(57)【要約】  電気穿孔法用キュベットは、シリンダー軸にフィラメント電極を、および内部シリンダー壁に一またはそれ以上の周辺電極を有するシリンダーとして構築される。追加のキュベットの構造は、キュベット壁の周囲の、様々な場所に分布された多数の周辺電極を有し、そして中心の電極を有さないものである。電極の様々な変形は、不均一であって方向を変える磁場ベクトルを導き、そしてそれは、高い磁場強度および電気穿孔法中におけるキュベット内の細胞懸濁液の攪拌を実現する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
長手方向軸、ほぼ前記長手方向軸に対称に配置されたシリンダー壁、および基部を含む、液体保持容器；
前記シリンダー壁に取り付けられた周辺電極；ならびに
前記容器に取り付けられ、そして前記長手方向軸に沿って伸びているフィラメント電極を含む電気穿孔法用キュベットであって、
前記容器が液体で満たされ、そして前記周辺およびフィラメント電極が、反対の極性で帯電している時に、前記周辺とフィラメント電極との間に、および前記液体を通じて、電気ポテンシャルが構築されるように前記周辺およびフィラメント電極が配置されている、前記キュベット。
【請求項２】
前記フィラメント電極が、前記基部に取り付けられ、そして前記容器中で固定されていない先端部で終結している、請求項１記載の電気穿孔法用キュベット。
【請求項３】
前記シリンダー壁が円形シリンダーであり、そして前記周辺電極が前記円形シリンダーの全周囲に広がっている、請求項１記載の電気穿孔法用キュベット。
【請求項４】
前記シリンダー壁が多角形横断面を有し、その全ての側面が同じ面積であり、そして前記長手方向軸から等距離である、請求項１記載の電気穿孔法用キュベット。
【請求項５】
前記多角形横断面が５〜１２本の辺を有する多角形である、請求項４記載の電気穿孔法用キュベット。
【請求項６】
前記多角形横断面が６〜８本の辺を有する多角形である、請求項５記載の電気穿孔法用キュベット。
【請求項７】
前記シリンダー壁が六角形横断面を有する、請求項５記載の電気穿孔法用キュベット。
【請求項８】
前記多角形横断面が、少なくとも６本である、偶数の辺を有する多角形であり、複数個の周辺電極を含み、その一の周辺電極が前記多角形の交互の辺の各々の上にある、請求項４記載の電気穿孔法用キュベット。
【請求項９】
複数の周辺電極を含み、その一の周辺電極が前記多角形の各々の辺上にあり、前記周辺電極へ独立に電圧をかける手段をさらに含む、請求項４記載の電気穿孔法用キュベット。
【請求項１０】
第一および第二の組に分けられた複数の周辺電極を含み、各々の組のうちの一つである一対の周辺電極が、前記多角形の各々の辺上に軸方向に配置され、前記第二組の周辺電極とは独立に、前記第一組の周辺電極に電圧をかけることができる軸方向電位手段をさらに含む、請求項４記載の電気穿孔法用キュベット。
【請求項１１】
前記フィラメント電極の振動運動を引き起こす、電極振動手段をさらに含む、請求項１記載の電気穿孔法用キュベット。
【請求項１２】
前記電極振動手段が超音波変換器である、請求項１１記載の電気穿孔法用キュベット。
【請求項１３】
前記フィラメント電極が前記基部に取り付けられており、前記容器中で固定されていない先端部で終結しており、そして前記電極振動手段が前記基部でフィラメント電極とつながれている超音波水晶である、請求項１１記載の電気穿孔法用キュベット。
【請求項１４】
シリンダー壁および基部を含む液体保持容器であり、前記シリンダー壁は少なくとも６本の辺の多角形横断面を有する；
隣接する電極が各々独立に電気的に帯電され得る方法で、前記シリンダー壁の前記面に取り付けられた電極；および、
前記シリンダー壁の相対する面にある電極に、反対の極性の電圧をかける手段
を含む、電気穿孔法用キュベット。
【請求項１５】
前記電極が、前記シリンダー壁の前記側面に、一つの面につき一つの電極を有するように取り付けられ、そして第一組の電極が第二組の電極と交互になるように配置されている、前記第一および前記第二組の電極、ならびに、前記第一組の前記電極が前記第二組の前記電極と反対の極性を有するように、前記第一および第二組の前記電極に電圧をかける通電手段からなる、請求項１４記載の電気穿孔法用キュベット。
【請求項１６】
