(57)【要約】本発明は、インスリン様成長因子受容体−１（ＩＧＦ−１Ｒ）に結合する抗体、およびその使用に関し、特に、癌の診断および治療における使用に関する。ＩＧＦ−１Ｒが介在する生存促進経路および腫瘍増殖経路を阻害する特定のヒトモノクローナル抗体およびマウスモノクローナル抗体、およびその改変体、フラグメント、および誘導体が提供される。さらに、リガンドであるインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）およびインスリン様成長因子２（ＩＧＦ−２）が、ＩＧＦ−１Ｒに結合するのを相乗的に阻害可能な特定のヒトモノクローナル抗体およびマウスモノクローナル抗体、およびこの抗体のフラグメント、改変体および誘導体が提供される。本発明の抗体は、ＩＧＦ−１Ｒのリガンド結合を、アロステリック効果によって阻害および／または競合的に阻害することによって、このような相乗効果が得られる。2010537985.tif 000083
2010537985.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体、または抗体フラグメントを２種類以上組み合わせて投与する工程を含み、前記２種類以上の抗体、または抗体フラグメントによって、ＩＧＦ−１Ｒシグナル伝達の阻害において、相加効果、相加効果よりも高い効果、または相乗効果が得られる、ＩＧＦ−１Ｒシグナル伝達を阻害する方法。
【請求項２】
前記シグナル伝達が、インビボで阻害される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体、または抗体フラグメントを２種類以上組み合わせて投与する工程を含み、前記２種類以上の抗体、または抗体フラグメントによって、過剰増殖性障害の阻害において、相加効果、相加効果よりも高い効果、または相乗効果が得られる、動物において過剰増殖性障害を治療する方法。
【請求項４】
前記過剰増殖性障害が癌である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記過剰増殖性障害が腫瘍である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記動物がヒトである、請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記２種類以上の抗体、または抗体フラグメントが、少なくとも２種類の異なるＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記２種類以上の抗体、または抗体フラグメントが、ＩＧＦ−１リガンドの結合を阻害する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記２種類以上の抗体、または抗体フラグメントが、ＩＧＦ−２リガンドの結合を阻害する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記２種類以上の抗体、または抗体フラグメントが、ＩＧＦ−１リガンドおよびＩＧＦ−２リガンドの結合を阻害する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記２種類以上の抗体、または抗体フラグメントが、リガンドの結合をアロステリック効果によって阻害する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記２種類以上の抗体、または抗体フラグメントが、リガンドの結合を競合的に阻害する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記２種類以上の抗体、または抗体フラグメントが、リガンドの結合をアロステリック効果によって阻害し、かつ競合的に阻害する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体、または抗体フラグメントを２種類以上組み合わせて投与する工程を含み、この投与によって、前記２種類以上の抗体、または抗体フラグメントのうちいずれか１種類のみを、ほぼ同じである最終的な合計モル濃度で投与する場合よりも効果的にシグナル伝達を阻害する、ＩＧＦ−１Ｒシグナル伝達を阻害する方法。
【請求項１５】
前記シグナル伝達が、インビボで阻害される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体、または抗体フラグメントを２種類以上組み合わせて投与する工程を含み、この投与によって、前記２種類以上の抗体、または抗体フラグメントのうちいずれか１種類のみを、ほぼ同じである最終的な合計モル濃度で投与する場合よりも効果的に過剰増殖性障害を治療する、動物において過剰増殖性障害を治療する方法。
【請求項１７】
前記２種類以上の抗体、または抗体フラグメントを投与することによって、前記２種類以上の抗体、または抗体フラグメントのうちいずれか１種類のみを、ほぼ同じである最終的な合計モル濃度で投与する場合よりも効果的に、ＩＧＦ−１がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを阻害する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記２種類以上の抗体、または抗体フラグメントを投与することによって、前記２種類以上の抗体、または抗体フラグメントのうちいずれか１種類のみを、ほぼ同じである最終的な合計モル濃度で投与する場合よりも効果的に、ＩＧＦ−２がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを阻害する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記２種類以上の抗体、または抗体フラグメントを投与することによって、前記２種類以上の抗体、または抗体フラグメントのうちいずれか１種類のみを、ほぼ同じである最終的な合計モル濃度で投与する場合よりも効果的に、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを阻害する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記２種類以上の抗体、または抗体フラグメントの組み合わせが、
（ａ）ＩＩＩ型フィブロネクチンドメイン１（ＦＮＩＩＩ−１）；
（ｂ）システインに富む繰り返しドメイン（ＣＲＲ）；
（ｃ）ロイシンに富む繰り返しドメイン１（Ｌ１）；
（ｄ）ロイシンに富む繰り返しドメイン１（Ｌ２）；
（ｅ）システインに富む繰り返しドメイン（ＣＲＲ）の中心領域；
（ｆ）ＣＲＲのカルボキシル末端（Ｃ末端）領域；
（ｇ）ＣＲＲのアミノ末端（Ｎ末端）領域；
（ｈ）ＣＲＲの中心領域からＣ末端までと、Ｌ２ドメイン；
（ｉ）ＣＲＲと、Ｌ２領域；
（ｊ）ＩＧＦ−１リガンド結合領域；
（ｋ）ＩＧＦ−２リガンド結合領域；および
（ｌ）（ａ）〜（ｋ）のうち、２つ以上の完全に重複した領域または部分的に重複した領域の任意の組み合わせ
からなる群から選択されるヒトＩＧＦ−１Ｒ領域に存在するＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記２種類以上の抗体、または抗体フラグメントの組み合わせが、
（ａ）配列番号１５８のアミノ酸２４１〜２６６；
（ｂ）配列番号１５８のアミノ酸２４１〜３７９；
（ｃ）配列番号１５８のアミノ酸２４８〜２６５；
（ｄ）配列番号１５８のアミノ酸２４８〜３０３；
（ｅ）配列番号１５８のアミノ酸２４８〜３７９；
（ｆ）配列番号１５８のアミノ酸３０１〜３０８；
（ｇ）配列番号１５８のアミノ酸３２７〜３７９；
（ｈ）配列番号１５８のアミノ酸４２４〜４６４；
（ｉ）配列番号１５８のアミノ酸４３７〜５８７；
（ｊ）配列番号１５８のアミノ酸４４０〜５８６；
（ｋ）配列番号１５８のアミノ酸４５９〜５７１；
（ｌ）配列番号１５８のアミノ酸４６１〜４６４；
（ｌ）配列番号１５８のアミノ酸４６２〜４６４；および
（ｍ）配列番号１５８のアミノ酸４６６〜５６８
からなる群から選択されるヒトＩＧＦ−１Ｒアミノ酸の任意の組み合わせを含む領域に存在するＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記２種類以上の抗体、または抗体フラグメントの組み合わせが、
（ａ）配列番号１５８のアミノ酸２２６；
（ｂ）配列番号１５８のアミノ酸２４１；
（ｃ）配列番号１５８のアミノ酸２４２；
（ｄ）配列番号１５８のアミノ酸２４８；
（ｅ）配列番号１５８のアミノ酸２４９；
（ｆ）配列番号１５８のアミノ酸２５０；
（ｇ）配列番号１５８のアミノ酸２５１；
（ｈ）配列番号１５８のアミノ酸２５４；
（ｉ）配列番号１５８のアミノ酸２５５；
（ｊ）配列番号１５８のアミノ酸２５７；
（ｋ）配列番号１５８のアミノ酸２５９；
（ｌ）配列番号１５８のアミノ酸２６０；
（ｍ）配列番号１５８のアミノ酸２６３；
（ｎ）配列番号１５８のアミノ酸２６５；
（ｏ）配列番号１５８のアミノ酸２６６；
（ｐ）配列番号１５８のアミノ酸３０１；
（ｑ）配列番号１５８のアミノ酸３０３；
（ｒ）配列番号１５８のアミノ酸３０６；
（ｓ）配列番号１５８のアミノ酸３０８；
（ｔ）配列番号１５８のアミノ酸３２７；
（ｕ）配列番号１５８のアミノ酸３７９；
（ｖ）配列番号１５８のアミノ酸４５９；
（ｗ）配列番号１５８のアミノ酸４６０；
（ｘ）配列番号１５８のアミノ酸４６１；
（ｙ）配列番号１５８のアミノ酸４６２；
（ｚ）配列番号１５８のアミノ酸４６４；
（ａａ）配列番号１５８のアミノ酸４６６；
（ｂｂ）配列番号１５８のアミノ酸４６７；
（ｃｃ）配列番号１５８のアミノ酸４７８；
（ｄｄ）配列番号１５８のアミノ酸４８０；
（ｅｅ）配列番号１５８のアミノ酸４８２；
（ｆｆ）配列番号１５８のアミノ酸４８３；
（ｇｇ）配列番号１５８のアミノ酸５３３；
（ｈｈ）配列番号１５８のアミノ酸５６４；
（ｉｉ）配列番号１５８のアミノ酸５６５；
（ｊｊ）配列番号１５８のアミノ酸５６８；
（ｋｋ）配列番号１５８のアミノ酸５７０；および
（ｌｌ）配列番号１５８のアミノ酸５７１
からなる群から選択されるヒトＩＧＦ−１Ｒアミノ酸を含む２種類以上の異なるエピトープに特異的に結合する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
（ａ）ＩＧＦ−１Ｒを、ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体、または抗体フラグメントに曝露する工程と；
（ｂ）前記抗体、または抗体フラグメントを、十分な時間をかけて前記ＩＧＦ−１Ｒと結合させる工程と
を含む、ＩＧＦ−１がＩＧＦ−１Ｒに結合するのをアロステリック効果によって阻害する方法。
【請求項２４】
前記抗体、または抗体フラグメントが、ＩＧＦ−２がＩＧＦ−１Ｒに結合するのは阻害しない、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗体が、
（ａ）Ｐ１Ｅ２および
（ｂ）Ｐ１Ａ２
からなる群から選択される、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
（ａ）ＩＧＦ−１Ｒを、ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体、または抗体フラグメントに曝露する工程と；
（ｂ）前記抗体、または抗体フラグメントを、十分な時間をかけて前記ＩＧＦ−１Ｒと結合させる工程と
を含む、ＩＧＦ−２がＩＧＦ−１Ｒに結合するのをアロステリック効果によって阻害する方法。
【請求項２７】
前記抗体、または抗体フラグメントが、ＩＧＦ−１がＩＧＦ−１Ｒに結合するのは阻害しない、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗体がＰ３Ｆ９である、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
（ａ）ＩＧＦ−１Ｒを、１種以上のＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体、または抗体フラグメントに曝露する工程と；
（ｂ）前記１種以上の抗体、または抗体フラグメントを、十分な時間をかけて前記ＩＧＦ−１Ｒと結合させる工程と
を含む、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２がＩＧＦ−１Ｒに結合するのをアロステリック効果によって阻害する方法。
【請求項３０】
（ａ）ＩＧＦ−１Ｒを、１種以上のＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体、または抗体フラグメントに曝露する工程と；
（ｂ）前記１種以上の抗体、または抗体フラグメントを、十分な時間をかけて前記ＩＧＦ−１Ｒと結合させる工程と
を含む、ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２がＩＧＦ−１Ｒに結合するのをアロステリック効果によって阻害する方法。
【請求項３１】
前記１種以上の抗体が、
（ａ）Ｐ１Ｅ２；
（ｂ）Ｐ１Ａ２；
（ｃ）Ｐ３Ｆ９；
（ｄ）Ｍ１３−Ｃ０６；
（ｅ）Ｍ１４−Ｃ０３；
（ｆ）２０Ｃ８；および
（ｇ）前記抗体の２種類以上の組み合わせ
からなる群から選択される、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
（ａ）ＩＧＦ−１Ｒを、ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体、または抗体フラグメントに曝露する工程と；
（ｂ）前記抗体、または抗体フラグメントを、十分な時間をかけて前記ＩＧＦ−１Ｒと結合させる工程と
を含む、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを競合的に阻害する方法。
【請求項３３】
（ａ）ＩＧＦ−１Ｒを、ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体、または抗体フラグメントに曝露する工程と；
（ｂ）前記抗体、または抗体フラグメントを、十分な時間をかけて前記ＩＧＦ−１Ｒと結合させる工程と
を含む、ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを競合的に阻害する方法。
【請求項３４】
前記抗体がＭ１４−Ｇ１１である、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
（ａ）ＩＧＦ−１Ｒを、ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体、または抗体フラグメントに曝露する工程と；
（ｂ）前記抗体、または抗体フラグメントを、十分な時間をかけて前記ＩＧＦ−１Ｒと結合させる工程と
を含む、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを競合的に阻害し、かつアロステリック効果によって阻害する方法。
【請求項３６】
（ａ）ＩＧＦ−１Ｒを、ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体、または抗体フラグメントに曝露する工程と；
（ｂ）前記抗体、または抗体フラグメントを、十分な時間をかけて前記ＩＧＦ−１Ｒと結合させる工程と
を含む、ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを競合的に阻害し、かつアロステリック効果によって阻害する方法。
【請求項３７】
前記競合的に阻害する抗体がＭ１４−Ｇ１１であり、前記アロステリック効果によって阻害する抗体が、
（ａ）Ｐ１Ｅ２；
（ｂ）Ｐ１Ａ２；
（ｃ）Ｐ３Ｆ９；
（ｄ）Ｍ１３−Ｃ０６；
（ｅ）Ｍ１４−Ｃ０３；
（ｆ）２０Ｃ８；および
（ｇ）前記抗体の２種類以上の組み合わせ
からなる群から選択される１種以上の抗体である、請求項３５または３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２００７年８月２８日に出願された米国特許仮出願第６０／９６８，５４０号の利益を主張する。本出願はまた、２００７年３月２８日に出願された米国特許出願公開第１１／７２７，８８７号と関連しており、この米国特許出願公開第１１／７２７，８８７号は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２００６年３月２８日に出願された米国特許仮出願第６０／７８６，３４７号の利益と、２００６年１２月２２日に出願された米国特許仮出願第６０／８７６，５５４号の利益とを主張する。上に引用した各出願の内容の全ては参照することにより本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
循環血中ＩＧＦ−１濃度が正常値よりも高くなると、乳癌（Ｈａｎｋｉｎｓｏｎら、Ｌａｎｃｅｔ  １９９８．３５１：１３９３−６）、前立腺癌（Ｃｈａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９８．２７９：５６３−６）、肺癌（Ｙｕら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．１９９９．９１：１５１−６）、および結腸直腸癌（Ｍａら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．１９９９．９１：６２０−５）などのいくつかの一般的な癌にかかる危険性が上昇することが、多くの疫学的研究から分かってきている。循環血中ＩＧＦ−２濃度が高まると、子宮内膜癌にかかる危険性が高まることも分かっている（Ｏｈ，Ｊ．Ｃ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ．Ｐｒｅｖ．２００４．１３：７４８−７５２）。一方、ＩＧＦ結合タンパク質の１つであるＩＧＦ−ＢＰ３の濃度が高まることと、癌にかかる危険性とには逆の相関関係があることが分かっている。さらに、癌患者でＩＧＦ濃度が上昇することも分かっている（Ｐｅｙｒａｔら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．１９９３．３５１：１３９３−６、Ｏｈ，Ｊ．Ｃ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ．Ｐｒｅｖ．２００４．１３：７４８−７５２）。
【０００３】
ＩＧＦ系は、細胞増殖、分化、アポトーシスおよび細胞の形質転換の制御に重要な役割を果たしている（Ｊｏｎｅｓら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖ．１９９５．１６：３−３４）。ＩＧＦ系は、インスリン様成長因子受容体１（ＩＧＦ−１Ｒ、ＣＤ２２１）、インスリン様成長因子受容体２（ＩＧＦ−２Ｒ、ＣＤ２２２）という互いに関連しない２種類の受容体と、インスリン様成長因子１という２種類のリガンド（ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２）と、数種類のＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ−１〜ＩＧＦＢＰ−６）とで構成されている。さらに、大きなＩＧＦＢＰプロテアーゼの群（例えば、カスパーゼ、メタロプロテイナーゼ、前立腺特異抗原）は、ＩＧＦに結合したＩＧＦＢＰを加水分解し、ＩＧＦを遊離させ、このＩＧＦが、ＩＧＦ−１ＲおよびＩＧＦ−２Ｒと相互作用する。ＩＧＦ系は、インスリンおよびインスリン受容体（ＩｎｓＲ）とも密接に関連がある（Ｍｏｓｃｈｏｓら、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２００２．６３：３１７−３２、Ｂａｓｅｒｇａら、Ｉｎｔ  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．２００３．１０７：８７３−７７、Ｐｏｌｌａｋら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ．２００４．４：５０５−５１６）。
【０００４】
癌細胞において、チロシンキナーゼ受容体（ＴＫ）は、細胞分裂周期、生存、アポトーシス、遺伝子発現、細胞骨格の構築、細胞の接着および細胞の移動といった多様な細胞機能を制御する細胞内シグナル伝達経路と、細胞外にある腫瘍内微細環境とを繋ぐのに重要な役割を果たす。細胞のシグナル伝達を制御する機構は十分に理解されているため、所定のリガンドの結合度で、シグナル伝達事象に関与する受容体の発現／リサイクリングや、受容体の活性化や、シグナル伝達事象に関与するタンパク質を標的とすることによって、上述の１つ以上の細胞機能を破壊する治療計画が開発され得る（Ｈａｎａｈａｎ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｂｅｒｇ、Ｃｅｌｌ  ２０００．１００：５７−７０）。
【０００５】
Ｉ型のインスリン様成長因子受容体（ＩＧＦ−１Ｒ、ＣＤ２２１）は、チロシンキナーゼ受容体（ＲＴＫ）群に属している（Ｕｌｌｒｉｃｈら、Ｃｅｌｌ．１９９０．、６１：２０３−１２）。ＩＧＦ−１Ｒは、広範囲にわたって発現しており、ＩＧＦ−１ＲのリガンドであるＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２は、出生前および出生後の成長、成長ホルモンへの応答性、細胞の形質転換、生存にきわめて重要な役割を果たし、侵襲性で転移性の腫瘍表現型の獲得に関連付けられている（Ｂａｓｅｒｇａ、Ｃｅｌｌ．１９９４．７９：９２７−３０、Ｂａｓｅｒｇａら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１９９９．２５３：１−６、Ｂａｓｅｒｇａら、Ｉｎｔ  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．２００３．１０７：８７３−７７）。免疫組織化学的研究から、多くのヒト腫瘍で、高濃度のＩＧＦ−１Ｒが発現していることが分かった。
【０００６】
ＩＧＦ−１Ｒの分子構造は、２つの細胞外αサブユニット（１３０〜１３５ｋＤ）と、細胞質のキナーゼ触媒領域を含む２つの膜貫通型βサブユニット（９５ｋＤ）とで構成されている。ＩＧＦ−１Ｒは、インスリン受容体（ＩｎｓＲ）と同様に、共有結合ダイマー（α２β２）構造を有するという点で他のＲＴＫ群とは異なっている。ＩＧＦ−１Ｒは、ＩｎｓＲと構造的にきわめて関連性がある（Ｐｉｅｒｒｅ  Ｄｅ  Ｍｅｙｔｓ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．２００２、１：７６９−８３）。ＩＧＦ−１Ｒは、キナーゼ領域でＩｎｓＲとの配列同一性が８４％であり、一方、膜近傍領域での同一性は６１％であり、Ｎ末端領域での同一性は４４％である（Ｕｌｒｉｃｈら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１９８６、５：２５０３−１２、Ｂｌａｋｅｓｌｅｙら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．、１９９６．７：１５３−５６）。
【０００７】
ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２は、ＩＧＦ−１Ｒの２種類の活性リガンドである。ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２が、ＩＧＦ−１Ｒのα鎖に結合すると、立体構造の変化を引き起こし、特定のチロシン残基で各β鎖の自己リン酸化が起こり、受容体が、リン酸化していない状態から活性状態に変換する。β鎖のキナーゼ領域の活性化ループにある３個のチロシン（１１３１、１１３５および１１３６のＴｙｒ残基）が活性化すると、触媒活性が高まり、ＩＲＳ−１およびＳｈｃアダプタータンパク質のような基質の結合およびリン酸化が開始される。上述の基質が活性化すると、生存に関するシグナル伝達カスケードに関与するさらなるタンパク質（ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ＴＯＲ、Ｓ６）がリン酸化され、および／または増殖に関するシグナル伝達カスケードに関与するさらなるタンパク質（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ、ｐ４２／ｐ４４）がリン酸化される（Ｐｏｌｌａｋら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ．２００４．４：５０５−５１６、Ｂａｓｅｒｇａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔ．１９９７．１３３２：Ｆ１０５−Ｆ１２６、Ｂａｓｅｒｇａら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．２００３．１０７：８７３−７７）。
【０００８】
ＩＧＦ−１ＲとＩｎｓＲとの同一性が高いにもかかわらず、両者の生体での役割は全く異なっていることを示唆する証拠がある。ＩｎｓＲは、グルコース輸送や、グリコーゲンおよび脂肪の生合成のような生理学的機能を制御する鍵物質であるのに対し、ＩＧＦ−１Ｒは、細胞の成長および分化を強く制御する物質である。ＩｎｓＲとは対照的に、ＩＧＦ−１Ｒは、組織に遍在的に発現し、組織内で、成長ホルモン（ＧＨ）の制御下（これはＩＧＦ−１を調整する）、組織成長に何らかの役割を果たす。ＩＧＦ−１Ｒ活性化によって、正常な細胞成長が促進されることが分かっているが、実験で得られた証拠からは、ＩＧＦ−１Ｒが絶対要件ではないことが示唆されている（Ｂａｓｅｒｇａら、Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１９９９．２５３：１−６、Ｂａｓｅｒｇａら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．２００３．１０７：８７３−７７）。
【０００９】
ＩＧＦは、細胞増殖、分化およびアポトーシスの制御に重要な役割を果たす。ＩＧＦ−１Ｒによるシグナル伝達が阻害されると、腫瘍の成長速度が低下し、アポトーシスが高まり、化学療法および他の分子標的療法による殺腫瘍効果が高まることが分かっている（Ｐｏｌｌａｋら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ．２００４．４：５０５−５１６、Ｚｈａｎｇら、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０００．２：１７０−７５、Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００２．６２：２００−０７に掲載）。
【００１０】
腫瘍においてＩＧＦ−１Ｒ機能を阻害するために行われる実験的アプローチは、有望ではあるが成功例が限定されており、癌治療への有効性は、未だ臨床段階で確認する必要がある。実験的アプローチとしては、以下のものが挙げられる。ＩＧＦ−１Ｒ抗体（Ｋｕｌｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８３、２５８：６５６１−６６、Ｋａｌｅｂｉｃら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９４．５４：５５３１−４）、ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２の中和抗体（Ｆｅｎｇら、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ．２００６．５：１１４−２０、Ｍｉｙａｍｏｔｏら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００５、１１：３４９４−５０２）、小分子チロシンキナーゼ阻害剤（Ｇａｒｃｉａ−Ｅｓｃｈｅｖｅｒｒｉａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．２００４．５：２３１−９、Ｓｃｏｔｌａｎｄｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００５．６５：３８６８−７６）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｓｈａｐｉｒｏら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９４．９４：１２３５−４２、Ｗｒａｉｇｈｔら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０００．１８：５２１−２６、Ｓｃｏｔｌａｎｄｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．２００２．９：２９６−０７）、ＩＧＦ−１Ｒのドミナントネガティブ変異体（Ｐｒａｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９９４、９１：２１８１−８５、Ｋａｌｅｂｉｃら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １９９８．７６：２２３−７；Ｓｃｏｔｌａｎｄｉら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．２００２：１０１：１１−６）、ＩＧＦリガンドの類似体（Ｐｉｅｔｒｚｋｏｗｓｋｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９９２．１２：３８８３−８９）、組み換えＩＧＦ結合タンパク質（Ｙｅｅら、Ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．１９９４．５：７３−７７、Ｖａｎ  Ｄｅｎ  Ｂｅｒｇら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．１９９７、３３：１１０８−１１１３；Ｊｅｒｏｍｅら、ＡＡＣＲ  ２００４、Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｏ．５３３４）、ＧＨ放出ホルモンＧＨＲＨのアンタゴニスト（Ｓｚｅｒｅｄａｙら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００３．６３：７９１３−１９、Ｌｅｔｓｈら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００３．１００：１２５０−５５）およびＧＨのアンタゴニスト（Ｋｏｐｃｈｉｃｋら、２００２．Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．２３，  ６２３−４６）。
【００１１】
抗体がＩＧＦ−１Ｒ機能を阻害する性能は、ＩＧＦ−１Ｒのαサブユニットにある未知のエピトープを標的とするマウスモノクローナル抗体（αＩＲ３）で最初に示された（Ｋｕｌｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８３、２５８：６５６１−６６）。その後、ＩＧＦ−１Ｒのαサブユニットの他の抗体が開発され、この抗体が、異なる実験的な癌モデルにおいて、ＩＧＦ−１Ｒ機能を種々の強さで阻害することが示された（Ｍａｌｏｎｅｙら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００３．６３：５０７３−８３、Ｂｕｒｔｒｕｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００３．６３：８９１２−２１、Ｓａｃｈｄｅｖ  Ｄら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００３．６３、６２７−３５、Ｗｕ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００５．１１：３０６５−７４、Ｇｏｅｔｓｃｈら、Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．２００５．１１３：３１６−２８、Ｌｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００５．２８０：１９６６５−７２）。
【００１２】
癌細胞で、ＩＧＦ−１Ｒの活性化は、生存の促進、増殖に関するシグナル伝達に加え、細胞の移動性および侵襲性に関与していることも分かっている（Ｒｅｉｓｓら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２００１．２０：４９０−５００、Ｎｏｌａｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．１９９７．７２：８２８−３４、Ｓｔｒａｃｋｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８９．２６４：２１５４４−４９、Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２００１．２０：７３１８−２５）。
【００１３】
腫瘍細胞は、ＩＧＦ系の１つ以上の要素（ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＧＦ−２ＲおよびＩＧＦ−ＢＰ）を産生することが分かっている。インビトロ試験では、腫瘍細胞がＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２を産生し得ることが示されたが、トランスレーショナル研究では、腫瘍においてＩＧＦ−２の方が関連性が高く、一般的に、発現されるＩＧＦであることが示された。この事象は、腫瘍において、エピジェネティックな変化によって、サイレンシングされたＩＧＦ−２アリルがインプリンティング消失（ＬＯＩ）する結果、ＩＧＦ−２遺伝子の両アレルが発現することによるものである（Ｆｉｅｎｂｅｒｇら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ２００４．４：１４３−５３、Ｇｉｏｖａｎｎｕｃｃｉら、Ｈｏｒｍ．Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｓ．２００３．３５：６９４−０４、Ｄｅ  Ｓｏｕｚａら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．ら、１９９７．  １１：６０−７）。この結果、癌細胞へのＩＧＦ−２供給量が増加し、腫瘍成長を支える微細環境へのＩＧＦ−２供給量が増加する。
【００１４】
ＩＧＦ−１Ｒに高感度の腫瘍は、循環血（肝臓で作られる）由来のＩＧＦ−１および腫瘍由来のＩＧＦ−２の受容体活性化シグナルを受ける。したがって、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２が介在する生体活性を破壊することを目的とするアプローチによって、良好な抗腫瘍反応が得られるはずである。したがって、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２が介在する生体機能を効果的にブロックする抗−ＩＧＦ−１Ｒ抗体を用いる方法は、腫瘍微細環境において、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２が介在するＩＧＦ−１Ｒシグナル伝達に関する生体機能を効果的にブロックできない他のアプローチよりも、効率が高くなり得る。
【００１５】
安全性に関して言えば、ＩＧＦ−１Ｒが遍在的に発現するため、ＩＧＦ−１Ｒを標的とする抗体は、正常組織のＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性によって生じる毒性を避けるために、エフェクター活性が低いか、全くないようにしなくてはならない。上述の抗体を開発する１つの可能性は、ＡＤＣＣ機能およびＣＤＣ機能に介在しないように、ヒトγ４Ｆｃ領域を非グルコシル化形態にすることである。
【００１６】
ＩＧＦ−１Ｒは、癌遺伝子が介在する細胞形質転換に関与している。
【００１７】
ＩＧＦ／ＩＧＦ−１Ｒの活性化は、癌細胞において、マイトジェンおよび生存促進に関するシグナル伝達を介在する。
【００１８】
ＩＧＦ−１Ｒが活性化することによって、細胞の移動および転移も促進される。
【００１９】
ＩＧＦ−１Ｒは、多くの癌で過剰に発現している。
【００２０】
循環血中ＩＧＦ−１濃度が正常値よりも高い個体では、癌を発症する危険性が高い。
【００２１】
多くの癌患者で、ＩＧＦ１およびＩＧＦ２の血漿濃度が上昇している。
【００２２】
ヒト腫瘍は、ＩＧＦ−２を自己分泌増殖因子として産生する。
【００２３】
腫瘍の成長阻害効果は、単一の薬剤でも示されており、化学療法および生体作用薬剤の組み合わせでも示されている。
【００２４】
癌を含む種々の新生物性疾患およびその転移を治療するのに、結合性、効力および安全性が異なるか、または改良されたＩＧＦ−１Ｒ抗体が、当該技術分野で依然として必要とされている。
【発明の開示】
【００２５】
（発明の簡単な概要）
本発明は、ＩＧＦ系が、細胞増殖、分化、アポトーシスおよび細胞の形質転換の制御に重要な役割を果たしていることに基づく。特に、Ｉ型のインスリン様成長因子受容体であるＩＧＦ−１Ｒ、およびそのリガンドであるＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２は、出生前および出生後の成長、成長ホルモンへの応答性、細胞の形質転換、生存にきわめて重要な役割を果たし、侵襲性で転移性の腫瘍表現型の獲得に関連付けられている。本発明は、一般的に、ＩＧＦ−１Ｒ抗体、ＩＧＦ−１Ｒ抗体の抗原結合性を保持したフラグメントまたは誘導体に関する。特定のＩＧＦ−１Ｒ抗体および抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒの機能を阻害するか、またはＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２が介在するＩＧＦ−１Ｒのシグナル伝達に関する生体機能をブロックする。さらに、本発明は、一般的に、癌を含む種々の新生物性疾患および転移、ならびにＩＧＦ−１Ｒシグナル伝達に関連する種々の過剰増殖性疾患、障害または疾病を治療する方法に関する。
【００２６】
いくつかの実施形態では、本発明は、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１およびＭ１２−Ｇ０４からなる群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体フラグメント、またはハイブリドーマが産生するＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２およびＰ１Ｇ１０．２Ｂ８からなる群から選択される参照モノクローナル抗体と同一のＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する抗体の単離物、または抗原結合性を保持したフラグメントを提供する。
【００２７】
いくつかの実施形態では、本発明は、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１およびＭ１２−Ｇ０４からなる群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体フラグメント、またはハイブリドーマが産生するＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２およびＰ１Ｇ１０．２Ｂ８からなる群から選択される参照モノクローナル抗体とＩＧＦ−１Ｒに結合するのを競合的に阻害する、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体の単離物、または抗原結合性を保持したフラグメントを提供する。
【００２８】
いくつかの実施形態では、本発明は、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１およびＭ１２−Ｇ０４からなる群から選択されるモノクローナルＦａｂ抗体と同一の抗原結合領域を含むか、またはハイブリドーマが産生するＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２およびＰ１Ｇ１０．２Ｂ８からなる群から選択されるモノクローナル抗体と同一の抗原結合領域を含む、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体の単離物、または抗原結合性を保持したフラグメントを提供する。
【００２９】
いくつかの実施形態では、本発明は、抗体または抗体フラグメントの重鎖可変領域（ＶＨ）が、配列番号４、配列番号９、配列番号１４、配列番号２０、配列番号２６、配列番号３２、配列番号３８、配列番号４３、配列番号４８、配列番号５３、配列番号５８および配列番号６３からなる群から選択される参照アミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体の単離物、または抗原結合性を保持したフラグメントを提供する。
【００３０】
いくつかの実施形態では、本発明は、抗体または抗体フラグメントの軽鎖可変領域（ＶＬ）が、配列番号６８、配列番号７３、配列番号７８、配列番号８３、配列番号８８、配列番号９３、配列番号９８、配列番号１０３、配列番号１０８、配列番号１１３および配列番号１１８からなる群から選択される参照アミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体の単離物、または抗原結合性を保持したフラグメントを提供する。
【００３１】
いくつかの実施形態では、本発明は、抗体または抗体フラグメントのＶＨが、２０箇所以下のアミノ酸同類置換以外は、配列番号４、配列番号９、配列番号１４、配列番号２０、配列番号２６、配列番号３２、配列番号３８、配列番号４３、配列番号４８、配列番号５３、配列番号５８および配列番号６３からなる群から選択される参照アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体の単離物、または抗原結合性を保持したフラグメントを提供する。
【００３２】
いくつかの実施形態では、本発明は、抗体または抗体フラグメントのＶＬが、２０箇所以下のアミノ酸同類置換以外は、配列番号６８、配列番号７３、配列番号７８、配列番号８３、配列番号８８、配列番号９３、配列番号９８、配列番号１０３、配列番号１０８、配列番号１１３および配列番号１１８からなる群から選択される参照アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含むＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体の単離物、または抗原結合性を保持したフラグメントを提供する。
【００３３】
いくつかの実施形態では、本発明は、抗体または抗体フラグメントのＶＨが、配列番号４、配列番号９、配列番号１４、配列番号２０、配列番号２６、配列番号３２、配列番号３８、配列番号４３、配列番号４８、配列番号５３、配列番号５８および配列番号６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体の単離物、または抗原結合性を保持したフラグメントを提供する。
【００３４】
いくつかの実施形態では、本発明は、抗体または抗体フラグメントのＶＬが、配列番号６８、配列番号７３、配列番号７８、配列番号８３、配列番号８８、配列番号９３、配列番号９８、配列番号１０３、配列番号１０８、配列番号１１３および配列番号１１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体の単離物、または抗原結合性を保持したフラグメントを提供する。
【００３５】
いくつかの実施形態では、本発明は、抗体または抗体フラグメントのＶＨおよびＶＬが、それぞれ、配列番号４および配列番号６８、配列番号８および配列番号７３、配列番号１４および配列番号７８、配列番号２０および配列番号８３、配列番号２６および配列番号８８、配列番号３２および配列番号９３、配列番号３８および配列番号９８、配列番号４３および配列番号１０３、配列番号４８および配列番号１０８、配列番号５３および配列番号１０３、配列番号５８および配列番号１１３、および配列番号６３および配列番号１１８からなる群から選択される参照アミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体の単離物、または抗原結合性を保持したフラグメントを提供する。
【００３６】
いくつかの実施形態では、本発明は、抗体または抗体フラグメントのＶＨおよびＶＬが、２０箇所以下のアミノ酸同類置換以外は、それぞれ、配列番号４および配列番号６８、配列番号８および配列番号７３、配列番号１４および配列番号７８、配列番号２０および配列番号８３、配列番号２６および配列番号８８、配列番号３２および配列番号９３、配列番号３８および配列番号９８、配列番号４３および配列番号１０３、配列番号４８および配列番号１０８、配列番号５３および配列番号１０３、配列番号５８および配列番号１１３、および配列番号６３および配列番号１１８からなる群から選択される参照アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体の単離物、または抗原結合性を保持したフラグメントを提供する。
【００３７】
いくつかの実施形態では、本発明は、抗体または抗体フラグメントのＶＨおよびＶＬが、それぞれ、配列番号４および配列番号６８、配列番号８および配列番号７３、配列番号１４および配列番号７８、配列番号２０および配列番号８３、配列番号２６および配列番号８８、配列番号３２および配列番号９３、配列番号３８および配列番号９８、配列番号４３および配列番号１０３、配列番号４８および配列番号１０８、配列番号５３および配列番号１０３、配列番号５８および配列番号１１３、および配列番号６３および配列番号１１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体の単離物、または抗原結合性を保持したフラグメントを提供する。
【００３８】
いくつかの実施形態では、本発明は、抗体または抗体フラグメントのＶＨが、２箇所以下のアミノ酸同類置換以外は、配列番号５、配列番号１０、配列番号１５、配列番号２１、配列番号２７、配列番号３３、配列番号３９、配列番号４４、配列番号４９、配列番号５４、配列番号５９および配列番号６４からなる群から選択される参照ＶＨ−ＣＤＲ１アミノ酸配列と同一のＫａｂａｔ重鎖相補性決定領域−１（ＶＨ−ＣＤＲ１）のアミノ酸配列を含む、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体の単離物、または抗原結合性を保持したフラグメントを提供する。さらなる実施形態では、ＶＨ−ＣＤＲ１アミノ酸配列は、配列番号５、配列番号１０、配列番号１５、配列番号２１、配列番号２７、配列番号３３、配列番号３９、配列番号４４、配列番号４９、配列番号５４、配列番号５９および配列番号６４からなる群から選択される。
【００３９】
いくつかの実施形態では、本発明は、抗体または抗体フラグメントのＶＨが、４箇所以下のアミノ酸同類置換以外は、配列番号６、配列番号１１、配列番号１６、配列番号２２、配列番号２８、配列番号３４、配列番号４０、配列番号４５、配列番号５０、配列番号５５、配列番号６０および配列番号６５からなる群から選択される参照ＶＨ−ＣＤＲ２アミノ酸配列と同一のＫａｂａｔ重鎖相補性決定領域−２（ＶＨ−ＣＤＲ２）のアミノ酸配列を含む、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体の単離物、または抗原結合性を保持したフラグメントを提供する。さらなる実施形態では、ＶＨ−ＣＤＲ２アミノ酸配列は、配列番号６、配列番号１１、配列番号１６、配列番号２２、配列番号２８、配列番号３４、配列番号４０、配列番号４５、配列番号５０、配列番号５５、配列番号６０および配列番号６５からなる群から選択される。
【００４０】
いくつかの実施形態では、本発明は、抗体または抗体フラグメントのＶＨが、４箇所以下のアミノ酸同類置換以外は、配列番号７、配列番号１２、配列番号１７、配列番号２３、配列番号２９、配列番号３５、配列番号４１、配列番号４６、配列番号５１、配列番号５６、配列番号６１および配列番号６６からなる群から選択される参照ＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と同一のＫａｂａｔ重鎖相補性決定領域−３（ＶＨ−ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体の単離物、または抗原結合性を保持したフラグメントを提供する。さらなる実施形態では、ＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列は、配列番号７、配列番号１２、配列番号１７、配列番号２３、配列番号２９、配列番号３５、配列番号４１、配列番号４６、配列番号５１、配列番号５６、配列番号６１および配列番号６６からなる群から選択される。
【００４１】
いくつかの実施形態では、本発明は、抗体または抗体フラグメントのＶＬが、４箇所以下のアミノ酸同類置換以外は、配列番号６９、配列番号７４、配列番号７９、配列番号８４、配列番号８９、配列番号９４、配列番号９９、配列番号１０４、配列番号１０９、配列番号１１４および配列番号１１９からなる群から選択される参照ＶＬ−ＣＤＲ１アミノ酸配列と同一のＫａｂａｔ軽鎖相補性決定領域−１（ＶＬ−ＣＤＲ１）のアミノ酸配列を含む、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体の単離物、または抗原結合性を保持したフラグメントを提供する。さらなる実施形態では、ＶＬ−ＣＤＲ１アミノ酸配列は、配列番号６９、配列番号７４、配列番号７９、配列番号８４、配列番号８９、配列番号９４、配列番号９９、配列番号１０４、配列番号１０９、配列番号１１４および配列番号１１９からなる群から選択される。
【００４２】
いくつかの実施形態では、本発明は、抗体または抗体フラグメントのＶＬが、２箇所以下のアミノ酸同類置換以外は、配列番号７０、配列番号７５、配列番号８０、配列番号８５、配列番号９０、配列番号９５、配列番号１００、配列番号１０５、配列番号１１０、配列番号１１５および配列番号１２０からなる群から選択される参照ＶＬ−ＣＤＲ２アミノ酸配列と同一のＫａｂａｔ軽鎖相補性決定領域−２（ＶＬ−ＣＤＲ２）のアミノ酸配列を含む、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体の単離物、または抗原結合性を保持したフラグメントを提供する。さらなる実施形態では、ＶＬ−ＣＤＲ２アミノ酸配列は、配列番号７０、配列番号７５、配列番号８０、配列番号８５、配列番号９０、配列番号９５、配列番号１００、配列番号１０５、配列番号１１０、配列番号１１５および配列番号１２０からなる群から選択される。
【００４３】
いくつかの実施形態では、本発明は、抗体または抗体フラグメントのＶＬが、４箇所以下のアミノ酸同類置換以外は、配列番号７１、配列番号７６、配列番号８１、配列番号８６、配列番号９１、配列番号９６、配列番号１０１、配列番号１０６、配列番号１１１、配列番号１１６および配列番号１２１からなる群から選択される参照ＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と同一のＫａｂａｔ軽鎖相補性決定領域−３（ＶＬ−ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体の単離物、または抗原結合性を保持したフラグメントを提供する。さらなる実施形態では、ＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列は、配列番号７１、配列番号７６、配列番号８１、配列番号８６、配列番号９１、配列番号９６、配列番号１０１、配列番号１０６、配列番号１１１、配列番号１１６および配列番号１２１からなる群から選択される。
【００４４】
いくつかの実施形態では、本発明は、抗体または抗体フラグメントのＶＨが、配列番号５、６および７、配列番号１０、１１および１２、配列番号１５、１６および１７、配列番号２１、２２および２３、配列番号２７、２８および２９、配列番号３３、３４および３５、配列番号３９、４０および４１、配列番号４４、４５および４６、配列番号４９、５０および５１、配列番号５４、５５および５６、配列番号５９、６０および６１、ならびに配列番号６４、６５および６６からなる群から選択される、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２およびＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むが、これらのＶＨ−ＣＤＲのうち少なくとも１つについて、１箇所、２箇所、３箇所または４箇所のアミノ酸が置換されている、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体の単離物、または抗原結合性を保持したフラグメントを提供する。
【００４５】
いくつかの実施形態では、本発明は、抗体または抗体フラグメントのＶＨが、配列番号５、６および７、配列番号１０、１１および１２、配列番号１５、１６および１７、配列番号２１、２２および２３、配列番号２７、２８および２９、配列番号３３、３４および３５、配列番号３９、４０および４１、配列番号４４、４５および４６、配列番号４９、５０および５１、配列番号５４、５５および５６、配列番号５９、６０および６１、ならびに配列番号６４、６５および６６からなる群から選択される、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２およびＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体の単離物、または抗原結合性を保持したフラグメントを提供する。
【００４６】
いくつかの実施形態では、本発明は、抗体または抗体フラグメントのＶＬが、配列番号６９、７０および７１、配列番号７４、７５および７６、配列番号７９、８０および８１、配列番号８４、８５および８６、配列番号８９、９０および９１、配列番号９４、９５および９６、配列番号９９、１００および１０１、配列番号１０４、１０５および１０６、配列番号１０９、１１０および１１１、配列番号１１４、１１５および１１６、ならびに配列番号１１９、１２０および１２１からなる群から選択される、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２およびＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むが、これらのＶＨ−ＣＤＲのうち少なくとも１つについて、１箇所、２箇所、３箇所または４箇所のアミノ酸が置換されている、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体の単離物、または抗原結合性を保持したフラグメントを提供する。
【００４７】
いくつかの実施形態では、本発明は、抗体または抗体フラグメントのＶＬが、配列番号６９、７０および７１、配列番号７４、７５および７６、配列番号７９、８０および８１、配列番号８４、８５および８６、配列番号８９、９０および９１、配列番号９４、９５および９６、配列番号９９、１００および１０１、配列番号１０４、１０５および１０６、配列番号１０９、１１０および１１１、配列番号１１４、１１５および１１６、ならびに配列番号１１９、１２０および１２１からなる群から選択される、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２およびＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体の単離物、または抗原結合性を保持したフラグメントを提供する。
【００４８】
上述の抗体または抗体フラグメントの種々の実施形態では、ＶＨフレームワーク領域および／またはＶＬフレームワーク領域は、５箇所以下のアミノ酸置換以外は、ヒトである。
【００４９】
いくつかの実施形態では、上述の抗体または抗体フラグメントは、線形または非線形のエピトープに結合する。
【００５０】
いくつかの実施形態では、上述の抗体または抗体フラグメントは、多価であり、少なくとも２つの重鎖と、少なくとも２つの軽鎖とを含む。
【００５１】
いくつかの実施形態では、上述の抗体または抗体フラグメントは、多重特異性である。さらなる実施形態では、上述の抗体または抗体フラグメントは、二重特異性である。
【００５２】
上述の抗体または抗体フラグメントの種々の実施形態では、重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、完全にヒトである。さらなる実施形態では、重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１およびＭ１２−Ｇ０４からなる群から選択されるモノクローナルＦａｂ抗体フラグメント由来である。
【００５３】
上述の抗体または抗体フラグメントの種々の実施形態では、重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、マウスである。さらなる実施形態では、重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、ハイブリドーマが産生するＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２およびＰ１Ｇ１０．２Ｂ８からなる群から選択されるモノクローナル抗体由来である。
【００５４】
種々の実施形態では、上述の抗体または抗体フラグメントは、ヒト化抗体またはヒト化抗体フラグメントである。種々の実施形態では、上述の抗体または抗体フラグメントは、キメラ抗体またはキメラ抗体フラグメントである。種々の実施形態では、上述の抗体または抗体フラグメントは、霊長類化抗体または霊長類化抗体フラグメントである。種々の実施形態では、上述の抗体または抗体フラグメントは、完全にヒトである。
【００５５】
特定の実施形態では、上述の抗体または抗体フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメントまたはＦｖフラグメントである。
【００５６】
特定の実施形態では、上述の抗体は、単鎖抗体である。
【００５７】
特定の実施形態では、上述の抗体または抗体フラグメントは、ヒトκ定常領域およびヒトλ定常領域からなる群から選択される軽鎖定常領域を含む。
【００５８】
特定の実施形態では、上述の抗体または抗体フラグメントは、重鎖定常領域またはそのフラグメントを含む。さらなる実施形態では、この重鎖定常領域またはそのフラグメントは、ヒトＩｇＧ４である。特定の他の実施形態では、ＩｇＧ４は、突然変異によって糖鎖付加部位が除去されたものである。さらなる実施形態では、ＩｇＧ４の突然変異体は、Ｓ２４１ＰおよびＴ３１８Ａを含む（Ｋａｂａｔ付番システムによる）。
【００５９】
いくつかの実施形態では、上述の抗体または抗体フラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントに特異的に結合するか、またはＩＧＦ−１Ｒポリペプチド改変体に特異的に結合し、親和性を特徴づける解離定数（ＫＤ）が、上述の参照モノクローナル抗体よりも小さい。さらなる実施形態では、解離定数（ＫＤ）は、約５×１０−２Ｍ以下、約１０−２Ｍ以下、約５×１０−３Ｍ以下、約１０−３Ｍ以下、約５×１０−４Ｍ以下、約１０−４Ｍ以下、約５×１０−５Ｍ以下、約１０−５Ｍ以下、約５×１０−６Ｍ以下、約１０−６Ｍ以下、約５×１０−７Ｍ以下、約１０−７Ｍ以下、約５×１０−８Ｍ以下、約１０−８Ｍ以下、約５×１０−９Ｍ以下、約１０−９Ｍ以下、約５×１０−１０Ｍ以下、約１０−１０Ｍ以下、約５×１０−１１Ｍ以下、約１０−１１Ｍ以下、約５×１０−１２Ｍ以下、約１０−１２Ｍ以下、約５×１０−１３Ｍ以下、約１０−１３Ｍ以下、約５×１０−１４Ｍ以下、約１０−１４Ｍ以下、約５×１０−１５Ｍまたは約１０−１５Ｍ以下である。
【００６０】
いくつかの実施形態では、上述の抗体または抗体フラグメントは、マウスＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメント、または非ヒト霊長類ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントよりも、ヒトＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントに選択的に結合する。
【００６１】
特定の他の実施形態では、上述の抗体または抗体フラグメントは、ヒトＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントに結合し、非ヒト霊長類ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントにも結合する。
【００６２】
いくつかの実施形態では、上述の抗体または抗体フラグメントは、細胞表面で発現したＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する。さらなる実施形態では、この細胞は、悪性細胞、新生物性細胞、腫瘍細胞または転移細胞である。
【００６３】
いくつかの実施形態では、上述の抗体または抗体フラグメントは、インスリン様成長因子がＩＧＦ−１Ｒに結合するのをブロックする。さらなる実施形態では、インスリン様成長因子は、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）またはインスリン様成長因子−２（ＩＧＦ−２）である。特定の実施形態では、上述の抗体または抗体フラグメントは、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の双方がＩＧＦ−１Ｒに結合するのをブロックする。  
【００６４】
いくつかの実施形態では、上述の抗体または抗体フラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒが介在する細胞増殖、ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２が介在するＩＧＦ−１Ｒリン酸化、腫瘍細胞成長またはＩＧＦ−１Ｒの内在化を阻害する。
【００６５】
さらなる実施形態では、上述の抗体または抗体フラグメントには、異種ポリペプチドがさらに融合している。
【００６６】
いくつかの実施形態では、上述の抗体または抗体フラグメントは、細胞毒性薬、治療薬、細胞増殖抑制剤、生物毒素、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生体応答修飾物質、医薬品、リンホカイン、異種抗体またはそのフラグメント、検出可能な標識、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびこれらの薬剤の２種以上の組み合わせからなる群から選択される薬剤に接合している。さらなる実施形態では、細胞毒性薬は、放射性核種、生物毒素、酵素によって活性化する毒素、細胞増殖抑制性または細胞毒性性の治療薬、プロドラッグ、免疫学的に活性なリガンド、生体応答修飾物質、または上述の細胞毒性薬の２種以上の組み合わせからなる群から選択される。さらなる実施形態では、検出可能な標識は、酵素、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、放射性標識、または上述の検出可能な標識の２種以上の組み合わせからなる群から選択される。
【００６７】
さらなる実施形態では、本発明は、上述の抗体または抗体フラグメントと、担体とを含む組成物を含む。
【００６８】
本発明の特定の実施形態は、抗体のＶＨポリペプチドをコードする核酸を含む、ポリヌクレオチドの単離物を含む。このＶＨポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号４、配列番号９、配列番号１４、配列番号２０、配列番号２６、配列番号３２、配列番号３８、配列番号４３、配列番号４８、配列番号５３、配列番号５８および配列番号６３からなる群から選択されるアミノ酸配列との同一性が少なくとも９０％であり、このＶＨポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する。さらなる実施形態では、このＶＨポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号４、配列番号９、配列番号１４、配列番号２０、配列番号２６、配列番号３２、配列番号３８、配列番号４３、配列番号４８、配列番号５３、配列番号５８および配列番号６３からなる群から選択される。
【００６９】
特定の実施形態では、このＶＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、このＶＨポリペプチドのアミノ酸配列を変えることなく、発現量が増えるように最適化されている。さらなる実施形態では、最適化は、スプライス供与部位およびスプライス受容部位の特定および除去、および／またはこのポリヌクレオチドを発現する細胞で使用するコドンの最適化を含む。さらなる実施形態では、この核酸は、配列番号３、配列番号８、配列番号１３、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２４、配列番号２５、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３６、配列番号３７、配列番号４２、配列番号４７、配列番号５２、配列番号５７および配列番号６２からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００７０】
いくつかの実施形態では、本発明は、抗体のＶＬポリペプチドをコードする核酸を含む、ポリヌクレオチドの単離物を含む。このＶＬポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号６８、配列番号７３、配列番号７８、配列番号８３、配列番号８８、配列番号９３、配列番号９８、配列番号１０３、配列番号１０８、配列番号１１３および配列番号１１８からなる群から選択されるアミノ酸配列との同一性が少なくとも９０％であり、このＶＬポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する。さらなる実施形態では、このＶＬポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号６８、配列番号７３、配列番号７８、配列番号８３、配列番号８８、配列番号９３、配列番号９８、配列番号１０３、配列番号１０８、配列番号１１３および配列番号１１８からなる群から選択される。
【００７１】
特定の実施形態では、このＶＬポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、このＶＬポリペプチドのアミノ酸配列を変えることなく、発現量が増えるように最適化されている。さらなる実施形態では、最適化は、スプライス供与部位およびスプライス受容部位の特定および除去、および／またはこのポリヌクレオチドを発現する細胞で使用するコドンの最適化を含む。さらなる実施形態では、この核酸は、配列番号６７、配列番号７２、配列番号７７、配列番号８２、配列番号８７、配列番号９２、配列番号９７、配列番号１０２、配列番号１０７、配列番号１１２および配列番号１１７からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００７２】
特定の他の実施形態では、本発明は、抗体のＶＨポリペプチドをコードする核酸を含む、ポリヌクレオチドの単離物を提供する。このＶＨポリペプチドのアミノ酸配列は、２０箇所以下の保存アミノ酸置換以外は、配列番号４、配列番号９、配列番号１４、配列番号２０、配列番号２６、配列番号３２、配列番号３８、配列番号４３、配列番号４８、配列番号５３、配列番号５８および配列番号６３からなる群から選択される参照アミノ酸配列と同一であり、このＶＨポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する。
【００７３】
いくつかの実施形態では、本発明は、抗体のＶＬポリペプチドをコードする核酸を含む、ポリヌクレオチドの単離物を提供する。このＶＬポリペプチドのアミノ酸配列は、２０箇所以下の保存アミノ酸置換以外は、配列番号６８、配列番号７３、配列番号７８、配列番号８３、配列番号８８、配列番号９３、配列番号９８、配列番号１０３、配列番号１０８、配列番号１１３および配列番号１１８からなる群から選択される参照アミノ酸配列と同一であり、このＶＬポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する。
【００７４】
いくつかの実施形態では、本発明は、２箇所以下のアミノ酸置換以外は、配列番号５、配列番号１０、配列番号１５、配列番号２１、配列番号２７、配列番号３３、配列番号３９、配列番号４４、配列番号４９、配列番号５４、配列番号５９および配列番号６４からなる群から選択される参照ＶＨ−ＣＤＲ１アミノ酸配列と同一である、ＶＨ−ＣＤＲ１アミノ酸配列をコードする核酸を含む、ポリヌクレオチドの単離物を提供し、このＶＨ−ＣＤＲ１を含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する。さらなる実施形態では、このＶＨ−ＣＤＲ１アミノ酸配列は、配列番号５、配列番号１０、配列番号１５、配列番号２１、配列番号２７、配列番号３３、配列番号３９、配列番号４４、配列番号４９、配列番号５４、配列番号５９および配列番号６４からなる群から選択される。
【００７５】
いくつかの実施形態では、本発明は、４箇所以下のアミノ酸置換以外は、配列番号６、配列番号１１、配列番号１６、配列番号２２、配列番号２８、配列番号３４、配列番号４０、配列番号４５、配列番号５０、配列番号５５、配列番号６０および配列番号６５からなる群から選択される参照ＶＨ−ＣＤＲ２アミノ酸配列と同一である、ＶＨ−ＣＤＲ２アミノ酸配列をコードする核酸を含む、ポリヌクレオチドの単離物を提供し、このＶＨ−ＣＤＲ２を含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する。さらなる実施形態では、このＶＨ−ＣＤＲ２アミノ酸配列は、配列番号６、配列番号１１、配列番号１６、配列番号２２、配列番号２８、配列番号３４、配列番号４０、配列番号４５、配列番号５０、配列番号５５、配列番号６０および配列番号６５からなる群から選択される。
【００７６】
いくつかの実施形態では、本発明は、４箇所以下のアミノ酸置換以外は、配列番号７、配列番号１２、配列番号１７、配列番号２３、配列番号２９、配列番号３５、配列番号４１、配列番号４６、配列番号５１、配列番号５６、配列番号６１および配列番号６６からなる群から選択される参照ＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と同一である、ＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列をコードする核酸を含む、ポリヌクレオチドの単離物を提供し、このＶＨ−ＣＤＲ３を含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する。さらなる実施形態では、このＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列は、配列番号７、配列番号１２、配列番号１７、配列番号２３、配列番号２９、配列番号３５、配列番号４１、配列番号４６、配列番号５１、配列番号５６、配列番号６１および配列番号６６からなる群から選択される。
【００７７】
いくつかの実施形態では、本発明は、４箇所以下のアミノ酸置換以外は、配列番号６９、配列番号７４、配列番号７９、配列番号８４、配列番号８９、配列番号９４、配列番号９９、配列番号１０４、配列番号１０９、配列番号１１４および配列番号１１９からなる群から選択される参照ＶＬ−ＣＤＲ１アミノ酸配列と同一である、ＶＬ−ＣＤＲ１アミノ酸配列をコードする核酸を含む、ポリヌクレオチドの単離物を提供し、このＶＬ−ＣＤＲ１を含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する。さらなる実施形態では、このＶＨ−ＣＤＲ１アミノ酸配列は、配列番号６９、配列番号７４、配列番号７９、配列番号８４、配列番号８９、配列番号９４、配列番号９９、配列番号１０４、配列番号１０９、配列番号１１４および配列番号１１９からなる群から選択される。
【００７８】
いくつかの実施形態では、本発明は、２箇所以下のアミノ酸置換以外は、配列番号７０、配列番号７５、配列番号８０、配列番号８５、配列番号９０、配列番号９５、配列番号１００、配列番号１０５、配列番号１１０、配列番号１１５および配列番号１２０からなる群から選択される参照ＶＬ−ＣＤＲ２アミノ酸配列と同一である、ＶＬ−ＣＤＲ２アミノ酸配列をコードする核酸を含む、ポリヌクレオチドの単離物を提供し、このＶＬ−ＣＤＲ２を含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する。さらなる実施形態では、このＶＬ−ＣＤＲ２アミノ酸配列は、配列番号７０、配列番号７５、配列番号８０、配列番号８５、配列番号９０、配列番号９５、配列番号１００、配列番号１０５、配列番号１１０、配列番号１１５および配列番号１２０からなる群から選択される。
【００７９】
いくつかの実施形態では、本発明は、４箇所以下のアミノ酸置換以外は、配列番号７１、配列番号７６、配列番号８１、配列番号８６、配列番号９１、配列番号９６、配列番号１０１、配列番号１０６、配列番号１１１、配列番号１１６および配列番号１２１からなる群から選択される参照ＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と同一である、ＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列をコードする核酸を含む、ポリヌクレオチドの単離物を提供し、このＶＬ−ＣＤＲ３を含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する。さらなる実施形態では、このＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列は、配列番号７１、配列番号７６、配列番号８１、配列番号８６、配列番号９１、配列番号９６、配列番号１０１、配列番号１０６、配列番号１１１、配列番号１１６および配列番号１２１からなる群から選択される。
【００８０】
いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号５、６および７、配列番号１０、１１および１２、配列番号１５、１６および１７、配列番号２１、２２および２３、配列番号２７、２８および２９、配列番号３３、３４および３５、配列番号３９、４０および４１、配列番号４４、４５および４６、配列番号４９、５０および５１、配列番号５４、５５および５６、配列番号５９、６０および６１、ならびに配列番号６４、６５および６６からなる群から選択される、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２およびＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む抗体のＶＨポリペプチドをコードする核酸を含む、ポリヌクレオチドの単離物を提供し、このＶＨ−ＣＤＲ３を含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する。
【００８１】
いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号６９、７０および７１、配列番号７４、７５および７６、配列番号７９、８０および８１、配列番号８４、８５および８６、配列番号８９、９０および９１、配列番号９４、９５および９６、配列番号９９、１００および１０１、配列番号１０４、１０５および１０６、配列番号１０９、１１０および１１１、配列番号１１４、１１５および１１６、ならびに配列番号１１９、１２０および１２１からなる群から選択される、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２およびＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む抗体のＶＬポリペプチドをコードする核酸を含む、ポリヌクレオチドの単離物を提供し、このＶＬ−ＣＤＲ３を含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する。
【００８２】
いくつかの実施形態では、上述のポリヌクレオチドは、抗体のＶＨポリペプチドまたは抗体のＶＬポリペプチドに融合したシグナルペプチドをコードする核酸をさらに含む。
【００８３】
特定の他の実施形態では、上述のポリヌクレオチドは、ＶＨポリペプチドに融合した重鎖定常領域ＣＨ１領域をコードする核酸、またはＶＨポリペプチドに融合した重鎖定常領域ＣＨ２領域をコードする核酸、またはＶＨポリペプチド融合した重鎖定常領域ＣＨ３領域をコードする核酸、またはＶＨポリペプチドに融合した重鎖ヒンジ領域をコードする核酸をさらに含む。さらなる実施形態では、この重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ４である。特定の他の実施形態では、ＩｇＧ４は、突然変異によって糖鎖付加部位が除去されたものである。さらなる実施形態では、ＩｇＧ４の突然変異体は、Ｓ２４１ＰおよびＴ３１８Ａを含む（Ｋａｂａｔ付番システムによる）。
【００８４】
いくつかの実施形態では、上述のポリヌクレオチドは、上述の抗体のＶＬポリペプチドに融合した軽鎖定常領域をコードする核酸を含む。さらなる実施形態では、この軽鎖定常領域は、ヒトκ領域である。
【００８５】
上述のポリヌクレオチドの種々の実施形態では、上述の核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントは、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１およびＭ１２−Ｇ０４からなる群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体フラグメント、またはハイブリドーマが産生するＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２およびＰ１Ｇ１０．２Ｂ８からなる群から選択される参照モノクローナル抗体と同一のＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する。
【００８６】
上述のポリヌクレオチドの種々の実施形態では、上述の核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントは、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１およびＭ１２−Ｇ０４からなる群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体フラグメント、またはハイブリドーマが産生するＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２およびＰ１Ｇ１０．２Ｂ８からなる群から選択される参照モノクローナル抗体を競合的に阻害する。
【００８７】
上述のポリヌクレオチドの種々の実施形態では、ＶＨポリペプチドまたはＶＬポリペプチドのフレームワーク領域は、５箇所以下のアミノ酸置換以外はヒトである。
【００８８】
上述のポリヌクレオチドの種々の実施形態では、本発明は、核酸によってコードされるポリペプチドを含み、線形または非線形のエピトープに結合する抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントを提供する。
【００８９】
上述のポリヌクレオチドの種々の実施形態では、上述の核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントは、多価であり、少なくとも２つの重鎖と、少なくとも２つの軽鎖とを含む。
【００９０】
上述のポリヌクレオチドの特定の実施形態では、上述の核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントは、多重特異性である。さらなる実施形態では、上述の核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントは、二重特異性である。
【００９１】
上述のポリヌクレオチドの種々の実施形態では、上述の核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、この領域は、完全にヒトである。さらなる実施形態では、この重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１およびＭ１２−Ｇ０４からなる群から選択されるモノクローナルＦａｂ抗体フラグメントの該当領域と同一である。
【００９２】
上述のポリヌクレオチドの特定の実施形態では、上述の核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、この領域は、マウスである。さらなる実施形態では、この重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、ハイブリドーマが産生するＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２およびＰ１Ｇ１０．２Ｂ８からなる群から選択されるモノクローナル抗体の該当領域と同一である。
【００９３】
上述のポリヌクレオチドの種々の実施形態では、上述の核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントは、ヒト化抗体またはヒト化フラグメントである。
【００９４】
上述のポリヌクレオチドの種々の実施形態では、上述の核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントは、霊長類化抗体または霊長類化フラグメントである。
【００９５】
上述のポリヌクレオチドの種々の実施形態では、上述の核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントは、キメラ抗体またはキメラフラグメントである。
【００９６】
上述のポリヌクレオチドのいくつかの実施形態では、上述の核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントは、完全にヒトである。
【００９７】
上述のポリヌクレオチドの種々の実施形態では、上述の核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメントまたはＦｖフラグメントである。上述のポリヌクレオチドの特定の実施形態では、上述の核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントは、単鎖抗体である。
【００９８】
上述のポリヌクレオチドのいくつかの実施形態では、上述の核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントに特異的に結合するか、またはＩＧＦ−１Ｒポリペプチド改変体に特異的に結合し、親和性を特徴づける解離定数（ＫＤ）が、約５×１０−２Ｍ、約１０−２Ｍ、約５×１０−３Ｍ、約１０−３Ｍ、約５×１０−４Ｍ、約１０−４Ｍ、約５×１０−５Ｍ、約１０−５Ｍ、約５×１０−６Ｍ、約１０−６Ｍ、約５×１０−７Ｍ、約１０−７Ｍ、約５×１０−８Ｍ、約１０−８Ｍ、約５×１０−９Ｍ、約１０−９Ｍ、約５×１０−１０Ｍ、約１０−１０Ｍ、約５×１０−１１Ｍ、約１０−１１Ｍ、約５×１０−１２Ｍ、約１０−１２Ｍ、約５×１０−１３Ｍ、約１０−１３Ｍ、約５×１０−１４Ｍ、約１０−１４Ｍ、約５×１０−１５Ｍまたは約１０−１５Ｍ以下である。
【００９９】
上述のポリヌクレオチドのいくつかの実施形態では、上述の核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントは、マウスＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメント、または非ヒト霊長類ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントよりも、ヒトＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントに選択的に結合する。
【０１００】
上述のポリヌクレオチドのいくつかの実施形態では、上述の核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントは、ヒトＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントに結合し、非ヒト霊長類ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントにも結合する。
【０１０１】
上述のポリヌクレオチドのいくつかの実施形態では、上述の核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントは、細胞表面で発現したＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する。さらなる実施形態では、この細胞は、悪性細胞、新生物性細胞、腫瘍細胞または転移細胞である。
【０１０２】
上述のポリヌクレオチドのいくつかの実施形態では、上述の核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントは、インスリン様成長因子がＩＧＦ−１Ｒに結合するのをブロックする。さらなる実施形態では、インスリン様成長因子は、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）またはインスリン様成長因子−２（ＩＧＦ−２）である。上述のポリヌクレオチドの特定の実施形態では、上述の抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の双方がＩＧＦ−１Ｒに結合するのをブロックする。
【０１０３】
上述のポリヌクレオチドのいくつかの実施形態では、上述の核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒが介在する細胞増殖を阻害するか、ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２が介在するＩＧＦ−１Ｒリン酸化を阻害するか、腫瘍細胞成長を阻害するか、またはＩＧＦ−１Ｒの内在化を阻害する。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、上述のポリヌクレオチドは、異種ポリペプチドをコードする核酸をさらに含む。
【０１０５】
上述のポリヌクレオチドのいくつかの実施形態では、上述の核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントは、細胞毒性薬、治療薬、細胞増殖抑制剤、生物毒素、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生体応答修飾物質、医薬品、リンホカイン、異種抗体またはそのフラグメント、検出可能な標識、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびこれらの薬剤の２種以上の組み合わせからなる群から選択される薬剤に接合している。さらなる実施形態では、細胞毒性薬は、放射性核種、生物毒素、酵素によって活性化する毒素、細胞増殖抑制性または細胞毒性性の治療薬、プロドラッグ、免疫学的に活性なリガンド、生体応答修飾物質、または上述の細胞毒性薬の２種以上の組み合わせからなる群から選択される。特定の実施形態では、検出可能な標識は、酵素、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、放射性標識、または上述の検出可能な標識の２種以上の組み合わせからなる群から選択される。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、本発明は、上述のポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。
【０１０７】
特定の他の実施形態では、本発明は、上述のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。さらなる実施形態では、上述のポリヌクレオチドは、プロモーターと作動可能に連結している。さらなる実施形態では、本発明は、上述のベクターを含む宿主細胞を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、上述のポリヌクレオチドがプロモーターと作動可能に連結しているベクターを提供する。
【０１０８】
さらなる実施形態では、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを製造する方法を与え、この方法は、上述のポリヌクレオチドを含むベクターを組み込んだ状態で宿主細胞を培養する工程と、上述の抗体または抗体フラグメントを回収する工程とを含む。さらなる実施形態では、本発明は、上述の方法で製造されたポリペプチドの単離物を提供する。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、本発明は、上述のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの単離物を提供する。
【０１１０】
上述のポリペプチドのさらなる実施形態では、上述のポリペプチドを含む抗体、またはそのフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する。他の実施形態は、上述のポリペプチドを含む抗体の単離物、またはそのフラグメントを含む。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、本発明は、ＶＨをコードするポリヌクレオチドの単離物と、ＶＬをコードするポリヌクレオチドの単離物とを含む組成物を提供し、ここで、ＶＨをコードするポリヌクレオチドおよびＶＬをコードするポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号４および配列番号６８、配列番号８および配列番号７３、配列番号１４および配列番号７８、配列番号２０および配列番号８３、配列番号２６および配列番号８８、配列番号３２および配列番号９３、配列番号３８および配列番号９８、配列番号４３および配列番号１０３、配列番号４８および配列番号１０８、配列番号５３および配列番号１０３、配列番号５８および配列番号１１３、および配列番号６３および配列番号１１８からなる群から選択されるアミノ酸配列との同一性が少なくとも９０％であるアミノ酸をコードする核酸を含み、ＶＨおよびＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する。さらなる実施形態では、ＶＨをコードするポリヌクレオチドおよびＶＬをコードするポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号４および配列番号６８、配列番号８および配列番号７３、配列番号１４および配列番号７８、配列番号２０および配列番号８３、配列番号２６および配列番号８８、配列番号３２および配列番号９３、配列番号３８および配列番号９８、配列番号４３および配列番号１０３、配列番号４８および配列番号１０８、配列番号５３および配列番号１０３、配列番号５８および配列番号１１３、および配列番号６３および配列番号１１８からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸を含む。
【０１１２】
特定の他の実施形態では、本発明は、ＶＨをコードするポリヌクレオチドの単離物と、ＶＬをコードするポリヌクレオチドの単離物とを含む組成物を提供し、ここで、ＶＨをコードするポリヌクレオチドおよびＶＬをコードするポリヌクレオチドは、それぞれ、２０箇所以下の保存アミノ酸置換以外は、配列番号４および配列番号６８、配列番号８および配列番号７３、配列番号１４および配列番号７８、配列番号２０および配列番号８３、配列番号２６および配列番号８８、配列番号３２および配列番号９３、配列番号３８および配列番号９８、配列番号４３および配列番号１０３、配列番号４８および配列番号１０８、配列番号５３および配列番号１０３、配列番号５８および配列番号１１３、および配列番号６３および配列番号１１８からなる群から選択される参照アミノ酸配列と同一の核酸をコードするアミノ酸配列を含み、ＶＨおよびＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する。さらなる実施形態では、ＶＨをコードするポリヌクレオチドは、配列番号５、６および７、配列番号１０、１１および１２、配列番号１５、１６および１７、配列番号２１、２２および２３、配列番号２７、２８および２９、配列番号３３、３４および３５、配列番号３９、４０および４１、配列番号４４、４５および４６、配列番号４９、５０および５１、配列番号５４、５５および５６、配列番号５９、６０および６１、ならびに配列番号６４、６５および６６からなる群から選択される、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２およびＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むＶＨポリペプチドをコードし、ＶＬをコードするポリヌクレオチドは、配列番号６９、７０および７１、配列番号７４、７５および７６、配列番号７９、８０および８１、配列番号８４、８５および８６、配列番号８９、９０および９１、配列番号９４、９５および９６、配列番号９９、１００および１０１、配列番号１０４、１０５および１０６、配列番号１０９、１１０および１１１、配列番号１１４、１１５および１１６、ならびに配列番号１１９、１２０および１２１からなる群から選択される、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２およびＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むＶＬポリペプチドをコードし、ＶＨおよびＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する。
【０１１３】
上述の組成物の種々の実施形態では、ＶＨをコードするポリヌクレオチドは、抗体のＶＨポリペプチドに融合したシグナルペプチドをコードする核酸をさらに含む。
【０１１４】
上述の組成物の種々の実施形態では、ＶＬをコードするポリヌクレオチドは、抗体のＶＬポリペプチドに融合したシグナルペプチドをコードする核酸をさらに含む。
【０１１５】
上述の組成物のいくつかの実施形態では、ＶＨをコードするポリヌクレオチドは、ＶＨポリペプチドに融合した重鎖定常領域ＣＨ１領域をコードする核酸、またはＶＨポリペプチドに融合した重鎖定常領域ＣＨ２領域をコードする核酸、またはＶＨポリペプチドに融合した重鎖定常領域ＣＨ３領域をコードする核酸、またはＶＨポリペプチドに融合した重鎖ヒンジ領域をコードする核酸をさらに含む。さらなる実施形態では、この重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ４である。特定の他の実施形態では、ＩｇＧ４は、突然変異によって糖鎖付加部位が除去されたものである。さらなる実施形態では、ＩｇＧ４の突然変異体は、Ｓ２４１ＰおよびＴ３１８Ａを含む（Ｋａｂａｔ付番システムによる）。
【０１１６】
上述の組成物のいくつかの実施形態では、ＶＬをコードするポリヌクレオチドは、上述の抗体のＶＬポリペプチドに融合した軽鎖定常領域をコードする核酸をさらに含む。さらなる実施形態では、この軽鎖定常領域は、ヒトκ領域である。
【０１１７】
上述の組成物のいくつかの実施形態では、ＶＨおよびＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントは、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１およびＭ１２−Ｇ０４からなる群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体フラグメント、またはハイブリドーマが産生するＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２およびＰ１Ｇ１０．２Ｂ８からなる群から選択される参照モノクローナル抗体と同じＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する。
【０１１８】
上述の組成物のいくつかの実施形態では、ＶＨおよびＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントは、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１およびＭ１２−Ｇ０４からなる群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体フラグメント、またはハイブリドーマが産生するＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２およびＰ１Ｇ１０．２Ｂ８からなる群から選択される参照モノクローナル抗体がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを競合的に阻害する。
【０１１９】
上述の組成物のいくつかの実施形態では、ＶＨポリペプチドおよびＶＬポリペプチドのフレームワーク領域はヒトであるが、但し、アミノ酸の置換は５個以下である。
【０１２０】
上述の組成物のいくつかの実施形態では、ＶＨおよびＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントは、線形または非線形のエピトープに結合する。
【０１２１】
上述の組成物のいくつかの実施形態では、ＶＨおよびＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントは、多価であり、少なくとも２つの重鎖と、少なくとも２つの軽鎖とを含む。
【０１２２】
上述の組成物のいくつかの実施形態では、ＶＨおよびＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントは、多重特異性である。さらなる実施形態では、ＶＨおよびＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントは、二重特異性である。
【０１２３】
上述の組成物のいくつかの実施形態では、ＶＨおよびＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、この領域は、完全にヒトである。さらなる実施形態では、この重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１およびＭ１２−Ｇ０４からなる群から選択されるモノクローナルＦａｂ抗体フラグメントの該当領域と同じである。
【０１２４】
上述の組成物のいくつかの実施形態では、ＶＨおよびＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、この領域は、マウスである。さらなる実施形態では、この重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、ハイブリドーマが産生するＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２およびＰ１Ｇ１０．２Ｂ８からなる群から選択されるモノクローナル抗体の該当領域と同じである。
【０１２５】
上述の組成物のいくつかの実施形態では、上述の核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントは、ヒト化抗体またはヒト化抗体フラグメントである。
【０１２６】
上述の組成物のいくつかの実施形態では、上述の核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントは、霊長類化抗体または霊長類化抗体フラグメントである。
【０１２７】
上述の組成物のいくつかの実施形態では、上述の核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントは、キメラ抗体またはキメラ抗体フラグメントである。
【０１２８】
上述の組成物のいくつかの実施形態では、上述の核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントは、完全にヒトである。
【０１２９】
上述の組成物のいくつかの実施形態では、上述の核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメントまたはＦｖフラグメントである。上述の組成物の特定の実施形態では、上述の核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントは、単鎖抗体である。
【０１３０】
上述の組成物のいくつかの実施形態では、上述の核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントに特異的に結合するか、またはＩＧＦ−１Ｒポリペプチド改変体に特異的に結合し、親和性を特徴づける解離定数（ＫＤ）が、約５×１０−２Ｍ、約１０−２Ｍ、約５×１０−３Ｍ、約１０−３Ｍ、約５×１０−４Ｍ、約１０−４Ｍ、約５×１０−５Ｍ、約１０−５Ｍ、約５×１０−６Ｍ、約１０−６Ｍ、約５×１０−７Ｍ、約１０−７Ｍ、約５×１０−８Ｍ、約１０−８Ｍ、約５×１０−９Ｍ、約１０−９Ｍ、約５×１０−１０Ｍ、約１０−１０Ｍ、約５×１０−１１Ｍ、約１０−１１Ｍ、約５×１０−１２Ｍ、約１０−１２Ｍ、約５×１０−１３Ｍ、約１０−１３Ｍ、約５×１０−１４Ｍ、約１０−１４Ｍ、約５×１０−１５Ｍまたは約１０−１５Ｍ以下である。
【０１３１】
上述の組成物のいくつかの実施形態では、上述の核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントは、マウスＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメント、または非ヒト霊長類ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントよりも、ヒトＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントに選択的に結合する。
【０１３２】
上述の組成物のいくつかの実施形態では、上述の核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントは、ヒトＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントに結合し、非ヒト霊長類ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントにも結合する。
【０１３３】
上述の組成物のいくつかの実施形態では、上述の核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントは、細胞表面で発現したＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する。さらなる実施形態では、この細胞は、悪性細胞、新生物性細胞、腫瘍細胞または転移細胞である。
【０１３４】
上述の組成物のいくつかの実施形態では、上述の核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントは、インスリン様成長因子がＩＧＦ−１Ｒに結合するのをブロックする。さらなる実施形態では、インスリン様成長因子は、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）またはインスリン様成長因子−２（ＩＧＦ−２）である。上述の組成物の特定の実施形態では、上述の抗体または抗体フラグメントは、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の双方がＩＧＦ−１Ｒに結合するのをブロックする。
【０１３５】
上述の組成物のいくつかの実施形態では、上述の核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒが介在する細胞増殖を阻害するか、ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２が介在するＩＧＦ−１Ｒリン酸化を阻害するか、腫瘍細胞成長を阻害するか、またはＩＧＦ−１Ｒの内在化を阻害する。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、上述の組成物、ＶＨをコードするポリヌクレオチド、ＶＬをコードするポリヌクレオチド、またはＶＨをコードするポリヌクレオチドおよびＶＬをコードするポリヌクレオチドの両方は、異種ポリペプチドをコードする核酸をさらに含む。
【０１３７】
上述の組成物のいくつかの実施形態では、上述の核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントは、細胞毒性薬、治療薬、細胞増殖抑制剤、生物毒素、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生体応答修飾物質、医薬品、リンホカイン、異種抗体またはそのフラグメント、検出可能な標識、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびこれらの薬剤の２種以上の組み合わせからなる群から選択される薬剤に接合している。さらなる実施形態では、細胞毒性薬は、放射性核種、生物毒素、酵素によって活性化する毒素、細胞増殖抑制性または細胞毒性性の治療薬、プロドラッグ、免疫学的に活性なリガンド、生体応答修飾物質、または上述の細胞毒性薬の２種以上の組み合わせからなる群から選択される。特定の他の実施形態では、検出可能な標識は、酵素、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、放射性標識、または上述の検出可能な標識の２種以上の組み合わせからなる群から選択される。
【０１３８】
上述の組成物のいくつかの実施形態では、ＶＨをコードするポリヌクレオチドは、第１のベクターに入っており、ＶＬをコードするポリヌクレオチドは、第２のベクターに入っている。さらなる実施形態では、ＶＨをコードするポリヌクレオチドは、第１のプロモーターと作動可能に連結しており、ＶＬをコードするポリヌクレオチドは、第２のプロモーターと作動可能に連結している。特定の他の実施形態では、第１のプロモーターおよび第２のプロモーターは、同じプロモーターを複製したものである。さらなる実施形態では、第１のプロモーターと第２のプロモーターは、同一ではない。
【０１３９】
上述の組成物の種々の実施形態では、第１のベクターおよび第２のベクターは、１個の宿主細胞の中にある。
【０１４０】
上述の組成物の特定の実施形態では、第１のベクターと、第２のベクターとは、別個の宿主細胞の中にある。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、本発明は、上述の宿主細胞を培養する工程と、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを回収する工程を含む、上述の抗体または抗体フラグメントを産生する方法を提供する。
【０１４２】
他の実施形態では、本発明は、別個の宿主細胞を一緒に培養する工程と、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを回収する工程を含む、上述の抗体または抗体フラグメントを産生する方法を提供する。上述の組成物のさらなる実施形態では、本発明は、ＶＨをコードするポリヌクレオチドとＶＬをコードするポリヌクレオチドとを混合する工程と、上述の抗体または抗体フラグメントを回収する工程を提供する。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、本発明は、上述の方法によって産生される、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体または抗体フラグメントを提供する。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、本発明は、ＶＨをコードするポリヌクレオチドとＶＬをコードするポリヌクレオチドとが同じベクター内にある組成物、およびそのベクターを提供する。
【０１４５】
上述のベクターのいくつかの実施形態では、ＶＨをコードするポリヌクレオチドおよびＶＬをコードするポリヌクレオチドは、それぞれプロモーターと作動可能に連結している。
【０１４６】
上述のベクターの種々の実施形態では、ＶＨをコードするポリヌクレオチドおよびＶＬをコードするポリヌクレオチドは、フレーム内で融合しており、これらのポリヌクレオチドと作動可能に連結している１個のプロモーターから一緒に転写され、単鎖抗体または抗原結合性を保持したフラグメントに一緒に翻訳される。
【０１４７】
上述のベクターの種々の実施形態では、ＶＨをコードするポリヌクレオチドおよびＶＬをコードするポリヌクレオチドは、これらのポリヌクレオチドと作動可能に連結している１個のプロモーターから一緒に転写されるものの、翻訳は別個に行われる。さらなる実施形態では、ベクターは、ＩＲＥＳ配列を含んでおり、この配列は、ＶＨをコードするポリヌクレオチドとＶＬをコードするポリヌクレオチドとの間に配置されている。特定の他の実施形態では、ＶＨをコードするポリヌクレオチドとＶＬをコードするポリヌクレオチドは、別個に転写され、それぞれ、別個のプロモーターと作動可能に連結している。さらなる実施形態では、上述の別個のプロモーターは、同じプロモーターを複製したものであるか、または上述の別個のプロモーターは、同一ではない。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、本発明は、上述のベクターを含む宿主細胞を提供する。
【０１４９】
他の実施例では、本発明は、上述の宿主細胞を培養する工程と、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを回収する工程を含む、上述の抗体または抗体フラグメントを産生する方法を提供する。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、本発明は、上述の方法によって産生される、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体または抗体フラグメントを提供する。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、本発明は、（ａ）上述の抗体の単離物、またはそのフラグメントと、（ｂ）医薬的に許容される担体とを含む組成物を、過剰増殖性障害を治療することが必要な動物に投与する工程を含む、動物において過剰増殖性障害を治療する方法を提供する。さらなる実施形態では、過剰増殖性疾患または過剰増殖性障害は、癌、新生物、腫瘍、悪性腫瘍、またはその転移からなる群から選択される。
【０１５２】
上述の方法の種々の実施形態では、上述の抗体または抗体フラグメントは、悪性細胞の表面で発現したＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する。さらなる実施形態では、上述の抗体または抗体フラグメントが悪性細胞に結合することによって、悪性細胞の成長を阻害する。
【０１５３】
上述の方法の種々の実施形態では、上述の抗体または抗体フラグメントは、ＩＧＦが悪性細胞に結合するのを阻害する。さらなる実施形態では、ＩＧＦは、ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２である。
【０１５４】
上述の方法の種々の実施形態では、上述の抗体または抗体フラグメントは、ＩＧＦ−１が悪性細胞に結合するのを阻害するが、ＩＧＦ−２が悪性細胞に結合するのは阻害しない。特定の他の実施形態では、上述の抗体または抗体フラグメントは、ＩＧＦ−２が悪性細胞に結合するのを阻害するが、ＩＧＦ−１が悪性細胞に結合するのは阻害しない。
【０１５５】
上述の方法の種々の実施形態では、上述の抗体または抗体フラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒが悪性細胞に内在化するのを促進する。
【０１５６】
上述の方法の種々の実施形態では、上述の抗体または抗体フラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒリン酸化を阻害するか、または腫瘍細胞の増殖を阻害する。さらなる実施形態では、転移成長を阻止するか、または遅らせることにより、腫瘍細胞の増殖が阻害される。
【０１５７】
上述の方法の種々の実施形態では、上述の抗体または抗体フラグメントは、腫瘍細胞の移動を阻害する。さらなる実施形態では、隣接する組織に腫瘍が広がるのを阻止するか、または遅らせることにより、腫瘍細胞の増殖が阻害される。
【０１５８】
上述の方法の種々の実施形態では、過剰増殖性疾患または過剰増殖性障害は、以下の場所にある新生物である。前立腺、結腸、腹部、骨、胸、消化系、肝臓、膵臓、腹膜、副腎、副甲状腺、下垂体、睾丸、卵巣、胸腺、甲状腺、眼、頭、首、中枢神経系、末梢神経系、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部または尿生殖路。
【０１５９】
上述の方法の種々の実施形態では、過剰増殖性疾患は、癌であり、癌は、扁平上皮細胞癌、黒色腫、白血病、骨髄腫、胃癌、脳癌、肺癌、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、腎癌、前立腺癌、精巣癌、甲状腺癌、および頭頸部癌からなる群から選択される。さらなる実施形態では、癌は、胃癌、腎癌、脳癌、膀胱癌、結腸癌、肺癌、乳癌、膵臓癌、卵巣癌および前立腺癌からなる群から選択される。
【０１６０】
上述の方法の種々の実施形態では、動物は、哺乳動物である。さらなる実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。
【図面の簡単な説明】
【０１６１】
【図１】ＩＧＦ−１Ｒに特異的なＦａｂの結合活性。（Ａ）ＥＬＩＳＡによる、抗−ＩＧＦ−１Ｒ  Ｆａｂ抗体精製物の、組み換えＩＧＦ−１Ｒ−ｈｉｓタンパク質およびＩＧＦ１Ｒ−Ｆｃタンパク質への結合。（Ｂ）フローサイトメトリーによる、抗−ＩＧＦ−１Ｒ  Ｆａｂ抗体精製物の、３Ｔ３で発現したヒトＩＧＦ−１Ｒへの結合。
【図２】ＭＣＦ−７細胞で発現したＩＧＦ−１Ｒに対する、Ｆａｂの結合活性。
【図３】ＭＣＦ７細胞における、抗−ＩＧＦ−１Ｒ  Ｆａｂの（Ａ）ＩＧＦ−１によって誘発されるリン酸化の阻害、（Ｂ）ＩＧＦ−２によって誘発されるリン酸化の阻害。
【図４】ＥＬＩＳＡによる、（Ａ）可溶性ＩＧＦ−１Ｒおよび（Ｂ）ＩＮＳＲに対するＩＧＦ−１Ｒ  Ｆａｂフラグメント抗体の結合。
【図５】Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３およびＭ１４−Ｂ０１の元々のＶＨ鎖およびＶＬ鎖、およびその改変体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列。（Ａ）（配列番号１３）は、重鎖Ｍ１３−Ｃ０６の単鎖ＤＮＡ配列を示す。（Ｂ）（配列番号７７）は、軽鎖Ｍ１３−Ｃ０６の単鎖ＤＮＡ配列を示す。（Ｃ）（配列番号１４）は、重鎖Ｍ１３−Ｃ０６のアミノ酸配列を示す。（Ｄ）（配列番号７８）は、軽鎖Ｍ１３−Ｃ０６のアミノ酸配列を示す。（Ｅ）（配列番号２５）は、重鎖Ｍ１４−Ｃ０３の単鎖ＤＮＡ配列を示す。（Ｆ）（配列番号８７）は、軽鎖Ｍ１４−Ｃ０３の単鎖ＤＮＡ配列を示す。（Ｇ）（配列番号２６）は、重鎖Ｍ１４−Ｃ０３のアミノ酸配列を示す。（Ｈ）（配列番号８８）は、軽鎖Ｍ１４−Ｃ０３のアミノ酸配列を示す。（Ｉ）（配列番号３１）は、重鎖Ｍ１４−Ｇ１１の単鎖ＤＮＡ配列を示す。（Ｊ）（配列番号９２）は、軽鎖Ｍ１４−Ｇ１１の単鎖ＤＮＡ配列を示す。（Ｋ）（配列番号３２）は、重鎖Ｍ１４−Ｇ１１のアミノ酸配列を示す。（Ｌ）（配列番号９３）は、軽鎖Ｍ１４−Ｇ１１のアミノ酸配列を示す。（Ｍ）（配列番号１９）は、重鎖Ｍ１４−Ｂ０１の単鎖ＤＮＡ配列を示す。（Ｎ）（配列番号８２）は、軽鎖Ｍ１４−Ｂ０１の単鎖ＤＮＡ配列を示す。（Ｏ）（配列番号２０）は、重鎖Ｍ１４−Ｂ０１のアミノ酸配列を示す。（Ｐ）（配列番号８３）は、軽鎖Ｍ１４−Ｂ０１のアミノ酸配列を示す。（Ｑ）（配列番号１８）は、配列が最適化された重鎖Ｍ１３−Ｃ０６の単鎖ＤＮＡ配列を示す。（Ｒ）（配列番号１４）は、配列が最適化された重鎖Ｍ１３−Ｃ０６のアミノ酸配列を示す。（Ｓ）（配列番号３０）は、配列が最適化された重鎖Ｍ１４−Ｃ０３の単鎖ＤＮＡ配列を示す。（Ｔ）（配列番号２６）は、配列が最適化された重鎖Ｍ１４−Ｃ０３のアミノ酸配列を示す。（Ｕ）（配列番号３６）は、配列が最適化された重鎖Ｍ１４−Ｇ１１の単鎖ＤＮＡ配列を示す。（Ｖ）（配列番号３２）は、配列が最適化された重鎖Ｍ１４−Ｇ１１のアミノ酸配列を示す。（Ｗ）（配列番号２４）は、配列が最適化された重鎖Ｍ１４−Ｂ０１の単鎖ＤＮＡ配列を示す。（Ｘ）（配列番号２０）は、配列が最適化された重鎖Ｍ１４−Ｂ０１のアミノ酸配列を示す。（Ｙ）（配列番号１５３）は、軽鎖定常領域の単鎖ＤＮＡ配列を示す。（Ｚ）（配列番号１５４）は、軽鎖定常領域のアミノ酸配列を示す。（ＡＡ）（配列番号１５５）は、重鎖ａｇｌｙ．ＩｇＧ４．Ｐ定常領域の単鎖ＤＮＡ配列を示す。（ＢＢ）（配列番号１５６）は、重鎖ａｇｌｙ．ＩｇＧ４．Ｐ定常領域のアミノ酸配列を示す。
【図６】全ヒトＭ１３−Ｃ０６抗体および全ヒトＭ１４−Ｃ０３抗体のＧ４．Ｐ．ａｇｌｙ態様の非還元条件下および還元条件下でのＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析。
【図７】ＥＬＩＳＡによって決定した、抗−ＩＧＦ−１Ｒ抗体の全ヒトＧ４．Ｐ態様（Ａ）およびＧ４．Ｐ．ａｇｌｙ態様（Ｂ）の結合活性。
【図８】（Ａ）ＭＣＦ−７細胞で発現したＩＧＦ−１Ｒに対する全ヒト抗体の結合、（Ｂ）フローサイトメトリーで決定されたＩＧＦ−１Ｒ／３Ｔ３細胞で発現したＩＧＦ−１Ｒに対する全ヒト抗体の結合対３Ｔ３細胞のみに対する全ヒト抗体の結合。ＭＣＦ−７の結合ＥＣ５０は、２．７×１０−１０〜１２×１０−１０ｎＭであった。
【図９】ＲＩＡで決定された全ヒト抗体のＧ４態様が、ＩＧＦ−１Ｒに対する（Ａ）ＩＧＦ−１の結合および（Ｂ）ＩＧＦ−２の結合をブロック（阻害）する能力。
【図１０】（Ａ）全ヒト抗体のＧ４態様による、ＩＧＦ−１に応答するＨ−２３腫瘍細胞の増殖阻害。（Ｂ）全ヒト抗体のＧ４態様による、ＩＧＦ−２に応答するＨ−２３腫瘍細胞の増殖阻害。（Ｃ）全ヒト抗体のＧ４態様による、ＩＧＦ−１に応答するＣａｌｕ−６腫瘍細胞の増殖阻害。
【図１１】Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体、Ｍ１４．Ｃ０３．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体およびＭ１４．Ｇ１１．Ｐ抗体による、（Ａ）ＩＧＦ−１による受容体リン酸化の阻害、および（Ｂ）ＩＧＦ−２による受容体リン酸化の阻害。
【図１２】Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ．による、下流のシグナル伝達の阻害。（Ａ）ホスホＡｋｔ（Ｔｈｒ３０８）を上段に示し、完全Ａｋｔを下段に示した。（Ｂ）Ｔｏｐ  Ｐｈｏｓｐｈｏ  ｐ４４／４２  ＭＡＰＫを上段に示し、完全ｐ４４／４２  ＭＡＰＫを下段に示した。
【図１３】選択したＩＧＦ−１Ｒ  ｍＡｂによる、ＩＧＦ−１が介在する腫瘍細胞の成長阻害。（Ａ）Ｈ２３；（Ｂ）Ｃａｌｕ−６；（Ｃ）Ｐａｎｃ−１；（Ｄ）ＢｘＰＣ３；（Ｅ）ＭａＰａＣａ；および（Ｆ）Ｃｏｌｏ２０５。棒線は、平均値と標準偏差を示す。
【図１４】抗−ＩＧＦ−１Ｒ抗体による、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２によるＨ−２３細胞増殖の阻害。
【図１５】（組み換えヒトＩＧＦ−１および組み換えヒトＩＧＦ−２による）ＢｘＰＣ３細胞の増殖のＭ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体による阻害。
【図１６】（組み換えヒトＩＧＦ−１および組み換えヒトＩＧＦ−２による）ＮＣＩ−Ｈ２３細胞の増殖のＭ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体による阻害。
【図１７】（組み換えヒトＩＧＦ−１および組み換えヒトＩＧＦ−２による）Ａ５４９細胞の増殖のＭ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体による阻害。
【図１８】全ヒトＩＧＦ−１Ｒ抗体による、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２が誘発するアミノ酸残基Ｓｅｒ４７３でのＡｋｔリン酸化の阻害。
【図１９】全ヒトＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体が、膵臓癌モデルにおいて、インビボで腫瘍の成長を用量依存的に阻害することを示している。
【図２０】全ヒトＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体が、肺癌モデルにおいて、インビボで腫瘍の成長を用量依存的に阻害することを示している。
【図２１】全ヒトＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体を、ゲムシタビンと組み合わせて投与することで腫瘍細胞の成長を阻害する効力が高まることを示している。
【図２２】樹立したカニクイザル線維芽細胞系で発現したＩＧＦ−１Ｒに結合する全ヒトＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体。
【図２３】ＩＧＦ−１Ｒ抗体が結合するエピトープの交差競合分析。
【図２４】ＩＲＳ−１とｐ８５（ＰＩ３Ｋの制御サブユニット）とを同時に免疫沈降させることによる、Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙが介在する、ＩＧＦ−１Ｒの信号伝達の阻害を示している。
【図２５】哺乳動物の細胞において、ＩＧＦ−１ＲおよびＩＮＳＲを免疫沈降させることにより、Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体が、ＩＧＦ−１Ｒに結合するが、インスリン受容体には結合しないことを示している。ＩＧＦ−１Ｒタンパク質およびＩＮＳＲタンパク質を、（Ａ）マウス抗−ヒトＩＲまたは（Ｂ）マウス抗−ヒトＩＧＦ−１Ｒを用い、免疫ブロット（ウェスタンブロット）分析によって検出した。
【図２６】（Ａ）ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃおよび（Ｂ）ｍＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃに対する、Ｍ１３−Ｃ０６  Ｆａｂの相対的な結合親和性測定値。ｘ軸およびｙ軸のスケールは、（Ａ）と（Ｂ）で同じである。結合フィッティングの残余分を、それぞれの図の下側に示し、各受容体に対するＭ１３−Ｃ０６の相対親和性を決定する際の、１：１結合モデルの適用可能性を示している。
【図２７】ＳＰＲアッセイにおいて、ＩＧＦ−１Ｒ変異タンパク質ＳＤ００６（結合陽性）およびＳＤ０１５（結合陰性）に対する抗体の結合と比較した場合の、コントロールであるｈＩＧＦ−１Ｒ−ＦｃおよびｍＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃに対する、Ｍ１３．Ｃ０６抗体の結合例。（Ａ）Ｍ１３−Ｃ０６表面で捕捉したＷＴ  ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃに対する、Ｍ１３−Ｃ０６  Ｆａｂ；（Ａ）Ｍ１３−Ｃ０６表面で捕捉したＷＴ  ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃに対する、Ｍ１３−Ｃ０６  Ｆａｂ、（Ｂ）Ｍ１３−Ｃ０６表面で捕捉したｍＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃに対する、Ｍ１３−Ｃ０６  Ｆａｂ、（Ｃ）Ｍ１３−Ｃ０６表面で捕捉したＳＤ００６（表１７を参照）に対するＭ１３−Ｃ０６  Ｆａｂ、（Ｄ）Ｍ１３−Ｃ０６表面で捕捉したＳＤ０１５（表１７を参照）に対するＭ１３−Ｃ０６  Ｆａｂ。
【図２８】ＩＧＦ−１Ｒ構造およびＩＮＳＲ構造を示す。（Ａ）ＩＧＦ−１Ｒ構造の模式図。（Ａ）ＦｎＩＩＩ−２は、図に示されるように、タンパク質分解によってインビボで加工されるループ構造を含む。膜貫通領域は、図のリン脂質の二層を貫通するらせんループとして示されている。ＩＧＦ−１Ｒ内にあるＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２結合位置は、星印で示されている。それぞれのＩＧＦ−１Ｒヘテロダイマー分子に、ＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２分子は１つのみが結合するが示されている。（ＢおよびＣ）相同性のＩＮＳＲの構造表面に対してマッピングした、Ｍ１３−Ｃ０６  ＩＧＦ−１Ｒ結合エピトープ。Ｍ１３−Ｃ０６のＩＧＦ−１Ｒ結合エピトープは、きわめて相同性の高いＩＮＳＲ結晶構造に基づいて設計されている。（Ｂ）ＩＧＦ−１ＲのＶ４６２〜Ｈ４６４の相同性部分に対応するアミノ酸残基（すなわち、ＩＮＳＲのＬ４７２〜Ｋ４７４）の位置に黒い影をつけた、ＩＮＳＲ構造の表面形状。ＩＧＦ−１Ｒに対応する最初の３つの領域（すなわち、Ｌ１−ＣＲ−Ｌ２）（例えば、本明細書に記載の欠失ＩＧＦ−１Ｒ（１−４６２）−Ｆｃ構築物に含まれるもの）に、灰色の影をつけている。（Ｃ）、溶媒に表面をさらしており、ＩＧＦ−１Ｒの４６２〜４６４に対応する半径が１４Å（オングストローム）以内、すなわち直径が２８Å以内の残基（すなわち、ＩＮＳＲの４７２〜４７４）に黒色の影をつけた、ＩＮＳＲ構造の表面形状。ＩＧＦ−１Ｒアミノ酸４６２〜４６４に対応する残基には灰色の影をつけており、提案されているエピトープの表面積を実験的に確認したことを示す。
