(57)【要約】  本発明は、一般的に、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に、そして特に、ＨＩＶに対する中和抗体を誘導する方法に、そしてこうした方法で使用するのに適した化合物および組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者において、抗ＨＩＶ抗体の産生を誘導する方法であって、こうした方法が必要な患者に、前記誘導を達成するのに十分な量で、少なくとも１つのリポソーム−ペプチド・コンジュゲートの量を投与する工程を含み、前記ペプチドが膜外部近位領域（ＭＰＥＲ）エピトープを含み、そして前記リポソームがリゾホスホリルコリンまたはホスファチジルセリンを含む、前記方法。
【請求項２】
前記ペプチドが、配列ＥＬＤＫＷＡＳまたはＷＦＮＩＴＮＷを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記リポソーム−ペプチド・コンジュゲートがさらに脂質Ａを含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記リポソーム−ペプチド・コンジュゲートをβ２糖タンパク質１の組換えドメインＶと混合する、請求項１記載の方法。
【請求項５】
リポソーム中に包埋されたＭＰＥＲエピトープを含む免疫原であって、前記リポソームがリゾホスホリルコリンまたはホスファチジルセリンを含む、前記免疫原。
【請求項６】
前記免疫原がさらに脂質Ａを含む、請求項５記載の免疫原。
【請求項７】
前記免疫原がさらに、β２糖タンパク質１の組換えドメインＶを含む、請求項５記載の免疫原。
【請求項８】
ＨＩＶを治療する方法であって、こうした方法が必要な患者に、ＨＩＶ表面上またはＨＩＶ感染細胞表面上の脂質に結合し、そしてそれによってＨＩＶ−１を中和する、正常被験体からまたは自己免疫疾患被験体から誘導可能な抗体を投与する工程を含み、前記抗体がＣＬ１、またはその結合特異性を有する抗体、またはその結合性断片であり、そして前記治療を達成するのに十分な量で投与される、前記方法。
【請求項９】
ＨＩＶ−１  ｇｐ４１およびＭＰＥＲペプチドの膜貫通ドメインを含む免疫原性コンジュゲートであって、前記ＭＰＥＲペプチドが前記膜貫通ドメインを介してリポソーム中に係留される、前記コンジュゲート。
【請求項１０】
前記リポソームが合成脂質を含む、請求項９記載の免疫原性コンジュゲート。
【請求項１１】
前記ＭＰＥＲペプチドが２Ｆ５または４Ｅ１０モノクローナル抗体のエピトープを含む、請求項９記載の免疫原性コンジュゲート。
【請求項１２】
患者において免疫応答を誘導する方法であって、前記患者に、前記誘導を達成するのに十分な量の請求項９記載の前記免疫原性コンジュゲートを投与する工程を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００７年４月１３日出願の米国出願第１１／７８５，０７７号、２００７年６月２２日出願の米国出願第１１／８１２，９９２号および２００７年９月２８日出願の米国仮出願第６０／９６０，４１３号から優先権を請求し、これらの出願の全内容は、本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は、米国衛生研究所によって授与される助成金番号Ｕ０１  ＡＩ０６７８５４のもとに米国政府の援助を受けて作成された。米国政府は、本発明において特定の権利を有する。
技術分野
本発明は、一般的に、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に、そして特に、ＨＩＶに対する中和抗体を誘導する方法に、そしてこうした方法で使用するのに適した化合物および組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
急性ＨＩＶ−１感染において最初に作製される抗体は、ＣＤ４結合部位（Ｍｏｏｒｅら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６８（８）５１４２（１９９４））、ＣＣＲ５共受容体結合部位（Ｃｈｏｅら，  Ｃｅｌｌ  １１４（２）：１６１−１７０（２００３））、およびＶ３ループ（Ｍｏｏｒｅら，  Ｊ．  Ａｃｑｕｉｒ．  Ｉｍｍｕｎ．  Ｄｅｆ．  Ｓｙｎ．  ７（４）：３３２（１９９４））に対するものである。しかし、これらの抗体は、ＨＩＶ−１を制御せず、そして容易にエスケープされる（Ｂｕｒｔｏｎら，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎ．  ５：２３３−２３６（２００４）、Ｗｅｉら，  Ｎａｔｕｒｅ  ４２２（６９２９）：３０７−３１２（２００３））。自家ウイルスに対する中和抗体は、感染５０〜６０日後に発展するが、異種ＨＩＶ−１株を中和可能な抗体は、感染１年後まで生じない（Ｒｉｃｈｍａｎら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １００（７）：４１４４−４１４９（２００３）、Ｗｅｉら，  Ｎａｔｕｒｅ  ４２２（６９２９）：３０７−３１２（２００３））。
【０００４】
稀な広範反応性中和抗体が結合するＨＩＶ−１エンベロープ上の４つのエピトープは、ＣＤ４結合部位（ＣＤ４ＢＳ）（ｍａｂ（モノクローナル抗体）ＩｇＧ１ｂ１２）（Ｚｗｉｃｋら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７７（１０）：５８６３−５８７６（２００３））、ヒトｍａｂ  ２Ｆ５および４Ｅ１０によって定義される膜近位外部領域（ＭＰＥＲ）エピトープ（Ａｒｍｂｒｕｓｔｅｒら，  Ｊ．  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ５４：９１５−９２０（２００４）、ＳｔｉｅｇｌｅｒおよびＫａｔｉｎｇｅｒ，  Ｊ．  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ５１：７５７−７５９（２００３）、Ｚｗｉｃｋら，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７９：１２５２−１２６１（２００５）、Ｐｕｒｔｓｃｈｅｒら，  ＡＩＤＳ  １０：５８７（１９９６））（図１）、ならびにヒトｍａｂ  ２Ｇ１２によって定義されるマンナングリカンエピトープ（Ｓｃａｎｌａｎら，  Ａｄｖ．  Ｅｘｐｅｒ．  Ｍｅｄ．  Ｂｉｏｌ．  ５３５：２０５−２１８（２００３））である。これらの４つの稀なヒトｍａｂはすべて独特である：２つはＩｇＧ３（２Ｆ５および４Ｅ１０）であり、１つはユニークなＩｇ二量体構造を有し（２Ｇ１２）、１つは非常に疎水性であるＣＤＲ３を有し（２Ｆ５）（Ｏｆｅｋら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  １９８：１０７２４（２００４））、そして４つすべてにおいて、ＣＤＲ３が異常に長い（Ｂｕｒｔｏｎら，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ５（３）：２３３−２３６（２００４）、Ｋｕｎｅｒｔら，  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．  Ｈｕｍ．  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ２０（７）：７５５−７６２（２００４）、Ｚｗｉｃｋら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７８（６）：３１５５−３１６１（２００４）、Ｃａｒｄｏｓｏら，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２２：１６３−１７２（２００５））。これらのうち、２Ｆ５および４Ｅ１０様ヒトｍａｂｓは非常に稀である。急性ＨＩＶ−１患者は、ＭＰＥＲまたは２Ｇ１２エピトープに対する抗体を作製せず（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、未刊行（２００５）、Ｓｈａｗ、未刊行（２００５））、ＭＰＥＲは、ＨＩＶエンベロープのアミノ酸６５２〜６８３と定義可能である（Ｃａｒｄｏｓｏら，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２２：１６３−１７３（２００５））（例えば、ＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬＥＬＤＫＷＡＳＬＷＮＷＦＤＩＴＮＷＬＷＹＩＫ）。ＣＤ４結合部位（ＢＳ）抗体は、一般的に、ＨＩＶ−１感染初期に作製されるが、これらの抗体は、一般的に、ｍａｂ  ＩｇＧ１ｂ１２によって示される広範囲の中和を持たない（Ｂｕｒｔｏｎら，  Ｎａｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ５（３）：２３３−２３６（２００４））。
【０００５】
いくつかのＨＩＶ−１エンベロープのエピトープが宿主組織と交差反応することが示されてきており（Ｐｉｎｔｏら，  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．  Ｈｕｍ．  Ｒｅｔｒｏｖ．  １０：８２３−８２８（１９９４）、Ｄｏｕｖａｓら，  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．  Ｈｕｍ．  Ｒｅｔｒｏｖ．  １０：２５３−２６２（１９９４）、Ｄｏｕｖａｓら，  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．  Ｈｕｍ．  Ｒｅｔｒｏｖ．  １２：１５０９−１５１７（１９９６））、そして自己免疫患者はＨＩＶタンパク質と交差反応する抗体を作製することが示されてきている（Ｐｉｎｔｏら，  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．  Ｈｕｍ．  Ｒｅｔｒｏｖ．  １０：８２３−８２８（１９９４）、Ｄｏｕｖａｓら  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．  Ｈｕｍ．  Ｒｅｔｒｏｖ．  １０：２５３−２６２（１９９４）、Ｄｏｕｖａｓら，  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．  Ｈｕｍ．  Ｒｅｔｒｏｖ．  １２：１５０９−１５１７（１９９６）、Ｂａｒｔｈｅｌら，  Ｓｅｍｉｎ．  Ａｒｔｈｒ．  Ｒｈｅｕｍ．  ２３：１−７（１９９３））。同様に、自己エピトープに対する免疫応答の誘導が、ＡＩＤＳにおける自己免疫異常およびＴ細胞枯渇の原因であると示唆されてきている（Ｄｏｕｖａｓら，  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．  Ｈｕｍ．  Ｒｅｔｒｏｖ．  １２：１５０９−１５１７（１９９６）、Ｚｉｅｇｌｅｒら，  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈ．  ４１：３０５−３１３（１９８６））。
【０００６】
ペプチドに対する高レベルの抗体を誘導するが、ＨＩＶ−１初代単離体を広範には中和しない、２Ｆ５  ｍａｂに対する高アフィニティーペプチドリガンドが作製されてきている（ＭｃＧａｕｇｈｅｙら，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２（１１）：３２１４−３２２３（２００３）、Ｚｈａｎｇら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７８（１５）：８３４２−８３４８（２００４）、Ｚｗｉｃｋら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７９：１２５２−１２６１（２００５）における概説）。これらの結果は、２Ｆ５に対するペプチドリガンドが抗ＭＰＥＲ抗体を誘導するのに適したコンホメーションを取っていないことを意味すると解釈されてきた（Ｂｕｒｔｏｎら，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５（３）：２３３−２３６（２００４）、Ｚｗｉｃｋら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７９：１２５２−１２６１（２００５））。安定に発現されたＩｇＧ１ｂ１２、２Ｇ１２、２Ｆ５および４Ｅ１０エピトープを用いて、一連の非常に拘束されたＨＩＶ−１  Ｅｎｖ免疫原が作製されてきており、そしてこれらの免疫原が、モルモットまたはウサギにおいて広範反応性中和抗体を誘導せず、そして特に、ＭＰＥＲエピトープに対する中和抗体を作製しないことが立証されてきている（Ｌｉａｏら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７８（１０）：５２７０−５２７８（２００４）；  Ｈａｙｎｅｓ、未刊行（２００５））。これらの結果は、ＨＩＶ−１エンベロープに対する広範反応性中和抗体が作製不能であるため、これらが正常な動物およびヒトにおいて作製されるかどうかに関する疑問が生じている。
