(57)【要約】本発明は、１種以上の反応生成物、例えば、エピトープ、酵素基質、酵素活性化物質、およびリガンドの核酸テンプレート生成による生物学的標的（例えば、核酸およびタンパク質）の検出および／または定量化のための組成物ならびに方法を提供する。増幅系を用いたシグナル増幅後に、これらの反応生成物を検出および／または定量することができる。本発明は、ＤＮＡプログラム化学（ＤＰＣ）媒介アッセイにおける検出限界の改善は、１標的分子当り複数の検出可能な部分を生成できる場合に達成し得るという発見に一部基づいている。本質的には、ＤＰＣ媒介反応を使用して１つまたは複数の反応生成物の生成を介して標的分子を検出する。次いで反応生成物の各分子を用い、増幅方法論を用いて複数の検出可能な部分を生成させる。その結果、所与のアッセイ感度を増大させることができ、サンプル中の生物学的標的の検出および／または定量化が可能になる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の生物学的標的の存在および／または量を判定する方法であって：
（ａ）（１）（ｉ）前記生物学的標的に対して結合親和性を有する第一の結合性部分と、（ｉｉ）第一のオリゴヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）前記第一のオリゴヌクレオチド配列と結合した第一の生成物前駆体とを含んでなる第一のプローブと、（２）（ｉ）前記生物学的標的に対して結合親和力を有する第二の結合性部分と、（ｉｉ）前記第一のオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズできる第二のオリゴヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）前記第二のオリゴヌクレオチド配列と結合した第二の生成物前駆体とを含んでなる第二のプローブと、前記サンプルとを合わせることであって、前記生物学的標的が前記サンプル中に存在する場合、前記第一および第二の結合性部分の双方を前記生物学的標的に結合させ、その際、前記第一および第二のオリゴヌクレオチド配列が互いにハイブリダイズして、前記第一および第二の生成物前駆体を互いに反応性に近接させ、完全エピトープ、酵素基質、酵素活性化物質、およびリガンドよりなる群から選択される反応生成物を生成させる条件下で、前記サンプルを前記第一および第二のプローブと合わせること；
（ｂ）ステップ（ａ）の反応生成物が存在する場合、複数の検出可能な部分を生成させる条件下で増幅成分と検出成分とを含んでなる検出システムに前記反応生成物を曝露させること；および
（ｃ）ステップ（ｂ）において生成した検出可能な部分の存在および／または量を判定し、それによってサンプル中の生物学的標的の存在および／または量を判定すること、
を含んでなる方法。
【請求項２】
ステップ（ａ）において、前記第一の結合性部分が、前記第一のオリゴヌクレオチド配列に共有結合している請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ａ）において、前記第二の結合性部分が、前記第二のオリゴヌクレオチド配列に共有結合している請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ａ）において、前記第一の結合性部分が、前記第一のオリゴヌクレオチド配列に非共有結合している請求項１に記載の方法。
【請求項５】
アンチジップコード配列にハイブリダイズしたジップコード配列を介して、前記第一の結合性部分が、前記第一のオリゴヌクレオチド配列に非共有結合している請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ａ）において、前記第二の結合性部分が、前記第二のオリゴヌクレオチド配列に非共有結合している請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
アンチジップコード配列にハイブリダイズしたジップコード配列を介して、前記第二の結合性部分が、前記第二のオリゴヌクレオチド配列に非共有結合している請求項６に記載の方法。
【請求項８】
サンプル中の生物学的標的の存在および／または量を判定する方法であって：
（ａ）（ｉ）前記生物学的標的に対して結合親和性を有する第一の結合性部分と、（ｉｉ）第一のオリゴヌクレオチドのジップコード配列と、を含んでなる第一の標的結合性成分を提供すること；
（ｂ）（ｉ）前記生物学的標的に対して結合親和性を有する第二の結合性部分と、（ｉｉ）第二のオリゴヌクレオチドのジップコード配列と、を含んでなる第二の標的結合性成分を提供すること；
（ｃ）（ｉ）前記第一のオリゴヌクレオチドのジップコード配列にハイブリダイズできる第一のオリゴヌクレオチドのアンチジップコード配列と、（ｉｉ）第一のレポーターオリゴヌクレオチドと、（ｉｉｉ）前記第一のレポーターオリゴヌクレオチドと結合した第一の生成物前駆体と、を含んでなる第一のレポーター成分を提供すること；
（ｄ）（ｉ）前記第二のオリゴヌクレオチドのジップコード配列にハイブリダイズできる第二のオリゴヌクレオチドのアンチジップコード配列と、（ｉｉ）前記第一のレポーターオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズできる第二のレポーターオリゴヌクレオチドと、（ｉｉｉ）前記第二のレポーターオリゴヌクレオチド配列と結合しており、前記第一の生成物前駆体と反応性に近接させると、前記第一の生成物前駆体と反応できる第二の生成物前駆体と、を含んでなる第二のレポーター成分を提供すること；
（ｅ）前記生物学的標的がサンプル中に存在する場合、前記第一および第二の結合性部分が前記生物学的標的に結合し、その際（ｉ）前記第一のジップコード配列が、前記第一のオリゴヌクレオチドのアンチジップコード配列にハイブリダイズし、（ｉｉ）前記第二のオリゴヌクレオチドのジップコード配列が、前記第二のオリゴヌクレオチドのアンチジップコード配列にハイブリダイズし、（ｉｉｉ）前記第二のレポーターオリゴヌクレオチドを、前記第一のレポーターオリゴヌクレオチドにハイブリダイズして、前記第一および第二の生成物前駆体を反応性に近接させて反応生成物を生成させるような条件下で、前記第一の標的結合性成分と、前記第二の標的結合性成分と、前記第一のレポーター成分と、前記第二のレポーター成分とを前記サンプルと合わせること；
（ｆ）ステップ（ｅ）の反応生成物が存在する場合、複数の検出可能な部分を生成させる条件下で増幅成分と検出成分とを含んでなる検出システムに前記反応生成物を曝露させること；および
（ｇ）検出可能な部分の存在および／または量を判定し、それによって前記サンプル中の生物学的標的の存在および／または量を判定すること；
を含んでなる方法。
【請求項９】
ステップ（ｅ）において、前記第一の標的結合性成分と、前記第二の標的結合性成分と、前記第一のレポーター成分と、前記第二のレポーター成分とを、全て同時に前記サンプルと合わせる請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｅ）において、前記第一のレポーター成分および前記第二のレポーター成分の前に、前記第一の標的結合性成分と前記第二の標的結合性成分とを前記サンプルに加える請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記増幅成分が、検出可能性部分の生成を触媒する酵素を含んでなる請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記増幅成分が、前記反応生成物１分子当り少なくとも１０分子の前記検出可能な部分を生成させることができる請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記増幅成分が、前記反応生成物１分子当り少なくとも１００分子の前記検出可能な部分を生成させることができる請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記増幅成分が、前記反応生成物１分子当り少なくとも１，０００分子の前記検出可能な部分を生成させることができる請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記反応生成物が、ペプチドまたはタンパク質である請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記反応生成物が、図１５に掲げられたペプチド類から選択されるペプチジル配列を含んでなる請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記反応生成物が小型分子である請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記反応生成物が、色素、抗生物質、酵素補因子、酵素阻害剤、殺虫剤、薬物、毒素、蛍光体、発色団、ホルモン、炭水化物または脂質である請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記生物学的標的が、タンパク質、ペプチド、免疫グロブリン、成長因子受容体または酵素である請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記生物学的標的が、ホモ二量体タンパク質である請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記生物学的標的が、ヘテロ二量体タンパク質である請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記生物学的標的が、Ｂｃｒ−Ａｂ１のヘテロ二量体、ＥｒｂＢファミリーのホモ二量体、ＥｒｂＢファミリーのヘテロ二量体、およびＰＤＧＦよりなる群から選択される請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記生物学的標的が核酸である請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記核酸が、ＤＮＡまたはＲＮＡである請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記第一および第二の結合性部分が同一である請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記第一および第二の結合性部分が異なっている請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記第一および第二の結合性部分の各々が、前記生物学的標的により規定された別個の結合部位に結合する請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
第一の結合性部分、第二の結合性部分または前記第一および第二の結合性部分の各々が抗体である請求項１から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記第一の生成物前駆体および前記第二の生成物前駆体が、追加の試薬の存在下で互いに反応する請求項１から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記第一の生成物前駆体が前記第二の生成物前駆体と自発的に反応して前記反応生成物を生成する請求項１から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記反応が、天然の化学的連結によって生じる請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
Ｃ−末端チオエステルを含有する第一の前駆体ペプチドとＮ−末端システインを含有する第二の前駆体ペプチドとの間の反応によって、ペプチド結合が生成する請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
Ｃ−末端チオエステルとシステイン以外のＮ−末端チオールとの間の反応によって、ペプチド結合アイソスターが生成する請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記第一および第二のオリゴヌクレオチド配列または前記第一および第二のレポーターオリゴヌクレオチド配列が、約８℃と約２５℃との間の融解温度を有する請求項３０から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記融解温度が、約９℃と約２０℃との間である請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
サンプル中の生物学的標的の存在および／または量を判定する方法であって：
（ａ）（１）（ｉ）前記生物学的標的に対して結合親和性を有する第一の結合性部分と、（ｉｉ）第一のオリゴヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）前記第一のオリゴヌクレオチド配列と結合した第一のマスク化生成物前駆体とを含んでなる第一のプローブと、（２）（ｉ）前記生物学的標的に対して結合親和力を有する第二の結合性部分と、（ｉｉ）前記第一のオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズできる第二のオリゴヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）前記第二のオリゴヌクレオチド配列と結合した非マスク性基とを含んでなる第二のプローブと前記サンプルとを合わせることであって、前記生物学的標的が前記サンプル中に存在する場合、前記第一および第二の結合性部分を前記生物学的標的に結合させ、前記第一および第二のオリゴヌクレオチド配列が互いにハイブリダイズして、前記非マスク性基と前記マスク化生成物前駆体とを反応性に近接させて、非マスク化反応生成物を生成させる条件下で、前記サンプルを前記第一および第二のプローブと合わせること；
（ｂ）ステップ（ａ）の反応生成物が存在する場合、複数の検出可能な部分を生成させる条件下で増幅成分と検出成分とを含んでなる検出システムに前記反応生成物を曝露させること；および
（ｃ）検出可能な部分の存在および／または量を判定し、それによってサンプル中の生物学的標的の存在および／または量を判定すること、
を含んでなる方法。
【請求項３７】
前記マスク化生成物前駆体が、マスク化エピトープ、マスク化酵素基質、マスク化酵素活性化物質、またはマスク化リガンドである請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記非マスク化反応生成物が、ペプチドまたはタンパク質である請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記非マスク化反応生成物が、小型分子である請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記生物学的標的が、タンパク質、ペプチド、免疫グロブリン、成長因子、または酵素である請求項３６から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記生物学的標的が、ホモ二量体タンパク質である請求項３６から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記生物学的標的が、ヘテロ二量体タンパク質である請求項３６から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記生物学的標的が、Ｂｃｒ−Ａｂ１のヘテロ二量体、ＥｒｂＢファミリーのホモ二量体、ＥｒｂＢファミリーのヘテロ二量体、およびＰＤＧＦよりなる群から選択される請求項３６から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記生物学的標的が核酸である請求項３６から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記第一の結合性部分、前記第二の結合性部分、または前記第一の結合性部分および前記第二の結合性部分の各々が、抗体である請求項３６から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記第一および第二の結合性部分が同一である請求項３６から４３および４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記第一および第二の結合性部分が異なっている請求項３６から４３および４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
ステップ（ｂ）の前記増幅成分が、前記検出可能な部分の生成を触媒する酵素を含んでなる請求項３６から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記増幅成分が、ステップ（ａ）において生成した反応生成物１分子当り少なくとも１００分子の前記検出可能な部分を生成させることができる請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記酵素が、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、リボヌクレアーゼ、または乳酸デヒドロゲナーゼである請求項１１または４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記サンプルが、組織サンプルまたは体液サンプルである請求項１から５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
（ａ）（ｉ）生物学的標的に対して結合親和性を有する第一の結合性部分と、（ｉｉ）前記第一の結合性部分と結合した第一のレポーターオリゴヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）前記第一のレポーターオリゴヌクレオチド配列と結合した第一の生成物前駆体と、を含んでなる第一のプローブと、
（ｂ）（ｉ）前記生物学的標的に対して結合親和性を有する第二の結合性部分と、（ｉｉ）前記第二の結合性部分と結合した第二のレポーターオリゴヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）前記第二のレポーターオリゴヌクレオチド配列と結合した第二の生成物前駆体と、を含んでなり、
前記生物学的標的に対する前記第一および第二の結合性部分の結合の際に、前記第一および第二のレポーターオリゴヌクレオチド配列が、互いにハイブリダイズでき、前記第一および第二の生成物前駆体が互いに反応して、完全エピトープ、酵素基質、酵素活性化物質、およびリガンドよりなる群から選択される反応生成物を生成させることができる第二のプローブと；
（ｃ）複数の検出可能な部分を生成させることができる増幅成分と検出成分とを含んでなる検出システムと；
（ｄ）生物学的標的の検出用キットを使用するための取扱説明書と、
を含んでなるキット。
【請求項５４】
第一のプローブが、第一のオリゴヌクレオチドのアンチジップコード配列にハイブリダイズした第一のオリゴヌクレオチドのジップコード配列をさらに含んでなり、第二のプローブが、第二のオリゴヌクレオチドのアンチジップコード配列にハイブリダイズした第二のオリゴヌクレオチドのジップコード配列をさらに含んでなる請求項５２に記載のキット。
【請求項５５】
（ａ）（ｉ）前記生物学的標的に対して結合親和性を有する第一の結合性部分と、（ｉｉ）前記第一の結合性部分と結合した第一のオリゴヌクレオチドのジップコード配列と、を含んでなる第一の標的結合性成分と、
（ｂ）（ｉ）前記生物学的標的に対して結合親和性を有する第二の結合性部分と、（ｉｉ）前記第二の結合性部分と結合した第二のオリゴヌクレオチドのジップコード配列と、を含んでなる第二の標的結合性成分と、
（ｃ）（ｉ）前記第一のオリゴヌクレオチドのジップコード配列にハイブリダイズできる第一のオリゴヌクレオチドのアンチジップコード配列と、（ｉｉ）前記第一のオリゴヌクレオチドのジップコード配列と結合した第一のレポーターオリゴヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）前記第一のレポーターオリゴヌクレオチド配列と結合した第一の生成物前駆体と、を含んでなる第一のレポーター成分と、
（ｄ）（ｉ）前記第二のオリゴヌクレオチドのジップコード配列にハイブリダイズできる第二のオリゴヌクレオチドのアンチジップコード配列と、（ｉｉ）前記第二のオリゴヌクレオチドのジップコード配列と結合しており、前記第一のレポーターオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズできる第二のレポーターオリゴヌクレオチドと、（ｉｉｉ）前記第二のレポーターオリゴヌクレオチド配列と結合した第二の生成物前駆体と、を含んでなり、
前記生物学的標的に対する前記第一および第二の結合性部分の結合、前記第一のジップコードのオリゴヌクレオチド配列とアンチジップコードのオリゴヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーション、および前記第二のジップコードのオリゴヌクレオチド配列とアンチジップコードのオリゴヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションの際に、前記第一および第二のレポーターオリゴヌクレオチド配列が、互いにハイブリダイズして、前記第一および第二の生成物前駆体を反応性に近接させ、完全エピトープ、酵素基質、酵素活性化物質、およびリガンドよりなる群から選択される反応生成物を生成させる第二のレポーター成分と；
（ｅ）複数の検出可能な部分を生成させることができる増幅成分と検出成分とを含んでなる検出システムと；
（ｆ）生物学的標的の検出用キットを使用するための取扱説明書と、
を含んでなるキット。
【請求項５６】
直接にまたはペプチドリンカーを介して、またはオリゴヌクレオチドリンカーを介して、前記第一の結合性部分が、前記第一のオリゴヌクレオチドのジップコード配列に共有結合しており；
直接にまたはペプチドリンカーを介して、またはオリゴヌクレオチドリンカーを介して、前記第一のレポーターオリゴヌクレオチドが、前記第一のオリゴヌクレオチドのアンチジップコード配列に共有結合している請求項５３または５４に記載のキット。
【請求項５７】
直接にまたはペプチドリンカーを介して、またはオリゴヌクレオチドリンカーを介して、前記第一の生成物前駆体が、前記第一のレポーターオリゴヌクレオチドに共有結合しており；
直接にまたはペプチドリンカーを介して、またはオリゴヌクレオチドリンカーを介して、前記第二の生成物断片が、前記第二のレポーターオリゴヌクレオチドに共有結合している請求項５２から５５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５８】
前記検出可能な部分の前駆体をさらに含んでなる請求項５２から５６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５９】
前記反応生成物が、ＭＡＳＭＴＧＧＱＱＭＧ（配列番号４）、ＭＡＳＭＴＣＧＱＱＭＧ（配列番号３８）、ＭＡＳＭＴＧＣＱＱＭＧ（配列番号３９）、ＭＡＳＭＴＧＧＣＱＭＧ（配列番号４０）、ＭＡＳＭＴＧＧＱＣＭＧ（配列番号４１）、（Ｇ）０−２−ＮＷＣＨＰＱＦＥ−（Ｇ）０−２（配列番号４２）、（Ｇ）０−２−ＮＷＳＣＰＱＦＥ−（Ｇ）０−２（配列番号４３）、（Ｇ）０−２−ＮＷＳＨＣＱＦＥ−（Ｇ）０−２（配列番号４４）、（Ｇ）０−２−ＮＷＳＨＰＣＦＥ−（Ｇ）０−２（配列番号４５）、（Ｇ）０−２−ＮＷＳＨＰＱＦＥ−（Ｇ）０−２（配列番号４６）、ＫＥＴＡＡＡＫＦＣＲＱＨＭＤＳ（配列番号４７）、ＫＥＴＡＡＡＫＦＧＲＱＨＭＤＳ（配列番号４８）、およびＭＡＳＭＴＧ−［ＳＣＨ２Ｃ（Ｏ）］−ＱＱＭＧ（配列番号４９）から選択されるペプチジル配列を含んでなる請求項５２から５５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６０】
各結合性部分が、前記生物学的標的に直接的または間接的に結合する抗体であり、前記生物学的標的が、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、ＥｒｂＢファミリーのホモ二量体、ＥｒｂＢファミリーのヘテロ二量体、およびＰＤＧＦよりなる群から選択される請求項５２から５８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６１】
各抗体が、前記生物学的標的に間接的に結合する請求項５９に記載のキット。
【請求項６２】
２種の追加抗体をさらに含み、それらの各々が、前記生物学的標的に直接的に結合し、前記生物学的標的が、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、ＥｒｂＢファミリーのホモ二量体、ＥｒｂＢファミリーのヘテロ二量体、およびＰＤＧＦよりなる群から選択される請求項６０に記載のキット。
【請求項６３】
前記第一の結合性部分および前記第二の結合性部分が、異なる抗体である請求項５２から６１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６４】
ＭＡＳＭＴＣＧＱＱＭＧ（配列番号３８）、ＭＡＳＭＴ−チオエステル（配列番号５０）、ＭＡＳＭＴＧＣＱＱＭＧ（配列番号３９）、ＭＡＳＭＴＧ−チオエステル（配列番号５）、ＭＡＳＭＴＧＧＣＱＭＧ（配列番号４０）、ＭＡＳＭＴＧＧ−チオエステル（配列番号５１）、ＭＡＳＭＴＧＧＱＣＭＧ（配列番号４１）、ＭＡＳＭＴＧＧＱ−チオエステル（配列番号５２）、（Ｇ）０−２−ＮＷＣＨＰＱＦＥ−（Ｇ）０−２（配列番号４２）、（Ｇ）０−２−ＮＷ−チオエステル（配列番号５３）、（Ｇ）０−２−ＮＷＳＣＰＱＦＥ−（Ｇ）０−２（配列番号４３）、（Ｇ）０−２−ＮＷＳ−チオエステル（配列番号５４）、（Ｇ）０−２−ＮＷＳＨＣＱＦＥ−（Ｇ）０−２（配列番号４４）、（Ｇ）０−２−ＮＷＳＨ−チオエステル（配列番号５５）、（Ｇ）０−２−ＮＷＳＨＰＣＦＥ−（Ｇ）０−２（配列番号４５）、（Ｇ）０−２−ＮＷＳＨＰ−チオエステル（配列番号５６）、ＫＥＴＡＡＡＫＦＣＲＱＨＭＤＳ（配列番号４７）、ＫＥＴＡＡＡＫＦ−チオエステル（配列番号５７）、ＣＧＱＱＭＧ（配列番号５８）、ＣＨＰＱＦＥ−（Ｇ）０−２（配列番号５９）、ＣＰＱＦＥ−（Ｇ）０−２（配列番号６０）、ＣＲＱＨＭＤＳ（配列番号６１）、およびＭＡＳＭＴＧ−［ＳＣＨ２Ｃ（Ｏ）］−ＱＱＭＧ（配列番号４９）よりなる群から選択されるペプチジル部分を含んでなり、前記チオエステルは、ＲがＣ−末端チオエステルを含有するペプチドとＮ−末端システインを含有するペプチドとの間でのペプチド結合の形成を妨げない任意の部分である式−Ｃ（Ｏ）−Ｓ−Ｒを有する分子。
【請求項６５】
Ｒが、Ｃ１〜Ｃ６直鎖状または分枝状アルキルである請求項６３に記載の分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００７年７月２７日に出願された米国仮特許出願第６０／９６２，３３３号の利益と優先権を主張しており、参照としてその全体が本明細書に援用されている。
【０００２】
本発明は一般に、生体検出および診断におけるアッセイ技術とそれらの使用に関する。本発明は、より具体的には、生体検出および診断における核酸鋳型化学（例えば、反応生成物の合成）の組成物と方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
標的依存のＤＮＡプログラム化学（「ＤＰＣ」）に基づく検出原理は、例えば、Ｃｏｕｌｌらにより特許文献１に示されている。ある一定の適用に関して、ＤＰＣ反応は、検出可能な単一分子、例えば、１標的分子につき１蛍光体を作出することができる。これは、所望の感度を有するアッセイを提供することができる。しかしながら、ある一定の他のアッセイでは、必要な感度を欠く場合がある。例えば、ある一定のアッセイにおいて、検出可能な単一分子の生成では、生物学的標的、例えば、組織または体液サンプル中に低濃度で存在するタンパク質二量体を検出するための適切な感度を有する系を付与することができない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第０６/１２８１３８号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、一定の生物学的標的、例えば、注目しているサンプル中のタンパク質または核酸の検出を可能にするために、検出感度を改善したアッセイ系を提供する必要性が存続している。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ＤＮＡプログラム化学（ＤＰＣ）媒介アッセイにおける検出限界の改善は、１標的分子当り複数の検出可能な部分を生成できる場合に達成し得るという発見に一部基づいている。本質的には、ＤＰＣ媒介反応を使用して１つまたは複数の反応生成物の生成を介して標的分子を検出する。次いで反応生成物の各分子を用い、増幅方法論を用いて複数の検出可能な部分を生成させる。その結果、所与のアッセイ感度を増大させることができ、サンプル中、例えば、組織または体液サンプル中の生物学的標的の検出および／または定量化が可能になる。
【０００７】
選択されたアッセイフォーマットに依って、反応生成物は、例えば、完全エピトープ、酵素基質、酵素活性化物質またはリガンドであり得、それらの各々は、下記により詳細に検討されている直接的または間接的な検出システムを用いることによって検出または定量化することができる。本発明に使用される検出システムは、検出成分と、ＤＰＣ反応から生じるシグナルを増幅させることによってアッセイ感度を増大させるために互いに相互作用する増幅成分とを含んでなる。例えば、下記により詳細に検討されているように、反応生成物が完全エピトープである場合、このエピトープを、抗体によって認識させることができる。この抗体は、アルカリホスフェートまたはペルオキシダーゼなどの酵素など、通常使用される幾つかのシグナル発生システムの任意の１つと結合（例えば、共有結合）させることができる（Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｐ．、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙにおいて「Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ」、１５巻、１９８５年、編集者Ｒ．Ｈ．ＢｕｒｄｏｎおよびＰ．Ｈ．ｖａｎ  Ｋｎｉｐｐｅｎｂｅｒｇ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）。あるいは、このエピトープに結合する抗体は、非標識でもよい。この場合、非標識抗体を次に、別の抗体またはシグナル発生システムと結合した（例えば、共有結合した）他の結合部分により結合させる。酵素が使用される場合、これらは、高ターンオーバー速度を有し、出発基質、例えば、比色基質、蛍光基質、および化学発光前駆体基質から大量の検出可能な部分を迅速に生成させることができる。
【０００８】
一態様において、本発明は、サンプル中の生物学的標的の存在および／または量を判定する方法を提供する。本法は：（１）（ｉ）生物学的標的に対して結合親和性を有する第一の結合性部分と、（ｉｉ）第一の結合性部分と結合（例えば、共有または非共有結合）した第一のオリゴヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）第一のオリゴヌクレオチド配列と結合した（例えば、共有または非共有結合した）第一の生成物前駆体とを含んでなる第一のプローブと、（２）（ｉ）生物学的標的に対して結合親和性を有する第二の結合性部分と、（ｉｉ）第二の結合性部分に結合した（例えば、共有または非共有結合した）第一のオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズできる第二のオリゴヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）サンプル中に生物学的標的が存在する場合、その生物学的標的に第一および第二の結合性部分双方を結合させる条件下、第二のオリゴヌクレオチド配列と結合した（例えば、共有または非共有結合した）第二の生成物前駆体とを含んでなる第二のプローブをサンプルと合わせることを含んでなる。第一および第二の結合性部分が生物学的標的に結合する時に、第一および第二のオリゴヌクレオチド配列は互いにハイブリダイズし、第一および第二の生成物前駆体を互いに反応性に近接させて反応生成物を生成させる。反応生成物は、完全エピトープ、酵素基質、酵素活性化物質またはリガンドであり得る。
