(57)【要約】  本発明は、トランスジェニック非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞、及びその作出方法に関する。本発明のトランスジェニック非ヒト動物、或いは該動物由来の組織又は細胞により、相同内在性非ヒト動物タンパク質に代わって薬物代謝に関与すると共に、該動物に導入されたヒト遺伝子の発現の調節がヒトにおいてin vivoで見られるものと一層同様になされるように該遺伝子を制御することに関与するヒトタンパク質を発現することが可能な系が得られる。本発明の一様相は、ヒトＰＸＲ遺伝子のイントロン６及び／又はイントロン７の少なくとも一部を含むヒトＤＮＡ配列の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
転写因子ＰＸＲ（即ち、プレグナンＸ受容体）をコードする少なくとも１個のヒトＤＮＡ配列を含む非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞であって、前記ヒトＤＮＡ配列は、ヒトＰＸＲ遺伝子のイントロン６及び／又はイントロン７の少なくとも一部を含む非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞。
【請求項２】
前記ヒトＤＮＡ配列は、ヒトＰＸＲ遺伝子のイントロン４、５、６及び／又は７の少なくとも一部を含む、請求項１に記載の非ヒト動物、組織又は細胞。
【請求項３】
前記ヒトＤＮＡ配列において、ヒトＰＸＲ遺伝子のエクソン４とエクソン８との間のイントロン−エクソン構造が維持されている、先の請求項のいずれかに記載の非ヒト動物、組織又は細胞。
【請求項４】
前記ヒトＤＮＡ配列は、ヒトＰＸＲ遺伝子のイントロン２、イントロン３及び／又はイントロン８の少なくとも一部を更に含む、先の請求項のいずれかに記載の非ヒト動物、組織又は細胞。
【請求項５】
前記ヒトＤＮＡ配列において、ヒトＰＸＲ遺伝子のエクソン２とエクソン９との間のイントロン−エクソン構造が維持されている、先の請求項のいずれかに記載の非ヒト動物、組織又は細胞。
【請求項６】
前記ヒトＤＮＡ配列は、配列番号２の配列又は配列番号３の配列と少なくとも７０％同一である配列を含む、請求項１に記載の非ヒト動物、組織又は細胞。
【請求項７】
前記ヒトＤＮＡ配列はマウスＰＸＲ遺伝子座に挿入されて、ヒトＰＸＲの発現がマウスＰＸＲプロモーターの制御下にあるようになっている、先の請求項のいずれかに記載の非ヒト動物、組織又は細胞。
【請求項８】
次のヒトＤＮＡ配列、即ち、
（ｉ）更なる転写因子、
（ｉｉ）第１相薬物代謝酵素、
（ｉｉｉ）第２相薬物代謝酵素、及び／又は
（ｉｖ）薬物輸送タンパク質をコードするヒトＤＮＡ配列のいずれか一以上の少なくとも１個を更に含む、先の請求項のいずれかに記載の非ヒト動物、組織又は細胞。
【請求項９】
前記少なくとも１個の更なる転写因子は、ＣＡＲ、ＡｈＲ及び／又はＰＰＡＲαの一以上である、請求項８に記載の非ヒト動物、組織又は細胞。
【請求項１０】
前記動物、組織又は細胞はＣＡＲをコードするヒトＤＮＡ配列を含み、該ヒトＤＮＡ配列は、ヒトＣＡＲ遺伝子のイントロン２、イントロン３、イントロン４、イントロン５、イントロン６、イントロン７及び／又はイントロン８の少なくとも一部を含み、及び／又は、必要に応じて、前記ヒトＤＮＡ配列はエクソン２とエクソン９との間のイントロン−エクソン構造を保持しており、及び／又は、必要に応じて、前記ヒトＤＮＡ配列は配列番号４の配列と少なくとも７０％同一であり、及び／又は、必要に応じて、前記ヒトＤＮＡ配列はマウスＣＡＲ遺伝子座に挿入されて、ヒトＣＡＲの発現がマウスＣＡＲプロモーターの制御下にあるようになっている、請求項９に記載の非ヒト動物、組織又は細胞。
【請求項１１】
前記動物、組織又は細胞はＡｈＲをコードするヒトＤＮＡ配列を含み、該ヒトＤＮＡ配列はヒトＡｈＲ遺伝子の少なくともエクソン３〜１１を含み、及び／又は、該ヒトＤＮＡ配列はマウスＡｈＲ遺伝子座に挿入されて、ヒトＡｈＲの発現がマウスＡｈＲプロモーターの制御下にあるようになっている、請求項９又は１０のいずれか１項に記載の非ヒト動物、組織又は細胞。
【請求項１２】
前記動物、組織又は細胞はＰＰＡＲαをコードするヒトＤＮＡ配列を含み、該ヒトＤＮＡ配列は、ヒトＰＰＡＲα遺伝子のイントロン５及び／又はイントロン６の少なくとも一部を含み、また、必要に応じて、該ヒトＤＮＡ配列において、ヒトＰＰＡＲα遺伝子のエクソン３とエクソン８との間のイントロン−エクソン構造が保持されており、及び／又は、該ヒトＤＮＡ配列はマウスＰＰＡＲα遺伝子座に挿入されて、ヒトＰＰＡＲαの発現がマウスＰＰＡＲαプロモーターの制御下にあるようになっている、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の非ヒト動物、組織又は細胞。
【請求項１３】
前記少なくとも１個の第１相薬物代謝酵素は、必要に応じてＣＹＰ１Ａ、ＣＹＰ３Ａ、ＣＹＰ２Ｂ、ＣＹＰ２Ｃ、ＣＹＰ２Ｄ及びＣＹＰ２Ｅアイソフォームから成る群から選択され、必要に応じてＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ３Ａ９、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｂ１０、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１の一以上から選択されるシトクロムＰ４５０アイソフォームであり、及び／又は、前記第１相薬物代謝酵素をコードするヒトＤＮＡ配列は、必要に応じてＣＹＰ３Ａクラスター、ＣＹＰ２Ｄクラスター、ＣＹＰ２Ｃクラスター及び／又はＣＹＰ１Ａクラスターから選択されるシトクロムＰ４５０遺伝子クラスターを含む、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の非ヒト動物、組織又は細胞。
【請求項１４】
前記少なくとも１個の第２相薬物代謝酵素は、グルクロニルトランスフェラーゼ、ＵＧＴ１Ａ遺伝子、ＵＧＴ１Ａ遺伝子クラスター、グルタチオントランスフェラーゼ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、スルホニルトランスフェラーゼ及び／又はアセチルトランスフェラーゼである、請求項８〜１３のいずれか１項に記載の非ヒト動物、組織又は細胞。
【請求項１５】
前記少なくとも１個の薬物輸送タンパク質は、多剤耐性タンパク質（ＭＤＲ）、ＭＤＲ１、ＭＤＲ１ａ、ＭＤＲ１ｂ、多剤耐性関連タンパク質（ＭＲＰ）、ＭＲＰ１、ＭＲＰ２、有機アニオン輸送ポリペプチド（ＯＡＴＰ）及び／又はＢＣＲＰ（膜貫通ＡＢＣ型半輸送体ＡＢＣＧ２）である、請求項８〜１４のいずれか１項に記載の非ヒト動物、組織又は細胞。
【請求項１６】
ＰＸＲをコードするヒトＤＮＡ配列を含み、ＣＡＲの内在性遺伝子が無効化されている非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞。
【請求項１７】
ＣＡＲをコードするヒトＤＮＡ配列を含み、ＰＸＲの内在性遺伝子が無効化されている非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞であって、前記ヒトＣＡＲをコードするＤＮＡ配列は、必要に応じて請求項１０に記載のように定義されている非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞。
【請求項１８】
ＰＸＲ及びＣＡＲの両方の内在性遺伝子が無効化されている非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞。
【請求項１９】
（ｉ）転写因子ＰＸＲをコードするヒトＤＮＡ配列と、
（ｉｉ）転写因子ＣＡＲをコードするヒトＤＮＡ配列と、
（ｉｉｉ）転写因子ＡｈＲをコードするヒトＤＮＡ配列と、
（ｉｖ）転写因子ＰＰＡＲαをコードするヒトＤＮＡ配列とを含む非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞。
【請求項２０】
前記転写因子ＰＸＲをコードするヒトＤＮＡ配列は、請求項１〜７のいずれか１項に記載のように定義されており、及び／又は、前記ヒトＣＡＲをコードするＤＮＡ配列は、請求項１０に記載のように定義されており、及び／又は、前記ヒトＡｈＲをコードするＤＮＡ配列は、請求項１１に記載のように定義されており、及び／又は、前記転写因子ＰＰＡＲαをコードするヒトＤＮＡ配列は、請求項１２に記載のように定義されている、請求項１９に記載の非ヒト動物、組織又は細胞。
【請求項２１】
（ｉ）必要に応じて請求項１３に記載の一以上の第１相薬物代謝酵素又は一以上のシトクロムＰ４５０遺伝子クラスター、及び／又は
（ｉｉ）必要に応じて請求項１４に記載の一以上の第２相薬物代謝酵素、及び／又は
（ｉｉｉ）必要に応じて請求項１５に記載の一以上の薬物輸送タンパク質をコードする一以上のヒトＤＮＡ配列を更に含む、請求項１９又は２０のいずれか１項に記載の非ヒト動物、組織又は細胞。
【請求項２２】
（ｉ）転写因子ＰＸＲをコードするヒトＤＮＡ配列と、
（ｉｉ）ＣＹＰ３Ａ４をコードするヒトＤＮＡ配列を含む非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞。
【請求項２３】
ＣＹＰ３Ａ４と等価な内在性遺伝子が無効化されている、請求項２２に記載の非ヒト動物、組織又は細胞。
【請求項２４】
該動物はマウスであり、前記ＣＹＰ３Ａ４と等価な内在性遺伝子はＣｙｐ３ａ１１である、請求項２３に記載の非ヒト動物、組織又は細胞。
【請求項２５】
ＣＹＰ３Ａ４をコードするヒトＤＮＡ配列は非ヒト動物の等価遺伝子の内在性プロモーターの制御下にある、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の非ヒト動物、組織又は細胞。
【請求項２６】
該動物はマウスであり、ＣＹＰ３Ａ４をコードするヒトＤＮＡ配列はマウスＣｙｐ３ａ１１遺伝子座に挿入されて、ＣＹＰ３Ａ４をコードするヒトＤＮＡ配列の発現がマウスＣｙｐ３ａ１１プロモーターの制御下にあるようになっている、請求項２２〜２５のいずれか１項に記載の非ヒト動物、組織又は細胞。
【請求項２７】
該動物はマウスであり、ＣＹＰ３Ａ４をコードするヒトＤＮＡ配列はマウスＣｙｐ３ａ２５遺伝子座に挿入されて、ＣＹＰ３Ａ４をコードするヒトＤＮＡ配列の発現がヒトＣＹＰ３Ａ４プロモーターの制御下、又は必要に応じてマウスＣｙｐ３ａ２５プロモーターの制御下にあるようになっている、請求項２２〜２５のいずれか１項に記載の非ヒト動物、組織又は細胞。
【請求項２８】
ＣＹＰ３Ａ４をコードするヒトＤＮＡ配列はヒトＣＹＰ３Ａ４プロモーターの制御下にある、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の非ヒト動物、組織又は細胞。
【請求項２９】
ＣＹＰ３Ａ４をコードするヒトＤＮＡ配列はマウスＲｏｓａ２６遺伝子座に挿入されて、ヒトＣＹＰ３Ａ４の発現がヒトＣＹＰ３Ａ４プロモーターの制御下にあるようになっている、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の非ヒト動物、組織又は細胞。
【請求項３０】
