(57)【要約】  ある化学反応又は生化学反応を実行するための組成物であり、前記組成物は凍結乾燥形態であり、(i)前記化学反応又は生化学反応を実施するために必要な化学又は生化学試薬を少なくとも幾つか含む複数の試薬のセットであり、少なくとも1つの試薬が蛍光剤(fluorescent)である前記セット、(ii)ガラス形成剤(glass forming agent)、及び(iii)スレオニンを含む、前記組成物。これらの組成物を含むキット及びそれらの使用方法は、本発明の更なる側面を形成する。
2010529850.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学反応又は生化学反応を実行するための組成物であり、前記組成物は凍結乾燥形態であり、
(i)前記化学反応又は生化学反応を実施するために必要な化学又は生化学試薬を少なくとも幾つか含む複数の試薬のセットであり、少なくとも1つの試薬が蛍光剤(fluorescent)である前記セット、
(ii)ガラス形成剤(glass forming agent)、及び
(iii)スレオニン
を含む、前記組成物。
【請求項２】
前記組成物中に2〜10mMの量の前記スレオニンが存在する、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
前記ガラス形成剤(ii)が非還元糖(non-reducing sugar)である、請求項1又は請求項2のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項４】
前記ガラス形成剤の安定化剤(iv)を更に含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項５】
前記安定化剤(iv)が、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリビニルピロリジン(PVP)、又は多糖から選択される、請求項5に記載の組成物。
【請求項６】
前記試薬セット(i)が、蛍光試薬を含むポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の実行に特に適合した複数の試薬のセットである、請求項1〜5のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項７】
前記試薬セットが、ポリメラーゼ連鎖反応のときに鋳型核酸配列と結合したときにプライマーを伸長させることが可能なポリメラーゼを含む、請求項6に記載の組成物。
【請求項８】
前記試薬セットが、DNA配列を増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応を実施するのに適した緩衝剤、塩、プライマー、及びヌクレオチドを全て含む、請求項6又は請求項7に記載の組成物。
【請求項９】
前記(i)の混合物が、DNA配列を増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応を実施するのに適した緩衝液、プライマー、及びヌクレオチドを含む、請求項6又は請求項7に記載の組成物。
【請求項１０】
蛍光標識した試薬が、リアルタイムでポリメラーゼ連鎖反応の進行をモニタリングするのに有用な、標識されたオリゴヌクレオチドを含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記標識されたオリゴヌクレオチドが、2つの標識を担持するプローブであり、前記標識の1つがエネルギーの供与体として作用し、もう1つがそのエネルギーの受容体である、請求項10に記載の組成物。
【請求項１２】
前記標識されたオリゴヌクレオチドが分子ビーコンの形態をとる請求項10又は請求項11のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物が1対の標識されたプローブを含み、前記プローブの1つが担持する標識が蛍光エネルギー供与体であり、及び前記プローブのもう1つが担持する標識が前記エネルギー供与体からの蛍光エネルギーを受容することが可能であり、更にそれらのプローブがごく近接してPCR生産物鎖上にハイブリダイズする、請求項10に記載の組成物。
【請求項１４】
前記組成物が、前記蛍光標識されたオリゴヌクレオチドとのエネルギー交換が可能なDNA二重鎖結合剤を更に含む、請求項10〜13のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１５】
PCR反応の開始を制御することが可能な1つ以上の試薬を更に含む、請求項5〜14のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記試薬が抗-Taq抗体である、請求項15に記載の組成物。
【請求項１７】
RNAse阻害剤を更に含む、請求項5〜16のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１８】
RNAse阻害剤のユニット数が、少なくとも前記組成物中に存在するポリメラーゼの量と同一又はそれ以上である、請求項17に記載の組成物。
【請求項１９】
抗-酸化剤及び／又は抗-メイラード剤(anti-maillard agent)を更に含む、請求項1〜18のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項２０】
ブロッキング化合物を更に含む、請求項1〜19のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項２１】
請求項1〜20のいずれか1項に記載の組成物を調製する方法であり、前記組成物の内容物を全て混合し、続いて得られた混合物を凍結乾燥することを含んでなる前記方法。
【請求項２２】
請求項5に記載の組成物及び再水和(rehydration)緩衝剤を含むキット。
