(57)【要約】  本発明は、ヒト投与に適した高純度および品質の物質をもたらす、順次直交クロマトグラフィーおよびろ過技術を利用した哺乳動物細胞培養液からのモノクローナル抗体の精製に関する。その方法では、固定化プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、その後少なくとも１つのイオン交換技術を使ってＩｇＧ生成物を捕捉した後、前記ＩｇＧをヒドロキシアパタイトに吸着させ１回の均一濃度工程で生成物を選択的に溶出して不純物からの精製を実現し、同時に、ＩｇＧ凝集物、残留プロテインＡ、非ＩｇＧタンパク質、宿主細胞タンパク質、ウイルス粒子、およびＤＮＡを含むが、これらに限定されることはない多種の不純物を減らす。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体を精製する方法であって、
ａ）抗体含有溶液をセラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー媒体に接触させ、抗体をセラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー媒体に吸着することと、
ｂ）少なくとも１つの不純物を同時に除去する定組成的溶出により抗体を選択的に溶出することと
を含む方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つの不純物が、宿主細胞タンパク質、宿主細胞核酸、レトロウイルス粒子、外来性ウイルス、作製中に取り込まれる不純物、精製中に取り込まれる不純物、および凝集型の抗体の群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抗体が、モノクローナル抗体、モノクローナル抗体の断片、ポリクローナル抗体、およびポリクローナル抗体の断片の群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
水溶液中のモノクローナル抗体を精製する方法であって、
ａ）水溶液中のモノクローナル抗体をアフィニティークロマトグラフィー樹脂に接触させ、モノクローナル抗体をアフィニティークロマトグラフィー樹脂に吸着する工程と、
ｂ）モノクローナル抗体をアフィニティークロマトグラフィー樹脂から溶出する工程と、
ｃ）工程ｂ）のモノクローナル抗体溶出液をｐＨ２．５から４．５に調整することによりウイルス混入物を不活性化する工程と、
ｄ）工程ｃ）のモノクローナル抗体溶出液をｐＨ６．０から８．５に調整する工程と、
ｅ）工程ｄ）のモノクローナル抗体溶出液を０．２ｕｍフィルターに通してろ過する工程と、
ｆ）工程ｅ）のモノクローナル抗体ろ液を、陰イオン交換フィルターまたは陰イオン交換クロマトグラフィー媒体に通してろ過する工程と、
ｇ）工程ｆ）のモノクローナル抗体ろ液をセラミックヒドロキシアパタイトに適用し、モノクローナル抗体をセラミックヒドロキシアパタイトに吸着する工程と、
ｈ）モノクローナル抗体を定組成的溶出緩衝液で溶出する工程と
を含む方法。
【請求項５】
水溶液中のモノクローナル抗体を精製する方法であって、
ａ）水溶液中のモノクローナル抗体をアフィニティークロマトグラフィー樹脂に接触させ、モノクローナル抗体をアフィニティークロマトグラフィー樹脂に吸着する工程と、
ｂ）モノクローナル抗体をアフィニティークロマトグラフィー樹脂から溶出する工程と、
ｃ）工程ｂ）のモノクローナル抗体溶出液をｐＨ２．５から４．５に調整することによりウイルス混入物を不活性化する工程と、
ｄ）工程ｃ）のモノクローナル抗体溶出液をｐＨ６．０から８．５に調整する工程と、
ｅ）工程ｄ）のモノクローナル抗体溶出液を０．２ｕｍフィルターに通してろ過する工程と、
ｆ）工程ｅ）のモノクローナル抗体ろ液を、陰イオン交換フィルターまたは陰イオン交換クロマトグラフィー媒体に通してろ過する工程と、
ｇ）工程ｆ）のモノクローナル抗体ろ液をセラミックヒドロキシアパタイトに適用し、モノクローナル抗体をセラミックヒドロキシアパタイトに吸着する工程と、
ｈ）モノクローナル抗体を定組成的溶出緩衝液で溶出する工程と、
ｉ）工程ｈ）のモノクローナル抗体溶出液をウイルスフィルターに通してろ過する工程と、
ｊ）工程ｉ）のモノクローナル抗体を、限外ろ過および連続ダイアフィルトレーションにより処方する工程と
を含む方法。
【請求項６】
水溶液中のモノクローナル抗体またはその断片を精製する方法であって、
ａ）水溶液中のモノクローナル抗体またはその断片を、固定化組換えプロテインＡリガンドを含有するアフィニティークロマトグラフィー樹脂に接触させ、モノクローナル抗体またはその断片をアフィニティークロマトグラフィー樹脂に吸着する工程と、
ｂ）工程ａ）のモノクローナル抗体またはその断片を、モノクローナル抗体またはその断片を溶出しない約ｐＨ７の洗浄液で洗浄する工程と、
ｃ）工程ｂ）のモノクローナル抗体またはその断片を、ｐＨ２．１から４．０の溶出緩衝液で溶出する工程と、
ｄ）工程ｃ）のモノクローナル抗体またはその断片溶出液を、酸でｐＨ２．５から４．５に調整することによりウイルス混入物を不活性化する工程と、
ｅ）工程ｄ）のモノクローナル抗体またはその断片溶出液を、塩基でｐＨ６．０から８．５に調整する工程と、
ｆ）工程ｅ）のモノクローナル抗体またはその断片溶出液を、０．２ｕｍフィルターに通してろ過する工程と、
ｇ）工程ｆ）のモノクローナル抗体またはその断片を、セラミックヒドロキシアパタイトに結合させる工程と、
ｈ）工程ｇ）の結合したモノクローナル抗体またはその断片を、モノクローナル抗体またはその断片を溶出しないｐＨ６．５から８．０の洗浄液で洗浄する工程と、
ｉ）工程ｈ）のモノクローナル抗体またはその断片を、ｐＨ６．５から８．０の定組成的溶出緩衝液、１０から５０ｍＭリン酸ナトリウムおよび５０ｍＭから１．０Ｍ塩化ナトリウムで溶出する工程と、
ｊ）工程ｉ）のモノクローナル抗体またはその断片溶出液を、ウイルスフィルターに通してろ過する工程と、
ｋ）工程ｊ）のモノクローナル抗体またはその断片を、限外ろ過および連続ダイアフィルトレーションにより処方する工程と
を含む方法。
【請求項７】
水溶液中のモノクローナル抗体またはその断片を精製する方法であって、
ａ）水溶液中のモノクローナル抗体またはその断片を、固定化組換えプロテインＡリガンドを含有するアフィニティークロマトグラフィー樹脂に接触させ、モノクローナル抗体をアフィニティークロマトグラフィー樹脂に吸着する工程と、
ｂ）工程ａ）のモノクローナル抗体またはその断片を、モノクローナル抗体またはその断片を溶出しない約ｐＨ７の洗浄液で洗浄する工程と、
ｃ）工程ｂ）のモノクローナル抗体またはその断片を、ｐＨ２．１から４．０の溶出緩衝液で溶出する工程と、
ｄ）工程ｃ）のモノクローナル抗体またはその断片溶出液を、酸でｐＨ２．５から４．５に調整することによりウイルス混入物を不活性化する工程と、
ｅ）工程ｄ）のモノクローナル抗体またはその断片溶出液を、塩基でｐＨ６．０から８．５に調整する工程と、
ｆ）工程ｅ）のモノクローナル抗体またはその断片溶出液を、０．２ｕｍフィルターに通してろ過する工程と、
ｇ）工程ｆ）のモノクローナル抗体またはその断片溶出液を、陰イオン交換フィルターまたは陰イオン交換クロマトグラフィー媒体に通してろ過する工程と、
ｈ）工程ｇ）のモノクローナル抗体またはその断片を、セラミックヒドロキシアパタイトに結合させる工程と、
ｉ）工程ｈ）の結合したモノクローナル抗体またはその断片を、モノクローナル抗体またはその断片を溶出しないｐＨ６．５から８．０の洗浄液で洗浄する工程と、
ｊ）工程ｉ）のモノクローナル抗体またはその断片を、ｐＨ６．５から８．０の定組成的溶出緩衝液、１０から５０ｍＭリン酸ナトリウムおよび５０ｍＭから１．０Ｍ塩化ナトリウムで溶出する工程と、
ｋ）工程ｊ）のモノクローナル抗体またはその断片溶出液を、ウイルスフィルターに通してろ過する工程と、
ｌ）工程ｋ）のモノクローナル抗体またはその断片を、限外ろ過および連続ダイアフィルトレーションにより処方する工程と
を含む方法。
【請求項８】
水溶液中のモノクローナル抗体またはその断片を精製する方法であって、
ａ）水溶液中のモノクローナル抗体またはその断片を、固定化組換えプロテインＡリガンドを含有するアフィニティークロマトグラフィー樹脂に接触させ、モノクローナル抗体をアフィニティークロマトグラフィー樹脂に吸着する工程と、
ｂ）工程ａ）のモノクローナル抗体またはその断片を、モノクローナル抗体またはその断片を溶出しない約ｐＨ７の洗浄液で洗浄する工程と、
ｃ）工程ｂ）のモノクローナル抗体またはその断片を、約ｐＨ３．５の約２５ｍＭクエン酸溶出緩衝液で溶出する工程と、
ｄ）工程ｃ）のモノクローナル抗体またはその断片溶出液を、酸でｐＨ２．５から４．５に調整することによりウイルス混入物を不活性化する工程と、
ｅ）工程ｄ）のモノクローナル抗体またはその断片溶出液を、塩基でｐＨ３．５から７．５に調整する工程と、
ｆ）工程ｅ）のモノクローナル抗体またはその断片溶出液を、０．２ｕｍフィルターに通してろ過する工程と、
ｇ）工程ｆ）のモノクローナル抗体またはその断片溶出液を、陽イオン交換クロマトグラフィー媒体に結合させる工程と、
ｈ）工程ｇ）の結合したモノクローナル抗体またはその断片を、モノクローナル抗体またはその断片を溶出しないｐＨ５．５から８．０の洗浄液で洗浄する工程と、
ｉ）工程ｈ）のモノクローナル抗体またはその断片を、１０から１００ｍＭリン酸ナトリウムおよび１０ｍＭから２００ｍＭ塩化ナトリウムからなるｐＨ５．５から８．０の溶出緩衝液で溶出する工程と、
ｊ）工程ｉ）のモノクローナル抗体またはその断片溶出液を、陰イオン交換フィルターまたは陰イオン交換クロマトグラフィー媒体に通してろ過する工程と、
ｋ）工程ｊ）のモノクローナル抗体またはその断片を、セラミックヒドロキシアパタイトに結合させる工程と、
ｌ）工程ｋ）の結合したモノクローナル抗体またはその断片を、モノクローナル抗体またはその断片を溶出しないｐＨ６．５から８．０の洗浄液で洗浄する工程と、
ｍ）工程ｌ）のモノクローナル抗体またはその断片を、ｐＨ６．５から８．０の定組成的溶出緩衝液、１０から５０ｍＭリン酸ナトリウムおよび５０ｍＭから１．０Ｍ塩化ナトリウムで溶出する工程と、
ｎ）工程ｍ）のモノクローナル抗体またはその断片溶出液を、ウイルスフィルターに通してろ過する工程と、
ｏ）工程ｎ）のモノクローナル抗体またはその断片を、限外ろ過および連続ダイアフィルトレーションにより処方する工程と
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物およびヒト投与に適した高純度および品質の物質をもたらす、順次直交クロマトグラフィーおよびろ過技術を利用した細胞培養液からの抗体の精製に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体を治療上の使用のために作製するとき、免疫原性の、毒性の、またはその他の点で有害な不純物および／もしくは混入物を所管の監督機関によって安全だと見なされるレベルにまで減少させる、実績のある方法を用いる必要がある。
【０００３】
固定化プロテインＡを使ったアフィニティークロマトグラフィーが、臨床製造用の抗体を含む抗体の精製のために一般的に使用されている方法である。たとえば、Ｈａｈｎ，Ｒ，Ｓｃｈｌｅｇｅｌ，Ｒ，Ｊｕｎｇｂａｕｅｒ，Ａ．２００３  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｓｏｒｂｅｎｔｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ，７９０  ３５頁〜５１頁を参照されたい。ＩｇＧ  Ｆｃ領域は、その高い結合活性および特異性のために、細胞培養液から抗体を最初に単離するのにもっとも有用な道具の１つになっている。低ｐＨ緩衝液を使った培養液からの選択的溶出により９０〜９５％の純度が生じる場合が多いが、最終的な５〜１０％の混入物を除去するためには追加の精製が必要である。さらに、一部の残留プロテインＡは、潜在的に毒性があり、クロマトグラフィー媒体から浸出する。このプロテインＡの分離が特に困難なのは、プロテインＡが、対象のＩｇＧから分離しなければならないＩｇＧ：プロテインＡ複合体として存在しているからである。プロテインＡクロマトグラフィーは、有用ではあるが、上記の不純物が混入するために、ヒトへの投与に十分な高品質のＩｇＧを提供しない。
【０００４】
プロテインＡ媒体の費用は別として、任意の抗体を精製する費用の大部分は、多数の追加のクロマトグラフィー工程を伴う捕捉工程の後の残存不純物の除去のために費やされることになる。
【０００５】
クロマトグラフィー工程は別として、任意のモノクローナル抗体プロセスについてウイルスに対する安全性をある程度保証するのに必要な多数の直交工程がある。これらは、精製スキームにおける戦略的位置に含まれる。これらには、低ｐＨ処理、ウイルスろ過（ナノろ過と呼ばれる場合がある）、熱処理および化学的不活性化などが挙げられる。
【０００６】
ヒドロキシアパタイトへの吸着クロマトグラフィーは、時に、タンパク質の精製のための非常に効果的なプロセスである。たとえば、Ｔｉｓｅｌｉｕｓ，Ａ．，Ｈｊｅｒｔｅｎ，Ｓ．，Ｌｅｖｉｎ  Ｏ．１９５６．Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｏｎ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｃｏｌｕｍｎｓ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．６５，１３２頁〜１５５頁を参照されたい。反応性リガンドが「中性」マトリックスに付着されている吸着性の化学的性質と違って、ヒドロキシアパタイトはリガンドでもありマトリックスでもある。その単位式はＣａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２である。セラミック型のヒドロキシアパタイトの導入によって、ヒドロキシアパタイトは適切な流速および化学的安定性の特徴を備えた製造クロマトグラフィー媒体として実用的になった。たとえば、Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｌ．Ｊ．，Ｏｇａｗａ，Ｔ．，Ｔｕｎｏｎ，Ｐ．Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｃｅｒａｍｉｃ  Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ−ｎｅｗ  ｌｉｆｅ  ｆｏｒ  ａｎ  ｏｌｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｂｕｌｌｅｔｉｎ  １９２７，ＲｅｖＡ．Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを参照されたい。キレート剤および約５〜６より低いｐＨを除いて、ヒドロキシアパタイト媒体は、濃縮水酸化ナトリウム、尿素、グアニジン、有機溶剤および清浄剤を含むもっとも過酷な洗浄剤に抵抗性がある。
【０００７】
マトリックスを含むカルシウムおよびリン酸基の二重機能性のために、タンパク質相互作用の特異性は複雑である。タンパク質上のアミノ基はリン酸部位に引き付けられるが、カルシウム部位によりはじかれる。カルボン酸基はカルシウム部位に引き付けられるが、リン酸部位によりはじかれるので、カルボン酸基では状況は逆になる。リン酸部位へのアミン結合およびカルボン酸基のカルシウム部位への最初の誘引は静電気的であるが、カルボキシル基のカルシウム部位への実際の結合は、カルシウム部位とタンパク質カルボキシルのクラスター間のはるかに強力な配位錯体の形成を伴う。たとえば、Ｇｏｒｂｕｎｏｆｆ，Ｍ．Ｊ．Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ：ＩＩ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ａｃｉｄｉｃ  ａｎｄ  Ｂａｓｉｃ  Ｇｒｏｕｐｓ．１９８４．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１３６，４３３頁〜４３９頁を参照されたい。
【０００８】