前記通電手段が、前記第一組の電極に連続的に電圧をかける手段、および前記第二の電極を、前記第一組の電極と反対の極性で連続的に電圧をかける手段を含む、請求項１５記載の電気穿孔法用キュベット。
【請求項１７】
膜性構造体を、前記構造体の外部に存在する種を用いて形質移入する方法であって、以下のステップ：
（ａ）キュベットを、前記種の液体溶液中に前記膜性構造体を懸濁させたもので満たし、ここで前記キュベットは、
長手方向軸、ほぼ前記長手方向軸に関して対称に配置されているシリンダー壁、および基部を含む液体保持容器、
前記シリンダー壁に取り付けられた周辺電極、および、
前記容器に取り付けられ、そして前記長手方向軸に沿って伸びているフィラメント電極
を含み；ならびに、
（ｂ）前記キュベット中の前記懸濁液を、前記形質移入を引き起こすのに十分な電場に曝露するために、前記周辺およびフィラメント電極を、反対の極性に電気的に帯電させること、
を含む、前記方法。
【請求項１８】
前記シリンダー壁が一のシリンダーであり、そして前記周辺電極が前記シリンダーの全周囲に広がっている、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記シリンダー壁が多角形横断面を有し、その全ての面が同じ面積かつ前記長手方向軸から等距離にある、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
前記多角形横断面が、少なくとも６本である偶数の辺を有し、前記電気穿孔法用キュベットが多数の周辺電極を含み、その一つの周辺電極が前記多角形の一つおきの辺の各々にある、請求項１７記載の方法。
【請求項２１】
膜性構造体を、前記構造体の外部にある種を用いて形質移入する方法であって、以下のステップ：
（ａ）キュベットを、前記種の液体溶液中に前記膜性構造体を懸濁させたもので満たし、ここで前記キュベットは、
シリンダー壁および基部を含む液体保持容器であり、前記シリンダー壁は少なくとも６本の辺の多角形横断面を有する、
隣接する電極が互いに独立に電気的に帯電するような方法で、前記シリンダー壁の前記面に取り付けられた電極を含み；ならびに
（ｂ）前記キュベット中の前記懸濁液を、前記形質移入を引き起こすために十分な電場に曝露するために、前記シリンダー壁の相対する側にある電極を電気的に帯電させること
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
１．発明の技術分野
本発明は、電気穿孔法、すなわち、外因性分子種を生物細胞、リポソーム、または小胞のような膜性構造体へ、該分子種の液体溶液中に該構造体を懸濁させ、そして該懸濁液に電場を適用することにより挿入する方法、の分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
２．従来技術の説明
電気穿孔法は、広範囲の研究の実行において、ならびに生物学研究者および生化学研究者によって行われる手法において有益な技術である。これらは、臨床の手法、および外因性分子を用いた細胞、リポソーム、または小胞へのトランスフェクションに関する他の全ての手法のみならず、ｓｉＲＮＡの実験およびｃＤＮＡライブラリーを用いた研究も含む。しかし、前記方法は、効率の変動を起こしやすく、そしてこの変動の起こしやすさのため、膜性構造体への損傷を回避する、または最小化する必要性とも相まって、前記方法の効率は通常とても低い。前記効率に影響を与えるひとつの要因は、懸濁液中の構造体の分布、および凝集して塊を形成する特定の構造体の傾向である。別の要因は、電場の均一性または均一性の欠如であり、そして第三の要因は、電場から他の構造体を遮蔽し、それにより前記場および外因種への、前記遮蔽された構造体の曝露を制限する、個々の構造体の傾向である。
【０００３】
電気穿孔法が個々のキュベット中で行われる時、通常のキュベットは、正方形または矩形の横断面のいずれかであり、そして電極は、該キュベットの反対側にある平板である。首尾よく形質移入された膜性構造体の数対消費された電気エネルギー量の観点からの、前記手法の効率は、空間への考慮、とりわけ電極間の容積および膜性構造体の移動制限、およびキュベット全体にわたる電場の均一性の欠如によって制限される。本発明は、この制限に対処しようとする。
【発明の概要】
【０００４】
発明の概要
