(57)【要約】サンプル中の病原体の有無を決定する方法であって、ａ）前記病原体を結合することができる細胞表面受容体タンパク質の全部及び一部のずれかを、前記サンプルに接触させる工程と、ｂ）前記細胞表面受容体タンパク質及びその一部のいずれかを前記病原体に結合させる工程と、ｃ）前記受容体タンパク質及びその一部のいずれかを結合させる病原体の有無を決定する工程とを含むことを特徴とする方法を提供する。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の病原体の有無を決定する方法であって、
ａ）前記病原体を結合することができる細胞表面受容体タンパク質の全部及び一部のいずれかを、前記サンプルに接触させる工程と、
ｂ）前記細胞表面受容体タンパク質及びその一部のいずれかを前記病原体に結合させる工程と、
ｃ）前記受容体タンパク質及びその一部のいずれかを結合させた病原体の有無を決定する工程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
サンプル中の病原体の捕捉、濃縮、精製及び単離の少なくともいずれかを行う方法であって、
ａ）前記病原体を結合することができる細胞表面受容体タンパク質の全部及び一部のいずれかを、前記サンプルに接触させる工程と、
ｂ）前記細胞表面受容体タンパク質及びその一部のいずれかを前記病原体に結合させる工程と、
ｃ）前記受容体タンパク質及びその一部のいずれかを結合させた病原体の有無を決定する工程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項３】
方法がマイクロ流体法及びナノ流体法のいずれかである請求項１から２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
捕捉、濃縮、精製及び単離の少なくともいずれかを診断フロープロセス（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｆｌｏｗ  ｐｒｏｃｅｓｓ）の一部として行う請求項２から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
工程（ａ）が、サンプルと、細胞表面受容体タンパク質の病原体を結合させる部分のみとを接触させる工程を含む請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
細胞表面受容体タンパク質が、病原体のｉｎ  ｖｉｖｏでの野生型感染（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）の間、病原体に結合させられるタンパク質である請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
タンパク質に結合した病原体を濃縮する工程を更に含む請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
サンプルにおける病原体を定量する工程を更に含む請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
タンパク質に結合した病原体をサンプルから分離する工程を更に含む請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
病原体がウイルス及び細菌のいずれかである請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ウイルスがＲＮＡウイルスである請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ウイルスがＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）である請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
細胞表面受容体タンパク質がＣＤ８１受容体、ＣＤ２０９受容体、及びＣＤ２０９Ｌ受容体から選択される請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
細胞表面受容体タンパク質の一部がＣＤ８１受容体の大型細胞外ループ（ＬＥＬ）である請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
ウイルスがヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）である請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
細胞表面受容体タンパク質がＣＤ４及びＣＣＲ５のいずれかである請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ウイルスがインフルエンザウイルスである請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
細胞表面受容体タンパク質が、α２−３結合シアル酸受容体及びα２−６結合ＳＡ受容体のいずれかから選択されるシアロ糖タンパク質である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ウイルスがライノウイルスである請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
細胞表面受容体タンパク質がＩＣＡＭ１である請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
受容体の全部及び一部のいずれかが固体表面に結合される請求項１から２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
固体表面がビーズである請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ビーズが磁性ビーズである請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ビーズが非磁性ビーズである請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
受容体の全部及び一部のいずれかが、融合タグを有する融合タンパク質である請求項１から２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
融合タグがグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）である請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
融合タグが蛍光タンパク質である請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
病原体の有無の決定、及び、病原体の捕捉、濃縮、精製及び単離の少なくともいずれかのいずれかが被験体からのサンプルにおいて行われる請求項１から２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
サンプルが被験体から採取された体液である請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
体液が血液、尿、血清、及び血漿から選択される請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
病原体の有無の決定、及び、病原体の捕捉、濃縮、精製及び単離の少なくともいずれかのいずれかが環境由来サンプルにおいて行われる請求項１から２７のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
サンプルが土壌サンプル、大気サンプル、及び水サンプルのいずれかである請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
被験体における病原体の存在を診断する方法であって、
（ａ）被験体からサンプルを採取する工程と、
（ｂ）前記サンプル中の病原体の有無を請求項１から３０のいずれかに記載の方法によって決定する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）の結果に基づいて診断を行う工程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項３４】
