(57)【要約】フィーダ細胞の必要性をなくすか、あるいは少なくとも減少させる細胞培養培地および培養系を提供する。細胞培養培地は、フィーダ細胞によって正常に分泌および／または産生される１種以上の因子と、ＩＧＦ−Ｉおよびビトロネクチンのタンパク質を含む合成キメラタンパク質とを含む。該細胞培養培地は、特に、ヒト胚性幹細胞および角化細胞を増殖するのに適している。また、本発明は、本発明の細胞培養培地で培養された細胞を利用する組成物および方法にも関する。
2010537626.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培地であって、
（ｉ）インスリン様成長因子（ＩＧＦ）アミノ酸配列およびビトロネクチン（ＶＮ）アミノ酸配列を含む合成キメラタンパク質と、
（ｉｉ）ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、骨形成タンパク質１５（ＢＭＰ−１５）、増殖分化因子９（ＧＤＦ−９）、巨核球コロニー刺激因子、分泌フリッツルド関連タンパク質２、Ｗｎｔ−２ｂ、Ｗｎｔ−１２、成長抑制因子、フェチュイン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、形質転換成長因子−α（ＴＧＦ−α）、ＴＧＦ−β、神経成長因子、血小板由来成長因子−β（ＰＤＧＦ−β）、ＰＣ由来成長因子（プログラヌリン）、インターロイキン（ＩＬ）−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３およびアクチビン−Ａからなる群から選択される１種以上の単離されたフィーダ細胞置換因子とを含み、かつ、
（ｉｉｉ）血清が存在しない、あるいはＩＧＦの不在下において細胞成長をサポートしない非常に少量の血清を含む、細胞培地。
【請求項２】
前記１種以上の単離されたフィーダ細胞置換因子が、ｈＧＨ、ＢＭＰ−１５、ＧＤＰ−９、巨核球コロニー刺激因子、分泌フリッツルド関連タンパク質２、Ｗｎｔ−２ｂ、Ｗｎｔ−１２、成長抑制因子およびアクチビン−Ａからなる群から選択される、請求項１に記載の細胞培地。
【請求項３】
前記１種以上の単離されたフィーダ細胞置換因子がアクチビン−Ａである、請求項１または２に記載の細胞培地。
【請求項４】
前記細胞培地が、さらに、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩおよびラミニンからなる群から選択される１種以上の追加の生物学的に活性なタンパク質を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞培地。
【請求項５】
前記１種以上の追加の生物学的に活性なタンパク質がｂＦＧＦおよびラミニンから選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞培地。
【請求項６】
前記ＩＧＦアミノ酸配列がＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列またはＩＧＦ−ＩＩアミノ酸配列である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の細胞培地。
【請求項７】
前記ＩＧＦアミノ酸配列がＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞培地。
【請求項８】
前記ＶＮアミノ酸配列が成熟ＶＮのアミノ酸残基１〜６４である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の細胞培地。
【請求項９】
前記合成キメラタンパク質が、さらに、１個以上のグリシン残基および１個以上のセリン残基のリンカー配列を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の細胞培地。
【請求項１０】
前記リンカー配列が（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の細胞培地。
【請求項１１】
単離されたＩＧＦ含有複合体をさらに含み、前記ＩＧＦはＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩから選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の細胞培地。
【請求項１２】
前記単離されたＩＧＦ含有複合体中にＩＧＦ−ＩＩが存在する場合、さらにＶＮを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の細胞培地。
【請求項１３】
前記単離されたＩＧＦ含有複合体中にＩＧＦ−Ｉが存在する場合、さらにＩＧＦＢＰおよびＶＮを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の細胞培地。
【請求項１４】
前記ＩＧＦＢＰが、ＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＧＦＢＰ−５およびＩＧＦＢＰ−６からなる群から選択されるＩＧＦＢＰである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の細胞培地。
【請求項１５】
前記ＩＧＦＢＰがＩＧＦＢＰ−３またはＩＧＦＢＰ−５である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の細胞培地。
【請求項１６】
前記各フィーダ細胞置換因子の最終濃度が０．１ｎｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の細胞培地。
【請求項１７】
前記各フィーダ細胞置換因子の最終濃度が約５ｎｇ／ｍｌ〜１５００ｎｇ／ｍｌである、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の細胞培地。
【請求項１８】
前記各フィーダ細胞置換因子の最終濃度が２５ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の細胞培地。
【請求項１９】
前記各フィーダ細胞置換因子の最終濃度が、１５０ｎｇ／ｍｌ〜６００ｎｇ／ｍｌである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の細胞培地。
【請求項２０】
ＩＧＦアミノ酸配列およびＶＮアミノ酸配列を含む約２５０ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌの合成キメラタンパク質と、約５０ｎｇ／ｍｌ〜ｌ００ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦと、約２５ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌのアクチビン−Ａと、約１０μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌのラミニンとを含む胚性幹細胞培地。
【請求項２１】
ＩＧＦアミノ酸配列およびＶＮアミノ酸配列を含む約１０００ｎｇ／ｍｌの前記合成キメラタンパク質と、約１００ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦと、約３５ｎｇ／ｍｌのアクチビン−Ａと、約４０μｇ／ｍｌの前記ラミニンとを含む、請求項２０に記載の胚性幹細胞培地。
【請求項２２】
前記ＩＧＦアミノ酸配列がＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列またはＩＧＦ−ＩＩアミノ酸配列である、請求項２０または２１に記載の胚性幹細胞培養。
【請求項２３】
前記ＩＧＦアミノ酸配列がＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列である、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の胚性幹細胞培地。
【請求項２４】
前記ＶＮアミノ酸配列が成熟ＶＮのアミノ酸残基１〜６４である、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の胚性幹細胞培地。
【請求項２５】
培養容器と、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の細胞培地または請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の胚性幹細胞培地とを含む細胞培養系。
【請求項２６】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の細胞培地、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の胚性幹細胞培地、あるいは請求項２５に記載の培養系において、１個以上の細胞を培養するステップを含む細胞培養方法。
【請求項２７】
前記１個以上の細胞がフィーダ依存性細胞型である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記１個以上の細胞がヒト胚性幹細胞である、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記１個以上の細胞が角化細胞である、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項３０】
請求項２６〜２９のいずれか一項に記載の方法によって産生された１個以上の細胞と、医薬的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項３１】
角化細胞、ヒト胚性幹細胞および角化細胞前駆細胞から選択される１個以上の細胞を含む医薬組成物。
【請求項３２】
前記１個以上の細胞がヒト胚性幹細胞である、請求項３０または３１に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
前記１個以上の細胞が角化細胞である、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
請求項２６〜２９のいずれか一項に記載の方法によって培養された１個以上の細胞を送達する方法であって、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の医薬組成物を個体に送達することにより、前記個体における１個以上の細胞の再生および／または増殖を促進するステップを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養に関する。より詳しくは、本発明は、フィーダ細胞非依存性細胞培養系のための培地、系および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞は、約４〜５日齢の初期段階胚芽である胚盤胞の内部細胞塊（ＩＣＭ）に由来する。ｈＥＳ細胞は、３つの一次胚葉、すなわち、外胚葉、内胚葉および中胚葉を生じさせることができる多能性の細胞型である［非特許文献１，２］。言い換えると、これらの細胞は、分化のために必要な刺激が与えられると、成人体の２００個を超える細胞型に進化する。あるいは、分化の刺激が与えられない場合は、これらの細胞は自己複製し、多能性娘細胞を生じさせる。
【０００３】
これを考慮して、ｈＥＳ細胞の多能性行動は、治療用途、たとえば、パーキンソン病［非特許文献３］、糖尿病［非特許文献４］、または脊髄損傷［非特許文献５］のための細胞および組織を、より効率的に産生するように操作することができると考えられる。しかし、これらの潜在的用途は、単なる移植用の組織の産生を超えるものにまで及ぶ。近年、ｈＥＳ細胞は、新しい薬物および化学薬品［非特許文献６］を試験するための特定の組織型を形成するように操作されている。これらの利点にもかかわらず、ｈＥＳ細胞は、安全な培養方法が確立されるまで治療的に実行可能ではない。
【０００４】
ｈＥＳ細胞の誘導は、１９９８年に始めて成功を収めた［非特許文献１］。Ｔｈｏｍｓｏｎら（１９９８）は、有糸分裂的に不活化されたフィーダ層およびウシ胎児血清（ＦＢＳ）を使用して、ｈＥＳ細胞を増殖するのに成功したと開示した。しかし、ヒトまたは動物血清およびマウスの線維芽細胞のような異種産生物の使用により、ウシ海綿状脳症のような汚染産生物が、培養液に導入される可能性がある［非特許文献７，８］。また、より最近では、これらの動物成分の追加により、これらの条件における細胞成長が、それらの微小環境によって表現型的に操作することができることを示唆する免疫原性剤（たとえば、Ｎ−グリコリルノイラミン酸，Ｎｅｕ５Ａｃ）（Ｍａｒｔｉｎら、２００５、Ｈｅｉｓｋａｎｅｎら、２００７）の導入も実証された。明らかに、ｈＥＳ細胞インビトロ増大のために必要な条件を提供しつつ、ｈＥＳ細胞培養方法の改善を開発することが必要とされる。
【０００５】
このような事情に鑑みて、多くの研究者達は、ヒト包皮線維芽細胞［非特許文献９，１０］およびヒト成人骨髄細胞［非特許文献１１］を始めとするヒトフィーダ細胞の使用について研究している。これらは両方とも、ｈＥＳ細胞の成長をサポートし、これによって動物由来のフィーダ細胞からの汚染の危険性が除かれることが実証されている。しかし、増殖を長引かせた後は、分化および異常核型の割合がより高くなることが研究によって明らかになっている［非特許文献１２，９］。たとえば、細胞遺伝学的分析を受けたｈＥＳ細胞の中には、染色体１７ｑ［非特許文献１３］および２０番染色体トリソミー［非特許文献１４］の増加を含む、異数性［非特許文献１２］を示すものもある。
【０００６】
これに対処するため、多くの研究者達は、畜産物を全く含まないｈＥＳ細胞培養条件を開発することを試みている。特に、Ｘｕら（２００５）は、ｈＥＳ細胞の自己再生のために非常に重要である、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）シグナル伝達を同定し［非特許文献１５］、一方他の研究者達は、形質転換成長因子（ＴＧＦ）−βシグナル伝達経路の調節は、デフォルトによる分化を防止するのに必要であると仮定している。つい最近、Ｌｕｄｗｉｇら（２００６）は、タンパク質と大量の精製ヒト血清アルブミンとの複合混合物を使用して、ｈＥＳ細胞のフィーダのない培養物を成功させたことを実証した［非特許文献１７］。しかし、この研究は、ｈＥＳ細胞を数ヶ月培養すると、４７ＸＸＹ核型が現れた。これは前進には重要なステップであるが、ｈＥＳ細胞の増殖を成功させるためには、ｈＥＳ細胞には、未だ、フィーダ細胞が必要であることが明らかである。興味深いことに、Ｘｕら（２００１）は、マウス胚性線維芽（ＭＥＦ）細胞からの調整培地（ＣＭ）は、ｈＥＳ細胞成長を、それらの正常な核型を維持しつつ、１３０集団倍加までサポートすることができることを実証した［非特許文献１８］。
【０００７】
マウス線維芽フィーダ細胞に依存して樹立および増大する他の細胞型は、初代ヒト角化細胞である。事実、ｈＥＳ細胞の増殖のために使用される多くの培養技術、すなわち、血清およびフィーダ細胞は、角化細胞培養に使用されるものに類似している。初代角化細胞は、それらのインビトロでの未分化増大のために、マウスの線維芽フィーダ細胞に依存することが実証されている（Ｄａｗｓｏｎら、２００６）。
【０００８】
今まで、ｈＥＳ細胞培養においてＭＥＦがどのような機能を持つのかは、未だ理解されていない。しかし、これらのフィーダ細胞が、未分化状態において、ｈＥＳ細胞を維持するのに重要であろう様々なタンパク質、およびおそらく角化細胞を供給することが実証されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．Ａ．，Ｊ．Ｉｔｓｋｏｖｉｔｚ−Ｅｌｄｏｒ，Ｓ．Ｓ．Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｍ．Ａ．Ｗａｋｎｉｔｚ，ＪＪ．Ｓｗｉｅｒｇｉｅｌ，Ｖ．Ｓ．Ｍａｒｓｈａｌｌ，ａｎｄ  Ｊ．Ｍ．Ｊｏｎｅｓ．（１９９８）．Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５−７
【非特許文献２】Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ，Ｂ．Ｅ．，Ｍ．Ｆ．Ｐｅｒａ，ＣＹ．Ｆｏｎｇ，Ａ．Ｔｒｏｕｎｓｏｎ，ａｎｄ  Ａ．Ｂｏｎｇｓｏ．（２０００）．Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ：ｓｏｍａｔｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：３９９−４０４
【非特許文献３】Ｌｅｖｙ，Ｙ．Ｓ．，Ｍ．Ｓｔｒｏｏｍｚａ，Ｅ．Ｍｅｌａｍｅｄ，ａｎｄ  Ｄ．Ｏｆｆｅｎ．（２００４）．Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｄ  ａｄｕｌｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｓ  ａ  ｓｏｕｒｃｅ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊ  ＭｏＩ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２４：３５３−８６
【非特許文献４】Ｔｕｔｔｅｒ，Ａ．Ｖ．，Ｇ．Ａ．Ｂａｌｔｕｓ，ａｎｄ  Ｓ．Ｋａｄａｍ．（２００６）．Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：ａ  ｇｒｅａｔ  ｈｏｐｅ  ｆｏｒ  ａ  ｎｅｗ  ｅｒａ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ９：１６９−７５
【非特許文献５】Ｋｅｉｒｓｔｅａｄ，Ｈ．Ｓ．，Ｇ．Ｎｉｓｔｏｒ，Ｇ．Ｂｅｒｎａｌ，Ｍ．Ｔｏｔｏｉｕ，Ｆ．Ｃｌｏｕｔｉｅｒ，Ｋ．Ｓｈａｒｐ，ａｎｄ  Ｏ．Ｓｔｅｗａｒｄ．（２００５）．Ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ  ｒｅｍｙｅｌｉｎａｔｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｔｏｒｅ  ｌｏｃｏｍｏｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ  ｉｎｊｕｒｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２５：４６９４−７０５
【非特許文献６】Ｒｏｈｗｅｄｅｌ，Ｊ．，Ｋ．Ｇｕａｎ，Ｃ．Ｈｅｇｅｒｔ，ａｎｄ  Ａ．Ｍ．Ｗｏｂｕｓ．（２００１）．Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｓ  ａｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｍｕｔａｇｅｎｉｃｉｔｙ，ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｅｍｂｒｙｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｓｔｕｄｉｅｓ：ｐｒｅｓｅｎｔ  ｓｔａｔｅ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ｌｎ−Ｖｉｔｒｏ  １５：７４１−５３
【非特許文献７】Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｋ．，Ｊ．Ｓ．Ｄｒａｐｅｒ，Ｈ．Ｓ．Ｂａｉｌｌｉｅ，Ｓ．Ｆｉｓｈｅｌ，Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｈ．Ｍｏｏｒｅ，ａｎｄ  Ｐ．Ｗ．Ａｎｄｒｅｗｓ．（２００２）．Ｐｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｓ  ａｎｄ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｓｈｏｗ  ｃｏｍｐａｒａｂｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎｓ．  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２０：３２９−３７
【非特許文献８】Ｓｃｈｉｃｋ，Ｂ．Ｐ．，Ｈ．Ｃ．Ｈｏ，Ｋ．Ｃ．Ｂｒｏｄｂｅｃｋ，ＣＷ．Ｗｒｉｇｌｅｙ，ａｎｄ  Ｊ．Ｋｌｉｍａｓ．（２００３）．Ｓｅｒｇｌｙｃｉｎ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  ａｃｔａ  １５９３：２５９−６７
【非特許文献９】Ａｍｉｔ，Ｍ．，Ｖ．Ｍａｒｇｕｌｅｔｓ，Ｈ．Ｓｅｇｅｖ，Ｋ．Ｓｈａｒｉｋｉ，Ｉ．Ｌａｅｖｓｋｙ，Ｒ．Ｃｏｌｅｍａｎ，ａｎｄ  Ｊ．Ｉｔｓｋｏｖｉｔｚ−Ｅｌｄｏｒ．（２００３）．Ｈｕｍａｎ  ｆｅｅｄｅｒ  ｌａｙｅｒｓ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ６８：２１５０−６
【非特許文献１０】Ｈｏｖａｔｔａ，Ｏ．，Ｍ．Ｍｉｋｋｏｌａ，Ｋ．Ｇｅｒｔｏｗ，Ａ．Ｍ．Ｓｔｒｏｍｂｅｒｇ，Ｊ．Ｉｎｚｕｎｚａ，Ｊ．Ｈｒｅｉｎｓｓｏｎ，Ｂ．Ｒｏｚｅｌｌ，Ｅ．Ｂｌｅｎｎｏｗ，Ｍ．Ａｎｄａｎｇ，ａｎｄ  Ｌ．Ａｈｒｌｕｎｄ−Ｒｉｃｈｔｅｒ．（２００３）．Ａ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｕｓｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｆｏｒｅｓｋｉｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ａｓ  ｆｅｅｄｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｌｌｏｗｓ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  １８：１４０４−９
【非特許文献１１】Ｃｈｅｎｇ，Ｌ．，Ｈ．Ｈａｍｍｏｎｄ，Ｚ．Ｙｅ，Ｘ．Ｚｈａｎ，ａｎｄ  Ｇ．Ｄｒａｖｉｄ．（２００３）．Ｈｕｍａｎ  ａｄｕｌｔ  ｍａｒｒｏｗ  ｃｅｌｌｓ  ｓｕｐｐｏｒｔ  ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２１：１３１−４２
【非特許文献１２】Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，Ｍ．Ｋ．，Ｅ．Ｓ．Ｒｏｓｉｅｒ，ＧＪ．Ｆｉｓｋ，Ｒ．Ｂｒａｎｄｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｘ．Ａｒｅｓ，Ｔ．Ｍｉｕｒａ，Ｍ．Ｌｕｃｅｒｏ，ａｎｄ  Ｍ．Ｓ．Ｒａｏ．（２００４）．Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｆｏｕｒ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｍａｉｎｔａｉｎｅｄ  ｉｎ  ａ  ｆｅｅｄｅｒ−  ｆｒｅｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ２２９：２４３−５８
