(57)【要約】本発明は、タンパク質濃度を５０ｍｇ／ｍｌより多い量にまで増大させることによって、液体処方物中のタンパク質のマンニトール誘導性の凝集を阻害するための方法を提供する。本発明はまた、マンニトールおよび５０ｍｇ／ｍｌより多いタンパク質濃度を含む液体処方物を貯蔵および調製するための方法を提供する。具体的には、本発明の方法は、最初にマンニトールを除去せずに、マンニトールを含むタンパク質処方物の凍結貯蔵を可能にする。従って、本発明は、費用および処理工程、ならびにマンニトールを含むタンパク質処方物を貯蔵および調製するための時間を減らす。【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体処方物を貯蔵するための方法であって、該方法は、該液体処方物を、−１０℃より低い温度へと徐々に冷却する工程を包含し、ここで該液体処方物は、マンニトールおよびタンパク質を含み、該タンパク質は、５０ｍｇ／ｍｌより高い濃度で存在し、その結果、該高い濃度が、冷却の間にタンパク質凝集を抑制する、方法。
【請求項２】
前記温度は、約−２０℃、−４０℃、または−５０℃である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記マンニトールは、約０〜１５％の量で存在する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記冷却する工程は、約０．５℃／分、０．３℃／分、または０．１℃／分の速度である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記タンパク質は、５０ｍｇ／ｍｌ〜２００ｍｇ／ｍｌの間の濃度で存在する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記タンパク質は、７５ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、１２５ｍｇ／ｍｌ、または１５０ｍｇ／ｍｌより高い濃度で存在する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記タンパク質は抗体である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体はモノクローナル抗体である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記タンパク質は、薬学的薬物物質である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記方法は、処理手段（ｐｒｏｃｅｓｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
液体処方物を調製するための方法であって、該方法は、該液体処方物を、凍結状態から０℃より高い温度へ徐々に加温する工程を包含し、ここで該液体処方物は、マンニトールおよびタンパク質を含み、該タンパク質は、５０ｍｇ／ｍｌより高い濃度で存在し、その結果、該高い濃度は、加温の間にタンパク質凝集を抑制する、方法。
【請求項１２】
前記温度は、約２０℃、または３０℃である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記マンニトールは、約０〜１５％の量で存在する、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記加温する工程は、約０．５℃／分、０．３℃／分、または０．１℃／分の速度である、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記タンパク質は、５０ｍｇ／ｍｌ〜２００ｍｇ／ｍｌの間の濃度で存在する、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記タンパク質は、７５ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、１２５ｍｇ／ｍｌ、または１５０ｍｇ／ｍｌより高い濃度で存在する、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記タンパク質は抗体である、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体はモノクローナル抗体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記タンパク質は、薬学的薬物物質である、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記方法は、処理手段である、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１１〜２０のいずれか一項に記載の方法によって調製された液体処方物において、生物学的に有効な量のタンパク質を含む、組成物。
