(57)【要約】  本発明は、乳製品からのアンギオゲニン富化分画の調製方法であって、該方法は乳製品をカチオン交換樹脂に接触させることと、移動相を用いてアンギオゲニン富化分画をカチオン交換樹脂から溶出させることとを含む方法を提供する。本発明は、方法によって製造されるアンギオゲニン富化分画、更にこのようなアンギオゲニンを含む食品製品、栄養補助食品及び医薬品も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳製品からのアンギオゲニン富化分画の調製方法であって、該方法は、
（ａ）乳製品をカチオン交換樹脂に接触させることと、
（ｂ）移動相を用いてアンギオゲニン富化分画をカチオン交換樹脂から溶出させることと、
（ｃ）溶出させたアンギオゲニン富化分画を回収することと、を含み、前記乳製品は段階（ａ）に先立ちカチオン交換クロマトグラフィーに付さない方法。
【請求項２】
前記乳製品は全乳、スキムミルク及びバターミルクからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記カチオン交換樹脂に接触させる乳製品の量は、約１６カラム体積〜約６００カラム体積である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記カチオン交換樹脂に接触させる乳製品の量は、約１６カラム体積〜約１５０カラム体積である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記カチオン交換樹脂に接触させる乳製品の量は、約６８カラム体積である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
段階（ｂ）に先立ちアンギオゲニン低減化ラクトペルオキシダーゼ分画をカラムから流出させる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記アンギオゲニン低減化ラクトペルオキシダーゼ分画は、０．３４Ｍ塩化ナトリウム（２．０％ｗ／ｖ）又はこれのイオン強度等価物を含み、ｐＨが６．５である移動相を用いて溶出させる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記アンギオゲニン富化分画の溶出に先立ち、カチオン交換樹脂を低イオン強度（＜０．３４Ｍの塩又はその等価物）のバッファー又は水で洗うことにより、カラムに残存する乳製品を除去する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記アンギオゲニン富化分画は０．３８〜１．５Ｍ塩化ナトリウム（２．２５〜８．７％ｗ／ｖ）又はこれのイオン強度等価物を含む移動相を用いて溶出させる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記アンギオゲニン富化分画は０．３８〜０．５９Ｍ塩化ナトリウム（２．２５〜３．５％ｗ／ｖ）又はこれのイオン強度等価物を含む移動相を用いて溶出させる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記アンギオゲニン富化分画は０．４３Ｍ塩化ナトリウム（２．５％ｗ／ｖ）又はこれのイオン強度等価物を含む移動相を用いて溶出させる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記アンギオゲニン富化分画はｐＨ４．０〜９．０を有する移動相を用いて溶出させる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記アンギオゲニン富化分画はｐＨ５．５〜７．５を有する移動相を用いて溶出させる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記アンギオゲニン富化分画はｐＨ６．５を有する移動相を用いて溶出させる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記カチオン交換樹脂はセファローズビーズを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記セファローズビーズの粒径は４５〜９００μｍである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記セファローズビーズの粒径は９０〜３００μｍである、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
段階（ａ）の間、前記カチオン交換樹脂を流量約６〜９０Ｌ／Ｌ（樹脂）／時に付す、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
接触流量は約６〜５０Ｌ／Ｌ（樹脂）／時である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