【非特許文献１３】Ｄｒａｐｅｒ，Ｊ．Ｓ．，Ｋ．Ｓｍｉｔｈ，Ｐ．Ｇｏｋｈａｌｅ，Ｈ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ，Ｅ．Ｍａｌｔｂｙ，Ｊ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｌ．Ｍｅｉｓｎｅｒ，Ｔ．Ｐ．Ｚｗａｋａ，Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ，ａｎｄ  Ｐ．Ｗ．Ａｎｄｒｅｗｓ．（２００４）．Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｇａｉｎ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  １７ｑ  ａｎｄ  １２  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２２：５３−４
【非特許文献１４】Ｒｏｓｉｅｒ，Ｅ．Ｓ．，ＧＪ．Ｆｉｓｋ，Ｘ．Ａｒｅｓ，Ｊ．Ｉｒｖｉｎｇ，Ｔ．Ｍｉｕｒａ，Ｍ．Ｓ．Ｒａｏ，ａｎｄ  Ｍ．Ｋ．Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ．（２００４）．Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｆｅｅｄｅｒ−ｆｒｅｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ２２９：２５９−１  Ａ．
【非特許文献１５】Ｘｕ，Ｃ，Ｅ．Ｒｏｓｉｅｒ，Ｊ．Ｊｉａｎｇ，Ｊ．Ｓ．Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ｄ．Ｇｏｌｄ，Ｃ．Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｋ．Ｄｅｌａｖａｎ−Ｂｏｏｒｓｍａ，Ｍ．Ｍｏｋ，Ａ．Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ，ａｎｄ  Ｍ．Ｋ．Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ．（２００５）．Ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｓｕｐｐｏｒｔｓ  ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２３：３１５−２３
【非特許文献１６】Ｊａｍｅｓ，Ｄ．，Ａ．Ｊ．Ｌｅｖｉｎｅ，Ｄ．Ｂｅｓｓｅｒ，ａｎｄ  Ａ．Ｈｅｍｍａｔｉ−Ｂｒｉｖａｎｌｏｕ．（２００５）．ＴＧＦｂｅｔａ／ａｃｔｉｖｉｎ／ｎｏｄａｌ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｉｓ  ｎｅｃｅｓｓａｒｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３２：１２７３−８２
【非特許文献１７】Ｌｕｄｗｉｇ，Ｔ．Ｅ．，Ｍ．Ｅ．Ｌｅｖｅｎｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｍ．Ｊｏｎｅｓ，Ｗ．Ｔ．Ｂｅｒｇｇｒｅｎ，Ｅ．Ｒ．Ｍｉｔｃｈｅｎ，Ｊ．Ｌ．Ｆｒａｎｅ，ＬＪ．Ｃｒａｎｄａｌｌ，ＣＡ．Ｄａｉｇｈ，Ｋ．Ｒ．Ｃｏｎａｒｄ，Ｍ．Ｓ．Ｐｉｅｋａｒｃｚｙｋ，Ｒ．Ａ．Ｌｉａｎａｓ，ａｎｄ  Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ．（２００６）．Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２４：１８５−７
【非特許文献１８】Ｘｕ，Ｃ，Ｍ．Ｓ．Ｉｎｏｋｕｍａ，Ｊ．Ｄｅｎｈａｍ，Ｋ．Ｇｏｌｄｓ，Ｐ．Ｋｕｎｄｕ，Ｊ．Ｄ．Ｇｏｌｄ，ａｎｄ  Ｍ．Ｋ．Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ．（２００１）．Ｆｅｅｄｅｒ−ｆｒｅｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９：９７１−４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
細胞の増殖および／または繁殖のための成長および条件付け因子を供給するため、細胞の有糸分裂的に不活性なフィーダ層に依存する現在の細胞培養系は、治療用途に厳しい潜在的欠点を有している。特に、異種産生物を使用することにより、汚染、ならびにＢＳＥおよびＨＩＶのような感染病原体を導入するかもしれない。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
したがって、本発明者らは、フィーダ細胞の必要性を取除いた、あるいは少なくとも減らした、新規かつ改良された細胞培養系の必要条件を確認した。さらに、驚くべきことに、本発明者らは、ＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列と、成熟ビトロネクチンのアミノ酸残基１〜６４とを含む合成キメラタンパク質は、細胞培地においてより高い活性を示し、特に、細胞移動および／または増殖を高いレベルに刺激することができることを発見した。
【００１２】
１つの幅広い形態では、本発明は、フィーダ細胞の置換物または交換物として使用するための、１個以上の単離されたフィーダ細胞置換因子を含む、無血清非調整細胞培地に関する。該１個以上の単離されたフィーダ細胞置換因子は、フィーダ依存性細胞の成長を促進するように、フィーダ細胞によって正常に分泌および／または産生される、任意のタンパク質、またはその生物学的に活性なフラグメントが可能であると予想されている。
【００１３】
第一態様で、本発明は、
（ｉ）インスリン様成長因子（ＩＧＦ）アミノ酸配列およびビトロネクチン（ＶＮ）アミノ酸配列を含む合成キメラタンパク質と、
（ｉｉ）ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、骨形成タンパク質１５（ＢＭＰ−１５）、増殖分化因子９（ＧＤＦ−９）、巨核球コロニー刺激因子、分泌フリッツルド関連タンパク質２、Ｗｎｔ−２ｂ、Ｗｎｔ−１２、成長抑制因子、フェチュイン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、形質転換成長因子−α（ＴＧＦ−α）、形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）、神経成長因子、血小板由来成長因子−β（ＰＤＧＦ−β）、ＰＣ由来成長因子（プログラヌリン）、インターロイキン（ＩＬ）−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３およびアクチビン−Ａからなる群から選択される１種以上の単離されたフィーダ細胞置換因子とを含み、
（ｉｉｉ）血清が存在しない、あるいはＩＧＦの不在下では細胞成長をサポートしない非常に少量の血清を含む、細胞培地を提供する。
【００１４】
好ましくは、１種以上の単離されたフィーダ細胞置換因子は、ｈＧＨ、ＢＭＰ−１５、ＧＤＰ−９、巨核球コロニー刺激因子、分泌フリッツルド関連タンパク質２、Ｗｎｔ−２ｂ、Ｗｎｔ−１２、成長抑制因子およびアクチビン−Ａからなる群から選択される。
【００１５】
さらに好ましくは、１種以上の単離されたフィーダ細胞置換因子は、アクチビン−Ａである。
好ましい実施形態では、細胞培地は、さらに、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩおよびラミニンからなる群から選択される１種以上の追加の生物学的に活性なタンパク質を含む。
【００１６】
さらに好ましい実施形態では、１種以上の追加の生物学的に活性なタンパク質は、ｂＦＧＦおよびラミニンから選択される。
好ましくは、ＩＧＦアミノ酸配列は、ＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列またはＩＧＦ−ＩＩアミノ酸配列である。
【００１７】
さらに好ましくは、ＩＧＦアミノ酸配列は、ＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列である。
好ましい実施形態では、ＶＮアミノ酸配列は、成熟ビトロネクチンのアミノ酸残基１〜６４である。
【００１８】
好ましくは、合成キメラタンパク質は、さらに、１個以上のグリシン残基のリンカー配列を含み、特に好ましい実施形態では、前記リンカー配列は、さらに、１個以上のセリン残基を含む。
【００１９】
より好ましくは、リンカー配列は（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４である。
他の好ましい実施形態では、細胞培地は、さらに、ＩＧＦがＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩから選択される、単離されたＩＧＦ含有複合体を含む。
【００２０】
他の好ましい実施形態では、単離されたＩＧＦ含有複合体がＩＧＦ−Ｉを含む場合、細胞培地は、さらに、インスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）およびＶＮを含む。
【００２１】
さらに他の好ましい実施形態では、単離されたＩＧＦ含有複合体に存在するＩＧＦがＩＧＦ−ＩＩである場合、細胞培地は、さらに、ＶＮを含む。
好ましくは、該または各フィーダ細胞置換因子の最終濃度は、約０．１ｎｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌである。
【００２２】
さらに好ましくは、該または各フィーダ細胞置換因子の最終濃度は、約５ｎｇ／ｍｌ〜１５００ｎｇ／ｍｌである。
さらに好ましくは、該または各フィーダ細胞置換因子の最終濃度は、約２５ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌである。
【００２３】
さらに好ましくは、該または各フィーダ細胞置換因子の最終濃度は、約１５０ｎｇ／ｍｌ〜６００ｎｇ／ｍｌである。
さらにより好ましくは、該または各フィーダ細胞置換因子の最終濃度は、約２５０ｎｇ／ｍｌ〜４００ｎｇ／ｍｌである。
【００２４】
適切には、細胞培地は、フィーダ依存性細胞の培養に使用される。
フィーダ依存性細胞は、増殖にフィーダ細胞を必要とする任意の細胞であることは容易に認められる。限定ではない例として、マウスおよびヒト胚性幹細胞、ヒト胚性生殖細胞、ヒト胚性細胞腫および角化細胞が挙げられる。
【００２５】
好ましくは、フィーダ依存性細胞は、ヒト胚性幹細胞および角化細胞から選択される。
第二態様で、本発明は、ＩＧＦアミノ酸配列およびＶＮアミノ酸配列を含む約２５０ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌの合成キメラタンパク質と、約５０ｎｇ／ｍｌ〜ｌ００ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦと、約２５ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌのアクチビン−Ａと、約１０μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌのラミニンとを含む胚性細胞培地を提供する。
【００２６】
好ましくは、胚性幹細胞培地は、約１０００ｎｇ／ｍｌの合成キメラタンパク質と、約１００ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦと、約３５ｎｇ／ｍｌのアクチビン−Ａと、約４０μｇ／ｍｌのラミニンとを含む。
【００２７】
好ましくは、ＩＧＦアミノ酸配列は、ＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列またはＩＧＦ−ＩＩアミノ酸配列である。
より好ましくは、ＩＧＦアミノ酸配列は、ＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列である。
【００２８】
好ましい実施形態では、ＶＮアミノ酸配列は、成熟ビトロネクチンのアミノ酸残基１〜６４である。
第三態様で、本発明は、培養容器と、第一態様の細胞培地または第二態様の胚性幹細胞培地とを含む細胞培養系を提供する。
【００２９】
第四態様で、本発明は、第一態様の細胞培地、第二態様の胚性幹細胞培地および／または第三態様の細胞培養系において、１個以上の細胞を培養するステップを含む細胞培養方法を提供する。
【００３０】
好ましくは、１個以上の細胞は、フィーダ依存性細胞型である。
より好ましくは、１個以上の細胞は、ｈＥＳ細胞または角化細胞である。
第五態様で、本発明は、第四態様の方法に従って産生される１個以上の細胞と、医薬的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
【００３１】
好ましい実施形態では、医薬組成物は、ｈＥＳ細胞、角化細胞および角化細胞前駆細胞からなる群から選択される１個以上の細胞を含む。
第六態様で、本発明は、第四態様の方法に従って培養される１個以上の細胞を送達する方法であって、第五態様の医薬組成物を個体に送達し、それによって前記個体の１個以上の細胞の再生、細胞移動および／または増殖を促進するステップを含む方法を提供する。
【００３２】
前記態様において、１個以上のフィーダ細胞置換因子は、その生物学的に活性なフラグメントを含むことは認められるであろう。
本明細書を通して、内容が他のことを必要としない限り、用語「含む」、および「含んでいる」は、記載された整数または整数の群を含有することを意味し、任意の他の整数または整数の群を排除しないと理解される。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ＶＮ：ＧＦ−ｈＥＳ培地対ＫＳＲ培地を比較する、ノックアウト血清置き換え（ＫＳＲ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地対ビトロネクチン：ＩＧＦＢＰ３：ＩＧＦ−Ｉ：ｂＦＧＦ（ＶＮ：ＧＦ−ｈＥＳ）培地１０％勾配のポリアクリルアミドゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。レーンは、Ｍ）２５０ｋＤａのマーカ、１）０．１μＬのＫＳＲ、２）１０μＬのＶＮ：ＧＦ−ｈＥＳ培地を含む。分子量マーカは、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから供給された。
【図２】ＫＳＲおよびＶＮ：ＧＦ−ｈＥＳ培養条件において成長させたｈＥＳ細胞およびＭＥＦ細胞の組織形態。ＭＥＦ細胞は、Ａ）ＫＳＲおよびＥ）ＶＮ：ＧＦ−ｈＥＳを含有する培地を使用して増殖させた。ｈＥＳ細胞は、Ｂ）ＫＳＲおよびＦ）ＶＮ：ＧＦ−ｈＥＳを含有する培地を使用して増殖させた。ｈＥＳ細胞は、Ｃ）ＫＳＲおよびＧ）ＶＮ：ＧＦ−ｈＥＳを含有する培地中で培養した場合、マウス抗−Ｏｃｔ−４抗体に対して、マーカを発現する。ｈＥＳ細胞は、Ｄ）ＫＳＲおよびＨ）ＶＮ：ＧＦ−ｈＥＳを含有する培地中で培養した場合、マウス抗−Ｔｒａ１−８１抗体に対してマーカを発現する（スケールバー＝２００μｍ）。
【図３】ＫＳＲおよびＶＮ：ＧＦ−ｈＥＳ培養条件で成長させたｈＥＳ細胞から単離したｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析。（Ａ）ＫＳＲ培養条件で成長させたｈＥＳ細胞からのｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析。レーンは、Ｍ）１００ｂｐのＤＮＡラダー、１）１８ｓＲＮＡ内部標準（１５１ｂｐのバンド）、２）１８ｓＲＮＡネガティブコントロール、３）ＡＰ（１７７ｂｐのバンド）、４）ＡＰネガティブコントロール、５）Ｏｃｔ−４（１６９ｂｐのバンド）、６）Ｏｃｔ−４ネガティブコントロールを含有する。（Ｂ）ＶＮ：ＧＦ−ｈＥＳ培養条件で成長させたｈＥＳ細胞からのｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析。レーンは、Ｍ）１００ｂｐのＤＮＡラダー、１）１８ｓＲＮＡ内部標準（１５１ｂｐのバンド）、２）１８ｓＲＮＡネガティブコントロール、３）ＡＰ（１７７ｂｐのバンド）、４）ＡＰネガティブコントロール、５）Ｏｃｔ−４（１６９ｂｐのバンド）、６）Ｏｃｔ−４ネガティブコントロールを含有する。
【図４】ＭＥＦ細胞単独から集められた調整培地の二次元分離。（Ａ）ＭＥＦ細胞から集められた調整培地（ＣＭ）の一次元分離。一次元分離は、０．８ｍｇのタンパク質を注入することを含み、該タンパク質は、ＭＥＦ  ＣＭから濃縮し、０〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配を使用して分離した。（Ｂ）次いで、後のフラクションを集め、二次元分離に適用し、該分離は、材料および方法の項により、０〜１００％のＡＣＮ勾配の使用を含んでいた。示したデータは、３回行った反復試験分析の代表例である。
【図５】ＭＥＦ：ｈＥＳ細胞培養から集めた調整培地の二次元分離。（Ａ）ＭＥＦ：ｈＥＳ細胞から集めたＣＭの一次元分離。一次元分離は、０．８ｍｇのタンパク質の注入を含み、該タンパク質は、ＭＥＦ：ｈＥＳ細胞ＣＭから濃縮し、０〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配を使用して分離した。（Ｂ）次いで、後のフラクションを集め、二次元分離に適用し、該分離は、材料および方法の項により、０〜１００％のＡＣＮ勾配の使用を含んでいた。示したデータは、３回行った反復試験分析の代表例である。
【図６】プロテオミクス分析用のビトロネクチン：ＩＧＦＢＰ３：ＩＧＦ−Ｉ：ＥＧＦ（ＶＮ：ＧＦ（登録商標）−Ｋｃ）培地を使用して増殖された第２継代角化細胞上の細胞表面マーカの組織形態および発現。初代角化細胞を、血清なしで単離し、次いで（Ａ）血清およびフィーダ細胞層を含有する培地を使用して増殖するか、あるいは（Ｂ）フィーダ細胞層とともにＶＮ：ＧＦ−Ｋｃ培地を用いて、血清なしで増殖した。第４日、ＶＮ：ＧＦ−Ｋｃを使用して増殖した初代角化細胞が、未分化のまま残ったかどうかを調べるため、角化細胞を、（Ｃ）ケラチン６、および（Ｄ）ケラチン１４に対して、抗体でプロービングした。調整培地を、３つの異なる患者サンプルから２日ごとに培養物から集めた（スケールバー＝１００μｍ）（ｎ＝３，画像は、分析した３つの異なる患者サンプルの代表的な培養物である）。
【図７】調整培地の二次元分離。培地を、（Ａ）フィーダ細胞単独、および（Ｂ）フィーダ細胞：角化細胞培養物から集めた。一次元分離は、０〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配での、１ｍｇのタンパク質の注入を含み、該タンパク質は、調整培地から濃縮した。続けて、フラクションを集め、二次元分離に適用し、該分離は、材料および方法の項により、０〜１００％のアセトニトリル勾配を使用することを含んでいた（３つの異なる患者の培養物からの調整培地を貯めた）。
【図８】フィーダおよび血清のないｈＥＳ細胞の組織形態およびマーカ分析。ｈＥＳ細胞を、１５継代増殖させ、細胞の分化を、Ａ）組織形態、Ｂ）ＤＡＰＩ、Ｃ）ＳＳＥＡ−４、Ｄ）Ｏｃｔ４、Ｅ）ＳＳＥＡ１およびＦ）ＴＲＡ１−６０によってモニタリングした。
【図９】未分化幹細胞で発現した転写産物のリアルタイムＰＣＲ分析。ｈＥＳ細胞を１５継代増殖させ、リアルタイムＰＣＲをＤｐｐａ、ＲＥＸ、ＴＥＲＴ、ＵＴＦ１、ＳＯＸ２、ＦＯＸＤ４、ＮａｎｏｇおよびＯｃｔ４について行った。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明を容易に理解し、実用的な効果を得るために、一例として、好ましい実施形態を添付の図面に関連して説明する。ここで、同様の参照番号は、同様の部分を参照している。
【００３５】
本発明は、フィーダ細胞依存性系におけるパラクリン相互作用のプロテオミクス分析から発展した。さらに詳しくは、本発明者らは、フィーダ細胞依存性系のインビトロ微小環境を特徴付けることにより、フィーダ依存性細胞の成長に必要なフィーダ細胞によって産生する因子が同定されるという仮説を立てた。このプロテオミクス手法には、完全に定義され、最小のタンパク質含量を有するＶＮ：ＧＦ培地を使用して、調整培地を調べることが不可欠である。そのような細胞培地の使用により、フィーダ依存性細胞成長をサポートするために重要であるかもしれないフィーダ細胞によって分泌された重要な因子の外因性タンパク質による「マスキング」は排除される。
【００３６】
このタイプの分析を用い、本発明者らは、先に記載したインビトロ微小環境において、フィーダ細胞によって分泌される数種の因子を同定した。したがって、これらの因子は、細胞を培養する明確に定義された非細胞調整培地を形成するために使用することができ、これは、フィーダ細胞の必要性を取除く。したがって、本発明は、フィーダ細胞非依存性細胞培養系および細胞の成長のための培地の開発に大きな進歩を提供する。
【００３７】
当業者は、本発明が、フィーダ細胞に依存しない方法で成長させることができる、ヒト由来の細胞および非ヒト細胞の成長のための任意の細胞培養系に広く適用可能であることを認めるであろう。ほんの一例として、本発明をマウスのＥＳ細胞に適用してもよい。
【００３８】
本発明の内容において、「フィーダ細胞置換因子」は、細胞培地に含有されている場合、フィーダ細胞の１つ以上の機能および／または特性を模倣する、置換する、あるいは置き換えるタンパク質を意味する。より詳しくは、関心のある機能として、フィーダ依存性細胞の接着、増殖の促進および／または細胞生存率の維持が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３９】
さらに、本発明は、フィーダ細胞置換因子の生物学的に活性なフラグメントの使用も意図する。
「タンパク質」は、アミノ酸ポリマーを意味する。アミノ酸は、天然でも非天然アミノ酸でもよく、Ｄ−またはＬ−アミノ酸は、それ自体、当該分野でよく理解されている。
【００４０】
用語「タンパク質」は、「ペプチド」を含有および包含し、これは、通常、５０個以下のアミノ酸を有するタンパク質を記載するのに使用され、「ポリペプチド」は、通常、５０個を超えるアミノ酸を有するタンパク質を記載するのに使用される。
【００４１】
一実施形態では、前記「生物学的に活性なフラグメント」は、該フラグメントが由来するタンパク質の生物活性の１０％以上、好ましくは２５％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは７５、８０、８５、９０または９５％以上を有する。
【００４２】
一部、フィーダ細胞依存系中のパラクリン相互作用の複雑な性質のため、本明細書に記載される調整培地のプロテオミクス分析によって実証されるように、フィーダ細胞置換因子としての使用に適切なタンパク質の広大なアレイがある。ほんの一例として、適切なフィーダ細胞置換因子として、細胞外マトリックスタンパク質、成長因子、細胞情報伝達およびシグナル伝達タンパク質、ならびに成長因子レセプタが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４３】
