(57)【要約】本発明は、抗Ｒｏｂｏ４抗体、およびこの抗体を含む組成物、ならびにこれらの抗体を用いる方法であって、診断方法および治療方法を包含する方法を提供する。一つの実施形態において、本発明は、Ｒｏｂｏ４（例えば、ヒトおよび／またはマウスのＲｏｂｏ４などの霊長類および／またはげっ歯類のＲｏｂｏ４を含む）に特異的に結合する抗体、ならびにこのような抗体を用いる診断および治療の方法を提供する。別の実施形態では、この抗体は、ヒト化されるか、またはヒトである。ある実施形態では、この抗体は以下からなる群より選択される：インタクトな抗体、抗体改変体、および抗体の誘導体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、およびＦｖ。
2010518115.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗Ｒｏｂｏ４抗体であって：
（ｉ）ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号１）である配列Ａ１−Ａ１１を含む、ＨＶＲ−Ｌ１
（ｉｉ）ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号２）である配列Ｂ１−Ｂ７を含む、ＨＶＲ−Ｌ２
（ｉｉｉ）ＱＱＳＹＴＴＰＰＴ（配列番号３）である配列Ｃ１−Ｃ９を含む、ＨＶＲ−Ｌ３
（ｉｖ）ＧＦＴＩＮＧＹＹＩＨ（配列番号１７）である配列Ｄ１−Ｄ１０を含むＨＶＲ−Ｈ１
（ｖ）ＧＦＩＹＰＡＧＧＤＴＤＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１８）である配列Ｅ１−Ｅ１８を含む、ＨＶＲ−Ｈ２；
（ｖｉ）ＡＲＬＩＧＮＫＦＧＷＳＳＹＧＭＤＹ（配列番号１９）である配列Ｆ１−Ｆ１７を含むＨＶＲ−Ｈ３；および
（ｖｉｉ）配列番号１、２、３、１７、１８、または１９において示された配列の少なくとも１つのアミノ酸残基の挿入、欠失または置換を含む少なくとも１つの改変体ＨＶＲ、
からなる群より選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの超可変領域（ＨＶＲ）配列を含む、抗体。
【請求項２】
図１Ａおよび図２Ａに示される配列番号７２〜９７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
図１Ｂおよび図２Ｂに示される配列番号１４０〜１６５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
請求項１に記載の抗体であって、
配列番号１を含むＨＶＲ−Ｌ１、
配列番号２を含むＨＶＲ−Ｌ２、および
配列番号２０を含むＨＶＲ−Ｌ３、
を含む軽鎖可変ドメインを含む、抗体。
【請求項５】
請求項１に記載の抗体であって、
配列番号１７を含むＨＶＲ−Ｈ１、
配列番号１８を含むＨＶＲ−Ｈ２、および
配列番号１９を含むＨＶＲ−Ｈ３、
を含む重鎖可変ドメインを含む、抗体。
【請求項６】
請求項１に記載の抗体であって、
（ｉ）配列番号１を含むＨＶＲ−Ｌ１、
配列番号２を含むＨＶＲ−Ｌ２、および
ＱＱＳＲＳＤＨＰＴ（配列番号２０）を含むＨＶＲ−Ｌ３、
を含む軽鎖可変ドメインと
（ｉｉ）配列番号１７を含むＨＶＲ−Ｈ１、
配列番号１８を含むＨＶＲ−Ｈ２、および
配列番号１９を含むＨＶＲ−Ｈ３、
を含む重鎖可変ドメインと、
を含む、抗体。
【請求項７】
前記抗体がヒト化されている、請求項１に記載の抗体。
【請求項８】
前記抗体がＦａｂ、Ｆａｂ’、および（Ｆａｂ’）２からなる群より選択される、請求項１に記載の抗体。
【請求項９】
細胞傷害性剤をさらに含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項１０】
前記細胞傷害性剤が、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ−２’（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシン（ＤＭ１）、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
さらに検出可能な標識を含む、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
前記検出可能な標識が：ビオチン、蛍光色素、放射性核種、キレート剤１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ、Ｎ’、Ｎ’’、Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）、マイクロバブル、ペルフルオロカーボンナノ粒子エマルジョン、金属粒子、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１１に記載の抗体。
【請求項１３】
前記検出可能な標識が、システイン残基で前記抗体に共有結合されている、請求項１１に記載の抗体。
【請求項１４】
前記システイン残基が、ＥＵナンバリングに従って重鎖Ｆｃ領域の１１８位である、請求項１３に記載の抗体。
【請求項１５】
血管形成を調節する方法であって、細胞または組織と有効量の請求項１に記載の抗体とを接触させる工程を包含する、方法。
【請求項１６】
前記抗体がさらに細胞傷害性剤を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記血管形成が阻害される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記血管形成が：ガン、アテローム性動脈硬化症、水晶体後部線維増殖症、血管腫、慢性炎症、眼内新生血管疾患、増殖性網膜症、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、血管新生緑内障、移植角膜組織および他の組織の免疫拒絶、関節リウマチ、乾癬およびそれらの組み合わせからなる群より選択される障害に関連する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記血管形成がガンに関連する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記ガンが、扁平上皮細胞癌、肺癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃腸の癌を含む胃癌、膵臓癌、膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路の癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液線癌、腎臓癌または腎癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌、黒色腫、多発性骨髄腫およびＢ細胞リンパ腫、脳腫瘍、頭頸部癌、骨肉腫および血管肉腫、ならびに関連する転移ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞または組織が哺乳動物である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記哺乳動物がヒトである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞と、抗悪性腫瘍剤、化学療法剤、増殖阻害剤、細胞傷害性剤、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される薬剤とを接触させる工程をさらに包含する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
前記薬剤が抗ＶＥＧＦ抗体である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
哺乳動物に対して請求項１１に記載の抗体を投与する工程を包含する、インビボの画像化の方法。
【請求項２６】
前記哺乳動物がヒトである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記哺乳動物が、ガン、アテローム性動脈硬化症、水晶体後部線維増殖症、血管腫、慢性炎症、眼内新生血管疾患、増殖性網膜症、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、血管新生緑内障、移植角膜組織の免疫拒絶、関節リウマチ、乾癬およびそれらの組み合わせからなる群より選択される疾患または障害を有すると疑われる、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、２００７年２月９日に出願された米国仮特許出願第６０／８８９，２１４号、および２００７年２月２３日に出願された米国仮特許出願第６０／８９１，４７５号の利益を主張し、これらの米国仮特許出願の開示は、あらゆる目的のためにそれらの全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は概して、血管形成、ならびに内皮細胞増殖および遊走の分野に関する。さらに詳細には、本発明は、Ｒｏｂｏ４の修飾因子およびこのような修飾因子の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
ラウンドアバウト（Ｒｏｕｎｄａｂｏｕｔ）ファミリーのレセプターは、分子ガイダンス分子であって、軸索の誘導、神経の遊走および白血球の走化性（Ｓｌｉｔタンパク質との相互作用に応答する）を調節する。（Ｓｕｃｈｔｉｎｇら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１９：１２１−１２３（２００５））。ラウンドアバウトレセプター分子は、５つの免疫グロブリンおよび３つのフィブロネクチンドメインをその細胞外領域に含む。マジック・ラウンドアバウト（Ｍａｇｉｃ  Ｒｏｕｎｄａｂｏｕｔ）（すなわち、Ｒｏｂｏ４または内皮細胞特異的分子４（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ４）（ＥＳＣＳＭ４））は、他のラウンドアバウトファミリーのメンバーと構造的に異なる。ヒトのマジック・ラウンドアバウト（Ｒｏｂｏ４）は、２つの免疫グロブリンおよび主要組織適合性遺伝子複合体ドメイン（アミノ酸４６〜１１６および１５１〜２０９）、２つのフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（アミノ酸２５２〜３３５および３４７〜４３２）、膜貫通領域（４６８〜４９０）、およびプロリンリッチ領域（アミノ酸７１５〜７７２）（Ｈｕｍｉｎｉｅｃｋｉら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ７９（４）：５４７−５５２（２００２）、およびその図１を参照のこと）を含む。マウスおよびヒトのＲｏｂｏ４は、７５％のヌクレオチド配列同一性を示す（Ｈｕｍｉｎｉｅｃｋｉら、上掲（２００２））。
【０００４】
Ｒｏｂｏ４の発現分析によって、Ｒｏｂｏ４発現は高度に制限されており、胎盤および腫瘍（肝臓への脳、膀胱および結腸の転移を含む）（腫瘍発現が腫瘍の脈管構造に限定される）において発現が強力である（Ｈｕｍｉｎｉｅｃｋｉら、上掲（２００２））。さらに、Ｒｏｂｏ４発現は、活性な血管形成の部位に関連するが、神経組織では検出されない（Ｈｕｍｉｎｉｅｃｋｉ，Ｌ．ら、上掲（２００２））。
【０００５】
細胞外ドメインを有する膜会合レセプターとして、Ｒｏｂｏ４は、血管形成の間の血管内皮細胞増殖の阻害のために細胞傷害性治療を送達するために有用な標的である。Ｒｏｂｏ４はまた、血管内皮細胞を増殖するための検出可能なマーカーの送達のために有用な標的である。Ｒｏｂｏ４（ＥＣＳＭ４とも呼ばれる）に対して標的化される抗体コンジュゲートはまた、強力な治療化合物として（このコンジュゲートが、細胞毒を含む場合）、および強力な診断マーカーとして（このコンジュゲートが検出可能な標識を含む場合）報告されている（例えば、特許文献１を参照のこと）。
【０００６】
細胞毒または細胞増殖抑制剤（すなわち、ガンの処置において腫瘍細胞を殺傷または阻害する薬物）の局所送達のための抗体−薬物コンジュゲートの使用（ＳｙｒｉｇｏｓおよびＥｐｅｎｅｔｏｓ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９：６０５〜６１４（１９９９）；Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕ−ＤｕｖａｚおよびＳｐｒｉｎｇｅｒ，Ａｄｖ．Ｄｒｇ  Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．２６：１５１〜１７２（１９９７）；特許文献２）によって、腫瘍に対する薬物部分の標的化送達、および薬物の細胞内蓄積が可能になる。
【０００７】
他の分子を標的する多数の抗体−薬物コンジュゲートが開発されているか、開発中である。例えば、ＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標）（イブリツモマブ・チウキセタン，Ｂｉｏｇｅｎ／Ｉｄｅｃ）は、正常なおよび悪性のＢリンパ球の表面に見出されるＣＤ２０抗原に対するマウスＩｇＧ１κモノクローナル抗体、およびチオ尿素リンカーキレーターによって結合された１１１Ｉｎまたは９０Ｙ放射性同位元素から構成される抗体−放射性同位元素コンジュゲートである（Ｗｉｓｅｍａｎら、Ｅｕｒ．Ｊｏｕｒ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２７（７）：７６６−７７（２０００）；Ｗｉｓｅｍａｎら、Ｂｌｏｏｄ  ９９（１２）：４３３６−４２（２００２）；Ｗｉｔｚｉｇら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０（１０）：２４５３−６３（２００２）；Ｗｉｔｚｉｇら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０（１５）：３２６２−６９（２００２））。ＺＥＶＡＬＩＮは、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）に対する活性を有するが、投与は、ほとんどの患者で重篤かつ長期の血小板減少症を生じる。ＭＹＬＯＴＡＲＧ（商標）（ゲムシタビンオゾガマイシン，Ｗｙｅｔｈ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）は、カリケアマイシンに結合されたｈｕＣＤ３３抗体から構成されており、注射による急性骨髄性白血病の処置について２０００年に承認された（Ｄｒｕｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｕｔｕｒｅ（２０００）２５（７）：６８６；特許文献３；特許文献４；特許文献５；特許文献６；特許文献７；特許文献８；特許文献９；特許文献１０）。カンツズマブメルタンシン（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）は、メイタンシノイド薬物部分ＤＭ１に対してジスルフィドリンカーＳＰＰを介して連結されたｈｕＣ２４２抗体から構成されており、結腸、膵臓、胃などのＣａｎＡｇ抗原を発現するガンの処置について開発されている。ＭＬＮ−２７０４（Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍ．，ＢＺＬ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．）は、メイタンシノイド薬物部分ＤＭ１に対して連結された抗前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）モノクローナル抗体から構成されており、前立腺腫瘍の可能性のある処置について開発されている。同じメイタンシノイド薬物部分ＤＭ１は、マウスモノクローナル抗体ＴＡ．１に対して非ジスルフィド切断不能リンカーを通じて連結された（Ｃｈａｒｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：１２７−１３１（１９９２））。このコンジュゲートは、対応するジスルフィドリンカーコンジュゲートよりも２００分の１弱いと報告された。
【０００８】
アウリスタチンペプチドであるアウリスタチンＥ（ＡＥ）およびモノメチルアウリスタチン（ＭＭＡＥ）（ドラスタチンの合成のアナログ）は、以下に対してコンジュゲートされている：（ｉ）癌腫上のＬｅｗｉｓＹに特異的なキメラモノクローナル抗体であるｃＢＲ９６；（ｉｉ）血液学的悪性腫瘍上のＣＤ３０に特異的であるｃＡＣ１０（Ｋｌｕｓｓｍａｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １５（４）：７６５−７７３（２００４）；Ｄｏｒｏｎｉｎａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１（７）：７７８−７８４（２００３）；Ｆｒａｎｃｉｓｃｏら、Ｂｌｏｏｄ  １０２（４）：１４５８−１４６５（２００３）；特許文献１１；（ｉｉｉ）ＣＤ２０を発現するガンおよび免疫障害の処置のための、抗ＣＤ２０抗体、例えば、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）（リツキシマブ）（特許文献１２）；（ｉｖ）結腸直腸癌の処置のための抗−ＥｐｈＢ２抗体２Ｈ９および抗−ＩＬ−８（Ｍａｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４（３）：７８１−７８８（２００４））；（ｖ）Ｅ−セレクチン抗体（Ｂｈａｓｋａｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：６３８７−６３９４（２００３））；ならびに（ｖｉ）他の抗−ＣＤ３０抗体（特許文献１３）。モノメチルアウリスタチン（ＭＭＡＥ）はまた、マウスとヒトとの間で密接な相同性を有する１型ＴＭチロシンキナーゼレセプターであるＥｐｈＢ２Ｒに対する抗体である２Ｈ９に対してコンジュゲートされており、結腸直腸癌細胞で過剰発現される（Ｍａｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４：７８１−７８８（２００４））。
【０００９】
モノメチルアウリスタチンＭＭＡＦは、Ｃ末端にフェニルアラニンを有するアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）の改変体であって（特許文献１４および特許文献１５）、ＭＭＡＥほど強力ではないが、モノクローナル抗体に対してコンジュゲートされた場合はより強力であることが報告されている（Ｓｅｎｔｅｒら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅ  ４５，Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｕｍｂｅｒ  ６２３，ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ  Ｍａｒｃｈ  ２８，２００４）。アウリスタチンＦフェニレンジアミン（ＡＦＰ）；ＭＭＡＥのフェニルアラニン改変体は、抗ＣＤ７０  ｍＡｂである１Ｆ６に対して、フェニレンジアミンスペーサーを介して１Ｆ６のＣ末端を通じて連結された（Ｌａｗら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅ  ４５，Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｕｍｂｅｒ  ６２５，ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ  Ｍａｒｃｈ  ２８，２００４）。
【００１０】
内皮由来の脈管構造の成長および増殖に依存するガンに関連する異常な血管形成を例えば含んでいる、血管形成に関連する疾患および障害を処置するためのさらなる薬物が、当該分野で必要である。例えば、血管の過剰な増殖によって支持されるかまたは生じる、ガンまたは眼の障害において、ならびに生理学的状態を理解または処置するのに血管成長をモニタリングすることが有用である障害または他の生理学的状態において、血管の成長および増殖の検出および可視化のためのさらなる内皮細胞標的化抗Ｒｏｂｏ４抗体−薬物コンジュゲートの必要性も当該分野では存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第２００２０３６７７１号パンフレット
【特許文献２】米国特許第４，９７５，２７８号明細書
【特許文献３】米国特許第４，９７０，１９８号明細書
【特許文献４】米国特許第５，０７９，２３３号明細書
【特許文献５】米国特許第５，５８５，０８９号明細書
【特許文献６】米国特許第５，６０６，０４０号明細書
【特許文献７】米国特許第５，６９３，７６２号明細書
【特許文献８】米国特許第５，７３９，１１６号明細書
【特許文献９】米国特許第５，７６７，２８５号明細書
【特許文献１０】米国特許第５，７７３，００１号明細書
【特許文献１１】米国特許出願公開第２００４／００１８１９４号明細書
【特許文献１２】国際公開第０４／０３２８２８号パンフレット
【特許文献１３】国際公開第０３／０４３５８３号パンフレット
【特許文献１４】米国特許第５，７６７，２３７号明細書
【特許文献１５】米国特許第６，１２４，４３１号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の要旨）
本発明は、Ｒｏｂｏ４（例えば、ヒトおよび／またはマウスのＲｏｂｏ４などの霊長類および／またはげっ歯類のＲｏｂｏ４を含む）に特異的に結合する抗体、ならびにこのような抗体を用いる診断および治療の方法を提供する。ある実施形態では、この抗体は、ヒト化されるか、またはヒトである。ある実施形態では、この抗体は以下からなる群より選択される：インタクトな抗体、抗体改変体、および抗体の誘導体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、およびＦｖ。一実施形態では、本発明は、ヒトＲｏｂｏ４、および必要に応じてマウスＲｏｂｏ４に親和性および特異性を有する抗Ｒｏｂｏ４抗体を提供し、この抗体は、図１Ａ、図１Ｂおよび図２Ｂに示されるような軽鎖および重鎖の可変領域ドメイン配列の超可変領域（ＨＶＲｓ）（配列番号１〜８、１７〜７１）を含むか、それらからなるか、または本質的にそれらからなる。別の実施形態では、本発明は、ヒトＲｏｂｏ４、および必要に応じてマウスＲｏｂｏ４に親和性および特異性を有する抗Ｒｏｂｏ４抗体を提供し、この抗体は、図１Ａ、図１Ｂ、図２Ａ、図２Ｂ、図３Ａ、図３Ｂ、図４Ａおよび図４Ｂに示されるような軽鎖および重鎖の可変領域ドメイン配列（配列番号９〜１６、配列番号１２（ここでＶはＭで置換されている）、および配列番号９９〜１３９）のフレームワーク領域（ＦＲｓ）を含むか、それらからなるか、または本質的にそれらからなる。別の実施形態では、本発明は、ヒトＲｏｂｏ４、および必要に応じてマウスＲｏｂｏ４に親和性および特異性を有する抗Ｒｏｂｏ４抗体を提供し、この抗体は、図１Ａ、および図１Ｂ（配列番号７２〜９７）ならびに図２Ａおよび図２Ｂ（配列番号１４０〜１６５）に示されるような軽鎖および重鎖の可変領域ドメイン配列を含むか、それらからなるか、または本質的にそれらからなる。
【００１３】
一実施形態では、本発明は、抗Ｒｏｂｏ４抗体を提供し、この抗体は：
以下：
（ｉ）ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号１）である配列Ａ１−Ａ１１を含む、ＨＶＲ−Ｌ１と
（ｉｉ）ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号２）である配列Ｂ１−Ｂ７を含む、ＨＶＲ−Ｌ２と
（ｉｉｉ）ＱＱＳＹＴＴＰＰＴ（配列番号３）である配列Ｃ１−Ｃ９を含む、ＨＶＲ−Ｌ３と、
（ｉｖ）ＧＦＴＩＮＧＹＹＩＨ（配列番号１７）である配列Ｄ１−Ｄ１０を含むＨＶＲ−Ｈ１と、
（ｖ）ＧＦＩＹＰＡＧＧＤＴＤＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１８）である配列Ｅ１−Ｅ１８を含む、ＨＶＲ−Ｈ２と；
（ｖｉ）ＡＲＬＩＧＮＫＦＧＷＳＳＹＧＭＤＹ（配列番号１９）である配列Ｆ１−Ｆ１７を含むＨＶＲ−Ｈ３と；
（ｖｉｉ）配列番号１、２、３、１７、１８、または１９において示された配列の少なくとも１つのアミノ酸残基の挿入、欠失または置換を含む少なくとも１つの改変体ＨＶＲと、
からなる群より選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの超可変領域（ＨＶＲ）配列（単数または複数）を含む。
【００１４】
別の実施形態では、本発明は、抗Ｒｏｂｏ４抗体を提供し、この抗体は：
以下：
（ｉ）ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号１）である配列Ａ１−Ａ１１を含む、ＨＶＲ−Ｌ１と
（ｉｉ）ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号２）である配列Ｂ１−Ｂ７を含む、ＨＶＲ−Ｌ２と
（ｉｉｉ）ＱＱＳＹＴＴＰＰＴ（配列番号３）である配列Ｃ１−Ｃ９を含む、ＨＶＲ−Ｌ３と
（ｉｖ）ＧＦＴＩＳＧＳＷＩＨ（配列番号４）である配列Ｄ１−Ｄ１０を含むＨＶＲ−Ｈ１と
（ｖ）ＡＶＩＴＰＡＧＧＹＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５）である配列Ｅ１−Ｅ１８を含む、ＨＶＲ−Ｈ２と；
（ｖｉ）ＳＮＲＹＳＧＱＦＶＰＡＹＡＭＤＹ（配列番号６）である配列Ｆ１−Ｆ１６を含むＨＶＲ−Ｈ３と；
からなる群より選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの超可変領域（ＨＶＲ）配列を含む。
【００１５】
一実施形態では、本発明の抗体のＨＶＲ−Ｌ１は、配列番号１の配列を含む。一実施形態では、本発明の抗体のＨＶＲ−Ｌ２は、配列番号２の配列を含む。一実施形態では、本発明の抗体のＨＶＲ−Ｌ３は、配列番号３の配列を含む。一実施形態では、本発明の抗体のＨＶＲ−Ｈ１は、配列番号４の配列を含む。一実施形態では、本発明の抗体のＨＶＲ−Ｈ２は、配列番号５の配列を含む。一実施形態では、本発明の抗体のＨＶＲ−Ｈ３は、配列番号６の配列を含む。一実施形態では、ＨＶＲ−Ｌ１は、ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＡ（配列番号７）またはＲＡＳＱＤＧＡＲＳＬＡ（配列番号３９）またはＲＡＳＱＤＧＡＩＹＬＡ（配列番号４０）を含む。一実施形態では、ＨＶＲ−Ｌ２は、ＧＡＳＳＲＡＳ（配列番号８）またはＳＡＳＦＬＡＳ（配列番号４１）またはＳＡＳＬＥＳ（配列番号４２）またはＳＡＴＬＡＳ（配列番号４３）またはＳＡＳＦＬＡＳ（配列番号４４）またはＳＡＳＮＬＡＳ（配列番号４５）またはＳＡＳＴＬＡＳ（配列番号４６）を含む。一実施形態では、これらの配列を（本明細書に記載されるとおり組み合わせて）含む本発明の抗体はヒト化されているかまたはヒトである。
【００１６】
一局面では、本発明は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのＨＶＲｓを含む抗体を提供し、ここで各々のＨＶＲは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、および８からなる群より選択される配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなり、ここで配列番号１または７は、ＨＶＲ−Ｌ１に対応し、配列番号２または８はＨＶＲ−Ｌ２に対応し、配列番号３は、ＨＶＲ−Ｌ３に対応し、配列番号４はＨＶＲ−Ｈ１に対応し、配列番号５はＨＶＲ−Ｈ２に対応し、かつ配列番号６はＨＶＲ−Ｈ３に対応する。一実施形態では、本発明の抗体は、配列番号７を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号２を含むＨＶＲ−Ｌ２、配列番号３を含むＨＶＲ−Ｌ３、配列番号４を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号５を含むＨＶＲ−Ｈ２、および配列番号６を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。別の実施形態では、本発明の抗体は  配列番号１を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号８を含むＨＶＲ−Ｌ２、配列番号３を含むＨＶＲ−Ｌ３、配列番号４を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号５を含むＨＶＲ−Ｈ２、および配列番号６を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。一実施形態では、本発明の抗体は、配列番号１を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号２を含むＨＶＲ−Ｌ２、配列番号３を含むＨＶＲ−Ｌ３、配列番号４を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号５を含むＨＶＲ−Ｈ２、および配列番号６を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。別の実施形態では、本発明の抗体は、配列番号１を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号２を含むＨＶＲ−Ｌ２、配列番号２０を含むＨＶＲ−Ｌ３、配列番号１７を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１８を含むＨＶＲ−Ｈ２、および配列番号１９を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。
【００１７】
本発明の抗体における改変体ＨＶＲｓは、ＨＶＲ内の１つ以上の残基の改変を有し得る。一実施形態では、ＨＶＲ−Ｌ１改変体は配列番号１を含み、ここでＡ１−１１は以下の位置のうちの任意の組み合わせにおいて１〜６（１、２、３、４、５、または６）個の置換を含む：Ａ５（Ｓ）、Ａ６（ＩまたはＧ）、Ａ７（Ａ）、Ａ８（Ｓ、Ｒ、またはＩ）、Ａ９（ＹまたはＳ）、およびＡ１０（Ｌ）。一実施形態では、ＨＶＲ−Ｌ２改変体は配列番号２を含み、ここでＢ１−７は、１〜４（１、２、３、４、５、または６）個の置換を以下の位置の任意の組み合わせにおいて含む：Ｂ１（Ｇ）、Ｂ３（Ｔ）、Ｂ４（Ｓ、Ｌ、Ｎ、またはＴ）、Ｂ５（Ｒ，Ｅ、またはＡ）、Ｂ６（ＡまたはＳ）およびＢ７（Ｙ）。一実施形態では、ＨＶＲ−Ｌ３改変体は配列番号３を含み、ここでＣ１−９は１〜６（１、２、３、４、５、または６）個の置換を以下の位置の任意の組み合わせにおいて含む：Ｃ３（Ｙ、Ｐ、Ｔ、ＦまたはＧ）、Ｃ４（Ｗ、Ｆ、ＲまたはＮ）、Ｃ５（Ｓ、Ｎ、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、ＶまたはＧ）、Ｃ６（Ｙ、Ｓ、Ａ、Ｄ、Ｎ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、ＹまたはＧ）、Ｃ７（Ｌ、Ｈ、またはＴ）およびＣ８（Ｌ、Ｆ、Ａ、ＭまたはＳ）。一実施形態では、ＨＶＲ−Ｈ１改変体は配列番号４を含み、ここでＤ１−１０は１〜９（１、２、３、４、５、６、７、８または９）個の置換を以下の位置の任意の組み合わせにおいて含む：Ｄ２（Ｙ）、Ｄ３（Ｓ）、Ｄ４（ＦまたはＬ）、Ｄ５（Ｎ、Ｔ、Ｙ、Ｄ、またはＫ）、Ｄ６（ＮまたはＳ）、Ｄ７（Ｙ、ＮまたはＲ）、Ｄ８（ＹまたはＡ）、Ｄ９（Ｍ、Ｆ、ＬまたはＮ）およびＤ１０（Ｓ、ＥまたはＱ）。一実施形態では、ＨＶＲ−Ｈ２改変体は、配列番号５を含み、ここでＥ１−１８は、１〜１０（１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）個の置換を以下の位置の任意の組み合わせにおいて含む：Ｅ１（ＧまたはＳ）、Ｅ２（Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｔ、またはＲ）、Ｅ４（ＹまたはＳ）、Ｅ５（ＧまたはＳ）、Ｅ６（Ｔ、Ｙ、またはＭ）、Ｅ７（ＤまたはＬ）、Ｅ８（Ｓ）、Ｅ９（Ｄ、Ｓ、Ｔ、Ｈ、Ｋ、ＡまたはＶ）、Ｅ１０（Ｉ）、およびＥ１１（Ｄ、Ｎ、Ａ、Ｅ、またはＩ）。一実施形態では、ＨＶＲ−Ｈ３改変体は、配列番号６を含み、ここでＦ１−１８は、１〜１７（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７）個の置換を以下の位置の任意の組み合わせにおいて含む：Ｆ２（Ｓ）、Ｆ３（Ｌ、Ｇ、Ｄ、ＭまたはＷ）、Ｆ４（Ｉ、Ｇ、Ｖ、またはＳ）、Ｆ５（Ｇ、Ｙ、またはＮ）、Ｆ６（Ｎ、Ｓ、またはＶ）、Ｆ７（Ｋ、Ｙ、Ｗ、またはＭ）、Ｆ８（Ｆ、Ｓ、Ｐ、または欠失）、Ｆ９（Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｙ、または欠失）、Ｆ１０（Ｗ、Ｒ、Ｐ、Ｅ、Ｇ、または欠失）、Ｆ１１（Ｓ、Ｗ、Ｇ、Ｈ、または欠失）、Ｆ１２（Ｓ、Ｗ、Ｈ、または欠失）、Ｆ１３（Ｙ、Ｄ、Ｇ、Ｖ、または欠失）、Ｆ１４（Ｇまたは欠失）、Ｆ１５（Ｖまたは欠失）、Ｆ１６（ＬまたはＦ）、Ｆ１７（ａ）、およびＦ１８（Ｖ）。以下の各々の位置のカッコ内の文字（単数または複数）は、例示的な置換（すなわち、置き換え）のアミノ酸、または（示される場合は）アミノ酸欠失を示している。一実施形態では、ＨＶＲ−Ｌ１は、配列番号１の配列を含み；ＨＶＲ−Ｌ２は、配列番号２を含み；ＨＶＲ−Ｌ３改変体は、配列番号３を含み、ここでＣ４、Ｃ５、Ｃ６、およびＣ６は、それぞれＲ、Ｓ、Ｄ、およびＨであり；ＨＶＲ−Ｈ１は、配列番号１７を含み；ＨＶＲ−Ｈ２は、配列番号１８を含み；かつＨＶＲ−Ｈ３は、配列番号１９、または配列番号１９を含むＨＶＲ−Ｈ３改変体を含む。これらの抗体の一実施形態では、これらの抗体はさらに、ヒトκＩ軽鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。一実施形態では、軽鎖のフレームワーク領域４（ＬＣ−ＦＲ４）の１０４位置（Ｋａｂａｔナンバリング）はＶである。一実施形態では、ＬＣ−ＦＲ４の１０４位置はＭである。
【００１８】
一実施形態では、本発明の抗体は、Ｄ１−Ｄ１０とナンバリングされた改変体ＨＶＲ−Ｈ１配列番号４を含み、ここでは１〜６個の置換基が以下から選択される：Ｄ２（Ｙ）、Ｄ３（Ｓ）、Ｄ４（ＦまたはＬ）、Ｄ５（Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｄ、またはＫ）、Ｄ６（ＮまたはＳ）、Ｄ７（Ｓ、Ｎ、またはＲ）、Ｄ８（ＷまたはＡ）、Ｄ９（Ｍ、Ｆ、ＬまたはＮ）、およびＤ１０（Ｓ、Ｅ、またはＱ）。一実施形態では、本発明の抗体は、配列番号２４、２５、２６、２７または２８を含む改変体ＨＶＲ−Ｈ１を含む。一実施形態では、本発明の抗体は、Ｅ１−Ｅ１８とナンバリングされた改変体ＨＶＲ−Ｈ２配列番号５を含み、ここで１〜７個の置換が、以下から選択される：Ｅ１（ＡまたはＳ）、Ｅ２（Ｖ、Ｇ、Ｉ、ＴまたはＲ）、Ｅ４（ＴまたはＳ）、Ｅ５（ＧまたはＳ）、Ｅ６（Ｔ、Ｙ、またはＭ）、Ｅ７（ＤまたはＬ）、Ｅ８（Ｓ）、Ｅ９（Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｈ、Ｋ、ＡまたはＶ）、Ｅ１０（Ｉ）およびＥ１１（Ｙ、Ｎ、Ａ、Ｅ、またはＩ）。一実施形態では、本発明の抗体は、配列番号２９、３０、３１、３２、または３３を含む改変体ＨＶＲ−Ｈ２を含む。一実施形態では、本発明の抗体は、Ｆ１−Ｆ１６とナンバリングされる配列番号６を含む改変体ＨＶＲ−Ｈ３を含み、ここで１−１５個の置換は以下から選択される：Ｆ１（Ｓ、Ｇ、Ｄ、Ｍ、またはＷ）、Ｆ２（Ｎ、Ｇ、Ｖ、またはＳ）、Ｆ３（Ｒ、ＹまたはＮ）、Ｆ４（Ｙ、Ｓ、またはＶ）、Ｆ５（Ｓ、Ｙ、ＷまたはＭ）、Ｆ６（Ｇ、Ｓ、Ｐまたは欠失）、Ｆ７（Ｑ、Ａ、Ｓ、Ｙ、または欠失）、Ｆ８（Ｆ、Ｒ、Ｐ、Ｅ、Ｇ、または欠失）、Ｆ９（Ｖ、Ｗ、Ｇ、Ｈ、または欠失）、Ｆ１０（Ｐ、Ｗ、Ｈ、または欠失）、Ｆ１１（Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｖ、または欠失）、Ｆ１２（Ｙまたは欠失）、Ｆ１３（ＡまたはＶ）、Ｆ１４（ＬまたはＦ）、およびＦ１５（Ｖ）。本発明によれば、アミノ酸置換は、所定の配列にアミノ酸欠失を包含し得る。本発明の一実施形態では、本発明の抗体は、配列番号３４、３５、３６、３７、または３８を含む改変体ＨＶＲ−Ｈ３を含む。これらの抗体の一実施形態では、このフレームワークコンセンサス配列は、位置７１、７３および／または７８に置換を含む。これらの抗体のいくつかの実施形態では、位置７１はＡであり、７３はＴであるか、および／または７８はＡである。これらの抗体の一実施形態では、これらの抗体はさらに、ヒトサブグループＩＩＩ重鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。
【００１９】
一局面では、本発明は、図１、図２、図３および（配列番号１〜８、１７〜７１）に示される１、２、３、４、５、６またはそれ以上のＨＶＲ配列を含む抗Ｒｏｂｏ４抗体を提供する。
【００２０】
一実施形態では、本発明は、ヒト化抗Ｒｏｂｏ４抗体を提供する。本発明のヒト化抗Ｒｏｂｏ４抗体は、その重鎖および／または軽鎖の可変ドメインに、１つ以上のヒトおよび／またはヒトコンサンサスの非超可変領域（例えば、フレームワーク）配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の改変が、このヒトおよび／またはヒトのコンセンサス非−超可変領域配列内に存在する。一実施形態では、本発明の抗体の重鎖可変ドメインは、ヒトのコンセンサスなフレームワーク配列を含み、これは一実施形態では、サブグループＩＩＩのコンセンサスなフレームワーク配列である。一実施形態では、本発明の抗体は、少なくとも１つのアミノ酸位置で改変された、改変体サブグループＩＩＩのコンセンサスなフレームワーク配列を含む。例えば、一実施形態では、改変体サブグループＩＩＩのコンセンサスなフレームワーク配列は、位置７１、７３および／または７８のうちの１つ以上で置換を含んでもよい。一実施形態では、この置換はＲ７１Ａ、Ｎ７３Ｔおよび／またはＮ７８Ａおよび／またはＬ／７８Ａであって、その任意の組み合わせである。一実施形態では、本発明の抗体の軽鎖可変ドメインは、ヒトのコンセンサスフレームワーク配列を含み、これは一実施形態では、サブグループκＩコンセンサスフレームワーク配列である。一実施形態では、この軽鎖コンセンサスフレームワーク配列は、１つ以上の位置で改変される。一実施形態では、この軽鎖コンセンサス配列は、位置１０４にアミノ酸Ｖを有する。一実施形態では、この軽鎖コンセンサス配列は、Ｋａｂａｔのナンバリングシステムに従って位置１０４で改変され、ここで位置１０４はＭである。
【００２１】
一局面では、本発明は、軽鎖ＦＲ配列ＬＣ−ＦＲ１（配列番号９）、ＬＣ−ＦＲ２（配列番号１０、ＬＣ−ＦＲ３（配列番号１１）、およびＬＣ−ＦＲ４（配列番号１２）のうちの１〜４つまたは全てを含む抗体を提供する。一実施形態では、ＬＣ−ＦＲ４（配列番号１２）は、位置１０４がＭである改変体である。
【００２２】
一局面では本発明は、重鎖ＦＲ配列であるＨＣ−ＦＲ１（配列番号１３）、ＨＣ−ＦＲ２（配列番号１４）、ＨＣ−ＦＲ３（配列番号１５）、およびＨＣ−ＦＲ４（配列番号１６）のうちの１〜４つまたは全てを含む抗体を提供する。
【００２３】
一実施形態では、本発明は、ホスト被験体であって、このような被験体でこの薬剤に対して免疫応答をわずかにしか惹起しないか全く惹起しない被験体における使用のための治療剤を提供する。例えば、一実施形態では、本発明は、ヒトＲｏｂｏ４に対して惹起されるマウス抗体に比較してホスト被験体で実質的に低レベルでヒト抗マウス抗体応答（ＨＡＭＡ）を惹起するか、および／または惹起すると期待されるヒト化抗体を提供する。別の実施例では、本発明はヒト抗マウス抗体応答（ＨＡＭＡ）を最小限に惹起するかもしくは全く惹起しないか、および／または惹起しないことが予想されるヒト化抗体を提供する。一実施例では、本発明の抗体は、臨床的に受容可能なレベル以下の抗マウス抗体応答を惹起する。
【００２４】
本発明はまた、本明細書において下に記載されるようなハイブリッドの超可変位置に改変を含む抗体を提供する。一実施形態では、本発明の抗体は、１つ以上のハイブリッド超可変位置で改変された改変体ヒトサブグループコンセンサスフレームワーク配列を含む。一実施形態では、本発明の抗体は、位置２６〜３５、４９〜６５、９５〜１０２、および９４のうちの１つ以上で改変された、改変体ヒトサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク配列を含む重鎖可変ドメインを含む。一実施形態では、本発明の抗体は、位置２４〜３４、５０〜５６、および３９〜９７のうちの１つ以上で改変された、改変体ヒトκサブグループＩコンセンサスフレームワーク配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。
【００２５】
一実施形態では、本発明の抗体は、ヒトκ軽鎖のフレームワーク配列の少なくとも一部（または全て）を含む。一実施形態では、本発明の抗体は、ヒトκサブグループＩフレームワークコンセンサス配列の少なくとも一部（または全て）を含む。一実施形態では、本発明の抗体は、図３Ａおよび図３Ｂに示されるフレームワーク配列を含む。
【００２６】
本発明の抗体は任意の適切なヒトまたはヒトのコンセンサス重鎖フレームワーク配列を含んでもよく、ただしこの抗体は、所望の生物学的特徴を示す（例えば、所望の結合親和性）。一実施形態では、本発明の抗体は、ヒトサブグループＩＩＩ重鎖のフレームワーク配列の少なくとも一部（または全て）を含む。一実施形態では、本発明の抗体は、図４Ａおよび図４Ｂに示されるフレームワーク配列を含む。
【００２７】
一実施形態では、本発明の抗体は、重鎖および／または軽鎖の可変ドメインであって、配列番号７２〜１３７に示されるフレームワーク配列を含む可変ドメインを含む（図１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、４Ａおよび４Ｂ）。
【００２８】
一局面では、本発明の抗体は、ヒトＲｏｂｏ４血管内皮細胞マーカーに結合するヒト化抗Ｒｏｂｏ４抗体である。例えば、一実施形態では、本発明の抗体は、１０００ｎＭ未満、５００ｎＭ未満、２００ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、３０ｎＭ未満、２０ｎＭ未満  １０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、３ｎＭ未満、１ｎＭ未満、０．１ｎＭ未満、または０．０１ｎＭ未満であるＩＣ５０値でヒトＲｏｂｏ４に結合する。そのレセプターに対するリガンド結合を阻害する能力の比較は、下の実施例に記載されるものを含む、当該分野で公知の種々の方法に従っておこなってもよい。
【００２９】
一局面では、本発明の抗体は、細胞傷害性部分にコンジュゲートされた抗Ｒｏｂｏ４抗体（抗Ｒｏｂｏ４抗体薬物コンジュゲートであって、抗Ｒｏｂｏ４  ＡＤＣとも呼ばれる）であって、この抗Ｒｏｂｏ４ＡＤＣはＲｏｂｏ４を発現する細胞中でのＲｏｂｏ４依存性細胞増殖を阻害する。Ｒｏｂｏ４発現細胞としては、限定はしないが、血管内皮細胞などの内皮細胞が挙げられる。例示的な抗Ｒｏｂｏ４  ＡＤＣｓは本明細書に開示される。一実施形態では、この抗Ｒｏｂｏ４抗体はヒト化されている。一実施形態では、この抗Ｒｏｂｏ４抗体はヒト抗体である。一実施形態では、この抗Ｒｏｂｏ４抗体はファージディスプレイ突然変異誘発および選択に由来する。
【００３０】
一局面では、本発明の抗体は、細胞傷害性剤にコンジュゲートされていない参照抗Ｒｏｂｏ４抗体よりもＲｏｂｏ４依存性細胞増殖を阻害する抗Ｒｏｂｏ４抗体ＡＤＣである。例えば、一実施形態では、本発明の抗Ｒｏｂｏ４  ＡＤＣ抗体は、細胞傷害性剤にコンジュゲートされていない参照抗Ｒｏｂｏ４抗体の値の約半分未満のＩＣ５０値で細胞増殖を阻害する。一実施形態では、本発明のＡＤＣ抗体のＩＣ５０値は非ＡＤＣ参照抗体の値の約０．００１、０．０１  ０．１、０．２、０．３または０．４である。細胞増殖を阻害する能力の比較は、下の実施例に記載される方法を含む当該分野で公知の種々の方法に従って行ってもよい。一実施形態では、ＩＣ５０値は、約０．０１ｎＭ〜約１００ｎＭの抗体濃度範囲にまたがって決定される。
【００３１】
一実施形態では、ヒト化抗体およびキメラ抗体の両方とも単価である。一実施形態では、ヒト化抗体およびキメラ抗体の両方とも、Ｆｃ領域に結合された単一のＦａｂ領域を含む。一実施形態では、参照キメラ抗体は、ヒトＦｃ領域に結合される図７（配列番号９および１０）に示される可変ドメイン配列を含む。一実施形態では、このヒトＦｃ領域は、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、２、３または４）のものである。
【００３２】
一局面では、本発明の抗体は、Ｆｃ領域を含む。ある実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、２、３または４である。一実施形態では、このＩｇＧは天然のＩｇＧである。一実施形態では、Ｆｃ領域は、天然のＩｇＧ１、２、３、または４の野生型ＡＤＣＣ活性に対する抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）の増強を示す。一実施形態では、このＩｇＧは、変更したＦｃ領域が天然のＦｃ領域に対して増強したＡＤＣＣ活性を示すように天然のＩｇＧからＦｃ領域が変更されている。
【００３３】
一局面では、本発明の抗体は、画像化剤などの検出可能部分にコンジュゲートされた抗Ｒｏｂｏ４抗体である。一局面では、本発明の抗体は、反応性部分、活性化部分、または反応性システインチオール基を通じて抗体に共有結合され得る、任意の標識部分とコンジュゲートされ得る（Ｓｉｎｇｈら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０４：１４７−１５（２００２）；Ｈａｒｌｏｗ  Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．（１９９９）Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ｌｕｎｄｂｌａｄ  Ｒ．Ｌ．（１９９１）Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，第２版、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ）。結合された標識は、以下を果たすように機能し得る：（ｉ）検出可能シグナルを与える；（ｉｉ）第二の標識と相互作用して、第一および第二の標識によって得られる検出可能シグナルを改変し、例えば、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を与える；（ｉｉｉ）抗原またはリガンドとの相互作用を安定化するか、または結合の親和性を増大する；（ｉｖ）電荷、疎水性、形状または他の物理的パラメーターによって、移動度、例えば、電気泳動移動度または細胞透過性に影響する、あるいは（ｖ）捕獲部分を提供して、リガンド親和性、抗体／抗原結合、またはイオン錯体生成を調整する。本発明の標識された抗体はさらに本明細書に開示される。
【００３４】
ある実施形態では、この検出可能標識は、インビトロまたはインビボで検出可能な水不溶性の粒子である。ある実施形態では、この粒子は磁気粒子または金属粒子である。金属粒子は、磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）、単一粒子または単一分子トラッキング、免疫細胞化学、暗視野照明によるプラズモン周波数、微分干渉コントラスト法およびビデオ強化（ｖｉｄｅｏ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ）、全反射（ｔｏｔａｌ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ）、および光熱干渉コントラスト（ＰＩＣ）技術などの方法によって検出可能である（例えば、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  １００（２０）：１１３５０−１１３５５（２００３）；Ｓｈｅｅｔｚら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４０：２８４−２８８（１９８９）；Ｂａｓｃｈｏｎｇら、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ８３：４０９−４１１（１９８５）；ＳｌｏｔおよびＧｅｕｚｅ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３８：８７−９３（１９３５）；ＦｒｅｙおよびＦｒｅｙ，Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１２７：９４−１００（１９９９）；ＨａｉｎｆｅｌｄおよびＰｏｗｅｌｌ，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．４８：４７１−４８０（２０００）；Ｓｃｈｕｌｔｚら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９７：９９６−１００１（２０００）；Ｇｅｌｌｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３１：４５０−４５３（１９８８）；Ｓｏｎｎｉｃｈｓｅｎら、Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．７７：２９４９−２９５１（２０００）；Ｂｏｙｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９７：１１６０−１１６３（２００２）を参照のこと）。本発明のナノ粒子性薬剤としてはまた、限定はしないが、マイクロバブル（Ｅｌｌｅｇａｌａら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０８：３３６−３４１（２００３）を参照）、（これはまた、聴覚活性リポスフェア（ａｃｏｕｓｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｌｉｐｏｓｐｈｅｒｅｓ）（ＡＡＬｓ）（Ｔａｒｔｉｓら、Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．３２（１１）：１７７１−８０（２００６）を参照）とも呼ばれる）、超常磁性剤、リポソーム、ペルフルオロカーボンナノ粒子エマルジョン（国際公開第２００５１０４０５１号）、およびデンドリマー（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１２４：３８７−４００（２００６）およびそこに引用された引用文献（その全てが全体が参照によって本明細書に援用されている）を参照のこと）が挙げられる。
【００３５】
一局面では、本発明は、図１Ｂおよび図２Ｂに示されるＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２および／またはＨＶＲ−Ｈ３の配列を含む、重鎖可変ドメインを含む抗体を提供する。一実施形態では、この可変ドメインは、図１Ｂ、２Ｂ、４Ａおよび４Ｂに示されるＨＣ−ＦＲ１、ＨＣ−ＦＲ２、ＨＣ−ＦＲ３および／またはＨＣ−ＦＲ４配列を含む。一実施形態では、この抗体は、ＣＨ１および／またはＦｃ配列を含む。一実施形態では、本発明の抗体は、重鎖可変ドメインを含み、このドメインは、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２および／またはＨＶＲ−Ｈ３配列、ならびにＨＣ−ＦＲ１、ＨＣ−ＦＲ２、ＨＣ−ＦＲ３および／またはＨＣ−ＦＲ４配列（図１Ｂ、図２Ｂ、図４Ａ、および図４Ｂに示される）を含む。一実施形態では、本発明の抗体は、重鎖可変ドメインを含み、このドメインは、ＨＶＲ１−ＨＣ、ＨＶＲ２−ＨＣおよび／またはＨＶＲ３−ＨＣ配列（図１Ｂ、２Ｂ、４Ａおよび４Ｂに示される）、ならびにＣＨ１および／またはＦｃ配列を含む。
【００３６】
一局面では、本発明は、ＨＶＲ１−ＬＣ、ＨＶＲ２−ＬＣおよび／またはＨＶＲ３−ＬＣ配列（図１Ａまたは２Ａに示される）を含む、軽鎖可変ドメインを含む抗体を提供する。一実施形態では、この可変ドメインは、ＦＲ１−ＬＣ、ＦＲ２−ＬＣ、ＦＲ３−ＬＣおよび／またはＦＲ４−ＬＣ配列（図３Ａおよび図３Ｂに示される）を含む。
【００３７】
一実施形態では、本発明の抗体は、前の２つの段落に示される軽鎖および重鎖可変ドメインを含む。一実施形態では、この抗体は、一価であって、Ｆｃ領域を含む。一実施形態では、Ｆｃ領域は、少なくとも１つの突起（ｐｒｏｔｕｂｅｒａｎｃｅ）（ノブ）および少なくとも１つの腔（ｃａｖｉｔｙ）（孔）を含み、ここでこの突起および腔の存在は、例えば、国際公開第２００５／０６３８１６号に記載のような、突起を含むＦｃポリペプチドと腔を含むＦｃポリペプチドとの間の複合体の形成を増強する。一実施形態では、本発明の抗体のＦｃ領域は、第一および第二のＦｃポリペプチドを含み、ここでこの第一および第二のポリペプチドは各々、野生型ヒトＦｃに対して１つ以上の変異を含む。一実施形態では、腔の変異はＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａおよび／またはＹ４０７Ｖである。一実施形態では、突起の変異はＴ３６６Ｗである。一実施形態では、この第一のポリペプチドは、図１３に示されるＦｃ配列を含み、かつ第二のポリペプチドは、図１４に示されるＦｃ配列を含む。
【００３８】
一実施形態では、本発明は、被験体（例えば、ヒトなどの哺乳動物被験体）に対して抗Ｒｏｂｏ４抗体を投与することによって、Ｒｏｂｏ−４関連の効果（例えば、Ｒｏｂｏ４活性化、下流分子シグナル伝達（例えば、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）リン酸化）、細胞増殖、細胞遊走、細胞生存、細胞形態形成および血管形成）の１つ以上の局面を調節する方法を提供する。ある実施形態では、この抗Ｒｏｂｏ４抗体は、Ｒｏｂｏ４に対するリガンド結合を破壊する（例えば、Ｒｏｂｏ４細胞外ドメイン内の配列に対する結合、およびそれによってその結合パートナー（例えば、リガンド分子）とのこの結合したドメインの相互作用を阻害することによる）。他の実施形態では、このＲｏｂｏ４抗体は、Ｒｏｂｏ４リガンド結合部位内にない配列に結合し、ここでこの結合は、その結合パートナーとＲｏｂｏ４が相互作用する能力の破壊を生じる。
【００３９】
本発明の一実施形態では、Ｒｏｂｏ４に対する抗体の結合は、Ｒｏｂｏ４関連内皮細胞増殖を阻害する。本発明のＲｏｂｏ４抗体の別の実施形態では、細胞中のＲｏｂｏ４に対する抗体の結合は、細胞の増殖、生存、分散、形態形成、および／または運動性を阻害する。別の実施形態では、この細胞は、内皮細胞、例えば、限定はしないが、血管内皮細胞である。
【００４０】
一実施形態では、本発明のＲｏｂｏ４抗体は特異的に、図５（配列番号１３８）に示されるＲｏｂｏ４の少なくとも一部、またはその改変体に結合する。一実施形態では、本発明の抗体は特に、リーダー配列を欠く（すなわち、図５に破線の下線で示される領域を欠く）全長Ｒｏｂｏ４アミノ酸配列内で結合する。一実施形態では、本発明の抗体は特に、図５に示される細胞外ドメイン配列（図５に実線の下線で示される）内に結合する。一実施形態では、本発明の抗体は、Ｒｏｂｏ４細胞外ドメインの一部または全てによって形成される立体構造エピトープに特異的に結合する。一実施形態では、本発明の抗体は、図５に示される配列（配列番号１３８）と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％の配列同一性または類似性を有するアミノ酸配列に特異的に結合する。一実施形態では、本発明の抗体は、リーダー配列を欠いている（すなわち、図５に破線の下線で示される領域を欠いている）Ｒｏｂｏ４全長アミノ酸配列の配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％の配列同一性または類似性を有するアミノ酸配列に特異的に結合する。一実施形態では、本発明の抗体はＲｏｂｏ４の細胞外ドメインの配列（図５で実線の下線で示される領域）と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％の配列同一性または類似性を有するアミノ酸配列に特異的に結合する。
【００４１】
一実施形態では、本発明の抗体は第一の動物種のＲｏｂｏ４に特異的に結合し、第二の動物種のＲｏｂｏ４には特異的に結合しない。一実施形態では、この第一の動物種は、ヒトおよび／または霊長類（例えば、カニクイザル）であって、第二の動物種は、ｒａｔｕｓ（例えば、ラット）、ネズミ科（例えば、マウス）および／またはイヌである。一実施形態では、この第一の動物種はヒトである。一実施形態では、この第一の動物種は霊長類、例えば、カニクイザルである。一実施形態では、この第二の動物種はネズミ、例えば、マウスである。一実施形態では、この第二の動物種は、イヌである。一実施形態では、本発明の抗体は特に、少なくとも２つの種のＲｏｂｏ４に結合する。一実施形態では、この第一の動物種はヒトおよび／または霊長類（例えば、カニクイザル）であり、かつこの第二の動物種はネズミ（例えば、マウス）である。２つ以上の種に結合する本発明の抗体は、治療剤または診断剤についての動物モデル研究において用途を見出す。
【００４２】
一局面では、本発明は、哺乳動物の血清中のＲｏｂｏ４を検出する方法を提供し、ここではＲｏｂｏ４の正常な値よりも高い血清中のＲｏｂｏ４の濃度がこの哺乳動物中の血管形成の存在を示す。本発明のこの方法によれば、本発明の検出可能なまたは検出可能に標識された抗Ｒｏｂｏ４抗体は、限定はしないがヒトを含む、試験哺乳動物由来の血清サンプルと接触させられる。この抗Ｒｏｂｏ４抗体は、検出可能な標識を介して直接、または、例えば、検出可能に標識されるか、もしくは検出可能な二次抗体との接触によって間接的に検出される。正常な哺乳動物由来の抗Ｒｏｂｏ４血清濃度よりも高い試験哺乳動物中の抗Ｒｏｂｏ４の血清濃度（値）は、試験哺乳動物中の血管形成を示す。正常な哺乳動物とは、血管形成を経験していないことが既知の哺乳動物、または血管形成を経験していない哺乳動物の集団をいう。一実施形態では、試験および正常な哺乳動物、または哺乳動物の集団は、同じ種であって、これには限定はしないがヒトを包含する。Ｒｏｂｏ４タンパク質の血清の値は、進行した非小細胞肺癌を有するヒト患者で検出されている（Ｇｏｒｎら、Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  ４９：７１−７６（２００５））。血清の抗Ｒｏｂｏ４値は、ガンに関連する血管形成の診断および予後診断に有用である。
【００４３】
一局面では、本発明は、１つ以上の本発明の抗体および担体を含む組成物を提供する。一実施形態では、この担体は、薬学的に受容可能である。
【００４４】
一局面では、本発明は、本発明のＲｏｂｏ４抗体をコードする核酸、この核酸を含むベクター、ならびにこの核酸および／またはベクターを含む、宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）、本発明の核酸および／またはベクターを含む細胞を提供する。ベクターは、任意のタイプ、例えば、発現ベクターのような組み換えベクターであってもよい。任意の種々の宿主細胞が用いられ得る。一実施形態では、宿主細胞は、原核生物細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉである。一実施形態では、宿主細胞は真核生物細胞、例えば、哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。
【００４５】
一局面では、本発明は、抗Ｒｏｂｏ４を作製するための方法を提供する。例えば、本発明は、Ｒｏｂｏ４抗体を作製する方法であって、適切な宿主細胞中で、この抗体（またはそのフラグメント）をコードする本発明の組み換えベクターを発現する工程と、この抗体を回収する工程とを包含する方法を提供する。
【００４６】
一局面では、本発明は、容器を備える製品；およびこの容器内に含まれる組成物を提供し、この組成物は本発明の１つ以上の抗Ｒｏｂｏ４抗体を含む。一実施形態では、この組成物は、本発明の核酸を含む。一実施形態では、抗体を含む組成物はさらに、担体（ある実施形態では薬学的に許容される）を含む。一実施形態では、本発明の製品はさらに、被験体に対して組成物（例えば、抗体）を投与するための説明書を備える。
【００４７】
一局面では、本発明は、本発明の１つ以上の抗Ｒｏｂｏ４抗体を含む組成物を含む第一の容器と、緩衝液を含む第二の容器とを備えるキットを提供する。一実施形態では、この緩衝液は、薬学的に受容可能である。一実施形態では、抗体を含む組成物は、ある実施形態では薬学的に受容可能である担体をさらに含む。一実施形態では、キットは、被験体に対して組成物（例えば、抗体）を投与するための説明書をさらに備える。
【００４８】
一局面では、本発明は、ガン、腫瘍、細胞増殖障害、免疫（例えば、自己免疫）障害および／または血管形成関連障害などの疾患の治療処置および／または予防処置のための医薬の調製における本発明のＲｏｂｏ４抗体の使用を提供する。
【００４９】
一局面では、本発明は、ガン、腫瘍、細胞増殖障害、免疫（例えば、自己免疫）障害および／または血管形成関連障害などの疾患の治療処置および／または予防処置のための医薬の調製における本発明の核酸の使用を提供する。
【００５０】
一局面では、本発明は、ガン、腫瘍、細胞増殖障害、免疫（例えば、自己免疫）障害および／または血管形成関連障害などの疾患の治療処置および／または予防処置のための医薬の調製における本発明の発現ベクターの使用を提供する。
【００５１】
一局面では、本発明は、ガン、腫瘍、細胞増殖障害、免疫障害（例えば、自己免疫障害、例えば、関節リウマチなど）および／または血管形成関連障害などの疾患の治療処置および／または予防処置のための医薬の調製における本発明の宿主細胞の使用を提供する。
【００５２】
一局面では、本発明は、ガン、腫瘍、細胞増殖障害、免疫障害（例えば、自己免疫障害、例えば、関節リウマチなど）および／または血管形成関連障害などの疾患の治療処置および／または予防処置のための医薬の調製における本発明の製品の使用を提供する。
【００５３】
一局面では、本発明は、ガン、腫瘍、細胞増殖障害、免疫（例えば、自己免疫）障害および／または血管形成関連障害などの疾患の治療処置および／または予防処置のための医薬の調製における本発明のキットの使用を提供する。
【００５４】
本発明は、Ｒｏｂｏ４シグナル伝達軸索の調節不全に関連する疾患状態を調節するために有用な方法および組成物を提供する。Ｒｏｂｏ４シグナル伝達経路は、複数の生物学的機能および生理学的機能（例えば、細胞増殖および血管形成を含む）に関与する。従って、一局面では、本発明は、本発明の抗体を被験体に投与する工程を包含する方法を提供する。
【００５５】
