(57)【要約】  Streptoverticillium ladakanum(ストレプトベルチシリウム・ラダカヌム）由来のトランスグルタミナーゼの変異体で、ヒト成長ホルモンのＧｌｎ-１４１に対する改善された選択性を有する変異体を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、該配列が、配列番号：１のアミノ酸残基Ｔｙｒ６２、Ｔｙｒ７５及びＳｅｒ２５０に対する一又は複数の位置において修飾されている、単離されたペプチド。
【請求項２】
配列番号：１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、該配列が、配列番号：１のアミノ酸残基Ｔｙｒ６２、Ｔｙｒ７５及びＳｅｒ２５０に対応する一又は複数の位置において修飾されている、請求項１に記載の単離されたペプチド。
【請求項３】
配列番号：１に記載のアミノ酸配列を含んでなり、該配列が、配列番号１：のアミノ酸残基Ｔｙｒ６２、Ｔｙｒ７５及びＳｅｒ２５０に対応する一又は複数の位置において修飾されている、請求項２に記載の単離されたペプチド。
【請求項４】
前記アミノ酸配列が、１〜１０のアミノ酸をＮ末端に付加することにより修飾されている、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の単離されたペプチド。
【請求項５】
付加されたジペプチド基がＧｌｙ-Ｐｒｏ-である、請求項４に記載の単離されたペプチド。
【請求項６】
付加されたジペプチド基がＡｌａ-Ｐｒｏ-である、請求項４に記載の単離されたペプチド。
【請求項７】
ペプチドがトランスグルタミナーゼ活性を有している、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の単離されたペプチド。
【請求項８】
ペプチドがトランスグルタミナーゼ活性を有している、請求項５又は６に記載の単離されたペプチド。
【請求項９】
ペプチドが、ｈＧＨのＧｌｎ-４０と比較してｈＧＨのＧｌｎ-１４１に対して特異性を有し、該特異性が、ｈＧＨのＧｌｎ-４０と比較したｈＧＨのＧｌｎ-１４１に対して、配列番号：１に示したアミノ酸配列を有するペプチドの特異性よりも高い、請求項７又は８に記載の単離されたペプチド。
【請求項１０】
請求項１ないし９のいずれか１項に記載のペプチドをコードする核酸コンストラクト。
【請求項１１】
前記核酸コンストラクトが核酸配列を含み、該核酸配列がプロテアーゼ基質アミノ酸配列をコードし、該プロテアーゼ基質アミノ酸配列が、核酸コンストラクトによりコードされる請求項１ないし９のいずれか１項に記載のペプチドのＮ末端部又はＣ末端部として発現される、請求項１０の核酸コンストラクト。
【請求項１２】
請求項１０又は１１に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１３】
請求項１０又は１１に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１４】
請求項１２に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１ないし９のいずれか１項に記載のペプチドを含有する組成物。
【請求項１６】
ｉ）ペプチドの組換え発現を可能にする宿主細胞を、ペプチドの発現を可能にする条件下で発酵させ、
ｉｉ）工程ｉ）で発酵した組換えペプチドを含有する組成物を、さらなるイオン交換クロマトグラフィーにかける前に、カチオン交換クロマトグラフィーにかける、
実施例１ないし９のいずれか１項に記載のペプチドを調製する方法。
【請求項１７】
ａ）ペプチドの組換え発現を可能にする宿主細胞を、ペプチドの発現が可能な条件下で発酵させ、該宿主細胞は、請求項１３に記載のベクターを含み、
ｂ）ａ）で発酵した組換えペプチドを含有する組成物を、プロテアーゼ基質アミノ酸配列を切断可能なプロテアーゼを用いた処理にかける、
実施例１ないし９のいずれか１項に記載のペプチドを調製する方法。
【請求項１８】
ペプチドのコンジュゲート方法であって、該方法が、請求項１ないし９のいずれか１項に記載のペプチドの存在下で、前記ペプチドをアミン供与体と反応させることを含む方法。
【請求項１９】
前記コンジュゲートされるペプチドが成長ホルモンである、請求項１８に記載のペプチドのコンジュゲート方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の成長ホルモンのコンジュゲート方法において、前記成長ホルモンがｈＧＨ又はその変異体又は誘導体であり、配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するペプチドが、請求項１ないし９のいずれか１項に記載のペプチドの代わりに該方法において使用される場合、ｈＧＨの位置Ｇｌｎ-４０に対応する位置でコンジュゲートしたｈＧＨの量と比較したｈＧＨの位置Ｇｌｎ-１４１に対応する位置でコンジュゲートした成長ホルモンの量が、位置Ｇｌｎ-４０に対応する位置でコンジュゲートしたｈＧＨの量と比較したｈＧＨの位置Ｇｌｎ-１４１に対応する位置でコンジュゲートしたｈＧＨの量と比べて有意に増加している方法。
【請求項２１】
位置１４１に対応する位置でコンジュゲートしたｈＧＨの調製方法であって、請求項１ないし９のいずれか１項に記載のペプチドの存在下で、前記ｈＧＨをアミン供与体と反応させることを含む方法。
【請求項２２】
コンジュゲートした成長ホルモンの製薬調製方法において、請求項１ないし９のいずれか１項に記載のペプチドの存在下で、前記ｈＧＨ又はその変異体又は誘導体をアミン供与体と反応させる工程を含む方法。
【請求項２３】
ペグ化成長ホルモンの製薬調製方法において、請求項１ないし９のいずれか１項に記載のペプチドの存在下で、前記ｈＧＨ又はその変異体又は誘導体をアミン供与体と反応させ、得られたコンジュゲートした成長ホルモンペプチドを、ペグ化成長ホルモンの調製に使用する工程を含み、該ペグ化がコンジュゲート位置で生じる方法。
【請求項２４】
コンジュゲートした成長ホルモンの調製における請求項１ないし９のいずれか１項に記載のペプチドの使用。
【請求項２５】
患者の成長ホルモンの欠乏に関連した病気又は疾患の治療方法において、請求項２２又は請求項２３に記載の方法を使用して調製された薬学的調製物を、それを必要とする患者に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Streptoverticillium ladakanum(ストレプトベルチシリウム・ラダカヌム)由来のトランスグルタミナーゼの新規変異体に関する。該変異体は、改善された選択性を有し、所定のグルタミン残基でのペプチドの部位特異的修飾に使用され得る。
【背景技術】
【０００２】
性質を適切に変化させる基をタンパク質にコンジュゲートさせることにより、ペプチドの性質及び特徴を改変することはよく知られている。特に治療用ペプチドにとって、ペプチドの半減期を延長する基を前記ペプチドにコンジュゲートさせることは望ましく、又は必要でさえある場合がある。典型的には、このようなコンジュゲート基は、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、デキストラン、又は脂肪酸である−J.Biol.Chem. 271, 21969-21977 (1996)を参照。
【０００３】
これまで、トランスグルタミナーゼ(ＴＧａｓｅ)は、ペプチドの特性を変化させるために使用されている。食品産業、特にダイアリー産業において、多くの技術が、ＴＧａｓｅを使用した例えばペプチドの交差結合に利用されている。他の文献には、生理学的に活性なペプチドの特性を変えるためにＴＧａｓｅを使用することが開示されている。欧州特許出願公開第９５０６６５号、欧州特許出願公開第７８５２７６号、及びSato, Adv. Drug Delivery Rev. 54, 487-504(2002)には、ＴＧａｓｅの存在下での少なくとも一のＧｌｎを含有するペプチドとアミノ官能化ＰＥＧ又は類似のリガンド間の直接反応が開示されており、Wada、Biotech. Lett. 23, 1367-1372(2001)には、ＴＧａｓｅによる脂肪酸とのβ-ラクトグロブリンの直接コンジュゲーションが開示されており、Valdivia, J. Biotechnol. 122, 326-333(2006)には、ＴＧａｓｅにより触媒されたカタラーゼの部位特異性グリコシド化が報告されている。国際公開第２００５０７０４６８号には、ＴＧａｓｅを用いてグルタミン含有ペプチド中に官能基を導入して官能化ペプチドを形成し、次の工程において該官能化ペプチドを、該官能化タンパク質と反応可能なＰＥＧ等と反応させて、ペグ化ペプチドを形成することができることが開示されている。
【０００４】
また、トランスグルタミナーゼ(Ｅ.Ｃ.２.３.２.１３)は、タンパク質-グルタミン-γ-グルタミルトランスフェラーゼとして知られていて、一般反応：
2010518842.tif 000002
[上式中、Ｑ-Ｃ(Ｏ)-ＮＨ２はグルタミン含有ペプチドを表すことができ、Ｑ'-ＮＨ２はそのとき上で検討した反応においてペプチドに導入される官能基を提供するアミン供与体を表す]
を触媒する。
【０００５】
インビボにおける一般的なアミン供与体はペプチド結合リジンであり、そのとき上述の反応によりペプチドの交差結合が可能となる。凝固第ＸＩＩＩ因子は、損傷時に血液凝固を生じさせるトランスグルタミナーゼである。例えば、Ｇｌｎの回りのどのアミノ酸残基が、タンパク質が基質であるために必要であるかについて、様々なＴＧａｓｅは互いに異なっており、すなわち、様々なＴＧａｓｅは、どのアミノ酸残基がＧｌｎ残基に隣接しているかに応じて、基質として異なったＧｌｎ含有ペプチドを有しうる。この態様は、修飾されるペプチドが一を越えるＧｌｎ残基を含む場合に利用できる。存在するＧｌｎ残基のいくつかでのみペプチドを選択的にコンジュゲートさせることが所望される場合、この選択性は、基質として関連Ｇｌｎ残基(群)のみを受容するＴＧａｓｅを選択することにより、得ることができる。
【０００６】
ヒト成長ホルモン(ｈＧＨ)は１３のグルタミン残基を有しており、よって、ｈＧＨの任意のＴＧａｓｅ媒介性コンジュゲーションは、低選択性により潜在的に妨害される。ｈＧＨの１３のグルタミン(Ｇｌｎ)残基のうち、２つの(Ｑ１４１及びＱ４０)グルタミンが、ＴＧａｓｅ触媒の存在下で反応性であることが以前に記載されている(国際公開第２００６／１３４１４８号)。ｈＧＨのさらに特異的な官能化を媒介するＴＧａｓｅを同定する必要がある。
【発明の概要】
【０００７】
Streptoverticillium ladakanum由来のｍＴＧａｓｅ(ｍＴＧａｓｅなる用語は、それが単離された微生物により発現されるとしてＴＧａｓｅを示すために使用される)(S. ladakanum由来のｍＴＧａｓｅはｍＴＧａｓｅ-ＳＬと省略される)は、Streptomyces mobaraensis(ストレプトマイセス・モバレンス)のｍＴＧａｓｅの２倍の、さらに高い部位特異性(選択性とも呼ぶ)を有している。
【０００８】
一実施態様では、本発明は、配列番号：１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、該配列が、配列番号：１のアミノ酸残基Ｔｙｒ６２、Ｔｙｒ７５及びＳｅｒ２５０に対する位置の一又は複数で修飾されている、単離されたペプチドに関する。
一実施態様では、本発明は、本発明のペプチドをコードする核酸コンストラクトに関する。
一実施態様では、本発明は、本発明のペプチドをコードする核酸を含んでなるベクターに関する。
一実施態様では、本発明は、本発明のペプチドをコードする核酸を含んでなるベクターを含む宿主に関する。
一実施態様では、本発明は、本発明のペプチドを含有する組成物に関する。
一実施態様では、本発明は、ｈＧＨのコンジュゲート方法に関し、該方法は、本発明のペプチドの存在下でｈＧＨをアミン供与体と反応させることを含む。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、Streptomyces mobaraensis由来のｍＴＧａｓｅと、Streptoverticillium ladakanum由来のｍＴＧａｓｅの配列の配列アラインメントを示す。
【図２Ａ】図２Ａは、反応のブランクである：１,３-ジアミノプロパノールを用いた野生型ｈＧＨ。ｍＴＧａｓｅを添加せず。
【図２Ｂ】図２Ｂは、S. mobaraensis由来のＡｌａＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅである。反応時間＝３０分；選択性＝５．７；転換率＝３２％。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ＧｌｙＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅ-ＳＬである；反応時間＝１５分；選択性＝１０．３１；ｈＧＨ転換率＝５５％。