【請求項２３】
前記組成物がPCRを実行するのに必要な塩を含有しておらず、それらの塩を前記再水和緩衝剤が含有している、請求項22に記載のキット。
【請求項２４】
化学反応又は生化学反応を実施する方法であり、請求項1〜20のいずれか1項に記載の組成物を水和し、続いてこれを化学反応又は生化学反応が起こり得る条件下に置き、更にその蛍光シグナルをモニタリングすることを含む前記方法。
【請求項２５】
蛍光試薬を含む凍結乾燥した組成物の安定化剤としての、L-スレオニンの使用。
【請求項２６】
凍結乾燥した組成物の安定化剤としての、RNA分解酵素阻害剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応等の化学反応又は生化学反応において使用される試験用試薬を含む組成物、及びこれらの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
日常的に同時に使用される試薬の調製済み混合物を提供する様々な調製品が市販されている。例えば、広く使用されるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)(逆転写(RT)-PCRを含む)は、核酸の増幅に必要な、塩化マグネシウム及び塩化カリウム等の塩、Taqポリメラーゼ等のポリメラーゼ酵素、Tris-HCl等の緩衝剤、並びにヌクレオチドを含む様々な標準的な試薬を利用する。
【０００３】
そのような調製品としては、例えばAmersham BioSciences(UK)又はPharmaciaから「ready-to-go PCR beads」等が市販されている。
【０００４】
一般に、これらは凍結乾燥法により調製される。係る方法は、ガラス形成剤(glass-forming agent)及び形成される構造を安定化する薬剤、並びに任意により充填剤の存在下で実施される(例えば米国特許第5,250,429号、米国特許第5,763,157号、及びEP-0726310を参照されたい)。但し、ワックス担体を使用する手法等の他の種類の調製法も知られる(例えば米国特許第5,599,660号を参照されたい)。
【０００５】
これらは、研究機関において必要に応じて選択されるPCR反応を実施するための簡便な、かつ容易に入手可能な手法を提供する。一般的に、プライマー、及び例えばリアルタイムPCRに関連して使用されるのに必要な任意のプローブ等の、PCRを特定の標的に合わせて調整する特異的な試薬は、用事に添加される。
【０００６】
しかしながら、多くの場合において、特に診断の分野において、標的は多くの場合において同一であり、故に、ビーズを試験に特異的にするために、プローブ及びプライマーをビーズ中に含有することは、使用を簡略化するのに望ましい。
【０００７】
そのような全てのビーズ及び調製品は、それらの成分が常に長期間安定であり続けるわけではないという問題がある。試験の性質がより複雑になっていくために、標識、特に蛍光標識又は色素等の視覚的標識等の相対的に検出しやすい化学部分を含み得る試薬を含む更なる試薬が添加される必要があり得る。これらは、特に、「リアルタイム」の実験の実施に使用され得る。前記検出しやすい部分は、しばしばプローブ又は標識されたプライマーとして機能するように設計されたオリゴヌクレオチドに付加される。これらは一連のPCRの間に増幅された核酸にハイブリダイズし得る。一連のPCRの間のプローブの運命及び前記標識からの関連するシグナルの変化は、PCRの進行をモニタリングするために様々な手法で使用される。
【０００８】
しかしながら、そのような部分の存在は、前記組成物の安定性に関連する問題を悪化させる場合がある。更に、組成物中の添加剤の存在は、特に蛍光標識のシグナル作用の減少を引き起こす場合がある。
【０００９】
L-スレオニンは、アルコール酸化酵素及びカタラーゼ等の酵素に関して、凍結乾燥酵素組成物における安定化剤としての使用が提案されている。(JP 61015685を参照されたい)。それは更に、遷移金属等の化学発光標識における可能な副反応物(possible co-reactant)として提案されている(WO2007/005626)。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本出願人らは、凍結乾燥組成物、特に蛍光標識を含む凍結乾燥組成物の改善を提供する手段を見出した。
【００１１】
本発明において、蛍光試薬を含む凍結乾燥組成物の安定化剤としてのL-スレオニンの使用が提供される。本出願人らは、前記組成物が非冷蔵温度で保管されていても、L-スレオニンが前記組成物に含まれるとき、前記組成物の安定化剤として機能し得るのみならず、蛍光シグナルの作用が良好に維持され得ることをも見出した。
【００１２】
適切な凍結乾燥組成物は、シグナル又は指標として蛍光標識又は部分を利用する化学反応又は生化学反応に使用されるものを含み得る。
【００１３】
本発明は、化学反応又は生化学反応を実行するための組成物を提供し、ここで前記組成物は凍結乾燥形態をとり、(i)前記化学反応又は生化学反応を実施するために必要な化学又は生化学試薬を少なくとも幾つか含む複数の試薬のセットであり、少なくとも1つの試薬が蛍光剤(fluorescent)である前記セット、(ii)ガラス形成剤(glass forming agent)、及び(iii)スレオニンを含む。
【００１４】
本出願人らは、スレオニンが効果的な抗-酸化剤及び／又は抗-メイラード剤(anti-maillard agent)として機能し、これが恐らく凍結乾燥組成物の安定性を亢進していることを見出した。特に、L-スレオニンが使用される。理論に拘束されるものではないが、前記スレオニンは、任意の酸化産物と反応し、それにより反応混合物の安定性を補助するものと考えられる。
【００１５】
更に、スレオニンの存在は、前記組成物中に(特に高温で保存されたとき)含まれる蛍光標識から検出され得るシグナル強度を高め得ることが見出された。
