(57)【要約】【解決手段】本発明は、効果的で安全な包括的組合せ治療法であって、患者の腫瘍組織中の腫瘍細胞のサイズを安全且つ効果的に縮小する。方法は、患者の腫瘍組織から単球細胞を採取し、単球細胞から未成熟樹状細胞を形成するために１又は複数の因子を用いて単球細胞を培養し、患者の腫瘍組織に未成熟樹状細胞とアジュバントを導入し、患者の腫瘍組織内に活性化したＴ細胞を導入することによって、患者の腫瘍組織において腫瘍細胞のサイズを縮小することを含んでいる。方法には、患者の体内に未成熟樹状細胞、アジュバント及び活性化されたＴ細胞を導入する前に、患者に局部的化学療法、全身化学療法、腫瘍放射線治療、又は、局部的腫瘍放射線治療を組み合わせた全身化学療法を用いて前処置することをさらに含む。また、患者の腫瘍のサイズを縮小するための癌ワクチンを提供するものであって、癌ワクチンには、患者から採取された単球細胞に由来する未成熟樹状細胞、アジュバント、患者の体内の腫瘍からの抗原及び活性化したＴ細胞が含まれる。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の腫瘍組織中の腫瘍細胞のサイズを縮小する方法であって、
患者から単球細胞を採取するステップ、
単球細胞から未成熟樹状細胞を形成するために、１又は複数の因子を用いて単球細胞を培養するステップ、
患者の腫瘍組織に未成熟樹状細胞とアジュバントを導入するステップ、及び、
活性化したＴ細胞を患者の腫瘍組織に導入するステップと、
を含んでいる患者の腫瘍組織中の腫瘍細胞のサイズを縮小する方法。
【請求項２】
未成熟樹状細胞、アジュバント及び活性化したＴ細胞の導入は、腫瘍内注射によりもたらされる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
活性化したＴ細胞は、患者の体内に未成熟樹状細胞及びアジュバントを導入し
た後に導入され、抗原特性Ｔ細胞が生成される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
単球細胞は、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を用いて培養される請求項１に記載の方法。
【請求項５】
アジュバントは、活性化したリンパ球溶液、スーパーリンパ系組織抽出物、ベータ・グルカン及びキーホールリンペットヘモシニアンからなる群より選択される請求項１に記載の方法。
【請求項６】
活性化したリンパ球溶液は、ＣＤ３−ＣＤ２８ビーズを用いて作成される請求項５に記載の方法。
【請求項７】
活性化したＴ細胞の活性化は、Ｔ細胞を、抗ＣＤ３抗体とイオノフォアに曝すことによりもたらされる請求項１に記載の方法。
【請求項８】
イオノフォアは、イオノマイシンである請求項７に記載の方法。
【請求項９】
アジュバント及び活性化したＴ細胞を患者の腫瘍組織内に導入するステップの前に、患者に局部的化学療法を用いて前処置するステップをさらに含んでいる請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
未成熟樹状細胞、アジュバント及び活性化したＴ細胞を患者の腫瘍組織内に導入するステップの前に、患者に全身化学療法を用いて前処置するステップをさらに含んでいる請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
未成熟樹状細胞、アジュバント及び活性化したＴ細胞を患者の腫瘍組織内に導入するステップの前に、患者に全身化学療法と局部的腫瘍放射線治療を用いて前処置するステップをさらに含んでいる請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
患者は、ヒトである請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
腫瘍組織中に導入されると、抗原と結合して、患者の腫瘍のサイズを縮小する癌ワクチンであって、
患者から採取された単球細胞に由来する未成熟樹状細胞、アジュバント、患者の体内の腫瘍からの抗原及び活性化したＴ細胞を含んでいる癌ワクチン。
【請求項１４】
腫瘍内注射によって患者の腫瘍組織中に導入される請求項１３に記載の癌ワクチン。
【請求項１５】
単球細胞は、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を用いて培養される請求項１３に記載の癌ワクチン。
【請求項１６】
アジュバントは、活性化したリンパ球溶液、スーパーリンパ系組織抽出物、ベータ・グルカン及びキーホールリンペットヘモシニアンからなる群より選択される請求項１３に記載の癌ワクチン。
【請求項１７】
活性化したリンパ球溶液は、ＣＤ３−ＣＤ２８ビーズを用いて作成される請求項１６に記載の癌ワクチン。
【請求項１８】
活性化したＴ細胞の活性化は、Ｔ細胞を、抗ＣＤ３抗体とイオノフォアに曝すことによりもたらされる請求項１３に記載の癌ワクチン。
【請求項１９】
イオノフォアは、イオノマイシンである請求項１８に記載の癌ワクチン。
【請求項２０】
患者は、ヒトである請求項１３に記載の癌ワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜関連出願の相互参照＞
この出願は、２００６年１０月３１日に出願された米国特許出願第60/855,905号の優先権を主張し、引用を以て本願への記載加入とする。
【０００２】
本発明は、癌患者のための治療法に関し、より詳細には、従来の癌治療を癌免疫療法と共に用いる組み合わせ治療法に関する。
