(57)【要約】  本発明は、使い捨て可能な実験用具、特に、分析および診断目的のためにポリメラーゼ連鎖反応を実施するための準備された反応容器に関する。本発明は、更に、反応容器において、安定な保存と、オリゴヌクレオチドと参照核酸との最小量の乾燥とのための方法に関する。そのオリゴヌクレオチドとその核酸は、１〜５ｍＭのトレハロースの存在において、別の更なる成分無しに、反応容器の壁に乾燥される。
2010510789.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析、診断、および、技術的な目的のためにＰＣＲを実行するためのパッケージング・ユニットまたはキットであって、
適合する試薬、酵素、および、ＤＮＡまたはＲＮＡのサンプルの追加後に、ＰＣＲにおいて標的配列の増幅を開始する、一連の既知な量のプライマー−オリゴヌクレオチドを有し、保管形態においてラベルされた乾燥反応容器のセットと、
一連の既知な量のプライマー−オリゴヌクレオチドと参照核酸と有し、所定量の液体を追加後に、その参照核酸の一連の濃度を与え、その参照核酸が標的配列を含んでいる、保管形態においてラベルされた乾燥反応容器のセットと
を具備しており、
ラベルされた乾燥反応容器の両セットは、保管形態において、既知の量のプライマー−オリゴヌクレオチドの水性溶液、および／または、参照核酸が、その反応容器において室温を超えた５から最大３０℃の温度で、環境圧力の下、単独で、１〜５ｍＭｏｌ／Ｌのトレハロースの存在において、その結果としてペレットが完全に乾燥されるが、吸湿しないような方法で、乾燥されるように、準備されることを特徴とする、
パッケージング・ユニットまたはキット。
【請求項２】
分析、診断、および、技術的な目的のためにＰＣＲを実行するためのパッケージング・ユニットまたはキットであって、
適合する試薬、酵素、および、ＤＮＡまたはＲＮＡのサンプルの追加後に、ＰＣＲにおいて標的配列の増幅を開始する、一連の既知な量のプライマー−オリゴヌクレオチドを有し、保管形態においてラベルされた乾燥反応容器のセットと、
一連の既知な量のプライマー−オリゴヌクレオチドと参照核酸とを有し、所定量の液体を追加後に、その参照核酸の一連の濃度を与え、その参照核酸が標的配列を含んでいる、保管形態においてラベルされた乾燥反応容器のセットと
を具備しており、
ラベルされた乾燥反応容器の両セットは、その反応容器において、既知の量なプライマー−オリゴヌクレオチドの水性溶液、および／または、参照核酸が、環境温度で、０．１〜０．３ｂａｒの減圧下、単独で、１〜５ｍＭｏｌ／Ｌのトレハロースの存在において、その結果としてペレットが完全に乾燥されるが、吸湿しないような方法で、穏やかに乾燥されるように、生成されることを特徴とする、
パッケージング・ユニットまたはキット。
【請求項３】
反応容器中の水性溶液の体積が、乾燥前が、１〜２５μＬであり、プライマーの量が、０．１〜２０ｎＭｏｌ／Ｌの間である、
請求項１または２に記載のキット。
【請求項４】
その参照核酸を有する反応容器は、好ましくは、ゲノムのＤＮＡまたはプラスミドとしての１０〜１００００のコピーの標的配列を含む、
請求項１〜３のいずれかに記載のキット。
【請求項５】
ベッセルの壁上の乾燥ペレットが、炭化水素ワックスによってカバーされ、５７℃の温度で溶融が開始し、そして、水性溶液内で浮遊する、
請求項１〜４のいずれかに記載のキット。
【請求項６】
ＰＣＲの付加的な試薬を含む水性溶液の追加後に、プライマー−オリゴヌクレオチドと参照核酸とが、その水性溶液中に溶解されるように、空間的に分離されたプライマー−オリゴヌクレオチドと参照核酸とが、トレハロースの存在において、その容器の壁上へ乾燥されている反応容器
をさらに有する、
請求項１〜５のいずれかに記載のキット。
【請求項７】
その反応容器が、マイクロ滴定プレートのウェルである
請求項１〜６のいずれかに記載のキット。
【請求項８】
その反応容器においては、両者のプライマーの量が７．５〜１５ｐＭｏｌで、参照核酸の量が標的配列の１００または１０００のコピーで、標準化されている、
請求項１〜７のいずれかに記載のキット。
【請求項９】
さらに、ＤＮＡまたはＲＮＡ抽出溶液、プロティナーゼ（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）−Ｋ溶液、ゲル・ローディング・バッファ（ｇｅｌ  ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）、ヌクレオチドおよび増幅バッファ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ  ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（登録商標）の１以上の緩衝および反応溶液を含む、
請求項１〜８のいずれかに記載のキット。
【請求項１０】
その反応容器は、ハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ）プローブ（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）  ｐｒｏｂｅ）、加水分解プローブ（ＴａｑＭａｎ（登録商標）  ｐｒｏｂｅｓ）、モレキュラー・ビーコン（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ）、スコーピオン（ｓｃｏｒｐｉｏｎ）−プライマー、または、Ｌｕｘ（登録商標）−プライマーのような、リアルタイムなＰＣＲのためにラベルされたＦＲＥＴプローブを含む、
請求項１〜９のいずれかに記載のキット。
【請求項１１】
特定の蛍光放射によって定量化可能であり、２重鎖ＤＮＡとＤＮＡ蛍光染料コンプレックスを形成する、インターカレートする蛍光染料の存在の下において、ＰＣＲの実施のために準備されている、
請求項１〜９のいずれかに記載のキット。
【請求項１２】
その蛍光染料は、ＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎ（登録商標）、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ、ＳＹＢＲ  Ｓａｆｅ、  ＹＯ（オキサゾール・イエロー）、ＴＯ（チアゾール・オレンジ）、および、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）のグループから選択される、
請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
保管形態においてラベルされた乾燥反応容器のセット中にて、プライマー−オリゴヌクレオチドと、標的配列を有する参照核酸の量は、そのインターカレートする蛍光染料の存在において、所定数のＰＣＲサイクルの後に、そのＤＮＡ蛍光染料コンプレックスの特有な蛍光放射のために、視覚的または容易に検出可能なターゲット値が得られるような方法で選択される、
請求項１１または１２に記載のキット。
【請求項１４】
その反応容器は、そのインターカレートする蛍光染料の吸収および放射周波数に対して、透明である、
請求項１０〜１３のいずれかに記載のキット。
【請求項１５】
分析、診断、および、技術的な目的のためにＰＣＲを実行するプロセスであって、
適合する試薬、酵素、および、ＤＮＡまたはＲＮＡのサンプルの追加後に、ＰＣＲにおいて標的配列の増幅を開始する、一連の既知な量のプライマー−オリゴヌクレオチドを有する、保管形態においてラベルされた乾燥反応容器のセットと、
一連の既知な量のプライマー−オリゴヌクレオチドと参照核酸と有しており、所定量の液体を追加後に、その参照核酸の一連の濃度を与え、その参照核酸が標的配列を含んでいる、保管形態においてラベルされた乾燥反応容器のセットとを使用することを具備しており、
ラベルされた乾燥反応容器の両セットは、保管形態において、既知の量のプライマー−オリゴヌクレオチドの水性溶液、および／または、参照核酸が、その反応容器において室温を超えた５から最大３０℃の温度で、環境圧力の下、単独で、１〜５ｍＭｏｌ／Ｌのトレハロースの存在において、その結果としてペレットが完全に乾燥されるが、吸湿しないような方法で、乾燥されるように、準備されることを特徴とする、
プロセス。
【請求項１６】
保管形態において、既知な量のプライマー−オリゴヌクレオチドと参照核酸とを有する、ラベルされた乾燥反応容器のセット中において、プライマー−オリゴヌクレオチドと標的配列を含む参照核酸との量は、既知な量のインターカレートする蛍光染料の存在、および、所定数のＰＣＲサイクルで、そのＤＮＡ蛍光染料コンプレックスの特有な蛍光放射のための、視覚的または容易に検出可能なターゲット値が得られ、そして、所定数のＰＣＲサイクルの実行後に、ＤＮＡ蛍光染料コンプレックスの特有な蛍光放射の決定が、そのサンプルを含む反応容器中と、参照核酸を含む反応容器中とにおいて、そのターゲット値に到達するような方法で、選択される、
請求項１５に記載のプロセス。
【請求項１７】
そのＤＮＡ蛍光染料コンプレックスの特有な蛍光放射の決定は、モバイルな蛍光測定デバイスを用いて実施される、
