(57)【要約】Ｂ細胞が、自己抗体およびサイトカインを分泌すること、ならびにＴ細胞に抗原を提示することによって、自己免疫性炎症の維持に主要な役割を果たすことを示す証拠は増えつつある。モノクローナル抗体を使った最近の臨床研究では、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、および他の自己免疫疾患を持つ患者において、Ｂ細胞枯渇は有効な治療アプローチであることが示されている。慢性関節リウマチにおける患部関節組織は、活性化Ｂ細胞の浸潤を示す。本発明は、関節炎関連Ｂ細胞に観察される差次的遺伝子発現の利益を受ける方法および組成物を特徴とする。
2010501182.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
関節炎関連Ｂ細胞活性化を評価する方法であって、
（ａ）１つ以上の遺伝子のＢ細胞発現レベルを検出する工程、および
（ｂ）該発現レベルを、Ｂ細胞の活性化状態を示す基準発現レベルと比較する工程
を含み、該１つ以上の遺伝子が、ＡＨＣＹＬ１（Ｓ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ様１）、ＰＫＣ−δ、ＧＮＧ１２、ホスホジエステラーゼ７Ａ、ＦＡＭ６０Ａ、ＴＣＴＥ１Ｌ、ＳＴＵＢ１／ＣＨＩＰ、コピンＩＩＩ、ＳＴＫ１０、ＳＴＥ−２０様キナーゼ、ＭＡＰ４Ｋ５、ＭＡＰキナーゼ相互作用セリン／スレオニンキナーゼ２、ホスホイノシチド−３−キナーゼ調節サブユニット４（ｐ１５０）、Ｒｏ５２、染色体構造維持５（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  ５）、ＷＤリピートドメイン１２、エキソソームコンポーネント１０、カルパイン３、Ｓｒｃ様アダプタータンパク質、ＣＤＣ様キナーゼ１、宿主細胞因子Ｃ１制御因子１、Ｒａｂ３Ｄ、リソソーム関連オルガネラ生合成複合体−１（ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｌｙｓｏｓｏｍｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｏｒｇａｎｅｌｌｅｓ  ｃｏｍｐｌｅｘ−１）、膜貫通タンパク質４、酸性ホスファターゼ５、コロイデレミア、ＰＢＥＦ／ビスファチン、ユビキチンＢ、およびジンクフィンガータンパク質１０６からなる群より選択される方法。
【請求項２】
前記Ｂ細胞がヒトＢ細胞であり、前記１つ以上の遺伝子がヒト遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
自己免疫応答の徴候に関して患者を評価する方法であって、
（ａ）該患者由来の試料において、１つ以上の遺伝子のＢ細胞発現レベルを検出する工程、および
（ｂ）該発現レベルを、該患者における免疫応答を示す基準発現レベルと比較する工程
を含み、該１つ以上の遺伝子が、ＡＨＣＹＬ１、ＰＫＣ−δ、ＧＮＧ１２、ホスホジエステラーゼ７Ａ、ＦＡＭ６０Ａ、ＴＣＴＥ１Ｌ、ＳＴＵＢ１／ＣＨＩＰ、コピンＩＩＩ、ＳＴＫ１０、ＳＴＥ−２０様キナーゼ、ＭＡＰ４Ｋ５、ＭＡＰキナーゼ相互作用セリン／スレオニンキナーゼ２、ホスホイノシチド−３−キナーゼ調節サブユニット４（ｐ１５０）、Ｒｏ５２、染色体構造維持５（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  ５）、ＷＤリピートドメイン１２、エキソソームコンポーネント１０、カルパイン３、Ｓｒｃ様アダプタータンパク質、ＣＤＣ様キナーゼ１、宿主細胞因子Ｃ１制御因子１、Ｒａｂ３Ｄ、リソソーム関連オルガネラ生合成複合体−１（ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｌｙｓｏｓｏｍｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｏｒｇａｎｅｌｌｅｓ  ｃｏｍｐｌｅｘ−１）、膜貫通タンパク質４、酸性ホスファターゼ５、コロイデレミア、ＰＢＥＦ／ビスファチン、ユビキチンＢ、およびジンクフィンガータンパク質１０６からなる群より選択される方法。
【請求項４】
免疫応答が自己免疫応答である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記自己免疫応答が慢性関節リウマチである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
試料が血液、リンパ、および滑膜からなる群より選択される流体試料である、請求項３〜５のいずれか一項またはそれ以上に記載の方法。
【請求項７】
工程（ａ）に先だって試料からＢ細胞を精製する工程をさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項またはそれ以上に記載の方法。
【請求項８】
前記患者がヒト患者であり、前記１つ以上の遺伝子がヒト遺伝子である、請求項１〜７のいずれか一項またはそれ以上に記載の方法。
【請求項９】
コピンＩＩＩ、宿主細胞因子制御因子Ｉ、Ｒａｂ３Ｄ、リソソーム関連オルガネラ生合成複合体−１（ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｌｙｓｏｓｏｍｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｏｒｇａｎｅｌｌｅｓ  ｃｏｍｐｌｅｘ−１）、膜貫通タンパク質４、酸性ホスファターゼ５、コロイデレミア、ユビキチンＢ、および／またはＳＴＫ１０からなる群より選択される遺伝子または遺伝子産物を活性化する工程、またはＡＨＣＹＬ１（Ｓ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ様１）、ＰＫＣ−δ、ＧＮＧ１２、ホスホジエステラーゼ７Ａ、ＳＴＥ−２０様キナーゼ、ＭＡＰキナーゼ相互作用セリン／スレオニンキナーゼ２、ホスホイノシチド−３−キナーゼ調節サブユニット４（ｐ１５０）、染色体構造維持５（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  ５）、ＷＤリピートドメイン１２、エキソソームコンポーネント１０、カルパイン３、Ｓｒｃ様アダプタータンパク質、ＣＤＣ様キナーゼ１、ＦＡＭ６０Ａ、ＴＣＴＥ１Ｌ、ＳＴＵＢ１／ＣＨＩＰ、ＭＡＰ４Ｋ５、Ｒｏ５２、およびジンクフィンガータンパク質１０６からなる群より選択される遺伝子または遺伝子産物を阻害する工程を含む、Ｂ細胞を処置する方法。
【請求項１０】
コピンＩＩＩ、宿主細胞因子制御因子Ｉ、Ｒａｂ３Ｄ、リソソーム関連オルガネラ生合成複合体−１（ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｌｙｓｏｓｏｍｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｏｒｇａｎｅｌｌｅｓ  ｃｏｍｐｌｅｘ−１）、膜貫通タンパク質４、酸性ホスファターゼ５、コロイデレミア、ユビキチンＢ、およびＳＴＫ１０からなる群より選択される遺伝子または遺伝子産物を、該遺伝子産物をコードする核酸の発現によって活性化することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＡＨＣＹＬ１（Ｓ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ様１）、ＰＫＣ−δ、ＧＮＧ１２、ホスホジエステラーゼ７Ａ、ＳＴＥ−２０様キナーゼ、ＭＡＰキナーゼ相互作用セリン／スレオニンキナーゼ２、ホスホイノシチド−３−キナーゼ調節サブユニット４（ｐ１５０）、染色体構造維持５（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  ５）、ＷＤリピートドメイン１２、エキソソームコンポーネント１０、カルパイン３、Ｓｒｃ様アダプタータンパク質、ＣＤＣ様キナーゼ１、ＦＡＭ６０Ａ、ＴＣＴＥ１Ｌ、ＳＴＵＢ１／ＣＨＩＰ、ＭＡＰ４Ｋ５、Ｒｏ５２、およびジンクフィンガータンパク質１０６からなる群より選択される遺伝子を、該遺伝子の発現を阻害する核酸の発現によって阻害することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
患者における慢性関節リウマチを処置する方法であって、請求項９〜１１のいずれか一項またはそれ以上に記載の方法に従って、該患者におけるＢ細胞を処置する工程を含む方法。
【請求項１３】
Ｂ細胞に関する処置を評価する方法であって、該処置の適用後に、１つ以上の遺伝子のＢ細胞発現レベルを検出し、該発現レベルを、Ｂ細胞活性化状態を示す基準発現レベルと比較することによって、該処置の効力を評価することを含み、該１つ以上の遺伝子が、ＡＨＣＹＬ１、ＰＫＣ−δ、ＧＮＧ１２、ホスホジエステラーゼ７Ａ、ＦＡＭ６０Ａ、ＴＣＴＥ１Ｌ、ＳＴＵＢ１／ＣＨＩＰ、コピンＩＩＩ、ＳＴＫ１０、ＳＴＥ−２０様キナーゼ、ＭＡＰ４Ｋ５、ＭＡＰキナーゼ相互作用セリン／スレオニンキナーゼ２、ホスホイノシチド−３−キナーゼ調節サブユニット４（ｐ１５０）、Ｒｏ５２、染色体構造維持５（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  ５）、ＷＤリピートドメイン１２、エキソソームコンポーネント１０、カルパイン３、Ｓｒｃ様アダプタータンパク質、ＣＤＣ様キナーゼ１、宿主細胞因子Ｃ１制御因子１、Ｒａｂ３Ｄ、リソソーム関連オルガネラ生合成複合体−１（ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｌｙｓｏｓｏｍｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｏｒｇａｎｅｌｌｅｓ  ｃｏｍｐｌｅｘ−１）、膜貫通タンパク質４、酸性ホスファターゼ５、コロイデレミア、ユビキチンＢ、およびジンクフィンガータンパク質１０６からなる群より選択される方法。
