(57)【要約】  本発明は、骨格部分およびヘリックス部分を含むポリペプチドであって、このとき前記ヘリックス部分は前記骨格部分内に挿入され、前記骨格部分はノッティン（ノッティン（knottin））タンパク質または少なくとも１つのそのフラグメントを含み、前記ポリペプチドのアミノ酸配列は、前記ノッティンタンパク質または少なくとも１つのそのフラグメントのアミノ酸配列とは相違する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨格部分およびヘリックス部分を含むポリペプチドであって、
前記ヘリックス部分は前記骨格部分内に挿入され、
前記骨格部分はノッティンタンパク質または少なくとも１つのそのフラグメントを含み、
前記ポリペプチドのアミノ酸配列は、前記ノッティンタンパク質または少なくとも１つのそのフラグメントのアミノ酸配列とは相違するポリペプチド。
【請求項２】
骨格部分および生物活性ペプチド部分を含むポリペプチドであって、
前記生物活性ペプチド部分は前記骨格部分内に挿入され、
前記骨格部分はノッティンタンパク質または少なくとも１つのそのフラグメントを含み、
前記ポリペプチドのアミノ酸配列は、前記ノッティンタンパク質もしくは少なくとも１つのそのフラグメントのアミノ酸配列とは相違するポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドおよび／または前記骨格部分は、環状である請求項１または２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドおよび／または前記骨格部分は、直鎖状である請求項１または２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記ノッティンタンパク質は、ＥＥＴＩ−ＩＩＭ７Ｉ、ｏＭｃｏＴＩ−ＩＩ、ＭｃｏＥｅＴＩ、ＡＧＲＰ’およびオブツスタチンを含む群から選択される請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記ヘリックス部分はアミノ酸配列を含んでおり、そのようなアミノ酸配列は、生物活性ペプチドの１つであり、好ましくはそのような生物活性ペプチドは、ペプチドホルモン、サイトカイン、インテグリン、インテグリンリガンド、プロテアーゼ阻害剤、ＧＰＣＲリガンド、イオンチャネルリガンド、ＤＮＡもしくはＲＮＡリガンド、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、またはそれらのフラグメントおよび／もしくは誘導体を含む群から選択される請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記生物活性ペプチド部分はアミノ酸配列を含んでおり、そのようなアミノ酸配列は、ペプチドホルモン、サイトカイン、インテグリン、プロテアーゼ阻害剤、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、またはそれらのフラグメントおよび／もしくは誘導体を含む群から選択されるペプチドの１つである請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記骨格部分のアミノ酸配列は、少なくとも２個、好ましくは少なくとも４個、およびより好ましくは６個のＣｙｓ残基を含む請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記骨格部分のアミノ酸配列は、６または８個のシステインを含む請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記ヘリックス部分または前記生物活性ペプチド部分は、前記骨格部分内であって、前記骨格部分の前記ノッティンタンパク質の２個のＣｙｓ残基の間に挿入される請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記ヘリックス部分または前記生物活性ペプチド部分は、前記骨格部分内であって、Ｎ末端からＣ末端へ計数して、前記骨格部分の第１および第２のＣｙｓ残基の間、第４および第５のＣｙｓ残基の間、または第５および第６のＣｙｓ残基の間に挿入される請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記骨格部分は、前記ヘリックス部分または前記生物活性ペプチド部分が挿入されている前記ノッティンタンパク質またはそのフラグメントのＣｙｓ残基間において、少なくとも１個のアミノ酸残基、好ましくはそれ以上のアミノ酸残基、および最も好ましくは全部のアミノ酸残基が欠失したノッティンタンパク質に由来する請求項８〜１１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記ノッティンタンパク質もしくは少なくとも１つのそのフラグメントのＣｙｓ残基間のアミノ酸残基の全部が欠失している請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記ノッティンタンパク質が、ＥＥＴＩ−ＩＩ  Ｍ７Ｉであり、前記ノッティンタンパク質の前記第１および第２システイン間のアミノ酸配列が、一部またはその全部がヘリックス部分または前記生物活性ペプチド部分のアミノ酸配列で置換されている、あるいは、
前記ノッティンタンパク質が、ｏＭｃｏＴＩ−ＩＩであり、前記ノッティンタンパク質の前記第１および第２システイン間のアミノ酸配列が、一部またはその全部がヘリックス部分または前記生物活性ペプチド部分のアミノ酸配列で置換されている、あるいは、
前記ノッティンタンパク質が、ＭｃｏＥｅＴＩであり、前記ノッティンタンパク質の前記第１および第２システイン間のアミノ酸配列が、一部またはその全部がヘリックス部分または生物活性ペプチド部分のアミノ酸配列で置換されている、あるいは、
前記ノッティンタンパク質が、ＡＧＲＰ’であり、前記ノッティンタンパク質の第５および第６システイン間のアミノ酸配列が、一部またはその全部がヘリックス部分または生物活性ペプチド部分のアミノ酸配列で置換されている、あるいは、
前記ノッティンタンパク質が、オブツスタチンであり、前記ノッティンタンパク質の第４および第５システイン間のアミノ酸配列が、一部またはその全部がヘリックス部分または生物活性ペプチド部分のアミノ酸配列で置換されている請求項１〜１３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記ヘリックス部分または前記生物活性ペプチド部分が、前記骨格部分のＮ末端またはＣ末端へ融合している請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記生物活性ペプチド部分が、ＰＴＨ、ＰＴＨ誘導体およびＰＴＨアナログを含む群から選択され、好ましくは配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、またはそれらのフラグメントおよび／もしくは誘導体を含む群より選択される請求項１〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
前記骨格部分が配列番号４に記載のｏＭｃｏＴＩ−ＩＩであり、前記ヘリックス部分または前記生物活性ペプチド部分が配列番号２記載のアミノ酸配列または配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するペプチドであり、前記生物活性ペプチド部分の前記ヘリックス部分は配列番号４に記載のアミノ酸配列の前記第１システインおよび前記第２システインの間に挿入され、アミノ酸残基の置換が前記ノッティンタンパク質のアミノ酸配列の前記２つのシステイン間で発生する請求項１〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
前記骨格部分が配列番号４に記載のｏＭｃｏＴＩ−ＩＩであり、前記ヘリックス部分または前記生物活性ペプチド部分が配列番号３記載のアミノ酸配列を有するペプチドであり、前記生物活性ペプチド部分の前記ヘリックス部分は配列番号４に記載のアミノ酸配列の第１システインおよび第２システインの間に挿入され、前記アミノ酸残基の置換が前記ノッティンタンパク質のアミノ酸配列の前記２つのシステイン間で自然に発生する請求項１〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
前記ヘリックス部分および／または前記生物活性ペプチド部分の長さは約４〜３０アミノ酸、好ましくは約４〜２５アミノ酸、より好ましくは約４〜２０アミノ酸、および一層より好ましくは約４〜１５アミノ酸である請求項１〜１８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
前記ポリペプチドが、配列番号６、配列番号７、または配列番号１３に記載のアミノ酸配列を含む請求項１〜１９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
前記ポリペプチドは、組換えタンパク質である請求項１〜２０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
前記ポリペプチドは、化学的に合成されたタンパク質または合成タンパク質である請求項１〜２０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
前記骨格部分は、１つのノッティンタンパク質または少なくとも１つのそのフラグメントを含む請求項１〜２２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
前記骨格部分は、１つのノッティンタンパク質または少なくとも１つのそのフラグメントのマルチマー、好ましくはダイマーを含む請求項１〜２２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
前記ノッティンタンパク質または少なくとも１つのそのフラグメントは、請求項１〜２１のいずれか一項に規定されたノッティンタンパク質または少なくとも１つのそのフラグメントである請求項２３または２４に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
請求項１〜２５のいずれか一項に記載のポリペプチドおよび医薬上許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項２７】
前記医薬組成物は、経口投与用である請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
疾患を治療または予防するための医薬品を製造するための請求項１〜２５のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項２９】
疾患を診断するための診断薬を製造するための請求項１〜２５のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項３０】
前記疾患は、骨関連疾患である請求項２８または２９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３１】
前記骨関連疾患は、低骨ミネラル含量および／または骨の脆弱性を特徴とする骨疾患である請求項３０に記載の使用。
【請求項３２】
前記骨疾患は、原発性および続発性骨粗しょう症、骨減少症、骨軟化症、骨形成不全症、虚血壊死、骨折およびインプラント治癒、ならびに他の疾患に起因する骨量減少を含む群から選択される請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
骨量減少を生じさせる前記他の疾患が、ＨＩＶ感染症、癌および関節炎を含む群から選択される請求項３２に記載の使用。
【請求項３４】
前記インプラント治癒が、歯科インプラントまたは股関節インプラントのインプラント治癒である請求項３２に記載の使用。
【請求項３５】