請求項１６に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、使い捨て可能な実験用具（ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ａｒｔｉｃｌｅ）に関し、特に、分析や診断目的のためにポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を実施するための反応容器に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、イン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）において、核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）分子の指数関数的な増幅を可能にする。ＰＣＲは、遺伝子指紋（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ）の決定、遺伝子のクローン作成、実父であることの決定、および、多くの他の用途のために、遺伝性で伝染性の疾病についての診断で用いられている。ヘーゼルナッツ、ピーナッツ、大豆、魚、小麦、穀物、動物種、そして、任意に遺伝子組み換えが行われている有機体（ＧＭＯ）、構成物質の起源の形成にて型や割合の量の決定のために、および、サルモネラ菌、リステリア菌などのような、病原になる細菌の存在の決定のためのコースの決定のために、食品化学（ｆｏｏｄ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ）において使用されている。多くの用途にも関わらず、ＰＣＲの基本的な手順は、おおむね、いつも同様である。その分析は、本質的には、サンプル品と、増幅されたＤＮＡまたはＲＮＡのタイプ、または、開始オリゴヌクレオチド（ｓｔａｒｔｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）（プライマー）、増幅されたＤＮＡ配列（ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の先頭または末端へ補われる配列とにおいて相違する。プライマーは、アニーリングによって、そのサンプル中で、相補的なヌクレオチド鎖（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｔｒａｎｄ）に結合し、もし存在するときは、その時、その合成的に生成された新規な二重鎖（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ）は、さらにＤＮＡ鎖（ＤＮＡ−ｓｔｒａｎｄ）の合成をするための開始点を更に含む。その反応の感度と特異性は、プライマーの長さと配列、および、ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）による、その酵素のＤＮＡ合成の顕著な忠実性（ｆｉｄｅｌｉｔｙ）によって与えられる。一般に、プライマーの最適な長さは、５５から７０℃の融点を持つ、１５から４０のヌクレオチドの間にある。特定のプライマーは別として、ＰＣＲのための反応混合物は、いつも、同じデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（ｄＮＴＰ）、水性の緩衝液（ｂｕｆｆｅｒ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、ＤＮＡポリメラーゼ、または、逆転写酵素、そして、さらに、分析されたサンプルのＤＮＡまたはＲＮＡを含む。ＰＣＲの後、その合成されたＤＮＡ生成物は、通常、その長さが分析され、そして、該当する場合には、酵素の制限によって照合される。特別なケースでは、そのＤＮＡの配列決定が行われる。
【０００３】
分析や診断目的のために、ＰＣＲロボットが利用されるが、これらは、一定に数多くのサンプルについてのみ、経済的に操作され得る。食物の分析においては、特に、個別なコントロールまたはバッチ（ｂａｔｃｈ）における分析の要求がある（たとえば、疑わしい汚染物の場合）。各調査のために、異なるプライマーとサンプルの試作が必要であることから、個別またはバッチの分析は、自動化が困難である。
【０００４】
ＤＥ  １９８  ４０  ５３１（ＷＯ００／１２７５６；ＣＡ  ２  ３４２  ５８１）は、所定量のプライマー、および、必要ならば、既知の量の参照核酸（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）でコートされた内壁を有する反応容器を開示しており、その内壁は、別に化学的または生化学的に変更されていない。実際には、その内壁のコーティングは、プラスチックの反応容器中で水性の核酸溶液の「マイルドな凍結乾燥（ｍｉｌｄ  ｌｙｏｐｈｉｌｉｓａｔｉｏｎ）」によって実施されており、核酸が内壁の上へ吸着される。吸着は、必ずしも可逆ではないので、多量な不特定なキャリア核酸（ｃａｒｒｉｅｒ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）を特定の核酸へ混合することが、更に推奨される。バイオ・テクニックス（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）１８（６）：９８１−９８４，Ｄａｙ  ＩＮＭ（１９９５）では、乾燥されたマトリックスＤＮＡ（ｍａｔｒｉｘ−ＤＮＡ）（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ＤＮＡ）と、ＰＣＲ・スターター・オリゴヌクレオチドを、遺伝分析に関連するマイクロ滴定プレート（ｍｉｃｒｏ−ｔｉｔｒｅ  ｐｌａｔｅ）で保管することが開示されている。遺伝分析においては、サンプル内のＤＮＡの量は、既知であるか、または、そのマトリックスＤＮＡの量は、その反応容器内で、関連していない。その開示された方法は、定量分析またはＤＮＡの未知な量の決定に対して、適していない。しかしながら、食物の分析や診断の多くの分野では、そのサンプル内での特定の核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の濃度は、正確に決定されなければならず、そして、そのような定量的な調査のための一の必要条件は、正確な標準希釈シリーズ（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｓｅｒｉｅｓ）の利用可能性である。反応に対して１から１０００００分子の非常に低い濃度では、核酸さえも、「不安定（ｕｎｓｔａｂｌｅ）」になるか、または、その分子が、その反応容器において、反応に利用されない。これは、より多量な不特定なＤＮＡを、その検出された核酸を有する実用的な配列相同性（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）がない、低濃度な特定の核酸へ加えることで改善される。しかしながら、これは、多くの理由で解決が難しく、多くの定誤差（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｒｒｏｒ）をもたらし、そのために、確定した濃度の原液から始める、全ての必要な希釈ステップ（ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｓｔｅｐ）を常に実施することが、一般に推奨される。これは、非常に作業を要し、ピペットで取ることの精度の変化が生じ、信頼性と再現性とを低減する。
【０００５】
国際特許出願（ＷＯ  ２００４／１０６５４９）は、核酸の保存のための方法が開示されており、ここでは、核酸の水性溶液が、二糖類（ｄｉｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）とコラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）、好ましくは、トレハロース（ｔｒｅｈａｌｏｓｅ）とコラーゲンの存在において、凍結乾燥される。トレハロースは、本質的に、より長く、核酸を形成すると思われ、そして、コラーゲンは、張り付いて、ガラス表面に存在する核酸を保護すると思われる。
【０００６】
国際特許出願（ＷＯ  ２００５／１０３２７７）は、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ）、緩衝成分、ＤＮＡ電気泳動法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）のための水溶性染料、および、安定剤（ｓｔａｂｉｌｉｓｅｒ）、Ｄ−グルコース（Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ），二糖類（たとえば、イヌリン（ｉｎｎｕｌｉｎ），スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）、トレハロース、および、マルトース（ｍａｌｔｏｓｅ））、および、多糖類（ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）（たとえば、Ｄ−マンニトール（Ｄ−ｍａｎｎｉｔｏｌ）、デキストラン（ｄｅｘｔｒａｎ）、フィコール（ｐｈｙｃｏｌｌ）、ポリビニルピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ  ｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）などを含む、ＰＣＲのための乾燥増幅混合（ｄｒｙ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｉｘｔｕｒｅ）と、技術的なＰＣＲ分析を教示している。そのＰＣＲ方法は、マグネシウムイオンを有するバッファ中での乾燥増幅混合の溶解、および、その次のプライマーとその分析されたＤＮＡサンプルとの付加を含む。