【請求項２２】
液体処方物中のタンパク質のマンニトール誘導性の凝集を阻害するための方法であって、該方法は、該タンパク質の濃度を、５０ｍｇ／ｍｌより多い量にまで増大させる工程を包含する、方法。
【請求項２３】
前記タンパク質は、７５ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、１２５ｍｇ／ｍｌ、または１５０ｍｇ／ｍｌより高い濃度で存在する、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
この出願は、２００６年１２月６日に出願された、米国仮特許出願第６０／８７３，５２６号（その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、マンニトールを含むタンパク質処方物を貯蔵および調製するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
マンニトールは、一般に、タンパク質処方物の安定性および等張性を維持するために、タンパク質処方物において使用されてきた。過去、液体窒素を使用して、貯蔵のためにタンパク質処方物を急速凍結してきた。しかし、液体処方物の大規模な制御されていない凍結へのほぼすべてのアプローチは、制御されない凝固および融解のネガティブ効果を欠点として持っている。相変化の不適切な制御は、凝集、沈降、酸化および変性に起因して、生成物の喪失を生じることが示された。近年の技術は、タンパク質処方物の凍結および融解プロセスを制御するために導入された。これら技術は、代表的には、非常にゆっくりとした速度で凍結および融解する。結果として、マンニトール含有タンパク質処方物においては、上記のゆっくりとした凍結融解プロセスは、マンニトールを結晶化させてしまい、このことは、続いて、タンパク質凝集を誘導する。ゆっくりとした凍結融解プロセスの間のマンニトール誘導性のタンパク質凝集を避けるために、既存の方法は、マンニトールをタンパク質処方物から除去し、融解後の操作の間にマンニトールを添加し戻すことを要した。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、マンニトールを含むタンパク質処方物を貯蔵および調製するための改善された方法を提供する。具体的には、本発明の方法は、最初にマンニトールを除去せずに、マンニトールを含むタンパク質処方物の凍結貯蔵を可能にする。従って、本発明は、費用および処理工程、ならびにマンニトールを含むタンパク質処方物を貯蔵および調製するための時間を減らす。
【０００５】
一局面において、本発明は、液体処方物を貯蔵するための方法を提供し、上記方法は、上記液体処方物を、約−１０℃より低い温度へと徐々に冷却する工程を包含する。上記液体処方物は、マンニトールおよびタンパク質を含み、上記タンパク質は、５０ｍｇ／ｍｌより高い濃度で存在し、その結果、上記高い濃度が、冷却の間にタンパク質凝集を抑制する。
【０００６】
一実施形態において、本発明の方法は、上記液体処方物を、約−２０℃より低い温度へと徐々に冷却する工程を包含する。別の実施形態において、本発明の方法は、上記液体処方物を、約−４０℃以下の温度へと徐々に冷却する工程を包含する。なお別の実施形態において、本発明の方法は、上記液体処方物を、約−５０℃以下の温度へと徐々に冷却する工程を包含する。
【０００７】
いくつかの実施形態において、本発明は、マンニトールを約０〜１５％の範囲の量で含む上記液体処方物を貯蔵するために使用され得る。特に、上記液体処方物は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％または１５％の量でマンニトールを含み得る。パーセンテージは、固体に言及する場合には、重量／重量であり、液体に言及する場合には、重量／容積である。
【０００８】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、上記液体処方物を、約０．６℃／分、０．５℃／分、０．４℃／分、０．３℃／分、０．２℃／分、または０．１℃／分の速度で徐々に冷却する工程を包含する。
【０００９】
いくつかの実施形態において、上記液体処方物は、約７５ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、１２５ｍｇ／ｍｌ、１５０ｍｇ／ｍｌ、または２００ｍｇ／ｍｌより高い濃度でタンパク質を含む。好ましくは、上記液体処方物は、５０ｍｇ／ｍｌ〜２００ｍｇ／ｍｌの間の濃度でタンパク質を含む。
【００１０】
いくつかの実施形態において、上記液体処方物は、抗体であるタンパク質を含む。特に、上記抗体は、モノクローナル抗体である。他の実施形態において、上記液体処方物は、薬学的薬物物質であるタンパク質を含む。