【０００９】
反応生成物が得られた場合、それを、反応生成物と相互作用することができる検出成分と、複数の検出可能な部分を生成させることのできる増幅成分とを含んでなる検出システムに曝露させる。検出可能な部分の存在および／または量により、サンプル中の生物学的標的の存在および／または量が示されることになる。
【００１０】
当然のことながら第一および第二のプローブは各々、単一分子であり得る。例えば、第一および第二のプローブにおいて、結合性部分を、１つまたは複数のオリゴヌクレオチド配列を介して生成物前駆体と共有結合させることができる。あるいは、第一プローブおよび第二のプローブは、機能性プローブを生成させるため、互いに相互作用する２つ以上の部分を含むことができる。これは、例えば、生成物前駆体と共有結合した相補的または実質的に相補的なアンチジップコードのオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズする結合性部分と共有結合したジップコードのオリゴヌクレオチド配列を介して促進させることができる。このプローブはまた、一定の実施形態において、一端でアンチジップのオリゴヌクレオチド配列と、他端では生成物前駆体と共有結合している１つまたは複数のオリゴヌクレオチドを含む。
【００１１】
別の態様において、本発明は、サンプル中の生物学的標的の存在および／または量を判定する方法を提供する。本法は、
（ａ）（ｉ）生物学的標的に対して結合親和性を有する第一の結合性部分と、（ｉｉ）第一の結合性部分に結合した（例えば、共有または非共有結合した）第一のオリゴヌクレオチドのジップコード配列と、を含んでなる第一の標的結合性成分を提供すること；
（ｂ）（ｉ）生物学的標的に対して結合親和性を有する第二の結合性部分と、（ｉｉ）第二の結合性部分に結合した（例えば、共有または非共有結合した）第二のオリゴヌクレオチドのジップコード配列と、を含んでなる第二の標的結合性成分を提供すること；
（ｃ）（ｉ）第一のオリゴヌクレオチドのジップコード配列にハイブリダイズできる第一のオリゴヌクレオチドのアンチジップコード配列と、（ｉｉ）第一のオリゴヌクレオチドのアンチジップコード配列に結合した（例えば、共有または非共有結合した）第一のレポーターオリゴヌクレオチドと、（ｉｉｉ）第一のレポーターオリゴヌクレオチドと結合した（例えば、共有または非共有結合した）第一の生成物前駆体と、を含んでなる第一のレポーター成分を提供すること；
（ｄ）（ｉ）第二のオリゴヌクレオチドのジップコード配列にハイブリダイズできる第二のオリゴヌクレオチドのアンチジップコード配列と、（ｉｉ）第二のオリゴヌクレオチドのアンチジップコード配列と結合（例えば、共有または非共有結合）しており、第一のレポーターオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズできる第二のレポーターオリゴヌクレオチドと、（ｉｉｉ）第二のレポーターオリゴヌクレオチド配列と結合（例えば、共有または非共有結合）しており、反応性に近接させた場合に第一の生成物前駆体と反応することができる第二の生成物前駆体とを含んでなる第二のレポーター成分を提供すること、を含んでなる。
【００１２】
一実施形態において、サンプル中に生物学的標的が存在する場合、第一および第二の結合性部分が生物学的標的に結合するような条件下で、サンプルは、第一の標的結合性成分、第二の標的結合性成分、第一のレポーター成分、および第二のレポーター成分と同時に結合する。第一および第二の結合性部分が生物学的標的に結合すると、第一のジップコード配列が、第一のアンチジップコードのオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズし、第二のオリゴヌクレオチドのジップコード配列が、第二のオリゴヌクレオチドのアンチジップコード配列にハイブリダイズし、第二のレポーターオリゴヌクレオチドが、第一のレポーターオリゴヌクレオチドにハイブリダイズして、第一および第二の反応生成物前駆体を反応性に近接させて反応生成物を生成する。
【００１３】
別の実施形態において、第一および第二のオリゴヌクレオチドのジップコード配列を、対応する第一および第二のオリゴヌクレオチドのアンチジップコード配列にアニールさせて機能性プローブを生成させる条件下で、第一の標的結合性成分、第二の標的結合性成分、第一のレポーター成分、および第二のレポーターをサンプルと合わせる前に互いにプレインキュベートする。当然のことながら、加える順序は、シグナル対ノイズ比を最適化するために変えることができる。例えば、第一および第二の標的結合性成分をサンプルと共にインキュベートし、第一および第二のレポーター成分を加える前に生物学的標的に結合させることができる。
【００１４】
反応生成物が得られた場合、これを検出システムに曝露させる。その後、検出可能な部分の存在および／または量を用いて、サンプル中の生物学的標的の存在および／または量を判定することができる。
【００１５】
本明細書に記載されたそれぞれの方法において、検出システムの増幅成分は、触媒、例えば、検出可能な部分の生成を触媒する酵素を含んでなる。例えば、増幅成分は、反応生成物１分子当り少なくとも１０分子、１００分子、１，０００分子、または１０，０００分子の検出可能な部分を生成することができる。一定の代表的な酵素としては、例えば、ペルオキシダーゼ類、例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ホスファターゼ類、例えば、アルカリホスファターゼ、ヌクレーゼ類、例えば、リボヌクレアーゼ、およびデヒドロゲナーゼ類、例えば、乳酸デヒドロゲナーゼが挙げられる。
【００１６】
選択されたアッセイフォーマットに依って、反応生成物は、ペプチドまたはタンパク質であり得る。例えば、反応生成物は、本明細書に開示された１つまたは複数のペプチジル配列、例えば、以下の実施例３に検討されたペプチジル配列ならびに、例えば、図１５に表されたものを含むことができる。あるいは、反応生成物は、小型分子、例えば、エピトープを規定する小型分子であり得る。反応生成物は、色素、抗生物質、酵素補因子、酵素阻害剤、殺虫剤、薬物、毒素、蛍光体、発色団、ホルモン、炭水化物または脂質であり得る。
【００１７】
当然のことながら、本明細書に記載された方法を用いて、例えば、タンパク質またはペプチドなど多数の生物学的標的を検出および／または定量することができる。本法を用いて多量体タンパク質、例えば、ホモ二量体タンパク質、ヘテロ二量体タンパク質、および融合タンパク質の存在および／または量を判定することができる。代表的な生物学的標的としては、例えば、Ｂｃｒ−Ａｂ１ヘテロ二量体、ＥｒｂＢファミリーのホモ二量体、ＥｒｂＢファミリーのヘテロ二量体、およびＰＤＧＦを挙げることができる。あるいは、本明細書に記載された方法を用いて、核酸、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡを検出および／または定量することができる。
【００１８】
生物学的標的およびアッセイ様式に依って、第一および第二の結合性部分の各々を、生物学的標的により規定された別個の結合性部位に結合させることができる。さらに、第一および第二の結合性部分は、同一であっても異なっていてもよい。さらに、第一の結合性部分、第二の結合性部分または第一および第二の結合性部分の各々が、抗体であり得る。
【００１９】
さらに、使用されるアッセイ様式およびＤＰＣ化学に依って、第一の生成物前駆体および第二の生成物前駆体は、追加の試薬、例えば、この化学反応を促進させるために必要な試薬の存在下でのみ反応することができる。しかしながら、選択された化学に依って、第一の生成物前駆体は、第二の生成物前駆体と自然に反応して反応生成物を生成することができる。本明細書に記載されるアプローチの１つは、天然の化学的連結と称され、この一実施形態において、たとえばＣ−末端チオエステルを含有する第一の前駆体ペプチドとＮ−末端システインを含有する第二の前駆体ペプチドとの間の反応によって、ペプチド結合が生成する。一定の実施形態において、Ｃ−末端チオエステルとシステイン以外の部分によって提供されるＮ−末端チオールとの間の反応によって、ペプチド結合アイソスターが生成する。アッセイ特異性を最大にするために、当然のことながら一定の反応物および反応条件の調整を必要とする場合が考えられる。このことは、例えば、約８℃から約２５℃、より好ましくは約９℃から約２０℃の融解温度を有するように第一および第二のオリゴヌクレオチド配列または第一および第二のレポーターオリゴヌクレオチド配列を選択することによって達成することができる。あるいは、または前記に加えて、このことは、例えば、サンプルを第一の生成物前駆体を含んでなるプローブと共にインキュベートし、未結合の第一の生成物プローブを除去し、次いでサンプルを第二の生成物前駆体を含んでなる第二のプローブと共にインキュベートすることによって達成することができる。
【００２０】
別の態様において、本発明は、生成物前駆体の非マスク化に基づいた、サンプル中の生物学的標的の存在および／または量を判定する別の方法を提供する。本法は、（１）（ｉ）生物学的標的に対して結合親和性を有する第一の結合性部分と、（ｉｉ）第一の結合性部分と結合した（例えば、共有または非共有結合した）第一のオリゴヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）第一のオリゴヌクレオチド配列と結合した（例えば、共有または非共有結合した）第一のマスク化生成物前駆体とを含んでなる第一のプローブと、（２）（ｉ）生物学的標的に対して結合親和力を有する第二の結合性部分と、（ｉｉ）第二の結合性部分と結合（例えば、共有または非共有結合）しており、第一のオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズできる第二のオリゴヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）生物学的標的がサンプル中に存在する場合、第一および第二の結合性部分を生物学的標的に結合させる条件下、第二のオリゴヌクレオチド配列と結合した（例えば、共有または非共有結合した）非マスク基とを含んでなる第二のプローブと、サンプルとを合わせることを含んでなる。結合性部分を生物学的標的に結合する際、第一および第二のオリゴヌクレオチド配列が互いにハイブリダイズし、非マスク基をマスク化生成物前駆体との反応性に近接させ、反応生成物、すなわち、非マスク化反応生成物が生成する。
【００２１】
反応生成物が得られた場合、これを検出システムに曝露させる。次いで検出可能な部分の存在および／または量を用いてサンプル中の生物学的標的の存在および／または量を判定することができる。
【００２２】
当然のことながら、マスク化前駆体は、マスク化エピトープ、マスク化酵素基質、マスク化酵素活性化物質、またはマスク化リガンドであり得る。この反応時に、マスク基が除去されて、非マスク生成物、例えば、非マスクエピトープ、非マスク酵素基質、非マスク酵素活性化物質、または非マスクリガンドを生成する。この反応生成物は、例えば、ペプチド、タンパク質または小型分子であり得る。
【００２３】
一定の状況下で生物学的標的は、多量体タンパク質、例えば、ホモ二量体タンパク質、ヘテロ二量体タンパク質または融合タンパク質であり得る。例えば、生物学的標的は、Ｂｃｒ−Ａｂ１ヘテロ二量体、ＥｒｂＢファミリーのホモ二量体、ＥｒｂＢファミリーのヘテロ二量体、およびＰＤＧＦから選択することができる。
【００２４】
生物学的標的およびアッセイ様式に依って、第一の結合性部分、第二の結合性部分、または第一の結合性部分および第二の結合性部分の各々は、抗体であり得る。さらに、当然のことながら、第一および第二の結合性部分は、同一であっても異なっていてもよい。
【００２５】
さらに、選択された増幅成分に依って、増幅成分は、検出可能な部分の生成を触媒する酵素を含むことができる。具体的な用途に求められるアッセイ感度に依って、増幅成分は、反応生成物１分子当り少なくとも１０分子、１００分子、１，０００分子または１０，０００分子の検出可能な部分を生成することができると考えられる。
【００２６】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載された１つまたは複数のアッセイを促進させるキットを提供する。このキットは、（ｉ）生物学的標的に対して結合親和性を有する第一の結合性部分と、（ｉｉ）第一の結合性部分と結合した（例えば、共有または非共有結合した）第一のレポーターオリゴヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）第一のレポーターオリゴヌクレオチド配列と結合した（例えば、共有または非共有結合した）第一の生成物前駆体と、を含む第一のプローブを含んでなる。このキットはまた、（ｉ）生物学的標的に対して結合親和力を有する第二の結合性部分と、（ｉｉ）第二の結合性部分と結合した（例えば、共有または非共有結合した）第二のレポーターオリゴヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）第二のレポーターオリゴヌクレオチド配列と結合した（例えば、共有または非共有結合した）第二の生成物前駆体と、を含む第二のプローブを含んでなり、生物学的標的に対する第一および第二の結合性部分の結合の際に、第一および第二のレポーターオリゴヌクレオチド配列は、互いにハイブリダイズでき、第一および第二の生成物前駆体が互いに反応して、反応生成物を生成させることができる。この反応生成物は、完全エピトープ、酵素基質、酵素活性化物質、およびリガンドよりなる群から選択することができる。
【００２７】
別の態様において、このキットは、（ｉ）生物学的標的に対して結合親和性を有する第一の結合性部分と、（ｉｉ）第一の結合性部分と結合した（例えば、共有または非共有結合した）第一のレポーターオリゴヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）第一のレポーターオリゴヌクレオチド配列と結合した（例えば、共有または非共有結合した）第一のマスク化生成物前駆体と、を含む第一のプローブを含んでなる。このキットはまた、（ｉ）生物学的標的に対して結合親和性を有する第二の結合性部分と、（ｉｉ）第二の結合性部分と結合した（例えば、共有または非共有結合した）第二のレポーターオリゴヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）第二のレポーターオリゴヌクレオチド配列と結合した（例えば、共有または非共有結合した）非マスク基を含む第二のプローブを含んでなる。生物学的標的に対する第一および第二の結合性部分の結合の際に、第一および第二のレポーターオリゴヌクレオチド配列は、互いにハイブリダイズし、非マスク剤およびマスク化生成物前駆体が互いに反応して反応生成物（すなわち、非マスク化反応生成物）が生成する。この反応生成物は、非マスクエピトープ、非マスク酵素基質、非マスク酵素活性化物質、および非マスクリガンドよりなる群から選択することができる。
【００２８】
本明細書に記載されたキットはまた、複数の検出可能な部分を生成できる検出システムを任意に含んでなる。さらに、キットはまた、生物学的標的の検出用キット使用するための取扱説明書を任意に含んでなる。
【００２９】
幾つかのキットにおいて、第一および第二のプローブの各々は、各プローブの成分が互いに共有結合している単一分子である。あるいは、第一および第二のプローブの各々は、互いに非共有結合している複数の成分を含んで機能性プローブを生成することができる。例えば、これらのプローブは、互いにハイブリダイズして種々のプローブ成分の非共有結合を可能にすることのできる２つ以上のオリゴヌクレオチド配列、例えば、ジップコードのオリゴヌクレオチド配列および相補的または実質的に相補的なアンチジップコードのオリゴヌクレオチド配列を含むことができる。
【００３０】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載された１つまたは複数のアッセイを促進させるために別のキットを提供する。そのキットは、
（ａ）（ｉ）生物学的標的に対して結合親和性を有する第一の結合性部分と、（ｉｉ）第一の結合性部分と結合した（例えば、共有または非共有結合した）第一のオリゴヌクレオチドのジップコード配列と、を含んでなる第一の標的結合性成分と；
（ｂ）（ｉ）生物学的標的に対して結合親和性を有する第二の結合性部分と、（ｉｉ）第二の結合性部分と結合した（例えば、共有または非共有結合した）第二のオリゴヌクレオチドのジップコード配列と、を含んでなる第二の標的結合性成分と；
（ｃ）（ｉ）第一のオリゴヌクレオチドのジップコード配列にハイブリダイズできる第一のオリゴヌクレオチドのアンチジップコード配列と、（ｉｉ）第一のオリゴヌクレオチドのジップコード配列と結合した（例えば、共有または非共有結合した）第一のレポーターオリゴヌクレオチドと、（ｉｉｉ）第一のレポーターオリゴヌクレオチドと結合した（例えば、共有または非共有結合した）第一の生成物前駆体と、を含んでなる第一のレポーター成分と；
（ｄ）（ｉ）第二のオリゴヌクレオチドのジップコード配列にハイブリダイズできる第二のオリゴヌクレオチドのアンチジップコード配列と、（ｉｉ）第二のオリゴヌクレオチドのジップコード配列と結合（例えば、共有または非共有結合）しており、第一のレポーターオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズできる第二のレポーターオリゴヌクレオチドと、（ｉｉｉ）第二のレポーターオリゴヌクレオチド配列と結合した（例えば、共有または非共有結合した）第二の生成物前駆体とを含む第二のレポーター成分を含んでなる。生物学的標的に対する第一および第二の結合性部分の結合、ならびにジップコードおよびアンチジップコードそれぞれのオリゴヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションの際に、レポーターオリゴヌクレオチド配列は、互いにハイブリダイズして、第一および第二の生成物前駆体を反応性に近接させ、反応生成物、例えば、完全エピトープ、酵素基質、酵素活性化物質、およびリガンドを生成させる。
【００３１】
本明細書に記載されたキットはまた、複数の検出可能な部分を生成させることができる検出システムを任意に含んでなる。さらに、キットはまた、生物学的標的の検出用キットを使用するための取扱説明書を任意に含んでなる。
【００３２】
さらにキットの各々において、反応生成物は、ＭＡＳＭＴＧＧＱＱＭＧ（配列番号４）、ＭＡＳＭＴＣＧＱＱＭＧ（配列番号３８）、ＭＡＳＭＴＧＣＱＱＭＧ（配列番号３９）、ＭＡＳＭＴＧＧＣＱＭＧ（配列番号４０）、ＭＡＳＭＴＧＧＱＣＭＧ（配列番号４１）、（Ｇ）０−２−ＮＷＣＨＰＱＦＥ−（Ｇ）０−２（配列番号４２）、（Ｇ）０−２−ＮＷＳＣＰＱＦＥ−（Ｇ）０−２（配列番号４３）、（Ｇ）０−２−ＮＷＳＨＣＱＦＥ−（Ｇ）０−２（配列番号４４）、（Ｇ）０−２−ＮＷＳＨＰＣＦＥ−（Ｇ）０−２（配列番号４５）、（Ｇ）０−２−ＮＷＳＨＰＱＦＥ−（Ｇ）０−２（配列番号４６）、ＫＥＴＡＡＡＫＦＣＲＱＨＭＤＳ（配列番号４７）、ＫＥＴＡＡＡＫＦＧＲＱＨＭＤＳ（配列番号４８）、およびＭＡＳＭＴＧ−［ＳＣＨ２Ｃ（Ｏ）］−ＱＱＭＧ（配列番号４９）から選択されるペプチジル配列を含むことができる。さらに、各々のキットは、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、ＥｒｂＢファミリーのホモ二量体、ＥｒｂＢファミリーのヘテロ二量体、およびＰＤＧＦよりなる群から選択された生物学的標的を結合する抗体を含むことができる。
【００３３】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載された方法およびキットに使用できる分子を提供する。この分子は、ＭＡＳＭＴＣＧＱＱＭＧ（配列番号３８）、ＭＡＳＭＴ−チオエステル（配列番号５０）、ＭＡＳＭＴＧＣＱＱＭＧ（配列番号３９）、ＭＡＳＭＴＧ−チオエステル（配列番号５）、ＭＡＳＭＴＧＧＣＱＭＧ（配列番号４０）、ＭＡＳＭＴＧＧ−チオエステル（配列番号５１）、ＭＡＳＭＴＧＧＱＣＭＧ（配列番号４１）、ＭＡＳＭＴＧＧＱ−チオエステル（配列番号５２）、（Ｇ）０−２−ＮＷＣＨＰＱＦＥ−（Ｇ）０−２（配列番号４２）、（Ｇ）０−２−ＮＷ−チオエステル、（配列番号５３）、（Ｇ）０−２−ＮＷＳＣＰＱＦＥ−（Ｇ）０−２（配列番号４３）、（Ｇ）０−２−ＮＷＳ−チオエステル（配列番号５４）、（Ｇ）０−２−ＮＷＳＨＣＱＦＥ−（Ｇ）０−２（配列番号４４）、（Ｇ）０−２−ＮＷＳＨ−チオエステル（配列番号５５）、（Ｇ）０−２−ＮＷＳＨＰＣＦＥ−（Ｇ）０−２（配列番号４５）、（Ｇ）０−２−ＮＷＳＨＰ−チオエステル（配列番号５６）、ＫＥＴＡＡＡＫＦＣＲＱＨＭＤＳ（配列番号４７）、ＫＥＴＡＡＡＫＦ−チオエステル（配列番号５７）、ＣＧＱＱＭＧ（配列番号５８）、ＣＨＰＱＦＥ−（Ｇ）０−２（配列番号５９）、ＣＰＱＦＥ−（Ｇ）０−２（配列番号６０）、ＣＲＱＨＭＤＳ（配列番号６１）、およびＭＡＳＭＴＧ−［ＳＣＨ２Ｃ（Ｏ）］−ＱＱＭＧ（配列番号４９）よりなる群から選択されるペプチジル部分を含むことができる。前述のペプチド配列において、チオエステルは、ＲがＣ−末端チオエステルを含有するペプチドとＮ−末端システインを含有するペプチドとの間でのペプチド結合の形成を妨げない任意の部分、例えば、Ｃ１〜Ｃ６直鎖状または分枝状アルキルである式−Ｃ（Ｏ）−Ｓ−Ｒを有する。さらに、配列番号４９のペプチドにおいて、基［ＳＣＨ２Ｃ（Ｏ）］は、成分の各々がアミノ酸ではなく、原子を表す（例えば、「Ｓ」は硫黄である）リンカーのことである。
定義
本明細書に用いられる用語の「抗体」とは、完全抗体（例えば、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗血清に見られる完全抗体）、抗体の抗原結合性断片、または生合成抗体結合部位のことである。抗体断片としては、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、（Ｆａｂ’）２断片またはＦｖ断片が挙げられる。抗体および抗体断片は、当業界に知られた従来の技法を用いて作製することができる。多数の生合成抗体結合部位が当業界に知られており、例えば、米国特許第５，０９１，５１３号明細書、米国特許第５，１３２，４０５号明細書、および米国特許第５，４７６，７８６号明細書に記載された、例えば、単一のＦｖ分子またはｓＦｖ分子が挙げられる。他の生合成抗体結合部位としては、例えば、二重特異性または二官能性結合タンパク質、例えば、少なくとも２つの異なるエピトープに結合する抗体または抗体断片である二重特異性または二官能性抗体が挙げられる。二重特異性抗体を作製する方法は、当業界に知られており、例えば、ハイブリドーマを融合するか、Ｆａｂ’断片を結合させることによる方法が挙げられる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉら（１９９０）ＣＬＩＮ．ＥＸＰ．ＩＭＭＵＮＯＬ．７９：３１５−３２５；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら（１９９２）Ｊ．ＩＭＭＵＮＯＬ．１４８：１５４７−１５５３頁を参照されたい。
【００３４】
本明細書に用いられる用語の「と結合した」とは、２つ以上の基、部分、化合物、モノマー、ポリマー、または小型分子の間での相互作用のことである。本明細書に明記されない限り、この相互作用は、共有結合および非共有結合を含み得る。共有結合は、例えば、アミド結合、エステル結合、炭素−炭素結合、ジスルフィド結合、カルバメート結合、エーテル結合、またはカーボネート結合を介して生じ得る。非共有結合としては、例えば、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、磁気相互作用、および静電相互作用が挙げられる。非共有相互作用とは、具体的にはオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが挙げられる。この用語はまた、オリゴヌクレオチドのリンカー配列、ペプチドのリンカー配列、化学的リンカー、または前述のものの任意の機能的等価体、またはそれらの任意の組合わせなど、スペーサーまたはクロスリンカーを介した結合を含む。
【００３５】
本明細書に用いられる用語の「結合性部分」とは、異なる分子に特異的に結合できる１つの分子のことである。代表的な結合部分としては、例えば、タンパク質（例えば、抗体、アドネクチン（ａｄｎｅｃｔｉｎｓ）、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ）、受容体、リガンド、成長因子、ホルモン、サイトカイン、アビジンおよびアビジン類縁体）、核酸（例えば、一本鎖ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列、アプタマー）、炭水化物、脂質、および小型分子が挙げられる。
【００３６】
本明細書に用いられる用語の「検出システム」とは、反応生成物（非マスク反応生成物を含む）の検出および単一の反応生成物から複数の検出可能な部分（例えば、視覚または好適な検出器、例えば、光学検出器、蛍光検出器、比色計、同位体検出器により検出できる部分）の合成を可能にする１つまたは複数の成分を含有するシステムのことである。検出システムは、検出成分および増幅成分を含んでなる。検出成分は、生成物前駆体またはマスク化生成物前駆体に比して反応生成物と優先的に相互作用し、したがって、生成物前駆体またはマスク化生成物前駆体に曝露させた場合よりも反応性生物に曝露させた場合に、有意により多くの検出可能な部分を生じる。例えば、検出成分と増幅成分とが、生成物前駆体および／またはマスク化生成物前駆体と相互作用する際に生じた検出可能な部分の数は、反応生成物の存在下で生じたものの２０％未満、１０％未満、５％未満、１％未満、または０．１％未満である。
【００３７】
本明細書に用いられる用語の「検出成分」とは、生成物前駆体またはマスク化生成物前駆体よりも反応生成物（非マスク反応生成物を含む）と優先的に相互作用し、および／または優先的にそれと結合する検出システムのことである。検出成分は、例えば、結合性部分、例えば、抗体、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）、リガンド、受容体、アプタマー、アドネクチン（ａｄｎｅｃｔｉｎ）、酵素、または小型分子（例えば、アビジンまたストレプトビジン）であり得る。
【００３８】
本明細書に用いられる用語の「増幅成分」とは、検出成分と直接または間接的に結合して複数の検出可能な部分を生成する検出システム成分のことである。増幅成分は、検出成分と同じ分子の一部、例えば、アンチ反応生成物抗体−酵素（例えば、ＨＲＰ）結合体の酵素成分であり得る。あるいは、増幅成分と検出成分とは、互いに相互作用する異なる分子、例えば、反応生成物に結合する検出成分に結合するアンチ検出成分抗体−酵素（例えば、ＨＲＰ）結合体の酵素成分であり得る。増幅成分は、一緒に作用するか、または互いに相互作用して検出可能な部分を生成する２つ以上の分子を含むことができる。例えば、増幅成分は、増幅システムの他の試剤により検出可能な部分に変換される検出可能な部分の前駆体を含むことができる。
【００３９】
本明細書に用いられる用語の「ＤＮＡプログラム化学」、「ＤＰＣ」、「核酸プログラム化学」または「核酸鋳型反応」は、同義語であり、特異的な反応生成物を生成するために、核酸配列が、それと結合した反応物の反応性を制御する化学反応のことである。一般に、この反応は、（ｉ）結合した反応性基を有する１つまたは複数の核酸鋳型を提供すること；（ｉｉ）１つまたは複数の鋳型の少なくとも一部に相補的な配列であるオリゴヌクレオチド配列および結合した反応性基を有する１つまたは複数の試薬（時にはトランスファ単位と称される）を提供すること；および（ｉｉｉ）試薬を（それらの相補的オリゴヌクレオチド配列を介して）鋳型にハイブリダイズさせ、反応性基を反応性に近接させて１つまたは複数の反応生成物を生成させる条件下で鋳型と試薬を接触させること、によって達成される。例えば、ワンステップの核酸鋳型反応において、「鋳型」と「相補的」オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションにより、それらと結合した反応性基を反応性に近接させて特定の生成物を生成させる化学反応が可能になる。反応物ならびに生成物の構造は、鋳型および試薬に存在する核酸配列の構造と関連させる必要はない。核酸鋳型反応の考察に関しては、例えば、Ｌｉｕらによる米国特許第７，０７０，９２８Ｂ１号明細書ならびに米国特許第７，２２３，５４５号明細書および欧州特許第１，４２３，４００Ｂｌ号明細書；Ｌｉｕらによる米国特許出願公開第２００４／０１８０４１２号明細書（米国特許出願第１０／６４３，７５２号明細書；２００３年８月１９日）；Ｇａｒｔｎｅｒら、（２００４）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０５巻、１６０１−１６０５頁；Ｄｏｙｏｎら、（２００３）、ＪＡＣＳ、１２５巻、１２３７２−１２３７３頁、を参照されたい。これらは全て参照として本明細書に援用されている。また、２００６年３月３日に出願されたＣｏｕｌｌらによる「Ｔｕｒｎ  Ｏｖｅｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」、ＰＣＴ国際公開第０７／００８２７６Ａ２号パンフレットを参照されたい。
【００４０】
本明細書に用いられる用語の「エピトープ」とは、抗体のようなエピトープ結合分子により認識され、結合される分子（例えば、生体分子）または小型分子のことである。古典的には、エピトープは、抗体により認識される高分子の小部分、しばしばタンパク質の一部分である。一定のエピトープでは、エピトープは、アミノ酸の線形配列により規定し得るか、またはエピトープを規定する分子の一部の三次元構造を介して互いに近接させたアミノ酸から生じ得る。エピトープは、ペプチド配列であることが多い。また、本明細書に用いられる用語の「エピトープ」とは、それ自体は免疫原性であり得ないが、抗体以外のタンパク質などの高分子に結合した場合に、小型分子、高分子または小型分子／高分子複合体に特異的な免疫応答を誘発するペプチドなどの任意のタイプの小型分子、またはその一部のことである。現在、ホルモン、薬物、殺虫剤および毒素などの小型分子からなる多種多様のエピトープに結合する抗体が一般に利用でき、このような抗体は、これら小型分子の検出アッセイにしばしば使用される。
【００４１】
本明細書に用いられる用語の「核酸」、「オリゴヌクレオチド」（時には単に「オリゴ」と称される）または「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドのポリマーのことである。このポリマーとしては、限定はしないが、天然のヌクレオシド類（すなわち、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）、ヌクレオシド類縁体（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニルウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、および２−チオシチジン）、化学的に修飾された塩基類、生物学的に修飾された塩基類（例えば、メチル化塩基類）、介在塩基類、修飾された糖類（例えば、２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）、または修飾されたリン酸基（例えば、ホスホロチオエート類および５’−Ｎ−ホスホラミダイト結合）が挙げられる。また、核酸およびオリゴヌクレオチドとしては、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）などの修飾された主鎖を有する塩基類の他のポリマーを挙げることができる。