【０００７】
長い疎水性ＣＤＲ３領域は、天然多重反応性自己抗体の典型であり（Ｍｅｆｆｒｅら，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １０８：８７９−８８６（２００１）、Ｒａｍｓｌａｎｄら，  Ｅｘｐ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎ．  １８：１７６−１９８（２００１））、そしてＨＩＶ−１感染患者Ｂリンパ球は、ポリクローン性に駆動されて、カルジオリピン抗体を作製する（Ｗｅｉｓｓら，  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．  ７７：６９−７４（１９９５）、Ｇｒｕｎｅｗａｌｄら，  Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５：４６４−７１（１９９９））ため、カルジオリピンに対するこれらのおよび他の抗ＨＩＶ−１  ｍａｂ、ならびに他の自己抗原反応をアッセイする研究が行われた。本発明は、少なくとも部分的に、２つの広範反応性ＨＩＶ−１エンベロープｇｐ４１ヒトｍａｂ、２Ｆ５および４Ｅ１０が、カルジオリピンと反応性である多重特異性自己抗体であるという認識から生じる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｍｏｏｒｅら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６８（８）５１４２（１９９４）
【非特許文献２】Ｃｈｏｅら，  Ｃｅｌｌ  １１４（２）：１６１−１７０（２００３）
【非特許文献３】Ｍｏｏｒｅら，  Ｊ．  Ａｃｑｕｉｒ．  Ｉｍｍｕｎ．  Ｄｅｆ．  Ｓｙｎ．  ７（４）：３３２（１９９４）
【非特許文献４】Ｂｕｒｔｏｎら，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎ．  ５：２３３−２３６（２００４）
【非特許文献５】Ｗｅｉら，  Ｎａｔｕｒｅ  ４２２（６９２９）：３０７−３１２（２００３）
【非特許文献６】Ｒｉｃｈｍａｎら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １００（７）：４１４４−４１４９（２００３）
【非特許文献７】Ｚｗｉｃｋら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７７（１０）：５８６３−５８７６（２００３）
【非特許文献８】Ａｒｍｂｒｕｓｔｅｒら，  Ｊ．  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ５４：９１５−９２０（２００４）
【非特許文献９】ＳｔｉｅｇｌｅｒおよびＫａｔｉｎｇｅｒ，  Ｊ．  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ５１：７５７−７５９（２００３）
【非特許文献１０】Ｚｗｉｃｋら，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７９：１２５２−１２６１（２００５）
【非特許文献１１】Ｐｕｒｔｓｃｈｅｒら，  ＡＩＤＳ  １０：５８７（１９９６）
【非特許文献１２】Ｓｃａｎｌａｎら，  Ａｄｖ．  Ｅｘｐｅｒ．  Ｍｅｄ．  Ｂｉｏｌ．  ５３５：２０５−２１８（２００３）
【非特許文献１３】Ｏｆｅｋら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  １９８：１０７２４（２００４）
【非特許文献１４】Ｋｕｎｅｒｔら，  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．  Ｈｕｍ．  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ２０（７）：７５５−７６２（２００４）
【非特許文献１５】Ｚｗｉｃｋら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７８（６）：３１５５−３１６１（２００４）
【非特許文献１６】Ｃａｒｄｏｓｏら，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２２：１６３−１７３（２００５）
【非特許文献１７】Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、未刊行（２００５）
【非特許文献１８】Ｓｈａｗ、未刊行（２００５）
【非特許文献１９】Ｐｉｎｔｏら，  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．  Ｈｕｍ．  Ｒｅｔｒｏｖ．  １０：８２３−８２８（１９９４）
【非特許文献２０】Ｄｏｕｖａｓら，  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．  Ｈｕｍ．  Ｒｅｔｒｏｖ．  １０：２５３−２６２（１９９４）
【非特許文献２１】Ｄｏｕｖａｓら，  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．  Ｈｕｍ．  Ｒｅｔｒｏｖ．  １２：１５０９−１５１７（１９９６）
【非特許文献２２】Ｂａｒｔｈｅｌら，  Ｓｅｍｉｎ．  Ａｒｔｈｒ．  Ｒｈｅｕｍ．  ２３：１−７（１９９３）
【非特許文献２３】Ｚｉｅｇｌｅｒら，  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈ．  ４１：３０５−３１３（１９８６）
【非特許文献２４】ＭｃＧａｕｇｈｅｙら，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２（１１）：３２１４−３２２３（２００３）
【非特許文献２５】Ｚｈａｎｇら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７８（１５）：８３４２−８３４８（２００４）
【非特許文献２６】Ｌｉａｏら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７８（１０）：５２７０−５２７８（２００４）
【非特許文献２７】Ｈａｙｎｅｓ、未刊行（２００５）
【非特許文献２８】Ｍｅｆｆｒｅら，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １０８：８７９−８８６（２００１）
【非特許文献２９】Ｒａｍｓｌａｎｄら，  Ｅｘｐ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎ．  １８：１７６−１９８（２００１）
【非特許文献３０】Ｗｅｉｓｓら，  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．  ７７：６９−７４（１９９５）
【非特許文献３１】Ｇｒｕｎｅｗａｌｄら，  Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５：４６４−７１（１９９９）
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、一般的に、ヒトＨＩＶに関する。より具体的には、本発明は、ＨＩＶに対する中和抗体を誘導する方法に、そしてこうした方法で使用するのに適した化合物および組成物に関する。特定の態様において、本発明は、天然膜結合環境において、ＭＰＥＲエピトープを提示する免疫原、およびこうした免疫原を用いた、寛容を中断する免疫法を提供する。
【００１０】
本発明の目的および利点は、以下の説明から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】広範中和性抗体（２Ｆ５、４Ｅ１０）は、宿主膜に対して近位に位置するエピトープに結合する。２Ｆ５および４Ｅ１  ｍＡｂはどちらも、ＩｇＧ３であり、長いＣＤＲ３を有し、そしてＨＩＶ−１  ｇｐ４１（ａａ  ６６０〜６８３）膜近位外部領域（ＭＰＥＲ）内に位置するエピトープに結合する。
【図２】図２Ａ〜２Ｄ。ヒトＨｅｐ−２上皮細胞と、２Ｆ５、４Ｅ１０、ＩｇＧ１ｂ１２  Ｍａｂの反応性。図２Ａは、散在性の細胞質および核パターンでＨｅｐ−２細胞と反応するＭａｂ  ２Ｆ５を示し、図２Ｂは、２Ｆ５と類似のパターンでＨＥｐ−２細胞と反応するＭａｂ  ４Ｅ１０を示す。図２Ｃは、散在性細胞質パターンであり、核においては核小体が反応性である、Ｈｅｐ−２細胞と反応するＭａｂ  ＩｇＧ１ｂ１２を示す。図２Ｃ挿入図は、ＩｇＧ１ｂ１２の核反応性を示す（矢印）、細胞のより大きい拡大図を示す。図２Ｄは、Ｈｅｐ−２細胞に対するＭａｂ  １．９Ｆの陰性反応性を示す。図２Ａ〜２Ｄにおいてアッセイしたスライドあたりの抗体量は、スライドあたりＭａｂ  ３．７５μｇであった。Ｍａｂ  ２Ｆ５は、スライドあたり０．１２５μｇ（５μｇ／ｍｌ）で、ＨＥｐ−２細胞に対して陽性であった。Ｍａｂ  ４Ｅ１０は、スライドあたり０．１２５μｇ（５μｇ／ｍｌ）で陽性であり、そしてＩｇＧ１ｂ１２は、スライドあたり１．２５μｇ（５０μｇ／ｍｌ）で陽性であった。すべての図は２００倍であり；図２Ｃ挿入図は４００倍である。示す画像は、実行した３つの実験を代表する実験に由来する。
【図３−１】図３Ａ〜３Ｄ。脂質に対するＭａｂ  ２Ｆ５および４Ｅ１０のアッセイおよび結合特異性。図３Ａは、カルジオリピン（ＣＬ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、およびスフィンゴミエリン（ＳＭ）に対するＭＡｂ  ４Ｅ１０（黒塗りバー）および２Ｆ５（白抜きバー）のＥＬＩＳＡ反応性を示す。４Ｅ１０および２Ｆ５はどちらもカルジオリピンと反応するが、４Ｅ１０のみが試験した他の脂質と反応した。対照ヒト抗ＣＣＲ５結合部位ＭＡｂ  １．７ｂの反応性は陰性であった（データ未提示）。空のコーティングプレートに対するＭＡｂの反応性は同様に陰性であった（未提示）。カルジオリピンに対するＭＡｂ  ２Ｆ５の結合の特異性を示すため、２Ｆ５  １５０〜３００μｇ／ｍｌ、およびＭＡｂ  ２Ｆ５によるＨＩＶ−１の中和を遮断する（Ｋｕｎｅｒｔら，  ＡＩＤＳ  １６：６６７（２００２））、抗２Ｆ５イディオタイプ・ネズミＭＡｂ  ３Ｈ６の１０００μｇ／ｍｌを用いた。２Ｆ５抗イディオタイプは、３回の別個の実験において、カルジオリピンに対するＭＡｂ  ２Ｆ５の結合を平均７０％で有意に遮断した（ｐ＜０．０３）（図３Ｂ）。別個のＥＬＩＳＡにおいて、ＭＡｂ  ２Ｆ５は、６６０ｎＭの半最大（ＥＣ５０）応答で、カルジオリピンに結合した（未提示）。図３Ｃは、カルジオリピンに対する４Ｅ１０  ＭＡｂ結合の用量反応曲線を示す。４パラメトリックＳ字形曲線適合分析から、４Ｅ１０結合（８０ｎＭ）の半最大（ＥＣ５０）応答を計算した。ＥＬＩＳＡプレート上にコーティングされたカルジオリピン（１．３５μｇ／ウェル）に対する４Ｅ１０  ＭＡｂ結合（０．５ｎＭ〜１０００ｎＭ）のＥＬＩＳＡから、結合データを獲得した。図３Ｄは、４Ｅ１０エピトープを発現する可溶性ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ  ｇｐ１４０オリゴマー（ＣＯＮ−Ｓ）がカルジオリピンに対する４Ｅ１０  ＭＡｂの結合を阻害することを示す。カルジオリピンに対する４Ｅ１０結合の阻害のＩＣ５０は、１４５ｎＭであると計算された。１０μｇ／ｍｌの４Ｅ１０  ＭＡｂと混合した多様な濃度のｇｐ１４０（１９．２５〜１２３０ｎＭ）を用いて、これを次いで、１．３５μｇのカルジオリピンを含有するウェルに添加することによって、阻害アッセイを行った。ＭＡｂ  ３Ｈ６（１ｍｇ／ｍｌ）はまた、ＳＳＡ／Ｒｏ、セントロメアＢ、およびヒストンに対するＭＡｂ  ２Ｆ５の結合を遮断した（が、対照ＭＡｂはしなかった）（未提示）。図３Ａ〜３Ｄ中のすべてのデータは、実行した少なくとも２つの実験の代表である。