【請求項１４】
前記基準発現レベルが処置を適用する前の発現レベルに相当する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記１つ以上の遺伝子がヒト遺伝子である、請求項１３〜１４のいずれか一項またはそれ以上に記載の方法。
【請求項１６】
ＰＢＥＦ／ビスファチン、ＡＨＣＹＬ１（Ｓ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ様１）、ＰＫＣ−δ、ＧＮＧ１２、ホスホジエステラーゼ７Ａ、ＳＴＥ−２０様キナーゼ、ＭＡＰキナーゼ相互作用セリン／スレオニンキナーゼ２、ホスホイノシチド−３−キナーゼ調節サブユニット４（ｐ１５０）、染色体構造維持５（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  ５）、ＷＤリピートドメイン１２、エキソソームコンポーネント１０、カルパイン３、Ｓｒｃ様アダプタータンパク質、ＣＤＣ様キナーゼ１、ＦＡＭ６０Ａ、ＴＣＴＥ１Ｌ、ＳＴＵＢ１／ＣＨＩＰ、ＭＡＰ４Ｋ５、Ｒｏ５２、およびジンクフィンガータンパク質１０６からなる群より選択される遺伝子産物を特異的に結合する精製された抗体またはモノクローナル抗体。
【請求項１７】
前記遺伝子産物がヒト遺伝子産物である、請求項１６に記載の抗体。
【請求項１８】
請求項１６〜１７のいずれか一項またはそれ以上に記載の抗体を投与する工程を含む、活性化Ｂ細胞を標的化する方法。
【請求項１９】
前記抗体をヒトに投与する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ヒトが、抗体で活性化Ｂ細胞を標的化することによって処置しうる慢性関節リウマチであると以前に診断されている、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、関節炎関連Ｂ細胞遺伝子発現、ならびに関節炎関連Ｂ細胞遺伝子を診断および処置のために使用する方法に関連する。
【０００２】
（配列表への参照）
本願は、２００６年８月２５日に出願された米国仮特許出願第６０／８４０，３８０号に関連し、米国仮特許出願第６０／８４０，３８０号は最初に出願された内容の一部として、「コピー１」および「コピー２」とラベルされた二つのコンパクトディスクを含み、それぞれのディスクは配列表を含む。それぞれのコンパクトディスクのコンピュータフォーマットはＩＢＭ−ＰＣであり、そしてそれぞれのコンパクトディスクのオペレーティングシステムはＭＳ−Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）である。該それぞれのコンパクトディスクは、「ＷＹＥ−０６８ＰＲ．ＳＴ２５．ｔｘｔ」と名付けられた単一のテキストファイル（５８３ｋｂ、２００６年８月２５日に作成された）を含む。「コピー１」および「コピー２」とラベルされた該コンパクトディスクの内容は、その全体が全ての目的のために本明細書中に参考として援用される。
【背景技術】
【０００３】
Ｂ細胞が、自己抗体およびサイトカインを分泌すること、ならびにＴ細胞に抗原を提示することによって、自己免疫性炎症の維持に主要な役割を果たすことを示す証拠は増えつつある。モノクローナル抗体を使った最近の臨床研究では、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、および他の自己免疫疾患を持つ患者において、Ｂ細胞枯渇は有効な治療アプローチであることが示されている。慢性関節リウマチにおける患部関節組織は、活性化Ｂ細胞の浸潤を示す。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、Ｂ細胞におけるその発現レベルが慢性関節リウマチなどの自己免疫疾患において調整される遺伝子を特徴とする。それゆえに、本明細書において「Ｂ細胞活性化調節遺伝子（Ｂ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ）」または「ＢＣＡＲＧ」と呼ばれるこれらの遺伝子の発現レベルを検出することを使って、自己免疫疾患を検出または監視することができる。同様に、これらの遺伝子または遺伝子産物を、自己免疫疾患を処置するための標的として使用することもできる。
【０００５】
ＢＣＡＲＧには、自己免疫疾患において活性化Ｂ細胞中で差次的に発現されると本明細書に記載する遺伝子のそれぞれ（例えば表１に列挙する遺伝子のそれぞれを含む）が包含される。それらの遺伝子の一部は、これらの活性化Ｂ細胞において、より多量に発現（「アップレギュレート」）され、そのような遺伝子には、例えばＰＢＥＦ／ビスファチン、ＡＨＣＹＬ１（Ｓ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ様１）、ＰＫＣ−δ、ＧＮＧ１２、ホスホジエステラーゼ７Ａ、ＳＴＥ−２０様キナーゼ、ＭＡＰキナーゼ相互作用セリン／スレオニンキナーゼ２、ホスホイノシチド−３−キナーゼ調節サブユニット４（ｐ１５０）、ＳＭＣ（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ（染色体構造維持））５、ＷＤリピートドメイン１２、エキソソームコンポーネント（ｅｘｏｓｏｍｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）１０、カルパイン３、Ｓｒｃ様アダプタータンパク質、ＣＤＣ様キナーゼ１、ＦＡＭ６０Ａ、ＴＣＴＥ１Ｌ、ＳＴＵＢ１／ＣＨＩＰ、ＭＡＰ４Ｋ５、Ｒｏ５２、およびジンクフィンガータンパク質１０６などが含まれる。他の遺伝子はダウンレギュレートされ、例えばｃｏｐｉｎｅ（コピン）ＩＩＩ、宿主細胞因子制御因子Ｉ、Ｒａｂ３Ｄ、ＢＬＯＣ（ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｌｙｓｏｓｏｍｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｏｒｇａｎｅｌｌｅｓ  ｃｏｍｐｌｅｘ（リソソーム関連オルガネラ生合成複合体）−１、膜貫通タンパク質４、酸性ホスファターゼ５、コロイデレミア（ｃｈｏｒｏｉｄｅｒｅｍｉａ）、ユビキチンＢ、およびＳＴＫ１０が含まれる。
【０００６】
したがって一態様として、本発明は、関節炎関連Ｂ細胞活性化を評価するための方法を提供する。本方法は、１つ以上の遺伝子のＢ細胞発現レベルを検出し、その発現レベルを、Ｂ細胞の活性化状態を示す基準発現レベルと比較することを含む。１つ以上の遺伝子には、好ましくは、以下に挙げる遺伝子の少なくとも一つが含まれる：ＰＢＥＦ／ビスファチン、ＡＨＣＹＬ１（Ｓ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ様１）、ＰＫＣ−δ、ＧＮＧ１２、ホスホジエステラーゼ７Ａ、ＦＡＭ６０Ａ、ＴＣＴＥ１Ｌ、ＳＴＵＢ１／ＣＨＩＰ、コピンＩＩＩ、ＳＴＫ１０、ＳＴＥ−２０様キナーゼ、ＭＡＰ４Ｋ５、ＭＡＰキナーゼ相互作用セリン／スレオニンキナーゼ２、ホスホイノシチド−３−キナーゼ調節サブユニット４（ｐ１５０）、Ｒｏ５２、ＳＭＣ５、ＷＤリピートドメイン１２、エキソソームコンポーネント１０、カルパイン３、Ｓｒｃ様アダプタータンパク質、ＣＤＣ様キナーゼ１、宿主細胞因子Ｃ１制御因子１、Ｒａｂ３Ｄ、ＢＬＯＣ−１、膜貫通タンパク質４、酸性ホスファターゼ５、コロイデレミア、ユビキチンＢ、またはジンクフィンガータンパク質１０６。Ｂ細胞において検出される遺伝子発現は内在性遺伝子のものであるだろうから、そのＢ細胞がヒト由来であると１つ以上のヒト遺伝子の発現が検出され、そのＢ細胞がマウス由来であると１つ以上のマウス遺伝子の発現が検出されるという具合になるだろう。ある実施形態では、１つ以上の遺伝子が、以下に挙げるヒト遺伝子の少なくとも一つを含む：ＡＨＣＹＬ１（Ｓ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ様１）、ＰＫＣ−δ、ＧＮＧ１２、ホスホジエステラーゼ７Ａ、ＦＡＭ６０Ａ、ＴＣＴＥ１Ｌ、ＳＴＵＢ１／ＣＨＩＰ、コピンＩＩＩ、ＳＴＫ１０、ＳＴＥ−２０様キナーゼ、ＭＡＰ４Ｋ５、ＭＡＰキナーゼ相互作用セリン／スレオニンキナーゼ２、ホスホイノシチド−３−キナーゼ調節サブユニット４（ｐ１５０）、Ｒｏ５２、ＳＭＣ５、ＷＤリピートドメイン１２、エキソソームコンポーネント１０、カルパイン３、Ｓｒｃ様アダプタータンパク質、ＣＤＣ様キナーゼ１、宿主細胞因子Ｃ１制御因子１、Ｒａｂ３Ｄ、ＢＬＯＣ−１、膜貫通タンパク質４、酸性ホスファターゼ５、コロイデレミア、ユビキチンＢ、またはジンクフィンガータンパク質１０６。