【図２９】Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体で処置したマウス腫瘍における、インビボでのＩＧＦ−１Ｒ発現の免疫ブロット（ウェスタンブロット）分析。
【図３０】原発性ヒト結腸腫瘍から作成した腫瘍における、Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙのインビボでの抗腫瘍活性。
【図３１】乳癌（ＭＣＦ−７）細胞から作成した腫瘍における、Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙのインビボでの抗腫瘍活性。
【図３２】Ｍ１３−Ｃ０６抗体は、インビトロでＡＤＣＣ活性を示さない。
【図３３】ヒトＩＧＦ−１  Ｈｉｓのビオチン化ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃへの結合におけるＭ１３−Ｃ０６抗体、Ｍ１４−Ｃ０３抗体、Ｍ１４−Ｇ１１抗体およびαＩＲ３抗体による阻害。
【図３４】ヒトＩＧＦ−２  Ｈｉｓのビオチン化ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃへの結合におけるＭ１３−Ｃ０６抗体、Ｍ１４−Ｃ０３抗体、Ｍ１４−Ｇ１１抗体およびαＩＲ３抗体による阻害。
【図３５】ヒトＩＧＦ−１  Ｈｉｓがビオチン化ｈＩＧＦ−１Ｒに結合するのを検出するＥＬＩＳＡアッセイ。ヒトＩＧＦ−１  Ｈｉｓを、ＰＢＳＴで段階的に希釈し（丸）、２μＭのＭ１３−Ｃ０６を含有するＰＢＳＴで段階的に希釈した（四角）。
【図３６】相同性ＩＲ細胞外領域の構造にマッピングされたＭ１３−Ｃ０６のｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃへの結合に影響を与える残基の変異。ＩＧＦ−１Ｒアミノ酸残基４１５、４２７、４６８、４７８および５３２の変異は、Ｍ１３−Ｃ０６抗体の結合性に検出可能なほどの影響を与えなかった。ＩＧＦ−１Ｒアミノ酸残基４６６、４６７、５３３、５６４および５６５の変異は、Ｍ１３−Ｃ０６抗体の結合性をわずかに低下させる影響を与えた。ＩＧＦ−１Ｒアミノ酸残基４５９、４６０、４６１、４６２、４６４、４８２、４８３、４９０、５７０および５７１の変異は、Ｍ１３−Ｃ０６抗体の結合性を強く低下させる影響を与えた。変異分析の結果の集計は、表２０を参照。
【図３７】ヒトＩＧＦ−１Ｒの最初の３つの細胞外領域にマッピングされたＭ１４−Ｇ１１のｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃへの結合に影響を与える残基の変異。ＩＧＦ−１Ｒアミノ酸残基２８、２２７、２３７、２８５、２８６、３０１、３２７および４１２の変異は、Ｍ１４−Ｇ１１抗体の結合に検出可能なレベルの影響を与えなかった。ＩＧＦ−１Ｒアミノ酸残基２５７、２５９、２６０、２６３および２６５の変異は、Ｍ１４−Ｇ１１抗体の結合を少し低下させる影響を与えた。ＩＧＦ−１Ｒアミノ酸残基２５４の変異は、Ｍ１４−Ｇ１１抗体の結合を中程度に低下させた。ＩＧＦ−１Ｒアミノ酸残基２４８および２５０の変異は、Ｍ１４−Ｇ１１抗体の結合を強力に低下させた。変異分析の結果の集計は、表２０を参照。
【図３８】ヒトＩＧＦ−１Ｒの最初の３つの細胞外領域にマッピングされたαＩＲ３およびＰ１Ｅ２のｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃへの結合に影響を与える残基の変異。ＩＧＦ−１Ｒアミノ酸残基２８、２２７、２３７、２８５、２８６、３０１、３２７および４１２の変異は、抗体の結合に検出可能なレベルの影響を与えなかった。ＩＧＦ−１Ｒアミノ酸残基２５７、２６３、３０１、３０３、３０８、３２７および３８９の変異は、抗体の結合を少しだけ低下させた。ＩＧＦ−１Ｒアミノ酸残基２４８および２５４は、Ｍ１４−Ｇ１１抗体の結合を中程度に低下させた。ＩＧＦ−１Ｒアミノ酸残基２６５の変異は、抗体の結合を強力に低下させた。変異分析の結果の集計は、表２０を参照。
【図３９】無血清状態で、明らかなＩＧＦ−１Ｒエピトープの抗原標的と組み合わせることによって、ＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２によって刺激されるＢＸＰＣ３（膵臓癌細胞株）の細胞成長阻害率の向上を示している。
【図４０】等モル濃度のＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ（Ｃ０６）抗体およびＭ１４．Ｇ１１．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ（Ｇ１１）抗体を、５００ｎＭ〜５ｎＭの濃度で組み合わせることにより、対応する同じ抗体濃度で、いずれかの抗体を単独で用いた場合と比較して、細胞成長が顕著に阻害されていることを示している。
【図４１】１０％ウシ胎児血清存在下、標準的な細胞培養条件で成長させたＨ３２２Ｍで観察した効果の例を示している。Ｃ０６／Ｇ１１抗体を組み合わせると、いずれかの抗体を単独で使用した場合と比較して、細胞成長を顕著に阻害した。
【図４２】ＩＧＦ−１リガンドおよびＩＧＦ−２リガンドを抗−ＩＧＦ−１Ｒ抗体アロステリック効果によって阻害する場合、または競合的に阻害する場合の区別を示している。
【図４３】公開されている結晶構造（Ｇａｒｒｅｔｔら、「Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｔｈｒｅｅ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｙｐｅ−１  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ」、Ｎａｔｕｒｅ（１９９８）７月２３日；３９４（６６９１）：３９５−９）に基づく、ＩＧＦ−１ＲのＬ１／ＣＲＲ／Ｌ２ドメインの表面モデル。ＩＧＦ−１の結合にとって重要であると記載されている残基を示している（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒら、２００１）。
【図４４】公開されている結晶構造（Ｇａｒｒｅｔｔら、「Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｔｈｒｅｅ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｙｐｅ−１  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ」、Ｎａｔｕｒｅ（１９９８）７月２３日；３９４（６６９１）：３９５−９）に基づく、ＩＧＦ−１ＲのＬ１／ＣＲＲ／Ｌ２ドメインの表面モデル。表面図は、分子表面にある各ＩＧＦ−１Ｒ変異体の位置と、ＣＲＲ／Ｌ２領域に結合する６個の抗体それぞれの結合に対する影響を示している。結合に影響を与える変異は黒色で示しており、影響を与えない変異は白色で示している。
【図４５】等温滴定熱量計（ＩＴＣ）によってモニタリングされる、ＩＧＦ−１Ｒに対するＩＧＦ−１の結合。（Ａ）熱量計で測定した、２μＬの６０μＭ  ＩＧＦ−１を、５μＭ  ｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）約２００μＬに注入することにより発生した熱。（Ｂ）５℃、２５℃、および３７℃でのｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）に対するＩＧＦ−１のＩＴＣ結合曲線。３種類の温度でのＩＧＦ−１の平衡解離定数（ＫＤ）を、グラフの下側に掲載している。
【図４６】阻害性ＭＡｂを注入した後に、ＩＧＦ−１を注入する二重注入サイクル。（Ａ）左側の図：７５μＭ  Ｍ１３−Ｃ０６を１．５μＬ注入した後に、６０μＭ  ＩＧＦ−１  ２．０μＬを約２００μＬの５μＭ  ＩＧＦ−１Ｒ溶液に注入する場合（上側）と、１．５μＬの７５μＭ  Ｍ１３−Ｃ０６を注入しない場合（下側）で、熱量分析の熱容量を３７℃で測定。右側の図：Ｍ１３−Ｃ０６存在下（◆）または非存在下（●）、系のエンタルピー変化（ΔＨ°）によって決定した場合の、ｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）に対するＩＧＦ−１の結合曲線。（Ｂ）（Ａ）と同様であるが、２５℃において、実験で、阻害性抗体として２０Ｃ８を使用。（Ｃ）（Ａ）と同様であるが、２５℃において、実験で、阻害性抗体としてＭ１４−Ｇ１１を使用。
【図４７】ＭＡｂが存在する状態、および存在しない状態での、溶液系でのｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）に対するＩＧＦ−１の結合。（Ａ）種々の受容体濃度（ｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）について、（▲）＝０ｎＭ（標準曲線）、（■）＝２４ｎＭ、（◆）＝６４ｎＭ、および（●）＝２４０ｎＭ）での、ｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）に対するＩＧＦ−１の結合親和性の測定。（Ｂ）抗体非存在下（■）、および飽和状態の阻害性抗−ＩＧＦ−１Ｒ  ＭＡｂｓ  Ｍ１３−Ｃ０６存在下（●）、２０Ｃ８存在下（▲）およびＧ１１存在下（◆）、２４０ｎＭのｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）を用いた、溶液での結合実験。阻害性抗体を用いた実験データと重ねて、親和性が、２０μＭ〜６ｎＭの範囲にわたる種々の親和性で、リガンドが受容体に結合する理論的な曲線が示される。この理論的な曲線は、ＭＡｂの阻害効果を視覚的に判断する手掛かりになる。
【発明を実施するための形態】
【０１６２】
発明の詳細な説明
米国特許仮出願第６０／７８６，３４７号（２００６年３月２８日に出願）、米国特許仮出願第６０／８７６，５５４号（２００６年１２月２２日に出願）および米国特許出願公開第１１／７２７，８８７号（２００７年３月２８日に出願）の全体が、参照することによって本明細書に組み込まれる。
【０１６３】
（Ｉ．定義）
用語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、１つ以上の物体を指すことを注記しておく。例えば、「（１つの）ＩＧＦ−１Ｒ抗体」は、１つ以上のＩＧＦ−１Ｒ抗体をあらわすと理解される。このように、用語「１つの（ａ）」（または「１つの（ａｎ）」）、「１つ以上の」「少なくとも１つの」は、本明細書では同じ意味で使用することができる。
【０１６４】
本明細書で使用するとき、用語「ポリペプチド」は、単一の「ポリペプチド」だけでなく、複数の「ポリペプチド」も含むことを意味しており、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）で直線状に結合したモノマー（アミノ酸）で構成される分子を指す。用語「ポリペプチド」は、２個以上のアミノ酸の任意の鎖を指し、特定の長さの産物を指すものではない。したがって、２個以上のアミノ酸の１つ以上の鎖を指すために用いる、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」または任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義に含まれる。用語「ポリペプチド」を、これらの用語の代わりに用いてもよいし、同じ意味で用いてもよい。用語「ポリペプチド」は、ポリペプチドを発現後に改変（限定されないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロッキング基の誘導体化、タンパク質分解による開裂、または非天然アミノ酸による改変）した産物も指している。ポリペプチドは、天然の生物供給源に由来するものであってもよく、組み換え技術によって産生してもよいが、設計した核酸配列から翻訳する必要はない。化学合成を含む任意の様式でポリペプチドを作成することができる。
【０１６５】
本発明のポリペプチドは、アミノ酸数が約３以上、５以上、１０以上、２０以上、２５以上、５０以上、７５以上、１００以上、２００以上、５００以上、１，０００以上、または２，０００以上であってもよい。ポリペプチドは、特定の三次元構造を有していてもよいが、必ずしもその構造を有していなくてもよい。特定の三次元構造を有するポリペプチドは、折りたたみ構造と呼ばれ、特定の三次元構造をとらず、異なるさまざまな配置をとるポリペプチドは、ほどけた構造と呼ばれる。本明細書で使用するとき、糖タンパク質という用語は、少なくとも１個の炭水化物部分に連結したタンパク質を指し、その炭水化物部分は、アミノ酸残基（例えば、セリン残基またはアスパラギン残基）の酸素または窒素を含有する側鎖を介してそのタンパク質と結合する。
【０１６６】
ポリペプチドまたはフラグメント、改変体、またはその誘導体の「単離物」は、自然環境に存在しないポリペプチドを意味する。特定の精製レベルが必要とされるわけではない。例えば、ポリペプチドの単離物は、元々の環境または天然環境から取り出されてもよい。宿主細胞で発現する、組み換えによって産生したポリペプチドおよびタンパク質は、任意の好適な技術によって分離され、分画され、または部分的または実質的に精製された天然ポリペプチドまたは組み換えポリペプチドと同様に、本発明では単離されたものであると考える。
【０１６７】
本明細書で使用するとき、所定のタンパク質「に由来する」という用語は、ポリペプチドの起源が何であるかを示す。ある実施形態では、特定のポリペプチド原料に由来するポリペプチドまたはアミノ酸の配列は、可変領域の配列（例えば、ＶＨまたはＶＬ）であるか、これに関連する配列（例えば、ＣＤＲ領域またはフレームワーク領域）である。ある実施形態では、特定のポリペプチド原料に由来するアミノ酸配列は、連続していない。例えば、ある実施形態では、１個、２個、３個、４個、５個または６個のＣＤＲが、１つの抗体原料に由来する。ある実施形態では、特定のポリペプチド原料またはアミノ酸配列に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、原料の配列またはその一部分と本質的に同じアミノ酸配列を有する。この一部分は、少なくとも３〜５アミノ酸、５〜１０アミノ酸、少なくとも１０〜２０アミノ酸、少なくとも２０〜３０アミノ酸、または少なくとも３０〜５０アミノ酸で構成されているか、または当業者が、他の方法を用いて、原料の配列に由来することを確認可能である。
【０１６８】
上述のポリペプチドのフラグメント、誘導体、類似体または改変体、およびこれらの任意の組み合わせも、本発明のポリペプチドに含まれる。本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体または抗体ポリペプチドを指す場合、用語「フラグメント」、「改変体」、「誘導体」および「類似体」には、対応する元々の抗体またはポリペプチドの抗原結合性を少なくともある程度保持した任意のポリペプチドが含まれる。本発明のポリペプチドのフラグメントとしては、本明細書の他の部分で記載される特定の抗体フラグメント以外にも、タンパク質分解フラグメント、欠失フラグメントが挙げられる。本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体および抗体ポリペプチドの改変体としては、上述のフラグメントが挙げられ、アミノ酸の置換、欠失または挿入によってアミノ酸配列が改変されたポリペプチドも含む。改変体は、天然物であってもよいし、非天然のものであってもよい。非天然の改変体は、当該技術分野で既知の突然変異技術で作成してもよい。ポリペプチド改変体は、アミノ酸同類置換を含んでもよいし、同類置換ではないアミノ酸の置換、欠失または付加を含んでもよい。本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体および抗体ポリペプチドの誘導体は、天然のポリペプチドではみられない特徴が追加されるように改変されたポリペプチドである。例としては、融合タンパク質があげられる。ポリペプチド改変体は、本明細書で「ポリペプチド類似体」と呼ばれることもある。本明細書で使用するとき、ＩＧＦ−１Ｒ抗体および抗体ポリペプチドの「誘導体」は、目的のポリペプチドの１つ以上の残基が、側鎖の官能基の反応によって化学的に誘導体化されたものを指す。２０種類の標準アミノ酸から天然で生じる１つ以上のアミノ酸誘導体を含有するペプチドも「誘導体」に含まれる。例えば、４−ヒドロキシプロリンが、プロリンと置換されてもよく、５−ヒドロキシリジンが、リジンと置換されてもよく、３−メチルヒスチジンが、ヒスチジンと置換されてもよく、ホモセリンが、セリンと置換されてもよく、オルニチンが、リジンと置換されてもよい。
【０１６９】
用語「ポリヌクレオチド」は、単一の核酸並びに複数個の核酸も含むことを意図しており、核酸分子の単離物または構築物を指す（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ））。ポリヌクレオチドは、一般的なホスホジエステル結合を含んでいてもよいし、一般的ではない結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）でみられるようなアミド結合）を含んでいてもよい。用語「核酸」は、任意の１個以上の核酸部分を指し、例えば、ポリヌクレオチド中に存在するＤＮＡフラグメントまたはＲＮＡフラグメントを指す。核酸またはポリヌクレオチドの「単離物」とは、天然環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。例えば、ベクターに含まれるＩＧＦ−１Ｒ抗体をコードする組み換えポリヌクレオチドは、本発明の目的では単離物と考える。ポリヌクレオチドの単離物の例をさらに挙げると、異種宿主細胞中に存在する組み換えポリヌクレオチド、または溶液中で（部分的または実質的に）精製されたポリヌクレオチドがある。ＲＮＡ分子の単離物としては、本発明のポリヌクレオチドのインビボまたはインビトロでのＲＮＡ転写物が挙げられる。本発明のポリヌクレオチド単離物または核酸単離物には、合成によって作られたそのような分子も含まれる。さらに、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位または転写ターミネーターのような制御因子であってもよいし、このような制御因子を含んでいてもよい。
【０１７０】
本明細書で使用するとき、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸部分である。「停止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡまたはＴＡＡ）はアミノ酸には変換されないが、コード領域の一部であると考えてよい。一方、任意のフランキング配列（例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロンなど）は、コード領域の一部分ではない。本発明の２箇所以上のコード領域は、単一のポリヌクレオチド構築物（例えば、単一のベクター）に存在してもよく、別個のポリヌクレオチド構築物（例えば、別個の（異なる）ベクター）に存在してもよい。さらに、ベクターは、１箇所のコード領域を含んでいてもよいし、２箇所以上のコード領域を含んでいてもよい。例えば、１個のベクターが、免疫グロブリンの重鎖可変領域をコードし、それとは別に軽鎖可変領域をコードしてもよい。さらに、本発明のベクター、ポリヌクレオチドまたは核酸は、異種コード領域をコードしてもよく、ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはそのフラグメント、改変体または誘導体をコードする核酸に融合していてもよく、融合していなくてもよい。異種コード領域としては、限定されないが、分泌シグナルペプチドまたは異種機能性領域（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｏｍａｉｎ）のような特殊な要素またはモチーフが挙げられる。
【０１７１】
特定の実施形態では、上述のポリヌクレオチドまたは核酸は、ＤＮＡである。ＤＮＡである場合、ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは、通常は、プロモーターおよび／または他の転写制御要素または翻訳制御要素を含んでいてもよく、これらの要素は、１箇所以上のコード領域と作動可能に連結している。作動可能な連結とは、遺伝子産物（例えば、ポリペプチド）を作るためのコード領域が、制御配列の影響下または制御下で遺伝子産物を発現するような様式で、１つ以上の制御配列と連結していることである。プロモーター機能が誘発されることによって、所望な遺伝子産物をコードするｍＲＮＡが転写される場合、２個のＤＮＡフラグメントが結合することによって、発現制御配列が、遺伝子産物を直接的に発現させる性質を妨害しない場合、またはＤＮＡテンプレートの転写を妨害しない場合、２個のＤＮＡフラグメント（例えば、ポリペプチドコード領域と、この領域に連結するプロモーター）は、「作動可能に連結して」いる。したがって、プロモーターによって、ポリペプチドをコードする核酸を転写させることが可能な場合、このプロモーター領域は、この核酸と作動可能に連結している。プロモーターは、所定の細胞内でのみＤＮＡを実質的に転写する、細胞特異的なプロモーターであってもよい。プロモーター以外の転写制御要素（例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサーおよび転写停止シグナル）は、ポリヌクレオチドと作動可能に連結し、細胞特異的な転写に直接かかわることができる。好適なプロモーターおよび他の転写制御領域を、本明細書に開示している。
【０１７２】
種々の転写制御領域は、当業者に既知である。転写制御領域としては、限定されないが、脊椎動物の細胞で機能する転写制御領域（例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター部分およびエンハンサー部分（ＩＥ期プロモーター、イントロン−Ａと組み合わせる）、サルウイルス４０（初期プロモーター）およびレトロウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルス）が挙げられる。他の転写制御領域としては、脊椎動物の遺伝子に由来するもの、例えば、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモンおよびウサギβ−グロブリンや、真核細胞で発現する遺伝子を制御可能な他の配列が挙げられる。好適な転写制御領域のさらなる例としては、組織特異的なプロモーターおよびエンハンサー、ならびにリンホカイン誘発性プロモーター（例えば、インターフェロンまたはインターロイキンによって誘発されるプロモーター）が挙げられる。
【０１７３】
同様に、当業者にとって、種々の転写制御要素が既知である。転写制御要素の例としては、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始コドンおよび停止コドン、およびピコルナウイルスに由来する要素（特に、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、ＣＩＴＥ配列とも呼ばれる）が挙げられる。
【０１７４】
他の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡであり、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態である。
【０１７５】
本発明のポリヌクレオチドおよび核酸コード領域は、分泌ペプチドまたはシグナルペプチドをコードする別のコード領域と連結していてもよく、この別のコード領域によって、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが分泌する。シグナル仮説によれば、哺乳動物の細胞で分泌したタンパク質は、シグナルペプチドまたは分泌リーダー配列を有しており、成長したタンパク質鎖が、粗面小胞体から外に運ばれると、この部分は、成熟タンパク質から開裂する。当業者ならば、脊椎動物の細胞で分泌したポリペプチドは、一般的に、ポリペプチドのＮ末端にシグナルペプチドが融合しており、完全なポリペプチドまたは「全長」ポリペプチドが開裂し、ポリペプチドの分泌物または「成熟」形態を生成することを知っている。特定の実施形態では、未処理のシグナルペプチド（例えば、免疫グロブリンの重鎖シグナルペプチドまたは軽鎖シグナルペプチド）を使用するか、またはポリペプチドに作動可能に連結し、ポリペプチドを分泌させる能力を保持した、この配列の機能的誘導体を使用する。あるいは、異種哺乳動物のシグナルペプチドまたはその機能的誘導体を使用してもよい。例えば、野生型リーダー配列を、ヒト組織プラスミノゲン活性化因子（ＴＰＡ）またはマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列と置換してもよい。
【０１７６】
本発明は、特定のＩＧＦ−１Ｒ抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体に関する。天然の抗体として全長抗体を特定的に示しているのでない限り、用語「ＩＧＦ−１Ｒ抗体」は、全長抗体だけではなく、抗原結合性を保持したフラグメント、改変体、類似体または誘導体も含み、例えば、天然の抗体、または免疫グロブリン分子、または抗体分子と似た様式で抗原に結合する人工的な抗体分子またはフラグメントも含む。
【０１７７】
用語「抗体」および「免疫グロブリン」は、本明細書では同じ意味で使用する。抗体または免疫グロブリンは、少なくとも重鎖可変領域を含み、通常は、少なくとも重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む。脊椎動物系の基本的な免疫グロブリン構造は、比較的よく理解されている。例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２版．１９８８）を参照。
【０１７８】
以下に詳細に記載するように、用語「免疫グロブリン」は、生化学分野で区別可能な種々のポリペプチド群を含む。当業者は、重鎖が、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）またはエプシロン（ε）に分類され、その中にいくつかの副分類がある（例えば、γ１〜γ４）ことを知っているであろう。この鎖の性質から、抗体の「種類」を、それぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ  ＩｇＧまたはＩｇＥと決定する。免疫グロブリンの副分類（アイソタイプ）は、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１などがあり、これらの性質は十分に調べられており、機能的な特徴も十分に知られている。これらの分類およびアイソタイプを改変したものも、本発明の開示内容を鑑みれば、当業者は容易に理解でき、したがって、これらの改変物も、本発明の範囲に含まれる。すべての分類の免疫グロブリンが本発明の範囲に入ることは明らかであるので、以下の議論は、一般的に、ＩｇＧ群の免疫グロブリン分子について記載する。ＩｇＧに関して言うと、標準的な免疫グロブリン分子は、２個の同一の軽鎖ポリペプチドと、２個の同じ重鎖ポリペプチドとを有しており、軽鎖ポリペプチドの分子量は、約２３，０００ダルトンであり、重鎖ポリペプチドの分子量は、５３，０００〜７０，０００である。これらの４本の鎖は、典型的には、ジスルフィド結合で「Ｙ」字型に接続しており、「Ｙ」の２つに分かれた根元部分で軽鎖が重鎖を覆うように位置し、可変領域まで続いている。
【０１７９】
軽鎖は、カッパ（κ）またはラムダ（λ）に分類される。κ軽鎖またはλ軽鎖に、それぞれの分類の重鎖が結合し得る。一般的に、軽鎖と重鎖とは、共有結合で互いに結合しており、ハイブリドーマ、Ｂ細胞または遺伝子操作された宿主細胞が免疫グロブリンを作成するとき、２個の重鎖の「尾」にあたる部分は、ジスルフィド共有結合で互いに結合しているか、または非共有結合で結合している。重鎖では、アミノ酸配列は、Ｙ字の２つに分かれた末端にあるＮ末端から、それぞれの鎖の底部にあるＣ末端まで続いている。
【０１８０】
構造同一性および機能同一性によって、軽鎖も重鎖もいくつかの領域に分けられる。用語「定常」および「可変」は、機能を示すために用いられる用語である。この観点では、軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖可変領域（ＶＨ）の鎖部分が、抗原の認識性および特異性を決定づけていることを理解されたい。これとは逆に、軽鎖定常領域（ＣＬ）および重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３）は、例えば、分泌、経胎盤移行、Ｆｃ受容体の結合、補体結合などの重要な生物学的性質をになっている。定常領域の付番は慣習的に、抗体の抗原結合部位またはアミノ末端に近いところから順に、遠ざかる方向に番号が大きくなる。Ｎ末端部分は、可変領域であり、Ｃ末端部分は定常領域であり、ＣＨ３領域およびＣＬ領域は、実際には、それぞれ重鎖および軽鎖のカルボキシ末端を含む。
【０１８１】
上に示したように、可変領域によって、抗体が抗原を選択的に認識し、抗原のエピトープに特異的に結合する。すなわち、抗体のＶＬ領域およびＶＨ領域、または抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）の一部分が組み合わさって可変領域を形成し、三次元の抗体結合部位を形作る。この４つの要素からなる抗体構造によって、Ｙの２つに分かれた部分の末端に抗原結合部位が形成される。さらに具体的には、抗原結合部位は、それぞれのＶＨ鎖およびＶＬ鎖にある３個のＣＤＲによって構造が決まる。いくつかの場合、例えば、ラクダ科の動物に由来する特定の免疫グロブリン分子、またはラクダ由来免疫グロブリンから合成した分子、完全な免疫グロブリン分子は、重鎖のみで、軽鎖を有していない場合がある。例えば、Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６−４４８（１９９３）を参照。
【０１８２】
天然抗体では、各抗原結合部位に存在する６個の「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、短く、抗体が水性環境で三次元構造をとる際、抗原結合領域を形成するように特定的に配置された非連続的なアミノ酸配列である。抗原結合領域のそれ以外のアミノ酸（「フレームワーク」領域と呼ばれる）は、分子間でほとんど変わらない。フレームワーク領域は、主にβシート構造をとり、ＣＤＲは、ループ構造をとり、βシート構造に接続しているか、ある場合には、β構造の一部を形成している。したがって、フレームワーク領域は、共有結合以外の鎖間相互作用によってＣＤＲを鎖の中で正しい位置に配置する足場の役割を果たす。所定の位置に配置されたＣＤＲによって抗原結合領域が形成され、この抗原結合領域が、免疫反応性の抗原に存在するエピトープと相補的な表面を形作る。この相補的な表面によって、抗体と、関連するエピトープとの結合が促進される。ＣＤＲおよびフレームワーク領域は、正確に定義されているため、任意の所与の重鎖可変領域または軽鎖可変領域について、ＣＤＲとフレームワーク領域とを成すアミノ酸を同定することは当業者には容易である（「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、Ｋａｂａｔ，Ｅ．ら、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９８３）；およびＣｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１−９１７（１９８７）を参照。この内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる）。
【０１８３】
１つの用語に、当該技術分野で使用され、および／または受け入れられている２つ以上の定義が存在する場合、矛盾する内容のことが明示されていない限り、その用語が本明細書で使用されるとき、別途特定のない限り、すべての定義を含むことが意図される。具体的な例は、用語「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）の使用であり、この用語は、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチド双方の可変領域に存在する非連続的な抗原結合部位を示すのに用いられる。この特定の領域は、Ｋａｂａｔら、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９８３）およびＣｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）に記載されており、この内容は、本明細書に参照することにより組み込まれる。これらの相補性決定領域の定義には、互いに比較した場合に、重複するアミノ酸残基またはアミノ酸残基のサブセットも含まれる。しかしながら、抗体またはその改変体のＣＤＲを定義するための、いずれの定義の使用も、本明細書に定義され、使用されるその用語の範囲内であることが意図される。上に引用した各参考文献で定義されている、ＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基を、比較のために以下の表Ｉに示す。特定のＣＤＲを包含する実際の残基番号は、ＣＤＲの配列および大きさによって異なる。当業者は、抗体の可変領域のアミノ酸配列が与えられれば、どの残基が特定のＣＤＲを含むのかを、通常の方法で決定することができる。
【０１８４】
（表１）ＣＤＲの定義１
2010537985.tif 000003
１表１のすべてのＣＤＲの定義につけた番号は、Ｋａｂａｔらが発表した付番方式による（以下を参照）。
【０１８５】
Ｋａｂａｔらは、任意の抗体に適用可能な、可変領域の配列の付番システムも定義している。当業者は、配列以外の実験データを使わずに、この「Ｋｏｂａｔ付番」システムを任意の可変領域の配列に明確にあてはめることができる。本明細書で使用するとき、「Ｋａｂａｔ付番法」は、Ｋａｂａｔらが、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９８３）で発表した方法を指す。他に特定されない限り、本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体中に存在する特定のアミノ酸残基の位置に対する付番は、Ｋａｂａｔ付番システムによるものである。
【０１８６】
ラクダ科の動物では、重鎖可変領域（ＶＨＨと呼ばれる）が、抗原結合領域全体を形成している。ラクダ科のＶＨＨ可変領域と、従来の抗体から誘導された重鎖可変領域（ＶＨ）との大きな違いは、（ａ）ＶＨが軽鎖と接触する表面には、対応するＶＨＨの領域と比較して疎水性のアミノ酸が多いこと、（ｂ）ＶＨＨの方がＣＤＲ３が長いこと、（ｃ）ＶＨＨのＣＤＲ１とＣＤＲ３との間で頻繁にジスルフィド結合が発生することである。
【０１８７】
本発明の抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体としては、限定されないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体またはキメラ抗体、単鎖抗体、エピトープ結合性フラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖｓ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、ＶＬ領域またはＶＨ領域のいずれかを含むフラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリから作成したフラグメント、抗イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体（例えば、本明細書に開示するＩＧＦ−１Ｒ抗体の抗−Ｉｄ抗体）が挙げられる。ＳｃＦｖ分子は、当該技術分野で知られており、例えば、米国特許第５，８９２，０１９号に記載されている。本発明の免疫グロブリンまたは抗体分子は、いかなる型のものであってもよく（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、いかなる分類のものであってもよく（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）、いかなる副分類の免疫グロブリン分子であってもよい。
【０１８８】
抗体フラグメント（単鎖抗体を含む）は、可変領域を単独で含んでもよいし、ヒンジ領域、ＣＨ１領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域の全体または一部分と組み合わせて含んでもよい。可変領域と、ヒンジ領域、ＣＨ１領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域との任意の組み合わせを含む、抗原結合性を保持したフラグメントも、本発明に含まれる。本発明の抗体または免疫特異的なフラグメントは、鳥および哺乳動物を含む任意の動物由来であってもよい。好ましくは、抗体は、ヒト抗体、マウス抗体、ロバ抗体、ウサギ抗体、ヤギ抗体、モルモット抗体、ラクダ抗体、ラマ抗体、ウマ抗体またはニワトリ抗体である。別の実施形態では、可変領域は、コンドリクトイド（ｃｏｎｄｒｉｃｔｈｏｉｄ）由来（例えば、サメ由来）であってもよい。本明細書で使用するとき、「ヒト」抗体には、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体が含まれ、ヒト免疫グロブリンライブラリから単離した抗体、または１種以上のヒト免疫グロブリンについて遺伝子組み換えし、内因性免疫グロブリンを発現しない動物由来の抗体（例えば、後述の、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらによる米国特許第５，９３９，５９８号に記載されるもの）が含まれる。
【０１８９】
本明細書で使用するとき、用語「重鎖部分」は、免疫グロブリンの重鎖に由来するアミノ酸配列を含む。重鎖部分を含むポリペプチドは、ＣＨ１領域、ヒンジ（例えば、上側、中央部、および／または下側のヒンジ領域）領域、ＣＨ２領域、ＣＨ３領域、またはその改変体またはフラグメントのうち、少なくとも１つを含む。例えば、本発明で使用する結合ポリペプチドは、ＣＨ１領域を含むポリペプチド鎖を含んでもよく、ＣＨ１領域と、ヒンジ領域の少なくとも一部分と、ＣＨ２領域とを含むポリペプチド鎖を含んでもよく、ＣＨ１領域と、ＣＨ３領域とを含むポリペプチド鎖を含んでもよく、ＣＨ１領域と、ヒンジ領域の少なくとも一部分と、ＣＨ３領域とを含むポリペプチド鎖を含んでもよく、ＣＨ１領域と、ヒンジ領域の少なくとも一部分と、ＣＨ２領域と、ＣＨ３領域とを含むポリペプチド鎖を含んでもよい。別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＣＨ３領域を含むポリペプチド鎖を含む。さらに、本発明で使用する結合ポリペプチドは、ＣＨ２領域の数なくとも一部分（例えば、ＣＨ２領域全体または一部分）が欠失していてもよい。上述のように、上述の領域（例えば、重鎖部分）が、天然の免疫グロブリン分子とはアミノ酸配列が異なるように改変されていてもよいことも当業者は理解するであろう。
【０１９０】
本明細書に開示する特定のＩＧＦ−１Ｒ抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体では、マルチマーの１本のポリペプチド鎖にある重鎖部分は、そのマルチマーの第２のポリペプチド鎖にある重鎖部分と同一である。または、本発明の重鎖部分を含有するモノマーは、同一ではない。例えば、それぞれのモノマーは、異なる標的結合部位を含んでいてもよく、例えば、二重特異性抗体を形成してもよい。
【０１９１】
本明細書に開示する、診断方法および治療方法で使用する結合ポリペプチドの重鎖部分は、異なる免疫グロブリンに由来するものであってもよい。例えば、ポリペプチドの重鎖部分は、ＩｇＧ１分子由来のＣＨ１領域と、ＩｇＧ３分子由来のヒンジ領域とを含んでいてもよい。別の例では、重鎖部分は、一部分がＩｇＧ１分子由来で、一部分がＩｇＧ３分子由来のヒンジ領域を含んでもよい。別の例では、重鎖部分は、一部分がＩｇＧ１分子由来で、一部分がＩｇＧ４分子由来のキメラヒンジを含んでもよい。
【０１９２】
本明細書で使用するとき、用語「軽鎖部分」は、免疫グロブリンの軽鎖に由来するアミノ酸配列を含む。好ましくは、軽鎖部分は、ＶＬ領域またはＣＬ領域のうち、少なくとも１つを含む。
【０１９３】
本明細書に開示した、ＩＧＦ−１Ｒ抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体は、抗原（例えば、認識し、特異的に結合する標的ポリペプチド（ＩＧＦ−１Ｒ））のエピトープまたは抗原の一部分という観点から記述され、または特定されてもよい。標的ポリペプチドの一部分で、抗体の抗原結合領域と特異的に相互作用する部分は、「エピトープ」または「抗原決定基」である。標的ポリペプチドは、単一ののエピトープを含んでいてもよいが、典型的には、少なくとも２個のエピトープを含んでおり、抗原の大きさ、構造および種類によって、任意の数のエピトープを含んでいてもよい。さらに、標的ポリペプチドにある「エピトープ」は、ポリペプチドではない要素であってもよく、ポリペプチドではない要素を含んでいてもよいことを注記しておく。例えば、「エピトープ」は、炭水化物側鎖を含んでいてもよい。
【０１９４】
抗体のペプチドエピトープまたはポリペプチドエピトープとして最も小さいものは、アミノ酸数が約４〜約５個のものであると考えられる。ペプチドエピトープまたはポリペプチドエピトープは、好ましくは、アミノ酸数が少なくとも７個、さらに好ましくは、少なくとも９個、最も好ましくは、少なくとも約１５〜約３０個である。ＣＤＲは、三次元形状で抗原ペプチドまたは抗原ポリペプチドを認識することができるため、エピトープを成すアミノ酸は、連続している必要はなく、いくつかの場合では、同じペプチド鎖にさえ存在していなくてもよい。本発明では、本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体が認識するペプチドエピトープまたはポリペプチドエピトープは、ＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸を連続して、または非連続で少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、さらに好ましくは少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、または約１５〜約３０個含有する。
【０１９５】
「特異的に結合する」とは、一般的に、抗体が、抗原結合領域でエピトープに結合し、その結合が、抗原結合領域とエピトープとの間にある程度の相補性をもたらすことを意味する。この定義によれば、抗体が、無作為に無関係なエピトープと結合するよりも、抗原結合領域でエピトープと選択的に結合する場合、抗体は、エピトープに「特異的に結合する」と言う。用語「特異性」は、本明細書では、特定の抗体が特定のエピトープに結合するときの相対的な親和性を定量化するのに用いる。例えば、抗体「Ａ」が、抗体「Ｂ」よりも所与のエピトープに対して特異性が高いと考えられ、または抗体「Ａ」は、関連するエピトープ「Ｄ」よりも高い親和性でエピトープ「Ｃ」に結合すると記載してもよい。
【０１９６】
「選択的に結合する」とは、抗体が、あるエピトープに対し、関連するエピトープ、同様のエピトープ、同種のエピトープ、または類似のエピトープに結合するよりも容易に、特異的に結合することを意味する。したがって、所与のエピトープに「選択的に結合する」抗体は、抗体が関連するエピトープと交差反応する場合であっても、関連するエピトープよりも、所与のエピトープに結合する可能性がより高いであろう。
【０１９７】
非限定的な例として、抗体が、第２のエピトープに対する解離定数（ＫＤ）より小さいＫＤで、第１のエピトープと結合する場合、その抗体は、第１のエピトープに選択的に結合すると考えられる。別の非限定的な例では、抗体が、第２のエピトープに対するＫＤより少なくとも１桁小さな親和性で、第１のエピトープと結合する場合、その抗体は、第１の抗原に選択的に結合すると考えられ得る。別の非限定的な例では、抗体が、第２のエピトープに対するＫＤより少なくとも２桁小さな親和性で第１のエピトープと結合する場合、その抗体は、第１のエピトープに選択的に結合すると考えてもよい。
【０１９８】
別の非限定的な例では、抗体が、第２のエピトープに対する解離速度（ｋ（ｏｆｆ））よりも小さなｋ（ｏｆｆ）で、第１のエピトープと結合する場合、その抗体は、第１のエピトープに選択的に結合すると考えてもよい。別の非限定的な例では、抗体が、第２のエピトープに対するｋ（ｏｆｆ）より少なくとも１桁小さな親和性で、第１のエピトープと結合する場合、その抗体は、第１のエピトープに選択的に結合すると考えてもよい。別の非限定的な例では、抗体が、第２のエピトープに対するｋ（ｏｆｆ）より少なくとも２桁小さな親和性で、第１のエピトープと結合する場合、その抗体は、第１のエピトープに選択的に結合すると考えてもよい。
【０１９９】
本明細書に開示した抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体は、５×１０−２秒−１以下、１０−２秒−１以下、５×ｌ０−３秒−１以下、またはｌ０−３秒−１以下の解離速度（ｋ（ｏｆｆ））で、本明細書に開示した標的ポリペプチドまたはそのフラグメントまたは改変体に結合すると言ってもよい。さらに好ましくは、本明細書の抗体は、５×１０−４秒−１以下、１０−４秒−１以下、５×１０−５秒−１以下、または１０−５秒−１以下、５×１０−６秒−１以下、１０−６秒−１以下、５×１０−７秒−１以下、または１０−７秒−１以下の解離速度（ｋ（ｏｆｆ））で、本明細書に開示した標的ポリペプチドまたはそのフラグメントまたは改変体に結合すると言ってもよい。
【０２００】
本明細書に開示した抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体は、１０３Ｍ−１秒−１以上、５×１０３Ｍ−１秒−１以上、１０４Ｍ−１秒−１以上、または５×１０４Ｍ−１秒−１以上の結合速度（ｋ（ｏｎ））で、本明細書に開示した標的ポリペプチドまたはそのフラグメントまたは改変体に結合すると言ってもよい。さらに好ましくは、本明細書の抗体は、１０５Ｍ−１秒−１以上、５×１０５Ｍ−１秒−１以上、１０６Ｍ−１秒−１以上、または５×１０６Ｍ−１秒−１以上、または１０７Ｍ−１秒−１以上の結合速度（ｋ（ｏｎ））で、本明細書に開示した標的ポリペプチドまたはそのフラグメントまたは改変体に結合すると言ってもよい。
【０２０１】
ある抗体が、あるエピトープに選択的に結合し、参照抗体が、そのエピトープに結合するのをブロックするか、またはある程度ブロックする場合、その抗体は、参照抗体がエピトープに結合するのを競合的に阻害すると言う。競合的な阻害は、当該技術分野で知られている任意の方法によって、例えば、競合ＥＬＩＳＡアッセイによって決定してもよい。抗体は、所与の参照抗体がエピトープに結合するのを、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％、競合的に阻害すると言ってもよい。
【０２０２】
本明細書で使用するとき、用語「親和性」は、個々のエピトープが免疫グロブリン分子のＣＤＲと結合する強さの測定値を指す。例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２版．１９８８）の２７〜２８ページ参照。本明細書で使用するとき、用語「結合活性（ａｖｉｄｉｔｙ）」は、免疫グロブリンの集合体と、抗原との複合体の全体的な安定性を指す。すなわち、免疫グロブリン混合物と抗原との機能的な結合強度である。例えば、Ｈａｒｌｏｗの２９〜３４ページを参照。結合活性は、集合体に含まれる個々の免疫グロブリン分子と、特定のエピトープとの親和性に関係があり、免疫グロブリンおよび抗原の価数にも関係がある。例えば、二価モノクローナル抗体と、きわめて繰り返しの多いエピトープ構造を有する抗原（例えば、ポリマー）との相互作用は、結合活性が高い相互作用である。
【０２０３】
本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体は、交差反応性の観点から記載され、特定されてもよい。本明細書で使用するとき、用語「交差反応性」は、ある抗原に特異的な抗体が、第２の抗原と反応する性質を指し、２種類の異なる抗原基質間の関連性の尺度である。したがって、ある抗体が、それを誘導したエピトープ以外のエピトープに結合する場合、その抗体は、交差反応性である。交差反応性のエピトープは、一般的に、誘導エピトープと同じ相補性構造の多くを含有しており、ある場合には、元々のエピトープよりも実際には良好に適合することもある。
【０２０４】
例えば、特定の抗体は、関連性があるが、同一ではないエピトープ、例えば、参照エピトープと少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、および少なくとも５０％の同一性を有するエピトープ（当該技術分野で既知の方法および本明細書に記載の方法で算出）に結合するという点で、ある程度の交差反応性を有する。抗体が、参照エピトープと９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、および５０％未満の同一性を有するエピトープ（当該技術分野で既知の方法および本明細書に記載の方法で算出）には結合しない場合、そのエピトープは、交差反応性がほとんどないか、全くないと言うことができる。ある抗体が、そのエピトープの任意の他の類似体、オルソログ、またはホモログに結合しない場合、その抗体は、特定のエピトープに「きわめて特異的」であると考えてもよい。
【０２０５】
本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体は、本発明のポリペプチドに対する結合親和性の観点から記載され、特定されてもよい。好ましい結合親和性としては、解離定数（すなわちＫｄ）が、５×１０−２Ｍ未満、１０−２Ｍ未満、５×１０−３Ｍ未満、１０−３Ｍ未満、５×１０−４Ｍ未満、１０−４Ｍ未満、５×１０−５Ｍ未満、１０−５Ｍ未満、５×１０−６Ｍ未満、１０−６Ｍ未満、５×１０−７Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、５×１０−８Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、５×１０−９Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、５×１０−１０Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、５×１０−１１Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、５×１０−１２Ｍ未満、１０−１２Ｍ未満、５×１０−１３Ｍ未満、１０−１３Ｍ未満、５×１０−１４Ｍ未満、１０−１４Ｍ未満、５×１０−１５Ｍ未満または１０−１５Ｍ未満である。
【０２０６】
本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体は、「多重特異性」であってもよく、例えば、二重特異性、三重特異性、またはそれ以上の特異性を有していてもよい。多重特異性とは、１つ以上の異なる抗原（例えば、タンパク質）に存在する２個以上の異なるエピトープを同時に認識し、結合することを意味する。したがって、ＩＧＦ−１Ｒ抗体が「単一特異性」か「多重特異性」（例えば、「二重特異性」）であるかは、ある結合ポリペプチドに反応する異なるエピトープの数を指す。多重特異性抗体は、本明細書に記載の標的ポリぺプチドの異なるエピトープに特異的であり得、標的ポリペプチドと、異種エピトープ（例えば、異種ポリペプチドまたは固体支持材料）とに特異的であり得る。
【０２０７】
本明細書で使用するとき、用語「価数」は、結合可能な領域（例えば、ＩＧＦ−１Ｒ抗体、結合ポリペプチドまたは抗体に存在する抗原結合領域）の数を指す。それぞれの結合領域は、１つのエピトープに特異的に結合する。ＩＧＦ−１Ｒ抗体、結合ポリペプチドまたは抗体が、２個以上の結合領域を含む場合、それぞれの結合領域は、同じエピトープに特異的に結合してもよく、２個の結合領域を有する抗体の場合、「二価の単一特異性」と称する。または、それぞれの結合領域は、異なるエピトープに特異的に結合してもよく、２個の結合領域を有する抗体の場合、「二価の二重特異性」と称する。抗体は、それぞれの特異性について、二重特異性であり、二価であってもよい（「二重特異性の四価抗体」と称する）。別の実施形態では、四価のミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）または領域を欠く抗体を作成してもよい。
【０２０８】
二重特異性の二価抗体、および製造方法は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号；同第５，８０７，７０６号；同第５，８２１，３３３号；および米国特許出願公開第２００３／０２０７３４号および同第２００２／０１５５５３７号に記載されており、上述の各出願の内容の全ては、参照することにより本明細書に組み込まれる。二重特異性の四価抗体、および製造方法は、例えば、ＷＯ０２／０９６９４８号およびＷＯ００／４４７８８号に記載されており、上述の両出願の内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。一般的に、ＰＣＴ出願公開ＷＯ９３／１７７１５号；ＷＯ９２／０８８０２号；ＷＯ９１／００３６０号；ＷＯ９２／０５７９３号；Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９（１９９１）；米国特許第４，４７４，８９３号；同第４，７１４，６８１号；同第４，９２５，６４８号；同第５，５７３，９２０号；同第５，６０１，８１９号；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３（１９９２）を参照。
【０２０９】
すでに示したように、種々の分類の免疫グロブリンの定常領域のサブユニット構造および三次元配置は、十分に知られている。本明細書で使用するとき、用語「ＶＨ領域」は、免疫グロブリン重鎖のアミノ末端可変領域を含み、「ＣＨ１領域」は、免疫グロブリン鎖の第１の（最もアミノ末端に近い）定常領域を含む。ＣＨ１領域は、ＶＨ領域に隣接しており、免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域に対して、アミノ末端である。
【０２１０】
本明細書で使用するとき、用語「ＣＨ２領域」は、従来の付番スキームを用い、例えば、抗体の残基２４４〜残基３６０に広がる重鎖分子の一部分を含む（Ｋａｂａｔ付番システムでは残基２４４〜３６０、およびＥＵ付番号システムでは残基２３１〜３４０、Ｋａｂａｔ  ＥＡら（前出）参照）。ＣＨ２領域は、別の領域と密接な対をつくらないという点で、固有の領域である。むしろ、２個のＮが結合した分枝炭水化物鎖は、インタクトな未処理ＩｇＧ分子の２個のＣＨ２領域の間に入る。ＣＨ３領域は、ＩｇＧ分子のＣＨ２領域からＣ末端まで広がり、約１０８残基を含むことも、十分に記載されている。
【０２１１】
本明細書で使用するとき、用語「ヒンジ領域」は、ＣＨ１領域をＣＨ２領域に接続する重鎖分子の一部分を含む。このヒンジ領域は、約２５残基を有し、可とう性であり、これにより、２個のＮ末端にある抗原結合領域を独立して動かすことができる。ヒンジ領域は、上側、中央部および下側の３つの別個な領域に分けることができる（Ｒｏｕｘら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：４０８３（１９９８））。
【０２１２】
本明細書で使用するとき、用語「ジスルフィド結合」は、２個の硫黄原子間に形成される共有結合を含む。アミノ酸であるシステインは、チオール基を含み、このチオール基は、第２のチオール基とジスルフィド結合を形成することができ、また第２のチオール基と架橋することができる。最も天然に存在するＩｇＧ分子では、ＣＨ１領域とＣＬ領域とは、ジスルフィド結合で接続しており、２個の重鎖は、Ｋａｂａｔ付番システムによると、対応する２３９および２４２の位置で２個のジスルフィド結合で接続している（ＥＵ付番号システムでは、２２６または２２９）。
【０２１３】
本明細書で使用するとき、用語「キメラ抗体」は、免疫反応性領域または免疫反応性部位は、第１の種から得られるか、または第１の種に由来し、定常領域（インタクトなままであってもよく、本発明によって部分的に改変されてもよいし、改変されてもよい）が、第２の種から得られる任意の抗体を意味するのに使われる。好ましい実施形態では、標的結合領域または標的結合部位は、非ヒト由来であり（例えば、マウスまたは霊長類）、定常領域は、ヒトである。
【０２１４】
本明細書で使用するとき、用語「遺伝子操作した抗体」は、重鎖または軽鎖の可変領域または両鎖の可変領域が、既知の特異性を有する抗体の１つ以上のＣＤＲと少なくとも部分的に交換することによって改変され、必要な場合、フレームワーク領域も部分的に交換し、配列を変化させる、抗体を指す。ＣＤＲは、フレームワーク領域の由来である抗体と同じ分類またはさらに同じ副分類の抗体由来であってもよいが、ＣＤＲは、異なる分類の抗体由来であること、好ましくは、異なる種類の抗体由来であることが想定される。既知の特異性を有する非ヒト抗体由来の１個以上の「ドナー」ＣＤＲが、ヒト重鎖フレームワーク領域または軽鎖フレームワーク領域にグラフト結合するように遺伝子操作された抗体は、「ヒト化抗体」と呼ばれる。ある可変領域の抗原結合性を他の領域に移すために、すべてのＣＤＲを、ドナー可変領域由来の完全なＣＤＲと交換することは必須ではない。むしろ、標的結合部位の活性を維持するために必要な残基のみを移すだけでよい場合がある。この説明は、例えば、米国特許第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、同第５，６９３，７６２号および同第６，１８０，３７０号に記載されており、機能的な遺伝子操作された抗体またはヒト化抗体を得ることは、通常の実験を行うことによって、または試行錯誤によって、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０２１５】
本明細書で使用するとき、用語「適切に折りたたまれたポリペプチド」は、ポリペプチドに含まれるすべての機能的な領域が、明確に活性であるようなポリペプチド（例えば、ＩＧＦ−１Ｒ抗体）を含む。本明細書で使用するとき、用語「不適切に折りたたまれたポリペプチド」は、ポリペプチドの機能的な領域のうち、少なくとも１つでも活性でないポリペプチドを含む。ある実施形態では、適切に折りたたまれたポリペプチドは、少なくとも１個のジスルフィド結合で接続したポリペプチド鎖を含む。逆に、不適切に折りたたまれたポリペプチドは、少なくとも１個のジスルフィド結合で接続していないポリペプチドを含む。
【０２１６】
本明細書で使用するとき、用語「遺伝子操作された」は、合成手段による核酸またはポリペプチド分子の操作を含む（例えば、組み換え技術、インビトロペプチド合成、酵素によるペプチドカップリングまたは化学物質によるペプチドカップリング、またはこれらの技術の組み合わせ）。
【０２１７】
本明細書で使用するとき、用語「接続して」、「融合して」または「融合」は、同じ意味で使用される。これらの用語は、化学的な接続または組み換え手段を含むいかなる手段であってもよいが、２個以上の要素または成分が一緒になることを意味する。「フレーム内で融合」は、２個以上のポリヌクレオチドオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が、元々のＯＲＦの正しい翻訳リーディングフレームを維持するような様式で接続して、長くなった連続ＯＲＦを得ることを指す。したがって、組み換え融合タンパク質は、元々のＯＲＦによってコードされるポリペプチドに対応する２個以上の部分（この部分は、通常は天然では接続していない）を含有する、１個のタンパク質である。リーディングフレームは、融合した部分全体に連続的に作成されるが、各部分は、例えば、フレーム内のリンカー配列によって物理的または空間的に分割されていてもよい。例えば、免疫グロブリン可変領域のＣＤＲをコードするポリヌクレオチドは、フレーム内で融合していてもよいが、「融合した」ＣＤＲが、連続ポリペプチドの一部分として一緒に翻訳される限り、少なくとも１つの免疫グロブリンフレームワーク領域またはさらなるＣＤＲ領域をコードするポリヌクレオチドによって分割されていてもよい。
【０２１８】
ポリペプチドの文脈で、「線形配列」または「配列」は、ポリペプチド中のアミノ酸の順序を、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって示すものであり、この配列で互いに隣接する残基は、ポリペプチドの一次構造では連続している。
【０２１９】
用語「発現」は、本明細書で使用するとき、遺伝子が、生化学物質（例えば、ＲＮＡまたはポリペプチド）を産生するプロセスを指す。このプロセスは、細胞内で遺伝子が機能的に存在するような明らかな徴候を含む（限定されないが、遺伝子ノックダウン、および一過性発現および安定な発現）。限定されないが、遺伝子を、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または任意のＲＮＡ産物に転写すること、および上述のｍＲＮＡをポリペプチドに翻訳することが挙げられる。最終的な所望の生成物が生化学物質である場合、発現は、この生化学物質と任意の前駆体を作出することを含む。遺伝子の発現によって「遺伝子産物」が得られる。本明細書で使用するとき、遺伝子産物は、核酸（例えば、遺伝子の転写によって産生するメッセンジャーＲＮＡ）であってもよく、転写物から翻訳されるポリペプチドであってもよい。本明細書で記載の遺伝子産物は、転写後に改変（例えば、ポリアデニル化）した核酸、または翻訳後に改変（例えば、メチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットと結合、タンパク質開裂など）したポリペプチドを含む。
【０２２０】
本明細書で使用するとき、用語「治療する」または「治療」は、治療のための処置、および予防または防止のための手段を指し、望ましくない生理学的変化または障害（例えば、癌の進行または広がり）を予防するか、または遅らせる（弱める）ことを目的としている。有益な臨床結果または望ましい臨床結果としては、限定されないが、検出できるかできないかを問わず、症状の軽減、疾患の軽症化、疾患状態の安定化（すなわち、悪化しない）、疾患の進行を遅らせるか、弱めること、疾患状態の改善または緩和、および回復（部分的または全体的に）が挙げられる。「治療」は、治療を受けない場合に予想される生存時間と比較して、生存時間が伸びることを意味し得る。治療が必要な対象としては、すでに、ある状態や障害に罹患しているもの、およびその状態または障害になるおそれがあるもの、またはその状態または障害を予防すべきものが挙げられる。
【０２２１】
「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」は、診断、予後、または治療が望ましい任意の対象、特に哺乳動物の対象を意味する。哺乳動物対象としては、ヒト、家畜動物、農場の動物、および動物園の動物、スポーツ用動物、またはペット用動物（例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、乳牛などが挙げられる。
【０２２２】
本明細書で使用するとき、「結合分子を投与することが有益な対象」および「治療が必要な動物」といった句は、例えば、結合分子によって認識される抗原を検出するために（例えば、診断手順で）結合分子を投与することが有益な対象（例えば、哺乳動物対象）、および／または所与の標的タンパク質に特異的に結合する結合分子で治療する（すなわち、癌のような疾患を緩和または予防する）ことが有益な対象（例えば、哺乳動物対象）を含む。本明細書に詳細に記載しているように、結合分子は、複合体ではない形態で使用してもよく、（例えば、薬物、プロドラッグまたは同位体との）複合体の形態で使用してもよい。
【０２２３】
本明細書で使用するとき、用語「結合分子」は、目的の標的分子（例えば抗原）に結合する（例えば、特異的に結合するか、または選択的に結合する）分子を指す。特定の実施形態では、本発明の結合分子は、ＩＧＦ−１Ｒの少なくとも１個のエピトープに特異的に結合するか、選択的に結合するポリペプチドである。本発明の範囲内にある結合分子としては、小分子、核酸、ペプチド、ペプチド模倣物、デンドリマー、非免疫グロブリン分子、および本明細書に記載のＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する他の分子が挙げられる。
【０２２４】
（非免疫グロブリン結合分子）
特定の実施形態では、本発明の結合分子は、非免疫グロブリン結合分子である。本明細書で使用するとき、用語「非免疫グロブリン結合分子」は、結合部分に、免疫グロブリン以外のポリペプチドに由来する部分（例えば、足場タンパク質またはフレームワーク）を含む結合分子であるが、所望な結合特異性を提供するために、遺伝子操作をしていてもよい（例えば、突然変異）。
【０２２５】
非免疫グロブリン結合分子は、免疫グロブリン以外の免疫グロブリンスーパーファミリー由来の結合部分を含み得る（例えば、Ｔ細胞受容体または細胞接着タンパク質（例えば、ＣＴＬＡ−４、Ｎ−ＣＡＭ、テロキン））。このような結合分子は、免疫グロブリンの折りたたみ構造を保持し、ＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合可能な結合部分を含む。他の実施形態では、本発明の非免疫グロブリン結合分子は、免疫グロブリンの折りたたみ構造に基づかないタンパク質トポロジーを有する（例えば、アンキリン繰り返しタンパク質またはフィブロネクチン）が、標的（例えば、ＩＧＦ−１Ｒエピトープ）に特異的に結合可能な結合部位も含む。
【０２２６】
非免疫グロブリン結合分子は、人工的に多様化させた結合部位を有する結合分子ライブラリから、標的に結合する改変体を選別するか、または単離することによって同定してもよい。多様化させたライブラリは、完全に無作為なアプローチを用いて作成してもよく（例えば、エラープローンＰＣＲ、エクソンシャッフリング、または定方向進化）、または当該技術分野で認識された設計方法を使って作成してもよい。例えば、結合部位が、同族の標的分子と相互作用するときに、通常関与するアミノ酸の位置は、縮重コドン、トリヌクレオチド、ランダムペプチド、または結合部位をコードする核酸の中の対応する位置に完全なループを挿入することによって、ランダム化してもよい（例えば、米国特許出願公開第２００４０１３２０２８号を参照）。アミノ酸の位置は、標的分子との複合体で、結合部位の結晶構造を観察することによって特定することができる。ランダム化する候補となる位置は、ループ、平坦な表面、らせん、および結合部位の結合空洞が挙げられる。特定の実施形態では、多様化の候補になりそうな結合部位に存在するアミノ酸は、免疫グロブリンの折りたたみ構造との同一性によって特定してもよい。例えば、フィブロネクチンのＣＤＲ様ループに含まれる残基をランダム化し、フィブロネクチン結合分子のライブラリを作成してもよい（例えば、Ｋｏｉｄｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２８４：１１４１−１１５１（１９９８）を参照）。結合部位のうち、ランダム化可能な他の部分としては、平坦な表面が挙げられる。ランダム化した後、多様化させたライブラリを選択またはスクリーニングし、所望の結合特性を有する（例えば、上述のＩＧＦ−１Ｒエピトープに対して特異的に結合する）結合分子を得てもよい。例えば、当該技術分野で認識されている方法（例えば、ファージディスプレイ、イーストディスプレイ、またはリボソームディスプレイ）で、選択してもよい。
【０２２７】
ある実施形態では、本発明の結合分子は、フィブロネクチン結合分子に由来する結合部分を含む。フィブロネクチン結合分子（例えば、Ｉ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型のフィブロネクチンドメインを含む分子）は、ＣＤＲ様のループ形状をとり、これは、免疫グロブリンとは違い、鎖内ジスルフィド結合にはよらない。ＦｎＩＩＩループは、ランダム変異を受け得る領域を含んでおり、この領域は、有用な治療ツールを開発するための、標的への結合、選択、およびさらなる変異を繰り返す進化スキームへと繋がる可能性を有している。本明細書に記載のＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合するか、または選択的に結合するように、フィブロネクチン系の「対応可能な（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ）」治療用結合分子（「ＦＡＴＢＩＭ」）を開発してもよい。ＦＡＴＢＩＭとしては、例えば、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃにより命名されたＡｄｎｅｃｔｉｎという名称のフィブロネクチン系結合分子群が挙げられる。フィブロネクチン結合ポリペプチドの製造方法は、例えば、ＷＯ０１／６４９４２および米国特許第６，６７３，９０１号、同第６，７０３，１９９号、同第７，０７８，４９０号および同第７，１１９，１７１号に記載されており、これらの内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０２２８】
別の実施形態では、本発明の結合分子は、アフィボディ由来の結合部位を含む。アフィボディは、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ（ＳＰＡ）の免疫グロブリン結合領域に由来する（例えば、Ｎｏｒｄら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１５：７７２−７７７（１９９７）を参照）。本発明で利用するアフィボディ結合部位は、ＳＰＡの領域（例えば、領域Ｂ）に由来する、ＳＰＡに関連するタンパク質（例えば、タンパク質Ｚ）を突然変異させ、ＩＧＦ−１Ｒエピトープへの結合親和性を有するＳＰＡ関連ポリペプチド変異体を選択することによって合成してもよい。アフィボディ結合部位を製造する他の方法は、米国特許第６，７４０，７３４号および同第６，６０２，９７７号およびＷＯ００／６３２４３号に記載されており、これらの内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０２２９】
別の実施形態では、本発明の結合分子は、アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎ）由来の結合部位を含む。アンチカリン（リポカリンとしても知られる）は、多様なβ−バレルタンパク質を有する群であり、バレル／ループ領域で標的分子に結合する機能がある。リポカリン結合部位は、バレルのストランドに接続するループ配列をランダム化することによって、ＩＧＦ−１Ｒエピトープに結合するように遺伝子操作されてもよい（例えば、Ｓｃｈｌｅｈｕｂｅｒら、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ、１０：２３−３３（２００５）；Ｂｅｓｔｅら、ＰＮＡＳ、９６：１８９８−１９０３（１９９９）を参照）。本発明の結合分子で利用するアンチカリン結合部位は、Ｐｉｅｒｉｓ  ｂｒａｓｓｉｃａのビリン結合タンパク質（ＢＢＰ）のアミノ酸位置２８〜４５、５８〜６９、８６〜９９および１１４〜１２９を含む線形ポリペプチド配列の配列位置に対応する４箇所の部分で突然変異を起こしたリポカリン群のポリペプチドから得てもよい。アンチカリン結合部位を製造する他の方法は、ＷＯ９９／１６８７３号およびＷＯ０５／０１９２５４号に記載されており、これらの内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０２３０】
別の実施形態では、本発明の結合分子は、システインに富むポリペプチド由来の結合部位を含む。本発明を実施するのに利用するシステインに富む領域は、典型的には、α−らせん、β−シート、またはβ−バレルの構造をとらない。典型的には、ジスルフィド結合によって、この領域の三次元構造への折りたたみが促進される。通常は、システインに富む領域は、少なくとも２個のジスルフィド結合を有しており、さらに典型的には、少なくとも３個のジスルフィド結合を有している。システインに富むポリペプチドの例は、Ａ領域のタンパク質である。Ａ領域（「相補性の繰り返し（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｔｙｐｅ  ｒｅｐｅａｔ）」と呼ばれることもある）は、約３０〜５０個または約３０〜６５個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、この領域は、約３５〜４５個のアミノ酸を含み、ある場合には、約４０個のアミノ酸を含む。３０〜５０個のアミノ酸の中に、システイン残基は約６個存在する。この６個のシステインのうち、ジスルフィド結合は、典型的には、Ｃ１とＣ３との間、Ｃ２とＣ５との間、Ｃ４とＣ６との間に存在する。Ａ領域は、リガンド結合部位を構成する。この領域のシステイン残基は、ジスルフィド結合によって、小さくまとまった、安定で機能的に独立した部分を形成する。この繰り返しがクラスターになってリガンド結合領域を作り、異なるクラスターができることによって、リガンド結合に対する特異性が付与され得る。Ａ領域を含むタンパク質の例としては、例えば、相補性成分（例えば、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９およびＦａｃｔｏｒ  Ｉ）、セリンプロテアーゼ（例えば、エンテロペプチダーゼ、マトリプターゼおよびコリン）、膜貫通タンパク質（例えば、ＳＴ７、ＬＲＰ３、ＬＲＰ５およびＬＲＰ６）およびエンドサイトーシス受容体（例えば、Ｓｏｒｔｉｌｉｎ関連受容体、ＬＤＬ−受容体、ＶＬＤＬＲ、ＬＲＰ１、ＬＲＰ２およびＡｐｏＥＲ２）が挙げられる。所望の結合特異性を有するＡ領域タンパク質を製造する方法は、例えば、ＷＯ０２／０８８１７１号およびＷＯ０４／０４４０１１号に開示されており、これらの内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０２３１】
他の実施形態では、本発明の結合分子は、リピートタンパク質の結合部位を含む。リピートタンパク質は、小さな（例えば、約２０〜約４０個のアミノ酸残基）構造単位または構造の繰り返しが連続した複製物を含有し、これらが合わさって連続的な領域を形成するタンパク質である。リピートタンパク質は、このタンパク質中の繰り返し数を調節することによって、特定の標的結合部位に合うように改変することができる。リピートタンパク質の例としては、設計されたアンキリンリピートタンパク質（すなわち、ＤＡＲＰｉｎ）（例えば、Ｂｉｎｚら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２２：５７５−５８２（２００４）を参照）、またはロイシンに富むリピートタンパク質（すなわち、ＬＲＲＰ）（例えば、Ｐａｎｃｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、４３０：１７４−１８０（２００４）を参照）が挙げられる。今までに分かっていることは、アンキリン繰り返し単位の三次元構造は、β−ヘアピン構造の後に、２個の逆行性のα−らせんがあり、繰り返し単位と次の繰り返し単位を接続するループへと続く構造であるということである。アンキリン繰り返し単位を構成するドメインは、この繰り返し単位を、広がった構造や曲がった構造になるように繋ぎ合わせることによって作られる。ウミヤツメおよび他の無顎類の適応免疫系の一部から得られるＬＲＲＰ結合部位は、それらがリンパ球の成熟期にロイシンに富む一組の繰り返し遺伝子を再び組み合わせることによって形成されるという点で、抗体に類似する。ＤＡＲｐｉｎ結合部位またはＬＲＲＰ結合部位を製造する方法は、ＷＯ０２／２０５６５号およびＷＯ０６／０８３２７５に記載されており、これらの内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０２３２】
本発明の結合分子で利用可能な他の非免疫グロブリン結合部位としては、Ｓｒｃ同一性領域（例えば、ＳＨ２領域またはＳＨ３領域）、ＰＤＺ領域、β−ラクタマーゼ、高親和性プロテアーゼ阻害剤、または小分子ジスルフィド結合足場タンパク質（例えば、サソリの毒素など）に由来する結合部位が挙げられる。これらの分子に由来する結合部位を製造する方法は、当該技術分野で開示されており、例えば、Ｐａｎｎｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７７：２１６６６−２１６７４（２００２）、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１７：１７０−１７５（１９９９）；Ｌｅｇｅｎｄｒｅら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．、１１：１５０６−１５１８（２００２）；Ｓｔｏｏｐら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２１：１０６３−１０６８（２００３）；およびＶｉｔａら、ＰＮＡＳ、９２：６４０４−６４０８（１９９５）を参照。さらに他の結合部位は、ＥＧＦ様領域、Ｋｒｉｎｇｌｅ領域、ＰＡＮ領域、Ｇｌａ領域、ＳＲＣＲ領域、Ｋｕｎｉｔｚ／Ｂｏｖｉｎｅ膵臓トリプシン阻害領域、Ｋａｚａｌ型セリンプロテアーゼ阻害領域、Ｔｒｅｆｏｉｌ（Ｐ型）領域、フォンウィルブランド因子Ｃ型領域、Ａｎａｐｈｙｌａｔｏｘｉｎ様領域、ＣＵＢ領域、サイログロブリンＩ型繰り返し、ＬＤＬ受容体Ａ型領域、Ｓｕｓｈｉ領域、Ｌｉｎｋ領域、トロンボスポンジンＩ型領域、免疫グロブリン様領域、Ｃ型レクチン領域、ＭＡＭ領域、フォンウィルブランド因子Ａ型領域、Ｓｏｍａｔｏｍｅｄｉｎ  Ｂ領域、ＷＡＰ型の４つのジスルフィドコアを有する領域、Ｆ５／８  Ｃ型領域、Ｈｅｍｏｐｅｘｉｎ領域、Ｌａｍｉｎｉｎ型のＥＧＦ様領域、Ｃ２領域、および当業者に既知の他の領域、およびこれらの誘導体および／または改変体からなる群から選択される結合領域に由来してもよい。非免疫グロブリン結合分子の例、およびその製造方法は、Ｓｔｅｍｍｅｒら、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ  ａｎｄ  ｕｓｅｓ  ｔｈｅｒｅｏｆ」、米国特許出願公開第２００６０２３４２９９号（２００６年１０月１９日）およびＨｅｙら、Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ、Ｎｏｎ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＴＲＥＮＤＳ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．２３、Ｎｏ．１０、表２およびｐｐ．５１４−５２２（２００５年１０月）にも記載されており、本明細書の引用文献も参照のこと。
【０２３３】
本明細書で使用するとき、結合分子のＩＧＦ−１Ｒへの結合に関して、用語「ＩＧＦ−１Ｒが介在するシグナル伝達をより大きくブロックする」は、ＩＧＦ−１Ｒの第１のエピトープに結合する第１の結合部分（ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２のうち、少なくとも１つがＩＧＦ−１Ｒに結合するのをブロックする部分）と、ＩＧＦ−１Ｒの第２の異なるエピトープに結合する第２の結合部分（ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２のうち、少なくとも１つがＩＧＦ−１Ｒに結合するのをブロックする部分）とが、第１の結合部分単独、または第２の結合部分単独で結合する場合よりも、ＩＧＦ−１Ｒが介在するシグナル伝達をより大きくブロックする状況を指す。ＩＧＦ−１Ｒが介在するシグナル伝達の阻害は、多くの異なる方法で測定することができ、例えば、腫瘍の成長度が下方修正されること（例えば、腫瘍の成長が遅れること）、腫瘍が小さくなるか、または転移が減ること、癌の臨床的な機能障害または症状が軽減するか、最低限のものになること、この治療をしない場合に予想される対象の生存期間よりも、生存期間が長くなること、投与前には腫瘍ができていなかった動物で、腫瘍の成長を予防すること（すなわち、予防的投与）が挙げられる。本明細書で使用するとき、用語「下方修正する」「下方修正すること」または「下方修正」は、特定のプロセスが起こる速度を下げること、特定のプロセスを阻害すること、特定のプロセスを逆行させること、および／または特定のプロセスが開始するのを予防することを指す。したがって、特定のプロセスが腫瘍の成長または転移である場合、用語「下方修正」としては、限定されないが、腫瘍の成長および／または転移の発生する速度を下げること、腫瘍成長および／または転移を阻害すること、腫瘍の成長および／または転移を逆行させること（腫瘍が小さくなること、および／または根絶することを含む）、および／または腫瘍の成長および／または転移を予防することが挙げられる。
【０２３４】
ある実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒが介在するシグナル伝達が、より大きくブロックされる場合、相加効果が観察される。用語「相加効果」は、本明細書で使用するとき、第１の結合部分および第２の結合部分の結合効果を組み合わせた合計が、第１の結合部分のみ、または第２の結合部分のみが結合する場合に観察された効果とほぼ等しい状況を指す。相加効果は、典型的には、ＩＧＦ−１Ｒに対する、第１の結合部分または第２の結合部分のモル比（単独の場合）が、ＩＧＦ−１Ｒに対する、第１の結合部分および第２の結合部分のモル比（合わせたもの）とほぼ同じである条件下で測定される。
【０２３５】
ある実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒが介在するシグナル伝達が、より大きくブロックされる場合、相乗効果が観察される。用語「相乗効果」は、本明細書で使用するとき、第１の結合部分および第２の結合部分が結合して生じる相加効果よりも大きく、第１の結合部分のみ、または第２の結合部分のみが結合する場合に生じた効果を超える効果を指す。相乗効果は、典型的には、ＩＧＦ−１Ｒに対する、第１の結合部分または第２の結合部分のモル比（単独の場合）が、ＩＧＦ−１Ｒに対する、第１の結合部分および第２の結合部分のモル比（合わせたもの）とほぼ同じである条件下で測定される。本発明の実施形態は、第１のＩＧＦ−１Ｒ結合部位および第２のＩＧＦ−１Ｒ結合部位を用いることによって、ＩＧＦ−１Ｒが介在するシグナル伝達の下方修正において、相乗効果を得る方法を含む。ここで、上述の効果は、対応する相加効果よりも少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも１００％大きい。
【０２３６】
ある実施形態では、相乗効果は、半有効原理に基づくＣｈｏｕおよびＴａｌａｌａｙの組み合わせ指数（ＣＩ）法を用いて測定される（Ｃｈａｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４５：２４３４−２４３９（１９８５）を参照）。この方法は、種々の濃度の細胞毒性で、２種類の薬物の相乗効果、相加性、または拮抗作用の程度を算出するものである。ＣＩ値が１未満の場合、２種類の薬物に相乗効果がある。ＣＩ値が１の場合、相加効果はあるが、相乗効果はない。ＣＩ値が１より大きいことは、拮抗作用があることを示す。ＣＩ値が小さくなるほど、相乗効果は大きくなる。別の実施形態では、相乗効果は、部分阻害濃度（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）（ＦＩＣ）を用いて決定される。この部分値は、組み合わせにおいて作用する薬物のＩＣ５０を、その薬物が単独で作用する場合のＩＣ５０の関数としてあらわすことによって決定される。２種類の相互作用する薬物の場合、それぞれの薬物のＦＩＣ値の合計は、相乗的な相互作用の測定値をあらわす。ＦＩＣが１未満の場合、２種類の薬物に相乗効果が存在する。ＦＩＣ値が１であるとは、相加効果が存在することを示す。ＦＩＣの値が小さくなるほど、相乗効果が大きくなる。
【０２３７】
特定の代わりの実施形態では、２種類の別個の化合物（例えば、別個の結合部分）を組み合わせると、それぞれの化合物の飽和濃度または飽和投薬量を使用した場合に可能な効果よりも大きな変化が観察されるときに、相乗効果が観察される。個々の結合分子自体が、完全な効果を発揮することができない場合（例えば、薬物の濃度をどこまで高くしても、下方修正率１００％には到達しない）、このような相乗効果が起こり得る。この状況で、相乗効果は、ＥＣ５０値またはＩＣ５０値を分析することによっても、十分につかめることはできない。２種類の化合物（例えば、結合部分）を組み合わせることにより、１種類の化合物で可能なレベルよりも大きく下方修正する場合、強力な相乗効果があると認識される。
【０２３８】
（過剰増殖性疾患または過剰増殖性障害）
「過剰増殖性疾患または過剰増殖性障害」とは、悪性あるいは良性の、あらゆる形質転換した細胞および組織、およびすべての癌細胞および癌組織を含む、あらゆる新生物細胞の成長および増殖を意味する。過剰増殖性疾患または過剰増殖性障害としては、限定されないが、前癌病変、異常な細胞成長、良性の腫瘍、悪性の腫瘍および「癌」が挙げられる。本発明の特定の実施形態では、過剰増殖性疾患または過剰増殖性障害、例えば、前癌病変、異常な細胞成長、良性の腫瘍、悪性の腫瘍および「癌」は、ＩＧＦ−１Ｒを発現する細胞、ＩＧＦ−１Ｒを過剰発現する細胞、またはＩＧＦ−１Ｒを異常なレベルで発現する細胞を含む。
【０２３９】
過剰増殖性疾患、過剰増殖性障害および／または過剰増殖状態のさらなる例としては、限定されないが、良性あるいは悪性の、以下の場所にある新生物が挙げられる。前立腺、結腸、腹部、骨、胸、消化系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、睾丸、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭、首、神経（中枢神経系および末梢神経系）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部または尿生殖路。このような新生物は、特定の実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒを発現するか、過剰に発現するか、または異常なレベルで発現する。
【０２４０】
他の過剰増殖性障害としては、限定されないが、上に列挙した臓器系に存在する、高ガンマグロブリン血、リンパ球増殖障害、タンパク異常血症、紫斑病、サルコイドーシス、セザリー症候群、ワルデンストローム・マクログロブリン血症、ゴーシェ病、組織球増殖症、および新生物以外の任意の他の過剰増殖性疾患が挙げられる。本発明の特定の実施形態では、この疾患は、ＩＧＦ−１Ｒを発現するか、過剰に発現するか、または異常なレベルで発現する細胞を含む。
【０２４１】
本明細書で使用するとき、用語「腫瘍」または「腫瘍組織」は、過剰な細胞分化から生じた異常な組織の塊を指し、特定の場合、ＩＧＦ−１Ｒを発現するか、過剰に発現するか、または異常なレベルで発現する細胞を含む組織を指す。腫瘍または腫瘍組織は、異常な成長特性を有する新生物細胞であり、体内で有用な機能をもたない「腫瘍細胞」を含む。腫瘍、腫瘍組織および腫瘍細胞は、良性または悪性であり得る。腫瘍または腫瘍組織は、「腫瘍に関連する腫瘍ではない細胞」、例えば、腫瘍または腫瘍組織を供給する血管を形成する血管細胞を含み得る。腫瘍ではない細胞は、腫瘍細胞によって複製され、成長するように誘発され得、腫瘍または腫瘍組織における血管形成の誘発がその例である。
【０２４２】
本明細書で使用するとき、用語「悪性細胞」は、良性ではない腫瘍または癌を指す。本明細書で使用するとき、用語「癌」は、細胞死の制御がはずれたか、または制御不能になったことを特徴とする悪性細胞を含む、ある種の過剰増殖性疾患を暗示する。癌の例としては、限定されないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病またはリンパ球の悪性細胞が挙げられる。癌のさらに特定の例を、以下に示し、以下のものが挙げられる。有棘細胞癌（例えば、扁平上皮細胞癌）、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌および肺の有棘細胞癌を含む肺癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸の癌を含む胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｏｒｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、膵臓癌、膠芽細胞腫、頸部癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、直腸結腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌（ｋｉｄｎｅｙ  ｏｒ  ｒｅｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝臓癌（ｈｅｐａｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肛門癌、陰茎癌、および頭頸部癌。用語「癌」は、原発性の悪性細胞または腫瘍（例えば、他の元々の悪性細胞または腫瘍がある位置以外の、対象の体内の位置に移動していないもの）、および二次的な悪性細胞または腫瘍（例えば、他の元々の腫瘍がある位置とは異なる第２の場所に、悪性細胞または腫瘍細胞が転移し、移動して生じるもの）を含む。本発明の治療方法の助けとなる癌は、ＩＧＦ−１Ｒを発現するか、過剰に発現するか、または異常なレベルで発現する細胞を含む。
【０２４３】
癌または悪性細胞の他の例としては、限定されないが、小児急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、成人（原発性）肝細胞癌、成人（原発性）肝臓癌、成人急性リンパ球性白血病、成人急性骨髄性白血病、成人ホジキン病、成人ホジキンリンパ腫、成人リンパ球性白血病、成人非ホジキンリンパ腫、成人原発性肝臓癌、成人軟部組織の肉腫、エイズ関連リンパ腫、エイズ関連悪性細胞、肛門癌、星状細胞腫、胆管癌、膀胱癌、骨肉腫、脳幹グリオーマ、脳腫瘍、乳癌、腎盂および尿管の癌、中枢神経系（原発性）リンパ腫、中枢神経系リンパ腫、小脳星状細胞腫、脳の星状細胞腫、子宮頸癌、小児（原発性）肝細胞癌、小児（原発性）肝臓癌、小児急性リンパ芽球性白血病、小児急性骨髄性白血病、小児脳幹グリオーマ、小児小脳星状細胞腫、小児の脳の星状細胞腫、小児頭蓋外胚細胞腫瘍、小児ホジキン病、小児ホジキンリンパ腫、小児視床下部および視経路の膠腫、小児リンパ芽球性白血病、小児髄芽腫、小児非ホジキンリンパ腫、小児のテント上未分化神経外胚葉性および松果体腫瘍、小児原発性肝臓癌、小児横紋筋肉腫、小児軟部組織肉腫、小児の視経路および視床下部の膠腫、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、直腸癌、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、膵島細胞癌、子宮内膜癌、上衣腫、上皮癌、食道癌、ユーイング肉腫および関連腫瘍、膵外分泌部の腫瘍、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼癌、女性の乳癌、ゴーシェ病、胆嚢癌、胃癌、胃腸のカルチノイド腫瘍、胃腸の腫瘍、胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍、有毛細胞白血病、頭頸部癌、肝細胞癌、ホジキン病、ホジキンリンパ腫、高ガンマグロブリン血症、下咽頭癌、腸癌、眼内黒色腫、島細胞癌、膵島細胞癌、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、口唇及び口腔癌、肝臓癌、肺癌、リンパ増殖性障害、マクログロブリン血症、男性の乳癌、悪性中皮腫、悪性胸腺腫、髄芽腫、黒色腫、中皮腫、転移性の原発不明扁平上皮頸癌、転移性の原発性扁平上皮頸癌、転移性扁平上皮頸癌（Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｓｑｕａｍｏｕｓ  Ｎｅｃｋ  Ｃａｎｃｅｒ）、多発性骨髄腫、多発性骨髄腫／形質細胞腫、骨髄形成異常症候群、骨髄性白血病（Ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ）、骨髄性白血病（Ｍｙｅｌｏｉｄ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ）、骨髄増殖性障害、鼻腔および副鼻腔の癌、鼻咽頭癌、神経芽腫、妊娠期の非ホジキンリンパ腫、非黒色腫皮膚癌（Ｎｏｎｍｅｌａｎｏｍａ  Ｓｋｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ）、非小細胞肺癌、潜在性原発性転移性扁平上皮頸癌（Ｏｃｃｕｌｔ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  Ｓｑｕａｍｏｕｓ  Ｎｅｃｋ  Ｃａｎｃｅｒ）、口腔咽頭癌、骨／悪性線維性肉腫、骨肉腫／悪性線維性組織球腫、骨の骨肉腫／悪性線維性組織球腫、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣境界型腫瘍、膵臓癌、パラプロテイン血症、紫斑、上皮小体癌、陰茎癌、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、形質細胞腫／多発性骨髄腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性肝臓癌、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、腎盤および尿管の癌、網膜芽腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、サルコイドーシス肉腫、セザリー症候群、皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟組織肉腫、扁平上皮頸癌、胃癌、���ント上未分化神経外胚葉性および松果体腫瘍、Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、胸腺腫、甲状腺癌、腎盂および尿管の移行上皮癌、移行性の腎盂および尿管の癌、栄養膜腫瘍、尿管およびｖ細胞の癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣の癌、視路および視床下部グリオーマ、外陰部の癌、ワルデンストローム・マクログロブリン血症、ウィルムス腫、および上に列挙した臓器に存在する任意の他の過剰増殖性疾患、新生物が挙げられる。
【０２４４】
本発明の方法を使用し、前癌状態を治療することができ、新生物または悪性細胞（限定されないが、上述の障害が挙げられる）に進行するのを予防することができる。このような用途が示されるのは、新生物または癌に進行することが知られているか、または疑わしい状況であり、特に、過形成、化生からなる新生物性ではない細胞成長、または最も特定的には、形成異常が起こっている状況である（このような異常な成長状態の概説としては、Ｒｏｂｂｉｎｓ  ａｎｄ  Ａｎｇｅｌｌ、Ｂａｓｉｃ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、２ｄ  Ｅｄ．、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ｐｐ．６８−７９（１９７６）を参照。ＩＧＦ−１Ｒを発現し始めるか、過剰に発現し始めるか、または異常なレベルで発現し始めるこのような状態は、本発明の方法で治療するのに特に好ましい。
【０２４５】
過形成は、細胞増殖が制御されている一種の形態であり、細胞の構造または機能が顕著に変わることなく、組織または臓器の細胞数が増加することを含む。本発明の方法で治療可能な過形成障害としては、限定されないが、脈管濾胞性縦隔リンパ節増殖、好酸球増加随伴性血管類リンパ組織増殖症、非定型メラニン細胞過形成、基底細胞過形成、良性巨大リンパ節増殖、セメント質過形成、先天性副腎過形成、先天性脂腺増生症、嚢胞性増殖、乳房嚢胞性過形成、義歯性線維症、導管過形成、子宮内膜過形成、線維筋過形成、局所性上皮肥厚、歯肉増殖、炎症性線維性過形成、炎症性乳頭状過形成、血管内乳頭状内皮過形成、結節性前立腺過形成、結節性再生過形成、偽上皮腫性増殖、老年性脂腺増生症、ならびに疣贅性肥厚が挙げられる。
【０２４６】
化生は、細胞増殖が制御されている一種の形態であり、成熟細胞または完全に分化したある種の細胞が、別の種類の成熟細胞に変わったものである。本発明の方法で治療可能な化生としては、限定されないが、原因不明骨髄様化生、アポクリン化生、非定型化性（ａｔｙｐｉｃａｌ  ｍｅｔａｐｌａｓｉａ）、自己実質化生、結合組織化生、上皮化生、腸上皮化生、化生性貧血、変形骨化、形成異常性ポリープ、骨髄化生、原発性骨髄様化生、二次性骨髄様化生、扁平化生、羊膜の扁平化生、および症候性骨髄化生が挙げられる。
【０２４７】
形成異常は、頻繁に起こる癌の前兆であり、主に上皮に生成する。形成異常は、新生物性ではない細胞成長の中で、もっとも障害の大きな形態であり、個々の細胞の均一性が失われており、構造上の配置も乱れている。形成異常細胞は、異常に大きく、深く染色される核を有し、多態性を呈する。形成異常は、慢性的に刺激または炎症が起こる場所で特徴的に生じる。本発明の方法で治療可能な形成異常としては、限定されないが、無汗性外胚葉性形成異常、前後形成異常、窒息性胸郭形成異常、心房指（ａｔｒｉｏｄｉｇｉｔａｌ）形成異常、気管支肺形成異常症、終脳形成異常、子宮頸部形成異常、軟骨外胚葉性形成異常、鎖骨頭蓋骨形成不全、先天性外胚葉性形成異常、頭蓋骨幹形成異常、頭蓋骨手根骨足根骨形成不全、頭蓋骨幹端形成異常、ぞうげ質形成異常症、骨幹形成異常、外胚葉性形成異常、エナメル質形成異常、脳−眼球形成異常（ｅｎｃｅｐｈａｌｏ−ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、足根骨肥大、多発性骨端形成異常、点状骨端形成異常、上皮形成異常、顔面指趾生殖器形成異常、家族性顎骨の線維性形成障害、家族性白色襞性形成異常、線維筋性形成異常、線維性骨形成異常、開花性骨形成異常症、遺伝性腎性−網膜性形成異常（ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  ｒｅｎａｌ−ｒｅｔｉｎａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、発汗性外胚葉性形成異常、無汗性外胚葉形成異常症、リンパ球減少性胸腺形成異常、乳房形成異常、顎顔面形成異常、骨幹端形成異常、モンディーニ型内耳形成異常、単発性線維性形成異常、粘膜上皮形成異常、多発性骨端形成異常、眼耳脊椎形成異常、眼歯指形成異常、眼脊椎形成異常、歯牙形成不全、眼下顎四肢形成不全、根尖性セメント質形成異常症、多発性線維性骨形成異常、偽軟骨発育不全脊椎骨端形成異常、網膜形成異常、中隔−視覚形成異常症、脊椎骨端形成異常、および心室橈骨形成異常が挙げられる。
【０２４８】
本発明の方法で治療可能なさらなる前腫瘍性障害としては、限定されないが、良性の異常増殖障害（例えば、良性腫瘍、線維嚢胞状態、組織肥大、腸ポリープ、結腸ポリープ、および食道形成異常）、白斑症、角化症、ボーエン病、農夫皮膚、日光口唇炎、および日光性角化症が挙げられる。
【０２４９】
好ましい実施形態では、本発明の方法を使用し、癌（特に、上に列挙したもの）の成長、進行および／または転移を阻止する。
【０２５０】
さらなる過剰増殖性疾患、過剰増殖性障害および／または過剰増殖性状態としては、以下の進行および／または転移が挙げられるが、これらに限定されない。悪性腫瘍および関連する障害（例えば、白血病（急性白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（骨髄芽球性白血病、前骨髄性白血病（ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ）、骨髄単球性白血病、単球性白血病および赤白血病を含む））、ならびに慢性白血病（例えば、慢性骨髄性白血病（顆粒球性白血病）および慢性リンパ性白血病）を含む）、真性赤血球増加、リンパ腫（例えば、ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンストローム・マクログロブリン血症、Ｈ鎖病、および固形腫瘍（これらは、以下が挙げられるが、これらに限定されない：肉腫および癌（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮性肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リンパ管肉腫、リンパ管内皮腫、骨膜腫、中皮腫、ユーイング腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞癌、ヘパトーム、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎生期癌、ウィルムス腫、頚部癌、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫（ｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）、聴神経鞘腫（ａｃｏｕｓｔｉｃ  ｎｅｕｒｏｍａ）、乏突起神経膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、黒色腫、神経芽腫、ならびに網膜芽腫））。
【０２５１】
（ＩＩ．ＩＧＦ−１Ｒ）
天然のインスリン様成長因子受容体−１（ＩＧＦ−１Ｒ）。ＩＧＦ−１Ｒは、２個のαサブユニット（それぞれ１３０ｋＤａ）と、２個のβサブユニット（それぞれ９０ｋＤａ）とがジスルフィド結合で結合した、ヘテロテトラマーの血漿膜糖タンパク質である。Ｍａｓｓａｇｕｅ，ＪおよびＣｚｅｃｈ，Ｍ．Ｐ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：５０３８−５０４５（１９９２）。ＩＧＦ−１Ｒは、当該技術分野でＣＤ２２１およびＪＴＫ１３という名称でも知られている。ヒトＩＧＦ−１Ｒ  ｍＲＮＡの核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ＿０００８７５で入手可能であり、本明細書では配列番号１として示される。
配列番号１
＞ｇｉ｜１１０６８００２｜ｒｅｆ｜ＮＭ＿０００８７５．２｜ホモサピエンスインスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ），ｍＲＮＡ
ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＡＧＡＡＡＧＧＧＡＡＴＴＴＣＡＴＣＣＣＡＡＡＴＡＡＡＡＧＧＡＡＴＧＡＡＧＴＣＴＧＧＣＴＣＣＧＧＡＧＧＡＧＧＧＴＣＣＣＣＧＡＣＣＴＣＧＣＴＧＴＧＧＧＧＧＣＴＣＣＴＧＴＴＴＣＴＣＴＣＣＧＣＣＧＣＧＣＴＣＴＣＧＣＴＣＴＧＧＣＣＧＡＣＧＡＧＴＧＧＡＧＡＡＡＴＣＴＧＣＧＧＧＣＣＡＧＧＣＡＴＣＧＡＣＡＴＣＣＧＣＡＡＣＧＡＣＴＡＴＣＡＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧＣＧＣＣＴＧＧＡＧＡＡＣＴＧＣＡＣＧＧＴＧＡＴＣＧＡＧＧＧＣＴＡＣＣＴＣＣＡＣＡＴＣＣＴＧＣＴＣＡＴＣＴＣＣＡＡＧＧＣＣＧＡＧＧＡＣＴＡＣＣＧＣＡＧＣＴＡＣＣＧＣＴＴＣＣＣＣＡＡＧＣＴＣＡＣＧＧＴＣＡＴＴＡＣＣＧＡＧＴＡＣＴＴＧＣＴＧＣＴＧＴＴＣＣＧＡＧＴＧＧＣＴＧＧＣＣＴＣＧＡＧＡＧＣＣＴＣＧＧＡＧＡＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＡＡＣＣＴＣＡＣＧＧＴＣＡＴＣＣＧＣＧＧＣＴＧＧＡＡＡＣＴＣＴＴＣＴＡＣＡＡＣＴＡＣＧＣＣＣＴＧＧＴＣＡＴＣＴＴＣＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＴＣＴＣＡＡＧＧＡＴＡＴＴＧＧＧＣＴＴＴＡＣＡＡＣＣＴＧＡＧＧＡＡＣＡＴＴＡＣＴＣＧＧＧＧＧＧＣＣＡＴＣＡＧＧＡＴＴＧＡＧＡＡＡＡＡＴＧＣＴＧＡＣＣＴＣＴＧＴＴＡＣＣＴＣＴＣＣＡＣＴＧＴＧＧＡＣＴＧＧＴＣＣＣＴＧＡＴＣＣＴＧＧＡＴＧＣＧＧＴＧＴＣＣＡＡＴＡＡＣＴＡＣＡＴＴＧＴＧＧＧＧＡＡＴＡＡＧＣＣＣＣＣＡＡＡＧＧＡＡＴＧＴＧＧＧＧＡＣＣＴＧＴＧＴＣＣＡＧＧＧＡＣＣＡＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＧＣＣＧＡＴＧＴＧＴＧＡＧＡＡＧＡＣＣＡＣＣＡＴＣＡＡＣＡＡＴＧＡＧＴＡＣＡＡＣＴＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＣＡＣＡＡＡＣＣＧＣＴＧＣＣＡＧＡＡＡＡＴＧＴＧＣＣＣＡＡＧＣＡＣＧＴＧＴＧＧＧＡＡＧＣＧＧＧＣＧＴＧＣＡＣＣＧＡＧＡＡＣＡＡＴＧＡＧＴＧＣＴＧＣＣＡＣＣＣＣＧＡＧＴＧＣＣＴＧＧＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＧＣＧＣＣＴＧＡＣＡＡＣＧＡＣＡＣＧＧＣＣＴＧＴＧＴＡＧＣＴＴＧＣＣＧＣＣＡＣＴＡＣＴＡＣＴＡＴＧＣＣＧＧＴＧＴＣＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＣＴＧＣＣＣＧＣＣＣＡＡＣＡＣＣＴＡＣＡＧＧＴＴＴＧＡＧＧＧＣＴＧＧＣＧＣＴＧＴＧＴＧＧＡＣＣＧＴＧＡＣＴＴＣＴＧＣＧＣＣＡＡＣＡＴＣＣＴＣＡＧＣＧＣＣＧＡＧＡＧＣＡＧＣＧＡＣＴＣＣＧＡＧＧＧＧＴＴＴＧＴＧＡＴＣＣＡＣＧＡＣＧＧＣＧＡＧＴＧＣＡＴＧＣＡＧＧＡＧＴＧＣＣＣＣＴＣＧＧＧＣＴＴＣＡＴＣＣＧＣＡＡＣＧＧＣＡＧＣＣＡＧＡＧＣＡＴＧＴＡＣＴＧＣＡＴＣＣＣＴＴＧＴＧＡＡＧＧＴＣＣＴＴＧＣＣＣＧＡＡＧＧＴＣＴＧＴＧＡＧＧＡＡＧＡＡＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＧＡＣＣＡＴＴＧＡＴＴＣＴＧＴＴＡＣＴＴＣＴＧＣＴＣＡＧＡＴＧＣＴＣＣＡＡＧＧＡＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＡＴＴＴＧＣＴＣＡＴＴＡＡＣＡＴＣＣＧＡＣＧＧＧＧＧＡＡＴＡＡＣＡＴＴＧＣＴＴＣＡＧＡＧＣＴＧＧＡＧＡＡＣＴＴＣＡＴＧＧＧＧＣＴＣＡＴＣＧＡＧＧＴＧＧＴＧＡＣＧＧＧＣＴＡＣＧＴＧＡＡＧＡＴＣＣＧＣＣＡＴＴＣＴＣＡＴＧＣＣＴＴＧＧＴＣＴＣＣＴＴＧＴＣＣＴＴＣＣＴＡＡＡＡＡＡＣＣＴＴＣＧＣＣＴＣＡＴＣＣＴＡＧＧＡＧＡＧＧＡＧＣＡＧＣＴＡＧＡＡＧＧＧＡＡＴＴＡＣＴＣＣＴＴＣＴＡＣＧＴＣＣＴＣＧＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＣＴＴＧＣＡＧＣＡＡＣＴＧＴＧＧＧＡＣＴＧＧＧＡＣＣＡＣＣＧＣＡＡＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＡＡＧＣＡＧＧＧＡＡＡＡＴＧＴＡＣＴＴＴＧＣＴＴＴＣＡＡＴＣＣＣＡＡＡＴＴＡＴＧＴＧＴＴＴＣＣＧＡＡＡＴＴＴＡＣＣＧＣＡＴＧＧＡＧＧＡＡＧＴＧＡＣＧＧＧＧＡＣＴＡＡＡＧＧＧＣＧＣＣＡＡＡＧＣＡＡＡＧＧＧＧＡＣＡＴＡＡＡＣＡＣＣＡＧＧＡＡＣＡＡＣＧＧＧＧＡＧＡＧＡＧＣＣＴＣＣＴＧＴＧＡＡＡＧＴＧＡＣＧＴＣＣＴＧＣＡＴＴＴＣＡＣＣＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＧＴＣＧＡＡＧＡＡＴＣＧＣＡＴＣＡＴＣＡＴＡＡＣＣＴＧＧＣＡＣＣＧＧＴＡＣＣＧＧＣＣＣＣＣＴＧＡＣＴＡＣＡＧＧＧＡＴＣＴＣＡＴＣＡＧＣＴＴＣＡＣＣＧＴＴＴＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＡＧＣＡＣＣＣＴＴＴＡＡＧＡＡＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＴＡＴＧＡＴＧＧＧＣＡＧＧＡＴＧＣＣＴＧＣＧＧＣＴＣＣＡＡＣＡＧＣＴＧＧＡＡＣＡＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＧＡＣＣＴＣＣＣＧＣＣＣＡＡＣＡＡＧＧＡＣＧＴＧＧＡＧＣＣＣＧＧＣＡＴＣＴＴＡＣＴＡＣＡＴＧＧＧＣＴＧＡＡＧＣＣＣＴＧＧＡＣＴＣＡＧＴＡＣＧＣＣＧＴＴＴＡＣＧＴＣＡＡＧＧＣＴＧＴＧＡＣＣＣＴＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＧＡＧＡＡＣＧＡＣＣＡＴＡＴＣＣＧＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＡＧＴＧＡＧＡＴＣＴＴＧＴＡＣＡＴＴＣＧＣＡＣＣＡＡＴＧＣＴＴＣＡＧＴＴＣＣＴＴＣＣＡＴＴＣＣＣＴＴＧＧＡＣＧＴＴＣＴＴＴＣＡＧＣＡＴＣＧＡＡＣＴＣＣＴＣＴＴＣＴＣＡＧＴＴＡＡＴＣＧＴＧＡＡＧＴＧＧＡＡＣＣＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＣＣＡＡＣＧＧＣＡＡＣＣＴＧＡＧＴＴＡＣＴＡＣＡＴＴＧＴＧＣＧＣＴＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＣＴＣＡＧＧＡＣＧＧＣＴＡＣＣＴＴＴＡＣＣＧＧＣＡＣＡＡＴＴＡＣＴＧＣＴＣＣＡＡＡＧＡＣＡＡＡＡＴＣＣＣＣＡＴＣＡＧＧＡＡＧＴＡＴＧＣＣＧＡＣＧＧＣＡＣＣＡＴＣＧＡＣＡＴＴＧＡＧＧＡＧＧＴＣＡＣＡＧＡＧＡＡＣＣＣＣＡＡＧＡＣＴＧＡＧＧＴＧＴＧＴＧＧＴＧＧＧＧＡＧＡＡＡＧＧＧＣＣＴＴＧＣＴＧＣＧＣＣＴＧＣＣＣＣＡＡＡＡＣＴＧＡＡＧＣＣＧＡＧＡＡＧＣＡＧＧＣＣＧＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＧＧＣＴＧＡＡＴＡＣＣＧＣＡＡＡＧＴＣＴＴＴＧＡＧＡＡＴＴＴＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＴＴＣＧＴＧＣＣＣＡＧＡＣＣＴＧＡＡＡＧＧＡＡＧＣＧＧＡＧＡＧＡＴＧＴＣＡＴＧＣＡＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＡＣＣＡＣＣＡＴＧＴＣＣＡＧＣＣＧＡＡＧＣＡＧＧＡＡＣＡＣＣＡＣＧＧＣＣＧＣＡＧＡＣＡＣＣＴＡＣＡＡＣＡＴＣＡＣＣＧＡＣＣＣＧＧＡＡＧＡＧＣＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＡＣＣＣＴＴＴＣＴＴＴＧＡＧＡＧＣＡＧＡＧＴＧＧＡＴＡＡＣＡＡＧＧＡＧＡＧＡＡＣＴＧＴＣＡＴＴＴＣＴＡＡＣＣＴＴＣＧＧＣＣＴＴＴＣＡＣＡＴＴＧＴＡＣＣＧＣＡＴＣＧＡＴＡＴＣＣＡＣＡＧＣＴＧＣＡＡＣＣＡＣＧＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＧＣＴＧＧＧＣＴＧＣＡＧＣＧＣＣＴＣＣＡＡＣＴＴＣＧＴＣＴＴＴＧＣＡＡＧＧＡＣＴＡＴＧＣＣＣＧＣＡＧＡＡＧＧＡＧＣＡＧＡＴＧＡＣＡＴＴＣＣＴＧＧＧＣＣＡＧＴＧＡＣＣＴＧＧＧＡＧＣＣＡＡＧＧＣＣＴＧＡＡＡＡＣＴＣＣＡＴＣＴＴＴＴＴＡＡＡＧＴＧＧＣＣＧＧＡＡＣＣＴＧＡＧＡＡＴＣＣＣＡＡＴＧＧＡＴＴＧＡＴＴＣＴＡＡＴＧＴＡＴＧＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＣＧＧＡＴＣＡＣＡＡＧＴＴＧＡＧＧＡＴＣＡＧＣＧＡＧＡＡＴＧＴＧＴＧＴＣＣＡＧＡＣＡＧＧＡＡＴＡＣＡＧＧＡＡＧＴＡＴＧＧＡＧＧＧＧＣＣＡＡＧＣＴＡＡＡＣＣＧＧＣＴＡＡＡＣＣＣＧＧＧＧＡＡＣＴＡＣＡＣＡＧＣＣＣＧＧＡＴＴＣＡＧＧＣＣＡＣＡＴＣＴＣＴＣＴＣＴＧＧＧＡＡＴＧＧＧＴＣＧＴＧＧＡＣＡＧＡＴＣＣＴＧＴＧＴＴＣＴＴＣＴＡＴＧＴＣＣＡＧＧＣＣＡＡＡＡＣＡＧＧＡＴＡＴＧＡＡＡＡＣＴＴＣＡＴＣＣＡＴＣＴＧＡＴＣＡＴＣＧＣＴＣＴＧＣＣＣＧＴＣＧＣＴＧＴＣＣＴＧＴＴＧＡＴＣＧＴＧＧＧＡＧＧＧＴＴＧＧＴＧＡＴＴＡＴＧＣＴＧＴＡＣＧＴＣＴＴＣＣＡＴＡＧＡＡＡＧＡＧＡＡＡＴＡＡＣＡＧＣＡＧＧＣＴＧＧＧＧＡＡＴＧＧＡＧＴＧＣＴＧＴＡＴＧＣＣＴＣＴＧＴＧＡＡＣＣＣＧＧＡＧＴＡＣＴＴＣＡＧＣＧＣＴＧＣＴＧＡＴＧＴＧＴＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＴＧＡＧＴＧＧＧＡＧＧＴＧＧＣＴＣＧＧＧＡＧＡＡＧＡＴＣＡＣＣＡＴＧＡＧＣＣＧＧＧＡＡＣＴＴＧＧＧＣＡＧＧＧＧＴＣＧＴＴＴＧＧＧＡＴＧＧＴＣＴＡＴＧＡＡＧＧＡＧＴＴＧＣＣＡＡＧＧＧＴＧＴＧＧＴＧＡＡＡＧＡＴＧＡＡＣＣＴＧＡＡＡＣＣＡＧＡＧＴＧＧＣＣＡＴＴＡＡＡＡＣＡＧＴＧＡＡＣＧＡＧＧＣＣＧＣＡＡＧＣＡＴＧＣＧＴＧＡＧＡＧＧＡＴＴＧＡＧＴＴＴＣＴＣＡＡＣＧＡＡＧＣＴＴＣＴＧＴＧＡＴＧＡＡＧＧＡＧＴＴＣＡＡＴＴＧＴＣＡＣＣＡＴＧＴＧＧＴＧＣＧＡＴＴＧＣＴＧＧＧＴＧＴＧＧＴＧＴＣＣＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＣＡＡＣＡＣＴＧＧＴＣＡＴＣＡＴＧＧＡＡＣＴＧＡＴＧＡＣＡＣＧＧＧＧＣＧＡＴＣＴＣＡＡＡＡＧＴＴＡＴＣＴＣＣＧＧＴＣＴＣＴＧＡＧＧＣＣＡＧＡＡＡＴＧＧＡＧＡＡＴＡＡＴＣＣＡＧＴＣＣＴＡＧＣＡＣＣＴＣＣＡＡＧＣＣＴＧＡＧＣＡＡＧＡＴＧＡＴＴＣＡＧＡＴＧＧＣＣＧＧＡＧＡＧＡＴＴＧＣＡＧＡＣＧＧＣＡＴＧＧＣＡＴＡＣＣＴＣＡＡＣＧＣＣＡＡＴＡＡＧＴＴＣＧＴＣＣＡＣＡＧＡＧＡＣＣＴＴＧＣＴＧＣＣＣＧＧＡＡＴＴＧＣＡＴＧＧＴＡＧＣＣＧＡＡＧＡＴＴＴＣＡＣＡＧＴＣＡＡＡＡＴＣＧＧＡＧＡＴＴＴＴＧＧＴＡＴＧＡＣＧＣＧＡＧＡＴＡＴＣＴＡＴＧＡＧＡＣＡＧＡＣＴＡＴＴＡＣＣＧＧＡＡＡＧＧＡＧＧＣＡＡＡＧＧＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＧＴＧＣＧＣＴＧＧＡＴＧＴＣＴＣＣＴＧＡＧＴＣＣＣＴＣＡＡＧＧＡＴＧＧＡＧＴＣＴＴＣＡＣＣＡＣＴＴＡＣＴＣＧＧＡＣＧＴＣＴＧＧＴＣＣＴＴＣＧＧＧＧＴＣＧＴＣＣＴＣＴＧＧＧＡＧＡＴＣＧＣＣＡＣＡＣＴＧＧＣＣＧＡＧＣＡＧＣＣＣＴＡＣＣＡＧＧＧＣＴＴＧＴＣＣＡＡＣＧＡＧＣＡＡＧＴＣＣＴＴＣＧＣＴＴＣＧＴＣＡＴＧＧＡＧＧＧＣＧＧＣＣＴＴＣＴＧＧＡＣＡＡＧＣＣＡＧＡＣＡＡＣＴＧＴＣＣＴＧＡＣＡＴＧＣＴＧＴＴＴＧＡＡＣＴＧＡＴＧＣＧＣＡＴＧＴＧＣＴＧＧＣＡＧＴＡＴＡＡＣＣＣＣＡＡＧＡＴＧＡＧＧＣＣＴＴＣＣＴＴＣＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＡＴＣＡＡＡＧＡＧＧＡＧＡＴＧＧＡＧＣＣＴＧＧＣＴＴＣＣＧＧＧＡＧＧＴＣＴＣＣＴＴＣＴＡＣＴＡＣＡＧＣＧＡＧＧＡＧＡＡＣＡＡＧＣＴＧＣＣＣＧＡＧＣＣＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＡＧＣＣＡＧＡＧＡＡＣＡＴＧＧＡＧＡＧＣＧＴＣＣＣＣＣＴＧＧＡＣＣＣＣＴＣＧＧＣＣＴＣＣＴＣＧＴＣＣＴＣＣＣＴＧＣＣＡＣＴＧＣＣＣＧＡＣＡＧＡＣＡＣＴＣＡＧＧＡＣＡＣＡＡＧＧＣＣＧＡＧＡＡＣＧＧＣＣＣＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＧＴＧＣＴＧＧＴＣＣＴＣＣＧＣＧＣＣＡＧＣＴＴＣＧＡＣＧＡＧＡＧＡＣＡＧＣＣＴＴＡＣＧＣＣＣＡＣＡＴＧＡＡＣＧＧＧＧＧＣＣＧＣＡＡＧＡＡＣＧＡＧＣＧＧＧＣＣＴＴＧＣＣＧＣＴＧＣＣＣＣＡＧＴＣＴＴＣＧＡＣＣＴＧＣＴＧＡＴＣＣＴＴＧＧＡＴＣＣＴＧＡＡＴＣＴＧＴＧＣＡＡＡＣＡＧＴＡＡＣＧＴＧＴＧＣＧＣＡＣＧＣＧＣＡＧＣＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＧＧＧＡＧＡＧＡＧＡＧＴＴＴＴＡＡＣＡＡＴＣＣＡＴＴＣＡＣＡＡＧＣＣＴＣＣＴＧＴＡＣＣＴＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＴＣＡＧＴＴＣＴＧＣＣＣＴＴＧＣＴＧＣＣＣＧＣＧＧＧＡＧＡＣＡＧＣＴＴＣＴＣＴＧＣＡＧＴＡＡＡＡＣＡＣＡＴＴＴＧＧＧＡＴＧＴＴＣＣＴＴＴＴＴＴＣＡＡＴＡＴＧＣＡＡＧＣＡＧＣＴＴＴＴＴＡＴＴＣＣＣＴＧＣＣＣＡＡＡＣＣＣＴＴＡＡＣＴＧＡＣＡＴＧＧＧＣＣＴＴＴＡＡＧＡＡＣＣＴＴＡＡＴＧＡＣＡＡＣＡＣＴＴＡＡＴＡＧＣＡＡＣＡＧＡＧＣＡＣＴＴＧＡＧＡＡＣＣＡＧＴＣＴＣＣＴＣＡＣＴＣＴＧＴＣＣＣＴＧＴＣＣＴＴＣＣＣＴＧＴＴＣＴＣＣＣＴＴＴＣＴＣＴＣＴＣＣＴＣＴＣＴＧＣＴＴＣＡＴＡＡＣＧＧＡＡＡＡＡＴＡＡＴＴＧＣＣＡＣＡＡＧＴＣＣＡＧＣＴＧＧＧＡＡＧＣＣＣＴＴＴＴＴＡＴＣＡＧＴＴＴＧＡＧＧＡＡＧＴＧＧＣＴＧＴＣＣＣＴＧＴＧＧＣＣＣＣＡＴＣＣＡＡＣＣＡＣＴＧＴＡＣＡＣＡＣＣＣＧＣＣＴＧＡＣＡＣＣＧＴＧＧＧＴＣＡＴＴＡＣＡＡＡＡＡＡＡＣＡＣＧＴＧＧＡＧＡＴＧＧＡＡＡＴＴＴＴＴＡＣＣＴＴＴＡＴＣＴＴＴＣＡＣＣＴＴＴＣＴＡＧＧＧＡＣＡＴＧＡＡＡＴＴＴＡＣＡＡＡＧＧＧＣＣＡＴＣＧＴＴＣＡＴＣＣＡＡＧＧＣＴＧＴＴＡＣＣＡＴＴＴＴＡＡＣＧＣＴＧＣＣＴＡＡＴＴＴＴＧＣＣＡＡＡＡＴＣＣＴＧＡＡＣＴＴＴＣＴＣＣＣＴＣＡＴＣＧＧＣＣＣＧＧＣＧＣＴＧＡＴＴＣＣＴＣＧＴＧＴＣＣＧＧＡＧＧＣＡＴＧＧＧＴＧＡＧＣＡＴＧＧＣＡＧＣＴＧＧＴＴＧＣＴＣＣＡＴＴＴＧＡＧＡＧＡＣＡＣＧＣＴＧＧＣＧＡＣＡＣＡＣＴＣＣＧＴＣＣＡＴＣＣＧＡＣＴＧＣＣＣＣＴＧＣＴＧＴＧＣＴＧＣＴＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＡＣＡＣＡＧＧＴＣＴＣＡＴＴＧＣＴＴＣＴＧＡＣＴＡＧＡＴＴＡＴＴＡＴＴＴＧＧＧＧＧＡＡＣＴＧＧＡＣＡＣＡＡＴＡＧＧＴＣＴＴＴＣＴＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＴＧＧＧＧＡＧＡＡＧＣＴＧＡＡＣＣＧＧＣ
【０２５２】
前駆ポリペプチドの配列は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＰ＿０００８６６で入手可能であり、本明細書では配列番号２として示される。
配列番号２
＞ｇｉ｜４５５７６６５｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿０００８６６．１｜インスリン様成長因子１受容体の前駆体［ホモサピエンス］
ＭＫＳＧＳＧＧＧＳＰＴＳＬＷＧＬＬＦＬＳＡＡＬＳＬＷＰＴＳＧＥＩＣＧＰＧＩＤＩＲＮＤＹＱＱＬＫＲＬＥＮＣＴＶＩＥＧＹＬＨＩＬＬＩＳＫＡＥＤＹＲＳＹＲＦＰＫＬＴＶＩＴＥＹＬＬＬＦＲＶＡＧＬＥＳＬＧＤＬＦＰＮＬＴＶＩＲＧＷＫＬＦＹＮＹＡＬＶＩＦＥＭＴＮＬＫＤＩＧＬＹＮＬＲＮＩＴＲＧＡＩＲＩＥＫＮＡＤＬＣＹＬＳＴＶＤＷＳＬＩＬＤＡＶＳＮＮＹＩＶＧＮＫＰＰＫＥＣＧＤＬＣＰＧＴＭＥＥＫＰＭＣＥＫＴＴＩＮＮＥＹＮＹＲＣＷＴＴＮＲＣＱＫＭＣＰＳＴＣＧＫＲＡＣＴＥＮＮＥＣＣＨＰＥＣＬＧＳＣＳＡＰＤＮＤＴＡＣＶＡＣＲＨＹＹＹＡＧＶＣＶＰＡＣＰＰＮＴＹＲＦＥＧＷＲＣＶＤＲＤＦＣＡＮＩＬＳＡＥＳＳＤＳＥＧＦＶＩＨＤＧＥＣＭＱＥＣＰＳＧＦＩＲＮＧＳＱＳＭＹＣＩＰＣＥＧＰＣＰＫＶＣＥＥＥＫＫＴＫＴＩＤＳＶＴＳＡＱＭＬＱＧＣＴＩＦＫＧＮＬＬＩＮＩＲＲＧＮＮＩＡＳＥＬＥＮＦＭＧＬＩＥＶＶＴＧＹＶＫＩＲＨＳＨＡＬＶＳＬＳＦＬＫＮＬＲＬＩＬＧＥＥＱＬＥＧＮＹＳＦＹＶＬＤＮＱＮＬＱＱＬＷＤＷＤＨＲＮＬＴＩＫＡＧＫＭＹＦＡＦＮＰＫＬＣＶＳＥＩＹＲＭＥＥＶＴＧＴＫＧＲＱＳＫＧＤＩＮＴＲＮＮＧＥＲＡＳＣＥＳＤＶＬＨＦＴＳＴＴＴＳＫＮＲＩＩＩＴＷＨＲＹＲＰＰＤＹＲＤＬＩＳＦＴＶＹＹＫＥＡＰＦＫＮＶＴＥＹＤＧＱＤＡＣＧＳＮＳＷＮＭＶＤＶＤＬＰＰＮＫＤＶＥＰＧＩＬＬＨＧＬＫＰＷＴＱＹＡＶＹＶＫＡＶＴＬＴＭＶＥＮＤＨＩＲＧＡＫＳＥＩＬＹＩＲＴＮＡＳＶＰＳＩＰＬＤＶＬＳＡＳＮＳＳＳＱＬＩＶＫＷＮＰＰＳＬＰＮＧＮＬＳＹＹＩＶＲＷＱＲＱＰＱＤＧＹＬＹＲＨＮＹＣＳＫＤＫＩＰＩＲＫＹＡＤＧＴＩＤＩＥＥＶＴＥＮＰＫＴＥＶＣＧＧＥＫＧＰＣＣＡＣＰＫＴＥＡＥＫＱＡＥＫＥＥＡＥＹＲＫＶＦＥＮＦＬＨＮＳＩＦＶＰＲＰＥＲＫＲＲＤＶＭＱＶＡＮＴＴＭＳＳＲＳＲＮＴＴＡＡＤＴＹＮＩＴＤＰＥＥＬＥＴＥＹＰＦＦＥＳＲＶＤＮＫＥＲＴＶＩＳＮＬＲＰＦＴＬＹＲＩＤＩＨＳＣＮＨＥＡＥＫＬＧＣＳＡＳＮＦＶＦＡＲＴＭＰＡＥＧＡＤＤＩＰＧＰＶＴＷＥＰＲＰＥＮＳＩＦＬＫＷＰＥＰＥＮＰＮＧＬＩＬＭＹＥＩＫＹＧＳＱＶＥＤＱＲＥＣＶＳＲＱＥＹＲＫＹＧＧＡＫＬＮＲＬＮＰＧＮＹＴＡＲＩＱＡＴＳＬＳＧＮＧＳＷＴＤＰＶＦＦＹＶＱＡＫＴＧＹＥＮＦＩＨＬＩＩＡＬＰＶＡＶＬＬＩＶＧＧＬＶＩＭＬＹＶＦＨＲＫＲＮＮＳＲＬＧＮＧＶＬＹＡＳＶＮＰＥＹＦＳＡＡＤＶＹＶＰＤＥＷＥＶＡＲＥＫＩＴＭＳＲＥＬＧＱＧＳＦＧＭＶＹＥＧＶＡＫＧＶＶＫＤＥＰＥＴＲＶＡＩＫＴＶＮＥＡＡＳＭＲＥＲＩＥＦＬＮＥＡＳＶＭＫＥＦＮＣＨＨＶＶＲＬＬＧＶＶＳＱＧＱＰＴＬＶＩＭＥＬＭＴＲＧＤＬＫＳＹＬＲＳＬＲＰＥＭＥＮＮＰＶＬＡＰＰＳＬＳＫＭＩＱＭＡＧＥＩＡＤＧＭＡＹＬＮＡＮＫＦＶＨＲＤＬＡＡＲＮＣＭＶＡＥＤＦＴＶＫＩＧＤＦＧＭＴＲＤＩＹＥＴＤＹＹＲＫＧＧＫＧＬＬＰＶＲＷＭＳＰＥＳＬＫＤＧＶＦＴＴＹＳＤＶＷＳＦＧＶＶＬＷＥＩＡＴＬＡＥＱＰＹＱＧＬＳＮＥＱＶＬＲＦＶＭＥＧＧＬＬＤＫＰＤＮＣＰＤＭＬＦＥＬＭＲＭＣＷＱＹＮＰＫＭＲＰＳＦＬＥＩＩＳＳＩＫＥＥＭＥＰＧＦＲＥＶＳＦＹＹＳＥＥＮＫＬＰＥＰＥＥＬＤＬＥＰＥＮＭＥＳＶＰＬＤＰＳＡＳＳＳＳＬＰＬＰＤＲＨＳＧＨＫＡＥＮＧＰＧＰＧＶＬＶＬＲＡＳＦＤＥＲＱＰＹＡＨＭＮＧＧＲＫＮＥＲＡＬＰＬＰＱＳＳＴＣ
【０２５３】
配列番号２のアミノ酸１〜３０は、ＩＧＦ−１Ｒシグナルペプチドをコードすると報告されており、配列番号２のアミノ酸３１〜７４０は、ＩＧＦ−１Ｒ  αサブユニットをコードすると報告されており、配列番号２のアミノ酸７４１〜１３６７は、ＩＧＦ−１Ｒ  βサブユニットをコードすると報告されている。ＮＰ＿０００８６６  ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号で報告されている、ヒトＩＧＦ−１Ｒの上述の特徴および他の特徴を表２に示す。
【０２５４】
（表２）
2010537985.tif 000004
【０２５５】
本発明は、非ヒトＩＧＦ−１Ｒタンパク質（例えば、げっ歯類由来または非ヒト霊長類由来のＩＧＦ−１Ｒ）に特異的に結合する、選択に結合する、および／または競合的に結合する、ＩＧＦ−１Ｒ抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体にも関する。
【０２５６】
ＩＧＦ−１Ｒは、多くの腫瘍細胞（限定されないが、以下の特定の腫瘍細胞を含む）で発現する。膀胱腫瘍（Ｏｕｂａｎら、Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．３４：８０３（２００３））；脳腫瘍（Ｄｅｌ  Ｖａｌｌｅら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．８：１８２２（２００２））；乳房の腫瘍（Ｒａｉｌｏら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ３０：３０７（１９９４）およびＡｌｔｕｎｄａｇら、Ｈｕｍ  Ｐａｔｈｏｌ．３６：４４８−４４９（２００５））；結腸腫瘍、例えば、腺癌、転移およびアデノーマ（Ｈａｋａｍら、Ｈｕｍａｎ  Ｐａｔｈｏｌ．３０：１１２８（１９９９）、Ｇｏｎｇｏｌｌら、Ｖｉｒｃｈｏｗｓ．Ａｒｃ．４４３：１３９（２００３）、およびＮａｋａｍｕｒａら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１０：８４３４−８４４１（２００４）；胃腫瘍（Ｊｉａｎｇら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ２１：７５５（２００４））；腎臓腫瘍、例えば、明細胞型、嫌色素性細胞型および乳頭状ＲＣＣ（Ｓｃｈｉｐｓら、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．１２２：９３１−９３７（２００４））；肺腫瘍（Ｏｕｂａｎら、Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．３４：８０３−８０８  （２００３））およびＫａｉｓｅｒら、Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌ．１１９：６６５−６６８（１９９３））；卵巣腫瘍（Ｏｕｂａｎら、Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．３４：８０３−８０８（２００３））；膵臓腫瘍、例えば、膵管腺癌（Ｈａｋａｍら、Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｓｃｉ．４８：１９７２−１９７８（２００３）およびＦｕｒｕｋａｗａら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１１：３２３３−３２４２（２００５））；および前立腺腫瘍（Ｈｅｌｌａｗｅｌｌら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６２：２９４２−２９５０  （２００２））。
【０２５７】
（ＩＩＩ．ＩＧＦ−１Ｒ抗体）
