(57)【要約】  成長抑制性のプロテオグリカンの産生に起因する病態生理学的症状を治療する方法が提供される。それはＳＯＸ９の下方制御の結果、成長抑制因子、例えばプロテオグリカン類の産生の低下、ならびに成長促進因子、例えばラミニンおよびフィブロネクチンの産生の増加がもたらされるという知見に基づく。本発明の方法は、阻害剤、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡを用いるＳＯＸ９発現および機能の抑制を含む。
2010507595.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類においてＳＯＸ９活性を抑制する工程を含む、哺乳類におけるプロテオグリカン産生に関連する症状を治療する方法。
【請求項２】
前記プロテオグリカンが、ＣＳＰＧ、ＨＳＰＧおよびＫＳＰＧからなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記症状が、ニューロンの成長抑制に関連したものである請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記症状が、ニューロンの可塑性を増大させることにより改善させる請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記症状が、脊髄損傷、外傷性脳損傷、脳血管疾患、アルツハイマー病および関連する認知症からなる群から選択される請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記症状が、線維症に関連する症状である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記症状が、ＸＰＥ、糖尿病性腎症、心筋線維症、アテローム性動脈硬化症および角膜疾患からなる群から選択される請求項５に記載の方法。
【請求項８】
哺乳類においてＳＯＸ９活性を抑制する工程を含む、哺乳類におけるニューロンの変性に関連する症状を治療する方法。
【請求項９】
ＳＯＸ９活性が、ｓｉＲＮＡの投与により抑制される請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ＳＯＸ９活性が、アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与により抑制される請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ＳＯＸ９活性が、免疫学的に抑制される請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ＳＯＸ９抑制物質を含む、哺乳類における少なくとも１種類のプロテオグリカン産生に関連する症状を治療するための組成物。
【請求項１３】
前記抑制物質がｓｉＲＮＡである請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
ＳＯＸ９を抑制する候補化合物をスクリーニングする方法であって、
ａ）候補化合物を、ＳＯＸ９レポーター構築物を含むＳＯＸ９発現細胞株とともにインキュベートする工程であって、前記構築物が、レポーター遺伝子の発現を調節する制御領域と関連するＳＯＸ９結合領域を含む、工程と、
ｂ）レポーター遺伝子の出力を測定する工程と、
を含み、
候補物でのインキュベーションを行わずに得られた対照出力と比較した際の前記レポーター遺伝子の出力の低下が、前記候補化合物がＳＯＸ９抑制物質であることを示す方法。
【請求項１５】
ＳＯＸ９抑制の少なくとも１つのマーカーの発現レベルを測定する工程をさらに含み、対照と比較した際の発現の低下が、前記候補化合物がＳＯＸ９抑制物質であることを示す請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＳＯＸ９抑制のマーカーが、ＳＯＸ９  ｍＲＮＡ、ＳＯＸ９、プロテオグリカン、キシロシルトランスフェラーゼｍＲＮＡ、ＸＴ−Ｉ、ＸＴ−ＩＩ、スルホトランスフェラーゼｍＲＮＡ、スルホトランスフェラーゼ、ラミニンおよびフィブロネクチンからなる群から選択される請求項１６に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＳＯＸ９発現細胞株が、星状細胞株である請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＳＯＸ９結合領域が、ＳＯＸ９結合部位、ＸＴ−１遺伝子由来のプロモーター領域およびＣ４ＳＴ遺伝子由来のプロモーター領域からなる群から選択される請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
哺乳類において少なくとも１種類のプロテオグリカンの産生に関連する症状を治療するための薬物の製造のためのＳＯＸ９抑制物質の使用。
【請求項２０】
前記症状が、ニューロンの成長抑制に関連する症状、ニューロンの可塑性を増大することにより改善される症状、および線維症に関連する症状からなる群から選択される請求項１９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテオグリカン（ＰＧ）の産生に関連する症状を治療する方法に関する。特に、本発明は、ＰＧ産生がＳＯＸ９の阻害により調節される治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテオグリカン代謝の変化は、心筋線維症、腎疾患、弾力線維性仮性黄色腫（ＰＸＥ）ならびに損傷もしくは病変した神経系における再生不全および回復不良を含む多数の症状に関与している。ＰＸＥは、進行性の鉱化（ｍｉｎｅｒａｌｉｓａｔｉｏｎ）および弾性線維の分裂およびプロテオグリカンの堆積の増大を特徴とする、全身性の結合組織の変性疾患である。細胞外マトリックスにおけるこれらの変化は、皮膚、眼、および心血管系の弾性の低下をもたらす。ＰＸＥの重症度はＸＴ−ＩＩの特定の変種に関連し、全体的なキシロシルトランスフェラーゼ活性は、ＸＴ−Ｉの特定の変種を持つ患者において高いことが示されている。
【０００３】
心筋線維症は、心筋の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の広範囲のリモデリングおよびその後の弾力のない線維性組織による機能性組織の置換により特徴付けられるプロセスである。これらの変化は、臓器機能障害、さらに最終的に慢性心不全を引き起こす。プロテオグリカン発現の増加は、この心筋の不全の進行の主な特徴である。心室組織の線維性リモデリングの間、増大したレベルのプロテオグリカン類のデコリンおよびバイグリカンが見出され、このプロセスにおけるこれらのマトリックス成分の重要性が確認された。
【０００４】
脊髄損傷（ＳＣＩ）後に軸索再生がみられないことは、グリア性瘢痕の非許容性の環境に一部起因する（Ｆａｗｃｅｔｔ  ａｎｄ  Ａｓｈｅｒ  １９９９）。マクロファージ、ミクログリア、オリゴデンドロサイト、侵入性（ｉｎｖａｄｉｎｇ）シュワン細胞および髄膜の線維芽細胞は、グリア性瘢痕の一因であるが、星状細胞が優勢である（Ｆａｗｃｅｔｔ  ａｎｄ  Ａｓｈｅｒ  １９９９）。損傷したＣＮＳにおける反応性星状細胞は、瘢痕タンパク質の産生に関して異質である（Ｆｉｔｃｈ  ａｎｄ  Ｓｌｉｖｅｒ  １９９７）。多くの事例で、星状細胞により産生される細胞外マトリックス分子（ＥＣＭ）が軸索再生を阻害することが示されているが（Ｂａｈｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９５；Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９９；ＭｃＫｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９１；Ｒｅｉｅｒ  ａｎｄ  Ｈｏｕｌｅ  １９８８）、星状細胞は軸索成長を促進するＥＣＭ分子を分泌することも示されている（ＭｃＫｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９１）。したがって、星状細胞は、それらの産生するＥＣＭ分子の成長抑制と成長促進のバランスによって、ＳＣＩ後の再生を促進または阻害し得る。
【０００５】
コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＣＳＰＧ）は、反応性星状細胞により産生される抑制分子の中で恐らく最も重要である（Ｅｄｄｌｅｓｔｏｎ  ａｎｄ  Ｍｕｃｋｅ  １９９３；Ｆａｗｃｅｔｔ  ａｎｄ  Ａｓｈｅｒ  １９９９）。インビボおよびインビトロ研究により、再生する軸索はそれらの軸索をＣＳＰＧの多い区域に伸ばすことを中止することが示された（Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９７；Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９９；ＭｃＫｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９１；Ｚｕｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）。ＣＳＰＧは中心のコアタンパク質と多数のコンドロイチン硫酸側鎖を含む共通する構造を共有する（Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．２００２）。コンドロイチン硫酸側鎖合成は、キシロースのコアタンパク質のセリン部分への添加により開始される。この機能は、２つの異なる遺伝子ＸＴ−ＩおよびＸＴ−ＩＩによりコードされる２つのイソ型を有する酵素キシロシルトランスフェラーゼ（ＸＴ）により行われる（Ｇｏｔｔｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。これらの側鎖は、その後にコンドロイチン４−スルホトランスフェラーゼ（Ｃ４ＳＴ）（Ｙａｍａｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．２０００）またはコンドロイチン６−スルホトランスフェラーゼ（Ｆｕｋｕｔａ  ｅｔ  ａｌ．１９９５）のいずれかにより硫酸化されるが、星状細胞Ｃ４ＳＴでの方が優勢である（Ｇａｌｌｏ  ａｎｄ  Ｂｅｒｔｏｌｏｔｔｏ  １９９０）。
【０００６】
星状細胞はまた、ラミニン（Ｌｉｅｓｉ  ａｎｄ  Ｓｉｌｖｅｒ  １９８８）、Ｎ−カドヘリン（Ｔｏｍａｓｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．１９８８）、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）（Ｎｅｕｇｅｂａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９８８）およびフィブロネクチン（Ｍａｔｔｈｉｅｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．１９８９）を含む、一連の成長促進分子を産生することもできる。軸索成長のインビトロモデルを用いて、ラミニンおよびフィブロネクチンが神経突起伸展のための良好な基質であることが示された（Ｃｏｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．２００２；Ｆｏｋ−Ｓｅａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．１９９５；Ｈａｍｍａｒｂａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．１９８８；ＭｃＫｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９１；Ｒｏｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．１９８３；Ｒｏｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．１９８７）。インビボモデルにより、感覚性の軸索再生が星状細胞関連フィブロネクチンに依存すること（Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９７；Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９９；Ｔｏｍ  ｅｔ  ａｌ．２００４）および、ＳＣＩのラットモデルにおいてラミニン−γ１のくも膜下腔内投与により再生が促進されること（Ｗｉｋｓｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２００４）が実証される。