一局面では、本発明は、Ｒｏｂｏ４活性化細胞増殖を阻害する方法を提供し、この方法は、細胞または組織と、有効量の本発明の抗体とを接触させる工程であって、これによってＲｏｂｏ４活性化に関連する細胞増殖が阻害される工程を包含する。
【００５６】
一局面では、本発明は、被験体中のＲｏｂｏ４活性化の調節不全に関連する生理学的状態を処置する方法を提供し、この方法は、この被験体に対して有効量の本発明の抗体を投与することであって、これによってこの状態が処置される工程を包含する。
【００５７】
一局面では、本発明は、Ｒｏｂｏ４を発現する細胞の増殖を阻害する方法を提供し、この方法は、この細胞と、本発明の抗体または本発明の抗体薬物コンジュゲートとを接触させる工程であって、これによってこの細胞の増殖阻害を生じる工程を包含する。
【００５８】
一局面では、本発明は、Ｒｏｂｏ４を発現する細胞を含む癌性腫を有する哺乳動物を治療的に処置する方法を提供し、この方法は、この哺乳動物に対して、有効量の本発明の抗体または本発明の抗体薬物コンジュゲートを投与することであって、これによってこの哺乳動物を有効に処置する工程を包含する。
【００５９】
一局面では、本発明は、Ｒｏｂｏ４の発現または活性の増大に関連する細胞増殖障害を処置または予防するための方法を提供し、この方法は、このような処置の必要な被験体に対して、有効量の本発明の抗体または本発明の抗体薬物コンジュゲートを投与することであって、これによってこの細胞増殖障害を有効に処置または予防する工程を包含する。一実施形態では、この増殖性障害は、異常なまたは望ましくない内皮細胞増殖、例えば、障害における異常または望ましくない血管細胞増殖に関連する病理学的状態であり、この障害としては、限定はしないが、ガン、血管形成およびこのような腫瘍および転移に関連する（例えば、障害を経験している組織内の内皮細胞増殖によって増強される）障害、アテローム性動脈硬化症、水晶体後部線維増殖症、血管腫、慢性炎症、眼内新生血管疾患、例えば、増殖性網膜症、例えば、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、血管新生緑内障、移植角膜組織および他の組織の免疫拒絶、関節リウマチ、および乾癬が挙げられる。
【００６０】
別の局面では、本発明は、哺乳動物中の腫瘍を治療上処置する方法であって、この腫瘍の増殖が、内皮細胞（限定はしないが血管内皮細胞を含む）中で発現されるＲｏｂｏ４の増殖増強効果に少なくとも部分には依存している方法を提供し、この方法は、この細胞と、有効量の本発明の抗体または本発明の抗体薬物コンジュゲートとを接触させる工程であって、これによって例えば、この腫瘍に関連する血管形成における内皮細胞の増殖を阻害し、これによってこのような腫瘍を有効に処置する工程を包含する。
【００６１】
本発明のさらに別の実施形態は、血管形成を調節する方法であって、細胞または組織と本明細書に記載される抗Ｒｏｂｏ４抗体の有効量とを接触させることによる方法を提供する。いくつかの実施形態では、この抗体はさらに、細胞傷害性剤を含む。ある実施形態では、この血管形成は阻害される。ある実施形態では、この血管形成は増強される。ある実施形態では、この血管形成は、以下から選択される障害と関連する：癌、アテローム性動脈硬化症、水晶体後部線維増殖症、血管腫、慢性炎症、眼内新生血管疾患、増殖性網膜症、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、血管新生緑内障、移植角膜組織および他の組織の免疫拒絶、関節リウマチ、乾癬、およびそれらの組み合わせ。ある実施形態では、この血管形成はガンに関連する。ある実施形態では、このガンは、以下からなる群より選択される：骨肉腫および血管肉腫を含む肉腫、扁平上皮細胞癌、肺癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃腸の癌を含む胃癌、膵臓癌、膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路の癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液線癌、腎臓癌（ｋｉｄｎｅｙ  ｃａｎｃｅｒ）または腎癌（ｒｅｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌、黒色腫、多発性骨髄腫およびＢ細胞リンパ腫、脳腫瘍、頭頸部癌、ならびに関連の転移およびそれらの組み合わせ。ある実施形態では、この細胞または組織は哺乳動物である。ある実施形態では、この哺乳動物はヒトである。ある実施形態では、この方法は、上記細胞と、以下：抗悪性腫瘍剤、化学療法剤、増殖阻害剤、細胞傷害性剤、血管形成阻害剤およびそれらの組み合わせから選択される薬剤とを接触させる工程をさらに包含する、ある実施形態では、この薬剤は抗ＶＥＧＦ抗体である。ある実施形態では、この方法は、上記細胞と以下から選択される第二、第三または第四の薬剤とを接触させる工程をさらに包含する：抗悪性腫瘍剤、化学療法剤、増殖阻害剤、細胞傷害性剤、抗血管形成剤、およびそれらの組み合わせ。ある実施形態では、この第二、第三または第四の薬剤は抗ＶＥＧＦ抗体である。
【００６２】
本発明の方法は、任意の適切な病理学的状態、例えば、Ｒｏｂｏ４発現の上方制御に関連する細胞および／または組織に影響するように用いられ得る。一実施形態では、本発明の方法で標的される細胞は、腫瘍（例えば、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、乳頭癌（例えば、甲状腺の）結腸癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、中枢神経系癌、骨肉腫、腎臓癌、肝臓癌、膀胱癌、胃癌、頭頸部扁平上皮癌、黒色腫および白血病、または肉腫（例えば、骨肉腫または血管肉腫）、または血管形成における上皮細胞増殖によって増殖が支持される任意のガンを含む）内で増殖している内皮細胞または血管内皮細胞である。一実施形態では、この病理学的状態は、異常または望ましくない内皮細胞増殖に関連する。ある実施形態では、本発明の抗Ｒｏｂｏ４抗体または抗体薬物コンジュゲートの標的としては、限定はしないが、ガン（例えば、固形腫瘍および転移を含む）、アテローム性動脈硬化症、水晶体後部線維増殖症、血管腫、慢性炎症、眼内新生血管疾患、例えば、増殖性網膜症、例えば、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、血管新生緑内障、移植角膜組織および他の組織の免疫拒絶、関節リウマチ、乾癬、および血管形成に関連する障害（障害を経験している組織内の内皮細胞増殖によって増強される障害を含む）を含む障害における異常なまたは望ましくない血管細胞増殖が挙げられる。
【００６３】
本発明の方法はさらに、追加の処置段階を含んでもよい。例えば、一実施形態では、ある方法は、さらに、標的細胞および／または組織（例えば、ガン細胞）が、放射線療法または化学療法剤に曝されている段階を包含する。
【００６４】
本発明の一実施形態では、標的される細胞（例えば、腫瘍組織または網膜の内皮細胞）は、Ｒｏｂｏ４発現が、同じ組織由来の正常組織における内皮細胞に比較して増大されている細胞である。一実施形態では、本発明の方法は、標的化された細胞の殺滅を生じる。例えば、本発明の抗Ｒｏｂｏ４抗体との接触（本発明の抗体薬物コンジュゲートとの接触を含む）は、細胞死を生じる細胞傷害性部分の取り込みを生じる。あるいは、細胞傷害性化合物にコンジュゲートされた本発明の抗Ｒｏｂｏ４抗体との接触は、この細胞傷害性化合物の内部移行を生じ得、これが細胞死を生じる。別の代替的な実施形態では、検出可能な部分に対してコンジュゲートされた本発明の抗Ｒｏｂｏ４抗体との接触は、当該分野で周知の画像化技術などによる、検出されるべき組織（例えば、腫瘍組織または網膜）の例えば、脈管構造の内皮細胞を生じる。
【００６５】
本発明の別の実施形態は、哺乳動物に対して本明細書に記載の抗Ｒｏｂｏ４抗体を投与することによる、インビボ画像化の方法を提供する。ある実施形態では、この哺乳動物はヒトである。ある実施形態では、この哺乳動物は、以下から選択される疾患または障害を有すると疑われている：癌、アテローム性動脈硬化症、水晶体後部線維増殖症、血管腫、慢性炎症、眼内新生血管疾患、増殖性網膜症、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、血管新生緑内障、移植角膜組織の免疫拒絶、関節リウマチ、乾癬、およびそれらの組み合わせ。
【００６６】
本発明の別の実施形態では、Ｒｏｂｏ４を発現する細胞と、本明細書に記載の抗Ｒｏｂｏ４抗体とを接触させることによって、この細胞を検出する方法を提供する。ある実施形態では、この細胞は、血管内皮細胞である。ある実施形態では、この細胞は、哺乳動物である。ある実施形態では、この哺乳動物は、以下から選択される疾患または障害を有すると疑われている：癌、アテローム性動脈硬化症、水晶体後部線維増殖症、血管腫、慢性炎症、眼内新生血管疾患、増殖性網膜症、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、血管新生緑内障、移植角膜組織の免疫拒絶、関節リウマチ、乾癬、およびそれらの組み合わせ。いくつかの実施形態では、この哺乳動物は、以下から選択されるガンを有すると疑われる：扁平上皮細胞癌、肺癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃腸の癌を含む胃癌、膵臓癌、膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路の癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液線癌、腎臓癌または腎癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌、黒色腫、多発性骨髄腫およびＢ細胞リンパ腫、脳腫瘍、頭頸部癌、ならびに関連の転移およびそれらの組み合わせ。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１−１】図１Ａは、本発明の種々の抗Ｒｏｂｏ４クローンの軽鎖の可変領域のアミノ酸配列のアラインメントを示す（図１Ａ）。軽鎖の超可変領域（ＨＶＲｓ）は、ボックスの相補性決定領域（ＣＤＲｓ）で示される。図１Ａでは、この軽鎖ＨＶＲｓ−Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３は、それぞれＫａｂａｔの位置２４〜３４、５０〜５６、および８９〜１０２である。クローンは、実施例に開示されるファージディスプレイによって調製され、配列決定された。
【図１−２】図１Ａは、本発明の種々の抗Ｒｏｂｏ４クローンの軽鎖の可変領域のアミノ酸配列のアラインメントを示す（図１Ａ）。軽鎖の超可変領域（ＨＶＲｓ）は、ボックスの相補性決定領域（ＣＤＲｓ）で示される。図１Ａでは、この軽鎖ＨＶＲｓ−Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３は、それぞれＫａｂａｔの位置２４〜３４、５０〜５６、および８９〜１０２である。クローンは、実施例に開示されるファージディスプレイによって調製され、配列決定された。
【図１−３】図１Ｂは、本発明の種々の抗Ｒｏｂｏ４クローンの重鎖の可変領域のアミノ酸配列のアラインメントを示す（図１Ｂ）。重鎖の超可変領域（ＨＶＲｓ）は、ボックスの相補性決定領域（ＣＤＲｓ）で示される。図１Ｂでは、この重鎖ＨＶＲｓ−Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３は、それぞれＫａｂａｔの位置２６〜３５、４９〜６５、および９３〜１０２である。クローンは、実施例に開示されるファージディスプレイによって調製され、配列決定された。
【図１−４】図１Ｂは、本発明の種々の抗Ｒｏｂｏ４クローンの重鎖の可変領域のアミノ酸配列のアラインメントを示す（図１Ｂ）。重鎖の超可変領域（ＨＶＲｓ）は、ボックスの相補性決定領域（ＣＤＲｓ）で示される。図１Ｂでは、この重鎖ＨＶＲｓ−Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３は、それぞれＫａｂａｔの位置２６〜３５、４９〜６５、および９３〜１０２である。クローンは、実施例に開示されるファージディスプレイによって調製され、配列決定された。
【図２−１】図２Ａは、個々にランダマイズされたＨＶＲを有するライブラリーから選択された親和性成熟抗体の軽鎖（図２Ａ）の可変領域のアミノ酸配列を示す。図２ＡのＨＶＲｓは、図１Ａに示されるのと同じ位置である。
【図２−２】図２Ａは、個々にランダマイズされたＨＶＲを有するライブラリーから選択された親和性成熟抗体の軽鎖（図２Ａ）の可変領域のアミノ酸配列を示す。図２ＡのＨＶＲｓは、図１Ａに示されるのと同じ位置である。
【図２−３】図２Ａは、個々にランダマイズされたＨＶＲを有するライブラリーから選択された親和性成熟抗体の軽鎖（図２Ａ）の可変領域のアミノ酸配列を示す。図２ＡのＨＶＲｓは、図１Ａに示されるのと同じ位置である。
【図２−４】図２Ｂは、個々にランダマイズされたＨＶＲを有するライブラリーから選択された親和性成熟抗体の重鎖（図２Ｂ）の可変領域のアミノ酸配列を示す。図２ＢのＨＶＲｓは、図１Ｂに示されるのと同じ位置である。
【図２−５】図２Ｂは、個々にランダマイズされたＨＶＲを有するライブラリーから選択された親和性成熟抗体の重鎖（図２Ｂ）の可変領域のアミノ酸配列を示す。図２ＢのＨＶＲｓは、図１Ｂに示されるのと同じ位置である。
【図２−６】図２Ｂは、個々にランダマイズされたＨＶＲを有するライブラリーから選択された親和性成熟抗体の重鎖（図２Ｂ）の可変領域のアミノ酸配列を示す。図２ＢのＨＶＲｓは、図１Ｂに示されるのと同じ位置である。
【図３】図３Ａ、図３Ｂは、以下のような配列識別子を用いて本発明を行うのにおける使用のための例示的なアクセプターヒトコンセンサスフレームワーク配列を示す。
【００６８】
可変軽鎖（ＶＬ）コンセンサスフレームワーク領域マイナスＫａｂａｔ  ＨＶＲｓ（図３Ａおよび図３Ｂ）
ヒトＶＬκサブグループＩコンセンサスフレームワーク１−４（配列番号９、１０、９９、１００）
ヒトＶＬκサブグループＩ’コンセンサスフレームワーク１−４（配列番号９、１０１、９９、１００）
ヒトＶＬκサブグループＩＩコンセンサスフレームワーク１−４（配列番号１０２、１０３、１０４、１００）
ヒトＶＬκサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク１−４（配列番号１０５、１０６、１０７、１００）
ヒトＶＬκサブグループＩＶコンセンサスフレームワーク１−４（配列番号１０８、１０９、１１０、１００）
フレームワーク配列内のＫａｂａｔのＨＶＲのＬ１、Ｌ２、およびＬ３の位置は、影付きのボックスとして示される。
【図４Ａ】図４Ａは、以下のような配列識別子を用いて本発明を行うのにおける使用のための例示的なアクセプターヒトコンセンサスフレームワーク配列を示す。可変重鎖（ＶＨ）コンセンサスフレームワーク領域マイナスのＫａｂａｔＨＶＲｓ（図４Ａおよび図４Ｂ）ヒトＶＨサブグループＩコンセンサスフレームワーク１−４マイナスＫａｂａｔＨＶＲｓ（サブグループＩＡ、配列番号１１１、１１２、１１３、１６）および（サブグループＩＢ、配列番号１１４、１１５、１１３、１６）ヒトＶＨサブグループＩコンセンサスフレームワーク１−４マイナス伸長したＨＶＲｓ、（サブグループＩＣ、配列番号１１４、１１５、１１６、１６）および（サブグループＩＤ、配列番号１１４、１１５、１１７、１６）ヒトＶＨサブグループＩＩコンセンサスフレームワーク１−４マイナスＫａｂａｔＨＶＲｓ（サブグループＩＩＡ、配列番号１１８、１１９、１２０、１６）、（サブグループＩＩＢ、配列番号１２１、１２２、１２０、１６）ヒトＶＨサブグループＩＩコンセンサスフレームワーク１−４マイナス伸長したＨＶＲｓ（サブグループＩＩＣ、配列番号１２１、１２２、１２３、１６）、（サブグループＩＩＤ、配列番号１２１、１２２、１２４、１６）ヒトＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク１−４マイナスＫａｂａｔＨＶＲｓ（サブグループＩＩＩＡ、配列番号１２５、１２６、１２７、１６）、（サブグループＩＩＩＢ、配列番号１２８、１２９、１２７、１６）ヒトＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク１−４マイナス伸長したＨＶＲｓ（サブグループＩＩＩＣ、配列番号１２８、１２９、１３０、１６）、（サブグループＩＩＩＤ、配列番号１２８、１２９、１３１、１６）ヒトＶＨアクセプター１フレームワーク１−４マイナスＫａｂａｔＨＶＲｓ（サブグループアクセプター１Ａ、配列番号１３２、１２６、１３３、１６）および（サブグループアクセプター１Ｂ、配列番号１２８、１２９、１３３、１６）ヒトＶＨアクセプター１フレームワーク１−４マイナス伸長したＨＶＲｓ（サブグループアクセプター１Ｃ、配列番号１２８、１２９、１３４、１６）ヒトＶＨアクセプター２フレームワーク１−４マイナスＫａｂａｔＨＶＲｓ（サブグループアクセプター２Ａ、配列番号１３２、１２６、１３５、１６）および（サブグループアクセプター２Ｂ、配列番号１２８、１２９、１３５、１６）ヒトＶＨアクセプター２フレームワーク１−４マイナス伸長したＨＶＲｓ（サブグループアクセプター２Ｃ、配列番号１２８、１２９、１３６、１６）および（サブグループアクセプター２Ｄ、配列番号１２８、１２９、１３７、１６）。
【図４Ｂ】図４Ｂは、以下のような配列識別子を用いて本発明を行うのにおける使用のための例示的なアクセプターヒトコンセンサスフレームワーク配列を示す。可変重鎖（ＶＨ）コンセンサスフレームワーク領域マイナスのＫａｂａｔＨＶＲｓ（図４Ａおよび図４Ｂ）ヒトＶＨサブグループＩコンセンサスフレームワーク１−４マイナスＫａｂａｔＨＶＲｓ（サブグループＩＡ、配列番号１１１、１１２、１１３、１６）および（サブグループＩＢ、配列番号１１４、１１５、１１３、１６）ヒトＶＨサブグループＩコンセンサスフレームワーク１−４マイナス伸長したＨＶＲｓ、（サブグループＩＣ、配列番号１１４、１１５、１１６、１６）および（サブグループＩＤ、配列番号１１４、１１５、１１７、１６）ヒトＶＨサブグループＩＩコンセンサスフレームワーク１−４マイナスＫａｂａｔＨＶＲｓ（サブグループＩＩＡ、配列番号１１８、１１９、１２０、１６）、（サブグループＩＩＢ、配列番号１２１、１２２、１２０、１６）ヒトＶＨサブグループＩＩコンセンサスフレームワーク１−４マイナス伸長したＨＶＲｓ（サブグループＩＩＣ、配列番号１２１、１２２、１２３、１６）、（サブグループＩＩＤ、配列番号１２１、１２２、１２４、１６）ヒトＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク１−４マイナスＫａｂａｔＨＶＲｓ（サブグループＩＩＩＡ、配列番号１２５、１２６、１２７、１６）、（サブグループＩＩＩＢ、配列番号１２８、１２９、１２７、１６）ヒトＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク１−４マイナス伸長したＨＶＲｓ（サブグループＩＩＩＣ、配列番号１２８、１２９、１３０、１６）、（サブグループＩＩＩＤ、配列番号１２８、１２９、１３１、１６）ヒトＶＨアクセプター１フレームワーク１−４マイナスＫａｂａｔＨＶＲｓ（サブグループアクセプター１Ａ、配列番号１３２、１２６、１３３、１６）および（サブグループアクセプター１Ｂ、配列番号１２８、１２９、１３３、１６）ヒトＶＨアクセプター１フレームワーク１−４マイナス伸長したＨＶＲｓ（サブグループアクセプター１Ｃ、配列番号１２８、１２９、１３４、１６）ヒトＶＨアクセプター２フレームワーク１−４マイナスＫａｂａｔＨＶＲｓ（サブグループアクセプター２Ａ、配列番号１３２、１２６、１３５、１６）および（サブグループアクセプター２Ｂ、配列番号１２８、１２９、１３５、１６）ヒトＶＨアクセプター２フレームワーク１−４マイナス伸長したＨＶＲｓ（サブグループアクセプター２Ｃ、配列番号１２８、１２９、１３６、１６）および（サブグループアクセプター２Ｄ、配列番号１２８、１２９、１３７、１６）。
【図５Ａ】Ｒｏｂｏ４ポリペプチドの全長アミノ酸配列を示す。可能性のあるシグナル配列は破線の下線によって示される。細胞外ドメインの一部は、実線の下線によって示される。Ｒｏｂｏ４細胞外ドメインは、回収または検出の容易さのためにヒスチジンタグに連結された。
【図５Ｂ】図５Ｂは、例えば、本明細書で開示される抗Ｒｏｂｏ４Ｆａｂファージディスプレイ実験中で用いられるＨｉｓタグ化可溶性Ｒｏｂｏ４細胞外ドメインフラグメント（配列番号１７１）の配列を示す。Ｒｏｂｏ４細胞外ドメインは、回収または検出の容易さのためにヒスチジンタグに連結された。
【図６Ａ】図６Ａは、抗Ｒｏｂｏ４抗体ＹＷ７１．２２重鎖の全長配列（配列番号１６９）を示す。太字かつ下線で示されるアラニンは、システインが置換されてチオＭＡｂを生成した位置である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、抗Ｒｏｂｏ４抗体ＹＷ７１．２２軽鎖の全長配列（配列番号１７０）を示す。太字かつ下線で示されるアラニンは、システインが置換されてチオＭＡｂを生成した位置である。
【図７】図７は、マウスＲｏｂｏ４細胞外ドメインのアミノ酸配列を示しており、このドメインは、可能性のあるシグナル配列を含み、かつＨ２３２位置に結合されたヒスチジンタグＲＲＡ（Ｈ）５を有する（配列番号１７２）。破線の下線は、哺乳動物細胞での発現の間に切断される、可能性のあるシグナル配列を示す。
【図８】図８はＲｏｂｏ４構築物を用いるＨＵＶＥＣ遊走アッセイの結果の棒グラフである。
【図９】図９は、Ｒｏｂｏ４がＳｌｉｔ２に結合しないことを示しているＢｉａＣｏｒｅアッセイの結果を示す。
【図１０】図１０は、Ｒｏｂｏ４がＵＮＣ５Ｂと相互作用することを示しているＢｉａＣｏｒｅアッセイの結果を示す。
【図１１】図１１は、Ｒｏｂｏ４が胎児マウス内皮で発現されることを示しているＩＳＨアッセイの写真である。
【図１２】図１２Ａは、ヒトＨＭ−７結腸癌マウス異種移植片腫瘍モデルでのＲｏｂｏ４の発現を示す。図１２Ｂは、ヒトＨＭ−７結腸癌マウス異種移植片腫瘍モデルでのＲｏｂｏ４の発現を示す。図１２Ｃは、ヒトＭＤＡ−ＭＢ−１７５乳癌腫瘍マウス異種移植片モデルでのＲｏｂｏ４発現を示す。図１２Ｄは、ヒトＭＤＡ−ＭＢ−１７５乳癌腫瘍マウス異種移植片モデルでのＲｏｂｏ４発現を示す。
【図１３】図１３Ａは、ヒト悪性黒色腫でのＲｏｂｏ４の発現を示す。図１３Ｂは、ヒト悪性黒色腫でのＲｏｂｏ４の発現を示す。図１３Ｃは、ヒト悪性黒色腫でのＲｏｂｏ４の発現を示す。図１３Ｄは、ヒト悪性黒色腫でのＲｏｂｏ４の発現を示す。
【図１４−１】図１４Ａは、小細胞肺癌におけるＲｏｂｏ４の発現を示す。図１４Ｂは、小細胞肺癌におけるＲｏｂｏ４の発現を示す。図１４Ｃは、小細胞肺癌におけるＲｏｂｏ４の発現を示す。図１４Ｄは、小細胞肺癌におけるＲｏｂｏ４の発現を示す。
【図１４−２】図１４Ｅは結腸癌におけるＲｏｂｏ４の発現を示す。図１４Ｆは結腸癌におけるＲｏｂｏ４の発現を示す。図１４Ｇは結腸癌におけるＲｏｂｏ４の発現を示す。図１４Ｈは結腸癌におけるＲｏｂｏ４の発現を示す。
【図１５Ａ】図１５Ａは、マウスＭＳ１細胞による抗Ｒｏｂｏ４抗体７１．２２の内部移行（図１５Ａ）を示す。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、マウスＭＳ１細胞による抗Ｒｏｂｏ４抗体７１．２２の内部移行（図１５Ｂ）を示す。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、マウスＭＳ１細胞による親和性成熟した抗Ｒｏｂｏ４抗体７１．２２．Ｓ１．１６の内部移行（図１５Ｃ）を示す。
【図１６】図１６は、内皮細胞遊走アッセイの結果を示している棒グラフである。抗Ｒｏｂｏ４抗体は、ＶＥＧＦ誘発性のＥＣ遊走をブロックしなかった。
【図１７】図１７は、コントロール、抗ＶＥＧＦ、抗Ｒｏｂｏ４（ＹＷ７１．２２）および抗Ｒｏｂｏ４プラス抗ＶＥＧＦ抗体を投与した、異種移植片マウスモデルでの時間の関数としての中央腫瘍値の変化のグラフである。裸のＲｏｂｏ４抗体はこれらの実験では腫瘍増殖を阻害しなかった。
【図１８】図１８Ａは、ＦＡＣＳプロットの結果を示しており、これは親和性成熟した抗Ｒｏｂｏ４クローン７１．２２．Ｓ１．１６および７１．２２．Ｓ１．２１がＨＵＶＥＣ細胞上で内因性に発現されるＲｏｂｏ４に結合することを示している。これらのプロットはまた、親の抗体７１．２２がまた、ヒトのＲｏｂｏ４と交差反応することを示している。図１８Ｂは、ＦＡＣＳプロットの結果を示しており、これは親和性成熟した抗Ｒｏｂｏ４クローン７１．２２．Ｓ１．１６および７１．２２．Ｓ１．２１がＨＵＶＥＣ細胞上で内因性に発現されるＲｏｂｏ４に結合することを示している。これらのプロットはまた、親の抗体７１．２２がまた、ヒトのＲｏｂｏ４と交差反応することを示している。図１８Ｃは、ＦＡＣＳプロットの結果を示しており、これは同じ親和性成熟した抗Ｒｏｂｏ４抗体クローンが、マウスＭＳ１細胞上で内因性に発現されたマウスＲｏｏ４に結合することを示している。これらのプロットはまた、親の抗体７１．２２がまた、マウスのＲｏｂｏ４と交差反応することを示している。図１８Ｄは、ＦＡＣＳプロットの結果を示しており、これは同じ親和性成熟した抗Ｒｏｂｏ４抗体クローンが、マウスＭＳ１細胞上で内因性に発現されたマウスＲｏｏ４に結合することを示している。これらのプロットはまた、親の抗体７１．２２がまた、マウスのＲｏｂｏ４と交差反応することを示している。
【図１９】図１９Ａは、実施例１２に記載されるとおりマウスへの注射後、抗Ｒｏｂｏ４抗体７１．２２が脈管構造と会合することを示す。図１９Ｂは、実施例１２に記載されるとおりマウスへの注射後、抗Ｒｏｂｏ４抗体７１．２２が脈管構造と会合することを示す。
【図２０】図２０Ａは、ビーズ増殖アッセイの結果を示しており、これは、抗Ｒｏｂｏ４抗体７１．２２がＨＵＶＥＣの管の伸長を阻害すること示している。図２０Ａは、管の総数および長さの両方が、無関係のコントロールの抗体（抗ブタクサ，Ｅ２５）に比較して７１．２２でのＨＵＶＥＣの処置の際に軽減されることを示している。抗ＶＥＦを陽性のコントロール抗体として用いた。図２０Ｂは、ビーズ増殖アッセイの結果を示しており、これは、抗Ｒｏｂｏ４抗体７１．２２がＨＵＶＥＣの管の伸長を阻害すること示している。抗ＶＥＦを陽性のコントロール抗体として用いた。図２０Ｂは、１００、２００および３００μｍでひいた同心円で代表的な例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６９】
（発明の詳細な説明）
Ｉ．序
本発明は、Ｒｏｂｏ４またはその一部に結合する組成物、このような組成物を備えるキットおよび製品、ならびにこのような組成物を用いる方法であって、例えば、Ｒｏｂｏ４レに結合するリガンドを調節するため、およびＲｏｂｏ４レセプターに対するリガンド結合と関連する生物学的／生理学的な活性を調節するための方法を包含する方法を提供する。本発明は、治療および診断（例えば、インビボ、インビトロ、またはエキソビボの画像化）の標的として有用なレセプターであるＲｏｂｏ４レセプターに結合する種々の抗Ｒｏｂｏ４抗体の特異性に一部は基づく。本発明の抗Ｒｏｂｏ４抗体は、異常または所望されない内皮細胞増殖、例えば、障害における異常または望ましくない血管細胞増殖に関連する生理学的状態を標的するのにおける使用のための治療剤および診断剤として都合よく用いられ得、この障害としては限定はしないが、ガン、血管形成の調節不全およびこの障害を経験している組織内の内皮細胞増殖と関連する（例えば、それによって、増強される）障害、固形腫瘍および転移、アテローム性動脈硬化症、水晶体後部線維増殖症、血管腫、慢性炎症、眼内新生血管疾患、例えば、増殖性網膜症、例えば、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、血管新生緑内障、移植角膜組織および他の組織の免疫拒絶、関節リウマチ、および乾癬が挙げられる。本発明の抗Ｒｏｂｏ４抗体は、単独で、または追加の薬剤（抗悪性腫瘍組成物、化学療法剤、細胞傷害性剤、増殖阻害剤を含む）と組み合わせて用いられてもよい。ある実施形態では、本発明は、Ｒｏｂｏ４機能をブロックするためにＲｏｂｏ４標的化抗体を特定および／または用いるための方法を提供し、Ｒｏｂｏ４を発現する細胞に対して（例えば、その細胞表面に）細胞傷害性剤を送達し、および／またはその細胞表面上にＲｏｂｏ４を発現する細胞に対して造影剤を送達する。例えば、ある実施形態では、検出可能に標識された抗Ｒｏｂｏ４抗体は好都合には、血管形成の増大が有害である疾患状態（例えば、ガンおよび黄斑変性症）のための、あるいは内皮細胞増殖、血管細胞増殖および／または血管形成が望ましい状態である（例えば、創傷治癒などにおける）生理学的状態のための造影剤として用いられてもよい。
【００７０】
ＩＩ．定義
本明細書において用いる場合、以下の用語は、特記しない限り、下でそれらに関して考えられる意味を有する。
【００７１】
「Ｒｏｂｏ４」または「マジック・ラウンドアバウト（Ｍａｇｉｃ  Ｒｏｕｎｄａｂｏｕｔ）」、「内皮細胞特異的分子４（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ４）」または「ＥＣＳＭ４」という用語は、本明細書において用いる場合、図５に示されるアミノ酸配列、その改変体またはサブ配列（ここに本発明の抗体が特異的に結合する）（これは、例えば、Ｒｏｂｏ４の細胞外ドメインまたはその任意のサブ配列を含む）を含む、任意の天然または改変体（天然であるかまたは合成のいずれか）のＲｏｂｏ４ポリペプチドを指す。「野性型Ｒｏｂｏ４」という用語は一般には、天然に存在するＲｏｂｏ４タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。「野生型Ｒｏｂｏ４配列」という用語は一般には、天然に存在するＲｏｂｏ４で見出されるアミノ酸配列をいう。本発明のＲｏｂｏ４ポリペプチドは、哺乳動物Ｒｏｂｏ４ポリペプチド、例えば、限定はしないがヒト、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、げっ歯類のＲｏｂｏ４である。「Ｒｏｂｏ４」、「マジック・ラウンドアバウト」、「内皮細胞特異的分子４」または「ＥＣＳＭ４」とはまた、核酸、およびポリペプチド多形性改変体、対立遺伝子、変異体および種間ホモログをいい、これは：（１）Ｒｏｂｏ４核酸によってコードされるアミノ酸配列（ヒトＲｏｂｏ４ポリペプチド配列については、例えば、図５および７および配列番号１３８および１７１を参照のこと；マウスＲｏｂｏ４ポリペプチド配列については，例えば、配列番号１７２を参照のこと）に対して、約６０％を超えるアミノ酸配列同一性、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、好ましくは９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％またはそれ以上のアミノ酸配列同一性を、好ましくは少なくとも約２５、約５０、約１００、約２００、約５００、約１０００またはそれ以上のアミノ酸の領域にわたって有するアミノ酸配列を有し；（２）Ｒｏｂｏ４タンパク質のアミノ酸配列、およびその保存的に改変された改変体を含む免疫原に対して惹起された抗体、例えば、ポリクローナル抗体、および／またはモノクローナル抗体に結合し；（３）Ｒｏｂｏ４タンパク質をコードする核酸配列、およびその保存的に改変された改変体に対応するアンチセンス鎖に対してストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズし、（４）Ｒｏｂｏ４核酸（例えば、図５および７、ならびに配列番号１３８、１７１または１７２に示されるポリペプチドをコードする核酸）に対して約９５％、好ましくは約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、またはそれ以上のヌクレオチド配列同一性を、好ましくは少なくとも約２５、約５０、約１００、約２００、約５００、約１０００、またはそれ以上のヌクレオチドの領域にわたって有する核酸配列を有する。好ましくは、このＲｏｂｏ４核酸は、配列番号１３８、１７１または１７２をコードする核酸配列に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を超える同一性を、好ましくは少なくとも約２５、約５０、約１００、約１５０、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、また���約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、または約１０００以上のヌクレオチドの領域にまたがって有する。
【００７２】
「抗Ｒｏｂｏ４抗体」または「Ｒｏｂｏ４に結合する抗体」という用語は、その抗体がＲｏｂｏ４を標的化するのに診断剤および／または治療剤として有用であるように、十分な親和性でＲｏｂｏ４に結合し得る抗体を指す。好ましくは、未関連の非Ｒｏｂｏ４タンパク質に対する抗Ｒｏｂｏ４抗体の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定した場合、Ｒｏｂｏ４に対する抗体の結合の約１０％未満である。特定の実施形態では、Ｒｏｂｏ４に結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、または≦０．１ｎＭという解離定数（Ｋｄ）を有する。特定の実施形態では、抗Ｒｏｂｏ４抗体は、種々の種由来のＲｏｂｏ４の間で保存されているＲｏｂｏ４のエピトープに結合する。他の実施形態では、抗Ｒｏｂｏ４抗体は、種々の種由来のＲｏｂｏ４の間で保存されていないＲｏｂｏ４のエピトープに結合する。
【００７３】
本明細書における「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、かつ具体的には、それらが所望の生物学的活性を示す限りは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つのインタクトな抗体から形成される多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、および抗体フラグメントを包含する。
【００７４】
「単離された」抗体とは、その天然環境の構成成分から同定され、分離され、および／または回収されている抗体である。その天然環境の混入構成成分は、その抗体についての研究、診断または治療的な用途を妨害する物質であり、それらとしては、酵素、ホルモン、およびその他のタンパク質様または非タンパク質様の溶質を挙げることができる。いくつかの実施形態では、抗体は、（１）例えば、ローリー法によって決定したときに、抗体の９５重量％を超えるまで、ある実施形態では９９重量％を超えるまで精製されるか、（２）例えば、スピニングカップ（ｓｐｉｎｎｉｎｇ  ｃｕｐ）シークエネーターの使用により、少なくとも１５残基のＮ末端アミノ酸配列もしくは内部アミノ酸配列を得るのに十分な程度まで精製されるか、または（３）例えば、クマシー・ブルー染色もしくは銀染色を用いた、還元条件もしくは非還元条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、均一になるまで精製される。単離された抗体としては、組み換え細胞内でインサイチュの抗体が含まれる。なぜなら、その抗体の天然環境の少なくとも一つの構成成分が存在しないからである。しかし、通常は、単離された抗体とは、少なくとも１回の精製段階によって調製されるものである。
【００７５】
「天然の抗体」とは通常は、２本の同一の軽（Ｌ）鎖および２本の同一の重（Ｈ）鎖から構成される約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合する一方で、ジスルフィド結合の数は異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間で変化する。各重鎖および軽鎖はまた、規則的に間隔のあいた鎖内ジスルフィド架橋も有する。各々の重鎖は、一方の末端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、続いて多数の定常ドメインを有する。各軽鎖は、一方の末端に可変ドメイン（ＶＬ）と、そのもう一方の末端に定常ドメインとを有する；軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第一定常ドメインと整列され、軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列されている。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間の界面を形成すると考えられる。
【００７６】
抗体の「可変領域」または「可変ドメイン」とは、その抗体の重鎖または軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。重鎖の可変ドメインは、「ＶＨ」と呼ばれてもよい。軽鎖の可変ドメインは、「ＶＬ」と呼ばれてもよい。これらのドメインは一般には、抗体の最も可変の部分であって、抗原結合部位を含む。
【００７７】
「可変」という用語は、可変ドメインの特定の部分が、抗体間で広範囲に配列が異なり、それぞれ特定の抗体の、その特定の抗原に対する結合および特異性に用いられるという事実を指す。しかし、可変性は、抗体の可変ドメイン全体にわたり均等に分布しているわけではない。この可変性は、軽鎖および重鎖両方の可変ドメインにおける超可変領域（ＨＶＲｓ）と呼ばれる三つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク部（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、四つのＦＲ領域を含み、それらのＦＲ領域は大部分がβシート立体配置を採っており、三つのＨＶＲにより連結され、これらのＨＶＲは、βシート構造を連結するループを形成して、場合によりこのβシート構造の一部を形成する。各鎖中のＨＶＲｓは、ＦＲ領域によって近接して一緒に保持されて、もう一方の鎖由来のＨＶＲｓと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら、，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）を参照のこと）。定常ドメインは、抗原に抗体を結合させることに直接には関与していないが、抗体依存性細胞性細胞傷害作用への抗体の関与などの様々なエフェクター機能を示す。
【００７８】
任意の脊椎動物種由来の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる二つの明らかに別個の型のうちの一つに割り当てることができる。
【００７９】
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、抗体（免疫グロブリン）を異なる分類に割り当てることができる。免疫グロブリンには以下の五つの主要な分類：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのいくつかを「サブクラス」（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに分けることができる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なる分類のサブユニット構造および三次元立体配置は周知であり、例えば、Ａｂｂａｓら、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第４版（Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｃｏ．２０００）に一般的に記載されている。抗体は、１つ以上の他のタンパク質またはペプチドとのこの抗体の共有結合または非共有結合によって形成される、より大きい融合分子の一部であってもよい。
【００８０】
「全長抗体」、「インタクトな抗体」および「全抗体（ｗｈｏｌｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、本明細書において相互交換可能に用いられ、下に定義されるような抗体のフラグメントではなく、その実質的にインタクトな形態の抗体を指す。この用語は特にＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
【００８１】
「裸の抗体」とは本明細書の目的のために、細胞傷害性部分または放射標識にコンジュゲートされていない抗体である。
【００８２】
「抗体フラグメント」とは、インタクトな抗体の一部を含み、その一部は好ましくはその抗原結合領域を含む。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；ダイアボディ（二特異性抗体）（ｄｉａｂｏｄｙ）；線状抗体（ｌｉｎｅａｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）；一本鎖抗体分子；ならびに抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が挙げられる。
【００８３】
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる、それぞれ単一の抗原結合部位を有する２本の同一の抗原結合フラグメントと、その名称が容易に結晶化できる能力を反映している残りの「Ｆｃ」フラグメントとを産生する。ペプシン処理は、二つの抗原結合部位を有するＦ（ａｂ’）２フラグメントを生じ、このフラグメントは、依然として抗原と架橋できる。
【００８４】
「Ｆｖ」とは、完全な抗原結合部位を有する、最小限の抗体フラグメントである。一実施形態では、２つの鎖のＦｖ種は、密接に非共有的に会合した、一つの重鎖可変ドメインと一つの軽鎖可変ドメインとの二量体からなる。一本鎖のＦｖ（ｓｃＦｖ）種では、１つの重鎖および１つの軽鎖可変ドメインが、可塑性のペプチドリンカーによって共有結合されてもよく、その結果、その軽鎖および重鎖が、２つの鎖のＦｖ種における構造と類似の「二量体」構造で会合し得る。各可変ドメインの三つのＨＶＲｓが相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体の表面上に抗原結合部位を規定するのは、この立体配置である。まとめると、六つのＨＶＲｓは、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン（すなわち抗原に対して特異的な三つのＨＶＲｓのみを含む、Ｆｖの半分）でさえも、結合部位全体よりも低い親和性ではあるが、抗原を認識してその抗原と結合する能力を有する。
【００８５】
Ｆａｂフラグメントは、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含み、また軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）も含む。Ｆａｂ’フラグメントは、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に、抗体のヒンジ部由来の１つ以上のシステインを含む２〜３の残基が付加していることが、Ｆａｂフラグメントと異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書においては定常ドメインのシステイン残基（単数または複数）が１つの遊離チオール基を有するＦａｂ’についての呼称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、その間にヒンジシステインを有するＦａｂ’フラグメントの対として本来産生された。抗体フラグメントのその他の化学的カップリングも公知である。
【００８６】
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」の抗体フラグメントは、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、ここで、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中に存在する。一般には、このｓｃＦｖポリペプチドは、このｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖの総説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｅｎ，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  編，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４）ｐｐ．２６９〜３１５を参照のこと。
【００８７】
「ダイアボディ、二特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）」という用語は、二つの抗原結合部位を有する抗体フラグメントを指し、このフラグメントは、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）中で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖上のこの二つのドメイン間で対形成させるには短すぎるリンカーを用いることによって、これらのドメインに別の鎖の相補的ドメインと対形成することを強いて、二つの抗原結合部位を生み出す。ダイアボディは二価であってもまたは二重特異性であってもよい。ダイアボディは、例えば、欧州特許第４０４，０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Ｈｕｄｓｏｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９〜１３４（２００３）；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，９０：６４４４〜６４４８（１９９３）に、さらに詳細に記載されている。トリアボディ（三特異性抗体）（ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）およびテトラボディ（四特異性抗体）（ｔｅｔｒａｂｏｄｉｅｓ）はまた、Ｈｕｄｓｏｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９〜１３４（２００３）に記載されている。
【００８８】
本明細書に使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、微量に存在し得る潜在的な変異体、例えば、天然に存在する変異体を除いて同一である抗体を指す。従って、「モノクローナル」という修飾詞は、別個の抗体の混合物ではないという、その抗体の特徴を示す。特定の実施形態では、このようなモノクローナル抗体は代表的には、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を包含し、ここでこの標的に結合するポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列からの単一の標的結合ポリペプチド配列の選択を包含するプロセスによって得られた。例えば、この選択プロセスは、複数のクローン、例えば、ハイブリドーマクローンのプール、ファージクローンまたは組み換えＤＮＡクローンからの特有のクローンの選択であってもよい。選択された標的結合配列をさらに変更して、例えば、標的について親和性を改善する、標的結合配列をヒト化する、細胞培養物でのその産生を改善する、インビボでのその免疫原性を減少する、多特異性の抗体を作製するなどを行うことができ、変更した標的結合配列を含んでいる抗体も本発明のモノクローナル抗体であることが理解されるべきである。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を代表的には含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各々のモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、他の免疫グロブリンが代表的には混入していないという点で有利である。
【００８９】
「モノクローナル」という修飾詞は、実質的に均一な抗体集団から得られているという抗体の特徴を示しており、抗体を何か特定の方法で生産する必要があると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、様々な技術、例えば、ハイブリドーマ法（例えばＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）；Ｈａｎｇｏら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１４（３）：２５５〜２６０（１９９５）；Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，第２版、１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３〜６８１，（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１））、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照）、ファージディスプレイ技術（例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４〜６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１〜５９７（１９９２）；Ｓｉｄｈｕら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９〜３１０（２００４）；Ｌｅｅら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３〜１０９３（２００４）；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  １０１（３４）：１２４６７〜１２４７２（２００４）；およびＬｅｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８４（１〜２）：１１９〜１３２（２００４））、ならびにヒト免疫グロブリン遺伝子座またはヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子の一部またはすべてを含む動物のヒト抗体またはヒト様抗体を産生するための技術（例えば、国際公開第１９９８／２４８９３号；国際公開第１９９６／３４０９６号；国際公開第１９９６／３３７３５号；国際公開第１９９１／１０７４１号；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５〜２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３（１９９３）；米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；および同第５，６６１，０１６号；Ｍａｒｋｓら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９〜７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇら，Ｎａｔｕｒｅ，３６８：８５６〜８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３６８：８１２〜８１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１４：８４５〜８５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：８２６（１９９６）；ならびにＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３：６５〜９３（１９９５））によって作製され得る。
【００９０】
本明細書におけるモノクローナル抗体とは、詳細には、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の種由来の抗体あるいは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同であり、ただしその鎖（単数または複数）の残りの部分が別の種由来の抗体あるいは別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同である「キメラ」抗体、ならびにそれが所望の生物的活性を有する限りこのような抗体のフラグメントを包含する（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，８１：６８５１〜６８５５（１９８４））。キメラ抗体としては、抗体の抗原結合領域が例えば、目的の抗原でマカクザルを免疫することによって生成される抗体由来である、ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）抗体が挙げられる。
【００９１】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」型とは、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体とは、レシピエントの超可変領域由来の残基が、所望の特異性、親和性および能力を有する、マウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域由来の残基によって置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）の残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体に、またはドナー抗体に見出されない残基を含んでもよい。これらの修飾は抗体の能力をさらに洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てまたは実質的に全ての超可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、かつ全てあるいは実質的に全てのＦＲがヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つ、代表的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体はまた、必要に応じて免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、代表的にはヒトの免疫グロブリンのものを含む。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１，５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２，３２３〜３２９（１９８８）およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３〜５９６（１９９２）を参照のこと。また、以下の概説文献およびそこに引用された参考文献も参照のこと：ＶａｓｗａｎｉおよびＨａｍｉｌｔｏｎ，Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ  ＆  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：１０５〜１１５（１９９８）；Ｈａｒｒｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ２３：１０３５〜１０３８（１９９５）；ＨｕｒｌｅおよびＧｒｏｓｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：４２８〜４３３（１９９４）。
【００９２】
「ヒト抗体」とは、ヒトによって生成される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を保有するか、および／または本明細書において開示されるようなヒト抗体を作製するための任意の技術を用いて作製されている抗体である。ヒト抗体のこの定義は詳細には、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を除外する。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーを含む、当該分野で公知の種々の技術を用いて生成され得る。ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１）。ヒトモノクローナル抗体の調製のためには、Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒら、，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４７（１）：８６〜９５（１９９１）に記載される方法も利用可能である。ｖａｎ  Ｄｉｊｋおよびｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，５：３６８〜７４（２００１）も参照のこと。ヒト抗体は、抗原のチャレンジに応答してこのような抗体を生成するように改変されているが、その内因性の遺伝子座が無効にされているトランスジェニック動物、例えば、免疫されたゼノマウス（ｘｅｎｏｍｉｃｅ）に対して抗原を投与することによって調製されてもよい（例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術に関しては米国特許第６，０７５，１８１号および同第６，１５０，５８４号を参照のこと）。例えば、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されるヒト抗体に関しては、Ｌｉら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，１０３：３５５７〜３５６２（２００６）を参照のこと。
【００９３】
「抗原」は、抗体が選択的に結合し得る所定の抗原（例えば、Ｒｏｂｏ４配列）である。この標的抗原は、ポリペプチド、炭水化物、核酸、脂質、ハプテンまたは他の天然に存在するかまたは合成の化合物であってもよい。好ましくはこの標的抗原はポリペプチドである。
【００９４】
本明細書の目的に関して「アクセプターヒトフレームワーク」とは、ヒト免疫グロブリンフレームワーク由来の、またはヒトコンセンサスフレームワーク由来のＶＬもしくはＶＨフレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワーク「由来」のアクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含んでもよいし、または既存のアミノ酸配列変化を含んでもよい。ある実施形態では、既存のアミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、または２以下である。既存のアミノ酸変化がＶＨに存在する場合、好ましくはこれらの変化は、位置７１Ｈ、７３Ｈおよび７８Ｈのうちの３、２または１つだけで生じる；例えば、それらの位置でのアミノ酸残基は７１Ａ、７３Ｔおよび／または７８Ａであってもよい。一実施形態では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列またはヒトのコンセンサスフレームワーク配列に対して配列が同一である。既存のアミノ酸変化が、ＶＨに存在する場合、好ましくは、これらの変化は、位置７１Ｈ、７３Ｈおよび７８Ｈのうちの３、２または１つだけで生じる；例えば、それらの位置でのアミノ酸残基は７１Ａ、７３Ｔおよび／または７８Ａであってもよい。一実施形態では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列またはヒトのコンセンサスフレームワーク配列に対して配列が同一である。
【００９５】
「ヒトのコンセンサスフレームワーク」とは、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨのフレームワーク配列の選択において最も一般的に存在するアミノ酸残基に相当するフレームワークである。一般にはヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨの配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループ由来である。一般には、配列のサブグループは、Ｋａｂａｔらのとおりである。一実施形態では、ＶＬについて、このサブグループは、ＫａｂａｔらにおけるサブグループκＩである。一実施形態では、ＶＨについて、このサブグループは、ＫａｂａｔらのサブグループＩＩＩである。
【００９６】
「ＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク」は、Ｋａｎａｔらの可変重鎖サブグループＩＩＩのアミノ酸配列から得られたコンセンサス配列を含む。一実施形態では、このＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワークアミノ酸配列は、以下の配列の各々の少なくとも一部または全てを含む：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号１２８）−Ｈ１−ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ（配列番号１２９）−Ｈ２−ＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣ（配列番号１３１）−Ｈ３−ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１６）。別の実施形態では、ＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワークアミノ酸配列は、以下の各々の配列のうちの少なくとも一部または全てを含む：ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号１２８）−Ｈ１−ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ（配列番号１２９）−Ｈ２−ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣ（配列番号１３７）−Ｈ３−ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１６）。
【００９７】
「ＶＬサブグループＩコンセンサスフレームワーク」は、Ｋａｂａｔらの可変軽鎖κサブグループＩのアミノ酸配列から得られたコンセンサス配列を含む。一実施形態では、このＶＨサブグループＩコンセンサスフレームワークアミノ酸配列は、以下の配列の各々のうちの少なくとも一部または全てを含む：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号９）−Ｌ１−ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１０）−Ｌ２−ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（配列番号９９）−Ｌ３−ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１００）。