結合した後、もっとも一般的な溶出機構は増加リン酸濃度の勾配であった。たとえば、Ｓｃｈｒｏｄｅｒ，Ｅ．，Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｔ．，Ｐｏｏｌｅ，Ｌ．２００３．Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ａｌｔｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｌｕｔｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐＨ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３１３，１７６頁〜１７８頁を参照されたい。これが溶出緩衝液のもっとも都合のよい選択であると思われる。なぜならば、それが、ＣＯＯ−：Ｃａ＋相互作用ならびにＮＨ３＋：ＰＯ４−相互作用の両方を妨害する置換剤として働くからである。増加リン酸濃度法では、カラムに結合しているタンパク質すべてを、ヒドロキシアパタイトマトリックス上のリン酸基との相互作用の強度に基づいて溶出させ溶解させることができる。したがって、増加リン酸濃度の勾配を使うことによって、ＮＨ３＋：ＰＯ４−相互作用により結合されたもっとも弱く結合しているタンパク質（より酸性のタンパク質）のほうがＣＯＯ−：Ｃａ＋相互作用により結合されたタンパク質（より塩基性のタンパク質）よりも早い時期に溶出する。さらに、種々の結合タンパク質の溶出時間およびそれらの間の溶解度は、溶出緩衝液のｐＨの変化を通じて顕著に変えることが可能である。たとえば、Ｓｃｈｒｏｄｅｒ，Ｅ．，Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｔ．，Ｐｏｏｌｅ，Ｌ．２００３．Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ａｌｔｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｌｕｔｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐＨ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３１３，１７６頁〜１７８頁を参照されたい。この溶出法においては、リン酸が結合している不純物も溶出し、対象の生成物と一緒に共溶出することができることに注目すべきである。
【０００９】
塩類が異なれば、それによるタンパク質の溶出も異なる機構に従う。ＮａＣｌ（またはＣａＣｌまたはＭｇＣｌ）などの塩類の使用は、電荷スクリーニング機構によっておよび樹脂リン酸基との錯体形成によるＮａ（またはＫ、Ｃａ、Ｍｇ）置換によって作用する。増加塩類濃度の勾配を使えば、もっとも塩基性のタンパク質はもっとも低い濃度の塩類に溶出すると考えられ、酸性タンパク質は非常に高いＮａＣｌ濃度でさえ保持される。たとえば、Ｇｏｒｂｕｎｏｆｆ，Ｍ．Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｏｎ  Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  Ｃｏｌｕｍｎｓ．１９８５．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．１８２，３２９頁〜３３９頁およびＧｕｅｒｒｉｅｒ，Ｌ．，Ｆｌａｙｅｕｘ，Ｉ．，Ｂｏｓｃｈｅｔｔｉ，Ｅ．２００１．Ａ  ｄｕａｌ−ｍｏｄｅ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ．７５５．３７頁〜４６頁を参照されたい。不運にも、勾配溶出は商業製造環境においては費用がかかるだけでなく確実に実行するのも困難である。
【００１０】
ＩｇＧ：プロテインＡ複合体と宿主細胞由来タンパク質を結合させ、対象のタンパク質（組換え融合タンパク質、抗体およびＴＮＦＲ：Ｆｃ）は、精製物の非結合画分で貫流させるヒドロキシアパタイトを使うある程度の有用性を明らかにした研究者もいた。たとえば、Ｖｅｎｄａｎｔｈａｍ，Ｇ．，Ｂｒｏｏｋｓ，Ｃｌａｙｔｏｎ  Ａ．，Ｒｅｅｄｅｒ，Ｊ．Ｍ．，Ｇｏｅｔｚｅ，Ａ．Ｍ．２００３．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ．米国特許出願公開第２００３／０１６６８６９  Ａ１号、およびＶｅｎｄａｎｔｈａｍ，Ｇ．，Ｂｒｏｏｋｓ，Ｃｌａｙｔｏｎ  Ａ．，Ｒｅｅｄｅｒ，Ｊ．Ｍ．，Ｇｏｅｔｚｅ，Ａ．Ｍ．２００３．Ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  ａ  ｓａｍｐｌｅ  ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔ  ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ  ｓｕｂｊｅｃｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓａｍｐｌｅ  ｔｏ  ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．国際特許出願第２００３０６９９３５  Ａ２号を参照されたい。さらに、ＩｇＧ：プロテインＡ複合体からのＩｇＧの効果的な分離は、試料をセラミックヒドロキシアパタイト（ｃＨＡ）に結合させ、続いてリン酸勾配で溶出させることによって実証されている。たとえば、Ｈｏｒｅｎｓｔｅｉｎ，Ａ．Ｌ．，Ｃｒｉｖｅｌｌｉｎ，Ｆ．，Ｆｕｎａｒｏ，Ａ．，Ｓａｉｄ，Ｍ．，Ｍａｌａｖａｓｉ，Ｆ．２００３．Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｓｃａｌｅｕｐ  ｏｆ  ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ：ｆｒｏｍ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｔｏ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｒｏｏｆ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２７５．９９頁〜１１２頁を参照されたい。
【００１１】
種々の抗体も、ヒドロキシアパタイトを使った二次または三次精製を介して精製されてきた。主要目的は生成凝集物からのＩｇＧモノマーの分離であった。増加クエン酸濃度の勾配溶出を利用して、ＩｇＧ：プロテインＡ複合体の分離もＩｇＧ凝集物の分離も実現された。他の条件の下では、溶出の工程は凝集物、宿主細胞タンパク質およびＤＮＡを除去することが明らかにされたが、ＩｇＧ：プロテインＡ複合体は除去されなかった。たとえば、Ａｈｍａｄ，Ｚ．，Ｓｃｏｔｔ，Ｒ．，Ｄｉｅｎｅｒ，Ａ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．Ｍ．，Ｍｉｓｃｚａｋ，Ｊ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｅ．，Ｗａｎｇ，Ｗ．Ｋ．，Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ａ．Ｈ．，Ｓｈａｄｌｅ，Ｐ．１９９９．ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．Ａｂｓｔｒａｃｔ  ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ  ａｔ“Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ＩＸ”ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅを参照されたい。
【００１２】
ヒドロキシアパタイトの繰り返し再利用の限界は、クエン酸などのカルシウムキレート緩衝液中でのヒドロキシアパタイトの不安定性である。したがって、本発明は、ｐＨ２．１〜３．５のリン酸ナトリウムを使ってプロテインＡからの溶出を実行する。このように、本発明はクエン酸の使用を回避し、ヒドロキシアパタイト上への直接添加を、あるいは陰イオン交換フィルターに通してのろ過、その後のｃＨＡカラム上への直接添加を可能にする。さらに、本発明の実施形態は、生成物がリン酸ナトリウム緩衝液のみと直接接触する精製プロセスを使い、全プロセスを通じてｐＨおよび塩濃度のみを変化させることにより高度の精製を実現する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００３／０１６６８６９Ａ１号
【特許文献２】国際特許出願第２００３０６９９３５Ａ２号
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｈａｈｎ，Ｒ，Ｓｃｈｌｅｇｅｌ，Ｒ，Ｊｕｎｇｂａｕｅｒ，Ａ．２００３  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｓｏｒｂｅｎｔｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ，７９０  ３５頁〜５１頁
【非特許文献２】Ｔｉｓｅｌｉｕｓ，Ａ．，Ｈｊｅｒｔｅｎ，Ｓ．，Ｌｅｖｉｎ  Ｏ．１９５６．Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｏｎ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｃｏｌｕｍｎｓ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．６５，１３２頁〜１５５頁
【非特許文献３】Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｌ．Ｊ．，Ｏｇａｗａ，Ｔ．，Ｔｕｎｏｎ，Ｐ．Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｃｅｒａｍｉｃ  Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ−ｎｅｗ  ｌｉｆｅ  ｆｏｒ  ａｎ  ｏｌｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｂｕｌｌｅｔｉｎ  １９２７，ＲｅｖＡ．Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
【非特許文献４】Ｇｏｒｂｕｎｏｆｆ，Ｍ．Ｊ．Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ：ＩＩ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ａｃｉｄｉｃ  ａｎｄ  Ｂａｓｉｃ  Ｇｒｏｕｐｓ．１９８４．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１３６，４３３頁〜４３９頁
【非特許文献５】Ｓｃｈｒｏｄｅｒ，Ｅ．，Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｔ．，Ｐｏｏｌｅ，Ｌ．２００３．Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ａｌｔｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｌｕｔｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐＨ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３１３，１７６頁〜１７８頁
【非特許文献６】Ｇｏｒｂｕｎｏｆｆ，Ｍ．Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｏｎ  Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  Ｃｏｌｕｍｎｓ．１９８５．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．１８２，３２９頁〜３３９頁
【非特許文献７】Ｇｕｅｒｒｉｅｒ，Ｌ．，Ｆｌａｙｅｕｘ，Ｉ．，Ｂｏｓｃｈｅｔｔｉ，Ｅ．２００１．Ａ  ｄｕａｌ−ｍｏｄｅ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ．７５５．３７頁〜４６頁
【非特許文献８】Ｈｏｒｅｎｓｔｅｉｎ，Ａ．Ｌ．，Ｃｒｉｖｅｌｌｉｎ，Ｆ．，Ｆｕｎａｒｏ，Ａ．，Ｓａｉｄ，Ｍ．，Ｍａｌａｖａｓｉ，Ｆ．２００３．Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｓｃａｌｅｕｐ  ｏｆ  ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ：ｆｒｏｍ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｔｏ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｒｏｏｆ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２７５．９９頁〜１１２頁
【非特許文献９】Ａｈｍａｄ，Ｚ．，Ｓｃｏｔｔ，Ｒ．，Ｄｉｅｎｅｒ，Ａ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．Ｍ．，Ｍｉｓｃｚａｋ，Ｊ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｅ．，Ｗａｎｇ，Ｗ．Ｋ．，Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ａ．Ｈ．，Ｓｈａｄｌｅ，Ｐ．１９９９．ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．Ａｂｓｔｒａｃｔ  ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ  ａｔ“Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ＩＸ”ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、ヒトまたは動物投与に適したモノクローナル抗体を精製するための方法に関する。
【００１６】
さらに、従来の分離物の収率を高め、それら従来の方法を適切に浄化して、アフィニティーおよび／またはろ過媒体ならびにそのような精製において使用される器具または装置表面の再利用および除染を可能にするよう、本発明の方法を従来の精製方法に適用してもよい。本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態により範囲を限定されるものではない。実際、本明細書に記載の改変に加えて本発明の種々の改変が、前述の説明から当業者には明らかになるであろう。そのような改変は添付の特許請求の範囲内に含まれるように意図されている。
【００１７】
一実施形態はモノクローナル抗体の精製に適用されるが、他の抗体、たとえば、ポリクローナル抗体、またはモノクローナルもしくはポリクローナル抗体の断片の精製のためにも使用してよい。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
一実施形態では、本発明は水溶液中の抗体を精製する方法に関し、そのような方法は抗体含有溶液、セラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー媒体、および定組成的溶出を利用する。抗体を精製する方法は、ａ）抗体含有溶液をセラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー媒体に適用し、抗体をセラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー媒体に吸着することと、ｂ）少なくとも１つの不純物を同時に除去する定組成的溶出により抗体を選択的に溶出することとを含む。
【００１９】
他の実施形態では、本発明は、除去された不純物が、宿主細胞タンパク質、宿主細胞核酸、レトロウイルス粒子、外来性ウイルス、作製中に取り込まれた不純物、精製中に取り込まれた不純物、および凝集型の抗体の群から選択される方法を提供する。
【００２０】
他の実施形態では、本発明により精製することができる抗体は、モノクローナル抗体、モノクローナル抗体の断片、ポリクローナル抗体、およびポリクローナル抗体の断片の群から選択される。一実施形態では、本方法により精製される抗体はモノクローナル抗体である。
【００２１】
別の実施形態では、本発明は、水溶液中のモノクローナル抗体を精製する方法であって、
ａ）モノクローナル抗体含有溶液をアフィニティークロマトグラフィー樹脂に適用し、モノクローナル抗体をアフィニティークロマトグラフィー樹脂に吸着する工程と、
ｂ）モノクローナル抗体をアフィニティークロマトグラフィー樹脂から溶出する工程と、
ｃ）工程ｂ）のモノクローナル抗体溶出液を、ｐＨ２．５から４．５、ならびに／またはｐＨ２．５、ｐＨ３．０、ｐＨ３．５、ｐＨ４．０、およびｐＨ４．５に調整することによりウイルス混入物を不活性化する工程と、
ｄ）工程ｃ）のモノクローナル抗体溶出液を、ｐＨ６．０から８．５、ならびに／またはｐＨ６．０、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０、ｐＨ７．５、ｐＨ８．０およびｐＨ８．５に調整する工程と、
ｅ）工程ｄ）のモノクローナル抗体溶出液を０．２ｕｍフィルターに通してろ過する工程と、
ｆ）工程ｅ）のモノクローナル抗体ろ液を、陰イオン交換フィルターまたは陰イオン交換クロマトグラフィー媒体に通してろ過する工程と、
ｇ）工程ｆ）のモノクローナル抗体ろ液をセラミックヒドロキシアパタイトに適用し、モノクローナル抗体をセラミックヒドロキシアパタイトに吸着する工程と、
ｈ）モノクローナル抗体を定組成的溶出緩衝液で溶出する工程と
を含む方法に関する。
【００２２】
本実施形態はウイルス排除の十分な保証をもたらすのに十分である可能性がある。しかし、規制指針はウイルス排除の十分な保証をもたらす追加の工程を要求する可能性がある。
【００２３】
別の実施形態では、本発明は、水溶液中のモノクローナル抗体を精製する方法であって、
ａ）モノクローナル抗体含有溶液をアフィニティークロマトグラフィー樹脂に適用し、モノクローナル抗体をアフィニティークロマトグラフィー樹脂に吸着する工程と、