【０００７】
成長抑制分子の上方制御および／または成長促進分子の下方制御に関連する疾患およびその他の症状の治療法を開発するために、プロテオグリカンなどの成長抑制分子およびラミニンおよびフィブロネクチンなどの成長促進分子の発現を差次的に調節する経路および因子を特定することが望まれている。
【発明の概要】
【０００８】
現在、ＳＯＸ９を下方制御すると、プロテオグリカンなどの成長抑制因子の産生の低下およびラミニンおよびフィブロネクチンなどの成長促進因子の産生の増加がもたらされることが示されている。また、プロテオグリカンが、病状を含む多数の症状に関連していることも示されていおり、ＳＯＸ９を抑制することにより調節され得るかもしれない。
【０００９】
したがって、本発明の一態様では、哺乳類において少なくとも１種類のプロテオグリカンの産生に関連する症状を治療する方法が提供される。該方法は、哺乳類においてＳＯＸ９活性を抑制する工程を含む。
【００１０】
本発明のもう一つの態様では、哺乳類においてＳＯＸ９活性を抑制する工程を含む、哺乳類においてニューロン成長または再生を促進する方法が提供される。
【００１１】
もう一つの態様では、ＳＯＸ９発現を抑制する治療上有効な量の化合物を哺乳類に投与することを含む、哺乳類におけるプロテオグリカンの産生に関連する症状を哺乳類において治療する方法が提供される。
【００１２】
本発明のさらなる態様では、哺乳類において少なくとも１種類のプロテオグリカンの産生に関連する症状を治療するための組成物が提供される。該組成物は、ＳＯＸ９の抑制物質を含む。
【００１３】
本発明のもう一つの態様では、哺乳類において少なくとも１種類のプロテオグリカンの産生に関連する症状を治療するための薬物の製造のためのＳＯＸ９抑制物質の使用。
【００１４】
さらなる態様では、ＳＯＸ９の抑制のための候補化合物をスクリーニングする方法が提供される。該方法は、
ａ）候補化合物を、ＳＯＸ９レポーター構築物を含むＳＯＸ９発現細胞株とともにインキュベートする工程であって、前記構築物は、レポーター遺伝子の発現を調節する制御領域に結合されたＳＯＸ９結合領域を含む工程と、
ｂ）該レポーター遺伝子についての出力結果を測定する工程と、
を含み、ここで、該レポーター遺伝子の出力の低下は、候補物でのインキュベーションを行わずに得られた対照の出力結果と比較して、候補化合物がＳＯＸ９抑制物質であることを示す。
【００１５】
本発明のこれらおよびその他の態様は、詳細な説明において以下の図面を参照して説明される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】脊髄（ｓｐｉｎａｌ  ｃｈｏｒｄ）損傷（ＳＣＩ）後のＸＴ−Ｉ、ＸＴ−ＩＩ、Ｃ４ＳＴ、ラミニンおよびフィブロネクチンの遺伝子発現プロフィールを棒グラフで示す図である。
【図２】脊髄病変における（Ａ）ＴＧＦβ２および（Ｂ）ＩＬ−６の発現プロフィールの定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）による測定結果を棒グラフで示す図である。
【図３】Ｑ−ＰＣＲを用いて測定される損傷後の脊髄におけるＳＯＸ９  ｍＲＮＡレベルを示す棒グラフを示す図である。
【図４】一次星状細胞培養中のＸＴ−Ｉ（Ａ）、ＸＴ−ＩＩ（Ｂ）およびＧＦＡＰ（Ｃ）の発現レベルを示す図である。
【図５】ＴＮＦαまたはｂＦＧＦ（Ｈ）の効果と比較した、一次星状細胞における、ＸＴ−Ｉ（Ｂ）、ＸＴ−ＩＩ（Ａ）、Ｃ４ＳＴ（Ｃ）、ＣＳ５６タンパク質（Ｄ）、フィブロネクチン（Ｅ）およびラミニン（Ｆ）遺伝子発現へのＴＧＦβ２、ＩＬ−６およびＰＤＧＦの効果を示す図である。
【図６】ＳＯＸ９発現がＸＴ−Ｉ、ＸＴ−ＩＩおよびＣ４ＳＴ遺伝子発現を増加させるが、ラミニンまたはフィブロネクチン遺伝子発現（Ａ）を増加させないこと、およびＴＧＦβ２、ＩＬ−６およびＰＤＧＦがＳＯＸ９の発現を増加させることを示すＱ−ＰＣＲを示す図である。
【図７】ＳＯＸ９発現が、ＸＴ−Ｉ（Ｂ）、ＸＴ−ＩＩ（Ｃ）およびＣ４ＳＴ（Ｄ）の基底およびＴＧＦβ２に駆動される発現に必要であること、ならびにラミニンおよびフィブロネクチン遺伝子発現がＳＯＸ９の不在下で増加することを示す、Ｑ−ＰＣＲ結果を示す図である。
【図８】ＳＣＩ後、急性の時点での抗ＣＤ１１ｄ  ｍＡｂ処理は、ＴＧＦβ２（Ａ）、ＳＯＸ９（Ｂ）、ＸＴ−Ｉ（Ｃ）、ＸＴ−ＩＩ（Ｄ）およびＣ４ＳＴ（Ｅ）発現を低下させるが、ラミニン（Ｆ）およびフィブロネクチン（Ｇ）遺伝子発現を増加させることを示す、Ｑ−ＰＣＲ結果をグラフにより示す図である。
【図９Ａ】ＳＯＸ９タンパク質配列（Ａ、Ｂ）を示す図である。
【図９Ｂ】ＳＯＸ９タンパク質配列（Ａ、Ｂ）を示す図である。
【図１０】ＴＧＦ−β２での処理の後で増加したＳＯＸ９ルシフェラーゼレポーター構築物中のルシフェラーゼ活性をグラフにより示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
哺乳類におけるプロテオグリカンの産生に関連する症状を治療する方法が提供される。該方法は、哺乳類においてＳＯＸ９活性を抑制する工程を含む。
【００１８】
ＳＯＸ９は、軟骨細胞分化および軟骨形成に必要とされる転写因子である。ヒトにおいて、ＳＯＸ９は、５０９アミノ酸を有する５６Ｋｄａタンパク質である。ＳＯＸ９タンパク質および核酸配列を、ヒトおよびその他の哺乳類のＳＯＸ９配列（配列番号１〜３）を含めて、図９に例証する。本発明の目的において、用語「ＳＯＸ９」は、その機能性変異体を含む、任意の機能性哺乳類ＳＯＸ９タンパク質を包含する。用語「機能性」とは、ネイティブの、天然に存在するＳＯＸ９タンパク質の活性、例えば、ＸＴ−１などのキシロシルトランスフェラーゼまたはＣ４ＳＴなどのスルホトランスフェラーゼの調節を保持するＳＯＸ９タンパク質をさす。
【００１９】
用語「プロテオグリカン」とは、コアタンパク質と、少なくとも一部分、キシロシルトランスフェラーゼおよびスルホトランスフェラーゼの作用により形成される１以上の共有結合されたグリコサミノグリカン鎖を含む糖タンパク質のファミリーをさす。かかるプロテオグリカンの例としては、ホスファン、ＮＧ２およびブレビカンなどのコアタンパク質を含むコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＣＳＰＧ）；デコリンなどのコアタンパク質を含むデルマタン硫酸プロテオグリカン（ＤＳＰＧ）；シンデカン、グリピカン、パールカン、アグリンおよびコラーゲンＸＶＩＩなどのコアタンパク質を含むヘパリン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）；ならびにルミカン、ケラトカン、ミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）、フィブロモジュリン、ＰＲＥＬＰ、オステオアドヘリン（Ｏｓｔｅｏａｄｈｅｒｉｎ）およびアグリカンなどのコアタンパク質を含むケラチン硫酸プロテオグリカン（ＫＳＰＧ）が挙げられる。キシロシルトランスフェラーゼ、例えばＸＴ−ＩまたはＸＴ−ＩＩは、キシロースの該添加によりグリコサミノグリカン鎖のプロテオグリカンコアタンパク質への添加における最初の律速工程を触媒する。
【００２０】
プロテオグリカン、およびそれに関連する症状に関して、用語「産生」とは、プロテオグリカン活性を修飾または調節する分子の転写調節をさし、該分子には、限定されるものではないが、コアプロテオグリカンタンパク質、グリコサミノグリカン鎖およびプロテオグリカン合成酵素、例えばＸＴ−Ｉ、ＸＴ−ＩＩおよびＣ４ＳＴなどが含まれる。
【００２１】
本明細書において用語「哺乳類」とは、ヒトおよび非ヒト哺乳類の両方をさす。
【００２２】
用語「プロテオグリカン産生に関連する症状」は、本明細書において、プロテオグリカン産生がそれに寄与し、かつ、少なくとも１種類のプロテオグリカンの減少が該症状または病態を寛解させる、望ましくない症状および病態を包含するために用いられる。例えば、プロテオグリカン産生、例えばＣＳＰＧなどは、ニューロンの再生を含む、正常なニューロンの成長またはニューロンの可塑性が阻害されるか、さもなければ妨げられる症状に寄与することが知られている。かかる症状の例としては、限定されるものではないが、神経系の主な症状が挙げられ、それには、限定されるものではないが、脊髄損傷、外傷性脳損傷、神経変性疾患、例えばフリードライヒ運動失調、脊髄小脳失調症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ルー・ゲーリック病（ＡＬＳ）、脱髄性疾患、例えば多発性硬化症、横断性脊髄炎、脊髄損傷に起因する疾患、炎症、および網膜神経の変性に関連する疾患、例えば加齢による弱視、黄斑症および網膜症、例えばウイルス、毒素、糖尿病および虚血性の遺伝性網膜変性症、例えばケリン（Ｋｊｅｌｌｉｎ）症候群およびバーナード−ショルツ（Ｂａｒｎａｒｄ−Ｓｃｈｏｌｚ）症候群、変性近視、急性網膜壊死ならびに加齢による病態、例えば認知機能の喪失が挙げられる。例には、脳血管損傷を引き起こす症状も含まれ、それには、限定されるものではないが、卒中、血管奇形、例えば動静脈奇形（ＡＶＭ）、二重の（ｄｕｒａｌ）動静脈瘻（ＡＶＦ）、脊髄血管腫、海綿状血管腫および動脈瘤、脊髄血管の閉塞（解離性大動脈瘤、塞栓、動脈硬化症を含む）に起因する虚血および発達障害、例えば二分脊椎症、髄膜脊髄瘤（ｍｅｎｉｎｇｏｍｙｏｌｃｏｅｌｅ）、またはその他の原因が含まれる。プロテオグリカンはまた、線維症に関連する病態または望ましくない症状に寄与することが知られ、したがって、かかる病態／症状は、用語「プロテオグリカン産生に関連する症状」に包含される。線維症に関連する病態および／または症状の例としては、膵臓および肺の嚢胞性線維症、心疾患、例えば心筋症、心内膜心筋線維症および特発性心筋症を含む心筋線維症、アテローム性動脈硬化症、肝臓の硬変、肺の特発性肺線維症、びまん性実質性肺疾患、縦隔線維症、骨髄線維症、精巣切除後疼痛症候群、後腹膜線維症、進行性の塊状線維症、増殖性線維形成、腫瘍性線維形成、結核（ＴＢ）、鎌形赤血球貧血症に由来する脾臓の線維症、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、腎症、例えば糖尿病性腎症、角膜瘢痕を含む強膜および角膜の症状ならびに弾力線維性仮性黄色腫（ＰＸＥ）などの線維症の主な障害が挙げられる。
【００２３】
本発明の一態様では、プロテオグリカン産生に関連する症状を治療する方法は、ＳＯＸ９を抑制することを含む。当業者は、ＳＯＸ９の発現を核酸レベルで抑制することができ、一方、ＳＯＸ９タンパク質活性をタンパク質レベルで抑制することができることを理解する。いずれの場合でも、ＳＯＸ９活性を抑制する、または少なくとも低下させるという結果が達成される。本明細書においてＳＯＸ９活性に関して用いられる用語「抑制する」は、ＳＯＸ９活性の完全な抑制そして部分的抑制の両方を含む、ＳＯＸ９活性のどのような低下もさすことを意味する。
【００２４】