【背景技術】
【０００３】
＜従来技術の説明＞
樹状細胞(ＤＣｓ)は、免疫システムのセンチネル抗原提示細胞である(Banchereau, J. et al, Ann NY Acad Sci, 987:180-7, 2003)。これら細胞は、それらの環境から抗原物質を得て、その後活発な免疫反応を開始する能力を持つ。この可能性が認識され、ＤＣｓは癌免疫療法用の候補ワクチンを送達するプラットホームとして用いられている(den Brok, M.B. et al., Expert Rev Vaccines, 4:699-710, 2005)。これらの研究の大部分において、未成熟ＤＣｓは、生体外にて、単球細胞又は幹細胞前駆体から発現し、腫瘍細胞溶解物、タンパク質又はＨＬＡクラスＩ対立遺伝子特性ペプチドの形態の候補ワクチンを携える。ＤＣｓは、選択されたサイトカインとともに成熟し、静脈ルート又は非経口のルートにより投与される。
【０００４】
他のアプローチとして、アジュバントと共に未成熟ＤＣｓを患者の腫瘍組織に直接注射することで、理論上、多岐に亘る抗原決定基への免疫反応の生成を高めることのできる注射部位にて、これらの細胞が多様な腫瘍細胞生成物を得ることができる(Chi, K.H. et al., J Immunother, 28:129-35, 2005)。
【０００５】
未成熟ＤＣｓの腫瘍内注射と、放射線治療や化学療法のような通常治療の組み合わせることが、免疫反応を増加させ、臨床結果を改善するものとして提案されている(Hoffmann T.K. et al., Cancer Res, 60:3542-9, 2000)。そのような治療はアポトーシスを誘発し、腫瘍抗原を利用するＤＣｓの能力を高める環境を作り出し、Ｔ細胞への腫瘍抗原を効果的に示すリンパ節を成熟させ、移動させることができる(Pierre, P. et al., Nature, 388:787-92, 1997)。免疫抑制制御性Ｔ細胞を制御するための化学療法を実施したり、活性化したＴ(ＡＴ)細胞のような他の細胞生成物と共に注射することも、免疫応答性を高める助けとなると示唆されている(Berd, D. et al., Cancer Res, 44:5439-43, 1984)。シクロホスファミドは、例えば、免疫活性効果を発揮するだけでなく、多くの制御性Ｔ細胞を減少させ、アポトーシスを増加させることが認められている(Berd, D. et al., Cancer Res, 44:5439-43, 1984)。ＣＤ４ＯＬを発現し、ＤＣ成熟に影響を及ぼす誘導因子である自己ＡＴ細胞の注入、は臨床で血行状態を安定させる状況を示している。注入された細胞は、生体内にて著しく拡張し、広Ｔ細胞スペクトル(broad T cell spectrum)を維持することができる(Berger C. et al., Blood, 101 : 476-84, 2003)。それゆえ、大量のＡＴ細胞を投与することで、癌に対して反応する能力のあるＴ細胞プールを増加させる可能性がある。Ｔ細胞によるＩＦＮγのようなサイトカインの放出により、さらに制癌効果を高めることができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、癌患者のためのより効果的な治療プロトコルを提供する要求がある。
【０００７】
＜発明の概要＞
本発明は、この要求を満足させるために、患者の腫瘍組織中の腫瘍細胞のサイズを縮小させる包括的な組み合わせ治療法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一態様として、患者の腫瘍組織において腫瘍細胞のサイズを縮小する方法を提供するものであり、該方法は、患者の腫瘍組織から単球細胞を採取し、単球細胞から未成熟樹状細胞を形成するために１又は複数の因子を用いて単球細胞を培養し、患者の腫瘍組織に未成熟樹状細胞とアジュバントを導入し、そして、患者の腫瘍組織内に活性化したＴ細胞を導入することを含んでいる。患者の体内に未成熟樹状細胞及びアジュバントを導入した数日後に、活性化したＴ細胞が導入され、抗原特異的Ｔ細胞が生成される。
【０００９】
未成熟樹状細胞、アジュバント及び活性化したＴ細胞の導入は、腫瘍内注射によりもたらすことができる。
【００１０】
患者の単球細胞、すなわち、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣｓ)は、例えば、ＧＭ−ＣＳＦやＩＬ−４のような因子を用いて培養することができる。
【００１１】
Ｔ細胞の活性化は、Ｔ細胞を、抗ＣＤ３抗体や、例えばイオノマイシンのようなイオノフォアに曝すことによりもたらすことができる。
【００１２】
活性化したリンパ球溶液は、ＣＤ３−ＣＤ２８ビーズを用いて準備することができる。
【００１３】
本発明の方法において用いられるアジュバントは、活性化したリンパ球溶液(ＡＬＭ)、スーパーリンパ系組織抽出物、ベータ・グルカン又はキーホールリンペットヘモシニアンを含むが、これらに限定されるものではない。
【００１４】
本発明の他の態様として、患者の腫瘍組織内の腫瘍細胞のサイズを縮小させるための方法であって、未成熟樹状細胞、アジュバント及び活性化したＴ細胞を患者の腫瘍組織内に導入する前に、患者に局部的化学療法を用いて前処置することをさらに含む。
【００１５】
本発明の他の態様として、患者の腫瘍組織内の腫瘍細胞のサイズを縮小させるための方法であって、未成熟樹状細胞、アジュバント及び活性化したＴ細胞を患者の腫瘍組織内に導入する前に、患者に全身化学療法を用いて前処置することをさらに含む。