【図３−２】図３Ａ〜３Ｄ。脂質に対するＭａｂ  ２Ｆ５および４Ｅ１０のアッセイおよび結合特異性。図３Ａは、カルジオリピン（ＣＬ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、およびスフィンゴミエリン（ＳＭ）に対するＭＡｂ  ４Ｅ１０（黒塗りバー）および２Ｆ５（白抜きバー）のＥＬＩＳＡ反応性を示す。４Ｅ１０および２Ｆ５はどちらもカルジオリピンと反応するが、４Ｅ１０のみが試験した他の脂質と反応した。対照ヒト抗ＣＣＲ５結合部位ＭＡｂ  １．７ｂの反応性は陰性であった（データ未提示）。空のコーティングプレートに対するＭＡｂの反応性は同様に陰性であった（未提示）。カルジオリピンに対するＭＡｂ  ２Ｆ５の結合の特異性を示すため、２Ｆ５  １５０〜３００μｇ／ｍｌ、およびＭＡｂ  ２Ｆ５によるＨＩＶ−１の中和を遮断する（Ｋｕｎｅｒｔら，  ＡＩＤＳ  １６：６６７（２００２））、抗２Ｆ５イディオタイプ・ネズミＭＡｂ  ３Ｈ６の１０００μｇ／ｍｌを用いた。２Ｆ５抗イディオタイプは、３回の別個の実験において、カルジオリピンに対するＭＡｂ  ２Ｆ５の結合を平均７０％で有意に遮断した（ｐ＜０．０３）（図３Ｂ）。別個のＥＬＩＳＡにおいて、ＭＡｂ  ２Ｆ５は、６６０ｎＭの半最大（ＥＣ５０）応答で、カルジオリピンに結合した（未提示）。図３Ｃは、カルジオリピンに対する４Ｅ１０  ＭＡｂ結合の用量反応曲線を示す。４パラメトリックＳ字形曲線適合分析から、４Ｅ１０結合（８０ｎＭ）の半最大（ＥＣ５０）応答を計算した。ＥＬＩＳＡプレート上にコーティングされたカルジオリピン（１．３５μｇ／ウェル）に対する４Ｅ１０  ＭＡｂ結合（０．５ｎＭ〜１０００ｎＭ）のＥＬＩＳＡから、結合データを獲得した。図３Ｄは、４Ｅ１０エピトープを発現する可溶性ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ  ｇｐ１４０オリゴマー（ＣＯＮ−Ｓ）がカルジオリピンに対する４Ｅ１０  ＭＡｂの結合を阻害することを示す。カルジオリピンに対する４Ｅ１０結合の阻害のＩＣ５０は、１４５ｎＭであると計算された。１０μｇ／ｍｌの４Ｅ１０  ＭＡｂと混合した多様な濃度のｇｐ１４０（１９．２５〜１２３０ｎＭ）を用いて、これを次いで、１．３５μｇのカルジオリピンを含有するウェルに添加することによって、阻害アッセイを行った。ＭＡｂ  ３Ｈ６（１ｍｇ／ｍｌ）はまた、ＳＳＡ／Ｒｏ、セントロメアＢ、およびヒストンに対するＭＡｂ  ２Ｆ５の結合を遮断した（が、対照ＭＡｂはしなかった）（未提示）。図３Ａ〜３Ｄ中のすべてのデータは、実行した少なくとも２つの実験の代表である。
【図４−１】図４Ａおよび４Ｂ。ＣＯＮ−Ｓ  Ｅｎｖ  ｇｐ１６０のアミノ酸（図４Ａ）および核酸（図４Ｂ）配列。図４Ａのタンパク質のＣＦＩ型を実施例２で用いた。（Ｇｐ１４０ＣＦＩは、膜貫通および細胞質ドメインの欠失に加えて、切断部位（Ｃ）、融合部位（Ｆ）、およびｇｐ４１免疫優勢領域（Ｉ）の欠失を含む、ＨＩＶ−１エンベロープ設計を指す。）
【図４−２】図４Ａおよび４Ｂ。ＣＯＮ−Ｓ  Ｅｎｖ  ｇｐ１６０のアミノ酸（図４Ａ）および核酸（図４Ｂ）配列。図４Ａのタンパク質のＣＦＩ型を実施例２で用いた。（Ｇｐ１４０ＣＦＩは、膜貫通および細胞質ドメインの欠失に加えて、切断部位（Ｃ）、融合部位（Ｆ）、およびｇｐ４１免疫優勢領域（Ｉ）の欠失を含む、ＨＩＶ−１エンベロープ設計を指す。）
【図５】免疫措置で用いるリン脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）の構造および生じる中和力価。
【図６−１】図６Ａおよび６Ｂ。ペプチド−リポソーム・コンジュゲートの生成に用いるペプチド配列。ｍＡｂ  ２Ｆ５および４Ｅ１０結合エピトープの名目上の（ｎｏｍｉｎａｌ）エピトープには、それぞれ、配列ＥＬＤＫＷＡＳおよびＷＦＮＩＴＮＷが含まれ、そしてこれらを下線で示す。Ｖ３配列は、ＨＩＶ−１  ＭＮ株のｇｐ１２０に由来し、そしてこれらを対照構築物として用いた。スクランブル化配列を対照として用いる。
【図６−２】図６Ａおよび６Ｂ。ペプチド−リポソーム・コンジュゲートの生成に用いるペプチド配列。ｍＡｂ  ２Ｆ５および４Ｅ１０結合エピトープの名目上の（ｎｏｍｉｎａｌ）エピトープには、それぞれ、配列ＥＬＤＫＷＡＳおよびＷＦＮＩＴＮＷが含まれ、そしてこれらを下線で示す。Ｖ３配列は、ＨＩＶ−１  ＭＮ株のｇｐ１２０に由来し、そしてこれらを対照構築物として用いた。スクランブル化配列を対照として用いる。
【図７】ＭＰＥＲ  ｇｐ４１構築物の多様な設計の模式的提示。模式的構築物の上に、機能領域を示す。各模式的構築物の下に、アミノ酸配列を示す。開始および成熟シグナル配列を青で強調し；免疫優勢領域を太字で強調し；ＭＰＥＲ領域を茶色で強調し、そしてＧＴＨ１ドメインを赤で強調し、そして膜貫通ドメインを下線で示す。精製を容易にするため、Ｈｉｓタグを構築物のＣ末端に添加して、そして緑で強調する。
【図８】ペプチド−リポソーム・コンジュゲートに対するｍＡｂ  ４Ｅ１０の結合。ＢＩＡｃｏｒｅ結合曲線は、ＧＴＨ１−４Ｅ１０リポソームに対するｍＡｂ  ４Ｅ１０の特異的でそして顕著により高い結合を示す。ＧＴＨ１−２Ｆ５リポソームに対する迅速な動力学での低レベルの結合もまた検出された。
【図９】ペプチド−リポソームに対する２Ｆ５  ｍＡｂの結合。ＭＡｂ  ２Ｆ５は、ＧＴＨ１−２Ｆ５リポソームに特異的に結合し、そしてＧＴＨ１−４Ｅ１０リポソームに対する結合はまったく示さなかった。
【図１０】ペプチド−リポソームに対するＡ３２  ｍＡｂ結合。対照抗ｇｐ１２０  Ｍａｂ、Ａ３２は、リポソーム・コンジュゲートのいずれにもまったく結合を示さなかった。ＣＤ４誘導性ｍＡｂである１７ｂもまた、上記リポソーム・コンジュゲートに対する結合をまったく示さなかった（データ未提示）。
【図１１】フルオレセインがコンジュゲート化されたペプチド−リポソームの生成。脂質組成物中にフルオレセイン−ＰＯＰＥを取り込むことによって、ペプチド−リポソームをフルオレセイン・タグとコンジュゲート化した。結合アッセイは、フルオレセイン・コンジュゲート化リポソーム中で、ｍＡｂ  ４Ｅ１０結合の特異性が保持されることを示す。フルオレセイン−コンジュゲート化ＧＴＨ１−２Ｆ５リポソームは類似の結果を生じた。
【図１２】４Ｅ１０ペプチドと免疫モルモット血清の反応性。ＥＬＩＳＡ結合アッセイは、ＧＴＨ１−４Ｅ１０リポソームで免疫した２匹のモルモット由来の４Ｅ１０ペプチドに対する血清の強い陽性反応性を示す。すべての前採血（ｐｒｅ−ｂｌｅｅｄ）血清はバックグラウンド結合を生じ、一方、４Ｅ１０ペプチドで免疫した動物由来の血清において、低レベルの結合が観察された。ペプチド−リポソーム免疫動物由来の陽性血清もまた、どちらも、中和活性を示した（表２）。１つの血清（１１０２）は、それぞれ、１：２０９および１：３２の抗体力価で、ＭＮおよびＳＳ１１９６株の中和を示した。第二の血清（１１０３）は、ＭＮウイルスに対してのみ有効であった（１：６０）。
【図１３】ペプチドエピトープに対するＭＰＥＲ  ｍＡｂ結合は、単純なモデル（ラングミュア等式）にしたがう。
【図１４】エピトープペプチド−脂質コンジュゲートに対する中和性ＭＰＥＲ  ｍＡｂ結合は、２段階コンホメーション変化モデルにしたがう。
【図１５】ヒト・クラスターＩＩ  ｍＡｂ（９８−６、１６７−Ｄ、１２６−６）は、Ｅｎｖ  ｇｐ１４０に強く結合する。
【図１６】図１６Ａ〜１６Ｄ。ヒト・クラスターＩＩ  ｍＡｂは、陰イオン性リン脂質、カルジオリピンに強く結合した。
【図１７−１】図１７Ａ〜１７Ｅ。ヒト・クラスターＩＩ  ｍＡｂ  ９８−６は、より高いアビディティーで２Ｆ５ペプチド−脂質コンジュゲートに結合し、そして２段階コンホメーション変化モデルにしたがった。
【図１７−２】図１７Ａ〜１７Ｅ。ヒト・クラスターＩＩ  ｍＡｂ  ９８−６は、より高いアビディティーで２Ｆ５ペプチド−脂質コンジュゲートに結合し、そして２段階コンホメーション変化モデルにしたがった。
【図１８】図１８Ａ〜１８Ｃ：リポソームとともに配合されたＴＬＲアジュバントの構造。図１８Ａ  脂質Ａ；図１８Ｂ  オリゴＣｐＧ；図１８Ｃ  Ｒ−８４８。
【図１９】図１９Ａ〜１９Ｃ。ＴＬＲアジュバント−ＭＰＥＲペプチド・リポソームの図的記述。図１９Ａ  脂質Ａ；図１９Ｂ  オリゴＣｐＧ；図１９Ｃ  Ｒ−８４８。
【図２０】図２０Ａ〜２０Ｃ。ＴＬＲアジュバントにコンジュゲート化されたＭＰＥＲペプチド−リポソームと２Ｆ５  ｍＡＢの相互作用。図２０Ａは、脂質Ａを含むｇｐ４１  ＭＰＥＲリポソーム構築物に対する２Ｆ５  ｍａｂの強い結合を示す（２００μｇ用量当量）。図２０Ｂは、ｇｐ４１  ＭＰＥＲリポソームにコンジュゲート化されたｏＣｐＧ（５０μｇ用量当量）に対する２Ｆ５  ｍＡｂの結合を示す。図２０Ｃは、Ｒ８４８コンジュゲート化ｇｐ４１  ＭＰＥＲ含有リポソームに対する２Ｆ５  ｍＡｂの結合を示す。ＴＬＲアジュバントのみを含む対照リポソームに比較すると、ｇｐ４１  ＭＰＥＲ−アジュバント・リポソーム構築物各々に対する２Ｆ５  ｍＡｂの強い結合が観察された。
【図２１】ＭＰＥＲ６５６−ＴＭＤペプチドのアミノ酸配列。
【図２２】図２２Ａおよび２２Ｂ。Ｌ−１チップ上のリポソーム固定の図的記述。図２２Ａ  合成リポソーム。図２２Ｂ  ＭＰＥＲ６５６−ＴＭＤリポソーム。
【図２３】図２３Ａおよび２３Ｂ：ＭＰＥＲ６５６−ＴＭＤリポソームと２Ｆ５および４Ｅ１０  ｍＡｂの相互作用。図２３Ａ  ２Ｆ５および図２３Ｂ  ４Ｅ１０。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、少なくとも部分的に、特定の広範中和性ＨＩＶ−１抗体が自己抗体であることを立証する研究から生じる。多数のＨＩＶ＋患者は、低レベルのこうした抗体を一過性に作製するが、本明細書記載の研究は、ｇｐ４１エピトープがこれらの抗体特異性を誘導するのではなく、むしろカルジオリピンを含む交差反応性自己抗原がプライミング抗原であることを示す。
【００１３】
本発明は、ＨＩＶを中和する抗体を誘導する方法を提供する。該方法は、こうした方法が必要な患者に、該誘導を達成するのに十分な量の少なくとも１つの異種（例えば非ヒト）または同種（例えばヒト）交差反応性自己抗原を投与する工程を含む。本発明で使用するのに適した交差反応性自己抗原には、カルジオリピン、ＳＳ−Ａ／ＲＯ、細菌または哺乳動物細胞由来のｄｓＤＮＡ、セントロメアＢタンパク質およびＲｉＢｏ核タンパク質（ＲＮＰ）が含まれる。
【００１４】
適切な自己抗原にはまた、カルジオリピンに加えてリン脂質、例えばホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、およびその誘導体、例えば、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ＰＯＰＳ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）も含まれる。リン脂質の六方晶ＩＩ相の使用が好適である可能性もあり、そして（例えば生理学的条件下で）六方晶ＩＩチューブ状相の六方充填円筒を容易に形成するリン脂質が好ましく、六方晶ＩＩ相で安定化されうるリン脂質も同様である（Ｒａｕｃｈら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７：４１１２−４１１４（１９９０）；  Ａｇｕｉｌａｒら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７４：２５１９３−２５１９６（１９９９））。
【００１５】
交差反応性エピトープを含む、こうした自己抗原の断片もまた使用可能である。
自己抗原またはその断片を、例えば、プライム・ブースト措置において用いてもよく、こうした措置は、当業者によって容易に最適化可能である（こうした措置のタンパク質性構成要素をコードするＤＮＡ配列を、タンパク質性構成要素がｉｎ  ｖｉｖｏで産生される条件下で投与してもよい）。例えば、交差反応性自己抗原を、第一のワクチン・プライムとして用いて、天然自己抗体（例えば抗カルジオリピン４Ｅ１０および２Ｆ５様抗体）をブーストしてもよい。自己抗原（例えばカルジオリピン（またはその断片））、または交差反応性エピトープ（単数または複数）、例えば２Ｆ５および／または４Ｅ１０エピトープ（このエピトープには、それぞれ、少なくとも配列ＥＬＤＫＷＡおよびＮＷＦＤＩＴが含まれてもよい）を含むＨＩＶエンベロープタンパク質／ポリペプチド／ペプチドは、いずれも、ブーストとして使用可能である。（ＰＣＴ／ＵＳ０４／３０３９７に開示される配列を参照されたい。）（ＨＩＶエンベロープは自己抗原でないことが理解されるであろう。）
自己抗原および／またはＨＩＶタンパク質／ポリペプチド／ペプチド、またはコード配列の投与様式は、免疫原、患者および求める効果によって多様であり、投与用量も同様である。最適投薬措置は、当業者によって容易に決定可能である。典型的には、投与は皮下、筋内、静脈内、鼻内または経口である。
【００１６】
免疫原性剤をアジュバントと組み合わせて投与してもよい。多様なアジュバントが使用可能であるが、好ましいアジュバントには、自己免疫疾患を誘導することなく、自己抗原に対する寛容を中断可能なＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび他の剤（例えばＴＲＬ９アゴニスト）が含まれる（Ｔｒａｎら，  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １０９：２７８−２８７（２００３）、米国出願第２００３０１８１４０６号、第２００４０００６２４２号、第２００４０００６０３２号、第２００４００９２４７２号、第２００４００６７９０５号、第２００４００５３８８０号、第２００４０１５２６４９号、第２００４０１７１０８６号、第２００４０１９８６８０号、第２００５０００５９６１９号）。