好ましい実施形態では、１種以上の単離されたフィーダ細胞置換因子は、ヒト成長ホルモン、骨形成タンパク質１５、増殖分化因子９（ＧＤＦ−９）、巨核球コロニー刺激因子、分泌フリッツルド関連タンパク質２、Ｗｎｔ−２ｂ、Ｗｎｔ−１２、成長抑制因子、フェチュイン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、形質転換成長因子−α（ＴＧＦ−α）、ＴＧＦ−β、神経成長因子、血小板由来成長因子−β（ＰＤＧＦ−β）、ＰＣ由来成長因子（プログラヌリン）、インターロイキン（ＩＬ）−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３およびアクチビン−Ａからなる群から選択される。
【００４４】
より好ましくは、１種以上の単離されたフィーダ細胞置換因子は、ヒト成長ホルモン、骨形成タンパク質１５、増殖分化因子９、巨核球コロニー刺激因子、分泌フリッツルド関連タンパク質２、Ｗｎｔ−２ｂ、Ｗｎｔ−１２、成長抑制因子およびアクチビン−Ａからなる群から選択される。
【００４５】
さらにより好ましくは、１種以上の単離されたフィーダ細胞置換因子は、アクチビン−Ａである。
他の一般的な実施形態では、１種以上の単離されたフィーダ細胞置換因子は、表１、表２、表３、表４および表５に挙げられたタンパク質からなる群から選択されてもよい。
【００４６】
したがって、本発明は、１種以上の前記フィーダ細胞置換因子が、フィーダ依存性細胞を培養するための細胞培地に含有されていると規定する。本発明の細胞培地の形成は、１種以上のフィーダ細胞置換因子（本明細書に記載のような）、あるいは単離および／または合成された他のタンパク質成分の使用に基づくことが意図される。
【００４７】
本発明の目的に関し、「単離された」は、天然の状態から取り出された物質、またはその他ヒトの操作を受けた物質を意味する。単離された物質は、その天然の状態では、通常該物質に伴って存在する成分を、実質的にまたは本質的に含まなくてもよく、あるいは、その天然の状態では通常該物質に伴って存在する成分を含む人工的な状態になるように操作されてもよい。単離された物質は、天然の形態でも、組換え形態であってもよい。
【００４８】
本明細書で使用される「合成」は、自然現象ではなく、ヒトの技術的な処置によって作られたものを意味する。合成タンパク質との関連では、これは、組換えまたは化学合成によって産生された分子を包含し、組合せ技術は、それ自体、当該分野においてよく理解されている。
【００４９】
好ましい実施形態において、本発明の特に有利な点は、細胞培地および系を、１種以上のフィーダ細胞置換因子の他の成長因子を追加するように改良できることである。
有利には、このような成長因子は、血清の不在下で、エクスビボの初代細胞培養において、増殖応答を大きく刺激する。
【００５０】
一般的態様では、本発明の細胞培地は、成長因子レセプタ（たとえば、ＩＧＦ−Ｉレセプタ）およびＶＮ結合インテグリンレセプタを、結合および相乗的に共活性化することによって細胞移動および／または増殖を刺激する合成キメラタンパク質を含む。好ましい実施形態では、合成キメラタンパク質は、ＩＧＦアミノ酸配列と、ＶＮアミノ酸配列とを含む。普通、合成キメラタンパク質は、インテグリンレセプタとＩＧＦとを結合する成熟ＶＮのドメイン、あるいは少なくともＩＧＦレセプタを結合することができるＩＧＦのドメインを含むが、これらに限定されない。国際公開公報第ＷＯ０４／０６９８７１号には、適切な合成キメラタンパク質の非限定的例示が掲載され、該公報は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００５１】
好ましくは、ＩＧＦアミノ酸配列は、ＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列またはＩＧＦ−ＩＩアミノ酸配列である。
より好ましくは、ＩＧＦアミノ酸配列は、ＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列である。
【００５２】
好ましい一般的な実施形態では、ＶＮアミノ酸配列は、αＶインテグリンを結合しうる、ＶＮ（および特に成熟ＶＮ）の任意の部分またはドメインである。
好ましい実施形態では、ＶＮアミノ酸配列は、成熟ＶＮのアミノ酸残基１〜６４である。
【００５３】
また、本発明は、適切なリンカー配列の一般的な例示を掲載する国際公開公報第ＷＯ０４／０６９８７１号に一般的に記載されるように、前記合成キメラタンパク質（これらに限定されないが）におけるリンカー配列の包含も意図し、該公報は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００５４】
好ましくは、該リンカー配列は、１個以上のグリシン残基を含む。
より好ましくは、該リンカー配列は、さらに、１個以上のセリン残基を含む。
好ましい実施形態では、リンカー配列は、Ｇｌｙ４Ｓｅｒを含む。
【００５５】
特に好ましい実施形態では、リンカー配列は（ＧＩｙ４Ｓｅｒ）４である。
特に好ましい実施形態では、合成キメラタンパク質は、ＩＧＦ−Ｉと、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４のリンカー配列と、成熟ビトロネクチンのアミノ酸残基１〜６４（以下、ＩＧＦ−Ｉ／１−６４ＶＮと称する）とを含む。特に好ましい実施形態では、ＩＧＦ−Ｉ／１−６４ＶＮは、単一の連続するタンパク質である。
【００５６】
好ましい実施形態では、本発明の細胞培地は、さらに単離されたＩＧＦ含有タンパク質複合体の形態の成長因子を含み、そのＩＧＦはＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩからなる群から選択される。
【００５７】
ＩＧＦがＩＧＦ−ＩＩである単離されたＩＧＦ含有タンパク質複合体の追加を意図する他の好ましい実施形態では、細胞培地は、さらに、ビトロネクチンを含む。
ＩＧＦ−Ｉの追加を包含するさらに他の好ましい実施形態では、細胞培地は、さらに、ＩＧＦＢＰおよびＶＮを含む。
【００５８】
適切には、ＩＧＦＢＰは、ＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＧＦＢＰ−５およびＩＧＦＢＰ−６からなる群から選択される。
好ましくは、ＩＧＦＢＰは、ＩＧＦＢＰ−３またはＩＧＦＢＰ−５である。
【００５９】
ＩＧＦ−ＩＩと、ＶＮまたはＩＧＦ−Ｉと、ＩＧＦＢＰと、ＶＮとが存在する実施形態では、これらのタンパク質は、タンパク質複合体、たとえば、国際公開公報第ＷＯ０２／２４２１９号に記載されるようなものを含んでもよい。
【００６０】
本発明の単離されたタンパク質複合体は、非共有的に結合したオリゴタンパク質複合体、または共有的に架橋している(可逆的または非可逆的)オリゴタンパク質複合体の形態であってもよいことは、前記から容易に認められるであろうが、これらに限定されない。
【００６１】
適切には、１種以上のフィーダ細胞置換因子は、細胞成長および増殖を促進する細胞培地において、ある濃度で存在する。
一般的に好ましい実施形態では、該または各単離されたフィーダ細胞置換因子は、細胞生存率、維持、再生および／または増殖をサポートするように改良可能な最終濃度、好ましくは０．１ｎｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌで存在する。より好ましくは、該単離された各フィーダ細胞置換因子は、０．１ｎｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌの最終濃度、より好ましくは、１ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、４５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、ｌ００ｎｇ／ｍｌ、１５０ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、３５０ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、６００ｎｇ／ｍｌ、８００ｎｇ／ｍｌ、ｌ０００ｎｇ／ｍｌ、１５００ｎｇ／ｍｌ、さらに好ましくは、２μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、３５μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、４５μｇ／ｍｌおよび５０μｇ／ｍｌで存在しうる。
【００６２】
本発明は、増殖のため、フィーダ細胞または他のフィーダ細胞置換技術、たとえば、マトリゲル、または高細胞外マトリックス濃度に依存する任意の細胞型に適用可能であることが容易に認められるであろう。
【００６３】
一般的に、このようなフィーダ依存性細胞は、偏好性であり、成長および増殖のために、フィーダ細胞から、成長のための血清、および排出物および可溶性因子の供給を必要とする。たとえば、多能性細胞または初代細胞培養については、さらなる適用、特に治療的適用のために、未分化状態で細胞を保つことも望ましいかもしれない。
【００６４】
ひとつの好ましい実施形態では、フィーダ依存性細胞は、ヒト胚性幹細胞である。
他の好ましい実施形態では、フィーダ依存性細胞は角化細胞である。
本発明の特に有利な点は、血清を必要としない、あるいは血清を殆ど必要としないフィーダ非依存性細胞培養系であるということである。
【００６５】
したがって、特定の態様では、本発明は、１種以上のフィーダ細胞置換因子を含む細胞培地および細胞系であって、フィーダ細胞および血清のような外因性の動物由来の因子を必要とせず、あるいは非常に少量しか必要とせず、それによって細胞成長および/または生存率が維持される細胞培地および細胞系を提供する。
【００６６】
したがって、「血清の不在下、または前記少なくとも１種のＩＧＦの不在下において、細胞成長をサポートしない血清の量」とは、血清がないこと、またはインビトロでの最適細胞成長および／または発育に通常必要とされる量より大幅に減らされた血清の量または濃度を意味することが認められるであろう。
【００６７】
「血清」は、血液に由来するフラクションを意味し、広域スペクトルの巨大分子、脂質物質および微量元素のための担体タンパク質、細胞接着および細胞拡散因子、低分子量栄養素およびホルモンおよび成長因子を含む。操作上は、血清は、赤血球、血小板および血漿の凝固成分を取除いた後に残る血液のタンパク質性の無細胞フラクションと定義されてもよい。細胞培養のために、最も広く使用されている動物血清は、ウシ胎児血清、ＦＢＳであるが、成体ウシ血清、ウマ血清、およびこれらのタンパク質フラクション（たとえば、フラクションＶ血清アルブミン）を使用してもよい。
【００６８】
典型的には、哺乳類の細胞は、細胞型、培養の持続時間、培養系のフィーダ細胞および／または他の細胞成分の存在または不在、および当業者には明らかな他の因子に依存して、５〜１０％の血清を必要とする。
【００６９】
しがたって、好ましい実施形態では、本発明は、５％未満の血清、より好ましくは２％未満の血清、さらに好ましくは１％未満の血清、あるいは有利には０．５％、０．４％、０．３％または０．２％以下の血清（ｖ／ｖ）を意図する。
【００７０】
特に有利な実施形態では、本発明は、無血清、あるいは０．５％または０．２５％以下の血清（ｖ／ｖ）を意図する。
適切には、本発明の培地は、他に定義される成分を含んでもよい。限定ではなく、かつ場合によっては任意の成分のものとして、ＤＭＥＭまたはＨａｍ培地のような周知の基本培地、ストレプトマイシンまたはペニシリンのような抗生物質、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、リン脂質（たとえば、ホスファチジルコリン）、スフィンゴミエリン、アクチビン−Ａ、アミノ酸、Ｌ−グルタミンのようなサプリメント、β−メルカプトエタノールのような抗酸化剤、カーボネート緩衝液のような緩衝液、ＨＥＰＥＳおよび細胞培養の培養器に通常与えられるような二酸化炭素源が挙げられる。
【００７１】
また、本発明は、細胞成長、分化、生存および／または移動を調節する追加の生物学的に活性なタンパク質またはそのフラグメント、たとえば、インスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、ラミニン、上皮成長因子（ＥＧＦ、Ｈｅｌｄｉｎら、１９８１，Ｓｃｉｅｎｃｅ４  １１２２−１１２３）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ、Ｎｕｒｃｏｍｂｅら、２０００，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５  ３０００９−３００１８）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ、Ｔａｒａｂｏｌｅｔｔｉら、１９９７，Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ．Ｄｉｆｆｅｒ．８  ４７１−４７９）、オステオポンチン（Ｎａｍら、２０００，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４１  １１００）、トロンボスポンジン−１（Ｎａｍら、２０００，前出）、テネイシン−Ｃ（Ａｒａｉら、１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１  ６０９９）、ＰＡＩ−１（Ｎａｍら、１９９７，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３８  ２９７２）、プラスミノーゲン（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、１９９８，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２７５  Ｅ３２１）、フィブリノーゲン（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ２７４  ３０２１５）、フィブリン（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、１９９９，前出）またはトランスフェリン（Ｗｅｉｎｚｉｍｅｒら、２００１，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．８６  １８０６）の使用も意図する。
【００７２】
好ましくは、本発明は、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩおよびラミニンからなる群から選択される１種以上の追加の生物学的に活性なタンパク質をさらに含む細胞培地を提供する。
【００７３】
さらに好ましくは、該１種以上の追加の生物学的に活性なタンパク質は、ｂＦＧＦおよびラミニンから選択される。
ラミニンは、少なくとも３種の同一ではない鎖（α、βおよびγ鎖）およびα、βおよびγ鎖の様々な組合せから生じる多くの異なるイソ型で構成される真核細胞外マトリックス糖タンパク質のファミリーであることは、当業者によって認められるであろう。異なるラミニンイソ型の限定ではない例として、ラミニン−１、ラミニン−２、ラミニン−３、ラミニン−４、ラミニン−５、ラミニン−５Ｂ、ラミニン−６、ラミニン−７、ラミニン−８、ラミニン−９、ラミニン−１０、ラミニン−１２、ラミニン−１３、ラミニン−１４およびラミニン−１５が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、ラミニンは、本明細書に上述するラミニンイソ型の組合せであることも意図する。さらに、ラミニンは、細胞培地、特にマウス、ブタ、ヒト、ヒツジのような（これらに限定されない）、潜在的に治療用途のある細胞培地に含まれるのに適切な任意の複製起点のものであることも認められるであろう。
【００７４】
特に好ましい実施形態では、ラミニンは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから入手しうるカテゴリＮｏ．ＣＣ０９５に記載されるようなものである。
好ましい実施形態では、１種以上の追加の生物学的に活性なタンパク質は、０．１ｎｇ／ｍｌから５０μｇ／ｍｌまで、６０μｇ／ｍｌまで、７０μｇ／ｍｌまで、８０μｇ／ｍｌまで、９０μｇ／ｍｌまでまたは１００μｇ／ｍｌまでの最終濃度で存在しうる。好ましくは、１種以上の追加の生物学的に活性なタンパク質は、０．１ｎｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌの最終濃度、より好ましくは５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、１０００ｎｇ／ｍｌ、１５００ｎｇ／ｍｌ、さらに好ましくは、２μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、３５μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌおよび４５μｇ／ｍｌで存在しうる。
【００７５】
ラミニンを包含する特に好ましい実施形態では、ラミニンの濃度は、５０μｇ／ｍｌまで（または有利には、２５〜１００μｇ／１０ｃｍ２の細胞培養皿の面積）、好ましくはｌ０μｇ／ｍｌ〜４０μｇ／ｍｌである。
【００７６】
一般的態様では、本発明は、胚性幹細胞培地を提供する。特に、胚性幹細胞培地は、ＩＧＦアミノ酸配列およびＶＮアミノ酸配列を含む約２５０〜１０００ｎｇ／ｍｌの合成キメラタンパク質と、約５０〜１００ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦと、約２５〜５０ｎｇ／ｍｌのアクチビン−Ａと、約１０〜約５０μｇ／ｍｌのラミニンとを含む。
【００７７】
好ましい実施形態では、本発明の細胞培地は、ＩＧＦアミノ酸配列およびＶＮアミノ酸配列を含む約１０００ｎｇ／ｍｌの合成キメラタンパク質と、約１００ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦと、約３５ｎｇ／ｍｌのアクチビン−Ａと、約４０μｇ／ｍｌのラミニンとを含む。
【００７８】
特に好ましい実施形態では、合成キメラタンパク質は、ＩＧＦ−Ｉ／１−６４ＶＮである。
先の記載を考慮すると、任意のタンパク質、特に単離されたフィーダ細胞置換因子は、当業者に知られた任意の適切な手法によって産生されてもよいことを、当業者は容易に認めるであろう。
【００７９】
さらに、本発明は、単離されたフィーダ細胞置換因子の変異体も意図する。一実施形態では、「変異体」は、異なるアミノ酸によって置き換えられている１種以上のアミノ酸を有する。いくつかのアミノ酸を、タンパク質の活性の性質を変えることなく、広く類似する特性を持つ他のものに変化させてもよい（保存的置換）ことは、当業者によく理解されている。
【００８０】
一実施形態では、変異体は、本明細書に記載するアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、有利には少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を共有する。
【００８１】
好ましくは、配列同一性は、本発明の合成タンパク質の少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、有利には完全長にわたって測定される。
【００８２】
配列同一性の割合を測定するために、アミノ酸および／またはヌクレオチド配列の至適アラインメントは、アルゴリズムのコンピュータ実行（ＩｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓによるＧｅｎｅｗｏｒｋｓプログラム、ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ  Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ，参照により本明細書に組み入れられる）によって、あるいは種々の選択された方法のいずれかによって作られる、検査および最もよいアラインメント（すなわち、比較用ウインドを超える最も高い相同性割合となる）によって実施されてもよい。プログラムそれ自身のＢＬＡＳＴファミリーについては、たとえば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５  ３３８９によって開示され、該文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【００８３】
他の例では、「配列同一性」は、ＤＮＡＳＩＳコンピュータプログラム（ウィンドウズ版バージョン２．５、Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ社，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡから入手可能）によって計算された「マッチする割合」を意味すると理解されうる。
【００８４】
配列分析の詳細な検討は、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ  のＵｎｉｔ  １９．３、Ａｕｓｕｂｅｌら編（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社、ＮＹ、１９９５−１９９９）に見出すことができる。
【００８５】
また、本発明は、本明細書で記載した任意のタンパク質、特にフィーダ細胞置換因子の誘導体も意図する。
本明細書で使用される「誘導体」は、たとえば、他の化学的部位の付加、共役または複合によって、あるいは当該分野でよく理解されている翻訳後修飾の技術によって、変化させられている。
【００８６】
アミノ酸の「付加」は、他のペプチドまたはポリペプチドとの融合を含んでもよい。他のペプチドまたはポリペプチドは、たとえば、タンパク質の精製において役に立つかもしれない。たとえば、これらには、ポリヒスチジンタグ、マルトース結合タンパク質、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、タンパク質ＡまたはグルタチオンＳ−転移酵素（ＧＳＴ）が含まれる。
【００８７】
本発明によって意図されている他の誘導法として、側鎖への修飾、タンパク質合成中の非天然アミノ酸および／またはそれらの誘導体の導入、架橋剤の使用、およびタンパク質上の立体構造の制約を課す他の方法が挙げられるが、これらに限定されない。本発明によって意図される側鎖修飾の限定ではない例として、無水酢酸でのアシル化、無水コハク酸および無水テトラヒドロフタル酸でのアミノ基のアシル化、メチルアセトイミデートでのアミジン化、シアネートでのアミノ基のカルバモイル化、ピリドキサール−５−ホスフェート、次いでＮａＢＨ４での還元によるリシンのピリドキシル化、アルデヒドとの反応、次いでＮａＢＨ４での還元による還元的アルキル化、および２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）でのアミノ基のトリニトロベンジル化によるアミノ基の修飾が挙げられる。