【００１６】
本発明の他の態様として、患者の腫瘍組織内の腫瘍細胞のサイズを縮小させるための方法であって、未成熟樹状細胞、アジュバント及び活性化したＴ細胞を患者の腫瘍組織内に導入する前に、患者に全身化学療法と局部的腫瘍放射線治療を用いて前処置することをさらに含む。
【００１７】
本発明の他の態様として、腫瘍組織に導入すると、抗原と結合して、患者の体内の腫瘍のサイズを縮小させる癌ワクチンプレカーサーを提供するものであり、癌ワクチンには、患者から採取された単球細胞に由来する未成熟樹状細胞、アジュバント、患者の体内の腫瘍からの抗原及び活性化したＴ細胞が含まれる。
【００１８】
本発明の目的は、癌患者のためのより安全で効果的な組み合わせ治療プロトコルを提供することである。
【００１９】
さらに本発明の目的は、従来の治療法に加え、未成熟樹状細胞、アジュバント及び活性化したＴ細胞の腫瘍内注射を用いて、患者の体内の腫瘍細胞のサイズを縮小するための効果的で安全な方法を提供することである。
【００２０】
さらに本発明の目的は、患者の腫瘍細胞のサイズを縮小するための効果的で安全な癌ワクチンを提供するものであり、癌ワクチンは、未成熟樹状細胞、アジュバント及び活性化したＴ細胞を含んでいる。
【００２１】
本発明は、以下の望ましい実施例の説明と共に、添付の図面を参照することで、十分理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、本発明の実施例に関する４つの治療プロトコルを示している。
【００２３】
【図２】図２は、４５歳女性における再発上部喉頭癌再発のＰＥＴ ＣＴイメージであり、ＡＴ細胞治療の前(Ａ)、３週間後(Ｂ)、３.５カ月後(Ｃ)及び９ヵ月後(Ｄ)を示している。
【００２４】
【図３】図３は、ＣＥＡ血中濃度が、樹状細胞とＡＴ細胞(プロトコルIV)を用いた治療法によって低下していることを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
＜望ましい実施例の説明＞
本発明は、患者の腫瘍組織中の腫瘍細胞のサイズを縮小するための安全で効果的な包括的組み合わせ治療法を提供するものである。
【００２６】
本発明の一つの実施例として患者の腫瘍組織において腫瘍細胞のサイズを縮小する方法を提供するものであり、該方法は、患者の腫瘍組織から単球細胞を採取し、単球細胞から未成熟樹状細胞を形成するために１又は複数の因子を用いて単球細胞を培養し、患者の腫瘍組織に未成熟樹状細胞とアジュバントを導入し、そして、患者の腫瘍組織内に活性化したＴ細胞を導入することを含んでいる。患者の体内に未成熟樹状細胞及びアジュバントを導入した数日後に、活性化したＴ細胞を導入し、抗原特異的Ｔ細胞が生成される。
【００２７】
未成熟樹状細胞、アジュバント及び活性化したＴ細胞の導入は、腫瘍内注射によりもたらすことができる。
【００２８】
患者の単球細胞、すなわち、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣｓ)は、例えば、ＧＭ−ＣＳＦやＩＬ−４のような因子を用いて培養することができる。
【００２９】
Ｔ細胞の活性化は、Ｔ細胞を、抗ＣＤ３抗体や、例えばイオノマイシンのようなイオノフォアに曝すことによりもたらすことができる。
【００３０】
活性化したリンパ球溶液は、ＣＤ３−ＣＤ２８ビーズを用いて準備することができる。
【００３１】
本発明の方法において用いられるアジュバントは、活性化したリンパ球溶液(ＡＬＭ)、スーパーリンパ系組織抽出物、ベータ・グルカン又はキーホールリンペットヘモシニアンを含むが、これらに限定されるものではない。
【００３２】
本発明の他の実施例として、患者の腫瘍組織内の腫瘍細胞のサイズを縮小させるための方法であって、未成熟樹状細胞、アジュバント及び活性化したＴ細胞を患者の腫瘍組織内に導入する前に、患者に局部的化学療法を用いて前処置することをさらに含む。
【００３３】
本発明の他の実施例として、患者の腫瘍組織内の腫瘍細胞のサイズを縮小させるための方法であって、未成熟樹状細胞、アジュバント及び活性化したＴ細胞を患者の腫瘍組織内に導入する前に、患者に全身化学療法を用いて前処置することをさらに含む。
【００３４】
本発明の他の実施例として、患者の腫瘍組織内の腫瘍細胞のサイズを縮小させるための方法であって、未成熟樹状細胞、アジュバント及び活性化したＴ細胞を患者の腫瘍組織内に導入する前に、患者に全身化学療法と局部的腫瘍放射線治療を用いて前処置することをさらに含む。
【００３５】
本発明の他の実施例として、腫瘍組織に導入されると、抗原と結合して、患者の体内の腫瘍のサイズを縮小させる癌ワクチンプレカーサーを提供するものであり、癌ワクチンには、患者から採取された単球細胞に由来する未成熟樹状細胞、アジュバント、患者の体内の腫瘍からの抗原及び活性化したＴ細胞が含まれる。
【００３６】
ここでは、「患者」はヒトを含む哺乳類を意味する。
【００３７】
本発明は、以下の非制限的な実施例にてより具体的に説明するが、これらは説明のみを目的としたものであり、当業者であれば多くの改変や変更を行なうことができることは明らかであろう。
【実施例】
【００３８】
１．イントロダクション
