(57)【要約】  本発明は、タンパク質の発現を増加させるための、および、例えば遺伝子治療において腫瘍および癌疾患、心臓および循環器系統の病気、感染症、自己免疫疾患、または単一遺伝子疾患の治療に用いる薬学的組成物、特にワクチンの調製のための、塩基修飾されたＲＮＡとその使用を提供する。さらに、本発明は、インビトロ転写法、塩基修飾されたＲＮＡを用いてタンパク質の発現を増加させるためのインビトロでの方法、および、インビボでの方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質の発現を増加させるための、塩基修飾されたＲＮＡ配列の使用であって、該塩基修飾されたＲＮＡ配列は、少なくとも１つの塩基修飾を含み、かつ少なくとも１つのタンパク質をコードする、使用。
【請求項２】
上記塩基修飾されたＲＮＡが、一本鎖または二本鎖であり、線状または環状であり、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡまたはｍＲＮＡの形態である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
上記塩基修飾されたＲＮＡがｍＲＮＡである、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
上記塩基修飾されたＲＮＡは、組換えによって、または、天然に産生されるタンパク質の群より選択されるタンパク質の少なくとも１つをコードし、該タンパク質の群は、成長ホルモンまたは成長因子；代謝および／または造血に影響するタンパク質；血液凝固系のタンパク質；［ベータ］−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）；ＤＮＡ制限酵素；リゾチーム；プロテアーゼ；細胞の信号伝達を刺激するタンパク質；アポトーシス因子またはアポトーシスと関連または結合するタンパク質；腫瘍特異性表面抗原（ＴＳＳＡ）を含む抗原；ＮＹ−Ｅｓｏ−１またはＮＹ−Ｅｓｏ−Ｂを含む配列；上記タンパク質のうちの１つに対して、少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質またはタンパク質配列からなり、
上記成長ホルモンまたは成長因子は、ＴＧＦα、ＩＧＦ（インスリン様増殖因子）を含み、
上記代謝および／または造血に影響するタンパク質は、α−アンチトリプシン、ＬＤＬ受容体、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インシュリン、ＧＡＴＡ−１を含み、
上記血液凝固系のタンパク質は、第８因子、第６因子等であり、
上記ＤＮＡ制限酵素は、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩを含み、
上記プロテアーゼは、パパイン、ブロメライン、ケラチナーゼ、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、レニン（キモシン）、Ｓｕｉｚｙｍｅ、Ｎｏｒｔａｓｅを含み、
上記細胞の信号伝達を刺激するタンパク質は、４つの位置特異的な保存システイン残基（ＣＣＣＣ）と保存配列モチーフＴｒｐ−Ｓｅｒ−Ｘ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ＷＳＸＷＳ）とを含むクラスＩサイトカインファミリーのサイトカイン、４つの位置特異的な保存システイン残基（ＣＣＣＣ）を含んでいるが保存配列モチーフＴｒｐ−Ｓｅｒ−Ｘ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ＷＳＸＷＳ）を含んでいないクラスＩＩサイトカインファミリー、腫瘍壊死ファミリーのサイトカイン、７つの膜貫通ヘリックスを含みかつＧ−タンパク質と相互作用するケモカインファミリーのサイトカインを含み、
上記４つの位置特異的な保存システイン残基（ＣＣＣＣ）と保存配列モチーフＴｒｐ−Ｓｅｒ−Ｘ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ＷＳＸＷＳ）とを含むクラスＩサイトカインファミリーのサイトカインは、ＩＬ−３；ＩＬ−５；ＧＭ−ＣＳＦ；ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２を含むＩＬ−６サブファミリー；ＩＬ−２、ＩＬ−４ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５を含むＩＬ−２サブファミリー；サイトカインＩＬ−１α；ＩＬ−１β；ＩＬ−１０を含み、
上記４つの位置特異的な保存システイン残基（ＣＣＣＣ）を含んでいるが保存配列モチーフＴｒｐ−Ｓｅｒ−Ｘ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ＷＳＸＷＳ）を含んでいないクラスＩＩサイトカインファミリー（インターフェロン受容体ファミリー）のサイトカインは、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γを含み、
上記腫瘍壊死ファミリーのサイトカインは、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＴＮＦ−ＲＩ、ＴＮＦ−ＲＩＩ、ＣＤ４０、Ｆａｓを含み、
上記７つの膜貫通ヘリックスを含みかつＧ−タンパク質と相互作用するケモカインファミリーのサイトカインは、ＩＬ−８、ＭＩＰ−１、ランテス、ＣＣＲ５、ＣＸＲ４を含み、
上記アポトーシス因子またはアポトーシスと関連または結合するタンパク質は、ＡＩＦ、Ａｐａｆ、ＡＰＯ−２（Ｌ）、ＡＰＯ−３（Ｌ）、アポパイン、Ｂａｄ、Ｂａｋ、Ｂａｘ、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−ｘＳ、ｂｉｋ、ＣＡＤ、カルパイン、カスパーゼ、ｃｅｄ−３、ｃｅｄ−９、ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−Ｍｙｃ、ｃｒｍ  Ａ、シトクロムＣ、ＣｄＲ１、ＤｃＲ１、ＤＤ、ＤＥＤ、ＤＩＳＣ、ＤＮＡ−ＰＫＣＳ、ＤＲ３、ＤＲ４、ＤＲ５、ＦＡＤＤ／ＭＯＲＴ−１、ＦＡＫ、Ｆａｓ（ＦａｓリガンドＣＤ９５／ｆａｓ（受容体））、ＦＬＩＣＥ／ＭＡＣＨ、ＦＬＩＰ、ホドリン、ｆｏｓ、Ｇ―アクチン、ガス−２、ゲルゾリン、グランザイムＡ／Ｂ、ＩＣＡＤ、ＩＣＥ、ＪＮＫ、ラミンＡ／Ｂ、ＭＡＰ、ＭＣＬ−１、Ｍｄｍ−２、ＭＥＫＫ−１、ＭＯＲＴ−１、ＮＥＤＤ、ＮＦ−ｋＢ、ＮｕＭａ、ｐ５３、ＰＡＫ−２、ＰＡＲＰ、パーフォリン、ＰＩＴＳＬＲＥ、ＰＫＣσ、ｐＲｂ、プレセニリン、ｐｒＩＣＥ、ＲＡＩＤＤ、Ｒａｓ、ＲＩＰ、スフィンゴミエリナーゼ、単純ヘルぺス由来のチミジンキナーゼ、ＴＲＡＤＤ、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、トランスグルタミナーゼを含み、
上記Ａｐａｆは、例えばＡｐａｆ−１、Ａｐａｆ−２、Ａｐａｆ−３であり、
上記カスパーゼは、例えば、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１１であり、
上記腫瘍特異性表面抗原（ＴＳＳＡ）を含む抗原は、５Ｔ４、α５β１−インテグリン、７０７−ＡＰ、ＡＦＰ、ＡＲＴ−４、Ｂ７Ｈ４、ＢＡＧＥ、β−カテニン／ｍ、Ｂｃｒ−ａｂｌ、ＭＮ／Ｃ  ＩＸ抗原、ＣＡ１２５、ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ−１、ＣＡＳＰ−８、β−カテニン／ｍ、ＣＤ４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤＣ２７／ｍ、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ８０、ＣＤＫ４／ｍ、ＣＥＡ、ＣＴ、Ｃｙｐ−Ｂ、ＤＡＭ、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、ＥＬＦ２Ｍ、ＥＭＭＰＲＩＮ、ＥｐＣａｍ、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１、Ｇ２５０、ＧＡＧＥ、ＧｎＴ−Ｖ、Ｇｐ１００、ＨＡＧＥ、ＨＥＲ−２／ｎｅｗ、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１−Ｒ１７０Ｉ、ＨＰＶ−Ｅ７、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＡＳＴ−２、ｈＴＥＲＴ（またはｈＴＲＴ）、ｉＣＥ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−５、ＫＩＡＡ０２０５、ＬＡＧＥ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ−１／ｍｅｌａｎ−Ａ、ＭＡＲＴ−２／Ｓｋｉ、ＭＣ１Ｒ、ミオシン／ｍ、ＭＵＣ１、ＭＵＭ−１、−２、−３、ＮＡ８８−Ａ、ＰＡＰ、プロテイナーゼ−３、ｐ１９０  ｍｉｎｏｒ  ｂｃｒ−ａｂｌ、Ｐｍｌ／ＲＡＲα、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＰＳＭＡ、ＲＡＧＥ、ＲＵ１、ＲＵ２、ＳＡＧＥ、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−３、サバイビン、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＴＧＦβ、ＴＰＩ／ｍ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＴＲＰ−２／ＩＮＴ２、ＶＥＧＦ、およびＷＴ１を含む、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
上記塩基修飾されたＲＮＡは、２−アミノ６−クロロプリンリボシド−５'−三リン酸塩、２−アミノアデノシン５'−三リン酸塩、２−チオシチジン−５'−三リン酸塩、２−チオウリジン５'−三リン酸塩、４−チオウリジン５'−三リン酸塩、５−アミノアリルシチジン−５'−三リン酸塩、５−アミノアリルウリジン−５'−三リン酸塩、５−ブロモシチジン−５'−三リン酸塩、５―ブロモウリジン５'−三リン酸塩、５−ヨードシチジン−５'−三リン酸塩、５−ヨードウリジン−５'−三リン酸塩、５−メチルシチジン−５'−三リン酸塩、５メチルウリジン５'−三リン酸塩、６−アザシチジン５'−三リン酸塩、６―アザウリジン５'−三リン酸塩、６−クロロプリンリボシド−５'−三リン酸塩、７−デアザアデノシン５'−三リン酸塩、７−デアザグアノシン５'−三リン酸塩、８−アザアデノシン−５'−三リン酸塩、８−アジドアデノシン−５'−三リン酸塩、ベンズイミダゾール−リボシド５'−三リン酸塩、Ｎ１−メチルアデノシン−５'−三リン酸塩、Ｎ１−メチルグアノシン−５'−三リン酸塩、Ｎ６−メチルアデノシン−５'−三リン酸塩、Ｏ６−メチルグアノシン−５'−三リン酸塩、プソイドウリジン５'−三リン酸塩、プロマイシン５'−三リン酸塩、および、キサントシン５'−三リン酸塩からなる群より選択される塩基修飾の少なくとも１つを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
上記塩基修飾は、５−メチルシチジン−５'−三リン酸塩、７−デアザグアノシン５'−三リン酸塩、５−ブロモシチジン−５'−三リン酸塩、および、プソイドウリジン５'−三リン酸塩からなる群より選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
上記塩基修飾されたｍＲＮＡが、骨格修飾および糖修飾を含んでいない、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
上記塩基修飾されたｍＲＮＡが、少なくとも１つの骨格修飾および／または少なくとも１つの糖修飾を含んでいる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
上記塩基修飾されたｍＲＮＡが、該塩基修飾されたＲＮＡのコード領域内に、天然型のＲＮＡ配列のコード領域のＧ／Ｃ含量よりも多いＧ／Ｃ含量をさらに有しており、コードされるアミノ酸配列が野生型と比較して変更されていない、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
ｔＲＮＡをコードする天然型のＲＮＡの少なくとも１つのコドンであって細胞内に比較的まれに存在するコドンが、細胞内に比較的多く存在しかつ該比較的まれに存在するｔＲＮＡと同一のアミノ酸を運ぶｔＲＮＡをコードするコドンの１つによって置換される様式にて、上記塩基修飾されたＲＮＡのコード領域が、天然型のＲＮＡのコード領域と比較して変更されている、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
上記塩基修飾されたＲＮＡが、ｍ７Ｇ（５'）ｐｐｐ（５'（Ａ，Ｇ（５'）ｐｐｐ（５'）ＡおよびＧ（５'）ｐｐｐ（５'）Ｇからなる群より選択される５'−キャップ構造をさらに含んでいる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１２】
上記塩基修飾されたＲＮＡが、少なくとも５０ヌクレオチドのポリＡテールを含んでいる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１３】
上記塩基修飾されたＲＮＡが、少なくとも２０ヌクレオチドのポリＡテールを含んでいる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１４】
上記塩基修飾されたＲＮＡが、ヘキサヒスチジンタグ（ＨＩＳタグ、ポリヒスチジンタグ）、ストレプトアビジンタグ（連鎖球菌タグ）、ＳＢＰタグ（ストレプトアビジン結合タグ）、またはＧＳＴ（グルタチオンＳ-トランスフェラーゼ）タグからなる群より選択される精製用のタグ、または、抗体結合タグ、Ｍｙｃタグ、Ｓｗａｌｌエピトープ、ＦＬＡＧタグ、およびＨＡタグからなる群より選択される抗体エピトープを介する精製用のタグをさらにコードする、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１５】
上記塩基修飾されたＲＮＡが、脂質修飾を含んでいる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１６】
腫瘍および癌疾患、心臓および循環器系統の病気、感染症、自己免疫疾患または単一遺伝子疾患からなる群より選択される疾患を処置するための薬学的組成物を調製するための、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の塩基修飾されたＲＮＡの使用。
【請求項１７】
上記薬学的組成物が、プロタミン、ヌクレオリン、スペルミン、またはスペルミジンを含むカチオン性ペプチドまたはポリペプチド；キトサン、ＴＤＭ、ＭＤＰ、ムラミルジペプチド、プルロニクス、アルム溶液、水酸化アルミニウム、ＡＤＪＵＭＥＲ（商標）（ポリホスファゼン）を含むカチオン性の多糖類；リン酸アルミニウムゲル；藻類由来のグルカン；アルガムリン；水酸化アルミニウムゲル（アルム）；高タンパク質吸着性水酸化アルミニウムゲル；低粘性酸化アルミニウムゲル；ＡＦまたはＳＰＴ（スクアラン（５％）、Ｔｗｅｅｎ  ８０（０．２％）、プルロニック  Ｌ１２１（１．２５％）、リン酸緩衝食塩水のエマルジョン、ｐＨ７．４）；ＡＶＲＩＤＩＮＥ（商標）（プロパンジアミン）；ＢＡＹ  Ｒ１００５（商標）（（Ｎ−（−２デオキシ−２−Ｌ−ロイシルアミノ−ｂ−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｎ−オクタデシルドデカノイル−アミドハイドロ酢酸塩）；ＣＡＬＣＩＴＲＩＯＬ（商標）（１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３）；リン酸カルシウムゲル；ＣＡＰＴＭ（リン酸カルシウムナノ粒子）；コレラホロトキシン、コレラ毒素−Ａ１−タンパク質−Ａ−Ｄ−フラグメント融解タンパク質、コレラ毒素のサブユニットＢ；ＣＲＬ  １００５（ブロック共重合体Ｐ１２０５）；サイトカイン含有リポソーム；ＤＤＡ（ジメチルジオクタデシルアンモニウム臭化物）；ＤＨＥＡ（デヒドロエピアンドロステロン）；ＤＭＰＣ（ジミリストイルホスファチジルコリン）；ＤＭＰＧ（ジミリストイルホスファチジルグリセロール）；ＤＯＣ／アルム複合体（デオキシコール酸ナトリウム塩）；フロイント完全アジュバント；フロイント不完全アジュバント；ガンマイヌリン；ゲルブアジュバント（（ｉ）Ｎ−アセチルグルコサミニル（Ｐ１−４）−Ｎ−アセチルムラミル−ＬアラニルＤ−グルタミン（ＧＭＤＰ）と、（ｉｉ）ジメチルジオクタデシルアンモニウム塩化物（ＤＤＡ）と、（ｉｉｉ）亜鉛−Ｌ―プロリン塩複合体（ＺｎＰｒｏ−８）との混合物；ＧＭ−ＣＳＦ）；ＧＭＤＰ（Ｎ−アセチルグルコサミニル−（ｂ１−４）−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン）；イミキモド（１−（２−メチプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン）；ＩｍｍＴｈｅｒ（商標）（Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−ｉｓｏＧｌｕ−Ｌ−Ａｌａ−グリセロールジパルミテート）；ＤＲＶ（脱水−再水和小泡から調製された免疫リポソーム）；インターフェロン−γ；インターロイキン−１β；インターロイキン−２；インターロイキン−７；インターロイキン−１２；ＩＳＣＯＭＳ（商標）（「Immune Stimulating Complexes」）；ＩＳＣＯＰＲＥＰ  ７．０．３．（商標）；  リポソーム；ＬＯＸＯＲＩＢＩＮＥ（商標）（７−アリル−８−オキソグアノシン）；ＬＴ経口アジュバント（大腸菌の不安定なエンテロトキシンプロトキシン）；任意の組成のマイクロスフェアおよび微粒子；ＭＦ５９（商標）；（スクアレン水エマルジョン）；ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ  ＩＳＡ  ５１（商標）（精製不完全フロインドアジュバント）；ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ  ＩＳＡ  ７２０（商標）（代謝可能なオイルアジュバント）；ＭＰＬ（商標）（３−Ｑ−デサシル−４’−モノホスホリルリピドＡ）；ＭＴＰ−ＰＥおよびＭＴＰ−ＰＥリポソーム（（Ｎ−アセチル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ―アラニン−２−（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−（ヒドロキシホスホリルオキシ））エチルアミド、モノナトリウム塩）；ＭＵＲＡＭＥＴＩＤＥ（商標）（Ｎａｃ−Ｍｕｒ−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−Ｇｌｎ−ＯＣＨ３）；ＭＵＲＡＰＡＬＭＩＴＩＮＥ（商標）およびＤ−ＭＵＲＡＰＡＬＭＩＴＩＮＥ（商標）（Ｎａｃ−Ｍｕｒ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｄ−ｉｓｏＧＩｎ−ｓｎ−グリセロールジパルミトイル）；ＮＡＧＯ（ノイラミニダーゼガラクトースオキシダーゼ）；任意の組成のナノスフェアまたはナノ粒子；ＮＩＳＶ（非イオン界面活性剤小泡）；ＰＬＥＵＲＡＮ（商標）（β−グルカン）；ＰＬＧＡ、ＰＧＡ、およびＰＬＡ（乳酸およびグリコール酸のホモポリマーおよびコポリマー；マイクロ／ナノスフェア）；ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｌ１２１（商標）；ＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）；ＰＯＤＤＳ（商標）（プロテノイドマイクロスフェア）；ポリエチレンカルバメート誘導体；ポリ−ｒＡ：ポリ−ｒＵ（ポリアデニル酸のポリウリジル酸複合体）；ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ  ８０）；タンパク質コキエート（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，  Ｉｎｃ．，  Ａｌａｂａｓｔｅｒ，  ＡＬ）；ＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）（ＱＳ−２１）；Ｑｕｉｌ−Ａ（Ｑｕｉｌ−Ａサポニン）；Ｓ−２８４６３（４−アミノ−ｏｔｅｃ−ジメチル−２−エトキシメチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］−キノリン−１−エタノール）；ＳＡＦ−１（商標）（「Syntex adjuvant formulation」）；センダイプロテオリポソームおよび脂質センダイマトリックス；Ｓｐａｎ−８５（ソルビタントリオレート）；スペコール（Ｍａｒｃｏｌ  ５２、Ｓｐａｎ８５、およびＴｗｅｅｎ８５のエマルジョン）；スクアレンまたはＲｏｂａｎｅ（登録商標）（２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチルテトラコサン、および２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサン）；ステアリルチロシン（オクタデシルチロシン塩酸塩）；Ｔｈｅｒａｍｉｄ（登録商標）（Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−ｉｓｏＧｌｕ−Ｌ−Ａｌａ−ジパルミトキシプロピルアミド）；Ｔｈｅｒｏｎｙｌ−ＭＤＰ（Ｔｅｒｍｕｒｔｉｄｅ（商標）または［ｔｈｒ  １］−ＭＤＰ；Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン）；Ｔｙ粒子（Ｔｙ−ＶＬＰまたはウイルス様粒子）；Ｗａｌｔｅｒ−Ｒｅｅｄリポソーム（水酸化アルミニウム上に吸着されたリピドＡを含むリポソーム）；Ｐａｍ３Ｃｙｓを含むリポペプチド；ＣｐＧおよび／またはＲＮＡオリゴヌクレオチドから選択された核酸系のアジュバント、または、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＴＬＲ１１、ＴＬＲ１２、またはＴＬＲ１３、またはそれらの相同体のリガンドから選択されたトール様受容体からなる群より選択されるアジュバントをさらに含んでいる、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
上記薬学的組成物がワクチンである、請求項１６または１７に記載の使用。
【請求項１９】
上記癌または腫瘍の疾患が、黒色腫、悪性黒色腫、結腸癌、リンパ腫、肉腫、芽腫、腎癌、胃腸腫瘍、神経膠腫、前立腺腫瘍、膀胱癌、直腸腫瘍、胃癌、食道癌、膵臓癌、肝癌、乳癌、子宮癌、子宮頸癌、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、ヘパトーム、ウイルスによって誘発される様々な腫瘍（例えば、乳頭腫ウイルスによって誘発される悪性腫瘍（例えば子宮頚癌）、悪性腺腫、ヘルペスウイルスによって誘発される腫瘍（例えばバーキットリンパ腫、ＥＢＶによって誘発されるＢ細胞リンパ腫）、Ｂ型肝炎によって誘発される腫瘍（肝細胞悪性腫瘍）、ＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−２によって誘発されるリンパ腫等）、聴神経腫、肺癌（＝気管支癌）、小細胞肺癌、咽頭癌、肛門癌、グリア芽腫、直腸癌、星状細胞腫、脳腫瘍、網膜芽腫、基底細胞腫、脳転移、髄芽腫、膣癌、膵臓癌、精巣癌、ホジキン症候群、髄膜腫、シュネーベルガー病、脳下垂体腫瘍、菌状息肉腫、カルチノイド、神経鞘腫、棘細胞腫、バーキットリンパ腫、喉頭癌、腎癌、胸腺腫、体癌、骨肉腫、非ホジキンリンパ腫、尿道癌、ＣＵＰ症候群、頭頸部腫瘍、乏突起膠腫、外陰癌、腸癌、結腸癌、食道悪性腫瘍（＝食道癌）、いぼ合併症、小腸腫瘍、頭蓋咽頭腫、卵巣癌、生殖器腫瘍、卵巣癌、膵臓癌、子宮内膜癌、肝転移、陰茎癌、舌癌、胆嚢癌、白血病、形質細胞腫、まぶた腫瘍、および、前立腺癌（＝前立腺腫瘍）からなる群より選択される、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２０】
上記感染症が、インフルエンザ、マラリア、ＳＡＲＳ、黄熱、エイズ、ライムボレリア症、リーシュマニア症、炭疽病、髄膜炎、ウイルス感染症、細菌感染症、炭疽病、虫垂炎、ボレリア症、ボツリヌス中毒、カンフィローバクター、トラコーマクラミジア（尿道の炎症、結膜炎）、コレラ、ジフテリア、鼠径肉芽腫、喉頭蓋炎、発疹チフス、ガス壊疽、淋病、野兎病、ヘリコバクターピロリ、百日咳、鼠径リンパ肉芽腫、骨髄炎、レジオネラ症、ハンセン病、リステリア症、肺炎、髄膜炎、細菌性髄膜炎、炭疽病、中耳炎、マイコプラズマホミニス、新生児敗血症（絨毛羊膜炎）、水癌、パラチフス、ペスト、ライター症候群、ロッキー山紅斑熱、サルモネラ菌パラチフス、サルモネラ菌発疹チフス、猩紅熱、梅毒、破傷風、トリッパー、ツツガムシ病、結核、発疹チフス、膣炎、軟性下疳等、および寄生虫、原生動物、または菌によって発症する感染症、疥癬、皮膚のリーシュマニア症、ランブル鞭毛虫症、シラミ、マラリア、顕微鏡検査、糸状虫症（河川盲目症）、真菌症、ウシ条虫、住血吸虫病、睡眠病、ブタ条虫、トキソプラズマ症、トリコモナス症、トリパノソーマ症（睡眠病）、内臓性リーシュマニア症、おしめ／おむつ皮膚炎、または微小条虫によって引き起こされる感染症からなる群より選択され、
上記ウイルス感染症は、例えば、エイズ、尖圭コンジローマ、凹窩いぼ、デング熱、三日熱、エボラウイルス、風邪、初夏髄膜脳炎（ＦＳＭＥ）、インフルエンザ、帯状ヘルペス、肝炎、単純ヘルぺス  Ｉ型、単純ヘルぺス  ＩＩ型、帯状疱疹、インフルエンザ、日本脳炎、ラッサ熱、マールブルグウイルス、麻疹、口蹄疫、単核症、流行性耳下腺炎、ノーウォークウイルス感染、プファイファー腺熱、疱瘡、ポリオ（幼年期  跛行）、仮性クループ、伝染性紅斑、狂犬病、いぼ、西ナイル熱、水痘、巨細胞ウイルス（ＣＭＶ）等であり、
上記細菌感染症は、例えば、流産（前立腺炎症）であり、
上記寄生虫、原生動物、または菌によって発症する感染症は、例えば、アメーバ症、ビルハルツ住血吸虫症、シャーガス病、エキノコックス属、広節裂頭条虫、魚類中毒症（シガテラ中毒）、キツネ条虫、みずむし、イヌ条虫、カンジダ症、酵母菌斑である、
請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２１】
上記心臓および循環器系統の病気が、冠動脈心疾患、動脈硬化、卒中、高血圧からなる群より選択され、神経細胞の疾患が、アルツハイマー病、筋萎縮側索硬化、ジストニー、てんかん、多発硬化、およびパーキンソン病から選択される、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２２】
上記自己免疫疾患が、Ｉ型自己免疫疾患、ＩＩ型自己免疫疾患、ＩＩＩ型自己免疫疾患、またはＩＶ型自己免疫疾患からなる群より選択され、
上記自己免疫疾患が、例えば、多発硬化（ＭＳ）、関節リウマチ、糖尿病、Ｉ型糖尿病（真性糖尿病）、全身性エリテマートーデス（ＳＬＥ）、慢性多発関節炎、バセドウ氏病、自己免疫型慢性肝炎、潰瘍性大腸炎、Ｉ型アレルギー疾患、ＩＩ型アレルギー疾患、ＩＩＩ型アレルギー疾患、ＩＶ型アレルギー疾患、線維筋痛、脱毛症、ベヒテレフ病、クローン病、重症筋無力症、神経皮膚炎、リウマチ性多発筋痛、全身性進行性硬化（ＰＳＳ）、乾癬、ライター症候群、関節リウマチ、乾癬および脈管炎である、
請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２３】
上記単一遺伝子疾患が、アデノシンデアミナーゼ欠乏症、家族性高コレステロール血症、Ｃａｎａｖａｎ症候群、ゴーシェ病、ファンコニ貧血、神経セロイドリポフスチノーシス、ムコビシドーシス（嚢胞性線維症）、鎌状赤血球貧血、フェニルケトン尿症、アルカプトン尿症、白皮症、甲状腺機能低下不全症、ガラクトース血症、α１アンチトリプシン欠損症、色素性乾皮症、Ｒｉｂｂｉｎｇ症候群、ムコ多糖体症、唇裂、顎、口蓋、ローレンス・ムーン・バルデー・ビードル症候群、短肋骨多指症候群、クレチン病、ジュベール症候群、ＩＩ型早老症、短指症、副腎性器症候群のような常染色体劣性遺伝性疾患からなる群、および色覚異常、ぜい弱Ｘ症候群、筋ジストロフィ（デュシエンヌ型、Ｂｅｃｋｅｒ−Ｋｉｅｎｅｒ型）、血友病ＡおよびＢ、Ｇ６ＰＤ欠損症、ファブリー病、ムコ多糖体症、Ｎｏｒｒｉｅ症候群、色素性網膜炎、敗血性肉芽腫症、Ｘ−ＳＣＩＤ、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、レッシュ‐ナイハン症候群のようなＸ染色体遺伝性疾患からなる群、または、例えば遺伝性欠陥浮腫、マルファン症候群、神経線維腫症、Ｉ型早老症、骨形成不全症、クリッペル・トレノーネイ症候群、スタージ‐ウェーバー症候群、ヒッペル・リンダウ症候群、結節性硬化症のような常染色体優性遺伝性疾患より選択され、上記色覚異常は例えば赤緑色盲である、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２４】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の、塩基修飾されたＲＮＡ配列。
【請求項２５】
以下の工程（ａ）〜（ｄ）を含む、塩基修飾されたＲＮＡの調製のためのインビトロ転写法：
（ａ）目的のタンパク質をコードする（デオキシ）リボ核酸を調製する工程；
（ｂ）ＲＮＡポリメラーゼ、緩衝液、核酸混合物、および必要に応じてリボヌクレアーゼ阻害剤を含むインビトロ転写媒質に上記核酸を添加する工程であって、該核酸混合物は、１つ以上の天然型のヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ、および／またはＵの代りとしての、請求項５に定義されている１つ以上の塩基修飾ヌクレオチドと、天然型のヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ、またはＵの全てが置換されるわけではない場合、必要に応じて、１つ以上の天然型のヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ、またはＵとを含む、工程；
（ｃ）上記インビトロ転写媒質中にて上記核酸をインキュベートし、該核酸をインビトロ転写する工程；
（ｄ）必要に応じて、精製および組み込まれなかったヌクレオチドの上記インビトロ転写媒質からの除去を行う工程。
【請求項２６】
タンパク質の発現を増加させるためにインビトロで転写および翻訳を行う方法であって、以下の工程（ａ）〜（ｇ）を包含する方法：
（ａ）目的のタンパク質をコードする（デオキシ）リボ核酸を調製する工程；
（ｂ）ＲＮＡポリメラーゼ、緩衝液、核酸混合物、および必要に応じてリボヌクレアーゼ阻害剤を含むインビトロ転写媒質に上記核酸を添加する工程であって、該核酸混合物は、１つ以上の天然型のヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ、および／またはＵの代りとしての、請求項５に定義されている１つ以上の塩基修飾ヌクレオチドと、天然型のヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ、またはＵの全てが置換されるわけではない場合、必要に応じて、１つ以上の天然型のヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ、またはＵとを含む、工程；
（ｃ）上記インビトロ転写媒質中にて上記核酸をインキュベートし、該核酸をインビトロ転写する工程；
（ｄ）必要に応じて、精製および組み込まれなかったヌクレオチドの上記インビトロ転写媒質からの除去を行う工程；
（ｅ）工程（ｃ）および必要に応じて工程（ｄ）において得られた塩基修飾された核酸を、インビトロ翻訳媒質に添加する工程；
（ｆ）上記インビトロ翻訳媒質中にて上記塩基修飾された核酸をインキュベートし、該塩基修飾された核酸によってコードされるタンパク質をインビトロ翻訳する工程；
（ｇ）必要に応じて、工程（ｆ）において翻訳されたタンパク質を精製する工程。
【請求項２７】
宿主細胞中におけるタンパク質の発現を増加させるためにインビトロで転写および翻訳を行う方法であって、以下の工程（ａ）〜（ｇ'）を包含する方法：
（ａ）目的のタンパク質をコードする（デオキシ）リボ核酸を調製する工程；
（ｂ）ＲＮＡポリメラーゼ、緩衝液、核酸混合物、および必要に応じてリボヌクレアーゼ阻害剤を含むインビトロ転写媒質に上記核酸を添加する工程であって、該核酸混合物は、１つ以上の天然型のヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ、および／またはＵの代りとしての、請求項５に定義されている１つ以上の塩基修飾ヌクレオチドと、天然型のヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ、またはＵの全てが置換されるわけではない場合、必要に応じて、１つ以上の天然型のヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ、またはＵとを含む、工程；
（ｃ）上記インビトロ転写媒質中にて上記核酸をインキュベートし、該核酸をインビトロ転写する工程；
（ｄ）必要に応じて、精製および組み込まれなかったヌクレオチドの上記インビトロ転写媒質からの除去を行う工程；
（ｅ'）工程（ｃ）および必要に応じて工程（ｄ）において得られた塩基修飾された核酸を、宿主細胞にトランスフェクトする工程；
（ｆ'）上記宿主細胞中にて上記塩基修飾された核酸をインキュベートし、該塩基修飾された核酸によってコードされるタンパク質を翻訳する工程；
（ｇ'）必要に応じて、工程（ｆ）において翻訳されたタンパク質を単離および／または精製する工程。
【請求項２８】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を包含する、エキソビボでの治療法：
（ａ）必要に応じて患者から細胞または組織を外植する工程；
（ｂ）培養された細胞／組織、または工程（ａ）で得られた細胞／組織を、請求項２４に記載の塩基修飾されたＲＮＡによってトランスフェクトする工程；
（ｃ）必要に応じて、工程（ｂ）においてトランスフェクトされた細胞を患者に移植する工程。
【請求項２９】
上記トランスフェクトされた細胞が抗原提示細胞（ＡＰＣ）である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
請求項２４に記載の塩基修飾されたＲＮＡ配列を含んでいる、ＲＮＡライブラリー。
【請求項３１】
細胞／組織転写物の一部を提示するサブトラクションライブラリーである、請求項３０に記載のＲＮＡライブラリー。
【請求項３２】
以下の工程（ａ）〜（ｃ）によって特徴付けられる方法より取得される、ＲＮＡライブラリー：
（ａ）任意の細胞または組織から、ｃＤＮＡライブラリーまたはその一部を作製／調製する工程；
（ｂ）上記ｃＤＮＡライブラリーまたはその一部を用いて、本発明に係る塩基修飾されたＲＮＡをインビトロ転写するためのマトリックスを作製／調製する工程；
（ｃ）上記マトリックスをインビトロ転写する工程。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は、タンパク質の発現を増加させるための、および、例えば遺伝子治療において腫瘍および癌疾患、心臓および循環器系統の病気、感染症、自己免疫疾患、または単一遺伝子疾患の治療に用いる薬学的組成物、特にワクチンの調製のための、塩基修飾されたＲＮＡとその使用を説明する。さらに、本発明は、インビトロでの転写方法、および塩基修飾されたＲＮＡを用いてタンパク質の発現を増加させるためのインビトロでの方法、エキソビボおよびインビボでの方法を説明する。
【０００２】
心臓および循環器系統の病気と感染症に加えて、腫瘍および癌疾患の発生は、現代社会において最も大きな死因の１つであり、たいていの場合、治療とその後のリハビリテーション対策において相当なコストを伴う。腫瘍および癌疾患の治療は、例えば、発生する腫瘍の種類に大きく依存し、現在では通常、観血法に加えて放射線療法または化学療法を用いることで行われる。しかし、そのような療法は、免疫系に異常なストレスを与え、場合によっては、限られた範囲でしか用いることができない。その上、これらの療法の形態のほとんどは、免疫系を再生させるために、個々の治療の間に長い間隔を必要としている。従って、近年、そのような「従来の処置」に加えて、特に、遺伝子治療的なアプローチまたは遺伝子ワクチン接種が、治療のために、またはそのような療法をサポートするために非常に有望であることが分かっている。遺伝子治療的なアプローチの場合、単一遺伝子疾患、すなわち、１つの遺伝子欠陥によって引き起こされ、メンデルの法則に従って遺伝する（遺伝性）疾患も挙げられる。とりわけ、単一遺伝子疾患の最もよく知られている代表例としては、嚢胞性線維症と鎌状赤血球貧血が挙げられる。
【０００３】
遺伝子治療と遺伝子ワクチン接種は、分子医学的方法であり、それらの疾患の治療と予防における一般的な使用は、医療行為に多大な影響を及ぼす。両方法は、患者の細胞または組織への核酸の導入と、その後に続く、導入された核酸によってコードされる情報の、細胞または組織による処理、すなわち、所望のポリペプチドの発現とに基づいている。
【０００４】
遺伝子治療と遺伝子ワクチン接種の現在の方法における習慣的な手順は、求められる遺伝子情報を細胞に挿入するためにＤＮＡを使用することである。これに関連して、細胞にＤＮＡを導入するための様々な方法が開発されている。これらの方法としては、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリプレントランスフェクション、プロトプラスト融合、電気穿孔法、顕微注射、および、リポフェクション等が挙げられる。特に、リポフェクションは、適切な方法であることが知られている。