接触流量は約３３Ｌ／Ｌ（樹脂）／時である、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記方法は連続方法又はバッチ方法である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記アンギオゲニン富化分画はアンギオゲニンを２％ｗ／ｗ以上含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記アンギオゲニン富化分画は、組成物中の非アンギオゲニンタンパク質及び／又は塩の量を低減するために更に処理される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法により調製された、アンギオゲニン富化分画。
【請求項２５】
請求項２４に記載のアンギオゲニン富化分画の食品物質又は栄養補助食品の調製における使用。
【請求項２６】
前記食品物質はスポーツ栄養食又は幼児食サプリメントである、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
請求項２４に記載のアンギオゲニン富化分画を含む食品物質又は栄養補助食品。
【請求項２８】
請求項２４に記載のアンギオゲニン富化分画と、医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項２９】
請求項２４に記載のアンギオゲニン富化分画の、ウイルス、バクテリア又は真菌及びそれらの毒素によって起こされる疾病、或いは血管新生の刺激が必要とされる疾病の治療又は予防のための医薬品の調製における使用。
【請求項３０】
請求項２４に記載のアンギオゲニン富化分画の、ヒト粘膜表面の感染を引き起こす病原体を標的とし得る栄養補助食品の成分としての使用。
【請求項３１】
ヒト粘膜表面の感染を引き起こす病原体を標的とする方法であって、請求項２７に記載の栄養補助食品又は請求項２８に記載の組成物の有効量を患者に投与する段階を含む方法。
【請求項３２】
ウイルス、バクテリア又は真菌及びそれらの毒素によって起こされる疾病、或いは血管新生の刺激が必要とされる疾病の治療方法であって、請求項２７に記載の栄養補助食品又は請求項２８に記載の組成物の有効量を患者に投与する段階を含む方法。
【請求項３３】
前記粘膜表面は鼻、目、耳、肺、乳房及び膣からなる群から選択される、請求項３０に記載の使用又は請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は乳製品からアンギオゲニン富化分画を調製するための方法、及びこのような分画の食品添加物及び栄養補助食品としての使用若しくは治療用組成物調製のための使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アンギオゲニンは、血管内皮細胞、大動脈平滑筋細胞、フィブロブラスト等の増殖細胞及び直腸ガン、卵巣ガン、乳ガン等の腫瘍によって生産される分子量１４ｋＤａの非グリコシル化ポリペプチドである。アンギオゲニンは、正常ヒト血漿、ウシ血漿、牛乳、マウス、ウサギ及びブタの血清等、種々の原料から単離されている。
【０００３】
アンギオゲニンは膵臓リボヌクレアーゼの同族体であり、顕著なリボヌクレアーゼ活性を有する。このタンパク質は血管新生能を有するが、このタンパク質によって誘起される血管新生においてアンギオゲニンのリボヌクレアーゼ活性がどのような役割を果たしているかは未だ解明されていない。
【０００４】
正常ヒト血漿のアンギオゲニン濃度は６０〜１２０ｎｇ／ｍＬである。しかし、このタンパク質濃度は種々のガン患者において増加するため、アンギオゲニンを抑制するとヒトの腫瘍成長が抑制されることが知られている。
【０００５】
アンギオゲニンは強力な血管新生刺激剤としてのみならず、他の種々の活性を有する。これらにはシミ等の皮膚トラブルの除去、免疫応答の調節、多形核白血球の自己分解防止及び全身の細菌・真菌性病原体に対する殺菌活性等の能力が含まれる。このタンパク質の知られている生理機能に基づいて、医薬品、ダイエタリー食品サプリメント、化粧品におけるアンギオゲニンの種々の応用が考えられている。
【０００６】
しかし、これら応用におけるアンギオゲニンの使用には、適切な原料から商業スケールで該タンパク質を効率的に調製するための方法が必要である。従って、本発明の好ましい形態の目的は、このような方法を提供することにある。この方法は、ラクトフェリン、ラクトペルオキシダーゼ、成長因子等、乳製品の他の成分を精製するための既存方法の一部として含まれることができる。
【０００７】
本明細書に挙げる特許や特許出願を含む全ての文献については、これらを本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。本明細書では数々の従来技術文献が参照されているとはいえ、そのことは、これら文献のいずれかがオーストラリア或いは他のいずれかの国において当技術分野における共通一般知識の一部となっていることの自認を構成するものではないことは明白であろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明はその第一の態様において、乳製品からのアンギオゲニン富化分画の調製方法であって、該方法は、
（ａ）乳製品をカチオン交換樹脂に接触させることと、
（ｂ）移動相を用いてアンギオゲニン富化分画をカチオン交換樹脂から溶出させることと、及び
（ｃ）溶出させたアンギオゲニン富化分画を回収することと、を含み、前記乳製品は段階（ａ）に先立ちカチオン交換クロマトグラフィーに付さない方法を提供する。
【０００９】
