(57)【要約】  本発明は、細胞生物学及び移植医療の技術分野に関する。また本発明は、生物サンプルを迅速かつ非侵襲的に分析又はコントロールするための装置及び方法、特に無菌コントロールするための、生物サンプル中に含有されている感染粒子及び微生物を特徴付けるための、かつ組織細胞ならびに移植片を特徴付けるための装置及び方法に関する。本発明の主な適用分野は、薬理学的活性物質及び治療剤のバイオテクノロジーによる生産ならびに移植医療である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の工程：
−  サンプルホルダーユニットに生物サンプルを固定し、
−  生物サンプル中に場合により含まれている粒子を、生物サンプル及び／又はその中に含まれている粒子の顕微鏡写真の画像データの分析によりカテゴリー化し、かつ
−  生物サンプルの範囲内に位置可能な測定ゾーン内で、生物サンプルをラマン分光分析する
を含む、液体中の生物サンプルを光学−分光分析する方法において、
−  測定ゾーンは、確立された判断基準によるカテゴリー化の結果に基づき、生物サンプルの特定の箇所又は粒子に自動的に位置し、かつラマン分光分析は、この測定ゾーンの範囲に限定される
ことを特徴とする、液体中の生物サンプルを光学−分光分析する方法。
【請求項２】
測定ゾーンは、所定のカテゴリーに属するサンプル中に存在する少なくとも１つの粒子上に位置する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
粒子のカテゴリー化は、"生物細胞"と"非生物細胞、人工産物"のカテゴリーで行われる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
"生物細胞"のカテゴリー内でのカテゴリー化は、"細菌細胞、真菌細胞、細菌胞子、真菌胞子"及び"（ヒト）組織細胞" のカテゴリーで行われる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
"（ヒト）組織細胞"のカテゴリー内でのカテゴリー化は、"生細胞"と"死細胞"のカテゴリーで行われる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
"（ヒト）組織細胞"のカテゴリー内でのカテゴリー化は、"分化細胞"と"脱分化細胞"のカテゴリーで行われる、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
ラマン散乱放射線のスペクトル分析は：
−  測定ゾーン内で、複数の直線励起ゾーン[i・・・i＋n]の形で励起放射線を連続的に生物サンプルに集束すること
により行われる、請求項１から６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ラマン散乱放射線の位置分解スペクトル分析は、
−  二次元CCDアレイ検出器による位置分解スペクトル分析により行われ、その際、CCDアレイの１次元では、直線励起ゾーンiは、その長手方向の範囲に沿った正しい位置に結像され、かつCCDアレイの２次元では、前記励起ゾーンの長手方向の範囲に沿った各ポイントからラマン散乱放射線のスペクトル分布を結像し、かつ局所的ラマンスペクトルを位置分解により記録すること
により行われる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
−  第一の測定サイクルでは、局所的ラマンスペクトルの第一の群は、第一の励起ゾーンi内で記録され、
−  後続の第二の測定サイクルでは、測定サイクルの間に、励起放射線の線状焦点を測定ゾーンに固定した生物サンプルに対して第一の位置から第二の位置に移動させることにより、局所的ラマンスペクトルの第二の群は、第一の励起ゾーンiに位置的に隣接する第二の励起ゾーンi＋１で記録され、
−  位置的に隣接する励起ゾーンi＋nを繰り返す更なる測定サイクルにおいて、全ての励起ゾーン[i・・・i＋n]の局所的ラマンスペクトルの群を、測定ゾーンに固定した生物サンプルの位置分解スペクトル分布パターンの全ての画像にまとめる（ラインスキャン）、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
更に工程：
−  測定ゾーンで分析した生物サンプル又は粒子を次のように特徴付ける：少なくとも１つのラマンスペクトルからの一般的な特有値を決定し、かつ決定した一般的なスペクトル特有値を記憶したスペクトル特有値と比較する
を含む、請求項１から９までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
更に工程：
−  測定ゾーンで分析した生物サンプル又は粒子を次のように特徴付ける：
顕微鏡写真画像データから一般的な特有値を決定し、かつ決定した画像特有値を記憶した画像特有値と比較する
を含む、請求項１から１０までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
確立した判断基準によって決定した特有値を比較することにより、生物サンプル又はこの中に含まれている粒子の特徴付けを次のもの：属、種、分化度、活力及び化学組成物から選択されるパラメーターで行う、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
生物サンプルの可逆的固定を次の：
−  生物サンプルをサンプルホルダーユニットに流過させ、その際、生物サンプル中に場合により含まれている粒子が測定ゾーン内に保持され、かつそこに少なくとも分析の間に、可逆的に固定され、この場合に生物サンプルは生物学的液体であり、かつサンプルホルダーユニットを流体セルとして構成する
ように行う、請求項１から１２までのいずれか１項に記載の、又は請求項１の前提部分に記載の方法。
【請求項１４】
流体セル中の粒子は、１つ以上の穿孔を有する流体セル内に配列された少なくとも１つの多孔板により保持される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
生物学的液体からの粒子は、場合により一時的に多孔板の反対側の"下側"の方向に向けて、動圧及び／又は静圧勾配をかけることにより、多孔板の"上側"に固定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
多孔板の個々の穿孔に、正確に個々の粒子が固定される、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
更に次の工程：
−  分析すべき粒子を次のように予備選択する：流体セル内で、流れ方向で互いに連結され、種々の穿孔直径を有する複数の多孔板において、粒子をその大きさに応じて分ける
を含む、請求項１３から１６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
次の工程：
−  決定したスペクトル特有値及び／又は画像特有値を用いて生物学的液体中に場合により存在する汚染を検出し、その際、特有値の十分な一致は、生物学的液体中の感染粒子の存在を証明し、かつ特有値の一致に欠ける場合には、生物学的液体の汚染の不在が証明される
を含む、請求項１３から１７までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
励起放射線は、７８５±６０nm又は２５０±５０nmの波長を有する、請求項１から１８までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
次のもの：
−  測定ゾーン内の生物サンプルを固定するためのサンプルホルダーユニット；
−  測定ゾーン内の励起ゾーンで励起放射線によりラマン散乱放射線を励起するために適切な励起放射線ユニット、及び
−  生物サンプルの励起ゾーン内で放射されたラマン散乱放射線のスペクトル分析に適切な分析ユニット
を含む生物サンプルを光学−分光分析するための装置において、
−  生物サンプルは生物学的液体であり、かつ
−  サンプルホルダーユニットは生物サンプルが流過することができる流体セルであり、その際、前記流体セルは、流体セルの測定ゾーン内の生物サンプル中に場合により含まれている粒子を保持し、かつ一時的に可逆的に固定するために適切な媒体を有する
を特徴とする、生物サンプルを光学−分光分析するための装置。
【請求項２１】
流体セルは、流体セル中の粒子を保持するための媒体として、第一の直径で１つ以上の穿孔を有する少なくとも１つの第一の多孔板を有する、請求項２０に記載の装置。
【請求項２２】
第一の直径は１μm以下である、請求項２１に記載の装置。
【請求項２３】
流体セルは、第二の直径で１つ以上の穿孔を有する第二の多孔板を有し、その際、第二の多孔板は、流体セルを通る生物学的液体の流れ方向で、第一の多孔板の上流に配置され、かつその際に、第二の直径は第一の直径よりも大きい、請求項２０又は２１に記載の装置。
【請求項２４】
第二の直径は２〜６μmである、請求項２３に記載の装置。
【請求項２５】
多孔板の複数の穿孔は規則的な構造で配置されている、請求項２１から２４までのいずれか１項に記載の装置。
【請求項２６】
流体セルは、流体セル内で粒子を保持するための媒体として、少なくとも１つのミクロ流体流路を有する、請求項２０から２５までのいずれか１項に記載の装置。
【請求項２７】
流体セルは、少なくとも励起ゾーンの範囲内で次のもの：
ケイ酸塩ガラス、石英ガラス、シリコン、二酸化ケイ素、窒化ケイ素、フッ化カルシウムガラス、フッ化バリウムガラス、セレン化亜鉛ガラス、硫化亜鉛ガラス及びゲルマニウムガラス