前記骨関連疾患が、変形性関節症、関節炎、および溶骨性病変の形成および存在を含む群から選択される請求項３１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨格部分およびヘリックス部分もしくは生物活性ペプチド部分を含むポリペプチド、同一物を含む医薬組成物およびそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨粗しょう症は、閉経後の女性において一般的であるが、閉経前の女性や男性も罹患する疾患であり、骨ミネラル密度の減少および骨微細構造の崩壊と結び付いている。骨粗しょう症は、骨を弱化させる骨格の疾患であり、特に脊柱、股関節および手関節における骨折のリスク上昇を引き起こす。この疾患は無症状で発生することが多く、骨折が発生するまで数十年にわたり知覚されないまま進行する。骨粗しょう症により弱化した骨は、非骨粗しょう症性のヒトにおいては通常は発生しないような小さな転倒や傷害の結果として折れることがあり、可動度の減少、疼痛および変形を引き起こす。
【０００３】
骨粗しょう症を治療および／または予防するために使用できる多数の療法（総説については、Ｈｏｄｓｍａｎ，Ａ．Ｂ．，Ｂａｕｅｒ，Ｄ．Ｃ．，Ｄｅｍｐｓｔｅｒ，Ｄ．Ｗ．，Ｄｉａｎ，Ｌ．，Ｈａｎｌｅｙ，Ｄ．Ａ．，Ｈａｒｒｉｓ，Ｓ．Ｔ．，Ｋｅｎｄｌｅｒ，Ｄ．Ｌ．，ＭｃＣｌｕｎｇ，Ｍ．Ｒ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｐ．Ｄ．，Ｏｌｓｚｙｎｓｋｉ，Ｗ．Ｐ．，Ｏｒｗｏｌｌ，Ｅ．，ａｎｄ  Ｙｕｅｎ，Ｃ．Ｋ．（２００５），Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖ．２６，６８８−７０３を参照されたい）、特にビスホスフォネート製剤（Ｓｔｏｒｍ，Ｔ．，Ｔｈａｍｓｂｏｒｇ，Ｇ．，Ｓｔｅｉｎｉｃｈｅ，Ｔ．，Ｇｅｎａｎｔ，Ｈ．Ｋ．，ａｎｄ  Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，Ｏ．Ｈ．（１９９０），Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２２，１２６５−１２７１；Ｗａｔｔｓ，Ｎ．Ｂ．，Ｈａｒｒｉｓ，Ｓ．Ｔ．，Ｇｅｎａｎｔ，Ｈ．Ｋ．，Ｗａｓｎｉｃｈ，Ｒ．Ｄ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｐ．Ｄ．，Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｒ．Ｄ．，Ｌｉｃａｔａ，Ａ．Ａ．，Ｒｏｓｓ，Ｐ．，Ｗｏｏｄｓｏｎ，Ｇ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｙａｎｏｖｅｒ，Ｍ．Ｊ．（１９９０），Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２３，７３−３９；Ｂｌａｃｋ，Ｄ．Ｍ．，Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｓ．Ｒ．，Ｋａｒｐｆ，Ｄ．Ｂ．，Ｃａｕｌｅｙ，Ｊ．Ａ．，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｄ．Ｅ．，Ｎｅｖｉｔｔ，Ｍ．Ｃ．，Ｂａｕｅｒ，Ｄ．Ｃ．，Ｇｅｎａｎｔ，Ｈ．Ｋ．，Ｈａｓｋｅｌｌ，Ｗ．Ｌ．，Ｍａｒｃｕｓ，Ｒ．，Ｏｔｔ，Ｓ．Ｍ．，Ｔｏｍｅｒ，Ｊ．Ｃ．，Ｑｕａｎｄｔ，Ｓ．Ａ．，Ｒｅｉｓｓ，Ｔ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｅｎｓｒｕｄ，Ｋ．Ｅ．（１９９６），Ｌａｎｃｅｔ  ３４８，１５３５−１５４１；Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｓ．Ｒ．，Ｂｌａｃｋ，Ｄ．Ｍ．，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｄ．Ｅ．，Ａｐｐｌｅｇａｔｅ，Ｗ．Ｂ．，Ｂａｒｒｅｔｔ−Ｃｏｎｎｏｒ，Ｅ．，Ｍｕｓｌｉｎｅｒ，Ｔ．Ａ．，Ｐａｌｅｒｍｏ，Ｌ．，Ｐｒｉｎｅａｓ，Ｒ．，Ｒｕｂｉｎ，Ｓ．Ｍ．，Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｃ．，Ｂｏｇｔ，Ｔ．，Ｗａｌｌａｃｅ，Ｒ．，Ｙａｔｅｓ，Ａ．Ｊ．，ａｎｄ  ＬａＣｒｏｉｓ，Ａ．Ｚ．（１９９８），ＪＡＭＡ  ２８０，２０７７−２０８２）、エストロゲン（Ｒｏｓｓｏｕｗ，Ｊ．Ｅ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｇ．Ｌ．，Ｐｒｅｎｔｉｃｅ，Ｒ．Ｌ．，ＬａＣｒｏｉｚ，Ａ．Ｚ．，Ｋｏｏｐｅｒｂｅｒｇ，Ｃ．，Ｓｔｅｆａｎｉｃｋ，Ｍ．Ｌ．，Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｒ．Ｄ．，Ｂｅｒｅｓｆｏｒｄ，Ｓ．Ａ．，Ｈｏｗａｒｄ，Ｂ．Ｖ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｃ．，Ｋｏｔｃｈｅｎ，Ｊ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｏｃｋｅｎｅ，Ｊ．（２００２）：Ｗｒｉｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｗｏｍｅｎｓ’ｓ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒｓ  ２００２，ＪＡＭＡ  ２８８，３２１−３３３）、ラロキシフェン（Ｅｔｔｉｎｇｅｒ，Ｂ．，Ｂｌａｃｋ，Ｄ．Ｍ．，Ｍｉｔｌａｋ，Ｂ．Ｈ．，Ｋｎｉｃｋｅｒｂｏｃｋｅｒ，Ｒ．Ｋ．，Ｎｉｃｋｅｌｓｅｎ，Ｔ．，Ｇｅｎａｎｔ，Ｈ．Ｋ．，Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ，Ｃ．，Ｄｅｌｍａｓ，Ｐ．Ｄ．，Ｚａｎｃｈｅｔｔａ，Ｊ．Ｒ．Ｓｔａｋｋｅｓｔａｄ，Ｊ．，Ｇｌｕｅｒ，Ｃ．Ｃ．，Ｋｒｕｅｇｅｒ，Ｋ．，Ｃｏｈｅｎ，Ｆ．Ｊ．，Ｅｃｋｅｒｔ，Ｓ．，Ｅｎｓｒｕｄ，Ｋ．Ｅ．，Ａｖｉｏｌｉ，Ｌ．Ｖ．，Ｌｉｐｓ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｓ．Ｒ．（１９９９），ＪＡＭＡ  ２８２，６３７−６４５）、鼻腔内カルシトニン（Ｃｈｅｓｎｕｔ，Ｃ．Ｈ．，Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｓ．，Ａｎｄｒｉａｎｏ，Ｋ．，Ｇｅｎａｎｔ，Ｈ．，Ｇｉｍｏｎａ，Ａ．，Ｈａｒｒｉｓ，Ｓ．，Ｋｉｅｌ，Ｄ．，ＬｅＢｏｆｆ，Ｍ．，Ｍａｒｉｃｉｃ，Ｍ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｐ．，Ｍｏｎｉｚ，Ｃ．，Ｐｅａｃｏｃｋ，Ｍ．，Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｐ．，Ｗａｔｔｓ，Ｎ．，ａｎｄ  Ｂａｙｌｉｎｋ，Ｄ．（２０００），Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．１０９，２６７−２７６）および副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）（Ｈｏｄｓｍａｎ，Ａ．Ｂ．，Ｈａｎｌｅｙ，Ｄ．Ａ．，Ｅｔｔｉｎｇｅｒ，Ｍ．Ｐ．，Ｂｏｌｏｇｎｅｓｅ，Ｍ．Ａ．，Ｆｏｘ，Ｊ．，Ｍｅｔｃａｌｆｅ  Ａ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｌｉｎｄｓａｙ，Ｒ．（２００３），Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．８８，５２１２−５２２０）は公知である。
【０００４】
ＰＴＨは、８４個のアミノ酸残基を含むペプチドであり、血液および腎臓における細胞外カルシウム恒常性を調節する責任を担っている（Ｃｈｏｒｅｖ，Ｍ．，Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎｂｌａｔｔ，Ｍ．（２００１），Ｉｎ：Ｔｈｅ  Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄｓ  −  Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ（Ｂｉｌｅｚｉｋｉａｎ，Ｊ．，Ｌｅｖｉｎｅ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｍａｒｃｕｓ，Ｒ．，ｅｄｓ），ｐｐ．５３−９１．Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｍ．Ｃｈｏｒｅｖ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎｂｌａｔｔ，Ｍ．（２００２），Ｉｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｏｎｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｂｉｌｅｚｉｋｉａｎ，Ｊ．，Ｒａｉｓｚ，Ｌ．，ａｎｄ  Ｒｏｄａｎ，Ｇ．Ａ．，ｅｄｓ），ｐｐ．４２３−４６１．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ．）。ＰＴＨは、クラスＩＩのＧタンパク質結合受容体であるＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ受容体に作用して、アデニリルシクラーゼ／ｃＡＭＰおよびホスホリパーゼＣ／イノシトールリン酸シグナル伝達経路を刺激する。ペプチド欠失試験は、ＰＴＨのＮ末端残基がＰ１Ｒ活性化（Ｔｒｅｇｅａｒ，Ｇ．Ｗ．，Ｖａｎ  Ｒｉｅｔｓｃｈｏｔｅｎ，Ｊ．，Ｇｒｅｅｎｅ，Ｅ．，Ｋｅｕｔｍａｎｎ，Ｈ．Ｔ．，Ｎｉａｌｌ，Ｈ．Ｄ．，Ｒｅｉｔ，Ｂ．，Ｐａｒｓｏｎｓ，Ｊ．Ａ．，ａｎｄ  Ｐｏｔｔｓ，Ｊ．Ｔ．（１９７３），Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ９３，１３４９；Ｔａｋａｓｕ，Ｈ．，Ｇａｒｄｅｌｌａ，Ｔ．Ｊ．，Ｌｕｃｋ，Ｍ．Ｄ．，Ｐｏｔｔｓ，Ｊ．Ｔ．，ａｎｄ  Ｂｒｉｎｇｈｕｒｓｔ，Ｆ．Ｒ．（１９９９），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８，１３４５３）および架橋結合に極めて重要な役割を果たすことを証明している。受容体突然変異誘発試験は、ＰＴＨのＮ末端残基が、膜貫通ヘリックスの細胞外ループおよび細胞外末端を含有するＰ１Ｒの部分と相互作用することを解明した（Ｂｅｒｇｗｉｔｚ，Ｃ．，Ｇａｒｄｅｌｌａ，Ｔ．Ｊ．，Ｆｌａｎｎｅｒｙ，Ｍ．Ｒ．，Ｐｏｔｔｓ，Ｊ．Ｔ．，Ｈ．Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｍ．，Ｇｏｌｄｒｉｎｇ，Ｓ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｊｕｅｐｐｎｅｒ，Ｈ．（１９９６），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，２６４６９；Ｈｏａｒｅ，Ｓ．Ｒ．Ｊ．，Ｇａｒｄｅｌｌａ，Ｔ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｕｓｄｉｎ，Ｔ．Ｂ．（２００１），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，７７４１；Ｖ．Ｂｅｈａｒ，Ａ．Ｂｉｓｅｌｌｏ，Ｂ．Ｂｉｔａｎ，Ｍ．Ｒｏｓｅｎｂｌａｔｔ，Ｍ．Ｃｈｏｒｅｖ（２０００），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，９；Ｍ．Ｄ．Ｌｕｃｋ，Ｐ．Ｈ．Ｃａｒｔｅｒ，Ｔ．Ｊ．Ｇａｒｄｅｌｌａ（１９９９），Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３，６７０．）。
