(57)【要約】本発明は、Ｂ型インフルエンザをＮＳ１タンパク質から検出する方法を提供する。ＮＳ１タンパク質は、臨床試料中に検出可能なレベルで存在しており、Ｂ型インフルエンザに汎特異性でありＡ型インフルエンザウイルスまたは他のウイルスに結合しない抗体を用いて検出できる。一実施形態において、本発明は、患者がＢ型インフルエンザウイルスに感染しているかどうかを特定するための方法を提供し、この方法は、Ｂ型インフルエンザウイルスのＮＳ１タンパク質が患者試料中に存在しているかどうか判定するステップであって、存在から、該患者がＢ型インフルエンザウイルスに感染していることが示されるステップを含む。一局面において、この患者試料は、血液、組織、鼻分泌物、肺滲出液、排泄腔試料、糞便試料、咽頭スワブおよび唾液からなる群より選択される。
2010507780.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者がＢ型インフルエンザウイルスに感染しているかどうかを特定するための方法であって、
Ｂ型インフルエンザウイルスのＮＳ１タンパク質が患者試料中に存在しているかどうか判定するステップであって、存在から、該患者がＢ型インフルエンザウイルスに感染していることが示されるステップ
を含む方法。
【請求項２】
前記判定するステップが、
Ｂ型インフルエンザウイルスＮＳ１タンパク質に特異的に結合する薬剤と患者試料を接触させるステップと、
該薬剤と該ＮＳ１タンパク質との特異的な結合を検出するステップであって、特異的な結合からＢ型インフルエンザウイルスの存在が示されるステップと
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記判定するステップが、前記ＮＳ１タンパク質をコードするｍＲＮＡの存在を判定し、該ｍＲＮＡの存在から該ＮＳ１タンパク質の存在を推測するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記薬剤が、ＮＳ１タンパク質に特異的に結合する抗体である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体が、Ｂ型インフルエンザの様々な株に汎特異性である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体が、Ｂ型インフルエンザの単一株に単一特異性である、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記接触させるステップが、Ｂ型インフルエンザウイルスＮＳ１タンパク質の様々なエピトープに特異的に結合する第１および第２の薬剤と前記患者試料を接触させるステップを含み、該第１の薬剤が支持体に固定されており、前記検出するステップが、該第１および第２の薬剤が該ＮＳ１タンパク質に特異的に結合しているサンドイッチを検出して前記ウイルスの存在を示す、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記第１および第２の薬剤が第１および第２の抗体である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記第１および／または第２の薬剤がポリクローナル抗体である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１および／または第２の薬剤がＢ型インフルエンザの様々な株に汎特異性である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記患者試料が、血液、組織、鼻分泌物、肺滲出液、排泄腔試料、糞便試料、咽頭スワブおよび唾液からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記試料がＡ型インフルエンザウイルスに感染しているかどうか判定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
Ａ型インフルエンザウイルスＮＳ１タンパク質の存在または不在からＡ型インフルエンザウイルスの存在または不在を判定する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
患者試料中のＢ型インフルエンザウイルスの同定および亜型判定のためのキットであって、
Ｂ型インフルエンザウイルスＮＳ１タンパク質に特異的に結合する薬剤
を含み、該薬剤が固体支持体に固定されている、キット。
【請求項１５】
前記薬剤が抗体である、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
Ｂ型インフルエンザウイルスを検出および／または定量化するための、Ｂ型インフルエンザウイルスのＮＳ１タンパク質の使用。
【請求項１７】
Ｃ型インフルエンザウイルスを検出および／または定量化するための、Ｃ型インフルエンザウイルスのＮＳ１タンパク質の使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
インフルエンザはオルトミクソウイルス科のＲＮＡウイルスによって引き起こされる。これらのウイルスには３つの型があり、インフルエンザの３つの異なった型、すなわちＡ型、Ｂ型およびＣ型を引き起こす。インフルエンザウイルスのＡ型ウイルスは、哺乳動物（ヒト、ブタ、フェレット、ウマ）および鳥に感染する。これは、世界的パンデミックを引き起こしたウイルス型であるため、人類にとって非常に重要である。Ｂ型インフルエンザウイルス（単にＢ型インフルエンザとしても知られている）はヒトのみに感染する。これは、たまに流感の局所的な大流行を引き起こす。Ｃ型インフルエンザウイルスも、ヒトのみに感染する。これは、若いときにほとんどの人に感染し、めったに重大な病気を引き起こさない。
【０００２】