【図２Ｄ】図２Ｄは、ＧｌｙＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅ＿Ｙ７５Ａ-ＳＬである；反応時間＝３００分；選択性＝１７．３３；ｈＧＨ転換率＝４０％。
【図２Ｅ】図２Ｅは、ＧｌｙＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅ＿Ｙ７５Ｆ-ＳＬである；反応時間＝７５分；選択性＝２０．９４；ｈＧＨ転換率＝３３％。
【図２Ｆ】図２Ｆは、ＧｌｙＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅ＿Ｙ７５Ｎ-ＳＬである；反応時間＝９０分；選択性＝１５．６６；ｈＧＨ転換率＝５０％。
【図２Ｇ】図２Ｇは、ＧｌｙＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅ＿Ｙ６２Ｈ＿Ｙ７５Ｎ-ＳＬである；反応時間＝７５分；選択性＝２６．３３；ｈＧＨ転換率＝３８％。
【図２Ｈ】図２Ｈは、ＧｌｙＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅ＿Ｙ６２Ｈ＿Ｙ７５Ｆ-ＳＬである；反応時間＝１２０分；選択性＝３６．２１；ｈＧＨ転換率＝４９．４％。
【図３】図３は、ＨＰＬＣによるS. ladakanum由来ＴＧａｓｅで触媒されるｈＧＨ変異体の反応混合物の分析である。頂部：ｈＧＨ-Ｑ４０Ｎ。第１のピーク(２６．５分、面積１２３８)は生成物-Ｑ１４１であり、第２のピーク(２９．７分、面積(３７５)は残りのｈＧＨ-Ｑ４０Ｎである。底部：ｈＧＨ-Ｑ１４１Ｎ。第１のピーク(１９．２分、面積１２７)は生成物-Ｑ４０であり、第２のピーク(３０．３分、面積１１５８)は残りのｈＧＨ-Ｑ１４１Ｎである。
【図４】図４は、ＨＰＬＣによるS. mobarenseのＴＧａｓｅで触媒されるｈＧＨ変異体の反応混合物の分析である。頂部：ｈＧＨ-Ｑ４０Ｎ。第１のピーク(２６．９分、面積１２８３)は生成物-Ｑ１４１であり、第２のピーク(３０．１分、面積５１９)は残存するｈＧＨ-Ｑ４０Ｎである。底部：ｈＧＨ-Ｑ１４１Ｎ。第１のピーク(１９．５分、面積２９６)は生成物-Ｑ４０であり、第２のピーク(３０．６分、面積１２９１)は残存するｈＧＨ-Ｑ１４１Ｎである。
【図５】図５は、表５のアミノ基転移混合物３及び４のＣＩＥ ＨＰＬＣである。ピーク１＝ｈＧＨ、ピーク２＝４０位でアミノ基転移、ピーク３＝１４１位でアミノ基転移、及びピーク４＝４０／１４１位でアミノ基転移。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、ＴＧａｓｅ活性を有するペプチドを提供するものであり、該ペプチドは、ｈＧＨ中のＧｌｎ４０に対してｈＧＨ中のＧｌｎ１４１に対して改善された選択性を有し、より詳細には、本発明は、ｈＧＨのＧｌｎ-４０と比較して、ｈＧＨのＧｌｎ-１４１に対する特異性を有し、これがｈＧＨのＧｌｎ-４０と比較してｈＧＨのＧｌｎ-１４１に対し、配列番号：１に示すようなアミノ酸配列を有するペプチドの特異性よりも高いトランスグルタミナーゼペプチドに関する。
【００１１】
「ポリペプチド」及び「ペプチド」なる用語は、ここでは交換可能に使用され、ペプチド結合により連結した、少なくとも５の構成アミノ酸からなる化合物を意味すると理解されるべきである。構成アミノ酸は、遺伝暗号によりコードされるアミノ酸の群からのものであってよく、またそれらは遺伝暗号によりコードされない天然アミノ酸、並びに合成アミノ酸であってもよい。遺伝暗号によりコードされない天然アミノ酸は、例えばヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタマート、オルニチン、ホスホセリン、Ｄ-アラニン及びＤ-グルタミンである。合成アミノ酸は、化学合成により製造されたアミノ酸、すなわち遺伝暗号によりコードされるアミノ酸のＤ-異性体、例えばＤ-アラニン及びＤ-ロイシン、Ａｉｂ(ａ-アミノイソ酪酸)、Ａｂｕ(ａ-アミノ酪酸)、Ｔｌｅ(tert-ブチルグリシン)、β-アラニン、３-アミノメチル安息香酸、及びアントラニル酸を含む。名詞としての「コンジュゲート」なる用語は、修飾されたペプチド、すなわち該ペプチドの特性を改変させる部分をそれに結合させたペプチドを表すことを意図している。動詞としては、該用語は、前記ペプチドの特性を改変する部分をペプチドに結合させる方法を表すことを意図している。
【００１２】
本文脈において、「ＴＧａｓｅ活性を有するペプチド」又は「トランスグルタミナーゼ」又はその類似語は、グルタミン残基のγ-カルボキシアミド基と、アミン供与体として働く種々の第１級アミンとの間のアシル転移反応を触媒する能力を有するポリペプチドを意味することを意図している。
本文脈において、「アミノ基転移」、「グルタミン転移」、「トランスグルタミナーゼ反応」又はその類似語は、タンパク質／ペプチドからのグルタミン残基のγ-グルタミニルが、アンモニア分子が放出される水又はリジンのε-アミノ基又は第１級アミンに移動する反応を示すことを意図している。
【００１３】
本文脈において、「特異性」及び「選択性」なる用語は、交換可能に使用され、ｈＧＨにおける他の特定のグルタミン残基と比較した、ｈＧＨにおける一又は複数の特定のグルタミン残基との反応についてのＴＧａｓｅの優先性を記述するものである。この明細書における目的にとって、ｈＧＨにおけるＧｌｎ１４１と比較した場合のＧｌｎ-４０に対する本発明のペプチドの特異性は、実施例に記載するようにしてペプチドを試験した結果に従い決定される。
【００１４】
本発明のペプチドは、ｈＧＨ等のペプチドをグルタミン転移させるためのトランスグルタミナーゼとして有用である。ペプチドのグルタミン転移は、例えば国際公開第２００５／０７０４６８号及び国際公開第２００６／１３４１４８号に記載されているように、前記ペプチドのコンジュゲートを調製するのに有用である。
【００１５】
例としてｈＧＨを使用してコンジュゲートペプチドを調製するための一方法は、ｈＧＨを官能基を有するアミン供与体と反応させて官能化ｈＧＨを得る第１の反応を含み、該第１の反応は、ＴＧａｓｅによって媒介(すなわち触媒)される。第２の反応工程において、前記官能化ｈＧＨは、該導入された官能基と反応するか又は反応可能な脂肪酸又はＰＥＧ等とさらに反応させられて、コンジュゲートされたｈＧＨが得られる。第１の反応の概略を以下に記載する。
2010518842.tif 000003
[上式中、Ｘは官能基又は潜在的官能基、すなわち、さらなる反応、例えば酸化又は加水分解時に官能基に転換される基を表す]
【００１６】
微生物S. mobaraensisはまたStreptoverticillium mobaraense(ストレプトベルチシリウム・モバレンス)として分類されている。ＴＧａｓｅは生物から単離され得、このＴＧａｓｅは比較的低分子量(〜３８ｋＤａ)であることと、カルシウム非依存性であることで特徴付けられる。S. mobaraensis由来のＴＧａｓｅは比較的よく記載されており；例えば、結晶構造は解析されている(米国特許第１５６９５６号; Appl. Microbiol. Biotech. 64, 447-454(2004))。
【００１７】
上述の反応が、Streptomyces mobaraensis由来のＴＧａｓｅにより媒介される場合、ｈＧＨとＨ２Ｎ-Ｘ(アミン供与体)との反応が、主にＧｌｎ-４０及びＧｌｎ-１４１で生じる。上述の反応は、例えばｈＧＨのペグ化に使用され、延長された半減期を有する治療用成長ホルモン生成物が得られる。治療用組成物が単一化合物の組成物であることが一般的に所望されている場合、上で議論した特異性の欠落は、Ｇｌｎ-４０官能化ｈＧＨ、Ｇｌｎ-１４１官能化ｈＧＨ、及び／又はＧｌｎ-４０／Ｇｌｎ-１４１二重官能化ｈＧＨが互いに分離されるさらなる精製工程を必要とする。
【００１８】
ヒト成長ホルモンのコンジュゲーションにおけるトランスグルタミナーゼのかかる使用は、国際公開第２００５／０７０４６８号、国際公開第２００６／１３４１４８号、国際公開第２００７／０２０２９１号及び国際公開第２００７／０２０２９０号に広く記載されている。
S. ladakanumから単離されたＴＧａｓｅの配列は、２つの配列に間に全部で２２のアミノ酸差異があることを除けば、S. mobaraensis由来の配列と同一のアミノ酸配列を有する(Yi-Sin Linら, Process Biochemistry 39(5), 591-598(2004)。
【００１９】
S. ladakanum由来のｍＴＧａｓｅの配列は、配列番号：１に与えられており、S. mobaraensis由来のｍＴＧａｓｅの配列は、配列番号：２に与えられている。
本発明のペプチドは、ｈＧＨのＧｌｎ-４０と比較してＧｌｎ-１４１に対して特異性を有しており、該特異性は、配列番号：２に示すアミノ酸配列を有するペプチドのｈＧＨのＧｌｎ-４０と比較したＧｌｎ-１４１に対する特異性よりも有意に高く、ここで特異性は、実施例に記載したようにして測定される。よって、本発明のペプチドは、ｈＧＨをグルタミン転移させる方法に使用され得、配列番号：２のアミノ酸配列を有するＴＧａｓｅを使用する反応と比較して、Ｇｌｎ-４０官能化ｈＧＨ又はＧｌｎ-１４１官能化ｈＧＨの生成を増加させる。
【００２０】
よって、一実施態様では、本発明のトランスグルタミナーゼペプチドは、ｈＧＨのＧｌｎ-４０と比較してｈＧＨのＧｌｎ-１４１に対して特異性を有し、該特異性は、配列番号：２に示すアミノ酸配列を有するペプチドのｈＧＨのＧｌｎ-４０と比較したｈＧＨのＧｌｎ-１４１に対する特異性よりも高い。一実施態様では、Ｇｌｎ-４０と比較したＧｌｎ-１４１に対する本発明のペプチドの特異性は、Ｇｌｎ-４０と比較したＧｌｎ-１４１に対する配列番号：２に示すアミノ酸配列を有するペプチドの特異性よりも、少なくとも１．２５、例えば少なくとも１．５０、例えば少なくとも１．７５、例えば少なくとも２．０、例えば少なくとも２．５、例えば少なくとも３．０、例えば少なくとも３．５、例えば少なくとも４．０、例えば少なくとも４．５、例えば少なくとも５．０、例えば少なくとも５．５、例えば少なくとも６．０、例えば少なくとも６．５、例えば少なくとも７．０、例えば少なくとも７．５、例えば少なくとも８．０、例えば少なくとも８．５、例えば少なくとも９．０、例えば少なくとも９．５、例えば少なくとも１０．０倍高い。
【００２１】
一実施態様では、本発明のトランスグルタミナーゼペプチドは、ｈＧＨのＧｌｎ-４０と比較してｈＧＨのＧｌｎ-１４１に対して特異性を有し、該特異性は、Ａｌａ-ＰｒｏのＮ末端付加の配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するペプチドが、配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するペプチドと同じ特異性を有するので、配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するペプチド、又はＡｌａ-ＰｒｏのＮ末端付加の配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するペプチドのｈＧＨのＧｌｎ-４０と比較したｈＧＨのＧｌｎ-１４１に対する特異性よりも高い(実施例を参照)。一実施態様では、Ｇｌｎ-４０と比較したＧｌｎ-１４１に対する本発明のペプチドの特異性は、Ｇｌｎ-４０と比較したＧｌｎ-１４１に対する配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するペプチドの特異性よりも、少なくとも１．２５、例えば少なくとも１．５０、例えば少なくとも１．７５、例えば少なくとも２．０、例えば少なくとも２．５、例えば少なくとも３．０、例えば少なくとも３．５、例えば少なくとも４．０、例えば少なくとも４．５、例えば少なくとも５．０、例えば少なくとも５．５、例えば少なくとも６．０、例えば少なくとも６．５、例えば少なくとも７．０、例えば少なくとも７．５、例えば少なくとも８．０、例えば少なくとも８．５、例えば少なくとも９．０、例えば少なくとも９．５、例えば少なくとも１０．０倍高い。
【００２２】
一実施態様では、本発明のペプチドは、特定のアミノ酸残基における変異を有し、及び／又はさらにＮ末端付加されたアミノ酸残基を有する、S. ladakanum由来のｍＴＧａｓｅの配列をベースにした配列を含む。一実施態様では、本発明のペプチドは、さらにＮ末端付加されたアミノ酸配列を有する、S. mobaraensis由来のｍＴＧａｓｅの配列をベースにした配列を含む。
【００２３】
本発明は、特にStreptoverticillium ladakanum由来のトランスグルタミナーゼの新規変異体に関する。変異体は、改善された選択性を有し、所定のグルタミン残基でペプチドを部位特異性修飾するために使用されうる。