【００１１】
いくつかの実施形態において、本発明の液体処方物を貯蔵するための方法は、処理手段（ｐｒｏｃｅｓｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）である。
【００１２】
別の局面において、本発明は、液体処方物を調製するための方法を提供し、上記方法は、上記液体処方物を、凍結状態から約０℃より高い温度へ徐々に加温する工程を包含する。上記液体処方物は、マンニトールおよび５０ｍｇ／ｍｌより高い濃度のタンパク質を含み、その結果、上記高い濃度は、加温の間にタンパク質凝集を抑制する。
【００１３】
いくつかの実施形態において、液体処方物を調製するための方法は、上記液体処方物を、凍結状態から約１０℃、２０℃、２５℃、３０℃またはそれ以上の温度へと徐々に加温する工程を包含する。
【００１４】
いくつかの実施形態において、本発明は、約０〜１５％の範囲の量でマンニトールを含む液体処方物を調製するために使用され得る。特に、上記液体処方物は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％または１５％の量でマンニトールを含む。パーセンテージは、固体に言及する場合には、重量／重量であり、液体に言及する場合には、重量／容積である。
【００１５】
いくつかの実施形態において、液体処方物を調製するための方法は、上記液体処方物を、約０．６℃／分、０．５℃／分、０．４℃／分、０．３℃／分、０．２℃／分、または０．１℃／分の速度で徐々に加温する工程を包含する。
【００１６】
いくつかの実施形態において、上記液体処方物は、約７５ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、１２５ｍｇ／ｍｌ、１５０ｍｇ／ｍｌ、または２００ｍｇ／ｍｌより高い濃度でタンパク質を含む。好ましくは、上記液体処方物は、５０ｍｇ／ｍｌ〜２００ｍｇ／ｍｌの間の濃度でタンパク質を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態において、上記液体処方物は、抗体であるタンパク質を含む。特に、上記抗体は、モノクローナル抗体である。他の実施形態において、上記液体処方物は、薬学的薬物物質であるタンパク質を含む。
【００１８】
いくつかの実施形態において、本発明の液体処方物を調製するための方法は、処理手段である。
【００１９】
本発明の液体処方物は、通常は、水溶性処方物である。
【００２０】
本発明は、上記の種々の実施形態に記載されるように、本発明の方法によって調製される液体処方物において生物学的に有効な量のタンパク質を含む組成物をさらに提供する。
【００２１】
なお別の局面において、本発明は、タンパク質濃度を、５０ｍｇ／ｍｌより多い量にまで増大させることによって、液体処方物においてタンパク質のマンニトール誘導性の凝集を阻害するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、タンパク質濃度を、約７５ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、１２５ｍｇ／ｍｌ、１５０ｍｇ／ｍｌ、または２００ｍｇ／ｍｌより多い量にまで増大させることによって、液体処方物においてタンパク質のマンニトール誘導性の凝集を阻害する。代表的なタンパク質濃度は、５０ｍｇ／ｍｌ〜２００ｍｇ／ｍｌの間である。
【００２２】
本願において、「または」の使用は、別段示されなければ、「および／または」を意味する。本願において使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」およびこの用語のバリエーション（例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」）は、他の付加物、構成成分（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）、成分（ｉｎｔｅｇｅｒ）もしくは工程を排除することを意味しない。本願において使用される場合、用語「約（ａｂｏｕｔ）」および「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、等価物として使用される。約（ａｂｏｕｔ）／約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）ありまたはなしに関わらず、本願において使用される任意の数値は、関連分野の当業者によって認識される任意の正常の変動を網羅することを意味する。
【００２３】
本発明の他の特徴、目的および利点は、以下の詳細な説明において明らかになる。しかし、詳細な説明は、本発明の実施形態を示すと同時に、単なる例示によって提供されるに過ぎず、限定によって提供されるのではないことが理解されるべきである。本発明の範囲内の種々の変更および改変は、詳細な説明から当業者に明らかになる。