【００４２】
本明細書に用いられる用語の「タンパク質」および「ペプチド」とは、アミノ酸のポリマーのことであり、特定の長さまたは数のアミノ酸のことではない。当然のことながら、アミノ酸は、天然であっても非天然であってもよく、１つまたは複数の修飾、例えば、アミノ酸側鎖に対して１つまたは複数の修飾を含有してもよい。さらに、このポリマーは、１つまたは複数のペプチジル結合、および任意に１つまたは複数の修飾された結合を含有してもよい。
【００４３】
本明細書に用いられる用語の「生成物前駆体」または「反応生成物前駆体」とは、ＤＮＡプログラム化学によって反応生成物に変換される出発物質に存在する任意の原子または分子のことである。当然のことながら、反応生成物中に生成物前駆体の全体もしくは反応生成物前駆体の全体が存在してもよいし、それらの一部が存在してもよい。前駆体としては、例えば、小型分子の一部、酵素基質、酵素活性化物質、リガンドまたはエピトープを挙げることができる。
【００４４】
本明細書に用いられる用語の「マスク化前駆体」または「マスク化生成物前駆体」とは、除去されると、操作性生成物、例えば、操作性酵素基質、操作性酵素活性化物質、操作性リガンドおよび操作性エピトープを生じ得る、１つまたは複数の化学基によって不活化された任意の分子のことである。
【００４５】
本明細書に用いられる用語の「小型分子」とは、１モル当り５，０００グラム未満、任意に１モル当り２，０００グラム未満、および任意に１モル当り１，０００グラム未満の分子量を有し、実験室で合成されたか、または天然に見出された有機化合物のことである。
【００４６】
組成物が、特定の成分を有する、含む、もしくは含んでなると記載されているか、または処理が、特定の処理ステップを有する、含む、または含んでなると記載されている記述を通して、本発明の組成物はまた、列挙された組成物からなるか、または本質的になること、また、本発明の加工処理が、挙げられた処理ステップから本質的になるか、またはなることが考慮されている。さらに当然のことながら、本発明が操作可能のままである限り、ステップの順序または一定の作用を実施する順序は重要なことではない。さらに、２つ以上のステップまたは動作が同時に実施されてもよい。
【００４７】
本発明は、以下の図面からさらに理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】ＤＰＣベースのエピトープ作出を介して生物学的標的を検出する代表的な方法を示す概略図である。このアッセイは、各アセンブリが生物学的標的（Ｌ１またはＬ２と示す）上の部位に対する結合性部分（結合性リガンド）、核酸配列（レポーター核酸または補体と示す）、および化学反応することができる前駆体分子（前駆体１または前駆体２と示す）を含んでなる２つのプローブ（リガンド−レポーターアセンブリと示す）を使用する。各リガンド−レポーターアセンブリは、任意のスペーサー基（Ｓｐ１、Ｓｐ２、Ｓｐ３、Ｓｐ４と示す）および架橋基（ＣＬと示す）を含有することができる。レポーター核酸配列および補体は、核酸二重鎖を形成するために、通常は完全に、または殆どが自己相補的かつ逆平行である。リガンド−レポーターアセンブリが標的に結合すると、レポーター核酸と補体とが互いにハイブリダイズし、前駆体１を前駆体２へ反応性に近接させて生成物、例えば、エピトープを含有する生成物が生成する。エピトープに結合する抗体（ＡＢと示す）を用いることによって、この反応生成物を検出することができる。
【図２】２つの別個のオリゴヌクレオチド結合体から生成されるプローブ（２ピース断片のリガンド−レポーターアセンブリ）を示す概略図である。一方のオリゴヌクレオチド結合体（標的結合性成分と示す）は、結合性部分（Ｌ）、任意のスペーサー／クロスリンカー（Ｓｐ／ＣＬ）、およびジップコードＤＮＡの配列を含有する。他方のオリゴヌクレオチド結合体（レポーター結合体と示す）は、前駆体、任意のスペーサーまたはクロスリンカー（Ｓｐ／ＣＬ）、レポーター核酸、任意のスペーサー（Ｓｐ）およびアンチジップコードの配列を含有する。ジップコード（「ジップ」）およびアンチジップコード（「アンチジップ」）配列は、相補的または実質的に相補的であり、通常、レポーター核酸よりも配列が長く、それらの配列は、レポーター配列にアニールしないように選択される。ジップコード配列とアンチジップコード配列とが共にハイブリダイズして、安定なリガンド−レポーター複合体を支持する安定な二重鎖を形成する。生じた複合体は、図１に示された単一分子のリガンド−レポーターアセンブリの機能的に等価である。
【図３−１】エピトープを生成できる代表的なＤＰＣ反応の概要を示す図である。
【図３−２】エピトープを生成できる代表的なＤＰＣ反応の概要を示す図である。
【図４】ビオチンリガーゼによるビオチン化に利用できる部位を作製する酵素ビオチンリガーゼに対する基質中のイプシロンリシンからブロック性アジド基を除去する方法を示す概略図である。
【図５−１】アジドビオチンリガーゼペプチド（ＢＬＰ）−オリゴヌクレオチド結合体の合成を示す概略図である。
【図５−２】アジドビオチンリガーゼペプチド（ＢＬＰ）−オリゴヌクレオチド結合体の合成を示す概略図である。
【図６】ビオチンリガーゼにより脱ブロック化ＢＬＰ基質（図４を参照）に加えたビオチン分子の存在を検出できる代表的なアッセイ様式を示す概略図である。
【図７】図６に記載されたアッセイ様式の結果を示す棒グラフである。最初の２つのカラムは、ビオチンリガーゼの非存在下のサンプルを表し、１つは、トリス−（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）塩酸塩で還元されたサンプル、２番目は、ＴＣＥＰで還元されないサンプルを表す。３番目と４番目のカラムは、ビオチンリガーゼと共にインキュベートした同じサンプルを表す。ＴＣＥＰで還元され、ビオチンリガーゼと共にインキュベートしたサンプルだけが、陽性のシグナルを生じ、このサンプルがビオチン化されていることを示した。
【図８−１】４−アジドベンジルカルバメート形成を介して、ビオチンリガーゼに対し基質中のリシンのε−アミノ基をマスクするための反応スキームを示す概略図である。
【図８−２】４−アジドベンジルカルバメート形成を介して、ビオチンリガーゼに対し基質中のリシンのε−アミノ基をマスクするための反応スキームを示す概略図である。
【図９】ビオチンリガーゼに対する基質を作製するための２つのヘミペプチドの連結に基づくＤＰＣ媒介検出反応を示す概略図である。連結前に、このヘミペプチドは、ビオチンリガーゼにより認識されない。連結後、生じた生成物は、ビオチンリガーゼにより認識され、ペプチド中のリシンのイプシロンアミノ基にビオチンが付加される。
【図１０】ビオチンリガーゼに対する基質を形成するために連結させることのできる代表的なヘミペプチドを示す概略図である。この場合、Ｎ−末端ヘミペプチドは、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて抗フルオレセイン抗体により連結ペプチドの捕獲を可能にするフルオレセイン分子を含有する。２つのヘミペプチドは、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド（ＥＤＣ）塩酸塩の存在下で連結することができる。
【図１１】図１０に記載されたペプチドを用いたアッセイ系の結果を示す棒グラフである。陽性対照は、完全長フルオレセイン含有ビオチンリガーゼペプチドを含んだ。ペプチドは、２つの異なる濃度、２．５ｍＭと０．２５ｍＭを用い、ＥＤＣは、２つの異なる濃度、１ｍｇ／ｍＬと０．１ｍｇ／ｍＬで加えた。ビオチン化反応で生じたシグナル量は、ペプチドおよびＥＤＣのより高い濃度の存在下で最大であった。ＥＤＣの不存在下で生じたシグナルは、バックグラウンドに等しかった（ヘミペプチド自体を除いたものと同じ）。
【図１２】完全長Ｔ７エピトープペプチド（完全長として示す）だけを認識するが、２つのヘミペプチド（それぞれＮ−末端およびＣ−末端として示す）は認識しないモノクローナルアンチＴ７抗体の能力を示すＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すグラフである。
【図１３−１】Ｔ７ヘミペプチド−オリゴヌクレオチド結合体を生成するための反応スキームを示す概略図である。
【図１３−２】Ｔ７ヘミペプチド−オリゴヌクレオチド結合体を生成するための反応スキームを示す概略図である。
【図１３−３】Ｔ７ヘミペプチド−オリゴヌクレオチド結合体を生成するための反応スキームを示す概略図である。
【図１４Ａ】ゲル電気泳動により特性化された（図１４Ｂ）、Ｔ７ヘミペプチド−オリゴヌクレオチド結合体（図１４Ａ）からＴ７ペプチドを形成した結果を示す図である。
【図１４Ｂ】ゲル電気泳動により特性化された（図１４Ｂ）、Ｔ７ヘミペプチド−オリゴヌクレオチド結合体（図１４Ａ）からＴ７ペプチドを形成した結果を示す図である。
【図１５−１】ペプチドエピトープに結合する抗体が市販されている代表的なペプチドエピトープを示す表である。
【図１５−２】ペプチドエピトープに結合する抗体が市販されている代表的なペプチドエピトープを示す表である。
【図１６Ａ】チオエステル形成を介して（図１６Ａ）またはＳｔａｕｄｉｎｇｅｒ連結を介して（図１６Ｂ）ペプチド連結を促進させるために使用することができるＤＰＣ反応の２つの例を示す図である。
【図１６Ｂ】チオエステル形成を介して（図１６Ａ）またはＳｔａｕｄｉｎｇｅｒ連結を介して（図１６Ｂ）ペプチド連結を促進させるために使用することができるＤＰＣ反応の２つの例を示す図である。
【図１７】固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によりチオエステルおよびホスフィンペプチドを生成するための反応スキームを示す概略図である。
【図１８Ａ】リボヌクレアーゼＳ−タンパク質のリボヌクレアーゼ活性を活性化できるペプチドを可逆的に不活化するための３つのアプローチを示す系統図である。図１８Ａは、ジスルフィド結合を介してペプチドを循環させ、不活化するために使用できるさらなるＮ−末端およびＣ−末端システインを含有するペプチドを示す。このジスルフィド結合は、スルフヒドリル系還元試薬により切断することができる。図１８Ｂは、ペプチド中の１つまたは複数のリシンを任意にジアゾ化し、Ｓ−タンパク質による配列認識を破壊するペプチドを示す。図１８Ｃは、活性な完全長生成物を生成するために連結させることができる完全長Ｓ−ペプチド配列の２つのヘミペプチドを示す。
【図１８Ｂ】リボヌクレアーゼＳ−タンパク質のリボヌクレアーゼ活性を活性化できるペプチドを可逆的に不活化するための３つのアプローチを示す系統図である。図１８Ａは、ジスルフィド結合を介してペプチドを循環させ、不活化するために使用できるさらなるＮ−末端およびＣ−末端システインを含有するペプチドを示す。このジスルフィド結合は、スルフヒドリル系還元試薬により切断することができる。図１８Ｂは、ペプチド中の１つまたは複数のリシンを任意にジアゾ化し、Ｓ−タンパク質による配列認識を破壊するペプチドを示す。図１８Ｃは、活性な完全長生成物を生成するために連結させることができる完全長Ｓ−ペプチド配列の２つのヘミペプチドを示す。
【図１８Ｃ】リボヌクレアーゼＳ−タンパク質のリボヌクレアーゼ活性を活性化できるペプチドを可逆的に不活化するための３つのアプローチを示す系統図である。図１８Ａは、ジスルフィド結合を介してペプチドを循環させ、不活化するために使用できるさらなるＮ−末端およびＣ−末端システインを含有するペプチドを示す。このジスルフィド結合は、スルフヒドリル系還元試薬により切断することができる。図１８Ｂは、ペプチド中の１つまたは複数のリシンを任意にジアゾ化し、Ｓ−タンパク質による配列認識を破壊するペプチドを示す。図１８Ｃは、活性な完全長生成物を生成するために連結させることができる完全長Ｓ−ペプチド配列の２つのヘミペプチドを示す。
【図１９】核酸標的上の標的配列を検出するためのエピトープ作出反応を示す概略図である。２つのオリゴヌクレオチド−ペプチド結合体は、標的配列上で隣接またはほぼ隣接した相補的配列にアニールする。この結合体上の局在化した高濃度のペプチドは、核酸標的上の相補的配列にアニールする際に迅速な連結を促進させる。
【図２０】特定の標的の検出に適応させた図３に記載したジアジドローダミン（ＤＡＺＲ）のビスジフェニルホスフィン還元のＤＰＣ反応を説明する試験系を示す概略図である。この場合、２つの標的結合性成分は、ＰＤＧＦ−ＡＢのＡおよびＢのサブユニットに対して特異的である。標的結合性成分の各々は、別個にジップコード化されて、それぞれＤＡＺＲ基およびビスジフェニルホスフィン基を含有するオリゴヌクレオチド結合体を保持した。２つの標的結合性成分への同時結合は、レポーターＤＮＡ配列のアニーリングを増加させ、ＤＡＺＲ基とビスジフェニルホスフィン基との近接を増加させ、蛍光生成物ローダミンを生成する反応を迅速にする。
【図２１】図２０に記載されたアッセイ様式の反応の時間経過を示すグラフである。ローダミン生成の蛍光が経時的にモニターされた。陰性対照は、ＰＤＧＦ−ＡＢ標的またはビスジフェニルホスフィンオリゴヌクレオチド結合体のいずれかを除外する操作をした。陽性対照は、大過剰の遊離ＴＣＥＰを含んだ。
【図２２】ＤＡＺＲ上のローダミンに優先的に結合する抗フルオレセイン抗体−西洋わさびペルオキシダーゼ結合体により、シグナルが増幅される代表的なアッセイ様式を示す概略図である。
【図２３】図２２に記載された反応からの反応生成物を検出するＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すグラフである。標的分子（ＰＤＧＦ−ＡＢ）を除くか、またはビスジフェニルホスフィンを除いた陰性対照と比較して、反応物の全てを含有した反応からより大きなシグナルが得られた。全ての反応物の存在下で生じたシグナル量は、全てのＤＡＺＲが過剰のＴＣＥＰにより還元された陽性対照において生じたシグナル量にほぼ等しかった。
【図２４】アルドールタイプの縮合反応を介してシアニン色素を生成する代表的なＤＰＣ反応スキームを示す概略図である。
【図２５】アルドール縮合を介してｐ−クマリン酸を生成する代表的なＤＰＣ反応スキームを示す概略図である。
【図２６】ＤＰＣを介して近接させた場合に、アンチＴ７抗体により検出可能なＴ７ペプチドを生成する、Ｔ７ヘミペプチドと結合したＥＧＦＲの各々に対する２つの別個の抗体を用いてＡ４３１細胞上のＥＧＦＲホモ二量体の検出を示す棒グラフである。
【図２７】Ｔ７ヘミペプチドと結合したＥＧＦＲの各々に対する２つの別個の抗体またはＴ７ヘミペプチドと結合したＥＧＦＲに対する抗体およびＴ７ヘミペプチドと結合したＥｒｂＢ２に対するアフィボディを用いてフローサイトメトリーによりＡ４３１細胞中のＥＧＦＲホモ二量体またはＥＧＦＲ−ＥｒｂＢ２ヘテロ二量体の検出を示す棒グラフである。抗体−ヘミペプチド複合体が、ＤＰＣを介して反応性に近接させられると、アンチＴ７抗体−ＨＲＰ結合体により触媒されたチラミド−Ａｌｅｘａ５６８の組込みにより検出可能なＴ７ペプチドが生成する。
【図２８Ａ】アンチＴ７単独で処理されたＫＹ０１細胞（図２８Ａ）、アンチＴ７抗体と反応したＢｃｒおよびＴ７ヘミペプチドに対する抗体を含んでなる結合体（図２８Ｂ）、およびアンチＴ７抗体と反応したＡｂ１およびＴ７ヘミペプチドに対する抗体を含んでなる結合体と共にＢｃｒおよびＴ７ヘミペプチドに対する抗体を含んでなる結合体（図２８Ｃ）、のフローサイトメトリーによる分布を示すヒストグラムである。
【図２８Ｂ】アンチＴ７単独で処理されたＫＹ０１細胞（図２８Ａ）、アンチＴ７抗体と反応したＢｃｒおよびＴ７ヘミペプチドに対する抗体を含んでなる結合体（図２８Ｂ）、およびアンチＴ７抗体と反応したＡｂ１およびＴ７ヘミペプチドに対する抗体を含んでなる結合体と共にＢｃｒおよびＴ７ヘミペプチドに対する抗体を含んでなる結合体（図２８Ｃ）、のフローサイトメトリーによる分布を示すヒストグラムである。
【図２８Ｃ】アンチＴ７単独で処理されたＫＹ０１細胞（図２８Ａ）、アンチＴ７抗体と反応したＢｃｒおよびＴ７ヘミペプチドに対する抗体を含んでなる結合体（図２８Ｂ）、およびアンチＴ７抗体と反応したＡｂ１およびＴ７ヘミペプチドに対する抗体を含んでなる結合体と共にＢｃｒおよびＴ７ヘミペプチドに対する抗体を含んでなる結合体（図２８Ｃ）、のフローサイトメトリーによる分布を示すヒストグラムである。
【図２９Ａ】図２９Ａは、ＢｃｒおよびＴ７ヘミペプチドに対する抗体を含んでなる結合体で処理したＫＹ０１細胞；Ａｂ１およびＴ７ヘミペプチドに対する抗体を含んでなる結合体；またはＢｃｒおよびＴ７ヘミペプチドに対する抗体を含んでなる結合体とＡｂ１およびＴ７ヘミペプチドに対する抗体を含んでなる結合体双方のフローサイトメトリー分布を示す図である。各々の場合に、結合体処理細胞をアンチＴ７抗体と反応させ、次いでヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ）２−Ａｌｅｘａ５６８シグナルを増幅して検出した。図２９Ｂは、Ａｂ１およびＴ７ヘミペプチドに対する抗体を含んでなる結合体で処理した精製骨髄単核細胞；またはＢｃｒおよびＴ７ヘミペプチドに対する抗体を含んでなる結合体とＡｂ１およびＴ７ヘミペプチドに対する抗体を含んでなる結合体双方のフローサイトメトリー分布を示す図である。各々の場合に、結合体処理細胞をアンチＴ７抗体と反応させ、次いでヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ）２−Ａｌｅｘａ５６８シグナルを増幅して検出した。
【図２９Ｂ】図２９Ａは、ＢｃｒおよびＴ７ヘミペプチドに対する抗体を含んでなる結合体で処理したＫＹ０１細胞；Ａｂ１およびＴ７ヘミペプチドに対する抗体を含んでなる結合体；またはＢｃｒおよびＴ７ヘミペプチドに対する抗体を含んでなる結合体とＡｂ１およびＴ７ヘミペプチドに対する抗体を含んでなる結合体双方のフローサイトメトリー分布を示す図である。各々の場合に、結合体処理細胞をアンチＴ７抗体と反応させ、次いでヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ）２−Ａｌｅｘａ５６８シグナルを増幅して検出した。図２９Ｂは、Ａｂ１およびＴ７ヘミペプチドに対する抗体を含んでなる結合体で処理した精製骨髄単核細胞；またはＢｃｒおよびＴ７ヘミペプチドに対する抗体を含んでなる結合体とＡｂ１およびＴ７ヘミペプチドに対する抗体を含んでなる結合体双方のフローサイトメトリー分布を示す図である。各々の場合に、結合体処理細胞をアンチＴ７抗体と反応させ、次いでヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ）２−Ａｌｅｘａ５６８シグナルを増幅して検出した。
【図３０Ａ】それぞれＴ７ヘミペプチドに結合したＥｒｂＢ２に対する抗体なしで（図３０Ｄ）、１つの抗体で（図３０Ｃ）または２つの別個の抗体（図３０Ａ）で処理したヒト乳癌の組織切片を示す画像である。各々をＴ７ヘミペプチドと結合したＥｒｂＢ２に対する２つの別個の抗体は、ＤＰＣを介して反応性に近接させた場合にＴ７ペプチドを生成した。図３０Ｂは、ヘマトキシリン−エオシン染色切片を示す。図３０Ａ、３０Ｃおよび３０Ｄの各々に関して、細胞は、ＨＲＰに結合したアンチＴ７抗体で処理し、次いでチラミド−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５６８で検出した。
【図３０Ｂ】それぞれＴ７ヘミペプチドに結合したＥｒｂＢ２に対する抗体なしで（図３０Ｄ）、１つの抗体で（図３０Ｃ）または２つの別個の抗体（図３０Ａ）で処理したヒト乳癌の組織切片を示す画像である。各々をＴ７ヘミペプチドと結合したＥｒｂＢ２に対する２つの別個の抗体は、ＤＰＣを介して反応性に近接させた場合にＴ７ペプチドを生成した。図３０Ｂは、ヘマトキシリン−エオシン染色切片を示す。図３０Ａ、３０Ｃおよび３０Ｄの各々に関して、細胞は、ＨＲＰに結合したアンチＴ７抗体で処理し、次いでチラミド−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５６８で検出した。
【図３０Ｃ】それぞれＴ７ヘミペプチドに結合したＥｒｂＢ２に対する抗体なしで（図３０Ｄ）、１つの抗体で（図３０Ｃ）または２つの別個の抗体（図３０Ａ）で処理したヒト乳癌の組織切片を示す画像である。各々をＴ７ヘミペプチドと結合したＥｒｂＢ２に対する２つの別個の抗体は、ＤＰＣを介して反応性に近接させた場合にＴ７ペプチドを生成した。図３０Ｂは、ヘマトキシリン−エオシン染色切片を示す。図３０Ａ、３０Ｃおよび３０Ｄの各々に関して、細胞は、ＨＲＰに結合したアンチＴ７抗体で処理し、次いでチラミド−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５６８で検出した。
【図３０Ｄ】それぞれＴ７ヘミペプチドに結合したＥｒｂＢ２に対する抗体なしで（図３０Ｄ）、１つの抗体で（図３０Ｃ）または２つの別個の抗体（図３０Ａ）で処理したヒト乳癌の組織切片を示す画像である。各々をＴ７ヘミペプチドと結合したＥｒｂＢ２に対する２つの別個の抗体は、ＤＰＣを介して反応性に近接させた場合にＴ７ペプチドを生成した。図３０Ｂは、ヘマトキシリン−エオシン染色切片を示す。図３０Ａ、３０Ｃおよび３０Ｄの各々に関して、細胞は、ＨＲＰに結合したアンチＴ７抗体で処理し、次いでチラミド−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５６８で検出した。
【図３１】Ｃ−末端チオエステルを有する第一のＤＮＡ−ペプチド結合体およびＮ−末端システインまたはシステイン類縁体を有する第二のＤＮＡ−ペプチド結合体を用いて天然のペプチド結合を生成するための一般的な反応スキームを示す図である。
【図３２−１】脱保護Ｔ７＿ｐ１＿チオエステル合成のための代表的な反応スキームを示す図である。
【図３２−２】脱保護Ｔ７＿ｐ１＿チオエステル合成のための代表的な反応スキームを示す図である。
【図３３】天然の化学的連結による変異体Ｔペプチドの形成に対する、種々のミスマッチド対または異なるサイズのレポーター配列、すなわち、１つはＴ７＿ｐ１−Ｓ（Ｅｔ３ＭＰ）に結合したもの、他はＴ７＿ｐ２＿Ｃｙｓに結合したものの影響を示す棒グラフである。
【図３４】Ｔ７＿ｐ１−Ｓ（Ｅｔ３ＭＰ）およびＴ７＿ｐ２＿Ｃｙｓの天然の化学的連結、ならびにマッチド対もしくはミスマッチド対またはレポーターオリゴヌクレオチドを用いたＤＰＣによるＡ４３１細胞系におけるＥＧＦＲホモ二量体の検出を示す棒グラフである。
【図３５】Ｔ７＿ｐ１−Ｓ（Ｅｔ３ＭＰ）およびＴ７＿ｐ２＿Ｃｙｓの天然の化学的連結（ＮＣＬ）、またはＴ７＿ｐ１−Ｓ（Ｅｔ３ＭＰ）およびＴ７＿ｐ２＿ＭＡのチオエステル交換を用いたＤＰＣによるＤＮＡ配列の検出を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
本発明は、サンプル中の生物学的標的（標的分子とも称される）の検出を可能にする。生物学的標的の存在下、ＤＰＣ反応は、反応生成物、適切な検出システムを用いて直接的または間接的に検出できる、例えば、完全エピトープ、酵素基質、酵素活性化物質、またはリガンドを生成する。この検出システムは、１反応性生物当り複数の検出可能な部分を生成できる増幅成分を含む。次いで検出可能な部分は、視覚または適切な検出器（例えば、光学検出器、蛍光検出器、比色計、または同位体検出器）を介して検出することができる。適切な検出器は、所与のアッセイにおいて生成した検出可能な部分に依存する。
【００５０】
本発明は、サンプル、例えば、組織サンプルまたは体液サンプル中の生物学的標的の存在および／または量を判定するための方法、試薬、およびキットを提供する。一般にこのアッセイシステムは、２つのプローブを含み、それらの各々は、他方にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド結合体、生物学的標的に結合するための結合性部分および前駆体、例えば、生成物前駆体またはマスク化生成物前駆体を含んでなる。これらの成分は、互いに共有または非共有結合して機能性プローブを生成することができる。このような２つのプローブをサンプルと合わせると、生物学的標的が存在する場合、この結合性部分が生物学的標的に結合し、その際、オリゴヌクレオチドは互いにハイブリダイズして生成物前駆体またはマスク化生成物前駆体および非マスク基を反応性に近接させ、反応生成物（非マスク反応生成物を含む）を生成させる。その後、適切な検出システムを用い、反応生成物の各々を用いて、各反応生成物から複数の検出可能な部分を生成することができる。
【００５１】
一定の実施形態において、生成物前駆体（エピトープを欠く）は互いに反応して、検出成分、例えば、抗体により検出できるエピトープを含有する生成物を生成する。あるいは、反応生成物は、結合性部分、例えば、受容体に対するリガンドであり得るが、その前駆体は検出成分により結合されない。あるいは、反応生成物は、酵素活性化物質および／または酵素基質であり得るが、その前駆体は、酵素に対する操作性基質として活性化せず、および／または作用しない。当然のことながら、反応生成物は、合成スキーム、分解スキームまたは修飾によって作製することができる。この２つの前駆体分子自体は、互いに自然反応性があってもよいし、反応生成物を生成するためには溶液中に存在する他の試薬または触媒の存在を必要としてもよい。
【００５２】
本明細書に記載された方法および組成物を使用して、注目しているサンプル中の特定の生物学的標的の存在、所望の場合は量を判定することができる。生物学的標的は、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物またはタンパク質であり得る。代表的なタンパク質としては、例えば、受容体、リガンド、ホルモン、酵素、または免疫グロブリンが挙げられる。代表的な標的としては、タンパク質複合体、細胞表面抗原、抗体、抗原、ウィルス、細菌、有機表面、膜、または細胞小器官が挙げられる。
【００５３】
一定の状況下で、生物学的標的は、多量体タンパク質、例えば、ホモ二量体タンパク質、ヘテロ二量体タンパク質、または融合タンパク質であり得る。本明細書に記載されたアッセイを用いて、一定の二量体タンパク質および融合タンパク質の存在および／または量を判定することができる。さらに、本明細書に記載されたアッセイを用いて、一定の翻訳後の修飾タンパク質の存在および／または量を判定することができる。
【００５４】
検出および／または定量できる代表的な多量体タンパク質としては、例えば、ＥｒｂＢタンパク質ファミリーのホモおよびヘテロ二量体；ＶＥＧＦ受容体のホモおよびヘテロ二量体；ＶＥＧＦ二量体；ＰＤＧＦ二量体；チロシンキナーゼ受容体の複合体；ＴＮＦ／ＴＮＦＲ複合体；カドヘリン複合体；カテニン複合体；ＩＧＦＲ複合体；インスリン受容体複合体；受容体／受容体リガンド複合体（例えば、ＥＰＯ／ＥＰＯ受容体）；ＮＦ−ｋＢ／ＩｋＢ複合体；Ｔ細胞抗原複合体；インテグリンタンパク質複合体；ＦＫＢＰタンパク質複合体；ｐ５３タンパク質複合体；Ｂｃｌファミリーのタンパク質複合体；Ｍｙｃ／Ｍａｘ複合体；シクリンタンパク質複合体；細胞内タンパク質キナーゼ複合体；カスパーゼタンパク質複合体；自己抗体−抗原複合体；および分泌タンパク質複合体（例えば、アミロイドタンパク質複合体）が挙げられる。
【００５５】
検出および／または定量できる代表的な融合タンパク質としては、例えば、Ｂｃｒ−Ａｂ１；ＮＰＭ−ＡＬＫ；および一定のＡＬＫ含有融合タンパク質が挙げられる。検出および／または定量できる代表的な翻訳後の修飾としては、例えば、リン酸化タンパク質（例えば、リン酸化ＳＴＡＴタンパク質）；グリコシル化タンパク質；およびファルネシル化タンパク質（例えば、ＲＡＳ）が挙げられる。
【００５６】
当然のことながら、本明細書に記載されたプローブに関して、用語の「生物学的標的に対する結合親和性を有する結合性部分」とは、結合性部分が、生物学的標的に対して直接的または間接的に結合し得ることを意味していると解釈される。例えば、結合性部分は、生物学的標的に直接結合することができ、例えば、プローブ中の結合性部分が抗ＥｒｂＢ抗体の場合は、ＥｒｂＢタンパク質に直接結合する。しかしながら、また当然のことながら、結合性部分は、生物学的標的に間接的に結合してもよく、例えば、プローブの結合性部分が、例えば、ヤギ抗マウス抗体である場合、本明細書に記載された本発明の実施時に、ＥｒｂＢタンパク質に結合したマウス抗ＥｒｂＢ抗体は結合する。当然のことながら、後者の実施形態において、実際にＥｒｂＢタンパク質に結合する抗体は、一般に何らかの様式が異なっている（例えば、異なる供給源に由来する（例えば、１つは、マウスに由来する抗体であり、他は、ウサギに由来する抗体である）か、または異なる構造形体を有する（例えば、異なるＦｃ領域を有する）抗体）。
【００５７】
代表的な核酸としては、ＤＮＡ（例えば、ゲノムまたは相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ））またはそれらの部分、またはＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、またはリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）またはそれらの部分）が挙げられる。
【００５８】
これらの標的は、本明細書に記載された方法と組成物とを用いて検出することができる。しかし、当然のことながら、具体的なアッセイ様式は、そのアッセイが定量的であろうと、半定量的であろうと定性的であろうと、一定の考慮事項、例えば、検出される生物学的標的、所望のアッセイ感度に依って、本明細書に記載された１つまたは複数の形体、試薬および化学を含み得る。下記の節では、代表的なアッセイ様式、試薬の考慮事項、およびアッセイの考慮事項を記載している。
Ｉ．代表的なアッセイ様式
本明細書に記載されたアッセイ様式は、一般に２つ以上の生成物前駆体からの反応生成物の合成、および／または１つまたは複数のマスク化（不活性）前駆体からの反応生成物の合成を含む。
【００５９】
２つ以上の生成物前駆体から反応生成物の合成を含む代表的なアッセイは、以下のとおり実施することができる。この方法は、試験するサンプルを２つのプローブと合わせることを含んでなる。第一のプローブは、（ｉ）生物学的標的に対して結合親和性を有する第一の結合性部分と、（ｉｉ）第一の結合性部分と結合した（例えば、共有または非共有結合した）第一のオリゴヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）第一のオリゴヌクレオチド配列と結合した（例えば、共有または非共有結合した）第一の生成物前駆体とを含んでなる。第二のプローブは、（ｉ）生物学的標的に対して結合親和性を有する第二の結合性部分と、（ｉｉ）第二の結合性部分に結合（例えば、共有または非共有結合）しており、第一のオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズできる第二のオリゴヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）第二のオリゴヌクレオチド配列と結合した（例えば、共有または非共有結合した）第二の生成物前駆体とを含んでなる。
【００６０】
生物学的標的がサンプル中に存在する場合、生物学的標的に第一および第二の結合性部分の双方を結合させる条件下でこれらのプローブをサンプルと合わせる。第一および第二の結合性部分が生物学的標的に結合する際、第一および第二のオリゴヌクレオチド配列を互いにハイブリダイズして、第一および第二の生成物前駆体を互いに反応性に近接させ、反応生成物を生成させる。反応生成物は、完全エピトープ、酵素基質、酵素活性化物質またはリガンドであり得る。
【００６１】
反応生成物が得られたら、反応生成物の単一の分子が、複数の検出可能な部分を生成するように、検出可能な部分を生成できる検出システムに曝露させる。この検出システムの検出成分は、反応生成物と相互作用するが生成物前駆体と相互作用せず、増幅成分と結合して複数の検出可能な部分を生成する。検出可能な部分の存在および／または量により、サンプル中の生物学的標的の存在および／または量が示される。