【００１７】
特定の態様において、本発明は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンドおよびＨＩＶ−１  ｇｐ４１中和抗原を提示するアジュバント・コンジュゲートに基づくリポソームに関する。この態様にしたがって、ＨＩＶ−１  ｇｐ４１  ＭＰＥＲペプチド免疫原が中にコンジュゲート化されたリポソーム内に、脂質Ａ、オリゴＣｐＧおよびＲ−８４８などの免疫応答増進性ＴＬＲリガンドを、個々に配合してもよい。以下の実施例７に記載するように、広範中和性ｇｐ４１膜近位外部領域（ＭＰＥＲ）抗体（２Ｆ５、４Ｅ１０）は、リポソーム構築物と会合したＴＬＲリガンド・アジュバント各々に強く結合する。この態様の構築物は、ＨＩＶ−１  ｇｐ４１  ＭＰＥＲの劣った免疫原性に対する免疫応答を増進する際に適用を有する。
【００１８】
さらに特定の態様において、本発明は、２Ｆ５および４Ｅ１０などの広範中和性抗体のエピトープを機能的にディスプレイするための、リポソームに対するＨＩＶ−１  ｇｐ４１  ＭＰＥＲペプチドの膜貫通ドメイン係留に関する。本態様にしたがって、ＨＩＶ−１  ｇｐ４１の膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）を用いて、合成脂質を含むリポソーム内にＭＰＥＲペプチドを係留してもよい。以下の実施例８に記載するように、広範中和性抗ｇｐ４１抗体２Ｆ５および４Ｅ１０はどちらも、ＭＰＥＲ−ＴＭＤ−リポソーム・コンジュゲートに結合する。この構築物は、ＨＩＶ−１の天然ＴＭＤを用いて、リポソーム上に係留された本ｇｐ４１中和エピトープを提示するための戦略を提供する。ＴＭＤの三量体化の誘導は、ｇｐ４１  ＭＰＥＲの三量体型の形成を促進しうる。
【００１９】
本発明には、本方法で使用するのに適した組成物が含まれ、これには、自己抗原、および／または１以上の交差反応性エピトープ（例えば４Ｅ１０および／または２Ｆ５エピトープ）を含むＨＩＶタンパク質／ポリペプチド／ペプチド、あるいは４Ｅ１０または２Ｆ５エピトープ模倣体、およびキャリアーを含む組成物が含まれる。ＤＮＡプライムまたはブーストを用いてもよい場合、適切な配合物には、ＤＮＡプライムおよび組換えアデノウイルスブーストならびにＤＮＡプライムおよび組換えミコバクテリアブーストが含まれ、この場合、ＤＮＡまたはベクターは、例えばＨＩＶエンベロープ、またはＳＳ−Ａ／Ｒｏなどのタンパク質自己抗原のいずれかをコードする。ＨＩＶタンパク質／ポリペプチド／ペプチドおよび／または自己抗原を伴うかまたは伴わないかのいずれかで、プライムまたはブーストとして、これらのベクターの他の組み合わせを用いてもよい。組成物は、例えば、注射または鼻投与に適した型で存在してもよい。都合よくは、組成物は無菌である。組成物は投薬単位型で存在してもよい。
【００２０】
本発明はまた、交差反応性抗体（４Ｅ１０および２Ｆ５以外のモノクローナル抗体を含む）の産生において、原発性自己免疫疾患、例えば全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）または抗リン脂質抗体症候群の患者、あるいは感染性疾患、例えば梅毒、リーシュマニア症、およびハンセン病の患者に由来するＢ細胞が使用可能である、受動免疫療法アプローチにも関する。自己免疫疾患患者は、ＨＩＶエンベロープに対する結合に際して、またはビリオン表面上の脂質に対する結合に際してのいずれかで、あるいはその両方で、ＨＩＶ−１を中和する能力を、ある程度有する抗体を作製しうる。さらに、自己免疫疾患患者は、恒常的に、またはＨＩＶ−１感染後のいずれかで、防御中和型抗体を作製しうる。
【００２１】
すなわち、本発明には、ＳＬＥ患者ならびに免疫制御が混乱した他の患者（すなわち、ＨＩＶエンベロープと交差反応性である自己抗体を産生する、原発性自己免疫疾患、または上述のものなどの非ＨＩＶ感染の患者）由来のＢ細胞の、ＨＩＶエンベロープと交差反応する抗体（２Ｆ５様および４Ｅ１０様抗体など）の供給源を提供する不死細胞株の産生における使用が含まれる（Ｓｔｉｅｇｌｅｒら，  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．  Ｈｕｍ．  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  １７：１７５７−１７６５（２００１）、Ａｒｍｂｒｕｓｔｅｒら，  Ｊ．  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ５４：９１５−９２０（２００４）、米国特許５，８３１，０３４を参照されたい）。都合よくは、Ｂ細胞は、ＨＩＶに感染しているか、またはエンベロープに基づくＨＩＶワクチンを投与されているＳＬＥ患者由来である（理論によって束縛されることは望ましくないが、ＨＩＶ感染またはワクチン接種は、プライミングされたＢ１細胞（例えばカルジオリピン−プライミングＢ１細胞）を「ブースト」して、２Ｆ５および／または４Ｅ１０様抗体を産生し、そして除去（正常被験体においては起こる）をエスケープしうるように働く−「ブースト」は、生じたＩｇ遺伝子が、２Ｆ５およびまたは４Ｅ１０様エピトープに適合するか、または広範中和性抗体を誘導するが、正常被験体においては除去される他のｇｐ１６０エピトープに適合する抗体をコードするように、体細胞過剰突然変異を誘発しうる）。Ｂ細胞由来の不死細胞株の産生は、当該技術分野に認識される多様な技術のいずれかを用いて達成可能であり、これには、限定されるわけではないが、ハイブリドーマを産生する、こうしたＢ細胞と骨髄腫細胞との融合が含まれる。本発明にはまた、ＨＩＶエンベロープと反応しないが、むしろウィルス感染細胞およびまたはビリオンと反応する正常被験体由来および自己免疫疾患患者由来の抗体も含まれ、すなわちこれらの抗体は、ウイルスまたはウイルス感染細胞上の脂質に結合する（実施例６を参照されたい）。
【００２２】
ひとたび選択されたら、こうした交差反応性抗体（またはその結合性断片）をコードする配列をクローニングし、そして増幅してもよい（例えば、Ｈｕｓｅら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１（１９８９）、およびＷＯ  ９１／１７２７１、ＷＯ  ９２／０１０４７、米国特許５，８７７，２１８、５，８７１，９０７、５，８５８，６５７、５，８３７，２４２、５，７３３，７４３および５，５６５，３３２に記載されるようなファージ−ディスプレイ技術を参照されたい）。次いで、当該技術分野に認識される技術を用いて、療法用の可溶性抗体を設計しそして産生してもよい（Ｓｔｉｅｇｌｅｒら，  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．  Ｈｕｍ．  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  １７：１７５７−１７６５（２００１）、Ａｒｍｂｒｕｓｔｅｒら，  Ｊ．  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ５４：９１５−９２０（２００４））。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中で、適切な抗体を産生してもよい。
【００２３】
このアプローチにしたがって、抗体（またはその結合性断片）を、約１０〜１００ｍｇ／用量の範囲の、好ましくは２５ｍｇ／用量の用量で投与してもよい。投薬量および頻度は、抗体（またはその結合性断片）、患者および求める効果によって多様でありうる（Ａｒｍｂｒｕｓｔｅｒら，  Ｊ．  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ５４：９１５−９２０（２００４）を参照されたい）。上述の抗体を予防的にまたは療法的に用いてもよい。
【００２４】
抗体（またはその結合性断片）、あるいは抗体または結合性断片をコードするＤＮＡを、キャリアー（例えば薬学的に許容されうるキャリアー）とともに配合して、そして例えば、非経口、静脈内、皮下、筋内または鼻内経路によって投与してもよい。
【００２５】
最後に、ラクダ（ｃａｍｅｌ）（Ｒａｍｓｌａｎｄら，  Ｅｘｐ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．  １８：１７６−１９８（２００１）、Ｌｉｔｍａｎら，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ７：１０９−１４７（１９９９））、ウシ（ｃｏｗ）（Ｒａｍｓｌａｎｄら，  Ｅｘｐ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．  １８：１７６−１９８（２００１）、Ｌｉｔｍａｎら，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ７：１０９−１４７（１９９９））およびサメ（ｓｈａｒｋ）（Ｒａｍｓｌａｎｄら，  Ｅｘｐ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．  １８：１７６−１９８（２００１）、Ｌｉｔｍａｎら，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ７：１０９−１４７（１９９９）、Ｈｏｈｍａｎら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ９０：９８８２−９８８６（１９９３））などの動物種は、非常に長いＣＤＲ３長を有し、そしてその抗体は、多重反応性を示す。ＨＩＶエンベロープに対する多重反応性を示す、これらの操作されたＣＤＲ３は、ＨＩＶに対する、そして多くの感染性病原体に対する、強力な療法抗体（例えばキメラおよびヒト化抗体を含むモノクローナル抗体、ならびにその抗原結合性部分）を作製するために使用可能である。
【００２６】
特定の態様において、本発明はさらに、合成リポソーム−ペプチド・コンジュゲートに、そしてＨＩＶ−１に対する広範中和性抗体を生成するための免疫原として該コンジュゲートを用いる方法に関する。本発明のこの態様は、ＨＩＶ−１  ｇｐ４１のＭＰＥＲに結合する広範中和性抗体の名目上のエピトープペプチドを合成リポソーム内に包埋するための組成物および方法を提供する。抗ＨＩＶ−１中和抗体の生成および抗原特異的Ｂ細胞応答の検出のための免疫戦略およびプロトコルもまた提供する。
【００２７】
本発明のこの態様にしたがって、広範中和性抗ＨＩＶ抗体の名目上のエピトープおよびＧＴＨ１などの疎水性リンカーを含むペプチド配列（配列に関しては図６を参照されたい）を合成リポソーム内に包埋する。好ましい側面において、名目上のエピトープは、上述のように、ＨＩＶ−１エンベロープｇｐ４１のＭＰＥＲ中に存在する、ｍＡｂ  ２Ｆ５（ＥＬＤＫＷＡＳ）または４Ｅ１０（ＷＦＮＩＴＮＷ）のものである。エピトープは、それに特異的な抗体が、比較的制約されないアクセスを有するようにペプチド中に存在してもよいし、あるいはＭＰＥＲ領域の天然配向を模倣するように、疎水性リンカーに関連してペプチド中に存在していてもよい。本発明で使用するのに適したペプチド配列の特定の例を図６に示す。さらに、ＭＰＥＲ  ｇｐ４１領域を、ヒト細胞発現系中、組換えワクシニアウイルス中で組換えタンパク質として発現し、そしてリポソームとの会合を容易にするため、ｇｐ４１構成要素のＮまたはＣ末端で両親媒性アルファらせんを伴って配合してもよい（図７）。
【００２８】