本発明は、電気エネルギーを消費する、高比率の懸濁液容積、単一パルスまたは連続パルスをかけている間に電場ベクトルの方向を変え、そしてそれにより、異なる角度から個々の膜構造体に接近する能力、ならびに構造体の攪拌、回転、再配向、および再分布を引き起こす指向性の力を、懸濁された膜性構造体に課す能力を種々に提供する、特定のキュベット構造物に属する。一組の実施形態において、本発明は、基部、およびほぼ長手方向軸に対称であるシリンダー壁を有する、液体保持容器形状のキュベットに属し、ここで前記電極は、一またはそれ以上の前記シリンダー壁に沿った周辺電極、および長手方向軸に沿って中心にあるフィラメント電極からなる。この組み合わせのいくつかの実施形態において、単一の周辺電極は、容器の壁の全周囲に伸びており、そしてそれが環状空間、周辺電極、およびフィラメント電極中に電場を構築している。この構造物は、相対する電極間（周辺電極およびフィラメント電極間）に比較的短い距離を提供し、そしてその結果、等しい断面積を有し、および電極上に同一の電荷を有するが、反対側の壁に平板電極を有するキュベットの電場密度以上に、潜在的により高い電場密度を提供する。この第一の組み合わせ中の他の実施形態において、前記単一の周辺電極は、容器の壁の周囲に沿って分布された、一連の平板電極または帯状電極に置き換えられ、それらの各々の電極が、独立した通電のための電源と個々に結合されている。この配置において、次々と、キュベット軸周辺の電場の位置を移動させながら、そして電場ベクトルを回転させながら、電場は、フィラメント電極と、全ての個々の電極または電極のサブグループとの間に構築され得る。別の組み合わせの実施形態において、周辺電極は、キュベットの軸に沿って、間隙を介して、上部および下部の電極に分けられ、電極が膜性構造体に軸方向成分の力を適用できるようにするため、個々に電源に接続されている。この組み合わせにおける周辺電極は、単一の上部電極および単一の下部電極、または一連の上部電極および下部電極のいずれかである。前記一連の実施形態によって、複数の方向における電場ベクトルを作り出すために、通電のための、いくつかの異なる電極の対の中から一つが選択され得る。もう一組のさらなる実施形態は、フィラメント電極が機械的振動源と接続されており、それにより機械的攪拌を、懸濁された膜性構造体に課された力に加えるものである。
【０００５】
もう一つのさらなる実施形態は、フィラメント電極が完全に取り除かれ、そして一連の周辺電極がキュベットの壁の周囲に分布されており、前記周辺電極が、独立した通電のために個々の電源に接続されているものであって、多数の電圧を加えられた電極対を許容し、それぞれがそれ自身の個別の電場ベクトルを生ずるものである。
【０００６】
構造的特徴およびこれらの操作、並びに本発明の他の実施形態は、以下の記載によって、よりよく理解されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、軸方向のフィラメント電極を有する、円形シリンダー形状の、本発明の電気穿孔法用キュベットの斜視図である。
【図２】図２は、再び、軸方向のフィラメント電極を有する、六角形横断面を有するシリンダー形状の、本発明の第二の電気穿孔法用キュベットの斜視図である。
【図３】図３は、本発明の第三の電気穿孔法用キュベットの斜視図であって、図２のキュベットを変形したものを示している。
【図４】図４は、本発明の第４の電気穿孔法用キュベットの斜視図であって、軸方向のフィラメント電極が無いものである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
発明の詳細な説明および好ましい実施形態
キュベットとしての役割を有する容器の壁に関連する、本明細書で使用される用語「シリンダー状の」または「シリンダー」とは、直線が前記容器の長手方向軸に平行に移動することによって描かれ、そして固定された平面の閉じた縁部と直行している表面を意味する。前記の閉じた縁部は、直線の辺を有する多角形、円もしくは楕円の曲線形状、または直線部および曲線部の組み合わせである形状であり得る。前記シリンダーは、ほぼ長手方向軸に関して対称、または非対称であるが、ほぼ前記軸またはほぼ前記軸を含む平面のいずれかに関して対称であるシリンダーが好ましい。曲線上の輪郭を有するシリンダーにとって、円形シリンダー（すなわち、円形の横断面を有するシリンダー）が好ましい。多角形の横断面図を有するシリンダーにとって好ましい多角形は、側面が全て等しい面積であり、そして長手方向軸から全て等距離であるものである。５〜１２本の辺を有する多角形が、特定の実施形態には好ましく、一方、６本またはそれ以上の辺を有する多角形、そして特に６本から８本の辺を有する多角形が、特定の他の実施形態では好ましい。六角形横断面キュベットは、多角形の形状のものの中では最も好ましい。