【０００５】
図１に示したＰＴＨのＮ末端１−３４配列は、ＰＴＨ（１−３４）とも呼ばれ、無傷ＰＴＨホルモンの全カルシウム調節活性（ｃａｌｃｉｏｔｒｏｐｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を維持している。臨床試験は、ＰＴＨ（１−３４）が、閉経後の女性における骨ミネラル密度を回復させる、そして骨折のリスクを減少させることのできる強力な骨同化剤であることを証明している。近年、ＦＯＲＴＥＯ（登録商標）（テリパラチド；Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ社、米国インディアナ州インディアナポリス）という名称が付けられた組換えヒトＰＴＨ（１−３４）が、骨折に対して高リスク状態にある閉経後の女性における骨粗しょう症を治療する目的でＦＤＡにより承認された。
【０００６】
ＰＴＨもしくはそのＮ末端フラグメントが骨粗しょう症の治療薬として適切な薬剤であるという所見は、例えば腫瘍の結果としてのＰＴＨ過剰の存在に結び付いた病理的状態である副甲状腺機能亢進症は骨量の増加ではなく骨量の減少と関連付けられていたので、若干驚くべきことである。しかし厳密には、ＰＴＨは骨粗しょう症を治癒させるのではなく、骨量を大きく回復させ、骨の強度を増加させ、そして骨折の発生率を劇的に減少させる（Ｒｅｅｖｅ，Ｊ．，Ｍｅｕｎｉｅｒ，Ｐ．Ｊ．，Ｐａｒｓｏｎｓ，Ｊ．Ａ．，ＢＥｒｎａｔ，Ｍ．，Ｂｉｊｖｏｅｔ，Ｏ．Ｌ．，Ｃｏｕｒｐｒｏｎ，Ｐ．，Ｅｄｏｕａｒｄ，Ｃ．，Ｋｌｅｎｅｒｍａｎ，Ｌ．，Ｎｅｅｒ，Ｒ．Ｍ．，Ｒｅｎｉｅｒ，Ｊ．Ｃ．，Ｓｌｏｖｉｋ，Ｄ．，Ｖｉｓｍａｎｓ，Ｆ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｐｏｔｔｓ，Ｊ．Ｔ．（１９８０），Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２８０，１３４０−１３４４；Ｔａｍ，Ｃ．Ｓ．，Ｈｅｅｒｓｃｈｅ，Ｊ．Ｍ．，Ｍｕｒｒａｙ，Ｔ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｐａｒｓｏｎｓ，Ｊ．Ａ．（１９８２），Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １１０，５０６−５１２；Ｌｉｎｄｓａｙ，Ｒ．，Ｎｉｅｖｅｓ，Ｊ．，Ｆｏｒｍｉｃａ，Ｃ．，Ｈｅｎｎｅｍａｎ，Ｅ．，Ｗｏｅｌｆｅｒｔ，Ｌ．，Ｓｈｅｎ，Ｖ．，Ｄｅｍｐｓｔｅｒ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｃｏｓｍａｎ，Ｆ．（１９９７），Ｌａｎｃｅｔ  ３５０，５５０−５５５；Ｌａｎｅ，Ｎ．Ｅ．，Ｓａｎｃｈｅｚ，Ｓ．，Ｍｏｄｉｎ，Ｇ．Ｗ．，Ｇｅｎａｎｔ，Ｈ．Ｋ．，Ｐｉｅｒｉｎｉ，Ｅ．，ａｎｄ  Ａｒｎａｕｄ，Ｃ．Ｄ．（１９９８），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １０２，１６２７−１６３３；Ｄｅｍｐｓｔｅｒ，Ｄ．Ｗ．，Ｃｏｓｍａｎ，Ｆ．，Ｋｕｒｌａｎｄ，Ｅ．Ｄ．，Ｚｈｏｕ，Ｈ．，Ｎｉｅｖｅｓ，Ｊ．，Ｗｏｅｌｆｅｒｔ，Ｌ．，Ｓｈａｎｅ，Ｅ．，Ｐｌａｖｅｔｉｃ，Ｋ．，Ｍｕｌｌｅｒ，Ｒ．，Ｂｉｌｅｚｉｋｉａｎ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｌｉｎｄｓａｙ，Ｒ．（２００１），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １６，１８４６−１８５３；Ｎｅｅｒ，Ｒ．Ｍ．，Ａｒｎａｕｄ，Ｃ．Ｄ．，Ｚａｎｃｈｅｔｔａ，Ｊ．Ｒ．，Ｐｒｉｎｃｅ，Ｒ．，Ｇａｉｃｈ，Ｇ．Ａ．，Ｒｅｇｉｎｓｔｅｒ，Ｊ．Ｙ．，Ｈｏｄｓｍａｎ，Ａ．Ｂ．，Ｅｒｉｋｓｅｎ，Ｅ．Ｆ．，Ｉｓｈ−Ｓｈａｌｏｍ，Ｓ．，Ｇｅｎａｎｔ，Ｈ．Ｋ．，Ｗａｎｄ，Ｏ．，ａｎｄ  Ｍｉｔｌａｋ，Ｂ．Ｈ．（２００１）  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ（１−３４）  ｏｎ  ｆｒａｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｂｏｎｅ  ｍｉｎｅｒａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｉｎ  ｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌ  ｗｏｍｅｎ  ｗｉｔｈ  ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ．Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３４４，１４３４−１４４１）。ＰＴＨ（１−８４）は、ＥＵ内での製造販売承認を得たもので、Ｐｒｅｏｔａｃｔ（登録商標）として公知である。その作用機序は、骨芽細胞上にのみ存在するＰＴＨ受容体に関連している。ホルモンによるその活性化は骨芽細胞の寿命を延長させ、その活性を増加させて骨形成を導くことができる。骨芽細胞から破骨細胞への幾つかの中間メッ��ンジャーによる後者を刺激して骨を吸収することのシグナル伝達は、骨芽細胞の初期の直接刺激ほど迅速には発生しない。そこで、一過性であるＰＨＴレベルの上昇は骨芽細胞同化活性を刺激する可能性があるが、それでもまだ破骨細胞を通しての結合異化反応は誘発しない（Ｐｏｔｔｓ，Ｊ．Ｔ．（２００５），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １８７，３１１−３２５）。ＰＴＨの投与においては、タイミングが極めて重要であると思われる。制御された速度でホルモンの投与を行った試験動物における重要な試験（Ｄｏｂｉｎｇ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｔｕｒｎｅｒ，Ｒ．Ｔ．（１９９７），Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３８，４６０７−４６１２）は、ＰＴＨへの２時間未満の暴露が同化反応を誘発するが、２時間より長くなると異化反応を誘発することを証明した。このため、増加したＰＴＨレベルへの短時間の暴露の結果として好都合の同化反応が発生する精確な細胞機序は公知ではないが、ＰＴＨの間欠的投与、例えば組換えＰＴＨ（１−３４）の１日２０μｇの皮下投与は、ペプチドの持続的投与とは対照的に有益であることは明瞭に確証されている（Ｃｏｍｐｓｔｏｎ，Ｊ．Ｅ（２００６），Ｂｏｎｅ  ２００６  Ｏｃｔ  １１，ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ）。
【０００７】
極性および非極性溶媒中のＰＴＨ（１−３４）アナログについてのＮＭＲおよび構造計算による立体配座研究（Ｍａｒｘ，Ｕ．Ｃ．，Ａｕｓｔｅｒｍａｎｎ，Ｓ．，Ｂａｙｅｒ，Ｐ．，Ａｄｅｒｍａｎｎ，Ｋ．，Ｅｓｃｈａｒｔ，Ａ．，Ｓｔｉｃｈ，Ｈ．，Ｗａｌｔｅｒ，Ｓ．，Ｓｃｈｍｉｄ，Ｆ．Ｘ．，Ｊａｎｉｃｋｅ，Ｒ．，Ｆｏｒｓｓｍａｎｎ，Ｗ．Ｇ．，ａｎｄ  Ｒｏｓｃｈ，Ｐ．（１９９５）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，１５１９４；Ｍａｒｘ，Ｕ．Ｃ．，Ａｄｅｒｍａｎｎ，Ｋ．，Ｂａｙｅｒ，Ｐ．，Ｍｅｙｅｒ，Ｍ．，Ｆｏｒｓｓｍａｎｎ，Ｗ．Ｇ．，Ｒｏｓｃｈ，Ｐ．（１９９８），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，４３０８；Ｍ．Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｉ，Ａ．Ｂｉｓｅｌｌｏ，Ｍ．Ｒｏｓｅｎｂｌａｔｔ，Ｍ．Ｃｈｏｒｅｖ，Ｄ．Ｆ．Ｍｉｅｒｋｅ（１９９８），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７，１２７３７）は、膜貫通ヘプタヘリカルＧタンパク質結合受容体の活性化の責任を担っていることが公知のＰＴＨのＮ末端部分が、１０個のアミノ酸残基の短いヘリックス部分を含有すると提案している。さらに、もっと短いアナログであるＰＴＨ（１−１４）は、細胞中の高マイクロモル濃度でｃＡＭＰ形成を活性化することができる（Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｍ．，Ｐｏｔｔｓ，Ｊ．Ｔ．，Ｇａｒｄｅｌｌａ，Ｔ．Ｊ．（２０００），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，２１８３６）。ＰＴＨ（１−１４）の効力は、特異的アミノ酸置換の導入によって顕著に増加させることができる。ホモアルギニン（Ｈａｒ）含有アナログは、天然ＰＴＨ（１−Ｈ）−ＮＨ2より４０倍効力が高い。近年、Ｃａ−四置換の立体障害α−アミノ酸（Ａｉｂ）の導入は、ＰＴＨ−（１−１４）−ＮＨ2の効力およびより短い配列であるＰＴＨ（１−１１）−ＮＨ2の効力さえ強度に増加させることが証明されている（Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｎ．，Ｇｕｏ，Ｊ．，Ｇａｒｄｅｌｌａ，Ｔ．Ｊ．（２００１），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，４９００３）。Ａｉｂならびに関連するキラルおよびアキラルアナログおよびホモログは、Ｘ線分析による極めて多数の結晶構造決定によって例示されるように、オリゴペプチドにおける安定性ヘリックス形成を促進することが広汎に公知である（Ｔｏｎｉｏｌｏ，Ｃ．，ａｎｄ  Ｂｅｎｅｄｅｔｔｉ，Ｅ．（１９９１），Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１９９１，１６，３５０；Ｋａｒｌｅ，Ｌ．，ａｎｄ  Ｂａｌａｒａｍ，Ｐ．（１９９０），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９，６７４７；Ｋａｕｌ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｂａｌａｒａｍ，Ｐ．（１９９９）：Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｏｌｄｉｎｇ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．７，１０５）。
【０００８】
天然ＰＴＨのＮ末端残基の一部をペプチドヘリシティ増加性残基（Ｇｌｎ、Ａｉｂ、Ｈａｒ）と交換すると、ＰＴＨ−１受容体（Ｐ１Ｒ）への増加した結合効力を生じさせるという以前の所見と一致して、αヘリックス構造モチーフはＰＴＨ／Ｐ１Ｒ受容体との相互作用を助長できると提案されてきた（Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｎ．，Ｐｅｔｒｏｎｉ，Ｂ．Ｄ．，Ｋｈａｔｒｉ，Ａ．，ａｎｄ  Ｇａｒｄｅｌｌａ，Ｔ．Ｊ．（２００３），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２，２２８２；Ｔｓｏｍａｉａ，Ｎ．，Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｉ，Ｍ．，Ｈｙｄｅ，Ｋ．，Ｇａｒｄｅｌｌａ，Ｔ．Ｊ．，Ｍｉｅｒｋｅ，Ｄ．Ｆ．（２００４），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３，６９０）。
【０００９】
しかし、短く、概して構造化されていないペプチドは細胞プロテアーゼによって容易に分解されるという見解と一致して、ヒト血漿中のＰＴＨおよび最小化ＰＴＨの半減期は極端に短い。結果として、ＦＯＲＴＥＯ（登録商標）は、皮下注射によって毎日投与されなければならず、患者および医師両方の側で高度の努力を必要とする、むしろ非便宜的な投与方法である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