ＳＯＸ９活性は、十分確立された方法、例えばアンチセンス、ｓｎｐまたはｓｉＲＮＡ技術を用いるＳＯＸ９遺伝子発現を抑制することにより抑制される。ＳＯＸ９コード核酸分子を用いて、ＳＯＸ９の核に結合し、その発現を抑制するのに効果的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを調製することができる。用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、本明細書において、標的ＳＯＸ９核酸配列の少なくとも一部分と相補的であるヌクレオチド配列を意味する。用語「オリゴヌクレオチド」とは、天然に存在する塩基、糖、および糖間（ｉｎｔｅｒｓｕｇａｒ）（骨格）結合からなるヌクレオチドまたはヌクレオシドモノマーのオリゴマーまたはポリマーをさす。この用語はまた、天然に存在しないモノマーまたは同じように機能するその一部を含む、修飾もしくは置換されたオリゴマーも含む。かかる修飾もしくは置換オリゴヌクレオチドは、細胞取込みの増大、またはヌクレアーゼの存在下での安定性の増加などの特性のために、天然に存在する形態よりも好ましい可能性がある。この用語はまた、２またはそれ以上の化学的に別個の領域を含むキメラオリゴヌクレオチドも含む。例えば、キメラオリゴヌクレオチドは、有益な特性（例えば増大したヌクレアーゼ耐性、増大した細胞への取込み）を付与する修飾ヌクレオチドの少なくとも１つの領域ならびにアンチセンス結合領域を含んでよい。その上、２またはそれ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドは結合してキメラオリゴヌクレオチドを形成することができる。
【００２５】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、リボ核酸であってもデオキシリボ核酸であってもよく、アデニン、グアニン、シトシン、チミジンおよびウラシルを含む、天然に存在する塩基を含み得る。オリゴヌクレオチドはまた、修飾された塩基、例えば、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチル、２−プロピルおよびその他のアルキルアデニン、５−ハロウラシル、５−ハロシトシン、６−アザチミン、シュードウラシル、４−チオウラシル、８−ハロアデニン、８−アミノアデニン、８−チオールアデニン、８−チオールアルキルアデニン、８−ヒドロキシルアデニンおよびその他の８−置換アデニン、８−ハログアニン、８−アミノグアニン、８−チオールグアニン、８−チオールアルキルグアニン、８−ヒドロジルグアニンおよびその他の８−置換グアニン、その他のアザおよびデアザウラシル、チミジン、シトシン、アデニン、またはグアニン、５−トリ−フルオロメチルウラシルおよび５−トリフルオロシトシンなども含んでよい。
【００２６】
本発明のその他のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、リン酸骨格、短鎖アルキルもしくはシクロアルキル糖間結合または短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式糖間結合中に修飾されたリン、酸素ヘテロ原子を含み得る。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、ホスホン酸メチルおよびホスホロジチオエートを含んでよい。その上、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、結合の組合せを含んでよく、例えば、ホスホロチオエート結合は、３’末端の４〜６塩基にしか結合しなくてもよいし、全てのヌクレオチドに結合してもよいし、１組の塩基にしか結合しなくてもよい。
【００２７】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、治療用または実験用試薬としてより適し得るヌクレオチド類似体を含んでよい。オリゴヌクレオチド類似体の例は、ＤＮＡ（またはＲＮＡ）中のデオキシリボース（ｄｅｏｘｒｉｂｏｓｅ）（またはリボース）リン酸骨格が、ペプチドにおいて見られるものと同様のポリミド（ｐｏｌｙｍｉｄｅ）骨格で置換された、ペプチド核酸（ＰＮＡ）である（Ｐ．Ｅ．Ｎｉｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９１，２５４，１４９７）。ＰＮＡ類似体は、酵素による分解に耐性であること、ならびにインビボおよびインビトロで生存が延長されることが示されている。また、ＰＮＡ鎖とＤＮＡ鎖との間に電荷の反発がないため、ＰＮＡは相補的なＤＮＡ配列とより強い結合を形成する。その他のオリゴヌクレオチド類似体は、ポリマー骨格、環状骨格、または非環式骨格を有するヌクレオチドを含んでよい。例えば、ヌクレオチドは、モルホリノ骨格構造を有してよい（米国特許第５，０３４，５０６号）。また、オリゴヌクレオチド類似体は、レポーター基、保護基およびオリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基などの基を含んでもよい。また、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、当業者に理解される糖ミメティクスを組み込んでいてもよい。
【００２８】
アンチセンス核酸分子は、本明細書に提供されるものなどの所与ＳＯＸ９核酸配列に基づいて、当分野で公知の手順を用いる化学合成および酵素連結反応を用いて構築することができる。本発明のアンチセンス核酸分子、またはその断片は、天然に存在するヌクレオチド、あるいは分子の生物学的安定性を高めるかまたはｍＲＮＡもしくはネイティブ遺伝子で形成された二重鎖の物理的安定性を高めるように設計された、様々に修飾されたヌクレオチド、例えばホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを用いて化学的に合成されてよい。アンチセンス配列はまた、生物学的に産生されてもよい。この場合、アンチセンスをコードする核酸は発現ベクターの中に組み込まれ、それは次に高効率の調節領域の制御下でアンチセンス配列を産生する組換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒ウイルスの形態の細胞に導入され、その活性はベクターが導入される細胞種により決定され得る。
【００２９】
もう１つの実施形態では、ｓｉＲＮＡ技術をＳＯＸ９の発現を抑制するために適用することができる。ＳＯＸ９遺伝子の領域に合致し、選択的にＳＯＸ９遺伝子を標的化するｓｉＲＮＡ核酸断片の適用を用いてＳＯＸ９発現を抑制することができる。かかる抑制は、ｓｉＲＮＡ断片がＳＯＸ９遺伝子に結合し、その結果機能性ＳＯＸ９を生じる遺伝子の翻訳を妨げる場合に起こる。
【００３０】
ＳＯＸ９に合致するＳｉＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチドに関して上に概説される核酸合成の十分確立された方法を用いて作成される。標的ＳＯＸ９遺伝子の構造は既知であるため、それと一致するＲＮＡの断片は容易に作成することができる。選択されたｓｉＲＮＡがＳＯＸ９活性を抑制する有効性は、ＳＯＸ９発現細胞株を用いて確認することができる。要するに、選択されたｓｉＲＮＡを、適切な成長条件下でＳＯＸ９発現細胞株とともにインキュベートすればよい。十分な反応時間の後、すなわちｓｉＲＮＡがＳＯＸ９  ｍＲＮＡに結合してＳＯＸ９  ｍＲＮＡのレベルが低下する時間の後、反応混合物を試験してそのような低下が起こったかどうか判定する。適したｓｉＲＮＡは、機能性ＳＯＸ９タンパク質を生じるＳＯＸ９遺伝子のプロセシングを妨げる。これは、例えば、本明細書においてさらに詳細に説明されるように、ＳＯＸ９結合により調節されるレポーター遺伝子の発現を同定する、細胞に基づくアッセイ法でＳＯＸ９活性についてアッセイすることにより検出することができる。
【００３１】
当業者には、本方法において有用なｓｉＲＮＡ断片が、遺伝子発現のより効果的な抑制をもたらすことのできるＳＯＸ９をコードする核酸の特定の領域、例えば、遺伝子の５’末端に由来し得ることが理解される。その上、当業者に理解されるように、有用なｓｉＲＮＡ断片は、ＳＯＸ９標的遺伝子に正確に合致しない可能性があるが、配列修飾、例えば、その中の１以上のヌクレオチド塩基の付加、欠失または置換を、その修飾されたｓｉＲＮＡが標的ＳＯＸ９遺伝子に結合する能力を有するのであれば、組み込むことができる。選択されたｓｉＲＮＡ断片は、より使用に望ましい断片を生じるためにさらに修飾することができる。例えば、ｓｉＲＮＡ断片を修飾して、アンチセンスオリゴヌクレオチドについて記載されるものと同様の方法で増大した安定性を達成することができる。
【００３２】
調製されるとすぐに、ＳＯＸ９遺伝子発現を抑制するために有用であると決定されたオリゴヌクレオチド、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびｓｉＲＮＡなどは、神経損傷もしくは変性に関連する症状の哺乳類を処置する治療的方法に用いることができる。適したオリゴヌクレオチドは、ベクター（レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびＤＮＡウイルスベクター）を含む当分野の技法を用いて、またはマイクロインジェクションなどの物理的技法を用いることにより、該哺乳類の組織または細胞に導入されてよい。
【００３３】
ＳＯＸ９活性は、例えば、直接的にまたは間接的にＳＯＸ９を抑制するよう設計された抑制物質を用いて、タンパク質レベルで抑制することもできる。ＳＯＸ９抑制物質としては、生物学的化合物、および合成小分子またはペプチドミメティクス、例えば、かかる生物学的化合物に基づくものを挙げることができる。
【００３４】
生物学的ＳＯＸ９抑制物質にはまた、免疫学的抑制物質、例えばＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎにより開発された十分確立されたハイブリドーマ技術（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５−４９７（１９７５））を用いて調製されたモノクローナル抗体が含まれる。ハイブリドーマ細胞は、選択されたＳＯＸ９領域に特異的に反応性の抗体の産生について免疫化学的にスクリーニングすることができ、モノクローナル抗体を単離することができる。本明細書において用語「抗体」は、それも本発明に従うＳＯＸ９タンパク質に特異的に反応性のその断片、ならびにキメラ抗体誘導体、すなわち可変非ヒト動物ペプチド領域と定常ヒトペプチド領域の組合せの結果生じる抗体分子を含むことが意図される。
【００３５】
合成小分子またはペプチドミメティクスなどの候補ＳＯＸ９抑制物質はまた、例えば、既知の生物学的抑制物質に基づいて、ただしプロテアーゼ耐性などの望ましい特徴を組み込んで調製することができる。一般に、かかるペプチドミメティクスは、コンピューターモデリングを含む、当分野で十分確立された技法に基づいて設計される。
【００３６】
候補抑制物質は、細胞に基づく系におけるＳＯＸ９活性をアッセイすることにより、抑制活性についてスクリーニングすることができる。適したアッセイ法は一次または株化ＳＯＸ９発現細胞株、例えば、星状細胞、心臓線維芽細胞、腎メサンギウム細胞、または角膜細胞株を利用する。ＳＯＸ９活性は、限定されるものではないが、ＳＯＸ９のｍＲＮＡまたはタンパク質レベル、プロテオグリカン（例えばＣＳＰＧ、ＨＳＰＧまたはＫＳＰＧなど）、キシロトランスフェラーゼ（例えばＸＴ−Ｉ、ＸＴ−ＩＩなど）、スルホトランスフェラーゼ（例えばＣ４ＳＴなど）、ラミニンまたはフィブロネクチンのタンパク質レベル、およびその他の出力（例えばタンパク質活性、タンパク質修飾、細胞機能、細胞活性、および同種類のものなど）を含む、ＳＯＸ９抑制の１以上のマーカーのレベルを測定することにより、かかる細胞株においてモニターすることができる。ＳＯＸ９を抑制する化合物の存在下で、プロテオグリカン、酵素およびＳＯＸ９レベルは、候補化合物の不在下でインキュベートされるＳＯＸ９発現細胞株で決定された対照レベルと比較して各々低下するが、ラミニンおよびフィブロネクチンのレベルは対照と比較して増加する。プロテオグリカンレベルは、選択されるプロテオグリカンに対して作られる標識された抗体、例えばＣＳＰＧに対して作られたＣＳ５６（Ｓｉｇｍａ）を用いて、あるいは、例えば、サフラニン−Ｏを用いる染色により、免疫学的に容易に検出することができる。当業者に理解されるように、ＳＯＸ９抑制のマーカーのレベルは、１以上の多数の標準技法、例えばスロットブロットまたはウェスタンブロット（タンパク質の定量化用）またはＱ−ＰＣＲ（ｍＲＮＡの定量化用）を用いて、一次星状細胞培養において、または別の適した細胞培養において、候補抑制物質とともに適した期間、例えば２４〜４８時間インキュベーションの後に、決定することもできる。