【０００７】
ＥＰＡ２１  ３７４  ８２７は、乾燥の安定化の方法と、ＰＣＲ−酵素と試薬との部分的な乾燥混合物と、さらに、これらの乾燥混合物を含むキットを開示している。これらの混合物は、クーリング・チャンバー（ｃｏｏｌｉｎｇ  ｃｈａｍｂｅｒ）内で、保管されるときでさえ、短期間の耐久力だけである。
【０００８】
Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  （２００５）  ７１  （１１）  ６７０２−１０において、トムリンソン（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ＪＡ）らは、実地試験における病原体の検出のための試薬セットを示している。彼らは、特に、室温で耐久性がある、リアルタイムに凍結乾燥されたＰＣＲ試薬を含む反応容器について述べており、ＤＮＡ抽出（ＤＮＡ−ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）の成功を示す、トレハロースによりＰＣＲ試薬混合物の長期の安定性と、プラントＤＮＡ（ｐｌａｎｔ  ＤＮＡ）のための内部のＰＣＲコントロールを有するキットについて述べている。その容器は、１０のＰＣＲ実験のための十分な試薬を含み、水が、その実験前に付加されなければならない。
【０００９】
Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  （１９９８）  ３６  （６）  １７９９の図２において、クラスター（Ｋｌａｔｓｅｒ  ＰＲ）は、トレハロースによるＰＣＲ試薬混合物の長期の安定性について示している。
【００１０】
ＩＥＥＥ  （２００６）における「Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  １ｓｔ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈｏｍｅ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｄ２Ｈ２）Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ，ＵＳＡ，Ａｐｒｉｌ２−４，２００６，ｔｈｅ  ａｒｔｉｃｌｅ  Ｄｒｙ−ｒｅａｇｅｎｔ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｆｏｒ  ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ  ｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃａｒｄ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｅｎｔｅｒｉｃ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ」においては、ラマチャドラン（Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ  Ｓ）らによる、トレハロースを用いたＰＣＲ試薬の安定性についても調査が示されている。その試薬は、マイクロ流体カード（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｃａｒｄ）に置かれ、そこでは、保存の間、トレハロースが、プライマー−ダイマー（ｄｉｍｅｒ）の形成を阻害する（同じ文献のｐ．１８の右列）。
【００１１】
その技術の状態は、問題を提示している。特に、その技術の状態の一の不利益は、全ての予防措置にも関わらず、同量のＤＮＡが容器へ導入された場合においてさえ、ＰＣＲ容器中において存在するＰＣＲの活性ＤＮＡの量が変わることである。これは、思うに、ＰＣＲ試薬−デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄｅｏｘｙ（ｒｉｂｏ）ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、プライマー・オリゴヌクレオチド、および、マトリクスＲＮＡまたはＤＮＡが、別々に、または、特別な物質または安定剤（非特定なＤＮＡ，ゼラチン（ｇｅｌａｔｉｎｅ）、コラーゲン、グルコース、イヌリン、マルトース、マンニトール、デキストラン、トレハロース、スクロース、および、他の二糖類、ＴＨＥＳＩＴ（登録商標）、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、ポリビニルピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ  ｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）、ＴＲＩＴＯＮ−Ｘ  １００（登録商標）、ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）、ウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）（ＢＳＡ）、フィコール、緩衝塩（ｂｕｆｆｅｒ  ｓａｌｔ）（たとえば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ＫＣｌ，ＤＴＴなど）と一緒に混合されて、容器内において凍結乾燥で乾燥されることに起因する。そのような乾燥されたＰＣＲ混合物は、高い吸湿性であり、湿度の上昇で、長期保存の間に活性と能力を失う。この効果は、コラーゲンとゼラチンのような安定化剤の付加によって、更に増幅される。もし、凍結乾燥がコラーゲンやゼラチンのような、ペースト状な物質無しに実施されたときには、そのＰＣＲ試薬は、フレーク（ｆｌａｋｅ）を形成し、容器内を移動して、その準備した容器内での定量的な分析が可能で無くなる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
それゆえ、特に、散在するサンプル（ｓｐｏｒａｄｉｃ  ｓａｍｐｌｅ）のために適しており、特別なツール（ｔｏｏｌ）を必要とせず、いかなる実験室でもすぐに日常的に使用でき、定量的かつ分析的な調査のために、化学的技術アシスタントのような適任者による特別な準備がいらない、ＰＣＲ試薬キットが必要である。本発明の目的は、上記のような問題を解決することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本問題は、請求項１による、準備された反応容器を有するパッケージング・ユニットと、請求項１５による独創的な方法によって解決される。本発明の好ましい実施態様は、従属請求項から派生される。
【００１４】
分析、診断、および、技術的な目的のためにＰＣＲを実行するための独創的なパッケージング・ユニットは、適合する試薬、酵素、および、ＤＮＡまたはＲＮＡのサンプルの追加後に、ＰＣＲにおいて標的配列の増幅を開始する、一連の既知な量のプライマー−オリゴヌクレオチドを有し、保管形態においてラベルされた乾燥反応容器のセットと、所定量の液体を追加後に、参照核酸の一連の濃度を与え、その参照核酸が標的配列が含む、一連の既知な量のプライマー−オリゴヌクレオチドと参照核酸と有し、保管形態においてラベルされた乾燥反応容器のセットとを具備している。本発明によれば、そのラベルされた乾燥反応容器の両セットは、保管形態において、既知の量のプライマー−オリゴヌクレオチドの水性溶液、および／または、参照核酸が、その反応容器において室温を超えた５から最大３０℃の温度で、環境圧力の下、単独で、１〜５ｍＭｏｌ／Ｌのトレハロースの存在において、その結果としてペレットが完全に乾燥されるが、吸湿しないような方法で、乾燥されるように準備される。本発明の別の実施形態においては、そのラベルされた乾燥反応容器の両セットは、その反応容器において、既知の量なプライマー−オリゴヌクレオチドの水性溶液、および／または、参照核酸が、環境温度で、０．１から０．３ｂａｒの減圧下、単独で、１から５ｍＭｏｌ／Ｌのトレハロースの存在において、その結果としてペレットが完全に乾燥されるが、吸湿しないような方法で、穏やかに乾燥されるように生成され、トレハロースが、結晶化されない。
【００１５】
その技術では、一貫して、オリゴヌクレオチド−プライマーまたは参照核酸の凍結乾燥について、それらの安定性を確実にするために、教示している。しかしながら、核酸またはオリゴヌクレオチドの凍結乾燥は、しばしば、リント（ｌｉｎｔ）の出現を導いて、貯蔵可能でない反応容器が得られる。また、その「アクティブな乾燥（ａｃｔｉｖｅ  ｄｒｙｉｎｇ）」、または、バッファや増幅の混合物の凍結乾燥は、しばしば、表面反応をもたらす。近い水素結合は、その反応容器の壁上で、ヒドロキシ、および、他の酸素含有官能基と共に形成され、それによって、さらに、核酸が、部分的に不溶になる。そして、分離ステップにおいて、その表面から核酸とオリゴヌクレオチドを分離することが必要になる。それゆえ、その技術では、不特定なＤＮＡ、ゼラチン、コラーゲン、グルコース、イヌリン、マルトース、マンニトール、デキストラン、トレハロース、スクロース、および、他の二糖類、ＴＨＥＳＩＴ（登録商標）、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ＴＲＩＴＯＮ−Ｘ  １００（登録商標）、ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、フィコール、および、その他のもののような、水素結合を形成する分子を含む、ヒドロキシは、所望な非常な低濃度において、「安定な」オリゴヌクレオチドと核酸のために、および、その容器の壁上でそのペレットを保持するために、その乾燥混合物へ加えられる。そのような緩衝溶液のみが、ゆっくりと、不十分に、乾燥されることから、これらの溶液は、通常、凍結乾燥され、吸湿性のペレットをもたらし、そこでは、その核酸とそのプライマー−オリゴヌクレオチドは、安定で無くなる。本発明者らは、低濃度なトレハロースの存在において、わずかに高温で乾燥することが、多くの好適な結果をもたらすことを見出した。しかしながら、あまりに多くのトレハロースまたは他の緩衝塩は、その乾燥の間に、フレークの形成をもたらす。本発明によれば、ガラスのようにハードな（ｇｌａｓｓ−ｈａｒｄ）トレハロース層は、高められた温度の下での、１から４時間以上の乾燥の間に形成され、その容器の表面に強力に付着し、そこでは、プライマー−オリゴヌクレオチドおよび／または参照核酸が、埋め込まれた。そのような乾燥プロセスの間のみで、そのトレハロースは、水素結合で水分子を置換することができ、その核酸とオリゴヌクレオチドが、必要な非常に低い量で、安定に残る。