ｂ）モノクローナル抗体をアフィニティークロマトグラフィー樹脂から溶出する工程と、
ｃ）工程ｂ）のモノクローナル抗体溶出液を、ｐＨ２．５から４．５、ならびに／またはｐＨ２．５、ｐＨ３．０、ｐＨ３．５、ｐＨ４．０、およびｐＨ４．５に調整することによりウイルス混入物を不活性化する工程と、
ｄ）工程ｃ）のモノクローナル抗体溶出液を、ｐＨ６．０から８．５、ならびに／またはｐＨ６．０、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０、ｐＨ７．５、ｐＨ８．０およびｐＨ８．５に調整する工程と、
ｅ）工程ｄ）のモノクローナル抗体溶出液を０．２ｕｍフィルターに通してろ過する工程と、
ｆ）工程ｅ）のモノクローナル抗体ろ液を、陰イオン交換フィルターまたは陰イオン交換クロマトグラフィー媒体に通してろ過する工程と、
ｇ）工程ｆ）のモノクローナル抗体ろ液をセラミックヒドロキシアパタイトに適用し、モノクローナル抗体をセラミックヒドロキシアパタイトに吸着する工程と、
ｈ）モノクローナル抗体を定組成的溶出緩衝液で溶出する工程と、
ｉ）工程ｈ）のモノクローナル抗体溶出液をウイルスフィルターに通してろ過する工程と、
ｊ）工程ｉ）のモノクローナル抗体を、限外ろ過および連続ダイアフィルトレーションにより処方する工程と
を含む方法に関する。
【００２４】
別の実施形態では、本発明は、水溶液中のモノクローナル抗体またはその断片を精製する方法であって、
ａ）水溶液中のモノクローナル抗体またはその断片を、固定化組換えプロテインＡリガンドを含有するアフィニティークロマトグラフィー樹脂に接触させる工程と、
ｂ）工程ａ）の結合したモノクローナル抗体またはその断片を、モノクローナル抗体またはその断片を溶出しない約ｐＨ７の洗浄液を使って洗浄する工程と、
ｃ）工程ｂ）のモノクローナル抗体またはその断片を、ｐＨ２．１から４．０、ならびに／またはｐＨ２．１、ｐＨ２．５、ｐＨ３．０、ｐＨ３．５、およびｐＨ４．０の溶出緩衝液で溶出する工程と、
ｄ）工程ｃ）のモノクローナル抗体またはその断片溶出液を、酸で１５から６０分間、ｐＨ２．５から４．５ならびに／またはｐＨ２．５、ｐＨ３．０、ｐＨ３．５、ｐＨ４．０、およびｐＨ４．５に調整することによりウイルス混入物を不活性化する工程と、
ｅ）工程ｄ）のモノクローナル抗体またはその断片溶出液を、塩基でｐＨ６．０から８．５ならびに／またはｐＨ６．０、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０、ｐＨ７．５、ｐＨ８．０、およびｐＨ８．５に調整する工程と、
ｆ）工程ｅ）のモノクローナル抗体またはその断片溶出液を、０．２ｕｍフィルターに通してろ過する工程と、
ｇ）工程ｆ）のモノクローナル抗体またはその断片を、セラミックヒドロキシアパタイトに結合させる工程と、
ｈ）工程ｇ）の結合したモノクローナル抗体またはその断片を、モノクローナル抗体またはその断片を溶出しないｐＨ６．５から８．０ならびに／またはｐＨ６．０、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０、ｐＨ７．５、ｐＨ８．０、およびｐＨ８．５の洗浄液で洗浄する工程と、
ｉ）工程ｈ）のモノクローナル抗体またはその断片を、ｐＨ６．５から８．０ならびに／またはｐＨ６．０、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０、ｐＨ７．５、およびｐＨ８．０の定組成的溶出緩衝液、１０から５０ｍＭリン酸ナトリウムおよび５０ｍＭから１．０Ｍ塩化ナトリウムで溶出する工程と、
ｊ）工程ｉ）のモノクローナル抗体またはその断片溶出液を、ウイルスフィルターに通してろ過する工程と、
ｋ）工程ｊ）のモノクローナル抗体またはその断片を、限外ろ過および連続ダイアフィルトレーションにより処方する工程と
を含む方法に関する。
【００２５】
別の実施形態では、本発明は、水溶液中のモノクローナル抗体またはその断片を精製する方法であって、
ａ）水溶液中のモノクローナル抗体またはその断片を、固定化組換えプロテインＡリガンドを含有するアフィニティークロマトグラフィー樹脂に接触させる工程と、
ｂ）工程ａ）の結合したモノクローナル抗体またはその断片を、モノクローナル抗体またはその断片を溶出しない約ｐＨ７の洗浄液で洗浄する工程と、
ｃ）工程ｂ）のモノクローナル抗体またはその断片を、ｐＨ２．１から４．０ならびに／またはｐＨ２．１、ｐＨ２．５、ｐＨ３．０、ｐＨ３．５、およびｐＨ４．０の溶出緩衝液で溶出する工程と、
ｄ）工程ｃ）のモノクローナル抗体またはその断片溶出液を、酸で１５から６０分間、ｐＨ２．５から４．５ならびに／またはｐＨ２．５、ｐＨ３．０、ｐＨ３．５、ｐＨ４．０、およびｐＨ４．５に調整することによりウイルス混入物を不活性化する工程と、
ｅ）工程ｄ）のモノクローナル抗体またはその断片溶出液を、塩基でｐＨ６．０から８．５ならびに／またはｐＨ６．０、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０、ｐＨ７．５、ｐＨ８．０、およびｐＨ８．５に調整する工程と、
ｆ）工程ｅ）のモノクローナル抗体またはその断片溶出液を、０．２ｕｍフィルターに通してろ過する工程と、
ｇ）工程ｆ）のモノクローナル抗体またはその断片溶出液を、陰イオン交換フィルターまたは陰イオン交換クロマトグラフィー媒体に通してろ過する工程と、
ｈ）工程ｇ）のモノクローナル抗体またはその断片を、セラミックヒドロキシアパタイトに結合させる工程と、
ｉ）工程ｈ）の結合したモノクローナル抗体またはその断片を、モノクローナル抗体またはその断片を溶出しないｐＨ６．５から８．０ならびに／またはｐＨ６．５、ｐＨ７．０、ｐＨ７．５、およびｐＨ８．０の洗浄液で洗浄する工程と、
ｊ）工程ｉ）のモノクローナル抗体またはその断片を、ｐＨ６．５から８．０ならびに／またはｐＨ６．５、ｐＨ７．０、ｐＨ７．５、およびｐＨ８．０の定組成的溶出緩衝液、１０から５０ｍＭリン酸ナトリウムおよび５０ｍＭから１．０Ｍ塩化ナトリウムで溶出する工程と、
ｋ）工程ｊ）のモノクローナル抗体またはその断片溶出液を、ウイルスフィルターに通してろ過する工程と、
ｌ）工程ｋ）のモノクローナル抗体またはその断片を、限外ろ過および連続ダイアフィルトレーションにより処方する工程と
を含む方法に関する。
【００２６】
さらに別の実施形態では、本発明は、水溶液中のモノクローナル抗体またはその断片を精製する方法であって、
ａ）水溶液中のモノクローナル抗体またはその断片を、固定化組換えプロテインＡリガンドを含有するアフィニティークロマトグラフィー樹脂に接触させる工程と、
ｂ）工程ａ）の結合したモノクローナル抗体またはその断片を、モノクローナル抗体またはその断片を溶出しない約ｐＨ７の洗浄液で洗浄する工程と、
ｃ）工程ｂ）のモノクローナル抗体またはその断片を、約ｐＨ３．５またはｐＨ３．５の約２５ｍＭまたは２５ｍＭクエン酸溶出緩衝液で溶出する工程と、
ｄ）工程ｃ）のモノクローナル抗体またはその断片溶出液を、酸で１５から６０分間、ｐＨ２．５から４．５ならびに／またはｐＨ２．５、ｐＨ３．０、ｐＨ３．５、ｐＨ４．０、およびｐＨ４．５に調整することによりウイルス混入物を不活性化する工程と、
ｅ）工程ｄ）のモノクローナル抗体またはその断片溶出液を、塩基でｐＨ３．５から７．５ならびに／またはｐＨ３．５、ｐＨ４．０、ｐＨ４．５、ｐＨ５．０、ｐＨ５．５、ｐＨ６．０、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０、およびｐＨ７．５に調整する工程と、
ｆ）工程ｅ）のモノクローナル抗体またはその断片溶出液を、０．２ｕｍフィルターに通してろ過する工程と、
ｇ）工程ｆ）のモノクローナル抗体またはその断片溶出液を、陽イオン交換クロマトグラフィー媒体に結合させる工程と、
ｈ）工程ｇ）の結合したモノクローナル抗体またはその断片を、モノクローナル抗体またはその断片を溶出しないｐＨ５．５から８．０ならびに／またはｐＨ５．５、ｐＨ６．０、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０、ｐＨ７．５、ｐＨ８．０、およびｐＨ８．５の洗浄液で洗浄する工程と、
ｉ）工程ｈ）のモノクローナル抗体またはその断片を、１０から１００ｍＭリン酸ナトリウムおよび１０ｍＭから２００ｍＭ塩化ナトリウムからなるｐＨ５．５から８．０ならびに／またはｐＨ５．５、ｐＨ６．０、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０、ｐＨ７．５、ｐＨ８．０、およびｐＨ８．５の溶出緩衝液で溶出する工程と、
ｊ）工程ｉ）のモノクローナル抗体またはその断片溶出液を、陰イオン交換フィルターまたは陰イオン交換クロマトグラフィー媒体に通してろ過する工程と、
ｋ）工程ｊ）のモノクローナル抗体またはその断片を、セラミックヒドロキシアパタイトに結合させる工程と、
ｌ）工程ｋ）の結合したモノクローナル抗体またはその断片を、モノクローナル抗体またはその断片を溶出しないｐＨ６．５から８．０ならびに／またはｐＨ６．５、ｐＨ７．０、ｐＨ７．５、およびｐＨ８．０の洗浄液で洗浄する工程と、
ｍ）工程ｌ）のモノクローナル抗体またはその断片を、ｐＨ６．５から８．０ならびに／またはｐＨ６．５、ｐＨ７．０、ｐＨ７．５、およびｐＨ８．０の定組成的溶出緩衝液、１０から５０ｍＭリン酸ナトリウムならびに５０ｍＭから１．０Ｍ塩化ナトリウムで溶出する工程と、
ｎ）工程ｍ）のモノクローナル抗体またはその断片溶出液を、ウイルスフィルターに通してろ過する工程と、
ｏ）工程ｎ）のモノクローナル抗体またはその断片を、限外ろ過および連続ダイアフィルトレーションにより処方する工程と
を含む方法に関する。
【００２７】
前述の概要の説明および以下の詳細説明は共に、例示的かつ説明的なものであり、特許請求に係る本発明の追加の説明を提供することを目的とすることを理解すべきである。
【００２８】
添付の図は本発明をさらに理解するために含まれており、本明細書に組み込まれ、その一部を構成し、本発明のいくつかの実施形態を図解し、その説明と共に本発明の原理を説明する役割を果たしている。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】プロテインＡアフィニティー、予備的ｐＨ調整、およびｃＨＡクロマトグラフィーの使用によるモノクローナル抗体精製を含むプロセスを図式的に示す図である。
【図２】プロテインＡアフィニティー、ウイルス不活性化のための低ｐＨ調整、追加の予備的ｐＨ調整、ｃＨＡクロマトグラフィー、および限外ろ過／ダイアフィルトレーションによる最終処方の使用によるモノクローナル抗体精製を含むプロセスを図式的に示す図である。
【図３】プロテインＡアフィニティー、ウイルス不活性化のための低ｐＨ調整、追加の予備的ｐＨ調整、陰イオン交換ろ過（またはクロマトグラフィー）、ｃＨＡクロマトグラフィー、および限外ろ過／ダイアフィルトレーションによる最終処方の使用によるモノクローナル抗体精製を含むプロセスを図式的に示す図である。
【図４】プロテインＡアフィニティー、ウイルス不活性化のための低ｐＨ調整、追加の予備的ｐＨ調整、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換ろ過（またはクロマトグラフィー）、ｃＨＡクロマトグラフィー、および限外ろ過／ダイアフィルトレーションによる最終処方の使用によるモノクローナル抗体精製を含むプロセスを図式的に示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明の記載では、特定の用語は下に定義する通りに使用される。
【００３１】
哺乳動物宿主細胞において産生されるモノクローナル抗体などの組換えタンパク質は細胞外の細胞培養培地に分泌される。対象のタンパク質の回収では、限外ろ過または遠心分離により細胞培養液から無傷の細胞および細胞残屑を分離する。このプロセスから得られる産物は、ろ過によりさらに浄化され、本明細書では浄化無条件バルクまたは「ＣＵＢ」と呼ばれる。
【００３２】
「アフィニティークロマトグラフィー」とは、生体分子間の特異的、可逆的相互作用、たとえば、クロマトグラフ分離をもたらす等電点、疎水性、またはサイズなどの分子の一般的性質ではなく、ＩｇＧ抗体のＦｃ部分に結合するプロテインＡの能力を利用するクロマトグラフィーのことである。実際、アフィニティークロマトグラフィーでは、固体支持体に付着しているプロテインＡなどの吸収剤を使って、吸収剤に多かれ少なかれ堅固に結合している分子をクロマトグラフィーにより分離する。
【００３３】
「プロテインＡ」は、ＩｇＧ抗体のＦｃ部分に特異的に結合するスタフィロコッカスの細胞壁で最初に発見されたタンパク質である。本発明において、プロテインＡは、市販のおよび／または組換え型のプロテインＡを含む、スタフィロコッカスプロテインＡと同一のまたは実質的に類似の任意のタンパク質である。本発明において、実質的な類似性を判定するためのプロテインＡの生物活性には、ＩｇＧ抗体のＦｃ部分との結合能が挙げられる。
【００３４】
「プロテインＧ」は、ＩｇＧ抗体のＦＣ部分に特異的に結合するスタフィロコッカスの細胞壁で最初に発見されたタンパク質である。本発明において、プロテインＧは、市販のおよび／または組換え型のプロテインＧを含む、スタフィロコッカスプロテインＧと同一のまたは実質的に類似の任意のタンパク質である。本発明において、実質的な類似性を判定するためのプロテインＧの生物活性には、ＩｇＧ抗体のＦｃ部分に結合する能力が挙げられる。
【００３５】
「プロテインＬＧ」は、プロテインＧ（上の定義を参照されたい）とプロテインＬ両方の部分を含み、ＩｇＧ抗体に結合する組換え融合タンパク質である。プロテインＬは、ペプトストレプトコッカスの細胞壁から最初に単離された。プロテインＬＧは、プロテインＬとＧ両方由来のＩｇＧ結合ドメインを含む。Ｖｏｌａら（１９９４）Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４頁〜２５頁：２７頁〜３６頁、前記文献はその全体を本明細書に組み込まれているものとする。本発明では、プロテインＬＧは、市販のおよび／または組換え型のプロテインＬＧを含む、プロテインＬＧと同一のまたは実質的に類似の任意のタンパク質である。本発明において、実質的な類似性を判定するためのプロテインＬＧの生物活性には、ＩｇＧ抗体に結合する能力が挙げられる。
【００３６】
「陽イオン交換樹脂」とは、共有結合した負に帯電したリガンドを有し、したがって、樹脂を接触させる溶液中の陽イオンと交換するための遊離陽イオンを有するイオン交換樹脂のことである。幅広い種類の陽イオン交換樹脂、たとえば、共有結合基がカルボン酸またはスルホン酸である陽イオン交換樹脂は、当技術分野では公知である。精製するタンパク質のクロマトグラフィーおよび添加は、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、塩化物、フッ化物、酢酸、リン酸、および／またはクエン酸塩および／またはトリス緩衝液を含むが、これに限定されることはない種々の緩衝液または塩類中で行うことができる。当業者は、使用する緩衝液の正確な組成およびｐＨは、標的物質との所望の相互作用を生じるように調整すべきであることを認識するであろう。
【００３７】
「陰イオン交換樹脂」とは、第三級または第四級アミノ基などの共有結合した正に帯電した基を有するイオン交換樹脂またはフィルター膜（Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑ（商標）またはＩｎｔｅｒｃｅｐｔ  Ｑ（商標）など）のことである。カラムを通じて精製されるタンパク質のクロマトグラフィーおよび添加は、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、塩化物、フッ化物、酢酸、リン酸、および／またはクエン酸塩および／またはトリス緩衝液を含むが、これに限定されることはない種々の緩衝液または塩類中で行うことができる。当業者は、使用する緩衝液の正確な組成およびｐＨは、標的物質との所望の相互作用を生じるように調整すべきであることを認識するであろう。
【００３８】
「ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー」は、吸収剤としてセラミックヒドロキシアパタイトを使うクロマトグラフィーである。精製されるタンパク質のクロマトグラフィーおよび添加は、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、塩化物、フッ化物、酢酸、リン酸、および／またはクエン酸塩および／またはトリス緩衝液を含むが、これに限定されることはない種々の緩衝液または塩類中で行うことができる。そのような緩衝液または塩類は少なくとも約５．５のｐＨを有しうる。いくつかの実施形態では、平衡はトリスまたはリン酸ナトリウム緩衝液を含む溶液中で起こる可能性がある。所望により、リン酸ナトリウム緩衝液は、約１ｍＭと約５０ｍＭの間の濃度であり、別の実施形態では、約１０ｍＭと３０ｍＭの間の濃度である。一実施形態では、平衡は少なくとも約５．５のｐＨで起こる。一実施形態では、溶液は、約３０ｍＭの濃度のおよび約７．０のｐＨのリン酸ナトリウム緩衝液を含む。平衡は、約６．０と約８．６の間のｐＨで、別の実施形態では、約６．５と７．５の間のｐＨで起こる可能性がある。平衡緩衝液は、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、塩化物、フッ化物を含む追加の塩類も、約１ｍＭと約５０ｍＭの間の濃度で、別の実施形態では、約２５ｍＭと５０ｍＭの間の濃度で含有していてよい。溶出緩衝液は、一実施形態では、追加の塩類（上に収載した種類を含む）が１００ｍＭと２Ｍの間の濃度にまで、別の実施形態では、約２５０ミリモルと１モルの間の濃度で添加された同じ緩衝液組成を含有する。