【００３７】
もう一つのＳＯＸ９スクリーニングアッセイでは、ＳＯＸ９レポーター構築物を含むＳＯＸ９発現細胞株を用いてよい。構築物は、レポーター遺伝子の発現を調節する制御領域、例えばプロモーターに結合されたＳＯＸ９結合領域を組み込む。Ｓｏｘ９結合領域は、本明細書において以下の具体的な例で例証されるように、例えば、ＳＯＸ９結合部位、あるいは、ＸＴ−１遺伝子のプロモーター領域に由来する、またはＣ４ＳＴ遺伝子に由来する、ＳＯＸ９結合領域の反復であってよい。レポーター遺伝子は、その出力、例えば発現、タンパク質レベル、タンパク質活性、タンパク質修飾、細胞機能、細胞活性、および同種類のものが、容易に検出可能である任意の遺伝子、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子、緑色蛍光タンパク質遺伝子およびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子であってよい。ＳＯＸ９の存在下、制御領域が活性化され、レポーター遺伝子が発現される。ＳＯＸ９抑制物質の存在下、制御領域は活性化されず、レポーター遺伝子の発現は減少するかまたは妨げられる。
【００３８】
もう１つの実施形態では、Ｓｏｘ９抑制物質についてスクリーニングする方法は、上に述べたような決定、例えば、上記のＳＯＸ９抑制の１以上のマーカーのレベルの決定、ならびにレポーター構築物の出力の測定、の組合せを含み得る。ＳＯＸ９抑制のマーカーの測定は、例えば、免疫学的技法、染色、および定量的ＰＣＲを含む、当分野で確立された技法を用いて達成することができる。この組合せ法は、プロテオグリカン産生を調節する、あらゆる注目されるＳＯＸ９の抑制を確認するのに役立つ。
【００３９】
ＳＯＸ９の治療抑制物質は、既に記載したようにプロテオグリカンの産生に関連する症状の治療を必要とする哺乳類に投与してよい。核酸に基づく抑制物質およびその他の抑制物質の両方を含む、ＳＯＸ９発現の抑制物質およびＳＯＸ９活性の抑制物質は、適した製薬上許容される担体と組み合わせて投与されてよい。「製薬上許容される」との表現は、製薬および獣医学分野での使用に許容される、すなわち許容されないほど毒性であるかまたはその他の点で不適当でないことを意味する。製薬上許容される担体の例としては、希釈剤、賦形剤および同種類のものが挙げられる。製剤についてのガイダンスには、一般に、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」２１ｓｔ  Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５を参照することができる。アジュバントの選択は、抑制物質の種類および意図される組成物の投与様式によって決まる。本発明の一実施形態では、化合物は、注入による投与、または皮下、静脈内、くも膜下腔内、脊髄内注射による投与あるいは人工マトリックスの一部としての投与のために処方され、したがって滅菌およびパイロジェンフリーの形態の、所望により、緩衝されているかまたは等張性にされた水溶液として利用される。したがって、該化合物は、蒸留水中、または、より望ましくは、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水または５％デキストロース溶液中で投与されてよい。錠剤、カプセル剤または懸濁液による経口投与用の組成物は、アジュバントを用いて調製され、それには、糖類、例えばラクトース、グルコースおよびスクロースなど；デンプン類、例えばトウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなど；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースを含む、セルロースおよびその誘導体；トラガント末；モルト；ゼラチン；タルク；ステアリン酸；ステアリン酸マグネシウム；硫酸カルシウム；植物油、例えばピーナッツ油、綿実油、ゴマ油、オリーブ油およびコーン油など；ポリオール類、例えばプロピレングリコール、グリセリン、ソルビタル（ｓｏｒｂｉｔａｌ）、マンニトールおよびポリエチレングリコール；寒天；アルギン酸；水；等張生理食塩水およびリン酸緩衝溶液が含まれる。湿潤剤、ラウリル硫酸ナトリウムなどの滑沢剤、安定剤、錠剤成形剤（ｔａｂｌｅｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）、抗酸化剤、防腐剤、着色剤および香味剤も含めてよい。例えば、鼻腔送達用のエアゾール製剤も、適した噴霧剤アジュバントを用いて調製され得る。その他のアジュバントも、組成物がどのように投与されるかにかかわらず、組成物に加えてよい。例えば、抗菌剤は、長期にわたる保存期間の間、微生物の増殖を布施部ために組成物に加えることができる。
【００４０】
抑制物質は、治療プロトコールを促進するためにその他の治療薬と組み合わせて投与することができる。
【００４１】
本発明は、その活性が、望ましくない症状、例えば、瘢痕組織の形成（例えば神経細胞に関連してグリア性瘢痕形成）、および細胞の正常な成長、再生または活性を抑制する（例えば線維症に関連する症状における）過剰な結合組織または患部領域内の結合組織に関連する場合に、プロテオグリカン、例えばＣＳＰＧ、ＫＳＰＧおよびＨＳＰＧなどの活性を抑制する手段を有利に提供する。本発明に従って、ＳＯＸ９の抑制は、かかる症状に関連するプロテオグリカンの活性または産生を、その合成に関与する酵素、例えばＸＴ−１、ＸＴ−１１およびＣ４ＳＴを下方制御することにより、有利に下方制御する。その上、ＳＯＸ９の抑制は、フィブロネクチンおよびラミニンなどの成長促進分子の産生を増加させる。したがって、本発明は、プロテオグリカンの産生に関連する望ましくない症状に苦しむ哺乳類を処置して、一般に成長抑制に関与する因子を抑制すると同時に成長を促進することのできる手段を提供する。
【００４２】
本発明の実施形態は、限定と解釈されるべきものでない以下の具体的な実施例で説明される。
【実施例１】
【００４３】
（軸索成長調節因子へのＳＯＸ９の効果）
（材料および方法）
（動物および外科手術）
これらの実験のすべてのプロトコールは、カナダ動物管理協会（Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ）により作成された「実験動物の管理および使用の指針（Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｎｉｍａｌｓ）」において確立されたポリシーに従って、西オンタリオ大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｏｎｔａｒｉｏ）動物管理委員会（Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）に認可された。３２匹の秤量２５０〜３００ｇの雌ウィスターラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）にジアゼパム（３．５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）およびアトロピン（０．０５ｍｇ／ｋｇ、皮下）を前投与した。麻酔を４％ハロタンで誘導し、１〜１．５％ハロタンで維持した。椎弓切除術を行ってＴ４脊髄セグメントを露出させ、秤量５０ｇの改造した動脈瘤クリップを、脊髄を囲むように硬膜外に通した。クリップを開放し、それを１分間閉じたままにすることにより重篤な脊髄圧迫を実現した（Ｆｅｈｌｉｎｇｓ  ａｎｄ  Ｔａｔｏｒ  １９９５）。手術創を閉じ、ラットに５ｍｇ／ｋｇのＢａｙｔｒｉｌ（Ｂａｙｅｒ  Ｉｎｃ．）、５ｍＬの０．９％生理食塩水を１日２回、３日間、およびブプレノルフィン（０．０１ｍｇ／ｋｇ、皮下）を必要に応じて投与した。膀胱を１日２回、手作業で空にした。１２時間後または３、７、２１もしくは４２日後、ラットを１：２比のケタミン：キシラジン（０．１３ｍｌ／１００ｇ）で麻酔し、脊髄の損傷したセグメントを取り出し、直ちに氷冷トリゾール溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でホモジナイズし、記載されるとおりにＲＮＡを抽出した（Ｃａｒｍｅｌ  ｅｔ  ａｌ．２００１）。
【００４４】
（一次細胞培養）
一次星状細胞培養を新生仔ラットから出生後１日（Ｐ１）に調製した（Ｗｉｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｄｉｘｏｎ  １９８９）。頭蓋骨の上部を取り外し、線維芽細胞を含む培養物の混入を回避するため、髄膜を注意深く切離した。新皮質を取り外し、無血清アドバンストＤ−ＭＥＭ（ダルベッコの改変イーグル培地、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に入れ、ピペッティングによりホモジナイズし、７０μｍ細胞濾過器（Ｆａｌｃｏｎ）を通じて重力濾過した。細胞を６ウェル皿（Ｆａｌｃｏｎ）に載せた。これらの培養中のＧＦＡＰ発現細胞の割合は９５％を上回ることが分かった。ＰＤＧＦ、ＩＬ−６、ＴＮＦαおよびＴＧＦβ２（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）およびｂＦＧＦ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いる一次星状細胞のサイトカイン処理を１２時間行った。Ｑｉａｇｅｎ（Ｇｅｒｍａｎｙ）ＲＮＡイージーキットを製造業者の仕様書に従って用いてＲＮＡを抽出した。一次星状細胞のＳｉＲＮＡおよびＣＭＶ−ＳＯＸ９発現構築物でのトランスフェクションを、６ウェル皿（Ｆａｌｃｏｎ）中で、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の仕様書に従って用いて行った。ｓｉＲＮＡ（ＡＡＡＧＵＵＧＵＣＧＣＵＣＣＣＡＣＵＧＡＡＧＵＵＵ）（配列番号４）を１５０ｐＭの濃度で用いた。普遍的な陰性対照スクランブルＳｉＲＮＡを製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の仕様書に従って用いた。蛍光標識された対照ＳｉＲＮＡでのトランスフェクション効率は３５％〜４０％であった。ＣＭＶ−ＳＯＸ９構築物は既に記載され（Ｆｏｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９４；Ｌｅｆｅｂｖｒｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９７）、ＣＭＶ−ＧＦＰ構築物での同時トランスフェクションにより推定されるプラスミドトランスフェクション効率はおよそ１０％であった。
【００４５】
（ＲＮＡインサイチューハイブリダイゼーション）