前記乳製品は全乳、スキムミルク、バターミルク、ホエイ又は初乳を含むことができる。カチオン交換樹脂に接触させる乳製品の量は、好ましくは約１６カラム体積（ＣＶ）〜約６００ＣＶ、より好ましくは約１６ＣＶ〜約１５０ＣＶ、最も好ましくは約６８ＣＶである。
【００１０】
第一の態様の実施形態においては、段階（ｂ）に先立ちアンギオゲニン低減化ラクトペルオキシダーゼ分画をカラムから流出させることが好ましい。好ましくは、アンギオゲニン低減化ラクトペルオキシダーゼ分画は、０．３４Ｍ塩化ナトリウム（２．０％ｗ／ｖ）又はこれのイオン強度等価物を含み、ｐＨが６．５である移動相を用いて溶出させる。
【００１１】
第一の態様の更なる実施形態においては、アンギオゲニン富化分画の溶出に先立ち、カチオン交換樹脂を低イオン強度（＜０．３４Ｍの塩又はその等価物）のバッファー又は水で洗うことにより、カラムに残存する乳製品を除去することが好ましい。
【００１２】
第一の態様の更なる実施形態においては、アンギオゲニン富化分画の溶出には、好ましくは０．３８〜１．５Ｍ塩化ナトリウム（２．２５〜８．７％ｗ／ｖ）又はこれのイオン強度等価物、より好ましくは０．３８〜０．５９Ｍ塩化ナトリウム（２．２５〜３．５％ｗ／ｖ）又はこれのイオン強度等価物、最も好ましくは０．４３Ｍ塩化物（２．５％ｗ／ｖ）又はこれのイオン強度等価物を含む移動相を用いる。
【００１３】
さらに好ましい実施形態としては、アンギオゲニン富化分画の溶出には、ｐＨ４．０〜９．０、好ましくは５．５〜７．５、最も好ましくは６．５を有する移動相を用いる。
【００１４】
前記カチオン交換樹脂はセファローズビーズを含むことができる。好ましくは、セファローズビーズは粒径４５〜９００μｍ、より好ましくは９０〜３００μｍを有する。
【００１５】
一実施形態において、第一の態様の方法の段階（ａ）の間、カチオン交換樹脂を流量約６〜９０Ｌ／Ｌ（樹脂）／時、より好ましくは約６〜５０Ｌ／Ｌ（樹脂）／時、最も好ましくは約３３Ｌ／Ｌ（樹脂）／時に付す。
【００１６】
本発明の第一の態様に係る方法は、連続方法でもバッチ方法でもよいが、好ましくは連続方法である。
【００１７】
一実施形態においては、アンギオゲニン富化分画はアンギオゲニンを２％ｗ／ｗ以上、好ましくは１０％ｗ／ｗ以上、より好ましくは２０％ｗ／ｗ以上含む。
【００１８】
更なる実施形態においてアンギオゲニン富化分画は、組成物中の非アンギオゲニンタンパク質及び／又は塩の量を低減するために更に処理される。
【００１９】
本発明はその第二の態様において、本発明の第一の態様に係る方法によって調製されるアンギオゲニン富化分画を提供する。
【００２０】
本発明はその第三の態様において、本発明の第二の態様に従うアンギオゲニン富化分画の、食品物質又は栄養補助食品の調製における使用を提供する。好ましい実施形態においては、この食品物質はスポーツ栄養食又は幼児食サプリメントである。
【００２１】
本発明はその第四の態様において、本発明の第二の態様に従うアンギオゲニン富化分画を含む食品物質又は栄養補助食品を提供する。
【００２２】
本発明はその第五の態様において、本発明の第二の態様に従うアンギオゲニン富化分画と、医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
【００２３】
本発明はその第六の態様において、本発明の第二の態様に従うアンギオゲニン富化分画の、ウイルス、バクテリア又は真菌及びそれらの毒素によって起こされる疾病、或いは血管新生の刺激が必要とされる疾病の治療又は予防のための医薬品の調製における使用を提供する。
【００２４】
本発明はその第七の態様において、本発明の第二の態様に従うアンギオゲニン富化分画の、ヒト粘膜表面の感染を引き起こす疾患を標的とする栄養補助食品の成分としての使用を提供する。好ましい実施形態において、粘膜表面は鼻、目、耳、肺、乳房及び膣の粘膜を含むことができる。
【００２５】
本発明はその第八の態様において、ヒト粘膜表面の感染を引き起こす疾患を標的とする方法であって、本発明の第四の態様に従う栄養補助食品又は本発明の第五の態様に従う組成物の有効量を患者に投与する段階を含む方法を提供する。
【００２６】
本発明はその第九の態様において、ウイルス、バクテリア又は真菌及びそれらの毒素によって起こされる疾病を含む疾病の治療方法であって、本発明の第四の態様に従う栄養補助食品又は本発明の第五の態様に従う組成物の有効量を患者に投与する段階を含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明の方法によって調製される溶出アンギオゲニン富化分画のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電機泳動。
【図２】アンギオゲニン富化分画（図１）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離のゲルデンシトメトリー分析の結果。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明者らは、効率よくアンギオゲニン富化分画を調製せしむる方法の必要性を認識した。従って本発明は第一の態様において、乳製品をカチオン交換カラムに接触させ、更にアンギオゲニン富化分画をカラムから移動相を用いて溶出させる方法を提供する。
【００２９】