【００１６】
前記組成物中のスレオニンの量は、その組成物の具体的な性質に応じて異なる。それは、幾つかの化学反応又は生化学反応において重要であり得るところの前記組成物のpHに影響しない程度に適宜選択される。しかしながら、典型的には、2〜10mM、例えば約2.5mMの量のスレオニンが、前記組成物中に存在し得る。
【００１７】
ある組成物がガラス形成試薬(ii)の存在下で凍結乾燥されると、それは一般に、「ケーキ状」の三次元構造を形成する。この構造は、そのケーキ構造をとるのに適切な安定化剤(iv)を含むことにより補助されてもよい。この場合、これは前記混合物の更なる成分である。
【００１８】
適切なガラス形成試薬は、糖、特に非還元糖、例えばトレハロース、スクロース、又はマンノースを含む。適切には、最終的な組成物中に約1〜10％w/w、適切には約5％w/wの量の前記試薬が存在する。
【００１９】
前記組成物中に含まれ得る適切な安定化剤の例として、ポリマー化合物、例えばポリエチレングリコール(PEG)、ポリビニルピロリジン(PVP)等、及び、又は多糖類、例えばフィコール(Ficoll)、若しくはデキストラン等が含まれる。しかしながら、特定の態様において、安定化剤は前記組成物に加えられない。これは、PEG等の化合物が蛍光シグナルの阻害に関与する場合があることが見出されたためである。
【００２０】
また、幾つかの場合において、ケーキの安定性を補強するために、ゼラチンが使用されてもよい。ゼラチンは、ウシ、ブタ、海藻(カラギーナン)、又は魚ゼラチン等の様々な供給源から収得されてもよい(ウシを供給源とする場合、BSEを保有しないことが保証されたものが適切である)。
【００２１】
上記複数の試薬のセット(i)は、達成されるべき化学反応又は生化学反応の具体的な性質に応じて選択される。それらは、診断的試験、スクリーニング試験、核酸増幅反応、塩基配列解読反応等の、複数回、又は反復して実施される反応を含み得る。前記試薬セットは、蛍光物質(fluorophore)又は蛍光部分が採用され、特に、それらの手順を達成させるために酵素の使用に頼る、いずれかの試験又は反応において使用されるのに適切であり得る。そのような試験の具体的な群としては、核酸塩基配列解読反応及び核酸増幅反応(ポリメラーゼ連鎖反応(PCR))を含む)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、鎖置換増幅(strand displacement amplification)(SDA)、転写-媒介性増幅(TMA)、ループ-媒介性等温増幅(LAMP)、ローリングサークルDNA増幅(rolling circle DNA amplification)、多重ライゲーション依存性プローブ増幅(MLPA)、及び多重置換増幅(multiple displacement amplification)がある。
【００２２】
適切な蛍光試薬は、蛍光色素、あるいはSYBR Green I若しくはSYBR Gold等のSYBR Green、エチジウムブロマイド、YOPRO-I、並びにSYTO色素、例えばSYTO 9等の緑色色素及びSYTO（登録商標）17、SYTO（登録商標）59、SYTO（登録商標）60、SYTO（登録商標）61、SYTO（登録商標）62、SYTO（登録商標）63、及びSYTO（登録商標）64等の赤色SYTO色素等のインターカレーターを含み得る。
【００２３】
また、それらは、蛍光標識で標識されたプローブ及びプライマーを含む。適切な標識には、フルオレセイン又はフルオレセイン誘導体、例えばカルボキシフルオレセイン化合物、例えば5-カルボキシフルオレセイン、6-カルボキシフルオレセイン等、又はそれらのスクシンイミジルエステル等、シアニン色素、又はローダミン色素が含まれる。そのような色素の具体例としては、フルオレセイン、JOE、FAM、HEX、TET、TAMRA、ROX Cy5、Cy3、Cy5.5、BoDIPY FL、ローダミン、ローダミングリーン、ローダミンレッド、オレゴングリーン488、500、又は514、テキサスレッド(Texas red)、ライトサイクラーレッド(LightCycler Red)610、640、670、又は705が含まれる。
【００２４】
また、ダーククエンチャーが存在してもよい。これらは、蛍光シグナルを変化させるがそれら自体は検出可能なシグナルを放出しない実験系において一般に使用される。これらは本質的に非蛍光色素であり、具体的には、アゾ色素(DABCYL又はDABSYL色素及びそれらの構造的類似体)、トリアリールメタン色素、例えばマラカイトグリーン若しくはフェノールレッド、4'5-ジエーテル置換フルオレセイン(例えば米国特許第4,318,846号に記載されている)、又は非対称シアニン色素クエンチャー(例えば、WO 99/37717に記載される。なお、それぞれの内容は、本明細書中に参照により援用される)が含まれる。
【００２５】
特に、消光部分は、DABCYL(4-（ジメチルアミノアゾ)ベンゼン-4-カルボン酸)又はその誘導体、例えばハロゲン化物又はアミド誘導体であり、これらは前記部分がオリゴヌクレオチドのアミノ酸に結合するのを促進する。
【００２６】
もう一つの態様において、前記消光部分は、本質的に、1つ以上の窒素原子が芳香族又は複素芳香環系により置換された3-及び／又は6-アミノキサンテンの非蛍光性誘導体である(例えば、米国特許第6,399,392号に記載される。なお、その内容は、本明細書中に参照により援用される)。典型的には、これらの消光色素は、最高で530nmを超える吸光を示し、検出可能な蛍光を殆ど又は全く発せず、化学発光物質、リン光物質、又は蛍光物質から発せられる発光放射を、効率的に広い範囲で消光する。一の態様において、前記消光色素は、置換されたローダミンである。もう一つの態様において、前記消光色素は、置換されたロドールである。