ＳＣＩ後２１または４２日にラットを４％パラホルムアルデヒドで灌流し、その脊髄を取り外し、クリオスタットによって水平に１６μｍの切片を作成した。ＸＴ−Ｉ発現のためのＲＮＡインサイチューハイブリダイゼーションを標準的な手順を用いて行った（Ｓｃｈａｅｒｅｎ−Ｗｉｅｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｇｅｒｆｉｎ−Ｍｏｓｅｒ  １９９３）。ラッタス属（ｒａｔｔｕｓ）ＸＴ−Ｉ遺伝子のヌクレオチド２２６〜７１７（ＮＣＢＩ受託番号ＸＭ３４１９１２．１、参照により本明細書に援用）由来の４９１ｂｐ断片を逆転写ＰＣＲにより増幅させ、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローニングした。アンチセンスリボプローブを、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼおよびジゴキシゲニン標識ＵＴＰを用いて作成した。抗ジゴキシゲニンアルカリ性ホスファターゼ標識抗体（１：５００；Ｒｏｃｈｅ）および４−ニトロブルーテトラゾリウムクロライドを５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスフェート（ＮＢＴ−ＢＣＩＰ；Ｒｏｃｈｅ）とともに用いてリボプローブシグナルを検出した。センスリボプローブを陰性対照として用いた。
【００４６】
（免疫組織化学）
ＳＣＩ後２１または４２日にラットを４％パラホルムアルデヒドで灌流し、その脊髄を取り外し、クリオスタットによって水平に１６μｍの切片を作成した。反応性星状細胞を同定する抗ＧＦＡＰ抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）を１：２００希釈で用いて、マクロファージを同定する抗ＣＤ１１ｂ抗体（Ｓｉｇｍａ）を１：２００希釈で用いて、またはコンドロイチン硫酸−４または−６側鎖の末端部分を認識し、したがって多様なＣＳＰＧを検出する（Ａｖｎｕｒ  ａｎｄ  Ｇｅｉｇｅｒ  １９８４；Ｆａｗｃｅｔｔ  ａｎｄ  Ａｓｈｅｒ  １９９９）抗体、ＣＳ５６（Ｓｉｇｍａ）を１：５０希釈で用いて、スライドを免疫組織化学用に加工した。
【００４７】
（スロットブロット分析）
組織および細胞サンプルを、ＲＩＰＡバッファー［２０ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１％  ＳＤＳ］に溶解した。次に、タンパク質（３μｇ／ウェル）を、Ｂｉｏ−Ｄｏｔスロットブロット装置（ＢｉｏＲａｄ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）を用いてポリ二フッ化ビニリデン膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）に移した。膜を最初に１０％脱脂粉乳中でブロッキングし、次にＣＳ−５６（Ｓｉｇｍａ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）の１：２００希釈一次抗体とともに一晩インキュベートした。ＨＲＰ標識ロバ抗マウス抗体（１：１０，０００）でインキュベーションした後、ＥＣＬ  ｐｌｕｓ  ウェスタンブロッティング検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）中で製造業者の仕様書に従って膜をインキュベートした。免疫反応性バンドを、イメージングデンシトメーター（ＢｉｏＲａｄ  ＧＦ−７００  イメージングデンシトメーター，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）によりスキャンし、Ｍｕｌｔｉ−Ａｎａｌｉｓｔソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）を用いて結果を定量化した。全ての値は、発現に関するデンシトメトリー値を、β−アクチン（１：１０，０００希釈のＳｉｇｍａ製抗β−アクチン抗体）の発現に関する値で除算することにより正規化した。
【００４８】
（推定プロモーター領域のコンピュータでの解析）
ＣＢＧの推定プロモーター領域は、ＥＬＤＯＲＡＤＯソフトウェアを用いて同定した。転写開始部位は、プロモーター同定プログラムＥＬＤＯＲＡＤＯに組み込まれたデータベースを用いて遺伝子に自動的に割り当てられた（Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２００６）。ＤＩＡＬＩＧＮソフトウェアツール（Ｇｅｎｏｍａｔｉｘ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，ＧｍｂＨ）を用いてプロモーターヌクレオチド配列を解析した。
【００４９】
（マイクロアレイハイブリダイゼーションおよびデータ解析）
全てのジーンチップは、Ｌｏｎｄｏｎ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｃｅｎｔｒｅ（Ｒｏｂａｒｔｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）で加工された。Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）およびＲＮＡ  ６０００  ナノキット（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を用いてＲＮＡの質を評価した。ＲＮＡを、（脊髄損傷ラットの病変の中心の）Ｔ４を中心とする脊髄の２ｍｍ部分から抽出した。ビオチン化した相補ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｍａｎｕａｌ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）のように１０μｇの全ＲＮＡから調製した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）およびオリゴ（ｄＴ）２４プライマーを用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成した。ビオチン標識ｃＲＮＡを、ビオチン化ＵＴＰおよびＣＴＰを組み込んだＢｉｏＡｒｒａｙ  Ｈｉｇｈ−Ｙｉｅｌｄ  ＲＮＡ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｅｎｚｏ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を用いてインビトロ転写により調製した。１０μｇの標識ｃＲＮＡを、４５℃にて１６時間、ＲＡＥ２３０Ａ  ＧｅｎｅＣｈｉｐｓにハイブリダイズさせた。ＧｅｎｅＣｈｉｐｓは、  Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｓｃａｎｎｅｒ  ３０００（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）でスキャンした。プローブシグナル強度を、ＧＣＯＳ１．３（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）でＳｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎアルゴリズムパラメータの初期値を用いて生成し、全てのプローブセットの１５０のＴａｒｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌおよび１．Ｇｅｎｅ発現レベルデータのＮｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｖａｌｕｅを、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  ＧＸ  ７．０のＲＭＡプレプロセッサ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて生成した。次に、データを変換し（０．０１未満の測定値を０．０１に設定）、チップごとに第５０百分位数に、さらに遺伝子ごとに中央値に正規化した。
【００５０】
（定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ））
最初に、鎖ｃＤＮＡを、条件（細胞培養または動物組織）ごとに、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ａｒｃｈｉｖｅ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ  ＣＡ）を製造業者のプロトコールに従って用いて、１μｇ  ＲＮＡから合成した。プライマープローブセット、光学接着剤カバー、およびＰＣＲプレートは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）より購入した。５’をＶＩＣで標識したリボソームプローブを除いて、プローブを、５’をＦＡＭで、さらにクエンチャーとして３’をＴＡＭＲＡで標識した。Ｔａｑ  Ｍａｎアッセイのためのサーマルサイクラー条件は、９５℃で１０分、それに続いて９５℃で３０秒を４０サイクル、それに続いて６０℃で３０秒であった。ｃＤＮＡ連続希釈を用いるサイクル閾値の標準曲線を確立し、各標的ｍＲＮＡの存在量を算出するために用いた。技術的三重反復試験および少なくとも生物学的三重反復試験を、試験した全ての条件で行った。Ｑ−ＰＣＲにより測定された１８Ｓ  ｍＲＮＡの量に値を正規化した。二元配置分散分析、それに続いて多重比較のためのＤｕｎｎの補正、または比較を単一変数（対照）で行う場合にＤｕｎｎｅｔの手順を加えた、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ検定によりデータを解析した。２群のみを比較する場合にはスチューデントｔ検定を用いた。
【００５１】
【表１】
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【００５２】
（結果）
（ＳＣＩ後のＸＴ−Ｉ、ＸＴ−ＩＩおよびＣ４ＳＴの発現プロフィール）
ＸＴ−Ｉ、ＸＴ−ＩＩおよびＣ４ＳＴはすべて、Ｑ−ＰＣＲにより検出されるＳＣＩ後の遺伝子発現の同様のパターンを示した（図１Ａ〜Ｃ）。これらの遺伝子ピークのｍＲＮＡレベルはＳＣＩ後１２時間から３日間までピークに達し、その後、損傷後７日までにベースラインレベルに戻る。ＸＴ−Ｉ、ＸＴ−ＩＩおよびＣ４ＳＴはそれらの発現レベルを後の時点で増加させるので、損傷後４２日までにＸＴ−Ｉ、ＸＴ−ＩＩおよびＣ４ＳＴのｍＲＮＡレベルの増加は、対照と比較してそれぞれ２、５および７倍である。記述を簡単にするために、ＸＴ−Ｉ、ＸＴ−ＩＩおよびＣ４ＳＴは、本明細書においてそれらがコンドロイチン硫酸側鎖の生成に必要な酵素のサブセットのみを表すという了解の下でＣＢＧと称される。ＳＣＩ後のＸＴ−Ｉ、ＸＴ−ＩＩおよびＣ４ＳＴの発現の増加は、脊髄病変由来のタンパク質抽出物および抗体ＣＳ−５６を用いるスロットブロット解析により測定されるＣＳＰＧレベルの増加を伴う。Ｑ−ＰＣＲにより明らかとなる発現プロフィールは、ＣＢＧように、ラミニンおよびフィブロネクチンのｍＲＮＡレベルはＳＣＩ後すぐに上昇するが、ＣＢＧとは違って、それらは損傷後の後の時点（２１日および４２日）で上昇しないことを実証する（図１Ｄ、Ｅ）。
【００５３】
（インサイチューハイブリダイゼーションによるＣＢＧ  ｍＲＮＡの細胞供給源の同定）
ＳＣＩ後のＣＢＧ  ｍＲＮＡの細胞供給源を決定するため、ラット損傷脊髄の切片でのＲＮＡインサイチューハイブリダイゼーション分析を、ＸＴ−Ｉアンチセンスリボプローブを用いて行った。マクロファージを検出する抗ＣＤ１１ｂ  ｍＡｂおよび星状細胞を検出する抗ＧＦＡＰ抗体を用いる、これらの同じ切片での免疫組織化学は、損傷後６週にこれらの細胞種の両方が病変においてＸＴ−Ｉを発現することを示した。
【００５４】
（ＩＬ−６、ＰＤＧＦ、およびＴＧＦβ２は、ＸＴ−Ｉ、ＸＴ−ＩＩおよびＣ４ＳＴの推定制御因子である）