「アンギオゲニン富化」とは、溶出分画中のアンギオゲニンタンパク質対総タンパク質の比が、カチオン交換クロマトグラフィーの前の乳製品の同比に対して増加されることを意味する。アンギオゲニンが富化されたと考えられる分画は、アンギオゲニン含有量が２％ｗ／ｗ以上、好ましくは１０％ｗ／ｗ以上、より好ましくは２０％ｗ／ｗ以上である。
【００３０】
本明細書において、「分画」とは、部分的に精製された乳製品の一部分を意味する。
【００３１】
「効率よく」とは、アンギオゲニンを含むタンパク質を富化させるために現在利用されている方法と比べ、安価で迅速な方法に対して使用される。
【００３２】
適切な乳製品としては、全乳やスキムミルク、バターミルク、ホエイ（酸ホエイ、チーズ／レンネットホエイ等）又はホエイ誘導体（ホエイタンパク質濃縮物、ホエイタンパク質アイソレートフロースルー）、初乳等が挙げられる。乳製品は、本発明に係る方法に先立ちカチオン交換クロマトグラフィーに付されることはない。
【００３３】
前記乳製品は、例えばウシ、ヒツジ、水牛、ヤギ、シカ等の反芻動物、ヒト等の霊長類を含む非反芻動物、ブタ等の単胃動物等のいかなる泌乳動物からも得ることができることは、当業者にとっては明らかであろう。ウシ全乳から得られるスキムミルクを本発明方法に用いることが好ましい。
【００３４】
本発明の第一の態様に係る方法には、単一のカチオン交換樹脂若しくはカラムを用いる。種々のタイプのカチオン交換樹脂マトリックスを使用することができ、これらは当技術分野で知られている。これらマトリックスは、例えば、架橋多糖類を基材とする支持体（架橋アガロース（セファロース）やデキストラン（セファデックス）等）や、セルロースを基材とする支持体（ファイバー及びビーズ（セファセル、ジブコＨＢ）、粒子（ジブコＨＧ）、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体（ダウエックス樹脂）等）、ポリアクリルアミドを基材とする支持体（ヒドロキシル化メタクリル酸ポリマー（トーソーＨＷ）等）を含む。
【００３５】
適切な樹脂官能基も当業者には知られており、例えば、スルホプロピル（ＳＰ）、カルボキシメチル（ＣＭ）、オルトホスフェート／リン酸（例えばワットマンＰｌＩ）、メチルスルホネート（Ｓ）、カルボン酸、スルホン酸（５０Ｗ）等が挙げられる。
【００３６】
選択された樹脂は最小ビーズ粒径４５μｍ及び最大粒径９００μｍを有することが好ましい。最適なビーズ粒径は９０μｍ〜３００μｍであろう。
【００３７】
好ましい実施形態において、ＳＰセファロースカチオン交換樹脂ビーズはビーズ粒径４５〜１６５μｍ及び１００〜３００μｍを有していると、アンギオゲニンの吸着及び精製に適する。
【００３８】
通常、樹脂は１０ｃｍ長のカラムに充填される。しかし、カラム長は、得ようとするアンギオゲニンの量によって４ｃｍ〜２００ｃｍの範囲で変更することができる。カラム径も用途に応じて変化させることができる。通常このカラム径は０．９ｃｍ〜２００ｃｍ、最適には６２ｃｍである。樹脂を収容するカラムは、ステンレススチール、プラスチック、ガラス等の適切な材料のいずれかから製作できる。
【００３９】
接触段階において乳製品をカチオン交換カラムに吸着させる際の流量は、方法の規模と使用する乳製品の種類に依存する。流量の下限は工業的な適用に関する対費用効果によって決定され、流量が低すぎると、製造コストが収益を上回る。
【００４０】
好ましい実施形態において、乳製品はスキムミルクである。これをカラムにアプライする際の速度は６〜９０Ｌ／Ｌ（樹脂）／時（ｈ）（線流：６０〜９００ｃｍ／ｈ）である。好ましくは流量６〜５０Ｌ／Ｌ（樹脂）／時（ｈ）（線流：６０〜５００ｃｍ／ｈ）、より好ましくは流量３４Ｌ／Ｌ（樹脂）／時（ｈ）（線流：３３１ｃｍ／ｈ）を採用する。樹脂に接触する乳製品の総量に限界があると仮定すれば、高流量がアンギオゲニンの精製には適している。上述の流量を用い、アンギオゲニンを最適に分画するためには、例えばカチオン交換樹脂に接触するスキムミルクの量は約１６〜６００カラム（ベッド）体積、好ましくは１６〜１５０カラム体積、より好ましくは６８カラム体積であることが判明した。
【００４１】
オ−ストラリア特許第６１３６８８号に記載されるように、乳製品の体積が樹脂の体積をはるかに超えることがラクトペルオキシダーゼやラクトフェリン等の他の乳製品の調製に適している一方で、本発明者らは、樹脂体積に対する乳製品の体積が１０００カラム体積（Ｌ（乳製品）／Ｌ（樹脂））のオーダーでは、本発明方法によるアンギオゲニンの調製には適さないことを見出した。本発明者らは、樹脂体積に対する乳製品の体積が約６００カラム体積を超える場合、アンギオゲニンの樹脂への結合が減少し、回収されるアンギオゲニンが出発材料に対して富化されないことを見出した。従って、本発明における好ましい上限は、スキムミルクの場合約６００カラム体積、好ましくは約１５０カラム体積、最も好ましくは約６８カラム体積である。樹脂に対する乳製品の比が増加するほど、アンギオゲニンの結合及び溶出されるアンギオゲニンの純度が次第に減少する。流量に関しては、下限はカラムに関する因子よりむしろ利益的観点から設定される。もし装荷する乳製品の体積が１６カラム体積を大幅に下回るならば、洗いと溶出の回数が、十分量のアンギオゲニンが精製できてプロセスを経済的に有効なものとする段階を超えるようになってしまう。
【００４２】