【０００５】
特に遺伝子ワクチン接種方法において提案されているさらなる方法は、ＤＮＡ媒体としてＤＮＡウイルスを使用することである。そのようなウイルスには、その感染性により非常に高いトランスフェクション効率を実現できるという利点がある。使用されるウイルスは、トランスフェクションされた細胞の中で機能的な感染性粒子が一切形成されないように遺伝子操作される。しかし、この予防策にもかかわらず、組み換えが起こる可能性があるため、導入された遺伝子治療的に活性のあるウイルス遺伝子が無制限に増殖してしまうという一定の危険性を排除することはできない。
【０００６】
細胞に導入されたＤＮＡは、通常、トランスフェクトされた細胞のゲノム中にある程度組み込まれる。一方では、この現象によって、導入されたＤＮＡの作用を長持ちさせることができるので、所望の効果を及ぼすことができる。他方では、ゲノム中への組み込みは、遺伝子治療に対して相当な危険性をもたらす。例えば、導入されたＤＮＡが無傷遺伝子に挿入され、それが突然変異して内在性遺伝子の機能を妨げたり、完全になくしたりするということが考えられる。そのような組み込みが起こる結果、一方では、細胞にとって不可欠な酵素系が排除される可能性があり、他方では、細胞増殖の制御を大きく左右する遺伝子が外来ＤＮＡの組み込みによって変えられる場合、退化した状態に変性された細胞に形質転換する危険性もある。このため、遺伝子治療薬やワクチンとしてＤＮＡウイルスを用いいる場合、癌形成等の危険性を排除することはできない。なお、これに関連して、細胞に導入された遺伝子の効果的な発現のために、対応するＤＮＡ媒体は、例えばウイルスＣＭＶプロモーター等の強いプロモーターを含んでいる。処理された細胞のゲノム中へのそのようなプロモーターの組み込みによって、細胞中の遺伝子発現の制御に好ましくない変化が引き起こされる可能性がある。
【０００７】
遺伝子治療薬やワクチンとしてＤＮＡを使用することのさらなる欠点は、患者の体内に好ましくない抗ＤＮＡ抗体を誘導し、致命的な免疫応答を引き起こす可能性があることである。
【０００８】
ＤＮＡとは対照的に、遺伝子治療薬やワクチンとしてのＲＮＡの使用は、かなり安全な部類に入れられる。特に、ＲＮＡは、トランスフェクトされた細胞のゲノム中に安定して組み込まれるという危険性を伴わない。さらに、効果的な転写のために、プロモーター等のウイルス配列を必要としない。そして、ＲＮＡは、はるかに単純にインビボで分解する。抗ＲＮＡ抗体はこれまで一切検出されてこなっかたが、それは恐らくＲＮＡはＤＮＡと比べて血液循環中の半減期が相対的に短いためであると思われる。従って、ＲＮＡは、分子医学的治療方法に適した分子と見なすことができる。
【０００９】
しかし、多くの場合、患者の細胞または組織への核酸の導入とその後の核酸によってコードされる所望のポリペプチドの発現とに基づいた発現系は、ＤＮＡとＲＮＡのどちらを使用するかに関わらず、効果的な治療を行うために望ましい発現量どころか、そのために必要な発現量さえ示さない。
【００１０】
従来技術において、インビトロおよび／またはインビボでの発現系のタンパク質発現の収率を高めるための様々な異なる試みがこれまでなされてきた。従来技術において一般に記載された、発現を増加させるための方法は、従来、特定のプロモーターとこれらに対応して使用可能な制御要素とを含んでいる発現カセットの使用に基づいている。そのような発現カセットの多くは、それらのサイズのため（使用した挿入物とは無関係に）トランスフェクションにおける制限を明確に示す。さらに、通常、発現カセットは特定の細胞系に限定されるため、扱われる細胞に基づいて、新しい発現システムのクローンを作り、細胞にトランスフェクトしなければならない。従って、標的細胞において、発現カセット上に導入されたプロモーターと制御要素とは無関係に、細胞に内在する系によってコードされるタンパク質を発現することができる核酸分子が最も好ましい。
【００１１】
例えば、ＤＥ１０１１９００５（Roche Diagnostics GmbH）には、ＤＮＡ分子に基づいたタンパク質の発現方法が記載されており、線状の短いＤＮＡの安定性の向上が様々な対策によって実現され、その結果、エクソヌクレアーゼによる分解の低下のため発現が向上する。そこで、ＤＥ１０１１９００５には、耐エクソヌクレアーゼヌクレオチド類似体または他の分子を線状の短いＤＮＡの３'末端に取り込むことが記載されている。また、ＤＥ１０１１９００５には、例えばビオチン、アビジン、またはストレプトアビジン等の大きな分子を線状の短いＤＮＡの末端に結合することが記載されている。最後に、ＤＥ１０１１９００５では、エクソヌクレアーゼは、また、拮抗または非拮抗阻害剤を加えることによって不活性化または抑制することもできる。しかし、ＤＥ１０１１９００５には、使用される線状の短いＤＮＡの安定性を向上することによってのみタンパク質の発現を増加させることしか記載されていない。また、ＤＥ１０１１９００５には、ＲＮＡに対する修飾については一切示されていない。
【００１２】
従来技術において、ＲＮＡの安定性を改善し、それによってＲＮＡを遺伝子治療薬またはＲＮＡワクチンとして使用することを可能にするためのいくつかの対策が追加的に提案さてれいる。ＥＰ  Ａ−１０８３２３２には、例えば、ＲＮＡがエキソビボで不安定であるという問題を解決するために、ＲＮＡ、特にｍＲＮＡを細胞と生物に導入するための方法が提案されている。この方法では、ＲＮＡはカチオン性ペプチドまたはタンパク質との複合体という形で存在している。
【００１３】
または、ＷＯ９９／１４３４６には、リボヌクレアーゼによる分解に対してｍＲＮＡ種を安定させる、ｍＲＮＡの安定化方法、特にｍＲＮＡの修飾が記載されている。そのような修飾は、一方では、配列の修飾、特に塩基除去または塩基置換によるＣおよび／またはＵ含量の低減による安定化に関する。他方では、５'-および３'-保護基だけでなく、ヌクレオチド類似体の使用、ポリＡテールの長さの増加、分解防止剤とのｍＲＮＡの複合化、およびこれらの組み合わせ等の化学修飾が提案されているが、ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質の発現増加は達成されていない。
【００１４】
米国特許５，５８０，８５９と米国特許６，２１４，８０４では、とりわけ、ｍＲＮＡワクチンと治療薬が「一過性遺伝子治療」（ＴＧＴ）の範囲内で開示されている。翻訳効率とｍＲＮＡ安定性を向上させるための様々な方法が記載されており、これらの方法は、特に、翻訳されなかった配列領域に基づいている。しかし、そのような修飾は、翻訳されたｍＲＮＡ配列に比べて比較的長い、非翻訳配列を含む発現ベクターを必要とする。しかし、これにより、発現ベクターが大幅に増化し、トランスフェクションを低下させるおそれがある。さらに、米国特許５，５８０，８５９と米国特許６，２１４，８０４に記載された配列には、当該配列によってコードされるタンパク質の発現の増加は示されていない。
【００１５】
また、最適化されたｍＲＮＡは、ＷＯ０２／０９８４４３（CureVac社）に記載されている。例えば、ＷＯ０２／０９８４４３には、一般的な形で安定し、それらのコーディング領域において翻訳のために最適化されたｍＲＮＡが記載され、例えば、配列修飾を決定するための方法が開示されている。また、ＷＯ０２／０９８４４３には、配列のＧ／Ｃ含量を増加させるために、ｍＲＮＡ配列においてアデノシンとウラシルヌクレオチドの置換の可能性が記載されている。ＷＯ０２／０９８４４３によると、Ｇ／Ｃ含量を増加させるためのそのような置換と適応は、遺伝子治療への応用において、および、癌治療のための遺伝子ワクチンとして使用することができる。ＷＯ０２／０９８４４３は、上記修飾のための塩基配列として、修飾されたｍＲＮＡが、例えば全く治療されない、十分に治療されない、または誤って治療される患者の体内で形成される少なくとも１つの活性ペプチドまたはポリペプチドをコードする配列を一般に言及している。または、ＷＯ０２／０９８４４３には、そのような修飾のための塩基配列として癌抗原をコードするｍＲＮＡが提案されている。
【００１６】
さらに、従来技術の多くの方法において、修飾は、まず複雑で、たいていの場合は高価なプロセスによって、例えば、ＤＮＡ/ＲＮＡ合成装置を用いた核酸合成によるヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの置換等によって、遺伝子配列に導入しなければならないことがよく知られている。これにより、一般に、修飾された遺伝子配列の安定性と発現を調べるためのコストと、当該遺伝子配列によってコードされるタンパク質を発現するために当該遺伝子配列をインビトロおよびインビボで使用するコストがともに増加する。
【００１７】
要するに、従来技術では、ＤＮＡ発現ベクターの使用とは別に、実用にかなった費用便益比（率）と同時に最大限の反応可変性で、インビトロまたはインビボでＲＮＡ鋳型分子から始まるタンパク質の発現を意図的に増加させる標的方法または使用が示されていない。従って、本発明の目的は、遺伝子治療薬またはワクチンとしてＤＮＡを使用することの欠点を避けながらも、ｍＲＮＡに基づいて、標的細胞系におけるタンパク質の発現の増加を実現する遺伝子治療または遺伝子ワクチン接種のための方法および使用を提供することである。
【００１８】
この目的は、タンパク質の発現を増加させるための、塩基修飾されたＲＮＡ配列の使用によって実現される。当該塩基修飾されたＲＮＡ配列は、少なくとも１つの塩基修飾を含み、かつ少なくとも１つのタンパク質をコードする。本発明が、コードされるタンパク質/ペプチドの発現量を増加させるための塩基修飾されたＲＮＡの使用に関する一方、（単独でまたは任意の組み合わせによってここに開示された（好ましい）特徴を含む）そのような塩基修飾されたＲＮＡは、本発明の対象でもある。
【００１９】
本発明に関連して、本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡは、少なくとも１つのタンパク質/ペプチドをコードするＲＮＡであればどんなＲＮＡでもよい。本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡは、一本鎖または二本鎖の、線状または環状の、ｍＲＮＡの形態をとることができる。本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡは、特に好ましくは一本鎖ＲＮＡの形態、さらに好ましくはｍＲＮＡという形態をとる。本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡは、好ましくは５０から１５，０００ヌクレオチドの長さ、より好ましくは５０から１０，０００ヌクレオチドの長さ、さらに好ましくは５００から１０，０００ヌクレオチドの長さ、最も好ましくは５００から５０００ヌクレオチドの長さを有している。最も好ましくは、本発明の塩基修飾されたＲＮＡは、少なくとも１つのタンパク質/ペプチドの配列をコードする。ここで、コードするＲＮＡは、通常、ｍＲＮＡであり、当該ｍＲＮＡはいくつかの構造要素、例えば、任意的な５'−ＵＴＲ領域、後にコーディング領域が続く上流に位置するリボソーム結合部位、任意的な３'−ＵＴＲ領域等から構成され、これらの後にポリＡテール（および／またはポリＣテール）が続いてもよい。
【００２０】
本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡ配列は、通常、少なくとも１つの塩基修飾を含んでおり、当該少なくとも１つの塩基修飾は、未変化の、すなわち自然（＝天然）の、ＲＮＡ配列に比べて有意に、ＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現を増加させるのに適していることが好ましい。ここでいう「有意に」とは、天然のＲＮＡ配列の発現に比べてタンパク質の発現の増加が、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、４０％、５０％、または６０％、より好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、または１００％、最も好ましくは少なくとも１５０％、２００％、または３００％であることを意味している。本発明に関連して、本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡの塩基修飾を有するヌクレオチドは、好ましくは、次からなる塩基修飾されたヌクレオチドの群から選択される：
・ ２−アミノ−６−クロロプリンリボシド−５'−三リン酸塩
・ ２−アミノアデノシン−５'−三リン酸塩
・ ２−チオシチジン−５'−三リン酸塩
・ ２−チオウリジン−５'−三リン酸塩
・ ４−チオウリジン−５'−三リン酸塩
・ ５−アミノアリルシチジン−５'−三リン酸塩
・ ５−アミノアリルウリジン−５'−三リン酸塩
・ ５−ブロモシチジン−５'−三リン酸塩
・ ５−ブロモウリジン−５'−三リン酸塩
・ ５−ヨードシチジン−５'−三リン酸塩
・ ５−ヨードウリジン−５'−三リン酸塩
・ ５−メチルシチジン−５'−三リン酸塩
・ ５−メチルウリジン−５'−三リン酸塩
・ ６−アザシチジン−５'−三リン酸塩
・ ６−アザウリジン−５'−三リン酸塩
・ ６−クロロプリンリボシド−５'−三リン酸塩
・ ７−デアザアデノシン−５'−三リン酸塩
・ ７−デアザグアノシン−５'−三リン酸塩
・ ８−アザアデノシン−５'−三リン酸塩
・ ８−アジドアデノシン−５'−三リン酸塩
・ ベンズイミダゾール−リボシド−５'−三リン酸塩
・ Ｎ１−メチルアデノシン−５'−三リン酸塩
・ Ｎ１−メチルグアノシン−５'−三リン酸塩
・ Ｎ６−メチルアデノシン−５'−三リン酸塩
・ Ｏ６−メチルグアノシン−５'−三リン酸塩
・ プソイドウリジン−５'−三リン酸塩
・ プロマイシン−５'−三リン酸塩
・ キサントシン−５'−三リン酸塩
中でも、５−メチルシチジン−５'−三リン酸塩、７−デアザグアノシン−５'−三リン酸塩、５−ブロモシチジン−５'−三リン酸塩、および、プソイドウリジン−５'−三リン酸塩からなる塩基修飾されたヌクレオチドの群から選択された塩基修飾のためのヌクレオチドが特に好ましい。
【００２１】
これに関連して、これに限定されるものではないが、発明者らは、塩基修飾されたＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現の増加は、とりわけ、二次構造の安定化の向上、そして状況に応じては、その結果生じる「より高い剛性を有する」ＲＮＡの構造および「塩基の積み重ね」の増加に起因すると考えている。例えば、プソイドウリジン−５'−三リン酸塩は、真核生物および原核生物の両方において、構造ＲＮＡ（ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、およびｓｎＲＮＡ）に天然に存在することが知られている。これに関連して、プソイドウリジンは、二次構造を安定させるためにｒＲＮＡにおいて必要であると考えられる。進化の過程で、ＲＮＡにおけるプソイドウリジンの量は増加し、驚くべきことに、翻訳がｔＲＮＡとｒＲＮＡにおけるプソイドウリジンの存在に左右され、ｔＲＮＡとｍＲＮＡとの相互作用はおそらくこれによって増加していることを示すことが可能である。プソイドウリジンへのウリジンの変換は、プソイドウリジンシンターゼによって転写後に起こる。５−メチルシチジン−５'−三リン酸塩の場合も、メチルトランスフェラーゼによって触媒されるＲＮＡの転写後修飾が起こる。プソイドウリジンの量と他のヌクレオチドの塩基修飾のさらなる増加は、同様な効果をもたらすと考えうるが、これらの効果は、プソイドウリジン量の自然発生的増加とは違って、標的化された方法で、かつ、はるかに大きな可変性をもって行うことができる。従って、プソイドウリジン−５'−三リン酸塩と同様の機構、すなわち、二次構造の安定化の向上とそれに基づいた翻訳効率の向上が、５−メチルシチジン−５'−三リン酸塩とその他の上述の塩基修飾に対して想定される。しかし、構造に基づく発現の増加に加えて、翻訳へのプラス効果も、二次構造の安定化と「より高い剛性を有する」ＲＮＡの構造とは無関係に想像される。さらに、状況に応じて、発現の増加は、インビトロまたはインビボにてリボヌクレアーゼによるｍＲＮＡ配列の分解率が低いことに起因することもある。
【００２２】
本発明で用いられるＲＮＡの塩基修飾は、当業者に公知の方法によってＲＮＡに導入することができる。適切な方法としては、例えば、（自動または半自動）オリゴヌクレオチド合成装置を用いた合成方法、例えばインビトロ転写方法等の化学的方法等が挙げられる。これに関連して、長さが一般に５０から１００ヌクレオチドを超えない（相対的に短い）配列の場合、インビトロ転写方法だけでなく、（自動または半自動）オリゴヌクレオチド合成装置を用いた合成方法も好ましく使うことができるが、（相対的に長い）配列、例えば、５０から１００ヌクレオチドを超える長さを有する配列の場合、インビトロ転写方法等の化学的方法が好ましく適しており、本発明に係る以下に記載のインビトロ転写方法が好ましい。しかし、さらに長い塩基修飾されたＲＮＡ分子を、共有結合により様々な合成断片を結合することによって合成的に合成してもよい。
【００２３】
本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡ配列の塩基修飾は、通常、塩基修飾されたＲＮＡ配列の少なくとも１つの（塩基修飾が可能な）ヌクレオチドに、好ましくは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の（塩基修飾が可能な）ヌクレオチドに、より好ましくは少なくとも１０から２０個の（塩基修飾が可能な）ヌクレオチドに、さらに好ましくは少なくとも１０から１００個の（塩基修飾が可能な）ヌクレオチドに、最も好ましくは少なくとも１０から２００個以上の（塩基修飾が可能な）ヌクレオチドに生じる。すなわち、本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡ配列における塩基修飾は、通常、塩基修飾されたＲＮＡ配列の少なくとも１つの（塩基修飾が可能な）ヌクレオチドに、好ましくはすべての（塩基修飾が可能な）ヌクレオチドの少なくとも１０％に、より好ましくはすべての（塩基修飾が可能な）ヌクレオチドの少なくとも２５％に、さらに好ましくはすべての（塩基修飾が可能な）ヌクレオチドの少なくとも５０％に、さらにまた好ましくはすべての（塩基修飾が可能な）ヌクレオチドの少なくとも７５％に、最も好ましくは本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡ配列に含まれる全ての（塩基修飾が可能な）ヌクレオチドの１００％に生じる。上記の好ましい百分率の値は、塩基修飾されたＲＮＡのコーディング領域にも当てはまる。すなわち、塩基修飾されたされたＲＮＡのコーディング領域のヌクレオチドの、例えば、好ましくは１０％、より好ましくは２０％、さらに好ましくは少なくとも２５％、特に好ましくは少なくとも７５％等が置換されてもよい。
【００２４】
ここでいう「塩基修飾が可能なヌクレオチド」とは、上記のように塩基修飾されたヌクレオチドに置換されるヌクレオチドであればどんなヌクレオチド（好ましくは天然型（自然、天然）で修飾されない）でもよい。これにより、ＲＮＡ配列のすべてのヌクレオチドまたはＲＮＡ配列の特に選ばれたヌクレオチドのみを塩基修飾することが可能となる。ＲＮＡ配列の全てのヌクレオチドを塩基修飾する場合、ＲＮＡ配列の「塩基修飾が可能なヌクレオチド」の１００％は、使用されたＲＮＡ配列のすべてのヌクレオチドである。一方、ＲＮＡ配列の特に選ばれたヌクレオチドのみを塩基修飾する場合、選ばれたヌクレオチドは、例えば、アデノシン、シチジン、グアノシン、またはウリジンである。従って、天然の配列のアデノシンは塩基修飾されたアデノシンによって、シチジンは塩基修飾されたシチジンよって、ウリジンは塩基修飾されたウリジンによって、そしてグアノシンは塩基修飾されたグアノシンによって置換することができる。この場合、ＲＮＡ配列の「塩基修飾が可能なヌクレオチド」の１００％は、使用されたＲＮＡ配列に含まれるアデノシン、シチジン、グアノシン、またはウリジンの１００％である。
【００２５】
本発明の塩基修飾されたＲＮＡの好ましい実施形態は、例えば５−メチルシチジン−５'−三リン酸塩および／または５−ブロモシチジン−５'−三リン酸塩ヌクレオチド等の塩基修飾されたシチジンヌクレオチドに修飾されたすべてのＲＮＡシチジン−５'−三リン酸塩ヌクレオチド（またはコーディング領域のすべてのシチジン−５'−三リン酸塩ヌクレオチド）の少なくとも１０％、および／または例えば７−デアザグアノシン−５'−三リン酸塩ヌクレオチド等の塩基修飾されたグアノシンヌクレオチドに修飾されたすべてのグアノシン−５'−三リン酸塩ヌクレオチド（またはコーディング領域のすべてのグアノシン−５'−三リン酸塩ヌクレオチド）の少なくとも１０％、および／または例えばプソイドウリジン−５'−三リン酸塩等の塩基修飾されたウリジンヌクレオチドに修飾されたすべてのウリジン−５'−三リン酸塩ヌクレオチド（またはコーディング領域のすべてのウリジン−５'−三リン酸塩ヌクレオチド）の少なくとも１０％を含んでもよい。本発明の塩基修飾されたＲＮＡの他の好ましい実施形態は、例えば５−メチルシチジン−５'−三リン酸塩および／または５−ブロモシチジン−５'−三リン酸塩ヌクレオチド等の塩基修飾されたシチジンヌクレオチドに修飾されたすべてのＲＮＡシチジン−５'−三リン酸塩ヌクレオチド（またはコーディング領域のすべてのシチジン−５'−三リン酸塩ヌクレオチド）の少なくとも２５％、および／または例えば７−デアザグアノシン−５'−三リン酸塩ヌクレオチド等の塩基修飾されたグアノシンヌクレオチドに修飾されたすべてのグアノシン−５'−三リン酸塩ヌクレオチド（またはコーディング領域のすべてのグアノシン−５'−三リン酸塩ヌクレオチド）の少なくとも２５％、および／または例えばプソイドウリジン−５'−三リン酸塩等の塩基修飾されたウリジンヌクレオチドに修飾されたすべてのウリジン−５'−三リン酸塩ヌクレオチド（またはコーディング領域のすべてのウリジン−５'−三リン酸塩ヌクレオチド）の少なくとも２５％を含んでもよい。本発明の塩基修飾されたＲＮＡの他の好ましい実施形態は、例えば５−メチルシチジン−５'−三リン酸塩および／または５−ブロモシチジン−５'−三リン酸塩ヌクレオチド等の塩基修飾されたシチジンヌクレオチドに修飾されたすべてのＲＮＡシチジン−５'−三リン酸塩ヌクレオチド（またはコーディング領域のすべてのシチジン−５'−三リン酸塩ヌクレオチド）の少なくとも５０％、および／または例えば７−デアザグアノシン−５'−三リン酸塩ヌクレオチド等の塩基修飾されたグアノシンヌクレオチドに修飾されたすべてのグアノシン−５'−三リン酸塩ヌクレオチド（またはコーディング領域のすべてのグアノシン−５'−三リン酸塩ヌクレオチド）の少なくとも５０％、および／または例えばプソイドウリジン−５'−三リン酸塩等の塩基修飾されたウリジンヌクレオチドに修飾されたすべてのウリジン−５'−三リン酸塩ヌクレオチド（またはコーディング領域のすべてのウリジン−５'−三リン酸塩ヌクレオチド）の少なくとも５０％を含んでもよい。本発明の塩基修飾されたＲＮＡの他の好ましい実施形態は、例えば５−メチルシチジン−５'−三リン酸塩および／または５−ブロモシチジン−５'−三リン���塩ヌクレオチド等の塩基修飾されたシチジンヌクレオチドに修飾されたすべてのＲＮＡシチジン−５'−三リン酸塩ヌクレオチド（またはコーディング領域のすべてのシチジン−５'−三リン酸塩ヌクレオチド）の少なくとも７５％、および／または例えば７−デアザグアノシン−５'−三リン酸塩ヌクレオチド等の塩基修飾されたグアノシンヌクレオチドに修飾されたすべてのグアノシン−５'−三リン酸塩ヌクレオチド（またはコーディング領域のすべてのグアノシン−５'−三リン酸塩ヌクレオチド）の少なくとも７５％、および／または例えばプソイドウリジン−５'−三リン酸塩等の塩基修飾されたウリジンヌクレオチドに修飾されたすべてのウリジン−５'−三リン酸塩ヌクレオチド（またはコーディング領域のすべてのウリジン−５'−三リン酸塩ヌクレオチド）の少なくとも７５％を含んでもよい。特に好ましい実施形態では、塩基修飾されたＲＮＡのコーディング領域が、１つの特定のタイプの塩基修飾されたヌクレオチドを少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％を含んでいるが、これは、すべてのウリジンヌクレオチドの例えば少なくとも７５％、８５％、９０％、９５％が、例えばプソイドウリジン−５'−三リン酸塩、または少なくとも他の一種類の塩基修飾されたウリジンヌクレオチドとプソイドウリジン−５'−三リン酸塩との組み合わせ等の塩基修飾されたウリジンヌクレオチドによって置換されること、または、すべてのシチジンヌクレオチドの例えば少なくとも７５％、８５％、９０％、９５％が、例えば５−メチルシチジン−５'−三リン酸塩および／または５−ブロモシチジン−５'−三リン酸塩ヌクレオチド、または少なくとも他の一種類の塩基修飾されたシチジンヌクレオチドと５−メチルシチジン−５'−三リン酸塩および／または５−ブロモシチジン−５'−三リン酸塩ヌクレオチドとの組み合わせ等の塩基修飾されたシチジンヌクレオチドによって置換されること、または、すべてのアデノシンヌクレオチドの例えば少なくとも７５％、８５％、９０％、９５％が、塩基修飾されたアデノシンヌクレオチドまたは少なくとも二種類の塩基修飾されたアデノシンヌクレオチドの組み合わせによって置換されること、または、すべてのグアノシンヌクレオチドの例えば少なくとも７５％、８５％、９０％、９５％が、例えば７−デアザグアノシン−５'-三リン酸塩ヌクレオチド、または少なくとも他の一種類の塩基修飾されたグアノシンヌクレオチドと７−デアザグアノシン−５'−三リン酸塩ヌクレオチドとの組み合わせ等の塩基修飾されたグアノシンヌクレオチドによって置換されることを意味する。
【００２６】
本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡ配列は、さらに骨格修飾を含んでもよい。本発明でいう骨格修飾は、ＲＮＡに含まれるヌクレオチドの骨格のリン酸塩が化学的に修飾される修飾である。そのような骨格修飾は、通常、いかなる制限もなく、メチルホスホネート、ホスホルアミデート、およびホスホロチオエート（例えばシチジン５'−Ｏ−（１−チオリン酸塩））からなる群からの修飾を含む。
【００２７】
【化１】
2010508014.tif 000002
【００２８】
スキーム１：様々な骨格修飾の位置
本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡ配列は、同様に糖修飾を含むこともできる。本発明でいう糖修飾は、存在するヌクレオチドの糖の化学修飾であり、通常、いかなる制限もなく、２'−デオキシ−２'−フルオロ−オリゴリボヌクレオチド（２'−フルオロ−２'−デオキシシチジン−５'−三リン酸、２'−フルオロ−２'−デオキシウリジン−５'−三リン酸塩）、２'−デオキシ−２'−ジアミンオリゴリボヌクレオチド（２'−アミノ−２'−デオキシシチジン−５'−三リン酸、２'−アミノ−２'−デオキシウリジン−５'−三リン酸塩）、２'−Ｏ−アルキルオリゴリボヌクレオチド、２'−デオキシ−２'−Ｃ−アルキルオリゴリボヌクレオチド（２'−Ｏ−メチルシチジン−５'−三リン酸、２'−メチルウリジン−５'−三リン酸塩）、２'−Ｃ−アルキルオリゴリボヌクレオチド、およびその異性体（２'−アラシチジン−５'−三リン酸塩、２'−アラウリジン−５'−三リン酸塩）、またはアジド三リン酸塩（２'−アジド−２'−デオキシシチジン−５'−三リン酸塩、２'−アジド−２'−デオキシウリジン−５'−三リン酸塩）からなる群から選択された糖修飾を含む。
【００２９】
【化２】
2010508014.tif 000003
【００３０】
スキーム２：様々な糖修飾の位置
しかし、本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡ配列は、いかなる糖修飾または骨格修飾も含まないことがより好ましい。その理由は、ＲＮＡ配列の特定の骨格修飾と糖修飾が、一方では、自身のインビトロでの転写を妨げるか、少なくとも著しく減らすおそれがあるからである。従って、一例として行われたｅＧＦＰのインビトロ転写は、例えば、糖修飾では、２'−アミノ−２'−デオキシウリジン５'-リン酸塩、２'−フルオロ−２'−デオキシウリジン−５'−リン酸塩、および２'−アジド−２'−デオキシウリジン−５'−リン酸塩でのみ機能する。さらに、タンパク質の翻訳、すなわちインビトロまたはインビボでのタンパク質の発現は、通常、骨格修飾によって、またそれとは無関係に、ＲＮＡ配列の糖修飾によって大幅に低下する。上記選ばれた骨格修飾と糖修飾に関連して、例えばｅＧＦＰについて、これを示すことは可能であった。
【００３１】
好ましい実施形態によると、本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡは、ＧＣ含量が天然の配列とは異なる。本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡの第１の代替案によると、塩基修飾されたＲＮＡのコーディング領域のＧＣ含量は、天然のＲＮＡ配列のコーディング領域のＧＣ含量より大きく、コードされるアミノ酸配列は、野生型、すなわち天然のＲＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列と比べて変わらない。ここで、様々なヌクレオチドの組成と配列が大きな役割を果たす。特に、増加したＧ（（グアニン）／Ｃ（シトシン）含量を有する配列は、増加したＡ（アデニン）／Ｕ（ウラシル）含量を有する配列より安定している。従って、本発明によると、コドンは、翻訳されたアミノ酸配列順序を保持しながら、増加したＧ／Ｃヌクレオチドを含むように、野生型と比べて変更される。いくつかのコドンが同じアミノ酸をコードするため（遺伝暗号の縮退）、安定性に有利なコドンを決定することができる（代替コドンの使用）。
【００３２】
本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡによってコードされるアミノ酸配列に基づいて、本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡの天然の配列を修飾するための異なる可能性が考えられる。ＧまたはＣのヌクレオチドのみを含むコドンによってコードされるアミノ酸の場合、コドンの修飾を一切必要としない。よって、ＡやＵはまったく存在しないため、Ｐｒｏ（ＣＣＣまたはＣＣＧ）、Ａｒｇ（ＣＧＣまたはＣＧＧ）、Ａｌａ（ＧＣＣまたはＧＣＧ）、および、Ｇｌｙ（ＧＧＣまたはＧＧＧ）のコドンはいかなる変化も必要としない。
【００３３】
以下の場合、Ａおよび／またはＵヌクレオチドを含むコドンは、同じアミノ酸をコードするが、Ａおよび／またはＵを含まないコドンとの置換によって変更することができる。例は次のとおりである：
Ｐｒｏのコドンは、ＣＣＵまたはＣＣＡからＣＣＣまたはＣＣＧに変更することができる；
Ａｒｇのコドンは、ＣＧＵ、ＣＧＡ、ＡＧＡ、または、ＡＧＧからＣＧＣまたはＣＧＧに変更することができる；
Ａｌａのコドンは、ＧＣＵまたはＧＣＡからＧＣＣまたはＧＣＧに変更することができる；
Ｇｌｙのコドンは、ＧＧＵまたはＧＧＡからＧＧＣまたはＧＧＧに変更することができる。
【００３４】
他の場合、ＡやＵヌクレオチドをコドンから取り除くことができないが、よりわずかなＡおよび／またはＵヌクレオチドしか含まないコドンの使用によってＡとＵの含量を減らすことは可能である。例えば：
Ｐｈｅのコドンは、ＵＵＵからＵＵＣに変更することができる；
Ｌｅｕのコドンは、ＵＵＡ、ＣＵＵ、または、ＣＵＡからＣＵＣまたはＣＵＧに変更することができる；
Ｓｅｒのコドンは、ＵＣＵ、ＵＣＡ、または、ＡＧＵからＵＣＣ、ＵＣＧ、または、ＡＧＣに変更することができる；
Ｔｙｒのコドンは、ＵＡＵからＵＡＣに変更することができる；
停止コドンＵＡＡは、ＵＡＧまたはＵＧＡに変更することができる；
Ｃｙｓのコドンは、ＵＧＵからＵＧＣに変更することができる；
Ｈｉｓのコドンは、ＣＡＵからＣＡＣに変更することができる；
Ｇｌｎのコドンは、ＣＡＡからＣＡＧに変更することができる；
Ｉｌｅのコドンは、ＡＵＵまたはＡＵＡからＡＵＣに変更することができる；
Ｔｈｒのコドンは、ＡＣＵまたはＡＣＡからＡＣＣまたはＡＣＧに変更することができる；
Ａｓｎのコドンは、ＡＡＵからＡＡＣに変更することができる；
Ｌｙｓのコドンは、ＡＡＡからＡＡＧに変更することができる；
Ｖａｌのコドンは、ＧＵＵまたはＧＵＡからＧＵＣまたはＧＵＧに変更することができる；
Ａｓｐのコドンは、ＧＡＵからＧＡＣに変更することができる；
Ｇｌｕのコドンは、ＧＡＡからＧＡＧに変更することができる。
【００３５】
Ｍｅｔ（ＡＵＧ）とＴｒｐ（ＵＧＧ）のコドンの場合、一方では、配列修飾の可能性がまったくない。
【００３６】
上述した置換は、もちろん、天然のＲＮＡ配列（または核酸配列）と比べて、本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡのＧ／Ｃ含量を増加させるために、単独でまたは全ての可能な組み合わせで使用することができる。例えば、天然のＲＮＡ配列に存在しているＴｈｒのすべてのコドンは、ＡＣＣ（またはＡＣＧ）に変更することができる。しかし、より好ましくは、上記に考えられた置換の組み合わせが使用される。例えば：
天然のＲＮＡ配列においてＴｈｒをコードする全てのコドンのＡＣＣ（またはＡＣＧ）による置換および本来Ｓｅｒをコードする全てのコドンのＵＣＣ（またはＵＣＧ、またはＡＧＣ）による置換；
天然のＲＮＡ配列においてＩｌｅをコードする全てのコドンのＡＵＣによる置換、本来Ｌｙｓをコードする全てのコドンのＡＡＧによる置換、および、本来Ｔｙｒをコードする全てのコドンのＵＡＣによる置換；
天然のＲＮＡ配列においてＶａｌをコードする全てのコドンのＧＵＣ（またはＧＵＧ）による置換、本来Ｇｌｕをコードする全てのコドンのＧＡＧによる置換、本来Ａｌａをコードする全てのコドンのＧＣＣ（またはＧＣＧ）による置換、および、本来Ａｒｇをコードする全てのコドンのＣＧＣ（またはＣＧＧ）による置換；
天然のＲＮＡ配列においてＶａｌをコードする全てのコドンのＧＵＣ（またはＧＵＧ）による置換、本来Ｇｌｕをコードする全てのコドンのＧＡＧによる置換、本来Ａｌａをコードする全てのコドンのＧＣＣ（またはＧＣＧ）による置換、本来Ｇｌｙをコードする全てのコドンのＧＧＣ（またはＧＧＧ）による置換、および、本来Ａｓｎをコードする全てのコドンのＡＡＣによる置換；
天然のＲＮＡ配列においてＶａｌをコードする全てのコドンのＧＵＣ（またはＧＵＧ）による置換、本来Ｐｈｅをコードする全てのコドンのＵＵＣによる置換、本来Ｃｙｓをコードする全てのコドンのＵＧＣによる置換、本来Ｌｅｕをコードする全てのコドンのＣＵＧ（またはＣＵＣ）による置換、本来Ｇｌｎをコードする全てのコドンのＣＡＧによる置換、および、本来Ｐｒｏをコードする全てのコドンのＣＣＣ（またはＣＣＧ）による置換等である。
【００３７】
本発明で用いられる塩基修飾されたされたＲＮＡのコーディング領域のＧ／Ｃ含量は、好ましくは、天然のＲＮＡのコーディング領域のＧ／Ｃ含量に比べて、天然のＲＮＡ（または核酸）のコーディング領域の、考えられる修飾可能なコドンの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、さらに好ましくは少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％が修飾されるように、増加される。
【００３８】
これに関して、天然のＲＮＡ配列に比べてできるだけ、特にコーディング領域において、本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡのＧ／Ｃ含量を増加させることが特に好ましい。Ｇ／Ｃ修飾されたＲＮＡは、好ましくは、この修飾に従って導入された、置換されたＧ／Ｃヌクレオチドの少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも５９％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％が、塩基修飾されたＧおよび／またはＣヌクレオチド、例えば、７−デアザグアノシン−５'−三リン酸塩ヌクレオチド、および／または５−メチルシチジン−５'−三リン酸塩、および／または５−ブロモシチジン−５'−三リン酸塩ヌクレオチドとなるように提供されてもよい。
【００３９】
本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡの第２の代替案は、ＲＮＡの転写効率が、細胞におけるｔＲＮＡの異なる発生頻度によっても決定されるという知見に基づいている。従って、ＲＮＡ配列中に存在するいわゆる「まれな」コドンの数が増加したならば、対応するＲＮＡは、相対的に「頻繁な」ｔＲＮＡをコードするコドンが存在する場合と比べて、翻訳が著しく劣る。
【００４０】
従って、この本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡの第２の代替案によると、本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡのＲＮＡのコーディング領域は、細胞において相対的にまれなｔＲＮＡをコードする天然のＲＮＡの少なくとも１つのコドンが、細胞において相対的に頻繁なｔＲＮＡをコードし、相対的にまれなｔＲＮＡと同じアミノ酸を担持するコドンによって置換されるように、天然のＲＮＡコーディング領域と比べて変更される。
【００４１】
この修飾によって、本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡ配列は、頻繁に現れるｔＲＮＡが使用可能なコドンが挿入されるように修飾される。どのｔＲＮＡが細胞において比較的頻繁に出現しているか、そしてどれが対照的に比較的まれであるかは当業者に知られている（例えば、Akashi, Curr. Opin. Genet. Dev. 2001, 11（6）: 660-666参照）。
【００４２】