から選択される放射線透過材料を有する、請求項２０から２６までのいずれか１項に記載の装置。
【請求項２８】
更に次のもの：
−  直線励起ゾーンの形で、流体セル内に保持された粒子上で励起放射線ユニットの励起放射線を集束するための直線集束ユニット
を含んでいる、請求項２０から２７までのいずれか１項に記載の装置。
【請求項２９】
直線集束ユニットは、その長手方向の範囲にわたり、保持された粒子上で直線励起ゾーンを移動するために適切であるスキャナーユニットを更に有している、請求項２８に記載の装置。
【請求項３０】
次のもの：
−  保持された粒子を画像顕微鏡分析するために適切な顕微鏡ユニット、その際、保持された粒子の光学画像は、画像記録系において結像される
を含んでいる、請求項２０から２９までのいずれか１項に記載の装置。
【請求項３１】
顕微鏡ユニットは、位相差顕微鏡／透過型蛍光顕微鏡である、請求項３０に記載の装置。
【請求項３２】
分析ユニットは次のもの：
−  ラマン散乱放射線の位置分解による電気的検出に適切な二次元CCDアレイ；
−  生物サンプルの励起ゾーン内で放射されたラマン散乱放射線のスペクトル分離に適切な光回折格子、及び
−  一次元では励起ゾーンがその長手方向の範囲に沿って正しい位置で結像され、かつ二次元では各ポイントからのスペクトル分布が励起ゾーンの長手方向の範囲に沿って結像されるように、CCDアレイにおいて励起ゾーンからスペクトル分離したラマン散乱放射線の位置分解結像に適切な光学装置
を含んでいる、請求項２０から３１までのいずれか１項に記載の装置。
【請求項３３】
分析ユニットは、レンズベースのラマン分光器として構成される、請求項２０から３２までのいずれか１項に記載の装置。
【請求項３４】
分析ユニットは、２００〜３５００cm-1の領域内で、ラマン散乱放射線に最適な検出感度を有する、請求項２０から３３までのいずれか１項に記載の装置。
【請求項３５】
次のもの：
−  決定した特有値と記憶した特有値を比較し、かつ特有値の比較結果を決定するために、分析ユニットにより記録したラマンスペクトルの特有値を決定するために適切なコンピューター装置；
−  記憶した特有値、決定した特有値及びコンピューター装置の特有値比較の結果を記憶するために適切なメモリー素子、及び
−  特有値比較の結果を表示するために適切な表示素子
を含んでいる、請求項２０から３４までのいずれか１項に記載の装置。
【請求項３６】
無菌及び汚染に関して生物学的液体を非侵襲的、非破壊的にコントロールするための、請求項１から１９までのいずれか１項に記載の方法、又は請求項２０から３５までのいずれか１項に記載の装置の使用。
【請求項３７】
液体中に含まれている生物細胞を非侵襲的、非破壊的に特徴付け又は類型化及び／又は選択するための、請求項１から１９までのいずれか１項に記載の方法、又は請求項２０から３５までのいずれか１項に記載の装置の使用。
【請求項３８】
液体中に含まれている生物細胞の分化状態を非侵襲的、非破壊的に特徴付けるための、請求項１から１９までのいずれか１項に記載の方法、又は請求項２０から３５までのいずれか１項に記載の装置の使用。
【請求項３９】
組織又は組織部分を非侵襲的、非破壊的に特徴付け又は類型化するための、請求項１から１９までのいずれか１項に記載の方法、又は請求項２０から３５までのいずれか１項に記載の装置の使用。
【請求項４０】
同種間の又は自己移植片を非侵襲的、非破壊的に特徴付又は類型化するための、請求項１から１９までのいずれか１項に記載の方法、又は請求項２０から３５までのいずれか１項に記載の装置の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞生物ならびに移植医療の技術分野に関する。本発明は、生物サンプルを迅速かつ非侵襲性的に分析又はコントロールするための装置及び方法、特に無菌コントロールのため、生物サンプル中に含まれている感染粒子及び微生物を特徴付けるための、及び組織細胞及び移植片を特徴付けるための装置及び方法に関する。本発明の主な適用分野は、薬理学的活性物質及び治療剤のバイオテクノロジーによる生産ならびに移植医療である。
【０００２】
本発明の１つめの態様は、特に移植医療における汚染及び品質コントロールに関する。器官に類似した組織培養、例えば、皮膚又は軟骨移植による器官欠損症の個々の治療では、生物学的移植片の病原菌が無いことが移植の公開に法的に規定されている前提条件である。細菌や真菌のような汚染微生物の検出は、公知の検出法では時間的な遅れを伴ってのみ可能である。従って、生物学的移植片の無菌もしくは汚染コントロールは、従来公知の方法で検査すべき液体の押捺標本及び塗抹標本により行われ、かつ引き続きインキュベートされる。この場合の欠点は、一部は緩慢にしか成長しない病原菌である汚染微生物の特徴付けを含む分析結果が、患者に移植する生物学的移植片を剥離してから約２週間後にしか入手できないことである。よって、検出された汚染に対する相応の治療工程として、例えば特異的抗体治療だけが開始できる。従って、生物学的移植片の汚染を短時間で敏感にかつ選択的に検出できる手段と方法が望ましく、かつ存在する汚染微生物を特徴付け、かつ場合により同定することができる。
【０００３】
生物学的移植片、組織調製物又は移植片を品質コントロールするために、移植片を使用する前ならびに培養の間にも、移植片の培養組織細胞、例えばヒト軟骨細胞を特徴付けることができるのが望ましい。細胞の分化度及び／又は活力は、優先的に決定すべきである。これは（自己由来の）ヒト細胞からの移植片の場合には、特に著しく重要である。それというのも、これらの細胞は培養の際に脱分化し得るため、この場合に、これらの細胞はそれらの組織特異性及び治療に望ましい特性を失ってしまうからである。このため移植片の品質が減少してしまう。更に、脱分化した細胞は、しばしば増殖速度が増す傾向があり、この理由でこれらは潜在的な癌細胞としてみなされる。従って、組織細胞と組織の細胞外マトリックスを特徴付け、かつ類型化する手段と方法、ひいては生物学的移植片を品質コントロールするための方法と手段が望ましい。
【０００４】
生物学的移植片の品質コントロールは、現在では法的に一様に規定されていない。それというのも、種々の組織細胞タイプにゴールデンスタンダードとして等しく適用できる公知の方法が無いからである。その品質が使用される抗体の特異性に殆ど依存する免疫細胞学的方法が使用されているが、これを基準化又は標準化できないことが公知である。生物材料を特徴付ける公知の方法は、検査細胞の再利用を不可能にする"侵襲的"方法である。例えば、公知のフローサイトメトリーでは、細胞は特定の表面分子の発現により特徴付けられる（CD抗原試験）。この手順の欠陥により、培養組織の一部だけが移植用の生物学的移植片として提供できる。他の部分は、細胞の侵襲的特徴付けにとって"犠牲的"であるべきである。従って、検査すべき細胞の非侵襲的、非破壊的な生物学的特徴付けを、可能な限り液体培地で行うことができる手段と方法が望ましい。また、測定の際に組織への負担が最小限になることが望ましい。
【０００５】
本発明のもう１つの態様は、主にバイオテクノロジーによる方法により薬剤又は活性物質を製造する際の無菌コントロールに関する。このような方法では、活性物質は生物細胞又は細胞系、例えば、バイオリアクター内の微生物及び／又はいわゆる組織細胞により生産される。工業的規模では、５０リットル以上の体積を有するバイオリアクターが使用される。活性物質の回収には、しばしば反応器内で数週間の培養時間を必要とする。生産チェーンで、大抵のバイオリアクターは多工程の精製に連結していて、これから最終的に所望の活性物質組成物を得ることができる。
【０００６】
従って、反応器装入物中には外来の汚染が何も生じず、かつバイオリアクターから回収された活性物質組成物の無菌が保証されるのが重要である。公知の方法では、反応器培養の開始時と終了時又は生産チェーンの終了時に、外部汚染と無菌に関して装入物が検査される。汚染が確認された場合には、生成物の全体積を捨てなくてはならない。
【０００７】
公知の無菌試験では、生物サンプルを少量の液体の形で運転生産プロセスから取り出し、通常の微生物学的方法により栄養培地において培養し、次に分化して汚染のタイプを決定する。結果は、数日遅れて漸く予測できる。プロセスへの法的な介入の可能性が制限されることが欠点である。殆どの場合には、製造プロセスの継続に用いられる資源は、液体サンプリングの取り出しの時点と、汚染の陽性検出の時点の間に少なくとも失われてしまう。
【０００８】
製法を改善するため、かつコストを回避するために、全体の生産プロセスの際及び／又は全体の生産チェーンに沿って、全体の培養時間にわたり無菌又は汚染に関して連続的に試験する必要がある。短い検出時間を提供する迅速な検出法と、このような方法を行う手段が望ましい。同時に、高い特異性と感度が存在すべきである。有利には、このような検出法は汚染の種類を明確に証明するために、すなわち特に汚染微生物を決定するために適切である。失われたその他の資源のコストを節約する他に、時間の節約がこれに関連することになる。それというのも、汚染されたプロセスは素早く中止され、かつ適時に新たなプロセスが開始するからである。
【０００９】