ＣＹＰ３Ａ４をコードするヒトＤＮＡ配列はマウスＣｙｐ３ａクラスターに挿入されて、ヒトＣＹＰ３Ａ４の発現がヒトＣＹＰ３Ａ４プロモーターの制御下にあるようになっている、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の非ヒト動物、組織又は細胞。
【請求項３１】
ヒトＣＹＰ３Ａ４をコードするヒトＤＮＡ配列はヒトＣＹＰ３Ａ４遺伝子のイントロン１の少なくとも一部を含む、請求項２２〜３０のいずれか１項に記載の非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞。
【請求項３２】
（ｉ）必要に応じて請求項１０に記載のＣＡＲ、必要に応じて請求項１１に記載のＡｈＲ、及び必要に応じて請求項１２に記載のＰＰＡＲαから成る群から必要に応じて選択される一以上の更なる転写因子、及び／又は
（ｉｉ）必要に応じて請求項１３に記載の一以上の更なる第１相薬物代謝酵素又は一以上のシトクロムＰ４５０遺伝子クラスター、及び／又は
（ｉｉｉ）必要に応じて請求項１４に記載の一以上の第２相薬物代謝酵素、及び／又は
（ｉｖ）必要に応じて請求項１５に記載の一以上の薬物輸送タンパク質をコードする一以上のヒトＤＮＡ配列を更に含む、請求項２２〜３１のいずれか１項に記載の非ヒト動物、組織又は細胞。
【請求項３３】
（ｉ）ＣＹＰ２Ｃ９をコードするヒトＤＮＡ配列、及び
（ｉｉ）転写因子ＰＸＲをコードするヒトＤＮＡ配列、及び／又は
（ｉｉｉ）転写因子ＣＡＲをコードするヒトＤＮＡ配列を含む非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞。
【請求項３４】
ＣＹＰ２Ｃ９をコードするヒトＤＮＡ配列は１２ｋｂのヒトＣＹＰ２Ｃ９プロモーターの制御下にあり、及び／又は、前記ＣＹＰ２Ｃ９をコードするＤＮＡ配列はヒトＣＹＰ２Ｃ９遺伝子のイントロン４の少なくとも一部を含み、及び／又は、前記ＣＹＰ２Ｃ９をコードするＤＮＡ配列はマウスＲｏｓａ２６遺伝子座又はマウスＣｙｐ２ｃクラスターに挿入されている、請求項３３に記載の非ヒト動物、組織又は細胞。
【請求項３５】
該動物はマウスであり、ＣＹＰ２Ｃ９をコードするヒトＤＮＡ配列はマウスＣｙｐ２ｃ５５遺伝子座に挿入されて、ＣＹＰ２Ｃ９をコードするヒトＤＮＡ配列の発現がヒトＣＹＰ２Ｃ９の制御下、又は必要に応じてマウスＣｙｐ２ｃ５５プロモーターの制御下にあるようになっている、請求項３３又は３４のいずれか１項に記載の非ヒト動物、組織又は細胞。
【請求項３６】
（ｉ）ＣＹＰ２Ｄ６をコードするヒトＤＮＡ配列、及び
（ｉｉ）転写因子ＰＸＲをコードするヒトＤＮＡ配列、及び／又は
（ｉｉｉ）転写因子ＣＡＲをコードするヒトＤＮＡ配列を含む非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞。
【請求項３７】
ＣＹＰ２Ｄ６をコードするＤＮＡ配列はヒトＣＹＰ２Ｄ６プロモーターの制御下にあり、及び／又は、前記ＣＹＰ２Ｄ６をコードするＤＮＡ配列はマウスＣｙｐ２ｄクラスターに挿入されている、請求項３６に記載の非ヒト動物、組織又は細胞。
【請求項３８】
（ｉ）ＣＹＰ１Ａ１をコードするヒトＤＮＡ配列と、
（ｉｉ）ＣＹＰ１Ａ２をコードするヒトＤＮＡ配列を含む非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞。
【請求項３９】
前記ヒトＤＮＡ配列はマウスＣｙｐ１ａクラスターに挿入されており、ヒトＣＹＰ１Ａ１の発現がヒトＣＹＰ１Ａ１プロモーターの制御下にあり、ヒトＣＹＰ１Ａ２の発現がヒトＣＹＰ１Ａ２プロモーターの制御下にあるようになっている、請求項３８に記載の非ヒト動物、組織又は細胞。
【請求項４０】
（ｉ）転写因子ＰＸＲをコードするヒトＤＮＡ配列と、
（ｉｉ）転写因子ＣＡＲをコードするヒトＤＮＡ配列と、
（ｉｉｉ）ＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターをコードするヒトＤＮＡ配列とを含む非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞。
【請求項４１】
ヒトＣＹＰ３ＡクラスターをコードするヒトＤＮＡ配列はマウスＣｙｐ３ａクラスターに挿入されており、ヒトＣＹＰ３Ａクラスターの発現がヒトＣＹＰ３Ａプロモーターの制御下にあるようになっている、請求項４０に記載の非ヒト動物、組織又は細胞。
【請求項４２】
（ｉ）転写因子ＰＸＲをコードするヒトＤＮＡ配列と、
（ｉｉ）転写因子ＣＡＲをコードするヒトＤＮＡ配列と、
（ｉｉｉ）ＣＹＰ２Ｃ遺伝子クラスターをコードするヒトＤＮＡ配列とを含む非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞。
【請求項４３】
ＣＹＰ２Ｄクラスターがヒト化された非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞。
【請求項４４】
ＣＹＰ２Ｃクラスターがヒト化された非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞。
【請求項４５】
ＣＹＰ１Ａクラスターがヒト化された非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞。
【請求項４６】
（ｉ）必要に応じて請求項１〜７のいずれか１項に記載のＰＸＲ、必要に応じて請求項１０に記載のＣＡＲ、必要に応じて請求項１１に記載のＡｈＲ、及び必要に応じて請求項１２に記載のＰＰＡＲαから成る群から必要に応じて選択される一以上の転写因子、及び／又は
（ｉｉ）必要に応じて請求項１３に記載の一以上の第１相薬物代謝酵素及び／又は一以上の更なるシトクロムＰ４５０遺伝子クラスター、及び／又は
（ｉｉｉ）必要に応じて請求項１４に記載の一以上の第２相薬物代謝酵素、及び／又は
（ｉｖ）必要に応じて請求項１５に記載の一以上の薬物輸送タンパク質をコードする一以上のヒトＤＮＡ配列を更に含む、請求項４３〜４５のいずれか１項に記載の非ヒト動物、組織又は細胞。
【請求項４７】
必要に応じて請求項１１に記載の転写因子ＡｈＲをコードするヒトＤＮＡ配列を更に含む、請求項４５に記載の非ヒト動物、組織又は細胞。
【請求項４８】
Ｃｙｐ３ａ１１の内在性遺伝子が無効化されているマウス、該マウス由来の組織又は細胞。
【請求項４９】
Ｃｙｐ１ａ１の内在性遺伝子及び／又はＣｙｐ１ａ２の内在性遺伝子が無効化されているマウス、該マウス由来の組織又は細胞。
【請求項５０】
内在性ＣＹＰ３Ａクラスターが無効化されている非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞。
【請求項５１】
（ｉ）必要に応じて請求項１〜７のいずれか１項に記載のＰＸＲ、必要に応じて請求項１０に記載のＣＡＲ、必要に応じて請求項１１に記載のＡｈＲ、及び必要に応じて請求項１２に記載のＰＰＡＲαから成る群から必要に応じて選択される一以上の転写因子、及び／又は
（ｉｉ）必要に応じて請求項１３に記載の一以上の第１相薬物代謝酵素又は一以上のシトクロムＰ４５０遺伝子クラスター、及び／又は
（ｉｉｉ）必要に応じて請求項１４に記載の一以上の第２相薬物代謝酵素、及び／又は
（ｉｖ）必要に応じて請求項１５に記載の一以上の薬物輸送タンパク質をコードする一以上のヒトＤＮＡ配列を更に含む、請求項１７、１８、３８、３９又は４８〜５０のいずれか１項に記載の非ヒト動物、組織又は細胞。
【請求項５２】
ヒトＵＧＴ１クラスターをコードするヒトＤＮＡ配列を含む非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞であって、前記ヒトＤＮＡ配列はマウスＵｇｔ１クラスターに挿入されて、必要に応じてヒトＵＧＴ１クラスターの発現がヒトＵＧＴ１プロモーターの制御下にあるようになっている、非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞。
【請求項５３】
（ｉ）必要に応じて請求項１〜７のいずれか１項に記載のＰＸＲ、必要に応じて請求項１０に記載のＣＡＲ、必要に応じて請求項１１に記載のＡｈＲ、及び必要に応じて請求項１２に記載のＰＰＡＲαから成る群から必要に応じて選択される一以上の転写因子、及び／又は
（ｉｉ）必要に応じて請求項１３に記載の一以上の第１相薬物代謝酵素又は一以上のシトクロムＰ４５０遺伝子クラスター、及び／又は
（ｉｉｉ）必要に応じて請求項１４に記載の一以上の更なる第２相薬物代謝酵素、及び／又は
（ｉｖ）必要に応じて請求項１５に記載の一以上の薬物輸送タンパク質をコードする一以上のヒトＤＮＡ配列を更に含む、請求項５２に記載の非ヒト動物、組織又は細胞。
【請求項５４】
（ｉ）転写因子ＰＸＲをコードするヒトＤＮＡ配列と、
（ｉｉ）薬物輸送体ＭＲＰ２をコードするヒトＤＮＡ配列を含む非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞。
【請求項５５】
前記薬物輸送体ＭＲＰ２をコードするヒトＤＮＡ配列の発現は非ヒト動物の内在性プロモーターの制御下にある、請求項５４に記載の非ヒト動物、組織又は細胞。
【請求項５６】
前記動物はマウスであり、前記ＭＲＰ２をコードするＤＮＡ配列は必要に応じてマウスＭｒｐ２遺伝子座に挿入されて、ヒトＭＲＰ２の発現がマウスＭｒｐ２プロモーターの制御下にあるようになっている、請求項５５に記載の非ヒト動物、組織又は細胞。
【請求項５７】
（ｉ）転写因子ＣＡＲをコードするヒトＤＮＡ配列、及び／又は
（ｉｉ）薬物輸送体ＭＤＲ１ａをコードするヒトＤＮＡ配列、及び／又は
（ｉｉｉ）薬物輸送体ＭＤＲ１ｂをコードするヒトＤＮＡ配列を更に含む、請求項５２又は５５のいずれか１項に記載の非ヒト動物、組織又は細胞。
【請求項５８】
薬物輸送タンパク質ＭＤＲ１をコードするヒトＤＮＡ配列を含み、ヒトＰＸＲ及びヒトＣＡＲをコードする一以上の更なるヒトＤＮＡ配列を必要に応じて更に含む非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞であって、前記ＭＤＲ１をコードするＤＮＡ配列は必要に応じてマウスＭｄｒ１ａ遺伝子座に挿入されて、ヒトＭＤＲ１の発現がマウスＭｄｒ１ａプロモーターの制御下にあるようになっている非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞。
【請求項５９】
薬物輸送タンパク質ＭＤＲ１をコードするヒトＤＮＡ配列を含み、ヒトＰＸＲ及びヒトＣＡＲをコードする一以上の更なるヒトＤＮＡ配列を必要に応じて更に含む非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞であって、前記ＭＤＲ１をコードするＤＮＡ配列は必要に応じてマウスＭｄｒ１ｂ遺伝子座に挿入されて、ヒトＭＤＲ１の発現がマウスＭｄｒ１ｂプロモーターの制御下にあるようになっている非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞。
【請求項６０】
薬物輸送タンパク質ＭＤＲ１ａをコードするヒトＤＮＡ配列を含み、ヒトＰＸＲ、ヒトＣＡＲ及び／又はヒトＭＤＲ１ｂをコードする一以上の更なるヒトＤＮＡ配列を必要に応じて更に含む非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞。