サンプル中の病原体の捕捉、濃縮、精製、及び単離の少なくともいずれかを行う方法であって、
（ａ）サンプルを採取する工程と、
（ｂ）サンプル中の病原体の捕捉、濃縮、精製、及び単離の少なくともいずれかを請求項１から３０のいずれかに記載の方法によって行う工程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項３５】
細胞表面受容体の全部及び一部のいずれかと緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）とを含む融合タンパク質であって、細胞表面受容体タンパク質及びその一部のいずれかが病原体に結合するタンパク質である融合タンパク質。
【請求項３６】
細胞表面受容体タンパク質がＣＤ８１、ＣＤ２０９、及びＣＤ２０９Ｌのいずれかである請求項３５に記載の融合タンパク質。
【請求項３７】
サンプル中の病原体の存在を決定する方法における、及び、サンプル中の病原体の捕捉、濃縮、精製、及び単離の少なくともいずれかを行う方法のいずれかにおける、請求項３５から３６のいずれかに記載の融合タンパク質の使用。
【請求項３８】
マイクロ流体法及びナノ流体法のいずれか、及び診断フロープロセスの少なくともいずれかにおける請求項３５から３６のいずれかに記載の使用。
【請求項３９】
請求項１から２８のいずれかに記載の方法における請求項３７から３８のいずれかに記載の使用。
【請求項４０】
被験体において病原体の存在の診断を行う方法における請求項３７から３９のいずれかに記載の使用。
【請求項４１】
請求項３３から３４のいずれかに記載の方法における請求項４０に記載の使用。
【請求項４２】
サンプル中の病原体の存在を決定するため、及び、サンプル中の病原体の捕捉、濃縮、精製、及び単離の少なくともいずれかを行うため、のいずれかのキットであって、請求項３５から３６のいずれかに記載の融合タンパク質を含むことを特徴とするキット。
【請求項４３】
サンプルが被験体由来のサンプルである請求項４２に記載のキット。
【請求項４４】
サンプルが環境由来サンプルである請求項４２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプル中の病原体を検出する方法に関する。前記方法は、病原体を結合することができる細胞表面受容体タンパク質の全部及び一部のいずれかを、サンプルに接触させる工程を含む。前記細胞表面受容体タンパク質は、病原体のｉｎ  ｖｉｖｏでの野生型感染において、該病原体を結合するタンパク質であることが好ましい。本発明は、また、被験体を診断する方法、及び本発明の方法において使用される融合タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
診断を改善するために病原体の検出感度を向上させることは、重要な目的である。被験体及び患者のいずれかから採取したサンプル中の病原体を検出する従来のアッセイには、種々の制約がある。例えばＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の検出を行うために最もよく使用される手段は、微量の核酸を増幅したりするもの及び抗体を使用してウイルスタンパク質を検出するもののいずれかである（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）。これらの方法は、患者のサンプルを比較的多く用いることができて（例えば数ミリリットルの血液）検出に十分な量の核酸及び抗原のいずれかを利用できる場合に適切である。しかしながら、より少ない量の血液中における低力価ウイルスを検出すること、及びサンプル由来の病原体を濃縮及び精製する能力は、診断の大きな助けとなる。
【０００３】
１つの解決策が非特許文献７によって与えられており、これにはＡ群ロタウイルスの群特異的内部カプシドタンパク質（ＶＰ６）に対して製造されたモノクローナル抗体で被覆された磁性ビーズの使用が示されている。ウイルスが磁石によって捕捉され精製されると、次にウイルス粒子を熱破壊することによってウイルスのゲノムが逆転写に利用可能になり、ウイルスの検出及び分析の両方が可能になる。
【０００４】
ウイルスを濃縮する自明の方法は、抗体で被覆された不活性媒体を使用することであろう。しかし、このような解決策は、独自の問題点を抱えている。例えば、ＨＣＶなどのＲＮＡウイルスの検出においては、ウイルスのゲノムは、絶え間なく突然変異を起こしており、ウイルス表面のエピトープは、高アフィニティー抗体による検出を「回避する」ことができる。事実、一人の患者が有するＨＣＶの形態は、単一ではないことが示されている。それどころか、ウイルスは、多くの異なるゲノムを有する亜種として存在し、それゆえその宿主中では僅かに異なる表面タンパク質を有して存在する。このようなウイルスに対して感染の正確な分析結果を得るのは、困難となる可能性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｅｒｅｎｓｏｙ，  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ（ＨＣＶ）  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｖｉｒｏｌ．  ２００１年，２１巻（３号），ｐｐ．２７１−８１．
【非特許文献２】Ｋｕｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ａ  ｍａｊｏｒ  ｅｔｉｏｌｏｇｉｃ  ｖｉｒｕｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｎｏｎ−Ａ，  ｎｏｎ−Ｂ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８９年，２４４巻，ｐｐ．３６２−４．
【非特許文献３】Ｈｏｄｉｎｋａ，  Ｒ．Ｌ．，  Ｔｈｅ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｕｔｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｖｉｒａｌ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｔｈｏｄｓ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．  １９９８年，１０巻，ｐｐ．２５−４７．
【非特許文献４】Ｋｕｒｔｚ，ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ａｎ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ‘ｔｏｔａｌ’  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｃｏｒｅ  ａｎｔｉｇｅｎ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ２００１年，９６巻（２号），ｐｐ．１２７−３２．
【非特許文献５】Ｔｒｉｍｏｕｌｅｔ，ｅｔ  ａｌ．  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＶＥＲＳＡＮＴ  ＨＣＶ  ＲＮＡ  ３．０  Ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  Ｖｉｒｕｓ  ＲＮＡ  ｉｎ  Ｓｅｒｕｍ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．  ２００２年，４０巻（６号），ｐｐ．２０３１−２０３６．
【非特許文献６】Ｓｔｒａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ．  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２００４年，３９巻（４号），ｐｐ．１１４７−７１．
【非特許文献７】Ｇｒｉｎｄｅ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｒｏｕｐ  Ａ  ｒｏｔａｖｉｒｕｓｅｓ  ｂｙ  ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９９５年，５５巻（３号），ｐｐ．３２７−３８．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、サンプル中の病原体の有無を決定及び診断することができる改善された方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
