｒｏｓｅｐ（登録商標）遠心分離装置だけを使用して濃縮した、超遠心していないＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅｍ組成物は、４５％のＨＭＷＰ、２３％のディスク及び２１％の二量体と単量体形態で構成された。ウエスタンブロット法（図２２Ａ）を、ポリクローナル抗ＰａｐＭＶＣＰ抗体を使用して実施例ＩＩで述べたように実施した。精製後、タンパク質濃度をＢＣＡタンパク質キット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）で評価した。
【０２５１】
電子顕微鏡検査
タンパク質をＰＢＳで希釈し、カーボン被覆したフォームバーグリッドに３分間吸着させた。グリッドを脱イオン水で２回洗浄し、室温で１０分間、０．１％酢酸ウラニルで染色して、その後ＪＥＯＬ  ＪＥＭ２２０ＦＳ透過型電子顕微鏡で観察した。平均ＶＬＰ長を、先の実施例で述べたように測定した。
【０２５２】
結果
本実施例では、インフルエンザウイルス株Ｈ１Ｎ１  Ａ／ＷＳＮ／３３からのＭ２ｅペプチド配列を、図１２Ａに示すようにＰａｐＭＶＣＰのＣ末端に融合した。ＰａｐＭＶＣＰ及びＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅの精製は、ＶＬＰをペレット化し、より小さな分子量形態（主としてディスク、二量体及び単量体）を保持して、上清中に残存させるための超遠心工程を含んだ。ＰａｐＭＶＣＰ及びＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅのＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイルは高純度の組換えタンパク質を示すが、同時に上清中の分解されたタンパク質形態も明らかにする（図２２Ａ）。既に記述されているように（Ｔｒｅｍｂｌａｙ  ｅｔ  ａｌ，２００６、同上；Ｌｅｃｏｕｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６、同上）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価したときのＰａｐＭＶＣＰタンパク質の大きさ（２５から３３ｋＤａの間）は、コンピュータシミュレーションによって予想される大きさ（ＰａｐＭＶＣＰについて２３．１ｋＤａ及びＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅについては２６．４ｋＤａ）よりも大きい。抗ＰａｐＭＶＣＰポリクローナル抗体を使用したウエスタンブロット法（図２２Ｂ）により、製剤中の分解されたＰａｐＭＶＣＰタンパク質の存在が確認された。これは、低分子量タンパク質（ＬＭＷＰ）の主要部分が分解されていないディスクから構成される（ＦＰＬＣによって測定したとき約６０％）場合でも、不均質なタンパク質混合物の有意の部分が全長Ｍ２ｅエピトープを示さないことを強く示唆している。
【０２５３】
予想されたように、ＦＰＬＣはペレット中の高い割合（９０％）の高分子量タンパク質（分子量≧６５０ｋＤａのＨＭＷＰ）を示した。先に明らかにされたように、大腸菌において発現されるＰａｐＭＶＣＰは、電子顕微鏡検査によって数多くの棒状体が見られるので（図２２Ｂ、左のパネル）、ＶＬＰへと効率的に自己組織化することができる。重要な点として、ＰａｐＭＶＣＰのＣ末端でのＭ２ｅエピトープの融合は、超遠心後にペレット中で多くの棒状体が認められたので（図２２Ｂ、右のパネル）、ＰａｐＭＶＣＰ融合物がＶＬＰへと自己組織化する能力を損なわなかった。上清中では棒状体は検出されず、ディスクだけが検出可能であった（図２２Ｂ、中央のパネル）。ＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰは、ＰａｐＭＶ  ＶＬＰと同様に、１０１ｎｍ（±５．６）の平均長を有する（Ｔｒｅｍｂｌａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００６、同上）。
【０２５４】
ＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰの精製を容易にするため、ＶＬＰを含むタンパク質抽出物を濃縮するもう１つの方法を試験し、この方法では、ＬＭＷＰ（ディスクとより組織化されていない形態のタンパク質）からＨＭＷＰ（ＶＬＰ）を分離するために、超遠心によってＶＬＰをペレット化するのではなく１０００ｋＤａのカットオフ値を有するＭａｃｒｏｓｅｐ（登録商標）遠心分離装置を使用した。この方法は、精製タンパク質中でＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅ  ＨＭＷＰの量を濃縮する上で効率はより低く、超遠心での８０％に対してＨＭＷＰの４５％含量が認められた。Ｍａｃｒｏｓｅｐ（登録商標）精製ＨＭＷＰ抽出物中のＶＬＰの存在を電子顕微鏡検査によって確認し、単離されたＶＬＰは、平均して、超遠心によって単離されたＶＬＰよりも短い（７８．８ｎｍ±３．９）と思われた（ｐ＜０．０１）。この所見は、この新しい方法が超遠心よりも広いサイズ範囲のＶＬＰを選択することを示唆する。
（実施例Ｘ）
インフルエンザ感染細胞による、Ｍ２ｅインフルエンザ抗原を含むＰａｐＭＶ  ＶＬＰに対するＩｇＧの特異的結合
マウスの免疫
１０匹の６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）に、ｉ）ＰａｐＭＶＣＰ  １００μｇ；ｉｉ）ＰａｐＭＶＣＰ  １００μｇ及びＭ２ｅペプチド１０μｇ（図２のみ）；ｉｉｉ）ＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅ  １００μｇ（ＶＬＰ又はディスク）、又はｉｖ）エンドトキシン不含ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ−Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を皮下注射した。初回免疫に続いて、２週間後に同じ量の１回の追加接種を実施した。追加接種後８日目に血液試料を採取し、分析まで−２０℃で保存した。
【０２５５】
ＥＬＩＳＡ定量
Ｍ２ｅペプチド（ＳＬＬＴＥＶＥＴＰＩＲＮＥＷＧＣＲＣＮＤＳＳＤ［配列番号６］）は、ＧＬＢｉｏｃｈｅｍ  Ｓｈａｎｇｈａｉ社（Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）によって合成され、エンドトキシン不含ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ−Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に再懸濁された。Ｃｏｓｔａｒ  Ｈｉｇｈ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ９６穴プレート（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を、０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３緩衝液、ｐＨ９．６中で１μｇ／ｍｌ濃度に希釈したＭ２ｅペプチド１００μｌ／穴で、４℃にて一晩被覆した。プレートをＰＢＳ／０．１％トゥイーン−２０／２％ＢＳＡ（１５０μｌ／穴）により３７℃で１時間ブロックした。ＰＢＳ／０．１％トゥイーン−２０で３回洗浄した後、血清を１：５０から始まる２倍段階希釈に添加し、３７℃で９０分間インキュベートした。次にプレートを４回洗浄し、ＰＢＳ／０．１％トゥイーン−２０／２％ＢＳＡ中１／１０，０００（ＩｇＡを除くすべてのアイソタイプについて）又は１／２，０００（ＩｇＡについて）の希釈のペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ（すべてＪａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＰＡより）、ＩｇＧ３（Ｒｏｃｋｌａｎｄ，Ｇｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ，ＰＡ）、ＩｇＧＡ（Ｓｅｒｏｔｅｃ，Ｒａｌｅｉｇｈ，ＮＣ）１００μｌと共に３７℃で１時間インキュベートした。４回の洗浄後、ＩｇＧの存在を、製造者の指示に従ってＴＭＢ−Ｓ  １００μｌで検出した。０．１８ｍＭ  Ｈ２ＳＯ４  １００μｌを添加することによって反応を停止させた。４５０ｎｍでＯＤを読み取った。結果は、ＯＤ値がＰＢＳ注射マウスからの血清の１：５０希釈で得られたバックグラウンド値の３倍であるときに測定された、抗体終点力価として表されている。