【００３９】
「平衡液」または「平衡緩衝液」とは、クロマトグラフィーカラムまたは荷電膜を調製して標的物質と相互作用する所望の化学反応をもたらすのに適した平衡能力およびｐＨの液体のことである。典型的平衡液は、クロマトグラフィー技術では公知であり、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、塩化物、フッ化物、酢酸、リン酸、および／またはクエン酸塩および／またはトリス緩衝液を含む種々の緩衝液または塩類を含むことができる。当業者は、使用する緩衝液の正確な組成およびｐＨは、標的物質との所望の相互作用を生じるように調整すべきであることを認識するであろう。
【００４０】
「洗液」または「洗浄緩衝液」とは、標的物質が結合しているクロマトグラフィー樹脂から未結合のまたは緩く結合している混入物を洗い流すのに使用する液体のことである。典型的平衡液は、クロマトグラフィー技術では公知であり、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、塩化物、フッ化物、酢酸、リン酸、および／またはクエン酸塩および／またはトリス緩衝液を含む種々の緩衝液または塩類を含むことができる。当業者は、使用する緩衝液の正確な組成およびｐＨは、標的物質との所望の相互作用を生じるように調整すべきであることを認識するであろう。
【００４１】
「溶出液」または「溶出緩衝液」とは本明細書では、混入物をクロマトグラフィー樹脂から除いてしまった後に、標的物質をクロマトグラフィー樹脂から解離するために使う液体のことである。溶出液は、標的物質を不可逆的に変性することなく解離するように作用する。典型的溶出液はクロマトグラフィー技術では公知であり、比較的高濃度の塩類、遊離アフィニティーリガンドもしくは類似物、または標的物質のクロマトグラフィー樹脂からの解離を促進する他の物質を有していてよい。溶出条件とは、標的物質結合クロマトグラフィー樹脂を溶出液または溶出緩衝液と接触させてそのような解離を生じさせるなどの、標的物質結合クロマトグラフィー樹脂に課せられ、（非変性）標的物質をクロマトグラフィー樹脂から解離させるプロセス条件のことである。
【００４２】
ヒト投与に適している「薬物製品」または「製品」とは、ＦＤＡ、ＩＣＨおよび他の所管監督機関が概説する最新の優良医薬品製造基準（ｃＧＭＰ）に従ったプロセスから期待される品質、純度および安全基準を満たす製品のことである。本明細書に記載する方法により精製され、これらの厳しい要件を満たすタンパク質は、ヒト投与にのみ適していると見なされるべきではなく、したがって、目的とする最終用途に関して範囲を制限されるべきではない。さらに、本明細書に記載する実施形態は、目的の用途がヒト投与のためである例を説明する。しかし、タンパク質の目的の用途がヒト投与のためでなければ、これらの説明全体を通して概説される特定の工程は随意だと見なしうるために、これらの実施形態は制限的と見なすべきではない。たとえば、本明細書に記載される方法により精製され、生物学的アッセイ用の試薬として使用することを目的とするＩｇＧは、必ずしも陰イオン交換フィルターまたはウイルス除去のためのウイルスフィルターに通してろ過されることはないであろう。
【００４３】
「抗体」（Ａｂｓ）および「免疫グロブリン」（Ｉｇｓ）は、同じ構造特性を有する糖タンパク質である。抗体は特定の抗原に結合特異性を示すが、免疫グロブリンは抗体も抗原特異性を欠く他の抗体様分子も含む。後の種類のポリペプチドは、たとえば、リンパ系により低レベルで、および骨髄腫により増加したレベルで産生される。
【００４４】
「自然抗体」および「免疫グロブリン」は通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖で構成された約１５０，０００ダルトンのヘテロテトラマー糖タンパク質である。各軽鎖は１本の共有ジスルフィド結合により重鎖に連結されており、ジスルフィド連鎖の数は異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変動する。各重および軽鎖は、規則的に間隔の開いた鎖内ジスルフィド架橋も有している。各重鎖は、１つの末端に可変ドメイン（ＶＨ）続いていくつかの定常ドメインを有する。各軽鎖は、一方の末端に可変ドメイン（ＶＬ）およびもう一方の末端に定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは重鎖の第１定常ドメインと整列しており、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基は、軽鎖および重鎖可変ドメイン間で接合面を形成すると考えられている（Ｃｌｏｔｈｉａら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８６：６５１頁（１９８５）；Ｎｏｖｏｔｎｙ  ａｎｄ  Ｈａｂｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：４５９２頁（１９８５））。
【００４５】
用語「可変の」とは、可変ドメインのある種の部分は抗体間で配列が広く異なり、特定の抗原に対する１つ１つの特定の抗体の結合および特異性に利用されるという事実のことである。しかし、可変性は抗体の可変ドメイン全体を通じて均一に分配されてはいない。可変性は、軽鎖と重鎖可変ドメイン両方において相補性決定領域（ＣＤＲ）または高頻度可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインの比較的高度に保存されている部分はフレームワーク（ＦＲ）と呼ばれている。自然重および軽鎖の可変ドメインはそれぞれ４つのＦＲ領域を含み、大部分がβシート構造をとり、そのβシート構造を接続させ、いくつかの場合には、その一部を形成するループを形成する３つのＣＤＲで接続されている。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域によりごく接近して結合されており、もう一方の鎖由来のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ（１９９１）を参照されたい）。定常ドメインは、抗体を抗原に結合させるのに直接関与してはいないが、抗体依存性細胞毒性における抗体の関与などの種々のエフェクター機能を示す。
【００４６】
抗体をパパイン消化すると、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる、それぞれが単一抗原結合部位を有する２つの同一の抗原結合断片と、その名称が容易に結晶化する能力を反映する残留「Ｆｃ」断片を生じる。ペプシン処理すると、２つの抗原結合部位を有し、依然として抗原と架橋結合することができるＦ（ａｂ’）２断片が生じる。
【００４７】
「Ｆｖ」は、完全抗原認識および結合部位を含有する最小抗体断片である。２本鎖Ｆｖ種では、この領域は堅固に非共有結合している１つの重および１つの軽鎖可変ドメインのダイマーからなる。１本鎖Ｆｖ種（ｓｃＦｖ）では、１つの重および１つの軽鎖可変ドメインは、可動性ペプチドリンカーにより共有結合的に連結することができるので、その軽および重鎖は、２本鎖Ｆｖ種における構造に類似する「二量体」構造に会合することができる。各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ−ＶＬダイマーの表面に抗原結合部位を規定するのは、この高次構造においてである。まとめると、６つのＣＤＲが抗原結合特異性を抗体に与える。しかし、単一可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でも、抗原を認識して結合する能力を有するが、結合部位全体よりも低いアフィニティーで結合する。ｓｃＦｖの概論は、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２６９頁〜３１５頁（１９９４）を参照されたい。
【００４８】
Ｆａｂ断片は、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）も含有している。Ｆａｂ’断片は、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ終端に、抗体ヒンジ領域由来の１つまたは複数のシステインを含む数個の残基の追加の分だけＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を有するＦａｂ’を表す本明細書での名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元来、間にヒンジシステインを有する対のＦａｂ’断片として産生された。抗体断片の他の化学的結合も知られている。
【００４９】
いかなる脊椎動物種由来の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」も、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、２つの明確に異なる種類、すなわちカッパ（ｋ）とラムダ（ｌ）のうちの１つに割り当てることができる。
【００５０】
その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列により、免疫グロブリンは別々のクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンには５つの主要クラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、このうちのいくつかはさらにサブクラス（アイソタイプ）、たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２に分けることができる。免疫グロブリンの別々のクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。免疫グロブリンの別々のクラスのサブユニット構造および三次元高次構造は公知である。
【００５１】
用語「抗体」は、もっとも広い意味で使われ、具体的には、単一モノクローナル抗体（アゴニストおよびアンタゴニスト抗体を含む）ならびにポリエピトープ特異性のある抗体組成物を包含する。さらに、用語「抗体」は、抗原に対する適切な特異的結合を有し、ＥＬＩＳＡまたはＥＬＩＳＡ型検出系におけるその使用を可能にする適切な免疫グロブリンおよびその断片をすべて記述するのに本明細書では使われることになる。
【００５２】
本明細書で使用する「抗体断片」およびそのすべての文法上の変化形は、その部分に無傷の抗体のＦｃ領域の定常重鎖ドメイン（すなわち、抗体アイソタイプによりＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４）がない、抗原結合部位または無傷の抗体の可変領域を含む無傷の抗体の一部として定義される。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片；二重特異性抗体；（１）１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子（２）会合した重鎖部分がなく、軽鎖可変ドメインの３つのＣＤＲを含有する１つの軽鎖可変ドメインまたはその断片のみを含有する１本鎖ポリペプチドおよび（３）会合した軽鎖部分がなく、重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含有する１つの重鎖可変領域またはその断片のみを含有する１本鎖ポリペプチド、を制限なく含む、近接アミノ酸残基の１つの途切れのない配列からなる一次構造を有するポリペプチドである任意の抗体断片（本明細書では、１本鎖抗体断片または１本鎖ポリペプチドと呼ぶ）；ならびに、抗体断片から形成される多特異的または多価の構造体が挙げられる。１つまたは複数の重鎖を含む抗体断片では、重鎖は、無傷の抗体の非Ｆｃ領域で見出される任意の定常ドメイン配列（たとえば、ＩｇＧアイソタイプ中のＣＨ１）を含有することができる、および／または、無傷の抗体に見出される任意のヒンジ領域配列を含有することができる、および／または、ヒンジ領域配列もしくは重鎖の定常ドメイン配列に融合されているもしくは位置しているロイシンジッパー配列を含有することができる。適切なロイシンジッパー配列には、Ｋｏｓｔｅｌｎｅｙら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：１５４７頁〜１５５３頁（１９９２）により教唆されるｊｕｎおよびｆｏｓロイシンジッパー、ならびに下の実施例に記載されるＧＣＮ４ロイシンジッパーが挙げられる。
【００５３】
本明細書で使用する用語「モノクローナル抗体（ｍＡｂ）」とは、実質的に均一な、すなわち、その集団を含む個々の抗体が、少量存在している可能性があると考えられる天然の突然変異を除いて同一である、抗体の集団から得られる抗体のことである。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対して誘導される。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対して誘導された異なる抗体を典型的に含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各ｍＡｂは抗原上の単一決定基に対して誘導される。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養により合成することができ、他の免疫グロブリンが混入していない点で有利である。修飾語の「モノクローナル」は、抗体の特徴を、抗体の実質的に均一な集団から得られるものとして示しており、いかなる特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈すべきではない。たとえば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９６５頁（１９７５）により初めて記載されたハイブリドーマ法により作製してもよいし、組換えＤＮＡ法（たとえば、Ｃａｂｉｌｌｙらへの米国特許第４８１６５６７号を参照されたい）により作製してもよい。モノクローナル抗体は、たとえば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４頁〜６２８頁（１９９１）およびＭａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１頁〜５９７頁（１９９１）に記載されている技術を使ってファージ抗体ライブラリーから単離された抗原認識および結合部位含有抗体断片のクローン（Ｆｖクローン）も含んでいる。
【００５４】
本明細書のモノクローナル抗体には、起源の種類または免疫グロブリンクラスもしくはサブクラス名称、ならびに抗体断片（たとえば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ）とは無関係に、抗−ＩＬ−８抗体の可変（超可変を含む）ドメインを定常ドメインに（たとえば、「ヒト化」抗体）、または軽鎖を重鎖に、またはある種由来の鎖を別の種由来の鎖に、または融合物を異種タンパク質にスプライスすることにより産生される「ハイブリッド」および「組換え抗体」が、それが所望の生物活性を示す限り、含まれる（たとえば、Ｃａｂｉｌｌｙらへの米国特許第４８１６５６７号；Ｍａｇｅ  ａｎｄ  Ｌａｍｏｙｉ，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，７９頁〜９７頁（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）を参照されたい）。
【００５５】
本明細書のモノクローナル抗体には、具体的には、重および／または軽鎖の一部分が、特定種由来のまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一であるまたは類似しており、一方その鎖の残部は、別の種由来のまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体、ならびにそのような抗体の断片における対応する配列と同一であるまたは類似している「キメラ」抗体（免疫グロブリン）が、それが所望の生物活性を示す限り、含まれる（Ｃａｂｉｌｌｙら，上記を参照；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６８５１頁（１９８４））。
【００５６】