ある実施形態では、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒ抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体にも関する。例えば、本発明は、表３および表４に示すような、特定のモノクローナル抗体の少なくとも抗原結合性を保持した領域、そのフラグメント、改変体および誘導体を含む。表３には、ファージディスプレイライブラリから同定したヒト抗−ＩＧＦ−１Ｒ  Ｆａｂ領域と、実施例に詳細に示す抗体の種々の結合性能を列挙している。表４には、ハイブリドーマ技術で同定したマウス抗−ヒトＩＧＦ−１Ｒモノクローナル抗体と、実施例に詳細に示す抗体の種々の結合性能を列挙している。
【０２５８】
（表３）ＩＧＦ−１Ｒに特異的なＦａｂの機能特性
2010537985.tif 000005
【０２５９】
（表４）マウスモノクローナル抗体の機能特性
2010537985.tif 000006
１．ＭＣＦ−７＝乳癌細胞；Ｈ−２３およびＣａｌｕ−６＝肺癌細胞；Ｐａｎｃ−１＝膵臓癌細胞；Ｃｏｌｏ２０５＝結腸癌細胞
2010537985.tif 000007
【０２６０】
Ｍ１３−Ｃ０６およびＭ１４−Ｃ０３の全長抗体を発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞株を、２００６年３月２８日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）に寄託し、それぞれ、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４４４およびＰＴＡ−７４４５を得た。Ｆａｂ抗体フラグメントＭ１４−Ｇ１１を発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞株を、２００６年８月２９日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）に寄託し、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７８５５を得た。
【０２６１】
全長ヒト抗体Ｐ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８およびＰ１Ａ２．２Ｂ１１を発現するハイブリドーマ細胞株を、それぞれ、２００６年３月２８日、２００６年６月１３日、および２００６年３月２８日にＡＴＣＣに寄託し、それぞれ、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４５８、ＰＴＡ−７７３２およびＰＴＡ−７４５７を得た。全長ヒト抗体２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２およびＰ１Ｇ１０．２Ｂ８を発現するハイブリドーマ細胞株を、それぞれ、２００６年３月２８日、２００６年７月１１日、および２００６年７月１１日にＡＴＣＣに寄託し、それぞれＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４５６、ＰＴＡ−７７３０およびＰＴＡ−７７３１を得た。抗体および寄託した細胞株の相関関係については、ＡＴＣＣ寄託表（以下）を参照。
【０２６２】
ＡＴＣＣは、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９，ＵＳＡにある。ＡＴＣＣ寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に準拠して行った。
【０２６３】
本発明の特定の実施形態は、以下の表に示すように、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託した（「ＡＴＣＣ寄託表」）。
ＡＴＣＣ寄託表
2010537985.tif 000008
【０２６４】
本明細書で使用するとき、用語「抗原結合領域」は、抗原のエピトープ（例えば、ＩＧＦ−１Ｒのエピトープ）に特異的に結合する部位を含む。抗体の抗原結合領域は、典型的には、免疫グロブリン重鎖可変領域の少なくとも一部分と、免疫グロブリン軽鎖可変領域の少なくとも一部分とを含む。これらの可変領域から作られる結合部位は、抗体の特異性を決定づける。  
【０２６５】
より特定的には、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒ抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体に関する。ここで、ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１およびＭ１２−Ｇ０４からなる群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体フラグメント、またはハイブリドーマが産生するＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２およびＰ１Ｇ１０．２Ｂ８からなる群から選択される参照モノクローナル抗体と同じＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する。
【０２６６】
本発明は、ＩＧＦ−１Ｒ抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体に関する。ここで、ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１およびＭ１２−Ｇ０４からなる群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体フラグメント、またはハイブリドーマが産生するＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２およびＰ１Ｇ１０．２Ｂ８からなる群から選択される参照モノクローナル抗体を競合的に阻害する。
【０２６７】
本発明は、ＩＧＦ−１Ｒ抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体に関する。ここで、ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１およびＭ１２−Ｇ０４からなる群から選択されるモノクローナルＦａｂ抗体と同一の抗原結合領域を含むか、またはハイブリドーマが産生するＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２およびＰ１Ｇ１０．２Ｂ８からなる群から選択されるモノクローナル抗体と同一の抗原結合領域を含む。
【０２６８】
抗体の製造方法は、当該技術分野で周知であり、本明細書に記載している。シグナル配列を含まない全長ＩＧＦ−１Ｒまたはその種々のフラグメントに対する抗体が製造されると、抗体または抗原結合性を保持したフラグメントが結合するＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸またはエピトープの決定は、本明細書に記載のエピトープマッピングプロトコルおよび当該技術分野で既知の方法（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｄ．Ａｕｓｕｂｅｌら、ｖ．２、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９６）の「Ｃｈａｐｔｅｒ  １１  −  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」に記載されている二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ）によって決定することができる。その他のエピトープマッピングプロトコルは、Ｍｏｒｒｉｓ，Ｇ．Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ：Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）に記載されており、これらの内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。エピトープマッピングは、市販の手段で行うことができる（すなわち、ＰｒｏｔｏＰＲＯＢＥ，Ｉｎｃ．（ウィスコンシン州ミルウォーキー））。
【０２６９】
さらに、ＩＧＦ−１Ｒの任意の部分に結合する抗体を製造し、この抗体を、ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストとしての性能、インスリン成長因子の結合（例えば、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、またはＩＧＦ−１とＩＧＦ−２の両方がＩＧＦ−１Ｒに結合すること）を阻害する性能、ＩＧＦ−１Ｒの内在化を促進する性能、ＩＧＦ−１Ｒのリン酸化を阻害する性能、その下流にあるリン酸化、例えば、Ａｋｔまたはｐ４２／４４  ＭＡＰＫのリン酸化を阻害する性能、または細胞増殖、移動または転移を阻害する性能によってスクリーニングすることができる。実施例に詳細に記載する方法にしたがって、上述の性質および他の性質について、抗体をスクリーニングすることができる。本発明の抗体がもつ他の機能を、本明細書の実施例に記載する他のアッセイを用いて試験することができる。
【０２７０】
他の実施形態では、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒの少なくとも１つのエピトープに特定的に結合するか、または選択的に結合する抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体を含む。ここで、エピトープは、配列番号２の少なくとも約４〜５個のアミノ酸、少なくとも７個、少なくとも９個、または少なくとも約１５〜約３０個のアミノ酸を含むか、これらのアミノ酸から本質的になるか、またはこれらのアミノ酸からなる。上述の配列番号２の所与のエピトープのアミノ酸は、連続的であっても線形であってもよいが、必ずしもそうでなければならないわけではない。特定の実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒの少なくとも１つのエピトープは、ＩＧＦ−１Ｒの細胞外領域から作られた、細胞表面に発現する非線形エピトープ、または可溶性フラグメント（例えば、ＩｇＧ  Ｆｃ領域に融合しているもの）としての非線形エピトープを含むか、これらの非線形エピトープから本質的になるか、またはこれらの非線形エピトープからなる。したがって、特定の実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒの少なくとも１つのエピトープは、配列番号２のうち少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、約１５〜約３０個、または少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個または１００個の連続したアミノ酸または非連続アミノ酸を含むか、これらのアミノ酸から本質的になるか、またはこれらのアミノ酸からなり、非連続アミノ酸は、タンパク質が折りたたまれることによってエピトープを形成する。
【０２７１】
他の実施形態では、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒの少なくとも１つのエピトープに特定的に結合するか、または選択的に結合する抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体を含む。ここで、エピトープは、上述の配列番号２の１個、２個、３個、４個、５個、６個またはそれ以上の連続したアミノ酸または非連続アミノ酸を含むか、これらのアミノ酸から本質的になるか、またはこれらのアミノ酸からなることに加え、標的タンパク質を改変すると、改変していないタンパク質よりもＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合親和性が高くなるように、タンパク質を改変する別の部分、例えば、炭水化物部分を含んでもよい。あるいは、ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、改変していない形態の標的タンパク質には全く結合しない。
【０２７２】
特定の態様では、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントに特異的に結合するか、またはＩＧＦ−１Ｒポリペプチド改変体に特異的に結合し、親和性を特徴づける解離定数（ＫＤ）が、所与のモノクローナル抗体に対するＫＤよりも小さい抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体に関する。
【０２７３】
特定の実施形態では、本発明の抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体は、上述のＩＧＦ−１Ｒまたはそのフラグメントまたは改変体の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する（すなわち、関連のない、無作為なエピトープに結合するよりも、上述のエピトープに容易に結合する）か、上述のＩＧＦ−１Ｒまたはそのフラグメントまたは改変体の少なくとも１つのエピトープに選択的に結合する（すなわち、関連するエピトープ、同様のエピトープ、同種のエピトープ、または類似のエピトープに結合するよりも上述のエピトープに容易に結合する）か、上述のＩＧＦ−１Ｒまたはそのフラグメントまたは改変体の特定のエピトープに特異的に結合するか、または選択的に結合する参照抗体の結合を競合的に阻害するか、または上述のＩＧＦ−１Ｒまたはそのフラグメントまたは改変体の少なくとも１つのエピトープに結合し、親和性を特徴づける解離定数（ＫＤ）が、５×１０−２Ｍ未満、１０−２Ｍ未満、５×１０−３Ｍ未満、１０−３Ｍ未満、５×１０−４Ｍ未満、１０−４Ｍ未満、５×１０−５Ｍ未満、１０−５Ｍ未満、５×１０−６Ｍ未満、１０−６Ｍ未満、５×１０−７Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、５×１０−８Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、５×１０−９Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、５×１０−１０Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、５×１０−１１Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、５×１０−１２Ｍ未満、１０−１２Ｍ未満、５×１０−１３Ｍ未満、１０−１３Ｍ未満、５×１０−１４Ｍ未満、１０−１４Ｍ未満、５×１０−１５Ｍ未満または１０−１５Ｍ未満である。特定の態様では、上述の抗体またはそのフラグメントは、マウスＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントよりも、ヒトＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントに選択的に結合する。別の特定の態様では、上述の抗体またはそのフラグメントは、１つ以上のＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメント（例えば、１つ以上の哺乳動物ＩＧＦ−１Ｒポリペプチド）に選択的に結合しやするが、インスリン受容体（ＩｎｓＲ）ポリペプチドには結合しない。理論によって束縛されないが、インスリン受容体ポリペプチドは、一部ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドと似た配列を有していることが知られており、ＩｎｓＲと交差反応してしまう抗体は、インビボで望ましくない副作用を与えてしまうことがある（例えば、糖代謝を妨害する）。
【０２７４】
抗体の結合解離定数の文脈で使用する場合、用語「約」は、抗体親和性を測定するのに使用する方法に固有な偏差を考慮に入れることを可能にする。例えば、使用する装置の精度、測定サンプル数に基づく標準誤差、および丸め誤差に依存して、用語「約１０−２Ｍ」は、例えば、０．０５Ｍ〜０．００５Ｍを含み得る。
【０２７５】
特定の実施形態では、本発明の抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体は、５×１０−２秒−１以下、１０−２秒−１以下、５×ｌ０−３秒−１以下、またはｌ０−３秒−１以下の解離速度（ｋ（ｏｆｆ））で、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチド、またはそのフラグメントまたは改変体に結合する。あるいは、本発明の抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体は、５×１０−４秒−１以下、１０−４秒−１以下、５×１０−５秒−１以下、または１０−５秒−１以下、５×１０−６秒−１以下、１０−６秒−１以下、５×１０−７秒−１以下、または１０−７秒−１以下の解離速度（ｋ（ｏｆｆ））で、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチド、またはそのフラグメントまたは改変体に結合する。
【０２７６】
他の実施形態では、本発明の抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体は、１０３Ｍ−１秒−１以上、５×１０３Ｍ−１秒−１以上、１０４Ｍ−１秒−１以上、または５×１０４Ｍ−１秒−１以上の結合速度（ｋ（ｏｎ））で、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチド、またはそのフラグメントまたは改変体に結合する。あるいは、本発明の抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体は、１０５Ｍ−１秒−１以上、５×１０５Ｍ−１秒−１以上、１０６Ｍ−１秒−１以上、または５×１０６Ｍ−１秒−１以上、または１０７Ｍ−１秒−１以上の結合速度（ｋ（ｏｎ））で、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチド、またはそのフラグメントまたは改変体に結合する。
【０２７７】
種々の実施形態では、本明細書に記載のＩＧＦ−１Ｒ抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体は、ＩＧＦ−１Ｒ活性を有するアンタゴニストである。特定の実施形態では、例えば、アンタゴニストであるＩＧＦ−１Ｒ抗体が、腫瘍細胞で発現したＩＧＦ−１Ｒに結合すると、インスリン成長因子（例えば、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、またはＩＧＦ−１とＩＧＦ−２の両方）がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを阻害し、ＩＧＦ−１Ｒの内在化を促進し、それによって、シグナル伝達能力を阻害するか、ＩＧＦ−１Ｒのリン酸化を阻害するか、シグナル伝達の下流にある分子（例えば、Ａｋｔまたはｐ４２／４４  ＭＡＰＫ）のリン酸化を阻害するか、または腫瘍細胞の増殖、移動または転移を阻害する。
【０２７８】
特記しない限り、本明細書で使用するとき、抗体について記載しているときの「そのフラグメント」は、抗原結合性を保持したフラグメント（すなわち、抗原に特異的に結合する、抗体の一部分）を指す。ある実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒ抗体（例えば、本発明の抗体）は、二重特異性ＩＧＦ−１Ｒ抗体であり、例えば、二重特異性抗体、ミニボディ、領域を欠いた抗体、または２個以上のエピトープ（例えば、２個以上の抗原、または同じ抗原にある２個以上のエピトープ）への結合特異性を有する融合タンパク質である。ある実施形態では、二重特異性ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、本明細書に開示する標的ポリペプチド（例えば、ＩＧＦ−１Ｒ）にある少なくとも１つのエピトープに特異的な、少なくとも１つの結合領域を有する。別の実施形態では、二重特異性ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、標的ポリペプチドにある１つのエピトープに特異的な、少なくとも１つの結合領域と、薬物または毒素に特異的な少なくとも１つの標的結合領域とを有する。さらに別の実施形態では、二重特異性ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、本明細書に開示する標的ポリペプチドにあるエピトープに特異的な、少なくとも１つの結合領域と、プロドラッグに特異的な少なくとも１つの結合領域とを有する。二重特異性ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、本明細書に開示する標的ポリペプチドのエピトープに特異的な、２つの標的結合領域と、第２の標的に特異的な２つの結合領域とを有する四価抗体であってもよい。したがって、四価の二重特異性ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、それぞれの特異性について二価であり得る。
【０２７９】
本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体は、当業者にとっては既知なように、１つ以上のエフェクター機能に介在する定常領域を含むことができる。例えば、抗体の定常領域に、相補的なＣ１要素が結合すると、補体系が活性化し得る。補体の活性化は、細胞病原体のオプソニン化および溶解にとって重要である。さらに、補体が活性化すると、炎症反応が刺激され、この事象は、自己免疫過敏にも関与する場合がある。さらに、抗体は、種々の細胞で、Ｆｃ領域を介して受容体に結合し、抗体のＦｃ領域にあるＦｃ受容体結合部位は、細胞のＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合する。異なる種類の抗体に特異的な多くのＦｃ受容体が存在する（ＩｇＧ（γ受容体）、ＩｇＥ（ε受容体）、ＩｇＡ（α受容体）およびＩｇＭ（μ受容体）を含む）。抗体が、細胞表面でＦｃ受容体に結合すると、それは、抗体でコーティングされた粒子の飲み込みおよび破壊、免疫複合体のクリアランス、抗体でコーティングされた標的細胞をキラー細胞で溶解（抗体依存性の、細胞が介在する細胞毒性、すなわちＡＤＣＣと呼ばれる）、炎症メディエーターの放出、胎盤通過、および免疫グロブリンの産生制御を含む、重要で多様な多くの生体反応を引き起こす。
【０２８０】
したがって、本発明の特定の実施形態は、ＩＧＦ−１Ｒ抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体を含み、ここで、免疫原性はほぼ同じの改変していない全抗体と比較して、望ましい生化学的特性（例えば、エフェクター機能の低下、非共有結合による二量化能、腫瘍部位に局在化する性能、血清での半減期短縮、または血清での半減期延長）を提供するように、１つ以上の定常領域の少なくとも一部のフラクションが失われているか、または改変されている。例えば、本明細書に記載の診断方法および治療方法で使用する特定の抗体は、免疫グロブリン重鎖に似たポリペプチド鎖を含むが、１つ以上の重鎖領域の少なくとも一部分を欠いた、領域を欠いた抗体である。例えば、特定の抗体では、改変した抗体の１つの定常領域が全体的に失われ、例えば、ＣＨ２領域のすべてまたは一部分が失われる。他の実施形態では、本明細書に記載の診断方法および治療方法で使用する特定の抗体は、グリコシル化をしないように改変された定常領域（例えば、ＩｇＧ４重鎖定常領域）を有する（本明細書の他の部分では、「ａｇｌｙ」抗体と称する）。理論によって束縛されないが、「ａｇｌｙ」抗体は、インビボでの安全性および安定性が改良されていると考えられる。
【０２８１】
本明細書に記載の特定のＩＧＦ−１Ｒ抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体では、Ｆｃ部分は、当該技術分野で既知の技術を用い、エフェクター効果が低下するように変異されていてもよい。例えば、定常領域の欠失または不活化（点変異または他の手段による）によって、循環抗体の改変体へのＦｃ受容体の結合が低下し、それによって、腫瘍の局在化が高めることができる。他の場合、本発明にしたがって定常領域を適切に改変すると、補体結合を抑え、血清での半減期を短くし、結合した細胞毒の非特異的な結合を減らすことができる。定常領域を改変する他の方法を利用し、抗原の特異性または抗体の可とう性を高めることによって、局在化を高めるジスルフィド結合を改変してもよいし、またはオリゴ糖部分を改変してもよい。得られた生理学的プロフィール、バイオアベイラビリティ、および改変による他の生化学効果（例えば、腫瘍の局在化、生体内分布および血清での半減期）を容易に測定することができ、過度な実験を行うことなく、周知の免疫技術で定量化することができる。
【０２８２】
本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体を改変した形態、または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体は、当該技術分野で既知の技術を用い、前駆体または親抗体から作成することができる。技術の例を、本明細書で詳細に示す。
【０２８３】
特定の実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒ抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体の可変領域も、定常領域も完全にヒトである。全ヒト抗体は、当該技術分野で既知の技術を用いて、および本明細書に記載したように製造することができる。例えば、特定の抗原に対する全ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答して、抗原を産生し、内因性遺伝子座が無効化するように改変されたトランスジェニック動物に抗原を投与することによって調製することができる。このような抗体を製造するのに使用可能な技術の例は、米国特許第６，１５０，５８４号、第６，４５８，５９２号、第６，４２０，１４０号に記載されている。他の技術は、当該技術分野で既知である。全ヒト抗体は、同様に、本明細書の他の箇所で詳細に記載しているように、種々のディスプレイ技術、例えば、ファージディスプレイまたは他のウイルスディスプレイシステムで製造することができる。
【０２８４】
本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体は、当該技術分野で既知の技術を用いて作成または製造することができる。特定の実施形態では、抗体分子またはそのフラグメントは、「組み換えによって産生されて」おり、すなわち、組み換えＤＮＡ技術によって産生されている。抗体分子またはそのフラグメントを製造する技術の例は、本明細書の他の箇所に詳細に記載している。
【０２８５】
本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体としては、例えば、抗体が、その同族のエピトープに特異的に結合するのを妨害しないように、任意の種類の分子が抗体に共有結合することによって改変された誘導体が挙げられる。例えば、限定されないが、改変された抗体（例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解による開裂、細胞リガンドまたは他のタンパク質への結合など）を含む抗体誘導体が挙げられる。任意の多くの化学修飾は、限定されないが、特異的な化学的開裂、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成などの既知の技術によって行われてもよい。さらに、誘導体は、１個以上の標準的ではないアミノ酸を含有してもよい。
【０２８６】
特定の実施形態では、本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体は、治療対象の動物（例えばヒト）で、有害な免疫反応を誘発しない。ある実施形態では、本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体は、当該技術分野で認識された技術を用い、免疫原性を低下させるように改変する。例えば、抗体は、ヒト化抗体、霊長類化抗体、脱免疫化抗体であってもよく、キメラ抗体を作成してもよい。これらの種類の抗体は、非ヒト化抗体（典型的には、マウス抗体または霊長類抗体）に由来しており、親抗体の抗原結合性を保持しているか、または実質的に保持しているが、ヒトにおいて免疫原性はより少ない。これらの抗体作成は、（ａ）完全な非ヒト可変領域をヒト定常領域にグラフト結合してキメラ抗体を作成する方法；（ｂ）重要なフレームワーク残基を保持した状態、または保持していない状態で、１つ以上の非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも一部分をヒトフレームワークおよび定常領域にグラフト結合する方法；または（ｃ）完全な非ヒト可変領域を移植するが、表面残基を交換することによって、ヒトに似た部分で「覆ってしまう」方法を含む種々の方法で達成してもよい。このような方法は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１−６８５５（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４：６５−９２（１９８９）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．２８：４８９−４９８（１９９１）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．３１：１６９−２１７（１９９４）、および米国特許第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、同第５，６９３，７６２号、および同第６，１９０，３７０号に開示されており、これらの内容は全て、参照することにより本明細書に組み込まれる。。
【０２８７】
脱免疫化によって、抗体の免疫原性を低下させることもできる。本明細書で使用するとき、用語「脱免疫化」は、Ｔ細胞エピトープを改変するように抗体を変えることを含む（例えば、ＷＯ９８５２９７６Ａ１号、ＷＯ００３４３１７Ａ２号を参照）。例えば、原料抗体由来のＶＨ配列およびＶＬ配列を分析し、それぞれのＶ領域から得たヒトＴ細胞エピトープ「マップ」は、相補性決定領域（ＣＤＲ）およびその配列内の他の鍵となる残基に対するエピトープの位置を示す。最終的な抗体の活性が変わってしまう危険性を低く保ちつつ、代替的なアミノ酸置換を特定するために、Ｔ細胞エピトープマップから得た個々のＴ細胞エピトープを分析する。アミノ酸置換の組み合わせを含む、代わりとなるさまざまなＶＨ配列およびＶＬ配列を設計し、この配列は、本明細書に開示した診断方法および治療方法で使用するさまざまな結合ポリペプチド（例えば、ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体または免疫特異的なフラグメント）を組み込んだものであり、次いで、この配列の機能を試験する。典型的には、１２〜２４の抗体改変体を作成し、試験する。改変したＶ領域およびヒトＣ領域を含む、完全な重鎖および軽鎖の遺伝子を発現ベクターにクローン化し、その後、全抗体を産生させるために、プラスミドを細胞株に導入する。次いで、この抗体を適切な生化学アッセイおよび生物アッセイで比較し、最適な改変体を特定する。
【０２８８】
本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体を、当該技術分野で既知の任意の好適な方法で作成することができる。目的の抗原に対するポリクローナル抗体を、当該技術分野で周知のさまざまな手順で作成することができる。例えば、ＩＧＦ−１Ｒ抗体、例えば、結合ポリペプチド、例えば、ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体、または免疫特異的なフラグメントを、種々の宿主動物（限定されないが、ウサギ、マウス、ラット、ニワトリ、ハムスター、ヤギ、ロバなど）に投与し、抗原に特異的なポリクローナル抗体を含有する血清を産生してもよい。種々のアジュバントを使用し、宿主の種類に応じて、免疫反応を高めてもよい。アジュバントの例としては、限定されないが、Ｆｒｅｕｎｄアジュバント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムのような鉱物のゲル、表面活性基質、例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルション、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、および有用な可能性を秘めたヒトアジュバント、例えば、ＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍが挙げられる。このようなアジュバントは、当該技術分野でよく知られている。
【０２８９】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組み換えおよびファージディスプレイ技術の使用、またはこれらの組み合わせを使用することを含む、当該技術分野で既知の多くの技術で調製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、当該技術分野で既知の技術および以下の文献の教示を含むハイブリドーマ技術を用いて製造することができる。例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２ｎｄ  ｅｄ．  （１９８８）；  Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、５６３−６８１（１９８１）（この参考文献の内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる）。用語「モノクローナル抗体」は、本明細書で使用するとき、ハイブリドーマ技術で製造された抗体に限定されない。用語「モノクローナル抗体」は、任意の真核細胞クローン、原核細胞クローン、またはファージクローンを含む１個のクローンに由来する抗体を指し、製造される方法は問わない。したがって、用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術で製造された抗体に限定されない。モノクローナル抗体は、エピトープ認識領域を増やすために、ＩＧＦ−１Ｒノックアウトマウスを用いて調製することができる。モノクローナル抗体は、本明細書に記載するようなハイブリドーマの使用、および組み換えファージディスプレイ技術を含む、当該技術分野で既知の多くの技術を用いて調製することができる。
【０２９０】
当該技術分野で認識されたプロトコルを用い、一例では、関連する抗原（例えば、ＩＧＦ−１Ｒ精製物、またはＩＧＦ−１Ｒを含む細胞または細胞抽出物）およびアジュバントを、動物に複数回皮下注射または腹腔内注射することによって、抗体を生じさせる。この免疫法は、典型的には、脾細胞またはリンパ球が活性化し、抗原反応性の抗体が産生することを含む免疫応答を誘発する。得られた抗体を動物の血清から集め、ポリクローナル調製物を得るが、多くは、均質な調製物であるモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を得るために、脾臓、リンパ節または末梢血から個々のリンパ球を単離することが望ましい。好ましくは、リンパ球は、脾臓に由来する。
【０２９１】
この周知のプロセス（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５））では、抗原を注射した哺乳動物に由来する、比較的寿命の短いリンパ球または致死性のリンパ球を、不死化した腫瘍細胞系（例えば、骨髄腫細胞系）と融合し、不死化し、Ｂ細胞を遺伝的にコードした抗体を産生可能なハイブリッド細胞、すなわち「ハイブリドーマ」を産生する。得られたハイブリッドを選択し、１種類の遺伝子株に分け、希釈し、１種類の抗体をつくるのに特異的な遺伝子を含む個々の株を再び成長させる。これらの株は、所望の抗原に対して均質な抗体を産生し、純粋な１つの系統の遺伝子を有するため、「モノクローナル」と呼ばれる。
【０２９２】
このようにして調製したハイブリドーマ細胞を、好適な培地、好ましくは、融合していない親細胞である骨髄腫細胞の成長または生存を阻害する１種以上の基質を含有する培地に播種し、成長させる。当業者は、ハイブリドーマを作成し、選抜し、成長させるための試薬、細胞系および培地は、多くの供給業者から入手可能であり、標準的なプロトコルが十分に確立されていることを理解している。一般的に、ハイブリドーマ細胞を成長させる培地は、所望の抗原に対するモノクローナル抗体を製造するという観点でアッセイされる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞で産生したモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）のようなインビトロアッセイで決定する。ハイブリドーマ細胞が、所望の特異性、親和性および／または活性を有する抗体を産生することが特定されたら、クローンを限界希釈手順によってサブクローン化し、標準的な方法で成長させてもよい（Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ｐｐ５９−１０３（１９８６））。さらに、サブクローンから分泌したモノクローナル抗体を、従来の精製手順（例えば、プロテイン−Ａ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析法または親和性クロマトグラフィー）によって、培地、腹水または血清から分離してもよいことも理解されるであろう。
【０２９３】
特定のエピトープを認識する抗体フラグメントを、既知の技術によって作成してもよい。例えば、ＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、免疫グロブリン分子を組み換え操作するか、またはパパイン（Ｆａｂフラグメントを得る）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを作成する）のような酵素を用い、タンパク質分解によって開裂させて作成してもよい。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、可変領域と、軽鎖定常領域と、重鎖のＣＨ１領域とを含有する。
【０２９４】
当業者は、抗体または抗体フラグメント（例えば、抗原結合部位）をコードするＤＮＡが、ファージディスプレイライブラリのような抗体ライブラリに由来するものであってもよいことを理解するであろう。特に、抗体ライブラリのレパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリ（例えば、ヒトまたはマウス）から発現した抗原結合領域を示すために、このようなファージを利用することができる。目的の抗原に結合する抗原結合領域を発現するファージは、抗原を用いて（例えば、標識した抗原を用いるか、または固体表面またはビーズに結合または捕捉された抗体を用いて）選択し、または特定することができる。これらの方法で使用するファージは、典型的には、Ｆａｂ、Ｆｖ  ＯＥ  ＤＡＢ（軽鎖または重鎖に由来する個々のＦｖ領域）を有するファージから発現するｆｄ結合領域およびＭ１３結合領域を含むか、またはファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかが組み換えによって融合した、ジスルフィドによって安定化したＦｖ抗体領域を含む糸状ファージである。方法の例は、例えば、欧州特許第３６８  ６８４  Ｂ１号；米国特許第５，９６９，１０８号、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．およびＣｈａｍｅｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ２１：３７１（２０００）；Ｎａｇｙら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：８０１（２００２）；Ｈｕｉｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：２６８２（２００１）；Ｌｕｉら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１５：１０６３（２００２）に記載されており、これらの内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。種々の刊行物（例えば、Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２））には、大量のファージライブラリを構築するために、チェーンシャッフリング（ｃｈａｉｎ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）、およびコンビナトリアル感染およびインビボ組み換え法によって高親和性を有するヒト抗体の製造法が記載されている。別の実施形態では、リボソームディスプレイを、ディスプレイプラットフォームとしてバクテリオファージの代わりに用いてもよい（例えば、Ｈａｎｅｓら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：１２８７（２０００）；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：３７５０（２００１）；またはＩｒｖｉｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８：３１（２００１）を参照）。さらに別の実施形態では、細胞表面ライブラリをスクリーニングして抗体を調べてもよい（Ｂｏｄｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：１０７０１（２０００）；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４３：２１１（２０００））。上述の手順は、モノクローナル抗体を単離し、クローン化するための従来のハイブリドーマ技術にとって代わるものである。
【０２９５】
ファージディスプレイ法では、抗体の機能的領域をファージ粒子表面に提示し、このファージ粒子は、上述の機能的領域をコードするポリヌクレオチド配列を有している。例えば、ＶＨ領域およびＶＬ領域をコードするＤＮＡ配列を増幅するか、または他の方法で動物のｃＤＮＡライブラリ（例えば、ヒトまたはマウスのリンパ組織のｃＤＮＡライブラリ）または合成ｃＮＤＡライブラリから単離する。特定の実施形態では、ＰＣＲによって、ＶＨ領域およびＶＬ領域をコードするＤＮＡをｓｃＦｖリンカーによって接続し、ファージミドベクター（例えば、ｐ  ＣＡＮＴＡＢ  ６またはｐＣｏｍｂ  ３  ＨＳＳ）にクローン化する。このベクターをＥ．ｃｏｌｉに電気穿孔し、Ｅ．ｃｏｌｉをヘルパーファージで感染させる。この方法で使用するファージは、典型的には、ｆｄおよびＭ１３を含む糸状ファージであり、ＶＨ領域またはＶＬ領域は、通常は、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩのいずれかが組み換えによって融合している。目的の抗原（すなわち、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメント）に結合する抗原結合領域を発現するファージは、抗原を用いて（例えば、標識した抗原を用いるか、または固体表面またはビーズに結合または捕捉された抗体を用いて）選択し、または特定することができる。
【０２９６】
抗体を製造するのに使用可能なファージディスプレイ法のさらなる例としては、Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８２：４１−５０（１９９５）；Ａｍｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８４：１７７−１８６（１９９５）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５８（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ  １８７：９−１８（１９９７）；Ｂｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５７：１９１−２８０（１９９４）；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４号；ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ９０／０２８０９号；ＷＯ９１／１０７３７号；ＷＯ９２／０１０４７号；ＷＯ９２／１８６１９号；ＷＯ９３／１１２３６号；ＷＯ９５／１５９８２号；ＷＯ９５／２０４０１号；および米国特許第５，６９８，４２６号；第５，２２３，４０９号；第５，４０３，４８４号；第５，５８０，７１７号；第５，４２７，９０８号；第５，７５０，７５３号；第５，８２１，０４７号；第５，５７１，６９８号；第５，４２７，９０８号；第５，５１６，６３７号；第５，７８０，２２５号；第５，６５８，７２７号；第５，７３３，７４３号および第５，９６９，１０８号に開示されており、これらの内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０２９７】
上述の引用文献に記載されているように、ファージを選択した後、ファージから得られる抗体コード領域を単離し、全抗体（ヒト抗体または任意の他の所望な抗原結合性を保持したフラグメントを含む）を作成し、任意の所望の宿主（哺乳動物の細胞、昆虫の細胞、植物細胞、酵母および微生物を含む）で発現させることができる。例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントを組み換えによって産生する技術は、ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ９２／２２３２４号；Ｍｕｌｌｉｎａｘら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １２（６）：８６４−８６９（１９９２）；およびＳａｗａｉら、ＡＪＲＩ  ３４：２６−３４（１９９５）；およびＢｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３（１９８８）（この参考文献は、参照することにより本明細書に組み込まれる）に開示されている方法のような、当該技術分野で既知の方法を用いて実施することができる。
【０２９８】
単鎖Ｆｖおよび抗体を産生するのに使用可能な技術の例としては、米国特許第４，９４６，７７８号および第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２０３：４６−８８（１９９１）；Ｓｈｕら、ＰＮＡＳ  ９０：７９９５−７９９９（１９９３）；およびＳｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０３８−１０４０（１９８８）に記載されている技術が挙げられる。インビボでのヒトでの抗体の使用、およびインビトロ検出アッセイを含むいくつかの使用で、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体を使用することが好ましい場合もある。キメラ抗体は、抗体の異なる部分が、異なる動物種に由来するものである分子であり、例えば、マウスモノクローナル抗体に由来する可変領域と、ヒト免疫グロブリン定常領域とを含む抗体である。キメラ抗体を産生する方法は、当該技術分野で既知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１−２０２（１９８９）；米国特許第５，８０７，７１５号；第４，８１６，５６７号；および４，８１６３９７号を参照（この内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる）。ヒト化抗体は、所望の抗原に結合する非ヒト種の抗体に由来する抗体分子であり、非ヒト種に由来する１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト免疫グロブリン分子に由来するフレームワーク領域とを含む。抗原への結合性を変更する（好ましくは、高める）ために、ヒトフレームワーク領域のフレームワーク残基が、ＣＤＲ供与抗体に由来する対応する残基と置換していることが多い。これらのフレームワークの置換は、例えば、ＣＤＲとフレームワーク残基との相互作用をモデリングし、抗原への結合に重要なフレームワーク残基を特定すること、および配列を比較し、特定の位置にある一般的ではないフレームワーク残基を特定することのような、当該技術分で周知の方法によって同定される（例えば、Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３（１９８８）を参照。この内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる）。例えば、ＣＤＲグラフティング（欧州特許第２３９，４００号；ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ９１／０９９６７号；米国特許第５，２２５，５３９号；第５，５３０，１０１号および第５，５８５，０８９号）、ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサーファリング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（欧州特許第５９２，１０６号；欧州特許第５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２８（４／５）：４８９−４９８（１９９１）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７（６）：８０５−８１４（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａら、ＰＮＡＳ  ９１：９６９−９７３（１９９４））およびチェーンシャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）を含む、当該技術分野で既知の種々の技術を用い、抗体をヒト化することができる。
【０２９９】
全ヒト抗体は、ヒト患者を治療するには、特に望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリを用いる上述のファージディスプレイ法を含む、当該技術分野で既知の種々の方法で製造することができる。さらに、米国特許第４，４４４，８８７号および第４，７１６，１１１号；およびＰＣＴ出願公開ＷＯ９８／４６６４５号、ＷＯ９８／５０４３３号、ＷＯ９８／２４８９３号、第ＷＯ９８／１６６５４号、ＷＯ９６／３４０９６号、ＷＯ９６／３３７３５号およびＷＯ９１／１０７４１号も参照（この内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる）。
【０３００】
ヒト抗体は、機能的な内因性免疫グロブリンを発現することはできず、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現可能なトランスジェニックマウスを用いて産生することができる。例えば、ヒト免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の遺伝子複合体を、無作為に導入してもよいし、またはマウスＥＳ細胞への相同組み換えによって導入してもよい。あるいは、ヒトの重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子に加え、ヒトの可変領域、定常領域および多様な領域を、マウスＥＳ細胞に導入してもよい。マウス免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の遺伝子は、相同組み換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入とは別に、または同時に機能を失わせてもよい。特に、ＪＨ領域のホモ接合体欠失によって、内因性抗体の産生が抑えられる。改変されたＥＳ細胞の数を増やし、胚盤胞に微量注入し、キメラマウスを産生する。次いで、キメラマウスを繁殖させ、ヒト抗体を発現するホモ接合性の子孫を産生する。トランスジェニックマウスを、選択した抗原（例えば、所望の標的ポリペプチド全体または一部分）を用いて通常の様式で免疫化する。免疫化したトランスジェニックマウスから、従来のハイブリドーマ技術を用いて、所定の抗原に結合性のモノクローナル抗体を得ることができる。トランスジェニックマウスによって得られたヒト免疫グロブリンのトランス遺伝子は、Ｂ細胞分化中に再編成され、その後、クラススイッチが起こり、体細胞変異が起こる。したがって、この技術を用い、治療に有用なＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＭ抗体およびＩｇＥ抗体を産生することが可能である。ヒト抗体を産生するこの技術の概説は、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ  Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）を参照。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生する技術、およびこのような抗体を産生するプロトコルのさらなる詳細は、ＰＣＴ出願公開第ＷＯ９８／２４８９３号；ＷＯ９６／３４０９６号；ＷＯ９６／３３７３５号；米国特許第５，４１３，９２３号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，５６９，８２５号；第５，６６１，０１６号；第５，５４５，８０６号；第５，８１４，３１８号；および第５，９３９，５９８号を参照（この内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる）。さらに、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州フレモント）およびＧｅｎＰｈａｒｍ（カリフォルニア州サンノゼ）のような企業と交渉し、上述の技術と似た技術を用い、所定の抗原に対するヒト抗体を得ることができる。
【０３０１】
所定のエピトープを認識する全ヒト抗体を、「誘導選択（ｇｕｉｄｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」と呼ばれる技術を用いて作成することができる。このアプローチでは、所定の非ヒトモノクローナル抗体（例えばマウス抗体）を使用し、同じエピトープを認識する全ヒト抗体の選択を誘導する（Ｊｅｓｐｅｒｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：８９９−９０３（１９９４）。さらに、米国特許第５，５６５，３３２号も参照）。
【０３０２】
さらに、本発明の標的ポリペプチドに対する抗体を使用し、当該技術分野で周知の技術を用い、標的ポリペプチドを「模倣する」抗イディオタイプ抗体を作成することができる（例えば、Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ  ＆  Ｂｏｎａ，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．７（５）：４３７−４４４（１９８９）およびＮｉｓｉｎｏｆｆ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（８）：２４２９−２４３８（１９９１）を参照）。例えば、本発明のポリペプチドに結合するか、ポリペプチドのマルチマー化および／または本発明のポリペプチドがリガンドに結合することを競合的に阻害するか、またはアロステリック効果によって阻害する抗体を使用し、ポリペプチドのマルチマー化および／または結合領域を「模倣する」抗イディオタイプを作成し、その結果、ポリペプチドおよび／またはそのリガンドに結合し、中和することができる。このような中和能を有する抗イディオタイプまたは抗イディオタイプのＦａｂフラグメントを、ポリペプチドを中和する治療法に使用することができる。例えば、このような抗イディオタイプ抗体を使用し、所望の標的ポリペプチドおよび／またはそのリガンド／受容体に結合し、その生体活性を失わせることができる。
【０３０３】
別の実施形態では、所望のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡを、従来の手順を用いて簡単に単離し、配列決定することができる（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを用いる）。単離し、サブクローン化したハイブリドーマ細胞は、このＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。単離したら、ＤＮＡを発現ベクターに入れてよく、真核宿主細胞または原核宿主細胞（例えば、限定されないが、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または免疫グロブリンを産生しないそれ以外の骨髄腫細胞）にトランスフェクトする。より特定的には、本明細書に参照することにより組み込まれるＮｅｗｍａｎら、米国特許第５，６５８，５７０号（１９９５年１月２５日出願）に記載されるような抗体を製造するために、単離したＤＮＡ（本明細書で記載したように合成してもよい）を使用し、定常領域および可変領域の配列をクローン化してもよい。本質的には、この操作は、ＲＮＡの所定の細胞からの抽出、ｃＤＮＡへの変換、およびＩｇ特異的なプライマーを用いたＰＣＲによる増幅をもたらす。この目的に好適なプライマーは、米国特許第５，６５８，５７０号にも記載されている。以下にさらに詳細に記載するように、免疫グロブリンを臨床的および商業的に提供するために、所望の抗体を発現するように形質転換した細胞を、比較的大量に成長させてもよい。
【０３０４】
ある実施形態では、本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体は、抗体分子の重鎖または軽鎖にＣＤＲを少なくとも１箇所含む。別の実施形態では、本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体は、１種以上の抗体分子に由来する、少なくとも２箇所のＣＤＲを含む。別の実施形態では、本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体は、１種以上の抗体分子に由来する、少なくとも３箇所のＣＤＲを含む。別の実施形態では、本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体は、１種以上の抗体分子に由来する、少なくとも４箇所のＣＤＲを含む。別の実施形態では、本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体は、１種以上の抗体分子に由来する、少なくとも５箇所のＣＤＲを含む。別の実施形態では、本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体は、１種以上の抗体分子に由来する、少なくとも６箇所のＣＤＲを含む。少なくとも１箇所のＣＤＲを含み、目的のＩＧＦ−１Ｒ抗体に含まれる抗体分子の例を本明細書に記載している。
【０３０５】
特定の実施形態では、重鎖および／または軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を調査し、当該技術分野で周知の方法によって、相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列を特定してもよい（例えば、他の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の既知のアミノ酸配列と比較し、配列の超可変性を決定する）。一般的な組み換えＤＮＡ技術を用い、１つ以上のＣＤＲをフレームワーク領域に挿入してもよい（例えば、ヒトフレームワーク領域に挿入し、非ヒト抗体をヒト化する）。フレームワーク領域は、天然のものであっても、またはコンセンサスフレームワーク領域であってもよく、好ましくは、ヒトフレームワーク領域である（例えば、ヒトフレームワーク領域のリストは、Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８：４５７−４７９（１９９８）を参照）。好ましくは、フレームワーク領域とＣＤＲとを組み合わせて作成したポリヌクレオチドは、所望のポリペプチド（例えばＩＧＦ−１Ｒ）の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する抗体をコードする。好ましくは、１つ以上のアミノ酸置換を、フレームワーク領域内で実施してよく、好ましくは、このアミノ酸置換によって、抗原への抗体の結合性が高まる。さらに、この方法を使用し、鎖内ジスルフィド結合に関与する１つ以上の可変領域にあるシステイン残基のアミノ酸を置換するか、または欠失させ、１つ以上の鎖内ジスルフィド結合を欠いた抗体分子を作成してもよい。ポリヌクレオチドに対する他の改変も本発明に包含され、当該技術分野の技術の範囲内である。
【０３０６】
さらに、適切な抗原特異性を有するマウス抗体分子に由来する遺伝子を、適切な生体活性を有するヒト抗体分子に由来する遺伝子とともにスプライシングする、「キメラ抗体」を産生するために開発された技術を使用することができる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：８５１−８５５（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−６０８（１９８４）；Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２−４５４（１９８５））。本明細書で使用するとき、キメラ抗体は、異なる部分が、異なる動物種に由来するものである分子であり、例えば、マウスモノクローナル抗体に由来する可変領域と、ヒト免疫グロブリン定常領域とを含む抗体（例えば、ヒト化抗体）である。
【０３０７】
あるいは、単鎖抗体を産生するために開発された技術（米国特許第４，６９４，７７８号；Ｂｉｒｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４４２（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３（１９８８）；およびＷａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５４４−５５４（１９８９））を適用し、単鎖抗体を産生することができる。単鎖抗体は、Ｆｖ領域の重鎖フラグメントおよび軽鎖フラグメントをアミノ酸架橋で結合し、単鎖抗体を得ることによって作成される。Ｅ  ｃｏｌｉの機能的なＦｖ領域をアセンブリする技術を使用してもよい（Ｓｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：１０３８−１０４１（１９８８））。
【０３０８】
本発明のさらに他の実施形態は、内因性免疫グロブリンを産生することができないトランスジェニック動物（例えば、マウス）で、ヒト抗体または実質的にヒトである抗体を作成することを含む（例えば、米国特許第６，０７５，１８１号、第５，９３９，５９８号、第５，５９１，６６９号および第５，５８９，３６９号を参照、この内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる）。例えば、キメラ変異マウスおよび生殖細胞系変異マウスにおける、抗体の重鎖結合領域のホモ接合体欠失によって、内因性抗体の産生が完全に阻害されることが記載されている。ヒト免疫グロブリン遺伝子アレイを上述のような生殖細胞系変異マウスに移すと、抗体チャレンジの際にヒト抗体が産生する。ＳＩＣＤマウスを用いてヒト抗体を作成する別の好ましい手段は、米国特許第５，８１１，５２４号に開示されており、この内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。これらのヒト抗体に関連する遺伝物質を本明細書に記載のように単離し、操作してもよいことが理解されるであろう。
【０３０９】
組み換え抗体を作成するのにきわめて効果的な別の手段は、Ｎｅｗｍａｎ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１４５５−１４６０（１９９２）に開示されている。特に、この技術によって、サル可変領域とヒト定常領域とを含む霊長類化抗体が得られる。この参考文献の内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。さらに、この技術は、同一出願人による米国特許第５，６５８，５７０号、第５，６９３，７８０号および第５，７５６，０９６号にも記載されており、この内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０３１０】
別の実施形態では、リンパ球を、マイクロマニピュレーションおよび単離された可変領域によって選択することができる。例えば、末梢血の単核細胞を免疫化した哺乳動物から単離し、インビトロで約７日間培養することができる。この培養物をスクリーニングし、このスクリーニング基準を満たす特異的なＩｇＧを調べることができる。ポジティブウェルから得た細胞を単離することができる。個々のＩｇを産生するＢ細胞をＦＡＣＳで単離するか、または相補性による溶血プラークアッセイで特定することによって単離することができる。Ｉｇを産生するＢ細胞を、管でマイクロマニピュレーションし、ＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子を、例えばＲＴ−ＰＣＲを用いて増幅させることができる。ＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子を、抗体発現ベクターにクローン化し、細胞（例えば、真核細胞または原核細胞）に移して発現させることができる。
【０３１１】
あるいは、当業者に周知の技術を用い、抗体を産生する細胞株を選択し、培養してもよい。このような技術は、種々の実験マニュアルおよび主要な刊行物に記載されている。この観点で、以下に記載する本発明で使用するのに好適な技術は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｃｏｌｉｇａｎら編、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１）に記載されており、この内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる（補足事項を含む）。
【０３１２】
本発明の抗体は、抗体合成分野で既知の任意の方法によって製造することができ、特に、化学合成によって、好ましくは、本明細書に記載の組み換え発現技術によって製造することができる。
【０３１３】
ある実施形態では、本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体は、１つ以上の領域が部分的または完全に失われた（「領域を欠いた抗体」）合成定常領域を含む。特定の実施形態では、適合するように改変された抗体は、ＣＨ２領域が完全に除去された（△ＣＨ２構築物）、領域を欠いた構築物または改変体を含む。他の実施形態では、短い結合ペプチドを、上述の除去された領域の代わりに使い、可変領域の可とう性および移動の自由度を上げてもよい。当業者は、ＣＨ２領域が、抗体の異化速度を制御するという性質によって、このような構築物が特に好ましいことを理解するであろう。領域を欠いた構築物は、ＩｇＧ１ヒト定常領域をコードするベクターを用いて誘導され得る（例えば、ＷＯ０２／０６０９５５Ａ２号およびＷＯ０２／０９６９４８Ａ２号）。このベクターは、ＣＨ２領域を欠き、領域を欠いたＩｇＧ１定常領域を発現するベクターを提供するように遺伝子操作される。
【０３１４】
特定の実施形態では、本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体は、ミニボディである。ミニボディは、当該技術分野で記載の方法を用いて製造することができる（例えば、米国特許第５，８３７，８２１号またはＷＯ９４／０９８１７Ａ１号を参照）。
【０３１５】
ある実施形態では、本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体は、モノマーサブユニット間の会合が可能な限り、いくつかのアミノ酸または１個のアミノ酸を欠いているか、または置換された免疫グロブリン重鎖を含む。例えば、ＣＨ２領域の所定領域にある１個のアミノ酸の変異でも、Ｆｃ結合性を大幅に低下させ、腫瘍の局在化を高めるのに十分な場合がある。同様に、制御されるべきエフェクター機能（例えば、相補性結合）を制御する１つ以上の定常領域の一部分が単純に失われていることも望ましい場合がある。このような定常領域の部分的な欠失によって、目的のインタクトな定常領域に関連する他の望ましい機能はそのままで、抗体の所定の性質（血清での半減期）が高められ得る。さらに、暗に示されているように、開示した抗体の定常領域は、１つ以上のアミノ酸の変異または置換によって合成され、得られた構築物のプロフィールを高め得る。この観点で、改変された抗体の構造および免疫プロフィールを実質的に維持したままで、保存された結合部位（例えば、Ｆｃ結合）によって付与される活性を失わせ得る。さらにほかの実施形態は、１個以上のアミノ酸を定常領域に付加し、エフェクター機能のような望ましい特性を高めるか、または細胞毒素または炭水化物への結合力を高めたものである。このような実施形態では、所定の定常領域に由来する特定の配列を挿入するか、または複製することが望ましい場合がある。
【０３１６】
さらに、本発明はまた、本明細書に記載の抗体分子（例えば、ＶＨ領域および／またはＶＬ領域）の改変体（誘導体を含む）を含むか、これらの物質から本質的になるか、またはこれらの物質からなる抗体を提供する。ここで、抗体または抗体フラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントまたは改変体に免疫特異的に結合する。当業者に既知の標準的な技術を用い、ＩＧＦ−１Ｒ抗体をコードするヌクレオチド配列に変異（限定されないが、アミノ酸置換が起こる、部位特異的な変異およびＰＣＲによる変異）を導入することができる。好ましくは、改変体（誘導体を含む）は、参照ＶＨ領域のＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、ＶＨ−ＣＤＲ３、ＶＬ領域のＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２またはＶＬ−ＣＤＲ３に対してアミノ酸の置換が５０個未満、４０個未満、３０個未満、２５個未満、２０個未満、１５個未満、１０個未満、５個未満、４個未満、３個未満、または２個未満のアミノ酸をコードする。「アミノ酸の同類置換」は、アミノ酸残基が、同様の電荷を有する側鎖を有するアミノ酸残基と置換されたものである。同じ電荷を側鎖に有するアミノ酸残基は、当該技術分野で定義されている。この分類には、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、電荷をもたない極性側鎖有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分枝を有する側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。あるいは、コード配列全体または一部分に、無作為に変異が導入されてもよく（例えば、飽和突然変異誘発）、得られた変異体の生体活性をスクリーニングし、活性（例えば、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドに結合する能力）を保持した変異体を特定することができる。
【０３１７】
例えば、抗体分子のフレームワーク領域のみ、または抗体分子のＣＤＲ領域にのみ、変異を導入することが可能である。導入された変異は、サイレント変異であってもよく、中立的なミスセンス変異であってもよく（すなわち、抗体が抗原に結合する能力が全くないか、ほとんどない）、実際に、いくつかの変異は、アミノ酸配列を全く変えない。これらの種類の変異は、コドンの用法を最適化するか、またはハイブリドーマの抗体産生を高めるのに有用な場合がある。コドンを最適化した、本発明のＩＧＦ−１Ｒ領域をコードするコード領域は、本明細書の他の部分に開示している。あるいは、中立的ではないミスセンス変異は、抗体が抗原に結合する能力を変え得る。ほとんどのサイレント変異および中立的なミスセンス変異の位置は、フレームワーク領域内にある可能性が高く、一方、ほとんどの中立的ではないミスセンス変異は、ＣＤＲ内にある可能性が高いが、必ずそうでなければならないというわけではない。当業者は、例えば、抗原への結合活性を変更しないか、または結合活性を変更する（例えば、抗体への結合活性を高めるか、または抗体特異性を変える）といった所望の性質を有する変異分子を設計し、試験することができる。突然変異させた後、コードされたタンパク質を通常の方法で発現させることができ、このコードされたタンパク質の機能的活性および／または生体活性（例えば、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドの少なくとも１つのエピトープに免疫特異的に結合する能力）を、本明細書に記載の技術を用いて決定することができ、当該技術分野で既知の技術を一般的な方法で改変することによって決定することができる。
【０３１８】
（ＩＶ．ＩＧＦ−１Ｒ抗体をコードするポリヌクレオチド）
さらに、本発明は、本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体をコードする核酸分子も提供する。
【０３１９】
ある実施形態では、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸を含むか、この核酸から本質的になるか、またはこの核酸からなる、ポリヌクレオチドの単離物を提供する。ここで、重鎖可変領域の少なくとも１箇所のＣＤＲ、または重鎖可変領域のの少なくとも２個のＶＨ−ＣＤＲが、本明細書に開示したモノクローナルＩＧＦ−１Ｒ抗体に由来する重鎖のＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２またはＶＨ−ＣＤＲ３の参照アミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一である。あるいは、ＶＨのＶＨ−ＣＤＲ１領域、ＶＨ−ＣＤＲ２領域およびＶＨ−ＣＤＲ３領域は、本明細書に開示したモノクローナルＩＧＦ−１Ｒ抗体に由来する重鎖のＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２またはＶＨ−ＣＤＲ３の参照アミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一である。したがって、この実施形態によれば、本発明の重鎖可変領域は、表５に示したポリペプチド配列に関連するＶＨ−ＣＤＲ１ポリペプチド配列、ＶＨ−ＣＤＲ２ポリペプチド配列またはＶＨ−ＣＤＲ３ポリペプチド配列を有する。
【０３２０】
（表５）参照ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２およびＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列＊
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＊Ｋａｂａｔシステムで決定した（上述）。
Ｎ＝ヌクレオチド配列、Ｐ＝ポリペプチド配列。
【０３２１】
当該技術分野で知られているように、２個のポリペプチド間または２個のポリヌクレオチド間の「配列同一性」は、片方のポリペプチドまたはポリヌクレオチドのアミノ酸配列または核酸配列と、第２のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの配列とを比較することによって決定される。本明細書で記載する場合、任意の特定のポリペプチドが、別のポリペプチドと少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％同一であることは、当該技術分野で既知の方法およびコンピュータプログラム／ソフトウェアを用いて決定することができる（例えば、限定されないが、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１１））。ＢＥＳＴＦＩＴは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９（１９８１）の局所同一性アルゴリズムを使用し、２個の配列間の同一性が最も良好な部分を見つける。特定の配列が、例えば、本発明の参照配列と９５％同一であることを決定するために、ＢＥＳＴＦＩＴまたは任意のほかの配列アラインメントプログラムを用いる場合、言うまでもなく、参照ポリペプチド配列の全長にわたって同一性の％を算出し、参照配列の全アミノ酸数の５％までの同一性ギャップを許容するようにパラメーターを設定する。
【０３２２】
特定の実施形態では、上述のポリペプチドがコードするＶＨを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合するか、またはＩＧＦ−１Ｒに選択的に結合する。特定の実施形態では、ＶＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、このヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を変えることなく、配列が変更されている。例えば、所与の種でのコドン使用頻度を改良し、スプライス部分を除去するか、または制限酵素部位を除去するように、この配列が変更されてもよい。このような配列最適化法は、実施例に記載されており、周知であり、当業者が一般的に実施している方法である。
【０３２３】
別の実施形態では、本発明は、表５に示すＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２またはＶＨ−ＣＤＲ３と同一のポリペプチド配列を有する、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２またはＶＨ−ＣＤＲ３をコードする核酸を含むか、この核酸から本質的になるか、またはこの核酸からなる、ポリヌクレオチドの単離物を提供する。特定の実施形態では、このポリヌクレオチドがコードするＶＨを含む抗体または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合するか、またはＩＧＦ−１Ｒに選択的に結合する。
【０３２４】
特定の実施形態では、上述の１つ以上のポリヌクレオチドがコードするＶＨを含むか、またはこのＶＨから本質的になるか、またはこのＶＨからなる抗体または抗原結合性を保持したフラグメントは、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１およびＭ１２−Ｇ０４からなる群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体フラグメント、またはハイブリドーマが産生するＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２およびＰ１Ｇ１０．２Ｂ８からなる群から選択される参照モノクローナル抗体と同じＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合するか、または選択的に結合するか、またはこのようなモノクローナル抗体または抗体フラグメントが、ＩＧＦ−１Ｒに結合するのを競合的に阻害する。  
【０３２５】
特定の実施形態では、上述の１つ以上のポリヌクレオチドがコードするＶＨを含むか、またはこのＶＨから本質的になるか、またはこのＶＨからなる抗体または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントに特異的に結合するか、または選択的に結合し、またはＩＧＦ−１Ｒポリペプチド改変体に特異的に結合するか、または選択的に結合し、親和性を特徴づける解離定数（ＫＤ）は、約５×１０−２Ｍ以下、約１０−２Ｍ以下、約５×１０−３Ｍ以下、約１０−３Ｍ以下、約５×１０−４Ｍ以下、約１０−４Ｍ以下、約５×１０−５Ｍ以下、約１０−５Ｍ以下、約５×１０−６Ｍ以下、約１０−６Ｍ以下、約５×１０−７Ｍ以下、約１０−７Ｍ以下、約５×１０−８Ｍ以下、約１０−８Ｍ以下、約５×１０−９Ｍ以下、約１０−９Ｍ以下、約５×１０−１０Ｍ以下、約１０−１０Ｍ以下、約５×１０−１１Ｍ以下、約１０−１１Ｍ以下、約５×１０−１２Ｍ以下、約１０−１２Ｍ以下、約５×１０−１３Ｍ以下、約１０−１３Ｍ以下、約５×１０−１４Ｍ以下、約１０−１４Ｍ以下、約５×１０−１５Ｍ以下または約１０−１５Ｍ以下である。
【０３２６】
別の実施形態では、本発明は、免疫グロブリンの軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むか、ＶＬから本質的になるか、ＶＬからなる、ポリヌクレオチドの単離物を提供する。ここで、軽鎖可変領域の少なくとも１箇所のＶＬ−ＣＤＲ、または軽鎖可変領域の少なくとも２個のＶＬ−ＣＤＲが、本明細書に開示したモノクローナルＩＧＦ−１Ｒ抗体に由来する軽鎖のＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２またはＶＬ−ＣＤＲ３の参照アミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一である。あるいは、ＶＬのＶＬ−ＣＤＲ１領域、ＶＬ−ＣＤＲ２領域およびＶＬ−ＣＤＲ３領域は、本明細書に開示したモノクローナルＩＧＦ−１Ｒ抗体に由来する軽鎖のＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２またはＶＬ−ＣＤＲ３の参照アミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一である。したがって、この実施形態によれば、本発明の軽鎖可変領域は、表６に示したポリペプチド配列に関連するＶＬ−ＣＤＲ１ポリペプチド配列、ＶＬ−ＣＤＲ２ポリペプチド配列またはＶＬ−ＣＤＲ３ポリペプチド配列を有する。
【０３２７】
（表６）参照ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２およびＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列＊
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＊Ｋａｂａｔシステムで決定した（上述）。
ＰＮ＝ポリヌクレオチド配列、ＰＰ＝ポリペプチド配列。
【０３２８】
特定の実施形態では、上述のポリヌクレオチドがコードするＶＬを含む抗体または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合するか、またはＩＧＦ−１Ｒに選択的に結合する。
【０３２９】
別の実施形態では、本発明は、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸を含むか、この核酸から本質的になるか、またはこの核酸からなる、ポリヌクレオチドの単離物を提供する。ここで、ＶＬ−ＣＤＲ１領域、ＶＬ−ＣＤＲ２領域またはＶＬ−ＣＤＲ３領域が、表６に示すＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２またはＶＬ−ＣＤＲ３と同一である。特定の実施形態では、上述のポリヌクレオチドがコードするＶＬを含む抗体または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合するか、またはＩＧＦ−１Ｒに選択的に結合する。
【０３３０】
さらなる態様では、本発明は、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸を含むか、この核酸から本質的になるか、またはこの核酸からなる、ポリヌクレオチドの単離物を提供する。ここで、ＶＬ−ＣＤＲ１領域、ＶＬ−ＣＤＲ２領域およびＶＬ−ＣＤＲ３領域は、表６に示すＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２またはＶＬ−ＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列と同じヌクレオチド配列によってコードされる。特定の実施形態では、上述のポリヌクレオチドがコードするＶＬを含む抗体または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合するか、またはＩＧＦ−１Ｒに選択的に結合する。
【０３３１】
特定の実施形態では、上述の１つ以上のポリヌクレオチドがコードするＶＬを含むか、このＶＬから本質的になるか、またはこのＶＬからなる、抗体または抗原結合性を保持したフラグメントは、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１およびＭ１２−Ｇ０４からなる群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体フラグメント、またはハイブリドーマが産生するＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２およびＰ１Ｇ１０．２Ｂ８からなる群から選択される参照モノクローナル抗体と同じＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合するか、または選択的に結合するか、またはこのようなモノクローナル抗体または抗体フラグメントが、ＩＧＦ−１Ｒに結合するのを競合的に阻害する。
【０３３２】
特定の実施形態では、上述の１つ以上のポリヌクレオチドがコードするＶＬを含むか、このＶＬから本質的になるか、またはこのＶＬからなる、抗体または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントに特異的に結合するか、または選択的に結合するか、またはＩＧＦ−１Ｒポリペプチド改変体に特異的に結合するか、または選択的に結合し、親和性を特徴づける解離定数（ＫＤ）は、約５×１０−２Ｍ以下、約１０−２Ｍ以下、約５×１０−３Ｍ以下、約１０−３Ｍ以下、約５×１０−４Ｍ以下、約１０−４Ｍ以下、約５×１０−５Ｍ以下、約１０−５Ｍ以下、約５×１０−６Ｍ以下、約１０−６Ｍ以下、約５×１０−７Ｍ以下、約１０−７Ｍ以下、約５×１０−８Ｍ以下、約１０−８Ｍ以下、約５×１０−９Ｍ以下、約１０−９Ｍ以下、約５×１０−１０Ｍ以下、約１０−１０Ｍ以下、約５×１０−１１Ｍ以下、約１０−１１Ｍ以下、約５×１０−１２Ｍ以下、約１０−１２Ｍ以下、約５×１０−１３Ｍ以下、約１０−１３Ｍ以下、約５×１０−１４Ｍ以下、約１０−１４Ｍ以下、約５×１０−１５Ｍ以下または約１０−１５Ｍ以下である。
【０３３３】
さらなる実施形態では、本発明は、配列番号４、９、１４、２０、２６、３２、３８、４３、４８、５３、５８および６３からなる群から選択される参照ＶＨポリペプチド配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一であるＶＨをコードする核酸を含むか、またはこの核酸から本質的になるか、またはこの核酸からなるポリヌクレオチドの単離物を含む。特定の実施形態では、上述のポリヌクレオチドがコードするＶＨを含む抗体または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合するか、またはＩＧＦ−１Ｒに選択的に結合する。
【０３３４】
別の態様では、本発明は、配列番号４、９、１４、２０、２６、３２、３８、４３、４８、５３、５８および６３からなる群から選択されるポリペプチド配列を有するＶＨをコードする核酸配列を含むか、またはこの核酸配列から本質的になるか、またはこの核酸配列からなるポリヌクレオチドの単離物を含む。特定の実施形態では、上述のポリヌクレオチドがコードするＶＨを含む抗体または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合するか、またはＩＧＦ−１Ｒに選択的に結合する。
【０３３５】
さらなる実施形態では、本発明は、配列番号３、８、１３、１８、１９、２４、２５、３０、３１、３６、３７、４２、４７、５２、５７および６２からなる群から選択される参照核酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一であるＶＨをコードする核酸を含むか、またはこの核酸から本質的になるか、またはこの核酸からなるポリヌクレオチドの単離物を含む。特定の実施形態では、上述のポリヌクレオチドがコードするＶＨを含む抗体または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合するか、またはＩＧＦ−１Ｒに選択的に結合する。
【０３３６】
別の態様では、本発明は、本発明のＶＨをコードする核酸配列を含むか、またはこの核酸から本質的になるか、またはこの核酸からなるポリヌクレオチドの単離物を含む。ここで、ＶＨのアミノ酸配列は、配列番号４、９、１４、２０、２６、３２、３８、４３、４８、５３、５８および６３からなる群から選択される。さらに、本発明は、本発明のＶＨをコードする核酸配列を含むか、またはこの核酸から本質的になるか、またはこの核酸からなるポリヌクレオチドの単離物を含む。ここで、この核酸の配列は、配列番号３、８、１３、１８、１９、２４、２５、３０、３１、３６、３７、４２、４７、５２、５７および６２からなる群から選択される。特定の実施形態では、上述のポリヌクレオチドがコードするＶＨを含む抗体または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合するか、またはＩＧＦ−１Ｒに選択的に結合する。
【０３３７】
特定の実施形態では、上述の１つ以上のポリヌクレオチドがコードするＶＨを含むか、このＶＨから本質的になるか、またはこのＶＨからなる、抗体または抗原結合性を保持したフラグメントは、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１およびＭ１２−Ｇ０４からなる群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体フラグメント、またはハイブリドーマが産生するＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２およびＰ１Ｇ１０．２Ｂ８からなる群から選択される参照モノクローナル抗体と同じＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合するか、または選択的に結合するか、またはこのようなモノクローナル抗体または抗体フラグメントが、ＩＧＦ−１Ｒに結合するのを競合的に阻害するか、またはこのようなモノクローナル抗体が、ＩＧＦ−１Ｒに結合するのを競合的に阻害する。
【０３３８】
特定の実施形態では、上述の１つ以上のポリヌクレオチドがコードするＶＨを含むか、またはこのＶＨから本質的になるか、またはこのＶＨからなる抗体または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントに特異的に結合するか、または選択的に結合するか、またはＩＧＦ−１Ｒポリペプチド改変体に特異的に結合するか、または選択的に結合し、親和性を特徴づける解離定数（ＫＤ）は、約５×１０−２Ｍ以下、約１０−２Ｍ以下、約５×１０−３Ｍ以下、約１０−３Ｍ以下、約５×１０−４Ｍ以下、約１０−４Ｍ以下、約５×１０−５Ｍ以下、約１０−５Ｍ以下、約５×１０−６Ｍ以下、約１０−６Ｍ以下、約５×１０−７Ｍ以下、約１０−７Ｍ以下、約５×１０−８Ｍ以下、約１０−８Ｍ以下、約５×１０−９Ｍ以下、約１０−９Ｍ以下、約５×１０−１０Ｍ以下、約１０−１０Ｍ以下、約５×１０−１１Ｍ以下、約１０−１１Ｍ以下、約５×１０−１２Ｍ以下、約１０−１２Ｍ以下、約５×１０−１３Ｍ以下、約１０−１３Ｍ以下、約５×１０−１４Ｍ以下、約１０−１４Ｍ以下、約５×１０−１５Ｍ以下または約１０−１５Ｍ以下である。
【０３３９】
さらなる実施形態では、本発明は、配列番号６８、７３、７８、８３、８８、９３、９８、１０３、１０８、１１３および１１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む参照ＶＬポリペプチド配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一であるＶＬをコードする核酸を含むか、またはこの核酸から本質的になるか、またはこの核酸からなるポリヌクレオチドの単離物を含む。さらなる実施形態では、本発明は、配列番号６７、７２、７７、８２、８７、９２、９７、１０２、１０７、１１２および１１７からなる群から選択される核酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一であるＶＬをコードする核酸を含むか、またはこの核酸から本質的になるか、またはこの核酸からなるポリヌクレオチドの単離物を含む。特定の実施形態では、上述のポリヌクレオチドがコードするＶＬを含む抗体または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合するか、またはＩＧＦ−１Ｒに選択的に結合する。
【０３４０】
別の態様では、本発明は、配列番号６８、７３、７８、８３、８８、９３、９８、１０３、１０８、１１３および１１８からなる群から選択されるポリペプチド配列を有するＶＬをコードする核酸配列を含むか、またはこの核酸配列から本質的になるか、またはこの核酸配列からなるポリヌクレオチドの単離物を含む。さらに、本発明は、本発明のＶＬをコードする、配列番号６７、７２、７７、８２、８７、９２、９７、１０２、１０７、１１２および１１７からなる群から選択される核酸配列を含むか、またはこの核酸配列から本質的になるか、またはこの核酸配列からなるポリヌクレオチドの単離物を含む。特定の実施形態では、上述のポリヌクレオチドがコードするＶＬを含む抗体または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合するか、またはＩＧＦ−１Ｒに選択的に結合する。
【０３４１】
特定の実施形態では、上述の１つ以上のポリヌクレオチドがコードするＶＬを含むか、またはこのＶＬから本質的になるか、またはこのＶＬからなる抗体または抗原結合性を保持したフラグメントは、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１およびＭ１２−Ｇ０４からなる群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体フラグメント、またはハイブリドーマが産生するＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２およびＰ１Ｇ１０．２Ｂ８からなる群から選択される参照モノクローナル抗体と同じＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合するか、または選択的に結合するか、またはこのようなモノクローナル抗体または抗体フラグメントが、ＩＧＦ−１Ｒに結合するのを競合的に阻害する。
【０３４２】
特定の実施形態では、上述の１つ以上のポリヌクレオチドがコードするＶＬを含むか、またはこのＶＬから本質的になるか、またはこのＶＬからなる抗体または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントに特異的に結合するか、選択的に結合するか、またはＩＧＦ−１Ｒポリペプチド改変体に特異的に結合するか、選択的に結合し、親和性を特徴づける解離定数（ＫＤ）は、約５×１０−２Ｍ以下、約１０−２Ｍ以下、約５×１０−３Ｍ以下、約１０−３Ｍ以下、約５×１０−４Ｍ以下、約１０−４Ｍ以下、約５×１０−５Ｍ以下、約１０−５Ｍ以下、約５×１０−６Ｍ以下、約１０−６Ｍ以下、約５×１０−７Ｍ以下、約１０−７Ｍ以下、約５×１０−８Ｍ以下、約１０−８Ｍ以下、約５×１０−９Ｍ以下、約１０−９Ｍ以下、約５×１０−１０Ｍ以下、約１０−１０Ｍ以下、約５×１０−１１Ｍ以下、約１０−１１Ｍ以下、約５×１０−１２Ｍ以下、約１０−１２Ｍ以下、約５×１０−１３Ｍ以下、約１０−１３Ｍ以下、約５×１０−１４Ｍ以下、約１０−１４Ｍ以下、約５×１０−１５Ｍ以下または約１０−１５Ｍ以下である。
【０３４３】
上述のいずれのポリヌクレオチドも、例えば、コードされたポリペプチド、本明細書に記載の抗体の定常領域、または本明細書に記載の他の異種ポリペプチドを分泌させるシグナルペプチドをコードする、さらなる核酸を含んでもよい。
【０３４４】
さらに、本明細書の他の部分に記載しているように、本発明は、上述の１つ以上のポリヌクレオチドを含むポリペプチドを含む組成物を含む。ある実施形態では、本発明は、第１のポリヌクレオチドと、第２のポリヌクレオチドとを含む組成物を含み、第１のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のＶＨポリペプチドをコードし、第２のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のＶＬポリペプチドをコードする。特に、ＶＨポリヌクレオチドおよびＶＬポリヌクレオチドを含むか、これらのポリヌクレオチドから本質的になるか、またはこれらのポリペプチドからなる組成物。ここで、ＶＨポリヌクレオチドおよびＶＬポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号４および６８、８および７３、１４および７８、２０および８３、２６および８８、３２および９３、３８および９８、４３および１０３、４８および１０８、５３および１０３、５８および１１３、ならびに６３および１１８からなる群から選択される参照ＶＬおよび参照ＶＬポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一なポリペプチドをコードする。または、それぞれ、配列番号３および６７、８および７２、１３および７７、１８および７７、１９および８２、２４および８２、２５および８７、３０および８７、３１および９２、３６および９２、３７および９７、４２および１０２、４７および１０７、５８および１０２、５７および１１２、ならびに６２および１１７からなる群から選択される参照ＶＬおよび参照ＶＬ核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一なＶＬポリヌクレオチドを含むか、これらのポリヌクレオチドから本質的になるか、またはこれらのポリペプチドからなる組成物。特定の実施形態では、上述のポリヌクレオチドがコードするＶＨおよびＶＬを含む抗体または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合するか、またはＩＧＦ−１Ｒに選択的に結合する。
【０３４５】
さらに、本発明は、他の部分で記載したような、本発明のポリヌクレオチドのフラグメントも含む。融合ポリヌクレオチド、Ｆａｂフラグメントおよび他の誘導体をコードするポリヌクレオチドも、本発明の想定内である。
【０３４６】
このポリヌクレオチドは、当該技術分野で既知の任意の方法で製造されてもよい。例えば、抗体のヌクレオチド配列が既知の場合、抗体をコードするポリヌクレオチドを、化学合成によって得たオリゴヌクレオチドからアセンブリしてもよく（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １７：２４２（１９９４）に記載）、簡単に説明すると、抗体をコードする配列の一部分を含有するオーバーラッピングオリゴヌクレオチドを合成する工程と、このオリゴヌクレオチドをアニーリングし、接続する工程と、接続したオリゴヌクレオチドをＰＣＲによって増幅させる工程とを含む。
【０３４７】
あるいは、ＩＧＦ−１Ｒ抗体をコードするポリヌクレオチド、または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体は、好適な供給源から得た核酸から作成してもよい。特定の抗体をコードする核酸を含有するクローンは入手できないが、抗体分子の配列は分かっている場合、この抗体をコードする核酸を化学合成してもよく、または好適な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリ、またはこのライブラリから作成したｃＤＮＡライブラリ、またはこの抗体または他のＩＧＦ−１Ｒ抗体を発現する任意の組織または細胞（例えば、抗体を発現するように選択されたハイブリドーマ細胞）から単離した核酸、好ましくは、ｐｏｌｙ  Ａ＋ＲＮＡ）から、上述の３’末端および５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを用いたＰＣＲ増幅によって得てもよいし、特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いてクローン化し、例えば上述の抗体または他のＩＧＦ−１Ｒ抗体をコードするＤＮＡライブラリから得たｃＤＮＡクローンを特定することによって得てもよい。ＰＣＲによって作成された、増幅された核酸を、当該技術分野で周知の任意の方法を用い、この核酸を複製可能なクローン化ベクターへクローン化してもよい。
【０３４８】
ＩＧＦ−１Ｒ抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列を決定したら、ヌクレオチド配列を操作する技術分野で周知の方法（例えば、組み換えＤＮＡ技術、部位特異的な変異、ＰＣＲなど）を用い、そのヌクレオチド配列を操作し（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）およびＡｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９８）に記載されている方法を参照（この内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる））、異なるアミノ酸配列を有する抗体を作成してもよい（例えば、アミノ酸の置換、欠失および／または挿入を行う）。
【０３４９】
ＩＧＦ−１Ｒ抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体をコードするポリヌクレオチドは、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドで構成されていてもよく、改変されたＲＮＡまたはＤＮＡであってもよく、改変されていないＲＮＡまたはＤＮＡであってもよい。例えば、ＩＧＦ−１Ｒ抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体をコードするポリヌクレオチドは、単鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ、単鎖領域と二本鎖領域との混合物であるＤＮＡ、単鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡ、単鎖領域と二本鎖領域との混合物であるＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡとを含むハイブリッド分子で構成されていてもよく、このハイブリッド分子は、単鎖であってもよく、さらに典型的には二本鎖であってもよく、単鎖領域と二本鎖領域との混合物であってもよい。それに加え、ＩＧＦ−１Ｒ抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体をコードするポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡを含むか、またはＲＮＡとＤＮＡとの両方を含む三本鎖領域で構成されていてもよい。ＩＧＦ−１Ｒ抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体をコードするポリヌクレオチドは、安定性または他の理由のために、１箇所以上の改変された塩基を含有していてもよく、または改変されたＤＮＡ骨格またはＲＮＡ骨格を含有していてもよい。「改変された」塩基としては、例えば、トリチル化塩基、およびイノシンのような一般的ではない塩基が挙げられる。ＤＮＡおよびＲＮＡに対し、種々の改変がなされ得る。このように、「ポリヌクレオチド」は、化学的に改変された形態、酵素によって改変された形態、または代謝によって改変された形態を包含する。
【０３５０】
免疫グロブリン（例えば、免疫グロブリンの重鎖部分または軽鎖部分）に由来するポリペプチドの非天然改変体をコードするポリヌクレオチドの単離物は、免疫グロブリンのヌクレオチド配列に対し、１個以上のヌクレオチドの置換、付加または欠失を導入し、１個以上の置換、付加または欠失が、コードされるタンパク質に導入されることによって作成してもよい。突然変異は、部位特異的な変異およびＰＣＲによる変異のような標準的な技術によって導入してもよい。好ましくは、アミノ酸の同類置換は、１つ以上の非必須アミノ酸残基で行われる。
【０３５１】
（Ｖ．ＩＧＦ−１Ｒ抗体のポリペプチド）
本発明は、ＩＧＦ−１Ｒ抗体を構成するポリペプチドの単離物、このポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにも関する。本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体は、ポリペプチド（例えば、免疫グロブリン分子に由来するＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗原結合部位をコードするアミノ酸配列）を含む。所定のタンパク質「に由来する」ポリペプチドまたはアミノ酸配列は、特定のアミノ酸配列を有するポリペプチドの起源が何であるかを示す。特定の場合、特定のポリペプチド原料または原料のアミノ酸配列に由来するポリペプチドまたはアミノ酸の配列は、原料の配列またはその一部分と本質的に同一のアミノ酸配列を有し、この部分は、少なくとも１０〜２０アミノ酸、少なくとも２０〜３０アミノ酸、または少なくとも３０〜５０アミノ酸で構成されているか、または当業者が、他の方法を用いて、原料の配列に由来することを同定可能であるかずのアミノ酸で構成される。
【０３５２】
ある実施形態では、本発明は、免疫グロブリンの重鎖可変領域（ＶＨ）を含むか、ＶＨから本質的になるか、またはＶＨからなるポリペプチドの単離物を提供する。ここで、重鎖可変領域の少なくとも１箇所のＶＨ−ＣＤＲ、または重鎖可変領域の少なくとも２箇所のＶＨ−ＣＤＲが、本明細書に開示したモノクローナルＩＧＦ−１Ｒ抗体に由来する重鎖のＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２またはＶＨ−ＣＤＲ３の参照アミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一である。あるいは、ＶＨのＶＨ−ＣＤＲ１領域、ＶＨ−ＣＤＲ２領域およびＶＨ−ＣＤＲ３領域は、本明細書に開示したモノクローナルＩＧＦ−１Ｒ抗体に由来する重鎖のＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２またはＶＨ−ＣＤＲ３の参照アミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一である。このように、この実施形態によれば、本発明の重鎖可変領域は、表５（前出）に示す群に関連するＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２およびＶＨ−ＣＤＲ３のポリペプチド配列を含む。表５には、Ｋａｂａｔシステムで定義されたＣＨ−ＣＤＲが示されているが、他のＣＤＲの定義、例えば、Ｃｈｏｔｈｉａシステムで定義されたＶＨ−ＣＤＲも、本発明に含まれる。特定の実施形態では、ＶＨを含む抗体または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合するか、または選択的に結合する。
【０３５３】
別の実施形態では、本発明は、免疫グロブリンの重鎖可変領域（ＶＨ）を含むか、ＶＨから本質的になるか、またはＶＨからなるポリペプチドの単離物を提供する。ここで、ＶＨ−ＣＤＲ１領域、ＶＨ−ＣＤＲ２領域およびＶＨ−ＣＤＲ３領域は、表５に示したＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２およびＶＨ−ＣＤＲ３と同一のポリペプチド配列を有する。特定の実施形態では、ＶＨを含む抗体または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合するか、または選択的に結合する。
【０３５４】
別の実施形態では、本発明は、免疫グロブリンの重鎖可変領域（ＶＨ）を含むか、ＶＨから本質的になるか、またはＶＨからなるポリペプチドの単離物を提供する。ここで、ＶＨ−ＣＤＲ１領域、ＶＨ−ＣＤＲ２領域およびＶＨ−ＣＤＲ３領域は、表５に示したＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２およびＶＨ−ＣＤＲ３と同一のポリペプチド配列を有するが、任意の１つのＶＨ−ＣＤＲで、１個、２個、３個、４個、５個または６個のアミノ酸が置換されている。さらに大きなＣＤＲ（例えば、ＶＨ−ＣＤＲ−３）では、ＶＨ−ＣＤＲを含むＶＨが、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合するか、または選択的に結合する限り、ＣＤＲ内でさらに置換されていてもよい。特定の実施形態では、アミノ酸置換は、同類置換である。特定の実施形態では、ＶＨを含む抗体または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合するか、または選択的に結合する。
【０３５５】
さらなる実施形態では、本発明は、配列番号４、９、１４、２０、２６、３２、３８、４３、４８、５３、５８および６３からなる群から選択されるＶＨポリペプチドの参照アミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一であるＶＨポリペプチドを含むか、またはこのＶＨポリペプチドから本質的になるか、またはこのＶＨポリペプチドからなるポリペプチドの単離物を含む。特定の実施形態では、ＶＨポリペプチドを含む抗体または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合するか、または選択的に結合する。
【０３５６】
別の態様では、本発明は、配列番号４、９、１４、２０、２６、３２、３８、４３、４８、５３、５８および６３からなる群から選択されるＶＨポリペプチドを含むか、またはこのＶＨポリペプチドから本質的になるか、またはこのＶＨポリペプチドからなるポリペプチドの単離物を含む。特定の実施形態では、ＶＨポリペプチドを含む抗体または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合するか、または選択的に結合する。
【０３５７】
特定の実施形態では、上述の１つ以上のＶＨポリペプチドを含むか、このＶＨポリペプチドから本質的になるか、またはこのＶＨポリペプチドからなる、抗体または抗原結合性を保持したフラグメントは、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１およびＭ１２−Ｇ０４からなる群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体フラグメント、またはハイブリドーマが産生するＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２およびＰ１Ｇ１０．２Ｂ８からなる群から選択される参照モノクローナル抗体と同じＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合するか、または選択的に結合するか、またはこのようなモノクローナル抗体または抗体フラグメントが、ＩＧＦ−１Ｒに結合するのを競合的に阻害する。  
【０３５８】
特定の実施形態では、上述の１つ以上のＶＨポリペプチドを含むか、このＶＨポリペプチドから本質的になるか、またはこのＶＨポリペプチドからなる、抗体または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントに特異的に結合するか、選択的に結合するか、またはＩＧＦ−１Ｒポリペプチド改変体に特異的に結合するか、選択的に結合し、親和性を特徴づける解離定数（ＫＤ）は、約５×１０−２Ｍ以下、約１０−２Ｍ以下、約５×１０−３Ｍ以下、約１０−３Ｍ以下、約５×１０−４Ｍ以下、約１０−４Ｍ以下、約５×１０−５Ｍ以下、約１０−５Ｍ以下、約５×１０−６Ｍ以下、約１０−６Ｍ以下、約５×１０−７Ｍ以下、約１０−７Ｍ以下、約５×１０−８Ｍ以下、約１０−８Ｍ以下、約５×１０−９Ｍ以下、約１０−９Ｍ以下、約５×１０−１０Ｍ以下、約１０−１０Ｍ以下、約５×１０−１１Ｍ以下、約１０−１１Ｍ以下、約５×１０−１２Ｍ以下、約１０−１２Ｍ以下、約５×１０−１３Ｍ以下、約１０−１３Ｍ以下、約５×１０−１４Ｍ以下、約１０−１４Ｍ以下、約５×１０−１５Ｍ以下または約１０−１５Ｍ以下である。
【０３５９】
別の実施形態では、本発明は、免疫グロブリンの軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むか、ＶＬから本質的になるか、またはＶＬからなるポリペプチドの単離物を提供する。ここで、軽鎖可変領域の少なくとも１箇所のＶＬ−ＣＤＲ、または重鎖可変領域の少なくとも２箇所のＶＬ−ＣＤＲが、本明細書に開示したモノクローナルＩＧＦ−１Ｒ抗体に由来する軽鎖のＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２またはＶＬ−ＣＤＲ３の参照アミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一である。あるいは、ＶＬのＶＬ−ＣＤＲ１領域、ＶＬ−ＣＤＲ２領域およびＶＬ−ＣＤＲ３領域は、本明細書に開示したモノクローナルＩＧＦ−１Ｒ抗体に由来する軽鎖のＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２またはＶＬ−ＣＤＲ３の参照アミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一である。このように、この実施形態によれば、本発明の軽鎖可変領域は、表６（前出）に示す群に関連するＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２およびＶＬ−ＣＤＲ３のポリペプチド配列を含む。表６には、Ｋａｂａｔシステムで定義されたＣＬ−ＣＤＲが示されているが、他のＣＤＲの定義、例えば、Ｃｈｏｔｈｉａシステムで定義されたＶＬ−ＣＤＲも、本発明に含まれる。特定の実施形態では、ＶＬポリペプチドを含む抗体または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合するか、または選択的に結合する。
【０３６０】
別の実施形態では、本発明は、免疫グロブリンの軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むか、ＶＬから本質的になるか、またはＶＬからなるポリペプチドの単離物を提供する。ここで、ＶＬ−ＣＤＲ１領域、ＶＬ−ＣＤＲ２領域およびＶＬ−ＣＤＲ３領域は、表６に示したＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２およびＶＬ−ＣＤＲ３と同一のポリペプチド配列を有する。特定の実施形態では、ＶＬポリペプチドを含む抗体または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合するか、または選択的に結合する。
【０３６１】
別の実施形態では、本発明は、免疫グロブリンの重鎖可変領域（ＶＬ）を含むか、ＶＬから本質的になるか、またはＶＬからなるポリペプチドの単離物を提供する。ここで、ＶＬ−ＣＤＲ１領域、ＶＬ−ＣＤＲ２領域およびＶＬ−ＣＤＲ３領域は、表６に示したＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２およびＶＬ−ＣＤＲ３と同一のポリペプチド配列を有するが、任意の１つのＶＬ−ＣＤＲで、１個、２個、３個、４個、５個または６個のアミノ酸が置換されている。さらに大きなＣＤＲでは、ＶＬ−ＣＤＲを含むＶＬが、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合するか、または選択的に結合する限り、ＣＤＲ内でさらに置換されていてもよい。特定の実施形態では、アミノ酸置換は、同類置換である。特定の実施形態では、ＶＬを含む抗体または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合するか、または選択的に結合する。
【０３６２】
さらなる実施形態では、本発明は、配列番号６８、７３、７８、８３、８８、９３、９８、１０３、１０８、１１３および１１８からなる群から選択されるＶＬポリペプチド配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一であるＶＬポリペプチドを含むか、またはこのＶＬポリペプチドら本質的になるか、またはこのＶＬポリペプチドからなるポリペプチドの単離物を含む。特定の実施形態では、ＶＬポリペプチドを含む抗体または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合するか、または選択的に結合する。
【０３６３】
別の態様では、本発明は、配列番号６８、７３、７８、８３、８８、９３、９８、１０３、１０８、１１３および１１８からなる群から選択されるＶＬポリペプチドを含むか、またはこのＶＬポリペプチドから本質的になるか、またはこのＶＬポリペプチドからなるポリペプチドの単離物を含む。特定の実施形態では、ＶＬポリペプチドを含む抗体または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合するか、または選択的に結合する。
【０３６４】
特定の実施形態では、上述の１つ以上のＶＬポリペプチドを含むか、このＶＬポリペプチドから本質的になるか、またはこのＶＬポリペプチドからなる、抗体または抗原結合性を保持したフラグメントは、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１およびＭ１２−Ｇ０４からなる群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体フラグメント、またはハイブリドーマが産生するＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２およびＰ１Ｇ１０．２Ｂ８からなる群から選択される参照モノクローナル抗体と同じＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合するか、または選択的に結合するか、またはこのようなモノクローナル抗体または抗体フラグメントが、ＩＧＦ−１Ｒに結合するのを競合的に阻害する。
【０３６５】
特定の実施形態では、上述の１つ以上のＶＬポリペプチドを含むか、このＶＬポリペプチドから本質的になるか、またはこのＶＬポリペプチドからなる、抗体または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントに特異的に結合するか、選択的に結合するか、またはＩＧＦ−１Ｒポリペプチド改変体に特異的に結合するか、選択的に結合するか、親和性を特徴づける解離定数（ＫＤ）は、約５×１０−２Ｍ以下、約１０−２Ｍ以下、約５×１０−３Ｍ以下、約１０−３Ｍ以下、約５×１０−４Ｍ以下、約１０−４Ｍ以下、約５×１０−５Ｍ以下、約１０−５Ｍ以下、約５×１０−６Ｍ以下、約１０−６Ｍ以下、約５×１０−７Ｍ以下、約１０−７Ｍ以下、約５×１０−８Ｍ以下、約１０−８Ｍ以下、約５×１０−９Ｍ以下、約１０−９Ｍ以下、約５×１０−１０Ｍ以下、約１０−１０Ｍ以下、約５×１０−１１Ｍ以下、約１０−１１Ｍ以下、約５×１０−１２Ｍ以下、約１０−１２Ｍ以下、約５×１０−１３Ｍ以下、約１０−１３Ｍ以下、約５×１０−１４Ｍ以下、約１０−１４Ｍ以下、約５×１０−１５Ｍ以下または約１０−１５Ｍ以下である。
【０３６６】
他の実施形態では、抗体または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＶＨポリペプチドおよびＶＬポリペプチドを含むか、またはＶＨポリペプチドおよびＶＬポリペプチドから本質的になるか、またはＶＨポリペプチドおよびＶＬポリペプチドからなる。ここで、ＶＨポリペプチドおよびＶＬポリペプチドは、それぞれ、配列番号４および６８、８および７３、１４および７８、２０および８３、２６および８８、３２および９３、３８および９８、４３および１０３、４８および１０８、５３および１０３、５８および１１３、ならびに６３および１１８からなる群から選択されるＶＬおよびＶＬポリペプチドの参照アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一である。特定の実施形態では、ＶＨポリペプチドおよびＶＬポリペプチドを含む抗体または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合するか、または選択的に結合する。
【０３６７】
上述のいかなるポリペプチドも、さらなるポリペプチドを含んでいてもよい（例えば、コードされるポリペプチドを分泌させるシグナルペプチド、本明細書に記載の抗体定常領域、または本明細書に記載の異種ポリペプチド）。さらに、本発明のポリペプチドは、本明細書の他の部分で記載したポリペプチドフラグメントを含む。さらに、本発明のポリペプチドは、本明細書に記載されるような、融合ポリペプチド、Ｆａｂフラグメントおよび他の誘導体を含む。
【０３６８】
さらに、本明細書の他の部分に詳細に記載しているように、本発明は、上述のポリペプチドを含む組成物を含む。
【０３６９】
本明細書に開示するＩＧＦ−１Ｒ抗体ポリペプチドを、天然の結合ポリペプチドに由来するアミノ酸配列とは異なるように改変してもよいこと当業者は理解するであろう。例えば、所定のタンパク質に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、原料の配列に類似していてもよく、例えば、特定の同一性を有していてもよく、例えば、原料の配列との同一性が６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％であってもよい。
【０３７０】
さらに、「非必須」アミノ酸領域で同類置換または変化が生じるように、ヌクレオチドまたはアミノ酸を置換、欠失または挿入してもよい。例えば、所定のタンパク質に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、１個以上の個々のアミノ酸の置換、挿入または欠失、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個またはそれ以上の個々のアミノ酸の置換、挿入または欠失がある以外は、原料の配列と同一であってもよい。所定のタンパク質に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、１個以上の個々のアミノ酸の置換、挿入または欠失、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個またはそれ以上の個々のアミノ酸の置換、挿入または欠失がある以外は、原料の配列と同一であってもよい。他の実施形態では、所定のタンパク質に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、２個以下、３個以下、４個以下、５個以下、６個以下、７個以下、８個以下、９個以下、１０個以下、１１個以下、１２個以下の個々のアミノ酸の置換、挿入または欠失がある以外は、原料の配列と同一であってもよい。特定の実施形態では、所定のタンパク質に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、原料の配列に対し、１〜５個、１〜１０個、１〜１５個、または１〜２０個の個々のアミノ酸の置換、挿入または欠失があってもよい。
【０３７１】
本発明の特定のＩＧＦ−１Ｒ抗体のポリペプチドは、ヒトアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含むか、このアミノ酸配列から本質的になるか、またはこのアミノ酸配列からなる。しかし、特定のＩＧＦ−１Ｒ抗体のポリペプチドは、別の哺乳動物種に由来する１個以上の連続したアミノ酸を含む。例えば、本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体は、霊長類の重鎖部分、ヒンジ部分、または抗原結合領域を含んでもよい。別の例では、１個以上のマウスに由来するアミノ酸が、非マウス抗体のポリペプチド（例えば、ＩＧＦ−１Ｒ抗体の抗原結合部位）中に存在してもよい。別の例では、ＩＧＦ−１Ｒ抗体の抗原結合部位は、完全にマウスである。特定の治療用途では、ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、またはその改変体または類似体は、抗体が投与される動物において免疫原性でないように設計されている。