【０００７】
また、本発明は、自己免疫応答の徴候に関して患者、例えばヒトを評価する方法を提供する。本方法は、患者から採取した試料において、１つ以上の遺伝子のＢ細胞発現レベルを検出し、その発現レベルを、その患者における免疫応答を示す基準発現レベルと比較することを含む。免疫応答は慢性関節リウマチなどの自己免疫応答であることができる。試料は血液、リンパ、または滑膜などの流体試料であることができ、場合によっては、例えば蛍光励起細胞分取などにより、検出工程に先だってＢ細胞を試料から精製することができる。１つ以上の遺伝子は、好ましくは、以下に挙げる遺伝子の少なくとも一つを含む：ＰＢＥＦ／ビスファチン、ＡＨＣＹＬ１（Ｓ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ様１）、ＰＫＣ−δ、ＧＮＧ１２、ホスホジエステラーゼ７Ａ、ＦＡＭ６０Ａ、ＴＣＴＥ１Ｌ、ＳＴＵＢ１／ＣＨＩＰ、コピンＩＩＩ、ＳＴＫ１０、ＳＴＥ−２０様キナーゼ、ＭＡＰ４Ｋ５、ＭＡＰキナーゼ相互作用セリン／スレオニンキナーゼ２、ホスホイノシチド−３−キナーゼ調節サブユニット４（ｐ１５０）、Ｒｏ５２、ＳＭＣ５、ＷＤリピートドメイン１２、エキソソームコンポーネント１０、カルパイン３、Ｓｒｃ様アダプタータンパク質、ＣＤＣ様キナーゼ１、宿主細胞因子Ｃ１制御因子１、Ｒａｂ３Ｄ、ＢＬＯＣ−１、膜貫通タンパク質４、酸性ホスファターゼ５、コロイデレミア、ユビキチンＢ、またはジンクフィンガータンパク質１０６。Ｂ細胞において検出される遺伝子発現は内在性遺伝子のものであるだろうから、そのＢ細胞がヒト由来であると１つ以上のヒト遺伝子の発現が検出され、そのＢ細胞がマウス由来であると１つ以上のマウス遺伝子の発現が検出されるという具合になるだろう。ある実施形態では、１つ以上の遺伝子が、以下に挙げるヒト遺伝子の少なくとも一つを含む：ＡＨＣＹＬ１（Ｓ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ様１）、ＰＫＣ−δ、ＧＮＧ１２、ホスホジエステラーゼ７Ａ、ＦＡＭ６０Ａ、ＴＣＴＥ１Ｌ、ＳＴＵＢ１／ＣＨＩＰ、コピンＩＩＩ、ＳＴＫ１０、ＳＴＥ−２０様キナーゼ、ＭＡＰ４Ｋ５、ＭＡＰキナーゼ相互作用セリン／スレオニンキナーゼ２、ホスホイノシチド−３−キナーゼ調節サブユニット４（ｐ１５０）、Ｒｏ５２、ＳＭＣ５、ＷＤリピートドメイン１２、エキソソームコンポーネント１０、カルパイン３、Ｓｒｃ様アダプタータンパク質、ＣＤＣ様キナーゼ１、宿主細胞因子Ｃ１制御因子１、Ｒａｂ３Ｄ、ＢＬＯＣ−１、膜貫通タンパク質４、酸性ホスファターゼ５、コロイデレミア、ユビキチンＢ、またはジンクフィンガータンパク質１０６。
【０００８】
本発明は、例えばＢ細胞活性化を低減（ｒｅｄｕｃｅ）、防止（ｐｒｅｖｅｎｔ）、または阻止（ｆｏｒｅｓｔａｌｌ）するために、活性化Ｂ細胞においてダウンレギュレートされる遺伝子もしくは遺伝子産物、例えばコピンＩＩＩ、宿主細胞因子制御因子Ｉ、Ｒａｂ３Ｄ、ＢＬＯＣ−１、膜貫通タンパク質４、酸性ホスファターゼ５、コロイデレミア、ユビキチンＢ、もしくはＳＴＫ１０を活性化することによって、または活性Ｂ細胞においてアップレギュレートされる遺伝子もしくは遺伝子産物、例えばＡＨＣＹＬ１（Ｓ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ様１）、ＰＫＣ−δ、ＧＮＧ１２、ホスホジエステラーゼ７Ａ、ＳＴＥ−２０様キナーゼ、ＭＡＰキナーゼ相互作用セリン／スレオニンキナーゼ２、ホスホイノシチド−３−キナーゼ調節サブユニット４（ｐ１５０）、ＳＭＣ５、ＷＤリピートドメイン１２、エキソソームコンポーネント１０、カルパイン３、Ｓｒｃ様アダプタータンパク質、ＣＤＣ様キナーゼ１、ＦＡＭ６０Ａ、ＴＣＴＥ１Ｌ、ＳＴＵＢ１／ＣＨＩＰ、ＭＡＰ４Ｋ５、Ｒｏ５２、もしくはジンクフィンガータンパク質１０６を阻害することによって、Ｂ細胞を処置する方法も提供する。本方法は、場合によっては、１つ以上のダウンレギュレートされる遺伝子または遺伝子産物の活性化と、１つ以上のアップレギュレートされる遺伝子または遺伝子産物の阻害とを、両方とも組み入れることができる。本方法は、場合によっては、患者のＢ細胞を処置することにより、患者の慢性関節リウマチを処置するために使用することができる。
【０００９】
本発明はＢ細胞に関する処置を評価するための方法も提供する。本方法は、処置の適用後に、１つ以上の遺伝子のＢ細胞発現レベルを検出し、その発現レベルを、Ｂ細胞活性化状態を示す基準発現レベルと比較することによって、処置の効力を評価することを含む。例えば、基準発現レベルは処置を適用する前の発現レベルに相当することができる。１つ以上の遺伝子は、好ましくは、以下に挙げる遺伝子の少なくとも一つを含む：ＡＨＣＹＬ１、ＰＫＣ−δ、ＧＮＧ１２、ホスホジエステラーゼ７Ａ、ＦＡＭ６０Ａ、ＴＣＴＥ１Ｌ、ＳＴＵＢ１／ＣＨＩＰ、コピンＩＩＩ、ＳＴＫ１０、ＳＴＥ−２０様キナーゼ、ＭＡＰ４Ｋ５、ＭＡＰキナーゼ相互作用セリン／スレオニンキナーゼ２、ホスホイノシチド−３−キナーゼ調節サブユニット４（ｐ１５０）、Ｒｏ５２、ＳＭＣ５、ＷＤリピートドメイン１２、エキソソームコンポーネント１０、カルパイン３、Ｓｒｃ様アダプタータンパク質、ＣＤＣ様キナーゼ１、宿主細胞因子Ｃ１制御因子１、Ｒａｂ３Ｄ、ＢＬＯＣ−１、膜貫通タンパク質４、酸性ホスファターゼ５、コロイデレミア、ユビキチンＢ、およびジンクフィンガータンパク質１０６。患者がヒトであるとき、遺伝子はヒト遺伝子である。
【００１０】
本発明は、活性化Ｂ細胞において（例えば自己免疫疾患時の活性化ヒトＢ細胞において）過剰発現される遺伝子産物、例えばＰＢＥＦ／ビスファチン、ＡＨＣＹＬ１（Ｓ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ様１）、ＰＫＣ−δ、ＧＮＧ１２、ホスホジエステラーゼ７Ａ、ＳＴＥ−２０様キナーゼ、ＭＡＰキナーゼ相互作用セリン／スレオニンキナーゼ２、ホスホイノシチド−３−キナーゼ調節サブユニット４（ｐ１５０）、ＳＭＣ５、ＷＤリピートドメイン１２、エキソソームコンポーネント１０、カルパイン３、Ｓｒｃ様アダプタータンパク質、ＣＤＣ様キナーゼ１、ＦＡＭ６０Ａ、ＴＣＴＥ１Ｌ、ＳＴＵＢ１／ＣＨＩＰ、ＭＡＰ４Ｋ５、Ｒｏ５２、およびジンクフィンガータンパク質１０６を特異的に結合する抗体、例えば精製抗体およびモノクローナル抗体も提供する。本明細書で使用する用語「抗体」は、可変ドメインおよび定常ドメインを持つ完全長抗体、可変ドメインまたは抗原に特異的に結合する能力を持つその一部を保持している抗体フラグメント、単鎖抗体などを包含する。抗原がアクセス可能であると、抗体の投与（例えば細胞培養物への投与またはヒト対象への投与）を、活性化Ｂ細胞（例えば、その抗体で活性化Ｂ細胞を標的化することによって処置しうる慢性関節リウマチであると以前に診断されているヒトに由来するもの）を標的化するために使用することができる。
【００１１】
本発明の他の特徴、目的、および利点は、以下の詳細な説明から明白である。ただし、詳細な説明は、本発明の好ましい実施形態を示すものではあるが、それは例示であって、限定ではないと理解すべきである。当業者には、本発明の範囲に含まれる様々な改変および変更が、詳細な説明から明白になるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】０日目のコラーゲン免疫および２１日目の追加免疫後のマウスにおける関節炎症状の誘発を表す図である。臨床スコアを２８日目、３５日目、４２日目、４９日目、５６日目、６３日目および７０日目に評価し、４本の足の炎症を以下のようにスコア化した：０（炎症なし）；１（１本または２本の腫脹した指）；２（３本以上の腫脹した指または足の軽度〜中等度の腫脹）；３（足全体の広範囲にわたる腫脹）；４（腫脹の消散、足の関節強直）。表示したスコアは、各動物に関する個々の総スコアである。高い臨床スコアを持つ動物は５６日目に屠殺した。したがって、６３日目および７０日目に観察されたスコアは、これらの日に実験に参加しつづけていた、動物の部分集合における疾患の継続的進行を表すのであって、５６日目以降の疾患重症度の減少を表すのではない。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
疾患時に差次的に発現される遺伝子は、その疾患のマーカーとして有用であり、治療的介入の標的としても有用である。慢性関節リウマチのマウスマーカーを使って、Ｂ細胞において差次的に発現される遺伝子を同定した。これらの遺伝子を、本明細書では、「Ｂ細胞活性化調節遺伝子」または「ＢＣＡＲＧ」と呼ぶ。
ＢＣＡＲＧの同定
ヒト慢性関節リウマチに似た自己免疫応答の過程で調節される新規Ｂ細胞標的を同定するために、マウスコラーゲン誘発性関節炎（ＣＩＡ）モデルにおけるＢ細胞の転写プロファイルの時間的変化を評定した。
【００１４】