従って本発明は、サンプル中の病原体の有無を決定する方法であって、
ａ）前記病原体を結合することができる細胞表面受容体タンパク質の全部及び一部のいずれかを、前記サンプルに接触させる工程と、
ｂ）前記細胞表面受容体タンパク質及びその一部のいずれかを前記病原体に結合させる工程と、
ｃ）前記受容体タンパク質及びその一部のいずれかを結合させた病原体の有無を決定する工程とを含むことを特徴とする方法を提供する。
【０００８】
本発明は、また、サンプルにおける病原体の捕捉、濃縮、精製及び単離の少なくともいずれかを行う方法であって、
ａ）前記病原体を結合することができる細胞表面受容体タンパク質の全部及び一部のいずれかを、前記サンプルに接触させる工程と、
ｂ）前記細胞表面受容体タンパク質及びその一部のいずれかを前記病原体に結合させる工程と、
ｃ）前記受容体タンパク質及びその一部のいずれかを結合させた病原体の有無を決定する工程とを含むことを特徴とする方法を提供する。
【０００９】
本発明の方法は、いずれのシステムにも適用できるが、特にマイクロ流体システム及びナノ流体システムのいずれかに適しており、特にこのようなシステムにおいて行われる診断フロープロセスに適している。
【００１０】
前記方法が、サンプルと、細胞表面受容体タンパク質の病原体を結合させる部分のみ（例えばＣＤ８１における大型細胞外ループ（ＬＥＬ））とを接触させる工程を含むのも特に好ましい。これは、関与する分子種のサイズを低減する一方で、病原体への結合に使用される手段を単純化するという利点を有し、これは、マイクロ流体システム及びナノ流体システムに特に適している。従来から、病原体の結合に関与する受容体の部分のみを使用する方法は、その信頼性に問題があった。しかし本発明では、これら問題点が克服されると共に信頼できる過程が開発されている。
【００１１】
好ましい態様において、前記方法は、結合病原体を濃縮する工程を更に含む。
【００１２】
この方法は、検出の前にサンプルからの低力価病原体を濃縮することを可能にするので特に有利である。その結果、比較的少量のサンプルで病原体を検出することができ、そして現行のアッセイの感度を向上させることができる。従って、病原体を比較的低濃度で有する患者も特定することができる。
【００１３】
特に、本発明の方法では、血液及び他の組織のいずれかからの無傷のＣ型肝炎ウイルスを、ＣＤ８１受容体、ＣＤ２０９受容体、及びＣＤ２０９Ｌ受容体のいずれか又はこれらの断片に対する該ウイルスの結合アフィニティーを利用して、濃縮及び検出することができる。これらのタンパク質及びその断片のいずれかは、不活性表面に結合させて使用できる。これらの受容体をそれ自体でタグにカップリングするか（例えばＣＤ８１−ＧＳＴ融合タンパク質）、磁性ビーズ及び他のビーズ（例えばアガロース）のいずれかなどの表面上でタグと混合させるかすることで、血液及び組織マトリックスのいずれかからウイルスを分離及び濃縮することが可能になる。結合させたウイルスは、次いで、検出及び下流におけるタンパク質、核酸、及び脂質の分析のために崩壊させることができる。
【００１４】
ＣＤ８１受容体は、高アフィニティーでＨＣＶ粒子のＥ１Ｅ２表面複合体に結合することが示されており、細胞へのウイルスの侵入に不可欠である。異なる遺伝子型のＨＣＶの全てがＣＤ８１に結合するが、そのアフィニティーは、僅かに異なる。仮に、結合時に極めて重要な役割を果たすウイルスのアミノ酸残基が突然変異によって有効に受容体にドッキングすることができなければ、ウイルスは、生育不能になり、細胞に侵入し複製することができないであろう。したがって、本発明の利点は、感染性を有するウイルス粒子のみ、即ちＣＤ８１受容体に結合可能なウイルス粒子のみを検出できることにある。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
以下の図面を参照して本発明を更に説明するが、これは、ほんの一例に過ぎない。
【図１】図１は、ＣＤ８１タグ付融合タンパク質に結合したＣ型肝炎ウイルス粒子の概略図である。
【図２】図２は、磁性粒子表面に結合したＣＤ８１  ＬＥＬタグ付融合タンパク質を介して磁性粒子に結合させられるＣ型肝炎ウイルス粒子の概略図である。
【図３】図３は、血漿サンプル由来のウイルスを濃縮、検出、及び分析する本発明の方法の一実施形態を示す概略図である。
【図４】図４は、ＧＦＰレポータータンパク質を使用してサンプル中のウイルスの有無を検出する本発明の方法の一実施形態を示す概略図である。
【図５】図５は、細胞膜におけるＣＤ８１のｉｎ  ｓｉｔｕでの構造を示す。ＬＥＬが見られる。
【図６】図６は、実施例１において使用されるＣＤ８１ＬＥＬのアミノ酸配列（配列番号１）とＤＮＡ配列（配列番号２）を示す。
【図７】図７は、ｐＧＥＸ６ｐ−１ベクターからのＧＳＴ遺伝子のアミノ酸配列（配列番号３）とＤＮＡ配列（配列番号４）を示す。
【図８】図８は、（Ａ）ＣＤ８１ＬＥＬ−ＧＳＴ融合タンパク質を発現している細菌細胞培養物から単離された封入体のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル；（Ｂ）ＣＤ８１ＬＥＬ−ＧＳＴと思われる高分子量バンドを示すウエスタンブロット（１６倍希釈）−より色の薄いバンドは、分解産物及びＧＳＴに相当する；（Ｃ）グルタチオンカラムからの溶出画分、レーン１：最初の封入体調製物、レーン２〜５溶出画分、を示す図である。
【図９】図９は、既知のＢＳＡ量との比較によるタンパク質濃度の決定を示す図である。
【図１０】図１０は、タンパク質アッセイキット（ＢＳＡ標準曲線）を用いたタンパク質濃度の決定を示す。
【図１１】図１１は、タンパク質のカルボキシル基への結合に関する化学反応を示す。
【図１２】図１２は、ＨＣＶｐｐからのＰＣＲ増幅ｅＧＦＰ遺伝子のゲル電気泳動を示す。キー；＋ｖｅ対照、ＲＮＡ単離ビーズを直接混合したＨＣＶｐｐ；ＣＤ８１被覆ビーズ、磁性ビーズに共有結合させたＣＤ８１ＬＥＬ−ＧＳＴを使用して濃縮したＨＣＶｐｐ；−ｖｅ対照、陰性対照（ｃＤＮＡ鋳型はない）。
【図１３】図１３は、３種のＰＣＲ産物の蛍光測定値を示す。励起波長、４９７ｎｍ；５２０ｎｍの波長の発光を読み取る。
【図１４】図１４は、ＨＣＶｐｐからのＰＣＲ増幅ｅＧＦＰ遺伝子のゲル電気泳動を示す。キー；Ｄ、２ｌｏｇ−ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ；＋ｖｅ、陽性対照、ＲＮＡ単離ビーズを直接混合したＨＣＶｐｐ；ＣＤ８１、磁性ビーズに共有結合させたＣＤ８１ＬＥＬ−ＧＳＴを使用して濃縮したＨＣＶｐｐ；ＣＤ８１Ｂ、ストレプトアビジン被覆磁性ビーズに結合させたビオチン化ＣＤ８１ＬＥＬ−ＧＳＴを使用して濃縮したＨＣＶｐｐ；−ｖｅ、陰性対照（ｃＤＮＡ鋳型はない）。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、サンプル中の病原体の有無を決定する方法であって、
ａ）前記病原体を結合することができる細胞表面受容体タンパク質の全部及び一部のいずれかを、前記サンプルに接触させる工程と、
ｂ）前記細胞表面受容体タンパク質及びその一部のいずれかを前記病原体に結合させる工程と、
ｃ）前記受容体タンパク質及びその一部のいずれかを結合させた病原体の有無を決定する工程とを含むことを特徴とする方法に関する。
【００１７】
本発明の病原体は、特に制限されず、ｉｎ  ｖｉｖｏでの野生型感染において特異的細胞表面受容体に結合する病原体であれば如何なる病原体であってもよい。病原体は、ＤＮＡウイルス及びＲＮＡウイルス、細菌類、真菌類、寄生生物類、及びプリオン類から選択することができる。本発明の方法は、上述したように、継続的に突然変異し易いＲＮＡゲノムを有するＲＮＡウイルスであって、ウイルス表面のエピトープが変化し得るＲＮＡウイルスを用いる場合に特に有用である。
【００１８】
本発明の方法は、被験体から採取したサンプル及び環境由来サンプルのいずれかにおける病原体の有無を決定するのに使用できる。したがって、用語「サンプル」は、特に限定されない。サンプルが被験体から採取される場合には、サンプルは、全血、尿、血漿、脊髄液又は血清等の体液、及び、固形組織又は細胞の粗溶解物のいずれかであってもよい。また、サンプルは、組織培養物由来であってもよい。サンプルを環境から採取する場合には、サンプルは、土壌サンプル、大気サンプル、水サンプル等の流体サンプルであってよい。