本文脈において、「変異体」なる用語は、与えられたポリペプチドの自然に生じた変異体、又は与えられたペプチド又はタンパク質の組換え的に調製され又は他の方法で修飾された変異体を意味することを意図しており、ここで、一又は複数のアミノ酸残基は、アミノ酸の置換、付加、欠失、挿入、又は反転(invertion)により修飾されている。
【００２４】
一実施態様では、本発明は、配列番号：１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含有する単離されたペプチドを提供し、ここで、該配列は、配列番号：１のアミノ酸残基Ｔｙｒ６２、Ｔｙｒ７５及びＳｅｒ２５０に対する一又は複数の位置で修飾されている。
【００２５】
当該分野で知られている「同一性」なる用語は、配列を比較することにより決定される、２又はそれ以上のペプチド配列間の関係を意味する。当該分野では、「同一性」とは、２又はそれ以上のアミノ酸残基の鎖間の適合数により決定される、ペプチド間の配列関連性の度合いを意味する。「同一性」は、特定の数学的モデル又はコンピュータプログラム(すなわち「アルゴリズム」)により処理されるギャップアラインメント(もしあれば)を用いて、２又はそれ以上の配列の小さい方の同一適合性のパーセントを測定する。関連ペプチドの同一性は、既知の方法により容易に算出することができる。このような方法は、限定されるものではないが、Computational Molecular Biology, Lesk, A. M編, Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W編, Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M.,及びGriffin, H. G編, Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. 及びDevereux, J編, M. Stockton Press, New York, 1991;及びCarilloら, SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988)に記載されているものを含む。
【００２６】
同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間に最も大きな適合性を与えるように設計される。同一性を決定するための方法は、公に入手可能なコンピュータプログラムに記載されている。２つの配列間の同一性を決定するための好ましいコンピュータプログラム法は、ＧＡＰ(Devereuxら, Nucl. Acid. Res., 12：387(1984)を含むＧＣＧプログラムパッケージ；Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.)、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ(Altschulら, J. Mol. Biol., 215：403-410(1990))を含む。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、全米バイオテクノロジー情報センター(NCBI)及び他の供給源(BLAST Manual, Altschulら, NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894；Altschulら, 上掲)から公に入手可能である。よく知られているスミス・ウォーターマン・アルゴリズム(Smith Waterman algorithm)も、同一性を決定するために使用されうる。
【００２７】
例えば、コンピュータアルゴリズムＧＡＰ(Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.)の使用では、パーセント配列同一性が決定される２つのペプチドを、それぞれのアミノ酸が最適に適合するように整列させられる(アルゴリズムにより決定される「適合スパン」)。ギャップ開裂ペナルティ(これは平均ダイアゴナルの３倍と算出される；「平均ダイアゴナル」は使用される比較マトリックスのダイアゴナルの平均である；「ダイアゴナル」とは、特定の比較マトリックスによるそれぞれの完全なアミノ酸適合に割り当てられるスコア又は数である)及びギャップ伸長ペナルティ(これは通常はギャップ開裂ペナルティの倍数{分率(１／１０)}である)、並びに比較マトリックス、例えばＰＡＭ２５０又はＢＬＯＳＵＭ６２が、アルゴリズムに併せて使用される。標準的な比較マトリックス(ＰＡＭ２５０比較マトリックス用には、Dayhoffら, Atlas of Protein Sequence and Structure, vol.5, supp.3(1978)；ＢＬＯＳＵＭ６２比較マトリックス用には、Henikoffら, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89：10915-10919(1992)を参照)も、アルゴリズムにより使用される。
【００２８】
ペプチド配列比較のための好ましいパラメータは、次のものを含む：
アルゴリズム：Needlemanら, J. Mol. Biol, 48：443-453(1970)；比較マトリックス：Henikoffら, PNAS. USA, 89：10915-10919(1992)のＢＬＯＳＵＭ６２；ＧＡＰペナルティ：１２、ＧＡＰ長ペナルティ：４、類似性閾値：０。
上述のパラメータでのＧＡＰプログラムが有用である。上述のパラメータは、ＧＡＰアルゴリズムを使用するペプチド比較(末端ギャップに対するペナルティを伴わない)のための初期設定パラメータである。
【００２９】
一実施態様では、本発明は、上述した単離ペプチドを提供するものであり、ここで該アミノ酸配列はＴｙｒ６２に対応する位置で修飾されており、該修飾はＴｙｒとは異なるアミノ酸残基で、最初のチロシン残基を置換することからなる。一実施態様では、Ｔｙｒ６２に対応する位置におけるアミノ酸残基の修飾は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ及びＶａｌから選択されるアミノ酸残基で、最初のチロシン残基を置換することからなる。一実施態様では、Ｔｙｒ６２に対応する位置におけるＴｙｒは、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、及びＬｅｕから選択されるアミノ酸残基で置換される。
【００３０】
一実施態様では、本発明は、上述した単離したペプチドを提供するものであり、ここで該アミノ酸配列はＴｙｒ７５に対応する位置で修飾されており、修飾はＴｙｒとは異なるアミノ酸残基で、最初のチロシン残基を置換することからなる。一実施態様では、Ｔｙｒ７５に対応する位置におけるアミノ酸残基の修飾は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ及びＶａｌから選択されるアミノ酸残基で、最初のチロシン残基を置換することからなる。一実施態様では、Ｔｙｒ７５に対応する位置におけるＴｙｒは、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、又はＣｙｓで置換される。
【００３１】
一実施態様では、本発明は、上述した単離したペプチドを提供するものであり、ここで該アミノ酸配列はＳｅｒ２５０に対応する位置で修飾されており、修飾はＳｅｒとは異なるアミノ酸残基で、最初のセリン残基を置換することからなる。一実施態様では、Ｓｅｒ２５０に対応する位置におけるアミノ酸残基の修飾は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＶａｌから選択されるアミノ酸残基で、最初のチロシン残基を置換することからなる。
【００３２】
一実施態様では、本発明のペプチドは、Ｎ末端に、一又は複数、例えば１〜９、例えば１〜８、例えば１〜７、例えば１〜６、例えば１〜５、例えば１〜４、例えば１〜３、例えば１〜２、例えば１のアミノ酸が付加されることにより修飾される。一実施態様では、前記配列はＭｅｔをＮ末端に付加することにより修飾されている。
一実施態様では、本発明のペプチドは、Ｎ末端に、一又は複数、例えば２〜９、例えば２〜８、例えば２〜７、例えば２〜６、例えば２〜５、例えば２〜４、例えば２〜３、例えば２のアミノ酸が付加されることにより修飾される。一実施態様では、付加されるアミノ酸残基は、ジペプチド基Ｇｌｙ-Ｐｒｏ-である。一実施態様では、付加されるアミノ酸残基は、ジペプチド基Ａｌａ-Ｐｒｏ-である。
【００３３】
本発明のペプチドは、米国特許第５１５６９５６号に記載されたアッセイで測定されるＴＧａｓｅ活性を示す。簡単に記載すれば、与えられたペプチド活性の測定は、Ｃａ２＋の不在下、基質としてベンジルオキシカルボニル-Ｌ-グルタミニルグリシン及びヒドロキシルアミンとを使用する反応を実施し、トリクロロ酢酸の存在下、得られたヒドロキサム酸を用いて鉄錯体を形成させ、５２５ｎｍでの吸光度を測定し、検量線によりヒドロキサム酸の量を測定し、活性を算出することにより行われる。この明細書の目的では、前記アッセイにおいてトランスグルタミナーゼ活性を示すペプチドは、トランスグルタミナーゼ活性を有しているとみなされる。特に、本発明のペプチドは、配列番号：２のアミノ酸配列を有するS. ladakanum由来のＴＧａｓｅより、３０％以上、例えば５０％以上、例えば７０％以上、例えば９０％以上の活性を示す。
【００３４】
一実施態様では、本発明は、本発明のペプチドをコードする核酸コンストラクトを提供する。
ここで使用される場合、「核酸コンストラクト」なる用語は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ又はＲＮＡ起源の任意の核酸分子を示すことを意図している。「コンストラクト」なる用語は、一本鎖又は二本鎖であってよく、関心あるタンパク質をコードする、完全な又は部分的な自然に発生するヌクレオチド配列をベースにしてもよい核酸セグメントを示すことを意図している。コンストラクトは、場合によっては、他の核酸セグメントを含んでいてもよい。
本発明のペプチドをコードする本発明の核酸コンストラクトは、ゲノム又はｃＤＮＡ由来のものが適しており、例えばゲノム又はｃＤＮＡライブラリーを調製し、標準的な技術(例えば、J. Sambrookら, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor,New York)に従い、合成オリゴヌクレオチドプローブを使用するハイブリダイゼーションにより、タンパク質の全体又は一部をコードするＤＮＡ配列をスクリーニングし、当該分野で知られているようにして、変異を導入することにより得られる。
【００３５】
また、タンパク質をコードする本発明の核酸コンストラクトは、確立された標準的な方法、例えばBeaucage及びCaruthers, Tetrahedron Letters 22, 1859-1869(1981)に記載されたホスホラミダイト法、又はMatthesら, EMBO Journal 3, 801-805(1984)により記載された方法により合成的に調製してもよい。ホスホラミダイト法によれば、オリゴヌクレオチドは、例えば自動ＤＮＡ合成器において合成され、精製され、アニーリングされ、ライゲーションされて、適切なベクターにクローニングされる。
【００３６】
さらに、核酸コンストラクトは、標準的な技術に従い、合成、ゲノム又はｃＤＮＡ由来(適切であるならば)のフラグメント、全核酸コンストラクトの種々の部位に相当するフラグメントをライゲーションすることにより調製される、混合された合成及びゲノム、混合された合成及びｃＤＮＡ、又は混合されたゲノム及びｃＤＮＡ由来のものであってもよい。
核酸コンストラクトは、例えば米国特許第４６８３２０２号、又はSaikiら, Science 239, 487-491(1988)に記載されたようにして、特定のプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応により調製されてもよい。
【００３７】
一実施態様では、核酸コンストラクトはＤＮＡコンストラクトである。
一実施態様では、本発明の核酸コンストラクトは核酸配列を含み、該核酸配列はプロテアーゼ基質アミノ酸配列をコードし、該プロテアーゼ基質アミノ酸配列は、核酸コンストラクトによりコードされるペプチドのＮ末端部として発現される。一実施態様では、本発明の核酸コンストラクトは核酸配列を含み、該核酸配列はプロテアーゼ基質アミノ酸配列をコードし、該プロテアーゼ基質アミノ酸配列は、該核酸コンストラクトによりコードされるペプチドのＣ末端部として発現される。