【００６２】
ＤＰＣ反応により完全エピトープを生成する場合、当然のことながら、多くの既知のエピトープおよびそれらの類縁体を、図３にも掲げている前述の反応を介して生成させることができる。図１５はまた、エピトープに結合する抗体が市販されているエピトープのリストを提供している。幾つかの場合、有効なＤＰＣ反応を設計して化合物を合成でき、このような化合物に対する抗体を生じさせることができる。同様の反応化学を用いて、他の反応生成物、例えば、酵素基質および抗素活性化物質などを生成することができる。
【００６３】
１つまたは複数の不活性前駆体からの反応性生成物の合成を含む別の代表的なアッセイは、以下のとおり実施することができる。この方法は、試験するサンプルを２つのプローブと合わせることを含んでなる。第一のプローブは、（ｉ）生物学的標的に対して結合親和性を有する第一の結合性部分と、（ｉｉ）第一の結合性部分と結合した（例えば、共有または非共有結合した）第一のオリゴヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）第一のオリゴヌクレオチド配列と結合した（例えば、共有または非共有結合した）第一のマスク化前駆体とを含んでなる。第二のプローブは、（ｉ）生物学的標的に対して結合親和性を有する第二の結合性部分と、（ｉｉ）第二の結合性部分に結合（例えば、共有または非共有結合）しており、第一のオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズできる第二のオリゴヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）第二のオリゴヌクレオチド配列と結合した（例えば、共有または非共有結合した）非マスク基とを含んでなる。生物学的標的がサンプル中に存在する場合、その生物学的標的に第一および第二の結合性部分を結合させる条件下で、このサンプルとプローブとを合わせる。結合性部分が生物学的標的に結合する場合、第一および第二のオリゴヌクレオチド配列は互いにハイブリダイズし、非マスク基をマスク化生成物前駆体との反応性に近接させて反応生成物（非マスク化反応生成物）を生成させる。
【００６４】
反応生成物が得られたら、反応生成物の単一の分子が複数の検出可能な部分を生成するように、検出可能な部分を生成できる検出システムに曝露させる。次いで検出可能な部分の存在および／または量を用いて、サンプル中の生物学的標的の存在および／または量を判定することができる。
【００６５】
当然のことながら、マスク化前駆体は、マスク化エピトープ、マスク化酵素基質、マスク化酵素活性化物質またはマスク化リガンドであり得る。反応時に、マスク基が除去されて、非マスク化生成物、例えば、非マスク化エピトープ、非マスク化酵素基質、非マスク化酵素活性化物質または非マスク化リガンドが生成する。
ＩＩ．試薬およびアッセイ条件
当然のことながら、具体的なアッセイでは、本明細書に開示された多数の試薬およびアッセイ条件を使用することができる。例えば、リガンド−受容体アセンブリとも称される本明細書に記載されたプローブは、例えば、図１に示されたような単一の分子、または図２に示されたような互いに非共有結合して機能性プローブを生成する複数の分子であり得る。
【００６６】
図１に示された反応生成物は、完全エピトープを含有するペプチドである。しかしながら、本明細書に記載された他の反応生成物に関して同じ原理を適用できる。本様式において、このアッセイでは、所望のエピトープの前駆体（前駆体１および前駆体２と示す）の各々が、オリゴヌクレオチド（それぞれレポーター核酸と補体とで示す）と結合する２つのリガンド−レポーターアセンブリ１００と１２０とを使用する。さらに、各リガンド−レポーターアセンブリは、標的分子１４０上の対応する結合部位（それぞれＢ１とＢ２とで示す）に結合する結合性部分（それぞれＬ１とＬ２とで示す）を含有する。この結合性部分は、標的に対して結合親和性を有する抗体、アドネクチン、アプタマー、または他の分子を含むことができる。核酸標的の検出に関して、結合性部分は、標的核酸配列またはその部分に相補的なヌクレオチド配列であり得る。このように、標的はまた、核酸または２つの結合部位を有する任意の他の分子でもあり得る。
【００６７】
本アッセイ時に、リガンド−レポーター複合体の２つの結合部位（Ｌ１とＬ２）は、標的上の対応する結合部位Ｂ１とＢ２の各々に結合する。生物学的標的に依って、当然のことながら、Ｌ１およびＬ２は、同じであっても異なっていてもよい。「レポーターＤＮＡ配列」および「補体」は、核酸、例えば、長さが一般に短く、好ましくは４〜２５の塩基、より好ましくは８〜１５の塩基であり、互いに相補的または実質的に相補的であるＤＮＡ配列を表す。標的に結合した場合、２つのアニールした核酸配列を含有するハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）が、典型的には、使用される緩衝系において幾らか周囲温度（Ｔｍ）超であるように、核酸の長さ、塩基組成、および相補的配列の程度が選択される。標的に対する結合の非存在下、２つのアニールした核酸配列を含有するハイブリッドのＴｍは、周囲温度未満である。
【００６８】
図１に記載されたアッセイ様式において、オリゴヌクレオチド配列は、任意のスペーサー（Ｓｐ１、Ｓｐ２、Ｓｐ３およびＳｐ４と示す）および／またはクロスリンカー（ＣＬと示す）を介して結合性部分および前駆体と共有結合している。種々のヘテロ二官能性クロスリンカーを用いて、リガンド−受容体アセンブリを合成することができる。以下のものが最も一般的に用いられる：１）スクシイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）などのアミン反応性およびスルフヒドリル反応性クロスリンカー；２）化合物を含有するヒドラジン／ヒドロキシルアミンおよびマレイミド／ヨードアセテート官能基などのアルデヒド反応性およびスルフヒドリル反応性クロスリンカー；３）化合物を含有するヒドラジン／ヒドロキシルアミンおよびスクシンイミジル官能基などのアルデヒド反応性およびアミン反応性クロスリンカー（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ１９９６年を参照）。前駆体を核酸に結合させるために通常、例えば、前駆体を、カルボン酸基により官能化し、次いでアミン含有ＤＮＡと反応させる。アルデヒド基およびスルフヒドリル基などの他の官能基もまた、核酸に組み込むことができる。幾つかの場合、前駆体は、例えば、それぞれヒドラゾン／ヒドロキシルアミン基およびマレイミド基により官能化することが好ましい。
【００６９】
Ｓｐ１およびＳｐ２は、結合性部分（Ｌ１とＬ２）がそれらの標的に結合する間に、レポーター核酸および補体が互いにアニールできるように、標的上の結合性部位（例えば、Ｂ１とＢ２）間の距離にまたがる十分な長さを加えるように設計されるさらなる任意の分子スペーサーを表す。Ｓｐ１およびＳｐ２は、レポーターを有するＤＮＡの単一片として合成されたＤＮＡモノマーまたはオリゴマーそれら自体を含むＤＮＡオリゴヌクレオチドであり得る。しかしながら、スペーサーは、標準的な合成化学を用いて組み込むことができるエチレングリコールオリゴマーなどの他の基を含有することもできる。エチレングリコールのスペーサーはその配列に可撓性と親水性とを付与することから、有用であることが多い。Ｓｐ３およびＳｐ４はまた、前駆体分子の反応性を妨げる何らかの立体障害を防ぐための任意のスペーサーでもある。
【００７０】
前駆体１および前駆体２は、２種の反応性（例えば、交差反応性）化学種、例えば、反応して反応生成物を生成する小型の分子である。結合性部分Ｌ１とＬ２とが標的上の対応する結合性部位に同時に結合した後、局在化した高濃度のリガンド−レポーター基は、レポーター核酸と補体とを、互いにアニールさせ（Ｔｍを上昇させ）、前駆体を互いに反応性に近接させるとバルク溶液中よりも高濃度になる。反応性前駆体が反応して、反応生成物には結合するが、２つの開始前駆体には反応しない抗体（ＡＢと示す）により検出できる生成物が生成する。図１は、合成反応の１つのタイプを例示しているが、この反応がエピトープ−結合部分により認識される生成物を作製するという条件で、実際の機構は異なる可能性がある。あるいは、アッセイ様式および反応生成物に依って、反応生成物は、例えば、酵素、リガンドまたは受容体により認識される。この反応は、同時に生じ得るか、または生成物の合成を促進させるために溶液中に存在する１つまたは複数の反応物、補因子、または触媒を必要とし得る。
【００７１】
一定の状況下、５’末端および３’末端において２つの異なる官能基を有し、それらの双方は、互いに反応してはならないが、それでも固相ＤＮＡ合成およびＤＮＡ開裂条件を可能にしなければならない核酸を必要とするために、単一分子のアセンブリは困難であり得る。５’官能基が、溶液中でＤＮＡに組み込む必要がある場合、３’官能基に交差反応しないヘテロ二官能性クロスリンカーを使用することができる。
【００７２】
一アプローチにおいて、プローブは、２つ以上の別個のピースとして合成することができ、次いでそれらをアセンブルして（例えば、非共役結合により）官能性リガンド−レポーターアセンブリを生成できる。これは、各結合性部分をいわゆるジップコード配列に結合させ、別に前駆体分子を相補的なアンチジップコード配列に結合させることにより実施できる（図２を参照）。２ピースのリガンド−レポーターアセンブリでは、１つのリガンド受容体アセンブリ（標的結合性成分と示す）は、ジップコードＤＮＡ（ジップコードと示す）、任意のスペーサー（Ｓｐと示す）および任意の架橋剤（ＣＬ）を有するオリゴヌクレオチドと結合した結合性部分（リガンド）を含んでなる。他のリガンド受容体アセンブリ（レポーター成分と示す）は、任意のスペーサーと共にアンチジップコードＤＮＡ配列（アンチジップコードと示す）に結合しているレポーター核酸（例えば、ＤＮＡ）と結合した生成物前駆体（使用される化学に依ってマスク化生成物前駆体であり得る）を含んでなる。しかし当然のことながら、具体的なアッセイに依って、レポーター成分におけるこれら要素の順序は、変わり得る。例えば、その順序は、例えば、アンチジップコード−レポーター核酸−前駆体または、例えば、レポーター核酸−アンチジップコード−前駆体などを含み得る。
【００７３】
互いに相対的に高いＴｍでアニールするが、ジップコードとアンチジップコードの第二の対に対してもレポーター核酸配列に対しても有意にアニールしないようにジップコード配列とアンチジップコード配列の各対を設計する必要がある。単一の自己アセンブル化種の各々は、標的結合性部分、レポーター配列、および前駆体に非共役結合するが、典型的な反応条件下の溶液中で安定である。
【００７４】
ジップコード配列とアンチジップコード配列は、典型的にはレポーター核酸およびその補体よりも長く、より安定な二重鎖を形成する。このことは、完全に相補的でレポーター核酸よりも長くするようにジップコード配列とアンチジップコード配列を設計することにより達成することができる。典型的なジップコード配列とアンチジップコード配列は、長さが１５〜２５の塩基である。ジップコードは、一般にＤＮＡからなるが、任意のタイプの核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ）であり得る。アッセイが、２つのリガンド−レポーターアセンブリを必要とする場合（図１を参照）、このようなアッセイは図２に示されるように、２つの標的結合性成分および２つのレポーター成分を一般に必要とする。ジップコード配列およびアンチジップコード配列は、各対が、互いに対してだけアニールするが、他のジップコードまたはアンチジップコードにも、いずれのレポーターＤＮＡ配列のいずれにもアニールしないように選択される。これらの設計条件下で図１に例示されたアッセイは、十分なレポーター成分が標的結合成分に対してアニールされることだけを必要とする。２ピースのリガンド−レポーターアセンブリ（すなわち、プローブ）はまた、予備アセンブルし、所望の場合は精製して反応混合物に添加することができる。
【００７５】
一定の実施形態において、このアッセイは、同一であっても同一でなくてもよい２つの結合性部位を有する生物学的標的の検出に有用である。一般に、本明細書に記載されたアッセイは、２つのリガンド−レポーターアセンブリを使用し、それらの各々が、（１）標的の結合性部位に対する結合性部分；（２）対の各々が、対の他方のレポーター配列に相補的または実質的に相補的なレポーター核酸配列；および（３）生成物前駆体、マスク化生成物前駆体または非マスク基、を含む。双方の結合性部分がそれらの標的に結合すると、局在化したより高濃度のアセンブリにより、より高いＴｍおよび核酸二重鎖の形成に至る。
【００７６】
プローブに用いられた結合性部分は、同定される標的分子に依って変わり得る。検討されたように、本明細書に記載されたアッセイシステムを用いてサンプル中の種々の生物学的標的を検出できる。このアッセイは、タンパク質多量体、例えば、タンパク質二量体、融合タンパク質およびグリコシル化タンパク質を検出するのに特に有用である。種々の結合性部分、例えば、抗体、アフィボディ、アドネクチン、リガンド、受容体、アプタマー、および当業界に知られた他の結合分子を、本発明の実施に使用することができる。標的に依って、リガンド−レポーターアセンブリの各々に使用される結合性部分は、同じであっても異なっていてもよい。
【００７７】
例えば、本発明は、融合タンパク質（例えば、ＢＣＲ−ＡＢＬ）、受容体ホモ二量体およびヘテロ二量体（例えば、ＥｒｂＢ受容体ファミリーのホモ二量体およびヘテロ二量体、例えば、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）ホモ二量体、ＥｒｂＢ１（ＥＧＦＲ）ホモ二量体、ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ２ヘテロ二量体など）、および複数サブユニット含有タンパク質（例えば、ＰＤＧＦ）の検出に特に有用である。例えば、標的がＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ２ヘテロ二量体である場合、結合部分の１つは、ＥＧＦＲを結合するように選択され、他の結合部分は、ＥｒｂＢ２を結合するように選択される。
【００７８】
ヘテロ二量体タンパク質ＰＤＧＦ−ＡＢの検出のための代表的なアッセイ様式が、図２２に示してある。本アッセイにおいて、ＰＤＧＦ−ＡＢヘテロ二量体は、固体支持体、例えば、ＥＬＩＳＡプレートのウェルの表面上に捕捉される。その後に、ＰＤＧＦ分子を、図２に示されたタイプの２つのリガンド−レポーターアセンブリに曝露させる。第一の標的結合性成分（標的結合性成分１と示す）は、ジップ３配列に結合したアンチＰＤＧＦ−Ａ抗体を含んでなり、ヘテロ二量体のサブユニットＡに結合する。第二の標的結合性成分（標的結合性成分２と示す）は、ジップ２配列に結合したアンチＰＤＧＦ−Ｂ抗体を含んでなり、ヘテロ二量体のサブユニットＢに結合する。第一のレポーター成分（レポーター成分１と示す）は、ジフェニルホスフィンに結合したアンチジップ３配列を含んでなり、このアンチジップ３配列は、プローブ１のジップ３配列にアニールする。第二のレポーター成分（レポーター成分２と示す）は、ローダミン前駆体に結合したアンチジップ２配列を含んでなる。レポーター成分の各々においてレポーター配列（レポーター１およびレポーター２）のハイブリダイゼーションにより促進されて、レポーター成分１がレポーター成分２との反応性に近接すると、ローダミン前駆体は還元されてローダミングリーンを生成する。ローダミングリーンの存在は、ローダミングリーンに結合するが、ローダミン前駆体には結合しない抗フルオレセイン抗体−ＨＲＰ結合体を用いて検出することができる。ＨＲＰは、基質（ＴＭＢ）を発色された検出可能な部分に変換する。
【００７９】
当然のことながら、反応生成物はエピトープではなくて、例えば、酵素基質または酵素活性化物質でもあり得る。代表的な酵素基質（ビオチンリガーゼペプチド）の合成は、実施例２に記載されている。図９に示されているように、操作性ビオチンリガーゼ基質を、２つの非操作性ヘミペプチドから完全操作性ペプチドのＤＰＣ媒介合成により作出する。合成後、ビオチンリガーゼは、ビオチン分子をペプチドに加えた。次いでビオチンを、酵素（増幅成分）に結合したアンチビオチン分子（検出成分）を含有する検出システムを用いて検出することができる。変異リボヌクレアーゼを活性化する代表的な操作性酵素活性化物質、Ｓ−１３ペプチドの合成を、実施例４に記載している。
【００８０】
ＤＰＣが、反応生成物、例えば、エピトープ、酵素基質または酵素活性化物質の新規合成を促進させるアッセイ様式に加えて、当然のことながら、１つまたは複数のマスク基を含有するマスク化生成物前駆体から反応生成物を生成することができる。ＤＰＣ時にマスク基は除去される。例えば、ＤＰＣ時に、脱マスク剤を、１つまたは複数のマスク基を含有するマスク化生成物前駆体との反応性に近接させる。その結果、マスク基は、１つまたは複数のマスク基を含有する前駆体から除去される。代表的なアッセイ様式は、実施例１に記載している。実施例１において、アジド修飾リシンを含有する修飾ＢＬＰは、ビオチンリガーゼによるビオチン化に対してブロックされる。アジド基は、ＤＰＣにより還元されて第一級アミノ基を生成する。次いで非マスク化ＢＬＰは、ビオチンリガーゼに対する基質として作用することができる。
【００８１】
当然のことながら、操作性エピトープ、酵素基質、酵素活性化物質またはリガンドの形成を可能にする任意のタイプのＤＰＣ媒介化学反応を、本発明の実施に使用することができる。しかしながら、増幅処理時により高いシグナル／ノイズ比を得るために、ＤＰＣ反応は、クリーンで迅速かつ定量的であることが好ましい。有用なＤＰＣ反応の例としては以下のものが挙げられる：１）１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を介したアミド結合またはシステインアミノ酸残基またはシステイン類縁体を含んでなるエピトープに対するチオエステル（ＮＣＬ）を介した天然の化学的連結（Ｄａｗｓｏｎ，ＰＥら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９４年、２６６、７７６−７７９頁）、２）アミン触媒存在下でのアルドール縮合、３）ホスホロチオエステル結合（Ｘｕら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０００年、１２２、９０４０−９０４１頁）、および４）チオエステル／チオエーテルペプチド結合のアイソスター連結。チオエステル置換により、エピトープ反応性断片の末端アミノ酸の窒素原子は硫黄原子と効率的に置き換わる。
【００８２】
理論に拘束されることは望まないが、ペプチドベースの反応生成物の合成に使用する連結法を判定する際に以下の一般的ガイドラインが使用できることが考慮されている。例えば、一般にＥＤＣ／ｓＮＨＳ媒介アミド結合形成反応は、実施例２に記載されているように、嵩高いアミノ酸側鎖による立体障害に鋭敏であるため、この化学は、連結反応に関与するアミノ酸のうちの少なくとも１つがグリシンである場合に最も好適である。ＥＤＣ／ｓＮＨＳは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、またはＴｙｒを含有するペプチド、あるいはＣ−末端ヘミペプチド中に３つ以上連続したＨｉｓを含有するペプチドには最適とは考えられない。例えば、一般に天然の化学的連結は、実施例１２に記載されているようなＣ−末端ヘミペプチドにおけるようにＮ−末端システイン残基の存在を必要とする。Ｃｙｓ含有ペプチドが、特定の結合性部分に対する結合親和性を保持することを判定しなければならない。一般に、チオエステル結合の形成には、Ｃ−末端ヘミペプチドのＮ−末端が、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＰｈｅまたはＴｒｐであることが必要である。ペプチドがＣｙｓを含有する場合にチオール交換副反応を妨げるため、チオエステル結合の形成を用いてはならない。
【００８３】
当然のことながら、反応生成物（例えば、完全エピトープを含有する生成物、酵素基質、酵素活性化物質またはリガンドである生成物）の生成には、その反応を促進させるために溶液中に追加の試薬または反応物が必要であり得る。そうした場合、それらを過剰の濃度で提供できる。アッセイ様式に依って、またこのアッセイが、定性的ではなくて定量的または半定量的であることに依って、生成物前駆体および非マスク基は、律速である必要性があると考えられる。反応濃度は、反応生成物（例えば、エピトープ）の量、したがってアッセイで生じたシグナル量が、サンプル中の生物学的標的量に直接比例するように提供されることが好ましい。
【００８４】
しかし当然のことながら、天然の化学的連結の場合、反応生成物（例えば、ペプチド）を自然に合成される。その結果、一定の状況下での生成物前駆体は、生物学的標的に対する結合性を欠いていても互いに反応し得る。これは、多くのアプローチを用いることによって減少または除去することができる。実施例１３は、ミスマッチを導入するか、または長さの異なる配列を用いることによってリガンド−レポーターアセンブリのレポーターオリゴヌクレオチド部分のＴｍを（例えば、約８℃から約２５℃、より好ましくは約９℃から約２０℃の範囲で）低下させることにより達成することができるという利点を記載している。これらのアプローチの各々は、検出システムの特異性を改善するために見出された。
【００８５】
以下の実施例は、種々の実施形態およびそれらの等価体において本発明の実施に適応させることができる重要なさらなる情報、例証および指針を含有する。本発明の実施は、以下の実施例からさらに十分に理解されるであろうが、これらは、例示のみを目的として本明細書に提示されており、決して限定するものとして解釈してはならない。
【実施例】
【００８６】
実施例１は、ビオチンリガーゼのマスク化ペプチド基質を非マスク化して酵素に対する操作性基質になる試験系を記載している。実施例２は、ペプチド断片が互いに連結して操作性酵素基質を生成する実験を記載している。実施例３は、ペプチド断片が、互いに連結して完全エピトープを生成する実験を記載している。実施例４は、酵素活性化物質の合成に関連する実験を記載している。実施例５および６は、反応生成物が、完全エピトープを含有する小型の分子である実験を記載している。実施例７は、ＥＧＦＲ二量体を検出するためのアッセイ様式を記載している。実施例８は、ＥＧＦＲ二量体およびＥｒｂＢ２二量体を検出するためのアッセイ様式を記載している。実施例９は、Ｂｃｒ−Ａｂ１融合タンパク質を検出するためのアッセイ様式を記載している。実施例１０は、ＣＭＬ由来の細胞系および骨髄サンプル中のＢｃｒ−Ａｂ１を検出するためのアッセイ様式を記載している。実施例１１は、乳癌組織中のＥｒｂＢ２ホモ二量体を検出するためのアッセイ様式を記載している。実施例１２は、ＮＣＬによるエピトープを含有するペプチドの生成を記載している。実施例１３は、反応生成物が、ＮＣＬにより作製されるアッセイの特異性を増加させるアプローチを記載している。実施例１４は、ＮＣＬ時に生成することができる代表的なヘミペプチドを記載している。実施例１５は、ＮＣＬを用いたＥＧＦＲホモ二量体を検出するためのアッセイ様式を記載している。実施例１６は、ＮＣＬに有用なペプチドを作製するためのさらなる反応スキームを記載している。実施例１７は、アミド結合アイソスターを含有するＴ７ペプチドの形成を介してＤＮＡ標的を検出するためのアッセイ様式を記載している。
【００８７】
実施例に記載されたオリゴヌクレオチドは、標準的なホスホラミダイト化学（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ  ＶＡ、米国）を用いて調製し、逆相Ｃ１８クロマトグラフィーにより精製した。５’−アミノ基を有するオリゴヌクレオチドは、５’−アミノ−モディファイヤー５制御ポアガラス（アンチジップオリゴ）または５’−アミノ−モディファイヤーＣ６制御ポアガラス（ジップオリゴ）を用いて調製し、３’−アミノ基を有するオリゴヌクレオチドは、３’−アミノ−モディファイヤーＣ７  ＣＰＧ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ  ＶＡ、米国）を用いて調製した。実施例に用いられた種々のオリゴヌクレオチドは、表１に示してある。
【００８８】
【表１】
2010534836.tif 000002
実施例１：ビオチンリガーゼペプチド−ビオチン化部位の非マスク化
ビオチンおよびＡＴＰの存在下、ビオチンリガーゼは、ビオチン分子をビオチンリガーゼにより認識されたペプチド配列に存在するリシン残基に特異的に付加する。より大きな配列の一部であであり得るビオチンリガーゼペプチドとして知られているビオチンリガーゼに対する基質は、配列ＬＸ１Ｘ２ＩＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＫＸ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０を含むことができ、式中、Ｘ１は、任意のアミノ酸であり；Ｘ２は、Ｌ、Ｖ、Ｉ、Ｗ、Ｆ、Ｙを除く任意のアミノ酸であり；Ｘ３は、Ｆ、Ｌであり；Ｘ４は、Ｅ、Ｄであり；Ｘ５は、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｔであり；Ｘ６は、Ｑ、Ｍであり；Ｋは、リシンであり；Ｘ７は、Ｉ、Ｍであり；Ｘ８は、Ｅ、Ｌ、Ｖ、Ｙ、Ｉであり；Ｘ９は、Ｗ、Ｙ、Ｖ、Ｆ、Ｌ、Ｉであり；Ｘ１０は、Ｄ、Ｅではなくて、好ましくはＲ、Ｈである（Ｂｅｃｋｅｔｔら、（１９９９）Ａ  ｍｉｎｉｍａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｈｏｌｏｅｎｚｙｍｅ  Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ  Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、８、９２１−９２９頁）。ペプチドがビオチン化されたら、ビオチン分子の存在は、一般に当業界に使用されるアビジンまたはストレプトアビジンなど、結合性部分を含有するレポーター分子を用いて検出できる。
【００８９】
アジド修飾リシンを含有する修飾ＢＬＰを、ビオチンリガーゼによるビオチン化に対してブロックする。アジド基は、ビス（ジフェニルホスフィン）などの還元剤の存在下で第一級アミノ基に還元することができる（図４）。あるいは、リポ酸およびリポアミドなどの他の試剤を用いてアジド基を第一級アミノ基に還元することができる。
【００９０】
図４は、前述の図２に示されたように２成分のリガンドレポーターアセンブリ（プローブ）のアンチジップコード−レポーターオリゴヌクレオチド−前駆体の結合体における生成物前駆体部分（すなわち、レポーター成分の生成物前駆体部分）を表す。共有結合の前駆体種が、アミノ酸配列ＬＧＧＩＦＥＡＭＫＭＶＬＨ（配列番号１）を含有したオリゴヌクレオチド−ペプチド結合体を合成し、式中、リシン残基（Ｋ）を、リシン末端側鎖のイプシロンアミン上のアジド基により修飾した（図４を参照）。Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＯＨのイプシロンアミンを、最初にアジドＦｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＯＨに変換し、次いで標準的なＦｍｏｃ固相方式を介してＢＬＰに結合した。アジドＢＬＰを、ヒドラゾンを介してオリゴヌクレオチド（ＤＮＡと示す）に結合した。手短に言えば、Ｆｍｏｃ保護６−ヒドラジニルニコチン酸とアジドＢＬＰとの結合を介してヒドラジン官能基を組み込み、図５に示されるように、アルデヒド官能基をアミン含有オリゴヌクレオチドに付加した。さらにＮ−Ｆｍｏｃ−アミノ−ｄＰＥＧ２−酸のＢＬＰへの結合によりアジドＢＬＰとＤＮＡとの間に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）スペーサーを組み込んでその可撓性を増加させた（図５を参照）。第二のプローブ上で、ビスジフェニルホスフィン（ビスジＰｈｐ）を、標準的なアミド結合形成を介してオリゴヌクレオチドに結合させて式Ｉの化合物を生成させた。
【００９１】
【化１】
2010534836.tif 000003
第一のアンチジップコード−レポーターオリゴヌクレオチド前駆体の結合体は、１８塩基アンチジップのオリゴヌクレオチド配列、１０の塩基オリゴヌクレオチドレポーター、およびアジド修飾ペプチドを含有した。
【００９２】
５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ８中で３０分間、３０℃で４ｍＭのＴＣＥＰ存在下、第一のオリゴペプチド結合体を非還元または還元状態で試験した。還元後、この結合体は、ビオチン、ＡＴＰ、ならびに緩衝液（「ＢｉｏＭｉｘ  Ａ」および「ＢｉｏＭｉｘ  Ｂ」）（Ａｖｉｄｉｔｙ，Ｉｎｃ．，Ａｕｒｏｒａ，ＣＯ）および２μｇのビオチンリガーゼ（Ａｖｉｄｉｔｙ，Ｉｎｃ．，Ａｕｒｏｒａ，ＣＯ）の反応混合物２０μＬ中、３０℃で１時間インキュベートした。
【００９３】
アジド基が、第一級アミンに還元されると、このアミノ基は、ビオチンリガーゼにより認識され、ＡＴＰおよびビオチンの存在下、ビオチンにより置換され得る。リシン上のビオチンの存在を、図６に記載されたアッセイ様式により検出した。具体的には、この結合体を、固定化ジップコードのオリゴヌクレオチドを含有するＥＬＩＳＡプレート（固体支持体）上で捕捉し、ストレプトアビジン−ＨＲＰ結合体を用いて検出した（図６を参照）。
【００９４】
手短に言えば、ＥＬＩＳＡプレートは、ＰＢＳ緩衝液中、ヤギ抗マウス抗体（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）に次いで１：１０００希釈の１ｍｇ／ｍＬのマウスモノクローナル抗フルオレセイン抗体（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、ＣＡ）の１００μＬで置換された第一のコーティングＥＬＩＳＡプレートウェルにより調製した。洗浄後、抗フルオレセイン抗体の同定を開始させるために、このウェルを、６カルボキシ−フルオレセインにより５’末端が標識された１０ピコモルのジップ２オリゴヌクレオチドと共にさらにインキュベートした。次にＴＣＥＰにより還元されないかまたは還元されたビオチン−リガーゼのオリゴヌクレオチドペプチド結合体（アジド置換された）をインキュベートし、固定化ジップ２捕捉オリゴヌクレオチドにアニールした。結合体上のビオチンの存在は、１：４０００希釈の１ｍｇ／ｍＬのストレプトアビジン−ＨＲＰ結合体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）とのインキュベーションにより検出した。このウェルを洗浄し、ＴＭＢ基質（ＫＰＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）の存在下で発色させた。この結果を図７に要約してある。
【００９５】
ＴＣＥＰでインキュベートすることによってリシン残基が非マスクされた結合体に関してのみ、陽性応答が見られた。次いで非マスクリシンは、ビオチンリガーゼによりビオチン化した。
【００９６】