【請求項６１】
薬物輸送タンパク質ＭＤＲ１ｂをコードするヒトＤＮＡ配列を含み、ヒトＰＸＲ、ヒトＣＡＲ及び／又はヒトＭＤＲ１ａをコードする一以上の更なるヒトＤＮＡ配列を必要に応じて更に含む非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞。
【請求項６２】
ヒトＰＸＲ及び／又はヒトＣＡＲをコードするヒトＤＮＡ配列を含み、ＭＤＲ１ａ及び／又はＭＤＲ１ｂの内在性遺伝子が無効化されている非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞。
【請求項６３】
（ｉ）必要に応じて請求項１０に記載のＣＡＲ、必要に応じて請求項１１に記載のＡｈＲ、及び／又は必要に応じて請求項１２に記載のＰＰＡＲαから成る群から必要に応じて選択される一以上の更なる転写因子、及び／又は
（ｉｉ）必要に応じて請求項１３に記載の一以上の第１相薬物代謝酵素、及び／又は必要に応じて請求項１３に記載の一以上のシトクロムＰ４５０遺伝子クラスター、及び／又は
（ｉｉｉ）必要に応じて請求項１４に記載の一以上の第２相薬物代謝酵素、及び／又は
（ｉｖ）必要に応じて請求項１５に記載の一以上の更なる薬物輸送タンパク質をコードする一以上のヒトＤＮＡ配列を更に含む、請求項１６、５２又は５８〜６２のいずれか１項に記載の非ヒト動物、組織又は細胞。
【請求項６４】
内在性プロモーターの制御下でＰＸＲをコードするヒトＤＮＡ配列を含み、その等価内在性マウスＰＸＲ遺伝子が必要に応じて無効化されているトランスジェニックマウス、該マウス由来の組織又は細胞であって、
（ｉ）対応する野生型マウス、該マウス由来の組織又は細胞に比べて、シトクロムＰ４５０の発現及び／又は活性のリファンピシン介在による誘導に対する感受性が高く、及び／又は
（ｉｉ）対応する野生型マウス、該マウス由来の組織又は細胞に比べて、シトクロムＰ４５０の発現及び／又は活性のデキサメタゾン介在、プレグネノロン−１６αカルボニトリル介在又はクロトリマゾール介在による誘導に対する感受性が低い、トランスジェニックマウス、該マウス由来の組織又は細胞。
【請求項６５】
シトクロムＰ４５０はＣｙｐ３ａ酵素である、請求項６４に記載のトランスジェニックマウス、該マウス由来の組織又は細胞。
【請求項６６】
内在性プロモーターの制御下でＣＡＲをコードするヒトＤＮＡ配列を含み、その等価内在性マウスＣＡＲ遺伝子が必要に応じて無効化されているトランスジェニックマウス、該マウス由来の組織又は細胞であって、
（ｉ）対応する野生型マウス、該マウス由来の組織又は細胞に比べて、シトクロムＰ４５０の発現及び／又は活性のＣＩＴＣＯ介在による誘導に対する感受性が高く、及び／又は
（ｉｉ）対応する野生型マウス、該マウス由来の組織又は細胞に比べて、シトクロムＰ４５０の発現及び／又は活性のＴＣＰＯＢＯＰ介在による誘導に対する感受性が低い、トランスジェニックマウス、該マウス由来の組織又は細胞。
【請求項６７】
シトクロムＰ４５０はＣｙｐ２ｂ酵素である、請求項６６に記載のトランスジェニックマウス、該マウス由来の組織又は細胞。
【請求項６８】
内在性プロモーターの制御下でＰＸＲ及びＣＡＲをコードするヒトＤＮＡ配列を含み、その等価内在性ＰＸＲ遺伝子及びＣＡＲ遺伝子が必要に応じて無効化されているトランスジェニックマウス、該マウス由来の組織又は細胞であって、
（ｉ）対応する野生型マウス、該マウス由来の組織又は細胞に比べて、シトクロムＰ４５０の発現及び／又は活性のリファンピシン介在による誘導に対する感受性が高いか、又は、
（ｉｉ）対応する野生型マウス、該マウス由来の組織又は細胞に比べて、シトクロムＰ４５０の発現及び／又は活性のデキサメタゾン介在、プレグネノロン−１６αカルボニトリル介在又はクロトリマゾール介在による誘導に対する感受性が低く、
且つ、
（ｉｉｉ）対応する野生型マウス、該マウス由来の組織又は細胞に比べて、シトクロムＰ４５０の発現及び／又は活性のＣＩＴＣＯ介在による誘導に対する感受性が高いか、又は、
（ｉｖ）対応する野生型マウス、該マウス由来の組織又は細胞に比べて、シトクロムＰ４５０の発現及び／又は活性のＴＣＰＯＢＯＰ介在による誘導に対する感受性が低い、トランスジェニックマウス、該マウス由来の組織又は細胞。
【請求項６９】
（ｉ）及び（ｉｉ）に記載のシトクロムＰ４５０はＣｙｐ３ａ酵素であり、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）に記載のシトクロムＰ４５０はＣｙｐ２ｂ酵素である、請求項６８に記載のトランスジェニックマウス、該マウス由来の組織又は細胞。
【請求項７０】
内在性プロモーターの制御下でＰＸＲをコードするヒトＤＮＡ配列を含み、その等価内在性ＰＸＲ遺伝子が必要に応じて無効化されているトランスジェニックマウス、該マウス由来の組織又は細胞であって、対応する野生型マウスに比べて、デキサメタゾン介在による肝毒性が高いトランスジェニックマウス、該マウス由来の組織又は細胞。
【請求項７１】
ヒトＣＹＰ３Ａ４プロモーター配列の制御下のレポーター遺伝子配列を含む非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞であって、
（ｉ）転写因子ＰＸＲをコードするヒトＤＮＡ配列、及び／又は
（ｉｉ）転写因子ＣＡＲをコードするヒトＤＮＡ配列を更に含む非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞。
【請求項７２】
前記動物はマウスであり、前記レポーター遺伝子及びヒトＣＹＰ３Ａ４プロモーター配列はマウスゲノムにランダムに組み込まれている、請求項６４に記載の非ヒト動物、組織又は細胞。
【請求項７３】
マウスＣｙｐ３ａ１１プロモーター配列の制御下のレポーター遺伝子配列を含むトランスジェニックマウス、該マウス由来の組織又は細胞であって、レポーター遺伝子はマウスＣｙｐ３ａ１１遺伝子座に挿入されており、前記マウス、組織又は細胞は、
（ｉ）転写因子ＰＸＲをコードするヒトＤＮＡ配列、及び／又は
（ｉｉ）転写因子ＣＡＲをコードするヒトＤＮＡ配列を必要に応じて更に含むトランスジェニックマウス、該マウス由来の組織又は細胞。
【請求項７４】
ヒトＣＹＰ２Ｂ６プロモーター配列の制御下のレポーター遺伝子配列を含む非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞であって、レポーター遺伝子及びヒトＣＹＰ２Ｂ６プロモーター配列は非ヒト動物、組織又は細胞の内在性等価遺伝子の遺伝子座に必要に応じて挿入されており、前記非ヒト動物、組織又は細胞は、
（ｉ）転写因子ＰＸＲをコードするヒトＤＮＡ配列、及び／又は
（ｉｉ）転写因子ＣＡＲをコードするヒトＤＮＡ配列を必要に応じて更に含む非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞。
【請求項７５】
前記動物はマウスであり、前記レポーター遺伝子及びヒトＣＹＰ２Ｂ６プロモーター配列はマウスＣｙｐ２ｂ６遺伝子座において挿入されている、請求項７４に記載の非ヒト動物、組織又は細胞。
【請求項７６】
ヒトＣＹＰ２Ｄ６プロモーター配列の制御下のレポーター遺伝子配列を含む非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞であって、レポーター遺伝子及びヒトＣＹＰ２Ｄ６プロモーター配列は非ヒト動物、組織又は細胞の内在性等価遺伝子の遺伝子座に必要に応じて挿入されており、前記非ヒト動物、組織又は細胞は、
（ｉ）転写因子ＰＸＲをコードするヒトＤＮＡ配列、及び／又は
（ｉｉ）転写因子ＣＡＲをコードするヒトＤＮＡ配列を必要に応じて更に含む非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞。
【請求項７７】
前記動物はマウスであり、前記レポーター遺伝子及びヒトＣＹＰ２Ｄ６プロモーター配列はマウスＣｙｐ２ｄ６遺伝子座において挿入されている、請求項７６に記載の非ヒト動物、組織又は細胞。
【請求項７８】
ヒトＭＤＲ１プロモーター配列の制御下のレポーター遺伝子配列を含む非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞であって、レポーター遺伝子及びヒトＭＤＲ１プロモーター配列はマウスＲｏｓａ２６遺伝子座に必要に応じて挿入されており、前記非ヒト動物、組織又は細胞は、
（ｉ）転写因子ＰＸＲをコードするヒトＤＮＡ配列、及び／又は
（ｉｉ）転写因子ＣＡＲをコードするヒトＤＮＡ配列を必要に応じて更に含む非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞。
【請求項７９】
ヒトＭＤＲ１プロモーター配列の制御下のレポーター遺伝子配列を含む非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞であって、
（ｉ）転写因子ＰＸＲをコードするヒトＤＮＡ配列、及び／又は
（ｉｉ）転写因子ＣＡＲをコードするヒトＤＮＡ配列を必要に応じて更に含む非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞。
【請求項８０】
前記動物はマウスであり、前記レポーター遺伝子及びヒトＭＤＲ１プロモーター配列はマウスＲｏｓａ２６遺伝子座に挿入されている、請求項７９に記載の非ヒト動物、組織又は細胞。
【請求項８１】
前記ヒトＭＤＲ１プロモーター配列は上流プロモーター配列及び下流プロモーター配列の両方を含む、請求項７９〜８０のいずれか１項に記載の非ヒト動物、組織又は細胞。
【請求項８２】
必要に応じて請求項７２に記載のヒトＣＹＰ３Ａ４プロモーター配列の制御下のレポーター遺伝子配列を更に含む、請求項７９〜８１のいずれか１項に記載の非ヒト動物、組織又は細胞。
【請求項８３】
（ｉ）必要に応じて請求項７４又は７５のいずれか１項に記載のヒトＣＹＰ２Ｂ６プロモーター配列の制御下のレポーター遺伝子配列と、
（ｉｉ）必要に応じて請求項７６又は７７のいずれか１項に記載のヒトＣＹＰ２Ｄ６プロモーター配列の制御下のレポーター遺伝子配列を更に含む、請求項８２に記載の非ヒト動物、組織又は細胞。
【請求項８４】
（ｉ）必要に応じて請求項１１に記載のＡｈＲ、及び必要に応じて請求項１２に記載のＰＰＡＲαから成る群から必要に応じて選択される一以上の更なる転写因子、及び／又は
（ｉｉ）必要に応じて請求項１３に記載の一以上の更なる第１相薬物代謝酵素又は一以上の更なるシトクロムＰ４５０遺伝子クラスター、及び／又は
（ｉｉｉ）必要に応じて請求項１４に記載の一以上の第２相薬物代謝酵素、及び／又は
（ｉｖ）必要に応じて請求項１５に記載の一以上の薬物輸送タンパク質をコードする一以上のヒトＤＮＡ配列を更に含む、請求項３３〜３５、４１、４２又は６４〜８３のいずれか１項に記載の非ヒト動物、組織又は細胞。
【請求項８５】
前記転写因子ＰＸＲをコードするヒトＤＮＡ配列は請求項１〜７のいずれか１項に記載のように定義されている、請求項１６、１９、２２〜３２、３３〜４２、５２〜６３又は６４〜８４のいずれか１項に記載の非ヒト動物、組織又は細胞。
【請求項８６】
前記転写因子ＣＡＲをコードするヒトＤＮＡ配列は請求項１０に記載のように定義されている、請求項１７、１９、３３〜４２、５７〜６２又は６４〜８４のいずれか１項に記載の非ヒト動物、組織又は細胞。
【請求項８７】