マウスコラーゲン誘発性関節炎（ＣＩＡ）モデルは、ＲＡの特徴、例えば多発性関節炎、滑膜炎および続発する軟骨／骨びらんなどを全て持つ慢性炎症性疾患である。ＣＩＡはマウスの感受性株、例えばＤＢＡ１／Ｊにおいて、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中に乳化された異種ＩＩ型コラーゲンの免疫（０日目）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）中に乳化されたコラーゲンＩＩの追加免疫（２１日目）によって誘発される。ＣＩＡの発生はＴ細胞に依存すると考えられ、疾患感受性はＭＨＣ領域に関連づけられる。Ｔ細胞活性化に続いて、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ／単球、および活性化滑膜細胞が関与する炎症カスケードがトリガーされる。
【００１５】
免疫および追加免疫後の種々な時点で流入領域リンパ節から精製されたＢ細胞から、遺伝子チップハイブリダイゼーション用のＲＮＡを抽出した。ＣＦＡ（追加免疫についてはＩＦＡ）のみを注射した動物は、類似する全般的免疫応答を示すものの、その関節に関節炎症状を発生させることは決してないので、これらを対照群とした。
【００１６】
ＢＣＡＲＧは実施例１に説明するように同定された。４６０を超える遺伝子が、抗コラーゲン免疫応答を発生させるマウスのＢ細胞中で差次的発現を持つと同定された。これらの遺伝子は、もちろん、マウスＢ細胞の活性化状態を評定するために単独で、または集合的に使用することができ、治療的介入の標的である。ＣＩＡはヒト慢性関節リウマチの広く認識された動物モデルであるから、対応するヒト遺伝子をそのように使用することもできる。これらのヒト遺伝子のいくつかを下記の表に要約し、以下に議論する。
【００１７】
【表１Ａ】
2010501182.tif 000003
【００１８】
【表１Ｂ】
2010501182.tif 000004
【００１９】
ヒトＳ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ様１（ＡＨＣＹＬ１）遺伝子は、アデノシルホモシステイナーゼ２（Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステインヒドロラーゼ２）（ＡｄｏＨｃｙａｓｅ２）とも呼ばれ、ヒト１番染色体上の１ｐ１３．２にマッピングされている。そのタンパク質配列および核酸配列は周知である。代表的なタンパク質配列および核酸配列を、それぞれ配列番号１および配列番号２として、配列表に示す。Ｄｅｋｋｅｒら（２００２）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５３（１２）：９９３−１００１において、ＡＨＣＹＬ１  ｍＲＮＡは血液および皮膚樹状細胞（ＤＣ）の活性化時に著しく増加するが、最終分化した扁桃ＤＣでは減少することが測定された。
ＰＫＣδ
ヒトｎＰＫＣδ遺伝子は３番染色体上の３ｐ２１．３１にマッピングされている。ヒト遺伝子に対応するタンパク質配列および核酸配列は周知であり、代表的な核酸配列およびタンパク質配列を、それぞれ配列番号３および配列番号４として提供する。
【００２０】
ｎＰＫＣδはＢ細胞シグナリングに関与し、種々な細胞タイプの増殖、アポトーシス、および分化の調節に関与する。ｎＰＫＣδは、正常マウスのリンパ器官のＢおよびＴリンパ球、大脳、ならびに腸に最も豊富に存在する。ｎＰＫＣδは転写因子ＣＲＥＢをＳｅｒ−１３３でリン酸化して、その活性化を促進する。Ｍｉｙａｍｏｔｏら（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  ４１６（６８８３）：８６５−９では、Ｐｒｋｃｄ遺伝子が破壊されたマウスを作出することにより、１年までは生存可能であるが、自己免疫疾患を起こしやすく、数多くの胚中心を含有する肥大したリンパ節および脾臓を持つことが観察された。Ｍｅｃｋｌｅｎｂｒａｅｕｋｅｒら（２００４）Ｎａｔｕｒｅ  ４３１：４５６−４６１は、マウスモデルを使って、セリン／スレオニンプロテインキナーゼＣ−δによる末梢Ｂ細胞サバイバルの調節機序、すなわち休止Ｂ細胞の自発的な死は、ヒストンＨ２Ｂのセリン−１４におけるリン酸化に寄与するＰｋｃｄの核局在化によって調節されることを報告した。
ＧＮＧ１２；グアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質），γ１２
Ｇタンパク質γ１２はヒト１番染色体上の１ｐ３１．３にマッピングされている。そのタンパク質配列および核酸配列は周知であり、代表的な核酸配列およびタンパク質配列を配列番号５および配列番号６として提供する。このタンパク質は、活性化ＰＫＣによるリン酸化の標的であると報告されている（Ｍｏｒｉｓｈｉｔａら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（４９）：２９４６９−２９４７５）。
ＰＤＥ７Ａ；ホスホジエステラーゼ７Ａ
ヒトＰＤＥ７Ａ遺伝子は８番染色体上の８ｑ１３にマッピングされている。ヒト遺伝子のタンパク質配列および核酸配列は既知であり、代表的な配列を配列番号７および配列番号８として提供する。ＰＤＥ７Ａはヒト炎症誘発細胞および免疫細胞において発現され、サイトカイン産生、増殖および活性化マーカーの発現を含むヒトＴ細胞機能を調節する潜在能力を持つ。
ＳＴＥ−２０様キナーゼ（ＳＬＫ）
Ｓｔｅ２０グループキナーゼはＭＡＰキナーゼカスケードの制御因子であると提唱されている。ＳＬＫはヒト１０番染色体上の１０ｑ２５．１にマッピングされている。ＳＬＫの核酸配列およびタンパク質配列は既知であり、典型的な配列を配列番号９および配列番号１０として提供する。
ＭＡＰ４Ｋ５
１番染色体上の１４ｑ１１．２−ｇ２１にマッピングされているヒトＭＡＰ４Ｋ５遺伝子は、酵母ＳＰＳ１／ＳＴＥ２０キナーゼに対して高い類似性を示すセリン／スレオニンプロテインキナーゼファミリーのメンバーである。ＭＡＰ４Ｋ５は哺乳動物細胞中でＪｕｎキナーゼを活性化することが示されていることから、ストレス応答における役割が示唆される。この遺伝子については、同じタンパク質をコードする、選択的にスプライシングされた２つの転写変異体が記載されている。典型的な核酸配列を配列番号１１および配列番号１３として提示し、タンパク質翻訳を配列番号１２および配列番号１４として２回提示する。ＭＡＰ４Ｋ５はキナーゼ活性を持ち、ＪＮＫを活性化するが、ＥＲＫ１は活性化しない。
ＭＫＮＫ２；ＭＡＰキナーゼ相互作用セリン／スレオニンキナーゼ２；Ｇタンパク質共役受容体キナーゼ７
ＭＫＮＫ２遺伝子はヒト１９番染色体上の１９ｐ１３．３にマッピングされている。この遺伝子は、Ｃ末端が異なるタンパク質をコードする、選択的にスプライシングされた転写変異体を持つと報告されており、どちらも形態のタンパク質も、真核生物開始因子ｅＩＦ４Ｅをリン酸化すると報告されている（Ｓｃｈｅｐｅｒら（２００３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２３（１６）：５６９２−７０５）。典型的な核酸配列を配列番号１５および配列番号１７として提示し、対応するタンパク質配列をそれぞれ配列番号１６および配列番号１８として提示する。
ＦＡＭ６０Ａ；ホモサピエンス配列類似性ファミリー６０，メンバーＡ
ＦＡＭ６０Ａはヒト１２番染色体上の１２ｐ１１にマッピングされている。ヒトＦＡＭ６０Ａのタンパク質配列および核酸配列は既知であり、代表的な配列をそれぞれ配列番号１９および配列番号２０として提供する。
ＴＣＴＥ１Ｌ；ＤＹＮＬＴ３；ダイニン軽鎖Ｔｃｔｅｘ３型
ＴＣＴＥ１ＬはヒトＸ染色体上のＸｐ２１にマッピングされている。ヒトＴＣＴＥ１Ｌのタンパク質配列および核酸配列は既知であり、代表的な配列をそれぞれ配列番号２１および配列番号２２として提供する。
ＰＩＫ３Ｒ４；ホスホイノシチド−３−キナーゼ，調節サブユニット４，ｐ１５０
ＰＩＫ３Ｒ４はインビボでホスホイノシチド−３−キナーゼと会合し、インビトロでその活性を増強する（Ｐａｎａｒｅｔｏｕら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（４）：２４７７−８５）。ＰＩＫ３Ｒ４はヒト３番染色体上の３ｑ２２．１にマッピングされている。ヒトＰＩＫ３Ｒ４のタンパク質配列および核酸配列は既知であり、代表的な配列をそれぞれ配列番号２３および配列番号２４として提供する。
ＳＴＵＢ１／ＣＨＩＰ；ＳＴＩＰ１ホモロジーおよびＵボックス含有タンパク質１
ＣＨＩＰはヒト１６番染色体上の１６ｐ３３にマッピングされている。ヒトＣＨＩＰのタンパク質配列および核酸配列は既知であり、代表的な配列をそれぞれ配列番号２５および配列番号２６として提供する。
【００２１】
Ｊｉａｎｇら（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（４６）：４２９３８−４２９４４は、インビトロユビキチン化アッセイと組換えタンパク質とを使って、ＣＨＩＰが固有のＥ３ユビキチンリガーゼ活性を有し、ユビキチン化を促進することを証明した。この活性はＣ末端Ｕボックス（酵母ＵＦＤ２と類似性を共有するドメイン）に依存した。ＣＨＩＰはストレス応答性ユビキチン結合酵素ファミリーＵＢＣＨ５と機能的にも物理的にも相互作用した。ＣＨＩＰのユビキチンリガーゼ活性の主な標的はＨＳＣ７０そのものであった。ＣＨＩＰは主として短い非典型的マルチユビキチン鎖でＨＳＣ７０をユビキチン化するが、このタンパク質の定常状態レベルまたは半減期に対して、それとわかるほどの影響は持たなかった。著者らは、ＣＨＩＰは真の（ｂｏｎａ  ｆｉｄｅ）ユビキチンリガーゼであり、Ｕボックス含有タンパク質はＥ３の新規ファミリーを構成しうると結論した。