「Ｂｉｎａｘ  ＮＯＷ  ＦｌｕＡおよびＦｌｕＢ（商標）」（Ｂｉｎａｘ社、米国Ｍａｉｎｅ州Ｐｏｒｔｌａｎｄ所在）、「Ｄｉｒｅｃｔｉｇｅｎ  Ｆｌｕ  Ａ＋Ｂ（商標）」（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、米国Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ州Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ所在）、「Ｆｌｕ  ＯＩＡ（商標）」（Ｂｉｏｓｔａｒ社、米国Ｃｏｌｏｒａｄｏ州Ｂｏｕｌｄｅｒ所在）、「Ｑｕｉｃｋ  Ｖｕｅ（商標）」（Ｑｕｉｄｅｌ社、米国Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ所在）、「Ｉｎｆｌｕ  ＡＢ  Ｑｕｉｃｋ（商標）」（デンカ生研社、日本国所在）、および「Ｘｐｅｃｔ  Ｆｌｕ  Ａ＆Ｂ」（Ｒｅｍｅｌ社、米国Ｋａｎｓａｓ州Ｌｅｎｅｘａ所在）などの、インフルエンザ抗原の現在の迅速免疫診断試験は、報告によれば、インフルエンザＡ型を検出するか、またはインフルエンザＡ型とＢ型とを識別することができる。これらの試験フォーマットの複雑さは、特別の訓練を要するものでありうる。加えて、陽性試験結果を得るためには、通常、かなりの量のビリオン粒子が必要であり、このことから、それらの使用が、ウイルス脱粒がその最高レベルにある短い期間に制限される。アッセイ感度も様々であり、ある種のアッセイにおける最大で２０％の偽陰性試験結果が現在の重大な懸念となっている（例えば、「ＷＨＯ  ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｒａｐｉｄ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｆｏｒ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ」、２００５年７月を参照）。逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）ベースの診断が性能の前進をもたらしたが、手間がかかり、高度に訓練された人員を必要とし、オンサイトまたは実地試験が困難となっている。逆転写酵素の相対的な非能率性のため、ウイルスＲＮＡを効果的に検出するには、かなりの量のウイルス（例えば１０４ビリオン粒子）と２０ものプライマーとが必要となりうる。残念ながら、ＲＴ−ＰＣＲは、流行の状況での対象の高スループットスクリーニングにも、農業またはポイントオブケアの状況での実地利用にも容易には適合しない。
【０００３】
加えて、新規なインフルエンザ株の複雑さ、多様性および迅速な出現が高リスク株の診断を困難にしており、それゆえ、現在のところ迅速な対応はほとんど不可能である。疫学者にとっては、高い突然変異率および遺伝的再集合から生じる多様性によって、どこにＰＣＲ用の新規な診断プライマーの適時な導入を行えば、新規な株が発生および反応するのか予期するのが困難となっている。その結果、（現在のところ）インフルエンザの多様性によって、複合ＰＣＲアプローチの必要性が決定づけられている。
【０００４】
本発明者らのひとりは、病原性形態のＡ型インフルエンザで、ＮＳ１タンパク質が、典型的な非トリ型のヒトインフルエンザ（すなわちＢ型またはＣ型インフルエンザ）とは異なった形態で存在しているかもしれず、それゆえ、病原性形態のＡ型インフルエンザを同定するのに有用であるかもしれないと報告している。非特許文献１。Ｂ型インフルエンザによる感染は現在、Ａ型インフルエンザによるものほど深刻ではないが、このウイルスに感染している対象を、他のインフルエンザに感染している対象およびインフルエンザに類似した症候を示す他の障害を患っている対象の両方から識別するために、このウイルスに感染している対象を同定する改良法の必要性が依然として存在している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｌｕ、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００６年４月２１日）３１２巻、３３７頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、患者がＢ型インフルエンザウイルスに感染しているかどうかを特定する方法を提供する。そのような方法は、Ｂ型インフルエンザウイルスのＮＳ１タンパク質が患者試料中に存在しているかどうか判定するステップであって、存在から、患者がＢ型インフルエンザウイルスに感染していることが示されるステップを含む。一部の方法では、判定するステップは、Ｂ型インフルエンザウイルスＮＳ１タンパク質に特異的に結合する薬剤と患者試料を接触させるステップと、薬剤とＮＳ１タンパク質との特異的な結合を検出するステップであって、特異的な結合からＢ型インフルエンザウイルスの存在が示されるステップを含む。一部の方法では、判定するステップは、上記ＮＳ１タンパク質をコードするｍＲＮＡの存在を判定し、ｍＲＮＡの存在から上記ＮＳ１タンパク質の存在を推測するステップを含む。薬剤は、場合によっては、ＮＳ１タンパク質に特異的に結合する抗体である。抗体は、場合によっては、インフルエンザＢ型の様々な株に汎特異性（ｐａｎｓｐｅｃｉｆｉｃ）である。抗体は、場合によっては、Ｂ型インフルエンザの単一株に単一特異性である。場合によっては、接触させるステップは、Ｂ型インフルエンザウイルスＮＳ１タンパク質の様々なエピトープに特異的に結合する第１および第２の薬剤と患者試料を接触させるステップを含み、上記第１の薬剤が支持体に固定されており、検出するステップは、第１および第２の薬剤がＮＳ１タンパク質に特異的に結合しているサンドイッチを検出して上記ウイルスの存在を示す。第１および第２の薬剤は、場合によっては、第１および第２の抗体である。第１および／または第２の薬剤は、場合によっては、ポリクローナル抗体である。第１および／または第２の薬剤は、場合によっては、Ｂ型インフルエンザの様々な株に汎特異性である。一部の方法では、患者試料が、血液、組織、鼻分泌物、肺滲出液、排泄腔試料、糞便試料、咽頭スワブおよび唾液からなる群より選択される。
【０００７】
一部の方法は、試料がＡ型インフルエンザウイルスに感染しているかどうか判定するステップをさらに含む。一部のそのような方法では、Ａ型インフルエンザウイルスＮＳ１タンパク質の存在または不在からＡ型インフルエンザウイルスの存在または不在を判定する。
【０００８】
本発明は、患者試料中のＢ型インフルエンザウイルスの同定および亜型判定のためのキットをさらに提供する。そのようなキットは、Ｂ型インフルエンザウイルスＮＳ１タンパク質に特異的に結合する薬剤を含み、薬剤は固体支持体に固定されている。薬剤は、場合によっては抗体である。
【０００９】
本発明は、Ｂ型インフルエンザウイルスを検出および／または定量化するための、Ｂ型インフルエンザウイルスのＮＳ１タンパク質の使用をさらに提供する。
【００１０】
本発明は、Ｃ型インフルエンザウイルスを検出および／または定量化するための、Ｃ型インフルエンザウイルスのＮＳ１タンパク質の使用をさらに提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】２株のＢ型インフルエンザのＮＳ１アミノ酸配列。
【図２Ａ】Ｂ型インフルエンザのＮＳ１に対する様々なモノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡアッセイにおける、２株のＢ型インフルエンザからの組換え体ＮＳ１の検出を示す。対照として、いくつかの株のＡ型インフルエンザのＮＳ１が含まれている。Ｂ型インフルエンザのＮＳ１に対する抗体はいずれも、Ａ型インフルエンザのＮＳ１とは交差反応しなかった。