【００９８】
「未改変のヒトフレームワーク」とは、例えば、アクセプターヒトフレームワークにおいて非ヒトアミノ酸置換（単数または複数）を欠いている、アクセプターヒトフレームワークと同じアミノ酸配列を有するヒトフレームワークである。
【００９９】
「超可変領域」、「ＨＶＲ」、または「ＨＶ」という用語は、本明細書において用いる場合、抗体の可変ドメインの領域であって、配列が超可変であるか、および／または構造的に規定されたループを形成する領域を指す。一般には、抗体は、６つの超可変領域を含む；ＶＨにおいて３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、およびＶＬにおいて３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）。多数の超可変領域の描写は、使用されており、本明細書に包含される。Ｋａｂａｔの相補性決定領域（Ｋａｂａｔ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎｓ）（ＣＤＲｓ）は、配列の変動に基づくＨＶＲｓであって、最も一般的に用いられている（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））。Ｃｈｏｔｈｉａは、構造ループの位置の代わりを言及している（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７（１９８７））。ＡｂＭ超可変領域は、ＫａｂａｔのＣＤＲｓとＣｈｏｔｈｉａの構造的ループとの間の妥協に相当しており、Ｏｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって用いられる。「コンタクト（ｃｏｎｔａｃｔ）」超可変領域は、利用可能な複合体結晶構造の分析に基づく。これらの超可変領域の各々に由来ずる残基は以下に注記される。
【０１００】
【数１】
2010518115.tif 000003
抗体の超可変領域を描写するアミノ酸の位置／境界は、当該分野で公知の状況および種々の定義（下に記載のとおり）に依存して変化し得る。可変ドメイン内のいくつかの位置は、これらの位置が１セットの基準のもとでは超可変領域内であるとみなされ得るが、異なるセットの基準のもとでは超可変領域の外側であるとみなされているという点でハイブリッドの超可変位置と見られ得る。これらの位置のうちの１つ以上がまた、伸長された超可変領域にも見出され得る。一実施形態では、これらのハイブリッドの超可変位置は、重鎖可変ドメイン内に、位置２６〜３０、２６〜３５  ３３〜３５Ｂ、４７〜４９、４９〜６５、５７〜６５、９５〜１０２、９３、９４および１０２のうちの１つ以上を含む。一実施形態では、これらのハイブリッドの超可変位置は、軽鎖可変ドメイン中に、位置２４〜２９、２４〜３４、３５〜３６、４６〜４９、５０〜５６、８９〜９７、５６および９７のうちの１つ以上を含む。
【０１０１】
本明細書において用いる場合、軽鎖のＨＶＲｓは、ＨＶＲ−Ｌ１、−Ｌ２、もしくは−Ｌ３、またはＨＶＲ１−ＬＣ、ＨＶＲ２−ＬＣもしくはＨＶＲ３−ＬＣまたは他の類似の命名（軽鎖ＨＶＲが言及されることを示す）として交換可能に言及される。本明細書において用いる場合、重鎖のＨＶＲｓは、ＨＶＲ−Ｈ１、−Ｈ２、もしくは−Ｈ３、またはＨＶＲ１−ＨＣ、ＨＶＲ２−ＨＣもしくはＨＶＲ３−ＨＣまたは他の類似の命名（重鎖ＨＶＲが言及されることを示す）として交換可能に言及される。
【０１０２】
超可変領域は、以下のような「伸長した超可変領域」を含んでもよい：ＶＬ中で２４−３６または２４〜３４（Ｌ１）、４６〜５６または５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）、およびＶＨ中で２６〜３５（Ｈ１）、５０〜６５または４９〜６５（Ｈ２）および９３〜１０２、９４〜１０２または９５〜１０２（Ｈ３）。可変ドメイン残基は、これらの定義の各々についてＫａｂａｔら、上掲に従ってナンバリングされる。
【０１０３】
本明細書の目的に関して「変更された超可変領域」とは、その中の１つ以上の（例えば、１〜約１６個の）アミノ酸置換（単数または複数）を含む超可変領域である。
【０１０４】
本明細書の目的について「未改変の超可変領域」とは、それが由来する非ヒト抗体と同じアミノ酸配列を有する超可変領域、すなわち、その中に１つ以上のアミノ酸置換を欠いている領域である。
【０１０５】
「フレームワーク」または「ＦＲ」残基とは、本明細書において定義されるような超可変領域残基以外の可変ドメインの残基である。本明細書において用いる場合、ＬＣ−ＦＲ１−４またはＦＲ１−４−ＬＣまたは類似の命名は、交換可能に用いられて、軽鎖のフレームワーク領域をいう。本明細書において用いる場合、ＨＣ−ＦＲ１−４またはＦＲ１−４−ＨＣまたは類似の命名は、交換可能に用いられて、重鎖のフレームワーク領域をいう。
【０１０６】
「親和性成熟した」抗体とは、変更（単数または複数）を有さない親抗体に比べて、抗原に対する抗体の親和性に改善を生じる１つ以上の変更を、その１つ以上のＣＤＲｓに有する抗体である。好ましい親和性成熟した抗体は、標的抗原に対してナノモル濃度またはピコモル濃度の親和性さえ有する。親和性成熟した抗体は、当該分野で公知の手順を用いて産生されてもよい。例えば、Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９〜７８３（１９９２）は、ＶＨおよびＶＬドメインシャッフリングによる親和性成熟を記載している。ＣＤＲおよび／またはフレームワーク残基のランダム突然変異誘発は、Ｂａｒｂａｓら、ＰＮＡＳ，ＵＳＡ  ９１：３８０９〜３８１３（１９９４）；Ｓｃｈｉｅｒら、Ｇｅｎｅ  １６９：１４７〜１５５（１９９５）；Ｙｅｌｔｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１９９４〜２００４（１９９５）；Ｊａｃｋｓｏｎら、，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４（７）：３３１０〜９（１９９５）；およびＨａｗｋｉｎｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９〜８９６（１９９２）に記載されている。
【０１０７】
「遮断、ブロッキング」抗体、または抗体の「アンタゴニスト」とは、それが結合する抗原の生物学的活性を阻害または低減するものである。例えば、ブロッキング抗体またはアンタゴニストの抗Ｒｏｂｏ４抗体は、Ｒｏｂｏ４に結合することによって、血管形成を実質的にまたは完全に阻害する。
【０１０８】
「Ｋａｂａｔでの可変ドメイン残基ナンバリング」または「Ｋａｂａｔでのアミノ酸位置ナンバリング」という用語およびそれらのバリエーションは、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）における抗体の編集の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインについて用いられるナンバリングのシステムを指す。このナンバリングのシステムを用いて、正確な直線のアミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲまたはＨＶＲを短くすること、またはそこへの挿入に対応するアミノ酸を少ししか含まなくてもよいし、または追加でアミノ酸を含んでもよい。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後ろに単一のアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔによれば残基５２ａ）を含んでもよく、重鎖ＦＲ残基８２の後ろに挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔによれば残基８２ａ、８２ｂ、および８２ｃなど）を含んでもよい。残基のＫａｂａｔナンバリングは、「標準」Ｋａｂａｔナンバリング配列とのこの抗体の配列の相同性の領域でのアラインメントによって所定の抗体について決定され得る。
【０１０９】
「実質的に同様」または「実質的に同じ」という句は本明細書において用いる場合、２つの数値（一般には一方は本発明の抗体に関連したもので、他方は参照／比較の抗体に関連したもの）の間の十分に高い程度の類似性であって、その結果、この２つの値の間の相違を、この値（例えば、Ｋｄ値）によって測定される生物学的特徴の状況内で生物学的および／または統計学的な相違がほとんどまたは全くないと当業者がみなすような類似性を意味する。この２つの値の間の相違は、参照／比較の抗体についての値の関数として、好ましくは約５０％未満、好ましくは約４０％未満、好ましくは約３０％未満、好ましくは約２０％未満、好ましくは約１０％未満である。
【０１１０】
「結合親和性」とは一般に、分子（例えば抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば抗原）との間の非共有結合的な相互作用の総合的な強度を意味する。特に明記しない限り、本明細書において用いる場合、「結合親和性」とは、結合対のメンバー（例えば抗体と抗原）間の１：１相互作用を反映する内因性の結合親和性を意味する。一般的に、分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、解離定数（Ｋｄ）として表される。親和性は、本明細書中に記載のものを含む当業者に公知の共通した方法によって測定することができる。低親和性抗体は一般に抗原をゆっくり結合して容易に解離する傾向があるのに対し、高親和性抗体は一般に抗原により早く結合し、かつより長く結合したままである傾向である。結合親和性の様々な測定方法が当分野で公知であり、それらの何れかを本発明のために用いることができる。以下に具体的な例示的実施形態を記載する。
【０１１１】
一実施形態では、「Ｋｄ」、「ＫＤ」、または「Ｋｄ値」「Ｋｄ」、または「Ｋｄ値」は、抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性が、一連の段階的な力価の非標識抗原の存在下で、最小濃度の（１２５Ｉ）−標識抗原にてＦａｂを均衡化し、次いで抗Ｆａｂ抗体コーティングしたプレートで結合した抗原を捕獲することによって測定するその後のアッセイによって記載される、目的の抗体のＦａｂバージョンとその抗原を用いて実行される放射性標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって測定される（Ｃｈｅｎ，ら（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９３：８６５〜８８１）。アッセイの条件を決めるために、マイクロタイタープレート（Ｄｙｎｅｘ）を、５μｇ／ｍｌの捕獲抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ  Ｌａｂｓ）を含む５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）にて一晩コーティングして、その後２％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳにて室温（およそ２３℃）で２〜５時間、ブロックする。非吸着プレート（Ｎｕｎｃ＃２６９６２０）中で、１００ｐＭまたは２６ｐＭの［１２５Ｉ］抗原を階段希釈した目的のＦａｂ（例えば、Ｐｒｅｓｔａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４５９３−４５９９（１９９７）に記載のＦａｂ−１２）と混合する。次いで目的のＦａｂを一晩インキュベートする；しかし、インキュベーションは確実に平衡状態に達するまでに長時間（例えば６５時間）かかるかもしれない。その後、室温でのインキュベーション（例えば、１時間）のためにその混合物を捕獲プレートに移す。次いで、溶液を取り除き、そのプレートを０．１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０が含まれるＰＢＳにて８回洗浄する。プレートが乾燥したとき、１５０μｌ／ウェルのシンチレーション物質（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）（ＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ−２０；Ｐａｃｋａｒｄ）を加え、そのプレートをＴｏｐｃｏｕｎｔガンマ・カウンター（Ｐａｃｋａｒｄ）にて１０分間カウントする。最大結合の２０％以下という各々のＦａｂの濃度を選択してそれぞれ競合結合アッセイに用いる。別の実施形態によれば、約１０反応単位（ＲＵ）の固定した抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃のＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−２０００またはＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用い表面プラズモン共鳴アッセイを行うことによりＫｄまたはＫｄ値を測定する。要するに、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５，ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｃ．）を、供給業者の指示書に従ってＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）で活性化した。抗原を１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍｌ（約０．２μＭ）に希釈し、その後、結合したタンパク質の反応単位（ＲＵ）がおよそ１０になるように５μｌ／分の流速で注入した。抗原の注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入した。動力学的な測定のために、２倍の段階希釈したＦａｂ（０．７８ｎＭから５００ｎＭ）を２５℃で、およそ２５μｌ／分の流速で０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳに注入する。会合および解離のセ��サーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル（ｓｉｍｐｌｅ  ｏｎｅ−ｔｏ−ｏｎｅ  Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｄｅｌ）（ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン３．２）を用いて、会合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）を算出する。平衡解離定数（Ｋｄ）をｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出する。例えば、Ｃｈｅｎ，Ｙ．，ら、Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９３：８６５−８８１（１９９９）を参照のこと。上記の表面プラスモン共鳴アッセイによる結合速度が１０６Ｍ−１Ｓ−１を上回るならば、結合速度は、分光計、例えば、流動停止装置を備えた分光光度計（ｓｔｏｐ−ｆｌｏｗ  ｅｑｕｉｐｐｅｄ  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｍｅｔｅｒ）（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）または撹拌キュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ−Ａｍｉｎｃｏ（商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）で測定される、漸増濃度の抗原の存在下にて、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中で、２５℃の、２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の蛍光放出強度（励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ）における増大または減少を測定する蛍光クエンチング技術を用いることによって測定され得る。
【０１１２】
「実質的に減少した」、または「実質的に異なる」という句は、本明細書において用いる場合、２つの数値（一般には一方は本発明の抗体に関連したもので、他方は参照／比較の抗体に関連したもの）の間の十分に高い程度の相違であって、その結果、この２つの値の間の相違を、この値（例えば、Ｋｄ値、ＨＡＭＡ応答）によって測定される生物学的特徴の状況内で統計学的に相違すると当業者がみなすような相違を意味する。この２つの値の間の相違は、参照／比較の抗体についての値の関数として、好ましくは約１０％を超え、好ましくは約２０％を超え、好ましくは約３０％を超え、好ましくは約４０％を超え、好ましくは約５０％を超える。
【０１１３】
ペプチドまたはポリペプチド配列に関して「アミノ酸配列同一性のパーセント（％）」とは、最大パーセント配列同一性を達成するために必要に応じて配列を整列させて、ギャップを導入した後に、その特異的なペプチドまたはポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージとして定義され、配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮しない。アミノ酸配列同一性のパーセントを決定する目的のためのアライメントは当該分野の技術の範囲内の種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ（商標））ソフトウエアのような市販のコンピュータソフトウエアを用いて達成することができる。当業者は比較すべき配列の完全長に渡り最大アライメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含むアライメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。しかし本明細書の目的のためには、アミノ酸配列同一性％の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を用いて作成する。このＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃによって書かれており、そして示されるソースコードは合衆国著作権局Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，２０５５９においてユーザードキュメンテーションと共にファイルされておりここで合衆国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７として登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムはＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから公的に入手することができる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムはＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ（登録商標）Ｖ４．０Ｄ上で使用するためにコンパイルしなければならない。全ての配列比較パラメーターはＡＬＩＧＮ−２プログラムにより設定され、変更されない。
【０１１４】
アミノ酸配列比較のためにＡＬＩＧＮ−２を使用する状況において、所定のアミノ酸配列Ａの所定のアミノ酸配列Ｂに対するアミノ酸配列同一性％（これは代替として所定のアミノ酸配列Ｂに対して特定のアミノ酸配列同一性％を有するかまたは含む所定のアミノ酸配列Ａと表現できる）は下の式により計算され：
１００×分数Ｘ／Ｙ
ここで、ＸはＡおよびＢのプログラムアライメントにおいて配列アライメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により同一マッチとして採点されたアミノ酸残基の数であり、ＹはＢにおけるアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合は、Ｂに対するＡのアミノ酸配列同一性％はＡに対するＢのアミノ酸配列同一性％と等しくならないことが理解される。
【０１１５】
特段の記載が無い限り、本明細書で用いる全てのアミノ酸配列同一性％の値はＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを用いて直前の段落において記載したとおりに得られる。
【０１１６】
「ベクター」という用語は本明細書において用いる場合、それが結合している、別の核酸を輸送することのできる核酸分子を意味するものである。一つのタイプのベクターは「プラスミド」であり、これは付加的なＤＮＡセグメントが結合され得る円形の二重鎖ＤＮＡループを指す。別のタイプのベクターはファージベクターである。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、付加的なＤＮＡセグメントをウイルスゲノムへ結合させ得る。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞内において自己複製することができる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノム中に組み込まれてもよく、それによって宿主ゲノムと共に複製する。さらに、特定のベクターは、それらが作用可能に結合している遺伝子の発現を指令し得る。このようなベクターは本明細書では「組換え発現ベクター」（または単に「組換えベクター」）と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術で有用な発現ベクターはしばしばプラスミドの形態をとる。本明細書では、プラスミドが最も広く使用されているベクターの形態であるので、「プラスミド」と「ベクター」を相互交換可能に用いてもよい。
【０１１７】
本明細書において交換可能に用いられる、「ポリヌクレオチド」または「核酸」とは、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを意味し、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。ヌクレオチドとは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチドまたは塩基、および／またはそれらのアナログ（アナログ）、またはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼにより、または合成反応によりポリマー中に取り込み可能な任意の基質であってもよい。ポリヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチドおよびそれらのアナログを含んでもよい。存在するならば、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーのアセンブリの前になされても、または後になされてもよい。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分により中断されてもよい。ポリヌクレオチドは合成後に、例えば標識とのコンジュゲーションにより、さらに修飾されてもよい。他のタイプの修飾には、例えば「キャップ」、天然に存在するヌクレオチドのうちの１つ以上のアナログでの置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電連結での（例えばホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホアミダート、カルバマートなど）および荷電連結（ホスホロチオアート、ホスホロジチオアートなど）での修飾など、ペンダント部分、例えばタンパク質（例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ｐｌｙ−Ｌ−リジンなど）などを含む修飾、インターカレータ（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒｓ）（例えばアクリジン、ソラレンなど）での修飾、キレート剤（例えば金属、放射性金属、ホウ素、酸化的金属など）を含む修飾、アルキル化剤を含む修飾、修飾された連結を含む修飾（例えばアルファアノマー核酸など）、ならびにポリヌクレオチド（単数または複数）の未修飾形態が挙げられる。さらに、糖類中に通常存在する任意のヒドロキシル基は、例えばホスホナート基、ホスファート基で置き換えられてもよく、標準的な保護基で保護されてもよく、または付加的なヌクレオチドへのさらなる連結を調製するように活性化されてもよく、あるいは固体または半固体の支持体にコンジュゲートされてもよい。５’および３’末端のＯＨはホスホリル化可能であり、または１〜２０個の炭素原子を有する有機キャップ基部分またはアミンで置換することもできる。他のヒドロキシルも標準的な保護基に誘導体化されてもよい。ポリヌクレオチドはまた当該分野で一般的に公知であるリボースまたはデオキシリボース糖類の類似の形態のものをさらに含んでもよく、これらとしては例えば２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロまたは２’−アジド−リボース、炭素環式糖のアナログ類、α−アノマー糖類、エピマー糖類、例えばアラビノース、キシロース類またはリキソース類、ピラノース糖類、フラノース糖類、セドヘプツロース類、非環式アナログ類、および非塩基性ヌクレオシドアナログ類、例えばメチルリボシドが挙げられる。１つ以上のホスホジエステル連結は代替の連結基で置き換えられてもよい。これらの代替の連結基としては、限定されるものではないが、ホスファートがＰ（Ｏ）Ｓ（「チオアート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオアート」）、「（Ｏ）ＮＲ２（「アミダート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（���）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２（「ホルムアセタール」）と置き換えられた実施形態のものが挙げられ、ここでそれぞれのＲおよびＲ’は独立して、Ｈまたは、必要に応じてエーテル（−Ｏ−）結合を含む置換もしくは未置換のアルキル（１−２０Ｃ）、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはアラルジル（ａｒａｌｄｙｌ）である。ポリヌクレオチド中の全ての結合が同一である必要はない。先の記述は、ＲＮＡおよびＤＮＡを含む、本明細書で引用される全てのポリヌクレオチドに適用される。
【０１１８】
「オリゴヌクレオチド」とは本明細書において用いる場合、短く、一般的に単鎖であり、また必須ではないが、一般的に約２００未満のヌクレオチド長さの、一般的に合成のポリヌクレオチドを意味する。「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」という用語は、相互に排他的なものではない。ポリヌクレオチドについての上述の記載はオリゴヌクレオチドと等しく、十分に適用可能である。
【０１１９】
「障害」または「疾患」とは、本発明の物質／分子または方法での処置から利点がある任意の状態である。これには、慢性および急性の障害または疾患が挙げられ、これには該当の障害に対して哺乳動物がかかりやすい病的状態を含むものを包含する。本明細書中で処置されるべき障害の非限定的例としては、悪性腫瘍および良性腫瘍；非白血病およびリンパ性悪性疾患；神経の、グリアの、アストロサイトの、視床下部のおよび他の腺の、マクロファージの、上皮の、間質性のおよび胞胚腔の障害；ならびに炎症性、免疫学的および他の血管形成関連の障害が挙げられる。
【０１２０】
「細胞増殖性障害」および「増殖性障害」という用語は、ある程度の異常な細胞増殖と関係している障害を指す。一実施形態では、細胞増殖性障害は癌である。一実施形態では、この細胞増殖性障害は血管形成である。
【０１２１】
「腫瘍」とは、本明細書において用いる場合、悪性または良性に関わらず、全ての腫瘍形成性細胞成長および増殖、ならびに全ての前癌性および癌性細胞および組織を指す。「癌」、「癌性」、「細胞増殖性障害」、「増殖性障害」および「腫瘍」という用語は本明細書において言及される場合互いに排除するものではない。
【０１２２】
「癌」および「癌性」という用語は、制御されない細胞増殖を代表的には特徴とする哺乳動物の生理学的状態を指すかまたは表す。癌の例としては、限定するものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病が挙げられる。このような癌のより具体的な例としては、扁平細胞癌、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌を含む）、腹膜の癌、肝細胞癌、胃癌（胃腸癌を含む）、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸管癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜または子宮の癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌、および種々のタイプの頭頸部癌、ならびにＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度のびまん性ＮＨＬ；高悪性度の免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度のリンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度の小型非分割細胞ＮＨＬ；巨大病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；およびワルデンシュトレームマクログロブリン血症を含む）；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；ヘアリー細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；および移植後のリンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、ならびに母斑症、浮腫（例えば、脳腫瘍に関連する）、およびメグス症候群に関連する異常血管増殖が挙げられる。
【０１２３】
「抗腫瘍性組成物」または「抗癌組成物」または「抗癌剤」という用語は、少なくとも一つの活性治療的作用剤、例えば「抗癌剤」を含む、癌を処置する際に有用な組成物を指す。治療剤（抗癌剤）の例としては、限定するものではないが、例えば、化学療法剤、増殖阻害性剤、細胞傷害性剤、放射線療法に用いられる薬剤、抗血管形成剤、アポトーシス剤、抗チューブリン剤および癌を処置する他の薬剤、例えば、抗ＨＥＲ−２抗体、抗ＣＤ２０抗体、表皮の成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）アンタゴニスト（例えばチロシンキナーゼインヒビター）、ＨＥＲ１／ＥＧＦＲインヒビター（例えばエルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（商標））、血小板由来成長因子インヒビター（例えばＧｌｅｅｖｅｃ（商標）（メシル酸イマチニブ））、ＣＯＸ−２インヒビター（例えばセレコキシブ）、インターフェロン、サイトカイン、以下の標的ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＰＤＧＦＲ−β、ＢｌｙＳ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡまたはＶＥＧＦレセプターの一つ以上と結合するアンタゴニスト（例えば中和抗体）、またはＶＥＧＦレセプター（単数または複数）、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２および他の生物活性でかつ有機化学的薬剤などが挙げられる。その組合せも本発明に包含される。
【０１２４】
「血管形成の因子または薬剤」とは、血管の発達を刺激する、例えば、血管形成、内皮細胞成長、血管の安定化および／または脈管形成などを促進する成長因子である。例えば、血管形成因子としては、限定するものではないが、例えば、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦファミリーのメンバー、ＰｌＧＦ、ＰＤＧＦファミリー、線維芽細胞増殖因子ファミリー（ＦＧＦ）、ＴＩＥリガンド（アンギオポイエチン）、エフリン、Ｄｅｌ−１、線維芽細胞増殖因子：酸性（ａＦＧＦ）および塩基性（ｂＦＧＦ）、Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）／散乱因子（ｓｃａｔｔｅｒ  ｆａｃｔｏｒ）（ＳＦ）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、レプチン、ミドカイン（Ｍｉｄｋｉｎｅ）、胎盤成長因子、血小板由来内皮細胞増殖因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、血小板由来増殖因子、特にＰＤＧＦ−ＢＢまたはＰＤＧＦＲ−β、プレイオトロフィン（Ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎ）（ＰＴＮ）、プログラヌリン（Ｐｒｏｇｒａｎｕｌｉｎ）、プロリフェリン（Ｐｒｏｌｉｆｅｒｉｎ）、トランスフォーミング成長因子−α（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦβ）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）／血管透過性因子（ＶＰＦ）などが挙げられる。また、創傷治癒を促進する因子、例として成長ホルモン、インスリン様増殖因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、ＶＩＧＦ、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、ＣＴＧＦ、および、そのファミリーメンバーならびにＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−βも包含される。例えば、ＫｌａｇｓｂｒｕｎおよびＤ’Ａｍｏｒｅ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，５３：２１７〜３９（１９９１）；ＳｔｒｅｉｔおよびＤｅｔｍａｒ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２２：３１７２−３１７９（２００３）；Ｆｅｒｒａｒａ  ＆  Ａｌｉｔａｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５（１２）：１３５９−１３６４（１９９９）；Ｔｏｎｉｎｉら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２２：６５４９−６５５６（２００３）（例えば、公知の血管形成因子を挙げている表１）；および、Ｓａｔｏ  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，８：２００−２０６（２００３）を参照のこと。
【０１２５】
「ＶＥＧＦ」という用語は本明細書において用いる場合、Ｌｅｕｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１３０６（１９８９）、およびＨｏｕｃｋら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．，５：１８０６（１９９１）によって記載されているように、１６５アミノ酸のヒト血管内皮成長因子と、関連した１２１−、１８９−、および２０６−アミノ酸のヒト血管内皮成長因子、並びにそれらの天然に存在する対立遺伝子型およびプロセシング型を指す。「ＶＥＧＦ」という用語はまた、非ヒト動物種、例えば、マウス、ラットまたは霊長類由来のＶＥＧＦも意味する。特定の種由来のＶＥＧＦは、ヒトＶＥＧＦについてはｈＶＥＧＦ、マウスＶＥＧＦについてはｍＶＥＧＦなどの用語で表されることが多い。「ＶＥＧＦ」という用語はまた、１６５アミノ酸のヒト血管内皮細胞成長因子のアミノ酸８〜１０９、または１〜１０９を含む切断型のポリペプチドを意味する。任意のこのようなＶＥＧＦ型を指すときは、本出願では、例えば、「ＶＥＧＦ（８−１０９）」、「ＶＥＧＦ（１−１０９）」または「ＶＥＧＦ１６５」で特定してもよい。「切断した（切断型の）」天然のＶＥＧＦのアミノ酸位置は、天然のＶＥＧＦ配列に示される数で示す。例えば、切断型の天然ＶＥＧＦのアミノ酸位置１７（メチオニン）は、天然のＶＥＧＦ中の位置１７（メチオニン）でもある。切断型の天然ＶＥＧＦは天然のＶＥＧＦに匹敵するＫＤＲおよびＦｌｔ−１レセプターに結合親和性を有する。好ましい実施形態によれば、このＶＥＧＦはヒトＶＥＧＦである。
【０１２６】
「ＶＥＧＦアンタゴニスト」とは、ＶＥＧＦまたは１つ以上のＶＥＧＦレセプターまたはそれらをコードする核酸への結合を含むＶＥＧＦ活性を中和、遮断、阻害、抑止、低減または干渉することができる分子を指す。好ましくは、このＶＥＧＦアンタゴニストは、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦレセプターに結合する。ＶＥＧＦアンタゴニストとしては、抗ＶＥＧＦ抗体およびその抗原結合性フラグメント、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦレセプターに結合し、かつリガンドレセプター相互作用をブロックするポリペプチド（例えば、イムノアドヘシン、ペプチボディ（ｐｅｐｔｉｂｏｄｉｅｓ））、抗ＶＥＧＦレセプター抗体およびＶＥＧＦレセプターアンタゴニスト、例えばＶＥＧＦＲチロシンキナーゼの小分子インヒビター、ＶＥＧＦに結合するアプタマーおよびストリンジェントな条件下でＶＥＧＦまたはＶＥＧＦレセプターをコードする核酸配列にハイブリダイズする核酸（例えば、ＲＮＡｉ）が挙げられる。１つの好ましい実施形態によれば、ＶＥＧＦアンタゴニストは、ＶＥＧＦに結合して、ＶＥＧＦ誘発性の内皮細胞増殖をインビトロで阻害する。１つの好ましい実施形態によれば、ＶＥＧＦアンタゴニストは、非ＶＥＧＦまたは非ＶＥＧＦレセプターよりも大きい親和性でＶＥＧＦまたはＶＥＧＦレセプターに結合する。１つの好ましい実施形態によれば、ＶＥＧアンタゴニストは、１μＭ〜１ｐＭの間のＫｄでＶＥＧＦまたはＶＥＧＦレセプターに結合する。別の好ましい実施形態では、このＶＥＧＦアンタゴニストは、５００ｎＭ〜１ｐＭの間でＶＥＧＦまたはＶＥＧＦレセプターに結合する。
【０１２７】
好ましい実施形態によれば、ＶＥＧＦアンタゴニストは、抗体、ペプチボディ（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）、イムノアドヘシン、低分子またはアプタマーなどのポリペプチドからなる群より選択される。好ましい実施形態では、この抗体は、抗ＶＥＧＦ抗体、例えば、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）抗体または抗ＶＥＧＦレセプター抗体、例えば、抗ＶＥＧＦＲ２または抗ＶＥＧＦＲ３抗体である。ＶＥＧＦアンタゴニストの他の例としては以下が挙げられる：ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ、Ｍｕｃａｇｅｎ、ＰＴＫ７８７、ＳＵ１１２４８、ＡＧ−０１３７３６、Ｂａｙ  ４３９００６（ソラフェニブ）、ＺＤ−６４７４、ＣＰ６３２、ＣＰ−５４７６３２、ＡＺＤ−２１７１、ＣＤＰ−１７１、ＳＵ−１４８１３、ＣＨＩＲ−２５８、ＡＥＥ−７８８、ＳＢ７８６０３４、ＢＡＹ５７９３５２、ＣＤＰ−７９１、ＥＧ−３３０６、ＧＷ−７８６０３４、ＲＷＪ−４１７９７５／ＣＴ６７５８およびＫＲＮ−６３３。
【０１２８】
「抗ＶＥＧＦ抗体」とは、十分な親和性および特異性でＶＥＧＦに結合する抗体である。好ましくは、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦ活性が関与する疾患または状態を標的して、妨害する治療剤として用いられ得る。抗ＶＥＧＦ抗体は通常、他のＶＥＧＦホモログ、例えば、ＶＥＧＦ−ＢまたはＶＥＧＦ−Ｃにも、他の増殖因子、例えば、ＰｌＧＦ、ＰＤＧＦまたはｂＦＧＦにも結合しない。好ましい抗ＶＥＧＦ抗体は、ハイブリドーマＡＴＣＣ  ＨＢ１０７０９によって産生されるモノクローナル抗ＶＥＧＦ抗体Ａ４．６．１と同じエピトープに結合するモノクローナル抗体である。より好ましくは、抗ＶＥＧＦ抗体は、ベバシズマブ（ＢＶ；Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））として公知の抗体を包含するがこれに限定されない、Ｐｒｅｓｔａら、（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４５９３−４５９９に従って生成された、組み換えヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体である。別の実施形態によれば、用いられ得る抗ＶＥＧＦ抗体としては、限定はしないが、国際公開第２００５／０１２３５９号に開示される抗体が挙げられる。一実施形態によれば、抗ＶＥＧＦ抗体は、国際公開第２００５／０１２３５９号の図２４、図２５、図２６、図２７および図２９に開示される抗体のいずれか１つの可変重鎖および可変軽鎖の領域を含む（例えば、Ｇ６、Ｇ６−２３、Ｇ６−３１、Ｇ６−２３．１、Ｇ６−２３．２、Ｂ２０、Ｂ２０−４およびＢ２０．４．１）。別の好ましい実施形態では、ラニビズマブとして公知の抗ＶＥＧＦ抗体は、糖尿病性神経障害およびＡＭＤなどの眼の疾患に投与されるＶＥＧＦアンタゴニストである。
【０１２９】
「ｒｈｕＭＡｂ  ＶＥＧＦ」または「Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）」としても公知の、抗ＶＥＧＦ抗体「ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）（ＢＶ）」は、Ｐｒｅｓｔａら、（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４５９３−４５９９に従って生成される組み換えヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体である。この抗体は、ヒトＶＥＧＦのそのレセプターへの結合をブロックするマウス抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体Ａ．４．６．１由来の変異した、ヒトＩｇＧ１フレームワーク領域および抗原結合相補性決定領域を含む。ほとんどのフレームワーク領域を含むベバシズマブのアミノ酸配列のほぼ９３％が、ヒトＩｇＧ１に由来し、その配列の約７％がマウス抗体Ａ４．６．１に由来する。ベバシズマブは、約１４９，０００ダルトンの分子量を有し、グリコシル化されている。他の抗ＶＥＧＦ抗体としては、米国特許第６８８４８７９号および国際公開第２００５／０４４８５３号に記載の抗体が挙げられる。
【０１３０】
この抗ＶＥＧＦ抗体ラニビズマブ（Ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ）またはＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）抗体またはｒｈｕＦａｂ  Ｖ２はヒト化、親和性成熟抗ヒトＶＥＧＦ  Ｆａｂフラグメントである。ラニビズマブは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの発現ベクターおよび細菌のファーメンテーションで、標準的な組換え技術方法によって産生される。ラニビズマブは、グリコシル化されておらず、約４８，０００ダルトンという分子量を有する。国際公開第９８／４５３３１号および米国特許出願公開第２００３０１９０３１７号を参照のこと。
【０１３１】
血管形成の調節不全は、異常な血管形成を、すなわち、新しい血管の過剰なまたは不適切な増殖（例えば、血管形成の位置、タイミングまたは発現が、医学的観点から所望されない）の時、疾患状態でもたらし得、または疾患状態を生じるような状態でもたらし得る。過剰な、不適切なまたは制御されない血管形成は、疾患状態の悪化に寄与するかまたは疾患状態を生じる新しい血管増殖が存在するときに生じる。新しい血管は、疾患組織を供給し、正常な組織を破壊し得、ガンの場合には、その新しい血管によって腫瘍細胞が流出して、循環し他の器官に留まる（腫瘍転移）ことが可能になる。異常な血管形成に関与する疾患状態としては、非腫瘍性および腫瘍性状態の両方を包含し、これには、例えば、ガン、特に血管新生された固形腫瘍および転移腫瘍（結腸癌、乳癌、肺癌（特に小細胞肺癌）、または前立腺癌を含む）、所望されないまたは異常な肥大、関節炎、慢性関節リューマチ（ＲＡ）、炎症性腸疾患すなわちＩＢＤ（クローン病および潰瘍性結腸炎）、乾癬、乾癬性プラーク、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化症、アテローム性動脈硬化性プラーク、糖尿病性網膜症および未熟児網膜症を含む他の増殖性の網膜症、水晶体後腺維増殖症、血管新生緑内障、加齢関連黄斑変性、糖尿病性斑状浮腫、角膜血管新生、角膜グラフト血管新生、角膜グラフト拒絶、網膜／脈絡膜血管新生、虹彩前面の血管新生（ルベオーシス）、眼の血管新生性疾患、血管再狭窄、動脈静脈奇形（ＡＶＭ）、髄膜腫、血管腫、血管腺維腫、甲状腺肥大（グレーブス病を含む）、慢性炎症、肺炎症、急性肺傷害／ＡＲＤＳ、敗血症、一次肺高血圧症、悪性肺滲出、脳水腫（例えば急性卒中／閉鎖性頭部傷害／外傷に関連）、滑膜炎症、骨化性筋炎、肥大性骨形成、骨関節炎（ＯＡ）、難治性腹水、多嚢胞性卵巣症、子宮内膜炎、第三腔体液疾患（３ｒｄ  ｓｐａｃｉｎｇ  ｏｆ  ｆｌｕｉｄ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）（膵炎、コンパートメント症候群、熱傷、腸疾病）、子宮線維症、早産、慢性炎症、例えばＩＢＤ、腎臓同種移植片拒絶、炎症性腸疾病、ネフローゼ症候群、望ましくない、または、異常な組織嵩増大（非癌）、血友病性関節、肥大瘢痕、毛髪増殖抑制、オースラー‐ウェーバー症候群、化膿性肉芽腫  水晶体後線維増殖、硬皮症、トラコーマ、血管接着、滑膜炎、皮膚炎、子癇前症、腹水、心内膜液浸出（例えば心内膜炎に関連するもの）および胸水が挙げられる。
【０１３２】
本明細書において用いる場合、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」とは、処置されている個体または細胞の自然の経過を変化させる試みにおける臨床的介入を指しており、予防のため、または臨床病理経過中に実施することができる。処置の所望する効果には、疾患の発症または再発の予防、症状の緩和、疾病の任意の直接的または間接的な病理学的結果の減少、転移の予防、疾患進行の速度の低下、病状の寛解または軽減、および緩和または予後の改善が挙げられる。ある実施形態では、本発明の抗体は、疾患または障害の進行を遅延化させるために用いられる。
【０１３３】
「有効量」とは、所望される治療的または予防的結果を達成するのに必要な投薬量および期間での有効量を意味する。
【０１３４】
本発明の物質／分子、アゴニストまたはアンタゴニストの「治療的有効量」とは、病状、年齢、性別、および個体の体重、ならびにその個体に所望の応答を誘発するためのその物質／分子、アゴニストまたはアンタゴニストの能力などの要因に応じて変化し得る。治療的有効量とは、この物質／分子、アゴニストまたはアンタゴニストの任意の毒性または有害な影響を、治療的に有益な効果が上回る量でもある。「治療的有効量」という用語は、哺乳動物（ａｋａ患者）の疾患または疾病を「処置」するのに有効な本発明の抗体、ポリペプチドまたはアンタゴニストの量を指す。ガンの場合、この薬物の治療上有効な量は、ガン細胞の数を減じ；腫瘍の大きさまたは重量を減じ；末梢器官へのガン細胞の浸潤を阻害（すなわち、ある程度まで減速、好ましくは停止）し；腫瘍転移を阻害（すなわち、ある程度まで減速および好ましくは停止）し；腫瘍成長をある程度まで阻害し；および／またはガンに関連する１つ以上の症状をある程度まで緩和することができる。この薬物が既存のガン細胞の成長を妨げおよび／または死滅させる限り、それは、細胞分裂抑制性および／または細胞傷害性であり得る。一実施形態では、この治療上有効な量は、増殖阻害量である。別の実施形態では、この治療上有効な量は、患者の生存を延長する量である。別の実施形態では、この治療上有効な量は、患者の無増悪生存を改善する量である。
【０１３５】
「予防上有効な量」とは、所望される予防的結果を達成するのに必要な投薬量および期間で有効な量を意味する。必ずではないが、典型的には、予防的用量は、疾病の前または初期の段階に対象に用いられるので、予防的有効量は治療的有効量よりも少ない。
【０１３６】
「細胞傷害性剤」という用語は本明細書において用いる場合、細胞の機能を阻害もしくは阻止するか、および／または細胞破壊を生ずる物質を意味する。この用語は、放射性同位元素（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、およびＬｕの放射性同位元素）、化学治療薬、例えばメトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド類（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシンまたは他の挿入剤、酵素およびその断片、例えば核酸分解酵素、抗生物質、ならびに毒素、例えば小分子毒素または細菌、糸状菌、植物もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素と、その断片および／または変異体など、ならびに下に開示する種々の抗腫瘍または抗癌剤を含むものとする。他の細胞傷害性剤を以下に記載する。殺腫瘍性剤は、腫瘍細胞の破壊を引き起こす。
【０１３７】
「化学療法剤」とは、癌の治療に有用な化合物である。化学療法剤の例としては、アルキル化剤、例えば、チオテパおよびＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｓｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）；アルキルスルホネート、例えば、ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファン；アジリジン、例えば、ベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、およびウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド（ｔｒｉｅｔｙｌｅｎｅｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、トリエチレンチオホスホルアミド（ｔｒｉｅｔｈｉｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、およびトリメチロールメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含めたエチレンイミンおよびメチルメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）；アセトゲニン（特に、ブラタシンおよびブラタシノン（ｂｕｌｌａｔａｃｉｎｏｎｅ））；δ−９−テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標））；β−ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン（合成アナログであるトポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標））、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン（ｓｃｏｐｏｌｅｃｔｉｎ）、および９−アミノカンプトテシンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン、およびビゼレシン合成アナログを含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）；テニポシド；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）（合成アナログＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エルテロビン（ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｂｉｎ）；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンギスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、シクロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベンビキン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソ尿素（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａｓ）、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチン（ｒａｎｉｍｎｕｓｔｉｎｅ）；抗生物質、例えば、エンジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特に、カリケアマイシンγ１ＩおよびカリケアマイシンωＩ１（例えば、Ａｇｎｅｗ，Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：１８３−１８６（１９９４）参照））；ダイネマイシンＡを含むダイネマイシン；エスペラマイシン；ならびにネオカルジノスタチン発色団および関係する色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）ドキソルビシン、（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、およびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えばマイトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗剤、例えば、メトトレキサート、および５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸アナログ、例えば、デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート；プリンアナログ、例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、およびチオグアニン；ピリミジンアナログン、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン；アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎剤（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌ）、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補給物（ｆｏｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒ）、例えば、フロリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクオン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；エルフォルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄｓ）、例えば、メイタンシンおよびアンサマイトシン（ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎｓ）；ミトグアゾン（ｍｉｔｏｇｕａｚｏｎｅ）；ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）；モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）；ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ロソキサントロン（ｌｏｓｏｘａｎｔｒｏｎｅ）；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）ポリサッカライド複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン（ｔｒｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｅｓ）（特に、Ｔ−２毒素、ベラクリンＡ（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ  Ａ）、ロリジンＡおよびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登��商標））；ダカルバジン；マンノムスチン（ｍａｎｎｏｍｕｓｔｉｎｅ）；ミトブロニトール；ミトラクトール（ｍｉｔｏｌａｃｔｏｌ）；ピポブロマン（ｐｉｐｏｂｒｏｍａｎ）；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；チオテパ；タキソイド類、例えばＴＡＸＯＬ（登録商標）パクリタキセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標）クレモフォー無添加、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）、およびＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）ドキセタキセル（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロランブシル；ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；プラチナアナログ、例えばシスプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））；プラチナ；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトキサントロン；ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））；オキサリプラチン；ロイコボリン（ｌｅｕｃｏｖｏｖｉｎ）；ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））；ノバントロン（ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロナート（ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｌｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸のようなレチノイド；カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標）；任意の上述したものの薬学的に受容可能な塩類、酸類または誘導体類：ならびに上記のうち２以上の組み合わせ、例えば、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニソロン併用療法の略称であるＣＨＯＰ、ならびに５−ＦＵおよびロイコボリン（ｌｅｕｃｏｖｏｖｉｎ）とオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（商標））とを組み合わせた治療法の略称であるＦＯＬＦＯＸが挙げられる。追加の化学療法剤としては、抗体薬物コンジュゲートとして有用な細胞傷害性剤、例えば、メイタンシノイド類（ｍａｙｔａｓｉｎｏｉｄｓ（例えば、ＤＭ１）、ならびにアウリスタチンＭＭＡＥおよびＭＭＡＦ、などが挙げられる。
【０１３８】