乳製品とカチオン交換樹脂との接触によりアンギオゲニンを吸着させる際、原料のｐＨは本発明の方法においては調整する必要はないが、好ましくは約６．５である。
【００４３】
カラムに吸着されたアンギオゲニンの溶出には、イオン強度０．３８〜１．５Ｍの緩衝溶液からなる移動相を用いる。移動相に用いる塩の種類は特に限定されず、当業者には周知であろう。例えば、溶解性で非毒性のバッファーであればどれでも用いることができる。例としては、溶解性のナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム及びリチウムの各塩化物、クエン酸塩、リン酸塩、酢酸塩、硫酸塩、重炭酸塩、水酸化物、イミダゾール塩及びマレイン酸塩が挙げられる。Ｔｒｉｚｍａ、ＨＥＰＥＳ、トリシン等の合成双生イオンバッファーも用いることができる。
【００４４】
イオン強度が０．６Ｍを超えると、非アンギオゲニンタンパク質が溶出し始めるのでアンギオゲニンの純度が減少し、アンギオゲニンは他のタンパク質で希釈される。好ましい実施形態においては、移動相はイオン強度０．３８〜１．５Ｍ（２．２５〜８．７％ｗ／ｖ）、より好ましくはイオン強度０．３８〜０．５９Ｍ（２．２５〜３．５％ｗ／ｖ）の塩化ナトリウムからなる。最も好ましくは、０．４３Ｍ塩化ナトリウム（２．５％）に相当するイオン強度以下を用いる。
【００４５】
移動相のｐＨは広い範囲から選択することができる。例えば、４．０〜９．０、好ましくは５．５〜７．５、最も好ましくは約６．５である。このｐＨの上限及び下限においては、タンパク質の安定性及びタンパク質のカチオン交換樹脂への結合能が共に影響を受けるようになる。５．５〜７．５のｐＨ範囲であれば、アンギオゲニンの収率を下げることなく純度を最大とすることができる。
【００４６】
移動相の体積及び流量も変化させることができる。例えば、樹脂１Ｌに対して１〜２０Ｌのバッファーからなる移動相を用いることができる。好ましくは樹脂１Ｌに対して１〜１０Ｌ、より好ましくは２．５Ｌのバッファーである。移動相は好ましくは６〜９０Ｌ／Ｌ（樹脂）／時（６０〜９００ｃｍ／ｈ）で流通させる。より好ましい流量は６〜４０（６０〜４００ｃｍ／ｈ）、最も好ましくは７．５Ｌ／Ｌ（樹脂）／時（７５ｃｍ／ｈ）の最適線流量である。
【００４７】
本発明の第一の態様に係る方法は、単独でアンギオゲニン富化分画の調製を行うこともでき、また他の所望の乳製品成分が分画される組合せ分画方法の一部として行うこともできる。例えば、カチオン交換カラムからのアンギオゲニン富化分画の溶出に先立ち、アンギオゲニン−低減化ラクトペルオキシダーゼ分画をカラムから溶出させることができる。ラクトペルオキシダーゼ分画の溶出に用いられるバッファーの種類、流量及び体積は通常、前述のようなアンギオゲニン分画の溶出に用いられるものと同様である。しかし、バッファーのイオン強度は異なる。例えば、このバッファーはイオン強度０．２６〜０．４３Ｍ（１．５〜２．５％ｗ／ｖ）の塩化ナトリウムからなることができ、より好ましいイオン強度は０．３〜０．３８Ｍ（１．７５〜２．２５％ｗ／ｖ）である。最も好ましくは、ラクトペルオキシダーゼ溶出用バッファーは０．３４Ｍ塩化ナトリウム（２．０％）と等価なイオン強度を有する。
【００４８】
更に、一旦ラクトペルオキシダーゼ分画及びアンギオゲニン分画が溶出してしまうと、カラムからラクトフェリン分画を溶出させることができる。ここでもラクトフェリン分画溶出用のバッファーの種類、体積及び流量は通常、前述のようなラクトペルオキシダーゼ分画及びアンギオゲニン分画の溶出に用いられるのと同様である。しかし、バッファーのイオン強度は異なる。例えば、このバッファーはイオン強度０．５９〜３．０Ｍ（３．５〜１７．４％ｗ／ｖ）の塩化ナトリウムからなることができ、より好ましいイオン強度は０．６８〜２．０Ｍ（４．０〜１１．７％ｗ／ｖ）である。最も好ましくは、ラクトフェリン溶出用バッファーは１．５Ｍ塩化ナトリウム（８．７５％）と等価なイオン強度を有する。
【００４９】
本発明の第一の態様の更なる実施形態において、カチオン交換カラムに乳製品を装荷する段階に続いて、カラムを低イオン強度のバッファーか水で洗うことによりカチオン交換カラム内の非結合タンパク質を除去することができる。バッファーを用いる場合、そのイオン強度は通常０．３４Ｍ未満、好ましくは０．０５Ｍ未満である。適切なバッファー及びそのｐＨと体積は、前述のようなラクトペルオキシダーゼ、アンギオゲニン、ラクトフェリンの各分画の溶出用と同様である。しかし、洗い落とし用バッファーの流量は好ましくは１５Ｌ／Ｌ（樹脂）／時（１４７ｃｍ／ｈ）である。
【００５０】
本発明方法により調製されたアンギオゲニン富化分画は更に処理されて、非アンギオゲニンタンパク質及び／又は塩を除去することができる。これは、規格食品物質又は栄養補助食品を製造するために、また治療剤を調製するために重要であると考えられ得る。このような段階は膜ろ過により達成できる。理想的には限外ろ過、或いは透析、電気透析、サイズ排除クロマトグラフィー、固相抽出、ナノろ過、他の公知の手段等の当業界で知られている等価な方法である。アンギオゲニン富化保持物が保持され、浸透物は廃棄する。
【００５１】
限外ろ過を選択する場合、膜サイズは好ましくは０．１５〜１０ｋＤａ  ＮＭＷＣＯで、最も好ましくは５ｋＤａ  ＮＭＷＣＯである。
【００５２】