【図２Ｂ】Ｂ型インフルエンザのＮＳ１に対する様々なモノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡアッセイにおける、２株のＢ型インフルエンザからの組換え体ＮＳ１の検出を示す図である。対照として、いくつかの株のＡ型インフルエンザのＮＳ１が含まれている。Ｂ型インフルエンザのＮＳ１に対する抗体はいずれも、Ａ型インフルエンザのＮＳ１とは交差反応しなかった。
【図３】様々な組合せの捕獲抗体および検出抗体を用いたラテラルフローアッセイ（ｌａｔｅｒａｌ  ｆｌｏｗ  ａｓｓａｙ）における、２株のＢ型インフルエンザの組換え体ＮＳ１の検出。
【図４】Ｂ型インフルエンザのＮＳ１を検出するための、捕獲抗体および検出抗体の適した組合せを示すチャート。
【図５】臨床試料中のＢ型インフルエンザのＮＳ１の検出を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（定義）
結合剤、例えば抗体と、ＮＳ１タンパク質との「特異的結合」は、捕獲剤または検出剤が、様々なウイルス分析物の混合物中に存在する特定のウイルス分析物に優先的に結合する能力を指す。例えば、本出願に記載の抗体は、Ａ型インフルエンザのＮＳ１には特異的に結合せずに、Ｂ型インフルエンザのＮＳ１に特異的に結合する。特異的結合は、約１０−６Ｍ未満、好ましくは約１０−７Ｍ未満、そして最も好ましくは約１０−８Ｍ未満の解離定数（ＫＤ）を意味する。
【００１３】
「捕獲剤／分析物複合体」は、分析物、例えばインフルエンザウイルスＮＳ１タンパク質と捕獲剤の特異的な結合から生じる複合体である。捕獲剤および分析物は、特異的な結合に適した条件下で、特異的に、すなわち相互に結合し、そのような物理化学的条件は、例えば、塩濃度、ｐＨ、界面活性剤濃度、タンパク質濃度、温度、および時間に関して表現するのが好都合である。本条件は、例えば溶液中で、あるいはその代わりに結合要素の１つが固相に固定されている場合に、結合が起こることを可能にするのに適している。そのように適した代表的条件は、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社、米国Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ州Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ所在（１９８９年）に記載されている。適した条件は、約１０−６Ｍ未満、好ましくは約１０−７Ｍ未満、そして最も好ましくは約１０−８Ｍ未満の解離定数（ＫＤ）を有する結合相互作用をもたらすことが好ましい。
【００１４】
「固相」は、１または複数種の反応体が静電気的に、疎水的に、または共有結合で結合しうる表面を意味する。代表的な固相には、例えば、ナイロン６、ナイロン６６、ポリスチレン、ラテックスビーズ、磁性ビーズ、ガラスビーズ、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリブチレン、ブタジエン−スチレンコポリマー、シラスティックゴム、ポリエステル、ポリアミド、セルロースおよび誘導体、アクリレート、メタクリレート、ポリビニル、塩化ビニル、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニル、ポリスチレンのコポリマー、シリカゲル、シリカウェーハガラス、アガロース、デキストラン、リポソーム、不溶性の金属タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｅｔａｌ）およびニトロセルロースが含まれる。代表的な固相には、ビーズ、管、細片、円板、濾紙およびプレートなどとして形成されたものが含まれる。フィルターは、分析物を、例えば濾液として捕獲するか、または捕捉によって作用するか、または共有結合によって作用する働きをしうる。使用者に配給するための固相捕獲試薬は、「捕獲試薬」でコーティングされた固相から構成され得、生物学的な試料中におけるインフルエンザＮＳ１分析物への捕獲試薬の結合を保存および／または最大化するように（例えば、窒素雰囲気下で）容器に入れることができる。
【００１５】
生物学的な試料には、組織の流体、組織切片、空気中または水中に保持されている生物学的な物質、ならびにそこから、例えばバイオテロの脅威などを評価するために、例えば濾過および遠心法などによって収集された生物学的な物質が含まれる。代替の生物学的な試料は、胎児または卵、卵黄、および羊水から採取できる。代表的な生物学的流体には、尿、血液、血漿、血清、脳脊髄液、精液、肺洗浄液、糞便、痰、粘液、および生物学的な物質を保持している水などが含まれる。あるいは、生物学的な試料には、鼻咽頭または口咽頭スワブ、鼻腔洗浄液、気管、肺、気嚢、腸、脾臓、腎臓、脳、肝臓および心臓からの組織、痰、粘液、生物学的な物質を保持している水、排泄腔スワブ、痰、鼻粘液および口腔粘液などが含まれる。代表的な生物学的な試料には、食糧、例えば肉、加工食品、家禽およびブタなどの試料も含まれる。生物学的な試料には、外来患者診療所、病院、クリニック、および食料備蓄施設（例えば、レストラン、屠殺場、冷蔵施設およびスーパーマーケットの包装など）からの汚染溶液（例えば食品加工溶液など）およびスワブ試料も含まれる。生物学的な試料には、ｉｎ−ｓｉｔｕの組織および体液（すなわち試験用に収集したのではない試料）が含まれてもよく、例えば、本方法は、例えば、点眼剤、結膜に直接適用する試験細片を用いた、眼内のウイルス感染の存在もしくは重度の検出、または、例えば、試験対象の口または鼻咽頭内に指示薬カプセルを入れることによる肺感染の存在もしくは程度を検出の際に有用となりうる。あるいは、スワブまたは試験細片を口内に入れることができる。生物学的な試料は、対象の細胞のいかなる組織、臓器または細胞群に由来するものでもよい。一部の実施形態では、擦過検体、生検、または洗浄液を対象から得る。生物学的な試料には、血液、尿、痰、および口腔液などの体液、ならびに鼻の洗浄液、スワブ、または吸引液、気管吸引液、下疳スワブ、糞便試料などの試料が含まれうる。対象とする個々の病原体を検出するのに適した生物検体、例えば、呼吸器疾患に関与した高危険性Ａ型インフルエンザウイルスの場合には鼻腔スワブ、洗浄液、もしくは吸引液、または気管の吸引液などの鼻咽頭の検体、あるいは口腔スワブなどを収集する方法は、当業者によく知られている。場合によっては、生物学的な試料は、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、およびマイコスタチンなどの抗生物質類を含有する等張液中に懸濁してもよい。
【００１６】
（発明の詳細な説明）