ラマン分光法は、これまでに殆どの化学分析と表面解析に使用されてきた公知の方法である。この方法は生物サンプルの特徴付けならびに生物学的液体の検査にも益々使用されている。生物サンプルの照射を特定の波長又は波長領域の励起放射線で行う場合には、弾性及び非弾性散乱プロセスの両方がサンプル中の照射分子において生じる。放射された励起光の主なフラクションはサンプル中で弾性的に散乱する（主にいわゆるレイリー散乱）。更に、より小さな程度の非弾性散乱が分子において生じる（いわゆるラマン散乱放射線）。ラマン散乱放射線は、エネルギー含有量、放射された励起放射線からの波長が異なる。ラマン散乱放射線は、短波長にシフトしたフラクション（反ストークス線）と、長波長のフラクション（ストークス線）の両方を有する。長波長にシフトしたラマン散乱放射線のフラクションのスペクトル分布は、通常はラマンスペクトルとして解釈される（ストークス線）。ラマンスペクトルは、照射されたサンプルの照射分子又は分子組成物にとって殆どの特徴である。とりわけ統計的アルゴリズムに基づく方法を用いると、このようなスペクトルを場合により照射サンプルの特定の分子に明確に割り当てることができるので、分子組成物、生物細胞、細胞コンパートメント及び細胞より小さな構造を特徴付け、かつ場合により特定することができる。
【００１０】
WO 2004/099763A1からは、ラマン分光法を使用して生物細胞を検査かつ分析することが公知であり、その際、検査すべき微生物が培養され、単離され、励起放射線で放射され、かつ細胞から放射されたラマン散乱放射線が分光分析される。照射されたラマン散乱放射線を記録したスペクトル分布からは、統計分析により個々の微生物に特徴的な特有値により、例えば、スペクトル中の特定のバンドが記録され、かつデータベースに記憶された公知の微生物の相応する特有値と比較される。この分析法は侵襲性である。それというのも、検査すべき微生物は細胞組合せ物から抽出され、かつ調製されるからである。分析細胞の再培養は規定されていない。
【００１１】
この方法での欠点は、侵襲的アプローチであり、これは分析した細胞の破壊につながる。更なる欠点は公知のラマン分光法と関連する長い測定時間である。
【００１２】
従来技術から出発して、本発明の根底にある技術的問題は、特に生物サンプル、有利には、細胞組合せ物、組織、細胞懸濁液又は生物学的液体中の生物細胞の取り扱いやすく、迅速に、非侵襲的で非破壊的に検出及び特徴付ける手段と方法を提供することにある。
【００１３】
光学−分光学的原則に基づき、かつ少なくとも以下の工程を含む生物サンプルを分析する方法の提供により、本発明はその根底にある技術的問題を解決した：
有利には液体又は殆ど液体サンプル（生物学的液体）として存在するか又は用意された生物サンプルを、サンプルホルダーユニットに有利には可逆的に、すなわち再び除去できるように、かつ非侵襲的に固定し、すなわち固く留め；生物サンプル中に場合により含まれている粒子を次のようにカテゴリー化する：生物サンプル及び／又はサンプル中に含まれている粒子を顕微鏡写真により記録し、かつ自動パターン認識法を用いて画像データを分析し；かつ前記生物サンプルを、とりわけ有利には生物サンプルの範囲内に位置可能な測地ゾーン内でラマン分光分析するが、これは、励起放射線の集束により測定ゾーン内でラマン散乱放射線を励起もしくは発生させ、かつ測定ゾーン内の生物サンプルから放射されたラマン散乱放射線を検出し、かつラマン散乱放射線のスペクトル分布を分析し、その際に、生物サンプルの少なくとも１つのラマンスペクトルが得られることにより行われる。
【００１４】
この方法は、確立された判断基準に倣った顕微鏡写真によるカテゴリー化の結果により、測定ゾーンが生物サンプルの特定の箇所又は粒子に自動的に置かれ、かつラマン分光分析が自動的に置かれた少なくとも１つの測定ゾーンに限定される事により、本発明によって特徴付けられる。
【００１５】
本発明は、生物サンプルのラマン分光分析を、所定のカテゴリーに属していて、場合によりそこに空間的に存在する粒子に限定することを提唱する。これは、測定ゾーンを生物サンプルの特定の粒子上にその都度自動的に置き、かつそこでラマン分光分析を行うことにより本発明により有利に実施される。カテゴリー化を制御した測定ゾーンの位置調整は、サンプル及び／又は他のカテゴリー判断基準の他の領域に関しても有利な変法で数回繰り返される。
【００１６】
本発明の範囲内では、"生物サンプル"とは別々の又は細胞組合せ物の形の、１つ以上の生物細胞、組織、移植片、インプラント、器官−及び組織−代用調製物、ならびにそれらの部分を意味すると解釈される。ここでは、生物細胞として、とりわけ動物及びヒトの細胞、例えば、組織細胞、胚細胞又は幹細胞、細菌細胞及び細菌胞子、マイコプラズマ、真菌細胞、菌糸及び真菌胞子が該当する。この場合に、生物サンプルは必ずしもこのような細胞を含有している必要は無く、生物サンプル中に潜在的に含まれている細胞の検出は本発明の１つの対象である。生物サンプルは、少なくとも１つの生物細胞が潜在的に含まれている組成物である。これは、臨床サンプル、生検材料、ならびに組織、移植片、器官−及び組織−代用調製物からの液体及び殆どが非液体の生物サンプル及びそれらの部分ならびに無菌濾過の残留物も意味すると解釈される。
【００１７】
本発明の範囲内では、"粒子"とは生物サンプル中に、例えば液体の形で存在し得る生物細胞又は生物細胞の一部を意味すると解釈される。"粒子"とは、生物サンプル中、特に細胞組合せ物、組織、移植片、移植片、器官−及び組織−代用調製物又はこれらの部分内に存在し得る全ての個別化可能もしくはカテゴリー化可能な細胞又は細胞フラグメントを意味するとも解釈される。
【００１８】
本発明の範囲内の"生物学的液体"とは、生物サンプルの特殊な形であると解釈され、潜在的に滅菌されていないか又は生物細胞で汚染された流体又は懸濁液を意味し、特にこれらは生物細胞の培養の状況で生じる。このような生物学的液体中に存在する生物細胞は、汚染物だけではなく、培養された生物細胞、例えば、組織細胞も意味すると解釈される。従って、細胞は細胞組合せ物もしくは組織として又は細胞懸濁液として培養される。生物学的液体は、有利には次のものから選択される：とりわけ生物学的に生産される製剤学的活性物質又は活性物質組成物、バイオファーメンターの培地、臨床サンプル、例えば血液、尿、液体、髄液、血漿、血清、リンパ、硝子体液、粘膜粘液、気管支洗浄液及びそのようなもの、ならびに液体培地及び組織培養の上澄液、生物移植片の培養物、器官−及び組織−代用調製物、これには特に輸送媒体、解凍媒体、洗浄媒体及び貯蔵媒体が含まれる。
【００１９】
本発明は、顕微鏡写真画像分析と分光分析法を組み合わせ、顕微鏡により分析すべきサンプル領域のターゲットを絞って、かつ意図的に減らすことにより、著しい時間の獲得を可能にする。生物サンプルの顕微鏡写真画像分析によるカテゴリー化により、時間的に集中した生物サンプルのラマン分光分析をサンプルの特定の測定ゾーンに空間的に限定できる。これにより全体の分析時間は、公知の方法よりも相当に短くなる。適用分野に応じて、測定時間（生物サンプルを導入してから測定データを獲得し終わるまで、又は分析結果を獲得し終わるまでの時間）は、４８時間、２４時間及び１２時間まで短くなる。
【００２０】
この場合に、有利には予め確定した判断基準により、測定ゾーンの選択が自動的に行われることを提唱する。その際、この選択は、その都度の分析で実質的に関心のある側面に向けて行われる：分析の問題提起が主に病原菌を含有するサンプルの汚染のコントロールに向けられる場合には、細菌及び真菌細胞又は真菌胞子のような顕微鏡画像で検出された病原菌のカテゴリー化による予備選択は、このような病原菌にターゲットを絞った分光分析を可能にする。
【００２１】
分析の問題提起が主に組織細胞の活力又は分化段階の特徴付けに向けられる場合には、顕微鏡画像で検出された組織細胞、例えば軟骨細胞のカテゴリー化による予備選択は、ラマンスペクトログラムの特異的な特有値を用いて認識可能な"活力マーカー"又は"組織型マーカー"に関して、これらの細胞のターゲットを絞った分光分析を可能にする。
【００２２】
粒子の電子顕微鏡写真によるカテゴリー化は、有利には"生物細胞"と"非生物細胞、人工産物"のカテゴリーで行われる。"生物細胞"のカテゴリーでのカテゴリー化は、有利には"細菌細胞"、"真菌細胞"、"細菌胞子"、"真菌胞子"及び"（ヒト）組織細胞"のカテゴリーで行われる。"（ヒト）組織細胞"のカテゴリーでのカテゴリー化は、有利には"生細胞"と"死細胞"のカテゴリーで、かつ／又は有利には"分化細胞"と"脱分化細胞"のカテゴリーで行われる。
【００２３】
ラマン散乱放射線を発生させるために、近赤外線、有利には７８５±６０nmの波長、又は２００±５０nmのUV領域の波長を有する励起放射線が使用される。
【００２４】
直線励起ゾーンの形で集束した励起放射線を、固定した粒子上で分析の間に有利には徐々に移動することが提唱される。各工程の後に、新たな測定サイクルを行うのが有利である。励起ゾーンから記録されたラマンスペクトルの個々の連続的測定サイクルで得られた分析データは、引き続き局所的ラマンスペクトルの位置分解画像と組み合わされる。このために、ラマン散乱放射線の位置分解スペクトル分析は、励起ゾーンのラマン散乱放射線をスペクトルにより分離し、かつ二次元CCDアレイ検出器を用いて検出することによって有利に本発明により行われる。
【００２５】
従って、本発明は生物サンプル上の測定ゾーン内で、複数の直線励起ゾーン[i・・・i＋n]の形で励起放射線を連続的に集束することにより、ラマン散乱放射線のスペクトル分析を実施することを提唱する。スペクトル分析の測定時間は、直線集束により更に短くなる。なぜならば、励起ゾーンの延長線に沿って、平行検出と複数の局所的ラマンスペクトルの記録が同時に可能であるからである。
【００２６】
従って、ラマン散乱放射線のスペクトル分析は、有利には二次元CCDアレイ検出器を用いて、位置分解スペクトル分析により行われ、その際、CCDアレイの１次元では、（１番目の）直線励起ゾーンiは、その長手方向の範囲に沿った位置に正確に結像され、かつCCDアレイの２次元では、この（１番目の）励起ゾーンの長手方向の範囲に沿った各ポイントからラマン散乱放射線のスペクトル分布を結像し、かつ局所的ラマンスペクトルを位置分解によって分け、記録することにより行われる。