このようなプロテアーゼ及びプロテアーゼ基質アミノ酸配列は、当該分野でよく知られている。このような配列を担持するペプチドが、適切な環境下、適切なプロテアーゼで処理されるならば(プロテアーゼの選択に応じて)、プロテアーゼは、プロテアーゼとプロテアーゼ基質アミノ酸配列に応じた位置でペプチドを切断するであろう。よって、プロテアーゼ基質アミノ酸配列の実際のアミノ酸配列は、調製の設定と、もちろんプロテアーゼの選択に応じて異なるであろう。
【００３８】
いくつかの場合、プロテアーゼ処理により、その場合に最初のペプチドへのＮ又はＣ末端付加として考えられるいくつかのアミノ酸が残り、最初のペプチドは、プロテアーゼ基質アミノ酸配列をコードする核酸配列が付加される前の核酸によりコードされるものである。
【００３９】
一実施態様では、前記プロテアーゼは３Ｃプロテアーゼである。一実施態様では、前記プロテアーゼは３Ｃプロテアーゼであり、プロテアーゼ基質アミノ酸配列は、適切な環境下で、３Ｃプロテアーゼにより切断され得る配列である。一実施態様では、前記３Ｃプロテアーゼ基質アミノ酸配列はＬＥＶＬＦＱＧＰである。さらなる実施態様では、３Ｃプロテアーゼ基質アミノ酸配列ＬＥＶＬＦＱＧＰは、最初のペプチドのＮ末端に結合されており、３Ｃプロテアーゼでの処理により、Ｇｌｙ-Ｐｒｏジペプチドが最初のペプチドのＮ末端に結合して残る。
【００４０】
一実施態様では、前記プロテアーゼはエンテロキナーゼである。一実施態様では、前記プロテアーゼはエンテロキナーゼであり、プロテアーゼ基質アミノ酸配列は、適切な環境下で、エンテロキナーゼにより切断され得る配列である。さらなる実施態様では、エンテロキナーゼ基質アミノ酸配列は、最初のペプチドのＮ末端に結合しており、エンテロキナーゼを用いた処理により、Ａｌａ-Ｐｒｏジペプチドが最初のペプチドのＮ末端に結合して残る。
これは、例えば、ある種のアミノ酸はＮ末端に付加されているｍＴＧａｓｅ-ＳＬ変異体の調製に利用される。
【００４１】
一実施態様では、本発明は、本発明の核酸コンストラクトを含む組換えベクターを提供する。
一実施態様では、本発明は、本発明のベクターを含む宿主を提供する。
【００４２】
本発明のＤＮＡコンストラクトが挿入される組換えベクターは、簡便に組換えＤＮＡ手順にかけられうる任意のベクターであってよく、多くの場合、ベクターの選択は、それが導入される宿主細胞に依存する。例えば、ベクターは自己複製可能なベクター、すなわち染色体外実体として存在しており、その複製は染色体複製、例えばプラスミドとは独立しているベクターでありうる。また、ベクターは、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれる染色体(群)と共に複製されるものであってもよい。ベクターは好ましくは本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ配列が、ＤＮＡの転写に必要な付加的なセグメントに作用可能に結合している発現ベクターである。「作用可能に結合する」なる用語は、セグメントが、意図する目的に合わせて機能するように、例えばプロモーターにおいて転写が開始し、タンパク質をコードするＤＮＡ配列を介して進行するように構成されることを示す。プロモーターは、選択した宿主細胞において転写活性を示す任意のＤＮＡ配列であってよく、宿主細胞と同属又は異種のタンパク質をコードする遺伝子から誘導されたものであってもよい。また、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、必要であるならば、適切なターミネーター、例えばヒト成長ホルモンターミネーター(Palmiterら, 前掲)又は(真菌宿主では)ＴＰＩ１(Alber及びKawasaki, 前掲)又はＡＤＨ３(McKnightら, 前掲)ターミネーターに作用可能に結合していてもよい。さらにベクターは、ポリアデニル化シグナル(例えば、ＳＶ４０又はアデノウイルス５Ｅｌｂ領域からのもの）、転写エンハンサー配列(例えば、ＳＶ４０エンハンサー)、及び翻訳エンハンサー配列(例えば、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡをコードするもの)等のエレメントを含んでいてもよい。
【００４３】
本発明の組換えベクターは、ベクターを当該宿主細胞で複製させうるＤＮＡ配列をさらに含んでいてもよい。
また、ベクターは、選択可能マーカー、例えば宿主細胞における欠失を補完する生成物の遺伝子、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ(ＤＨＦＲ)をコードする遺伝子、又はSchizosaccharomyces pombe(シゾサッカロミセス・ポンベ)ＴＰＩ遺伝子(P.R. Russell, Gene 40, 125-130(1985)に記載)、又は例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ハイグロマイシン、又はメトトレキサート等の薬剤に対する耐性を付与するものを含んでいてもよい。糸状菌用の選択可能マーカーには、ａｍｄＳ、ｐｙｒＧ、ａｒｇＢ、ｎｉａＤ及びｓＣが含まれる。
【００４４】
宿主細胞の分泌経路に本発明のタンパク質を方向付けるために、分泌シグナル配列(リーダー配列、プレプロ配列、又はプレ配列としても既知)が、組換えベクター内に提供されてもよい。分泌シグナル配列は正確なリーディングフレームでタンパク質をコードするＤＮＡ配列に結合している。分泌シグナル配列は、通常、タンパク質をコードするＤＮＡ配列の５'に位置している。分泌シグナル配列は、タンパク質に通常付随しているものでもよく、又は他の分泌タンパク質をコードする遺伝子からのものであってもよい。
【００４５】
本タンパク質、プロモーター、場合によってはターミネーター、及び／又は分泌シグナルペプチドをそれぞれコードするＤＮＡ配列をライゲーションし、複製に必要な情報を含む適切なベクターにそれらを挿入するのに使用される手順は、当業者によく知られている(例えば、Sambrookら, 前掲を参照)。
本発明の組換えベクター又はＤＮＡコンストラクトが導入される宿主細胞は、本タンパク質を生成可能な任意の細胞であってよく、細菌、酵母、真菌、及び高等真核細胞が含まれる。ついで、上述した形質転換又は形質移入された宿主細胞は、本ペプチドの発現を可能にする条件下で、適切な栄養培地中で培養された後、生じたタンパク質が培地から回収される。
【００４６】
細胞培養に使用される培地は、宿主細胞の増殖に適した任意の従来からの培地、例えば適切なサプリメントを含有する最小又は複合培地であってよい。適切な培地は商業的供給者から入手可能であり、又は公開されているレシピ(例えば、American Type Culture Collectionのカタログ)に従い調製されてもよい。ついで、細胞により生成されるタンパク質は、遠心分離又は濾過による培地からの宿主細胞の分離、硫酸アンモニウム等の塩による上清又は濾液のタンパク質様成分の沈殿、当該タンパク質の種類に応じて、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の多様なクロマトグラフィー手順による精製を含む一般的な手順により培養培地から回収されうる。
【００４７】
本発明のペプチドは種々の方法で調製されうる。本ペプチドは、当該分野で知られているタンパク質合成方法により調製されうる。ペプチドがかなり大きい場合、これは、ペプチドのいくつかのフラグメントを合成し、ついで組み合わせることにより簡便になされ、本発明のペプチドが得られる。しかしながら、特定の実施態様では、本発明のペプチドは、本発明のペプチドをコードする核酸コンストラクト、又は本発明のペプチドに修飾され得るペプチドをコードする核酸コンストラクトを含む適切な宿主を発酵することにより調製される。
【００４８】
一実施態様では、本発明は、本発明のペプチドを調製する方法を提供するものであり、ここでは、
ｉ）ペプチドの組換え発現を可能にする宿主細胞を、ペプチドの発現が可能な条件下で発酵させ、
ｉｉ）工程ｉ）で発現したペプチドを含有する組成物を、第１のイオン交換クロマトグラフィー工程として、カチオン交換クロマトグラフィーにかける。
カチオン交換クロマトグラフィーを使用することで、発酵後の第１のクロマトグラフィー工程として、同様のアニオン交換クロマトグラフィーと比較して、選択性及び収率が大きくなる。
【００４９】
場合によっては、ｉｉ）のペプチドを含有する組成物は、各工程の前と後の双方で、さらなる精製工程にかけてもよく、但し、工程ｉｉ）のカチオンクロマトグラフィーは第１のクロマトグラフィー工程である。また、それが唯一のクロマトグラフィー工程であってもよい。
例えば、工程ｉ）での発酵の上清を、希釈及びｐＨ調節等、カチオン交換にかける前に、さらなる修飾にかけてもよい。上清は、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０倍、もしくはそれ以上に希釈されてもよく、ｐＨは、カチオン交換物質の選択によって、又は他に当業者によって適切であると判断されているもので調節されうる。
【００５０】
一実施態様では、工程ｉｉ）に記載されているカチオン交換は、ＳＰビッグビーズ(Big Beads)(GE Healthcare)等のアガロースベースの樹脂、又はトーヨーパール・メガキャップ(Toyopearl Megacap)２(TosoBioscience)等のポリマーベースの樹脂において実施される。双方の例示的な樹脂は強カチオン交換樹脂である。さらなる実施態様では、ｉｉ）のカチオン交換工程にかけられる組成物は、５．２のｐＨを有する。
【００５１】
一実施態様では、本発明は、本発明のペプチドを調製する方法を提供するものであり、ここでは、
ａ）ペプチドの組換え発現を可能にする宿主細胞を、ペプチドの発現が可能な条件下で発酵させ、該宿主細胞は、本発明のペプチドをコードする核酸コンストラクトを含有するベクターを含み、該核酸コンストラクトは核酸配列を含有し、核酸配列はプロテアーゼ基質アミノ酸配列をコードし、プロテアーゼ基質アミノ酸配列は、核酸コンストラクトによりコードされる最初のペプチドのＮ-又はＣ末端部として発現され、
ｂ）ａ）の元での発酵からの組換えペプチドを含有する組成物を、プロテアーゼ基質アミノ酸配列を切断可能なプロテアーゼを用いた処理にかける。
プロテアーゼ基質アミノ酸配列をコードする核酸配列を含むこのような核酸コンストラクトは本明細書の他の箇所で記載されている。
【００５２】
一実施態様では、ａ）で発酵した組換えペプチドを、上述したプロテアーゼを用いた処理にかける前に、第１のクロマトグラフィー工程としてカチオン交換クロマトグラフィーにかける。
一実施態様では、工程ｂ）でプロテアーゼ処理にかけたペプチドを含有する組成物を、工程ｂ）の後に、第２のカチオン交換クロマトグラフィーにかける。
一実施態様では、エチレングリコールを、最終濃度２０％になるまで、本発明のペプチドを含有する得られた組成物に添加する。
【００５３】
一実施態様では、本発明は、ペプチドをコンジュゲートさせる方法を提供するもので、該方法は、本発明のペプチドの存在下、該ペプチドをアミン供与体と反応させることを含む。一実施態様では、コンジュゲートされるペプチドは成長ホルモンである。一実施態様では、ペプチドはｈＧＨ又はその変異体又は誘導体である。
本文脈において、「誘導体」なる用語は、修飾した、すなわち親ペプチドに、好ましくは生物活性を有する任意の種類の分子を共有結合させたポリペプチド又は変異体又はフラグメントを意味することを意図している。典型的な修飾は、アミド、炭水化物、アルキル基、アシル基、エステル、ペグ化等である。
【００５４】
一実施態様では、本発明は、上述の成長ホルモンのコンジュゲート法を提供するもので、ここで、配列番号：２に示すアミノ酸配列を有するペプチドが、本発明のペプチドの代わりに該方法に使用される場合、ｈＧＨの位置Ｇｌｎ-４０に対応する位置でコンジュゲートしたｈＧＨの量と比較した、ｈＧＨの位置Ｇｌｎ-１４１に対応する位置でコンジュゲートした成長ホルモンの量が、位置Ｇｌｎ-４０に対応する位置でコンジュゲートしたｈＧＨと比較した、ｈＧＨの位置Ｇｌｎ-１４１に対応する位置でコンジュゲートしたｈＧＨの量と比べて、有意に増加している。
【００５５】
一実施態様では、本発明は、ｈＧＨのコンジュゲート法を提供するもので、ここで、配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するペプチドが、本発明のペプチドの代わりに該方法に使用される場合、ｈＧＨの位置Ｇｌｎ-４０に対応する位置でコンジュゲートしたｈＧＨの量と比較した、ｈＧＨの位置Ｇｌｎ-１４１に対応する位置でコンジュゲートした成長ホルモンの量は、位置Ｇｌｎ-４０に対応する位置でコンジュゲートしたｈＧＨと比較した、ｈＧＨの位置Ｇｌｎ-１４１に対応する位置でコンジュゲートしたｈＧＨの量と比べて、有意に増加している。
【００５６】
一実施態様では、本発明は、位置１４１に対応する位置でコンジュゲートしたｈＧＨを調製する方法を提供するものであり、該方法は、本発明のペプチドの存在下で、前記ｈＧＨをアミン供与体と反応させることを含む。