このため、本発明の基礎にある課題は、好ましくは生物活性ペプチドであるペプチドを例えば有機体などの生体系へ投与することを許容する手段を提供することである。
【００１１】
本発明の基礎にあるまた別の課題は、好ましくは生物活性ペプチドおよび／または非構造化ペプチドであるペプチドが生物学的に非活性にされることから保護することを可能にする手段を提供することであるが、そのような非活性化はペプチドの分解またはそれに該ペプチドが投与されている有機体などの生体系からのペプチドの除去によって発生する可能性がある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
これらやその他の課題は、本発明およびそれに添付の独立請求項によって解決される。好ましい実施形態は、従属請求項から取り出すことができる。
【００１３】
本発明の基礎にある課題は、第１態様では、骨格部分およびヘリックス部分を含むポリペプチドによって解決されるが、このとき
該ヘリックス部分は該骨格部分内に挿入され、
該骨格部分はノッティン（knottin）タンパク質もしくは少なくとも１つのそのフラグメントを含み、
該ポリペプチドのアミノ酸配列は、該ノッティン（knottin）タンパク質もしくは少なくとも１つのそのフラグメントのアミノ酸配列とは相違する。
【００１４】
本発明の基礎にある課題は、第２態様では、骨格部分および生物活性ペプチド部分を含むポリペプチドによって解決されるが、このとき
該生物活性ペプチド部分は該骨格部分内に挿入され、
該骨格部分はノッティン（knottin）タンパク質もしくは少なくとも１つのそのフラグメントを含み、
該ポリペプチドのアミノ酸配列は、該ノッティン（knottin）タンパク質もしくは少なくとも１つのそのフラグメントのアミノ酸配列とは相違する。
【００１５】
本発明の第１および第２態様の１つの実施形態では、ポリペプチドおよび／または骨格部分は、環状である。
【００１６】
本発明の第１および第２態様のまた別の実施形態では、ポリペプチドおよび／または骨格部分は、直鎖状である。
【００１７】
本発明の第１および第２態様の１つの実施形態では、ノッティン（knottin）タンパク質は、ＥＥＴＩ−ＩＩ  Ｍ７Ｉ、ｏＭｃｏＴＩ−ＩＩ、ＭｃｏＥｅＴＩ、ＡＧＲＰ’およびＯｂｔｕｓｔａｔｉｎを含む群から選択される。
【００１８】
本発明の第１および第２態様のまた別の実施形態では、ヘリックス部分はアミノ酸配列を含み、このときそのようなアミノ酸配列は生物活性ペプチドであり、好ましくはそのような生物活性ペプチドは、ペプチドホルモン、サイトカイン、インテグリン、インテグリンリガンド、プロテアーゼ阻害剤、ＧＰＣＲリガンド、イオンチャネルリガンド、ＤＮＡもしくはＲＮＡリガンド、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、またはそれらのフラグメントおよび／または誘導体を含む群から選択される。
【００１９】
本発明の第１および第２態様の１つの実施形態では、生物活性ペプチド部分はアミノ酸配列を含んでおり、このときそのようなアミノ酸配列は、ペプチドホルモン、サイトカイン、インテグリン、プロテアーゼ阻害剤、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、またはそれらのフラグメントおよび／または誘導体を含む群から選択されるペプチドの１つである。
【００２０】
本発明の第１および第２態様の１つの実施形態では、骨格部分のアミノ酸配列は、少なくとも２個、好ましくは少なくとも４個、およびより好ましくは６個のＣｙｓ残基を含む。
【００２１】
本発明の第１および第２態様の１つの実施形態では、骨格部分のアミノ酸配列は、６または８個のシステインを含む。
【００２２】
本発明の第１および第２態様の１つの実施形態では、ヘリックス部分もしくは生物活性ペプチド部分は、骨格部分内に、骨格部分のノッティン（knottin）タンパク質の２個のＣｙｓ残基間で挿入されている。
【００２３】
本発明の第１および第２態様の１つの実施形態では、ヘリックス部分もしくは生物活性ペプチド部分は、骨格部分内に、Ｎ末端からＣ末端へ計数して、骨格部分の第１および第２、第４および第５、または第５および第６Ｃｙｓ残基間で挿入されている。
【００２４】
本発明の第１および第２態様の１つの実施形態では、骨格部分は、それらの間にヘリックス部分もしくは生物活性ペプチド部分が挿入されているノッティン（knottin）タンパク質もしくはそれらのフラグメントのＣｙｓ残基間の少なくとも１個、好ましくはそれ以上、および最も好ましくは全部のアミノ酸残基が欠失していることによってノッティン（knottin）タンパク質から引き出される。
【００２５】
１つの好ましい実施形態では、ノッティン（knottin）タンパク質もしくはそのフラグメントのＣｙｓ残基間のアミノ酸残基の全部が欠失している。
【００２６】
本発明の第１および第２態様の１つの実施形態では、ポリペプチドは、以下の構造を含むか、それからなる。
ノッティン（knottin）タンパク質は、ＥＥＴＩ−ＩＩ  Ｍ７Ｉであり、ノッティン（knottin）タンパク質の第１および第２システイン間のアミノ酸配列は、一部またはその全部がヘリックス部分もしくは生物活性ペプチド部分のアミノ酸配列で置換されている、または
ノッティン（knottin）タンパク質は、ｏＭｃｏＴＩ−ＩＩであり、ノッティン（knottin）タンパク質の第１および第２システイン間のアミノ酸配列は、一部またはその全部がヘリックス部分もしくは生物活性ペプチド部分のアミノ酸配列で置換されている、または
ノッティン（knottin）タンパク質は、ＭｃｏＥｅＴＩであり、ノッティン（knottin）タンパク質の第１および第２システイン間のアミノ酸配列は、一部またはその全部がヘリックス部分もしくは生物活性ペプチド部分のアミノ酸配列で置換されている、または
ノッティン（knottin）タンパク質は、ＡＧＲＰ’であり、ノッティン（knottin）タンパク質の第５および第６システイン間のアミノ酸配列は、一部またはその全部がヘリックス部分もしくは生物活性ペプチド部分のアミノ酸配列で置換されている、または
ノッティン（knottin）タンパク質は、Ｏｂｔｕｓｔａｔｉｎであり、ノッティン（knottin）タンパク質の第４および第５システイン間のアミノ酸配列は、一部またはその全部がヘリックス部分もしくは生物活性ペプチド部分のアミノ酸配列で置換されている。
【００２７】
本発明の第１および第２態様の１つの実施形態では、ヘリックス部分もしくは生物活性ペプチド部分は、骨格部分のＮ末端またはＣ末端に融合している。
【００２８】
本発明の第１および第２態様の１つの実施形態では、生物活性ペプチド部分は、ＰＴＨ、ＰＴＨ誘導体およびＰＴＨアナログを含む群から選択され、好ましくは配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、およびそれらのフラグメントおよび／または誘導体から選択される。
【００２９】
本発明の第１および第２態様の１つの実施形態では、骨格部分は配列番号４に記載のｏＭｃｏＴＩ−ＩＩであり、ヘリックス部分もしくは生物活性ペプチド部分は配列番号２記載のアミノ酸配列もしくは配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するペプチドであり、生物活性ペプチド部分のヘリックス部分は配列番号４に記載のアミノ酸配列の第１システインおよび第２システインの間に挿入され、アミノ酸残基の置換はノッティン（knottin）タンパク質のアミノ酸配列の該２つのシステイン間で発生する。
【００３０】
本発明の第１および第２態様の１つの実施形態では、骨格部分は配列番号４に記載のｏＭｃｏＴＩ−ＩＩであり、ヘリックス部分もしくは生物活性ペプチド部分は配列番号３記載のアミノ酸配列を有するペプチドであり、生物活性ペプチド部分のヘリックス部分は配列番号４に記載のアミノ酸配列の第１システインおよび第２システインの間に挿入され、アミノ酸残基の置換はノッティン（knottin）タンパク質のアミノ酸配列の該２つのシステイン間で発生する。
【００３１】
本発明の第１および第２態様の１つの実施形態では、ヘリックス部分および／または生物活性ペプチド部分の長さは約４〜３０アミノ酸、好ましくは約４〜２５アミノ酸、より好ましくは約４〜２０アミノ酸、および一層より好ましくは約４〜１５アミノ酸である。
【００３２】
本発明の第１および第２態様の１つの実施形態では、ポリペプチドは、組換えタンパク質である。
【００３３】
本発明の第１および第２態様の１つの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号６、配列番号７、または配列番号１３に記載のアミノ酸配列を含む、またはそれらからなる。
【００３４】
本発明の第１および第２態様の別の実施形態では、ポリペプチドは、化学的に合成されたタンパク質もしくは合成タンパク質である。
【００３５】
本発明の第１および第２態様の１つの実施形態では、骨格部分は、１つのノッティン（knottin）タンパク質もしくは少なくとも１つのそのフラグメントを含む。
【００３６】
本発明の第１および第２態様の別の実施形態では、骨格タンパク質は、１つのノッティン（knottin）タンパク質もしくは少なくとも１つのそのフラグメントのマルチマー、好ましくはダイマーを含む。
【００３７】
本発明の第１および第２態様の１つの実施形態では、ノッティン（knottin）タンパク質もしくは少なくとも１つのそのフラグメントは、本発明の第１および第２態様の１つの実施形態のいずれかの実施形態で規定したノッティン（knottin）タンパク質もしくは少なくとも１つのそのフラグメントである。
【００３８】
本発明の基礎にある課題は、第３態様では、本発明の第１および／または第２態様に記載のポリペプチド、および医薬上許容される担体を含む医薬組成物によって解決される。
【００３９】
本発明の第３態様の実施形態では、医薬組成物は、経口投与用である。
【００４０】
本発明の基礎にある課題は、第４態様では、疾患を治療または予防するための医薬品を製造するための本発明の第１および／または第２態様によるポリペプチドの使用によって解決される。
【００４１】
本発明の基礎にある課題は、第５態様では、疾患を診断するための診断薬を製造するための本発明の第１および／または第２態様によるポリペプチドの使用によって解決される。
【００４２】
本発明の第４および第５態様の１つの実施形態では、疾患は、骨関連疾患である。
【００４３】
本発明の第４および第５態様の１つの実施形態では、骨関連疾患は、低骨ミネラル含量（ＢＭＤ）および／または骨脆弱性を特徴とする骨疾患である。
【００４４】
本発明の第４および第５態様の１つの実施形態では、骨疾患は、原発性および続発性骨粗しょう症、骨減少症、骨軟化症、骨形成不全症（ＯＩ）、虚血壊死（骨壊死）、骨折およびインプラント治癒、ならびに他の疾患に起因する骨量減少を含む群から選択される。
【００４５】
本発明の第４および第５態様の１つの実施形態では、骨量減少の結果として生じる他の疾患は、ＨＩＶ感染症、癌および関節炎を含む群から選択される。
【００４６】
本発明の第４および第５態様のまた別の実施形態では、インプラント治癒は、歯科インプラントまたは股関節インプラントのインプラント治癒である。
【００４７】
本発明の第４および第５態様の１つの実施形態では、骨関連疾患は、変形性関節症、関節炎、ならびに骨溶解性病変の形成および存在を含む群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】指示されたテリパラチド配列（１−３４）を備える、すなわち新薬設計における修飾のために一般に使用される部位が変化させられているヒトＰＴＨを示す図である。