「ヒト化」型の非ヒト（たとえば、マウスの）抗体は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含有する特異的キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはその断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または抗体の他の抗原結合配列など）である。大部分、ヒト化抗体は、受容者の相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト種のＣＤＲ（供与者抗体）由来の残基により置き換えられているヒト免疫グロブリン（受容者抗体）である。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基により置き換えられている。さらに、ヒト化抗体は、受容者抗体にも移入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見出されない残基を含むことができる。これらの改変は、抗体性能をさらに洗練し最大限にするように行われている。一般に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に一致しており、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のＦＲ領域である少なくとも１つ、および典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含む。ヒト化抗体は、至適には免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域も含む。さらに詳細には、Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２頁（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３頁（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３頁（１９９２）を参照されたい。
【００５７】
本発明は、とりわけ、ヒト投与に適したモノクローナル抗体を精製するための方法を提供する。本発明の一実施形態は、多数の種類の不純物を同時に除去するためのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の精製におけるセラミックヒドロキシアパタイト（ｃＨＡ）の使用である。これらの不純物および／または混入物には、１）組換え宿主細胞由来のタンパク質、２）宿主細胞由来の核酸、３）レトロウイルス粒子および外来性ウイルス、４）培地成分、アフィニティー精製中に浸出したプロテインＡなどの製造および精製中に取り込まれた不純物、ならびに５）凝集型の抗体それ自体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。これ以降、一般的な意味で使う場合、および上記の種類の混入物または不純物を明記しない場合は、これらはまとめて不純物または混入物と呼ぶことにする。
【００５８】
追加の態様では、本発明は、順次クロマトグラフィーおよびろ過工程を使ったモノクローナル抗体の精製方法に関する。そのような工程は、精製プロセスを完了し、ヒト投与に適した高品質、高純度のモノクローナル抗体を提供するためのセラミックヒドロキシアパタイトを含む。使用者がモノクローナル抗体の固有特性に合わせて精製を調整し、依然としてヒトへの投与に適した物質を提供することを可能にする本発明の少なくとも３つの実施形態が存在する。
【００５９】
特定のモノクローナル抗体では、セラミックヒドロキシアパタイト上での精製のために使われる条件（使用する緩衝液およびカラムに添加するタンパク質の量）は、モノクローナル抗体の固有特性を利用して、同時に１回の処理工程で多数の不純物および混入物を除去する能力を維持するように調整することができる。
【００６０】
本発明は、１）組換え宿主細胞由来のタンパク質、２）宿主細胞由来の核酸、３）レトロウイルス粒子および外来性ウイルス、４）培地成分、アフィニティー精製中に浸出したプロテインＡなどの製造および精製中に取り込まれた不純物、ならびに５）凝集型の抗体それ自体を含むが、これらに限定されるものではない不純物または混入物の除去のためのセラミックヒドロキシアパタイトの使用を教唆する。さらに、本発明は、高レベルの純度を有しヒト投与に適した精製された抗体を実現するために、（サブクラスＩｇＧ１およびＩｇＧ４の）ＩｇＧを吸着し、１回の脱離事象で前記ＩｇＧを選択的に溶出する（勾配のない均一濃度）ことにより、上に収載する５種類の残留混入物の除去のためのセラミックヒドロキシアパタイトの使用を教唆する。このように、細胞培養液からモノクローナル抗体を精製するために、費用効率のよい２工程カラムクロマトグラフィープロセスを実現することは可能である。必要であれば、ウイルス安全性およびＤＮＡの低減の保証のためにプロセス全体を通じて種々の段階で、追加のクロマトグラフィーおよび／またはろ過工程を含むことができ、投与または凍結乾燥用のタンパク質を調製するために、最終限外ろ過／ダイアフィルトレーション工程が含まれる。
【００６１】
商業製造環境においては、勾配溶出は高価であるし確実に実行するのが困難でもある。したがって、代案として、本発明は、この媒体の二重機能性を利用し、精製するＩｇＧの固有特性、ならびにＩｇＧから分割する不純物の特性を最大限に活用するように考案した溶出の工程を開示する。たとえば、塩基性および酸性タンパク質は、ｃＨＡに結合してしまうと、別々の機構により溶出することができることが知られているので、アミン−リン酸相互作用の塩化ナトリウム置換により優先的にＩｇＧを溶出し、カルボキシル−カルシウム相互作用を介して結合しているより酸性のタンパク質を残すことができる。より酸性のタンパク質は、カルシウムとより強力な複合体を形成するイオン、すなわちリン酸を使って溶出することができる。
【００６２】
クロマトグラフィー工程全体を通じて使用される緩衝液のｐＨおよびイオン強度を調整することにより、本発明は、対象のＩｇＧを混入物から分離させながら、選択的に吸収し、その後にＩｇＧを溶出する方法を開示する。
【００６３】
以下の実施例は本発明をさらに例示するものである。本実施例は、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明のさらなる理解をもたらす。
【実施例】
【００６４】
本発明は、本発明を説明することを目的とする以下の実施例により、本発明をさらに例示する。これらの実施例は、本発明の範囲を限定することを目的としているのではなく、限定するものとして解釈すべきでもない。本発明の多数の改変および変更は、本明細書の教唆を考慮すれば実現可能であり、したがって、本発明の範囲内にある。下の実施例は標準的技術を使って実施されており、そのような標準的技術は、他の方法で詳細に記載されている場合を除けば、当業者にとって公知であり常法である。
【実施例１】
【００６５】
順次プロテインＡからセラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーまでを含むモノクローナル抗体（ＩｇＧ１、抗−ＩＬ−５抗体）の精製
一実施形態では、本プロセスは、プロテインＡアフィニティー、予備的ｐＨ調整、およびｃＨＡクロマトグラフィーの使用による抗体精製を含む。このプロセスは図１に描かれている。
【００６６】
ｃＨＡを本明細書に記載の通りに使用することにより、２クロマトグラフィー工程のみが必要とされ、ヒト投与用に使用するモノクローナル抗体の品質、純度または適合性を損う、または減少させることなく製造費用を削減する。
【００６７】
個々のプロセス工程の詳細は下に記載している。工程ごとに、予想される成果を含めて簡単な説明を与えている。工程ごとの重要なプロセスパラメータを収載している。手順の詳細、緩衝液組成、プロセス設定点、カラム寸法等はすべて例証目的に含まれており、本技術の操作において包括的または限定的と見なされるべきではない。
【００６８】
１．１  アフィニティークロマトグラフィー
固定化組換えプロテインＡリガンドを含有するアフィニティークロマトグラフィー樹脂、すなわち、あらかじめ３０ｍＭリン酸、ｐＨ７．０で平衡化されているＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）（使用するプロテインＡ媒体には、プロテインＡ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）、組換えプロテインＡ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）、ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）、ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ  ＳＵＲＥ（商標）、ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ  ＸＴＲＡ（商標）、ＰＲＯＳＥＰ（登録商標）Ａ、ＰＲＯＳＥＰ（登録商標）ｖＡ、ＰＲＯＳＥＰ（登録商標）ｒＡ、ＰＯＲＯＳ（登録商標）５０Ａ、ＡＦ−ＰＲＯＴＥＩＮ  Ａ  ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）６５０Ｍも挙げられるが、これらに限定されるものではない）上に、ろ過された細胞培養液から捕捉されるモノクローナル抗体（たとえば、米国特許第５６９３３２３号、第５６８３８９２号、第６１２９９１３号、第５７８３１８４号、および第６９４６１３０号に記載されている抗−ＩＬ−５抗体。前記文献は参照により本明細書に組み込まれているものとする）。２Ｍ塩化ナトリウムを含有する３総容量（ＢＶ）の３０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７および３ＢＶの２０ｍＭリン酸、ｐＨ５．５での塩洗浄に続いて、生成物は３０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ２．７を使ったｐＨシフトで溶出した。当業者であれば、緩衝液組成は、２．５〜３．５のｐＨ範囲でリン酸、クエン酸、酢酸等を含むことができるが、これらに限定されるものではないことを認識するであろう。しかし、リン酸または他の非カルシウムキレート緩衝液の使用により、それに続くｃＨＡカラムをキレート緩衝液に曝露することなく繰り返し使用することが可能になる。生成物ピーク収集はＵＶ吸光度の上昇で開始し、吸光度ピークが基線近くに戻るまで続いた。決定的ピーク切断基準は存在しない。その意図は全ピークを収集し、ＵＶ吸光度が基線近くに戻った後により多くの溶出液を収集することによる生成物の不必要な希釈を防ぐことである。安定させる目的で、未調整ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）溶出液の推奨保管期間は２〜１０℃で最長１４日である。溶出後、溶出液は≦３．５であり、したがって、ｐＨ調整は必要ではなかった。ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）カラムはｐＨ１．５の塩酸で取り除き、バッチの最後に５０ｍＭリン酸ナトリウム中６ＭグアニジンｐＨ７．０で浄化した。ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）カラムは、１％ベンジルアルコールを含有する０．１Ｍ酢酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウムｐＨ５．２中に貯蔵した。
【００６９】
ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）クロマトグラフィーは、細胞および培養液由来不純物ならびにウイルス粒子の大部分を除去する。新規のアプローチでは、追加のＤＮＡ排除を実現するために塩洗浄が含まれる。このアフィニティー精製技術により、９０％を超える収率で、≧９０％純度のＩｇＧがもたらされる。
【００７０】
１．２  ｐＨ調整およびろ過
本実施例でのように、上記の溶出緩衝液を２．５〜３．５ｐＨ範囲で使用すれば、ｐＨ３．５のまたは未満の溶出液を得ることができ、したがって、この溶出液は、ウイルス不活性化のためのｐＨ調整を必要としない。ｐＨ調整が必要ならば、プロテインＡ溶出液は、酸でｐＨ２．５〜４．５に調製される。
【００７１】
ウイルス不活性化を３０分保持した後、溶出液を塩基でｐＨ７．０に調整した。次に、ｐＨ調整溶出液を０．２ｕｍフィルター処理した。
【００７２】
低ｐＨ処理は、潜在的ウイルス混入物、特にレトロウイルスおよび他のエンベロープウイルスを不活性化することを目的とする。比較的高いｐＨでのろ過は、次のクロマトグラフィー工程のための溶液を調製し、ＤＮＡを減らす。
【００７３】
１．３  ｃＨＡクロマトグラフィー
ろ過された溶出液（工程１．２から）は、（ＢｉｏＲａｄ  ＣＨＴ（商標）ＴｙｐｅＩ樹脂またはＣＨＴ（商標）ＴｙｐｅＩＩ樹脂などの任意のヒドロキシアパタイト樹脂を使った）ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによりさらに精製された。
【００７４】
カラムは、４００ｍＭリン酸からなる５ＢＶのプレ平衡緩衝液、ｐＨ７．０（プロセス全体を通して適切な使用のために検討すべき代替えの緩衝液には、トリス、酢酸、ＭＥＳ等が挙げられるが、これらに限定されるものではない）ですすぐことによりクロマトグラフィー用に調製した。次に、カラムは、３０ｍＭリン酸、５０ｍＭ塩化ナトリウムからなる５ＢＶの平衡緩衝液、ｐＨ７．０で平衡化した。ｃＨＡ添加試料をカラム上に添加した。添加が完了すると、カラムは３０ｍＭリン酸ナトリウム、５０ｍＭ塩化ナトリウムからなる５ＢＶの洗浄緩衝液、ｐＨ７．０で洗浄した。結合生成物は、３つの別個の実験において、３０ｍＭリン酸ナトリウムおよびそれぞれ３００、４００、５００ｍＭ塩化ナトリウムからなる溶出緩衝液、ｐＨ７．０で溶出した。２ｍｍ路長のオンラインＵＶモニタを使って、ピークは、吸光度が８８０ｍＡＵまで上昇すると収集され、ピークが２．０ＡＵに相当する吸光度に戻るまで続いた。ピーク切断基準は、不純物除去には決定的である可能性があり、基準は所与のモノクローナル抗体に特異的であることが予想される。溶出液収集に続いて、カラムは５ＢＶの０．５Ｎ  ＮａＯＨで浄化した。浄化に続いて、カラムは３ＢＶの０．０１Ｎ  ＮａＯＨ保存液で洗浄する。
【００７５】
ｃＨＡ工程は、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、プロテインＡ（プロテインＡ：ＩｇＧ複合体）、およびＩｇＧ凝集物などの（しかし、これらに限定されることはない）いくつかの不純物を同時に除去することが実証された。結果は下の表１に示している。
【００７６】
【表１】
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【００７７】
実施例１に使用された特定のモノクローナル抗体が、光誘発性凝集を受けることに注目するのは重要である。その結果、プロセス中間体すべてが保護覆幕で光から遮蔽された。生成物が光から保護されていない実験では、ｃＨＡ溶出液ＩｇＧレベルは１．０〜３．９％に及んだ。これはすべての抗体に必要であるとは予想されていない。
【実施例２】
【００７８】
順次プロテインＡからセラミックヒドロキシアパタイト、ウイルスろ過および限外ろ過／ダイアフィルトレーションによる最終処方までを含む
一実施形態では、本プロセスは、プロテインＡアフィニティー、ウイルス不活性化のための低ｐＨ調整、追加の予備的ｐＨ調整、ｃＨＡクロマトグラフィー、および限外ろ過／ダイアフィルトレーションによる最終処方の使用による抗体精製を含む。このプロセスは図２に描かれている。
【００７９】
本明細書に記載の通りにｃＨＡを使うことにより、２クロマトグラフィー工程のみが必要であり、ヒト投与用に使用するモノクローナル抗体の品質、純度または適合性を損う、または減少させることなく製造費用を削減する。
【００８０】
個々のプロセス工程の詳細は下に記載している。工程ごとに、予想される成果を含めて簡単な説明を与えている。工程ごとの重要なプロセスパラメータを収載している。手順の詳細、緩衝液組成、プロセス設定点、カラム寸法等はすべて例証目的に含まれており、本技術の操作において包括的または限定的と見なされるべきではない。
【００８１】
２．２  アフィニティークロマトグラフィー