【０２５６】
ＭＤＣＫ細胞への抗Ｍ２血清の結合能力試験
ＭＤＣＫ細胞［Ｌａｂｔｅｋ  ＩＩチャンバー型カバーガラス（Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）中１．５×１０６細胞／穴；９６穴平底プレート中４×１０４細胞／穴］を、集密細胞単層を得るために３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。培地を除去し、細胞を、ＭＥＭ  ＨＥＰＥＳアルブミン（０．５％）ＧＶＦに希釈したＡ／ＷＳＮ／３３インフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１）に１の感染多重度（１ＭＯＩ）で感染させた。インキュベーションの２０時間後、培地を除去し、ＰＢＳ、ＰａｐＭＶＣＰ又はＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅを注射したマウスからの血清のプールの１：４０希釈（ＰＢＳ中）を各々のウェルに添加した。
【０２５７】
プレートを４℃で１時間インキュベートし、その後ＰＢＳで２回洗浄した。次に、ウイルスに感染した細胞上の抗Ｍ２の蛍光視覚化のために、二次抗マウスＩｇＧ−Ａｌｅｘａ  ４８８（ＰＢＳ中１：１００希釈）標識抗体を各ウェルに添加した。あるいは、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＰＢＳ中１：５００希釈）を添加した。その後プレートを４℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、ウェルをＰＢＳで４回洗浄した。Ａｌｅｘａ  ４８８蛍光染色を、ＦＩＴＣフィルター（４８８ｎｍ）付きＮＩＫＯＮ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ３００顕微鏡で直ちに観察した。Ｉｍａｇｅ  Ｊ  １．３７ｖを使用して画像を分析した。９６穴平底プレートについて、従ったプロトコールはＥＬＩＳＡに関して前述したとおりである。これらの実験はすべて、結合特異性を確実にするために非感染細胞に関する同じ処理を含む。
【０２５８】
インフルエンザＡ株
使用したインフルエンザＡ株はＡ／ＷＳＮ／３３インフルエンザ株（Ｈ１Ｎ１）であり、この株は、新生児マウスにおける及びその後成体マウスの脳への連続継代によって得られた、マウス肺適応臨床単離物、Ａ／ＷＳ／３３に由来した（Ｓｔｕａｒｔ−Ｈａｒｒｉｓ，１９３９，Ｌａｎｃｅｔ  １：４９７−４９９）。この株のＬＤ５０は、以前に約１０３プラーク形成単位（ｐｆｕ）と評価された（Ａｂｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ａｎｔｉｖｉｒ  Ｔｈｅｒ  １１：９７１−９７６）。本実施例では、低用量のインフルエンザ感染は１ＬＤ５０に相当し、中間用量の感染は４ＬＤ５０に相当する。
【０２５９】
ウイルス抗原投与実験
マウスを、１×１０３（１ＬＤ５０）のインフルエンザウイルス株Ａ／ＷＳＮ／３３を含む３５μｌで鼻内感染させた。マウスを臨床徴候（体重減少、直腸温度、異常行動及び毛の乱れ）に関して毎日観測した。１６日間にわたって死亡を記録した。
【０２６０】
統計解析
スチューデント検定、チューキー検定及びダン検定は、マウスの群の間の差（抗体価、温度、体重、肺におけるウイルス力価）を比較した。生存曲線における差をカプラン−マイヤー生存分析によって解析した。ｐ＜０．０５（＊）、ｐ＜０．０１（＊＊）、ｐ＜０．０００１（＊＊＊）の値を統計的に有意とみなした。ＰＲＩＳＭ  ３．０３で統計解析を実施した。
【０２６１】
結果
ＰａｐＭＶＣＰへのＭ２ｅの遺伝子融合がこのペプチドに対する免疫応答の誘導を促進するかどうかを評価するため、ＢＡＬＢ／ｃマウスを２週間の間隔で２回、１００μｇのＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅ、ＰａｐＭＶＣＰ  ＶＬＰ（融合エピトープを含まない）又はＰａｐＭＶＣＰ  ＶＬＰ＋融合していない合成Ｍ２ｅペプチドで免疫した。結果は２３Ａに示されており、ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰだけがＭ２ｅに対する体液性応答を誘発することができ、ＩｇＧ２ａへのクラススイッチを誘導できることを示し、ＶＬＰへのＭ２ｅペプチドの遺伝子融合がこのペプチドを免疫原性にすることを示す。ＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰでのワクチン接種によって誘導される抗体が、インフルエンザ感染細胞によって提示されるＭ２タンパク質を認識できるかどうかを調べるため、ＥＬＩＳＡと共焦点顕微鏡検査を実施した。ＥＬＩＳＡ（図２３Ｂ）と共焦点顕微鏡検査の両方から得られた結果により、これらの抗Ｍ２ｅ抗体が生理的Ｍ２ｅを認識することを確認した。さらに、血清対照症例（ＰＢＳ及びＰａｐＭＶＣＰ  ＶＬＰのいずれかを注射したマウスから）は、感染細胞又は非感染細胞のいずれにも効率的に結合しなかった（図２３Ｂ）。
【０２６２】
大腸菌において発現されるＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅタンパク質の両方の形態（ＶＬＰとディスク）の比較免疫原性を試験した。２つの形態のいずれかを注射したマウスにおける抗Ｍ２ｅ抗体応答を、追加免疫後及びＨ１Ｎ１インフルエンザ株（Ａ／ＷＳＮ／３３）での抗原投与前に測定した。結果は図２４に示されており、第一に、ＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰは、ディスクが引き金となる免疫応答よりも高い（ｐ＜０．０１）ＩｇＧ抗  Ｍ２ｅ応答を誘発することができること（図２４Ａ）、第二に、ＶＬＰはＩｇＧ２ａクラススイッチを誘導したが、ディスクは誘導しなかったこと（図２４Ａ）が明らかである。しかし、ＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰは明確に抗Ｍ２ｅ応答の引き金となるが、群の間で体重（図２４Ｂ）及び生存率に有意差がないことによって証明されるように、この用量のＶＬＰに関してインフルエンザ抗原投与後に目に見える利益は認められなかった。
（実施例ＸＩ）
Ｍ２ｅインフルエンザ抗原を含むＰａｐＭＶ  ＶＬＰ又はディスクによるマウスの免疫：投与レジメン、アジュバント添加及びオプソニン化の作用
マウスの免疫
１０匹の６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ社）に、各マウスにつき１００μｌの最終注射容量中、エンドトキシン不含ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ社）１００μｇ、ＰａｐＭＶＣＰ  １００μｇ、又は種々の形態のＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅ（単独、オプソニン化又はアジュバント添加）１００μｇを皮下注射した。初回免疫の後に、初回接種後２週間の間隔をおいて同じ量の２回の追加接種を実施した。
【０２６３】
ＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅオプソニン化のために、ＰａｐＭＶＣＰに対するモノクローナルＩｇＧ２ａ抗体（発明者の施設で作製された）又はポリクローナル抗体（ＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰで２回注射されたマウスから）をＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅと共に、血清：ＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅの１：１０容量／容量比を順守しながら３７℃で４５分間インキュベートした。その後、注射の前に製剤をエンドトキシン不含ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ−Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で希釈した。ＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅタンパク質を含まない同量の抗体を含有する製剤を陰性対照ワクチンとして使用した。