本発明の方法の一実施態様では、コンジュゲートしたｈＧＨは、ペグ化されたｈＧＨの調製にも使用され、ここで該ペグ化はコンジュゲートした位置で生じる。
一実施態様では、本発明はコンジュゲートした成長ホルモンを製薬調製する方法を提供するものであり、該方法は、本発明のペプチドの存在下で、該ｈＧＨ又はその変異体又は誘導体をアミン供与体と反応させる工程を含む。一実施態様では、成長ホルモンはｈＧＨ又はその変異体又は誘導体である。
【００５７】
一実施態様では、本発明は、ペグ化された成長ホルモンを製薬調製する方法を提供するものであり、該方法は、本発明のペプチドの存在下、該ｈＧＨ又はその変異体又は誘導体をアミン供与体と反応させ、ペグ化された成長ホルモンの調製に、得られたコンジュゲートした成長ホルモンペプチドを使用する工程を含み、ここで該ペグ化はコンジュゲートした位置で生じる。一実施態様では、成長ホルモンはｈＧＨ又はその変異体又は誘導体である。一実施態様では、ペグ化された成長ホルモンは、位置Ｇｌｎ１４１でペグ化されたｈＧＨである。一実施態様では、ペグ化された成長ホルモンは、国際公開第２００６／１３４１４８号に記載されているペグ化された成長ホルモンである。
【００５８】
一実施態様では、本発明は、コンジュゲートした成長ホルモンの調製への、本発明のペプチドの使用を提供する。一実施態様では、成長ホルモンはｈＧＨ又はその変異体又は誘導体である。一実施態様では、成長ホルモンは、ｈＧＨの位置Ｇｌｎ１４１に対応する位置でコンジュゲートされている。
【００５９】
一実施態様では、本発明は、患者の成長ホルモンの欠失に関連した病気又は疾患を処置する方法を提供するものであり、該方法は、本発明の方法を使用して調製された製薬用調製物を、それを必要とする患者に投与することを含み、ここで、コンジュゲートしたペプチドは成長ホルモンである。一実施態様では、患者の成長ホルモンの欠失に関連した病気又は疾患は、成長ホルモン欠損症(ＧＨＤ)；ターナー症候群；プラダーウィリ症候群(ＰＷＳ)；ヌーナン症候群；ダウン症候群；慢性腎臓病、若年性関節リウマチ；嚢胞性線維症、ＨＡＡＲＴ治療を受けた小児のＨＩＶ感染(ＨＩＶ／ＨＡＬＳ小児)；ＳＧＡで出生した低身長小児；ＳＧＡ以外の極少低出生時体重(ＶＬＢＷ)で出生した低身長症；骨格形成異常；軟骨低形成症；軟骨形成不全；特発性低身長(ＩＳＳ)；成人のＧＨＤ；脛骨、腓骨、大腿、上腕、橈骨、尺骨、鎖骨、中手、中足、及び指等、長骨又は内部の骨折；頭蓋骨、手の基部、及び足の基部等、海綿様骨の中又はその骨折；例えば手、膝又は肩等の腱又は靱帯の手術後の患者；仮骨延長術を受けるか又は受けた患者；人工股関節置換手術又は円板置換手術、半月板修復、脊椎固定術、又は膝、臀部、肩、肘、手首又は顎の補綴固定術後の患者；例えばネイル、スクリュー及びプレートのような骨接合術材料が固定されている患者；骨折の変形癒合又は偽関節を有する患者；例えば脛骨又は第一趾からの骨切り術後の患者；移植片植え込み後の患者；外傷又は関節炎に起因する膝の関節軟骨変性；ターナー症候群を患っている患者の骨粗鬆症；男性における骨粗鬆症、慢性透析の成人患者(ＡＰＣＤ)；ＡＰＣＤにおける栄養不良関連循環器疾患；ＡＰＣＤにおける悪液質の逆流；ＡＰＣＤにおける癌；ＡＰＣＤにおける慢性的閉塞性肺疾患；ＡＰＣＤにおけるＨＩＶ；ＡＰＣＤの高齢者；ＡＰＣＤにおける慢性的な肝臓病、ＡＰＣＤにおける疲労症候群；クローン病；肝機能障害；ＨＩＶ感染した男性；短腸症候群；中心性肥満；ＨＩＶ関連リポジストロフィー症候群(ＨＡＬＳ)：男性不妊；待機的大手術後の患者、アルコール／薬物解毒又は神経的トラウマ；加齢；虚弱な高齢者；骨関節炎；衝撃的な損傷を受けた軟骨；勃起不全；繊維筋痛；記憶障害；鬱病；外傷性脳損傷；くも膜下出血；極低出生体重；メタボリックシンドローム；グルココルチコイドミオパシー；又は小児のグルココルチコイド治療による低身長症から選択される。
【００６０】
以下は、本発明の実施態様の列挙であり、該列挙に限定されるとみなされるものではない。
実施態様１：配列番号：１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、該配列が、配列番号：１のアミノ酸残基Ｔｙｒ６２、Ｔｙｒ７５及びＳｅｒ２５０に対する一又は複数の位置において修飾されている、単離されたペプチド。
実施態様２：配列番号：１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、該配列が、配列番号：１のアミノ酸残基Ｔｙｒ６２、Ｔｙｒ７５及びＳｅｒ２５０に対応する一又は複数の位置において修飾されている、実施態様１の単離されたペプチド。
実施態様３：配列番号：１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、該配列が、配列番号：１のアミノ酸残基Ｔｙｒ６２、Ｔｙｒ７５及びＳｅｒ２５０に対応する一又は複数の位置において修飾されている、実施態様２の単離されたペプチド。
実施態様４：配列番号：１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、該配列が、配列番号：１のアミノ酸残基Ｔｙｒ６２、Ｔｙｒ７５及びＳｅｒ２５０に対応する一又は複数の位置において修飾されている、実施態様３の単離されたペプチド。
【００６１】
実施態様５：前記配列が、配列番号１：のアミノ酸残基Ｔｙｒ６２、Ｔｙｒ７５及びＳｅｒ２５０に対応する一又は複数の位置において修飾されている、配列番号：１に記載のアミノ酸配列を含有する、実施態様４の単離されたペプチド。
実施態様６：前記アミノ酸配列が、Ｔｙｒ６２に対応する位置で修飾されており、修飾が、Ｔｙｒとは異なるアミノ酸残基で、最初のチロシン残基が置換されることからなる、実施態様１ないし５のいずれかの単離されたペプチド。
実施態様７：Ｔｙｒ６２に対応する位置でのアミノ酸残基の修飾が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、及びＶａｌから選択されるアミノ酸残基で、最初のチロシン残基が置換されることからなる、実施態様６の単離されたペプチド。
【００６２】
実施態様８：Ｔｙｒ６２に対応する位置のＴｙｒが、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、及びＬｅｕから選択されるアミノ酸残基で置換されている、実施態様７の単離されたペプチド。
実施態様９：Ｔｙｒ６２に対応する位置のＴｙｒがＨｉｓで置換されている、実施態様８の単離されたペプチド。
実施態様１０：Ｔｙｒ６２に対応する位置のＴｙｒがＶａｌで置換されている、実施態様８の単離されたペプチド。
【００６３】
実施態様１１：Ｔｙｒ６２に対応する位置のＴｙｒが、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、及びＬｅｕから選択されるアミノ酸残基で置換されている、実施態様８の単離されたペプチド。
実施態様１２：Ｔｙｒ６２に対応する位置のＴｙｒがＭｅｔで置換されている、実施態様８の単離されたペプチド。
実施態様１３：Ｔｙｒ６２に対応する位置のＴｙｒがＡｎｓで置換されている、実施態様８の単離されたペプチド。
実施態様１４：Ｔｙｒ６２に対応する位置のＴｙｒがＴｈｒで置換されている、実施態様８の単離されたペプチド。
実施態様１５：Ｔｙｒ６２に対応する位置のＴｙｒがＬｅｕで置換されている、実施態様８の単離されたペプチド。
【００６４】
実施態様１６：前記アミノ酸配列がＴｙｒ７５に対応する位置において修飾されており、修飾が、Ｔｙｒとは異なるアミノ酸残基で、最初のチロシン残基が置換されることからなる、実施態様１ないし１５のいずれかの単離されたペプチド。
実施態様１７：Ｔｙｒ７５に対応する位置におけるアミノ酸残基の修飾が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、及びＶａｌから選択されるアミノ酸残基で、最初のチロシン残基が置換されることからなる、実施態様１６の単離されたペプチド。
【００６５】
実施態様１８：Ｔｙｒ７５に対応する位置のＴｙｒが、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、又はＣｙｓで置換されている、実施態様１７の単離されたペプチド。
実施態様１９：Ｔｙｒ７５に対応する位置のＴｙｒがＰｈｅで置換されている、実施態様１８の単離されたペプチド。
実施態様２０：Ｔｙｒ７５に対応する位置のＴｙｒがＡｓｎで置換されている、実施態様１８の単離されたペプチド。
実施態様２１：Ｔｙｒ７５に対応する位置のＴｙｒが、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、又はＣｙｓで置換されている、実施態様１８の単離されたペプチド。
【００６６】
実施態様２２：Ｔｙｒ７５に対応する位置のＴｙｒがＡｌａで置換されている、実施態様２１の単離されたペプチド。
実施態様２３：Ｔｙｒ７５に対応する位置のＴｙｒがＭｅｔで置換されている、実施態様２１の単離されたペプチド。
実施態様２４：Ｔｙｒ７５に対応する位置のＴｙｒがＬｅｕで置換されている、実施態様２１の単離されたペプチド。
実施態様２５：Ｔｙｒ７５に対応する位置のＴｙｒがＣｙｓで置換されている、実施態様２１の単離されたペプチド。
【００６７】
実施態様２６：前記アミノ酸配列がＳｅｒ２５０に対応する位置において修飾されており、修飾が、Ｓｅｒとは異なるアミノ酸残基で、最初のセリン残基が置換されることからなる、実施態様１ないし２５のいずれかの単離されたペプチド。
実施態様２７：Ｓｅｒ２５０に対応する位置におけるアミノ酸残基の修飾が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＶａｌから選択されるアミノ酸残基で、最初のセリン残基が置換されることからなる、実施態様２６の単離されたペプチド。
【００６８】
実施態様２８：Ｓｅｒ２５０に対応する位置におけるアミノ酸残基の修飾が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＶａｌから選択されるアミノ酸残基で、最初のセリン残基が置換されることからなる、実施態様２７の単離されたペプチド。
実施態様２９：Ｓｅｒ２５０に対応する位置におけるアミノ酸残基の修飾が、Ｇｌｙで最初のセリン残基が置換されることからなる、実施態様２７の単離されたペプチド。
実施態様３０：Ｓｅｒ２５０に対応する位置におけるアミノ酸残基の修飾が、Ｃｙｓ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＶａｌから選択されるアミノ酸残基で、最初のセリン残基が置換されることからなる、実施態様２７の単離されたペプチド。
【００６９】
実施態様３１：前記Ｓｅｒ２５０がＣｙｓで置換されている、実施態様３０の単離されたペプチド。
実施態様３２：前記Ｓｅｒ２５０がＬｅｕで置換されている、実施態様３０の単離されたペプチド。
実施態様３３：前記Ｓｅｒ２５０がＰｒｏで置換されている、実施態様３０の単離されたペプチド。
実施態様３４：前記Ｓｅｒ２５０がＴｒｐで置換されている、実施態様３０の単離されたペプチド。
実施態様３５：前記Ｓｅｒ２５０がＴｙｒで置換されている、実施態様３０の単離されたペプチド。
実施態様３６：前記Ｓｅｒ２５０がＶａｌで置換されている、実施態様３０の単離されたペプチド。
【００７０】
実施態様３７：前記アミノ酸配列が、１〜１０のアミノ酸をＮ末端に付加することにより修飾されている、実施態様１ないし３６のいずれかの単離されたペプチド。
実施態様３８：前記アミノ酸配列が、１〜９のアミノ酸をＮ末端に付加することにより修飾されている、実施態様３７の単離されたペプチド。
実施態様３９：前記配列が、１〜８のアミノ酸をＮ末端に付加することにより修飾されている、実施態様３８の単離されたペプチド。
実施態様４０：前記配列が、１〜７のアミノ酸をＮ末端に付加することにより修飾されている、実施態様３９の単離されたペプチド。
実施態様４１：前記配列が、１〜６のアミノ酸をＮ末端に付加することにより修飾されている、実施態様４０の単離されたペプチド。
実施態様４２：前記配列が、１〜５のアミノ酸をＮ末端に付加することにより修飾されている、実施態様４１の単離されたペプチド。
実施態様４３：前記配列が、１〜４のアミノ酸をＮ末端に付加することにより修飾されている、実施態様４２の単離されたペプチド。
実施態様４４：前記配列が、１〜３のアミノ酸をＮ末端に付加することにより修飾されている、実施態様４３の単離されたペプチド。
実施態様４５：前記配列が、１〜２のアミノ酸をＮ末端に付加することにより修飾されている、実施態様４４の単離されたペプチド。
実施態様４６：前記配列が、１つのアミノ酸をＮ末端に付加することにより修飾されている、実施態様４５の単離されたペプチド。
実施態様４７：前記配列が、ＭｅｔをＮ末端に付加することにより修飾されている、実施態様４８の単離されたペプチド。