リシンのε−アミノ基をマスク化する別の方法は、４−アジドベンジル−４−ニトロフェニルカーボネートを用いて、４−アジドベンジルオキシカルボニルでε−アミンを保護する（Ｍｉｔｃｈｉｎｓｏｎら、１９９４年、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２６１３−２６１４頁）。アジドの化学的還元により、イミノキノンの中間体を介して自然断片化を受けた４−アミノベンジルカルバメートを生成する（Ｇｒｉｆｆｉｎら、１９９６年、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．１，１２０５−１２１１頁）。前の方法よりもこの方法の利点としては、脂肪族アジドよりも芳香族アジドの還元が容易であること、およびＢＬＰ−オリゴの合成後に保護基が取込み得ることから、不安定なヒドラゾン結合の還元的アミノ化を介して安定な結合形成を含む。４−アミノベンジルカルバメートのＢＬＰ−オリゴを生成するための一般的な合成経路は、図８に示してある。手短に言えば、水性塩酸中、４−アミノベンジルアルコールのジアゾ化−アジド化により、４−アジドベンジルアルコールが得られ、さらにこれは、４−ニトロフェニルカルボノクロリデートによる反応を受けて４−アジドベンジル−４−ニトロフェニルカーボネートが得られた（２ステップで８０％収率）。次に４−アジドベンジル−４−ニトロフェニルカーボネートをＮａＣＮＢＨ３と反応させ、ＢＬＰ−オリゴを還元して４−アジドベンジルオキシカルボニル保護のｌｙｓＢＬＰ−オリゴを生成した。
【００９７】
リシンのε−アミノ基または他のアミノ基をマスクするさらに別の方法は、チオ（フェニル）エチルカルバメートなど、メチオニンおよび類縁体基による保護である。この実施形態において、結合体の１つは、メチオニンまたはその類縁体で保護されたアミノ酸側鎖のアミン基を有する前駆体を含む。他の結合体は、ヨードアセトアミドなど、反応性ヨウ化アルキル基を有する前駆体を含む。２つの前駆体を、ＤＰＣにより反応性に近接させる（例えば、それぞれの結合体上の相補的レポーター核酸の結合により）と、メチオニンが開裂して遊離アミンが残る。メチオニンまたはチオ（フェニル）エチルカルバメートの遊離アミン基への付加およびヨードアセトアミドの遊離アミンへの付加に関する化学は、当業界に周知である。
【００９８】
１つの前駆体上のヒスチジン側鎖をブロックする方法は、２，６−ジニトロフェニルを用いて達成できる（Ｓｈａｌｔｉｅｌ，Ｓ．ら、１９７０年Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、９：５１２２−２７頁）。この前駆体を有する結合体を、チオール基を有する前駆体がある別の結合体との反応性に近接させると、ヒスチジンは脱保護される。この脱保護法は、完全長ＳｔｒｅｐＴａｇ（ＷＳＨＰＱＦＥＧ−配列番号６９）または切断ＳｔｒｅｐＴａｇ（ＨＰＱＦＥＧ−配列番号７０）を利用する場合に有用である。いずれの前駆体に関しても、ヒスチジン側鎖の保護は、ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ結合をブロックする。脱保護によりＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ結合が回復する。
実施例２：酵素基質を作製するためのペプチド断片の連結
本実施例は、ＤＰＣによる前駆体断片からの合成（連結）後の操作性酵素基質の検出を記載する。
（ｉ）ビオチンリガーゼペプチド
本アプローチの操作可能性は、ＢＬＰを用いて立証されている。このペプチドの酵素認識に関する最少要件としては、ペプチド中の単一リシン上の遊離の第一級アミノ基に関する要件など、各部位に指定された特定のアミノ酸を有する最少の長さである１３のアミノ酸（実施例１に示すＢＬＰ配列を参照）が挙げられる。１３の残基よりも短い断片は、通常ビオチンリガーゼにより認識されない。
【００９９】
図９に示されるように、ＤＰＣベースの検出アッセイは、各々がビオチンリガーゼペプチドの部分長の断片（前駆体）を含有する２つのリガンドレポーターアセンブリに基づくことができる。Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ｇｒｅｇ  Ｔ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓの１７０頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、１９９６年）に記載されているように、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）の存在下、Ｎ−末端断片のカルボキシ末端とＣ−末端断片のアミノ末端とを一緒に結合させることができる。他の２つの末端は、アミドとしての合成により、または図１０に記載された試験系に示されるように、フルオレセイン残基によりブロックすることができる。
【０１００】
図９に例示されるように、注目のサンプルを、１００と１２０とで示された２つの単一分子のリガンドレポーターアセンブリと合わせる。リガンドレポーターアセンブリ１００は、ビオチンリガーゼに対する基質の第一のペプチド断片（Ｎ−末端ペプチド断片と示す）に結合する第一のオリゴヌクレオチド配列（レポーター核酸と示す）に結合した標的１４０に対して結合親和性を有する第一の結合性部分（Ｌ１と示す）を含有する。第二のリガンドレポーターアセンブリ１２０は、第一のオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズでき、ビオチンリガーゼに対する基質の第二のペプチド断片（Ｃ−末端ペプチド断片と示す）に結合する第二のオリゴヌクレオチド配列（補体と示す）に結合した標的１４０に対して結合親和性を有する第二の結合性部分（Ｌ２と示す）を含有する。標的１４０の存在下、第一および第二双方のリガンドレポーターアセンブリは標的に結合するが、その際、第一のオリゴヌクレオチド配列（レポーターＤＮＡ）および第二のオリゴヌクレオチド配列（補体）が互いにハイブリダイズして、Ｎ−末端ペプチド断片とＣ−末端ペプチド断片とを反応性に近接させる。
【０１０１】
ＥＤＣの存在下、ペプチドが一緒になって結合して遊離リシン側鎖を含有する完全長ペプチドを生成する。Ｃ−末端断片に存在するリシンは、連結前にＡＴＰおよびビオチンの存在下でビオチンリガーゼによりビオチン化されない。対照的に、ペプチド断片の連結後、ＡＴＰおよびビオチンの存在下でビオチンリガーゼにより遊離のリシンがビオチン化されるペプチドが生成する。
【０１０２】
図１０は、ビオチンリガーゼによりビオチン化できる基質を生成するために、ＥＤＣの存在下で連結できる２つのヘミペプチドのアミノ酸配列を例示している。Ｎ−末端ヘミペプチド（ＬＧＧＩＦＥ−配列番号２）は、フルオレセインでブロックされたそのＮ−末端基を有し、Ｃ−末端ヘミペプチド（ＡＭＫＭＶＬＨ−配列番号３）は、アミド基でブロックされたそのＣ−末端を有する。ＥＤＣの存在下で反応性の可能性のある他の基は、グルタメートのカルボキシル側鎖（Ｅ）およびリシンのイプシロンアミノ基（Ｋ）だけである。連結の反応速度は、ペプチド断片の濃度に依存し、したがって、ＤＰＣベースアッセイにおいて、ペプチド断片の局在化された濃度増大が、完全長ビオチンリガーゼペプチドの形成のための反応速度を大いに増加させることが予想され、次いでそれをビオチンリガーゼによりビオチン化できる。
【０１０３】
この連結反応に関して、連結生成物（Ｎ−末端ペプチド上のＮ−末端フルオレセインにより完全連結されたペプチド）が、抗フルオレセイン抗体でコーティングされたプレート上で捕捉されるＥＬＩＳＡアッセイを開発した。５０μＬのペプチド混合物（２．５ｍＭ）を、０．１ＭのＭＥＳ緩衝液、ｐＨ６．５中、１ｍｇ／ｍＬのＥＤＣの存在下または非存在下、２５℃で１時間インキュベートした。次に５μＬの各混合物を、抗フルオレセイン抗体を含有するＥＬＩＳＡプレートのウェルに加えた。次いで、１００μＬのビオチン化反応混合物（実施例１に記載した）を、各ウェルに加え、３０℃で１時間インキュベートして固定化リガンドペプチドをビオチン化した。この結果を図１１に示す。
【０１０４】
２つの断片ペプチド（各々が完全長ビオチンリガーゼペプチドの半分の長さ）のＥＤＣ触媒結合の生成物は、ビオチンリガーゼによりビオチン化されたが、ＥＤＣの非存在下では非結合ペプチドはビオチン化されなかったことが分かった（図１１を参照）。反応速度は０．１ｍｇ／ｍＬのＥＤＣよりも１ｍｇ／ｍＬのＥＤＣの存在下の方がより速く、また、より高濃度のペプチドの存在下の方がより速かった（すなわち、反応速度は、０．２５ｍＭのペプチドよりも２．５ｍＭのペプチドの存在下の方がより効率的であった）。結合生成物から得られるシグナルの量（４５０ｎｍにおける吸光度）は、２．５ｍＭに比較して、０．０２５ｍＭのペプチド断片投入濃度ではより少なかった（ＥＤＣ濃度は同一）。これらの結果は、完全長結合生成物の収量はおよそ１０％であったことを示している。反応速度は、高濃度のペプチドでは増加し、溶液中、遊離状態の触媒の存在下で生じ得ることを、このアッセイは示している。
【０１０５】
一定の状況下で、ＥＤＣ化学はカルボキシル基およびアミノ基の結合に関して非特異的であり、したがって一定の状況下で、ペプチド内の第一級アミンとカルボキシルの可能な全ての対のランダムな結合をもたらし得る。ビオチンリガーゼペプチドの場合、必ずしも全ての架橋が所望のＮ末端とＣ末端との間に位置するとは限らず、Ｎ末端ヘミペプチドにおけるグルタミン側鎖カルボキシルからカルボキシル末端ヘミペプチドにおける重要なリシン残基のアミノ末端への架橋も含み得る。結合のこの非特異性により、所望の完全長、非ブロックペプチドの収量の減少に至り得る。
実施例３：エピトープ作出のためのペプチド断片の連結
本実施例では、ペプチド前駆体からのＤＰＣにより作出されたエピトープの検出を記載する。
（ｉ）モノクローナル抗Ｔ７抗体による完全長Ｔ７エピトープペプチドを検出するためのＥＬＩＳＡアッセイ
Ｔ７エピトープペプチドは、ヘミペプチドの双方とも操作的Ｔ７エピトープ、例えば、抗Ｔ７抗体により特異的に結合したエピトープの再構成に必要なヘミペプチドの連結により作出できる。得られた完全長ペプチドは、高反応性のアミノ側鎖またはカルボキシル側鎖を含有しない。したがって、Ｔ７ヘミペプチドは、ペプチド内の他のアミノ酸の他の遊離アミノ側鎖またはカルボキシル側鎖との望ましくない架橋反応なしに、ＥＤＣと架橋することができる。
【０１０６】
２つのＴ７ヘミペプチド、Ｎ末端ヘミペプチドとＣ末端ヘミペプチドを合成した。Ｎ末端ヘミペプチドのＮ末端アミンおよびＣ末端ヘミペプチドのＣ末端カルボキシルは双方ともアミドとして合成し、１つだけの遊離アミンと遊離カルボキシルを反応に残した。Ｎ末端ペプチドはフルオレセインと結合させてフルオレセイン−ＭＡＳＭＴ（配列番号５０）を与え、Ｃ末端ペプチドはＧＧＱＱＭＧ（配列番号７１）であった。したがって、完全長ペプチドは、フルオレセイン−ＭＡＳＭＴＧＧＱＱＭＧ（配列番号４）であった。これらのペプチドは、実施例１および２に記載されたように、ＥＤＣを用いて連結させた。ヘミペプチドまたは結合させた、フルオレセイン標識化完全長ペプチドをＥＬＩＳＡプレートのウェルに固定した抗フルオレセイン抗体に暴露させてから、セイヨウワサビペルオキシダーゼに結合させた抗Ｔ７抗体（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ）により検出した。モノクローナル抗Ｔ７抗体が完全長エピトープのみを認識した結果が図１２にまとめてある。前駆体ヘミペプチドは検出可能なシグナル応答を生じなかった。
（ｉｉ）ヘミペプチドからＥＤＣ媒介ＤＰＣを経てＴ７ペプチドの合成
２つのＴ７ヘミペプチドを合成し、図１３に示したように、オキシム形成を経てオリゴヌクレオチドに結合させた。Ｎ末端ヘミペプチドＭＡＳＭＴＧ（配列番号５）（Ｔ７＿ｐ１）はオリゴヌクレオチド結合に関して、そのＣ末端に遊離のカルボン酸基を、そのＮ末端にヒドロキシルアミン基を含んだ。Ｃ末端ヘミペプチドＧＱＱＭＧ（配列番号６）（Ｔ７＿ｐ２）はオリゴヌクレオチド結合に関して、そのＮ末端に遊離のアミン基を、そのＣ末端にヒドロキシルアミン基を含んだ。
【０１０７】
これらのヘミペプチドは双方とも標準的なＦｍｏｃ固相法により合成した。ＳｅｒおよびＴｈｒの側鎖官能基は第三級ブチル基で保護し、Ｇｌｎの遊離アミド側鎖はトリチル基で保護した。ペプチド結合は、標準的なｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウム−ヘキサフルオロ−ホスフェート（ＨＢＴＵ）結合により実施し、Ｆｍｏｃ基は、ＤＭＦ中２０％ピペリジンを用いて脱保護した。
【０１０８】
合成後、ＴＦＡ（水中８０容量％）、水（５容量％）、チオアニソール（５容量％）、エタンジチオール（２．５容量％）およびフェノール（７．５重量／容量％）の緩衝液を用いて、ペプチドを樹脂から開裂させた。次いで粗製ペプチドは、ＴＦＡ勾配（０％のＢを０〜２分間維持、次いで勾配０〜３０％のＢを１５分間、続いて３０〜９５％で２分間；緩衝液Ａ：水中０．１％ＴＦＡ；緩衝液Ｂ：アセトニトリル中０．１％ＴＦＡ）を２０ｍＬ／分で用いてペプチドを溶出させる分離用ＨＰＬＣ（ＸＴｅｒｒａ  Ｐｒｅｐ  ＭＳ  Ｃ１８  ＯＢＤ、５μｍ、１９×１００ｍｍのカラム、Ｗａｔｅｒｓ）により精製した。Ｎ末端ヘミペプチドのＮ末端−ＭＡＳＭＴＧ−Ｃ末端（配列番号５）（Ｔ７＿ｐ１）内にヒドロキシルアミン官能基を導入するために、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）の最後にビス−Ｂｏｃ−アミノオキシ酢酸を末端メタン基に結合させ、ワン（Ｗａｎｇ）樹脂を開裂させた結果、遊離のカルボン酸を得た。５０ｍｇの粗製材料から、約３ｍｇの純粋な生成物Ｔ７＿ｐ１を単離した（回収率６％、Ｃ２４Ｈ４３Ｎ７Ｏ１１Ｓ２の計算質量値：６６９．２５、実測値：Ｍ＋Ｈ  ６７０．２５３１Ｄａ）。ヒドロキシルアミン基は、ヒドロキシルアミンＮｏｖａＴａｇ樹脂（ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ）を用いて、Ｃ末端ヘミペプチドのＮ末端−ＧＱＱＭＧ−Ｃ末端（配列番号６）（Ｔ７＿ｐ２）内に簡便に導入した。４２ｍｇの粗製産物から、約１０．２ｍｇの最終生成物Ｔ７＿ｐ２が得られた（回収率２４％、分子Ｃ２３Ｈ４２Ｎ１０Ｏ９Ｓの計算質量値：６３４．２９、実測値：Ｍ＋Ｈ  ６３５．３２６５）。
【０１０９】
次いでこれらのヘミペプチド（Ｔ７＿ｐ１およびＴ７＿ｐ２）を、アルデヒド官能基（表１に記載された配列番号を有する、図１３におけるアンチジップ２＿アルデヒドおよびアンチジップ５＿アルデヒドと称する）を含有する一対の相補ＤＮＡに結合させた。簡単に述べると、２００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液２０μＬ、ｐＨ４．６中、２ｎモルのＤＮＡ＿アルデヒドを２０ｎモルのヘミペプチドと合わせて、３７℃で混合した。ＨＰＬＣ分析により、１時間後に出発ＤＮＡ＿アルデヒドは反応混合物中に残っていないことが確認された。次いで産物を、ＴＥＡＡ勾配緩衝液（緩衝液Ａ：０．１％ＴＥＡＡ、ｐＨ７．０；緩衝液Ｂ：アセトニトリル；勾配５〜３０％のＢを１５分間、次いで、３０〜８０％で５分間、最終勾配は８０〜１００％で５分間を１ｍＬ／分で）中、分析用Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ  ＸＴｅｒｒａ  Ｃ１８、３．５μｍ、４．６×５０ｎｍ）を用いて精製し、ＬＣ−ＭＳにより分析した。質量分析データ：アンチジップ２＿アルデヒド：Ｃ３００Ｈ３８９Ｎ１０９Ｏ１７７Ｐ２９［Ｍ−７］−７の計算単一同位体質量値：１３２０．０９４７、実測値：１３２０．１３６４；アンチジップ５＿アルデヒド：Ｃ３０１Ｈ３８９Ｎ１０７Ｏ１８０Ｐ２９［Ｍ−７］−７の計算単一同位体質量値：１３２４．６６３１、実測値：１３２４．７０８６；アンチジップ２＿Ｔ７＿ｐ１：Ｃ３２４Ｈ４３０Ｎ１１６Ｏ１８７Ｐ２９Ｓ２［Ｍ−７］−７の計算平均質量値：１４１３．８６１７、実測値：１４１３．５６２３；アンチジップ５＿Ｔ７＿ｐ２：Ｃ３２４Ｈ４２９Ｎ１１７Ｏ１８８Ｐ２９Ｓ［Ｍ−７］−７の計算平均質量値：１４１３．４２３７、実測値：１４１３．１４７７。
【０１１０】
アンチジップ２＿Ｔ７＿ｐ１およびアンチジップ５＿Ｔ７＿ｐ２のＤＰＣ反応は、図１４Ａに示されるように、ＥＤＣおよびスルホ−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシルスルホスクシンイミドナトリウム塩）の存在下で実施した。スルホ−ＮＨＳの添加は必ずしも必要ではないがそれは高収量をもたらした。しかし、ＥＤＣはカルボキシル基と反応して、活性エステル（Ｏ−アシリソユリア）遊離基を形成し、これは水溶液中の標的アミンに遭遇する前に加水分解され得る。スルホ−ＮＨＳ上のヒドロキシル基はＥＤＣ活性エステル複合体と反応して、究極的には攻撃性のアミンと反応する活性中間体の安定性を増大させることができる。この反応は、８００μＬの総反応容量で実施され、アンチジップ２＿Ｔ７＿ｐ１およびアンチジップ５＿Ｔ７＿ｐ２を各々０．２μＭ、ならびにＭＥＳ（０．１Ｍ、ｐＨ６．０）、ＮａＣｌ（１５０ｍＭ）、ＥＤＣ（２０ｍＭ）およびｓＮＨＳ（１５ｍＭ）を含有し、室温で実施された。５０μＬのアリコートが、異なる時間インターバル後に取り出され、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｐ−６サイズ排除カラムにおけるクロマトグラフィーによって脱塩された。減圧乾燥後、サンプルを１４μＬのＴＢＥ−尿素サンプル緩衝液中に再溶解し、４５℃で３分間加熱し、氷上で冷却してからゲル電気泳動（１５％ＴＢＥ−尿素ゲル、３００ボルト、２５分）により分析した。エチジウムブロマイド染色によりゲルを可視化した。結果は図１４Ｂに示してある。
【０１１１】
図１４Ｂは、Ｔ７ペプチドが１５分以内に形成されたことを示している（約３０〜４０％の産物形成）。生成物のバンドは反応時間が増加するにつれて強くなり、一方出発材料は減少した。４時間後のＤＰＣ反応混合物のＨＰＬＣ分析が生成物のピークを示した（アンチジップ２＿Ｔ７＿ｐ１の精製と同じ方法だが、カラムを３５℃で操作した）。これを回収し、ＬＣ−ＭＳにより確認した。
（ｉｉｉ）他のペプチドエピトープ
エピトープ含有ペプチドの作出に上記のプロトコルを用いることができる。特異的抗体が確認されている他の多数のペプチド配列が知られている（例えば、ｉｍｔｅｃｈ．ｒｅｓ／ｉｎ／ｒａｇｈａｖａ／ｍｈｃｈｅｍ／ｉｎｄｅｘ／ｈｔｍｌにおけるワールドワイドウェブで見ることができるＴｈｅ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｄａｔａｂａｓｅを参照）。やはり市販の抗体が入手できるペプチドエピトープの小型サブセットのリストが図１５により提供されている。これらのペプチドエピトープは他のタンパク質においては出現することが稀であるため、遺伝子改変タンパク質の単離用アフィニティータグとして通常用いられる。多くの場合、ペプチドの最短の長さおよびこれらのエピトープの種々の配列に対する抗体の親和性が同定されている。
【０１１２】
図１５ではまた、どの配列がアミンまたはカルボキシル側鎖を含有するペプチドを有さないか、そしてどれが内部グリシンを含有するかが確認されている。ＥＤＣ結合を用いる高特異的に結合するヘミペプチドの選択に関して、アミンまたはカルボキシル側鎖の欠如は望ましい。内部グリシンの存在は、当業界に知られているいくつかの利用可能な化学を用いてヘミペプチドに関するペプチド配列における簡便なブレークポイントを提供することができる。
【０１１３】
反応可能性を有する側鎖基を含有するペプチドの選択的結合に関する好適な反応スキームの２つの例を図１６に示す。図１６Ａは、チオエステル部分を介するアミド形成を示す。チオエステルは一般に、Ｎ末端Ｃｙｓ（トランス−チオエステル化）と特異的に反応して、チオエステル結合中間体を与え、それが自然に迅速な分子内反応を受けて、アミド結合を形成する（Ｄａｗｓｏｎら、１９９４年、Ｓｃｉｅｎｃｅ２６６、７７６頁）。ピリミジルおよびベンゾチアゾールなどの一定の遊離基を有するチオエステルは、金属触媒の添加なしにアミノ基と直接的に反応できることが報告されている（Ｂｅｎａｇｌｉａら、２００５年、Ａ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、６１、１２１００−１２１０６頁）。金属触媒の添加はＤＮＡにとって有害であると考えられる。図１６Ｂは、チオエステルとアジドとの間のシュタウディンガー結合反応を示す（Ｎｉｌｓｓｏｎら、２０００年、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２、１９３９−１９４１頁）。
【０１１４】
本発明の構築体を構成するために、同様の反応スキームを用いてペプチドをオリゴヌクレオチドに結合させることができる。図１７は、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によるチオエステルとホスフィンペプチドＤＮＡ結合体の合成に関する反応スキームを示す。
実施例４．酵素基質の作出
エピトープを含有するペプチド以外のペプチド配列を作出するために、実施例２および３に記載されたものと同様の方法が使用できると考えられる。例えば、いくつかの酵素は、活性のために特定のペプチド配列の存在を必要とする。一例は、活性のために１５アミノ酸長のペプチド（Ｓ−１５ペプチド）の存在に依存する、リボヌクレアーゼの欠失変異体であるリボヌクレアーゼＳ−タンパク質酵素の基質である（Ｌｅｖｉｔら、１９７６年、「Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｓ−Ｐｅｐｔｉｄｅ」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５１（５）１３３３−１３３９頁）。したがって、１５のアミノ酸よりも短い基質ペプチドはＳ−タンパク質のリボヌクレアーゼ活性を活性化する能力がはるかに低いか、またはその能力が無い。Ｓ−１５ペプチドの不活性な断片を連結させて、リボヌクレアーゼ活性を再構成できる操作的Ｓ−１５ペプチドを形成するために、上記のペプチドエピトープの結合に提案された同じ反応を用いることができる。したがって、Ｓ−１５ペプチドは、リボヌクレアーゼＳ−タンパク質酵素の操作的酵素活性化剤である。この方法において、リボヌクレアーゼはシグナル報告酵素として使用できる。リボヌクレアーゼは迅速なターンオーバー速度を有し、クエンチした蛍光基質を用いて、蛍光発生を引き起こすことができる（Ｋｅｌｅｍｅｎら、１９９９年、「Ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｆｏｒ  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ」Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ２７、１８号、３６９６−３７０１頁）。
【０１１５】
図１８は、不活性のＳ−１５ペプチドを作出してから、それをＤＰＣによって活性化することのできる３つの方法を示す。例えば、図１８Ａに示されるように、Ｓ−１５配列に加えられたＮ末端とＣ末端のシステイン間のジスルフィド架橋を介した環化によって、Ｓ−１５ペプチドを不活性化することができる。次いで、還元剤、例えばジフェニルホスフィン−オリゴヌクレオチド結合体によりジスルフィド架橋を還元して、活性の、Ｓ−１５ペプチドを作製することができる。図１８Ｂに示されるように、ペプチドを不活性化するために、ペプチドの内部リシンの１つまたは両方（星印で示されている）をジアゾ基に変換する。チアアジド基もまた、ビオチンリガーゼペプチドによるジアゾ基の還元に用いたのと同じ方法を用いて、例えば、ジフェニルホスフィン−オリゴヌクレオチド結合体により還元することができる。図１８Ｃに示されるように、Ｓ−１５は２つのヘミペプチド、１つはＣ末端チオエステルを有するもの、他方はＮ末端システインを有するものに開裂する。どちらも単独ではリボヌクレアーゼＳ−タンパク質を活性化しない得られたヘミペプチドを、天然の化学結合を介して本発明の方法において連結させることができる。
【０１１６】
すでに検討したように、非核酸生物学的標的に対して、抗体などの結合部分を含有するリガンドレポーター構築体、およびレポーター基を用いることができる。しかしながら、図１９に示されるように、上記の同様な化学を用いて、結合体は核酸標的の検出のために用いることもできる。この場合、反応物は、「核酸レポーター」および「相補体」が自己相補性ではなく、標的ＤＮＡ内の隣接の（またはほぼ隣接した）相補的配列にアニールするプローブであることを除いては、タンパク質ベースの検出試薬と同様である。
【０１１７】
図１９に示すように、第一のプローブ（リガンドレポーター構築体）１５０は、ペプチド前駆体１８０（前駆体１と示されている）に結合した標的配列における相補的な、または実質的に相補的な配列１７０にアニールする核酸配列１６０（ＮＡプローブ１と示されている）を含有する。第二のプローブ（リガンドレポーター構築体）１９０は、ペプチド前駆体２００（前駆体２と示されている）に結合した標的配列における相補的な、または実質的に相補的な配列２１０にアニールする核酸配列２２０（ＮＡプローブ２と示されている）を含有する。標的配列における領域１７０および２１０内の配列は、同一の場合も、異なっていてもよい。プローブが標的領域にハイブリダイズすると、それらは２種の前駆体を反応性に近接させ、エピトープを規定するペプチド生成物が生成する。次いでこの生成物を、これと特異的に結合する抗体（ＡＢと示されている）などの結合部分を用いて検出することができる。
実施例５：エピトープとしての色素の作出
フルオレセインなどの単純な色素もまたエピトープとして役立ち得る。例えば、ＤＰＣアッセイは、ジフェニルホスフィンにより非蛍光分子ジアジドローダミン（ＤＡＺＲ）を還元して蛍光色素ローダミングリーンを作製することを含み得る（図３を参照）。ローダミングリーンは抗フルオレセイン抗体に結合するため、直接検出することができる。より高感度にするため、ローダミングリーン色素はレポーター酵素に結合させた抗フルオレセイン抗体によって検出することができる。
【０１１８】
調べたＤＰＣアッセイ様式の一つでは、ジップコード配列およびアンチジップコード配列を介してジフェニルホスフィンおよびＤＡＺＲにそれぞれ結合した抗ＰＤＧＦ−Ａ抗体および抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体の結合体を用いてタンパク質血小板由来成長因子（ＡＢサブユニット）またはＰＤＧＦ−ＡＢの存在を検出した（図２０を参照）。この反応において、抗ＰＤＧＦ−Ｂ結合体および抗ＰＤＧＦ−Ａ結合体（０．１５μＭ）を、０．１５μＭの標的（ＰＤＧＦ−ＡＢ）の存在下および非存在下で、０．１５μＭのジップコード化ＤＡＺＲオリゴヌクレオチド結合体および０．３０μＭのジフェニルホスフィンジップコード化オリゴヌクレオチド結合体と共にインキュベートした。これらの反応混合物は、緩衝液として０．０５Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ８を含有し、マイクロプレートベースの蛍光光度計で５２０ｎｍにおいて３０℃で経時的にモニターした。図２１は、ＰＤＧＦ−ＡＢの存在下でのこのような系の蛍光発生の典型的な時間経過を示す。陰性対照は、ＰＤＧＦ−ＡＢまたはジップコード化ビスジフェニルホスフィン反応物質を欠いていた。高濃度の過剰なＴＣＥＰ（「＋ＴＣＥＰ」と示されている）の存在下での陽性対照は、全てのＤＡＺＲオリゴヌクレオチドがローダミンに還元された場合に得ることのできる最大の蛍光を示す。
【０１１９】
図２２は、最初の反応生成物（ローダミングリーン）が検出システムの増幅成分（例えばＨＲＰ）によって増幅されるＰＤＧＦ−ＡＢの検出に関するアッセイの概略図を示す。ＥＬＩＳＡ様式に基づいたアッセイでは、十分な親和性と特異性でローダミングリーンに結合しローダミングリーンをＤＡＺＲ前駆体から識別する抗フルオレセイン抗体−ＨＰＲ結合体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ヤギ抗フルオレセイン−ＨＲＰ結合体）が用いられる。ＰＤＧＦ−ＡＢの存在下でＤＰＣを介したＤＡＺＲ還元からのシグナルを増幅する一方、ＤＡＺＲおよびジフェニルホスフィン前駆体を識別するために抗体結合体を使用し得るかどうかを試験した。
【０１２０】
手短に述べると、ＥＬＩＳＡプレート（固体支持体）のウェルを抗ＰＤＧＦポリクローナル抗血清によってコーティングした。ＰＤＧＦと共にインキュベートした後、２種のリガンド−レポーター構築体（プローブ）を用いて、ＰＤＧＦ−ＡＢのヘテロダイマーを検出した。リガンド−レポーター構築体の各々は図２に示した２種の分子系に基づいていた。標的結合性成分１は、ジップ３オリゴヌクレオチドに共有結合した抗ＰＤＧＦ−Ａ抗体を含んでなり、標的結合性成分２は、ジップ２オリゴヌクレオチドに共有結合した抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体を含んでなる。これら２種の標的結合性成分を、レポーター成分１およびレポーター成分２と示された２種のレポーター成分と共にインキュベートした。レポーター成分１は、ＤｉＰｈＰと共有結合したアンチジップ３オリゴヌクレオチド（ジップ３オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする）を含有した。レポーター成分２は、ＤＡＺＲと共有結合したアンチジップ２オリゴヌクレオチド（ジップ２オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする）を含有した。レポーター成分１のレポーター１配列がレポーター成分２のレポーター２配列にハイブリダイズすると、ＤｉＰｈＰはＤＡＺＲと反応性に近接し、ＤＡＺＲ分子を還元してローダミンを生成させる。
【０１２１】
生じた産物は抗フルオレセイン抗体−ＨＲＰ結合体（抗フルオレセイン−ＨＲＰと示す）により結合した。ＨＲＰ酵素はＴＭＢを発色産物に変換する。ＴＭＢ基質を有するＲｏｃｋｌａｎｄヤギ抗フルオレセイン−西洋わさびペルオキシダーゼ結合体と共にインキュベーション後、シグナル（４５０ｎｍにおける吸光度）が発現した。
【０１２２】
図２２に示された反応の最後に生じたＤＰＣ生成物を、ＥＬＩＳＡへの反応供給量からのＤＡＺＲオリゴヌクレオチドの総ピコモルの関数としてプロットした（図２３を参照）。図２３に示されるように、ＰＤＧＦ−ＡＢの存在下（＋標的として示す）で発現した反応混合物のＥＬＩＳＡ応答は、ＴＣＥＰの存在下（＋ＴＣＥＰとして示されている）で得られたものと同様であり、それらは両方とも、ＰＤＧＦ−ＡＢの非存在下（標的なしとして示す）、またはビスジフェニルホスフィンオリゴヌクレオチドを除いて（−ビスＤｉＰｈＰとして示す）発現した応答よりはるかに高かった。試験条件下では、前駆体と生成物との間の抗体の識別は、ほぼ還元ＤＡＺＲ（ローダミングリーン）を生成させた反応条件を出発産物（非還元ＤＡＺＲ）と比較して約５倍であった。
【０１２３】
抗体を多くのクラスの色素、例えばローダミン類やクマリン類に対して発現させた。他の有用な検出試薬のセットは、非蛍光前駆体であるインドリニウムおよびインドールアルデヒド、ならびにＣｙ３として知られているそれらの蛍光反応生成物である（図２４）。Ｃｙ３反応生成物は抗Ｃｙ３抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａｎｔｉ  Ｃｙ３／Ｃｙ５  またはＫｒｅａｔｅｃｈ  Ａｎｔｉ  Ｃｙ３）により検出でき、これらはどちらもインドリニウムまたはアルデヒド前駆体に結合しない。
実施例６：エピトープを含有する小型分子
抗体を発現させた多数の小型分子がエピトープを規定する。抗体は、典型的には免疫アッセイにおいて、例えば、ＥＬＩＳＡ様式において、例えば毒素、殺虫剤残基、薬剤等の検出用に通常は検出試薬として利用される。ＤＰＣによって生成させることができ（すなわち前駆体ではなくて生成物が抗体に結合する）、それらに対する抗体が市販入手できる（例えばＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚから）エピトープとしては、限定はしないが、アモジアキン、アンピシリン、アルギニン、ベンゾピレン、ビオチン、セファロスポリン、クロロキン、クマル酸、ジゴキシゲニン、ジゴキシン、エテノアデノシン、フルオレセイン、イソチオシアネート、ＦＫ５０６、グルタチオン、モルフィン、フェンシクリジン、テオフィリン、チオグアニンが挙げられる。
【０１２４】
アルドール縮合によるｐ−クマル酸のＤＰＣ媒介合成に関する代表的な合成スキームが図２５に記載されている。
実施例７：ＥＧＦＲ二量体の検出