【００２７】
特定の態様において、前記複数の試薬のセットは、特にポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を実行するのに適合した複数の試薬のセットである。この場合、項目(i)は、一般に、ポリメラーゼ連鎖反応の間に鋳型核酸配列と結合したときにプライマーを伸長させることが可能なポリメラーゼを含む。前記鋳型核酸はDNA、又はRT-PCRの場合はRNA配列であってもよい。
【００２８】
適切には、上記項目(i)の複数の試薬のセットは、標的DNA配列を増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応をもたらすのに必要なプライマーの伸長を構築するのに必要な、緩衝剤、塩、1つ以上のプライマー、及びヌクレオチドを含む。典型的なPCRにおいて、使用される緩衝剤は、一般に、pHが8.3〜9、例えば8.5〜8.8であり得る。しかしながら、特にこれらの要素が後で容易に添加され得るときは、1つ以上のこれらの要素が含まれていない場合があり、その場合、それらは例えば乾燥した組成物を使用直前に再構築するのに使用される再水和緩衝剤中に含まれる。特に、必要な塩類はこのようにして添加されてもよく、故に前記項目(i)の複数の試薬のセットは、それらの塩を含んでいない場合がある。この場合、前記組成物は、必要な塩の添加物を含む再水和緩衝剤を有するキットの形態で供給され得る。
【００２９】
前記組成物は、ポリメラーゼ連鎖反応の進行をリアルタイムでモニタリングするのに有用な、蛍光標識されたオリゴヌクレオチドを更に含んでもよい。本明細書中で使用される場合も、「リアルタイム」という表現は、そのポリメラーゼ連鎖反応を進行させながら、停止させず、又は反応容器を開けることなくモニタリングすることが出来ることを意味する。増幅がどのように起こるか、及び特に単位複製配列(amplicon)における指数関数的な増加が顕著になるサイクルをモニタリングすることにより、PCRの対象であるサンプル中に存在する標的核酸の量を、当業者に周知であり、かつ常識である技術を用いて定量することが出来る。
【００３０】
前記組成物中に含まれる様々な成分の量は、具体的な成分の正確な性質、実施されるべきPCRの性質等に応じて異なる。しかしながら、これは、当該技術分野において既知であるべき従来のプロトコル及び手順を使用して、各場合において決定可能であり得る。
【００３１】
適切な標識されたオリゴヌクレオチドは、リアルタイムでポリメラーゼ連鎖反応をモニタリングするのに使用され得る標識されたプローブ又は標識されたプライマーのいずれかである。従って、特定の態様において、それらは、増幅された核酸配列とハイブリダイズすることが可能であり、及び蛍光標識、特にPCRの進行に関連して変化するシグナルを提供する蛍光標識を担持するプローブを含み得る。
【００３２】
従って、例えばTAQMAN(商標)アッセイにおける利用が意図されるプローブは、一般に、1つがエネルギー、特に蛍光エネルギーの供与体として機能し得て、及び1つがそのエネルギーの受容体、あるいは「クエンチャー」として機能し得る、2つの標識を担持するプローブを含む。そのプローブが無傷である間は、エネルギーの相互作用が起こるように、これらの標識は互いに接近して固定されている。蛍光標識においては、これは、蛍光エネルギー移動(FET)又は蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)として知られる。
【００３３】
前記プローブは、鋳型核酸の一方の鎖状の特定の領域に結合するように設計されている。この鎖にPCRプライマーがアニーリングした後、Taq酵素が、5'-3'ポリメラーゼ活性をもってそのDNAを伸長する。また、Taq酵素は、5'-3'エキソヌクレアーゼ活性も有する。TaqMan(商標)プローブは、Taq伸長が開始されるのを防止するために、3'末端をリン酸化することにより保護されている。前記TaqMan(商標)プローブが生産された鎖とハイブリダイズすると、伸長反応を進めているTaq分子がそのプローブを加水分解し、前記供与体を前記受容体から開放する。これは、前記供与体と前記受容体との間の相互作用が破られたことを意味し、これにより各プローブから発せられるシグナルが変化し、このシグナルが検出の基礎として使用され得る。この手法におけるシグナルは累積的であり、増幅反応のサイクルが重ねられるにつれて、有利状態の供与体及び受容体分子の濃度は増大してゆく。
【００３４】
ハイブリダイゼーションプローブは、様々な形態で入手可能であり、またこれらは組成物中に含有されている場合もある。分子ビーコンは、それらがヘアピンループを形成するように、相補的な5'及び3'配列を有するオリゴヌクレオチドである。2つの末端蛍光標識は、ヘアピン構造が形成されたときにFRETが起こる程度にごく近接する。相補的配列に分子ビーコンがハイブリダイズすると、前記蛍光標識が隔離され、これによりFRETが解除され、これがポリメラーゼ連鎖反応の過程の検出の基礎をなす。
【００３５】
また、対となる標識されたオリゴヌクレオチドも、ポリメラーゼ連鎖反応の検出におけるプローブとして使用され得る。これらは、PCR生産物鎖上に互いがごく近接してハイブリダイズし、双方が担持する供与体及び受容体分子がFRETを引き起こす。FRETの亢進が、検出の基礎である。この種類の方法は、例えば、欧州特許出願第0912760号に記載されており、その全ての内容は、本明細書に参照により援用される。この種類の変法として、単独の隣接プローブ(adjacent probe)を有する標識された増幅プライマーの使用が含まれる。
【００３６】