アンギオゲニンは数多くの生理的機能に関与しているので、本発明に係る方法によりこのタンパク質を調製すると、更にこれらの機能を発揮可能なタンパク質の理想的且つ経済的な原料となる。例えば、この精製タンパク質は食品物質又は栄養補助食品の調製に用いることができる。食品物質の典型例としてはスポーツ栄養パウダーであり、これは摂取後の競技能力を向上させる。また、幼児食サプリメントも例として挙げられる。
【００５３】
本明細書において「栄養補助食品」とは、食品から単離・精製される可食製品を意味し、乳製品の場合、経口投与した際に生理的利点を示し、また急性・慢性の疾患又は障害の防止又は軽減を提供することを示す製品である。従って、栄養補助食品は、単独或いは食品・飲料に混合されて、食物製剤又はサプリメントの形態とすることができる。栄養補助食品は、心血管疾患、クローン病、又は非治癒性の障害を伴う状態（潰瘍等）に対して臨床的に好影響を及ぼす。
【００５４】
栄養補助食品組成物は、溶解性粉末、液体又は即席飲料の形態とすることができる。或いは、手軽に食べられるバーや朝食シリアル等の固形物とすることができる。この組成物は種々のフレーバー、ファイバー、甘味料、他の添加物等を含むことができる。
【００５５】
栄養補助食品は、好ましくは許容される官能的性質（許容される香り、味、風味等）を有し、ビタミンＡ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ１１、Ｂ１２、ビオチン、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｈ及びＫ、カルシウム、マグネシウム、カリウム、亜鉛及び鉄から選択される一以上のビタミン及び／又はミネラルを更に含むことができる。
【００５６】
この組成物は患者に経鼻胃管又は空腸管を経由して、或いは患者に飲食せしめることにより投与することができる。
【００５７】
栄養補助食品組成物は従来通りに、例えばタンパク質と他の添加物をブレンドして製造することができる。必要であれば、乳化剤を含ませることもできる。この時点でビタミン及びミネラルを追加することもできるが、通常は熱による変性を避けるために後で加える。
【００５８】
粉末状の栄養補助食品組成物を製造したい場合、タンパク質を粉末状の追加成分と混和することができる。この粉末は水分量約５重量％未満でなければならない。水、好ましくは逆浸透処理済の水を更に混合して混合液体とすることができる。
【００５９】
栄養補助食品組成物を即席液体として提供する場合、バクテリアを低減するために組成物を加熱することができる。液状の栄養補助食品組成物を製造したい場合、液体混合物を好ましくは無菌状態で適切な容器に充填する。容器への無菌充填は当業界で通常可能な技法により行うことができる。この種の無菌充填に好適な装置は市販されている。
【００６０】
本発明方法により調製されるアンギオゲニン富化分画は、患者への投与に好適な医薬組成物として調製することもできる。
【００６１】
好ましくは、本組成物は一以上の医薬的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含むこともできる。このような組成物は、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水等のバッファー；グルコース、マンノース、スクロース、デキストラン等の炭水化物；マンニトール；タンパク質；ポリペプチド又はグリシン等のアミノ酸；酸化防止剤；ＥＤＴＡ等のキレート剤；及び補助剤及び保存剤を含むことができる。本発明の組成物は経静脈投与用、局所適用用、経口摂取用に調製することができる。
【００６２】
このような組成物は、治療及び／又は予防される疾病に対する適切な方法で患者に投与することができる。投与量・回数は、患者の状態、患者の疾病の種類及び／又は重度等の因子によって決定される。適切な用量は臨床試験によって決定することもできる。本組成物の有効量は、患者個々の年齢、体重、疾病の重度、患者の状態、投与経路、患者の治療に関する他の因子全てを考慮して医師によって決定することができる。本質的に、組成物の「有効量」とは、所望の治療効果を得るのに十分な量である。
【００６３】
本発明は他の態様において、疾病の治療及び／又は予防の方法を提供する。このような治療方法は、上述の栄養補助食品又は医薬組成物の有効量を患者に投与することを含む。好ましくは、このような疾病はウイルス、バクテリア又は真菌及びそれらの毒素によって起こされる疾病を含む。しかし、アンギオゲニンは血管新生の役割を担うため、血管新生刺激が必要とされる疾病も本発明のアンギオゲニン含有組成物を用いて治療することができる。これら疾患としては、冠動脈疾患、卒中、虚血性肢疾患、障害治癒の遅延等が挙げられる。
【００６４】
本明細書において特に断らない限り「含む（comprise、comprises、comprising等）」とは、述べられている一構成要素や一完全体、或いは構成要素群や完全体群を含むが、その他の一構成要素や一完全体、或いは構成要素群や完全体群を排除するものではないことを意味すると解釈されたい。
【００６５】
本明細書においては、文脈上明確に断らない限り単数表現（a、an及びtheを伴う）は複数概念も含むことを付記する。
【００６６】