この修飾によって、本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡ配列の、細胞において相対的にまれなｔＲＮＡをコードする全てのコドンは、本発明に従って、細胞において相対的に頻繁なｔＲＮＡをコードし、相対的にまれなｔＲＮＡと同じアミノ酸を担持するコドンによって置換することができる。
【００４３】
本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡによってコードされるアミノ酸配列を変えることなく、本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡにおける増加した、特に最大の、配列Ｇ／Ｃ含量を「頻繁な」コドンと組み合わせることが特に好ましい。この好ましい実施形態は、本発明で用いられる、特に効率的に翻訳され、安定化された塩基修飾されたＲＮＡ（例えば、本発明に係る薬学的組成物）を表す。
【００４４】
本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡの上述の実施形態は、適宜、互いに組み合わせることができる。本発明で用いられる最適な塩基修飾されたＲＮＡの決定は、当業者に公知の方法、例えば、ＷＯ０２／０９８４４３に開示されているような、手動または自動化された方法によって行うことができる。これにより、ＲＮＡ配列の適応は、上記他の異なる最適化目的のために、すなわち、一方ではコドンの使用に従ってｔＲＮＡの頻度をできるだけ考慮に入れながら、他方ではＧ／Ｃ含量を最大にするために行うことができる。方法の第１の工程では、所望するＲＮＡ（またはＤＮＡ）配列であればどんなＲＮＡ（またはＤＮＡ）配列でも、仮想翻訳を行って、対応するアミノ酸配列を生成することができる。当該アミノ酸配列を起点として、仮想逆翻訳が実行され、遺伝暗号の縮退に基づいて、対応するコドンの選択の可能性が得られる。求められる最適化または修飾に応じて、対応する選択リストと最適化アルゴリズムを用いて適切なコドンを選ぶ。アルゴリズムは、通常、コンピュータ上で適切なソフトウェアによって実行される。例えば、作成した最適化されたＲＮＡ配列は、例えば、適切な表示装置によって表示し、元の（野生型の）配列と比較することができる。個々のヌクレオチドの頻度にも同じことが言える。元のヌクレオチド配列と比べての変化は、強調することが好ましい。さらに、好ましい実施形態によると、事実上知られている安定した配列が読み込まれ、これらの配列は、天然の配列モチーフに従って安定化されたＲＮＡのための基礎とすることができる。同様に、二次構造分析を提供することも可能であり、これにより、構造計算に基づいてＲＮＡの安定化および不安定化特性または領域を分析することができる。
【００４５】
真核ＲＮＡの配列においては、通常、不安定化配列要素（ＤＳＥ）があり、これらにシグナルタンパク質が結合し、インビボでのＲＮＡの酵素分解を調整する。従って、本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡをさらに安定させるために、不安定化配列要素が一切存在しないように、天然のＲＮＡの対応する領域と比べて１つ以上の変化をもたらすことが好ましい。もちろん、同様に、本発明によると、ＲＮＡから非翻訳領域（３'−および／または５'−ＵＴＲ）において状況に応じて存在しているＤＳＥを取り除くことが好ましい。
【００４６】
そのような不安定化配列としては、例えば、高ＡＵ配列（「ＡＵＲＥＳ」）があり、これらは多数の不安定なＲＮＡの３'−ＵＴＲ部分に存在する（Caput et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986, 83: 1670 to 1674）。従って、本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡは、そのような不安定化配列を一切含まないように、天然のＲＮＡと比べて変化させることが好ましい。同じことが、考えられるエンドヌクレアーゼによって認識される配列モチーフ、例えば、トランスフェリン受容体をコードする遺伝子の３'−ＵＴＲ部分に含まれる配列ＧＡＡＣＡＡＧにも当てはまる（Binder et al., EMBO J. 1994, 13: 1969 to 1980）。そのような配列モチーフも、本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡから取り除くことが好ましい。
【００４７】
ＲＮＡにおけるコドンの置換、すなわち、本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡにおけるコドンの置換に適した様々な方法が、当業者に知られている。例えば、（生物活性のあるまたは抗原性を示すペプチドをコードする）相対的に短いコーディング領域の場合、当業者に知られている標準的な技術を用いて、本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡ全体を化学的に合成することが可能である。
【００４８】
しかし、本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡを作成するために、ターゲット変異誘発の技術によって、ＤＮＡマトリックスを用いて塩基置換を導入することがより好ましい（例えばManiatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd Ed., Cold Spring Harbor, NY, 2001参照）。従ってこの工程において、対応するＤＮＡ分子はインビトロで転写され（下記参照）、本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡを生産する。このＤＮＡマトリックスは、インビトロ転写のための適切なプロモーターとインビトロ転写のための終結シグナルを任意で有しており、適切なプロモーターとしては、例えば、Ｔ３、Ｔ７、またはＳＴ６プロモーターがあり、このプロモーターの後には、塩基修飾されたＲＮＡを作成するための所望のヌクレオチド配列が続いている。そして、生産される塩基修飾されたＲＮＡ構造のマトリックスを形成するＤＮＡ分子は、細菌内で複製可能なプラスミドの一部として、発酵増殖とそれに続く単離によって作成することができる。そのために適したプラスミドとしては、例えば、プラスミドｐＴ７Ｔｓ（GenBank受託番号U2 6404；Lai et al., Development 1995, 121: 2349 to 2360）、例えばｐＧＥＭ（登録商標）−１（GenBank受託番号X65300；Promegaから提供）等のｐＧＥＭ（登録商標）シリーズ、および、ｐＳＰ６４（GenBank受託番号X65327）がある。また、Mezei and Storts, Purification of PCR Products, in: Griffin and Griffin （eds.）, PCR Technology: Current Innovation, CRC Press, Boca Raton, FL, 2001参照のこと。
【００４９】
このように、切断部位において短い一本鎖の塩基転位を有する短い合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いて、または、化学合成によって作成された遺伝子を用いて、当業者に知られている分子生物学的方法によって、適切なプラスミドにおいて所望のヌクレオチド配列のクローンを作ることが可能である（上記Maniatis et al., （2001）参照）。そして、ＤＮＡ分子は、制限エンドヌクレアーゼによる消化によって、自身が１つのまたは複数のコピーで存在し得るプラスミドから切り取られる。
【００５０】
本発明の特定の実施形態によると、本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡは、５'−キャップ構造（修飾されたグアノシンヌクレオチド）をさらに有してもよい。キャップ構造の例としては、ｍ７Ｇ（５'）ｐｐｐ（５'（Ａ，Ｇ（５'）ｐｐｐ（５'）ＡおよびＧ（５'）ｐｐｐ（５'）Ｇ等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５１】
本発明のさらなる好ましい実施形態によると、本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡは、少なくとも約５０ヌクレオチドの、好ましくは少なくとも約７０ヌクレオチドの、より好ましくは少なくとも約１００ヌクレオチドの、さらに好ましくは少なくとも約２００ヌクレオチドのポリＡテールを含んでいる。
【００５２】
本発明の別の好ましい実施形態によると、本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡは、少なくとも約２０ヌクレオチドの、好ましくは少なくとも約３０ヌクレオチドの、より好ましくは少なくとも約４０ヌクレオチドの、さらに好ましくは少なくとも約５０ヌクレオチドのポリＡテールを含んでいる。
【００５３】
さらなる実施形態によると、上記のように、本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡは、精製用のタグをコードする核酸部をさらに含んでいる。そのようなタグの例としては、ヘキサヒスチジンタグ（ＨＩＳタグ、ポリヒスチジンタグ）、ストレプトアビジンタグ（ｓｔｒｅｐタグ）、ＳＢＰタグ（ストレプトアビジン結合タグ）、ＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）タグ等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。塩基修飾されたＲＮＡは、例えばＭｙｃタグ、Ｓｗａ１１エピトープ、ＦＬＡＧタグ、Ｈａタグ等の抗体エピトープ（抗体結合タグ）を介して、すなわち、（固定化された）抗体を介したエピトープの認識によって、精製用のタグをさらにコードすることができる。
【００５４】
ＲＮＡ、特にｍＲＮＡの効率的な翻訳のためには、リボソーム結合部位（Ｋｏｚａｋ配列：ＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＵＧＧ（配列番号１、ＡＵＧは開始コドンを形成する）へのリボソームの効果的な結合も必要である。なお、この点において、この部位の周囲におけるＡ／Ｕ含量の増加により、ｍＲＮＡとのより効率的なリボソーム結合が可能になることが知られている。従って本発明の他の好ましい実施形態によると、本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡは、天然のＲＮＡと比べて、リボソーム結合部位の周囲において、５％から５０％、より好ましくは２５％から５０％以上増加したＡ／Ｕ含量を有することができる。
【００５５】
さらに、本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡの実施形態によると、１つ以上のいわゆるＩＲＥＳ（配列内リボソーム進入部位）をＲＮＡに導入することが可能である。このように、ＩＲＥＳは、唯一のリボソーム結合部位として機能することができるが、リボソーム（「マルチシストロニックＲＮＡ」）によって互いに独立して翻訳される複数のタンパク質をコードする本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡを提供する働きをすることもできる。本発明に従って使用することができるＩＲＥＳ配列の例としては、ピコルナ・ウイルス（例：ＦＭＤＶ）、ペストウイルス（ＣＦＦＶ）、ポリオ・ウイルス（ＰＶ）、脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）、口蹄ウイルス（ＦＭＤＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）、マウス白斑ウイルス（ＭＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、またはコオロギ麻痺ウイルス（ＣｒＰＶ）からのＩＲＥＳ配列が挙げられる。
【００５６】
本発明のさらなる好ましい実施形態によると、本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡは、その５'−および／または３'−非翻訳領域において、細胞質ゾルにおけるＲＮＡの半減期を増すことが可能な安定化配列を含んでいる。これらの安定化配列は、ウイルス、細菌、および真核生物に存在している天然由来の配列と１００％の配列相同性を示すものであってもよいが、それらはまた部分的にまたは全体的に合成的な性質を有していてもよい。本発明において使用可能な安定化配列の例としては、例えばヒトまたはツメガエルのβ−グロビン遺伝子の非翻訳配列（ＵＴＲ）が挙げられる。安定化配列の他の例は、一般式（Ｃ／Ｕ）ＣＣＡＮｘＣＣＣ（Ｕ／Ａ）ＰｙｘＵＣ（Ｃ／Ｕ）ＣＣ（配列番号２）を有しており、これは、α−グロビン、α−（Ｉ）−コラーゲン、１５−リポキシゲナーゼ、またはチロシン水酸化酵素をコードする非常に安定したＲＮＡの３'−ＵＴＲに含まれている（Holcik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94: 2410 to 2414参照）。もちろん、そのような安定化配列は、当業者に知られている他の安定化配列との組み合わせにおいてだけでなく、単独でまたは互いとの組み合わせにおいて使用することができる。
【００５７】
さらに、好ましい実施形態において、処置される細胞または治療される生物に対する、本発明に従って塩基修飾されたＲＮＡの効果的な移入は、本発明で塩基修飾されたＲＮＡをカチオン性ペプチドまたはタンパク質に対応付けるかまたは結合させることによって改善することができる。特に、ポリカチオン性の核酸結合タンパク質として、プロタミン、ヒストン、スペルミン、ヌクレオリン、または基本的な核酸結合配列を含むそれらの配列の誘導体を使用することが特に効果的である。さらに、同様に、例えばポリ−Ｌ−リジンまたはヒストン等、他のカチオン性ペプチドまたはタンパク質の使用も可能である。この修飾されたＲＮＡを安定させるための手順は、例えば、ＥＰ−Ａ−１０８３２３２において記載されており、その特許文献の開示内容は、参照により全体として本発明に組み入れられる。
【００５８】
本発明に関連して、本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡによってコードされるタンパク質は、診断目的のために、好ましくは、全ての治療上有益なタンパク質から、例えば、組み換えの方法によって作り出されるか、自然界に生じ、かつ、治療目的のために使用される、当業者に知られている全てのタンパク質から選択することができる。さらに、本発明は、ほとんどいかなる目的に対しても、例えば、診断または研究目的に対しても有益な高い発現率で、タンパク質を発現することを可能にする、塩基修飾されたＲＮＡによるシステムを提供する。よって、本発明の塩基修飾されたＲＮＡは、インビトロまたはインビボ発現系において、（塩基修飾されたヌクレオチドなしで）対応する天然由来のＲＮＡより高い発現率で発現されるほとんどいかなるタンパク質をコードしてもよい。
【００５９】
本発明の塩基修飾されたＲＮＡによってコードされるタンパク質は、例えば、以下に挙げるタンパク質のいずれかから選択してもよい：０ＡＴＬ３，０ＦＣ３，０ＰＡ３，０ＰＤ２，４−１ＢＢＬ，５Ｔ４，６Ｃｋｉｎｅ，７０７−ＡＰ，９Ｄ７，Ａ２Ｍ，ＡＡ，ＡＡＡＳ，ＡＡＣＴ，ＡＡＳＳ，ＡＢＡＴ，ＡＢＣＡ１，ＡＢＣＡ４，ＡＢＣＢ１，ＡＢＣＢ１１，ＡＢＣＢ２，ＡＢＣＢ４，ＡＢＣＢ７，ＡＢＣＣ２，ＡＢＣＣ６，ＡＢＣＣ８，ＡＢＣＤ１，ＡＢＣＤ３，ＡＢＣＧ５，ＡＢＣＧ８，ＡＢＬ１，ＡＢＯ，ＡＢＲ  ＡＣＡＡ１，ＡＣＡＣＡ，ＡＣＡＤＬ，ＡＣＡＤＭ，ＡＣＡＤＳ，ＡＣＡＤＶＬ，ＡＣＡＴ１，ＡＣＣＰＮ，ＡＣＥ，ＡＣＨＥ，ＡＣＨＭ３，ＡＣＨＭ１，ＡＣＬＳ，ＡＣＰＩ，ＡＣＴＡ１，ＡＣＴＣ，ＡＣＴＮ４，ＡＣＶＲＬ１，ＡＤ２，ＡＤＡ，ＡＤＡＭＴＳ１３，ＡＤＡＭＴＳ２，ＡＤＦＮ，ＡＤＨ１Ｂ，ＡＤＨ１Ｃ，ＡＤＬＤＨ３Ａ２，ＡＤＲＢ２，ＡＤＲＢ３，ＡＤＳＬ，ＡＥＺ，ＡＦＡ，ＡＦＤ１，ＡＦＰ，ＡＧＡ，ＡＧＬ，ＡＧＭＸ２，ＡＧＰＳ，ＡＧＳ１，ＡＧＴ，ＡＧＴＲ１，ＡＧＸＴ，ＡＨ０２，ＡＨＣＹ，ＡＨＤＳ，ＡＨＨＲ，ＡＨＳＧ，ＡＩＣ，ＡＩＥＤ，ＡＩＨ２，ＡＩＨ３，ＡＩＭ−２，ＡＩＰＬ１，ＡＩＲＥ，ＡＫ１，ＡＬＡＤ，ＡＬＡＳ２，ＡＬＢ，ＨＰＧ１，ＡＬＤＨ２，ＡＬＤＨ３Ａ２，ＡＬＤＨ４Ａ１，ＡＬＤＨ５Ａ１，ＡＬＤＨ１Ａ１，ＡＬＤＯＡ，ＡＬＤＯＢ，ＡＬＭＳ１，ＡＬＰＬ，ＡＬＰＰ，ＡＬＳ２，ＡＬＸ４，ＡＭＡＣＲ，ＡＭＢＰ，ＡＭＣＤ，ＡＭＣＤ１，ＡＭＣＮ，ＡＭＥＬＸ，ＡＭＥＬＹ，ＡＭＧＬ，ＡＭＨ，ＡＭＨＲ２，ＡＭＰＤ３，ＡＭＰＤ１，ＡＭＴ，ＡＮＣ，ＡＮＣＲ，ＡＮＫ１，ＡＮＯＰ１，ＡＯＭ，ＡＰ０Ａ４，ＡＰ０Ｃ２，ＡＰ０Ｃ３，ＡＰ３Ｂ１，ＡＰＣ，ａＰＫＣ，ＡＰＯＡ２，ＡＰＯＡ１，ＡＰＯＢ，ＡＰＯＣ３，ＡＰＯＣ２，ＡＰＯＥ，ＡＰＯＨ，ＡＰＰ，ＡＰＲＴ，ＡＰＳ１，ＡＱＰ２，ＡＲ，ＡＲＡＦ１，ＡＲＧ１，ＡＲＨＧＥＦ１２，ＡＲＭＥＴ，ＡＲＳＡ，ＡＲＳＢ，ＡＲＳＣ２，ＡＲＳＥ，ＡＲＴ−４，ＡＲＴＣ１／ｍ，ＡＲＴＳ，ＡＲＶＤ１，ＡＲＸ，ＡＳ，ＡＳＡＨ，ＡＳＡＴ，ＡＳＤ１，ＡＳＬ，ＡＳＭＤ，ＡＳＭＴ，ＡＳＮＳ，ＡＳＰＡ，ＡＳＳ，ＡＳＳＰ２，ＡＳＳＰ５，ＡＳＳＰ６，ＡＴ３，ＡＴＤ，ＡＴＨＳ，ＡＴＭ，ＡＴＰ２Ａ１，ＡＴＰ２Ａ２，ＡＴＰ２Ｃ１，ＡＴＰ６Ｂ１，ＡＴＰ７Ａ，ＡＴＰ７Ｂ，ＡＴＰ８Ｂ１，ＡＴＰＳＫ２，ＡＴＲＸ，ＡＴＸＮ１，ＡＴＸＮ２，ＡＴＸＮ３，ＡＵＴＳ１，ＡＶＭＤ，ＡＶＰ，ＡＶＰＲ２，ＡＶＳＤ１，ＡＸＩＮ１，ＡＸＩＮ２，ＡＺＦ２，Ｂ２Ｍ，Ｂ４ＧＡＬＴ７，Ｂ７Ｈ４，ＢＡＧＥ，ＢＡＧＥ−１，ＢＡＸ，ＢＢＳ２，ＢＢＳ３，ＢＢＳ４，ＢＣＡ２２５，ＢＣＡＡ，ＢＣＨ，ＢＣＨＥ，ＢＣＫＤＨＡ，ＢＣＫＤＨＢ，ＢＣＬ１０，ＢＣＬ２，ＢＣＬ３，ＢＣＬ５，ＢＣＬ６，ＢＣＰＭ，ＢＣＲ，ＢＣＲ／ＡＢＬ，ＢＤＣ，ＢＤＥ，ＢＤＭＦ，ＢＤＭＲ，ＢＥＳＴ１，ｂｅｔａ−Ｃａｔｅｎｉｎ／ｍ，ＢＦ，ＢＦＨＤ，ＢＦＩＣ，ＢＦＬＳ，ＢＦＳＰ２，ＢＧＬＡＰ，ＢＧＮ，ＢＨＤ，ＢＨＲ１，ＢＩＮＧ−４，ＢＩＲＣ５，ＢＪＳ，ＢＬＭ，ＢＬＭＨ，ＢＬＮＫ，ＢＭＰＲ２，ＢＰＧＭ，ＢＲＡＦ，ＢＲＣＡ１，ＢＲＣＡ１／ｍ，ＢＲＣＡ２���ＢＲＣＡ２／ｍ，ＢＲＣＤ２，ＢＲＣＤ１，ＢＲＤＴ，ＢＳＣＬ，ＢＳＣＬ２，ＢＴＡＡ，ＢＴＤ，ＢＴＫ，ＢＵＢ１，ＢＷＳ，ＢＺＸ，Ｃ０Ｌ２Ａ１，Ｃ０Ｌ６Ａ１，Ｃ１ＮＨ，Ｃ１ＱＡ，Ｃ１ＱＢ，Ｃ１ＱＧ，Ｃ１Ｓ，Ｃ２，Ｃ３，Ｃ４Ａ，Ｃ４Ｂ，Ｃ５，Ｃ６，Ｃ７，Ｃ７ｏｒｆ２，Ｃ８Ａ，Ｃ８Ｂ，Ｃ９，ＣＡ１２５，ＣＡ１５−３／ＣＡ  ２７−２９，ＣＡ１９５，ＣＡ１９−９，ＣＡ７２−４，ＣＡ２，ＣＡ２４２，ＣＡ５０，ＣＡＢＹＲ，ＣＡＣＤ，ＣＡＣＮＡ２Ｄ１，ＣＡＣＮＡ１Ａ，ＣＡＣＮＡ１Ｆ，ＣＡＣＮＡ１Ｓ，ＣＡＣＮＢ２，ＣＡＣＮＢ４，ＣＡＧＥ，ＣＡ１，ＣＡＬＢ３，ＣＡＬＣＡ，ＣＡＬＣＲ，ＣＡＬＭ，ＣＡＬＲ，ＣＡＭ４３，ＣＡＭＥＬ，ＣＡＰ−１，ＣＡＰＮ３，ＣＡＲＤ１５，ＣＡＳＰ−５／ｍ，ＣＡＳＰ−８，ＣＡＳＰ−８／ｍ，ＣＡＳＲ，ＣＡＴ，ＣＡＴＭ，ＣＡＶ３，ＣＢ１，ＣＢＢＭ，ＣＢＳ，ＣＣＡ１，ＣＣＡＬ２，ＣＣＡＬ１，ＣＣＡＴ，ＣＣＬ−１，ＣＣＬ−１１，ＣＣＬ−１２，ＣＣＬ−１３，ＣＣＬ−１４，ＣＣＬ−１５，ＣＣＬ−１６，ＣＣＬ−１７，ＣＣＬ−１８，ＣＣＬ−１９，ＣＣＬ−２，ＣＣＬ−２０，ＣＣＬ−２１，ＣＣＬ−２２，ＣＣＬ−２３，ＣＣＬ−２４，ＣＣＬ−２５，ＣＣＬ−２７，ＣＣＬ−３，ＣＣＬ−４，ＣＣＬ−５，ＣＣＬ−７，ＣＣＬ−８，ＣＣＭ１，ＣＣＮＢ１，ＣＣＮＤ１，ＣＣＯ，ＣＣＲ２，ＣＣＲ５，ＣＣＴ，ＣＣＶ，ＣＣＺＳ，ＣＤ１，ＣＤ１９，ＣＤ２０，ＣＤ２２，ＣＤ２５，ＣＤ２７，ＣＤ２７Ｌ，ｃＤ３，ＣＤ３０，ＣＤ３０，ＣＤ３０Ｌ，ＣＤ３３，ＣＤ３６，ＣＤ３Ｅ，ＣＤ３Ｇ，ＣＤ３Ｚ，ＣＤ４，ＣＤ４０，ＣＤ４０Ｌ，ＣＤ４４，ＣＤ４４ｖ，ＣＤ４４ｖ６，ＣＤ５２，ＣＤ５５，ＣＤ５６，ＣＤ５９，ＣＤ８０，ＣＤ８６，ＣＤＡＮ１，ＣＤＡＮ２，ＣＤＡＮ３，ＣＤＣ２７，ＣＤＣ２７／ｍ，ＣＤＣ２Ｌ１，ＣＤＨ１，ＣＤＫ４，ＣＤＫ４／ｍ，ＣＤＫＮ１Ｃ，ＣＤＫＮ２Ａ，ＣＤＫＮ２Ａ／ｍ，ＣＤＫＮ１Ａ，ＣＤＫＮ１Ｃ，ＣＤＬ１，ＣＤＰＤ１，ＣＤＲ１，ＣＥＡ，ＣＥＡＣＡＭ１，ＣＥＡＣＡＭ５，ＣＥＣＲ，ＣＥＣＲ９，ＣＥＰＡ，ＣＥＴＰ，ＣＦＮＳ，ＣＦＴＲ，ＣＧＦ１，ＣＨＡＣ，ＣＨＥＤ２，ＣＨＥＤ１，ＣＨＥＫ２，ＣＨＭ，ＣＨＭＬ，ＣＨＲ３９Ｃ，ＣＨＲＮＡ４，ＣＨＲＮＡ１，ＣＨＲＮＢ１，ＣＨＲＮＥ，ＣＨＳ，ＣＨＳ１，ＣＨＳＴ６，ＣＨＸ１０，ＣＩＡＳ１，ＣＩＤＸ，ＣＫＮ１，ＣＬＡ２，ＣＬＡ３，ＣＬＡ１，ＣＬＣＡ２，ＣＬＣＮ１，ＣＬＣＮ５，ＣＬＣＮＫＢ，ＣＬＤＮ１６，ＣＬＰ，ＣＬＮ２，ＣＬＮ３，ＣＬＮ４，ＣＬＮ５，ＣＬＮ６，ＣＬＮ８，Ｃ１ＱＡ，Ｃ１ＱＢ，Ｃ１ＱＧ，Ｃ１Ｒ，ＣＬＳ，ＣＭＣＷＴＤ，ＣＭＤＪ，ＣＭＤ１Ａ，ＣＭＤ１Ｂ，ＣＭＨ２，ＭＨ３，ＣＭＨ６，ＣＭＫＢＲ２，ＣＭＫＢＲ５，ＣＭＬ２８，ＣＭＬ６６，ＣＭＭ，ＣＭＴ２Ｂ，ＣＭＴ２Ｄ，ＣＭＴ４Ａ，ＣＭＴ１Ａ，ＣＭＴＸ２，ＣＭＴＸ３，Ｃ−ＭＹＣ，  ＣＮＡ１，  ＣＮＤ，  ＣＮＧＡ３，  ＣＮＧＡ１，ＣＮＧＢ３，ＣＮＳＮ，ＣＮＴＦ，  ＣＯＡ−１／ｍ，  ＣＯＣＨ，  ＣＯＤ２，  ＣＯＤ１，ＣＯＨ１，ＣＯＬ１０Ａ，  ＣＯＬ２Ａ２，  ＣＯＬ１１Ａ２，  ＣＯＬ１７Ａ１，  ＣＯＬ１Ａ１，ＣＯＬ１Ａ２，  ＣＯＬ２Ａ１，  ＣＯＬ３Ａ１，  ＣＯＬ４Ａ��，  ＣＯＬ４Ａ４，  ＣＯＬ４Ａ５，  ＣＯＬ４Ａ６，  ＣＯＬ５Ａ１，  ＣＯＬ５Ａ２，  ＣＯＬ６Ａ１，  ＣＯＬ６Ａ２，  ＣＯＬ６Ａ３，  ＣＯＬ７Ａ１，  ＣＯＬ８Ａ２，  ＣＯＬ９Ａ２，  ＣＯＬ９Ａ３，  ＣＯＬ１１Ａ１，  ＣＯＬ１Ａ２，  ＣＯＬ２３Ａ１，  ＣＯＬ１Ａ１，  ＣＯＬＱ，  ＣＯＭＰ，  ＣＯＭＴ，  ＣＯＲＤ５，  ＣＯＲＤ１，  ＣＯＸ１０，  ＣＯＸ−２，  ＣＰ，  ＣＰＢ２，  ＣＰＯ，  ＣＰＰ，  ＣＰＳ１，  ＣＰＴ２，  ＣＰＴ１Ａ，  ＣＰＸ，  ＣＲＡＴ，  ＣＲＢ１，  ＣＲＢＭ，  ＣＲＥＢＢＰ，  ＣＲＨ，  ＣＲＨＢＰ，  ＣＲＳ，  ＣＲＶ，  ＣＲＸ，  ＣＲＹＡＢ，  ＣＲＹＢＡ１，  ＣＲＹＢＢ２，  ＣＲＹＧＡ，  ＣＲＹＧＣ，  ＣＲＹＧＤ，  ＣＳＡ，  ＣＳＥ，  ＣＳＦ１Ｒ，  ＣＳＦ２ＲＡ，  ＣＳＦ２ＲＢ，  ＣＳＦ３Ｒ，  ＣＳＦ１Ｒ，  ＣＳＴ３，  ＣＳＴＢ，  ＣＴ，  ＣＴ７，  ＣＴ−９／ＢＲＤ６，  ＣＴＡＡ１，  ＣＴＡＣＫ，  ＣＴＥＮ，  ＣＴＨ，  ＣＴＨＭ，  ＣＴＬＡ４，  ＣＴＭ，  ＣＴＮＮＢ１，  ＣＴＮＳ，  ＣＴＰＡ，  ＣＴＳＢ，  ＣＴＳＣ，  ＣＴＳＫ，  ＣＴＳＬ，  ＣＴＳ１，  ＣＵＢＮ，  ＣＶＤ１，  ＣＸ３ＣＬ１，  ＣＸＣＬ１，  ＣＸＣＬ１０，  ＣＸＣＬ１１，  ＣＸＣＬ１２，  ＣＸＣＬ１３，  ＣＸＣＬ１６，  ＣＸＣＬ２，  ＣＸＣＬ３，  ＣＸＣＬ４，  ＣＸＣＬ５，  ＣＸＣＬ６，  ＣＸＣＬ７，  ＣＸＣＬ８，  ＣＸＣＬ９，  ＣＹＢ５，  ＣＹＢＡ，  ＣＹＢＢ，  ＣＹＢＢ５，  ，  ＣＹＦＲＡ  ２１−１，  ＣＹＬＤ，  ＣＹＬＤ１，  ＣＹＭＤ，  ＣＹＰ１１Ｂ１，  ＣＹＰ１１Ｂ２，  ＣＹＰ１７，  ＣＹＰ１７Ａ１，  ＣＹＰ１９，  ＣＹＰ１９Ａ１，  ＣＹＰ１Ａ２，  ＣＹＰ１Ｂ１，  ＣＹＰ２１Ａ２，  ＣＹＰ２７Ａ１，  ＣＹＰ２７Ｂ１，  ＣＹＰ２Ａ６，  ＣＹＰ２Ｃ，  ＣＹＰ２Ｃ１９，  ＣＹＰ２Ｃ９，  ＣＹＰ２Ｄ，  ＣＹＰ２Ｄ６，  ＣＹＰ２Ｄ７Ｐ１，  ＣＹＰ３Ａ４，  ＣＹＰ７Ｂ１，  ＣＹＰＢ１，  ＣＹＰ１１Ｂ１，  ＣＹＰ１Ａ１，  ＣＹＰ１Ｂ１，  ＣＹＲＡＡ，  Ｄ４０，ＤＡＤｌ，  ＤＡＭ，  ＤＡＭ−１０／ＭＡＧＥ−Ｂ１，  ＤＡＭ−６／ＭＡＧＥ−Ｂ２，  ＤＡＸ１，  ＤＡＺ，  ＤＢＡ，  ＤＢＨ，  ＤＢＩ，  ＤＢＴ，  ＤＣＣ，  ＤＣ−ＣＫ１，  ＤＣＫ，  ＤＣＲ，  ＤＣＸ，  ＤＤＢ  １，  ＤＤＢ２，  ＤＤＩＴ３，  ＤＤＵ，  ＤＥＣＲ１，  ＤＥＫ−ＣＡＮ，  ＤＥＭ，  ＤＥＳ，  ＤＦ，ＤＦＮ２，  ＤＦＮ４，  ＤＦＮ６，  ＤＦＮＡ４，  ＤＦＮＡ５，  ＤＦＮＢ５，  ＤＧＣＲ，  ＤＨＣＲ７，  ＤＨＦＲ，  ＤＨＯＦ，  ＤＨＳ，  ＤＩＡ１，  ＤＩＡＰＨ２，  ＤＩＡＰＨ１，  ＤＩＨ１，  ＤＩＯ１，  ＤＩＳＣＩ，  ＤＫＣ１，  ＤＬＡＴ，  ＤＬＤ，  ＤＬＬ３，  ＤＬＸ３，  ＤＭＢＴ１，  ＤＭＤ，  ＤＭ１，  ＤＭＰＫ，  ＤＭＷＤ，  ＤＮＡＩ１，  ＤＮＡＳＥ１，  ＤＮＭＴ３Ｂ，  ＤＰＥＰ１，  ＤＰＹＤ，  ＤＰＹＳ，  ＤＲＤ２，  ＤＲＤ４，  ＤＲＰＬＡ，  ＤＳＣＲ１，  ＤＳＧ１，  ＤＳＰ，  ＤＳＰＰ，  ＤＳＳ，  ＤＴＤＰ２，  ＤＴＲ，  ＤＵＲＳ１，  ＤＷＳ，  ＤＹＳ，  ＤＹＳＦ，  ＤＹＴ２，  ＤＹＴ３，  ＤＹＴ４，  ＤＹＴ２，  ＤＹＴ１，  ＤＹＸ１，  ＥＢＡＦ，  ＥＢＭ，  ＥＢＮＡ，  ＥＢＰ，  ＥＢＲ３，  ＥＢＳ１，  ＥＣＡ１，  ＥＣＢ２，  ＥＣＥ１，  ＥＣＧＦ１，  ＥＣＴ，  ＥＤ２，  ＥＤ���，  ＥＤＡ，  ＥＤＡＲ，  ＥＣＡ１，  ＥＤＮ３，  ＥＤＮＲＢ，  ＥＥＣ１，  ＥＥＦ１Ａ１Ｌ１４，  ＥＥＧＶ１，  ＥＦＥＭＰ１，  ＥＦＴＵＤ２／ｍ，  ＥＧＦＲ，  ＥＧＦＲ／Ｈｅｒ１，  ＥＧＩ，  ＥＧＲ２，  ＥＩＦ２ＡＫ３，  ｅＩＦ４Ｇ，  ＥＫＶ，  Ｅｌ  ＩＳ，  ＥＬＡ２，  ＥＬＦ２，  ＥＬＦ２Ｍ，  ＥＬＫ１，  ＥＬＮ，  ＥＬＯＮＧ，  ＥＭＤ，  ＥＭＬ１，  ＥＭＭＰＲＩＮ，  ＥＭＸ２，  ＥＮＡ−７８，  ＥＮＡＭ，  ＥＮＤ３，  ＥＮＧ，  ＥＮＯ１，  ＥＮＰＰ１，  ＥＮＵＲ２，  ＥＮＵＲ１，  ＥＯＳ，  ＥＰ３００，  ＥＰＢ４１，  ＥＰＢ４２，  ＥＰＣＡＭ，  ＥＰＤ，  ＥｐｈＡ１，  ＥｐｈＡ２，  ＥｐｈＡ３，  ＥｐｈｒｉｎＡ２，  ＥｐｈｒｉｎＡ３，  ＥＰＨＸ１，  ＥＰＭ２Ａ，  ＥＰＯ，ＥＰＯＲ，  ＥＰＸ，  ＥＲＢＢ２，  ＥＲＣＣ２  ＥＲＣＣ３，ＥＲＣＣ４，  ＥＲＣＣ５，  ＥＲＣＣ６，  ＥＲＶＲ，  ＥＳＲ１，  ＥＴＦＡ，  ＥＴＦＢ，  ＥＴＦＤＨ，  ＥＴＭ１，  ＥＴＶ６−ＡＭＬ１，  ＥＴＶ１，  ＥＶＣ，  ＥＶＲ２，  ＥＶＲ１，  ＥＷＳＲ１，  ＥＸＴ２，  ＥＸＴ３，  ＥＸＴ１，  ＥＹＡ１，  ＥＹＣＬ２，  ＥＹＣＬ３，  ＥＹＣＬ１，  ＥＺＨ２，  Ｆ１０，  Ｆ１１，  Ｆ１２，  Ｆ１３Ａ１，  Ｆ１３Ｂ，  Ｆ２，  Ｆ５，  Ｆ５Ｆ８Ｄ，  Ｆ７，  Ｆ８，  Ｆ８Ｃ，  Ｆ９，  ＦＡＢＰ２，  ＦＡＣＬ６，  ＦＡＨ，  ＦＡＮＣＡ，  ＦＡＮＣＢ，  ＦＡＮＣＣ，  ＦＡＮＣＤ２，  ＦＡＮＣＦ，  ＦａｓＬ，ＦＢＮ２，  ＦＢＮ１，  ＦＢＰ１，  ＦＣＧ３ＲＡ，ＦＣＧＲ２Ａ，  ＦＣＧＲ２Ｂ，  ＦＣＧＲ３Ａ，  ＦＣＨＬ，  ＦＣＭＤ，  ＦＣＰ１，  ＦＤＰＳＬ５，  ＦＥＣＨ，  ＦＥＯ，  ＦＥＯＭ１，  ＦＥＳ，  ＦＧＡ，  ＦＧＢ，  ＦＧＤ１，  ＦＧＦ２，  ＦＧＦ２３，  ＦＧＦ５，  ＦＧＦＲ２，  ＦＧＦＲ３，  ＦＧＦＲ１，  ＦＧＧ，  ＦＧＳ１，  ＦＨ，  ＦＩＣ１，  ＦＩＨ，  Ｆ２，  ＦＫＢＰ６，  ＦＬＮＡ，  ＦＬＴ４，  ＦＭＯ３，ＦＭＯ４，  ＦＭＲ２，  ＦＭＲ１，  ＦＮ，  ＦＮ１／ｍ，  ＦＯＸＣ１，  ＦＯＸＥ１，  ＦＯＸＬ２，  ＦＯＸＯ１Ａ，  ＦＰＤＭＭ，  ＦＰＦ，  Ｆｒａ−１，  ＦＲＡＸＦ，  ＦＲＤＡ，  ＦＳＨＢ，  Ｆ
ＳＨＭＤ１Ａ，  ＦＳＨＲ，  ＦＴＨ１，  ＦＴＨＬ１７，  ＦＴＬ，  ＦＴＺＦ１，  ＦＵＣＡ１，  ＦＵＴ２，  ＦＵＴ６，  ＦＵＴ１，  ＦＹ，  Ｇ２５０，  Ｇ２５０／ＣＡＩＸ，  Ｇ６ＰＣ，  Ｇ６ＰＤ，  Ｇ６ＰＴ１，  Ｇ６ＰＴ２，  ＧＡＡ，  ＧＡＢＲＡ３，  ＧＡＧＥ−１，  ＧＡＧＥ−２，  ＧＡＧＥ−３，  ＧＡＧＥ−４，  ＧＡＧＥ−５，  ＧＡＧＥ−６，  ＧＡＧＥ−７ｂ，  ＧＡＧＥ−８，  ＧＡＬＣ，  ＧＡＬＥ，  ＧＡＬＫ１，  ＧＡＬＮＳ，  ＧＡＬＴ，  ＧＡＭＴ，  ＧＡＮ，  ＧＡＳＴ，  ＧＡＳＴＲＩＮ１７，  ＧＡＴＡ３，  ＧＡＴＡ，  ＧＢＡ，  ＧＢＥ，  ＧＣ，  ＧＣＤＨ，  ＧＣＧＲ，  ＧＣＨ１，  ＧＣＫ，  ＧＣＰ−２，  ＧＣＳ１，  Ｇ−ＣＳＦ，  ＧＣＳＨ，  ＧＣＳＬ，  ＧＣＹ，  ＧＤＥＰ，ＧＤＦ５，  ＧＤＩ１，  ＧＤＮＦ，  ＧＤＸＹ，  ＧＦＡＰ，  ＧＦＮＤ，  ＧＧＣＸ，  ＧＧＴ１，  ＧＨ２，  ＧＨ１，  ＧＨＲ，  ＧＨＲＨＲ，  ＧＨＳ，  ＧＩＦ，  ＧＩＮＧＦ，  ＧＩＰ，  ＧＪＡ３，  ＧＪＡ８，  ＧＪＢ２，  ＧＪＢ３，  ＧＪＢ６，  ＧＪＢ１，  ＧＫ，  ＧＬＡ，  ＧＬＢ，  ＧＬＢ１，  ＧＬＣ３Ｂ，  ＧＬＣ１Ｂ，  ＧＬＣ１Ｃ，  ＧＬＤＣ，  ＧＬＩ３，  ＧＬＰ１，  ＧＬＲＡ１，  ＧＬＵＤ１，  ＧＭ１  （ｆｕｃ−ＧＭ１），  ＧＭ２Ａ，  ＧＭ−ＣＳＦ，  ＧＭＰＲ，  ＧＮＡＩ２，  ＧＮＡＳ，  ＧＮＡＴ１，  ＧＮＢ３，  ＧＮＥ，  ＧＮＰＴＡ，  ＧＮＲＨ，  ＧＮＲＨ１，  ＧＮＲＨＲ，  ＧＮＳ，  ＧｎＴ−Ｖ，  ｇｐ１００，  ＧＰ１ＢＡ，  ＧＰ１ＢＢ，  ＧＰ９，  ＧＰＣ３，  ＧＰＤ２，  ＧＰＤＳ１，  ＧＰＩ，  ＧＰ１ＢＡ，  ＧＰＮ１ＬＷ，  ＧＰＮＭＢ／ｍ，  ＧＰＳＣ，  ＧＰＸ１，  ＧＲＨＰＲ，  ＧＲＫ１，  ＧＲＯα，  ＧＲＯβ，  ＧＲＯγ，  ＧＲＰＲ，  ＧＳＥ，  ＧＳＭ１，  ＧＳＮ，  ＧＳＲ，  ＧＳＳ，  ＧＴＤ，  ＧＴＳ，  ＧＵＣＡ１Ａ，  ＧＵＣＹ２Ｄ，  ＧＵＬＯＰ，  ＧＵＳＢ，  ＧＵＳＭ，  ＧＵＳＴ，  ＧＹＰＡ，  ＧＹＰＣ，  ＧＹＳ１，  ＧＹＳ２，  Ｈ０ＫＰＰ２，  Ｈ０ＭＧ２，  ＨＡＤＨＡ，  ＨＡＤＨＢ，  ＨＡＧＥ，  ＨＡＧＨ，  ＨＡＬ，  ＨＡＳＴ−２，  ＨＢ  １，  ＨＢＡ２，  ＨＢＡ１，  ＨＢＢ，  ＨＢＢＰ１，  ＨＢＤ，  ＨＢＥ１，  ＨＢＧ２，  ＨＢＧ１，  ＨＢＨＲ，  ＨＢＰ１，  ＨＢＱ１，  ＨＢＺ，  ＨＢＺＰ，  ＨＣＡ，  ＨＣＣ−１，  ＨＣＣ−４，  ＨＣＦ２，  ＨＣＧ，  ＨＣＬ２，  ＨＣＬ１，  ＨＣＲ，  ＨＣＶＳ，  ＨＤ，  ＨＰＮ，  ＨＥＲ２，  ＨＥＲ２／ＮＥＵ，  ＨＥＲ３，  ＨＥＲＶ−Ｋ−ＭＥＬ，  ＨＥＳＸ１，  ＨＥＸＡ，  ＨＥＸＢ，  ＨＦ１，  ＨＦＥ，  ＨＦ１，  ＨＧＤ，  ＨＨＣ２，  ＨＨＣ３，  ＨＨＧ，  ＨＫ１  ＨＬＡ−Ａ，  ＨＬＡ−Ａ＊０２０１−Ｒ１７０Ｉ，  ＨＬＡ−Ａ１１／ｍ，  ＨＬＡ−Ａ２／ｍ，  ＨＬＡ−ＤＰＢ１  ＨＬＡ−ＤＲＡ，  ＨＬＣＳ，  ＨＬＸＢ９，  ＨＭＢＳ，  ＨＭＧＡ２，  ＨＭＧＣＬ，  ＨＭＩ，  ＨＭＮ２，  ＨＭＯＸ１，  ＨＭＳ１  ＨＭＷ−ＭＡＡ，  ＨＮＤ，  ＨＮＥ，  ＨＮＦ４Ａ，  ＨＯＡＣ，  ＨＯＭＥＯＢＯＸ  ＮＫＸ  ３．１，  ＨＯＭ−ＴＥＳ−１４／ＳＣＰ−１，  ＨＯＭ−ＴＥＳ−８５，  ＨＯＸＡ１  ＨＯＸＤ１３，  ＨＰ，  ＨＰＣ１，  ＨＰＤ，  ＨＰＥ２，  ＨＰＥ１，  ＨＰＦＨ，  ＨＰＦＨ２，  ＨＰＲＴ１，  ＨＰＳ１，  ＨＰＴ，  ＨＰＶ−���６，  ＨＰＶ−Ｅ７，  ＨＲ，  ＨＲＡＳ，  ＨＲＤ，  ＨＲＧ，  ＨＲＰＴ２，  ＨＲＰＴ１，  ＨＲＸ，  ＨＳＤ１１Ｂ２，  ＨＳＤ１７Ｂ３，  ＨＳＤ１７Ｂ４，  ＨＳＤ３Ｂ２，  ＨＳＤ３Ｂ３，  ＨＳＮ１，  ＨＳＰ７０−２Ｍ，  ＨＳＰＧ２，  ＨＳＴ−２，  ＨＴＣ２，  ＨＴＣ１，  ｈＴＥＲＴ，  ＨＴＮ３，  ＨＴＲ２Ｃ，  ＨＶＢＳ６，  ＨＶＢＳ１，  ＨＶＥＣ，  ＨＶ１Ｓ，  ＨＹＡＬ１，  ＨＹＲ，  Ｉ−３０９，  ＩＡＢ，  ＩＢＧＣ１，  ＩＢＭ２，  ＩＣＡＭ１，  ＩＣＡＭ３，  ｉＣＥ，  ＩＣＨＱ，  ＩＣＲ５，  ＩＣＲ１，  ＩＣＳ  １，  ＩＤＤＭ２，  ＩＤＤＭ１，  ＩＤＳ，  ＩＤＵＡ，  ＩＦ， 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ＭＳＳＥ，  ＭＳＸ２，  ＭＳＸ１，  ＭＴＡＴＰ６，  ＭＴＣ０３，  ＭＴＣＯ１，  ＭＴＣＹＢ，  ＭＴＨＦＲ，  ＭＴＭ１，  ＭＴＭＲ２，  ＭＴＮＤ２，  ＭＴＮＤ４，  ＭＴＮＤ５，  ＭＴＮＤ６，  ＭＴＮＤ１，  ＭＴＰ，  ＭＴＲ，  ＭＴＲＮＲ２，  ＭＴＲＮＲ１，  ＭＴＲＲ，ＭＴＴＥ，  ＭＴＴＧ，  ＭＴＴＩ，  ＭＴＴＫ，  ＭＴＴＬ２，  ＭＴＴＬ１，  ＭＴＴＮ，  ＭＴＴＰ，  ＭＴＴＳ１，  ＭＵＣ１，ＭＵＣ２，  ＭＵＣ４，  ＭＵＣ５ＡＣ，  ＭＵＭ−１，  ＭＵＭ−１／ｍ，  ＭＵＭ−２，  ＭＵＭ−２／ｍ，  ＭＵＭ−３，  ＭＵＭ−３／ｍ，  ＭＵＴ，  ｍｕｔａｎｔ  ｐ２１  ｒａｓ，  ＭＵＴＹＨ，  ＭＶＫ，  ＭＸ２，  ＭＸＩ１，  ＭＹ０５Ａ，  ＭＹＢ，  ＭＹＢＰＣ３，  ＭＹＣ，  ＭＹＣＬ２，  ＭＹＨ６，  ＭＹＨ７，  ＭＹＬ２，  ＭＹＬ３，  ＭＹＭＹ，  ＭＹＯ１５Ａ，  ＭＹＯ１Ｇ，  ＭＹＯ５Ａ，  ＭＹＯ７Ａ，  ＭＹＯＣ，  Ｍｙｏｓｉｎ／ｍ，  ＭＹＰ２，  ＭＹＰ１，  ＮＡ８８−Ａ，  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−Ｖ，  ＮＡＧＡ，  ＮＡＧＬＵ，  ＮＡＭＳＤ，  ＮＡＰＢ，  ＮＡＴ２，  ＮＡＴ，  ＮＢＩＡ１，  ＮＢＳ１，  ＮＣＡＭ，  ＮＣＦ２，  ＮＣＦ１，  ＮＤＮ  ，  ＮＤＰ，  ＮＤＵＦＳ４，  ＮＤＵＦＳ７，  ＮＤＵＦＳ８，  ＮＤＵＦＶ１，  ＮＤＵＦＶ２，  ＮＥＢ，  ＮＥＦＨ，  ＮＥＭ１，  Ｎｅｏ−ＰＡＰ，  ｎｅｏ−ＰＡＰ／ｍ，  ＮＥＵ１，  ＮＥＵＲＯＤ１，  ＮＦ２，  ＮＦ１，  ＮＦＹＣ／ｍ，  ＮＧＥＰ，  ＮＨＳ，  ＮＫＳ１，  ＮＫＸ２Ｅ，  ＮＭ，  ＮＭＥ１，  ＮＭＰ２２，  ＮＭＴＣ，  ＮＯＤＡＬ，  ＮＯＧ，  ＮＯＳ３，  ＮＯＴＣＨ３，  ＮＯＴＣＨ１，  ＮＰ，  ＮＰＣ２，  ＮＰＣ１，  ＮＰＨＬ２，  ＮＰＨＰ１，  ＮＰＨＳ２，  ＮＰＨＳ１，  ＮＰＭ／ＡＬＫ