【００２７】
全体の測定ゾーンの位置分解スペクトル分析は有利には反復過程で行われ、その際、第一の測定サイクルでは、局所的ラマンスペクトルの第一の群が第一の励起ゾーンiで記録され、かつ後続の第二の測定サイクルでは、第一の励起ゾーンiに位置的に隣接する第二の励起ゾーンi＋１の局所的ラマンスペクトルの第二の群が記録される。このために、測定サイクルの間に励起放射線の線状焦点は、測定ゾーン内に固定された生物サンプルに対して、第一の位置から第二の位置まで移動する。更なる測定サイクルは、更に位置的に隣接する励起ゾーンi＋nでも繰り返され、その際、測定サイクルの間に線状焦点は常に次の位置に導かれる。この場合に、全ての励起ゾーン[i・・・i＋n]の局所的ラマンスペクトルの群は、測定ゾーンに固定された生物サンプルの位置分解スペクトル分布パターンの全体の画像に合成される（ラインスキャン）。
【００２８】
本発明は、粒子の顕微鏡画像データにより、個々の粒子を局所化し、特徴付け、かつ場合によりサンプル比較により同定することを提唱する。記録した画像データは有利には幾何学的に分析され、この場合に画像の特有値が得られる。画像分析は自体公知の方法で、有利にはソフトウェアにより構築された機能検出器とサンプル認識により行われる。特に画像の特有値から粒子の第一のカテゴリー化又は類型化が行われる。
【００２９】
また画像データを、このように局所化した粒子に平行して記録した局所的ラマンスペクトルと相関させることを提唱する。光学的に局所化した粒子のラマンスペクトルを粒子の特徴付けに使用するのが有利である。従って、有利には個別化した特徴付け、及び場合により粒子の特徴的ラマンスペクトルをベースとする同定は、特徴的形態学に基づき、有利には画像分析とスペクトル分析から得られた結果を組み合わせて特徴付け、規定しかつ同定される。
【００３０】
得られた顕微鏡画像データと、少なくとも１つのラマンスペクトルから、少なくとも１つの更なる工程において測定ゾーンで分析した生物サンプル又は粒子が有利に特徴付けられる。これは、少なくとも１つのラマンスペクトルからの一般的な特有値を決定し、かつ決定した一般的なスペクトル特有値と記憶された公知のスペクトル特有値を比較することにより、有利な変法で行われる。もう１つの有利な変法では、顕微鏡写真画像データから一般的な特有値を決定し、かつ決定した画像特徴を記憶されている公知の画像特徴と比較することにより特徴付けが行われる。もう１つの他の有利な変法では、スペクトル特有値と画像特有値の特有値比較の結果を組み合わせることにより特徴付けが行われる。
【００３１】
予め確定された判断基準により、決定した特有値の比較から、生物サンプル又はこの中に含まれている粒子の特徴付けが有利に行われる。特徴付けの有利なパラメーターは：属、種、分化度、活力及び化学組成物である。
【００３２】
第二の態様では、本発明は少なくとも以下の工程を含む生物学的液体を分析するための光学−分光法を提供する：生物サンプルを、サンプルホルダーユニットに有利には可逆的に固定し；生物サンプル中に場合により含まれている粒子を次のようにカテゴリー化する：生物サンプル及び／又は含有粒子を顕微鏡写真により記録し、かつ自動パターン認識法を用いて画像データを分析し、かつ生物サンプルの範囲内に位置可能な測定ゾーン内の生物サンプルのラマン分光分析を次のように行う：測定ゾーン内の励起放射線の集束によりラマン散乱放射線を励起し、かつ測定ゾーン内の生物サンプルから放射されたラマン散乱放射線を検出し、かつラマン散乱放射線のスペクトル分布を分析し、その際に、生物サンプルの少なくとも１つのラマンスペクトルが得られる。この方法は次のことによって特徴づけられる：生物サンプルの可逆的固定が、サンプルホルダーユニットを生物サンプルが流過するか又はそこで注入されることにより行われ、この場合に、生物サンプル中に場合により含まれている粒子が測定ゾーン内に保持され、かつそこで少なくとも分析の間は可逆的に固定される。従って、本発明によれば、生物サンプルは生物学的液体であり、かつサンプルホルダーユニットをいわゆる流体セルとして構成することが提唱される。
【００３３】
流体セル内で粒子は生物学的液体で濯がれ、かつそこで流体セル内の適切な媒体により保持又は固定される。本発明は、ラマン分光法により、有利には更に光学顕微鏡により、好ましくはDIC（differential interphase contrast）として流体セル内に保持もしくは固定された粒子を検出し、かつ有利に特徴付けることを提唱する。
【００３４】
更に流体セル内で粒子を予備カテゴリー化する方法も提唱される。これは有利には次にように行われる：流体セルに流れ方向で連続的に連結され、種々の穿孔直径を有する複数の多孔板にて、大きさに応じて粒子を分ける。従って、該方法は、予備選択の分光分析を行う前、後又は同時に、各サンプル範囲又は粒子の準２工程又は多工程の予備選択もしくは予備選定を提供する。すなわち本発明の有利な変法では、第一工程で大きさに応じて予備選択が行われ、かつ最後の工程でカテゴリーに応じて選択が行われる。
【００３５】
もう１つの有利な工程では、場合により存在する生物学的液体の汚染の検出は、本発明により決定したスペクトル及び／又は画像特有値により行われ、その際、特有値が十分に一致する場合には、生物学的液体中の感染粒子の存在が証明され、かつ特有値の一致に欠ける場合には、生物学的液体の汚染の不在が証明される。
【００３６】
従って、本発明は次のことを提唱する：流体セルに、分析すべき生物学的液体を流過させ、その際に、前記生物学的液体中に含まれている粒子、すなわち特に生物細胞を流体セル内に保持し、有利には固定する。これは、一時的に行われ、有利には少なくとも分析の間に行われる；分析のために、流体セル内に保持もしくは固定された粒子は、照射された粒子内で非弾性散乱放射線、すなわちラマン散乱放射線を励起する励起放射線で照射される。分析に関しては、照射粒子から放射されたラマン散乱放射線が検出され、かつラマン散乱放射線のスペクトル分布が分析され、その際に少なくとも１つのラマンスペクトルが得られる。少なくとも１つのラマンスペクトルからは、１つの、かつ有利には複数の特徴的な特有値が決定され、かつ決定された特有値は、有利には自体公知の分析法により公知の記憶された特有値と比較される。
【００３７】
本発明による方法は、決定された特有値が記憶された特有値と十分に一致する場合には、生物学的液体中の細菌、細胞、細菌胞子、真菌細胞又は真菌胞子のような粒子、有利には感染粒子の存在を証明し；特有値の一致に欠ける場合には、生物学的液体が感染粒子で汚染されていない、すなわち無菌であることを保証できる。
【００３８】
本発明による方法の他の有利な変法では、本発明による特有値の比較により、特定の特有値が十分に一致する場合には、保持された粒子が特徴付けられる。すなわち、とりわけ細胞タイプ、細胞種及び／又は細胞の分化度は、特定の細胞種もしくは細胞の存在が、生物学的液体の中で特定の分化度で検出されるように決定される。従って、本発明による方法は有利には生物学的液体中の連続的な無菌コントロール及び／又は決定及び特徴付け、特に生物学的液体中に場合により含まれている生物細胞の分化度の決定に役立つ。
【００３９】
本発明は、有利には薬剤開発と個々の治療剤の調製の両方の場合に可能である。すなわち、例えば生物学的移植片及び組織調製物、主要な生物学的液体を、検査される生物学的液体の組成を変化又は劣化させること無く検査できる。特に、生物学的液体中に場合により含まれている粒子、すなわち特に組織細胞はそれらの生命機能に影響を与えず、かつそれらの結合性を分解させない。これは、とりわけ生物細胞がそれらの"自然な"環境で、すなわち、殆どの場合に細胞の培地である生物学的液体中で測定できることで可能になる。その際、細胞は専ら測定の間もしくは本発明が提唱する流体細胞の分析の間に保持又は固定される。
【００４０】
また本発明は、連続的な製造法又は培養法において、プロセスから一部分もしくはサンプルを取り出さずに、かつ別々に分析し、引き続き廃棄すること無く、生物学的液体中に含まれている生物細胞を検出し、かつ場合により特徴付けるために有利には連続的又は準連続的にラマン分光分析を行うことができる。従って有利な変法では、本発明による装置は製造チェーンで、有利には側流で組み込まれ、例えば、生物学的に製造された活性物質の製造又は精製の間、発酵プロセスで又は組織移植片の培養の際に、無菌、外部汚染の存在又は細胞分化度を連続的に検査できる。
【００４１】
また組織移植片の無菌コントロールの際に、既に患者へ移植する時点で、移植片が汚染されているか否かを断言できるという利点がある。既に移植された調製物の汚染が検出される際に、比較的に短時間で鑑別診断を確立でき、場合により帰納的推論で最も疾病のありそうな患者を決定した病原菌に対してターゲットを絞って治療することができる。他の利点は、１つの装置でもしくは組み合わせた方法を用いて、本発明による無菌試験、鑑別診断ならびに細胞や移植片の活力もしくは生存度の決定を統合する可能性である。これにより、自己移植片の場合には、分析方法の全体的に必要なバンド幅がカバーされる。
【００４２】
本発明による方法は、場合により生物学的液体中に含有され、かつ分析すべき粒子が、流体セル内に配列された１つ以上の穿孔を有する少なくとも１つの多孔板により、流体セル内に保持されることを提唱する。これらの穿孔は、多孔板の中に構造化されて配置されるのが有利である。ここでは以下の実施を参考にする。この方法は、生物学的液体からの粒子を多孔板の上側で保持するのが特に有利である。この事は、多孔板の反対側に部分真空を適用し、生物学的液体中に存在する粒子を多孔板の上側の穿孔に外見上"吸引"させ、かつ穿孔の範囲内又は上に固定することにより有利に保証される。本発明によれば、粒子は多孔板上に少なくとも一時的に、有利には少なくとも分析の間に固定される。これは、有利には部分真空を固定の間に適用することにより達成される。