【００１６】
本発明の別の観点は、プライマー−オリゴヌクレオチドまたは核酸を有する、均一に生成された反応容器の組合せに関する。驚くべきことに、その水性溶液がトレハロースの存在においてのみ、乾燥されると、１００から１０００のような標的配列の小さなコピー数が、安定になる。なぜならば、そのプライマーと参照核酸とを有する反応容器は、同様な方法で生成されるので、そのサンプルと参照との間の明白な相当性は、保証される。
【００１７】
本発明の一の好ましい実施形態は、上記の反応容器を有するパッケージング・ユニットであって、反応容器中の水性溶液の体積が、乾燥前で、１〜２５μＬである。そのプライマー濃度が、１から５ｍＭｏｌ／Ｌのトレハロースを有し、０．１と１００μＭｏｌ／Ｌとの間である。その標的配列が、好ましくは、ゲノムのＤＮＡまたはプラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）として、１０から１０００００単位の量の参照核酸を有する反応容器内に存在する。増幅（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｅ）も、また、使用される。しかしながら、増幅が、このような条件の下で、より不安定になることが見出された。思うに、ヌクレアーゼ（ｎｕｃｌｅａｓｅ）の外部の活性（ｅｘｏ−ａｃｔｉｖｉｔｙ）は、増幅が使用されるときに導入される。反応容器当たりのコピー数は、好ましくは、１００と５０００との間である。
【００１８】
さらなる実施形態は、ホット・スタート・ＰＣＲ（Ｈｏｔ−Ｓｔａｒｔ−ＰＣＲ）のための反応容器に関する。この場合には、その乾燥されたプライマーまたは参照核酸は、５７℃の温度で溶融が開始し、そして、水性溶液内で浮遊する、炭化水素ワックスによってカバーされる。これは、プライマーと核酸とが、低温で互いにハイブリット形成すること（ｈｙｂｒｉｄｉｓｉｎｇ）から防止する。ホット・スタート・ポリメラーゼが通常のポリメラーゼと逆転写酵素よりも相当に高価ではあるが、同じ効果は、また、５０°Ｃを超える温度で活性になる、ホット・スタート・ポリメラーゼ（ｈｏｔ−ｓｔａｒｔ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を使用することで達成される。高融点な炭化水素ワックスの層は、また、プライマー、および／または、参照核酸を有する、底にあるペレット（ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ  ｐｅｌｌｅｔ）を、湿気から保護する。
【００１９】
特に好適な本発明の実施形態においては、そのキットが反応容器を含み、そこでは、ＰＣＲのためのさらなる試薬を有する水性溶液の追加後に、プライマー−オリゴヌクレオチドおよび参照核酸が、その水性溶液中へ溶解されるような方法で、空間的に分離されたプライマー−オリゴヌクレオチドと参照核酸とが、トレハロースの存在において、その容器の壁上へ乾燥される。
【００２０】
実用的な理由のために、その容器は、好適には、マイクロ滴定プレート内でウェル（ｗｅｌｌ）として形成される。マイクロ滴定プレートは、通常、２４、４８、９６、１９２、または、３８４のウェルを有するプレートとして、商業的に利用可能である。
【００２１】
その反応容器において、２つのプライマーの量は、好適には、７．５ｐｍｏｌ（２．５〜１５ｐｍｏｌ）にセットされ、参照核酸の量が、標的配列の１００〜１０００コピーにセットされる。すなわち、増幅の第１段階では、マトリクス（標的配列）の量は、限定され、マトリクス、プライマー、および、ポリメラーゼが会う確率は、最適以下（ｓｕｂｏｐｔｉｍａｌ）ではあるが、増幅の第３段階の間、生成物（ＤＮＡ、ピロリン酸塩（ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、一リン酸ヌクレオチド（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ））の量が、それらがその反応を阻害する範囲まで増加され、さらなる生成物のフラグメントが互いにハイブリッド形成されて、その基質がゆっくりと消費され、そして、最終的には、そのポリメラーゼとヌクレオチドが、ゆっくりとその熱で破壊される。指数関数的な増加は、リアルタイムなＰＣＲのための蛍光を用いるときに、定量化が可能であり、間における段階の間にのみに生ずる。そのＰＣＲは、１２から４００で開始するコピーの場合には約３０サイクルで、２００から３２００で開始するコピーの場合には２５サイクルで、および、３０００から５００００で開始するコピーの場合には、少なくとも２０サイクルで、指数関数的であり続ける。その指数関数的な段階の開始で測定を可能にするために、そのＣＴ値（ＣＴ−ｖａｌｕｅ）（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｃｙｃｌｅ）、または、ＣＰ値（Ｃｐ−ｖａｌｕｅ）（ｃｒｏｓｓｉｎｇ  ｐｏｉｎｔ）は、しばしば、使用され、蛍光がわずかに最初のバックグラウンドな蛍光を超えて上昇する間に、そのサイクルを示す。
【００２２】
本パッケージング・ユニットは、さらに、たとえば、ＤＮＡまたはＲＮＡ抽出溶液、プロティナーゼ（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）−Ｋ溶液、ゲル・ローディング・バッファ（ｇｅｌ  ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）、ヌクレオチド、および、増幅バッファ（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）（ＭａｓｔｅｒＭｉｘ）、ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素のような、緩衝および反応溶液の１つ以上を含む。たとえば、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．のＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ（登録商標）ＭａｓｔｅｒＭｉｘのように、全ての可能な手段で最適化された、より完全な増幅混合物が、すぐに利用できる形態で、商業的に利用可能であるので、ユーザーは、ＭａｓｔｅｒＭｉｘを含む最後に名付けられたオプションのみが完全に述べられているように、ただ、これまでに用いられた混合物を信じる。
【００２３】
本発明によれば、プライマー−オリゴヌクレオチドと参照核酸のみが、その反応スペースまたは反応容器の内壁上に存在し、トレハロース膜に埋め込まれている。トレハロース（ミコース（ｍｙｃｏｓｅ）としても知られている）は、非還元な二糖類であり、２つのα−１，１−グルコシド結合されたＤ−グルコース分子から形成されており、タンパク質およびヌクレオチドと水素結合を形成することができる（Ｃｏｌａｃｏ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ  （１９９２）  ｉｎ  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０，１００７−１０１１参照）。トレハロースは、それゆえ、強いＰＣＲエンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）であり、一方で、溶液において、融点を下げ、他方で、熱的に、そのＴａｑ−ＤＮＡポリメラーゼを安定にする（Ｓｐｉｅｓｓ  ＡＮ  ａｔ  ａｌ  （２００４）  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５０（７），  １２５６−１２５９）。さらに、ホット・スタート（Ｈｏｔ−Ｓｔａｒｔ）ＰＣＲにおいて、トレハロースの存在にて、反応成分の一部を乾燥し、そして、約５７°Ｃで溶融するワックス内にそれらを埋め込むことが教示されている（Ｋａｉｊａｌａｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２１（１２）：２９５９−２９６０参照）。その反応成分は、ワックスの液滴内に埋め込まれ、そのとき、より高温でのワックス・コーティングの溶融の上方でＰＣＲ分析（ａｓｓａｙ）の他の反応成分のみへ放出され、ミスプリミング（ｍｉｓｐｒｉｍｉｎｇ）と、低温でのＤＮＡポリメラーゼ反応の早期な開始を避ける。