【０２６４】
アジュバント添加のために、ＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅ１００μｇを、製造者の指示に従ってＩｍｊｅｃｔ  Ａｌｕｍ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）又はＰａｐＭＶＣＰ  １００μｇと混合した。
【０２６５】
（超遠心していない）ＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅｍを利用した実験に関して、注射した用量は、超遠心したＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅに関して使用したタンパク質１００μｇ中で認められるＨＭＷＰ  ８０μｇに相当した。ＰａｍＭＶ−Ｍ２ｅｍタンパク質は４５％のＨＭＷＰを含むので、ＨＭＷＰ  ８０μｇにおおよそ対応する、全タンパク質混合物２００μｇを注射した。
【０２６６】
（超遠心していない）ＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅｍを使用した実験に関して、注射した用量は、ＨＭＷＰ  ８０μｇにおおよそ対応する（ＰａｍＭＶ−Ｍ２ｅｍタンパク質は約４５％のＨＭＷＰを含むため）、全タンパク質混合物２００μｇであった。この量は、超遠心したＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅ  １００μｇ中で認められるＨＭＷＰ  ８０μｇに相当した。対照（ＰＢＳ、ＰａｐＭＶＣＰ）及びＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅワクチン接種マウスは図２５、２６、２７及び２８に示す実験に共通であるので、これらの群に関するデータはこれら４つの図において同じである。すべての実験プロトコールはラヴァル大学動物保護委員会によって承認された。
【０２６７】
ＥＬＩＳＡ定量
実施例Ｘで述べたようにＥＬＩＳＡを実施した。
ウイルス抗原投与実験
抗原投与のために４×１０３ｐｆｕ（４ＬＤ５０）を使用したことを除き、実施例Ｘで述べたようにマウスをインフルエンザウイルス株Ａ／ＷＳＮ／３３で鼻内感染させた。マウスを臨床徴候（体重減少、直腸温度、異常行動及び毛の乱れ）に関して毎日観察した。１６日間にわたって死亡を記録した。同時点での肺抗Ｍ２レベル及びウイルス肺力価の定量のために、条件ごとに５匹のマウスの群を接種後７日目に犠死させた。気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を３×１ｍｌの滅菌ＰＢＳで実施した。肺を無菌的に切除し、滅菌ＰＢＳ  １ｍｌ中−８０℃で保存した。その後、肺を均質化し、２５００ｒｐｍ／４℃で１０分間遠心分離して、上清を、先に述べられている（Ａｂｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ４９：５５６−５５９）標準プラークアッセイを用いてＭＤＢＫ細胞で滴定した。
【０２６８】
統計解析
統計解析を実施例Ｘで述べたように実施した。
結果
ＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅ構築物によって開始されるＩｇＧ２ａ抗Ｍ２ｅ応答を上昇させるため、３つの異なる方策を実施した：（１）追加抗原注射の回数を２回に増やすこと、（２）製剤にアジュバント（ミョウバン又はＰａｐＭＶＣＰ  ＶＬＰ）を添加すること、及び（３）抗ＰａｐＭＶＣＰ又は抗ＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅ抗体でのオプソニン化すること。
【０２６９】
２回の追加抗原注射を含む投与レジメンに応答して、及び動物の２つの群ではミョウバン又はＰａｐＭＶＣＰ  ＶＬＰをアジュバントとして含む製剤に応答して産生された抗Ｍ２抗体を、異なる製剤の間でアイソタイププロファイルに何らかの相違が存在するかどうかを評価するためにアイソタイプ分類した（図２５Ａ）。ＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰは、先に異なるエピトープで明らかにされたように（実施例ＶＩ参照）、融合エピトープに対する平衡Ｔｈｌ／Ｔｈ２抗体応答を誘発することが示された。加えて、２回目の追加抗原投与は、実施例Ｘで述べた初回免疫−１回の追加接種実験と比較したときＩｇＧ２ａ抗Ｍ２ｅレベルを著明に上昇させた。アジュバントは体液性応答を大きく改善することが認められた。ミョウバンは、予想されたＴｈ２体液性応答を駆動し、ＩｇＧ１抗Ｍ２の誘導をわずかに上昇させたが、一方ＰａｐＭＶＣＰ  ＶＬＰは、ＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅ単独でワクチン接種された群と比較してＩｇＧ２ａ抗Ｍ２のレベルを４倍に上昇させた。インフルエンザウイルスの致死量５０の４倍（４ＬＤ５０）で感染させたとき、アジュバントを含む製剤でワクチン接種されたマウスはすべて、疾患の症状軽減を示し、体温のより良好な調節（図２５Ｂ）及びより安定な総体重（図２５Ｃ）を示した。これらの結果は、アジュバント添加したＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰワクチン接種したマウスに関して最も著明であり、ＰａｐＭＶ  ＣＰをアジュバントとして含む製剤はミョウバンを含む製剤よりもわずかにより良好な改善を示した。これらの実験において、ミョウバンがマウスにおける注射部位に肉芽種を誘発したことは注目すべきである。これに対し、ＰａｐＭＶＣＰ  ＶＬＰでのアジュバント添加は明らかな局所毒性作用を全く生じなかった。
【０２７０】
感染経過の間に、各群のマウスの半数（５／１０）について生存率を分析した。残りのマウスは、肺のウイルス量及び気管支肺胞洗浄液中の抗Ｍ２応答を測定するために犠死させた。いずれのアジュバントの使用も生存率を上昇させた（ミョウバンでの４／５及びＰａｐＭＶＣＰ  ＶＬＰでの５／５に対し、アジュバントなしでは２／５、図２５Ｄ参照）。これらの結果は肺で測定されたウイルス量によって確認され、対照と比較したとき、アジュバント添加したＶＬＰでワクチン接種したマウスは非アジュバント添加ＶＬＰでワクチン接種したマウスよりも低い肺ウイルス力価を示した（図２５Ｅ）。抗Ｍ２ｅ抗体は、すべてのＰａｐＭＶ−Ｍ２ワクチン接種マウスの気管支肺胞洗浄液中で検出され、ＩｇＧ２ａ抗Ｍ２ｅの高レベルが、ＰａｐＭＶＣＰ  ＶＬＰをアジュバントとして添加したＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰによって誘導された（図２５Ｆ）。
【０２７１】
全体として、上記結果は、ＰａｐＭＶプラットフォームがインフルエンザに対する体液性防御応答の引き金となり得ること、及び高用量のＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰ及びアジュバントの使用の両方がインフルエンザ抗原投与に対する防御を改善し得ることを示す。この点に関して、ＨＣＶ  Ｅ２エピトープに融合したＰａｐＭＶＣＰの２回の注射（実施例ＶＩ参照）が有意のＩｇＧ２ａ抗Ｅ２（１／３２００）抗体レベルの引き金を引くために十分であったことは注目に値する。これは、融合エピトープの性質が融合エピトープに対する全体的免疫原性にある程度まで影響を及ぼすこと、及びＰａｐＭＶコートタンパク質への異なるインフルエンザ抗原の融合が、それ故、十分な防御応答の引き金となるためにより少数の投与しか必要としないであろうことを示唆する。
【０２７２】