本発明で使用するのに適したリポソームには、限定されるわけではないが、ＰＯＰＣ、ＰＯＰＥ、ＤＭＰＡ（またはスフィンゴミエリン（ＳＭ））、リゾホスホリルコリン、ホスファチジルセリン、およびコレステロール（Ｃｈ）を含むものが含まれる。当業者は最適比を決定可能であり、例には、４５：２５：２０：１０の比のＰＯＰＣ：ＰＯＰＥ（またはＰＯＰＳ）：ＳＭ：ＣｈまたはＰＯＰＣ：ＰＯＰＥ（またはＰＯＰＳ）：ＤＭＰＡ：Ｃｈが含まれる。使用可能なリポソームの別の配合物には、９：７．５：１のモル比で配合された、ＤＭＰＣ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）（またはリゾホスホリルコリン）、コレステロール（Ｃｈ）およびＤＭＰＧ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）が含まれる（Ｗａｓｓｅｆら，  ＩｍｍｕｎｏＭｅｔｈｏｄｓ  ４：２１７−２２２（１９９４）；  Ａｌｖｉｎｇら，  Ｇ．  Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ（監修），  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  第２版，  第ＩＩＩ巻  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  フロリダ州ボーカラトーン（１９９３）；  Ｒｉｃｈａｒｄｓら，  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ６６（６）：２８５９０２８６５（１９９８））。上述の脂質組成物を脂質Ａと複合体化して、そしてリン脂質に対する抗体応答を誘導する免疫原として用いてもよい（Ｓｃｈｕｓｔｅｒら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １２２：９００−９０５（１９７９））。好ましい配合物は、Ｓｃｈｕｓｔｅｒら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １２２：９００−９０５（１９７９）にしたがった、脂質Ａと複合体化された、６０：３０：１０の比のＰＯＰＣ：ＰＯＰＳ：Ｃｈを含む。こうした配合物に含まれるのに適したペプチドには、限定されるわけではないが、２Ｆ５−ＧＴＨ１、４Ｅ１０−ＧＴＨ１、ＳＰ８９２６−ＧＴＨ１、およびＳＰ８９２８−ＧＴＨ１が含まれる。
【００２９】
ペプチド対総脂質の最適比は、例えば、ペプチドおよびリポソームによって多様でありうる。実施例３のペプチドに関しては、１：４２０の比が好適であった。
上述のリポソームを、β２糖タンパク質１の組換えドメインＶと混合して、このドメインに対する抗体を誘発してもよい。
【００３０】
標準的技術を用いて、リポソーム−ペプチド・コンジュゲートを調製してもよい（以下の実施例３および４も参照されたい）。
本発明のペプチド−リポソーム免疫原を、頑強な抗体応答を促進する脂質Ａ、ｏＣｐＧ、ＴＲＬ４アゴニストまたはＴＬＲ７アゴニストなどのアジュバントとともに配合してもよいし、そして／または投与してもよい（Ｒａｏら，  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ８２（５）：５２３（２００４））。使用可能な他のアジュバントにはミョウバンおよびＱ５２１（存在するＢ細胞寛容を中断しないもの）が含まれる。好ましい配合物は、Ｂ細胞寛容の型を中断するように設計されたアジュバント、例えばＥｍｕｌｓｉｇｅｎ（水中油エマルジョン）などの油エマルジョン中のｏＣｐＧを含む（Ｔｒａｎら，  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １０９（３）：２７８−２８７（２００３））。さらなる適切なアジュバントには、２００５年１２月１４日出願の１１／３０２，５０５に記載されるものが含まれ、該出願に開示されるＴＲＬアゴニストが含まれる。
【００３１】
ペプチド−リポソーム免疫原を、例えば、ＩＶ、鼻内、皮下、腹腔内、膣内、または直腸内投与してもよい。投与経路は、例えば、患者、コンジュゲートおよび／または求める効果によって多様であり、同様に投与措置によって多様でありうる。ペプチド−リポソーム免疫原は予防的使用に好ましいが、感染個体への投与はウイルス負荷を減少させうる。
【００３２】
以下の実施例３に記載するように、ペプチド−リポソーム・コンジュゲートをＭＰＥＲ特異的Ｂ細胞応答の検出のための試薬として用いてもよい。例えば、ペプチド−リポソーム構築物を、検出可能標識、例えばフルオレセインなどの蛍光標識とコンジュゲート化してもよい。フルオレセイン−コンジュゲート化リポソームを、曝露されたＭＰＥＲ領域を提示するＨＩＶ−１  Ｅｎｖタンパク質で免疫された宿主における抗ＭＰＥＲ特異的Ｂ細胞応答の検出のための試薬として、フローサイトメトリーアッセイで用いてもよい。これらの試薬を用いて、末梢血Ｂ細胞を研究して、免疫後の循環メモリーＢ細胞数を測定することによって、抗ＭＰＥＲ抗体誘導のための免疫有効性を決定してもよい。以下の実施例に提示するデータは、名目上のエピトープペプチド脂質コンジュゲートに対するＨＩＶ−１クラスターＩＩモノクローナル抗体の結合に関連するコンホメーション変化が、ＨＩＶ−１中和と相関することを示す（実施例５を参照されたい）。
【００３３】
ＨＩＶが、ＨＩＶに対して免疫系をブラインドにすることによって、宿主免疫応答をエスケープするように進化してきたのであれば、他の感染性病原体が同様に進化してきた可能性もあることが、前記を読むと理解されるであろう。すなわち、これは、エスケープの一般的機構を代表しうる。もしそうであれば、本明細書記載のものと匹敵するアプローチは、こうした他の病原体の治療に十分に有用であると予期されうる。
【００３４】
本発明の特定の側面が、以下の限定されない実施例により詳細に記載される（Ｍａｋｓｙｕｔｏｖら，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  Ｄｅｃ；  ３１  Ｓｕｐｐｌ  １：Ｓ２６−３８（２００４）、米国出願２００４０１６１４２９、およびＨａｙｎｅｓら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０８：１９０６（２００５）もまた参照されたい）。
【００３５】
本出願は、２００７年６月２２日出願の米国出願第１１／８１２，９９２号、２００７年４月１３日出願の米国出願第１１／７８５，０７７号、２００６年４月１２日出願のＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１３６８４、２００５年４月１２日出願の米国仮出願第６０／６７０，２４３号、２００５年４月２７日出願の米国仮出願第６０／６７５，０９１号、２００５年７月１２日出願の米国仮出願第６０／６９７，９９７号、および２００６年１月１０日出願の米国仮出願第６０／７５７，４７８号に関連し、これら出願の前内容は、本明細書に援用される。
【実施例】
【００３６】
実施例１
広範反応性中和抗体を誘導可能なＨＩＶ−１免疫原の設計は、ＨＩＶ−１ワクチン開発の大きな目的である。ＨＩＶ−１を広範に中和する稀なヒトｍａｂが存在する一方、ＨＩＶ−１エンベロープ免疫原は、これらの抗体特異性を誘導しない。この研究において、２つの最も広範に反応性であるＨＩＶ−１エンベロープｇｐ４１ヒトｍａｂ、２Ｆ５および４Ｅ１０は、カルジオリピンと反応性である多重特異性自己抗体であることが立証された。したがって、ｇｐ４１膜近位エピトープが自己抗原を模倣しているため、現在のＨＩＶ−１ワクチンは、膜近位ｇｐ４１エピトープに対する抗体を誘導しない可能性もある。
【００３７】
実験詳細
モノクローナル抗体。Ｍａｂ  ２Ｆ５、２Ｇ１２、および４Ｅ１０を、記載されるように産生した（Ｓｔｅｉｇｌｅｒら，  ＡＩＤ  Ｒｅｓ．  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  １７：１７５７（２００１）、Ｐｕｒｔｓｃｈｅｒら，  ＡＩＤＳ  １０：５８７（１９９６）、Ｔｒｋｏｌａら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７０：１１００（１９９６））。ＩｇＧ１ｂ１２（Ｂｕｒｔｏｎら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：１０２４−１０２７（１９９４））は、Ｄｅｎｎｉｓ  Ｂｕｒｔｏｎ、Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、カリフォルニア州ラホヤの寛大な贈り物であった。Ｍａｂ  ４４７−５２Ｄ（Ｚｏｌｌａ−Ｐａｚｎｅｒら，  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌ．  ２０：１２５４（２００４））を、ＡＩＤＳ試薬貯蔵所、ＮＩＡＩＤ、ＮＩＨから得た。表１中のｍａｂの残りは、ＨＩＶ−１感染被験体から産生され、そしてこれらを、記載されるように用いた（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら，  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌ．  ６：５６７（１９９０）、Ｂｉｎｌｅｙら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７８：１３２３２（２００４））。
【００３８】
自己抗体アッセイ。抗カルジオリピンＥＬＩＳＡを、記載されるように用いた（ＤｅＲｏｅら，  Ｊ．  Ｏｂｓｔｅｔ．  Ｇｙｎｅｃｏｌ．  Ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｎｕｒｓ．  ５：２０７（１９８５）、Ｈａｒｒｉｓら，  Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ６８：２１５（１９８７））。ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、およびスフィンゴミエリン（すべて、Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイスから購入した）に対するｍａｂ反応性に関してアッセイするため、同様のＥＬＩＳＡを適応させた。ＳＳ−Ａ／Ｒｏ、ＳＳ−Ｂ／Ｌａ、Ｓｍ、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）、Ｓｃｌ−７０、Ｊｏ−１、二重鎖（ｄｓ）ＤＮＡ、セントロメアＢ、およびヒストンに対するｍａｂ反応性に関して、Ｔｈｅ  Ｌｕｍｉｎｅｘ    ＡｔｈｅＮＡ  Ｍｕｌｔｉ−Ｌｙｔｅ  ＡＮＡ試験（Ｗａｍｐｏｌｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ニュージャージー州プリンストン）を用いた。アッセイしたＭａｂ濃度は、１５０μｇ、５０μｇ、１５μｇ、および５μｇ／ｍｌであった。各濃度（アッセイあたり、それぞれ、０．１５μｇ、０．０５μｇ、０．０１５μｇ、および０．００５μｇ）１０μｌを、Ｌｕｍｉｎｅｘ蛍光ビーズとインキュベーションし、そして製造者の仕様書にしたがって、試験を実行した。表１中の値は、試験あたり０．１５μｇを添加したアッセイ結果である。さらに、ＳＳ−Ａ／Ｒｏ（ＩｍｍｕｎｏＶｉｓｉｏｎ、アリゾナ州スプリングデール）およびｄｓＤＮＡ（Ｉｎｏｖａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、カリフォルニア州サンディエゴ）に関するＥＬＩＳＡもまた用いて、これらの自己抗原特異性を確認した。対比染色としてＥｖａｎｓ  Ｂｌｕｅを、そしてＦＩＴＣ−コンジュゲート化ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｚｅｕｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ニュージャージー州ラリタン）を用い、Ｈｅｐ−２スライド上で間接免疫蛍光を用いて、ヒト上皮Ｈｅｐ−２細胞に対する反応性を決定した。Ｎｉｋｏｎ  Ｏｐｔｉｐｈｏｔ蛍光顕微鏡上で、スライドの写真を撮影した。比濁法によって、リウマトイド因子測定を実行した（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ，  Ｉｎｃ（デラウェア州ニューアーク）。記載されるような活性化部分トロンボプラスチン（ａＰＴＴ）および希釈ラッセルクサリヘビ（Ｒｕｓｓｅｌｌ  ｖｉｐｅｒ）毒試験によって、ループス性抗凝固因子アッセイを実行した（ＭｏｌｌおよびＯｒｔｅｌ，  Ａｎｎ．  Ｉｎｔ．  Ｍｅｄ．  １２７：１７７（１９９７））。ループス性抗凝固因子アッセイのため、４０μｌの１ｍｇ／ｍｌの２Ｆ５、４Ｅ１０および対照ｍａｂを、プールした正常血漿に添加した（最終ｍａｂ濃度、２００μｇ／ｍｌ）。抗β２糖タンパク質−１アッセイは、ＥＬＩＳＡ（Ｉｎｏｖａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，  Ｉｎｃ．）であった。ｄｓＤＮＡ、ＳＳ−Ａ／Ｒｏ、ＳＳ−Ｂ／Ｌａ、Ｓｍ、ＲＮＰおよびヒストンに対する血清抗体は、ＳＬＥ患者で生じ；セントロメアＢおよびｓｃｌ−７０（トポイソメラーゼＩ）に対する血清抗体は全身性硬化症で見出され；そしてＪｏ−１に対する抗体は、多発性筋炎と関連して見出される（ＲｏｓｅおよびＭａｃＫａｙ，  Ｔｈｅ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，  第３版  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ���リフォルニア州サンディエゴ（１９９８））。
【００３９】
結果