，  ＮＰＰＡ，  ＮＱＯ１，  ＮＲ２Ｅ３，  ＮＲ３Ｃ１，  ＮＲ３Ｃ２，  ＮＲＡＳ，  ＮＲＡＳ／ｍ，  ＮＲＬ，  ＮＲＯＢ１，  ＮＲＴＮ，  ＮＳＥ，  ＮＳＸ，  ＮＴＲＫ１，  ＮＵＭＡ１，  ＮＸＦ２，  ＮＹ−ＣＯ１，  ＮＹ−ＥＳＯ１，  ＮＹ−ＥＳＯ−Ｂ，  ＮＹ−ＬＵ−１２，  ＡＬＤＯＡ，  ＮＹＳ２，  ＮＹＳ４，  ＮＹ−ＳＡＲ−３５，  ＮＹＳ１，  ＮＹＸ，  ＯＡ３，  ＯＡ１，  ＯＡＰ，  ＯＡＳＤ，  ＯＡＴ，  ＯＣＡ１，  ＯＣＡ２，  ＯＣＤ１，  ＯＣＲＬ，  ＯＣＲＬ１，  ＯＣＴ，  ＯＤＤＤ，  ＯＤＴ１，  ＯＦＣ１，  ＯＦＤ１，  ＯＧＤＨ，  ＯＧＴ，  ＯＧＴ／ｍ，  ＯＰＡ２，  ＯＰＡ１，  ＯＰＤ１，  ＯＰＥＭ，  ＯＰＧ，  ＯＰＮ，  ＯＰＮ１ＬＷ，  ＯＰＮ１ＭＷ，  ＯＰＮ１ＳＷ，  ＯＰＰＧ，  ＯＰＴＢ１，  ＴＴＤ，  ＯＲＭ１，  ＯＲＰ１，  ＯＳ−９，  ＯＳ−９／ｍ，  ＯＳＭ  ＬＩＦ，  ＯＴＣ，  ＯＴＯＦ，  ＯＴＳＣ１，  ＯＸＣＴ１，  ＯＹＴＥＳ１，  Ｐ１５，  Ｐ１９０  ＭＩＮＯＲ  ＢＣＲ−ＡＢＬ，  Ｐ２ＲＹ１２，  Ｐ３，  Ｐ１６，  Ｐ４０，  Ｐ４ＨＢ，  Ｐ−５０１，  Ｐ５３，  Ｐ５３／ｍ，  Ｐ９７，  ＰＡＢＰＮ１，  ＰＡＦＡＨ１Ｂ１，  ＰＡＦＡＨ１Ｐ１，  ＰＡＧＥ−４，  ＰＡＧＥ−５，  ＰＡＨ，  ＰＡＩ−１，  ＰＡＩ−２，  ＰＡＫ３，  ＰＡＰ，  ＰＡＰＰＡ，  ＰＡＲＫ２，  ＰＡＲＴ−１，  ＰＡＴＥ，  ＰＡＸ２，  ＰＡＸ３，  ＰＡＸ６，  ＰＡＸ７，  ＰＡＸ８，  ＰＡＸ９，  ＰＢＣＡ，  ＰＢＣＲＡ１，  ＰＢＴ，  ＰＢＸ１，  ＰＢＸＰ１，  ＰＣ，  ＰＣＢＤ，  ＰＣＣＡ，  ＰＣＣＢ，  ＰＣＫ２，  ＰＣＫ１，  ＰＣＬＤ，  ＰＣＯＳ１，  ＰＣＳＫ１，  ＰＤＢ１，  ＰＤＣＮ，  ＰＤＥ６Ａ，  ＰＤＥ６Ｂ，  ＰＤＥＦ，  ＰＤＧＦＢ，  ＰＤＧＦＲ，  ＰＤＧＦＲＬ，  ＰＤＨＡ１，  ＰＤＲ，  ＰＤＸ１，  ＰＥＣＡＭ１，  ＰＥＥ１，  ＰＥＯ１，  ＰＥＰＤ，  ＰＥＸ１０，  ＰＥＸ１２，  ＰＥＸ１３，  ＰＥＸ３，  ＰＥＸ５，  ＰＥＸ６，  ＰＥＸ７，  ＰＥＸ１，  ＰＦ４，  ＰＦＢＩ，  ＰＦＣ，  ＰＦＫＦＢ１，  ＰＦＫＭ，  ＰＧＡＭ２，  ＰＧＤ，  ＰＧＫ１，  ＰＧＫ１Ｐ１，  ＰＧＬ２，  ＰＧＲ，  ＰＧＳ，  ＰＨＡ２Ａ，  ＰＨＢ，  ＰＨＥＸ，  ＰＨＧＤＨ，  ＰＨＫＡ２，  ＰＨＫＡ１，  ＰＨＫＢ，  ＰＨＫＧ２，  ＰＨＰ，  ＰＨＹＨ，  ＰＩ，  ＰＩ３，  ＰＩＧＡ，  ＰＩＭ１−ＫＩＮＡＳＥ，  ＰＩＮ１，  ＰＩＰ５Ｋ１Ｂ，  ＰＩＴＸ２，  ＰＩＴＸ３，  ＰＫＤ２，  ＰＫＤ３，  ＰＫＤ１，  ＰＫＤＴＳ，  ＰＫＨＤ１，  ＰＫＬＲ，  ＰＫＰ１，  ＰＫＵ１，  ＰＬＡ２Ｇ２Ａ，  ＰＬＡ２Ｇ７，  ＰＬＡＴ，  ＰＬＥＣ１，  ＰＬＧ，  ＰＬＩ，  ＰＬＯＤ，  ＰＬＰ１，  ＰＭＥＬ１７，  ＰＭＬ，  ＰＭＬ／ＲＡＲα，  ＰＭＭ２，  ＰＭＰ２２，  ＰＭＳ２，  ＰＭＳ１，  ＰＮＫＤ，  ＰＮＬＩＰ，  ＰＯＦ１，  ＰＯＬＡ，  ＰＯＬＨ，  ＰＯＭＣ，  ＰＯＮ２，  ＰＯＮ１，  ＰＯＲＣ，  ＰＯＴＥ，  ＰＯＵ１Ｆ１，  ＰＯＵ３Ｆ４，  ＰＯＵ４Ｆ３，  ＰＯＵ１Ｆ１，  ＰＰＡＣ，  ＰＰＡＲＧ，  ＰＰＣＤ，  ＰＰＧＢ，  ＰＰＨ１，  ＰＰＫＢ，  ＰＰＭＸ，  ＰＰＯＸ，  ＰＰＰ１Ｒ３Ａ，  ＰＰＰ２Ｒ２Ｂ，  ＰＰＴ１，  ＰＲＡＭＥ，  ＰＲＢ，  ＰＲＢ３，  ＰＲＣＡ１，  ＰＲＣＣ，  ＰＲＤ，  ＰＲＤＸ５／ｍ，  ＰＲＦ１，  ＰＲＧ４，  ＰＲＫＡＲ１Ａ，  ＰＲＫＣＡ，  ＰＲＫＤＣ，  ＰＲＫＷＮＫ４，  ＰＲＮＰ，  ＰＲＯＣ，  ＰＲＯＤＨ，  ＰＲＯＭ１，  ＰＲＯＰ１，  ＰＲＯＳ１，  ＰＲＳＴ，  ＰＲＰ８，  ＰＲＰＦ３１，  ＰＲＰＦ８，  ＰＲＰＨ２，  ＰＲＰＳ２，  ＰＲＰＳ１，  ＰＲＳ，  ＰＲＳＳ７，  ＰＲＳＳ１，  ＰＲＴＮ３，  ＰＲＸ，  ＰＳＡ，  ＰＳＡＰ，  ＰＳＣＡ，  ＰＳＥＮ２，  ＰＳＥＮ１，  ＰＳＧ１，  ＰＳＧＲ，  ＰＳＭ，  ＰＳＭＡ，  ＰＳＯＲＳ１，  ＰＴＣ，  ＰＴＣＨ，  ＰＴＣＨ１，  ＰＴＣＨ２，  ＰＴＥＮ，  ＰＴＧＳ１，  ＰＴＨ，  ＰＴＨＲ１，  ＰＴＬＡＨ，  ＰＴＯＳ１，  ＰＴＰＮ１２，  ＰＴＰＮＩ  ｌ，  ＰＴＰＲＫ，  ＰＴＰＲＫ／ｍ，  ＰＴＳ，  ＰＵＪＯ，  ＰＶＲ，  ＰＶＲＬ１，  ＰＷＣＲ，  ＰＸＥ，  ＰＸＭＰ３，  ＰＸＲ１，  ＰＹＧＬ，  ＰＹＧＭ，  ＱＤＰＲ，  ＲＡＢ２７Ａ，  ＲＡＤ５４Ｂ，  ＲＡＤ５４Ｌ，  ＲＡＧ２，  ＲＡＧＥ，  ＲＡＧＥ−１，  ＲＡＧ１，  ＲＡＰ１，  ＲＡＲＡ，  ＲＡＳＡ１，  ＲＢＡＦ６００／ｍ，  ＲＢ１，  ＲＢＰ４，  ＲＢＰ４，  ＲＢＳ，  ＲＣＡ１，  ＲＣＡＳ１，  ＲＣＣＰ２，  ＲＣＤ１，  ＲＣＶ１，  ＲＤＨ５，  ＲＤＰＡ，  ＲＤＳ，  ＲＥＣＱＬ２，  ＲＥＣＱＬ３，  ＲＥＣＱＬ４，  ＲＥＧ１Ａ，  ＲＥＨＯＢＥ，  ＲＥＮ，  ＲＥＮＢＰ，  ＲＥＮＳ１，  ＲＥＴ，  ＲＦＸ５，  ＲＦＸＡＮＫ，  ＲＦＸＡＰ，  ＲＧＲ，  ＲＨＡＧ，  ＲＨＡＭＭ／ＣＤ１６８，  ＲＨＤ，  ＲＨＯ，  Ｒｉｐ−１，  ＲＬＢＰ１，  ＲＬＮ２，  ＲＬＮ１，  ＲＬＳ，  ＲＭＤ１，  ＲＭＲＰ，  ＲＯＭ１，  ＲＯＲ２，  ＲＰ，  ＲＰ１，  ＲＰ１４，  ＲＰ１７，  ＲＰ２，  ＲＰ６，  ＲＰ９，  ＲＰＤ１，  ＲＰＥ６５，  ＲＰＧＲ，  ＲＰＧＲＩＰ１，  ＲＰ１，  ＲＰ１０，  ＲＰＳ１９，  ＲＰＳ２，  ＲＰＳ４Ｘ，  ＲＰＳ４Ｙ，  ＲＰＳ６ＫＡ３，  ＲＲＡＳ２，  ＲＳ１，  ＲＳＮ，  ＲＳＳ，  ＲＵ１，  ＲＵ２，  ＲＵＮＸ２，ＲＵＮＸｌ，  ＲＷＳ，  ＲＹＲ１，  Ｓ−１００，  ＳＡＡ１，  ＳＡＣＳ，  ＳＡＧ，  ＳＡＧＥ，  ＳＡＬＬ１，  ＳＡＲＤＨ，  ＳＡＲＴ１，  ＳＡＲＴ２  ，  ＳＡＲＴ３，  ＳＡＳ，  ＳＡＸ１，  ＳＣＡ２，  ＳＣＡ４，  ＳＣＡ５，  ＳＣＡ７，  ＳＣＡ８，  ＳＣＡ１，  ＳＣＣ，  ＳＣＣＤ，  ＳＣＦ，  ＳＣＬＣ１，  ＳＣＮ１Ａ，  ＳＣＮ１Ｂ，  ＳＣＮ４Ａ，  ＳＣＮ５Ａ，  ＳＣＮＮ１Ａ，  ＳＣＮＮ１Ｂ，  ＳＣＮＮ１Ｇ，  ＳＣＯ２，  ＳＣＰ１，  ＳＣＺＤ２，  ＳＣＺＤ３，  ＳＣＺＤ４，  ＳＣＺＤ６，  ＳＣＺＤ１，  ＳＤＦ−１/ＳＤＨＡ，  ＳＤＨＤ，  ＳＤＹＳ，  ＳＥＤＬ，  ＳＥＲＰＥＮＡ７，  ＳＥＲＰＩＮＡ３，  ＳＥＲＰＩＮＡ６，  ＳＥＲＰＩＮＡ１，  ＳＥＲＰＩＮＣ１，  ＳＥＲＰＩＮＤ１，  ＳＥＲＰＩＮＥ１，  ＳＥＲＰＩＮＦ２，  ＳＥＲＰＩＮＧ１，  ＳＥＲＰＩＮＩ１，  ＳＦＴＰＡ１，  ＳＦＴＰＢ，  ＳＦＴＰＣ，  ＳＦＴＰＤ，  ＳＧＣＡ，  ＳＧＣＢ，  ＳＧＣＤ，  ＳＧＣＥ，  ＳＧＭ１，  ＳＧＳＨ，  ＳＧＹ−１，  ＳＨ２Ｄ１Ａ，  ＳＨＢＧ，  ＳＨＦＭ２，  ＳＨＦＭ３，  ＳＨＦＭ１，  ＳＨＨ，  ＳＨＯＸ，  ＳＩ，  ＳＩＡＬ，  ＳＩＡＬＹＬ  ＬＥＷＩＳＸ  ，  ＳＩＡＳＤ，  Ｓ１１，  ＳＩＭ１，  ＳＩＲＴ２／ｍ，  ＳＩＸ３，  ＳＪＳ１，  ＳＫＰ２，  ＳＬＣ１０Ａ２，  ＳＬＣ１２Ａ１，  ＳＬＣ１２Ａ３，  ＳＬＣ１７Ａ５，  ＳＬＣ１９Ａ２，  ＳＬＣ２２Ａ１Ｌ，  ＳＬＣ２２Ａ５，  ＳＬＣ２５Ａ１３，  ＳＬＣ２５Ａ１５，  ＳＬＣ２５Ａ２０，  ＳＬＣ２５Ａ４，  ＳＬＣ２５Ａ５，  ＳＬＣ２５Ａ６，  ＳＬＣ２６Ａ２，  ＳＬＣ２６Ａ３，  ＳＬＣ２６Ａ４，  ＳＬＣ２Ａ１，  ＳＬＣ２Ａ２，  ＳＬＣ２Ａ４，  ＳＬＣ３Ａ１，  ＳＬＣ４Ａ１，  ＳＬＣ４Ａ４，  ＳＬＣ５Ａ１，  ＳＬＣ５Ａ５，  ＳＬＣ６Ａ２，  ＳＬＣ６Ａ３，  ＳＬＣ６Ａ４，  ＳＬＣ７Ａ７，  ＳＬＣ７Ａ９，  ＳＬＣ１１Ａ１，  ＳＬＯＳ，  ＳＭＡ，  ＳＭＡＤ１，  ＳＭＡＬ，  ＳＭＡＲＣＢ１，  ＳＭＡＸ２，  ＳＭＣＲ，  ＳＭＣＹ，  ＳＭ１，  ＳＭＮ２，  ＳＭＮ１，  ＳＭＰＤ１，  ＳＮＣＡ，  ＳＮＲＰＮ，  ＳＯＤ２，  ＳＯＤ３，  ＳＯＤ１，  ＳＯＳ１，  ＳＯＳＴ，  ＳＯＸ９，  ＳＯＸ１０，  Ｓｐ１７，  ＳＰＡＮＸＣ，  ＳＰＧ２３，  ＳＰＧ３Ａ，  ＳＰＧ４，  ＳＰＧ５Ａ，  ＳＰＧ５Ｂ，  ＳＰＧ６，  ＳＰＧ７，  ＳＰＩＮＫ１，  ＳＰＩＮＫ５，  ＳＰＰＫ，  ＳＰＰＭ，  ＳＰＳＭＡ，  ＳＰＴＡ１，  ＳＰＴＢ，  ＳＰＴＬＣ１，  ＳＲＣ，  ＳＲＤ５Ａ２，  ＳＲＰＸ，  ＳＲＳ，  ＳＲＹ，  ｓｓ（エスツェット）ｈＣＧ，  ＳＳＴＲ２，  ＳＳＸ１，  ＳＳＸ２  （ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０／ＳＳＸ２），  ＳＳＸ４，  ＳＴ８，  ＳＴＡＭＰ−１，  ＳＴＡＲ，  ＳＴＡＲＰ１，  ＳＴＡＴＨ，  ＳＴＥＡＰ，  ＳＴＫ２，  ＳＴＫ１１，  ＳＴｎ／  ＫＬＨ，  ＳＴＯ，  ＳＴＯＭ，  ＳＴＳ，  ＳＵＯＸ，  ＳＵＲＦ１，  ＳＵＲＶＩＶＩＮ−２Ｂ，  ＳＹＣＰ１，  ＳＹＭ１，  ＳＹＮ１，  ＳＹＮＳ１，  ＳＹＰ，  ＳＹＴ／ＳＳＸ，  ＳＹＴ−ＳＳＸ−１，  ＳＹＴ−ＳＳＸ−２，  ＴＡ−９０，  ＴＡＡＬ６，  ＴＡＣＳＴＤ１，  ＴＡＣＳＴＤ２，  ＴＡＧ７２，  ＴＡＦ７Ｌ，  ＴＡＦ１，  ＴＡＧＥ，  ＴＡＧ−７２，  ＴＡＬＩ，  ＴＡＭ，  ＴＡＰ２，  ＴＡＰ１，  ＴＡＰＶＲ１，  ＴＡＲＣ，  ＴＡＲＰ，  ＴＡＴ，  ＴＡＺ，  ＴＢＰ，  ＴＢＸ２２，  ＴＢＸ３，  ＴＢＸ５，  ＴＢＸＡ２Ｒ，  ＴＢＸＡＳ１，  ＴＣＡＰ，  ＴＣＦ２，  ＴＣＦ１，  ＴＣＩＲＧ１，  ＴＣＬ２，  ＴＣＬ４，  ＴＣＬ１Ａ，  ＴＣＮ２，  ＴＣＯＦ１，  ＴＣＲ，  ＴＣＲＡ，  ＴＤＤ，  ＴＤＦＡ，  ＴＤＲＤ１，  ＴＥＣＫ，  ＴＥＣＴＡ，  ＴＥＫ，  ＴＥＬ／ＡＭＬ１，  ＴＥＬＡＢ１，  ＴＥＸ１５，  ＴＦ，  ＴＦＡＰ２Ｂ，  ＴＦＥ３，  ＴＦＲ２，  ＴＧ，  ＴＧＦＡ，  ＴＧＦ−β，  ＴＧＦＢＩ，  ＴＧＦＢ１，  ＴＧＦＢＲ２，  ＴＧＦＢＲＥ，  ＴＧＦβ，  ＴＧＦβＲＩＩ，  ＴＧＩＦ，  ＴＧＭ−４，  ＴＧＭ１，  ＴＨ，  ＴＨＡＳ，  ＴＨＢＤ，  ＴＨＣ，  ＴＨＣ２，  ＴＨＭ，  ＴＨＰＯ，  ＴＨＲＡ，  ＴＨＲＢ，  ＴＩＭＭ８Ａ，  ＴＩＭＰ２，  ＴＩＭＰ３，  ＴＩＭＰ１，  ＴＩＴＦ１，  ＴＫＣＲ，  ＴＫＴ，  ＴＬＰ，  ＴＬＲ１，  ＴＬＲ１０，  ＴＬＲ２，  ＴＬＲ３，  ＴＬＲ４，  ＴＬＲ４，  ＴＬＲ５，  ＴＬＲ６，  ＴＬＲ７，  ＴＬＲ８，  ＴＬＲ９，  ＴＬＸ１，  ＴＭ４ＳＦ１，  ＴＭ４ＳＦ２，  ＴＭＣ１，  ＴＭＤ，  ＴＭＩＰ，  ＴＮＤＭ，  ＴＮＦ，  ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ，  ＴＮＦＲＳＦ１Ａ，  ＴＮＦＲＳＦ６，  ＴＮＦＳＦ５，  ＴＮＦＳＦ６，  ＴＮＦα，  ＴＮＦβ，  ＴＮＮＩ３，  ＴＮＮＴ２，  ＴＯＣ，  ��ＯＰ２Ａ，  ＴＯＰ１，  ＴＰ５３，  ＴＰ６３，  ＴＰＡ，  ＴＰＢＧ，  ＴＰＩ，  ＴＰＩ／ｍ，  ＴＰＩ１，  ＴＰＭ３，  ＴＰＭ１，  ＴＰＭＴ，  ＴＰＯ，  ＴＰＳ，  ＴＰＴＡ，  ＴＲＡ，  ＴＲＡＧ３，  ＴＲＡＰＰＣ２，  ＴＲＣ８，  ＴＲＥＨ，  ＴＲＧ，  ＴＲＨ，  ＴＲＩＭ３２，  ＴＲＩＭ３７，  ＴＲＰ１，  ＴＲＰ２，  ＴＲＰ−２／６ｂ，  ＴＲＰ−２／ＩＮＴ２，  Ｔｒｐ−ｐ８，  ＴＲＰＳ１，  ＴＳ，  ＴＳＣ２，  ＴＳＣ３，  ＴＳＣ１，  ＴＳＧ１０１，  ＴＳＨＢ，  ＴＳＨＲ，  ＴＳＰ−１８０，  ＴＳＴ，  ＴＴＧＡ２Ｂ，  ＴＴＮ，  ＴＴＰＡ，  ＴＴＲ，  ＴＵ  Ｍ２−ＰＫ，  ＴＵＬＰ１，  ＴＷＩＳＴ，  ＴＹＨ，  ＴＹＲ，  ＴＹＲＯＢＰ，  ＴＹＲＯＢＰ，  ＴＹＲＰ１，  ＴＹＳ，  ＵＢＥ２Ａ，  ＵＢＥ３Ａ，  ＵＢＥ１，  ＵＣＨＬ１，  ＵＦＳ，  ＵＧＴ１Ａ，  ＵＬＲ，  ＵＭＰＫ，  ＵＭＰＳ，  ＵＯＸ，  ＵＰＡ，  ＵＱＣＲＣ１，  ＵＲＯ５，  ＵＲＯＤ，  ＵＰＫ１Ｂ，  ＵＲＯＳ，  ＵＳＨ２Ａ，  ＵＳＨ３Ａ，  ＵＳＨ１Ａ，  ＵＳＨ１Ｃ，  ＵＳＰ９Ｙ，  ＵＶ２４，  ＶＢＣＨ，  ＶＣＦ，  ＶＤＩ，  ＶＤＲ，  ＶＥＧＦ，  ＶＥＧＦＲ−２，  ＶＥＧＦＲ−１，  ＶＥＧＦＲ−２／ＦＬＫ−１，  ＶＨＬ，  ＶＩＭ，  ＶＭＤ２，  ＶＭＤ１，  ＶＭＧＬＯＭ，  ＶＮＥＺ，  ＶＮＦ，  ＶＰ，  ＶＲＮＩ，  ＶＷＦ，  ＶＷＳ，  ＷＡＳ，  ＷＢＳ２，  ＷＦＳ２，  ＷＦＳ１，  ＷＨＣＲ，  ＷＨＮ，  ＷＩＳＰ３，  ＷＭＳ，  ＷＲＮ，  ＷＳ２Ａ，  ＷＳ２Ｂ，  ＷＳＮ，  ＷＳＳ，  ＷＴ２，  ＷＴ３，  ＷＴ１，  ＷＴＳ，  ＷＷＳ，  ＸＡＧＥ，  ＸＤＨ，  ＸＩＣ，  ＸＩＳＴ，  ＸＫ，  ＸＭ，  ＸＰＡ，  ＸＰＣ，  ＸＲＣＣ９，  ＸＳ，  ＺＡＰ７０，  ＺＦＨＸ１Ｂ，  ＺＦＸ，  ＺＦＹ，  ＺＩＣ２，  ＺＩＣ３，  ＺＮＦ１４５，  ＺＮＦ２６１，  ＺＮＦ３５，Ｚ
ＮＦ４１，  ＺＮＦ６，  ＺＮＦ１９８，  ＺＷＳ１。本発明の塩基修飾されたＲＮＡは、上記タンパク質に対する２つ以上のコーディング領域を含んでもよい。よって、本発明のＲＮＡは例えばバイまたはマルチシストロニックであってもよい。
【００６０】
好ましくは、本発明のＲＮＡによってコードされるタンパク質は、例えばＴＧＦα、ＩＧＦ（インスリン様増殖因子）等の（トランスジェニック）生物において成長を促進する成長ホルモンまたは成長因子から、例えばα−アンチトリプシン、ＬＤＬ受容体、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インシュリン、ＧＡＴＡ−１等の代謝および／または造血に影響するタンパク質から、または例えば血液凝固系の第８因子と第６因子等のタンパク質から（いかなる限定もなく）選択される。かかるタンパク質には、さらに、例えばβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）、ＤＮＡ制限酵素（例えばＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ等）、リゾチーム等、または例えばパパイン、ブロメライン、ケラチナーゼ、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、レニン（キモシン）、Ｓｕｉｚｙｍｅ、Ｎｏｒｔａｓｅ等のプロテアーゼのような酵素が含まれる。これらのタンパク質は、高い発現量を特徴とする、本発明の塩基修飾されたＲＮＡによって提供されうる。よって、本発明は、（例えば変異により、または発現不良や発現欠落により）治療される生物において欠陥のあるタンパク質の置換を可能にする技術を提供する。よって、本発明は、治療される生物において、例えば単一遺伝子疾患において見られるような機能しないタンパク質の効果的で高い発現の提供を可能にする。
【００６１】
または、本発明は、例えば、病気や疾患を引き起こす、機能不全のタンパク質または外因性のタンパク質の（過剰）発現等による特定の病気を治すことが可能な、例えば抗体やプロテアーゼ等の治療用タンパク質を提供することができる。よって、本発明は、（ウイルス、細菌等の）病原体を攻撃する本発明のＲＮＡを、生物に治療目的で導入するのに用いることができる。例えば、治療用プロテアーゼをコードするＲＮＡは、ウイルスの組み立てまたはウイルス生産の他の必須工程に必須のウイルスタンパクを切断するのに用いることができる。
【００６２】
または、本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡによってコードされるタンパク質は、塩基修飾されたＲＮＡの元のＲＮＡが免疫応答を誘発しないのに対して、適応的免疫応答を引き起こすのに十分に発現された抗原を提供することによって、適応免疫応答を刺激するのに用いることができる。その程度において、本発明は、抗原性のタンパク質またはペプチドの高い発現量を示す塩基修飾されたＲＮＡに基づき、ワクチンを提供することを可能にする。これらのワクチンは、腫瘍抗原を提供する腫瘍ワクチン、または、感染症等を引き起こす病原微生物に由来する抗原を提供するのに用いることができる。本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡによってコードされるタンパク質は、特に好ましくは、以下の抗原から選択することができる。５Ｔ４，  α５β１−インテグリン，  ７０７−ＡＰ，  ＡＦＰ，  ＡＲＴ−４，  Ｂ７Ｈ４，  ＢＡＧＥ，  β−カテニン／ｍ，  Ｂｃｒ−ａｂｌ，  ＭＮ／Ｃ  ＩＸ  抗原，  ＣＡ１２５，  ＣＡＭＥＬ，  ＣＡＰ−１，  ＣＡＳＰ−８，  β−カテニン／ｍ，  ＣＤ４，  ＣＤ１９，  ＣＤ２０，  ＣＤ２２，  ＣＤ２５，  ＣＤＣ２７／ｍ，  ＣＤ  ３０，  ＣＤ３３，  ＣＤ５２，  ＣＤ５６，  ＣＤ８０，  ＣＤＫ４／ｍ，  ＣＥＡ，  ＣＴ，  Ｃｙｐ−Ｂ，  ＤＡＭ，  ＥＧＦＲ，  ＥｒｂＢ３，  ＥＬＦ２Ｍ，  ＥＭＭＰＲＩＮ，  ＥｐＣａｍ，  ＥＴＶ６−ＡＭＬ１，  Ｇ２５０，  ＧＡＧＥ，  ＧｎＴ−Ｖ，  Ｇｐ１００，  ＨＡＧＥ，  ＨＥＲ−２／ｎｅｗ，  ＨＬＡ−Ａ＊０２０１−Ｒ１７０Ｉ，  ＨＰＶ−Ｅ７，  ＨＳＰ７０−２Ｍ，  ＨＡＳＴ−２，  ｈＴＥＲＴ  （ｏｒ  ｈＴＲＴ），  ｉＣＥ，  ＩＧＦ−１Ｒ，  ＩＬ−２Ｒ，  ＩＬ−５，  ＫＩＡＡ０２０５，  ＬＡＧＥ，  ＬＤＬＲ／ＦＵＴ，  ＭＡＧＥ，  ＭＡＲＴ−１／ｍｅｌａｎ−Ａ，  ＭＡＲＴ−２／Ｓｋｉ，  ＭＣ１Ｒ，  ミオシン／ｍ，  ＭＵＣ１，  ＭＵＭ−１，  −２，  −３，  ＮＡ８８−Ａ，  ＰＡＰ，  ＮＹ−ＥＳＯ１，  プロテイナーゼ−３，  ｐ１９０  ｍｉｎｏｒ  ｂｃｒ−ａｂｌ，  Ｐｍｌ／ＲＡＲα，  ＰＲＡＭＥ，  ＰＳＡ，  ＰＳＭ，  ＰＳＭＡ，  ＲＡＧＥ，  ＲＵ１  または  ＲＵ２，  ＳＡＧＥ，  ＳＡＲＴ−１  または  ＳＡＲＴ−３，  サバイビン，  ＴＥＬ／ＡＭＬ１，  ＴＧＦβ，  ＴＰＩ／ｍ，  ＴＲＰ−１，  ＴＲＰ−２，  ＴＲＰ−２／ＩＮＴ２，  ＶＥＧＦ，  ＷＴ１等の腫瘍特異性表面抗原（ＴＳＳＡ）、または例えばＮＹ−Ｅｓｏ−１またはＮＹ−Ｅｓｏ−Ｂ等の配列。
【００６３】
本発明の塩基修飾されたされたＲＮＡによって発現可能な他のクラスのタンパク質としては、例えば、特に生物の免疫系において、アポトーシスや細胞増殖等の重要な細胞内プロセスに影響を与える信号伝送調節（抑制または刺激）等によって、様々な細胞内経路を調節するタンパク質を挙げることができる。よって、塩基修飾されたされたＲＮＡによって、例えばサイトカイン、リンフォカイン、モノカイン、インターフェロン等の免疫調節成分を効率的に発現することができる。従って、好ましくは、これらのタンパク質としては、例えば、４つの位置特異的な保存システイン残基（ＣＣＣＣ）と保存配列モチーフＴｒｐ−Ｓｅｒ−Ｘ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ＷＳＸＷＳ）とを含むクラスＩサイトカインファミリーのサイトカインも挙げられる。ここで、Ｘは、保存されていないアミノ酸を表す。クラスＩサイトカインファミリーのサイトカインとしては、例えばＩＬ−３、ＩＬ−５、ＧＭ−ＣＳＦ等のＧＭ−ＣＳＦサブファミリー、例えばＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２等のＩＬ−６サブファミリー、例えばＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５等のＩＬ−２サブファミリー、またはサイトカインＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１０等が挙げられる。同様に、上記タンパク質としては、４つの位置特異的な保存システイン残基（ＣＣＣＣ）を同様に含んでいるが保存配列モチーフＴｒｐ−Ｓｅｒ−Ｘ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ＷＳＸＷＳ）は含んでいなクラスＩＩサイトカインファミリー（インターフェロン受容体ファミリー）のサイトカインも挙げることができる。クラスＩＩサイトカインファミリーのサイトカインとしては、例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ等が挙げられる。
【００６４】
また、本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡによってコードされるタンパク質は、例えばＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＴＮＦ−ＲＩ、ＴＮＦ−ＲＩＩ、ＣＤ４０、Ｆａｓ等腫瘍壊死ファミリーのサイトカイン、または例えばＩＬ−８、ＭＩＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＲ５、ＣＸＲ４等の、７つの膜貫通へリックスを含みかつＧタンパク質と相互作用するケモカインファミリーのサイトカインをさらに含むことができる。また、上記タンパク質は、アポトーシス因子またはアポトーシス関連タンパク質から選択することができる。アポトーシス因子またはアポトーシス関連タンパク質としては、ＡＩＦ、例えばＡｐａｆ−１、Ａｐａｆ−２、Ａｐａｆ−３等のＡｐａｆ、ＡＰＯ−２（Ｌ）、ＡＰＯ−３（Ｌ）、アポパイン，Ｂａｄ，Ｂａｋ，Ｂａｘ，Ｂｃｌ−２，Ｂｃｌ−ｘＬ，Ｂｃｌ−ｘＳ，ｂｉｋ，ＣＡＤ，カルパイン，例えばカスパーゼ−１、カスパーゼ−２、カスパーゼ−３、カスパーゼ−４、カスパーゼ−５、カスパーゼ−６、カスパーゼ−７、カスパーゼ−８、カスパーゼ−９、カスパーゼ−１０、カスパーゼ−１１等のカスパーゼ、ｃｅｄ−３、ｃｅｄ−９、ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−Ｍｙｃ、ｃｒｍ  Ａ、シトクロムＣ、ＣｄＲ１、ＤｃＲ１、ＤＤ、ＤＥＤ、ＤＩＳＣ、ＤＮＡ−ＰＫＣＳ、ＤＲ３、ＤＲ４、ＤＲ５、ＦＡＤＤ／ＭＯＲＴ−１、ＦＡＫ、Ｆａｓ（ＦａｓリガンドＣＤ９５／ｆａｓ（受容体））、ＦＬＩＣＥ／ＭＡＣＨ、ＦＬＩＰ、ホドリン、ｆｏｓ、Ｇ−アクチン、Ｇａｓ−２、ゲルゾリン、グランザイムＡ／Ｂ、ＩＣＡＤ、ＩＣＥ、ＪＮＫ、ｌａｍｉｎ  Ａ／Ｂ、ＭＡＰ、ＭＣＬ−１、Ｍｄｍ−２、ＭＥＫＫ−１、ＭＯＲＴ−１、ＮＥＤＤ、ＮＦ−κＢ、ＮｕＭａ、ｐ５３、ＰＡＫ−２、ＰＡＲＰ、パーフォリン、ＰＩＴＳＬＲＥ、ＰＫＣσ、ｐＲｂ、プレセニリン、ｐｒＩＣＥ、ＲＡＩＤＤ、Ｒａｓ、ＲＩＰ、スフィンゴミエリナーゼ、単純ヘルペス由来のチミジンキナーゼ、ＴＲＡＤＤ、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、トランスグルタミナーゼ等が挙げられる。
【００６５】
最後に、塩基修飾されたＲＮＡは、抗原特異的なＴ細胞受容体をコードしてもよい。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、Ｔリンパ球（またはＴ細胞）の表面に見られ、一般に、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子と結合した抗原の認知に関与する分子である。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、Ｔ細胞の９５％においてアルファ鎖およびベータ鎖からなるヘテロダイマーであり、Ｔ細胞の５％はガンマ鎖およびデルタ鎖からなるＴＣＲを有している。抗原およびＭＨＣに対するＴＣＲの関与は、関連した酵素、コレセプター、および特殊化したアクセサリー分子によって媒介された一連の生化学的事象を通して、結果的にそのＴリンパ球の活性化を招く。それゆえ、これらのタンパク質は、特定の抗原を特に標的にすることを可能にし、その標的特性によって免疫系の機能性をサポートすることができる。よって、これらの受容体をコードする塩基修飾されたＲＮＡを投与することによるインビボにおける細胞のトランスフェクション、または好ましくは、（例えば、特定の免疫細胞をトランスフェクトすることによる）インビトロトランスフェクションアプローチを達成することができる。導入されたＴ細胞受容体分子は、ＭＨＣ分子上で特定の抗原を認識することで、攻撃すべき抗原に対する免疫系の感知能力をサポートすることができる。
【００６６】
本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡによってコードすることができるタンパク質としては、上記タンパク質のいずれかと、例えばこれらの天然の配列と、少なくとも８０％または８５％、好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するタンパク質またはタンパク質配列がさらに挙げられる。ここで、塩基修飾されたヌクレオチドとこれらの天然の（塩基修飾されていない）類似体とは、「同一である」と考えられる。
【００６７】
本願において「同一性」とは、以下に示すように、配列が互いに同等であることを意味する。２つの核酸配列の同一性百分率を決定するためには、続く配列の比較を可能にするために、まず、配列を相互に配置する(アラインメント)。このために、例えば、最初の核酸配列の配列にギャップを挿入することができ、ヌクレオチドは２番目の核酸配列の対応する位置と比較されうる。そして、最初の核酸配列中のある位置が２番目の核酸配列中の位置と同じヌクレオチドによって占められる時に、２つの配列はその位置で同一である。２つの核酸配列間の同一性百分率は、同一の位置の数を、調べられた核酸配列のすべての比較された位置の数によって割った関数である。もし例えば、ある特定の核酸（例えば、上述のタンパク質をコードする核酸）について、定義された長さを有する参照核酸(例えば従来技術の核酸)との比較において、ある特定の配列の同一性が推定されたら、この同一性百分率は参照核酸に関連して相対的に示される。従って、例えば、１００ヌクレオチドの長さを有する参照核酸と５０％の配列の同一性を有する核酸といえば、その核酸は、５０ヌクレオチドの長さを有する参照核酸の一部とまったく同一の５０ヌクレオチドの長さを有する核酸を表す可能性がある。しかし、それは、参照核酸とその全長にわたって５０％の同一性を有する１００ヌクレオチドの核酸、すなわちこの場合、５０％同一の核酸を表すともいえる。また、その核酸は、１００ヌクレオチドの長さを有する参照核酸と、その核酸の１００ヌクレオチドの長さを有する一部において、まったく同一の、２００ヌクレオチドの核酸でありうる。もちろん他の核酸も同様にこれらの基準を満たす。核酸の同一性に関する説明はタンパク質またはペプチドの配列にも同様に適用される。
【００６８】
２つの配列の同一性百分率の決定は、数学的なアルゴリズムによって行われうる。２つの配列を比較するために用いることができる数学的なアルゴリズムの好ましい例は、これに限定されるものではないが、Karlin et al. (1993), PNAS USA, 90:5873-5877のアルゴリズムである。かかるアルゴリズムはＮＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれており、当該プログラムを用いて、本発明の配列との所望の同一性を有する配列を同定することができる。上述したギャップドアラインメント（gapped alignment）を得るためには、Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res, 25:3389-3402に記載されているように、「ギャップドＢＬＡＳＴ」（Gapped BLAST）プログラムを用いることができる。ＢＬＡＳＴプログラムおよび「ギャップドＢＬＡＳＴ」プログラムを用いるときには、特定のプログラム（例えばＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを用いることができる。配列は、さらに、Genetic Computing Group社のＧＡＰ（global alignment program）バージョン９を用い、−１２のギャップオープニングペナルティ（ギャップの最初のゼロ点）および−４のギャップエクステンションペナルティ（ギャップのそれぞれの追加的な連続するゼロ点）を有するデフォルト（ＢＬＯＳＵＭ６２）マトリックス（−４から＋１１の値）を用いてアライメントを行うことができる。アラインメントの後、同一性百分率は、クレームされた配列において、一致の数を核酸のパーセンテージとして表すことによって求められる。２つの核酸配列の同一性百分率を決定する上記方法は、必要に応じて、アミノ酸配列についても同様に適用されうる。
【００６９】
好ましい実施形態では、本発明で用いられ、上記タンパク質をコードする部分を含む塩基修飾されたＲＮＡは、さらに、少なくとも１つの他の治療の成分をコードする機能的部分をＲＮＡ配列上に含みうる。当該治療の成分は、治療されるべき疾患に応じて選択されうる。このような他の成分は、例えば自己免疫疾患を治療する時には、例えば免疫抑制の性質を有していてもよく（例えば免疫抑制剤をコーディング）、塩基修飾されたＲＮＡがワクチン接種目的(例えば、感染症または腫瘍の治療のため)に使われる時には、免疫賦活性の性質（免疫原性腫瘍または病原性抗原によって誘発された適応免疫応答を強化する性質）を有していてもよい。したがって、塩基修飾されたＲＮＡ上において追加的にコードされている免疫賦活性成分は、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＩＮＦ−α、ＩＦＮ−β、ＩＮＦ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＬＴ−β、または、ＴＮＦ−α、ｈＧＨ等の成長因子のような、免疫反応を促進するサイトカイン(モノカイン、リンフォカイン、インターロイキン、またはケモカイン)から選ばれてもよい。塩基修飾されたＲＮＡのこの少なくとも１つの追加の成分は、一般にＩＲＥＳと結合し、これにより、バイ−またはマルチシストロニックな、塩基修飾されたＲＮＡが形成される。
【００７０】
さらなる好ましい実施形態では、本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡは、上述したタンパク質に加えて、分泌シグナルペプチドをコードしていてもよい。かかるシグナルペプチドは、通常１５から３０までの長さのアミノ酸を含み、好ましくはコードされる（ポリ）ペプチドのＮ末端に位置する（シグナル）配列である。シグナルペプチドは、一般に、これに融合されたタンパク質（ここでは、例えば治療上活性なタンパク質）を、定められた細胞成分、好ましくは、細胞表面、小胞体、またはエンドソーム−リソソームの中に輸送する。本発明で使用できるシグナル配列の例は、例えば、従来のおよび非従来のＭＨＣ分子、サイトカイン、免疫グロブリンのシグナル配列；インバリアント鎖、Ｌａｍｐ１、ｔａｐａｓｉｎ、Ｅｒｐ５７、カルレティキュリンおよびカルネキシン並びにすべての膜に存在するエンドソーム−リソソームの関連タンパク質または小胞体の関連タンパク質のシグナル配列である。ヒトＭＨＣクラスＩ分子ＨＬＡ−Ａ＊０２０１をより好適に用いることができる。
【００７１】
特定の実施形態では、本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡは、脂質修飾を含むことができる。かかる脂質修飾されたＲＮＡは、典型的に、本発明で用いられる上記塩基修飾されたＲＮＡで、少なくとも１つのリンカーが当該ＲＮＡと共有結合で結合し、少なくとも１つの脂質がそれぞれのリンカーと共有結合で結合している。或いは、本発明で用いられる脂質修飾されている、塩基修飾されたＲＮＡは、（少なくとも）１つの本発明で用いられる上記塩基修飾されたＲＮＡからなり、少なくとも１つの（二官能性の）脂質が当該ＲＮＡと共有結合で結合している。第３には、本発明で用いられる脂質修飾されている、塩基修飾されたＲＮＡは、本発明で用いられる上記塩基修飾されたＲＮＡと、当該ＲＮＡに結合された少なくとも１つのリンカーと、それぞれのリンカーと共有結合で結合された少なくとも１つの脂質と、本発明で用いられる上記塩基修飾されたＲＮＡと共有結合で（リンカー無しで）結合された少なくとも１つの（二官能性の）脂質とからなる。
【００７２】
本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡの脂質修飾のために用いられる脂質は、一般に、好ましくは、当該脂質自身が、生物活性のある脂質または親油性ラジカルである。
かかる脂質は、好ましくは、例えば、ビタミン（例えば、ＲＲＲ−α−トコフェロール（以前のＤ−α−トコフェロール）、Ｌ−α−トコフェロール、ラセミ化合物Ｄ,Ｌ−α−トコフェロール、ビタミンＥコハク酸塩（ＶＥＳ）を含むα−トコフェロール（ビタミンＥ））；または、ビタミンＡおよびその誘導体（例えばレチノイン酸、レチノール）、ビタミンＤおよびその誘導体（例えば、ビタミンＤおよびそのエルゴステロール前駆体）、ビタミンＥおよびその誘導体、ビタミンＫおよびその誘導体（例えばビタミンＫおよび関連するキノン化合物またはフィトール化合物）；または、胆汁酸（例えばコール酸、デオキシコール酸、デヒドロコール酸、コーチゾン、デオキシゲニン（digoxygenin）、テストステロン、コレステリン、またはチオコレステロール）等のステロイド類のような天然物質または天然化合物である。本発明の範囲に含まれるさらなる脂質または親油性ラジカルには、これに限定されるものではないが、ポリアルキレングリコール（Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533）；例えばＣ１−Ｃ２０のアルカン、Ｃ１−Ｃ２０のアルケン、または、Ｃ１−Ｃ２０のアルカノール化合物等（例えば、ドデカンジオール、ヘキサデカノール、または、ウンデシルラジカル（Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10, 111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49）等の脂肪族グループ；例えば、ホスファチジルグリセロール、ジアシルホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ジヘキサデシル−rac−グリセロール、スフィンゴ脂質、セレブロシド、ガングリオシド、または、トリエチルアンモニウム１,２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−rac−グリセロ−３−Ｈ−ホスホン酸塩（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777）等のリン脂質；ポリアミン；例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969）、ヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）等のポリアルキレングリコール；パルミチンまたはパルミチルラジカル（Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229）；オクタデシルアミンまたはヘキシルアミノカルボニルオキシコレステロールラジカル（Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923）；および、ろう、テルペン類、脂環式炭化水素、飽和−および一価不飽和−または多価不飽和−脂肪酸ラジカル等が含まれる。
【００７３】
脂質と本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡとの間の結合は、原理的には、本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡの、どのヌクレオチドでも、どのヌクレオチドの塩基または糖ラジカルでも、３´および／または５´末端でも、および／または、リン酸塩部分でも起こる。本発明では、塩基修飾されたＲＮＡの３´および／または５´末端における、末端の脂質修飾が特に好ましい。末端の修飾には配列中の修飾よりも多くの利点がある。一方では、配列中の修飾はハイブリダイゼーションに影響を与えうる。このことは、立体的に厳しいラジカルの場合には逆効果となりうる。配列中の修飾(立体的に厳しい修飾)は、翻訳を妨げることが非常に多く、それは頻繁にタンパク質合成の終了を引き起こす。これに対して、本発明で用いられる、脂質修飾されている、塩基修飾されたＲＮＡが、末端でのみ修飾される合成の場合には、塩基修飾されたＲＮＡの合成は、大量に入手可能な市販されている単量体を用いて、従来公知の合成方法を用いて行うことができる。
【００７４】
第１の好適な実施形態では、本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡと少なくとも１つの脂質との間の結合は、「リンカー」（塩基修飾されたＲＮＡと共有結合で結合している）を介して形成される。本発明の範囲に含まれるリンカーは、一般に、少なくとも２つの、場合に応じて、３、４、５、６、７、８、９、１０、１０−２０、２０−３０、または、これより多い、例えば、水酸基、アミノ基、アルコキシ基等から選択される反応性基を有する。より好ましくは、１つの反応性基が、本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡに結合する。当該反応性基は、例えば、ＤＭＴ基（ジメトキシトリチルクロライド）、Ｆｍｏｃ基、ＭＭＴ（モノメトキシトリチル）基、ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）基等として、保護された形で存在していてもよい。さらに、硫黄グループは、例えばアルキルチオール（例えば、３−チオプロパノール等）等のジスルフィドによって、または、２−チオピリジン等の活性化された成分によって保護されうる。１つまたはそれ以上のさらなる反応性基が、本発明において、１つまたはそれ以上の脂質の共有結合に用いられる。第１の実施形態では、従って、本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡは、共有結合で結合されたリンカーを介して、塩基修飾されたＲＮＡ毎に、好ましくは、少なくとも１つの脂質、例えば１、２、３、４、５、５−１０、１０−２０、２０−３０、またはより多くの脂質と、特に好ましくは、少なくとも３−８、またはより多くの脂質と結合する。ここで、結合した脂質は、本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡの異なる位置に、互いに離れて結合されていてもよいし、塩基修飾されたＲＮＡの一ヶ所またはより多い箇所で、複合体を形成して存在していてもよい。リンカーの追加的な反応性基が、例えば、固相のようなキャリア材への、直接的または間接的な（切断可能な）結合のために使用されうる。本発明に好適に用いられるリンカーとしては、例えば、グリコール、グリセロールおよびグリセロール誘導体；２−アミノブチル−１,３−プロパンジオールおよび２−アミノブチル−１,３―プロパンジオール誘導体／骨格；ピロリジンリンカーまたはピロリジン含有有機分子（特に３´末端での修飾のための）等が含まれる。グリセロールまたはグリセロール誘導体（Ｃ３アンカー）または２−アミノブチル−１,３−プロパンジオール誘導体／骨格（Ｃ７アンカー）はリンカーとして、本発明で特に好適に用いられる。グリセロール誘導体（Ｃ３アンカー）は、脂質修飾がエーテル結合を介して導入されるときに、リンカーとして、特に好適に用いられる。脂質修飾が、例えば、アミドまたはウレタン結合を介して導入されるときは、２−アミノブチル−１,３−プロパンジオール骨格（Ｃ７アンカー）が好ましい。これに関連して、リンカーと本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡとの間に形成される結合の性質は、アミダイト化学の条件および化学物質と同様である。すなわち、好ましくは、酸にも塩基にも不安定でない。好ましくは、合成的に容易に得ることができ、核酸合成工程のアンモニアによる分解処理によって加水分解されない結合である。好適な結合は、原理的には、すべての相当する好適な結合であり、より好ましくは、エステル結合、アミド結合、ウレタン結合、および、エーテル結合である。(合成の工程が少ない)出発物質を得やすいことに加えて、酵素的な加水分解に対する比較的高い生物的安定性のために、エーテル結合が特に好ましい。
【００７５】