「化学療法剤」には、ガンの増殖を促進し得るホルモンの影響を調節、低減、遮断または阻害するように働き、多くの場合、全身的または身体全体の処置の形態である「抗ホルモン剤」も挙げられる。それらはそれ自体がホルモンであってもよい。例としては、抗エストロゲン類および選択的エストロゲン受容体調節物質類（ＳＥＲＭ類）が挙げられ、これには、例えば、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）タモキシフェンを含む）、ＥＶＩＳＴＡ（登録商標）ラロキシフェン（ｒａｌｏｘｉｆｅｎｅ）、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン（ｔｒｉｏｘｉｆｅｎｅ）、ケオキシフェン（ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ）、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン（ｏｎａｐｒｉｓｔｏｎｅ）、およびＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標）トレミフェン；抗プロゲステロン類；エストロゲンレセプター下方調節剤類（ＥＲＤ）；卵巣を抑止または停止させる機能がある薬剤、例えばＬＵＰＲＯＮ（登録商標）およびＥＬＩＧＡＲＤ（登録商標）酢酸ロイプロリドなどの黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）アゴニスト、酢酸ゴセレリン、酢酸ブセレリンおよびトリプテレリン（ｔｒｉｐｔｅｒｅｌｉｎ）；他の抗アンドロゲン、例えばフルタミド（ｆｌｕｔａｍｉｄｅ）、ニルタミド（ｎｉｌｕｔａｍｉｄｅ）、ビカルタミド；ならびに副腎のエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ（登録商標）酢酸メゲストロール、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）エキセメスタン、フォルメスタニー（ｆｏｒｍｅｓｔａｎｉｅ）、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標）ボロゾール、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）レトロゾール、およびＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）アナストロゾールなどを包含する。加えて、このような化学療法剤の定義には、クロドロネート（例えばＢＯＮＥＦＯＳ（登録商標）またはＯＳＴＡＣ（登録商標））、ＤＩＤＲＯＣＡＬ（登録商標）エチドロネート、ＮＥ−５８０９５、ＺＯＭＥＴＡ（登録商標）ゾレドロン酸／ゾレドロネート、ＦＯＳＡＭＡＸ（登録商標）アレンドロネート、ＡＲＥＤＩＡ（登録商標）パミドロネート、ＳＫＥＬＩＤ（登録商標）チルドロネート、またはＡＣＴＯＮＥＬ（登録商標）リセドロネート、ならびにトロキサシタビン（ｔｒｏｘａｃｉｔａｂｉｎｅ）（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシンアナログ）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に接着細胞の増殖に結びつくシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えばＰＫＣ−α、Ｒａｆ、およびＨ−Ｒａｓ、および上皮成長因子レセプター（ＥＧＦ−Ｒ）など；ＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（登録商標）ワクチンおよび遺伝子治療ワクチンなどのワクチン、例えばＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、およびＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチン；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害剤；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ；ラパチニブジトシレート（ｌａｐａｔｉｎｉｂ  ｄｉｔｏｓｙｌａｔｅ）（ＧＷ５７２０１６としても知られるＥｒｂＢ−２およびＥＧＦＲ二重チロシンキナーゼ小��子阻害剤）および任意の上記のものの薬学的に受容可能な塩類、酸類または誘導体類が包含される。
【０１３９】
「増殖阻害剤」とは、本明細書において用いる場合、細胞（例えば、Ｒｏｂｏ４を発現する細胞）の成長および／または増殖をインビトロまたはインビボのいずれかで阻害する化合物または組成物を指す。このように、増殖阻害剤は、Ｓ期のＲｏｂｏ４発現細胞の割合を有意に低減する薬剤であってもよい。増殖阻害剤の例としては、Ｇ１停止およびＭ期停止を誘導する薬剤などの、細胞周期の進行を（Ｓ期以外の位置で）遮断する薬剤が挙げられる。古典的なＭ期遮断薬としては、ビンカ（ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、タキサン、ならびにドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、およびブレオマイシンなどのトポイソメラーゼＩＩインヒビターが挙げられる。Ｇ１で停止させる薬剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、およびａｒａ−ＣなどのＤＮＡアルキル化剤は、Ｓ期停止にも波及する。さらなる情報は、Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ  ａｎｄ  Ｉｓｒａｅｌ，編集の、Ｍｕｒａｋａｍｉらによる「Ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ，ａｎｄ  ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｄｒｕｇｓ」（ＷＢ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９５）という標題の第１章、特に１３頁に見出すことができる。タキサン類（パクリタキセルおよびドセタキセル）は、両方ともイチイに由来する抗癌剤である。ヨーロッパイチイに由来するドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ）は、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）の半合成アナログである。パクリタキセルおよびドセタキセルは、チューブリン二量体から微小管の集合を促進し、細胞の有糸分裂を阻害する結果となる脱重合を防ぐことによって微小管を安定化する。
【０１４０】
「ドキソルビシン」はアントラサイクリン抗生物質である。ドキソルビシンの完全な化学名は、（８Ｓ−シス）−１０−［（３−アミノ−２，３，６−トリデオキシ−α−Ｌ−リキソ−ヘキサピラノシル）オキシ］−７，８，９，１０−テトラヒドロ−６，８，１１−トリヒドロキシ−８−（ヒドロキシアセチル）−１−メトキシ−５，１２−ナフタセンジオンである。
【０１４１】
ＩＩＩ．抗Ｒｏｂｏ４抗体
一局面では、本発明は、Ｒｏｂｏ４に結合する抗体を提供する。一実施形態では、抗Ｒｏｂｏ４抗体は、モノクローナル抗体である。一実施形態では、抗Ｒｏｂｏ４抗体は、抗体フラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、または（Ｆａｂ’）２フラグメントである。一実施形態では、抗Ｒｏｂｏ４抗体はキメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である。一実施形態では、抗Ｒｏｂｏ４抗体は精製されている。
【０１４２】
本発明の別の局面では、抗Ｒｏｂｏ４抗体をコードするポリヌクレオチドが提供される。特定の実施形態では、抗Ｒｏｂｏ４抗体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。特定の実施形態では、このようなベクターを含む宿主細胞が提供される。本発明の別の局面では、抗Ｒｏｂｏ４抗体を含む組成物、または抗Ｒｏｂｏ４抗体をコードするポリヌクレオチドが提供される。特定の実施形態では、組成物とは、例えばガン、アテローム性動脈硬化症、水晶体後部線維増殖症、血管腫、慢性炎症、眼内新生血管疾患、増殖性網膜症、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、血管新生緑内障、移植角膜組織および他の組織の免疫拒絶、関節リウマチ、乾癬およびそれらの組み合わせを含む疾患および障害の処置のための薬学的処方物である。
【０１４３】
ファージライブラリー由来の例示的なモノクローナル抗体は、本明細書に提供され、下の実施例に記載される。それらの抗体は、ＹＷ７１．６、ＹＷ７１．１、ＹＷ７１．２２、ＹＷ７１．８９、ＹＷ７９．１、ＹＷ７９．８、およびＹＷ７９．１１と命名される。
それらの抗体は、親和性成熟されて、ＹＷ７１．２２．Ｓ１．２、ＹＷ７１．２２Ｓ１．８、ＹＷ７１．２２Ｓ１．１６、ＹＷ７１．２２Ｓ１．２３、ＹＷ７１．２２Ｓ１．２４、ＹＷ７１．２２Ｓ１．２７、ＹＷ７１．２２Ｓ１．３１、ＹＷ７１．２２Ｓ１．３８、ＹＷ７１．２２Ｓ１．７７  ＹＷ７１．２２．Ｓ２．２１、ＹＷ７１．２２．Ｓ２．７９、ＹＷ７１．２２．Ｈ１．２、ＹＷ７１．２２．Ｈ１．９、ＹＷ７１．２２．Ｈ１．４６、ＹＷ７１．２２．Ｈ１．７７、ＹＷ７１．２２．Ｈ１．９１、およびＹＷ７１．２２．Ｈ２．３１を生成する。この抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメインの配列は、図１および図２に示される。
【０１４４】
本発明の抗体は、この抗体が所望の生物学的な特徴（例えば、所望の結合親和性）を示すならば、任意の適切なヒトのまたはヒトのコンセンサスな軽鎖フレームワーク配列を含んでもよい。
【０１４５】
一実施形態では、本明細書のヒトコンセンサスフレームワークは、ＶＨサブグループＩＩＩ（図４Ａおよび図４Ｂを参照のこと）および／またはＶＬκサブグループＩ（図３Ａおよび図３Ｂを参照のこと）コンセンサスフレームワーク配列由来であるか、それから誘導される。
【０１４６】
従って、このＶＨアクセプターヒトフレームワークは、以下のフレームワーク配列のうちの１、２、３または４つ全てを含んでもよい：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号１３）を含むＦＲ１、
ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ（配列番号１４）を含むＦＲ２、
ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣ（配列番号１５）を含むＦＲ３を含むＦＲ３、
ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１６）を含むＦＲ４。
【０１４７】
他の実施形態では、このＶＨコンセンサスフレームワークは以下を含む：
ヒトＶＨサブグループＩコンセンサスフレームワーク１−４マイナスＫａｂａｔＣＤＲｓ（配列番号１１１、１１２、１１３、１６）；
ヒトＶＨサブグループＩコンセンサスフレームワーク１−４マイナス伸長した超可変領域（配列番号１１４、１１５、１１３、１６または配列番号１１４、１１５、１１６、１６または配列番号１１４、１１５、１１７、１６）；
ヒトＶＨサブグループＩＩコンセンサスフレームワーク１−４マイナスＫａｂａｔＣＤＲｓ（配列番号１１８、１１９、１２０、１６）；
ヒトＶＨサブグループＩＩコンセンサスフレームワーク１−４マイナス伸長した超可変領域（配列番号１２１、１２２、１２０、１６または配列番号１２１、１２２、１２３、１６または配列番号１２１、１２２、１２４、１６）；
ヒトＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク１−４マイナスＫａｂａｔＣＤＲｓ（配列番号１２５、１２６、１２７、１６）；
ヒトＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク１−４マイナス伸長した超可変領域（配列番号１２８、１２９、１２７、１６または配列番号１２８、１２９、１３０、１６または配列番号１２８、１２９、１３１、１６）；
ヒトＶＨアクセプター１フレームワーク１−４マイナスＫａｂａｔＣＤＲ（配列番号１３２、１２６、１３３、１６）；
ヒトＶＨアクセプター１フレームワーク１−４マイナス伸長した超可変領域（配列番号１２８、１２９、１３３、１６または配列番号１２８、１２９、１３４、１６）；
ヒトＶＨアクセプター２フレームワーク１−４マイナスＫａｂａｔＣＤＲｓ（配列番号１３２、１２６、１３５、１６）；または
ヒトＶＨアクセプター２フレームワーク１−４マイナス伸長した超可変領域（配列番号１２８、１２６、１３５、１６または配列番号１２８、１２６、１３６、１６または配列番号１２８、１２６、１３７、１６）。
【０１４８】
一実施形態では、ＶＨアクセプターヒトフレームワーク領域４（Ｈ−ＦＲ４）は、ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号４５）を含む。
【０１４９】
ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、以下のフレームワーク配列のうち１、２３または４つを含んでもよい：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号９）を含むＦＲ１、
ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１０）を含むＦＲ２、
ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（配列番号１１）を含むＦＲ３、
ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号１７３）またはＦＧＱＧＴＫＭＥＩＫＲ（配列番号１３９）を含むＦＲ４。
他の実施形態では、このＶＬコンセンサスフレームワークは以下を含む：
ヒトＶＬκサブグループＩコンセンサスフレームワーク１−４（配列番号９、１０、９９、１００）；
ヒトＶＬκサブグループＩコンセンサスフレームワーク１−４（配列番号９、１０１、９９、１００）；
ヒトＶＬκサブグループＩＩコンセンサスフレームワーク１−４（配列番号１０２、１０３、１０４、１００）；
ヒトＶＬκサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク１−４（配列番号１０５、１０６、１０７、１００）；または
ヒトＶＬκサブグループＩＶコンセンサスフレームワーク１−４（配列番号１０８、１０９、１１０、１００）
アクセプターは、ヒト免疫グロブリン由来であろうと、またはヒトコンセンサスフレームワーク由来であろうと、選択されたヒトフレームワーク配列に対して配列が同一であってもよいが、本発明は、このアクセプター配列がヒト免疫グロブリン配列またはヒトコンセンサスフレームワーク配列に対して既存のアミノ酸置換を含み得るということを考慮する。これらの既存の置換は好ましくは、最小；通常はヒトの免疫グロブリン配列またはコンセサスなフレームワーク配列に対して４、３、２または１個のアミノ酸の相違のみである。
【０１５０】
非ヒト抗体の超可変領域残基は、ＶＬおよび／またはＶＨのアクセプターヒトフレームワーク中に組み込まれる。例えば、ＫａｂａｔのＣＤＲ残基に相当する残基、Ｃｈｏｔｈｉａ超可変ループ残基、Ａｂｍ残基、および／または接触（ｃｏｎｔａｃｔ）残基を組み込んでもよい。必要に応じて、以下のような伸長した超可変領域残基が組み込まれる：２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）、２６〜３５（Ｈ１）、５０〜６５または４９〜６５（Ｈ２）および９３〜１０２、９４〜１０２、または９５〜１０２（Ｈ３）。
【０１５１】
超可変領域残基の「組み込み」は、本明細書において考察されているが、これは、種々の方法で達成され得ることが明らかであり、例えば、所望のアミノ酸配列をコードする核酸は、マウス可変ドメイン配列をコードする核酸を変異させ、その結果そのフレームワーク残基がアクセプターヒトフレームワーク残基に変換されるようにすることによって、またはヒト可変ドメイン配列をコードする核酸を変異させ、その結果超可変ドメイン残基が非ヒト残基に変換されるようにすることによって、または所望の配列をコードする核酸を合成することによって、などで生成され生成され得る。
【０１５２】
本明細書のこの実施例では、超可変領域接合改変体は、各々の超可変領域の別個のオリゴヌクレオチドを用いて、ヒトアクセプター配列をコードする核酸のＫｕｎｋｅｌ突然変異誘発によって生成された。Ｋｕｎｋｅｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２（１９８７）。適切な変化が、適切な超可変領域抗原相互作用を訂正および再確立するために、慣用的な技術を用いて、フレームワークおよび／または超可変領域内に導入されてもよい。
【０１５３】
Ａ．抗体フラグメント
本発明は抗体フラグメントを包含する。抗体フラグメントは、伝統的な手段、例えば、酵素消化によって、または組み換え技術によって生成されてもよい。特定の環境では、抗体まるごとではなく、抗体フラグメントを用いる利点がある。より小さいサイズのフラグメントによって、急速なクリアランスが可能になり、固形腫瘍への接近が改善され得る。特定の抗体フラグメントの概説については、Ｈｕｄｓｏｎら（２００３）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９〜１３４を参照のこと。
【０１５４】
抗体フラグメントの製造のためには種々の技術が開発されている。伝統的には、これらのフラグメントはインタクトな抗体の蛋白分解的消化を介して誘導された（例えばＭｏｒｉｍｏｔｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：１０７−１１７（１１９２）およびＢｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照のこと）。しかし、これらのフラグメントは現在では組み換え宿主細胞により直接製造することができる。Ｆａｂ、ＦｖおよびＳｃＦｖ抗体フラグメントは全て、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、これから分泌させることができ、これにより、これらのフラグメントを大量に容易に生産することが可能になる。抗体フラグメントは上記した抗体ファージライブラリから単離できる。あるいは、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントを直接Ｅ．ｃｏｌｉから回収し、化学的にカップリングしてＦ（ａｂ’）２フラグメントを形成することができる（Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２）。別の方法によれば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは組み換え宿主細胞培養物から直接単離できる。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含むインビボ半減期の延長されたＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは米国特許第５，８６９，０４６号に記載されている。抗体フラグメントの生産のための他の技術は当業者の知る通りである。特定の実施形態では、抗体は単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である。国際公開第９３／１６１８５号、米国特許第５，５７１，８９４号、および同第５，５８７，４５８号を参照のこと。ＦｖおよびｓＦｖは定常領域を欠いたインタクトな複合化部位を有する唯一の種であり、従って、それらはインビボ使用時の低下した非特異的結合のために適している場合がある。ｓＦｖ融合タンパク質を構築することによりｓＦｖのアミノまたはカルボキシ末端のいずれかにエフェクタータンパクを融合させてもよい。Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，編集、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ（上掲）を参照のこと。抗体フラグメントはまた、例えば米国特許第５，６４１，８７０号に記載の「線状抗体」であってもよい。そのような線状抗体は単一特異性であっても、または二重特異性であってもよい。
【０１５５】
Ｂ．ヒト化抗体
本発明はヒト化抗体を包含する。非ヒト抗体をヒト化するための種々の方法が当該分野で公知である。例えば、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源からその抗体に１つ以上のアミノ酸残基が導入されていてもよい。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、「輸入、インポート（ｉｍｐｏｒｔ）」残基と称され、この残基は、代表的には「輸入、インポート」可変ドメインから取り入れられる。ヒト化は本質的に、ヒト抗体の対応配列を超可変領域配列に置換することによって、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者らの方法（Ｊｏｎｅｓら、（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２〜５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３〜３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４〜１５３６）に従って行うことができる。したがって、このような「ヒト化」抗体とは、インタクトなヒト可変ドメインよりも実質的に小さな配列が非ヒト種由来の対応する配列に置換されているキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）である。実際にはヒト化抗体は、代表的には一部の超可変部残基と、可能性があることには一部のＦＲ残基とが、げっ歯動物抗体の類似部位由来の残基に置換されているヒト抗体である。
【０１５６】
ヒト化抗体を作成する際に用いられるべき、軽鎖および重鎖両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低減するために重要であり得る。いわゆる「ベストフィット」法により、げっ歯動物抗体の可変ドメインの配列を、公知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。次に、そのげっ歯動物の配列に最も近いヒト配列を、ヒト化抗体についてのヒトフレームワークとして受け入れる。例えば、Ｓｉｍｓら（１９９３）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２２９６；Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８７），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１を参照のこと。別の方法は、特定のサブグループの軽鎖または重鎖の全ヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを用いる。同じフレームワークを、いくつかの異なるヒト化抗体に用いてもよい。例えば、Ｃａｒｔｅｒら（１９９２）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，８９：４２８５；Ｐｒｅｓｔａら、（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３を参照のこと。
【０１５７】
抗体が抗原に対する高い親和性およびその他の好都合な生物学的性質を保持してヒト化されることは、一般にはさらに所望される。この目標を実現するために、一方法により、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを用いる、親配列および様々な概念上のヒト化産物の分析プロセスによってヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルが、一般に利用可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の有望な三次元コンフォメーション構造を図解して表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらのディスプレイの調査により、候補免疫グロブリン配列の機能発揮にこれらの残基が果たしそうな役割を分析すること、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原と結合する能力に影響する残基を分析することが可能になる。このようにして、ＦＲ残基を、レシピエント配列および輸入配列より選択して組合せることが可能で、その結果、標的抗原（単数または複数）に対する親和性増大などの所望の抗体特性が実現される。一般には、超可変領域残基は、抗原結合に影響することに直接的かつ最も実質的に関与している。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、本発明は、ＨＡＭＡ応答が軽減されるか排除されるようにヒト化されている抗体を提供する。ＨＡＭＡ応答の軽減または排除は、適切な治療剤の臨床開発の重要な局面である。例えば、Ｋｈａｘｚａｅｌｉら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．（１９８８），８０：９３７；Ｊａｆｆｅｒｓら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（１９８６），４１：５７２；Ｓｈａｗｌｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８５），１３５：１５３０；Ｓｅａｒｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｍｏｄ．（１９８４），３：１３８；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｂｌｏｏｄ（１９８３），６２：９８８；Ｈａｋｉｍｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９１），１４７：１３５２；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８８），３３２：３２３；Ｊｕｎｇｈａｎｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９０），５０：１４９５を参照のこと。これらの抗体の改変体はさらに、当該分野で公知の慣用的な方法（そのいくつかが下にさらに記載されている）を用いて達成され得る。
【０１５９】
例えば、本明細書に記載のような抗体由来のアミノ酸配列は、フレームワークおよび／または超可変の配列（単数または複数）の多様化のための出発（親）配列として機能し得る。出発する超可変配列が連結されている、選択されたフレームワーク配列は、本明細書においてアクセプターヒトフレームワークとして言及される。アクセプターヒトフレームワークは、ヒト免疫グロブリン（そのＶＬおよび／またはＶＨ領域）由来であってもよいし、またはそれから誘導されてもよく、好ましくは、このアクセプターヒトフレームワークは、ヒトコンセンサスフレームワーク配列由来であるか、またはそれから誘導され、そういうものとしてフレームワークは、ヒト患者では有する免疫原性が最小であるかまたは全く有さないことが実証されている。
【０１６０】
アクセプターがヒト免疫グロブリン由来である場合、ヒトフレームワーク配列の収集において種々のヒトフレームワーク配列とドナーのフレームワーク配列とを整列させることによって、ドナーのフレームワーク配列に対するその相同性に基づいて選択されるヒトフレームワーク配列を必要に応じて選択して、アクセプターとして最も相同なフレームワーク配列を選択してもよい。
【０１６１】
Ｃ．ヒト抗体
本発明のヒト抗体は上記したとおりヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択したＦｖクローン可変ドメイン配列（単数または複数）と公知のヒト定常ドメイン配列（単数または複数）とを組み合わせることにより構築できる。あるいは本発明のヒトモノクローナル抗体はハイブリドーマ法により作成できる。ヒトモノクローナル抗体の製造のためのヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株は例えばＫｏｚｂｏｒ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１〜６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）およびＢｏｅｒｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６（１９９１）に記載されている。
【０１６２】
現在では、免疫化の際、内因性の免疫グロブリン生産の非存在下においてヒト抗体の完全なレパートリーを製造することができるトランスジェニック動物（例えばマウス）を製造できる。例えばキメラマウスおよび生殖細胞系列変異マウスにおける抗体重鎖連結領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合欠失が内因性抗体生産の完全な抑制をもたらすことが記載されている。そのような生殖細胞系列突然変異体マウスにおけるヒト生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子アレイの移入は、抗原チャレンジの際にヒト抗体の生産をもたらすことになる。例えばＪａｋｏｂｏｖｉｔｓら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７：３３（１９９３）を参照のこと。
【０１６３】
遺伝子シャフリングもまた、非ヒト、例えばげっ歯類の抗体からヒト抗体を誘導するために使用することができ、その場合、ヒト抗体は開始の非ヒト抗体と同様の親和性および特異性を有する。「エピトープ・インプリンティング」とも称されるこの方法によれば、本明細書に記載されるファージディスプレイ手法により得られる非ヒト抗体フラグメントの重鎖または軽鎖可変領域のいずれかをヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーと置き換えることにより、非ヒト鎖／ヒト鎖のｓｃＦＶまたはＦａｂキメラの集団が作成される。抗原を用いた選択により、非ヒト鎖／ヒト鎖キメラのｓｃＦＶまたはＦａｂの単離がもたらされ、ここでは、ヒト鎖は一次ファージディスプレイクローン内の相当する非ヒト鎖の除去により破壊された抗原結合部位を回復し、すなわち、エピトープがヒト鎖パートナーの選択を支配（インプリント）する。プロセスを反復することにより残存する非ヒト鎖を置き換える場合、ヒト抗体が得られる（１９９３年４月１日公開のＰＣＴ国際公開第９３／０６２１３号を参照のこと）。ＣＤＲグラフティングによる非ヒト抗体の伝統的なヒト化とは異なり、この技術によって非ヒト起源のＦＲおよびＣＤＲを有さない完全にヒト型の抗体が得られる。
【０１６４】
Ｄ．抗体の可変体
ある実施形態においては、本明細書に記載した抗体のアミノ酸配列の修飾（単数または複数）が意図される。例えば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的特性を向上させることが望まれる場合がある。抗体のアミノ酸配列改変体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な変化を導入することによるか、または、ペプチド合成により調製され得る。このような修飾としては、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、および／または残基の挿入および／または置換が挙げられる。欠失、挿入および置換のいずれかの組み合わせを最終構築物に到達するまで行ってよいが、ただし最終構築物は所望の特性を保有しなければならない。アミノ酸の改変は配列が作成される時点で対象となる抗体のアミノ酸配列に導入されてもよい。
【０１６５】
突然変異誘発のために好ましい位置である、抗体の特定の残基または領域の特定のための有用な方法は、ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５により記載される通り「アラニンスキャニング突然変異誘発」と称される。ここでは、残基または標的残基の群を特定し（例えばａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓおよびｇｌｕなどの荷電残基）て、中性または逆に荷電したアミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）で置き換えることにより抗原とのアミノ酸の相互作用に影響を与える。次いで、置換に対する機能的感受性を示すこれらのアミノ酸の位置を、置換の位置において、またはそのための、追加的または別の改変体を導入することにより精査する。すなわち、アミノ酸配列変異を導入するための部位が予め決定されるが、突然変異そのものの性質は予め決定されている必要はない。例えば、所定の部位における突然変異の性能を分析するためには、ａｌａスキャニングまたはランダム突然変異誘発を標的コドンまたは領域において実施して、発現された免疫グロブリンを所望の活性についてスクリーニングする。
【０１６６】
アミノ酸配列の挿入は、１残基〜１００以上の残基を含有するポリペプチドの長さの範囲のアミノおよび／またはカルボキシ末端の融合、ならびに、１つ以上のアミノ酸残基の配列内の挿入を包含する。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入による改変体は、抗体の血清半減期を増大させる酵素（例えばＡＤＥＰＴについて）またはポリペプチドに対する抗体のＮまたはＣ末端への融合を包含する。
【０１６７】
特定の実施形態では、本発明の抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増大または減少するように変更される。ポリペプチドのグリコシル化は代表的にはＮ連結またはＯ連結のいずれかである。Ｎ連結とはアスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニン（ここでＸはプロリン以外の任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合に関する認識配列である。従って、これらのトリペプチド配列のいずれかのポリペプチド中の存在が、潜在的グリコシル化部位を生じさせる。Ｏ連結グリコシル化はヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニンへの糖類Ｎ−アセチルグルコサミン、ガラクトースまたはキシロースのうちの１つの結合を指すが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンも使用してよい。
【０１６８】
抗体に対するグリコシル化部位の付加または欠失は、好都合には、アミノ酸配列を改変して、その結果、上記したトリペプチド配列の１つ以上が（Ｎ連結グリコシル化部位の場合）作製または除去されるようにさせることによって達成される。改変はまた、元の抗体の配列に対する、１つ以上のセリンまたはトレオニン（スレオニン）残基の付加または置換により行ってよい（Ｏ連結リコシル化部位の場合）。
【０１６９】
抗体がＦｃ領域を含む場合、それに結合している炭水化物は改変してよい。哺乳動物細胞によって産生される天然の抗体は代表的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に対してＮ連結によって一般には結合される分岐した、二分岐のオリゴヌクレオチドを含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔら（１９９７）ＴＩＢＴＥＣＨ  １５：２６〜３２を参照のこと。このオリゴヌクレオチドは、種々の炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、およびシアル酸、ならびに二分岐のオリゴヌクレオチド構造の「幹、ステム」においてＧｌｃＮＡｃに結合されたフコースを含んでもよい。ある実施形態では、本発明の抗体中のオリゴサッカライドの修飾を行って、特定の改善された特性を有する抗体改変体を作製してもよい。
【０１７０】
例えば、Ｆｃ領域に対して（直接的にまたは間接的に）結合されたフコースを欠いている炭水化物構造を有する抗体改変体が提供される。そのような改変体は向上したＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）、米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号（協和発酵工業株式会社）を参照のこと。「脱フコシル化」または「フコース欠損」抗体改変体に関連する刊行物の例としては以下が挙げられる。米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号、国際公開第２０００／６１７３９、国際公開第２００１／２９２４６、米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４、米国特許出願公開第２００２／０１６４３２８号、米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号、米国特許出願公開第２００４／０１３２１４０号、米国特許出願公開第２００４／０１１０７０４号、米国特許出願公開第２００４／０１１０２８２号、米国特許出願公開第２００４／０１０９８６５号、国際公開第２００３／０８５１１９号、国際公開第２００３／０８４５７０号、国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第２００５／０３５７７８号、国際公開第２００５／０５３７４２号、国際公開第２００２／０３１１４０号、Ｏｋａｚａｋｉら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９−１２４９（２００４）；Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）。脱フコシル化抗体を産生し得る細胞株の例としては、タンパク質フコシル化を欠くＬｅｃ１３  ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３−５４５（１９８６）、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号Ａ１，Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ、および国際公開第２００４／０５６３１２号Ａ１，Ａｄａｍｓら、特に実施例１１）、およびノックアウト細胞株、例えば、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）；Ｋａｎｄａ，Ｙ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９４（４）：６８０−６８８（２００６）、および国際公開第２００３／０８５１０７号を参照のこと）。
【０１７１】
抗体改変体はさらに、例えば抗体のＦｃ領域に結合した二分岐のオリゴヌクレオチドがＧｌｃＮＡｃによって分岐されている、分岐されたオリゴヌクレオチドを提供される。このような抗体改変体は、低減したフコシル化機能および／または向上したＡＤＣＣ機能を有し得る。このような抗体改変体の例は、例えば、国際公開第２００３／０１１８７８号（Ｊｅａｎ−Ｍａｉｒｅｔら）、米国特許第６，６０２，６８４号（Ｕｍａｎａら）、および米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Ｕｍａｎａら）に記載される。Ｆｃ領域に結合したオリゴサッカライド中に少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体改変体も提供される。このような抗体改変体は、向上したＣＤＣ機能を有し得る。このような抗体改変体は、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号（Ｐａｔｅｌら）、ＷＯ１９９８／５８９６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）およびＷＯ１９９９／２２７６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）に記載されている。
【０１７２】
特定の実施形態では、抗体改変体は、１つ以上のアミノ酸置換を有するＦｃ領域を含み、この置換は、例えば、Ｆｃ領域の位置２９８、３３３、および／または３３４（Ｅｕの残基ナンバリング）の置換でＡＤＣＣをさらに改善する。このような置換は、上記の任意の改変体と組み合わされて存在してもよい。
【０１７３】
特定の実施形態では、本発明は、抗体改変体であって、全てではないがいくつかのエフェクター機能（これによってこの抗体は、抗体のインビボ半減期が重要であるが、特定のエフェクター機能（例えば、補体およびＡＤＣＣ）が必須でないかまたは有害である、多くの適用のための所望の候補物となる）を保有する抗体改変体を考慮している。特定の実施形態では、この抗体のＦｃ活性を測定して、所望の特性のみが維持されるということを確実にする。インビトロおよび／またはインビボの細胞傷害性アッセイを行って、ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣ活性の低減／欠失を確認してもよい。例えば、Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）結合アッセイを行って、この抗体がＦｃγＲ結合を欠く（それゆえ、ＡＤＣＣ活性を欠く可能性が高い）が、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを保証してもよい。ＡＤＣＣを媒介するための一次細胞、ＮＫ細胞は、Ｆｃ（ＲＩＩＩのみを発現するが、単球はＦｃ（ＲＩ、Ｆｃ（ＲＩＩおよびＦｃ（ＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲ発現は、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７〜９２（１９９１）の４６４頁の表３にまとめられている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．，ら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８３：７０５９−７０６３（１９８６））およびＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８２：１４９９−１５０２（１９８５）；米国特許第５，８２１，３３７号（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１−１３６１（１９８７）を参照のこと）に記載されている。あるいは、非放射活性のアッセイ方法が使用される（例えば、フローサイトメトリーのＡＣＴＩ（商標）非放射活性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ；ａｎｄ  ＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）非−放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を参照のこと。このようなアッセイのための有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。あるいは、またはさらに、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９５：６５２−６５６（１９９８）に記載される動物モデルにおいて評価され得る。Ｃ１ｑ結合アッセイも行って、その抗体がＣ１ｑに結合できず、従ってＣＤＣ活性を欠くということを確認してもよい。補体活性化を評価するため、ＣＤＣアッセイが行われてもよい（例えば，Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３（１９９６）；Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｂｌｏｏｄ  １０１：１０４５−１０５２（２００３）；ならびにＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．およびＭ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ  １０３：２７３８−２７４３（２００４）を参照のこと）。ＦｃＲｎ結合およびインビボのクリアランス／半減期の決定はまた、当該分野で公知の方法を用いて行ってもよい（例えば，Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ら、Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：���７５９−１７６９（２００６）を参照のこと）。
【０１７４】
１つ以上のアミノ酸置換を有する他の抗体改変体が提供される。実質的な突然変異誘発のための目的の部位は、超可変領域を含むが、ＦＲの変更もまた考慮される。保存的置換は、「好ましい置換」の見出しで表１に示される。「例示的な置換」と名付けられたさらに実質的な変化は表１に示されるか、またはアミノ酸の分類を参照して下にさらに記載される。例えば、所望の活性、例えば、抗原結合の改善、免疫原性の低下、ＡＤＣＣまたはＣＤＣの改善のために、目的の抗体およびスクリーニングされた産物にアミノ酸置換が導入されてもよい。
【０１７５】
【表１】
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抗体の生物学的特性における改変（修飾）は、（ａ）例えばシートまたはヘリックス高次構造などの、置換の領域におけるポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のかさ高さ、に影響する置換を選択することによって実現され得る。側鎖の性質の類似性によりアミノ酸を以下のような群に分けてもよい（Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第２版、７３〜７５頁，Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７５））：
（１）非極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）
（２）無電荷極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）
（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）
（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）。
【０１７６】
あるいは、共通の側鎖の性質に基づいて天然に存在する残基を以下の群に分けてもよい：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０１７７】
非保存的置換は、これらのクラスのうち一つのメンバーを別のクラスのものに交換することを必要とするものである。このような置換された残基はまた、保存的置換部位に導入されても、または残りの（非保存）部位に導入されてもよい。
【０１７８】
置換改変体の１つのタイプは、親抗体（例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基を置換することを包含する。一般的に、さらなる開発のために選択された、結果として生じた改変体（単数または複数）は、それらの改変体が作成された元の親抗体に対して、改変された（例えば、改善された）生物学的性質を有する。例示的な置換の改変体は、ファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を用いて都合よく生成され得る、親和性成熟抗体である。要するに、いくつかの超可変領域部位（例えば、６〜７個の部位）を突然変異させて全ての可能なアミノ置換を各部位に作製する。このように作製された抗体は、糸状ファージ粒子から、各粒子内にパッケージングされたファージコートタンパク質（例えば、Ｍ１３の遺伝子ＩＩＩ産物）の少なくとも一部に対する融合物として提示される。次いで、ファージディスプレイされた改変体を、それらの生物学的活性（例えば結合親和性）についてスクリーニングする。改変のための候補となる超可変領域部位を同定するために、スキャニング変異誘発（例えば、アラニンスキャンニング）を行って、抗原結合に重大に寄与する超可変領域残基を同定してもよい。あるいは、または追加的に、抗原−抗体複合体の結晶構造を分析して、抗体と抗原との間の接触点を分析することが有益である場合がある。そのような接触残基および隣接する残基は、本明細書に詳細に述べられた技術を含む、当該分野で公知の技術による置換のための候補である。このような改変体がいったん発生すれば、一団の改変体を本明細書に記載された技術を含む、当該分野で公知の技術を用いるスクリーニングに供して、優れた性質を有する改変体を、１つ以上の関連するアッセイでさらなる開発のために選択し得る。
【０１７９】
この抗体のアミノ酸配列改変体をコードする核酸分子は、当該分野で公知の種々の方法によって調製される。これらの方法としては、限定はしないが、天然の供給源からの単離（天然に存在するアミノ酸配列改変体の場合）または初期調製改変体もしくは非改変体バージョンの抗体のオリゴヌクレオチド媒介性（もしくは部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、およびカセット突然変異誘発による調製が挙げられる。
【０１８０】
本発明の抗体のＦｃ領域に１つ以上のアミノ酸改変を導入し、それによってＦｃ領域の改変体を生じることが所望され得る。このＦｃ領域の改変体は、ヒンジのシステインの改変を含む、１つ以上のアミノ酸位置でアミノ酸の改変（例えば、置換）を含む、ヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４Ｆｃ領域）を含んでもよい。
【０１８１】
本明細書の詳細な説明および当該分野の技術に従って、ある実施形態では、本発明の抗体は、例えばＦｃ領域に、野性型の対応抗体に比較して１つ以上の改変を含んでもよいということが考えられる。これらの抗体はそれにもかかわらず、これらの野性型対応物に比較して治療的な有用性に必要な実質的に同じ特徴を保持している。例えば、国際公開第９９／５１６４２号に記載されるような、変更された（すなわち、改善されるかまたは軽減された）Ｃ１ｑ結合性および／または補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を生じる、Ｆｃ領域で特定の変更が作製され得ると考えられる。Ｄｕｎｃａｎ＆Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：７３８〜４０（１９８８）；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号；および国際公開第９４／２９３５１号（Ｆｃ領域の改変体の他の例に関する）も参照のこと。国際公開第００／４２０７２（Ｐｒｅｓｔａ）および国際公開第２００４／０５６３１２号（Ｌｏｗｍａｎ）は、ＦｃＲｓに対する結合の改善または軽減を有する抗体改変体を記載する。これらの特許刊行物の内容は、参照によって本明細書に詳細に援用される。またＳｈｉｅｌｄｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１−６６０４（２００１）も参照のこと。半減期の延長および新生児のＦｃレセプター（ＦｃＲｎ）に対する結合の改善（これは、胎児への母のＩｇＧの移行を担う）（Ｇｕｙｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）およびＫｉｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））を有する抗体は、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４号Ａ１（Ｈｉｎｔｏｎら）に記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎに対するＦｃ領域の結合を改善する、１つ以上の置換をその中に有するＦｃ領域を含む。Ｆｃ領域のアミノ酸配列が変更され、かつＣ１ｑ結合能が増大または低下しているポリペプチド改変体は、米国特許第６，１９４，５５１号Ｂ１、国際公開第９９／５１６４２号に記載される。これらの特許公報の内容は、参照によって本明細書に詳細に援用される。またＩｄｕｓｏｇｉｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８〜４１８４（２０００）も参照のこと。
【０１８２】
別の局面では、本発明は、Ｆｃ領域を含むＦｃポリペプチドの境界における改変であって、この改変がヘテロ二量体化を容易にするかおよび／または促進する改変を含む抗体を提供する。これらの改変は、第一のＦｃポリペプチドへの突起の導入および第二のＦｃポリペプチドへの腔の導入を含み、この突起は、第一および第二のＦｃポリペプチドの複合体化を促進するようにこの腔中に配置可能である。これらの改変を有する抗体を生成する方法は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号に記載のとおり、当該分野で公知である。
【０１８３】
さらに別の局面では、システインを操作した抗体、例えば「チオＭＡｂｓ」、および「チオＦａｂｓ」（抗体の１つ以上の残基が、システイン残基で置換されている）を作製することが所望される場合がある。特定の実施形態では、この置換された残基は、抗体の接近可能な部位に存在する。これらの残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基はその抗体の接近可能な部位に位置し、本明細書にさらに記載されるとおり、薬物部分またはリンカー−薬物部分などの、他の部分に対して抗体をコンジュゲートするために用いられ得る。特定の実施形態では、以下の残基のうちいずれか１つ以上がシステインで置換されてもよい：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔナンバリング）；重鎖のＡ１１８（ＥＵナンバリング）；および重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵナンバリング）。好ましい実施形態では、重鎖のＡ１１８（ＥＵナンバリング）がシステインに置換されている。システインが操作されたチオＭａｂｓおよびチオＦａｂｓは、本明細書において下にさらに詳細に記載される。
【０１８４】
Ｅ．抗体誘導体
本発明の抗体は、さらに改変されて、当該分野で公知でありかつ容易に利用可能である、さらなる非タンパク質性部分を含んでもよい。好ましくは、抗体の誘導体化に適する部分は、水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、限定はしないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）およびデキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレン（ｐｒｏｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）グリコールホモポリマー、プロリプロプレン（ｐｒｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）オキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、およびそれらの混合物が挙げられる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性に起因して製造の利点を有するだろう。ポリマーは、任意の分子量のポリマーであってもよく、分枝状であっても、非分枝状であってもよい。抗体に結合されるポリマーの数は、変動し得、２つ以上のポリマーが結合される場合、それらは同じであっても、または異なる分子であってよい。一般的に、誘導体化のために用いられるポリマーの数および／または型は、検討に基づいて決定することができ、その検討としては、抗体誘導体が定められた条件下での治療等に使用されるかどうかにかかわらず、改善されるべき抗体の特定の性質または機能を含むが、これらに限定されない。
【０１８５】
別の実施形態において、放射線に曝すことで選択的に加熱され得る非タンパク質部分と抗体とのコンジュゲートが、提供される。一実施形態において、この非タンパク質部分はカーボンナノチューブである（Ｋａｍら，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  １０２：１１６００−１１６０５（２００５））。上記放射線は、任意の波長であってもよく、その波長としては、通常の細胞を損傷しない波長であって、抗体−非タンパク質性部分の近位にある細胞が殺される温度までこの非タンパク質部分を加熱する波長が挙げられるが、これに限定されない。
【０１８６】
ＩＶ．抗体を作製する方法
Ａ．ファージ由来の抗体を作製する工程
本発明の抗体は、Ｌｅｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００４），３４０（５）：１０７３−９３）に開示されるファージ（ミド）ディスプレイ技術によって調製されてもよい。ファージ（ミド）ディスプレイによって、標的分子に対して高い親和性で結合する配列について迅速に分類できる、タンパク質改変体の大きいライブラリーの作製が可能になる。改変体ポリペプチドをコードする核酸は一般には、ウイルスコートタンパク質、例えば、遺伝子ＩＩＩタンパク質または遺伝子ＶＩＩＩタンパク質をコードしている核酸配列に融合される。タンパク質またはポリペプチドをコードしている核酸配列が、遺伝子ＩＩＩタンパク質の一部をコードする核酸配列に融合されている一価のファージミドディスプレイシステムが開発されている。（Ｂａｓｓ，Ｓ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，８：３０９（１９９０）；ＬｏｗｍａｎおよびＷｅｌｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ：  Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，３：２０５（１９９１））。一価のファージミドディスプレイシステムでは、遺伝子融合物が低レベルで発現し、野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質も粒子の感染性が維持されるように発現されている。ペプチドライブラリーを作製してそのライブラリーをスクリーニングする方法は多くの特許で開示されている（例えば、米国特許第５，７２３，２８６号、米国特許第５，４３２，０１８号、米国特許第５，５８０，７１７号、米国特許第５，４２７，９０８号および米国特許第５，４９８，５３０号を参照のこと）。
【０１８７】
抗体または抗原結合ポリペプチドのライブラリーは、単独の遺伝子を偏向することによって  ランダムなＤＮＡ配列を挿入することによって、または関連の遺伝子のファミリーをクローニングすることによってなどの多数の方法で調製されている。ファージ（ミド）ディスプレイを用いて、抗体または抗原結合を提示するための方法は、米国特許第５，７５０、３７３号、同第５，７３３，７４３号、同第５，８３７，２４２号、同第５，９６９，１０８号、同第６，１７２，１９７号、同第５、５８０、７１７号、および同第５，６５８，７２７号に記載されている。次いで、このライブラリーを所望の特徴を有するタンパク質または抗原結合タンパク質の発現についてスクリーニングする。
【０１８８】
テンプレート核酸へえり抜きのアミノ酸を置換する方法は、当該分野で十分確立されており、そのいくつかが本明細書に記載されている。例えば、超可変領域残基は、Ｋｕｎｋｅｌの方法を用いて置換されてもよい。例えば、Ｋｕｎｋｅｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２（１９８７）を参照のこと。
【０１８９】
オリゴヌクレオチドの配列は、変更されるべき超可変領域について１つ以上の意図的なコドンのセットを含む。あるコドンのセットとは、所望の改変体アミノ酸をコードするために用いられた異なるヌクレオチドの三つ組みのセットである。コドンのセットは、ＩＵＢコードに従って下に示される、特定のヌクレオチドまたはヌクレオチドの等モル混合物を指定する記号を用いて提示され得る。
【０１９０】
ＩＵＢコード
Ｇ  グアニン
Ａ  アデニン
Ｔ  チミン
Ｃ  シトシン
Ｒ（ＡまたはＧ）
Ｙ（ＣまたはＴ）
Ｍ（ＡまたはＣ）
Ｋ（ＧまたはＴ）
Ｓ（ＣまたはＧ）
Ｗ（ＡまたはＴ）
Ｈ（ＡまたはＣまたはＴ）
Ｂ（ＣまたはＧまたはＴ）
Ｖ（ＡまたはＣまたはＧ）
Ｄ（ＡまたはＧまたはＴ）Ｈ
Ｎ（ＡまたはＣまたはＧまたはＴ）
例えば、コドンのセットＤＶＫでは、ＤはヌクレオチドＡであっても、またはＧであっても、またはＴであってもよい；ＶはＡであっても、またはＧであっても、またはＣであってもよい；そしてＫはＧであっても、またはＴであってもよい。このコドンのセットは、１８個の異なるコドンに相当し得、かつアミノ酸Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、およびＣｙｓをコードし得る。
【０１９１】
オリゴヌクレオチドまたはプライマーのセットは、標準的な方法を用いて合成され得る。あるセットのオリゴヌクレオチドは、例えば、このコドンセットによって提供されるヌクレオチドの三つ組みの全ての可能な組み合わせに相当し、アミノ酸の所望の群をコードする配列を含む、固相合成によって合成されてもよい。特定の位置で選択されたヌクレオチド「縮重」を有するオリゴヌクレオチドの合成は、当該分野で周知である。特定のコドンセットを有するヌクレオチドのこのようなセットは、市販の核酸シンセサイザー（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡから入手可能）を使って合成してもよいし、または市販品を入手してもよい（例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから）。従って、特定のコドンセットを有する合成されたオリゴヌクレオチドのセットは、代表的に異なる配列の複数のオリゴヌクレオチドを含み、この相違は配列全体の中のこのコドンセットによって構築されたものである。本発明に従って用いる場合、オリゴヌクレオチドは可変ドメイン核酸テンプレートへのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有し、また、クローニングに役立つ制限酵素部位を含んでもよい。
【０１９２】
１つの方法では、改変体アミノ酸をコードしている核酸配列は、オリゴヌクレオチド媒介性の突然変異誘発によって作製することができる。この技術はＺｏｌｌｅｒら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：６４８７−６５０４頁（１９８７）に記載されているとおり、当該分野で周知である。要するに、改変体アミノ酸をコードしている核酸配列は所望のコドンセットをコードしているオリゴヌクレオチドセットをＤＮＡテンプレートとハイブリダイズすることによって作製され、このテンプレートは可変領域核酸テンプレート配列を含むプラスミドの一本鎖型である。ハイブリダイゼーションの後、ＤＮＡポリメラーゼを用いてテンプレートの二次相補鎖全体を合成し、これによって、この相補鎖はオリゴヌクレオチドプライマーを取り込み、このオリゴヌクレオチドセットによって提供されるコドンセットを含むようになる。
【０１９３】