モノクローナル抗体（ｍＡｂ、ＩｇＧ）は、あらかじめ１０〜５０ｍＭリン酸、ｐＨ６．０〜８．５で平衡化されている固定化組換えプロテインＡリガンドを含有するアフィニティークロマトグラフィー樹脂（プロテインＡ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）、組換えプロテインＡ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）、ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）、ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ  ＳＵＲＥ（商標）、ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ  ＸＴＲＡ（商標）、ＰＲＯＳＥＰ（登録商標）Ａ、ＰＲＯＳＥＰ（登録商標）ｖＡ、ＰＲＯＳＥＰ（登録商標）ｒＡ、ＰＯＲＯＳ（登録商標）５０Ａ、ＡＦ−ＰＲＯＴＥＩＮ  Ａ  ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）６５０Ｍが挙げられるが、これらに限定されるものではない）上に、ろ過された細胞培養液から捕捉される。１〜２Ｍ塩化ナトリウム、一実施形態では２Ｍ塩化ナトリウムを含有する２〜８総容量（ＢＶ）の１０〜５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０での塩洗浄および２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０での３ＢＶ洗浄に続いて、生成物は１０〜５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ２．１〜３．５を使ったｐＨシフトで溶出する。収率が容認できるのであれば、さらに高いｐＨ（たとえば、最高ｐＨ４．０）を使ってもよい。当業者であれば、緩衝液組成は、２．５〜３．５のｐＨ範囲でリン酸、クエン酸、酢酸等を含むことができるが、これらに限定されるものではないことを認識するであろう。しかし、リン酸または他の非カルシウムキレート緩衝液の使用により、それに続くｃＨＡカラムをキレート緩衝液に曝露することなく繰り返し使用することが可能になる。生成物ピーク収集はＵＶ吸光度の上昇で開始し、吸光度ピークが基線近くに戻るまで続く。決定的ピーク切断基準は存在しない。その意図は全ピークを収集し、ＵＶ吸光度が基線近くに戻った後により多くの溶出液を収集することによる生成物の不必要な希釈を防ぐことである。安定させる目的で、未調整ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）溶出液の推奨保管期間は２〜１０℃で最長１４日である。溶出に続いて、溶出液は貯蔵し、直ちにｐＨ３．５に調整する。ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）カラムは、サイクルとサイクルの合間にｐＨ１．５塩酸溶液で取り除き、バッチの最後に５０ｍＭリン酸ナトリウム中６ＭグアニジンｐＨ７．０で浄化する。ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）カラムは、１％ベンジルアルコールを含有する０．１Ｍ酢酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウムｐＨ５．２中に貯蔵する。
【００８２】
ＣＵＢ中の生成物の質量によっては、多数のサイクルが必要になる可能性がある。
【００８３】
ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）クロマトグラフィーは、細胞および培養液由来不純物ならびにウイルス粒子の大部分を除去する。新規のアプローチでは、追加のＤＮＡ排除を実現するために塩洗浄が含まれる。このアフィニティー精製技術により、９０％を超える収率で、≧９０％純度のＩｇＧがもたらされる。
【００８４】
２．２  ｐＨ調整およびろ過
貯蔵したプロテインＡ溶出液は酸でｐＨ２．５〜４．５に調整する。ウイルス不活性化のための１５〜６０分保持に続いて、溶出液は塩基でｐＨ６．０〜８．５に調整する。次に、ｐＨ調整溶出液はろ過して沈殿物を除去し、０．２ｕｍフィルター処理する。
【００８５】
低ｐＨ処理は、潜在的ウイルス混入物、特にレトロウイルスおよび他のエンベロープウイルスを不活性化することを目的とする。比較的高いｐＨでのろ過は、次のクロマトグラフィー工程のための溶液を調製し、ＤＮＡを減らす。
【００８６】
２．３  ｃＨＡクロマトグラフィー
ろ過された溶出液（工程２．２からの）は、（ＢｉｏＲａｄ  ＣＨＴ（商標）ＴｙｐｅＩ樹脂またはＣＨＴ（商標）ＴｙｐｅＩＩ樹脂など任意のヒドロキシアパタイト樹脂を使った）ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによりさらに精製する。
【００８７】
カラムは、１００ｍＭ〜１Ｍリン酸からなる２〜５ＢＶのプレ平衡緩衝液、ｐＨ６．０〜８．５（プロセス全体を通して適切な使用のために検討すべき代替えの緩衝液には、トリス、酢酸、ＭＥＳ等が挙げられるが、これらに限定されるものではない）ですすぐことによりクロマトグラフィー用に調製する。次に、カラムは、１０〜５０ｍＭリン酸、０〜５０ｍＭ塩化ナトリウムからなる２〜１０ＢＶの平衡緩衝液、ｐＨ６．０〜８．５で平衡化する。ｃＨＡ添加試料をカラム上に添加する。添加が完了すると、カラムは１０〜５０ｍＭリン酸ナトリウム、０〜５０ｍＭ塩化ナトリウムからなる２〜５ＢＶの洗浄緩衝液、ｐＨ６．５〜８．０で洗浄する。結合生成物は、１０〜５０ｍＭリン酸ナトリウム、５０ｍＭ〜１．０Ｍ塩化ナトリウムからなる溶出緩衝液、ｐＨ６．５〜８．５で溶出する。ピークは、吸光度が上昇すると収集され、ピークが任意のプリセットした基準に相当する吸光度に戻るまで続く。溶出液収集に続いて、カラムは２〜５ＢＶの０．１〜１Ｎ  ＮａＯＨで浄化する。浄化に続いて、カラムは２〜５ＢＶの０．０１〜０．０５Ｎ  ＮａＯＨ保存溶液で洗浄する。
【００８８】
ｃＨＡ工程は、非ＩｇＧタンパク質、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、プロテインＡ、プロテインＡ：ＩｇＧ複合体、およびウイルス粒子などの（しかし、これらに限定されることはない）いくつかの不純物を同時に除去する。
【００８９】
２．４  ウイルスろ過
ｃＨＡ溶出液（工程２．３からの）は、（サイズが２０ｎｍに等しいまたはそれより大きい粒子を保持することができるとして名目上引用され、Ｐａｌｌ  ＤＶ２０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＶＩＲＥＳＯＬＶＥ（登録商標）ＮＦＰ等を含むが、これらに限定されることはない任意のタイプの）ウイルスフィルターに通してろ過するが、ウイルス除去フィルターは製造元が推奨する手順に従う。ウイルスろ過は、推定上および／または実際のウイルス混入物を除去することになる。
【００９０】
２．５  限外ろ過および連続ダイアフィルトレーションによる処方
ろ液（工程２．４からの）は、接線流限外ろ過（ＴＦＵＦ）によって３〜１０容量の処方緩衝液でダイアフィルター処理する。次に、ダイアフィルター液は、必要に応じて、ヒト投与に実用的な既定濃度まで濃縮する。最終濃縮後、処方バルク製剤物質は、０．２ｕｍフィルター処理し、既定温度で貯蔵する。
【実施例３】
【００９１】
順次プロテインＡから陰イオン交換、セラミックヒドロキシアパタイト、ウイルスろ過および限外ろ過／ダイアフィルトレーションによる最終処方までを含む
別の実施形態では、本プロセスは、プロテインＡアフィニティー、ウイルス不活性化のための低ｐＨ調整、追加の予備的ｐＨ調整、陰イオン交換ろ過（またはクロマトグラフィー）、ｃＨＡクロマトグラフィー、および限外ろ過／ダイアフィルトレーションによる最終処方の使用によるモノクローナル抗体精製を含む。このプロセスは図３に描かれている。
【００９２】
製品の安全性または品質の追加の保証を与えるためにＤＮＡの追加の排除が必要な場合は、陰イオン交換フィルター（またはカラムクロマトグラフィー）を例として追加する。
【００９３】
個々のプロセス工程の詳細は下に記載している。工程ごとに、予想される成果を含めて簡単な説明を与えている。工程ごとの重要なプロセスパラメータを収載している。手順の詳細、緩衝液組成、プロセス設定点、カラム寸法等はすべて例証目的に含まれ、本技術の操作において包括的または限定的と見なされるべきではない。
【００９４】
３．１  アフィニティークロマトグラフィー
モノクローナル抗体（ｍＡｂ、ＩｇＧ）は、あらかじめ１０〜５０ｍＭリン酸、ｐＨ６．０〜８．５で平衡化されている固定化組換えプロテインＡリガンドを含有するアフィニティークロマトグラフィー樹脂（プロテインＡ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）、組換えプロテインＡ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）、ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）、ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ  ＳＵＲＥ（商標）、ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ  ＸＴＲＡ（商標）、ＰＲＯＳＥＰ（登録商標）Ａ、ＰＲＯＳＥＰ（登録商標）ｖＡ、ＰＲＯＳＥＰ（登録商標）ｒＡ、ＰＯＲＯＳ（登録商標）５０Ａ、ＡＦ−ＰＲＯＴＥＩＮ  Ａ  ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）６５０Ｍが挙げられるが、これらに限定されるものではない）上に、ろ過された細胞培養液から捕捉される。１〜２Ｍ塩化ナトリウム、一実施形態では２Ｍ塩化ナトリウムを含有する２〜８総容量（ＢＶ）の１０〜５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０での塩洗浄および２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０での３ＢＶ洗浄に続いて、生成物は１０〜５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ２．１〜３．５を使ったｐＨシフトで溶出する。収率が容認できるのであれば、さらに高いｐＨ（たとえば、最高ｐＨ４．０）を使ってもよい。当業者であれば、緩衝液組成は、２．５〜３．５のｐＨ範囲でリン酸、クエン酸、酢酸等を含むことができるが、これらに限定されるものではないことを認識するであろう。しかし、リン酸または他の非カルシウムキレート緩衝液の使用により、それに続くｃＨＡカラムをキレート緩衝液に曝露することなく繰り返し使用することが可能になる。生成物ピーク収集はＵＶ吸光度の上昇で開始し、吸光度ピークが基線近くに戻るまで続く。決定的ピーク切断基準は存在しない。その意図は全ピークを収集し、ＵＶ吸光度が基線近くに戻った後により多くの溶出液を収集することによる生成物の不必要な希釈を防ぐことである。安定させる目的で、未調整ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）溶出液の推奨保管期間は２〜１０℃で最長１４日である。溶出に続いて、溶出液は貯蔵し、直ちにｐＨ３．５に調整する。ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）カラムは、サイクルとサイクルの合間にｐＨ１．５塩酸溶液で取り除き、バッチの最後に５０ｍＭリン酸ナトリウム中６ＭグアニジンｐＨ７．０で浄化する。ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）カラムは、１％ベンジルアルコールを含有する０．１Ｍ酢酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウムｐＨ５．２中に貯蔵する。
【００９５】
ＣＵＢ中の生成物の質量によっては、多数のサイクルが必要になる可能性がある。
【００９６】
ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）クロマトグラフィーは、細胞および培養液由来不純物ならびにウイルス粒子の大部分を除去する。新規のアプローチでは、追加のＤＮＡ排除を実現するために塩洗浄が含まれる。このアフィニティー精製技術により、９０％を超える収率で、≧９０％純度のＩｇＧがもたらされる。
【００９７】
３．２  ｐＨ調整およびろ過
貯蔵したプロテインＡ溶出液は酸でｐＨ２．５〜４．５に調整する。ウイルス不活性化のための１５〜６０分保持に続いて、溶出液は塩基でｐＨ６．０〜８．５に調整する。次に、ｐＨ調整溶出液はろ過して沈殿物を除去し、０．２ｕｍフィルター処理する。
【００９８】
低ｐＨ処理は、潜在的ウイルス混入物、特にレトロウイルスおよび他のエンベロープウイルスを不活性化することを目的とする。比較的高いｐＨでのろ過は、次のクロマトグラフィー工程のための溶液を調製し、ＤＮＡを減らす。
【００９９】
３．３  陰イオン交換ろ過またはクロマトグラフィー
ろ過した溶出液（工程３．２からの）は、生成物をプロテインＡカラムからの溶出のために使用される緩衝液に近い緩衝液であらかじめ平衡化されているフィルターに貫流させる貫流式で操作する（ＭＵＳＴＡＮＧ（登録商標）ＱまたはＩＮＴＥＲＣＥＰＴ（商標）Ｑを含むが、これらに限定されることはない陰イオン官能性を有する任意の膜を使った）陰イオン交換フィルターを通すろ過によりさらに精製される。軽微な変更では、（ＤＥＡＥ、Ｑ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）、ＱＸＬ等を含むが、これらに限定されることはない陰イオン官能性のリガンドを有する任意の樹脂を使った）陰イオン交換クロマトグラフィーカラムをフィルターの代わりに使い、類似の貫流式で操作することができる。陰イオン交換カラムは０．１〜１Ｎ  ＮａＯＨで浄化し、０．０１〜０．０５Ｎ  ＮａＯＨ中に貯蔵する。陰イオン交換工程（フィルターまたはカラム版）は生成物中のＤＮＡの量をさらに減少させる。
【０１００】
３．４  ｃＨＡクロマトグラフィー
ろ過された溶出液（工程３．３からの）は、（ＢｉｏＲａｄ  ＣＨＴ（商標）ＴｙｐｅＩ樹脂またはＣＨＴ（商標）ＴｙｐｅＩＩ樹脂などの任意のヒドロキシアパタイト樹脂を使った）ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによりさらに精製する。
【０１０１】
カラムは、１００ｍＭ〜１Ｍリン酸からなる２〜５ＢＶのプレ平衡緩衝液、ｐＨ６．０〜８．５（プロセス全体を通して適切な使用のために検討すべき代替えの緩衝液には、トリス、酢酸、ＭＥＳ等が挙げられるが、これらに限定されるものではない）ですすぐことによりクロマトグラフィー用に調製する。次に、カラムは、１０〜５０ｍＭリン酸、０〜５０ｍＭ塩化ナトリウムからなる２〜１０ＢＶの平衡緩衝液、ｐＨ６．０〜８．５で平衡化する。ｃＨＡ添加試料をカラム上に添加する。添加が完了すると、カラムは１０〜５０ｍＭリン酸、０〜５０ｍＭ塩化ナトリウムからなる２〜５ＢＶの洗浄緩衝液、ｐＨ６．５〜８．０で洗浄する。結合生成物は、１０〜５０ｍＭリン酸ナトリウム、５０ｍＭ〜１．０Ｍ塩化ナトリウムからなる溶出緩衝液、ｐＨ６．５〜８．５で溶出する。ピークは、吸光度が上昇すると収集され、ピークが任意のプリセットした基準に相当する吸光度に戻るまで続く。溶出液収集に続いて、カラムは２〜５ＢＶの０．１〜１Ｎ  ＮａＯＨで浄化する。浄化に続いて、カラムは２〜５ＢＶの０．０１〜０．０５Ｎ  ＮａＯＨ貯蔵溶液で洗浄する。
【０１０２】
ｃＨＡ工程は、非ＩｇＧタンパク質、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、プロテインＡ、プロテインＡ：ＩｇＧ複合体、およびウイルス粒子などの（しかし、これらに限定されることはない）いくつかの不純物を同時に除去する。
【０１０３】
３．５  ウイルスろ過
ｃＨＡ溶出液（工程３．４からの）は、（サイズが２０ｎｍに等しいまたはそれより大きい粒子を保持することができるとして名目上引用され、Ｐａｌｌ  ＤＶ２０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＶＩＲＥＳＯＬＶＥ（登録商標）ＮＦＰ等を含むが、これらに限定されることはない任意のタイプの）ウイルスフィルターに通してろ過するが、ウイルス除去フィルターは製造元が推奨する手順に従う。ウイルスろ過は、推定上および／または実際のウイルス混入物を除去することになる。
【０１０４】
３．６  限外ろ過および連続ダイアフィルトレーションによる処方
ろ液（工程３．５からの）は、接線流限外ろ過（ＴＦＵＦ）によって３〜１０容量の処方緩衝液でダイアフィルター処理する。次に、ダイアフィルター液は、必要に応じて、ヒト投与に実用的な既定濃度まで濃縮する。最終濃縮後、処方バルク製剤物質は、０．２ｕｍフィルター処理し、既定温度で貯蔵する。
【実施例４】
【０１０５】
順次プロテインＡから陽イオン交換、ＭＵＳＴＡＮＧ（登録商標）Ｑフィルター、セラミックヒドロキシアパタイト、ウイルスろ過および限外ろ過／ダイアフィルトレーションによる最終処方までを含む
別の実施形態では、本プロセスは、プロテインＡアフィニティー、ウイルス不活性化のための低ｐＨ調整、追加の予備的ｐＨ調整、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換ろ過（またはクロマトグラフィー）、ｃＨＡクロマトグラフィー、および限外ろ過／ダイアフィルトレーションによる最終処方の使用によるモノクローナル抗体精製を含む。このプロセスは図４に描かれている。
【０１０６】
製品品質、純度および／または安全性の追加の保証を与えるために不純物の追加の排除が必要な場合は、任意の陽イオン交換工程の追加を加える。
【０１０７】
個々のプロセス工程の詳細は下に記載している。工程ごとに、観察される成果を含めて簡単な説明を与えている。工程ごとの代表的プロセスパラメータを収載している。手順の詳細、緩衝液組成、プロセス設定点、カラム寸法等はすべて例証目的に含まれ、本技術の操作において包括的または限定的と見なされるべきではない。
【０１０８】
４．１  アフィニティークロマトグラフィー