通常の治療に、ＤＣ細胞とＡＴ細胞治療を組み合わせることで、血行状態が安定するかどうか調査するために、安全なパイロットテストを行なった。いくつかのプロトコルを開発し、その中で未成熟ＤＣｓとＡＴ細胞は、末梢血から作成し、悪性腫瘍の進行段階にある患者の転移病巣に注射した。０日目、患者には、最初に、自己の未成熟ＤＣｓとアジュバントを注射した。すぐに、未成熟ＤＣ注射が、拒絶反応を引き起こさないことが確認され、実質的に毒性のない免疫反応を高めるとして知られている追加の治療法(treatment modalities)を治療群に組み込んだ。放射線治療又は化学療法は、未成熟ＤＣ投与の前に行なった。特定の腫瘍部位は、放射線治療(20-50Gy)の影響を受けて、腫瘍ＤＮＡの分解に由来する抗原性を誘発した。いくつかのケースでは、特定悪性腫瘍に対する従来の治療に用いられているシスプラチン(CDDP)、シクロホスファミド(Cytoxan)、フルオロウラシル(5-FU)、ドセタキセル(DTX)或いはアドリアマイシン(ADM)を含む化学療法薬を、アポトーシスを誘発し、又は、免疫反応を抑制することができる細胞の存在を減少させるため投与した。ＡＴ細胞治療は、未成熟ＤＣ及びアジュバント治療に引き続いて３日間行なった。
【００３９】
II．患者及び方法
１．患者治療
４１〜８３歳の３７人の患者を、ＤＣ及びＡＴ細胞治療の研究プロトコルに登録した。すべての患者は、癌の標準的化学療法及び／又は放射線治療を受診し、失敗した後に、再発していた。研究に含まれる癌のタイプとケース数を表１の中に示している。患者を研究プロトコルに組み入れ、表２のようにまとめた。
【表１】
2010508364.tif 000002
【表２】
2010508364.tif 000003
【００４０】
全ての患者には、未成熟ＤＣｓ(１注射毎に４.９×１０6〜５.９×１０9の範囲)とアジュバントを、単独で、又は、従来の化学療法、放射線治療及び／又はＡＴ細胞(４.１×１０1〜７.５×１０8)と組み合わせて投与した。治療前に、腫瘍を生検し、血液検査を行なった。図１は、引き続き行なわれた５つのプルトコルの各治療コースを示している。全ての患者には、０日目に未成熟ＤＣｓとアジュバントを投与した。プルトコルＩに登録された患者には、未成熟ＤＣｓとアジュバントを投与した。プロトコルIIの患者には、未成熟ＤＣｓとアジュバントを投与する前に、局部的な化学療法を用いて前処置を施した。他のグループの患者には、化学療法及び放射線療法による前処置の有無に関わらず、未成熟ＤＣとアジュバントを注射して３日後に、ＡＴ細胞を投与した。化学療法は、腫瘍内に(プルトコルIII)、又は、全身に(プロトコルIV)、又は、放射線治療と組み合わせて(プルトコルＶ)、実施した。患者には、局部的に及び／又は全身に拒絶反応の徴候が生じた。細胞生検と血液検査は、治療の後３〜４週間に行なった。局部的又は転移性の腫瘍の退縮は、ＰＥＴ−ＣＴイメージングによって評価した。腫瘍の退縮が観察されると、治療を繰り返した。
【００４１】
２．末梢血単核細胞(ＰＢＭＣｓ)の採取と単離
白血球フェレーシスは、単球核(ＭＮＣｓ)の採取プログラム(version 7.1)を使用したＣＯＢＥスペクトラ血液分離器(Gambro KK, Tokyo, Japan)を、手動調整のプラズマポンプと共に用いることで実施した。抗凝固は、ＡＣＤ−Ａ(比１２：１, Baxter, Deerfield, IL)を用いて行なった。注入速度は、４０〜６０ｍｌ／分、採取速度は１ｍｌ／分、分離係数は７００であった。ＭＮＣｓは、細胞分離を行ない、ＡＩＭ−Ｖ溶液(Gibco, Invitrogen, Tokyo)の１０％ＤＭＳＯ中、１.５×１０8cells/ml/vialで低温保存し、１〜３ヶ月間、−８０℃で保存した。ＤＣ及びＡＴ細胞培養に使用する前に、ＭＮＣｓは、３Ｖのウォーターバスで解凍し、ＡＩＭ−Ｖ溶液中で２度洗浄して、カウントした。
【００４２】
３．未成熟ＤＣｓ(ｉＤＣｓ)の生成
解凍したＭＮＣｓ(およそ６×１０8)を、２０ｍｌのＡＩＭ-Ｖ溶液で再懸濁させて、それぞれ１OralのＡＩＭ−Ｖ溶液を入れた4４−Ｔ−７５ｃｍ2のポリスチレンフラスコ中へ、５ｍｌアリコートずつ分配した。３７℃にて２時間培養した後、非接着性細胞をピペットにより除去し、コニカルチューブへ移し、ＡＴ細胞作成(下記参照)のために保管した。１５ｍｌのＤＣ成長溶液(８００ＩＵ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦを追加したＡＩＭ−Ｖ溶液(CellGenix, Germany)＋５００ＵｍｌのＩＬ４(BD Pharmingen))を、接着性細胞の入ったフラスコに夫々添加した。フラスコを３７℃、５％の二酸化炭素で培養した。成長溶液は３日目に新しくし、ＤＣｓはピペッティングにより７日目に採取した。採取した細胞をカウントし、２０％の自己血清＋１０％のＤＭＳＯを含むＡＩＭ-Ｖ冷凍溶液で再懸濁させて、ＢＩＣＥＬＬコンテナ(Nihon Freezer Co., Tokyo, Japan)で冷凍保存した。ＢＩＣＥＬＬコンテナは、プログラムされた冷凍処理(１℃／分の冷凍速度)にて段階的な細胞の冷凍が可能である。細胞は、患者に注射するまで(０.５〜３ヶ月)、−８０℃にて保存した。
【００４３】
４．ＡＴ細胞の作成