【図２】短いα−ヘリカルペプチドＰＴＨ（１−１１）およびそのアナログ（Ｉ−Ｖ）の配列をそれらの最低エネルギー構造とともに示す図である。略語は、Ａｉｂはα−アミノイソ−酪酸、Ａｃ5ｃは１−アミノシクロペンタン−１−カルボン酸、Ａｃ6ｃは１−アミノシクロヘキサン−１−カルボン酸[i]を意味する。
【図３】シスチンノットモチーフの略図であり、このとき２つのジスルフィド架橋は結合バックボーンと一緒に、第３ジスルフィド結合が貫通している環を形成している。Ｓ−Ｓ結合は矢印で表示され、Ｃｙｓ残基のラテン数字は様々なタイプのシスチンノットに特異的な結合性を表し、括弧の前のラテン数字はＩＣＫおよびＣＣＫに対応し、括弧内のラテン数字はＧＦＣＫに対応する。図は、ｈｔｔｐ：／／ノッティン（knottin）．ｃｂｓ．ｃｎｒｓ．ｆｒから修飾されている。
【図４】環状ＭｃｏＴＩのＮＭＲ構造から推定された、開環ＭＣｏＴＩ−ＩＩアナログであるｏＭｃｏＴＩ−ＩＩのモデルを示した図である。Ｐ１位置、Ｎ末端およびＣ末端ならびにジスルフィド結合ＣＩ−ＣＩＶ、ＣＩＩ−ＣＶ、ＣＩＩＩ−ＣＶＩが示されている。β鎖は、矢印で表示されている。
【図５】粗ペプチドｏＭｃｏＴＩＡｉｂＨａｒのＨＰＬＣプロファイルを示した図である。
【図６】直鎖状前駆体ＮＣ−ＭＣ−ＰＴＨ−１*のＥＳＩ−ＭＳ分析の結果を示す図である。
【図７】ＨＰＬＣによって２１５ｎｍで監視されたフォールディングを示す図である。
【図８】フォールディングされたｏＭｃｏＴＩＡｉｂＨａのＥＳＩ−ＭＳ分析の結果を示す図である。
【図９】粗ペプチドＮＣ−ＭＣ−ＰＴＨ−２のＨＰＬＣプロファイルを示した図である。
【図１０】酸化ペプチドＮＣ−ＭＣ−ＰＴＨ−２のＨＰＬＣ分析の結果を示す図である。
【図１１】最終生成物ＮＣ−ＭＣ−ＰＴＨ−２の高分解能ＥＳＩ−ＭＳ分析の結果を示す図である。
【図１２Ａ】ホルスコリンの非存在下および存在下で生成されるｃＡＭＰの量によって判定されるＰＴＨ（１−３４）およびＮＣ−ＭＣ−ＰＴＨ−１*に反応したＰＴＨ受容体の刺激度を決定するためにＰＴＨ受容体を発現するＣＣｌ３９ｈＲ５細胞を用いた機能アッセイの結果を示す図である。
【図１２Ｂ】ホルスコリンの非存在下および存在下で生成されるｃＡＭＰの量によって判定されるＰＴＨ（１−３４）およびＮＣ−ＭＣ−ＰＴＨ−１*および−２に反応したＰＴＨ受容体の刺激度を決定するためにＰＴＨ受容体を発現するＨＥＫ２９３細胞を用いた機能アッセイの結果を示す図である。
【図１３】本発明のポリペプチドの骨格を提供できる様々なノッティン（knottin）タンパク質のジスルフィド架橋を含む一次アミノ酸配列を示し、このとき本発明に関連して使用される骨格部分を提示できるように、それらから欠失しているノッティン（knottin）タンパク質のアミノ酸は囲み内に記載されている。
【００４９】
本発明者らは、驚くべきことに、骨格部分およびヘリックス部分、より好ましくはαヘリックス部分もしくは生物活性ペプチド部分を含むポリペプチドであって、該ヘリックス部分もしくは該生物活性ペプチド部分は該骨格部分内に挿入され、該骨格部分はノッティン（knottin）タンパク質もしくは少なくとも１つのそのフラグメントを含み、および該ポリペプチドのアミノ酸配列は該ノッティン（knottin）タンパク質もしくは少なくとも１つのそのフラグメントのアミノ酸配列とは相違するポリペプチドは、該ヘリックス部分もしくは該生物活性ペプチド部分を安定的に提示するのに適していることを見いだした。
【００５０】
本明細書で使用するヘリックス部分は、好ましくはヘリックスを含む部分であるか、ヘリックスからなる。好ましい実施形態では、ヘリックスは、αヘリックスである。
【００５１】
本明細書で使用する生物活性ペプチド部分は、生物活性ペプチドを含む部分であるか、生物活性ペプチドからなる。
【００５２】
１つの好ましい実施形態では、本明細書で使用する用語「ヘリックス」もしくは例えば「ヘリカル」などの関連用語は、αヘリックスに関する。αヘリックスは、球状タンパク質および線維性タンパク質中で見いだされるタンパク質の共通二次構造モチーフである。球状タンパク質中のαヘリックスの平均長さは１１アミノ酸であるが、一部の場合には５０を超えるアミノ酸に伸長させることができる。ヘリックスは１回転に付き３．６アミノ酸を含有し、水素結合は、ｎ番目のペプチドＣ＝Ｏ結合が（ｎ＋４番目）のＮ−Ｈ基を指示するように配列されている（Ｖｏｅｔ  ａｎｄ  Ｖｏｅｔ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９０，Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，ｐ．１４９−１５０）。
【００５３】
なお一層驚くべきことに、本発明者らは、それ自体が一部の生物学的作用を示しているそのようなヘリックス部分、およびそれ自体が一部の生物学的作用を有する生物活性ペプチド部分は、それらが本発明のポリペプチドの一部である場合には該作用を保持することを明確に認識した。同様に驚くべきことに、本発明者らは、ノッティン（knottin）タンパク質の機能性がヘリックス部分が挿入されると保持されることを見いだした。１つの好ましい実施形態では、本明細書で使用する「ノッティン（knottin）タンパク質の機能性」は、各野生型タンパク質と比較して本質的に変化していない構造的および機能的特性の状態を意味する。
【００５４】
任意の理論によって結び付けることを望まなくても、本発明者らは、ノッティン（knottin）タンパク質もしくは少なくとも１つのそのフラグメントはそのようなヘリックス部分のための骨格として、すなわち好ましくは一部のヘリックスを二次構造として有するペプチド、およびそのような生物活性ペプチド各々としてそれらの作用または活性を妨害せずに作用するために適合することを見いだした。さらに本発明者らは、そのような分子環境において作用もしくは活性を保持することは、典型的には部分およびペプチド各々の安定化とともに進行することを見いだした。そのような安定化は、好ましくは、本発明によるポリペプチドの一部を形成するのでなければ、ヘリックスおよびペプチド各々の安定化と比較して、ヘリックスおよびペプチド各々の増加した寿命によって示される。
【００５５】
詳細にはＰＨＴおよびそのアナログに関して、本発明者らは、驚くべきことに例えば本明細書ではＰＴＨ−２とも呼ばれ、Ａｉｂ−Ｖａｌ−Ａｉｂ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｈａｒ（配列番号３）のアミノ酸配列を有するＰＴＨ（１−１１）、ならびに本明細書ではＰＴＨ−１とも呼ばれ、Ａｉｂ−Ｖａｌ−Ａｉｂ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｈａｒ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ（配列番号２）のアミノ酸配列を有するＰＴＨ（１−１４）、およびＡｉｂ−Ｖａｌ−Ａｉｂ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｈａｒ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ（配列番号１２）のアミノ酸配列を有するＰＴＨ−１*などの生物活性ＰＴＨフラグメントは、それらの生物活性を保持しながらノッティン（knottin）骨格部分内に安定性で挿入ことができることを見いだした。本発明の好ましい実施形態では、骨格部分は、阻害剤シスチンノット（ＩＣＫ）ポリペプチド（ノッティン（knottin）ｓ）の剛体分子骨格によって提供される。
【００５６】
当分野においてシスチンノットミニタンパク質、本明細書ではノッティン（knottin）タンパク質もしくはマイクロタンパク質とも呼ばれるノッティン（knottin）は、典型的には４０未満のアミノ酸から構成され、典型的には図３に示したようにシスチンノット、小さな三重鎖βシートおよび短い３10ヘリックスを形成する三重ジスルフィド結合の配列からなる規定構造によって特徴付けられる（Ｃｒａｉｋ，Ｄ．Ｊ．，Ｄａｌｙ，Ｎ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｗａｉｎｅ，Ｃ．（２００１），Ｔｏｘｉｃｏｎ  ３９，４３−６０）。本発明の好ましい実施形態では、本文書のいずれかの状況、より好ましくはシステイン間のヘリックス部分もしくは生物活性ペプチド部分の挿入の状況で扱われる任意の「システイン」は、各ノッティン（knottin）の天然ジスルフィド結合形成システインの１つである。ここで、システインは、広く受容された教科書に記載の略称によると「Ｃｙｓ」とも呼ばれる。ノッティン（knottin）は、カボチャ（ｓｑｕａｓｈ）科に属する植物におけるプロテアーゼ阻害からヒトにおけるシグナル変換事象の誘発、海洋イモガイ（ｃｏｎｅ  ｓｎａｉｌ）により産生するきわめて強力な毒素であるコノトキシンのメンバーによるイオンチャネル遮断にまで及ぶ多量の様々な生物活性を実際に提示する。
【００５７】
シスチンノットは、構造安定化のために高度に効率的なモチーフであると思われる。ノッティン（knottin）の自律フォールディング単位は、いわゆるシスチン安定化βシートである基本の２つのジスルフィドモチーフである。ノッティン（knottin）の規定構造は、それらをｐＨ、温度、ならびに追加のペプチド結合によってそれらのＮ末端およびＣ末端の結合を通して環状骨格を有する一部の変異体において特に顕著な作用であるタンパク質分解性攻撃に対して安定性にさせる（Ｃｏｌｇｒａｖｅ，Ｍ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｃｒａｉｋ，Ｄ．Ｊ．（２００４），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３，５９６５−５９７５）。
【００５８】
典型的なノッティン（knottin）タンパク質は、キュウリ植物であるＥｃｂａｌｉｕｍ  ｅｌａｔｅｒｉｕｍの種子由来のトリプシン阻害剤ＥＥＴＩ−ＩＩの変異体であるＥＥＴＩ−ＩＩ  Ｍ７Ｉ（「−ＥＴ」とも呼ばれる）（Ｈｅｉｔｚ，Ａ．，Ｃｈｉｃｈｅ，Ｌ．，Ｌｅ−Ｎｇｕｙｅｎ，Ｄ．＆Ｃａｓｔｒｏ，Ｂ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８９．２８（６）：ｐ．２３９２−８），Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｏｃｈｉｎｃｈｉｎｅｎｓｉｓ（ナンバンキカラスウリ）の種子由来の天然環状トリプシン阻害剤ＭＣｏＴＩ−ＩＩの直鎖状変異体であるｏＭｃｏＴＩ−ＩＩ（「−ＭＣ」とも呼ばれる）（Ａｖｒｕｔｉｎａ，Ｏ．，Ｓｃｈｍｏｌｄｔ，Ｈ．Ｕ．，Ｋｏｌｍａｒ，Ｈ．＆Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓｅｎ，Ｕ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｏｒｇ  Ｃｈｅｍ，２００４（２３）：ｐ．４９３１−４９３５）、Ｍｃｏ  ＴＩのアミノ末端部分およびＥＥＴＩのカルボキシ末端部分からなる雑種ミニタンパク質であるＭｃｏＥｅＴＩ（「−ＭＧ」とも呼ばれる）（Ｓｃｈｍｏｌｄｔ，Ｈ．Ｕ．，Ｗｅｎｔｚｅｌ，Ａ．，Ｂｅｃｋｅｒ，Ｓ．＆Ｋｏｌｍａｒ，Ｈ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ，２００５．３９（１）：ｐ．８２−８９）、オレキシゲン作用を備える視床下部メラノコルチン受容体の内因性アンタゴニストであるヒト−アグーチ関連タンパク質由来の合理的に最小化されたミニタンパク質であるＡＧＲＰ’（「−ＡＧ」とも呼ばれる）（Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｐ．Ｊ．，ＭｃＮｕｌｔｙ，Ｊ．Ｃ  Ｙａｎｇ，Ｙ．Ｋ．，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｄ．Ａ．，Ｃｈａｉ，Ｂ．，Ｇａｎｔｚ，Ｉ．，Ｂａｒｓｈ，Ｇ．Ｓ．＆Ｍｉｌｌｈａｕｓｅｒ，Ｇ．Ｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２．４１（２４）：ｐ．７５６５−７２）ならびにＶｉｐｅｒａ  ｌｅｂｅｔｉｎａ  ｏｂｔｕｓａ  ｖｉｐｅｒ（クサリヘビ）の毒液から最初に単離されたジスインテグリンであるＯｂｔｕｓｔａｔｉｎ（「−ＯＢ」とも呼ばれる）（Ｐａｚ−Ｍｏｒｅｎｏ−Ｍｕｒｃｉａｎｏ，Ｍ．，Ｍｏｎｉｅｏｎ，Ｄ．，Ｍａｒｃｉｎｋｉｅｗｉｃｚ，Ｃ．，Ｃａｌｖｅｔｅ，Ｊ．Ｊ．＆Ｃｅｌｄａ，Ｂ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２００３  Ｍａｙ  ２３；３２９（１）：１３５−４５）である。これらのタンパク質は、他のインテグリンに特徴的な伝統的ＲＧＤ配列を含有していない。