第２の好適な実施形態では、上記（少なくとも１つの）本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡは、直接、すなわち、上述したリンカーを用いずに、上述した少なくとも１つの（二官能性の）脂質と結合している。かかる場合、本発明で用いられる上記（二官能性の）脂質は、好ましくは、少なくとも２つの反応性基、または、必要に応じて、３、４、５、６、７、８、９、１０またはこれより多い反応性基を含んでいる。１つめの反応性基は、脂質を直接的または間接的にここで説明したキャリア材と結合するために供され、少なくとも１つの更なる反応性基は、塩基修飾されたＲＮＡを結合するために供される。したがって、第２の実施形態では、本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡは、好ましくは、塩基修飾されたＲＮＡ毎に、少なくとも１つの脂質、例えば、１、２、３、４、５、５〜１０、１０〜２０、２０〜３０、または、これより多い脂質、特に好ましくは、少なくとも３〜８、または、これより多い脂質と、（リンカー無しで直接）結合しうる。結合された脂質は、相互に独立して、塩基修飾されたＲＮＡの異なる位置に結合しうるか、または、塩基修飾されたＲＮＡの１以上の位置で、複合体の形で存在しうる。或いは、第２の実施形態では、上記少なくとも１つの本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡ、例えば、必要に応じて、３、４、５、６、７、８、９、１０、１０−２０、２０−３０、またはそれ以上の塩基修飾がされたＲＮＡは、その反応性基を介して、上述したように脂質に結合していてもよい。本第２の実施形態で用いられる脂質は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とその誘導体、ヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）とその誘導体、アルカンジオール、アミノアルカン、チオアルカノール等の（好ましくはその末端または必要に応じて分子間で）結合を可能とする（二官能性の）脂質を含んでいることが特に好ましい。
【００７６】
第３の実施形態では、本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡと、上述した少なくとも１つの脂質との間の結合は、上述した実施形態の両方が同時に起こったものであってもよい。例えば、本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡは、当該ＲＮＡの一か所で、少なくとも１つの脂質と、（第１の実施形態と同様に）リンカーを介して結合されているとともに、当該塩基修飾されたＲＮＡの異なった位置でリンカーを介さずに（第２の実施形態と同様に）少なくとも１つの脂質に結合されていてもよい。例えば、上記塩基修飾されたＲＮＡの３´末端で、上述した少なくとも１つの脂質がリンカーを介して共有結合により当該ＲＮＡに結合し、上記塩基修飾されたＲＮＡの５´末端で、上述した少なくとも１つの脂質がリンカーを介さずに共有結合により当該ＲＮＡに結合していてもよい。あるいは、本発明で用いられる上記塩基修飾されたＲＮＡの５´末端で、上述した少なくとも１つの脂質がリンカーを介して当該塩基修飾されたＲＮＡに共有結合により結合し、上記塩基修飾されたＲＮＡの３´末端で、上述した少なくとも１つの脂質がリンカーを介さずに共有結合により当該塩基修飾されたＲＮＡに結合していてもよい。同様に、共有結合は、本発明で用いられる上記塩基修飾されたＲＮＡの末端のみでなく、上述したように分子内でも起こりうる。共有結合は、例えば、３´末端および分子内、５´末端および分子内、３´末端と５´末端と分子内、分子内のみ、等で起こりうる。
【００７７】
本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡは、例えば、既知の合成核酸の合成方法（例えば、Maniatis et al. (2001) supra参照）を用いて、自動的または手動的に、従来公知の調製方法により得ることができる。
【００７８】
本発明のさらなる目的によると、本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡは、腫瘍および癌疾患、心臓および循環器系統の病気、感染症、または自己免疫疾患を治療するための薬学的組成物の製造にも、遺伝子療法において単一遺伝子疾患の治療にも用いることができる。
【００７９】
本発明の範囲に含まれる薬学的組成物は、上述の塩基修飾されたＲＮＡと、必要に応じて、薬学的に許容されるキャリアおよび／またはさらなる補助剤および添加剤および／またはアジュバントとを含んでいる。本発明で用いられる薬学的組成物は、典型的には、安全且つ効果的な量の上述した塩基修飾されたＲＮＡを含んでいる。ここで、「安全且つ効果的な量」とは、治療される状態、例えば、後述する腫瘍若しくは癌の疾患、心臓若しくは循環器系統の病気、または、感染症における好ましい変化を顕著に誘発するのに十分な、本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡの量を意味する。しかし、同時に、「安全且つ効果的な量」は、これらの疾患の治療において重大な副作用を避けるために、すなわち、効果とリスクとの間の実用的な関係を可能にするために十分に少ない。これらの限界の決定は、一般に実用的な医学的判断の範囲内である。したがって、かかる薬学的組成物における本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡの濃度は、例えば、如何なる限定も含むことなく、広い範囲、例えば、０．１μｇ〜１００ｍｇ／ｍｌの範囲で変化する。かかる本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡの「安全且つ効果的な量」は、治療される特定の状態と関連して、および、治療を受ける患者の年齢および健康状態、状態の深刻さ、治療の期間、同時に行う治療の性質、用いられる特定の薬学的に許容されるキャリアの性質および類似の要因と関連して、医師の知識と経験の範囲内で変化する。ここに記載の薬学的組成物は、ヒトのために、そしてさらに獣医学の目的のためにも使用することができる。
【００８０】
もし、(例えば腫瘍または感染症の治療のための、ワクチンとしての使用のため)薬学的組成物の免疫原性を増大させる必要がある場合は、当該薬学的組成物は、さらに、１以上の補助剤を含んでいてもよい。本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡと、必要に応じてさらに含まれる補助剤との、薬学的組成物における相乗作用が、好ましくはこれにより達成される。かかる観点では、補助剤の様々なタイプに依存して、様々なメカニズムが考慮されうる。例えば、樹状細胞（ＤＣ）の成熟を可能とする化合物（例えば、リポ多糖体、ＴＮＦ−α、またはＣＤ４０配位子）は、好適な補助剤の第１のクラスを形成する。一般に、補助剤としては、「danger signal」（ＬＰＳ、ＧＰ９６等）またはＧＭ−ＣＳＦ等のサイトカインのように免疫系に影響する物質であれば、どのような物質でも用いることができる。「danger signal」（ＬＰＳ、ＧＰ９６等）またはＧＭ−ＣＳＦ等のサイトカインは、本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡにより生み出される免疫応答が、目標とされる方法で、強化されおよび／または影響され、同時に免疫反応が開始されることを可能とする。特に好ましい補助剤は、モノカイン、リンフォカイン、インターロイキン、ケモキネシス等のサイトカインであり、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８ 、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＩＮＦ−α、ＩＦＮ−β、ＩＮＦ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＬＴ−β、または、ＴＮＦ−αまたはインターフェロン（例えばＩＦＮ−γ）または成長因子（例えばｈＧＨ）を挙げることができる。
【００８１】
腫瘍または感染症を治療するためのワクチンとして提供された場合の上記薬学的組成物は、従来知られているアジュバントをさらに追加的に含むことができる。本発明に関連して、従来知られているアジュバントの例としては、これらに限定されるものではないが、例えばプロタミン、ヌクレオリン（nucleoline）、スペルミン、スペルミジン等の上記安定化カチオン性ペプチドまたはポリペプチド、およびカチオン性多糖類特にキトサン、ＴＤＭ、ＭＤＰ、ムラミルジペプチド、プルロニクス、アルム水、水酸化アルミニウム、ＡＤＪＵＭＥＲ（商標）（ポリホスファゼン）；リン酸アルミニウムゲル；藻類由来のグルカン；アルガムリン；水酸化アルミニウムゲル（アルム）；タンパク質高吸着性水酸化アルミニウムゲル；低粘性酸化アルミニウムゲル；ＡＦまたはＳＰＴ（スクアラン（５％）、Ｔｗｅｅｎ  ８０（０．２％）、プルロニック  Ｌ１２１（１．２５％）、リン酸緩衝生理食塩水のエマルジョン、ｐＨ７．４）；ＡＶＲＩＤＩＮＥ（商標）（プロパンジアミン）；ＢＡＹ  Ｒ１００５（商標）（（Ｎ−（２デオキシ−２−Ｌ−ロイシルアミノ−ｂ−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｎ−オクタデシルドデカノイル−アミドハイドロ酢酸塩）；ＣＡＬＣＩＴＲＩＯＬ（商標）（１α、２５−ジヒドロキシ−ビタミンＤ３）；リン酸カルシウムゲル；ＣＡＰＴＭ（リン酸カルシウムナノ粒子）；コレラホロトキシン、コレラ毒素−Ａ１タンパク質−Ａ−Ｄ−フラグメント融合タンパク質、コレラ毒素のサブユニットＢ；ＣＲＬ  １００５（ブロック重合体Ｐ１２０５）；サイトカイン含有リポソーム；ＤＤＡ（臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム）；ＤＨＥＡ（デヒドロエピアンドロステロン）；ＤＭＰＣ（ジミリストイルホスファチジルコリン）；ＤＭＰＧ  （ジミリストイルホスファチジルグリセロール）；ＤＯＣ／アルム複合体（デオキシコール酸ナトリウム塩）；フロインド完全アジュバント；フロイント不完全アジュバント；ガンマイヌリン；ゲルブアジュバント（（ｉ）Ｎ−アセチルグルコサミニル（Ｐ１−４）−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニルＤ−グルタミン（ＧＭＤＰ）と、（ｉｉ）塩化ジメチルジオクタデシルアンモニウム塩化（ＤＤＡ）と、（ｉｉｉ）亜鉛−Ｌ―プロリン塩複合体（ＺｎＰｒｏ−８）との混合物；ＧＭ−ＣＳＦ）；ＧＭＤＰ（Ｎ−アセチルグルコサミニル−（ｂ１−４）−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン）；イミキモド（１−（２−メチプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４、５−ｃ］キノリン−４−アミン）；ＩｍｍＴｈｅｒ（商標）（Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−イソＧｌｕ−Ｌ−Ａｌａ−グリセロールジパルミテート）；ＤＲＶ（脱水−再水和小胞から調製された免疫リポソーム）；インターフェロン−γ；インターロイキン−１β；インターロイキン−２；インターロイキン−７；インターロイキン１２；ＩＳＣＯＭＳ（商標）（「Immune Stimulating Complexes（免疫刺激性コンプレックス）」）；ＩＳＣＯＰＲＥＰ  ７．０．３．（商標）；リポソーム；ＬＯＸＯＲＩＢＩＮＥ（商標）（７−アリル−８−オキソグアノシン）；ＬＴ経口アジュバント（大腸菌の不安定なエンテロトキシンプロトキシン）；任意���組成のマイクロスフェアおよび微粒子；ＭＦ５９（商標）；（スクアレン−水エマルジョン）；ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ  ＩＳＡ  ５１（商標）（精製不完全フロインドアジュバント）；ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ  ＩＳＡ  ７２０（商標）（代謝可能なオイルアジュバント）；ＭＰＬ（商標）（３−Ｑ−デサシル−４’−モノホスホリルリピドＡ）；ＭＴＰ−ＰＥおよびＭＴＰ−ＰＥリポソーム（（Ｎ−アセチル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ―アラニン−２−（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−（ヒドロキシホスホリロキシ））エチルアミド、モノナトリウム塩）；ＭＵＲＡＭＥＴＩＤＥ（商標）（Ｎａｃ−Ｍｕｒ−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−Ｇｌｎ−ＯＣＨ３）；ＭＵＲＡＰＡＬＭＩＴＩＮＥ（商標）およびＤ−ＭＵＲＡＰＡＬＭＩＴＩＮＥ（商標）（Ｎａｃ−Ｍｕｒ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｄ−イソＧＩｎ−ｓｎ−グリセロールジパルミトイル）；ＮＡＧＯ（ノイラミニダーゼ−ガラクトースオキシダーゼ）；任意の組成のナノスフェアまたはナノ粒子；ＮＩＳＶ（非イオン界面活性剤小胞）；ＰＬＥＵＲＡＮ（商標）（β−グルカン）；ＰＬＧＡ、ＰＧＡ、およびＰＬＡ（乳酸およびグリコール酸のホモおよびコポリマー；マイクロおよびナノスフェア）；ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｌ１２１（商標）；ＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）；ＰＯＤＤＳ（商標）（プロテイノイドマイクロスフェア）；ポリエチレンカルバメート誘導体；ポリ−ｒＡ：ポリ−ｒＵ（ポリアデニル酸のポリウリジル酸複合体）；ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ  ８０）；タンパク質コキレート（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，  Ｉｎｃ．，  Ａｌａｂａｓｔｅｒ，  ＡＬ）；ＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）（ＱＳ−２１）；Ｑｕｉｌ−Ａ（Ｑｕｉｌ−Ａサポニン）；Ｓ−２８４６３（４−アミノ−ｏｔｅｃ−ジメチル−２−エトキシメチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−エタノール）；ＳＡＦ−１（商標）（「Syntex adjuvant formulation（シンテックスアジュバントフォーミュレーション）」）；センダイプロテオリポソームと脂質センダイマトリックス；Ｓｐａｎ−８５（ソルビタントリオレアート）；スペコール（Ｍａｒｃｏｌ  ５２、Ｓｐａｎ−８５、およびＴｗｅｅｎ  ８５のエマルジョン）；スクアレンまたはＲｏｂａｎｅ（登録商標）（２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチルテトラコサン、および２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサン）；ステアリルチロシン（オクタデシルチロシン塩酸塩）；Ｔｈｅｒａｍｉｄ（登録商標）（Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−ｉｓｏＧｌｕ−Ｌ−Ａｌａ−ジパルミトキシプロピルアミド）；トレオニル−ＭＤＰ（Ｔｅｒｍｕｒｔｉｄｅ（商標）または［ｔｈｒ  １］−ＭＤＰ；Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン）；Ｔｙ粒子（Ｔｙ−ＶＬＰまたはウイルス様粒子）；Ｗａｌｔｅｒ−Ｒｅｅｄリポソーム（水酸化アルミニウム上に吸着されたリピドＡを含んでいるリポソーム）等が挙げられる。同様に、例えばＰａｍ３Ｃｙｓ等のリポペプチドは、ここに記載された薬学的組成物と結合するのに特に好適である。（Deres et al., Nature 1989, 342: 561-564参照）。同様に、上記薬学的組成物は、例えばＣｐＧやＲＮＡオリゴヌクレオチド等の核酸系のアジュバント、または例えばＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＴＬＲ１１、ＴＬＲ１２、またはＴＬＲ１３またはそれらの同族体のリガンド等のToll様受容体リガンドを、（追加）アジュバントとして含むことが可能である。
【００８２】
ここに記載された本発明に係る薬学的組成物は、（その治療目的が何であれ）薬学的に許容されるキャリアを任意で含むことができる。ここでいう「薬学的に許容されるキャリア」とは、好ましくは、ヒトへの投与に適した、適合した１つ以上の固体または液体の充てん剤、希釈剤、または封止化合物を含む。ここでいう「適合した」とは、組成物の構成成分が、組成物の薬学的有効性を大幅に低くするような相互作用が起こらないような形、例えば、コードされる医薬効果のあるタンパク質の医薬活性を低くしたり、さらには医薬効果のあるタンパク質の発現を妨げたり損ねたりするような相互作用が起こらないような形で、本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡと混合したり、任意で追加的に存在するアジュバンドと混合したり、互いに混合したりすることができることを意味する。薬学的に許容されるキャリアは、もちろん、治療対象者への投与に適するように、十分に高い純度と十分に低い毒性を有する必要がある。薬学的に許容されるキャリアまたはそれらの構成成分として使用可能な化合物のいくつかの例としては、例えば乳糖、グルコース、サッカロース等の糖類；例えばコーンスターチ、ジャガイモでんぷん等のでんぷん；例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、酢酸セルロース等のセルロースおよびその誘導体；トラガント粉末；麦芽；ゼラチン；獣脂；例えばオクタデシル酸、ステアリン酸マグネシウム等の固体流動促進剤；硫酸カルシウム；例えばラッカセイ油、綿実油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、およびカカオの油等の植物油；例えばポリプロピレングリコール、グリセロール、ソルビトール、マンニトール、ポリエチレングリコール等のポリオル；アルギン酸；例えばＴｗｅｅｎ（登録商標）等の乳化剤；例えばラウリル硫酸ナトリウム等の湿潤剤；着色剤；味付与剤、薬学的キャリア；錠剤形成剤；安定化剤；酸化防止剤；防腐剤；発熱物質を含まない水；等張食塩水リン酸緩衝溶液等が挙げられる。
【００８３】
薬学的に許容されるキャリアの選択は、原則として、本発明で用いられる薬学的組成物が投与される方法により決定される。本発明で用いられる薬学的組成物は、例えば、全身的に投与することができる。投与経路としては、例えば、経皮的経路、経口経路、皮下または静脈注射を含む非経口経路、局所および／または鼻腔内の経路等が挙げられる。使用する薬学的組成物の適当量は、動物モデルを用いたルーチン実験によって決定することができる。そのようなモデルとしては、これらに限定されないが、ウサギ、ヒツジ、マウス、ラット、イヌ、およびヒト以外の霊長類動物モデルが挙げられる。注射に好ましい単位用量形としては、滅菌水溶液、生理食塩水、またはそれらの混合物が挙げられる。なお、そのような溶液のｐＨは、約７．４に調整される。注射に適したキャリアとしては、ヒドロゲル、制御または遅延放出のための手段、ポリ乳酸、およびコラーゲンのマトリックスが挙げられる。ここで使用可能な局所適用のための薬学的に許容されるキャリアとしては、ローション、クリーム、ゲル等における使用に適しているものが挙げられる。化合物を自分自身で投与する場合は、錠剤やカプセル等が好ましい単位用量形である。経口投与に使用可能な、単位用量形の調製のための薬学的に許容されるキャリアは、従来技術においてよく知られており、その選択は、味、コスト、および貯蔵性等の二次的な検討材料に依存するが、これらは本発明の目的にとって重要でなく、当業者よって容易に行うことができる。
【００８４】
特定の実施形態によると、ここで使用される薬学的組成物は、ワクチンの形をとることもできる。理論に縛られることなく、ワクチン接種は、生物、特に細胞への抗原（この場合、本発明で用いられる、（治療効果のある）タンパク質をコードする塩基修飾されたＲＮＡ）の導入に基づく。ここで使用される薬学的組成物に含まれる塩基修飾されたＲＮＡは、コードされるタンパク質に翻訳される。すなわち、本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡによってコードされるタンパク質が発現され、当該タンパク質をターゲットにした免疫反応が結果的に刺激される。癌または腫瘍の疾患または感染症の治療のための遺伝子ワクチンとして使用するこの場合、適応的免疫反応は、例えば、腫瘍または病原抗原の遺伝情報の導入によって実現される。結果として、癌抗原が生物内に発現され、癌または腫瘍の細胞に効果的に向けられる免疫反応が結果的に誘発される。本発明に係るワクチンは、薬学的組成物のための上記組成物を含み、当該組成物は、特に、それらの投与方法によって決定される。ここで説明するとおり、ワクチンは、好ましくは全身的に投与される。そのようなワクチンの投与経路としては、例えば、経皮的経路、経口経路、皮下または静脈注射を含む非経口経路、局所および／または鼻腔内の経路等が挙げられる。従って、ここで説明されるようなワクチンは、好ましくは液体または固体の形で製剤される。また、上記のように、ワクチンの免疫原性をさらに高めることができるさらなる補助剤は、任意でワクチンに組み入れることもできる。有利に、１つ以上のさらなる補助剤は、以上に定義されているように、本発明で用いられる塩基修飾されたＲＮＡの他の特性に依存して、ここに説明されたワクチンに選ばれる。
【００８５】
本発明のさらなる好ましい目的によると、ここに説明される、塩基修飾されたＲＮＡ、またはここに説明されるような薬学的組成物、特に好ましくは、ここに説明されるワクチンは、以下の例に示す適応症を治療するために使われる。上記の薬学的組成物、特に好ましくは上記のワクチンを用いることによって、特に限定するものではないが、例えば、癌または腫瘍疾患もしくは感染症（ウイルス性、細菌性、または原生動物学的感染症）等の疾患または健康状態を治療し得る。癌または腫瘍疾患としては、黒色腫、悪性黒色腫、結腸癌、リンパ腫、肉腫、芽腫、腎癌、胃腸腫瘍、神経膠腫、前立腺腫瘍、膀胱癌、直腸腫瘍、胃癌、食道癌、膵臓癌、肝癌、乳癌、子宮癌、子宮頸癌、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、ヘパトーム、ウイルスによって誘発される様々な腫瘍（例えば、乳頭腫ウイルスによって誘発される悪性腫瘍（例えば子宮頚癌）、悪性腺腫、ヘルペスウイルスによって誘発される腫瘍（例えばバーキットリンパ腫、ＥＢＶによって誘発されるＢ細胞リンパ腫）Ｂ型肝炎によって誘発される腫瘍（肝細胞悪性腫瘍）、ＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−２によって誘発されるリンパ腫等）、聴神経腫、肺癌（＝気管支癌）、小細胞肺癌、咽頭癌、肛門癌、グリア芽腫、直腸癌、星状細胞腫、脳腫瘍、網膜芽腫、基底細胞腫、脳転移、髄芽腫、膣癌、膵臓癌、精巣癌、ホジキン症候群、髄膜腫、シュネーベルガー病、脳下垂体腫瘍、菌状息肉腫、カルチノイド、神経鞘腫、棘細胞腫、バーキットリンパ腫、喉頭癌、腎癌、胸腺腫、体癌（ｃｏｒｐｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、骨肉腫、非ホジキンリンパ腫、尿道癌、ＣＵＰ症候群、頭／頸部腫瘍（ｈｅａｄ/ｎｅｃｋ  ｔｕｍｏｕｒｓ）、乏突起膠腫、外陰癌、腸癌、結腸癌、食道悪性腫瘍（＝食道癌）、いぼ合併症、小腸腫瘍、頭蓋咽頭腫、卵巣癌、生殖器腫瘍、卵巣癌、膵臓癌、子宮内膜癌、肝転移、陰茎癌、舌癌、胆嚢癌、白血病、形質細胞腫、まぶた腫瘍、前立腺癌（＝前立腺腫瘍）等が挙げられる。感染症（ウイルス性、細菌性、または原生動物学的感染症）としては、例えば、インフルエンザ、マラリア、ＳＡＲＳ、黄熱、エイズ、ライムボレリア症、リーシュマニア症、炭疽病、髄膜炎、ウイルス感染症（例えば、エイズ、尖圭コンジローマ、凹窩いぼ（ｈｏｌｌｏｗ  ｗａｒｔｓ）、デング熱、三日熱、エボラウイルス、風邪、初夏髄膜脳炎（Ｅａｒｌｙ  ｓｕｍｍｅｒ  ｍｅｎｉｎｇｏｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）（ＦＳＭＥ）、インフルエンザ、帯状ヘルペス、肝炎、単純ヘルぺス  Ｉ型、単純ヘルぺス  ＩＩ型、帯状疱疹、インフルエンザ、日本脳炎、ラッサ熱、マールブルグウイルス、麻疹、口蹄疫、単核症、流行性耳下腺炎、ノーウォークウイルス感染、プファイファー腺熱、疱瘡、ポリオ（幼年期  跛行）、仮性クループ、伝染性紅斑、狂犬病、いぼ、西ナイル熱、水痘、巨細胞ウイルス（ＣＭＶ）等）、細菌感染症（例えば、流産（前立腺炎症）、炭疽病、虫垂炎、ボレリア症、ボツリヌス中毒、カンフィローバクター（Ｃａｍｐｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、トラコーマクラミジア（尿道の炎症、結膜炎）、コレラ、ジフテリア、鼠径肉芽腫（ｄｏｎａ���ａｎｏｓｉｓ）、喉頭蓋炎、発疹チフス、ガス壊疽、淋病、野兎病、ヘリコバクターピロリ、百日咳、鼠径リンパ肉芽腫、骨髄炎、レジオネラ症、ハンセン病、リステリア症、肺炎、髄膜炎、細菌性髄膜炎、炭疽病、中耳炎、マイコプラズマホミニス、新生児敗血症（絨毛羊膜炎）、水癌、パラチフス、ペスト、ライター症候群、ロッキー山紅斑熱、サルモネラ菌パラチフス、サルモネラ菌発疹チフス、猩紅熱、梅毒、破傷風、トリッパー、ツツガムシ病、結核、発疹チフス、膣炎、軟性下疳等）、および寄生虫、原生動物、または菌によって発症する感染症（例えば、アメーバ症、ビルハルツ住血吸虫症、シャーガス病、エキノコックス属、広節裂頭条虫（ｆｉｓｈ  ｔａｍｅｗｏｒｍ）、魚類中毒症（シガテラ中毒）、キツネ条虫（ｆｏｘ  ｔａｐｅｗｏｒｍ）、みずむし、イヌ条虫（ｃａｎｉｎｅ  ｔａｐｅｗｏｒｍ）、カンジダ症、酵母菌斑（ｙｅａｓｔ  ｆｕｎｇｕｓ  ｓｐｏｔｓ）、疥癬、皮膚のリーシュマニア症、ランブル鞭毛虫症、シラミ、マラリア、顕微鏡検査（ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）、糸状虫症（河川盲目症）、真菌症、ウシ条虫（ｂｏｖｉｎｅ  ｔａｐｅｗｏｒｍ）、住血吸虫病、睡眠病、ブタ条虫（ｐｏｒｃｉｎｅ  ｔａｐｅｗｏｒｍ）、トキソプラズマ症、トリコモナス症、トリパノソーマ症（睡眠病）、内臓性リーシュマニア症、おしめ／おむつ皮膚炎、または微小条虫（ｍｉｎｉａｔｕｒｅ  ｔａｐｅｗｏｒｍ）を挙げることができる。
【００８６】
本発明の塩基修飾されたＲＮＡを含む、塩基修飾されたＲＮＡの組成物によって治療される疾患の別のグループは、心臓および循環器系統の疾患、神経の疾患、および自己免疫疾患に関する。心臓および循環器系統の疾患は、冠動脈心疾患、動脈硬化、卒中、高血圧から選ばれ、神経細胞の疾患は、アルツハイマー病、筋萎縮側索硬化、ジストニー、てんかん、多発硬化、およびパーキンソン病から選ばれ、自己免疫疾患は、Ｉ型自己免疫疾患、ＩＩ型自己免疫疾患、ＩＩＩ型自己免疫疾患、またはＩＶ型自己免疫疾患（例えば、多発硬化（ＭＳ）、関節リウマチ、糖尿病、Ｉ型糖尿病（真性糖尿病）、全身性エリテマートーデス（ＳＬＥ）、慢性多発関節炎、バセドウ氏病、自己免疫型慢性肝炎、潰瘍性大腸炎、Ｉ型アレルギー疾患、ＩＩ型アレルギー疾患、ＩＩＩ型アレルギー疾患、ＩＶ型アレルギー疾患、線維筋痛、脱毛症、ベヒテレフ病、クローン病、重症筋無力症、神経皮膚炎、リウマチ性多発筋痛、全身性進行性硬化（ＰＳＳ）、乾癬、ライター症候群、関節リウマチ、乾癬、脈管炎等、またはＩＩ型糖尿病）から選ばれる。
【００８７】
塩基修飾されたＲＮＡ、または塩基修飾されたＲＮＡを含む組成物は、例えばタンパク質の活性が失われる遺伝子突然変異、またはタンパク質の転写や翻訳が行えなくなる調節変異に起因する遺伝子異常によって起こる遺伝子疾患を治療するためにも用いることができる。これらの疾患は、例えば筋ジストロフィ等の代謝異常の症状等を引き起こすことが多い。従って、本発明では、上昇した発現率によって充分な量のタンパク質が翻訳されうる、塩基修飾されたＲＮＡを介して、正常に機能していなかったタンパク質を供給することによって、これらの疾患を治療することができる。この条件において、以下の疾患を治療し得る。３−β−ヒドロキシステロイド脱水素酵素欠乏症（ＩＩ型）；３−ケトチオラーゼ欠乏症；６−メルカプトプリン過敏症；アールスコグ−スコット症候群；無βリポタンパク血症；無カタラーゼ血症；軟骨無形成症；軟骨無形成症・軟骨低発生症；軟骨形成不全症；色覚異常；遠位中間肢異形成症（ハンター・トンプソン型）；ＡＣＴＨ欠乏症；アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠乏症（短鎖、中鎖、長鎖）；大腸線種性ポリポーシス；アデノシン−デアミナーゼ欠乏症；アデニロスクシナーゼ欠乏症；サルコグリカン異常症（Ａｄｈａｌｉｎｏｐａｔｈｙ）；先天性副腎皮質過形成（１１−β−ヒドロキシラーゼ欠乏症に起因するもの；１７−α−ヒドロキシラーゼ欠乏症に起因するもの；２１−ヒドロキシラーゼ欠乏症に起因するもの）；低ゴナドトロピン性性機能低下を伴う先天性副腎形成不全；副腎生器症候群；副腎白質ジストロトフィ；副腎脊髄神経障害；無フィブリノーゲン血症；無ガンマグロブリン血症；アラジル症候群；白皮症（褐色、眼白子症、眼皮膚、赤褐色）；急性アルコール不耐性；アルドラーゼＡ欠乏症；糖質コルチコイド反応性アルドステロン症；アレグザンダー病；アルカプトン尿；全身性脱毛症；α−１−抗キモトリプシン欠乏症；αメチルアシルＣｏＡラセマーゼ欠乏症；αサラセミア／精神遅滞症候群；アルポート症候群；アルツハイマー病１（ＡＰＰ関連）；アルツハイマー病３；アルツハイマー病４；エナメル質形成不全症；アミロイド神経障害（家族性、いくつかの対立遺伝子型）；アミロイドーシス（オランダ型、フィンランド型、遺伝性腎性、腎性、老年性全身性）；筋萎縮性側索硬化症；無アルブミン血症；アンドロゲン非感受性；貧血（ダイアモンド−ブラックファン）；貧血（溶血性、ＰＫ欠損による）；貧血（溶血性、ＲＨナル、ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｔｙｐｅ）；貧血（新生児溶血性、致死的および準致死的）；貧血（鉄芽球性、運動失調を伴う）；貧血（鉄芽球性／低色素性）；Ｇ６ＰＤ欠損症による貧血；動脈瘤（家族性  動脈性）；アンジェルマン症候群；血管性浮腫；無虹彩症；前部異型（ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｓｅｇｍｅｎｔ  ａｎｏｍａｌｉｅｓ）と白内障；前部間葉性異形成（ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｓｅｇｍｅｎｔ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｄｙｓｇｅｎｅｓｉｓ）；前部間葉性異形成（ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｓｅｇｍｅｎｔ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｄｙｓｇｅｎｅｓｉｓ）と白内障；抗トロンビンＩＩＩ欠乏症；不安関連の性格特性；アペール症候群；無呼吸（麻酔後）；ＡｐｏＡ−ＩおよびａｐｏＣ−ＩＩＩ欠乏（複合）；アポリポ��ンパクＡ−ＩＩ欠乏症；アポリポタンパクＢ−１００（リガンド欠損）；顕性の鉱質コルチコイド過剰（高血圧を伴う）；アルギニン血症；アルギニノコハク酸尿症；関節症（進行性偽性リューマチ、幼年期）；アスパルチルグルコサミン尿症；運動失調（一過性）；ビタミンＥ単独欠乏を伴う運動失調；毛細血管拡張性運動失調；骨発生不全症ＩＩ型；ＡＴＰ感受性ＤＮＡリガーゼＩ欠乏症；房室伝導欠陥を伴う心房中隔欠損；丘疹性病変を伴う無毛症；自閉症（スクシニルプリン性）；自己免疫多腺性疾患（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｐｏｌｙｇｌａｎｄｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）  Ｉ型；自律神経機能障害；アクセンフェルト異常（Ａｘｅｎｆｅｌｄ  ａｎｏｍａｌｙ）；無精子症；Ｂａｍｆｏｒｔｈ−Ｌａｚａｒｕｓ症候群；Ｂａｎｎａｙａｎ−Ｚｏｎａｎａ症候群；バース症候群；バーター症候群（２型または３型）；基底細胞癌；基底細胞母斑症候群；ＢＣＧ感染；Ｂｅａｒｅ−Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  ｃｕｔｉｓ  ｇｙｒａｔａ症候群；ベッカー筋ジストロフィ；ベックウィズ−ヴィーデマン症候群；ベルナール−スーリエ症候群（Ｂ型；Ｃ型）；ベスレムミオパチー；原発性胆汁酸吸収不良；ビオチニダーゼ欠損症；膀胱癌；欠損トロンボキサンＡ２受容体によって発生する出血性障害；ブルーム症候群；短指症（Ｂ１型またはＣ型）；鰓耳症候群；鰓性耳腎症候群；乳癌（浸潤性乳管癌、小葉乳癌、ライフェンスタイン症候群を伴う雄性乳癌、散発性乳癌）；乳癌１（早発型）；乳癌２（早発型）；ブロディミオパチー（Ｂｒｏｄｙ  ｍｙｏｐａｔｈｙ）；ブルガダ症候群；ブルンナー症候群；バーキットリンパ腫；蝶形ジストロフィ（網膜）；Ｃ１ｑ欠損（Ａ型；Ｂ型；タイプＣ型）；Ｃ１ｒ／Ｃ１ｓ欠損；単独Ｃ１ｓ欠損；Ｃ２欠損；Ｃ３欠損；Ｃ３ｂ不活化因子欠損；Ｃ４欠損；Ｃ８欠損、ＩＩ型；Ｃ９欠損；常染色体の性転換を伴う屈曲肢異形成症；屈指症関節症内反股心膜炎症候群；キャナヴァン病；カルバモイルリン酸シンセターゼＩ欠乏症；含水炭素不足の糖タンパク質症候群（Ｉ型；Ｉｂ型；ＩＩ型）；肺のカルチノイド腫瘍；心筋脳筋症（乳児致死性、シトクロムｃオキシダーゼ欠損症による）；心筋症（拡張型；Ｘ連鎖拡張型；家族性肥大性；肥大性）；カルニチン欠乏症（全身性  原発性）；カルニチン−アシルカルニチントランスロカーゼ欠損；手根管症候群（家族性）；白内障（青色；先天的性；結晶状；棘状（ａｃｕｌｅｉｆｏｒｍ）；若年発症型；多形性で層状；点状；小帯の粉末状（ｚｏｎｕｌａｒ  ｐｕｌｖｅｒｕｌｅｎｔ））；Ｃｏｐｐｏｃｋ様白内障；ＣＤ５９欠損；中心コア病；小脳性運動失調；脳のアミロイドアンギオパチー；皮質下梗塞と白質脳症を伴う脳動脈障害；脳の海綿形成異常１（Ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｃａｖｅｒｎｏｕｓ  ｍａｌｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ−１）；頭蓋顔骨格症候群（ＯＦＳ症候群）；脳腱黄色腫症；脳血管障害；セロイドリポフスチノーシス（神経性、異型若年型、顆粒状のオスミウム酸親性の沈着物を伴う）；セロイドリポフスチノーシス（神経性１、乳児性）；セロイドリポフスチノーシス（神経性３、若年性）；Ｃｈａｒ症候群；シャルコー−マリー−ツース病；シャルコー−マリー−ツース神経障害；シャルルボワ・サグネ型；チェディアッ���−東症候群；クロール下痢症（ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｄｉａｒｒｈｅａ）（フィンランド型）；胆汁うっ滞（良性反復性肝内）；胆汁うっ滞（家族性肝内）；胆汁うっ滞（進行性家族性肝内）；コレステロールエステル貯蔵病；点状軟骨異形成症（末節骨短縮；四肢根部；Ｘ連鎖優性型；Ｘ連鎖劣性型；グレーベ型）；軟骨肉腫；コロイデレミア；慢性肉芽腫症（常染色体性、ＣＹＢＡの欠失による）；慢性肉芽腫症（Ｘ連鎖）；ＮＣＦ−１の欠失による慢性肉芽腫症；ＮＣＦ−２の欠失による慢性肉芽腫症；家族性カイロミクロン血症候群；シトルリン血症；古典的コケーン症候群１；唇裂、顎裂、口蓋裂；唇裂／口蓋裂の外胚葉性異形成症候群；鎖骨頭蓋異形成不全；ＣＭＯ  ＩＩ欠失；コーツ病；コケーン症候群２  Ｂ型；コフィン−ローリー症候群；コルヒチン耐性；結腸腺癌；結腸癌；色盲（第２色覚異常；第１色覚異常；第３色覚異常）；結腸直腸癌；複合第Ｖ・第ＶＩＩＩ因子欠乏症；複合高脂血症（家族性）；複合免疫不全症（Ｘ連鎖性、中等症）；コンプレックスＩ欠失；複合神経障害；錐体ジストロフィ３；錐体杆体ジストロフィ３；錐体杆体網膜ジストロフィ６；錐体杆体網膜ジストロフィ２；先天的な、両側の輸精管の欠如；木質性結膜炎；拘縮クモ指症；コプロポルフィリン症；先天性扁平角膜；角膜混濁；角膜ジストロフィ（アベリノ型；膠様滴状；グレーノー型Ｉ；格子状Ｉ；ライス−ビュックラース）；コルチソル耐性；クマリン耐性；カウデン病；ＣＰＴ欠損、肝性（Ｉ型；ＩＩ型）；痙攣（家族性、カリウムにより悪化する）；頭蓋・聾・手症候群；頭蓋骨癒合（２型）；クレチン病；クロイツフェルト−ヤコブ病；クリグラー−ナジャー症候群；クルゾン症候群；クラリーノ症候群；弛緩性皮膚；周期性造血；周期性魚鱗癬；円柱腫症；嚢胞性線維症；シスチン症（腎症）；シスチン尿症（ＩＩ型；ＩＩＩ型）；先天色盲；ダリエ病；Ｄ−二官能性タンパク質欠乏症；常染色体優性遺伝性難聴１、；常染色体優性遺伝性難聴１１；常染色体優性遺伝性難聴１２；常染色体優性遺伝性難聴１５；常染色体優性遺伝性難聴２；常染色体優性遺伝性難聴３；常染色体優性遺伝性難聴５；常染色体優性遺伝性難聴８；常染色体優性遺伝性難聴９；常染色体劣性遺伝性難聴１；常染色体劣性遺伝性難聴２；常染色体劣性遺伝性難聴２１；常染色体劣性遺伝性難聴３；常染色体劣性遺伝性難聴４；常染色体劣性遺伝性難聴９；非症候性感音性難聴１３；Ｘ連鎖難聴１；Ｘ連鎖難聴３；デブリソキン感受性；ドゥジュリーヌ−ソッタ病；認知症（家族性、デンマーク型）；認知症（前頭側頭型、パーキンソニズムを伴う）；デント病；歯の異常；歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症；デニス・ドラッシュ症候群；隆起性皮膚線維肉腫；類腱疾患；尿崩症（腎性）；尿崩症（神経下垂体性）；糖尿病（インシュリン耐性）；糖尿病（まれな形態のもの）；糖尿病（ＩＩ型）；捻曲性骨異形成症；ジヒドロピリミジン尿症；量感受性性転換（Ｄｏｓａｇｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｓｅｘ  ｒｅｖｅｒｓａｌ）；ドインの鉢巣状網膜退化；デュービン−ジョンソン症候群；デュシェーヌ型筋ジストロフィ；血小板減少を伴う異常造血性貧血；異常フィブリノゲン血症（α型；β型；γ型）；先天性角化不全症１；プロトロンビン異常症；ジストニー（ＤＯＰＡ反応性）；ジストニー（間代性筋痙攣症）；ジストニー１（捻転）；外胚葉性異形成；水晶体偏位；瞳孔転位；欠指症（外胚葉性異形成、口唇裂／口蓋裂症候群３）；エーラース−ダンロス症候群（早老型）；エーラース−ダンロス症候群（Ｉ型；ＩＩ型；ＩＩＩ型；ＩＶ型；ＶＩ型；ＶＩＩ型）；エラスチン大動脈弁上部狭窄；楕円赤血球症１；楕円赤血球症２；楕円赤血球症３；エリス−ファンクレフェルト症候群；エメリー−ドライフス筋ジストロフィ；気腫；脳症；心内膜繊維弾性症２；子宮内膜癌；端板アセチルコリンエステラーゼ欠失；ヒト遺伝性網膜変性症  （Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｓ−ｃｏｎｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）；前庭水管の拡大；表皮水疱症；栄養障害型表皮水疱症（優性または劣性）；単純型表皮水疱症；表皮剥離性角質増殖症；表皮溶解性掌蹠角皮症；てんかん（全身性；若年性；ミオクローヌス性；夜行性前頭葉；進行性ミオクローヌス性）；良性新生児てんかん（１型または２型）；骨端異形成症（多発性）；エピソード性運動失調（２型）；エピソード性運動失調／ミオキミア症候群；赤血病（α−；異形成）；赤血球増加；紅斑角皮症；エストロゲン耐性；ＬＤＨ−Ａの欠失による労作性ミオグロビン尿症；外骨症、多発性（１型；２型））；滲出性硝子体網膜症、Ｘ連鎖；ファブリー病；第Ｈ因子欠失；第ＶＩＩ因子欠失；第Ｘ因子欠失；第ＸＩ因子欠失；第ＸＩＩ因子欠失；第ＸＩＩＩＡ因子欠失；第ＸＩＩＩＢ因子欠失；家族性地中海熱；ファンコニ貧血；ファンコーニ−ビッケル症候群；ファーバー脂肪肉芽腫症；脂肪肝（急性）；ソラマメ中毒；魚眼病；中心窩の形成不全（ｆｏｖｅａｌ  ｈｙｐｏｐｌａｓｉａ）；脆弱Ｘ症候群；Ｆｒａｓｉｅｒ症候群；フリードライヒ運動失調；フルクトースービスホスファターゼフルクトース不耐性；フコース蓄積症；フマラーゼ欠失；白点眼底；黄色斑眼底；Ｇ６ＰＤ欠損症；ＧＡＢＡトランスアミナーゼ欠失；白内障を伴うガラクトキナーゼ欠損；ガラクトースエピメラーゼ欠損；ガラクトース血症；ガラクトシアリドーシス；ＧＡＭＴ欠失；ガードナー症候群；胃癌；ゴーシェ病；熱性けいれんプラスをもつ全般てんかん；生殖細胞腫瘍；ゲルストマン‐シュトロイスラー‐シャインカー症候群；巨細胞性肝炎（新生児期）；巨血小板障害（ｇｉａｎｔ  platelet  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）；巨細胞線維芽腫；ギテルマン症候群；