【００１９】
サンプルは、本発明の方法において使用する前に処理工程に付してもよい。例えば本発明における使用前にｉｎ  ｖｉｔｒｏでサンプルを培養してもよい。
【００２０】
本発明の好ましい態様では病原体は、Ｃ型肝炎ウイルスであり、本発明の方法は、血液及び他の組織のいずれかから無傷のＣ型肝炎ウイルス粒子を検出するために使用することができる。特に好ましい態様においては本発明の方法を、血液及び他の組織のいずれかから無傷のＣ型肝炎ウイルス粒子を濃縮及び検出するために使用することができる。
【００２１】
細胞表面受容体及びその一部のいずれかの性質は、病原体を特異的に結合する限り、特に制限されない。受容体及びその一部のいずれかは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの病原体の野生型感染の際に病原体に結合するタンパク質であることが好ましい。特に、この野生型感染は、哺乳動物、例えばヒトへの感染である。
【００２２】
用語「その一部」とは、細胞表面受容体タンパク質の断片を意味する。前記断片は、ウイルスへの結合を可能にするために正しい立体構造（即ち、野生型の立体構造）をとることができるように、十分に長いことが好ましい。しかし、より短い断片であっても、ウイルスの有効な検出及び分離の少なくともいずれかが可能となるのに十分高いアフィニティーでウイルスと結合するならば、これらの断片も使用することができる。特に、本発明の一実施形態においては、前記断片は、ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞表面の外膜上に露出する前記受容体の部分を含むのが好ましい。
【００２３】
前記受容体及びその一部のいずれかは、高アフィニティー及び高アビディティーのいずれかで病原体と結合するタンパク質であることが好ましい。特に受容体は、病原体を、１０−４Ｍ及びこれより高い親和性を示す解離定数（ＫＤ）のいずれかで結合するタンパク質である。受容体が病原体を１０−６ＭのＫＤで結合タンパク質であることが最も好ましい。これらの値は、従来技術の諸方法において成功裏に用いられるタンパク質の解離定数に匹敵する。例えば、１０−４ＭのＫＤを有する抗体が使用されている。更に、グルタチオンとグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼは、「良好」と見なされる約１０−６ＭのＫＤ（解離定数）を有し、そしてＧＳＴタグが組換えタンパク質を精製するのに使用されている（Ｎｉｅｓｌａｎｉｋ及びＡｔｋｉｎｓ  Ｔｈｅ  Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ｔｙｒ−９  ｏｆ  Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  Ａ１−１  Ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｔｈｅ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃ  ｔｅｒｍｉｎｕｓ．  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２０００年，２７５巻（２３号），ｐｐ．１７４４７−５１）。自然抗体は、最高で約１０−９Ｍのアフィニティーを有する。更に、ＣＤ８１も、約１０−９ＭのＫＤでＨＣＶタンパク質に結合することが示されており、これは、「強い」親和性と見なされる。ビオチンは、ストレプトアビジンに１０−１５ＭのＫＤで結合し、これは、「非常に強く−殆ど共有結合に近い」親和性と見なされる（Ｂｏｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  “Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ  ｆｅｍｔｏｍｏｌａｒ  （１０−１５Ｍ）  ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｆｆｉｎｉｔｙ．”  ＰＮＡＳ．  ２０００年，９７巻（２０号），ｐｐ．１０７０１−５）。
【００２４】
好ましい実施形態においては、前記細胞表面受容体は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの野生型感染の際に、病原体の結合及び細胞への侵入の少なくともいずれかを可能にするタンパク質、又は病原体結合及び細胞侵入の少なくともいずれかに部分的に関与するタンパク質である。
【００２５】
更に好ましい実施形態においては、前記細胞表面受容体タンパク質及びその一部のいずれかは、病原体と結合してタンパク質−病原体複合体を形成する。
【００２６】
前記細胞表面受容体タンパク質の全部及び一部のいずれかを本発明の方法に使用できる。本発明の一態様においては、前記タンパク質及びその一部のいずれかは、融合タンパク質として使用される、即ち、タグに結合させられる。適切なタグ、即ち融合タンパク質のパートナーには、二量体化し結合を促進することが示されているグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等がある。
【００２７】
特にＧＳＴタグは、病原体粒子の濃縮、分離、及び精製のいずれかが必要とされる方法に使用することができる。前記ＧＳＴタグは、細胞表面受容体タンパク質及びその一部のいずれかのＮ末端及びＣ末端のいずれかに融合される。ＧＳＴ−融合タンパク質は、例えばＥ．ｃｏｌｉ等の細菌システムにおいて組換えタンパク質として容易に産生することができる。ＧＳＴ融合タンパク質にサンプルを接触させて病原体を結合させた後、ＧＳＴ−融合タンパク質−病原体複合体を、ＧＳＴの基質であるグルタチオンと接触させることによってサンプルから分離することができる。特に、このグルタチオンで、セファロースビーズを被覆してもよい。前記複合体がビーズに結合した時点で、洗浄してサンプルの残りを除去し、サンプルの残りと病原体とを分離し、病原体を濃縮する。
【００２８】
本発明の別の実施形態においては、前記細胞表面受容体タンパク質及びその一部のいずれかは、ＧＦＰ及び他のレポータータンパク質のいずれかとの融合タンパク質として使用される。このような融合タンパク質は、サンプル中の病原体の有無の検出に抗体の場合と同様にして使用することができる。図４に示す概略図は、この実施形態がどのように行われるかを示す。具体的には、受容体（例えばＣＤ８１ＬＥＬ）遺伝子及びレポーター（例えばＧＦＰ）遺伝子を、適切なプロモーター配列と、ポリアデニル化配列と、必要に応じて精製用タグ（例えばＧＳＴ、ポリヒスチジン、ＩｇＧＦｃなど）とを含有するプラスミド中にクローン化することができる。前記の各遺伝子は、プラスミド中に同時に存在し、小型のリンカー領域で隔てられていてもよい。前記プラスミドを、次に細胞（細菌細胞及び真核細胞のいずれか）に形質導入又はトランスフェクトする。そして、発現した組換え受容体／レポーター融合タンパク質は、確立された技法を使用して精製することができる（例えばＧＳＴタグに対するグルタチオンカラムの使用、及び、抗受容体抗体若しくは抗レポーター抗体で被覆されたカラムの使用のいずれか）。
【００２９】
（未結合）受容体は、プラスチックイムノプレート、アガロースビーズ、磁性ビーズ等の不活性表面上に固定化させる。前記磁性ビーズの直径は、１０ｎｍ以上であることが好ましく、１０ｎｍ〜１０μｍであることがより好ましく、１００ｎｍ〜５μｍであることが更に好ましい。これらのビーズの市販品としては、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ＭＡＣＳビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）、Ｂｉｏ−Ａｄｅｍｂｅａｄｓ（Ａｄｅｍｔｅｃｈ  Ｐａｒｃ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｑｕｅ  Ｕｎｉｔｅｃ）等を利用することができる。アガロースビーズもまた適切なものが市販されており、例えばＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃから入手することが利用できる。