ＸＴ−Ｉ、ＸＴ−ＩＩおよびＣ４ＳＴ遺伝子転写の可能性な陽性制御因子を同定するために用いた最初の戦略は、発現を増加させることのできる分子のサブセットは、上記のようにＱ−ＰＣＲに描かれたＸＴ−Ｉ、ＸＴ−ＩＩおよびＣ４ＳＴの発現パターンに類似の発現パターンを示すという前提に基づいていた。例えば、ＸＴ−Ｉ、ＸＴ−ＩＩおよびＣ４ＳＴ発現の誘導因子は、それ自体がＸＴ−Ｉ、ＸＴ−ＩＩおよびＣ４ＳＴの発現レベルが高い場合に上昇したレベルの発現を示し、ＸＴ−Ｉ、ＸＴ−ＩＩおよびＣ４ＳＴの発現レベルが低い場合に低いレベルの発現を示す。したがって、遺伝子発現プロフィールは、ラットにおけるクリップ圧迫ＳＣＩの後にＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプラットフォーム（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｒａｔ  ２３０Ａ遺伝子チップ）を用いてラット損傷脊髄で分析した。炎症は線維症および瘢痕の主要な制御因子であることが知られているため、その分析は炎症の既知のサイトカインメディエーターに限定した。この群から、発現プロフィールがＸＴ−Ｉ、ＸＴ−ＩＩおよびＣ４ＳＴの発現プロフィールに最も類似する３つのサイトカイン、ＩＬ−６、ＴＧＦβ２およびＰＤＧＦを特定した。マイクロアレイにより描かれた、これらのサイトカインの中の２つ、ＴＧＦβ２およびＩＬ−６についての発現プロフィールを、ＳＣＩ後１２時間、３、７、２１および４２日に病変部位から単離されたｍＲＮＡでのＱ−ＰＣＲにより検証した（図２Ａ、Ｂ）。マイクロアレイデータに一致して、これらのサイトカインは、ｍＲＮＡレベルのＳＣＩ後１２時間の急速な増加を実証し、それに続いてＴＧＦβ２においてはＳＣＩ後７日でベースラインレベルまで低下し、その後増加するが、ＩＬ−６  ｍＲＮＡはＳＣＩ後２１および４２日に増加しなかった。したがってこれらのサイトカインおよびＸＴ−Ｉ、ＸＴ−ＩＩおよびＣ４ＳＴは、ＳＣＩ後の発現のパターンが類似する。
【００５５】
（ＸＴ−Ｉ、ＸＴ−ＩＩおよびＣ４ＳＴのプロモーター領域のコンピュータでの解析）
ＸＴ−Ｉ、ＸＴ−ＩＩおよびＣ４ＳＴの制御因子を同定するために用いた第２の戦略は、３つ全ての遺伝子のプロモーターに共通する転写因子結合部位を同定することであった。この戦略は、ＸＴ−Ｉ、ＸＴ−ＩＩおよびＣ４ＳＴが遺伝子集団（ｇｅｎｅ  ｂａｔｔｅｒｙ）の一部を構成する場合、それらは重複する転写因子のセットにより制御されるとの前提に基づいていた。ＸＴ−Ｉ、ＸＴ−ＩＩおよびＣ４ＳＴの推定プロモーター領域は、Ｇｅｎｏｍａｔｉｘ  ｓｕｉｔｅソフトウェア（Ｇｅｎｏｍａｔｉｘ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＧｍｂＨ）を用いて定義された。推定転写因子結合部位を誤って同定する可能性を減らすため、ヒト、ラットおよびマウスＸＴ−Ｉ、ＸＴ−ＩＩおよびＣ４ＳＴ遺伝子のプロモーター配列を比較し、３つ全ての種の３つ全ての遺伝子において、予測される結合部位を含む転写因子だけをＸＴ−Ｉ、ＸＴ−ＩＩおよびＣ４ＳＴの候補制御因子として認めた。Ｇｅｎｏｍａｔｉｘ  ソフトウェアを用いて、ＳＯＸ９をＸＴ−Ｉ、ＸＴ−ＩＩおよびＣ４ＳＴ発現を調節する転写因子として同定した。
【００５６】
Ｇｅｎｏｍａｔｉｘの予測した、ＸＴ−１遺伝子のプロモーター中のＳＯＸ９結合部位は、以下のＸＴ−１遺伝子転写開始部位の上流のヌクレオチド配列、つまり
【化１】
2010507595.tif 000004
を含む、ＸＴ−Ｉ遺伝子の上流領域由来の配列において強調表示される。
【００５７】
生物情報科学解析は、Ｃ４ＳＴ遺伝子の転写開始部位上流の２つの別々の領域にＳＯＸ９結合配列を予測した。これらの２つの領域由来の配列を下に示す。Ｇｅｎｏｍａｔｉｘの予測したＳＯＸ９結合部位が強調表示される。
【化２】
2010507595.tif 000005
【００５８】
ＳＯＸ９がＣＢＧ発現を調節する可能性を調べるため、ラットにおいてＳＣＩ後のＳＯＸ９発現をＱ−ＰＣＲにより分析した。ＳＯＸ９は損傷後１２時間で急速な１２倍の発現レベルの増加を示した。ＳＣＩ後の３日まで、ＳＯＸ９のｍＲＮＡレベルは対照と変わらなかったが、それらはＳＣＩ後１週間で再び対照と比較して１１倍増加し、損傷後４２日まで上昇したままであった（図３）。リン酸化された活性形態のＳＯＸ９を認識する抗体および抗ＧＦＡＰ抗体を用いる免疫組織化学は、明らかに、損傷後４２日に脊髄病変部におけるＳＯＸ９とＧＦＡＰの同時発現を示す。
【００５９】
（一次星状細胞培養におけるＣＢＧ発現の特性決定）
ＸＴ−Ｉ、ＸＴ−ＩＩおよびＣ４ＳＴの推定制御因子を試験するため、細胞培養系を損傷した脊髄の細胞による埋め合わせ（ｍａｋｅ−ｕｐ）を反映するように開発した。星状細胞は、グリア性瘢痕のＣＳＰＧの主要な供給源であり（Ａｌｏｎｓｏ  ａｎｄ  Ｐｒｉｖａｔ  １９９３；Ｆａｗｃｅｔｔ  ａｎｄ  Ａｓｈｅｒ  １９９９；Ｒｅｉｅｒ  ａｎｄ  Ｈｏｕｌｅ  １９８８）、ＣＢＧおよびＳＯＸ９を発現するため、一次星状細胞培養を用いてＸＴ−Ｉ、ＸＴ−ＩＩおよびＣ４ＳＴの転写調節を調べ、培養中の３週および６週後の一次βにおけるこれらの遺伝子の発現に関するベースライン値を得るた。一次星状細胞におけるＸＴ−ＩおよびＸＴ−ＩＩ  ｍＲＮＡのレベルは、３週の培養物において６週の培養物よりもおよそ２倍大きかった（図４Ａ、Ｂ）。３週齢の一次星状細胞におけるＸＴ−ＩおよびＸＴ−ＩＩ  ｍＲＮＡのレベルがより高いことは、これらの培養物が単離手順により誘導されて活性化症状であったことが反映されている。これは、ＣＮＳ損傷の後に反応性星状細胞により発現される遺伝子である、ＧＦＡＰの発現（Ｊａｎｅｃｚｋｏ  １９８８；Ｖｉｊａｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９０）も、６週齢の星状細胞培養と比較して３週齢において上昇したという知見により支持される（図４Ｃ）。
【００６０】
（ＴＧＦ２、ＩＬ−６およびＰＤＧＦはＸＴ−Ｉ、ＸＴ−ＩＩおよびＣ４ＳＴの発現レベルを増大させる）
ＴＧＦβ２、ＰＤＧＦおよびＩＬ−６を候補ＸＴ−Ｉ、ＸＴ−ＩＩおよびＣ４ＳＴ転写制御因子として評価するため、ラット一次星状細胞培養を１、１０または１００ｎｇ／ｍｌの各々のサイトカインに曝露させた。サイトカイン曝露の１２時間後、ＸＴ−Ｉ、ＸＴ−ＩＩおよびＣ４ＳＴ  ｍＲＮＡレベルをＱ−ＰＣＲにより未処理の培養と比較して測定した。６週齢の培養物を、この時点までに星状細胞は静止症状であり（低下したＧＦＡＰ発現により証明される）、ＸＴ−Ｉ、ＸＴ−ＩＩおよびＣ４ＳＴ遺伝子のベースラインレベルが低いために、用いた。６週齢の一次星状細胞培養をＴＧＦβ２、ＩＬ−６およびＰＤＧＦで処理すると、対照値を上回る、ＸＴ−ＩＩ  ｍＲＮＡの強い濃度依存性の増加がもたらされた（図６Ａ）。同様の発現の増加がＸＴ−ＩおよびＣ４ＳＴについて観察された（図６Ｂ、６Ｃ）。これらの培養物におけるこのＣＢＧの発現増加は、スロットブロット分析により評価されるＣＳＰＧタンパク質の発現の増加に一致する（図６Ｄ）。フィブロネクチンおよびラミニン発現は同様にこれらのサイトカイン処理の後に増加した（図６Ｆ、６Ｇ）。この実験アプローチを支持して、ＸＴ−Ｉ、ＸＴ−ＩＩおよびＣ４ＳＴの発現プロフィールとは異なる発現プロフィールを有するＴＮＦβ２およびｂＦＧＦなどのサイトカインは、一次星状細胞においてＸＴ−ＩＩ  ｍＲＮＡレベルに影響を及ぼさないことが見出された（図６Ｈ）。  
【００６１】
（ＳＯＸ９はＣＢＧを調節するが、ラミニンｍＲＮＡレベルは調節しない）
ＳＯＸ９がインビトロでＸＴ−Ｉ、ＸＴ−ＩＩおよびＣ４ＳＴの発現を調節するかどうかを試験するため、一次星状細胞にＳＯＸ９発現構築物をトランスフェクトし、４８時間後、Ｑ−ＰＣＲによりＣＢＧ  ｍＲＮＡレベルを評価した。ＣＭＶに駆動されるＳＯＸ９発現は、ＸＴ−Ｉ、ＸＴ−ＩＩおよびＣ４ＳＴ  ｍＲＮＡの有意な増加をもたらした（図６Ａ）。これらの同じ培養中のフィブロネクチンおよびラミニンｍＲＮＡのレベルはＳＯＸ９過剰発現によって影響を受けなかった。ＩＬ−６、ＰＤＧＦおよびＴＧＦβ２がＳＯＸ９発現を増加させることによりＸＴ−Ｉ、ＸＴ−ＩＩおよびＣ４ＳＴ遺伝子発現を増加させるかどうか決定するため、一次星状細胞培養においてこれらのサイトカイン処理の後にＳＯＸ９  ｍＲＮＡの発現レベルをアッセイした。ＸＴ−Ｉ、ＸＴ−ＩＩおよびＣ４ＳＴの発現を増加したサイトカイン処理（ＴＧＦβ２、ＩＬ−６およびＰＤＧＦ）は、ＳＯＸ９  ｍＲＮＡレベルの有意な増加を引き起こした（図６Ｂ）。
【００６２】
ＸＴ−Ｉ、ＸＴ−ＩＩおよびＣ４ＳＴの発現へのＳＯＸ９ノックダウンの効果を試験するため、対照（スクランブルされた）低分子干渉ＲＮＡ（ＳｉＲＮＡ）または抗ＳＯＸ９  ＳｉＲＮＡを一次星状細胞にトランスフェクトし、ＳＯＸ９、ＸＴ−Ｉ、ＸＴ−ＩＩおよびＣ４ＳＴのｍＲＮＡレベルを１２時間後にＱ−ＰＣＲによりアッセイした。一次星状細胞に抗ＳＯＸ９  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした結果、ＳＯＸ９  ｍＲＮＡレベルが７５±１２％低下し、ＸＴ−Ｉ  ｍＲＮＡが７１±５．５％低下した（図７Ａ、７Ｂ）。ＴＧＦβ２処理した一次星状細胞に抗ＳＯＸ９  ＳｉＲＮＡをトランスフェクトした結果、ＳＯＸ９  ｍＲＮＡレベルが８７±１３％低下し、ＸＴ−Ｉ  ｍＲＮＡが６８±６．４％低下したが、ＴＧＦβ２処理のみの場合はＳＯＸ９およびＸＴ−１  ｍＲＮＡレベルが増加した。ＸＴ−ＩＩおよびＣ４ＳＴ発現においても、ＴＧＦβ２処理培養物および未処理培養物の両方において、抗ＳＯＸ９  ＳｉＲＮＡの存在下で同様の低下が観察された（図７Ｃ、７Ｄ）。ＳＯＸ９ノックダウンは、ラミニンまたはフィブロネクチン遺伝子発現を減少させなかった（図７Ｅ、７Ｆ）。
【００６３】
これらの結果は、明らかに、ＳＯＸ９発現が一次星状細胞におけるＣＢＧ発現に必要かつ十分であること、およびＣＢＧ発現のサイトカイン上方制御がＳＯＸ９に依存することを示す。抗ＳＯＸ９  ＳｉＲＮＡのトランスフェクションは、ラミニンおよびフィブロネクチン発現がＳＯＸ９により負に調節されることを示す。
【実施例２】
【００６４】
（抗ＣＤ１１ｄ  ｍＡｂ処理のＳＣＩへの効果）
（実験方法）
（動物および外科手術）
実施例１に記載されるとおりである。
【００６５】
（マイクロアレイ分析）