しかしながら、ポリエチレン・ワイヤ上でのワックス液滴（ｗａｘ  ｄｒｏｐｌｅｔ）内におけるその反応成分の一部の埋め込み（ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ）が、複雑であることから、本プロセスが、非常に多いサンプルの数に対して、唯一、適している。ポリエチレン・ワイヤ（ｗｉｒｅ）上での、プライマーと参照核酸の長期耐久性の教示は、ない。本発明によれば、ワックス液滴技術とは異なり、そのプライマーおよび／または参照核酸は、トレハロースの存在において、反応容器の壁上へ、好ましくは、容器の底（ｂａｓｅ）の上に乾燥される。そのように具体的に準備されたサンプル容器は、そのとき、水と増幅混合物（ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ、Ｍｇ２＋、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ  ８．０）の定義済みな量の追加によって、活性化される。そのラベルされたサンプル容器が、すでに、プライマーと、既知な量で前もって決定された標的配列のコピー数とを含み、ガラスのようなトレハロース層によって保護され、ＰＣＲのその条件の下で、完全に溶解されているので、さらなるステップは、必要ではない。そのトレハロースは、参照核酸の２、３のコピーのために、たいてい、溶解補助剤（ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ  ａｉｄ）として作用する。
【００２４】
酵素反応（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）のために必要な試薬を反応容器へプレ導入し、必要ならば、そのサンプル容器の表面上へその試薬を乾燥することが知られているが、その試薬が凍結乾燥または乾燥の間に互いに異なって結晶化して、小さなフレークを形成し、その表面に付着せずに、容器全体を介して散乱することが問題になる。その容器の底（ｂａｓｅ）で、ペレットとして、その試薬の全てを凝縮したいときには、多量な塩（ｓａｌｔ）が必要になる。これは、次の酵素反応を妨害し、そして、異なる試薬の安定性がもはや確保できないが、それらも、水に結合する。本発明によれば、この問題は、過剰な試薬の除去により、および、生理学的な量のトレハロースの存在において、オリゴヌクレオチドと参照核酸のみを、ポリエチレンの壁のような、不活性な基材（ｉｎｅｒｔ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）上へ乾燥することにより、解決される。全ての糖が適するとは限らず、ガラスのような層を乾燥で形成するだけである。同時に、その糖は、水の存在において、速く溶解しなければならない。
【００２５】
これらの必要条件は、理想的には、トレハロースによって満たされる。トレハロースは、若干、吸湿性があり、比較的に高いゲル化およびガラス転移（ｇｌａｓｓ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）温度を有する。本質的に、トレハロースは、霜または冷凍保存状態の間、および、また、乾燥期間（ｄｒｏｕｇｈｔ  ｐｅｒｉｏｄ）の間の氷結晶からの損傷から、セルを保護する。ある方法では、トレハロースは、機能上、ショ糖（ｓａｃｃｈａｒｏｓｅ）と同等であるが、異なるガラス点（ｇｌａｓｓ−ｐｏｉｎｔ）と安定化特性を有する。トレハロースは、植物（ｐｌａｎｔ）や、キノコ（ｆｕｎｇｉ）や、多くの昆虫の血リンパ（ｈｅｍｏｌｙｍｐｈ）中において、自然に存在する。トレハロースは、化学的および熱的に安定であって、酸に対して安定であり、そして、水に容易に溶解し、それにより、トレハロースは、低い温度では、ショ糖よりも溶解せずに、高温では、より溶解する。二糖類と対照的に、トレハロースは、加水分解性（ｈｙｄｒｏｌｙｓａｂｌｅ）でなく、アミノ酸またはタンパク質とのメイラード反応（Ｍａｉｌｌａｒｄ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）に加わらない。また、プラスチックの壁に、高い密着性を有する。
【００２６】
それゆえ、ＰＣＲのための反応容器が利用でき、室温で、何月、何年の間、保存することができる。必要なときは、その反応容器は、すぐに使用できる。したがって、不連続または散発的なサンプルを有する、小さく、中間なサイズの実験室でさえ、定量的なＰＣＲ分析の必要性が、手作業で、即時かつ多大な努力なしに、これらを処理できる。全てのプライマーおよび参照核酸は、正確な量、および、その反応容器中での即時の使用のために利用でき、そして、特定な分析反応とマスターミックス（Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ）（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｉｘｔｕｒｅ）とのために準備されたサンプルＤＮＡまたはＲＮＡのみが、加えられなければならない。しかしながら、これは、いつも、必須である。本発明によれば、プライマーと参照核酸の量の不適当な追加または不適当な決定によってもたらされる、起こりうるエラーが、除かれる。好ましい実施例においては、「不適当な（ｗｒｏｎｇ）」核酸を有する容器、または、さらにポジティブおよびネガティブなコントロールは、独創的なサンプル容器と同様に、供給される。
【００２７】
すぐに使用できるマスターまたは増幅混合物は、自然に、または、遺伝的に変性、または、化学的に変性されたＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素を変更して、多くのサプライヤーから商業的に入手される。典型的に使用されるＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ−ＤＮＡポリメラーゼ、５’−３’−外部活性（ｅｘｏａｃｔｉｖｉｔｙ）（ＫｌｅｎＴａｑ）が欠落している、Ｔａｑ−ＤＮＡポリメラーゼの組み替え型（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）のトランケートされた形態、ホット・スタート（Ｈｏｔ−Ｓｔａｒｔ）ＰＣＲのために化学的に変性されたＴａｑ−ＤＮＡポリメラーゼ、または、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉｉからの高い忠実度（ｈｉｇｈ−ｆｉｄｅｌｉｔｙ）な組み替え体である熱安定性のＤＮＡポリメラーゼなどである。そのマスター混合物は、繰り返して、濃縮され、マグネシウムイオンを含むか、または、含まない。これは、そのマグネシウムイオンが、分離されたマグネシウム・ストック（たとえば、２５ｍＭのＭｇＣｌ２）から加えられることを意味する。そのマスターミックス（Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ）は、さらに、サンプルの密度を増加させる成分を含み、そのＰＣＲからの生成物が、分析または定量的なアガロース・ゲルのポケットへ直接的に追加される。そのマスターミックス（Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ）は、リアルタイムなＰＣＲ、または、アガロース・ゲル上での分析のいずれか一方のために、さらに、染料を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
本発明のさらなる問題点、利点、および、解決が、下記の実施例と図から導かれる。
【図１】図１は、異なるサンプルと参照核酸を有する、本発明のラベルされた反応容器において、増幅された生成物のゲル電気泳動を示している。
【図２】図２は、３７℃で６月間（エージングの挙動の比較）のエージング実験における、従来のサンプルと、本発明による参照核酸の乾燥サンプルを有する、ラベルされた反応容器において、増幅された生成物のゲル電気泳動を示している。
【図３】図３は、異なる量でヘーゼルナッツＤＮＡが加えられ、３７℃で６月を越えてエージング（感度実験）がされた本発明の反応容器において、増幅された生成物のゲル電気泳動を示している。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００２９】
実施例１：食品におけるヘーゼルナッツ（Ｃｏｒｙｌｕｓ  Ａｖｅｌｌａｎａ）の検出のためのテスト
【００３０】