【００３０】
固定化された無傷の病原体を、前記受容体／レポーター融合タンパク質を用いて検出することができる。レポーターが蛍光性を有する場合、レポーターは直接検出できる。レポーターは、また、基質の化学的特性の変化を誘発することができる酵素（例えばアルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ等）であってもよい。更には、抗レポーターコンジュゲート抗体を、病原体の有無を検出するために使用することもできよう。
【００３１】
病原体が受容体へのドッキング部位を複数有するウイルスである場合には、これら部位の幾つかは、捕捉のために用いることができ、また他の幾つかは、検出のために用いることができる。
【００３２】
前記融合タンパク質は、不活性表面及び固体表面上のいずれかに結合させることができる。適切な表面としては、例えば受動的吸着（例えば重炭酸ナトリウム緩衝液を用いて）、イオン性吸着、臭化シアン、カルボジイミド、ニッケル／ヒスチジン、光化学反応等の多数の利用可能なカップリング化学反応を用いて前記融合タンパク質を結合させることができる磁性ビーズ及びアガロースビーズのいずれかなどがある。また、前記融合タンパク質は、融合タンパク質を前記表面に結合させることを可能にする更なるタンパク質及びペプチドのいずれかを含んでいてもよい。例えば、アビジンで被覆したビーズへ結合させるために、前記融合タンパク質にビオチンタグを付加してもよい。
【００３３】
利用可能と考えられるＲＮＡウイルスとそのそれぞれに対応する細胞表面受容体の組み合わせは、Ｃ型肝炎ウイルスとＣＤ８１（特にＣＤ８１の大型細胞外ループ（ＬＥＬ））；Ｃ型肝炎ウイルスとＣＤ２０９；Ｃ型肝炎ウイルスとＣＤ２０９Ｌ；ライノウイルスとＩＣＡＭ１；ヒト免疫不全ウイルスとＣＤ４；ヒト免疫不全ウイルスとＣＣＲ５；インフルエンザとシアロ糖タンパク質等である。
【００３４】
利用可能と考えられるＤＮＡウイルスとそのそれぞれに対応する細胞表面受容体の組み合わせは、単純ヘルペスウイルスとｎｅｃｔｉｎ−１（Ｓｐｅａｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ  ｏｎ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｇＤ  ｃａｎ  ｔｒｉｇｇｅｒ  ｅｖｅｎｔｓ  ｌｅａｄｉｎｇ  ｔｏ  ｃｅｌｌ  ｆｕｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｖｉｒａｌ  ｅｎｔｒｙ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．  ２００６年，３４４巻（１号），ｐｐ．１７−２４；Ｃｏｍｐｔｏｎ．  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｅｎｓｏｒｓ：  ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｅｎｔｒｙ  ｐａｔｈ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ．  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．  ２００４年，１４巻（１号））；サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（同じく、ヘルペスウイルス）と上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）（Ｓｐｅａｒ．  Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ：  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ  ｅｎｔｒｙ．  Ｃｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２００４年，６巻（５号），ｐｐ．４０１−１０）；麻疹とＣＤ１５０（Ｓｉｄｏｒｅｎｋｏ及びＣｌａｒｋ  Ｔｈｅ  ｄｕａｌ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ＣＤ１５０  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ：  ｔｈｅ  ｖｉｒａｌ  ａｔｔｒａｃｔｉｏｎ．  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００３年，４巻（１号），ｐｐ．１９−２４）；エプスタイン−バーウイルス（腺熱及び多数の癌を引き起こす）と補体受容体２（ＣＲ２）（Ｆｉｎｇｅｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｂ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｉｓ  ｔｈｅ  Ｃ３ｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＣＲ２．  ＰＮＡＳ．  １９８４年、８１巻，ｐｐ．４５１０−１４）等である。
【００３５】
本発明の１つの態様においては、病原体がＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）であり、細胞表面受容体がＣＤ８１である。ＨＣＶは、フラビウイルス科のプラス鎖ＲＮＡウイルスである。肝細胞及びＢリンパ球等の種々の細胞に発現する細胞表面受容体であるＣＤ８１が、ＨＣＶのエンベロープタンパク質Ｅ２に結合することが示されている。特に、ＣＤ８１の大型細胞外ループ（ＬＥＬ）が、ＨＣＶ粒子に結合することが示されている（Ｐｉｌｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｔｏ  ＣＤ８１．  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  １９９８年，２８２巻，ｐｐ．９３８−４１）。更に、他の有用な受容体としては、ＣＤ２０９、ＣＤ２０９Ｌ等（Ｃｏｒｍｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｌ−ＳＩＧＮ  （ＣＤ２０９Ｌ）  ａｎｄ  ＤＣ−ＳＩＧＮ  （ＣＤ２０９）  ｍｅｄｉａｔｅ  ｔｒａｎｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｖｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ．  ＰＮＡＳ  ２００４年，１０１巻（３９号），ｐｐ．１４０６７−１４０７２）及びこれらに由来するペプチドのいずれかがある。
【００３６】
これらの及び他のウイルス−受容体の組み合わせを次の表１に示す。
【表１】
2010518046.tif 000003
【００３７】
好適な細菌と受容体との組み合わせを次の表２に示す。
【表２】
2010518046.tif 000004
出典：http://textbookofbacteriology.net/colonization.html
【００３８】
更に、次の表３に好適な寄生生物と受容体の組み合わせを示す。
【表３】
2010518046.tif 000005
【００３９】
本発明の好ましい態様においては、被験体を診断する方法が提供される。具体的には、被験体における病原体の有無を診断する方法であって、
（ａ）被験体からサンプルを採取する工程と、
（ｂ）前記サンプルにおける病原体の有無を上述の方法によって決定する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）の結果に基づいて診断を行う工程とを含むことを特徴とする方法が提供される。
【００４０】
更に本発明は、被験体由来のサンプルにおいて病原体の有無を決定するためのキットであって、上述の融合タンパク質を含むキットを提供する。特に、前記融合タンパク質は、細胞表面受容体の全部及び一部のいずれかと緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）とを含み、前記細胞表面受容体タンパク質及びその一部のいずれかは、病原体のｉｎ  ｖｉｖｏでの野生型感染において病原体に結合するタンパク質である。特定の実施形態においては、前記細胞表面受容体タンパク質は、ＣＤ８１、ＣＤ２０９、及びＣＤ２０９Ｌのいずれかである。