ＤＣ生成のために、単球接着(monocyte adherence)の後に採取された非付着性Ｔ細胞(およそ６〜９×１０8細胞)を洗浄し、２０ｍｌのＡＩＭ−Ｖ溶液で再懸濁した。この細胞懸濁液５ｍｌとＡＴ細胞溶液３５ｍｌを夫々抗ＣＤ３抗体でコーティングされた４つのＴ−２２５ｃｍ2フラスコに添加した(Yamazaki, T. et al, Neurol Med Chir, Tokyo, 32:255-61, 1992)。次に、フラスコを３７℃、５％の二酸化炭素で培養した。採取３時間前に、Ｔ細胞を刺激するためにイオノマイシン１ｕｇ／ｍｌ(Sigma, USA)を溶液に添加した(Sato, T. et al., Cancer Immunol Immunother, 53:53-61, 2004)。ＡＴ細胞溶液は、ＩＬ２と自己血清を加えたＡＩＭ−Ｖ溶液から構成されるため、各フラスコは、最終レベル１０００ＩＵ／ｍｌ、１０％自己血清を含むこととなる。抗ＣＤ抗体コーティングは、ＤＰＢＳ中５ｕｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体(Orthoclone, OKT3 injection. Janssen Pharmaceutical, KK)１０ｍｌをフラスコに添加して、室温で２時間放置して行ない、その後、細胞を添加する前に、１５ｍｌのＤＰＢＳを用いてフラスコを３回洗浄した。採取した細胞は、低温保存し、患者へ注射する前に−８０℃にて貯蔵した(０.５〜３ヶ月)。
【００４４】
５．細胞培養の無菌及び純度試験
細胞を採取する７日前に、３７℃の寒天上で培養細胞を培養することで微生物試験を行なった。結果が陰性の細胞のみを臨床的に使用した。細胞の純度は、商業的に利用可能な発色エンドトクシン試験キット(Toxicolor system LS-50M, Seikagaku Corp., Tokyo, Japan)を用い、製造者の指示に従って、エンドトキシンレベル(＜０.５ＥＵ／ｍｌ)を測定することで評価した。各サンプルのエンドトクシンの濃度は、リムラスアメーバ溶解物試験(ＬＡＬ)で測定した。簡単に説明すると、各サンプル５０ｕｌを、エンドトクシンフリーの９６ウェルプレート(Toxipet LP; Seikagaku)へ移し、ＬＡＬ試薬５０ｕｌを各ウェルに添加して混合し、３７℃にて３０分間培養した。反応を止めるために、各ウェルに０.８Ｍ酢酸を添加、混合して、４０５ｎｍで測定した。エンドトクシンレベルは、参照エンドトクシンE. coli 011 1:B4 LPS(Toxicolor system CSE; Seikagaku)と対照して計測した。
【００４５】
６．細胞培養の特性
標準的なフローサイトメトリーラベリングプロトコルを、細胞の表面マーカーの発現を判断するために用いた(Parks, D. et al., Flow Cytometry and Fluorescence- Activated Cell Sorting; Raven Press Ltd, New York, 1989)。ＤＣｓは、７日間培養した後、表面マーカーの発現について特徴付けし、解凍した後、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６及びＨＬＡ−ＤＲ(BD Pharmingen)に対する蛍光色素標識モノクローナル抗体を用いてＤＣ注射を行なった。ＡＴ細胞は、培養後、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ１５４(ＣＤ４０Ｌ)及びＨＬＡ−ＤＲについて評価した。最小、１０,０００事象について、ＢＤ ＦＡＣスキャン(BD Biosciences)で入手し、データをセルクエスト分析ソフトウェア(Cell Quest analysis software)を用いて分析した。マーカー発現は、患者の細胞培養の標準偏差において蛍光の平均レベルとして表わしている。
【００４６】
７．注射用の細胞作成
ＤＣｓ及びＡＴ細胞のバイアルを、計画された注射前の１時間、３７℃のウォーターバスで解凍した。ＡＩＭ−Ｖ溶液１ｍｌを解凍した各バイアルに添加し、バイアルを２分間放置して、５０ｍｌの溶液に移し、ＤＭＳＯを除去するために遠心分離(３００×ｇ、７分)した。細胞を新しい溶液中で再懸濁、カウントし、サンプルを寒天培地による無菌性試験を行なうために取り出した。残った細胞を、２つのラベル付けしたマイクロチューブ(各５００ｕｌ)へ分配し、患者の転移病巣への注射用に病院へ輸送するため、氷の上に載置した。細胞は、ＣＴスキャンの情報に基づいて注射した。
【００４７】
８．アジュバントの作成
プロトコルには、以下のように、異なるアジュバントを含めた。商業的に入手可能な(１)スーパーリンパ系組織抽出物(S-LTE, 0.5ml, Shukokai, Inc., Japan, プロトコルＩとプロトコルII)、(２)β‐グルカン(0.5ml-1.0 ml at 50 ug/ml in saline, Wako, Japan, プロトコルII及びプロトコルIII)、(３)キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)１ｍｇ(Immucothel、プロトコルIV)。これらは、製造業者の推奨通り準備した。また、(４)活性化されたリンパ球溶液(ALM)(プロトコルIII、IV及びＶ、エルトリエートしたリンパ球(Gambro BCT, Colorado, USA)から、我々の臨床検査室で作成)。ＡＬＭを作成するために、リンパ球をＴ−７５ｃｍ2フラスコ当たりＸＶＩＶＯ溶液５０ｍｌ(Cambrex, Walkersville, MD)中１×１０6cells/mlで懸濁し、ＣＤ３−ＣＤ２８ Ｔ細胞エキスパンダービーズ(Dynal. Norway)(Levine, B.L. et al., J Immunol, 159:5921-30, 1997)を１細胞に対して１ビーズとの比となるように添加し、３７℃、５％二酸化炭素濃度にて２日間培養した。上清(supematants)を遠心分離(３００×Ｇ、７分)により採取し、後で使用するために４℃で保管した。すべてのアジュバントは、ＤＣｓの送達と同時に、腫瘍内に送達した。