WO 99/28500(その全ての内容は、本明細書に参照により援用される)において、試料中の標的核酸の存在を検出するための非常に好ましいアッセイが記載されている。この方法において、DNA二重鎖結合試薬、及び前記標的配列に特異的なプローブが、その試料に添加される。前記プローブは、前記DNA二重鎖結合試薬から発せられる蛍光を吸収することが可能な、又は前記DNA二重鎖結合試薬に蛍光エネルギーを供与することが可能な反応性分子を含む。そして、この混合物は、標的核酸が増幅する増幅反応に付され、続いて増幅プロセスの途中で、又はその後で、前記プローブが標的配列とハイブリダイズするように条件が誘導される。前記試料から発せられる蛍光がモニタリングされる。
【００３７】
従って、「Resonsence(商標)」として知られる、このアッセイで使用されるように適用された組成物も調製され得る。この場合、その組成物は、適切には、インターカレーション色素等のDNA二重鎖結合試薬を更に含む。
【００３８】
前記プローブ状の蛍光標識から発せられる蛍光エネルギーを吸収することが可能であり、しかし可視光を放射しない、DNA二重鎖結合試薬を利用する、このアッセイの代替的な形態は、WO2004/033726において記載され、その全ての内容は、本明細書中に参照により援用される。
【００３９】
一般に、これらの種類のアッセイに使用される全てのプローブは、例えばリン酸化により、又は3'ヒドロキシル基に直接連結される標識を有することにより、3'末端で伸長が遮られる。これにより、前記プローブが第二のプライマーとして機能し、続いてPCRの間に伸長し、それにより阻害生産物が除去されるのを防ぐことが出来る。
【００４０】
いずれかの特定の組成物において使用されるプローブの量は、それがPCRの間に増加するのか若しくは加水分解されるのかに応じて、及びそのシグナル系の性質等の要素に応じて異なる。これらは、当業者に理解されるべきである。しかしながら、一般に、ある組成物に添加される(各)プローブの量は、プローブの濃度が最終濃度で0.05μM〜1μM、例えば約0.2μMとなるようにすれば十分であり得る。
【００４１】
他のリアルタイムアッセイは、モニタリング系を提供するために、標識されたプライマーを利用する。これらのプライマーの中には、自己プローブ「尾部」を含むものがあり、これらは「Scorpion」プライマーとして知られている。標識されたプローブは、前記反応に対し、「阻害基」を介してプライマーとして機能するDNA配列と連結する。適切には、これはヘキシエチレングリコールのような化学リンカー又は非増幅モノマーであり、そのオリゴヌクレオチドのプローブ領域を増幅する伸長反応を妨げる。この一般的な種類のプローブ／プライマーの組合せは、「Scorpion」として知られ、これらは例えばWO 99/66071に記載されている。前記Scorpionは、上記のようなFRETシグナリングが可能なように、その全長に、供与体／消光体の対を含む。
【００４２】
LUX(商標)(light upon extension)蛍光放射プライマーと称される更なるクラスのリアルタイムプローブも入手可能である。これらは「ヘアピン」様プローブであり、前記分子ビーコンに類似している。しかしながら、LUXプライマーは、溶液中でステムループ構造をとり、かつScorpionプローブのように、LUXプライマーは、PCRプライマーとして使用されることが意図される。配列の状況に基づいて自己消光するように設計された蛍光オリゴヌクレオチドであるので、それらは消光部分を含まない。LUXプライマーは、溶液中で遊離状態にあるときは消光しており、変性(denature)状態のときは弱い蛍光を発し、及びDNA中に組み込まれているときは強力な光を放射する。これらも、本発明の組成物中に含まれてもよい。
【００４３】
前記試薬セット(i)に含まれるポリメラーゼは、それが所望の「リアルタイム」アッセイを引き起こすのに有用であるように選択される。従って、検出可能なシグナルを発するためにプローブの加水分解が必要であるTAQMAN(商標)等のアッセイにおいて、高レベルの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼが適切に採用され、他方、プローブのハイブリダイゼーションが採用されるResonsence(商標)アッセイにおいては、そのような活性は低い又は欠いたものであってもよい。前記ポリメラーゼは、適切には、ポリメラーゼ連鎖反応を引き起こすのに必要な高温条件下で活動し得て、及びこれに耐え得る、熱安定性のポリメラーゼである。添加されるポリメラーゼの量は、当該技術分野において理解されるように、PCR反応を導くのに十分であるべきである。典型的には、添加されるポリメラーゼの量は、組成物中に0.02〜1.0U/μl、典型的には約0.025U/μlの濃度があれば十分であり得る。
【００４４】
適切には、前記組成物は、ポリメラーゼ連鎖反応の早発的な開始を妨げるのに使用される試薬を更に含んでもよい。いわゆる「ホットスタート（Hot-Start)」PCRは、様々な方法により達成され得る。
【００４５】
「ホットスタート」PCRが対照とする問題は、PCRの成否が、変性、アニーリング及び伸長という一連のステップに依存しているために生じる。これらのステップは、そのステップの操作に必要な、非常に正確な順番で、及び正確な温度下で実施しなければならない。試薬が混合されるとき、例えば反応開始前、短時間であっても異なる温度にあることが問題となる。プライマーが核酸鋳型と相互作用し、その温度で伸長を起こす。これは、所望の生産物の全体的な収量の減少、及び非特異的な生産物の生産を招き得る。
【００４６】
この問題を克服する最初の試みは、試験管中の異なるPCR試薬を互いに隔離するのに蝋の障壁を使用することであった(例えば、USP 5,565,339を参照されたい)。最初の変性温度まで反応混合物が加熱されるとその蝋が融解し、最後にそれらの試薬が混合される。それにより、副反応の起こる可能性が最小になり、これが「ホットスタート」という表現を生じさせた。
【００４７】