グランツマン血小板無力症（Ａ型；Ｂ型）；緑内障１Ａ；緑内障３Ａ；多形膠芽腫；糸球体硬化症（巣状分節状）；グルコース輸送欠陥（血液脳関門）；グルコース／ガラクトース吸収不良；グルコシダーゼＩ欠失；グルタル酸尿症（Ｉ型；ＩＩＢ型；ＩＩＣ型）；グルタチオンシンセターゼ欠損症；グリセロールキナーゼ欠失；グリシン受容体（α−１ポリペプチド）；糖原病Ｉ；糖原病ＩＩ；糖原病ＩＩＩ；糖原病ＩＶ；糖原病ＶＩ；糖原病ＶＩＩ；糖原病（肝型、常染色体性）；糖原病（Ｘ連鎖性、肝型）；ＧＭ１ガングリオシドーシス；ＧＭ２ガングリオシドーシス；甲状腺腫（青年期、多結節性）；甲状腺腫（先天性）；甲状腺腫（非地方病性、単純性）；性器発育異常（ＸＹ型）；敗血症性肉芽腫症；グレーヴズ病；グレーグ頭蓋多合指症候群；グリセリ症候群；成長ホルモン不足による小人症；難聴と精神遅滞を伴う成長遅延；女性化乳房（家族性、アロマターゼ活性の増大による）；オルニチン血症（Ｂ６反応性または非反応性）を伴う脳回転状網膜脈絡膜萎縮；ヘーリー−ヘーリー病；Ｈａｉｍ−Ｍｕｎｋ症候群；手足子宮症候群；ハルデロポルフィリン尿症（Ｈａｒｄｅｒｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｕｒｉａ）；ＨＤＬ欠失（家族性）；心ブロック（非進行性または進行性）；ハインツ小体性貧血；ＨＥＬＬＰ症候群；血尿（家族性良性）；ヘム・オキシゲナーゼ１欠失；片麻痺性片頭痛；ヘモクロマトーシス；ヘモグロビンＨ症；ＡＤＡ過剰による溶血性貧血；アデニル酸キナーゼ欠損による溶血性貧血；バンド３欠損症による溶血性貧血；グルコース―リン酸イソメラーゼ欠損による溶血性貧血；グルタチオン合成酵素欠損症による溶血性貧血；ヘキソキナーゼ欠損による溶血性貧血；ＰＧＫ欠失による溶血性貧血；溶血性尿毒症症候群；血球貪食性リンパ組織球増多症；血友病Ａ；血友病Ｂ；第Ｖ因子欠失による出血性素因；血鉄症（全身性、無セルロプラスミン血症による）；肝性リパーゼ欠失；肝芽腫；肝細胞癌；遺伝性出血性毛細管拡張症１；遺伝性出血性毛細管拡張症２；ヘルマンスキー−パドラック症候群；内臓逆位（Ｘ連鎖  内臓性）；異所形成（室周線維）；Ｈｉｐｐｅｌ−Ｌｉｎｄａｕ症候群；ヒルシュスプルング病；ＨＲＧ欠失による、ヒスチジン豊富糖タンパク質栓友病；ＨＭＧ−ＣｏＡリアーゼ欠失；全前脳症２；全前脳症３；全前脳症４；全前脳症５；ホールト−オーラム症候群；ホモシスチン尿症；Ｈｏｙｅｒａａｌ−Ｈｒｅｉｄａｒｓｓｏｎ症候群；ＨＰＦＨ（欠失型または非欠失型）；ＨＰＲＴ関連の痛風；ハンティングトン病；中脳水道狭窄による水頭症；胎児水腫；高βリポタンパク血症；家族性高コレステロール血症；高フェリチン血症白内障症候群；高グリセロール血症；高グリシン血症；高免疫グロブリン血症Ｄと周期熱症候群；高インスリン血症；高インスリン高アンモニア血症候群；高カリウム血性周期性麻痺；高リポタンパク血症；高リシン血症；高メチオニン血症（持続性、常染色体性、優性、メチニオンによる、アデノシルトランスフェラーゼＩ／ＩＩＩ欠損）；高オルニチン血・高アンモニア血ホモシトルリン血症候群；高シュウ酸尿症；上皮小体亢進；プテリン・４カルビノールアミンデヒドラターゼ欠失による高フェニルアラニン血症；高プロインスリン血症；高プロリン血症；高血圧症；甲状腺機能亢進症（先天性）；高トリグリセリド血症；低αリポプロテイン血症（Ｈｙｐｏａｌｐｈａｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｅｍｉａ）；低β―リポタンパク血症；低カルシウム血症；低軟骨形成症；低色性小球性貧血症；歯数不足症；低フィブリノーゲン血症；低グロブリン血とＢ細胞非存在（Ｈｙｐｏｇｌｏｂｕｌｉｎｅｍｉａ  ａｎｄ  ａｂｓｅｎｔ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ）；性腺機能低下症（性腺刺激ホルモン過剰）；下垂体性機能不全（性腺機能低下症）；低カリウム血性周期性麻痺；血中マグネシウム減少症；ミエリン形成減少症（先天性）；副甲状腺機能低下；低フォスファターゼ血症（成人型；小児型；乳児型；遺伝性）；低プロトロンビン血症；甲状腺機能低下症（先天性；遺伝性先天性；非甲状腺腫）；魚鱗癬様紅皮症；魚鱗癬；ジーメンス型水疱性魚鱗癬；ＩｇＧ２欠失；線毛不動症候群１；免疫不全（Ｔ細胞受容体／ＣＤ３複合体）；免疫不全（Ｘ連鎖、高ＩｇＭ）；ＣＤ３−γ欠損による免疫不全；免疫不全動原体の不安定顔面異常症候群（Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ−ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｉｃ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙｆａｃｉａｌ  ａｎｏｍａｌｉｅｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）；色素失調；無痛症（先天性、無汗症）；不眠症（致死的、家族性）；インターロイキン−２受容体欠乏症（α鎖）；椎間板疾患；虹彩角発生奇形；  成長ホルモン単独欠損症（ＧＨを欠くイリグ型と生物学的不活性ＧＨのＫｏｗａｒｓｋｉ型）；イソ吉草酸血；ジャクソン・ワイス症候群；イェンセン症候群；ジェルヴェル‐ランゲ・ニールセン症候群；ジュベール症候群；ジュバーグ・マーシディ症候群；カルマン症候群；神崎病；角膜炎；角皮症（掌蹠角皮症）；線状掌蹠角化症Ｉ；線状掌蹠角化症ＩＩ；ＳＣＯＴ欠損によるケトアシドーシス；Ｋｅｕｔｅｌ症候群；クリッペル・トレノーネイ症候群；  クニースト骨異形成症；コストマン好中球減少症；クラッベ病；Ｋｕｒｚｒｉｐｐ−Ｐｏｌｙｄａｋｔｙｌｅ症候群；  ＰＤＸ１欠損による乳酸血症；ランガー中間肢異形成症；ラロン小人症；ローレンス・ムーン・バルデー・ビードル症候群；ＬＣＨＡＤ欠損症；レーバー先天黒内障；左右軸奇形；リー症候群；平滑筋腫症（広範性、アルポート症候群を伴う）；妖精症；Ｌｅｒｉ−  Ｗｅｉｌｌ軟骨異形成症；レッシュ‐ナイハン症候群；白血病（急性骨髄性、急性前骨髄球性、急性Ｔ細胞性リンパ芽球性、慢性骨髄性、若年性骨髄単球性）；白血病−１（Ｔ細胞性急性リンパ芽球性）；白血球接着不全；ライディッヒ細胞腺腫；レルミット・デュクロ症候群；リドル症候群；リー・フラウメニ症候群；リポアミドデヒドロゲナーゼ欠乏症；脂肪異栄養症；リポイド副腎過形成症；リポ蛋白質リパーゼ欠損症；脳回欠損症（Ｘ連鎖）；脳回欠損症１；肝型糖原病（０型）；ＱＴ延長症候群１；ＱＴ延長症候群２；ＱＴ延長症候群３；ＱＴ延長症候群５；ＱＴ延長症候群６；ロウ症候群；肺癌；肺癌（非小細胞）；肺癌（小細胞）；リンパ水腫；リンパ腫（Ｂ細胞非ホジキン）；リンパ腫（びまん性大細胞型）；リンパ腫（濾胞性）；リンパ腫（ＭＡＬＴ）；リンパ腫（マントル細胞）；リンパ増殖症候群（Ｘ連鎖）；リジン蛋白不耐症；マチャド‐ジョセフ病；難治性大球性貧血（５ｑ症候群）；黄斑ジストロフィ；悪性中皮腫；マロニルＣｏＡ脱炭酸酵素欠損症；マンノシドーシス（αまたはβ）；カエデシロップ病（Ｉａ型、Ｉｂ型、ＩＩ型）；マルファン症候群；マロトー‐ラミー症候群；マーシャル症候群；ＭＡＳＡ症候群；肥満細胞性白血病；血液疾患を伴う肥満細胞症；マッカードル病；マックキューン‐オールブライト多骨性線維性異形成症；ＭｃＫｕｓｉｃｋ−Ｋａｕｆｍａｎ症候群；マクラウド表現型；甲状腺髄様癌；髄芽細胞腫；メースマン角膜上皮変性症；巨赤芽球性貧血１；黒色腫；膜性増殖性糸球体腎炎；メニエール病；髄膜腫（ＮＦ２関連、ＳＩＳ関連）；メンケス病；精神遅滞（Ｘ連鎖）；メフェニトイン低代謝；中皮腫；異染性白質萎縮症；骨幹端軟骨異形成症（Ｍｕｒｋ  Ｊａｎｓｅｎ型、  Ｓｃｈｍｉｄ型）；メトヘモグロビン血症；メチオニンアデノシルトランスフェラーゼ欠損症（常染色体劣性）；メチルコバラミン欠損症（ｃｂｌ  Ｇ型）；メチルマロン酸性尿症（ムターゼ欠損型）；メバロン酸尿症；  ＭＨＣクラスＩＩ欠損症；小眼球症（白内障、虹彩異常）；三好ミオパチー；ＭＯＤＹ；  Ｍｏｈｒ−Ｔｒａｎｅｂｊａｅｒｇ症候群；モリブデン補因子欠損症（Ａ型またはＢ型）；連珠毛；ファブリー病；ゴーシェ病；ムコ多糖体症；ムコビシドーシス；Ｍｕｅｎｃｋｅ症候群；ミュア‐トール症候群；マリブレー低身長症；マルチプルカルボキシラーゼ欠損症（ビオチン反応性）；多発性内分泌腫瘍；筋糖原病；筋ジストロフィ（先天性、メロシン欠損型）；筋ジストロフィ（福山型先天性）；筋ジストロフィ（肢帯）；筋ジストロフィ（デュシェーヌ様）；単純型先天性表皮水疱症を伴う筋ジストロフィ；筋無力症症候群（スローチャネル型先天性）；マイコバクテリア感染（非定型、家族性播種性）；骨髄異形成症候群；骨髄性白血病；骨髄性悪性腫瘍；ミエロペルオキシダーゼ欠損症；ミオアデニル酸デアミナーゼ欠損症；ＰＧＫ欠損によるミオグロビン尿症／溶血；Ｍｙｏｎｅｕｒｏｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｐａｔｈｙ症候群；ミオパシー（アクチン、先天性、デスミン関連、心骨格、遠位型、ネマリン）；ＣＰＴＩＩ欠損によるミオパシー；ホスホグリセリン酸ムターゼ欠損によるミオパシー；先天性ミオトニー；先天性筋強直症（Ｍｙｏｔｏｎｉａ  ｌｅｖｉｏｒ）；筋緊張性ジストロフィ；粘液性脂肪肉腫；ＮＡＧＡ欠損；爪膝蓋骨症候群；ネマリンミオパシー１（常染色体優性）；ネマリンミオパシー２（常染色体劣性）；新生児副甲状腺機能亢進症；腎石症；ネフロン癆（若年性）；腎症（慢性  低補体血症性）；ネフローゼ１；ネフローゼ症候群；ネザートン症候群；神経芽細胞腫；神経線維腫症（１型または２型）；神経線維鞘腫症（Ｎｅｕｒｏｌｅｍｍｏｍａｔｏｓｉｓ）；  神経セロイドリポフスチノーシス５；ニューロパシー；好中球減少症（自己免疫性  新生児）；ニーマン‐ピック病（Ａ型、Ｂ型、Ｃ１型、Ｄ型）；夜盲症（先天性定常）；ナイミーヘン症候群；左室心筋緻密化障害；非表皮溶解性掌蹠角化症；ノリエ病；Ｎｏｒｕｍ病；ヌクレオシドホスホリラーゼ欠損症；肥満症；後角症候群；眼白子症（ネトルシップファルス型）；眼咽頭筋ジストロフィ；小口病；乏歯症；オーメン症候群；両眼隔離症；腎疾患を伴う視神経欠損症；オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症；オロト酸尿症；  起立性調節障害；ＯＳＭＥＤ症候群；頚椎後縦靭帯骨化症；変形性関節症；骨形成不全症；骨溶解；大理石骨病（劣性または突発性）；骨肉腫；卵巣癌；卵巣形成不全；先天性爪肥厚症（Ｊａｃｋｓｏｎ−Ｌａｗｌｅｒ型または  Ｊａｄａｓｓｏｈｎ−Ｌｅｗａｎｄｏｗｓｋｙ型）；骨パジェット病；パリスター・ホール症候群；膵発育不全；膵臓癌；膵炎；パピヨン‐ルフェーヴル症候群；傍神経節腫；先天性パラミオトニ；頭頂孔（Ｐａｒｉｅｔａｌ  ｆｏｒａｍｉｎａ）；パーキンソン病（家族性または若年性）；発作性夜間血色素尿症；ペリツェーウス‐メルツバッヒャー病；ペンドレッド症候群；会陰尿道下裂；周期熱；ペリオキシソーム病；新生児持続性高インスリン性低血糖病；持続性ミュラー管開存症（ＩＩ型）；ペーテルス異常；ポイツ‐ジェガーズ症候群；プファイファー症候群；フェニルケトン尿症；ホスホリボシルピロリン酸合成酵素関連通風；肝臓および筋肉のホスホリラーゼキナーゼ欠損症；まだら症；毛母腫；  両眼性の網膜芽細胞腫を伴う松果体腫；ＡＣＴＨ分泌性下垂体腺腫；下垂体ホルモン欠乏症；下垂体部腫瘍；胎盤のステロイドスルファターゼ欠乏症；プラスミン・インヒビター欠乏症；プラスミノゲン欠乏症（Ｉ型とＩＩ型）；プラスミノゲン栃木型異常病；血小板障害；血小板糖蛋白質ＩＶ欠乏症；血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ欠乏症；多発性嚢胞腎疾患；硬化性白質脳症を伴う多発嚢胞性脂肪膜性骨異形成症；軸後指過剰症；ポリポーシス；膝窩翼状片症候群；ポルフィリン症（急性肝性、急性間欠性、または先天性赤血球生成性）；晩発性皮膚ポルフィリン症；肝造血性ポルフィリン症；異型ポルフィリン症；プラーダー‐ヴィリ症候群；性的早熟症；早発性卵巣機能不全；早老症  Ｉ型；早老症  ＩＩ型；進行性外眼筋麻痺症；進行性妊娠性肝内胆汁うっ滞２；プロラクチノーマ（副甲状腺機能亢進症、カルチノイド症候群）；プロリダーゼ欠損症；プロピオン酸血症；  前立腺癌；プロテインＳ欠損症；蛋白尿；プロトポルフィリン症（造血性）；偽性軟骨形成不全症；偽半陰陽；偽性低アルドステロン症；偽性上皮小体機能低下症；偽膣性会陰部陰嚢部尿道下裂（Ｐｓｅｕｄｏｖａｇｉｎａｌ  ｐｅｒｉｎｅｏｓｃｒｏｔａｌ  ｈｙｐｏｓｐａｄｉａｓ）；偽性ビタミンＤ
欠乏性くる病；弾力線維性仮性黄色腫（常染色体優性、常染色体劣性）；肺胞蛋白症；肺高血圧症；電撃性紫斑病；濃化異骨症；熱変形赤血球症；ピルビン酸カルボキシラーゼ欠乏症；ピルビン酸デヒドロゲナーゼ欠乏症；Ｒａｂｓｏｎ−Ｍｅｎｄｅｎｈａｌｌ症候群；レフサム病；腎細胞癌；尿細管性アシドーシス；難聴を伴う尿細管性アシドーシス；尿細管性アシドーシス−大理石骨病症候群；細網症（家族性細網肉腫）；網膜変性；網膜ジストロフィ；色素性網膜炎；白点状網膜炎；網膜芽細胞腫；レチノール結合タンパク質欠乏症；網膜分離症；レット症候群；ＲＨｍｏｄ症候群；Ｒｈａｂｄｏｉｄ  ｐｒｅｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ症候群；ラブドイド腫瘍；横紋筋肉腫；横紋筋肉腫（胞状）；近節短縮性点状軟骨形成異常症；Ｒｉｂｂｉｎｇ症候群；くる病（ビタミンＤ耐性）；リーガー異常；ロビノー症候群；ロートムント‐トムソン症候群；Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ−Ｔａｙｂｉ症候群；サッカロピン尿症；シーザー‐ショッツェン症候群；サラ病；ザントホフ病（乳児性、若年性、成人性）；サンフィリポ症候群（Ａ型、Ｂ型）；シンドラー病；脳裂；精神分裂病（慢性）；シュワン細胞腫（散発性）；ＳＣＩＤ（常染色体劣性、Ｔ陰性／Ｂ陽性型）；ＴＭＤをもつ分泌経路（Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｐａｔｈｗａｙ  ｗ／ＴＭＤ）；先天性ＳＥＤ；セガワ症候群；選択的Ｔ細胞欠損；ＳＥＭＤ（パキスタン型）；ＳＥＭＤ（Ｓｔｒｕｄｗｉｃｋ型）；中隔視覚異形成症；重症複合免疫不全症（Ｂ細胞陰性）；重症複合免疫不全症（Ｔ細胞陰性、Ｂ細胞／  ＮＫ細胞陽性型）；重症複合免疫不全症（Ｘ連鎖）；ＡＤＡ欠損による重症複合免疫不全症；性転換（ＸＹ、副腎不全を伴う）；セザリー症候群；Ｓｈａｈ−Ｗａａｒｄｅｎｂｕｒｇ症候群；低身長；Ｓｈｐｒｉｎｔｚｅｎ−Ｇｏｌｄｂｅｒｇ症候群；シアル酸蓄積症；シアリドーシス（Ｉ型またはＩＩ型）；シアル酸尿症；  鎌状赤血球貧血；Ｓｉｍｐｓｏｎ−Ｇｏｌａｂｉ−Ｂｅｈｍｅｌ症候群；内臓錯位；シェーグレン‐ラルソン症候群；    Ｓｍｉｔｈ−Ｆｉｎｅｍａｎ−Ｍｙｅｒｓ症候群；スミス‐レムリ‐オピッツ症候群（Ｉ型またはＩＩ型）；成長ホルモン分泌細胞腫瘍（Ｓｏｍａｔｏｔｒｏｐｈｉｎｏｍａ）；  ソースビー黄斑変性症；痙性対麻痺；球状赤血球症；球状赤血球症−１；球状赤血球症−２；ケネディ球脊髄性筋萎縮；脊髄性筋萎縮；脊髄小脳性運動失調；脊椎肋骨異骨症（Ｓｐｏｎｄｙｌｏｃｏｓｔａｌ  ｄｙｓｏｓｔｏｓｉｓ）；遅発性脊椎骨端異形成症；脊椎・骨幹端異形成症（日本型）；シュタルガルト病−１；多発性皮脂嚢腫症；スティックラー症候群；スタージ‐ウェーバー症候群；皮質下層状ｈｅｔｅｒｏｐｉａ（Ｓｕｂｃｏｒｔｉｃａｌ  ｌａｍｉｎａｌ  ｈｅｔｅｒｏｐｉａ）；皮質下層状異所性灰白質（Ｓｕｂｃｏｒｔｉｃａｌ  ｌａｍｉｎａｒ  ｈｅｔｅｒｏｔｏｐｉａ）；コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ欠損；ショ糖不耐症；Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ−Ｈａａｎ症候群；ＣＦを伴わない汗中塩素濃度上昇；指節癒合症；Ｓｙｎｏｓｔｏｓｅｓ症候群；合多指症；タンジアー病；テイ‐サックス病；Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病；Ｔ細胞免疫不全症；Ｔ細胞前リンパ球性白血病；サラセミア（αまたはδ）；Ｈｂ  Ｌｅｐｏｒｅによるサラセミア；致死性骨異形成症（Ｉ型またはＩＩ型）；チアミン反応性巨赤芽球性貧血症候群；血小板血症；血栓形成傾向（プラスミノーゲン異常）；ヘパリンコファクターＩＩ欠乏による栓友病；プロテインＣ欠乏による栓友病；トロンボモジュリン欠乏による血栓形成傾向；甲状腺腺腫；甲状腺ホルモン不応症；甲状腺ヨウ素ペルオキシダーゼ欠乏症；ティエッツ症候群；トルブタミド低代謝；Ｔｏｗｎｅｓ−Ｂｒｏｃｋｓ症候群；トランスコバラミンＩＩ欠乏症；トリーチャー・コリンズ下顎顔面形成異常；Ｔｒｉｃｈｏｄｏｎｔｏｏｓｓｅｏｕｓ症候群；毛髪鼻指節骨症候群；裂毛症；三機能性タンパク質欠乏症（Ｉ型またはＩＩ型）；トリプシノーゲン欠乏症；結節硬化症−１；結節硬化症−２；ターコット症候群；チロシンホスファターゼ；チロシン血症；Ｕｌｎａｒ−ｍａｍｍａｒｙ症候群；尿石症（２，８−ジヒドロキシアデニン）；アッシャー症候群（１Ｂ型または２Ａ型）；静脈奇形；心室性頻拍；男性化；ビタミンＫ依存性凝固障害；ＶＬＣＡＤ欠損；フォーヴィンケル症候群；フォン・ヒッペル‐リンダウ症候群；ヴォン・ヴィレブランド病；ワールデンブルヒ症候群；ワールデンブルヒ症候群／眼白子症；Ｗａａｒｄｅｎｂｕｒｇ−Ｓｈａｈ神経変異；Ｗａａｒｄｅｎｂｕｒｇ−Ｓｈａｈ症候群；ヴァーグナー症候群；ワルファリンナトリウム過敏；ワトソン症候群；Ｗｅｉｓｓｅｎｂａｃｈｅｒ−Ｚｗｅｙｍｕｌｌｅｒ症候群；ヴェルナー症候群；Ｗｅｙｅｒｓ  ａｃｒｏｄｅｎｔａｌ  骨形成不全；白色海綿状母斑；ウィリアムズ症候群；ウィルムス腫（１型）；ウィルソン病；ヴィスコット‐オールドリッチ症候群；Ｗｏｌｃｏｔｔ−Ｒａｌｌｉｓｏｎ症候群；ウォルフラム症候群；ウォルマン病；キサンチン尿症（Ｉ型）；色素性乾皮症；Ｘ−ＳＣＩＤ；  イエメン盲ろう色素脱失症候群（Ｙｅｍｅｎｉｔｅ  ｄｅａｆ−ｂｌｉｎｄ  ｈｙｐｏｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）；低カルシウム尿性高カルシウム血症（Ｉ型）；ツェルヴェーガー症候群；Ｚｌｏｔｏｇｏｒａ−Ｏｇｕｒ症候群。
【００８８】
遺伝的背景をもつ疾患、および主に単一遺伝子異常によって起こりメンデルの法則に従って遺伝する疾患で、この治療を行うことが望ましい疾患は、好ましくは、アデノシンデアミナーゼ欠乏症、家族性高コレステロール血症、Ｃａｎａｖａｎ症候群、ゴーシェ病、ファンコニ貧血、神経セロイドリポフスチノーシス、ムコビシドーシス（嚢胞性線維症）、鎌状赤血球貧血、フェニルケトン尿症、アルカプトン尿症、白皮症、甲状腺機能低下不全症、ガラクトース血症、α１アンチトリプシン欠損症、色素性乾皮症、Ｒｉｂｂｉｎｇ症候群、ムコ多糖体症、唇裂、顎、口蓋、ローレンス・ムーン・バルデー・ビードル症候群、短肋骨多指症候群、クレチン病、ジュベール症候群、ＩＩ型早老症、短指症、副腎性器症候群等の常染色体劣性遺伝性疾患、および色覚異常（例えば赤緑色盲）、ぜい弱Ｘ症候群、筋ジストロフィ（デュシエンヌ型、Ｂｅｃｋｅｒ−Ｋｉｅｎｅｒ型）、血友病ＡとＢ、Ｇ６ＰＤ欠損症、ファブリー病、ムコ多糖体症、Ｎｏｒｒｉｅ症候群、色素性網膜炎、敗血性肉芽腫症、Ｘ−ＳＣＩＤ、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、レッシュ‐ナイハン症候群等のＸ染色体遺伝性疾患からなる群から選ばれる。または、例えば遺伝性欠陥浮腫、マルファン症候群、神経線維腫症、Ｉ型早老症、骨形成不全症、クリッペル・トレノーネイ症候群、スタージ‐ウェーバー症候群、ヒッペル・リンダウ症候群、結節性硬化症等の常染色体優性遺伝性疾患から選ばれる。
【００８９】
本発明によると、自己免疫疾患を治療するための治療方法をも提供しうる。従って、塩基修飾されたＲＮＡ、または塩基修飾されたＲＮＡを含む組成物を、自己免疫疾患の治療、または自己免疫疾患の治療のための薬物を製造するために用いることができる。自己免疫疾患は、それぞれの疾患の主要な臨床病理学的特徴により、全身性自己免疫疾患と、器官特異性または局在性自己免疫疾患とに大別することができる。自己免疫疾患は、全身性エリテマートーデス（ＳＬＥ）、シェーグレン症候群、強皮症、関節リウマチ、および多発性筋炎を含む全身性症候群の範疇と、内分泌性（Ｉ型糖尿病（糖尿病１型）、橋本甲状腺炎、アジソン病等）、皮膚性（尋常性天疱瘡）、血液性（自己免疫性溶血性貧血）、もしくは神経性（多発性硬化症）、または事実上いかなる限局性体組織塊にも関わりうる局在性症候群の範疇とに分けることができる。治療する対象の自己免疫疾患は、Ｉ型自己免疫疾患、ＩＩ型自己免疫疾患、ＩＩＩ型自己免疫疾患、あるいはＩＶ型自己免疫疾患からなる群から選択することができ、それらには、例えば多発硬化（ＭＳ）、関節リウマチ、糖尿病、Ｉ型糖尿病（真性糖尿病）、慢性多発関節炎、バセドウ氏病、自己免疫型慢性肝炎、潰瘍性大腸炎、Ｉ型アレルギー疾患、ＩＩ型アレルギー疾患、ＩＩＩ型アレルギー疾患、ＩＶ型アレルギー疾患、線維筋痛、脱毛症、べヒテレフ病、クローン病、重症筋無力症、神経皮膚炎、リウマチ性多発筋痛、全身性進行性硬化（ＰＳＳ）、ライター症候群、関節リウマチ、乾癬、脈管炎等、またはＩＩ型糖尿病を含む。なぜ免疫系が自己抗原に対して免疫応答を引き起こすかについての正確な様態がこれまで解明されなかったが、その病因についてはいくつかの研究結果がある。それによると、自己反応はＴ細胞バイパスによるものである可能性がある。正常な免疫系では、Ｂ細胞が抗体を大量に産生できるようになる前に、Ｔ細胞によってＢ細胞を活性化させる必要がある。このようなＴ細胞の必要性は、超抗原を産生する生物による感染等の稀な例において回避することができる。超抗原は、非特異的な方法でＴ細胞受容体のβサブユニットと直接結合して、Ｂ細胞の、あるいはＴ細胞までもの多クローン性活性化を開始することができる。別の説明では、自己免疫疾患を分子擬態によるものであると推定している。外来性抗原は、一定の宿主抗原に対して、構造面での類似性を有している可能性がある。従って、この（自己抗原を模倣する）抗原に対して産生されるいかなる抗体もまた、理論上は、宿主抗原に結合し、免疫応答を増幅しうる。分子擬態の最も著しい形は、ヒトの心筋と抗原を同じくする、グループＡベータ溶血性連鎖球菌で観察され、リウマチ熱による心臓の症状の原因となる。従って、本発明によると、一般に免疫系の脱感作を可能にする自己抗原をコードする塩基修飾されたＲＮＡを含む本発明の組成物が得ることができ、また（自己抗原を含まない）本発明に係る（免疫賦活性の）組成物を得ることができる。
【００９０】
従って、本発明はまた、上述の適応症または疾患の治療における、ここで説明されるような塩基修飾されたＲＮＡ、またはここで説明されるような薬学的組成物、特に好ましくはここで説明されるワクチンの使用に関する。本発明はまた、特に、ここで説明される塩基修飾されたＲＮＡの、接種のための使用、または上記薬学的組成物の、接種剤としての使用を含む。
【００９１】
本発明のさらに別の目的は、上述の疾患を治療するための方法または上述の疾患を予防するための接種の方法を提供することであるが、この方法は、患者、特にヒトに対して上述した薬学的組成物を投与する工程を含む。
【００９２】
本発明はまた、塩基修飾されたＲＮＡの作製のためのインビトロ転写法に関し、
ａ）特に上述した目的のタンパク質をコードする核酸を作製／調製する工程；
ｂ）ＲＮＡポリメラーゼ、緩衝液、核酸混合物、および必要に応じてリボヌクレアーゼ阻害剤を含むインビトロ転写媒質に上記（デオキシ）リボ核酸を添加する工程であって、該核酸混合物は、１つ以上の天然型のヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ、および／またはＵの代りとしての、上述の１つ以上の塩基修飾ヌクレオチドと、天然型のヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ、またはＵの全てが置換されるわけではない場合、必要に応じて、１つ以上の天然型のヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ、またはＵとを含む、工程；
ｃ）上記インビトロ転写媒質中にて上記核酸をインキュベートし、該核酸をインビトロ転写する工程；および
ｄ）必要に応じて、精製および組み込まれなかったヌクレオチドの上記インビトロ転写媒質からの除去を行う工程；
の各工程を含む。
【００９３】
本発明に係るインビトロ転写法の、工程ａ）において述べられる核酸は、上述のように、目的のタンパク質をコードするいかなる核酸でもよく、とりわけ、上述したように、好ましくは診断学上重要なタンパク質、治療活性タンパク質、または他の、実験または研究を目的として使用された、あるいは使用可能な、いかなるタンパク質をも含む。この目的のために使用されるのは、通常、上述のようにタンパク質をコードするＤＮＡ配列、例えばゲノムＤＮＡもしくはその断片、またはプラスミドであり、あるいは（それに対応する）ＲＮＡ配列、例えば、好ましくは直線化した、ｍＲＮＡ配列である。上記インビトロ転写は通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位を有するベクターを用いて行うことができる。この目的のために、関連技術分野において公知のあらゆるベクター、例えば上述の市販されるベクターを用いることができる。例えば、クローニングサイトの上流および／または下流においてＳＰ６、Ｔ７またはＴ３結合部位を有するベクターが好ましい。これにより、使用される核酸配列は、選択されたＲＮＡポリメラーゼによって、所望に沿って、のちに転写することができる。上に規定されるような、インビトロ転写およびタンパク質のコーディングに使用される核酸配列は、通常、例えば使用するベクターの持つマルチクローニングサイトを介して、ベクターにクローン化する。転写の前に、クローンは通常、後にＲＮＡの３’末端になる箇所が位置する箇所で、適切な制限酵素によって切断され、その断片は精製される。これにより、ＲＮＡがベクター配列を含むことを防ぎ、決まった長さのＲＮＡが得られる。３’突出末端を産生する制限酵素（例えばＡａｔ  ＩＩ、Ａｐａ  Ｉ、Ｂａｎ  ＩＩ、Ｂｇｌ  Ｉ、Ｂｓｐ  １２８６、ＢｓｔＸ  Ｉ、Ｃｆｏ  Ｉ、Ｈａｅ  ＩＩ、ＨｇｉＡ  Ｉ、Ｈｈａ  Ｉ、Ｋｐｎ  Ｉ、Ｐｓｔ  Ｉ、Ｐｖｕ  Ｉ、Ｓａｃ  Ｉ、Ｓａｃ  ＩＩ、Ｓｆｉ  Ｉ、Ｓｐｈ  Ｉ等）はいずれも使用しない方が好ましい。それでもなお、このような制限酵素を使用する場合、３’突出末端は、好ましくは、例えばクレノウまたはＴ４−ＤＮＡポリメラーゼで埋められる。
【００９４】
あるいは、核酸を、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）によって、転写テンプレートとして作製することも可能である。この目的のために使用されるプライマーの１つは通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位の配列を含んでいる。さらに、使用されるプライマーの５’末端は、好ましくは長さがおよそ１０から５０ヌクレオチドであり、さらに好ましくは１５から３０ヌクレオチドであり、最も好ましくはおよそ２０ヌクレオチドである。
【００９５】
インビトロ転写に先立って、高い収率を確保するために、例えばＤＮＡテンプレートまたはＲＮＡテンプレート等の核酸は通常精製され、リボヌクレアーゼが除去される。精製は、例えば塩化セシウム濃度勾配法またはイオン交換法等の、関連技術分野において公知のいかなるプロセスによっても行うことができる。
【００９６】
方法工程ｂ）では、核酸がインビトロ転写媒質に添加される。適切なインビトロ転写媒質にはまず、工程ａ）で作製された核酸が、例えばおよそ０．１から１０μｇ、好ましくはおよそ１から５μｇ、より好ましくは２．５μｇ、最も好ましくはおよそ１μｇ含まれる。適切なインビトロ転写媒質にはまた、必要に応じて、ＤＴＴ等の還元剤を、より好ましくは５０ｍＭのＤＴＴが１から２０μｌ、さらに好ましくは５０ｍＭのＤＴＴがおよそ５μｌ含まれる。インビトロ転写媒質はさらにヌクレオチド、例えば、本発明の場合、例えば、上述のように規定される塩基修飾されたヌクレオチド（通常、ヌクレオチドごとにおよそ０．１から１０ｍＭ、好ましくはヌクレオチドごとに０．１から１ｍＭ、好ましくは合計でおよそ４ｍＭ）、および、必要に応じて未修飾のヌクレオチドからなるヌクレオチド混合物を含む。例えばプソイドウリジン５’−三リン酸塩、５−メチルシチジン−５’−三リン酸塩等の、上述の塩基修飾されたヌクレオチド（ヌクレオチドごとにおよそ１ｍＭ、好ましくは合計でおよそ４ｍＭ）は通常、塩基修飾されたヌクレオチドが天然型のヌクレオチドによって完全に置換されるような量を添加する。しかしながら、特定のヌクレオチドの代わりに、１つ以上の塩基修飾されたヌクレオチドおよび天然型のヌクレオチドとの混合物を用いることも可能である。すなわち、天然型のヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃおよび／またはＵの１つ以上の代替物として、上述のように１つ以上の塩基修飾されたヌクレオチド、あるいは、天然型のヌクレオチドＡ、Ｇ、ＣまたはＵの全てを置換しない場合は、天然型のヌクレオチドＡ、Ｇ、ＣまたはＵの１つ以上が必要に応じてさらに存在していてもよい。インビトロ転写媒質へ所望の塩基を選択的に添加することによって、転写された塩基修飾されたＲＮＡ配列における所望の塩基修飾の内容、すなわち発生と量とを制御することができる。適切なインビトロ転写媒質は同様に、例えばＴ７−ＲＮＡポリメラーゼ（例えばＴ７オプティｍＲＮＡキット、ＣｕｒｅＶａｃ社、テュービンゲン、ドイツ）、Ｔ３−ＲＮＡポリメラーゼまたはＳＰ６等のＲＮＡポリメラーゼを、通常およそ１０から５００Ｕ、好ましくはおよそ２５から２５０Ｕ、より好ましくはおよそ５０から１５０Ｕ、最も好ましくはおよそ１００Ｕ含んでいる。インビトロ転写媒質はさらに、転写ＲＮＡの分解を避けるために、リボヌクレアーゼがない状態に保たれることが好ましい。従って、適切なインビトロ転写媒質には、必要に応じてリボヌクレアーゼ阻害剤がさらに含まれる。
【００９７】
工程ｃ）において、核酸は、通常およそ３０分から１２０分、好ましくはおよそ４０分から９０分、最も好ましくはおよそ６０分の間、およそ３０℃から４５℃、好ましくは３７℃から４２℃で、インビトロ転写媒質中でインキュベートされ、転写される。インキュベーション温度は、使用されるＲＮＡポリメラーゼによって決定され、例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの場合は、およそ３７℃である。転写によって得られる核酸は、好ましくはＲＮＡ、さらに好ましくはｍＲＮＡである。
【００９８】
インキュベーションの後に、本発明に係るインビトロ転写法の工程ｄ）において、必要に応じて反応物の精製を行ってもよい。この目的のために、関連技術分野において公知の、いかなる適切なプロセスを用いてもよく、そのプロセスは、例えばアフィニティクロマトグラフィ、ゲル濾過等のクロマトグラフィ精製工程である。精製によって、組み込まれなかった、すなわち過剰なヌクレオチドをインビトロ転写媒質から除去することができる。
【００９９】
本発明はまた、タンパク質の発現を増加させるためにインビトロで転写および翻訳を行う方法に関し、
ａ）特に上述した目的のタンパク質をコードする核酸を作製／調製する工程；
ｂ）ＲＮＡポリメラーゼ、緩衝液、核酸混合物、および必要に応じてリボヌクレアーゼ阻害剤を含むインビトロ転写媒質に上記（デオキシ）リボ核酸を添加する工程であって、該核酸混合物は、１つ以上の天然型のヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ、および／またはＵの代りとしての、上述の１つ以上の塩基修飾ヌクレオチドと、天然型のヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ、またはＵの全てが置換されるわけではない場合、必要に応じて、１つ以上の天然型のヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ、またはＵとを含む、工程；
ｃ）上記インビトロ転写媒質中にて上記核酸をインキュベートし、該核酸をインビトロ転写する工程；
ｄ）必要に応じて、精製および組み込まれなかったヌクレオチドの上記インビトロ転写媒質からの除去を行う工程；
ｅ）工程ｃ）（および必要に応じて工程ｄ））で得られた塩基修飾された核酸を、インビトロ翻訳媒質に添加する工程；
ｆ）上記インビトロ翻訳媒質中にて上記塩基修飾された核酸をインキュベートし、該塩基修飾された核酸によってコードされるタンパク質をインビトロ翻訳する工程；および
ｇ）必要に応じて、工程ｆ）において翻訳されたタンパク質を精製する工程；
の各工程を含む。
【０１００】
本発明に係る、タンパク質の発現を増加させるためにインビトロで転写および翻訳を行う方法の工程ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）は、上述の、本発明に係るインビトロ転写法の工程ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）と同一である。
【０１０１】
本発明に係る、タンパク質の発現を増加させるためにインビトロで転写および翻訳を行う方法の工程ｅ）において、工程ｃ）（必要に応じて工程ｄ））で得られた塩基修飾された核酸は、適切なインビトロ翻訳媒質に添加される。適切なインビトロ翻訳媒質は、例えば網状赤血球溶解物、小麦胚芽抽出物等を含む。そのような媒質は通常さらにアミノ酸混合物を含む。かかるアミノ酸混合物は典型的には、（全ての）天然型のアミノ酸を含み、あるいは（例えば、オートラジオグラフィによって翻訳効率を制御するための）３５Ｓ−メチオニン等の修飾アミノ酸を必要に応じて含む。適切なインビトロ翻訳媒質はさらに反応緩衝液を含む。インビトロ翻訳媒質は、例えばクリーグとメルトン（１９８７）によって説明されており（P. A. Krieg and D. A. Melton (1987) In vitro RNA synthesis with SP6 RNA polymerase Methods Enzymol 155:397-415）、その開示内容全体が、参照によって本発明に組み込まれるものとする。
【０１０２】
本発明に係る、タンパク質の発現を増加させるためにインビトロで転写および翻訳を行う方法の工程ｆ）において、塩基修飾された核酸はインビトロ翻訳媒質中でインキュベートされ、塩基修飾された核酸によってコードされるタンパク質はインビトロで翻訳される。インキュベーション時間は通常、およそ３０分から１２０分、好ましくはおよそ４０分から９０分、最も好ましくはおよそ６０分である。インキュベーション温度は通常、およそ２０℃から４０℃の範囲であり、好ましくはおよそ２５℃から３５℃、最も好ましくはおよそ３０℃である。
【０１０３】
本発明に係る、タンパク質の発現を増加させるためにインビトロで転写および翻訳を行う方法の、ｂ）からｆ）の各工程、またはｂ）からｆ）の個々の工程は、互いに組み合わせることができる。すなわち、同時に行うことができる。必要な成分は全て最初に同時に添加するか、あるいは上述の工程ｂ）からｆ）の順番に従って、反応の間に、連続して反応媒質に添加することが好ましい。
【０１０４】