【００４３】
更に、流体セル内の粒子を、流体セル内に配置された１つ以上の穿孔を有する少なくとも１つの多孔板により保持する方法が提唱される。粒子は、多孔板の反対側の"下側"の方向に向けて、場合により一時的に動圧及び／又は静圧勾配をかけることにより、生物学的液体から多孔板の"上側"に固定されるのが有利である。この事は多孔板の上側と多孔板の反対側の下側の間の圧力差が、多孔板に備えられた少なくとも１つの穿孔を介して通じていることを意味すると解釈される。この事は、多孔板の上側に位置するか又は流過する粒子を含有している生物学的液体の少なくとも一部が、多孔板上の少なくとも１つの穿孔を介して下方に流れるという有利な変法で達成される。二者択一的な変法では、多孔板の上側で加圧された生物学的液体は、多孔板上の少なくとも１つの穿孔を介して少なくとも部分的に下方に流れる。部分真空の適用は、有利には生物学的液体が流体セルを流過し、よって多孔板の上側に沿って流れる運転状況で行われる。二者択一的な変法では、生物学的液体の正味流れが流体セルを通って、かつ多孔板の表面に沿って生じない運転状況で部分真空は適用される。
【００４４】
二者択一的に有利な変法又は更なる変法では、生物学的液体は主流で多孔板を流過し、これにより生物学的液体中に場合により含まれている粒子は、多孔板の上流側の穿孔直径と粒径の幾何学的条件に相応して固定され、生物学的液体から外見上"濾別"される。流体セルの適用分野と特異的な幾何学的構造に応じて、当業者は本発明の教示から外れることなく、適切な方法又は複数の有利な方法の変法を組み合わせて選択することになる。
【００４５】
励起放射線は、局所励起ゾーンにおいて流体セル内に保持される少なくとも１つの粒子に集束されるのが有利である。この励起ゾーンは、線状（線状焦点）であるのが特に有利であるので、測定ゾーン内、すなわち流体セル又は培養皿に保持又は固定された一連の粒子は、ラマン散乱放射線を放射するために隣り合って同時に励起される。
【００４６】
本発明の根底にある技術的問題は、特に前記の方法の実施に適切である装置を提供することによっても解決された。以下の装置と一緒に記載する手順、パラメーター及びプロセス工程も上記方法の有利な特徴である。
【００４７】
本発明による生物サンプルを光学−分光分析する装置は、少なくとも以下の部材を含む：
−  測定ゾーン内に生物サンプルを固定するためのサンプルホルダーユニット；
−  測定ゾーン内の励起ゾーンで、励起放射線によりラマン散乱放射線の励起に適切な励起放射線ユニット；及び
−  生物サンプルの励起ゾーン内で放射されたラマン散乱放射線のスペクトルに適切な分析ユニット。
【００４８】
前記装置は、有利には次のことに特徴付けられる。
【００４９】
−  生物サンプルは生物学的液体であり、かつ
−  サンプルホルダーユニットは、生物サンプルが流過することが可能な流体セルであり、その際、流体セルは、流体セルの測定ゾーン内で生物サンプル中に場合により含まれている粒子を保持かつ可逆的に一時的に固定するために適切な媒体を有する。
【００５０】
従って、前記装置は少なくとも以下の部材を含有する：
生物学的液体の形で生物サンプルが流過することができる少なくとも１つの流体セル；その際、流体セルは、粒子を保持、特に固定するための少なくとも１つの媒体を有し、前記粒子は少なくとも分光分析及び場合により顕微鏡分析の間に、その媒体の上に固定される；
流体セル中に保持又は固定された粒子中でラマン散乱放射線を励起できるように励起放射線を発生させることができる少なくとも１つの励起放射線ユニット；
粒子により放射されたラマン散乱放射線をスペクトルにより分離し、かつラマンスペクトルを記録するために適切である少なくとも１つの分析ユニット（スペクトル分析）。
【００５１】
本発明のこの態様によれば、流体セル中に入る粒子が生物サンプルと一緒に、すなわち可能性として有り得る汚染物又は組織細胞としての生物細胞もしくは可能性として有り得る人工産物と一緒に流体セル中に保持され、かつ特にそこで特定の位置で固定できるように流体セルを配置するのが有利である。これは、有利には流体セル内に設置された、１つの、有利には複数の穿孔又は細孔、いわゆるミクロ細孔を有する少なくとも１つの多孔板又は穿孔配置により可能になる。穿孔又は細孔は、円形又は殆ど円形の横断面を有するのが有利である。有利な変法では、穿孔は線状又はスリットの形に形成される。この場合に、多孔板はフィルターメッシュと同じように、流体セルを流れる液体生物サンプルから粒子が保持される。多孔板中の穿孔の直径又は寸法は、有利には粒子又は生物細胞がそれらの大きさゆえに穿孔を実質的に通れずに、流体セル内に保持されるように選択される。少なくとも１つ、有利には正確に１つのこのような粒子は、個々の穿孔内に保持又は固定されることができる。
【００５２】
本発明による流体セルは、特に少なくとも１つの多孔板又はホールアレイが構造化して配置された穿孔を有することにより特徴付けられる。穿孔は、規則的なパターン（配列）で配置されるのが有利であり、その際、互いの穿孔の平均的間隔（ホール間隔、グリッド寸法）：穿孔の直径の割合は、１つの、有利には個々の穿孔にて、少なくとも１つの有利には正確に１つの粒子が保持できるように選択される。このグリッド寸法／直径の割合は、有利には１．１〜２０、特に有利には５〜１５であり、より有利には約１０である。多孔板は、有利には穿孔又は細孔がそこでアドレス可能な規則的な配列、線及び円柱の形で配置されるように構成される。約１．６cm2（約０．５×０．５インチ）のホールアレイの大きさでは、約１０6個の穿孔が有利にはミクロホールの形で配列される；１μmの細孔直径では、グリッド寸法は約１２μmである。これにより、細孔に固定された生物細胞又は粒子が、隣り合う細孔に固定された細胞又は粒子と重ならずに、細胞と粒子の両方が別々に光学的に分析できることが保証される。細菌のような小さな生物細胞を固定する多孔板の場合には、大きな（ヒト）哺乳類細胞を固定するための多孔板の場合よりも、ホールグリッドは小さな値をとると解釈される。１つの変法では、ホールは１μmの直径を有し、かつホールアレイの表面は１０mm2（１０×１０mm）である。１０μmのホールグリッドの場合には、ホールアレイ中に約１００２，０００個のホールがある。このホールアレイは、特に細菌細胞、真菌胞子及びそのような物の保持又は固定に役立つ。このような多孔板は、有利には１μm以下の範囲内の穿孔の直径を有し、有利な下限は０．２μmである。有利なホールグリッドは、２〜１５μmの間であり、有利には約１０〜１２μmである。
【００５３】
多孔板の他の有利な態様では、ホールは２μmの直径を有し、ホールグリッドは２０μmである。このホールアレイは特に動物又はヒト由来の組織細胞の保持又は固定に役立つ。このような多孔板は、２μm以上、有利には約２〜６μmの直径を有する。有利なホールグリッドは１５μm以上、有利には約１５〜５０μmである。
【００５４】
それぞれの適用分野に適切な多孔板の寸法決定は、本発明により規定された範囲内で、検査すべき生物学的液体の流体特性に従い、かつ分析すべき粒子を用いて当業者により決定される。
【００５５】
有利な実施態様では、流体セルは少なくとも１つの第二の又は更なる多孔板を有する。この又はこれらの多孔板は、流体セル内で、生物サンプルの流れ方向に対して第一の多孔板の上流に配置される。第二の又は更なる多孔板も同様に１つの、有利には複数の穿孔を有する。第二の又は更なる多孔板内での穿孔の配列に関しては、先に第一の多孔板に関して記載したものが該当する。第二の又は更なる多孔板の穿孔の直径は、第一の多孔板の穿孔の直径よりも大きいのが有利である。第一の多孔板の穿孔の直径と、第二の及び場合により更なる多孔板の穿孔の直径の割合は、生物学的液体中に含まれている大きな粒子、例えばヒトの細胞が、第二の及び場合により更なる多孔板により保持できるように、それに対して細菌細胞、細菌胞子、マイコプラズマ、真菌細胞又は真菌胞子のような小さな粒子は、第二の及び場合により更なる多孔板を実質的に通過し、かつ（下流の）第一の多孔板内に保持できるように選択される。
【００５６】
第一、第二及び場合により更なる多孔板又はホールアレイは、実質的に互いに平行に上下に配列されるのが有利である。この流体セル内の規則的なフィルター又は篩い配置を通して、生物学的液体中に含まれている粒子をそれらの大きさに応じて分け、かつこれらを流体セル内の多孔板により構成される、有利には上下にある第一、第二及び場合により更なる平面で別々に分けて配置することができる。これは大きさに応じて分けて保持された粒子を、その都度別々に検査し、かつ有利にはラマン分光ならびに有利には更なる光学顕微鏡により検査することを可能にする。
【００５７】
少なくとも第一の（下流にある）多孔板又はホールアレイは、有利には生物学的液体の正味の流れ方向と殆ど平行して配置されるので（正味流れのベクトルに対する多孔板の表面法線の角度は約９０度である）、流体セルの第一の運転状況でサンプル液体中に存在する粒子は、多孔板の上側に沿って動くことができ、かつ第二の運転状況では粒子は、有利には多孔板の反対側に適用される部分真空により溢れ出る液体から保持され、かつ多孔板の上側の穿孔に固定されることができる。流体セル中に保持される粒子は隣り合って、特に１つの平面で配置可能であるのが有利である。
【００５８】