【００８８】
スルフヒドリル基は、システイン酸への過ギ酸酸化、４−クロロメルクリフェニルスルホン酸、４−クロロメルクリベンゾエート、２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノール、塩化フェニル水銀、および他の水銀剤を使用する水銀誘導体の形成、他のチオール化合物との混合ジスルフィドの形成、マレイミド、無水マレイン酸、または他の置換マレイミドとの反応、ヨード酢酸またはヨードアセタミドとのカルボキシメチル化、およびアルカリ性ｐＨでのシアネートを用いるカルバモイル化のような方法によって修飾してもよい。
【００８９】
ヒスチジン残基のイミダゾール環は、ジエチルピロカルボネートを用いるＮ−カルベトキシル化、またはヨード酢酸誘導体を用いるアルキル化によって修飾してもよい。
ペプチド合成中の非天然アミノ酸および誘導体導入の例として、４−アミノ酪酸、６−アミノへキサン酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸、ｔ−ブチルグリシン、ノルロイシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、２−チエニルアニリンおよび／またはアミノ酸類のＤ−異性体の使用が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９０】
タンパク質の化学誘導のさらなる例は、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＣＩＥＮＣＥの第１５章、Ｃｏｌｉｇａｎら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  ＮＹ（１９９５−２００１）に掲載されている。
【００９１】
本発明によれば、タンパク質は、当業者に公知の任意の適切な手法により製造してもよい。
本発明のタンパク質は、実質的に純粋な原型であってもよいことが意図される。
【００９２】
他の実施形態では、タンパク質は、化学合成によって製造される。化学合成技術は当該分野で周知であるが、適切な方法の例として、当業者は、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＣＩＥＮＣＥの第１８章、Ｃｏｌｉｇａｎら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  ＮＹ（１９９５−２００１）を参照することもできる。
【００９３】
さらに他の実施形態では、タンパク質を組換えタンパク質として製造してもよい。
組換えタンパク質の製造は、当該分野で周知であり、当業者は、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）（参照により本明細書に組み込まれる）、特にセクション１６および１７、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社１９９５−１９９９），（参照により本明細書に組み込まれる）、特に第１０および１６章、およびＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＣＩＥＮＣＥ、Ｃｏｌｉｇａｎら編、（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社１９９５−１９９９）（参照により本明細書に組み込まれる）、特に第１、５および６章に記載のような、標準のプロトコルを参照してもよい。
【００９４】
組換えタンパク質は、さらに、融合パートナーを含んでもよい。
融合パートナーの周知の例として、グルタチオン−Ｓ−転移酵素（ＧＳＴ）、ヒトＩｇＧのＦｃ部、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）およびヘキサヒスチジン（ＨＩＳ６）が挙げられるが、これらに限定されない。これらは、特に、アフィニティクロマトグラフィによる融合タンパク質の単離に有用である。アフィニティクロマトグラフィによる融合タンパク質精製の目的のために、アフィニティクロマトグラフィに関連するマトリックスは、それぞれ、グルタチオン−、アミロース−、およびニッケル−またはコバルト−共役樹脂である。該マトリックスの多くは、「キット」形態、たとえば、（ＨＩＳ６）融合パートナーとともに有用なＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ（商標）システム（Ｑｉａｇｅｎ）、およびＰｈａｒｍａｃｉａ  ＧＳＴ精製システムとして入手可能である。
【００９５】
ある場合は、融合パートナーは、第Ｘａ因子またはトロンビンのように、プロテアーゼ切断部位も有し、これは、関連するプロテアーゼが、本発明の融合タンパク質を部分的に消化することを可能にし、これによって、そこから組換えタンパク質を遊離する。次いで、遊離されたタンパク質を、その後のクロマトグラフ的分離によって、融合パートナーから単離することができる。
【００９６】
本発明による融合パートナーは、それらの範囲の中に、特定の抗体が使用できる、普通短いペプチド配列である「エピトープタグ」も含む。特定のモノクローナル抗体が容易に使用できるエピトープタグの周知の例として、ｃ−ｍｙｃ、赤血球凝集素およびＦＬＡＧタグが挙げられる。
【００９７】
発現のために適切なホスト細胞は、原核または真核でもよく、たとえば、大腸菌（たとえば、ＤＨ５α）、酵母菌、バキュロウィルス発現系とともに利用されるＳｆ９細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ、ＣＶ−１、ＮＩＨ３Ｔ３およびＨＥＫ２９３細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９８】
組換えタンパク質発現は、発現構築物のフィーダ依存性細胞への導入によって達成される。
典型的には、発現構築物は、プロモーターに操作可能にリンクまたは操作可能に結合された、発現されるべき核酸（組換えタンパク質をコード化する）を含む。
【００９９】
プロモーターは、構成型または誘導型であってもよい。
構成型または誘導型プロモーターとして、たとえば、テトラサイクリン−抑制型プロモーター、エクジソン−誘導型プロモーター、アルコール−誘導型プロモーターおよびメタロチオネイン−誘導型プロモーターが挙げられる。プロモーターは、天然のプロモーター（たとえば、アルファ結晶性プロモーター、ＡＤＨプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、ヒト伸長因子αプロモーターおよびＳＶ４０、ＣＭＶ、ＨＴＬＶ−誘導プロモーターのようなウィルス性プロモーター）でも、複数のプロモーターの要素を組み合わせた合成ハイブリッドプロモーター（たとえば、ＳＲアルファプロモーター）でもよい。
【０１００】
好ましい実施形態では、発現ベクターは、選択マーカ遺伝子を含む。選択マーカ遺伝子は、形質転換菌（たとえば、ｂｌａ、ｋａｎＲおよびｔｅｔＲ）、あるいは形質転換哺乳類細胞（たとえば、ハイグロマイシン、Ｇ４１８およびピューロマイシン）の選択の目的のために有用である。
【０１０１】
発現構築物は、周知の方法、たとえば、電気穿孔、マイクロ粒子照射、ウィルス仲介遺伝子導入、リン酸カルシウム沈降、ＤＥＡＥ−デキストラン、カチオン性リポソーム、リポフェクチン、リポフェクタミンなど（これらに限定されない）によって、フィーダ依存性細胞、特に哺乳類細胞に導入してもよい。
【０１０２】
ｈＥＳへの核酸送達に適用可能な技術の限定ではない例については、Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、２００５，Ｂｉｒｔｈ  Ｄｅｆｅｃｔｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｔ  Ｃ：Ｅｍｂｒｙｏ  Ｔｏｄａｙ：Ｒｅｖｉｅｗｓ，７５  １０−１８が参照される。
【０１０３】
角化細胞における組換え成長因子タンパク質の発現に適用可能な方法の限定ではない特定の例については、Ｓｕｐｐら、２０００，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１４  ５およびＳｕｐｐら、２０００，Ｗｏｕｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｒｅｇｅｎ．８  ２６−３５が参照される。
【０１０４】
医薬組成物
また、本発明は、本発明の培地および／または系を使用して産生される１種以上の細胞、たとえば、ｈＥＳ細胞および角化細胞（これらに限定されない）と、医薬的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤とを含む医薬組成物も提供する。
【０１０５】
本発明の医薬組成物は、細胞移動、組織の再生および傷の治癒を促進する、あるいは容易にするために使用できる。
一般的に、本発明の組成物は、要求に応じ、治療的または予防的処置において使用できる。たとえば、ｈＥＳ細胞、角化細胞または角化前駆細胞を含む医薬組成物は、皮膚の再生、傷の治癒、火傷の治癒、および他の皮膚治療のために、治療または美容調剤の形態で適用できる。
【０１０６】
好ましくは、医薬的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤が、哺乳類、好ましくはヒトに投与するのに適切である。
特定の実施形態では、医薬組成物は、本発明に従って培養された自己または同種のｈＥＳ細胞または角化細胞を含む。
【０１０７】
「医薬的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤」は、全身投与において安全に使用できる固体または液体充填剤、希釈剤、あるいは被包物質を意味する。特定の投与経路に応じて、当該分野で周知の種々の担体を使用することができる。これらの担体は、糖類、トウモロコシ、セルロースおよびその誘導体、麦芽、ゼラチン、タルク、硫酸カルシウム、植物油、合成油、ポリオール類、アルギン酸、リン酸緩衝溶液、乳化剤、等張生理食塩水、および塩酸塩、臭化物および硫酸塩を始めとする鉱酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩およびマロン酸塩のような有機酸、および発熱物質を含まない水からなる群から選択してもよい。
【０１０８】
医薬的に許容しうる担体、希釈剤および賦形剤を記載する有用な参考文献は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．Ｎ．Ｊ．ＵＳＡ，１９９１）があり、該文献は参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１０９】
本発明の組成物を患者に提供するために、任意の安全な投与経路を使用することができる。たとえば、経口、直腸、非経口、舌下、頬側、静脈内、関節内、筋肉内、皮内、皮下、吸入、眼内、腹腔内、脳室内、経皮などを使用することができる。
【０１１０】
剤形として、錠剤、分散剤、懸濁剤、注射剤、溶液、シロップ、トローチ、カプセル、座剤、エアロゾル、経皮パッチなどが挙げられる。また、これらの剤形は、この目的のために特別に設計された、制御された注入またはインプラント放出デバイス、またはこの様式で追加的に変形されたインプラントの他の形態も含んでもよい。
【０１１１】
放出制御製剤は、たとえば、アクリル樹脂、ワックス、高級脂肪族アルコール、ポリ乳酸、ポリグリコール酸およびヒドロキシプロピルメチルセルロースのようなある種のセルトース誘導体を始めとする疎水性ポリマーで被覆することによって達成できる。制御された放出は、他のポリマーマトリックス、リポソームおよび／または微粒子を使用することによって達成できる。放出制御製剤および送達デバイスの限定ではない例として、たとえば、浸透圧ポンプ、ポリラクチド−コ−グリコリド（ＰＬＧ）ポリマー系微粒子、ヒドロゲル系ポリマー、化学的に架橋されたデキストランゲル、たとえば、ＯｃｔｏＤＥＸ（商標）およびｄｅｘ−ラクテート−ＨＥＭＡが挙げられる。
【０１１２】
前記組成物は、投薬製剤に適合性のある方法、および医薬的に効果のある量で投与することができる。本発明との関連で、患者に投与される用量は、適正な期間、患者に有益な応答を実効するのに十分であるべきである。投与すべき薬剤（複数を含む）の量は、対象の年齢、性別、体重および一般的健康状態を含む治療すべき対象、担当医の判断に依存する要因により変化する。
【０１１３】
傷の治癒のための医薬組成物については、特に、米国特許第５，９３６，０６４号および国際公開公報第ＷＯ９９／６２５３６号が参照される。これらの公報は参照により本明細書に組み入れられる。
【０１１４】
角化細胞に関連する特定の実施形態では、本発明の組成物は、その場でのスプレー送達に適している。
用語「スプレー」は、「エアロゾル」または「ミスト」、または一般的に液滴の形での液体懸濁剤と記載される「凝縮物」のような用語を包含し、含むものである。
【０１１５】
治療適用
本発明のフィーダ依存性細胞の増殖のための細胞培地、系および方法の広い適用には、治療的用途を含む。
【０１１６】
特定の態様で、本発明は、前記方法に従って培養、産生された１種以上の細胞を送達する方法であって、本明細書の先に記載した医薬組成物を個体に送達するステップを含む方法を意図する。
【０１１７】
該方法は、特に、哺乳類、特にヒトの治療を目的とする。しかし、本発明は、当業者によってよく理解されるように、ペット、家畜およびパフォーマンス動物を治療するための獣医学的適用もある。
【０１１８】
本発明の方法により培養されたｈＥＳ細胞の治療適用としては、人間の状態であると合理的に言えるようなものを得る方法を除く、組織再構築、組織移植または組織再生が挙げられるが、これらに限定されない。前記方法の限定ではない例として、卵子の受精方法、第４細胞期で、分割によってクローニングする方法および核ＤＮＡを置き換えることによりクローニングする方法が挙げられる。
【０１１９】
ＥＳ、特にｈＥＳ細胞の治療適用の限定ではない例が、Ｓｈｕｆａｒｏら、２００４，Ｂｅｓｔ  Ｐｒａｃｔ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎａｅｃｏｌ  １８（６）：９０９−２７にある。
【０１２０】
一つの好ましい実施形態で、本発明は、初代角化細胞をエクスビボで増殖する培地、系および方法であって、該細胞は、本発明に従って個体に投与される方法を提供する。
特定の実施形態では、角化細胞は、本発明に従って培養された自己または同種の角化細胞である。
【０１２１】
そのような方法として、本明細書で先に定義した医薬組成物の投与が挙げられ、米国特許第６，０９０，７９０号に記載されるような、特定の組織部位への顕微針注射の方法によるもの、米国特許第６，０５４，１２２号に記載されるような、傷、火傷または潰瘍に塗布される局所クリーム、ローションまたはシーラント包帯の方法によるもの、あるいは国際公開公報第ＷＯ９／４７０７０号に記載されるような組成物を放出するインプラントの方法によるものであってもよい。
【０１２２】
また、所望の成長因子発現を遺伝子工学的に製造する方法（Ｓｕｐｐら、２０００，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１４５）のように、皮膚代替物を造る目的のために、皮膚細胞を遺伝的に改変することができる方法も存在する。この分野の検討の例は、Ｂｅｖａｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｇｅｎｔ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ．１６  ２３１に掲載されている。
【０１２３】
また、国際公開公報第ＷＯ９９／１１７８９号に記載されるように、レシピエントへのトランスフェクト細胞または形質変換細胞の「シーディング」も意図される。
これらの方法を使用して、細胞移動を刺激することができ、これによって、傷および火傷の治癒、潰瘍のような皮膚病変の修復、自己の皮膚のインビトロ培養によるような組織置換および移植、腎臓および肺のような内臓の再上皮化、および損傷された神経組織の修復を、促進または進行させる。
【０１２４】
皮膚置換治療は、当該分野でよく知られるようになり、たとえば、Ｋｅｈｅら、１９９９，Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｒｅｓ．２９１  ６００に記載されるように、共培養上皮／角化細胞の株化細胞の使用、または初代（普通自己）表皮性、真皮性および／または角化細胞のインビトロ培養を採用してもよい。また、これらの技術は、遺伝子操作された生体材料および合成ポリマー「スカフォールド」を利用してもよい。
【０１２５】
一般的に、この分野の検討の例は、Ｔｅｒｓｋｉｋｈ  ＆  Ｖａｓｉｌｉｅｖ，１９９９，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１８８４１およびＥａｇｌｅｓｔｅｉｎ  ＆  Ｆａｌａｎｇａ，１９９８，Ｃｕｔｉｓ６２  １．に掲載されている。
【０１２６】
より好ましくは、頭蓋顔面手術において有用な口腔粘膜の代替物の製造は、Ｉｚｕｍｉら、２０００，Ｊ．Ｄｅｎｔ．Ｒｅｓ．７９  ７９８に記載されている。胎児角化細胞および皮膚線維芽細胞は、Ｆａｕｚａら、Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｓｕｒｇ．３３  ３５７に記載されるように、インビトロで広がり、皮膚の損傷を治療するために、移植用の皮膚を産生することができ、一方、ヒアルロン酸誘導生体材料上でインビトロ培養した真皮および表皮の皮膚要素から得た皮膚代替物は、火傷の治療に大いに有用であることが示されている（Ｚａｃｃｈｉら、１９９８，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．４０  １８７）。また、ポリマー、スカフォールドは、たとえば、Ｓｈｅｒｉｄａｎら、２０００，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ１４  ９１およびＦａｕｚａら、１９９８，前出に記載されるように、皮膚細胞の傷および火傷への送達のための薬剤として微粒子（ＬａＦｒａｎｃｅ  ＆  Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，１９９９，Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．５  １５３）と同じく、皮膚の取替えエンジニアリングを容易にする目的も意図される。
【０１２７】
通常、治療的用途のために製造される角化細胞シートは、火傷を最終的に閉じる役割を果たす。このシート移植技術は、部分層火傷の全てに適用可能であり、傷および供与部位の両方の早期の永久閉鎖が、外部の助けなしでは殆ど不可能な広い表面積の傷の治療に最も有用である。これは、最近のバリで起こった爆発において、火傷を負った患者を死に至らしめるタイプの損傷である。
【０１２８】
現在、５０セントのサイズの患者の皮膚生検から成人を完全に覆うのに十分な皮膚を成長させることができる。この培養方法では１７日間を費やす。しかし、患者のトラウマ、感染の危険性、傷跡、および永久的な皮膚移植の前に、高価な一時的なの皮膚交換という現在の必要性を減らすために、より早い皮膚交換が早急に必要である。さらに、培養皮膚のシートは、多くの皮膚細胞を含み、あるものは成熟し、あるものは未成熟である。培養角化細胞を密集状態にするための単純な操作（皮膚シートを製造するために必要な）により、細胞は、それらの基本的な特性を途中で失ってしまう、すなわち、分化を起こす。培養皮膚のシートを適用した場合、未成熟細胞だけが、患者に接着し、樹立することができる。小さな面積だけが接着するので、シートは、患者の摩擦または動きから生じる損傷を非常に受けやすく、時には、全部の移植片を失う結果となる可能性もある。その上、シート状移植片では、シート中の皮膚細胞が成熟しているほど、移植片は取り込まれず、細胞それ自身は傷床上で増殖および移動しない可能性が高い。したがって、未成熟皮膚細胞の早期の適用により、より良好に移植片が取り込まれ、傷跡が減らされることは明らかである。
【０１２９】
したがって、本発明は、エクスビボで培養された皮膚細胞を、患者の火傷、潰瘍化したまたは傷の付いた皮膚上へ送達し、現在あるシート移植片技術より格段に早く、患者の体の広い表面積を未成熟皮膚細胞により被覆することを可能にするスプレーまたはエアロゾル送達方法を提供する。これは、たった７日間という早い期間で行うことができる。また、これは、傷跡の形成、ショックおよび熱損失を大きく減らし、部分層および全層火傷において、皮膚機能のより素早い回復を可能にする。
【０１３０】
皮膚の表面（表皮）および深層（真皮）の両方を取除かれた傷上での培養皮膚の取り込みが乏しいので、本発明によって意図される他の治療は、全層傷を早く閉じることを達成する火傷患者の治療である。本発明は、これらの最もぞっとする損傷を素早く永久的に閉じるために、スプレー・オン・スキンと組み合わせた、代用皮膚の使用を意図する。生物的および合成代用皮膚の両方が意図される。たとえば、本発明の単離されたタンパク質複合体を含む、表皮が除かれ、細胞が除かれた、死体から誘導された皮膚スカフォールドを、合成表皮（包帯）で覆ってもよい。約７日後、この真皮は、自己内皮細胞によって大きく浸潤されているであろうと本発明者らは仮定する。この時、合成真皮は取除かれ、エクスビボで増やした患者自身の線維芽細胞および角化細胞が、アロ型真皮に適用されるであろう。
【０１３１】
代用皮膚が、皮膚細胞および皮膚において通常見られる他の重要な細胞の移動および固着を促進する栄養のある安定化スカフォールドとして作用するので、表皮シートよりスプレー・オン・スキンが成功するであろうことは予測される。これは、全層皮膚損傷における培養皮膚の取り込みを改良する結果となるであろう。
【０１３２】
本発明を容易に理解し、実用的な効果を得るために、以下の限定ではない実施例を掲載する。
【実施例】
【０１３３】
（実施例１）
ヒト胚性幹細胞インビトロ微小環境の分析
材料および方法
マウス胚性線維芽細胞の細胞培養