本実施例では、エピトープを作製するために、ＥＤＣ−ｓＮＨＳ  ＤＰＣを用いてＥＧＦＲ二量体の存在および／または量を検出するためのアッセイを記載する。検出可能なシグナルの生成は受容体二量体の存在に依存し、このアッセイにより構成成分一量体が効果的に識別される。
【０１２５】
ＥＧＦ活性化Ａ４３１細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（「ＰＢＳ」；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）中、３回遠心分離により洗浄した。５０，０００個の細胞をＰＢＳ中ハイバインドプレートの各ウェル内に導入し、４℃で一晩沈降させた。固定化した細胞をＰＢＳで３回洗浄した。これらのウェルをブロック用溶液（ＰＢＳ−Ｔ  １ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）０．１ｍｇ／ｍＬのウサギＩｇＧ）で１時間、室温でブロックしてから、ＰＢＳプラスＴｗｅｅｎ−２０（「ＰＢＳ−Ｔ」；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）で３回、水で１回洗浄し、室温で乾燥した。
【０１２６】
次いでウェルを、Ｚｉｐ２のアミノ末端に結合させた抗ＥＧＦＲ（Ｌａｂｖｉｓｉｏｎ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）（抗ＥＧＦＲ−Ｚｉｐ２；０〜１５ピコモル）の等量およびＺｉｐ５のアミノ末端に結合させた抗ＥＧＦＲ（Ｌａｂｖｉｓｉｏｎ）（抗ＥＧＦＲ−Ｚｉｐ５；０〜１５ピコモル）の等量と共に１時間インキュベートし、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。次いでウェルをアンチジップ２＿Ｔ７＿ｐ１およびアンチジップ５＿Ｔ７＿ｐ２の各々２０ピコモルと共にインキュベートし、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。次いで、アンチジップ−Ｔ７ヘミペプチド結合体を含有するウェルを、０．１Ｍの４−モルホリンエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ｐＨ６．５緩衝液中、０．２ＭのＥＤＣ、０．１５Ｍのスルホ−ＮＨＳの溶液（ＥＤＣ−スルホ−ＮＨＳ）と共に３０分間インキュベートした。次いで、２回目のインキュベーションおよびブロック用溶液による洗浄を行った。
【０１２７】
次いでサンプルをブロック用溶液中、６．６μＭ抗Ｔ７−ＨＲＰ結合体１００μＬと共に１時間インキュベートした。ウェルを製造元の指示に従い、Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄと共にインキュベートし、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅリーダーを用いて、５３０ｎＭにおける励起ならびに５８５ｎＭにおける発光によりモニターした。対照は、抗ＥＧＦＲ結合体なしでインキュベートしたサンプル；Ｔ７ヘミペプチド結合体なしでインキュベートしたサンプル；および抗ＥＧＦＲ結合体とＴ７ヘミペプチド結合体の双方なしでインキュベートしたサンプルを含んだ。
【０１２８】
結果は図２６に示されている。このアッセイの線形位相における反応速度は、細胞上の完全長Ｔ７エピトープの関数として増加した。
実施例８：ＥＧＦＲおよびＥｒｂＢ２二量体に関するフローサイトメトリーアッセイ
接着性のＡ４３１細胞を一晩血清飢餓状態にしてから洗浄し、トリプシン消化によりプレートから分離した。Ａ４３１細胞の懸濁液を非処理のままでおくか、または氷上でＥＧＦ（２００ｎｇ／ｍＬ）により処理した。次いで細胞を、２％ホルムアルデヒドと共に氷上で２０分間のインキュベーションにより固定した。内因性ペルオキシダーゼ活性を、ＰＢＳ中、３％過酸化水素と共に、室温で５分間のインキュベーションによりクエンチした。２％ＢＳＡおよび５％硫酸デキストランを含有するＰＢＳ中、非特異的ウサギＩｇＧ（１００μｇ／ｍＬ）およびｔＲＮＡ（１μＭ）によりブロックしてから、ＰＢＳ中、２％ＢＳＡ、５％硫酸デキストラン、１００μｇ／ｍＬのウサギＩｇＧ、１μＭのｔＲＮＡ、ならびに以下の抗体−ジップコード結合体およびアンチジップコードＴ７ヘミペプチドを含有する溶液と共にインキュベートした。
【０１２９】
ＥＧＦＲホモ二量体のアッセイでは、抗体結合体ｅｇｆｒ１抗体−Ｚｉｐ２およびｅｇｆｒ１抗体−Ｚｉｐ５の各５μｇ／ｍＬ、ならびにアンチジップ２＿Ｔ７＿ｐ１およびアンチジップ５＿Ｔ７＿ｐ２の各６０ｎＭと共に細胞をインキュベートした。
【０１３０】
ＥＧＦＲ−ＥｒｂＢ２ヘテロ二量体では、ｅｇｆｒ１抗体−Ｚｉｐ５の各５μｇ／ｍＬおよびジップコード２レポーターのアミノ末端に結合した２００ｎＭの抗ＥｒｂＢ２抗体、ならびにアンチジップ２＿Ｔ７＿ｐ１およびアンチジップ５＿Ｔ７＿ｐ２の各６０ｎＭと共に細胞をインキュベートした。
【０１３１】
試薬は細胞と共に３０℃で１時間インキュベートした。各アッセイに、ＥＤＣ−スルホ−ＮＨＳを室温で１時間添加して結合させ、得られたヘミペプチドをアンチジップコード配列の相補性部分のハイブリダイゼーションを介して反応近接性とした。次いで、セイヨウワサビペルオキシダーゼに結合させた１μｇ／ｍＬのウサギ抗Ｔ７抗体（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、ＣＯ）を各アッセイに添加し、アッセイ混合物中、室温で１時間インキュベートした。次いでチラミド−Ａｌｅｘａ５６８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を加え、混合物を室温で５分間インキュベートした。ウサギ抗Ｔ７抗体−ＨＲＰ複合体において、Ａｌｅｘａ５６８標識はＨＲＰにより共有結合した。Ａｌｅｘａ５６８標識の存在に関して、細胞をフローサイトメトリーにより分析した。結果は図２７にまとめてある。
【０１３２】
図２７に見られるように、ＥＧＦＲホモ二量体に関するＴ７ペプチド結合ＤＰＣアッセイで得られた平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、バックグラウンド（ｂｋｇｄと示されている）よりも有意に大きかった。バックグラウンド値は、上記のように判定したが、抗ＥＧＦＲ抗体のうちの１つを欠いていた。ＥＧＦＲホモ二量体に関するＭＦＩは、ＥＧＦ処理（ＥＧＦと示されている）に応答して増加した。これらの結果は、非処理細胞におけるＥＧＦＲホモ二量体の基底レベルの存在および外因性ＥＧＦに応答したさらなるホモ二量体化の誘導と一致した。対照的に、非処理細胞におけるＥＧＦＲ−ＥｒｂＢ２ヘテロ二量体に関するＭＦＩは、バックグラウンドを有意に超えていることはなく、基底レベルにおいては、ヘテロ二量体がきわめてわずかしか存在しないか、または存在しないことを示唆した。しかし、ＥＧＦに応答して、ＥＧＦＲ−ＥｒｂＢ２に関するＤＰＣシグナルは基底レベル以上に上昇し、ＥＧＦによりヘテロ二量体が誘導されたことを示唆した。
【０１３３】
これらの結果は、ＥＧＦに対する応答における細胞の活動の受容された機序と一致する。Ａ４３１細胞において、ＥＧＦＲは高度に発現するが、ＥｒｂＢ２の発現ははるかに低いレベルである。本アッセイにおいて検出されたＭＦＩシグナルの大きさはこれらの発現レベルと一致した。
実施例９：Ｂｃｒ−Ａｂｌに関するＤＰＣアッセイ
Ｂｃｒ−Ａｂｌは、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）において発現する異常な融合腫瘍性タンパク質である。Ｂｃｒ−Ａｂｌの検出および個々のＢｃｒおよびＡｂｌの識別は、ＣＭＬの診断ならびにＧｌｅｅｖｅｃ（登録商標）（イマチニブメシレート）などの治療薬で治療した後の最小残留疾患の検出にとって重要であり得る。ＣＭＬ細胞系のＫＹ０１は、Ｂｃｒ−Ａｂｌ融合タンパク質ならびに個々のＢｃｒおよびＡｂｌタンパク質を発現する。
【０１３４】
Ｂｃｒ−Ａｂｌに関するＴ７ペプチド結合ＤＰＣアッセイのプロトコルは，使用された抗体−ジップコード結合体がＺｉｐ２のアミノ末端に共有結合した抗Ｂｃｒ抗体７Ｃ６およびＺｉｐ５のアミノ末端（１９〜１１０−Ｚｉｐ５）に共有結合した抗Ａｂｌ抗体１９〜１１０であったことを除いては、実施例８に記載されたものと同様であった。また、Ｂｃｒ−Ａｂｌは細胞内タンパク質であるため、細胞内にＤＰＣアッセイの試薬を透過させるために細胞を透過化処理した。透過化処理は、細胞を固定するために先ずホルムアルデヒドを用い、アッセイに用いられた全ての溶液に０．３％のサポニンを添加することによって達成した。これらの修飾以外に、実施例８に記載されたものと同じプロトコルを用いて、ＫＹ０１細胞内のＢｃｒ−Ａｂｌを検出した。
【０１３５】
３つのアッセイサンプルのフローサイトメトリー分析結果が図２８にまとめてある。図２８Ａは、非特異的ＩｇＧによりブロックし、ウサギ抗Ｔ７−ＨＲＰのみに暴露させたＫＹ０１細胞のＭＦＩ分布を示し；ＫＹ０１細胞に対するこの抗体の非特異的結合によるバックグラウンドの影響内にある。図２８Ｂは、抗Ａｂｌ抗体結合体は含有せず、ＤＰＣ反応に必要な他の全ての試薬を含有した陰性対照サンプルのＭＦＩ分布を示す。この陰性対照のＭＦＩは、抗Ｔ７−ＨＲＰバックグラウンドのＭＦＩよりわずかに上昇する。図２８Ｃは、Ｂｃｒ−Ａｂｌの存在を指示するＤＰＣシグナルを示す。このサンプルは、抗体−ジップコード結合体、ならびにＤＰＣ結合および完全Ｔ７ペプチドの検出に必要な他の試薬の双方を含有した。ＭＦＩ分布はいずれの対照よりも高い。
実施例１０：ＣＭＬ由来細胞系およびＣＭＬ親の骨髄サンプルにおけるＢｃｒ−ＡｂｌのＤＰＣ検出
１０％ウシ胎仔血清を有する１０％ＲＰＭＩ  １６４０培地中でＫＹ０１細胞を増殖させた。精製ＣＭＬ親の骨髄単核細胞を新鮮採取して精製するか、または凍結保存したサンプルから得た。約２００，０００個の細胞をＰＢＳ中で洗浄してから、０．２５ｍＬの透過化／固定緩衝液（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）と共に、室温で２０分間インキュベートした。次いで細胞を、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中で洗浄してから、３％の過酸化水素を含有する０．２ｍＬの透過化／洗浄用緩衝液（Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ）（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）と共に、室温で１０分間インキュベートした。次いで細胞を、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液で２回洗浄してから、非特異的５９量体オリゴヌクレオチドの混合物５０ｎＭを含有するＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液で３０分間ブロックした。
【０１３６】
室温で、Ｚｉｐ２のアミノ末端に共有結合した抗Ｂｃｒ抗体Ｂ１２、Ｚｉｐ５のアミノ末端に共有結合した抗Ａｂｌ抗体１９〜１１０と共に、５０ｎＭのブロックオリゴマー混合物を含有するＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液中、アンチジップ２＿Ｔ７＿ｐ１およびアンチジップ５＿Ｔ７＿ｐ２を含有する混合物（０．１ｍＬ）を調製した。この混合物を前記細胞に加えてから、細胞を氷上で１時間インキュベートした。次いで細胞をＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液で洗浄し、０．２％のサポニンを含有するＥＤＣ−スルホ−ＮＨＳ０．３ｍＬと共に、室温で１時間インキュベートした。
【０１３７】
前記細胞をＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液で１回洗浄し、２００μｇ／ｍＬの正常なヒトＩｇＧで３０分間ブロックしてから、ＨＲＰに共有結合したウサギ抗Ｔ７抗体（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、ＣＯ）と共に１時間インキュベートした。次いで細胞をＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液で洗浄し、Ａｌｅｘａ５６８に共有結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片と共にインキュベートした。前記抗体は使用前に、２００μｇ／ｍＬの正常なヤギＩｇＧを含有するＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液中で１：２０００に希釈した。反応容量は０．２ｍＬであった。次いで細胞をＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液で２回洗浄し、フローサイトメトリーで分析した。結果は図２９に示してある。
【０１３８】
図２９は、ＫＹ０１細胞に関して（図２９Ａ）およびＣＭＬ親の単核細胞に関して（図２９Ｂ）この方法により得られた結果を示す。各細胞型に関して、Ｂｃｒ−Ａｂｌの存在に関連したシグナルは、有意にバックグラウンドの対照以上であった。これらの対照は、反応混合物中にＡｂｌ抗体１９〜１１０ジップ５もＢｃｒ抗体Ｂ１２ジップ２も含まないサンプルを含んだ。
実施例１１：乳癌組織中のＥｒｂＢ２ホモ二量体の検出
乳管癌の組織切片（４ミクロン厚；ＢｉｏＧｅｎｅｘ、Ｓａｎ  Ｒａｍｏｎ、ＣＡ、カタログ番号  ＦＧ−１３４Ｍ）を、キシレンの３回交換で脱パラフィンし、エチルアルコールの段階系（９０％、８０％および７０％）で再水和した。マイクロ波オーブン内で、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中２０分間、ＥｒｂＢ２に関するエピトープ回収を行った。ＰＢＳ中３％Ｈ２Ｏ２中で内因性ＨＲＰ活性をブロックした。洗浄後、ブロック用緩衝液中、４℃で１時間切片をブロックした。インキュベート時、スライドは加湿チャンバー内に保持した。
【０１３９】
ジップ２に共有結合した抗ＥｒｂＢ２  ９Ｇ６抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）およびジップ５に共有結合した抗ＥｒｂＢ２  ９Ｇ６抗体（結合用緩衝液中、各６０ｎＭ）の混合物を室温で３０分間、前記切片に適用した。結合用緩衝液で洗浄後、結合用緩衝液中、各１８０ｎＭのアンチジップ２＿Ｔ７＿ｐ１およびアンチジップ５＿Ｔ７＿ｐ２と共に、前記切片を室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄し、０．１ＭのＭＥＳ／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液で１回洗浄した後、ＥＤＣ−スルホ−ＮＨＳ中、室温で２時間、Ｔ７ペプチド結合を実施した。ＰＢＳで洗浄後、Ｔ７ブロック用緩衝液（ＰＢＳ、２％ＢＳＡ、０．１ｍｇ／ｍＬのラクトアルブミン、０．１ｍｇ／ｍＬのウサギＩｇＧ）中、室温で４５分間、前記スライドをブロックしてから、Ｔ７ブロック用緩衝液中、２μｇ／ｍＬの抗Ｔ７−ＨＲＰ抗体（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、ＣＯ）と共に、室温でさらに４５分間インキュベートした。次いで、前記スライドをチラミド−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５６８（ＴＳＡ  ＫＩＴ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）により、室温で５分間標識し、ＰＢＳ中で洗浄し、Ｐｒｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄのアンチフェード封入剤（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中に封入し、４℃で保存した。通過幅５１０〜５５０ｎｍ、励起およびロングパス５８０ｎｍ、発光フィルターを備えたエピ蛍光のＮｉｋｏｎ  ＥＴ−２０００Ｕ顕微鏡で顕微鏡分析を実施した。結果は図３０に示してある。
【０１４０】
ＥｒｂＢ２ホモ二量体の特異的染色を管細胞でのみ観察すると、細胞膜に局在していた（図３０Ａ）。図３０Ｂは、組織構成を明らかにするために示された対応するＨＥ染色断面である。図３０Ｃおよび３０Ｄは、９Ｇ６−Ｚｉｐ５結合体を欠いた（図３０Ｃ）、または９Ｇ６−Ｚｉｐ２結合体と９Ｇ６−Ｚｉｐ５結合体の双方を欠いた（図３０Ｄ）陰性対照である。
実施例１２：天然化学結合を用いたＴ７修飾ヘミペプチドの作製および使用
天然の化学的連結（ＮＣＬ）は、あるペプチドのチオエステル置換カルボキシル基と別のペプチドにおけるＮ末端システインアミノ酸（またはシステイン類縁体）との反応を縮合し再構成して両者を連結し、天然のペプチド結合を生じさせることを含む。この化学の利点として考えられることは、外部触媒を必要とせず、標的のタンパク質または細胞に対する非特異的反応の程度が大きく減少することである。さらにこの化学では、アミノ酸を含有するカルボキシル側鎖およびアミノ側鎖は副反応をもたらさないため、エピトープ内にそれらが多数許容される。本実施例で用いられる一般的な化学は図３１に記載されている。
【０１４１】
Ｔ７Ｐ１ヘミペプチドチオエステルの合成は、図３２に記載されている。手短に述べると、Ｔ７Ｐ１ヘミペプチドを先ず、標準的なＦｍｏｃプロトコルにより予め充填されたアシルスルホンアミドセーフティーキャッチ樹脂（ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ）上に構成した。ビス−Ｂｏｃ（ｔ−ブトキシカルボニル）保護したアミノオキシ酢酸の結合を介してＤＮＡ結合を可能にするために、Ｎ末端にヒドロキシルアミン官能基を組み込んだ。合成後、前記樹脂をトリメチルシリルジアゾメタン（ＴＭＳ−ＣＨＮ２）によって活性化してから、エチル３−メルカプトプロピオネートおよび触媒量のＮａＳＰｈで処理した。これにより、Ｔ７Ｐ１におけるカルボキシル末端のグリシンがチオエステルに変換される。粗製開裂混合物が主に保護されたＴ７Ｐ１チオエステルを含有していることを、ＭＳデータは示した。さらにＴＦＡ処理およびＨＰＬＣ精製により、完全に脱保護されたＴ７Ｐ１チオエステルが得られた。Ｔ７Ｐ１チオエステルの合成への代替経路は、下記の実施例１７に記載されている。
【０１４２】
修飾Ｔ７Ｐ２ヘミペプチドは、ＧｌｙからＧｙｓへの変異および配列ＧＭＱＱＣ−ＮＨ２（配列番号７２）を含有した。先に記載されたように、Ｔ７Ｐ１ヘミペプチドチオエステルは、アンチジップ２に結合してアンチジップ２＿Ｔ７＿ｐ１チオエステルを作出し、修飾Ｔ７Ｐ２ヘミペプチドは、アンチジップ５に結合してアンチジップ５＿Ｔ７＿ｐ２＿Ｃｙｓを作出した。アンチジップ５に対するＴ７Ｐ２ヘミペプチドの結合は、システイン残基の酸化を防ぐために、２ｍＭのＤＴＴの存在下で行われた。アンチジップに結合したヘミペプチド類（各５μＭ）を、２％のチオフェノール、５０ｍＭのＮａＰｉ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０中で一晩一緒に混合した。反応生成物のゲル電気泳動により、Ｃｙｓ含有Ｔ７ペプチドの生成が実証された。Ｔ７ペプチド生成物は、２％のチオフェノールを０．５ｍＭのＤＴＴに替える場合にも調製し得る。先の実験に用いられた抗Ｔ７抗体はＣｙｓ修飾Ｔ７ペプチドを認識したが、Ｔ７＿ｐ１＿Ｓ（Ｅｔ３ＭＰ）ヘミペプチドにもＴ７＿ｐ２＿Ｃｙｓヘミペプチドにも結合しなかった。
【０１４３】
ＥＤＣ／ｓＮＨＳペプチド連結プロトコルとは異なり、ＮＣＬはペプチド結合の形成にさらなる試薬を必要としない２種のヘミペプチドを利用する。したがって、生成物の形成が標的依存のオリゴヌクレオチド二重鎖の存在下でのみ生じることを確実にするために、アッセイプロトコルにおける調整か、各々のヘミペプチドに結合したレポーターオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）における調整かのいずれかが必要となり得る。一実施形態において、アンチジップ−レポーター−ヘミペプチド構築体の１つを反応混合物に加え、標的への特異的結合を可能にするのに十分なインキュベーションの時間インキュベートした。次いで、非結合の構築体を除去するために反応混合物を洗浄してから、第二のアンチジップ−レポーター−ヘミペプチド構築体を加えた。
【０１４４】
ＥＤＣ／ｓＮＨＳペプチド結合プロトコルでは、レポーターオリゴヌクレオチドは典型的には１０塩基長で１００％相補性である。このようなレポーターオリゴヌクレオチドは約２５℃超の融解温度（Ｔｍ）を有する。しかしＮＣＬプロトコルでは、レポーターオリゴヌクレオチドは、標的への特異的結合なしにペプチド形成をもたらし得る。それでも、Ｔｍを２５℃未満に下げることによって、非特異的結合を減少させることができる。したがって一実施形態において、レポーターオリゴヌクレオチドが約８℃から約２５℃のＴｍを有するように、それらが修飾される。レポーターオリゴヌクレオチドは、約９℃から約２０℃のＴｍを有することが好ましい。個々のレポーターオリゴヌクレオチドの長さが異なる場合、長い方のリポーターオリゴヌクレオチドは一般に、チオエステル末端を有するヘミペプチドに結合させ、短い方のリポーターヘミペプチドは、チオール（すなわちシステインまたはシステイン類縁体）未満を有するヘミペプチドに結合させる。
【０１４５】
レポーターオリゴヌクレオチドのＴｍの修飾は、レポーターの一方または両方の長さを短くすること、反応の塩条件および他の試薬を変えること、および／またはレポーター配列の相補性を１００％以下に減少させるミスマッチを導入することによって達成することができる。２種のオリゴヌクレオチドのＴｍは、Ｐａｎｊｋｏｖｉｃｈ，Ａ．ら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２００５年、２１（６）：７１１−２２頁およびＰａｎｊｋｏｖｉｃｈ，Ａ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２００５年、３３：Ｗ５７０−Ｗ５７２頁に記載されている方法を用いて、公知の数式により、配列の長さおよび内容に基づいて推定することができる。あるいは、本発明で用いられた２種のレポーターオリゴヌクレオチドいずれのＴｍの判定も、当業界で周知の実験的試験によって達成される。
実施例１３：ＮＣＬを介したＤＮＡ標的検出のため、低いＴｍのレポーターオリゴヌクレオチド部分を含有するＴ７修飾ヘミペプチド−アンチジップ結合体の使用
種々のレポーターオリゴヌクレオチド部分を含有するアンチジップ２＿Ｔ７＿ｐ１−Ｓ（Ｅｔ３ＭＰ）および種々のレポーターオリゴヌクレオチド部分を含有するアンチジップ５＿Ｔ７＿ｐ２−Ｃｙｓの各５ピコモルを、５重量／容量％の硫酸デキストランを含有する５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６）１００μＬに加えた。ストレプトアビジンプレート上に固定した５ピコモルのビオチン−ジップ５またはビオチン−ジップ２とビオチン−ジップ５各々２．５ピコモルの組合わせを含有するウェルを試験した。これらのウェルを２５℃で３０分間インキュベートしてから、ＰＢＳ−Ｔ緩衝液で３回洗浄した。反応はＰＢＳ−Ｔ緩衝液中、０．０１μＭのマウス抗Ｔ７−アルカリホスファターゼ結合体（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ）１００μＬと共にインキュベートした。反応混合物をＡｔｔｏｐｈｏｓ検出用溶液（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）により発現させ、蛍光発現の動態を動態をモニターした（２５℃で、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅプレートリーダー上、励起４３５ｎＭ／５８５ｎＭにおける発光）。各実験条件に対する線形範囲内（典型的には０秒と６００秒との間）の蛍光発光の増加率（ΔＦ／ｓｅｃ）をプロットした。
【０１４６】
この実験に用いられた種々のアンチジップ２およびアンチジップ５の個々の配列は、表２に記載されている。
【０１４７】
【表２】
2010534836.tif 000004
室温でＰＢＳ緩衝液（１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５４ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中、修飾アンチジップ５レポーターＤＮＡと修飾アンチジップ２レポーターＤＮＡの各１μＭを組み合わせることによって作製されたサンプル溶液によって、ＵＶ融解曲線を得た。測定は全て、光路長１ｃｍの石英セル（合計１２００μＬ）中、磁気攪拌バーを入れて行った。２６０ｎｍにおける吸光度を、Ｐｅｌｔｉｅｒシステム温度調整器を備えたＣａｒｙ３００  Ｂｉｏ  ＵＶ−Ｖｉｓ分光計を用いて、０℃〜７５℃の範囲にわたり、０．５℃／分の加熱／冷却速度で、温度の関数として記録した。室温以下での結露を防ぐために、乾燥Ｎ２ガスを分光計のサンプルチャンバーに通した。
【０１４８】
データを補正し、得られた曲線を補整した。次いで補整した融解曲線を、非線形最小二乗プログラムＭｅｌｔＷｉｎ３．０（ＭｃＤｏｗｅｌｌ，ＪＡら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９６年、３５：１４０７７−１４０８９頁）を用い、勾配ベースラインで二状態モデルに適合化した。融解温度Ｔｍ（５０％の複合体がその構成成分へと解離する温度として規定）は、融解曲線の第一微分の屈曲点極大値から判定した。結合用緩衝液が硫酸デキストランを含有する場合は、適合化を行う前に、サンプルから緩衝液融解曲線を差し引いた。
【０１４９】
この実験で用いられた特異的なアンチジップ対、およびそれらの実験的に判定された融解温度を表３に示す。特定のアンチジップ対に対して２つ以上のＴｍが示されている場合は、複数のＴｍ判定の結果を反映するものである。
【０１５０】
【表３】
2010534836.tif 000005
図３３に示されている本試験の結果は、一般に、２５℃未満かつ８℃超のＴｍを有するレポーターオリゴヌクレオチド対は、特異的なヘミペプチド結合をもたらすことを実証している。理論に拘束されることは望まないが、アンチジップ２＿９量体／アンチジップ５＿１０量体対で見られる低シグナルは、効率的な結合が妨げられた２種のヘミペプチド間に作り出された幾何学的配置に関連すると考えられる。同様のＴｍを示したアンチジップ５＿９量体／アンチジップ２＿１０量体は、極めて長い特異的シグナルを生じた。したがって、レポーターオリゴヌクレオチドが異なる長さの場合は、長い方のレポーターがチオエステル末端を有し、短い方のレポーターがシステインまたはシステイン類縁体の末端を有することが重要であると考えられる。
実施例１４：さらなるＣｙｓ置換変異ペプチドならびにヘミペプチド対
Ｔ７における他の位置でシステイン組込みを試験した。Ｇｌｙ７、Ｇｌｎ８およびＧｌｎ９各々でのＴ７におけるシステイン組込みにより、抗Ｔ７抗体および非反応性のヘミペプチドにより認識されたペプチドが生成した。したがって本発明は表４に示された変異Ｔ７ペプチドならびにＰ１ヘミペプチドおよびＰ２ヘミペプチドと示されるヘミペプチド対を提供する。下記のペプチドおよびＰ２ヘミペプチドの各々に関して、システインはシステイン類縁体に任意に置換される。
【０１５１】
【表４】
2010534836.tif 000006
リガンド結合などの他の手段によって検出されるペプチド（ストレプトアビジンまたはストレパクチンに対する結合により検出されるＳｔｒｅｐＴａｇペプチド）に関しても同様なＮＣＬ法が用いられた。ＳｔｒｅｐＴａｇに関して、Ｓｅｒ３、Ｈｉｓ４、Ｐｒｏ５およびＧｌｎ６のいずれにおけるＣｙｓ置換も、ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎおよび非反応性ヘミペプチドによって認識されるペプチドを生成した。したがって、本発明は下表５に示された変異ＳｔｒｅｐＴａｇペプチドならびにＰ１ヘミペプチドおよびＰ２ヘミペプチドと表された対応するヘミペプチド対（同列のＰ１およびＰ２ヘミペプチド）を提供し、それらは本発明において有用であり、本発明の一部である。下記のペプチドおよびＰ２ヘミペプチドの各々に関して、システインはシステイン類縁体に任意に置換される。
【０１５２】
【表５】
2010534836.tif 000007
酵素活性化により検出されるペプチド（例えば、リボヌクレアーゼＳ−タンパク質の欠失変異体を活性化するために必要なＳ−１５ペプチド）に関しても同様のＮＣＬ法を用いた。Ｓ−１５では、Ｇｌｕ９におけるＣｙｓ置換により、リボヌクレアーゼ変異体およびＮ末端不活性ヘミペプチドを活性化するペプチドが生成される。したがって、本発明は下表６に示された変異Ｓ−１５ペプチドならびに対応するヘミペプチド対を提供し、それらは本発明において有用であり、本発明の一部である。下記のペプチドおよびＰ２ヘミペプチドに関して、システインはシステイン類縁体に任意に置換される。
【０１５３】
【表６】
2010534836.tif 000008
表４〜６に記載された各ヘミペプチドは、本発明による反応性ペプチド断片である。したがって、いずれのヘミペプチドもレポーターオリゴヌクレオチド配列に結合することができる。同様に、表４〜６に記載されたペプチドもまた、レポーターオリゴヌクレオチド配列に結合することができる。ヘミペプチド−レポーターオリゴヌクレオチド配列ならびにペプチド−レポーターオリゴヌクレオチド配列は、アンチジップ配列に任意にさらに結合される。
【０１５４】
一実施形態において、本発明は、第一のレポーターオリゴヌクレオチド配列に結合した表４〜６に記載された第一のヘミペプチド対のメンバーを含んでなる第一のリガンド−レポーターアセンブリ、および第二のレポーターオリゴヌクレオチド配列に結合した対応するヘミペプチド対のメンバーを含んでなる第二のリガンド−レポーターアセンブリを含んでなるキットを提供し、第一および第二のレポーターオリゴヌクレオチド配列は、互いに十分相補性であってハイブリダイズし、約８℃から約２５℃のＴｍを有する。各リガンド−レポーターアセンブリは、ジップまたはアンチジップオリゴヌクレオチド配列、スペーサーオリゴヌクレオチド配列、および生物学的標的に対して結合親和性を有する結合部分から選択される１つまたは複数の追加成分を任意に含んでなり得る。
【０１５５】
リガンド−レポーターアセンブリは単一分子であり得る。あるいは、リガンドレポーターアセンブリは、機能的プローブを作り出すために互いに非共有結合している２つ以上の成分（例えば、レポーター成分と標的結合性成分）を含んでなり得る。一定の実施形態において、各プローブ成分は、１つのアンチジップオリゴヌクレオチド配列を含んでなるが、結合性部分を欠いている。一定の実施形態において、各プローブ成分は、異なるアンチジップオリゴヌクレオチド配列を含んでなるが、結合性部分を欠いている。
【０１５６】
一定の実施形態において、前記キットは、ジップオリゴヌクレオチド配列に共有結合または非共有結合している生物学的標的に対して結合親和性を有する結合性部分を含んでなる１つまたは複数の結合性成分をさらに含んでなり、前記ジップオリゴヌクレオチド配列は、第一または第二のレポーター成分上に存在するアンチジップオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズする。前記キットは、第一および第二のレポーター成分ならびに第一および第二の標的結合性成分を任意にさらに含んでなることができ、前記第一の標的結合性成分のジップ配列は、前記第一のレポーター成分のアンチジップ配列にハイブリダイズし；前記第二の標的結合性成分のジップ配列は、前記第二のレポーター成分のアンチジップ配列にハイブリダイズする。
【０１５７】