検出可能なレベルの、Ｂ型インフルエンザウイルスのインフルエンザＮＳ１タンパク質は、鼻分泌物などの体分泌物中に見出すことができる。本発明は、Ａ型インフルエンザには特異的に結合せず、様々な株のＢ型インフルエンザに汎反応性である、Ｂ型インフルエンザに対する抗体を提供する。そのような抗体は、Ｂ型インフルエンザの存在を、そのＮＳ１タンパク質の存在から検出することを可能にする。
【００１７】
Ｉ．インフルエンザウイルス
インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルス科に属し、それらの核タンパク質（ＮＰ）およびマトリックスタンパク質（Ｍ１）の抗原性の相違に基づいて、Ａ、ＢおよびＣの群に分類されている。株へのさらなる亜型判定は、通常、２種のビリオン糖タンパク質、すなわち赤血球凝集素（ＨＡ；Ｈ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ；Ｎ）に存在する抗原の型の評価に基づいている。ＨＡおよびＮＰは、宿主細胞表面へのビリオンの付着を媒介する病原因子である。Ｍ１タンパク質は、ウイルスのアセンブリーおよび脱粒で機能すると考えられており、ＮＰは、ＲＮＡ複製および転写で機能している。これらのビリオンタンパク質に加えて、非構造タンパク質１および２（ＮＳ１、ＮＳ２）と呼ばれる他の２種の非構造タンパク質、すなわち非ビリオンタンパク質がウイルス感染細胞内で発現される。非構造ウイルスタンパク質ＮＳ１は、スプライシングならびに細胞性ｍＲＮＡの核外輸送および翻訳の刺激の調節と、宿主インターフェロン能力の相殺とを含めた多機能を有する。ＮＳ１タンパク質は、インフルエンザウイルスで同定および配列決定されており、その配列は、ＮＣＢＩデータベース内に見出すことができる。Ｂ型インフルエンザの例示的な２株に由来するＮＳ１タンパク質の配列を図１に示す。その２株は９３％の配列同一性を示す。他のインフルエンザ株のＮＳ１タンパク質とは、例えば図１に示す配列を用いて、既知のインフルエンザ亜型でＮＳ１タンパク質として認識されているタンパク質のうちの１つに最も大きな配列類似性を有するタンパク質を意味する。
【００１８】
ＩＩ．診断および治療に使用するための抗体
本発明はＢ型インフルエンザのＮＳ１タンパク質に対する抗体を提供する。そのような抗体の一部は、少なくとも２株もしくは５株、またはすべてもしくは実質的にすべての既知の株のＢ型インフルエンザに由来するＮＳ１タンパク質に特異的に結合する点で汎反応性である。他の抗体は、１株のＢ型インフルエンザのみに特異的に結合する点で単一特異性である。通常、そのような抗体は、すべての株のＡ型インフルエンザに対して特異的な結合を行わない。抗体は、ポリクローナル抗体でも、様々なエピトープ特異性を有する別個のモノクローナル抗体またはモノクローナル抗体のプールでもよい。モノクローナル抗体は、タンパク質の抗原含有断片から、抗体の型に応じた標準的手順によって作製される（例えば、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻、４９５頁、（１９７５年）；ならびにＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（Ｃ．Ｓ．Ｈ．Ｐ．社、米国Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ州所在、１９８８年）；Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８６巻、１００２９〜１００３３頁（１９８９年）および国際公開第９０／０７８６１号；Ｄｏｗｅｒら、国際公開第９１／１７２７１号；ならびに、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、国際公開第９２／０１０４７号（それぞれを参照によりすべての目的で本明細書に援用する）を参照）。
【００１９】
Ｂ型インフルエンザの複数の株で免疫感作することによって、または１株で免疫感作し、別の株で追加免疫することによって、汎特異性の抗体を産生するように免疫感作を偏らせることができる。あるいは、Ｂ型インフルエンザＮＳ１の高度に保存された領域に由来する断片を免疫原として用いることができる。逆に、単一特異性抗体を産生させるには、単一株のＮＳ１または非保存領域に由来するＮＳ１断片で免疫感作を行うことが好ましい。
【００２０】
「抗体」または「免疫グロブリン」という用語は、完全な抗体およびそれらの結合性断片が含まれるように使用される。通常、別々になっている重鎖、軽鎖Ｆａｂ、Ｆａｂ’Ｆ（ａｂ’）２、ＦａｂｃおよびＦｖを含めた断片は、それらの由来である完全な抗体と、抗原断片への特異的な結合に関して競合する。断片は、組換えＤＮＡ技法によって、または完全な免疫グロブリンの酵素的もしくは化学的分離によって産生される。「抗体」という用語には、他のタンパク質と化学的に結合されているか、またはそれらとの融合タンパク質として発現された１または複数本の免疫グロブリン鎖が含まれる。「抗体」という用語には、二重特異性抗体も含まれる。
【００２１】
ＩＩＩ．他の結合剤
ＮＳ１タンパク質の検出での使用には、抗体が好ましいが、Ｂ型インフルエンザのＮＳ１に特異的親和性を有するいかなる結合剤も抗体代用物として使用できる。代用物には、Ｂ型インフルエンザのＮＳ１に対してスクリーニングされたランダム化ファージディスプレーライブラリーから得られたペプチドが含まれる。代用物にはアプタマーも含まれる。アプタマーは、結合ポケットを形成することによって特異的なリガンドを認識する、ランダム配列の巨大な集団からｉｎ  ｖｉｔｒｏで選択されたＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子である。アロステリックリボザイムは、それらの活性が、活性部位から離れて位置するアプタマードメインへのエフェクター分子の結合によって調節されているＲＮＡ酵素である。これらのＲＮＡは、特定のエフェクターの存在または不在によって制御されている精密分子スイッチとして働く。アプタマーは、核酸、タンパク質および生物全体にさえ結合できる。アプタマーは抗体とは異なるが、それでも、それらは様々な診断フォーマットで抗体の特性を模倣する。したがって、アプタマーは、抗体の代わりに、または抗体と組み合わせて、一般的、または特定のＮＳ１領域の存在を同定するのに使用できる。
【００２２】
ＩＶ．診断試験