【００２４】
図面は、例示目的に過ぎず、限定のためではない。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、ＣｒｙｏＰｉｌｏｔ（ＣＰ）システムによる各例示的プロセススケールでのサンプル生成物温度追跡を示す。
【図２】図２は、−４０℃まで冷却し、次いで、２０℃まで加温した場合（ともに０．５℃／分において）の、凍結抗体溶液のＸ線回折（ＸＲＤ）パターンを示す。
【図３】図３は、３０ｍｇ／ｍｌの濃度のモノクローナル抗体を−４２℃より低く冷却した場合の、変調型示差走査熱量測定法（ｍＤＳＣ）のサンプルサーモグラフを示す。
【図４】図４は、ゆっくりとした凍結融解プロセスの間のタンパク質濃度に対してプロットした総エンタルピーを示す。
【図５】図５は、代表的抗体のサイズ排除クロマトグラフィーＨＰＬＣ（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）のクロマトグラムを示す。
【図６】図６は、タンパク質濃度に対してプロットした高分子量（ＨＭＷ）種のパーセンテージにおける変化を示す。
【図７】図７は、同じ混合速度での同じ凍結／融解プロフィールが、生成物負荷量に基づいて、２セットの記録を生じたことを示す。
【図８】図８は、実験系のより速い凍結および融解の速度が、最小の生成物負荷量での速度より速かったことを示す。
【図９】図９は、実験系のゆっくりとした凍結および融解の速度が、最大の生成物スケールでの速度よりゆっくりとしていたことを示す。
【図１０】図１０は、ゆっくりとした凍結および融解の実験スケールサイクル開発の間に観察された代表的な過冷却現象を示す。
【図１１】図１１は、マンニトールありまたはなしで（合計１５個）、修正プロフィールを５種の緩衝液試験で行い、続いて、５種のＭａｂＭ試験を行い、過冷却が１０個の熱電対追跡のいずれにおいても認められなかった（０％  発生）を示す。
【図１２】図１２は、ＭａｂおよびＭａｂＭの生成物温度追跡を重ね合わせたこと、マンニトールありまたはなしで、最大５種のＭａｂ試行まで１０個の熱電対追跡のいずれについてもおよび過冷却が認められなかったことを示す。
【図１３】図１３は、速い速度と比較して、ＨＭＷ種のパーセンテージが、ゆっくりとした速度での複数回の凍結融解プロセス後に、より顕著に増大したことを示す。
【図１４】図１４は、ＨＭＷ種における増加が、マンニトールを含む１００ｍｇ／ｍＬの濃度のＭａｂ処方物において観察されなかったことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
（発明の詳細な説明）
本発明は、マンニトールを含むタンパク質処方物を貯蔵および調製するための改善された方法を提供する。具体的には、本発明は、タンパク質濃度を増大させることによって、ゆっくりとした凍結および／または融解プロセスの間に、液体処方物におけるマンニトール誘導性のタンパク質凝集を抑制または排除するための方法を提供する。
【００２７】
本発明の種々の局面は、以下の小節においてさらに詳細に記載される。小節の使用は、本発明の限定を意味しない。各小節は、本発明のいずれに局面にも当てはまり得る。
【００２８】
（マンニトールを含むタンパク質処方物）
タンパク質は、水性状態においては比較的不安定であり、化学的および物理的分解を受け、処理および貯蔵の間に生物学的活性の喪失を生じる。凍結融解および凍結乾燥は、貯蔵のためのタンパク質を保存する十分に確立された方法である、タンパク質のコンホメーション、活性および安定性を保存するために、タンパク質処方物は、通常、このことを促進するための薬剤、いわゆる溶解保護剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）および凍結保護剤（ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）を含む。凍結保護剤は、凍結誘導性のストレスからタンパク質に対して安定性を提供する薬剤である；しかし、上記用語はまた、例えば、非凍結誘導性プロセスから貯蔵の間にバルク薬物処方物に、安定性を提供する薬剤を含む。溶解保護剤は、おそらく、水素結合を介するタンパク質の適切なコンホメーションを維持することによって、乾燥プロセスの間に上記系から水を除去する間にタンパク質に対する安定性を提供する薬剤である。凍結保護剤はまた、溶解保護効果も有し得る。頻繁に使用される充填剤（ｂｕｌｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）の例としては、マンニトール、グリシン、スクロース、ラクトースなどが挙げられる。上記薬剤はまた、上記処方物の等張性に寄与する。