モノクローナル抗体（ｍＡｂ、ＩｇＧ）は、あらかじめ１０〜５０ｍＭリン酸、ｐＨ６．０〜８．５で平衡化されている固定化組換えプロテインＡリガンドを含有するアフィニティークロマトグラフィー樹脂（プロテインＡ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）、組換えプロテインＡ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）、ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）、ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ  ＳＵＲＥ（商標）、ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ  ＸＴＲＡ（商標）、ＰＲＯＳＥＰ（登録商標）Ａ、ＰＲＯＳＥＰ（登録商標）ｖＡ、ＰＲＯＳＥＰ（登録商標）ｒＡ、ＰＯＲＯＳ（登録商標）５０Ａ、ＡＦ−ＰＲＯＴＥＩＮ  Ａ  ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）６５０Ｍが挙げられるが、これらに限定されるものではない）上に、ろ過された細胞培養液から捕捉される。１〜２Ｍ、一実施形態では２Ｍ塩化ナトリウムを含有する２〜８総容量（ＢＶ）の１０〜５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０での塩洗浄および２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０での３ＢＶ洗浄に続いて、生成物は１０〜５０ｍＭクエン酸緩衝液、または１０〜５０の範囲内の整数ｍＭ、一実施形態では２５ｍＭクエン酸緩衝液、ｐＨ２．５から４．５、一実施形態ではｐＨ３．５を使ったｐＨシフトで溶出する。生成物ピーク収集はＵＶ吸光度の上昇で開始し、吸光度ピークが基線近くに戻るまで続く。決定的ピーク切断基準は存在しない。その意図は全ピークを収集し、ＵＶ吸光度が基線近くに戻った後により多くの溶出液を収集することによる生成物の不必要な希釈を防ぐことである。安定させる目的で、未調整ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）溶出液の推奨保管期間は２〜１０℃で最長１４日である。溶出に続いて、溶出液は貯蔵し、直ちにｐＨ３．５に調整する。ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）カラムは、サイクルとサイクルの合間にｐＨ１．５塩酸溶液で取り除き、バッチの最後に５０ｍＭリン酸ナトリウム中６ＭグアニジンｐＨ７．０で浄化する。ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）カラムは、１％ベンジルアルコールを含有する０．１Ｍ酢酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウムｐＨ５．２中に貯蔵する。
【０１０９】
ＣＵＢ中の生成物の質量によっては、多数のサイクルが必要になる可能性がある。
【０１１０】
ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）クロマトグラフィーは、細胞および培養液由来不純物ならびにウイルス粒子の大部分を除去する。新規のアプローチでは、塩洗浄（上記のように、１〜２Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０および２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０を使って）が、追加のＤＮＡ排除を実現するために含まれる。このアフィニティー精製技術により、９０％を超える収率で、≧９０％純度のＩｇＧがもたらされる。
【０１１１】
４．２  ｐＨ調整およびろ過
貯蔵したプロテインＡ溶出液は酸でｐＨ２．５〜４．５に調整する。ウイルス不活性化のための１５〜６０分保持に続いて、溶出液は塩基でｐＨ３．５〜７．５に調整する。次に、ｐＨ調整溶出液は０．２ｕｍフィルター処理して沈殿物を除去する。
【０１１２】
低ｐＨ処理は、潜在的ウイルス混入物、特にレトロウイルスおよび他のエンベロープウイルスを不活性化することを目的とする。比較的高いｐＨでのろ過は、次のクロマトグラフィー工程のための溶液を調製し、ＤＮＡを減らす。
【０１１３】
４．３  陽イオン交換クロマトグラフィー
ろ過し、ｐＨ調整したプロテインＡ溶出液（工程４．２からの）は、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＭ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）、ＳＰ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）、ＣＭ  Ｈｙｐｅｒ  Ｄ、ＳＰＸＬを含むが、これらに限定されることはない、陽イオン官能性リガンドを有する樹脂を使って）によりさらに精製する。カラムは、陽イオン交換樹脂に結合する生成物に適合することがわかっているいずれの緩衝液でも平衡化する。当業者であれば、緩衝液組成は、２．５〜７．０のｐＨ範囲でリン酸、クエン酸、酢酸等を含むことができるが、これらに限定されるものではないことを認識するであろう。しかし、リン酸または他の非カルシウムキレート緩衝液の使用により、それに続くｃＨＡカラムをキレート緩衝液に曝露することなく繰り返し使用することが可能になる。添加後、カラムは、１０〜１００ｍＭリン酸、ｐＨ５．５〜８．０で洗浄する。生成物は、１０〜１００ｍＭリン酸ナトリウム、１０〜２００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５．５〜８．０で溶出する。陽イオンカラムは、０．１〜１Ｎ  ＮａＯＨで浄化し、０．０１〜０．０５Ｎ  ＮａＯＨ中に貯蔵する。
【０１１４】
陽イオン交換工程は、余分なタンパク質ならびに凝集物、ウイルス粒子、およびＤＮＡを含む非タンパク質不純物を除去する。この工程は、生成物をリン酸中に緩衝液交換する働きもし、ｃＨＡクロマトグラフィーにおいてクエン酸または他のキレート緩衝液の使用を回避する。
【０１１５】
４．４  陰イオン交換ろ過またはクロマトグラフィー
ろ過した溶出液（工程４．３からの）は、生成物を陽イオン交換カラムからの溶出のために使用される緩衝液に近い緩衝液であらかじめ平衡化されているフィルターに貫流させる貫流式で操作する（ＭＵＳＴＡＮＧ（登録商標）ＱまたはＩＮＴＥＲＣＥＰＴ（商標）Ｑを含むが、これらに限定されることはない陰イオン官能性を有する任意の膜を使った）陰イオン交換フィルターを通すろ過によりさらに精製される。軽微な変更では、（ＤＥＡＥ、Ｑ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）、ＱＸＬ等を含むが、これらに限定されることはない陰イオン官能性のリガンドを有する任意の樹脂を使った）陰イオン交換クロマトグラフィーカラムをフィルターの代わりに使い、類似の貫流式で操作することができる。陰イオン交換カラムは０．１〜１Ｎ  ＮａＯＨで浄化し、０．０１〜０．０５Ｎ  ＮａＯＨ中に貯蔵する。陰イオン交換工程（フィルターまたはカラム版）は生成物中のＤＮＡおよびウイルス粒子の量をさらに減少させる。
【０１１６】
４．５  ｃＨＡクロマトグラフィー
ろ過溶出液（工程４．４からの）は、（ＢｉｏＲａｄ  セラミックヒドロキシアパタイト  ＣＨＴ（商標）ＴｙｐｅＩ樹脂またはＣＨＴ（商標）ＴｙｐｅＩＩ樹脂を含むが、これらに限定されることはないヒドロキシアパタイト樹脂を使った）ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによりさらに精製する。
【０１１７】
カラムは、１００ｍＭ〜１Ｍリン酸からなる２〜５ＢＶのプレ平衡緩衝液、ｐＨ６．５〜８．５（プロセス全体を通して適切な使用のために検討すべき代替えの緩衝液には、トリス、酢酸、ＭＥＳ等が挙げられるが、これらに限定されるものではない）ですすぐことによりクロマトグラフィー用に調製する。次に、カラムは、１０〜５０ｍＭリン酸、０〜５０ｍＭ塩化ナトリウムからなる２〜１０ＢＶの平衡緩衝液、ｐＨ６．５〜８．５で平衡化する。ｃＨＡ添加試料をカラム上に添加する。添加が完了すると、カラムは１０〜５０ｍＭリン酸、０〜５０ｍＭ塩化ナトリウムからなる２〜５ＢＶの洗浄緩衝液、ｐＨ６．５〜８．５で洗浄する。結合生成物は、１０〜５０ｍＭリン酸ナトリウム、５０ｍＭ〜１．０Ｍ塩化ナトリウムからなる溶出緩衝液、ｐＨ６．５〜８．５で溶出する。ピークは、吸光度が上昇すると収集され、ピークが任意のプリセットした基準に相当する吸光度に戻るまで続く。溶出液収集に続いて、カラムは２〜５ＢＶの０．１〜１Ｎ  ＮａＯＨで浄化する。浄化に続いて、カラムは２〜５ＢＶの０．０１〜０．０５Ｎ  ＮａＯＨ保存溶液で洗浄する。
【０１１８】
ｃＨＡ工程は、非ＩｇＧタンパク質、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、プロテインＡ、およびプロテインＡ：ＩｇＧ複合体などの（しかし、これらに限定されることはない）いくつかの不純物を同時に除去する。
【０１１９】
４．６  ウイルスろ過
ｃＨＡ溶出液（工程４．５からの）は、（サイズが２０ｎｍに等しいまたはそれより大きい粒子を保持することができるとして名目上引用され、Ｐａｌｌ  ＤＶ２０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＶＩＲＥＳＯＬＶＥ（登録商標）ＮＦＰ等を含むが、これらに限定されることはない任意のタイプの）ウイルスフィルターに通してろ過するが、ウイルス除去フィルターは製造元が推奨する手順に従う。ウイルスろ過は、推定上および／または実際のウイルス混入物を除去することになる。
【０１２０】
４．７  限外ろ過および連続ダイアフィルトレーションによる処方
ろ液（工程４．６からの）は、接線流限外ろ過（ＴＦＵＦ）によって３〜１０容量の処方緩衝液でダイアフィルター処理する。次に、ダイアフィルター液は、必要に応じて、ヒト投与に適した既定濃度まで濃縮する。最終濃縮後、処方バルク製剤物質は、０．２ｕｍフィルター処理し、既定温度で貯蔵する。
【実施例５】
【０１２１】
陽イオン交換でのモノクローナル抗体（ＩｇＧ１）の精製を含む
別の実施形態では、本プロセスは、プロテインＡアフィニティー、ｐＨ調整、陽イオン交換クロマトグラフィー、およびｃＨＡクロマトグラフィーによるＩｇＧ１モノクローナル抗体の精製を含み、高収率であり、生成凝集物、ＤＮＡ、宿主細胞タンパク質および残留プロテインＡの著しい除去を実証している。
【０１２２】
５．１  ＭａｂＳｅｌｅｃｔアフィニティークロマトグラフィー
モノクローナル抗体（今後は「ＩｇＧ１」と呼ぶ）は、０．３ｕｍデプスフィルター処理したＣＵＢから、０．５ｃｍ×２０ｃｍカラムのＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）アフィニティークロマトグラフィー樹脂上に捕捉した。ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）カラムは、先ず５ＢＶの２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０で平衡化した。次に、ＣＵＢをカラム上に添加した。２Ｍ塩化ナトリウムを含有する３ＢＶの２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０での洗浄、および２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０での３ＢＶ洗浄に続いて、生成物は、２５ｍＭクエン酸緩衝液、ｐＨ３．５を使ったｐＨシフトで溶出した。生成物ピーク収集は、ＵＶ吸光度の上昇で開始し、吸光度ピークが基線近くに戻るまで続いた。溶出に続いて、溶出液は直ちにｐＨ３．５に調整した。ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）カラムは、ｐＨ１．５塩酸溶液で取り除き、５０ｍＭリン酸ナトリウム中６ＭグアニジンｐＨ７．０で浄化した。ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）カラムは、１％ベンジルアルコールを含有する０．１Ｍ酢酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウムｐＨ５．２中に２〜８℃で貯蔵した。
【０１２３】
５．２  ｐＨ３．５調整およびｐＨ５．０ろ過
貯蔵したＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）溶出液（工程５．１からの）は、２．５Ｍ  ＨＣｌでｐＨ３．５に調整した。３０分保持（ウイルス不活性化）に続いて、溶出液は３Ｍトリス塩基でｐＨ５．０に調整した。ｐＨ５．０溶出液はデプスフィルター処理して任意の沈殿物を除去し、０．２ｕｍフィルターで処理し、追加の処理まで２〜８℃で保持した。貯蔵温度は室温で生じるものでもよい。
【０１２４】
５．３  ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗクロマトグラフィー
ろ過したｐＨ５．０のＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）溶出液（工程５．２からの）は、ＳＰ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ＦＦ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を使った陽イオン交換クロマトグラフィーによりさらに精製した。０．５ｃｍ×２０ｃｍカラムのＳＰ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＳＰＳＦＦ）陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂を使用した。ＳＰＳＦＦカラムは先ず、５ＢＶの３０ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ５．０で平衡化した。次に、ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）溶出液をカラム上に添加した。添加および３０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０での洗浄に続いて、生成物は、３０ｍＭリン酸ナトリウム、１２０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０で溶出した。生成物ピーク収集は、ＵＶ吸光度が増加すると開始し、ピーク吸光度がほぼ３％最大ピーク高に戻るまで続いた。ＳＰ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ＦＦ溶出液は０．２ｕｍフィルター処理した。ＳＰ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ＦＦカラムは０．５Ｎ  ＮａＯＨで浄化し、０．０１Ｎ  ＮａＯＨ中に貯蔵した。
【０１２５】
５．４  ｃＨＡクロマトグラフィー
ろ過したＱＳＦＦ溶出液（工程５．３からの）は、ｃＨＡ  ＴｙｐｅＩ樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を使うセラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによりさらに精製した。カラムは、≧５ＢＶの４００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８プレ平衡化緩衝液ですすぐことによりクロマトグラフィー用に調製した。次に、カラムは５ＢＶの１０ｍＭリン酸ナトリウム、５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．８平衡化緩衝液で平衡化した。ｃＨＡ添加試料をカラム上に添加した。添加が完了すると、カラムは５ＢＶの１０ｍＭリン酸ナトリウム、５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．８洗浄緩衝液で洗浄した。添加および洗浄に続いて、生成物は、１０ｍＭリン酸ナトリウム、１．０Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．８で溶出した。生成物ピーク収集は、ＵＶ吸光度が増加すると開始し、ピークが３．０ｍｇ／ｍＬに相当する吸光度に戻るまで続いた。ｃＨＡ溶出液は０．２ｕｍフィルター処理した。溶出液収集に続いて、カラムは５ＢＶの０．５Ｎ  ＮａＯＨで浄化した。浄化に続いて、カラムは３ＢＶの０．０１Ｎ  ＮａＯＨ貯蔵液で洗浄し、カラムは１８〜２５℃で貯蔵した。
【０１２６】
５．５  分析試験
４．１〜４．４に記載する精製全体を通じて採取する試料は、Ａ２８０による濃度、％生成物凝集、残留プロテインＡ含有量、宿主細胞タンパク質、および宿主細胞ＤＮＡを試験した。さらに、上記の手順は、ＩＣＨ指針に従って、各添加試料をモデルウイルスでスパイクして、新たなカラムで繰り返し、各工程を通して排除を試験した。この試験の結果は表２にまとめている。
【０１２７】
【表２】
2010510963.tif 000003
【実施例６】
【０１２８】
陽イオンおよび陰イオン交換でのモノクローナル抗体（ＩｇＧ１）の精製を含む