付加的な実験では、ＩｇＧ２ａモノクローナル抗ＰａｐＭＶＣＰ（ｍＡｂ）抗体及びマウスポリクローナル抗ＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅ（ｐＡｂ）抗体のいずれかを、インビトロで免疫複合体（ＩＣ）を形成するために使用した。ＩＣは、それぞれＩＣ［ｍＡｂ／ＰａｐＭＶＣＰ−  Ｍ２ｅ］及びＩＣ［ｐＡｂ／ＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅ］と命名された。ＩＣで免疫したマウスは、検討したすべてのアイソタイプについて、ＰａｐＭＶ−Ｍ２  ＶＬＰで免疫したマウスと比較して有意に高いレベルの抗Ｍ２ｅ抗体を示さなかった（図２６Ａ）。インフルエンザ感染の経過中、ＩＣで免疫したマウスは、ＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰ単独でワクチン接種したマウスと同様の疾患症状（体温、体重減少のレベル）を示し（図２６Ｂ及び図２６Ｃ）、ＰＢＳ、ＰａｐＭＶＣＰ  ＶＬＰ、モノクローナル抗ＰａｐＭＶＣＰ又はポリクローナル抗ＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅを注射したマウスの対照群と比較してわずかな改善のみを示した。これらの傾向は生存率（図２６Ｄ）及び肺ウイルス量（図２６Ｅ）によって十分に確認され、どちらもオプソニン化ＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰについての利益が存在しないことを明らかにした。加えて、気管支肺胞洗浄液中で検出されたＩｇＧ２ａ抗体（抗Ｍ２）レベルは、他のＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅワクチン接種群と比較してＩＣ［ｍＡｂ／ＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅ］で免疫したマウスにおいてわずかにより高かった（図２６Ｆ）。
【０２７３】
４５％の高分子量粒子≧６００ｋＤａ及び５５％ディスクを含む（実施例ＩＸ参照）、Ｍａｃｒｏｓｅｐ（登録商標）装置によって精製されたＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰ（ＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅｍ）の製剤の効果を調べるため、さらなる実験を実施した。免疫に使用するためのＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅｍの量を決定する際には、製剤中のＨＭＷＰの量だけを考慮した。ゲルろ過によって測定したとき、超遠心したＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅタンパク質  １００μｇはＨＭＷＰ  ８０μｇを含むことが示されたので、ＨＭＷＰ  ８０μｇの含量に相当する、ＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅｍ  ２００μｇをマウスに注射した。この製剤の免疫原性を試験するため、１０匹のマウスに、ＰＢＳ、ＰａｐＭＶＣＰ  ＶＬＰ  １００μｇ又はＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅｍ  ２００μｇを３回注射し、その後低用量のインフルエンザ（ＩＬＤ５０）に感染させた。ＩｇＧ２ａ抗Ｍ２ｅ抗体のレベルは、超遠心したＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰ（１／８０００  ＩｇＧ２ａ、図２７Ａ）の３回の注射後に産生されたＩｇＧ２ａ抗体のレベルと比較すると、ＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅｍ抗体で免疫したマウスでは劇的に低下した（ｐ＜０．０００１）（＜ｌ／２００  ＩｇＧ２ａ、図２７Ａ）。ＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰでワクチン接種したマウスはまた、対照群と比較して疾患症状の悪化を示し（図２７Ｂ及び図２７Ｃ）、生存率の有意でない（ｐ＝０．１９）上昇を有していた（図２７Ｄ）。
【０２７４】
ＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅｍのアジュバント添加とオプソニン化の影響を試験した。すべてのＩｇＧアイソタイプに関して、抗Ｍ２ｅ抗体価は、ＩｇＧ１についての３０倍からＩｇＧ２ａについての８０倍まで上昇し（図２８Ａ）、これらはミョウバンをアジュバントとして使用したＴｈ２抗体プロファイル（ＩｇＧ１）及びＰａｐＭＶＣＰ  ＶＬＰをアジュバントとして使用したＴｈ１抗体プロファイル（ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂ）に関する。ミョウバン及びＰａｐＭＶＣＰ  ＶＬＰのいずれかによるＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅｍ混合物へのアジュバント添加も、中間用量のインフルエンザ抗原投与後、体内温度の制御（図２８Ｂ）、体重（図２８Ｃ）、及び生存率（ｐ＜０．０００１）（１／１０からそれぞれ８／１０及び９／１０に）を劇的に改善した（図２８Ｄ）。
【０２７５】
ｍＡｂ又はｐＡｂでのＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅｍ混合物のオプソニン化は、ワクチンの免疫原性を改善したが（図２９Ａ）、その程度はアジュバント添加ほど印象的ではなかった。抗Ｍ２  ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ抗体レベルは、ＩｇＧ１についての２０倍からＩｇＧ２ａについての５０倍まで上昇した。ｍＡｂ又はｐＡｂでのオプソニン化は、中間用量のインフルエンザ抗原投与後、体内温度の制御（図２９Ｂ）、体重（図２９Ｃ）、及び生存率（ｐ＜０．００１、１／１０からそれぞれ６／１０及び７／１０に、図２９Ｄ）を有意に上昇させた。これらの結果は、オプソニン化が弱免疫原性のＡＣＳのための良好な選択肢であり得ることを示唆する。
（実施例ＸＩＩ）
フェレットにおけるＭ２ｅインフルエンザ抗原を含むＰａｐＭＶ  ＶＬＰの免疫原性の評価
ＰａｐＭＶ  ＶＬＰ
実施例ＩＸで述べたＰａｐＭＶＣＰ−Ｍ２ｅ構築物をすべての実験に使用した。
【０２７６】
フェレット及び免疫スケジュール
１６週齢又はそれ以上の雄性フェレットをすべての実験のために使用した。動物は狂犬病に対してワクチン接種されており、イヌジステンパー及びインフルエンザＡ型サブタイプＨ１Ｎ１及びＨ２Ｎ３に対するＥＬＩＳＡ検出可能抗体を有していなかった。初回免疫の当日に、血清試料を収集し、プレブリード（ｐｒｅｂｌｅｅｄ）として使用した。２つの連続的な実験を実施した。最初の実験のために、４匹の動物にＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰ  ２５μｇを皮下注射した。同じ濃度で２回目及び３回目の注射を３週間の間隔で実施した。ワクチン接種動物並びに２匹の非ワクチン接種対照フェレットを、インフルエンザウイルス株Ｈ１Ｎ１  Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／９９のヘマグルチニン及びノイラミニダーゼ糖タンパク質を担持する、ワクチン再集合体ＰＲ８の１０５組織培養感染用量の鼻内接種により、最後の追加免疫の３週間後に抗原投与した。感染後、７日間毎日体温を測定し、２、４及び６又は７日目に体重を測定した。血清試料を３日目と７日目に収集し、感染細胞及びＭ２ｅペプチドのいずれかを抗原として使用するＥＬＩＳＡによって抗体価を定量した。
【０２７７】
２番目の実験の全体的試験計画は、以下を除いて最初の実験と同様であった。すなわち、ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ用量を最後の追加接種に関して１０倍に増加し（すなわち２５０μｇ）、インフルエンザ株Ｈ１Ｎ１  ＵＳＳＲ／７７を抗原投与ウイルスとして使用し、ＰａｐＭＶ  ＥＬＩＳＡを１：５０希釈のＯＤではなく限界希釈法を用いて実施し、鼻洗浄液力価を臨床パラメータと同じ日に測定した。
【０２７８】
結果
抗原投与の時点で、１番目の群の４匹のワクチン接種動物のうち３匹が、Ｍ２ｅペプチド並びにウイルス感染細胞を認識する抗体を発現した（図３０Ａ及び図３０Ｂ）。これらの抗体は、感染後７日以内にさらに増加した。対照動物は、感染の３日後にウイルス感染細胞に対して同様の力価に達し、その後ワクチン接種動物の動態に従った。しかし、対照動物はＭ２ｅペプチドと交差反応する抗体を発現することができなかった。感染後１日目に抗体を有さない動物において体温がわずかにより高かったことを別にして、ワクチン接種動物と対照動物の間で臨床徴候の識別できる差は認められなかった（図３０Ｃ及びＤ）。
【０２７９】