少なくとも２μmの大きさの粒子が、第二の多孔板により形成される平面内に固定され、かつ線状に配列することができるように、流体セルは、第一の、かつ少なくとも１つの第二の多孔板又はホールアレイを備えているのが有利であり、その結果、焦点が合った励起放射線の形でセルの測定を行うことができる。下流にある第一の多孔板では、既に第二の多孔板を通過した２μm未満と１μm以上の大きさを有する粒子を固定できる。これらは特に細菌、真菌、マイコプラズマならびに細菌胞子及び真菌胞子であり、これらは全て"感染粒子"として検査した生物学的液体の汚染を示すことができる。本発明による装置のこの実施態様では、励起放射線を下流にある（"下の"）第一の多孔板中に固定可能な粒子に焦点を合わせられることが提唱される。従って、１つ測定装置で例えば、ヒト由来の組織細胞のような大きな粒子、及びこれらから分離された小さな粒子、特に細菌、真菌、胞子のような微生物の両方を液体生物サンプル中で有利に分析できる。
【００５９】
本発明のこの態様の更に有利な実施態様では、流体セル内にミクロ流体流路が備えられる。この流路は、流体セルに生物サンプルが通過する場合に、生物サンプル液体中に存在する粒子が連続的に又は殆ど連続的に流路を通って移動でき、かつ粒子を分類及び特徴付けるために連続して光学素子に供給できるように配置される。分析のために流体セル内で粒子を一時的に固定することは、特に流体セルを通る生物学的液体の正味の流れを停止することにより可能である。生物学的液体中に存在する粒子は、有利には直列に、有利には一直線に又は実質的に互いに規則的な間隔をあけてミクロ流体流路内に配列される。流路幅は、光学素子の焦点の大きさに調節される。流路内には、有利には音場及び電磁場から選択される力場を生じる更なる装置が備えられ、測定法の実施の間に正しい位置に粒子が保持される。当業者はミクロ流体の法則性を熟知しており、かつ容易にこのような流路を本発明により規定した機能を満たすように寸法決定することができる。
【００６０】
有利な変法では、互いに平行に、有利には規則的な間隔をあけて配列された複数のミクロ流体流路が流体セル内に備えられる。従って、複数の流路のうち少なくとも２つは、大きさ及び／又は形態が互いに異なっているのが有利であり、種々のミクロ流体の条件をこれらの流路内で行うことができる。この構成は、生物学的液体中で生じる種々の粒子をその顕微特性又は物理特性に応じて分離もしくはカテゴリー化し、かつ場合により別々に分析するために適切である。流体セル内では、本発明による多孔板又はホールアレイの後ろに少なくとも１つの流路が連結され、実質的に粒子だけ、有利には専ら多孔板のホールよりも小さな粒子がカテゴリー化と特徴付けのために連続して光学素子に供給されるのが有利である。
【００６１】
本発明の他の態様によれば、本発明による装置のサンプルホルダーユニットは、光学的透過性の薄い材料を用いて培養皿として構成され、励起放射源の集束を生物サンプル中で行うことができる。有利な変法では、上側が開いた通常の細胞培養皿又は顕微鏡用の細胞培養皿又は光学的に非屈折性の薄いプラスチックもしくはガラス底を有するペトリ皿が小さな組織サンプル（１〜２mm2）を分析するためのサンプルホルダーユニットとして備えられる。
【００６２】
従って、本発明による装置の光路内にある流体セル又は培養皿の少なくとも一部を、放射線透過材料又は光透過材料から作ることが提唱される。有利な材料は、次のものから選択される：ケイ酸塩ガラス、石英ガラス、シリコンガラス、二酸化ケイ素ガラス、窒化ケイ素ガラス、フッ化カルシウムガラス、フッ化バリウムガラス、セレン化亜鉛ガラス、硫化亜鉛ガラス及びゲルマニウムガラス。ここでは、窒化ケイ素が特に有利である。本発明は、これらの材料に限定されるわけではなく、当業者はこの目的に適切な類似した材料、特に光学的に透明で出来るだけ僅かな屈折性で、出来るだけ僅かな色彩分散性材料の全て、ならびに励起放射線の波長領域内でも、放射され検出すべきラマン散乱放射線の範囲内でも出来るだけ透過性の材料を考慮することになる。これらは、本発明の教示に含まれる。このような更なる材料には、特に合成ポリマー、例えばポリアクリル、ポリエチレン、エチレン／プロピレン−コポリマー、ポリスチレン、ポリアミド及びポリカーボネートが含まれる。
【００６３】
更に、サンプルホルダーユニットを、その中でも特に少なくとも生物サンプルとの接触範囲で、金属又は金属コロイドで表面に被覆する又は濃厚にするか、もしくは流体セルの多孔板を少なくとも粒子が固定可能な穿孔又は細孔の範囲内で、金属又は金属コロイドで被覆する又は濃厚にすることが提唱される。金属の結合は自体公知の方法で、有利には表面の局所的誘導化により行われる。金コロイドで培養皿の表面又は多孔板表面を濃厚にするのが特に有利である。多孔板の他の場所又は多孔板の範囲内に存在する粒子に対して、穿孔の範囲内に固定された粒子のラマン分光分析を改善するために、金属又は金属コロイドだけを多孔板の穿孔の範囲内に塗布することが提唱される。
【００６４】
金属の電子特性は、照射した生物サンプル、生物細胞又は保持及び固定した粒子のラマン発光を増大するために適切である（SERS、表面増強ラマン分光法）。自体公知の原則により強度を増大することにより、検出の積分時間を短くすることができる。これは、測定時間又は分析時間を短くするための本発明による解決策のもう１つの態様である。更に、SERSと組み合わせて、S／N比の改善し、それによりラマンスペクトルにおいて更に可能性として有り得る特徴的バンドが検出することができる。
【００６５】
励起放射ユニットは、励起放射線を生じる少なくとも１つの光源を有するのが有利である。この光源は、準単色発光スペクトルを有する少なくとも１つのレーザーであるのが有利である。二者択一的に、光源は放電ランプ及び／又は白熱発光ランプ、例えばタングステンランプ又はネルンストピンであり、その際、これらのランプの発光スペクトルを狭くするために、適切なモノクロメーター、例えば、１つの光回折格子又は複数の光回折格子の組合せを連結させるのが有利である。励起放射線ユニットは、主波長をフィルターするいわゆるプラズマラインフィルター又は相応する媒体を有するのが有利である。また励起放射線ユニットは、レーザー光を平行にするための少なくとも１つのいわゆるバンドパスフィルター又は相応の媒体を有するのが更に有利である。
【００６６】
有利な変法では、励起放射線は近赤外領域でスペクトル分布を有する。７００〜１２００nmの波長が有利である。励起放射線は、約７８５±６０nm、より有利には７８５±３０nm、７８５±１０nm、最も有利には約７８５nmの波長を有するのが特に有利である。理論に縛られることなく、液体媒体又は細胞組合せ物又は組織内の生きている生物細胞にとってラマン分光法のこの波長領域は、多くの利点を有する：液体媒体中の励起放射線の吸収は許容できる低さであり、不所望な蛍光放射線の放射は許容できる低さであり、照射した生細胞の構造と生命機能に障害を与える作用は最小である。同時に、この波長領域内で励起したラマン散乱放射線は、細胞特異的なラマンスペクトル（いわゆる"指紋範囲"）の記録を容易にする。
【００６７】
本発明の他の変法では、UV領域内の励起放射線が提唱される。有利な波長は、２００±５０nmである。従って、以下の実施はUV−ラマン分光法にも当てはまり、その際に、放射線強度、光学媒体の材料選択及び検出器の感度は、IR分光法に対して相応して合わせられる。
【００６８】
ラマンスペクトルの検出と記録の測定時間を更に減らすために（時間の積分）、出来るだけ高い強度の励起放射線を使用すべきである。これは、有利には５０mW以上、特に有利には５０〜５００mWの範囲内の励起エネルギーを有する高エネルギーレーザーを用いることにより達成される。有利な変法では、約１００mWを有するレーザーが使用される。ダイオードレーザーが有利である。当業者は、照射した粒子に作用する放射線エネルギーが具体的に用いられる光学系と光学装置によることを認識している。光学的構成に応じて、場合により高い放射線エネルギー又は相応して低い放射線エネルギーを有する光源が必要である。測定の間に生物細胞に放射される放射線エネルギーは、ラマン散乱放射線に使用される検出器の測定時間とS／N比により下方に制限される：これは高エネルギーで使用される照射細胞の結合性と生命機能における不利な作用により上方に制限される。少なくとも約１０ジュール〜最大約３００ジュール、有利には約１００〜約２００ジュールの放射線エネルギー（照射細胞の位置に関して計算し、かつ露出時間にわたり積分）が有利である。
【００６９】
この装置は更に少なくとも１つの直線集束ユニットを有するのが有利である。これは主に直線励起ゾーンの形で、生物サンプルにおいて、特にサンプル中で分析すべき生物細胞又は粒子において励起放射線ユニット内で生じる励起放射線を集束するために適切である。
【００７０】
従って、本発明による装置は測定時間を減らす利点を有する。それというのも、直線励起ゾーンに沿って複数のポイントを同時に測定できるからである。従って、検査される生きた生物細胞が良好に保護されるように、レーザーパワーを相応して減らすことが提唱される。いわゆる"ラインスキャン"を用いることにより、直線集束は同時に位置分解測定を可能にし、最終的に個々の粒子又は生物細胞を、測定ゾーン内で個別化した方法で有利に分析できる。
【００７１】
直線集束は、励起放射線の光路内で少なくとも１つの円柱レンズを用いて行われるのが有利である。当業者は本発明により提唱された直線集束装置を実現するために、線状焦点を生じる更なる処置も適切であることを認識するであろう。
【００７２】
直線集束装置は、励起放射線の集束を改善する少なくとも１つのビームエクスパンダーを有するのが有利である。集束装置は、励起放射線の集束ビームが測定ゾーンの表面法線に３０度以下の角度で現れるように構成されるのが有利である。