【０３７２】
特定の実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒ抗体のポリペプチドは、通常は抗体とは結合しないアミノ酸配列または１つ以上の部分を含む。改変の例は、以下に詳細に説明される。例えば、本発明の単鎖ｆｖ抗体フラグメントは、可とう性リンカー配列を含んでいてもよく、または、機能的な部分（例えば、ＰＥＧ、薬物、毒素または標識）を付加するように改変されていてもよい。
【０３７３】
本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体のポリペプチドは、融合タンパク質を含むか、融合タンパク質から本質的になるか、または融合タンパク質からなってもよい。融合タンパク質は、例えば、少なくとも１つの標的結合部位を有する免疫グロブリンの抗原結合領域と、少なくとも１つの異種部分（すなわち、天然では接続していない部分）とを含むキメラ分子である。このアミノ酸配列は、通常は、合わさって融合ポリペプチドをもたらす別個のタンパク質に存在してもよく、または、このアミノ酸配列は、同じタンパク質に存在するが、融合ポリペプチドでは新しい配列で配置されていてもよい。融合タンパク質は、例えば、化学合成によって作成されてもよく、またはペプチド領域が所望の関係性でコードされるポリヌクレオチドを作成し、翻訳することによって作成されてもよい。
【０３７４】
用語「異種」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに適用される場合、そのポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、比較対象となる残りの部分とは別個の部分に由来するものであることを意味する。例えば、本明細書で使用するとき、ＩＧＦ−１Ｒ抗体または抗原結合性を保持したフラグメント、またはその改変体または類似体に融合する「異種ポリペプチド」は、同じ種類の非免疫グロブリン部分に由来するポリペプチドであるか、または異なる種類の免疫グロブリンまたは非免疫グロブリン部分に由来するポリペプチドである。
【０３７５】
「アミノ酸の同類置換」は、アミノ酸残基が、同様の側鎖を有するアミノ酸残基と交換したものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基は、当該技術分野で定義されている。この分類には、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、電荷をもたない極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分枝を有する側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。このように、免疫グロブリンポリペプチドの非必須アミノ酸残基は、好ましくは、同じ側鎖のグループの別のアミノ酸残基と交換される。別の実施形態では、アミノ酸の鎖は、側鎖のグループの順序および／または組成が異なる、構造的に類似した鎖と交換されていてもよい。
【０３７６】
あるいは、別の実施形態では、免疫グロブリンのコード配列全体または一部分に、無作為に変異が導入されてもよく（例えば、飽和突然変異誘発）、本明細書に開示した診断方法および治療方法で使用するために、得られた変異体を、ＩＧＦ−１Ｒ抗体に組み込んでもよく、所望の抗原（例えば、ＩＧＦ−１Ｒ）に結合する能力についてスクリーニングしてもよい。
【０３７７】
（ＶＩ．ＩＧＦ−１Ｒエピトープ）
（Ａ．結合を競合的に阻害するエピトープ）
特定の実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒ結合部分は、ＩＧＦ−１Ｒのエピトープに競合的に結合し、リガンド（例えば、ＩＧＦ１および／またはＩＧＦ２）がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを競合的にブロックし得る。このような結合特異性は、本明細書で「競合的に結合する部分」と呼ばれる。ある実施形態では、競合的に結合する部分は、ＩＧＦ−１（ＩＧＦ−２ではない）がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを競合的にブロックする。別の実施形態では、競合的に結合する部分は、ＩＧＦ−２（ＩＧＦ−１ではない）がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを競合的にブロックする。さらに別の実施形態では、競合的に結合する部分は、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の双方がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを競合的にブロックする。
【０３７８】
結合分子は、リガンド（例えば、ＩＧＦ）がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを、リガンドの濃度に依存する様式で、阻害するか、またはブロックする（例えば、立体的にブロックする）程度まで、エピトープに特異的に結合するか、または選択的に結合する場合、リガンドが結合するのを「競合的に阻害する」か、または「競合的にブロックする」と言われる。例えば、生化学的に測定する場合、所与の濃度の結合分子で競合的に阻害しようとしても、リガンドの濃度を高めることによって結合分子が負けてしまい、この場合には、リガンドが標的分子（例えば、ＩＧＦ−１Ｒ）に結合する方が、結合分子が標的分子に結合するのよりも勝ってしまうことがある。任意の特定の理論に束縛されないが、結合分子が結合するエピトープが、リガンドの結合部位にあるか、またはリガンドの結合部位に近い場合に、競合が起こり、リガンドの結合が抑えられると考えられる。競合による阻害は、当該技術分野で周知の方法、および／または、例えば、競合ＥＬＩＳＡアッセイを含む実施例に記載の方法で決定されてもよい。ある実施形態では、本発明の結合分子は、リガンドが所与のエピトープに結合するのを、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％阻害する。
【０３７９】
競合的なエピトープの例は、ＩＧＦ−１Ｒの残基２４８〜３０３にあるＣＲＲドメインの中央領域およびＣ末端領域を包含する領域にあるエピトープである。ＩＧＦ−１Ｒのこのエピトープは、Ｌ１ドメインのＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２リガンド結合部位に隣接している（三次元空間で）。このエピトープに競合的に結合する抗体の例は、Ｍ１４−Ｇ１１と呼ばれるヒト抗体である。Ｍ１４−Ｇ１１抗体は、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の両方がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを競合的にブロックすることが分かっている。Ｍ１４−Ｇ１１のＦａｂ抗体フラグメントを発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）に２００６年８月２９日に寄託されており、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７８５５が与えられている。
【０３８０】
したがって、特定の実施形態では、本発明の組成物で使用する結合部分は、Ｍ１４−Ｇ１１抗体と同じエピトープに競合的に結合し得る。例えば、結合部分は、Ｍ１４−Ｇ１１抗体を交差的にブロックする（すなわち、Ｍ１４−Ｇ１１抗体と競合的に結合する）抗体に由来していてもよく、またはＭ１４−Ｇ１１抗体の結合を他の方法で妨害する抗体に由来していてもよい。他の実施形態では、結合部分は、Ｍ１４−Ｇ１１抗体自体、またはそのフラグメント、改変体または誘導体を含んでいてもよい。他の実施形態では、結合部分は、抗原結合領域、可変領域（ＶＬまたはＶＨ）、またはこれらのＣＤＲを含んでいてもよい。例えば、競合的に結合する部分は、Ｍ１４−Ｇ１１抗体の６個のＣＤＲ（すなわちＣＤＲ１〜６）をすべて含んでいてもよく、またはＭ１４−Ｇ１１抗体に由来する６個のＣＤＲのうち、６個より少ないＣＤＲ（例えば、１個、２個、３個、４個、または５個のＣＤＲ）を含んでいてもよい。ある例示的な実施形態では、競合的な結合特異性は、Ｍ１４−Ｇ１１抗体に由来するＣＤＲ−Ｈ３を含む。
【０３８１】
ＩＧＦ−１Ｒの競合的なエピトープに結合する他の抗体を、当該技術分野で認識されている方法で特定してもよい。例えば、シグナル配列を含んでいない全長ＩＧＦ−１Ｒの種々のフラグメントまたは全長ＩＧＦ−１Ｒに対する抗体が製造されたら、抗体または抗原結合性を保持したフラグメントが、ＩＧＦ−１Ｒのどのアミノ酸またはエピトープに結合するかは、本明細書に記載のエピトープマッピングプロトコル、および当該技術分野で既知の方法で決定してもよい（例えば、「Ｃｈａｐｔｅｒ  １１  −  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｄ．Ａｕｓｕｂｅｌら、ｖ．２，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９６）に記載されているような、二重抗体−サンドイッチＥＬＩＳＡ）。さらなるエピトープマッピングプロトコルは、Ｍｏｒｒｉｓ，Ｇ．Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ：Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）に記載されており、この内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。エピトープマッピングは、市販の手段（すなわち、ＰｒｏｔｏＰＲＯＢＥ，Ｉｎｃ．（ウィスコンシン州ミルウォーキー））で行ってもよい。さらに、ＩＧＦ−１Ｒの競合的なエピトープに結合するように産生された抗体を、インスリン成長因子（例えば、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、またはＩＧＦ−１とＩＧＦ−２との両方）がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを競合的に阻害する能力についてスクリーニングすることができる。実施例に詳細に記載する方法にしたがって、上述の性質および他の性質について、抗体をスクリーニングすることができる。
【０３８２】
他の実施形態では、競合的にＩＧＦ−１Ｒに結合する部分は、ＩＧＦ−１Ｒの残基２４８〜３０３に広がる（境界部のアミノ酸を含む）配列の少なくとも約４〜５個のアミノ酸を含むか、またはこれらのアミノ酸から本質的になるか、またはこれらのアミノ酸からなる競合的なエピトープに特異的に結合するか、または選択的に結合する。例えば、ある実施形態では、競合的にＩＧＦ−１Ｒに結合する部分は、ＩＧＦ−１Ｒの残基２４８〜３０３に広がる配列の少なくとも約７個、少なくとも９個、または少なくとも約１５〜約３０個のアミノ酸を含む。所与のエピトープのアミノ酸は、連続的であっても線形であり得るが、必ずしもそうでなければならないわけではない。特定の実施形態では、競合的なエピトープは、細胞表面で発現するＩＧＦ−１ＲのＣＲＲドメインとＬ２ドメインとの境界に形成される非線形エピトープ、または例えば、ＩｇＧ  Ｆｃ領域に融合する可溶性フラグメントとしての非線形エピトープを含むか、これらの非線形エピトープから本質的になるか、またはこれらの非線形エピトープからなる。このように、特定の実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒの競合的なエピトープは、ＩＧＦ−１Ｒの残基２４８〜３０３に広がる配列の少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、約１５〜約３０個、または少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個または４５個の連続したアミノ酸または非連続アミノ酸を含むか、これらのアミノ酸から本質的になるか、またはこれらのアミノ酸からなる。非連続アミノ酸の場合、アミノ酸から、タンパク質が折りたたまれることによってエピトープを形成する。
【０３８３】
他の実施形態では、結合部分が結合する競合的なエピトープは、ＩＧＦ−１Ｒの連続したアミノ酸または非連続アミノ酸の少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、約１５〜約３０個、およびＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸番号２４８、２５０、２５４、２５７、２５９、２６０、２６３、２６５、３０１および３０３からなる群から選択されるエピトープのアミノ酸のうち、少なくとも１つから本質的になるか、またはこれらのアミノ酸からなる。
【０３８４】
他の実施形態では、本発明の結合部分が結合するアミノ酸は、ＩＧＦ−１Ｒの残基２４８〜３０３に広がるエピトープ中に存在する。ある実施形態では、本発明の結合部分が結合するエピトープは、変異してしまうと、抗体の親和性が失われるか、または大きく低下する（例えば、親和性において、１００分の1未満）、少なくとも１個のアミノ酸を含む（例えば、ＩＧＦ−１Ｒの残基２４８および／または２５０）。別の実施形態では、エピトープは、変異してしまうと、受容体に対する抗体の親和性の低下率が中程度である（野生型ＩＧＦ−１ＲのＫＤと比較して、１０倍≧ＫＤ≧１００倍）、ＩＧＦ−１Ｒの１個以上のアミノ酸を含んでもよい。さらに他の実施形態では、エピトープは、変異してしまうと、野生型ＩＧＦ−１Ｒと比較して、抗体の親和性が少し低下する（例えば、２．５≧ＫＤ≧１０ｎＭ）、ＩＧＦ−１Ｒの１個以上のアミノ酸を含んでもよい（例えば、ＩＧＦ−１Ｒの残基２５４、２５７、２５９、２６０、２６３、２６５、３０１または３０３のうち１つ以上）。好ましい実施形態では、本発明の結合部分に結合するエピトープは、ＩＧＦ−１Ｒの残基２４８、２５０および／または２５４のうち任意の１個、任意の２個、または３個すべてを含む。特に好ましい実施形態では、競合的に結合する部分は、３種類のアミノ酸２４８、２５０および２５４すべてを含むエピトープに結合し、これらのアミノ酸残基を同時に認識する。
【０３８５】
（Ｂ．結合をアロステリック効果によって阻害するエピトープ）
特定の実施形態では、結合部分は、アロステリックなエピトープに結合し、ＩＧＦリガンドがＩＧＦ−１Ｒに結合するのをアロステリック効果によって阻害してもよい。このような結合特異性は、本明細書で「アロステリックな結合部位」と呼ばれる。ある実施形態では、アロステリックな結合部位は、ＩＧＦ−１（ＩＧＦ−２ではない）がＩＧＦ−１Ｒに結合するのをアロステリック効果によってブロックする。別の実施形態では、アロステリックな結合部位は、ＩＧＦ−２（ＩＧＦ−１ではない）がＩＧＦ−１Ｒに結合するのをアロステリック効果によってブロックする。さらに別の実施形態では、アロステリックな結合部位は、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の双方がＩＧＦ−１Ｒに結合するのアロステリック効果によってブロックする。
【０３８６】
結合部位は、リガンド（例えば、ＩＧＦ１および／またはＩＧＦ２）が、ＩＧＦ−１Ｒに結合するのを、結合分子の濃度によらない形式で、阻害するか、またはブロックする程度まで、エピトープに特異的に結合するか、または選択的に結合する場合、リガンドが結合するのを「アロステリック効果によって阻害する」または「アロステリック効果によってブロックする」と言われる。例えば、リガンドの濃度が高くなっても、阻害力に影響を与えない（例えば、ＩＣ５０、つまり結合分子のリガンド最大阻害値の５０％まで阻害値が低下する濃度）。任意の特定の理論によって束縛されないが、アロステリック効果による阻害は、アロステリックなエピトープに結合分子が結合することによって、標的分子（例えば、ＩＧＦ−１Ｒ）に構造変化または力学的変化が誘発され、これによって標的に対するリガンドの親和性が低下する場合に起こると考えられる。アロステリック効果による阻害は、当該技術分野で周知の方法、および／または、例えば、競合ＥＬＩＳＡアッセイを含む実施例に記載の方法で決定することができる。ある実施形態では、結合分子は、リガンドが所与のエピトープに結合するのを、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％、アロステリック効果によって阻害し得る。
【０３８７】
（ｉ）ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の結合をアロステリック効果によってブロックするエピトープ
特定の例示的な実施形態では、本発明の結合部分は、ＩＧＦ−１ＲのＦｎＩＩＩ−１ドメイン全体に広がる領域およびＩＧＦ−１Ｒの残基４４０〜５８６を含む領域に位置する、アロステリックなエピトープに結合する結合部分を含む。この領域内にあるエピトープにアロステリックに結合する抗体の例は、Ｍ１３−Ｃ０６およびＭ１４−Ｃ０３と命名されたヒト抗体である。Ｍ１３−Ｃ０６抗体も、Ｍ１４−Ｃ０３抗体も、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の両方がＩＧＦ−１Ｒに結合するのをアロステリック効果によってブロックすることが実施例で示されている。Ｍ１３−Ｃ０６およびＭ１４−Ｃ０３の全長抗体を発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）に２００６年３月２８日に寄託され、それぞれＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４４４およびＰＴＡ−７４４５が与えられている。したがって、特定の実施形態では、本発明の組成物で使用する結合部分は、Ｍ１３−Ｃ０６抗体またはＭ１４−Ｃ０３抗体と同じアロステリックなエピトープに結合し得る。例えば、結合特異性は、Ｍ１３−Ｃ０６抗体またはＭ１４−Ｃ０３抗体を交差的にブロックする（これらの抗体と競合する）抗体によるものであってもよいし、またはＭ１３−Ｃ０６抗体またはＭ１４−Ｃ０３抗体の結合を他の方法で妨害する抗体によるものであってもよい。他の実施形態では、結合部分は、Ｍ１３−Ｃ０６抗体自体またはＭ１４−Ｃ０３抗体自体を含んでいてもよく、またはそのフラグメント、改変体または誘導体を含んでいてもよい。他の実施形態では、結合部分は、抗原結合領域、可変領域（ＶＬおよび／またはＶＨ）、またはこれらのＣＤＲを含んでいてもよい。例えば、アロステリックな結合部分は、Ｍ１３−Ｃ０６抗体またはＭ１４−Ｃ０３抗体の６個のＣＤＲ（すなわちＣＤＲ１〜６）をすべて含んでいてもよく、またはＭ１３−Ｃ０６抗体またはＭ１４−Ｃ０３抗体に由来する６個のうち、それより少ない数のＣＤＲ（例えば、１個、２個、３個、４個、または５個のＣＤＲ）を含んでいてもよい。ある例示的な実施形態では、アロステリックな結合特異性は、Ｍ１３−Ｃ０６抗体またはＭ１４−Ｃ０３抗体に由来するＣＤＲ−Ｈ３を含む。
【０３８８】
特定の実施形態では、アロステリックなＩＧＦ−１Ｒ結合部分は、ＩＧＦ−１Ｒの残基４４０〜５８６に広がる配列の少なくとも約４〜５個のアミノ酸、ＩＧＦ−１Ｒの残基４４０〜５８６に広がる配列の少なくとも７個、少なくとも９個、または少なくとも約１５〜約３０個のアミノ酸を含むか、またはこれらのアミノ酸から本質的になるか、またはこれらのアミノ酸からなるアロステリックなエピトープに特異的に結合するか、または選択的に結合する。所与のエピトープのアミノ酸は、連続的であっても線形であってもよいが、必ずしもそうでなければならないわけではない。
【０３８９】
特定の実施形態では、アロステリックなエピトープは、細胞表面で発現するＩＧＦ−１ＲのＬ２ドメインおよび／またはＦｎＩＩＩ−１ドメインに位置する非線形エピトープ、または例えば、ＩｇＧ  Ｆｃ領域に融合する可溶性フラグメントとしての非線形エピトープを含むか、これらの非線形エピトープから本質的になるか、またはこれらの非線形エピトープからなる。このように、特定の実施形態では、アロステリックなエピトープは、ＩＧＦ−１Ｒの残基４４０〜５８６に広がる配列の少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、約１５〜約３０個、または少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、またはそれ以上の連続したアミノ酸または非連続アミノ酸を含むか、これらのアミノ酸から本質的になるか、またはこれらのアミノ酸からなり、非連続アミノ酸は、タンパク質が折りたたまれることによってエピトープを形成する。
【０３９０】
別の実施形態では、結合部分が結合するアロステリックなエピトープは、ＩＧＦ−１Ｒの連続したアミノ酸または非連続アミノ酸の少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、約１５〜約３０個を含むか、これらのアミノ酸から本質的になるか、またはこれらのアミノ酸からなり、さらにＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸数４３７、４３８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６４、４６６、４６７、４６９、４７０、４７１、４７２、４７４、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８２、４８３、４８８、４９０、４９２、４９３、４９５、４９６、５０９、５１３、５１４、５１５、５３３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５５１、５６４、５６５、５６８、５７０、５７１、５７２、５７３、５７７、５７８、５７９、５８２、５８４、５８５、５８６および５８７からなる群から選択されるエピトープのアミノ酸のうち、少なくとも１つから本質的になるか、またはこれらのアミノ酸からなる。
【０３９１】
他の実施形態では、本発明の結合部分が結合するエピトープは、ＩＧＦ−１ＲのＦｎＩＩＩ−１表面にある、残基４６２〜４６４から半径１４Å以内にある残基から選択される、ＩＧＦ−１Ｒの少なくとも１個のアミノ酸を含む（例えば、残基Ｓ４３７、Ｅ４３８、Ｅ４６９、Ｎ４７０、Ｅ４７１、Ｌ４７２、Ｋ４７４、Ｓ４７６、Ｙ４７７、Ｉ４７８、Ｒ４７９、Ｒ４８８、Ｅ４９０、Ｙ４９２、Ｗ４９３、Ｐ４９５、Ｄ４９６、Ｅ５０９、Ｑ５１３、Ｎ５１４、Ｖ５１５、Ｋ５４４、Ｓ５４５、Ｑ５４６、Ｎ５４７、Ｈ５４８、Ｗ５５１、Ｒ５７７、Ｔ５７８、Ｙ５７９、Ｋ５８２、Ｄ５８４、Ｉ５８５、Ｉ５８６およびＹ５８７）。他の実施形態では、本発明の結合部分は、ＩＧＦ−１Ｒの残基４４０〜５８６に含まれる残基から選択され、この部分が変異してしまうと、抗体の親和性が失われるか、または大きく低下する（例えば、親和性において１００分の１未満）、少なくとも１個のアミノ酸に結合する（例えば、ＩＧＦ−１Ｒの残基４５９、４６０、４６１、４６２、４６４、４８０、４８２、４８３、４９０、５３３、５７０または５７１）。さらに他の実施形態では、エピトープは、この部分が変異してしまうと、野生型ＩＧＦ−１Ｒと比較して、受容体に対する抗体の親和性が少し低下する（２．５≧ＫＤ≧１０ｎＭ）、ＩＧＦ−１Ｒの１個以上のアミノ酸を含んでもよい（例えば、ＩＧＦ−１Ｒの残基４６６、４６７、４７８、５３３、５６４、５６５または５６８）。特に好ましい実施形態では、本発明の結合部位に結合するエピトープは、ＩＧＦ−１Ｒの残基４６１、４６２および４６４のうち任意の１個、任意の２個、または３個すべてを含む。
【０３９２】
（ｉｉ）ＩＧＦをアロステリック効果によってブロックするが、ＩＧＦ−２はブロックしないエピトープ
アロステリックなエピトープの別の例は、ＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２結合ポケットからわずかに離れて回転した受容体表面にある、ＩＧＦ−１ＲのＣＲＲドメインの表面に位置している。エピトープは、ＣＲＲドメインおよびＬ２ドメインの両方を含む大きな領域に広がっている可能性がある。ある実施形態では、アロステリックなエピトープは、ＩＧＦ−１Ｒの残基２４１〜３７９を含む領域内にある。特定の実施形態では、アロステリックなエピトープは、ＩＧＦ−１ＲのＣＲＲドメインの残基２４１〜２６６を含む領域内、またはＩＧＦ−１ＲのＬ２ドメインの残基３０１〜３０８および３２７〜３７９を含む領域内にある。エピトープにアロステリックに結合する抗体の例は、Ｐ１Ｅ２およびαＩＲ３と命名された抗体である。Ｐ１Ｅ２抗体も、αＩＲ３抗体も、ＩＧＦ−１がＩＧＦ−１Ｒに結合するのをアロステリック効果によってブロックする（ＩＧＦ−２はブロックしない）ことが実施例で示されている。ある実施形態では、Ｐ１Ｅ２抗体は、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２マウスハイブリドーマが発現するマウス抗体に由来するマウスのＶＨおよびＶＬを含み、ヒトＩｇＧ４Ｐａｌｇｙ／κ定常領域（例えば、Ｓ２２８ＰおよびＴ２９９Ａの置換を含むＩｇＧ４定常領域（ＥＵ付番による変換））に融合した、キメラ抗体である。全長マウス抗体Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２を発現するハイブリドーマ細胞株は、ＡＴＣＣに２００６年７月１１日に寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７７３０が与えられている。
【０３９３】
したがって、特定の実施形態では、本発明の組成物で使用する結合部分は、Ｐ１Ｅ２抗体またはαＩＲ３抗体と同じアロステリックなエピトープに結合し得る。例えば、結合特異性は、Ｐ１Ｅ２抗体またはαＩＲ３抗体の結合を交差的にブロックする（これらの抗体と競合する）抗体によるものであってもよいし、またはＰ１Ｅ２抗体またはαＩＲ３抗体の結合を他の方法で妨害する抗体によるものであってもよい。他の実施形態では、結合特異性は、Ｐ１Ｅ２抗体自体またはαＩＲ３抗体自体のいずれかを含んでいてもよく、またはそのフラグメント、改変体または誘導体を含んでいてもよい。他の実施形態では、結合部分は、抗原結合領域、可変領域（ＶＬおよび／またはＶＨ）、またはこれらのＣＤＲを含んでいてもよい。例えば、アロステリックな結合部分は、Ｐ１Ｅ２抗体またはαＩＲ３抗体の６個のＣＤＲをすべて含んでいてもよく、またはＰ１Ｅ２抗体またはαＩＲ３抗体に由来する６個より少ないＣＤＲ（例えば、１個、２個、３個、４個、または５個のＣＤＲ）を含んでいてもよい。ある例示的な実施形態では、アロステリックな結合特異性は、Ｐ１Ｅ２抗体またはαＩＲ３抗体に由来するＣＤＲ−Ｈ３を含む。
【０３９４】
ＩＧＦ−１Ｒのアロステリックなエピトープに結合する他の抗体は、当該技術分野で認識されている方法（例えば、上述の方法）で特定することがきる。さらに、ＩＧＦ−１Ｒのアロステリックなエピトープに結合する抗体が製造されたら、この抗体を、インスリン成長因子（例えば、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、またはＩＧＦ−１とＩＧＦ−２との両方）がＩＧＦ−１Ｒに結合するのをアロステリック効果によって阻害する能力についてスクリーニングしてもよい。実施例に詳細に記載する方法にしたがって、上述の性質および他の性質について、抗体をスクリーニングすることができる。
【０３９５】
さらに他の実施形態では、アロステリックにＩＧＦ−１Ｒに結合する部分は、ＩＧＦ−１Ｒの残基２４１〜２６６に広がる配列の約４〜５個のアミノ酸、ＩＧＦ−１Ｒの残基２４１〜２６６に広がる配列の少なくとも約７個、少なくとも９個、または少なくとも約１５〜約２５個のアミノ酸を含むか、またはこれらのアミノ酸から本質的になるか、またはこれらのアミノ酸からなるアロステリックなエピトープに特異的に結合するか、または選択的に結合する。エピトープのアミノ酸は、連続的であっても線形であってもよいが、必ずしもそうでなければならないわけではない。特定の実施形態では、アロステリックなエピトープは、細胞表面で発現するＩＧＦ−１ＲのＣＲＲ領域の細胞外表面に存在する非線形エピトープ、または例えば、ＩｇＧ  Ｆｃ領域に融合する可溶性フラグメントとしての非線形エピトープを含むか、これらの非線形エピトープから本質的になるか、またはこれらの非線形エピトープからなる。このように、特定の実施形態では、アロステリックなエピトープは、ＩＧＦ−１Ｒの残基２４１〜３７９に広がる配列の少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、約１５〜約２５個、または少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、または少なくとも２５個の連続したアミノ酸または非連続アミノ酸（例えば、残基２４１〜２６６または３０１〜３０８または３２７〜３７９）を含むか、これらのアミノ酸から本質的になるか、またはこれらのアミノ酸からなり、非連続アミノ酸は、タンパク質が折りたたまれることによってエピトープを形成する。
【０３９６】
他の実施形態では、結合部分が結合するアロステリックなエピトープは、ＩＧＦ−１Ｒの連続したアミノ酸または非連続アミノ酸の少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、約１５〜約３０個の連続したアミノ酸または非連続アミノ酸を含むか、これらのアミノ酸から本質的になるか、またはこれらのアミノ酸からなり、ここで、エピトープの少なくとも１個のアミノ酸（好ましくは、エピトープのすべてのアミノ酸）は、２４１、２４８、２５０、２５１、２５４、２５７、２６３、２６５、２６６、３０１、３０３、３０８、３２７および３７９からなる群から選択される。
【０３９７】
他の実施形態では、本発明の結合部分が認識するエピトープは、変異してしまうと、抗体の親和性が失われるか、または大きく低下する（例えば、親和性において１００分の１未満）、ＩＧＦ−１Ｒの２４１〜２６６の１個以上のアミノ酸を含む（例えば、ＩＧＦ−１Ｒの残基２４８、２５４または２６５の少なくとも１個またはすべて）。別の実施形態では、エピトープは、変異してしまうと、受容体に対する抗体の親和性の低下率が中程度である（野生型ＩＧＦ−１ＲのＫＤと比較して、１０倍≧ＫＤ≧１００倍）、ＩＧＦ−１Ｒの１個以上のアミノ酸を含んでもよい（例えば、ＩＧＦ−１Ｒの残基２５４および／または２５７）。さらに他の実施形態では、エピトープは、変異してしまうと、野生型ＩＧＦ−１Ｒと比較して、受容体に対する抗体の親和性が少し低下する（２．５≧ＫＤ≧１０ｎＭ）、ＩＧＦ−１Ｒの１個以上のアミノ酸を含んでもよい（例えば、ＩＧＦ−１Ｒの残基２４８、２６３、３０１、３０３、３０８、３２７または３７９のうち、１個以上）。特に好ましい実施形態では、エピトープは、ＩＧＦ−１Ｒの残基２４１、２４２、２５１、２５７、２６５および２６６のうち、任意の１個、任意の２個、任意の３個、任意の４個、任意の５個、または６個すべてを含む。
【０３９８】
（Ｃ．他のＩＧＦ−１Ｒエピトープ）
特定の実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒに結合する部分は、Ｐ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２およびＰ１Ｇ１０．２Ｂ８からなる群から選択される抗体と同じエピトープに結合し得る。本発明のある例示的な実施形態では、本発明の結合分子のＩＧＦ−１Ｒに結合する部分は、Ｐ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２およびＰ１Ｇ１０．２Ｂ８からなる群から選択される親抗体であるマウス抗体に由来する。Ｐ２Ａ７．３Ｅ１１抗体、２０Ｃ８．３Ｂ８抗体およびＰ１Ａ２．２Ｂ１１抗体を発現するハイブリドーマ細胞株は、ＡＴＣＣにそれぞれ２００６年３月２８日、２００６年６月１３日、および２００６年３月２８日に寄託され、それぞれＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４５８、ＰＴＡ−７７３２およびＰＴＡ−７４５７が与えられている。全長２０Ｄ８．２４Ｂ１１抗体および全長Ｐ１Ｇ１０．２Ｂ８抗体を発現するハイブリドーマ細胞株は、ＡＴＣＣにそれぞれ２００６年３月２８日および２００６年７月１１日に寄託され、それぞれＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４５６およびＰＴＡ−７７３１が与えられている。
【０３９９】
さらに他の実施形態では、本発明の組成物で使用する結合部分は、Ｐ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２およびＰ１Ｇ１０．２Ｂ８からなる群から選択される任意の抗体からなる群から選択される抗体を交差的にブロックする（すなわち、Ｍ１４−Ｇ１１抗体と競合的に結合する）抗体に由来していてもよく、またはＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２およびＰ１Ｇ１０．２Ｂ８からなる群から選択される抗体の結合を他の方法で妨害してもよい。他の実施形態では、結合部分は、Ｐ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２およびＰ１Ｇ１０．２Ｂ８からなる群から選択される抗体、またはそのフラグメント、改変体または誘導体を含んでいてもよい。他の実施形態では、結合部分は、抗原結合領域、可変領域（ＶＬおよび／またはＶＨ）、またはこれらのＣＤＲを含んでいてもよい。例えば、結合部分は、Ｐ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２およびＰ１Ｇ１０．２Ｂ８からなる群から選択される抗体の６個のＣＤＲ（すなわちＣＤＲ１〜６）をすべて含んでいてもよく、またはＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２およびＰ１Ｇ１０．２Ｂ８からなる群から選択される抗体に由来する６個より少ないＣＤＲ（例えば、１個、２個、３個、４個、または５個のＣＤＲ）を含んでいてもよい。ある例示的な実施形態では、結合特異性は、Ｐ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２およびＰ１Ｇ１０．２Ｂ８からなる群から選択される抗体に由来するＣＤＲ−Ｈ３を含む。
【０４００】
（ＶＩＩ．融合タンパク質および抗体の接合体）
本明細書で詳細に記載しているように、本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体は、異種ポリペプチドにＮ末端またはＣ末端で組み換えによって融合していてもよく、ポリペプチドまたは他の組成物に化学的に接合していてもよい（共有結合および非共有結合を含む）。例えば、ＩＧＦ−１Ｒに特異的なＩＧＦ−１Ｒ抗体は、検出アッセイで標識として有用な分子に組み換えによって融合していてもよく、または接合していてもよく、異種ポリペプチド、薬物、放射性核種または毒素のようなエフェクター分子に組み換えによって融合していてもよく、または接合していてもよい。例えば、ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ９２／０８４９５号；ＷＯ９１／１４４３８号；ＷＯ８９／１２６２４号；米国特許第５，３１４，９９５号；および欧州特許第３９６，３８７号を参照。
【０４０１】
本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体は、改変された誘導体（すなわち、抗体がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを妨害しないように、抗体に対して任意の種類の分子が共有結合することによって、改変された誘導体）を含む。例えば、限定されないが、抗体誘導体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、ホスフィル化（ｐｈｏｓｐｈｙｌａｔｉｏｎ）、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解による開裂、細胞リガンドまたは他のタンパク質への結合などによって改変された抗体を含む。任意の多くの化学修飾は、限定されないが、特異的な化学的開裂、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成などの既知の技術によって行われてもよい。さらに、誘導体は、１個以上の標準的ではないアミノ酸を含有してもよい。
【０４０２】
本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体は、ペプチド結合または改変されたペプチド結合で接続したアミノ酸で構成されていてもよく（すなわち、ペプチドアイソスター）、２０遺伝子でコードされたアミノ酸以外のアミノ酸を含有していてもよい。ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体は、天然のプロセスによって（例えば、翻訳後の処理）、または当該技術分野で周知の化学修飾技術によって、改変されていてもよい。このような改変は、基本的な書籍、さらに詳細なモノグラフ、およびに多くの研究論文に十分に記載されている。ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体のどの場所で改変を行ってもよい（ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノ酸末端またはカルボキシル末端、または炭水化物のような部分を含む）。ＩＧＦ−１Ｒに特異的な所与の抗体のいくつかの部位で、同じ部分の改変が同程度または種々の程度で行われてもよいことが理解されるであろう。さらに、ＩＧＦ−１Ｒに特異的な所与の抗体は、多くの改変部を含有していてもよい。ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体は、例えば、ユビキチン化の結果、分枝していてもよく、分枝しているか、または分枝していない環状であってもよい。ＩＧＦ−１Ｒに特異的な環状の抗体、ＩＧＦ−１Ｒに特異的な分枝した抗体、およびＩＧＦ−１Ｒに特異的な環状で分枝した抗体は、翻訳後の天然のプロセスで生じてもよく、または合成法によって製造してもよい。改変としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合による架橋形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解による開裂、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化（ｓｅｌｅｎｏｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化、トランスファー−ＲＮＡが介在する、タンパク質へのアミノ酸付加（例えば、アルギニル化（ａｒｇｉｎｙｌａｔｉｏｎ）およびユビキチン化が挙げられる。（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ２ｎｄ  Ｅｄ．、（１９９３）；Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐｇｓ．１−１２（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：６２６−６４６（１９９０）；Ｒａｔｔａｎら、Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３：４８−６２（１９９２）を参照）。
【０４０３】
さらに、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒ抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、またはその改変体または誘導体と、異種ポリペプチドとを含む融合タンパク質を提供する。抗体が融合する異種ポリペプチドは、機能的に有用な場合があり、またはＩＧＦ−１Ｒポリペプチドを発現する細胞に標的化するのに有用である。ある実施形態では、本発明の融合タンパク質は、本発明の抗体の任意の１つ以上のＶＨ領域のアミノ酸配列、または本発明の抗体の任意の１つ以上のＶＬ領域のアミノ酸配列、またはそのフラグメントまたは改変体を有するポリペプチドと、異種ポリペプチド配列とを含み、このポリペプチドと、異種ポリペプチド配列とから本質的になり、またはこのポリペプチドと、異種ポリペプチド配列とからなる。別の実施形態では、本明細書に開示した診断方法および治療方法に使用する融合タンパク質は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体またはそのフラグメント、改変体または誘導体のＶＨ−ＣＤＲのうち任意の１個、２個、３個のアミノ酸配列、またはＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体またはそのフラグメント、改変体または誘導体のＶＬ−ＣＤＲのうち任意の１個、２個、３個のアミノ酸配列を有するポリペプチドと、異種ポリペプチド配列とを含み、このポリペプチドと、異種ポリペプチド配列とから本質的になり、またはこのポリペプチドと、異種ポリペプチド配列とからなる。ある実施形態では、融合タンパク質は、本発明のＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体、またはそのフラグメント、改変体または誘導体のＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するポリペプチドと、異種ポリペプチド配列とを含み、融合タンパク質は、ＩＧＦ−１Ｒの少なくとも１個のエピトープに特異的に結合する。別の実施形態では、融合タンパク質は、本発明のＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体、またはそのフラグメント、改変体または誘導体の少なくとも１つのＶＨ領域のアミノ酸配列、および本発明のＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体、またはそのフラグメント、改変体または誘導体の少なくとも１つのＶＬ領域のアミノ酸配列を有するポリペプチドと、異種ポリペプチド配列とを含む。好ましくは、上述の融合タンパク質のＶＨ領域およびＶＬ領域は、ＩＧＦ−１Ｒの少なくとも１個のエピトープに特異的に結合する、１種類の起源から得られた抗体（またはｓｃＦｖフラグメントまたはＦａｂフラグメント）に対応する。さらに別の実施形態では、本明細書に開示の診断方法および治療方法で使用する融合タンパク質は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体、またはそのフラグメントまたは改変体のＣＨ  ＣＤＲの任意の１個、２個、３個またはそれ以上のアミノ酸配列、およびＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体、またはそのフラグメントまたは改変体のＶＬ  ＣＤＲの任意の１個、２個、３個またはそれ以上のアミノ酸配列を有するポリペプチドと、異種ポリペプチド配列とを含む。好ましくは、ＶＨ−ＣＤＲまたはＶＬ−ＣＤＲのうち、２個、３個、４個、５個、６個またはそれ以上は、本発明の１種類の起源から得られた抗体（またはｓｃＦｖフラグメントまたはＦａｂフラグメント）に対応する。これらの融合タンパク質をコードする核酸分子も、本発明に包含される。
【０４０４】
文献に報告されている融合タンパク質の例としては、Ｔ細胞受容体の融合物（Ｇａｓｃｏｉｇｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：２９３６−２９４０（１９８７））；ＣＤ４（Ｃａｐｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３７：５２５−５３１（１９８９）；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３９：６８−７０（１９８９）；Ｚｅｔｔｍｅｉｓｓｌら、ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．ＵＳＡ  ９：３４７−３５３（１９９０）；およびＢｙｒｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：６６７−６７０（１９９０））；Ｌ−セレクチンの融合物（ホーミング受容体）（Ｗａｔｓｏｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１０：２２２１−２２２９（１９９０）；およびＷａｔｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：１６４−１６７（１９９１））；ＣＤ４４の融合物（Ａｒｕｆｆｏら、Ｃｅｌｌ  ６１：１３０３−１３１３（１９９０））；ＣＤ２８およびＢ７の融合物（Ｌｉｎｓｌｅｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：７２１−７３０（１９９１））；ＣＴＬＡ−４の融合物（Ｌｉｎｓｌｅｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：５６１−５６９（１９９１））；ＣＤ２２の融合物（Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃら、Ｃｅｌｌ  ６６：１１３３−１１４４（１９９１））；ＴＮＦ受容体の融合物（Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１０５３５−１０５３９（１９９１）；Ｌｅｓｓｌａｕｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：２８８３−２８８６（１９９１）；およびＰｅｐｐｅｌら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：１４８３−１４８９（１９９１））；およびＩｇＥ受容体の融合物（Ｒｉｄｇｗａｙ  ａｎｄ  Ｇｏｒｍａｎ、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．１１５、Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｏ．１４４８（１９９１））が挙げられる。
【０４０５】
本明細書の他の箇所で記載したように、本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体を、ポリペプチドのインビボでの半減期を延ばすため、または当該技術分野で既知の免疫アッセイで使用するために、異種ポリペプチドに融合してもよい。例えば、ある実施形態では、本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体にＰＥＧを融合し、インビボでの半減期を延ばすことができる（Ｌｅｏｎｇ，Ｓ．Ｒ．ら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  １６：１０６（２００１）；Ｃｈａｐｍａｎら、「ＰＥＧｙｌａｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｕｅｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｔｈｅｒａｐｙ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ」、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５４：５３１（２００２年６月）；またはＷｅｉｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ３０：５１２（２００２））。
【０４０６】
さらに、本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体を、精製または検出を容易にするために、マーカー配列（例えば、ペプチド）に融合してもよい。好ましい実施形態では、マーカーアミノ酸配列は、ヘキサヒスチジンペプチドである（例えば、特に、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．、９２５９  Ｅｔｏｎ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，Ｃａｌｉｆ．，９１３１１）で提供されるタグ、あるいはそれ以外であり、その多くは市販されている）。Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８２１−８２４（１９８９）に記載されているように、例えば、ヘキサヒスチジンによって、融合タンパク質を簡便に精製することができる。精製に有用な他のペプチドタグとしては、限定されないが、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープに対応する「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ  ３７：７６７（１９８４））および「フラッグ」タグが挙げられる。
【０４０７】
融合タンパク質は、当該技術分野で周知の方法を用いて調製することができる（例えば、米国特許第５，１１６，９６４号および第５，２２５，５３８号を参照）。融合を生じさせる正確な位置は、その融合タンパク質の分泌特性または結合特性を最適化するために実験的に選択されてもよい。次いで、融合タンパク質をコードするＤＮＡを宿主細胞にトランスフェクトし、発現させる。
【０４０８】
本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体を、接合していない形態で使用してもよく、または、例えば、分子の治療性能を高めるため、標的の検出を促進するため、または患者の撮像または治療のために、種々の分子のうち少なくとも１つと接合させてもよい。本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体を、精製前または精製後に（精製を行う場合）標識するか、または接合させることができる。
【０４０９】
特に、本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体を、治療薬、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生体応答修飾物質、医薬品またはＰＥＧに接合させてもよい。
【０４１０】
当業者は、この接合物を、接合するために選択した薬剤に依存する種々の技術でアセンブリしてもよいことを理解するであろう。例えば、ビオチンとの接合物は、例えば、結合ポリペプチドと、ビオチンの活性化エステル（例えば、ビオチン  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）とを反応させることによって調製される。同様に、蛍光マーカーとの接合物は、カップリング剤（例えば、本明細書に列挙したもの）存在下で調製されてもよく、またはイソシアネート（好ましくは、フルオレセイン−イソチオシアネート）との反応によって調製されてもよい。本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体の接合物も、類似の様式で調製される。
【０４１１】
さらに、本発明は、本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体が、診断薬または治療薬に接合したものを含む。ＩＧＦ−１Ｒ抗体を、例えば、所与の治療法および／または予防法の効力を判断するための臨床的な試験手順の一部分として、例えば、神経疾患の発症または進行を監視するための診断に使用することができる。ＩＧＦ−１Ｒ抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体を、検出可能な物質にカップリングさせることによって、検出しやすくすることができる。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、種々の陽電子発生トモグラフィーを用いて陽電子を発生する金属、および放射性ではない常磁性金属イオンが挙げられる。例えば、本発明の診断薬として使用する抗体に接合可能な金属イオンについては、米国特許第４，７４１，９００号を参照。好適な酵素の例としては、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ、好適な補欠分子族の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ、好適な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられ、発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ、生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられ、好適な放射性物質としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎまたは９９Ｔｃが挙げられる。
【０４１２】
ＩＧＦ−１Ｒ抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体を、化学発光性化合物にカップリングすることによって、検出可能になるように標識してもよい。化学発光性タグをつけたＩＧＦ−１Ｒ抗体の存在は、一連の化学反応中に生じる発光の存在を検出することによって決定される。特に有用な化学発光標識となる化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、テロマティックアクリジニウムエステル（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ  ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ  ｅｓｔｅｒ）、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルである。
【０４１３】
ＩＧＦ−１Ｒ抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体を検出可能になるように標識する１つの方法は、これらの物質を酵素に結合し、結合した生成物に酵素免疫測定（ＥＩＡ）を用いる方法である（Ｖｏｌｌｅｒ，Ａ．、「Ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）」Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｈｏｒｉｚｏｎｓ  ２：１−７（１９７８））；Ｖｏｌｌｅｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．３１：５０７−５２０（１９７８）；Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｅ．、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：４８２−５２３（１９８１）；Ｍａｇｇｉｏ，Ｅ．（編）、Ｅｎｚｙｍｅ  免疫アッセイ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（１９８０）；Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｅ．ら（編）、Ｅｎｚｙｍｅ  免疫アッセイ、Ｋｇａｋｕ  Ｓｈｏｉｎ、Ｔｏｋｙｏ（１９８１））。ＩＧＦ−１Ｒ抗体に結合する酵素は、例えば、分光光度法、蛍光分析法または視覚的な方法によって検出可能な化学部分を生成するような様式で、適切な基質（好ましくは、発色性基質）と反応する。抗体を検出可能になるように標識するのに使用可能な酵素としては、限定されないが、リンゴ酸脱水素酵素、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、δ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロホスフェート、デヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。さらに、酵素に発色性の基質を用いた比色分析によって検出してもよい。基質の酵素反応度と、同様に調製した標準物質の酵素反応度とを視覚的に比較して、検出してもよい。
【０４１４】
種々の他の免疫アッセイを使用して抗体を検出することもできる。例えば、ＩＧＦ−１Ｒ抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体を放射性物質で標識することにより、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を通して抗体を検出することが可能となる（例えば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｂ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ、Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｔｒａｉｎｉｎｇ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｏｎ  Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｔｈｅ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ（１９８６年３月）、この内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる）。放射性同位体は、限定されないが、γカウンタ、シンチレーションカウンタ、またはオートラジオグラフィーを含む手段で検出することができる。
【０４１５】
ＩＧＦ−１Ｒ抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体を、蛍光を発光する金属（例えば、１５２Ｅｕまたは他のランタノイド種）で検出可能になるように標識してもよい。ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属キレート化基を用い、上述の金属を抗体に接続してもよい。
【０４１６】
種々の部分をＩＧＦ−１Ｒ抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体に接合する技術は、周知であり、例えば、Ａｒｎｏｎら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編）、ｐｐ．２４３−５６（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（第２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編）、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、ｐｐ．６２３−５３（１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）、ｐｐ．４７５−５０６（１９８５）；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌｄｗｉｎら（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  ｐｐ．３０３−１６（１９８５）、およびＴｈｏｒｐｅら、「Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−５８（１９８２）を参照。
【０４１７】
特に、本明細書に開示する診断方法および治療方法で使用する結合分子（例えば、結合ポリペプチド、例えば、ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体または免疫特異的なフラグメント）は、細胞毒素（例えば、放射性同位体、細胞毒性の薬物、または毒素）治療薬、細胞増殖抑制剤、生体毒素、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生体応答修飾物質、医薬品、免疫学的に活性なリガンド（例えば、リンホカイン、または得られた分子が、新生物性細胞およびエフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）の両方に結合する他の抗体）、またはＰＥＧに接合させてもよい。別の実施形態では、本明細書に開示する診断方法および治療方法で使用する結合分子（例えば、結合ポリペプチド、例えば、ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体または免疫特異的なフラグメント）は、腫瘍の血管新生を減らす分子に接合させてもよい。他の実施形態では、本明細書で開示した組成物は、薬物またはプロドラッグに結合した、結合分子（例えば、結合ポリペプチド、例えば、ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体または免疫特異的なフラグメント）を含んでいてもよい。本発明のさらに他の実施形態は、特定の生物毒素（例えば、リシン、ゲロニン、緑膿菌外毒素、またはジフテリア毒素）またはその細胞毒性を保持したフラグメントに接合した、結合分子（例えば、結合ポリペプチド、例えば、ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体または免疫特異的なフラグメント）の使用を含む。どの接合していない結合分子または接合した結合分子を使用するかの選択は、癌の種類およびステージ、補助治療（例えば、化学療法または外部放射線）の使用、および患者の状態によって変わる。当業者は、本明細書の教示から、このような選択を簡単に行うことができることを理解するであろう。
【０４１８】
以前の研究で、同位体標識された抗−腫瘍抗体を使用し、動物モデル（ある場合には、ヒト）の固体腫瘍およびリンパ腫／白血病の細胞を首尾よく破壊できたことを理解するであろう。放射性同位体の例としては、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、１０５Ｒｈ、１５３Ｓｍ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、１６６Ｈｏ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅおよび１８８Ｒｅが挙げられる。放射性核種は、電離放射線を発生し、核ＤＮＡの鎖を複数箇所破壊し、細胞を死に至らしめることによって作用する。治療用接合体で使用する同位体は、典型的には、経路長の短い高エネルギーのα粒子またはβ粒子を発生する。このような放射性核種は、接合体が接続しているか、または入り込んでいる細胞に近い位置にある細胞（例えば、新生物性細胞）を死滅させる。放射性核種は、局在化していない細胞にはほとんど影響を与えないか、全く影響を与えない。放射性核種は、本質的に、非免疫原性である。
【０４１９】
放射性標識した接合体を本発明と組み合わせて使用する場合、結合分子（例えば、結合ポリペプチド、例えば、ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体または免疫特異的なフラグメント）は、直接標識されていてもよく（例えば、ヨウ素化によって）、またはキレート化剤を用いて間接的に標識されていてもよい。本明細書で使用するとき、「間接的に標識する」および「間接的な標識アプローチ」という句は、両方とも、キレート化剤が、結合分子に接続しており、少なくとも１つの放射性核種が、キレート化剤と会合していることを意味する。このようなキレート化剤は、ポリペプチドと放射性同位体の両方に結合するため、典型的には、二官能キレート化剤と呼ばれる。特に好ましいキレート化剤は、１−イソチオシクマートベンジル−３−メチルジオテレントリアミン五酢酸（１−ｉｓｏｔｈｉｏｃｙｃｍａｔｏｂｅｎｚｙｌ−３−ｍｅｔｈｙｌ  ｄｉｏｔｈｅｌｅｎｅ  ｔｒｉａｍｉｎｅｐｅｎｔａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）（「ＭＸ−ＤＴＰＡ」）誘導体およびシクロヘキシルジエチレントリアミン五酢酸（「ＣＨＸ−ＤＴＰＡ」）誘導体である。他のキレート化剤は、Ｐ−ＤＯＴＡ誘導体およびＥＤＴＡ誘導体を含む。間接的に標識するのに特に好ましい放射性核種としては、１１１Ｉｎおよび９０Ｙが挙げられる。
【０４２０】
本明細書で使用するとき、「直接標識する」および「直接標識アプローチ」という句は、両方とも、放射性核種が、ポリペプチドに直接共有結合していることを意味する（典型的には、アミノ酸残基を介して）。さらに特定的には、この結合技術は、ランダム標識および部位特異的な標識を含む。部位特異的な標識の場合、標識は、ポリペプチドの特定の場所（例えば、接合体のＦｃ部分にのみ存在する、Ｎに結合した糖残基）に結合する。さらに、種々の直接的な標識技術およびプロトコルが、本発明に適合する。例えば、テクネチウム−９９で標識したポリペプチドは、リガンド交換プロセスによって調製してもよく、過テクネチウム酸塩（ｐｅｒｔｅｃｈｎａｔｅ）（ＴｃＯ４−）をスズイオン溶液で還元し、還元したテクネチウムをＳｅｐｈａｄｅｘカラムでキレート化し、結合ポリペプチドをこのカラムに入れることによって調製してもよく、またはバッチ標識技術（例えば、過テクネチウム酸塩と、ＳｎＣｌ２のような還元剤と、ナトリウム−カリウムフタル酸溶液のようなバッファ溶液と、抗体とをインキュベートすること）によって調製してもよい。いかなる場合でも、抗体を直接的に標識するのに好ましい放射性核種は、当該技術分野で周知であり、直接的に標識するのに特に好ましい放射性核種は、チロシン残基によって共有結合した１３１Ｉである。本明細書に開示する診断方法および治療方法で使用する結合分子（例えば、結合ポリペプチド、例えば、ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体または免疫特異的なフラグメント）を、例えば、放射性ヨウ化ナトリウムまたはヨウ化カリウム、および化学酸化剤（例えば、次亜塩素酸ナトリウム、クロラミンＴなど）または酵素による酸化剤（例えば、ラクトペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼおよびグルコース）を用いて誘導してもよい。
【０４２１】
キレート化剤およびキレート化接合物に関する特許は、当該技術分野で既知である。例えば、Ｇａｎｓｏｗの米国特許第４，８３１，１７５号は、多置換ジエチレントリアミン五酢酸キレート化剤およびこのキレート化剤を含むタンパク質接合物、およびこれらの調製方法に関するものである。Ｇａｎｓｏｗの米国特許第５，０９９，０６９号、第５，２４６，６９２号、第５，２８６，８５０号、第５，４３４，２８７号および第５，１２４，４７１号も、多置換ＤＴＰＡキレート化剤に関するものである。これらの特許は、参照することにより本明細書に組み込まれる。適する金属キレート化剤の他の例は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＰＴＡ）、１，４，８，１１−テトラアザテトラデカン、１，４，８，１１−テトラアザテトラデカン−１，４，８，１１−四酢酸、１−オキサ−４，７，１２，１５−テトラアザヘプタデカン−４，７，１２，１５−四酢酸などである。シクロヘキシル−ＤＴＰＡまたはＣＨＸ−ＤＴＰＡは、特に好ましく、以下で詳細に例示している。他の適合するキレート剤は、まだ発見されていないものも含め、当業者にとっては簡単に分かるものであり、明らかに本発明の範囲に含まれる。
【０４２２】
米国特許第６，６８２，１３４号、第６，３９９，０６１号、および第５，８４３，４３９号（この内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる）のキレート化を促進するのに使用される、特定の二官能キレート化剤を含む適合するキレート化剤が、好ましくは、三価金属に高い親和性を示し、腫瘍／非腫瘍比率が高く、骨への吸収量が低く、標的部位（例えば、Ｂ細胞リンパ腫の腫瘍部位）での放射性核種のインビボでの保持量が高ように選択される。しかし、これらの特性すべてを有しているか、または有していない他の二官能キレート化剤が、当該技術分野で既知であり、腫瘍治療に有益な場合がある。
【０４２３】
本明細書の教示によって、診断および治療のために、結合分子を異なる放射性標識に接合してもよいことも理解されるであろう。この目的のために、上述の米国特許第６，６８２，１３４号、第６，３９９，０６１号および第５，８４３，４３９号は、治療用抗体を投与する前に、腫瘍を「造影」するための、放射性標識した治療用接合物を開示している。「Ｉｎ２Ｂ８」接合体は、ヒトＣＤ２０抗原に特異的なマウスモノクローナル抗体２Ｂ８を含み、この抗原が、二官能キレート化剤（すなわち、ＭＸ−ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸））で１１１Ｉｎに接続しており、ＭＸ−ＤＴＰＡは、１−イソチオシアネートベンジル−３−メチル−ＤＴＰＡおよび１−メチル−３−イソチオシアネートベンジル−ＤＴＰＡの１：１混合物を含む。１１１Ｉｎは、検出可能な毒性がない状態で、約１〜約１０ｍＣｉを安全に投与できるため、診断に用いる放射性核種として特に好ましい。撮像データは、一般的に、その後の９０Ｙ標識した抗体の分布を予測するデータである。ほとんどの撮像試験では、５ｍＣｉの１１１Ｉｎで標識した抗体を使用する。この線量は、安全であり、これより低い線量の場合よりも撮像効率が高まり、抗体を投与してから３〜６日後に最適な画像が得られるからである。例えば、Ｍｕｒｒａｙら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２８：２５−３３（１９８７）およびＣａｒｒａｇｕｉｌｌｏら、Ｊ．Ｎｕｃ．Ｍｅｄ．２６：６７（１９８５）。
【０４２４】
上述のように、種々の放射性核種が、本発明に適用可能であり、種々の環境下でどの放射性核種が最も適しているかを、当業者は容易に決定することができる。例えば、１３１Ｉは、標的に対する免疫治療に使用する、周知の放射性核種である。しかし、１３１Ｉを臨床で使用する有用性は、体内の半減期が８日間であること、血中および腫瘍部位の両方でヨード化抗体が脱ハロゲン化すること、腫瘍内部で局所的に沈着することによって最適状態からはずれ得る発光特性（例えば、大きなγ成分）を含む、いくつかの因子によって制限されてしまっている。優れたキレート化剤が出現し、金属キレート化基をタンパク質に接続する機会が増え、１１１Ｉｎおよび９０Ｙのような他の放射性核種を利用する機会も増えた。９０Ｙには、放射性免疫治療に適用する場合、９０Ｙの半減期が６４時間であり、例えば、１３１Ｉとは異なり、腫瘍を抗体に蓄積させるのに十分なほど長いこと、９０Ｙは、高エネルギーのβ線のみを発生し、崩壊時にγ線を発生しないこと、組織での範囲が、１００〜１，０００個分の細胞の直径分であることといった、いくつかの利点がある。さらに、透過性の放射線が少ないため、外来患者に９０Ｙ標識した抗体を投与することができる。さらに、細胞を死滅させるのに、標識した抗体の内在化を必要とせず、電離放射線を局所的に照射し、標的分子が存在しない隣接する腫瘍細胞も死滅させる。
【０４２５】
結合分子（例えば、結合ポリペプチド、例えば、ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体または免疫特異的なフラグメント）に接合するのに好ましいさらなる薬剤は、細胞毒性薬であり、特に、癌治療で使用される細胞毒性薬である。本明細書で使用するとき、「細胞毒または細胞毒性薬」は、細胞の成長および増殖に悪影響を与え、細胞または悪性細胞の量を減らすか、これらの細胞を阻害し、またはこれらの細胞を破壊する任意の薬剤である。細胞毒の例としては、限定されないが、放射性核種、生物毒素、酵素によって活性化する毒素、細胞増殖抑制薬または細胞毒性薬、プロドラッグ、免疫学的に活性なリガンドおよび生体応答修飾物質（例えばサイトカイン）が挙げられる。免疫反応性の細胞または悪性細胞の成長を遅らせるか、または弱める任意の細胞毒は、本発明の範囲に含まれる。
【０４２６】
細胞毒の例としては、一般的に、細胞増殖抑制剤、アルキル化剤、代謝拮抗物質、抗増殖剤、チューブリン結合剤、ホルモンおよびホルモンアンタゴニストなどが挙げられる。本発明に適合する細胞増殖抑制剤の例としては、アルキル化基質（例えば、メクロレタミン、トリエチレンホスホラミド、シクロホスファミド、イホスファミド、クロラムブシル、ブスルファン、メルファランまたはトリアジコン）が挙げられ、さらに、ニトロソウレア化合物（例えば、カルムスチン、ロムスチンまたはセムスチン）が挙げられる。他の好ましい細胞毒性薬としては、例えば、マイタンシノイド系薬物が挙げられる。他の好ましい細胞毒性薬としては、例えば、アントラサイクリン系薬物、ビンカ薬物、マイトマイシン、ブレオマイシン、細胞毒性ヌクレオシド、プテリジン系薬物、ジイネンおよびポドフィロトキシンが挙げられる。細胞毒性薬のうち、特に有用なものとしては、例えば、アドリアマイシン、カルミノマイシン、ダウノルビシン（ダウノマイシン）、ドキソルビシン、アミノプテリン、メトトレキサート、メトプテリン、ミトラマイシン、ストレプトニグリン、ジクロロメトトレキサート、マイトマイシンＣ、アクチノマイシン−Ｄ、ポルフィロマイシン、５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、フトラフール、６−メルカプトプリン、シタラビン、シトシンアラビノシド、ポドフィロトキシン、またはポドフィロトキシン誘導体（例えば、エトポシドまたはエトポシドホスフェート）、メルファラン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ロイロシジン、ビンデシン、ロイロシンなどが挙げられる。本明細書の教示に適合するさらに他の細胞毒は、タキソール、タキサン、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、テノポシド、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ  ａｎｔｈｒａｃｉｎ  ｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピューロマイシン、およびこれらの類似体またはホモログが挙げられる。コルチコステロイド（例えばプレドニゾン）、プロゲスチン（例えば、ヒドロキシプロゲステロンまたはメドロプロゲステロン）、エストロゲン（例えば、ジエチルスチルベストロール）、抗エストロゲン剤（例えば、タモキシフェン）、アンドロゲン（例えばテストステロン）、およびアロマターゼ阻害剤（例えば、アミノグルテチミド）のようなホルモンおよびホルモンアンタゴニストも、本明細書の教示に適合している。当業者は、本発明の接合物を調製するのに便利な反応を起こさせるために、所望の化合物になるように化学的に改変することができる。
【０４２７】
特に好ましい細胞毒の一例は、カリケアマイシン、エスペラミシンまたはジネミシンを含む、抗腫瘍抗生物質であるエンジイン系誘導体である。これらの毒素は、特に強力であり、核ＤＮＡを開裂させ、細胞死を導く作用がある。インビボで開裂し、多くの不活性で免疫原性のポリペプチドフラグメントを与えるタンパク質毒素とは異なり、カリケアマイシン、エスペラミシンおよび他のエンジイン系毒素は、本質的に免疫原性をもたない小分子である。これらの非ペプチド毒素は、モノクローナル抗体および他の分子を標識するのにすでに使用した技術によって、ダイマーまたはテトラマーに化学的に結合する。これらの結合技術は、構築物のＦｃ部分にのみ存在する、Ｎに結合した糖残基を介する、部位特異的な結合を含む。このような部位特異的に結合させる方法は、構築物が結合する際に、結合にともなう影響を減らすことができるという利点を有する。
【０４２８】
すでに示唆したように、接合物を調製するのに適合する細胞毒は、プロドラッグを含み得る。本明細書で使用するとき、用語「プロドラッグ」は、医薬品として活性な基質の前駆体または誘導体であり、親薬物と比較して、腫瘍細胞への細胞毒性は低く、酵素によって活性化されるか、またはさらに活性な親形態へと変換可能な形態を指す。本発明に適合するプロドラッグとしては、限定されないが、細胞毒性を有さず、さらに活性が高い薬物へと変換可能な、リン酸を含有するプロドラッグ、チオリン酸を含有するプロドラッグ、硫酸を含有するプロドラッグ、ペプチドを含有するプロドラッグ、β−ラクタムを含有するプロドラッグ、場合により置換されたフェノキシアセトアミドを含有するプロドラッグ、または場合により置換されたフェニルアセトアミドを含有するプロドラッグ、５−フルオロシトシンおよび他の５−フルオロウリジンのプロドラッグが挙げられる。本発明で使用する、プロドラッグ形態に誘導体化可能な細胞毒性薬のさらなる例は、上述の化学療法薬を含む。
【０４２９】
他の細胞毒の中で、本明細書に開示した結合分子（例えば、結合ポリペプチド、例えば、ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体または免疫特異的なフラグメント）が、リシンサブユニットＡ、アブリン、ジフテリア毒素、ボツリヌス菌、シアンジノシン（ｃｙａｎｇｉｎｏｓｉｎ）、サキシトキシン、志賀毒素、破傷風、テトロドトキシン、トリコテセン、ベルルクロゲンまたは毒性の酵素のような細胞毒素と会合するか、または接合してもよいことも理解されるであろう。好ましくは、このような構築物は、抗体−毒素構築物を直接発現させる遺伝子操作技術を用いて作成する。本明細書に開示した結合分子（例えば、結合ポリペプチド、例えば、ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体または免疫特異的なフラグメント）と会合可能な他の生体応答修飾物質は、サイトカイン（例えば、リンホカインおよびインターフェロン）を含む。本開示の観点から、当業者は、従来の技術を用いてこのような構築物を容易に合成できると考えられる。
【０４３０】
本明細書に開示した結合分子（例えば、結合ポリペプチド、例えば、ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体または免疫特異的なフラグメント）と会合させるのに使用可能な適合する別の種類の細胞毒は、腫瘍細胞または免疫反応性細胞に直接有効な、放射性増感作用を有する薬物である。このような薬物は、電離放射線への感度を高め、放射線治療の効力を高める。腫瘍細胞に内在化した抗体接合物は、放射線増感作用を最大にする核の近くに放射線増感剤を送達する。放射線増感剤が接続した本発明の結合分子のうち、結合していないものは、血中で迅速に除去され、残った放射性増感剤が標的腫瘍内に局在化し、正常な組織への取り込みは最小限ですむ。血中から迅速に除去された後、補助的な放射線療法を、以下の３つの方法のいずれかで投与する。（１）腫瘍に対し、特異的に直接外部から照射、（２）腫瘍に放射性物質を直接移植する、または（３）同じ標的抗体を用いて全身的に放射線免疫治療する。このアプローチをさらに有望な方法に変えた方法は、放射線増感させた免疫接合体に、治療用放射性同位体を接合する方法であり、患者には１種類の薬物を投与すればよく、簡便な方法である。
【０４３１】
特定の実施形態では、結合分子（例えば、結合ポリペプチド、例えば、ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体または免疫特異的なフラグメント）の安定性または効力を高める部分を接合してもよい。例えば、ある実施形態では、本発明の結合分子にＰＥＧを接合し、インビボでの半減期を高めることができる。Ｌｅｏｎｇ，Ｓ．Ｒ．ら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  １６：１０６（２００１）；Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５４：５３１（２００２）；またはＷｅｉｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ３０：５１２（２００２）。
【０４３２】
さらに、本発明は、結合分子（例えば、結合ポリペプチド、例えば、ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体または免疫特異的なフラグメント）を診断薬または治療薬に接合したものも含む。結合分子を、例えば、所与の治療法および／または予防法の効力を判断するための臨床的な試験手順の一部分として、腫瘍の発生または進行を監視する診断に使用することができる。結合分子（例えば、結合ポリペプチド、例えば、ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体または免疫特異的なフラグメント）を、検出可能な物質にカップリングさせることによって、検出しやすくすることができる。検出可能な基質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、種々の陽電子発生トモグラフィーを用いて陽電子を発生する金属、および放射性ではない常磁性金属イオンが挙げられる。例えば、本発明の診断薬として使用する抗体に接合可能な金属イオンについては、米国特許第４，７４１，９００号を参照。好適な酵素の例としては、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ、好適な補欠分子族の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ、好適な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられ、発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ、生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられ、好適な放射性物質としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎまたは９９Ｔｃが挙げられる。
【０４３３】
結合分子（例えば、結合ポリペプチド、例えば、ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体または免疫特異的なフラグメント）を、化学発光性化合物にカップリングすることによって、検出可能になるように標識してもよい。化学発光性タグをつけたＩＧＦ−１Ｒ抗体の存在は、一連の化学反応中に生じる発光の存在を検出することによって決定される。特に有用な化学発光標識となる化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、テロマティックアクリジニウムエステル（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ  ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ  ｅｓｔｅｒ）、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルである。
【０４３４】
結合分子（例えば、結合ポリペプチド、例えば、ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体または免疫特異的なフラグメント）を検出可能になるように標識する１つの方法は、これらの物質を酵素に結合し、結合した生成物に酵素免疫測定（ＥＩＡ）を用いる方法である（Ｖｏｌｌｅｒ，Ａ．、「Ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）」Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｈｏｒｉｚｏｎｓ  ２：１−７（１９７８））；Ｖｏｌｌｅｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．３１：５０７−５２０（１９７８）；Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｅ．、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：４８２−５２３（１９８１）；Ｍａｇｇｉｏ，Ｅ．（編）、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（１９８０）；Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｅ．ら（編）、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、Ｋｇａｋｕ  Ｓｈｏｉｎ、Ｔｏｋｙｏ（１９８１））。結合分子に結合する酵素は、例えば、分光光度法、蛍光分析法または視覚的な方法によって検出可能な化学部分を生成するような様式で、適切な基質（好ましくは、発色性基質）と反応する。抗体を検出可能になるように標識するのに使用可能な酵素としては、限定されないが、リンゴ酸脱水素酵素、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、δ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロホスフェート、デヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。さらに、酵素に発色性の基質を用いた比色分析によって検出してもよい。基質の酵素反応度と、同様に調製した標準物質の酵素反応度とを視覚的に比較して、検出してもよい。
【０４３５】
種々の免疫アッセイを用い、検出を行ってもよい。例えば、結合分子（例えば、結合ポリペプチド、例えば、ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体または免疫特異的なフラグメント）を放射性物質で標識することによって、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を使用して抗体を検出することも可能である（例えば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｂ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ、Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｔｒａｉｎｉｎｇ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｏｎ  Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｔｈｅ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ（１９８６年３月）、この内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる）。放射性同位体は、限定されないが、γカウンタ、シンチレーションカウンタ、またはオートラジオグラフィーを含む手段で検出することができる。
【０４３６】
結合分子（例えば、結合ポリペプチド、例えば、ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体または免疫特異的なフラグメント）を、蛍光を発光する金属（例えば、１５２Ｅｕまたは他のランタノイド種）で検出可能になるように標識してもよい。ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属キレート化基を用い、上述の金属を抗体に接続してもよい。
【０４３７】
種々の部分を結合分子（例えば、結合ポリペプチド、例えば、ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体または免疫特異的なフラグメント）に接合する技術は、周知であり、例えば、Ａｒｎｏｎら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編）、ｐｐ．２４３−５６（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（第２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編）、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、ｐｐ．６２３−５３（１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）、ｐｐ．４７５−５０６（１９８５）；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌｄｗｉｎら（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  ｐｐ．３０３−１６（１９８５）、およびＴｈｏｒｐｅら、「Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−５８（１９８２）を参照。
【０４３８】
（ＶＩＩ．抗体のポリペプチドの発現）
周知のように、ＲＮＡは、例えば、イソチアン酸グアニジニウムによる抽出、沈殿、次いで遠心分離またはクロマトグラフィーのような標準的な技術で、元々のハイブリドーマ細胞から単離されるか、または他の形質転換された細胞から単離される。所望な場合、ｍＲＮＡは、オリゴ−ｄＴセルロースを用いたクロマトグラフィーのような標準的な技術を用い、全ＲＮＡから単離してもよい。好適な技術は、当該技術分野でよく知られている。
【０４３９】
ある実施形態では、抗体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡは、周知の方法にしたがって、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを用い、同時に作成してもよいし、別個に作成してもよい。コンセンサス定常領域プライマーによって、または公開されている重鎖および軽鎖のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列に基づいて、さらに特異的なプライマーによってＰＣＲを開始してもよい。上述のように、ＰＣＲを使用し、抗体の軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡクローンを単離してもよい。この場合、コンセンサスプライマーまたはこれより同一性の高いプロープ（例えば、マウス定常領域のプローブ）によって、ライブラリをスクリーニングしてもよい。
【０４４０】
当該技術分野で既知の技術を用い、ＤＮＡ（典型的にはプラスミドＤＮＡ）を細胞から単離し、例えば、上述の参考文献に詳細を記載した、組み換えＤＮＡ技術に関する標準的な周知の技術にしたがって、制限マッピングを行い、配列を決定してもよい。もちろん、本発明の方法にしたがって、単離プロセスまたはその後の分析プロセスの任意の時間に、ＤＮＡを合成してもよい。
【０４４１】
本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体を得るために、遺伝子物質の単離物を操作した後に、典型的には、ＩＧＦ−１Ｒ抗体をコードするポリヌクレオチドを発現ベクターに挿入し、宿主細胞に導入し、この宿主細胞を、所望の性質を有するＩＧＦ−１Ｒ抗体を作成するために使用することができる。
【０４４２】
抗体、またはそのフラグメント、誘導体または類似体（例えば、本明細書に記載の標的分子（例えば、ＩＧＦ−１Ｒ）に結合する抗体の重鎖または軽鎖）を組み換えによって発現させるためには、この抗体をコードするポリヌクレオチドをコードする発現ベクターを構築する必要がある。本発明の抗体分子または抗体の重鎖または軽鎖、またはその一部分（好ましくは、重鎖または軽鎖の可変領域を含むもの）をコードするポリヌクレオチドが得られたら、抗体分子を産生するベクターを、当該技術分野で周知の組み換えＤＮＡ技術によって産生してもよい。したがって、ヌクレオチド配列をコードする抗体を含むポリヌクレオチドを発現させることによって、タンパク質を調製する方法を、本明細書に説明する。当該技術分野で周知の方法を使用し、配列および適切な転写制御シグナルおよび翻訳制御シグナルをコードする抗体を含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、例えば、インビトロでの組み換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボでの遺伝子組み換えが含まれる。このように、本発明は、本発明の抗体分子、またはその重鎖または軽鎖、または重鎖または軽鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列が、プロモーターに作動可能に連結した、複製可能なベクターを提供する。このようなベクターは、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含み（例えば、ＰＣＴ出願公開ＷＯ８６／０５８０７；ＰＣＴ出願公開ＷＯ８９／０１０３６；および米国特許第５，１２２，４６４号を参照）、抗体の可変領域を、完全な重鎖または軽鎖を発現するベクターにクローン化し得る。
【０４４３】
宿主細胞を、本発明の２種類の発現ベクターと一緒にトランスフェクトしてもよい。ここで、第１のベクターは、重鎖に由来するポリペプチドをコードし、第２のベクターは、軽鎖に由来するポリペプチドをコードする。この２種類のベクターは、重鎖および軽鎖のポリペプチドを同じ量で発現可能な、同一の選択可能なマーカーであってもよい。あるいは、重鎖および軽鎖のポリペプチドを両方ともコードする１種類のベクターを使用してもよい。このような状況で、毒性のない重鎖が過剰量作られてしまうのを防ぐために、軽鎖は、重鎖の前に配置される方が有利である（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：５２（１９８６）；Ｋｏｈｌｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：２１９７（１９８０））。重鎖および軽鎖をコードする配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含んでいてもよい。
【０４４４】
用語「ベクター」または「発現ベクター」は、本明細書では、宿主細胞に導入され、宿主細胞で所望の遺伝子を発現するためのビヒクルとして、本発明にしたがって使用されるベクターを意味する。当業者が知っているように、このようなベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルスおよびレトロウイルスからなる群から簡単に選択することができる。一般的に、本発明に適合するベクターは、選択マーカーと、所望の遺伝子のクローン化を容易にする適切な制限部位とを含み、真核細胞または原核細胞に入り込み、および／または複製する能力を有する。
【０４４５】
本発明のために、多くの発現ベクター系が使用可能である。例えば、ある種のベクターに、動物ウイルス（例えば、ウシパピローマウウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶまたはＭＯＭＬＶ）またはＳＶ４０ウイルス）に由来するＤＮＡ要素を利用する。それ以外には、内部にあるリボソーム結合部位を用いたポリシストロニック系の使用を含む。さらに、トランスフェクトされた宿主細胞を選択可能な１個以上のマーカーを導入することによって、ＤＮＡを染色体に組み込んだ細胞を、選択してもよい。このマーカーは、栄養要求性宿主への栄養要求性、殺生物剤への耐性（例えば、抗生物質）、または銅のような重金属への耐性を与え得る。選択可能なマーカー遺伝子は、発現するＤＮＡ配列に直接結合しているか、または同時形質転換によって同じ細胞に導入されてもよい。ｍＲＮＡの合成を最適化するために、さらなる要素が必要となることもある。これらの要素は、シグナル配列、スプライスシグナル、および転写プロモーター、エンハンサー、および停止シグナルを含み得る。
【０４４６】
特に好ましい実施形態では、クローン化された可変領域の遺伝子を、上述のように合成した、重鎖および軽鎖の定常領域遺伝子（好ましくは、ヒト）とともに、発現ベクターに挿入する。ある実施形態では、Ｂｉｏｇｅｎ  ＩＤＥＣ，Ｉｎｃ．の特許品であるＮＥＯＳＰＬＡという発現ベクター（米国特許第６，１５９，７３０号に開示されている）を用いて行う。このベクターは、サイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサーと、マウスβグロビン主要プロモーターと、ＳＶ４０由来複製物と、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列と、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼのエクソン１およびエクソン２と、ジヒドロフォレートレダクターゼ遺伝子と、リーダー配列とを含んでいる。このベクターは、可変領域および定常領域の遺伝子を組み込み、ＣＨＯ細胞にトランスフェクトし、次いでＧ４１８を含有する培地で選択し、メトトレキサートで増幅させると、抗体をきわめて高レベルで発現することが分かっている。もちろん、真核細胞での発現を誘発可能な任意の発現ベクターを本発明に使用してもよい。好適なベクターの例としては、限定されないが、プラスミドｐｃＤＮＡ３、ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦ１／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸ１、およびｐＺｅｏＳＶ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州サンディエゴ）から入手可能）、およびプラスミドｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ（ウィスコンシン州マディソン）から入手可能）が挙げられる。一般的に、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖が、例えばロボットによるシステムによって行われるような、日常の実験である場合、多くの形質転換細胞が、好適に高レベルで発現するものについてスクリーニングされる。ベクター系は、米国特許第５，７３６，１３７号および第５，６５８，５７０号にも教示があり、この内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。この系は、例えば、３０ｐｇ／細胞／日を超える高い発現濃度を提供する。ベクター系の他の例は、例えば、米国特許第６，４１３，７７７号に開示されている。
【０４４７】
他の好ましい実施形態では、本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、改変体または誘導体は、２００２年１１月１８日に出願した米国特許出願第２００３−０１５７６４１  Ａ１号（この内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる）に開示されるようなポリシストロニック構築物を用いて発現してもよい。これらの新規発現系で、目的の複数の遺伝子産物（例えば、抗体の重鎖および軽鎖）を、１個のポリシストロニック構築物から作成し得る。これらの系には、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を使用し、真核細胞を宿主として、比較的高濃度のＩＧＦ−１Ｒ抗体（例えば、ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体または免疫特異的なフラグメントのような結合ポリペプチド）を得ることが有利である。適合するＩＲＥＳ配列は、米国特許第６，１９３，９８０号に開示されており、この内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。当業者は、このような発現系を使用し、この出願で開示されているＩＧＦ−１Ｒ抗体の全範囲を効果的に作成し得ることを理解するであろう。
【０４４８】
さらに一般的には、ＩＧＦ−１Ｒ抗体のモノマーサブニットをコードするベクターまたはＤＮＡ配列を調製したら、発現ベクターを適切な宿主細胞に導入することができる。プラスミドを宿主細胞に導入する操作は、当業者に周知の種々の技術で行うことができる。この操作としては、限定されないが、トランスフェクション（電気泳動および電気穿孔を含む）、原形質融合、リン酸カルシウム沈殿法、エンベロープＤＮＡを用いた細胞融合、微量注入、およびインタクトなウイルスに感染させる方法が挙げられる。Ｒｉｄｇｗａｙ，Ａ．Ａ．Ｇ．「Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ」Ｖｅｃｔｏｒｓ、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ａｎｄ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ編、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２４．２，ｐｐ．４７０−４７２（１９８８）を参照。典型的には、宿主細胞へのプラスミドの導入は、電気穿孔によって行う。発現構築物を含む宿主細胞を、軽鎖および重鎖を産生するのに適した条件下で成長させ、重鎖および／または軽鎖のタンパク質合成についてアッセイする。アッセイ技術の例としては、酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、または蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学的方法などが挙げられる。
【０４４９】
発現ベクターを、従来の技術で宿主細胞に移し、トランスフェクト下細胞を従来の技術で培養し、本明細書で記載の方法で使用する抗体を産生する。このように、本発明は、本発明の抗体、またはその重鎖または軽鎖をコードするポリヌクレオチドが、異種プロモーターに作動可能に連結した宿主細胞を含む。二本鎖抗体を発現するのに好ましい実施形態では、以下に詳細を説明するように、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクターを、宿主細胞で一緒に発現させ、完全な免疫分子を発現させてもよい。
【０４５０】
本明細書で使用するとき、「宿主細胞」は、組み換えＤＮＡ技術を用い、少なくとも１つの異種遺伝子をコードするようにて構築されたベクターを含む細胞を指す。組み換え宿主から抗体を単離するプロセスを説明する際に、用語「細胞」および「細胞培養物」は、他の意味であると明確に示されていない限り、抗体の起源を示すという同じ意味で用いる。言い換えると、「細胞」からポリペプチドを回収することは、全細胞を沈降させて回収するか、または培地と懸濁した細胞の両方を含む細胞培養物から回収することを意味し得る。
【０４５１】
種々の宿主−発現ベクター系を利用し、本明細書に記載の方法で使用する抗体分子を発現させることができる。このような宿主−発現系は、目的のコード配列を産生し、精製するビヒクルをあらわすとともに、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換するか、またはトランスフェクトし、目的の抗体分子を系中で発現させる細胞をあらわす。このような宿主−発現系としては、限定されないが、抗体をコードする配列を含む組み換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターでトランスフェクトした細菌類（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；抗体をコードする配列を含む組み換え酵母発現ベクターで形質転換した酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）；抗体をコードする配列を含む組み換えウイルス発現ベクターに感染した昆虫細胞系（例えば、バキュロウイルス）；組み換えウイルス発現ベクターに感染した植物細胞系（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）、または抗体をコードする配列を含む組み換えプラスミド発現ベクターで形質転換されたもの（例えば、Ｔｉプラスミド）；または哺乳動物細胞に由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含有する、組み換え発現構築物を含む哺乳動物系（例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＬＫ細胞、２９３細胞、３Ｔ３細胞）が挙げられる。好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのような細菌細胞、さらに好ましくは、全組み換え抗体分子を特異的に発現する真核細胞を、組み換え抗体分子を発現するのに使用する。例えば、哺乳動物の細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ））を、ヒトサイトメガロウイルスに由来する主要な前初期遺伝子プロモーター要素のようなベクターと組み合わせることと、抗体を有効に発現する系になる（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら、Ｇｅｎｅ  ４５：１０１（１９８６）；Ｃｏｃｋｅｔｔら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：２（１９９０）  ８（７）：６６２−６６７）。
【０４５２】
タンパク質を発現させるのに使用する宿主細胞は、哺乳動物に由来するものが多く、当業者は、所望な産物を発現させるのに最も適した特定の宿主細胞株を選ぶ能力を有すると考える。宿主細胞株の例としては、限定されないが、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）、ＤＧ４４およびＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣株、ＤＨＦＲ  ｍｉｎｕｓ）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頸癌）、ＣＶＩ（サル腎臓株）、ＣＯＳ（ＳＶ４０  Ｔ抗原を有するＣＶＩ誘導体）、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ（幼若ハムスターの腎臓）、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）、ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓株）、ＳＰ２／Ｏ（マウス骨髄腫）、Ｐ３ｘ６３−Ａｇ３．６５３（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ−１ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）および２９３（ヒト腎臓）が挙げられる。ＣＨＯ細胞が特に好ましい。宿主細胞株は、典型的には、商業的なサービス機関であるＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能であり、または公開されている文献から入手可能である。
【０４５３】
さらに、挿入した配列の発現を調節するか、または望ましい特定の様式で遺伝子産物を改変し、加工する宿主細胞株を選択してもよい。このような改変（例えば、グリコシル化）およびタンパク質産物の加工（例えば、開裂）は、タンパク質の機能にとって重要な場合がある。異なる宿主細胞は、翻訳後の処理、およびタンパク質および遺伝子産物の改変の際に、特徴的かつ特異的な機構を有する。発現した異種タンパク質を正しく改変し、処理するために、適切な細胞株または宿主系を選択することができる。この目的のために、一次転写物の適切な処理、遺伝子産物のグリコシル化およびリン酸化のための機構を有する真核宿主細胞を使用してもよい。
【０４５４】
長期間にわたって、組み換えタンパク質を高濃度で産生するために、安定して発現することが好ましい。例えば、抗体分子を安定に発現する細胞株を遺伝子操作によって作出すことができる。ウイルス由来の複製物を含有する発現ベクターを用いるよりも、適切な発現制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写停止コドン、ポリアデニル化部位など）によって制御されたＤＮＡと、選択可能なマーカーとを用いて宿主細胞を形質転換することができる。異種ＤＮＡを導入した後、遺伝子操作した細胞を栄養分が豊富な培地で１〜２日間成長させ、選択性を有する培地に移すことができる。組み換えプラスミドの選択可能なマーカーは、選択に対する耐性を付与し、これにより、細胞は、染色体にプラスミドを安定に組み込み、成長して遺伝子座を形成し、これを細胞株へクローン化し、数を増やすことができる。この方法は、抗体分子を安定に発現する細胞株を遺伝子操作するのに有利に使用することができる。
【０４５５】
多くの選択系を使用することができ、限定されないが、ヘルペス単純ウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ  １１：２２３（１９７７））、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ  ＆  Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ４８：２０２６−２０３４（１９９２））およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら、Ｃｅｌｌ  ２２：８１７  １９８０）の遺伝子を、それぞれ、ｔｋ細胞、ｈｇｐｒｔ細胞またはａｐｒｔ細胞に使用してもよい。さらに、代謝拮抗物質への耐性を、以下の遺伝子を選択する基準として使用してもよい。ｄｈｆｒ、メトトレキサートへの耐性を付与する（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：３５６７−３５７０（１９８０）；Ｏ’Ｈａｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：１５２７（１９８１））；ｇｐｔ、ミコフェノール酸への耐性を付与する（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ＆  Ｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：２０７２（１９８１））；ｎｅｏ、アミノ酸配糖体Ｇ−４１８への耐性を付与する（Ｇｏｄｓｐｉｅｌら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２：４８８−５０５（１９９３））；Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２（１９９３）；およびＭｏｒｇａｎ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；ＴＩＢ  ＴＥＣＨ  １１（５）：１５５−２１５（１９９３年５月）；およびｈｙｇｒｏ、ハイグロマイシンへの耐性を付与する（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、Ｇｅｎｅ  ３０：１４７（１９８４）。組み換えＤＮＡ技術の分野で一般的に知られており、使用可能な方法は、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）；および第１２章および第１３章、Ｄｒａｃｏｐｏｌｉら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４）；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９８１）に記載されており、この内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０４５６】
ベクターの増幅によって、抗体分子の発現濃度を高めることができる（概説として、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ、Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｇｅｎｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｖｏｌ．３．（１９８７）を参照）。抗体を発現するベクター系のマーカーが、増幅可能な性質を有している場合、宿主細胞培養物中に存在する組成物の量が多くなると、マーカー遺伝子の複製物の数も増える。増幅した領域が抗体遺伝子と関係があるため、抗体の産生量も増える（Ｃｒｏｕｓｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５７（１９８３））。
【０４５７】
インビトロでの産生は、生産規模を増大して、所望のポリペプチドを大量に得ることができる。組織培養条件での哺乳動物細胞の培養技術は、当該技術分野で既知であり、例えば、空気揚水反応機または連続的な撹拌反応器での均一懸濁培養、例えば、中空繊維、マイクロカプセル、アガロースマイクロビーズまたはセラミックカートリッジに細胞を固定するか、または封入しての培養が挙げられる。必要な場合、および／または所望な場合、ヒンジ領域の合成ポリペプチドを優先的に生合成した後、または本明細書に記載のＨＩＣクロマトグラフィー工程の前または後に、一般的なクロマトグラフィー法（例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セルロースによるクロマトグラフィー、または（免疫）親和性クロマトグラフィー）によって、ポリペプチドの溶液を精製してもよい。
【０４５８】
本発明の遺伝子をコードするＩＧＦ−１Ｒ抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、改変体または誘導体をコードする遺伝子を、非哺乳動物細胞（例えば、細菌または昆虫細胞または酵母または植物細胞）から発現させてもよい。核酸を取り出すことが容易な細菌類としては、腸内細菌（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ；Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ；ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓおよびＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅが挙げられる。細菌で発現する場合、異種ポリペプチドは、典型的には、封入体の一部分になることも理解されるであろう。この異種ポリペプチドを単離し、精製し、次いで、機能的な分子にアセンブリしなければならない。四価形態の抗体が望ましい場合、サブユニットが四価抗体になるように自己集合させる必要がある（ＷＯ０２／０９６９４８Ａ２号）。
【０４５９】
細菌系では、発現する抗体分子の目的とする用途によって、有利に、多くの発現ベクターを選択することができる。例えば、抗体分子の医薬組成物を製造するために、大量のタンパク質を産生しなければならない場合、高濃度の融合タンパク質産物を発現し、精製が簡単になベクターが望ましい場合がある。このようなベクターとしては、限定されないが、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．２：１７９１（１９８３）、抗体をコードする配列は、融合タンパク質が産生するように、ベクターのフレーム内に、ｌａｃＺコード領域とともに個々に接続していてもよい）；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ＆Ｉｎｏｕｙｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９（１９８５）；Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ  ＆  Ｓｃｈｕｓｔｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９（１９８９））などが挙げられる。ｐＧＥＸベクターを使用し、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）で異種ポリペプチドを融合タンパク質として発現させてもよい。一般的に、このような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオンマトリックス−アガロースビーズに吸着させ、結合させ、遊離グルタチオン存在下で溶出させることによって、溶解した細胞から簡単に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、トロンビンまたはＸａ因子プロテアーゼ開裂部位を含むように設計されており、その結果、クローン化した標的遺伝子産物が、ＧＳＴ部分から放出されるようになっている。
【０４６０】
原核生物だけでなく、真核微生物も使用してよい。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（一般的なパン用酵母）は、最も一般的に使用される真核微生物であるが、多くの他の株も一般的に利用可能である（例えば、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）
【０４６１】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓで発現させる場合、例えば、プラスミドＹＲｐ７（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ  ２８２：３９（１９７９）；Ｋｉｎｇｓｍａｎら、Ｇｅｎｅ  ７：１４１（１９７９）；Ｔｓｃｈｕｍｐｅｒら、Ｇｅｎｅ  １０：１５７（１９８０））が一般的に使用される。このプラスミドは、ＴＲＰ１遺伝子を含有しており、この遺伝子によって、トリプトファンで成長する能力を欠いた酵母の変異株の選択マーカーを提供する。例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰＥＰ４−１（Ｊｏｎｅｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８５（１）：２３−３３（１９７７））。この酵母宿主細胞のゲノムの特徴であるｔｒｐｌ変異の存在によって、トリプトファンが存在しない状態で成長させることによる形質転換を有効に検出する環境を提供する。
【０４６２】
昆虫系では、典型的には、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が、異種遺伝子を発現するベクターとして用いられる。このウイルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞中で成長する。抗体をコードする配列を、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下で、このウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）に個々にクローン化してもよい。
【０４６３】
本発明の抗体分子が組み換えによって発現したら、免疫グロブリン分子を精製する分野で既知の任意の方法（例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、特に、プロテインＡの後で、特異的な抗原に対する親和性、およびサイズカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度の差による方法、またはタンパク質を精製する任意の他の標準的な技術）によって精製してもよい。あるいは、本発明の抗体の親和性を高めるのに好ましい方法は、ＵＳ  ２００２  ０１２３０５７  Ａ１号に開示されている。
【０４６４】
（ＶＩＩＩ．ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体、または免疫特異的なフラグメントを用いる治療方法）
本発明の一実施形態は、ＩＧＦ−１ＲまたはＩＧＦ−１Ｒの改変体に結合する抗体または免疫特異性のフラグメントを有効量投与する工程を含むか、この工程から本質的になるか、またはこの工程からなる、過剰増殖性疾患または障害（例えば、癌、悪性細胞、腫瘍またはその転移）を患っている動物、または上述の疾患にかかる恐れがあると診断された動物において、上述の疾患または障害を治療する方法を提供する。好適な抗体としては、本明細書に記載したすべての抗体および抗原結合性を保持したフラグメントが挙げられる。例としては、限定されないが、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１およびＭ１２−Ｇ０４からなる群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体フラグメント、またはハイブリドーマが産生するＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２およびＰ１Ｇ１０．２Ｂ８からなる群から選択される参照モノクローナル抗体と同じＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する抗体の単離物または抗原結合性を保持したフラグメント、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合し、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１およびＭ１２−Ｇ０４からなる群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体フラグメント、またはハイブリドーマが産生するＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２およびＰ１Ｇ１０．２Ｂ８からなる群から選択される参照モノクローナル抗体がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを競合的に阻害する、抗体の単離物または抗原結合性を保持したフラグメント、またはＭ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１およびＭ１２−Ｇ０４からなる群から選択されるモノクローナルＦａｂ抗体と同一の抗原結合領域を含むか、またはハイブリドーマが産生するＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２およびＰ１Ｇ１０．２Ｂ８からなる群から選択されるモノクローナル抗体と同一の抗原結合領域を含む、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体の単離物、または抗原結合性を保持したフラグメントが挙げられる。
【０４６５】
特定の実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒまたはその改変体に特異的に結合する本発明の抗体は、１つ以上のインスリン成長因子（例えば、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、またはＩＧＦ−１とＩＧＦ−２の両方）がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを阻害する。他の実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒまたはその改変体に特異的に結合する本発明の抗体は、１つ以上のインスリン成長因子が結合したときに起こるＩＧＦ−１Ｒのリン酸化を阻害する。さらなる実施形態では、細胞（特に、腫瘍細胞）で発現したＩＧＦ−１Ｒまたはその改変体に特異的に結合する本発明の抗体は、細胞増殖、細胞の移動および／または転移に関与する、下流にあるシグナル伝達分子のリン酸化を阻害する。このような伝達分子としては、限定されないが、Ａｋｔおよびｐ４２／４４  ＭＡＰＫが挙げられる。さらなる実施形態では、細胞で発現したＩＧＦ−１Ｒまたはその改変体に特異的に結合する本発明の抗体は、表面で発現したＩＧＦ−１Ｒの内在化を促進し、ＩＧＦと相互作用するのに利用できる量を制限する。さらなる実施形態では、細胞（特に、腫瘍細胞）で発現したＩＧＦ−１Ｒまたはその改変体に特異的に結合する本発明の抗体は、細胞増殖、細胞の移動および／または転移を阻害する。
【０４６６】
本明細書に開示した治療方法で使用されるＩＧＦ−１Ｒまたはその改変体に特異的に結合する本発明の抗体は、細胞の過剰増殖に関与する細胞活性（例えば、過剰増殖性疾患または過剰増殖性障害に関連することの多い、血管新生の変更または異常な血管新生パターンを誘発する細胞活性）を停止させ、低下させ、抑止させるか、または阻害する治療薬として調製され、使用することができる。
【０４６７】
本発明の抗体、または免疫特異的なフラグメントとしては、限定されないが、モノクローナル抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体、ＩＧＦ−１Ｒのような腫瘍に関連するタンパク質に特異的に結合する抗体フラグメントが挙げられる。この抗体は、一価、二価、多価であってもよく、二官能抗体であってもよく、抗体フラグメントとしては、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントおよびＦｖフラグメントが挙げられる。