ＭＥＦ（ＳＣＲＣ−１０４６株化細胞，Ｃｒｙｏｓｉｔｅ，Ｌａｎｅ  Ｃｏｖｅ，Ｓｙｄｎｅｙ，ＮＳＷ，ＡＵＳ）を、８０ｃｍ２の培養フラスコ（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ，ＵＳＡ）で、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２×１０−３ＭのＬ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１０００ＩＵ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた８５％ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｍｏｕｎｔ  Ｗａｖｅｒｌｅｙ，ＶＩＣ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を使用して、５％ＣＯ２中、３７℃で、第６継代に広げた。引き続き、マイトマイシン−Ｃ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃａｓｔｌｅ  Ｈｉｌｌ，ＮＳＷ，ＡＵＳ）を、ＭＥＦを含有するフラスコに加え、細胞を５％ＣＯ２中、２．５〜３時間、３７℃で培養した。次いで、培養皿（１０ｃｍ２）（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を０．１％ゼラチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中で最低１時間被覆し、その後、ＭＥＦを加えた。１ウェル当たり２．５ｍＬのＭＥＦ培養液を含む０．１％ゼラチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）が被覆された１０ｃｍ２（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）組織培養皿上に、ＭＥＦ細胞を２０，０００個の細胞／ｃｍ２で播種した。
【０１３４】
無血清培地、ＶＮ：ＧＦ−ｈＥＳに変える前に、事前に付着させたＭＥＦ細胞を、２時間血清欠乏させた。この培地は、０．６μｇ／ｍＬのＶＮ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ａｎｎａｎｄａｌｅ，ＮＳＷ，ＡＵＳ）、０．６μｇ／ｍＬのＩＧＦＢＰ−３（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ社，Ｂｒｉｓｂａｎｅ，ＱＬＤ，ＡＵＳ）、０．２μｇ／ｍＬのＩＧＦ−Ｉ（ＧｒｏＰｅｐ，Ａｄｅｌａｉｄｅ，ＳＡ，ＡＵＳ）、０．０２μｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｂｏｒｏｎｉａ，ＶＩＣ，ＡＵＳ）、２×１０−３ＭのＬ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０００ＩＵ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１μＬ／ｍＬのベータ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および１２ｎｇ／ｍＬの白血病抑制因子（ＬＩＦ）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を含有するＫＯ−ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で構成されている。ＭＥＦ細胞を、合計で５枚の１０ｃｍ２／ウェル培養皿（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ−Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）中、２．５ｍＬのＶＮ：ＧＦ−ｈＥＳ／ウェルで培養し、５％ＣＯ２、３７℃で培養した。細胞の播種の４８時間後、培地を毎日交換した。細胞を９６時間培養した後、約１５０ｍｌのＣＭを集めた。
【０１３５】
ヒト胚性幹細胞培養
ＢＧ０１Ｖ  ｈＥＳ細胞（ＡＴＴＣ，Ｍａｎａｓｓａ，ＶＡ，ＵＳＡ）を、ＫＯ−ＤＭＥＭ、０．０２μｇ／ｕＬのｂＦＧＦ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、２×ｌ０−３ＭのＬ−グルタミン、１０００ＩＵ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン、１μＬ／ｍＬのベータ−メルカプトエタノール、１２ｎｇ／ｍＬのＬＩＦおよびノックアウト血清代替物（ＫＳＲ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するｈＥＳ細胞培地中、第６継代マイトマイシン−Ｃ不活性化ＭＥＦ上で培養した。ｈＥＳ細胞を、０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、５％ＣＯ２中、３７℃、３０秒で、１０ｃｍ２の培養皿に、成長率および密集率に応じて１：１〜１：６で分けた。次いで、細胞をｈＥＳ細胞培地中に再懸濁し、５００〜６００ｇで５分間遠心し、０．１％ゼラチン含有第６継代マイトマイシン−Ｃ不活性化ＭＥＦフィーダ層を予め塗布された１０ｃｍ２の培養皿に移した。ｈＥＳ細胞およびフィーダ細胞を、転写後４８時間から、毎日再供給した。
【０１３６】
ｈＥＳ細胞の無血清培養は、先に記載した不活性化ＭＥＦ細胞を１０ｃｍ２の培養皿（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ−Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）で予め平板培養したものを使用することを含み、使用する前に２時間、血清を欠乏させた。次いで、ｈＥＳ細胞を２．５ｍＬの先に記載したＶＮ：ＧＦ−ｈＥＳ培地中の血清が欠乏したＭＥＦに移した。培養物を、５％ＣＯ２中、３７℃で成長させ、最初の移動の４８時間後、毎日再供給した。細胞が密集した時、約７５ｍｌのＣＭを集めた。
【０１３７】
ＫＳＲ対ＶＮ：ＧＦ−ｈＥＳ培地のゲル分析
ＫＳＲ対ＶＮ：ＧＦ−ｈＥＳ含有培地のタンパク質含有量を、１０％の均一濃度ポリアクリルアミドゲルを使用して比較した。簡単に述べると、サンプルを、それらの適正な濃度に希釈し、サンプル緩衝液（４５ｍＬのＴＲＩＳ−ＨＣｌ／ブロモフェノールブルー中５０ｍＬのグリセロール／５ｇのＳＤＳ）中で混合し、１００℃で１０分間変性させた。レーンに、２５０ｋＤａのＡｍｅｒｓｈａｍマーカ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）、０．１μＬのＫＳＲ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１０μＬのＶＮ：ＧＦ−ｈＥＳ培地を負荷した。１×移動緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ／２００ｍＭのグリシン）を用いて、１００ボルトで１〜１．５時間、タンパク質を分離した。次いで、ＧｅｌＣｏｄｅ（登録商標）ＳｉｌｖｅｒＳＮＡＰ（登録商標）染色キットＩＩ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を使用して、バンドが見えるようになるまで３０分、ゲルを銀染色し、次いでＧ：ＢＯＸ  ｃｈｅｍｉ（Ｓｙｎｇｅｎｅ，Ｆｒｅｄｒｉｃｋ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）を使用して、可視化した。
【０１３８】
免疫蛍光法
ステージ特異的胎児抗原−１（ＳＳＥＡ−１）、腫瘍抑制因子抗原１−８１（Ｔｒａ１−８１）および八量体結合転写因子−４（Ｏｃｔ−４）は、ｈＥＳ細胞における多能性のマーカである［１，２］。これらのマーカの存在をモニタリングし、ＣＭが未分化ｈＥＳ細胞から集められたことを確認した。２％パラホルムアルデヒド／抽出緩衝液（ｐＨ７．０で０．５％トリトンＸ−１００，０．１ＭのＰｉｐｅｓ緩衝液，５ｍＭのＭｇＣｌ２および１ｍＭのＥＧＴＡ）を使用して、ｈＥＳ細胞の培養物を１０分間固定した。固定化剤を除去し、培養物を、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中で５分間、３回洗浄し、過剰のパラホルムアルデヒドを除去した。次いで、培養物を、４％ヤギ血清中、２５℃で１時間培養した。この溶液を取り出し、４％ヤギ血清で１：５０に希釈したＳＳＥＡ−１、Ｔｒａ１−８１およびＯｃｔ−４（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）に対する一次抗体および培養物を、２５℃で１時間培養した。一次抗体を取り出し、洗浄ステップを繰り返した。次いで抗マウス二次抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）をＰＢＳで１：１００に希釈し、１時間培養した。二次抗体を取り出し、洗浄ステップを繰り返し、コロニーをＮｉｋｏｎ  ＴＥ−２０００蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ，Ｌｉｄｃｏｍｂｅ，ＮＳＷ，ＡＵＳ）で撮影した。
【０１３９】
ＲＴ−ＰＣＲ分析
ｈＥＳ細胞の分化状態をさらに分析するために、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析を適用して、Ｏｃｔ−４およびアルカリホスファターゼ（ＡＰ）遺伝子の転写産物を検出した。ｔｒｉ試薬およびそれに添付のプロトコル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して、ＲＮＡをｈＥＳ細胞コロニーから単離した。次いで、ｃＤＮＡを産生するためにＲＮＡサンプルをオリゴ−ｄＴ１８ｍｅｒとハイブリダイズさせた。Ｏｃｔ−４プライマーは、センス，５’−ＣＴＴＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＴＧＧＧＴＧ−ＧＡＧＧＡＡ−３’（配列番号１）、およびアンチセンス，５’−ＣＴＧＣＡＧＴＧＴ−ＧＧＧＴＴＴＣＧＧＧ−ＣＡ−３’（配列番号２）であった。アルカリホスファターゼプライマーは、センス，５’−ＴＣＡＧＡＡＧＣＴＣＡＡＣＡＣＣＡＡＣＧ−３’（配列番号３）、およびアンチセンス，５’−ＴＴＧＴＡＣＧＴＣＴＴＧＧＡＧ−ＡＧＧＧＣ−３’（配列番号４）であった。１８ｓＲＮＡ内部標準プライマーは、センス，５’−ＴＴＣＧＧＡＡＣＴＧＡＧＧＣＣＡＴＧＡ−Ｔ−３’（配列番号５）、およびアンチセンス，５’−ＣＧＡＡＣＣＴＣＣＧＡＣＴＴＴＣ−ＧＴＴＣＴ−３’（配列番号６）であった。１μｇのｃＤＮＡを４つのプライマーセットのそれぞれに加え、９４℃５分間の最初の変性ステップに供し、次いで９４℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、および７２℃で３０秒の伸展のサイクルを３５回行い、次いで７２℃で５分間、最後の伸展を行った。次いで、１０μＬのＲＴ−ＰＣＲ生成物を、２％アガロースゲル上、１００ボルトで１時間分析した。次いで、生成物を、エチジウムブロマイド（Ｓｉｇｍａ−Ａｄｌｒｉｃｈ）を使用して視覚化した。
【０１４０】
二次元液体クロマトグラフィプロテオミクス分析
一次元分離のためにＢｉｏＬｏｇｉｃ  Ｄｕｏフローシステム（Ｂｉｏ−ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を使用し、および二次元分離のためにＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ’ｓ  ＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂ（商標）ＰＦ２Ｄ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｇｌａｄｅｓｖｉｌｌｅ，ＮＳＷ，ＡＵＳ）プラットフォームの第２ステージを使用して、二次元液体クロマトグラフィを用いてＣＭサンプルを分画した。最初に、１．２ｍＬの１００％酢酸を使用して、ＣＭをｐＨ４の酸性にし、バルク相ＳＰＥフェニル−シリカ収着剤（Ａｌｌｔｅｃｈ−Ａｕｓｔｒａｌｉａ，Ｄａｎｄｅｎｏｎｇ  Ｓｏｕｔｈ，ＶＩＣ，ＡＵＳ）を用いて濃縮した。簡単に述べると、マトリックスを１００％メタノール中で生成し、１０ｃｍ３の重力流カラム（Ｂｉｏ−ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に注ぎ入れ、０．１％酢酸を含有する３カラム容量の超純水を使用して平衡化した。続いて、疎水性相互作用によって樹脂に結合したタンパク質の入ったカラム（Ｂｉｏ−ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）にサンプルを負荷した。次いで、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する超純水中で、２カラム容量の８０％アセトニトリル（ＡＣＮ）を使用して、結合タンパク質を溶出した。次いで、溶出されたサンプルを、エッペンドルフ濃縮器５３０１（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｓｏｕｔｈ  Ｐａｃｉｆｉｃ，Ｎｏｒｔｈ  Ｒｙｄｅ，ＮＳＷ，ＡＵＳ）を使用して凍結乾燥した。濃縮されたサンプルを２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌを使用して再構成し、タンパク質濃度を、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｌｕｓタンパク質アッセイ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して測定した。ＢｉｏＬｏｇｉｃ  ＤｕｏＦｌｏｗ高速液体クロマトグラフィシステム（Ｂｉｏ−ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）につながれたＵＮＯ−Ｑ（Ｂｉｏ−ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）アニオン交換クロマトグラフィカラムを使用して、タンパク質サンプルを一次元で分割した。簡単に述べると、塩勾配（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬから２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬを含有する５００ｍＭのＮａＣｌへ）を使用してポリペプチドを分画し、０．５ｍＬ／分の流速を使用して、２分間隔で１ｍＬのフラクションを集めた。
【０１４１】
一次元分離が完了すると、タンパク質を含有するアニオン交換フラクションをさらに３０×４．２ｍｍ非多孔性シリカＣ１８カラム中で、高速逆相液体クロマトグラフィを使用して二次元で分離した。逆相クロマトグラフィは、‘ＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂ（商標）ＰＦ２Ｄ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）上へ各フラクションからの２００μＬのサンプルを注入することによって行った。注入サンプルを、０〜１００％ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡの勾配を使用して３０分間、別々に分画し、４分から２４分までの間の１分フラクションを集めた。流速およびカラム温度は、全ての分離に関し、それぞれ、０．７５ｍＬ／分および５０℃を維持した。二次元画像を、ＭＥＦ  ＣＭおよびＭＥＦ：ｈＥＳ細胞ＣＭサンプルの両方について、ＰｒｏｔｅｏＶｕｅソフトウェア（Ｅｐｒｏｇｅｎ，Ｄａｒｉｅｎ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，ＵＳＡ）を使用して作成した。
【０１４２】
サンプル調製およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦ質量分析
２Ｄクロマトグラフィワークフローでサンプルを分画すると、４００μＬの各フラクションを、それらのそれぞれの二次元９６ウェルプレートから集め、先に記載したように凍結乾燥した。次いで、凍結乾燥サンプルを、還元し、アルキル化し、トリプシン消化した。還元は、凍結乾燥タンパク質を１００μＬの還元緩衝液（０．１ＭのＮＨ４ＣＯ３／２０ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ７．９）に再懸濁し、次いで、サンプルを５６℃で１時間培養することによって行った。アルキル化は、１０μＬの５０ｍＭヨードアセタミド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を還元サンプルに加え、該サンプルを暗所中、３７℃で３０分培養することによって行った。次いで、タンパク質を、２．２μＬのシークエンシンググレードの変性トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して消化し、暗所中、３７℃で一晩培養した。次いで、マイクロＣ１８ＺｉｐＴｉｐｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して該サンプルを脱塩し、６０％ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ中の５ｍｇ／ｍｌのアルファ−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）を用い、マトリックス会合レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）プレート上で、ペプチドを直接溶出した。１０倍希釈の標準校正混合物を、トリプシン消化物サンプルがスポットされるＭＡＬＤＩプレートの校正体として使用した。使用したサンプルマトリックスは、５ｍＭのリン酸アンモニウムおよび０．１％ＴＦＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中の５０％アセトニトリル中の濃度が５ｍｇ／ｍｌのＣＨＣＡであった。次いで、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓｔ  Ｌｕｃｉａ，ＱＬＤ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）で、４７００プロテオミクスアナライザＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、サンプルを分析した。質量分析（ＭＳ）スペクトルは、全て、陽性反射体モードで、３２００μＪ／パルスのレーザエネルギで記録した。ＭＳデータは、４７００ＴＯＦ−ＴＯＦ  ＭＳ／ＭＳから得られる各スペクトルについて、１０００ショットを蓄積した。ＴＯＦ−ＴＯＦからのＭＳデータは全て、デフォルト１ｋＶ  ＭＳ／ＭＳ方法を使用し、４５００μＪ／パルスのレーザエネルギで得た。非処理ＴＯＦ−ＭＳおよびＴＯＦ−ＴＯＦ  ＭＳ／ＭＳデータから得た情報は、ＭＳＤＢデータベースの哺乳類エントリを問合わせるために使用し、ＭＡＳＣＯＴデータベースの照合が自動化されたＧＰＳ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。ペプチド集団を検索する場合、以下のパラメータを設定した。誤切断（ｍｉｓｓｅｄ  ｃｌｅａｖａｇｅ）＝２、ペプチドトレランス＝＋／−０．５、酵素＝トリプシン、変動性変性はメチオニンの酸化を含む、固定変性はシステインのカルバミドメチルを含む。ヒットの最高数を選択し、タンパク質スコア、タンパク質スコア信頼区間、総イオンスコア（ＴＩＳ）および総イオンスコア信頼区間を使用して、タンパク質を分析した。
【０１４３】
簡単に述べると、先ず、タンパク質をＴＩＳによってランク付けした。このスコアは、ＭＳ／ＭＳ分析から得られた配列データベース上で、タンパク質がどのくらいよくマッチしているかを示すもので、≧３８のスコアを有意であると仮定した（ｐ＜０．０５のタンパク質配列データは、無作為にマッチした）。≧３８のスコアを持つタンパク質マッチは、さらなる分析に使用された。しかし、ＭＳ／ＭＳデータが得られない場合は、タンパク質をタンパク質スコアに基づいてランク付けした。このスコアは、ペプチド集団が予測されるトリプシン切断ペプチド配列とどのくらいよくマッチするかを示し、≧６０のスコアを有意であると仮定した（ｐ＜０．０５の集団は、無作為にマッチした）。タンパク質は、最も高いタンパク質スコアに基づいて選択したが、≦６０のスコアのタンパク質が数多く報告された。これらのフラクションは、さらなる分析のために使用された。さらに、各タンパク質の報告された機能を、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ，ＰｕｂＭｅｄ、およびＯｎｌｉｎｅ  Ｍｅｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎ（ＯＭＩＭ）検索を使用して調べた。
【０１４４】
サンプル調製およびＬＣ／ＥＳＩ／ＭＳを使用するＬＣ／ＭＳおよびＬＣ−ＭＡＬＤＩ分析
最初に、一次元フラクションおよび原料サンプル（濃縮調整培地）を、それぞれＬＣ／ＥＳＩ／ＭＳおよびＬＣ／ＭＳについて、エッペンドルフ濃縮器５３０１（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｓｏｕｔｈ  Ｐａｃｉｆｉｃ）を使用して凍結乾燥した。次いで、凍結乾燥サンプルを、先に記載したように、還元、アルキル化およびトリプシンで消化した。次いで、液体クロマトグラフィ（ＬＣ）用のサンプルを、５０／５０溶剤Ａ／Ｂ（溶剤Ａ０．１％ギ酸）（溶剤Ｂ０．１％ギ酸中の９０％アセトニトリル）に溶解した。４０／６０の溶剤Ａ／Ｂが入ったＣ１８  ３００Ａカラム（１５０ｍｍ×０．５ｍｍ×５μｍの粒径）（Ｖｙｄａｃ，Ｈｅｓｐｅｒｉａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）に、サンプルを流速３００μＬ／分で負荷した。溶剤送達は、Ａｇｉｌｅｎｔ１１００Ｂｉｎａｒｙ  ＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｉｎｃ  Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を使用して実施した。
【０１４５】
エレクトロスプレー質量分析を、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓで、大気圧イオン化源（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を備える４０００ＥＳＩ−ＱｑＬＩＴ質量分析計（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して行った。データは、Ａｎａｌｙｓｔ１．４．１ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して獲得した。タンパク質分析は、先に記載したような、ＭＡＳＣＯＴ  データベースＧＰＳ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（商標）ソフトウェア（バージョン４．０）を使用して行い、質量／イオンピーク情報は、ＭＳおよびＭＳ／ＭＳスペクトルの両方から得た。簡単に述べると、スコアは−１０＊Ｌｏｇ（Ｐ）（ここで、Ｐは、観察された一致が偶然事象である蓋然性）である。＞３８の個々のイオンスコアは、同一性または広範な相同性（ｐ＜０．０５）を示す。
【０１４６】