【００７３】
直線集束装置は、有利には測定ゾーン内に固定された粒子又は生物細胞上で直線励起ゾーンを動かすために適切である。これは、自体公知の方法で構成された直線集束装置に備えられた少なくとも１つのスキャナーユニットにより可能になる。当業者は、適切な処置ならびにこのようなスキャナーユニットを実行する媒体を熟知している。直線集束装置は、直線励起ゾーンの動きが、その長手方向の範囲に対して実質的に垂直であるようにスキャナーユニットに結合しているのが有利である。スキャナーユニットとして音響光学波長可変フィルター（AOTF）を使用するのが有利である。これは構成と機能により移動する光学的部分を有さない。有利な変法では、測定ゾーンは固定した焦点ビームに対して粒子又は生物細胞と共に移動可能である。これは、有利には電動式のサンプルホルダー又は培養皿が備え付けて連結された台により実施される。ここでは、例えばピエゾ駆動系も適切である。
【００７４】
有利な実施態様では、本発明による分析ユニットは、少なくとも以下の部材を有するCCD（電荷結合素子）をベースとするラマン分光器である：
−  励起ゾーン内で放射されるラマン散乱放射線をスペクトル分離するための少なくとも１つの光回折格子又は類似の媒体；
−  位置分解により電気的に検出するための、場合によりスペクトル分離した散乱放射線を画像記録するための、少なくとも１つの２次元CCDアレイ；及び
−  二次元CCDアレイにおいてスペクトル分離した散乱放射線を結像するための少なくとも１つの光学装置。
【００７５】
分析ユニットは、有利にはツェルニーターナー（Czerny-Turner）によるラマン分光器として構成される。二者択一的に、ラマン分光器はレンズベース系であるのが有利である。分析ユニットは、直線励起ゾーンのスペクトル分離された散乱放射線を位置分解結像する光学装置が、CCDアレイの１次元では、有利には直線励起ゾーンがその長手方向の範囲に沿って正しい位置で結像され、かつCCDアレイの２次元では、分散放射線のスペクトル分布が直線励起ゾーンの長手方向の範囲に沿った各ポイントから結像されるように二次元CCDアレイで結像されることに特徴付けられる。この構成は、特にラインスキャン法と一緒に、分析すべき粒子又は生物細胞が配列した測定ゾーンの位置分解再現を可能にする。測定ゾーン内の粒子又は生物サンプルの局所的ラマンスペクトルのデータの正確な位置の表示は、３次元及び有利には４次元アレイの形で行われ、その際に、初めの二次元は、測定ゾーンの横幅と長手方向の範囲に相当する。３次元及び場合により４次元では、分析範囲の各位置に相応して、局所的ラマンスペクトルは、特徴的な特有値又は"バンド"（３次元）の形で、又は有利には波長もしくは波数による（４次元）強さのスペクトル分布（３次元）の形で、励起波長に対して記録される。このために、第一の測定サイクルではラインスキャン法にて、第一の励起ゾーンの長手方向の範囲に沿った位置（２次元）に関して、局所的ラマンスペクトル（３次元と４次元）が同時に記録される。更なる測定サイクルでは、これは全体の測定ゾーンの横幅の範囲（１次元）に沿って２番目ならびに更なる励起ゾーンに関して続けることができる。
【００７６】
放射されたラマン散乱放射線を記録／検出及び分析する分析ユニット内に備えられたCCDアレイ（CCDチップ）は、近赤外線範囲又は２００〜３５００cm-1の波数のスペクトル範囲に特に感度があるように有利に構成される。当業者は、このために自体公知の処置を提案できる。良好なS／N比で迅速な測定時間（積分時間）を有するCCDアレイ、特にいわゆるオープンエレクトロードCCD、背面照射型CCD、ディープディプレッションCCD又はエレクトロン・マルチプライアーCCDを構成するのが有利である。S／N比を改善するために、CCDアレイは有利に冷却され、有利な冷却温度は約−５０℃から約−１００℃である。
【００７７】
本発明の１態様によれば、該装置は少なくとも１つの顕微鏡−光学ユニット又は装置を有する。すなわち、本発明による測定ゾーン内に保持又は固定された粒子を画像顕微鏡法により又は顕微鏡写真により分析するための顕微鏡ユニットを有する。この光学ユニットは、有利には交互に切り換えが可能な位相差光学素子を有する透過型顕微鏡であり、有利には微分干渉顕微鏡（DIS）、特に有利には蛍光顕微鏡のものである。
【００７８】
顕微鏡ユニットは、励起放射線の波長領域内及び放射されたラマン散乱放射線の波長領域内で、特にこの波長領域に最適化された十分な透過性を有する光学素子を有するのが有利である。励起放射線ユニットを適切な媒体により顕微鏡ユニットの光路に結合させるのが有利である。例えば、蛍光を発生させるために蛍光顕微鏡に一般的に備えられている光源は、本発明による励起放射線ユニットと置き換えられているか又は補足されている。
【００７９】
適切な光学媒体、特に遮断フィルターを通して、顕微鏡ユニット内で励起放射線が観察光路から離され、かつ顕微鏡ユニットの結像部分の発光光路から離され、かつ有利には顕微鏡ユニットによって記録され、放射したラマン散乱放射線の光路から離されることを保証されるのが有利である。従って、通常生産される顕微鏡系に本発明による装置を組込むことが可能である。またラマン散乱放射線のスペクトル分布の分析に適切な分析ユニットを顕微鏡ユニットに組込むのが有利である。これは、有利には分析ユニットを適切な方法で観察光路にカップリングすること、例えばカメラ連結により達成される。
【００８０】
励起放射線ユニットに加えて、顕微鏡画像を作成するための少なくとも１つの更なる照明源、特に蛍光顕微鏡用の光源を顕微鏡ユニットに組込むことができる。これは、一般的に高圧水銀ランプである。顕微鏡ユニットには、有利には蛍光顕微鏡を運転する自体公知のフィルターが備えてある。
【００８１】
また顕微鏡ユニットには、装置の測定ゾーンに配列された粒子もしくは生物細胞から得られた顕微鏡画像を記録し、かつ後に分析するために、少なくとも１つの画像記録ユニット、有利には適切な光学素子を有するCCDカメラが備えられる。場合により、適切な画像分析アルゴリズムを用いて、顕微鏡ユニットで記録した粒子もしくは生物細胞の顕微鏡画像を分析し、かつ分析結果を表示かつ／又は記憶するために、画像記録ユニットを適切に用意されたコンピューターユニットと連結するのが特に有利である。
【００８２】
有利な実施態様では、該装置は少なくとも１つのコンピューター装置を有する。この装置は、放射されたラマン散乱放射線を分析するための分析ユニットに少なくとも連結されるのが有利である。このコンピューター装置は、記録したラマンスペクトルの特有値（スペクトル特有値）及び記録した粒子の顕微鏡画像の特有値（画像特有値）を決定するためにも適切である。また該コンピューター装置は、決定したスペクトル特有値もしくは画像特有値を記憶し、有利には所定のスペクトル特有値もしくは画像特有値と比較するためにも適切である。該装置は、更に少なくとも１つのメモリー素子を有するのが有利であり、これは特に記憶した特有値やコンピューター装置内で決定した特有値及びコンピューターユニット内で行った特有値比較の結果を記憶するために適切である。更に該装置は、少なくとも１つの出力素子、有利には表示素子を有し、これは分析した粒子のカテゴリー化、類型化、特徴付け及び／又は規定を含む特有値比較の少なくとも１つの結果を出力又は表示するために適切である。次に即座に行われた特性比較の少なくとも１つの結果が表示される。二者択一的に、少なくとも１つのメモリー素子に記憶された上記の特有値比較の結果が出力又は表示される。該装置は、分析した粒子の顕微鏡画像を、場合により特有値比較及び／又はラマンスペクトルの結果と一緒に表示するためにも適切である。
【００８３】
コンピューター装置は、画像分析の結果とラマンスペクトルの特有値の分析結果を、流体セルの生物学的液体から保持された粒子、すなわち特に生物細胞の明確な特徴付けを可能にするように計算するためにも適切である。少なくとも１つのメモリー素子は、画像分析の結果及び画像分析結果とラマンスペクトルの特有値比較の結果の計算結果を記憶するためにも適切である。少なくとも１つの出力ユニット又は表示ユニットは、光学画像分析の結果及び／又は光学画像分析の結果とラマンスペクトルの特有値比較の結果の計算結果を出力又は表示し、かつ特に実際の結果と、場合により少なくとも１つのメモリーユニットに記憶された以前の測定もしくは分析結果の両方を出力するためにも適切である。
【００８４】
本発明により提唱された顕微鏡画像の評価により、記録された位置分解局所的ラマンスペクトルを顕微鏡画像データにより局在化された特定の粒子に割り当てることができる。このように、生物サンプル中、すなわち特に分析した組織箇所、細胞組合せ物又は移植片中の特定の粒子、有利には組織細胞の分散、配列及び頻度に関して断定ができる。
【００８５】
本発明のもう１つの対象は、先に記載した本発明による装置の使用及び／又は以下の有利な使用目的のための先に記載した本発明による方法、又はそれらの組合せの使用である：
無菌及び／又は汚染に関して生物サンプル、有利には液体を非侵襲的、非破壊的にコントロールするための使用；
生物サンプル中に含まれている生物細胞を非侵襲的、非破壊的に特徴付け又は類型化及び／又は選択するための使用；
生物サンプル中に含まれている生物細胞の分化状態を非侵襲的、非破壊的に特徴付けするための使用；
同種間の又は自己移植片を非侵襲的、非破壊的に特徴付け又は類型化するための使用。
【００８６】
本発明は、以下の図１と図２ならびにその後に続く用途例により特徴付けられるが、本発明の教示に限定されないものと解釈される。
【００８７】