【００２９】
本明細書において使用される場合、「タンパク質」は、任意の組換えポリペプチドまたは精製ポリペプチドを含み、これらとしては、抗体（例えば、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、および他の抗体改変体）；種々の成長ホルモン；および任意の薬学的薬物物質が挙げられるが、これらに限定されない。本願において言及されるタンパク質は、任意の天然に存在するポリペプチド、改変されたポリペプチド、または合成ポリペプチドを包含する。
【００３０】
本明細書において使用される場合、「タンパク質処方物」、「液体処方物」、または文法的等価物は、任意の液体ポリペプチド含有組成物を包含する。代表的には、本発明の液体処方物は、水性処方物である。上記液体ポリペプチド含有組成物は、受容可能な範囲において上記溶液ｐＨを維持する因子を含む「緩衝化剤」をさらに含み得、そして上記の充填剤を含み得、そしてまた、ヒスチジン、ホスフェート、シトレート、トリス、ジエタノールアミンなどを含み得る。上記液体ポリペプチド含有組成物が薬学的組成物である場合、上記液体処方物は、「賦形剤」をさらに含み得る。用語「賦形剤」とは、薬学的に受容可能なキャリア、ならびに生物学的活性の実質的な保持およびタンパク質安定性が維持されるように、貯蔵の間にタンパク質の適切なコンホメーションを提供する溶解保護剤および凍結保護剤を包含する。
【００３１】
（マンニトールは、ゆっくりとした凍結および融解の間にタンパク質凝集を誘導する）
上記で議論されるように、凍結および融解は、長期貯蔵のために、または中間工程として十分に確立された方法である。しかし、液体処方物の大規模凍結に対するほぼすべてのアプローチは、制御されていない凝固および融解というネガティブな効果を欠点として持っている。バッグおよびボトル中での凍結のようなアプローチは、容器内における低温濃縮および不均一な温度プロフィールを生じることが繰り返し示されてきた。相変化の不適切な制御は、凝集、沈澱、酸化および変性に起因して、生成物の喪失を生じることが示されてきた。対照してみると、制御された凍結および融解（ゆっくりとした凍結および融解ともいわれる）は、制御されていない方法に代表的な生成物変性を回避し、費用および時間のかかる洗浄を排除する。さらに、全体的なプロセスは、十分に制御されかつ推定可能な作動から利益を得る。
【００３２】
制御された凍結（またはゆっくりとした凍結）は、代表的には、液体処方物を、所定の速度で貯蔵に適した温度にまで徐々に冷却する工程を包含する。代表的には、貯蔵に適した温度としては、約−１０℃以下、−２０℃以下、−３０℃以下、−４０℃以下、−５０℃以下が挙げられるが、これらに限定されない。徐々に冷却する工程は、約０．６℃／分、０．５℃／分、０．４℃／分、０．３℃／分、０．２℃／分、または０．１℃／分の速度であり得る。
【００３３】
同様に、制御された融解（ゆっくりとした融解）は、代表的には、液体処方物を、所定の速度で、凍結状態から所望の温度にまで徐々に加温する工程を包含する。代表的には、融解目的の所望の温度としては、約０℃以上、１０℃以上、２０℃以上、または３０℃以上が挙げられるが、これらに限定されない。徐々に加温する工程は、約０．６℃／分、０．５℃／分、０．４℃／分、０．３℃／分、０．２℃／分、または０．１℃／分の速度であり得る。
【００３４】
制御された凍結および融解は、容器（例えば、チューブ、バッグ、ボトルまたは任意の他の適した容器）中で行われ得る。上記容器は、使い捨てであり得る。制御された凍結および融解はまた、大規模で行われてもよいし、小規模で行われてもよい。代表的な大規模生成については、液体処方物は、約１Ｌから３００Ｌ、例えば、３Ｌのバッチで凍結され得る。代表的な小規模系については、液体処方物は、約１ｍｌから５００ｍｌ、例えば、３０ｍｌのバッチで凍結され得る。
【００３５】
しかし、マンニトール含有液体処方物において、上記のゆっくりとした凍結および／または融解は、マンニトールを結晶化させてしまい、続いて、このことは、タンパク質凝集を誘導する。本明細書において使用される場合、「タンパク質凝集」は、高分子量（ＨＭＷ）種の形成を意味する。上記高分子量種は、濁度測定によって検出可能な不溶性種およびサイズ排除クロマトグラフィーＨＰＬＣ（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）、陽イオン交換ＨＰＬＣ（ＣＥＸ−ＨＰＬＣ）、Ｘ線回折（ＸＲＤ）、変調型示差走査熱量測定法（ｍＤＳＣ）および当業者に公知の他の手段によって検出可能な可溶性種の両方を包含する。
【００３６】
複数回の凍結融解サイクルの際のマンニトール含有液体処方物中のＨＭＷ種のパーセンテージは実質的に増加する（実施例の節を参照のこと）ことが認められた。上記処方物中においてマンニトール量の増加はまた、より高いパーセンテージのＨＭＷ種形成を生じる。低下させた処理容積は、大規模（例えば、１２５Ｌ）と比較して、形成されるＨＭＷ種のパーセンテージを維持するようである。