２番目の群では、最後の追加免疫のために注射するＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰの量を１０倍に上昇させた。抗原投与の時点で、すなわち最後の追加免疫から３週間後に、すべてのワクチン接種動物が、ウイルス感染細胞と交差反応するペプチドに対する抗体を発現していた（図３１Ａ及び図３１Ｂ）。ペプチドＥＬＩＳＡの実施法をＯＤから限界希釈に変更したため、これらの値を直接比較することはできないが、ウイルス感染細胞を認識する抗体の同様のレベルが両方のワクチン接種レジメンに関して検出された（図３０Ａと図３１Ａを比較されたい）。抗原投与感染の経過中、体温及び体重に関してワクチン接種動物と対照動物の間で差は存在しなかった。ワクチン接種動物のうちの２匹は鼻洗浄液においてわずかに低く、短縮された期間のウイルス排出を経験し、その他の２匹の動物は対照フェレットの動態に追随した。興味深いことに、ペプチドに対して最も低い抗体価を有していたｖａｃ２個体が抗原投与において最も良好に耐容した（図３１、黒い四角）。これに対し、３日目までに組成物の交差反応性抗体供給が枯渇していたｖａｃ３は、疾患の最も重篤な経過を経験した（図３１、黒い円）。
【０２８０】
この試験は、ワクチン候補物質としてのＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰの潜在的可能性を評価すること及びフェレット動物モデルを樹立することという２つの目的を有するパイロット試験として設計された。結果は、ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅの皮下注射が、ウイルス感染細胞も同時に認識する、フェレットでの体液性免疫応答を惹起することを明らかにしている。使用した抗原投与ウイルスによって引き起こされる疾患は、しかしながら、あまりに軽度で、ワクチン接種動物と対照動物を明瞭に分けることができなかった。ゴールドスタンダードとして広く認められているワクチンで予防接種された群を含み、より毒性の高い抗原投与ウイルスを使用する追加試験により、フェレットにおいて防御作用を提供するＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰの能力が確認されると予想される。
【０２８１】
上記Ｈ１Ｎ１構築物並びにＨ９Ｎ２  Ｍ２ｅペプチドを含む構築物（実施例ＸＩＩＩ参照）を使用して実施した追加試験は、初回注射とそれに続く１回の追加免疫注射後に、処置したフェレットがそれぞれのＶＬＰに対する抗体を既に惹起していたことを示し、Ｍ２ｅペプチドに対する抗体は２回目の追加免疫注射後に検出されると予想される。これらの実験において、フェレットはまた、アジュバントとしてのＰａｐＭＶ及びＰａｐＭＶ  ＶＬＰのいずれかと併用された各々の構築物を含む製剤を注射された。Ｈ１Ｎ１構築物に関しては、アジュバントとしてのＰａｐＭＶの作用はＰａｐＭＶ  ＶＬＰの作用よりもわずかに著明であった。
（実施例ＸＩＩＩ）
インフルエンザＡ型Ｈ９Ｎ２株からのＭ２ｅエピトープを含むＡＣＳの開発
Ｈ９Ｎ２  ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅウイルス様粒子（ＶＬＰ）のクローニング及び作製
タンパク質のＣ末端で融合したＨ９Ｎ２インフルエンザ株からのＭ２ｅエピトープを含むＰａｐＭＶコートタンパク質を、Ｍ２ｅコード配列を創製するために以下のオリゴヌクレオチドを使用したことを除き、実施例ＩＸで述べたように作製した：
オリゴＨ９Ｎ２フォワード：
５’−ＣＴＡＧＴＴＣＣＣＴＧＣＴＧＡＣＣＧＡＡＧＴＧＧＡＡＡＣＣＣＣＧＡＣＣＣＧＣＡＡＣＧＧＴＴＧＧＧＧＣＴＧＣＣＧＣＴＧＣＴＣＴＧＡＴＴＣＣＴＣＣＧＡＴＡ−３’［配列番号５０］
オリゴＨ９Ｎ２リバース：
５’−ＣＧＣＧＴＡＴＣＧＧＡＧＧＡＡＴＣＡＧＡＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＣＣＣＡＡＣＣＧＴＴＧＣＧＧＧＴＣＧＧＧＧＴＴＴＣＣＡＣＴＴＣＧＧＴＣＡＧＣＡＧＧＧＡＡ−３’［配列番号５１］。
【０２８２】
最終構築物（Ｈ９Ｎ２  ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ）のアミノ酸配列を図１Ｇ［配列番号４７］に示す。ＰａｐＭＶ  ＣＰとＭ２ｅペプチドの間にグリシン−ロイシンスペーサ（ＧＧＧＬＬＬＴＳ）を含むもう１つの型の構築物も作製した。簡単に述べると、ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅクローンのＤＮＡをＳｐｅＩで線状化した。以下に示すオリゴヌクレオチド［配列番号５２及び５３］をアニーリングし、６×ＨタグとＰａｐＭＶ  ＣＰのＣ末端との間のＳｐｅＩ部位に挿入した。
【０２８３】
オリゴＨ９Ｎ２  ｓｐｅ１−ＧＬＹフォワード：
５’−ＣＴＡＧＴＧＧＴＧＧＣＧＧＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡ−３’［配列番号５２］
オリゴＨ９Ｎ２  ｓｐｅ１−ＧＬＹリバース：
５’−ＣＴＡＧＴＣＡＧＣＡＧＣＡＧＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡ−３’［配列番号５３］。
【０２８４】
スペーサを含む最終構築物（Ｈ９Ｎ２  ＰａｐＭＶ−３ＧＬＭ２ｅ）のアミノ酸配列を図１Ｈ［配列番号４８］に示す。
生じた構築物を実施例ＩＸで述べたように大腸菌において発現させ、Ｈ９Ｎ２  ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ及びＨ９Ｎ２  ＰａｐＭＶ−３ＧＬＭ２ｅタンパク質を実施例ＩＸで述べたように超遠心によって精製した。
【０２８５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＦＰＬＣ及び電子顕微鏡検査
発現されたタンパク質の分析を実施例ＩＸで述べたように実施した。
結果
ＰａｐＭＶコートタンパク質、Ｈ９Ｎ２  ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ及びＨ９Ｎ２  ＰａｐＭＶ−３ＧＬＭ２ｅのＣ末端配列を３２Ａに示す。ＰａｐＭＶ、Ｈ９Ｎ２  ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ及びＨ９Ｎ２  ＰａｐＭＶ−３ＧＬＭ２ｅのＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイルは、組換えタンパク質の高い純度を示す（図３２Ｂ）。予想されたように、ＦＰＬＣプロファイルは、両方のタンパク質についてＶＬＰに対応する固有のピークを示し、Ｈ９Ｎ２  ＰａｐＭＶ−３ＧＬＭ２ｅに関してペレット中に高い比率のＶＬＰ（９０％  ＶＬＰ、分子量≧６５０ｋＤａ）を指示し、Ｈ９Ｎ２  ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰ（８０％  ＶＬＰ）についても同様の結果を示した（図３２Ｃ）。既に明らかにされているように、大腸菌において発現されるＰａｐＭＶＣＰは、電子顕微鏡検査によって数多くの棒状体が見られるので（図３２Ｄ、左のパネル）、ＶＬＰへと効率的に自己組織化することができる。重要な点として、ＰａｐＭＶＣＰのＣ末端でのＨ９Ｎ２  Ｍ２ｅエピトープの融合は、超遠心後にペレット中で多くの棒状体が認められたので（図３２Ｄ、中央のパネル（Ｈ９Ｎ２  ＰａｐＭＶ−  ３ＧＬＭ２ｅ）及び右のパネル（Ｈ９Ｎ２  ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ））、このタンパク質がＶＬＰへと自己組織化する能力を損なわなかった。
（実施例ＸＩＶ）
インフルエンザＡ型Ｈ９Ｎ２株からのＭ２ｅエピトープを含むＡＣＳの免疫原性
Ｂａｌｂ／ＣマウスにおけるＨ９Ｎ２  ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰの免疫原性
１０匹のマウスの群に、１００μｇの精製Ｈ９Ｎ２  ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰ、等量のミョウバンをアジュバントとして添加したＨ９Ｎ２  ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰ、又はさらなる１００μｇのＰａｐＭＶ  ＶＬＰをアジュバントとして添加したＨ９Ｎ２  ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰを３回皮下注射した。また、別の群のマウスに、全タンパク質、すなわち超遠心を行わずに大腸菌から単離した、少なくとも２０％のディスクを含む全精製タンパク質を注射した。すべての場合において、マウスに注射した最終容量は５００μｌであった。
【０２８６】