内在性等価遺伝子のいずれか１種が無効化されている、先の請求項のいずれか１項に記載の非ヒト動物、組織又は細胞。
【請求項８８】
内在性等価遺伝子のいずれか１種が無効化されていない、先の請求項のいずれか１項に記載の非ヒト動物、組織又は細胞。
【請求項８９】
ＣＹＰ３Ａクラスター、ＣＹＰ２Ｃクラスター、ＣＹＰ２Ｄクラスター又はＣＹＰ１Ａクラスターの一以上は、少なくとも１個のヒトシトクロムＰ４５０酵素をコードするＤＮＡ配列で置換されている、先の請求項のいずれか１項に記載の非ヒト動物、組織又は細胞。
【請求項９０】
前記ヒトＤＮＡ配列の一以上は全ヒトゲノム遺伝子配列である、先の請求項のいずれか１項に記載の非ヒト動物、組織又は細胞。
【請求項９１】
前記ヒトＤＮＡ配列の一以上は部分ヒトゲノム遺伝子配列である、先の請求項のいずれか１項に記載の非ヒト動物、組織又は細胞。
【請求項９２】
前記ヒトＤＮＡ配列の一以上はｃＤＮＡである、先の請求項のいずれか１項に記載の非ヒト動物、組織又は細胞。
【請求項９３】
非ヒト動物は、必要に応じてラット又はマウスであるげっ歯動物、又は非ヒト霊長類である、先の請求項のいずれか１項に記載の非ヒト動物、組織又は細胞。
【請求項９４】
前記ヒトＤＮＡ配列の一以上の発現は、対応するヒトプロモーターの制御下にある、先の請求項のいずれか１項に記載の非ヒト動物、組織又は細胞。
【請求項９５】
前記ヒトＤＮＡ配列の一以上の発現は、非ヒト動物又はマウスの対応する内在性プロモーターの制御下にある、先の請求項のいずれか１項に記載の非ヒト動物、組織又は細胞。
【請求項９６】
生体異物の代謝又は毒性を調べるための方法であって、
（ｉ）内在性調節配列の制御下で薬物代謝に関与するタンパク質をコードするヒトＤＮＡ配列を含み、必要に応じてその内在性等価遺伝子が無効化されている非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞と、
（ｉｉ）内在性等価遺伝子は無効化されているが、薬物代謝に関与するタンパク質をコードするヒトＤＮＡ配列を含まない対応する非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞と、
（ｉｉｉ）必要に応じて、対応する野生型非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞とを用いることを含む方法。
【請求項９７】
（ｉ）内在性調節配列の制御下で薬物代謝に関与する異なるタンパク質をコードする２以上、３以上、４以上又は５以上のヒトＤＮＡ配列をそれぞれ含む２以上、３以上、４以上又は５以上の非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞であって、その各々において、必要に応じてその内在性等価遺伝子が無効化されている非ヒト動物、組織又は細胞と、
（ｉｉ）内在性等価遺伝子は無効化されているが、関連する薬物代謝タンパク質をコードするヒトＤＮＡ配列を含まない２以上、３以上、４以上又は５以上の対応する非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞と、
（ｉｉｉ）必要に応じて、対応する野生型非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞とを用いることを含む、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
生体異物の代謝又は毒性を調べるための方法であって、
（ｉ）内在性ヒト調節配列の制御下で薬物代謝に関与するタンパク質をコードするヒトＤＮＡ配列を含み、必要に応じてその内在性等価遺伝子が無効化されている第１の非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞と、
（ｉｉ）内在性非ヒト動物調節配列の制御下で薬物代謝に関与するタンパク質をコードするヒトＤＮＡ配列を含み、必要に応じてその内在性等価遺伝子が無効化されている第２の非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞と、
（ｉｉｉ）必要に応じて、内在性等価遺伝子は無効化されているが、薬物代謝に関与するタンパク質をコードするヒトＤＮＡ配列を含まない対応する非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞と、
（ｉｖ）必要に応じて、対応する野生型非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞とを用いることを含む方法。
【請求項９９】
生体異物の代謝又は毒性を調べるための方法であって、少なくとも３種の非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞を用いることを含む方法において、非ヒト動物、組織又は細胞の各々の種は、薬物代謝に関与するタンパク質のアミノ酸配列又は発現に影響を及ぼす異なる遺伝子改変を含む方法。
【請求項１００】
配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４に示す核酸分子に対しその全長に亘って少なくとも７０％同一であるＤＮＡ配列を含むか、又はこのような核酸分子と相補的なＤＮＡ配列を含むトランスジェニック非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞。
【請求項１０１】
ＤＮＡ配列は内在性等価遺伝子の遺伝子座において安定的に組み込まれている、請求項１００に記載のトランスジェニック非ヒト動物、組織又は細胞。
【請求項１０２】
配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４に示す核酸分子に対しその全長に亘って少なくとも７０％同一であるＤＮＡ配列を含むか、又はこのような核酸分子と相補的なＤＮＡ配列を含み、更に、内在性等価遺伝子の遺伝子座における５’及び３’領域と相同である５’及び３’フランキング核酸配列を含み、更に必要に応じて、内在性等価遺伝子の遺伝子座内へのヒトＤＮＡ配列の組み込み後に該配列の条件的欠失を可能とする核酸配列要素を含む核酸ターゲティングベクター。
【請求項１０３】
請求項１０２に記載の核酸ターゲティングベクターを含む非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞。
【請求項１０４】
生体異物の代謝又は毒性を調べるための方法であって、
（ｉ）転写産物及び／又は翻訳産物のアッセイによってその発現が簡便に測定できるＤＮＡ配列と作用的に連結した第１の内在性調節配列（例えば、マウスプロモーターやヒトプロモーター）を含む第１の非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞と、
（ｉｉ）転写産物及び／又は翻訳産物のアッセイによってその発現が簡便に測定できるＤＮＡ配列と作用的に連結した前記第１の内在性調節配列とは異なる第２の内在性調節配列（例えば、マウスプロモーターやヒトプロモーター）を含む第２の非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞を用いることを含む方法において、
（ｉｉｉ）第１及び第２の内在性調節配列は、薬物代謝に関与するタンパク質をコードする遺伝子に通常関連する調節配列である方法。
【請求項１０５】
生体異物の代謝又は毒性を調べるための方法であって、少なくとも３種の非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞を用いることを含む方法において、非ヒト動物、組織又は細胞の各々の種は、転写産物及び／又は翻訳産物のアッセイによってその発現が簡便に測定できるＤＮＡ配列と作用的に連結した異なる内在性調節配列を含み、且つ、各内在性調節配列は、薬物代謝に関与するタンパク質をコードする遺伝子に通常関連する調節配列である方法。
【請求項１０６】
転写産物及び／又は翻訳産物のアッセイによってその発現が簡便に測定できるＤＮＡ配列は、異なる非ヒト動物、組織又は細胞において同一である、請求項１０４又は１０５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０７】
異なる種の非ヒト動物に対して同一薬物を同用量で投与することと、異なる動物間における該薬物の代謝又は毒性について比較することを含む、請求項１０４〜１０６のいずれかに記載の方法。
【請求項１０８】
生体異物の代謝又は毒性を調べるための方法であって、２種以上の非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞に薬物化合物を投与することを含む方法において、各非ヒト動物、組織又は細胞は、内在性調節配列の制御下で薬物代謝に関与するタンパク質をコードするヒトＤＮＡ配列を含み、必要に応じてその内在性等価因子が無効化されている方法。
【請求項１０９】
異なる非ヒト動物、組織又は細胞について得られた実験結果を比較する工程を更に含む、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
必要に応じてマウス、該マウス由来の組織又は細胞である、トランスジェニック非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞であって、次の遺伝子型：
ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ／ｈｕＡｈＲ；ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ／ｈｕＰＰＡＲα；ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ／ｈｕＡｈＲ／ｈｕＰＰＡＲα；
ｋｏＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；ｈｕＰＸＲ／ｋｏＣＡＲ；ｋｏＰＸＲ／ｋｏＣＡＲ；ｋｏＰＸＲ／ｋｏＣＡＲ／ｋｏＡｈＲ；ｋｏＰＸＲ／ｋｏＣＡＲ／ｋｏＰＰＡＲα；ｋｏＰＸＲ／ｋｏＣＡＲ／ｋｏＡｈＲ／ｋｏＰＰＡＲα；
ｈｕＣＹＰ２Ｃ９／ｈｕＰＸＲ；ｈｕＣＹＰ２Ｄ６；ｈｕＣＹＰ２Ｄ６／ｈｕＰＸＲ；ｈｕＣＹＰ３Ａ４／ｈｕＰＸＲ；ｈｕＣＹＰ３Ａクラスター；ｈｕＣＹＰ３Ａクラスター／ｈｕＰＸＲ：ｈｕＣＹＰ３Ａクラスター／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；ｈｕＣＹＰ３Ａ４／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；ｈｕＣＹＰ２Ｃクラスター；ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＹＰ２Ｃクラスター；ｈｕＣＹＰ２Ｃクラスター／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；ｈｕＣＹＰ１Ａ１／ｈｕＣＹＰ１Ａ２；ｈｕＣＹＰ２Ｄ６；ｋｏＣｙｐ１Ａクラスター；ｈｕＣＹＰ１Ａ１／ｈｕＣＹＰ１Ａ２／ｈｕＡｈＲ；ｈｕＣＹＰ１Ａ１／ＣＹＰ１Ａ２／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；ｈｕＣＹＰ２Ｄ６／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；ｋｏＣｙｐ２ｄクラスター；ｈｕＣＹＰ３Ａクラスター／ｈｕＣＹＰ２Ｃクラスター／ｈｕＣＹＰ２Ｄ６／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；