前記キットは、ヘミペプチド対の２つのメンバーにより形成されたエピトープ検出用の検出成分を任意に含んでなる。一実施形態において、ヘミペプチド対は表４における対の１つであり、検出試薬は抗Ｔ７抗体である。別の実施形態において、ヘミペプチド対は表５における対の１つであり、検出試薬はストレプトアクチンまたはストレプトアビジンである。別の実施形態において、ヘミペプチド対は表６における対の１つであり、検出試薬は、Ｓ−１５により活性化される変異リボヌクレアーゼおよび検出可能なリボヌクレアーゼ基質である。一定の実施形態において、前記キットは、ＤＣＳによって生成した反応生成物の各分子に対して複数の検出可能部分を生成するための増幅成分をさらに含んでなる。
実施例１５：ＮＣＬを用いたＡ４３１細胞におけるＥＧＦＲホモ二量体の検出
Ａ４３１細胞の接着培養物を１６時間、血清飢餓状態にした。細胞をトリプシンによりプレートから分離し、受容体の二量体化を誘導するために、細胞懸濁液をＡＧ１４７８（１μＭ）により３７℃で５分間、次いで氷上でＥＧＦ（２００ｎｇ／ｍＬ）により１５分間処理した。細胞懸濁液を氷上、ＰＢＳ中の２％ホルムアルデヒドにより３０分間固定した。固定した細胞を２％のＢＳＡ、５％の硫酸デキストラン、１０μＭのｔＲＮＡ、および１００μｇ／ｍＬのヤギＩｇＧを含有する５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６と共に、氷上で１時間ブロックした。次いで細胞を、ブロック用緩衝液中、抗体ジップコード結合体（ｅｇｆｒ１−ジップ２およびｅｇｆｒ１−ジップ５、各５μｇ／ｍＬ）およびアンチジップ２＿１０量体レポーター（６０ｎＭ）を含有するアンチジップコード２＿Ｔ７＿ｐ１チオエステルと共に室温でインキュベートした。非特異的シグナルを判定するための対照サンプルは、双方の、または単独の抗体結合体を除外したものを含んだ。細胞を遠心分離し、上澄み液をデカントした。次いで細胞を、アンチジップ５＿１０量体レポーター配列またはアンチジップ５＿１ｍｉｓレポーター配列のいずれかを含有するアンチジップコード５＿Ｔ７＿ｐ２Ｃｙｓを含有するブロック用緩衝液中に懸濁し、室温で３０分間インキュベートした。ＤＰＣ反応の生成物として形成された完全Ｔ７Ｃｙｓ置換ペプチドを、先ずＨＲＰに結合させたウサギ抗Ｔ７抗体との結合、次いでＡｌｅｘａ５６８に結合させたヤギ抗ウサギＩｇＧとの結合により検出した。
【０１５８】
ＥＧＦＲホモ二量体に対するこの天然化学連結ＤＰＣアッセイによって染色した細胞を、フローサイトメトリーにより分析した。このアッセイの結果は図３４に示してあり、ここでＭＦＩは、対照およびＤＰＣサンプルの各々に関してプロットしてある。アンチジップ５＿１０量体レポーター配列を含有するアンチジップ５＿Ｔ７＿ｐ２Ｃｙｓを含有するサンプル、双方の抗体結合体を含有するＤＰＣサンプルは、単一の抗体結合体を含有する対照以上のシグナルを生じなかった。対照的に、アンチジップ５＿１ｍｉｓレポーター配列を含有するアンチジップ５＿Ｔ７＿ｐ２−ＣｙｓによるＤＰＣ反応によって染色した細胞は、対応する対照サンプルのいずれよりも有意に高いシグナルを生じた。
実施例１６：アミド結合アイソスターを含有するＴ７ペプチドの形成に有用なＴ７修飾ヘミペプチドの合成
（ｉ）アンチジップ２  Ｔ７ｐ１  Ｓ（Ｅｔ３ＭＰ）に関する代替合成経路
【０１５９】
【化２】
2010534836.tif 000009
アンチジップ２＿Ｔ７＿ｐ１−Ｓ（Ｅｔ３ＭＰ）
アンチジップ２＿Ｔ７ｐ１−ＯＨ（１０．５ｎｍｏｌ）を５μＬの水に溶解し、４５μＬのＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）で希釈した。上記の溶液、ジイソプロピルカルボジイミド（５．２１ｍｇ、２５μｍｏｌ）および２０μＬのＮＭＰに溶解した４−ジメチルアミノピリジン（０．３３ｍｇ、２．７μｍｏｌ）を加え、引き続き５μＬ（３９μｍｏｌ）のエチル３−メルカプトプロピオネートを加えた。反応混合物を室温で１５時間攪拌し、７５μＬの水でクウェンチした。反応混合物をＮＡＰ５カラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）上に充填した。生成物を７００μＬのＴＥＡＡ緩衝液（０．０５Ｍ、ｐＨ５．５）により溶出させ、ＴＥＡＡ系（溶媒Ａ、０．０５ＭのＴＥＡＡ、ｐＨ５．５；溶媒Ｂ、アセトニトリル；溶媒Ｂの勾配は４〜１４分間に１０％から４０％へと増加）。１２．４分の時点でのフラクションを回収して、３．３ｎｍｏｌのアンチジップ２＿Ｔ７ｐ１−Ｓ（Ｅｔ３ＭＰ）を得た。
（ｉｉ）アンチジップ５＿Ｔ７＿ｐ２−ＭＡの合成
【０１６０】
【化３】
2010534836.tif 000010
（ＭＡ）２−ＱＱＭＧ−Ｅｄａ−Ａｏａ（配列番号８３）
最後の結合を除き、Ｃ末端ヘミペプチドＧＱＱＭＧ（Ｔ７−ｐ２）（配列番号６）と同様にペプチドを合成した。Ｎ末端にグリシンの代わりにメルカプトアセテートのジスルフィド型を置くためにジチオグリコール酸を用いた。ＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ２Ｏ（９４：３：３）により樹脂からペプチドを開裂させ、精製せずに使用した。
（ＭＡ）２−Ｔ７ｐ２−アンチジップ５
１００μＬの酢酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ４．８）中、アンチジップ５−ＣＨＯ（２０ｎｍｏｌ）および（ＭＡ）２−ＱＱＭＧ−Ｅｄａ−Ａｏａ（１．１２ｍｇ）（配列番号８３）を、室温で４時間攪拌した。反応混合物を１００μＬのＴＥＡＡ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７）により希釈し、ＮＡＰ５カラム上に充填した。精製物を、７００μＬのＴＥＡＡ緩衝液で溶出させ、ＴＥＡＡ系（溶媒Ａ、０．１ＭのＴＥＡＡ、ｐＨ７；溶媒Ｂ、アセトニトリル；溶媒Ｂの勾配は４〜１４分間に１０％から４０％へと増加）を用いＨＰＬＣで精製した。９．８分の時点でのフラクションを回収して、１２．２ｎｍｏｌ（６１％）のアンチジップ５＿Ｔ７＿ｐ２−（ＭＡ）２を得た。
【０１６１】
アンチジップ５＿Ｔ７＿ｐ２−ＭＡストック溶液の調製：水中、アンチジップ５＿Ｔ７＿ｐ２−（ＭＡ）２（９μＬ、１００μＭ）の溶液に、水中ＴＣＥＰ・ＨＣｌ（１μＬ、１００ｍＭ）の溶液を加えた。使用前にサンプル溶液を室温で１時間攪拌するか、または１ヶ月まで−８０℃で保存した。
【０１６２】
アンチジップ５＿Ｔ７＿ｐ２−ＭＡとアンチジップ２＿Ｔ７＿ｐ１−チオエステルを合わせると、以下のスキームに示されるように、２種のアンチジップレポーターオリゴヌクレオチドに結合した完全変異Ｔ７ペプチド（Ｔ７＿チオエステル）であるアンチジップ２＿Ｔ７＿チオエステル＿アンチジップ５が自然に生成した。
【０１６３】
【化４】
2010534836.tif 000011
アイソスターとしてチオエーテル結合を含有するＴ７ペプチドを生成させるために、代替化学も使用した。この化学においては、一方のヘミペプチドはエチルチオール末端を含有するように修飾し、他方のヘミペプチドはハロアセトアミド部分を含有するように修飾した。これら２種のヘミペプチドは自然に反応して、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ配列を模倣するチオエーテル結合を形成する。
実施例１７：アミド結合アイソスターを含有するＴ７ペプチドの形成を介してＤＮＡ標的を検出するためのＤＰＣの使用
９６ウェルマイクロプレート（Ｐｉｅｒｃｅ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＢＳＡブロック）のウェル（固体支持体）内に固定化したストレプトアビジンを一晩インキュベートすることにより、固定化ＤＮＡ標的配列を調製した。ビオチン−ジップ２およびビオチン−ジップ５の各々２．５ピコモルの混合物を含有する１００μＬのＰＢＳ緩衝液によりウェルを洗浄した。インキュベーション後、２００μＬのＰＢＳ−Ｔで３回、次いで水で１回プレートを洗浄し、風乾した。
【０１６４】
次いで、５％の硫酸デキストランを含有する５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０中、０．０５μＭのアンチジップ２＿Ｔ７＿ｐ１−Ｓ（Ｅｔ３ＭＰ）と共にウェルをインキュベートした。次いでウェルを、リン酸ナトリウム／硫酸デキストラン緩衝液により洗浄してから、同じ緩衝液中の（ＭＡ）２−Ｔ７ｐ２−アンチジップ５またはアンチジップ５＿Ｔ７＿ｐ２＿Ｃｙｓのいずれかをウェルに加えた。次いで各ウェルにＰＢＳ−Ｔ緩衝液中、０．０１μＭのマウス抗Ｔ７抗体アルカリホスファターゼ結合体（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ）１００μＬを加えた。ウェルを２５℃で３０分間インキュベートしてから、２００μＬのＰＢＳ−Ｔ緩衝液で４回洗浄した。Ａｔｔｏｐｈｏｓ検出用溶液（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）により反応混合物を発現させ、実施例１３に記載されたように、蛍光発現の動態をモニターした。結果は図３５にまとめてある。
【０１６５】
結果としてＴ７チオエステルペプチド（チオエステルと表されている）が形成され、対応するＴ７−Ｃｙｓペプチド（ＮＣＬと表されている）よりもわずかに低いレベルで検出されたことを図３５は実証している。標的またはいずれかのＴ７ヘミペプチドアンチジップ分子を欠いた陰性対照は、低いバックグラウンド値を示した。
文献の援用
本明細書に引用した刊行物および特許文書各々の全開示は、各々個々の刊行物または特許文書が個々に表されたのと同じ程度に、全ての目的のためにその全体が参照として援用されている。
等価物
本発明は、本発明の意図または基本的な性格を逸脱することなく、他の特定の形態に具体化できる。したがって前述の実施形態は全てに関して、本明細書に記載した本発明を限定するものではなく例示と考えるべきである。したがって本発明の範囲は、前述の説明によるのではなく、添付の請求項によって示され、また請求項の等価物の意味および範囲内に入る変更は全てそれらに包含されることが意図されている。
【図１】
2010534836.tif 000012
【図２】
2010534836.tif 000013
【図３−１】
2010534836.tif 000014
【図３−２】
2010534836.tif 000015
【図４】
2010534836.tif 000016
【図５−１】
2010534836.tif 000017
【図５−２】
2010534836.tif 000018
【図６】
2010534836.tif 000019
【図７】
2010534836.tif 000020
【図８−１】
2010534836.tif 000021
【図８−２】
2010534836.tif 000022
【図９】
2010534836.tif 000023
【図１０】
2010534836.tif 000024
【図１１】
2010534836.tif 000025
【図１２】
2010534836.tif 000026
【図１３−１】
2010534836.tif 000027
【図１３−２】
2010534836.tif 000028
【図１３−３】
2010534836.tif 000029
【図１４Ａ】
2010534836.tif 000030
【図１４Ｂ】
2010534836.tif 000031
【図１５−１】
2010534836.tif 000032
【図１５−２】
2010534836.tif 000033
【図１６Ａ】
2010534836.tif 000034
【図１６Ｂ】
2010534836.tif 000035
【図１７】
2010534836.tif 000036
【図１８Ａ】
2010534836.tif 000037
【図１８Ｂ】
2010534836.tif 000038
【図１８Ｃ】
2010534836.tif 000039
【図１９】
2010534836.tif 000040
【図２０】
2010534836.tif 000041
【図２１】
2010534836.tif 000042
【図２２】
2010534836.tif 000043
【図２３】
2010534836.tif 000044
【図２４】
2010534836.tif 000045
【図２５】
2010534836.tif 000046
【図２６】
2010534836.tif 000047
【図２７】
2010534836.tif 000048
【図２８Ａ】
2010534836.tif 000049
【図２８Ｂ】
2010534836.tif 000050
【図２８Ｃ】
2010534836.tif 000051
【図２９Ａ】
2010534836.tif 000052
【図２９Ｂ】
2010534836.tif 000053
【図３０Ａ】
2010534836.tif 000054
【図３０Ｂ】
2010534836.tif 000055
【図３０Ｃ】
2010534836.tif 000056
【図３０Ｄ】
2010534836.tif 000057
【図３１】
2010534836.tif 000058
【図３２−１】
2010534836.tif 000059
【図３２−２】
2010534836.tif 000060
【図３３】
2010534836.tif 000061
【図３４】
2010534836.tif 000062
【図３５】
2010534836.tif 000063
【手続補正書】
【提出日】平成22年7月12日(2010.7.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
本発明は、以下の図面からさらに理解することができる。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
サンプル中の生物学的標的の存在および／または量を判定する方法であって：
（ａ）（１）（ｉ）上記生物学的標的に対して結合親和性を有する第一の結合性部分と、（ｉｉ）第一のオリゴヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）上記第一のオリゴヌクレオチド配列と結合した第一の生成物前駆体とを含んでなる第一のプローブと、（２）（ｉ）上記生物学的標的に対して結合親和力を有する第二の結合性部分と、（ｉｉ）上記第一のオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズできる第二のオリゴヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）上記第二のオリゴヌクレオチド配列と結合した第二の生成物前駆体とを含んでなる第二のプローブと、上記サンプルとを合わせることであって、上記生物学的標的が上記サンプル中に存在する場合、上記第一および第二の結合性部分の双方を上記生物学的標的に結合させ、その際、上記第一および第二のオリゴヌクレオチド配列が互いにハイブリダイズして、上記第一および第二の生成物前駆体を互いに反応性に近接させ、完全エピトープ、酵素基質、酵素活性化物質、およびリガンドよりなる群から選択される反応生成物を生成させる条件下で、上記サンプルを上記第一および第二のプローブと合わせること；
（ｂ）ステップ（ａ）の反応生成物が存在する場合、複数の検出可能な部分を生成させる条件下で増幅成分と検出成分とを含んでなる検出システムに上記反応生成物を曝露させること；および
（ｃ）ステップ（ｂ）において生成した検出可能な部分の存在および／または量を判定し、それによってサンプル中の生物学的標的の存在および／または量を判定すること、
を含んでなる方法。
（項目２）
ステップ（ａ）において、上記第一の結合性部分が、上記第一のオリゴヌクレオチド配列に共有結合している項目１に記載の方法。
（項目３）
ステップ（ａ）において、上記第二の結合性部分が、上記第二のオリゴヌクレオチド配列に共有結合している項目２に記載の方法。
（項目４）
ステップ（ａ）において、上記第一の結合性部分が、上記第一のオリゴヌクレオチド配列に非共有結合している項目１に記載の方法。
（項目５）
アンチジップコード配列にハイブリダイズしたジップコード配列を介して、上記第一の結合性部分が、上記第一のオリゴヌクレオチド配列に非共有結合している項目４に記載の方法。
（項目６）
ステップ（ａ）において、上記第二の結合性部分が、上記第二のオリゴヌクレオチド配列に非共有結合している項目４または５に記載の方法。
（項目７）
アンチジップコード配列にハイブリダイズしたジップコード配列を介して、上記第二の結合性部分が、上記第二のオリゴヌクレオチド配列に非共有結合している項目６に記載の方法。
（項目８）
サンプル中の生物学的標的の存在および／または量を判定する方法であって：
（ａ）（ｉ）上記生物学的標的に対して結合親和性を有する第一の結合性部分と、（ｉｉ）第一のオリゴヌクレオチドのジップコード配列と、を含んでなる第一の標的結合性成分を提供すること；
（ｂ）（ｉ）上記生物学的標的に対して結合親和性を有する第二の結合性部分と、（ｉｉ）第二のオリゴヌクレオチドのジップコード配列と、を含んでなる第二の標的結合性成分を提供すること；
（ｃ）（ｉ）上記第一のオリゴヌクレオチドのジップコード配列にハイブリダイズできる第一のオリゴヌクレオチドのアンチジップコード配列と、（ｉｉ）第一のレポーターオリゴヌクレオチドと、（ｉｉｉ）上記第一のレポーターオリゴヌクレオチドと結合した第一の生成物前駆体と、を含んでなる第一のレポーター成分を提供すること；
（ｄ）（ｉ）上記第二のオリゴヌクレオチドのジップコード配列にハイブリダイズできる第二のオリゴヌクレオチドのアンチジップコード配列と、（ｉｉ）上記第一のレポーターオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズできる第二のレポーターオリゴヌクレオチドと、（ｉｉｉ）上記第二のレポーターオリゴヌクレオチド配列と結合しており、上記第一の生成物前駆体と反応性に近接させると、上記第一の生成物前駆体と反応できる第二の生成物前駆体と、を含んでなる第二のレポーター成分を提供すること；
（ｅ）上記生物学的標的がサンプル中に存在する場合、上記第一および第二の結合性部分が上記生物学的標的に結合し、その際（ｉ）上記第一のジップコード配列が、上記第一のオリゴヌクレオチドのアンチジップコード配列にハイブリダイズし、（ｉｉ）上記第二のオリゴヌクレオチドのジップコード配列が、上記第二のオリゴヌクレオチドのアンチジップコード配列にハイブリダイズし、（ｉｉｉ）上記第二のレポーターオリゴヌクレオチドを、上記第一のレポーターオリゴヌクレオチドにハイブリダイズして、上記第一および第二の生成物前駆体を反応性に近接させて反応生成物を生成させるような条件下で、上記第一の標的結合性成分と、上記第二の標的結合性成分と、上記第一のレポーター成分と、上記第二のレポーター成分とを上記サンプルと合わせること；
（ｆ）ステップ（ｅ）の反応生成物が存在する場合、複数の検出可能な部分を生成させる条件下で増幅成分と検出成分とを含んでなる検出システムに上記反応生成物を曝露させること；および
（ｇ）検出可能な部分の存在および／または量を判定し、それによって上記サンプル中の生物学的標的の存在および／または量を判定すること；
を含んでなる方法。
（項目９）
ステップ（ｅ）において、上記第一の標的結合性成分と、上記第二の標的結合性成分と、上記第一のレポーター成分と、上記第二のレポーター成分とを、全て同時に上記サンプルと合わせる項目８に記載の方法。
（項目１０）
ステップ（ｅ）において、上記第一のレポーター成分および上記第二のレポーター成分
の前に、上記第一の標的結合性成分と上記第二の標的結合性成分とを上記サンプルに加える項目８に記載の方法。
（項目１１）
上記増幅成分が、検出可能性部分の生成を触媒する酵素を含んでなる項目１から１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
上記増幅成分が、上記反応生成物１分子当り少なくとも１０分子の上記検出可能な部分を生成させることができる項目１から１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
上記増幅成分が、上記反応生成物１分子当り少なくとも１００分子の上記検出可能な部分を生成させることができる項目１２に記載の方法。
（項目１４）
上記増幅成分が、上記反応生成物１分子当り少なくとも１，０００分子の上記検出可能な部分を生成させることができる項目１３に記載の方法。
（項目１５）
上記反応生成物が、ペプチドまたはタンパク質である項目１から１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
上記反応生成物が、図１５に掲げられたペプチド類から選択されるペプチジル配列を含んでなる項目１５に記載の方法。
（項目１７）
上記反応生成物が小型分子である項目１から１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
上記反応生成物が、色素、抗生物質、酵素補因子、酵素阻害剤、殺虫剤、薬物、毒素、蛍光体、発色団、ホルモン、炭水化物または脂質である項目１から１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
上記生物学的標的が、タンパク質、ペプチド、免疫グロブリン、成長因子受容体または酵素である項目１から１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
上記生物学的標的が、ホモ二量体タンパク質である項目１から１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
上記生物学的標的が、ヘテロ二量体タンパク質である項目１から１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
上記生物学的標的が、Ｂｃｒ−Ａｂ１のヘテロ二量体、ＥｒｂＢファミリーのホモ二量体、ＥｒｂＢファミリーのヘテロ二量体、およびＰＤＧＦよりなる群から選択される項目１から１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
上記生物学的標的が核酸である項目１から１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
上記核酸が、ＤＮＡまたはＲＮＡである項目２３に記載の方法。
（項目２５）
上記第一および第二の結合性部分が同一である項目１から２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
上記第一および第二の結合性部分が異なっている項目１から２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
上記第一および第二の結合性部分の各々が、上記生物学的標的により規定された別個の結合部位に結合する項目２６に記載の方法。
（項目２８）
第一の結合性部分、第二の結合性部分または上記第一および第二の結合性部分の各々が抗体である項目１から２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
上記第一の生成物前駆体および上記第二の生成物前駆体が、追加の試薬の存在下で互いに反応する項目１から２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
上記第一の生成物前駆体が上記第二の生成物前駆体と自発的に反応して上記反応生成物を生成する項目１から２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
上記反応が、天然の化学的連結によって生じる項目３０に記載の方法。
（項目３２）
Ｃ−末端チオエステルを含有する第一の前駆体ペプチドとＮ−末端システインを含有する第二の前駆体ペプチドとの間の反応によって、ペプチド結合が生成する項目３０または３１に記載の方法。
（項目３３）
Ｃ−末端チオエステルとシステイン以外のＮ−末端チオールとの間の反応によって、ペプチド結合アイソスターが生成する項目３０に記載の方法。
（項目３４）
上記第一および第二のオリゴヌクレオチド配列または上記第一および第二のレポーターオリゴヌクレオチド配列が、約８℃と約２５℃との間の融解温度を有する項目３０から３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
上記融解温度が、約９℃と約２０℃との間である項目３３に記載の方法。
（項目３６）
サンプル中の生物学的標的の存在および／または量を判定する方法であって：
（ａ）（１）（ｉ）上記生物学的標的に対して結合親和性を有する第一の結合性部分と、（ｉｉ）第一のオリゴヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）上記第一のオリゴヌクレオチド配列と結合した第一のマスク化生成物前駆体とを含んでなる第一のプローブと、（２）（ｉ）上記生物学的標的に対して結合親和力を有する第二の結合性部分と、（ｉｉ）上記第一のオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズできる第二のオリゴヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）上記第二のオリゴヌクレオチド配列と結合した非マスク性基とを含んでなる第二のプローブと上記サンプルとを合わせることであって、上記生物学的標的が上記サンプル中に存在する場合、上記第一および第二の結合性部分を上記生物学的標的に結合させ、上記第一および第二のオリゴヌクレオチド配列が互いにハイブリダイズして、上記非マスク性基と上記マスク化生成物前駆体とを反応性に近接させて、非マスク化反応生成物を生成させる条件下で、上記サンプルを上記第一および第二のプローブと合わせること；
（ｂ）ステップ（ａ）の反応生成物が存在する場合、複数の検出可能な部分を生成させる条件下で増幅成分と検出成分とを含んでなる検出システムに上記反応生成物を曝露させること；および
（ｃ）検出可能な部分の存在および／または量を判定し、それによってサンプル中の生物学的標的の存在および／または量を判定すること、
を含んでなる方法。
（項目３７）
上記マスク化生成物前駆体が、マスク化エピトープ、マスク化酵素基質、マスク化酵素活性化物質、またはマスク化リガンドである項目３６に記載の方法。
（項目３８）
上記非マスク化反応生成物が、ペプチドまたはタンパク質である項目３６または３７に
記載の方法。
（項目３９）
上記非マスク化反応生成物が、小型分子である項目３６または３７に記載の方法。
（項目４０）
上記生物学的標的が、タンパク質、ペプチド、免疫グロブリン、成長因子、または酵素である項目３６から３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
上記生物学的標的が、ホモ二量体タンパク質である項目３６から３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
上記生物学的標的が、ヘテロ二量体タンパク質である項目３６から３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
上記生物学的標的が、Ｂｃｒ−Ａｂ１のヘテロ二量体、ＥｒｂＢファミリーのホモ二量体、ＥｒｂＢファミリーのヘテロ二量体、およびＰＤＧＦよりなる群から選択される項目３６から３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
上記生物学的標的が核酸である項目３６から３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目４５）
上記第一の結合性部分、上記第二の結合性部分、または上記第一の結合性部分および上記第二の結合性部分の各々が、抗体である項目３６から４３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４７）
上記第一および第二の結合性部分が同一である項目３６から４３および４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
上記第一および第二の結合性部分が異なっている項目３６から４３および４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目４９）
ステップ（ｂ）の上記増幅成分が、上記検出可能な部分の生成を触媒する酵素を含んでなる項目３６から４７のいずれか一項に記載の方法。
（項目５０）
上記増幅成分が、ステップ（ａ）において生成した反応生成物１分子当り少なくとも１００分子の上記検出可能な部分を生成させることができる項目４８に記載の方法。
（項目５１）
上記酵素が、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、リボヌクレアーゼ、または乳酸デヒドロゲナーゼである項目１１または４９に記載の方法。
（項目５２）
上記サンプルが、組織サンプルまたは体液サンプルである項目１から５０のいずれか一項に記載の方法。
（項目５３）
（ａ）（ｉ）生物学的標的に対して結合親和性を有する第一の結合性部分と、（ｉｉ）上記第一の結合性部分と結合した第一のレポーターオリゴヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）上記第一のレポーターオリゴヌクレオチド配列と結合した第一の生成物前駆体と、を含んでなる第一のプローブと、
（ｂ）（ｉ）上記生物学的標的に対して結合親和性を有する第二の結合性部分と、（ｉｉ）上記第二の結合性部分と結合した第二のレポーターオリゴヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）上記第二のレポーターオリゴヌクレオチド配列と結合した第二の生成物前駆体と、を含んでなり、
上記生物学的標的に対する上記第一および第二の結合性部分の結合の際に、上記第一お
よび第二のレポーターオリゴヌクレオチド配列が、互いにハイブリダイズでき、上記第一および第二の生成物前駆体が互いに反応して、完全エピトープ、酵素基質、酵素活性化物質、およびリガンドよりなる群から選択される反応生成物を生成させることができる第二のプローブと；
（ｃ）複数の検出可能な部分を生成させることができる増幅成分と検出成分とを含んでなる検出システムと；
（ｄ）生物学的標的の検出用キットを使用するための取扱説明書と、
を含んでなるキット。
（項目５４）
第一のプローブが、第一のオリゴヌクレオチドのアンチジップコード配列にハイブリダイズした第一のオリゴヌクレオチドのジップコード配列をさらに含んでなり、第二のプローブが、第二のオリゴヌクレオチドのアンチジップコード配列にハイブリダイズした第二のオリゴヌクレオチドのジップコード配列をさらに含んでなる項目５２に記載のキット。（項目５５）
（ａ）（ｉ）上記生物学的標的に対して結合親和性を有する第一の結合性部分と、（ｉｉ）上記第一の結合性部分と結合した第一のオリゴヌクレオチドのジップコード配列と、を含んでなる第一の標的結合性成分と、
（ｂ）（ｉ）上記生物学的標的に対して結合親和性を有する第二の結合性部分と、（ｉｉ）上記第二の結合性部分と結合した第二のオリゴヌクレオチドのジップコード配列と、を含んでなる第二の標的結合性成分と、
（ｃ）（ｉ）上記第一のオリゴヌクレオチドのジップコード配列にハイブリダイズできる第一のオリゴヌクレオチドのアンチジップコード配列と、（ｉｉ）上記第一のオリゴヌクレオチドのジップコード配列と結合した第一のレポーターオリゴヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）上記第一のレポーターオリゴヌクレオチド配列と結合した第一の生成物前駆体と、を含んでなる第一のレポーター成分と、
（ｄ）（ｉ）上記第二のオリゴヌクレオチドのジップコード配列にハイブリダイズできる第二のオリゴヌクレオチドのアンチジップコード配列と、（ｉｉ）上記第二のオリゴヌクレオチドのジップコード配列と結合しており、上記第一のレポーターオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズできる第二のレポーターオリゴヌクレオチドと、（ｉｉｉ）上記第二のレポーターオリゴヌクレオチド配列と結合した第二の生成物前駆体と、を含んでなり、