【００７１】
実施態様４８：前記配列が、２〜９のアミノ酸をＮ末端に付加することにより修飾されている、実施態様３７の単離されたペプチド。
実施態様４９：前記配列が、２〜８のアミノ酸をＮ末端に付加することにより修飾されている、実施態様４８の単離されたペプチド。
実施態様５０：前記配列が、２〜７のアミノ酸をＮ末端に付加することにより修飾されている、実施態様４９の単離されたペプチド。
実施態様５１：前記配列が、２〜６のアミノ酸をＮ末端に付加することにより修飾されている、実施態様５０の単離されたペプチド。
実施態様５２：前記配列が、２〜５のアミノ酸をＮ末端に付加することにより修飾されている、実施態様５１の単離されたペプチド。
実施態様５３：前記配列が、２〜４のアミノ酸をＮ末端に付加することにより修飾されている、実施態様５２の単離されたペプチド。
実施態様５４：前記配列が、２〜３のアミノ酸をＮ末端に付加することにより修飾されている、実施態様５３の単離されたペプチド。
実施態様５５：前記配列が、２つのアミノ酸をＮ末端に付加することにより修飾されている、実施態様５４の単離されたペプチド。
【００７２】
実施態様５６：付加されたジペプチド基がＧｌｙ-Ｐｒｏ-である、実施態様５５の単離されたペプチド。
実施態様５７：付加されたジペプチド基がＡｌａ-Ｐｒｏ-である、実施態様５５の単離されたペプチド。
【００７３】
実施態様５８：ペプチドがトランスグルタミナーゼ活性を有している、実施態様１ないし５５のいずれかの単離されたペプチド。
実施態様５９：ペプチドが、ｈＧＨのＧｌｎ-４０と比較して、ｈＧＨのＧｌｎ-１４１に対して特異性を有し、該特異性が、ｈＧＨのＧｌｎ-４０と比較したｈＧＨのＧｌｎ-１４１に対し、配列番号：２に示すアミノ酸配列を有するペプチドの特異性よりも高い、実施態様５８の単離されたペプチド。
実施態様６０：ペプチドが、ｈＧＨのＧｌｎ-４０と比較して、ｈＧＨのＧｌｎ-１４１に対して特異性を有し、該特異性が、ｈＧＨのＧｌｎ-４０と比較したｈＧＨのＧｌｎ-１４１に対し、配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するペプチドの特異性よりも高い、実施態様５８の単離されたペプチド。
【００７４】
実施態様６１：ペプチドがトランスグルタミナーゼ活性を有している、実施態様５６又は実施態様５７の単離されたペプチド。
実施態様６２：ペプチドが、ｈＧＨのＧｌｎ-４０と比較して、ｈＧＨのＧｌｎ-１４１に対して特異性を有し、該特異性が、ｈＧＨのＧｌｎ-４０と比較したｈＧＨのＧｌｎ-１４１に対し、配列番号：２に示すようなアミノ酸配列を有するペプチドの特異性よりも高い、実施態様６１の単離されたペプチド。
実施態様６３：ペプチドが、ｈＧＨのＧｌｎ-４０と比較して、ｈＧＨのＧｌｎ-１４１に対して特異性を有し、該特異性が、ｈＧＨのＧｌｎ-４０と比較したｈＧＨのＧｌｎ-１４１に対し、配列番号：１に示すようなアミノ酸配列を有するペプチドの特異性よりも高い、実施態様６１の単離されたペプチド。
【００７５】
実施態様６４：実施態様１ないし６３のいずれかのペプチドをコードする核酸コンストラクト。
実施態様６５：前記核酸コンストラクトが核酸配列を含み、核酸配列がプロテアーゼ基質アミノ酸配列をコードし、プロテアーゼ基質アミノ酸配列が、核酸コンストラクトによりコードされる実施態様１ないし６３のいずれかのペプチドのＮ末端部として発現される、実施態様６４の核酸コンストラクト。
実施態様６６：前記核酸コンストラクトが核酸配列を含み、核酸配列がプロテアーゼ基質アミノ酸配列をコードし、プロテアーゼ基質アミノ酸配列が、核酸コンストラクトによりコードされる実施態様１ないし６３のいずれかのペプチドのＣ末端部として発現される、実施態様６４の核酸コンストラクト。
【００７６】
実施態様６７：前記プロテアーゼ基質アミノ酸配列が、適切な条件下で、３Ｃプロテアーゼにより切断可能である、実施態様６５又は実施態様６６の核酸コンストラクト。
実施態様６８：前記プロテアーゼ基質アミノ酸配列がＬＥＶＬＦＱＧＰである、実施態様６７の核酸コンストラクト。
実施態様６９：前記プロテアーゼ基質アミノ酸配列が、適切な条件下で、エンテロキナーゼにより切断可能である、実施態様６５の核酸コンストラクト。
【００７７】
実施態様７０：実施態様６４の核酸を含んでなるベクター。
実施態様７１：実施態様６５ないし６９の核酸を含んでなるベクター。
実施態様７２：実施態様７０のベクターを含有する宿主細胞。
実施態様７３：実施態様１ないし６３のいずれかのペプチドを含有する組成物。
【００７８】
実施態様７４：
ｉ）ペプチドの組換え発現を可能にする宿主細胞を、ペプチドの発現が可能な条件下で発酵させ、
ｉｉ）工程ｉ）で発酵した組換えペプチドを含有する組成物を、任意のさらなるイオン交換クロマトグラフィーにかける前に、カチオン交換クロマトグラフィーにかける、
実施態様１ないし６３のいずれかのペプチドを調製する方法。
実施態様７５：工程ｉｉ）のカチオン交換クロマトグラフィーが、ＳＰビッグビーズ又はトーヨーパール・メガキャップ２から選択される樹脂で実施される、実施態様７４の方法。
【００７９】
実施態様７６：
ａ）ペプチドの組換え発現を可能にする宿主細胞を、ペプチドの発現が可能な条件下で発酵させ、該宿主細胞は、実施態様７１のベクターを含み、
ｂ）ａ）で発酵した組換えペプチドを含有する組成物を、プロテアーゼ基質アミノ酸配列を切断可能なプロテアーゼを用いた処理にかける、
実施態様１ないし６３のいずれかのペプチドを調製する方法。
【００８０】
実施態様７７：ａ）で発酵した組換えペプチドを、工程ｂ）に記載のプロテアーゼで処理する前に、カチオン交換クロマトグラフィーにかける、実施態様７６の方法。
実施態様７８：工程ｉｉ）のカチオン交換クロマトグラフィーが、ＳＰビッグビーズ又はトーヨーパール・メガキャップ２から選択される樹脂で実施される、実施態様７７の方法。
実施態様７９：工程ｂ）でプロテアーゼ処理にかけられたペプチドを含有する組成物を、工程ｂ）の後に、第２のカチオン交換クロマトグラフィーにかける、実施態様７６又は実施態様７８の方法。
実施態様８０：エチレングリコールを、全量が２０％になるまで、ペプチドを含有する組成物に添加する、実施態様７４ないし７９のいずれかの方法。
【００８１】
実施態様８１：ペプチドをコンジュゲートさせる方法であって、該方法が、実施態様１ないし６３のいずれかのペプチドの存在下で、アミン供与体と該ペプチドとを反応させることを含む方法。
実施態様８２：前記コンジュゲートされるペプチドが成長ホルモンである、実施態様８１のペプチドをコンジュゲートさせる方法。
実施態様８３：前記成長ホルモンが、ｈＧＨ又はその変異体又は誘導体である、実施態様８２の方法。
【００８２】
実施態様８４：実施態様８３の成長ホルモンをコンジュゲートさせる方法であって、ここで、配列番号：２に示すアミノ酸配列を有するペプチドが、実施態様１ないし６３のいずれかのペプチドの代わりに該方法に使用される場合、ｈＧＨの位置Ｇｌｎ-４０に対応する位置でコンジュゲートしたｈＧＨの量と比較した、ｈＧＨの位置Ｇｌｎ-１４１に対応する位置でコンジュゲートした成長ホルモンの量が、位置Ｇｌｎ-４０に対応する位置でコンジュゲートしたｈＧＨと比較した、ｈＧＨの位置Ｇｌｎ-１４１に対応する位置でコンジュゲートしたｈＧＨの量と比べて、有意に増加している方法。
【００８３】
実施態様８５：実施態様８１のｈＧＨをコンジュゲートさせる方法であって、ここで、配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するペプチドが、実施態様１ないし６３のいずれかのペプチドの代わりに該方法に使用される場合、ｈＧＨの位置Ｇｌｎ-４０に対応する位置でコンジュゲートしたｈＧＨの量と比較した、ｈＧＨの位置Ｇｌｎ-１４１に対応する位置でコンジュゲートした成長ホルモンの量が、位置Ｇｌｎ-４０に対応する位置でコンジュゲートしたｈＧＨと比較した、ｈＧＨの位置Ｇｌｎ-１４１に対応する位置でコンジュゲートしたｈＧＨの量と比べて、有意に増加している方法。
【００８４】
実施態様８６：位置１４１に対応する位置でコンジュゲートしたｈＧＨを調製する方法であって、該方法が、実施態様１ないし６３のいずれかのペプチドの存在下で、ｈＧＨをアミン供与体と反応させることを含む方法。
実施態様８７：実施態様８１ないし８６のいずれかの方法であって、コンジュゲートしたｈＧＨが、ペグ化されたｈＧＨの調製に使用され、ここで該ペグ化がコンジュゲートした位置で生じる方法。
実施態様８８：コンジュゲートした成長ホルモンを製薬調製する方法であって、該方法が、実施態様１ないし６３のいずれかのペプチドの存在下で、該ｈＧＨ又はその変異体又は誘導体をアミン供与体と反応させる工程を含む方法。
実施態様８９：成長ホルモンがｈＧＨ又はその変異体又は誘導体である、実施態様８８の方法。
【００８５】
実施態様９０：ペグ化された成長ホルモンを製薬調製する方法であって、該方法が、実施態様１ないし６３のいずれかのペプチドの存在下、該ｈＧＨ又はその変異体又は誘導体をアミン供与体と反応させ、ペグ化された成長ホルモンの調製に、得られたコンジュゲートした成長ホルモンペプチドを使用する工程を含み、ここで該ペグ化がコンジュゲートした位置で生じる方法。
実施態様９１：成長ホルモンがｈＧＨ又はその変異体又は誘導体である、実施態様９０の方法。
実施態様９２：ペグ化された成長ホルモンが、位置Ｇｌｎ１４１でペグ化されたｈＧＨである、実施態様９１の方法。
【００８６】
実施態様９３：コンジュゲートした成長ホルモンの調製における、実施態様１ないし６３のいずれかのペプチドの使用。
実施態様９４：成長ホルモンがｈＧＨ又はその変異体又は誘導体である、実施態様６３の使用。
実施態様９５：成長ホルモンが、ｈＧＨの位置Ｇｌｎ１４１に対応する位置でコンジュゲートしている、実施態様９３又は実施態様９４の使用。
【００８７】
実施態様９６：患者の成長ホルモンの欠乏に関連した病気又は疾患を処置する方法であって、該方法が、実施態様８８ないし９２のいずれかの方法を使用して調製された製薬用調製物を、それを必要とする患者に投与することを含む方法。
実施態様９７：実施態様９６の方法であって、患者における成長ホルモンの欠乏に関連した病気又は疾患が、成長ホルモン欠損症(ＧＨＤ)；ターナー症候群；プラダーウィリ症候群(ＰＷＳ)；ヌーナン症候群；ダウン症候群；慢性腎臓病、若年性関節リウマチ；嚢胞性線維症、ＨＡＡＲＴ治療を受けた小児のＨＩＶ感染(ＨＩＶ／ＨＡＬＳ小児)；ＳＧＡで出生した低身長小児；ＳＧＡ以外の極少低出生時体重(ＶＬＢＷ)で出生した低身長症；骨格形成異常；軟骨低形成症；軟骨形成不全；特発性低身長(ＩＳＳ)；成人のＧＨＤ；脛骨、腓骨、大腿、上腕、橈骨、尺骨、鎖骨、中手、中足、及び指等、長骨又は内部の骨折；頭蓋骨、手の基部、及び足の基部等、海綿様骨の中又はその骨折；例えば手、膝又は肩等の腱又は靱帯の手術後の患者；仮骨延長術を受けるか又は受けた患者；人工股関節置換手術又は円板置換手術、半月板修復、脊椎固定術、又は膝、臀部、肩、肘、手首又は顎の補綴固定術後の患者；例えばネイル、スクリュー及びプレートのような骨接合術材料が固定されている患者；骨折の変形癒合又は偽関節を有する患者；例えば脛骨又は第一趾からの骨切り術後の患者；移植片植え込み後の患者；外傷又は関節炎に起因する膝の関節軟骨変性；ターナー症候群を患っている患者の骨粗鬆症；男性における骨粗鬆症、慢性透析の成人患者(ＡＰＣＤ)；ＡＰＣＤにおける栄養不良関連循環器疾患；ＡＰＣＤにおける悪液質の逆流；ＡＰＣＤにおける癌；ＡＰＣＤにおける慢性的閉塞性肺疾患；ＡＰＣＤにおけるＨＩＶ；ＡＰＣＤの高齢者；ＡＰＣＤにおける慢性的な肝臓病、ＡＰＣＤにおける疲労症候群；クローン病；肝機能障害；ＨＩＶ感染した男性；短腸症候群；中心性肥満；ＨＩＶ関連リポジストロフィー症候群(ＨＡＬＳ)：男性不妊；待機的大手術後の患者、アルコール／薬物解毒又は神経的トラウマ；加齢；虚弱な高齢者；骨関節炎；衝撃的な損傷を受けた軟骨；勃起不全；繊維筋痛；記憶障害；鬱病；外傷性脳損傷；くも膜下出血；極低出生体重；メタボリックシンドローム；グルココルチコイドミオパシー；又は小児のグルココルチコイド治療による低身長症から選択される、実施態様９６の方法。
【００８８】
ここに引用された刊行物、特許出願及び特許を含む全ての文献は、特定の文献の別個に提供される援用がここでの他の箇所でなされているかにかかわらず、各文献が、出典明示により個々にかつ特に援用され、その全内容がここに記載されているかの如く、その全体が出典明示によりここに援用される(法律により許容される最大範囲)。
本発明で記載されて使用されている「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び類似指示対象なる用語は、ここで示され、文脈においてはっきりと矛盾していない限りは、単数形及び複数形の双方をカバーすると解釈される。例えば、「化合物」なる表現は、特に示さない限りは、本発明又は特定の記載された態様の種々の「化合物」を称すると理解される。