ｋｏＣｙｐ３ａ１１／ｈｕＰＸＲ；ｈｕＣＹＰ３Ａ４／ｋｏＣｙｐ３ａ１１／ｈｕＰＸＲ；ｋｏＣｙｐ３ａクラスター／ｈｕＰＸＲ；ｋｏＣｙｐ２ｃクラスター／ｈｕＰＸＲ；ｈｕＣＹＰ３Ａ４／ｋｏＣｙｐ３ａ１１／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；ｈｕＣＹＰ３Ａ４／ｋｏＣｙｐ３ａクラスター／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；ｈｕＣＹＰ２Ｃ９／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；ｈｕＣＹＰ２Ｃ９／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ／ｋｏＣｙｐ２ｃクラスター；ｋｏＣｙｐ３ａクラスター／ｋｏＣｙｐ２ｃクラスター／ｋｏＣｙｐ２ｄクラスター；ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ／ｋｏＣｙｐ３ａクラスター／ｋｏＣｙｐ２ｃクラスター／ｋｏＣｙｐ２ｄクラスター；
ｈｕＵＧＴ／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；ｈｕＵＧＴ１／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；
ｈｕＭＤＲ１／ｍｄｒ１ａ-/-／ｈｕＰＸＲ；ｈｕＭＤＲ１／ｍｄｒ１ｂ-/-／ｈｕＰＸＲ；ｈｕＭＤＲ１／ｍｄｒ１ａ-/-／ｍｄｒ１ｂ-/-／ｈｕＰＸＲ；ｈｕＭＲＰ２／ｈｕＰＸＲ；ｈｕＭＲＰ２／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；ｈｕＭＲＰ２／ ｈｕＭＤＲ１／ｍｄｒ１ａ-/-／ｍｄｒ１ｂ-/-／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；ｈｕＣＹＰ３Ａクラスター／ｈｕＭＤＲ１／ｍｄｒ１ａ-/-／ｍｄｒ１ｂ-/-／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；ｈｕＣＹＰ３Ａクラスター／ｈｕＭＤＲ１／ｍｄｒ１ａ-/-／ｍｄｒ１ｂ-/-／ｈｕＵＧＴ／ｈｕＭＲＰ２／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；ｈｕＣＹＰ３Ａクラスター／ｈｕＣＹＰ２Ｃクラスター／ｈｕＭＤＲ１／ｍｄｒ１ａ-/-／ｍｄｒ１ｂ-/-／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；ｈｕＵＧＴ／ｈｕＭＲＰ２／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；ｈｕＭＤＲ１／ｍｄｒ１ａ-/-／ｍｄｒ１ｂ-/-／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；ｈｕＭＲＰ２／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ／ｈｕＭＤＲ１ａ／ｂ；ｈｕＭＤＲ１ａ；ｈｕＭＤＲ１ｂ；ｈｕＭＤＲ１ａ／ｈｕＭＤＲ１ｂ（即ち、ｈｕＭＤＲ１ａ／ｂ）；
ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ／ｋｏＭＤＲ１ａ／ｂ；
ｒＣＹＰ２Ｂ６／ｈｕＣＡＲ；ｒＣｙｐ３ａ１１／ｈｕＰＸＲ；ｒＣｙｐ３ａ１１／ｈｕＰＸＲ；ｒＣＹＰ３Ａ４／ｈｕＰＸＲ；ｒＣＹＰ２Ｃ９／ｈｕＰＸＲ；ｒＣＹＰ２Ｄ６／ｈｕＰＸＲ；ｒＣＹＰ２Ｃ１９／ｈｕＰＸＲ；ｒＣＹＰ３Ａ４／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；ｒＣＹＰ２Ｃ９／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；ｒＣＹＰ２Ｄ６／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；ｒＣＹＰ２Ｃ１９／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；ｒＣＹＰ２Ｂ６／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；ｒＣＹＰ３Ａ４／ｈｕＣＹＰ２Ｂ６／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；ｒＣＹＰ３Ａ４／ｈｕＣＹＰ２Ｃ９／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；ｒＣＹＰ２Ｄ６／ｈｕＣＹＰ２Ｃ１９／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；ｒＣＹＰ３Ａ４／ｈｕＣＹＰ２Ｃ９／ｈｕＣＹＰ２Ｄ６／ｈｕＣＹＰ２Ｃ１９／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；ｒＣＹＰ３Ａ４／ｈｕＣＹＰ２Ｄ６／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；ｒＣＹＰ２Ｂ６／ｈｕＭＤＲ１／ｍｄｒ１ａ-/-／ ｍｄｒ１ｂ-/-／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；ｒＣＹＰ３Ａ４／ｈｕＣＹＰ２Ｃ９／ｈｕＣＹＰ２Ｂ６／ｈｕＭＤＲ１／ｍｄｒ１ａ-/-／ｍｄｒ１ｂ-/-／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；ｒＣＹＰ３Ａ４／ｈｕＣＹＰ２Ｂ６／ＭＤＲ１／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；ｒＣＹＰ３Ａ４／ｈｕＣＹＰ２Ｄ６／ｈｕＣＹＰ２Ｂ６／ｈｕＭＤＲ１／ｍｄｒ１ａ-/-／ｍｄｒ１ｂ-/-／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；ｈｕＰＸＲ／ｒＣＹＰ３Ａ４；ｒＣｙｐ３ａ１１；ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ／ｒＣＹＰ３Ａ４；ｈＣＡＲ／ｒＣＹＰ２Ｂ６；ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ／ｒＣＹＰ２Ｂ６；ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ／ｒＣＹＰ２Ｄ６；ｈＰＸＲ／ｒＣＹＰ２Ｄ６；
ｒＭＤＲ１／ｈｕＰＸＲ；ｒＭＤＲ１／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；ｒＭＤＲ１；ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ／ｒＭＤＲ１；ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ／ｒＣＹＰ２Ｂ６／ｒ２Ｄ６／ｒ３Ａ４／ｒＭＤＲ１から成る群から選択される遺伝子型を有するトランスジェニック非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トランスジェニック非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞、及びその作出方法に関する。本発明のトランスジェニック非ヒト動物、或いは該動物由来の組織又は細胞により、相同内在性（homologous endogenous）非ヒト動物タンパク質に代わって薬物代謝に関与すると共に、該動物に導入されたヒト遺伝子の発現の調節をヒト生体内で見られるものにより近づけるように発現制御することに関与するヒトタンパク質を発現することが可能な系が得られる。本発明のトランスジェニック非ヒト動物、或いは該動物由来の組織又は細胞は特に、導入されたヒトタンパク質の生体異物代謝や薬物代謝、毒性、その他の特性や機能（例えば内因性化合物の代謝及び／又は生合成）の評価に用いられるが、これらに限定されない。
【背景技術】
【０００２】
治療薬候補はそのかなりの割合が、治験時に見出された有害な代謝や毒性のために市場向けの薬物とはなり得ない。このような状況は、多額の開発費が無駄になっていることを示しており、よって、候補薬のヒトにおける代謝特性や毒物学的特性を前臨床開発段階で、より確実に、迅速に且つ経済的に予測できる新しい技術が必要である。現在、候補薬の前臨床代謝試験や毒性試験の多くは、実験動物やヒト及び／又は哺乳動物の培養細胞株及び／又は組織を利用している。しかし、これらの方法はいずれも、被験者における代謝や毒性を予測する上で完全に信頼できるものではない。動物から得た代謝データや毒物学的データは、生化学的機序に関する種差のため、被験者から得たものとは大きく異なる。また、インビトロでのヒト細胞培養物や単離ヒト組織の研究から得たデータの解釈は、このような系が全ての器官や組織について利用できるとは限らず、また、in vivoで有するのと同じ代謝特性を保持できないため問題となり得る。
【０００３】
先行技術においては、多くの薬剤の代謝、分布及び毒性は、互いに明瞭に区別される次の４種類の主要タンパク質クラスと該薬剤との相互作用に依存することが知られている。
ａ）第１相薬物代謝酵素（通常、生体異物分子上に極性基を付加したり或いは露出させるシトクロムＰ４５０等）；
ｂ）第２相薬物代謝酵素（例えば、トランスフェラーゼ、特に、極性化した生体異物分子に親水基を抱合させ、それに続く排泄を促進する、グルクロニルトランスフェラーゼやグルタチオントランスフェラーゼ、スルホニルトランスフェラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ）；
ｃ）薬物輸送タンパク質（例えば、薬物や他の生体異物分子の形質膜経由の輸送を促進する、多剤耐性タンパク質（ＭＤＲ）や多剤耐性関連タンパク質（ＭＲＰ）等のＡＴＰ結合カセットタンパク質や有機アニオン輸送ポリペプチド（ＯＡＴＰ））；
ｄ）転写因子（例えば、先のクラスのタンパク質（特に、シトクロムＰ４５０）をコードする遺伝子の転写を調節する、プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）や構成的アンドロスタン受容体（ＣＡＲ））。
【０００４】
これらのタンパク質クラスの各々においては、各クラス内のタンパク質の多様性やタンパク質自身の機能についての、また、その発現の遺伝的調節についての種間での差異が知られている。
【０００５】