本発明について明確さと理解の目的である種の詳細な説明をしているが、本明細書に開示される発明概念の範囲を逸脱しない限り、記載される実施形態及び方法の変形や改変が可能なことは当業者には明白であろう。
【００６７】
以下、実施例を参照して本発明を更に詳細に説明するが、これは単に説明の目的に提供されるものであって、特に断らない限り本発明は実施例に限定されない。従って、本発明は、ここに提供される教示の結果として明らかとなる全てのいかなる変形例も包含する。
【実施例１】
【００６８】
スキムミルクからのアンギオゲニン富化分画の調製方法
１０ｃｍ長のカラムにＳＰセファロースビッグビーズ（ＧＥヘルスケア）をカラム中の全ベッド体積が２９．７Ｌとなるように充填した。ウシスキムミルクを線流量３３１ｃｍ／ｈ（スキムミルク３４Ｌ／樹脂（１Ｌ）／時）で２時間カラムに流通させ、適用したスキムミルクの体積がカラムに充填した樹脂の６８倍となるようにした。
【００６９】
２．５カラム体積（ＣＶ）の水を線流量１４７ｃｍ／ｈ（バッファー１５Ｌ／樹脂（１Ｌ）／時）、即ち０．２５ＣＶ／ｍｉｎで１０分間加えることにより、カラムに残存するミルクを除去した。
【００７０】
アンギオゲニン低減化ラクトペルオキシダーゼ分画は、２．０％（０．３４Ｍ）ＮａＣｌ相当のナトリウムイオンを含むバッファー（ｐＨ６．５）２．５ＣＶを用いてカラムから溶出させた。このカチオンバッファー溶液は、線流量７５ｃｍ／ｈ（カチオンバッファー溶液７．５Ｌ／樹脂（１Ｌ）／時）、即ち０．１２５ＣＶ／ｍｉｎで２０分間流通させた。最初に樹脂１Ｌ当たり０．５Ｌのカチオンバッファー溶液を廃棄排出し、次の樹脂１Ｌ当たり２．５Ｌのカチオンバッファー溶液を回収してアンギオゲニン低減化ラクトペルオキシダーゼ分画（樹脂１Ｌ当たり０．５Ｌのカチオンバッファー溶液を含む。次のバッファーの適用時間（即ちブレイクスルー時間）は重複する）とした。
【００７１】
アンギオゲニン富化分画は、２．５％ｗ／ｖ（０．４３Ｍ）ＮａＣｌ相当のナトリウムイオンを含むバッファー（ｐＨ６．５）２．５ＣＶを用いてカラムから溶出させた。このカチオンバッファー溶液は、線流量７５ｃｍ／ｈ（カチオンバッファー溶液７．５Ｌ／樹脂（１Ｌ）／時）、即ち０．１２５ＣＶ／ｍｉｎで２０分間流通させた。最初に樹脂１Ｌ当たり０．５Ｌのカチオンバッファー溶液を廃棄排出し、次の樹脂１Ｌ当たり２．５Ｌのカチオンバッファーを回収してアンギオゲニン富化分画（樹脂１Ｌ当たり０．５Ｌのカチオンバッファー溶液を含む。次のバッファーの適用時間は重複する）とした。
【００７２】
最後にラクトフェリン分画を、８．７５％ｗ／ｖ（１．５Ｍ）ＮａＣｌ相当のナトリウムイオンを含むバッファー（ｐＨ６．５）２．５ＣＶを用いてカラムから溶出させる。このカチオンバッファー溶液は、線流量７５ｃｍ／ｈ（カチオンバッファー溶液７．５Ｌ／樹脂（１Ｌ）／時）、即ち０．１２５ＣＶ／ｍｉｎで２０分間流通させた。最初に樹脂１Ｌ当たり０．５Ｌのカチオンバッファー溶液を廃棄排出し、次の樹脂１Ｌ当たり２．５Ｌのカチオンバッファーを回収して ラクトフェリン分画とした。
【００７３】
回収されたアンギオゲニン富化分画は限外ろ過（ＮＭＷＣＯ  ５ｋＤａ）して濃縮し且つ塩分を低減させた。得られら濃縮物を次の使用のために凍結乾燥し、室温で貯蔵した。
【００７４】
アンギオゲニン富化分画のアンギオゲニン含有量をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１）で分析したところ、この分画は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦＭＳによってアンギオゲニンと同定された（結果は示さず）低分子量（１４ｋＤａ）タンパク質（図２）を５７％（タンパク質基準）含むことがわかった。
【００７５】
本アンギオゲニン調製方法を商業目的にスケールアップできることは当業者には明らかであろう。
【図１】
2010508827.tif 000002
【図２】
2010508827.tif 000003
【手続補正書】
【提出日】平成20年9月10日(2008.9.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳製品からのアンギオゲニン富化分画の調製方法であって、該方法は、
（ａ）乳製品をカチオン交換樹脂に接触させることと、
（ｂ）０．３０〜０．３８Ｍ塩化ナトリウム（１．７５〜２．２５％ｗ／ｖ）又はこれのイオン強度等価物の移動相を用いてアンギオゲニン低減化ラクトペルオキシダーゼ分画をカチオン交換カラムから溶出させることと、
（ｃ）移動相を用いてアンギオゲニン富化分画をカチオン交換樹脂から溶出させることと、
（ｄ）溶出させたアンギオゲニン富化分画を回収することと、を含み、前記乳製品は段階（ａ）に先立ち或いは段階（ｃ）の後にカチオン交換クロマトグラフィーに付さない方法。
【請求項２】
前記乳製品は全乳、スキムミルク及びバターミルクからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記カチオン交換樹脂に接触させる乳製品の量は、約１６カラム体積〜約６００カラム体積である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記カチオン交換樹脂に接触させる乳製品の量は、約１６カラム体積〜約１５０カラム体積である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記カチオン交換樹脂に接触させる乳製品の量は、約６８カラム体積である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