【００４１】
本発明のキットは、被験体から採取したサンプル中及び環境由来サンプル中のいずれかの病原体の有無を決定するのに使用できる。
【００４２】
更にキットは、細胞表面受容体タンパク質に結合した磁性ビーズ及び不活性ビーズのいずれか、例えばＣＤ８１ＬＥＬが結合した磁性ビーズ及び不活性ビーズのいずれかを含むことができる。あるいは、前記キットは、遊離のＣＤ８１ＬＥＬなどの、単独で存在する細胞表面受容体タンパク質と、カップリング緩衝液とを含むことができる。カップリング緩衝液は、例えばＣＤ８１のビーズへの結合など、ペプチド／タンパク質等の不活性表面との効率的な共有結合若しくは水素結合、及び他のタンパク質／ペプチド／核酸等との効率的な共有結合若しくは水素結合のいずれかを可能にする最適なレベルの塩、ｐＨ等を有する緩衝液である。適切なカップリング緩衝液の例としては、０．１Ｍ炭酸ナトリウム、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ９．０；０．１Ｍホウ酸ナトリウム、ｐＨ８．５；０．０２Ｍリン酸ナトリウム、０．２Ｍ塩化ナトリウム、及び３．０ｇ／Ｌシアノ水素化ホウ素ナトリウム、ｐＨ７．５；０．０１Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．５などが挙げられる。
【００４３】
本発明のキットは、次の緩衝液の１以上を更に含んでいてもよい：洗浄緩衝液、結合緩衝液、溶出緩衝液、及び希釈緩衝液。
【００４４】
洗浄緩衝液は、非特異的に結合した汚染物質の除去に使用され、また最適レベルの塩、ｐＨ等を有する。この緩衝液は、また、Ｔｗｅｅｎ−２０、ｎｏｎｉｄｅｔ等の非イオン性界面活性剤をしばしば含有する。
【００４５】
結合緩衝液は、関心のあるアナライトの結合（例えばＨＣＶのＣＤ８１への結合）を最適化し、その例としては、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）がある。
【００４６】
ブロッキング緩衝液は、「遊離の」反応基をブロックすることによって、人工的にシグナルを増加させることもある汚染物質（例えば第二抗体など）の結合を防止する。ブロッキング緩衝液は、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１Ｍエタノールアミン、魚皮ゼラチン、ブタゼラチン等を含有することができる。
【００４７】
溶出緩衝液は、関心のあるアナライトを結合状態から分離状態とすることを可能にし、最適レベルの塩等を含有する、及び結合した抗原と直接競合する可溶性化合物を含有するのいずれかである。例えば、グルタチオンカラムに結合したＧＳＴ融合タンパク質は、１０ｍＭの還元型グルタチオンを含有する緩衝液によって溶出される。加えて、溶出を最適化するために、これら溶液のｐＨを他の緩衝液のｐＨよりも上昇させたり低下させたりすることができる。例としては、グリシン緩衝液を挙げることができる。
【００４８】
希釈緩衝液は、サンプルを希釈して実際に使用できる範囲内の濃度にするために使用され、その後の反応には干渉しない緩衝液である。例としては、トリス緩衝液、ＰＢＳ等を挙げることができる。
【００４９】
更に、本発明のキットは、基質及び基質緩衝液；陽性対照及び陰性対照；検量用物質（ｃａｌｉｂｒａｔｏｒｓ）、検出タンパク質、及び増幅タンパク質（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）を更に含んでいてもよい。
【００５０】
受容体で被覆されたビーズを含む場合には、前記キットには多くの用途が見出される。前記受容体被覆ビーズは、例えば、診断及び研究の両方において使用できる。医学的用途の例としては、透析タイプの療法において患者の血液から病原体（例えばＨＣＶ）ウイルス粒子を除去することが挙げられる。前記ビーズを、患者由来のサンプル（血液及び生検材料のいずれか）及び培養サンプルのいずれかに混合することができる。ビーズをウイルスに結合させ、次いで例えば電磁石上に固定化することができる。続いて前記ビーズを洗浄し、必要に応じて以降の用途のために汚染物質を除去することができる。結合したウイルス粒子を次に少量の液体中で崩壊させて（即ち濃縮し）核酸、タンパク質、及び脂質を放出させることができ、これらの試料は、更なる分析のために利用することができる。あるいは、ＧＳＴタグを切断し（確立されたプロトコールを使用して）、ＣＤ８１ＬＥＬに結合した精製済の無傷のウイルスを研究用途における更なる分析のために使用することができる。
【実施例】
【００５１】
（背景及び概略図）
図３及び図４は、本発明がどのようにウイルス（例えばＨＣＶ）及び細胞表面受容体タンパク質（例えばＣＤ８１）のＬＥＬ部分に働きかけるかについての概略図である。
【００５２】
受容体（例えばＣＤ８１  ＬＥＬ）遺伝子を、適切なプロモーター配列、ポリアデニル化配列、更には精製用タグ（ＧＳＴ、ポリヒスチジン、ＩｇＧＦｃ等）を含有するプラスミド中にクローン化する。次に前記プラスミドの、細胞（細菌細胞及び真核細胞のいずれか）への形質導入及びトランスフェクトのいずれかを行う。そして、発現した受容体タンパク質は、確立された技法（例えばＧＳＴタグを利用する場合にはグルタチオンカラム、抗受容体抗体被覆カラム、プロテインＡ／Ｇカラム等）を用いて精製することができる。
【００５３】
次に前記精製ペプチドを、例えば磁性ビーズ、非磁性ビーズ、免疫吸着プレート等の不活性表面に結合させるが、不活性表面は、これらに制限されるものではない。次に、無傷ＨＣＶウイルスを含有する血漿を添加してインキュベートし、ウイルス粒子を固定化受容体に接触させる。続いて血漿を除去しウイルス粒子を少量の液体に再懸濁する。このプロセスには、確立された手段による検出及び上述した受容体／レポーター法を介した検出のいずれかに先立ち、ＨＣＶウイルスを濃縮する働きがある。
【００５４】
以下の実施例において使用される略語は、以下の意味を有する。
ＢＳＡ                ウシ血清アルブミン
ＣＤ８１              分化抗原８１のクラスター
ＥＤＡＣ              Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ′−エチルカルボジイミド塩酸塩
ＨＣＶ                Ｃ型肝炎ウイルス
ＨＣＶｐｐ            ＨＣＶ擬似粒子（ＨＣＶ  ｐｓｅｕｄｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）
ＨＩＶ                ヒト免疫不全ウイルス
ＩｇＧ                免疫グロブリンＧ
ＬＥＬ                大型細胞外ループ（ＣＤ８１の）
ｍＡｂ                モノクローナル抗体
ＭＥＳ                ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸
ＮＨＳ                Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド
ＰＢＳ                リン酸緩衝生理食塩水
ＰＣＲ                ポリメラーゼ連鎖反応
ＲＴ−ＰＣＲ          逆転写ＰＣＲ
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ      ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
【００５５】
（実施例１−ＨＣＶ擬似粒子を濃縮するためのアッセイにおけるＣＤ８１被覆ビーズの使用）
この実施例では、粒子表面上にＨＣＶのＥ１、Ｅ２を発現するＨＣＶ擬似粒子（ＨＣＶｐｐ）を濃縮するアッセイにおける、ＣＤ８１被覆ビーズの構築及び使用について詳述する。
【００５６】
ＣＤ８１は、ＨＣＶを結合するための受容体である。ＨＣＶ表面上のＥ２タンパク質は（Ｅ１との複合体として）、大型細胞外ループ（ＬＥＬ）を介してＣＤ８１に直接結合する（図５参照）。加えて、ＣＤ２０９及びＣＤ２０９Ｌ等の他の受容体もまた、ウイルスの細胞への結合において重要であることが示されている。
【００５７】
（方法）
＜ＣＤ８１ＬＥＬ−ＧＳＴの設計、クローン化、発現、及び精製＞