ＷＯ２００４／００７７０８からは、個々のＰ４５０遺伝子の欠失、或いはシトクロムＰ４５０全ての機能を左右する酵素をコードするシトクロムＰ４５０レダクターゼ遺伝子の欠失によって内在性シトクロムＰ４５０の機能が無効になった機能性ヒトＰ４５０を発現する非ヒトトランスジェニック動物を作出する方法が知られる。しかし、ここに記載された動物モデルは、導入Ｐ４５０が非ヒト動物の特定の器官や組織に限定されるだけでなく、ヒトにおいて見られるのと同様にはヒトＰ４５０の発現が調節されないという点で制約を受ける。また、先行技術モデルの或るものでは、内在性非ヒトＰ４５０を再活性化せずに導入ヒトＰ４５０にシトクロムＰ４５０レダクターゼ活性を付与するためには更なる改変が必要であるという点でも制約を受ける。更に不都合な点は、ヒト第２相代謝が再現性を欠くため、この系によって全代謝プロファイルを得ることができないことである。
【０００６】
また、先行技術によると、マウスＰＸＲ遺伝子及び／又はマウスＣＡＲ遺伝子がそれぞれ欠失したマウスにおいて、ヒトＰＸＲ（Xie et al., Nature Vol. 406, 435-9, 2000）又はヒトＣＡＲ（Zhang et al., Science Vol. 298, 422-4, 2002）を発現させることによりマウスにおけるシトクロムＰ４５０の誘導特性をヒト化することも知られている。このような動物は、ヒトにおいて見られる内在性Ｐ４５０誘導パターンを再現する内在性Ｐ４５０誘導パターンを示す一方、シトクロムＰ４５０の発現がヒトと同様に調節されるとはいえ依然として非ヒトシトクロムＰ４５０であるため、望ましくない特性を有する。更に不都合な点は、異種組織特異的プロモーター（アルブミンプロモーター）により駆動される導入遺伝子によって、ＰＸＲ遺伝子又はＣＡＲ遺伝子自身がヒトの場合と同様には調節されないため、異種遺伝子の過剰発現が生じ、その結果、通常の代謝経路が迂回されるおそれがあることである。また、ＰＸＲ及びＣＡＲ導入遺伝子は、ゲノムクローンではなくｃＤＮＡに由来しているため、トランスジェニック非ヒト動物には、ＰＸＲ発現又はＣＡＲ発現の転写調節及び転写後調節全てを正確に再現するのに必要な配列が欠如しており、従って、その発現は肝臓に限定され、生理学的レベルにはなり得ない。更に、これらのモデルは、ヒト遺伝子のスプライスバリアントをコードしない。ＰＸＲ／ＣＡＲモデルの他の欠点は、各遺伝子のヒト化が２種の独立したゲノム変化、即ち、（ｉ）内在性遺伝子のノックアウト及び（ｉｉ）異なるゲノム位置におけるアルブミンプロモーター制御下でのヒトオルソログとの遺伝子組換え、によってなされるため、ＰＸＲ／ＣＡＲモデルが一動物内において他の遺伝子の改変と組合せるのに適していないことである。
【０００７】
Ma et al.（Drug Metab Dispos. 2007, Feb;35(2):194-200）は、５’及び３’フランキング配列を含む完全ヒトＰＸＲ遺伝子を、バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）遺伝子組換えによってＰＸＲノックアウトマウスに導入した。肝臓及び腸においてヒトＰＸＲの選択的発現が観察された。ＰＸＲリガンドによるＰＸＲヒト化マウスの処理によってヒト応答が模倣された。即ち、肝臓と腸のＣｙｐ３ａ１１ｍＲＮＡ及びタンパク質の両方がリファンピシン（即ち、ヒト特異的ＰＸＲリガンド）によって強く誘導されたが、プレグネノロン１６α−カルボニトリル（ＰＣＮ）（即ち、げっ歯類特異的ＰＸＲリガンド）によっては誘導されなかった。野生型マウスにおいては、Ｃｙｐ３ａ１１ｍＲＮＡはＰＣＮによって強く誘導されたが、リファンピシンによっては誘導されなかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、導入されたヒト遺伝子の発現を制御することが可能なヒト代謝動物モデルを改良し、その発現がヒトにおいて見られるものと一層同様に調節されるようにする必要がある。また、ヒトの代謝経路をより多くの様相（more aspects）で再現できるようにすることも必要である。有効なヒト代謝動物モデルでは、関連するヒトタンパク質の発現だけでなく、相同内在性タンパク質の機能の無効化（annulment）も必要である。
【０００９】
本発明が先行技術を超える驚くべき先進性を具現化している一理由としては、先行技術の研究者の多くが、薬物代謝モデルが必要とされることに伴う問題は既に解決済みであると考えているように思われる点が挙げられる。例えば、Xie及びEvans（2002, DDT7, p509）は、ＰＸＲをヒト化することは「単一の転写調節因子を置換することによって種特異的な遺伝子調節の転換が可能となる稀な一例である」と述べている。また、研究者らがトランスジェニック動物系を利用する技術とは著しく異なる技術に注目を向けているのは明らかである。例えば、ヒト肝細胞を用い、臓器としてのマウス肝臓をヒト化する試みが行われているが、この目的は、ヒトにおける薬物代謝のマウスモデルを得ることである。しかしながらこの作業は労働集約的であり、本発明者らの考えでは、実際の状況に即したものであるかどうかは疑わしい。
【００１０】
本発明は、先行技術の系が悩んでいる問題の全てを考慮し、このような問題を実際的に解決しようとする最初の方法である。本発明者らは、先行技術に記載された動物モデルの望ましくない特徴を克服するヒト化薬物代謝経路を有するトランスジェニック非ヒト動物モデルを得るためには、幾つかの基準、即ち、
ａ）ヒトにおける発現パターンが再現されるように、導入されたヒトタンパク質の発現を調節すること、
ｂ）ヒト代謝の複数の様相（aspects）が再現されるように複数のヒトタンパク質を発現させること、及び
ｃ）導入されたヒトタンパク質の機能に対する非ヒト代謝経路からの干渉が大幅に低減するように複数の内在性遺伝子の発現又は機能を無効化することが理想的に満たされる必要があること、を認識した。
【００１１】
本発明において、本発明者らは、このような望ましい特性の全てではないにせよ少なくともそのいくらかを有する非ヒト動物細胞及び非ヒトトランスジェニック動物を作出する方法を提供する。このような非ヒト動物細胞及び非ヒトトランスジェニック動物は、単に個々の経路要素ではなくヒトの生体異物代謝経路全体をモデル化できると共に、このようなモデルが全ての組織及び器官に提供される点において、先行技術では得られなかった望ましい特性を有する。これは、広範囲の調節ＤＮＡ配列を用いてヒト細胞において見られるのと同様に導入遺伝子の発現を調節することや、欠失又は遺伝子交換によって内在性代謝経路を無効化することに関し、先行技術において従来得られなかった技術的アプローチの応用によってなされたものである。多数の関連するヒトタンパク質が単一の動物において発現される。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、特許請求の範囲及び本明細書にて後述するように、トランスジェニック非ヒト動物、組織、該動物由来の細胞、核酸ターゲティングベクター及び方法を提供する。
【００１３】
一般には、本発明は、転写因子プロモーターの制御下で少なくとも１種の転写因子をコードする少なくとも１個のヒトＤＮＡ配列を含み、その内在性等価遺伝子（endogenous equivalent genes）が必要に応じて無効化されている非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞であって、次のヒトＤＮＡ配列、即ち、
（ｉ）第１相薬物代謝酵素をコードするＤＮＡ配列、
（ｉｉ）第２相薬物代謝酵素をコードするＤＮＡ配列、及び／又は
（ｉｉｉ）薬物輸送タンパク質をコードするＤＮＡ配列、から成る群から選択されるヒトＤＮＡ配列の少なくとも一以上を更に含み、その内在性等価遺伝子が必要に応じて無効化されている非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞を提供する。
【００１４】
本明細書及びそれに続く特許請求の範囲においては、特に明記しない限り、「含む(comprise)」或いはその変形である「含む(comprises)」や「含んでいる(comprising)」は、述べられたとおりのインテジャ（自体完全であるもの）やインテジャの群（stated integer or group of integers）を包含するが、他のインテジャやインテジャの群を除外しないことを暗示すると理解されたい。
【００１５】
本明細書に記載の非ヒト動物の「内在性等価遺伝子」とは、一又は複数の遺伝子であって、その発現産物がヒトカウンターパート遺伝子と同様、類似或いは同一の機能を保持する遺伝子をいう。例えば、ＰＸＲ（ＮＲ１Ｉ２核内受容体サブファミリー１、グループＩ、メンバー２）として知られているヒト転写因子遺伝子（Ｅｎｔｒｅｚ  ＧｅｎｅＩＤ：８８５６）は、名称が同じでそのＥｎｔｒｅｚ  ＧｅｎｅＩＤが１８１７１であるマウスカウンターパートを有する。これらの遺伝子によってコードされるタンパク質は、その由来源の生物内において等価な機能を有する。
【００１６】
一般に、導入された転写因子遺伝子、第１相薬物代謝酵素遺伝子、第２相薬物代謝酵素遺伝子及び／又は薬物輸送タンパク質遺伝子は、それと等価の内在性遺伝子とある程度の相同性を有する。好ましくは、その相同度（the degree of homology）は３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超又は９５％超である。
【００１７】
薬物代謝酵素遺伝子の場合、遺伝子間の等価性（equivalence）は、基質特異性、調節様式（例えば、転写因子や外因性薬物による）、配列相同性及び組織分布の組合せによって評価することができる。正確に等価な遺伝子もあり、そのような遺伝子の例としては、ＣＹＰ２Ｅ１やＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２が挙げられる。ＣＹＰ２Ｂ６及びＣＹＰ２Ｄは、ヒトには１個の遺伝子しか存在しないが、マウスには多数の等価な遺伝子が存在する例である。ヒトには４種類のＣＹＰ２Ｃ遺伝子が存在し、マウスには多数の等価な遺伝子が存在する。このような状況で、好ましくは、等価なマウス遺伝子の少なくとも１個、より好ましくは２個、３個、４個、５個以上、或いはその全てを無効化する。ＣＹＰ３Ａ４はマウスにおいて明らかなオルソログが存在しない例であるが、Ｃｙｐ３ａ１１は、その肝発現、調節様式及び配列相同性から、少なくとも１個の等価なマウス遺伝子と考えることができる。
【００１８】
本明細書に記載の「無効化」とは、非ヒト動物の内在性等価遺伝子が遺伝子産物を発現できないように、少なくとも薬物代謝プロセスに重要なレベルまで発現しないようにサイレント化、欠失又は不活性化することを包含するものとする。例えば、無効化遺伝子の発現レベルは、野生型発現レベルの２０％未満でもよいが、好ましくは１０％未満、より好ましくは５％未満、より好ましくは２％未満、更に好ましくは１％以下である。無効化遺伝子の発現は、それが検出できない程度まで低下させるのが好ましい。非ヒト動物の内在性等価遺伝子を無効化するのが好ましいが、ある実施形態においては、非ヒト動物の内在性等価遺伝子を無効化しない。例えば、薬物代謝に関与するタンパク質をコードするヒトＤＮＡ配列をマウスＲｏｓａ２６遺伝子座（該遺伝子座自身はサイレント化しない）へ挿入して、薬物代謝に関与するマウス遺伝子を欠失又は不活性化することができる。
【００１９】