３回の注射後に収集した抗血清に関して実施したＥＬＩＳＡは、Ｈ９Ｎ２  ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰがマウスにおいて免疫原性であることを明らかにした。ＰａｐＭＶ  ＶＬＰ又はミョウバンをアジュバントとして使用することの利点は、この場合には認められなかった。マウスの間で免疫応答の変動が認められ（図３３Ａ）、これはおそらく、マウスのレパートリーが、Ｈ９Ｎ２  Ｍ２ｅペプチドを効率良く認識することができる記憶Ｂ細胞を含まないという事実によると考えられる。ＰａｐＭＶ  ＶＬＰの表面に融合したＨ１Ｎ１  Ｍ２ｅペプチドは処置されたすべてのＢａｌｂ／Ｃマウスにおいて免疫原性であることが明らかにされており（実施例ＸＩ参照）、Ｈ１Ｎ１  Ｍ２ｅペプチドはＨ９Ｎ２ペプチドと比較して３アミノ酸相違だけを有するので、この結果はむしろ興味深い。
【０２８７】
ＶＬＰが免疫原性であることを確認するため、Ｈ９Ｎ２  ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰに対するＩｇＧのレベルを先の実施例で述べたように測定した。予想されたように、処置マウスがＨ９Ｎ２  Ｍ２ｅペプチドに対して効率的に反応しない場合でも、Ｈ９Ｎ２  ＰａｐＭＶ  ＶＬＰ（すなわち、ワクチンプラットフォーム）に対する非常に高い力価のＩｇＧが検出された（図３３Ｂ）。この結果から、Ｈ９Ｎ２  ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰは免疫原性であるが、Ｂａｌｂ／Ｃの限られた免疫レパートリーの故に、必ずしもすべての個別マウスがＨ９Ｎ２  Ｍ２ｅペプチドに対して免疫応答を発現する能力を持たないことが確認される。
【０２８８】
しかし、鳥類の免疫系はインフルエンザウイルスに対するＢ細胞のレパートリーを維持するように進化したため、Ｈ９Ｎ２  ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰは、Ｈ９Ｎ２株のインフルエンザのための天然宿主であるニワトリにおいて免疫原性である可能性が高い。
【０２８９】
Ｈ９Ｎ２  ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰは長期間持続性の記憶応答を誘導する
Ｈ９Ｎ２  Ｍ２ｅペプチドに対する高レベルの抗体を産生し、３回目の注射後１４０日目に保持されていた２匹のマウスの血清を分析した。抗体応答はこの期間全体にわたって維持されることが認められ、Ｈ９Ｎ２  ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰがマウスにおいて効率的に記憶応答を誘導できることを指示した（図３４Ａ）。さらに、これらのマウスはまた、持続性で豊富な量のＩｇＧ１（図３４Ｂ）及びＩｇＧ２ａ（図３４Ｃ）アイソタイプを産生することが示された。この結果は、Ｈ９Ｎ２  ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰが種々のアイソタイプに対するＢ細胞のクラススイッチを効率的に誘導できることを示し、マウスにおける平衡Ｔｈ１／Ｔｈ２応答を示唆する。
【０２９０】
他のＭ２ｅペプチドとＨ９Ｎ２−Ｍ２ｅ抗血清の交差反応性
Ｈ９Ｎ２  ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰに対して強く反応したマウスから得られた抗血清を、他のＭ２ｅペプチドの配列が認識されるかどうかを判定するためＥＬＩＳＡによって分析した。Ｈ９Ｎ２ペプチドを含む５つの異なるＭ２ｅペプチドを試験した（表３参照）。
【０２９１】
【表３】
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ＥＬＩＳＡの結果から、予想されたように、Ｈ９Ｎ２血清がＨ９Ｎ２ペプチドと最も強く反応し、次いでＨ３Ｎ８ペプチドと反応し、Ｈ５Ｎ１、Ｈ１Ｎ１及び突然変異型Ｉ／Ｔペプチドとは弱く反応することが明らかとなった（図３５）。この結果は、Ｈ９Ｎ２  ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰでの動物の免疫がインフルエンザのＨ９Ｎ２株とＨ３Ｎ８株の両方による感染に対して防御を導き得ることを示唆する。
（実施例ＸＶ）
インフルエンザＡ型Ｈ３Ｎ８株からのＭ２ｅエピトープを含むＡＣＳの開発
Ｈ３Ｎ８  ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅウイルス様粒子（ＶＬＰ）のクローニング及び作製
タンパク質のＣ末端で融合したＨ３Ｎ８インフルエンザ株からのＭ２ｅペプチドを含むＰａｐＭＶコートタンパク質を、Ｍ２ｅコード配列を創製するために以下のオリゴヌクレオチドを使用したことを除き、実施例ＩＸで述べたように作製した：
オリゴＭ２−Ｈ３Ｎ８フォワード：
５’−ＣＴＡＧＴＴＣＣＣＴＧＣＴＧＡＣＣＧＡＡＧＴＧＧＡＡＡＣＣＣＣＧＡＣＣＣＧＣＡＡＣＧＧＴＴＧＧＧＡＡＴＧＣＡＡＡＴＧＣＴＣＴＧＡＴＴＣＣＴＣＣＧＡＴＡ−３’［配列番号５４］
オリゴＭ２−Ｈ３Ｎ８リバース：
５’−ＣＧＣＧＴＡＴＣＧＧＡＧＧＡＡＴＣＡＧＡＧＣＡＴＴＴＧＣＡＴＴＣＣＣＡＡＣＣＧＴＴＧＣＧＧＧＴＣＧＧＧＧＴＴＴＣＣＡＣＴＴＣＧＧＴＣＡＧＣＡＧＧＧＡＡ−３’［配列番号５５］
最終構築物のヌクレオチド配列を図１Ｉに示し［配列番号５６］、エンコードされるアミノ酸配列を図１Ｊ［配列番号５７］に示す。
【０２９２】
生じた構築物を実施例ＩＸで述べたように大腸菌において発現させ、Ｈ３Ｎ８  ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅタンパク質を実施例ＩＸで述べたように超遠心によって精製した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＦＰＬＣ及び電子顕微鏡検査
発現されたタンパク質の分析を実施例ＩＸで述べたように実施した。
【０２９３】
結果
ＰａｐＭＶコートタンパク質及びＨ３Ｎ８  ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅのＣ末端配列を図３６Ａに示す。ＰａｐＭＶ及びＨ３Ｎ８  ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅのＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイルは、組換えタンパク質の高い純度を示す（図３６Ｂ）。予想されたように、ＰＢＳに再懸濁した超遠心タンパク質のＦＰＬＣプロファイルは、両方のタンパク質についてＶＬＰに対応する固有のピークを示した（図３６Ｃ）。Ｈ３Ｎ８  ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ  ＶＬＰピークは、９２％のＶＬＰからなると推定された。ＰａｐＭＶＣＰのＣ末端でのＨ３Ｎ８  Ｍ２ｅエピトープの融合は、超遠心後にペレット中で多くの棒状体が認められたので（図３６Ｄ、右のパネル）、このタンパク質がＶＬＰへと自己組織化する能力を損なわなかった。
（実施例ＸＶＩ）
インフルエンザＡ型Ｈ５Ｎ１株からのＭ２ｅエピトープを含むＡＣＳの開発
Ｈ５Ｎ１  ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅウイルス様粒子（ＶＬＰ）のクローニング及び作製
タンパク質のＣ末端で融合したＨ５Ｎ１インフルエンザ株からのＭ２ｅペプチドを含むＰａｐＭＶコートタンパク質を、Ｍ２ｅコード配列を創製するために以下のオリゴヌクレオチドを使用したことを除き、実施例ＩＸで述べたように作製した：
オリゴＭ２−Ｈ５Ｎ１フォワード：
５’−ＣＴＡＧＴＴＣＣＣＴＧＣＴＧＡＣＣＧＡＡＧＴＧＧＡＡＡＣＣＣＣＧＡＣＣＣＧＣＡＡＣＧＡＡＴＧＧＧＡＡＴＧＣＣＧＣＴＧＣＴＣＴＧＡＴＴＣＣＴＣＣＧＡＴＡ−３’［配列番号６０］
オリゴＭ２−Ｈ５Ｎ１リバース：
５’−ＣＧＣＧＴＡＴＣＧＧＡＧＧＡＡＴＣＡＧＡＧＣＡＧＣＧＧＣＡＴＴＣＣＣＡＴＴＣＧＴＴＧＣＧＧＧＴＣＧＧＧＧＴＴＴＣＣＡＣＴＴＣＧＧＴＣＡＧＣＡＧＧＧＡＡ−３’［配列番号６１］
最終構築物のヌクレオチド配列を図１Ｋに示し［配列番号５８］、エンコードされるアミノ酸配列を図１Ｌ［配列番号５９］に示す。
【０２９４】
生じた構築物を実施例ＩＸで述べたように大腸菌において発現させ、Ｈ５Ｎ１  ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅタンパク質を実施例ＩＸで述べたように超遠心によって精製した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び電子顕微鏡検査