全てのＧｅｎｅＣｈｉｐｓを、Ｌｏｎｄｏｎ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｃｅｎｔｒｅ（Ｒｏｂａｒｔｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＯＮ）で加工した。Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）およびＲＮＡ  ６０００  Ｎａｎｏ  ｋｉｔ（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を用いて各々のＲＮＡサンプルの質を評価した。ビオチン化した相補ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｍａｎｕａｌ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＣＡ）のように１０μｇの全ＲＮＡから調製した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）およびオリゴ（ｄＴ）２４プライマーを用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成した。ビオチン標識ｃＲＮＡを、ビオチン化ＵＴＰおよびＣＴＰを組み込んだＢｉｏＡｒｒａｙ  Ｈｉｇｈ−Ｙｉｅｌｄ  ＲＮＡ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｅｎｚｏ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ）を用いてｃＤＮＡインビトロ転写により調製した。ビオチン標識されたｃＲＮＡ（１０μｇ）を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｍａｎｕａｌ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）に記載されるように、４５℃にて１６時間ＲＡＥ２３０Ａ  ＧｅｎｅＣｈｉｐｓにハイブリダイズさせた。各動物（各時点での３匹の抗ＣＤ１１ｄ処理動物および３匹の未処理動物）由来のＲＮＡサンプルを、別個のＧｅｎｅＣｈｉｐｓにハイブリダイズさせた。３匹の異なる未損傷動物由来の３つのＲＮＡサンプルを同様に３つの別個のＧｅｎｅＣｈｉｐｓにハイブリダイズさせて遺伝子発現の対照レベルを得た。ＧｅｎｅＣｈｉｐｓをストレプトアビジン−フィコエリトリンで、それに続いて抗体溶液で、さらに第２のストレプトアビジン−フィコエリトリン溶液で染色した。ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ４００が全ての液体の操作を行った。ＧｅｎｅＣｈｉｐｓをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｓｃａｎｎｅｒ  ３０００（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）でスキャンした。ＧＣＯＳ１．３（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｉｎｃ．，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を用いて、統計発現アルゴリズムパラメータを初期値で、全てのプローブセットの標的シグナルを１５０で、そして正規化値を１で、プローブシグナル強度を生成した。ＲＭＡプレプロセッサをＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  ＧＸ  ７．３（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）で用いて遺伝子レベルデータを生成した。データを変換し（０．０１未満の測定値を０．０１に設定）、チップごとに第５０百分位数に、さらに遺伝子ごとに中央値に正規化した。処理および／または損傷後の時間に相関する、ｍＲＮＡレベルの統計上有意な変化を、二元配置分散分析（ｐ＜０．０５）を用いて編集した。多重試験を訂正するＢｅｎｊａｍｉｎｉおよびＨｏｃｈｂｅｒｇの偽発見試験を用いて平均値間の差を決定した。全てのデータ解析および検索はＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  ＧＸ  ７．３（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を用いて行った。
【００６６】
（定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ））
この調査では、条件（細胞培養または動物組織）ごとに１μｇのＲＮＡを用いて、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ａｒｃｈｉｖｅ  Ｋｉｔを製造業者の仕様書に従って用いて（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）第１のｃＤＮＡを合成した。プライマープローブセット、光学接着剤カバー、およびＰＣＲプレートはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡより購入した。これらのプローブは、５’をＶＩＣ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で標識したリボソームプローブを除いて、５’末端をＦＡＭ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で、３’末端をクエンチャーとしてＴＡＭＲＡ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で標識した。Ｔａｑ  Ｍａｎアッセイのためのサーマルサイクラー条件は、９５℃で１０分、それに続いてＤＮＡを変性させるために９５℃で３０秒を４０サイクル、さらに鋳型をアニールおよび伸長させるために６０℃で３０秒であった。ｃＤＮＡ連続希釈を用いるサイクル閾値の標準曲線を確立し、標的遺伝子の存在量を算出するために用いた。これらの値は１８Ｓ  ｍＲＮＡの量に正規化された。一元分散分析に続いて多重比較のためのＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ検定を用いてデータを解析した。
【００６７】
【表２】
2010507595.tif 000006
【００６８】
ＳＣＩ後３、７または２１日に、対照および抗ＣＤ１１ｄ処理ラット（各時点各群につきＮ＝５）の腹膜内に２６％ケタミン（１００ｍｇ／ｍｌ、Ｖｅｔａｌａｒ，Ｂｉｏｎｉｃｈｅ，Ｂｅｌｌｅｖｉｌｌｅ，ＯＮ）および０．０６％キシラジン（２０ｍｇ／ｍｌ、Ｒｏｍｐｕｎ，Ｂａｙｅｒ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，ＯＮ）を２：１混合物で過剰投与した。各ラットの心臓内に、２５０ｍｌの酸素添加した組織培養基（ｐＨ７．４、ダルベッコの改変イーグル培地、Ｇｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）、それに続いて０．１Ｍ  リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）中５００ｍｌの４％ホルムアルデヒド固定液（両方ともに室温）を灌流させた。脊髄を中心とする病変周囲の切片を、それが病変部位（Ｔ３−Ｔ４）に対して０．５ｃｍ吻側および尾側であるように取り出した。全ての脊髄を、既に記載されるように処理した（Ｓａｖｉｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。各動物由来の連続的な１６μｍ厚さの切片を含有する８組のスライドを収集し、免疫組織化学解析に用いた。
【００６９】
（結果）
（創傷治癒および瘢痕遺伝子）
免疫応答遺伝子の発現の変化は、創傷治癒に関連する遺伝子の発現に計り知れない影響を有し得る。ＣＳＰＧ、ラミニンおよびフィブロネクチンは、脊髄損傷動物において可能な神経学的回復の程度を決定することのできるグリア性瘢痕の主要な成分である（Ｂｒａｄｂｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｇｒｉｍｐｅ  ａｎｄ  Ｓｉｌｖｅｒ，２００４）。したがって、抗ＣＤ１１ｄ  ｍＡｂ処理ラットにおける回復改善が、瘢痕形成に関与するこれらの遺伝子の発現の変化に部分的に起因する可能性を調査した。Ｑ−ＰＣＲにより、ＩＬ−６およびＴＧＦβ２  ｍＲＮＡが処理ラットにおいて急性的に下方制御されることが確認された（図８Ａ）。サイトカイン発現の低下は、抗ＣＤ１１ｄ  ｍＡｂ処理ラットにおけるＳＯＸ９、ＸＴ−Ｉ、ＸＴ−ＩＩおよびＣ４ＳＴ  ｍＲＮＡレベルの急性の低下に一致する（図８Ｃ〜８Ｅ）。ＳＯＸ９が一次星状細胞培養においてラミニンおよびフィブロネクチンの発現を抑制するという知見に一致して、抗ＣＤ１１ｄ  ｍＡｂ処理ラットにおけるＳＯＸ９発現の低下は、ラミニンおよびフィブロネクチンｍＲＮＡレベルの増加を伴った（図８Ｆ、８Ｇ）。抗ラミニン抗体および様々なＣＳＰＧを認識するＣＳ５６抗体（Ａｖｎｕｒ  ａｎｄ  Ｇｅｉｇｅｒ，１９８４）を用いるスロットブロット分析は、これらのｍＲＮＡレベルの差が、抗ＣＤ１１ｄ  ｍＡｂ処理ラットの病変におけるＣＳＰＧ：ラミニンタンパク質の比の有意な低下に関連することを示す（図８Ｈ）。病変中心由来の切片についての免疫組織化学はグリア性瘢痕の性質の変化を実証する。ＣＤ８α分析に用いた同じＳＣＩラット病変区域から採取した交代性の組織切片を用いて、抗ラミニンおよびＣＳ５６抗体、抗ニューロフィラメントおよび抗ＣＳ５６抗体ならびに抗ラミニンおよび抗ニューロフィラメント抗体での二重標識は、抗ＣＤ１１ｄ処理した脊髄損傷ラットにおいてＣＳＰＧに対してラミニンの量の増加、およびラミニンの豊富な区域で最も顕著な、病変中心のニューロフィラメント染色軸索の増加を示す。したがって、増加した軸索出芽または不足は、抗ＣＤ１１ｄ  ｍＡｂで処理したラットにおいて増加したラミニンおよび低下したＣＳＰＧ産生に関連する。
【実施例３】
【００７０】
（様々な神経病理学的サンプルにおけるＣＳＰＧの発現）
ヒトＳＣＩ、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、出血性卒中、虚血性脳卒中、およびアルツハイマー病（ＡＤ）におけるＣＳＰＧの役割を解明するため、これらの症状の被験体由来の切片で免疫組織化学を行った。組織学的切片は、ロンドンの大学病院の病理学部（Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ａｔ  Ｌｏｎｄｏｎ’ｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）（デイビッド・ラムゼイ博士（Ｄｒ．  Ｄａｖｉｄ  Ｒａｍｓａｙ））より入手した。ＣＳ５６（多くのＣＳＰＧを認識する抗体）を、ＧＦＡＰ（反応性星状細胞を染色するため）、ＳＭＩ３２（ニューロンを染色するため）、またはＣＤ６８（ミクログリア／マクロファージを染色するため）のいずれかに対する抗体と組み合わせて切片を染色した。
【００７１】
（方法）
（組織処理）
全ての神経病理学的症状のヒト切片を、デイビッド・ラムゼイ博士（西オンタリオ大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｏｎｔａｒｉｏ）病理学部）より入手した。マウスの心臓を４％パラホルムアルデヒドで灌流して組織を固定した。脳を切開して取り出し、パラフィンに包埋した。ミクロトームを用いて１０ｕｍの切片を切断し、スライドにマウントした。
【００７２】
（免疫組織化学）
一連のキシレンおよびエタノール洗浄、それに続いてメタノール中１０％過酸化水素でのインキュベーションを用いて、全ての切片を脱パラフィン（ｄｅｐｒａｆｆｉｎｉｚａｔｉｏｎ）のために処理した。脱パラフィン後、切片をクエン酸（ｐＨ６．０）中で１５分間沸騰させて抗原の回復を行った。次に、切片をＰＢＳ中で１０分間洗浄し、ＰＢＳ中１０％ヤギ血清および０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘで１時間ブロッキングした。
【００７３】
ヒト切片を、ＣＳ５６（１／１００，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、ＳＯＸ９（１／１００，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）、ＧＦＡＰ（１／１００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＳＭＩ３２（１／１００，Ｃｏｖａｎｃｅ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）、およびＣＤ６８（１／１００，Ｄａｋｏ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒａ，ＣＡ）に対する一次抗体の組合せを用いて二重染色した。マウスＭＣＡＯ切片を、ＳＯＸ９、ＧＦＡＰ、およびＴＵＪ１（１／１００  Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）に対する一次抗体の組合せを用いて二重染色した。表２および３に示されるように、異なる組合せの二次抗体を用いた。
【００７４】
【表３】
2010507595.tif 000007