Ｂ型インフルエンザに感染している疑いのある試料は、Ｂ型インフルエンザウイルスのＮＳ１タンパク質を検出することによって、それが存在しているかどうか試験する。そのタンパク質は、Ｂ型インフルエンザのＮＳ１タンパク質に特異的に結合する抗体または他の捕獲試薬を用いて、下記に、より詳細に記述するフォーマットで検出することができる。Ｂ型インフルエンザのＮＳ１タンパク質の存在は、試料がＢ型インフルエンザウイルスに感染していることを示す。そのような試験は、単独で、またはＡ型および／もしくはＣ型インフルエンザ用の他の試験と組み合わせて行うことができる。Ａ型インフルエンザおよびＣ型インフルエンザに関する試験も、これらの株に適した特異性を有する抗体または他の捕獲試薬を用いて、これらの株のＮＳ１タンパク質が存在しているかどうか検出することによって実施できる。Ａ型インフルエンザを検出する方法、および、とりわけ、その病原型および非病原型を識別する方法が、２００６年７月３日出願の同時係属出願である米国特許出願第１１／４８１，４１１号（参照により、本明細書に全体として、すべての目的に関して組み込まれている）に記載されている。
【００２３】
本発明の方法は、通常、Ｂ型インフルエンザのＮＳ１に汎特異性の抗体または他の結合試薬を用いて行う。この方法は、型を識別せずに、インフルエンザの一部またはすべての株を検出する。この方法は、Ｂ型インフルエンザ株を相互に識別する抗体を用いて行うこともできる。この場合、通常、単一のアッセイで１パネルの抗体が使用され、このアッセイは、Ｂ型インフルエンザの存在だけでなく、どの株が存在するかも同定する。
【００２４】
Ｖ．診断試験用のフォーマット
本発明は、異なった様々なタイプの生物学的な試料中のＢ型インフルエンザウイルスを同定するアッセイ法で有用な診断用捕獲試薬および検出試薬を提供する。そのようなフォーマットには、免疫沈降反応、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、競合アッセイおよび免疫測定アッセイ（ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ）が含まれる。ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（ＣＳＨＰ、ＮＹ、１９８８年）、米国特許第３，７９１，９３２号、第３，８３９，１５３号、第３，８５０，７５２号、第３，８７９，２６２号、第４，０３４，０７４号、第３，７９１，９３２号、第３，８１７，８３７号、第３，８３９，１５３号、第３，８５０，７５２号、第３，８５０，５７８号、第３，８５３，９８７号、第３，８６７，５１７号、第３，８７９，２６２号、第３，９０１，６５４号、第３，９３５，０７４号、第３，９８４，５３３号、第３，９９６，３４５号、第４，０３４，０７４号ならびに第４，０９８，８７６号を参照。
【００２５】
免疫測定アッセイまたはサンドイッチアッセイが好ましいフォーマットである（米国特許第４，３７６，１１０号、第４，４８６，５３０号、第５，９１４，２４１号および第５，９６５，３７５号を参照）。そのようなアッセイは、固相に固定された１種の抗体または抗体の集団と、溶液中の別の抗体または抗体の集団とを用いる。通常、その溶液抗体または抗体集団は標識されている。抗体集団を用いる場合、その集団は通常、標的抗原内の異なったエピトープ特異性に結合する抗体を含有する。したがって、同じ集団を、固相抗体および溶液抗体の両方に用いることができる。モノクローナル抗体を用いる場合、異なった結合特異性を有する第１および第２のモノクローナル抗体を固相および溶液相に用いる。固相抗体および溶液抗体は、標的抗原に、順次または同時に接触させることができる。固相抗体を最初に接触させる場合、そのアッセイは、フォワードアッセイ（ｆｏｒｗａｒｄ  ａｓｓａｙ）であると言われる。逆に、溶液抗体を最初に接触させる場合、そのアッセイは、リバースアッセイ（ｒｅｖｅｒｓｅ  ａｓｓａｙ）であると言われる。標的を両方の抗体と同時に接触させる場合、そのアッセイは、同時アッセイと呼ばれる。標的を抗体と接触させた後に、通常約１０分から約２４時間までの間で変動し、通常約１時間である時間、試料をインキュベートする。その後、検出試薬として使用された（１または複数種の）抗体に特異的に結合しなかった、試料の成分を除去するために、洗浄ステップを行うことができる。固相抗体および溶液抗体を別々のステップで結合させる場合、それらの結合ステップのいずれか、または両方の後に、洗浄を行うことができる。洗浄の後に、通常、標識された溶液抗体の結合を介して固相に連結されている標識を検出することによって、結合を定量化する。通常、抗体または抗体集団の所与の対、および所与の反応条件に関して、既知の濃度の標的抗原を含有する試料から検量線を作成する。その後、検量線の内挿によって、試験される試料中の抗原の濃度を決定する。平衡状態で結合した標識溶液抗体の量から、または平衡に達する前の一連の時点における、結合した標識溶液抗体の動態測定によって、分析物を測定できる。そのような曲線の勾配が試料中の標的濃度の尺度となる。
【００２６】
競合アッセイも使用できる。一部の方法では、抗体検出試薬との結合に関して、試料中の標的抗原が、外因的に添加された標識標的抗原と競合する。抗体に結合した標識標的抗原の量は、試料中の標的抗原の量と反比例している。抗体は、試料からの結合複合体の分離を容易にするために、検出前に固定することができ（不均一アッセイ）、または、均一アッセイフォーマットで行う場合には、分離が不要となりうる。他の方法では、検出試薬として使用される抗体を標識する。抗体が標識される場合、その結合部位は、試料中の標的抗原、および例えば固相に固定された標的抗原でありうる、外因的に供給される形態の標的抗原への結合に関して競合する。標識抗体は、試料中の、上記標識抗体と同じ標的抗原に結合する抗体を検出するのに、さらに別の競合的フォーマットで使用することもできる。上記フォーマットのそれぞれで、検出試薬として使用される抗体が、アッセイされている標的とほぼ同じ濃度の制限量として存在する。
【００２７】
ラテラルフローデバイスが好ましいフォーマットである。家庭用妊娠試験と同様に、ラテラルフローデバイスは、特定の生物製剤で処理されている試験細片に流体を添加することによって働く。液体試料によって運搬され、対応する生物製剤で標識されたリン光体が細片を貫流し、それらが特定の帯域に入ったときに、それらを捕獲することができる。細片上に見出されるリン光体シグナルの量が標的分析物の量に比例する。
【００２８】