副反応の抑制を達成する他の化学的手法も試みられている。例えば、米国特許第5,677,152号には、DNAポリメラーゼを化学的に修飾して、それが高温のときにのみ活性となるようにする方法が記載されている。この手法を達成するために、上記項目(i)が、適切に修飾されたDNAポリメラーゼを含むことが必要である。
【００４８】
もう一つの態様において、Sigmaから販売されている抗-Taq DNAポリメラーゼ抗体等の、Thermus aquaticus(Taq)DNAポリメラーゼに対するモノクローナル抗体が、前記組成物中に含まれる。室温では、その抗体が前記酵素に結合して、その酵素を不活性化する。しかし、増幅サイクルの時に用いられる高温においては、その抗体は変性し、そして前記酵素から解離し、それによりその酵素は活性化する。
【００４９】
前記組成物中に含まれる任意の抗-Taq抗体の相対量は、適切には、それが必要な程度にTaq酵素を抑制する機能を満足させることが出来るようにするのに十分な量である。従って、一般に、Taq酵素と比較して、過剰な量の抗-Taq抗体が添加されてもよい。故に、例えば、前記組成物中のTaq酵素1ユニットあたり、少なくとも1.5、好ましくは少なくとも2ユニットの抗-Taq抗体が含まれる。Taq抗体は、通常、μg単位で販売され、その濃度は、供給源及び抗体の品質、並びにそのアッセイの性質に大きく依存する。抗体が余りにも多いと不利益があり、実際に幾つかのアッセイでは、プライマー二量体の増大を引き起こした。しかしながら、Taq抗体の正確な量は通常の手段に従い決定され得て、典型的には、最終反応混合物中に0.001〜0.004μg/μlの範囲にあり得る。
【００５０】
プライマー伸長を妨げる阻害的な量のピロリン酸塩と、高温条件下でピロリン酸塩を分解し、PCRの進行を可能とするピロリン酸塩分解酵素との組合せの使用を含むなおももう一つのホットスタート法は、WO 02/088387に記載され、その全ての内容は、本明細書に参照により援用される。
【００５１】
この場合、前記ピロリン酸塩及びピロリン酸塩分解酵素は、本発明の組成物の更なる成分として含まれてもよい。
【００５２】
追加的な安定化剤(iv)の使用及び的確な選択は、ある程度、最終的な組成物を使用して実行を意図している具体的なアッセイに左右されてもよく、これは慣用的な手法を使用して試験され得る。例えば、前記組成物がDNA二重鎖結合試薬及び標識されたプローブを含み、上記のResonSense(商標)アッセイを行うために使用されることが意図されるときは、デキストランはあまり好ましくない。しかしながら、殆どのこれらの組成物において、PEGは特に適した安定化剤である。安定化剤は、適切には、最終的な組成物中に約1〜3％w/w存在するように添加される。
【００５３】
上で考察したように、項目(i)の試薬セットは、一般にPCR反応混合物の調製に必要と理解される量の緩衝剤、プライマー、ヌクレオチド及び任意の塩等を含み得る。プライマーは、適切には過剰に存在し、これは典型的には、最終的な組成物中の各プライマーの濃度を0.1μM〜1μM程度とするのに十分なプライマーを含むことにより達成される。
【００５４】
本発明の組成物は、RNA分解酵素阻害剤を更に含んでもよい。本出願人らは、その組成物がRNA要素を含まず、又はRT-PCRのような、RNAが関与する増幅反応における使用を意図していないにもかかわらず、RNA阻害剤の添加が前記組成物を安定化させる作用を有するという驚くべき知見を見出した。その添加は長期間にわたり前記組成物の安定性を改善し、その期間の経過後にリアルタイムPCR法に使用されたとき、その組成物はなおも有効な態様でこれを遂行することが出来る。
【００５５】
理論に拘束されること無く、それらはポリメラーゼによるプローブの攻撃の防止を、あるいはポリメラーゼの活性の制御を補助することが可能であるが、その理由は不明である。RNA分解酵素阻害剤(例えば、Invitrogenから入手可能なRI Out等の市販のRNA分解酵素阻害剤等)のユニット数は、適切には、組成物中のポリメラーゼの活性を制御するのに十分な値であるべきである。従って、一般に、RNA分解酵素阻害剤は、効果的な阻害を確保するために、概ね同程度のユニット数、又は好ましくは組成物中に存在するポリメラーゼより高いユニット数であってもよい。例えば、ある組成物中に0.05U/μlのポリメラーゼが含まれている場合、これは、0.04〜0.1 U/μlのRNA分解酵素阻害剤を含み得る。
【００５６】
特定の態様において、公知のPCR反応混合物と同じく、組成物中にブロッキング化合物が含まれ得る。ブロッキング化合物は、試験管の壁面との相互作用によるPCRの阻害を防止することにより、例えば、その反応の時に壁面から滲出し得る金属又は封鎖した(sequestering)任意の金属の漏出を防止することにより、作用すると考えられている。ブロッキング化合物の性質は、その中で反応が行われるべきことが意図される試験管の性質に依存し得る。
【００５７】
ブロッキング化合物の具体例は、ウシ血清アルブミン(BSA)等のガラスコーティング若しくはガラスブロッキング化合物単独、又はこれとゼラチン等の他のブロッキング材料との組合せである。上記のように、ゼラチンは、ウシ、ブタ、海藻（カラギーナン)又は魚ゼラチン等を含む、様々な供給源から収得され得る。
【００５８】
ブロッキング剤は、好ましくは、選択される具体的な化合物に応じた効果的な量が含まれる。しかしながら、例えばBSAにおいて、その量は、適切には、最終的な組成物中に0.1〜1mg/ml、好ましくは約0.25mg/mlを提供するのに十分な量である。ゼラチンは、適切には、約0.0025％〜0.01％w/wの範囲の量が存在する。ブロッキング剤の量が最終的な反応を顕著に阻害するのに十分なほど高くならないように、注意を払うべきである。
【００５９】
PCRの分野において理解されるべき更なる成分が、前記組成物中に更に含まれ得る。これらは、内部対照として使用される配列、及びこれらの配列を増幅するプライマー、並びに内部対照配列の増幅を検出するための、上に概説したシグナル系を含み得る。