ラベルされたポリプロピレン反応容器が供給され、そのウェル（ｗｅｌｌ）内においては、ヘーゼルナッツと、参照核酸としての完全なヘーゼルナッツＤＮＡの検出のための既知の量（２００μＬ）の特定なプライマーが、乾燥された。これは、濃度が１０μＭｏｌ／Ｌである第１のプライマーＣａＭＡＶ−Ｆ３の０．７５μＬと、濃度が１０μＭｏｌ／Ｌである第２のプライマーＣａ−Ｒ０５の０．７５μＬと、５ｍＭｏｌ／Ｌであるトレハロース溶液の２μＬと、０．５μＬの水との混合物に相当する。その参照核酸は、２００ｐｇであるゲノムのヘーゼルナッツＤＮＡであって、標的配列（ｔａｒｇｅｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（単位複製配列）の１００回のコピーに相当しており、および、それの５倍（ｆｉｖｅ−ｆｏｌｄ）および１０倍（ｔｅｎ−ｆｏｌｄ）が、それぞれ、０．５μＬ中で溶解され、水に代わって、溶液中へ加えられる。その乾燥時間は、環境気圧（ａｍｂｉｅｎｔ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）の下で、４０℃で３時間であり、乾式加熱オーブン（ｄｒｙ  ｈｅａｔｉｎｇ  ｏｖｅｎ）内で実行される。その反応容器は、使用まで、閉められていた。このステージでは可能であったが、リアルタイムなＰＣＲのためのＰＣＲプローブについては、さらに乾燥しなかった。最後に、そのマイクロ滴定プレート（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ  ｐｌａｔｅ）の準備したウェルは、サンプル内にてヘーゼルナッツＤＮＡの検出するために、または、ネガティブなコントロール（マスター混合物の汚染物をチェックすること）のため、および、抽出コントロール（汚染物の抽出をチェックすること）のために、最適な量で必要になるプライマーを含む。赤でラベルされた反応ウェルは、プライマーの付加において、低量なヘーゼルナッツＤＮＡを含む。それらは、一方でポジティブなコントロールがなされ（マスター混合物の機能）、他方で、阻害コントロール（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｃｏｎｔｒｏｌ）（阻害剤のためのＤＮＡアイソレート（ＤＮＡ−ｉｓｏｌａｔｅ）をチェックすること）、および、さらに、サンプル中でＤＮＡの定量化することを許容する。
【００３１】
ＤＮＡ抽出は、シリカ・マトリックス（ｓｉｌｉｃａ  ｍａｔｒｉｘ）上での精製を伴うＣＴＡＢ手順（ＩＳＯ２１５７１，Ｆｏｏｄｓｔｕｆｆｓ−Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ−  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）に従って、実施された。そのサンプルは、均質化され、１５ｍＬの遠心分離チューブへ、１ｇ分、入れられ、１０ｍＬのＣＴＡＢ抽出溶液（２％セチルトリメチルアンモニウムブロマイド（ｃｅｔｙｌ  ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）、１．４ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、０．０２Ｍ  ＥＤＴＡ、０．１ｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ｐＨ８．０）と、５０μＬのプロティナーゼ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）−Ｋ（１０ｍｇ／ｍＬ）が加えられ、６０℃で少なくとも９０分間シェイクして混合と培養を実施した。１ｍＬの液体は、各サンプルから移動されて、１７０００×ｇで５分間、遠心分離され、そして、７５０μＬの上澄み（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）が、３００μＬのクロロホルム（ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）／イソアミルアルコール（ｉｓｏａｍｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ）「Ｒｅａｄｙ  Ｒｅｄ（商標）」（ＭＢ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，  Ｉｌｌｋｉｒｃｈ，  Ｆｒａｎｃｅ）で抽出された。これは、１７０００×ｇで５分間、さらに遠心分離された。５００μＬの水性の上澄みは、３００μＬのイソプロパノール（ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ）で処理され、混合され、そして、その沈殿したＤＮＡが、１７０００×ｇで１０分間、ペレット化された。そのペレットは、５００μＬのエタノール（ｅｔｈａｎｏｌ（７０％））で洗浄され、そして、再び、１７０００×ｇで５分間、ペレット化された。その上澄みは、移動され、そのＤＮＡペレットは、簡潔に、空気で乾燥され、１００μＬの水に溶解された。（もし必要であれば、超音波処理（ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）を用いる）。
【００３２】
さらに、ＤＮＡ精製が、Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ（Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ＰＣＲ精製キットを用いて、実施された。５００μＬのＰＢバッファ（Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ）は、１００μＬのＤＮＡ抽出物へ加えられて、よく混合され、その溶液がそのカラム上へ搭載され、そして、そのカラムが、１７０００×ｇで１分間、遠心分離された。その貫流（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）は、処分され、７５０μＬのＰＥバッファ（Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ）が、そのカラム上に搭載されて、１７０００×ｇで３０秒間、遠心分離された。その貫流は、再び処分され、そして、そのカラムは、さらなる搭載無しに、別途、３０秒間、１７０００×ｇで遠心分離された。その回収したチューブは、処分され、そして、そのカラムは、新規な反応容器中へ導入された。２５０μＬのＥＢバッファと共にカラムを搭載した後に、１７０００×ｇで１分間、遠心分離し、そのカラムは、処分され、そして、その溶出液が、ＰＣＲで使用された。全ての手順が、通常の保護手段（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｍｅａｓｕｒｅ）を用いて実施された。繰越しを回避するために、保護服と共に、フィルタ付きのミクロピペット（ｍｉｃｒｏｐｉｐｅｔｔ）を使用することが推奨された。
【００３３】
その分離されて精製されたＤＮＡは、マイクロ滴定プレート（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ  ｐｌａｔｅ）の反応ウェル内で、増幅される。１２．５μＬのＤＮＡ抽出と、１２．５μＬの２×ＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ（登録商標）マスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とが、そのウェルへ加えられる。その標的配列の増幅が、サーモサイクラー（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ）で次に行われる。このケースでは、そのサイクラーのプロファイルは、ポリメラーゼ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）の初期活性化（ｉｎｉｔｉａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）として、９５℃で１０分間、４５サイクルの間で９５℃で１５秒間、および、６２℃で６０秒間である。もし、必要であるならば、その時間プロファイルは、変えなければならない。５μＬの増幅（７８の塩基対の増幅）は、２．５％のアガロース・ゲル（ａｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌ）（ＴＡＥバッファ中での２から４μＬのエチジウムブロマイド（ｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ））でのローディング・バッファー（ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）の付加と、通常の電気泳動（３〜６Ｖ／ｃｍ）で１０分）の後、分析され、そして、その生成物が、トランスイルミネーター（ｔｒａｎｓｉｌｌｕｍｉｎａｔｏｒ）で可視化される。
【００３４】
正確な分析結果を得るために、その標的配列を有するポジティブなリファレンスが、７８の塩基対の長さのバンドを示さなければならず、そして、ネガティブなコントロールが、このエリアにおいてバンドを示さなかった（図１参照）。もし、そのサンプルが、リファレンス以上の高いバンドを示すときには、その反応は、ポジティブとして確認される。もし、バンドがないときには、これは、ヘーゼルナッツＤＮＡがそのサンプルにて存在しないか、または、その反応が阻害されたことを意味するのみである。阻害は、参照核酸と共にウェル中で同じＤＮＡ分離が、明確にポジティブなときに、除外される。もし、そのようなケースでないときには、その反応の阻害があり、そして、そのＤＮＡ分離が、より高い希釈で増幅される。
【００３５】
分解に起因して参照核酸が不十分な量で存在するケースが起こらないために、全てのサンプルの組合せは、独創的なマイクロ滴定プレート上にて、標準化された量のリファレンスと、制御核酸と、最適化されたプライマー濃度でテストされる。