任意の工程ｇ）において、工程ｆ）で得られた翻訳されたタンパク質を精製してもよい。精製は、当業者に公知のプロセス、例えばアフィニティクロマトグラフィ（ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ等）、イオン交換クロマトグラフィ、ゲルクロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、ガスクロマトグラフィ等のクロマトグラフィ、抗体検出、または、ＮＭＲ分析等の生物物理学的プロセス（例えば、上記マニアティスら（２００１））によって行うことができる。アフィニティクロマトグラフィプロセスを含むクロマトグラフィプロセスでは、上述のように、例えばヘキサヒスチジンタグ（ＨＩＳタグ、ポリヒスチジンタグ）、ストレプトアビジンタグ（ｓｔｒｅｐタグ）、ＳＢＰタグ（ストレプトアビジン結合タグ）、ＧＳＴ（グルタチオンＳトランスフェラーゼ）等の、精製のためのタグを適切に用いることができる。精製はさらに、Ｍｙｃタグ、Ｓｗａ１１エピトープ、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ等の抗体エピトープ（抗体結合タグ）を用いて行ってもよい。つまり、（固定化）抗体を用いたエピトープの認識によって行ってもよい。
【０１０５】
本発明はまた、宿主細胞中におけるタンパク質の発現を増加させるためにインビトロで転写および翻訳を行う方法に関し、
ａ）特に上述した目的のタンパク質をコードする（デオキシ）リボ核酸を作製／調製する工程；
ｂ）ＲＮＡポリメラーゼ、緩衝液、および１つ以上の天然型のヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ、および／またはＵの代りとしての、上述の１つ以上の塩基修飾ヌクレオチドと、天然型のヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ、またはＵの全てが置換されるわけではない場合、必要に応じて、１つ以上の天然型のヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ、またはＵを含むインビトロ転写媒質に上記核酸を添加する工程；
ｃ）上記インビトロ転写媒質中にて上記核酸をインキュベートし、該核酸をインビトロ転写する工程；
ｄ）必要に応じて、精製および組み込まれなかったヌクレオチドの上記インビトロ転写媒質からの除去を行う工程；
ｅ’）工程ｃ）（および必要に応じて工程ｄ））において得られた塩基修飾された核酸を、宿主細胞にトランスフェクトする工程；
ｆ’）上記宿主細胞中にて上記塩基修飾された核酸をインキュベートし、該塩基修飾された核酸によってコードされるタンパク質を翻訳する工程；および
ｇ’）必要に応じて、工程ｆ’）において翻訳されたタンパク質を単離および／または精製する工程；
の各工程を含む。
【０１０６】
本発明に係る、宿主細胞におけるタンパク質の発現を増加させるためにインビトロで転写および翻訳を行う方法の工程ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）は、上述の本発明に係るインビトロ転写法、および、上述の本発明に係るタンパク質の発現を増加させるためにインビトロで転写および翻訳を行う方法の工程ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）と同一である。
【０１０７】
本発明に係る、インビトロで転写および翻訳を行う方法の工程ｅ’）によると、工程ｃ）（必要に応じて工程ｄ））で得られる塩基修飾された核酸は、宿主細胞にトランスフェクトされる。トランスフェクションは一般に、関連技術分野で公知のトランスフェクション法によって行われる（例えば、Maniatis et al. (2001) Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Habor, NY）。適切なトランスフェクション法には以下が含まれるが、これらに限定されるものではない：例えば改良型電気穿孔法（例えばヌクレオフェクション）等の電気穿孔法、例えばカルシウム共沈法等のリン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、例えばトランスフェリンを介したリポフェクション法等のリポフェクション法、ポリプレントランスフェクション、粒子衝突、例えばＰＬＧＡ等のナノプレックス、例えばＰＥＩ等のポリプレックス、プロトプラスト融合、およびマイクロインジェクション。リポフェクション法が特に適切な方法であることがわかっている。
【０１０８】
本発明に係る、宿主細胞におけるタンパク質の発現を増加させるためにインビトロで転写および翻訳を行う方法の工程ｅ’）に関連して、（適切な）宿主細胞は、本発明に従って用いられる塩基修飾されたＲＮＡを発現させることができれば、いかなる細胞でもよく、好ましくは、培養された真核細胞（例えば酵母細胞、植物細胞、動物細胞、およびヒト細胞）のいずれか、または原核細胞（バクテリア細胞）である。コードされるタンパク質に対する翻訳後修飾、例えば糖鎖修飾が必要であれば（Ｎ−および／またはＯ−結合）、本発明に従って用いられる塩基修飾されたＲＮＡによってコードされるタンパク質を発現させるために、多細胞生物の細胞が選択されることが好ましい。原核細胞とは異なり、そのような（高等）真核細胞は、合成タンパク質に対する翻訳後修飾を可能にする。当業者には、例えば２９３Ｔ（胚性肝細胞株）、ＨｅＬａ（ヒト子宮頸癌細胞）、ＣＨＯ（チャイニーズハムスターの卵巣由来の細胞）、およびその他の細胞株、例えばｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ、ＨＥＫ２９３、Ｓｆ９、またはＣＯＳ細胞等の、実験目的のために開発された細胞または細胞株等の、高等真核細胞または高等真核細胞株の多くが知られている。適切な真核細胞にはさらに、疾患または感染によって損なわれた細胞または細胞株、例えば癌細胞、特に本明細書に記載された癌の型のいずれかによる癌細胞、ＨＩＶによって損なわれた細胞、および／または免疫系もしくは中枢神経系（ＣＮＳ）の細胞等が含まれる。特に好ましい真核細胞は、ヒト細胞または動物細胞である。適切な宿主細胞は同様に、真核微生物由来のもの、例えば出芽酵母（Stinchcomb et al., Nature, 282:39, (1997)）、分裂酵母等の酵母、カンジダ、ピチア、およびアスペルギルス属、アオカビ属等の糸状菌等由来のものである。適切な宿主細胞は同様に、原核細胞、例えば、大腸菌またはバチルス属、ラクトコッカス属、乳酸菌、シュードモナス属、ストレプトマイセス属、連鎖球菌属、ブドウ球菌属等の細菌由来の、好ましくは大腸菌等由来のバクテリア細胞等を含む。
【０１０９】
本発明に係る、宿主細胞におけるタンパク質の発現を増加させるためにインビトロで転写および翻訳を行う方法の工程ｆ’）においては、塩基修飾された核酸を宿主細胞においてインキュベートし、塩基修飾された核酸によってコードされるタンパク質の翻訳を宿主細胞において行う。この目的のために、例えば、リボソームおよびｔＲＮＡを用いた、宿主細胞における（ｍ）ＲＮＡの翻訳等の、宿主細胞に固有の発現機構を用いることが好ましい。そのために利用されるインキュベーション温度は、個々のケースで用いられる宿主細胞系によって決定される。
【０１１０】
任意の工程ｇ’）において、工程ｆ’）で得られる翻訳されたタンパク質を単離および／または精製することができる。翻訳された（発現された）タンパク質の単離は通常、タンパク質を反応物の成分から分離する工程を含み、例えば細胞溶解、超音波分解、または同様の方法等、当業者にとって公知のプロセスによって行うことができる。精製は、本発明に係る、タンパク質の発現を増加させるためにインビトロで転写および翻訳を行う方法の工程ｅ）に記載される方法によって行うことができる。
【０１１１】
工程（ａ）から（ｄ）とは独立して、本発明に従って使用される核酸は、工程（ｅ’）から（ｇ’）のインビトロ翻訳法によって発現させることも可能であり、よってこれも本発明の一部を構成する。
【０１１２】
本発明はまた、生物内での（治療活性）タンパク質の発現を増加させるためにインビトロでの転写およびインビボでの翻訳を行う方法に関し、
ａ）特に上述した目的のタンパク質をコードする（デオキシ）リボ核酸を作製／調製する工程と、
ｂ）ＲＮＡポリメラーゼ、適切な緩衝液および核酸混合物を含むインビトロ転写媒質へ核酸を添加する工程であって、該核酸混合物は、天然型のヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃおよび／またはＵの１つ以上の代替物として、上述のように１つ以上の塩基修飾されたヌクレオチド、あるいは、天然型のヌクレオチドＡ、Ｇ、ＣまたはＵの全てを置換しない場合は、天然型のヌクレオチドＡ、Ｇ、ＣまたはＵの１つ以上、またあるいは、リボヌクレアーゼ阻害剤を含んでいる、工程と、
ｃ）上記インビトロ転写媒質で上記核酸をインキュベートし、インビトロで上記核酸を転写する工程と、
ｄ）精製および上記インビトロ転写媒質からの組み込まれなかったヌクレオチドの除去を行う任意の工程と、
ｅ’’）工程ｃ）（あるいは工程ｄ））で得られた上記塩基修飾された核酸を、宿主細胞にトランスフェクトし、トランスフェクトされた上記宿主細胞を生物内に移植する工程、そして
ｆ’’）上記塩基修飾された核酸によってコードされる上記タンパク質の翻訳を上記生物内で行う工程と、
の各工程を含む。
【０１１３】
本発明に係る生物内でのタンパク質の発現を増加させるためにインビトロでの転写およびインビボでの翻訳を行う方法の工程ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）は、上述の本発明に係るインビトロ転写法、上述の本発明に係るタンパク質の発現を増加させるためにインビトロで転写および翻訳を行う方法、および上述の本発明に係る宿主細胞におけるタンパク質の発現を増加させるためにインビトロで転写および翻訳を行う方法の工程ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）と同一である。
【０１１４】
工程ｅ’’）における宿主細胞にはまた、ここでは自己細胞、すなわち患者から取り出された後に戻される細胞（体に属している細胞）が含まれていてもよい。そのような自己細胞は、インビボでの適用の際の、免疫系による拒絶のリスクを軽減する。自己細胞の場合、患者の、患部のある身体領域／器官からの（正常な、または疾患状態の）細胞を用いることが好ましい。トランスフェクション法は、上述の工程ｅ）での方法が好ましい。工程ｅ’’）において、生物内への宿主細胞の移植は工程ｅ）に加えて行われる。本発明に関連する生物すなわち生命体は通常、ヒトに加えて、ウシ、ブタ、マウス、犬、猫、齧歯類、ハムスター、うさぎ等の動物である。工程ｅ’’）およびｆ’’）の代わりに、工程ｆ）／ｆ’）および／または工程ｇ）／ｇ’）に係る単離および／または精製、ならびにそれに続く、翻訳された（治療活性）タンパク質の生命体に対する投与を行うことができる。投与は、薬学的組成物に関する記載にあるように行うことができる。
【０１１５】
工程ｆ’’）において、塩基修飾された核酸によってコードされるタンパク質の翻訳を生物内で行う。翻訳は、使用される宿主細胞に基づいて、宿主細胞に固有の系によって行われる。
【０１１６】
工程（ａ）から（ｄ）とは独立して、本発明で用いられる核酸を、工程（ｅ’’）から（ｇ’’）のインビトロ翻訳法によって発現させることも可能であり、従ってこれも本発明の一部を構成する。
【０１１７】
本発明の他の実施形態では、治療目的の、細胞に基づいた手法を参照する。よって、生物、特にヒトの体から外植された細胞は、インビトロで培養される。ここで開示されるように、これらの細胞は塩基修飾されたＲＮＡによってトランスフェクトされる。かかる塩基修飾されたＲＮＡは、本明細書の他の箇所に説明されているようにして提供される。より詳細には、インビトロまたはインビボでの細胞または組織のトランスフェクションは一般に、工程ａ）によって調製される、および／または作製される塩基修飾されたＲＮＡを、細胞または組織に添加することで行われる。複合体化されたＲＮＡがその後、エンドサイトーシス等の細胞機構を用いて細胞に入ることが好ましい。細胞または組織への複合体化されたＲＮＡの添加は、さらに別の成分なしで直接行ってもよい。あるいは、工程ａ）に従って調製され、および／または作製され、細胞または組織に添加される、塩基修飾されたＲＮＡの添加は、本明細書で規定される（必要に応じてさらに別の成分を含む）組成物として行ってもよい。
【０１１８】
（工程ａ）に従って調製される、および／または作製される）塩基修飾されたＲＮＡの、インビトロによるトランスフェクションの構成における細胞（または宿主細胞）には、あらゆる細胞が含まれ、好ましくは、これらには限定されないが、塩基修飾されたＲＮＡによってコードされるタンパク質を発現させることができる細胞である。この構成における細胞には、好ましくは培養された真核細胞（例えば酵母細胞、植物細胞、動物細胞、およびヒト細胞）、または原核細胞（例えばバクテリア細胞等）が含まれる。コードされるタンパク質に対する翻訳後修飾、例えば糖鎖修飾が必要であれば（Ｎ−、および／またはＯ−結合）、多細胞生物の細胞が選択されることが好ましい。原核細胞と比較して、そのような（高等）真核細胞は合成タンパク質に対する翻訳後修飾を可能にする。当業者には、例えば２９３Ｔ（胚性肝細胞株）、ＨｅＬａ（ヒトの子宮頸癌細胞）、ＣＨＯ（チャイニーズハムスターの卵巣由来の細胞）、およびその他の細胞株、例えばｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ、ＨＥＫ２９３、Ｓｆ９、またはＣＯＳ細胞等の、実験目的のために開発された細胞または細胞株等の、高等真核細胞または高等真核細胞株の多くが知られている。適切な真核細胞にはさらに、疾患または感染によって損なわれた細胞または細胞株、例えば癌細胞、特に本明細書に記載された癌の型のいずれかによる癌細胞、ＨＩＶによって損なわれた細胞、および／または免疫系もしくは中枢神経系（ＣＮＳ）の細胞等が含まれる。適切な細胞は同様に、真核微生物由来のもの、例えば出芽酵母（Stinchcomb et al., Nature, 282:39, (1997)）,分裂酵母等の酵母、カンジダ、ピチア、アスペルギルス属、アオカビ属等の糸状菌等由来のものである。ヒト細胞または動物細胞、例えばここで述べられているような動物の細胞が、真核細胞として好ましい。ヒト細胞または例えば、ここで言及されるような動物の動物細胞は特に真核細胞として好ましい。さらに、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を、本発明に係る塩基修飾されたＲＮＡの、エキソビボのトランスフェクションに使用することができる。これにはまた、樹状細胞が含まれるが、これは、本発明に係る複合体化されたＲＮＡの、エキソビボのトランスフェクションに使用することができる。これらＡＰＣ、特に樹状細胞は、塩基修飾されたＲＮＡが病原体の抗原または腫瘍抗原をコードする場合に、特に有益である。これにより、再移植されたＡＰＣはインビボで抗原を発現し、インビボで適正な適応免疫応答を引き起こすことができる。従って、好ましくは血液中に再移植されたＡＰＣは、その生物が腫瘍または病原菌を免疫学的に攻撃することを可能にする、適正な免疫応答を引き起こす。ＡＰＣに対するトランスフェクション後に呈される自己抗原は、（適正な投与手順を踏めば）その生物を脱感作し、それによってその生物の免疫応答を抑制する可能性があるため、この方法は自己免疫疾患の処置を可能にすることもできる。
【０１１９】
適切な細胞は同様に、原核細胞、例えば、大腸菌またはバチルス属、ラクトコッカス属、乳酸菌、シュードモナス属、ストレプトマイセス属、連鎖球菌属、ブドウ球菌属等の細菌由来の、好ましくは大腸菌等由来のバクテリア細胞等を含む。
【０１２０】
要約すると、本実施形態によると、細胞に基づいた遺伝子治療の手法を遂行することができ、これにより（ａ）塩基修飾されたＲＮＡまたは塩基修飾されたＲＮＡを含む組成物を提供し、（ｂ）（必要であれば）細胞を多細胞生物から外植し、（ｃ）細胞を本発明の塩基修飾されたＲＮＡによってトランスフェクトし、そして（ｄ）細胞が生物内に再移植される。自己細胞が使用される場合、この手法は有効である。自己細胞を使う必要が全くないならば、同種細胞（例えば株化細胞）を用いることもでき、これはその後トランスフェクトされ、再移植される。したがって、同種細胞によって工程（ｂ）を省略することができる。エキソビボの方法が１つの実施形態ではあるが、本発明はまた、上に開示するように、細胞または組織の細胞外のトランスフェクションのための塩基修飾されたＲＮＡの使用も包含する。
【０１２１】
本発明によると、ＲＮＡライブラリーまたはＲＮＡライブラリーを含む組成物の作製するための製造方法を提供し、当該製造方法は
（ａ）任意の細胞または組織、特に患者の腫瘍組織から、ｃＤＮＡライブラリーまたはその一部を調整／提供する工程と、
（ｂ）上記ｃＤＮＡライブラリーまたはその一部を用いて、本発明に係る塩基修飾されたＲＮＡのインビトロ転写のためのマトリックスを作製／調製する工程と、
（ｃ） インビトロで上記マトリックスを転写する工程と
の各工程を含む。
【０１２２】
患者のどのような組織であっても、例えば単純な生検によって得られる（例えば腫瘍組織）。しかし、腫瘍の浸潤した組織等の外科的除去によっても得ることができる。本発明に係る、作製プロセスの工程（ａ）によるｃＤＮＡライブラリーまたはその一部の作製／調製は、さらに、対応する組織を、保存のために、好ましくは−７０℃未満の温度で冷凍した後に行うことができる。ｃＤＮＡライブラリーまたはその一部の作製のために、例えば腫瘍組織生検からの全ＲＮＡの単離がまず行われる。このためのプロセスは、上記のマニアティスらにおいて説明されている。このための対応キットはさらに、例えばロッシュＡＧ等によって市販されている（製品「ハイピュアＲＮＡアイソレイションキット」等）。対応するポリ（Ａ＋）ＲＮＡは、当業者にとって公知のプロセスに従って、全ＲＮＡから分離される（例えば、上記マニアティスらを参照）。このための適切なキットもまた、市販されている。例えば、ロッシュＡＧの「ハイピュアＲＮＡティシューキット」である。このように得られたポリ（Ａ＋）ＲＮＡから始めて、ｃＤＮＡライブラリーは作製される（この構成に関してはまた、例えば、上記マニアティスらを参照）。ｃＤＮＡライブラリーの作製におけるこの工程にも、例えばクロンテック社製「ＳＭＡＲＴ  ＰＣＲ  ｃＤＮＡ合成キット」等の、市販されているキットが当業者には入手可能である。ポリ（Ａ＋）ＲＮＡからニ本鎖ｃＤＮＡへの個々のサブステップは、クロンテック社製「スマート・ＰＣＲ・ｃＤＮＡ合成キット」に従って実行することができる。
【０１２３】
上記の作製プロセスでの工程（ｂ）によると、ｃＤＮＡライブラリーまたはその一部を用いて、インビトロ転写のためにマトリックスが合成される。本発明によると、これは特に、得られたｃＤＮＡの断片を、例えばプラスミド等の適切なＲＮＡ産生ベクターとしてクローン化することで達成される。本発明に係る工程（ｂ）で作製されたマトリックスのインビトロ転写のために、これらの断片はまず、環状プラスミド（ｃ）ＤＮＡとして存在している場合、対応する制限酵素によって線状とされる。このように分割されたコンストラクトは、実際のインビトロ転写の前に、例えば適切なフェノール／クロロホルムおよび／またはクロロホルム／フェノール／イソアミルアルコール混合物によって再び精製されることが好ましい。このようにして、ＤＮＡマトリックスが無タンパク質状態であることを、とりわけ確実にする。その後、精製されたマトリックスを用いて、ＲＮＡの酵素合成が行われる。このサブステップは、適切な緩衝液中に、線状とされた無タンパク質のＤＮＡマトリックスを含む、好ましくはリボヌクレアーゼ阻害剤が添加された適切な反応混合物中で、天然の、または塩基修飾されたヌクレオチドとして必要とされるリボヌクレオチド三リン酸塩（ｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＵＴＰ、およびｒＧＴＰ）と、十分な量の、例えばＴ７ポリメラーゼ等のＲＮＡポリメラーゼとの混合物を用いて行われる。これにより、特定の塩基修飾されたｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＵＴＰ、またはｒＧＴＰを排他的に含むＲＮＡライブラリーを調整することができる。また、例えば、塩基修飾されたアデノシンヌクレオチドおよび塩基修飾されたシチジンヌクレオチド（例えば７−デアザグアノシン−ＴＰおよびプソイドウリジン−ＴＰ）等の、塩基修飾されたヌクレオチドのいかなる組み合わせも得ることができる。上記の代わりに、または上記に加えて、ライブラリーは上記４タイプのうち１つ以上のタイプの一定量のみが塩基修飾されたヌクレオチドを含んでいてもよく、これは、転写反応媒質に添加された、塩基修飾されたヌクレオチド／未修飾のヌクレオチドの最初の比率（例えば２０％の７−デアザグアノシンＴＰと８０％の天然のグアノシン−ＴＰ）によって影響されうる。さらに、存在している４種類のヌクレオチドの１つ以上が異なる、塩基修飾されたヌクレオチドの組み合わせも可能であり、その比率は同様に、媒質に添加された、修飾されたヌクレオチドの最初の比率（例えば、５−ブロモシチジン−三リン酸塩３０％と５−メチルシチジン−三リン酸塩７０％との組み合わせ）による。ここで、反応混合物はリボヌクレアーゼのない水の中に存在する。また、実際のＲＮＡの酵素合成の間に、キャップアナログを添加することが好ましい。３７℃での、適切な長さの時間、例えば２時間のインキュベーションの後に、リボヌクレアーゼを含まないデオキシリボヌクレアーゼを添加することにより、ＤＮＡマトリックスは分解される。その後、再び３７℃でインキュベートすることが好ましい。
【０１２４】
このように調整されたＲＮＡは、酢酸アンモニウム／エタノールによって沈殿させられ、適切であれば一度または数回、リボヌクレアーゼを含まないエタノールで洗浄することが好ましい。最後に、このように精製されたＲＮＡは乾燥され、好適な実施形態では、リボヌクレアーゼを含まない水の中に取り上げられる。このように調整されたＲＮＡはさらに、フェノール／クロロホルムまたはフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールを用いて、何度か抽出されてもよい。
【０１２５】
上記で規定される製造方法のさらなる好適な実施形態によると、全ｃＤＮＡライブラリーの一部だけが得られ、対応するｍＲＮＡ分子に変換される。従って、本発明によると、いわゆるサブトラクションライブラリーはまた、本発明に係るｍＲＮＡ分子を作製するために、全ｃＤＮＡライブラリーの一部として用いることができる。どのような組織（例えば腫瘍組織）のｃＤＮＡライブラリーでも好ましい部分は、特に目的とする特定のタンパク質をコードする。だが一方、他のタンパク質はより重要性が低い。例えば、腫瘍特異性抗原のサブトラクションライブラリーを作製することに利点がある可能性がある。だが一方、どのような細胞にも存在するハウスキーピングタンパク質を取り去ることが好ましい。一定の腫瘍に対応する抗原は公知である。さらに別の好適な実施形態によると、（腫瘍）特異性抗原をコードするｃＤＮＡライブラリーの一部を最初に（つまり、上記で規定された製造方法の工程（ａ）の前に）規定することができる。これは、（腫瘍）特異性抗原の配列を、正常な組織由来の、対応するｃＤＮＡライブラリーを用いて、アラインメントによって決定することで達成されることが好ましい。病原体由来の一定の抗原が、本発明に係るＲＮＡライブラリーによって提示される場合、塩基修飾されたＲＮＡ配列を含むＲＮＡライブラリーを樹立するために、同様の方法を用いることができる。これらの抗原は、感染組織から正常なタンパク質を取り去ることで同様に単離できる。
【０１２６】
本発明のアラインメントには、特に正常な組織の発現パターンと、対象となっている（腫瘍）組織の発現パターンとの比較が含まれる。対応する発現パターンは、核酸レベルで、例えばハイブリダイゼーション実験の支援の下で決定できる。このために、例えばその組織における対応する（ｍ）ＲＮＡまたはｃＤＮＡは、それぞれの場合に適切なアガロースまたはポリアクリルアミドゲルの中で分離し、メンブランにトランスファーされて、対応する核酸プローブ、好ましくはオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズすることができ、これらのプローブはその特定の遺伝子を表す（それぞれ、ノーザンブロットおよびサザンブロット）。従って、対応するハイブリダイゼーションの比較は、腫瘍組織によって排他的に、またはその組織でより大きな程度に発現される遺伝子が提供される。
【０１２７】
さらに別の好適な実施形態によると、（１つ以上の）マイクロアレイによる診断の支援の下、上述のハイブリダイゼーション実験は行われる。かかるＤＮＡマイクロアレイは、小さな、またはごく小さな空間に、特に核酸プローブ、とりわけオリゴヌクレオチドプローブを、一定の配置で含んでいる。各プローブはそれぞれの場合での例えば遺伝子を表し、この遺伝子が存在するか否かは、対応する（ｍ）ＲＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーにおいて調べられる。適切なマイクロアレンジメントでは、数百、数千、および数万から数十万個までもの遺伝子をこのように表すことができる。次に、特定の組織の発現パターンを分析するため、ポリ（Ａ＋）ＲＮＡまたは、好ましくは対応するｃＤＮＡが、適切な標識によって標識され、特にこの目的のためには蛍光標識が用いられ、適切なハイブリダイゼーション条件の下でマイクロアレイと接触させる。ｃＤＮＡ種がマイクロアレイに存在するプローブ分子、特にオリゴヌクレオチドプローブ分子と結合した場合、それにより、適切な検出装置（適切に設計された蛍光分光計等）を用いて測定することができるような、ある程度はっきりした蛍光シグナルが観察される。ライブラリーで、ｃＤＮＡ（またはＲＮＡ）種がより多いと、蛍光シグナル等のシグナルがより大きくなる。対応する（何度かの、あるいは数多くの）マイクロアレイハイブリダイゼーション実験が、腫瘍組織と正常組織とで別々に行われる。従って、腫瘍組織によって排他的にまたはより大きな程度まで遺伝子が発現されたことは、マイクロアレイ実験によって解読された信号同士の差異から結論付けることができる。そのようなＤＮＡマイクロアレイ分析は、例えばSchena (2002), Microarray Analysis, ISBN 0-471-41443-3, John Wiley & Sons, Inc., New York、において説明されており、該文献のこの点に関する開示内容は、その全範囲にわたって本発明に含まれるものとする。
【０１２８】
しかし、（腫瘍）組織特異性発現パターンの樹立は、核酸レベルでの分析には限定されるものではない。従来技術により公知の、タンパク質レベルでの発現分析に有用な方法もまた、もちろん当業者には知られている。特に、ここに述べられるような、二次元ゲル電気泳動と質量分析の技術が存在し、これらの技術はまたタンパク質バイオチップと組み合わせることができる（すなわち、例えばタンパク質レベルのマイクロアレイで、例えば正常組織または腫瘍組織からの抽出タンパク質が、マイクロアレイ基板に塗布された抗体および／またはペプチドと接触させられる）。質量分析方法については、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（「マトリックス支援レーザー脱離イオン化」）法が、この点に関しては触れられるべきであろう。正常組織と比較した腫瘍組織の発現パターンを得るための、タンパク質化学の分析のために述べられた技術は、例えばRehm (2000) Der Experimentator: Proteinbiochemie/Proteomics [The Experimenter: Protein Biochemistry/Proteomics], Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 3rd ed.に説明されており、この開示内容は、本発明において、この点に関して、明確に参照する。タンパク質マイクロアレイではさらに、上述のＳｃｈｅｎａ（２００２）の記載をこの点に関してやはり参照する。
【０１２９】
塩基修飾されたヌクレオチドを含むいかなるＲＮＡライブラリー（ｃＲＮＡ）も、本発明に包含される。本発明のＲＮＡライブラリーはまた、ＲＮＡ分子の元の数から、一定のｍＲＮＡ分子を減じることによって、トランスクリプトーム（細胞／組織の転写されたｍＲＮＡ分子の全て）の一部のみを表す。特に、本発明に係る上記の方法によって得られるどのようなＲＮＡライブラリーも、本発明に包含される。
【０１３０】
以下の実施例および図は、上述の説明をより詳細に説明、図解することを意図したものである。
【０１３１】
図１は、プソイドウリジン５'-三リン酸塩を用いてルシフェラーゼＲＮＡの塩基修飾を行い、その後にHela細胞へトランスフェクトした結果を示す（実施例２Ｂ参照）。図２から分かるように、ルシフェラーゼの過剰発現は大幅に改善された（塩基修飾されたＲＮＡ配列の実量９４０１５ａｍｏｌと比較した未修飾のｍＲＮＡ配列の実量９６０ａｍｏｌ（アトモル））。
【０１３２】
図２は、５-メチルシチジン-５'-三リン酸塩を用いてルシフェラーゼＲＮＡの塩基修飾を行い、その後にHela細胞へトランスフェクトした結果を示す（実施例２Ｂ参照）。図２から分かるように、ルシフェラーゼの過剰発現は、同様に、大幅に改善された（塩基修飾されたｍＲＮＡ配列の実量３０８７ａｍｏｌと比較した未修飾のｍＲＮＡ配列の実量９６０ａｍｏｌ）。
【０１３３】
図３は、５−メチルシチジン−５三リン酸塩とともにプソイドウリジン５'−三リン酸塩を用い、ルシフェラーゼＲＮＡの塩基修飾をし、その後にｈＰＢＭＣ細胞へトランスフェクトした結果を示す（実施例３参照）。図３から分かるように、ここにおいてもまた、ルシフェラーゼの過剰発現は大幅に改善された（プソイドウリジン５'−三リン酸塩を用いて修飾されたｍＲＮＡ配列の実量３３５１ａｍｏｌ、および、５−メチルシチジン−５を用いて修飾されたｍＲＮＡ配列の実量１２７４ａｍｏｌと比較した未修飾のｍＲＮＡ配列の実量２６０ａｍｏｌ）。
【０１３４】
図４Ａは、以下のさらなる修飾を含むルシフェラーゼのｍＲＮＡ配列（配列番号３）を示す（実施例１Ａ参照）：
α−グロビン遺伝子由来の安定化配列；
３’末端の７０個のアデノシンのポリＡテール；
３’末端の３０個のシトシンのポリＡテール。
【０１３５】
図４Ｂは、ルシフェラーゼの天然型のｍＲＮＡ配列（配列番号４）を示す（実施例１Ａ参照）。
【０１３６】
図４Ｃは、以下のさらなる修飾を含む、プソイドウリジンを用いて修飾されたルシフェラーゼのｍＲＮＡ配列（配列番号５）を示す（実施例１Ｂ参照）：
α−グロビン遺伝子由来の安定化配列；
３’末端の７０個のアデノシンのポリＡテール；
３’末端の３０個のシトシンのポリＡテール。
【０１３７】
図４Ｄは、以下のさらなる修飾を含む、ルシフェラーゼのメチルシチジンを用いて修飾されたｍＲＮＡ配列（配列番号６）を示す（実施例１Ｂ参照）：
α−グロビン遺伝子由来の安定化配列；
３’末端の７０個のアデノシンのポリＡテール；
３’末端の３０個のシトシンのポリＡテール。
【０１３８】
図５は、トランスフェクション実験の結果を示す棒グラフである。ルシフェラーゼをコードする、修飾されていない、または修飾されたｍＲＮＡを用いてｈＰＢＭＣをトランスフェクトし、トランスフェクトしてから１６時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。このデータは、ＣＴＰを５−ブロモ−ＣＴＰまたは５−メチル−ＣＴＰと置換、ＧＴＰを７−デアザ−ＧＴＰと置換、またはＵＴＰをプソイド−ＵＴＰと置換することにより、未修飾のｍＲＮＡを用いてトランスフェクトした細胞におけるルシフェラーゼ活性に比べて、修飾されたｍＲＮＡによってコードされるルシフェラーゼの活性が増加することを示す。
【０１３９】
図６はトランスフェクション実験の結果を示す棒グラフである。ルシフェラーゼをコードする、修飾されていない、または修飾されたｍＲＮＡを用いてHela細胞をトランスフェクトし、トランスフェクトしてから１６時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。このデータは、ＣＴＰの５−ブロモ−ＣＴＰまたは５メチルＣＴＰと置換、ＧＴＰを７−デアザ−ＧＴＰと置換、またはＵＴＰをプソイド−ＵＴＰと置換することにより、未修飾のｍＲＮＡを用いてトランスフェクトした細胞におけるルシフェラーゼ活性に比べて、修飾されたｍＲＮＡによってコードされるルシフェラーゼの活性が増加することを示す。
【０１４０】
以下の実施例は、それに限定することなく本発明をさらに詳細に説明する。
【０１４１】
〔実施例１〕ＲＮＡの塩基修飾：
Ａ）ｍＲＮＡコンストラクト
まず、塩基修飾のためのテンプレートとしてルシフェラーゼコンストラクト（ＣＡＰ−Ｐｐｌｕｃ（ｗｔ）−ｍｕａｇ−Ａ７０−Ｃ３０）を作成した（図４Ａ、配列番号３を参照）。上記コンストラクトは、天然型のコーディング配列に加えて以下の修飾を含んでいた（配列番号４、図４ｂを参照）：
α−グロビン遺伝子由来の安定化配列；
３’末端の約７０個のアデノシンのポリＡテール；
３’末端の３０個のシトシンのポリＡテール。
【０１４２】
Ｂ）インビトロ転写
本発明に従って使用される塩基修飾の導入のために、Ｔ７ポリメラーゼ（T7-opti mRNA Kit, CureVac, Tubingen, Germany）を用いてルシフェラーゼコンストラクト（ＣＡＰ−Ｐｐｌｕｃ（ｗｔ）−ｍｕａｇ−Ａ７０−Ｃ３０、図４Ａ、配列番号３を参照）を転写した。このために、ＴｒｉＬｉｎｋ（San Diego, USA）から、修飾されたヌクレオチドを得た。すべてのｍＲＮＡトランスクリプトは、長さが約７０塩基であるポリＡテールと５'−キャップ構造を含んでいた。キャップ構造は、Ｎ７−メチルグアノシン−５'−三リン酸塩５'−グアノシンを過剰に添加することによって得られた。ウリジン３リン酸塩の代わりに、プソイドウリジン５'−三リン酸塩をインビトロ転写反応に添加することによって、プソイドウリジン５'−三リン酸塩で修飾されたｍＲＮＡを得た（配列番号５、図４Ｃ）（以下を参照）。シチジン三リン酸塩の代わりに、５−メチルシチジン−５'をインビトロ転写反応に添加することによって、５−メチルシチジン−５'で修飾されたｍＲＮＡを得た（配列番号６、図４Ｄ）（以下を参照）。
【０１４３】
〔実施例２〕Hela細胞中のルシフェラーゼの発現における塩基修飾の効果
Ａ）プソイドウリジン５'−三リン酸塩を用いた修飾
ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質の発現における様々な塩基修飾の効果を調べるために、ウリジン５'−三リン酸塩の代りに、プソイドウリジン５'−三リン酸塩を含む媒質を用いて、ルシフェラーゼをコードするプラスミドに対してインビトロ転写を行った。そして、転写したｍＲＮＡを、Hela細胞にトランスフェクトした（上記を参照）。細胞溶解の後、照度計を用いてルシフェラーゼの発現を測定した。ルシフェラーゼの過剰発現は、大幅に改善された（塩基修飾されたｍＲＮＡ配列の実量９４０１５ａｍｏｌと比較した未修飾のｍＲＮＡ配列の実量９６０ａｍｏｌ）（図１参照）。
【０１４４】
Ｂ）５−メチルシチジン−５'−三リン酸塩を用いた修飾
シチジン５'−三リン酸塩の代わりに、５−メチルシチジン−５'−三リン酸塩を含む媒質を用いることによって、ルシフェラーゼをコードするプラスミドに対して、インビトロ転写を行った。そして、転写したｍＲＮＡを、Hela細胞にトランスフェクトした（上記を参照）。細胞溶解の後、照度計を用いてルシフェラーゼの発現を測定した。ルシフェラーゼの過剰発現は、大幅に改善された（塩基修飾されたｍＲＮＡ配列の実量３０８７ａｍｏｌと比較した未修飾のｍＲＮＡ配列の実量９６０ａｍｏｌ）（図２参照）。
【０１４５】
〔実施例３〕ルシフェラーゼの発現における塩基修飾に関する比較試験
Ａ）ルシフェラーゼをコードする、未修飾の、および塩基修飾されたｍＲＮＡを用いて行った電気穿孔後の、Hela細胞とｈＰＢＭＣにおけるルシフェラーゼ発現の測定
実施例１によると、ＥａｓｙｊｅｃＴ  Ｐｌｕｓ（Peqlab, Erlangen, Germany）を使用して、１０ｍｇの未修飾の、または塩基修飾されたＲＮＡを用いて、Hela細胞とｈＰＢＭＣｓをトランスフェクトした。トランスフェクトした１６時間後に、溶解緩衝液（２５ｍＭ  ＰＯ４、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％のグリセロール、１％のトリトン-Ｘ  １００、２ｍＭ  ＤＴＴ）を用いて、細胞を溶解した。上清をルシフェリン緩衝液（２５ｍＭグリシルグリシン、１５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、５ｍＭ  ＡＴＰ、６２．５μＭルシフェリン）と混合し、照度計（Lumat LB9507(Berthold Technologies, Bad Wildbad, germany)）を用いて発光を測定した。
【０１４６】
Ｂ）
比較試験において、ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡ、（１）ウリジン５’−三リン酸塩の代わりにプソイドウリジン５'−三リン酸塩、および（２）シチジン５’−三リン酸塩の代わりに５−メチルシチジン−５'−三リン酸塩に対して、インビトロ転写を行い、ｈＰＢＭＣ細胞にトランスフェクトした。細胞の溶解後、照度計を用いてルシフェラーゼの発現を測定した。ここで、また、ルシフェラーゼの過剰発現は、大幅に改善された（プソイドウリジン５'−三リン酸塩を用いて修飾されたｍＲＮＡ配列の実量３３５１ａｍｏｌ、および、５−メチルシチジン−５を用いて修飾されたｍＲＮＡ配列の実量１２７４ａｍｏｌと比較した未修飾のｍＲＮＡ配列の実量２６０ａｍｏｌ）（図３を参照）。
【０１４７】
要約すれば、ｍＲＮＡの塩基修飾としてメチルシチジンを用いることによって、未修飾のｍＲＮＡに比べて、ルシフェラーゼはHela細胞において約３倍、ｈＰＢＭＣにおいて約５倍発現される。プソイドウリジンを用いてｍＲＮＡを修飾すると、コードされるルシフェラーゼの発現における効果ははるかに大きくなる。例えば、未修飾のｍＲＮＡに比べて、ルシフェラーゼはHela細胞において約１００倍発現され、ｈＰＢＭＣにおいて約１３倍発現される。それゆえ、本発明に従って使用される、塩基修飾されたＲＮＡによってコードされるタンパク質における増化した過剰発現の効果は、選択される宿主細胞と無関係である。