Ｂ型インフルエンザを含有している疑いがある試料をラテラルフローデバイスに添加する。試料は、拡散によって移動できるようになっており、線または有色帯域がインフルエンザＢの存在を示す。ラテラルフローは通常、３つの特定領域、すなわち試料添加領域、ＮＳ１に対する１または複数種の抗体を含有している捕獲領域、および各帯域が１つまたは複数の標識を含有している１つまたは複数の帯域を含有する読み取り領域を含有している固体支持体（例えばニトロセルロース膜）を含有している。ラテラルフローに、陽性対照および陰性対照を含有させることもできる。したがって、ラテラルフローデバイスは、例えば次の通りに使用できる。すなわち、生物学的な試料のアリコートを試験細片の一端に接触させることによって、Ｂ型インフルエンザのＮＳ１タンパク質を、生物学的な試料中の他のウイルス性タンパク質および細胞性タンパク質から分離し、その後、例えばラテラルフローなどの毛細管現象によって、タンパク質を試験細片上で移動させる。１または複数種の抗体および／またはアプタマーが、捕獲試薬および／または検出試薬として含有されている。ラテラルフローで分離、検出および定量化する方法およびデバイスは、例えば、参照により全体が本明細書に援用される、米国特許第５，５６９，６０８号、第６，２９７，０２０号および第６，４０３，３８３号に記載されている。一例として、試験細片は、試料を添加するために近位の領域（試料添加領域）、ならびにＮＳ１タンパク質に対する抗体および緩衝試薬およびその抗体と、移動している生物学的な試料中の任意のＢ型インフルエンザＮＳ１タンパク質との結合相互作用を確立するのに適した添加物を含有する遠位の試験領域を含みうる。別の例では、試験細片は、Ｂ型インフルエンザの異なった２株のＮＳ１に対する異なった抗体を含有する２箇所の試験領域、すなわち、それぞれが異なったＢ型インフルエンザ分析物と特異的に相互作用できる２箇所の試験領域を含む。
【００２９】
上記方法での使用に適した検出可能な標識には、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的もしくは化学的手段、または他の手段によって検出可能ないかなる部分も含まれる。例えば、適した標識には、標識されたストレプトアビジン結合体で染色するためのビオチン、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミンおよび緑色蛍光タンパク質など）、放射標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３２Ｐ）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、およびＥＬＩＳＡで一般的に使用される他の酵素）、およびコロイド状金または色ガラスまたはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレンまたはラテックスビーズ）などの比色分析標識が含まれる。そのような標識の使用を記載している特許には、米国特許第３，８１７，８３７号、第３，８５０，７５２号、第３，９３９，３５０号、第３，９９６，３４５号、第４，２７７，４３７号、第４，２７５，１４９号および第４，３６６，２４１号が含まれる。「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ」（第６版、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社、米国Ｏｒｅｇｏｎ州Ｅｕｇｅｎｅ所在）も参照のこと。放射標識は、写真フィルムまたはシンチレーションカウンターを用いて検出でき、蛍光標識は、発せられた光を検出する光検出器を用いて検出でき、酵素標識は通常、その酵素に基質を与え、基質への酵素の作用によって生成した反応生成物を検出することによって検出され、比色分析標識は、発色した標識を単純に可視化することによって検出される。
【００３０】
試料中のＢ型インフルエンザＮＳ１タンパク質のレベルは、定量化すること、および／または対照と比較することができる。適した陰性対照試料は、例えば、健康であることが分かっている個体、例えばインフルエンザウイルス感染を有していないことが分かっている個体から得られる。特異性対照は、既知のＡ型インフルエンザ感染またはＣ型インフルエンザ感染を有する個体、またはインフルエンザ以外のウイルスに感染している個体から収集できる。対照試料は、試験される対象と遺伝的な関係がある個体から得ることができるが、遺伝的に関係のない個体からも得ることができる。適した陰性対照試料は、感染のより早期、すなわち試験試料が採取された時点より早い時点に個体から収集された試料でもよい。陽性対照として、Ｂ型インフルエンザの組換え体ＮＳ１を用いることができる。
【００３１】
生物学的な試料中のＮＳ１レベルが、様々な異なった可能な免疫検定法フォーマットでこれらの抗原を検出することを可能にするのに十分であることを、ウエスタンブロットは示している。しかし、特定の免疫検定法フォーマットで検出するのに、特定の生物学的な試料中のＮＳ１レベルが限定的であると判明した場合には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞を感染させることによって、生物学的な試料中の生ウイルスを増幅させることができる。すなわち、ウイルス増幅試料のＮＳ１タンパク質は、約６時間から約１２時間以内に検出可能となる。生物学的な試料中およびウイルス増幅試料のＮＳ１抗原の収率は、プロテアーゼ阻害剤およびプロテアソーム阻害剤に含めることによって改善することができる。
【００３２】
あるいは、ＮＳ１タンパク質をｍＲＮＡレベルで検出することができる。試料から得られたＲＮＡを逆転写させて、増幅させる。場合によっては、増幅の過程で標識を添加する。その後、増幅された核酸を、少なくとも１株のＢ型インフルエンザウイルスのＮＳ１をコードする核酸に実質的または完全に相補的であることが知られている核酸プローブとハイブリッド形成させる。通常、標識の存在からハイブリッド形成を検出する。Ｂ型インフルエンザのＮＳ１タンパク質をコードする核酸に相補的なプローブにハイブリッド形成する増幅された核酸の存在は、試料中におけるＢ型インフルエンザの存在を示す。抗体を用いる場合と同様に、プローブは、Ｂ型インフルエンザの様々な株に汎特異性のものか、または非特異性のものを選択できる。ハイブリッド形成アッセイは、アレイフォーマットで行うことができる。そのようなフォーマットは、場合によっては様々な株のＢ型インフルエンザのＮＳ１タンパク質をコードする核酸に対するいくつかのプローブをアレイに含めることを可能にする。Ａ型またはＣ型インフルエンザのＮＳ１タンパク質のプローブも含めることができ、同様に、他のウイルスまたは他の病原体に対するプローブも含めることができる。
【００３３】
ＶＩ．試料調製法
検出可能な濃度のインフルエンザタンパク質、好ましくはＮＳ１を含有しているか、含有しているかもしれないと考えられるいかなる試料も使用できる。使用できる試料の例は、例えば、肺滲出液、細胞抽出物（気道上皮内層、鼻）、血液、粘液、および鼻腔スワブである。鼻腔スワブ中に、高濃度のＮＳ１を見出すことができる。したがって、ＮＳ１を同定するための好ましい試料は鼻分泌物である。
【００３４】
抗体へのＮＳ１の結合は、０．０３％および０．０１％を含めた、最大０．０５％までのＳＤＳの存在下で起こる。したがって、鼻分泌物または他の体分泌物がラテラルフローフォーマットで容易に用いられそうにない場合、それをＳＤＳで処理することができる。好ましくは、添加されるＳＤＳの量が、最大０．０１％まで、より好ましくは０．０３％まで、さらに好ましくは０．０５％までの最終濃度である。