発現されたタンパク質の分析を実施例ＩＸで述べたように実施した。
【０２９５】
結果
ＰａｐＭＶコートタンパク質及びＨ５Ｎ１  ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅのＣ末端配列を図３７Ａに示す。ＰａｐＭＶ及びＨ５Ｎ１  ＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅのＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイルは、組換えタンパク質の高い純度を示す（図３７Ｂ）。ＰａｐＭＶＣＰのＣ末端でのＨ５Ｎ１  Ｍ２ｅエピトープの融合は、超遠心後にペレット中で多くの棒状体が認められたので（図３７Ｃ、右のパネル）、このタンパク質がＶＬＰへと自己組織化する能力を損なわなかった。
（実施例ＸＶＩＩ）
インフルエンザＮＰタンパク質の作製
インフルエンザウイルス株Ａ／ＷＳＮ／３３からのＮＰタンパク質のコード配列（図４１Ａ；配列番号６３参照）を、以下のプライマーを使用してＰＣＲ増幅した：
フォワード：５’−ＧＡＣＴＣＣ  ＡＴＧ  ＧＣＧ  ＡＣＣ  ＡＡＡ  ＧＧＣ  ＡＣＣ  ＡＡＡ  ＣＧＡ−３’［配列番号６５］
リバース：５’−ＧＡＴＣ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＴＴＡ  ＧＴＧ  ＧＴＧ  ＧＴＧ  ＧＴＧ  ＧＴＧ  ＧＴＧ  ＡＴＴ  ＧＴＣ  ＧＴＡ  ＣＴＣ  ＣＴＣ−３’［配列番号６６］。
【０２９６】
増幅した配列を、ＮｃｏＩとＸｈｏＩで線状化したｐＥＴ−２４ｄ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）にクローニングした。ＮＰタンパク質のアミノ酸配列を図４１Ｂに示す［配列番号６４］。エンコードされる配列は、精製を容易にするための６×Ｈｉｓタグを含んだ。
【０２９７】
組換えＮＰタンパク質を、ＮＰコード配列を含むｐＥＴ−２４ｄ（＋）プラスミド（上述した）で形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）から作製した。細胞を、３０μｇ／ｍＬカナマイシンを含む２×ＹＴ中で増殖させた。培養が０．６のＯＤ６００に達したとき１ｍＭ  ＩＰＴＧでタンパク質発現を誘導した。誘導後、培養物を２２℃でさらに１６時間インキュベートし、その後細胞を遠心分離によって収集した。
【０２９８】
フレンチプレスを用いて細胞を溶解し、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ（Ｑｉａｇｅｎ社）及び５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール（ｐＨ８．０）を含む溶出緩衝液を使用してＨｉｓ標識ＮＰタンパク質を単離した。イミダゾールを除去するため、溶出したタンパク質を１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０に対して十分に透析した。最後に、ＨｉＴｒａｐ（商標）Ｈｅｐａｒｉｎ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）及び１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４中の漸増濃度のＮａＣｌ（２Ｍまで）の段階勾配を用いてＮＰタンパク質を精製した。
（実施例ＸＩＩＩ）
ＰａｐＭＶによる市販インフルエンザワクチンへのアジュバント添加は免疫原性を改善する
ＰａｐＭＶ
野生型ＰａｐＭＶを実施例Ｉで述べたように植物から単離した。
【０２９９】
マウスの免疫
５匹のマウスの２つの群を、最終容量３５０μｌ中の市販のＦｌｕｖｉｒａｌ（登録商標）ワクチン９μｇ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ社）（第１群）又は野生型ＰａｐＭＶウイルス１００μｇをアジュバントとして添加したＦｌｕｖｉｒａｌ（登録商標）ワクチン９μｇで皮下的に１回免疫した。免疫後５、１０及び１４日目に血液試料を収集した。
【０３００】
ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡ分析を、Ｆｌｕｖｉｒａｌ（登録商標）ワクチン及び組換えＮＰタンパク質（大腸菌において生産され、実施例ＸＶＩＩで述べたように精製された）のいずれかで被覆したプレートを使用したことを除き、先の実施例で概説したプロトコールを用いて実施した。ＮＰタンパク質に対するＩｇＧ２ａの量の測定のため（図４０Ｂに示すように）、ＮＰタンパク質でのプレートの被覆を４℃で一晩ではなく３７℃で２時間実施した。
【０３０１】
結果
血清中の総ＩｇＧを測定するために実施したＥＬＩＳＡは、免疫後５日目にＦｌｕｖｉｒａｌ（登録商標）ワクチンに対するＩｇＧが検出できなかったことを示す（図３８Ａ）。しかし、１０日目までに、ＰａｐＭＶによるアジュバント添加は、Ｆｌｕｖｉｒａｌ（登録商標）ワクチン単独で得られたＩｇＧ力価に比べて、２〜４倍に相当する１〜２対数だけＩｇＧ力価を改善し（図３８Ｂ）、この上昇は１４日目に維持されていたか又はわずかに改善されていた（図３８Ｃ）。
【０３０２】
Ｆｌｕｖｉｒａｌ（登録商標）ワクチンに対する血清中のＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ１抗体アイソタイプのそれぞれの量も分析した（図３９）。ＰａｐＭＶをアジュバントとして添加したＦｌｕｖｉｒａｌ（登録商標）で処置したマウスの血清は、約３２倍高いＩｇＧ２ａの量を示し（図３９Ａ）、ＰａｐＭＶアジュバントが免疫応答をＴＨ１応答へと推進することを示唆する。それ自体で、細胞応答はＦｌｕｖｉｒａｌ（登録商標）ワクチンに含まれるインフルエンザエピトープに対して誘発されると予想される。
【０３０３】
ＮＰタンパク質に対するマウスの免疫応答（総ＩｇＧ）もＥＬＩＳＡによって分析した。ＮＰタンパク質はインフルエンザウイルスの１つの成分であり、それ故Ｆｌｕｖｉｒａｌ（登録商標）ワクチンに含有される。ＰａｐＭＶをアジュバントとして添加したＦｌｕｖｉｒａｌ（登録商標）ワクチンで処置されたマウスの血清は、ＮＰタンパク質に対するＩｇＧの量の増加を示すことが認められる（図４０Ａ）。ワクチン接種マウスの血清中のＮＰタンパク質に対するＩｇＧ２ａの量の分析は、ＰａｐＭＶをアジュバントとして添加したＦｌｕｖｉｒａｌ（登録商標）ワクチンが、ＮＰタンパク質に対するＩｇＧ２ａの量より多く含んでいたことを示し（図４０Ｂ）、やはりＰａｐＭＶアジュバントが免疫応答をＴＨ１応答へと推進することを明らかにする。この場合に測定された比較的低い力価は、ＥＬＩＳＡプレートに関して加速被覆プロトコールを使用したことの結果であるが、結果は、アジュバント添加したＦｌｕｖｉｒａｌ（登録商標）ワクチンで処置されたマウスの血清中で測定されたＩｇＧ２ａの増加を明確に示している。
【０３０４】
本発明を一部の特定実施形態を参照して説明してきたが、本発明の精神と範囲から逸脱することなくその様々な変更例が当業者には明白であろう。当業者に明白であるすべてのそのような変更例は、特許請求の範囲内に包含されることが意図されている。
【図１−１】
2010508860.tif 000006
【図１−２】
2010508860.tif 000007
【図１−３】
2010508860.tif 000008
【図２】
2010508860.tif 000009
【図３】
2010508860.tif 000010
【図４】
2010508860.tif 000011
【図６】
2010508860.tif 000012
【図７】
2010508860.tif 000013
【図８】
2010508860.tif 000014
【図９】
2010508860.tif 000015
【図１０】
2010508860.tif 000016
【図１１】
2010508860.tif 000017
【図１３】
2010508860.tif 000018
【図１４】
2010508860.tif 000019
【図１５】
2010508860.tif 000020
【図１６】
2010508860.tif 000021
【図１７】
2010508860.tif 000022
【図１８】
2010508860.tif 000023
【図１９】
2010508860.tif 000024
【図２０】
2010508860.tif 000025
【図２１】
2010508860.tif 000026
【図２３】