【０４６８】
本発明の治療用抗体は、標識されていない形態または接合されていない形態で使用してもよく、または放射能標識および生化学的な細胞毒のような細胞毒性部分にカップリングし、または結合して、治療効果を発揮する薬剤を製造してもよい。
【０４６９】
特定の実施形態では、本発明の抗体、または免疫特異的なフラグメントは、抗原結合領域を含む。抗原結合領域は、抗体ごとに異なる抗体可変領域に由来する。天然の抗体は、少なくとも２個の抗原結合領域を含み、すなわち、天然の抗体は、少なくとも二価である。本明細書で使用するとき、用語「抗原結合領域」は、抗原（例えば、細胞尿面または可溶性抗原）のエピトープに特異的に結合する部位を含む。抗体の抗原結合領域は、典型的には、免疫グロブリン重鎖可変領域の少なくとも一部分と、免疫グロブリン軽鎖可変領域の少なくとも一部分とを含む。これらの可変領域から作られる結合部位は、抗体の特異性を決定づける。
【０４７０】
本発明は、ＩＧＦ−１Ｒ（例えば、ヒトＩＧＦ−１Ｒ）に特異的に結合するか、または選択的に結合する抗体または免疫特異性のフラグメントを有効量投与する工程を含むか、この工程から本質的になるか、またはこの工程からなる、例えば、腫瘍の成長を阻害することによって、哺乳動物の種々の過剰増殖性障害を治療する方法を提供する。
【０４７１】
本発明は、さらに特定的には、ＩＧＦ−１Ｒの１つ以上のエピトープに特異的に結合するか、または選択的に結合する抗体または免疫特異性のフラグメントを有効量投与する工程を含むか、この工程から本質的になるか、またはこの工程からなる、動物（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）において、哺乳動物の過剰増殖性障害を治療する（例えば、腫瘍の形成、腫瘍の成長、腫瘍の侵襲性、および／または転移の発生を阻害するか、または予防する）方法である。
【０４７２】
他の実施形態では、本発明は、動物（例えば、ヒト患者）において、医薬的に許容される担体に加え、ＩＧＦ−１Ｒの１つ以上のエピトープに特異的に結合するか、または選択的に結合する抗体または免疫特異性のフラグメントを有効量投与する工程を含むか、この工程から本質的になるか、またはこの工程からなる、哺乳動物の過剰増殖性障害を治療する（例えば、腫瘍の形成、腫瘍の成長、腫瘍の侵襲性、および／または転移の発生を阻害するか、または予防する）方法を含む。ここで、エピトープは、配列番号２の少なくとも約４〜５個のアミノ酸、少なくとも７個、少なくとも９個、または少なくとも約１５〜約３０個のアミノ酸を含むか、これらのアミノ酸から本質的になるか、またはこれらのアミノ酸からなる。上述の配列番号２の所与のエピトープのアミノ酸は、連続的であってもよいが、必ずしもそうでなければならないわけではない。特定の実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒの少なくとも１つのエピトープは、ＩＧＦ−１Ｒの細胞外領域から作られた、細胞表面に発現する非線形エピトープを含むか、この非線形エピトープから本質的になるか、またはこの非線形エピトープからなる。このように、特定の実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒの少なくとも１つのエピトープは、配列番号２のうち少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、約１５〜約３０個、または少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個または１００個の連続したアミノ酸または非連続アミノ酸を含むか、これらのアミノ酸から本質的になるか、またはこれらのアミノ酸からなり、非連続アミノ酸は、タンパク質が折りたたまれることによってエピトープを形成する。
【０４７３】
他の実施形態では、本発明は、動物（例えば、ヒト患者）において、医薬的に許容される担体に加え、ＩＧＦ−１Ｒの１つ以上のエピトープに特異的に結合するか、または選択的に結合する抗体または免疫特異性のフラグメントを有効量投与する工程を含むか、この工程から本質的になるか、またはこの工程からなる、哺乳動物の過剰増殖性障害を治療する（例えば、腫瘍の形成、腫瘍の成長、腫瘍の侵襲性、および／または転移の発生を阻害するか、または予防する）方法を含む。ここで、エピトープは、上述の配列番号２の１個、２個、３個、４個、５個、６個またはそれ以上の連続したアミノ酸または非連続アミノ酸を含むか、これらのアミノ酸から本質的になるか、またはこれらのアミノ酸からなることに加え、標的タンパク質を改変すると、改変していないタンパク質よりもＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合親和性が高くなるように、タンパク質を改変する別の部分、例えば、炭水化物部分を含んでもよい。あるいは、ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、改変していない形態の標的タンパク質には全く結合しない。
【０４７４】
さらに特定的には、本発明は、ヒトにおいて、ＩＧＦ−１Ｒの１つ以上のエピトープに特異的に結合するか、または選択的に結合する抗体または免疫特異性のフラグメントと、医薬的に許容される担体とを含む組成物を有効量投与する工程を含むか、この工程から本質的になるか、またはこの工程からなる、ヒトの癌を治療する方法を提供する。治療対象となる癌の種類としては、胃癌、腎癌、脳癌、膀胱癌、結腸癌、肺癌、乳癌、膵臓癌、卵巣癌および前立腺癌が挙げられるが、それに限定されない。
【０４７５】
特定の実施形態では、抗体または抗体フラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒ、または上述のフラグメントまたは改変体の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合し（すなわち、そのようなエピトープに、無関係なエピトープに結合したり、エピトープに無作為に結合したりするよりも、容易に結合し）、上述のＩＧＦ−１Ｒ、またはフラグメントまたは改変体の少なくとも１つのエピトープに選択的に結合し（すなわち、そのようなエピトープに、関連するエピトープ、同様のエピトープ、同種のエピトープ、または類似のエピトープよりも容易に結合し）、ＩＧＦ−１Ｒ、または上述のフラグメントまたは改変体の特定のエピトープに特異的に結合するか、または選択的に結合する参照抗体を競合的に阻害するか、またはＩＧＦ−１Ｒ、または上述のフラグメントまたは改変体の少なくとも１つのエピトープに結合し、親和性を特徴づける解離定数（ＫＤ）が、５×１０−２Ｍ未満、１０−２Ｍ未満、５×１０−３Ｍ未満、１０−３Ｍ未満、５×１０−４Ｍ未満、１０−４Ｍ未満、５×１０−５Ｍ未満、１０−５Ｍ未満、５×１０−６Ｍ未満、１０−６Ｍ未満、５×１０−７Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、５×１０−８Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、５×１０−９Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、５×１０−１０Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、５×１０−１１Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、５×１０−１２Ｍ未満、１０−１２Ｍ未満、５×１０−１３Ｍ未満、１０−１３Ｍ未満、５×１０−１４Ｍ未満、１０−１４Ｍ未満、５×１０−１５Ｍ未満または１０−１５Ｍ未満である。抗体の結合解離定数に関して使用する場合、用語「約」は、抗体親和性を測定するのに使用する方法に固有な偏差を考慮に入れることを可能にする。例えば、使用する装置の精度、測定サンプル数にに基づく標準誤差、丸め誤差に依存して、用語「約１０−２Ｍ」は、例えば、０．０５Ｍ〜０．００５Ｍを含み得る。特定の実施形態では、本発明の抗体または抗体フラグメントは、ヒトＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合し、霊長類ＩＧＦ−１Ｒおよび／またはマウスＩＧＦ−１Ｒにも結合する抗体または抗体フラグメントの由来となる他の種のＩＧＦ−１Ｒタンパク質に交差反応する。本発明の他の好適な抗体または抗体フラグメントは、きわめて種特異的なものを含む。
【０４７６】
特定の実施形態では、本明細書に開示した抗体、または免疫特異的なフラグメントは、５×１０−２秒−１以下、１０−２秒−１以下、５×ｌ０−３秒−１以下、またはｌ０−３秒−１以下の解離速度（ｋ（ｏｆｆ））で、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチド、またはそのフラグメントまたは改変体に結合する。本明細書に開示した他の抗体、または免疫特異的なフラグメントは、５×１０−４秒−１以下、１０−４秒−１以下、５×１０−５秒−１以下、または１０−５秒−１以下、５×１０−６秒−１以下、１０−６秒−１以下、５×１０−７秒−１以下、または１０−７秒−１以下の解離速度（ｋ（ｏｆｆ））で、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチド、またはそのフラグメントまたは改変体に結合する。
【０４７７】
他の実施形態では、本明細書に開示した抗体、または免疫特異的なフラグメントは、１０３Ｍ−１秒−１以上、５×１０３Ｍ−１秒−１以上、１０４Ｍ−１秒−１以上、または５×１０４Ｍ−１秒−１以上の結合速度（ｋ（ｏｎ））で、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチド、またはそのフラグメントまたは改変体に結合する。本明細書に開示した他の抗体、または免疫特異的なフラグメントは、１０５Ｍ−１秒−１以下、５×１０５Ｍ−１秒−１以下、１０６Ｍ−１秒−１以下、または５×１０６Ｍ−１秒−１以下、または１０７Ｍ−１秒−１以下の結合速度（ｋ（ｏｎ））で、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチド、またはそのフラグメントまたは改変体に結合する。
【０４７８】
種々の実施形態では、上述の１つ以上の結合分子は、ＩＧＦ−１Ｒ活性のアンタゴニストであり、例えば、ＩＧＦ−１Ｒ抗体のアンタゴニストが、腫瘍細胞で発現したＩＧＦ−１Ｒに結合すると、インスリン成長因子（例えば、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、またはＩＧＦ−１とＩＧＦ−２の両方）がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを阻害し、ＩＧＦ−１Ｒの内在化を促進し、それによって、シグナル伝達能力を阻害するか、ＩＧＦ−１Ｒのリン酸化を阻害するか、シグナル伝達の下流にある分子（例えば、Ａｋｔまたはｐ４２／４４  ＭＡＰＫ）のリン酸化を阻害するか、または腫瘍細胞の増殖、移動または転移を阻害する。
【０４７９】
（ＩＸ．ＩＧＦ−１Ｒに特異的な結合分子および核酸増幅アッセイを用いる、診断方法または予後判断方法）
ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体、またはその誘導体または類似体を、診断目的で使用し、ＩＧＦ−１Ｒの異常な発現および／または異常な活性に関連する疾患、障害および／または状態を検出し、診断し、または監視することができる。ＩＧＦ−１Ｒの発現量は、腫瘍組織および他の新生物状態では増える。
【０４８０】
ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体、またはそのフラグメントは、哺乳動物（好ましくはヒト）の過剰増殖性障害を診断し、治療し、予防し、および／または予後を判断するのに有用である。このような障害としては、限定されないが、癌、新生物、腫瘍および／または本明細書の他の部分に説明したものが挙げられ、特に、ＩＧＦ−１Ｒに関連する癌、例えば、癌が、胃癌、腎癌、脳癌、膀胱癌、結腸癌、肺癌、乳癌、膵臓癌、卵巣癌および前立腺癌が挙げられる。
【０４８１】
例えば、本明細書で開示しているように、ＩＧＦ−１Ｒの発現は、少なくとも、胃、腎臓、脳、膀胱、結腸、肺、乳房、膵臓、卵巣および前立腺の腫瘍組織に関係がある。したがって、ＩＧＦ−１Ｒに対する抗体（および抗体フラグメント）を利用し、高濃度のＩＧＦ−１Ｒを発現している特定の臓器を検出することができる。これらの診断アッセイは、インビボまたはインビトロで行われてもよく、例えば、血液サンプル、生検組織または剖検組織で行われてもよい。
【０４８２】
このように、本発明は、癌および他の過剰増殖性障害の診断に有用な診断方法を提供し、それは、個体由来の組織または他の細胞または身体中のＩＧＦ−１Ｒタンパク質または転写物の発現濃度を測定する工程と、測定した発現濃度と、正常な組織または体液の標準的なＩＧＦ−１Ｒ発現濃度とを比較し、標準値と比較して発現濃度が高くなっていることが、障害の指標となる工程が含まれる。
【０４８３】
一実施形態は、液体サンプルまたは組織サンプル中の異常な過剰増殖性細胞（例えば、前癌細胞または癌細胞）の存在を検出する方法を提供し、それは、個体の組織サンプルまたは体液サンプル中のＩＧＦ−１Ｒの発現をアッセイする工程と、そのサンプルのＩＧＦ−１Ｒ発現の存在または発現濃度と、標準的な組織サンプルまたは体液サンプル中のＩＧＦ−１Ｒ発現の存在または発現濃度とを比較する工程とを含み、ＩＧＦ−１Ｒの発現を検出すること、またはＩＧＦ−１Ｒの発現濃度が標準値よりも高いことは、異常な過剰増殖性細胞の成長の指標である。
【０４８４】
さらに具体的には、本発明は、体液サンプルまたは組織サンプル中の異常な過剰増殖性細胞の存在を検出する方法を提供し、それは、（ａ）本発明のＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体または免疫特異的な抗体を用い、個体の組織サンプルまたは体液サンプル中のＩＧＦ−１Ｒの発現をアッセイする工程と、（ｂ）そのサンプルのＩＧＦ−１Ｒ発現の存在または発現濃度と、標準的な組織サンプルまたは体液サンプル中のＩＧＦ−１Ｒ発現の存在または発現濃度とを比較する工程とを含み、ＩＧＦ−１Ｒの発現を検出すること、またはＩＧＦ−１Ｒの発現濃度が標準値よりも高いことは、異常な過剰増殖性細胞の成長の指標である。
【０４８５】
癌についていえば、比較的高濃度のＩＧＦ−１Ｒタンパク質が、個体の生検組織に存在することは、腫瘍または他の悪性細胞の成長の指標となる場合があり、このような悪性細胞または腫瘍の発生を前もって診断する指標となる場合があり、または実際の臨床症状が起こる前に、疾患を検出する手段を提供することがある。この種類の診断の信頼性が高まれば、医療従事者は、予防的な測定または初期の積極的な治療に利用することができ、それによって、癌の発生またはさらなる進行を抑えることができる。
【０４８６】
本発明のＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体を使用し、当業者に既知の従来からある免疫組織学法を用い、生体サンプルのタンパク質濃度をアッセイすることができる（例えば、Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５）；Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（１９８７）を参照）。タンパク質の発現を検出するのに有用な他の抗体に基づく方法としては、酵素免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）のような免疫アッセイが挙げられる。好適な抗体アッセイ用標識は、当該技術分野で既知であり、酵素標識、例えば、グルコースオキシダーゼ；放射性同位体、例えば、ヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１２Ｉｎ）およびテクネチウム（９９Ｔｃ）；発光標識、例えばルミノール；蛍光標識、例えば、フルオレセインおよびローダミン、およびビオチンが挙げられる。好適なアッセイは、本明細書の他の箇所で詳細に説明する。
【０４８７】
本発明のある態様は、動物（好ましくは、哺乳動物、最も好ましくは、ヒト）において、異常なＩＧＦ−１Ｒ発現に関連する過剰増殖性疾患または過剰増殖性障害をインビボで検出するか、または診断する方法である。ある実施形態では、診断は、（ａ）対象に、有効量の本発明の、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する、標識された抗体または抗体フラグメントを投与する工程（例えば、非経口、皮下、または腹腔内）と、（ｂ）投与した後に、標識された結合分子が、対象において、ＩＧＦ−１Ｒを発現する場所に優先的に濃縮することが可能なように（そして標識された分子のうち、結合していないものがバックグラウンド濃度にまで排泄されることが可能なように）、所定時間待つ工程と、（ｃ）バックグラウンド濃度を決定する工程と、（ｄ）対象において、標識された分子を検出する工程とを含み、標識された分子が、バックグラウンド濃度よりも高濃度で検出されることは、その対象が、ＩＧＦ−１Ｒの異常な発現に関連する特定の疾患または障害を患っていることを示す。バックグラウンド濃度は、標識された分子の検出量と、特定の系ですでに決定した標準的な値とを比較する方法を含む、種々の方法によって決定することができる。
【０４８８】
対象の体の大きさ、および使用する造影システムによって、診断用画像を得るのに必要な造影部分の量が決まることは、当該技術分野で理解されるであろう。放射性同位体部分の場合、ヒト対象では、注入する放射能の量は、通常は、例えば、９９Ｔｃを５〜２０ｍＣｉである。標識された結合分子（例えば、抗体または抗体フラグメント）は、特定のタンパク質を含有する細胞の所定位置に優先的に蓄積する。インビボでの腫瘍の造影は、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、「Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」（Ｃｈａｐｔｅｒ  １３  ｉｎ  Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｔｈｅ  Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌ  ａｎｄ  Ｂ．Ａ．Ｒｈｏｄｅｓ，ｅｄｓ．、Ｍａｓｓｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｉｎｃ．（１９８２）に記載されている。
【０４８９】
使用する標識の種類および投与態様を含むいくつかの変数によって変わるが、投与後に、標識された分子が対象の所定部位で優先的に濃縮されるのにかかる時間、標識された分子のうち、結合していない分子がバックグラウンド濃度まで戻るのにかかる時間は、６〜４８時間、または６〜２４時間、または６〜１２時間である。別の実施形態では、投与後の時間間隔は、５〜２０日、または７〜１０日である。
【０４９０】
標識された分子の存在は、インビボスキャニングの分野で既知の方法を用い、患者の内部で検出することができる。これらの方法は、使用する標識の種類によって変わる。当業者は、特定の標識を検出するのに適した方法を決定することができる。本発明の診断方法で使用可能な方法およびデバイスとしては、限定されないが、コンピュータ断層造影法（ＣＴ）、陽電子放射断層法（ＰＥＴ）、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）および超音波造影法のような全身スキャンが挙げられる。
【０４９１】
特定の実施形態では、結合分子は、放射性同位体で標識されており、放射線に応答する手術装置を用い、患者内部で検出する（Ｔｈｕｒｓｔｏｎら、米国特許第５，４４１，０５０号）。別の実施形態では、結合分子は、蛍光化合物で標識されており、蛍光に応答するスキャン装置を用い、患者内部で検出する。別の実施形態では、結合分子は、陽電子を発生する金属で標識されており、陽電子発生トモグラフィーを用いて患者内部で検出される。さらに別の実施形態では、結合分子は、常磁性標識で標識されており、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）を用いて患者内部で検出される。
【０４９２】
ＩＧＦ−１Ｒの発現をインビボで造影するための抗体の標識またはマーカーとしては、Ｘ線造影、核磁気共鳴映像法（ＮＭＲ）、ＭＲＩ、ＣＡＴ−スキャンまたは電子スピン共鳴造影法（ＥＳＲ）で検出可能なものが挙げられる。Ｘ線造影の場合、好適な標識としては、バリウムまたはセシウムのような放射性同位体が挙げられ、これらの同位体は、検出可能な放射線を発生するが、対象にとって明らかに有害なものではない。ＮＭＲおよびＥＳＲに好適なマーカーとしては、検出可能な特徴的なスピンを有するもの、例えば、重水素が挙げられ、このマーカーは、関連するハイブリドーマに提供する栄養物を標識することによって、抗体に組み込まれてもよい。ヒトでの診断のために、ＩＧＦ−１Ｒの濃度上昇を検出するためにインビボ造影を用いる場合、本明細書の他の部分で説明したようなヒト抗体または「ヒト化」キメラモノクローナル抗体を使用することが好ましい場合がある。
【０４９３】
上述の例と関連する実施形態では、すでに診断がついた疾患または障害の監視は、その疾患または障害の診断方法のいずれか１つを、例えば、最初の診断から１カ月後、６カ月後、１年後などに繰り返すことによって行われる。
【０４９４】
ある障害（腫瘍を含む）が、従来の方法ですでに診断されている場合、本明細書に開示した検出不法は、予後の指標として有用である。ＩＧＦ−１Ｒの発現量が高い状態が続く患者は、ＩＧＦ−１Ｒの発現量が標準値に近いレベルまで下がっている患者と比較して、臨床結果が悪くなる。
【０４９５】
「腫瘍に関連するＩＧＦ−１Ｒポリペプチドの発現濃度をアッセイすること」とは、第１の生体サンプルで、直接的に（例えば、全タンパク質レベルを決定するか、または概算することによって）、または相対的に（例えば、第２の生体サンプルの癌に関連するポリペプチド濃度と比較することによって）、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドの濃度を定性的または定量的に測定するか、または概算することを意味する。好ましくは、第１の生体サンプルでのＩＧＦ−１Ｒポリペプチドの発現濃度を測定するか、または概算し、標準的なＩＧＦ−１Ｒポリペプチド濃度と比較し、この標準は、その障害を患っていない個体から得た第２の生体サンプルから得るか、またはその障害を患っていない個体の集合から得た値を平均することによって決定してもよい。当該技術分野で理解されるように、ＩＧＦ−１の「標準」値が既知である場合、比較のために、その値を標準として繰り返し用いてもよい。
【０４９６】
「生体サンプル」とは、個体、細胞株、組織培養物、またはＩＧＦ−１Ｒを発現する可能性がある他の細胞供給源から得た任意の生体サンプルを意味する。ここで示されるように、生体サンプルとしては、体液（例えば、血清、血漿、尿、滑液および髄液）、およびＩＧＦ−１Ｒを発現する可能性がある他の組織供給源が挙げられる。哺乳動物から組織生検および体液を得る方法は、当該技術分野で周知である。
【０４９７】
さらなる実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒの構造的なエピトープに対する抗体、または免疫特異的なフラグメントを使用し、ＩＧＦ−１Ｒ遺伝子産物または保存された改変体またはペプチドフラグメントを定量的または定性的に検出することができる。この操作は、例えば、蛍光標識された抗体と、光学顕微鏡、フローサイトメトリーまたは蛍光分析による検出とを組み合わせた、免疫蛍光技術によって達成されてもよい。
【０４９８】
上述の方法を用いて診断および／または予防可能な癌としては、限定されないが、胃癌、腎癌、脳癌、膀胱癌、結腸癌、肺癌、乳癌、膵臓癌、卵巣癌および前立腺癌が挙げられる。
【０４９９】
（Ｘ．免疫アッセイ）
本明細書に開示したＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体、または免疫特異的なフラグメントを、当該技術分野で既知の任意の方法で、免疫特異的な結合についてアッセイすることができる。使用可能な免疫アッセイとしては、限定されないが、数例を挙げると、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ酵素免疫吸着法、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル内沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、相補体固定アッセイ、免疫放射定量測定アッセイ、蛍光免疫アッセイ、プロテインＡ免疫アッセイのような技術を用いる、競合的なアッセイ系および非競合的なアッセイ系が挙げられる。このようなアッセイは、一般的なものであり、当該技術分野で周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｖｏｌ．１（１９９４）を参照。この内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる）。免疫アッセイの例を、以下に簡単に示す（限定する意図はない）。
【０５００】
免疫沈降プロトコルは、一般的に、細胞の集合を、タンパク質ホスファターゼおよび／またはプロテアーゼ阻害剤（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチニン、バナジン酸ナトリウム）を追加したＲＩＰＡバッファ（１％  ＮＰ−４０またはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％  ナトリウムデオキシコレート、０．１％  ＳＤＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、１％  トラシロール）のような溶解バッファに溶解させる工程と、目的の抗体を細胞溶解物に加える工程と、４℃で所定時間（例えば、１〜４時間）インキュベートする工程と、プロテインＡおよび／またはプロテインＧセファロースビーズを細胞溶解物に加える工程と、４℃で約１時間以上インキュベートする工程と、ビーズを溶解バッファで洗浄する工程と、ビーズをＳＤＳ／サンプルバッファに再び懸濁させる工程とを含む。目的の抗体が特定の抗原を免疫沈降させる能力を、例えば、ウェスタンブロット分析によって評価することができる。当業者は、抗原に対する抗体の結合性を高めるように、およびバックグラウンドを下げる（例えば、セファロースビーズを用いて、細胞溶解物をあらかじめきれいにしておく）ようにパラメーターを変えてもよいことを理解するであろう。免疫沈降プロトコルに関するさらなる記載は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｖｏｌ．１（１９９４）の１０．１６．１を参照。
【０５０１】
ウェスタンブロット分析は、一般的に、タンパク質サンプルを調製し、タンパク質サンプルをポリアクリルアミドゲル（例えば、抗原の分子量によって、８％−２０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で電気泳動させる工程と、タンパク質サンプルをポリアクリルアミドゲルから、ニトロセルロース、ＰＶＤＦまたはナイロンのような膜に移す工程と、ブロッキング溶液（例えば、３％  ＢＳＡまたは脱脂乳を含むＰＢＳ）で膜をブロックする工程と、膜を洗浄バッファ（例えば、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ２０）で洗浄する工程と、ブロッキングバッファで希釈した一次抗体（目的の抗体）で膜をブロックする工程と、膜を洗浄バッファで洗浄する工程と、酵素基質（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）または放射性分子（例えば、３２ｐまたは１２５１）に接合した二次抗体（一次抗体を認識する抗体、例えば、抗−ヒト抗体）をブロッキングバッファで希釈し、この液で膜をブロックする工程と、膜を洗浄バッファで洗浄する工程と、抗原の存在を検出する工程とを含む。当業者は、検出されるシグナルを高めるように、バックグラウンドノイズを減らすようにパラメーターを変えてもよいことを理解するであろう。ウェスタンブロットに関するさらなる記載は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｖｏｌ．１（１９９４）の１０．８．１を参照。
【０５０２】
ＥＬＩＳＡは、抗原を調製する工程と、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルを抗原でコーティングする工程と、検出可能な化合物、例えば、酵素基質（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）に接合した目的の抗体をウェルに加える工程と、所定時間インキュベートする工程と、抗原の存在を検出する工程とを含む。ＥＬＩＳＡでは、目的の抗体は、検出可能な化合物に接合している必要はなく、その代わりに、検出可能な化合物に接合した二次抗体（目的の抗体を認識する抗体）をウェルに加えてもよい。さらに、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、抗体をウェルにコーティングしてもよい。この場合、コーティングされたウェルに目的の抗原を加えた後、検出可能な化合物に接合した二次抗体を加えてもよい。当業者は、検出されるシグナルを高めるように、当該技術分野で既知のＥＬＩＳＡの他の改変例になるようにパラメーターを変えてもよいことを理解するであろう。ＥＬＩＳＡに関するさらなる記載は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｖｏｌ．１（１９９４）の１１．２．１を参照。
【０５０３】
抗原に対する抗体の結合親和性、および抗体−抗原相互作用の解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）は、競合結合アッセイによって決定することができる。競合結合アッセイの例は、ラジオイムノアッセイであり、標識されていない抗原を増加しつつ、標識された抗原（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）を、目的の抗体とともにインキュベートし、標識された抗原に結合した抗体を検出することを含む。特定の抗原に対する、目的の抗体の親和性および結合解離速度は、Ｓｃａｔｃｈａｒｄプロット分析によって得たデータから決定することができる。第２の抗体との競合は、ラジオイムノアッセイを用いて決定してもよい。この場合、抗原を、標識されていない抗原を増加しつつ、標識された（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）に接合した化合物目的の抗体とともにインキュベートする。
【０５０４】
さらに、ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体は、癌抗原遺伝子産物またはその保存された改変体またはペプチドフラグメントを系中で検出するために、免疫蛍光法、免疫電子顕微鏡または非免疫アッセイで使用する場合のように、組織学的に使用されてもよい。系中での検出は、組織学的標本を患者から取り出す工程と、この標本に、標識されたＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体またはそのフラグメントを適用する（好ましくは、標識された抗体（またはフラグメント）を生体サンプルの上に置くことによって適用する）工程とによって行われ得る。この手順を用いることによって、ＩＧＦ−１Ｒタンパク質、またはその保存された改変体またはペプチドフラグメントの存在だけではなく、試験組織での分布も決定することができる。本発明を用いて、当業者は、系中で検出するために、種々の組織学的方法（例えば、染色手順）を改変してもよいことを容易に理解するであろう。
【０５０５】
ＩＧＦ−１Ｒ遺伝子産物またはその保存された改変体またはフラグメントの免疫アッセイおよび非免疫アッセイは、典型的には、サンプル（例えば、生体液、組織抽出物、集めたばかりの細胞、またはＩＧＦ−１Ｒまたはその保存された改変体またはペプチドフラグメントに結合可能な、検出可能に標識された抗体が存在する状態で、培地でインキュベートした細胞溶解物）をインキュベートする工程と、当該技術分野で周知のいずれかの技術によって、結合した抗体を検出する工程とを含む。
【０５０６】
生体サンプルを、固相支持体または担体（例えば、ニトロセルロース）、または細胞、細胞粒子または可溶性タンパク質を固定可能な他の固体支持体と接触させ、固定させてもよい。次いで、支持体を好適なバッファで洗浄した後、検出可能に標識されたＩＧＦ−１Ｒ特異的な抗体で処理してもよい。固相支持体を、バッファでもう一度洗浄し、結合していない抗体を除去してもよい。場合により、その後に抗体を標識してもよい。固体支持体に結合した標識の量を、従来の手段で検出してもよい。
【０５０７】
「固相支持体または担体」とは、抗原または抗体が結合可能な任意の支持体を意味する。周知の支持体または担体としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然セルロースおよび改変セルロース、ポリアクリルアミド、斑れい岩およびマグネタイトが挙げられる。担体の性質は、本発明の目的のために、ある程度可溶性であってもよいし、不溶性であってもよい。支持体材料は、カップリングした分子が抗原または抗体と結合可能な、任意実際に可能な構造であってもよい。したがって、支持体の構造は、球形（例えばビーズ）であってもよく、円筒形（試験管の内側表面のような形）であってもよく、棒の外側表面のような形であってもよい。あるいは、支持体の表面は、シート状、試験片状などのように、平坦であってもよい。好ましい支持体としては、ポリスチレンビーズが挙げられる。当業者は、抗体または抗原を結合させるのに好適な多くの他の担体を知っており、通常の実験によってこれを確認するであろう。
【０５０８】
所与のロットのＩＧＦ−１Ｒ特異的な抗体の結合活性を、周知の方法で決定することができる。当業者は、通常の実験によって、操作条件と、操作条件を決定するための最適なアッセイ条件を決定することができる。
【０５０９】
抗体−抗原相互作用の親和性を測定するのに利用可能な種々の方法が存在するが、速度定数を決定する方法は、比較的少ない。ほとんどの方法は、抗体または抗原を標識することによる方法であり、必然的に測定方法が複雑になり、定量の際に誤差が出てしまう。
【０５１０】
ＢＩＡｃｏｒｅで行われるような表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）は、抗体−抗原相互作用の親和性を測定する従来の方法に比べて、以下に示す多くの利点を有する。（ｉ）抗体または抗原を標識する必要がない。（ｉｉ）抗体を前もって精製しておく必要がなく、細胞培養物の上澄みを直接使用することができる。（ｉｉｉ）リアルタイムで測定が可能。異なるモノクローナル抗体の相互作用を迅速に半定量的に比較することができ、多くの評価目的にも十分である。（ｉｖ）二重特異性表面を作成することができ、一連の異なるモノクローナル抗体を、同一条件下で簡単に比較することができる。（ｖ）分析手順が完全に自動化されており、ユーザの手をわずらわせることなく、多くの測定を行うことができる。ＢＩＡａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、ｖｅｒｓｉｏｎ  ＡＢ（１９９８に増刷）、ＢＩＡＣＯＲＥコード番号ＢＲ−１００１−８６；ＢＩＡｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，ｖｅｒｓｉｏｎ  ＡＢ（１９９８に増刷）、ＢＩＡＣＯＲＥコード番号ＢＲ−１００１−８４。
【０５１１】
ＳＰＲによる結合試験は、結合対の片方をセンサー表面に固定しておくことが必要である。固定した物質をリガンドと呼ぶ。溶液中に存在する方を検体と呼ぶ。いくつかの場合には、リガンドは、別の固定された分子への結合を介し、センサー表面に間接的に接続する。この別の固定された分子を、捕捉分子と呼ぶ。ＳＰＲの応答は、検体が結合したり、解離したりするときに、検出器表面で質量濃度が変化することを反映している。
【０５１２】
ＳＰＲの原理に基づいて、リアルタイムＢＩＡｃｏｒｅ測定は、発生した相互作用を直接モニタリングする。この技術は、速度パラメーターを決定するのに適している。競合的な親和性の順位付けは、きわめて簡単な操作であり、センサーグラムのデータから、速度および親和性定数を誘導することができる。
【０５１３】
リガンド表面に、検体を何回かに分けて注入する場合、得られたセンサーグラムを、３つの重要な段階に分けることができる。（ｉ）サンプルを注入する際に、検体とリガンドとが会合する段階、（ｉｉ）サンプルを注入する際の、平衡状態または定常状態（この状態では、検体の結合速度は、複合体の解離速度とつりあっている）、（ｉｉｉ）バッファを流している間に、表面から検体が解離する段階。
【０５１４】
会合段階および解離段階からは、検体−リガンド相互作用の速度論に関する情報が得られる（複合体の生成速度（ｋａ）および解離速度（ｋｄ）の比率、ｋｄ／ｋａ＝ＫＤ）。平衡段階からは、検体−リガンド相互作用の親和性に関する情報が得られる（ＫＤ）。
【０５１５】
ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアは、数値積分法およびグローバルフィッティングのアルゴリズムを用い、曲線のフィッティングを容易にする包括的なソフトウェアである。単純なＢＩＡｃｏｒｅ観察によって、データを好適に分析し、相互作用の分離速度および親和性定数を得ることができる。この技術で測定可能な親和性の範囲は、ｍＭからｐＭまでの非常に広い範囲である。
【０５１６】
エピトープの特異性は、モノクローナル抗体の重要な特徴である。ＢＩＡｃｏｒｅを用いたエピトープマッピングは、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡまたは他の表面吸着法を用いた従来の技術とは対照的に、抗体を標識したり、精製したりする必要がなく、一連の数種類のモノクローナル抗体を用いた複数箇所での特異性試験を可能にする。さらに、大量の検体を自動的に処理することができる。
【０５１７】
ペアワイズ結合実験（ｐａｉｒ−ｗｉｓｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）は、２種類のＭＡｂが、同じ抗原に同時に結合する能力を試験する。別個のエピトープに向けられるＭＡｂは、独立して結合し、同じエピトープまたは密接に関連するエピトープに向けられるＭＡｂは、互いの結合を干渉しあう。このようなＢＩＡｃｏｒｅを用いた結合実験は、実施が簡単である。
【０５１８】
例えば、第１のＭａｂに結合する捕捉分子を使用した後、抗原および第２のＭＡｂを連続して加えてもよい。センサーグラムでは、以下のことが明らかになる。１．どのくらいの量の抗原が第１のＭＡｂに結合するか、２．第２のＭＡｂが、表面に接続した抗原にどの程度結合するか、３．第２のＭＡｂが結合しない場合、ペアワイズ試験の順序を入れ替えると、結果が変わるかどうか。
【０５１９】
ペプチド阻害は、エピトープマッピングに使用する別の技術である。この方法は、ペアワイズ抗体結合試験と協働して使用することができ、抗原の一次配列が分かっている場合に、エピトープの機能と構造とを関連づけることができる。異なるＭＡｂが、固定された抗原に結合するのを阻害するかについて、ペプチドまたは抗原フラグメントが試験される。所与のＭＡｂの結合を妨害するペプチドは、このＭＡｂで規定されるエピトープに構造的に関連していると予想される。
【０５２０】
（ＸＩ．医薬組成物および投与方法）
ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体または免疫特異的なフラグメントを調製する方法、および処置の必要な対象に投与する方法は、当業者に周知であるか、当業者によって簡単に決定される。結合分子（例えば、結合ポリペプチド、例えば、ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体または免疫特異的なフラグメント）の投与経路は、例えば、経口、非経口であってもよいし、吸入または局所投与によるものであってもよい。非経口という用語は、本明細書で使用するとき、例えば、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、直腸投与、または膣内投与を含む。これらのすべての投与形態が、本発明の範囲に含まれることは明らかであるが、１つの投与形態は、注射用溶液、特に静脈注射用または動脈注射用の溶液または液滴となるであろう。通常は、注射に好適な医薬組成物は、バッファ（例えば、酢酸バッファ、リン酸バッファまたはクエン酸バッファ）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート）を含み得、場合により、安定化剤（例えば、ヒトアルブミン）などを含んでいてもよい。しかし、本明細書の教示に適合する他の方法で、結合分子（例えば、結合ポリペプチド、例えば、ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体または免疫特異的なフラグメント）を、有害な細胞の集合場所に直接送達し、治療薬が罹患組織に届く量を増やしてもよい。
【０５２１】
非経口投与用製剤は、滅菌の水溶液または非水溶液、懸濁物およびエマルションを含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えばオリーブ油）、および注射用の有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）である。水性担体としては、水、アルコール／水溶液、エマルションまたは懸濁物が挙げられる（塩水および緩衝化媒体を含む）。本発明では、医薬的に許容される担体は、限定されないが、０．０１〜０．１Ｍ、好ましくは、０．０５Ｍのリン酸バッファ、または０．８％塩水を含む。他の一般的な非経口ビヒクルとしては、リン酸ナトリウム溶液、Ｒｉｎｇｅｒデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸化Ｒｉｎｇｅｒ溶液、または固定油が挙げられる。静脈用ビヒクルとしては、流体および栄養分補給剤、電解質補給剤（例えば、Ｒｉｎｇｅｒデキストロース系のもの）などが挙げられる。防腐剤、および例えば、抗菌剤、酸化防止剤、キレート化剤および不活性ガスなどの他の添加物が存在してもよい。
【０５２２】
さらに具体的には、注射に好適な医薬組成物は、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散物、およびその場で滅菌中佐溶液または分散物を調製するための滅菌粉末を含む。このような場合、組成物は、滅菌でなければならず、シリンジで容易に取り扱える程度に流体でなければならない。製造条件下、および貯蔵条件下で、安定でなければならず、好ましくは、細菌類および真菌類のような微生物が混入しないように防腐処理がされている。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体のポリエチレングリコールなど）、ならびにこれらの好適な混合物を含む溶媒または分散媒体であり得る。例えば、レシチンのようなコーティングを使用することによって、分散物の場合には所望の粒径を維持することによって、界面活性剤を使用することによって、適切な流動性を維持することができる。本明細書で開示した治療方法で使用するのに好適な配合物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、第１６版（１９８０）に記載されている。
【０５２３】
種々の抗菌剤および抗真菌薬、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどを用い、微生物の作用を防ぐことができる。多くの場合、等張性薬剤（例えば、糖類、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウム）を組成物に含むことが好ましい。吸収を遅らせる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を組成物に加えることによって、注射用組成物の吸収を遅らせることができる。
【０５２４】
いかなる場合でも、滅菌注射溶液は、所望な量の適切な溶媒中、活性化合物（例えば、結合分子（例えば、結合ポリペプチド、例えば、ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体または免疫特異的なフラグメント））自体、または他の活性薬剤とを、本明細書に列挙した１つ以上の成分と組み合わせ、必要な場合には、滅菌濾過することによって調製することができる。一般的に、分散物は、活性化合物を滅菌ビヒクルに組み合わせることによって調製され、分散物には、塩基性分散媒体と、上に列挙した必要な他の成分とを含有する。滅菌注射溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、減圧乾燥および凍結乾燥であり、活性成分と、あらかじめ滅菌濾過しておいた溶液から得た所望な成分とを含む粉末を得る。注射用製剤を加工し、容器（例えば、アンプル、袋、瓶、シリンジまたはバイアル）に入れ、当該技術分野で既知の方法にしたがって無菌状態で密閉する。さらに、製剤を包装し、同時係属中のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／２５９，３３７（ＵＳ−２００２−０１０２２０８  Ａ１、この内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載されるようなキットの形態で販売してもよい。このような製造物品には、好ましくは、この組成物が、自己免疫障害または新生物性障害を患う患者、またはこのような障害を患うおそれがあると診断された患者の治療に有用であることを示すラベルまたは添付物が入っていてもよい。
【０５２５】
本明細書に記載の過剰増殖性障害を治療するのに有効な本発明の組成物の投薬量は、投与手段、標的部位、患者の生理的な状態、患者がヒトであるか動物であるか、投薬中の他の医薬品、予防であるか治療であるかを含む多くの異なる因子によってさまざまである。通常は、患者はヒトであるが、トランスジェニック動物を含む非ヒト哺乳動物を治療してもよい。治療に使う投薬量は、当業者がよく知っている安全性および効力を最適化する一般的な方法を用いて決めてもよい。
【０５２６】
抗体または抗体フラグメントを用いて過剰増殖性障害を治療する場合、投薬量は、例えば、宿主の体重１ｋｇあたり、約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、さらに一般的には０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇなど）であり得る。例えば、投薬量は、体重１ｋｇあたり、１ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇであってもよく、または１〜１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｋｇであってもよい。上述の範囲に含まれる中間的な値も、本発明の範囲に入ることを意図している。対象に、このような投薬量を毎日、１日おき、週に１回、または経験的な判断によって決定した任意の他の間隔で投与してもよい。治療の例には、長期間にわたる複数回の投与、例えば、少なくとも６カ月にわたる投与も当然含む。治療計画のさらなる例には、２週間に１回、または１カ月に１回、または３〜６カ月に１回の投与も含む。投薬計画の例としては、１〜１０ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ／ｋｇを毎日連続投与、３０ｍｇ／ｋｇを１日おきに投与、または６０ｍｇ／ｋｇを週に１回投与する計画も含まれる。いくつかの方法では、異なる結合特異性を有する２つ以上のモノクローナル抗体を同時に投与し、この場合、投与されるそれぞれの抗体の投薬量は、上に記載の範囲内である。
【０５２７】
本明細書に開示したＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体または免疫特異的なフラグメントを、複数回投与してもよい。１種類の投薬の間隔は、週に１回、月に１回、または年に１回であってもよい。投薬間隔は、不規則であってもよく、患者の標的ポリペプチドまたは標的分子の血中濃度を測定することによって調整してもよい。いくつかの方法では、投薬量は、血漿ポリペプチド濃度が１〜１０００μｇ／ｍｌになるように、いくつかの場合、２５〜３００μｇ／ｍｌになるように調節する。あるいは、結合分子を徐放性配合物として投与してもよい。この場合、必要とされる投与頻度はより少なくなる。投薬量および投薬頻度は、患者における抗体の半減期によって変わる。結合分子の半減期は、安定なポリペプチドまたは安定な部分（例えば、アルブミンまたはＰＥＧ）に融合させることによって長くできる。一般的に、ヒト化抗体は、半減期が最も長く、次いでキメラ抗体および非ヒト抗体である。ある実施形態では、本発明の結合分子は、接合していない形態で投与されてもよい。別の実施形態では、本明細書に開示した方法で使用する結合分子（例えば、結合ポリペプチド、例えば、ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体または免疫特異的なフラグメント）は、接合した形態で複数回投与されてもよい。さらに別の実施形態では、本発明の結合分子は、接合していない形態で投与し、次いで接合している状態で投与してもよいし、逆の順序で投与してもよい。
【０５２８】
投薬量および投薬頻度は、治療であるか予防であるかによっても変わり得る。予防用途の場合、抗体またはその混合物を含む組成物を、まだその疾患の症状が出ていない、または前症状患者に投与し、その疾患への抵抗力をつける。このような場合の量は、「予防に効果的な投薬量」と定義される。この用途でも、正確な量は、患者の健康状態および全身の免疫状態によって変わるが、一般的には、１回の投薬あたり０．１〜２５ｍｇであり、特に、１回の投薬あたり０．５〜２．５ｍｇである。長期間にわたって、比較的不定期に、比較的少ない量を投与する。中には、残りの人生ずっと患者に投与し続ける場合もある。  
【０５２９】
治療用途の場合、比較的多い量（例えば、結合分子（例えば、抗体）を１回の投薬あたり約１〜４００ｍｇ／ｋｇ、放射線免疫接合体の場合、５〜２５ｍｇ、細胞毒−薬物接合分子の場合には、これより多い量）を比較的短い間隔で、疾患の進行が遅くなるか、または抑えられるまで、好ましくは、患者が疾患の症状が部分的または完全に軽快したと申告するまで、必要な回数投与する必要がある場合がある。その後、予防計画に沿って患者に投与してもよい。
【０５３０】
ある実施形態では、対象を、ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体または免疫特異的なフラグメントをコードする核酸分子（例えば、ベクターに入っている）で治療してもよい。ポリペプチドをコードする核酸の投薬量は、患者あたり、ＤＮＡ約１０ｎｇ〜１ｇ、１００ｎｇ〜１００ｍｇ、１μｇ〜１０ｍｇ、または３０〜３００μｇである。感染ウイルスベクターの投薬量は、１回の投薬あたり、ビリオンを１０〜１００、またはそれ以上である。
【０５３１】
治療薬を、予防および／または治療のために、非経口、局所、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、腹腔内、経鼻または筋肉に投与してもよい。いくつかの方法では、ＩＧＦ−１Ｒを発現する細胞が集まっている特定の組織に薬剤を直接注射する（例えば、頭蓋内注射）。抗体を投与する場合、筋肉内注射または静脈内注射が好ましい。いくつかの方法では、特定の治療用抗体を、頭蓋に直接注射する。いくつかの方法では、抗体を徐放性組成物または徐放性デバイスとして投与する（例えば、ＭｅｄｉｐａｄＴＭデバイス）。
【０５３２】
本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体またはそのフラグメントは、場合により、治療（例えば、予防または治療）の必要な障害または状態に有効な他の薬剤と組み合わせて投与される。
【０５３３】
９０Ｙ標識した結合ポリペプチドの効果的な１回の投薬量（すなわち、治療に有効な量）は、約５〜約７５ｍＣｉ、さらに好ましくは約１０〜約４０ｍＣｉである。１３１Ｉ標識した抗体を、骨髄を切除しないで投薬する１回の有効投薬量は、約５〜約７０ｍＣｉ、さらに好ましくは約５〜約４０ｍＣｉである。骨髄を切除して投薬する場合（すなわち、骨髄の自己移植が必要な場合）の、１３１Ｉ標識した抗体の有効投薬量は、約３０〜約６００ｍＣｉ、さらに好ましくは約５０〜約５００ｍＣｉ未満である。キメラ抗体と組み合わせる場合、対応するマウス抗体よりも血中半減期が長いため、１３１Ｉ標識したキメラ抗体を、骨髄を切除しないで投薬する１回の有効投薬量は、約５〜約４０ｍＣｉ、さらに好ましくは、約３０ｍＣｉ未満である。例えば、１１１Ｉｎ標識の造影基準は、典型的には、約５ｍＣｉ未満である。
【０５３４】
１３１Ｉおよび９０Ｙについてきわめて多くの臨床例が得られているが、他の放射性標識も当該技術分野で知られており、同様の目的で使用される。さらなる他の放射性同位体も造影に使用される。例えば、本発明の範囲で適合するさらなる放射性同位体としては、限定されないが、１２３Ｉ、１２５Ｉ、３２Ｐ、５７Ｃｏ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、７７Ｂｒ、８１Ｒｂ、８１Ｋｒ、８７Ｓｒ、１１３Ｉｎ、１２７Ｃｓ、１２９Ｃｓ、１３２Ｉ、１９７Ｈｇ、２０３Ｐｂ、２０６Ｂｉ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、４７Ｓｃ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１５３Ｓｍ、１８８Ｒｅ、１９９Ａｕ、２２５Ａｃ、２１１Ａｔおよび２１３Ｂｉが挙げられる。この観点で、α放射体、γ放射体およびβ放射体のいずれも本発明に適している。さらに、本開示の観点から、当業者は、過度の実験をすることなく、選択した一連の治療にどの放射性核種が適しているのかを簡単に決定することができるであろう。この目的のために、臨床診断で既に使用されているさらなる放射性核種としては、１２５Ｉ、１２３Ｉ、９９Ｔｃ、４３Ｋ、５２Ｆｅ、６７Ｇａ、６８Ｇａおよび１１１Ｉｎが挙げられる。標的への免疫治療で使用するために、種々の放射性核種で抗体を標識する（Ｐｅｉｒｅｒｓｚら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６５：１１１−１２５（１９８７））。これらの放射性核種としては、あまり頻度は高くないが、１８８Ｒｅおよび１８６Ｒｅ、および１９９Ａｕおよび６７Ｃｕが挙げられる。米国特許第５，４６０，７８５号は、このような放射性同位体に関するさらなるデータを提供しており、この内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０５３５】
本明細書に開示したＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体または免疫特異的なフラグメントを、接合した形態で使用するか、または接合していない形態で使用するかによらず、本発明の主な利点は、この化合物を骨髄抑制状態の患者、特に、放射線治療または化学療法のような補助療法を受けているか、または過去に受けた患者に使用可能であることが理解されるであろう。すなわち、この分子が、有益な送達プロフィールを有しているため（すなわち、血清残存時間が比較的短い、結合親和性が高い、局所性が高い）、骨髄予備能が低い患者および骨髄毒性に感受性が高い患者を治療するのに特に有用である。この観点から、この分子が固有の送達プロフィールを有しているため、骨髄抑制状態の癌患者に対し、放射能標識した接合体を投与することがきわめて有効である。このように、本明細書で開示したＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体または免疫特異的なフラグメントは、外部からの放射線照射または化学療法のような補助療法を受けているか、または過去に受けた患者に、接合している形態または接合していない形態で有用である。他の好ましい実施形態では、結合分子（例えば、結合ポリペプチド、例えば、ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体または免疫特異的なフラグメント、接合している形態または接合していない形態）を、化学療法との組み合わせ治療で使用してもよい。当業者は、このような治療計画で、開示した抗体または他の結合分子と、１つ以上の化学治療薬とを連続的に、同時に、一緒に、またはともに投与すしてもよい。本発明のこの態様で特に好ましい実施形態は、放射能標識した結合ポリペプチドの投与を含む。
【０５３６】
ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体または免疫特異的なフラグメントを前段落で説明したように投与することができるが、他の実施形態では、接合しているか、または接合していない結合分子を、第１の治療薬として、それ以外は健康な患者に投与してもよいことを強調しておく。このような実施形態では、結合分子を、骨髄予備能が正常または平均的な患者、および／または外部からの放射線照射または化学療法のような補助療法を受けたことがなく、現在受けていない患者に投与してもよい。
【０５３７】
しかし、上述のように、本発明の所定の実施形態は、骨髄抑制状態の患者に、ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体または免疫特異的なフラグメントを投与する工程、または放射線治療または化学療法のような１つ以上の補助療法と組み合わせて、ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体または免疫特異的なフラグメントを投与する（すなわち、組み合わせ治療）工程を含む。本明細書で使用するとき、ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体または免疫特異的なフラグメントを、補助療法とあわせて、または補助療法と組み合わせて投与するとは、補助療法の投与または適用と、開示した結合分子の投与または適用とを連続的に、同時に、一緒に、またはともに行うことを意味する。当業者は、組み合わせ治療の種々の要素の投与または適用を、全体的な治療が有効に働くように時間を調節してもよいことを理解するであろう。例えば、本明細書に記載の放射免疫接合物を投与してから数週間以内に、化学治療薬を、標準的な、周知の一連の治療形態で投与してもよい。逆に、細胞毒に接合した結合分子を、静脈内投与した後、腫瘍部位に局所的に外側から放射線を照射してもよい。さらに他の実施形態では、１回の通院で、結合分子を、１つ以上の選択した化学治療薬と同時に投与してもよい。当業者（例えば、経験豊富な癌専門医）は、選択した補助療法および本明細書の教示に基づいて、過度な実験をすることなく、有効な組み合わせ治療計画を作ることができる。
【０５３８】
この観点で、結合分子（細胞毒を含んでいても、含んでいなくてもよい）と、化学治療薬との組み合わせを、患者にとって有益な治療になるように、任意の順序、任意の期間で投与してもよい。すなわち、化学治療薬と、ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体または免疫特異的なフラグメントとを、任意の順序で、または同時に投与してもよい。所定の実施形態では、本発明のＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体または免疫特異的なフラグメントを、すでに化学療法を受けた患者に投与する。さらに他の実施形態では、本発明のＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体または免疫特異的なフラグメントを、化学治療薬を用いた治療と実質的に同時に、または同時に投与する。例えば、患者は、化学療法を受けている最中に、結合分子を摂取してもよい。好ましい実施形態では、結合分子を、任意の化学治療薬または治療から１年以内に投与する。他の好ましい実施形態では、ポリペプチドを、任意の化学治療薬または治療から１０カ月、８カ月、６カ月、４カ月、または２カ月以内に投与する。さらに他の好ましい実施形態では、結合分子を、任意の化学治療薬または治療から４週間、３週間、２週間、または１週間以内に投与する。さらに他の実施形態では、結合分子を、任意の化学治療薬または治療から５日、４日、３日、２日または１日以内に投与する。２種類以上の薬剤または治療を、数時間以内または数分以内（すなわち、実質的に同時に）患者に投与してもよいことも理解されるであろう。
【０５３９】
さらに、本発明によれば、骨髄抑制状態の患者とは、血球数が低下している任意の患者も意味する。当業者は、骨髄抑制状態の臨床的な指標として従来から使用してきたいくつかの血球数のパラメーターが存在し、患者がどの程度の骨髄抑制状態にあるかを簡単に測定することができることを理解するであろう。骨髄抑制状態の測定法として受け入れられている方法の例は、Ａｂｓｏｌｕｔｅ  Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  Ｃｏｕｎｔ（ＡＮＣ）または血小板の計測法である。このような骨髄抑制状態または部分的な骨髄抑制状態は、種々の生化学的な障害または疾患の結果として起こることもあり、化学療法または放射線治療の結果として起こることが多い。この観点で、当業者は、一般的な化学療法を受けた患者で、典型的には、骨髄予備能が低下するということを理解するであろう。上述のように、このような対象は、死亡率や罹患率を高める貧血または免疫抑制状態といった受け入れられない副作用のために、最適量の細胞毒（すなわち、放射性核種）を用いて治療することができない場合が多い。
【０５４０】
より具体的には、接合されたか、または接合されていない本発明のＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体または免疫特異的なフラグメントを使用し、ＡＮＣが約２０００／ｍｍ３未満、または血小板数が１５０，０００／ｍｍ３未満の患者を有効に治療することができる。さらに好ましくは、本発明のＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体または免疫特異的なフラグメントを使用し、ＡＮＣが約１５００／ｍｍ３未満、または約１０００／ｍｍ３未満、さらに好ましくは約５００／ｍｍ３未満の患者を有効に治療することができる。同様に、本発明のＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体または免疫特異的なフラグメントを使用し、血小板数が約７５，０００／ｍｍ３未満、または約５０，０００／ｍｍ３未満、さらに約１０，０００／ｍｍ３未満の患者を有効に治療するきおとができる。さらに一般的な意味で、当業者は、患者が骨髄抑制状態にある場合、政府の実施ガイドラインおよび手順を用い、容易に決定することができる。
【０５４１】
上述のように、多くの骨髄抑制状態の患者は、化学療法、移植による放射線治療または外部からの放射線治療を含む一連の治療を受けている。外部からの放射線治療の場合、この外部の放射線源は、悪性細胞に局所的に照射するものである。移植による放射線治療の場合、手術によって、放射性試薬を悪性細胞に入れ、疾患部位に選択的に照射する。いかなる場合でも、本発明のＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体または免疫特異的なフラグメントを使用して、原因にかかわらず、骨髄抑制状態を示す患者の障害を治療することができる。
【０５４２】
この観点では、本発明のＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体または免疫特異的なフラグメントを、任意の化学治療薬または薬剤と合わせて、または組み合わせて使用し（例えば、組み合わせ治療計画を提供し）、インビボで新生物細胞の成長を止めるか、成長を遅らせるか、成長を阻害するか、または成長を制御してもよいことも理解されるであろう。上述のように、このような薬剤は、骨髄予備能を低下させることが多い。このような患者の新生物を積極的に治療可能な利点を有する本発明の化合物の骨髄毒性を減らすことによって、骨髄予備能の低下を、全体的または部分的に相殺しうる。他の実施形態では、本明細書に開示した、放射能標識した免疫接合体を、放射性核種に対する新生物細胞の感受性を高める放射線増感剤として有効に使用することができる。例えば、放射能標識した結合分子が、血流にほとんど存在しなくなった後、腫瘍部位には治療に有効な濃度でとどまっている時点で、放射線増感剤を投与してもよい。
【０５４３】
本発明のこのような態様では、本発明に適合する化学治療薬の例としては、アルキル化剤、ビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、プロカルバジン、メトトレキサートおよびプレドニゾンが挙げられる。これらの４種類の薬物の組み合わせであるＭＯＰＰ（メクレタミン（ｍｅｃｈｌｅｔｈａｍｉｎｅ）（ナイトロジェンマスタード）、（オンコビン）、プロカルバジンおよびプレドニゾン）は、さまざまなリンパ腫を治療するのにきわめて有効であり、本発明の好ましい実施形態を成す。耐ＭＯＰＰ性の患者では、ＡＢＶＤ（例えばアドリアマイシン、ブレオマイシン、ビンブラスチンおよびダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ））、ＣｈｌＶＰＰ（クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、ビンブラスチン、プロカルバジンおよびプレドニゾン）、ＣＡＢＳ（ロムスチン（ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ）、ドキソルビシン、ブレオマイシンおよびストレプトゾトシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ））、ＭＯＰＰ＋ＡＢＶＤ、ＭＯＰＰ＋ＡＢＶ（ドキソルビシン、ブレオマイシンおよびビンブラスチン）またはＢＣＶＰＰ（カルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ）、シクロホスファミド、ビンブラスチン、プロカルバジンおよびプレドニゾン）の組合せが使用できる。標準的な投薬量および投薬計画については、Ａｒｎｏｌｄ  Ｓ．Ｆｒｅｅｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｌｅｅ  Ｍ．Ｎａｄｌｅｒ，Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｌｙｍｐｈｏｍａｓ、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １７７４−１７８８（Ｋｕｒｔ  Ｊ．Ｉｓｓｅｌｂａｃｈｅｒら編、第１３版、１９９４）およびＶ．Ｔ．ＤｅＶｉｔａら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、１５：８６７−８６９（１９９７）および引用文献。これらの治療をそのまま用いてもよいし、本発明の１種以上のＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体または免疫特異的なフラグメントと組み合わせて、特定の患者の必要に応じて変更して使用してもよい。
【０５４４】
本発明において有用なさらなる治療法は、シクロフォスファミドもしくはクロラムブシルのような単一のアルキル化剤、またはＣＶＰ（シクロフォスファミド、ビンクリスチンおよびプレドニゾン）、ＣＨＯＰ（ＣＶＰおよびドキソルビシン）、Ｃ−ＭＯＰＰ（シクロフォスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾンおよびプロカルバジン）、ＣＡＰ−ＢＯＰ（ＣＨＯＰ＋プロカルバジンとブレオマイシン）、ｍ−ＢＡＣＯＤ（ＣＨＯＰ＋メトトレキサート、ブレオマイシンおよびロイコボリン（ｌｅｕｃｏｖｏｒｉｎ））、ＰｒｏＭＡＣＥ−ＭＯＰＰ（プレドニゾン、メトトレキサート、ドキソルビシン、シクロフォスファミド、エトポシドおよびロイコボリン＋標準的ＭＯＰＰ）、ＰｒｏＭＡＣＥ−ＣｙｔａＢＯＭ（プレドニゾン、ドキソルビシン、シクロフォスファミド、エトポシド、シタラビン、ブレオマイシン、ビンクリスチン、メトトレキサートおよびロイコボリン）およびＭＡＣＯＰ−Ｂ（メトトレキサート、ドキソルビシン、シクロフォスファミド、ビンクリスチン、固定服用量プレドニゾン、ブレオマイシンおよびロイコボリン）などの組合せの使用を含む。当業者は上述のそれぞれの治療法について容易に標準的な投薬量および投薬計画を決定できるであろう。ＣＨＯＰは、ブレオマイシン、メトトレキサート、プロカルバジン、ナイトロジェンマスタード、シトシンアラビノシッドおよびエトポシドと組み合わせても用いられている。他の適合する化学療法剤としては、限定されないが、２−クロロデオキシアデノシン（２−ＣＤＡ）、２’−デオキシコフォルマイシンおよびフルダラビンが挙げられる。
【０５４５】
悪性度が中程度から高度の患者については、寛解していないか、または再発している場合、サルベージ治療が使用される。サルベージ治療は、シトシンアラビノシド、シスプラチン、カルボプラチン、エトポシドおよびイホスファミドなどの薬剤を単独で、または組み合わせて使用する。ある種の新生物障害の再発した形態または進行中の形態では、以下のプロトコルを使用することが多い。ＩＭＶＰ−１６（イホスファミド、メトトレキサートおよびエトポシド）、ＭＩＭＥ（メチル−ギャグ（ｍｅｔｈｙｌ−ｇａｇ）、イホスファミド、メトトレキサートおよびエトポシド）、ＤＨＡＰ（デクサメタゾン、高用量シタラビンおよびシスプラチン）、ＥＳＨＡＰ（エトポシド、メチルプレディゾロン（ｍｅｔｈｙｌｐｒｅｄｉｓｏｌｏｎｅ）、ＨＤシタラビン、シスプラチン）、ＣＥＰＰ（Ｂ）（シクロフォスファミド、エトポシド、プロカルバジン、プレドニゾンおよびブレオマイシン）、およびＣＡＭＰ（ロムスチン、ミトキサントロン、シタラビンおよびプレドニゾン）。いずれも、周知の投薬速度および投薬計画で行う。
【０５４６】
本発明のＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体または免疫特異的なフラグメントと組み合わせて使用する化学治療薬の量は、対象によってさまざまであり、または当該技術分野で知られている方法にしたがって投与されてもよい。例えば、Ｂｒｕｃｅ  Ａ  Ｃｈａｂｎｅｒら、Ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ、Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  １２３３−１２８７（Ｊｏｅｌ  Ｇ．Ｈａｒｄｍａｎら編、第９版（１９９６）を参照）。
【０５４７】
別の実施形態では、本発明のＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体または免疫特異的なフラグメントを、生物製剤と組み合わせて投与する。癌治療に有用な生物製剤は、当該技術分野で知られており、本発明の結合分子を、例えば、このような既知の生物製剤と組み合わせて投与してもよい。
【０５４８】
例えば、ＦＤＡは、乳癌の治療に、以下の生物製剤を承認している。ハーセプチン（Ｒ）（トラスツズマブ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．（カリフォルニア州南サンフランシスコ；ＨＥＲ２陽性の乳癌において抗腫瘍活性を有するヒト化モノクローナル抗体）；Ｆａｓｌｏｄｅｘ（Ｒ）（フルベストラント、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＬＰ（デラウエア州ウィルミントン）；乳癌治療に使用するエストロゲン受容体アンタゴニスト）；Ａｒｉｍｉｄｅｘ（Ｒ）（アナストロゾール、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＬＰ；エストロゲンを作るのに必要なアロマターゼをブロックする非ステロイド系アロマターゼ阻害剤）；Ａｒｏｍａｓｉｎ（Ｒ）（エキセメスタン、Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．（ニューヨーク州ニューヨーク）；乳癌治療に使用する不可逆性ステロイド系アロマターゼ不活化剤）；Ｆｅｍａｒａ（Ｒ）（レトロゾール、Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（ニュージャージー州イーストハノーバー）；ＦＤＡが承認した乳癌治療用の非ステロイド系アロマターゼ阻害剤）；およびＮｏｌｖａｄｅｘ（Ｒ）（タモキシフェン、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＬＰ；ＦＤＡが承認した乳癌治療用の非ステロイド系抗エストロゲン薬）。本発明の結合分子を組み合わせてもよい他の生物製剤としては、以下のものが挙げられる。ＡｖａｓｔｉｎＴＭ（ベバシズマブ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．；最初にＦＤＡが承認した、血管形成を阻害するように設計された治療薬）；およびＺｅｖａｌｉｎ（Ｒ）（イブリツモマブチウキセタン、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ（マサチューセッツ州ケンブリッジ；放射能標識したモノクローナル抗体、現時点では、Ｂ細胞リンパ腫の治療薬として承認されている）。
【０５４９】
これに加え、ＦＤＡは、直腸癌の治療に、以下の生物製剤を承認している。ＡｖａｓｔｉｎＴＭ；ＥｒｂｉｔｕｘＴＭ（セツキシマブ、ＩｍＣｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．（ニューヨーク州ニューヨーク）、およびＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ（ニューヨーク州ニューヨーク）；これは、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に対するモノクローナル抗体である）；Ｇｌｅｅｖｅｃ（Ｒ）（メシル酸イマチニブ；タンパク質キナーゼ阻害剤）；およびＥｒｇａｍｉｓｏｌ（Ｒ）（塩酸レバミゾール、Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＬＰ（ニュージャージー州タイタスビル）；ＦＤＡによって１９９０年に承認された免疫修飾物質、Ｄｕｋｅｓ’  Ｓｔａｇｅ  Ｃ結腸癌患者の外科切除後に、５−フルオロウラシルと組み合わせた治療のアジュバントとして）。
【０５５０】
非ホジキンリンパ腫の治療で使用する場合、現時点で承認されている治療薬としては、以下のものが挙げられる。Ｂｅｘｘａｒ（Ｒ）（トシツモマブおよびヨウ素  Ｉ−１３１トシツモマブ、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ，  ＮＣ；放射能活性分子（ヨウ素Ｉ−１３１）に結合したマウスモノクローナル抗体（トシツモマブ）が関与する多段階治療）；Ｉｎｔｒｏｎ（Ｒ）Ａ（インターフェロンα−２ｂ、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ニュージャージー州ケニルワース；アントラサイクリンを含有する組み合わせ化学療法（例えば、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチンおよびプレドニゾン［ＣＨＯＰ］）と組み合わせて使用する、小胞非ホジキンリンパ腫の治療で承認されたインターフェロンの一種）；Ｒｉｔｕｘａｎ（Ｒ）（リツキシマブ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．（カリフォルニア州ミナミサンフランシスコ）、およびＢｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ（マサチューセッツ州ケンブリッジ）；非ホジキンリンパ腫の治療で承認されたモノクローナル抗体；Ｏｎｔａｋ（Ｒ）（デニロイキンジフチトクス、Ｌｉｇａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．（カリフォルニア州サンディエゴ）；インターロイキン−２に遺伝的に融合したジフテリア毒素のフラグメントからなる融合タンパク質）；およびＺｅｖａｌｉｎ（Ｒ）（イブリツモマブチウキセタン、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ；Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫の治療でＦＤＡが承認した、放射能標識したモノクローナル抗体）。
【０５５１】
白血病の治療で使用する場合、本発明の結合分子と組み合わせて使用可能な生物製剤の例としては、以下のものが挙げられる。Ｇｌｅｅｖｅｃ（Ｒ）；Ｃａｍｐａｔｈ（Ｒ）−１Ｈ（アレムツズマブ、Ｂｅｒｌｅｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（カリフォルニアシュウリッチモンド）；慢性リンパ性白血病の治療で使用するモノクローナル抗体の一種）。さらに、Ｇｅｎａｓｅｎｓｅ（オブリメルセン、Ｇｅｎｔａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ニュージャージー州バークレーヘイツ（Ｂｅｒｋｌｅｙ  Ｈｅｉｇｈｔｓ））；白血病を治療するための開発において、使用可能なＢＣＬ−２アンチセンス治療（例えば、単独で、またはフルダラビンおよびシクロホスファミドのような１つ以上の化学治療薬と組み合わせて）を、特許請求の範囲に記載の結合分子とともに投与してもよい。
【０５５２】
肺癌を治療する場合、生物製剤の例としては、ＴａｒｃｅｖａＴＭ（エルロチニブＨＣＬ、ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．（ニューヨーク州メルビル）；ヒト上皮成長因子受容体１（ＨＥＲ１）の経路を標的とするように設計された小分子）が挙げられる。
【０５５３】
多発性骨髄腫を治療する場合、生物製剤の例としては、Ｖｅｌｃａｄｅ（Ｒ）Ｖｅｌｃａｄｅ（ボルテゾミブ、Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（マサチューセッツ州ケンブリッジ）；プロテアソーム阻害剤）が挙げられる。さらなる生物製剤としては、Ｔｈａｌｉｄｏｍｉｄ（Ｒ）（サリドマイド、Ｃｌｅｇｅｎｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ニュージャージー州ウォレン）；免疫修飾剤、骨髄腫細胞の成長および生存を阻害する能力、抗血管形成能力を含む複数の作用を有すると考えられている）が挙げられる。
【０５５４】
他の生物製剤の例としては、ＩｍＣｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（ニューヨーク州ニューヨーク）で開発されたＭＯＡＢ  ＩＭＣ−Ｃ２２５が挙げられる。
【０５５５】
すでに記載したように、本発明のＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体または免疫特異的なフラグメント、またはその組み換え体を、哺乳動物の過剰増殖性障害をインビボで治療するための医薬品として有効な量で投与してもよい。この観点で、開示した抗体を、投与しやすく、活性薬剤の安定性を高めるように配合してもよいことが理解されるであろう。好ましくは、本発明の医薬組成物は、医薬品として許容される、毒性のない滅菌担体（例えば、生理食塩水、非毒性バッファ、防腐剤など）を含む。本発明の適用のために、本発明のＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体または免疫特異的なフラグメント、またはその組み換え体の医薬品（接合していない状態で、または治療薬と接合した状態）として有効な量とは、標的に有効に結合させ、利益を得る（例えば、疾患または障害の症状を軽減し、または基質または細胞を検出する）のに十分な量である。腫瘍細胞の場合、結合分子は、好ましくは、新生物細胞または免疫反応性細胞（例えば、新生物細胞に関連する血管細胞）で、所定の免疫反応性の抗原と相互作用し、これらの細胞の死滅率を高めることができる。もちろん、本発明の医薬組成物を、医薬品として有効量の結合分子を提供するような用量で、１回または複数回投与してもよい。
【０５５６】
本開示の範囲内で、本発明のＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体または免疫特異的なフラグメントを、治療効果または予防効果を得るのに十分な量で、上述の治療方法にしたがって、ヒトまたは他の動物に投与することができる。本発明のＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体または免疫特異的なフラグメントを、既知の技術に従って、本発明の抗体と、従来の医薬的に許容される担体または希釈剤とを混合することによって調製される従来の投薬形態で、ヒトまたは他の動物に投与することができる。医薬的に許容される担体または希釈剤の形態および性質が、組み合わせる活性成分の量、投与経路および他の周知の変数によって示されることを、当業者は理解するであろう。当業者は、本発明の１つ以上の結合分子を含む混合物が、特に有効であると判明し得ることも理解するであろう。
【０５５７】
本発明の実施は、他の意味であると示されていない限り、細胞生物学、細胞培養学、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組み換えＤＮＡおよび免疫学の一般的な技術を利用しており、これらの技術は、当該技術分野の専門技術の範囲内である。このような技術は、文献に完全に説明されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：（１９８９）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｍａｎｉａｔｉｓら編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編（１９８４）；Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４，６８３，１９５号；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ、Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ、Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；論文Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ、Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８７）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４  ａｎｄ  １５５（Ｗｕら編）；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ（１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶ、Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編（１９８６）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８６）；およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）を参照。
【０５５８】
抗体の遺伝子操作に関する一般的な原理は、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第２版、Ｃ．Ａ．Ｋ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（１９９５）に記載されている。タンパク質の遺伝子操作に関する一般的な原理は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｒｉｃｋｗｏｏｄ，Ｄ．ら編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇ．（１９９５）に記載されている。抗体および抗体−ハプテン結合の一般的な原理は、Ｎｉｓｏｎｏｆｆ，Ａ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第２版、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、ＭＡ（１９８４）；およびＳｔｅｗａｒｄ，Ｍ．Ｗ．、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｔｈｅｉｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，（ニューヨーク州ニューヨーク）（１９８４）に記載されている。さらに、当該技術分野で既知の免疫学の標準的な方法、および特定的にではなく記載されている方法は、一般的に、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｓｔｉｔｅｓら（編）、Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ−Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）  ａｎｄ  Ｍｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｉｉｇｉ（編）、Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）に記載されている。
【０５５９】
免疫学の一般的な原理を記載している標準的な参考文献としては、以下のものが挙げられる。Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｋｌｅｉｎ，Ｊ．、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｓｅｌｆ−Ｎｏｎｓｅｌｆ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２）；Ｋｅｎｎｅｔｔ，Ｒ．ら編、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）；Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ａ．、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、Ｂｕｒｄｅｎ，Ｒ．ら編、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１３、Ｅｌｓｅｖｅｒｅ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９８４）、Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４ｔｈ  ｅｄ．Ｅｄ．Ｒｉｃｈａｒｄ  Ａ．Ｇｏｌｄｓｂｙ、Ｔｈｏｍａｓ  Ｊ．ＫｉｎｄｔおよびＢａｒｂａｒａ  Ａ．Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎｄ  ＆  Ｃｏ．（２０００）；Ｒｏｉｔｔ，Ｉ．、Ｂｒｏｓｔｏｆｆ，Ｊ．およびＭａｌｅ  Ｄ．、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６ｔｈ  ｅｄ．Ｌｏｎｄｏｎ：Ｍｏｓｂｙ（２００１）；Ａｂｂａｓ  Ａ．、Ａｂｕｌ，Ａ．およびＬｉｃｈｔｍａｎ，Ａ．、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｅｄ．５、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（２００５）；ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＤｕｂｅｌ、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｎ（２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）；Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ  ＶＩＩＩ，Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ（２００３）；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）；Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｄｖｅｋｓｌｅｒ、ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（２００３）。
【０５６０】
上に引用した参考文献、およびそこに引用されている参考文献はすべて、その内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０５６１】
（実施例１  ファージライブラリからの、ＩＧＦ−１Ｒに特異的なＦａｂの選択）
組み換えヒトＩＧＦ−１Ｒの細胞外領域を用い、３．５×１０１０種類の固有なクローンを含有する、未処理の（ｎａｉｖｅ）ヒトファージミドＦａｂライブラリをスクリーニングした（Ｈｏｅｔ、Ｒ．Ｍ．ら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（３）：３４４−８（２００５）（「Ｈｏｅｔら」）、この内容全体は、参照することにより本明細書に組み込まれる）。ビオチン化ＩＧＦ１Ｒ−ｈｉｓタンパク質およびＩＧＦ１Ｒ−Ｆｃタンパク質を用い、２種類の別個のパンニングを行った。上述のタンパク質を、ストレプトアビジンでコーティングした磁気ビーズで捕捉した後、上述のファージライブラリとともにインキュベートした。ＩＧＦ１Ｒ−Ｆｃの場合、ビオチン化した抗−Ｆｃ抗体を磁気ビーズで捕捉し、次いでＦｃ融合タンパク質を捕捉した。Ｈｏｅｔらが記載したように選別した。パンニング操作を３回行った後、ＭｌｕＩ消化によって４７９ｂｐのＩＩＩ型遺伝子片を取り出し、ＴＧ１細胞で可溶性Ｆａｂを発現させるために、ベクターを再び連結した。ビオチン化ＩＧＦ１Ｒ−ｈｉｓを用いた実験から得た９２０クローンをＥＬＩＳＡ分析し、５９３種類のポジティブクローンを得た。このポジティブクローンには、３３種類の固有な配列が含まれていた。ＩＧＦ１Ｒ−Ｆｃを用いた実験から得た９２０クローンをＥＬＩＳＡ分析し、１６３種類のポジティブクローンを得た。このポジティブクローンには、１２種類の固有な配列が含まれていた。両方のパンニングで得たすべてのクローンの配列を単離して分析し、１２種類のクローンを決定した。固有のクローンを精製し、ＥＬＩＳＡによって、組み換えヒトＩＧＦ−１Ｒ細胞外領域への結合性を再確認し、全長ヒトＩＧＦ−１Ｒで安定にトランスフェクションした３Ｔ３細胞で結合性を再確認した（図１Ａおよび図１Ｂ）。結合データに基づき、両パンニング実験で得た１２種類の固有なクローンのうち、６種類を選抜して、さらに分析を行った。
【０５６２】
（実施例２  腫瘍細胞で発現したＩＧＦ−１Ｒに対するＦａｂの結合活性）
Ｆａｂが、野生型ＩＧＦ−１Ｒに結合する能力を、ＭＣＦ−７腫瘍細胞系を用い、フローサイトメトリーによって決定した。
【０５６３】
アッセイの準備をする２４時間前に、ＭＣＦ−７細胞（アメリカ国立癌研究所（ＮＣＩ）から得たヒト乳腺腺癌）を継代し、７０％コンフルエントの単一層を得た。通常、ＭＣＦ−７細胞系の継代数は２０を超えないようにした。細胞を細胞解離バッファ（Ｇｉｂｃｏ  カタログ番号１３１５１−０１４）に入れ、数を計測し、洗浄し、１×１０６細胞／ｍＬになるように調節し、各チューブ（１２×７５ｍｍチューブ、Ｆａｌｃｏｎカタログ番号３５２０５４）に細胞１ｍＬを加えた。１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞をペレット状にし、上澄みを除去し、この細胞ペレットに、希釈した抗体１００μｌを加えた。初期濃度２１０μｇ／ｍＬまたは６０μｇ／ｍＬの精製したＦａｂをＦＡＣＳバッファで１：３希釈し、０．００１μｇ／ｍＬまで希釈して試験した。このアッセイで使用したＦＡＣＳバッファは、すべて、１％  ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ  カタログ番号Ａ−７９０６；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．（米国モントリオール州セントルイス））と、０．１％ナトリウムアジド（Ｓｉｇｍａ  カタログ番号Ｓ２００２）とを含有するＰＢＳであった（Ｃａ＋＋／Ｍｇ＋＋を含有しない）。ポジティブコントロールＩＲ３として、マウス抗体（Ａｂ−１；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  番号ＧＲ１１Ｌ）を使用した。サンプルを氷上で１時間１５分インキュベートし、ＦＡＣＳバッファ２ｍＬで洗浄し、４℃で、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上澄みを吸引し、それぞれの対応するチューブに、第２の検出抗体１００μＬを、ＦＡＣＳバッファを用いて加えた。次いで、光の入らない状態で、サンプルを氷上で３０分間インキュベートした。細胞を上述のように洗浄し、チューブ／サンプルあたり、ＦＡＣＳバッファ２５０μＬに再び懸濁させた。
【０５６４】
ＦＩＴＣ結合親和性で精製したＦ（ａｂ’）２フラグメントに特異的な、ヤギ抗−ヒト−ＩｇＧを用い（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ  カタログ番号１０９−０９６−００６、５μｇ／ｍＬ使用）、細胞に結合したＦａｂを検出し、ポジティブコントロールとして、Ｆ（ａｂ’）２  ＦＩＴＣに結合したヤギ抗−マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を用い、マウス抗体を検出した（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１１５−０９６−０６２、５μｇ／ｍＬ使用）。細胞の生存を判定するために、ヨウ化プロピジウム染色溶液（死細胞を排除するためのＰＩ；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  カタログ番号５１−６６２１１Ｅまたは５５６４６３、ＦＡＣＳバッファで最終的に１：５００で使用）を用い、細胞を染色した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ装置（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でサンプルを分析し、サンプルあたり１０，０００個の生存細胞のデータを集めた。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアバージョン４．０を用い、データを分析した（ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ）（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．，１１４５２  Ｅｌ  Ｃａｍｉｎｏ  Ｒｅａｌ，番号２１５、米国カリフォルニア州サンディエゴ  ９２１３０）。
【０５６５】
サンプルを分析し、相乗平均を決定したら、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ（Ｐｒｉｓｍ  Ｇｒａｐｈ）作図プログラムを用い、抗体の濃度（Ｘ軸）と相乗平均（Ｙ軸）について、ｌｏｇ１０でグラフ化した。データセット（Ｘ値のデータセット＝抗体の濃度）をＸ＝Ｌｏｇ（Ｘ）に変換し、非線形解析曲線であるＳ字用量−応答曲線にあてはめてグラフ化した。Ｐｒｉｓｍ  Ｇｒａｐｈソフトウェアを用い、ＥＣ５０値とＲ２値を得た。
【０５６６】
６種類のＦａｂは、ＭＣＦ−７腫瘍細胞で発現した野生型ＩＧＦ−１Ｒに対し、どれも良好な結合活性を示した（図２）。結合のＥＣ５０は、９〜４２ｎＭであった（表３）。
【０５６７】
（実施例３  Ｆａｂによる、リガンドのＩＧＦ−１Ｒへの結合の阻害）
Ｆａｂが、ＩＧＦ−１リガンドおよびＩＧＦ−２リガンドがＩＧＦ−１Ｒに結合するのをブロックする能力を有するか否かを、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を用いて決定した。
【０５６８】
リガンドのブロックアッセイ（Ｌｉｇａｎｄ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ａｓｓａｙ）（ＲＩＡ）。組み換えヒトＩＧＦ−１（カタログ番号２９１−Ｇ１）、ＩＧＦ−２（カタログ番号２９２−Ｇ２）、インスリン（カタログ番号Ｃｕｓｔｏｍ０２）、ヒトインスリン受容体（カタログ番号１５４４−１Ｒ）をＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（ミネソタ州ミネアポリス）から購入した。インスリン（Ａｒｇ−Ｉｎｓｕｌｉｎ、カタログ番号０１−２０７）をＵｐｓｔａｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（ニューヨーク州プラシド湖（現在は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（米国マサチューセッツ州コンコード）の一部）から購入した。１２５Ｉ−ｒｈＩＧＦ−１（カタログ番号ＩＭ１７２）、１２５Ｉ−ｒｈＩＧＦ−２（カタログ番号ＩＭ２３８）および１２５Ｉ−ｒｈＩｎｓｕｌｉｎ（カタログ番号ＩＭ１６６）をＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ニュージャージー州ピスカタウェイ）から購入した。ＩＧＦ−ＩＲ−Ｆｃを捕捉するのに、ＡｆｆｉＰｕｒｅヤギ抗−ヒトＩｇＧ、Ｆｃγフラグメントに特異的な抗体（カタログ番号１０９−００５−０９８、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ（ペンシルバニア州ウェストグローブ（Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ））を使用した。検出抗体として、ヤギ抗−マウスＩｇＧ  ＨＲＰ（カタログ番号１０３０−０５、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）を使用した。
【０５６９】
ＩＧＦ−１ブロッキングおよびＩＧＦ−２ブロッキングのポジティブコントロールとして、ＩＲ３（Ａｂ−１、カタログ番号ＧＲ１１ＬＳＰ５、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（カリフォルニア州ラホーヤ）および１Ｈ７（ＩＧＦ−１Ｒα鎖に特異的なマウスモノクローナル、ｓｃ−４６１、ＩｇＧ１  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（カリフォルニア州サンタクルーズ）をそれぞれ使用した。インスリン−インスリン受容体結合をブロックする実験のポジティブコントロールとして、ヒトインスリン受容体のαサブユニットに特異的な抗体であるクローン８３−１４（カタログ番号ＡＨＲ０２２１、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州カマリロ）およびクローン４７−９（カタログ番号Ｅ５５５０２Ｍ、Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（メイン州ソーコ）を使用した。組み換えＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ融合タンパク質は、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ（マサチューセッツ州ケンブリッジ）で製造した。
【０５７０】
アイソタイプの一致したマウス抗体２Ｂ８（マウスα−ＣＤ２０．ＩｇＧ１）および２Ｂ８ｍｋｍ．Ｇ２ａ（マウスα−ＣＤ２０  ＭＡｂ、ＩｇＧ２ａ、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ、ロット番号ＮＢ３３０４−８７、カリフォルニア州サンディエゴ）をネガティブコントロールとして使用した。Ｆａｂのネガティブコントロールは、Ｃｈｒｉｓｔｉｌｙｎ  Ｇｒａｆｆ（Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ（マサチューセッツ州ケンブリッジ））から得たＲ００１−１Ｂであった。ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ（カタログ番号１７−５１３Ｆ（メリーランド州ウォーカーズヴィル））から得たＰＢＳをバッファとして使用した。
【０５７１】
組み換えヒトＩＧＦ−１Ｒ（ヒスチジンタグ化したもの）またはＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃを、ＩＭＭＵＬＯＮ２  ＨＢ（高結合性）Ｒｅｍｏｖａｗｅｌｌ片（Ｄｙｎｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号６３０２）上で、カーボネートコーティングバッファ（ｐＨ９．５）で濃度２５０ｎｇ／ウェルになるまで希釈し、コーティングした。４℃で一晩インキュベートした後、洗浄バッファ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０／ＰＢＳ）でウェルを３回洗浄し、ブロッキングバッファ（３％  ＢＳＡ／ＰＢＳ）を用い、室温で１時間ブロッキングした。ブロッキングバッファを除去し、ウェルを３回以上洗浄した。希釈バッファ（１％  ＢＳＡ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０／ＰＢＳ）を用い、抗体、Ｆａｂまたはリガンド調製物を所望な濃度まで希釈し、２ッ組で、５０μＬ／ウェルの濃度で播種した。室温で４５分経過後、［１２５Ｉ］ｒｈＩＧＦ−１または［１２５Ｉ］ｒｈＩＧＦ−２のどちらか１００，０００ｃｐｍを希釈バッファ５０μＬで希釈したものを、それぞれのウェルに加えた。室温でさらに１時間インキュベートした。ウェルを３回以上洗浄し、最後の洗浄終了後、液を残しておいた。ウェルを風乾させ、Ｉｓｏｄａｔａ  Ｇａｍｍａ  Ｃｏｕｎｔｅｒで計測した。
【０５７２】
あるいは、改良型の捕捉アッセイでＦａｂを評価した。抗−ヒトＩｇＧをプレートに固定し、ＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃを捕捉した。ヤギ抗−ヒトＩｇＧ（Ｆｃγフラグメントに特異的な抗体）（２００ｎｇ／ウェル）をカーボネートコーティングバッファ中で一晩インキュベートさせ、固定化した。ウェルを洗浄し、ブロッキングし、ＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ  ２５０ｎｇ／ウェルを加えた。
【０５７３】
６種類の異なるＦａｂがＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２の結合をブロックする性能、またはＩＧＦ−１とＩＧＦ−２の両方の結合をブロックする性能を、表３に示す。異なるブロッキング活性を有する上位６種類のＦａｂを選抜し、さらに分析を行った。
【０５７４】
（実施例４  Ｆａｂは、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２が介在するＩＧＦ−１Ｒリン酸化を阻害した）
細胞株：ＩＧＦ１Ｒを発現するヒト乳癌細胞株ＭＣＦ−７（ＮＣＩ）を、１０％  ＦＢＳ、１×非必須アミノ酸、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウムおよび１０００Ｕ／ｍｌ  ペニシリンおよびストレプトマイシンを含有するＭＥＭ  ｅａｇｌｅ（ＡＴＣＣ）中、３７℃、５％  ＣＯ２で維持した。細胞を維持し、アッセイするために、週に２回、継代培養し、最大継代数は１２にとどまるように使用した。
【０５７５】
Ｐｌｏｙ−Ｄ−Ｌｙｓｉｎｅコーティングした１２ウェルプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、番号３５−６４７０）中、ＭＣＦ−７細胞を濃度２×１０５〜４．０×１０５細胞／ウェルで成長培地２ｍＬに播種し、３７℃、５％  ＣＯ２で培養した。４８時間後、培地を除去し、無血清状態で、３７℃、５％  ＣＯ２で細胞を一晩培養した。無血清培地を除去し、新しい無血清培地３５０ｕｌにコントロールまたは試験抗体を所定の濃度で加え、室温で１時間インキュベートするか、または３７℃で１時間インキュベートした。Ｆａｂを濃度２００ｎＭ、２０ｎＭおよび２ｎＭで試験し、ｍＡｂを濃度６７、６．７および０．６７ｎＭで試験した。市販の抗−ＩＧＦ−１Ｒコントロール抗体は、αＩＲ３（ＥＭＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ、番号Ｄ２７２４９）を使用した。無血清培地３５０ｕｌ中、ヒト組み換えＩＧＦ−１  １３ｎＭ、またはＩＧＦ−２  ２７ｎＭ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、番号２９１−Ｇ１、番号２９２−Ｇ２）をウェルに加え、３７℃で１５分間インキュベートした。３７℃の抗体実験のために、リガンドを室温でインキュベートした。１×細胞溶解バッファ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、番号９８０３）に１ｍＭ  ＰＭＳＦを加え、室温で１時間かけて細胞を溶解させた。
【０５７６】
ＩＧＦ−１Ｒβ抗体（クローン１−２、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、番号ＡＨＲ０３６１）であらかじめコーティングしておいたＥＬＩＳＡプレートに細胞溶解物を加え、２時間インキュベートした。その後、プレートを洗浄し、プレートに結合したリン酸化受容体を、ビオチン標識された抗−ホスホチロシン抗体４Ｇ１０（カタログ番号１６−１０３、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（ニューヨーク州プラシド湖（現在は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（米国マサチューセッツ州コンコード）の一部）およびストレプトアビジン−ＨＲＰ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、番号５５４０６６）で検出した。ＴＭＢ基質（Ｋｉｅｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ、番号５０−７６−００）を加えてアッセイを進行させ、４Ｎ  Ｈ２ＳＯ４（ＬａｂＣｈｅｍ、カタログ番号ＬＣ２５８３０−１）を加えて色を固定した。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓプレートリーダーを用い、４５０ｎｍで光学密度を測定し、各抗体−リガンドサンプルについて、リガンドコントロールに対する阻害率を算出した。
【０５７７】
表３には、ＭＣＦ−７細胞において、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２が介在するＩＧＦ−１Ｒのリン酸化をＦａｂによって阻害することについてまとめている。ＥＬＩＳＡによって、受容体リン酸化の阻害について、合計１６種類のＩＧＦ−１Ｒ  Ｆａｂをスクリーニングした。９種類の抗体が、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、またはＩＧＦ−１とＩＧＦ−２の両方に対し、陽性の応答「＋」を示すか、または濃度２００ｎＭで良好な結果を示した。スケールアップして定性試験を行うために、これらの抗体を選抜し、用量依存性の阻害応答について、再び試験した。リガンドの結合および受容体のリン酸化を阻害する性能に基づき、全長抗体を変換するためのリード候補物質として４種類のＦａｂを選抜した（実施例６を参照）。
【０５７８】
図３（ＡおよびＢ）は、上位６種類のＩＧＦ−１Ｒ  Ｆａｂを用い、スケールアップした場合のＩＧＦ−１Ｒリン酸化の阻害について示している。
【０５７９】
（実施例５  ＩＧＦ−１ＲとＩＮＳＲとを比較した、抗体結合特異性および親和性）
（第Ｉ部：酵素免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いた、可溶性ＩＧＦ−１Ｒと可溶性ＩＮＳＲに対する、抗体の結合分析）
Ｆａｂフラグメント抗体が、インスリン受容体よりも可溶性ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合するか否かを判定するために、ＥＬＩＳＡアッセイを行った。プレートを、ｒｈ−ＩＧＦ−１Ｒ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、番号３０５−ＧＲ）またはｒｈ−ＩＮＳＲ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、番号１５４４−ＩＲ）１０ｕｇ／ｍｌで一晩コーティングし、ミルク５％でブロックした。Ｆａｂの場合、抗体を２μＭ〜０．２ｎＭの濃度で、マウスＭＡｂの場合、抗体を６６７〜０．０６７ｎＭの濃度で１：１０に連続希釈して加え、室温で１時間インキュベートした。Ｆａｂの場合、ＨＲＰＯ標識したヤギα−ヒトκ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、番号２０６０−０５）を用い、結合した抗体を検出し、マウスＭＡｂの場合、ヤギα−マウスＩｇＧ  Ｆｃγ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、番号１１５−０３５−１６４）を用い、結合した抗体を検出した。４Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を加えて色の変化を止め、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅプレートリーダーを用い、４５０℃で光学密度を測定し、結合曲線を作成した。
【０５８０】
ＩＧＦ−１Ｒ  Ｆａｂは、いかなる濃度でも、可溶性インスリン受容体に対して、なんら特異的な結合性を示さなかった（表３）。一方、予想どおり、ＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃに対しては良好に結合した。
【０５８１】
図４（ＡおよびＢ）は、Ｆａｂ（Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１４−Ｃ０３およびＭ１２−Ｇ０４）を用いて得られた代表的な結合曲線を示す。Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１およびＭ１２−Ｅ０１でも同様の結合パターンが観察された（データは示していない）。
【０５８２】
（第ＩＩ部：表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）および時間分解蛍光共鳴エネルギー転移（ｔｒ−ＦＲＥＴ）を用いた、可溶性ＩＧＦ−１Ｒと可溶性ＩＮＳＲに対する、抗体の結合分析）
表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）および時間分解蛍光共鳴エネルギー転移（ｔｒ−ＦＲＥＴ）を用い、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３およびＭ１４−Ｇ１１抗体の、可溶性ヒトＩＧＦ−１Ｒに対する結合親和性と、インスリン受容体細胞外領域に対する結合親和性を比較した。Ｍ１３−Ｃ０６抗体は、インスリン受容体、マウスＩＧＦ−１Ｒ、またはヒトＩＧＦ−１Ｒの欠失物（すなわち、第１および第２のロイシンに富む繰り返しドメインと、システインに富む繰り返しドメインのみを含有し、ＩＧＦ−１Ｒの３箇所のＩＩＩ型フィブロネクチンドメインがない、ｈＩＧＦ−１Ｒアミノ酸残基１〜４６２）に対し、顕著な交差反応性を示さないことも、以下に示す。
【０５８３】
（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析）
ＳＰＲ分析を、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００を用いて行った。この装置を２５℃に設定し、Ｂｉａｃｏｒｅで購入した操作バッファＨＢＳ−ＥＰ（ｐＨ７．２）（Ｂｉａｃｏｒｅ、カタログ番号ＢＲ−１００１−８８）を用いてアッセイを行った。標準的なＮＨＳ／ＥＤＣ−アミン反応化学を用い、Ｂｉａｃｏｒｅが提供しているプロトコルにしたがって、全ヒト抗体、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３およびＭ１４−Ｇ１１を、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＣＭ５  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｒａｄｅ  ＳｅｎｓｏｒＣｈｉｐ表面に約１０，０００ＲＵで固定した。固定化のために、抗体を１０ｍＭ  酢酸バッファ（ｐＨ４．０）で約４０μｇ／ｍＬに希釈した。ヒトＩＧＦ−１Ｒ（１−９０２）−Ｈｉｓ１０（ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ））およびヒトＩＮＳＲ（２８−９５６）−Ｈｉｓ１０（ＩＮＳＲ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ））の全長細胞外領域が、それぞれヒト抗体に結合し、解離する相対速度を調べるために、上述のＳｅｎｓｏｒＣｈｉｐ表面に、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０またはＩＮＳＲを徐々に濃度を上げながら注入した。ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０の濃度は、１．０ｎＭ〜２５０ｎＭであり、ＩＮＳＲの濃度は、１．０ｎＭ〜２μＭであった。すべての抗体表面は、１００ｍＭグリシン（ｐＨ２．０）を用いて信頼性高く再生させた。再生を繰り返しても、いずれの抗体表面も活性低下はみられなかった。流速は、２０μＬ／分であった（「Ｈｉｓ１０」は、構築物のＣ末端に１０のヒスチジン残基タグがあることを示している）。
【０５８４】
（時間分解蛍光共鳴エネルギー転移（ｔｒ−ＦＲＥＴ）アッセイ）
ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０およびＭ１３−Ｃ０６を、標準的なＮＨＳ化学を用い、染料製造業者のプロトコルにしたがって、それぞれＣｙ５およびユーロピウムキレート物に共有結合させた。競合相手となる、標識していない可溶性細胞外領域受容体（１）ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０、（２）ヒトＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）−ＦｌａｇＨｉｓ１０（ｈＩＧＦ−１Ｒ−ＦｌａｇＨｉｓ１０、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ）、（３）ヒトＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）−Ｆｃ（ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ）、（４）ヒトＩＧＦ−１Ｒ（１−４６２）−Ｆｃ（ｈＩＧＦ−１Ｒ（１−４６２）−Ｆｃ、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ）、（５）マウスＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）−Ｆｃ（ｍＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ）または（６）ＩＮＳＲを、濃度６．２５μｇ（１２５μｇ／ｍＬストック溶液５０μＬ）で段階的に希釈し、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ製、黒色）中で、０．１μｇ  ｈＩＧＦ１Ｒ−Ｈｉｓ１０−Ｃｙ５（４μｇ／ｍＬストック溶液２５μＬ）および０．０７５μｇ  Ｅｕ−Ｃ０６（３μｇ／ｍＬストック溶液２５μＬ）と混合した。タンパク質濃度について、それぞれの染料の吸光度から決定すると、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０−Ｃｙ５の接合度は、６．８：１（Ｃｙ５：ＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０）であり、Ｅｕ−Ｃ０６の接合度は、１０．３：１（Ｅｕ：Ｃ０６）であった。各サンプルについて、合計容積は１００μＬであった。プレート攪拌器で、プレートを室温で１時間インキュベートした。Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ２蛍光プレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で、ＬＡＮＣＥプロトコルを用い、励起波長３４０ｎｍ、発光波長６６５ｎｍで蛍光を測定した。すべての構築物について、少なくとも２個ずつサンプルを測定した。
【０５８５】
Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃから得たすべての可溶性ＩＧＦ−１Ｒ受容体の細胞外領域構築物を、文献記載の方法（Ｂｒｅｚｉｎｓｋｙら、２００３）を用い、ＣＨＯを発現させるために、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ  ＰＶ−９０ベクターにサブクローン化した。Ｃ末端にＩｇＧ−Ｆｃタグを有する各受容体を、文献に記載されている１種類のプロテインＡ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ−ＦＦＴＭ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた親和性精製工程で精製した。ｈＩＧＦ−１Ｒ−ＦｌａｇＨｉｓ１０は、文献（Ｄｅｍａｒｅｓｔら、２００６）に記載の方法で、Ｎｉ２＋−アガロース（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。
【０５８６】
結果：全長ヒト抗−ＩＧＦ−１Ｒ抗体、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３およびＭ１４−Ｇ１１を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用い、可溶性ＩＧＦ−１Ｒと、ＩＮＳ細胞外領域の構築物とに対する競合的な結合活性について評価した。抗体を固定した表面にｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０およびＩＮＳＲを同じプロトコルで注入した。ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０は、最も低い濃度である０．５ｎＭでも、３種類の抗−ＩＧＦ−１Ｒ抗体すべてに結合した（データは示していない、濃度は、１〜２５０ｎＭの範囲であり、受容体注入時間は４００〜２２００であり、次いで、バッファ解離期間、次いでグリシン（ｐＨ２．０）での再生期間）。ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０の結合は、Ｍ１３−Ｃ０６表面で最も強固であった。対照的に、ＩＮＳＲは、受容体濃度が２μＭ（ＩＧＦ−１Ｒの結合が観察された濃度の１０００倍よりも大きい）まで高くなっても、Ｍ１３−Ｃ０６表面でほとんど活性を示さなかった（データは示していない、濃度は、１．０〜２μＭの範囲であり、受容体注入時間は５００〜１０００秒であり、次いで、バッファ解離期間）。Ｍ１４−Ｃ０３およびＭ１４−Ｇ１１の表面も、ＩＮＳＲに対してほとんど結合活性を示さなかった。
【０５８７】
次に、競合アッセイに基づくｔｒ−ＦＲＥＴアッセイを用い、Ｍ１３−Ｃ０６に対する、種々の組み換えＩＧＦ−１ＲおよびＩＮＳＲ構築物の親和性を決定した。すべての組み換え受容体構築物（以下に示す）について、最もよく適合する結合曲線を決定した（データは示していない）。全データを、１箇所での結合モデルに適合させ、ここから、対応するＩＣ５０値を決定した。３種類の全長ヒトＩＧＦ−１Ｒ細胞外領域構築物（ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０およびｈＩＧＦ−１Ｒ−ＦｌａｇＨｉｓ１０）を、濃度依存様式で競合させ、ＩＣ５０値は、それぞれ２．９、２．０、５．２μｇ／ｍＬであった。一部を欠いたヒトＩＧＦ−１Ｒ（１−４６２）−Ｆｃ構築物、全長マウスＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ構築物、全長ヒトＩＮＳＲ−Ｈｉｓ１０構築物は、組み換え全長ヒトＩＧＦ−１Ｒ構築物のＩＣ５０の１００倍より高い濃度で、Ｃｙ５標識されたｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０を阻害しなかった。この事実は、これらの構築物が、全長ヒトＩＧＦ−１Ｒとは異なり、Ｍ１３−Ｃ０６に対して顕著な結合活性を示さないことを示唆している。
【０５８８】
（第ＩＩＩ部：可溶性ヒトＩＧＦ−１Ｒと、可溶性マウスＩＧＦ−１Ｒとを比較した、Ｍ１３−Ｃ０６の相対的な結合親和性）
マウスＩＧＦ−１Ｒと、ヒトＩＧＦ−１Ｒとについて、Ｍ１３−Ｃ０６の相対的な結合親和性を比較した。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用い、マウスＩＧＦ−１Ｒ  ＦｃおよびヒトＩＧＦ−１Ｒ  Ｆｃに対する、Ｍ１３−Ｃ０６の親和性を決定した。実験は、２５℃に設定したＢｉａｃｏｒｅ  ３０００を用い、試験バッファとしてＨＢＳ−ＥＰ（Ｂｉａｃｏｒｅ、カタログ番号ＢＲ−１００１−８８）を用いて行った。抗−ヒトＩｇＧ−Ｆｃ抗体（Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ製、２Ｃ１１、カタログ番号５２１８−９８５０）を、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＣＭ５チップ（カタログ番号ＢＲ−１０００−１４）表面にＨＢＳ−ＥＰバッファとともに５００ｎｍで注入し、飽和状態で固定した。２０ｎＭ受容体４０μＬを３μＬ／分で注入することにより、ｍＩＧＦ−１Ｒ−ＦｃまたはｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃをチップ表面で捕捉した。受容体を捕捉した後、Ｍ１３−Ｃ０６  Ｆａｂ  ４０μＬを３μＬ／分で注入した。Ｆａｂの解離を約２７分間測定した。Ｆａｂを２５ｎＭから０．４ｎＭまで段階的に希釈して、濃度に依存する結合速度曲線を作成した。それぞれの注入後にチップ表面を再生するには、１００ｍＭグリシン（ｐＨ２．０）１０μＬを３回、６０μＬ／分で注入した。それぞれの曲線について、参照データは、（１）抗−ＩｇＧ抗体  ２Ｃ１１を加えない状態で、ＣＭ５チップ表面で得たデータと、（２）１回目に受容体を注入した後、ＨＢＳ−ＥＰバッファを２回目に注入するときに得たデータの２つであった。それぞれの受容体について、Ｍ１３−Ｃ０６  Ｆａｂの一連の濃度は、製造業者のＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアに入っている１：１結合モデルに合わせた。ｍＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃに対するＭ１３−Ｃ０６の結合ｋｄを得るために、Ｍ１３−Ｃ０６  Ｆａｂを２５ｎＭに固定し、ｍＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃを２０ｎＭに固定し、元々もプロトコルから、解離時間を３時間まで延長する点だけを変え、実験を繰り返した。
【０５８９】