【００８９】
特に示さない限り、ここで提供される全ての正確な値は、対応する近似値の代表例である(例えば、特定の要因又は測定値に関して提供される全ての正確な例示的値は、適切な場合は、「約」により修飾される、対応する近似測定値を提供するとみなすことができる)。
特に明記せず、文脈においてはっきりと矛盾していない限りは、要素又は要素群に関して、「含有する」、「有する」、「含む」又は「含める」等の用語を使用する、本発明の任意の側面又は実施態様のここでの記載は、特定の要素又は要素群「からなる」、「本質的になる」、又は「実施的に含有する」本発明の類似した側面又は実施態様に対する裏付けを提供することを意図したものである(例えば、特定の要素を含むここに記載の組成物は、特に明記しないか又は文脈においてはっきりと矛盾していない限りは、その要素からなる組成物をまた記述していると理解されなければならない)。
【実施例】
【００９０】
実施例１
ＧｌｙＰｒｏ-ＴＧａｓｅ形態のプロペプチド-ｍＴＧａｓｅのクローニング及び変異体生成
Streptoverticillium ladakanum  ＡＴＣＣ２７４４１由来のＴＧａｓｅ
S. ladakanum由来のプロペプチド-ｍＴＧａｓｅの配列(プロペプチド-ｍＴＧａｓｅは、大腸菌等の他の生物において、S. ladakanum由来のＴＧａｓｅをコードするＤＮＡを発させて得られるペプチドである)を、配列番号：３に示す。ポリペプチド部分は、配列番号：３のａａ１-４９であり、残りの配列は配列番号：１に示す成熟ｍＴＧａｓｅであった。成熟ｍＴＧａｓｅ部分(配列番号：１)は、図１に示すようにS. mobaraensis由来のｍＴＧａｓｅ(配列番号：２)と９３．４％の同一性を有する。
【００９１】
３Ｃ-プロテアーゼ配列ＬＥＶＬＦＱＧＰ(３Ｃ)を、S. ladakanumのプロペプチド-ＴＧａｓｅの成熟ｍＴＧａｓｅドメインとプロペプチド-ドメイン(配列番号：３のａａ１-４９)との間にクローニングした。３Ｃ-プロテアーゼにより、ＬＥＶＬＦＱＧＰ部位のＱとＧとの間で特異的に切断され、２つの付加的なアミノ酸残基Ｇｌｙ-Ｐｒｏが成熟ｍＴＧａｓｅ(配列番号：１に示す)のＮ末端に付加された。大腸菌での発現のために、Ｍｅｔ-プロペプチド-(３Ｃ)-ｍＴＧａｓｅをコードするＤＮＡを、ｐＥＴ３９ｂ(Novagen)発現ベクターのＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ部位の間でにクローニングし、発現のために大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)に移した。 S. ladakanum由来のプロペプチド-(３Ｃ)-ｍＴＧａｓｅの配列は、配列番号：６として示す。
部位特異的突然変異を、QuikChange部位特異的突然変異キット(Stratagene)を使用して実施した。例えばＹ７５Ａ、Ｙ７５Ｆ、Ｙ６２Ｈ＿Ｙ７５Ｎ及びＹ６２Ｈ＿Ｙ７５Ｆの突然変異(配列番号：１の番号付けを使用)を、ＰＣＲ鋳型として、プロペプチド-(３Ｃ)-ｍＴＧａｓｅ配列をコードするＤＮＡを使用して生成させた。
【００９２】
実施例２
アニオンクロマトグラフィーを使用するＮ末端にアミノ酸残基が付加されたＴＧａｓｅ変異体の調製
ＧｌｙＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅの調製
ｐＥＴ３９ｂ＿Ｍｅｔ-プロペプチド-(３Ｃ)-ｍＴＧａｓｅ-ＳＬ／大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)細胞を、光学密度０．４になるまで、３０μｇ／ｍｌのカナマイシンが補填されたＬＢ培地中で３０℃で培養し、さらに４時間、細胞を０．１ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。遠心分離により、細胞ペレットを収集した。
細胞ペレットからの可溶性フラクションを抽出し、アニオン交換、Ｑ-セファロースＨＰ、カラムを用いて精製し、純粋なプロペプチド-(３Ｃ)−ｍＴＧａｓｅタンパク質を得た。ついで、このタンパク質を、２０℃で一晩、プロペプチド-(３Ｃ)-ｍＴＧａｓｅタンパク質に対して１：１００(ｗ／ｗ)の比率で３Ｃ-プロテアーゼ(ポリオウイルス由来)を用いて消化させた。消化混合物を、ＴＧａｓｅ活性アッセイにより同定した活性なｍＴＧａｓｅについて、カチオン交換カラム、ＳＰセファロースＨＰ／ソース３０Ｓでさらに精製した。
【００９３】
ＡｌａＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅの調製
ポリペプチドの消化を、３Ｃプロテアーゼの代わりにエンテロキナーゼ(ＥＫ)にて実施したことを除けば、ＧｌｙＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅに類似した方法で、ＡｌａＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅを生成させた。簡単に述べると、Streptomyces mobaraensis由来のプロペプチド-ｍＴＧａｓｅを大腸菌で発現させ、可溶性フラクションに見出した。プロペプチド-ｍＴＧａｓｅをＱセファロースＨＰイオン交換クロマトグラフィーにより精製し、ＥＫにより消化させることで、ＡｌａＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅを得た。ついで、ＡｌａＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅを、ＳＰセファロースＨＰイオン交換カラムでさらに精製した。
S. ladakanum由来のｍＴＧａｓｅの選択性に対する種々のＮ末端外配列の効果を比較するために、S. ladakanum由来の野生型ｍＴＧａｓｅ、ＡｌａＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅ、Ｍｅｔ-ｍＴＧａｓｅの形態のｍＴＧａｓｅを別々にクローニングし、発現させ、精製した。
上述したようにしてＥＫから得られたS. mobaraensis由来のＡｌａＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅと比較すると、ＧｌｙＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅ-ＳＬの生成は、ＥＫ消化を使用するよりも改善された回収収率で、より特異的に、プロペプチド-３Ｃ-ｍＴＧａｓｅ-ＳＬからの３Ｃ-プロテアーゼ(ポリオウイルス由来)消化により処理された。
【００９４】
実施例３
カチオンクロマトグラフィーを使用するＮ末端にアミノ酸残基が付加されたＴＧａｓｅ変異体の精製
GE HealthcareからのAKTA技術を使用し、ＧｌｙＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅ(Ｔｙｒ６２Ｈｉｓ、Ｔｙｒ７５Ｐｈｅ)の調製物を、カチオン交換カラムで精製した。
使用したカラムは、トーヨーパール・メガキャップ２及びＳＰセファロースＢＢ、直径１１ｍｍ、高さ２００ｍｍ、室温での容量１９．０ｍｌであった。
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【００９５】
実施例４
カチオンクロマトグラフィーを使用するＮ末端にアミノ酸残基が付加されたＴＧａｓｅ変異体の調製
ＧｌｙＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅの調製(Ｔｙｒ６２Ｈｉｓ、Ｔｙｒ７５Ｐｈｅ)
ｐＥＴ３９ｂ＿Ｍｅｔ-プロペプチド-(３Ｃ)-ｍＴＧａｓｅ-ＳＬ Ｔｙｒ６２Ｈｉｓ、Ｔｙｒ７５Ｐｈｅ／大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)細胞を、光学密度０．４になるまで、３０μｇ／ｍｌのカナマイシンが補填されたＬＢ培地中で３０℃で培養し、さらに４時間、細胞を０．１ｍＭのＩＰＴＧで誘導させた。遠心分離により、細胞ペレットを収集した。
細胞ペレットからの可溶性フラクションを抽出し、実施例に記載したようなカチオン交換を用いて精製し、純粋なプロペプチド-(３Ｃ)-ｍＴＧａｓｅタンパク質を得た。ついで、このタンパク質を、２０℃で一晩、プロペプチド-(３Ｃ)-ｍＴＧａｓｅタンパク質に対して１：１００(ｗ／ｗ)の比率で３Ｃ-プロテアーゼ(ポリオウイルス由来)を用いて消化した。消化混合物を、活性なｍＴＧａｓｅについて、カチオン交換カラム、ＳＰセファロースＨＰ／ソース３０Ｓでさらに精製し、エチレングリコールを２０％濃度まで、精製したｍＴＧａｓｅに添加した。
【００９６】
実施例５
高度の選択性の変異体に対するスクリーニングアッセイ−S. ladakanum由来のｍＴＧａｓｅの選択性に対するＮ末端外配列の効果を評価するために使用した動力学的方法
ｈＧＨＱ４０Ｎ及びｈＧＨＱ１４１Ｎの調製
ｈＧＨ変異体ｈＧＨＱ４０Ｎ及びｈＧＨＱ１４１Ｎを、部位特異的突然変異により構築した。それらを、Ｎ末端に４つの付加アミノ酸残基を有するＭＥＡＥ-ｈＧＨＱ４０Ｎ及びＭＥＡＥ-ｈＧＨＱ１４１Ｎとして大腸菌中で発現させ、野生型組換えｈＧＨと同じ方法で精製した。簡単に述べると、可溶性ＭＥＡＥ-ｈＧＨ変異体を、ＱセファロースＸＬクロマトグラフィーを用いて、粗大腸菌溶解液から回収し、ついで、フェニルセファロースＦＦを用いて、さらにポリッシュした。部分的に精製されたＭＥＡＥ-ｈＧＨ変異体を、４２℃で１時間、ＤＡＰ-１酵素を用いて消化し、Ｎ末端のＭＥＡＥを除去した。最後に、ｈＧＨ変異体を、３８％の冷エタノールを用いて沈殿させ、ついで、７Ｍの尿素を用いて溶解させ、ソース３０Ｑカラムを用いて精製した。
【００９７】
動力学的反応
動力学的反応を、２００ｍＭのＮａＣｌ、５０μＭのｈＧＨＱ１４１Ｎ又はｈＧＨＱ４０Ｎ、１００μＭのダンシル-カダベリン(DNC, Fluka)を含有する２００μｌのトリス-ＨＣｌバッファー、２０ｍＭ、ｐＨ７．４中で実施した。２μｇのｍＴＧａｓｅを添加することにより反応を開始し、２６℃で操作した。２０秒毎に１時間、Ｅｘ／Ｅｍ：３４０／５２０ｎｍで、蛍光をモニターした。０−２０００秒の間に収集されたデータを使用し、二次多項式を用いて進行曲線を適合させ、勾配を得た。適合計算は、初期時間範囲(０-２０００秒)に得られたデータに基づいており、進行曲線の勾配は線形で、逆反応は比較的小さい。
【００９８】
実施例６
ＴＧａｓｅ変異体の高度の選択性を実証するためのキャピラリー電気泳動：
ｈＧＨのグルタミン転移(トランスグルタミネーション)反応
アミン供与体として１,３-ジアミノ-プロパノールを使用し、グルタミン転移反応を実施した。ＴＧａｓｅタンパク質を添加することにより、反応を開始させ、室温で２時間インキュベートした。時間間隔(１５−３０分)でサンプルを取り、液体窒素を使用して凍結させ、ＣＥによる転換率及び選択性の分析のために−２０℃で保存した。反応混合物が表１のように製造された。
【００９９】
表１
野生型ｈＧＨと１,３-ジアミノプロパノールを用いた、グルタミン転移のための反応混合物の調製。まず、ｈＧＨの作用溶液を、トリスＨＣｌ、５ｍＭ、ｐＨ７．０中にある保存溶液から調製した後、反応に使用した。
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【０１００】
ＣＥ分析
まず、グルタミン転移反応からの凍結サンプルを、Ｈ２Ｏを用いて１：１０に希釈し、３０．５ｃｍｘ５０μｍ内径のキャピラリーを用い、ベックマンコールター製のＰ／ＡＣＥ ＭＤＱを使用してＣＥを実施し、ＵＶ検出を２０℃、２１４ｎｍで実施した。アミノ基転移したｈＧＨのｐｌが約５．８０−６．２０になってから、トリスＨＣｌ、５０ｍＭ、ｐＨ８．０で、ＣＥ分析を実行した。
０．５分、０．１ＭのＨＣｌを用いてキャピラリーを最初に調整し、蒸留水で１．５分洗浄し、０．５分サンプルを注入し、最後に、サンプル分離のために＋１５ｋＶで２５分操作した。
ＣＥプロファイルから、野生型ｈＧＨ、Ｑ１４１で一置換されたｈＧＨ、及びＱ４０で一置換されたｈＧＨの保持時間は、それぞれ６．５、７．９及び１０分であった。
【０１０１】
実施例７
高選択性を有するｍＴＧａｓｅ変異体の評価
変異体の選択性の改善を、S. mobaraensis由来の野生型ｍＴＧａｓｅ(ＡｌａＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅ形態)からのものと比較した。Ｎ末端変異体の選択性は、スクリーニングアッセイで評価した。全ての変異体の選択性は、基質として野生型ｈＧＨを、アミン供与体として１,３-ジアミノプロパノールを使用する、グルタミン転移反応でのＣＥ分析により評価した。
【０１０２】
実施例８
S. ladakanum由来のｍＴＧａｓｅの選択性に対する、種々のＮ末端配列の効果