あるいは、１：１容積の５ｍｇ／ｍＬのＣＨＣＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）：ＬＣ−ＭＡＬＤＩ分析用タンパク質サンプルを使用して、ＬＣ相から集めたサンプルをＭＳプレート上にスポットした。Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅで、４７００プロテオミクスアナライザ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、プレートを分析した。ＭＳ／ＭＳ  Ｍａｓｓ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に含有される質量基準を使用して、ＭＳおよびＭＳ／ＭＳデータのプレート幅校正を行った。次いで、先に記載したＧＰＳ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（商標）タンパク質分析ソフトウェア（バージョン４．０）を使用して、ＭＡＳＣＯＴデータベースの自動検索から、潜在的なタンパク質一致を同定し、質量／イオンピーク情報を、ＭＳおよびＭＳ／ＭＳスペクトルから得た。次いで、各タンパク質の機能を、先に記載したように調べた。
【０１４７】
結果
ＶＮ：ＧＦ−ｈＥＳ培地対ＫＳＲ含有培地におけるタンパク質含有量
最初にｈＥＳ細胞を冷凍貯蔵から蘇生させ、次いで２０％ＫＳＲ含有培地を使用して、ＭＥＦ細胞上で培養した。しかし、重要な因子をマスクすることによって、血清アルブミンのような血清中に豊富に存在するタンパク質は、計画されたプロテオミクス分析を実行できることが認められた。したがって、無血清培地、ＶＮ：ＧＦ−ｈＥＳを、細胞の培養のために使用した。ＫＳＲ対ＶＮ：ＧＦ−ｈＥＳの総タンパク質含有量を比較するため、１０％等張ポリアクリルアミドゲルを使用するＰＡＧＥ分析を行った。この分析により、ＶＮ：ＧＦ−ｈＥＳ（図１、レーン２）は、多数の同定されていないタンパク質を明らかに含有するＫＳＲ（図１、レーン１）に比べて、最小限のタンパク質を含有することが明らかになった。
【０１４８】
ＶＮ：ＧＦ−ｈＥＳ培地で成長させたｈＥＳ細胞およびＭＥＦ細胞の組織形態
ｈＥＳ細胞は、ＶＮ：ＧＦ−ｈＥＳ培地を無血清培地として使用した場合、未分化状態で、接着し、増加し、生存することができることはすでに実証されている（Ｒｉｃｈａｒｄｓ２００３非公開データ）。分析すべき調整培地（ＣＭ）が未分化ｈＥＳ細胞から集められたことを確認するため、細胞の形態学的検査を行った。この実験により、ＶＮ：ＧＦ−ｈＥＳで増殖されたｈＥＳ細胞は、ＫＳＲ含有培地において成長させたものに類似する、きつく密接したコロニーを維持することが明らかになった（それぞれ図２Ｆおよび２Ｂを参照）。さらに、無血清培地で増殖させたＭＥＦ細胞は、ＫＳＲで増殖されたものに類似する組織形態を示した（それぞれ、図２Ｅおよび２Ａ）。
【０１４９】
ＶＮ：ＧＦ−ｈＥＳ培地で成長させたｈＥＳ細胞のマーカ発現
現在、ｈＥＳ細胞の多能性を特徴付ける決定的なマーカは存在しない。しかし、ｈＥＳ細胞は、数種のマーカ、たとえば、ＳＳＥＡ−４、Ｏｃｔ−４およびＴＲＡｌ−８１（これらは全て未分化ｈＥＳ細胞に対して特異的である）を発現する。これらのマーカは、まとめて、ｈＥＳ細胞が表現型的に未分化であることを検証するために、日常的に使用される［２９］。ＶＮ：ＧＦ−ｈＥＳ培地で成長させた細胞が未分化であったことを確かめるため、ＴＲＡ１−８１およびＯｃｔ−４に対する抗体を選択し、ｈＥＳ細胞の分化状態を分析した。Ｏｃｔ−４（緑色）およびＴＲＡ１−８１（赤色）は両方とも、ＫＳＲ条件およびＶＮ：ＧＦ−ｈＥＳ条件下で培養されたｈＥＳ細胞上でのタンパク質発現が高いレベルであることを明らかにした（それぞれ、図２Ｃおよび２Ｇ、ならびに図２Ｄおよび２Ｈ）。さらに、蛍光標識された、ＳＳＥＡ−４（未分化細胞によって発現）に対する二次抗体、および蛍光標識された、ＳＳＥＡ−１（未分化細胞によって発現されない）に対する二次抗体を選択し、ｈＥＳ細胞分化状態をさらに分析した。この分析により、ＳＳＥＡ−４は、ＫＳＲまたはＶＮ：ＧＦ−ｈＥＳ培地のどちらかで培養された細胞上で発現されることが明らかになった（データは示さず）。同様に、ＳＳＥＡ−１は、ＫＳＲまたはＶＮ：ＧＦ−ｈＥＳ培地のどちらかで培養された細胞上では発現されなかった（データは示さず）。二次抗体のみを用いてｈＥＳ細胞を培養した場合、免疫反応性は観察されなかった（データは示さず）。
【０１５０】
ＶＮ：ＧＦ−ｈＥＳで成長させたｈＥＳ細胞のＲＴ−ＰＣＲ分析
ＴＲＡ１−８１、Ｏｃｔ−４およびＳＳＥＡ−４の発現はともに、未分化ｈＥＳ細胞コロニーを同定するには確実ではない。したがって、２種の遺伝子、Ｏｃｔ−４およびＡＰ（アルカリホスファターゼ）の発現におけるＲＴ−ＰＣＲ分析を行い、ｈＥＳ細胞の分化状態をさらに検証した。サンプルが相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）、またはゲノムデオキシリボ核酸（ｇＤＮＡ）で汚染されていないことを確証するため、ネガティブコントロールのシリーズでは、テンプレートを省略した（データは示さず）。プライマーを遺伝子内で異なるエクソンにアニールするように設計し、したがって、ＰＣＲ反応中に存在する任意の汚染ゲノムデオキシリボ核酸（ｇＤＮＡ）は、ｃＤＮＡより大きな分子量バンドになる。この分析により、ＫＳＲ（図３Ａ）およびＶＮ：ＧＦ−ｈＥＳ培地（図３Ｂ）で成長させたｈＥＳ細胞コロニーは、Ｏｃｔ−４、ＡＰおよび１８ｓＲＮＡ（内部標準コントロールとして含まれる）に関するｍＲＮＡを発現したことが明らかになった。さらに、この実験により、プロテオミクス分析のために集められたＣＭは、未分化ｈＥＳ細胞から集められたということが立証される。
【０１５１】
ＭＥＦ単独およびＭＥＦ：ｈＥＳ細胞培養の両方から集めた調整培地の二次元分離
ＭＥＦ細胞単独（図４Ａおよび４Ｂ）、およびＭＥＦ：ｈＥＳ細胞（図５Ａおよび５Ｂ）からのＣＭ中に存在するタンパク質を、二次元液体クロマトグラフ分離の新規な形を使用して分離した。この方法は、一次元において塩勾配によってタンパク質を分離することを含んだ。次いで、タンパク質を含有する一次元フラクションを、Ｈ２Ｏ  ＡＣＮ勾配を採用する二次元分離手法を使用して分析した。次いで、ＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂ（商標）ソフトウェアパッケージＰｒｏｔｅｏＶｕｅを使用して、タンパク質を視覚化した。タンパク質プロファイルにおける明らかな相違は、ＭＥＦ細胞単独ＣＭ（図４Ｂ）とＭＥＦ：ｈＥＳ細胞ＣＭ（図５Ｂ）との間ではっきりしていた。このプロテオミクス手法により、数種のタンパク質がＣＭ中で観察されたが、本明細書ではｈＥＳ細胞インビトロ微小環境に関連するタンパク質のみを検討する。ＭＥＦ細胞単独からの合計１９２個のタンパク質、およびＭＥＦ：ｈＥＳ細胞からの２４７個のタンパク質を、３つの個別の二次元クロマトグラフプロファイルから同定した（それぞれ、図４Ｂおよび５Ｂ）。次いで、これらのタンパク質を単離し、消化し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦ分析に供した。さらに、ＭＥＦ  ＣＭからの３５個のフラクションおよびＭＥＦ：ｈＥＳ細胞ＣＭからの３８個のフラクションを、それらの一次元分離物から単離し、消化し、ＬＣ／ＥＳＩ／ＭＳに移した（それぞれ、図４Ａおよび５Ａ）。さらに、ＭＥＦ  ＣＭからの１個の原料サンプル（濃縮、凍結乾燥およびトリプシン消化されたもの）、およびＭＥＦ：ｈＥＳ細胞ＣＭからの１個の原料サンプルを、加工し、ＬＣ−ＭＡＬＤＩに供した。
【０１５２】
ＭＥＦ細胞単独およびＭＥＦ：ｈＥＳ細胞の調整培地からの同定タンパク質
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦ、ＬＣ／ＥＳＩ／ＭＳおよびＬＣ−ＭＡＬＤＩの三つの方法を使用して、ＭＥＦ  ＣＭおよびＭＥＦ：ｈＥＳ細胞ＣＭ中のタンパク質を分析した。Ｍａｓｃｏｔデータベースを使用して、ＣＭ内に存在するタンパク質を分析し、結果を、７種のタンパク質種である、ＥＣＭ、膜、核、分泌、分化および成長因子、ならびに血清由来に編成した。さらに、アクセッション番号、分子量、タンパク質スコアおよびイオンスコアを使用して、タンパク質を分類した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦ結果をタンパク質スコアに関連させた。ＭＥＦ  ＣＭ培地に関するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦ結果により、３種のＥＣＭ、３種の膜、３種の核、１種の細胞質、４種の分泌、ならびに７種の分化および成長因子タンパク質が明らかになった（表１）。さらに、ＭＥＦ：ｈＥＳ細胞ＣＭに関するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦ結果により、４種の膜、４種の核および６種の分泌タンパク質が明らかになった（表２）。核タンパク質ヘテロ核リボヌクレオタンパク質Ｍ（表２）以外の全てのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦ結果は、それらのタンパク質スコアによって測定されたように、未確認であった。ＬＣ／ＥＳＩ／ＭＳ結果はイオンスコアに関連する。ＭＥＦ  ＣＭに関するＬＣ／ＥＳＩ／ＭＳ結果により、１１種のＥＣＭ、４種の膜、５種の核、１種の細胞質、３種の分泌および３種の血清由来タンパク質が明らかになった（表１）。さらに、ＭＥＦ：ｈＥＳ細胞ＣＭに関するＬＣ／ＥＳＩ／ＭＳ結果により、１２種のＥＣＭ、４種の膜、６種の核、６種の細胞質、１種の分泌、および２種の血清由来タンパク質が明らかになった（表２）。また、ＬＣ−ＭＡＬＤＩ結果はイオンスコアに関連する。ＭＥＦ  ＣＭに関するＬＣ−ＭＡＬＤＩ結果により、１種のＥＣＭ、１種の膜、２種の細胞質、および１種の分泌タンパク質が明らかになった（表１）。さらに、ＭＥＦ：ｈＥＳ細胞ＣＭに関するＬＣ−ＭＡＬＤＩ結果により、１種の細胞質と、２種の分泌タンパク質が明らかになった（表２）。ＬＣ／ＥＳＩ／ＭＳ分析によって明らかにされたタンパク質は全て、それらのイオンスコアによって測定されたように、確認され、あるいは広範な相同性を示す。先に記載した三つの分析は、全て、返された結果の妥当性を上げるために行った。
【０１５３】
検討
１９９８年に最初に誘導されて以来［１］、ｈＥＳ細胞は、組織置換および修復のためのインビトロ細胞の最も見込みのある供給源の一つとなっている。しかし、これらの「原始」細胞は、未分化増殖を維持するために、ＭＥＦ細胞およびウシ血清のような異物由来成分を必要とする。これらの細胞から誘導される生成物を受ける患者は、なんらかの事情で、これらの定義付けが不十分でおよび／または異物由来の培養成分中に存在するかもしれない、「新しい変異体クロイツェルトヤコブ病」のような疾患に感染するかもしれないため、これは大きな問題を有している。しかも、Ａｊｉｔ  Ｖａｒｋｉ博士は、これらの異種培養条件において増殖されたｈＥＳ細胞株が、ＭＥＦフィーダ細胞によってもたらされると考えられた、非ヒトシアル酸Ｎｅｕ５Ｇｃを獲得したことを実証した［３０］。この発見は、ｈＥＳ細胞が、それらのインビトロ微小環境に存在する因子に対して脆弱であることを明確に実証する。したがって、これらの細胞の治療可能性をかなえるつもりであれば、これらの異物由来成分を現在の培養系からなくすことは、明らかに必要である。
【０１５４】
これを考慮して、世界中の多くの研究者らが、完全に定義され、異種物質を含まない培養系の開発を試みている。近年、Ｒｅｃｅｎｔｌｙ  Ｌｕｄｗｉｇら（２００６）は、ＴｅＳＲ１と呼ばれる、無フィーダ誘導方法およびｈＥＳ細胞株の増殖方法を発見した［１７］。ＴｅＳＲｌ法は、ｈＥＳ細胞のインビトロ増殖に成功をもたらしたが、１３ｍｇ／ｍｌのＨＳＡおよび２３μｇ／ｍＬのインスリンのように、かなりの量のタンパク質を必要とした。高濃度の成長因子により、ｈＥＳ細胞は潰瘍化するかもしれないので、これは、理想にはほど遠いものである。さらに、アルブミンが担体タンパク質であることを考えれば、精製ＨＳＡが、まだ同定されていない他のタンパク質を高濃度で含む可能性が非常に高い。したがって、このＴｅＳＲ１技術は、ｈＥＳ細胞の大規模な増殖に関し、商業的に実行可能ではない。さらに、Ｌｕｄｗｉｇら（２００６）は、ｈＥＳ細胞をＴｅＳＲｌ培養系で５ヶ月培養した時、４７ＸＸＹ核型を観察し、したがって、これらの細胞には治療的な発展はない［１７］。ｈＥＳ細胞の連続増殖用のＶＮ：ＧＦ−ｈＥＳと呼ばれる完全に定義された無血清培地は、未分化状態において、ｈＥＳ細胞の長期間増殖を可能にする［３１］。しかし、ｈＥＳ細胞の自己再生には、ＭＥＦの使用が未だ必要であり、したがって、これらの細胞のｈＥＳ細胞インビトロ微小環境への重要性が強調される。
【０１５５】
現在まで、ｈＥＳインビトロ微小環境において、ＭＥＦ細胞がどんな役割を持つのかは未だはっきりしていない。しかし、皮膚角化細胞の増大のために使用されるｉ３Ｔ３、マウス胚性線維芽細胞株化細胞は、大量のＩＧＦおよびＥＣＭタンパク質［３２］、ならびに種々の他の成分を分泌することが実証されている。したがって、ＭＥＦが、ｈＥＳ細胞の自己再生に重要な類似のタンパク質を分泌していることを想定することができる。多種多様なこれらのＥＣＭタンパク質は、ｈＥＳ細胞のための自己再生環境を促進することがますます評価されてきている。これらのタンパク質として、精製コラーゲン［３３］、ラミニン［１８，３３］、フィブロネクチン［２０，３３］およびマトリゲル（商標）［３３］が挙げられる。しかし、これらのＥＣＭ培養技術は、培地に他の成長促進成分を加えることでしか成功していない。これを強調するように、Ｘｕら（２００１）は、ラミニンおよびマトリゲル（商標）のみが、ＭＥＦによって調整された培地と組み合わせて使用した場合、ｈＥＳ細胞の増殖に成功することを発見した［１８］。このことは、ｈＥＳ細胞の生存に重要な成長促進成分は、ＣＭ中のＭＥＦによって分泌するかもしれないことを示唆する。
【０１５６】
これに鑑み、本発明者らは、ＭＥＦフィーダ細胞は、ｈＥＳ細胞の自己再生に重要な新規のタンパク質を分泌し、これらのタンパク質は、進歩したプロテオミクス技術の使用によって同定されるかもしれないと仮定した。近年、Ｐｒｏｗｓｅら（２００５）、ならびにＷｅｅ  Ｅｎｇ  ＬｉｍおよびＢｏｄｎａｒ（２００２）は、線維芽細胞フィーダ細胞およびそれらのそれぞれのＣＭのプロテオミクスプロファイルを分析した。これらの研究は、線維芽細胞が何をｈＥＳ細胞インビトロ微小環境にもたらすのかということにある予備的な見識を与えている。しかし、この研究は、ＭＥＦからのＣＭばかりでなく、ｈＥＳ細胞を持つＭＥＦの共培養物からのＣＭを分析することによって、この方法をさらに一歩進める。
【０１５７】
本明細書で報告したように、完全に定義された培地、ＶＮ：ＧＦ−ｈＥＳがｈＥＳ細胞の未分化成長をサポートしたことが改めて明らかにされた（図１〜３）。本研究は、ＫＳＲ含有培地における細胞培養よりむしろ、ＶＮ：ＧＦ−ｈＥＳにおける細胞の培養が、ＣＭ内のタンパク質の分割に改良をもたらしたことを実証した（図１）。さらに、この分析は、ＶＮ：ＧＦ−ｈＥＳ培地は、最小のタンパク質含有量を有していたことも明らかに実証した。対照的に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、ＫＳＲ培地内の多くの非常に豊富なタンパク質の存在を明らかにし、そのうちのいくつかは、該細胞によって分泌された重要な因子をマスクした可能性がある（図１、レーン１）。しかしながら、ＶＮ：ＧＦ−ｈＥＳ培地の最小のタンパク質含有量にもかかわらず、後続の質量分析で、アルファ−２−ＨＳ−グルコタンパク質およびアルブミンのような数種のウシ血清タンパク質が、まだ、ＶＮ：ＧＦ−ｈＥＳ培地で無血清培養された細胞から集められたＣＭ内に存在することが明らかにされた。細胞をＶＮ：ＧＦ−ｈＥＳ培地に移す前に、細胞はウシ血清含有培地で培養されたので、これは全く予期できなかった。そのうえ、アルブミンのような非常に豊富な血清タンパク質は、細胞外表面および培養容器に接着し、結合することが多く、したがって、洗浄ステップのみでこれらを完全に除去することを難しくしていた。さらに、Ｐｒｏｗｓｅら（２００５）、ならびにＬｉｍおよびＢｏｎｄａｒ（２００２）によって、無血清培地での細胞の培養の前に一連の洗浄を加えて行ったとしても、プロテオミクス分析で、数種のウシ血清タンパク質が観察されたことが報告された。それにもかかわらず、彼らの研究および本研究の両方において採用された、無血清条件に移す前の一連の洗浄および血清欠乏ステップにより、これらの血清由来成分の存在をＣＭ中で大幅に減らしたことは明らかである。したがって、これらのウシタンパク質は、プロテオミクスプロファイルの分割を著しく妨害しなかった（図３Ｂおよび図４Ｂ）。しかしながら、本明細書で強調されるべき他のプロテオミクス分析と比べると、本手法には重要な相違がある。すなわち、本研究で集められたＣＭは、細胞成長に最適な、すなわちＶＮ：ＧＦ−ｈＥＳが含有された培地を採用した。対照的に、Ｐｒｏｗｓｅら（２００５）、ならびにＬｉｍおよびＢｏｎｄａｒ（２００２）で使用されたプロテオミクス戦略では、分裂促進サプリメントを含まない無血清培地が使用され、すなわち、先の研究におけるＣＭは、「飢餓状態」および／または「ストレスのかかった」細胞から集められたものであり、したがって、最適成長条件ではなかった。
【０１５８】
また、本明細書で報告されたＣＭの分析は、ＭＥＦ細胞単独およびＭＥＦ：ｈＥＳ細胞培養の両方からの細胞外マトリックスタンパク質（ＥＣＭ）のように、普通細胞分泌物を含まないＣＭ内に数多くのタンパク質を確実に同定した。これらのタンパク質の存在は、タンパク質分解現象によるものであろう。たとえば、試みに、コラーゲナーゼ３活性をＭＥＦ：ｈＥＳ細胞ＣＭ内で同定した。さらに、この研究で確認されたＥＣＭタンパク質のうちの数種は、無フィーダ培養系で一般的に使用され、ｈＥＳ細胞の接着および増殖をサポートする。これらとして、コラーゲンＩおよびＩＶ、フィブロネクチン１［２０］、ラミニンＭ、ラミニンアルファ１、４および５［２１，１８，３４］、ならびにプロテオグリカン［１８］（表１および２）が挙げられる。その上、前記ＥＣＭタンパク質の数種は、ＥＣＭタンパク質に類似することが、Ｐｒｏｗｓｅら（２００５）、ならびにＬｉｍおよびＢｏｎｄａｒ（２００２）によって、ヒトおよび動物フィーダ細胞ＣＭにおいて、確実に同定され、したがって、ＣＭにおけるこれらのタンパク質の潜在的重要性が強化される。さらに、ＭＥＦ  ＣＭにおいて確認され、Ｐｒｏｗｓｅら（２００５）によってもヒトフィーダ細胞ＣＭにおいて確実に同定されたトロンボスポジン１は、細胞接着、移動および増殖における役割を実証している［３５，３６］。トロンボスポジン１遺伝子は、ｈＥＳ細胞の自己再生において重要な役割を持つ３種の成長因子である、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）［３７］、ｂＦＧＦ［３７］、および形質転換成長因子−ベータ（ＴＧＦ−ベータ）［３８］と相乗的に作用することが知られている。関心のある他のＥＣＭタンパク質として、コラーゲンＶ、ＶＩＩ、ＸＩ、ＸＩＩおよびＸＶ、テネイシンＸ、およびベルシカンコアタンパク質が挙げられる。これらのタンパク質は、ｈＥＳ細胞培養において検討されていないが、それぞれ、重要な機能、たとえば、細胞接着、増殖および移動を有し、したがって、ｈＥＳ細胞自己再生をサポートしうる環境にも貢献するかもしれない。
【０１５９】
先に検討したように、ＥＣＭタンパク質は、成長促進剤が加えられた場合に、ｈＥＳ細胞の広がりのサポートを成功させることが証明されているだけである。重要なことは、ＭＥＦ細胞ＣＭにより、ｈＥＳ細胞の自己再生に関係する数種の成長因子、たとえば、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＴＧＦ−ベータ２、ＰＤＧＦ、骨形成タンパク質１５（ＢＭＰ１５）、上皮成長因子（ＥＧＦ）および肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）が明らかになったことである（表１）。今日、ｈＥＳ細胞培養に加えられる最も重要な成長成分の一つはインスリンである［３９］。興味深いことに、ＩＧＦ−Ｉは、角化細胞の培養の間、インスリンの必要性に置き換わることができることが実証されている［２６］。実際、ＩＧＦ−Ｉは、ＶＮ：ＧＦ−ｈＥＳ無血清培地の主要な成分であり、ｈＥＳ細胞培地においてインスリンの必要性を置き換えることを実証している［３１］。さらに、前研究により、ＩＧＦ−ＩＩとビトロネクチン（ＶＮ）との間の相乗的な相互作用は、細胞移動を増やす結果となることが実証されている［４０，４１］。予備的研究では、ＩＧＦ−ＩＩが、ｈＥＳ細胞の増殖および自己再生も促進するかもしれないことを示唆する［３１］。ＴＧＦ−ベータおよびＰＤＧＦは、未分化状態でのｈＥＳ細胞の維持にある役割を持つことも実証されている［１６，２３］。興味深いことに、Ｈｏｌｌｉｅｒら（２００５）およびＳｃｈｏｐｐｅｔら（２００２）は、これらのヘパリン結合成長因子はどちらも、ＶＮに結合し相互作用する能力を有することを実証した［２６，４２］。本発明のプロテオミクス分析によってＣＭ内で観察された他の成長因子として、ＥＧＦおよびＨＧＦが挙げられる。これらは、ｈＥＳ細胞において分化を活性化することも報告されている［４３］。しかし、ｈＥＳ細胞培養に加えられる一般的な自己再生成分であるｂＦＧＦ［４４，４５］は、Ｓｃｈｕｌｄｉｎｅｒら（２０００）によって、ｈＥＳ細胞分化を含むことも報告されている。このデータは、成長因子が、それらの濃度および／または発現のレベルに依っては、分化において拮抗作用を持つことを示唆する。したがって、分化を起こすことが示された２種の成長因子、ＥＧＦおよびＨＧＦは、適正な濃度で使用された場合、ｈＥＳ細胞のための自己再生環境も促進するかもしれない。ＣＭにおいて観察されるＢＭＰ１５に関して、この成長因子とｈＥＳ細胞との間の関係を調査する研究は、今はない。しかし、ＢＭＰ４は、ｈＥＳ細胞分化を促進することを実証している［４６］。したがって、ＢＭＰ１５がＢＭＰ４に類似する効果を持つなら、ノギン［４７］、フォリスタチン［４８］、アクチビン−Ａ［４９］およびｂＦＧＦ［２２］のような拮抗剤を培地に添加することにより、ｈＥＳ細胞用の自己再生微小環境を提供することができる。したがって、このプロテオミクス手法により観察される多くのタンパク質が、ＶＮ：ＧＦ−ｈＥＳ培地とともに使用し、ＭＥＦ細胞と共培養すべきｈＥＳ細胞の必要性を取去ることができる候補因子であるかもしれないことは明らかである。
【０１６０】
もしもこれらの成長因子がｈＥＳ細胞の増殖に有用であることがわかれば、これらのそれぞれのレセプタも発現されるに相違ない。本明細書で報告されているＣＭのプロテオミクス分析により、両方ともｈＥＳ細胞成長に関連する、線維芽細胞成長因子レセプタ（ＦＧＦＲ）およびインスリンレセプタ（ＩＲ）を含む数種の成長因子レセプタが明らかになった［５０，３９］。しかし、この研究では、ＦＧＦ［５１，５２］およびインスリン［５３−５５］レセプタの活性を阻害することが実証されている、成長因子レセプタ結合タンパク質１４（Ｇｒｂｌ４）も明らかにされている。したがって、ｈＥＳ細胞におけるＧｒｂｌ４の発現は、ＦＧＦおよびインスリンレセプタによって開始される重要なシグナル伝達経路の不活性化を調節し、ｈＥＳ細胞の自己再生を間接的に調節するかもしれない。
【０１６１】