ＳＳＡ１／ＴＲＩＭ２１／Ｒｏ５２
Ｒｏ／ＳＳＡは、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を持つ患者の３５〜５０％およびシェーグレン症候群を持つ患者の９７％までにおいて、自己抗体に結合するリボ核タンパク質である。この遺伝子がコードするタンパク質はトリパータイト（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）モチーフ（ＴＲＩＭ）ファミリーのメンバーである。ＴＲＩＭモチーフは、３つの亜鉛結合ドメイン、ＲＩＮＧ、Ｂ−ボックス１型およびＢボックス２型、ならびにコイルドコイル領域を含む。このタンパク質は、単一のポリペプチドと４つの小ＲＮＡ分子の一つとを含むＲｏＳＳＡリボ核タンパク質の一部である。ＲｏＳＳＡ粒子は細胞質および核の両方に局在する。ＲｏＳＳＡはシェーグレン症候群および全身性エリテマトーデスを持つ患者において自己抗原と相互作用する。
【００２２】
ＴＲＩＭ２１遺伝子はヒト１１番染色体上の１１ｐ１５．５にマッピングされている。この遺伝子については、選択的にスプライシングされた２つの転写変異体が記載されている。代表的な核酸配列およびタンパク質配列をそれぞれ配列番号２７および配列番号２８として提供する。
ＳＭＣ５；ホモサピエンス染色体構造維持５
ヒトＳＭＣ５はヒトＳＭＣ６（Ｔａｙｌｏｒら（２００１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２（６）：１５８３−１５９４）およびヒトＭＭＳ２１（Ｐｏｔｔｓら（２００５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２５（１６）：７０２１−７０３２）と相互作用し、おそらくはＤＮＡ修復に参加する。ＳＭＣ５はヒト９番染色体上の９ｑ２１．１１にマッピングされている。ヒトＳＭＣ５のタンパク質配列および核酸配列は既知であり、代表的な配列をそれぞれ配列番号２９および配列番号３０として提供する。
ＷＤＲ１２；ＷＤリピートドメイン１２
この遺伝子は、ＷＤリピートタンパク質ファミリーのメンバーをコードし、インビボでＰｅｓ１およびＢｏｐ１と会合すると報告され、またリボソームＲＮＡプロセシングに要求されると報告されている（Ｈｏｅｌｚｅｌら（２００５）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７０（３）：３６７−３７８）。この遺伝子はヒト２番染色体上の２ｑ３３．１にマッピングされている。ヒトＷＤＲ１２のタンパク質配列および核酸配列は既知であり、代表的な配列をそれぞれ配列番号３１および配列番号３２として提供する。
ＥＸＯＳＣ１０；エキソソームコンポーネント１０
エキソソームは、種々な細胞過程（いずれもＲＮＡのプロセシングまたは分解に関与するもの）において機能する３’→５’エキソリボヌクレアーゼの複合体である。ヒトＥＸＯＳＣ１０遺伝子は１番染色体上の１ｐ３６．２２にマッピングされている。ＥＸＯＳＣ１０のタンパク質配列および核酸配列は既知である。代表的な核酸配列を配列番号３３および配列番号３５として提供し、対応するアミノ酸翻訳をそれぞれ配列番号３４および配列番号３６として提供する。
ＣＡＰＮ３；カルパイン３
カルパイン３はＢおよびＴリンパ球内では優先的に発現されるが、ナチュラルキラー細胞では発現量が少なく、多形核細胞ではほとんど検出することができない細胞内プロテアーゼである。この遺伝子中の突然変異は肢帯型筋ジストロフィー２型に関連する。この遺伝子は選択的にスプライシングされ、数個の転写変異体および関連タンパク質アイソフォームが既知である。典型的な核酸を配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、および配列番号５３として提示し、対応するポリペプチド配列をそれぞれ配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、および配列番号５４として提示する。
ＳＬＡ；Ｓｒｃ様アダプター；ＳＬＡＰ
Ｓｒｃ様アダプタータンパク質（ＳＬＡＰ）は、ＴＣＲレパートリーが選択される胸腺細胞発生の特異的段階中に、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）−ＣＤ３複合体の発現をダウンレギュレートする。組換えＳＬＡＰは活性型Ｅｃｋ受容体チロシンキナーゼに結合することが示されている。ヒト遺伝子はヒト８番染色体上の８ｑ２２．３−ｑｔｅｒ｜８ｑ２４にマッピングされている。ヒトＷＤＲ１２のタンパク質配列および核酸配列は既知であり、代表的な配列をそれぞれ配列番号５５および配列番号５６として提供する。
ＣＤＣ様キナーゼ１（ＣＬＫ１）
ＣＬＫ１はヒト２番染色体上の２ｑ３３にマッピングされている。ヒトＣＬＫ１遺伝子は、エクソン４を含んで、またはエクソン４を省いて、選択的にスプライシングされる。この遺伝子のタンパク質配列および核酸配列は既知である。代表的な核酸配列を配列番号５７および配列番号５９として提供し、その翻訳産物をそれぞれ配列番号５８および配列番号６０として提供する。
ＨＣＦＣ１Ｒ１；宿主細胞因子Ｃ１制御因子１（ＸＰＯ１依存性）
ＨＣＦＣ１Ｒ１は、細胞性転写因子ＬＺＩＰおよびＧＡＢＰの活性化補助因子であるＨＣＦ−１に結合すると報告されており、ＨＣＦ−１の細胞内局在を調整することによってＨＣＦ−１を調節しうる（Ｍａｈａｊａｎら（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（４６）：４４２９２−４４２９９）。この遺伝子はヒト１６番染色体上の１６ｐ１３．３にマッピングされている。ヒトＨＣＦＣ１Ｒ１のタンパク質配列および核酸配列は既知である。代表的な核酸配列を配列番号６１、配列番号６３、および配列番号６５として提供し、それらの翻訳をそれぞれ配列番号６２、配列番号６４、および配列番号６６として提供する。
ＲＡＢ３Ｄ
Ｒａｂ３Ｄは小胞輸送の既知制御因子である。この遺伝子はヒト１９番染色体上の１９ｐ１３．２にマッピングされている。ヒトＲＡＢ３Ｄのタンパク質配列および核酸配列は既知であり、代表的な配列をそれぞれ配列番号６７および配列番号６８として提供する。
ＢＬＯＣ１Ｓ１；リソソーム関連オルガネラ生合成複合体−１，サブユニット１
ＢＬＯＣ１Ｓ１は、「メラノソームおよび血小板密顆粒などといったエンドソーム−リソソーム系の特殊化した細胞小器官の正常な生合成に必要な遍在的に発現されるマルチサブユニットタンパク質複合体」であるＢＬＯＣ−１（リソソーム関連オルガネラ生合成複合体−１）複合体のサブユニットである（Ｓｔａｒｃｅｖｉｃら（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（２７）：２８３９３−４０１）。この遺伝子はヒト１２番染色体の１２ｑ１３−ｑ１４にマッピングされている。ヒトＢＬＯＣ１Ｓ１のタンパク質配列および核酸配列は既知であり、代表的な配列をそれぞれ配列番号６９および配列番号７０として提供する。
コピンＩＩＩ；ＣＰＮＥ３；カルシウム依存性リン脂質結合タンパク質
ＣＰＮＥ３は、古典的なキナーゼドメインは欠いているものの、内在性キナーゼ活性を持つようである（Ｃａｕｄｅｌｌら（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３９（４２）：１３０３４−４３）。この遺伝子はヒト８番染色体の８ｑ２１．３にマッピングされている。ヒトＣＰＮＥ３のタンパク質配列および核酸配列は既知であり、代表的な配列をそれぞれ配列番号７１および配列番号７２として提供する。
ＴＭＥＭ４；膜貫通タンパク質４
ＭＳＡＰ／ＴＭＥＭ４は、神経突起伸長を強化し、ミオシン調節軽鎖のレベルを増加させるＭＩＲ相互作用タンパク質である（Ｂｏｒｎｈａｕｓｅｒら（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（３７）：３５４１２−３５４２０）。ＴＭＥＭ４遺伝子はヒト１２番染色体の１２ｑ１５にマッピングされている。ヒトＴＭＥＭ４のタンパク質配列および核酸配列は既知であり、代表的な配列をそれぞれ配列番号７３および配列番号７４として提供する。
ＳＴＫ１０
ＳＴＫ１０は、ｐｏｌｏ様キナーゼキナーゼファミリーのメンバーであり、造血組織では多量に発現される（Ｗａｌｔｅｒら（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（２０）：１８２２１−８）。この遺伝子はヒト５番染色体の５ｑ３５．１にマッピングされている。ヒトＳＴＫ１０のタンパク質配列および核酸配列は既知であり、代表的な配列をそれぞれ配列番号７５および配列番号７６として提供する。
酸性ホスファターゼ５；ＡＣＰ５；酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＣＰ）