ｍａｂ  ２Ｆ５および４Ｅ１０、２つのさらなる稀な広範反応性中和ｍａｂ（２Ｇ１２およびＩｇＧ１ｂ１２）、および３１の一般的な抗ＨＩＶ−１  Ｅｎｖヒトｍａｂｓと、カルジオリピン（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら，  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌ．  ６：５６７（１９９０））との反応性を決定した（表１）。２Ｆ５および４Ｅ１０はどちらもカルジオリピンと反応したが、３３の他のｍａｂはすべて陰性であった。Ｍａｂ  ２Ｆ５はまた、ＳＳ−Ａ／Ｒｏ、ヒストンおよびセントロメアＢ自己抗原とも反応し、一方、ｍａｂ  ４Ｅ１０は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）自己抗原、ＳＳ−Ａ／Ｒｏと反応した。２Ｆ５および４Ｅ１０はどちらも、散在性の細胞質および核パターンで、Ｈｅｐ−２ヒト上皮細胞と反応した（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら，  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌ．  ６：５６７（１９９０））（図２）。したがって、２Ｆ５および４Ｅ１０はどちらも、多重特異性自己反応性によって特徴付けられる。
【００４０】
表１．
【００４１】
【表１】
2010523676.tif 000002
【００４２】
Ｋｕ３２  ｍａｂがＳｍと反応したことを除いて、すべてのＭａｂは、Ｌａ（ＳＳＢ）、Ｓｍ、Ｓｃｌ−７０およびＪｏ−１との反応性に関するアッセイにおいて陰性であった。Ｒｏ（ＳＳＡ）、ｄｓＤＮＡ、セントロメアＢ、ヒストンおよびカルジオリピン抗体価は、標準曲線に基づいた相対的単位である。−＝陰性。
【００４３】
２つの他の稀な中和ｍａｂのうち、一方のｍａｂ、２Ｇ１２は自己反応性でなかったが、もう一方のＣＤ４結合部位に対するｍａｂ、ＩｇＧ１ｂ１２（Ｓｔｉｅｇｌｅｒら，  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．  Ｈｕｍ．  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  １７：１７５７（２００１））は、リボ核タンパク質、ｄｓＤＮＡ、およびセントロメアＢと、ならびにＨｅｐ−２細胞と、細胞質および核パターンで反応した（表１および図２）。研究した３１のより一般的な抗ＨＩＶ−１  ｍａｂのうち、ＣＤ４結合部位近傍に結合特異性を持つ２つのｍａｂ（Ａ３２、１．４Ｇ）および非中和ｇｐ４１エピトープに対するｍａｂ（２．２  Ｂ）のみが、多重反応性の証拠を示した（表１）。
【００４４】
２Ｆ５および４Ｅ１０が、ＳＬＥ関連抗リン脂質症候群で見られる血栓形成促進性抗カルジオリピン抗体に類似であるかどうかを決定するため（Ｂｕｒｔｏｎら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：１０２４−１０２７（１９９４））、両方のｍａｂを、ループス性抗凝固因子活性に関して、そしてプロトロンビン（ＰＴ）、ベータ−２糖タンパク質−１、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、およびスフィンゴミエリン（ＳＭ）に結合する能力に関して試験した（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら，  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌ．  ６：５６７（１９９０））。２Ｆ５は、これらの反応性に関して陰性であったが、４Ｅ１０はループス抗凝固因子反応性を有し、そしてＰＳ、ＰＣ、ＰＥと強く反応し、ＳＭおよびＰＴと弱く反応し、そしてβ２糖タンパク質−１との反応は陰性であった（図３を参照されたい）。
【００４５】
抗カルジオリピン抗体は、自己免疫疾患または感染のため、免疫制御が混乱した患者で見出されうる（Ｂｕｒｔｏｎら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：１０２４−１０２７（１９９４））。抗カルジオリピン自己抗体は、梅毒、ハンセン病、リーシュマニア症、エプスタイン・バー・ウイルス、およびＨＩＶ−１によって誘導される（Ｂｕｒｔｏｎら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：１０２４−１０２７（１９９４））。ＳＬＥで見出される抗カルジオリピン抗体とは異なり、「感染性」抗カルジオリピン抗体は、めったに血栓形成促進性でなく、そして一過性である。したがって、４Ｅ１０は、自己免疫疾患における抗カルジオリピン抗体と同様であり、そして２Ｆ５は、感染性疾患における抗カルジオリピン抗体と同様である。
【００４６】
長いＣＤＲ３長を持つ自己反応性Ｂ細胞クローンは通常、除去されるか、または自己抗原に対して寛容にされる（Ｚｏｌｌａ−Ｐａｚｎｅｒら，  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌ．  ２０：１２５４（２００４））。したがって、ＨＩＶ−１は、自己抗体エピトープの模倣体として保存される中和エピトープを有することによって、膜近位抗体応答をエスケープするように進化してきた可能性もある。これらのデータによって、現在のＨＩＶ−１ワクチンは、頑強な膜近位抗エンベロープ中和抗体をルーチンには誘導せず、これはこれらのエピトープをターゲットとする抗体が、通常は除去されるか、またはＨＩＶ−１  Ｅｎｖによる抗原刺激に際して寛容にされる、自己反応性Ｂ細胞クローンに由来するためであると示唆される。これらの観察はまた、こうしたクローンを除去不能である可能性もあるＳＬＥ患者において、ＨＩＶ−１の発生が稀であることも説明しうる（Ｆｏｘら，  Ａｒｔｈ．  Ｒｈｕｍ．  ４０：１１６８（１９９７））。
【００４７】
実施例２
自己抗原として、カルジオリピン（層状および六方晶相）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ＰＯＰＳ）（層状および六方晶相）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）（層状相）、およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）（六方晶相）を用いて、本発明の自己抗原が、中和抗体の産生を誘導する能力を研究した。モルモット（群あたり４匹）を、１０；ｇのｏＣｐＧ中のリン脂質（カルジオリピン層状相、カルジオリピン六方晶相、ＰＯＰＳ層状相、ＰＯＰＳ六方晶相、ＰＯＰＥ層状相またはＤＯＰＥ六方晶相）で、各免疫を２週間ずつ離して、４回免疫した。４回のリン脂質免疫後、１０：ｇのｏＣｐＧと１００：ｇのＭ群コンセンサスＥｎｖ、ＣＯＮ−Ｓ  ｇｐ１４０ＣＦＩオリゴマー（すなわち図４Ａに示すタンパク質のＣＦＩ型）を用いて、ＩＰで最終免疫を行った。
【００４８】
以下に記載するように、ＴＭＺ細胞におけるＥｎｖ偽型中和アッセイを用いて、中和アッセイを実行した（Ｗｅｉら，  Ｎａｔｕｒｅ  ４２２：３０７−３１２（２００３）、Ｄｅｒｄｅｙｎら，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７４：８３５８−８３６７（２０００）、Ｗｅｉら，  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ４６：１８９６−１９０５（２００２）、Ｐｌａｔｔら，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７２：２８５５−２８６４（１９９８）、Ｍａｓｃｏｌａら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７９：１０１０３−１０１０７（２００５））：
細胞培養
ＴＺＭ−ｂｌは、接着細胞株であり、そしてこれをＴ−７５培養フラスコ中で維持する。完全増殖培地（ＧＭ）は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、熱不活化）およびゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を補ったＤ−ＭＥＭからなる。トリプシン／ＥＤＴＡでの処理によって、細胞単層を破壊し、そして除去する：
ＴＺＭ−ｂｌ細胞単層を破壊するためのトリプシン−ＥＤＴＡ処理：集密（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）状態で、ルーチン維持のために細胞を分割する際、そしてアッセイ用に細胞を調製する際、トリプシン／ＥＤＴＡでの処理によって、Ｔ−７５培養フラスコ中に維持した細胞単層を破壊しそして除去する。
【００４９】
１．  培地をデカントし、そして６ｍｌの滅菌ＰＢＳで単層をリンスすることによって、残った血清を除去する。
２．  細胞単層を覆うように、２．５ｍｌの０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液をゆっくりと添加する。室温で３０〜４５秒間インキュベーションする。トリプシン溶液をデカントし、そして３７℃で４分間インキュベーションする。細胞が剥離するのを待つ間、フラスコを叩いたりまた振盪したりすることによって細胞を攪拌してはならない。
【００５０】
３．  １０ｍｌのＧＭを添加し、そして穏やかにピペット操作することによって細胞を懸濁する。細胞を計数する。
４．  １５ｍｌのＧＭ中、新しいＴ−７５培養フラスコにおよそ１０６細胞を植え付ける。培養を、５％ＣＯ２／９５％空気環境において、３７℃でインキュベーションする。細胞はおよそ３日ごとに分割しなければならない。
【００５１】
ウイルスストック
クローニングされていないウイルスのストックを、ＰＢＭＣまたはＴ細胞株いずれかで産生してもよい。２９３Ｔ細胞などの適切な細胞種にトランスフェクションすることによって、偽ウイルスを産生してもよい。すべてのウイルスストックは、低速遠心分離およびろ過（０．４５ミクロン）によって細胞不含にして、そして２０％ＦＢＳを含有するＧＭ中、−８０℃で保存すべきである。
【００５２】
ＴＣＩＤ５０測定
中和アッセイを行う前に、ＴＺＭ−ｂｌ細胞中、単細胞感染アッセイ（２日インキュベーション）において、各ウイルスストックのＴＣＩＤ５０を測定する必要がある。ＴＣＩＤ５０アッセイにおいて、陽性感染を定量化する際には、２．５倍バックグラウンドＲＬＵのカットオフ値を用いる。
【００５３】
中和アッセイにおいて、ウイルスがあまりにも多いと、強いウイルス誘導性細胞変性効果が生じて、正確な測定に干渉する可能性もある。大部分のウイルスストックは、少なくとも１０倍希釈して、細胞殺傷を回避しなければならない。ウイルス誘導性細胞変性効果を最小限にしつつ、ウイルス感染性において２対数の減少を測定する能力を維持するため、中和アッセイのために２００  ＴＣＩＤ５０の標準的接種物を選択した。異なる株は、その細胞変性性が有意に多様であることに注目しなければならない。光学顕微鏡法のもとで、合胞体形成を視覚的に検査することによって、ウイルス誘導性細胞変性効果を監視してもよい。細胞変性効果はまた、ＴＣＩＤ５０アッセイにおける高ウイルス用量での発光の減少としても観察可能である。
【００５４】
中和抗体アッセイプロトコル
注１：別に明記しない限り、加湿３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中ですべてのインキュベーションを行った。
【００５５】
注２：  １μＭインジナビルを含有するＤＥＡＥ−ＧＭ中で、複製コンピテントウイルスを用いたアッセイを行う。
１．  ９６ウェル平底培養プレートの形式を用いて、第１列のすべてのウェルにＧＭ  １５０μｌを入れる（細胞対照）。第２〜１１列のすべてのウェルに１００μｌを入れる（第２列はウイルス対照になるであろう）。第３〜１２列、第Ｈ行のすべてのウェルにさらに４０μｌを入れる（試験試料を受け取るため）。
【００５６】
２．  １１μｌの試験試料を第３および４列、第Ｈ行の各ウェルに添加する。１１μｌの第二の試験試料を第５および６列、第Ｈ行の各ウェルに添加する。１１μｌの第三の試験試料を第７および８列、第Ｈ行の各ウェルに添加する。１１μｌの第四の試験試料を第９および１０列、第Ｈ行の各ウェルに添加する。１１μｌの第五の試験試料を第１１および１２列、第Ｈ行の各ウェルに添加する。第Ｈ行の試料を混合し、そして５０μｌを第Ｇ行にトランスファーする。第Ａ行まで、試料のトランスファーおよび希釈を反復する（これらは連続３倍希釈である）。最後のトランスファーおよび混合が完了した後、第３〜１２列、第Ａ行のウェルから、殺菌剤の廃棄物容器中に、５０μｌを廃棄する。
【００５７】
３．  周囲温度水槽中に入れることによって、必要な数のウイルス・バイアルを融解する。完全に融解したら、ＧＭ中でウイルスを希釈して、４，０００ＴＣＩＤ５０／ｍｌの濃度を達成する。