結果：Ｍ１３−Ｃ０６  Ｆａｂを、ｈＩＧＦ−１Ｒ−ＦｃまたはｍＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃを含有するＢｉａｃｏｒｅ表面に適用し、２種類の受容体に対するＭ１３−Ｃ０６  Ｆａｂの相対親和性を決定した。Ｃ末端にＩｇＧ１−Ｆｃタグが存在することによって、ＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ受容体構築物がマルチマー化する（データは示していない）。したがって、この結合モデルに適合させ、各受容体に対するＭ１３−Ｃ０６の相対親和性または見かけ親和性の測定値を得る。ヒトＩＧＦ−１Ｒ  ＦｃおよびマウスＩＧＦ−１Ｒ  Ｆｃに対するＭ１３−Ｃ０６の親和性は、それぞれ０．９７８ｎＭおよび８９．１ｎＭであった。図２６Ａおよび２６Ｂには、結合解離曲線、速度定数および平衡解離定数を示しており、この２図を比較すると、マウスＩＧＦ−１Ｒに対する結合は、１／１００倍に低下していることが容易に分かる。図２６Ａは、Ｍ１３−Ｃ０６  Ｆａｂが、ヒトＩＧＦ−１Ｒに濃度に依存して結合するという特性を示す（ｋａ（１／Ｍｓ）＝８．５２ｅ５Ｍ−１ｓ−１；ｋｄ（１／ｓ）＝８．３３ｅ−４ｓ−１；およびＫＤ＝９．７８ｅ−１０Ｍ）。図２６Ｂは、Ｍ１３−Ｃ０６が、ｍＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃに対し、ゆっくりと結合し、解離するという特性を示す（ｋａ（１／Ｍｓ）＝４７１Ｍ−１ｓ−１；ｋｄ（１／ｓ）＝４．２０ｅ−５ｓ−１；ＫＤ＝８．９１ｅ−８Ｍ）。Ｍ１３−Ｃ０６  Ｆａｂが、ｍＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃからきわめてゆっくりと解離するため、解離速度定数ｋｄは、初期のデータセットからは決定できなかった。解離時間を３時間にして第２の実験を行い、解離速度定数ｋｄ  ４．２０ｅ−５ｓ−１を得て、これを用い、平衡解離定数ＫＤ（上述）を元々のデータセットから得た。Ｃ末端にＩｇＧ１−Ｆｃタグが存在するため、ＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ受容体構築物がマルチマー化する（データは示していない）。したがって、この結合モデルに適合させ、各受容体に対するＭ１３−Ｃ０６の相対親和性または見かけ親和性の測定値を得る。
【０５９０】
（第ＩＶ部：Ｍ１３−Ｃ０６全長抗体は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合するが、哺乳動物で発現したＩＮＳＲには特異的に結合しない）
組み換えＩＧＦ−１Ｒおよびインスリン受容体（ＩＲ）は、独立して、哺乳動物細胞（３Ｔ３またはＣＨＯ）で発現する。１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で細胞を可溶化し、ネガティブコントロール抗体（ＩＤＥＣ−１５１）、Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体（Ｃ０６）、Ｍ１４−Ｇ１１．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体（Ｇ１１）またはＩＮＳＲ抗体（α−ＩＲ）を結合させたプロテイン−Ａ／Ｇビーズとともに、上述の受容体を免疫沈降させた。酸で処理し、抗体／抗原複合体をビーズからはずし、Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに入れ、ニトロセルロース膜でブロッティングした。マウス抗−ヒトＩＲ（図２５Ａ）またはマウス抗−ヒトＩＧＦ−１Ｒ（図２５Ｂ）およびヤギα−マウスＩｇＧを用い、検出した。結果：Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体は、ＩＧＦ−１Ｒに結合するが、哺乳動物細胞で発現したＩＮＳＲには結合しない。
【０５９１】
（実施例６：全長抗−ＩＧＦ−１Ｒ  ＩｇＧの構築）
４種類のＦａｂをＩｇＧ４．Ｐ．ａｇｌｙ態様に変換し、ＣＨＯ細胞で発現させた。４種類の別個の抗−ＩＧＦ−１Ｒ  ＦａｂであるＭ１３−Ｃ０６（図５（Ａ）〜（Ｄ））、Ｍ１４−Ｃ０３（図５（Ｅ）〜（Ｈ））、Ｍ１４−Ｇ１１（図（Ｉ）〜（Ｌ））およびＭ１４−Ｂ０１（図５（Ｍ）〜（Ｐ））をコードするＤＮＡ配列を、組み換えヒトＩＧＦ−１Ｒ細胞外領域−Ｆｃ融合タンパク質に対してバイオパンニングすることによって、ヒト抗体ファージライブラリ（Ｄｙａｘ  Ｃｏｒｐ）から選択した。この４種類の抗−ＩＧＦ−１Ｒ  Ｆａｂは、それぞれ、ＶＨ３−２３ヒト重鎖生殖系列のフレームワークを含んでおり、κ軽鎖であった。このＦａｂ遺伝子配列を使用し、哺乳動物細胞で抗体を産生するｐＶ９０ＡＳ発現ベクター系を用い、全長抗−ＩＧＦ−１Ｒ抗体をコードする発現プラスミドを構築した。ｐＶ９０ＡＳは、一次転写物を交互にスプライシングすることによって、１個のプロモーターから２個の転写物を作成するように設計された、改変されたｐＶ９０発現ベクターである（参考文献：米国特許庁に出願されたＷＯ２００５／０８９２８５号）。天然のＣＭＶスプライス供与部位は、一部分が失われたスプライス受容部位でスプライシングし、抗体の軽鎖をコードする転写物を作成するか、または天然のＣＭＶスプライス受容部位でスプライシングし、抗体の重鎖をコードする転写物を作成する。一部分が失われたスプライス受容部位は、重鎖転写物と軽鎖転写物とが同じ量で得られるように遺伝子操作されている。それぞれの抗−ＩＧＦ−１Ｒ  Ｆａｂ（Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｇ１１およびＭ１４−Ｂ０１）の軽鎖可変（ＶＬ）領域および軽鎖定常（ＣＬ）領域（配列番号１５３および１５４、図５（Ｙ）〜（Ｚ））を、ＰＣＲで増幅させた（表７）。５’軽鎖ＰＣＲプライマーＩＧＦ１Ｒ−ＦＫは、Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｔら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．２２：１３１−４１（２０００）に記載の方法によれば、Ｓｆｉ  Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位を含んでおり、その次に、ＶＬ領域のアミノ末端に対応する配列に対し、免疫グロブリンの軽鎖シグナルペプチドをコードする配列ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＰＧＡＲＣ（配列番号１５７）をフレーム内に含んでいた（この文献の内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる）。４種類の成熟したＩＧＦ１Ｒ軽鎖配列は、すべて同じアミノ末端を有していた。３’軽鎖ＰＣＲプライマーＩＧＦ１Ｒ−ＲＫは、ＣＬ領域のカルボキシル末端に対応する配列と、Ａｓｃ  Ｉ部位とを含んでいた。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＧｅｌＥｘｔｒａｔｉｏｎキットプロトコル（ＱＩＡＧＥＮ  ＣＡ）で抽出して精製し、制限エンドヌクレアーゼＳｆｉ  ＩおよびＡｓｃ  Ｉで消化し、Ｓｆｉ  Ｉ／Ａｓｃ  Ｉで消化したｐＨＬＰ０２５ベクター（Ｈｏｌｌｙ  Ｐｒｅｎｔｉｃｅ）に接続した。ｐＨＬＰ０２５ベクターは、抗体の軽鎖（シグナルペプチド−ＶＬ−ＣＬ）を、Ｓｆｉ  Ｉ／Ａｓｃ  Ｉで消化したＰＣＲフラグメントとして受け入れるためのＳｆｉ  Ｉ／Ａｓｃ  Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位を含んでおり、それに加え、天然ＣＭＶスプライス供与部位配列と、一部分が失われたスプライス受容部位配列と、ポリＡシグナル配列とを含んでいた（参考文献：米国特許庁に出願されたＷＯ２００５／０８９２８５号）。
【０５９２】
それぞれの抗−ＩＧＦ−１Ｒ  Ｆａｂ（Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｇ１１およびＭ１４−Ｂ０１）の重鎖可変（ＶＨ）領域を、ＰＣＲで増幅させた。５’重鎖ＶＨ  ＰＣＲプライマーＩＧＦ１Ｒ−ＦＨは、上述のように、Ｎｃｏ  Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位を含んでおり、その次に、ＶＨ領域のアミノ末端に対応する配列に対し、合重鎖シグナルペプチドをコードする配列ＭＧＷＳＬＩＬＬＦＬＶＡＶＡＴＲＶＬＳ（配列番号１２２）をフレーム内に含んでいた。３’重鎖ＶＨ  ＰＣＲプライマーＩＧＦ１Ｒ−ＲＨは、ＶＨ領域のカルボキシル末端に対応する配列と、Ｓｆｉ  Ｉ部位とを含んでいた。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＧｅｌＥｘｔｒａｔｉｏｎキットプロトコル（ＱＩＡＧＥＮ  ＣＡ）で抽出して精製し、制限エンドヌクレアーゼＮｃｏ  ＩおよびＳｆｉ  Ｉで消化し、Ｎｃｏ  Ｉ／Ｓｆｉ  Ｉで消化したｐＨＬＰ０２９ベクター（Ｈｏｌｌｙ  Ｐｒｅｎｔｉｃｅ）に接続した。ｐＨＬＰ０２９ベクターは、抗体のシグナルペプチド−ＶＨ配列を、Ｎｃｏ  Ｉ／Ｓｆｉ  Ｉで消化したＰＣＲフラグメントとして受け入れるためのＮｃｏ  Ｉ／Ｓｆｉ  Ｉ部位を含んでおり、それに加え、その上流にポリＡシグナル配列と、天然ＣＭＶスプライス受容部位配列と、その下流にポリＡシグナル配列とを含んでいた（参考文献：米国特許庁に出願されたＷＯ２００５／０８９２８５号）。
【０５９３】
ｐＨＬＰ０２５で（Ｓｆｉ  Ｉ部位−軽鎖シグナルペプチド−抗−ＩＧＦ−１ＲのＶＬおよびＣＬ）をコードする遺伝子配列と、ｐＨＬＰ０２９で（重鎖シグナルペプチド−抗−ＩＧＦ−１Ｒ  ＶＨ−Ｓｆｉ  Ｉ部位）をコードする遺伝子配列を、上述の５’軽鎖ＩＧＦ１Ｒ−ＦＫプライマーおよび３’重鎖ＶＨ  ＩＧＦ１Ｒ−ＲＨ  ＰＣＲプライマーを用い、両ベクターに存在する共通のオーバーラッピング配列によって、ＰＣＲ増幅によって得られた単鎖ＤＮＡフラグメントにアセンブリングした。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＧｅｌＥｘｔｒａｔｉｏｎキットプロトコル（ＱＩＡＧＥＮ  ＣＡ）で抽出して精製し、制限エンドヌクレアーゼＳｆｉ  Ｉで消化し、Ｄｒａ  ＩＩＩで紹介したｐＸＷＵ００７ベクターに接続した。簡単に説明すると、まず、ＩｇＧ４ヒンジ領域にＳ２２８Ｐ変異を含み、ＣＨ２領域にＴ２９９Ａ変異を含む（ＥＵ付番システムによる）Ａｇｅ  Ｉ／ＢａｍＨＩヒトＩｇＧ４定常領域フラグメント（プラスミドｐＥＡＧ１８０８（Ｅｌｌｅｎ  Ｇａｒｂｅｒから得た）から得た、配列番号１５５および１５６、図５（ＡＡ）〜（ＢＢ））を、Ａｇｅ  Ｉ／ＢａｍＨＩで消化したｐＨＬＰ０２８ベクターにサブクローン化し、ｐＸＷＵ００７を構築した（Ｋａｂａｔ，Ｅ，Ｗｕ，ＴＴ，Ｐｅｒｒｙ，ＨＭ，Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，ＫＳ，Ｆｏｅｌｌｅｒ，Ｃ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ，１９９１）。ｐＨＬＰ０２８は、上述のＳｆｉ  Ｉで消化されたＰＣＲ単鎖産物を受け入れるためのＤｒａ  ＩＩＩ部位を含むように改変されたｐＶ９０  ＩｇＧ４ベクターである（参考文献：米国特許庁に出願されたＷＯ２００５／０８９２８５号）。
【０５９４】
得られたプラスミドは、交互スプライシングすると、バイシストロニックな前駆転写物を産生し、翻訳活性な抗体の重鎖ｍＲＮＡおよび軽鎖ｍＲＮＡが、ほぼ化学量論量で得られる。全長非グリコシル化ヒト抗−ＩＧＦ−１Ｒ  ＩｇＧ４．Ｐ抗体を産生するための中間体および発現ベクターを表８に示す。ＤＮＡ配列分析によって正しい配列であることを確認した。哺乳動物において、プラスミドｐＸＷＵ０２０、ｐＸＷＵ０２２、ｐＸＷＵ０２４およびｐＸＷＵ０２５から得られる全長抗体の発現によって、安定な非グリコシル化ヒトＩｇＧ４．Ｐ抗体が産生する。
【０５９５】
（表７）ヒト抗体領域をＰＣＲ増幅させるためのオリゴヌクレオチド。
順方向５’軽鎖ＰＣＲプライマーは、Ｓｆｉ  Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位（下線部）と、軽鎖シグナルペプチドをコードする配列とを含んでいる。
逆方向３’軽鎖ＰＣＲプライマーは、Ａｓｃ  Ｉ部位（下線部）を含んでいる。
順方向５’重鎖可変ＰＣＲプライマーは、Ｎｃｏ  Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位（下線部）と、重鎖シグナルペプチドをコードする配列とを含んでいる。
逆方向３’重鎖可変ＰＣＲプライマーは、Ｓｆｉ  Ｉ部位（下線部）を含んでいる。
2010537985.tif 000029
【０５９６】
（表８）抗−ＩＧＦ−１Ｒ抗体をコードする中間体および発現プラスミド
2010537985.tif 000030
【０５９７】
（実施例７  哺乳動物での発現量を高めるための、全長抗−ＩＧＦ−１Ｒ  ＩｇＧの構築）
抗体の発現量を高め、産物の質を高めるために、抗−ＩＧＦ−１Ｒ  ＦａｂであるＭ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｇ１１およびＭ１４−Ｂ０１に由来する元々のＶＨ遺伝子の配列を改変した。まず、公共の配列認識プログラム（ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／ｔｄｂ／ＧｅｎｅＳｐｌｉｃｅｒ／ｇｅｎｅ＿ｓｐｌ．ｈｔｍｌ（Ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９７１２  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ  ２０８５０）、ｗｗｗ．ｆｒｕｉｔｆｌｙ．ｏｒｇ／ｓｅｑ＿ｔｏｏｌｓ／ｓｐｌｉｃｅ．ｈｔｍｌ）を用い、スプライス部位と思われる部位を含有する配列について、抗−ＩＧＦ−１Ｒ  ＶＨ配列を分析した。（Ｍａｒｔｉｎ  Ｇ．Ｒｅｅｓｅ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｋ  Ｈ．Ｅｅｃｋｍａｎ，Ｌａｗｒｅｎｃｅ  Ｂｅｒｋｅｌｅｙ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｇｒｏｕｐ，１  Ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ  Ｒｏａｄ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ，９４７２０。また、Ｒｅｅｓｅ  ＭＧ，Ｅｅｃｋｍａｎ，ＦＨ，Ｋｕｌｐ，Ｄ，Ｈａｕｓｓｌｅｒ，Ｄ，１９９７．「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｓｐｌｉｃｅ  Ｓｉｔｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｅｎｉｅ」。Ｊ  Ｃｏｍｐ  Ｂｉｏｌ  ４（３），３１１−２３も参照。）第２に、元々の抗−ＩＧＦ−１Ｒ  ＶＨポリペプチド配列をなんら変えることなく、抗−ＩＧＦ−１Ｒ  Ｆａｂの重鎖可変領域のコドンを、ＣＨＯで首尾よく発現される抗体に由来する同じＫａｂａｔ位置に対応するコドンと交換した。この第２の工程で、スプライス部位と思われる部分はほとんど除去されるが、さらにスプライス部位の分析を行った後、同義コドンを交換し、スプライス部位の可能性が高いと予想される部分を減らした。
【０５９８】
抗−ＩＧＦ−１Ｒ  ＦａｂｓであるＭ１３−Ｃ０６（配列番号１８、図５（Ｑ））、Ｍ１４−Ｃ０３（配列番号３０、図５（Ｓ））、Ｍ１４−Ｇ１１（配列番号３６、図５（Ｕ））およびＭ１４−Ｂ０１（配列番号２４、図５（Ｗ））の、配列が最適化されたＶＨ配列をフレーム内に含む合成重鎖リーダーをコードするＤＮＡフラグメントを、商業的な供給業者（Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（ワシントン州ボセル）から、化学合成した二本鎖ＤＮＡ配列として得た。この合成フラグメントには、５’および３’に、Ｎｃｏ  Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位およびＳｆｉ  Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位が含まれていた。このリーダー配列および抗−ＩＧＦ１Ｒの配列が最適化されたＶＨ領域フラグメントを、上の実施例６で示したように、Ｎｃｏ  Ｉ／Ｓｆｉ  Ｉ消化したｐＨＬＰ０２９ベクターにクローン化した。ｐＨＬＰ０２５で、適切な対応する軽鎖で組み換えし、次いで、上の実施例６で示したように、この単鎖フラグメントをｐＸＷＵ００７にクローン化した。配列が最適化された全長非グロコシル化ヒト抗−ＩＧＦ−１Ｒ  ＩｇＧ４．Ｐ抗体を産生する発現構築物を表９に示す。ＤＮＡ配列分析によって正しい配列であることを確認した。哺乳動物において、一連のプラスミドｐＸＷＵ０２９〜ｐＸＷＵ０３２から得られる全長抗体の発現によって、安定な非グリコシル化ヒトＩｇＧ４．Ｐ抗体が産生する。
【０５９９】
（表９）抗−ＩＧＦ−１Ｒ抗体をコードする、配列が最適化された発現プラスミド。最適化された重鎖配列は、前に「ｍ」をつけている。
2010537985.tif 000031
【０６００】
（実施例８  ＩＧＦ−１Ｒ抗体の一過性発現および特性決定）
プラスミドＤＮＡを使用し、ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞を、抗体たんぱく質を一過性発現するように形質変換した。１×ＰＢＳ  ０．４ｍＬ中で、プラスミドＤＮＡ  ２０μｇを、４×１０６細胞と混合した。混合物を０．４ｃｍのキュベット（ＢｉｏＲａｄ）に入れ、氷上に１５分間放置した。Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ電気穿孔装置（ＢｉｏＲａｄ）を用い、６００ｕＦ、３５０Ｖで細胞を電気穿孔した。Ｔ−２５フラスコに、１００ｕＭ  ヒポキサンチンおよび１６ｕＭ  チミジンを含むＣＨＯ−ＳＳＦＭ  ＩＩ培地を入れ、これに細胞を入れ、３７℃で４日間インキュベートした。上澄みを集め、ウェスタンブロットによって生化学的に特性決定し、ＥＬＩＳＡによって抗原への結合性を試験した。
【０６０１】
あるいは、選択したＦａｂを、全長ヒトＩｇＧ４．Ｐ態様に変換し、以下に記載する方法で、異なるベクター系を用いて発現させた。５種類の別個の抗−ＩＧＦ１Ｒ  Ｆａｂ抗体である、Ｍ１２−Ｅ０１、Ｍ１２−Ｇ０４、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３およびＭ１４−Ｇ１１をコードするＤＮＡ配列を、全長ヒトＩｇＧ４．Ｐを発現するベクターに移した。これらの５種類の抗体は、すべてＶＨ３−２３ヒト重鎖生殖系列のフラグメントを使用している。制限酵素ＭｆｅＩおよびＢｓｔＥＩＩを用い、可溶性Ｆａｂ発現ベクターから重鎖可変領域を除去した。得られたフラグメントをアガロースゲル電気泳動し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｔｉｏｎキットプロトコル（ＱＩＡＧＥＮ  ＣＡ）で抽出して精製し、ＭｆｅＩ／ＢｓｔＥＩＩ消化したｐＲＲ２５３ベクター（Ｒａｃｈｅｌ  Ｒｅｎｎａｒｄ）に接続した。得られたプラスミドは、重鎖シグナルペプチド（ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＡＨＳ、配列番号１２７）を含んでおり、その後に、抗−ＩＧＦ１Ｒ  ＶＨおよびヒトＩｇＧ４．Ｐ定常領域を含んでいた。
【０６０２】
５種類の抗体うちの４つ、Ｍ１２−Ｇ０４、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３およびＭ１４−Ｇ１１は、κ軽鎖を含んでいる。軽鎖可変領域を、プライマーを用いてＰＣＲで増幅し、可変領域に対し、５’にＥｃｏＲＶ部位を導入し、３’にＢｓｇＩ部位を導入した。得られたＰＣＲフラグメントをアガロースゲル電気泳動し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｔｉｏｎキットプロトコル（ＱＩＡＧＥＮ  ＣＡ）で抽出して精製し、ＴＯＰＯ２．１  ＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）に接続した。軽鎖κ可変領域を、制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＢｓｇＩを用いてＴＯＰＯベクターから除去し、精製した。このフラグメントを、ＥｃｏＲＶ／ＢｓｇＩで消化したｐＲＲ２３７ベクターに接続し、このフラグメントは、免疫グロブリン軽鎖シグナルペプチド（ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣ、配列番号１２８）と、κ定常領域とを含んでいた。得られたベクターをＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで消化し、完全な発現カセット（シグナル配列、可変κ領域および定常κ領域）を精製し、ＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩで消化したｐＲＲ２２３に接続した。
【０６０３】
Ｍ１２−Ｅ０１抗体は、λ軽鎖領域を含有している。軽鎖可変領域を、プライマーを用いてＰＣＲで増幅し、可変領域の５’にＡｇｅＩ部位を導入した。得られたＰＣＲフラグメントをアガロースゲル電気泳動し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｔｉｏｎキットプロトコル（ＱＩＡＧＥＮ  ＣＡ）で抽出して精製し、ＴＯＰＯ２．１  ＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）に接続した。軽鎖λ可変領域を、制限酵素ＡｇｅＩおよびＡｖｒＩＩを用いてＴＯＰＯベクターから除去し、精製した。このフラグメントを、ＡｇｅＩ／ＡｖｒＩＩで消化したｐＸＷ３４７ベクター（Ｘｉｎ  Ｗａｎｇ）に接続し、このフラグメントは、免疫グロブリン軽鎖シグナルペプチド（ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ、配列番号１２９）と、λ定常領域とを含んでいた。得られたベクターをＮｏｔＩで消化し、完全な発現カセット（シグナル配列、可変λ領域および定常λ領域）を精製し、ＮｏｔＩで消化したｐＲＲ２２３に接続した。
【０６０４】
プラスミドＤＮＡを使用し、抗体タンパク質を一過性発現するように、２９３Ｅ細胞をトランスフェクトした。それぞれの（重鎖および軽鎖）プラスミドＤＮＡ  １．２μｇを、Ｑｉａｇｅｎ’ｓ  Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ（Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）を用い、２×１０６細胞にトランスフェクトした。細胞を３７℃で３日間インキュベートした。上澄みを集め、ウェスタンブロット法およびＥＬＩＳＡ法の両方で、全長抗体であることを確認した。完全ＩｇＧ４．ＰがＩＧＦ−１Ｒに結合する能力をＥＬＩＳＡで確認した。
【０６０５】
（実施例９  抗−ＩＧＦ−１Ｒ抗体を産生するＣＨＯ細胞系の生成）
この実施例には、ヒンジを改変した全長ａｇｌｙ  γ４、κ（本明細書では、「ａｇｌｙ．ＩｇＧ４．Ｐ」または「Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ」と呼ばれる）抗体として、Ｆａｂ  Ｍ１３−Ｃ０６の結合領域を含む抗−ＩＧＦ−１Ｒ抗体を発現させることについて、詳細に説明する。本明細書で記載する他のＦａｂ（すなわち、表３に列挙したもの）は、同様の様式で発現させた。Ｍ１３−Ｃ０６の可変領域および定常領域は、ヒト配列に由来する。完全な軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、ＤＹＡＸファージディスプレイ技術によって、ヒトＩＧＦ−１Ｒに対して作成したＦａｂに由来する。軽鎖可変領域および軽鎖定常領域を、交互スプライス発現ベクターにサブクローン化した。交互スプライス構造を、１個のスプライス供与部分と２個のスプライス受容部分とを用いて軽鎖および重鎖に接続し、各スプライス受容部分は、２種類の鎖のうち１種類をコードする転写物を作成する。免疫グロブリン遺伝子をコードする発現ベクターＤＮＡを、インスリン非依存性チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ  ＤＧ４４ｉ）に電気穿孔した。産生させるために、ＣＨＯトランスフェクトーマ（細胞株４０Ｂ５）を選択した。
【０６０６】
ｐＸＷＵ００７（「空の」発現ベクター）は、ヒトγ４定常領域（重鎖）と、別個のプロモーター−エンハンサーと、哺乳動物細胞で遺伝子発現させるためのポリアデニル化領域とを含んでいるが、可変領域は含んでいない。発現させ、翻訳すると、この重鎖ポリペプチド２は、Ｓ２２８ＰおよびＴ２９９Ａの２箇所にアミノ酸置換が存在し、それぞれ、「半抗体（ｈａｌｆ−ａｎｔｉｂｏｄｙ）」を形成し、Ｎに結合するグルコシル化は起こらない。
【０６０７】
Ｍ１３−Ｃ０６の軽鎖遺伝子の対応する可変（ＶＬ）領域および定常（ＣＬ）領域と、Ｍ１３−Ｃ０６の重鎖遺伝子の対応する可変（ＨＬ）領域とに由来する相補性ＤＮＡを、発現ベクターｐＸＷＵ００７にクローン化した。ｐＸＷＵ００７ベクターは、完全な軽鎖と、ヒト重鎖定常領域のすぐ上流にある可変重鎖ｃＤＮＡとを挿入するためのクローン化部位を含んでいる。Ｉｇ遺伝子に加え、この発現ベクターは、ジヒドロフォレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子を含んでおり、哺乳動物細胞を選択するのに使用することができる。
【０６０８】
次いで、得られた発現ベクターをＣＨＯ細胞にトランスフェクトし、抗−ＩＧＦ−１Ｒを分泌するＣＨＯ細胞株（４０Ｂ５）の作成を開始した。
【０６０９】
ＰＸＷＵ０２２をＣＨＯ細胞に電気穿孔した。免疫グロブリンの軽鎖に特異的なＰＣＲプライマーを使用し、Ｆａｂ軽鎖のｃＤＮＡをＰＣＲで増幅させた。５’特異的なオリゴ配列は、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃの抗−ＣＤ２３分子の軽鎖に由来する未処理のシグナルペプチドを含んでいた。５’オリゴ配列および３’オリゴ配列は、中間体ベクター（ｐＨＬＰ０２５）にサブクローン化するために、それぞれＳｆｉ  Ｉ制限エンドヌクレアーゼ認識配列およびＡｓｃ  Ｉ制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含んでいる。合成重鎖シグナルペプチドを含む５’オリゴ配列を用い、ＶＨ  ｃＤＮＡをＰＣＲで増幅させた。５’オリゴ配列および３’オリゴ配列は、中間体ベクター（ｐＨＬＰ０２９）にサブクローン化するために、それぞれＮｃｏ  Ｉ制限エンドヌクレアーゼ認識配列およびＳｆｉ  Ｉ制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含んでいる。
【０６１０】
軽鎖５’オリゴ配列と、ＶＨ  ３’オリゴ配列と、ｐＨＬＰ０２５と、ｐＨＬＰ０２９とをテンプレートとして用いるオーバーラップＰＣＲ法を利用し、１つのｃＤＮＡセグメントとして、軽鎖およびＶＨ領域と組み合わせた。得られた産物を、ｐＸＷＵ００７のＤｒａ  ＩＩＩ部位にサブクローン化し、最終的な交互スプライス発現ベクターｐＸＷＵ０２２を作成した。この交互スプライス構造は、一次転写物を交互にスプライシングすることによって、１個のプロモーターから２個の転写物を作成する。天然のＣＭＶスプライス供与部位は、準最適化したスプライス受容部位でスプライシングし、軽鎖をコードする転写物を作成するか、または天然のＣＭＶスプライス受容部位でスプライシングし、重鎖をコードする転写物を作成する。準最適化したスプライス受容部位は、両転写物をほぼ同じ量で作成するように設計されている。
【０６１１】
ＤＮＡベクター（ｐＸＷＵ０２２）を、ＨＥＢＳバッファ中で、濃度約７００ｎｇ／μＬで調製した後、ＣＨＯ細胞に電気穿孔した。種々の濃度のＤＮＡ（１５、２０、３０、４０および４５μｇ）を用い、電気穿孔を５回行った。それぞれの電気穿孔は、０．４ｃｍの使い捨てキュベット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、対数期のＣＨＯ細胞４×１０６を、滅菌ＨＥＢＳバッファ０．７ｍＬとともに入れ、ＤＮＡを０．１ｍＬ  ＨＥＢＳとともに入れて行った（合計容積０．８ｍＬ）。Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＸＣＥＬＬを用い、２９０Ｖ、９５０μＦで細胞にショックを与えた。ショックを与えた細胞を室温で１０分間放置し、室温のインスリンを含まないＣＨＯＭ１６培地１０ｍＬと混合し、遠心分離し（１０００ｒｐｍで３回）、吸引した。次いで、細胞を、インスリンを含まないＣＨＯＭ１６培地１２ｍＬ（室温）に再び懸濁させ、Ｔ−７５組織培養フラスコに移した。
【０６１２】
細胞および培地：電気穿孔する前に、無血清培地（ＣＨＯＭ２４）に１×ヌクレオシドを加え、ＣＨＯ細胞を成長させた。ＣＨＯＭ２４は、任意の動物由来成分を含有しない、化学的に特定された、社内の培地処方物である。化学的に特定された、ヌクレオシドを含まないＣＨＯＭ１６培地およびＣＨＯＭ２４培地で、メトトレキサートを選択した。
【０６１３】
電気穿孔の後、４×１０６ＣＨＯ細胞をＴ−７５フラスコに入れた。ヌクレオシドを含まない培地に細胞を播種したら、すぐにＤＨＦＲ発現について選択を始めた。最終的には、１２５ｍＬの振とうフラスコに入ったＣＨＯＭ２４まで細胞を増やした（約３週間）。クローナル細胞株を単離するために、安定なトランスフェクト物を希釈し、４個の９６ウェルプレートにＣＨＯＭ１６  ２００μＬを入れ、これに１細胞／ウェルの濃度で入れた。抗体価をスクリーニングするまでは、プレートを３６℃に維持した。
【０６１４】
ヒトκ鎖に特異的なＥＬＩＳＡを用い、細胞の上澄みをアッセイすることによって、免疫グロブリン産生についてＣＨＯコロニーをスクリーニングした（播種２１日後〜２８日後）。ＥＬＩＳＡで使用した捕捉抗体は、ポリクローナルヤギ抗−ヒトＩｇＧ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）であり、検出抗体は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）に接合したポリクローナルヤギ抗−ヒトκであった。最も免疫グロブリン量が多いコロニーを選択し、数を増やした。
【０６１５】
接種した１９２０ウェルのうち、合計３８１ウェルが、ほぼコンフルエント状態になり、これをアッセイした。３８１ウェルのうち、６０ウェルを、さらなる試験のために数を増やし、この６０ウェルのうち、４種類を増幅のために選択した（１５Ａ７、４０Ｂ３、４０Ｂ５、４０Ｆ６）。
【０６１６】
（実施例１０  全ヒト抗−ＩＧＦ−１Ｒ  ＩｇＧ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体の精製および特性決定）
ＣＨＯ細胞が産生した抗体を、以下に記載する方法で精製し、特性決定した。
【０６１７】
プロテインＡの捕捉：プロテインＡカラムに、１００〜１５０ｃｍ／時間でカラム容積の３倍の量の１×ＰＢＳ（平衡バッファ）を流し、あらかじめ平衡状態にしておく。上澄みを１５０ｃｍ／時間で入れ、樹脂１ｍＬ当たり、αＩＧＦ−１Ｒの最大量は１０ｍｇである。入れた後、カラム容積の５倍分の平衡バッファでカラムを洗浄する。次いで、１００ｍＭグリシン（ｐＨ３．０）を上方向に流して溶出させる。所望のフラクションを集め、２Ｍ  Ｔｒｉｓ塩基で中性ｐＨになるまで滴定する。集めたフラクションを１×ＰＢＳで透析し、物質を濃縮し、サイズ排除工程のために準備する。
【０６１８】
ＳＵＰＥＲＤＥＸＴＭ２００（サイズ排除）による凝集物除去工程は、ＳＵＰＥＲＤＥＸＴＭ２００に、カラム容積の１．５倍の１×ＰＢＳを流速３６ｃｍ／時間で加えて平衡化した後、タンパク質を入れ、所望のフラクションを集める工程を含む。
【０６１９】
同一性試験を以下のように行った。
（１）質量分析による、インタクトな質量分析。電子スプレー質量分析計（ＥＳＩ−ＭＳＤ）で分子量を測定した。分析の前に、サンプルを還元し、ジスルフィド結合を除去した。デコンボリューションした質量スペクトルは、重鎖および軽鎖の質量をあらわしている。
【０６２０】
（２）ＡＢＩタンパク質シーケンサーにオンラインＰＴＨアナライザを取り付け、Ｅｄｍａｎ変性によって、Ｎ末端配列を分析した。軽鎖および重鎖の初期のアミノ酸配列を同定した。
【０６２１】
（３）質量分析によるペプチドマッピング。トリプシンおよび／またはＥｎｄｏＬｙｓＣペプチドマッピングを行い、それぞれのペプチドから得たＬＣ／ＭＳデータを分析することによって、完全な配列包括度を得た。さらに、酸化および脱アミド化の部位およびその量を検出した。
【０６２２】
純度試験を以下のように実施した。（１）ＳＤＳ−ＰａｇｅまたはＣＥ−ＳＤＳ：還元サンプルおよび非還元サンプル。この技術を使用し、抗体のフラグメント化、凝集および不純物を測定した。（２）ＬＳおよびＲＩを組み合わせたＳＥＣ−ＨＰＬＣ技術を使用し、凝集およびフラグメント化を測定し、光分散によって、サンプル成分のモル質量を決定した。（３）ＳＤＳゲル法およびキャピラリーＩＥＦ法を使用し、Ｃ末端およびＮ末端の不均一性および／または脱アミド化から得られる、荷電したアイソフォームの等電点電気泳動パターンおよびｐＩ分布を決定した。
【０６２３】
最後に、カブトガニの血球溶解物（ＬＡＬ）の比濁時間分析法によって、内毒素濃度を測定した。
【０６２４】
図６は、全ヒトＭ１３−Ｃ０６抗体および全ヒトＭ１４−Ｃ０３抗体のＧ４．Ｐ．ａｇｌｙ態様を、非還元条件下および還元条件下でＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析した結果を示す。抗体Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１およびＭ１４−Ｇ１１のＧ４．Ｐ態様およびＧ４．Ｐ．ａｇｌｙ態様の双方を製造した。Ｍ１２−Ｅ０１およびＭ１２−Ｇ０４のＧ４．Ｐ態様を製造した。
【０６２５】
（実施例１１  全ヒト抗−ＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合活性）
可溶性ＩＧＦ−１Ｒに対する、抗体のＧ４．Ｐ．ａｇｌｙ態様およびＧ４．Ｐ態様の結合活性を、ＥＬＩＳＡによって試験した。可溶性ＩＧＦ−１受容体融合タンパク質（Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ）２．５μｇ／ｍＬを０．０２５Ｍ炭酸バッファ（ｐＨ９．６）と混合したものを用い、９６ウェル（ＩＭＭＵＬＯＮ２  ＨＢ、Ｄｙｎｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号３４５５）プレートを５０μＬ／ウェルでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。Ｓｋａｎ  Ｗａｓｈｅｒ  ３００（Ｓｋａｔｒｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で、リン酸緩衝化塩水（ＰＢＳ、Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号９２４０、ｐＨ７．４）に０．０２５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を加えた液でプレートを洗浄し、１％脱脂乳、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）バッファでブロックし、室温で１時間インキュベートした。インキュベートした後、Ｓｋａｎ  Ｗａｓｈｅｒ  ３００で、０．０２５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するＰＢＳでプレートを洗浄した。アッセイのために、可溶性ＩＧＦ−１受容体でコーティングされたプレートを、１％脱脂乳、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を加えたＰＢＳでコントロールおよび種々の濃度の試験抗体を希釈し、これらの物質５０μＬ／ウェルとともにインキュベートした。室温で１時間インキュベートした後、Ｓｋａｎ  Ｗａｓｈｅｒ  ３００で、０．０２５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するＰＢＳでプレートを洗浄した。１％脱脂乳、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を加えたＰＢＳで、ヤギ抗−ヒトκ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈカタログ番号２０６０−０５）を２０００倍に希釈し、５０μＬ／ウェルを加え、結合した抗体を検出した。室温で１時間インキュベートしたプレートを、Ｓｋａｎ  Ｗａｓｈｅｒ  ３００で、０．０２５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するＰＢＳで洗浄した。ＴＭＢ溶液（ＫＩＲＫＥＧＡＡＲＤ  ＆  ＰＥＲＲＹ  ＬＡＢＳ，ＩＮＣ．カタログ：５０−７６−００）を１００μＬ／ウェル加え、２分後に、４Ｎ  Ｈ２ＳＯ４  ５０ｕＬ／ウェル（ＬａｂＣｈｅｍ，カタログ番号ＬＣ２５８３０−１）を加え、反応を停止させた。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓプレートリーダーを用い、吸光度を４５０ｎｍで測定し、ＴＭＢについて５４０ｎｍでバックグラウンドを測定した。ＳＯＦＴＭＡＸ  ＰＲＯソフトウェアパッケージバージョン４．３  ＬＳ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．）でデータを分析した。
【０６２６】
図７（Ａ）は、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１２−Ｅ０１およびＭ１２−Ｇ０４のＧ４態様の濃度依存性の結合を示す。一方、コントロール抗体であるＩＤＥＣ−１５１（Ｇ４．Ｐ）は、ＩＧＦ−１Ｒ．Ｆｃに対して全く結合しなかった。
【０６２７】
図７（Ｂ）は、ＥＬＩＳＡによる、可溶性ＩＧＦ−１Ｒに対する、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１２−Ｅ０１およびＭ１２−Ｇ０４のＧ４．Ｐ．ａｇｌｙ態様の濃度依存性の結合を示す。不適切な特異性を有するＧ４．Ｐ抗体（ＩＤＥＣ−１５１）をネガティブコントロールとして使用したが、ＩＧＦ−１Ｒ．Ｆｃに対して全く結合しなかった。
【０６２８】
ヒト抗体が、腫瘍細胞で発現した野生型ＩＧＦ−１Ｒに結合する性能を、フローサイトメトリーで決定した。腫瘍細胞株ＭＣＦ−７およびＣａｌｕ−６を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号３０００Ａ）および５０μ／ｍｌ  ゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１５７５０−０６０）を加えたＭｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ（ＡＴＣＣ、カタログ番号３０−２００３）で培養した。Ｐａｎｃ−１、Ｃｏｌｏ−２０５、ＮＣＩ−Ｈ２３およびＺＲ−７５を、１０％  ＦＢＳおよび５０μｇ／ｍｌ  ゲンタマイシンを加えたＲＰＭＩ−１６４０（ＡＴＣＣ、カタログ番号３０−２００１）で培養した。トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｔ４０４９；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．（米国モントリオール州セントルイス））溶液を使用し、培養容器に付着した細胞をはがした。
【０６２９】
細胞をリン酸緩衝化塩水（ＰＢＳ）（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号９２４０、ｐＨ７．４）で２回洗浄し、トリプシン処理し、ＰＢＳおよび１０％  ＦＢＳで１回洗浄した。ＦＡＣＳバッファ（０．０５％  ナトリウムアジド、２％  ＦＢＳ、１０％正常ヤギ血清および１００μｇ／ｍｌの正常なヤギＩｇＧとＰＢＳとを混合したもの）で、細胞が１０７細胞／ｍＬになるように調節し、氷上に少なくとも１５分間放置した。コントロールおよび試験抗体をＣｏｒｎｉｎｇ  ３７９０プレートに同量ずつ分けた。Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３７９９プレートに、細胞を５０μｌ／ウェルで加えた。Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３７９０プレートから得た一次抗体を、Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３７９９プレートの各ウェルに、５０μｌ／ウェルで加えた。次いで、細胞（０．５×１０６細胞／サンプル）を氷上で４５分間インキュベートした。インキュベートした後、プレートを１５００ｒｐｍで４分間遠心分離し、上澄みを吸引した。細胞をＦＡＣＳバッファ  １５０μｌに再び懸濁させた。プレートを１５００ｒｐｍで４分間遠心分離し、上澄みを吸引した。ヤギ抗−ヒトＩｇＧ−ＲＰＥ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  カタログ番号２０４０−０９）をＦＡＣＳバッファで７５０倍に希釈し、１００μｌ／ウェルで加えた。次いで、細胞（０．５×１０６細胞／二次抗体）を氷上で４５分間インキュベートした。７ＡＡＤ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、カタログ番号Ａ１３１０）をＦＡＣＳバッファで５００倍に希釈し、５０μｌ／ウェルで加え、氷上で５分間インキュベートした。インキュベートした後、プレートを１５００ｒｐｍで４分間遠心分離し、上澄みを吸引した。細胞をＦＡＣＳバッファ  １５０μｌに再び懸濁させた。細胞をＦＡＣＳバッファに１００μｌ／ウェルで再び懸濁させた。１２×７５ｍｍ  ＦＡＣＳ管ＦＡＣＳバッファ２００μｌを入れ、これに細胞を移した。最後に、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒで、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（両方ともＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用い、細胞の蛍光強度を調べた。
【０６３０】
図８は、ＭＣＦ−７細胞で発現したＩＧＦ−１Ｒに対する、Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ、Ｍ１４−Ｃ０３．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙおよびＭ１４−Ｇ１１．Ｇ４．Ｐの濃度依存性の結合を示す（図８（Ａ））。ＩＧＦ−１Ｒ／３Ｔ３形質転換体および３Ｔ３親細胞に対する結合を試験することによって、抗体の細胞表面での結合性を確認した。すべてのリード抗体は、ＩＧＦ−１Ｒを発現する３Ｔ３には特異的に反応するが、３Ｔ３細胞には反応しなかった（図８（Ｂ））。
【０６３１】
（実施例１２  全ヒト抗体による、リガンドのＩＧＦ−１Ｒへの結合の阻害）
ヒト抗体のＧ４．Ｐ．ａｇｌｙ態様およびＧ４．Ｐ態様が、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２が可溶性ＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃに結合するのをブロックする能力を決定した。Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１およびＭ１２−Ｇ０４のＩｇＧ４態様は、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを両方ともブロックした。一方、この実験では、Ｍ１４−Ｃ０３のみが、ＩＧＦ−２をブロックした（図９（Ａ）および（Ｂ））。
【０６３２】
実施例３に記載した固相ＲＩＡ捕捉法を用い、抗ＩＧＦ−１Ｒのリガンドをブロックする能力を決定した。簡単に説明すると、９６−ウェルＩＭＭＵＬＯＮ２プレートのウェルで、抗体を種々の濃度（１００ｎＭ〜０．０１ｎＭ）で、１２５Ｉ標識されたＩＧＦ−１または１２５Ｉ−ＩＧＦ−２  １００，０００ｃｐｍと一緒にインキュベートした。ヒトＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃは、あらかじめ固定しておいた（２００ｎｇ／ウェル）。室温で１時間インキュベートした後、ウェルを洗浄し、結合した物質の放射能をＧａｍｍａカウンタで計測した。アイソタイプの一致したネガティブ抗体コントロールＩＤＥＣ−１５１（ヒトＧ４）を使用した。阻害率（％）＝［１−（Ａｂ存在下での平均ＣＰＭ）／（バッファ存在下での平均ＣＰＭ）］×１００％で阻害率を算出した。
【０６３３】
結果から、全ヒト抗体Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ、Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ、Ｍ１４−Ｇ１１．Ｇ４．Ｐ、Ｍ１４−Ｇ１１．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ、Ｍ１４−Ｂ０１．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ、Ｍ１２−Ｅ０１．Ｇ４．ＰおよびＭ１２−Ｇ０４．Ｇ４．Ｐは、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを両方ともブロックすることが分かった。一方、この実験では、抗体Ｍ１４−Ｃ０３．Ｇ４．ＰおよびＭ１４−Ｃ０３．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙは、ＩＧＦ−１Ｒに対するＩＧＦ−２の結合のみをブロックした。図９（Ａ）〜（Ｂ）を参照。
【０６３４】
（実施例１３  全ヒト抗−ＩＧＦ−１Ｒ抗体による、腫瘍細胞の成長阻害）
抗体が、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２による腫瘍細胞の成長を阻害する能力を、細胞生存アッセイを用いて試験した。
【０６３５】
ＮＣＩ−Ｈ２３、Ｃａｌｕ−６、Ｃｏｌｏ−２０５、Ｐａｎｃ−１、ＢｘＰＣ−３（ＡＴＣＣ）腫瘍細胞株をＡＴＣＣから購入した。細胞を、ＲＰＭＩ−１６４０（ＡＴＣＣ）、１０％ウシ胎児血清（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）および５０μｇ／ｍｌ  ゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む完全成長培地で成長させた。トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（Ｓｉｇｍａ）を用い、培養容器から接着した細胞をはがした。リン酸緩衝化塩水（ｐＨ７．２）をＭｅｄｉａＴｅｃｈ  Ｉｎｃから得た。９６ウェルの底が透明なプレートを発光アッセイ用にＷａｌｌａｃ  Ｉｎｃから購入した。
【０６３６】
細胞が８０％の単一層になるまで成長させ、トリプシン処理し、洗浄し、ＮＣＩ−Ｈ２３細胞およびＣｏｌｏ−２０５細胞の場合、８×１０３細胞／ウェルを、Ｃａｌｕ−６細胞、Ｐａｎｃ−１細胞およびＢｘＰＣ−３細胞の場合、５×１０３細胞／ウェルを、２％成長培地２００μｌを入れた９６ウェルプレートに播種した。２４時間後、培地を無血清培地（ＳＦＭ）１００μｌと交換し、段階的に希釈した４倍濃度の抗体５０μｌを加えた。３７℃でさらに１時間インキュベートした後、４倍濃度のＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２  ５０μｌを加え、４８時間後に細胞成長率を測定するまで、３７℃でインキュベートした。すべての処理を３ッ組で行った。細胞の成長をＣＥＬＬ  ＴＩＴＥＲ−ＧＬＯＴＭ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ（ウィスコンシン州マディソン））で測定した。試薬とＳＦＭとの１：１混合物を２００μｌ／ウェルで加えた。Ｗａｌｌａｃ（マサチューセッツ州ボストン）プレートリーダーで発光を検出した。
【０６３７】
抗−ＩＧＦ−１Ｒ抗体の種々のヒトＩｇＧ４態様は、Ｈ−２３（ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２）、Ｃａｌｕ−６（ＩＧＦ−２）細胞における、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２による細胞増殖を阻害した（図１０（Ａ）〜（Ｃ））。他の細胞株も、これに匹敵する傾向を示した（例えば、実施例２０を参照）。
【０６３８】
（実施例１４  全ヒト抗−ＩＧＦ−１Ｒ抗体による、ＩＧＦ−１Ｒの内在化）
染色手順を行う４８時間前に、ＭＣＦ−７細胞を、８ウェルチャンバスライド（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  １型でコーティングされた培養スライド、ＢＤ  ＢｉｏＣｏａｔＴＭ  番号３５４６３０）に５０，０００細胞／ウェルで接種した。定期的に、細胞の継代数は２０を超えないようにした。染色手順を行う当日に、各ウェルから培地を取り出して捨て、冷インキュベーションバッファ（ＭＥＭ  Ｅａｇｌｅ  ＡＴＣＣ  番号３０−２００３＋１％ＢＳＡ）５００μＬと交換した。このバッファで細胞を２回洗浄した（各洗浄時間は３分）。試験対象のそれぞれのｍＡｂまたはヒトＧ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体２５０μＬを、適切なウェルに濃度１０μｇ／ｍｌで加え、インキュベーション用培地で希釈し、氷上で１時間インキュベートした。マウス抗−ヒト−ＩＧＦ−１Ｒ抗体（Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ／ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ、クローン２４−３１  カタログ番号ＭＳ−６４１）をポジティブコントロール抗体として使用し、内在化度を比較した。氷上で１時間インキュベートした後、０時間（ｔ＝０’）のスライドを冷たい洗浄バッファ（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋２％ヤギ血清）５００μＬで３回洗浄した（各洗浄時間は３分、スライドは常に氷上に置いておくこと！）。ｔ＝０のスライドを４％パラホルムアルデヒド（１６％ストック溶液をＰＢＳで希釈；ＥＭＳ  番号１５７１０）５００μＬで、室温で１５分間洗浄した。次いで、ｔ＝０のスライドを冷たい洗浄バッファで再び３回洗浄し（各洗浄時間は３分）、氷上に置いた。その間に、残りのスライドを３７℃のインキュベーターに所定の時間入れた（１５分および６０分）。インキュベート終了時間になったら、それぞれのスライドを、上述の洗浄および固定の工程と同じ手順で処理し、氷上に置いた。次いで、すべてのスライドに対し、氷上で冷たい透過バッファ（洗浄バッファ＋０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ）２００μＬを用いて１０分間透過処理した。次いで、すべてのスライドを冷たい洗浄バッファ５００μＬで３回洗浄した（各洗浄時間は３分）。洗浄バッファで１：１０００希釈（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８  ヤギ−抗−マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ｍＡｂのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ  番号Ａ１１０２９、およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８  ヤギ−抗−ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、Ｇ４抗体のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ  番号Ａ１１０１３  ｆｏｒ  Ｇ４  抗体）することによって、二次抗体を調製し、ストックバイアルを、初期回転速度１０，０００ｒｐｍで、４℃で１０分間回転させた。それぞれのウェルに、希釈した二次抗体２５０μＬを加え、暗状態（覆った状態）で、室温で４０分間インキュベートした。スライドを冷たい洗浄バッファ５００μＬで再び３回洗浄した。最後の洗浄時に、バッファを捨て、すべてのウェルを空にした。次いで、提供された分解ツールを用い、スライドからチャンバを分解し、ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ  番号Ｈ−１５００、Ｈａｒｄ  ＳｅｔＴＭ）を含有するＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ取り付け媒体で、カバー片を取り付けた。暗状態で、スライドを４℃で一晩保存し、取り付けた媒体を乾燥させた。
【０６３９】
ＬａｓｅｒＳｈａｒｐ  ２０００プログラム（ＢｉｏＲａｄ  ｖ５．２）を用い、共焦点顕微鏡でスライドの画像を造影し、Ｋａｌｍａｎの１０平均から、青色成分および緑色成分の組み合わせとしてあらわした。共焦点顕微鏡で、時間点０分、１５分および６０分で、Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体によるＩＧＦ−１Ｒの内在化を観察した。
【０６４０】
Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙは、ＩＧＦ−１Ｒを６０分ですみやかに内在化した（データは示していない）。Ｍ１４−Ｃ０３．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙおよびＭ１４−Ｇ１１．４．Ｐも、Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体と同様の内在化性能を示した（データは示していない）。予想されたように、ポジティブコントロールの、クローン２４−３１も、この受容体を内在化させたが、アイソタイプの一致したネガティブコントロール（マウス７Ｆ２およびヒトＧ４、ＩＤＥＣ−１５２．Ｇ．Ｐ（霊長類化抗体））は、結合しないか、または内在化させなかった（データは示していない）。
【０６４１】
さらに、受容体の内在化速度を、特定のマウスモノクローナル抗体について、ＦＡＣＳに基づく方法によって測定した。７０％コンフルエントの単一層になるまで成長させたＭＣＦ−７細胞を、細胞解離バッファ（Ｇｉｂｃｏ  カタログ番号１３１５１−０１４）を用いてフラスコから取り出した。細胞を培地に再懸濁させ、１２×７５ｍｍ管（Ｆａｌｃｏｎ  カタログ番号３５２０５４）に５×１０６細胞を加え、各管は、試験するそれぞれの異なるｍＡｂを示した。管にアジドを含まない０．５ｍｌ  ＦＡＣＳバッファ（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ）を入れ、対応する管に１０μｇ／ｍｌのｍＡｂを入れ、内在化実験の誤差を測定するために、抗体を入れないコントロール管も準備した。管を氷上で１時間１５分インキュベートし、１ｍｌ  ＦＡＣＳ  バッファで洗浄し、再構築した。各サンプル１００μＬを取り出し、９６ウェルの底部がｕ型のプレート（ＮＵＮＣ  番号１６３３２０）を氷上に置き、この１つのウェルに各サンプル１００μＬを入れ、内在化を防ぎ、この時間をゼロとした（ｔ＝０）。このサンプルを１００％Ａｂに結合したコントロールとして使用した。次いで、管を３７ｏＣの水浴に移し、サンプル１００μＬを時間（ｔ）＝５、１０、２０、４０および６０分で取り出し（その後、５、１０、１５、３０および６０分に変更）、９６ウェルの底部がｕ型のプレートを氷上に置いたまま、別のウェルに入れた。すべてのサンプルを集めたら、４℃の冷蔵庫の中でプレートを１２００ｒｐｍで回転させ、細胞をペレット化した。受容体の内在化を検出するために加えた抗体は、細胞表面に残った受容体を検出するために、抗−ＣＤ２２１−ＰＥ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  カタログ番号５５５９９９  −  抗−ＩＧＦ−１Ｒ；１０μ／１００μＬサンプル）であり、または細胞表面に残った抗体を検出するために、ヤギ−抗−マウス−ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ  カタログ番号１１５−１１６−１４６；５μμｇ／ｍＬ）であった。０．１％ナトリウムアジドを含有するＦＡＣＳバッファ中、サンプルを１時間インキュベートし、１回洗浄し、アジドを含有するＦＡＣＳで最終容積を２００μＬにした。次いで、サンプルを試験し、ＦＡＣＳＡｒｒａｙ（ＢＤ）を用いて集め、相乗平均を決定した。さらに、ＰＥ標識したＱｕａｎｔｉｂｒｉｔｅビーズ（ＢＤ  番号３４０４９５）を試験して、細胞表面に結合したＰＥ分子の数を定量し、Ｑｕａｎｔｉｂｒｉｔｅビーズを、同じＦＬ２設定でサンプルとして試験した。ビーズに結合したＰＥ分子の数は、パッケージング状態で得られ、サンプルおよびビーズの相乗平均を用い、細胞表面に結合したＰＥ分子の数を定量した。ＦＡＣＳアッセイによって、試験したマウスモノクローナル抗体は、ＩＧＦ−１Ｒの内在化を促進することが分かった（データは示していない）。
【０６４２】
（実施例１５  全ヒト抗体による、ＩＧＦ−１Ｒが介在するシグナル伝達の阻害）
第Ｉ部：ＭＣＦ−７細胞における、シグナル伝達の阻害
ヒト抗−ＩＧＦ−１Ｒ抗体がＩＧＦ−１Ｒシグナル伝達に与える影響を、ＭＣＦ−７細胞（ヒト乳腺癌細胞）を用いて評価した。抗体が、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２が介在するＩＧＦ−１Ｒ受容体リン酸化をブロックする能力は、実施例４に記載したように決定した。全ヒト抗体のすべてのＩｇＧ４態様は、良好な阻害性を示し（ＥＣ５０＜１ｎＭ）ＩＧＦ−１Ｒのリン酸化を阻害した（図１１（ＡおよびＢ））。
【０６４３】
下流のシグナル伝達を検出するために、実施例４に記載したように、細胞溶解物を作成した。シグナル伝達実験のために、血清を含まない状態にした後、新鮮な無血清培地３５０μＬ中、コントロールおよび試験抗体を１００ｎＭ、１５ｎＭ、５ｎＭおよび１ｎＭの濃度で加え、３７℃で１時間インキュベートした。ヒト組み換えＩＧＦ−１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、番号２９１−Ｇ１）を無血清培地３５μＬ中、１３ｎＭの濃度で、ヒト組み換えＩＧＦ−ＩＩ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、番号２９２−Ｇ２）を２７ｎＭの濃度でウェルに加え、室温で１５分間インキュベートした。細胞を溶解させ、回収したサンプルを４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルを用いて分離し、ニトロセルロース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）に固定した。ＩＧＦ−１Ｒシグナル伝達経路を、位置Ｔｈｒ３０８でホスホ−Ａｋｔで検出し（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、番号４０５６）、位置Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４でホスホ−ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、番号９１０１）で検出し、抗−ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、番号７０７１）で検出した。ＥＣＬルミノール試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、番号ＲＰＮ２１０９）およびオートラジオグラフィーを用い、バンドを視覚化した。各ブロットを抗体からはずし、完全Ａｋｔ（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、番号９２７２）または完全ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、番号９１０２）および抗−ウサギＩｇＧ−ＨＲＰを再びプローブした。ＥＣＬルミノール試薬およびオートラジオグラフィーを用い、バンドを視覚化した。
【０６４４】
抗体が下流のシグナル伝達事象（例えば、ＡｋｔおよびＭＡＰＫのリン酸化）に与える影響を決定した。自己リン酸化から得た細胞溶解物をポリクローナルＩＧＦ−１Ｒβ抗体−アガロース接合物（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、番号ＳＣ−７１３）で免疫沈降させた。回収した受容体タンパク質を４−１２％  Ｔｒｉｓ−グリシリンゲルを用いて分離し、ニトロセルロース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）に固定した。受容体を、抗−ホスホ−ＩＧＦ−１Ｒ部位であるＴｙｒ１１３１（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、場所３０２１）で検出するか、または抗−ＩＧＦ−１Ｒβ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、番号ＳＣ−９０３８）および抗−ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、番号７０７１）で検出した。ＥＣＬルミノール試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、番号ＲＰＮ２１０９）およびオートラジオグラフィーを用い、バンドを視覚化した（図１２Ａおよび１２Ｂ）。
【０６４５】
図１２Ａおよび１２Ｂは、Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙが、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２が介在するＡｋｔおよびｐ４２／４４  ＭＡＰＫのリン酸化を用量依存様式で阻害することを示す。特に、ＭＣＦ７細胞において、Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ  ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２によって誘発される、アミノ酸残基Ｓｅｒ４７３でのＡｋｔリン酸化の阻害によって示されるように、試験したすべての濃度（すなわち、１〜１００ｎＭ）で、リガンドによって誘発されるシグナル伝達を阻害した（図１８）。コントロール抗体を１００ｎＭで試験し、Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．ｐ．ａｇｌｙを、１００、１５、５および１ｎＭで試験した。ＩＤＥＣ−１５２抗体（不適切な特異性を有する抗体のヒトＧ４態様）をネガティブコントロールとして使用した。ＩＲ３抗体（ＩＧＦ−１Ｒに対するマウスモノクローナル抗体）をポジティブコントロールとして使用した。さらに、Ｍ１４−Ｃ０３．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体およびＭ１４．Ｇ１１．Ｇ４．Ｐ全長抗体も、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２による、Ａｋｔおよびｐ４２／４４  ＭＡＰＫを活性化するシグナル伝達を阻害した（データは示していない）。
【０６４６】
第ＩＩ部：Ａ５４９細胞、Ｃａｌｕ−６細胞およびＨ１２９９細胞における、シグナル伝達の阻害）
Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙが、インスリン受容体基質（ＩＲＳ−１）と、ホスホイノシチド  ３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）の制御サブユニットであるｐ８５との会合を破壊する能力を、腫瘍細胞株での同時免疫沈降アッセイによって決定した。特に、ＩＲＳ−１は、Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体感受性のＮＳＣＬＣ細胞株において、ＩＧＦ−１Ｒに依存する様式でＰＩ３Ｋサブユニットｐ８５に結合する。したがって、２種類の非小細胞肺癌細胞株（ＮＳＣＬＣ）であるＡ５４９細胞およびＨ１２９９細胞（Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙに応答しない）と、ＮＳＣＬＣ細胞株であるＣａｌｕ−６細胞（Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙにほとんど応答しない）を、Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体またはコントロール抗体（ＩＤＥＣ−１５１）存在下、２４時間成長させた。細胞溶解物を抗−ｐ８５抗体で免疫沈降させ、抗−ＩＲＳ−１抗体（上側のブロット）および抗−ｐ８５抗体（下側のブロット）（図２４）を用い、ウェスタンブロット分析を行った。
【０６４７】
このアッセイのために、ヒト肺腫瘍細胞株であるＡ５４９細胞、Ｃａｌｕ−６細胞およびＮＣＩ−１２９９細胞をＡＴＣＣから購入し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ培地１６４０中で維持した。１００ｍｍ皿に、細胞を３×１０６細胞／皿で接種し、２４時間培養し、５％  ＦＢＳ存在下、１００ｎＭのＭ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙまたはＩＤＥＣ−１５１（ヒトＧ４．Ｐのアイソタイプの一致したネガティブコントロール抗体）で２４時間処理した。Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（米国マサチューセッツ州ダンバーズ）から得た１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶解バッファで細胞溶解物を調製した。免疫沈降のために、抗−ｐ８５抗体（カタログ番号０６−６４９、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（現在は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（米国マサチューセッツ州コンコード）の一部）をこの溶解物に加え（溶解物１〜２ｍｇあたり、抗体４ｕｇ）、４℃で一晩インキュベートした。プロテイン−Ｇアガロースビーズと４℃で２時間混合することによって、免疫複合体を捕捉した。免疫沈降物を氷冷した溶解バッファで洗浄し、２×ＬＤＳ（ドデシル硫酸リチウム）サンプルバッファ中で沸騰させた後、ＮｕＰＡＧＥ（Ｒ）  Ｎｏｖｅｘ  ４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌ電気泳動（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．（米国カリフォルニア州カールズバッド）で分離し、ニトロセルロース膜に移した。ＩＲＳ−１抗体（カタログ番号０６−２４８、Ｕｐｓｔａｔｅ）およびｐ８５抗体（カタログ番号０６−６４９、Ｕｐｓｔａｔｅ）をＭｉｌｌｉｐｏｒｅから購入し、製造業者のプロトコルを用い、免疫ブロッティングを行った。
【０６４８】
結果：Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙは、Ａ５４９細胞株およびＨ１２９９細胞株において、血清存在下、ＩＲＳ−１と、ＰＩ３Ｋの制御ユニットｐ８５との会合を阻害したが、Ｃａｌｕ−６細胞では阻害しなかった（図２４）。
【０６４９】
（実施例１６  非ヒト霊長類化ＩＧＦ−１Ｒに対する、抗体の交差反応性）
抗−ヒトＩＧＦ−１Ｒ抗体が、非ヒト霊長類に由来するＩＧＦ−１Ｒを認識する能力について試験した。まず、アカゲザルおよびカニクイザルのＩＧＦ−１Ｒをクローン化し、ＣＨＯ細胞で発現させた。両抗体の結合性をフローサイトメトリーで決定し、共焦点顕微鏡で確認した。Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ、Ｍ１４．Ｃ０３．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙおよびＭ１４．Ｇ１１．Ｇ４．Ｐは、アカゲザルおよびカニクイザルのＩＧＦ−１Ｒに対し、すべて特異的な結合活性を示した（データは示していない）。さらなる種を用いた交差反応性試験によって、Ｍ１４．Ｇ１１．Ｇ４．ＰおよびＭ１４．Ｃ０３．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙが、マウスＩＧＦ−１Ｒを発現するＣＨＯ細胞に結合することを示した（データは示していない）。
【０６５０】
ＣＨＯ細胞で発現したカニクイザルＩＧＦ−１Ｒに加え、Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体は、マカク（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍａｃａｑｕｅ）に由来する顆粒球および単球で発現したマカクＩＧＦ−１Ｒと交差反応する。（結合特異性は、可溶性組み換えヒトＩＧＦ−１Ｒが、Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体の結合をブロックする能力によって示した（データは示していない））。同様に、Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体も、樹立されたカニクイザル線維芽細胞株に結合する（実施例２６、図２２を参照）。これらの結果は、マカクが、毒性試験を行うのに理想的な非げっ歯種であることを示している。
【０６５１】
霊長類でＩＧＦ−１Ｒ受容体を用いた試験とは対照的に、Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙは、ＦＡＣＳで評価した場合、免疫細胞（顆粒球、単球、リンパ球）で発現したラットまたはマウスのＩＧＦ−１Ｒに対し、交差反応しなかった。
【０６５２】
（実施例１７  ＩＧＦ−１Ｒに特異的なマウスＭａｂの作成）
ヒトＩＧＦ−１Ｒに特異的なマウスモノクローナル抗体を、標準的なハイブリドーマ技術で作成した。Ｂａｌｂ／ｃマウスに由来する脾細胞を、ＩＧＦ−１Ｒを発現するＮＩＨ−３Ｔ３線維芽細胞で免疫化し、ＩＧＦ−１Ｒ．Ｉｇ融合タンパク質を使用し、ＰＥＧによって誘発される体細胞融合を起こさせた。表４には、抗−ＩＧＦ−１Ｒマウスモノクローナル抗体の性質をまとめている。
【０６５３】
選択したマウス抗体が、いくつかのヒト腫瘍細胞株（肺、Ｈ−２３細胞、Ｃａｌｕ−６細胞；膵臓、ＢｘＰｃ−３細胞、Ｐａｎｃ−１細胞、ＭｉａＰａＣａ細胞、および直腸、Ｃｏｌｏ２０５細胞）のインビトロ成長に依存してＩＧＦ／ＩＧＦ−１Ｒを阻害する能力を、実施例１３に説明する増殖アッセイで測定した。図１３（Ａ）〜（Ｆ）は、ＩＧＦ−１  １００ｎｇ／ｍｌ存在下、８種類のマウス抗体が、腫瘍細胞に対し、抗体濃度に依存する阻害効果を有することを示す。
【０６５４】
抗体が、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２による腫瘍細胞の成長をブロックする能力を、ＮＣＩ−Ｈ２３肺腫瘍細胞株を用いて比較した。図１４は、３種類のマウスＭＡｂｓ’（Ｐ２Ａ７−３Ｅ１１（または「Ｐ２Ａ７」）、２０Ｃ８−３Ｅ８（または「２０Ｃ８」）、Ｐ１Ａ２−２Ｂ１１（または「Ｐ１Ａ２」））と、１種類の全ヒト抗体Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙとを用い、成長阻害効果を調べた例を示している。すべての抗体が、ＩＧＦＧ−１およびＩＧＦ−２による腫瘍成長を阻害していることが分かった。市販の抗−ＩＧＦ−１Ｒ抗体（ＩＲ３）をポジティブコントロールとして使用した。マウスＩｇＧ（抗−ＩＤｅｃｔｉｎ、ＩｇＧ１）および不適切な特異性を有するＩＤＥＣ−１５２抗体のヒトγ４態様を、アイソタイプの一致したコントロールとしてこの実験で使用した。
【０６５５】
（実施例１８  マウス抗−ヒトＩＧＦ−１Ｒ  ｍＡｂのクローン化）
抗−ＩＧＦ−１ＲマウスハイブリドーマＰ２Ａ７．３Ｅ１１免疫グロブリン可変領域のクローン化
Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙミニキットを用い、製造業者が推奨するプロトコルにしたがって、マウスハイブリドーマ細胞に由来する全細胞ＲＮＡを調製した。Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ合成キットを用い、製造業者が推奨するプロトコルにしたがい、ランダムヘキサマーをプライマーとして用い、全細胞ＲＮＡから、重鎖および軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲによってクローン化した。
【０６５６】
Ｐ２Ａ７．３Ｅ１１可変領域のクローン化およびキメラ化を、一例として詳細に記載する（他のｍＡｂ可変領域を同様の方法でクローン化し、キメラ化したが、抗体の遺伝子操作分野の当業者に周知の標準的な生物学的技術を使用したので、簡略化のために詳細は記載しない）。インタクトなシグナル配列を有するマウス免疫グロブリン可変領域をＰＣＲ増幅させるために、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、１９９９）に記載されるような、複数のマウス免疫グロブリン遺伝子群のシグナル配列にハイブリダイズする順方向変性プライマーと、マウス定常領域の５’末端に特異的な１個の逆プライマーとを含む混合物を使用した。Ｃｌｏｎｔｅｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  Ｔａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲ条件は、以下のとおりであった。初期変性は、９４℃で２分間、次いで、９４℃×１分変性し、４５℃で１分間アニーリングし、７２℃で１分間伸長させるサイクルを３０サイクル。Ｐ２Ａ７の重鎖可変領域は、以下のプライマーで増幅させた。５’  ＧＧＧ  ＧＡＴ  ＡＴＣ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＧＲ  ＡＴＧ  ＳＡＧ  ＣＴＧ  ＫＧＴ  ＭＡＴ  ＳＣＴ  ＣＴＴ  ３’（Ｍ＝Ａ／Ｃ、Ｋ＝Ｇ／Ｔ、Ｒ＝Ａ／ＧおよびＳ＝Ｃ／Ｇ）（配列番号１３０）および５’  ＡＧＧ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＡＹＣ  ＴＣＣ  ＡＣＡ  ＣＡＣ  ＡＧＧ  ＲＲＣ  ＣＡＧ  ＴＧＧ  ＡＴＡ  ＧＡＣ  ３’（Ｒ＝Ａ／ＧおよびＹ＝Ｃ／Ｔ）（配列番号１３１）。シグナル配列を有するＰ２Ａ７の軽鎖可変領域は、以下のプライマーで増幅させた。５’  ＧＧＧ  ＧＡＴ  ＡＴＣ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＧＡ  ＴＴＴ  ＴＣＡ  ＧＧＴ  ＧＣＡ  ＧＡＴ  ＴＴＴ  ＣＡＧ  ３’（配列番号１３２）および５’  ＧＣＧ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＡＣＴ  ＧＧＡ  ＴＧＧ  ＴＧＧ  ＧＡＧ  ＡＴＧ  ＧＡ  ３’（配列番号１３３）。Ｑｉａｇｅｎ  Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用い、製造業者が推奨するプロトコルにしたがってＰＣＲ産物をゲル精製した。ＴＯＰＯクローン化キットを用い、製造業者が推奨するプロトコルにしたがって、精製したＰＣＲ産物をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐＣＲ２．１ＴＯＰＯベクターにサブクローン化した。ＰＣＲ誤差を防ぐために、複数の独立したサブクローンに由来する挿入物を配列決定した。
【０６５７】
可変領域の配列をＢｌａｓｔ分析し、これらの免疫グロブリンの同一性を確認した。Ｐ２Ａ７の重鎖可変領域は、マウスサブグループＩＩ（Ａ）に属している。Ｐ２Ａ７成熟重鎖可変領域の配列を示す。ＣＤＲには下線を引いている（相補性決定領域（ＣＤＲ）は、Ｋａｂａｔ命名法による）。
2010537985.tif 000032
【０６５８】
２Ａ７の軽鎖可変領域は、マウスκサブグループＩＶに属している。Ｐ２Ａ７成熟軽鎖可変領域の配列を以下に示す（ＣＤＲには下線を引いている）。
2010537985.tif 000033
【０６５９】
（ｃｈＰ２Ａ７の構築および発現）
重鎖および軽鎖のマウスＰ２Ａ７可変領域をコードするｃＤＮＡを使用し、ｍｕＰ２Ａ７可変領域が、ヒトＩｇＧ４領域およびκ定常領域に結合しているマウス−ヒトキメラ（ｃｈＰ２Ａ７）を発現するベクターを構築した。重鎖のキメラ構造を構築するために、Ｐ２Ａ７重鎖サブクローンｐＣＮ３６３に由来する０．４７ｋｂのＮｏｔＩ−ＢｓｍＢＩフラグメントと、ｐＥＡＧ１９９５に由来する１．０ｋｂのＢｓｍＢＩ−ＮｏｔＩフラグメント（配列が確認された非グリコシル化Ｓ２２８Ｐ／Ｔ２９９Ａ（Ｋａｂａｔ  ＥＵ命名法）改変体のｈｕＩｇＧ４重鎖構築領域ｃＤＮＡを含有し、ＩｇＧ４のＣ末端リジン残基が遺伝的に除去されているプラスミド）とを、ｐＶ９０のホスファターゼ処理した６．１ｋｂのＮｏｔＩ−線形ベクター骨格（配列が確認されているｐＵＣ系の、ＳＶ４０初期プロモーターによって活性化するｄｈｆｒ選択可能マーカーを含むＢｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃが所有する発現ベクター、異種遺伝子の発現は、ＣＭＶ−ＩＥプロモーターおよびヒト成長ホルモンポリアデニル化シグナルによって制御されている）にサブクローン化した。得られたプラスミドｐＥＡＧ２０４５の重鎖ｃＤＮＡ配列をＤＮＡシーケンシングで確認した。このキメラＰ２Ａ７重鎖ｃＤＮＡ挿入物（開始コドンＡＴＧから停止コドンＴＧＡまでのシグナル配列）を、以下に配列番号１３４として示す。
2010537985.tif 000034
【０６６０】
成熟ｃｈＰ２Ａ７重鎖タンパク質の推定配列を、以下に配列番号１３５として示す。
2010537985.tif 000035
【０６６１】
マウス可変領域は、残基１〜１２２であり、ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域は、残基１２３〜４５９である。Ｋａｂａｔ  ＥＵで命名したＳ２２８Ｐヒンジ置換（ＩｇＧ４が、半抗体を形成する性質を補正する目的）は、上の残基２３１であり、Ｎ結合のグリコシル化を遺伝的に除去するＣＨ２のＴ２９９Ａ置換は、上の配列の残基３０２である。
【０６６２】
軽鎖キメラ構造を構築するために、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ（Ｒ）Ｑｕｉｃｋ−Ｃｈａｎｇｅ突然変異キットを用い、製造業者が推奨するプロトコルにしたがって、変異プライマー５’  ＣＧＣ  ＣＡＧ  ＴＧＴ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＴ  ＧＧＡ  ＡＴＴ  ＣＧＣ  ＣＣＴ  ＴＧ  ３’（配列番号１３６）およびその逆の相補体を用い、ＰＣＲで増幅したＰ２Ａ７軽鎖を部位特異的に変異させ、重鎖シグナル配列の５’に固有のＮｏｔＩ部位を導入し、５’  ＧＧＡ  ＣＣＡ  ＡＧＣ  ＴＧＧ  ＡＧＣ  ＴＧＡ  ＡＧＣ  ＧＴＡ  ＣＧＧ  ＡＴＧ  ＣＴＧ  ＣＡＣ  ＣＡＡ  ＣＴＧ  ＴＡＴ  ＣＣ  ３’（配列番号１３７）およびその逆の相補体を用い、軽鎖可変／κ定常領域の接合部のすぐ顆粒にある固有のＢｓｉＷＩ部位を導入した。導入したＮｏｔＩ部位およびＢｓｉＷＩ部位の変更について、変異させたプラスミドをスクリーニングによって同定した。軽鎖の配列をＤＮＡシーケンシングによって確認した。上述のように作成した０．４２ｋｂのＮｏｔＩ−ＢｓｉＷＩ軽鎖可変領域フラグメントと、プラスミドｐＥＡＧ１５７２に由来し、配列が確認されたヒト化抗−ＬＴｂＲκ軽鎖定常領域のｃＤＮＡ配列を含む０．３４ｋｂのＢｓｉＷＩ−ＮｏｔＩフラグメントとを、発現ベクターｐＥＡＧ１２５６のＮｏｔＩ部位（配列が確認されているｐＵＣ系の、ホスホグリセロキナーゼプロモーターによって活性化するｎｅｏ選択可能マーカーを含む発現ベクター、異種遺伝子の発現は、ＣＭＶ−ＩＥプロモーターおよびヒト成長ホルモンポリアデニル化シグナルによって制御されている）にサブクローン化した。得られたプラスミドの軽鎖ｃＤＮＡ配列をＤＮＡシーケンシングによって確認した。キメラＰ２Ａ７軽鎖ｃＤＮＡ挿入物（開始コドンＡＴＧから停止コドンＴＡＧまでのシグナル配列）を、以下に示す（配列番号１３８）。
2010537985.tif 000036
【０６６３】
成熟ｃｈＰ２Ａ７軽鎖タンパク質の推定配列を以下に示す（配列番号１３９）。
2010537985.tif 000037
【０６６４】
マウス可変領域は、上の残基１〜１０８であり、ヒトκ定常領域は、上の配列の残基１０９〜２１５である。
【０６６５】
ｃｈＰ２Ａ７重鎖発現ベクターおよびｃｈＰ２Ａ７軽鎖発現ベクターを、２９３−ＥＢＮＡ細胞にトランスフェクトし、トランスフェクトした細胞の抗体分泌性および抗体特異性を試験した。空のベクターと、ｈｕ５ｃ８−Ｓ２２８Ｐ／Ｔ２９９Ａ  ＩｇＧ４（分子クローン化したＣＤ４０Ｌに特異的なｍＡｂ）をトランスフェクトした細胞とをコントロールとして使用した。馴化培地のウェスタンブロット分析（抗−ヒト抗体の重鎖および軽鎖を用いて行った）から、ｃｈＰ２Ａ７をトランスフェクトした細胞が、重鎖および軽鎖を合成し、効率よく分泌することが分かった。ＩＧＦ−１Ｒを発現するＭＣＦ７ヒト乳腺癌細胞を、トランスフェクトした細胞から得た馴化培地で染色し、ＦＡＣＳ分析すると、ｃｈＰ２Ａ７抗体の結合パターンおよび染色パターンが、ｍｕＰ２Ａ７と類似しており、一方、モックでトランスフェクトした細胞およびｈｕ５ｃ８でトランスフェクトした細胞は、ＭＣＦ７細胞を染色することができないことが分かった（ＰＥ接合した抗−ヒト抗体の重鎖および軽鎖を用いて検出）。希釈滴定によって、ｃｈＰ２Ａ７  ｍＡｂを含有する馴化培地を用いた特異的な染色は、用量依存性であることが分かった。ＣＨＯ細胞を、ｃｈＰ２Ａ７重鎖発現ベクターおよびｃｈＰ２Ａ７軽鎖発現ベクターの両方でトランスフェクトし、キメラＰ２Ａ７−非グリコシル化ｈｕＩｇＧ４のκｍＡｂを安定に発現する株を作成した。
【０６６６】
（抗−ＩＧＦ−１Ｒマウスハイブリドーマ２０Ｃ８．３Ｂ８免疫グロブリン可変領域のクローン化）
他の抗−ＩＧＦ−１ＲｍＡｂの可変領域をクローン化し、Ｐ２Ａ７  ｍＡｂで記載した方法と似た標準的な組み換えＤＮＡ技術でキメラ化した。
【０６６７】
２０Ｃ８．３Ｂ８  ｍＡｂ重鎖可変領域の推定成熟配列は、マウスサブグループＩ（Ａ）に属しており、配列を以下に示す（ＣＤＲは下線部）。
2010537985.tif 000038
【０６６８】
２０Ｃ８軽鎖可変領域の推定成熟配列は、マウスκサブグループＩＩＩに属しており、配列を以下に示す。
2010537985.tif 000039
【０６６９】
キメラ２０Ｃ８の重鎖および軽鎖のｃＤＮＡのための発現ベクターを上述のように構築した。プラスミド挿入物中にある免疫グロブリンのｃＤＮＡ配列を、ＤＮＡシーケンシングによって確認した。キメラ２０Ｃ８重鎖ｃＤＮＡ挿入物の配列（開始コドンＡＴＧから停止コドンＴＧＡまでのシグナル配列）を、以下に配列番号１４０として示す。
2010537985.tif 000040
【０６７０】
ｃｈ２０Ｃ８重鎖タンパク質の推定成熟配列を、以下に配列番号１４１として示す。
2010537985.tif 000041
【０６７１】
マウス可変領域は、上の残基１〜１２２であり、ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域は、残基１２３〜４５９である。
【０６７２】
キメラ２０Ｃ８軽鎖ｃＤＮＡ挿入物の配列（開始コドンＡＴＧから停止コドンＴＡＧまでのシグナル配列）を、以下に配列番号１４２として示す。
2010537985.tif 000042
【０６７３】
ｃｈ２０Ｃ８軽鎖タンパク質の推定成熟配列を、以下に配列番号１４３として示す。
2010537985.tif 000043
【０６７４】
マウス可変領域は、上の残基１〜１１１であり、ヒトκ定常領域は、上の配列の残基１１２〜２１８である。
【０６７５】
ｃｈ２０Ｃ８重鎖発現ベクターおよびｃｈ２０Ｃ８軽鎖発現ベクターを、２９３−ＥＢＮＡ細胞にトランスフェクトし、トランスフェクトした細胞の抗体分泌性および抗体特異性を試験した。空のベクターと、ｈｕ５ｃ８−Ｓ２２８Ｐ／Ｔ２９９Ａ  ＩｇＧ４（分子クローン化したＣＤ４０Ｌに特異的なｍＡｂ）をトランスフェクトした細胞とをコントロールとして使用した。馴化培地のウェスタンブロット分析（抗−ヒト抗体の重鎖および軽鎖を用いて行った）から、ｃｈ２０Ｃ８をトランスフェクトした細胞が、重鎖および軽鎖を合成し、効率よく分泌することが分かった。ＩＧＦ−１Ｒを発現するＭＣＦ７ヒト乳腺癌細胞を、トランスフェクトした細胞から得た馴化培地で染色し、ＦＡＣＳ分析すると、ｃｈ２０Ｃ８抗体の結合パターンおよび染色パターンが、滴定可能な用量応答性を有しており、一方、モックでトランスフェクトした細胞およびｈｕ５ｃ８でトランスフェクトした細胞は、ＭＣＦ７細胞を染色することができないことが分かった（ＰＥ接合した抗−ヒト抗体の重鎖および軽鎖を用いて検出）。ＣＨＯ細胞を、ｃｈ２０Ｃ８重鎖発現ベクターおよびｃｈ２０Ｃ８軽鎖発現ベクターの両方でトランスフェクトし、キメラ２０Ｃ８−非グリコシル化ｈｕＩｇＧ４のκｍＡｂを安定に発現する株を作成した。
【０６７６】
（抗−ＩＧＦ−１Ｒ  ｍＡｂ  ２０Ｄ８．２４Ｂ１１免疫グロブリン可変領域のクローン化）
ｍＡｂ  ２０Ｄ８．２４Ｂ１１は、２０Ｃ８．３Ｂ８の兄弟にあたるクローンであると考えられ（両者とも、融合物７に由来しており）、共通の軽鎖を有し、重鎖の違いは、ＦＲ４の１個の残基が２０Ｃ８の残基であるという点である。２０Ｄ８．２４Ｂ１１  ｍＡｂ重鎖可変領域の推定成熟配列は、マウスサブグループＩ（Ａ）に属しており、配列を以下に示す（ＣＤＲは下線部）。
2010537985.tif 000044
【０６７７】
２０Ｄ８（上側）および２０Ｃ８（下側）の重鎖可変領域のアラインメントにより、ＦＲ４  Ｋａｂａｔ残基１０９に対応する１箇所の同類置換（以下の残基１１８）を以下に強調して示している。
2010537985.tif 000045
【０６７８】
キメラ２０Ｄ８の重鎖ｃＤＮＡのための発現ベクターを上述のように構築し、プラスミドｐＣＮ３８０中にある重鎖ｃＤＮＡ挿入物を、ＤＮＡシーケンシングによって確認した。キメラ２０Ｄ８重鎖ｃＤＮＡ挿入物の配列（開始コドンＡＴＧから停止コドンＴＧＡまでのシグナル配列）を、以下に配列番号１４４として示す。
2010537985.tif 000046
【０６７９】
上述の配列がコードするｃｈ２０Ｄ８重鎖タンパク質の推定成熟配列を、以下に配列番号１４５として示す。
2010537985.tif 000047
【０６８０】
マウス可変領域は、上の残基１〜１２２であり、ヒトＳ２２８Ｐ／Ｔ２９９Ａ  ＩｇＧ４重鎖定常領域は、残基１２３〜４５８である。
【０６８１】
２０Ｄ８軽鎖可変領域は、２０Ｃ８の可変領域と同一である。上述の２０Ｃ８に関する情報を参照されたい。
【０６８２】
（抗−ＩＧＦ−１Ｒ  ｍＡｂ  Ｐ１Ｇ１０．２Ｂ８免疫グロブリン可変領域のクローン化）
Ｐ１Ｇ１０重鎖可変領域の推定成熟配列を、以下に配列番号５８として示す（ＣＤＲは下線部）。
2010537985.tif 000048
【０６８３】
Ｐ１Ｇ１０は、マウス重鎖可変領域のサブグループＩＩ（Ａ）に属すると考えられるが、重鎖ＩＩ（Ａ）のコンセンサス配列とは、５５％のみの同一性である。
【０６８４】
キメラＰ１Ｇ１０の重鎖ｃＤＮＡのための発現ベクターを構築し、そのｃＤＮＡ挿入物の配列を確認した。キメラＰ１Ｇ１０重鎖ｃＤＮＡ挿入物の配列（開始コドンＡＴＧから停止コドンＴＧＡまでのシグナル配列）を、以下に配列番号１４６として示す。
2010537985.tif 000049
【０６８５】
上述の配列をコードするｃｈＰ１Ｇ１０重鎖タンパク質の推定成熟配列を、以下に配列番号１４７として示す。
2010537985.tif 000050
【０６８６】
マウス可変領域は、上の残基１〜１２１であり、ヒトＳ２２８Ｐ／Ｔ２９９Ａ  ＩｇＧ４重鎖定常領域は、残基１２２〜４５７である。
【０６８７】
Ｐ１Ｇ１０軽鎖可変領域の推定成熟配列は、マウスκサブグループＶに属しており、以下に配列番号１１３として示す（ＣＤＲは下線部）。
2010537985.tif 000051
【０６８８】
キメラＰ１Ｇ１０の軽鎖ｃＤＮＡのための発現ベクターを構築し、そのｃＤＮＡ挿入物の配列を確認した。キメラＰ１Ｇ１０軽鎖ｃＤＮＡ挿入物の配列（開始コドンＡＴＧから停止コドンＴＡＧまでのシグナル配列）を、以下に配列番号１４８として示す。
2010537985.tif 000052
【０６８９】
上述の配列をコードするｃｈＰ１Ｇ１０軽鎖タンパク質の推定成熟配列を、以下に配列番号１４９として示す。
2010537985.tif 000053
【０６９０】
マウス可変領域は、上の残基１〜１０７であり、ヒトκ定常領域は、上の配列の１０８〜２１４である。
【０６９１】
ｃｈＰ１Ｇ１０重鎖発現ベクターおよびｃｈＰ１Ｇ１０軽鎖発現ベクターを、２９３−ＥＢＮＡ細胞にトランスフェクトし、トランスフェクトした細胞の抗体分泌性および抗体特異性を試験した（空のベクターと、ｈｕ５ｃ８−Ｓ２２８Ｐ／Ｔ２９９Ａ  ＩｇＧ４（分子クローン化したＣＤ４０Ｌに特異的なｍＡｂ）をトランスフェクトした細胞とをコントロールとして使用した）。馴化培地のウェスタンブロット分析（抗−ヒト抗体の重鎖および軽鎖を用いて行った）から、ｃｈＰ１Ｇ１０をトランスフェクトした細胞が、重鎖および軽鎖を合成し、効率よく分泌することが分かった。ＩＧＦ−１Ｒを発現するＭＣＦ７ヒト乳腺癌細胞を、トランスフェクトした細胞から得た馴化培地で染色し、ＦＡＣＳ分析すると、ｃｈＰ１Ｇ１０抗体の結合パターンおよび染色パターンが、滴定可能な用量応答性を有しており、一方、モックでトランスフェクトした細胞およびｈｕ５ｃ８でトランスフェクトした細胞から得た馴化培地は、ＭＣＦ７細胞を染色することができないことが分かった（ＰＥ接合した抗−ヒト抗体の重鎖および軽鎖を用いて検出）。ＣＨＯ細胞を、ｃｈＰ１Ｇ１０重鎖発現ベクターおよびｃｈＰ１Ｇ１０軽鎖発現ベクターの両方でトランスフェクトし、キメラＰ１Ｇ１０−非グリコシル化ｈｕＩｇＧ４のκｍＡｂを安定に発現する株を作成した。
【０６９２】
（抗−ＩＧＦ−１Ｒ  ｍＡｂ  Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１免疫グロブリン可変領域のクローン化）
Ｐ１Ａ２重鎖可変領域の推定成熟配列は、マウスサブグループＩＩ（Ａ）に属しており、以下に配列番号４８として示す。
2010537985.tif 000054
【０６９３】
Ｐ１Ａ２重鎖は、Ｐ１Ｇ１０との同一性が９２．６％であり（両者とも融合物５に由来する）、１個のＦＲ１、１個のＦＲ２、２個のＣＤＲ２、２個のＦＲ３、２個のＣＤＲ３および１個のＦＲ４が異なっている。Ｐ１Ａ２（上側）およびＰ１Ｇ１０（下側）の重鎖可変領域のアラインメントを以下に示す。
2010537985.tif 000055
【０６９４】
キメラＰ１Ａ２の重鎖ｃＤＮＡのための発現ベクターを上述の方法で構築した。上述のプラスミドがコードするｃｈＰ１Ａ２重鎖の推定配列（配列番号１５０）は、以下のとおりである。
2010537985.tif 000056
【０６９５】
マウス可変領域は、上の残基１〜１２０であり、ヒトＳ２２８Ｐ／Ｔ２９９Ａ  ＩｇＧ４重鎖定常領域は、残基１２１〜４５６である。
【０６９６】
Ｐ１Ａ２軽鎖可変領域の推定成熟配列は、マウスκサブグループＶに属しており、以下に配列番号１０８として示す（ＣＤＲは下線部）
2010537985.tif 000057
【０６９７】
Ｐ１Ａ２軽鎖は、Ｐ１Ｇ１０との同一性が９７．２％であり（両者とも融合物５に由来する）、２個のＦＲ２および１個のＦＲ３が異なっているが、共通のＣＤＲを有している。Ｐ１Ａ２（上側）およびＰ１Ｇ１０（下側）の軽鎖可変領域のアラインメントを以下に示す。
2010537985.tif 000058
【０６９８】
キメラＰ１Ａ２の軽鎖ｃＤＮＡのための発現ベクターを構築し、そのｃＤＮＡ挿入物の配列を確認した。キメラＰ１Ａ２軽鎖ｃＤＮＡ挿入物（開始コドンＡＴＧから停止コドンＴＡＧまでのシグナル配列）を、以下に配列番号１５１として示す。
2010537985.tif 000059
【０６９９】
ｐＣＮ３７９がコードするｃｈＰ１Ａ２軽鎖タンパク質の推定成熟配列を、以下に配列番号１５２として示す。
2010537985.tif 000060
【０７００】
マウス可変領域は、上の残基１〜１０７であり、ヒトκ定常領域は、上の配列の１０８〜２１４である。
【０７０１】
（抗−ＩＧＦ−１Ｒ  ｍＡｂ  Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２免疫グロブリン可変領域のクローン化）
上述の方法で、Ｐ１Ｅ２可変領域をクローン化した。ここで、抗体「Ｐ１Ｅ２」は、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２ハイブリドーマ細胞株が発現する抗体（表４を参照）に由来するマウスのＶＨおよびＶＬを有し、ヒトＩｇＧ４Ｐａｇｌｙ／κ定常領域に融合したキメラ抗体として開発されたものである。
【０７０２】
（実施例１９  ＩＧＦ−１Ｒ  Ｆａｂ抗体は、可溶性ＩＧＦ−１Ｒに高親和性で結合する）
方法：Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３およびＭ１４−Ｇ１１  Ｆａｂが可溶性ＩＧＦ−１Ｒに結合する活性を、表面プラズモン共鳴を用いて測定した。ビオチン化ＰＥＮＴＡ−Ｈｉｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を、ストレプトアビジンでコーティングしたセンサーチップに固定した。可溶性／二量化ＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ細胞外領域（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を、ＰＥＮＴＡ−Ｈｉｓ抗体によって上述の表面で捕捉した。Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３またはＭ１４−Ｇ１１  Ｆａｂの２回目の注入（０．５ｎＭ〜１０００ｎＭ）を行った。この表面は、アセテート（ｐＨ４）を３回短期間注入することによって再生させた。
【０７０３】
結果：Ｍ１３−Ｃ０６  Ｆａｂは、組み換えＩＧＦ−１Ｒに対し、ＫＤ＝１．３ｎＭという最も高い親和性で結合し、一方、Ｍ１４−Ｇ１１  Ｆａｂは、ＫＤ＝４．０ｎＭで結合し、Ｍ１４−Ｃ０３  Ｆａｂは、ＫＤ＝４．９ｎＭで結合した（データは示していない）。
【０７０４】
（実施例２０  全ヒトＩＧＦ−１Ｒ抗体による、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２によって刺激を受ける腫瘍細胞成長の阻害）
方法：抗体が、インビトロで腫瘍の成長に与える影響を、ＣＥＬＬ  ＴＩＴＥＲ−ＧＬＯＴＭアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、２８００  Ｗｏｏｄｓ  Ｈｏｌｌｏｗ  Ｒｄ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１１  ＵＳＡ）で測定した。Ｗａｌｌａｃ  ９６ウェルの底が透明なＴＣ処理されたプレート中、ＢＸＰＣ３細胞を、ＲＰＭＩ培地を含む１０％  ＦＢＳで培養した（８０００細胞／ウェル）。２４時間後、培地を無血清条件に変更し、種々の濃度の抗体（１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭおよび０．１ｎＭ）を加えた。３０分インキュベートした後、ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２を１００ｎｇ／ｍＬ加えた。細胞をさらに４８時間インキュベートした後、溶解し、ＣＥＬＬ  ＴＩＴＥＲ−ＧＬＯＴＭ試薬を用いて、ＡＴＰ存在量を決定した。阻害率は、［１−（Ａｂ−ＳＦＭ）／（ＩＧＦ−ＳＦＭ）］×１００％で算出した。アイソタイプの一致した抗体であるＩＤＥＣ−１５１（ヒトＧ４）抗体をネガティブコントロールとして使用した。
【０７０５】
結果：全ヒト抗体であるＭ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ、Ｍ１４−Ｇ１１．Ｇ４．ＰおよびＭ１４−Ｃ０３．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙは、組み換えヒトＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２によるＢＸＰＣ３（ヒト膵腺癌）細胞増殖を阻害した（図１５）。ヒト肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ２３（図１６；Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体）およびヒト肺癌細胞株Ａ５４９（図１７；Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体）において、組み換えヒトＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２による細胞増殖に対する抗体を用いると、同様の結果が得られた。これら３種類の細胞株において、Ｍ１４−Ｇ１１．Ｇ４．Ｐ，ａｇｌｙは、Ｍ１４．Ｇ１１．Ｇ４．Ｐ態様と同様の結果を示した（データは示していない）。
【０７０６】
（実施例２１  全ヒトＩＧＦ−１Ｒ抗体による、腫瘍細胞成長の細胞周期のインビトロにおける阻止）
方法：全ヒトＩＧＦ−１Ｒ抗体が、細胞周期の進行を止める能力を、ＦＡＣＳ分析で評価した。培養したＢＸＰＣ３細胞で、ヨウ化プロピジウム取り込みをモニタリングした。ＢＸＰＣ３細胞（４×１０５細胞／ウェル）を６つのウェルプレートに接種した。２４時間後、細胞を無血清培地（ＳＦＭ）と交換した。次いで、ＩＧＦ−１Ｒ抗体を、最終濃度１３３．３ｎＭ（２０μｇ／ｍＬ）で、ＩＧＦ−１を２００ｎｇ／ｍＬで培地に加えた。２４時間後、細胞をトリプシン処理し、エタノールで固定した。ＤＮＡ内容物をヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色した後、ＦＡＣＳ分析を行った。アイソタイプの一致した抗体であるＩＤＥＣ−１５１（ヒトＧ４）をネガティブコントロールとして使用した。
【０７０７】
結果：全ヒト抗体Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ（表１１）、Ｍ１４−Ｇ１１．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙおよびＭ１４−Ｃ０３．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙは、細胞周期のＧ０／Ｇ１期で、ＢＸＰＣ３腫瘍細胞を止めた。
【０７０８】
（表１１）
2010537985.tif 000061
【０７０９】
（実施例２２  膵臓癌モデルにおける、腫瘍成長のインビボ阻害）
方法：ＢｘＰＣ３（膵臓の癌）細胞を用いた異種移植膵臓癌モデル系を用い、Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体の単剤でのインビボでの効力を評価した。ＣＢ１７  ＳＣＩＤマウスに、２×１０６細胞を接種し、腫瘍増殖を監視した。治療開始時の平均腫瘍容積は、約２００ｍｍ３であった。Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体を週に１回、６０、３０および１５ｍｇ／ｋｇを５週間、腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。アイソタイプの一致した抗体であるＩＤＥＣ−１５１（ヒトＧ４）を、ネガティブコントロールとして週に１回、６０ｍｇ／ｋｇを５週間投与した。接種してから所定の間隔で腫瘍を抽出し（図１９）、合計腫瘍容積を測定した。
【０７１０】
結果：全ヒトＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体は、用量に依存する様式で、腫瘍の成長を阻害した（図１９）。この抗体は、週に１回、６０、３０および１５ｍｇ／ｋｇを５週間投与した状態で、統計的に有意な単剤での効果を示した。さらに、この抗体は、週に１回、１５ｍｇ／ｋｇの少量投与でも効果的であった（図１９）。
【０７１１】
（実施例２３  肺癌モデルにおける、腫瘍成長のインビボ阻害）
方法：Ａ５４９（肺癌）細胞を用いた異種移植肺癌モデル系を用い、Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体の単剤でのインビボでの効力を評価した。ＣＢ１７  ＳＣＩＤマウスに、３〜５×１０６細胞を接種し、腫瘍の成長を監視した。治療開始時の平均腫瘍容積は、約１５０ｍｍ３であった。Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体を週に２回、１５ｍｇ／ｋｇを４週間、腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。アイソタイプの一致した抗体であるＩＤＥＣ−１５１（ヒトＧ４）を、ネガティブコントロールとして３０ｍｇ／ｋｇ投与した。接種してから所定の間隔で腫瘍を抽出し（図２０）、合計腫瘍容積を測定した。
【０７１２】
結果：全ヒトＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体は、用量に依存する様式で、腫瘍の成長を阻害した（図２０）。この抗体は、週に１回、３０および１５ｍｇ／ｋｇを４週間投与した状態で、統計的に有意な単剤での効果を示した（図２０）。このモデルについて、さらなる試験を実施し、Ｃ０６は、週に７．５ｍｇ／ｋｇの少量投与でも効果的であることが分かった（データは示していない）。
【０７１３】
（実施例２４  組み合わせ治療を用いた、腫瘍成長のインビボ阻害）
方法：ＢｘＰＣ３異種モデルを用い、ゲムシタビン（非小細胞肺癌、膵臓癌、膀胱癌および乳癌で一般的に使用する薬物）と組み合わせた場合の、Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体が腫瘍成長を阻害する効果を試験した。現時点での標準的な治療法にしたがってゲムシタビンを投与し（すなわち、３日ごとに８０ｍｇ／ｋｇ、４週間）、これと組み合わせてＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体を週に２回、３０ｍｇ／ｋｇを７週間、腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した場合の効力、（データは示していない）または週に１回、６０ｍｇ／ｋｇを５週間投与した場合の効力（図２１）を評価した。ゲムシタビンの単独投与、Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体の単独投与、および送達ビヒクルのみの偽注射を、ネガティブコントロールとして使用した。治療開始時の平均腫瘍容積は、約２００ｍｍ３であった。
【０７１４】
結果：Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体およびゲムシタビンを単剤で使用する（すなわち、単独で投与する）と、ほぼ同様の効力であることが分かった。ゲムシタビンと組み合わせて、Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体を週に２回、３０ｍｇ／ｋｇの投薬スケジュールで投与する場合（データは示していない）または週に１回、６０ｍｇ／ｋｇの投薬スケジュールで投与した場合（図２１）には、単剤療法と比較して、相加効果が得られた。さらに、１５ｍｇ／ｋｇを組み合わせ投与した場合も、相加効果が得られた（データは示していない）。
【０７１５】
（実施例２５  全ヒトＩＧＦ−１Ｒ抗体は、マカク線維芽細胞株に結合する）
方法：Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体は、マカクから樹立した線維芽細胞株に結合する。この線維芽細胞株は、皮膚生検によって作成した。線維芽細胞を細胞解離バッファで解離し、ビオチン化Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙとともに、４℃で４５分間インキュベートすることによって、抗体の結合性を評価した。細胞を洗浄した後、ストレプトアビジン−ＰＥを加え、暗状態で、４℃でさらに３０分間インキュベートした。次いで、細胞を冷ＰＢＳ  ２００ｕｌで洗浄し、１％ホルムアルデヒドで固定し、おだやかに攪拌した。抗体の結合性をＦＡＣＳ分析で評価した。
【０７１６】
結果：Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体は、マカクの線維芽細胞株で発現したＩＧＦ−１Ｒに濃度に依存する様式で結合する（図２２）。
【０７１７】
（実施例２６）
第Ｉ部：全ヒトＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体の生物学的特性のまとめ
全ヒトＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体の生物学的特性の評価結果を、表１１および表１２に示す。この特性は、本明細書に記載の方法、実験および実施例で得られたものであり、および／または当業者に既知であり、当業者が実施する方法および実験で一般的な作業で決定することができる。
【０７１８】
（表１１）
2010537985.tif 000062
【０７１９】
（Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体の血清半減期）
腫瘍のないマウスの薬物動態（ＰＫ）試験を、ＳＣＩＤマウスにＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体を３ｍｇ／ｋｇ（１回の投薬量、腹腔内注射）投与して行った。ＳＣＩＤマウス血清中のＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体を、ＩｇＧに特異的なＥＬＩＳＡで検出した。ヤギ抗−ヒトＩｇＧ（１００ｎｇ／ウェル）を、ＩＭＭＵＬＯＮＴＭプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．（米国マサチューセッツ州ウォルサム））に固定した。比率１：２５から開始し、段階的な２倍希釈によって、血清を３ッ組で測定した。ヤギ抗−ヒトκ−ＨＲＰを用い、結合性を決定した。この試験の結果から、このマウスモデル系の血清半減期は、約１１．５日であることが分かった（データは示していない）。
【０７２０】
Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙを腹腔内注射し、注射後の血清濃度を評価した（ＭＣＦ−７腫瘍のある動物（抗体３０ｕｇ／ｋｇ）、およびＢｘＰＣ３腫瘍のある動物（抗体１５ｕｇ／ｋｇ））。９６ウェル（ＩＭＭＵＬＯＮ２  ＨＢＴＭ、Ｄｙｎａｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号３４５５）に固定したヤギ抗−ヒトＩｇＧ（１００ｎｇ／ウェル）に対するＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体の結合性をＥＬＩＳＡで測定した。１０ｕｇ／ｍｌから開始し、段階的な３倍希釈によって標準曲線を測定した。比率１：２５から開始し、段階的な２倍希釈によって、血清を測定した。Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体を、ヤギ抗−ヒトκ−ＨＲＰを用いて検出した。ＳＯＦＴＭＡＸ  ＰＲＯソフトウェアパッケージバージョン４．３ＬＳ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．）を使用し、抗体濃度を決定した。
【０７２１】
平均血清濃度の測定結果を以下に示す通りであった。
2010537985.tif 000063
【０７２２】
Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体の薬物動態も、カニクイザルに１０ｍｇ／ｋｇおよび２５ｍｇ／ｋｇ投与した後に観察した。血清半減期は、約１０〜１２日であった（データは示していない）。
【０７２３】
表１２および表１３は、Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体を、ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２を追加した細胞培地に加えた場合（表１２）、または１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）またはウシ胎児血清（ＦＢＳ）を追加した細胞培地に加えた場合（表１３）の、種々の肺腫瘍細胞株、膵臓腫瘍細胞株および結腸腫瘍細胞株で観察された、インビトロでの細胞成長の用量に依存する阻害（阻害率）を示す。
【０７２４】
（表１２）
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【０７２５】
（表１３）
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【０７２６】
第ＩＩ部：抗体親和性の測定
目的：
目的は、ＩＧＦ−１Ｒ抗体に対する結合親和性を測定することである。
【０７２７】
方法：
Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３およびＭ１４−Ｇ１１のＦａｂの調製
固定化したパパイン（Ｐｉｅｒｃｅ  カタログ番号２０３４１）で消化することによって、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３およびＭ１４−Ｇ１１のＦａｂ抗体を調製した。パパイン樹脂を２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  システインで洗浄した。５００ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭシステイン（ｐＨ７．０）中、抗体をパパイン樹脂と混合し、３７℃の水浴で３時間消化し、反転シェーカーで、室温で一晩混合した。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で分析し、それぞれの消化が終了したことを判別した。消化したタンパク質から、焼結ガラス漏斗フィルターで樹脂を除去し、２０ｍＭ  アセテート（ｐＨ５．０）で洗浄した。流れた液を集め、２０ｍＭ  アセテート（ｐＨ５．０）で１０倍に希釈した。ＦａｂフラグメントをＳ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭカチオン交換クロマトグラフィーで線形の勾配を有する塩を用い、精製した。溶出したフラクションのＳＥＣ分析を行い、所望のフラクションを集め、ＰＢＳで透析した。Ｆａｂをアルキル化し、ヒンジジスフィドが再び形成し、（Ｆａｂ）２が生じるのを阻害した。１Ｍ  Ｔｒｉｓ、２００ｍＭヨードアセテート（ｐＨ８．５）をＦａｂ溶液に加えて１０倍に希釈することによって、アルキル化を行った。室温で、この混合物を反転シェーカーで２０分間インキュベートし、その後、１×ＰＢＳで徹底的に透析した。最終的に分取サイズ排除クロマトグラフィーを用い、それぞれのＦａｂを精製した。
【０７２８】
（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）親和性測定）
すべての表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験を、２５℃に設定したＢｉａｃｏｒｅ  ３０００を用い、試験バッファとしてＨＢＳ−ＥＰ（Ｂｉａｃｏｒｅ、カタログ番号ＢＲ−１００１−８８）を用いて行った。ビオチン標識された抗−Ｈｉｓ  Ｔａｇ抗体（ビオチン−ＰＥＮＴＡ−Ｈｉｓ、Ｑｉａｇｅｎ  カタログ番号３４４４０）を、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＳＡチップ（カタログ番号ＢＲ−１０００−３２）表面にＨＢＳ−ＥＰバッファとともに５００ｎＭで注入し、飽和状態で固定した。４０ｎＭタンパク質２０μＬを２μＬ／分で注入することにより、組み換えヒトＩＧＦ−１Ｒ−１０Ｈｉｓ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号３０５−ＧＲ−０５０）を、ビオチン−ＰＥＮＴＡ−Ｈｉｓ表面で捕捉した。抗−ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはＦａｂ  １３０μＬを再び注射し、受容体との相互作用を観察した。それぞれの抗体およびＦａｂを、６４ｎＭから０．５ｎＭまで段階的に希釈して、濃度に依存する結合速度曲線を作成した。それぞれの注入後に、１０ｍＭアセテート（ｐＨ４．０）２０μＬを３回、１０μＬ注入して再生した。それぞれの曲線について、（１）ＩＧＦ−１Ｒを加えない状態で、ストレプトアビジン表面で得たデータと、（２）１回目に受容体を注入した後、ＨＢＳ−ＥＰバッファを２回目に注入するときに得たデータの２つを用いて、二重参照した。それぞれの抗体およびＦａｂの一連の濃度は、製造業者のＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアに入っている１：１結合モデルに合わせた。
【０７２９】
結果：３種類の組み換え抗−ＩＧＦ−１Ｒ抗体（Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３およびＭ１４−Ｇ１１）を、上述の表面プラズモン共鳴を用い、ＩＧＦ−１Ｒに対する結合性を試験した。３種類の抗体は、すべてこの受容体に強固に結合した。固定した組み換えヒトＩＧＦ−１Ｒに対する、それぞれの抗体の濃度依存性の結合（６４ｎＭから段階的に０．５ｎＭまで希釈）を観察した（データは示していない）。抗体を種々の濃度で適用した場合に、抗体がＩＧＦ−１Ｒでコーティングされた表面に集まる速度、および純粋なバッファを適用している間に解離する速度を、データを１：１結合モデルに合わせることによって観察した。おおよその速度定数および平行解離定数を算出した（表１４）。
【０７３０】
（表１４）
2010537985.tif 000066
【０７３１】
（表１５）
2010537985.tif 000067
【０７３２】
別個の親和性を得るために、上述のパパイン消化を用い、各抗体のＦａｂフラグメントを作成した。１個の抗原結合部位が存在することによって、全長抗体で記載したのと同じ様式で、ＩＧＦ−１Ｒ抗体に適用した場合、均一な単相様の結合解離曲線を示した（データは示していない）。ＩＧＦ−１Ｒに対する各Ｆａｂの親和性を表１５に示す。
【０７３３】
（実施例２７）
第Ｉ部：Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体は、他のＩＧＦ−１Ｒ抗体とは異なる、固有のエピトープ結合特性を有する。
交差競合による抗体結合試験を行い、Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙのＩＧＦ−１Ｒ抗体結合エピトープと、他のＩＧＦ−１Ｒ抗体とを比較した。図２３を参照。標識していない競合相手の抗体が、可溶性ＩＧＦ−１Ｒに対する結合について、５種類の異なる標識された抗体と交差競合する能力を分析した。使用した５種類の標識された抗体は、ビオチン標識されたＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ（「Ｂｉｏｔｉｎ−Ｃ０６」）、ビオチン標識されたＭ１４−Ｇ１１（「Ｂｉｏｔｉｎ−Ｇ１１」）、ゼノン標識したＰ１Ｂ１０−１Ａ１０（「Ｚｅｎｏｎ−Ｏ」）、ゼノン標識した２０Ｃ８−３Ｂ４（「Ｚｅｎｏｎ−Ｍ」）またはゼノン標識したＩＲ３抗体（「Ｚｅｎｏｎ−ＩＲ３」）であった。図２３を参照。
【０７３４】
Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ製のＢｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎキット（番号２１３３５）を用い、抗体をビオチンで標識した。ゼノン標識は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ製ＺｅｎｏｎマウスＩｇＧ標識キット（Ｚ２５０００）で行った。
＋＋＋＋＋  ＝  自身に対して抗体結合が競合する（９０〜１００％）
＋＋＋＋  ＝  競合率７０〜９０％
＋＋＋  ＝  競合率５０〜７０％
＋＋  ＝  競合率３０〜５０％
＋  ＝  競合率１０〜３０％
＋／−  ＝  競合率０〜１０％
Ｎ／Ａ  ＝  結果は得られていない
【０７３５】
この分析結果から、Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体およびＭ１４．Ｃ０３．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体は、ＩＧＦ−１Ｒの同じ領域または類似した領域に結合し、試験したすべての他の抗体とは異なっていることが分かる。特に、ビオチン標識されたＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体は、標識されていないＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙまたは標識されていないＭ１４．Ｃ０３．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙがＩＧＦ−１Ｒに結合するのと、効果的に競合した。Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙは、十分に研究され尽くしたＩＲ３抗体とは交差競合しないことも注目に値する。したがって、この２種類の抗体は、特に、異なるＩＧＦ−１Ｒエピトープに結合する。
【０７３６】
第ＩＩ部：Ｍ１３−Ｃ０６は、ＦｎＩＩＩ−１ドメインのＮ末端に抗体が結合することによって、ＩＧＦ−１Ｒに対するＩＧＦ−１の結合親和性をアロステリック効果によって低下させる。
目的：目的は、ＩＧＦ−１Ｒに対するＭ１３−Ｃ０６抗体の結合エピトープを解明することと、ＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを阻害する機構を解明することである。
【０７３７】
背景：ＩＧＦ−１Ｒは、６個のドメインからなる（図２８Ａ）。ＩＧＦ−１Ｒの最初の３つのドメイン、すなわちＬ１（ロイシンに富む繰り返しドメイン１）、ＣＲ（システインに富む繰り返しドメイン）およびＬ２に呼ばれるドメイン、およびドメイン５のペプチドループ領域（ＦｎＩＩＩ−２、ＩＩＩ型フィブロネクチンドメイン２）に存在する変異は、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の結合に対し、悪影響を与えることが記載されている（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  ２００１；  Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ２００４）。ここで、本願発明者らは、Ｍ１３−Ｃ０６抗体が、成長因子結合部位に競合的に相互作用することによって、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２がＩＧＦ−１Ｒに結合するのをブロックするのではなく、ＦｎＩＩＩ−１に結合し、ＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２のシグナル伝達をアロステリック効果によって阻害することを示す。ＦｎＩＩＩ−１は、ＩＧＦ−１ＲおよびＩＮＳＲ双方の受容体ホモダイマー化を促進すると考えられており（ＭｃＫｅｒｎ  ２００６）、リガンドに結合すると、四次構造の変化を経て、活性シグナルが膜貫通領域を通ってＣ末端チロシンキナーゼドメインに伝わる。この実施例で得たデータから、Ｍ１３−Ｃ０６抗体が、ＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２によって誘発される、下流にある受容体シグナル伝達を阻害する構造変化を阻害することが示唆される。
【０７３８】
方法：Ｍ１３−Ｃ０６抗体存在下、および非存在下での、ＩＧＦ−１／ＩＧＦ−１Ｒの結合実験。数種類の構築物を使用し、ＩＧＦ−１Ｒ受容体またはインスリン受容体、ヒトＩＧＦ−１Ｒ（１−９０２）−Ｈｉｓ１０（ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０と示されている、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ製）、ヒトＩＮＳＲ（２８−９５６）−Ｈｉｓ１０（ＩＮＳＲと示されている、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ製）、ヒトＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）−Ｆｃ（ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃと示されている、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ製）、ヒトＩＧＦ−１Ｒ（１−４６２）−Ｆｃ（ｈＩＧＦ−１Ｒ（１−４６２）−Ｆｃと示されている、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ製）およびマウスＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）−Ｆｃ（ｍＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃと示されている、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ製）に対する抗体／ＩＧＦ−１の結合を観察した。「Ｈｉｓ１０」は、構築物のＣ末端に１０のヒスチジン残基タグがあることを示す。「Ｆｃ」は、Ｃ末端にあるヒトＩｇＧ１−Ｆｃ  タグを示す。
【０７３９】
ヒトＩＧＦ−１をＭｉｌｌｉｐｏｒｅから購入した。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用い、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０に対するＩＧＦ−１の親和性を決定した。ビオチン標識した抗−Ｈｉｓ  Ｔａｇ抗体（ビオチン−ＰＥＮＴＡ−Ｈｉｓ、Ｑｉａｇｅｎ  カタログ番号３４４４０）を、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＳＡチップ（カタログ番号ＢＲ−１０００−３２）表面にＨＢＳ−ＥＰバッファとともに５００ｎＭで注入し、飽和状態で固定した。それぞれのセンサーグラムで、実施例５のｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０（実施例５（第ＩＩ部）に記載）を、ビオチン−ＰＥＮＴＡ−Ｈｉｓ表面に４０ｎＭタンパク質２０μＬを２μＬ／分で注入し、捕捉した。ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０を注入した後、流速を２０μＬ／分まで上げた。ＩＧＦ−１を含有する注入液１３０μＬを再び注射し、成長ホルモンとこの受容体との相互作用を観察した。ＩＧＦ−１を、６４ｎＭから０．５ｎＭまで段階的に希釈して、濃度に依存する結合速度曲線を作成した。それぞれの注入後に、１０ｍＭアセテート（ｐＨ４．０）を２０μＬ／分で３回、１０μＬ注入して再生した。それぞれの曲線について、（１）ＰＥＮＴＡ−Ｈｉｓ抗体を加えない状態で、ストレプトアビジン表面で得たデータと、（２）１回目にｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０を注入した後、ＨＢＳ−ＥＰバッファを２回目に注入するときに得たデータの２つを参照として用いた。ＩＧＦ−１の一連の濃度は、製造業者のＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアに入っている１：１結合モデルに合わせた。２セットのデータを得た。うち１つは、試験バッファ中、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０注入バッファ中、およびＩＧＦ−１注入バッファ中に４００ｎＭ  Ｍ１３−Ｃ０６が存在しない場合、もう１つは、４００ｎＭ  Ｍ１３−Ｃ０６が存在する場合であった。
【０７４０】
（ＩＧＦ−１／ＩＧＦ−１Ｒ／Ｍ１３−Ｃ０６抗体の産生分複合体のプルダウン分析およびウェスタンブロット分析）