【００４８】
９．化学療法
化学療法のタイプを、特定の癌に対する標準的な治療を基に選択した。化学療法は、プロトコルに従って、腫瘍内又は全身に施した。２１人の患者には、シクロホスファミド(CPM, 5-800 mg, Shinogi)を施し、５人の患者には、シスプラチン(CDDP, 2.5-5.0 mg, Nihon Kayaku)を施し、１人の患者には、ドセタキセル(DTX, 55mg, Aventis)を施し、１人の患者には、ドキソルビシン(ADM, 20mg, Kyowa Hakko)を施した。ＣＤＤＰは、上部咽頭癌の一人の患者に、フルオロウラシル(5-FU, 900 mg/day, Kyowa Hakko)と組み合わせて全身に施した。
【００４９】
１０．放射線治療
放射線治療(２０〜５０Ｇｙ)は、プロトコルＶで２人の患者に施した。１人の転移性上部咽頭癌患者に５０Ｇｙを行ない、他の再発性転移食道癌患者には、２０Ｇｙを行なった。放射線治療は所定のプロトコル(Shimamura, H. et al., Eur Surg Res, 37:228-34, 2005)に従って患者へ施した。腫瘍部位の放射線範囲を予め指定し、放射線は、放射線は３〜４週間の間に１回当たり２〜２.５Ｇｙを施した。放射線治療は、化学療法と同じ期間に行なった。ＤＣｓは、放射線治療が完了した後７日目に腫瘍内に注射し、ＡＴ細胞は、放射線治療が完了した後１０日目に腫瘍内に注射、即ち、適用されたプロトコル中でＤＣ細胞を注射した後、３日目に注射した。
【００５０】
１１．反応の評価
癌(例えば大腸、直腸、胃、胸、肺や膵臓ガン)で上昇する癌胎児性抗原(ＣＥＡ)レベルを、治療と病気再発に対する患者の反応をモニターするために使用した。注射や照射が行なわれた部位も転移部についても、腫瘍のサイズは、ＰＥＴ−ＣＴイメージングと固形がん治療効果判定法(RECIST)を用いた処置の前とその３〜４週間後に評価した。ベースライン和は、測定可能な病巣中の最も大きい直径として評価した。処置の有効性は、完全な反応(ＣＲ、測定可能な病巣の完全に消滅し、４週を超える期間、新たな病巣が発現していないか維持されているものとして定義する)、部分的な反応(ＰＲ、注射された腫瘍のサイズが少なくとも３０％の縮小しているものとして定義する)、疾患安定(ＳＤ、サイズが３０％未満縮小又は２０％未満拡大で、新しい病巣の発現がないものとして定義する)、進行性疾患(ＰＤ、元の測定から２０％以上の増加として定義する)として評価した。副作用は、一般的なＷＨＯ毒性基準を用いて記録した。
【００５１】
１２．統計的測定
腫瘍サイズデータは、治療前後の変化を測定するために、スチューデントのｔ検定と対応のあるｔ検定を用いて比較した。統計学的有意性は、ｐ＜０.０５とした。
【００５２】
III.結果
１．ＤＣｓとＡＴ細胞の特性
接着性ＰＢＭＣｓは、ＤＣｓに対して識別することができる。７日間培養した種々の癌の患者からの接着性細胞は、共刺激マーカー(costimulatory markers)と低いＣＤ８３表面抗原を示し、未成熟ＤＣｓであることを示している(表３)。細胞生存能力は、７日の培養後、以下の低温保存後と同様に、８５〜９５％と高いままであった。抗ＣＤ３と共に処置したリンパ球と活性化したＴ細胞治療用のイオノマイシンは、ＣＤ２５及びＣＤ４ＯＬを示した(表３)。刺激された細胞の生存能力は、低温保存の前後で７５〜９０％の範囲であった。
【表３】
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【００５３】
２．毒性
治療の間及び後に行なった血液検査及び尿検査では、総タンパク質、グルタミン酸塩オキサロ酢酸トランスアミナーゼ(GOT)、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ(GPT)、乳酸脱水素酵素(LDH)、アルカリホスファターゼ、総ビリルビン、血中尿素窒素(BUN)、クレアチニン、全コレステロール、トリグリセリド、血糖、血尿症、また、蛋白尿には変化が見られなかった。
【００５４】
すべての治療は概ね耐容性が良好であり、ＡＴ細胞治療を受けたグループ中で２、３人だけが拒絶反応を伴った(表４)。プロトコルＩ及びIIでＤＣｓ＋アジュバントを受けた患者は、注射直後又は追跡期間中には、局部的又は全身的な拒絶反応は観察されなかった。ＡＴ細胞治療を受けた患者で、プロトコルIIIの４人の患者に注射直後に発熱(３８℃)が観察され、プロトコルＶの２人の患者は、注射部位の腫れ、リンパ節症及び痛みと、発熱を経験した。
【表４】
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【００５５】
３．患者の反応
臨床有効性を、治療前の腫瘍のサイズと、最初のＤＣ注射後３〜４周後の腫瘍のサイズを比較することによって観察した(表５)。
【表５】
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【００５６】
３７人の患者中７人(１９％)について、少なくとも３ヶ月間観察した腫瘍部位で、完治(プロトコルＶの患者１人)又は部分退縮(プロトコルＩとプロトコルIIの患者６人)の治療効果が見られた。完全な腫瘍退縮は、上部喉頭癌再発と診断され、治療部位と転移部位の両方で効果的にＤＣｓ、ＡＴ細胞、及び、化学療法と放射線治療(プロトコルＶ、図２)の両方を受けた患者に見られた。