一般には、長さが少なくとも２５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドが用いられる。最適オリゴヌクレオチドは、変異体（単数または複数）をコードするヌクレオチド（単数または複数）の片側上のテンプレートと完全に相補性である１２〜１５個のヌクレオチドを有する。これによって、オリゴヌクレオチドが正しく一本鎖ＤＮＡテンプレート分子にハイブリダイズすることが保証される。オリゴヌクレオチドは、当該分野で公知の技術、例えばＣｒｅａら，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，７５：５７６５（１９７８）に記載の技術を使って容易に合成される。
【０１９４】
ＤＮＡテンプレートはバクテリオファージＭ１３ベクター（市販のＭ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍｐ１９ベクターが適切）に由来するベクター、またはＶｉｅｒａら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：３頁（１９８７）に記載されている一本鎖ファージ複製起点を含むベクターによって生成される。このように、突然変異されるべきＤＮＡを、一本鎖テンプレートを生成するためにこれらのベクターの１つに挿入してもよい。一本鎖テンプレートの生産は、上記のＳａｍｂｒｏｏｋらのセクション４．２１〜４．４１に記載されている。
【０１９５】
天然のＤＮＡ配列を変えるために、オリゴヌクレオチドを適切なハイブリダイゼーション条件の下で一本鎖テンプレートにハイブリダイズさせる。ＤＮＡ重合酵素、通常、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを次に加え、合成のためのプライマーとしてオリゴヌクレオチドを用いてテンプレートの相補鎖を合成する。こうしてＤＮＡの１つの鎖が遺伝子１の突然変異した形態をコードし、他の鎖（元のテンプレート）が遺伝子１の天然の、未変更の配列をコードするようにヘテロ二重鎖分子を形成する。次いで、このヘテロ二重鎖分子を、適切な宿主細胞、通常はＥ．ｃｏｌｉのＪＭ１０１のような原核生物中に形質転換する。細胞を増殖させた後にアガロースプレートの上へプレートし、突然変異したＤＮＡを含む細菌コロニーを同定するために３２リン酸塩で放射性標識されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いてスクリーニングする。
【０１９６】
すぐ上で記載されている方法は、プラスミドの両方の鎖が突然変異（単数または複数）を含むホモ二本鎖分子が作製されるように改変してもよい。この改変は以下のとおりである：一本鎖オリゴヌクレオチドを先に述べたように一本鎖テンプレートにアニーリングする。３つのデオキシリボヌクレオチド、デオキシリボアデノシン（ｄＡＴＰ）、デオキシリボグアノシン（ｄＧＴＰ）およびデオキシリボチミジン（ｄＴＴ）の混合物を、ｄＣＴＰ−（ａＳ）と呼ばれる修飾されたチオデオキシリボシトシン（Ａｍｅｒｓｈａｍから入手できる）と合わせる。この混合物をテンプレート−オリゴヌクレオチド複合体に加える。ＤＮＡポリメラーゼをこの混合物へ追加すると、変異した塩基以外はテンプレートと同一のＤＮＡ鎖が生成される。さらに、この新しいＤＮＡ鎖はｄＣＴＰの代わりにｄＣＴＰ−（ａＳ）を含み、これはＤＮＡ鎖を制限酵素による消化作用から保護するように機能する。二重鎖ヘテロ二重鎖のテンプレート鎖に適切な制限酵素でニックを入れた後、突然変異を起こさせる部位（単数または複数）を含む領域の後方でテンプレート鎖はＥｘｏＩＩＩヌクレアーゼまたは適切な他のヌクレアーゼで消化され得る。次いで、反応が終了され、部分的にだけ一本鎖の分子が残る。次に、完全な二重鎖のＤＮＡホモ二重鎖が、４つのデオキシリボヌクレオチド三リン酸のすべて、ＡＴＰおよびＤＮＡリガーゼの存在下でＤＮＡポリメラーゼを用いて形成される。このホモ二重鎖分子は、次に適切な宿主細胞に形質転換することができる。
【０１９７】
前に示したとおり、オリゴヌクレオチドセットの配列はテンプレート核酸にハイブリダイズするために十分な長さであり、また、必須ではないが制限部位を含んでもよい。ＤＮＡテンプレートはバクテリオファージＭ１３ベクターに由来するベクター、またはＶｉｅｒａら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：３（１９８７）に記載されている一本鎖ファージ複製起点を含むベクターによって生成され得る。このように、突然変異させるべきＤＮＡを、一本鎖テンプレートを生成するためにこれらのベクターの１つに挿入しなければならない。一本鎖テンプレートの産生は、上掲のＳａｍｂｒｏｏｋらのセクション４．２１〜４．４１に記載されている。
【０１９８】
別の他の方法によれば、ライブラリーは上流および下流のオリゴヌクレオチドセットを提供することによって生成することができ、各セットは、オリゴヌクレオチドの配列内で提供されたコドンセットによって確立された異なる配列を有する複数のオリゴヌクレオチドを有する。上流および下流のオリゴヌクレオチドセットは、可変ドメインテンプレート核酸配列と共に、ＰＣＲ産物の「ライブラリー」を作製するためにポリメラーゼ連鎖反応で用いことができる。ＰＣＲ産物は確立された分子生物学的技術を用いて他の関連した、または無関係な核酸配列、例えばウイルスのコートタンパク質および二量体化ドメインと融合することができるので、「核酸カセット」と呼ぶこともある。
【０１９９】
ＰＣＲプライマーの配列は、超可変領域中の溶媒に接近可能でかつ非常に多様な位置のために１つ以上の設計されたコドンセットを含む。上記したとおり、コドンセットは所望の変異体アミノ酸をコードするのに用いられる、一組の異なるヌクレオチドの三つ組みの配列である。
【０２００】
適切なスクリーニング／選択工程を通じて選択される、所望の基準に合致する抗体選択物は、標準的な組み換え技術を用いて単離およびクローニングされ得る。
【０２０１】
一局面では、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、ＨＶＲ−Ｈ３配列は、特定の定常位置にアミノ酸を保持すること、および他の位置でアミノ酸を変化させることによって変化される。
【０２０２】
一局面では、本発明は、以下のうち少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てを含む抗体を提供する：
（ｉ）配列番号１の配列を含むＨＶＲ−Ｌ１配列
（ｉｉ）配列番号２の配列を含むＨＶＲ−Ｌ２配列
（ｉｉｉ）配列番号３の配列を含むＨＶＲ−Ｌ３配列。
【０２０３】
配列番号１、２および３のアミノ酸配列は、図１Ａ（それぞれ、位置２４〜３４、５０〜５６、および８９〜９７）、および図２Ａ（それぞれ、位置２４〜３４、５０〜５６、および８９〜９７）に示されるとおり、個々のＨＶＲ（すなわち、Ｌ１、Ｌ２、またはＬ３）に対してナンバリングされており、このナンバリングは、下記のようにＫａｂａｔナンバリングシステムと一致している。
【０２０４】
一局面では、本発明は、以下のうち少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てを含む抗体を提供する：
（ｉ）配列番号４の配列を含むＨＶＲ−Ｈ１配列
（ｉｉ）配列番号５の配列を含むＨＶＲ−Ｈ２配列
（ｉｉｉ）配列番号６の配列を含むＨＶＲ−Ｈ３配列。
【０２０５】
配列番号４、５および６のアミノ酸配列は、図１Ｂ（それぞれ、位置２６〜３５、４９〜６５、および９３〜１０２）、および図２Ｂ（それぞれ、位置２６〜３５、４９〜６５、および９３〜１０２）に示されるとおり、個々のＨＶＲ（すなわち、Ｈ１、Ｈ２、またはＨ３）に対してナンバリングされており、このナンバリングは、下記のようにＫａｂａｔナンバリングシステムと一致している。
【０２０６】
一局面では、本発明は、図１Ａおよび図２Ａに示される軽鎖ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。
【０２０７】
一局面では、本発明は、図１Ｂおよび図２Ｂに示される重鎖ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。
【０２０８】
本発明の抗体のいくつかの実施形態では、下の配列番号９８に示されるヒト化４Ｄ５抗体（ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８）の軽鎖可変ドメイン（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）抗ＨＥＲ２抗体、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）（米国特許第６，４０７，２１３号およびＬｅｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００４），３４０（５）：１０７３−９３においても言及される）を含む。
【０２０９】
【数２】
2010518115.tif 000005
一実施形態では、このｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８軽鎖可変ドメイン配列は、位置３０、６６および９１（それぞれ、上記の太字／イタリック体で示される、Ａｓｎ、ＡｒｇおよびＨ）のうちの１つ以上で改変されている。一実施形態では、この改変されたｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８配列は、位置３０にＳｅｒを、位置６６にＧｌｙを、および／または位置９１にＳｅｒを含む。従って、一実施形態では、本発明の抗体は、下の配列番号１６７に示される配列を含む軽鎖可変ドメインを含む：
【０２１０】
【数３】
2010518115.tif 000006
【０２１１】
【数４】
2010518115.tif 000007
ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８に対して置換された残基は、上で太字／イタリック体で示す。
【０２１２】
本発明の抗体は、任意の適切なフレームワーク可変ドメイン配列を含んでもよく、ただし、Ｒｏｂｏ４に対する結合活性が実質的に、本明細書に開示される本発明の抗体に対して、例えば、少なくとも１％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％以上の結合活性が保持されている。例えば、ある実施形態では、本発明の抗体は、ヒトサブグループＩＩＩ重鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。これらの抗体の一実施形態では、このフレームワークコンセンサス配列は、位置７１、７３および／または７８で置換を有する。これらの抗体のいくつかの実施形態では、位置７１はＡであり、７３はＴであり、および／または７８はＡである。一実施形態では、これらの抗体は、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標），Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）の重鎖可変ドメインフレームワーク配列（また、米国特許第６，４０７，２１３号および同第５，８２１，３３７号、ならびにＬｅｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３−９３（２００４）においても言及される）を含む。一実施形態では、これらの抗体はさらに、ヒトκＩ軽鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。一実施形態では、これらの抗体は、米国特許第６，４０７，２１３号および同第５，８２１，３３７号に記載されるようなｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８の軽鎖ＨＶＲ配列を含む。一実施形態では、これらの抗体は、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８（配列番号９８または１６７）（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）抗ＨＥＲ２抗体、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）の軽鎖可変ドメイン配列（また、米国特許第６，４０７，２１３号および同第５，８２１，３３７号、ならびにＬｅｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３−９３（２００４）においても言及される）を含む。
【０２１３】
一実施形態では、本発明の抗体は、下に示されるようなｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８の軽鎖および重鎖のフレームワーク領域配列を含んでもよい（配列番号９、１０、１６８、１２（軽鎖）および配列番号１３、１４、１５、１６（重鎖））。上付き文字／太字の数字は、Ｋａｂａｔによるアミノ酸位置を示す。
【０２１４】
ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８軽鎖のフレームワーク配列
【０２１５】
【数５】
2010518115.tif 000008
【０２１６】
【数６】
2010518115.tif 000009
ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８重鎖のフレームワーク配列
【０２１７】
【数７】
2010518115.tif 000010
一実施形態では、本発明の抗体は、下に示されるようなｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８の軽鎖および重鎖の改変された／改変体のフレームワーク領域配列を含んでもよい（配列番号９、１０、１１、１２（軽鎖）および配列番号１３、１４、１５、１６（重鎖））。上付き文字／太字の数字は、Ｋａｂａｔによるアミノ酸位置を示す。
【０２１８】
位置６６（下線を付した）で改変されたｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８軽鎖のフレームワーク配列
【０２１９】
【数８】
2010518115.tif 000011
位置７１、７３および７８（下線を付した）で改変されたｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８重鎖のフレームワーク配列
【０２２０】
【数９】
2010518115.tif 000012
【０２２１】
【数１０】
2010518115.tif 000013
一実施形態では、本発明の抗体は所望の標的結合親和性を得るために親和性成熟される。一例では、本発明の親和性成熟した抗体は、以下のような軽鎖のアミノ酸位置で置換を含む。一実施形態では、改変体ＨＶＲ−Ｌ１  Ａ１−Ａ１１（Ｋａｂａｔ位置２４−３４）はＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号１）であって、１、２、３、４、または５個の置換を以下の位置のうち任意の組み合わせで有する：Ａ６（Ｇ）、Ａ７（Ａ）、Ａ８（ＲまたはＩ）、Ａ９（ＳまたはＹ）、およびＡ１０（Ｌ）。一実施形態では、改変体ＨＶＲ−Ｌ２  Ｂ１−Ｂ７（Ｋａｂａｔ位置５０−５６）はＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号２）であって、１、２、３、４、または５個の置換を以下の位置の任意の組み合わせにおいて有する：Ｂ３（Ｔ）、Ｂ４（Ｌ、ＮまたはＴ）、Ｂ５（ＥまたはＡ）、Ｂ６（ＡまたはＳ）、およびＢ７（Ｙまたは欠失）。一実施形態では、改変体ＨＶＲ−Ｌ３  Ｃ１−Ｃ９（Ｋａｂａｔ位置８９−９７）はＱＱＳＹＴＴＰＰＴ（配列番号３）であって、１、２、３、４、５または６個の置換を以下の位置の任意の組み合わせにおいて有する：Ｃ３（Ｐ、Ｔ、Ｆ、またはＧ）、Ｃ４（Ｆ、Ｒ、またはＮ）、Ｃ５（Ａ、Ｓ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｎ、Ｖ、またはＧ）、Ｃ６（Ａ、Ｄ、Ｎ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｙ、またはＧ）、Ｃ７（Ｌ、Ｈ、またはＴ）、およびＣ８（Ａ、Ｍ、Ｆ、またはＳ）。
【０２２２】
一実施形態では、本発明の親和性成熟した抗体の抗体は、以下のように重鎖のアミノ酸位置に置換を含む。一実施形態では、改変体ＨＶＲ−Ｈ１  Ｄ１−Ｄ１０（Ｋａｂａｔ位置２６−３５）はＧＦＴＩＮＧＹＹＩＨ（配列番号１７）であって、１、２、３、４、または５個の置換を以下の位置の任意の組み合わせにおいて含む：Ｄ３（Ｓ）、Ｄ４（Ｌ）、Ｄ５（Ｙ、Ｄ、またはＫ）、Ｄ９（Ｆ、ＬまたはＮ）、およびＤ１０（ＥまたはＱ）。一実施形態では、改変体ＨＶＲ−Ｈ２  Ｅ１−Ｅ１８（Ｋａｂａｔ位置４９〜６５）はＧＦＩＹＰＡＧＧＤＴＤＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１８）であって、これは１、２、３、４、または５個の置換を以下の位置の任意の組み合わせにおいて有する：Ｅ２（Ｒ）、Ｅ５（Ｓ）、Ｅ７（Ｌ）、Ｅ９（Ｈ、Ｋ、Ａ、またはＶ）、およびＥ１１（Ａ、ＥまたはＩ）。一実施形態では、ＨＶＲ−Ｈ３  Ｆ１−Ｆ１８（Ｋａｂａｔの位置９３−１０２）はＡＲＬＩＧＮＫＦＧＷＳＳＹＧ＊ＭＤＹ（配列番号１９）であって、ここでアミノ酸配列中の「＊」は、位置Ｆ１５、Ｋａｂａｔ位置１００の欠失を示す）。
【０２２３】
一実施形態では、本発明の親和性成熟した抗体は、図２Ａに示される１、２または３つのＨＶＲｓ（Ｌ１、Ｌ２，および／またはＬ３）を含む。一実施形態では、本発明の親和性成熟した抗体は、図２Ｂに示される１、２または３つのＨＶＲｓ（Ｈ１、Ｈ２，および／またはＨ３）を含む。一実施形態では、本発明の親和性成熟した抗体は、図２Ａおよび図２Ｂに示されるＨＶＲｓから選択された１、２、３、４、５または６つ全てのＨＶＲｓを含む。
【０２２４】
一実施形態では、本発明の親和性成熟した抗体は、図２Ａに示される配列のいずれかの軽鎖可変領域配列を含む。一実施形態では、本発明の親和性成熟した抗体は、図２Ｂに示される配列のいずれかの重鎖可変領域配列を含む。
【０２２５】
一実施形態では、本発明の親和性成熟した抗体は、図２Ａに示される軽鎖可変領域配列（フレームワーク配列およびＨＶＲ配列を含む）、および図２Ｂに示される対応する抗体の重鎖可変領域配列（フレームワーク配列およびＨＶＲ配列を含む）を含む。
【０２２６】
一局面では、本発明は、Ｒｏｂｏ４に対する結合について上述の任意の抗体と競合する抗体を提供する。一局面では、本発明は、上述の任意の抗体と同じＲｏｂｏ４上のエピトープに結合する抗体を提供する。
【０２２７】
Ｂ．ハイブリドーマベースの方法
本発明のモノクローナル抗体はまた、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載され、さらに、例えば、Ｈｏｎｇｏら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１４（３）：２５３−２６０（１９９５）、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，第２版、１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１）、およびＮｉ，Ｘｉａｎｄａｉ  Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ，２６（４）：２６５−２６８（２００６）（ヒト−ヒトのハイブリドーマに関する）に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製され得る。さらなる方法としては、ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒト天然ＩｇＭ抗体の産生に関する、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号に記載の方法が挙げられる。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）は、ＶｏｌｌｍｅｒｓおよびＢｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０（３）：９２７−９３７（２００５）、ならびにＶｏｌｌｍｅｒｓおよびＢｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｆｉｎｄｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２７（３）：１８５−９１（２００５）に記載される。他のハイブリドーマ技術は、例えば、米国特許出願公開第２００６／２５８８４１号；米国特許出願公開第２００６／１８３８８７号（完全ヒト抗体）、米国特許出願公開第２００６／０５９５７５号；米国特許出願公開第２００５／２８７１４９号；米国特許出願公開第２００５／１００５４６号；米国特許出願公開第２００５／０２６２２９号；ならびに米国特許第７，０７８，４９２号および同第７，１５３，５０７号に記載されている。
【０２２８】
Ｃ．ベクター、宿主細胞および組み換え方法
抗体はまた、組み換え方法を用いて産生されてもよい。抗Ｒｏｂｏ４抗体の組み換え産生のためには、抗体をコードする核酸を単離して、さらなるクローニング（ＤＮＡの複製）のために、または発現のために複製ベクターに挿入する。抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて容易に単離および配列決定し得る（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に対して特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）。多くのベクターが利用可能である。このベクター成分は一般には、限定はしないが、以下の１つ以上を包含する：シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列。
【０２２９】
１．シグナル配列成分
本発明の抗体は、直接だけでなく、異種ポリペプチド（好ましくは、成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端に特定の切断部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドである）との融合ポリペプチドとしても組み換え的に産生され得る。選択される異種シグナル配列は、好ましくは、宿主細胞によって認識およびプロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）配列である。天然の抗体のシグナル配列を認識およびプロセシングしない原核生物宿主細胞については、シグナル配列は、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐまたは熱安定なエンテロトキシンＩＩリーダーの群から例えば選択される原核生物シグナル配列によって置換される。酵母の分泌に関しては、天然のシグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー（ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよびＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓのα因子リーダーを含む）、または酸ホスフォターゼリーダー、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓのグルコアミラーゼリーダー、国際公開第９０／１３６４６号に記載されているシグナルによって置換されてもよい。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列、およびウイルス分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルが利用可能である。
【０２３０】
２．複製起点
発現ベクターおよびクローニングベクターは両方とも１つ以上の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。一般には、クローニングベクターでは、この配列は、ベクターが宿主の染色体ＤＮＡと独立して複製できる配列であって、複製起点または自律的に複製する配列を包含する。このような配列は種々の細菌、酵母およびウイルスについて周知である。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製起点は、大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μのプラスミドの起点は酵母に適しており、様々なウイルスの起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ）は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般には、複製コンピテントの起点は、哺乳動物発現ベクターには必要がない（ＳＶ４０起点は代表的には、それが初期プロモーターを含むという理由だけで用いられ得る）。
【０２３１】
３．選択遺伝子成分
発現ベクターおよびクローニングベクターは、選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含んでもよい。代表的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートもしくはテトラサイクリンに対する耐性を付与するタンパク質、（ｂ）栄養要求性の欠損を補完するタンパク質、または（ｃ）複合培地から利用できない重要な栄養素を供給するタンパク質（例えば、ＢａｃｉｌｌｉについてのＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）をコードする。
【０２３２】
選択スキームの一例は、宿主細胞の増殖を停止させる薬物を利用する。異種遺伝子で首尾よく形質転換される細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を生じ、これによって選択レジメンを生き残る。このようなドメイン選択の例は、薬物ネオマイシン、ミコフェノール酸およびハイグロマイシンを用いる。
【０２３３】
哺乳動物細胞のための適切な選択マーカーの別の例は、抗体コード核酸を拾い上げるためにコンピテントな細胞の特定を可能にする、哺乳動物細胞のための適切な選択マーカー、例えば、ＤＨＦＲ、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン−Ｉおよび−ＩＩ、好ましくは、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなどである。
【０２３４】
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換された細胞は、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトレキセート（Ｍｔｘ）を含む培養培地中で形質転換体を培養することによって特定される。これらの条件下では、ＤＨＦＲ遺伝子は、任意の他の同時に形質転換された核酸とともに増幅される。内因性のＤＨＦＲ活性を欠くチャイニーズハムスター卵巣（Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ（ＣＨＯ））細胞株（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０９６）が用いられてもよい。
【０２３５】
あるいは、ＧＳ遺伝子で形質転換された細胞は、ＧＳのインヒビターであるＬ−メチオニンスルホキシイミン（Ｍｓｘ）を含む培養培地中で形質転換体を培養することによって特定される。これらの条件下では、ＧＳ遺伝子は、任意の他の同時に形質転換された核酸とともに増幅される。ＧＳ選択／増幅システムは、上記のＤＨＦＲ選択／増幅システムと組み合わせて用いられてもよい。
【０２３６】
あるいは、目的の抗体、野性型ＤＨＦＲ遺伝子、および別の選択マーカー、例えば、アミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）をコードするＤＮＡ配列で形質転換されるかまたは同時形質転換された宿主細胞（特に、内因性ＤＨＦＲを含む野性型宿主）は、アミノグリコシド系抗生物質、例えば、カナマイシン、ナオマイシンまたはＧ４１８のような選択マーカーのための選択因子を含む培地中での細胞増殖によって選択され得る。米国特許第４，９６５，１９９号を参照のこと。
【０２３７】
酵母における使用のための適切な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ，２８２：３９（１９７９））に存在するｔｒｐ１遺伝子である。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中で増殖する能力を欠く酵母の変異株、例えば、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．４４０７６またはＰＥＰ４−１についての選択マーカーを提供する。Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８５：１２（１９７７）。次いで、酵母宿主細胞ゲノムにおけるｔｒｐ１の損傷の存在によって、トリプトファンの非存在下での増殖によって形質転換を検出するための有効な環境が得られる。同様に、Ｌｅｕ−２欠損酵母株（ＡＴＣＣ  ２０，６２２または３８，６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を保有する公知のプラスミドによって補完される。
【０２３８】
さらに、１．６μｍの環状プラスミドｐＫＤ１由来のベクターが、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ酵母の形質転換のために用いられ得る。あるいは、組み換えウシキモシンの大規模産生のための発現系が、Ｋ．ｌａｃｔｉｓについて報告された。Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：１３５（１９９０）。Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓの工業的な株による成熟組み換えヒト血清アルブミンの分泌のための適切なマルチコピー発現ベクターも開示されている。Ｆｌｅｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：９６８〜９７５（１９９１）。
【０２３９】
４．プロモーター成分
発現ベクターおよびクローニングベクターは通常、宿主生物体によって認識され、かつ抗体をコードする核酸に作動可能に連結されるプロモーターを含む。原核生物宿主との使用に適切なプロモーターとしては、ｐｈｏＡプロモーター、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼプロモーター、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、およびハイブリッドプロモーター、例えば、ｔａｃプロモーターが挙げられる。しかし、他の公知の細菌プロモーターが適切である。細菌の系での使用のためのプロモーターはまた、抗体をコードするＤＮＡに対して作動可能に連結されたシャイン・ダルガーノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）（Ｓ．Ｄ．）配列を含むであろう。
【０２４０】
プロモーター配列は真核生物について公知である。実質的に全ての真核生物遺伝子が、転写が開始される部位からほぼ２５〜３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域を有する。多くの遺伝子の転写開始から７０〜８０塩基上流で見いだされる別の配列はＣＮＣＡＡＴ領域であり、ここでＮは任意のヌクレオチドであってもよい。ほとんどの真核生物遺伝子の３’末端は、ＡＡＴＡＡＡ配列であって、これは、コード配列の３’末端に対するポリＡテールの付加のためのシグナルであり得る。これらの配列の全てが真核生物発現ベクターに適切に挿入される。
【０２４１】
酵母宿主との使用のための適切なプロモーター配列の例としては、３−ホスホグリセレートキナーゼまたは他の解糖酵素、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスファターゼデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼのためのプロモーターが挙げられる。
【０２４２】
他の酵母プロモーターであって、増殖状態によって制御される転写のさらなる利点を有する誘導性プロモーターであるプロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ならびにマルトースおよびガラクトース利用を担う酵素についてのプロモーター領域である。酵母発現における使用のための適切なベクターおよびプロモーターは、さらに、欧州特許第７３，６５７号に記載される。酵母エンハンサーはまた、酵母プロモーターとともに有利に用いられる。
【０２４３】
哺乳動物宿主細胞におけるベクター由来の抗体転写物は、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、サルウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから、あるいは、異種哺乳動物プロモーター、例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターから、熱ショックプロモーターから得られたプロモーターによって制御され得、ただし、このようなプロモーターが宿主細胞系と適合性である。
【０２４４】
ＳＶ４０ウイルスの初期プロモーターおよび後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点も含むＳＶ４０制限フラグメントとして都合よく得られる。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限フラグメントとして都合よく得られる。ベクターとしてウシパピローマウイルスを用いて哺乳動物宿主でＤＮＡを発現するための系は、米国特許第４，４１９，４４６号に開示される。この系の改変は、米国特許第４，６０１，９７８号に記載される。また、単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの制御下のマウス細胞におけるヒトβインターフェロンｃＤＮＡの発現に対する、Ｒｅｙｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：５９８〜６０１（１９８２）も参照のこと。あるいは、ラウス肉腫ウイルス長末端反復が、プロモーターとして用いられてもよい。
【０２４５】
５．エンハンサーエレメント成分
高等な真核生物による本発明の抗体をコードするＤＮＡの転写はしばしば、ベクターへのエンハンサー配列の挿入によって増大される。多くのエンハンサー配列が現在、哺乳動物遺伝子から公知である（グロブリン、エラスターゼ、アルブミン、αフェトプロテインおよびインスリン）。しかし、代表的には、当業者は、原核生物細胞ウイルス由来のエンハンサーを用いている。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。また、原核生物プロモーターの活性化についてのエレメントのエンハンサーに対しては、Ｙａｎｉｖ，Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：１７〜１８（１９８２）を参照のこと。このエンハンサーは、抗体コード配列に対して５’位置または３’位置でベクター中にスプライシングされてもよいが、好ましくはプロモーターから５’部位に位置する。
【０２４６】
６．転写物末端成分
原核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトまたは他の多細胞生物体由来の核形成細胞）において用いられる発現ベクターはまた、転写の終結のため、およびｍＲＮＡの安定化のために必要な配列を含む。このような配列は、真核生物またはウイルスのＤＮＡもしくはｃＤＮＡの５’および時には３’非翻訳領域から商業的に入手可能である。これらの領域は、抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分におけるポリアデニル化フラグメントとして転写されたヌクレオチドセグメントを含む。１つの有用な転写終止成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＷＯ９４／１１０２６およびそこに記載される発現ベクターを参照のこと。
【０２４７】
７．宿主細胞の選択および形質転換
本明細書におけるベクターでＤＮＡをクローニングまたは発現するための適切な宿主細胞は、上記される原核生物、酵母または高等な真核生物の細胞である。この目的のために適切な原核生物としては、真正細菌、例えば、グラム陰性またはグラム陽性の生物体、例えば、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ、およびＳｈｉｇｅｌｌａ、ならびにＢａｃｉｌｌｉ、例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（例えば、１９８９年４月１２日公開、ＤＤ２６６，７１０に開示されるＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ４１Ｐ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓが挙げられる。１つの好ましいＥ．ｃｏｌｉクローニング宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）であるが、他の株、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）およびＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）が適切である。これらの例は限定ではなく例示である。
【０２４８】
全長の抗体、抗体融合タンパク質、および抗体フラグメントは、特に、グリコシル化およびＦｃエフェクター機能が必要でない場合、例えば、治療抗体が、腫瘍細胞の破壊においてそれ自体有効性を示す細胞傷害性剤（例えば、毒素）にコンジュゲートされる場合、細菌中で産生され得る。全長抗体は、循環中で有する半減期がより長い。Ｅ．ｃｏｌｉにおける産生は、より早くかつより費用効果的である。細菌中での抗体フラグメントおよびポリペプチドの発現については、米国特許第５，６４８，２３７号（Ｃａｒｔｅｒら）、米国特許第５，７８９，１９９号（Ｊｏｌｙら、）、米国特許第５，８４０、５２３号（Ｓｉｍｍｏｎｓら、）を参照のこと（これらは、発現および分泌を最適化するための翻訳開始領域（ＴＩＲ）およびシグナル配列を記載している）。また、Ｃｈａｒｌｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，編集，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３），２４５−２５４頁（Ｅ．ｃｏｌｉでの抗体フラグメントの発現を記載している）も参照のこと。発現の後、抗体は、可溶性画分中のＥ．ｃｏｌｉ細胞ペーストから単離されてもよく、アイソタイプに依存して例えば、プロテインＡまたはＧカラムを通じて精製され得る。最終の精製は、例えば、ＣＨＯ細胞で発現される抗体を精製するためのプロセスと同様に行ってもよい。
【０２４９】
原核生物に加えて、真核生物の微生物、例えば、糸状菌または酵母は、抗体をコードするベクターのための適切なクローニング宿主または発現宿主である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、または一般的なパン酵母は、下等な真核生物宿主生物体のなかで最も一般的に用いられる。しかし、多数の他の属、種、および株が一般に利用可能であって、本明細書において有用である。例えば、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ宿主、例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ  １２，４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ１６，０４５）、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ２４，１７８）、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ（ＡＴＣＣ５６，５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（ＡＴＣＣ３６，９０６）、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、およびＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ；ｙａｒｒｏｗｉａ（欧州特許第４０２，２２６号）；Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（欧州特許第１８３，０７０号）；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ（欧州特許第２４４，２３４号）；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ、例えば、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ；ならびに糸状菌、例えば、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主など、例えば、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓおよびＡ．ｎｉｇｅｒ。治療用タンパク質の産生のための酵母および糸状菌の使用を考察している概説については、例えば、Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２：１４０９〜１４１４（２００４）を参照のこと。
【０２５０】
グリコシル化経路が「ヒト化」されており、部分的または完全にヒトグリコシル化パターンを有する抗体の産生を生じる特定の真菌および酵母株が選択され得る。例えば、Ｌｉら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｃｈ．２４：２１０〜２１５（２００６）（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるグリコシル化経路のヒト化を記載している）；およびＧｅｒｎｇｒｏｓｓら（上掲）を参照のこと。
【０２５１】
グリコシル化抗体の発現のために適切な宿主細胞はまた、多細胞生物体（無脊椎動物および脊椎動物）由来である。無脊椎動物細胞の例としては植物および昆虫の細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株および改変体、ならびにＳｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（キャタピラー（イモムシ）（ｃａｔｅｒｐｉｌｌａｒ））、Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ（蚊）、Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ（蚊）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ショウジョウバエ）、およびＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉのような宿主由来の対応する許容される昆虫宿主細胞が特定されている。トランスフェクションのための種々のウイルス株は、公的に入手可能である。例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ＮＰＶのＬ−１改変体、およびＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ＮＰＶのＢｍ−５株、そしてこのようなウイルスは、本発明に従って本明細書のウイルスとして、特に、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために用いられ得る。
【０２５２】
綿、コーン、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマト、ウキクサ（ｄｕｃｋｗｅｅｄ）（Ｌｅｍｎａｃｅａｅ）、アルファルファ（Ｍ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）、およびタバコの植物細胞培養物も宿主として利用され得る。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０、４９８号、同第６，４２０、５４８号、同第７，１２５，９７８号、および同第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物において抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を記載している）を参照のこと。
【０２５３】
脊椎動物細胞は、宿主として用いられ得、培養（組織培養）中の脊椎動物細胞の増殖は、慣用的な手順となっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚性腎臓株（２９３細胞または懸濁培養物中での増殖のためにサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））｛ｔｃ「Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６＼：５９（１９７７））」＼ｆＤ｝；ベビーハムスター（ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ）腎臓細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；マウス・セルトリ（ｍｏｕｓｅ  ｓｅｒｔｏｌｉ）細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３〜２５１（１９８０））｛ｔｃ「Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３＼：２４３〜２５１（１９８０）」＼ｆＤ｝）；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファロー・ラット（ｂｕｆｆａｌｏ  ｒａｔ）肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ  ＮＹ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４〜６８（１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝細胞腫株（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が挙げられ、これはＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））；ならびに骨髄腫細胞株、例えば、ＮＳ０およびＳｐ２／０を含む。抗体産生のために適切な特定の哺乳動物宿主細胞株の概説については、例えば、ＹａｚａｋｉおよびＷｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２４８巻（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，編集，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３），２５５〜２６８頁を参照のこと。
【０２５４】
宿主細胞は、抗体産生のための上記の発現ベクターまたはクローニングベクターで形質転換されて、プロモーター誘導に、形質転換体選択にまたは所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適切であるように改変された従来の栄養培地中で培養される。
【０２５５】
８．宿主細胞を培養する工程
本発明の抗体を生成するために用いられる宿主細胞は、種々の培地中で培養され得る。市販の培地、例えば、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、最少基本培地（Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）（（ＤＭＥＭ），Ｓｉｇｍａ）が宿主細胞を培養するのに適切である。さらに、Ｈａｍら、Ｍｅｔｈ．Ｅｍ．５８：４４（１９７９），Ｂａｒｎｅｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  １０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号；同第４，６５７，８６６号；同第４，９２７，７６２号；同第４，５６０，６５５号；または同第５，１２２，４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；または米国再発行特許第３０，９８５号に記載される任意の培地が、宿主細胞のための培養培地として用いられ得る。任意のこれらの培地には、ホルモンおよび／または他の増殖因子（例えば、インスリン、トランスフェリン、または上皮増殖因子）、塩（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸塩）、緩衝液（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えば、アデノシンおよびチミジン）、抗生物質（例えば、ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬物）、微量元素（最終濃度でマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として規定される）、およびグルコースまたは等価なエネルギー供給源が必要に応じて補充されてもよい。任意の他の必要な補充物も、当業者に公知である適切な濃度で含まれてもよい。培養条件、例えば、温度、ｐＨなどは、発現のために選択された宿主細胞とともに以前に用いられているものであって、当業者には明白である。
【０２５６】
９．抗体の精製
組み換え技術を用いる場合、この抗体は、細胞内で、細胞膜周辺腔で生成され得、または培地に直接分泌され得る。抗体が細胞内で生成される場合、第一工程として、微粒子細片が、宿主細胞または溶解されたセグメントから、例えば、超遠心または限外濾過によって除去される。Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３〜１６７（１９９２）は、Ｅ．ｃｏｌｉの細胞膜周辺腔に分泌される抗体を単離するための手順を記載している。要するに、細胞ペーストを酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡおよびフェニルメチルスルホニルフッ化物（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分以上にわたって解凍する。細胞細片は、遠心分離によって除去され得る。抗体が培地に分泌される場合、このような発現系からの上清は一般に、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ超遠心ユニットを用いて最初に濃縮される。プロテアーゼインヒビター、例えば。ＰＭＳＦが、タンパク質分解を阻害するための任意の前述の工程に含まれてもよく、そして抗生物質が、アデノウイルス混入物の増殖を妨げるために含まれてもよい。
【０２５７】
細胞から調製される抗体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析およびアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製されてもよく、ここでアフィニティークロマトグラフィーがとりわけ代表的に好ましい精製技術の１つである。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、その抗体に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種およびアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２またはγ４重鎖に基づく抗体を精製するために用いられ得る（Ｌｉｎｄｍａｒｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１〜１３（１９８３））。プロテインＧが、全てのマウスアイソタイプについて、そしてヒトγ３について推奨される（Ｇｕｓｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．５：１５６７１５７５（１９８６））。アフィニティーリガンドが結合されるマトリックスは、ほとんどの場合アガロースであるが、他のマトリクックスも利用可能である。機械的に安定なマトリックス、例えば、制御細孔ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）またはポリ（シチレンジビニル）ベンゼンによって、アガロースで達成され得るよりも速い流速および短い処理時間が可能になる。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）が精製に有用である。タンパク質精製のための他の技術、例えば、イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｈａｓｅ）ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂（例えば、ポリアスパラギン酸カラム）上でのヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）クロマトグラフィー上でのクロマトグラフィー、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニウム沈殿も、回収される抗体に依存して利用可能である。
【０２５８】
任意の予備的精製工程（単数または複数）後、目的の抗体および混入物を含む混合物を、約２．５〜４．５のｐＨの溶出緩衝液を用い、好ましくは、低塩濃度（例えば、約０〜０．２５Ｍの塩）で行われる、低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーに供してもよい。
【０２５９】
一般には、研究、試験および臨床における使用のための抗体を調製するための種々の方法論が当該分野で十分確立されており、この方法論は、上記の方法論と一致しており、および／または目的の特定の抗体について当業者によって適切であるとみなされる。
【０２６０】
Ｖ．免疫コンジュゲート
本発明はまた、免疫コンジュゲート（「抗体−薬物コンジュゲート」または「ＡＤＣ」と交換可能に言及される）であって、１つ以上の細胞傷害性剤、例えば、化学療法剤、薬物、増殖阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物または動物由来の酵素的に活性な毒素、またはそのフラグメント）、または放射性同位体（すなわち、放射性コンジュゲート）に対してコンジュゲートされた本発明の任意の抗Ｒｏｂｏ４抗体を含む免疫コンジュゲートを提供する。抗体および１つ以上の低分子の毒素、例えば、カリケアマイシン、メイタンシノイド、トリコテセンおよびＣＣ１０６５、ならびに毒素活性を有するこれらの毒素の誘導体のコンジュゲートも本明細書で考慮される。
【０２６１】
特定の実施形態では、免疫コンジュゲートは、抗Ｒｏｂｏ４抗体および化学療法剤または他の毒素を含む。免疫コンジュゲートの生成に有用な化学療法剤は、本明細書に記載される（例えば、上記）。酵素的に活性な毒素およびそのフラグメントも用いられてもよく、本明細書に記載されている。
【０２６２】
特定の実施形態では免疫コンジュゲートは、抗Ｒｏｂｏ４抗体および１つ以上の低分子毒素を含み、この毒素としては限定はしないが、低分子薬物、例えば、カリケアマイシン、メイタンシノイド、ドラスタチン、アウリスタチン、トリコテセンおよびＣＣ１０６５、ならびに細胞傷害性活性を有するこれらの毒素の誘導体が挙げられる。このような免疫コンジュゲートの例は、下にさらに詳細に考察される。
【０２６３】
Ａ．例示的な免疫コンジュゲート
本発明の免疫コンジュゲート（または「抗体−薬物コンジュゲート」（「ＡＤＣ」））は、下の式Ｉであってもよく、ここで抗Ｒｏｂｏ４抗体が、任意のリンカー（Ｌ）を通じて１つ以上の薬物部分（Ｄ）に対してコンジュゲート（すなわち、共有結合）されている。
【０２６４】
Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｐ  式Ｉ
従って、この抗Ｒｏｂｏ４抗体は、薬物に対して直接またはリンカーを介してコンジュゲートされ得る。式Ｉでは、ｐは１抗体あたりの薬物部分の平均数であって、これは１抗体あたり、例えば、約１〜約２０個の薬物部分に及んでもよく、特定の実施形態では、１抗体あたり約１〜約８個の部分に及んでもよい。
【０２６５】
Ｂ．例示的なリンカー
例示的なリンカーおよび薬物部分は、本明細書において、ならびに米国特許出願公開第２００５０２３８６４９号Ａ１；同第２００５０２７６８１２号Ａ１；および同第２００７００９２９４０号Ａ１に開示される。リンカーは１つ以上のリンカー成分を含んでもよい。例示的なリンカー成分としては、６−マレイミドカプロイル（「ＭＣ」）、マレイミドプロパノイル（「ＭＰ」）、バリン−シトルリン（「ｖａｌ−ｃｉｔ」または「ｖｃ」）、アラニン−フェニルアラニン（「ａｌａ−ｐｈｅ」）、ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ａ「ＰＡＢ」）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート（「ＳＰＰ」），Ｎ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１カルボキシレート（「ＳＭＣＣ」）、およびＮ−スクシンイミジル（４−ヨード−アセチル）アミノベンゾエート（「ＳＩＡＢ」）、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）（例えば、Ｃａｒｌｓｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１７３，７２３−７３７（１９７８）を参照のこと）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）（例えば、米国特許第４，５６３，３０４号を参照のこと）、Ｎ−スクシンイミジル４−メチル−４−［２−（５−ニトロ−ピリジル）−ジチオ］ペンタノエート（ＳＭＮＰ）、およびポリエチレングリコール誘導体、メトキシ−ポリエチレンオキシド（ｍＰＥＯ）が挙げられる。種々のリンカー成分が当該分野で公知であって、そのいくつかは下に記載されている。
【０２６６】
リンカーは、細胞中の薬物の遊離を容易にする「切断可能なリンカー」であってもよい。例えば、酸不安定性のリンカー（例えば、ヒドラゾン）、プロテアーゼ感受性（例えば、ペプチダーゼ−感受性）リンカー、感光性リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７−１３１（１９９２）；米国特許第５，２０８，０２０号）を用いてもよい。
【０２６７】
ある実施形態では、リンカー成分は、別のリンカー成分に、または薬物部分に対して抗体を結合する「ストレッチャー単位」を含んでもよい。例示的なストレッチャー単位は、下に示す（ここで、波線は、抗体、別のリンカー成分または薬物部分に対する共有結合の部位を示す）：
【０２６８】
【化１】
2010518115.tif 000014
【０２６９】
【化２】
2010518115.tif 000015
ある実施形態では、リンカー成分は、アミノ酸単位を含んでもよい。１つのこのような実施形態では、このアミノ酸単位によって、プロテアーゼによるそのリンカーの切断が可能になり、それによってリソソーム酵素などの細胞内プロテアーゼに対する暴露の際、免疫コンジュゲートからの薬物の遊離が容易になる。例えば、Ｄｏｒｏｎｉｎａら、（２００３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：７７８〜７８４。例示的なアミノ酸単位としては限定はしないが、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、およびペンタペプチドが挙げられる。例示的なジペプチドとしては以下が挙げられる：バリン−シトルリン（ｖｃまたはｖａｌ−ｃｉｔ）、アラニン−フェニルアラニン（ａｆまたはａｌａ−ｐｈｅ）；フェニルアラニン−リジン（ｆｋまたはｐｈｅ−ｌｙｓ）；またはＮ−メチル−バリン−シトルリン（Ｍｅ−ｖａｌ−ｃｉｔ）。例示的なトリペプチドとしては以下が挙げられる：グリシン−バリン−シトルリン（ｇｌｙ−ｖａｌ−ｃｉｔ）およびグリシン−グリシン−グリシン（ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ）。アミノ酸単位は、天然に存在するアミノ酸残基、ならびにマイナーなアミノ酸および天然には存在しないアミノ酸アナログ、例えば、シトルリンを含んでもよい。アミノ酸単位は、特定の酵素、例えば、腫瘍関連プロテアーゼ、カテプシンＢ、ＣおよびＤ、またはプラスミンプロテアーゼによる酵素切断についてその選択性において、設計および最適化されてもよい。
【０２７０】
ある実施形態では、リンカー成分は、薬物部分に対して、直接、またはストレッチャー単位および／もしくはアミノ酸単位によってのいずれかで抗体を連結する「スペーサー」単位を含んでもよい。スペーサー単位は、「自己犠牲的」であっても、または「非自己犠牲的」であってもよい。「非自己犠牲的」スペーサー単位とは、ＡＤＣの酵素的（例えば、タンパク質分解性）切断の際に薬物部分に対する結合を一部または全てのスペーサー単位が保持しているスペーサー単位である。非自己犠牲的スペーサー単位の例としては、限定はしないが、グリシンスペーサー単位およびグリシン−グリシンスペーサー単位が挙げられる。配列特異的な酵素切断に感受性であるペプチドスペーサーの他の組み合わせも考慮される。例えば、腫瘍細胞関連プロテアーゼによるグリシン−グリシンスペーサー単位を含むＡＤＣの酵素的切断は、ＡＤＣの残りからのグリシン−グリシン−薬物部分の放出を生じる。一実施形態では、次いで、このグリシン−グリシン薬物部分を腫瘍細胞中の別の加水分解工程に供して、これによって薬物部分からグリシン−グリシンスペーサー単位を切断する。