特に、本発明の第１の様相は、転写因子ＰＸＲ（即ち、プレグナンＸ受容体）をコードする少なくとも１個のヒトＤＮＡ配列を含む非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞であって、前記ヒトＤＮＡ配列は、ヒトＰＸＲ遺伝子のイントロン６及び／又はイントロン７の少なくとも一部（least part）を含む非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞を提供する。
【００２０】
部分ゲノム配列
これまでに開示された先行技術において、研究者らは、非ヒト系（特にマウス）にヒト遺伝子を組み込んだトランスジェニックモデルを作出している。しかし、このような系を考案するに当り、ヒト遺伝子のコンテクストを保持することに対しては、それが自然の状態で存在するため、殆ど注意が払われていなかった。
【００２１】
一般に、先行技術においては、ヒト遺伝子のイントロン／エクソン構造を考慮する（例えば、ヒト遺伝子の少なくとも１個のイントロンを組み込む）のではなく、ｃＤＮＡ配列が用いられている。これは、自然に産生し得るスプライスバリアントが生成できないことを意味する。スプライスバリアントは幾つかの理由により重要である。第１には、ある機能を有し得ること。第２には、例えば、その通常のタンパク質パートナーに結合し、該タンパク質の生物学的作用を変えることによってドミナントネガティブ作用を有する。第３には、リガンドを隔離し得る。従って、in vivoでの状態を正確に反映する系は、生体系において存在するスプライスバリアントのバランスを反映するのが好ましい。
【００２２】
また、ｃＤＮＡを用いることは、ｍＲＮＡレベルが人工的に生成され、自然の生理学的状態の現実が反映されない場合があることも意味する。
【００２３】
これに対し、本発明では、可能な場合にはヒト遺伝子全長を提供することによってin vivoでの状態を反映することを試みる。これは、スプライシング現象が自然の状態と全く同様に起こり得るように、イントロン−エクソン接合を自然系同様に保持することを意味する。遺伝子の長さによって、そのヒト遺伝子全体をトランスジェニック系に組み込むことが容易でない場合には、本発明は、スプライシングイベントの大部分が生じる重要なイントロン−エクソン境界が保持されるようにｃＤＮＡとゲノムＤＮＡとの組合せをその構築物として用いようとするものである。
【００２４】
このように、転写因子、薬物代謝酵素又は薬物輸送タンパク質をコードするヒトＤＮＡ配列は、部分ヒトゲノム遺伝子配列又は全ヒトゲノム遺伝子配列であり得る。
【００２５】
従って、本発明においては、ある特定のイントロン内でのスプライシング変異によってスプライスバリアントの大部分が生じることが分かれば、このイントロンを構築物内にゲノムＤＮＡとして組み込むことが好ましい一方で、影響力の小さいイントロン配列は保持しない。この結果、機能性ｍＲＮＡ及び機能性タンパク質のレベルが、特定の薬物又は薬物カクテルへの曝露に反応してin vivoで見出されるレベルを反映する。これが、生理学的関連モデルにとって理想的に必要なものである。
【００２６】
従って、ｃＤＮＡ配列を用いてもよいが、この配列よりも好ましいものとして、本発明ではヒト化される遺伝子由来のｃＤＮＡとゲノム配列との組合せを用いることができる。
ｃＤＮＡとゲノム配列との組合せを用いる場合、ヒトＤＮＡ配列には、ヒト遺伝子のイントロン及びエクソンの一部が含まれるが、その全ては含まれない。ヒトｃＤＮＡとゲノム配列との組合せから成る構築物を含む多数の非ヒト動物モデルが本発明者らによって作出された。例えば、ヒトＰＸＲ遺伝子を発現するトランスジェニック動物の場合、ＷＯ２００６／０６４１９７に開示されているように、ヒトＰＸＲ遺伝子のサイズが３５ｋｂ超と大きいため、エクソン４とエクソン６との間のイントロン−エクソン構造を保持するのが好ましいが、それは、このゲノム領域がリガンド結合ドメイン内に位置するために、このゲノム領域で多くのスプライスバリアントが見られるからである（例えば、図２参照）。これによって、多くのスプライスバリアントが見られ、都合よくリガンド結合ドメイン内に位置する配列が有利に保持される。
【００２７】
しかし、ヒトＰＸＲ遺伝子を発現するトランスジェニック動物の場合、転写因子ＰＸＲをコードするヒトＤＮＡ配列には、ヒトＰＸＲ遺伝子のイントロン６及び／又はイントロン７の少なくとも一部が含まれるのが好ましいことが見出された。こうして、エクソン６と８、及び／又はエクソン７と８（或いは好ましくは、エクソン６、７及び８）を融合させずに部分ｃＤＮＡ配列を作出する。これによって、このような部分ｃＤＮＡ配列において（例えば、融合エクソン７と８との間の接合部において）生成し得る予期しない隠れたスプライス部位についての問題が回避される。このような隠れたスプライス部位によって異常なスプライスバリアントが生成し、その存在が非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞における機能性ヒトＰＸＲタンパク質の発現を低下させ、或いは、ＰＸＲ発現の最適なヒト化を妨げることになり得る。このように、ヒトＰＸＲ遺伝子のイントロン６及び／又はイントロン７の少なくとも一部を含むヒトＤＮＡ配列の発現は有利であるが、それは、このようなＰＸＲの発現がヒトで見出される発現レベル（スプライスバリアントの詳細な分布を含む）を最も正確に反映するからである。
【００２８】
実施例５（パートＡ）及び図８５に示すデータから、イントロン４、５、６及び７を含むＰＸＲをコードするヒトＤＮＡ配列を発現する（即ち、ｈｕＰＸＲ遺伝子型を有する）マウスは、イントロン４及び５のみを含むヒトＤＮＡ配列を発現するマウスに比べてリファンピシンに対する感受性が高いことが分かるが、これは、ヒトのリファンピシンに対する感受性がマウスよりも高いことと一致する。
【００２９】
本発明に係るＰＸＲをコードするヒトＤＮＡ配列は、ヒトＰＸＲ遺伝子のイントロン４、５、６及び／又は７の少なくとも一部を含むのが好ましい。イントロン４、５、６及び７は全て保持されているのが好ましい。このようなヒトＤＮＡは配列番号２のｈｕＰＸＲ配列によって例示される。
【００３０】
他の好ましい実施形態においては、ヒトＰＸＲ遺伝子のエクソン４とエクソン８との間のイントロン−エクソン構造が維持されている（配列番号２参照、また、例えば、図６２参照）。
【００３１】
他の好ましい実施形態においては、本発明に係るＰＸＲをコードするヒトＤＮＡ配列は、ヒトＰＸＲ遺伝子のイントロン２、イントロン３及び／又はイントロン８の少なくとも一部を更に含み、及び／又は、更に、ヒトＰＸＲ遺伝子のエクソン２とエクソン９との間のイントロン−エクソン構造が維持されている（例えば、図６４参照、また、配列番号３参照）。
【００３２】
ある好ましい実施形態において、本発明は、前記ヒトＤＮＡ配列が配列番号２の配列又は配列番号３の配列と少なくとも５０％、好ましくは６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％同一である配列を含む、請求項１に記載の非ヒト動物、組織又は細胞を提供する。以下、これらの配列についてより詳細に説明する。
【００３３】
他の例としてはＣＹＰ３Ａ４に好ましく用いられるヒト化カセットの場合が挙げられるが、これは、１３ｋｂのヒトＣＹＰ３Ａ４プロモーターと、通常のゲノム構成同様にエクソン１及びイントロン１と、エクソン２〜１３から成るヒトｃＤＮＡとを含むことができる（例えば、図９参照）。
【００３４】
他の例としてはＣＹＰ２Ｃ９に好ましく用いられるヒト化カセットの場合が挙げられるが、これは、１２ｋｂのヒトＣＹＰ２Ｃ９プロモーターと、エクソン１〜４から成るヒトｃＤＮＡと、イントロン４と、エクソン５〜９から成るｃＤＮＡとを含むことができる（例えば、図１０参照）。
【００３５】
他の例としてはＰＰＡＲαに好ましく用いられるヒト化カセットの場合が挙げられるが、この場合、例えば、イントロン５及び／又はイントロン６の少なくとも一部を含むことによって、ヒトＰＰＡＲα遺伝子のエクソン３とエクソン８との間のイントロン−エクソン構造を維持することができる（例えば、図６８参照）。
【００３６】
全ゲノム配列
全ゲノムＤＮＡ配列を用いることもできる。例えば、ヒトＣＡＲ遺伝子を発現するトランスジェニック動物の場合、ヒトＣＡＲのサイズは比較的小さい（エクソン２〜９由来の約７ｋｂ）ため、ターゲティングベクター内で全ゲノム構造を保持することが容易となる。構築物は、エクソン２とエクソン９との間のイントロン−エクソン構造を保持するのが好ましい。これによって、ターゲティングベクター内で全ゲノム構造が有利に保持され、ヒトＣＡＲの全てのスプライスバリアントをカバーすることができる。ゲノムヒトＣＡＲ配列はマウスＣＡＲ遺伝子の翻訳開始部位に融合するのが好ましい。その際、ヒトＣＡＲ配列はエクソン１〜９の全てのゲノム配列を含む。５’及び３’ＵＴＲはヒトであってもよく、マウスゲノムから保持されていてもよい。マウスＣＡＲ遺伝子のコード配列の他の全ての部分を欠失させることができる。
【００３７】
本明細書の他の箇所でより詳細に記載するように、ヒトＤＮＡ配列のクラスターを用いることによって全ゲノム遺伝子配列を簡便に使用することができる（例えば、図７２、７４及び７５参照）。
【００３８】
全ゲノムＤＮＡ配列を用いる場合、ヒトＤＮＡ配列にはヒト遺伝子のイントロン及びエクソンの全てが含まれることになるが、ヒト遺伝子に通常関連する調節配列の一部又は全部が更に必要に応じて含まれていてもよい（本明細書の他の箇所でより詳細に記載する）。
【００３９】
本発明に係るＰＸＲをコードするヒトＤＮＡ配列がマウスＰＸＲ遺伝子座に挿入され、ヒトＰＸＲの発現がマウスＰＸＲプロモーターの制御下にあるのが好ましい。
【００４０】
次のヒトＤＮＡ配列、即ち、
（ｉ）更なる転写因子、
（ｉｉ）第１相薬物代謝酵素、
（ｉｉｉ）第２相薬物代謝酵素、及び／又は
（ｉｖ）薬物輸送タンパク質をコードするヒトＤＮＡ配列のいずれか一以上の少なくとも１個（at least one of any one or more of）を更に含む非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞に本発明に係るＰＸＲをコードするヒトＤＮＡ配列を組み込むことが好ましい。
【００４１】
本発明においては、非ヒト動物、組織又は細胞の使用目的に応じて、更なる転写因子、第１相薬物代謝酵素、第２相薬物代謝酵素及び／又は薬物輸送タンパク質のいずれをも用いることができる。更なる転写因子、第１相薬物代謝酵素、第２相薬物代謝酵素及び／又は薬物輸送タンパク質は、特許請求の範囲及び本明細書にて後述するように定義されるのが好ましい。
【００４２】
転写因子
転写因子をコードするヒトＤＮＡは、プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ、ステロイド生体異物受容体（ＳＸＲ）としても知られている）、構成的アンドロスタン受容体（ＣＡＲ）、それらの複数での存在（multiples thereof）及びそれらの組合せから成る群から選択されるのが好ましい。本発明のこの様相における動物及び細胞は、上で詳述した理由によって有利である。例えば、最近のエビデンスによって、マウス及びヒトＣＡＲタンパク質のリガンド結合ドメインは他の核内ホルモン受容体に比べて分岐しており、これによって生体異物反応における種特異的差異がもたらされるという主張が更に支持されている（Huang et al., 2004, Molecular endocrinology 18(10): 2402-2408）。この論文で報告された結果から、げっ歯類及びヒトにおけるオルソロガスな受容体経由の相対する生体異物反応が単一の化合物によって誘導され得ることが分かる。