前記アンギオゲニン低減化ラクトペルオキシダーゼ分画は、０．３４Ｍ塩化ナトリウム（２．０％ｗ／ｖ）又はこれのイオン強度等価物を含み、ｐＨが６．５である移動相を用いて溶出させる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記アンギオゲニン富化分画の溶出に先立ち、カチオン交換樹脂を低イオン強度（＜０．３４Ｍの塩又はその等価物）のバッファー又は水で洗うことにより、カラムに残存する乳製品を除去する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記アンギオゲニン富化分画は０．３８〜１．５Ｍ塩化ナトリウム（２．２５〜８．７％ｗ／ｖ）又はこれのイオン強度等価物を含む移動相を用いて溶出させる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記アンギオゲニン富化分画は０．３８〜０．５９Ｍ塩化ナトリウム（２．２５〜３．５％ｗ／ｖ）又はこれのイオン強度等価物を含む移動相を用いて溶出させる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記アンギオゲニン富化分画は０．４３Ｍ塩化ナトリウム（２．５％ｗ／ｖ）又はこれのイオン強度等価物を含む移動相を用いて溶出させる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記アンギオゲニン富化分画はｐＨ４．０〜９．０を有する移動相を用いて溶出させる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記アンギオゲニン富化分画はｐＨ５．５〜７．５を有する移動相を用いて溶出させる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記アンギオゲニン富化分画はｐＨ６．５を有する移動相を用いて溶出させる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記カチオン交換樹脂はセファローズビーズを含むものである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記セファローズビーズの粒径は４５〜９００μｍである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記セファローズビーズの粒径は９０〜３００μｍである、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
段階（ａ）の間、前記カチオン交換樹脂を流量約６〜９０Ｌ／Ｌ（樹脂）／時に付す、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
接触流量は約６〜５０Ｌ／Ｌ（樹脂）／時である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
接触流量は約３３Ｌ／Ｌ（樹脂）／時である、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記方法は連続方法又はバッチ方法である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記アンギオゲニン富化分画はアンギオゲニンを２％ｗ／ｗ以上含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記アンギオゲニン富化分画は、組成物中の非アンギオゲニンタンパク質及び／又は塩の量を低減するために更に処理される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法により得られるアンギオゲニン富化分画。
【請求項２４】
請求項２３に記載のアンギオゲニン富化分画の食品物質又は栄養補助食品の調製における使用。
【請求項２５】
請求項２３に記載のアンギオゲニン富化分画を含む食品物質又は栄養補助食品。
【請求項２６】
前記食品物質はスポーツ栄養食又は幼児食サプリメントである、請求項２４に記載の使用又は請求項２５に記載の食品物質又は栄養補助食品。
【請求項２７】
請求項２３に記載のアンギオゲニン富化分画と、医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項２８】
請求項２３に記載のアンギオゲニン富化分画の、ウイルス、バクテリア又は真菌及びそれらの毒素によって起こされる疾病、或いは血管新生の刺激が必要とされる疾病の治療又は予防のための医薬品の調製における使用。
【請求項２９】
請求項２３に記載のアンギオゲニン富化分画の、ヒト粘膜表面の感染を引き起こす疾患を標的とするための栄養補助食品の成分としての使用。
【請求項３０】
前記粘膜表面は鼻、目、耳、肺、乳房及び膣からなる群から選択される、請求項２９に記載の使用。
【国際調査報告】
2010508827.tif 000004
2010508827.tif 000005
2010508827.tif 000006