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【図２４】
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【図２７】
2010508860.tif 000029
【図３４】
2010508860.tif 000030
【図３５】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
2010508860.tif 000034
【図４１】
2010508860.tif 000035
【図５】
2010508860.tif 000036
【図１２】
2010508860.tif 000037
【図２２】
2010508860.tif 000038
【図２５】
2010508860.tif 000039
【図２６】
2010508860.tif 000040
【図２８】
2010508860.tif 000041
【図２９】
2010508860.tif 000042
【図３０】
2010508860.tif 000043
【図３１】
2010508860.tif 000044
【図３２】
2010508860.tif 000045
【図３３】
2010508860.tif 000046
【図３６】
2010508860.tif 000047
【図３７】
2010508860.tif 000048
【配列表】
2010508860000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年7月17日(2009.7.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
パパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）又はＰａｐＭＶコートタンパク質を含むＶＬＰと併用される１つ以上のインフルエンザウイルス抗原を含む抗原提示系。
【請求項２】
前記ＶＬＰが、前記ＶＬＰを形成するように自己組織化することができる修飾ＰａｐＭＶコートタンパク質を含む、請求項１に記載の抗原提示系。
【請求項３】
前記１つ以上のインフルエンザウイルス抗原が前記ＰａｐＭＶ又は前記ＶＬＰのコートタンパク質に結合している、請求項１又は２に記載の抗原提示系。
【請求項４】
前記１つ以上のインフルエンザウイルス抗原が前記ＰａｐＭＶ又はＶＬＰに結合していない、請求項１又は２に記載の抗原提示系。
【請求項５】
前記系がＶＬＰを含み、かつ前記１つ以上のインフルエンザウイルス抗原がＶＬＰの前記コートタンパク質に遺伝子的に融合している、請求項３に記載の抗原提示系。
【請求項６】
前記１つ以上のインフルエンザウイルス抗原が、前記ＰａｐＭＶ又は前記ＶＬＰの前記コートタンパク質に共有結合している、請求項３に記載の抗原提示系。
【請求項７】
前記１つ以上のインフルエンザウイルス抗原が、市販のインフルエンザワクチンからなる、請求項１又は２に記載の抗原提示系。
【請求項８】
前記インフルエンザウイルス抗原の少なくとも１つがＭ２タンパク質に由来する、請求項１又は２に記載の抗原提示系。
【請求項９】
前記インフルエンザウイルス抗原の少なくとも１つがＭ２ｅペプチド又はそのフラグメントである、請求項１又は２に記載の抗原提示系。
【請求項１０】
前記抗原提示系がＶＬＰを含み、前記ＶＬＰが、配列番号１又は３に示される配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するＰａｐＭＶコートタンパク質を含む、請求項１又は２に記載の抗原提示系。
【請求項１１】
前記抗原提示系がＶＬＰを含み、前記ＶＬＰが、配列番号４、４７及び４８のいずれか１つに示される配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するＰａｐＭＶコートタンパク質を含む、請求項１又は２に記載の抗原提示系。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗原提示系を１つ以上含有する、インフルエンザワクチン組成物。
【請求項１３】
１つ以上のインフルエンザウイルス抗原に融合したパパイヤモザイクウイルスコートタンパク質を含むポリペプチド。
【請求項１４】
前記ポリペプチドが、配列番号４、４７及び４８のいずれか１つに示される配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１３又は１４に記載のポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド。
【請求項１６】
薬剤の製造における、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗原提示系の使用方法。
【請求項１７】
前記薬剤が、動物においてインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導するためのものである、請求項１６に記載の使用方法。
【請求項１８】
前記免疫応答が体液性応答を含む、請求項１７に記載の使用方法。
【請求項１９】
前記動物がヒトである、請求項１７又は１８に記載の使用方法。
【請求項２０】
前記動物が非ヒト動物である、請求項１７又は１８に記載の使用方法。
【請求項２１】
前記薬剤がアジュバントをさらに含む、請求項１６又は１７に記載の使用方法。
【請求項２２】
前記アジュバントがＰａｐＭＶ又はＰａｐＭＶ  ＶＬＰを含む、請求項２１に記載の使用方法。
【請求項２３】
動物においてインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導する市販のインフルエンザワクチンの効果を高めるために使用される、パパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）又はＰａｐＭＶコートタンパク質を含むＶＬＰを含有する組成物。
【請求項２４】
前記免疫応答がＮＰタンパク質に対する応答を含む、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記免疫応答がインフルエンザウイルスの２つ以上の株に対して有効である、請求項２３又は２４に記載の組成物。
【請求項２６】
動物においてインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導するための、請求項１又は２に記載の抗原提示系。
【請求項２７】
前記１つ以上のインフルエンザウイルス抗原が前記ＰａｐＭＶ又はＶＬＰのコートタンパク質に結合している、請求項２６に記載の抗原提示系。
【請求項２８】
前記１つ以上のインフルエンザウイルス抗原が前記ＰａｐＭＶ又はＶＬＰのコートタンパク質に結合していない、請求項２６に記載の抗原提示系。
【請求項２９】
前記系がＶＬＰを含み、かつ前記１つ以上のインフルエンザウイルス抗原がＶＬＰの前記コートタンパク質に遺伝子的に融合している、請求項２７に記載の抗原提示系。
【請求項３０】
前記１つ以上のインフルエンザウイルス抗原が、前記ＰａｐＭＶ又は前記ＶＬＰの前記コートタンパク質に共有結合している、請求項２７に記載の抗原提示系。
【請求項３１】
前記１つ以上のインフルエンザウイルス抗原が、市販のインフルエンザワクチンからなる、請求項２６に記載の抗原提示系。
【請求項３２】
前記インフルエンザウイルス抗原の少なくとも１つがＭ２タンパク質に由来する、請求項２６に記載の抗原提示系。
【請求項３３】
前記インフルエンザウイルス抗原の少なくとも１つがＭ２ｅペプチド又はそのフラグメントである、請求項２６に記載の抗原提示系。
【請求項３４】
前記抗原提示系がＶＬＰを含み、前記ＶＬＰが、配列番号１又は３に示される配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するＰａｐＭＶコートタンパク質を含む、請求項２６に記載の抗原提示系。
【請求項３５】
前記抗原提示系がＶＬＰを含み、前記ＶＬＰが、配列番号４、４７及び４８のいずれか１つに示される配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するＰａｐＭＶコートタンパク質を含む、請求項２６に記載の抗原提示系。
【請求項３６】
前記免疫応答が体液性免疫応答を含む、請求項２６に記載の抗原提示系。
【請求項３７】
前記動物がヒトである、請求項２６に記載の抗原提示系。
【請求項３８】
前記動物が非ヒト動物である、請求項２６に記載の抗原提示系。
【国際調査報告】
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