その増幅の配列の同定は、付加的に、制限によってテストされ、たとえば、ＢａｍＨ  Ｉを用いる。ヘーゼルナッツＤＮＡの場合には、これは、２０ｐｂと５８ｐｂのそれぞれの長さの２つのフラグメント（ｆｒａｇｍｅｎｔ）をもたらす。ゲノムのヘーゼルナッツＤＮＡのための検出限界は、約５０ｐｇである。本反応は、以下の種のいずれの１００ｎｇのＤＮＡに対して特有である。ピーナッツ、アーモンド、カシュナッツ、マカダミアナッツ、クルミ、ペカン・ナッツ（ｐｅｃａｎ  ｎｕｔ）、ピスタチオ、アプリコット、コーン、大豆、セロリ、アブラナ属（ｂｒａｓｓｉｃａ））、オレンジ、マンダリン、ブラジル・ナッツ、小麦、ライ麦、大麦、カラスムギ（ｏａｔ）、スペルト小麦（ｓｐｅｌｔ）、ソバ（ｆａｇｏｐｙｒｕｍ）（図１参照）
【００３６】
参照核酸との強度を比較することで、ポジティブなサンプルＤＮＡの定量化もまた、可能になる。
【００３７】
実施例２：トレハロースの存在と非存在とにおける乾燥でのエージングおよび相対感度；保存性（ｓｔｏｒａｂｉｌｉｔｙ）のアセスメントのためのストレステスト／耐久性（ｄｕｒａｂｉｌｉｔｙ）／収率（ｙｉｅｌｄ）
【００３８】
そのラベルされた反応容器は、参照ＤＮＡを有するいくつかの反応容器が、トレハロースの存在中で乾燥されると共に、参照ＤＮＡを有するいくつかの反応容器が、トレハロースの存在なしに乾燥されることを、相違点として、実施例１にて示すように、生成されている。その反応容器は、３７℃で６月間、保管された。増幅のために、その反応容器は、１２．５μＬの２倍に濃縮されたマスターミックス（ＭａｓｔｅｒＭｉｘ  （ＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ（登録商標）  ＭａｓｔｅｒＭｉｘ））と、１２．５μＬの水とで満たされて、閉じられ、そして、ＰＣＲサイクラー（ｃｙｃｌｅｒ）（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ）中へ置かれた。そのサイクラーのプロファイルは、実施例１でのプロファイルと同一である。その後のゲル電気泳動は、両者の反応容器について、７８ｂｐでバンドを示した。しかしながら、トレハロースなしの反応容器からのバンド強度は、トレハロース有りの反応容器からのバンド強度の約１／３であった（図２参照）。
【００３９】
これは、プライマーと参照ＤＮＡがトレハロースの存在で乾燥されない反応容器が、増幅において、明確に低い収率を与えることを示しており、したがって、それらがもし長期間保管されたときには、より感度が低下することを示している。
【００４０】
実施例３：３７℃での保管後の感度
そのラベルされた反応容器は、実施例１で示したように、生成され、そして、３７℃で６月保管された。増幅のために、その反応容器は、１２．５μＬの２倍に濃縮されたマスターミックス（ＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ（登録商標）ＭａｓｔｅｒＭｉｘ）と、１２．５μＬのＤＮＡ分離体（ＤＮＡ−ｉｓｏｌａｔｅ）とで満たされて、閉じられ、そして、ＰＣＲサイクラー（ｃｙｃｌｅｒ）（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ）中へ置かれた。そのＤＮＡ分離体（ＤＮＡ−ｉｓｏｌａｔｅ）は、１００ｐｇ，５０ｐｇ，２５ｐｇ，６．２５ｐｇ、そして、ヘーゼルナッツＤＮＡなしの量で、ヘーゼルナッツＤＮＡを含む。そのサイクラーのプロファイルは、実施例１でのプロファイルと同一である。そのゲル電気泳動は、ヘーゼルナッツＤＮＡを含まないものを除いた、全ての反応容器において、７８ｂｐの長いフラグメントの増幅を示した（図３参照）
【００４１】
したがって、もしそのプライマーが、５ｍＭｏｌ／Ｌのトレハロースの存在で乾燥されたときには、それらは、上昇された温度で、より長期な保管後でも、それらの活性を維持する。
【００４２】
実施例４：リアルタイムなＰＣＲでの適用
５０μＭｏｌ／Ｌの濃度である０．４５μＬの第１のプライマーＣａＭＡＶ−Ｆ３、５０μＭｏｌ／Ｌの濃度である０．４５μＬの第２のプライマーＣａ−Ｒ０５、１０μＭｏｌ／Ｌの濃度である０．６２５μＬのプローブＣａＭＡＶ−Ｓ１、５ｍＭｏｌ／Ｌである２μＬのトレハロース溶液、および、０．４７５μＬの水の混合物を、各反応容器へ加える。参照核酸は、標的配列（単位複製配列）の１００回のコピーに相当する、２００ｐｇのゲノムのヘーゼルナッツＤＮＡであり、０．４７５μＬに溶解され、水に代わって溶液へ加えられる。乾燥は、周囲圧力の下、乾燥加熱オーブン内において、４０℃で３時間以上、実施された。反応容器は、ホイルでラップされ、使用まで、暗所で保管された。
【００４３】
増幅のために、１２．５μＬのユニバーサル・マスターミックス（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＭａｓｔｅｒＭｉｘ）（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と、１２．５μＬのＤＮＡ分離体（ＤＮＡｉｓｏｌａｔｅ）は、各反応容器へ加えられ、その反応容器は、リアルタイムなＰＣＲマシン（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＳＤＳ  ７５００）中へ置かれた。増幅は、実施例１と同じ温度プロファイルに従って実施された。
【００４４】
ヘーゼルナッツＤＮＡ分離体は、マトリクスとして、異なる濃度へ追加された。反応容器当たりのコピー数は、２０と１０００００との間であった。各コピー数は、３倍に増幅された。その結果については、表１に示してある。
【００４５】
本発明によって準備された反応容器中でのリアルタイムＰＣＲ
【表１】
2010510789.tif 000003
【００４６】
得られたＣｔ値は、コピー数の全範囲にわたって、良い直線性を示している。
【００４７】
実施例５：蛍光終点決定における適用
本発明による反応容器は、終点決定で用いるＰＣＲ分析を許容するように、標準化される。これは、サルモネラ（ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ＤＮＡの決定のために、ここに示される。
【００４８】
２５ｇ（ｍＬ）の食品サンプルは、無菌なストマッカー（Ｓｔｏｍａｃｈｅｒ）バッグ中へ計量され、２２５ｍＬの緩衝されたペプトン水で１：１０（ｗ／ｖ）に希釈され、３７℃で１８時間、プレ培養される。サルモネラ菌の選択的な再生が、起こった。そのために、０．１ｍＬのプレ培養は、１０ｍＬのＲＶＳブイヨン（ｂｏｕｉｌｌｏｎ）と共に、細菌培養管（ｃｕｌｔｕｒｅ  ｔｕｂｅ）中へ移動され、そして、４２℃で５〜６時間、培養された。
【００４９】
ＤＮＡ抽出のために、その選択的な培養の１ｍＬは、１０００００×ｇで５分間、遠心分離され、その上澄みが移動され、そのペレットが、０．２ｍＬ  ０．１×ＴＥバッファで再懸濁（ｒｅ−ｓｕｓｐｅｎｄｅｄ）され、そして、１０分間、９５℃へ加熱された。冷却後、そのプローブは、５分間、１４０００×ｇで遠心分離され、そして、そのＤＮＡを含む上澄みが、直接的に、ＰＣＲにおいて使用された。
【００５０】
ＳＹＢＲグリーン蛍光終点を有するＰＣＲのために、マイクロ滴定プレートのキャビティ（ｃａｖｉｔｙ）は、プレ乾燥されたプライマーまたは参照ＤＮＡ（ＰＣＲ  Ｆａｓｔ  ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，  Ｌｏｔ  ＴＳＡＬ＿３９５３１）と、１２．５μＬのマスターミックス（ＭａｓｔｅｒＭｉｘ）（Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  ＭａｓｔｅｒＭｉｘ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｎｒ．４３６７６５９）で満たされた。そのとき、食品サンプルおよびその希釈物からのＤＮＡ分離体の１２．５μＬが、加えられ、その片（ｓｔｒｉｐ）が閉じられて、ＰＣＲ−サーモサイクラー（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ  Ｍｘ  ３００５  Ｐ）中へ置かれた。増幅は、下記の温度プロファイルで実行された。：９５℃，１０分、９５℃で１５秒を３０サイクル、および、６７℃で６０秒。
【００５１】
増幅の末端での最後のサイクル（Ｒ  Ｌａｓｔ／蛍光終点決定、ハロゲンランプからの白色光による刺激、および、５２０ｎｍでの放射測定、単位なし（ｎｏ  ｕｎｉｔ））の後の蛍光の測定は、以下の値を与えた。
【００５２】
【表２】
2010510789.tif 000004
【００５３】
ＰＣＲの状態（プローブ検出）：プレ乾燥されたプライマーとサンプル（ＰＣＲ  Ｆａｓｔ  ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，Ｌｏｔ  ＲＳＡＬ＿３９２３９）を含むウェルは、１２．５μＬのマスターミックス（ＭａｓｔｅｒＭｉｘ）（ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）ＰＣＲ  ＭａｓｔｅｒＭｉｘ，  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｎｒ．４３１８７３９）で処理された。そのとき、食品サンプルからのＤＮＡ分離体の１２．５μＬが、加えられ、その片が閉じられて、ＰＣＲサーモサイクラー（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ  Ｍｘ  ３００５  Ｐ）内へ置かれた。増幅は、下記の温度プロファイルで実施された。：９５℃，１０分、９５℃で３０秒を３５サイクル、６０℃で４５秒間、および、７２℃で３０秒。増幅末端での蛍光値（Ｒ  Ｌａｓｔ、ハロゲンランプからの白色光による刺激、および、５２０ｎｍでの放射測定、単位なし（ｎｏ  ｕｎｉｔ））の測定は、終点決定のために、下記の蛍光値を与えた。