【０２７１】
「自己犠牲的」スペーサー単位によって、別の加水分解工程なしに薬物部分を放出することが可能になる。特定の実施形態では、リンカーのスペーサー単位は、ｐ−アミノベンジルカルバモイル単位を含む。１つのこのような実施形態では、ｐ−アミノベンジルアルコールは、アミド結合およびカルバメートを介してアミノ酸単位に結合され、メチルカルバメートまたはカルバメートが、ベンジルアルコールと細胞傷害性剤との間で作製される。例えば、Ｈａｍａｎｎら、（２００５）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔｅｎｔｓ（２００５）１５：１０８７−１１０３を参照のこと。一実施形態では、このスペーサー単位は、ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢ）である。特定の実施形態では、ｐ−アミノベンジル単位のフェニレン部分は、Ｑｍで置換され、ここでＱは−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）、−ハロゲン、−ニトロまたは−シアノであり；そしてｍは０〜４におよぶ整数である。自己犠牲的スペーサー単位の例としてはさらに、限定はしないが、ｐ−アミノベンジルアルコールと電気的に類似である芳香族化合物（例えば、米国特許出願公開第２００５／０２５６０３０号Ａ１を参照のこと）、例えば、２−アミノイミダゾール−５−メタノール誘導体（Ｈａｙら、（１９９９）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．９：２２３７）およびオルト−またはパラ−アミノベンジルアセタールが挙げられる。アミド結合加水分解の際に環化を受けるスペーサー、例えば、置換および非置換の４−アミノ酪酸アミド（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，２，２２３）；適切に置換されたビシクロ［２．２．１］およびビシクロ［２．２．２］環系（Ｓｔｏｒｍ，ら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９７２，９４，５８１５）；および２−アミノデニルプロピオン酸アミド（Ａｍｓｂｅｒｒｙ，ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９０、５５、５８６７）が用いられてもよい。グリシンのａ−位置で置換されるアミン含有薬物の排除（Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９８４，２７，１４４７）も、ＡＤＣで有用な自己犠牲的スペーサーの例である。
【０２７２】
一実施形態では、スペーサー単位は、複数の薬物を組み込み、かつ遊離するために用いられ得る、下に示されるような、分枝のビス（ヒドロキシメチル）スチレン（ＢＨＭＳ）単位である。
【０２７３】
【化３】
2010518115.tif 000016
ここで、Ｑは、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）、−ハロゲン、−ニトロまたは−シアノであり；ｍは、０〜４の範囲の整数であり；ｎは、０または１であり；そして、ｐは、１〜約２０に及ぶ範囲である。
【０２７４】
リンカーは、上記のリンカー成分のうちの任意の１つ以上を含んでもよい。特定の実施形態では、リンカーは以下のＡＤＣ式ＩＩにおけるカッコで示されるとおりである
Ａｂ−（［Ａａ−Ｗｗ−Ｙｙ］-Ｄ）ｐ  式ＩＩ
ここでＡは、ストレッチャー単位であり、そしてａは０〜１の整数である；Ｗはアミノ酸単位であって、かつｗは０〜１２の整数である；Ｙは、スペーサー単位であって、かつｙは０、１、または２であり；かつＡｂ、Ｄ、およびｐは式Ｉについて上記されたとおりである。このようなリンカーの例示的な実施形態は、米国特許出願公開第２００５０２３８６４９号Ａ１に記載されており、これは参照によって本明細書に明示的に援用される。
【０２７５】
例示的なリンカー成分およびその組み合わせは、式ＩＩのＡＤＣｓの状況で下に示される：
【０２７６】
【化４】
2010518115.tif 000017
【０２７７】
【化５】
2010518115.tif 000018
ストレッチャー、スペーサーおよびアミノ酸単位を含むリンカー成分は、米国特許出願公開第２００５−０２３８６４９Ａ１に記載の方法などの、当該分野で公知の方法によって合成してもよい。
【０２７８】
Ｃ．例示的な薬物部分
１．メイタンシンおよびメイタンシノイド
ある実施形態では、免疫コンジュゲートは、１つ以上のメイタンシノイド分子にコンジュゲートされた本発明の抗体を含む。メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害することによって作用する分裂抑制因子である。メイタンシンは、東アフリカの低木Ｍａｙｔｅｎｕｓ  ｓｅｒｒａｔａから始めて単離された（米国特許第３，８９６，１１１号）。続いて、特定の微生物がまた、メイタンシノールおよびＣ−３メイタンシノールエステルなどのメイタンシノイドを産生することも発見された（米国特許第４，１５１，０４２号）。合成メイタンシノールならびにその誘導体およびアナログは、例えば、米国特許第４，１３７，２３０号、同第４，２４８，８７０号、同第４，２５６，７４６号、同第４，２６０，６０８号、同第４，２６５，８１４号、同第４，２９４，７５７号、同第４，３０７，０１６号、同第４，３０８，２６８号、同第４，３０８，２６９号、同第４，３０９，４２８号、同第４，３１３，９４６号、同第４，３１５，９２９号、同第４，３１７，８２１号、同第４，３２２，３４８号、同第４，３３１，５９８号、同第４，３６１，６５０号、同第４，３６４，８６６号、同第４，４２４，２１９号、同第４，４５０，２５４号、同第４，３６２，６６３号および同第４，３７１，５３３号（これらの開示は、参考として本明細書に明確に援用される）に開示されている。
【０２７９】
メイタンシン化合物は、マイクロチューブリンタンパク質、チューブリンの重合の阻害を通じて有糸分裂の間、微小管の形成を阻害することによって細胞増殖を阻害する（Ｒｅｍｉｌｌａｒｄら、（１９７５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  １８９：１００２−１００５；米国特許第５２０８０２０号）。メイタンシンおよびメイタンシノイドは極めて細胞傷害性であるが、ガン治療におけるそれらの臨床使用は、腫瘍についてその選択性が乏しいことに主に起因する、その重篤な全身の副作用によって大きく制限されている。メイタンシンによる臨床試験は、中枢神経系および胃腸系に対する重篤な有害作用に起因して中止された（Ｉｓｓｅｌら、，（１９７８）Ｃａｎ．Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｒｅｖ．５：１９９−２０７）。
【０２８０】
メイタンシノイドの薬物部分は、それらが（ｉ）発酵、または化学修飾、または発酵産物の誘導体化により比較的製造しやすく、（ｉｉ）抗体への非ジスルフィドリンカーを通したコンジュゲーションに適する官能基を用いた誘導体化に適しており、（ｉｉｉ）血漿中で安定であり、そして（ｉｖ）種々の腫瘍細胞株に対して有効であるという理由で、抗体薬剤コンジュゲートにおける魅力的な薬物部分である。
【０２８１】
メイタンシノイド薬物部分としての使用に適切なメイタンシン化合物は、当該分野で周知であって、公知の方法に従って天然の供給源から単離されてもよく、または遺伝子操作技術を用いて生成されてもよい（Ｙｕら、（２００２）ＰＮＡＳ  ９９：７９６８−７９７３を参照のこと）。メイタンシノールおよびメイタンシノールのアナログはまた、公知の方法に従って合成的に調製され得る。メイタンシノイド薬物部分の例示的な実施形態としては以下が挙げられる：ＤＭ１；ＤＭ３；およびＤＭ４（本明細書で下に開示される）。
【０２８２】
他の薬物部分と同様に、メイタンシノイド薬物部分の全ての立体異性体が、本発明の化合物ついて意図される（すなわち、Ｄの不斉炭素でＲおよびＳ高次構造の任意の組み合わせ）。一実施形態では、メイタンシノイド薬物部分（Ｄ）は、以下の立体化学を有する：
【０２８３】
【化６】
2010518115.tif 000019
メイタンシノイド薬物部分の例示的な実施形態としては以下が挙げられる：ＤＭ１、（ＣＲ２）ｍ＝ＣＨ２ＣＨ２；ＤＭ３、（ＣＲ２）ｍ＝ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）；およびＤＭ４、（ＣＲ２）ｍ＝ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２（以下の構造を有する）：
【０２８４】
【化７】
2010518115.tif 000020
標的される抗体の治療指数を改善させる試みにおいて、メイタンシンおよびメイタンシノイドは、腫瘍細胞の抗原に特異的に結合する抗体に対してコンジュゲートされている。メイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲートおよびそれらの治療的用途は、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号、同第５，４１６，０６４号および欧州特許第０４２５２３５号Ｂ１（これらの開示は参考としてここに明確に援用される）に開示されている。Ｌｉｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：８６１８−８６２３（１９９６）は、ヒト直腸結腸癌に対するモノクローナル抗体Ｃ２４２に連結された、ＤＭ１と命名されたメイタンシノイドを含む免疫コンジュゲートを記述した。このコンジュゲートは、培養された大腸癌細胞に対して細胞傷害性が高いことがわかっており、インビボ腫瘍増殖アッセイで抗腫瘍活性を示した。Ｃｈａｒｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７−１３１（１９９２）は、ヒト大腸癌細胞株上の抗原に結合するマウス抗体Ａ７、またはＨＥＲ−２／ｎｅｕ癌遺伝子に結合する別のマウスモノクローナル抗体ＴＡ．１に対して、メイタンシノイドがジスルフィドリンカーを介してコンジュゲートされている免疫コンジュゲートを記載している。１細胞あたり３×１０５個のＨＥＲ−２表面抗原を発現するヒト乳癌細胞株ＳＫ−ＢＲ−３に対してＴＡ．１−メイタンシノイドコンジュゲートの細胞傷害性をインビトロで試験した。この薬物コンジュゲートは、遊離のメイタンシノイド薬物に類似する細胞傷害性の程度を達成し、この細胞傷害性の程度は、１抗体分子あたりのメイタンシノイド分子の数を増やすことによって増大できると思われる。Ａ７−メイタンシノイドコンジュゲートは、マウスにおいて低い全身細胞傷害性を示した。
【０２８５】
抗体またはメイタンシノイド分子のいずれの生物学的活性を有意に低下させることなく抗体をメイタンシノイド分子に化学連結させることによって、抗体−メイタンシノイドコンジュゲートを調製する。１抗体分子あたりにコンジュゲートされた平均３〜４個のメイタンシノイド分子は、抗体の機能または溶解度に負の影響を与えることなく標的細胞の細胞傷害性（細胞傷害性を増強する効能を示しているが、１抗体あたり１分子の毒素でさえ、裸の抗体を使用するよりも細胞傷害性を増強することが期待されるであろう。メイタンシノイドは、当該分野で周知であり、公知の技術によって合成されてもよいし、または自然の材料から単離されてもよい。適切なメイタンシノイドは、例えば米国特許第５，２０８，０２０号または上記の他の特許および非特許文献に開示されている。好ましいメイタンシノイドは、メイタンシノール（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｌ）、およびメイタンシノール分子の芳香環または他の位置で改変されたメイタンシノールアナログ、例えば、種々のメイタンシノールエステルである。
【０２８６】
抗体−メイタンシノイドのコンジュゲートを産生するために当該分野で公知の多くの連結基、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号または欧州特許０４２５２３５Ｂ１号およびＣｈａｒｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７−１３１（１９９２）に開示された連結基が存在する。連結基としては、上で特定した特許に開示されたジスルフィド基、チオエーテル基、酸に不安定な基、感光性の基、ペプチダーゼに対して不安定な基またはエステラーゼに対して不安定な基が挙げられ、ジスルフィド基およびチオエーテル基が好ましい。
【０２８７】
抗体とメイタンシノイドとのコンジュゲートは、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミデートＨＣｌ）、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トリエン２，６−ジイソシアネート）、およびビス活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）などの種々の二官能性タンパク質カップリング剤を用いて作製され得る。特に好ましいカップリング剤としては、ジスルフィド結合を提供する、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）（Ｃａｒｌｓｓｏｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１７３：７２３−７３７［１９７８］）およびＮ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）が挙げられる。
【０２８８】
このリンカーは、結合の型に依存して、多様な位置でメイタンシノイド分子に結合させてよい。例えば、エステル結合は、従来のカップリング技術を用いてヒドロキシル基と反応させることで形成してもよい。この反応は、ヒドロキシル基を有するＣ−３位、ヒドロキシメチルで改変されたＣ−１４位、ヒドロキシル基で改変されたＣ−１５位およびヒドロキシル基を有するＣ−２０位で生じ得る。好ましい実施形態において、この結合は、メイタンシノイドまたはメイタンシノイドアナログのＣ−３位に形成される。
【０２８９】
２．アウリスタチン類およびドラスタチン類
いくつかの実施形態では、免疫コンジュゲートは、ドラスタチンまたはドロスタチンペプチド性アナログまたは誘導体、例えば、アウリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）（米国特許第５６３５４８３号；同第５７８０５８８号）にコンジュゲートされた本発明の抗体を含む。ドラスタチンおよびアウリスタチンは、微小管動態、ＧＴＰ加水分解、および核と細胞との分割を妨げて（Ｗｏｙｋｅら（２００１）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４５（１２）：３５８０−３５８４）、抗癌活性（米国特許第５６６３１４９号）および抗真菌性活性（Ｐｅｔｔｉｔら（１９９８）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４２：２９６１−２９６５）を有することが示されている。ドラスタチンまたはアウリスタチンの薬物部分は、ペプチド性薬物部分のＮ（アミノ）末端またはＣ（カルボキシル）末端を通じて抗体に結合され得る（国際公開第０２／０８８１７２号）。
【０２９０】
例示的なアウリスタチンの実施形態は、２００４年３月２８日に提示された、ＳｅｎｔｅｒらのＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，第４５巻、抄録番号６２３（その開示が全体として参照によって明示的に援用される）に開示された、Ｎ末端に連結されたモノメチルアウリスタチン薬物部分ＤＥおよびＤＦを含む。
【０２９１】
ペプチド性薬物部分は、下の式ＤＥおよびＤＦから選択され得る：
【０２９２】
【化８】
2010518115.tif 000021
ここで、ＤＥおよびＤＦの波線は、抗体または抗体リンカー成分に対する共有結合部位を示しており、かつ各々の位置で独立して：
Ｒ２はＨおよびＣ１−Ｃ８アルキルから選択され；
Ｒ３はＨ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ３−Ｃ８炭素環、アリール、Ｃ１−Ｃ８アルキル−アリール、Ｃ１−Ｃ８アルキル−（Ｃ３−Ｃ８炭素環）、Ｃ３−Ｃ８複素環およびＣ１−Ｃ８アルキル−（Ｃ３−Ｃ８複素環）から選択され；
Ｒ４はＨ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ３−Ｃ８炭素環、アリール、Ｃ１−Ｃ８アルキル−アリール、Ｃ１−Ｃ８アルキル−（Ｃ３−Ｃ８炭素環），Ｃ３−Ｃ８複素環およびＣ１−Ｃ８アルキル−（Ｃ３−Ｃ８複素環）から選択され；
Ｒ５はＨおよびメチルから選択されるか；
あるいはＲ４およびＲ５は結合して、炭素環を形成して、式−（ＣＲａＲｂ）ｎ−を有し、ここでＲａおよびＲｂは独立してＨ、Ｃ１−Ｃ８アルキルおよびＣ３−Ｃ８炭素環から選択され、かつｎは２、３、４、５および６から選択され；
Ｒ６はＨおよびＣ１−Ｃ８アルキルから選択され；
Ｒ７はＨ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ３−Ｃ８炭素環、アリール、Ｃ１−Ｃ８アルキル−アリール、Ｃ１−Ｃ８アルキル−（Ｃ３−Ｃ８炭素環）、Ｃ３−Ｃ８複素環およびＣ１−Ｃ８アルキル−（Ｃ３−Ｃ８複素環）から選択され；
各々のＲ８は独立してＨ、ＯＨ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ３−Ｃ８炭素環およびＯ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）から選択され；
Ｒ９はＨおよびＣ１−Ｃ８アルキルから選択され；
Ｒ１０はアリールまたはＣ３−Ｃ８複素環から選択され；
ＺはＯ、Ｓ、ＮＨ、またはＮＲ１２であって、Ｒ１２はＣ１−Ｃ８アルキルであり；
Ｒ１１はＨ、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、アリール、Ｃ３−Ｃ８複素環、−（Ｒ１３Ｏ）ｍ−Ｒ１４、または−（Ｒ１３Ｏ）ｍ−ＣＨ（Ｒ１５）２から選択され；
ｍは１〜１０００の範囲の整数である；
Ｒ１３はＣ２−Ｃ８アルキルである；
Ｒ１４はＨまたはＣ１−Ｃ８アルキルである；
Ｒ１５の各々の出現は独立して、Ｈ、ＣＯＯＨ、-（ＣＨ２）ｎ−Ｎ（Ｒ１６）２、-（ＣＨ２）ｎ−ＳＯ３Ｈ、または−（ＣＨ２）ｎ−ＳＯ３−Ｃ１−Ｃ８アルキルである；
Ｒ１６の各々の出現は独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、または-（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨである；
Ｒ１８は−Ｃ（Ｒ８）２−Ｃ（Ｒ８）２-アリール、-Ｃ（Ｒ８）２-Ｃ（Ｒ８）２-（Ｃ３−Ｃ８複素環）、および−Ｃ（Ｒ８）２−Ｃ（Ｒ８）２−（Ｃ３−Ｃ８炭素環）から選択され；そして
ｎは０〜６におよぶ整数である。
【０２９３】
一実施形態では、Ｒ３、Ｒ４およびＲ７は独立して、イソプロピルまたはｓｅｃ−ブチルであって、Ｒ５は−Ｈまたはメチルである。例示的な実施形態では、Ｒ３およびＲ４は各々イソプロピルであり、Ｒ５は−Ｈであり、かつＲ７はｓｅｃ−ブチルである。
【０２９４】
さらに別の実施形態では、Ｒ２およびＲ６は各々メチルであり、かつＲ９は−Ｈである。
【０２９５】
さらに別の実施形態では、Ｒ８の各々の出現は−ＯＣＨ３である。
【０２９６】
例示的な実施形態では、Ｒ３およびＲ４は各々、イソプロピルであり、Ｒ２およびＲ６は各々、メチルであり、Ｒ５は−Ｈであり、Ｒ７はｓｅｃ−ブチルであり、Ｒ８の各々の出現は−ＯＣＨ３であり、かつＲ９は−Ｈである。
【０２９７】
一実施形態では、Ｚは−Ｏ−または−ＮＨ−である。
【０２９８】
一実施形態では、Ｒ１０はアリールである。
【０２９９】
例示的な実施形態では、Ｒ１０は−フェニルである。
【０３００】
例示的な実施形態では、Ｚは−Ｏ−であり、Ｒ１１は−Ｈ、メチルまたはｔ−ブチルである。
【０３０１】
一実施形態では、Ｚが−ＮＨであるとき、Ｒ１１は−ＣＨ（Ｒ１５）２であり、式中のＲ１５は−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ（Ｒ１６）２であり、かつＲ１６は、−Ｃ１−Ｃ８アルキルまたは−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨである。
【０３０２】
別の実施形態では、Ｚが−ＮＨであるとき、Ｒ１１は、−ＣＨ（Ｒ１５）２であり、式中のＲ１５は、−（ＣＨ２）ｎ−ＳＯ３Ｈである。
【０３０３】
式ＤＥの例示的なアウリスタチン実施形態は、ＭＭＡＥであり、ここで波線は、抗体−薬物のコンジュゲートのリンカー（Ｌ）に対する共有結合を示している：
【０３０４】
【化９】
2010518115.tif 000022
式ＤＦの例示的なアウリスタチン実施形態はＭＭＡＦであり、ここでこの波線は抗体−薬物のコンジュゲートのリンカー（Ｌ）に対する共有結合を示している（米国特許出願公開第２００５／０２３８６４９号およびＤｏｒｏｎｉｎａら、（２００６）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１７：１１４−１２４を参照のこと）：
【０３０５】
【化１０】
2010518115.tif 000023
他の薬物部分としては以下のＭＭＡＦ誘導体が挙げられ、ここでこの波線は、抗体−薬物のコンジュゲートのリンカー（Ｌ）に対する共有結合を示している：
【０３０６】
【化１１】
2010518115.tif 000024
【０３０７】
【化１２】
2010518115.tif 000025
【０３０８】
【化１３】
2010518115.tif 000026
一局面では、上記のような、限定はしないが、トリエチレングリコールエステル（ＴＥＧ）を含む親水性の基は、Ｒ１１で薬物部分に結合され得る。いかなる特定の理論にも束縛されないが、この親水性基は、この薬物部分の内部移行および非凝集を補助する。
【０３０９】
アウリスタチン／ドラスタチンまたはその誘導体を含む式ＩのＡＤＣの例示的な実施形態は、米国特許出願公開第２００５−０２３８６４９号Ａ１およびＤｏｒｏｎｉｎａら、（２００６）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１７：１１４−１２４（参照によって本明細書に明確に援用される）に記載されている。ＭＭＡＥまたはＭＭＡＦおよび種々のリンカー成分を含む式ＩのＡＤＣの例示的な実施形態は、以下の構造および略語を有する（ここで「Ａｂ」は抗体であり；ｐは、１〜約８であり，「Ｖａｌ−Ｃｉｔ」はバリン−シトルリンのジペプチドであり；かつ「Ｓ」はイオウ原子である：
【０３１０】
【化１４】
2010518115.tif 000027
【０３１１】
【化１５】
2010518115.tif 000028
ＭＭＡＦおよび種々のリンカー成分を含む式ＩのＡＤＣの例示的な実施形態としてはさらに、Ａｂ−ＭＣ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦおよびＡｂ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦが挙げられる。興味深いことに、タンパク質分解切断できないリンカーによって抗体に結合されたＭＭＡＦを含む免疫コンジュゲートは、タンパク質分解切断可能なリンカーによって抗体に結合されたＭＭＡＦを含む免疫コンジュゲートに匹敵する活性を保有することが示されている。Ｄｏｒｏｎｉｎａら、（２００６）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１７：１１４−１２４を参照のこと。このような場合、薬物の放出は、細胞中の抗体分解によって影響されると考えられる。同上。
【０３１２】
代表的には、ペプチド−ベースの薬物部分は、２つ以上のアミノ酸および／またはペプチドフラグメントの間でペプチド結合を形成することによって調製され得る。このようなペプチド結合は、例えば、液相合成方法によって調製され得る（Ｅ．ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＫ．Ｌｕｅｂｋｅ，「Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、第１巻，７６〜１３６頁，１９６５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと）（これはペプチド化学の分野で周知である）。アウリスタチン／ドラスタチン薬物部分は、以下の方法に従って調製され得る：米国特許出願公開第２００５−０２３８６４９号Ａ１；米国特許第５６３５４８３号；米国特許第５７８０５８８号；Ｐｅｔｔｉｔら、（１９８９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：５４６３−５４６５；Ｐｅｔｔｉｔら、（１９９８）Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  １３：２４３−２７７；Ｐｅｔｔｉｔ，Ｇ．Ｒ．，ら、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９９６，７１９−７２５；Ｐｅｔｔｉｔら、（１９９６）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．１  ５：８５９−８６３；およびＤｏｒｏｎｉｎａ（２００３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１（７）：７７８−７８４。
【０３１３】
詳細には、式ＤＦのアウリスタチン／ドラスタチンの薬物部分、例えば、ＭＭＡＦおよびその誘導体は、米国特許出願公開第２００５−０２３８６４９号Ａ１およびＤｏｒｏｎｉｎａら、（２００６）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１７：１１４−１２４に記載の方法を用いて調製され得る。式ＤＥのアウリスタチン／ドラスタチンの薬物部分、例えば、ＭＭＡＥおよびその誘導体は、Ｄｏｒｏｎｉｎａら、（２００３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１：７７８−７８４に記載の方法を用いて調製され得る。薬物−リンカー部分であるＭＣ−ＭＭＡＦ、ＭＣ−ＭＭＡＥ、ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦ、およびＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥは、例えば、Ｄｏｒｏｎｉｎａら、（２００３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１：７７８−７８４、および米国特許出願公開２００５０２３８６４９号Ａ１に記載のような、慣用的な方法によって都合良く合成され、次いで目的の抗体にコンジュゲートされてもよい。
【０３１４】
３．カリケアマイシン
目的の別の免疫コンジュゲートは、１つ以上のカリケアマイシン分子とコンジュゲートした抗体を含む。抗生物質のカリケアマイシンファミリーは、ピコモル未満の濃度で二重鎖ＤＮＡ破壊を生じることができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第５７１２３７４号、同５７１４５８６号、同５７３９１１６号、同５７６７２８５号、同５７７０７０１号、同５７７０７１０号、同５７７３００１号、同５８７７２９６号（全て、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｙａｎａｍｉｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を参照のこと。使用可能なカリケアマイシンの構造的アナログとしては、限定するものではないが、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ−アセチル−γ１Ｉ、ＰＳＡＧおよびθＩ１（Ｈｉｎｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ５３：３３３６−３３４２（１９９３）、Ｌｏｄｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ５８：２９２５−２９２８（１９９８）および上述したＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｙａｎａｍｉｄの米国特許）が挙げられる。抗体が結合可能な別の抗癌剤は、葉酸代謝拮抗薬であるＱＦＡである。カリケアマイシンおよびＱＦＡは両方とも、細胞内の作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。従って、抗体媒介性の内部移行を通じたこれらの薬剤の細胞への取込により、その細胞傷害性効果が大きく向上する。
【０３１５】
４．他の細胞傷害性剤
本発明の抗体と結合可能な他の抗腫瘍剤としては、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン、ビンクリスチンおよび５−フルオロウラシル、米国特許第５０５３３９４号、同第５７７０７１０号に記載されており、総称的にＬＬ−Ｅ３３２８８複合体として公知の薬剤のファミリー、並びにエスペラマイシン（ｅｓｐｅｒａｍｉｃｉｎｅ）（米国特許第５８７７２９６号）が挙げられる。
【０３１６】
使用可能な酵素活性毒およびそのフラグメントとしては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖（シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、アルファ−サルシン（ｓａｒｃｉｎ）、アレウライツ・フォルディイ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）のタンパク質、ジアンシン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、フィトラッカ・アメリカーナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）のタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカ・キャランティア（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）インヒビター、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン、サパオナリア（ｓａｐａｏｎａｒｉａ）オフィシナリス・インヒビター、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、マイトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコセセンス（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅｓ）が挙げられる。例えば、１９９３年１０月２８日公開の国際公開第９３／２１２３２号を参照のこと。
【０３１７】
本発明は、抗体と核酸分解活性を有する化合物（例えばリボヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮアーゼ）との間に形成される免疫コンジュゲートをさらに考慮する。
【０３１８】
腫瘍を選択的に破壊するため、抗体は高い放射性を有する原子を含んでもよい。放射性コンジュゲートした抗体の生成のために、種々の放射性同位体が利用される。例としては、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２およびＬｕの放射性同位体が挙げられる。
【０３１９】
放射性標識または他の標識は、公知の方法でコンジュゲート中に組み込まれてもよい。例えば、ペプチドが生合成されてもよいし、または、例えば、水素の代わりにフッ素−１９を含む適切なアミノ酸前駆体を用いて化学的なアミノ酸合成によって合成されてもよい。標識、例えばＴｃ９９ｍまたはＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８およびＩｎ１１１は、ペプチドのシステイン残基を介して結合されてもよい。イットリウム−９０はリジン残基を介して結合され得る。ＩＯＤＯＧＥＮ法（Ｆｒａｋｅｒら（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．８０：４９−５７）は、ヨウ素−１２３の組み込みに用いられ得る。「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ」（Ｃｈａｔａｌ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９）に他の方法が詳細に記載されている。
【０３２０】
本発明の抗Ｒｏｂｏ４抗体は、ナノ粒子の薬剤とコンジュゲートされてもよく、これが次に細胞傷害性部分に対してコンジュゲートされ得る。適切なナノ粒子剤としては限定はしないが、音響活性リポスフェア（ａｃｏｕｓｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｌｉｐｏｓｐｈｅｒｅｓ）（ＡＡＬｓ）とも呼ばれる（Ｔａｒｔｉｓら、Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．３２（１１）：１７７１−８０（２００６）を参照のこと）、マイクロバブル（ｍｉｃｒｏｂｕｂｂｌｅｓ）（Ｅｌｌｅｇａｌａら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０８：３３６−３４１（２００３）を参照のこと）、超常磁性剤、リポソーム、ペルフルオロカーボンナノ粒子エマルジョン（国際公開第２００５０１４０５１号）、およびデンドリマー（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１２４：３８７−４００（２００６）およびそこに引用される引用文献（その全ての引用文献がその全体が参照によって本明細書に援用される）を参照のこと）が挙げられる。
【０３２１】
抗体と細胞傷害性剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステル類の二官能性誘導体（例えばジメチルアジピミダートＨＣｌ）、活性エステル類（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド類（例えば、グルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物類（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体類（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン−２，６−ジイソシアネート）、および二活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を用いて作製してもよい。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１０９８（１９８７）に記載されているようにして調製してもよい。炭素−１４標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレン−トリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）が抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である。国際公開第９４／１１０２６号を参照のこと。リンカーは細胞中の細胞傷害性剤の放出を容易にするための「切断可能リンカー」であってよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカーが用いられてもよい（Ｃｈａｒｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７−１３１（１９９２）；米国特許第５２０８０２０号）。
【０３２２】
本発明の化合物は、限定するものではないが、架橋剤：市販されている（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ．，Ｕ．Ｓ．Ａより）ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、およびスルホ−ＳＭＰＢ、およびＳＶＳＢ（スクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）安息香酸塩）にて調製したＡＤＣが特に考えられる。２００３−２００４  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ａｎｄ  Ｃａｔａｌｏｇの４６７−４９８頁を参照のこと。
【０３２３】
５．薬物の充填（ローディング）
薬物充填（率）は、ｐによって提示され、式Ｉ、Ｉａ、Ｉａ’またはＩＩの分子における、１抗体あたりの薬物部分の平均数である。薬物充填率は、１抗体あたり１〜２０個の薬物部分（Ｄ）の範囲であってもよい。式ＩのＡＤＣｓは、１〜２０個の薬物部分の範囲でコンジュゲートされた抗体のコレクションを包含する。コンジュゲーション反応からのＡＤＣの調製における１抗体あたりの薬物部分の平均数は、質量分析、ＥＬＩＳＡアッセイ、およびＨＰＬＣなどの従来の集団によって特徴づけられ得る。ｐに関するＡＤＣの定量的分布も、決定され得る。ある場合には、均質なＡＤＣの分離、精製および特徴づけ（ここではｐは他の薬物充填を有するＡＤＣからの特定の値である）は、逆相ＨＰＬＣまたは電気泳動などの方法によって得てもよい。
【０３２４】
いくつかの抗体−薬物コンジュゲートについては、ｐは、抗体上の結合部位の数によって限定され得る。例えば、結合がシステインチオールの場合、上記の例示的実施形態と同様に、抗体は、唯一のまたは数個のシステインチオール基を有してもよいし、または唯一のまたは数個の十分に反応性のチオール基（それを通じてリンカーが結合され得る）を有してもよい。特定の実施形態では、薬物充填率が高いほど（例えば、ｐ＞５）、特定の抗体−薬物結合体の凝集、不溶性、毒性、または細胞透過性の喪失を引き起こし得る。特定の実施形態では、本発明のＡＤＣの薬物充填率は、１〜約８；約２〜約６；約３〜約５；約３〜約４；約３．１〜約３．９；約３．２〜約３．８；約３．２〜約３．７；約３．２〜約３．６；約３．３〜約３．８；または約３．３〜約３．７におよぶ。実際に、特定のＡＤＣについては、１抗体あたりの薬物部分の最適の比は、８未満であってもよく、約２〜約５であってもよいことが示されている。米国特許出願公開第２００５−０２３８６４９号Ａ１（本明細書においてその全体が参照によって援用される）を参照のこと。
【０３２５】
特定の実施形態では、理論的最大値未満の薬物部分が、コンジュゲーション反応の間に、抗体にコンジュゲートされる。抗体は、例えば、下で考察されるような、薬物−リンカー中間体またはリンカー試薬と反応しないリジン残基を含み得る。一般に、抗体は、薬物部分に連結され得る多くの遊離および反応性システインチオール基を含まない；実際に、抗体中の大部分のシステインチオール残基は、ジスルフィド結合として存在する。特定の実施形態では、抗体は、部分的または完全な還元条件下で、還元剤、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）またはトリカルボニルエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）で還元されて、反応性システインチオール基を生成し得る。特定の実施形態では、抗体は、反応性の求核性基、例えば、リジンまたはシステインを露出するために、変性条件に供される。
【０３２６】
ＡＤＣの充填率（薬物／抗体比）は、例えば、以下による異なる様式において制御され得る：（ｉ）抗体に対してモル過剰の薬物−リンカー中間体またはリンカー試薬を制限すること、（ｉｉ）コンジュゲーション反応の時間または温度を制限すること、（ｉｉｉ）システインチオール改変のための部分的または限定的な還元条件、（ｉｖ）システイン残基の数および位置がリンカー−薬物結合の数および／または位置の制御のために改変されるような抗体のアミノ酸配列の組み換え技術による操作（例えば、本明細書におよびＷＯ２００６／０３４４８８（その全体が参照によって本明細書に援用される）に開示されるように調製されたチオＭａｂまたはチオＦａｂ）。本発明の実施形態では、本発明の抗体のアミノ酸残基は、システイン残基で置換されている。ある実施形態では、この抗体の重鎖Ｆｃ領域の１１８位置のアミノ酸は、システインであるか、またはシステイン残基で置換される（ここで１１８とは、ＥＵナンバリングに従ってナンバリングした抗体のＦｃ領域におけるアミノ酸位置をいう、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍ．Ｓｅｒｖ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ（１９９１）を参照のこと）。ある実施形態では、重鎖Ｆｃ領域の１１８位置（ＥＵナンバリング）のシステイン残基は、本明細書に開示される薬物部分または検出可能標識などの、薬物部分または検出可能標識に共有結合される。図６Ａでは、太字で示しておりかつ下線を付した重鎖Ｆｃ領域のアラニンは、システインが置換されてチオＭＡｂが生成される位置である。
【０３２７】
２つ以上の求核基が薬物−リンカー中間物、またはリンカー試薬、続いて薬物部分試薬と反応する場合は、その結果として生じた生成物は、抗体へ結合した１つ以上の薬物部分の分布を有するＡＤＣ化合物の混合物であるということが理解されるべきである。１つの抗体あたりの薬物の平均数は、抗体に特異的であって、かつ薬物に特異的である二重ＥＬＩＳＡ抗体アッセイによってこの混合物から計算され得る。個々のＡＤＣ分子は、質量分析計によって混合物中で特定されて、ＨＰＬＣ、例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィーによって分離されてもよい（例えば、Ｈａｍｂｌｅｔｔ，Ｋ．Ｊ．，ら、「Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｄｒｕｇ  ｌｏａｄｉｎｇ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ、ａｎｄ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＣＤ３０  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ」、Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｏ．６２４，ＡｍｅｒｉｃＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｍａｒｃｈ  ２７−３１，２００４，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＡＣＲ，Ｖｏｌｕｍｅ  ４５，Ｍａｒｃｈ  ２００４；Ａｌｌｅｙ，Ｓ．Ｃ．，ら、「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ｔｈｅ  ｌｏｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｒｕｇ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」、Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｏ．６２７，Ａｍｅｒｉｃ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｍａｒｃｈ  ２７−３１，２００４，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＡＣＲ，Ｖｏｌｕｍｅ  ４５，Ｍａｒｃｈ  ２００４を参照のこと）。特定の実施形態では、単一の充填値を有する均質なＡＤＣを、電気泳動またはクロマトグラフィーによってコンジュゲーション混合物から単離してもよい。
【０３２８】
Ｄ．抗体−薬物コンジュゲートの代謝物
本発明の範囲内には、本明細書に記載したＡＤＣ化合物のインビボ代謝産物もまた、そのような代謝産物が先行技術に照らして新規かつ非自明である範囲で包含される。そのような代謝産物は、例えば、投与された化合物の酸化、還元、加水分解、アミド化、エステル化、酵素的開裂などの結果として生じ得る。したがって、本発明は、その代謝産物を産生するために十分な期間にわたって本発明の化合物を哺乳動物と接触させる工程を含むプロセスによって生成される、新規かつ非自明の化合物を包含する。
【０３２９】
代謝産物は代表的には、放射性（例えば、１４Ｃまたは３Ｈ）ＡＤＣを調製すること、これを、ラット、マウス、モルモット、サルのような動物に、またはヒトに対して、検出可能な用量（例えば、約０．５ｍｇ／ｋｇより大きい）で、代謝が生じるのに十分な時間（代表的には、約３０秒〜３０時間）、非経口的に投与すること、および尿、血液または他の生物学的サンプルからその変換した産物を単離することによって特定する。これらの産物は、それらが標識されているおかげで、容易に単離される（他は、代謝物中で生存しているエピトープに結合し得る抗体の使用によって単離される）。この代謝物の構造は、例えば、ＭＳ、ＬＣ／ＭＳまたはＮＭＲ分析によって従来の方式で決定される。一般には、代謝物の分析は、当業者に周知の従来の薬物代謝研究と同じ方法で行われる。この変換産物は、それらがインビボで他に見いだされない限り、本発明のＡＤＣ化合物の治療的投与についての診断アッセイで有用である。
【０３３０】
ＶＩ．免疫コンジュゲートを調製する方法
本発明の抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）では、抗体（Ａｂ）を、リンカー（Ｌ）を通じて、１つ以上の薬物部分（Ｄ）、例えば抗体につき約１〜約２０の薬剤部分にコンジュゲートする。式Ｉ、Ｉａ、Ｉａ’、またはＩＩのＡＤＣは、以下を含む、当業者に公知の有機化学反応、状態および試薬を使用するいくつかの経路によって調製され得る：（１）二価のリンカー試薬との抗体の求核基の反応であって共有結合を介してＡｂ−Ｌを形成する反応、続いて薬物部分Ｄとの反応；および（２）二価のリンカー試薬との薬物部分の求核基の反応であって共有結合を介してＤ−Ｌを形成する反応、続いて抗体の求核基との反応。後者の経路を介して式ＩのＡＤＣを調製するための例示的な方法は、参照によって本明細書に明示的に援用される、米国特許出願公開第２００５０２３８６４９号Ａ１に開示される。
【０３３１】
抗体上の求核基としては、限定はしないが、以下が挙げられる：（ｉ）Ｎ末端アミン基、（ｉｉ）側鎖アミン基、例えばリシン、（ｉｉｉ）側鎖チオール基、例えばシステイン、および（ｉｖ）抗体がグリコシル化される糖水酸基またはアミノ基。アミン、チオールおよび水酸基は、求核であり、反応して、リンカー部分上の求電子性の基およびリンカー試薬と共有結合を形成することができこれには以下が挙げられる：（ｉ）活性エステル、例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロギ酸および酸ハロゲン化物；（ｉｉ）アルキルおよびベンジルハライド、例えばハロアセトアミド；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシルおよびマレイミド基。特定の抗体は、還元し得る鎖間ジスルフィド、すなわちシステイン架橋を有する。抗体は、還元剤、例えばＤＴＴ（ジチオトレイトール）またはトリカルボニルエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）による処置によって、リンカー試薬とのコンジュゲーションに反応性にされてもよく、その結果、その抗体は完全にまたは部分的に還元される。これによって、各々のシステイン架橋は、理論的には、２の反応性のチオール求核基を形成する。チオールにアミンを転換させる２−イミノチオラン（トラウトの試薬）とリジン残基とを例えば反応させることによって、リジン残基の修飾を通じて抗体に付加的な求核基を導入してもよい。反応性のチオール基は、１、２、３、４またはそれ以上のシステイン残基を導入する（例えば、１つ以上の非天然のシステインアミノ酸残基を含んでなる変異体抗体を調製する）ことによって抗体に導入されてもよい。
【０３３２】
本発明の抗体薬物コンジュゲートはまた、抗体上の求電子性の基、例えば、アルデヒドまたはケトンカルボニル基と、リンカー試薬または薬物上の求核基との反応によって生成してもよい。リンカー試薬上の有用な求電子性の基としては限定はしないが、ヒドラジド、オキシム、アミノ、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、およびアリールヒドラジドが挙げられる。一実施形態では、リンカー試薬または薬物上の求核置換基と反応し得る求電子性の部分を導入するように、抗体を修飾する。別の実施形態では、グリコシル化された抗体の糖類を、例えば過ヨウ素酸塩酸化試薬を用いて酸化して、リンカー試薬または薬剤部分のアミン基と反応し得るアルデヒドまたはケトン基を形成させてもよい。生じたイミンシッフ塩基の基が安定な結合を形成してもよいし、または例えば安定アミンな結合を形成させるためにホウ化水素試薬によって還元されてもよい。一実施形態では、ガラクトースオキシダーゼまたはナトリウムメタ過ヨウ素酸塩のいずれかによるグリコシル化抗体の炭水化物部分の反応により、薬物（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）上の適切な基と反応することができる抗体中のカルボニル（アルデヒドおよびケトン）基が生じ得る。別の実施形態では、Ｎ末端セリンまたはトレオニン残基を含んでいる抗体はナトリウムメタ過ヨウ素酸塩と反応して、第一のアミノ酸の代わりにアルデヒドを生成し得る（Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ  ＆  Ｓｔｒｏｈ，（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．３：１３８−１４６；米国特許第５３６２８５２号）。このようなアルデヒドは、薬剤部分またはリンカー求核基と反応することができる。
【０３３３】
薬物部分上の求核基としては限定はしないが以下が挙げられる：アミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、およびアリールヒドラジド基（リンカー部分およびリンカー試薬上の求電子性基との共有結合を形成するように反応し得る）が挙げられ、これには以下が挙げられる：（ｉ）活性エステル、例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロギ酸および酸ハロゲン化物；（ｉｉ）アルキルおよびベンジルハライド、例えばハロアセトアミド；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシルおよびマレイミド基。
【０３３４】
本発明の化合物は、限定はしないが、以下の架橋試薬で調製されるＡＤＣを明らかに意図する：ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣおよびスルホ−ＳＭＰＢ、およびＳＶＳＢ（スクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）（これらは、市販されている（例えばＰｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡより；２００３−２００４のＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ａｎｄ  Ｃａｔａｌｏｇのｐ４６７−４９８を参照のこと））。
【０３３５】
抗体と細胞傷害性剤を含む免疫コンジュゲートはまた、種々の２官能性のタンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの２官能性誘導体（例えばジメチルアジピミデートＨＣｌ）、活性エステル（例えばジスクシンイミジルズベレート）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビスジアゾニウム誘導体（例えばビス（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトルエン２，６−ジイソシアネート）およびビス活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を用いて作成してもよい。例えば、リシン免疫毒素はＶｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８：１０９８（１９８７）に記載のとおり調製できる。炭素−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミノペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体への放射性核種のコンジュゲーションのための例示的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照のこと。
【０３３６】
あるいは、抗体および細胞傷害性剤を含む融合タンパク質は、例えば、組み換え技術またはペプチド合成によって作製され得る。組み換えＤＮＡ分子は、お互いと隣接しているか、またはこのコンジュゲートの所望の特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域によって隔てられているかのいずれかの、このコンジュゲートの抗体および細胞傷害性部分をコードする領域を含んでもよい。
【０３３７】
本発明の化合物は、親抗体の１つ以上のアミノ酸が、遊離のシステインアミノ酸と置き換えられている、システイン操作抗体を含む。システイン操作抗体は、チオール反応性値が０．６〜１．０の範囲である１つ以上の遊離のシステインアミノ酸を含む。遊離のシステインアミノ酸とは親抗体中に操作されているシステイン残基であって、ジスルフィド架橋の一部ではない。
【０３３８】
一局面では、システイン操作抗体は、以下を含むプロセスによって調製される：
（ａ）親抗体の１つ以上のアミノ酸残基をシステインによって置換する工程と；
（ｂ）システイン操作抗体とチオール反応性試薬とを反応させることによってシステイン操作抗体のチオール反応性を決定する工程と。
このシステイン操作抗体は、親抗体よりもチオール反応性試薬と反応性であってもよい。
【０３３９】
遊離のシステインアミノ酸残基は、重鎖または軽鎖中に位置してもよいし、または定常ドメインもしくは可変ドメイン中に位置してもよい。抗体フラグメント、例えば、Ｆａｂをまた、この抗体フラグメントのアミノ酸を置き換える１つ以上のシステインアミノ酸で操作して、システイン操作抗体フラグメントを形成してもよい。
【０３４０】
本発明の別の局面では、システイン操作抗体を調製（作製）する方法が提供され、この方法は以下の工程を包含する：
（ａ）システイン操作抗体を生成するために親抗体に１つ以上のシステインアミノ酸を導入する工程と；
（ｂ）システイン操作抗体とチオール反応性試薬とのチオール反応性を決定する工程と；
ここでこのシステイン操作抗体は、親抗体よりもチオール反応性試薬と反応性である。
【０３４１】
システイン操作抗体を調製する方法の工程（ａ）は以下を含んでもよい：
（ｉ）システイン操作抗体をコードする核酸配列を変異誘発する工程と；
（ｉｉ）システイン操作抗体を発現する工程と；
（ｉｉｉ）システイン操作抗体を単離して精製する工程と。
【０３４２】
システイン操作抗体を調製する方法の工程（ｂ）は、ファージまたはファージミド粒子から選択されるウイルス粒子上でシステイン操作抗体を発現する工程を包含し得る。
【０３４３】
システイン操作抗体を調製する方法の工程（ｂ）はまた以下を含んでもよい：
（ｉ）システイン操作抗体と、チオール反応性親和性試薬とを反応させて、親和性標識された、システイン操作抗体を生成する工程と；
（ｉｉ）この親和性標識された、システイン操作抗体の、捕獲媒体に対する結合を測定する工程と。
【０３４４】
本発明の別の局面は、チオール反応性について、高度に反応性の不対のシステインアミノ酸を用いてシステイン操作抗体をスクリーニングする方法であり、以下の工程を包含する：
（ａ）システイン操作抗体を生成するために親抗体に１つ以上のシステインアミノ酸を導入する工程と；
（ｂ）システイン操作抗体とチオール反応性親和性試薬とを反応させて、親和性標識されたシステイン操作抗体を生成する工程と；
（ｃ）この親和性標識された、システイン操作抗体の捕獲媒体に対する結合を測定する工程と；
（ｄ）システイン操作抗体とチオール反応性親和性試薬とのチオール反応性を決定する工程と。
【０３４５】
システイン操作抗体をスクリーニングする方法の工程（ａ）は以下を包含してもよい：
（ｉ）システイン操作抗体をコードする核酸配列を変異誘発させる工程と；
（ｉｉ）システイン操作抗体を発現する工程と；
（ｉｉｉ）システイン操作抗体を単離および精製する工程と。
【０３４６】
システイン操作抗体をスクリーニングする方法の工程（ｂ）は、ファージまたはファージミド粒子から選択されるウイルス粒子上でシステイン操作抗体を発現する工程を包含し得る。
【０３４７】
システイン操作抗体をスクリーニングする方法の工程（ｂ）はまた以下を含んでもよい：
（ｉ）システイン操作抗体と、チオール反応性親和性試薬とを反応させて、親和性標識された、システイン操作抗体を生成する工程と；
（ｉｉ）この親和性標識された、システイン操作抗体の、捕獲媒体に対する結合を測定する工程と。
【０３４８】
システイン操作抗体は、ガンの処置に有用であり得、そして細胞表面および膜貫通レセプター、ならびに腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的な抗体を含む。このような抗体は、裸の抗体として（薬物または標識部分に対してコンジュゲートされていない）、または式Ｉ、Ｉａ、Ｉａ’もしくはＩＩの抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）として用いられ得る。
【０３４９】
システイン操作抗体を調製およびスクリーニングするための方法の実施形態としては、親抗体がｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８などの抗体フラグメントである実施形態が挙げられる。親抗体はまた、アルブミン結合ペプチド配列（ＡＢＰ）を含む融合タンパク質であってもよい。
【０３５０】
本発明のシステイン操作抗体は、チオール反応性試薬と部位特異的にかつ効率的にカップリングされ得る。このチオール反応性試薬は、多機能性のリンカー試薬、捕獲標識試薬、発蛍光団試薬、または薬物リンカー中間体であってもよい。
システイン操作抗体は、検出可能な標識で標識されても、固相支持体上に固定されても、および／または薬物部分とコンジュゲートされてもよい。
【０３５１】
本発明の別の局面は、システイン操作抗体（Ａｂ）および薬物部分（Ｄ）を含む抗体−薬物コンジュゲート化合物であって、ここでこのシステイン操作抗体は、リンカー部分（Ｌ）によって１つ以上の遊離のアミノ酸を通じてＤに対して結合されている；式Ｉａを有する化合物：
Ａｂ（ＬＤ）ｐ    Ｉａ
ここでｐは１、２、３または４であって；ここでシステイン操作抗体は、１つ以上の遊離のシステインアミノ酸によって親抗体の１つ以上のアミノ酸残基を置換する工程を包含するプロセスによって調製される。薬物部分としては限定はしないが、メイタンシノイド、アウリスタチン、ドラスタチン、トリコテセン、ＣＣ１０６５、カリケアマイシン、および他のエンジイン抗生物質、タキサン、アントラサイクリン、ならびにその立体異性体、アイソスター、アナログまたは誘導体が挙げられる。例示的な薬物部分としてはＤＭ１、ＭＭＡＥ、およびＭＭＡＦが挙げられる。例示的な抗体−薬物コンジュゲートは、米国特許出願公開第２００７００９２９４０号Ａ１に示される。
【０３５２】
式Ｉａの抗体−薬物コンジュゲートはさらに、以下のアルミニウム結合ペプチド（ＡＢＰ）配列を含んでもよい：この組成物は式Ｉａ’を有する：
ＡＢＰＡｂ（ＬＤ）ｐ                  Ｉａ’
ＡＢＰ配列との融合タンパク質を含む本発明の抗体は以下：（ｉ）Ｄｅｎｎｉｓら、（２００２）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７７：３５０３５−３５０４３の表ＩＩＩおよびＩＶ，３５０３８頁；（ｉｉ）米国特許出願公開第２００４０００１８２７号の［００７６］配列番号９−２２；ならびに（ｉｉｉ）国際公開第０１／４５７４６号の１２〜１３頁，配列番号ｚ１〜ｚ１４、によって教示されており、その全てが参照によって本明細書に援用される。
【０３５３】
ＶＩＩ．システイン操作抗体（チオＭａｂ類およびチオＦａｂ類）
本発明の化合物は、野生型抗体もしくは親抗体の１つ以上のアミノ酸が、システインアミノ酸と置き換えられている、システイン操作抗体を含む。抗体の任意の形態は、このように操作され得る（すなわち、変異され得る）。例えば、親Ｆａｂ抗体フラグメントは、システイン操作Ｆａｂを形成するように操作され得、本明細書中で「チオＦａｂ（ＴｈｉｏＭａｂ）」と呼ばれる。同様に、親モノクローナル抗体は、「チオＭａｂ」を形成するように操作され得る。一部位の変異は、チオＦａｂにおいて単一の操作システイン残基を生じ、一方、一部位の変異は、チオＭａｂにおいてはＩｇＧ抗体の二量体の性質に起因して２つの操作システイン残基を生じることに注意すべきである。置き換えられた（「操作された」）システイン（Ｃｙｓ）残基を有する変異体は、新規に導入された操作チオール基の反応性について評価される。チオール反応性値は、０から１．０の範囲の相対的な数値の項であり、任意のシステイン操作抗体について測定され得る。本発明のシステイン操作抗体のチオール反応性値は、０．６〜１．０；０．７〜１．０；もしくは０．８〜１．０の範囲内である。
【０３５４】
本発明の設計方法、選択方法および調製方法によって、求電子性官能基と反応性であるシステイン操作抗体が可能になる。これらの方法によって、さらに、指定された、設計された、選択的部位に薬物分子を有する抗体コンジュゲート化合物、例えば、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）化合物が可能になる。抗体表面上の反応性システイン残基は、チオール反応性基、例えば、マレイミドもしくはハロアセチルを通じた薬物部分の特異的なコンジュゲーションを可能にする。Ｃｙｓ残基のチオール官能基のマレイミド基に対する求核反応性は、タンパク質中の任意の他のアミノ酸官能基、例えば、リジン残基のアミノ基もしくはＮ末端アミノ基と比較して約１０００倍高い。ヨードアセチル試薬およびマレイミド試薬におけるチオール特異的官能基は、アミン基と反応し得るが、より高いｐＨ（＞９．０）およびより長い反応時間が必要とされる（Ｇａｒｍａｎ，１９９７，Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）。