【００３７】
マンニトール含有液体処方物における冷却の間に、発熱事象が認められる。認められたエンタルピー（これは、マンニトールの結晶化および凍結していない水に起因する）は、処理スケールが増大する（凍結および融解の速度が低下するにつれて）か、または上記処方物におけるマンニトールレベルが増大するにつれて増大する。上記マンニトール含有液体処方物において融解する際の結晶化事象もまた、認められる。理論に拘束されることは望まないが、凍結溶液中での上記結晶化事象は、結晶化に起因する相転移が、凍結および融解の際に、タンパク質の凝集を誘導し得ることを示唆する。マンニトールの結晶化は、マンニトールレベルとともに増大し、これは、より高い％ＨＭＷ形成に対応する。より多くのマンニトール結晶化が、小規模のものよりも、大規模プロセスシミュレーションにおいて認められた。このことは、繰り返すと、ＨＭＷ形成のより大きな割合に対応した。上記処方物中のマンニトールを減少させると、一般に、凍結および融解の間の上記液体処方物中のＨＭＷ種形成の減少に好都合である。
【００３８】
（タンパク質濃度の増大は、タンパク質凝集を抑制する）
本発明は、上記液体処方物中のタンパク質濃度を増大させると、ゆっくりとした凍結および／または融解プロセスの間にタンパク質凝集を抑制または阻害することを発見した。実施例の節において記載されるように、２０〜３０ｍｇ／ｍｌより上回ってタンパク質濃度を増大させると、ＨＭＷ種形成の量の減少を生じることが分かった。理論に束縛されることは望まないが、低タンパク質濃度（例えば、＜２０ｍｇ／ｍｌ）でのタンパク質凝集の増大は、凍結および／または融解の間に２分子が一緒になる可能性が増大することによって引き起こされ得ることが企図される。代表的には、５０ｍｇ／ｍｌより高いタンパク質濃度は、タンパク質凝集を抑制するために使用される。好ましくは、約７５ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、１２５ｍｇ／ｍｌ、または１５０ｍｇ／ｍｌより高い濃度のタンパク質濃度は、タンパク質凝集を抑制するために使用される。より好ましくは、５０ｍｇ／ｍｌ〜２００ｍｇ／ｍｌの間のタンパク質濃度が使用される。本明細書において使用される場合、用語「タンパク質凝集を抑制する」または文法的等価物は、類似だが、２０ｍｇ／ｍｌより低いタンパク質濃度を含む液体処方物中で形成されるＨＭＷ種のパーセンテージと比較して、液体処方物中のＨＭＷ種のパーセンテージの低下を示す。用語「タンパク質凝集を抑制する」はまた、ＨＭＷ種の形成を阻害または排除することを包含する。
【００３９】
従って、上記マンニトールを含む液体処方物中のタンパク質濃度を増大させることによって、本発明は、顕著なタンパク質凝集を誘導することなく、上記液体処方物のゆっくりとした凍結および／または融解を可能にする。本発明は、薬物物質を含む薬物生成物を貯蔵するのに特に有用である。例えば、本発明は、薬物生成物中のマンニトールを含むすべての賦形剤がゆっくりとした凍結および／または融解プロセスの間に存在することを可能にする一方で、薬物物質を安定かつ生物学的に活性に維持することを可能にする。従って、本発明は、貯蔵前に薬物処方物からマンニトールを除去し、そして上記薬物生成物の増量（ｆｉｌｌｉｎｇ）操作の間に添加し戻す必要性を排除する。
【００４０】
従って、マンニトールおよび５０ｍｇ／ｍｌより高いタンパク質濃度を含む液体処方物は、後の使用のためのその形態で直接貯蔵され得るか、中間工程として凍結状態で貯蔵されて使用前に融解され得るか、または使用前に液体形態もしくは他の形態へと、後に再構成するために、乾燥形態（例えば、凍結乾燥形態、風乾形態、または噴霧乾燥形態）においてその後に調製され得る。さらに、生物学的に活性な量のタンパク質を含む組成物は、利便性、再構成なしの投与しやすさ、および予め充填されたすぐ使用できるシリンジ中で処方物を供給できること、または上記処方物が制菌性薬剤と適合性である場合に複数用量の調製物としての十分な利点をとるために、本願に従って、液体形態で直接、調製および貯蔵され得る。本願はまた、上記で議論されるように貯蔵および調製される、上記液体処方物中に生物学的に活性な量のタンパク質を含む組成物の他の形態を提供する。
【００４１】
上記の実施形態および以下の実施例は、例示によって提供されるのであって、限定ではないことが理解されるべきである。本発明の液体処方物は、一般に、タンパク質に対して適用可能である。例えば、実施例の節に記載される液体処方物において使用される抗体は、任意の抗体であり得る。本発明の範囲内の種々の変化および改変は、本発明の説明から当業者に明らかになる。
【実施例】
【００４２】
（実施例１：モノクローナル抗体処方物のゆっくりとした凍結および融解）