【００５９】
１つの好ましい実施形態では、本明細書で使用する用語「骨格部分」は、単独で、またはヘリックス部分もしくは生物活性ペプチド部分と組み合わせてのいずれかで、安定性三次構造および／または四次構造を取るタンパク質またはポリペプチドを意味する。当業者であれば、例えば生物物理学的方法、例えば円偏光二色性（Ｃｉｒｃｕｌａｒ  Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ）分光法、比色法もしくは核磁気共鳴分光法などの技術によって監視される溶融実験を使用して、または例えばタンパク質分解消化にとって問題となる構築物の耐性を検出する機能アッセイを通して、そのような構築物の安定性を定量する方法を認識している。また別の特に好ましい実施形態では、骨格部分は、少なくとも２個、好ましくは少なくとも４個、およびより好ましくは６個、またはさらにそれ以上のシステイン残基を含む。また別の特に好ましい実施形態では、骨格部分は６または８個のシステインを含む。典型的には、該Ｃｙｓ残基は、ジスルフィド結合の形成を通してポリペプチドの安定性を増加させる。そのようなジスルフィド結合は、天然システインまたは遺伝子組換え技術を通して導入されたシステイン、またはそれらの任意の組み合わせを形成できる。当業者であれば、本明細書における他の状況において特に言及されているように、利用可能な構造情報に基づいてそのような追加のジスルフィド結合を導入することができる。さらに、当業者であれば、一次配列、例えばＮ末端を、原核細胞もしくは真核細胞分解機構による分解度を減少させる方法で修飾することができる。当業者であれば、そのようなポリペプチドの合成、発現および精製のための方法も認識している。発現させるための方法は、最も頻繁にはその後のタグを除去するためのプロテアーゼ開裂部位、または適切な抗体を用いてポリペプチドもしくはポリペプチドを含む複合体を単離もしくは検出するためのエピトープタグと組み合わせて、一次構造の修飾、例えばＨｉｓタグ、ＧＳＴタグもしくはＭＢＰタグなどの親和性タグの使用を含むことができる。
【００６０】
本発明の１つの実施形態では、骨格部分は、ノッティン（knottin）ｇタンパク質を含む。本発明の好ましい実施形態では、ノッティン（knottin）は、ＥＥＴＩ−ＩＩ  Ｍ７Ｉ（−ＥＴ）、ｏＭｃｏＴＩ−ＩＩ（−ＭＣ）、ＭｃｏＥｅＴＩ（−ＭＧ）、ＡＧＲＰ’（−ＡＧ）およびオブツスタチン（Ｏｂｔｕｓｔａｔｉｎ（−ＯＢ）を含む群から選択される。ｏＭｃｏＴＩ−ＩＩは、それがトリプシンを阻害する活性によってＭｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｏｃｈｉｎｃｈｉｎｅｎｓｉｓの種子から単離した天然環状カボチャ阻害剤ＭＣｏＴＩ−ＩＩに由来した。これらの２つのマイクロタンパク質間の唯一の差異は、ｏＭｃｏＴＩ−ＩＩが環化ループの一部を有していないことである（すなわち、アミノ酸残基２８−３２）。この超マイクロタンパク質は、出発点として使用された。本明細書においてより詳細に記載するように、ＰＴＨ（１−１１）およびＰＴＨ（１−１４）のヘリカルモチーフをｏＭｃｏＴＩ−ＩＩタンパク質のシステインＩおよびＩＩの間に導入すると（図４）、ＰＴＨ  Ｍｉｃｒｏｂｏｄｉｅｓ（商標）ＮＣ−ＭＣ−ＰＴＨ−１および−２が産生した。
【００６１】
１つの実施形態では、本発明のポリペプチドおよび／または骨格は環状であるが、これは好ましくは、例えば追加のペプチド結合によって、Ｎ末端およびＣ末端の結合を通して達成できる。しかし、原理上は、適切なアミノ酸残基側鎖は、環状ポリペプチドおよび／または骨格部分の形成を許容するように化学的に修飾することもできる。代替実施形態では、ポリペプチドおよび／または骨格部分は直鎖状であるが、これはアミノ酸残基側鎖を化学的に修飾することによって生成できるあらゆる種類の分枝状分子を含む。さらに、本発明のポリペプチドが直鎖状もしくは非環状であるが骨格部分は環状であること、および逆もまた同様であることも本発明の範囲内に含まれる。さらに、ポリペプチドもしくは骨格部分が直鎖状であり、ヘリックス部分もしくは生物活性ペプチド部分が環状であることもまた本発明の範囲内に含まれる。本明細書で使用する骨格部分はノッティン（knottin）タンパク質、そのフラグメントもしくはその誘導体であることは認識される。ノッティン（knottin）タンパク質のフラグメントもしくは誘導体は、好ましくは、そのようなフラグメントもしくは誘導体がノッティン（knottin）タンパク質として依然として機能的に活性である、少なくともそのようなフラグメントもしくは誘導体を含む本発明のポリペプチドが全長ノッティン（knottin）タンパク質もしくはそのような全長ノッティン（knottin）タンパク質由来の骨格を含む本発明のポリペプチドの特性の少なくとも１つを有する程度まで機能的に活性であることを前提に、ノッティン（knottin）タンパク質のフラグメントもしくは誘導体である。
【００６２】
ノッティン（knottin）タンパク質は、典型的にはモノマーであり、本発明のポリペプチドの１つの実施形態ではモノマーとして使用できる。しかし本発明の１つの実施形態では、骨格タンパク質は、そのようなノッティン（knottin）タンパク質もしくは少なくとも１つのそのフラグメントのマルチマーを含む、またはそのようなノッティン（knottin）タンパク質もしくは少なくとも１つのそのフラグメントの１つより多いモノマー、好ましくはダイマーから形成されている。本発明の好ましい実施形態では、本明細書で使用する「マルチマー」は、本明細書ではモノマーとも呼ばれる１つの種の１つより多い分子を含む複合体である。好ましくは本明細書で使用する「ダイマー」は、同一種の２つの分子からなる複合体を含む。そのような複合体は、共有結合もしくは非共有結合複合体であってよい。１つの実施形態では、ヘリックス部分もしくは生物活性ペプチド部分は、１つもしくは複数のそのようなモノマー内に挿入されている。
【００６３】
好ましくは、骨格部分は、ノッティン（knottin）タンパク質由来のタンパク質もしくはポリペプチドである。誘導体化は、ノッティン（knottin）タンパク質のアミノ酸配列から開始して、ノッティン（knottin）タンパク質の２個のＣｙｓ残基間に存在する１つ、２つ以上もしくは全部のアミノ酸が欠失しているように行われる。
【００６４】
１つの好ましい実施形態では、本明細書で使用する用語「ヘリックス部分」は、ヘリックスを形成する、もしくは少なくとも部分的にヘリックス特性を有するアミノ酸の配列を意味する。そのようなアミノ酸は、個別に、または任意の組み合わせで、天然アミノ酸、タンパク質生成性アミノ酸または非天然アミノ酸であってよい。好ましくは、そのようなアミノ酸は、自然にアミノ酸配列内、もしくはその誘導体内に組み込まれるとヘリックスの形成を促進する。当業者は、そのような部分が必ずしも１００％ヘリカルではないが、非構造化部分もしくは他の二次構造要素さえ含む可能性があることを認識している。別の好ましい実施形態では、ヘリックス部分は、例えばＧｌｎ、Ａｉｂ、Ｈａｒなどであるがそれらに限定されないペプチドヘリックス性増加残基として公知の天然もしくは非天然アミノ酸を含む。当業者であれば、適切なアミノ酸前駆体を使用して例えばそのようなペプチドもしくはポリペプチドの化学合成によって、該ペプチドもしくはポリペプチドを発現する有機体へ非天然アミノ酸もしくはそれらの前駆体を供給することによって、またはそのような非天然アミノ酸もしくはそれらの前駆体が化学的に取り込まれたｔＲＮＡ分子を使用することによって、非天然アミノ酸をペプチドもしくはポリペプチド内に導入することができる。好ましくは本明細書で使用するアミノ酸は、カルボキシ基およびアミノ基の両方を含み、好ましくはペプチドもしくはポリペプチドの一次配列内に組み込むことのできる化学化合物である。
【００６５】
ヘリックス部分は、原理上は、サイズもしくは機能に関して制限されない。１つの実施形態では、ヘリックス部分でさえ、本発明の骨格部分内に、したがってポリペプチド内に挿入されると生物活性もしくは生物学的作用が保持され、その安定性が危険に晒されない限り、完全にフォールディングされたポリペプチドもしくはそのフラグメントを含む。特に好ましい実施形態では、生物活性ペプチド部分もしくはヘリックス部分はアミノ酸配列を含んでおり、そのようなアミノ酸配列は生物活性ペプチドの１つであり、好ましくはそのような生物活性ペプチドは、ペプチドホルモン、サイトカイン、インテグリン、インテグリンリガンド、プロテアーゼ阻害剤、ＧＰＣＲリガンド、イオンチャネルリガンド、ＤＮＡもしくはＲＮＡリガンド、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、またはそれらのフラグメントおよび／または誘導体を含む群から選択される。
【００６６】
１つの好ましい実施形態では、本明細書で言及する用語「生物活性ペプチド部分」は、生物系における一部の生物学的作用を引き出せるペプチド部分を含む。生物活性ペプチド部分は、原理上は、サイズもしくは機能に関して制限されない。１つの実施形態では、ヘリックス部分は、骨格内に生物活性もしくはその生物学的作用が挿入されると保持され、骨格の安定性が危険に晒されない限り、完全にフォールディングされたポリペプチドもしくはそのフラグメントを含む。
【００６７】
ヘリックス部分は、好ましくは生物活性もしくは生物活性ペプチド部分に類似する生物学的作用を有する、または有する可能性があることは認識される。そのような生物活性は、好ましくは生物学的作用である。好ましくは本明細書で使用する生物学的作用は、抗原作用、受容体もしくは他の生物活性分子を阻害すること、免疫刺激作用、受容体結合作用、シグナルカスケードを誘発すること、および生物学的情報を伝達することを含む群から選択される任意の作用である。
【００６８】
１つの好ましい実施形態では、ヘリックスおよびヘリックス部分は、各々約４〜約３０アミノ酸を含む。より好ましい実施形態では、ヘリックスおよびヘリックス部分は各々、４〜約２５アミノ酸を含んでおり、さらに一層好ましい実施形態では、ヘリックスおよびヘリックス部分は各々、４〜約２０アミノ酸を含んでおり、最も好ましい実施形態では、ヘリックスおよびヘリックス部分は各々、４〜約１５アミノ酸を含む。サイズに関する同一の考察は、生物活性ペプチドおよび生物活性ペプチド部分各々にも適用できる。
【００６９】
最後に、ヘリックス部分が生物活性ペプチドを含む、もしくは表すこと、および生物活性ペプチド部分がヘリックスを含む、もしくはヘリックスからなることは本発明の範囲内に含まれる。
【００７０】
特に好ましい実施形態では、生物活性ペプチド部分もしくはヘリックス部分は、ペプチドホルモン、サイトカイン、インテグリン、インテグリンリガンド、プロテアーゼ阻害剤、ＧＰＣＲリガンド、イオンチャネルリガンド、ＤＮＡもしくはＲＮＡリガンド、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、またはそれらのフラグメントおよび／または誘導体を含む群から選択される。さらに一層好ましい実施形態では、生物活性ペプチド部分は、ＰＴＨ、ＰＴＨ誘導体およびＰＴＨアナログを含む群から選択され、好ましくは配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号３およびＰＴＨ（１−３４）に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、ならびにそれらのフラグメントおよび／または誘導体から選択される。