上記生物学的標的に対する上記第一および第二の結合性部分の結合、上記第一のジップコードのオリゴヌクレオチド配列とアンチジップコードのオリゴヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーション、および上記第二のジップコードのオリゴヌクレオチド配列とアンチジップコードのオリゴヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションの際に、上記第一および第二のレポーターオリゴヌクレオチド配列が、互いにハイブリダイズして、上記第一および第二の生成物前駆体を反応性に近接させ、完全エピトープ、酵素基質、酵素活性化物質、およびリガンドよりなる群から選択される反応生成物を生成させる第二のレポーター成分と；
（ｅ）複数の検出可能な部分を生成させることができる増幅成分と検出成分とを含んでなる検出システムと；
（ｆ）生物学的標的の検出用キットを使用するための取扱説明書と、
を含んでなるキット。
（項目５６）
直接にまたはペプチドリンカーを介して、またはオリゴヌクレオチドリンカーを介して、上記第一の結合性部分が、上記第一のオリゴヌクレオチドのジップコード配列に共有結合しており；
直接にまたはペプチドリンカーを介して、またはオリゴヌクレオチドリンカーを介して、上記第一のレポーターオリゴヌクレオチドが、上記第一のオリゴヌクレオチドのアンチジップコード配列に共有結合している項目５３または５４に記載のキット。
（項目５７）
直接にまたはペプチドリンカーを介して、またはオリゴヌクレオチドリンカーを介して、上記第一の生成物前駆体が、上記第一のレポーターオリゴヌクレオチドに共有結合しており；
直接にまたはペプチドリンカーを介して、またはオリゴヌクレオチドリンカーを介して、上記第二の生成物断片が、上記第二のレポーターオリゴヌクレオチドに共有結合している項目５２から５５のいずれか一項に記載のキット。
（項目５８）
上記検出可能な部分の前駆体をさらに含んでなる項目５２から５６のいずれか一項に記載のキット。
（項目５９）
上記反応生成物が、ＭＡＳＭＴＧＧＱＱＭＧ（配列番号４）、ＭＡＳＭＴＣＧＱＱＭＧ（配列番号３８）、ＭＡＳＭＴＧＣＱＱＭＧ（配列番号３９）、ＭＡＳＭＴＧＧＣＱＭＧ（配列番号４０）、ＭＡＳＭＴＧＧＱＣＭＧ（配列番号４１）、（Ｇ）０−２−ＮＷＣＨＰＱＦＥ−（Ｇ）０−２（配列番号４２）、（Ｇ）０−２−ＮＷＳＣＰＱＦＥ−（Ｇ）０−２（配列番号４３）、（Ｇ）０−２−ＮＷＳＨＣＱＦＥ−（Ｇ）０−２（配列番号４４）、（Ｇ）０−２−ＮＷＳＨＰＣＦＥ−（Ｇ）０−２（配列番号４５）、（Ｇ）０−２−ＮＷＳＨＰＱＦＥ−（Ｇ）０−２（配列番号４６）、ＫＥＴＡＡＡＫＦＣＲＱＨＭＤＳ（配列番号４７）、ＫＥＴＡＡＡＫＦＧＲＱＨＭＤＳ（配列番号４８）、およびＭＡＳＭＴＧ−［ＳＣＨ２Ｃ（Ｏ）］−ＱＱＭＧ（配列番号４９）から選択されるペプチジル配列を含んでなる項目５２から５５のいずれか一項に記載のキット。
（項目６０）
各結合性部分が、上記生物学的標的に直接的または間接的に結合する抗体であり、上記生物学的標的が、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、ＥｒｂＢファミリーのホモ二量体、ＥｒｂＢファミリーのヘテロ二量体、およびＰＤＧＦよりなる群から選択される項目５２から５８のいずれか一項に記載のキット。
（項目６１）
各抗体が、上記生物学的標的に間接的に結合する項目５９に記載のキット。
（項目６２）
２種の追加抗体をさらに含み、それらの各々が、上記生物学的標的に直接的に結合し、上記生物学的標的が、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、ＥｒｂＢファミリーのホモ二量体、ＥｒｂＢファミリーのヘテロ二量体、およびＰＤＧＦよりなる群から選択される項目６０に記載のキット。
（項目６３）
上記第一の結合性部分および上記第二の結合性部分が、異なる抗体である項目５２から６１のいずれか一項に記載のキット。
（項目６４）
ＭＡＳＭＴＣＧＱＱＭＧ（配列番号３８）、ＭＡＳＭＴ−チオエステル（配列番号５０）、ＭＡＳＭＴＧＣＱＱＭＧ（配列番号３９）、ＭＡＳＭＴＧ−チオエステル（配列番号５）、ＭＡＳＭＴＧＧＣＱＭＧ（配列番号４０）、ＭＡＳＭＴＧＧ−チオエステル（配列番号５１）、ＭＡＳＭＴＧＧＱＣＭＧ（配列番号４１）、ＭＡＳＭＴＧＧＱ−チオエステル（配列番号５２）、（Ｇ）０−２−ＮＷＣＨＰＱＦＥ−（Ｇ）０−２（配列番号４２）、（Ｇ）０−２−ＮＷ−チオエステル（配列番号５３）、（Ｇ）０−２−ＮＷＳＣＰＱＦＥ−（Ｇ）０−２（配列番号４３）、（Ｇ）０−２−ＮＷＳ−チオエステル（配列番号５４）、（Ｇ）０−２−ＮＷＳＨＣＱＦＥ−（Ｇ）０−２（配列番号４４）、（Ｇ）０−２−ＮＷＳＨ−チオエステル（配列番号５５）、（Ｇ）０−２−ＮＷＳＨＰＣＦＥ−（Ｇ）０−２（配列番号４５）、（Ｇ）０−２−ＮＷＳＨＰ−チオエステル（配列番号５６）、ＫＥＴＡＡＡＫＦＣＲＱＨＭＤＳ（配列番号４７）、ＫＥＴＡＡＡＫＦ−チオエステル（配列番号５７）、ＣＧＱＱＭＧ（配列番号５８）、ＣＨＰＱＦＥ−（Ｇ）０−２（配列番号５９）、ＣＰＱＦＥ−（Ｇ）０−２（配列番号６０）、ＣＲＱＨＭＤＳ（配列番号６１
）、およびＭＡＳＭＴＧ−［ＳＣＨ２Ｃ（Ｏ）］−ＱＱＭＧ（配列番号４９）よりなる群から選択されるペプチジル部分を含んでなり、上記チオエステルは、ＲがＣ−末端チオエステルを含有するペプチドとＮ−末端システインを含有するペプチドとの間でのペプチド結合の形成を妨げない任意の部分である式−Ｃ（Ｏ）−Ｓ−Ｒを有する分子。
（項目６５）
Ｒが、Ｃ１〜Ｃ６直鎖状または分枝状アルキルである項目６３に記載の分子。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の生物学的標的の存在および／または量を判定する方法であって：
（ａ）（１）（ｉ）前記生物学的標的に対して結合親和性を有する第一の結合性部分と、（ｉｉ）第一のオリゴヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）前記第一のオリゴヌクレオチド配列と結合した第一の生成物前駆体とを含んでなる第一のプローブと、（２）（ｉ）前記生物学的標的に対して結合親和力を有する第二の結合性部分と、（ｉｉ）前記第一のオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズできる第二のオリゴヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）前記第二のオリゴヌクレオチド配列と結合した第二の生成物前駆体とを含んでなる第二のプローブと、前記サンプルとを合わせることであって、前記生物学的標的が前記サンプル中に存在する場合、前記第一および第二の結合性部分の双方を前記生物学的標的に結合させ、その際、前記第一および第二のオリゴヌクレオチド配列が互いにハイブリダイズして、前記第一および第二の生成物前駆体を互いに反応性に近接させ、完全エピトープ、酵素基質、酵素活性化物質、およびリガンドよりなる群から選択される反応生成物を生成させる条件下で、前記サンプルを前記第一および第二のプローブと合わせること；
（ｂ）ステップ（ａ）の反応生成物が存在する場合、複数の検出可能な部分を生成させる条件下で増幅成分と検出成分とを含んでなる検出システムに前記反応生成物を曝露させること；および
（ｃ）ステップ（ｂ）において生成した検出可能な部分の存在および／または量を判定し、それによってサンプル中の生物学的標的の存在および／または量を判定すること、
を含んでなる方法。
【請求項２】
ステップ（ａ）において、前記第一の結合性部分が、前記第一のオリゴヌクレオチド配列に共有結合している請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ａ）において、前記第二の結合性部分が、前記第二のオリゴヌクレオチド配列に共有結合している請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ａ）において、前記第一の結合性部分が、前記第一のオリゴヌクレオチド配列に非共有結合している請求項１に記載の方法。
【請求項５】
アンチジップコード配列にハイブリダイズしたジップコード配列を介して、前記第一の結合性部分が、前記第一のオリゴヌクレオチド配列に非共有結合している請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ａ）において、前記第二の結合性部分が、前記第二のオリゴヌクレオチド配列に非共有結合している請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
アンチジップコード配列にハイブリダイズしたジップコード配列を介して、前記第二の
結合性部分が、前記第二のオリゴヌクレオチド配列に非共有結合している請求項６に記載の方法。
【請求項８】
サンプル中の生物学的標的の存在および／または量を判定する方法であって：
（ａ）（ｉ）前記生物学的標的に対して結合親和性を有する第一の結合性部分と、（ｉｉ）第一のオリゴヌクレオチドのジップコード配列と、を含んでなる第一の標的結合性成分を提供すること；
（ｂ）（ｉ）前記生物学的標的に対して結合親和性を有する第二の結合性部分と、（ｉｉ）第二のオリゴヌクレオチドのジップコード配列と、を含んでなる第二の標的結合性成分を提供すること；
（ｃ）（ｉ）前記第一のオリゴヌクレオチドのジップコード配列にハイブリダイズできる第一のオリゴヌクレオチドのアンチジップコード配列と、（ｉｉ）第一のレポーターオリゴヌクレオチドと、（ｉｉｉ）前記第一のレポーターオリゴヌクレオチドと結合した第一の生成物前駆体と、を含んでなる第一のレポーター成分を提供すること；
（ｄ）（ｉ）前記第二のオリゴヌクレオチドのジップコード配列にハイブリダイズできる第二のオリゴヌクレオチドのアンチジップコード配列と、（ｉｉ）前記第一のレポーターオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズできる第二のレポーターオリゴヌクレオチドと、（ｉｉｉ）前記第二のレポーターオリゴヌクレオチド配列と結合しており、前記第一の生成物前駆体と反応性に近接させると、前記第一の生成物前駆体と反応できる第二の生成物前駆体と、を含んでなる第二のレポーター成分を提供すること；
（ｅ）前記生物学的標的がサンプル中に存在する場合、前記第一および第二の結合性部分が前記生物学的標的に結合し、その際（ｉ）前記第一のジップコード配列が、前記第一のオリゴヌクレオチドのアンチジップコード配列にハイブリダイズし、（ｉｉ）前記第二のオリゴヌクレオチドのジップコード配列が、前記第二のオリゴヌクレオチドのアンチジップコード配列にハイブリダイズし、（ｉｉｉ）前記第二のレポーターオリゴヌクレオチドを、前記第一のレポーターオリゴヌクレオチドにハイブリダイズして、前記第一および第二の生成物前駆体を反応性に近接させて反応生成物を生成させるような条件下で、前記第一の標的結合性成分と、前記第二の標的結合性成分と、前記第一のレポーター成分と、前記第二のレポーター成分とを前記サンプルと合わせること；
（ｆ）ステップ（ｅ）の反応生成物が存在する場合、複数の検出可能な部分を生成させる条件下で増幅成分と検出成分とを含んでなる検出システムに前記反応生成物を曝露させること；および
（ｇ）検出可能な部分の存在および／または量を判定し、それによって前記サンプル中の生物学的標的の存在および／または量を判定すること；
を含んでなる方法。
【請求項９】
ステップ（ｅ）において、前記第一の標的結合性成分と、前記第二の標的結合性成分と、前記第一のレポーター成分と、前記第二のレポーター成分とを、全て同時に前記サンプルと合わせる請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｅ）において、前記第一のレポーター成分および前記第二のレポーター成分の前に、前記第一の標的結合性成分と前記第二の標的結合性成分とを前記サンプルに加える請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記増幅成分が、検出可能性部分の生成を触媒する酵素を含んでなる請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記増幅成分が、前記反応生成物１分子当り少なくとも１０分子の前記検出可能な部分を生成させることができる請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記増幅成分が、前記反応生成物１分子当り少なくとも１００分子の前記検出可能な部分を生成させることができる請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記増幅成分が、前記反応生成物１分子当り少なくとも１，０００分子の前記検出可能な部分を生成させることができる請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記反応生成物が、ペプチドまたはタンパク質である請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記反応生成物が、図１５に掲げられたペプチド類から選択されるペプチジル配列を含んでなる請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記反応生成物が小型分子である請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記反応生成物が、色素、抗生物質、酵素補因子、酵素阻害剤、殺虫剤、薬物、毒素、蛍光体、発色団、ホルモン、炭水化物または脂質である請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記生物学的標的が、タンパク質、ペプチド、免疫グロブリン、成長因子受容体または酵素である請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記生物学的標的が、ホモ二量体タンパク質である請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記生物学的標的が、ヘテロ二量体タンパク質である請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記生物学的標的が、Ｂｃｒ−Ａｂ１のヘテロ二量体、ＥｒｂＢファミリーのホモ二量体、ＥｒｂＢファミリーのヘテロ二量体、およびＰＤＧＦよりなる群から選択される請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記生物学的標的が核酸である請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記核酸が、ＤＮＡまたはＲＮＡである請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記第一および第二の結合性部分が同一である請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記第一および第二の結合性部分が異なっている請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記第一および第二の結合性部分の各々が、前記生物学的標的により規定された別個の結合部位に結合する請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
第一の結合性部分、第二の結合性部分または前記第一および第二の結合性部分の各々が抗体である請求項１から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記第一の生成物前駆体および前記第二の生成物前駆体が、追加の試薬の存在下で互いに反応する請求項１から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記第一の生成物前駆体が前記第二の生成物前駆体と自発的に反応して前記反応生成物を生成する請求項１から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記反応が、天然の化学的連結によって生じる請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
Ｃ−末端チオエステルを含有する第一の前駆体ペプチドとＮ−末端システインを含有する第二の前駆体ペプチドとの間の反応によって、ペプチド結合が生成する請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
Ｃ−末端チオエステルとシステイン以外のＮ−末端チオールとの間の反応によって、ペプチド結合アイソスターが生成する請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記第一および第二のオリゴヌクレオチド配列または前記第一および第二のレポーターオリゴヌクレオチド配列が、約８℃と約２５℃との間の融解温度を有する請求項３０から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記融解温度が、約９℃と約２０℃との間である請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
サンプル中の生物学的標的の存在および／または量を判定する方法であって：
（ａ）（１）（ｉ）前記生物学的標的に対して結合親和性を有する第一の結合性部分と、（ｉｉ）第一のオリゴヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）前記第一のオリゴヌクレオチド配列と結合した第一のマスク化生成物前駆体とを含んでなる第一のプローブと、（２）（ｉ）前記生物学的標的に対して結合親和力を有する第二の結合性部分と、（ｉｉ）前記第一のオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズできる第二のオリゴヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）前記第二のオリゴヌクレオチド配列と結合した非マスク性基とを含んでなる第二のプローブと前記サンプルとを合わせることであって、前記生物学的標的が前記サンプル中に存在する場合、前記第一および第二の結合性部分を前記生物学的標的に結合させ、前記第一および第二のオリゴヌクレオチド配列が互いにハイブリダイズして、前記非マスク性基と前記マスク化生成物前駆体とを反応性に近接させて、非マスク化反応生成物を生成させる条件下で、前記サンプルを前記第一および第二のプローブと合わせること；
（ｂ）ステップ（ａ）の反応生成物が存在する場合、複数の検出可能な部分を生成させる条件下で増幅成分と検出成分とを含んでなる検出システムに前記反応生成物を曝露させること；および
（ｃ）検出可能な部分の存在および／または量を判定し、それによってサンプル中の生物学的標的の存在および／または量を判定すること、
を含んでなる方法。
【請求項３７】
前記マスク化生成物前駆体が、マスク化エピトープ、マスク化酵素基質、マスク化酵素活性化物質、またはマスク化リガンドである請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記非マスク化反応生成物が、ペプチドまたはタンパク質である請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記非マスク化反応生成物が、小型分子である請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記生物学的標的が、タンパク質、ペプチド、免疫グロブリン、成長因子、または酵素である請求項３６から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記生物学的標的が、ホモ二量体タンパク質である請求項３６から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記生物学的標的が、ヘテロ二量体タンパク質である請求項３６から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記生物学的標的が、Ｂｃｒ−Ａｂ１のヘテロ二量体、ＥｒｂＢファミリーのホモ二量体、ＥｒｂＢファミリーのヘテロ二量体、およびＰＤＧＦよりなる群から選択される請求項３６から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記生物学的標的が核酸である請求項３６から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記第一の結合性部分、前記第二の結合性部分、または前記第一の結合性部分および前記第二の結合性部分の各々が、抗体である請求項３６から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記第一および第二の結合性部分が同一である請求項３６から４３および４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記第一および第二の結合性部分が異なっている請求項３６から４３および４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
ステップ（ｂ）の前記増幅成分が、前記検出可能な部分の生成を触媒する酵素を含んでなる請求項３６から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記増幅成分が、ステップ（ａ）において生成した反応生成物１分子当り少なくとも１００分子の前記検出可能な部分を生成させることができる請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記酵素が、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、リボヌクレアーゼ、または乳酸デヒドロゲナーゼである請求項１１または４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記サンプルが、組織サンプルまたは体液サンプルである請求項１から５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
（ａ）（ｉ）生物学的標的に対して結合親和性を有する第一の結合性部分と、（ｉｉ）前記第一の結合性部分と結合した第一のレポーターオリゴヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）前記第一のレポーターオリゴヌクレオチド配列と結合した第一の生成物前駆体と、を含んでなる第一のプローブと、
（ｂ）（ｉ）前記生物学的標的に対して結合親和性を有する第二の結合性部分と、（ｉｉ）前記第二の結合性部分と結合した第二のレポーターオリゴヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）前記第二のレポーターオリゴヌクレオチド配列と結合した第二の生成物前駆体と、を含んでなり、
前記生物学的標的に対する前記第一および第二の結合性部分の結合の際に、前記第一および第二のレポーターオリゴヌクレオチド配列が、互いにハイブリダイズでき、前記第一および第二の生成物前駆体が互いに反応して、完全エピトープ、酵素基質、酵素活性化物質、およびリガンドよりなる群から選択される反応生成物を生成させることができる第二のプローブと；
（ｃ）複数の検出可能な部分を生成させることができる増幅成分と検出成分とを含んでなる検出システムと；
（ｄ）生物学的標的の検出用キットを使用するための取扱説明書と、
を含んでなるキット。
【請求項５３】
第一のプローブが、第一のオリゴヌクレオチドのアンチジップコード配列にハイブリダイズした第一のオリゴヌクレオチドのジップコード配列をさらに含んでなり、第二のプローブが、第二のオリゴヌクレオチドのアンチジップコード配列にハイブリダイズした第二のオリゴヌクレオチドのジップコード配列をさらに含んでなる請求項５２に記載のキット。
【請求項５４】
（ａ）（ｉ）前記生物学的標的に対して結合親和性を有する第一の結合性部分と、（ｉｉ）前記第一の結合性部分と結合した第一のオリゴヌクレオチドのジップコード配列と、を含んでなる第一の標的結合性成分と、
（ｂ）（ｉ）前記生物学的標的に対して結合親和性を有する第二の結合性部分と、（ｉｉ）前記第二の結合性部分と結合した第二のオリゴヌクレオチドのジップコード配列と、を含んでなる第二の標的結合性成分と、
（ｃ）（ｉ）前記第一のオリゴヌクレオチドのジップコード配列にハイブリダイズできる第一のオリゴヌクレオチドのアンチジップコード配列と、（ｉｉ）前記第一のオリゴヌクレオチドのジップコード配列と結合した第一のレポーターオリゴヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）前記第一のレポーターオリゴヌクレオチド配列と結合した第一の生成物前駆体と、を含んでなる第一のレポーター成分と、
（ｄ）（ｉ）前記第二のオリゴヌクレオチドのジップコード配列にハイブリダイズできる第二のオリゴヌクレオチドのアンチジップコード配列と、（ｉｉ）前記第二のオリゴヌクレオチドのジップコード配列と結合しており、前記第一のレポーターオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズできる第二のレポーターオリゴヌクレオチドと、（ｉｉｉ）前記第二のレポーターオリゴヌクレオチド配列と結合した第二の生成物前駆体と、を含んでなり、
前記生物学的標的に対する前記第一および第二の結合性部分の結合、前記第一のジップコードのオリゴヌクレオチド配列とアンチジップコードのオリゴヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーション、および前記第二のジップコードのオリゴヌクレオチド配列とアンチジップコードのオリゴヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションの際に、前記第一および第二のレポーターオリゴヌクレオチド配列が、互いにハイブリダイズして、前記第一および第二の生成物前駆体を反応性に近接させ、完全エピトープ、酵素基質、酵素活性化物質、およびリガンドよりなる群から選択される反応生成物を生成させる第二のレポーター成分と；
（ｅ）複数の検出可能な部分を生成させることができる増幅成分と検出成分とを含んでなる検出システムと；
（ｆ）生物学的標的の検出用キットを使用するための取扱説明書と、
を含んでなるキット。
【請求項５５】
直接にまたはペプチドリンカーを介して、またはオリゴヌクレオチドリンカーを介して、前記第一の結合性部分が、前記第一のオリゴヌクレオチドのジップコード配列に共有結合しており；
直接にまたはペプチドリンカーを介して、またはオリゴヌクレオチドリンカーを介して、前記第一のレポーターオリゴヌクレオチドが、前記第一のオリゴヌクレオチドのアンチジップコード配列に共有結合している請求項５３または５４に記載のキット。
【請求項５６】
直接にまたはペプチドリンカーを介して、またはオリゴヌクレオチドリンカーを介して、前記第一の生成物前駆体が、前記第一のレポーターオリゴヌクレオチドに共有結合しており；
直接にまたはペプチドリンカーを介して、またはオリゴヌクレオチドリンカーを介して、前記第二の生成物断片が、前記第二のレポーターオリゴヌクレオチドに共有結合している請求項５２から５５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５７】
前記検出可能な部分の前駆体をさらに含んでなる請求項５２から５６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５８】
前記反応生成物が、ＭＡＳＭＴＧＧＱＱＭＧ（配列番号４）、ＭＡＳＭＴＣＧＱＱＭＧ（配列番号３８）、ＭＡＳＭＴＧＣＱＱＭＧ（配列番号３９）、ＭＡＳＭＴＧＧＣＱＭＧ（配列番号４０）、ＭＡＳＭＴＧＧＱＣＭＧ（配列番号４１）、（Ｇ）０−２−ＮＷＣＨＰＱＦＥ−（Ｇ）０−２（配列番号４２）、（Ｇ）０−２−ＮＷＳＣＰＱＦＥ−（Ｇ）０−２（配列番号４３）、（Ｇ）０−２−ＮＷＳＨＣＱＦＥ−（Ｇ）０−２（配列番号４４）、（Ｇ）０−２−ＮＷＳＨＰＣＦＥ−（Ｇ）０−２（配列番号４５）、（Ｇ）０−２−ＮＷＳＨＰＱＦＥ−（Ｇ）０−２（配列番号４６）、ＫＥＴＡＡＡＫＦＣＲＱＨＭＤＳ（配列番号４７）、ＫＥＴＡＡＡＫＦＧＲＱＨＭＤＳ（配列番号４８）、およびＭＡＳＭＴＧ−［ＳＣＨ２Ｃ（Ｏ）］−ＱＱＭＧ（配列番号４９）から選択されるペプチジル配列を含んでなる請求項５２から５５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５９】
各結合性部分が、前記生物学的標的に直接的または間接的に結合する抗体であり、前記生物学的標的が、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、ＥｒｂＢファミリーのホモ二量体、ＥｒｂＢファミリーのヘテロ二量体、およびＰＤＧＦよりなる群から選択される請求項５２から５８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６０】
各抗体が、前記生物学的標的に間接的に結合する請求項５９に記載のキット。
【請求項６１】
２種の追加抗体をさらに含み、それらの各々が、前記生物学的標的に直接的に結合し、前記生物学的標的が、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、ＥｒｂＢファミリーのホモ二量体、ＥｒｂＢファミリーのヘテロ二量体、およびＰＤＧＦよりなる群から選択される請求項６０に記載のキット。
【請求項６２】
前記第一の結合性部分および前記第二の結合性部分が、異なる抗体である請求項５２から６１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６３】
ＭＡＳＭＴＣＧＱＱＭＧ（配列番号３８）、ＭＡＳＭＴ−チオエステル（配列番号５０）、ＭＡＳＭＴＧＣＱＱＭＧ（配列番号３９）、ＭＡＳＭＴＧ−チオエステル（配列番号５）、ＭＡＳＭＴＧＧＣＱＭＧ（配列番号４０）、ＭＡＳＭＴＧＧ−チオエステル（配列番号５１）、ＭＡＳＭＴＧＧＱＣＭＧ（配列番号４１）、ＭＡＳＭＴＧＧＱ−チオエステル（配列番号５２）、（Ｇ）０−２−ＮＷＣＨＰＱＦＥ−（Ｇ）０−２（配列番号４２）、（Ｇ）０−２−ＮＷ−チオエステル（配列番号５３）、（Ｇ）０−２−ＮＷＳＣＰＱＦＥ−（Ｇ）０−２（配列番号４３）、（Ｇ）０−２−ＮＷＳ−チオエステル（配列番号５４）、（Ｇ）０−２−ＮＷＳＨＣＱＦＥ−（Ｇ）０−２（配列番号４４）、（Ｇ）０−２−ＮＷＳＨ−チオエステル（配列番号５５）、（Ｇ）０−２−ＮＷＳＨＰＣＦＥ−（Ｇ）０−２（配列番号４５）、（Ｇ）０−２−ＮＷＳＨＰ−チオエステル（配列番号５６）、ＫＥＴＡＡＡＫＦＣＲＱＨＭＤＳ（配列番号４７）、ＫＥＴＡＡＡＫＦ−チオエステル（配列番号５７）、ＣＧＱＱＭＧ（配列番号５８）、ＣＨＰＱＦＥ−（Ｇ）０−２（配列番号５９）、ＣＰＱＦＥ−（Ｇ）０−２（配列番号６０）、ＣＲＱＨＭＤＳ（配列番号６１）、およびＭＡＳＭＴＧ−［ＳＣＨ２Ｃ（Ｏ）］−ＱＱＭＧ（配列番号４９）よりなる群から選択されるペプチジル部分を含んでなり、前記チオエステルは、ＲがＣ−末端チオエステルを含有するペプチドとＮ−末端システインを含有するペプチドとの間でのペプチド結合の形成を妨げない任意の部分である式−Ｃ（Ｏ）−Ｓ−Ｒを有する分子。
【請求項６４】
Ｒが、Ｃ１〜Ｃ６直鎖状または分枝状アルキルである請求項６３に記載の分子。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2010534836000001.app
【国際調査報告】
2010534836.tif 000064
2010534836.tif 000065
2010534836.tif 000066
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2010534836.tif 000068