種々の濃度のモノクローナル抗体（Ｍａｂ）、ならびに１０ｍＭ  ヒスチジン、１０ｍＭ  メチオニン、０〜４％  マンニトールおよび０〜０．０２％  ポリソルベート−８０を含む処方物を、ＣｒｙｏＰｉｌｏｔ（ＣＰ）システム（Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、複数回凍結および融解した。各凍結および融解プロフィールには、−５５℃への段階的冷却（ｓｔｅｐ−ｄｏｗｎ  ｃｏｏｌｉｎｇ）、および上記溶液を混合する間に３２℃への加温を含めた。
【００４３】
上記ＣＰは、ＣｒｙｏＶｅｓｓｅｌ（Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、フルスケール生成ユニットの操作を模倣する。種々のプロセス容積のための上記ＣＰ設定点プロフィールは、ＣｒｙｏＶｅｓｓｅｌの挙動を模倣するために、この研究より前に開発した。図１は、ＣＰシステムを用いた各プロセススケールにおける生成物温度追跡のサンプルを例示する。凍結（または融解）速度は、熱電対が０℃から−４２℃に達する（または０℃から−４２℃）のを時間で割ったものとして定義される。
【００４４】
融解サンプルを、最初にＳＥＣ−ＨＰＬＣおよびＣＥＸ−ＨＰＬＣによって分析して、高分子量種のレベル（％ＨＭＷ）を評価し、酸性種および塩基性種のレベルを追跡した。変調型示差走査熱力測定法（ｍＤＳＣ）およびＸ線回折（ＸＲＤ）も使用して、凍結溶液中のマンニトールの結晶度および同質異像を評価した。
【００４５】
（実施例２：マンニトールは、ゆっくりとした凍結および融解の間にタンパク質凝集を誘導する）
ヒト化モノクローナル抗体（本実施例においてＭＡＢ−００１といわれる）は、実施例１に記載されるものと同様に、ゆっくりとした凍結融解プロセスの間に、マンニトールの存在下で凝集することが分かった。図２は、ともに０．５℃／分で、−４０℃にまで冷却し、次いで２０℃にまで加温した場合の、凍結したＭＡＢ−００１溶液のＸＲＤパターンを示す。上記凍結した溶液を、−４２℃、−３０℃および−１０℃で走査した。図２で示されるように、結晶化の量は、上記処方物中のマンニトールの量とともに増大し、より高いタンパク質濃度は、マンニトール結晶化を抑制した。
【００４６】
ＸＲＤに加えて、変調型示差走査熱量測定法（ｍＤＳＣ）もまた使用して、ＭＡＢ−００１サンプルにおけるマンニトール結晶化を試験した。図３は、３０ｍｇ／ｍｌの濃度のＭＡＢ−００１を−４２℃より低く冷却した場合の、ｍＤＳＣのサンプルサーモグラムのサンプルを示す。認められたエンタルピー（図３における褐色の線）は、図２において示されるように、マンニトールの結晶化に起因する。総エンタルピーが冷却エンタルピー＋加温エンタルピーに等しいとすると、総エンタルピーは、図４に示されるように、タンパク質濃度に対してプロットされ得る。さらに図４に示されるように、タンパク質濃度の増大（例えば、＞３０ｍｇ／ｍｌ）は、マンニトール結晶化を抑制した。
【００４７】
（実施例３：より高いタンパク質濃度は、マンニトール結晶化を抑制する）
ＭＡＢ−００１、ＭＡＢ−００２およびＭＡＢ−００３といわれる３種の抗体を、１０ｍＭ  ヒスチジン、２５０ｍＭ  マンニトール、ｐＨ６．０に透析し、次いで、５回の凍結融解サイクルに供し、ＨＭＷ種形成についてモニターした。そのＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムを図５に示す。図５に示されるように、３種のタンパク質ＭＡＢ−００１、ＭＡＢ−００２およびＭＡＢ−００３の各々に関して、処方物中のタンパク質濃度の増大は、ＨＭＷ種の形成を抑制した。ＨＭＷ種のパーセンテージの変化を、図６において、タンパク質濃度に対してプロットした。図６に示されるように、上記３種のタンパク質の各々に関して、２０〜３０ｍｇ／ｍｌを上回るタンパク質濃度の増大は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって検出されるＨＭＷ形成の量を減少させた。この結果は、ｍＤＳＣデータと一致した。
【００４８】
（実施例４：実験スケール  対  製造スケール）
速い凍結／融解サイクルおよびゆっくりとした凍結／融解サイクルを、製造スケールの生成物追跡にマッチさせ、最小生成物負荷量および最大生成物負荷量を考慮の対象外に置く（ｂｒａｃｋｅｔ）ために、実験系Ｓ３  Ｃｅｌｓｉｕｓ（Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において開発した。ＦＴ−１００  Ｃｅｌｓｉｕｓ（Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、種々の生成物負荷量で使用した。最小生成物負荷量については、４．２Ｌ（１バッグ）を使用した。最大生成物負荷量については、１００Ｌ（各１６．６Ｌで６バッグ）を使用した。ＦＴ−１００から同じ混合速度を用いた同一の凍結／融解設定点プロフィールは、図７に示されるように、生成物負荷量に基づいて、２セットの生成物温度追跡を生じた。