【００５８】
ウイルスの細胞不含ストックをあらかじめ調製し、そしておよそ１ｍｌの作業アリコットで凍結保存しなければならない。
４．  第２〜１２列、第Ａ〜Ｈ行のすべてのウェルに、細胞不含ウイルス５０μｌ（２００  ＴＣＩＤ５０）を分注する。各トランスファー後にピペット操作によって混合する。各トランスファー間で、４０ｍｌ滅菌ＰＢＳを含有する試薬貯蔵所中でピペットチップをリンスして、キャリー・オーバーを回避する。
【００５９】
５．  プレートを覆い、そして１時間インキュベーションする。
６．  ＤＥＡＥデキストラン（３７．５μｇ／ｍｌ）を含有するＧＭ中、１ｘ１０５細胞／ｍｌの密度で、ＴＺＭ−ｂｌ細胞の懸濁物を調製する（使用およそ１０〜１５分前にトリプシン処理する）。１００μｌの細胞懸濁物（ウェルあたり１０，０００細胞）を第１〜１２列、第Ａ〜Ｈ行中の各ウェルに分注する。各トランスファー間で、滅菌ＰＢＳが充填された試薬貯蔵所中でピペットチップをリンスして、キャリー・オーバーを回避する。ＤＥＡＥデキストランの最終濃度は１５μｇ／ｍｌである。
【００６０】
７．  プレートを覆い、そして４８時間インキュベーションする。
８．  各ウェルから培地１５０μｌを除去し、およそ１００μｌを残す。１００μｌのＢｒｉｇｈｔ  ＧｌｏＴＭ試薬を各ウェルに分注する。室温で２分間インキュベーションして、完全な細胞溶解を可能にする。ピペット操作（少なくとも２回の動作）によって混合し、そして対応する９６ウェル黒プレートに１５０μｌをトランスファーする。ルミノメーター中でプレートを直ちに読み取る。
【００６１】
９．  試験ウェル（細胞＋血清試料＋ウイルス）および細胞対照ウェル（細胞のみ、第１列）間の平均ＲＬＵ相違を計算し、この結果をウイルス対照（細胞＋ウイルス、第２列）および細胞対照ウェル（第１列）間の平均ＲＬＵ相違で割り、１から引いてそして１００を乗じることによって、中和パーセントを決定する。ＲＬＵを５０％減少させるのに必要な血清希釈の逆数として、中和抗体力価を表す。
【００６２】
図５に示すように、ＤＯＰＥ（六方晶相）を投与された動物は、１７０の中和力価を有した。
実施例３
免疫原設計
疎水性リンカー（ＧＴＨ１）に連結されたｍＡｂ  ２Ｆ５および４Ｅ１０の名目上のエピトープそれぞれを含むペプチド配列を合成し、そして合成リポソーム内に包埋した（図６）。脂質二重層の遠位端に２Ｆ５および４Ｅ１０エピトープ配列を持つ第一世代の免疫原を設計した（図６Ａ）。これらの構築物は、それぞれのエピトープに対するｍＡｂの拘束されないアクセスを提供した。２Ｆ５および４Ｅ１０  ｍＡｂエピトープ配列が疎水性リンカーの近位に連結された、ＭＰＥＲ領域の天然配向を模倣する、第二世代構築物が設計されている（図６Ａ、６Ｂ）。
【００６３】
合成リポソームの組成は、クロロホルム中に溶解された、以下のリン脂質、ＰＯＰＣ（１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＰＯＰＥ（１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＭＰＡ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート）、およびコレステロールを含んだ（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（アラバマ州アラバスター）より購入）。
【００６４】
クロロホルム耐性試験管中、適切なモル量のリン脂質（ＰＯＰＣ：ＰＯＰＥ：ＤＭＰＡ：Ｃｈ＝４５：２５：２０：１０）を分注することによって、合成リポソームを調製した。ボルテックスによってリン脂質を混合し、そして穏やかな窒素流のもとに、ドラフト中で混合物を乾燥させた。高圧下で脂質を保存する（１５時間）ことによって、クロロホルムのいかなる残渣も除去した。ＰＢＳまたはＴＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４を添加し、そして３７℃で１０〜３０分間インキュベーションしつつ、断続的に勢いよくボルテックスしてリン脂質を再懸濁することによって、リン脂質の水性懸濁物を調製した。次いで、リン脂質の乳白色の均質な懸濁物を、超音波処理装置槽（Ｍｉｓｏｎｉｘ  Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ  ３０００、Ｍｉｓｏｎｉｘ  Ｉｎｃ．、ニューヨーク州ファーミングデール）で超音波処理した。超音波処理装置は、周期あたり総超音波処理４５秒間の３連続周期を実行するようにプログラミングされた。各周期には、５秒間の超音波パルス（７０ワット出力）、その後の１２秒間のパルスオフ期が含まれた。超音波処理終了時、層状リポソームの懸濁物を４℃で保存した。
【００６５】
ＨＩＶ−１  ＭＰＥＲペプチドＧＴＨ１−２Ｆ５およびＧＴＨ１−４Ｅ１０（図６）を７０％クロロホルム、３０％メタノール中に溶解した。４５：２５：２０：１０（ＰＯＰＣ：ＰＯＰＥ：ＤＭＰＡ：コレステロール）のモル比で、脂質のクロロホルム溶液をペプチド溶液に添加した。各ペプチドを、１：４２０のペプチド：総リン脂質比に添加した。混合物を上述のようにボルテックスし、次いで乾燥させ、そして再懸濁した。
【００６６】
ＢＡｃｏｒｅ  Ｌ１センサーチップ上にリポソームを捕捉して、疎水性リンカーを介した脂質二重層の固定を可能にした後、各ペプチド−脂質コンジュゲートに対するｍＡｂ結合の特異性を試験する結合アッセイを行った。合成リポソーム、またはペプチド−脂質コンジュゲートのいずれかを含む各センサー表面上に、２Ｆ５、４Ｅ１０および対照ｍＡｂ（Ａ３２または１７ｂ）を注入し、そしてＢＩＡｃｏｒｅ  ３０００装置上で結合を監視した（図８〜１１）。
【００６７】
免疫戦略
免疫戦略は、寛容の一時的な中断を可能にする措置を取り込んだ。プロトコルは、マウスにおける抗ｄｓＤＮＡ抗体の産生のため、寛容を中断するために用いられてきているＴＬＲ９リガンドであるｏＣｐＧの使用を伴う（Ｔｒａｎら，  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １０９（３）：２７８−２８７（２００３））。ペプチド−リポソーム・コンジュゲートを、ＥｍｕｌｓｉｇｅｎにｏＣｐＧを加えたアジュバントと混合した（１：１）。３７５μＬのＥｍｕｌｓｉｇｅｎ、２５０μＬのｏＣｐＧおよび６２５μＬの生理食塩水を混合することによって、Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ混合アジュバント（２ｘ）を調製した。各モルモットを、２１日間隔で、２５０μｇのペプチドのみまたは等量のペプチドを含むペプチド−リポソーム・コンジュゲートのいずれかで免疫した。初回免疫、そして続く免疫各々の前に、血清試料を前採血として採取した。ペプチドエピトープに対する結合に関してＥＬＩＳＡアッセイ（図１２）によって、そしてウイルス中和アッセイ（表２）のため、血清試料を分析した。図１２中のデータは、ＧＴＨ１−４Ｅ１０リポソームで免疫した２匹のモルモット由来の血清の４Ｅ１０ペプチドに対する強い反応性を示し、一方、４Ｅ１０ペプチド免疫動物由来の血清においては、低レベルの反応性しか観察されなかった。陽性血清はまた、どちらも、ＨＩＶ−１  ＭＮ株も中和した（表２）。
【００６８】
【表２】
2010523676.tif 000003
【００６９】
抗原特異的Ｂ細胞応答の検出におけるペプチド−リポソーム・コンジュゲートの適用
上述のペプチド−リポソーム・コンジュゲートは、ＭＰＥＲ特異的Ｂ細胞応答の検出用の試薬として利用されてきている。脂質組成物中にフルオレセイン−ＰＯＰＥを取り込むことによって、ペプチド−リポソーム構築物（２Ｆ５および４Ｅ１０）をフルオレセインとコンジュゲート化した。フルオレセイン−ＰＯＰＥを４５：５５の比で非コンジュゲート化ＰＯＰＥと混合し、そして次いで、上述のようなモル比で、残りの脂質と混合した。ＢＩＡｃｏｒｅ結合アッセイにおいて、フルオレセインとコンジュゲート化された２Ｆ５および４Ｅ１０−ペプチド−リポソームはどちらも、それぞれのｍＡｂに対する結合特異性を保持した（図１１）。
【００７０】
実施例４
ペプチド−脂質コンジュゲートの生成。クロロホルム中に溶解されたリン脂質、ＰＯＰＣ（１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン）、ＰＯＰＥ（１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジル・エタノールアミン）；ＤＭＰＡ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート）、およびコレステロールをＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（アラバマ州アラバスター）より購入した。クロロホルム耐性試験管中で、適切なモル量のリン脂質を分注することによって、リン脂質リポソームを調製した。モル比４５：２５：２０：１０（ＰＯＰＣ：ＰＯＰＥ：ＤＭＰＡ：コレステロール）で、脂質のクロロホルム溶液をペプチド溶液に添加した。ＨＩＶ−１膜近位ペプチドを７０％クロロホルム、３０％メタノール中に溶解した。各ペプチドを１：４２０のペプチド：総リン脂質のモル比まで添加した。穏やかにボルテックスすることによってリン脂質を混合し、そして穏やかな窒素流のもとに、ドラフト中で混合物を乾燥させた。高圧下で脂質を保存する（１５時間）ことによって、クロロホルムのいかなる残渣も除去した。ＰＢＳまたはＴＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４を添加し、そしてＴｍより高い温度で１０〜３０分間維持しつつ、断続的に勢いよくボルテックスしてリン脂質を再懸濁することによって、リン脂質の水性懸濁物を調製し、その後、超音波処理装置槽（Ｍｉｓｏｎｉｘ  Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ  ３０００、Ｍｉｓｏｎｉｘ  Ｉｎｃ．、ニューヨーク州ファーミングデール）で超音波処理した。超音波処理装置は、周期あたり総超音波処理４５秒間の３連続周期を実行するようにプログラミングされた。各周期には、５秒間の超音波パルス（７０ワット出力）、その後の１２秒間のパルスオフ期が含まれた。超音波終了時、層状リポソームの懸濁物を４℃で保存し、そしてＢＩＡｃｏｒｅセンサーチップ上で捕捉する前に、上述のように再び超音波処理した。
【００７１】
ペプチド−脂質コンジュゲートの設計。ペプチドを合成し、そして逆相ＨＰＬＣによって精製し、そして質量分析によって純度を確認した。この研究で用いられるペプチドには、以下が含まれる−ＨＩＶ−１  ｇｐ４１  ２Ｆ５エピトープペプチド−２Ｆ５−ＧＴＨ１（ＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬＥＬＤＫＷＡＳＬＷＮ−ＹＫＲＷＩＩＬＧＬＮＫＩＶＲＭＹＳ）；およびＨＩＶ−１  ｇｐ４１  ４Ｅ１０エピトープペプチド−４Ｅ１０−ＧＴＨ１（ＳＬＷＮＷＦＮＩＴＮＷＬＷＹＩＫ−ＹＫＲＷＩＩＬＧＬＮＫＩＶＲＭＹＳ）。リポソームに取り込まれるべきさらなるペプチドには−ＳＰ８９２６−ＧＴＨ１（ＥＱＥＬＬＥＬＤＫＷＡＳＬＷＮ−ＹＫＲＷＩＩＬＧＬＮＫＩＶＲＭＹＳ）；およびＳｐ８９２８−ＧＴＨ１（ＫＷＡＳＬＷＮＷＦＤＩＴＮＷＬ−ＹＫＲＷＩＩＬＧＬＮＫＩＶＲＭＹＳ）が含まれる。
【００７２】
ペプチド−脂質コンジュゲート。これらのペプチドは各々：
ｉ）ＰＯＰＣ：ＰＯＰＥ：ＤＭＰＡ：コレステロール
ｉｉ）ＰＯＰＣ：ＰＯＰＳ
ｉｉｉ）ＰＯＰＣ：ＰＯＰＳ：リゾＰＣ
ｉｖ）ＰＯＰＣ：ＰＯＰＥ：スフィンゴミエリン：コレステロール
を含む多様な組成の合成リポソーム内に取り込まれるであろう。
【００７３】
リポソームは、モノホスホリル脂質Ａ（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）を伴いおよび伴わずに複合体化されるであろう。
実施例５
ストレプトアビジンをコーティングしたＢＩＡｃｏｒｅセンサーチップ（ＳＡ）上にビオチン化２Ｆ５名目上エピトープペプチド（ＳＰ６２）を係留し、そして２Ｆ５  ｍａｂまたは２Ｆ５  Ｆａｂのいずれかをペプチド表面上に注入した。ＨＲ−１ペプチド対照表面上の非特異的シグナルを減じた後、２Ｆ５  ｍＡｂ（４６．６〜１８００ｎＭ）または２Ｆ５  Ｆａｂ（１２０〜２０００ｎＭ）の特異的結合を得た。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトフェアを用いて、単純ラングミュア等式に対する全体的曲線適合後、Ｋｄを計算した。図１３に示すデータは、ペプチドエピトープに対するＭＰＥＲ  ｍＡｂ結合が、単純なモデル（ラングミュア等式）に適合することを示す。
【００７４】