種々のＮ末端外配列を有する、S. ladakanum由来のｍＴＧａｓｅの変異体を、実施例５に記載したアッセイを使用し、ｈＧＨＱ４０(基質としてｈＧＨＱ１４１を使用)に対する、ｈＧＨＱ１４１(基質としてｈＧＨＱ４０Ｎを使用)での選択性に対して比較した。
表２に示す結果には、S. ladakanum由来のｍＴＧａｓｅの全体的な選択性が、S. mobaraensis由来のＡｌａＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅのものよりも高いことが示された。
【０１０３】
異なるＮ末端配列を有するS. ladakanum由来の４つの異なる型のｍＴＧａｓｅの中でも、ＧｌｙＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅはＲＳ２．７の最も高度な選択性を有していることで突出する。S. ladakanum由来のｍＴＧａｓｅの結晶構造は利用できないが、表２に示す結果には、ｍＴＧａｓｅのＮ末端が、ｈＧＨ等のその基質に対するｍＴＧａｓｅの結合ポケットの高次構造変化に関与していることが示されている。ｍＴＧａｓｅの結合ポケットの締め付け低下により選択性が改善され、例えばｈＧＨのＱ１４１等の基質の所定部位のＧｌｎ残基を、ｍＴＧａｓｅで触媒されるグルタミン転移にとってより好ましいものにする。S. ladakanum由来の野生型ＧｌｙＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅの選択性は、ＣＥにより測定されるグルタミン転移反応でさらに確認した。上述の結果に基づき、S. ladakanumのＧｌｙＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅについてさらなる突然変異を生成させた。
S. mobaraensis由来の様々なＮ末端型のｍＴＧａｓｅに対して選択性に何の差異も観察されないため、S. mobaraensis由来のＡｌａＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅを参照として使用し、選択性の改善を、実施例５に記載のスクリーニングアッセイから算出されるＲＳ(相対的選択性)により評価した。
【０１０４】
表２
様々なＮ末端配列を有するS. ladakanum由来のｍＴＧａｓｅ変異体の選択性の比較。S. mobaraensis由来のＡｌａＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅを参照として使用した。算出された選択性は、ｈＧＨ４０(基質としてｈＧＨＱ１４１を使用)と比較した、ｈＧＨＱ１４１(基質としてｈＧＨＱ４０Ｎを使用)に対する活性であった。
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【０１０５】
実施例９
S. ladakanum由来のＧｌｙＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅをベースにした部位特異的突然変異よって生成されたｍＴＧａｓｅ
基質として野生型ｈＧＨを、及びアミン供与体として１,３-ジアミノプロパノールを用い、ＧｌｙＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅを使用して、グルタミン転移反応を実施した。Ｑ４０に対する、ｈＧＨのＱ１４１でのグルタミン転移に対する選択性を、ＣＥにより評価した。選択性の改善を、参照としてS. mobaraensis由来のＡｌａＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅを、ベンチマークとしてS. ladakanum由来のＧｌｙＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅを使用して、評価した。結果を表３にまとめる。各変異体に対するＣＥグラフを、図２Ｂから図２Ｈに示す。
【０１０６】
表３にまとめられた結果には、Ｙ７５Ａ、Ｙ７５Ｆ、Ｙ７５Ｎ、Ｙ６２Ｈ＿Ｙ７５Ｎ及びＹ６２Ｈ＿Ｙ７５Ｆを含む全ての変異体が、ＧｌｙＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅ-ＳＬのものよりも、改善された選択性を有していたことが示されている。最も高い選択性の変異体は、ｈＧＨの転換率が４９．２％の場合に、３６．２の選択性を有するＧｌｙＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅ＿Ｙ６２Ｈ＿Ｙ７５Ｆであり、S. mobaraensis由来のＡｌａＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅのものよりも、６．４倍高い。ｈＧＨ転換率が３８．１％以下で、選択性が７．６倍改善された、さらなる測定を実施した。ＧｌｙＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅ＿Ｙ６２Ｈ＿Ｙ７５Ｆ変異体を使用するグルタミン転移反応を繰り返すと、変異体及び参照ｍＴＧａｓｅの双方に対するｈＧＨ転換率が約４０％である場合、S. mobaraensis由来のＡｌａＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅのものより、選択性の改善度が、７．６倍高かった。
【０１０７】
表３
ｍＴＧａｓｅの選択性の比較
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S. ladakanum由来のＧｌｙＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅ＿Ｙ６２Ｈ＿Ｙ７５Ｆの配列は、配列番号：４として与える。
S. ladakanum由来のペプチド プロペプチド-(３Ｃ)-ＭＴＧａｓｅの配列は、配列番号：５として与える。
【０１０８】
実施例１０
ｈＧＨにおけるＧｌｎ-１４１対Ｇｌｎ-４０に対するそれらの選択性についてのS. ladakanum及びS. mobarense由来のｍＴＧａｓｅの試験
このアッセイでは、位置Ｇｌｎ-４０及びＧｌｎ-１４１の一にグルタミンの代わりにアスパラギン残基をそれぞれ有し、一のグルタミンのみを残して反応させる２つのｈＧＨ変異体を使用する。前記変異体の調製法は、Kunkel TAら, Methods in Enzymology 154, 367-382(1987)、及びChung Nan Changら, Cell 55, 189-196(1987)に記載されている。ｈＧＨ変異体Ｑ４０Ｎは、ｈＧＨにおけるＧｌｎ-１４１のモデル基質であり、Ｑ１４１ＮはＧｌｎ-４０のモデル基質である。
４００μｌのバッファー溶液に、２２５ｍＭの１,３-ジアミノ-２-プロパノール、及び３５ｍＭのトリス(ｐＨは、濃ＨＣｌを添加することにより８．０に調節)、６００μｌの変異ｈＧＨ(１．５ｍｇ／ｍｌ)及び５μｌのＴＧａｓｅ(１．６ｍｇ／ｍｌ)を添加する。反応混合物を２５℃で３０分、インキュベートする。
【０１０９】
続く分析を、２８０ｎｍで、モノＱ５／５ＧＬ １ｍｌ(GE Health)カラム及び２８０ｎｍでのＵＶ検出器を使用するＦＰＬＣにより実施する。バッファーＡ：２０ｍＭのトリエタノールアミン、ｐＨ８．５；バッファーＢ：２０ｍＭのトリエタノールアミン、０．２ＭのＮａＣｌ、Ｈ８．５；流量：０．８ｍｌ／分。溶離勾配は以下のように定める：
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【０１１０】
ついで、選択率を、２つの生成物Ｑ１４１及びＱ４０に帰する曲線(図３及び図４に示す)下の２つの面積(任意単位)の比率から算出する。S. ladakanum(配列番号：１)及びS. mobarense(配列番号：２)由来のＴＧａｓｅを使用する場合に達成される結果を、表４に示す。Ｑ４０Ｎ＋その生成物−Ｑ１４１＝Ｑ１４１Ｎ＋その生成物−Ｑ４０で、１００に正規化させる。
表４
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【０１１１】
実施例１１
ｈＧＨのペグ化
ａ)  ｈＧＨを、リン酸塩バッファー(５０ｍＭ、ｐＨ８．０)に溶解させる。この溶液を、リン酸塩バッファーにアミン供与体、例えば１,３-ジアミノ-プロパン-２-オールが入った溶液(５０ｍＭ、１ｍｌ、ｐＨ８．０、アミン供与体を溶解させた後、希塩酸で８．０に調整)と混合する。
最後に、リン酸塩バッファーにＴＧａｓｅ(〜４０Ｕ)を溶解させた溶液(５０ｍＭ、ｐＨ８．０、１ｍｌ)を添加し、リン酸塩バッファー(５０ｍＭ、ｐＨ８)を添加することにより、容量を１０ｍｌに調節する。組合せた混合物を３７℃で約４時間、インキュベートする。温度を室温まで低下させ、Ｎ-エチル-マレイミド(ＴＧａｓｅインヒビター)を、１ｍＭの最終濃度まで添加する。さらに１時間後、混合物を、１０容量のトリスバッファー(５０ｍＭ、ｐＨ８．５)で希釈する。
ｂ)  ついで、アミン供与体が存在しているならば、ａ）で得られたアミノ基転移されたｈＧＨを、場合によってはさらに反応させて、潜在的官能基を活性化させてもよい。
ｃ)  ついで、ａ）又はｂ）で得られた官能化されたｈＧＨを、ｈＧＨに導入された官能基と反応可能な、適切に官能化されたＰＥＧと反応させる。例として、オキシム結合を、アルコキシアミンとカルボニル部分(アルデヒド又はケトン)とを反応させることにより形成してもよい。
【０１１２】
実施例１２
ｈＧＨのペグ化
工程ａ
ｈＧＨを、トリエタノールアミンバッファー(２０ｍＭ、ｐＨ８．５、４０％ｖ／ｖのエチレングリコール)に溶解させる。この溶液を、トリエタノールアミンバッファーに、アミン供与体、例えば１,３-ジアミノ-プロパン-２-オールを溶解させた溶液(２０ｍＭ、ｐＨ８．５、４０％ｖ／ｖのエチレングリコール、アミン供与体を溶解させた後、希塩酸を用いて、ｐＨを８．６に調整)と混合する。
最終的に、S. mobarense由来のＡｌａＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅ(ＡｌａＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅ-ＳＭ)、又はS. ladakanum由来のＧｌｙＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅ  Ｙ６２Ｈ＿Ｙ７５Ｆ(ＧｌｙＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅ  Ｙ６２Ｈ＿Ｙ７５Ｆ-ＳＬ)(〜０．５−７ｍｇ／ｇのｈＧＨ)を、２０ｍＭのＰＢに溶解させた溶液、ｐＨ６．０を添加し、容量を調節し、５-１５ｍｇ／ｍｌのｈＧＨ(２０ｍＭ、ｐＨ８．５)に至らしめる。組合せた混合物を、室温で１-２５時間インキュベートする。表５及び図５に示すように、反応混合物をＣＩＥ ＨＰＬＣにより分析する。ＴＡ４０は位置４０におけるアミノ基転移を意味し、ＴＡ１４１は位置１４１におけるアミノ基転移を意味し、ＴＡ４０／１４１は、位置４０及び１４１におけるアミノ基転移を意味する。
【０１１３】
表５
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＊出発物質において７５％のｈＧＨ
【０１１４】
工程ｂ
アミン供与体が存在しているならば、工程ａ）で得られたアミノ基転移されたｈＧＨを、場合によってはさらに反応させて、潜在的官能基を活性化させてもよい。
工程ｃ
ついで、工程ａ）又はｂ）で得られた官能化されたｈＧＨを、ｈＧＨに導入された官能基と反応可能な、適切に官能化されたＰＥＧと反応させる。例として、オキシム結合を、アルコキシアミンとカルボニル部分(アルデヒド又はケトン)と反応させることにより形成してもよい。
【０１１５】
実施例１３
S. ladakanumのＴＧａｓｅ変異体の選択性
各反応を、室温にて、１００μＭのモノダンシル-カダベリン(酢酸にパウダーを溶解させて調製し、１Ｍのトリス-ＨＣｌで緩衝、ｐＨ８．５)、及び５０μＭのＱ１４１Ｎ又はＱ４０Ｎヒト成長ホルモンを含有する２００ｍＭのＮａＣｌバッファー、及び２０ｍＭのトリス-ＨＣｌ、ｐＨ７．４中において実施した。ＴＧａｓｅを混合物に添加し、反応を開始させた。３０秒毎に、ｅｘｔ／ｅｍ３４０／５２０ｎｍで蛍光を測定した。Ｑ４０Ｎ及びＱ１４１Ｎについての最初の反応速度を概算し、選択性を算出するのに使用した。
いくつかの S. ladakanumＧｌｙＰｒｏ-ＴＧａｓｅ変異体についてのこの実験の結果を、表６に示す。
表６
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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