【００６０】
本発明の組成物は、適切には、上記のような所望の成分を一緒に混合して組成物を形成し、続いてその組成物に水、好ましくはジエチルピロカルボネート(DEPC)で処理した滅菌水を添加して混合し易くすることにより調製される。例えば、添加される水の量は、組成物に対して少なくとも等量、及び好ましくはその1〜1.5倍である。そうして形成された混合物は、必要に応じて、独立した反応ポット中で各分注単位(aliquot)がPCRに十分な材料を含有するように適宜分注し、続いて凍結乾燥工程に付す。凍結乾燥を直ちに行わない場合は、前記最終的な混合物は、低温、例えば氷上で、又はもし凍結乾燥を行うまで0.5時間を越えて長時間置くのであれば、冷凍庫中等で保管するのが適切である。
【００６１】
使用される凍結乾燥プロトコールは、乾燥される具体的な組成物にある程度依存し得て、及びそれぞれの場合において慣用的な手順を使用して決定され得る。典型的には、前記組成物は凍結工程に付され、その工程において、圧力300〜400torrで、低温、例えば約-20℃〜-40℃、一般には約-40℃で冷却され、完全に凍結が完了するまでの十分な時間、その温度が維持される。
【００６２】
更に、使用される具体的な凍結乾燥機に依存して、適切なレベルまで減圧される。幾つかの場合、圧力を6Mtorr程度の低圧で動作する場合もあるが、通常の目的においては、水を昇華させるのには、圧力を10〜100mtorrとするのが適切であり得る。続いて、適切には、前記組成物は、凝縮効果(condensation effect)を最小にするため、真空状態を開放する前に、減圧下で徐々に室温に戻される。任意的に、前記真空状態は、生産物が不活性環境下で維持されるように、窒素等の不活性ガスの存在下で開放される。また、これは湿気侵入を防止する。
【００６３】
凍結乾燥生産物は、適切には、例えばホイル包装材等で直ちに包装され、コンタミネーションのリスクを最小にする。前記組成物を試薬ポット等の容器中に保管する場合は、それらは適切には、真空状態が開放される前に密封される。
【００６４】
前記組成物において使用される全ての試薬が、凍結乾燥を阻害又は妨げる材料又は汚染物を検出可能なレベルで含まないことを保証するべく、配慮する必要がある。そのために、例えば、ポリメラーゼ、逆転写酵素ポリメラーゼ及びRNA分解酵素阻害剤のような市販の酵素等に含まれる場合があるグリセロール等の物質の除去、並びに、又は、DNA二重鎖結合剤として使用され得るインターカレーション色素中に含まれ得るジメチルスルホキシド(DMSO)等の物質のレベルの低下が必要となり得る。
【００６５】
上記のような組成物は、3ヶ月の長期間に渡り安定であることが見出されており、その期間の経過後、活性の損失は全く認められなかった。
【００６６】
上記の組成物を形成する方法は、本発明の更なる側面を形成する。特定の態様において、本発明は、凍結乾燥組成物を調製する方法を提供し、それは、少なくとも上記項目(i)〜(vi)を一緒に混合し、続いて得られた混合物を凍結乾燥する工程を含む。
【００６７】
本発明の組成物をしようするとき、公知の手法、例えば再水和緩衝剤を使用して水和され、それから適切な化学反応又は生化学反応に付される。一般に、前記組成物は、その反応が行われる前に、化学又は生化学試料と混合され得る。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応の場合、前記混合物は、標的核酸が含まれている、又は含まれていると推察される試料と組み合わせられ、続いてその最終的な混合物はPCR条件に付される。蛍光試薬から発せられる蛍光は、必要に応じて、プロセスの前、途中、又は後にモニタリングされる。特に、当該技術分野において理解されるように、リアルタイムPCRにおいてシグナルをモニタリングすることにより、その反応の進行をモニタリングすることが可能となり、それにより試料中のサンプルの量を定量することが可能となる。そのような方法は、本発明の更なる側面を形成する。
【００６８】
よって、更なる側面において、本発明は、反応組成物においてRNA分解酵素阻害剤を安定化剤として使用することを提供する。
【００６９】
よって、例えば、試料中の標的DNA配列をリアルタイムでその反応をモニタリングし得る方法で増幅するポリメラーゼ連鎖反応を実行するための組成物は、(a)ポリメラーゼ連鎖反応の時に鋳型DNA配列に結合したプライマーを伸長することが可能なポリメラーゼを含む、ポリメラーゼ連鎖反応を導くのに適した複数の試薬のセット、(b)リアルタイムでポリメラーゼ連鎖反応の進行をモニタリングするのに有用な、標識されたオリゴヌクレオチド、及び(c)RNA分解酵素阻害剤を含む、調製済みの前記組成物である。そのポリメラーゼ連鎖反応が逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応ではなく、またその反応においてRNA要素が存在又は関与せず、更にその反応において逆転写酵素が使用されていない場合であっても、RNA分解酵素阻害剤の添加は有利なものであり得る。
【００７０】
適切には、RNA分解酵素阻害剤のユニット数は、その組成物中に存在するポリメラーゼの量と比較して、少なくとも同一であるか、又はそれよりも大きくなり得る。これらの組成物は、(d)ガラス形成剤、及び任意的に(e)安定化剤を更に含み、これが上記のように凍結乾燥される。更に、試薬(a)は、上記(i)との関連でRCR試薬であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】ここで、本発明は、添付の図を参照して、実施例として具体的に記載される。添付図は、公知のTaqManアッセイを実施するように適合された本発明の組成物と、対照としてそのスレオニン成分を抜いた類似の組成物とを使用してそれぞれ取得された、蛍光強度対サイクル数を示すグラフである。