ＡＣＰ５は、オルトリン酸モノエステルからアルコールおよびオルトリン酸塩への変換を触媒する鉄含有糖タンパク質である。ＡＣＰ５は最も基本的な酸性ホスファターゼであり、Ｌ−酒石酸によって阻害されない唯一の形態である。慢性関節リウマチでは、おそらく炎症性マクロファージまたは樹状細胞が分泌したと思われる血清酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼアイソフォームが検出されている（Ｊａｎｃｋｉｌａら（２００２）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ａｃｔａ３２０（１−２）：４９−５８）。活性化マクロファージおよび破骨細胞は多量の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼを発現させる。ＡＣＰ５によって生成される反応性酸素種は、活性化マクロファージにおける抗原提示中に、外来化合物の分解に参加しうる。この遺伝子はヒト１９番染色体上の１９ｐ１３．３−ｐ１３．２にマッピングされている。ヒトＡＣＰ５のタンパク質配列および核酸配列は既知であり、代表的な配列をそれぞれ配列番号７７および配列番号７８として提供する。
ＣＨＭ；コロイデレミア（Ｒａｂエスコートタンパク質１）
コロイデレミア遺伝子は、膜輸送に関与するタンパク質Ｒａｂエスコートタンパク質−１（ＲＥＰ１）をコードする。この遺伝子はヒトＸ染色体上のＸｑ２１．２にマッピングされている。ヒト遺伝子のタンパク質配列および核酸配列は既知であり、代表的な配列をそれぞれ配列番号７９および配列番号８０として提供する。
ＰＢＥＦ
プレＢ細胞コロニー強化因子（ＰＢＥＦ）は、初期Ｂ細胞の増殖因子であり、ビスファチンおよびニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｎａｍｐｔ）とも呼ばれている。この遺伝子は７ｑ２２．２にマッピングされており、そのタンパク質配列および核酸配列は周知である。代表的な核酸配列およびタンパク質配列を配列表にそれぞれ配列番号８１および配列番号８２として示す。ＰＢＥＦはＩＬ−１βによって好中球中でアップレギュレートされ、種々な炎症刺激に呼応して、アポトーシスの新規阻害因子として機能する。ＰＢＥＦは、ヒトでもマウスでも内臓脂肪に高度に濃縮され、肥満の発達時には血漿中でその発現レベルが増加するアディポサイトカインでもある。
ＵＢＢ；ユビキチンＢ
ユビキチンＢ遺伝子は、分解されるべきタンパク質に共有結合されるユビキチンをコードする。この遺伝子はヒト１７番染色体上の１７ｐ１２−ｐ１１．２にマッピングされている。ヒト遺伝子のタンパク質配列および核酸配列は既知である。代表的な核酸配列を配列番号８３として提供する。その翻訳産物は最後のアミノ酸として余分なバリンを持つポリユビキチン前駆体であり、ポリユビキチン前駆体の代表的なアミノ酸配列を配列番号８４として提供する。
ＺＦＰ１０６；ジンクフィンガータンパク質１０６；ＳＨ３ＢＰ３；ＳＩＲＭ（ｓｏｎ  ｏｆ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｕｔａｎｔ）
ＺＦＰ１０６遺伝子は、核小体と共局在するジンクフィンガータンパク質である（Ｇｒａｓｂｅｒｇｅｒら（２００５）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３７（７）：１４２１−３７）。この遺伝子はヒト１５番染色体上の１５ｑ１５．１にマッピングされている。ヒト遺伝子のタンパク質配列および核酸配列は既知であり、代表的な配列をそれぞれ配列番号８５および配列番号８６として提供する。
評価および処置
本発明のＢＣＡＲＧは、関節炎関連Ｂ細胞活性化の評価、および関節炎または他の自己免疫疾患の予測、診断または予後に使用することができる。例えばこれらの遺伝子は、慢性関節リウマチを発症しそうな患者を同定するために使用することができる。これらの遺伝子は、関心対象の患者における自己免疫疾患の進行またはその処置の有効性を評価するために使用することもできる。
【００２３】
関心対象者のＢ細胞試料におけるＢＣＡＲＧの発現レベルは、その関心対象者における慢性関節リウマチの進行または処置を予測、診断または評定するために、同じ遺伝子の基準発現レベルと比較することができる。基準発現レベルは、関心対象者の試料と同じタイプのＢ細胞試料（例えば、血液、リンパ、脾臓、または滑膜などの同じ由来源組織から得られるもの）を使って調製することができる。同じ調製手法または方法論を使って両方の発現レベルを決定することができる。基準発現レベルは前もって決定または前もって記録することができる。また、関心対象者のＢＣＡＲＧ発現レベルの決定と同時に、または関心対象者のＢＣＡＲＧ発現レベルの決定後に、調製することもできる。
【００２４】
本発明で使用される基準発現レベルは、典型的には、無疾患のヒトまたは慢性関節リウマチを持つこともしくは発症することがわかっている患者のＢ細胞試料における当該遺伝子の発現パターンを示唆する値または範囲を含むか、そのような値または範囲からなる。一実施形態では、基準発現レベルが、無疾患のヒトのＢ細胞試料における当該遺伝子の平均発現レベルを含む。別の例では、基準発現レベルが、慢性関節リウマチを持つことまたは発症することがわかっている患者のＢ細胞試料における当該遺伝子の平均発現レベルを含む。算術平均、調和平均、絶対値の平均、対数変換値の平均、および加重平均を含む（ただしこれらに限定されない）任意の平均化法を使用することができる。
【００２５】
本発明では他のタイプの基準発現レベルを使用することもできる。例えば数値的閾を基準として使用することができる。
【００２６】
関心対象の患者の発現レベルおよび基準発現レベルは、任意の形で構成させることができる。発現レベルは絶対レベル、標準化レベル、または相対レベルであることができる。適切な標準化手法には、核酸アレイ遺伝子発現解析で使用されているもの、またはＨｉｌｌら（２００１）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．，２：ｒｅｓｅａｒｃｈ００５５．１−００５５．１３に記載されているものなどがあるが、これらに限定されない。一例では、平均が０になり、標準偏差が１になるように、発現レベルを標準化する。別の例では、当業者には理解されるとおり、内部対照または外部対照に基づいて発現レベルを標準化する。さらに別の例では、Ｂ細胞内で既知の存在度を持つ１つ以上の対照転写物に対して、発現レベルを標準化する。
【００２７】
Ｂ細胞は、対象から得られる任意の適切な由来源から単離することができる。由来源は血液試料またはリンパ試料などの流体試料であることができる。一例として、血液、例えば末梢血を対象から単離することができ、次に細胞調製用チューブ（ＣＰＴ）を使って末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を単離することができる。非Ｂ細胞を選択的に結合する抗体カラムにＰＢＭＣを通すことにより、Ｂ細胞を高度に濃縮することができる。
【００２８】
関心対象者におけるＢＣＡＲＧの発現レベルは、その対象のＢ細胞試料におけるそれら遺伝子のそれぞれのＲＮＡ転写物レベルを測定することによって決定することができる。この目的に適した方法には、例えば定量ＲＴ−ＰＣＲ、競争的ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、ディファレンシャルディスプレイＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット、インサイチューハイブリダイゼーション、スロットブロット法、ヌクレアーゼ保護アッセイ、および核酸アレイ（ビーズアレイを含む）などがあるが、これらに限定されない。
【００２９】
ＢＣＡＲＧのＲＮＡ転写物の検出には、ＲＮＡまたは対応するｃＤＮＡに相補的なプローブの使用を組み入れることができる。関心対象の転写物にハイブリダイズする能力を持つプローブは、標識されていても、標識されていなくてもよい。標識プローブは、分光測光法的手段、光化学的手段、生化学的手段、生物電子工学的手段、免疫化学的手段、電気的手段、光学的手段、化学的手段、または他の適切な手段によって検出することができる。プローブ用の典型的な標識部分には、放射性同位体、化学発光化合物、標識結合タンパク質、重金属原子、分光学的マーカー、例えば蛍光マーカーおよび色素、磁気ラベル、結合酵素（ｌｉｎｋｅｄ  ｅｎｚｙｍｅ）、質量分析タグ、スピンラベル、電子移動ドナーおよびアクセプタなどがある。一実施形態では、プローブが１つ以上の基板支持体に安定に取り付けられる。核酸ハイブリダイゼーションまたはイムノアッセイは、その基板支持体で直接行うことができる。この目的に適した基板支持体には、ガラス、シリカ、セラミックス、ナイロン、石英ウェハ、ゲル、金属、紙、ビーズ、チューブ、繊維、フィルム、膜、カラムマトリクス、またはマイクロータイタープレートウェルなどがあるが、これらに限定されない。
【００３０】
ノーザンブロットなどのハイブリダイゼーションに基づく方法は、ストリンジェントなまたは高度にストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションおよび洗浄を含むことができる。本明細書にいう「ストリンジェントな条件」は、表２の条件Ｇ〜Ｌと少なくとも同程度にストリンジェントである。「高度にストリンジェントな条件」は、表２のＡ〜Ｆと少なくとも同程度にストリンジェントである。条件毎に、対応するハイブリダイゼーション条件（「ハイブリダイゼーション温度およびバッファ」）下でハイブリダイゼーションを約４時間行った後、対応する洗浄条件（「洗浄温度およびバッファ」）下で、２０分の洗浄を２回行うことができる。