【００７１】
本発明の特に好ましい実施形態では、骨格部分は配列番号４に記載のｏＭｃｏＴＩ−ＩＩであり、ヘリックス部分もしくは生物活性ペプチド部分は配列番号２もしくは配列番号１２記載のアミノ酸配列を有するペプチドであり、生物活性ペプチド部分の部分は配列番号４に記載のアミノ酸配列のＣｙｓ１およびＣｙｓ２の間に挿入され、全アミノ酸残基の置換はノッティン（knottin）タンパク質のアミノ酸配列の該２つのシステイン間で発生する。結果として生じるポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する。
【化１】
2010518175.tif 000002
【化２】
2010518175.tif 000003
【００７２】
本発明の別の特に好ましい実施形態では、骨格部分は配列番号４に記載のｏＭｃｏＴＩ−ＩＩであり、ヘリックス部分もしくは生物活性ペプチド部分は配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するペプチドであり、生物活性ペプチド部分のヘリックス部分は配列番号４に記載のアミノ酸配列のシステイン１およびシステイン２の間に挿入され、全アミノ酸残基の置換はノッティン（knottin）タンパク質のアミノ酸配列の該２つのシステイン間で自然に発生する。結果として生じるポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する。
【化３】
2010518175.tif 000004
【００７３】
本発明によると、ヘリックス部分もしくは生物活性ペプチド部分は、様々な位置で骨格部分内へ挿入できる。好ましい位置は、骨格部分の２つのシステイン残基間である。より好ましい実施形態では、ヘリックス部分もしくは生物活性ペプチド部分は、骨格部分の第１および第２システイン残基間で挿入されている。Ｃｙｓ残基のナンバリングに関連して、Ｃｙｓ残基の計数はポリペプチドおよび骨格部分各々のＮ末端から開始されることに留意されたい。したがって、アミノ末端アミノ酸残基は第１であり、第１残基のＣ末端に結合したアミノ酸残基は第２であるなどである。別の実施形態では、ヘリックス部分もしくは生物活性ペプチド部分の挿入の前には、２つのシステイン残基間の全アミノ酸が欠失している。本発明のまた別の実施形態では、ヘリックス部分もしくは生物活性ペプチド部分は、骨格部分のＮ末端またはＣ末端に融合している。
【００７４】
本発明のポリペプチドの好ましい実施形態では、ノッティン（knottin）タンパク質は、ＥＥＴＩ−ＩＩ  Ｍ７Ｉであり、ノッティン（knottin）タンパク質の第１および第２システイン間のアミノ酸配列は、ヘリックス部分もしくは生物活性ペプチド部分のアミノ酸配列によって完全または部分的に置換されている。本発明のポリペプチドの別の好ましい実施形態では、ノッティン（knottin）タンパク質は、ｏＭｃｏＴＩ−ＩＩであり、ノッティン（knottin）タンパク質の第１および第２システイン間のアミノ酸配列は、ヘリックス部分もしくは生物活性ペプチド部分のアミノ酸配列によって完全または部分的に置換されている。本発明のポリペプチドの別の好ましい実施形態では、ノッティン（knottin）タンパク質は、ＭｃｏＥｅＴＩであり、ノッティン（knottin）タンパク質の第１および第２システイン間のアミノ酸配列は、ヘリックス部分もしくは生物活性ペプチド部分のアミノ酸配列によって完全または部分的に置換されている。本発明のポリペプチドの別の好ましい実施形態では、ノッティン（knottin）タンパク質は、ＡＧＲＰ’であり、ノッティン（knottin）タンパク質の第５および第６システイン間のアミノ酸配列は、ヘリックス部分もしくは生物活性ペプチド部分のアミノ酸配列によって置換されている。別の好ましい実施形態では、ノッティン（knottin）タンパク質はＯｂｔｕｓｔａｔｉｎであり、ノッティン（knottin）タンパク質の第４および第５システイン間のアミノ酸配列は、ヘリックス部分もしくは生物活性ペプチド部分のアミノ酸配列によって完全または部分的に置換されている。
【００７５】
本発明の１つの実施形態では、ポリペプチドは組換えポリペプチドであり、すなわちポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターが、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母もしくは哺乳動物細胞系などの適切な発現有機体を形質転換させるために使用され、タンパク質は発現有機体の培養から精製される。別の実施形態では、ポリペプチドは、化学的に合成されたタンパク質または例えば固相合成法によってインビトロで合成されるタンパク質などの合成タンパク質である。各発現ベクターは、本発明のさらに別の態様である。
【００７６】
さらに別の態様では、本発明は、本発明のポリペプチドおよび医薬上許容される担体を含む医薬組成物に関する。
【００７７】
そのような医薬組成物は、ポリペプチドがタンパク質性アミノ酸からなるという前提の下で、治療有効量の本発明のポリペプチドもしくはそれをコードする核酸分子、および任意で医薬上許容される担体を含む。医薬組成物は、本明細書に記載したように、生理学的に許容される担体とともに患者へ投与することができる。１つの実施形態では、用語「医薬上許容される」は、規制官庁または動物、およびより特別にはヒトにおいて使用するための他の一般的に認識された薬局方によって承認されていることを意味する。用語「担体」は、それと一緒に治療薬が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、もしくはビヒクルを意味する。そのような医薬担体は、無菌液体、水および油、例えば石油、動物性、植物性もしくは合成起源の油を含む油、例えば落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などであってよい。水は、医薬組成物が静脈内投与される場合の好ましい担体である。食塩液および水性デキストロースおよびグリセロール液もまた、特別には注射溶液のための液体担体としても使用することができる。適切な医薬賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが含まれる。本組成物は、所望であれば、微量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有することができる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、ピル剤、カプセル剤、散剤、徐放性製剤などの形態を取ることができる。本組成物は、伝統的結合剤および担体、例えばトリグリセリドを用いて坐剤として調製することができる。
【００７８】
本発明に記載の組成物の好ましい実施形態は、経口組成物、すなわち経口投与のために企図される組成物である。いかなる理論によっても束縛されることを望むものではないが、本発明者らは、本発明によるポリペプチドの高度の安定性がそれらを経口投与および経口医薬製剤各々にし易くさせることを想定している。経口製剤には、標準的担体、例えば医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含むことができる。適切な医薬担体の例は、Ｅ．Ｗ．による“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”によって記載されている。そのような組成物は、患者への適正な投与のための形態を提供できるように適切な量の担体と一緒に、好ましくは精製形にある治療有効量の本発明のポリペプチドを含有している。本製剤は、投与様式に適合するはずである。本発明の好ましい実施形態では、医薬組成物は経口投与用である。
【００７９】
さらに別の態様では、本発明の基礎にある課題は、疾患を治療または予防するための医薬品を製造するために本発明のポリペプチドを使用することによって解決される。別の態様では、本発明の基礎にある課題は、疾患を診断するための診断薬を製造するためにポリペプチドを使用することによって解決される。両方の態様の好ましい実施形態では、疾患は、骨粗しょう症である。本発明の好ましい実施形態では、ポリペプチドは、ヘリックス部分および生物活性ペプチド部分各々としてＰＴＨまたはフラグメントおよび／または誘導体を含んでおり、間欠的投与用である。
【００８０】
本発明のポリペプチドから発生する任意の治療作用に類似する任意の診断は、好ましくはヘリックス部分および／または生物活性ペプチド部分によって媒介される。該部分は、好ましくはそれと該部分自体が反応性および相互作用性であるパートナーである相互作用パートナーと相互作用する。この相互作用は、治療作用について責任を担っている反応または相互作用パートナーの検出または相互作用パートナーの作用のいずれかを誘発する。
【００８１】
以下では、本発明のまた別の特徴、実施形態、態様および利点をそれから取り出すことのできる以下の図面および実施例によって、本発明をさらに説明する。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【００８２】
（ＮＣ−ＭＣ−ＰＴＨ−１*および−２の化学合成）
（材料および方法）
使用した全ての化学物質は、入手可能な最高等級の化学物質であった。溶媒は、分析等級の溶媒であり、供給されたままで使用した。Ｎα−Ｆｍｏｃ保護アミノ酸は、以下の側鎖保護基：ｔ−Ｂｕ（Ａｓｐ、Ｔｙｒ）、Ｂｏｃ（Ｌｙｓ）、Ｔｒｔ（Ｃｙｓ、Ａｓｎ）、Ｐｂｆ（Ａｒｇ）とともに使用した。シュード−プロリンジペプチドであるＦｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯtＢｕ）−Ｓｅｒ（ψMe,Me）プロ−ＯＨは、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ  ＧｍｂＨ社から購入した。ＥＳＩ質量スペクトルは、ＴＳＱ  ７００  Ｆｉｎｎｅｇａｎ分光計を用いて測定した。高分解能ＥＳＩ質量スペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＰＥＸ−Ｑ  ＩＩＩ  ７Ｔを用いて記録した。ＨＰＬＣは、ＹＭＣ  Ｊ’ｓｐｈｅｒｅ  ＯＤＳ  Ｈ−８０、分取的ラン（２５０×４．６ｍｍ、４μｍ、８０Å）および分析サンプル（２５０×４．６μｍ、８０Å）のためのＲＰ  Ｃ−１８カラムを用いてＰｈａｒｍａｃｉａ  Ａｋｔａ  ｂａｓｉｃシステム上で実施した。
【００８３】
（ＮＣ−ＭＣ−ＰＴＨ−１*および−２のＳＰＰＳ）
マイクロタンパク質のＢｏｃ−ＳＰＰＳにおいては進行を視認できるにもかかわらず、このアプローチには幾つかの不利益がある。収率は、通常は極めて低く、自動合成中の一段階工程監視は、適切な発色団の欠如に起因して妨害される。これらのマイクロタンパク質を効率的に生成させるために、合成進行の段階的制御は、特に非天然アミノ酸が組み込まれる場合は有益である。さらに、Ｆｍｏｃをベースとする合成は強度の酸分解を除去し、総合的により軽度の合成条件を生じさせる。このため、マイクロタンパク質はより長いペプチドを伴う可能性のある凝集現象を認識しているＦｍｏｃ保護戦略に基づくＳＰＰＳによって生成された。
【００８４】