【００５４】
【表３】
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【００５５】
両者の実験は、ポジティブとネガティブなコントロールの間、または、サンプルでの蛍光終点決定における測定の相違が、それぞれで大きく、複雑な測定なしに、食品サンプルにおいて、サルモネラ菌の有無を容易に区別できることを示している。その測定のために、ハロゲンランプからの白色光を用いた刺激と、５２０ｎｍでの放射測定で（別のユニットなしに）十分であった。したがって、サルモネラ菌のテストは、非常に基本的な装備の実験室で、ＰＣＲを用いて実行された。好ましくは、反応容器は、好適には、ポリカーボネートのように、関連有る波長で透明なものが、使用される。
【００５６】
まとめ（Ｓｕｍｍａｒｙ）
本発明に従って準備された反応容器によれば、生体分子の食品分析は、シンプルかつ標準化された方法で、実施される。したがって、革新的な製品が、食品および飼料（ｆｏｄｄｅｒ）において、特有なＤＮＡフラグメントのシンプルな生体分子の決定にて利用可能になる。その準備された反応容器は、アレルゲン、ＧＭＯ、動物種、および、衛生の分野において、すべての関連するパラメータに適用される。
【００５７】
これは、最も重要なキーとなる試薬が、すぐに利用できる独創的なＰＣＲ容器において、最適な量で（特有なプライマー配列、および、必要な特有のポジティブなコントロールで）与えられるからである。したがって、全ての面倒なピペット操作（ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ）ステップと、品質を保証するための測定と、ＰＣＲプロセスの間での汚染の回避が、除かれる。その種−特定なＤＮＡ−コントロールは、ポジティブコントロールの供給（マスターミックスの機能的な能力のためのチェック）と、その抽出されたサンプルＤＮＡにおける阻害効果（阻害コントロール）のためのチェックのようにＰＣＲの完璧なチェックを許容する。同時に、そのテストするキットは、ネガティブ・コントロール（ｗａｔｅｒ  ｃｏｎｔｒｏｌ）と、汚染物無しの抽出（ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ−ｆｒｅｅ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）（抽出コントロール）のチェックとを許容する。これらのコントロールは、分析物に対して同等であり、そして、マトリクスの実用的な阻害コントロールを許容する。
【００５８】
そのサンプルのＤＮＡのみが、標準化されたサンプルの拡張プロトコルに従って、分離される。ＤＮＡ拡張キットは、従来技術によって提案および確認されているように利用可能であり、そして、そのパッケージング・ユニットを加えることができる。そのサンプル材料からのＤＮＡの抽出後、そのＰＣＲの拡張のために、２つのピペット操作ステップが必要とされる。１２．５μＬのサンプルＤＮＡと、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、塩化マグネシウム（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、および、最適濃度でのバッファを含む１２．５μＬの２倍に濃縮されたマスターミックス（ＭａｓｔｅｒＭｉｘ）が、その反応容器中へ滴下される。ユーザーは、テストキットから、その必要な数の反応容器を取り、そして、シンプルに、不要な反応容器を保管庫へ戻すことができる。その反応容器は、好ましくは、ラック内において、マイクロ滴定プレートと同じように、きれいに配置される。
【００５９】
その試薬を有する反応容器のテストは、２〜１０℃で２年間、保管される。プライマーから離れて、そのラベルされた反応容器は、また、そのコントロールＤＮＡを含む。そのマスターミックス（ＭａｓｔｅｒＭｉｘ）は、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ）のような、リーディング・サプライヤーから、得ることができる。そのユニバーサル・マスターミックス（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＭａｓｔｅｒＭｉｘ）は、全てのパラメータに適合し、一のマスターミックス（ＭａｓｔｅｒＭｉｘ）のみが、完全な生産ラインのために必要とされることを意味する。これは、実験室における作業付加（ｗｏｒｋ−ｌｏａｄ）を相当に減少させ、そして、安全性と、ＰＣＲの再現性とを増加させる。
【００６０】
その温度とサイクラー（ｃｙｃｌｅｒ）のプロファイルは、全てのパラメータにとって、ほぼ同様であり、そのテストキットの説明で予め決められている。これは、１回で、同時な分析と、異なるパラメータの決定とを許容するそのユーザーは、そこにおいて自身で、マイクロチップに組み立てることができる（たとえば、アレルゲン、大豆、ヘーゼルナッツ、そして、ピーナッツ、または、平行ないくつかのＧＭＯパラメータの同時に行うスクリーニング）。
【００６１】
検出は、通常、エチジウムブロマイドを有するアガロース・ゲルにおいて実施される。選択されたパラメータは、また、ブロック・サイクラー（ｂｌｏｃｋ  ｃｙｃｌｅｒ）において急冷するために、リアルタイムに、考慮される。
【００６２】
以下のパラメータが、とりわけ、独創的なテストキットで考えられる。：
食品アレルゲン（ｆｏｏｄｓｔｕｆｆ  ａｌｌｅｒｇｅｎ）：ヘーゼルナッツ、アーモンド、くるみ、ペカン・ナッツ、ブラジル・ナッツ、カシュナッツ、ピスタチオ、ピーナッツ、小麦／大麦／ライ麦、小麦、セロリ、マスタード、ゴマ、大豆、魚、ルピナス（ｌｕｐｉｎｓ）
動物種：豚、牛、反芻動物（ｒｕｍｉｎａｎｔ）、哺乳類、チキン、ターキー（ｔｕｒｋｅｙ）、アヒル（ｄｕｃｋ）家禽（ｐｏｕｌｔｒｙ）、ヒツジ（ｓｈｅｅｐ）、ヤギ（ｇｏａｔ）、馬（ｈｏｒｓｅ）、リス（ｒｏｄｅｎｔ）、犬（ｄｏｇ）、猫（ｃａｔ）
ＧＭＯ：Ｓｃｒｅｅｎ  ３５Ｓ、Ｓｃｒｅｅｎ  ｎｏｓ、Ｒｏｕｎｄｕｐ  Ｒｅａｄｙ  Ｓｏｙ（ＲＲＳ）、カリフラワー・モザイク・ウィルス（Ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ（ＣＭＶ））、コーン  ＭＯＮ８１０（ｃｏｒｎ  ＭＯＮ８１０）、コーンＭＯＮ８６３（ｃｏｒｎ  ＭＯＮ８６３）、コーンＢＴ１７６（ｃｏｒｎ  ＢＴ１７６）、コーンＢＴ１１（ｃｏｒｎ  ＢＴ１１）、コーンＧＡ２１（ｃｏｒｎ  ＧＡ２１）、コーンＮＫ６０３（ｃｏｒｎ  ＮＫ  ６０３）、コーンＴ２５（ｃｏｒｎ  Ｔ２５）、ライスＬＬ６０１（ｒｉｃｅ  ＬＬ６０１）、ライスＬＬ６２（ｒｉｃｅ  ＬＬ６２）
衛生（Ｈｙｇｉｅｎｅ）：サルモネラ（ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｓｐｐ、リステリア・モノシトゲン（ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅ）、カンピロバクター菌（ｃａｍｐｉｌｏｂａｃｔｅｒ）（ｊｅｊｕｎｉ，  ｃｏｌｉ，  ｌａｒｉ）、ＥＨＥＣ、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、腸炎エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、フレクスナー菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）
【００６３】
独創的な反応容器の利点は、：
・試験システムが、保管可能になること
・プライマーと種の特有のポジティブなコントロールが、すぐに利用できること
・液体なしに、プライマーの取り扱いと必要な制御がされること
・汚染物（ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ）の更なるリスクがないこと
・新規なパラメータと生成物へのシンプルな拡張
・ＰＣＲの全体的な標準化
・サンプルの独立
・いくつかのパタメータが、１回で、同時にテストされること
・全てのパタメータのために必要とされるのが、単一なユニバーサル・マスターマトリックスのみであること
【００６４】
生体分子の食品分析は、品質管理（ｑｕａｌｉｔｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ）において、ますます、重要な役割を演じる。特有なＤＮＡフラグメントは、その方法でのＰＣＲによって、検出され、可視化される。今日、未解決な分析の問題は、ＤＮＡ分析で明確に解決できる。最近の例では、マジパン（ｍａｒｚｉｐａｎ）におけるアプリコットの種の検出、または、マスタードまたはセロリのように、アレルギーをもたらす物資の特有な検出が、挙げられる。
【００６５】
遺伝的に変性された有機体の同定のために、ＰＣＲは、病原に衛生的なエリアにおいて同様に、均一に重要な役割を有する。したがって、病原菌は、早期かつ迅速に、検出され、分析のリリースまでの保管時間が、相当に減少される。独創的な反応容器では、食品産業と分析実験室の全エリアにおけるＰＣＲの標準化が、可能になる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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