この実施例において使用されるＣＤ８１ＬＥＬ−ＧＳＴ融合タンパク質は、自由に利用可能な配列（受託番号：ＮＭ００４３５６、ＥＦ０６４７４９、及びＢＣ０９３０４７）を使用して設計した。使用したＣＤ８１ＬＥＬのアミノ酸配列及びＤＮＡ配列を、図６及び以下に示す：
【００５８】
2010518046.tif 000006
【００５９】
2010518046.tif 000007
【００６０】
この設計には、Ｅ２エンベロープタンパク質に結合することが先に示されているＣＤ８１ＬＥＬを含んでいた。ＣＤ８１ＬＥＬをヒトｃＤＮＡライブラリーから得ると共に増幅し、これを、標準的な分子生物学的技法を使用して遺伝子改変したＧＳＴ遺伝子（ＦｕｓｉｏｎＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｌｔｄ（ベルファスト、北アイルランド）製）を含有するｐＧＥＸ６ｐ−１ベクター（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）中にクローン化した。このＧＳＴのアミノ酸配列及びＤＮＡ配列を、図７及び以下に示す。
【００６１】
2010518046.tif 000008
【００６２】
2010518046.tif 000009
【００６３】
この融合タンパク質の発現は、Ｅ．ｃｏｌｉの実験室株（ＢＬ２１  ＳＴＡＲ株）を使用して達成した。先ず、この融合タンパク質を、封入体（そのドデシルナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動ゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）像は、図８参照のこと）を単離することによって単離した。精製タンパク質の可溶化及びリフォールディングは、透析によって行った。リフォールディングの間、凝集は、見られなかった。この発現融合タンパク質を、更に、グルタチオンアガロースカラム（ＧＳＴｒａｐカラム）に添加し、ＰＢＳで洗浄し、遊離グルタチオン（これは、後に透析によって除去される）を用いて溶出し、カラムクロマトグラフィーを用い濃縮して精製した。この融合タンパク質の濃度（０．６ｍｇ／ｍＬ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で既知量のＢＳＡと比較し（図９）、またタンパク質アッセイキット（ＰｉｅｒｃｅのＭｉｃｒｏ  ＢＣＡ）を使用することによって（図１０）決定した。そのデータを以下に示す。
【表４】
2010518046.tif 000010
【００６４】
＜ＣＤ８１ＬＥＬ−ＧＳＴの常磁性マイクロビーズへの結合＞
ＣＤ８１ＬＥＬ−ＧＳＴ融合タンパク質を、Ｄｙｎａｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の直径２．８μｍのカルボン酸被覆常磁性ビーズに共有結合させた。比較のために、ビオチン化ＣＤ８１ＬＥＬ−ＧＳＴをストレプトアビジン被覆ビーズ（非共有結合とはいえ強力な水素結合によって結合している）と混合した。使用した濃度及び技法は、製造元の推奨事項に基づいたものである。次に、ＨＣＶｐｐの濃度測定が可能かどうかを判定するアッセイにこのビーズを使用した。
【００６５】
３％ビーズ懸濁液１ｍｇに対し５００μｇの融合タンパク質の濃度割合で、マイクロビーズを融合タンパク質で被覆した。
【００６６】
（材料）
【表５】
2010518046.tif 000011
【００６７】
＜カルボン酸活性化ビーズへのＣＤ８１ＬＥＬ−ＧＳＴの共有結合＞
Ｄｙｎａｂｅａｄｓを０．１３６ｍＬ（２．７２×１０８ビーズ）ずつ１．５ｍＬチューブに等分した。このビーズを、磁石を使用して１分間固定化することによって洗浄した。上清を取り除き、１ｍＬの５０ｍＭ  ＭＥＳを添加した。この溶液を、ｒｏｔａｍｉｘｅｒを用いて５分間穏やかに回転することにより混合した。ビーズを前述のようにして固定化し、上清を取り除いた。この洗浄工程は、２回繰り返した。０．９２５ｍＬの５０ｍＭ  ＭＥＳ溶液を、溶液から分離したビーズに添加した。この溶液を回転により５分間混合した。５０ｍＭのＭＥＳに６０ｍｇ／ｍＬでＮＨＳを溶解させた溶液２５μＬを、５０ｍＭのＭＥＳに１００ｍｇ／ｍＬでＥＤＡＣを溶解させた溶液２５μＬと共にビーズに添加し、結合用のビーズを調製した。この溶液を１５分間回転し、次に上清を前述と同様にして取り除いた。この活性化工程は、２回繰り返した。０．９ｍＬのＣＤ８１ＬＥＬ−ＧＳＴ溶液を、ｐＨを維持するための０．５ｍＬの５０ｍＭ  ＭＥＳ溶液と共にビーズに添加した。１００μＬの１Ｍトリス−塩酸緩衝液を混合物に添加し、続いてこれを１時間回転し、その後上清を前述と同様にして除去した。このビーズを１ｍＬの洗浄緩衝液中に穏やかに再懸濁した。次にこの混合物を５分間回転し、前述と同様にして上清を除去した。この洗浄工程をもう１度繰り返し上清を除去した。ビーズは、１ｍＬの希釈緩衝液に再懸濁し、２℃〜８℃で保存した。
【００６８】
タンパク質のカルボキシル基への結合に関する化学反応を図１１に示す。脱水剤であるＥＤＡＣがビーズ上のカルボキシル基と反応して、アミン反応性Ｏ−アシルイソウレア中間体を形成する。ＮＨＳ分子が、中間体をアミン反応性スルホ−ＮＨＳエステルへ変換することによって中間体を安定化させ、これは、ＥＤＡＣが媒介する結合反応の効率を向上させる。
【００６９】
（実施例２−ＣＤ８１濃縮ＨＣＶｐｐ  ｅＧＦＰ遺伝子のＲＮＡ単離、逆転写、ＰＣＲ増幅）
（材料）
ＨＣＶ擬似粒子
ＭａｇＭＡＸウイルスＲＮＡキット−Ｃａｔ＃ＡＭ１９３９  Ｌｏｔ＃０７０９００４
Ｆｏｒｗａｒｄプライマー−Ｏｌｉｇｏ  Ｎｏ  ７０７２７  Ｂｒｕｃｅ  ２Ｆ０３  ３／４
Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー−Ｏｌｉｇｏ  Ｎｏ  ７０７３１  Ｂｒｕｃｅ  ２Ａ０１４／４
高圧蒸気滅菌水
逆転写酵素（ｉｍｐｒｏｍ  ＩＩ）−Ｍ３１４Ａ  Ｌｏｔ＃２４１３９６０２
逆転写酵素緩衝液×５−Ｃａｔ＃  Ｍ２８９Ａ  Ｌｏｔ＃  １７１９８５５８
ＭｇＣｌ２−Ｃａｔ＃  Ａ３５１Ｈ  Ｌｏｔ＃  ２２５３５６４２
ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ−Ｌｏｔ＃１２５ｋ１２１２
アガロース−Ａ９５３９−２５Ｇ  Ｌｏｔ＃１２ｋｋ０１５７  ×１０ＴＡＥ緩衝液
ＰＣＲ精製キット−Ｃａｔ＃２８１０４  ＧＲ＃  ２１１６６／１  Ｌｏｔ＃  １２７１４７８５４
ＲＮａｓｅ  Ｈ−Ｃａｔ＃Ｍ０２９７５  ５０００Ｕ／ｍｌ  Ｌｏｔ＃  ３
ＲＮａｓｅ  ×１０緩衝液−Ｃａｔ＃  Ｂ０２９７Ｓ  Ｌｏｔ＃１１０５
Ｅａｓｙ  Ａ  ｈｉｇｈ  ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ−Ｃａｔ＃６００６４０−５１  Ｌｏｔ＃０８７０４４８
Ｑｕｉｃｋ  ｌｏａｄ  ２−ｌｏｇ  ｌａｄｄｅｒ−＃Ｎ０４６９Ｓ  Ｌｏｔ：５
Ｃｏｒｎｉｎｇ  ｔｈｅｒｍｏｗｅｌｌ  ｇｏｌｄ  ＰＣＲ  ｔｕｂｅｓ  ０．５ｍｌ−ｌｏｔ＃３２００６０２３
Ｃｏｒｎｉｎｇ  ｔｈｅｒｍｏｗｅｌｌ  ｇｏｌｄ  ＰＣＲ  ｔｕｂｅｓ  ０．２ｍｌ−ｌｏｔ＃０８８０７０２０
高圧蒸気滅菌ＰＢＳ
【００７０】
＜ウイルスの濃縮＞
１００μＬの擬似粒子溶液（ウイルス濃度：１０５／ｍＬ）と１００μＬの被覆済みビーズとを５００μＬのＰＣＲチューブに添加した。得られたミックスを３秒間、中程度の速度でボルテックスした。この処理チューブを３７℃で１時間インキュベートした。次に、ビーズを捕捉するために処理チューブをマグネットスタンドに移動させた。このチューブを、マグネットスタンド上に３０秒間放置し、その後、注意深く上清を吸引除去した。次に、１００μＬのＰＢＳ（１０ｍＭ）をサンプルに添加した。ボルテックスする工程、インキュベートする工程、マグネットスタンドに設置する工程、及び吸引する工程を繰り返し、ビーズを２０μＬのＰＢＳ中に再懸濁した。
【００７１】
＜ＭａｇＭａｘウイルスＲＮＡの単離＞