【０００９】
用語「フィラメント電極」は、下端のみで固定された時に直立するための十分な剛性を有する、小径の棒または金属線を意味する。好ましい実施形態において、特に前記フィラメントが機械的振動源と接続されているものにおいて、前記フィラメント電極はまた、弾性があり、すなわち湾曲による起振力に対する反応性が高いが、静止時には完全に伸ばされた形態に戻っている。前記フィラメント電極は、静止時にシリンダーの軸と少なくともおよそ一直線になっており、そして容器に一端または両端のいずれかで固定され得る。好ましくは、前記フィラメントは、前記容器の基部にのみ固定されており、容器内部へ伸びて、固定されていない先端で終結している。
【００１０】
様々な実施形態の各々の中において、本発明を定義する特徴は種々の構造物で実施できるが、全体的に前記発明は、特定の実施形態の詳細な試験によって最もよく理解されるだろう。ここに示す図は、そのような実施形態を図示し、そして以下で議論される。
【００１１】
図１は、円形シリンダー状のキュベット１１を図示する。前記図に描かれているように、前記キュベット１１は、円形断面を有するシリンダー壁１２、および基部１３を有する、上部が開いている容器である。シリンダー壁１２全体の内部表面は、周辺電極としての役割を果たす導電体でめっきされている。シリンダーの中心軸（すなわち、キュベットの長手方向軸）に沿って、フィラメント電極１４がある。電極同士が異なる極性で帯電されているときに生ずる電場は、フィラメント電極１４の周辺の、キュベットの容積全体を満たし、そして半径方向に方向づけられる。フィラメント電極および周辺電極の間の距離は、キュベットの横寸法の丁度半分（すなわち、半径）であるので、電場強度は、同じ横寸法の矩形キュベットで達成されるだろう強度の二倍であり、そして同じ内部容積の矩形のキュベットのほぼ二倍である。より小さな電極間距離はまた、一の細胞が他の細胞によって遮蔽され得る程度を減らす。
【００１２】
加えて、電場ベクトルの半径形状は、キュベット中の懸濁された個々の細胞を通る、扇状の力線を作り出す。この場の不均一性は、電場勾配、および幾つかの場合において、細胞の移動を引き起こすために十分な電気モーメントを作り出す。この移動は、細胞の凝集を減らし、得られた細胞の膜の異なる部分を電場に曝露するために、継続的に細胞の方向を変化させ、そして速やかに細胞を囲む電場環境の変化を作り出すことができる。
【００１３】
本発明におけるキュベットの基部１３は、フィラメント電極１４に超音波振動を与える超音波水晶である。電極の上端１５が固定されていないか、または浮いているため、前記フィラメント電極は、前記振動に自由に反応する。前記超音波水晶１３は、超音波噴霧器、または心室機能の観察もしくは様々な臨床および生理学的な研究のための医療用インプラントに使用される種類のものであってもよい。超音波水晶は、医療機器の技術分野で知られている分野であり、そして圧電変換器および磁気変換器を含む様々な種類の変換器のいずれかによって駆動され得る。振動を引き起こし、それをフィラメント電極へ伝える他の手段は：磁性物質からフィラメントを製造し、そしてフィラメントの曝露された末端部またはキュベットの外側を覆うコイルに、変動電流を適用すること；機械的結合により、フィラメントへ機械的作動装置を取り付けること、ここで前記作動装置は、空気もしくは流体で駆動されるモーターまたはピストンである；フィラメントの底部に小型モーターを埋め込むこと、ここで前記モーターは、キュベット上を衝突する検出ＲＦ磁場に由来するエネルギーによって駆動される、である。
【００１４】
図１に示されるキュベットにおいて、超音波水晶１３の底面表面は、フィラメント電極１４のリードとしての役割を有する導電体１６で覆われているか、またはめっきされており、そして前記電極１４は、水晶を通って前記導電体に伸びている。周辺電極１２は、別々のリードと接続されている。
【００１５】