【００７５】
【表４】
2010507595.tif 000008
【００７６】
全てのＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ標識二次抗体は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）より入手した。全てのその他の二次抗体は、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈより入手した。各患者由来の３つの異なる切片中のＳｏｘ９陽性細胞を手作業で計数した。
【００７７】
（リアルタイム定量的ＰＣＲ）
マウスにケタミン：キシラジン（２：１）で麻酔をかけ、生理食塩水で灌流した。脳を切開し、皮質を取り出した。次にその皮質をトリゾールの中に入れ、組織ホモジナイザーでホモジナイズした。ＲＮＡを抽出し（ｕｓｉｎｇ，，）、−８０℃で保存した。次に、ｃＤＮＡを合成した。ＳＯＸ９および１８Ｓ（既に同定）のプライマープローブセットを、定量的ＰＣＲを用いる遺伝子発現を定量するために用いた。
【００７８】
（結果）
免疫組織化学により、調査した５つ全ての神経病理学的症状においてＣＳＰＧの発現が実証された。対照切片では、ＣＳＰＧは未損傷の健康な脳のペリニューロナルネット（ＰＮＮ）の外側に発現しないことが免疫組織化学により実証された。抗ＧＦＡＰおよびＣＳ５６抗体での二重標識により、ＣＳ５６免疫反応性の領域に反応性星状細胞が存在することが示された。ヒトＴＢＩ、出血性卒中、および虚血性脳卒中では、反応性星状細胞は、ＣＳＰＧの豊富な区域の外縁の周囲に見ることができる。ＳＣＩおよびＡＤでは、反応性星状細胞はＣＳＰＧの豊富な領域全体に存在する。ＣＳＰＧの豊富な区域に関連するニューロンは、虚血性脳卒中由来の切片においてのみ観察された。ＣＤ６８陽性ミクログリアおよびマクロファージもＣＳＰＧに対して免疫反応性の区域で観察された。
【００７９】
（ヒト神経病理学的切片におけるＳＯＸ９発現）
本発明者らの研究室での以前の研究では、転写因子ＳＯＸ９が硫酸コンドロイチン側鎖合成に関与する酵素の発現に必要かつ十分であることが示されたので、ＳＯＸ９の発現がＣＳＰＧの豊富な領域において調査された。ＳＯＸ９陽性核はＣＳ５６免疫反応性の全ての区域で観察された。ＳＯＸ９の細胞局在性を解明するため、反応性星状細胞、ニューロン、およびマクロファージをそれぞれ検出するために、抗ＧＦＡＰ、抗ＳＭＩ３２、または抗ＣＤ６８抗体の中の１つと組み合わせて、抗ＳＯＸ９抗体で二重染色を行った。ＳＯＸ９は、調べた全ての神経病理学的症状の反応性星状細胞の核に見出されたが、未損傷の脳には見出されなかった。その上、ＳＯＸ９は、健康な脳および損傷または罹患した脳のニューロンの核および細胞質に、さらにＣＤ６８陽性細胞の核に見出された。健康な未損傷のニューロンにおける発現は、恐らく、ＰＮＮの一部をなすＣＳＰＧの発現へのＳＯＸ９の関与を反映する。
【００８０】
ヒトの研究と同時に、卒中（ＭＣＡＯ）のマウスモデルを研究して脳血管（ｃｅｒｅｂｒｏａｓｕｌａｒ）損傷におけるＳＯＸ９の発現および細胞局在性を確認した。ＳＯＸ９はＭＣＡＯ損傷脳の反応性星状細胞の核に見出されるが、未損傷の脳には見出されない。また、ＳＯＸ９は健康な脳と損傷した脳の両方のニューロンの核にも見出される。定量的ＰＣＲによって、未損傷の対照と比較して、ＭＣＡＯマウスの損傷した皮質においてＳＯＸ９  ｍＲＮＡ発現が上昇することが示された。
【実施例４】
【００８１】
（ＳＯＸ９抑制物質のスクリーニングアッセイ）
損傷または罹患した中枢神経系（ＣＮＳ）の反応性星状細胞により産生されたプロテオグリカン、および特にＣＳＰＧは、再生に対して抑制的である。機能獲得実験および機能喪失実験の両方を用いて、転写因子ＳＯＸ９が一次星状細胞培養においてＸＴ−Ｉ、ＸＴ−ＩＩおよびＣ４ＳＴの発現を増加するために必要かつ十分であることが見出された。また、ＳＯＸ９がＣＳＰＧの産生を増加する一方で、それがラミニンおよびフィブロネクチンの発現を減少させることも実証されている。
【００８２】
ＳＯＸ９抑制物質をスクリーニングするためのアッセイが開発された。
【００８３】
星状細胞、例えば、萎縮した（ｗｉｔｈｅｒ）一次星状細胞（げっ歯類またはヒト）またはＮｅｕ７（Ｆｏｋ−Ｓｅａｎｇ，Ｓｍｉｔｈ−Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９５）と命名された樹立された星状細胞株に、標準条件下でＳＯＸ９レポーター構築物をトランスフェクトした。ＳＯＸ９レポーター構築物（ブリティッシュ・コロンビア大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ）、マイケル・アンダーヒル博士により寄贈された）は、プラスミドｐＧＬ４（Ｐｒｏｍｅｇａ）のルシフェラーゼ遺伝子の上流にクローニングされたマウスＣｏｌ２ａ１最小プロモーター（−８９〜＋６）に結合する、４反復のＳＯＸ９結合部位を有する（Ｗｅｓｔｏｎ，Ｃｈａｎｄｒａｒａｔｎａ  ｅｔ  ａｌ．２００２）。トランスフェクトした培養物のルシフェラーゼレベルの変化をＳＯＸ９活性の読み取りとして用いる。以前用いた抗ＳＯＸ９  ＳｉＲＮＡ（またはＳＯＸ９コンディショナルノックアウト由来の星状細胞）をこのスクリーニングの陽性対照として用い、スクランブルｓｉＲＮＡを陰性対照として用いる。スクリーニングを用いて、対照ウェルと比較してルシフェラーゼ活性のレベルを低下させる化合物を同定する。かかる化合物はＳＯＸ９抑制性となり、陽性の「ヒット」とみなされる。二次スクリーニングでは、細胞生存度への影響に起因するルシフェラーゼ活性の低下を引き起こす偽陽性は、ヨウ化プロピジウム取込みにより処理培養物中の細胞死をアッセイすることにより取り除かれる。一次星状細胞培養を用いる場合、トランスフェクションは、ＳＯＸ９レポーター構築物をコトランスフェクトされた対照プラスミドに正規化される。
【００８４】
このスクリーニングの検証は実験から得られ、これらの実験により、ＳＯＸ９ルシフェラーゼレポーター構築物をトランスフェクトした一次星状細胞は、ＴＧＦβ−２が一次星状細胞においてＳＯＸ９発現および活性を増加させる時に、ＴＧＦ−β２で処置後に、ルシフェラーゼ活性のおよそ２倍の増加を実証することが示された（図１０）。具体的には、新生仔ラットから得た一次星状細胞を６ウェル皿中で１０％ＦＢＳを含むアドバンスト−ＤＭＥＭ中で６週間培養した。培養基を、ウェルあたり１０ｕｌのリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１０ｕｇ  ＳＯＸ９−レポータープラスミドＤＮＡを含む２ｍｌの無血清アドバンスト−ＤＭＥＭに交換した。トランスフェクション効率は、対照プラスミドを用いる同時トランスフェクションにより算出した。２４時間後、細胞をＴＧＦ−β２で処理した（終濃度１０ｎＭ）。ＴＧＦ−β２の適用の２４時間後、細胞を溶解し、Ｌｕｓｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＰＲＯＭＥＧＡ）（製造業者のプロトコールに従って）およびルミノメーターを用いてルシフェラーゼ活性を測定した。
【００８５】
本明細書中で言及されている全ての引用文献
【表５Ａ】
2010507595.tif 000009
【表５Ｂ】
2010507595.tif 000010
【表５Ｃ】
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【表５Ｄ】
2010507595.tif 000012
【表５Ｅ】
2010507595.tif 000013
全ての参考文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
2010507595.tif 000014
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年6月30日(2009.6.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類におけるプロテオグリカン産生に関連する症状を治療する薬剤の製造方法であって、前記薬剤にＳＯＸ９阻害剤を含める方法。
【請求項２】
前記プロテオグリカンが、ＣＳＰＧ、ＨＳＰＧおよびＫＳＰＧからなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記症状が、ニューロンの成長抑制に関連したものである請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記症状が、脊髄損傷、外傷性脳損傷、脳血管疾患、アルツハイマー病および認知症からなる群から選択される請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記症状が、線維症に関連する症状である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記症状が、ＸＰＥ、糖尿病性腎症、心筋線維症、アテローム性動脈硬化症、および角膜疾患からなる群から選択される請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＳＯＸ９活性が、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与により抑制される請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＳＯＸ９活性が、免疫学的に抑制される請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ＳＯＸ９活性が、１または複数のＩＬ−６、ＴＧＦβ２およびＰＤＧＦを阻害することにより抑制される請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ＳＯＸ９阻害剤および製薬上許容される担体を含む、哺乳類における少なくとも１種類のプロテオグリカン産生に関連する症状を治療するための組成物。
【請求項１１】
哺乳類におけるプロテオグリカン産生に関連する症状の治療に用いる候補化合物をスクリーニングする方法であって、
ａ）前記候補化合物を、ＳＯＸ９レポーター構築物を含むＳＯＸ９発現細胞株とともにインキュベートする工程であって、前記構築物が、レポーター遺伝子の発現を調節する制御領域に関連するＳＯＸ９結合領域を含む工程と、
ｂ）レポーター遺伝子の出力を測定する工程と、
を含み、
候補物でのインキュベーションを行わずに得られた対照出力と比較した際の前記レポーター遺伝子の出力の低下が、前記候補化合物が前記症状を治療するために有用であることを示す方法。
【請求項１２】
ＳＯＸ９抑制の少なくとも１つのマーカーの発現レベルを測定する工程をさらに含み、対照と比較した際の発現の低下が、前記候補化合物がＳＯＸ９抑制物質であることを示す請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＳＯＸ９抑制のマーカーが、ＳＯＸ９  ｍＲＮＡ、ＳＯＸ９、プロテオグリカン、キシロシルトランスフェラーゼｍＲＮＡ、ＸＴ−Ｉ、ＸＴ−ＩＩ、スルホトランスフェラーゼｍＲＮＡ、スルホトランスフェラーゼ、ラミニン、フィブロネクチン、ＩＬ−６、ＴＧＦβ２およびＰＤＧＦからなる群から選択される請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＳＯＸ９発現細胞株が、星状細胞株である請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＳＯＸ９結合領域が、ＳＯＸ９結合部位、ＸＴ−１遺伝子由来のプロモーター領域およびＣ４ＳＴ遺伝子由来のプロモーター領域からなる群から選択される請求項１１に記載の方法。
【国際調査報告】
2010507595.tif 000025
2010507595.tif 000026
2010507595.tif 000027