【００３５】
ＶＩＩ．診断用および治療用キット
本発明の方法を実行するためのキットを提供する。そのキットは、Ｂ型インフルエンザのＮＳ１に特異的に結合する１つまたは複数の結合剤、通常は抗体を含有している。本キットは、場合によっては、実施例に開示する試薬、緩衝剤、添加剤の組成物または試薬のうち１つまたは複数を含有している。そのキットは、生物学的な試料中の他の潜在的干渉物質からインフルエンザウイルスのＮＳ１を分離するデバイスまたは系などの手段を含みうる。本キットは、望ましい場合には、アッセイを行うのに有用な１つもしくは複数の様々な構成要素、例えば、１つもしくは複数のアッセイ容器、１もしくは複数種の対照試薬もしくは較正試薬、アッセイを行うための１つもしくは複数の固相表面、１もしくは複数種の緩衝剤、添加物、検出試薬もしくは抗体、または、例えば、アッセイを行う際に使用するべき各成分の量およびアッセイの結果を評価するための指針を示す添付文書および／もしくは容器標識として、Ｂ型インフルエンザを検出するためのキットを用いる方法を詳述する１つまたは複数の印刷された説明書のうちの１つまたは複数をさらに含みうる。本キットは、例えば、試験細片、サンドイッチＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットアッセイおよびラテックス凝集などを含めた、様々な異なったタイプのアッセイフォーマットを行うのに有用な構成要素を含有しうる。
【００３６】
ＶＩＩＩ．抗体アレイ
本発明は、抗体アレイをさらに提供する。そのようなアレイは、アレイの異なった領域に、それぞれＢ型インフルエンザのＮＳ１に対する特異性を有する複数の異なった抗体を含有している。その異なった抗体は、Ｂ型インフルエンザの様々な株への特異性を有するように選択できる。複数の株に汎特異性である抗体を含めることもできる。Ａ型またはＣ型インフルエンザのＮＳ１タンパク質の抗体を含めることもできる。そのようなアレイは、Ｂ型インフルエンザの検出、株相互の識別、ならびにＡ型、Ｂ型およびＣ型インフルエンザの識別に有用である。
【００３７】
抗体アレイ用の多数のフォーマットが提唱されている。米国特許第５，９２２，６１５号は、膜表面に固定された抗体の複数の異なった帯域を用いた、アレイ内の複数の標的抗原を検出するデバイスを記載する。米国特許第５，４５８，８５２号、第６，０１９，９４４号、第６，１４３，５７６号および米国特許出願第０８／９０２，７７５号は、膜上ではなくデバイス内に固定された複数の異なった抗体帯域を有する、複数の標的抗原をアッセイするための診断デバイスを記載する。国際公開第９９／６７６４１号は、マイクロスフェアが光ファイバーの末端に固定された後に、個々のマイクロスフェア表面に固定された特異的な結合剤（抗体を含める）の解読および同定を可能にするタグを有するように作製されたマイクロスフェアのアレイを記載する。米国特許第５９８１１８０号では、この場合も、結合剤（抗体を含める）を固定するのにマイクロスフェアが使用され、マイクロスフェアは、それらを試料から分離せずに、マイクロスフェアに結合した特異的な結合剤を同定するために、マイクロスフェア内に含有されている２種の異なったフルオロフォアの相対量を検出することによって相互に識別される。
【００３８】
本明細書に引用されたすべての刊行物および特許を、個々の刊行物または特許のそれぞれを参照により本明細書に援用すると明確かつ個別に示したのと同じように、参照により本明細書に援用する。ＧＩＤまたはアクセッション番号によって参照されたＧｅｎｂａｎｋ記録、とりわけ、いかなるポリペプチド配列、ポリヌクレオチド配列またはそれらのアノテーションも、参照により本明細書に援用する。本発明の真の趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な改変および等価物の置換を行うことができる。例えば、主としてＢ型インフルエンザに関して本発明を説明したが、Ｃ型インフルエンザを検出するのに、必要な変更を加えて、同様な戦略を用いることができる。別のことが文脈から明らかでない限り、いかなる特徴、ステップまたは実施形態も、他の任意の特徴、ステップまたは実施形態と組み合わせて用いることができる。
【実施例】
【００３９】
（実施例１）
ＦＬＵ−ＢのＮＳ１に対するモノクローナル抗体の単離
Ｆｌｕ−Ｂ亜型のＮＳ１タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体を調製した。抗体は、汎特異性（すなわち、複数の株のＦｌｕ−Ｂに結合する）または単一特異性（すなわち、１株のＦｌｕ−Ｂに結合し、他のものに結合しない）でありうる。
【００４０】
２種のＦｌｕ−Ｂ亜型について、Ｆｌｕ−Ｂ  ＮＳ１のＧＳＴおよびＭＢＰ融合タンパク質を作製した（Ｂ／ＢＡ／７８、ＡＶＣ名称：タンパク質＃５２２、Ｇｅｎｂａｎｋ３２５１１２）および（Ｂ／Ｙａｇａｍａｔａ／２２２／２００２、ＡＶＣ名称：タンパク質＃５２３、Ｇｅｎｂａｎｋ５０３００３１２）。クローニングベクターは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社（ＧＳＴ）またはＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社（ＭＢＰ）から入手した。ＮＳ１コード領域は、ＤＮＡ２．０（米国Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ州Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ所在）によるオーバーラップオリゴヌクレオチドを用いて合成した。
【００４１】
１．ＣＦＡ、次にＩＦＡおよびＰＢＳにおいてＦｌｕ−Ｂ  ＭＢＰ−ＮＳ１融合タンパク質を１用量あたり１０〜１００μｇの範囲の用量を用いてマウスの免疫感作を行った。
【００４２】
２．対応するＧＳＴ−ＮＳ１融合タンパク質を用いた最後の追加免疫の３日後に、脾細胞およびリンパ球を採取し、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ、１９７５年）に記載のＦＯＸ−ＮＹ骨髄腫細胞と融合させた。
【００４３】
３．ハイブリドーマは、最初にＦｌｕ−Ｂ  ＭＢＰ−ＮＳ１を用いて、ＥＬＩＳＡでスクリーニングした（図２Ａおよび２Ｂ）。陽性ウェルをクローン化し、ＭＢＰおよびＧＳＴタグのいずれかを有するＦｌｕ−Ｂ  ＮＡ１タンパク質の両方に対して再スクリーニングを行った。ｍＡｂは汎反応性または亜型反応性に分類した。
【００４４】
４．反応性と、ラテラルフロー細片上での抗Ｆｌｕ−Ｂ  ＮＳ１  ｍＡｂの使用への適合性を確認するために、ラテラルフロー細片上の異なった位置で、両方のＦｌｕ−Ｂ  ＮＳ１タンパク質（＃５２２および＃５２３）でコーティングされたラテラルフロー細片を用いて、さらにスクリーニングを行った。これらのアッセイで、金標識された抗マウスＩｇ２次ｍＡｂを介した検出を行った。