【００３１】
【表２Ａ】
2010501182.tif 000005
【００３２】
【表２Ｂ】
2010501182.tif 000006
【００３３】
疾患遺伝子の発現プロファイルは、関心対象者のＢ細胞試料における各遺伝子のタンパク質産物レベルを測定することによって決定することもできる。この目的に適した方法には、イムノアッセイ（例えばＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、ＦＡＣＳ（蛍光励起細胞分取装置）、ウェスタンブロット、ドットブロット、免疫組織化学、抗体に基づくラジオイメージング、タンパク質アレイ、ハイスループットタンパク質シーケンシング、二次元ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、および質量分析などがあるが、これらに限定されない。また、疾患遺伝子がコードするタンパク質産物の生物学的活性（例えば酵素活性またはタンパク質／ＤＮＡ結合活性）も、関心対象のＢ細胞試料における遺伝子の発現レベルを測定するために使用することができる。
【００３４】
関心対象者の発現レベルと基準発現レベルとの間の相違または類似性は、例えば、標準化後に、変化倍率、絶対的相違、または相対的相違を評価することによって決定することができる。一例において、関心対象者におけるＢＣＡＲＧの発現レベルと、対応する基準発現レベルとは、それら二つのレベルの間の相違が基準発現レベルの５０％、４０％、３０％、２０％、または１０％未満である場合に、類似しているとみなされる。別の例において、関心対象者におけるＢＣＡＲＧの発現レベルと、対応する基準発現レベルとは、前者のレベルが基準発現レベルの標準偏差（またその倍数もしくは分数）内にある場合に、類似しているとみなされる。
【００３５】
ある患者の複数のＢＣＡＲＧの発現レベルを評価する場合は、その患者に由来するＢ細胞におけるＢＣＡＲＧの発現プロファイルを作成し、それを基準発現プロファイルと比較することができる。関心対象者の発現プロファイルと基準発現プロファイルとの間の総合的類似性に関する基準は、予測、診断または評価に関する正確度（正しいコールと間違ったコールとの合計に対する正しいコールの比率）が比較的高くなるように選択することができる。例えば類似性基準は、予測、診断または評価に関する正確度が少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上になるように選択することができる。一例では、関心対象者の発現プロファイル中の構成要素の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上が基準発現プロファイル中の対応する構成要素に類似するとみなされる場合に、総合的類似コールがなされる。発現プロファイル中の異なる構成要素は、比較に際して同じ重みまたは異なる重みを持ちうる。予測、診断または評価の正確度を改善するために、遺伝子発現に基づく方法を他の臨床検査と併用することもできる。
【００３６】
重みつき投票（ｗｅｉｇｈｔｅｄ  ｖｏｔｉｎｇ）アルゴリズムは、関心対象者にクラスへの帰属関係を割り当てることができる。Ｇｏｌｕｂら（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２８６：５３１−５３７；Ｓｌｏｎｉｍら（２０００）Ｐｒｏｃｓ．ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｏｕｒｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ、Ａｐｒｉｌ  ８−１１、ｐｐ．２６３−２７２を参照されたい。この目的に適したソフトウェアプログラムには、ＧｅｎｅＣｌｕｓｔｅｒ２ソフトウェア（Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、マサチューセッツ州ケンブリッジ）があるが、これに限定されない。
【００３７】
重みつき投票解析の一形態では、関心対象者が二つのクラス（すなわちクラス０またはクラス１）の一方に割り当てられ、各クラスは異なる状態（例えば慢性関節リウマチまたは無疾患）を表す。例えばクラス０は無疾患のヒトを含むことができ、クラス１は慢性関節リウマチ患者を含む。一組のＢＣＡＲＧを表１から選択して、分類子（ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ）（すなわちクラス予測子（ｃｌａｓｓ  ｐｒｏｄｉｃｔｏｒ））を形成させることができる。分類子中の各遺伝子は、二つのクラス（クラス０またはクラス１）の一方に、重みつきの票（ｖｏｔｅ）を投じる。遺伝子「ｇ」の票は、ｖｇ＝ａｇ（ｘｇ−ｂｇ）と定義することができ、式中、ａｇはＰ（ｇ，ｃ）に等しく、遺伝子「ｇ」の発現レベルとクラス０およびクラス１間のクラス識別との間の相関関係を反映する。ｂｇは［ｘ０（ｇ）＋ｘ１（ｇ）］／２に等しく、これは、クラス０およびクラス１における遺伝子「ｇ」の発現レベルの平均ｌｏｇ（ｍｅａｎ  ｌｏｇ）の平均値である。ｘｇは、関心対象の試料における遺伝子「ｇ」の発現レベルの標準化ｌｏｇ（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  ｌｏｇ）を表す。正のｖｇはクラス０への票を示し、負のｖｇはクラス１への票を示す。Ｖ０は全ての正の票の和を表し、Ｖ１は全ての負の票の和の絶対値を表す。予測強度（ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｓｔｒｅｎｇｔｈ：ＰＳ）は、ＰＳ＝（Ｖ０−Ｖ１）／（Ｖ０＋Ｖ１）と定義される。
【００３８】
本発明では任意の数のＢＣＡＲＧを使用することができる。一実施形態では、表１から選択される少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、またはそれ以上の遺伝子を、関心対象者における免疫応答の処置の有効性の予測、診断または評定に使用する。本発明で使用される疾患遺伝子は、慢性関節リウマチ患者では無疾患のヒトと比較してアップレギュレートされる遺伝子、ならびに慢性関節リウマチ患者では無疾患のヒトと比較してダウンレギュレートされる遺伝子を含むように選択することができる。
【００３９】
本発明のＢＣＡＲＧは、Ｂ細胞媒介免疫応答を調整するための薬物を同定または試験するために使用することもできる。ＢＣＡＲＧ発現レベルを、無疾患のヒトにおける発現レベルにより一層似かよった状態にまで戻す薬物候補の能力は、自己免疫疾患におけるその薬物候補の有効性を示唆する。薬物候補をスクリーニングまたは評定するための方法は当技術分野では周知である。これらの方法は、動物モデルで行うか、またはヒト臨床試験中に行うことができる。
【００４０】
本発明では、ＢＣＡＲＧ（その一部は自己免疫疾患を持つ患者のＢ細胞中で過少発現される）をコードする発現ベクターも考えられる。それらの発現ベクターをその必要がある患者に導入することにより、これらの遺伝子の異常な発現を修正することができる。この目的に適した発現ベクターおよび遺伝子送達技法は、当技術分野では周知である。
【００４１】
さらにまた、一部のＢＣＡＲＧは自己免疫疾患を持つ患者のＢ細胞において過剰発現されるので、本発明では、ＢＣＡＲＧまたはそれをコードする発現ベクターに対してアンチセンスである配列も考えられる。アンチセンス配列またはそれをコードする発現ベクターを導入することにより、これらの疾患遺伝子の異常な発現を修正することができる。
【００４２】
ＢＣＡＲＧの発現はＲＮＡ干渉（「ＲＮＡｉ」）によって阻害することもできる。ＲＮＡｉは転写後遺伝子サイレンシング（「ＰＴＧＳ」）において使用される技法であり、この技法では標的にされた遺伝子活性が特異的に打ち消される。一実施形態では、標的遺伝子の発現をサイレンシングするために、少なくとも約２１ヌクレオチドのｄｓＲＮＡが細胞に導入される。
【００４３】
さらにまた本発明はＢＣＡＲＧがコードするポリペプチドを特異的に認識する抗体を特徴とする。これらの抗体は、それを必要とする患者に投与することができる。一実施形態において、本発明の抗体は、疾患遺伝子の活性を実質的に減少させるか、または阻害することができる。例えば抗体は、ＢＣＡＲＧの活性を少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上減少させることができる。本発明に好適な抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、またはＦａｂ発現ライブラリーによって産生されるフラグメントがあるが、これらに限定されない。多くの実施形態において、本発明の抗体は、各ＢＣＡＲＧ産物または他の所望の抗原に、少なくとも１０６Ｍ−１、１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１、またはそれ以上の結合アフィニティ定数Ｋａで結合することができる。