図２のキュベットは、シリンダー横断面が多角形である、シリンダー状の壁２１を有することによって、図１のものとは異なり、この場合においては六角形である。フィラメント電極２２は、キュベットの長手方向軸に沿って上方に伸びており、キュベット内部にある浮動末端２３で終結している。キュベットの基部に、下面がフィラメント電極と接続されている導電体２５でめっきされている、超音波水晶２４がある。六角形シリンダー２１の内部表面全体は、キュベット内部全体を覆っている、単一の周辺電極を形成する導電体によってめっきされ得る。あるいは、六角形シリンダーの一側面ごとに、周辺電極を有する全部で３つの面が、電極を持たない３つの面と交互になるように、めっきはなされ得る。さらにあるいは、シリンダーの６つの面の各々が、一つというよりむしろ全体で６つの周辺電極を有するようにめっきされ、そしてめっきされた部分が、隣り合うそれぞれの面同士を接合する線２６に沿った間隙によって分離されている。いずれの場合であっても、それぞれの周辺電極は、分離した電気リードと接続されることができ、それにより電極が独立に操作され得る。異なる方向の電場ベクトルが次々と適用されると、曝露の方向を変えることに加えて、懸濁された細胞の運動性が付加され得る。
【００１６】
図３のキュベットは、電場ベクトルおよび細胞の移動する方向にさらなる次元を加える。キュベット３１は、図２と同様、六角形の横断面を有する周壁３２、ならびにその基部に六角形の超音波水晶３３および長手方向軸に沿ったフィラメント電極３４を含む、図２の他の特徴を有する。周辺電極は、キュベットの６つの面の全てに存在するが、また、上部電極３５および下部電極３６に分けられ、全部で１２個の周辺電極を有する。下部の電極には電圧をかけないで上部の電極に電圧を加えることにより、あるいは、上部および下部の電極に、異なる時間または様々な組み合わせで電圧をかけることにより、軸方向成分および動径方向成分を有するベクトルを用いて、電場が速やかに作られ、それが懸濁された細胞にさらなる運動性を付加し、そして攪拌可能性を増加させる。
【００１７】
図４のキュベット４１は、フィラメント電極を除外してあることを除いて、図２のものと同一である。ここでは同様に、キュベットは、六角形の横断面を有する側壁４２および基部４３を有する。唯一の電極は周辺電極であり、それは、隣接する電極がそれぞれ独立に帯電され得るように、キュベットの全ての面に取り付けられている。交互の側面上に、または隣接する側面が出会う場所に存在する線に沿った間隙を有する、隣接する側面上に電極を取り付けることによって、これは達成される。電源に電極をつなぐ電気的接続は、反対側の面の電極に電圧をかけることによって準備され、そして電極は、懸濁された細胞の回転および攪拌を引き起こすために、連続的に電圧を加えられ得る。
【００１８】
使用において、本発明のキュベットは、外因性種の溶液中で膜性構造体を懸濁させたもので満たされ、そして電気穿孔法は当技術分野において周知の条件および手順の下で行われる。手順および操作条件の記載は、バイオラッドラボラトリーズ社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）（ハーキュリーズ、カリフォルニア、米国）によって提供された、「ジーンパルサーエックスセルシステム」（Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔｅｍ）という表題の刊行物（公報番号２７５０ＵＳ／ＥＧ  Ｒｅｖ．  Ｂ、２００４年１月発行）にあり、そしてその中に、装置、材料ならびに真核細胞および原核細胞の両方を含む種々の細胞に対する電気穿孔法のための方法の記述が示されている。さらなる記載は、Ｃｈａｓｓｙ，Ｂ．Ｍ．らの「電気穿孔法によるラクトバチルス・カセイ（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）の形質転換」（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．４４：１７３〜１７７（１９８７））およびＰｏｗｅｌｌ，Ｉ．Ｂ．らの「電気穿孔法による、ラクティック・ストレプトコッキィ（Ｌａｃｔｉｃ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）の簡易かつ迅速な遺伝子形質転換の方法」（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｏｂｉｏｌ．５４（３）：６５５〜６６０（Ｍａｒ．