図１は、本発明による流体セル（１００）の図式的構成を示し、これには流体セル内に配置され、穿孔（１１５）を有する１つの多孔板（１１０）が備えられている。更に、生物学的液体用の少なくとも１つの流入部（１０１）と少なくとも１つの流出部（１０２）が示されている。図式的に、多孔板上に生物学的液体から保持される粒子ならびに圧力勾配に沿った正味流れ（矢印）が図示されている。
【００８８】
図２は、本発明による別の流体セル（１００）の図式的構成を示し、これには流体セル内で互いに平行かつ上下に配列され、穿孔（１１５、１２５）を有する２つの多孔板（１１０、１２０）が備えられている。更に、生物学的液体用の少なくとも１つの流入部（１０１）と少なくとも１つの流出部（１０２）ならびに多孔板の上側に対して部分真空を適用するために、下流にある第一の多孔板（１１０）の下側に少なくとも１つの更なる連結部（１０３）が示されている。多孔板（１１０，１２０）上に生物学的液体から保持される粒子ならびに正味流れ（矢印）が図示されている。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】図１は、流体セル内に配置され、穿孔（１１５）を有する１つの多孔板（１１０）が備えられている本発明による流体セル（１００）の図式的構成を示す図である。
【図２】図２は、流体セル内で互いに平行かつ上下に配列され、穿孔（１１５、１２５）を有する２つの多孔板（１１０、１２０）が備えられている本発明による別の流体セル（１００）の図式的構成を示す図である。
【００９０】
実施例
１．自己由来の軟骨生検材料からの移植片の滅菌コントロール及び品質コントロール
材料：
装置：滅菌ガラスピペット（５又は１０ml、エッペンドルフ社製）；滅菌シリンジ；安全作業台（HERAsave, classII, Heraeus社製）；遠心分離器（5810R, エッペンドルフ社製）；光学顕微鏡と位相差顕微鏡を有する本発明による装置ならびに流体セルを有するラマン分光器；ガス抜きインキュベーター（BBD 6220、Heraeus社製）。
【００９１】
溶液：コラゲナーゼ（Worthington Biochemicals社製）；自己ヒト血清（患者自体の血液サンプルから抽出）。
【００９２】
移植片：患者からの自己由来の軟骨生検材料。
【００９３】
生検材料の移植は、生検材料内の含有細胞にとって栄養培地としても機能する移植培地内で行った。この軟骨組織の貯蔵を８℃で２４〜４８時間行った。
【００９４】
実施：
１．１  液体生物サンプルの分析
１．輸送容器内の移植培地の上澄液又は上澄液からのアリクォット（通常は全体の上澄液の１０％）をピペットで取り、検査した。この場合に流体セル内のサンプル液体を分析する前に、前置フィルターを用いて、細菌及び真菌胞子よりも著しく大きな全ての粒子（例えば、３μm以上）を場合によりミクロホールアレイを用いて濾別した。
【００９５】
２．無菌条件下（無菌作業台にて、無菌シリンジを用いて）に、場合により流体セルの注入部位で１枚又は２枚の隔膜を介してサンプルを流体セルに注入した。場合により、流体セルを輸送容器に直接に繋げた。
【００９６】
３．流体セル内で多孔板（ホールアレイ；フィルターチップ）のミクロホールに、サンプル液体を流過させるか又は二者択一的に溢れさせた。ミクロホールの大きさは、分析に関連する粒子、細菌細胞、真菌胞子などがホールを通れずに、そこに位置するように選択された。
【００９７】
−  流体セルの第一の例では、ホールは１μmの直径を有し、かつホールアレイの表面は１０mm×１０mmの大きさを有した。ホールグリッドが１０μmの場合に、１００２００１個のホールがホールアレイにあった。
【００９８】
−  流体セルの二番目の例では、種々の大きさのホール（２μmと１μm）を有するホールアレイを直列に連結させて、顕微鏡学的に最大として特徴付けることができる粒子の数を増大させるか、又は更なる特徴によって（２μm未満又は２μm以上）、光学的かつ分光学的特徴付け又は分類をする前に、粒子を予備分類することができる。
【００９９】
−  流体セルの３番目の例では、ホールアレイの後に流路を連結させ、ホールアレイのホールよりも小さな粒子を、分類及び特徴付けるための光学素子に連続して供給した。流路幅は、光学素子の焦点の大きさに合わせた。場合により、粒子は、力場（音場、電磁場）を生じる装置により特徴付けの間に正しい位置に保持された。
【０１００】
このように、アレイの形で配列されたホール上での粒子の位置決めを行った。
４．以後の工程では、流体セルの測定ゾーン内に配列された粒子の顕微鏡検査を行い、かつヒト細胞、細菌、真菌、胞子及び人工産物のような他の粒子を、例えば画像分析ソフトウェアにより区別／カテゴリー化した。画質評価は、測定ゾーン内の粒子／細胞の局在化にも役立つ。
【０１０１】
場合により、輸送媒体の細胞不含部分のラマンスペクトルの記録は、サンプルもしくは細胞の実際のラマンシグナルを抽出するための基準として行った。
【０１０２】
５．データベースからの基準スペクトル、かつ得られたスペクトルと相応の基準（特徴付け、特徴的パラメーター、表示バンド）の調整により、細胞タイプ（ここでは、軟骨細胞と繊維芽細胞）と他の微生物［（例えば、スポロベネス菌）（DSM 1664）、大腸菌（DSM 498）、枯草菌（DSM 347）、黄色ぶどう球菌（DSM 799346）、緑膿菌（DMS 1128）、黒色アルケルギルス（DSM 1957）、カンジダアルビカンス（DSM 1386）］を区別するために局在化細胞をラマン分光法によって検査した。
【０１０３】
細胞の状態又は品質の第一のコントロールは、場合により予め得られた生細胞の基準スペクトルにより、調製中の軟骨細胞で行った。
【０１０４】
測定の継続期間：必要に応じて約１〜４８時間。例えば、無菌のコントロールは、ラマン分光法に加えてサンプル中に含まれている粒子の顕微鏡評価により行われ、ここでの継続期間は１〜１２時間であった。引き続き、いずれかの汚染の割り当て及び細胞活力のコントロールは、必要な場合に２〜３６時間の期間で行った。
【０１０５】
１．２  血清の無菌試験
器官／組織ドナーから取り出した血液サンプルからのヘマトクリット（固形血液成分）を遠心分離した後に自己由来の血清が得られ、これを移植片を細胞培養する栄養培地に加え、血清又はこれからのアリクォット（標準は血清１０％）の無菌試験を１．１項の工程１〜５により流体セル内で実施した。計測の継続時間：約１〜１２時間。
【０１０６】
自己由来の血清の回収は、ヘマトクリット（血液固形成分）の遠心分離により行った。次に、この血清を移植片の細胞を培養する栄養培地に加えた。更なる工程と平行して、更に血清試験をするために血清サンプルを外部に送り、ウイルス（例えばHIV）及び細菌毒素による汚染を排除した（例えば、菌体内毒素を一般的に検出するためのLAL試験により）。
【０１０７】
１．３  移植片品質のin-processコントロール
検出された汚染が陰性であり、かつ得られた細胞が基準スペクトルにより生細胞の規格値の範囲内にあると判明した場合には、単離した細胞の更なる培養と自己由来移植片の形成を行った。
【０１０８】
コラゲナーゼにより組織特異的細胞を単離した後に、１０％患者血清を含有する栄養培地に細胞を移し、これらを陰性コラーゲンマトリックス（Ars Arthro社製）に流し込んだ。培養をインキュベーター（例えば、最適かつ一定の培養条件の温度３７℃、CO2含有量５％）内で開始した。全体の培養時間は通常１０〜１４日間である。
【０１０９】
培地の上澄液からのサンプルのin-processコントロールを行った初めの５〜７日後に、無菌、組織特異的細胞及び移植片の活力が生じた。この場合に１．１項による手法を行った。
【０１１０】
１．４  ECMの分析
更に培養の間に、細胞が埋包されているマトリックスの第一の分析（ECM）を行った。細胞が埋包されているマトリックスは、例えば殆どが単離したI型コラーゲンから成っていた。しかし、培養を若干の時間行った後に生きている軟骨細胞の周辺に固有のマトリックスが形成され、これは殆どがII型コラーゲンから成っていた。これらの２つのタイプのコラーゲンはラマンスペクトルで区別された。
【０１１１】
このために、培養培地の上澄液に溶かしたフラクションを本発明による装置内で分光分析した。
【０１１２】
１．５  全調製物の分析
１．１〜１．４に補足して、基準スペクトルを用いて移植片の表面上の個々の細胞を生きているもの又は死亡したものとしてカテゴリー化した。これらの測定は、全移植片にて、本発明によるサンプルホルダーユニットとしての培養皿で直接に行った。このために、培養皿を取り出し、本発明による装置に取り付け、かつ測定した。
【０１１３】
１．６  最終コントロール
移植片が完成した後に、最終コントロールが必要であり、これは１．４項に記載された方法に倣った。
【０１１４】
結果：
ここでは測定時間を２４時間に減らした。本発明により達成された速さは極めて有利であった。それというのも２４〜４８時間以内に移植片を患者に移植でき、かつ細胞の作用能力が保持できるからである。本発明による最終コントロールでは、患者に移植した時点では、移植片が汚染されていないことが知られている。
【符号の説明】
【０１１５】
１００．  流体セル、  １０１．  流入部、  １０２．  流出部、  １０３．  連結部、  １１０．  多孔板、  １１５．  穿孔、  １２０．  多孔板、  １２５．  穿孔
【図１】
2010509601.tif 000002
【図２】
2010509601.tif 000003
【国際調査報告】
2010509601.tif 000004
2010509601.tif 000005
2010509601.tif 000006
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