【００５７】
すべてのプロトコルの３７人の患者中２５人(６７％)では、腫瘍のサイズは、少なくとも３ヵ月の間、同じあるいは変化なしのままであった。患者に続けて行なった血清腫瘍マーカーは、特定の腫瘍を示し、この期間に亘り安定していた。しかし、１人の転移性胃腺癌患者は、ＤＣｓとＡＴ細胞の注射後に、ＣＥＡレベルの劇的に低下を示した(図３)。患者は、我々のプロトコルに登録する前に、およそ３年診断を受けており、複数回の化学療法と胃切除術を経験していた。これらの標準的な治療アプローチにもかかわらず、ＣＥＡレベルは上がり続け、大動脈周囲リンパ節のサイズが増大していた。患者は、ＡＴ細胞に続けてＤＣｓを注射する前に、シクロホスファミド８００ｍｇを受けた。血清ＣＥＡレベルは、直近の試験で６.７のレベルに届く安定した低下を示した。
【００５８】
ＤＣｓのみ、または、化学療法と共にＤＣｓを受けた４人の患者(プロトコルＩ及びII)と、化学療法と放射線療法と共にＤＣｓとＡＴ細胞を受けた１人の患者(プロトコルＶ)に、進行性疾患が観察された。後者は、安定した症状が１ヶ月間観察され、未治療の腫瘍に３ヶ月で進行が観察された。
【００５９】
IV．考察
癌放射線治療、化学療法及び養子細胞療法を含む抗癌治療は、それ自体で有効性を示した。本研究の第一の目的は、種々の進行性癌患者に、自己の未成熟ＤＣｓを直接腫瘍へ施し、このアプローチを、活性化されたＴ細胞を転移病巣へ直接注射するような他の治療方法や、注射部位への局部的化学療法や放射線治療、全身化学療法のような前処置と組み合わせることの安全性と効果を判断することであった。本研究により、単一のプロトコル内で、独特の特性を有する異なる処置方法を組み合わせることで、抗癌反応を著しく増加することが示された。
【００６０】
ＤＣｓは、特異的Ｔ細胞免疫誘導(Banchereau, J. et al., Nature 392: 245- 52; 1998)用の重要な抗原提示細胞として役立つものであり、例えば、種々の癌の多くの診療試験の基礎を形成することは確立されている。幾つかの治験では、生体外で腫瘍特異的抗原を添加して生成されたＤＳｃを用いており、それらは、宿主に再び戻されたときに、抗腫瘍免疫の誘発をもたらす(Hsu, FJ. et al., Nat. Med., 2:52-58, 1996)。しかしながら、腫瘍に関連する抗原が十分明確でない癌では、この研究の場合のように、腫瘍全体が、アポトーシス細胞の形態で用いられている。アポトーシス細胞は、Ｔ細胞反応を効果的にクロスプライムし、強い免疫力を誘発する。
【００６１】
イオン化放射線療法や化学療法が、アポトーシスを誘発するために用いられる。腫瘍放射線治療は、一般的に、サイトカイン、プロスタグランジン及び熱ショックタンパク質(これらに限定されるものではない)の活性化に付随して生ずる周囲環境に、細胞内含有物を放出することによって、炎症を引き起こす。化学療法の局部送達は、腫瘍部位に類似した環境を作り出す。そのような方策は、抗原の獲得、処理、及び成熟を促進する環境を作るだけでなく、ＤＣｓの、広い範囲の潜在的なエフェクター細胞と相互作用する排出リンパ節への移動を刺激する。
【００６２】
原体放射線治療と化学療法を、ＤＣ腫瘍内注射と組み合わせることで、ヒトとネズミのモデルの両方に現れる免疫応答性が改善し、実践的な見地から、直接注射により、ＤＣｓ上に添加する抗原の量を十分確保することができる。
【００６３】
本研究の第一の目的は、未成熟ＤＣｓを基礎的な免疫として用いる異なる治療の安全性及び有効性を評価することであったので、患者のグループには、最初に未処置の腫瘍に直接ＤＣｓを注射した(プロトコルＩ)。この注射方法を用いて拒絶反応は観察されず、数名の患者は、実際に腫瘍部位に局部的反応を示し(２５％、２／８)、幾人かは、安定した症状(５０％、４／８)、一方、数名の患者(２５％、２／８)は疾患の進行を示した。次の患者のグループには、局部的癌化学療法をＤＣｓにより抗原取込みを高めるために追加したときに(プロトコルII)、拒絶反応は観察されなかった。実際に、局部的な治療を加えることは、局部的部分腫瘍反応を若干改善(４０％、４／１０)。患者はまた、安定(４０％、４／１０)と進行性疾患(２０％、２／１０)となった。
【００６４】
アポトーシスに耐性のある腫瘍細胞は、ＴＧＦＯやＩＬ１０のような免疫抑制因子の局部的分泌や、腫瘍周辺領域に到達する十分な体系機能的なＤＣｓが欠乏することで、免疫を誘発しないかもしれないと考えられている(Bodey, B. et al., Anti cancer Res., 20: 2665-76, 2000)。腫瘍環境は、耐性又は免疫を誘導することとなる成熟状態を決定する。それ故、注射部位でのＤＣ活性化を完全なものとするために、他の炎症誘発性サイトカインや免疫誘発性物質を未成熟ＤＳｃと組み合わせる必要があるかもしれない。
【００６５】
それ故、ＤＳｃを、ＡＴ細胞のような他の細胞タイプと組み合わせることは、有望な治療となる。ＤＳｃは、Ｔ細胞を活性化し、これらの相互作用は、効果的な免疫反応を確立するために重要である。活性化されたＴ細胞は、多くのメカニズムによって、ＤＣｓによる抗原提示に影響を与えることができる。ＡＴ細胞は、未成熟ＤＣｓと物理的に相互作用する表面分子を発現し、加えて、得られた抗原への適応力のある免疫反応が生じる部分的リンパ節へ、ＤＣｓの成熟及び移動に影響を与えるサイトカインとケモカインを生成する。結果として、腫瘍特異的免疫反応が生み出される可能性があり、長期記憶的に定着する。