個々のタンパク質が無フィーダ系における細胞の成長をサポートすることが同定されうるが、これらの候補の多くが、複合体経路およびシグナル伝達現象に関連することは明確である。たとえば、ＭＥＦ  ＣＭにおいて見出されるＷｎｔ２ｂおよび分泌フリッツルド関連タンパク質２は、ｈＥＳ細胞自己再生のために重要なＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達において役割を持つことが知られている［５６］。Ｗｎｔ２ｂは、β−カテニンを安定化することによってこの機能を誘発し、これによってＴｃｆ／ＬＥＦ標的遺伝子の転写を活性化しているようであり［５７］、分泌フリッツルド関連タンパク質２は、Ｗｎｔシグナル伝達経路を限定する分泌フリッツルド関連タンパク質１を抑制することによって、誘発しているようである［５８］。さらに、ＭＥＦ：ｈＥＳ細胞ＣＭに見出されるカゼインキナーゼＩ（イソ型アルファ）は、ベータ−カテニンの安定化およびＷｎｔシグナルの標的である遺伝子の導入を改善することが実証されている［５９］。カゼインキナーゼＩ（イソ型アルファ）は、Ｗｎｔ経路の公知の成分であり、ＭＥＦ：ｈＥＳ細胞ＣＭに存在する、リン酸化のディシブルドを結合し増加することも報告されている［６０］。ＭＥＦ  ＣＭで同定される転写因子、ＴＢＸ２０は、Ｗｎｔ経路を確実に調節することも実証されている［６１］。明らかに、複合体相互作用がこの経路内で起こるが、さらなる研究および分析では、ｈＥＳ細胞を自己再生させるＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の活性化における成分（複数を含む）が明らかにされるかもしれない。
【０１６２】
さらに、両方ともＣＭに確実に同定される、腫瘍拒絶抗原１（Ｔｒａ１）相同体およびフォリスタチン関連タンパク質１（表１，２）は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）の調節において役割があり、したがって、ｈＥＳ細胞の自己再生に関係している［６２］。これらもＭＥＦ：ｈＥＳ細胞ＣＭで確実に同定される、Ｔｒａ１相同体およびｍｙｃ結合タンパク質２は、ｃ−ｍｙｃの調節によってｈＴＥＲＴを活性化することが報告されている［６３］。興味深いことに、フォリスタチン関連タンパク質１は、アクチビン−Ａ  ［６４］およびＴＧＦ−βを不活性化することが実証されており、これら２つのタンパク質は、ｈＴＥＲＴを抑制することが実証されている［６５］。逆に、アクチビン／ＴＧＦ−β／結節枝は、ｈＥＳ細胞自己再生を誘発することが実証されている［１６］。したがって、前記研究は、ＴＧＦ−βはｈＴＥＲＴを阻害し、したがって分化も阻害するが、アクチビンと一緒になって作用し、ｈＥＳ細胞における多能性を促進し、そのため、調節経路内に存在する複雑性が強調されることを示唆する。
【０１６３】
胚性幹（ＥＳ）細胞の自己再生に重要な別の経路は、シグナル伝達性転写因子３（ＳＴＡＴ３）経路である［６６］。この研究により、ＳＴＡＴ３の調節に関与することが知られているＣＭ中の２種のタンパク質、すなわち、Ｅ３ＳＵＭＯ（阻害する）およびＥＧＦ（活性化する）が明らかになっている。Ｅ３Ｓｕｍｏは、ＳＴＡＴ３のＤＮＡ結合活性をブロックすることによって、ＳＴＡＴ３経路の調節を阻害するようであり［６７］、一方ＥＧＦは、マウスの肝細胞において、チロシンリン酸化およびＳＴＡＴ３の核転移を誘発するようである［６８］。いくつかの他の研究により、インターロイキン（ＩＬ）−６のようなサイトカインの添加により、ｇｐｌ３０レセプタが活性化され、マウスのＥＳ細胞におけるＳＴＡＴ３のリン酸化を誘発することが明らかにされている［６９］。しかし、ＩＬ−６は、ｈＥＳ細胞では、同じ応答を誘発することには失敗している［７０］。それにもかかわらず、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−８、ＩＬ−１３のような数種のサイトカインは、ＭＥＦおよびＭＥＦ：ｈＥＳ細胞ＣＭの両方において分泌されていることが見出された。したがって、これらのサイトカインの１種または数種が、ｇｐｌ３０レセプタに結合し、ＳＴＡＴ３経路を誘発し、したがって、ｈＥＳ細胞の自己再生をサポートしていると予測することは、不合理ではない。
【０１６４】
まとめると、この予備的な研究は、ｈＥＳ細胞インビトロ微小環境への興味をそそる見識を、初めて明確に明らかにしている。新しい技術により、単離において、ＭＥＦ細胞が何を分泌するかばかりでなく、ｈＥＳ細胞とともに生じるパラクリンに応答して、それらが何を分泌するかについても同定することを実証している。この研究で明らかにされた数種の候補タンパク質は、分化、増殖および細胞成長において役割を持つ。したがって、さらなる研究では、これらの候補タンパク質の存在の確認およびｈＥＳ細胞培養系に関するこれらのインビトロ生物活性の評価に焦点が合わせられるだろう。この研究は、おそらく、ｈＥＳ細胞のインビトロ微小環境を完全に理解するための最初のステップであり、実際、初めて、ｈＥＳ細胞用の完全に定義された合成培養系を得ることができる。この開発は、移植のための治療的に実行可能な組織源に道を開くものである。
（実施例２）
インビトロで培養された角化細胞により調整された培地のプロテオミクス分析
この実験は、角化細胞インビトロ微小環境の包括的な試験を行うことを目的とした。特に、角化細胞成長に必要なフィーダ細胞によって産生する重要な因子を同定するために、プロテオミクス手法を採用した。さらに、充分に定義され、最小タンパク質含有量を持つ先に記載した無血清培地を利用した。この無血清培地の最小タンパク質含有量は、角化細胞成長をサポートするのに重要な、フィーダ細胞によって分泌される決定的な因子を「マスク」しないという大きな利点を提供する。さらに、血清含有培地は、普通、プロテオミクス分析の前に前加工ステップ、たとえば「Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｍｏｖａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ」（ＭＡＲＳ）（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を必要とする。このＭＡＲＳ免疫除法は、血清含有培地からの非常に豊富なタンパク質の除去を含み、これにより、初代角化細胞の自己再生のために重要な候補因子を失う結果となる可能性がある。同様に、「調整」培地の収集において日常使用される手法である、無血清基本培地中での細胞の成長の必要がない。その代わりに、分析すべき培地は、それらの通常の「成長」培地で培養した細胞から集められた。したがって、それらは、栄養が不足したストレス状態にあるというよりも、むしろ活発に成長した。まとめると、インビトロ角化細胞培養微小環境で産生される決定的な因子を同定するために、これらの特徴は、理想的かつ独特な立場を提供する。
【０１６５】
方法
初代角化細胞の単離
初代角化細胞を、Ｇｏｂｅｒｄｈａｎら（１９９３）に記載されるように、乳房縮小術および腹壁形成術から得られた中間層皮膚生検体から単離した。簡単に述べると、この方法は、皮膚生検体を０．５ｃｍ２片に解体する工程を含み、その後一連の抗生物質洗浄ステップが続いた。次いで、皮膚を、４℃で一晩、０．１２５％トリプシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｍｕｌｇｒａｖｅ，ＶＩＣ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）中で培養した。次いで、表皮を真皮層から分離し、角化細胞を単離した。次いで、角化細胞を、ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に懸濁し、ろ過（１００μｍ）し、ペレット化した。
【０１６６】
ＶＮ：ＧＦ−Ｋｃ培養
新しく単離した角化細胞を、最初に、７５ｃｍ２フラスコ中、２×１０６個の細胞の密度で培養し、連続継代のために、７５ｃｍ２フラスコ当たり２×１０３個の細胞を播種した。角化細胞を播種する前に、γ線照射された（２５Ｇｙの２線量）（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｒｅｄ  Ｃｒｏｓｓ  Ｂｌｏｏｄ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｂｒｉｓｂａｎｅ，ＱＬＤ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）マウスｉ３Ｔ３細胞フィーダ層を、２×１０６個の細胞で４時間、前播種した。次いで、フィーダ層を３時間血清欠乏させ、次いで播種を行った。角化細胞を、フェノールレッドのないＤＭＥＭ／ＨＡＭＳ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．４μｇ／ｍＬのヒドロコルチゾン、０．１ｎＭのコレラ毒素、１．８×１０−４Ｍのアデニン、２×１０−７Ｍのトリヨード−１−チロニン、５μｇ／ｍＬのトランスフェリン、２×１０−３Ｍのグルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０００ＩＵ／ｍＬのペニシリン、１０００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．６μｇ／ｍＬのＶＮ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ａｎｎａｎｄａｌｅ，ＮＳＷ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）、０．６μｇ／ｍＬのＩＧＦＢＰ−３（Ｎ１０９Ｄ組換え変異体）（Ａｕｓｐｅｐ，Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ，ＶＩＣ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）、０．２μｇ／ｍＬのＩＧＦ−Ｉ（ＧｒｏＰｅｐ，Ａｄｅｌａｉｄｅ，ＳＡ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）、および０．２μｇ／ｍＬのＥＧＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（ＶＮ：ＧＦ−Ｋｃ）を含有するＶＮ：ＧＦ培地で増殖させた。角化細胞培養物を、５％二酸化炭素中３７℃で培養し、隔日にＶＮ：ＧＦ−Ｋｃ培地を再供給した。組織形態およびマーカ発現を使用して、この実験で使用した角化細胞が血清を使用して成長したものと表現型的に類似することを確認した。簡単に述べると、これは、ケラチン６、未分化角化細胞によって発現されたマーカに対する抗体で、培養物をプロービングすることを含んでいた。
【０１６７】
二次元プロテオミクス
本明細書の先に記載した実施例１中の方法を使用して、二次元液体クロマトグラフィを、調整培地サンプルを分画するために使用し、一次元分離のために、ＢｉｏＬｏｇｉｃ  Ｄｕｏ−ｆｌｏｗ高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）（Ｂｉｏ−ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を採用し、一方Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ’ｓ  ＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂ（商標）ＰＦ２Ｄプラットフォームの第２ステージを二次元分離のために利用した。
【０１６８】
サンプル調製およびＬＣ／ＥＳＩ／ＭＳを使用するＬＣ／ＭＳおよびＬＣ−ＭＡＬＤＩ分析
本明細書の先に記載した実施例１中の方法を使用して、フィーダ細胞およびフィーダ細胞角化細胞調整培地サンプル中に存在するタンパク質を、ＬＣ／ＥＳＩ／ＭＳおよびＬＣ−ＭＡＬＤＩの２つのＬＣ／ＭＳ手段を使用して同定した。
【０１６９】
サンプル調製およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦ質量分析
実施例１に記載した手段を使用して、タンパク質のピークを、ＴＯＦ−ＴＯＦ分析用の質量分析プレートに移した。
【０１７０】
データベース分析および解釈
ＭＳおよびＭＳ／ＭＳデータベース分析で得たタンパク質スコア、タンパク質スコア信頼区間、総イオンスコア（ＴＩＳ）および総イオンスコア信頼区間を使用して、潜在的な一致のリストからのタンパク質をランク付けした。
【０１７１】
結果
プロテオミクス分析用のＶＮ：ＧＦ−Ｋｃ培地を使用して増殖させた第２継代角化細胞上に存在する細胞表面マーカの組織形態および発現
組織形態およびマーカ発現を使用して、分析すべき調整培地が未分化初代角化細胞から集められたことを確認した。現在、培養初代角化細胞が未分化状態を保っているかどうかを測定するための決定的なアッセイはない。しかし、ケラチンマーカは、細胞の増殖性状態、および細胞が基底角化細胞であるか否かに関する有用な情報を得るために使用することができる。したがって、ケラチン６（高増殖性角化細胞中に存在する）、ケラチン１４（基底細胞中に存在する）、およびケラチン１／１０／１１（より分化された、前出の基底細胞中に存在する、データは示さず）を認識する抗体を使用して、プロテオミクス実験用の細胞培養物の分化状態を評価した。この分析により、ＶＮ：ＧＦ−Ｋｃ培地を使用して増殖された細胞は、血清を使用して成長したものと比べ、正常な組織形態を保っていたことが明らかになった（それぞれ、図６ＢおよびＡ）。さらに、ＶＮ：ＧＦ−Ｋｃ培地で培養された角化細胞は、ケラチン６および１４の発現を継続し（それぞれ、図６ＣおよびＤ）、したがって、これらの細胞が、未分化の初代角化細胞組織形態を保っていたことを示唆していた。
【０１７２】
フィーダ細胞単独およびフィーダ細胞：角化細胞培養の両方から集められた調整培地の二次元分離
フィーダ細胞単独の調整培地、およびフィーダ細胞：角化細胞共培養物からの調製培地に存在するタンパク質（それぞれ、図７ＡおよびＢ）を、二次元液体クロマトグラフィ分離の新規な形態を使用して分離した。これには、一次元における塩勾配、次いでアセトニトリル勾配を使用する二次元分離によって、タンパク質を分離することを含んでいた。プラットフォームの一次元分割が乏しいため、一次元の標準Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂを、Ｂｉｏ−ｒａｄ’ｓ  Ｄｕｏ−ｆｌｏｗ  ＨＰＬＣで置き換えた。ＰｒｏｔｅｏＶｉｅｗソフトウェアを使用して、タンパク質を視覚化した。明らかに、フィーダ細胞単独の調整培地で見出されるスポット数より、フィーダ細胞：角化細胞培養調整培地（図７Ｂ）において発現された、明確なタンパク質スポットの数が増加している。さらに、フィーダ細胞単独調整培地（図７Ａ）とフィーダ細胞：角化細胞培養から得られた培地（データは示さず）との間の発現レベルに目に見える変化があるようである。続いて、図７Ａに示されている１８７個のタンパク質スポット、および図７Ｂに示されている２３８個のタンパク質スポットを、単離し、消化し、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＴＯＦを使用して分析した。
【０１７３】
フィーダ細胞およびフィーダ細胞：角化細胞調整培地で同定されたタンパク質
最初に、タンパク質スポット上でＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦ分析を行った。フィーダ細胞単独またはフィーダ細胞：角化細胞調整培地（ＣＭ）に関して、有意なイオンスコアは明らかにならなかった。したがって、２つの液体クロマトグラフィ方法を使用してＣＭを分析した。該方法は、第一はＱＴＲＡＰ  ＭＳ／ＭＳ系（ＬＣ／ＥＳＩ／ＭＳ）（一次元分離からのフラクションで実施）を含み、一方、第２は、ＬＣ−ＭＡＬＤＩ（濃縮ＣＭサンプルで実施）を利用した（表３および４）。次いで、Ｍａｓｃｏｔデータベースを使用して、調整培地中に存在するタンパク質を分析した。ＬＣ／ＥＳＩ／ＭＳおよびＬＣ−ＭＡＬＤＩ結果を、７種の主な群、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）、膜、核、分泌、血清由来、およびその他のタンパク質／因子に編成した。さらに、アクセッション番号、分子量、総スコアおよびペプチドカウントを使用して、タンパク質を分類した。表３および４に示すタンパク質は全て、それぞれ同定されるか、またはイオンスコアで測定されるような広範な相同性を示す。フィーダ細胞単独の結果は、１２種のＥＣＭ、２種の成長因子、１７種のその他のタンパク質、１４種の膜タンパク質、１０種の核タンパク質、５種の分泌タンパク質、および３種の血清由来タンパク質を明らかにした（表３）。フィーダ細胞：角化細胞の結果は、３種の細胞質タンパク質、２２種のＥＣＭ、３０種のその他のタンパク質、２１種の膜タンパク質、１９種の核タンパク質、９種の分泌タンパク質、および４種の血清由来タンパク質を明らかにした。ＬＣＭＳ結果を、総イオンスコアに関連するランクによって編成した（表４）。
【０１７４】
フィーダ細胞およびフィーダ細胞ｈＥＳ／角化細胞調整培地で見出されるタンパク質種の発現の違い
ＬＣ−ＥＳＩ、ＬＣ−ＭＡＬＤＩおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦ分析を使用したタンパク質の同定を、フィーダ細胞単独またはフィーダ細胞：角化細胞調整培地（ＣＭ）から得た液体フラクション上で行った。Ｍａｓｃｏｔデータベースを使用して、これらの処理物中に存在するタンパク質を分析した。次いで、潜在的候補および関心のあるタンパク質を、細胞外マトリックス、成長因子およびサイトカイン、分泌および細胞内タンパク質を含む、それらのそれぞれのカテゴリに分離した。コラーゲンＩ、ＩＶおよびＶＩＩ、フィブロネクチンＩ、ラミニンＶ、ＴＧＦｓアルファおよびベータ、ＶＥＧＦ、インターロイキン１、１０および１５、テロメラーゼ結合タンパク質ＥＳＴ  ＩＡ、およびＴｒａ１相同体を含む、両処理物中のタンパク質の間には重なりがあった。しかし、独特のタンパク質は、Ｗｎｔ−２ｂ、Ｗｎｔ−１２、コラーゲンＶおよびＶＩ、骨形成タンパク質１（ＢＭＰ１）、ｂＦＧＦ、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、ＦＧＦ３、インスリン、ＩＧＦ−Ｉおよび−ＩＩ、インターロイキン−８、白血病抑制因子および巨核球ＣＳＦを含むフィーダ細胞単独処理物中にも観察された。さらに、独特のタンパク質は、フィブロネクチンＩＩＩ、ラミニンＩおよびＩＩＩ、神経成長因子（ＮＧＦ）、肝細胞増殖因子（ｈｇｆ）、ＰＣ細胞由来成長因子、血小板由来成長因子ベータ（ＰＤＧＦ）、インターロイキン４および６、ＰＤＧＦ誘発性ＪＥグルコタンパク質、フォリスタチン関連タンパク質５、成長抑制因子、増殖分化因子９およびテロメラーゼ逆転写酵素（表５）を含む、フィーダ細胞：角化細胞処理物中にも観察された。
【０１７５】
検討
初代角化細胞に関連する多くの新規な技術が、皮膚欠損の再生および治癒を補助する治療産業のために開発されている［７５，７６］。しかし、エクスビボでコレラの細胞を増殖するのに使用される技術は、未だ、血清および／またはフィーダ細胞のような定義されていない成分を必要とし、一般的に十分に定義されていない培養系を利用している。未分化角化細胞の単離、樹立および連続増殖をサポートすることができる完全に定義された無血清技術（ＶＮ：ＧＦ−Ｋｃ）は、前進であるものの、該培養手法は、未だ、連続増殖およびインビトロ増大の成功のために、照射ｉ３Ｔ３フィーダ層を使用することが必要であった。
【０１７６】
照射ｉ３Ｔ３フィーダ細胞は、大量のＩＧＦおよびＥＣＭタンパク質［７７］、ならびにさまざまな他のタンパク質を分泌することが実証されている。さらに角化細胞は、多くの成長因子およびＥＣＭタンパク質のレセプタを発現することも実証されている［７８−８３］。事実、他の研究所は、角化細胞の培養のためにこれらのタンパク質の使用を研究している。たとえば、Ｄａｗｓｏｎら（１９９６）は、角化細胞が、ＶＮ被覆表面に応答して接着および増殖することができることを実証した。それにもかかわらず、角化細胞の殆どの頑強な培養系は、未だ、フィーダ細胞層の使用を必要とする［８５］。フィーダ細胞層のこの必要性は、フィーダ細胞の培養系における重要性を強調する。より最近では、他のグループが、培養系にＭＥＦから得た調整培地を添加すると、ヒト胚性幹細胞のような他の細胞型をＥＣＭタンパク質を使用して、フィーダなしで増殖させることができることを実証し、これは、フィーダ細胞によって提供される重要な成分は、フィーダ層によって分泌される可溶性因子であることを示唆する［１８］。
【０１７７】
したがって、本発明者らは、調整培地中の新規なタンパク質は、プロテオミクス技術を使用して同定できる可能性があり、また、これらのタンパク質は、ＶＮ：ＧＦ−Ｋｃ培地と組み合わせて使用し、角化細胞の無血清および無フィーダ細胞増殖をサポートできる可能性があると仮定した。さらに、ＶＮ：ＧＦ−Ｋｃ培地が、血清を含まず、またはアルブミンのようなタンパク質を殆ど含有しない、すなわち低タンパク質量含有培地であるとすると、角化細胞生存に重要な決定的な因子を同定する独特の位置がもたらされる。これらの因子は、従来、血清含有または高タンパク質量含有培地中に組み込まれている非常に豊富なこれらのタンパク質によって、普通マスクされているかもしれない。
【０１７８】
今日まで、このエリアおよび関連分野における殆どのプロテオミクス分析は、フィーダ細胞層単独上で行われ［２４，２５，８６］、線維芽細胞が何を培地に分泌するのかに関する見識を提供してきた。しかし、この研究は、角化細胞を用いてフィーダ細胞のパラ分泌によって開始される分泌もまた分析することができるシステムを樹立することによって、これをさらに一歩進める。この仮説を試験するため、フィーダ細胞単独およびフィーダ細胞：角化細胞培養がなにを培地に分泌しているのかを試験した。これらの両処置の検討により、自己分泌相互作用ばかりでなくパラ分泌にも応答して分泌される因子のより完全な像が提供され、角化細胞のための最適インビトロ微小環境へのより優れた見識を提供する。
【０１７９】
ここで採用したシステムは、無血清ＶＮ：ＧＦ−Ｋｃ培地を利用したが、数種の血清由来タンパク質が、フィーダ細胞単独およびフィーダ細胞：角化細胞処理物、すなわち、ウシ血清アルブミン、フェチュイン、およびトランスフェリンファミリのメンバー中で同定された。これらのタンパク質は全て、血清の普通の成分、およびフィーダ細胞および角化細胞の増殖のために培地に普通に加えられる補充物であった。この分析におけるこれらのタンパク質の存在は、このプロテオミクス検討のために、ＶＮ：ＧＦ−Ｋｃ無血清培地を使用したが、広範な洗浄および血清欠乏ステップにもかかわらず、血清産生物が、線維芽細胞の独自の増大から持ち越されていたことを示す。さらに、該データより、角化細胞それ自体は、単離され、完全に無血清で培養されたので、血清由来タンパク質は、角化細胞の単離の間に、ドナー患者の皮膚から持ち越されたことが示唆される。その上、数種の細胞内タンパク質がこの実験の両処理物内で観察された。これらのタンパク質の存在は、細胞の溶解による可能性が最も高く、そのため、それらの細胞内含有量が培養系に漏出する。これらの細胞内タンパク質は、この実験の主焦点ではなかったが、同定されたタンパク質の中には、テロメラーゼ逆転写酵素、テロメラーゼ結合タンパク質、ｃ−ｍｙｃ、およびＴｒａ１のような、さらなる検討を保証したものもある。ここで、数種のタンパク質は、同定できなかったという事実ため、すなわち、仮定上のタンパク質、知られていないタンパク質、および未知の機能を持つタンパク質であったため、表３および４から省略されていることに注目することも重要である。