別の実施形態では、本プロセスは、プロテインＡアフィニティー、ｐＨ調整、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、およびｃＨＡクロマトグラフィーによるＩｇＧ１モノクローナル抗体の精製を含み、高収率であり、生成物宿主細胞タンパク質および残留プロテインＡの著しい除去を実証している。
【０１２９】
６．１  ＭａｂＳｅｌｅｃｔアフィニティークロマトグラフィー
モノクローナル抗体（今後は「ＩｇＧ１」と呼ぶ）は、０．３ｕｍデプスフィルター処理したＣＵＢから、３０．０ｃｍ×２０ｃｍカラムのＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）アフィニティークロマトグラフィー樹脂上に捕捉した。ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）カラムは、先ず５ＢＶの２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０で平衡化した。次に、ＣＵＢをカラム上に添加した。２Ｍ塩化ナトリウムを含有する３ＢＶの２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０での洗浄、および２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０での３ＢＶ洗浄に続いて、生成物は、２５ｍＭクエン酸緩衝液、ｐＨ３．５を使ったｐＨシフトで溶出した。生成物ピーク収集は、ＵＶ吸光度の上昇で開始し、吸光度ピークが基線近くに戻るまで続いた。溶出に続いて、溶出液は直ちにｐＨ３．５に調整した。ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）カラムは、ｐＨ１．５塩酸溶液で取り除き、５０ｍＭリン酸ナトリウム中６ＭグアニジンｐＨ７．０で浄化した。ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）カラムは、１％ベンジルアルコールを含有する０．１Ｍ酢酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウムｐＨ５．２中に２〜８℃で貯蔵した。
【０１３０】
６．２  ｐＨ３．５調整およびｐＨ５．０ろ過
貯蔵したＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）溶出液（工程６．１からの）は、２．５Ｍ  ＨＣｌでｐＨ３．５に調整した。３０分保持（ウイルス不活性化）に続いて、溶出液は３Ｍトリス塩基でｐＨ５．０に調整した。ｐＨ５．０溶出液はデプスフィルター処理して任意の沈殿物を除去し、０．２ｕｍフィルターで処理し、追加の処理まで２〜８℃で保持した。貯蔵は室温で行ってもよい。
【０１３１】
６．３  ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗクロマトグラフィー
ろ過したｐＨ５．０のＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）溶出液（工程６．２からの）試料は、ＳＰ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ＦＦ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を使った陽イオン交換クロマトグラフィーによりさらに精製した。４．４ｃｍ×２０ｃｍカラムのＳＰ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＳＰＳＦＦ）陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂を使用した。ＳＰＳＦＦカラムは先ず、５ＢＶの３０ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ５．０で平衡化した。次に、ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）溶出液をカラム上に添加した。添加および３０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０での洗浄に続いて、生成物は、３０ｍＭリン酸ナトリウム、１２０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０で溶出した。生成物ピーク収集は、ＵＶ吸光度が増加すると開始し、ピーク吸光度がほぼ３％最大ピーク高に戻るまで続いた。ＳＰ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ＦＦ溶出液は０．２ｕｍフィルター処理した。ＳＰ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ＦＦカラムは０．５Ｎ  ＮａＯＨで浄化し、０．０１Ｎ  ＮａＯＨ中に貯蔵した。
【０１３２】
６．４  Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗクロマトグラフィー
ろ過したＳＰ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ＦＦ溶出液（工程６．３からの）は、４．４×１０ｃｍＱ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＱＳＦＦ）上でのクロマトグラフィーによりさらに精製した。クロマトグラフィーは、ＳＰＳＦＦ溶出液をＱＳＦＦカラムに貫流させる貫流式で操作した。カラムは先ず、３ＣＶの水でおよび３ＣＶの４０ｍＭトリス、２Ｍ  ＮａＣｌからなる塩洗浄水、ｐＨ８．０で洗浄することにより調製した。次に、ＳＰＳＦＦ溶出液をカラムに添加し、生成物ピーク収集は、ＵＶ吸光度が増加すると開始し、ピーク吸光度がほぼ３％最大ピーク高に戻るまで続いた。ＱＳＦＦ溶出液は０．２ｕｍフィルター処理した。ＱＳＦＦカラムは０．５Ｍ  ＮａＯＨで浄化し、０．０１Ｍ  ＮａＯＨ中に貯蔵した。
【０１３３】
６．５  ｃＨＡクロマトグラフィー
ろ過したＱＳＦＦ溶出液（工程６．４からの）は、ｃＨＡ  ＴｙｐｅＩ樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を使うセラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによりさらに精製した。０．５ｃｍ×２０ｃｍカラムは、≧５ＢＶの４００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８プレ平衡化緩衝液ですすぐことによりクロマトグラフィー用に調製した。次に、カラムは５ＢＶの３０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０平衡化緩衝液で平衡化した。ｃＨＡ添加試料をカラム上に添加した。添加が完了すると、カラムは５ＢＶの３０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０洗浄緩衝液で洗浄した。添加および洗浄に続いて、生成物は、３０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５で溶出した。生成物ピーク収集は、ＵＶ吸光度が増加すると開始し、ピークがほぼ１０％最大ピーク高に戻るまで続いた。ｃＨＡ溶出液は０．２ｕｍフィルター処理した。溶出液収集に続いて、カラムは５ＢＶの０．５Ｎ  ＮａＯＨで浄化した。浄化に続いて、カラムは３ＢＶの０．０１Ｎ  ＮａＯＨ貯蔵液で洗浄し、カラムは１８〜２５℃で貯蔵した。
【０１３４】
６．６  分析試験
６．１〜６．５に記載する精製全体を通じて採取する試料は、Ａ２８０による濃度を試験した。ｃＨＡ添加および溶出液の試料は、残留プロテインＡ含有量、および宿主細胞タンパク質を試験した。この試験の結果は表３にまとめている。
【０１３５】
【表３】
2010510963.tif 000004
【実施例７】
【０１３６】
ウイルス排除を示すモノクローナル抗体（ＩｇＧ１）の精製
別の実施形態では、本プロセスは、プロテインＡアフィニティー、ｐＨ調整、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、ｃＨＡクロマトグラフィー、およびＤＶ２０ろ過によるＩｇＧ１の精製を含み、２つのモデルウイルス、すなわち異種指向性マウス白血病ウイルス（ｘＭｕＬＶ）およびブタパルボウイルス（ＰＰＶ）の著しい除去を実証している。
【０１３７】
７．１  ＭａｂＳｅｌｅｃｔアフィニティークロマトグラフィー
モノクローナル抗体（今後は「ＩｇＧ１」と呼ぶ）は、０．３ｕｍデプスフィルター処理ウイルススパイクＣＵＢから、０．５ｃｍ×２０ｃｍカラムのＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）アフィニティークロマトグラフィー樹脂上に捕捉した。ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）カラムは先ず、５ＢＶの２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０で平衡化した。次に、ＣＵＢをカラム上に添加した。２Ｍ塩化ナトリウムを含有する３ＢＶの２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０での洗浄および２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０での３ＢＶ洗浄に続いて、生成物は、２５ｍＭクエン酸緩衝液、ｐＨ３．５を使ったｐＨシフトで溶出した。生成物ピーク収集は、ＵＶ吸光度の上昇で開始し、吸光度ピークが基線近くに戻るまで続いた。溶出に続いて、溶出液は直ちにｐＨ３．５に調整した。ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）カラムは、ｐＨ１．５塩酸溶液で取り除き、５０ｍＭリン酸ナトリウム中６Ｍグアニジン、ｐＨ７．０で浄化した。ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）カラムは、１％ベンジルアルコール含有０．１Ｍ酢酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウムｐＨ５．２中に２〜８℃で貯蔵した。
【０１３８】
７．２  ｐＨ３．５調整およびｐＨ５．０ろ過
ウイルススパイクＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）溶出液は、２．５Ｍ  ＨＣｌでｐＨ３．５に調整した。３０分保持（ウイルス不活性化）に続いて、溶出液は３Ｍトリス塩基でｐＨ５．０に調整した。ｐＨ５．０溶出液はデプスフィルター処理して任意の沈殿物を除去し、０．２ｕｍフィルター処理し、追加の処理まで２〜８℃で保持した。
【０１３９】
７．３  ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗクロマトグラフィー
ｐＨ５．０のウイルススパイクフィルター処理ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）溶出液は、ＳＰ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ＦＦ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を使った陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製した。０．５ｃｍ×２０ｃｍカラムのＳＰ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＳＰＳＦＦ）陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂を使用した。ＳＰＳＦＦカラムは先ず、５ＢＶの３０ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ５．０で平衡化した。次に、ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）溶出液をカラム上に添加した。添加および３０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０での洗浄に続いて、生成物は、３０ｍＭリン酸ナトリウム、１２０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０で溶出した。生成物ピーク収集は、ＵＶ吸光度が増加すると開始し、ピーク吸光度がほぼ３％最大ピーク高に戻るまで続いた。ＳＰＳＦＦ溶出液は０．２ｕｍフィルター処理した。ＳＰ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ＦＦカラムは０．５Ｎ  ＮａＯＨで浄化し、０．０１Ｎ  ＮａＯＨ中に貯蔵した。
【０１４０】
７．４  Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗクロマトグラフィー
ウイルススパイクフィルター処理ＳＰ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ＦＦ溶出液は、０．５×１０ｃｍＱ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＱＳＦＦ）でのクロマトグラフィーにより精製した。クロマトグラフィーは、ＳＰＳＦＦ溶出液をＱＳＦＦカラムに貫流させる貫流式で操作した。カラムは先ず、３ＣＶの水および３ＣＶの４０ｍＭトリス、２Ｍ  ＮａＣｌからなる塩洗浄水、ｐＨ８．０で洗浄することにより調製した。次に、ＳＰＳＦＦ溶出液をカラム上に添加し、生成物ピーク収集は、ＵＶ吸光度が増加すると開始し、ピーク吸光度がほぼ３％最大ピーク高に戻るまで続いた。ＱＳＦＦ溶出液は０．２ｕｍフィルター処理した。ＱＳＦＦカラムは０．５Ｍ  ＮａＯＨで浄化し、０．０１Ｍ  ＮａＯＨ中に貯蔵した。
【０１４１】
７．５  ｃＨＡクロマトグラフィー
ウイルススパイクフィルター処理ＱＳＦＦ溶出液は、ｃＨＡ  ＴｙｐｅＩ樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を使うセラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにより精製した。０．５ｃｍ×２０ｃｍカラムは、≧５ＢＶの４００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８プレ平衡化緩衝液ですすぐことによりクロマトグラフィー用に調製した。次に、カラムは５ＢＶの１０ｍＭリン酸ナトリウム、５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．８平衡化緩衝液で平衡化した。ｃＨＡ添加試料をカラム上に添加した。添加が完了すると、カラムは５ＢＶの１０ｍＭリン酸ナトリウム、５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．８洗浄緩衝液で洗浄した。添加および洗浄に続いて、生成物は、１０ｍＭリン酸ナトリウム、１．０Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．８で溶出した。生成物ピーク収集は、ＵＶ吸光度が増加すると開始し、ピークが３．０ｍｇ／ｍＬに相当する吸光度に戻るまで続いた。ｃＨＡ溶出液は０．２ｕｍフィルター処理した。溶出液収集に続いて、カラムは５ＢＶの０．５Ｎ  ＮａＯＨで浄化した。浄化に続いて、カラムは３ＢＶの０．０１Ｎ  ＮａＯＨ貯蔵液で洗浄し、カラムは１８〜２５℃で貯蔵した。
【０１４２】
７．６  ウイルスろ過（ＤＶ２０）
ウイルススパイクｃＨＡ溶出液は、製造元が推奨する手順に従って、Ｐａｌｌ  ＤＶ２０ウイルス除去フィルターに通してろ過した。ＤＶ２０ろ液は０．２ｕｍフィルター処理し、２〜８℃で保持した。
【０１４３】
ＤＶ２０ろ過により、推定上のおよび／または実際のウイルス混入物が除去される。わずか２０ｎｍのウイルスのサイズ排除除去を製造元は主張している。
【０１４４】
７．７  分析試験
精製全体を通じて採取する試料は、ＩＣＨ指針に従って、各工程による排除を試験した。この試験から得られる対数減少値（ＬＲＶ）は表３にまとめている。
【０１４５】
【表４】
2010510963.tif 000005
【０１４６】
本明細書に引用する文書および優先権を主張する特許出願はすべて、参照によりその全体が本明細書に組み込まれているものとする。本発明は、本明細書に記載する特定の実施形態により範囲を限定されるべきではない。実際、本明細書に記載する改変に加えて本発明の種々の改変は、前述の説明から当業者には明らかとなるであろう。そのような改変は、添付の特許請求の範囲内に入るように意図されている。本明細書に引用する特許、特許出願、および特許公報の開示は参照によりその全体を組み込まれているものとする。
【図１】
2010510963.tif 000006
【図２】
2010510963.tif 000007
【図３】
2010510963.tif 000008
【図４】
2010510963.tif 000009
【国際調査報告】
2010510963.tif 000010
2010510963.tif 000011
2010510963.tif 000012