２Ｆ５ペプチド−脂質（図１４、左パネル）または４Ｅ１０ペプチド−脂質コンジュゲートのいずれかの約６００ＲＵを、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｌ１センサーチップに係留し、そして次いで、２Ｆ５  ｍＡｂまたは４Ｅ１０  ｍＡｂを１００：ｇ／ｍＬで注入した。曲線適合分析によって、ペプチド−脂質コンジュゲートに結合した両Ｍａｂの結合は、２段階コンホメーション変化様式にしたがうことが示される（図１４）。重ね合わせ各々において、結合データを黒で示し、そしてこのデータは、観察される総結合応答に相当する。実験的に決定した速度定数から、遭遇（ｅｎｃｏｕｎｔｅｒ）複合体（赤色）およびドッキング（ｄｏｃｋｅｄ）複合体（青色）の構成要素曲線をシミュレーションした。
【００７５】
エンベロープｇｐ１４０オリゴマーをＢＩＡｃｏｒｅ  ＣＭ５チップ上に係留し、そして図１５に示すｍＡｂ各々を、各Ｅｎｖ表面上に注入した。ヒト・クラスターＩＩ  ｍＡｂ、９８−６、１２６−６、および１６７−Ｄは、Ｅｎｖ  ｇｐ１４０に強く結合し、一方、非中和性ネズミＭＰＥＲ  ｍＡｂ、２Ｆ５、および４Ｅ１０との結合は検出されなかった。
【００７６】
脂質リンカーとの疎水性相互作用を通じて、合成リポソーム（ＰＣ：ＰＥ；緑色）、またはカルジオリピン（赤色）をＢＩＡｃｏｒｅＬ１センサーチップ上に係留した（図１６）。示すｍＡｂ（５００ｎＭ）各々を、脂質表面各々およびブランク対照表面上に注入した。クラスターＩＩ  ｍＡｂ  ９８−６および１６７−Ｄの強い結合、ならびにｍＡｂ  １２６−６の中程度の結合が示される（図１６Ａ〜Ｃ）。いずれの脂質に対しても抗ＭＰＥＲ  ｍＡｂ  １３Ｈ１１の結合はまったく観察されなかった。
【００７７】
２Ｆ５−ペプチド（ＳＰ６２）脂質コンジュゲートをＢＩＡｃｏｒｅ  Ｌ１表面に係留し、そしてｍＡｂ  ９８−６、１６７−Ｄまたは１２６−６に対する結合を監視した（図１７Ａ）。Ｍａｂ  ９８−６は、ペプチド−脂質コンジュゲートに強く結合し、一方、ｍＡｂ  １６７−Ｄおよび１２６−６では比較的より低いアビディティーの結合が検出された。曲線適合分析は、２Ｆ５（図１７Ｂ）および９８−６（図１７Ｃ）の結合に関連する２段階コンホメーション変化を示す；一方、ｍＡｂ  １６７−Ｄ（図１７Ｄ）および１２６−６（図１７Ｅ）の結合は、単純なモデル（ラングミュア等式）にしたがった。
【００７８】
表３に示すデータは、２５Ｆおよび他の原型抗ＭＰＥＲクラスターＩＩ  ｍＡｂの結合および中和特性を示す。直鎖エピトープペプチドに強く結合し、そして２段階コンホメーション変化モデルにしたがうｍＡｂ  ２Ｆ５および９８−６のみが、ＰＢＭＣアッセイにおいて、ＨＩＶ−１を中和した。
【００７９】
【表３】
2010523676.tif 000004
【００８０】
実施例６
抗リン脂質症候群の患者由来のヒト・モノクローナル抗体（ＣＬ１、ＩＳ４およびＩＳ６と称される）が研究されてきている（表４を参照されたい）（Ｇｉｌｅｓら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７７：１７２９−１７３６（２００６）、Ｚｈｕら，  Ｂｒｉｔ．  Ｊｏｕｒ．  Ｈａｅｍａｔｏｌ．  １０５：１０２−１０９（１９９９）、Ｃｈｕｋｗｕｏｃｈａら，  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３９：２９９−３１１（２００２）、Ｚｈｕら，  Ｂｒｉｔ．  Ｊｏｕｒ．  Ｈａｅｍａｔｏｌ．  １３５：２１４−２１９（２００６）、Ｐｉｅｒａｎｇｅｌｉら，  Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｈａｅｍｏｓｔ．  ８４：３８８−３９５（２０００）、Ｌｉｎら，  Ａｒｔｈ  Ｒｈｅｕｍ    ５６：１６３８（２００７）、Ａｌａｍら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７８：４４２４−４４３５（２００７）、Ｚｈａｏら，  Ａｒｔｈ．  Ｒｈｅｕｍ．  ４２：２１３２−２１３８（１９９９）、Ｌｕら，  Ａｒｔｈ．  Ｒｈｅｕｍ．  ５２：４０１８−４０２７（２００５））。ＩＳ４およびＩＳ６は病原性抗脂質抗体であり、一方、ＣＬ１は非病原性抗脂質自己抗体である（表４）。これらの抗体はいずれも、ビリオン−細胞融合によって初期感染を反映する偽ウイルス阻害アッセイにおいて、ＨＩＶ偽ウイルスを中和しなかった（Ｌｉら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７９：１０１０８−２５（２００５））（表５）が、これらの抗体３つすべては、ＨＩＶのエンドサイトーシスに依存し、そしてｉｎ  ｖｉｖｏのＣＤ４細胞のＨＩＶ感染性を反映するＰＢＭＣ  ＨＩＶ中和アッセイにおいて、ＨＩＶ−１を中和した（表６）。ＣＬ１がＨＩＶを中和することは：ａ）ヒトはＨＩＶを中和する非病原性抗脂質抗体を作製可能であり、そしてｂ）ＣＬ１は、ＨＩＶ感染被験体の治療のために、あるいはＨＩＶまたはＨＩＶ感染物質への針、性的または他の曝露後、被験体の曝露後予防の状況において、療法Ｍａｂとして安全に使用可能な抗体であるという事実を証明する。
【００８１】
【表４】
2010523676.tif 000005
【００８２】
【表５】
2010523676.tif 000006
【００８３】
【表６】
2010523676.tif 000007
【００８４】
Ａｌｖｉｎｇおよび同僚らは、ホスファチジルイノシトールリン酸に対してマウスｍａｂを作製し、そして該ｍａｂがＰＢＭＣアッセイにおいてＨＩＶを中和することを示した（Ｗａｓｓｅｆら，  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２１：８６３−８６８（１９８４）、Ｂｒｏｗｎら，  Ｖｉｒｏｌ．  ８１：２０８７−２０９１（２００７）、Ｂｅｃｋら，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．  ３５４：７４７−７５１（２００７））。本研究が示すのは、ヒトが自発的に抗脂質抗体を作製可能であり、そしてこれらの抗体が、前例のない方式で、ＨＩＶを広範に中和可能であることである。
【００８５】
要約すると、自己免疫疾患患者は、ウイルス感染細胞に結合し、そしておそらくＨＩＶ膜および宿主膜に対する反応性のために、出芽ＨＩＶビリオンに結合する抗体を作製可能である。自己免疫疾患患者由来の特定の抗脂質抗体はまた、エンベロープ三量体とも反応可能である（ＩＳ６など）が、すべての抗体が三量体とも反応するのではない（すなわちＣＬ１およびＩＳ４は反応しない）。したがって、ＨＩＶエンベロープとの反応性は、これらの抗体において中和の必要条件ではない。
【００８６】
これらの研究はまた、ｇｐ４１脂質複合体を用いて、ヒトにおいてＣＬ１様抗体産生を安全に刺激することが可能でありうることも立証する（Ａｌａｍら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７８：４４２４−４４３５（２００７）、Ｓｃｈｕｓｔｅｒら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １２２：９００−９０５（１９８４））。
【００８７】
実施例７
図１８に示すＴｏｌｌ様受容体リガンドをｇｐ４１  ＭＰＥＲペプチド免疫原を含むリポソーム型に配合した。
【００８８】
ＭＰＥＲペプチドリポソームを含有する脂質ＡおよびＲ−８４８の構築は、膜係留アミノ酸配列を有するＭＰＥＲペプチド、ならびに合成脂質、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（ＤＭＰＡ）、およびコレステロールを、それぞれ、モル分率０．２１６、４５．００、２５．００、２０．００および１．３３で同時可溶化する方法を利用した。適切な量のＭＰＥＲペプチドを、クロロホルム−メタノール混合物（７：３ｖ／ｖ）中に溶解し、脂質Ａをクロロホルム中に溶解するかまたはＲ−８４８をメタノール中に溶解し、適切な量のリン脂質のクロロホルムストックを、窒素流中で乾燥させ、その後、一晩真空乾燥させた。押出技術を用いて、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中で、乾燥ペプチド−脂質フィルムから、リポソームを作製した。ＭＰＥＲペプチドリポソームと複合体化されたオリゴ−ＣｐＧの構築は、ＰＯＰＣの代わりに、陽イオン性脂質、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＰＯＥＰＣ）を用いた。ペプチド免疫原を含有する陽イオン性リポソームを、所望の用量に適した量のｏＣｐＧストック溶液（１ｍｇ／ｍｌ）と混合することによって、ｏＣｐＧのコンジュゲート化を行った。
【００８９】
図１９に示す設計図は、異なるＴＬＲアジュバント；ＴＬＲ４（脂質Ａ）；ＴＬＲ９（ｏＣｐＧ）およびＴＬＲ７（Ｒ８４８）を含有するペプチド−リポソームを示す。
ペプチド−リポソーム構築物中のエピトープに対する２Ｆ５  ｍＡｂの結合に関するＢｉａｃｏｒｅアッセイによって、ＴＬＲアジュバントの取り込みまたはコンジュゲート化が、ＨＩＶ中和抗体２Ｆ５の結合に影響を及ぼさないことを明らかにした。ｍＡｂ  ２Ｆ５および４Ｅ１０両方の強い結合が観察された（図２０を参照されたい）。
【００９０】
実施例８
膜貫通ドメインに先行するＨＩＶ−１  ｇｐ４１膜近位外部領域が、広範中和性抗体２Ｆ５および４Ｅ１０のターゲットである。ＭＰＥＲペプチドが、膜界面、ならびに抗体２Ｆ５および４Ｅ１０の脂質反応性に分割されるという事実が、広範中和性ｇｐ４１  ＭＰＥＲ抗体の誘導のための候補免疫原として、ＭＰＥＲペプチド−リポソーム・コンジュゲートの設計につながった。ここで用いたペプチド−リポソーム・コンジュゲート化戦略は、２Ｆ５および４Ｅ１０  ｍＡｂ両方のエピトープを含有し、そしてＨＩＶ−１  ｇｐ４１の膜貫通ドメイン（ｇｐ１６０の残基６５６〜７０７）を取り込んでいるＭＰＥＲに対応する合成ペプチド、ＭＰＥＲ６５６−ＴＭＤ（図２１）の設計を伴った。
【００９１】
ＭＰＥＲ６５６−ＴＭＤペプチド−リポソーム・コンジュゲート構築物は、ＭＰＥＲ６５６−ＴＭＤペプチド、ならびに合成脂質、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（ＤＭＰＡ）、およびコレステロールの、それぞれ、モル分率０．４３、４５．００、２５．００、２０．００および１．３３での同時可溶化を伴った。適切な量のＭＰＥＲ６５６−ＴＭＤペプチドをクロロホルム−メタノール混合物（８：２  ｖ／ｖ）中に溶解し、適切な量のリン脂質のクロロホルムストックと混合し、窒素流中で乾燥させ、その後、一晩真空乾燥させた。押出技術を用いて、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中で、乾燥ペプチド−脂質フィルムから、リポソームを作製した。
【００９２】
ＴＭＤリポソーム構築物に対するＭＰＥＲエピトープの提示を評価するため、〜３０００  ＲＵ  ＢＳＡが各フローセル上に固定されたＢｉａｃｏｒｅ  Ｌ−１チップ上に、ＭＰＥＲ６５６−ＧＴＨ１およびペプチド不含合成リポソームを捕捉した（図２２）。
【００９３】
ＭＰＥＲ６５６−ＴＭＤ−リポソーム構築物におけるＭＰＥＲ領域の機能的提示の試験は、図２３に示す、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｌ−１チップ上に固定されたリポソームと２Ｆ５および４Ｅ１０  ｍＡｂの相互作用を検査することを伴った。２Ｆ５  ｍＡｂのペプチド特異的結合後の４Ｅ１０  ｍＡｂの結合またはその逆（図２３）によって、ＭＰＥＲ６５６−ＴＭＤペプチド中に含有されるそれぞれのエピトープの機能的提示が確認された。
【００９４】
したがって、２Ｆ５および４Ｅ１０は、ｇｐ４１  ＭＰＥＲ−ＴＭＤ構築物に強く結合した。したがって、この戦略は、天然ＴＭＤを介して係留されたｇｐ４１  ＭＰＥＲを提示する新規手段を提供する。ＨＩＶ−１  ｇｐ４１  ＭＰＥＲおよび膜貫通ドメインのアミノ酸配列（ｇｐ１６０の残基６５６〜７０７）を含有するＭＰＥＲ６５−ＴＭＤペプチドを用いて、ＭＰＥＲペプチドを合成リポソームに成功裡にコンジュゲート化した。ＭＰＥＲ６５６−ＴＭＤ−リポソーム・コンジュゲートにおける２Ｆ５および４Ｅ１０  ｍＡｂ両方のエピトープの機能的ディスプレイによって、この構築物は、２Ｆ５および４Ｅ１０様抗体の誘導に関して試験すべき、非常に有望な免疫原となっている。
【００９５】
上記に引用するすべての文書および他の情報供給源は、その全体が本明細書に援用される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【国際調査報告】
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