マイクロタンパク質の合成は、２つの部分に分けられた。最初の２０アミノ酸は、安全なＣｙｓ取り込みのために特殊サイクルを適用してペプチド合成装置ＡＢＩ  ４３３Ａを用いて標準自動合成によって組み立てられた。ｏＭｃｏＴＩ−ＩＩのシステインＩＩまでのタンパク質のこの部分は、Ｚａｇｏｔｏｖｋａと呼ばれた（заготовка    は、ラフストックの半製品を意味するロシア語である）。この樹脂を２つの部分に分け、次のアミノ酸はマニュアルプロトコールを用いて組み立てた。本発明者らは、最短配列ＰＴＨ−１から始めた。Ｚａｇｏｔｏｖｋａの自動合成が完了し、Ｎ末端Ｆｍｏｃ基が開裂された後、Ｆｍｏｃ−Ｈａｒ−ＯＨ構築ブロックを手動でＨＡＴＵ／ＤＩＥＡ（Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート／エチルジイソプロピルアミンもしくはＨｕｅｎｉｇ塩基）を用いて周囲温度で１．５時間以内にＮＭＰ（Ｎ−メチルピロリジノン）におけるインサイチュー活性化を通して結合させた。ニンヒドリンを用いたＫａｉｓｅｒ試験は、不完全結合を示したが、市販で入手できるこの構築ブロックが過剰に高価なために新鮮試薬との二重結合は実施しなかった。Ａｃ2ＯおよびＦｍｏｃ脱保護を用いたキャッピング後、鎖は、２つのグルタミンのための二重結合を用いて、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中のＨＣＴＵ／ＤＩＥＡ活性化を用いてＡｉｂ残基まで自動的に集合された。活性化因子（ＡＢＩ４３３ペプチド合成装置の計算プログラムによると３．９等量過剰）は固体としてアミノ酸カートリッジ内に直接的に加え、通常はＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ（Ｏ−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート／１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）溶液を含有する活性化混合液は純粋ＤＭＦと置換した。送達時間は、純粋ＤＭＦを用いて実施されたフローテストＤの結果に基づいてプログラミングした。Ａｉｂ残基は、Ｈａｒ構築ブロックについてと同一条件を用いて手動で結合した。Ｎ末端部分ＧＶＣＰは、Ｃｙｓの結合についての直交プログラムを用いて自動的に結合した。ペプチド鎖の集合が完了した後、ペプチドを乾燥させ、ＴＥＡ−スカベンジャー混合物を用いて開裂させた。粗ペプチドのＨＰＬＣ分析はむしろ低い品質の生成物を示した。それでも、混合物は完全に分離可能であり、標的生成物の精製後には顕著なピークを産生した（図５）。
【００８５】
直鎖状前駆体を精製し、４倍および３倍に荷電したフラグメントの存在ならびに質量ピークを証明したＥＳＩ−ＭＳを用いて分析した（図６）後、酸化を後に記載するように実施すると（フォールディング法）、驚くほど高い品質および収率でフォールディングされた生成物が得られた（図７）。
【００８６】
酸化した生成物は、ノッティン（knottin）ファミリーのメンバーに典型的な挙動を示した。それは還元直鎖状前駆体より早期に溶出された。ＥＳＩ−ＭＳ（図８）は、酸化ペプチド（直鎖状ペプチドより６Ｄａ少ない）を示したが、可能性のあるダイマー（各モノマー内の２つの分子内ジスルフィド架橋、および１つの分子間結合を含有する）が予想される領域ではシグナルは検出されなかった。これは、ヘリックスの挿入は構造を危険にさらさない、またはオリジナルのノッティン（knottin）骨格の特性に影響を及ぼさないことを確証している。
【００８７】
Ｚａｇｏｔｏｖｋａから出発したペプチドＮＣ−ＭＣ−ＰＴＨ−１*の合成は、初合成よりはるかに困難であった。配列ＡｉｂＶＡｉｂＥＩＱＬＭＨＱＨａｒＡＫＹを導入するために、この困難な配列へ、ペプチド合成の様々な技術を適用した。自動または手動合成いずれかによる標準Ｆｍｏｃ合成によってこのポリペプチドを合成する試みは、不成功に終わった。２つのＡｉｂ残基が、この失敗の理由であると予測された。第２アプローチでは、ＰＴＨ配列のＦｍｏｃ−Ｈａｒ−ＯＨ構築ブロックは、周囲温度で１．５時間以内にＮＭＰにおけるインサイチュー活性化によるＨＡＴＵ／ＤＩＥＡを用いて２回結合させた。Ａｃ2ＯおよびＦｍｏｃ脱保護を用いたキャッピング後、鎖は、全アミノ酸のための二重結合を用いて、ＤＭＦ中のＨＣＴＵ／ＤＩＥＡ活性化を用いてＡｉｂ残基まで手動で集合した。Ａｉｂ残基は、１構築ブロック当たり１０分間以内に２０Ｗおよび５０℃で手動ペプチド合成のためにマイクロ波反応器内でのＨＡＴＵ／ＤＩＥＡ活性化を用いて二重結合させた。Ｎ末端部分ＧＶＣＰは、２回結合させたＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨを除いて、１アミノ酸単一結合当たり５分間、２０Ｗおよび４０℃でマイクロ波支援ＳＰＰＳを用いて組み立てた。ペプチド鎖の集合が完了した後、ペプチドを乾燥させ、２０分間以内に２０Ｗおよび３８℃のマイクロ波反応器内においてＴＦＡスカベンジャー混合物を用いて開裂させた。生成物をＨＰＬＣによって合成後の粗混合物から精製すると（図９）、４ｍｇのＮＣ−ＭＣ−ＰＴＨ２が産生した。
【００８８】
分取的ＨＰＬＣ中に収集した全ピークをフォールディングバッファー中に溶解させ、一晩のインキュベーション後にＨＰＬＣによって分析した（図１０）。１つのピークだけがノッティン（knottin）ファミリーのメンバーに典型的な挙動を示したが、これは還元直鎖状前駆体より早期に溶出した。酸化生成物の収量は、１．６ｍｇである。
【００８９】
最終酸化かつ精製されたＮＣ−ＭＣ−ＰＴＨ−１*に高分解能ＥＳＩ−ＭＳを受けさせた（図１１）。計算分子量は４１３８．８４（酸化形）であり、実験的に決定された分子量は４１３８．８４である。
【００９０】
（フォールディング法）
直鎖状ＰＴＨミクロボディのシスチン−ノットへの酸化は、１ｍｇのペプチド当たり５０μＬの１０ｍＭ  ＨＣｌ中に還元凍結乾燥ペプチドを溶解させ、その後に１〜１．５ｍｇ／ｍＬの最終濃度へのＮＨ4ＨＣＯ3（２００ｍＭ、ｐＨ９．１）の添加によって実施した（Ｗｅｎｔｚｅｌ，Ａ．，Ｃｈｒｉｓｔｍａｎｎ，Ａ．，Ｋｒａｅｔｚｎｅｒ，Ｒ．ａｎｄ  Ｋｏｌｍａｒ，Ｈ．（１９９９）：Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＧＰＮＧ  ｂ−ｔｕｒｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｃｂａｌｌｉｕｍ  ｅｌａｔｅｒｉｕｍ  ｔｒｙｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＩＩ  ｅｘｐｌｏｒｅｄ  ｂｙ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，２１０３７−２１０４３）。反応混合物は、室温での強力な攪拌下でＰＥＴ容器中において一晩インキュベートした。フォールディングされたペプチドの精製は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｃ18カラム（分析的：２５０×４．６０ｍｍ、分取的：２５０×１０．００ｍｍ）を用いてＲＰ−ＨＰＬＣによって実施した。条件は以下のとおりであった。溶離液Ａ：０．１％のＴＦＡを含有するＨ2Ｏ。溶離液Ｂ：５０％アセトニトリル、０．１％（ｖ／ｖ）のＴＦＡを含有する５０％の２−プロパノール。１０〜３７％のＢの線形勾配は、分析目的には１ｍＬ／分、および分取的ランのためには３．５ｍＬ／分各々の流速を用いて実施した。２１７ｎｍでの監視を用いて、酸化ペプチドを含有する画分を収集して凍結乾燥させた。酸化の成功は、ＥＳＩ質量分光法によって確証された。
【実施例２】
【００９１】
（ノッティン（knottin）骨格内に挿入されたＰＴＨフラグメントによる１型副甲状腺ホルモン受容体（ＰＴＨＲ１）の活性化）
（材料および方法）
１型副甲状腺ホルモン受容体（ＰＴＨＲ１）の活性化は、ヒト胚腎臓２９３細胞（ＨＥＫ２９３）およびヒト組換え受容体を発現するハムスター肺線維芽細胞（ＣＣＬ３９）を用いて評価した。２４ウエルプレート内で増殖させたコンフルエントな細胞培養を無血清ＤＭＥＭ培地中で４時間にわたり［3Ｈ］アデニン（１００ＭＢｑ／ｍＬ；Ａｍｅｒｓｈａｍ社、スイス国チューリッヒ）を用いて標識した。細胞は次に３７℃の、１３０ｍＭのＮａＣｌ、０．９ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、５．４ｍＭのＫＣｌ、０．８ｍＭのＭｇＳＯ4、１．８ｍＭのＣａＣｌ2、２５ｍＭグルコースを含有する緩衝食塩液中でインキュベートした。ｃＡＭＰの集積を許容するために、ホスホジエステラーゼ阻害剤であるイソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ、１ｍＭ）を加えた。指示される場合は、ペプチドアゴニストと相乗させてアデニリルシクラーゼを刺激するためにホルスコリン（ＦＳＫ、１０μＭ）を加えた。インキュベーション時間は、１５分間であった。細胞は次に、Ｓａｌｏｍｏｎ，Ｙ．（１９７９）：Ａｄｅｎｙｌａｔｅ  ｃｙｃｌａｓｅ  ａｓｓａｙ．Ａｄｖ．Ｃｙｃｌｉｃ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｒｅｓ．１０，３５−５５に記載された方法にしたがってバッチ式カラムクロマトグラフィーを使用して、氷冷温のトリクロロ酢酸ならびに遊離アデニンおよびＡＴＰから分離したｃＡＭＰを用いて抽出した。ｃＡＭＰを定量するための方法は、特に、Ａｌｌｅｎ，Ｍｍ，Ｈａｌｌ，Ｄ．，Ｃｏｌｌｉｎｓ．，Ｂ．，Ｍｏｏｒｅ．，Ｋ．（２００２）  Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ．７，３５−４４；Ｇｏｌｌａ，Ｒ．，Ｓｅｅｔｈａｌａ，Ｒ．Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ．７，５１５−２５；Ｇａｂｒｉｅｌ，Ｄ．，Ｖｅｒｎｉｅｒ，Ｍ．，Ｐｆｅｉｆｅｒ，Ｍ．Ｊ．，Ｄａｓｅｎ，Ｂ．，Ｔｅｎａｉｌｌｏｎ，Ｌ．，Ｂｏｕｈｅｌａｌ，Ｒ．（２００３）  １，２９１−３０３；Ｋｅｎｔ，Ｔ．Ｃ．，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．，Ｎａｙｌｏｒ，Ｌ．Ｈ．．（２００５）  Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｃｒｅｅｎ．５，４３７−４６に記載されている。
【００９２】
（ノッティン（knottin）骨格（ｏＭｃｏＴｉ−ＩＩ）内に挿入されたＰＴＨ１*およびＰＴＨ２によるＰＴＨＲ１の活性化）
選択されたノッティン（knottin）骨格内に挿入されたＰＴＨ  Ｎ末端フラグメントがそれらの生物活性を維持したことを確証するために、２つの構築体ＮＣ−ＭＣ−ＰＴＨ−１*および−２がＰＴＨ（１−３４）（臨床使用について承認されたＰＴＨの生物活性Ｎ末端フラグメント）によって通常は提供される生物学的反応を引き出す能力について評価した。簡潔には、ヒト副甲状腺ホルモン受容体（ｈＰＴＨ）、ＣＣｌ３９ｈＲ５（ハムスター肺線維芽細胞）およびヒト肺腎臓細胞（ＨＥＫ２９３）を機能的に発現する２つの哺乳動物細胞系を、様々な濃度の両方の構築体ならびに陽性コントロールとしてのＰＴＨ（１−３４）を用いて処理した。
【００９３】
両方の構築体がＣＣｌ３９ｈＲ５細胞に及ぼす作用を試験すると、ホルスコリンの存在下および非存在下の両方において、高濃度（１００μｇ／ｍＬ）のＮＣ−ＭＣ−ＰＴＨ−１*および−２いずれかが加えられると、ｃＡＭＰ産生の有意な刺激が見いだされた。この作用は、ＨＥＫ２９３細胞が使用された場合、特に１００μｇ／ｍＬのＮＣ−ＭＣ−ＰＴＨ２が適用されて最高濃度のＰＴＨ  １−３４（１００ｎＭ）で産生したｃＡＭＰのおよそ６０％の産生を生じさせた場合に一層より顕著であった。これらをまとめると、高濃度のＮＣ−ＭＣ−ＰＴＨ−１*および−２はＰＴＨ  １−３４によって活性化されたアデニレートシクラーゼを刺激できることは明白である。
【００９４】
本明細書、特許請求項および／または図面に開示した本発明の特徴は、個別およびそれらの任意の組み合わせで本発明をその様々な形態で実現するための材料となり得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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