【０１４８】
塩基修飾として、５−ブロモ−ＣＴＰ（ＣＴＰの代わり）、５−メチル−ＣＴＰ（ＣＴＰの代わり）、７−デアザ−ＧＴＰ（ＧＴＰの代わり）、またはプソイド−ＵＴＰ（ＵＴＰの代わり）を有する塩基修飾されたＲＮＡをコードする、比較目的ルシフェラーゼについて、相当する実験を行った。トランスフェクトされたｈＰＢＭＣ（図５）およびトランスフェクトされたHela細胞（図６）の発現を示す（対数で示される百万分子ルシフェラーゼ）。トランスフェクションを行った１６時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。図５は、ルシフェラーゼｍＲＮＡがｈＰＢＭＣにおいて翻訳されたことを示す。ＣＴＰと５−ブロモ−ＣＴＰまたは５−メチル−ＣＴＰとの置換、ＧＴＰと７−デアザ−ＧＴＰとの置換、またはＵＴＰとプソイド−ＵＴＰとの置換によって、修飾されていないｍＲＮＡを用いてトランスフェクトされた細胞におけるルシフェラーゼ活性に比べて、修飾されたｍＲＮＡによってコードされるルシフェラーゼの活性が著しく（少なくとも１２倍）増加する。Hela細胞における実験は、これらの知見を反映し、本発明に係る塩基修飾ＲＮＡにおける増加した発現率をよりいっそう明確に示す。
【図面の簡単な説明】
【０１４９】
【図１】プソイドウリジン５'-三リン酸塩を用いてルシフェラーゼＲＮＡの塩基修飾を行い、その後にHela細胞へトランスフェクトした結果を示す図である。
【図２】５-メチルシチジン-５'-三リン酸塩を用いてルシフェラーゼＲＮＡの塩基修飾を行い、その後にHela細胞へトランスフェクトした結果を示す図である。
【図３】５−メチルシチジン−５三リン酸塩とともにプソイドウリジン５'−三リン酸塩を用い、ルシフェラーゼＲＮＡの塩基修飾をし、その後にｈＰＢＭＣ細胞へトランスフェクトした結果を示す図である。
【図４Ａ】さらなる修飾を含むルシフェラーゼのｍＲＮＡ配列（配列番号３）を示す図である。
【図４Ｂ】ルシフェラーゼの天然型のｍＲＮＡ配列を示す図である。
【図４Ｃ】さらなる修飾を含むルシフェラーゼのｍＲＮＡ配列（配列番号５）を示す図である。
【図４Ｄ】さらなる修飾を含むルシフェラーゼのｍＲＮＡ配列（配列番号６）を示す図である。
【図５】トランスフェクション実験の結果を示す図である。
【図６】トランスフェクション実験の結果を示す図である。
【図１】
2010508014.tif 000004
【図２】
2010508014.tif 000005
【図３】
2010508014.tif 000006
【図４Ａ】
2010508014.tif 000007
【図４Ｂ】
2010508014.tif 000008
【図４Ｃ】
2010508014.tif 000009
【図４Ｄ】
2010508014.tif 000010
【図５】
2010508014.tif 000011
【図６】
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【配列表】
2010508014000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年7月2日(2009.7.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質の発現を増加させるための、塩基修飾されたＲＮＡ配列の使用であって、該塩基修飾されたＲＮＡ配列は、少なくとも１つの塩基修飾を含み、かつ少なくとも１つのタンパク質をコードする、使用。
【請求項２】
上記塩基修飾されたＲＮＡが、一本鎖または二本鎖であり、線状または環状であり、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡまたはｍＲＮＡの形態である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
上記塩基修飾されたＲＮＡがｍＲＮＡである、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
上記塩基修飾されたＲＮＡは、組換えによって、または、天然に産生されるタンパク質の群より選択されるタンパク質の少なくとも１つをコードし、該タンパク質の群は、成長ホルモンまたは成長因子；代謝および／または造血に影響するタンパク質；血液凝固系のタンパク質；［ベータ］−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）；ＤＮＡ制限酵素；リゾチーム；プロテアーゼ；細胞の信号伝達を刺激するタンパク質；アポトーシス因子またはアポトーシスと関連または結合するタンパク質；腫瘍特異性表面抗原（ＴＳＳＡ）を含む抗原；ＮＹ−Ｅｓｏ−１またはＮＹ−Ｅｓｏ−Ｂを含む配列；上記タンパク質のうちの１つに対して、少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質またはタンパク質配列からなり、
上記成長ホルモンまたは成長因子は、ＴＧＦα、ＩＧＦ（インスリン様増殖因子）を含み、
上記代謝および／または造血に影響するタンパク質は、α−アンチトリプシン、ＬＤＬ受容体、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インシュリン、ＧＡＴＡ−１を含み、
上記血液凝固系のタンパク質は、第８因子、第６因子等であり、
上記ＤＮＡ制限酵素は、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩを含み、
上記プロテアーゼは、パパイン、ブロメライン、ケラチナーゼ、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、レニン（キモシン）、Ｓｕｉｚｙｍｅ、Ｎｏｒｔａｓｅを含み、
上記細胞の信号伝達を刺激するタンパク質は、４つの位置特異的な保存システイン残基（ＣＣＣＣ）と保存配列モチーフＴｒｐ−Ｓｅｒ−Ｘ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ＷＳＸＷＳ）とを含むクラスＩサイトカインファミリーのサイトカイン、４つの位置特異的な保存システイン残基（ＣＣＣＣ）を含んでいるが保存配列モチーフＴｒｐ−Ｓｅｒ−Ｘ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ＷＳＸＷＳ）を含んでいないクラスＩＩサイトカインファミリー、腫瘍壊死ファミリーのサイトカイン、７つの膜貫通ヘリックスを含みかつＧ−タンパク質と相互作用するケモカインファミリーのサイトカインを含み、
上記４つの位置特異的な保存システイン残基（ＣＣＣＣ）と保存配列モチーフＴｒｐ−Ｓｅｒ−Ｘ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ＷＳＸＷＳ）とを含むクラスＩサイトカインファミリーのサイトカインは、ＩＬ−３；ＩＬ−５；ＧＭ−ＣＳＦ；ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２を含むＩＬ−６サブファミリー；ＩＬ−２、ＩＬ−４ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５を含むＩＬ−２サブファミリー；サイトカインＩＬ−１α；ＩＬ−１β；ＩＬ−１０を含み、
上記４つの位置特異的な保存システイン残基（ＣＣＣＣ）を含んでいるが保存配列モチーフＴｒｐ−Ｓｅｒ−Ｘ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ＷＳＸＷＳ）を含んでいないクラスＩＩサイトカインファミリー（インターフェロン受容体ファミリー）のサイトカインは、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γを含み、
上記腫瘍壊死ファミリーのサイトカインは、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＴＮＦ−ＲＩ、ＴＮＦ−ＲＩＩ、ＣＤ４０、Ｆａｓを含み、
上記７つの膜貫通ヘリックスを含みかつＧ−タンパク質と相互作用するケモカインファミリーのサイトカインは、ＩＬ−８、ＭＩＰ−１、ランテス、ＣＣＲ５、ＣＸＲ４を含み、
上記アポトーシス因子またはアポトーシスと関連または結合するタンパク質は、ＡＩＦ、Ａｐａｆ、ＡＰＯ−２（Ｌ）、ＡＰＯ−３（Ｌ）、アポパイン、Ｂａｄ、Ｂａｋ、Ｂａｘ、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−ｘＳ、ｂｉｋ、ＣＡＤ、カルパイン、カスパーゼ、ｃｅｄ−３、ｃｅｄ−９、ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−Ｍｙｃ、ｃｒｍ  Ａ、シトクロムＣ、ＣｄＲ１、ＤｃＲ１、ＤＤ、ＤＥＤ、ＤＩＳＣ、ＤＮＡ−ＰＫＣＳ、ＤＲ３、ＤＲ４、ＤＲ５、ＦＡＤＤ／ＭＯＲＴ−１、ＦＡＫ、Ｆａｓ（ＦａｓリガンドＣＤ９５／ｆａｓ（受容体））、ＦＬＩＣＥ／ＭＡＣＨ、ＦＬＩＰ、ホドリン、ｆｏｓ、Ｇ―アクチン、ガス−２、ゲルゾリン、グランザイムＡ／Ｂ、ＩＣＡＤ、ＩＣＥ、ＪＮＫ、ラミンＡ／Ｂ、ＭＡＰ、ＭＣＬ−１、Ｍｄｍ−２、ＭＥＫＫ−１、ＭＯＲＴ−１、ＮＥＤＤ、ＮＦ−ｋＢ、ＮｕＭａ、ｐ５３、ＰＡＫ−２、ＰＡＲＰ、パーフォリン、ＰＩＴＳＬＲＥ、ＰＫＣσ、ｐＲｂ、プレセニリン、ｐｒＩＣＥ、ＲＡＩＤＤ、Ｒａｓ、ＲＩＰ、スフィンゴミエリナーゼ、単純ヘルぺス由来のチミジンキナーゼ、ＴＲＡＤＤ、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、トランスグルタミナーゼを含み、
上記Ａｐａｆは、例えばＡｐａｆ−１、Ａｐａｆ−２、Ａｐａｆ−３であり、
上記カスパーゼは、例えば、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１１であり、
上記腫瘍特異性表面抗原（ＴＳＳＡ）を含む抗原は、５Ｔ４、α５β１−インテグリン、７０７−ＡＰ、ＡＦＰ、ＡＲＴ−４、Ｂ７Ｈ４、ＢＡＧＥ、β−カテニン／ｍ、Ｂｃｒ−ａｂｌ、ＭＮ／Ｃ  ＩＸ抗原、ＣＡ１２５、ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ−１、ＣＡＳＰ−８、β−カテニン／ｍ、ＣＤ４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤＣ２７／ｍ、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ８０、ＣＤＫ４／ｍ、ＣＥＡ、ＣＴ、Ｃｙｐ−Ｂ、ＤＡＭ、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、ＥＬＦ２Ｍ、ＥＭＭＰＲＩＮ、ＥｐＣａｍ、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１、Ｇ２５０、ＧＡＧＥ、ＧｎＴ−Ｖ、Ｇｐ１００、ＨＡＧＥ、ＨＥＲ−２／ｎｅｗ、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１−Ｒ１７０Ｉ、ＨＰＶ−Ｅ７、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＡＳＴ−２、ｈＴＥＲＴ（またはｈＴＲＴ）、ｉＣＥ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−５、ＫＩＡＡ０２０５、ＬＡＧＥ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ−１／ｍｅｌａｎ−Ａ、ＭＡＲＴ−２／Ｓｋｉ、ＭＣ１Ｒ、ミオシン／ｍ、ＭＵＣ１、ＭＵＭ−１、−２、−３、ＮＡ８８−Ａ、ＰＡＰ、プロテイナーゼ−３、ｐ１９０  ｍｉｎｏｒ  ｂｃｒ−ａｂｌ、Ｐｍｌ／ＲＡＲα、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＰＳＭＡ、ＲＡＧＥ、ＲＵ１、ＲＵ２、ＳＡＧＥ、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−３、サバイビン、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＴＧＦβ、ＴＰＩ／ｍ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＴＲＰ−２／ＩＮＴ２、ＶＥＧＦ、およびＷＴ１を含む、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
上記塩基修飾されたＲＮＡは、２−アミノ６−クロロプリンリボシド−５'−三リン酸塩、２−アミノアデノシン５'−三リン酸塩、２−チオシチジン−５'−三リン酸塩、２−チオウリジン５'−三リン酸塩、４−チオウリジン５'−三リン酸塩、５−アミノアリルシチジン−５'−三リン酸塩、５−アミノアリルウリジン−５'−三リン酸塩、５−ブロモシチジン−５'−三リン酸塩、５―ブロモウリジン５'−三リン酸塩、５−ヨードシチジン−５'−三リン酸塩、５−ヨードウリジン−５'−三リン酸塩、５−メチルシチジン−５'−三リン酸塩、５メチルウリジン５'−三リン酸塩、６−アザシチジン５'−三リン酸塩、６―アザウリジン５'−三リン酸塩、６−クロロプリンリボシド−５'−三リン酸塩、７−デアザアデノシン５'−三リン酸塩、７−デアザグアノシン５'−三リン酸塩、８−アザアデノシン−５'−三リン酸塩、８−アジドアデノシン−５'−三リン酸塩、ベンズイミダゾール−リボシド５'−三リン酸塩、Ｎ１−メチルアデノシン−５'−三リン酸塩、Ｎ１−メチルグアノシン−５'−三リン酸塩、Ｎ６−メチルアデノシン−５'−三リン酸塩、Ｏ６−メチルグアノシン−５'−三リン酸塩、プソイドウリジン５'−三リン酸塩、プロマイシン５'−三リン酸塩、および、キサントシン５'−三リン酸塩からなる群より選択される塩基修飾の少なくとも１つを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
上記塩基修飾は、５−メチルシチジン−５'−三リン酸塩、７−デアザグアノシン５'−三リン酸塩、５−ブロモシチジン−５'−三リン酸塩、および、プソイドウリジン５'−三リン酸塩からなる群より選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
上記塩基修飾されたｍＲＮＡが、骨格修飾および糖修飾を含んでいない、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
上記塩基修飾されたｍＲＮＡが、少なくとも１つの骨格修飾および／または少なくとも１つの糖修飾を含んでいる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
上記塩基修飾されたｍＲＮＡが、該塩基修飾されたＲＮＡのコード領域内に、天然型のＲＮＡ配列のコード領域のＧ／Ｃ含量よりも多いＧ／Ｃ含量をさらに有しており、コードされるアミノ酸配列が野生型と比較して変更されていない、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
ｔＲＮＡをコードする天然型のＲＮＡの少なくとも１つのコドンであって細胞内に比較的まれに存在するコドンが、細胞内に比較的多く存在しかつ該比較的まれに存在するｔＲＮＡと同一のアミノ酸を運ぶｔＲＮＡをコードするコドンの１つによって置換される様式にて、上記塩基修飾されたＲＮＡのコード領域が、天然型のＲＮＡのコード領域と比較して変更されている、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
上記塩基修飾されたＲＮＡが、ｍ７Ｇ（５'）ｐｐｐ（５'（Ａ，Ｇ（５'）ｐｐｐ（５'）ＡおよびＧ（５'）ｐｐｐ（５'）Ｇからなる群より選択される５'−キャップ構造をさらに含んでいる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１２】
上記塩基修飾されたＲＮＡが、少なくとも５０ヌクレオチドのポリＡテールを含んでいる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１３】
上記塩基修飾されたＲＮＡが、少なくとも２０ヌクレオチドのポリＡテールを含んでいる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１４】
上記塩基修飾されたＲＮＡが、ヘキサヒスチジンタグ（ＨＩＳタグ、ポリヒスチジンタグ）、ストレプトアビジンタグ（連鎖球菌タグ）、ＳＢＰタグ（ストレプトアビジン結合タグ）、またはＧＳＴ（グルタチオンＳ-トランスフェラーゼ）タグからなる群より選択される精製用のタグ、または、抗体結合タグ、Ｍｙｃタグ、Ｓｗａｌｌエピトープ、ＦＬＡＧタグ、およびＨＡタグからなる群より選択される抗体エピトープを介する精製用のタグをさらにコードする、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１５】
上記塩基修飾されたＲＮＡが、脂質修飾を含んでいる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１６】
腫瘍および癌疾患、心臓および循環器系統の病気、感染症、自己免疫疾患または単一遺伝子疾患からなる群より選択される疾患を処置するための薬学的組成物を調製するための、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の塩基修飾されたＲＮＡの使用。
【請求項１７】
上記薬学的組成物が、プロタミン、ヌクレオリン、スペルミン、またはスペルミジンを含むカチオン性ペプチドまたはポリペプチド；キトサン、ＴＤＭ、ＭＤＰ、ムラミルジペプチド、プルロニクス、アルム溶液、水酸化アルミニウム、ＡＤＪＵＭＥＲ（商標）（ポリホスファゼン）を含むカチオン性の多糖類；リン酸アルミニウムゲル；藻類由来のグルカン；アルガムリン；水酸化アルミニウムゲル（アルム）；高タンパク質吸着性水酸化アルミニウムゲル；低粘性酸化アルミニウムゲル；ＡＦまたはＳＰＴ（スクアラン（５％）、Ｔｗｅｅｎ  ８０（０．２％）、プルロニック  Ｌ１２１（１．２５％）、リン酸緩衝食塩水のエマルジョン、ｐＨ７．４）；ＡＶＲＩＤＩＮＥ（商標）（プロパンジアミン）；ＢＡＹ  Ｒ１００５（商標）（（Ｎ−（−２デオキシ−２−Ｌ−ロイシルアミノ−ｂ−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｎ−オクタデシルドデカノイル−アミドハイドロ酢酸塩）；ＣＡＬＣＩＴＲＩＯＬ（商標）（１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３）；リン酸カルシウムゲル；ＣＡＰＴＭ（リン酸カルシウムナノ粒子）；コレラホロトキシン、コレラ毒素−Ａ１−タンパク質−Ａ−Ｄ−フラグメント融解タンパク質、コレラ毒素のサブユニットＢ；ＣＲＬ  １００５（ブロック共重合体Ｐ１２０５）；サイトカイン含有リポソーム；ＤＤＡ（ジメチルジオクタデシルアンモニウム臭化物）；ＤＨＥＡ（デヒドロエピアンドロステロン）；ＤＭＰＣ（ジミリストイルホスファチジルコリン）；ＤＭＰＧ（ジミリストイルホスファチジルグリセロール）；ＤＯＣ／アルム複合体（デオキシコール酸ナトリウム塩）；フロイント完全アジュバント；フロイント不完全アジュバント；ガンマイヌリン；ゲルブアジュバント（（ｉ）Ｎ−アセチルグルコサミニル（Ｐ１−４）−Ｎ−アセチルムラミル−ＬアラニルＤ−グルタミン（ＧＭＤＰ）と、（ｉｉ）ジメチルジオクタデシルアンモニウム塩化物（ＤＤＡ）と、（ｉｉｉ）亜鉛−Ｌ―プロリン塩複合体（ＺｎＰｒｏ−８）との混合物；ＧＭ−ＣＳＦ）；ＧＭＤＰ（Ｎ−アセチルグルコサミニル−（ｂ１−４）−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン）；イミキモド（１−（２−メチプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン）；ＩｍｍＴｈｅｒ（商標）（Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−ｉｓｏＧｌｕ−Ｌ−Ａｌａ−グリセロールジパルミテート）；ＤＲＶ（脱水−再水和小泡から調製された免疫リポソーム）；インターフェロン−γ；インターロイキン−１β；インターロイキン−２；インターロイキン−７；インターロイキン−１２；ＩＳＣＯＭＳ（商標）（「Immune Stimulating Complexes」）；ＩＳＣＯＰＲＥＰ  ７．０．３．（商標）；  リポソーム；ＬＯＸＯＲＩＢＩＮＥ（商標）（７−アリル−８−オキソグアノシン）；ＬＴ経口アジュバント（大腸菌の不安定なエンテロトキシンプロトキシン）；任意の組成のマイクロスフェアおよび微粒子；ＭＦ５９（商標）；（スクアレン水エマルジョン）；ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ  ＩＳＡ  ５１（商標）（精製不完全フロインドアジュバント）；ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ  ＩＳＡ  ７２０（商標）（代謝可能なオイルアジュバント）；ＭＰＬ（商標）（３−Ｑ−デサシル−４’−モノホスホリルリピドＡ）；ＭＴＰ−ＰＥおよびＭＴＰ−ＰＥリポソーム（（Ｎ−アセチル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ―アラニン−２−（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−（ヒドロキシホスホリルオキシ））エチルアミド、モノナトリウム塩）；ＭＵＲＡＭＥＴＩＤＥ（商標）（Ｎａｃ−Ｍｕｒ−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−Ｇｌｎ−ＯＣＨ３）；ＭＵＲＡＰＡＬＭＩＴＩＮＥ（商標）およびＤ−ＭＵＲＡＰＡＬＭＩＴＩＮＥ（商標）（Ｎａｃ−Ｍｕｒ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｄ−ｉｓｏＧＩｎ−ｓｎ−グリセロールジパルミトイル）；ＮＡＧＯ（ノイラミニダーゼガラクトースオキシダーゼ）；任意の組成のナノスフェアまたはナノ粒子；ＮＩＳＶ（非イオン界面活性剤小泡）；ＰＬＥＵＲＡＮ（商標）（β−グルカン）；ＰＬＧＡ、ＰＧＡ、およびＰＬＡ（乳酸およびグリコール酸のホモポリマーおよびコポリマー；マイクロ／ナノスフェア）；ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｌ１２１（商標）；ＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）；ＰＯＤＤＳ（商標）（プロテノイドマイクロスフェア）；ポリエチレンカルバメート誘導体；ポリ−ｒＡ：ポリ−ｒＵ（ポリアデニル酸のポリウリジル酸複合体）；ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ  ８０）；タンパク質コキエート（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，  Ｉｎｃ．，  Ａｌａｂａｓｔｅｒ，  ＡＬ）；ＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）（ＱＳ−２１）；Ｑｕｉｌ−Ａ（Ｑｕｉｌ−Ａサポニン）；Ｓ−２８４６３（４−アミノ−ｏｔｅｃ−ジメチル−２−エトキシメチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］−キノリン−１−エタノール）；ＳＡＦ−１（商標）（「Syntex adjuvant formulation」）；センダイプロテオリポソームおよび脂質センダイマトリックス；Ｓｐａｎ−８５（ソルビタントリオレート）；スペコール（Ｍａｒｃｏｌ  ５２、Ｓｐａｎ８５、およびＴｗｅｅｎ８５のエマルジョン）；スクアレンまたはＲｏｂａｎｅ（登録商標）（２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチルテトラコサン、および２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサン）；ステアリルチロシン（オクタデシルチロシン塩酸塩）；Ｔｈｅｒａｍｉｄ（登録商標）（Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−ｉｓｏＧｌｕ−Ｌ−Ａｌａ−ジパルミトキシプロピルアミド）；Ｔｈｅｒｏｎｙｌ−ＭＤＰ（Ｔｅｒｍｕｒｔｉｄｅ（商標）または［ｔｈｒ  １］−ＭＤＰ；Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン）；Ｔｙ粒子（Ｔｙ−ＶＬＰまたはウイルス様粒子）；Ｗａｌｔｅｒ−Ｒｅｅｄリポソーム（水酸化アルミニウム上に吸着されたリピドＡを含むリポソーム）；Ｐａｍ３Ｃｙｓを含むリポペプチド；ＣｐＧおよび／またはＲＮＡオリゴヌクレオチドから選択された核酸系のアジュバント、または、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＴＬＲ１１、ＴＬＲ１２、またはＴＬＲ１３、またはそれらの相同体のリガンドから選択されたトール様受容体からなる群より選択されるアジュバントをさらに含んでいる、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
上記薬学的組成物がワクチンである、請求項１６または１７に記載の使用。
【請求項１９】
上記癌または腫瘍の疾患が、黒色腫、悪性黒色腫、結腸癌、リンパ腫、肉腫、芽腫、腎癌、胃腸腫瘍、神経膠腫、前立腺腫瘍、膀胱癌、直腸腫瘍、胃癌、食道癌、膵臓癌、肝癌、乳癌、子宮癌、子宮頸癌、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、ヘパトーム、ウイルスによって誘発される様々な腫瘍（例えば、乳頭腫ウイルスによって誘発される悪性腫瘍（例えば子宮頚癌）、悪性腺腫、ヘルペスウイルスによって誘発される腫瘍（例えばバーキットリンパ腫、ＥＢＶによって誘発されるＢ細胞リンパ腫）、Ｂ型肝炎によって誘発される腫瘍（肝細胞悪性腫瘍）、ＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−２によって誘発されるリンパ腫等）、聴神経腫、肺癌（＝気管支癌）、小細胞肺癌、咽頭癌、肛門癌、グリア芽腫、直腸癌、星状細胞腫、脳腫瘍、網膜芽腫、基底細胞腫、脳転移、髄芽腫、膣癌、膵臓癌、精巣癌、ホジキン症候群、髄膜腫、シュネーベルガー病、脳下垂体腫瘍、菌状息肉腫、カルチノイド、神経鞘腫、棘細胞腫、バーキットリンパ腫、喉頭癌、腎癌、胸腺腫、体癌、骨肉腫、非ホジキンリンパ腫、尿道癌、ＣＵＰ症候群、頭頸部腫瘍、乏突起膠腫、外陰癌、腸癌、結腸癌、食道悪性腫瘍（＝食道癌）、いぼ合併症、小腸腫瘍、頭蓋咽頭腫、卵巣癌、生殖器腫瘍、卵巣癌、膵臓癌、子宮内膜癌、肝転移、陰茎癌、舌癌、胆嚢癌、白血病、形質細胞腫、まぶた腫瘍、および、前立腺癌（＝前立腺腫瘍）からなる群より選択される、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２０】
上記感染症が、インフルエンザ、マラリア、ＳＡＲＳ、黄熱、エイズ、ライムボレリア症、リーシュマニア症、炭疽病、髄膜炎、ウイルス感染症、細菌感染症、炭疽病、虫垂炎、ボレリア症、ボツリヌス中毒、カンフィローバクター、トラコーマクラミジア（尿道の炎症、結膜炎）、コレラ、ジフテリア、鼠径肉芽腫、喉頭蓋炎、発疹チフス、ガス壊疽、淋病、野兎病、ヘリコバクターピロリ、百日咳、鼠径リンパ肉芽腫、骨髄炎、レジオネラ症、ハンセン病、リステリア症、肺炎、髄膜炎、細菌性髄膜炎、炭疽病、中耳炎、マイコプラズマホミニス、新生児敗血症（絨毛羊膜炎）、水癌、パラチフス、ペスト、ライター症候群、ロッキー山紅斑熱、サルモネラ菌パラチフス、サルモネラ菌発疹チフス、猩紅熱、梅毒、破傷風、トリッパー、ツツガムシ病、結核、発疹チフス、膣炎、軟性下疳等、および寄生虫、原生動物、または菌によって発症する感染症、疥癬、皮膚のリーシュマニア症、ランブル鞭毛虫症、シラミ、マラリア、顕微鏡検査、糸状虫症（河川盲目症）、真菌症、ウシ条虫、住血吸虫病、睡眠病、ブタ条虫、トキソプラズマ症、トリコモナス症、トリパノソーマ症（睡眠病）、内臓性リーシュマニア症、おしめ／おむつ皮膚炎、または微小条虫によって引き起こされる感染症からなる群より選択され、
上記ウイルス感染症は、例えば、エイズ、尖圭コンジローマ、凹窩いぼ、デング熱、三日熱、エボラウイルス、風邪、初夏髄膜脳炎（ＦＳＭＥ）、インフルエンザ、帯状ヘルペス、肝炎、単純ヘルぺス  Ｉ型、単純ヘルぺス  ＩＩ型、帯状疱疹、インフルエンザ、日本脳炎、ラッサ熱、マールブルグウイルス、麻疹、口蹄疫、単核症、流行性耳下腺炎、ノーウォークウイルス感染、プファイファー腺熱、疱瘡、ポリオ（幼年期  跛行）、仮性クループ、伝染性紅斑、狂犬病、いぼ、西ナイル熱、水痘、巨細胞ウイルス（ＣＭＶ）等であり、
上記細菌感染症は、例えば、流産（前立腺炎症）であり、
上記寄生虫、原生動物、または菌によって発症する感染症は、例えば、アメーバ症、ビルハルツ住血吸虫症、シャーガス病、エキノコックス属、広節裂頭条虫、魚類中毒症（シガテラ中毒）、キツネ条虫、みずむし、イヌ条虫、カンジダ症、酵母菌斑である、
請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２１】
上記心臓および循環器系統の病気が、冠動脈心疾患、動脈硬化、卒中、高血圧からなる群より選択され、神経細胞の疾患が、アルツハイマー病、筋萎縮側索硬化、ジストニー、てんかん、多発硬化、およびパーキンソン病から選択される、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２２】
上記自己免疫疾患が、Ｉ型自己免疫疾患、ＩＩ型自己免疫疾患、ＩＩＩ型自己免疫疾患、またはＩＶ型自己免疫疾患からなる群より選択され、
上記自己免疫疾患が、例えば、多発硬化（ＭＳ）、関節リウマチ、糖尿病、Ｉ型糖尿病（真性糖尿病）、全身性エリテマートーデス（ＳＬＥ）、慢性多発関節炎、バセドウ氏病、自己免疫型慢性肝炎、潰瘍性大腸炎、Ｉ型アレルギー疾患、ＩＩ型アレルギー疾患、ＩＩＩ型アレルギー疾患、ＩＶ型アレルギー疾患、線維筋痛、脱毛症、ベヒテレフ病、クローン病、重症筋無力症、神経皮膚炎、リウマチ性多発筋痛、全身性進行性硬化（ＰＳＳ）、乾癬、ライター症候群、関節リウマチ、乾癬および脈管炎である、
請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２３】
上記単一遺伝子疾患が、アデノシンデアミナーゼ欠乏症、家族性高コレステロール血症、Ｃａｎａｖａｎ症候群、ゴーシェ病、ファンコニ貧血、神経セロイドリポフスチノーシス、ムコビシドーシス（嚢胞性線維症）、鎌状赤血球貧血、フェニルケトン尿症、アルカプトン尿症、白皮症、甲状腺機能低下不全症、ガラクトース血症、α１アンチトリプシン欠損症、色素性乾皮症、Ｒｉｂｂｉｎｇ症候群、ムコ多糖体症、唇裂、顎、口蓋、ローレンス・ムーン・バルデー・ビードル症候群、短肋骨多指症候群、クレチン病、ジュベール症候群、ＩＩ型早老症、短指症、副腎性器症候群のような常染色体劣性遺伝性疾患からなる群、および色覚異常、ぜい弱Ｘ症候群、筋ジストロフィ（デュシエンヌ型、Ｂｅｃｋｅｒ−Ｋｉｅｎｅｒ型）、血友病ＡおよびＢ、Ｇ６ＰＤ欠損症、ファブリー病、ムコ多糖体症、Ｎｏｒｒｉｅ症候群、色素性網膜炎、敗血性肉芽腫症、Ｘ−ＳＣＩＤ、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、レッシュ‐ナイハン症候群のようなＸ染色体遺伝性疾患からなる群、または、例えば遺伝性欠陥浮腫、マルファン症候群、神経線維腫症、Ｉ型早老症、骨形成不全症、クリッペル・トレノーネイ症候群、スタージ‐ウェーバー症候群、ヒッペル・リンダウ症候群、結節性硬化症のような常染色体優性遺伝性疾患より選択され、上記色覚異常は例えば赤緑色盲である、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２４】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の、塩基修飾されたＲＮＡ配列。
【請求項２５】
以下の工程（ａ）〜（ｄ）を含む、塩基修飾されたＲＮＡの調製のためのインビトロ転写法：
（ａ）目的のタンパク質をコードする（デオキシ）リボ核酸を調製する工程；
（ｂ）ＲＮＡポリメラーゼ、緩衝液、核酸混合物、および必要に応じてリボヌクレアーゼ阻害剤を含むインビトロ転写媒質に上記核酸を添加する工程であって、該核酸混合物は、１つ以上の天然型のヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ、および／またはＵの代りとしての、請求項５に定義されている１つ以上の塩基修飾ヌクレオチドと、天然型のヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ、またはＵの全てが置換されるわけではない場合、必要に応じて、１つ以上の天然型のヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ、またはＵとを含む、工程；
（ｃ）上記インビトロ転写媒質中にて上記核酸をインキュベートし、該核酸をインビトロ転写する工程；
（ｄ）必要に応じて、精製および組み込まれなかったヌクレオチドの上記インビトロ転写媒質からの除去を行う工程。
【請求項２６】
タンパク質の発現を増加させるためにインビトロで転写および翻訳を行う方法であって、以下の工程（ａ）〜（ｇ）を包含する方法：
（ａ）目的のタンパク質をコードする（デオキシ）リボ核酸を調製する工程；
（ｂ）ＲＮＡポリメラーゼ、緩衝液、核酸混合物、および必要に応じてリボヌクレアーゼ阻害剤を含むインビトロ転写媒質に上記核酸を添加する工程であって、該核酸混合物は、１つ以上の天然型のヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ、および／またはＵの代りとしての、請求項５に定義されている１つ以上の塩基修飾ヌクレオチドと、天然型のヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ、またはＵの全てが置換されるわけではない場合、必要に応じて、１つ以上の天然型のヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ、またはＵとを含む、工程；
（ｃ）上記インビトロ転写媒質中にて上記核酸をインキュベートし、該核酸をインビトロ転写する工程；
（ｄ）必要に応じて、精製および組み込まれなかったヌクレオチドの上記インビトロ転写媒質からの除去を行う工程；
（ｅ）工程（ｃ）および必要に応じて工程（ｄ）において得られた塩基修飾された核酸を、インビトロ翻訳媒質に添加する工程；
（ｆ）上記インビトロ翻訳媒質中にて上記塩基修飾された核酸をインキュベートし、該塩基修飾された核酸によってコードされるタンパク質をインビトロ翻訳する工程；
（ｇ）必要に応じて、工程（ｆ）において翻訳されたタンパク質を精製する工程。
【請求項２７】
宿主細胞中におけるタンパク質の発現を増加させるためにインビトロで転写および翻訳を行う方法であって、以下の工程（ａ）〜（ｇ'）を包含する方法：
（ａ）目的のタンパク質をコードする（デオキシ）リボ核酸を調製する工程；
（ｂ）ＲＮＡポリメラーゼ、緩衝液、核酸混合物、および必要に応じてリボヌクレアーゼ阻害剤を含むインビトロ転写媒質に上記核酸を添加する工程であって、該核酸混合物は、１つ以上の天然型のヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ、および／またはＵの代りとしての、請求項５に定義されている１つ以上の塩基修飾ヌクレオチドと、天然型のヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ、またはＵの全てが置換されるわけではない場合、必要に応じて、１つ以上の天然型のヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ、またはＵとを含む、工程；
（ｃ）上記インビトロ転写媒質中にて上記核酸をインキュベートし、該核酸をインビトロ転写する工程；
（ｄ）必要に応じて、精製および組み込まれなかったヌクレオチドの上記インビトロ転写媒質からの除去を行う工程；
（ｅ'）工程（ｃ）および必要に応じて工程（ｄ）において得られた塩基修飾された核酸を、宿主細胞にトランスフェクトする工程；
（ｆ'）上記宿主細胞中にて上記塩基修飾された核酸をインキュベートし、該塩基修飾された核酸によってコードされるタンパク質を翻訳する工程；
（ｇ'）必要に応じて、工程（ｆ）において翻訳されたタンパク質を単離および／または精製する工程。
【請求項２８】
培養された細胞または組織、または、生物の体から外植された細胞または組織を、請求項２４に記載の塩基修飾されたＲＮＡによってトランスフェクトする工程を包含する治療用細胞の製造方法。
【請求項２９】
上記工程によりトランスフェクトされた細胞が抗原提示細胞（ＡＰＣ）である、請求項２８に記載の製造方法。
【請求項３０】
請求項２４に記載の塩基修飾されたＲＮＡ配列を含んでいる、ＲＮＡライブラリー。
【請求項３１】
細胞／組織転写物の一部を提示するサブトラクションライブラリーである、請求項３０に記載のＲＮＡライブラリー。
【請求項３２】
以下の工程（ａ）〜（ｃ）によって特徴付けられる方法より取得される、ＲＮＡライブラリー：
（ａ）任意の細胞または組織から、ｃＤＮＡライブラリーまたはその一部を作製／調製する工程；
（ｂ）上記ｃＤＮＡライブラリーまたはその一部を用いて、本発明に係る塩基修飾されたＲＮＡをインビトロ転写するためのマトリックスを作製／調製する工程；
（ｃ）上記マトリックスをインビトロ転写する工程。
【国際調査報告】
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