【００４５】
５．両方のＦｌｕ−Ｂ  ＮＳ１タンパク質（ＡＶＣ＃５２２および＃５２３）で反応性を示した抗Ｆｌｕ−Ｂ  ｍＡｂを捕獲能力および検出能力、ならびに相互との適合性に関してラテラルフローサンドイッチ型アッセイで試験した。両方の型のＦｌｕ−Ｂ  ＮＳ１タンパク質の候補捕獲／選択対を選択して、組換え体Ｆｌｕ−Ｂ  ＮＳ１を検出する感受性のレベルに関して、同じ型のラテラルフローサンドイッチアッセイを用いて試験した。
【００４６】
６．最後に、その抗体が臨床検体中のＮＳ１を検出する能力に関して調べる。
【００４７】
このワークフローによって、ヒト臨床検体を認識する抗体が得られる。
【００４８】
（実施例２）
ラテラルフロー
上述の方法に従って産生された抗Ｂ型インフルエンザＮＳ１モノクローナル抗体を用いて、Ｂ型インフルエンザのＮＳ１を検出するラテラルフロー試験を開発した。ストライパー（ｓｔｒｉｐｅｒ）を用いて、抗Ｂ型インフルエンザＮＳ１モノクローナル抗体を約０．７ｍｇ／ｍｌの濃度でＨＦ０７５  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ膜に沈着させた。捕獲剤として沈着させた抗体の一部の例には、以下のもの、すなわちＦ８９  １Ｆ４、Ｆ９４  ３Ａ１およびＦ８９  ４Ｄ５が含まれる。１ｍｇ／ｍｌのヤギ抗マウス抗体（ＧＡＭ）で構成される対照バンドも沈着させた。容積１００μｌのＡＶＣ  ＦｌｕＢ緩衝液中で、ＦｌｕＢ  ＮＳ１タンパク質を、Ｆ９４  ３Ａ１（Ｆ９４  ３Ａ１が捕獲剤として使用されない場合）などの金結合体化抗ＮＳ１モノクローナル抗体と合わせた。使用されたＦｌｕＢ  ＮＳ１タンパク質は、組換え体であるＡＶＣ  ＩＤ５２２（Ｂ／ＢＡ／７８  ＮＳ１）およびＡＶＣ  ＩＤ５２３（Ｂ／ＹＭ／２２２／２００２）、またはＢ型インフルエンザに感染していることが分かっている患者からの臨床試料であった。
【００４９】
抗ＦｌｕＢ  ＮＳ１抗体のストライプを入れた（ｓｔｒｉｐｅｄ）膜を、ＦｌｕＢ  ＮＳ１／抗ＮＳ１タンパク質溶液中に挿入し、毛細管現象およびウィッキングパッド（ｗｉｃｋｉｎｇ  ｐａｄ）によって流動を開始させた。
【００５０】
抗ＦｌｕＢ  ＮＳ１捕獲剤および検出剤のいくつかの組合せをいくつかの実験で用いた。以下は、一例のプロトコールである。細片試験は、ヤギ抗マウス／Ｆ８９  １Ｆ４抗ＦｌｕＢ  ＮＳ１モノクローナル抗体で事前にストライプを入れた細片；９０％Ｍ４ウイルス輸送培地、１０％の１０×ＡＶＣ  ＦｌｕＢ緩衝液；ＮＳ１タンパク質であるＭＢＰ−ＦｌｕＢ  ＮＳ１（ＡＶＣ５２２およびＡＶＣ５２３）の保存液；金結合体化Ｆ９４  ３Ａ１抗体；およびＭａｘｉＳｏｒｐ  ＥＬＩＳＡプレートを用いて行った。この手順は以下の通りに行った。
【００５１】
１）ＮＳ１タンパク質の保存液を９０％Ｍ４ウイルス輸送培地、１０％の１０×ＡＶＣ  ＦｌｕＢ緩衝液で希釈した。
【００５２】
２）ＮＳ１の保存液は、９０％Ｍ４／１０％の１０×ＡＶＣ  ＦｌｕＢ緩衝液で希釈することによって、０．５ｎｇ／μＬまで希釈した。
【００５３】
３）４μＬの金結合体化抗体を、緩衝液１００μＬ毎に添加した。
【００５４】
４）９８μＬの抗体／緩衝液混合物を、ＥＬＩＳＡプレート内の別々のウェルに添加した。
【００５５】
５）望ましい最終タンパク質濃度（例、１ｎｇ  ＦｌｕＢ  ＮＳ１）を得るように、ＮＳ１希釈液２μＬを、緩衝液を含有しているウェルに添加した（１ウェルあたり１種のＮＳ１）。
【００５６】
６）１ウェルは、「ＮＳ１を含まない」陰性対照として働くように、抗体および緩衝液のみのままとした。
【００５７】
７）ウェルの内容物を混和させるため、ＥＬＩＳＡプレートを何度か軽く叩いた。
【００５８】
８）事前にストライプを入れた細片をウェル内に添加し、発色する間観察する。
【００５９】
約１５分後（すべての液体が吸収されたが、細片がまだ乾いていないとき）に、細片をウェルから取り出して、スキャンしてコンピューター内に取り込む。
【００６０】
図３は、様々な対のモノクローナル抗体を、２株のＢ型インフルエンザ、すなわちＢ／ＢＡ７８（株５２２としても知られている）およびＢ／Ｙａｇａｍａｔａ／２２２／２００２（株５２３としても知られている）での捕獲試薬および検出試薬として試験した結果を示す。４つの異なったパネルが、抗体の４つの組合せを示す。各パネルで、トラック３および６が陰性対照である。トラック１および２は、株５２２からの組換え体ＮＳ１であり、トラック４および５は、株５２３からの組換え体ＮＳ１である。第１のパネルのトラック１および２にはなく、トラック４および５にある追加のバンドの存在は、Ｆ８９−Ｆ４捕獲抗体Ｆ８９−４Ｇ１２検出抗体の組合せが、株５２３は検出するが、株５２２は検出しないことを示している。他のパネルも同様に分析することができる。この実験および他の同様な実験からの結果を図４にまとめる。図４は、どの抗体が捕獲抗体として役立ち、どれが検出抗体として役立つことができるか、そして、それらの抗体が両方の株のＢ型インフルエンザ（５２２および５２３）に汎特異性であるか、または５２２もしくは５２３に単一特異性であるかを示す。例えば、Ｆ８９−１Ｆ４抗体は、捕獲抗体としても、検出抗体としても役立つことができ、汎特異性である。Ｆ９４−４Ｃ１０は、検出抗体としては働くが、捕獲抗体としては働かず、Ｂ型インフルエンザ５２３に特異的である。Ｆ８９−１Ｆ４およびＦ９４−３Ａ１は、ラテラルフローフォーマットでの使用に好ましい抗体である。
【００６１】
患者試料中のＢ型インフルエンザを同定するのに、膜上に沈着した汎特異性抗体を有するように産生されたラテラルフローアッセイを用いた。患者試料を、すべてのＢ型インフルエンザのＮＳ１を認識する金標識抗体の混合物と混合した。試料をラテラルフロー検査細片に添加した。Ｂ型インフルエンザの存在は、細片上に形成される線によって示される。図５は、陽性対照および陰性対照と比較した、患者試料の様々な希釈物から得られた結果を示す。図の上部は、Ｂ型インフルエンザの存在を示す線の実際の外見を示す。図の下部は、バンドの相対強度を示す。Ｂ型インフルエンザは、少なくとも４００倍までの希釈で容易に検出可能であった。
【図１】
2010507780.tif 000003
【図２Ａ】
2010507780.tif 000004
【図２Ｂ】
2010507780.tif 000005
【図３】
2010507780.tif 000006
【図４】
2010507780.tif 000007
【図５】
2010507780.tif 000008
【配列表】
2010507780000001.app
【国際調査報告】
2010507780.tif 000009