【００４４】
本発明の抗体またはポリヌクレオチドを含む医薬組成物を製造することができる。医薬組成物は、意図した投与経路に適合するように製剤化することができる。投与経路の例には、非経口、静脈内、皮内、皮下、経口、吸入、経皮、局所外用、経粘膜、および直腸投与などがあるが、これらに限定されない。望ましい医薬組成物を製造するための方法は当技術分野では周知である。
【００４５】
上述の実施形態および以下の実施例は、限定ではなく例示のために記載されると理解すべきである。本発明の範囲に含まれる種々な改変および変更が本明細書から当業者には明白になるだろう。
【実施例】
【００４６】
（実施例１）
免疫および追加免疫後の種々な時点で流入領域リンパ節から精製したＢ細胞から、遺伝子チップハイブリダイゼーション用のＲＮＡを抽出した。完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）（追加免疫時は不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ））だけを注射した動物は、類似する全般的免疫応答を示すものの、その関節に関節炎症状を発生させることはないので、これらを対照群とした。
関節炎誘発
ＤＢＡ／１ＬａｃＪ雄マウスの尾基部の皮内にＣＦＡのみ（対照群）またはＣＦＡ中に乳化したウシＩＩ型コラーゲン１００μｇ（関節炎誘発受容群）を免疫した。次いで２１日目に、マウスにＩＦＡ（対照群）またはＩＦＡ中のウシＩＩ型コラーゲン１００μｇ（関節炎誘発受容群）を追加免疫した。免疫（０日目）後の２８、３５、４２、４９、５６、６３および７０日目に臨床スコアを評価し、４本の足の炎症を以下のようにスコア化した：
０：炎症なし
１：１本または２本の腫脹した指
２：３本以上の腫脹した指または軽度〜中等度の腫脹
３：足全体の広範囲にわたる腫脹
４：腫脹の消散、足の関節強直。
【００４７】
図１は、転写プロファイリング実験に使用した動物と並行する別個の動物のコホートから得られた疾患の進行を示す。
ＲＮＡの単離、定量およびハイブリダイゼーション
ＣＤ１９抗体を用いるＦＡＣＳ選別によってリンパ節試料からＢ細胞を単離した。標準的なＱｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙミニキット手順を使って全ＲＮＡをＢ細胞から極めて高純度（範囲８８．５％〜９９．５％）に精製した。ＲＮＡをＵＶ−Ｖｉｓ吸光度スペクトルによって定量したところ、全ＲＮＡ量はおおむね１μｇ程度（５００ｎｇ〜３．５μｇの範囲）だった。全ＲＮＡ量が少ないため、２ラウンド線形増幅法を使用した。後に解析に影響を及ぼすであろう試料処理バイアスが導入される可能性を避けるために、ＲＮＡ単離工程の後に、まず試料をランダム化した。ビオチン化ｃＲＮＡを調製するために、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ｔｗｏ−ｃｙｃｌｅ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｌａｂｅｌｉｎｇキットと一緒に提供されるプロトコールに従った。
【００４８】
ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘチップＭＯＥ４３０  ２．０へのチップハイブリダイゼーションには、標準的プロトコールを使用した。
【００４９】
全ての試料について標的作成には２ラウンドの増幅が必要だったが、さらなる解析から除外する必要がある系統的異常値（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｏｕｔｌｉｅｒ）はほとんどなかった。一つの試料群の複製試料間のピアソン相関は高かったことから（ｒ−Ｐｅａｒｓｏｎ＞９６％、おおむね＞９８％）、与えられた時間／処置点におけるロバストで再現性のあるＢ細胞応答が示された。
【００５０】
教師なし（２元）クラスタリングにより、試料レプリケートを、おおむね隣同士にグループ分けし、試料セット全体を、以下のように記述することができる３つの主要分枝に分割した：
・ナイーブ（全てのナイーブ試料＋免疫後３０日および免疫後３５日由来の試料）
・プレ応答（全ての２日ＣＦＡまたはＣＦＡ＋ＣＩＩ）および初期応答（６、８および２０日試料）
・追加免疫後（極後期（３０〜３５日）の試料を除き、追加免疫後に得られる試料の大半）。
【００５１】
以後の転写プロファイリング解析では、２１日目の追加免疫付近の時点に焦点を絞った。というのも、この処置は、ＣＦＡ＋ＣＩＩ処置動物から得られるリンパ節由来Ｂ細胞において、ＣＦＡ注射動物のみから得られる応答よりも強い、ロバストな応答を与えたからである。２２日目（追加免疫の１日後）にＣＦＡ＋ＣＩＩ処置動物から得られるＢ細胞の差次的発現を、以下の条件のいずれかにおいてやはり差次的である遺伝子を差し引いて探すことにより、差次的遺伝子リストを確立した：
・２２日目にＣＦＡ処置動物から得られるＢ細胞と２日目ナイーブとの間で差次的に発現される遺伝子（差次的遺伝子リストをコラーゲン応答特異的遺伝子に集中させるため）
・２０日目にＣＦＡまたはＣＦＡ＋ＣＩＩ処置動物から得られるＢ細胞と２日目ナイーブとの間で差次的に発現される遺伝子（初期応答中に誘発されるが、このモデルにおけるＲＡ様症状を生じさせるのに不可欠な追加免疫後のＢ細胞活性化には必ずしも必要とされない遺伝子を避けるため）。
【００５２】
この解析により、ＣＦＡ＋ＣＩＩ追加免疫後にＢ細胞において差次的に発現され、他の全ての基準に合致する４７０の遺伝子が明らかになった。これらの遺伝子を表３に提示する。表３には、遺伝子名の他に、追加免疫後Ｂ細胞をナイーブＢ細胞と比較した場合の遺伝子発現の変化倍率（正の数字はナイーブＢ細胞と比較した発現量の増加を示し、負の数字は発現量の減少を示す）；発現レベルの相違の有意性を示すｔ検定ｐ値；ナイーブ試料における平均発現レベル；および追加免疫後試料における平均発現レベルが含まれる。
【００５３】
【表３Ａ】
2010501182.tif 000007
【００５４】
【表３Ｂ】
2010501182.tif 000008
【００５５】
【表３Ｃ】
2010501182.tif 000009
【００５６】
【表３Ｄ】
2010501182.tif 000010
【００５７】
【表３Ｅ】
2010501182.tif 000011
【００５８】
【表３Ｆ】
2010501182.tif 000012
【００５９】
【表３Ｇ】
2010501182.tif 000013
【００６０】
【表３Ｈ】
2010501182.tif 000014
【００６１】
【表３Ｉ】
2010501182.tif 000015
【００６２】
【表３Ｊ】
2010501182.tif 000016
【００６３】
【表３Ｋ】
2010501182.tif 000017
【００６４】
【表３Ｌ】
2010501182.tif 000018
【００６５】
【表３Ｍ】
2010501182.tif 000019
【００６６】
【表３Ｎ】
2010501182.tif 000020
【００６７】
【表３Ｏ】
2010501182.tif 000021
【００６８】
【表３Ｐ】
2010501182.tif 000022
【００６９】
【表３Ｑ】
2010501182.tif 000023
【００７０】
【表３Ｒ】
2010501182.tif 000024
【００７１】
【表３Ｓ】
2010501182.tif 000025
【００７２】
【表３Ｔ】
2010501182.tif 000026
【００７３】
【表３Ｕ】
2010501182.tif 000027
【００７４】
【表３Ｖ】
2010501182.tif 000028
【００７５】
【表３Ｗ】
2010501182.tif 000029
【００７６】
【表３Ｘ】
2010501182.tif 000030
【００７７】
【表３Ｙ】
2010501182.tif 000031
【００７８】
【表３Ｚ１】
2010501182.tif 000032
【００７９】
【表３Ｚ２】
2010501182.tif 000033
【００８０】
【表３Ｚ３】
2010501182.tif 000034
【００８１】
上述した本発明の説明は実例および解説を与えるものであるが、本発明を網羅しているつもりはなく、本発明をここに開示したものだけに限定しようとするものでもない。変更および変形は先に教示した内容に照らして可能であるか、または本発明の実施によって獲得される。したがって本発明の範囲は請求項およびその等価物によって定義されることを注記する。
【００８２】
本願は、２００６年８月２５日に出願された米国仮特許出願第６０／８４０，３８０号に関係し、この仮特許出願は、あらゆる目的で、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる。
【図１】
2010501182.tif 000035
【配列表】
2010501182000001.app
【国際調査報告】
2010501182.tif 000036
2010501182.tif 000037
2010501182.tif 000038
2010501182.tif 000039
2010501182.tif 000040