【００４９】
凍結および融解サイクル開発を、実験スケールＳ３  システムを用いて行った。図８に示されるように、上記実験システムのより速い凍結および融解の速度は、上記最小生成物負荷量での速度より速かった。図９に示されるように、上記実験システムのゆっくりとした凍結および融解の速度は、最大生成物スケールでの速度より遅かった。
【００５０】
ゆっくりとした凍結および融解についての実験スケールサイクル開発の間に、過冷却が観察された。代表的な過冷却現象は、図１０に示される。凍結温度は、過冷却が起こると低下する。過冷却現象は、ゆっくりとした凍結／融解サイクルの３回の試験のうちの２回で観察された（６７％  発生）。過冷却は、タンパク質および緩衝剤の試行（ｒｕｎ）で無作為に発生し得るか、またはバッグの位置によって引き起こされ得、これらは予測不能であった。過冷却は、通常の凍結時間（ＮＦＴ）（５℃から−５℃）計算に影響を及ぼした。過冷却は、タンパク質濃度レベルに関連し得る。
【００５１】
過冷却を回避するために、モノクローナル抗体をモデルタンパク質（ＭａｂＭ）として使用して、実験システムのゆっくりとした凍結および融解サイクルを開発した。ＭａｂＭを濃縮し、Ｍａｂ処方物緩衝溶液に透析し、次いで、５０ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌおよび１５０ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈した。マンニトールなしの処方物を調製し、続いて、上記実験システムを用いて、５回凍結および融解した。次いで、固体マンニトールを、上記マンニトール非含有処方物に添加した。これら溶液を、再び、上記実験システムで５回凍結および融解し、ゆっくりとした凍結／融解プロフィールを、初期の極低温凍結（ｄｅｅｐ  ｆｒｏｚｅｎ）時間を延ばしかつ初期凍結温度を低下させて、核形成を促進することによって修正した。図１１に示されるように、上記修正プロフィールを、マンニトールありまたはなしで、５種の緩衝剤試験、続いて、５種のＭａｂＭ試験を行った（合計１５）ところ、１０個の熱電対追跡のいずれにおいても、過冷却は認められなかった（０％  発生）。融解後の手動混合は、すべてのタンパク質濃度レベルに必要であった。
【００５２】
速い凍結および融解、ならびにゆっくりとした凍結および融解のプロフィールを、上記のように開発し、モノクローナル抗体（Ｍａｂ）薬物物質の凍結および融解の可能性を評価するために使用した。上記Ｓ３  実験スケールＣｅｌｓｉｕｓを、この実験において使用した。アッセイ評価は、低温濃縮、ＨＭＷ種および低分子量（ＬＭＷ）種のためのＳＥＣ  ＨＰＬＣ、ｐＨ、Ａ４００による濁度、濃度ならびにＣＥＸ  ＨＰＬＣの肉眼観察を含んでいた。図１２に示されるように、ＭａｂおよびＭａｂＭの上記生成物温度追跡を重ね合わせた。過冷却は、マンニトールありまたはなしで、最大５種までのＭａｂ試行の１０個の熱電子対追跡のいずれについても認められなかった。融解後の手動の混合は、すべての濃度レベルに必要であった。
【００５３】
（実施例５：ＨＭＷの形成は、凍結および融解速度に関する）
図１３に示されるように、ＨＭＷ種のパーセンテージは、速い速度と比較した場合に、ゆっくりとした速度の複数回の凍結および融解サイクルの後により顕著に増大した。ＬＭＷ種の量、ｐＨ、濁度、濃度ならびに酸性種および塩基性種の変化は、認められなかった。図１３にも示されるように、ＨＭＷ種の増加は、５０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度を有しかつマンニトールを含む処方物でのみ認められた。図１４に示されるように、ＨＭＷ種の増加は、マンニトールを含む、１００ｍｇ／ｍＬの濃度のＭａｂ処方物では認められなかった。さらに、マンニトールなしのＭａｂは、５０ｍｇ／ｍＬおよび１５０ｍｇ／ｍＬの濃度を有するＳｔｅｄｉｍバッグにおいて、最大５回までの凍結および融解サイクルに対して安定なままであることが認められた。
【００５４】
（援用の表示）
本願で引用されるすべての刊行物および特許文献は、各個々の刊行物または特許文献の内容が本明細書に参考として援用されるかのように同程度まで、すべての目的で、それら全体が本明細書に参考として援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図５】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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