【０３５５】
本発明のシステイン操作抗体は好ましくは、その野性型、親抗体対応物の抗原結合能力を保持している。従って、システイン操作抗体は、抗原に対して、好ましくは特異的に結合し得る。このような抗原としては、例えば、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、細胞表面レセプタータンパク質、および他の細胞表面分子、膜貫通タンパク質、シグナル伝達タンパク質、細胞生存調節因子、細胞増殖調節因子、組織の発達または分化に関連する（例えば、機能的に寄与することが公知であるかまたは疑われる）分子、リンホカイン、サイトカイン、細胞周期調節に関与する分子、脈管形成に関与する分子、および血管形成に関与する（例えば、機能的に寄与することが公知であるかまたは疑われる）分子が挙げられる。腫瘍関連抗原は、クラスター分化因子（例えば、ＣＤタンパク質）であってもよい。システイン操作抗体が結合し得る抗原は、上述の１つのカテゴリーのうちの多数のサブセットであり得、このカテゴリーのうちの他のサブセット（単数または複数）は、別個の特徴（目的の抗原に関して）を有する他の分子／抗原を含む。
【０３５６】
親抗体はまた、ヒトもしくはヒト化抗Ｒｏｂｏ４抗体、または本明細書に開示されるＨＶＲ配列のうち任意の１、２、３、４、５または６つを有するＦａｂであってもよい。本発明のシステイン操作抗体は、部位特異的にかつ効率的にチオール反応性試薬とカップリングされ得る。このチオール反応性試薬は、多官能性リンカー試薬、捕獲、すなわち親和性、標識試薬（例えば、ビオチン−リンカー試薬）、検出標識（例えば、発蛍光団（フルオロフォア）試薬）、固相固定化試薬（例えば、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）、ポリスチレン、もしくはガラス）、または薬物−リンカー中間体であってもよい。チオール反応性試薬の１つの例は、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）である。例示的な実施形態において、チオＦａｂとビオチン−リンカー試薬との反応によって、ビオチン化チオＦａｂが得られ、これにより、操作されたシステイン残基の存在および反応性が検出されかつ測定され得る。チオＦａｂと多官能性リンカー試薬との反応性によって、官能化されたリンカーがチオＦａｂに提供され、このリンカーが、薬物部分試薬または他の標識とさらに反応させられ得る。チオＦａｂと薬物リンカー中間体との反応によって、チオＦａｂ薬物コンジュゲートが提供される。
【０３５７】
このようなアプローチは、他のチオール反応性剤のコンジュゲーションに適用されてもよく、ここで、この反応性基は、例えばマレイミド、ヨードアセトアミド、ピリジルジスルフィドもしくは他のチオール反応性結合体パートナーである（Ｈａｕｇｌａｎｄ，２００３，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｒｉｎｋｌｅｙ，１９９２，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．３：２；Ｇａｒｍａｎ，１９９７，Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ；Ｍｅａｎｓ（１９９０）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１：２；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９６）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ｐｐ．４０−５５，６４３−６７１）。このパートナーは、細胞傷害性剤（例えば、ドキソルビシンもしくは百日咳毒素などの毒素）、フルオロセインもしくはローダミンなどの蛍光色素のような発蛍光団、画像化のためのキレート剤もしくは放射線治療用の金属、ペプチド性もしくは非ペプチド性の標識もしくは検出タグ、またはポリエチレングリコールの種々の異性体のようなクリアランス改変剤、第３成分に結合するペプチド、または別の炭水化物もしくは親油性薬剤であってもよい。
【０３５８】
例示的な抗体フラグメント上で特定された部位は主に、全ての種の抗体にわたって十分に保存されている抗体の定常ドメインにある。これらの部位は、他の抗体に対し、構造的設計もしくは特異的抗体構造の知識をさらに必要とせずに、かつ抗体の可変ドメインに固有の抗原結合特性を妨害することなしに、広範に適用可能であるべきである。
【０３５９】
ＰＨＥＳＥＬＥＣＴＯＲアッセイ（Ｐｈａｇｅ  ＥＬＩＳＡ  ｆｏｒ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｔｈｉｏｌｓ、国際公開２００６／０３４４８８（その全体が参照によって本明細書に援用される）に開示される）によって、抗体中の反応性システイン基の検出がＥＬＩＳＡファージ形式で可能になる。ウェル表面上で目的のタンパク質（例えば、抗体）をコーティングし、続いてファージ粒子とともにインキュベートし、次いでＨＲＰで標識された二次抗体の吸光度を検出するプロセスは、国際公開第２００６／０３４４８８号において詳述される。ファージ上に提示される変異体タンパク質は、迅速、堅調かつ高速処理の方式でスクリーニングされ得る。システイン操作抗体のライブラリーを作製して同じアプローチを用いて結合選択に供し、抗体または他のタンパク質のランダムなタンパク質−ファージライブラリーから遊離のＣｙｓ取り込みの適切に反応性の部位を特定してもよい。この技術は、ファージ上に提示されたシステイン変異タンパク質を、親和性試薬またはレポーター基（チオール反応性でもある）と反応させる工程を包含する。
【０３６０】
ガンの処置において有用であり得るシステイン操作抗体としては、限定はしないが、細胞表面レセプターに対する抗体および腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する抗体が挙げられる。このような抗体は、裸の抗体（薬物もしくは標的部分にコンジュゲートされていない抗体）として用いられてもよく、または式Ｉ、Ｉａ、Ｉａ’もしくはＩＩの抗体−薬物結合体（ＡＤＣ）として用いられてもよい。腫瘍関連抗原は、当該分野で公知であり、そして当該分野で周知の方法および情報を用いた抗体の産生における使用のために調製され得る。癌診断および癌治療のための有効な細胞性標的を発見する試みにおいて、研究者らは、１種以上の特定の型（単数または複数）のガン細胞の表面上で、１種以上の正常な非癌性細胞（単数または複数）と比較して特異的に発現されるか、または血管形成細胞（例えば、血管内皮細胞）の表面上で、ガンに関連しない非内皮細胞に比較して特異的に発現される、膜貫通ポリペプチドもしくは他の腫瘍関連ポリペプチドを同定しようと努めている。多くの場合、このような腫瘍関連ポリペプチドは、癌細胞または血管形成細胞の表面上で、非癌性細胞または非血管形成細胞の表面上と比較して、より豊富に発現される。このような腫瘍関連細胞表面抗原ポリペプチドの同定は、抗体ベースの治療を介した破壊のために癌細胞または血管形成細胞を特異的に標的する能力をもたらしている。
【０３６１】
さらに別の実施形態では、抗体は、腫瘍の事前標的化における利用のために「レセプター」（例えば、ストレプトアビジン）に対してコンジュゲートされてもよく、ここでこの抗体−レセプターコンジュゲートは、患者に投与され、続いて除去剤を用いる循環からの未結合のコンジュゲートの除去、次いで細胞傷害性剤（例えば、放射性核種）にコンジュゲートされている「リガンド」（例えば、アビジン）の投与がされる。
【０３６２】
ＶＩＩＩ．抗Ｒｏｂｏ４抗体を用いる処置の方法
本発明の抗Ｒｏｂｏ４抗体（裸の抗Ｒｏｂｏ４抗体およびＡＤＣを含む）が、腫瘍または血管形成関連抗原、例えばＲｏｂｏ４の過剰発現によって例えば特徴付けられる、種々の疾患または障害を処置するために用いられ得ることが考えられる。過剰増殖性障害の例示的な状態としては、異常または所望されない内皮細胞増殖、例えば、異常または望ましくない血管細胞増殖の障害に関連する生理学的状態が挙げられ、これには限定はしないが、ガン、血管形成、ならびに固形腫瘍および転移と関連している（例えば、障害を経験している組織内の内皮細胞増殖によって増強される）障害、アテローム性動脈硬化症、水晶体後部線維増殖症、血管腫、慢性炎症、眼内新生血管疾患、例えば、増殖性網膜症、例えば、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、血管新生緑内障、移植角膜組織および他の組織の免疫拒絶、関節リウマチ、および乾癬が挙げられる。
【０３６３】
動物モデルおよび細胞ベースのアッセイで特定される抗Ｒｏｂｏ４抗体およびＡＤＣ化合物はさらに、腫瘍を保有する高等な霊長類およびヒトの臨床試験で試験され得る。ヒトの臨床試験が、細胞増殖性障害を経験している患者における本発明の抗Ｒｏｂｏ４モノクローナル抗体または免疫コンジュゲートの有効性を試験するために設計されてもよく、この細胞増殖性障害としては、限定はしないが、異常または所望されない内皮細胞増殖、例えば、異常または望ましくない血管細胞増殖の障害に関連する生理学的状態が挙げられ、これには限定はしないが、ガン、固形腫瘍および転移と関連している（例えば、障害を経験している組織内の内皮細胞増殖によって増強される）血管形成および障害、アテローム性動脈硬化症、水晶体後部線維増殖症、血管腫、慢性炎症、眼内新生血管疾患、例えば、増殖性網膜症、例えば、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、血管新生緑内障、移植角膜組織および他の組織の免疫拒絶、関節リウマチ、および乾癬が挙げられる。臨床試験は、公知の治療レジメン、例えば、放射線療法および／または化学療法（公知の化学療法剤および／または細胞傷害性剤を含む）と組み合わせて抗Ｒｏｂｏ４抗体の有効性を評価するために設計され得る。
【０３６４】
ガンは、Ｒｏｂｏ４発現細胞を含んでもよく、その結果、本発明の抗Ｒｏｂｏ４抗体は、ガン組織内のＲｏｂｏ４発現内皮細胞に結合し得る。ガンにおけるＲｏｂｏ４発現を決定するために、種々の診断／予後予測アッセイが利用可能である。一実施形態では、Ｒｏｂｏ４過剰発現は、ＩＨＣによって分析され得る。腫瘍生検由来のパラフィン包埋組織切片をＩＨＣアッセイに供して、染色の程度およびどの割合の腫瘍細胞が試験されるかに関するＲｏｂｏ４タンパク質染色強度基準と一致し得る。一実施形態では、Ｒｏｂｏ４過剰発現は、インビボでＲｏｂｏ４発現細胞と接触された検出マーカーで標識された抗Ｒｏｂｏ４抗体のインビボまたはインビトロの検出によって分析され得る。検出マーカーとしては限定はしないが、放射性同位体、蛍光化合物、金属および／または磁気ナノ粒子、マイクロバブル、キレート剤、および本明細書に開示される他の検出マーカーが挙げられる。
【０３６５】
疾患の予防または処置のために適切な投薬量の抗Ｒｏｂｏ４抗体は、上で規定されるように、処置されるべき疾患のタイプ、疾患の重篤度および経過、その分子が予防目的で投与されるか、または治療目的で投与されるか、事前の治療、患者の臨床の病歴、および抗体に対する応答、ならびに担当医の裁量に依存する。その分子は１回または一連の処置にわたって患者に適切に投与される。疾患のタイプおよび重篤度に依存して、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ）の分子が、患者への投与のための最初の候補投薬量である（例えば、１回以上の別々の投与によっても、または連続インフュージョンによっても）。代表的な１日投薬量は、上述の要因に依存して、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上にわたってもよい。患者に投与されるべきＡＤＣの例示的な投薬量は、患者の体重あたり約０．１〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。
【０３６６】
数日以上にわたる反復投与については、条件次第で、疾患症状の所望の抑制が生じるまで処置が維持される。例示的な投薬レジメンは、抗Ｒｏｂｏ４抗体の約４ｍｇ／ｋｇの初回ローディング用量を投与すること、続いて約２ｍｇ／ｋｇという毎週の維持用量を包含する。他の投薬レジメンが有用であり得る。さらに別の実施形態では、その投薬量範囲は２７５〜３７５ｍｇ／ｍ２である。この治療の進行は従来の技術およびアッセイによって容易にモニターされる。
【０３６７】
Ａ．抗Ｒｏｂｏ４抗体の投与
本発明の抗Ｒｏｂｏ４抗体（および補助の治療剤）は、処置されるべき状態に適切な任意の経路（非経口、皮下、腹腔内、肺内および鼻腔内、ならびに局所処置について所望される場合は、病変内投与を含む）によって投与され得る。抗Ｒｏｂｏ４抗体は、代表的には、非経口的、すなわち、インフュージョン（注入）、皮下、筋肉内、静脈内、皮内、クモ膜下腔内、硬膜外、動脈内および腹腔内に投与される。さらにこの抗体は、パルスインフュージョンによって、特に漸減用量の抗体が適切に投与される。投薬は、任意の適切な経路によって、例えば、投与が短時間であるかまたは長期であるかに部分的には依存して、静脈内注射または皮下注射などの注射によってもよい。
【０３６８】
ガンまたは血管形成が生じる任意の疾患を処置するためには、抗Ｒｏｂｏ４抗体または抗体−薬物コンジュゲートは、静脈内インフュージョンを介して投与される。インフュージョンを介して投与される投薬量は、１用量あたり約１μｇ／ｍ２〜１０，０００μｇ／ｍ２の範囲で、一般には、全部で１、２、３または４用量について１週あたり１用量である。あるいは、この投薬量範囲は、約１μｇ／ｍ２〜１０００μｇ／ｍ２、約１μｇ／ｍ２〜８００μｇ／ｍ２、約１μｇ／ｍ２〜６００μｇ／ｍ２、約１μｇ／ｍ２〜４００μｇ／ｍ２、約１０μｇ／ｍ２〜５００μｇ／ｍ２、約１０μｇ／ｍ２〜３００μｇ／ｍ２、約１０μｇ／ｍ２〜２００μｇ／ｍ２、または約１μｇ／ｍ２〜２００μｇ／ｍ２である。この用量は、この疾患の症状を救済または緩和するために、１日１回、１週に１回、１週に複数回、ただし１日に１回未満、１月に複数回だが１日に１回未満、１月に複数回だが１週に１回未満、１月に１回または断続的に投与されてもよい。投与は、処置されている疾患または障害の症状が軽減、緩和または排除される（例えば、腫瘍の収縮、リンパ腫の症状の排除の減少、白血病、原発性腫瘍の収縮なしの転移性の伝播の阻害（すなわち、無増悪生存）、眼の新血管新生の阻害によって示される場合）まで、任意の開示された間隔で継続されてもよい。投与は、症状の寛解または救済が達成されたあとまで継続されてもよく、この場合このような寛解または救済は、このような継続投与によって延長される。
【０３６９】
本発明はまた、血管内皮細胞の増殖によって特徴付けられるガン、および／またはガンの転移、および／または眼の障害を処置する方法を提供し、この方法は、このような障害に罹患している患者に対して、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗Ｒｏｂｏ４抗体の治療上有効な量を投与することを包含し、この抗体は、細胞傷害性分子にも検出可能分子にもコンジュゲートされていない。この抗体は代表的には、約１μｇ／ｍ２〜１０００μｇ／ｍ２の投薬量範囲で投与される。あるいは、この投薬量範囲は約１μｇ／ｍ２〜約８００μｇ／ｍ２、約１μｇ／ｍ２〜６００μｇ／ｍ２、約１μｇ／ｍ２〜４００μｇ／ｍ２、約１０μｇ／ｍ２〜５００μｇ／ｍ２、約１０μｇ／ｍ２〜３００μｇ／ｍ２、約１０μｇ／ｍ２〜２００μｇ／ｍ２、または約１μｇ／ｍ２〜２００μｇ／ｍ２である。
【０３７０】
本発明はまた、脈管内皮細胞の増殖によって特徴付けられるガン、および／またはガンの転移、および／または眼の障害を処置する方法を提供し、この方法は、このような障害に罹患している患者に対して、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗Ｒｏｂｏ４抗体の治療上有効な量を投与することを包含し、この抗体は、細胞傷害性分子にも検出可能分子にもコンジュゲートされていない。この抗体は代表的には、約１μｇ／ｍ２〜１０００ｍｇ／ｍ２の投薬量範囲で投与される。あるいは、この投薬量範囲は約１μｇ／ｍ２〜約８００μｇ／ｍ２、約１μｇ／ｍ２〜６００μｇ／ｍ２、約１μｇ／ｍ２〜４００μｇ／ｍ２、約１０μｇ／ｍ２〜５００μｇ／ｍ２、および約１０μｇ／ｍ２〜３００μｇ／ｍ２、および約１０μｇ／ｍ２〜２００μｇ／ｍ２、または約１μｇ／ｍ２〜２００μｇ／ｍ２である。
【０３７１】
Ｂ．薬学的処方物
一局面では、本発明はさらに、本発明の少なくとも１つの抗Ｒｏｂｏ４抗体、および／またはその少なくとも１つの免疫コンジュゲート、および／または本発明の少なくとも１つの抗Ｒｏｂｏ４抗体−薬物コンジュゲートを含む薬学的処方物を提供する。いくつかの実施形態では、薬学的処方物は、１）抗Ｒｏｂｏ４抗体および／または抗Ｒｏｂｏ４抗体−薬物コンジュゲート、および／またはその免疫コンジュゲート、ならびに薬学的に受容可能な担体を含む。ある実施形態では、薬学的処方物は、１）抗Ｒｏｂｏ４抗体および／またはその免疫コンジュゲート、ならびに少なくとも１つの追加の治療剤を含む。
【０３７２】
本発明の抗体もしくは免疫コンジュゲート、または本発明の抗体−薬物コンジュゲートを含む薬学的処方物は、所望の程度の純度を有する抗体または抗体−薬物コンジュゲートと、任意の生理学的に受容可能な担体、賦形剤または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０））とを、水溶液または凍結乾燥処方物または他の乾燥処方物の形態で、混合することによって、貯蔵のために調製される。受容可能な担体、賦形剤または安定剤は、使用される投薬量および濃度でレシピエントに対して非毒性であって、これには、緩衝液、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、ヒスチジン、および他の有機酸；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸およびメチオニン；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム）；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジン；マンノサッカライド、ジサッカライド、およびグルコース、マンノースまたはデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖類、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；および／または非イオン性サーファクタント、例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。インビトロの投与に用いられるべき薬学的処方物は一般には無菌である。これは滅菌濾過メンブレンを通した濾過によって容易に得られる。
【０３７３】
活性成分はまた、調製されるマイクロカプセルに、例えば、コアセルベーション技術によって、または界面重合によって、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル、コロイド薬物送達系に（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）、またはマクロエマルジョンに、取り込まれてもよい。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０）に開示される。
【０３７４】
インビボ投与のために用いられる処方物は、無菌でなければならない。これは、滅菌濾過メンブレンを通じた濾過によって容易に達成される。
【０３７５】
徐放性調製物が調製されてもよい。徐放性調製物の適切な例としては、本発明の抗体または免疫コンジュゲートを含む固体の疎水性ポリマーの半透過性マトリックスであって、成形物の形態、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルであるマトリックスが挙げられる。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸およびγエチル−Ｌ−グルタミン酸塩のコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えば、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成される注射用微粒子）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。ポリマー、例えば、エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸は１００日を超える分子の放出を可能にするが、特定のヒドロゲルがタンパク質を放出するのはそれより短期間である。カプセル化された抗体または免疫コンジュゲートが長期間体内で保持されるとき、それらは、３７℃で水分に曝された結果として変性するかまたは凝集し得、そして生物学的な活性の損失および免疫原性における潜在的な変化が生じる。合理的なストラテジーによって、関与する機構次第で安定化を工夫することができる。例えば、凝集機構が、チオ−ジスルフィド交換を通じて分子間Ｓ−Ｓ結合形成されることが発見される場合、安定化は、スルフヒドリル残基を改変すること、酸性溶液を凍結乾燥すること、水分を制御すること、適切な添加物を用いること、および特定のポリマーマトリックス成分を開発することによって達成され得る。
【０３７６】
本明細書の処方物はまた、処置されている特定の指標について必須である場合２つ以上の活性化合物を含んでもよく、好ましくはそれらはお互いに対して有害に影響しない補完的な活性を有する。このような分子は適切には、意図する目的に有効である量で組み合わされて存在する。
【０３７７】
Ｃ．併用療法
本発明の抗Ｒｏｂｏ４抗体は、薬学的併用処方物または併用療法としての投薬レジメンにおいて、抗癌特性を有する少なくとも１つの追加の化合物と併用することができる。薬学的併用処方物または投薬レジメンの少なくとも１つの追加の化合物は好ましくは、お互いに有害に影響しないように抗Ｒｏｂｏ４抗体組成物生物に対して補完的な活性を有する。
【０３７８】
この少なくとも１つの追加の化合物は、化学療法薬、細胞傷害性剤、サイトカイン、増殖阻害剤、抗ホルモン薬、およびそれらの組み合わせであってもよい。このような分子は、意図する目的に有効な量で組み合わされて適切に存在する。本発明の抗Ｒｏｂｏ４抗体を含有する薬学的組成物はまた、治療有効量の化学療法剤、例えば、チューブリン形成インヒビター、トポイソメラーゼインヒビターまたはＤＮＡ結合剤も含んでもよい。
【０３７９】
一局面では、第一の化合物は本発明の抗Ｒｏｂｏ４  ＡＤＣであって、少なくとも１つの追加の化合物は、抗Ｒｏｂｏ４以外の治療抗体（裸の抗体またはＡＤＣ）である。一実施形態では、この少なくとも１つの追加の化合物は、ガン細胞の表面マーカーに結合する抗体である。一実施形態では、少なくとも１つの追加の化合物は、抗ＨＥＲ２抗体、トラツズマブ（例えば、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標），Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）である。一実施形態ではこの少なくとも１つの追加の化合物は、抗ＨＥＲ２抗体、ペルツズマブ（Ｏｍｎｉｔａｒｇ（商標），Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ，米国特許第６９４９２４５号を参照）である。一実施形態では、この少なくとも１つの追加の化合物は、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標），Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）である。ある実施形態では、この少なくとも１つの追加の化合物は、抗体（裸の抗体またはＡＤＣのいずれか）である、そしてこの追加の抗体は、第二、第三、第四、第五、第六以上の抗体であって、その結果このような第二、第三、第四、第五、第六以上の抗体（裸のまたはＡＤＣとしてのいずれか）の組み合わせは、Ｒｏｂｏ４を発現する組織での細胞増殖性疾患を処置するのに有効である。
【０３８０】
他の治療レジメンを、本発明に従って特定される抗癌剤の投与と併用してもよく、この抗癌剤投与としては限定はしないが、放射線療法、ならびに／または骨髄移植および末梢血移植、ならびに／または細胞傷害性剤、化学療法剤、または増殖阻害剤が挙げられる。このような実施形態の１つでは、化学療法剤は、ある薬剤または薬剤の併用、例えば、シクロホスファミド、ヒドロキシダウノルビシン、アドリアマイシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（商標）、プレドニゾロン、ＣＨＯＰ、ＣＶＰもしくはＣＯＰ、または免疫療法剤、例えば、抗ＰＳＣＡ、抗ＨＥＲ２（例えば、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）、ＯＭＮＩＴＡＲＧ（商標）または抗ＶＥＧＦ（例えば、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））などである。この併用療法は、同時または連続のレジメンとして投与されてもよい。連続投与される場合、併用は、２回以上の施与で施してもよい。併用投与としては、別の処方物または単一の薬学的処方物を使用する共同投与、およびいずれかの順序での連続投与（この場合、好ましくは、両方の（またはすべての）活性薬剤がそれらの生物活性を同時に発揮する期間がある）を包含する。
【０３８１】
１つの実施形態において、抗Ｒｏｂｏ４抗体での処置は、本明細書において特定される抗癌剤と１つ以上の化学療法剤または成長阻害剤との併用投与（異なる化学療法剤のカクテルの共同投与を含む）を含む。化学療法剤としては、タキサン（例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル）および／またはアントラサイクリン抗生物質が挙げられる。そうした化学療法剤の調製および投与スケジュールは、製造業社の説示に従って、または技能のある医師が経験的に決定したとおり、用いることができる。そうした化学療法薬の調製および投与スケジュールは、「Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅ」（１９９２）編集，Ｍ．Ｃ．Ｐｅｒｒｙ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．にも記載されている。
【０３８２】
上の同時投与される任意の薬剤についての適切な投薬量は現在使用されているものでああって、新規に特定された薬剤および他の化学療法薬または処置の併用作用（相乗作用）に起因して減少されてもよい。
【０３８３】
併用療法は、「相乗作用」をもたらし、かつ「相乗的」と証明され得、すなわち、それらの活性成分を一緒に使用したときに達成される作用は、その化合物を別々に用いて生じる作用の合計より大きい。相乗作用は、活性成分が、（１）共に配合され、併用、単位剤形処方物で同時に投与もしくは送達される場合；（２）別の処方物として交互にもしくは並行して送達される場合；または（３）何らかの他のレジメンによる場合、達成され得る。交互療法で送達される場合、その化合物が連続的に、例えば、別の注射器での別の注射により、投与または送達されるとき、相乗作用が達成され得る。一般に、交互療法の間、それぞれの活性成分の有効投薬量は、連続的に、すなわち順次投与され、これに対して併用療法では、２つ以上の活性成分の有効投薬量が一緒に投与される。
【０３８４】
疾患の予防または処置のために、本発明の抗体の適切な投薬量（単独で、または化学療法剤などの他の薬剤と組み合わせて用いる場合）は、処置されるべき疾患のタイプ、抗体のタイプ、疾患の重篤度および経過、その抗体が予防目的で投与されるか、または治療目的で投与されるか、事前の治療、患者の臨床の病歴、およびその抗体に対する応答、ならびに担当医の裁量に依存する。その抗体は１回または一連の処置にわたって患者に適切に投与される。疾患のタイプおよび重篤度に依存して、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ）の抗体が、患者への投与のための最初の候補投薬量である（例えば、１回以上の別々の投与によっても、または連続インフュージョンによっても）。代表的な１日投薬量は、上述の要因に依存して、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上にわたってもよい。数日間またはそれ以上にわたる反復投与については、状態次第で、その処置は、疾患症状の所望の抑制が生じるまで維持される。抗体の１つの例示的な投薬量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。従って、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇという１つ以上の用量（またはその任意の組み合わせ）が患者に投与され得る。このような用量は、間欠的に、例えば、毎週または３週ごとに投与されてもよい（例えば、その患者が、約２〜約２０、例えば、約６用量の抗体を投与されるように）。最初のより高い負荷の用量、続いて１回以上のより低い用量が投与されてもよい。例示的な投薬レジメンは、その抗体の約４ｍｇ／ｋｇの初回ローディング用量を投与すること、続いて約２ｍｇ／ｋｇという毎週の維持用量を包含する。しかし、他の投薬レジメンが有用であり得る。この治療の進行は従来の技術およびアッセイによって容易にモニターされる。
【０３８５】
ＩＸ．標識された抗体およびその使用
本発明はまた、標識された抗Ｒｏｂｏ４抗体を提供する。標識された抗体は、診断アッセイにおいて、例えば、インビトロ、エキソビボ、またはインビボのアッセイにおいて、特異的な細胞または組織でのＲｏｂｏ４の発現を検出するために（例えば、血管形成、新血管新生および／または腫瘍脈管構造を画像化するために）有用であり得る。ある実施形態では、この標識された抗体は、インビボの画像化アッセイで用いられる。本発明の抗Ｒｏｂｏ４抗体は、抗体に対して共有結合し得る任意の標識部分とコンジュゲートされ得る。ある実施形態では、本発明の抗Ｒｏｂｏ４抗体（例えば、システイン操作抗Ｒｏｂｏ４抗体を含む）は、反応性のリジンまたはシステイン残基などの、抗体上の反応性基を通じて抗体に共有結合される。反応性のシステインチオール基を通じた共有結合は、Ｓｉｎｇｈら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０４：１４７−１５（２００２）；Ｈａｒｌｏｗ  Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．（１９９９）Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ｌｕｎｄｂｌａｄ  Ｒ．Ｌ．（１９９１）Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，第２版，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ）に開示されている。
【０３８６】
結合した標識は、以下を果たすように機能し得る：（ｉ）検出可能なシグナルを提供する；（ｉｉ）第２の標識と相互作用して、第１の標識または第２の標識によって提供される検出可能なシグナルを改変して、例えば、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）を与える；（ｉｉｉ）抗原またはリガンドとの相互作用を安定化するかまたは結合の親和性を増加させる；（ｉｖ）電荷、疎水性、形状または他の物理的パラメータによる移動度、例えば、電気泳動易動度または細胞浸透性に影響する；あるいは（ｖ）捕獲部分を提供して、リガンド親和性、抗体／抗原結合またはイオン性錯体形成を改変する。
【０３８７】
診断適用に関しては、この抗体は、代表的には、検出可能な部分によって標識される。一般に以下のカテゴリーに分類され得る多数の標識が利用可能である：
（ａ）ある実施形態では、抗Ｒｏｂｏ４抗体は、放射性同位体（放射性核種）例えば、３Ｈ、１１Ｃ、１４Ｃ、１８Ｆ、１９Ｆ、３２Ｐ、３５Ｓ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ、８６Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１３３Ｘｅ、１７７Ｌｕ、２１１Ａｔまたは２１３Ｂｉで標識される。放射性同位体で標識された抗Ｒｏｂｏ４抗体は、Ｒｏｂｏ４を発現する細胞のレセプターを標的とした画像化に有用である（例えば、本発明の診断の使用、例えば、腫瘍内皮細胞、腫瘍の脈管構造、血管形成および新血管新生のインビボの画像化における使用のため）
（ｂ）ある実施形態では、抗Ｒｏｂｏ４抗体は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１巻および２巻、Ｃｏｌｉｇｅｎら編，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、Ｐｕｂｓ．（１９９１）に記載されている技術を用いて、結合するか、キレート化するか、またはさもなければ放射性同位体金属を錯体化するリガンド試薬（ここで、この試薬は、抗体の操作されたシステインチオールと反応性である）によって標識される。金属イオンを錯体化し得るキレート化リガンドとしては、ＤＯＴＡ、ＤＯＴＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＴＰＡおよびＴＥＴＡ（Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）が挙げられる。ＤＯＴＡ−マレイミド（４−マレイミドブチルアミドベンジル−ＤＯＴＡ）のようなキレート化リンカー試薬は、Ａｘｗｏｒｔｈｙら（２０００）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９７（４）：１８０２−１８０７の手順に従って、イソプロピルクロロホルメート（Ａｌｄｒｉｃｈ）によって活性化された４−マレイミド酪酸（Ｆｌｕｋａ）とのアミノベンジル−ＤＯＴＡの反応により調製され得る。ＤＯＴＡ−マレイミド試薬は、システイン操作抗体の遊離システインアミノ酸と反応し、そして抗体上に金属錯体形成リガンドを提供する（Ｌｅｗｉｓら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．９：７２−８６（１９９８））。キレート化リンカー標識試薬（例えば、ＤＯＴＡ−ＮＨＳ）（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸モノ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）は、市販されている（Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）。放射性核種は、本発明の抗体−薬物結合体との錯体形成を介して標的化され得る（Ｗｕら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３（９）：１１３７−１１４６（２００５））。放射性核種で標識された抗体を用いたレセプター標的画像化は、腫瘍組織への抗体の進行性の蓄積の検出および定量によって、標的発現の増大のマーカーを提供し得る（Ａｌｂｅｒｔら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８：１２０７−１２１０（１９９８））。コンジュゲートされた放射性金属は、リソソーム分解後、細胞内に維持され得る。
【０３８８】
画像化実験のための抗体標識として適切な金属−キレート錯体は、以下に開示される：米国特許第５３４２６０６号；米国特許第５４２８１５５号；米国特許第５３１６７５７号；米国特許第５４８０９９０号；米国特許第５４６２７２５号；米国特許第５４２８１３９号；米国特許第５３８５８９３号；米国特許第５７３９２９４号；米国特許第５７５０６６０号；米国特許第５８３４４５６号；Ｈｎａｔｏｗｉｃｈら（１９８３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６５：１４７−１５７；Ｍｅａｒｅｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４２：６８−７８（１９８４）；Ｍｉｒｚａｄｅｈら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１：５９−６５（１９９０）；Ｍｅａｒｅｓら、Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ１９９０，Ｓｕｐｐｌ．１０：２１−２６（１９９０）；Ｉｚａｒｄら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．３：３４６−３５０（１９９２）；Ｎｉｋｕｌａら、Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２２：３８７−９０（１９９５）；Ｃａｍｅｒａら、Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２０：９５５−６２（１９９３）；Ｋｕｋｉｓら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３９：２１０５−２１１０（１９９８）；Ｖｅｒｅｌら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４４：１６６３−１６７０（２００３）；Ｃａｍｅｒａら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２１：６４０−６４６（１９９４）；Ｒｕｅｇｇら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０：４２２１−４２２６（１９９０）；Ｖｅｒｅｌら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４４：１６６３−１６７０（２００３）；Ｌｅｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：４４７４−４４８２（２００１）；Ｍｉｔｃｈｅｌｌら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４４：１１０５−１１１２（２００３）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１０：１０３−１１１（１９９９）；Ｍｉｅｄｅｒｅｒら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４５：１２９−１３７（２００４）；ＤｅＮａｒｄｏら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４：２４８３−９０（１９９８）；Ｂｌｅｎｄら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ＆  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  １８：３５５−３６３（２００３）；Ｎｉｋｕｌａら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４０：１６６−７６（１９９９）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３９：８２９−３６（１９９８）；Ｍａｒｄｉｒｏｓｓｉａｎら、Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２０：６５−７４（１９９３）；Ｒｏｓｅｌｌｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ＆  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，１４：２０９−２０（１９９９）。
【０３８９】
（ｃ）いくつかの実施形態では、抗Ｒｏｂｏ４抗体は、蛍光標識、例えば、希土類キレート（ユウロピウムキレート）、フルオレセイン型（ＦＩＴＣ、５−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシフルオレセインが挙げられる）；ローダミン型（ＴＡＭＲＡが挙げられる）；ダンシル；リサミン（Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ）；シアニン類；フィコエリトリン類；テキサスレッド；およびそれらのアナログで標識される。蛍光標識は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（前出）において開示される技術を使用して抗体にコンジュゲートされ得る。蛍光色素および蛍光標識試薬としては、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）およびＰｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から市販されているものが挙げられる。
【０３９０】
（ｄ）いくつかの実施形態では、抗Ｒｏｂｏ４抗体は入手可能であるかまたは開示されており（米国特許第４，２７５，１４９号）、種々の酵素−基質標識で標識されている。この酵素は、一般に、さまざまな技術を使用して測定され得る、色素形成性基質の化学変化を触媒する。例えば、この酵素は、基質の色変化を触媒し得、これが分光測光法により測定され得る。あるいは、これらの酵素は、基質の蛍光または化学発光を変更し得る。蛍光の変化を定量する技術は、上記に記載されている。化学発光基質は、化学反応によって電子的に励起されるようになり、その後、（例えば、化学ルミノメーターを用いて）測定され得る光を発し得るか、または蛍光アクセプターにエネルギーを提供する。酵素標識の例としては、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ；米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ））、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカライドオキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼおよびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環式オキシダーゼ（例えば、ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなどが挙げられる。抗体に酵素を結合させる技術は、Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎら（１９８１）「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ」，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍ．（Ｊ．ＬａｎｇｏｎｅおよびＨ．Ｖａｎ  Ｖｕｎａｋｉｓ編），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，７３：１４７−１６６に記載されている。
【０３９１】
酵素−基質の組合せの例としては、例えば、以下が挙げられる：
（ｉ）西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と、基質としての水素ペルオキシダーゼ（ここで、水素ペルオキシダーゼは、色素前駆体（例えば、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）または３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン塩酸塩（ＴＭＢ））を酸化する）；
（ｉｉ）アルカリホスファターゼ（ＡＰ）と、色素形成性基質としてのパラ−ニトロフェニルホスフェート；および
（ｉｉｉ）−Ｄ−ガラクトシダーゼ（−Ｄ−Ｇａｌ）と、色素形成性基質（例えば、ｐ−ニトロフェニル−−Ｄ−ガラクトシダーゼ）または蛍光発生性基質４−メチルウンベリフェリル−−Ｄ−ガラクトシダーゼ。多数の他の酵素−基質の組み合わせが当業者に利用可能である。一般的な概説については、米国特許第４２７５１４９号および米国特許第４３１８９８０号を参照のこと。
【０３９２】
標識は、抗Ｒｏｂｏ４抗体（例えば、システイン操作抗Ｒｏｂｏ４抗体を含む）と間接的にコンジュゲートされてもよい。例えば、抗Ｒｏｂｏ４抗体は、ビオチンとコンジュゲートされてもよく、そして、前述の３つの幅広いカテゴリーの標識のうちのいずれかが、アビジンまたはストレプトアビジンとコンジュゲートされてもよく、またはその逆であってもよい。ビオチンは、ストレプトアビジンと選択的に結合し、従って、この標識は、この間接的な様式で抗Ｒｏｂｏ４抗体とコンジュゲートし得る。あるいは、抗Ｒｏｂｏ４抗体と標識との間接的な複合体化を達成するために、抗Ｒｏｂｏ４抗体は、小さいハプテン（例えば、ジゴキシン）とコンジュゲートされ、そして前述の異なるタイプの標識のうちの１つが抗ハプテンポリペチド改変体（例えば、抗ジゴキシン抗体）とコンジュゲートされる。従って、抗Ｒｏｂｏ４抗体と標識との間接的な複合体化が達成され得る（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．（１９９６）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）。
【０３９３】
本発明の抗Ｒｏｂｏ４抗体は、任意の公知のアッセイ方法、例えば、ＥＬＩＳＡ、競合結合アッセイ、直接的サンドイッチアッセイおよび間接的サンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイで使用され得る（Ｚｏｌａ，（１９８７）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７−１５８，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）。
【０３９４】
本発明の標識された抗Ｒｏｂｏ４抗体は、細胞表面レセプターに結合し得、そして内皮細胞（例えば、腫瘍内皮細胞）、血管形成の部位、新血管新生の部位、および／または腫瘍脈管構造を局所決定し、可視化し、および定量するために有用である。検出可能な標識抗体のための別の用途は、蛍光標識抗体とビーズとをコンジュゲートする工程、およびリガンドの結合の際の蛍光シグナルを検出する工程を包含する、ビーズベースの免疫捕獲の方法である。類似の結合検出方法論は、抗体−抗原相互作用を測定および検出するために、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）効果を利用する。本発明の検出可能に標識された抗Ｒｏｂｏ４抗体は、任意の公知のアッセイ方法、例えば、ＥＬＩＳＡ、競合結合アッセイ、直接的サンドイッチアッセイおよび間接的サンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイで使用され得る（Ｚｏｌａ，（１９８７）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７−１５８，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）。
【０３９５】
検出標識、例えば、蛍光色素および化学発光色素（Ｂｒｉｇｇｓら「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｓｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｄｙｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｔｏ  Ａｍｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ」，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｐｅｒｋｉｎ−Ｔｒａｎｓ．１：１０５１−１０５８（１９９７））は、検出可能なシグナルを提供し、そして一般的に標識抗体に適用可能であり、好ましくは以下の特性を有する：（ｉ）この標識抗体は、低バックグラウンドを有する非常に高いシグナルを生じるはずであり、その結果、少量の抗体が、無細胞アッセイおよび細胞ベースアッセイの両方において高感度で検出され得る；ならびに（ｉｉ）この標識抗体は、光に安定でなければならず、その結果、有意な光退色なしで、蛍光シグナルが観察され得、モニタリングされ得、かつ記録され得る。膜または細胞表面（特に生きた細胞）への標識抗体の細胞表面結合に関する適用については、この標識は、好ましくは、（ｉｉｉ）有効な結合体濃度および検出感度を達成する良好な水溶性を有し、ならびに（ｉｖ）生きた細胞に対して無毒性であり、その結果、細胞の正常な代謝プロセスを破壊せず、早発性の細胞死も引き起こさない。
【０３９６】
細胞蛍光強度の直接定量および蛍光標識事象（例えば、ペプチド−色素結合体の細胞表面結合）の計数は、混合および読み取り（ｍｉｘ−ａｎｄ−ｒｅａｄ）、生きた細胞またはビーズを用いた非放射性アッセイを自動化したシステム（ＦＭＡＴ（登録商標）８１００  ＨＴＳ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）において実施可能である（Ｍｉｒａｇｌｉａ，「Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｃｅｌｌ−  ａｎｄ  ｂｅａｄ−ｂａｓｅｄ  ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｍｉｃｒｏｖｏｌｕｍｅ  ａｓｓａｙ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」，（１９９９）Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ４：１９３−２０４）。標識抗体の使用としてはまた、細胞表面レセプター結合アッセイ、免疫捕捉アッセイ、蛍光連結免疫吸着材アッセイ（ＦＬＩＳＡ）、カスパーゼ切断（Ｚｈｅｎｇ，「Ｃａｓｐａｓｅ−３  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｂｏｔｈ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｅｖｅｎｔｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｆａｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ」，（１９９８）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９５：６１８−２３；米国特許第６，３７２，９０７号）、アポトーシス（Ｖｅｒｍｅｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８４：３９−５１（１９９５））および細胞傷害性アッセイが挙げられる。蛍光定量的マイクロボリュームアッセイ技術は、細胞表面に標的化される分子によるアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを確認するために用いられ得る（Ｓｗａｒｔｚｍａｎ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７１：１４３−５１（１９９９））。
【０３９７】
本発明の標識されたシステイン操作抗体は、以下などの生物医学画像化および分子画像化の種々の方法および技術による画像化のバイオマーカー（生物マーカー）およびプローブとして有用である：（ｉ）ＭＲＩ（磁気共鳴画像化）；（ｉｉ）Ｘ線ＣＴ（Ｘ−ｒａｙ  ｃｏｍｐｕｔｅｄ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）；（ｉｉｉ）ＳＰＥＣＴ（シングルフォトンエミッションコンピューター連動断層撮影法）；（ｉｖ）ＰＥＴ（ポジトロン断層撮影法）（Ｃｈｅｎら（２００４）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１５：４１−４９）；（ｖ）生物発光；（ｖｉ）蛍光；および（ｖｉｉ）超音波。免疫シンチグラフィーは、放射性物質で標識された抗体が動物またはヒトの患者に投与され、そして抗体が局在する身体内部位（例えば、腫瘍脈管構造を含む腫瘍、またはその転位）の画像が撮影される、画像化手順である（米国特許第６５２８６２４号）。画像化生物マーカーは、客観的に測定され得、そして正常な生物学的プロセス、病的なプロセスまたは治療介入への薬理学的応答の指標として評価され得る。バイオマーカーは、いくつかのタイプのものであってもよい：０型は、疾患の天然の歴史的なマーカーであり、公知の臨床指数（例えば、関節リウマチにおける滑膜炎症のＭＲＩ評価）と長期的に相関する；Ｉ型のマーカーは、作用機構に従って介入の効果を捕捉するが、この機構は、臨床の転帰と関連しないかもしれない；ＩＩ型マーカーは、バイオマーカーの変化またはバイオマーカーからのシグナルが臨床利益を予測する代理終点として作用して、標的とされた応答（例えば、平面Ｘ線、ＭＲＩまたはＣＴによって関節リウマチにおいて測定される骨腐食）が「確認」される。画像化バイオマーカーは、このように、以下のような薬力学的（ＰＤ）治療情報を提供し得る：（ｉ）標的タンパク質の発現、（ｉｉ）標的タンパク質への治療剤の結合（すなわち、選択性）、ならびに（ｉｉｉ）クリアランスおよび半減期薬物動態データ。研究室ベースのバイオマーカーと比較したインビボでの画像化バイオマーカーの利点としては、以下が挙げられる：非侵襲的処理、定量可能な全身評価、反復投薬および評価（すなわち、複数の時点）、ならびに前臨床（小動物）から臨床（ヒト）までの結果からの潜在的に移行可能な効果。いくつかの適用に関しては、生体イメージング（画像化）が、前臨床試験における動物実験にとって代わるかまたは動物実験数を最小にする。
【０３９８】
ペプチド標識方法は、周知である。Ｈａｕｇｌａｎｄ，２００３，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｒｉｎｋｌｅｙ，１９９２，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．３：２；Ｇａｒｍａｎ，（１９９７）Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ；Ｍｅａｎｓ（１９９０）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１：２；Ｇｌａｚｅｒら（１９７５）Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｔ．Ｓ．ＷｏｒｋおよびＥ．Ｗｏｒｋ編）Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｌｕｎｄｂｌａｄ，Ｒ．Ｌ．およびＮｏｙｅｓ，Ｃ．Ｍ．（１９８４）Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｖｏｌｓ．ＩおよびＩＩ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ，Ｇ．（１９８５）「Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」，Ｍｏｄｅｒｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｈ．Ｔｓｃｈｅｓｃｈｅ編，Ｗａｌｔｅｒ  ＤｅＧｒｙｔｅｒ，Ｂｅｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；ならびにＷｏｎｇ（１９９１）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．）；Ｄｅ  Ｌｅｏｎ−Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら（２００４）Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．１０：１１４９−１１５５；Ｌｅｗｉｓら（２００１）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１２：３２０−３２４；Ｌｉら（２００２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１３：１１０−１１５；Ｍｉｅｒら（２００５）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１６：２４０−２３７を参照のこと。
【０３９９】
充分な近位にある２つの部分（蛍光リポーターおよびクエンチャー）で標識したペプチドおよびタンパク質は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を受ける。レポーター基は、代表的に、特定の波長の光で励起されて、最大の明るさでの放出のための適切なストークスシフトを伴ってエネルギーをアクセプター基（またはクエンチャー基）へ移動させる蛍光色素である。蛍光色素としては、拡張した芳香族性を有する分子（例えば、フルオレセインおよびローダミン）、ならびにそれらの誘導体が挙げられる。蛍光リポーターは、完全なペプチド中のクエンチャー部分によって、部分的にまたは著しくクエンチされ得る。ペプチダーゼまたはプロテアーゼによってペプチドが切断されると、蛍光の検出可能な増加が測定され得る（Ｋｎｉｇｈｔ，Ｃ．（１９９５）「Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  Ａｓｓａｙｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，２４８：１８−３４）。
【０４００】
本発明の抗Ｒｏｂｏ４標識抗体は、親和性精製剤としても用いられ得る。このプロセスでは、標識された抗体は、当該分野で周知の方法を用いて、固相（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ樹脂または濾紙）に固定される。この固定された抗体は、精製されるべき抗原を含んでいるサンプルと接触され、その後、支持体が、精製されるべき抗原（これは、固定された抗体に結合される）以外のサンプル中の実質的に全ての物質を除去する適切な溶媒によって洗浄される。最後に、この支持体は、抗原を抗体から遊離させる別の適切な溶媒（例えば、グリシン緩衝液（ｐＨ５．０））によって洗浄される。
【０４０１】
標識化試薬は、代表的に、反応性官能基を保有し、この反応性官能基は、（ｉ）システイン操作抗体のシステインチオールと直接反応して、標識された抗体を形成し得る、（ｉｉ）リンカー試薬と反応して、リンカー−標識中間体を形成し得る、または（ｉｉｉ）リンカー抗体と反応して、標識された抗体を形成し得る。標識化試薬の反応性官能基としては以下が挙げられる：マレイミド、ハロアセチル、ヨードアセトアミドスクシンイミジルエステル（例えば、ＮＨＳ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）、イソチオシアネート、塩化スルホニル、２，６−ジクロロトリアジニル、ペンタフルオロフェニルエステルおよびホスホルアミダイト、しかし、他の官能基もまた用いられてもよい。
【０４０２】
例示的な反応性官能基は、検出可能な標識（例えば、ビオチンまたは蛍光色素）のカルボキシル基置換基のＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ）である。標識のＮＨＳエステルは、予め成形され得、単離され得、精製され得、そして／もしくは特徴付けられ得るか、またはそれは、インサイチュで形成されて抗体の求核基と反応し得る。代表的に、カルボキシル形態の標識は、カルボジイミド試薬、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド、またはウロニウム試薬、例えば、ＴＳＴＵ（Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート）、ＨＢＴＵ（Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）またはＨＡＴＵ（Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート、アクチベーター、例えば、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ））およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドのいくつかの組合せと反応させて、標識のＮＨＳエステルを得ることにより活性化される。いくつかの場合には、標識および抗体は、一工程で、標識のインサイチュ活性化および抗体との反応により結合されて、標識−抗体結合体を形成し得る。他の活性化試薬および結合試薬としては、ＴＢＴＵ（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾ−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）、ＴＦＦＨ（Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’”−テトラメチルウロニウム２−フルオロ−ヘキサフルオロホスフェート）、ＰｙＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）、ＥＥＤＱ（２−エトキシ−１−エトキシカルボニル−１，２−ジヒドロ−キノリン）、ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）、ＤＩＰＣＤＩ（ジイソプロピルカルボジイミド）、ＭＳＮＴ（１−（メシチレン−２−スルホニル）−３−ニトロ−１Ｈ−１，２，４−トリアゾールおよびアリールスルホニルハロゲン化物（例えば、塩化トリイソプロピルベンゼンスルホニル）が挙げられる。
【０４０３】