各処理チューブに、２００μＬの調製済みＭａｇＭａｘウイルスＲＮＡ単離キット溶解／結合溶液と、２０μＬのビーズミックスと、１００μＬのサンプル（擬似粒子）と、７５μＬのＭａｇＭａｘウイルスＲＮＡ単離キット洗浄溶液ｎｏ．１とを添加した。３秒間ボルテックスすることにより、混合した。ビーズを捕捉するために処理チューブをマグネットスタンドに移動させた。このチューブを、マグネットスタンド上に３０秒間放置し、その後、注意深く上清を吸引除去した。次に、１１２μＬのＭａｇＭａｘウイルスＲＮＡ単離キット洗浄溶液ｎｏ．２をサンプルに添加した。ボルテックスする工程、インキュベートする工程、マグネットスタンドに設置する工程、及び吸引する工程を繰り返し、５０μＬ溶出緩衝液をサンプルに添加し、５秒間ボルテックスした。ＲＮＡ結合ビーズをマグネットスタンド上で３０秒間捕捉した。ＲＮＡを含有する上清を、ヌクレアーゼを含有しない容器に移した。
【００７２】
＜逆転写プロトコール＞
ＰＣＲを行うためには、このＧＦＰのＲＮＡを先ずｃＤＮＡへ逆転写する必要がある。これは、次のプロトコールを使用することで達成した。
１．プライマー及びＲＮＡを共に加え、７０℃で５分間融解させ、次にこれらを氷上に移した。この工程によって、プライマーのＲＮＡへのアニーリングを行った。
２．最初のプライマー／ＲＮＡ混合物を氷冷した後、残りの成分を添加した。
【００７３】
逆転写のための成分を以下に示す。
全ＲＮＡ＝５０μＬ（精製工程において回収した５０μＬ）
ＧＦＰ  Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー＝５μＬ
Ｈ２Ｏ＝逆転写用成分の最終容量を１００μＬにするために補充される量＝９μＬ
酵素緩衝液×５＝２０μＬ
ＭｇＣｌ２＝１０μＬ
１０ｍＭ  ｄＮＴＰｓ＝５μＬ
逆転写酵素＝１μＬ
【００７４】
用いた逆転写プログラムは、４２℃で２分間、９５℃で５分間、次に４℃に維持するものとした。
【００７５】
＜ＲＮａｓｅ  Ｈ処理＞
ＰＣＲを終了した後、如何なる残存ＲＮＡ鎖をも消化するために１μＬのＲＮａｓｅ  Ｈを添加した。この酵素を１１μＬの×１０ＲＮａｓｅ緩衝液と共に添加した。反応混合物を３７℃で１０分間、続いて９５℃で５分間置いた。
【００７６】
＜ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製微小遠心プロトコール＞
１容量の前記ＰＣＲ反応物に対して５容量のバッファーＰＢＩを添加し、混合した。ＱＩＡｑｕｉｃｋカラムを、提供された２ｍＬのコレクションチューブ中に設置した。前記サンプルをこのＱＩＡｑｕｉｃｋカラムにアプライし、カラムを３０秒間〜６０秒間遠心した。フロースルーを廃棄し、ＱＩＡｑｕｉｃｋカラムを同一のチューブ中に戻した。洗浄のために０．７５ｍＬのバッファーＰＥをＱＩＡｑｕｉｃｋカラムに添加し、カラムを３０秒間〜６０秒間遠心した。フロースルーを廃棄し、ＱＩＡｑｕｉｃｋカラムを同一のチューブ中に戻した。カラムを２ｍＬのコレクションチューブ（提供される）中で１分間遠心した。各ＱＩＡｑｕｉｃｋカラムを、汚染物質を含まない１．５ｍＬの微小遠心管中に設置した。５０μＬのバッファーＥＢ（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８．５）及び水のいずれかを、ＱＩＡｑｕｉｃｋメンブランの中心に添加し、カラムを１分間遠心しＤＮＡを溶出させた。ＤＮＡ濃度を増大させるために、３０ｍＬの溶出緩衝液（ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）を前記ＱＩＡｑｕｉｃｋメンブランの中心に添加し、このカラムを１分間放置し次いで遠心した。精製ＤＮＡをゲル上で分析する場合には、５容量の精製ＤＮＡに対して１容量のローディングダイを添加する。ゲルに添加する前に、ピペットでこの溶液の吸い上げと吐き出しを行って混合した。
なお、全ての遠心は、１７，９００×ｇで行った。
【００７７】
＜ＰＣＲプロトコール＞
ここで上述の工程において製造されたｃＤＮＡを、使用してＰＣＲによって増幅することができるようになっている。これは、以下のようにして行った。
【００７８】
成分：
ｃＤＮＡ＝１μＬ（ＲＴ−ＰＣＲからの製造物の一部）
ＧＦＰ  Ｆｏｒｗａｒｄプライマー＝２μＬの１０ｐｍｏｌｅ／μＬ溶液
ＧＦＰ  Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー＝２μＬの１０ｐｍｏｌｅ／μＬ溶液
Ｈ２Ｏ＝成分の最終容量を５０μＬにするために補充される量
Ｅａｓｙ  Ａ  ｈｉｇｈ  ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ＝２５μＬ
（ｄＮＴＰｓ、酵素、及びＭｇＣｌ２を含有する）
【００７９】
用いたプログラムは、９５℃で２分間の初期変性ステップと、これに続いて、９５℃（０．３０）；５５℃（０．３０）；７２℃（０．１０）を１サイクルとする処理を２５サイクル行うステップと、７２℃で７．００の処理を行うステップと、４℃に保持するステップとを含む。
【００８０】
＜増幅試験＞
ＴＡＥ（１ｇのアガロースを１００ｍＬ緩衝液に溶解）を用いて０．７５％のアガロースゲルを調製した。ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ（５０μＬに対して１μＬ）を用いてＤＮＡを染色した。５μＬのローディングバッファーを各５０μＬの反応混合物にピペットで添加し、続いてその１０μＬをゲルのウェルにピペットで添加した。ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎを添加した１０μＬのｑｕｉｃｋ  ｌｏａｄ  ２  ｌｏｇ  ｌａｄｄｅｒを、ゲルのレーン１に添加した。電気泳動を、１５０Ｖ、１００ｍＡで１時間３０分間行った。
【００８１】
＜結果＞
図１２は、ＨＣＶｐｐからのＰＣＲ増幅ｅＧＦＰ遺伝子のゲル電気泳動像を示す。ゲルを構成するレーンは；＋ｖｅ対照、ＲＮＡ単離ビーズを直接混合したＨＣＶｐｐ；ＣＤ８１被覆ビーズ、磁性ビーズに共有結合させたＣＤ８１ＬＥＬ−ＧＳＴを使用して濃縮したＨＣＶｐｐ；−ｖｅ対照、陰性対照（ｃＤＮＡ鋳型はない）。
【００８２】
図１３は、３種のＰＣＲ産物の蛍光測定値を示す。励起波長、４９７ｎｍ；５２０ｎｍの波長の発光を読み取る。
【００８３】
図１４は、ＨＣＶｐｐからのＰＣＲ増幅ｅＧＦＰ遺伝子のゲル電気泳動像を示す。キー；Ｄ、２ｌｏｇ−ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ；＋ｖｅ、陽性対照、ＲＮＡ単離ビーズを直接混合したＨＣＶｐｐ；ＣＤ８１、磁性ビーズに共有結合させたＣＤ８１ＬＥＬ−ＧＳＴを使用して濃縮したＨＣＶｐｐ；ＣＤ８１Ｂ、ストレプトアビジン被覆磁性ビーズに結合させたビオチン化ＣＤ８１ＬＥＬ−ＧＳＴを使用して濃縮したＨＣＶｐｐ；−ｖｅ、陰性対照（ｃＤＮＡ鋳型はない）。
【００８４】
結論として、ＣＤ８１ＬＥＬ−ＧＳＴを共有結合させた磁性ビーズ及びビオチン化ＣＤ８１ＬＥＬ−ＧＳＴを結合させたストレプトアビジン被覆磁性ビーズの両方が、ＨＣＶｐｐを２００μＬの出発容量から２０μＬまで濃縮するのに使用可能であるということが言える。このＨＣＶｐｐを、その後、崩壊させてＲＮＡを単離し、ＰＣＲ増幅反応を用いて検出することができる。したがって、細胞表面受容体を用いて病原体（ウイルスなど）の検出及び濃縮／精製の少なくともいずれかを行う方法の有効性が示された。
【図６】
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【図７】
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【図１０】
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【図１３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４】
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【配列表】
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【誤訳訂正書】
【提出日】平成21年10月14日(2009.10.14)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図１４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図１４】
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【国際調査報告】
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