１．５ｍＬのエッペンドルフ管中、プロテインＡ／Ｇビーズ（３００μＬ、Ｐｉｅｒｃｅ  カタログ番号２０４２２）を再び懸濁させ、１×ＰＢＳで洗浄し、１．０ｍｇのＭ１３−Ｃ０６と合わせ、ロータリーシェーカーで、室温で２時間混合した。別の管に、１２μｇのｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）および４６０ｎｇのヒトＩＧＦ−１（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  カタログ番号ＧＦ００６）を室温で１時間混合した（タンパク質：タンパク質比率は１：１）。Ｍ１３−Ｃ０６が結合したプロテインＡ／ＧをＰＢＳで洗浄し、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０／ＩＧＦ−１混合物を室温で３０分間インキュベートした。上述のタンパク質が結合したプロテインＡ／ＧをＰＢＳで洗浄した後、結合したタンパク質を１００ｍＭ  グリシン３００μＬ（ｐＨ３．０）で溶出させた。ネガティブコントロールには、１２μｇのヒトＩＧＦ−１Ｒ（１−９０２）−Ｈｉｓ１０を加えなかった。抗−ヒトＩＧＦ−１抗体（ウサギ抗−ヒトＩＧＦ−１ビオチン、ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  カタログ番号Ｉ７６６１−０１Ｂ）および抗−ヒトＩＧＦ−１Ｒ抗体（ＩＧＦ−１Ｒα  １Ｈ７、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  カタログ番号ｓｃ−４６１）を一次抗体として用い、次いで、ＨＲＰ標識したストレプトアビジン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  カタログ番号７１００−０５）およびＨＲＰ標識したヤギ抗−マウスＩｇＧ（ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  カタログ番号Ｉ１９０４−４０Ｊ）を二次抗体として用い、上述の溶出したタンパク質をウェスタンブロットで検出した。ＩＧＦ−１／ＩＧＦ−１Ｒ／Ｍ１３−Ｃ０６が三成分複合体を形成する能力を示すために、この実験で使用するＩＧＦ−１およびＩＧＦ−１Ｒの濃度は、これらのタンパク質の通常の生理的濃度（特に血清中のＩＧＦ−１濃度）よりも十分に過剰な濃度にし（１５倍を超える濃度）、ＩＧＦ−１Ｒ／ＩＧＦ−１の平衡解離定数を測定した。例えば、Ｈａｎｋｉｎｓｏｎら、１９９８年を参照。
【０７４１】
（ＩＧＦ−１Ｒ（１−４６２）−Ｆｃの構築、および全長受容体の細胞外領域との競合的な抗体結合試験）
ＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２結合領域、ヒトＩＧＦ−１ＲのＬ１−ＣＲ−Ｌ２（残基１〜４６２）の構築方法は、文献で公開されている（ＭｃＫｅｒｎ  １９９７）。この情報を利用し、本願発明者らは、ヒトＩＧＦ−１Ｒ残基１〜４６２（Ｎ末端にシグナル配列を有する）を、社内のＰＶ９０ベクターにサブクローン化し、全長ヒト細胞外領域（残基１〜９０３、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ）を得た。ＣＨＯでの発現は、文献に記載されている方法を用いて行った（Ｂｒｅｚｉｎｓｋｙ  ２００３）。ＣＨＯ上澄みを、他のＦｃ−融合タンパク質について文献に記載されているようにプロテインＡ親和性カラムに通し、タンパク質を精製した（Ｄｅｍａｒｅｓｔ  ２００６）。このタンパク質構築物を、ｈＩＧＦ−１Ｒ（１−４６２）−Ｆｃと称する。
【０７４２】
Ｍ１３−Ｃ０６抗体、Ｍ１４−Ｃ０３抗体およびＭ１４−Ｇ１１抗体が、ｈＩＧＦ−１Ｒ（１−４６２）−Ｆｃおよび全長細胞外領域構築物ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃに結合する能力を、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００を用いてＳＰＲで決定した。この装置を２５℃に設定し、試験バッファは、ＨＢＳ−ＥＰ（ｐＨ７．２）（Ｂｉａｃｏｒｅ、カタログ番号ＢＲ−１００１−８８）であった。標準的なＮＨＳ／ＥＤＣ−アミン反応化学を用い、Ｂｉａｃｏｒｅが提供しているプロトコルにしたがって、全ヒト抗体、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３およびＭ１４−Ｇ１１を、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＣＭ５  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｒａｄｅ  ＳｅｎｓｏｒＣｈｉｐ表面に約１０，０００ＲＵで固定した。固定化のために、抗体を１０ｍＭ  酢酸バッファ（ｐＨ４．０）で約４０μｇ／ｍＬに希釈した。ｈＩＧＦ−１Ｒ−ＦｃおよびｈＩＧＦ−１Ｒ（１−４６２）−Ｆｃが、それぞれヒト抗体に結合し、解離する相対速度を調べるために、述のＳｅｎｓｏｒＣｈｉｐ表面に、それぞれの受容体構築物を徐々に濃度を上げながら注入した。ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃの濃度は、１．０ｎＭ〜１００ｎＭであり、ｈＩＧＦ−１Ｒ（１−４６２）−Ｆｃの濃度は、１．０ｎＭ〜２μＭであった。すべての抗体表面は、１００ｍＭグリシン（ｐＨ２．０）を用いて信頼性高く再生させた。再生を繰り返しても、いずれの抗体表面も活性低下はみられなかった。流速は、２０μＬ／分であった。
【０７４３】
（エピトープマッピング変異）
マウスＩＧＦ−１Ｒに対するＭ１３−Ｃ０６の結合親和性が、ＢｉａｃｏｒｅおよびＦＲＥＴを用いた結合実験（実施例５（第ＩＩＩ部））において、顕著に低下するか、検出不可能になったという結果に基づいて、ＩＧＦ−１Ｒに対するＭ１３−Ｃ０６抗体のエピトープの性能を探るために、変異を選択した。マウスＩＧＦ−１Ｒと、ヒトＩＧＦ−１Ｒとは、一次アミノ酸配列の同一性が９５％である。ヒトＩＧＦ−１Ｒと、ヒトＩＮＳＲは、同一性が５７％である（類似性は７３％）。本願発明者らは、細胞外領域において、マウスＩＧＦ−１ＲとヒトＩＧＦ−１Ｒとで異なる３３残基を特定した（表１６）。これらの残基のうち、ＩＮＳＲ細胞外領域内にある相同性の位置が、最近のＩＮＳＲ結晶構造に基づいて溶媒にさらされる位置であるため、２０残基を変異標的とした（ｐｄｂコードは２ＤＴＧ、ＭｃＫｅｒｎ  ２００６）。接近可能な表面の面積を、プローブ半径１．４Åを用い、ＳｔｒｕｃＴｏｏｌｓ（ｈｔｔｐ：／／ｍｏｌｂｉｏ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｔｒｕｃｔｂｉｏ／ｂａｓｉｃ．ｈｔｍｌ）で算出した。ＩＮＳＲの構造には存在しない４個の残基も突然変異のために選択した。それは、ＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２の結合にとって重要であることが示されている、ＦｎＩＩＩ−２領域の構造化されていないループ領域に存在するからである。（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  ２００１；  Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ２００４）。エピトープマッピング試験で選択した２４種類の突然変異のリストを表１７に示す。
【０７４４】
（表１６）ヒトＩＧＦ−１ＲとマウスＩＧＦ−１Ｒとのアミノ酸の相違点。各残基の位置での溶媒接近可能性を、相同性のＩＮＳＲ細胞外領域の公的に利用可能な構造に基づいて決定した。太字／イタリックで示した残基は、その表面積のうち、３０％を超える部分が溶媒にさらされていることを示しており、突然変異を生成し、Ｍ１３−Ｃ０６のＩＧＦ−１Ｒエピトープについてスクリーニングした。
2010537985.tif 000068
【０７４５】
ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥＴＭ部位特異的変異キットを用い、製造業者のプロトコルにしたがって、野生型ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ  ＰＶ−９０プラスミドを突然変異させることによって、２４種類の変異エピトープマッピングライブラリを構築した。それぞれの変異（または、ライブラリのうち、ＳＤ００４、ＳＤ０１１、ＳＤ０１４、ＳＤ０１６およびＳＤ０１９の場合、２箇所の変異）をＰＶ−９０ベクターに組み込み、これを社内のＤＮＡ配列決定装置で確認した。Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔを用いてプラスミドをｍｉｎｉｐｒｅｐ処理し、Ｑｉａｇｅｎ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ−Ｆｒｅｅ  Ｍａｘｉｋｉｔを用いてプラスミドをｍａｘｉｐｒｅｐ処理した。ＰｏｌｙＦｅｃｔトランスフェクションキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、それぞれの変異プラスミド２００μｇをＨＥＫ２９３  Ｔ細胞  １００ｍＬに２×１０６細胞／ｍＬで一過性発現させ、可溶性タンパク質を培地に分泌させた。細胞を、ＤＭＥＭ（Ｉｖｒｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１０％  ＦＢＳ（低ＩｇＧウシ血清、２０ｍＬのプロテインＡカラムを通すことによって、ウシＩｇＧをさらに減らしたもの）に入れ、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で培養した。７日後、１２００ｒｐｍで遠心分離して、それぞれのＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ変異体を含む上澄みを集め、０．２μｍフィルターで濾過した。１．２ｍＬのプロテインＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラムを１×ＰＢＳで平衡状態にしておき、このカラムに上澄みを通すことによって、それぞれの変異体を親和性精製した。０．１Ｍ  グリシン（ｐＨ３．０）を用いて、上述のカラムから変異体を溶出させ、１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−８０で中和し、ＶｉｖａＳｐｉｎ  ６  ＭＷＣＯ  ３０，０００遠心濃縮装置（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、カタログ番号ＶＳ０６２１）で、容積が約３００μＬになるまで濃縮した。
【０７４６】
（ＩＧＦ−１Ｒ変異体のウェスタンブロット分析）
ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ変異体サンプルを、Ｘｃｅｌｌ  ＳｕｒｅＬｏｃｋ  Ｍｉｎｉ  Ｃｅｌｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  カタログ番号ＥＩ０００１）を用い、標準的な製造者のプロトコルにしたがって、４〜２０％  Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  カタログ番号ＥＣ６０２８）で処理した。ｉＢｌｏｔ  Ｄｒｙ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  カタログ番号ＩＢ１００１）およびＴｒａｎｓｆｅｒ  Ｓｔａｃｋｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  カタログ番号ＩＢ３０１０−０１または３０１０−０２）を用い、標準的な製造業者のプロトコルにしたがって、サンプルをニトロセルロースに移した。４℃で、ＰＢＳＴ２５ｍｌおよび脱脂粉乳５ｍｇ／ｍｌ中、膜を一晩ブロックした。ブロックした後、室温で、ＰＢＳＴ  ２５ｍｌで膜を５分間、１回洗浄した。ＰＢＳＴ  １０ｍｌ中、濃度１：１００で一次抗−ＩＧＦ−１Ｒβ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  カタログ番号ｓｃ−９０３８）とともに膜を室温で１時間インキュベートした。次いで、ＰＢＳＴ  ２５ｍｌで膜を５分間、３回洗浄した。検出のために、ＰＢＳＴ  １０ｍｌ中、濃度１：１０００で、膜をＨＲＰ接合型ヤギ抗−ウサギＩｇＧ−Ｆｃ二次抗体（ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  カタログ番号Ｉ１９０４−４０Ｊ）とともに室温で１時間インキュベートした。室温で、ＰＢＳＴ  ２５ｍｌで膜を５分間、３回洗浄した後、ＰＢＳＴ  ２５ｍｌで２０分間洗浄した。Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  カタログ番号ＲＰＮ２１０８）を用い、標準的な製造業者のプロトコルにしたがって、タンパク質のバンドを検出した。
【０７４７】
（ＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ変異体ライブラリのＢｉａｃｏｒｅ分析）
ｍＩＧＦ−１Ｒ−ＦｃおよびｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃは双方とも、２箇所の別個のホモダイマー領域（ＩＧＦ−１ＲおよびＩｇＧ１−Ｆｃ）を組み込むことによって、きわめて多価な性質が誘発されたため、上述のＭ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３およびＭ１４−Ｇ１１のセンサーチップ表面に対し、高い見かけ親和性で結合する。Ｍ１３−Ｃ０６に対するｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃの実際の高い結合親和性および、Ｍ１３−Ｃ０６に対するｍＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃの低い結合親和性を区別するために、Ｍ１３−Ｃ０６センサーチップ表面で受容体−Ｆｃ融合物を捕捉した後、可溶性Ｍ１３−Ｃ０６  Ｆａｂと結合させた。受容体−Ｆｃ構築物を親和性精製し、濃縮したものを６０μＬ、流速１μＬ／分で注入することによって、Ｍ１３−Ｃ０６チップ（上述のように調製）表面で捕捉した。その後、受容体−Ｆｃ結合工程が終了したら、流速を５μＬ／分に上げた。各受容体−Ｆｃ構築物を結合させた後、濃度が１０ｎＭ、３ｎＭおよび１ｎＭのＭ１３−Ｃ０６  Ｆａｂを注入した（５０μＬ）。各センサーグラムが終了したら、流速を３０μＬ／分に上げ、チップ表面に０．１Ｍグリシン（ｐＨ２）を１０μＬ、２回注入することによってチップ表面を再生した。
【０７４８】
（ＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ変異体をスクリーニングするための、時間分解蛍光共鳴エネルギー転移（ｔｒ−ＦＲＥＴ）アッセイ）
変異受容体を、０．２５〜０．５μｇ（２５μＬ）から始めて段階的に希釈し、３８４ウェルマイクロタイタープレート（白色、Ｃｏｓｔａｒ製）中、０．０５μｇ  ＩＧＦ１Ｒ−Ｈｉｓ１０−Ｃｙ５（１２．５μＬ）および０．００３７５μｇ  Ｅｕ：Ｃ０６（１２．５μＬ）と混合した。ＩＧＦ１Ｒ−Ｈｉｓ１０−Ｃｙ５の接合度は、６．８：１（Ｃｙ５：ＩＧＦ１Ｒ−Ｈｉｓ１０）であり、Ｅｕ−Ｃ０６の接合度は、１０．３：１（Ｅｕ：Ｃ０６）であった。各サンプルについて、合計容積は５０μＬであった。プレート攪拌器で、プレートを室温で１時間インキュベートした。Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ２蛍光プレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で、ＬＡＮＣＥプロトコルを用い、励起波長３４０ｎｍ、発光波長６６５ｎｍで蛍光を測定した。全データを、１箇所での結合モデルに適合させ、ここから、対応するＩＣ５０値を決定した。
【０７４９】
結果：ＩＧＦ−１および／またはＩＧＦ−２がｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃに結合するのを、Ｍ１３−Ｃ０６によって阻害する結果が、前の実施例３に示したように示された。飽和条件でさえ、ほとんどの抗体は、ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２がｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃに結合するのを完全には阻害しない。特に、Ｍ１３−Ｃ０６の場合、本願発明者らは、リガンド結合の阻害は、競合的ではなく、アロステリック効果によるものであるという仮説をたてた。この仮説を検証するために、本願発明者らは、４００ｎＭのＭ１３−Ｃ０６抗体存在下（ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０の抗体の親和性の約４０００倍を超える濃度）、および非存在下での、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０に対するＩＧＦ−１の親和性を決定した。ＳＰＲを用い、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０を抗−Ｈｉｓ  Ｔａｇ抗体でチップ表面に固定し、ＩＧＦ−１の濃度を増加させて（６４ｎＭまで）注入した。ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０に対するＩＧＦ−１の結合は、４００ｎＭのＭ１３−Ｃ０６が存在しても存在しなくても明らかであった（データは示していない。表面プラズモン分解は、ＩＧＦ−１が、４００ｎＭのＭ１３−Ｃ０６が存在しても存在しなくても、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０に結合していることを示す）。ＳＰＲ結合時間は、１４００〜１８００秒であり、解離時間は、１８００〜３０００秒であった。Ｍ１３−Ｃ０６が存在しない状態で、ＩＧＦ−１は、ＫＤ＝１７ｎＭ（ｋａ＝２．４×１０−５／Ｍ＊ｓ）でｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０に結合した。４００ｎＭのＭ１３−Ｃ０６が存在する状態で、ＩＧＦ−１は、ＫＤ＝５９ｎＭ（ｋａ＝７．１×１０−４／Ｍ＊ｓ）でｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０に結合した。ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０に対するＩＧＦ−１の結合解離定数は、Ｍ１３−Ｃ０６存在下では約１／３倍に低下し、このことは、Ｍ１３−Ｃ０６が、受容体に対するリガンドの親和性をアロステリック効果によって低下させていることを示唆している。
【０７５０】
Ｍ１３−Ｃ０６が、ＩＧＦ−１がｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０に結合するのと直接的に競合しないということの証拠は、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０に対するＩＧＦ−１およびＭ１３−Ｃ０６の見かけ親和性よりもかなり高い濃度のＭ１３−Ｃ０６を用い、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０およびＩＧＦ−１を一緒に免疫沈降させることによって得た。ウェスタンブロット分析により、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０と混合したＩＧＦ−１の約７０〜１００％が、Ｍ１３−Ｃ０６と一緒に減っており、このことは、Ｍ１３−Ｃ０６およびＩＧＦ−１が、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０と合わさって三成分複合体を形成することが可能であることを示している（データは示していない）。これらの結果は、通常の血清ＩＧＦ−１濃度で、ＩＧＦ−１の結合をＭ１３−Ｃ０６がアロステリック効果によって阻害することを示しており、Ｍ１３−Ｃ０６の結合部位は、ＩＧＦ−１Ｒリガンド結合ポケットとは重複していないことを示唆している。
【０７５１】
次に、本願発明者らは、Ｍ１３−Ｃ０６が、ＩＧＦ−１Ｒの推定リガンド結合領域（Ｌ１−ＣＲ−Ｌ２）に結合するかどうかを観察した。本願発明者らは、Ｎ末端の３つの領域（残基１〜４６２）が、ＩｇＧ１−Ｆｃに融合している欠失受容体を作成し、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用い、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３およびＭ１４−Ｇ１１の結合能力と、全長受容体の細胞外領域構築物ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃの結合能力とを比較した。Ｍ１４−Ｇ１１は、上述の欠失受容体に対し、同等の結合性を示したが、Ｍ１３−Ｃ０６およびＭ１４−Ｃ０３の結合性は顕著に低下した（データは示していない。ｈＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）ＦｃおよびｈＩＧＦ−１Ｒ（１−４６２）−Ｆｃ欠失体に対する、表面に固定したＭ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３およびＭ１４−Ｇ１１の結合性を、濃度範囲２μＭ、１００ｎＭ、３０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭおよび１ｎＭで試験した）。ＳＰＲ結合時間は、４８０〜９６０秒であり、解離時間は、９６０〜１１７０秒であった。Ｍ１３−Ｃ０６およびＭ１４−Ｃ０３の両方で、結合が残っていることは明らかであった。しかし、このデータは、ＩＧＦ−１Ｒ領域にある抗体残基のエピトープのうち、少なくとも良好な一部分が、リガンド結合領域の外側にあることを示唆している。
【０７５２】
本願発明者らは、マウスＩＧＦ−１Ｒが、Ｍ１３−Ｃ０６抗体に結合しないことを利用し、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ内のマウス変異のライブラリを設計し、ＩＧＦ−１Ｒに対するＭ１３−Ｃ０６の結合部位の位置を調べた。試験したｈＩＧＦ−１Ｒの種々の変異箇所を表１７に示す。ウェスタンブロット分析を用い、各ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ変異体の発現を確認し、ポジティブコントロールとしてｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ精製物を用い、標準曲線を作成し、各変異タンパク質の相対濃度を概算した（データは示していない）。
【０７５３】
（表１７）Ｍ１３−Ｃ０６に対するＩＧＦ−１Ｒの結合に対する変異の影響。ＳＤ０１５は、２種類のアッセイ法で、Ｍ１３−Ｃ０６に対する結合性をほとんど示さないか、または全く示さない唯一の残基であったため、太字である。ＮＤ＝判定できず
2010537985.tif 000069
【０７５４】
ＳＰＲおよびｔｒ−ＦＲＥＴを使用し、ＩＧＦ−１Ｒ−ＦｃがＭ１３−Ｃ０６に結合するのを阻害する変異体をスクリーニングした。ＳＤ０１５変異体を除き、すべてのＩＧＦ−１Ｒ変異構築物が、ＳＰＲ実験で、Ｍ１３−Ｃ０６への結合活性を示すか、またはＭ１３−Ｃ０６  Ｆａｂへの結合活性を示した。図２７、表１７を参照、データは示されていない（競合的な阻害分析を用い、標識していないｈＩＧＦ１Ｒ−Ｆｃ（ＳＤＷＴ）、マウスＩＧＦ１Ｒ−Ｆｃ（ｍＩＧＦ１Ｒ−Ｆｃ）および変異ｈＩＧＦ１Ｒ−Ｆｃ構築物の濃度を上げることによって、Ｃｙ５標識したＩＧＦ１Ｒに結合するＥｕ−Ｍ１３−Ｃ０６を交換するための結合曲線を確立した）。
【０７５５】
ｔｒ−ＦＲＥＴを用いて決定したＩＣ５０値およびＳＰＲを用いて決定した相対結合強度には、ウェスタンブロットによる表現および定量化に自然発生する偏差が存在するため、ある程度偏差が存在する。しかし、ＳＤ０１５は、両アッセイでＭ１３−Ｃ０６に対して実質的に結合しなかった唯一の変異体であり、ｍＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃコントロールの結果と匹敵する結果であった。Ｈｉｓ４６４は、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ欠失構築物（すなわち、ｈＩＧＦ−１Ｒ（１−４６２）−Ｆｃ）のＣ末端に対し、一次アミノ酸配列でＣ末端に位置する２個のアミノ酸である。Ｍ１３−Ｃ０６が、ｈＩＧＦ−１Ｒ（１−４６２）欠失体に対する結合活性を残していることは、Ｍ１３−Ｃ０６の結合エピトープが、残基Ｖａｌ４６２−Ｈｉｓ４６４を少なくとも包含するエピトープに結合していることを示唆している。Ｍ１３−Ｃ０６のエピトープは、構造的に独立していないことを示唆する証拠があるため、抗体−エピトープ結合の相互作用に、他の残基も関与していると考えられる。しかし、特に、残基Ｖａｌ４６２およびＨｉｓ４６４は、ＦｎＩＩＩ−１ドメインの外側表面にある残基であると予想される（図２８）。
【０７５６】
Ｍ１３−Ｃ０６エピトープ範囲の特徴（すなわち、４６２−４６４の周囲にある度の残基が、抗体の結合および活性に重要なのか）を調べる試みにおいて、本願発明者らは、構造モデリングアプローチを行った。ヒトＩＧＦ−１Ｒと、ヒトＩＮＳＲとは、同一性が５７％であり（類似性は７３％）、同様の三次構造を有している。タンパク質抗原：抗体結合表面のＸ線結晶構造の以前分析は、平均結合表面が７００Å２（平方オングストローム）であり、結合エピトープからの平均半径が１４Åであることが示唆している（Ｄａｖｉｅｓ  １９９６）。ＩＮＳＲの相同性細胞外領域（ｐｄｂコードは２ＤＴＧ、（ＭｃＫｅｒｎ  ２００６））のＸ線結晶構造を用い、本願発明者らは、ＩＧＦ−１Ｒ残基のＶ４６２からＨ４６４を、ＩＮＳＲの残基Ｌ４７２からＫ４７４に対してマッピングすることにより、残基４６２〜４６４の１４Å以内にあり、ＦｎＩＩＩ−１ドメインの表面にある残基を算出した。１４Å以内にある任意の原子と原子との距離にカットオフ値を適用し、平均距離は、各曲面パッチにあるそれぞれの残基とＬ４７２およびＬ４７４のＣα−Ｃα距離から算出した。算出した平均距離を、Ｃα−Ｃα距離が１４Åよりも大きい残基については、１４Åであるとし、側鎖は、１４Åのカットオフの範囲内である。Ｍ１３−Ｃ０６の結合および活性にとって重要であると考えられる残基を表１８に列挙している。
【０７５７】
（表１８）Ｍ１３−Ｃ０６の結合および活性にとって重要であると考えられる、ＩＧＦ−１Ｒ内の残基。残基４６２および４６４は、ＩＧＦ−１Ｒ結合エピトープの中心であると予想されるため、イタリックで示している。実験データは、Ｍ１３−Ｃ０６の結合に対する、これらの残基の重要性を示している。
2010537985.tif 000070
【０７５８】
公開されている研究結果は、残基４４０〜５８６を認識する抗体は、ＩＧＦ−１結合に対し、阻害効果およびアゴニスト効果の両方を示し得るこを示している（Ｓｏｏｓ  １９９２；  Ｋｅｙｈａｎｆａｒ  ２００７）。４４０〜５８６は、Ｌ２およびＦｎＩＩＩ−１の全体をあらわし、抗−ＩＧＦ−１Ｒ抗体に接近可能な重複していない表面であると考える箇所が多く存在する。本願発明者らの研究は、本願発明者の知る限りでは、ＩＧＦ−１Ｒの阻害性エピトープが、特定の残基にマップされた最初の研究である。ＩＮＳＲの最近の構造は、インスリンがインスリン受容体に結合するのを阻害することが知られている抗−ＩＮＳＲ抗体とともに結晶化させたものであった（Ｓｏｏｓ  １９８６；ＭｃＫｅｒｎ  ２００６）。ＩＧＦ−１ＲのＨｉｓ４６４と相同性の残基（ＩＮＳＲのＫ４７４）は、この抗体がＩＮＳＲと結合する表面の一部分である。Ｍ１３−Ｃ０６が、ＩＧＦ−１がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを、アンタゴニストである抗−ＩＮＳＲ抗体が阻害する機構と同様の阻害機構を有する可能性がある。
【０７５９】
（実施例２８  Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体は、インビボで腫瘍細胞に効果的に局在化し、Ｋｉ６７の発現を阻害し、ＩＧＦ−１Ｒの発現を下方修正する）
Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体は、インビボで腫瘍細胞に効果的に局在化する。
方法：ＳＣＩＤベージュマウスに、エストロゲン存在下（０．３６ｍｇペレット状、９０日放出（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ））、２×１０６のＭＣＦ−７細胞（マトリゲル中）を注入した。腫瘍を３００〜５００ｍｍ３まで成長させ、マウスに、Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体  ３０ｍｇ／ｋｇを腹腔内注射した。マウスを殺し、注射から２時間後、６時間後、１２時間後、２４時間後および４８時間後に腫瘍を取り出し、ＯＣＴで凍結させ、免疫組織分析（ＩＨＣ）のために６μｍを切除した。抗体を注入していない腫瘍をコントロールとして試験した。腫瘍をＯＣＴで凍結させ、ＩＨＣのために６μｍ切除した。基質は、Ｖｅｃｔｏｒ  ＶＩＰであり、紫色染色した。Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙまたはＩＤＥＣ１５１（ネガティブコントロール抗体）で処理した腫瘍で、結合した抗体を、ヤギ抗−ヒトＩｇＧ  Ｈ＋Ｌ（Ｈｕｍａｎ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣキット、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）で検出した。Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙまたはＩＤＥＣ１５１で処理した腫瘍で、α−ＩＧＦ−１Ｒ  Ｍａｂ（クローン２４−３１、ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ／Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ）を用い、ＩＧＦ−１Ｒの発現量を検出した。ＢｘＰＣ３膵臓癌の異種移植モデルにおいて、同様の試験を行った。
【０７６０】
結果（データは示していない）：マウスＭＣＦ−７乳房腫瘍の異種移植モデルまたはＢｘＰＣ３膵臓腫瘍の異種移植モデルを用い、インビボ効力実験を行うと、Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙを腹腔内注射すると、３０ｍｇ／ｋｇおよび１５ｍｇ／ｋｇで腫瘍細胞の成長を効果的に阻害することが分かった。薬効を試験するために、ＭＣＦ−７腫瘍を有するマウスまたはＢＸ−Ｐｃ３腫瘍を有するマウスに、Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙをそれぞれ３０ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ／ｋｇで１回投与し、経時実験を行った。Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙは、免疫組織化化学分析（ＩＨＣ）によって決定した場合、治療開始から６時間で、腫瘍に局在化し、４８時間で局在化が最大になった。ウェスタン分析およびＩＨＣ分析によって決定したＩＧＦ−１Ｒの発現量から、治療開始から６時間後に、Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙで処置した腫瘍において、ＩＧＦ−１Ｒが顕著に失われており、２４時間でＩＧＦ−１Ｒがほぼ完全に失われていることが分かった。アイソタイプの一致したコントロール抗体で治療した場合、腫瘍には何の変化もなかった。シグナル伝達経路について腫瘍溶解物を分析すると、２〜１２時間で、リン酸化Ｅｒｋおよびリン酸化Ａｋｔの量が一次的に減少していることが分かった。
【０７６１】
（Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体が、Ｋｉ６７の発現を阻害する）
Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ処置した細胞をＫｉ６７染色すると、コントロール抗体で処置した腫瘍と比較して、増殖細胞の数が減少していることが分かった（データは示していない）。これらのデータから、Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙが、インビボで腫瘍に効率的に局在化し、ＩＧＦ−１Ｒを下方制御し、ＩＧＦ−１Ｒが介在するシグナル伝達を阻害することにより、腫瘍の成長を阻害することが分かった。
【０７６２】
（腫瘍において、Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙが、ＩＧＦ−１Ｒを下方制御し、低下する）
ヒト膵臓細胞（ＢｘＰＣ３；図２９（Ａ））および乳癌細胞（ＭＣＦ−７；図２９（Ｂ））で作成したＳＩＣＤマウス腫瘍の溶解物から、ＩＧＦ−１Ｒを免疫ブロット分析した。Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙまたはＩＤＥＣ−１５１ネガティブコントロール抗体で処置した後、所定の時間点で腫瘍を切除した。腫瘍を凍結保存し、粉砕し、溶解した。腫瘍細胞溶解物のタンパク質濃度を正規化し、４−１２％  ＮｕＰＡＧＥ（Ｒ）ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．、ＳＤ、ＣＡ）で分離した。このゲルをニトロセルロースフィルターにブロッティングし、ポリクローナル抗−ＩＧＦ−１Ｒβプローブと反応させ、抗−ウサギ−セイヨウワサビペルオキシダーゼ抗体との酵素反応によって検出した。結果から、Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙは、ネガティブコントロールと比較して、ＩＧＦ−１Ｒを下方制御し、低下させることが分かった。
【０７６３】
（実施例２９  Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体は、種々の腫瘍モデル系において、インビボで抗腫瘍活性を示す）
前の実施例で記載したように、肺モデル系および膵臓モデル系で、Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙが、インビボで腫瘍の成長を阻害することを示したが、以下の実験では、Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙが活性を示す多様な腫瘍モデルについてさらに記載する。
【０７６４】
（ＭｉａＰａＣａ２膵臓癌細胞で作成した腫瘍における、Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙの抗腫瘍活性）
メスＳＣＩＤマウスの右わき腹に、５０％  Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）／ＰＢＳに入った２×１０６のＭｉａＰａＣａ２膵臓癌細胞を接種した。腫瘍の容積を１５０ｍｍ３（Ｌ×Ｗ２／２）に到達させ、マウスを、単剤（抗体のみ）を腹腔内投薬する群と、組み合わせ投薬する群（Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体およびゲムシタビン）とに分けた。ゲムシタビン単独（２０ｍｇ／ｋｇ、４日ごとに３回）、およびＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ（３０ｍｇ／ｋｇ）との組み合わせ、およびＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ単独（１５ｍｇ／ｋｇの場合と３０ｍｇ／ｋｇの場合、週に１回×６）は、腫瘍の成長を阻害した。
【０７６５】
ゲムシタビン以外にも、多くの他の組み合わせ治療を試験することができ、本発明の抗体と組み合わせて使用した。例えば、以下のカテゴリーの化合物との組み合わせを、小さなサンプリング例のリストにしており、これらの化合物を、本発明の抗体と組み合わせて使用した。
ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤、例えば、
タルセバ（エルロチニブ）
イレッサ（ゲフィチニブ）
ＥＧＦＲ抗体、例えば、
エルビタックス（セツキシマブ）
ベクチビックス（Ｖｉｃｔｉｂｉｘ）（パニツムマブ）
ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、
テムシロリムス
ラパマイシン
および他の抗癌化合物、例えば、
グリーベック（イマチニブ）
スーテント（スニチニブ）
ソラフェニブ（Ｂａｙ−４３９００６）
ＳＡＨＡ（ＨＤＡＣ阻害剤）
ＨＳＰ９０阻害剤
Ｍ２００（ヴォロシキシマブ（Ｖｏｌｏｃｉｘｉｍａｂ））
【０７６６】
（原発性ヒト結腸腺癌に由来する細胞から作成した腫瘍における、Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙの抗腫瘍活性）
メスＳＣＩＤマウスの右わき腹に、結腸腫瘍のフラグメント１ｍｍ３を接種した。この腫瘍のフラグメントは、結腸腺癌患者から手術によって腫瘍を切除して結腸腫瘍組織を得て、この結腸腫瘍組織を連続継代したもの（５回）に由来するものであった。腫瘍の容積を１５０ｍｍ３（Ｌ×Ｗ２／２）に到達させ、マウスを所定の治療群（ｎ＝６）に分けた（図３０）。抗体を１５ｍｇ／ｋｇまたは３０ｍｇ／ｋｇ、週に１回腹腔内投薬した。
【０７６７】
結果：Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙは、ＳＣＩＤマウスにおいて、原発性結腸腫瘍（ＣＴ３）の成長を効果的に阻害した（図３０）。
【０７６８】
（ＭＣＦ−７乳癌細胞から作成した腫瘍における、Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙの抗腫瘍活性）
メスＳＣＩＤベージュマウスの右わき腹に、５０％  Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）／ＰＢＳに入った２×１０６のＭＣＦ−７細胞（エストロゲン依存性）を接種した。細胞を接種する２４時間前に、左のわき腹にエストラジオールペレットを移植した（０．３６ｍｇのエストラジオールペレット、９０日間放出（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ））。腫瘍の容積を１５０ｍｍ３（Ｌ×Ｗ２／２）に到達させ、マウスを群に分け、所定の治療群（ｎ＝１０）で投薬を行った（図３１）。抗体を週に１回腹腔内投薬し、クエン酸タモキシフェン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．（米国モントリオール州セントルイス）をピーナッツ油と混合したものを、それぞれの治療中に、週に５回皮下投与した。ｐａｉｒｅｄ  ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定で統計分析を行った。
【０７６９】
結果：Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙは、ＳＣＩＤマウスにおいて、ＭＣＦ−７乳癌腫瘍の成長を効果的に阻害した（図３１）。
【０７７０】
もちろん、本発明の抗体の腫瘍阻害効果は、多くの他の癌細胞種で容易に試験することができた（例えば、少量の例示的なサンプルを挙げると、肺癌細胞株Ｈ−１２９９、Ｈ−４６０、Ｈ−２３；結腸癌細胞株Ｃｏｌｏ２０５およびＨＴ−２９；膵臓癌細胞株、例えばＰａｎｃ−１；および前立腺癌細胞株、例えば、ＰＣ−３）。
【０７７１】
（実施例３０  Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体は、インビトロでＡＤＣＣ活性を示さない）
方法：ヒト末梢血単核細胞を、標準的なＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ分離によって、ヘパリン化した全血から精製した。この細胞を、１０％ＦＢＳおよび２００Ｕ／ｍＬのヒトＩＬ−２を含有するＧＩＢＣＯＴＭ  ＲＰＭＩ１６４０培地に再び懸濁させ、３７℃で一晩インキュベートした。次の日、細胞を集め、培地で１回洗浄し、１×１０７細胞／ｍＬで再び懸濁させた。
【０７７２】
標的細胞（ＭＣＦ−７、乳癌細胞）を１００μＣｉ  ５１Ｃｒとともに３７℃で１時間インキュベートした。標的細胞を１回洗浄し、取り込まれていない５１Ｃｒを除去し、１×１０４細胞／ウェルの容積で播種した。標的細胞を、エフェクター細胞５０μＬおよび抗体５０μＬとともにインキュベートした。実験全体で、標的とエフェクターの比率は１：５０を使用した。抗体を含むコントロールと、抗体を含まないコントロールも一緒にインキュベートした。コントロールには、Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ、ハーセプチン（ポジティブコントロール）およびＩＤＥＣ−１５１（ネガティブコントロール−ＣＤ４に特異的なマカク／ヒトキメラＩｇＧ１モノクローナル抗体）が含まれていた。３７℃で４時間インキュベートした後、上澄みを集め、ガンマカウンタ（Ｉｓｏｄａｔａ  Ｇａｍｍａ  Ｃｏｕｎｔｅｒ、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で計測した。以下の計算式で、溶解率（％）を決定した。
【０７７３】
溶解率（％）＝［サンプル放出量（ＣＰＭ）−自然放出量（ＣＰＭ）］÷［最大放出量（ＣＰＭ）−自然放出量（ＣＰＭ）］×１００％
【０７７４】
結果：ポジティブコントロールであるハーセプチン抗体とは対照的に、Ｍ１３−Ｃ０６抗体も、ＩＤＥＣ−１５１抗体も、ＡＤＣＣ活性を示さず、このことは、Ｍ１３−Ｃ０６抗体、ＩＤＥＣ−１５１抗体が、エフェクター機能を有していないことを示している（図３２）。
【０７７５】
（実施例３１  抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体を用いる、ヒトの癌の治療）
本実施例は、悪性細胞（例えば、ＩＧＦ−１Ｒの発現が検出された過剰増殖性細胞）を標的として、ＩＧＦ−１Ｒに対する抗体を用いる癌の治療方法を記載する。
【０７７６】
特定の実施形態では、Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体（または本発明の別の抗体）を精製し、注射に好適な医薬ビヒクルを用いて処方化する。過剰増殖性障害を患うヒト患者に、Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体（または本発明の別の抗体）を体重１ｋｇあたり約１ｍｇ／ｋｇ体〜約１００ｍｇ／ｋｇ体を、例えば、２週間に１回または月に１回、少なくとも６週間にわたって、静脈内注入によって複数回投与する。投与間隔は、患者の症状を診断して測定することによって、上述のように不規則であってもよい。
【０７７７】
本明細書に記載したような標準的な放射線治療の前、治療と同時、または治療の後に、抗体を投与してもよい。患者を監視し、治療によって抗腫瘍反応が得られているか否かを決定する（例えば、腫瘍が小さくなっているか、新しい腫瘍の発生率が低下しているか、腫瘍での抗原の発現量が下がっているか、または疾患の予後を評価する他の手段に基づいて）。
【０７７８】
（実施例３２  ＩＧＦ−１Ｒのアロステリック効果による抗体阻害剤および競合的な抗体阻害剤の残基特異的なエピトープマッピング）
目的：目的は、阻害作用のある抗−ＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合エピトープを解明すること、およびＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２をブロックするに至る機構を解明すること。
【０７７９】
背景：ＩＧＦ−１Ｒ（１型のインスリン様成長因子受容体）は、多くの正常な細胞種で発現するチロシンキナーゼ受容体である。（Ｐｏｌｌａｋら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ（２００４）４：５０５−５１６）。ＩＧＦ−１Ｒは、腫瘍の成長および生存にも関与し、したがって、治療的介入のための、抗体および小分子に基づくアプローチの標的である。阻害性を有する抗体は、受容体の細胞外リガンド結合ドメインを標的とされてきた。ＩＧＦ−１Ｒの細胞外領域は、Ｌ１として知られるＮ末端のロイシンに富む繰り返しドメイン１、システインに富む領域（ＣＲＲ）、第２のロイシンに富む繰り返しドメイン（Ｌ２）、ＦｎＩＩＩ−１、ＦｎＩＩＩ−２およびＦｎＩＩＩ−３と呼ばれる３つのＣ末端ＩＩＩ型フィブロネクチンドメインの６種類のタンパク質ドメインからなる（図３６）。ここで、本願発明者らは、ＩＧＦ−１Ｒ細胞外領域表面にある２個の別個のエピトープが受容体の阻害に関わっている可能性を示す。本願発明者らは、４６種類の１箇所または２箇所が変異したＩＧＦ−１Ｒ変異体のデータセットに基づき、上述の２個のエピトープに関する、新しい残基特異的なエピトープマッピング情報を作成した。第１のエピトープは、ＦｎＩＩＩ−１にあり、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の結合をアロステリック効果によってブロックする。第２のエピトープは、ＣＲＲドメインにあり、ＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２の推定結合部位に近い。本願発明者らは、この領域にある抗体エピトープのわずかな違いによって、１個のリガンド（ＩＧＦ−１）の結合をアロステリック効果によってブロックする能力と、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の両方を競合的にブロックする能力とに分かれることを発見した。両リガンドを競合的にブロックするために標的にすべき特定の残基を、最初に特定した。
【０７８０】
材料：抗−ＩＧＦ−１Ｒ抗体であるＭ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３およびＰ１Ｅ２を上述のように精製した（例えば、実施例１０を参照）。市販の阻害性を有するＩＧＦ−１Ｒ抗体（αＩＲ３（Ｊａｃｏｂｓら、１９８６））は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（カタログ番号ＧＲ１１ＬＳＰ５）から購入した。末端にオクタヒスチジンタグを有するヒトＩＧＦ−１は、Ｐｉｃｈｉａで組み換え、Ｎｉ２＋−ＮＴＡアガロースで精製した。Ｃ末端に１０−ヒスチジンタグを含有する可溶性の組み換えヒトＩＧＦ−１Ｒ細胞外領域構築物は、ｈＩＧＦ−１Ｒ（１−９０２）−Ｈｉｓ１０と呼ばれ、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ（カタログ番号３０５−ＧＲ−０５０）から購入した。ヒトおよびマウスのＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）−ＩｇＧ１−Ｆｃ融合タンパク質を構築し、標準的なプロテインＡクロマトグラフィー法を用いて精製した。
【０７８１】
方法：抗体の交差ブロック試験。種々の抗体がＭ１３−Ｃ０６またはＭ１４−Ｇ１１をブロックする能力を、両抗体およびｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃのビオチン化態様を用いて決定した。簡単に説明すると、９６ウェルの透明ＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ）１ウェルあたり、１×ＰＢＳ中、２μｇ／ｍＬのｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ  ５０μＬを用い、室温で２時間コーティングした（ＲＴ、振とうせず）。プレートを１×ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ溶液を用い、２〜８℃で一晩ブロックした。プレートを洗浄し、ビオチン化Ｍ１３−Ｃ０６またはビオチン化Ｍ１４−Ｇ１１（８０ｎｇ／ｍＬ）および阻害性を有する抗体の混合物１００μＬとともに、室温で１時間インキュベートした。阻害性を有する抗体を、４０μｇ／ｍＬから３ｎｇ／ｍＬまで段階的に希釈した（５倍希釈）。ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ  カタログ番号２１３３５）を用い、製造業者のプロトコルにしたがって、Ｍ１３−Ｃ０６およびＭ１４−Ｇ１１をビオチン化した。コントロールも、ＩＧＦ−１Ｒに特異的ではないＩｇＧ４アイソタイプコントロール抗体をビオチン化Ｍ１３−Ｃ０６またはビオチン化Ｍ１４−Ｇ１１とともに段階希釈することによって行った。プレートを洗浄し、１００μＬ／ウェルのストレプトアビジン−ＨＲＰ（ブロッキングバッファで１：４０００希釈、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  カタログ番号７１００−０５）とともに室温で１時間振とうした。プレートを洗浄し、１００μＬ／ウェルのＳｕｒｅＢｌｕｅ  Ｒｅｓｅｒｖｅ  ＴＭＢ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ、カタログ番号５３−００−０１）をウェルに加えた。Ｗａｌｌａｃ  １４２０−０４１  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒプレートリーダーを用い、５分ごとに吸光度６５０ｎｍで測定することによって、ビオチン化Ｍ１３−Ｃ０６またはビオチン化Ｍ１４−Ｇ１１の存在を検出した。
【０７８２】
種々の抗体が、マウスαＩＲ３をブロックする能力を、「Ｚｅｎｏｎ−Ｆａｂ−ＨＲＰ」標識したαＩＲ３およびｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃを用いて決定した。αＩＲ（ＩｇＧ１）を、製造業者の記載にしたがって、Ｚｅｎｏｎ（Ｒ）−Ｆａｂ−ＨＲＰ標識した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  カタログ番号Ｚ２５０５４）。簡単に説明すると、９６ウェルの透明ＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ）１ウェルあたり、１×ＰＢＳ中、２μｇ／ｍＬのｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ  ５０μＬを用い、室温で２時間コーティングした（ＲＴ、振とうせず）。プレートを１×ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ溶液を用いて２〜８℃で一晩ブロックした。プレートを洗浄し、Ｚｅｎｏｎ標識したαＩＲ３（４０ｎｇ／ｍＬ）および阻害性を有する抗体の混合物１００μＬとともに、室温で１時間インキュベートした。阻害性を有する抗体を、４０μｇ／ｍＬから３ｎｇ／ｍＬまで段階的に希釈した（５倍希釈）。コントロールは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的ではないＩｇＧ４アイソタイプコントロール抗体をＺｅｎｏｎ標識したαＩＲ３とともに段階希釈することによって行った。プレートを洗浄し、１００μＬ／ウェルのＳｕｒｅＢｌｕｅ  Ｒｅｓｅｒｖｅ  ＴＭＢ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ、カタログ番号５３−００−０１）をウェルに加えた。Ｗａｌｌａｃ  １４２０−０４１  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒプレートリーダーを用い、５分ごとに吸光度６５０ｎｍで測定することによって、Ｚｅｎｏｎ標識したαＩＲ３を検出した。
【０７８３】
（ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２のブロッキング）
ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃを、ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎを用い、製造業者が提供するプロトコルにしたがってビオチン化した（Ｐｉｅｒｃｅ  カタログ番号２１３３５）。ＳｉｇｍａＳｃｒｅｅｎのストレプトアビジンでコーティングされた９６ウェルプレート（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｍ５４３２−５ＥＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．（米国モントリオール州セントルイス））１ウェルあたり、ビオチン化ヒトＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ  ５μｇ／ｍＬを加え、２〜８℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートを２００μＬ／ウェルのＰＢＳＴで４回洗浄した。ＰＢＳＴ、１．０ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ中、ヒトＩＧＦ−１  Ｈｉｓを３２０ｎＭで調製した。抗−ＩＧＦ−１Ｒ抗体であるＭ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｐ１Ｅ２およびαＩＲ３（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カタログ番号ＧＲ１１ＬＳＰ５）を３２０ｎＭ  ＩＧＦ−１  Ｈｉｓ溶液で段階的に希釈した。Ｍ１３−Ｃ０６およびＭ１４−Ｃ０３の場合、１．３μＭ〜１０ｐＭ、Ｍ１４−Ｇ１１の場合５．２μＭ〜１０ｐＭ、Ｐ１Ｅ２およびαＩＲ３の場合、２．６μＭ〜１０ｐＭで希釈した。ＰＢＳＴ、１．０ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ中、ヒトＩＧＦ−２  Ｈｉｓを３２０ｎＭで調製した。３２０ｎＭ  ＩＧＦ−２  Ｈｉｓ溶液を用い、この抗体を段階的に希釈した（Ｍ１３−Ｃ０６およびＭ１４−Ｃ０３の場合、１．３μＭ〜５ｐＭ、Ｍ１４−Ｇ１１およびαＩＲ３の場合５．２μＭ〜５ｐＭ、Ｐ１Ｅ２の場合、５．２μＭ〜２０ｐＭ）。プレートに、希釈物１００μＬ／ウェルを２ッ組で加え、プレートを室温で１時間インキュベートした。次いで、プレートを２００μＬ／ウェルのＰＢＳＴで４回洗浄した。ＨＲＰに接合した抗−Ｈｉｓ  Ｔａｇ抗体（Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ  ＨＲＰ接合物、ＱＩＡＧＥＮ、カタログ番号１０１４９９２）をＰＢＳＴで１：１０００に希釈し、１００μＬ／ウェルでプレートに加え、プレートを室温で１時間インキュベートした。次いで、このプレートを２００μＬ／ウェルのＰＢＳＴで４回洗浄した。１００μＬ／ウェルのＳｕｒｅＢｌｕｅ  Ｒｅｓｅｒｖｅ  ＴＭＢ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ、カタログ番号５３−００−０１）をプレートに加え、所望の反応が観察されたら、１％リン酸を１００μＬ／ウェルで１回加えた。各ウェルの吸光度を４５０ｎｍで決定し、結果を正規化し、抗体濃度をｌｏｇでプロットした。
【０７８４】
（エピトープマッピング変異）
ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥＴＭ部位特異的変異キットを用い、製造業者のプロトコルにしたがって、野生型ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ  ＰＶ−９０プラスミドを突然変異させることによって、４６種類の変異エピトープマッピングライブラリを構築した。それぞれの変異（または、２箇所の変異）をＰＶ−９０ベクターに組み込み、これをＤＮＡ配列決定装置で確認した。ＤＮＡ産生のために、プラスミドをＤＨ５α（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１８２５８−０１２）に形質転換し、３７℃で一晩培養し、Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔを用いてプラスミドをｍｉｎｉｐｒｅｐ処理し、Ｑｉａｇｅｎ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ−Ｆｒｅｅ  Ｍａｘｉｋｉｔを用いてプラスミドをｍａｘｉｐｒｅｐ処理した。ＰｏｌｙＦｅｃｔトランスフェクションキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、それぞれの変異プラスミド２００μｇをＨＥＫ２９３  Ｔ細胞  １００ｍＬに２×１０６細胞／ｍＬで一過性発現させ、可溶性タンパク質を培地に分泌させた。細胞を、ＤＭＥＭ（Ｉｖｒｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１０％  ＦＢＳ（低ＩｇＧウシ血清、２０ｍＬのプロテインＡカラムを通すことによって、ウシＩｇＧをさらに減らしたもの）に入れ、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で培養した。７日後、１２００ｒｐｍで遠心分離して、それぞれのＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ変異体を含む上澄みを集め、０．２μｍフィルターで濾過した。１．２ｍＬのプロテインＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラムを１×ＰＢＳで平衡状態にしておき、このカラムに上澄みを通すことによって、それぞれの変異体を親和性精製した。０．１Ｍ  グリシン（ｐＨ３．０）を用いて、上述のカラムから変異体を溶出させ、１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−８０で中和し、ＶｉｖａＳｐｉｎ  ６  ＭＷＣＯ  ３０，０００遠心濃縮装置（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、カタログ番号ＶＳ０６２１）で、容積が約３００μＬになるまで濃縮した。
【０７８５】
（ＩＧＦ−１Ｒ変異のウェスタンブロット分析）
ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ変異体サンプルを、Ｘｃｅｌｌ  ＳｕｒｅＬｏｃｋ  Ｍｉｎｉ  Ｃｅｌｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  カタログ番号ＥＩ０００１）を用い、標準的な製造者のプロトコルにしたがって、４〜２０％  Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  カタログ番号ＥＣ６０２８）で処理した。ｉＢｌｏｔ  Ｄｒｙ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  カタログ番号ＩＢ１００１）およびＴｒａｎｓｆｅｒ  Ｓｔａｃｋｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  カタログ番号ＩＢ３０１０−０１または３０１０−０２）を用い、標準的な製造業者のプロトコルにしたがって、サンプルをニトロセルロースに移した。４℃で、ＰＢＳＴ２５ｍｌおよび脱脂粉乳５ｍｇ／ｍｌ中、膜を一晩ブロックした。ブロックした後、室温で、ＰＢＳＴ  ２５ｍｌで膜を５分間、１回洗浄した。ＰＢＳＴ  １０ｍｌ中、濃度１：１００で一次抗−ＩＧＦ−１Ｒβ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  カタログ番号ｓｃ−９０３８）とともに膜を室温で１時間インキュベートした。次いで、ＰＢＳＴ  ２５ｍｌで膜を５分間、３回洗浄した。検出のために、ＰＢＳＴ  １０ｍｌ中、濃度１：１０００で、膜をＨＲＰ接合型ヤギ抗−ウサギＩｇＧ−Ｆｃ二次抗体（ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  カタログ番号Ｉ１９０４−４０Ｊ）とともに室温で１時間インキュベートした。室温で、ＰＢＳＴ  ２５ｍｌで膜を５分間、３回洗浄した後、ＰＢＳＴ  ２５ｍｌで２０分間洗浄した。Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  カタログ番号ＲＰＮ２１０８）を用い、標準的な製造業者のプロトコルにしたがって、タンパク質のバンドを検出した。
【０７８６】
（ＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ変異ライブラリの表面プラズモン分析）
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験を、２５℃に設定したＢｉａｃｏｒｅ  ３０００を用いて行った。ｍＩＧＦ−１Ｒ−ＦｃおよびｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃは、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３およびＭ１４−Ｇ１１を固定した研究グレードのＣＭ５センサーチップ表面に対し、高い見かけ親和性で結合する。標準的な製造業者のプロトコルを用い、それぞれの抗体（１０ｍＭ  アセテート（ｐＨ４．０）で１００μｇ／ｍＬ）を、ＥＤＣ／ＮＨＳで活性化したセンサーチップ表面に注入することによって、抗体センサーチップ表面を調製した。ｍＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃが、抗体表面に結合する能力は、タンパク質の見かけ結合活性が高い結果であった。ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃタンパク質およびｍＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃタンパク質は、２個の別個のホモダイマー領域（ＩＧＦ−１ＲおよびＩｇＧ１−Ｆｃ）が組み込まれているため、両方ともオリゴマー化する。ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃに対する抗体の高い実際の結合親和性と、ｍＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃに対する抗体の低い結合親和性を区別するために、Ｍ１３−Ｃ０６およびＭ１４−Ｇ１１のセンサーチップ表面で受容体−Ｆｃ融合物を捕捉した後、抗体（αＩＲ３およびＰ１Ｅ２）または抗体Ｆａｂ（Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３およびＭ１４−Ｇ１１）を注入して加えた。受容体−Ｆｃ構築物を親和性精製し、濃縮したものを６０μＬ、流速１μＬ／分でセンサーチップ表面に注入することによって、抗体表面で捕捉した。その後、受容体−Ｆｃ結合工程が終了したら、流速を５μＬ／分に上げた。各受容体−Ｆｃ構築物を結合させた後、Ｍ１３−Ｃ０６  Ｆａｂ抗体またはαＩＲ３抗体を１０ｎＭ、３ｎＭ、または１ｎＭで含む溶液、またはＭ１４−Ｃ０３  Ｆａｂ、Ｍ１４−Ｇ１１  ＦａｂまたはＰ１Ｅ２抗体を３０ｎＭ、１０ｎＭまたは３ｎＭで含む溶液を注入した（５０μＬ）。抗体の注入が完了してから７分間、解離を測定した。最後に、流速を３０μＬ／分に上げ、チップ表面に０．１Ｍグリシン（ｐＨ２）を１０μＬ、２回注入することによってチップ表面を再生した。
【０７８７】
結果：抗−ＩＧＦ−１Ｒ抗体がＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２をブロックする性能。５種類の抗体（Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｐ１Ｅ２およびαＩＲ３）が、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを阻害する能力について、ＥＬＩＳＡ系競合アッセイで試験した。Ｍ１３−Ｃ０６およびＭ１４−Ｃ０３は、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを両方ともブロックした（図３３および３４）。飽和濃度のＭ１３−Ｃ０６またはＭ１４−Ｃ０３が存在する条件下でさえ、このアッセイにおいて、リガンドの濃度を上げることによって、ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２は、部分的に結合した。さらに、Ｍ１３−Ｃ０６およびＭ１４−Ｃ０３の阻害曲線の中間点（ＩＣ５０）は、このアッセイにおけるＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２の濃度には依存しなかった。両方の結果から、リガンドのブロッキングはアロステリック効果による機構であることが示唆される。飽和濃度のＭ１３−Ｃ０６またはＭ１４−Ｃ０３が存在する状態、および存在しない状態で、ヒトＩＧＦ−１  Ｈｉｓを滴定すると、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃに対するリガンドの見かけ親和性が失われていることが示された。このデータから、Ｍ１３−Ｃ０６抗体が存在すると、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃに対するヒトＩＧＦ−１  Ｈｉｓの親和性がほぼ１／５０倍に低下することが示唆される（図３５）。Ｐ１Ｅ２およびαＩＲ３は、ＩＧＦ−１をアロステリック効果によってブロックするが、ＩＧＦ−２がＩＧＦ−１Ｒに結合するのにはほとんど影響を与えない（図３３および３４）。αＩＲ３に関するこれらの結果は、公開されている結果と一致している（Ｊａｃｏｂｓ  １９８６）。Ｍ１４−Ｇ１１は、競合的な様式で、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の両方をブロックすると考えられる（図３３および３４）。Ｍ１４−Ｇ１１のＩＣ５０は、アッセイで使用するＩＧＦ−１の濃度に依存する。飽和濃度のＭ１４−Ｇ１１は、両リガンドを１００％ブロックするが、Ｍ１４−Ｇ１１の濃度がＩＣ５０より高くなると、アロステリックなブロッカーになる。
【０７８８】
（抗−ＩＧＦ−１Ｒ抗体の交差ブロック性）
ＩＧＦ−１Ｒ  ＥＬＩＳＡ結合アッセイにおいて、抗体が、別の抗体を交差的にブロックする能力について、全ての抗体を試験した（表１９）。Ｍ１３−Ｃ０６およびＭ１４−Ｃ０３は、このアッセイで互いに交差的にブロックしたが、このアッセイでＰ１Ｅ２、αＩＲ３またはＭ１４−Ｇ１１に対しては交差的にブロックしなかった。Ｐ１Ｅ２およびαＩＲ３は、両方とも、このアッセイで、標識したαＩＲ３およびＭ１４−Ｇ１１を競合によって交差的にブロックすることができた。Ｍ１４−Ｇ１１は、αＩＲ３に対して中程度の交差ブロック活性を示し、このことは、Ｍ１４−Ｇ１１のエピトープが重複している可能性があるが、αＩＲ３およびＰ１Ｅ２のエピトープと同じではないことを示唆している。
【０７８９】
（予備的なエピトープマッピング−エピトープの位置を決定）
１９種類の変異体を予備的に構築し、阻害性を有する抗−ＩＧＦ−１Ｒ抗体のエピトープの位置を決定した。Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３およびＭ１４−Ｇ１１が、マウスＩＧＦ−１Ｒに対してほとんど活性を示さないという結果から、本願発明者らは、阻害性を有する抗−ＩＧＦ−１Ｒ抗体のエピトープの位置を決定可能なヒトＩＧＦ−１Ｒの限定的な変異のセットを特定した（例えば、実施例２７を参照）。マウスＩＧＦ−１ＲとヒトＩＧＦ−１Ｒとは、一次配列の同一性が９５％である。細胞外領域において、マウスＩＧＦ−１ＲとヒトＩＧＦ−１Ｒとで異なる残基は３３種類である。これらの残基のうち、ＩＮＳＲ細胞外領域内にある相同性の位置が、最近のＩＮＳＲ結晶構造に基づいて溶媒にさらされる位置であるため、２０残基を変異標的とした（ｐｄｂコードは２ＤＴＧ、ＭｃＫｅｒｎ  ２００６）。接近可能な表面の面積を、プローブ半径１．４Åを用い、ＳｔｒｕｃＴｏｏｌｓ（ｈｔｔｐ：／／ｍｏｌｂｉｏ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｔｒｕｃｔｂｉｏ／ｂａｓｉｃ．ｈｔｍｌ）で算出した。変異箇所が、一次配列でお互いにくっついている４つの変異対を特定した。これらの場合、それぞれの対は、１個の構築物の中で２箇所が変異していた。したがって、２０残基の位置は、１６種類の変異構築物が得られた。ＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２の結合にとって重要であることが示されている、ＦｎＩＩＩ−２ドメインの構造化されていないループ領域に存在する４個の残基を選択して突然変異を生成させた（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  ２００１；  Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ２００４）。これらの位置のうち２つは、一次配列で近い位置にあり、１個の変異構築物内で組み合われ得る。１９種類の予備的な変異体（ＳＤ００１〜ＳＤ０１９）の最終的なリストを表２０に示す。表２０に示した残基の付番は、３０残基のＩＧＦ−１Ｒシグナルペプチドが開裂したものであることを前提としている。１００  ｍＬのＨＥＫ２９３細胞で、１週間一過性トラスフェクトすることによって、それぞれの構築物を、構築し、プロテインＡクロマトグラフィーで精製した。変異ＩＧＦ−１Ｒ構築物の精製物を濃縮し、ウェスタンブロット分析によって、発現／折りたたみについてアッセイした。すべての変異構築物について、発現量は１０〜３０μｇであった。
【０７９０】
それぞれの変異ＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ機能構築物との相互作用について、表面プラズモン分解（Ｂｉａｃｏｒｅ）を用い、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｐ１Ｅ２およびαＩＲ３をアッセイした。このアッセイの変数としての、ＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ融合構築物の濃度の不確かさを除去するために、それぞれの変異構築物を、Ｍ１３−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｃ０３およびＭ１４−Ｇ１１を約１０，０００ＲＵで固定した研究グレードのＣＭ５センサーチップで捕捉した。抗体が、捕捉した変異ＩＧＦ−１Ｒ構築物に結合するのを視覚的に見やすくするために、本願発明者らは、酵素によって誘導したＭ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３およびＭ１４−Ｇ１１の抗原結合フラグメント（Ｆａｂｓ）を使用した。
【０７９１】
上述の予備的な１９種類の変異構築物の中で、ＳＤ０１５（Ｅ４６４Ｈ）のみが、Ｍ１３−Ｃ０６  ＦａｂおよびＭ１４−Ｃ０３  Ｆａｂが、ＩＧＦ−１Ｒに結合する能力に影響を与えた。残基４６４がヒスチジンに変異すると、両方のＦａｂとの結合反応が完全に抑えられる。他の変異ＩＧＦ−１Ｒ構築物は、すべて、匹敵する平衡解離定数であった（Ｍ１３−Ｃ０６  ＦａｂおよびＭ１４−Ｃ０３  Ｆａｂの場合、それぞれ、ＫＤ＝１ｎＭおよび５ｎＭ）。これらの実験では、Ｍ１３−Ｃ０６抗体およびＭ１４−Ｃ０３抗体のエピトープを、ＦｎＩＩＩ−１ドメイン表面に局在化する。上述の２種類の抗体のＶＨ  ＣＤＲ領域は、きわめてよく似ており（３８残基のうち、２６残基が同一である）、ＶＬドメインのＣＤＲ領域は無関係であり、抗原認識能力がＶＨに強く偏っていると示唆する。驚くべきことではないが、上述の２種の抗体は、互いに効率よく交差的にブロックする。Ｓｏｏｓらは、ＩＲ／ＩＧＦ−１Ｒキメラを用いて、２番目のロイシンに富む繰り返しドメイン（Ｌ２）および１番目のＩＩＩ型フィブロネクチンドメイン（ＦｎＩＩＩ−１）内にある１つ以上のエピトープが受容体の阻害可能につながることを示している（Ｓｏｏｓ  １９９２）。この範囲は、残基３３３〜６０９の合計２７６残基に広がっている。最初に、本願発明者らは、この阻害性を有するエピトープが、ＦｎＩＩＩ−１ドメイン内にある１個の残基Ｅ４６４にあることを発見した。
【０７９２】
１９種類の変異体のうち、ＳＤ００８（Ｓ２５７Ｆ）およびＳＤ０１２（Ｅ３０３Ｇ）の変異は、それぞれ、システインに富む繰り返し（ＣＲＲ）ドメインおよびＬ２ドメインにあり、Ｍ１４−Ｇ１１  Ｆａｂが、ヒトＩＧＦ−１Ｒを認識する能力を弱めた（表２０）。両方の場合で、変異によって、ＫＤ測定値に基づく親和性が、ほぼ１／３倍に低下した。他の変異ＩＧＦ−１Ｒ構築物は、ＳＤ０１５も含めてすべて、Ｍ１３−Ｃ０６およびＭ１４−Ｃ０３に対して反応性を示さず、野生型の親和性を有するＭ１４−Ｇ１１  Ｆａｂ（ＫＤ  約４〜６ｎＭ）に結合した。
【０７９３】
αＩＲ３およびＰ１Ｅ２も、予備的な変異ライブラリに対してスクリーニングした。これらの両抗体は、野生型ヒトＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃと比較して、ＳＤ０１２に対する親和性が同様に低下した。しかし、ＳＤ００８への結合力の低下は、Ｐ１Ｅ２のみであった（表２０）。
【０７９４】
（詳細なエピトープマッピング：Ｍ１３−Ｃ０６抗体およびＭ１４−Ｃ０３抗体のエピトープの残基特異的な定義）
Ｍ１３−Ｃ０６およびＭ１４−Ｃ０３のエピトープが、ＩＧＦ−１ＲのＦｎＩＩＩ−１ドメインに局在化しているという予備的なＩＧＦ−１Ｒ変異ライブラリの結果に基づいて、ＩＧＦ−１Ｒの元々の変異部分であり、この部分によって抗体の結合力が失われるＥ４６４Ｈの周囲にある表面を調べるように、第２の変異体群を設計した。三次元でＥ４６４と近いという観点で、全部で２１の変異残基を選択した（残基４６４での元々のヒスチジン変異以外の異なる変異を含む）。インスリン受容体の三次元構造を用い、４６４の周囲にある残基の近さを概算した。一次配列で隣接している変異について、７対の残基を特定した。これらの残基対の変異は、同時に行われ、二箇所に変異がある物質を提供する。したがって、この第２の変異体群は、表２０にＳＤ１０１〜ＳＤ１１４で列挙された１４種類の構築物からなった。
【０７９５】
この１４種類の変異構築物の発現、精製および品質制御は、予備的な第１の変異体群（ＳＤ００１〜ＳＤ０１９）の場合と同様に行った。１４種類の構築物は、ウェスタンブロットによれば、十分に発現し、折りたたみ構造であった（ＳＤ１１４を除く）。ＳＤ１１４は、発現量が非常に少なく、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３またはＭ１４−Ｇ１１を用いたＢｉａｃｏｒｅ実験でも反応しなかった。この変異体は、完全に異なるエピトープを認識している。したがって、変異構築物のデータからは除外した。他の１３種類の構築物は、Ｍ１３−Ｃ０６およびＭ１４−Ｃ０３のエピトープについて、位置を残基特異的に特定することができた。残基特定結果を表２０に列挙している。まとめると、Ｍ１３−Ｃ０６およびＭ１４−Ｃ０３のエピトープは、ほぼ同じであり、ＦｎＩＩＩ−１ドメインに完全に含まれている。最も重要な（おそらく中心となる）残基は、４６１および４６２であった。残基４６１および４６２に変異を含むＳＤ１０３は、Ｍ１３−Ｃ０６  ＦａｂおよびＭ１４−Ｃ０３  Ｆａｂに対し、全く反応せず、Ｍ１３−Ｃ０６表面およびＭ１４−Ｃ０３表面に対し、全く反応しない。Ｍ１４−Ｇ１１表面に対するＳＤ１０３の結合は、任意の他のＦｎＩＩＩ−２変異構築物と異なっておらず、この結合性が完全に失われることは、エピトープ特異性によるものであることを示す。ＩＧＦ−１Ｒに対する抗体の親和性を完全になくすか、または大きく減らす（親和性において、１／１００倍よりも大きい低下）他の変異は、ＩＧＦ−１Ｒの残基４５９、４６０、４６４、４８０、４８２、４８３、５７０および５７１にあることが分かっている。野生型ヒトＩＧＦ−１Ｒに対し、抗体の親和性を少しだけ低下させる（２．５≧ＫＤ≧１０ｎＭ）変異は、残基４６６、４６７、５６４、５６５にあることが分かっている。これらの残基の位置を、相同性ＩＲ構造の表面とマッピングした（図３６、ＭｃＫｅｒｎら、２００６）。Ｍ１３−Ｃ０６およびＭ１４−Ｃ０３に対する変異ＩＧＦ−１Ｒの結合は、たった２点だけが異なっていた。残基５３３での変異は、Ｍ１４−Ｃ０３の結合に大きく影響を与えるが、Ｍ１３−Ｃ０６の結合にも少しだけ影響を与える。残基５６８での変異は、Ｍ１４−Ｃ０３の結合を少し弱めるが、Ｍ１３−Ｃ０６の結合には影響を与えなかった。
【０７９６】
エピトープの位置および表面積の大きさに基づくと、Ｍ１３−Ｃ０６およびＭ１４−Ｃ０３が、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２がＩＧＦ−１Ｒに結合するのをアロステリック効果によって阻害することは驚くにあたらない。このエピトープは、既知のリガンド結合表面とは反対の受容体面にある（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  ２００１、Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ２００４）。公開されている研究結果から、残基４４０〜５８６を認識する抗体は、ＩＧＦ−１の結合に対し、阻害効果とアゴニスト効果の両方を有することが示されている（Ｓｏｏｓ  １９９２、Ｋｅｙｎａｎｆａｒ  ２００７）。ＩＧＦ−１Ｒの内部で、アミノ酸残基４４０〜５８６は、Ｌ２およびＦｎＩＩＩ−１のすべてをあらわし、抗−ＩＧＦ−１Ｒ抗体に接近可能な、オーバーラッピング面ではないと思われる箇所が多く存在する。本願発明者らの研究は、本願発明者らが知る限り、阻害性を有するエピトープを、残基に特異的な分解能で、受容体上の特定の領域に局在化する最初の研究である。インスリン受容体（ＩＲ）の最近の構造は、インスリンがインスリン受容体に結合するのを阻害することが知られている抗−ＩＮＳＲ抗体とともに結晶化させたものであった（ＭｃＫｅｒｎ  ２００６）。ＩＧＦ−１ＲのＨｉｓ４６４と相同性の残基（ＩＲのＫ４７４）は、この抗体がＩＲと結合する表面の一部分である。Ｍ１３−Ｃ０６が、ＩＧＦ−１がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを、アンタゴニストである抗−ＩＮＳＲ抗体が阻害する機構と同様の阻害機構を有する可能性がある。Ｂｉａｃｏｒｅの結果（例えば、実施例２７を参照）に基づき、Ｍ１３−Ｃ０６は、結合速度を下げることによって、ＩＧＦ−１を阻害すると考えられる（おそらくＩＧＦ−２も）。この抗体は、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２が、受容体結合部位に近づくことを困難にする構造で、受容体の細胞外領域を捕捉すると考えられる。
【０７９７】
（詳細なエピトープマッピング−Ｍ１４−Ｇ１１、Ｐ１Ｅ２およびαＩＲ３抗体エピトープの残基特異的な定義）
Ｍ１４−Ｇ１１、Ｐ１Ｅ２およびαＩＲ３のエピトープが、ＩＧＦ−１ＲのＣＲＲドメインおよびＬ２ドメインに局在化しているという予備的なＩＧＦ−１Ｒ変異ライブラリの結果に基づいて、ＩＧＦ−１Ｒの元々の変異部分であり、この部分によって抗体の結合力が失われるＳ２５７ＦおよびＥ３０３Ｇの周囲にある表面を調べるように、第３の変異体群を設計した。三次元でＳ２５７ＦおよびＥ３０３Ｇと近いという観点で、全部で２１の変異残基を選択した（残基２５７での元々のフェニルアラニン変異以外の異なる変異を含む）。インスリン受容体の三次元構造を用い、Ｓ２５７およびＥ３０３の周囲にある残基の近さを概算した。一次配列で隣接している変異について、２対の残基を特定した。これらの残基対の変異は、同時に行われ、二箇所に変異がある物質を提供する。したがって、この第２の変異体群は、表２０にＳＤ２０１〜ＳＤ２１３で列挙された１３種類の構築物からなる。
【０７９８】
この１３種類の変異構築物の発現、精製および品質制御は、予備的な第１の変異体群（ＳＤ００１〜ＳＤ０１９）の場合と同様に行った。これらの構築物は、ウェスタンブロットによれば、すべて十分に発現し、折りたたみ構造であった（ＳＤ２１３を除く）。ＳＤ２１３のデータは、受容体の折りたたみ状態の周囲が不明確なので、除外した。他の１２種類の構築物は、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｐ１Ｅ２およびαＩＲ３のエピトープについて、位置を残基特異的に特定することができる。残基特定結果を表２０に列挙している。Ｍ１４−Ｇ１１、Ｐ１Ｅ２およびαＩＲ３のエピトープは、異なっている。驚くべきことではないが、Ｍ１４−Ｇ１１は、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２を両方とも競合的に阻害する薬剤であることが示されたが、Ｐ１Ｅ２およびαＩＲ３は、ＩＧＦ−１の結合のみをアロステリック効果によって阻害することが示された。Ｍ１４−Ｇ１１のエピトープは、リガンド結合に影響を与えることが知られている残基と直接接している表面の、ＣＲＲ領域の中心部に近い位置にある（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  ２００１、Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ２００４）。Ｍ１４−Ｇ１１の結合力が失われる状況は、位置２４８および２５０で見られた。残基２５４での変異は、受容体に対する抗体の親和性の低下率が中程度であった（野生型ＩＧＦ−１ＲのＫＤに対して１０倍≧ＫＤ≧１００倍）。ＣＲＲの大部分にある多くの他の変異（残基２５７、２５９、２６０、２６３、２６５および３０３を含む）は、受容体に対するＭ１４−Ｇ１１の親和性を少しだけ低下させた（野生型ＩＧＦ−１ＲのＫＤに対して２．５倍≧ＫＤ≧１０倍）。これらの残基の位置を、ＩＧＦ−１Ｒの最初の３つの細胞外領域の構造とマッピングした（図３７）。（Ｇａｒｒｅｔｔら、「Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｔｈｒｅｅ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｙｐｅ−１  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ」Ｎａｔｕｒｅ，（１９９８）７月２３日；３９４（６６９１）：３９５−９）。
【０７９９】
Ｐ１Ｅ２およびαＩＲ３のエピトープは、互いによく似ており、小さな部分が少しだけ異なっている。これらのエピトープは、主に、ＣＲＲドメインのＭ１４−Ｇ１１のエピトープと重なる残基にあるが、ＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２結合ポケットからわずかに離れて回転した位置に、受容体表面が存在している。さらに、ＣＲＲドメインのＣ末端の残基と、Ｌ２ドメインにある残基（Ｍ１４−Ｇ１１の結合に影響を与える部分とは離れている）は、αＩＲ３の親和性のみを少しだけ低下させることが分かった（表２０）。ＩＧＦ−１Ｒに対するＰ１Ｅ２の結合は、残基２５４および２６５の変異によって失われ、低下率は中程度であり（野生型ＩＧＦ−１ＲのＫＤに対して１０倍≧ＫＤ≧１００倍）、残基２４８および３０３の変異によって、少しだけ低下する（野生型ＩＧＦ−１ＲのＫＤに対して２．５倍≧ＫＤ≧１０倍）。ＩＧＦ−１Ｒに対するαＩＲ３の結合は、残基２４８および２６５の変異によって失われ、残基２５４の変異によって、低下率は中程度であり（野生型ＩＧＦ−１ＲのＫＤに対して１０倍≧ＫＤ≧１００倍）、残基２６３、３０１、３０３、３０８、３２７および３７９の変異によって、少しだけ低下する（野生型ＩＧＦ−１ＲのＫＤに対して２．５倍≧ＫＤ≧１０倍）。ＩＧＦ−１Ｒに対するＰ１Ｅ２およびαＩＲ３の結合に影響を与える残基の位置（２個の抗体に対する影響の平均）を、ＩＧＦ−１Ｒの最初の３つの細胞外領域の構造とマッピングした（図３８）（Ｇａｒｒｅｔｔら、「Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｔｈｒｅｅ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｙｐｅ−１  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ」Ｎａｔｕｒｅ，（１９９８）７月２３日；３９４（６６９１）：３９５−９）。αＩＲ３およびＰ１Ｅ２は、同じアロステリック効果を有していると考えられ、文献に最近記載された２個の抗体の結合特性をＩＧＦ−１のみがブロックすると考えられる（Ｋｅｙｈａｎｆａｒ  ２００７）。残基２４１、２４２、２５１および２６６が、これらの抗体が受容体に結合する能力に影響を与えることが示された。本願発明者らのデータは、この文献と一致しており、残基２５７および２６５も重要であることが示唆された。
【０８００】
Ｍ１４−Ｇ１１エピトープ（ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２を競合的にブロックする）とＰ１Ｅ２／αＩＲ３エピトープとの主な違いは、ＩＧＦ−１Ｒ結合部位に隣接した領域であるということである。残基２４８、２５０および２５４を同時に認識する能力は、Ｍ１４−Ｇ１１が、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の結合を両方とも競合的にブロックすることを規定する因子であると思われる。Ｐ１Ｅ２およびαＩＲ３双方は、Ｄ２５０Ｓの変異には全く影響を与えず、Ｍ１４−Ｇ１１がこの受容体に結合する力を完全に失わせる。ＩＧＦ−１Ｒに対するＭ１４−Ｇ１１の結合は、ＩＧＦ−１結合部位に近いＣＲＲドメインの内側にある変異によって弱められ（残基２５９および２６０、図３７および３８）、この抗体が、リガンドが受容体に結合するのをどのようにして立体的にブロックし、競合的にブロックするのかを説明している。これらの位置での変異は、Ｐ１Ｅ２またはαＩＲ３の結合には全く影響を与えなかった。Ｐ１Ｅ２およびαＩＲ３の親和性は、ＩＧＦ−１が結合する溝部分のわずかに外側の表面にある変異によって弱められる（図３７および３８）。したがって、Ｍ１４−Ｇ１１によって特異的に認識され、リガンドの結合を競合的にブロックすると考えられる残基は、Ｄ２５０、Ｅ２５９およびＳ２６０である。
【０８０１】
αＩＲ３およびＭ１４−Ｇ１１がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを弱める残基の変異は、ＣＲＲ領域の中心部からＬ２ドメインにのびている。これらの残基が、平均抗体エピトープ領域を記載する公開済の結果に基づいて、抗体と同時に直接的に結合するということは考えにくい（Ｄａｖｉｅｓ  １９９６）。最近のデータから、繰り返しタンパク質の安定性および折りたたみは、ほとんどの球状ドメインで異なっていることが示されている（Ｋａｊａｎｄｅｒ  ２００５）。繰り返しドメインは、単離されたαらせんのらせん−コイル変換と同様に、共同的ではない折りたたみ／ほどけ反応を受ける構造を伸ばす傾向がある。単純に考えると、球状ドメインは、一般的に、共同して折りたたまれ、１個のもともと折りたたまれていた状態または変性状態のいずれかで存在する。球状ドメインの構造は、変異によって、ドメイン全体がほどけてしまわないかぎり、１個の変異によって部分的に破壊されない。対照的に、折りたたまれた繰り返しドメインは、変異があると、折りたたまれていない元々の状態に徐々に戻る。このように、抗体の結合に影響を与えるＩＧＦ−１ＲのＣＲＲドメインまたはＬ２ドメインの表面に沿った変異は、このドメインの最終的な構造（または順序）を変えることによってこのような現象を引き起こし得る。この機構は、部分的なＣＲＲドメインまたはＬ２ドメインの構造を抗体が安定化すると、ＣＲＲドメインとリガンドとの力学的な結合反応が影響を受けることがあることを説明している。この現象は、リガンドの結合を抗体が立体的にブロックする（Ｍ１４−Ｇ１１）のでない限り、アロステリックな様式で起こると予想される（Ｐ１Ｅ２およびαＩＲ３で観察した場合）。
【０８０２】
（表１９）抗体の交差ブロック実験の結果のまとめ
2010537985.tif 000071
＋＋＋＋＋  ＝  自身に対して抗体結合が競合する（９０〜１００％）
＋＋＋＋  ＝  競合率７０〜９０％
＋＋＋  ＝  競合率５０〜７０％
＋＋  ＝  競合率３０〜５０％
＋  ＝  競合率１０〜３０％
＋／−  ＝  競合率０〜１０％
Ｎ／Ａ  ＝  結果は得られていない
【０８０３】
（表２０）ＩＧＦ−１Ｒ変異体の全リスト、およびこの変異体が抗体の結合に与える影響
2010537985.tif 000072
2010537985.tif 000073
2010537985.tif 000074
ａ効果なし（ＮＥ）：測定したＫＤが、ＷＴ  ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃの２．５倍以内である；弱い（Ｗ）：測定したＫＤが、ＷＴよりも２．５〜１０倍大きい；中程度（Ｍ）：測定したＫＤが、ＷＴよりも１０〜１００倍大きい；強い（Ｓ）：抗体に対する結合が、変異によって失われた；ｎｄ：判定していない。
＊「折りたたみに影響を受けた」は、おそらく、受容体の「折りたたみ」が「影響を受けた」ために、変異受容体の発現が弱められ、タンパク質が、異常な様式で挙動することを暗示している。
【０８０４】
（実施例３３  リガンドを用いた、別個のＩＧＦ−１Ｒエピトープの組み合わせ標的化−抗体をブロックすると、腫瘍細胞の成長阻害率が高まる）
目的：細胞を用いた腫瘍成長アッセイにおいて、重複しないエピトープに結合する、阻害性を有する抗−ＩＧＦ−１Ｒ抗体を組み合わせた場合に、機能に与える影響を観察すること。
【０８０５】
背景：本明細書で記載した生化学試験により、重複しないエピトープに結合する阻害性の抗−ＩＧＦ−１Ｒ抗体を組み合わせると、ＩＧＦ−１リガンドおよびＩＧＦ−２リガンドが受容体に結合するのを相乗効果によって大きくブロックすることが示される。このような組み合わせによって、優れた効率で（すなわち、抗体濃度が低くても）リガンドを完全にブロックし得る。
【０８０６】
材料および方法：細胞成長阻害アッセイ
抗体が、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２による腫瘍細胞の成長をブロックする能力を、細胞生存アッセイを用いて試験した。ＢｘＰＣ３（ヒト膵腺癌）およびＨ３２２Ｍ（ヒト非小細胞肺腫瘍）（ＡＴＣＣ）の腫瘍株をＡＴＣＣから購入した。細胞株を、ＲＰＭＩ−１６４０（ＡＴＣＣ）および１０％ウシ胎児血清（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ  Ａｎａ，ＣＡ，ＵＳＡ））を含む完全成長培地で成長させた。トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．（米国モントリオール州セントルイス））を用い、培養容器に付着した細胞をはがした。リン酸緩衝化塩水（ｐＨ７．２）を、ＭｅｄｉａＴｅｃｈ  Ｉｎｃ．（Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ，ＵＳＡ）から得た。９６ウェルの底が透明なプレートを発光アッセイ用にＷａｌｌａｃ  Ｉｎｃから購入した。細胞が８０％の単一層になるまで成長させ、トリプシン処理し、洗浄し、再び懸濁さえ、ＢｘＰＣ３細胞およびＨ３２２Ｍ細胞の場合、８ｘ１０３細胞／ウェルを、０．５％成長培地２００μｌを入れた９６ウェルプレートに播種した。２４時間後、培地を無血清培地（ＳＦＭ）５０μｌまたは１００μｌと交換し、段階的に希釈した４倍濃度の抗体５０μｌを加えた（図３９〜４１に示す４倍濃度）。３７℃でさらに３０分間インキュベートした後、４倍濃度のＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２  ５０μｌを加えた。すべての処理を３ッ組で行った。細胞をさらに７２時間インキュベートした後、溶解し、ＣＥＬＬ  ＴＩＴＥＲ−ＧＬＯＴＭ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，２８００  Ｗｏｏｄｓ  Ｈｏｌｌｏｗ  Ｒｄ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１１  ＵＳＡ）を用い、存在するＡＴＰの量を決定した。。試薬とＳＦＭとの１：１混合物を２００μｌ／ウェルで加えた。Ｗａｌｌａｃ（マサチューセッツ州ボストン）プレートリーダーで発光を検出し、相対発光単位（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｕｎｉｔｓ）（ＲＬＵ）で定量化した。阻害率は、［１−（Ａｂ−ＳＦＭ  ＲＬＵ）／（ＩＧＦ−ＳＦＭ  ＲＬＵ）］  ×  １００％で算出した。アイソタイプの一致した抗体ＩＤＥＣ−１５１（ヒトＧ４．Ｐ抗体）を、ネガティブコントロールとして使用した（図３９〜４１の「ｃｔｒ」または「ｃｔｒｌ」）。
【０８０７】
結果：代謝活性測定で得た細胞ＡＴＰを相対的に比較することによって、Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ（Ｃ０６）およびＭ１４．Ｇ１１．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ（Ｇ１１）の抗−ＩＧＦ１−Ｒ抗体が、インビトロで細胞の成長を阻害する能力を間接的に測定した。Ｃ０６およびＧ１１は双方とも、無血清条件下、用量に依存する様式で、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２によって刺激されるＢｘＰＣ３膵臓腫瘍細胞株の成長を阻害した（図３９）。重要なことに、等モル量のＣ０６抗体およびＧ１１抗体を組み合わせたものと細胞とが接触すると、どちらかの抗体のみが存在している場合と比較して、１０ｎＭおよび１ｎＭの濃度で、大幅に改善した成長の阻害がみられた（図３９）。Ｃ０６およびＧ１１の組み合わせを、種々の濃度の抗体（１ｕＭ〜０．１５ｎＭ）で試験する実験によって、上述の結果をさらに確認した。図４０は、等モル量のＣ０６抗体およびＧ１１抗体を５００ｎＭ〜５ｎＭの濃度で組み合わせると、いずれかの抗体のみで、対応する抗体濃度を合わせた状態と比較して、大幅に改善した成長の阻害がみられた。
【０８０８】
膵臓癌細胞株（ＢｘＰＣ３）を用いて観察した阻害を、他の腫瘍細胞にも適用できるかどうかを示すために、非小細胞肺癌に由来するＨ３２２Ｍ細胞株で、Ｃ０６およびＧ１１の組み合わせを評価した。図４１は、１０％胎児ウシ血清存在下、標準的な細胞培養条件で成長したＨ３２２Ｍ細胞で観察した効果を示す例である。Ｃ０６／Ｇ１１の抗体組み合わせによって、いずれかの抗体のみの場合と比較して、大幅に改善した細胞成長の阻害がみられた。
【０８０９】
（実施例３４  抗−（ヒト）ＩＧＦ−１Ｒ抗体が、ＩＧＦ−１リガンドおよび／またはＩＧＦ−２リガンドの結合を、アロステリック効果によって阻害することと、競合的に阻害することとをさらに識別する）
背景：ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃを用いた抗体Ｆａｂファージパンニング（実施例１参照）、およびｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃを用いたマウス免疫法（実施例１７参照）によって、種々のリガンド結合阻害性を有する種々の抗体が得られた。本実施例では、阻害性を有する抗−ＩＧＦ−１Ｒ抗体（元々は、実施例３２に記載されるもの）のリガンド結合性をさらに識別し、異なるサブグループに分けた。例えば、抗体Ｐ１Ｅ２、Ｐ１Ａ２およびαＩＲ３が、ＩＧＦ−１がＩＧＦ−１Ｒに結合するのをアロステリック効果によって阻害し、抗体Ｐ３Ｆ９が、ＩＧＦ−２がＩＧＦ−１Ｒに結合するのをアロステリック効果によって阻害し、抗体Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３および２０Ｃ８が、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の両方がＩＧＦ−１Ｒに結合するのをアロステリック効果によって阻害することを決定した。さらに、抗体Ｍ１４−Ｇ１１は、ＧＦ−１およびＩＧＦ−２の両方がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを競合的に阻害する。
【０８１０】
（表２１）以下に示すように現時点では決定されている、ＩＧＦ−１Ｒ抗体のリガンド結合阻害性
2010537985.tif 000075
【０８１１】
方法：実施例３２に記載したように、抗体を構築し、精製した（但し、αＩＲ３およびＰ３Ｆ９を除く）。実施例３２に記載したように、ＩＧＦ−１をブロックすることが知られているコントロールαＩＲ３  ＭＡｂ（Ｊａｃｏｂｓら、１９８６）を商業的に購入した。Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３およびＭ１４−Ｇ１１の作成は、実施例１に記載している。Ｐ１Ｅ２、Ｐ１Ａ２、２０Ｃ８の作成は、実施例１７〜１９に記載している。Ｐ３Ｆ９抗体は、Ｐ１Ａ２抗体、Ｐ１Ｅ２抗体および２０Ｃ８抗体について記載したような、標準的なハイブリドーマ技術を用い、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃで同じマウスを免疫化したものに由来するものであった。
【０８１２】
リガンドのブロック性。実施例３２に記載の、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２をブロックするＥＬＩＳＡを用い、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２に対する抗体の能力を決定した。このアッセイ中のＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の濃度は、それぞれ３２０ｎＭおよび６４０ｎＭであった。
【０８１３】
結果：ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２をブロックするＥＬＩＳＡを用い、上述の８種類の抗体（すなわち、Ｐ１Ｅ２、Ｐ１Ａ２、αＩＲ３、Ｐ３Ｆ９、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３および２０Ｃ８、およびＭ１４−Ｇ１１）をアッセイした。このアッセイ中のＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の濃度は、それぞれ３２０ｎＭおよび６４０ｎＭであり（すなわち、リガンドが生物学的に活性であると予想される生理学的濃度よりも十分に高い濃度であり）、アロステリック効果によるリガンドのブロックと、競合によるリガンドのブロックを区別した。アロステリック効果によるリガンドのブロックは、受容体に対するリガンドの親和性を単純に変えると予想される。高いリガンド濃度（すなわち、ＩＧＦ−１  ３２０ｎＭおよびＩＧＦ−２  ６４０ｎＭ）は、ＩＧＦ−１Ｒの天然の親和性（ＫＤ）の約１０〜２０倍である。この条件下で、アロステリックな阻害剤は、ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２が受容体に結合するのを完全には失わせず、阻害性を有する抗体の濃度が飽和状態に達しても、阻害は不完全であった。競合による抗体は、抗体の濃度が飽和状態において、ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２の結合を完全に阻害しなければならない。さらに、競合による阻害剤を特定する第２の手段は、抗体のＩＣ５０値による方法であり、このアッセイでは、阻害は、ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２の濃度に依存するはずである（抗体は、溶液中に存在する所定量のリガンドと直接競合し、ＩＧＦ−１Ｒに対する結合と競合しなければならないからである）。
【０８１４】
アッセイの結果は、この抗体は、４種類の別個なリガンド結合阻害群にわけルことができることを示す（表２２、図４２）。Ｐ１Ｅ２、Ｐ１Ａ２およびαＩＲ３（Ｊａｃｏｂｓら、１９８６）は、ＩＧＦ−１のみをアロステリック効果によって阻害することが示された。Ｐ３Ｆ９は、ＩＧＦ−２のみをアロステリック効果によって特異的に阻害する唯一の抗体であった。Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３および２０Ｃ８は、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の両方をアロステリック効果によって阻害することが示された。飽和濃度の抗体が存在する状態で、どのアロステリックな阻害剤も、１００％ブロックすることはできなかった（表２２、図４２ＡおよびＢ）。Ｍ１４−Ｇ１１は、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２を競合的に阻害することが示された。Ｍ１４−Ｇ１１は、ＩＣ５０値が、ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２の濃度に影響を受けなかった（図４２Ｄ）Ｍ１３−Ｃ０６のようなアロステリックな阻害剤とは異なり、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２を競合的に阻害する（図４２ＡおよびＢ）だけではなく、ＩＣ５０値は、アッセイのリガンド濃度にきわめて大きく依存した（図４２Ｃ）。
【０８１５】
（表２２）選択した抗−ＩＧＦ−１Ｒ抗体（およびαＩＲ３）の、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２のブロック特性
2010537985.tif 000076
【０８１６】
図４２は、抗−ＩＧＦ−１Ｒ抗体の、ＩＧＦ−１リガンドおよびＩＧＦ−２リガンドをアロステリックに阻害する性質または競合によって阻害する性質の区別を示す。４種類の阻害群（ｉ）アロステリックなＩＧＦ−１のみの阻害剤；（ｉｉ）アロステリックなＩＧＦ−２のみの阻害剤；（ｉｉｉ）アロステリックなＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の阻害剤；および（ｉｖ）競合的なＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の阻害剤をあらわす抗体による、（Ａ）ＩＧＦ−１の結合阻害および（Ｂ）ＩＧＦ−２の結合阻害。（Ｃ）は、代表的なアロステリックなＩＧＦ−１Ｒ阻害剤Ｍ１３−Ｃ０６の活性が、ＩＧＦ−１濃度に依存することを示す。（Ｄ）は、代表的な競合的な阻害剤Ｍ１４−Ｇ１１を示す。
【０８１７】
（実施例３５  抗−（ヒト）ＩＧＦ−１Ｒ抗体のさらなるエピトープマッピング）
背景：上述の実施例は、４６種類の異なる、変異が１箇所または２箇所のヒトＩＧＦ−１Ｒ構築物に対し、抗体Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｇ１１、αＩＲ３およびＰ１Ｅ２の結合特性を分析することによって得られたデータを示す。本実施例は、選択したＣＲＲ／Ｌ２  ＩＧＦ−１Ｒ変異体に対し、抗体Ｐ１Ａ２、Ｐ３Ｆ９および２０Ｃ８の結合特性を分析することによって得られた、さらなるデータを示す。これらのデータは、上述の抗体の、Ｍ１４−Ｇ１１に対する交差ブロック活性を示す。エピトープ残基は、ＣＲＲ／Ｌ２領域にある。
【０８１８】
前の実施例３４において、Ｐ１Ａ２が、Ｐ１Ｅ２およびαＩＲ３の活性と同様に、ＩＧＦ−１の結合のみを阻害する（アロステリックに）ことを示した。さらに、Ｐ３Ｆ９が、ＩＧＦ−２を阻害し（アロステリックに）、この点で、固有であることを示した。同様に、２０Ｃ８が、Ｍ１３−Ｃ０６およびＭ１４−Ｃ０３の活性と同様に、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２を両方とも阻害する（アロステリックに）ことを示した。しかし、２０Ｃ８は、Ｍ１４−Ｇ１１が結合するエピトープと密接に重複するエピトープに特異的に結合することによって、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の結合を阻害し、Ｍ１３−Ｃ０６またはＭ１４−Ｃ０３のエピトープ（ＦｎＩＩＩ−１ドメインに結合する）には結合しない。
【０８１９】
さらなる抗体エピトープおよびリガンド結合阻害データを得るために、５種類のさらなるｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ変異構築物に対し、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｐ１Ｅ２、αＩＲ３、Ｐ１Ａ２、Ｐ３Ｆ９および２０Ｃ８の抗体結合活性をスクリーニングした。特に、これらの５種類のさらなるＩＧＦ−１Ｒ変異構築物によって、これらの抗体が結合するＩＧＦ−１ＲのＣＲＲ／Ｌ２領域のエピトープの評価をさらに向上させた。したがって、これらの５種類のさらなる変異構築物は、ＩＧＦ−１の受容体結合のみを阻害する抗体、ＩＧＦ−２の受容体結合のみを阻害する抗体、またはＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の受容体結合を阻害する抗体を、抗体のリガンド阻害活性によって区別することをさらに支援する。
【０８２０】
方法：ヒトＩＧＦ−１ＲのＣＲＲドメインにある、さらなる５つの変異の構築。ヒトＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ構築物内にある、ＩＧＦ−１Ｒ残基２２９（ＹをＬに）、２４９（ＲをＦに）、２５１（ＦをＬに）、２５５（ＩをＡに）、および２９０（ＹをＬに）を、中性（すなわち、アミノ酸の種類は顕著には変わらない）に基づいて変異させるか、またはＩＮＳＲ内に存在するアミノ酸に変更することによって変異させた。実施例２７に記載したように、さらなる５つの変異体を構築し、発現させ、精製した。
【０８２１】
結果：さらなる５つの変異ＩＧＦ−１Ｒタンパク質を、Ｍ１４−Ｇ１１に対してスクリーニングし、Ｍ１４−Ｇ１１の結合を交差的に阻害する異なる型の抗体（すなわち、ＩＧＦ−１を阻害する抗体、ＩＧＦ−２を阻害する抗体、またはＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２を阻害する抗体）に対してスクリーニングした。さらに、実施例２７に記載したいくつかの変異体に対し、Ｐ１Ａ２抗体、Ｐ３Ｆ９抗体および２０Ｃ８抗体もスクリーニングした（これにより、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｐ１Ｅ２およびαＩＲ３が特異的に結合するエピトープに関するさらなるデータが得られる）。スクリーニングの結果を表２３に示している。図２３において、（抗−ＩＧＦ−１Ｒ抗体による結合をスクリーニングするために）作成したＩＧＦ−１Ｒ変異の位置を、ＩＧＦ−１ＲのＬ１／ＣＲＲ／Ｌ２領域の結晶構造表面に対し、マッピングした（Ｇａｒｒｅｔｔら、１９９８）。図４４では、抗体の結合に影響を与える変異の位置を黒色で示し、抗体の結合に影響を与えない変異の位置を白色で示している。さらに、ＩＧＦ−１Ｒ内の変異によって抗体の結合にどのような影響があるのかに関する、さらなる情報については表２３を参照。（注：図４４では、各変異の位置の特定は、最初の図のみに示している（αＩＲ３を用いて境界を定めている））。
【０８２２】
ＩＧＦ−１のみの阻害剤、ＩＧＦ−２のみの阻害剤、およびＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の阻害剤で、エピトープに明確な違いがある。ＩＧＦ−１のみを阻害する抗体のエピトープは、ＣＲＲ領域とＬ１領域の両方の表面に広がっている（図４３および４４）。残基２５１での変異は、ＩＧＦ−１の結合にとって重要であることが知られており（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒら、２００１）、ＩＧＦ−１のみの阻害剤の結合親和性を少しだけ低下させる。ＩＧＦ−２の結合阻害剤であるＰ３Ｆ９は、リガンド結合ポケットにある変異（残基２５１、２５９および２６０を含む）によって影響を受けなかった。Ｐ３Ｆ９抗体は、ＣＲＲ領域の外側表面にあるＩＧＦ−１Ｒ表面に結合すると考えられる。ＩＧＦ−１のみの阻害剤またはＩＧＦ−２のみの阻害剤とは異なり、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の阻害剤である２０Ｃ８およびＭ１４−Ｇ１１は、リガンド結合ポケットに面しているＣＲＲ領域の内側にある残基２５９および２６０に変異を含有するＩＧＦ−１Ｒ構築物への結合を低下させた。ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の阻害剤は、１種類のリガンドのみの阻害剤と比較して、残基２５１で変異が起こると、結合をきわめて強力に弱めた。残基２５１は、リガンドの結合に直接関連する（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒら、２００１；Ｓｏｒｅｎｓｏｎら、２００４）。これらのデータから、２種類のリガンドの阻害剤である２０Ｃ８およびＭ１４−Ｇ１１は、１種類のリガンドのみの阻害剤よりも、リガンド結合ポケット内部に深く埋め込まれた領域に結合していることを示す。Ｍ１４−Ｇ１１は、２０Ｃ８よりも、リガンド結合ポケットに近い位置またはリガンド結合ポケット内部の位置にある変異によって顕著に影響を受けた。
【０８２３】
（表２３）ＩＧＦ−１Ｒ変異体、およびこれらの変異体が、抗体の結合に与える影響
2010537985.tif 000077
2010537985.tif 000078
ａ効果なし（ＮＥ）：測定したＫＤが、ＷＴ  ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃの２．５倍以内である；弱い（Ｗ）：測定したＫＤが、ＷＴよりも２．５〜１０倍大きい；中程度（Ｍ）：測定したＫＤが、ＷＴよりも１０〜１００倍大きい；強い（Ｓ）：抗体に対する結合が、変異によって失われた；ｎｄ：判定していない。「ＤＮＥ」は、変異体がタンパク質折りたたみに耐えられなくなり、発現しないか、またはほとんど発現しなかったことを意味する。（Ｍ＊）：変異によって、親和性の測定値が１０倍より大きくなった。（Ｗ＊）：変異によって、親和性の測定値が５倍より大きくなった。
【０８２４】
（実施例３６  等温滴定熱量計（ＩＴＣ）は、完全に競合的な状態から、完全にアロステリックな状態までの、種々の抗体の結合阻害性を示す）
背景：本実施例に説明した実験を行い、抗−ＩＧＦ−１Ｒ  ＭＡｂの生物物理学的な結合特性をさらに特徴づけた。特に、等温滴定熱量計（ＩＴＣ）を用い、ＩＧＦ−１Ｒに対する、ＩＧＦ−１および抗−ＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合を試験した。さらに、飽和濃度の阻害性の抗体が、受容体に対するＩＧＦ−１の結合に与える影響も調べた。特に、これらの実験は、抗体阻害剤がアロステリックな性質を有するのか、競合的な性質を有するのかを明らかにするように設計した。これらの試験では、３種類の異なる型の抗体（それぞれ、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の両方の結合を阻害する、Ｍ１３−Ｃ０６、２０Ｃ８およびＭ１４−Ｇ１１）をさらに観察した。
【０８２５】
方法：等温滴定熱量計（ＩＴＣ）−Ｍ１３−Ｃ０６（７５μＭ）抗体、２０Ｃ８（７５μＭ）抗体、およびＭ１４−Ｇ１１（６７μＭ）抗体、ＩＧＦ−１（６０μＭ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  カタログ番号ＧＦ００６）、および可溶性組み換えヒトＩＧＦ−１Ｒ細胞外領域の精製物（ｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３））のタンパク質（５μＭ）を、同じ容器でＰＢＳ（ｐＨ７．２）を用いて透析した。これらのタンパク質溶液の濃度を、ＰＢＳで透析することによって、上に列挙したように調節した。ＩＴＣ２００マイクロ熱量計（ＭｉｃｒｏＣａｌ、ＬＬＣ）でＩＴＣ実験を行った。それぞれの反応で、反応セルを５μＭ  ｈＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）で満たした。ｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）に対する抗体またはリガンドの結合を調べるために、注入用シリンジを抗体またはリガンドで満たし、１．５μＬまたは２．０μＬを注入して、反応セルを滴定した。それぞれの注入間隔は４分間にして、その間に平衡化させた。初期の遅れは６０秒であった。阻害性を有する抗体が、ＩＧＦ−１Ｒ／ＩＧＦ−１の結合に与える影響を調べるために、受容体結合部位が２：１で飽和になるように、抗体を滴定し、２回目のＩＧＦ−１を注入した。ＭｉｃｒｏＣａｌ（Ｏｒｉｇｉｎ）によって供給されたＩＴＣデータ分析ソフトウェアを用い、データの数値積分を行った。注入して結合させている間の平均放出熱／吸収熱の違いと、受容体ＩＧＦ−１Ｒが抗体またはリガンドで飽和したときの平均希釈熱とに基づいて、ΔＨＡ°（Ｔ）値を算出した。ＩＧＦ−１Ｒに対する抗体の結合は、２５℃以下で、ＩＧＦ−１Ｒに対するＩＧＦ−１の結合は５℃で、結合反応は、強すぎて測定できなかった＊−複数の滴定時間が存在しないことによって示されるように、受容体の結合部位が抗体またはリガンドで飽和状態になった。
＊結合が「強すぎて測定できない」とは、ＩＴＣで、親和性定数（ＫＤ）が、測定を行った濃度の１／５００未満であることを意味する。熱の変化を測定する熱量測定で十分なシグナルを作成可能なタンパク質濃度の下限値は、約２〜４μＭであった。したがって、５ｎＭよりも低いＫＤは、「強すぎて」測定きない。
【０８２６】
結果：最初の目的は、ＩＴＣを用いて、ｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）に対するＩＧＦ−１の結合特性を確立し、抗体存在下で、リガンドと受容体との相互作用のベースラインを得ることであった。ｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）に対するＩＧＦ−１の結合親和性は、きわめて温度依存性であることが分かった（表２４、図４５ＡおよびＢ）。５℃で、受容体に対するＩＧＦ−１の結合は、強すぎて親和性を正確に測定できなかたた（ＫＤ  約１０−９Ｍ）。しかし、２５℃で、親和性は弱くなる（ＫＤ＝１９ｎＭ）。３７℃で、親和性はさらに弱くなる（ＫＤ＝１３０ｎＭ）。受容体に対するＩＧＦ−１の結合で観察される大きな結合エンタルピーは、リガンドの結合について、エントロピーペナルティー（すなわち、秩序化する方向である）が存在することを示唆している。親和性が低下する理由として考えられるものは、リガンドのペプチド性が、高温では規則正しくなくなるということである。受容体に対するＩＧＦ−１の結合の化学量論量は、１：１であり、このことから、リガンドが結合して、リガンドが結合する第２のリガンド結合ポケットと思われる部分がふさがれてしまい、受容体で構造変化が起こることが示唆される。これらの結果は、公開されている研究結果と一致している（Ｊａｎｓｓｏｎ，  １９９８）。
【０８２７】
Ｍ１３−Ｃ０６抗体、Ｍ１４−Ｇ１１抗体および２０Ｃ８抗体が、ｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）に結合する能力をＩＴＣで試験した。これら３種類の抗体は、受容体に強く結合し、結合が強すぎて、ＩＴＣでは親和性を正確に測定できなかった（表２４、図４６のＡ〜Ｃ）。興味深いことに、２０Ｃ８およびＭ１４−Ｇ１１は、エピトープが互いに類似しており、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の両方を阻害するのにもかかわらず、結合エネルギーはかなり違っていることが分かる。
【０８２８】
飽和濃度の阻害ＭＡｂ存在下、ＩＧＦ−１が、ｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）に結合する能力を調べるために、二重滴定実験を行った（図４６Ａ〜Ｃ）。このデータは、完全にアロステリックと思われるＭ１３−Ｃ０６から、受容体に対するリガンドの親和性を顕著に変えるが、完全な結合阻害を誘発することはないと思われる２０Ｃ８まで、または競合的な様式で、受容体に対するＩＧＦ−１の結合を完全に阻害すると思われるＭ１４−Ｇ１１まで、広範囲にわたるＩＧＦ−１の結合を阻害する性質を示している（表２５、図４６Ａ〜Ｃ）。
【０８２９】
（表２４）ＩＴＣで決定される、ＩＧＦ−１およびｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）への阻害性抗体結合の、温度依存的性
2010537985.tif 000079
◆３つの実験の平均
Δ２ｔの実験の平均
φ＝強い結合によって、ＫＤを測定するための遷移領域が非常に少なくなった
【０８３０】
（表２５）飽和濃度の阻害性抗体存在下、または非存在下での、ＩＧＦ−１が、２５℃でｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）に結合する際のＩＴＣパラメーター
2010537985.tif 000080
φ  ＝  明らかな結合なし
【０８３１】
（実施例３７  表面プラズモン共鳴を用い、ＩＧＦ−１Ｒに対するＩＧＦ−１の結合を平衡状態にすると、完全に競合的な状態から完全にアロステリックな状態まで、種々の阻害性の抗体の性質を示す）
阻害性ＭＡｂ存在下、および非存在下で、ＩＧＦ−１Ｒに対するＩＧＦ−１の結合を、阻害ＥＬＩＳＡ（実施例３４）、速度論的Ｂｉａｃｏｒｅ結合実験（実施例２７）およびＩＴＣ結合実験（実施例３６）で測定し、リガンドが受容体に結合するのを阻害する異なる分子機構を示した。しかし、上述の実施例で得たデータは、ある種の阻害剤（Ｍ１４−Ｇ１１および２０Ｃ８）は、それぞれ伝統的な競合的な抗体およびアロステリックな抗体をあらわし、Ｍ１３−Ｃ０６のデータは、このアロステリックな阻害剤が、ＩＧＦ−１Ｒに対するＩＧＦ−１の親和性を０〜１／５０まで低下させる。本実施例では、両リガンドの阻害剤であるＭ１４−Ｇ１１、２０Ｃ８およびＭ１３−Ｃ０６が、ＩＧＦ−１Ｒに対するＩＧＦ−１の結合に与える影響を、異なる（直交）技術を用いて行った。特に、本実施例では、平衡溶液相の表面プラズモン共鳴結合実験によって、抗体を分析した。
【０８３２】
方法：表面プラズモン共鳴を用い、ＩＧＦ−１Ｒに対するＩＧＦ−１の結合を平衡状態にする。すべての実験を、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ）を用いて行った。ヒトＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ構築物を、製造業者が提供している標準的なアミン化学プロトコルを用い、標準的なＣＭ５チップ表面に固定した（約１５０００ＲＵ）。このようなｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃの固定濃度が高く、低濃度のＩＧＦ−１が流れる（５０ｎＭ未満）条件では、初期の結合速度Ｖｉ（ＲＵ／ｓ）が、チップ表面を流れるＩＧＦ−１溶液の濃度と線形の相関関係にある、線形の物質移動限定結合曲線を導き出した。可溶性ｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）タンパク質（実施例３６に記載）と、ＩＧＦ−１との結合定数を、ｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）およびＩＧＦ−１の混合物を、表面にｓＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃを含むセンサーチップ表面に流すことによって決定してもよい。それぞれのｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）／ＩＧＦ−１混合物で、ｓＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃセンサーチップ表面で、溶液中の結合していないＩＧＦ−１の濃度を測定する。ＩＧＦ−１とｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）との平衡解離定数ＫＤ、結合量論量、ｎを、以下の式を用い、結合していないＩＧＦ−１の濃度によって決定した。
2010537985.tif 000081
式中、Ｖｉ＝初期結合速度、ｍ＝ＩＧＦ−１濃度に依存する標準曲線の傾き、［ＩＧＦ−１］ｆ＝結合していないＩＧＦ−１の濃度＝Ｖｉ／ｍ、［ＩＧＦ−１］ｔ＝ＩＧＦ−１総濃度、［Ｒ］ｔ＝ｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）細胞外領域受容体の合計濃度（Ｄａｙら、２００５）。  
【０８３３】
ｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）および阻害性ＭＡｂをあらかじめ混合して複合体にしておき、これに対するＩＧＦ−１の結合を、同じ様式で行った。この実験で、ＭＡｂおよびｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）は、等モル濃度であり（２４０ｎＭ）、サイズ排除クロマトグラフィーを用い、過剰量のＭＡｂが、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃセンサーチップ表面に結合しないようにした。さらに、ｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）／ＭＡｂ混合物を、ＩＧＦ−１が存在しない状態でｓＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃセンサーチップに通し、表面に残留ＭＡｂが結合して結果が複雑にならないようにした。
【０８３４】
結果：溶液系表面プラズモン共鳴実験は、ＩＧＦ−１Ｒに対するＩＧＦ−１の親和性を調べる別の方法である。本実施例では、活性の高いＩＧＦ−１Ｒ  Ｂｉａｃｏｒｅチップセンサーを使用し、物質移動限定状態でＩＧＦ−１を捕捉した。Ｂｉａｃｏｒｅ装置で得られるシグナルは、センサーチップ表面を流れる溶液の遊離ＩＧＦ−１濃度と線形に比例する。ｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）を、ＩＧＦ−１を含む溶液に加え、センサーチップ表面のリガンド結合が、（ｉ）活性ｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）の濃度および（ｉｉ）ｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）に対するＩＧＦ−１の親和性に比例して交換される。２４ｎＭ〜２４０ｎＭの異なる濃度のｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）から実験を始め、約６−１０ｎＭの範囲にある結合親和性が、リガンド受容体対に対して観察された（表２６、図４７）。
【０８３５】
次いで、ＩＧＦ−１Ｒ受容体に対するリガンドの見かけ親和性に対しする、阻害性の抗−ＩＧＦ−１Ｒ抗体が与える効果を分析した。この目的のために、２４０ｎＭのｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）を、それぞれの阻害性抗体と比率１：１でプレインキュベートし、親和性測定アッセイを行った（図４７）。Ｍ１３−Ｃ０６は、リガンドと受容体との親和性を約１／２０に低下させていると考えられた（表２６）。２０Ｃ８は、リガンドと受容体との親和性を約１／５０〜１／１００に低下させていると考えられた（表２６、図４７）。Ｍ１４−Ｇ１１でＩＧＦ−１Ｒを飽和すると、ｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）タンパク質に対するＩＧＦ−１の結合が完全に阻害され、ｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）が存在しない状態で得た結果とよく似た線形のＩＧＦ−１結合曲線が得られた（表２６、図４７）。これらの実験は、Ｍ１３−Ｃ０６および２０Ｃ８が、受容体をアロステリック効果によって変化させ、受容体のリガンド結合親和性を低下させることを示す。Ｍ１３−Ｃ０６および２０Ｃ８の、アロステリック効果による阻害と対照的に、これらの結果は、Ｍ１４−Ｇ１１が競合的な阻害剤であることを示している。
【０８３６】
（表２８）阻害性抗−ＩＧＦ−１Ｒ  ＭＡｂが存在する状態、および存在しない状態での、溶液系でのｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）に対するＩＧＦ−１の結合。
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φ  ＝  ｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）に対するＩＧＦ−１の結合が観察されない。
【０８３７】
上の記載に加え、本発明の実施形態は、以下のものも包含することを意図している（「Ｅ」＝実施形態）。
Ｅ１．  