１９８８））；Ｐｏｔｔｅｒ．Ｈ．らの「電気穿孔法によりマウスプレＢリンパ球へ導入された、ヒトカッパ免疫グロブリン遺伝子のエンハンサー依存的発現」（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８１：７１６１〜７１６５（１９８４））、Ｓｈｉｖａｒｏｖａ，Ｎ．らの「電場効果の微生物学的意義  VII 、電場パルスによるプロトトラストのプラスミド形質転換の刺激」（Ｚｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔ  Ａｌｌｇｅ．Ｍｉｋｒｏ．２３：５９５−５９９（１９８３））およびＭｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｆ．らの「細菌の高電圧電気穿孔法：プラスミドＤＮＡを用いた、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｉｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）の遺伝子形質転換」（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：８５６〜８６０（１９８８））にある。電気穿孔法細胞、材料、および方法を公開している特許は、Ｄｏｗｅｒ，Ｗ．Ｊ．の米国特許第４９１０１４０号明細書（１９９０年３月２０日）および米国特許第５１８６８００号明細書（１９９３年２月１６日）、Ｋｏｒｅｎｓｔｅｉｎ，Ｒ．らの米国特許第５９６４７２６号明細書（１９９９年１０月１２日）、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｒ．の米国特許第５８７９８９１号明細書（１９９９年３月９日）ならびにＧｒｅｅｎｅｒ，Ａ．Ｌ．らの米国特許第６５８６２４９号明細書（２００３年７月１日）である。
【００１９】
電気穿孔法によって形質転換することを目的とする細胞は、電気的形質転換受容性細胞（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ）、すなわち、電気穿孔法中におけるアーク放電を防止するための低伝導培地中で、正常細胞を懸濁することによって得られる、電気的形質転換受容性を有する生命体、として知られている。電気的形質転換受容性細胞は、市販のものを利用でき、そして通常はマイクロチューブ中で固体である。電気穿孔法を行うために、使用者ははじめに、細胞懸濁液をマイクロチューブから空のチューブへ移し、それから核酸または他の外因種を加え、該種を分布させるために懸濁液を混合し、そして混合された懸濁液を電気穿孔法用のキュベットへ移す。あるいは、マイクロチューブ中にある電気的形質転換受容性細胞へ形質転換剤が加えられ、そして前記の混合された懸濁液がキュベット中に入れられる。
【００２０】
先の記載には、図中に示される構成材に対する様々な代替について記載されているが、さらなる代替は、当業者にとって明白であり、本発明の範囲内にある。
【００２１】
以下の特許請求の範囲において、用語「一つの（ａ）」および「一つの（ａｎ）」は、「一またはそれ以上」の意味である。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のようなその変形は、一の手順または一の部材についての記載の前にある場合には、さらなる手順または部材の追加が任意のものであって、除外されないことを意味する。全ての特許、特許出願、および本明細書に記載されている他の公開されている引例は、これにより、それら全体で参照として組み込まれる。本明細書に記載されている全ての参考資料、および本明細書の明白な教示との間の全ての矛盾は、本明細書中の教示を容認することで解決される。これは、ある技術分野で理解されている語および語句の定義、および本明細書で明確に規定されている、前記と同一の語または語句との間の全ての矛盾を含む。
【図１】
2010510864.tif 000003
【図２】
2010510864.tif 000004
【図３】
2010510864.tif 000005
【図４】
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【国際調査報告】
2010510864.tif 000007