【０１８０】
フィーダ細胞単独調整培地（図７Ａおよび表３）、およびフィーダ細胞：角化細胞培養調整培地（図７Ｂおよび表４）の分析により、初代角化細胞の生存に重要な数種のタンパク質が明らかにされた。数種のＥＣＭタンパク質が同定され、コラーゲンＩ、Ｖ、ＶＩおよびＶＩＩ、フィブロネクチン１および３、Ｌａｍｂ３、ラミニンアルファ１、３、５、およびテネイシンＸ（表３および４）が挙げられる。重要なことは、これらのＥＣＭタンパク質が、表皮および真皮細胞外マトリックスにおいて、インビボで見られることである［８７］。さらに、これらのタンパク質は、通常、角化細胞の接着、移動おおび／または増殖に関与し、傷の治癒において役割があることも考えられている［８８−９１］。
【０１８１】
近年、ｈＥＳ細胞の無血清および無フィーダ細胞培養方法の開発に従事する研究者のグループは、培養系において、記載されたようなＥＣＭタンパク質を使用することを探り始めた。たとえば、ラミニンは、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）調整培地の存在下で成長させる場合、フィーダ細胞層の必要性を置き換えること［１８］、あるいはノックアウト血清置換（ＫＳＲ）＋アクチビン−Ａ［２１］が実証された。さらに、Ａｍｉｔら（２００６）は、フィブロネクチンマトリックスを、形質転換成長因子β１（ＴＧＦ  β１）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）および塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を始めとするさまざまな成長因子と組み合わせて使用することによって、これらの細胞を増殖する方法を発見した［２０］。初代角化細胞の培養は、ｈＥＳ細胞培養に類似しているという事実から、これらのＥＣＭタンパク質に基づく技術を、角化細胞の培養に移すことができる可能性がある。興味深いことに、全てのＥＣＭ技術は、角化細胞の増殖のために開発され、したがって、今までのｈＥＳ細胞は、ある形態の分裂促進因子の使用も含む。
【０１８２】
本明細書で報告された結果により、数種の成長因子および分裂促進因子が、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、インスリン、形質転換成長因子（ＴＧＦ）αおよびβ、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）およびｂＦＧＦを含む調整培地中に存在し、これらは全て、２つの処置の調整培地中に存在したことが実証された（表３および表４）。インスリンは、多くの哺乳類細胞培養培地において重要な成分であり、これまでかなりの期間、角化細胞の培養に導入されてきた。通常、インスリンは、これらの角化細胞培養液中に高濃度で存在するが、本発明者らは、最近、低濃度のＩＧＦ−Ｉが、インスリンの必要性を置き換えることができることを実証した［２６，４１］。実際、インスリンを高濃度で存在させた場合、その成長刺激効果は、実際、ＩＧＦ−Ｉレセプタによって媒介される［９２］ので、インスリンをＩＧＦ−Ｉで置き換えることができることは、驚くべきことではない。同様に、発明者らのグループ内で行われた早期の研究によれば、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩをＶＮとともに使用した場合、ｈＥＳ細胞中に分裂促進因子影響を起こしたことが明らかにされている。さらに、ｂＦＧＦ、ＴＧＦ−ベータおよびＰＤＧＦは、フィーダ細胞依存性ｈＥＳ細胞の増殖および自己再生を強化することが実証されている、ヘパリン結合成長因子である［１６，２３，４４，４５］。その上、ＴＧＦタンパク質は、表皮性細胞および角化細胞の移動（Ｌｉら、２００６）および増殖［９３，９４］を強化することが実証され、したがって、傷の治癒措置の媒介において効果がある可能性があると提案されている［９５］。興味深いことに、これらのヘパリン結合成長因子は、そのヘパリン結合ドメインを介してＶＮに結合することができるようである［２６，４２］。したがって、このプロテオミクス分析で同定された成長因子は全て、角化細胞成長に関連する役割があり、臨床治療における使用のための移植可能な細胞のインビトロ増大用の無血清、無フィーダ培地を提供する、ＶＮ：ＧＦ−Ｋｃ培地とともに、有用であることが十分に証明されるかもしれない。
【０１８３】
さらに、フィーダＣＭ中に存在するＷｎｔ−１２およびヒト成長ホルモン、ならびにフィーダ細胞：角化細胞ＣＭ中に存在する増殖分化因子−９（ＧＤＦ−９）およびＰＣ由来成長因子（ＰＣ−ＤＧＦ）も同定された（表５）。ｈＥＳ細胞の成長および生存におけるこれらのタンパク質の効果については、今日まであまり知られていない。しかし、Ｗｎｔ経路およびあるＷｎｔタンパク質は、ｈＥＳ細胞を自己再生の状態で維持することが実証されている［５６］。また、ヒト成長ホルモンは、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路を活性化することによって、ｈＥＳ細胞の自己再生において重要な役割を果たすかもしれない［６６，７２］。さらに、ＰＣ由来成長因子は、胚発生の間、広く発現することが示され、３Ｔ３線維芽細胞のような細胞の増殖におけるある役割を実証している［７１］。さらに、ＧＤＦ−９は、ＳＭＡＤ−２／３シグナル伝達を活性化することが実証されており［７３］、これは、ｈＥＳ細胞を未分化状態で維持するために重要である［７４］。したがって、これらの因子は、ｈＥＳ細胞と類似する方法で培養される他の細胞、すなわち初代角化細胞にとって重要でありうる。
【０１８４】
先に検討したタンパク質に加えて、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）テロメラーゼ結合タンパク質（ＥＳＴ１Ａ）、フォリスタチン様５、および腫瘍拒絶抗原（Ｔｒａ１）相同体も、両処置の調整で発現されうる（表３および４）。テロメラーゼ結合タンパク質は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素によるインビトロでのテロメアの複製に関与する。興味深いことに、ｈＴＥＲＴまたはテロメラーゼ発現における下方制御は、胚性幹細胞分化に関連付けられる［６２］。したがって、もしこのタンパク質が、角化細胞の培養において、直接または間接的に誘発されうるなら、初代角化細胞の長期間の増殖を促進するかもしれない。関心の対象となりうる他の核タンパク質は、ｃ−Ｍｙｃ転写活性化において中心的な役割を持ち、細胞形質転換にも関与するＴｒａ１相同体である。さらに、ｃ−Ｍｙｃは、ｈＴＥＲＴの活性化および調節において重要であることが実証されている［６３］。分泌タンパク質、フォリスタチン様５は、検討した調整培地にも存在していた。とりわけ、このタンパク質に存在するフォリスタチン様ドメインは、アクチビン−ＡおよびＴＧＦ−βの不活性化に係わり合いがあり［９６，９７］、この２種のタンパク質は、ヒト胚性幹細胞の自己再生のために重要であることが実証されている［１６］。まとめると、このデータは、これらのタンパク質も、初代角化細胞のような他の原始細胞の未分化状態の維持に重要な役割を果たしているかもしれないことを示唆する。
【０１８５】
要約すれば、ここで報告したプロテオミクス実験により、フィーダ細胞単独およびフィーダ細胞：角化細胞培養処置の両方からの多くのタンパク質の発現が明らかにされている。真皮の線維芽細胞と角化細胞との間に存在するパラ分泌関係［９８，９９］を考慮すると、ここでの実験により、単離においてフィーダ細胞が何を分泌しているのかということだけではなく、それらのパラ分泌によって、それらおよび角化細胞が何を分泌するのかということも同定された。理想的には、フィーダ細胞なしで培養した場合、これらの細胞が何を分泌するかを決定するため、角化細胞単独によって調整された培地も調べることが、大きな利点になるはずであった。しかし、このことは、本研究の重要な点、すなわち、角化細胞はフィーダ細胞層の不在下では成長がよくないということを強調している。先に記載したデータは、初代角化細胞のインビトロ微小環境への魅力的な予備見識を提供し、無血清培地と組み合わせて使用できる候補タンパク質に関する有用な初期情報を提供している。
（実施例３）
ｈＥＳ細胞の無フィーダおよび無血清成長
ｈＥＳ細胞を以下の培地製剤、１ｕｇ／ｍＬのＩＧＦ−Ｉ／１−６４ＶＮキメラタンパク質、０．１ｕｇ／ｍＬのｂＦＧＦ、３５ｎｇ／ｍＬのアクチビン−Ａおよび４０μｇ／ｍＬのラミニンで成長させ、試験した。
【０１８６】
免疫蛍光法（ＩＦ）を、Ｏｃｔ４、ＴＲＡ１−６０、ＳＳＥＡ−４、ＳＳＥＡ−１抗原に対する抗体を使用して行った。ＩＦ実験（図８）では、Ｏｃｔ４、ＴＲＡ１−６０およびＳＳＥＡ−４の発現を実証したが、ＳＳＥＡ−１の発現は少量だけだった。また、ｈＥＳ細胞は、核の細胞質に対する比が大きいことも提示し、ｈＥＳ表現型が不活性であることを示した。
【０１８７】
Ｒｅｘ１は例外であり、この結果は、本発明者らの培養系内で大きな下方制御を示す。しかし、Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇを調べると、これらの増幅産物は、本発明者らの培養系内で、約２倍の増加を明らかにした（図９参照）。
【０１８８】
これらのデータをまとめると、記載した系は、確かに、これらの細胞を「未分化状態」で維持することができることを示唆している。
本明細書全体を通して、本発明の好ましい実施形態を記載してきたが、本発明は、いずれか一つの実施形態または特定の特徴の集合に限定されるものではない。したがって、本明細書の開示に照らし、本発明の範囲を逸脱しない限り、例示された特定の実施形態において、種々の変形例および変更例がなされうることは、当業者に理解されるであろう。
【０１８９】
本明細書で参照された全てのコンピュータプログラム、アルゴリズム、特許および科学文献は、参照により本明細書に組み入れられる。
参考文献
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【０１９０】
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【０１９１】
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【０１９２】
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【０１９３】
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【０１９４】
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【０１９５】
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【０１９６】
表
【０１９７】
【表１】
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【０１９８】
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【０１９９】
【表２】
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【０２００】
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【０２０１】
【表３】
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【０２０２】
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【０２０３】
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【０２０４】
【表４】
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【０２０５】
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【０２０６】
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【０２０７】
【表５】
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【０２０８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年4月1日(2009.4.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培地であって、
（ｉ）インスリン様成長因子（ＩＧＦ）アミノ酸配列およびビトロネクチン（ＶＮ）アミノ酸配列を含む合成キメラタンパク質と、
（ｉｉ）ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、骨形成タンパク質１５（ＢＭＰ−１５）、増殖分化因子９（ＧＤＦ−９）、巨核球コロニー刺激因子、分泌フリッツルド関連タンパク質２、Ｗｎｔ−２ｂ、Ｗｎｔ−１２、成長抑制因子、フェチュイン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、形質転換成長因子−α（ＴＧＦ−α）、ＴＧＦ−β、神経成長因子、血小板由来成長因子−β（ＰＤＧＦ−β）、ＰＣ由来成長因子（プログラヌリン）、インターロイキン（ＩＬ）−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３およびアクチビン−Ａからなる群から選択される１種以上の単離されたフィーダ細胞置換因子とを含み、かつ、
（ｉｉｉ）血清が存在しない、あるいはＩＧＦの不在下において細胞成長をサポートしない非常に少量の血清を含む、細胞培地。
【請求項２】
前記１種以上の単離されたフィーダ細胞置換因子が、ｈＧＨ、ＢＭＰ−１５、ＧＤＰ−９、巨核球コロニー刺激因子、分泌フリッツルド関連タンパク質２、Ｗｎｔ−２ｂ、Ｗｎｔ−１２、成長抑制因子およびアクチビン−Ａからなる群から選択される、請求項１に記載の細胞培地。
【請求項３】
前記１種以上の単離されたフィーダ細胞置換因子がアクチビン−Ａである、請求項１または２に記載の細胞培地。
【請求項４】
前記細胞培地が、さらに、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩおよびラミニンからなる群から選択される１種以上の追加の生物学的に活性なタンパク質を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞培地。
【請求項５】
前記１種以上の追加の生物学的に活性なタンパク質がｂＦＧＦおよびラミニンから選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞培地。
【請求項６】
前記ＩＧＦアミノ酸配列がＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列またはＩＧＦ−ＩＩアミノ酸配列である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の細胞培地。
【請求項７】
前記ＩＧＦアミノ酸配列がＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞培地。
【請求項８】
前記ＶＮアミノ酸配列が成熟ＶＮのアミノ酸残基１〜６４である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の細胞培地。
【請求項９】
前記合成キメラタンパク質が、さらに、１個以上のグリシン残基および１個以上のセリン残基のリンカー配列を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の細胞培地。
【請求項１０】
前記リンカー配列が（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の細胞培地。
【請求項１１】
単離されたＩＧＦ含有複合体をさらに含み、前記ＩＧＦはＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩから選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の細胞培地。
【請求項１２】
前記単離されたＩＧＦ含有複合体中にＩＧＦ−ＩＩが存在する場合、さらにＶＮを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の細胞培地。
【請求項１３】
前記単離されたＩＧＦ含有複合体中にＩＧＦ−Ｉが存在する場合、さらにＩＧＦＢＰおよびＶＮを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の細胞培地。
【請求項１４】
前記ＩＧＦＢＰが、ＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＧＦＢＰ−５およびＩＧＦＢＰ−６からなる群から選択されるＩＧＦＢＰである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の細胞培地。
【請求項１５】
前記ＩＧＦＢＰがＩＧＦＢＰ−３またはＩＧＦＢＰ−５である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の細胞培地。
【請求項１６】
前記各フィーダ細胞置換因子の最終濃度が０．１ｎｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の細胞培地。
【請求項１７】
前記各フィーダ細胞置換因子の最終濃度が約５ｎｇ／ｍｌ〜１５００ｎｇ／ｍｌである、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の細胞培地。
【請求項１８】
前記各フィーダ細胞置換因子の最終濃度が２５ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の細胞培地。
【請求項１９】
前記各フィーダ細胞置換因子の最終濃度が、１５０ｎｇ／ｍｌ〜６００ｎｇ／ｍｌである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の細胞培地。
【請求項２０】
ＩＧＦアミノ酸配列およびＶＮアミノ酸配列を含む約２５０ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌの合成キメラタンパク質と、約５０ｎｇ／ｍｌ〜ｌ００ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦと、約２５ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌのアクチビン−Ａと、約１０μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌのラミニンとを含む胚性幹細胞培地。
【請求項２１】
ＩＧＦアミノ酸配列およびＶＮアミノ酸配列を含む約１０００ｎｇ／ｍｌの前記合成キメラタンパク質と、約１００ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦと、約３５ｎｇ／ｍｌのアクチビン−Ａと、約４０μｇ／ｍｌの前記ラミニンとを含む、請求項２０に記載の胚性幹細胞培地。
【請求項２２】
前記ＩＧＦアミノ酸配列がＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列またはＩＧＦ−ＩＩアミノ酸配列である、請求項２０または請求項２１に記載の胚性幹細胞培養。
【請求項２３】
前記ＩＧＦアミノ酸配列がＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列である、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の胚性幹細胞培地。
【請求項２４】
前記ＶＮアミノ酸配列が成熟ＶＮのアミノ酸残基１〜６４である、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の胚性幹細胞培地。
【請求項２５】
培養容器と、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の細胞培地または請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の胚性幹細胞培地とを含む細胞培養系。
【請求項２６】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の細胞培地、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の胚性幹細胞培地、あるいは請求項２５に記載の培養系において、１個以上の細胞を培養するステップを含む細胞培養方法。
【請求項２７】
前記１個以上の細胞がフィーダ依存性細胞型である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記１個以上の細胞がヒト胚性幹細胞である、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記１個以上の細胞が角化細胞である、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項３０】
請求項２６〜２９のいずれか一項に記載の方法によって産生された１個以上の細胞と、医薬的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項３１】
角化細胞、ヒト胚性幹細胞および角化細胞前駆細胞から選択される１個以上の細胞を含む、請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
前記１個以上の細胞がヒト胚性幹細胞である、請求項３０または３１に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
前記１個以上の細胞が角化細胞である、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
請求項２６〜２９のいずれか一項に記載の方法によって培養された１個以上の細胞を送達する方法であって、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の医薬組成物を個体に送達することにより、前記個体における１個以上の細胞の再生および／または増殖を促進するステップを含む方法。
【国際調査報告】
2010537626.tif 000031
2010537626.tif 000032
2010537626.tif 000033