本発明の検出可能に標識された抗体は、磁性の粒子もしくはナノ粒子、または金属の粒子もしくはナノ粒子に対して結合される（共有結合されることを含む）によって、検出可能であり得る。金属粒子は、磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）、単一粒子または単一分子トラッキング、免疫細胞化学、暗視野照明によるプラズモン周波数、微分干渉コントラスト法およびビデオ強化（ｖｉｄｅｏ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ）、全反射（ｔｏｔａｌ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ）、および光熱干渉コントラスト（ＰＩＣ）技術などの方法によって検出可能である（例えば、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  １００（２０）：１１３５０−１１３５５（２００３）；Ｓｈｅｅｔｚら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４０：２８４−２８８（１９８９）；Ｂａｓｃｈｏｎｇら、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ８３：４０９−４１１（１９８５）；ＳｌｏｔおよびＧｅｕｚｅ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３８：８７−９３（１９３５）；ＦｒｅｙおよびＦｒｅｙ，Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１２７：９４−１００（１９９９）；ＨａｉｎｆｅｌｄおよびＰｏｗｅｌｌ，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．４８：４７１−４８０（２０００）；Ｓｃｈｕｌｔｚら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９７：９９６−１００１（２０００）；Ｇｅｌｌｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３１：４５０−４５３（１９８８）；Ｓｏｎｎｉｃｈｓｅｎら、Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．７７：２９４９−２９５１（２０００）；Ｂｏｙｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９７：１１６０−１１６３（２００２）を参照のこと）。本発明の抗Ｒｏｂｏ４抗体は、ナノ粒子性薬剤を含んでもよく、このナノ粒子性薬剤としては、限定はしないが、マイクロバブル（Ｅｌｌｅｇａｌａら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０８：３３６−３４１（２００３）を参照のこと）（これはまた、聴覚活性リポスフェア（ａｃｏｕｓｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｌｉｐｏｓｐｈｅｒｅｓ）（ＡＡＬｓ）とも呼ばれる（Ｔａｒｔｉｓら、Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．３２（１１）：１７７１−８０（２００６）を参照のこと））、超常磁性剤、リポソーム、ペルフルオロカーボンナノ粒子エマルジョン（国際公開第２００５１０４０５１号）、およびデンドリマー（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１２４：３８７−４００（２００６）およびそこに引用された引用文献（その全てが全体が参照によって本明細書に援用されている）を参照のこと）が挙げられる。
【０４０４】
この標識された抗Ｒｏｂｏ４抗体が検出に（例えば、シンチグラフィー研究に）用いられる場合、この標識は放射性の原子（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２およびＬｕの放射性同位元素）、または核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像化（磁気共鳴画像化、ｍｒｉとしても公知）のためのスピン標識、例えば、Ｔｃ９９ｍ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、１３１Ｉ、１９Ｆ、１Ｈ、１４Ｎ、１５Ｎ、１７Ｏ、２３Ｎａ、３１Ｐ、または１３Ｃ、ガドリニウム、マンガン、鉄、または酸化鉄（例えば、超常磁性酸化鉄粒子（ＳＰＩＬ）または極小常磁性酸化鉄粒子（ｕｌｔｒａ−ｓｍａｌｌ  ｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ  ｉｒｏｎ  ｏｘｉｄｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）（ＵＳＰＩＬ））、または他のＮＭＲで観察可能な薬剤を含んでもよい。
【０４０５】
Ｘ．製品
本発明の別の局面では、上記の障害の処置、予防および／または診断のために有用な物質を含む製品が提供される。この製品は、容器、および表示または添付文書を、その容器上に、またはその容器に付随して備える。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジなどが挙げられる。この容器は、ガラスまたはプラスチックのような種々の物質から形成され得る。この容器は、この状態を処置、予防および／または診断するためにそれ自体でまたは別の組成物と組み合わされた場合有効である組成物を保持し、そして無菌のアクセスポートを有してもよい（例えば、容器は、静脈内溶液バッグであっても、または皮下注射針によって穿刺可能な栓を有するバイアルであってもよい）。この組成物における少なくとも１つの活性因子は、本発明の抗体である。この表示または添付文書は、この組成物が、選ばれた状態、例えば、ガンを処置するために用いられることを示している。さらに、この製品は、（ａ）その中に組成物を含む第一の容器であって、その組成物が本発明の抗体を含む第一の容器と；（ｂ）その中に組成物を含む第二の容器であって、その組成物がさらなる細胞傷害性剤を含む第二の容器とを備える。本発明のこの実施形態の製品はさらに、この第一および第二の抗体組成物が、特定の状態、例えば、ガンを処置するために用いられ得ることを示している添付文書を備えてもよい。あるいは、またはさらに、この製品は、薬学的に受容可能な緩衝液、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化生理食塩水、リンゲル溶液およびデキストロース溶液を含む第二（または第三）の容器を備えてもよい。これは、商業的見地および使用者の観点から所望される他の物質をさらに備えてもよく、これには他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針およびシリンジが挙げられる。
【０４０６】
以下は本発明の方法および組成物の実施例である。上記の一般的な説明を考慮すれば、種々の他の実施形態が行われ得ることが理解される。
【実施例】
【０４０７】
抗体アミノ酸配列内のアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔら、，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））に従ってナンバリングする。一文字のアミノ酸略号を用いる。ＤＮＡの縮重は、ＩＵＢコードを用いて示す（Ｎ＝Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ、Ｄ＝Ａ／Ｇ／Ｔ、Ｖ＝Ａ／Ｃ／Ｇ、Ｂ＝Ｃ／Ｇ／Ｔ、Ｈ＝Ａ／Ｃ／Ｔ、Ｋ＝Ｇ／Ｔ、Ｍ＝Ａ／Ｃ、Ｒ＝Ａ／Ｇ、Ｓ＝Ｇ／Ｃ、Ｗ＝Ａ／Ｔ、Ｙ＝Ｃ／Ｔ）。
【０４０８】
（実施例１）
出発抗体の超可変領域をコードするファージ由来の抗体
ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）抗ＨＥＲ２抗体であるｒｈｕＭＡＢ  ４Ｄ５−８（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）のＶＬおよびＶＨドメインの核酸配列を、ＨＶＲｓの突然変異誘発のため、および図５Ｂに示されるヒトＲｏｂｏ４  Ｈｉｓ−タグ化抗原またはヒトＲｏｂ４−Ｆｃ融合タンパク質に対する結合のためのファージ選択のための出発配列として用いた。抗体４Ｄ５は、Ｈｅｒ−２（ｅｒｂＢ２）として公知のガン関連抗原に特異的なヒト化抗体である。この抗体は、コンセンサスなフレームワーク領域を有する可変ドメインを含む；２〜３の位置は、ヒト化抗体の親和性増大のプロセスの間にマウス配列に戻った。ヒト化抗体４Ｄ５の配列および結晶構造は、米国特許第６，０５４，２９７号，Ｃａｒｔｅｒら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８９：４２８５（１９９２）に記載されており、その結晶構造は、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２９：９６９（１９９３）および、オンラインでｗｗｗ／ｎｃｂｉ／ｎｉｈ／ｇｏｖ／ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｍｍｄｂ（ＭＭＤＢ＃ｓ−９９０−９９２）に示されている。Ｔｈｅ  ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）ＶＬおよびＶＨドメインは、コンセンサスなヒトκＩのＶＬドメインおよびヒトサブグループＩＩＩコンセンサスＶＨドメインの改変体をそれぞれ含む。改変体のＶＨドメインは、ヒトのコンセンサスから３つの変化を有する：Ｒ７１Ａ，Ｎ７３ＴおよびＬ７８Ａ。
【０４０９】
本研究に用いたファージミドは、本質的にＬｅｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００４），３４０（５）：１０７３−９３に記載されるとおりのｐｈｏＡプロモーターの制御下に２つのオープンリーディングフレームを有する一価のＦａｂ−ｇ３ディスプレイベクター（ｐＶ０３５０−２Ｂ）である。この最初のオープンリーディングフレームは、アクセプター軽鎖のＶＬおよびＣＨ１ドメインに融合されたｓｔＩＩシグナル配列からなり、かつ第二のオープンリーディングフレームは、アクセプター重鎖のＶＨおよびＣＨ１ドメインに融合されたｓｔＩＩシグナル配列続いて短縮されたマイナーなファージコートタンパク質Ｐ３からなる。Ｌｅｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００４），３４０（５）：１０７３−９３を参照のこと。
【０４１０】
（実施例２）
重鎖ＨＶＲｓの突然変異誘発によって生成される抗体
ＦａｂのクローンＹＷ７１．６，ＹＷ７１．１，ＹＷ７１．２２、およびＹＷ７１．８９は、ｈｕＭＡｂ  ４Ｄ５−８（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）抗ＨＥＲ２抗体、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）重鎖のＨＶＲ−Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３の突然変異誘発、ならびにヒトＲｏｂｏ４−Ｈｉｓタグ化抗原融合タンパク質に対する選択によって生成した。ＨＶＲ−Ｈ１では、Ｋａｂａｔの位置２６（Ｇ）、２７（Ｆ）、２８（Ｔ）、２９（Ｉ）、３４（Ｉ）、および３５（Ｈ）は一定に保持され、アミノ酸は位置３０〜３３で変化された。ＨＶＲ−Ｈ２では、Ｋａｂａｔの位置５１（Ｉ）、５２ａ（Ｐ）、５５（Ｇ）、５７（Ｔ）、５９（Ｙ）、６０（Ａ）、６１（Ｄ）、６２（Ｓ）、６３（Ｖ）、６４（Ｋ）、および６５（Ｇ）は一定に保持されて、位置４９、５０、５２、５３、５４、５６、および５８が変化された。ＨＶＲ−Ｈ３では、Ｋａｂａｔの位置９３（Ａ）および１０２（Ｙ）は一定に保持されて、位置９４〜１００、１００ａ〜ｈ、および１０１が変化された。ＹＷ７１．２２の軽鎖は、改変ｈｕＭＡｂ  ４Ｄ５−８配列（位置３０、６６および９１で改変、配列番号１６８を生じ、これには配列番号１、２、および３を、それぞれＨＶＲ−Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３として含む）、そのＨＶＲｓはファージ選択の間に変化されなかった。配列の多様性は、標準的な突然変異誘発技術を用いて選択されたアミノ酸位置の突然変異誘発によって各々の超可変領域に導入された。
【０４１１】
ファージライブラリーの作製−各々の超可変領域について設計されたランダマイズしたオリゴヌクレオチドプールを、６６０ｎｇのオリゴヌクレオチド、５０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ  ７．５、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＡＴＰ、２０ｍＭのＤＴＴ、および５  Ｕのポリヌクレオチドキナーゼを含有する６つの２０μｌの反応物中において３７℃で１時間、別々にリン酸化した。次いで、この６つのリン酸化オリゴヌクレオチドプールを２０μｇのＫｕｎｋｅｌテンプレートが含有される５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ  ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２が含有される５００μｌの最終容積と合わせて、オリゴヌクレオチド対テンプレートの比を３にした。その混合物を９０℃で４分間、５０℃で５分間アニーリングさせ、次いで氷上で冷却した。過剰の未アニーリングのオリゴヌクレオチドを、アニーリングされたＤＮＡの過剰の変性を防ぐように改変されたプロトコールを用いる、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（商標）ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ  ｋｉｔ  ２８１０６）で除去した。５００μｌのアニーリングされた混合物に、１５０μｌのＰＢを添加した。その混合物を２つのシリカカラムの間で分けた。７５０μｌのＰＥを用いて各々のカラムを洗浄し、さらにスピンしてカラムを乾燥させた後、各々のカラムを１１０μｌの１０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８）で溶出した。次いで、そのアニーリングおよび浄化されたテンプレート（２２０μｌ）を、１μｌの１００ｍＭのＡＴＰ、１０μｌの２５ｍＭのｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰの各々２５ｍＭ）、１５μｌの１００ｍＭのＤＴＴ、２５μｌの１０×ＴＭ緩衝液（０．５ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１ＭのＭｇＣｌ２）、２４００ＵのＴ４リガーゼ、および３０ＵのＴ７ポリメラーゼを添加することによって室温で３時間フィリング（充填）した。
【０４１２】
フィリングした生成物を、Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ−ＥＤＴＡ／アガロースゲル（Ｓｉｄｈｕら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ３２８：３３３〜３６３（２０００））で分析した。通常は３つのバンドが可視であった：下部のバンドは正確にフィリングされ、連結された生成物であって、真ん中のバンドは、フィリングされたが連結されていない生成物であって、上のバンドは鎖置換生成物である。上のバンドはＴ７ポリメラーゼの内在性の側鎖活性によって生成され、回避することが困難である（Ｌｅｃｈｎｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：１１１７４−１１１８４（１９８３））；しかし、このバンドは、下のバンドよりも３０分の一の効率で変形し、通常はライブラリーにはほとんど寄与しない。真ん中のバンドは、最終の連結反応の５’リン酸塩の非存在に起因し；このバンドは、効率的に変形して、主に野性型の配列をもたらす。
【０４１３】
次いで、このフィリングされた生成物を精製してＳＳ３２０細胞に電気穿孔して、Ｓｉｄｈｕら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ３２８：３３３−３６３（２０００）に記載のとおりＭ１３／ＫＯ７ヘルパーファージの存在下で増幅させた。ライブラリーのサイズは、１〜２×１０９個の独立したクローンにおよんだ。最初のライブラリーからのランダムなクローンを配列決定して、ライブラリーの質を評価した。
【０４１４】
ファージの選択−ヒトＲｏｂｏ４−ＦｃおよびＲｏｂｏ４−Ｈｉｓ−タグ化タンパク質を、選択抗原として用いた。ＨｕｍＲｏｂｏ４−ＦｃおよびＲｏｂｏ４−Ｈｉｓを、ＭａｘｉＳｏｒｐマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）上に１０μｇ／ｍｌ（ＰＢＳ中）でコーティングして、４℃で一晩インキュベートした。初回の選択については、１２ウェルの標的を用いた。ウェルを、Ｐｈａｇｅ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（１％のＢＳＡ，０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０、ＰＢＳ）を用いて室温で１時間ブロックした。Ｐｈａｇｅライブラリーを、凍結グリセロールストックからＰＥＧ沈殿し、ファージブロッキング緩衝液中で再懸濁して、室温で１時間インキュベートした。次いで、ファージライブラリーをブロックした抗原プレートに加えて、室温で一晩インキュベートした。一晩の結合後、未結合または非特異的に結合したファージを抗原プレートから、洗浄緩衝液（ＰＢＳ，０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０）での洗浄によって除去した。結合したファージを、５０ｍＭのＨＣｌ、０．５ＭのＫＣｌを用いて３０分間インキュベートすることによって溶出した。ファージをＸＬ−１  Ｂｌｕｅ細胞およびＭ１３／ＫＯ７ヘルパーファージを用いて増幅して、２ＹＴ、５０μｇ／ｍｌのカルバネシリン、５０ｕｇ／ｍｌのカナマイシン、１０μｇ／ｍｌのテトラマイシン中において３０℃で３６時間増殖させた。次いで、増幅されたファージを、改変したＰＥＧ沈殿プロトコール（Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ＆  Ｌｏｗｍ２００４）を用いて回収した。標的されたコーティングされたウェルから溶出したファージの力価を、非標的コーティングウェルから回収したファージの力価と比較して、富化を評価した。４回のファージ選択を完了し、ここで標的ウェルの数は４（２回目）および２（３および４回目）と低下した。カゼインブロック緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ）を、２回目および４回目の抗原プレートおよびファージのブロッキング試薬として用いた。選択回数２〜４は、３〜４時間のファージ−抗原結合期間を用い、洗浄のストリンジェンシーを増大した。４つのファージクローンを選択した：ＹＷ７１．６、ＹＷ７．１、ＹＷ７１．２２、およびＹＷ７１．８９。軽鎖および重鎖のドメインの配列を決定して、図１Ａおよび１Ｂに示す。Ｒｏｂｏ４結合の特徴は、本明細書の下に開示されるように決定した。
【０４１５】
（実施例３）
ＨＶＲｓのＨ１、Ｈ２、Ｈ３およびＬ３の改変によって作製した抗体
クローンＹＷ７９．１、ＹＷ７９．８、およびＹＷ７９．１１は、ｈｕＭＡｂ  ４Ｄ５−８（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）抗ＨＥＲ２抗体、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）重鎖可変ドメインおよびｈｕＭＡｂ  ４Ｄ５−８改変軽鎖可変ドメイン、配列番号１６８のＨＶＲ−Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３およびＬ３の突然変異誘発によって作製した。ＨＶＲ−Ｈ１では、Ｋａｂａｔの位置２６（Ｇ）、２８（Ｔ）、２９（Ｆ）、３０（Ｓ）、３１（Ｓ）、および３５（Ｓ）は一定に保持されており、アミノ酸は位置２７、３２−３４で変化された。ＨＶＲ−Ｈ２では、Ｋａｂａｔの位置４９（Ｓ）、５１（Ｉ）、５５（Ｇ）、５７（Ｔ）、５９（Ｙ）、６０（Ａ）、６１（Ｄ）、６２（Ｓ）、６３（Ｖ）、６４（Ｋ）、および６５（Ｇ）は一定に保持されており、位置５０、５２、５２ａ、５３、５４、５６、および５８が変化された。ＨＶＲ−Ｈ３では、Ｋａｂａｔの位置９３（Ａ）、９４（Ｒ）、１００ｆ〜ｇ（欠失）は一定に保持されており、位置９５〜１００、１００ａ〜ｅ、１００ｈ、および１０２が変化された。ＨＶＲ−Ｌ３では、Ｋａｂａｔの位置８９（Ｑ）、９０（Ｑ）、９５（Ｐ）および９７（Ｔ）は一定に保持されており、位置９１〜９４および９６が変化された。ＨＶＲ−Ｌ１の配列は、ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＡ（配列番号７）として一定に保持されており、ＨＶＲ−Ｌ２の配列は、ＧＡＳＳＲＡＳ（配列番号８）として一定に保持された。配列の多様性は、標準的な突然変異誘発技術を用いて選択されたアミノ酸位置の突然変異誘発によって各々の超可変領域中に導入された。抗Ｒｏｂｏ４抗体クローンＹＷ７９．１、ＹＷ７９．８、およびＹＷ７９．１１を選択して、配列決定した。軽鎖および重鎖の可変領域の配列を図１Ａおよび図１Ｂに示す。
【０４１６】
（実施例４）
可溶性のＲｏｂｏ４および抗Ｒｏｂｏ４抗体の精製
本実施例は、本発明のＲｏｂｏ４抗原および抗Ｒｏｂｏ４抗体の精製に有用な方法を記載する。Ｒｏｂｏ４抗原は、図５Ｂに示されるようなヒスチジンタグに融合された可溶性のＲｏｂｏ４細胞外ドメインとして精製した。
【０４１７】
Ｒｏｂｏ４抗原精製
ヒトＲｏｂｏ４構築物（アミノ酸Ｍ１〜アミノ酸Ｌ４６１およびアミノ酸Ｍ１〜アミノ酸Ｙ２３１）を、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に対する融合物として、またはＣ−末端ヒスチジンタグに対する融合物としてのいずれかで、真核生物発現ベクターｐＲＫ５にクローニングした。マウスＲｏｂｏ４（Ｍ１〜Ｈ２３２）を、Ｃ末端ヒスチジンタグのみに対する融合物としてｐＲＫ５中にクローニングした。全てのタンパク質は、ＣＨＯ細胞の一過性のトランスフェクションによって産生した。Ｆｃ融合タンパク質については、プロテイン−Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、またはヒスチジンタグ融合物についてはＮｉＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ）のいずれかを用いてアフィニティークロマトグラフィーによって、タンパク質を９０％を超える純度に精製した。必要に応じてイオン交換クロマトグラフィー工程（Ｑ−またはＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標），ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）および／またはサイズ排除クロマトグラフィー工程（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）７５，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を追加した。タンパク質の特定は、エドマン分解法を用いるＮ末端配列決定によって確認し、濃度はＢＣＡアッセイによって、およびＯＤ  ２８０吸収測定によって決定して、純度はサイズ排除クロマトグラフィーおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した。
【０４１８】
抗体精製
全長Ｒｏｂｏ４抗体を、ＣＨＯ細胞で一過性に発現して、プロテイン−Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いるアフィニティークロマトグラフィー、続いてＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いるイオン交換クロマトグラフィーによって９５％を超える純度まで精製した。必要に応じて、さらなるサイズ排除クロマトグラフィー工程（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を追加した。抗体濃度は、製造業者の指示（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）に従うＢＣＡアッセイによって、およびＯＤ  ２８０吸収測定によって決定して、純度はサイズ排除クロマトグラフィーおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した。全ての抗体精製については、レーザー光スキャッタリングによって決定した凝集の値は、５％未満であって、プロテインＡのＥＬＩＳＡで決定したプロテインＡの値は５０ｐｐｍ未満であって、ＬＡＬ（Ｌｉｍｕｌｕｓ  Ａｍｏｅｂｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ）色素生産性内毒素アッセイによって決定した内毒素の値は０．５ＥＵ／ｍｇ未満であった。
【０４１９】
（実施例５）
ＹＷ７１．２２の親和性成熟
抗Ｒｏｂｏ４抗体ＹＷ７１．２２の親和性を改善するために、３つのファージ・ディスプレイ・ライブラリーをＹＷ７１．２２のバックグラウンドで作製して、この各々がＬｅｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３−９３（２００４）に記載のようなソフト・ランダム化突然変異誘発の複数のＨＶＲｓを標的する。テンプレートの潜在的に高いバックグラウンドからのＹＷ７１．２２が再選択されることを回避するために、終止コドンをＨＶＲに導入して、各々のライブラリーを作製する前に突然変異させた。溶液ソーティング（ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｓｏｒｔｉｎｇ）法を用いて、親和性に基づく選択プロセスの有効性を向上した。ビオチン化標的濃度を操作すること、ファージ捕獲時間を減らしてバックグラウンドを下げること、および非ビオチン化標的の添加によって、より速い解離速度（ｏｆｆ  ｒａｔｅ）を有するクローンを排除することにより、高い親和性のクローンをうまく選択することができる。Ｌｅｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００４），３４０（５）：１０７３−９３。初回の選択から、富化（標的依存性のファージ捕獲）が観察され、このことは多数のクローンが、ヒトＲｏｂｏ４に合理的に高い親和性で各々のライブラリーに存在することを示唆している。選択のストリンジェンシーは、その後の回で増大した。５回の選択後、各々のライブラリーからのクローンを分析した。新規の配列が６つのＨＶＲｓの各々の標的するライブラリーで観察された（図２Ａおよび図２Ｂ）。選択されたクローンは、ファージＥＬＩＳＡによってスクリーニングし、次いでＩｇＧタンパク質として発現され、その親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）結合分析を用いて特徴付けた。
【０４２０】
親和性成熟したクローンのファージライブラリーを固体／溶液ソーティング法を用いてソーティングした。ヒトＨｕｍＲｏｂｏ４−Ｈｉｓは、５００μｌの３．６ｍｇ／ｍｌのヒトＲｏｂｏ４−Ｈｉｓが含有されるＰＢＳ、および１０μｌの１Ｍのリン酸カリウム（ｐＨ８）と、２０μｌの４ｍＭのスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）とを混合することによってビオチン化した。初回の選択については、ビオチン化Ｒｏｂｏ４−Ｈｉｓを、ＭａｘｉＳｏｒｐマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）上で１０μｇ／ｍｌでＰＢＳ中でコーティングして、４℃で一晩インキュベートした。初回の選択には、１６ウェルの標的を用いた。ウェルは、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて室温で１時間ブロックした。成熟ファージライブラリーをＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ緩衝液中で希釈して、室温で１時間インキュベートした。次いでファージライブラリーをブロックされた抗原プレートに添加して室温で２時間インキュベートした。結合後、未結合のおよび非特異的に結合したファージを、洗浄緩衝液（ＰＢＳ，０５％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）を用いて洗浄することによってこの抗原プレートから除いた。このウェルを５０ｍＭのＨＣｌ、０．５ＭのＫＣｌとともに３０分間インキュベートすることによって、結合したファージを溶出した。ファージは、ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ細胞およびＭ１３／ＫＯ７ヘルパーファージを用いて増幅し、２ＹＴ、５０μｇ／ｍｌのカルバネシリン、５０ｕｇ／ｍｌのカナマイシン、１０μｇ／ｍｌのテトラマイシン中において３０℃で３６時間増殖させた。次いで、増幅されたファージを、改変したＰＥＧ沈殿プロトコール（Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ＆  Ｌｏｗｍ２００４）を用いて回収した。標的のコーティングされたウェルから溶出したファージの力価を、非標的コーティングウェルから回収したファージの力価と比較して、富化を評価した。２〜５回の選択について溶液ソーティングプロトコールを行った。マイクロタイターウェルを、１０μｇ／ｍｌのニュートラビジンが含有されるＰＢＳを用いて４℃で一晩コーティングし、次いで、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて１時間ブロックした。回収されたファージライブラリーを、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋに懸濁して、５０ｎＭのビオチン化Ｒｏｂｏ４−Ｈｉｓとともに１時間混合した。ビオチン化Ｒｏｂｏ４−Ｈｉｓに結合したファージを、ニュートラビジンコーティングウェル上に３０分間捕獲して、未結合のファージを洗浄緩衝液で洗い流した。ファージは、５０ｍＭのＨＣｌ、５００ｍＭのＫＣｌを用いて３０分間溶出し、中和して、ＫＯ７ヘルパーファージ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在下でＸＬ１ブルー細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中で増殖させた。ソーティングのその後の回は、以下を除いて同様に行った：２回目は最終ビオチン化Ｒｏｂｏ４−Ｈｉｓ濃度は５０ｎＭ、３回目は、最終ビオチン化Ｒｏｂｏ４−Ｈｉｓ濃度は２５ｎＭ、４回目は、最終ビオチン化Ｒｏｂｏ４−Ｈｉｓ濃度は５ｎＭ、そして５回目は、最終ビオチン化Ｒｏｂｏ４−Ｈｉｓ濃度は０．５ｎＭであって、ここでニュートラビジン上の捕獲の前に１時間、５０ｎＭの未ビオチン化Ｒｏｂｏ４−Ｈｉｓをこ���混合物に添加した。
【０４２１】
数回の親和性成熟したクローンをヒトＲｏｂｏ４−Ｈｉｓに対する結合について選択して、配列決定した。クローンＹＷ７１．２２の親和性成熟によって誘導された抗体クローンの可変領域の配列は、図２Ａ（軽鎖可変領域）および図２Ｂ（重鎖可変領域）に示す。
【０４２２】
（実施例６）
選択された抗Ｒｏｂｏ４抗体クローンの特徴づけ
ファージＥＬＩＳＡ−ファージ競合結合アッセイを行って、Ｒｏｂｏ４についてのファージ−ディスプレイのＦａｂｓの適切な結合親和性（ファージＩＣ５０として測定）を測定した。そのアッセイは以下のとおり行った。要するに、各々のクローンから精製されたファージ上清を上記のような改変ＰＥＧ沈殿プロトコールを用いて産生した。精製したファージ上清をファージブロッキング緩衝液（Ｐｈａｇｅ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）中で連続希釈し、次いで、Ｒｏｂｏ４−Ｈｉｓ（１μｇ／ｍｌ）でコーティングしたプレート上に１５分間インキュベートした。このプレートを洗浄緩衝液（Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ）で洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ／抗Ｍ１３抗体コンジュゲート（ＰＢＳ緩衝液中で１：５０００希釈）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）とともに３０分間インキュベートした。そのプレートを洗浄し、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質（ＫｉｒｋｅｇａａｒｄおよびＰｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で発色させ、０．１ＮのＨ２ＳＯ４でクエンチした。吸収を４５０ｎｍで分光光度的に測定して、約５０％の飽和シグナルを与えるファージ濃度を測定した。ファージの固定された飽和未満の濃度を、３５０ｎＭのＲｏｂｏ４〜５ｎＭのＲｏｂｏ４というＲｏｂｏ４−Ｈｉｓタンパク質の２倍階段希釈を含むファージブロッキング（Ｐｈａｇｅ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ）緩衝液中で希釈した。この混合物を室温で穏やかに振盪しながら１時間インキュベートして、Ｒｏｂｏ４−Ｈｉｓ（１μｇ／ｍｌ）でコーティングしたプレートに移し、そのプレートを２０分間インキュベートした。そのプレートを上記のように洗浄して処理した。その結合親和性をＩＣ５０値（固定された抗原に対するファージ結合の５０％を阻害する抗原の濃度として規定）として見積もった。７つのクローンのＩＣ５０の結果を表２に示す。
【０４２３】
【表２】
2010518115.tif 000029
Ｆａｂ産生および親和性の決定−親和性測定のためにＦａｂタンパク質を発現するために、終止コドンを重鎖とファージディスプレイベクターのｇ３との間に導入した。クローンをＥ．ｃｏｌｉの３４Ｂ８細胞中に形質転換して、ＡＰ５培地中で、３０℃で増殖した（Ｐｒｅｓｔａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４５９３−４５９９（１９９７））。細胞を遠心分離によって回収して、１０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８）中に懸濁して、マイクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）を用いて破壊した。Ｆａｂは、プロテインＧアフィニティークロマトグラフィーで精製した。
【０４２４】
親和性の決定は、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）２０００システム（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて表面プラズモン共鳴によって行った。Ｒｏｂｏ４−Ｈｉｓを、ＣＭ５チップ上に固定し（約１０００の応答単位（ＲＵ））、種々の濃度のＦａｂ（４〜５００ｎＭ）を含有するＰＢＳＴを注射した。各々の注射後、１００ｍＭのＨＣｌを用いてチップを再生した。
【０４２５】
可溶性のＲｏｂｏ４細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対する３つの３つのファージ由来抗Ｒｏｂｏ４抗体の結合親和性を、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）３０００システム（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて表面プラズモン共鳴によって測定した。試験した抗体としては、ＹＷ７１．６，ＹＷ７１．２２、およびＹＷ７９．８を含んだ。要するに、カルボキシメチル化したデキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５，Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｉｎｃ．）を、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を用いて、供給業者の指示に従って活性化した。これらの活性化されたチップを、１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍｌに希釈することによって抗Ｒｏｂｏ４Ｆａｂでコーティングして、その後に５μｌ／分の流速で注射して、約５００応答単位（ＲＵ）の結合した抗体を得た。次に、１Ｍのエタノールアミンを注射して、未反応の基をブロックした。反応速度論の測定のために、ヒトまたはマウスのＥＣＤ−Ｈｉｓタグ化可溶性抗原の２倍階段希釈（約５００ｎＭ〜約７．８ｎＭ）を、０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むＰＢＳ中で２５℃で、２５μｌ／分という流速で注射した。結合応答は、ブランクのフローセルからＲＵを差し引きすることによって補正した。会合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）は、単純な１対１のＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデル（ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅのバージョン３．２）を用いて算出した。平衡の解離定数（ＫＤ）は、ｋ解離／ｋ会合の比として算出した。この実験の結果を下の表３に示す。抗体ＹＷ７１．２２は、ヒトおよびマウスのＲｏｂｏ４と交差反応する。
【０４２６】
【表３】
2010518115.tif 000030
ＹＷ７１．２２由来の親和性成熟した抗Ｒｏｂｏ４抗体クローンは、ＨＵＶＥＣ細胞中で内因性に発現されるヒトＲｏｂｏ４に対する、およびＭＳ１細胞中で内因性に発現されるマウスＲｏｂｏ４に対する結合について試験した。ＦＡＣＳ分析によって、クローンＹＷ７１．２２．Ｓ１．１６およびＹＷ７１．２２．Ｓ１．２１がヒトおよびマウスの両方のＲｏｂｏ４に結合すること、ならびに結合が、ＹＷ７１．２２抗体に匹敵することが明らかになった（図１８）。
【０４２７】
（実施例７）
親和性成熟したＲｏｂｏ４抗体の結合分析
親和性成熟したＹＷ７１．２２．Ｓ１．１６を用いて、ＥＵナンバリングによって、両方ともが重鎖Ｆｃ領域の１１８位置にＣｙｓ位置を有する、全長ＩｇＧ１およびＦａｂフラグメントを作製した。Ｃｙｓは、目的の標識または薬物に対する抗体の部位特異的なコンジュゲーションのために用いる。
【０４２８】
ヒトおよびマウスのＲｏｂｏ４に対する結合親和性は、インビトロ結合測定によって、ならびに全長ＹＷ７１．２２．Ｓ１．１６（Ｍａｂ）、操作されたＣｙｓを有する全長ＹＷ７１．２２．Ｓ１．１６（チオＭａｂ）、および操作されたＣｙｓを有するＹＷ７１．２２．Ｓ１．１６のＦａｂフラグメント（チオＦａｂ）に対する放射性標識細胞結合によって確認した。
【０４２９】
インビトロの結合実験は、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）上で２５℃でのＳＰＲ測定によって行った。親和性成熟したＲｏｂｏ４抗体（Ｍａｂ、チオＭａｂおよびチオＦａｂ）を、製造業者によって記載される標準的なアミンカップリング手順を用いて、活性化ＰｒｏｔｅＯｎ  ＧＬＣセンサーチップ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）で５００〜１０００ＲＵの表面密度で固定した。要するに、抗体を２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）中で１０μｇ／ｍｌの濃度で、３０μｌ／分の流速で５分間注射した。１Ｍのエタノールアミンを注射することによって未反応の基をブロックした。結合アッセイを行うために、サンプルを３０μｌ／分の流速で注射した。反応速度論の測定のために、精製されたヒトまたはマウスのいずれかのＲｏｂｏ４−Ｈｉｓの連続希釈（約２５ｎＭ〜０．８ｎＭ）を、０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ中で注射して、会合および解離の相のセンサーグラムを記録した。ブランク表面をバックグラウンド補正に用いた。表面を再生する必要はなかった。なぜなら、ＰｒｏｔｅＯｎタンパク質相互作用アレイシステムでは、同一表面上で平行して最大６つまで結合実験を行うことが可能であるからである。会合速度（ｋａ）および解離速度（ｋｄ）は、単純な１対１のＬｏｎｇｍｕｉｒ結合モデル（ＰｒｏｔｅＯｎ  Ｍａｎａｇｅｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｖ２．０、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて算出し、平衡解離定数（ＫＤ）は、比ｋｄ／ｋａとして算出した。結果を下の表４にまとめる。
【０４３０】
【表４】
2010518115.tif 000031
ＨＵＶＥＣｓおよびＭＳ１細胞（Ｒｏｂｏ４タンパク質を内因性に発現する）を放射性リガンド細胞結合実験に用いた。
【０４３１】
細胞結合実験のために、抗Ｒｏｂｏ４チオＭａｂおよびチオＦａｂ抗体を、Ｉｏｄｏｇｅｎ（ヨードゲン）法を用いてヨウ素化した。各々の放射性標識抗体は、ＮＡＰ−５カラムを用いてゲル濾過によって遊離１２５Ｉ−Ｎａから精製した；精製されたチオＭａｂ抗体は、６．９６μＣｉ／μｇという比活性を有し、かつ精製されたチオＦａｂ抗体は、１６．０５μＣｉ／μｇという比活性を有した。固定濃度のヨウ素化抗体および漸減濃度の非標識抗体を含む５０μＬの競合混合物を、９６ウェルのプレートに入れた。ＭＳ１およびＨＵＶＥＣ細胞を、増殖培地中で３７℃で５％のＣＯ２中で培養し、次いで引き続く結合研究のために非酵素的細胞解離溶液（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｃ５９１４）を用いて組織培養プレートから剥がした。細胞を結合緩衝液（５０：５０のＤＭＥＭ／Ｆ１２培地であって、２％のＦＢＳ、２ｍＭのアジ化ナトリウムおよび５０ｍＭのＨＥＰＥＳを含む（ｐＨ７．２））で洗浄して、競合混合物を含む９６ウェルプレート中に０．２ｍＬの結合緩衝液中で約２００，０００個の細胞でプレートした。細胞との各々のインキュベーションにおけるヨウ素化Ｍａｂ抗体の最終濃度は約１５０ｐＭ（０．２５ｍｌあたり約７０，０００ｃｐｍｓ）であって、細胞とのインキュベーションにおける未標識の抗体の最終濃度は４００ｎＭで開始して、２倍ずつ１０の濃度に連続希釈した。細胞との各々のインキュベーションにおけるヨウ素化Ｆａｂ抗体の最終濃度は約４００ｐＭ（０．２５ｍｌあたり約１５０，０００ｃｐｍｓ）で、細胞とのインキュベーションにおける未標識の抗体の最終濃度は１．０μＭで開始して、２倍ずつ１０の濃度に連続希釈した。競合反応は三連でアッセイした。この競合反応は、室温で２時間インキュベートした。次いで、それらをＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎフィルタープレートに移して、結合緩衝液で３回洗浄し、結合したヨウ素化抗体から分離した。そのフィルターをＷａｌｌａｃ  Ｗｉｚａｒｄ  １４７０ガンマ・カウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ，ＭＡ）でカウントした。その結合データを、ＮｅｗＬｉｇａｎｄ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を用いて評価したが、このソフトウェアは、ＭｕｎｓｏｎおよびＲｏｂａｒｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：２２０−３９（１９８０）のフィッティング・アルゴリズムを用いて、抗体の結合親和性およびウェルあたりの結合部位の濃度を決定する。１細胞あたりの結合部位の数は、総結合部位をウェルあたりの細胞の数で割ることによって測定した。
【０４３２】
（実施例８）
抗Ｒｏｂｏ４抗体はＨＵＶＥＣの管の伸長を阻害する
抗Ｒｏｂｏ４抗体（ＹＷ７１．２２）は、ビーズ成長（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）アッセイでのＨＵＶＥＣ管伸長を有意に阻害する。管の総数および長さの両方とも、コントロールの抗体に比べて減少する（図２０）。例えば、３００μｍ以上の長さを有する管の数は６０％まで減少する。
【０４３３】
ビーズ成長アッセイのために、デキストランコーティングしたＣｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリアビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を、ＥＧＭ−２中のＨＵＶＥＣ（１ビーズあたり４００個の細胞）とともに、３７℃および５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。凝固を誘導するために、２．５μｇ／ｍｌのフィブリノーゲンを含むＰＢＳ中の０．５ｍｌの細胞コーティングビーズ（２００ビーズ／ｍｌ）を、０．６２５単位のトロンビンを含む２４ウェルの組織培養プレートの１つのウェル中に加えて、室温で５分間、次いで３７℃で２０分間インキュベートした。その凝固物をＥＧＭ−２中で３７℃で３０分間平衡にした。次いでその培地を皮膚線維芽細胞を含むＥＧＭ−２（Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５５１、２０，０００細胞／ｍｌ）で置き換えた。抗体（５０μｇ／ｍｌ）を各々のウェルに添加して、そのアッセイを８日間モニターして、このとき１日おきに培地を変えた。ビーズの画像は、倒立顕微鏡で得て、１００、２００および３００μｍで間隔を空けた同心円を、各々の画像のビーズの周囲に引いた。各々の円に交差する血管の数をカウントし、数量化のために１条件あたり１０〜１２のビーズを用いた（Ｎａｋａｔｓｕら、Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６６：１０２−１１２（２００３））。
【０４３４】
（実施例９）
治療剤としての抗Ｒｏｂｏ４抗体および抗Ｒｏｂｏ４抗体薬物コンジュゲート
抗Ｒｏｂｏ４ＡＤＣｓは、薬物−リンカー部分ＭＣＣ−ＤＭ１、ＳＰＤＢ−ＤＭ４、およびｍＰＥＯ−ＤＭ１に対して抗Ｒｏｂｏ４抗体をコンジュゲートすることによって産生された。コンジュゲーションの前に、抗体を国際公開第２００４／０１０９５７号に記載の方法論に従って、標準的な方法を用いてＴＥＣＰで部分的に還元した。この部分的に還元された抗体を、Ｄｏｒｏｎｉｎａら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：７７８−７８４（２００３）および米国特許第出願公開第２００５／０２３８６４９号に記載の方法論に従って標準的な方法を用いて上記の薬物−リンカー部分に対してコンジュゲートした。要するに、この部分的に還元された抗体を、薬物リンカー部分と組み合わせて、システイン残基（限定はしないが、本明細書に開示のチオＭＡｂのシステイン操作残基を含む）に対するこの部分のコンジュゲーションを可能にした。このコンジュゲーション反応をクエンチして、ＡＤＣを精製した。各々のＡＤＣについての薬物負荷（１抗体あたりの薬物部分の平均数）は、ＨＰＬＣで決定した。追加の抗Ｒｏｂｏ４  ＡＤＣは、ｓｐｐ−ＤＭ１、ｓｍｃｃ−ＤＭ１、ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ；ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦ；ＭＣ−ＭＭＡＥおよびＭＣ−ＭＭＡＦを含む薬物リンカー部分を例えば用いて、作製する（例えば、国際公開第２００４／０１０９５７、および国際公開第２００６／０３４４８８を参照のこと（その各々はその全体が参照によって本明細書に援用される））。
【０４３５】
（実施例１０）
インビボの腫瘍容積減少アッセイ
裸の抗Ｒｏｂｏ４抗体：腫瘍増殖は、ヒト非小細胞肺癌ＳＫ−ＭＥＳ−１のマウス異種移植片モデルにおいて、裸の抗Ｒｏｂｏ４抗体ＹＷ７１．２２（細胞傷害性剤にも他の薬剤にもコンジュゲートされていない抗体）によっては阻害されなかった。この研究のために、各々のＨＲＬＮ雌性ヌードマウスには、わき腹に１ｍｍ３の腫瘍断片のｓ．ｃ．移植片を与えた。腫瘍増殖は、キャリパーでの測定によって毎週２回モニターした。腫瘍が８０〜１２０ｍｍ３という平均サイズに達したとき、平均腫瘍サイズがほぼ同一の群になるようにマウスをソートして、処置を開始した（１日目）。１０ｍｇ／ｋｇの抗Ｒｏｂｏ４および／または５ｍｇ／ｋｇの抗ＶＥＧＦまたはコントロールの抗体を用いて５週間、毎週２回動物にｉ．ｐ．（腹腔内）投与した。全ての処置は、０．２ｍｇ／２０ｇに体重調節した。この結果を図１７に示す。さらに、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌異種移植片を有するＦｏ５マウスモデルにおける腫瘍増殖の減少が観察された。
【０４３６】
ＡＤＣＣ活性の増強があるＦｃ領域を含む抗Ｒｏｂｏ４抗体を用いて腫瘍増殖を阻害してもよい。ＡＤＣＣ増強抗Ｒｏｂｏ４抗体は、本明細書に開示されるように、裸の抗体であってもよいし、または抗体薬物コンジュゲートであってもよい。ＡＤＣＣ増強は例えば、ＩｇＧ１−ＦｃγＲＩＩＩ相互作用（これは、抗体のＦｃ領域に連結された炭水化物部分に依存する）を増強することによって獲得される。ＡＤＣＣ増強のための非限定的な例示的な方法は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼをコードする、ＧｎＴＩＩＩを過剰発現する宿主細胞において抗Ｒｏｂｏ４を発現することによって抗体フコシル化を軽減する工程（Ｎａｒｉｓｈｉｍｈａｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１０２３５−１０２４２（１９８２）およびＵｍａｎａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６−１８０（１９９９））；α−１，６−フコシルトランスフェラーゼをコードする、ＦＵＴ８の発現が過少であるかまたは欠く宿主細胞（Ｓｈｉｎｋａｗａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３４６６−３４７３（２００３））；またはＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピネラーゼを欠くかまたは過少発現する宿主細胞（例えば、Ｌｅｃ３  ＣＨＯ細胞）（ＨｏｎｇおよびＳｔａｎｌｅｙ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：５３０４５−５３０５４（２００３））を包含する。さらに、ＡＤＣＣは、Ｆｃ領域におけるアミノ酸変化によって増強される（例えば、国際公開第第２００００４２０７２号および国際公開第２００４０２９２０７号を参照のこと）。従って、本発明の抗Ｒｏｂｏ４抗体は、細胞傷害性剤として有用であって、野性型のＦｃＡＤＣＣ活性を示す抗Ｒｏｂｏ４抗体に対して、増強したＡＤＣＣ機能を示す抗Ｒｏｂｏ４抗体を包含する。
【０４３７】
抗Ｒｏｂｏ４抗体薬物コンジュゲート（抗Ｒｏｂｏ４  ＡＤＣ）：毒素コンジュゲートされた抗Ｒｏｂｏ４  ＡＤＣの有効性をインビボで腫瘍容積を減少させる能力について試験するために、以下のプロトコールを使用する。
【０４３８】
ＳＣＩＤマウスには、ヒトガン細胞株の細胞をわき腹に各々皮下接種する。ヒトガン細胞株としては、非限定的な例として、ＳＫ−ＭＥＳ−１  ヒト非−小細胞肺癌細胞およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞が挙げられる。腫瘍が約８０〜２００ｍｍ３の平均腫瘍容積に達するとき、マウスを群に分けて、毒素コンジュゲート抗体または非コンジュゲート抗体の静脈内注射によって処置した。
【０４３９】
固形腫瘍容積を減少させるための抗Ｒｏｂｏ４メイタンシン薬物コンジュゲートの使用
ＳＣＩＤマウスには、ヒト腫瘍細胞をマウスの体重２０ｇあたり０．２ｍｌの容積でわき腹に皮下注射する。細胞は、ＨＢＳＳに懸濁する。平均腫瘍サイズが約８０〜２００ｍｍ３に達するとき、マウスを無作為に群に分けて、メイタンシンまたはコントロールの抗体のいずれかに対してコンジュゲートされた抗Ｒｏｂｏ４ＡＤＣの単回または複数回のＩ．Ｖ．処置（尾静脈を介する）を与える。
【０４４０】
平均腫瘍容積は、抗体注射後約３０日間各々の処置群でモニターする。腫瘍は例えば、ルシフェラーゼを発現するように腫瘍細胞が操作されている、残留ルシフェラーゼの蛍光検出によって検出され得る。毒素コンジュゲートされた抗ＣＤ２２抗体の有効性は、コントロール抗体および非コンジュゲート抗体に対する比較によって決定される。
【０４４１】
同じ実験を、抗Ｒｏｂｏ４  ＡＤＣ（ここで抗体に対してコンジュゲートされた薬物はアウリスタチンである）を用いて行う。
【０４４２】
同じ実験を、ＡＤＣＣ活性の増強を有するＦｃ領域を含む抗Ｒｏｂｏ４  ＡＤＣを用いて反復する。
【０４４３】
（実施例１１）
検出可能なマーカーにコンジュゲートされた抗Ｒｏｂｏ４抗体
ｓＤＯＴＡ−標識された抗Ｒｏｂｏ４抗体は以下のとおり調製する。ＤＯＴＡ−ＮＨＳ−エステルをジメチルアセトアミド（ＤＭＡ，Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｋａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に溶解して、６０〜１００ｍｇ／ｍＬの濃度に調製した。代表的な手順は、２ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７．２）を用いてＰＢＳ中にＭＡｂを緩衝液交換する工程を包含する。反応は、１分子のＭＡｂ対４個のＤＯＴＡ分子（１：４）の比で行い、かつＴｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒプレート（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）で穏やかに攪拌しながら２５℃で行った。ＤＯＴＡ−標識抗Ｒｏｂｏ４抗体は、非限定的な例としてはイットリウム、９０Ｙ、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕなどと会合されたとき、インビトロまたはインビボで検出マーカーとして有用である。このｍＡｂコンジュゲートは、例えば、このコンジュゲートと０．２５Ｍの酢酸アンモニウム中の１１１ＩｎＣｌ３とを４３℃で４５分間インキュベートすることによって１１１Ｉｎで標識される。ＥＤＴＡを１ｍＭという最終濃度まで加え、その混合物を３７℃で１５分間インキュベートする。例えば、９０Ｙでの標識は、４３℃で１時間のインキュベーションを用いて行い、その後、ＤＴＰＡを１ｍＭという最終濃度まで添加し、その混合物を３７℃でさらに１５分間インキュベートする。この放射性金属で標識されたｍＡｂコンジュゲートは、ＴｏｓｏＨａａｓ  ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ２０００  ＳＷカラムおよび生理食塩水の移動相を用いて、サイズ排除ＨＰＬＣによって精製する。
【０４４４】
（実施例１２）
Ｒｏｂｏ４および抗Ｒｏｂｏ４抗体のさらなる特徴づけ
Ｒｏｂｏ４は内皮細胞（ＥＣ）遊走をブロックしない。Ｒｏｂｏ４−ＦｃおよびＲｏｂｏ４−Ｈｉｓを、ＨＵＶＥＣ遊走アッセイを用いて、ＶＥＧＦの有無において、血管のＥＣと接触させた。図８は、アッセイの結果を示す。Ｒｏｂｏ４−ＦｃまたはＲｏｂｏ４−Ｈｉｓは単独では、ＥＣ遊走を誘導せず、ＶＥＧＦ誘発性のＥＣ遊走はＲｏｂｏ４によって増強されなかった。
【０４４５】
Ｒｏｂｏ４は、Ｓｌｉｔ２には結合しない。Ｓｌｉｔ２と接触されたＲｏｂｏ４−Ｆｃは、Ｂｉｏｃｏｒｅ（商標）分析では結合を示さなかったが、Ｒｏｂｏ１およびＳｌｉｔ２は、同じアッセイで結合を示す（図９）。Ｓｌｉｔ２−Ｈｉｓ（ヒスチジンタグ化全長Ｓｌｉｔ２）をＣＭ５  Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）チップ上に高密度で固定した。各々の分析物（Ｒｏｂｏ４−ＦｃまたはＲｏｂｏ１−Ｆｃ融合タンパク質）の５μｌのアリコートを注射して、緩衝液（ＨＥＰＥＳ／ＥＤＴＡ／ＮａＣｌ，ｐＨ７．５）中で固定リガンドと相互作用することを可能にさせた。
【０４４６】
Ｒｏｂｏ４はインビトロで、血管の誘導に関与する細胞表面レセプターであるＵＮＣ５Ｂと相互作用する。非協調性（ｕｎｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ）−５（ＵＮＣ５）ファミリーのレセプターのメンバー（ＵＮＣ５Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤ）に対するネトリン結合は、神経軸索の抑圧を生じることが示されている（Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ，Ｍ．およびＥｉｃｈｍａｎｎ，Ａ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ＆  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １６（４−５）：５３５−５４８（２００５））。ネトリン−ＵＮＣ５Ｂ相互作用は、血管形成に関与している（Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ，Ｍ．ａｎｄ  Ｅｉｃｈｍａｎｎ，Ａ．，上掲（２００５）およびＬｕ，Ｘ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ４３２：１７９−１８６（２００４））。Ｒｏｂｏ４とＵＮＣ５Ｂとのインビトロでの相互作用は、ＳＰＲ結合測定によって決定され、ここではＵＮＣ５Ｂ−Ｆｃ融合タンパク質（Ｆｃ領域に融合されたＵＮＣ５Ｂの細胞外ドメイン）をチップ上に固定して、可溶性のＲｏｂｏ４−ＦｃまたはＲｏｂｏ４−Ｈｉｓがそれと種々の濃度で相互作用することを可能にさせた。ＳＰＲ測定は、実施例７に記載のとおり行い、その相互作用の結果を図１０に示す。
【０４４７】
Ｒｏｂｏ４は、Ｒｏｂｏ４特異的なＲＮＡプローブを用いて、ＩＳＨアッセイによって示されるように雌性マウス内皮細胞で発現される（図１１）。Ｒｏｂｏ４はまた結腸腫瘍（ヒトＨＭ−７結腸腫瘍異種移植片、図１２Ａおよび１２Ｂ）のマウス腫瘍モデルで、および乳腺腫瘍（ヒトＭＤＡ−ＭＢ−１７５乳癌腫瘍異種移植片、図１２Ｃおよび１２Ｄ）で発現される。Ｒｏｂｏ４は、正常な組織（図１３Ｂおよび１３Ｄ）に対して、図１３Ａおよび図１３Ｃ（悪性黒色腫での発現の増大）で証明されるとおり正常ヒト組織に対してヒト腫瘍組織で発現の増大を示す。Ｒｏｂｏ４発現はまた、ヒト小細胞肺癌（図１４Ａ−Ｄ）、ヒト結腸癌（図１４Ｇ−Ｈ）、ヒト前立腺腫瘍、およびマウスの血管肉腫でも見られる。Ｒｏｂｏ４は、結腸の腫瘍内皮細胞、非小細胞肺癌、腎細胞癌（ＲＣＣ）、移行上皮癌（ＴＣＣ、膀胱癌の一般的な形態）、乳癌、神経膠腫および肉腫で発現される。
【０４４８】
抗Ｒｏｂｏ４抗体ＹＷ７１．２２は、Ｒｏｂｏ４発現するマウス微小血管内皮ＭＳ１細胞によって２時間にわたって内部移行された。ＹＷ７１．２２抗体を、マウスの微小血管内皮ＭＳ１細胞上のＲｏｂｏ４に対して０℃で３０分間結合させて、３７℃で０〜２時間インキュベートした。間をおいて、細胞を固定して透過させるかまたは透過させなかった。細胞表面上のまたは細胞によって内部移行された抗Ｒｏｂｏ４抗体は、蛍光標識された（Ａｌｅｘａ−ｌａｂｅｌｅｄ）抗ヒトＩｇＧ二次抗体と相互作用した。その結果を図１５Ａおよび図１５Ｂに示す。抗Ｒｏｂｏ４抗体をＭＳ１細胞上で、３７℃で０〜４時間インキュベートしたこと以外は同じプロトコールによって、ＹＷ７１．２２．Ｓ１．１６抗Ｒｏｂｏ４抗体を内部移行した。上記のように細胞を透過させて染色した。その結果を図１５Ｃに示す。
【０４４９】
内皮細胞遊走は、ヒト臍血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の細胞遊走アッセイを用いるインビトロアッセイでは抗Ｒｏｂｏ４抗体によってブロックされなかった。ＨＵＶＥＣはヒトＲｏｂｏ４を内因性に発現する。このアッセイは以下のとおりおこなった。ＨＵＶＥＣはＶＥＧＦとともに２時間、予備インキュベートした。細胞遊走は、抗Ｒｏｂｏ４抗体ＹＷ７１．２２、抗ＶＥＧＦ抗体、またはＲｏｂｏ４−ＦｃもしくはＲｏｂｏ４−Ｈｉｓの存在下で１６時間継続させた。抗Ｒｏｂｏ４も、可溶性Ｒｏｂｏ４細胞外ドメイン融合タンパク質（Ｒｏｂｏ４−ＦｃおよびＲｏｂｏ４−Ｈｉｓ）もこれらの条件下でＥＣ遊走をブロックしなかった（図１６）。
【０４５０】
抗Ｒｏｂｏ４抗体は、インビボで脈管構造と会合する。５０μｇの抗Ｒｏｂｏ４抗体７１．２２（図１９Ａ）またはコントロール抗体（抗ＨＥＲ２、図１９Ｂ）を、尾静脈を介して注射して、１０分間循環させた。１００μｇのＦＩＴＣ−Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ（トマト）を注入して、５分間循環させた。マウスは、ＰＢＳ中に含まれる１％ＰＦＡで灌流させ、組織は３０％のスクロース中に収集して、ＯＣＴ中に凍結させた。抗体をＣｙ３ヤギ抗ヒトＩｇＧで検出した。図１９Ａによって、脈管構造中のＦＩＴＣ−Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ染色の位置は、周囲の組織に遊走するコントロールの抗体とは異なり、抗Ｒｏｂｏ４Ｃｙ３染色の位置と重複することが示される。
【０４５１】
前述の本発明は、理解の明確化を目的として図示および実施例によってある程度詳細に記載してきたが、その詳細な説明および実施例は、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。本明細書に引用される全ての特許、特許出願、科学的引用文献およびＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号の開示は、あたかも各々の特許、特許出願、科学的引用文献およびＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号が詳細にかつ個々に参照によって援用されるかのように、その全体が全ての目的のために参照によって明示的に援用されている。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図２−６】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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