【実施例】
【００７２】
実施例1
Bacillus subtilis var. globigii (BG)のDNA及び胞子を検出するために、Resonsense(商標)を使用するための組成物の調製
以下の試薬を、共に混合した。プライマーは、公知のプライマー設計ソフトウェアを使用して、BG特異的DNA配列を増幅するように設計された。プローブは、2つのプライマーの中間の増幅されたBG配列とハイブリダイズするように設計され、更に公知のFAM標識で蛍光標識された。
【００７３】
【表１】
2010529850.tif 000003
【００７４】
これらを反応試験管中で組み合わせ、それを氷上で保管し、続いて予め半時間以内冷蔵庫で冷却しておいた試薬ポット中に50μlずつ分注された。これらはそれから凍結乾燥機(Virtis Advantage)内に置かれた。凍結乾燥機で実行された一連のプログラムを、表3において要約する。
【００７５】
【表２】
2010529850.tif 000004
【００７６】
それから、前記ポットは凍結乾燥機から取り出され、直ちにホイルで封じられた。それらは室温で保管されたが、6週間後に試験を行ったときも完全な活性を保持していた。
【００７７】
実施例２
ATXのDNAを検出するために、デュアルハイブリダイゼーションアッセイを行うための組成物の調製
実施例1の手順を概ね踏襲し、単一のFAM標識プローブに代わりデュアルハイブリダイゼーションプローブの対を使用する点を除いて、表2に列記した試薬を使用する。この場合、前記プローブ対は、FAMで標識されたプローブとCy5で標識されたプローブが、増幅されたATXのDNA上に、互いにごく近接してハイブリダイズするように設計する。
【００７８】
【表３】
2010529850.tif 000005
【００７９】
前述の場合と同様に、これらの試薬を反応試験管中で組み合わせ、それを氷上で保管し、続いて予め半時間以内冷蔵庫で冷却しておいた試薬ポット中に50μlずつ分注した。続いて、これらを+5℃に予め冷却された凍結乾燥機(Virtis Advantage)内に置いた。凍結乾燥機で実行された一連のプログラムを、表5に要約する。
【００８０】
【表４】
2010529850.tif 000006
【００８１】
それから前記ポットを凍結乾燥機から取り出し、直ちにホイルで封じた。それらは室温で保管されたが、6週間後に試験を行ったときも完全な活性を保持していた。
【００８２】
実施例３
BGのDNA及び胞子を検出するために、Taqman（商標)アッセイを行うための組成物の調製
実施例1及び実施例2の手順を概ね踏襲するが、この場合は、BGのDNAのためのTaqman(商標)アッセイが準備された。表6に列記された試薬の混合物が調製された。
【００８３】
【表５】
2010529850.tif 000007
【００８４】
これらを反応試験管中で組み合わせ、それを氷上で保管し、続いて予め半時間以内冷蔵庫で冷却しておいた試薬ポット中に50μlずつ分注した。続いて、これらを予め+5℃に冷却しておいた凍結乾燥機(Virtis Advantage)内に置いた。凍結乾燥機で実行された一連のプログラムを、上記表5に要約する。
【００８５】
それから前記ポットは凍結乾燥機から取り出され、直ちにホイルで封じられた。それらは室温で保管されたが、6週間後に試験を行ったときも完全な活性を保持していた。
【００８６】
実施例４
BGのDNA及び胞子を検出するために、Lux(商標)アッセイを行うための組成物の調製
実施例1〜3の手順を概ね踏襲するが、この場合は、BGのDNAのためのLux(商標)アッセイが準備された。表7に列記された試薬を含む組成物が調製された。
【００８７】
【表６】
2010529850.tif 000008
【００８８】
これらの試薬を反応試験管中で組み合わせ、それらを上記のようにして凍結乾燥した。
【００８９】
実施例５
CHLのDNAを検出するために、Scorpion(商標)アッセイを行うための組成物の調製
実施例1〜4の手順を概ね踏襲するが、この場合は、CHLのDNAのためのScorpion(商標)アッセイが準備された。表8に列記された試薬を含む組成物が調製された。
【００９０】
【表７】
2010529850.tif 000009
【００９１】
これらの試薬を反応試験管中で組み合わせ、それらを上記のようにして凍結乾燥した。
【００９２】
実施例６
BGのDNA及び胞子を検出するための、Taqman（商標)アッセイを使用した比較研究
TaqMan(商標)混合物を、表9に列記された成分と共に混合した。
【００９３】
【表８】
2010529850.tif 000010
【００９４】
L-スレオニンを含まない、類似の混合物が作り出された。続いて、両混合物を、実施例1に記載されているように凍結乾燥した。
【００９５】
それらを一旦乾燥させた後、更に鋳型DNAを含む試料(又は対照の水)に再懸濁し、BD陽性サンプルに対する公知のTaqMan(商標)アッセイを、LihgtCycler(商標)を用いて、以下のサイクル構成下で実施した：
開始時の変性  −  95℃、2分
サイクル      −  95℃、15秒
−  55℃、20秒
【００９６】
蛍光データは、各サイクル毎に1回ずつ取得された。それらの結果は、添付した図面にグラフとして示されている。L-スレオニンを含む組成物からのシグナルは、L-スレオニンが添加されていない類似の組成物からのシグナルと比較して明らかに阻害的影響が少なかった。よって、L-スレオニンの使用は、その抗-酸化／抗メイラード特性に基づいて安定性を補助し得るという作用のみならず、蛍光シグナルの阻害を減少させ得るという作用をも有することが認められる。
【図１】
2010529850.tif 000011
【国際調査報告】
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