【００６６】
適応可能な治療用のＴ細胞を生成する異なる方策があり、それらは、抗原特異性、腫瘍親和力や細胞表現型だけでなく、生体内における寿命、トラフィッキングや抗腫瘍効果のような性質にも影響を与える。Ｔ細胞は、種々の方法により増殖しており、その方法には、生体外で刺激を与えて、抗原提示用に設計された細胞(例えば、ペプチドをパルスしたＤＣｓ、トランスフェクトされたＲＮＡ)や、人工的抗原提示細胞を用いて、末梢血から抗原特異的Ｔ細胞を引き出すことが含まれる。腫瘍細胞から浸潤リンパ球を採取することで、腫瘍への腫瘍へ幅広い反応性を有する多クローン性Ｔ細胞群が生じる。生体外での増殖後、これらの細胞を再び注入することは、免疫療法の治療方法として用いられている。別のアプローチとして、抗体と共に、及び／又は、Ｔ細胞を促進するサイトカインを使用して、Ｔ細胞受容体と共刺激分子をトリガーすることによって、末梢血リンパ球を活性化し、増殖することが行なわれている。
【００６７】
本研究において、ＡＴ細胞は、抗ＣＤ３−ＩＬ２培養とイオノマイシン活性により、末梢血リンパ球から増殖され、ＣＤ４ＯＬをアップレギュレートしている。ＤＣ注射から数日後、培養されたＡＴ細胞は、抗原特異的Ｔ細胞が生成されるであろうとの考えの基で、腫瘍内に注射した。ＡＴ細胞療法を受けている患者には、１)局部的化学療法(プロトコルIII)、２)全身的化学療法(プロトコルIV)、又は、３)全身的化学療法と部分的腫瘍放射線治療(プロトコルＶ)により前処置を施した。
【００６８】
局部的腫瘍放射線治療を第３のＡＴ細胞プロトコル(プロトコルＶ)に追加した場合、ＡＴ細胞注射後、患者２人に、一時的な発熱、リンパ節症、転移部位の痛み、及び、ＡＴ細胞注射部位の腫れが現れた。これらの症状は、１週間以内に改善され、顕著には、咽頭癌患者１人に、治療部位及び未治療部位の両方で完全な腫瘍退縮が観察された。治療後最初の３週間は、注射部位以外では、咽頭、喉頭、子宮頸部のリンパ節を含むすべての領域で退縮があり、その後９ヶ月まで、腫瘍は、注射部位を含めて完全に退縮した。本治療グループの非常に進行した食道癌の段階にあった第２の患者は、初期に反応するように思われたが、進行性疾患を発症した。治療のどの部分が、強い炎症反応、免疫抑制因子のコントロール又は不足、又は、これら又は他の事象との組み合わせによって、反応に寄与するかは明白でない。発熱は、ＡＴ細胞と、化学療法(プロトコルIII)又は放射線治療(プロトコルＶ)の何れかと共に局部的腫瘍治療の両方を受けた２つのグループに関連しており、そのような反応を引き起こすことで知られている炎症サイトカインの解放を示唆している。実際、これらの拒絶反応は、腫瘍に生ずる免疫反応に必要であると思われる。
【００６９】
化学療法剤を全身又は局部的に投与して、これらの薬剤が免疫治療処置と共に安全で効果的に用いられるかどうかを決定しようとした。この化学療法の投与は、患者の悪性腫瘍を治療するために一般的に最適と思われる量ではなく、どちらかというと癌への免疫反応を対処する補助としてのものであった。化学療法は、腫瘍細胞内で抗原取り込みを増大させるアポトーシスを誘発することができる。より重要なのは、これらの薬により、制御性Ｔ細胞が生じるかもしれないことである。ＣＤ４+ＣＤ２５+として一般的に定義される制御性細胞は、大部分のヒト固形がんに存在することがわかっており、その数の多さとその度数は、全生存と相関あるように考えられている(Beyer, M. et al., Blood 108: 804-11, 2006)。細胞表面にてＣＤ２５を直接ターゲットとすることによるそれらの除去又は選択的な破壊は、免疫療法に対する腫瘍特異的な増強された反応を生じた結果であることが知られている。低投与量のシクロホスファミドを使用することで、特に、制御性細胞の数が減少するだけでなく、免疫刺激効果を発揮することが認識されている。化学療法を、ＤＣとＡＴ細胞の注射の前に全身に施しても、有害な事象は見られなかった。本研究の目的は、安全性であり必ずしも治療効果を必要としていないが、これらの手法を組み合わせることにより観察された明らかな利点は、各処置(化学療法、放射線治療、未成熟ＤＣとＡＴ細胞の注射)が、腫瘍に効果を与えることができたという認識をもって考えられるべきである。実際、患者２人(頭部及び頸部癌(プロトコルＶ)、胃癌(プロトコルＶV))は共に、標準的な放射線治療／化学療法に失敗したが、放射線治療及び／又は化学療法を受け、その後に、ＤＣｓ及びＡＴ細胞を腫瘍内注射したので、十分な反応を示した。
【００７０】
全体的に見れば、本研究では、治療プロトコルのすべてが、比較的良好な耐容性があり、免疫原生を高め又は耐性を覆すために、未成熟ＤＣｓとＡＴ細胞の腫瘍内注射に、従来の治療をプラスした組合せを単一のプロトコル中に安全に且つ効果的に組み入れることができることを証明した。
【００７１】
本発明について、好ましい実施例を参照して、具体的に説明し、記載したが、当業者であれば、その精神と発明の範囲から離れることなく、添付のクレームに規定したとおり、形態や詳細に種々の変更を行うことができることは理解されるべきである。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図３】
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【国際調査報告】
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