（ａ）Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託番号ＰＴＡ−７４４４で寄託されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株；
（ｂ）ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４４５で寄託され、指定されたＣＨＯ細胞株；
（ｃ）ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７８５５で寄託されたＣＨＯ細胞株；
（ｄ）ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４８５で寄託されたハイブリドーマ細胞株；
（ｅ）ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７７３２で寄託されたハイブリドーマ細胞株；
（ｆ）ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４５７で寄託されたハイブリドーマ細胞株；
（ｇ）ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４５６で寄託されたハイブリドーマ細胞株；
（ｈ）ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７７３０で寄託されたハイブリドーマ細胞株；および
（ｉ）ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７７３１で寄託されたハイブリドーマ細胞株からなる群から選択される細胞で産生された抗体。
Ｅ２．実施形態１の細胞株で産生した抗体。ここで、この細胞株のＡＴＣＣ寄託に関する記述は、以下のものからなる群から選択される。
（ａ）チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）：Ｃ０６−４０Ｂ５；ＣＨＯ  ＤＧ４４Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ  ＥＡ０３．１４．０６；
（ｂ）チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）：Ｃ０３−２  ＣＨＯ  ＤＧ４４Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ  ＤＡ  ０３．１４．０６；
（ｃ）チャイニーズハムスター卵巣細胞株：Ｇ１１  ７０  ８ｅ６細胞  ０８．０９．２００６；
（ｄ）ハイブリドーマ  ８．Ｐ２Ａ７．３Ｄ１１；
（ｅ）ハイブリドーマ細胞株：７．２０Ｃ８．３Ｂ８；
（ｆ）ハイブリドーマ：５．Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１；
（ｇ）ハイブリドーマ：７．２０Ｄ８．２４．Ｂ１１；
（ｈ）ハイブリドーマ細胞株：９．Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２；および
（ｉ）ハイブリドーマ細胞株：５Ｐ１Ｇ１０．２Ｂ８。
Ｅ３．実施形態１または２の細胞株の単離物。
Ｅ４．インスリン様成長因子−１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）のＩＩＩ型フィブロネクチンドメイン１（ＦＮＩＩＩ−１）からなるポリペプチドドメインに特定的に結合する抗体の単離物、または抗原結合性を保持したフラグメント。
Ｅ５．実施形態４の抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント。ここで、この抗体は、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）およびインスリン様成長因子−２（ＩＧＦ−２）がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを阻害する。
Ｅ６．実施形態５の抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント。アロステリック効果によって阻害する。
Ｅ７．ＩＧＦ−１Ｒに特定的に結合する抗体の単離物、または抗原結合性を保持したフラグメント。この抗体の結合親和性は、
（ａ）Ｇｌｕ−４５９；（ｂ）Ｓｅｒ−４６０；（ｃ）Ａｓｐ−４６１；（ｄ）Ｖａｌ−４６２；（ｅ）Ｈｉｓ−４６４；（ｆ）Ｔｈｒ−４６６；（ｇ）Ｓｅｒ−４６７；（ｈ）Ｔｈｒ−４７８；（ｉ）Ｈｉｓ−４８０；（ｊ）Ｔｙｒ−４８２；（ｋ）Ａｒｇ−４８３；（ｌ）Ｇｌｕ−５３３；（ｍ）Ｉｌｅ−５６４；（ｎ）Ａｒｇ−５６５；（ｏ）Ｌｙｓ−５６８；（ｐ）Ｇｌｕ−５７０；および（ｑ）Ｉｌｅ−５７１からなる群から選択される１個以上のＩＧＦ−１Ｒ残基の突然変異によって低下している。
Ｅ８．実施形態７の抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント。この突然変異は、以下からなる群から選択される、置換による変異である。
（ａ）Ｇｌｕ−４５９をＡｌａに；（ｂ）Ｓｅｒ−４６０をＡｌａに；（ｃ）Ａｓｐ−４６１をＡｌａに；（ｄ）Ｖａｌ−４６２をＴｈｒに；（ｅ）Ｈｉｓ−４６４をＡｌａに；（ｆ）Ｈｉｓ−４６４をＧｌｕに；（ｇ）Ｔｈｒ−４６６をＬｅｕに；（ｈ）Ｓｅｒ−４６７をＴｙｒに；（ｉ）Ｔｈｒ−４７８をＡｒｇに；（ｊ）Ｈｉｓ−４８０をＧｌｕに；（ｋ）Ｔｙｒ−４８２をＡｌａに；（ｌ）Ａｒｇ−４８３をＴｒｐに；（ｍ）Ｇｌｕ−５３３をＨｉｓに；（ｎ）Ｉｌｅ−５６４をＴｈｒに；（ｏ）Ａｒｇ−５６５をＡｌａに；（ｐ）Ｌｙｓ−５６８をＡｌａに；（ｑ）Ｇｌｕ−５７０をＡｌａに；および（ｒ）Ｉｌｅ−５７１をＴｈｒに。
Ｅ９．実施形態７または８の抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント。この抗体の結合親和性は、約１／２．５〜約１／１０に低下している。
Ｅ１０．実施形態７または８の抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント。この抗体の結合親和性は、約１／１０〜約１／１００に低下している。
Ｅ１１．実施形態７または８の抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント。この抗体の結合親和性は、約１／１００よりも大きく低下する。
Ｅ１２．実施形態７または８の抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント。この抗体の結合親和性は、失われている。
Ｅ１３．実施形態７〜１２のいずれか１つの抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント。この抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１リガンドおよびＩＧＦ−２リガンドがＩＧＦ−１Ｒに結合するのを阻害する。
Ｅ１４．実施形態１３の抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント。アロステリック効果によって阻害する。
Ｅ１５．ＩＧＦ−１Ｒのシステインに富む領域（ＣＲＲ）からなるポリペプチド領域に特異的に結合する、抗体の単離物、または抗原結合性を保持したフラグメント。
Ｅ１６．実施形態１５の抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント。この抗体は、ＩＧＦ−１リガンドおよびＩＧＦ−２リガンドがＩＧＦ−１Ｒに結合するのを阻害する。
Ｅ１７．実施形態１６の抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント。競合的に阻害する。
Ｅ１８．ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体の単離物、または抗原結合性を保持したフラグメント。この抗体の結合親和性は、（ａ）Ａｓｐ−２４８；（ｂ）Ａｓｐ−２５０；（ｃ）Ａｓｎ−２５４；（ｄ）Ｓｅｒ−２５７；（ｅ）Ｇｌｕ−２５９；（ｆ）Ｓｅｒ−２６０；（ｇ）Ｓｅｒ−２６３；（ｈ）Ｇｌｙ−２６５；および（ｉ）Ｇｌｕ−３０３からなる群から選択される１個以上のＩＧＦ−１Ｒ残基の突然変異によって低下している。
Ｅ１９．実施形態１８の抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント。この突然変異は、以下からなる群から選択される、置換による変異である。（ａ）Ａｓｐ−２４８をＡｌａに；（ｂ）Ａｓｐ−２５０をＳｅｒに；（ｃ）Ａｓｎ−２５４をＡｌａに；（ｄ）Ｓｅｒ−２５７をＰｈｅに；（ｅ）Ｓｅｒ−２５７をＬｙｓに；（ｆ）Ｇｌｕ−２５９をＬｙｓに；（ｇ）Ｓｅｒ−２６０をＡｓｎに；（ｈ）Ｓｅｒ−２６３をＡｒｇに；（ｉ）Ｇｌｙ−２６５をＴｙｒに；および（ｊ）Ｇｌｕ−３０３をＧｌｙに。
Ｅ２０．実施形態１８または１９の抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント。この抗体の結合親和性は、約１／２．５〜約１／１０に低下している。
Ｅ２１．実施形態１８または１９の抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント。この抗体の結合親和性は、約１／１０〜約１／１００に低下している。
Ｅ２２．実施形態１８または１９の抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント。この抗体の結合親和性は、約１／１００よりも大きく低下する。
Ｅ２３．実施形態１８または１９の抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント。この抗体の結合親和性は、失われている。
Ｅ２４．実施形態１８〜２３のいずれか１つの抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント。この抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１リガンドおよびＩＧＦ−２リガンドがＩＧＦ−１Ｒに結合するのを阻害する。
Ｅ２５．実施形態２４の抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント。競合的に阻害する。
Ｅ２６．ＩＧＦ−１Ｒのシステインに富む領域（ＣＲＲ）および第２のロイシンに富む繰り返しドメイン（Ｌ２）からなるポリペプチドドメインに特異的に結合する、抗体の単離物、または抗原結合性を保持したフラグメント。
Ｅ２７．実施形態２６の抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント。この抗体は、ＩＧＦ−１リガンドがＩＧＦ−１Ｒに結合するのを阻害するが、ＩＧＦ−２がＩＧＦ−１Ｒに結合するのは阻害しない。
Ｅ２８．実施形態２７の抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント。アロステリック効果によって阻害する。
Ｅ２９．ＩＧＦ−１Ｒに特定的に結合する抗体の単離物、または抗原結合性を保持したフラグメント。この抗体の結合親和性は、
（ａ）Ａｓｐ−２４８；（ｂ）Ａｓｎ−２５４；（ｃ）Ｓｅｒ−２５７；および（ｄ）Ｇｌｙ−２６５からなる群から選択される１個以上のＩＧＦ−１Ｒ残基の突然変異によって低下している。
Ｅ３０．実施形態２９の抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント。この突然変異は、以下からなる群から選択される、置換による変異である。    （ａ）Ａｓｐ−２４８をＡｌａに；（ｂ）Ａｓｎ−２５４をＡｌａに；（ｃ）Ｓｅｒ−２５７をＬｙｓに；および（ｄ）  Ｇｌｙ−２６５をＴｙｒに。
Ｅ３１．実施形態２９または３０の抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント。この抗体の結合親和性は、約１／１０〜約１／１００に低下している。
Ｅ３２．実施形態２９または３０の抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント。この抗体の結合親和性は、失われている。
Ｅ３３．実施形態２９〜３２のいずれか１つの抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント。この抗体は、ＩＧＦ−１リガンドがＩＧＦ−１Ｒに結合するのを阻害するが、ＩＧＦ−２がＩＧＦ−１Ｒに結合するのは阻害しない。
Ｅ３４．実施形態３３の抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント。アロステリック効果によって阻害する。
Ｅ３５．Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１およびＭ１２−Ｇ０４からなる群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体フラグメント、またはハイブリドーマが産生するＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２およびＰ１Ｇ１０．２Ｂ８からなる群から選択される参照モノクローナル抗体と同じインスリン様成長因子受容体−１（ＩＧＦ−１Ｒ）エピトープに特異的に結合する抗体の単離物、または抗原結合性を保持したフラグメント。
Ｅ３６．Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１およびＭ１２−Ｇ０４からなる群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体フラグメント、またはハイブリドーマが産生するＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２およびＰ１Ｇ１０．２Ｂ８からなる群から選択される参照モノクローナル抗体がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを競合的に阻害する、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体の単離物、または抗原結合性を保持したフラグメント。
Ｅ３７．Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１およびＭ１２−Ｇ０４からなる群から選択されるモノクローナルＦａｂ抗体フラグメントと同一の抗原結合領域を含むか、またはハイブリドーマが産生するＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２およびＰ１Ｇ１０．２Ｂ８からなる群から選択されるモノクローナル抗体と同一の抗原結合領域を含む、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体の単離物、または抗原結合性を保持したフラグメント。
Ｅ３８．抗体または抗体フラグメントの重鎖可変領域（ＶＨ）が、配列番号４、配列番号９、配列番号１４、配列番号２０、配列番号２６、配列番号３２、配列番号３８、配列番号４３、配列番号４８、配列番号５３、配列番号５８および配列番号６３からなる群から選択される参照アミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体の単離物、または抗体フラグメント。
Ｅ３９．抗体または抗体フラグメントの軽鎖可変領域（ＶＬ）が、配列番号６８、配列番号７３、配列番号７８、配列番号８３、配列番号８８、配列番号９３、配列番号９８、配列番号１０３、配列番号１０８、配列番号１１３および配列番号１１８からなる群から選択される参照アミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体の単離物、または抗体フラグメント。
Ｅ４０．抗体または抗体フラグメントのＶＨが、２０箇所以下のアミノ酸同類置換以外は、配列番号４、配列番号９、配列番号１４、配列番号２０、配列番号２６、配列番号３２、配列番号３８、配列番号４３、配列番号４８、配列番号５３、配列番号５８および配列番号６３からなる群から選択される参照アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体の単離物、または抗体フラグメント。
Ｅ４１．抗体または抗体フラグメントのＶＬが、２０箇所以下のアミノ酸同類置換以外は、配列番号６８、配列番号７３、配列番号７８、配列番号８３、配列番号８８、配列番号９３、配列番号９８、配列番号１０３、配列番号１０８、配列番号１１３および配列番号１１８からなる群から選択される参照アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体の単離物、または抗体フラグメント。
Ｅ４２．抗体または抗体フラグメントのＶＨが、配列番号４、配列番号９、配列番号１４、配列番号２０、配列番号２６、配列番号３２、配列番号３８、配列番号４３、配列番号４８、配列番号５３、配列番号５８および配列番号６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体の単離物、または抗体フラグメント。
Ｅ４３．抗体または抗体フラグメントのＶＬが、配列番号６８、配列番号７３、配列番号７８、配列番号８３、配列番号８８、配列番号９３、配列番号９８、配列番号１０３、配列番号１０８、配列番号１１３および配列番号１１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体の単離物、または抗体フラグメント。
Ｅ４４．抗体または抗体フラグメントのＶＨおよびＶＬが、配列番号４および配列番号６８、配列番号８および配列番号７３、配列番号１４および配列番号７８、配列番号２０および配列番号８３、配列番号２６および配列番号８８、配列番号３２および配列番号９３、配列番号３８および配列番号９８、配列番号４３および配列番号１０３、配列番号４８および配列番号１０８、配列番号５３および配列番号１０３、配列番号５８および配列番号１１３、および配列番号６３および配列番号１１８からなる群から選択される参照アミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体の単離物、または抗体フラグメント。
Ｅ４５．抗体または抗体フラグメントのＶＨおよびＶＬが、それぞれ、２０箇所以下のアミノ酸同類置換以外は、配列番号４および配列番号６８、配列番号８および配列番号７３、配列番号１４および配列番号７８、配列番号２０および配列番号８３、配列番号２６および配列番号８８、配列番号３２および配列番号９３、配列番号３８および配列番号９８、配列番号４３および配列番号１０３、配列番号４８および配列番号１０８、配列番号５３および配列番号１０３、配列番号５８および配列番号１１３、および、配列番号６３および配列番号１１８からなる群から選択される参照アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体の単離物、または抗体フラグメント。
Ｅ４６．抗体または抗体フラグメントのＶＨおよびＶＬが、それぞれ、配列番号４および配列番号６８、配列番号８および配列番号７３、配列番号１４および配列番号７８、配列番号２０および配列番号８３、配列番号２６および配列番号８８、配列番号３２および配列番号９３、配列番号３８および配列番号９８、配列番号４３および配列番号１０３、配列番号４８および配列番号１０８、配列番号５３および配列番号１０３、配列番号５８および配列番号１１３、および配列番号６３および配列番号１１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体の単離物、または抗体フラグメント。
Ｅ４７．抗体または抗体フラグメントのＶＨが、２箇所以下のアミノ酸同類置換以外は、配列番号５、配列番号１０、配列番号１５、配列番号２１、配列番号２７、配列番号３３、配列番号３９、配列番号４４、配列番号４９、配列番号５４、配列番号５９および配列番号６４からなる群から選択されるＶＨ−ＣＤＲ１参照アミノ酸配列と同一のＫａｂａｔ重鎖相補性決定領域−１（ＶＨ−ＣＤＲ１）のアミノ酸配列を含む、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体の単離物、または抗体フラグメント。
Ｅ４８．ＶＨ−ＣＤＲ１アミノ酸配列が、配列番号５、配列番号１０、配列番号１５、配列番号２１、配列番号２７、配列番号３３、配列番号３９、配列番号４４、配列番号４９、配列番号５４、配列番号５９および配列番号６４からなる群から選択される、実施形態４７の抗体または抗体フラグメント。
Ｅ４９．抗体または抗体フラグメントのＶＨが、４箇所以下のアミノ酸同類置換以外は、配列番号６、配列番号１１、配列番号１６、配列番号２２、配列番号２８、配列番号３４、配列番号４０、配列番号４５、配列番号５０、配列番号５５、配列番号６０および配列番号６５からなる群から選択されるＶＨ−ＣＤＲ２参照アミノ酸配列と同一のＫａｂａｔ重鎖相補性決定領域−２（ＶＨ−ＣＤＲ２）のアミノ酸配列を含むが、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体の単離物、または抗体フラグメント。
Ｅ５０．ＶＨ−ＣＤＲ２アミノ酸配列が、配列番号６、配列番号１１、配列番号１６、配列番号２２、配列番号２８、配列番号３４、配列番号４０、配列番号４５、配列番号５０、配列番号５５、配列番号６０および配列番号６５からなる群から選択される、実施形態４９の抗体または抗体フラグメント。
Ｅ５１．抗体または抗体フラグメントのＶＨが、４箇所以下のアミノ酸同類置換以外は、配列番号７、配列番号１２、配列番号１７、配列番号２３、配列番号２９、配列番号３５、配列番号４１、配列番号４６、配列番号５１、配列番号５６、配列番号６１および配列番号６６からなる群から選択されるＶＨ−ＣＤＲ３参照アミノ酸配列と同一のＫａｂａｔ重鎖相補性決定領域−３（ＶＨ−ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体の単離物、または抗体フラグメント。
Ｅ５２．ＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列が、配列番号７、配列番号１２、配列番号１７、配列番号２３、配列番号２９、配列番号３５、配列番号４１、配列番号４６、配列番号５１、配列番号５６、配列番号６１および配列番号６６からなる群から選択される、実施形態５１の抗体または抗体フラグメント。
Ｅ５３．抗体または抗体フラグメントのＶＬが、４箇所以下のアミノ酸同類置換以外は、配列番号６９、配列番号７４、配列番号７９、配列番号８４、配列番号８９、配列番号９４、配列番号９９、配列番号１０４、配列番号１０９、配列番号１１４および配列番号１１９からなる群から選択されるＶＬ−ＣＤＲ１参照アミノ酸配列と同一のＫａｂａｔ軽鎖相補性決定領域−１（ＶＬ−ＣＤＲ１）のアミノ酸配列を含む、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体の単離物、または抗体フラグメント。
Ｅ５４．ＶＬ−ＣＤＲ１アミノ酸配列が、配列番号６９、配列番号７４、配列番号７９、配列番号８４、配列番号８９、配列番号９４、配列番号９９、配列番号１０４、配列番号１０９、配列番号１１４および配列番号１１９からなる群から選択される、実施形態５３の抗体または抗体フラグメント。
Ｅ５５．抗体または抗体フラグメントのＶＬが、２箇所以下のアミノ酸同類置換以外は、配列番号７０、配列番号７５、配列番号８０、配列番号８５、配列番号９０、配列番号９５、配列番号１００、配列番号１０５、配列番号１１０、配列番号１１５および配列番号１２０からなる群から選択されるＶＬ−ＣＤＲ２参照アミノ酸配列と同一のＫａｂａｔ軽鎖相補性決定領域−２（ＶＬ−ＣＤＲ２）のアミノ酸配列を含む、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体の単離物、または抗体フラグメント。
Ｅ５６．ＶＬ−ＣＤＲ２アミノ酸配列が、配列番号７０、配列番号７５、配列番号８０、配列番号８５、配列番号９０、配列番号９５、配列番号１００、配列番号１０５、配列番号１１０、配列番号１１５および配列番号１２０からなる群から選択される、実施形態５５の抗体または抗体フラグメント。
Ｅ５７．抗体または抗体フラグメントのＶＬが、４箇所以下のアミノ酸同類置換以外は、配列番号７１、配列番号７６、配列番号８１、配列番号８６、配列番号９１、配列番号９６、配列番号１０１、配列番号１０６、配列番号１１１、配列番号１１６および配列番号１２１からなる群から選択されるＶＬ−ＣＤＲ３参照アミノ酸配列と同一のＫａｂａｔ軽鎖相補性決定領域−３（ＶＬ−ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含むが、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体の単離物、または抗体フラグメント。
Ｅ５８．ＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列が、配列番号７１、配列番号７６、配列番号８１、配列番号８６、配列番号９１、配列番号９６、配列番号１０１、配列番号１０６、配列番号１１１、配列番号１１６および配列番号１２１からなる群から選択される、実施形態５７の抗体または抗体フラグメント。
Ｅ５９．抗体または抗体フラグメントのＶＨが、配列番号５、６および７、配列番号１０、１１および１２、配列番号１５、１６および１７、配列番号２１、２２および２３、配列番号２７、２８および２９、配列番号３３、３４および３５、配列番号３９、４０および４１、配列番号４４、４５および４６、配列番号４９、５０および５１、配列番号５４、５５および５６、配列番号５９、６０および６１、ならびに配列番号６４、６５および６６からなる群から選択される、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２およびＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むが、これらのＶＨ−ＣＤＲのうち少なくとも１つについて、１箇所、２箇所、３箇所または４箇所のアミノ酸が置換されている、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体の単離物、または抗体フラグメント。
Ｅ６０．抗体または抗体フラグメントのＶＨが、配列番号５、６および７、配列番号１０、１１および１２、配列番号１５、１６および１７、配列番号２１、２２および２３、配列番号２７、２８および２９、配列番号３３、３４および３５、配列番号３９、４０および４１、配列番号４４、４５および４６、配列番号４９、５０および５１、配列番号５４、５５および５６、配列番号５９、６０および６１、ならびに配列番号６４、６５および６６からなる群から選択される、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２およびＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体の単離物、または抗体フラグメント。
Ｅ６１．抗体または抗体フラグメントのＶＬが、配列番号６９、７０および７１、配列番号７４、７５および７６、配列番号７９、８０および８１、配列番号８４、８５および８６、配列番号８９、９０および９１、配列番号９４、９５および９６、配列番号９９、１００および１０１、配列番号１０４、１０５および１０６、配列番号１０９、１１０および１１１、配列番号１１４、１１５および１１６、ならびに配列番号１１９、１２０および１２１からなる群から選択される、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２およびＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むが、これらのＶＬ−ＣＤＲのうち少なくとも１つについて、１箇所、２箇所、３箇所または４箇所のアミノ酸が置換されている、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体の単離物、または抗体フラグメント。
Ｅ６２．抗体または抗体フラグメントのＶＬが、配列番号６９、７０および７１、配列番号７４、７５および７６、配列番号７９、８０および８１、配列番号８４、８５および８６、配列番号８９、９０および９１、配列番号９４、９５および９６、配列番号９９、１００および１０１、配列番号１０４、１０５および１０６、配列番号１０９、１１０および１１１、配列番号１１４、１１５および１１６、ならびに配列番号１１９、１２０および１２１からなる群から選択される、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２およびＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体の単離物、または抗体フラグメント。
Ｅ６３．ＶＨフレームワーク領域は、５個以下のアミノ酸置換以外は、ヒトである、実施形態３５〜６２のいずれか１つの抗体または抗体フラグメント。
Ｅ６４．ＶＬフレームワーク領域は、５個以下のアミノ酸置換以外は、ヒトである、実施形態３５〜６３のいずれか１つの抗体または抗体フラグメント。
Ｅ６５．非線形のエピトープに結合する、実施形態３５〜６４のいずれか１つの抗体または抗体フラグメント。
Ｅ６６．アミノ酸残基バリン−４６２を含むＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する抗体の単離物、または抗原結合性を保持したフラグメント。
Ｅ６７．アミノ酸残基ヒスチジン−４６４を含むＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する抗体の単離物、または抗原結合性を保持したフラグメント。
Ｅ６８．アミノ酸残基バリン−４６２およびヒスチジン−４６４を含むＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する抗体の単離物、または抗原結合性を保持したフラグメント。
Ｅ６９．残基バリン−４６２に由来する、溶媒に接近可能な表面半径が、１Å、２Å、３Å、４Å、５Å、６Å、７Å、８Å、９Å、１０Å、１１Å、１２Å、１３Åまたは１４Åである、ＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する抗体の単離物、または抗原結合性を保持したフラグメント。
Ｅ７０．残基ヒスチジン−４６４に由来する、溶媒に接近可能な表面半径が、１Å、２Å、３Å、４Å、５Å、６Å、７Å、８Å、９Å、１０Å、１１Å、１２Å、１３Åまたは１４Åである、ＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する抗体の単離物、または抗原結合性を保持したフラグメント。
Ｅ７１．残基バリン−４６２および残基ヒスチジン−４６４に由来する、溶媒に接近可能な表面半径が、１Å、２Å、３Å、４Å、５Å、６Å、７Å、８Å、９Å、１０Å、１１Å、１２Å、１３Åまたは１４Åである、ＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する抗体の単離物、または抗原結合性を保持したフラグメント。
Ｅ７２．ヒトＩＧＦ−１Ｒの残基バリン−４６２および残基ヒスチジン−４６４に由来する、溶媒に接近可能な表面半径が、１Å、２Å、３Å、４Å、５Å、６Å、７Å、８Å、９Å、１０Å、１１Å、１２Å、１３Åまたは１４Åである、ＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する抗体の単離物、または抗原結合性を保持したフラグメント。
Ｅ７３．線形エピトープに結合する、実施形態３５〜６４のいずれか１つの抗体または抗体フラグメント。
Ｅ７４．多価であり、少なくとも２つの重鎖と、少なくとも２つの軽鎖とを含む、実施形態３５〜７３のいずれか１つの抗体または抗体フラグメント。
Ｅ７５．多重特異性である、実施形態３５〜７４のいずれか１つの抗体または抗体フラグメント。
Ｅ７６．二重特異性である、実施形態７５の抗体または抗体フラグメント。
Ｅ７７．二重特異性である、実施形態３５〜７６のいずれか１つの抗体または抗体フラグメント。
Ｅ７８．重鎖可変領域および軽鎖可変領域が、完全にヒトである、実施形態３５〜７７のいずれか１つの抗体または抗体フラグメント。
Ｅ７９．重鎖可変領域および軽鎖可変領域が、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１およびＭ１２−Ｇ０４からなる群から選択されるモノクローナルＦａｂ抗体フラグメントに由来する、実施形態７８の抗体または抗体フラグメント。
Ｅ８０．重鎖可変領域および軽鎖可変領域がマウスである、実施形態３５〜７７のいずれか１つの抗体または抗体フラグメント。
Ｅ８１．重鎖可変領域および軽鎖可変領域が、ハイブリドーマが産生するＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２およびＰ１Ｇ１０．２Ｂ８からなる群から選択されるモノクローナル抗体に由来する、実施形態８０の抗体または抗体フラグメント。
Ｅ８２．ヒト化抗体またはヒト化抗体フラグメントである、実施形態３５〜７７および８０〜８１のいずれか１つの抗体または抗体フラグメント。
Ｅ８３．キメラ抗体またはキメラ抗体フラグメントである、実施形態３５〜７７および８０〜８１のいずれか１つの抗体または抗体フラグメント。
Ｅ８４．霊長類化抗体または霊長類化抗体フラグメントである、実施形態３５〜７７および８０〜８１のいずれか１つの抗体または抗体フラグメント。
Ｅ８５．完全にヒトである、実施形態３５〜７９のいずれか１つの抗体または抗体フラグメント。
Ｅ８６．Ｆａｂフラグメントである、実施形態３５〜８５のいずれか１つの抗体または抗体フラグメント。
Ｅ８７．Ｆａｂ’フラグメントである、実施形態３５〜８５のいずれか１つの抗体または抗体フラグメント。
Ｅ８８．Ｆ（ａｂ）２フラグメントである、実施形態３５〜８５のいずれか１つの抗体または抗体フラグメント。
Ｅ８９．Ｆｖフラグメントである、実施形態３５〜８５のいずれか１つの抗体または抗体フラグメント。
Ｅ９０．単鎖抗体である、実施形態３５〜８５のいずれか１つの抗体または抗体フラグメント。
Ｅ９１．ヒトκ定常領域およびヒトλ定常領域からなる群から選択される軽鎖定常領域を含む、実施形態３５〜８５および９０のいずれか１つの抗体または抗体フラグメント。
Ｅ９２．重鎖定常領域またはそのフラグメントを含む、実施形態３５〜８８および９０のいずれか１つの抗体または抗体フラグメント。
Ｅ９３．重鎖定常領域またはそのフラグメントが、ヒトＩｇＧ４である、実施形態９２の抗体または抗体フラグメント。
Ｅ９４．ＩｇＧ４が、突然変異によって糖鎖付加部位が除去されたものである、実施形態９３の抗体または抗体フラグメント。
Ｅ９５．上述の突然変異体が、Ｓ２４１ＰおよびＴ３１８Ａを含む（Ｋａｂａｔ付番システムによる）、実施形態９４の抗体または抗体フラグメント。
Ｅ９６．ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントに特異的に結合するか、またはＩＧＦ−１Ｒポリペプチド改変体に特異的に結合し、親和性を特徴づける解離定数（ＫＤ）が、上述の参照モノクローナル抗体のＫＤよりも小さい、実施形態３５〜９５のいずれか１つの抗体または抗体フラグメント。
Ｅ９７．ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントに特異的に結合するか、またはＩＧＦ−１Ｒポリペプチド改変体に特異的に結合し、親和性を特徴づける解離定数（ＫＤ）が、約５×１０−２Ｍ以下、約１０−２Ｍ以下、約５×１０−３Ｍ以下、約１０−３Ｍ以下、約５×１０−４Ｍ以下、約１０−４Ｍ以下、約５×１０−５Ｍ以下、約１０−５Ｍ以下、約５×１０−６Ｍ以下、約１０−６Ｍ以下、約５×１０−７Ｍ以下、約１０−７Ｍ以下、約５×１０−８Ｍ以下、約１０−８Ｍ以下、約５×１０−９Ｍ以下、約１０−９Ｍ以下、約５×１０−１０Ｍ以下、約１０−１０Ｍ以下、約５×１０−１１Ｍｖ、約１０−１１Ｍ以下、約５×１０−１２Ｍ以下、約１０−１２Ｍ以下、約５×１０−１３Ｍ以下、約１０−１３Ｍ以下、約５×１０−１４Ｍ以下、約１０−１４Ｍ以下、約５×１０−１５Ｍ以下または約１０−１５Ｍ以下である、実施形態３５〜９６のいずれか１つの抗体または抗体フラグメント。
Ｅ９８．上述の親和性が、約１×１０−１０〜約５×１０−９Ｍの解離定数（ＫＤ）で特徴づけられる、実施形態３５〜９７のいずれか１つの抗体または抗体フラグメント。
Ｅ９９．上述の親和性が、
（ａ）約１．１×１０−１０Ｍ；（ｂ）約１．３×１０−１０Ｍ；（ｃ）約３．６×１０−１０Ｍ；（ｄ）約１．３×１０−９Ｍ；（ｅ）約４．０×１０−９Ｍ；および（ｆ）約４．９×１０−９Ｍからなる群から選択される解離定数（ＫＤ）で特徴づけられる、実施形態３５〜９８のいずれか１つの抗体または抗体フラグメント。
Ｅ１００．上述の親和性が、
（ａ）１．１×１０−１０Ｍ；（ｂ）１．３×１０−１０Ｍ；（ｃ）３．６×１０−１０Ｍ；（ｄ）１．３×１０−９Ｍ；（ｅ）４．０×１０−９Ｍ；および（ｆ）４．９×１０−９Ｍからなる群から選択される解離定数（ＫＤ）で特徴づけられる、実施形態３５〜９９のいずれか１つの抗体または抗体フラグメント。
Ｅ１０１．マウスＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメント、または非ヒト霊長類ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントよりも、ヒトＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントに選択的に結合する、実施形態３５〜１００のいずれか１つの抗体または抗体フラグメント。
Ｅ１０２．ヒトＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントに結合し、非ヒト霊長類ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントにも結合する、実施形態３５〜１００のいずれか１つの抗体または抗体フラグメント。
Ｅ１０３．細胞表面で発現したＩＧＦ−１Ｒに結合する、実施形態３５〜１０２のいずれか１つの抗体または抗体フラグメント。
Ｅ１０４．上述の細胞が、悪性細胞、新生物性細胞、腫瘍細胞または転移細胞である、実施形態１０３の抗体または抗体フラグメント。
Ｅ１０５．インスリン様成長因子がＩＧＦ−１Ｒに結合するのをブロックする、実施形態３５〜１０４のいずれか１つの抗体または抗体フラグメント。
Ｅ１０６．インスリン様成長因子が、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）である、実施形態１０５の抗体または抗体フラグメント。
Ｅ１０７．インスリン様成長因子が、インスリン様成長因子−２（ＩＧＦ−２）である、実施形態１０５の抗体または抗体フラグメント。
Ｅ１０８．ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の双方がＩＧＦ−１Ｒに結合するのをブロックする、実施形態１０５の抗体または抗体フラグメント。
Ｅ１０９．ＩＧＦ−１Ｒが介在する細胞増殖を阻害する、実施形態３５〜１０８のいずれか１つの抗体または抗体フラグメント。
Ｅ１１０．ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２が介在するＩＧＦ−１Ｒリン酸化を阻害する、実施形態３５〜１０９のいずれか１つの抗体または抗体フラグメント。
Ｅ１１１．腫瘍細胞の成長を阻害する、実施形態３５〜１１０のいずれか１つの抗体または抗体フラグメント。
Ｅ１１２．ＩＧＦ−１Ｒの内在化を阻害する、実施形態３５〜１１１のいずれか１つの抗体または抗体フラグメント。
Ｅ１１３．異種ポリペプチドがさらに融合している、実施形態３５〜１１２のいずれか１つの抗体または抗体フラグメント。
Ｅ１１４．上述の抗体が、細胞毒性薬、治療薬、細胞増殖抑制剤、生物毒素、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生体応答修飾物質、医薬品、リンホカイン、異種抗体またはそのフラグメント、検出可能な標識、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびこれらの薬剤の２種以上の組み合わせからなる群から選択される薬剤に接合している、実施形態３５〜１１３のいずれか１つの抗体または抗体フラグメント。
Ｅ１１５．細胞毒性薬が、放射性核種、生物毒素、酵素によって活性化する毒素、細胞増殖抑制性または細胞毒性性の治療薬、プロドラッグ、免疫学的に活性なリガンド、生体応答修飾物質、または上述の細胞毒性薬の２種以上の組み合わせからなる群から選択される、実施形態１１４の抗体または抗体フラグメント。
Ｅ１１６．検出可能な標識が、酵素、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、放射性標識、または上述の検出可能な標識の２種以上の組み合わせからなる群から選択される、実施形態１１４の抗体または抗体フラグメント。
Ｅ１１７．実施形態３５〜１１６のいずれか１つの抗体または抗体フラグメントと、担体とを含む組成物。
Ｅ１１８．抗体のＶＨポリペプチドをコードする核酸を含む、ポリヌクレオチドの単離物。このＶＨポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号４、配列番号９、配列番号１４、配列番号２０、配列番号２６、配列番号３２、配列番号３８、配列番号４３、配列番号４８、配列番号５３、配列番号５８および配列番号６３からなる群から選択される参照アミノ酸配列との同一性が少なくとも９０％であり、このＶＨポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する。
Ｅ１１９．ＶＨポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号４、配列番号９、配列番号１４、配列番号２０、配列番号２６、配列番号３２、配列番号３８、配列番号４３、配列番号４８、配列番号５３、配列番号５８および配列番号６３からなる群から選択される、実施形態１１８のポリヌクレオチド。
Ｅ１２０．ＶＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、このＶＨポリペプチドのアミノ酸配列を変えることなく、発現量が増えるように最適化されている、実施形態１１８または１１９のポリヌクレオチド。
Ｅ１２１．上述の最適化が、スプライス供与部位およびスプライス受容部位の特定および除去を含む、実施形態１２０のポリヌクレオチド。
Ｅ１２２．上述の最適化が、上述のポリヌクレオチドを発現する細胞のコドン使用率の最適化を含む、実施形態１２０または１２１のポリヌクレオチド。
Ｅ１２３．上述の核酸が、配列番号３、配列番号８、配列番号１３、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２４、配列番号２５、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３６、配列番号３７、配列番号４２、配列番号４７、配列番号５２、配列番号５７および配列番号６２からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、実施形態１１８〜１２２のいずれか１つのポリヌクレオチド。
Ｅ１２４．抗体のＶＬポリペプチドをコードする核酸を含む、ポリヌクレオチドの単離物。このＶＬポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号６８、配列番号７３、配列番号７８、配列番号８３、配列番号８８、配列番号９３、配列番号９８、配列番号１０３、配列番号１０８、配列番号１１３および配列番号１１８からなる群から選択される参照アミノ酸配列との同一性が少なくとも９０％であり、このＶＬポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する。
Ｅ１２５．ＶＬポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号６８、配列番号７３、配列番号７８、配列番号８３、配列番号８８、配列番号９３、配列番号９８、配列番号１０３、配列番号１０８、配列番号１１３および配列番号１１８からなる群から選択される、実施形態１２４のポリヌクレオチド。
Ｅ１２６．ＶＬポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、このＶＬポリペプチドのアミノ酸配列を変えることなく、発現量が増えるように最適化されている、実施形態１２４または１２５のポリヌクレオチド。
Ｅ１２７．上述の最適化が、スプライス供与部位およびスプライス受容部位の特定および除去を含む、実施形態１２６のポリヌクレオチド。
Ｅ１２８．上述の最適化が、上述のポリヌクレオチドを発現する細胞のコドン使用率の最適化を含む、実施形態１２６または１２７のポリヌクレオチド。
Ｅ１２９．上述の核酸が、配列番号６７、配列番号７２、配列番号７７、配列番号８２、配列番号８７、配列番号９２、配列番号９７、配列番号１０２、配列番号１０７、配列番号１１２および配列番号１１７からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、実施形態１２４〜１２８のいずれか１つのポリヌクレオチド。
Ｅ１３０．抗体のＶＨポリペプチドをコードする核酸を含む、ポリヌクレオチドの単離物。このＶＨポリペプチドのアミノ酸配列は、２０箇所以下のアミノ酸同類置換以外は、配列番号４、配列番号９、配列番号１４、配列番号２０、配列番号２６、配列番号３２、配列番号３８、配列番号４３、配列番号４８、配列番号５３、配列番号５８および配列番号６３からなる群から選択される参照アミノ酸配列と同一であり、このＶＨポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する。
Ｅ１３１．抗体のＶＬポリペプチドをコードする核酸を含む、ポリヌクレオチドの単離物。このＶＬポリペプチドのアミノ酸配列は、２０箇所以下のアミノ酸同類置換以外は、配列番号６８、配列番号７３、配列番号７８、配列番号８３、配列番号８８、配列番号９３、配列番号９８、配列番号１０３、配列番号１０８、配列番号１１３および配列番号１１８からなる群から選択される参照アミノ酸配列と同一であり、このＶＬポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する。
Ｅ１３２．２箇所以下のアミノ酸同類置換以外は、配列番号５、配列番号１０、配列番号１５、配列番号２１、配列番号２７、配列番号３３、配列番号３９、配列番号４４、配列番号４９、配列番号５４、配列番号５９および配列番号６４からなる群から選択されるＶＨ−ＣＤＲ１参照アミノ酸配列と同一である、ＶＨ−ＣＤＲ１アミノ酸配列をコードする核酸を含む、ポリヌクレオチドの単離物。このＶＨ−ＣＤＲ１を含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する。
Ｅ１３３．上述のＶＨ−ＣＤＲ１アミノ酸配列が、配列番号５、配列番号１０、配列番号１５、配列番号２１、配列番号２７、配列番号３３、配列番号３９、配列番号４４、配列番号４９、配列番号５４、配列番号５９および配列番号６４からなる群から選択される、実施形態１３２のポリヌクレオチドまたはそのフラグメント。
Ｅ１３４．４箇所以下のアミノ酸同類置換以外は、配列番号６、配列番号１１、配列番号１６、配列番号２２、配列番号２８、配列番号３４、配列番号４０、配列番号４５、配列番号５０、配列番号５５、配列番号６０および配列番号６５からなる群から選択されるＶＨ−ＣＤＲ２参照アミノ酸配列と同一である、ＶＨ−ＣＤＲ２アミノ酸配列をコードする核酸を含む、ポリヌクレオチドの単離物。このＶＨ−ＣＤＲ２を含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する
Ｅ１３５．上述のＶＨ−ＣＤＲ２アミノ酸配列が、配列番号６、配列番号１１、配列番号１６、配列番号２２、配列番号２８、配列番号３４、配列番号４０、配列番号４５、配列番号５０、配列番号５５、配列番号６０および配列番号６５からなる群から選択される、実施形態１３４のポリヌクレオチドまたはそのフラグメント。
Ｅ１３６．４箇所以下のアミノ酸同類置換以外は、配列番号７、配列番号１２、配列番号１７、配列番号２３、配列番号２９、配列番号３５、配列番号４１、配列番号４６、配列番号５１、配列番号５６、配列番号６１および配列番号６６からなる群から選択されるＶＨ−ＣＤＲ３参照アミノ酸配列と同一である、ＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列をコードする核酸を含む、ポリヌクレオチドの単離物。このＶＨ−ＣＤＲ３を含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する
Ｅ１３７．上述のＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列が、配列番号７、配列番号１２、配列番号１７、配列番号２３、配列番号２９、配列番号３５、配列番号４１、配列番号４６、配列番号５１、配列番号５６、配列番号６１および配列番号６６からなる群から選択される、実施形態１３６のポリヌクレオチドまたはそのフラグメント。
Ｅ１３８．４箇所以下のアミノ酸同類置換以外は、配列番号６９、配列番号７４、配列番号７９、配列番号８４、配列番号８９、配列番号９４、配列番号９９、配列番号１０４、配列番号１０９、配列番号１１４および配列番号１１９からなる群から選択されるＶＬ−ＣＤＲ１参照アミノ酸配列と同一である、ＶＬ−ＣＤＲ１アミノ酸配列をコードする核酸を含む、ポリヌクレオチドの単離物。このＶＬ−ＣＤＲ１を含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する
Ｅ１３９．上述のＶＬ−ＣＤＲ１アミノ酸配列が、配列番号６９、配列番号７４、配列番号７９、配列番号８４、配列番号８９、配列番号９４、配列番号９９、配列番号１０４、配列番号１０９、配列番号１１４および配列番号１１９からなる群から選択される、実施形態１３８のポリヌクレオチドまたはそのフラグメント。
Ｅ１４０．２箇所以下のアミノ酸同類置換以外は、配列番号７０、配列番号７５、配列番号８０、配列番号８５、配列番号９０、配列番号９５、配列番号１００、配列番号１０５、配列番号１１０、配列番号１１５および配列番号１２０からなる群から選択されるＶＬ−ＣＤＲ２アミノ酸配列と同一である、ＶＬ−ＣＤＲ２アミノ酸配列をコードする核酸を含む、ポリヌクレオチドの単離物。このＶＬ−ＣＤＲ２を含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する。
Ｅ１４１．上述のＶＬ−ＣＤＲ２アミノ酸配列が、配列番号７０、配列番号７５、配列番号８０、配列番号８５、配列番号９０、配列番号９５、配列番号１００、配列番号１０５、配列番号１１０、配列番号１１５および配列番号１２０からなる群から選択される、実施形態１４０のポリヌクレオチドまたはそのフラグメント。
Ｅ１４２．４箇所以下のアミノ酸同類置換以外は、配列番号７１、配列番号７６、配列番号８１、配列番号８６、配列番号９１、配列番号９６、配列番号１０１、配列番号１０６、配列番号１１１、配列番号１１６および配列番号１２１からなる群から選択されるＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と同一である、ＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列をコードする核酸を含む、ポリヌクレオチドの単離物。このＶＬ−ＣＤＲ３を含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する。
Ｅ１４３．上述のＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列が、配列番号７１、配列番号７６、配列番号８１、配列番号８６、配列番号９１、配列番号９６、配列番号１０１、配列番号１０６、配列番号１１１、配列番号１１６および配列番号１２１からなる群から選択される、実施形態１４２のポリヌクレオチドまたはそのフラグメント。
Ｅ１４４．配列番号５、６および７、配列番号１０、１１および１２、配列番号１５、１６および１７、配列番号２１、２２および２３、配列番号２７、２８および２９、配列番号３３、３４および３５、配列番号３９、４０および４１、配列番号４４、４５および４６、配列番号４９、５０および５１、配列番号５４、５５および５６、配列番号５９、６０および６１、ならびに配列番号６４、６５および６６からなる群から選択される、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２およびＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む抗体のＶＨポリペプチドをコードする核酸を含む、ポリヌクレオチドの単離物。このＶＨ−ＣＤＲ３を含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する。
Ｅ１４５．配列番号６９、７０および７１、配列番号７４、７５および７６、配列番号７９、８０および８１、配列番号８４、８５および８６、配列番号８９、９０および９１、配列番号９４、９５および９６、配列番号９９、１００および１０１、配列番号１０４、１０５および１０６、配列番号１０９、１１０および１１１、配列番号１１４、１１５および１１６、ならびに配列番号１１９、１２０および１２１からなる群から選択される、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２およびＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む抗体のＶＬポリペプチドをコードする核酸を含む、ポリヌクレオチドの単離物。このＶＬ−ＣＤＲ３を含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する。
Ｅ１４６．抗体のＶＨポリペプチドに融合したシグナルペプチドをコードする核酸をさらに含む、実施形態１１８〜１１１のいずれか１つのポリヌクレオチド。
Ｅ１４７．抗体のＶＬポリペプチドに融合したシグナルペプチドをコードする核酸をさらに含む、実施形態１１８〜１４６のいずれか１つのポリヌクレオチド。
Ｅ１４８．ＶＨポリペプチドに融合した重鎖定常領域ＣＨ１領域をコードする核酸をさらに含む、実施形態１１８〜１４７のいずれか１つのポリヌクレオチド。
Ｅ１４９．ＶＨポリペプチドに融合した重鎖定常領域ＣＨ２領域をコードする核酸をさらに含む、実施形態１１８〜１４８のいずれか１つのポリヌクレオチド。
Ｅ１５０．ＶＨポリペプチドに融合した重鎖定常領域ＣＨ３領域をコードする核酸をさらに含む、実施形態１１８〜１４９のいずれか１つのポリヌクレオチド。
Ｅ１５１．ＶＨポリペプチドに融合した重鎖ヒンジ領域をコードする核酸をさらに含む、実施形態１１８〜１５０のいずれか１つのポリヌクレオチド。
Ｅ１５２．重鎖定常領域が、ヒトＩｇＧ４である、実施形態１４８〜１５１のいずれか１つのポリヌクレオチド。
Ｅ１５３．ＩｇＧ４が、突然変異によって糖鎖付加部位が除去されたものである、実施形態１５２のポリヌクレオチド。
Ｅ１５４．ＩｇＧ４の突然変異体が、Ｓ２４１ＰおよびＴ３１８Ａを含む（Ｋａｂａｔ付番システムによる）、実施形態１５３のポリヌクレオチド。
Ｅ１５５．上述の抗体のＶＬポリペプチドに融合した軽鎖定常領域をコードする核酸をさらに含む、実施形態１１８〜１５４のいずれか１つのポリヌクレオチド。
Ｅ１５６．軽鎖定常領域が、ヒトκ領域である、実施形態１５５のポリヌクレオチド。
Ｅ１５７．上述の核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントが、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１およびＭ１２−Ｇ０４からなる群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体フラグメント、またはハイブリドーマが産生するＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２およびＰ１Ｇ１０．２Ｂ８からなる群から選択される参照モノクローナル抗体と同じＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する、実施形態１１８〜１５６のいずれか１つのポリヌクレオチド。
Ｅ１５８．上述の核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントが、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１およびＭ１２−Ｇ０４からなる群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体フラグメント、またはハイブリドーマが産生するＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２およびＰ１Ｇ１０．２Ｂ８からなる群から選択される参照モノクローナル抗体を競合的に阻害する、実施形態１１８〜１５７のいずれか１つのポリヌクレオチド。
Ｅ１５９．ＶＨポリペプチドのフレームワーク領域が、５個以下のアミノ酸置換以外は、ヒトである、実施形態１１８〜１５８のいずれか１つのポリヌクレオチド。
Ｅ１６０．ＶＬポリペプチドのフレームワーク領域が、５個以下のアミノ酸置換以外は、ヒトである、実施形態１１８〜１５９のいずれか１つのポリヌクレオチド。
Ｅ１６１．上述の核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントが、線形のエピトープに結合する、実施形態１１８〜１６０のいずれか１つのポリヌクレオチド。
Ｅ１６２．上述の核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントが、非線形のエピトープに結合する、実施形態１１８〜１６０のいずれか１つのポリヌクレオチド。
Ｅ１６３．上述の核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントは、多価であり、少なくとも２つの重鎖と、少なくとも２つの軽鎖とを含む、実施形態１１８〜１６２のいずれか１つのポリヌクレオチド。
Ｅ１６４．上述の核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントが、多重特異性である、実施形態１１８〜１６３のいずれか１つのポリヌクレオチド。
Ｅ１６５．上述の核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントが、二重特異性である、実施形態１１８〜１６４のいずれか１つのポリヌクレオチド。
Ｅ１６６．上述の核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントが、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、この領域が、完全にヒトである、実施形態１１８〜１６５のいずれか１つのポリヌクレオチド。
Ｅ１６７．重鎖可変領域および軽鎖可変領域が、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１およびＭ１２−Ｇ０４からなる群から選択されるモノクローナルＦａｂ抗体フラグメントの該当領域と同一である、実施形態１６６のポリヌクレオチド。
Ｅ１６８．上述の核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントが、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、この領域が、マウスである、実施形態１１８〜１６５のいずれか１つのポリヌクレオチド。
Ｅ１６９．重鎖可変領域および軽鎖可変領域が、ハイブリドーマが産生するＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２およびＰ１Ｇ１０．２Ｂ８からなる群から選択されるモノクローナル抗体の該当領域と同一である、実施形態１６８のポリヌクレオチド。
Ｅ１７０．上述の核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントが、ヒト化抗体またはヒト化フラグメントである、実施形態１１８〜１６５および１６８〜１６９のいずれか１つのポリヌクレオチド。
Ｅ１７１．上述の核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントが、キメラ抗体またはキメラフラグメントである、実施形態１１８〜１６５および１６８〜１６９のいずれか１つのポリヌクレオチド。
Ｅ１７２．上述の核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントが、霊長類化抗体または霊長類化フラグメントである、実施形態１１８〜１６５および１６８〜１６９のいずれか１つのポリヌクレオチド。
Ｅ１７３．上述の核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントが、完全にヒトである、実施形態１１８〜１６７のいずれか１つのポリヌクレオチド。
Ｅ１７４．上述の核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントが、Ｆａｂフラグメントである、実施形態１１８〜１７３のいずれか１つのポリヌクレオチド。
Ｅ１７５．上述の核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントが、Ｆａｂ’フラグメントである、実施形態１１８〜１７３のいずれか１つのポリヌクレオチド。
Ｅ１７６．上述の核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントが、Ｆ（ａｂ）２フラグメントである、実施形態１１８〜１７３のいずれか１つのポリヌクレオチド。
Ｅ１７７．上述の核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントが、Ｆｖフラグメントである、実施形態１１８〜１７３のいずれか１つのポリヌクレオチド。
Ｅ１７８．上述の核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントが、単鎖抗体である、実施形態１１８〜１７３のいずれか１つのポリヌクレオチド。
Ｅ１７９．上述の核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントが、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントに特異的に結合するか、またはＩＧＦ−１Ｒポリペプチド改変体に特異的に結合し、親和性を特徴づける解離定数（ＫＤ）が、約５×１０−２Ｍ以下、約１０−２Ｍ以下、約５×１０−３Ｍ以下、約１０−３Ｍ以下、約５×１０−４Ｍ以下、約１０−４Ｍ以下、約５×１０−５Ｍ以下、約１０−５Ｍ以下、約５×１０−６Ｍ以下、約１０−６Ｍ以下、約５×１０−７Ｍ以下、約１０−７Ｍ以下、約５×１０−８Ｍ以下、約１０−８Ｍ以下、約５×１０−９Ｍ以下、約１０−９Ｍ以下、約５×１０−１０Ｍ以下、約１０−１０Ｍ以下、約５×１０−１１Ｍ以下、約１０−１１Ｍ以下、約５×１０−１２Ｍ以下、約１０−１２Ｍ以下、約５×１０−１３Ｍ以下、約１０−１３Ｍ以下、約５×１０−１４Ｍ以下、約１０−１４Ｍ以下、約５×１０−１５Ｍ以下または約１０−１５Ｍ以下である、実施形態１１８〜１７８のいずれか１つのポリヌクレオチド。
Ｅ１８０．上述の核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントが、マウスＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメント、または非ヒト霊長類ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントよりも、ヒトＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントに選択的に結合する、実施形態１１８〜１７９のいずれか１つのポリヌクレオチド。
Ｅ１８１．上述の核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントが、ヒトＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントに結合し、非ヒト霊長類ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントにも結合する、実施形態１１８〜１７９のいずれか１つのポリヌクレオチド。
Ｅ１８２．上述の核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントが、細胞表面で発現したＩＧＦ−１Ｒに結合する、実施形態１１８〜１８１のいずれか１つのポリヌクレオチド。
Ｅ１８３．上述の細胞が、悪性細胞、新生物性細胞、腫瘍細胞または転移細胞である、実施形態１８２のポリヌクレオチド。
Ｅ１８４．上述の核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントが、インスリン様成長因子がＩＧＦ−１Ｒに結合するのをブロックする、実施形態１１８〜１８３のいずれか１つのポリヌクレオチド。
Ｅ１８５．インスリン様成長因子が、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）である、実施形態１８４のポリヌクレオチド。
Ｅ１８６．インスリン様成長因子が、インスリン様成長因子−２（ＩＧＦ−２）である、実施形態１８４のポリヌクレオチド。
Ｅ１８７．ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２がＩＧＦ−１Ｒに結合するのをブロックする、実施形態１８４のポリヌクレオチド。
Ｅ１８８．上述の核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントが、ＩＧＦ−１Ｒが介在する細胞増殖を阻害する、実施形態１１８〜１５３のいずれか１つのポリヌクレオチド。
Ｅ１８９．上述の核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントが、ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２が介在するＩＧＦ−１Ｒリン酸化を阻害する、実施形態１１８〜１８８のいずれか１つのポリヌクレオチド。
Ｅ１９０．上述の核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントが、腫瘍細胞の成長を阻害する、実施形態１１８〜１８９のいずれか１つのポリヌクレオチド。
Ｅ１９１．上述の核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントが、ＩＧＦ−１Ｒの内在化を阻害する、実施形態１１８〜１９０のいずれか１つのポリヌクレオチド。
Ｅ１９２．異種ポリペプチドをコードする核酸をさらに含む、実施形態１１８〜１９１のいずれか１つのポリヌクレオチド。
Ｅ１９３．上述の核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体、または抗原結合性を保持したフラグメントが、細胞毒性薬、治療薬、細胞増殖抑制剤、生物毒素、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生体応答修飾物質、医薬品、リンホカイン、異種抗体またはそのフラグメント、検出可能な標識、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびこれらの薬剤の２種以上の組み合わせからなる群から選択される薬剤に接合している、実施形態１１８〜１９２のいずれか１つのポリヌクレオチド。
Ｅ１９４．細胞毒性薬が、放射性核種、生物毒素、酵素によって活性化する毒素、細胞増殖抑制性または細胞毒性性の治療薬、プロドラッグ、免疫学的に活性なリガンド、生体応答修飾物質、または上述の細胞毒性薬の２種以上の組み合わせからなる群から選択される、実施形態１９３のポリヌクレオチド。
Ｅ１９５．検出可能な標識が、酵素、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、放射性標識、または上述の検出可能な標識の２種以上の組み合わせからなる群から選択される、実施形態１９３のポリヌクレオチド。
Ｅ１９６．実施形態１１８〜１９５のいずれか１つのポリヌクレオチドと、担体とを含む組成物。
Ｅ１９７．実施形態１１８〜１９６のいずれか１つのポリヌクレオチドを含むベクター。
Ｅ１９８．上述のポリヌクレオチドが、プロモーターと作動可能に連結している、実施形態１９７のベクター。
Ｅ１９９．実施形態１９７または１９８のベクターを含む宿主細胞。
Ｅ２００．実施形態１９９の宿主細胞を培養する工程と、上述の抗体または抗体フラグメントを回収する工程とを含む、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを製造する方法。
Ｅ２０１．実施形態２００の方法で製造されたポリペプチドの単離物。
Ｅ２０２．実施形態１１８〜１６１のいずれか１つのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの単離物。
Ｅ２０３．上述のポリペプチドを含む抗体、またはそのフラグメントが、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する、実施形態２０２のポリペプチドの単離物。
Ｅ２０４．実施形態１６８または１６９のポリペプチドを含む抗体の単離物、またはそのフラグメント。
Ｅ２０５．ＶＨをコードするポリヌクレオチドの単離物と、ＶＬをコードするポリヌクレオチドの単離物とを含む組成物。ＶＨをコードするポリヌクレオチドおよびＶＬをコードするポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号４および配列番号６８、配列番号８および配列番号７３、配列番号１４および配列番号７８、配列番号２０および配列番号８３、配列番号２６および配列番号８８、配列番号３２および配列番号９３、配列番号３８および配列番号９８、配列番号４３および配列番号１０３、配列番号４８および配列番号１０８、配列番号５３および配列番号１０３、配列番号５８および配列番号１１３、および配列番号６３および配列番号１１８からなる群から選択される参照アミノ酸配列との同一性が少なくとも９０％であるアミノ酸をコードする核酸を含み、ＶＨおよびＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する。
Ｅ２０６．ＶＨをコードするポリヌクレオチドおよびＶＬをコードするポリヌクレオチドが、それぞれ、配列番号４および配列番号６８、配列番号８および配列番号７３、配列番号１４および配列番号７８、配列番号２０および配列番号８３、配列番号２６および配列番号８８、配列番号３２および配列番号９３、配列番号３８および配列番号９８、配列番号４３および配列番号１０３、配列番号４８および配列番号１０８、配列番号５３および配列番号１０３、配列番号５８および配列番号１１３、および配列番号６３および配列番号１１８からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸を含む、実施形態２０５の組成物。
Ｅ２０７．ＶＨをコードするポリヌクレオチドの単離物と、ＶＬをコードするポリヌクレオチドの単離物とを含む組成物。ＶＨをコードするポリヌクレオチドおよびＶＬをコードするポリヌクレオチドは、それぞれ、２０箇所以下のアミノ酸同類置換以外は、配列番号４および配列番号６８、配列番号８および配列番号７３、配列番号１４および配列番号７８、配列番号２０および配列番号８３、配列番号２６および配列番号８８、配列番号３２および配列番号９３、配列番号３８および配列番号９８、配列番号４３および配列番号１０３、配列番号４８および配列番号１０８、配列番号５３および配列番号１０３、配列番号５８および配列番号１１３、および配列番号６３および配列番号１１８からなる群から選択される参照アミノ酸配列と同一のである、アミノ酸をコードする核酸を含む、ＶＨおよびＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する。
Ｅ２０８．ＶＨをコードするポリヌクレオチドの単離物と、ＶＬをコードするポリヌクレオチドの単離物とを含む組成物。ＶＨをコードするポリヌクレオチドは、配列番号５、６および７、配列番号１０、１１および１２、配列番号１５、１６および１７、配列番号２１、２２および２３、配列番号２７、２８および２９、配列番号３３、３４および３５、配列番号３９、４０および４１、配列番号４４、４５および４６、配列番号４９、５０および５１、配列番号５４、５５および５６、配列番号５９、６０および６１、ならびに配列番号６４、６５および６６からなる群から選択される、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２およびＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むＶＨポリペプチドをコードし、ＶＬをコードするポリヌクレオチドは、配列番号６９、７０および７１、配列番号７４、７５および７６、配列番号７９、８０および８１、配列番号８４、８５および８６、配列番号８９、９０および９１、配列番号９４、９５および９６、配列番号９９、１００および１０１、配列番号１０４、１０５および１０６、配列番号１０９、１１０および１１１、配列番号１１４、１１５および１１６、ならびに配列番号１１９、１２０および１２１からなる群から選択される、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２およびＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むＶＬポリペプチドをコードし、ＶＨおよびＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する。
Ｅ２０９．ＶＨをコードするポリヌクレオチドが、抗体のＶＨポリペプチドに融合したシグナルペプチドをコードする核酸をさらに含む、実施形態２０５〜２０８のいずれか１つの組成物。
Ｅ２１０．ＶＬをコードするポリヌクレオチドが、抗体のＶＬポリペプチドに融合したシグナルペプチドをコードする核酸をさらに含む、実施形態２０５〜２０８のいずれか１つの組成物。
Ｅ２１１．ＶＨをコードするポリヌクレオチドが、ＶＨポリペプチドに融合した重鎖定常領域ＣＨ１領域をコードする核酸をコードする核酸をさらに含む、実施形態２０５〜２１０のいずれか１つの組成物。
Ｅ２１２．ＶＨをコードするポリヌクレオチドが、ＶＨポリペプチドに融合した重鎖定常領域ＣＨ２領域をコードする核酸をコードする核酸をさらに含む、実施形態２０５〜２１１のいずれか１つの組成物。
Ｅ２１３．ＶＨをコードするポリヌクレオチドが、ＶＨポリペプチドに融合した重鎖定常領域ＣＨ３領域をコードする核酸をコードする核酸をさらに含む、実施形態２０５〜２１２のいずれか１つの組成物。
Ｅ２１４．ＶＨをコードするポリヌクレオチドが、ＶＨポリペプチドに融合した重鎖ヒンジ領域をコードする核酸をさらに含む、実施形態２０５〜２１３のいずれか１つの組成物。
Ｅ２１５．重鎖定常領域が、ヒトＩｇＧ４である、実施形態２０５〜２１４のいずれか１つの組成物。
Ｅ２１６．ＩｇＧ４が、突然変異によって糖鎖付加部位が除去されたものである、実施形態２１５の組成物。
Ｅ２１７．ＩｇＧ４の突然変異体が、Ｓ２４１ＰおよびＴ３１８Ａを含む（Ｋａｂａｔ付番システムによる）、実施形態２１６の組成物。
Ｅ２１８．ＶＬをコードするポリヌクレオチドが、上述の抗体のＶＬポリペプチドに融合した軽鎖定常領域をコードする核酸をさらに含む、実施形態２０５〜２１７のいずれか１つの組成物。
Ｅ２１９．軽鎖定常領域が、ヒトκ領域である、実施形態１７４の組成物。
Ｅ２２０．ＶＨおよびＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントが、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１およびＭ１２−Ｇ０４からなる群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体フラグメント、またはハイブリドーマが産生するＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２およびＰ１Ｇ１０．２Ｂ８からなる群から選択される参照モノクローナル抗体と同一のエピトープと特異的に結合する、実施形態２０５〜２１９のいずれか１つの組成物。
Ｅ２２１．ＶＨおよびＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントが、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１およびＭ１２−Ｇ０４からなる群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体フラグメント、またはハイブリドーマが産生するＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２およびＰ１Ｇ１０．２Ｂ８からなる群から選択される参照モノクローナル抗体がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを競合的に阻害する、実施形態２０５〜２２０のいずれか１つの組成物。
Ｅ２２２．ＶＨポリペプチドまたはＶＬポリペプチドのフレームワーク領域が、５個以下のアミノ酸の置換以外は、ヒトである、実施形態２０５〜２２１のいずれか１つの組成物。
Ｅ２２３．ＶＨおよびＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントが、線形のエピトープに結合する、実施形態２０５〜２２２のいずれか１つの組成物。
Ｅ２２４．ＶＨおよびＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントが、非線形のエピトープに結合する、実施形態２０５〜２２２のいずれか１つの組成物。
Ｅ２２５．ＶＨおよびＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントが、多価であり、少なくとも２つの重鎖と、少なくとも２つの軽鎖とを含む、実施形態２０５〜２２２のいずれか１つの組成物。
Ｅ２２６．ＶＨおよびＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントが、多重特異性である、実施形態２０５〜２２５のいずれか１つの組成物。
Ｅ２２７．ＶＨおよびＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントが、二重特異性である、実施形態２０５〜２２６のいずれか１つの組成物。
Ｅ２２８．ＶＨおよびＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントが、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、この領域が完全にヒトである、実施形態２０５〜２２７のいずれか１つの組成物。
Ｅ２２９．重鎖可変領域および軽鎖可変領域が、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１およびＭ１２−Ｇ０４からなる群から選択されるモノクローナルＦａｂ抗体フラグメントの該当領域と同一である、実施形態２２８の組成物。
Ｅ２３０．ＶＨおよびＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントが、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、この領域がマウスである、実施形態２０５〜２２７のいずれか１つの組成物。
Ｅ２３１．重鎖可変領域および軽鎖可変領域が、ハイブリドーマが産生するＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２およびＰ１Ｇ１０．２Ｂ８からなる群から選択されるモノクローナル抗体の該当領域と同一である、実施形態２３０の組成物。
Ｅ２３２．ＶＨおよびＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントが、ヒト化抗体またはヒト化抗体フラグメントである、実施形態２０５〜２２７および２３０〜２３１のいずれか１つの組成物。
Ｅ２３３．ＶＨおよびＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントが、キメラ抗体またはキメラ抗体フラグメントである、実施形態２０５〜２２７および２３０〜２３１のいずれか１つの組成物。
Ｅ２３４．ＶＨおよびＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントが、霊長類化抗体または霊長類化抗体フラグメントである、実施形態２０５〜２２７および２３０〜２３１のいずれか１つの組成物
Ｅ２３５．ＶＨおよびＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントが、完全にヒトである、実施形態２０５〜２２９のいずれか１つの組成物。
Ｅ２３６．ＶＨおよびＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントが、Ｆａｂフラグメントである、実施形態２０５〜２３５のいずれか１つの組成物。
Ｅ２３７．ＶＨおよびＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントが、Ｆａｂ’フラグメントである、実施形態２０５〜２３５のいずれか１つの組成物。
Ｅ２３８．ＶＨおよびＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントが、Ｆ（ａｂ）２フラグメントである、実施形態２０５〜２３５のいずれか１つの組成物。
Ｅ２３９．ＶＨおよびＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントが、Ｆｖフラグメントである、実施形態２０５〜２３５のいずれか１つの組成物。
Ｅ２４０．ＶＨおよびＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントが、単鎖抗体である、実施形態２０５〜２３５のいずれか１つの組成物。
Ｅ２４１．ＶＨおよびＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントが、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントに特異的に結合するか、またはＩＧＦ−１Ｒポリペプチド改変体に特異的に結合し、親和性を特徴づける解離定数（ＫＤ）が、約５×１０−２Ｍ以下、約１０−２Ｍ以下、約５×１０−３Ｍ以下、約１０−３Ｍ以下、約５×１０−４Ｍ以下、約１０−４Ｍ以下、約５×１０−５Ｍ以下、約１０−５Ｍ以下、約５×１０−６Ｍ以下、約１０−６Ｍ以下、約５×１０−７Ｍ以下、約１０−７Ｍ以下、約５×１０−８Ｍ以下、約１０−８Ｍ以下、約５×１０−９Ｍ以下、約１０−９Ｍ以下、約５×１０−１０Ｍ以下、約１０−１０Ｍ以下、約５×１０−１１Ｍ以下、約１０−１１Ｍ以下、約５×１０−１２Ｍ以下、約１０−１２Ｍ以下、約５×１０−１３Ｍ以下、約１０−１３Ｍ以下、約５×１０−１４Ｍ以下、約１０−１４Ｍ以下、約５×１０−１５Ｍ以下または約１０−１５Ｍ以下である、実施形態２０５〜２４０のいずれか１つの組成物。
Ｅ２４２．ＶＨおよびＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントが、マウスＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメント、または非ヒト霊長類ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントよりも、ヒトＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントに選択的に結合する、実施形態２０５〜２４１のいずれか１つの組成物。
Ｅ２４３．ＶＨおよびＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントが、ヒトＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントに結合し、非ヒト霊長類ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントにも結合する、実施形態２０５〜２４１のいずれか１つの組成物。
Ｅ２４４．ＶＨおよびＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントが、細胞表面で発現したＩＧＦ−１Ｒに結合する、実施形態２０５〜２４３のいずれか１つの組成物。
Ｅ２４５．上述の細胞が、悪性細胞、新生物性細胞、腫瘍細胞または転移細胞である、実施形態２２４の組成物。
Ｅ２４６．ＶＨおよびＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントが、インスリン様成長因子がＩＧＦ−１Ｒに結合するのをブロックする、実施形態２０５〜２４５のいずれか１つの組成物。
Ｅ２４７．インスリン様成長因子が、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）である、実施形態２４６の組成物。
Ｅ２４８．インスリン様成長因子が、インスリン様成長因子−２（ＩＧＦ−２）である、実施形態２４６の組成物。
Ｅ２４９．ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２がＩＧＦ−１Ｒ双方に結合するのをブロックする、実施形態２４６の組成物。
Ｅ２５０．ＶＨおよびＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントが、ＩＧＦ−１Ｒが介在する細胞増殖を阻害する、実施形態２０５〜２４９のいずれか１つの組成物。
Ｅ２５１．ＶＨおよびＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントが、ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２が介在するＩＧＦ−１Ｒリン酸化を阻害する、実施形態２０５〜２５０のいずれか１つの組成物。
Ｅ２５２．ＶＨおよびＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントが、腫瘍細胞の成長を阻害する、実施形態２０５〜２５１のいずれか１つの組成物。
Ｅ２５３．ＶＨおよびＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントが、ＩＧＦ−１Ｒの内在化を阻害する、実施形態２０５〜２５２のいずれか１つの組成物。
Ｅ２５４．ＶＨをコードするポリヌクレオチド、ＶＬをコードするポリヌクレオチド、またはＶＨをコードするポリヌクレオチドおよびＶＬをコードするポリヌクレオチドの両方が、異種ポリペプチドをコードする核酸をさらに含む、実施形態２０５〜２５３のいずれか１つの組成物。
Ｅ２５５．ＶＨおよびＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントが、細胞毒性薬、治療薬、細胞増殖抑制剤、生物毒素、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生体応答修飾物質、医薬品、リンホカイン、異種抗体またはそのフラグメント、検出可能な標識、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびこれらの薬剤の２種以上の組み合わせからなる群から選択される薬剤に接合している、実施形態２０５〜２５４のいずれか１つの組成物。
Ｅ２５６．細胞毒性薬が、放射性核種、生物毒素、酵素によって活性化する毒素、細胞増殖抑制性または細胞毒性性の治療薬、プロドラッグ、免疫学的に活性なリガンド、生体応答修飾物質、または上述の細胞毒性薬の２種以上の組み合わせからなる群から選択される、実施形態２５５の組成物。
Ｅ２５７．検出可能な標識が、酵素、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、放射性標識、または上述の検出可能な標識の２種以上の組み合わせからなる群から選択される、実施形態２５５の組成物。
Ｅ２５８．ＶＨをコードするポリヌクレオチドが、第１のベクターに入っており、ＶＬをコードするポリヌクレオチドが、第２のベクターに入っている、実施形態２０５〜２５７のいずれか１つの組成物。
Ｅ２５９．ＶＨをコードするポリヌクレオチドが、第１のプロモーターと作動可能に連結しており、ＶＬをコードするポリヌクレオチドが、第２のプロモーターと作動可能に連結している、実施形態２５８の組成物。
Ｅ２６０．第１のプロモーターおよび第２のプロモーターが、同じプロモーターを複製したものである、実施形態２５９の組成物。
Ｅ２６１．第１のプロモーターと第２のプロモーターが、同一ではない、実施形態２５９の組成物。
Ｅ２６２．第１のベクターおよび第２のベクターが、１個の宿主細胞の中にある、実施形態２５８〜２６１のいずれか１つの組成物。
Ｅ２６３．第１のベクターと、第２のベクターとは、別個の宿主細胞の中にある、実施形態２５８〜２６１のいずれか１つの組成物。
Ｅ２６４．実施形態２６２の宿主細胞を培養する工程と、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを回収する工程を含む、上述の抗体または抗体フラグメントを産生する方法。
Ｅ２６５．実施形態２６３の別個の宿主細胞を一緒に培養する工程と、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを回収する工程を含む、上述の抗体または抗体フラグメントを産生する方法。
Ｅ２６６．実施形態２６３の別個の宿主細胞を別個に培養する工程と、ＶＨをコードするポリヌクレオチドとＶＬをコードするポリヌクレオチドとを混合する工程と、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを回収する工程を含む、上述の抗体または抗体フラグメントを産生する方法。
Ｅ２６７．実施形態２６４〜２６６のいずれか１つの方法によって産生される、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント。
Ｅ２６８．ＶＨをコードするポリヌクレオチドとＶＬをコードするポリヌクレオチドとが同じベクター内にある、実施形態２０５〜２６７のいずれか１つの組成物。
Ｅ２６９．実施形態２６８のベクター。
Ｅ２７０．ＶＨをコードするポリヌクレオチドおよびＶＬをコードするポリヌクレオチドが、それぞれプロモーターと作動可能に連結している、実施形態２６９のベクター。
Ｅ２７１．ＶＨをコードするポリヌクレオチドおよびＶＬをコードするポリヌクレオチドが、フレーム内で融合しており、これらのポリヌクレオチドと作動可能に連結している１個のプロモーターから一緒に転写され、単鎖抗体または抗原結合性を保持したフラグメントに一緒に翻訳される、実施形態２６９のベクター。
Ｅ２７２．ＶＨをコードするポリヌクレオチドおよびＶＬをコードするポリヌクレオチドが、これらのポリヌクレオチドと作動可能に連結している１個のプロモーターから一緒に転写されるものの、翻訳は別個に行われる、実施形態２６９のベクター。
Ｅ２７３．ベクターが、ＩＲＥＳ配列を含んでおり、この配列は、ＶＨをコードするポリヌクレオチドとＶＬをコードするポリヌクレオチドとの間に配置されている、実施形態２７２のベクター。
Ｅ２７４．ＶＨをコードするポリヌクレオチドとＶＬをコードするポリヌクレオチドが、別個に転写され、それぞれ、別個のプロモーターと作動可能に連結している、実施形態２６９のベクター。
Ｅ２７５．上述の別個のプロモーターが、同じプロモーターを複製したものである、実施形態２７４のベクター。
Ｅ２７６．上述の別個のプロモーターが、同一ではない、実施形態２７４のベクター。
Ｅ２７７．実施形態２６９〜２７６のいずれか１つのベクターを含む宿主細胞。
Ｅ２７８．実施形態２７７の宿主細胞を培養する工程と、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを回収する工程を含む、上述の抗体または抗体フラグメントを産生する方法。
Ｅ２７９．実施形態２４４の方法によって産生される、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント。
Ｅ２８０．
（ａ）実施形態１〜８２、１７０、２３３および２４５の抗体の単離物、またはそのフラグメントと、
（ｂ）医薬的に許容される担体とを含む組成物を、過剰増殖性障害を治療することが必要な動物に投与する工程を含む、動物の過剰増殖性障害を治療する方法。
Ｅ２８１．過剰増殖性疾患または過剰増殖性障害が、癌、新生物、腫瘍、悪性腫瘍、またはその転移からなる群から選択される、実施形態２８０の方法。
Ｅ２８２．上述の抗体または抗体フラグメントは、悪性細胞の表面で発現するＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する、実施形態２８１の方法。
Ｅ２８３．上述の抗体または抗体フラグメントが悪性細胞に結合すると、悪性細胞の成長が阻害される、実施形態２８２の方法。
Ｅ２８４．上述の抗体または抗体フラグメントが、悪性細胞にＩＧＦが結合するのを阻害する、実施形態２８０〜２８３のいずれかの方法。
Ｅ２８５．ＩＧＦがＩＧＦ−１である、実施形態２８４の方法。
Ｅ２８６．ＩＧＦがＩＧＦ−２である、実施形態２８４の方法。
Ｅ２８７．ＩＧＦがＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２である、実施形態２８４の方法。
Ｅ２８８．上述の抗体または抗体フラグメントは、ＩＧＦ−１が悪性細胞に結合するのを阻害するが、ＩＧＦ−２が悪性細胞に結合するのは阻害しない、実施形態２８７の方法。
Ｅ２８９．上述の抗体または抗体フラグメントは、ＩＧＦ−２が悪性細胞に結合するのを阻害するが、ＩＧＦ−１が悪性細胞に結合するのは阻害しない、実施形態２８７の方法。
Ｅ２９０．上述の抗体または抗体フラグメントが、ＩＧＦ−１Ｒが悪性細胞に内在化するのを促進する、実施形態２８０〜２８３のいずれか１つの方法。
Ｅ２９１．上述の抗体または抗体フラグメントが、ＩＧＦ−１Ｒリン酸化を阻害する、実施形態２８０〜２８３のいずれか１つの方法。
Ｅ２９２．上述の抗体または抗体フラグメントが、腫瘍細胞の増殖を阻害する、実施形態２８０〜２８３のいずれか１つの方法。
Ｅ２９３．転移成長を阻止するか、または遅らせることにより、腫瘍細胞の増殖が阻害される、実施形態２９２の方法。
Ｅ２９４．上述の抗体または抗体フラグメントが、腫瘍細胞の移動を阻害する、実施形態２８０〜２８３のいずれか１つの方法。
Ｅ２９５．隣接する組織に腫瘍が広がるのを阻止するか、または遅らせることにより、腫瘍細胞の増殖が阻害される、実施形態２９２の方法。
Ｅ２９６．過剰増殖性疾患または過剰増殖性障害が、前立腺、結腸、腹部、骨、胸、消化系、肝臓、膵臓、腹膜、副腎、副甲状腺、下垂体、睾丸、卵巣、胸腺、甲状腺、眼、頭、首、中枢神経系、末梢神経系、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部または尿生殖路の位置にある新生物である、実施形態２８１の方法。
Ｅ２９７．過剰増殖性疾患が、癌であり、癌が、扁平上皮細胞癌、黒色腫、白血病、骨髄腫、胃癌、脳癌、肺癌、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、腎癌、前立腺癌、精巣癌、甲状腺癌、および頭頸部癌からなる群から選択される、実施形態２８１の方法。
Ｅ２９８．癌が、胃癌、腎癌、脳癌、膀胱癌、結腸癌、肺癌、乳癌、膵臓癌、卵巣癌および前立腺癌からなる群から選択される、実施形態２９７の方法。
Ｅ２９９．上述の動物が、哺乳動物である、実施形態２８０〜２９８のいずれか１つの方法。
Ｅ３００．哺乳動物が、ヒトである、実施形態２９９の方法。
Ｅ３０１．少なくとも２種類のＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する抗体、または抗体フラグメントを２種類以上組み合わせて投与する工程を含む、動物において過剰増殖性障害を治療する方法。
Ｅ３０２．上述の２種類以上の抗体、または抗体フラグメントが、ＩＧＦ−１リガンドおよび／またはＩＧＦ−２リガンドの結合を阻害する、実施形態３０１の方法。
Ｅ３０３．上述の２種類以上の抗体、または抗体フラグメントが、ＩＧＦ−１Ｒのシグナル伝達を阻害する、実施形態３０１の方法。
Ｅ３０４．上述の２種類以上の抗体、または抗体フラグメントが、リガンドの結合を競合的に阻害し、かつ、アロステリック効果によって阻害する、実施形態３０１〜３０３のいずれか１つの方法。
Ｅ３０５．上述の２種類以上の抗体、または抗体フラグメントを、単独で使用する場合と、組み合わせて使用する場合とで、ほぼ同じである最終的な合計モル濃度で比較すると、上述の２種類以上の抗体、または抗体フラグメントは、この２種類以上の抗体、または抗体フラグメントのうちいずれか１種類のみを使用する場合よりも効果的に腫瘍細胞の増殖またはＩＧＦ−１Ｒシグナル伝達を阻害する、実施形態３０１〜３０４のいずれか１つの方法。
Ｅ３０６．上述の２種類以上の抗体、または抗体フラグメントによって、ＩＧＦ−１Ｒシグナル伝達の阻害において、相乗効果が得られる、実施形態３０１〜３０４のいずれか１つの方法。
Ｅ３０７．上述の２種類以上の抗体、または抗体フラグメントを、単独で使用する場合と、組み合わせて使用する場合とで、ほぼ同じである最終的な合計モル濃度で比較すると、上述の２種類以上の抗体、または抗体フラグメントは、この２種類以上の抗体、または抗体フラグメントのうちいずれか１種類のみを使用する場合よりも効果的にＩＧＦ−１リガンドおよび／またはＩＧＦ−２リガンドの結合を阻害する、実施形態３０１〜３０４のいずれか１つの方法。
Ｅ３０８．上述の２種類以上の抗体、または抗体フラグメントによって、ＩＧＦ−１Ｒに対するＩＧＦ−１リガンドおよび／またはＩＧＦ−２リガンドの結合の阻害において相乗効果が得られる、実施形態３０１〜３０４のいずれか１つの方法。
Ｅ３０９．動物がヒトである、実施形態３０１〜３０８のいずれか１つの方法。
Ｅ３１０．上述の過剰増殖性障害が癌である、実施形態３０１〜３０９のいずれか１つの方法。
Ｅ３１１．上述の過剰増殖性障害が腫瘍である、実施形態３０１〜３１０のいずれか１つの方法。
３１２．ヒトＩＧＦ−１ＲのＩＩＩ型フィブロネクチンドメイン１（ＦＮＩＩＩ−１）を含むか、ヒトＩＧＦ−１ＲのＩＩＩ型フィブロネクチンドメイン１（ＦＮＩＩＩ−１）からなる、ポリペプチドの単離物。
Ｅ３１３．ヒトＩＧＦ−１Ｒのシステインに富む繰り返しドメイン（ＣＲＲ）およびロイシンに富む繰り返しドメイン２（Ｌ２）を含むか、ＣＲＲおよびＬＲ２からなる、ポリペプチドの単離物。
Ｅ３１４．ヒトＩＧＦ−１Ｒのシステインに富む繰り返しドメイン（ＣＲＲ）を含むか、ＣＲＲからなる、ポリペプチドの単離物。
Ｅ３１５．アミノ酸残基の数が３００以下であり、
（ａ）Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｈｉｓ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ；（ｂ）Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｉｌｅ  Ｉｌｅ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ；（ｃ）Ｔｒｐ  Ｈｉｓ  Ａｒｇ  Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ａｒｇ；（ｄ）Ａｓｐ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｌｙｓ；（ｅ）Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ａｓｎ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｇｌｕ  Ｔｙｒ；（ｆ）Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ；（ｇ）Ｔｒｐ  Ａｓｎ  Ｍｅｔ  Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ；（ｈ）Ａｓｎ  Ｌｙｓ  Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ；（ｉ）Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｔｒｐ  Ｔｈｒ  Ｇｌｎ  Ｔｙｒ  Ａｌａ；（ｊ）Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｍｅｔ；（ｋ）Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ａｓｐ  Ｈｉｓ  Ｉｌｅ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｌｙｓ；および（ｌ）  Ａｓｐ  Ｈｉｓ  Ｉｌｅ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅからなる群から選択される配列を含む、ポリペプチドの単離物。
Ｅ３１６．上述のポリペプチドのアミノ酸長が２００以下である、実施形態３１５のポリペプチド。
Ｅ３１７．上述のポリペプチドのアミノ酸長が２５０以下である、実施形態３１５のポリペプチド。
Ｅ３１８．上述のポリペプチドのアミノ酸長が１５０以下である、実施形態３１５のポリペプチド。
Ｅ３１９．上述のポリペプチドのアミノ酸長が１００以下である、実施形態３１５のポリペプチド。
Ｅ３２０．上述のポリペプチドのアミノ酸長が５０以下である、実施形態３１５のポリペプチド。
Ｅ３２１．上述のポリペプチドのアミノ酸長が４０以下である、実施形態３１５のポリペプチド。
Ｅ３２２．上述のポリペプチドのアミノ酸長が３０以下である、実施形態３１５のポリペプチド。
Ｅ３２３．上述のポリペプチドのアミノ酸長が２０以下である、実施形態３１５のポリペプチド。
Ｅ３２４．上述のポリペプチドのアミノ酸長が１０以下である、実施形態３１５のポリペプチド。
Ｅ３２５．（ａ）Ｆａｂ  Ｍ１３−Ｃ０６；（ｂ）Ｆａｂ  Ｍ１４−Ｃ０３；（ｃ）Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ；および（ｄ）Ｍ１４．Ｃ０３．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙからなる群から選択される抗体が特異的に結合する、実施形態３１５〜３２４のいずれか１つのポリペプチド。
Ｅ３２６．
（ａ）Ｇｌｕ−４５９；（ｂ）Ｓｅｒ−４６０；（ｃ）Ａｓｐ−４６１；（ｄ）Ｖａｌ−４６２；（ｅ）Ｈｉｓ−４６４；（ｆ）Ｔｈｒ−４６６；（ｇ）Ｓｅｒ−４６７；（ｈ）Ｔｈｒ−４７８；（ｉ）Ｈｉｓ−４８０；（ｊ）Ｔｙｒ−４８２；（ｋ）Ａｒｇ−４８３；（ｌ）Ｇｌｕ−５３３；（ｍ）Ｉｌｅ−５６４；（ｎ）Ａｒｇ−５６５；（ｏ）Ｌｙｓ−５６８；（ｐ）Ｇｌｕ−５７０；および（ｑ）Ｉｌｅ−５７１からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸を含み、このアミノ酸が、表２０に示しているようなシグナルペプチド配列の最初の３０アミノ酸を含まない、ヒトＩＧＦ−１Ｒの配列に対応している、ヒトＩＧＦ−１Ｒのエピトープ。
Ｅ３２７．アミノ酸残基の数が３００以下であり、
（ａ）  Ａｓｐ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ；（ｂ）Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ；（ｃ）Ｉｌｅ  Ｈｉｓ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ｃｙｓ  Ｍｅｔ  Ｇｌｎ  Ｇｌｕ  Ｃｙｓ；（ｄ）Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｉｌｅ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ；（ｅ）Ｓｅｒ  Ｍｅｔ  Ｔｙｒ  Ｃｙｓ  Ｉｌｅ  Ｐｒｏ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ；および（ｆ）Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｃｙｓ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕからなる群から選択される配列を含む、ポリペプチドの単離物。
Ｅ３２８．上述のポリペプチドのアミノ酸長が２００以下である、実施形態３２７のポリペプチド。
Ｅ３２９．上述のポリペプチドのアミノ酸長が２５０以下である、実施形態３２７のポリペプチド。
Ｅ３３０．上述のポリペプチドのアミノ酸長が１５０以下である、実施形態３２７のポリペプチド。
Ｅ３３１．上述のポリペプチドのアミノ酸長が１００以下である、実施形態３２７のポリペプチド。
Ｅ３３２．上述のポリペプチドのアミノ酸長が５０以下である、実施形態３２７のポリペプチド。
Ｅ３３３．上述のポリペプチドのアミノ酸長が４０以下である、実施形態３２７のポリペプチド。
Ｅ３３４．上述のポリペプチドのアミノ酸長が３０以下である、実施形態３２７のポリペプチド。
Ｅ３３５．上述のポリペプチドのアミノ酸長が２０以下である、実施形態３２７のポリペプチド。
Ｅ３３６．上述のポリペプチドのアミノ酸長が１０以下である、実施形態３２７のポリペプチド。
Ｅ３３７．
（ａ）Ｆａｂ  Ｍ１４−Ｇ１１；および
（ｂ）Ｍ１４−Ｇ１１．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙからなる群から選択される抗体が特異的に結合する、実施形態３２７〜３３６のいずれか１つのポリペプチド。
Ｅ３３８．
（ａ）Ａｓｐ−２４８；（ｂ）Ａｓｐ−２５０；（ｃ）Ａｓｎ−２５４；（ｄ）Ｓｅｒ−２５７；（ｅ）Ｇｌｕ−２５９；（ｆ）Ｓｅｒ−２６０；（ｇ）Ｓｅｒ−２６３；（ｈ）Ｇｌｙ−２６５；および（ｉ）Ｇｌｕ−３０３からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸を含み、このアミノ酸が、表２０に示しているようなシグナルペプチド配列の最初の３０アミノ酸を含まない、ヒトＩＧＦ−１Ｒの配列に対応している、ヒトＩＧＦ−１Ｒのエピトープ。
Ｅ３３９．アミノ酸残基の数が３００以下であり、
（ａ）Ａｓｐ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ；および（ｂ）Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙからなる群から選択される配列を含む、ポリペプチドの単離物。
Ｅ３４０．上述のポリペプチドのアミノ酸長が２００以下である、実施形態３３９のポリペプチド。
Ｅ３４１．上述のポリペプチドのアミノ酸長が２５０以下である、実施形態３３９のポリペプチド。
Ｅ３４２．上述のポリペプチドのアミノ酸長が１５０以下である、実施形態３３９のポリペプチド。
Ｅ３４３．上述のポリペプチドのアミノ酸長が１００以下である、実施形態３３９のポリペプチド。
Ｅ３４４．上述のポリペプチドのアミノ酸長が５０以下である、実施形態３３９のポリペプチド。
Ｅ３４５．上述のポリペプチドのアミノ酸長が４０以下である、実施形態３３９のポリペプチド。
Ｅ３４６．上述のポリペプチドのアミノ酸長が３０以下である、実施形態３３９のポリペプチド。
Ｅ３４７．上述のポリペプチドのアミノ酸長が２０以下である、実施形態３３９のポリペプチド。
Ｅ３４８．上述のポリペプチドのアミノ酸長が１０以下である、実施形態３３９のポリペプチド。
Ｅ３４９．
（ａ）キメラ抗体Ｐ１Ｅ２；および
（ｂ）ハイブリドーマ細胞株  Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２で発現した抗体からなる群から選択される抗体が特異的に結合する、実施形態３３９〜３４８のいずれか１つのポリペプチド。
Ｅ３５０．
（ａ）Ａｓｐ−２４８；（ｂ）Ａｓｎ−２５４；（ｃ）Ｓｅｒ−２５７；および（ｄ）Ｇｌｙ−２６５からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸を含み、このアミノ酸が、表２０に示しているようなシグナルペプチド配列の最初の３０アミノ酸を含まない、ヒトＩＧＦ−１Ｒの配列に対応している、ヒトＩＧＦ−１Ｒのエピトープ。
Ｅ３５１．ヒトＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基Ｇｌｕ−４５９からＨｉｓ−４６４を含む、ポリペプチドの単離物。このアミノ酸は、表２０に示しているようなシグナルペプチド配列の最初の３０アミノ酸を含まない、ヒトＩＧＦ−１Ｒの配列に対応している。
Ｅ３５２．ヒトＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基Ｓｅｒ−４６０からＴｈｒ−４６６を含む、ポリペプチドの単離物。このアミノ酸は、表２０に示しているようなシグナルペプチド配列の最初の３０アミノ酸を含まない、ヒトＩＧＦ−１Ｒの配列に対応している。
Ｅ３５３．ヒトＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基Ａｓｐ−４６１からＴｈｒ−４６６を含む、ポリペプチドの単離物。このアミノ酸は、表２０に示しているようなシグナルペプチド配列の最初の３０アミノ酸を含まない、ヒトＩＧＦ−１Ｒの配列に対応している。
Ｅ３５４．ヒトＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基Ｖａｌ−４６２からＳｅｒ−４６７を含む、ポリペプチドの単離物。このアミノ酸は、表２０に示しているようなシグナルペプチド配列の最初の３０アミノ酸を含まない、ヒトＩＧＦ−１Ｒの配列に対応している。
Ｅ３５５．ヒトＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基Ｈｉｓ−４６４からＴｈｒ−４７８を含む、ポリペプチドの単離物。このアミノ酸は、表２０に示しているようなシグナルペプチド配列の最初の３０アミノ酸を含まない、ヒトＩＧＦ−１Ｒの配列に対応している。
Ｅ３５６．ヒトＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基Ｔｈｒ−４６６からＴｈｒ−４７８を含む、ポリペプチドの単離物。このアミノ酸は、表２０に示しているようなシグナルペプチド配列の最初の３０アミノ酸を含まない、ヒトＩＧＦ−１Ｒの配列に対応している。
Ｅ３５７．ヒトＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基Ｓｅｒ−４６７からＴｈｒ−４７８を含む、ポリペプチドの単離物。このアミノ酸は、表２０に示しているようなシグナルペプチド配列の最初の３０アミノ酸を含まない、ヒトＩＧＦ−１Ｒの配列に対応している。
Ｅ３５８．ヒトＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基Ｔｈｒ−４７８からＴｙｒ−４８２を含む、ポリペプチドの単離物。このアミノ酸は、表２０に示しているようなシグナルペプチド配列の最初の３０アミノ酸を含まない、ヒトＩＧＦ−１Ｒの配列に対応している。
Ｅ３５９．ヒトＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基Ｈｉｓ−４８０からＧｌｕ−５３３を含む、ポリペプチドの単離物。このアミノ酸は、表２０に示しているようなシグナルペプチド配列の最初の３０アミノ酸を含まない、ヒトＩＧＦ−１Ｒの配列に対応している。
Ｅ３６０．ヒトＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基Ｔｙｒ−４８２からＧｌｕ−５３３を含む、ポリペプチドの単離物。このアミノ酸は、表２０に示しているようなシグナルペプチド配列の最初の３０アミノ酸を含まない、ヒトＩＧＦ−１Ｒの配列に対応している。
Ｅ３６１．ヒトＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基Ａｒｇ−４８３からＧｌｕ−５３３を含む、ポリペプチドの単離物。このアミノ酸は、表２０に示しているようなシグナルペプチド配列の最初の３０アミノ酸を含まない、ヒトＩＧＦ−１Ｒの配列に対応している。
Ｅ３６２．ヒトＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基Ｇｌｕ−５３３からＩｌｅ−５６４を含む、ポリペプチドの単離物。このアミノ酸は、表２０に示しているようなシグナルペプチド配列の最初の３０アミノ酸を含まない、ヒトＩＧＦ−１Ｒの配列に対応している。
Ｅ３６３．ヒトＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基Ｉｌｅ−５６４からＧｌｕ−５７０を含む、ポリペプチドの単離物。このアミノ酸は、表２０に示しているようなシグナルペプチド配列の最初の３０アミノ酸を含まない、ヒトＩＧＦ−１Ｒの配列に対応している。
Ｅ３６４．ヒトＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基Ａｒｇ−５６５からＧｌｕ−５７０を含む、ポリペプチドの単離物。このアミノ酸は、表２０に示しているようなシグナルペプチド配列の最初の３０アミノ酸を含まない、ヒトＩＧＦ−１Ｒの配列に対応している。
Ｅ３６５．ヒトＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基Ａｒｇ−５６５からＩｌｅ−５７１を含む、ポリペプチドの単離物。このアミノ酸は、表２０に示しているようなシグナルペプチド配列の最初の３０アミノ酸を含まない、ヒトＩＧＦ−１Ｒの配列に対応している。
Ｅ３６６．ヒトＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基Ｇｌｕ−４５９からＡｒｇ−４８３を含む、ポリペプチドの単離物。このアミノ酸は、表２０に示しているようなシグナルペプチド配列の最初の３０アミノ酸を含まない、ヒトＩＧＦ−１Ｒの配列に対応している。
Ｅ３６７．ヒトＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基Ａｒｇ−４８３からＧｌｕ−５３３を含む、ポリペプチドの単離物。このアミノ酸は、表２０に示しているようなシグナルペプチド配列の最初の３０アミノ酸を含まない、ヒトＩＧＦ−１Ｒの配列に対応している。
Ｅ３６８．ヒトＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基Ｇｌｕ−５３３からＩｌｅ−５７１を含む、ポリペプチドの単離物。このアミノ酸は、表２０に示しているようなシグナルペプチド配列の最初の３０アミノ酸を含まない、ヒトＩＧＦ−１Ｒの配列に対応している。
Ｅ３６９．ヒトＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基Ｇｌｕ−４５９からＩｌｅ−５７１を含む、ポリペプチドの単離物。このアミノ酸は、表２０に示しているようなシグナルペプチド配列の最初の３０アミノ酸を含まない、ヒトＩＧＦ−１Ｒの配列に対応している。
Ｅ３７０．ヒトＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基Ａｓｐ−２４８からＡｓｎ−２５４を含む、ポリペプチドの単離物。このアミノ酸は、表２０に示しているようなシグナルペプチド配列の最初の３０アミノ酸を含まない、ヒトＩＧＦ−１Ｒの配列に対応している。
Ｅ３７１．ヒトＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基Ａｓｐ−２５０からＳｅｒ−２５７を含む、ポリペプチドの単離物。このアミノ酸は、表２０に示しているようなシグナルペプチド配列の最初の３０アミノ酸を含まない、ヒトＩＧＦ−１Ｒの配列に対応している。
Ｅ３７２．ヒトＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基Ａｓｎ−２５４からＧｌｕ−２５９を含む、ポリペプチドの単離物。このアミノ酸は、表２０に示しているようなシグナルペプチド配列の最初の３０アミノ酸を含まない、ヒトＩＧＦ−１Ｒの配列に対応している。
Ｅ３７３．ヒトＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基Ｓｅｒ−２５７からＳｅｒ−２６３を含む、ポリペプチドの単離物。このアミノ酸は、表２０に示しているようなシグナルペプチド配列の最初の３０アミノ酸を含まない、ヒトＩＧＦ−１Ｒの配列に対応している。
Ｅ３７４．ヒトＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基Ｇｌｕ−２５９からＧｌｙ−２６５を含む、ポリペプチドの単離物。このアミノ酸は、表２０に示しているようなシグナルペプチド配列の最初の３０アミノ酸を含まない、ヒトＩＧＦ−１Ｒの配列に対応している。
Ｅ３７５．ヒトＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基Ｓｅｒ−２６０からＧｌｙ−２６５を含む、ポリペプチドの単離物。このアミノ酸は、表２０に示しているようなシグナルペプチド配列の最初の３０アミノ酸を含まない、ヒトＩＧＦ−１Ｒの配列に対応している。
Ｅ３７６．ヒトＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基Ｓｅｒ−２６３からＧｌｕ−３０３を含む、ポリペプチドの単離物。このアミノ酸は、表２０に示しているようなシグナルペプチド配列の最初の３０アミノ酸を含まない、ヒトＩＧＦ−１Ｒの配列に対応している。
Ｅ３７７．ヒトＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基Ｓｅｒ−２６５からＧｌｕ−３０３を含む、ポリペプチドの単離物。このアミノ酸は、表２０に示しているようなシグナルペプチド配列の最初の３０アミノ酸を含まない、ヒトＩＧＦ−１Ｒの配列に対応している。
Ｅ３７８．ヒトＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基Ｓｅｒ−２５４からＧｌｙ−２６５を含む、ポリペプチドの単離物。このアミノ酸は、表２０に示しているようなシグナルペプチド配列の最初の３０アミノ酸を含まない、ヒトＩＧＦ−１Ｒの配列に対応している。
Ｅ３７９．ＩＧＦ−１がＩＧＦ−１Ｒに結合するのをアロステリック効果によって阻害することが可能な、抗体の単離物。
Ｅ３８０．上述の抗体が、ＩＧＦ−２がＩＧＦ−１Ｒに結合するのは阻害しない、実施形態３７９の抗体。
Ｅ３８１．上述の抗体が、（ａ）Ｐ１Ｅ２；および（ｂ）Ｐ１Ａ２からなる群から選択される、実施形態３７９または３８０の抗体の単離物。
Ｅ３８２．
（ａ）ＩＧＦ−１Ｒを、ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体に曝露する工程と；
（ｂ）上述の抗体を、十分な時間をかけて上述のＩＧＦ−１Ｒと結合させる工程とを含む、ＩＧＦ−１がＩＧＦ−１Ｒに結合するのをアロステリック効果によって阻害する方法。
Ｅ３８３．上述の抗体が、ＩＧＦ−２がＩＧＦ−１Ｒに結合するのは阻害しない、実施形態３８２の方法。
Ｅ３８４．上述の抗体が、（ａ）Ｐ１Ｅ２；および（ｂ）Ｐ１Ａ２からなる群から選択される、実施形態３８２または３８３の方法。
Ｅ３８５．ＩＧＦ−２がＩＧＦ−１Ｒに結合するのをアロステリック効果によって阻害することが可能な、抗体の単離物。
Ｅ３８６．上述の抗体が、ＩＧＦ−１がＩＧＦ−１Ｒに結合するのは阻害しない、実施形態３８５の抗体。
Ｅ３８７．上述の抗体がＰ３Ｆ９である、実施形態３８５または３８６の抗体の単離物。
Ｅ３８８．
（ａ）ＩＧＦ−１Ｒを、ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体に曝露する工程と；
（ｂ）上述の抗体を、十分な時間をかけて前記ＩＧＦ−１Ｒと結合させる工程とを含む、ＩＧＦ−２がＩＧＦ−１Ｒに結合するのをアロステリック効果によって阻害する方法。
Ｅ３８９．上述の抗体が、ＩＧＦ−１がＩＧＦ−１Ｒに結合するのは阻害しない、実施形態３８８の方法。
Ｅ３９０．上述の抗体がＰ３Ｆ９である、実施形態３８８または３８９の方法。
Ｅ３９１．ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２がＩＧＦ−１Ｒに結合するのをアロステリック効果によって阻害することが可能な、抗体の単離物。
Ｅ３９２．上述の抗体が、（ａ）Ｍ１３−Ｃ０６；（ｂ）Ｍ１４−Ｃ０３；および（ｃ）２０Ｃ８からなる群から選択される、実施形態３９１の抗体の単離物。
Ｅ３９３．
（ａ）ＩＧＦ−１Ｒを、１種以上のＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体に曝露する工程と；
（ｂ）上述の１種以上の抗体を、十分な時間をかけて前記ＩＧＦ−１Ｒと結合させる工程とを含む、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２がＩＧＦ−１Ｒに結合するのをアロステリック効果によって阻害する方法。
Ｅ３９４．上述の１種以上の抗体が、（ａ）Ｐ１Ｅ２；（ｂ）Ｐ１Ａ２；（ｃ）Ｐ３Ｆ９；（ｄ）Ｍ１３−Ｃ０６；（ｅ）Ｍ１４−Ｃ０３；および（ｆ）２０Ｃ８からなる群から選択される、実施形態３９３の方法。
Ｅ３９５．ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを競合的に阻害することが可能な、抗体の単離物。
Ｅ３９６．上述の抗体がＭ１４−Ｇ１１である、実施形態３９５の抗体の単離物。
Ｅ３９７．
（ａ）ＩＧＦ−１Ｒを、ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体に曝露する工程と；
（ｂ）上述の抗体を、十分な時間をかけて上述のＩＧＦ−１Ｒと結合させる工程とを含む、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを競合的に阻害する方法。
Ｅ３９８．上述の抗体がＭ１４−Ｇ１１である、実施形態３９７の方法。
Ｅ３９９．
（ａ）ＩＧＦ−１Ｒを、ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体に曝露する工程と；
（ｂ）上述の抗体を、十分な時間をかけて上述のＩＧＦ−１Ｒと結合させる工程とを含む、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを競合的に阻害し、かつアロステリック効果によって阻害する方法。
Ｅ４００．前記競合的に阻害する抗体がＭ１４−Ｇ１１であり、前記アロステリック効果によって阻害する抗体が、
（ａ）Ｐ１Ｅ２；（ｂ）Ｐ１Ａ２；（ｃ）Ｐ３Ｆ９；（ｄ）Ｍ１３−Ｃ０６；（ｅ）Ｍ１４−Ｃ０３；および（ｆ）２０Ｃ８からなる群から選択される１種以上の抗体である、実施形態３９９の方法。
【０８３８】
（参考文献）
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【０８５２】
Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，Ｈ．，Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｌ．，Ｈｉｎｒｉｃｈｓｅｎ，Ｊ．，Ｇｒｏｔｈ，Ａ．，ａｎｄ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｊ．（２００４）”Ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ＩＩ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｙｐｅ  Ｉ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｙ  ａｌａｎｉｎｅ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，”ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５６５：  １９−２２．
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図５−６】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
2010537985.tif 000117
【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
2010537985.tif 000120
【図３１】
2010537985.tif 000121
【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
2010537985.tif 000125
【図３６】
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【図３７】
2010537985.tif 000127
【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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