【００４３】
ヒトＣＡＲのトランスジェニックマウスを作出したが、その説明は本明細書中、実施例にて行う。ＣＡＲヒト化マウス及びノックアウトマウスにおける薬物代謝経路の誘導についての詳細な検討を行った。様々な実験的アプローチによって、ＣＡＲをヒト化した（或いは、如何なるＣＡＲも発現しない（ノックアウト））非ヒトトランスジェニック動物が、本明細書に記載の方法及び戦略を用いて容易に得られることが確認された。
【００４４】
ヒトＰＸＲのトランスジェニックマウスを作出したが、その説明は本明細書中、実施例にて行う。ヒトＰＸＲは、予想されたように、内在性マウス遺伝子と等価なレベルでマウスの肝臓及び消化管の両方で発現することが分かる。こうして、この種の従来技術が直面する典型的な問題（過剰発現や低発現等）が回避される。また、現在入手可能なヒト化ＰＸＲモデルでは、アルブミンプロモーターを用いて、ＰＸＲヌルバックグラウンドにクロスしたヒトＰＸＲを作動させている。従って、ＰＸＲはこのようなモデルでは非常に高いレベルで発現するが、肝臓以外のいずれの組織にもＰＸＲは存在しない。このことは、消化管や血液脳関門、或いは実際に他の組織で遺伝子発現を制御するｈＰＸＲの役割を把握するためにこのようなモデルを使用する上で大幅に妥協することになる。
【００４５】
このようなモデルにおいては、この経路による遺伝子発現を誘導することが知られている化合物（リファンピシンやＴＣＰＯＢＯＰ等）にマウスが反応するため、ＰＸＲタンパク質が機能的であることも示されている。野生型とヒト化マウスとの系統差が示された。例えば、ヒト化マウスは、ｈＰＸＲに対する活性が高いことが知られている化合物（リファンピシン等）に対して高い反応性を示す。このように、ヒト化ＰＸＲマウスにおいては、野生型に比べてリファンピシンに対する感受性が変化したことが分かる。
【００４６】
また、野生型マウスとヒト化ＰＸＲマウスとの間には、テストステロンの１６−β−ヒドロキシル化及び７−ベンジルオキシキノリンの脱メチル化から得られたバックグラウンドＰ４５０酵素活性について、一方が他方より明らかに高い活性が見られた。
【００４７】
誘導剤ＴＣＰＯＢＯＰを用いた実験においては、テストステロンの肝ミクロソーム代謝を測定した。ここでも野生型とヒト化ＰＸＲマウスとの間には明らかな差が見られた。特に、テストステロンの７−α−ヒドロキシル化は、野生型と比べてｈｕＰＸＲマウスでは構成的に高かった。
【００４８】
野生型とヒトＰＸＲとの系統差に呼応して、ＴＣＰＯＢＯＰによる誘導に対するマウス系の感受性には顕著な差があった。テストステロンの１６−α−ヒドロキシル化の場合、この活性は野生型マウスでは大幅に誘導されたが、ヒト化ＰＸＲマウスでは誘導されなかった。特に興味深いのは、テストステロンの１６−β−ヒドロキシル化の誘導が、ｈｕＰＸＲマウスよりも野生型においてかなり顕著に見られたことである。実際に１ｍｇ／ｋｇの用量で、テストステロンの１６−β−ヒドロキシル化の誘導が野生型では約６倍であったが、ｈｕＰＸＲマウスでは１．７倍にすぎなかった。これからも、対照に比べてヒト化マウスの感受性が低下したことが分かる。
【００４９】
ＰＸＲヒト化マウス及びノックアウトマウスにおける薬物代謝経路の誘導についての詳細な検討を行った。様々な実験的アプローチによって、ＰＸＲをヒト化した（或いは、如何なるＰＸＲも発現しない（ノックアウト））非ヒトトランスジェニック動物が、本明細書に記載の方法及び戦略を用いて容易に得られることが確認された。
【００５０】
本発明に係るトランスジェニック動物（マウス等）及び細胞は、上述の及び本明細書の実施例に記載の機能特性を示すのが好ましい。例えば、この細胞及び動物は、リファンピシンに応じたＣｙｐ２ｂ１０活性の誘導を示さないのが好ましい。しかし、この細胞及び動物は、リファンピシンだけでなくＴＣＰＯＢＯＰにも応じてＣｙｐ３ａ１１に対する誘導作用を示す。
【００５１】
当然のことながら、転写因子をコードする他のヒトＤＮＡも、第１相薬物代謝酵素、第２相薬物代謝酵素及び／又は薬物輸送タンパク質を調節できるのであれば本発明で用いることができる。その例としては、ＰＰＡＲ（α、δ及びγ）やＮＲＦ２、Ａｈ受容体、ＨＮＦｌ、ＨＮＦ４が挙げられる。ＰＰＡＲα及びＡｈ受容体のノックイン（ヒト化）及びノックアウトに好適なターゲティング戦略については、本明細書の他の箇所でより詳細に記載する（図６８及び６９参照）。
【００５２】
転写因子をコードするヒトＤＮＡは、プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）及び構成的アンドロスタン受容体（ＣＡＲ）の両方を含むのが好ましい。本発明のこの実施形態においては、トランスジェニック動物、該動物由来の組織又は細胞は、これらの転写因子遺伝子について「二重ヒト化（double-humanised）である」と考えることができる。多くの薬物代謝酵素や薬物輸送体はＣＡＲ及びＰＸＲ両方の結合に反応する要素を有しているため、このような二重ヒト化モデルは、単一遺伝子（ＰＸＲ又はＣＡＲの一方）のみを組み込んでいるモデルよりも有利である。また、ＰＸＲ反応性要素の数はＣＡＲ反応性要素の数と異なることが多いため、両方の転写因子による調節が一般に重要である。従って、両方の因子の作用を考慮したモデルは好ましく、in vivoでの生理学的状態をより詳細に反映する。
【００５３】
ヒトＰＸＲ及びヒトＣＡＲ両方のトランスジェニックマウスを作出したが、その説明は本明細書の実施例にて行う。これらの転写因子の組合せの活性について予備研究を行ったが、この活性はバルビツール酸塩誘導睡眠時間を測定することによって求めた。長年、睡眠時間は肝シトクロムＰ４５０活性に正比例することが知られており、この活性は、ＣＡＲ及びＰＸＲの機能によって決まる肝臓内のＰ４５０レベルに少なくとも一部起因し得る。麻酔量のペントバルビトン（pentobarbitone）を投与した野生型マウスの睡眠時間は２１分間であったが、ＣＡＲ及びＰＸＲの二重ヒト化マウスの睡眠時間は３４分間であった。従って、二重ヒト化マウスは野生型対照に対して有意差を示したが、この結果から、二重ヒト化マウスは野生型マウスに比べて薬物に対する反応が顕著に異なることが分かる。
【００５４】
ＰＸＲ及びＣＡＲの二重ヒト化マウス及び二重ノックアウトマウスにおける薬物代謝経路の誘導についての詳細な検討を行った。様々な実験的アプローチによって、ＰＸＲ及びＣＡＲの両方をヒト化した（或いは、如何なるＰＸＲもＣＡＲも発現しない（二重ノックアウト））非ヒトトランスジェニック動物が、本明細書に記載の方法及び戦略を用いて容易に得られることが確認された。
【００５５】
本発明のこの様相におけるトランスジェニック動物（マウス等）及び細胞は、上述の機能特性を示すのが好ましい。例えば、ヒトＰＸＲのトランスジェニック動物及び細胞は、リファンピシンに応じたＣｙｐ２ｂ１０活性の誘導を示さないのが好ましいが、リファンピシンだけでなくＴＣＰＯＢＯＰにも応じてＣｙｐ３ａ１１に対する誘導作用を示す。
【００５６】
また、本発明者らは、プロモーターが酵素発現を誘導する能力は各組織によってそれぞれ異なることも見出した。従って、ヒト以外の動物由来の内在性転写因子ではなく、ヒト転写因子を用いることが非常に重要である。また、転写因子の調節配列及びそれが調節する遺伝子は、できるだけ詳細に自然の生理学的状態を反映する必要がある。よって、調節配列はヒト由来又は非ヒト動物由来であるのが好ましい。より好ましい実施形態においては、調節配列はヒト由来又は標的非ヒト動物（例えば、マウス）由来である。これにより、本明細書の他の箇所で説明するように、野生型発現パターンを保持することができる。これを確実に生じさせるためには、できるだけ多くのヒト転写因子、ヒト薬物代謝酵素及びヒト薬物輸送体を用いることが重要である。
【００５７】
また、特定の薬物によって生じるタンパク質レベルの割合（ratio of protein levels）も非常に重要である。例えば、マウスＰＸＲの作用によって、ヒトＰＸＲの作用に比べて様々なタンパク質の発現が様々なレベルで刺激される。特定の薬物やその代謝物のレベルは、どのような薬物代謝酵素や輸送体が発現しているかに大きく依存するが、このことからも、ヒト以外の動物由来の内在性転写因子ではなく、ヒト転写因子を用いることが非常に重要である。
【００５８】
毒物学的観点からもヒト転写因子を用いることが重要である。例えば、ＰＸＲは胆汁酸や他の生理学的化合物によって自然に調節され、胆管壊死や胆汁うっ帯等の中毒症状は特定の薬物への曝露によって生じ得る。従って、ヒトと試験動物との薬物代謝の差によって、ヒトの場合には明らかでなかった毒性作用が試験動物では顕著に見られることがあり得る。
【００５９】
転写因子の発現を左右する調節配列は、ヒト由来であるか、或いは標的動物種（例えば、マウス）由来であることが好ましい（本明細書の他の箇所でより詳細に記載する）。
【００６０】
トランスジェニックモデルに挿入される遺伝子は、内在性等価遺伝子又は遺伝子クラスターが自然に生じるゲノム内の部位に挿入するのが好ましい。これは、遺伝子座のコンテクストが保持される、即ち、この部位からの転写の忠実度が野生型の系で生じる転写レベルにできるだけ近くなるという点で有利である。
【００６１】
本発明者らは、本明細書の他の箇所に記載の適切なアッセイを用いて、トランスジェニック動物（例えば、ｈｕＰＸＲマウス、ｈｕＣＡＲマウス及びｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウス）における薬物代謝経路の様相について検証した。このようなアッセイで本発明者らのトランスジェニックマウスが示した機能特性から、本発明のトランスジェニック動物、組織及び細胞は薬物代謝及び毒性の解析に非常に有用であることが分かる。
【００６２】
ある実験においては、本発明者らは、ヒト又はマウスにおいてより強く作用することが知られている薬物代謝経路の構成成分の誘導剤を用いて、トランスジェニック動物における薬物代謝経路の様相について検証した。このような誘導剤を以下にまとめる。
【００６３】
【表１】
2010528644.tif 000002
【００６４】
上述のような種特異的な薬物代謝誘導剤は主に、ＣＡＲ又はＰＸＲを経由して、或いはＰＸＲ及びＣＡＲの両方を経由して作用する（例えば、図５５参照）。ＣＡＲ及びＰＸＲの種特異的誘導の区別は、ＰＸＲ経由の誘導とＣＡＲ経由の誘導とを区別することが可能なアッセイによって（例えば、Ｃｙｐ３ａ１１又はＣｙｐ２ｂ１０のレベルや活性を測定することによって）行うことができる（例えば、図４８参照）。ヒトやマウスにおけるＣｙｐ３ａ１１及びＣｙｐ２ｂ１０の誘導に対する上述の誘導剤の作用の概要については図５５及び５６に示す。
【００６５】
従って、本発明は、内在性プロモーターの制御下でＰＸＲをコードするヒトＤＮＡ配列を含み、その等価内在性（equivalent endogenous）マウスＰＸＲ遺伝子が必要に応じて無効化されているトランスジェニックマウス、該マウス由来の組織又は細胞であって、
（ｉ）対応する野生型マウス、該マウス由来の組織又は細胞に比べて、シトクロムＰ４５０の発現及び／又は活性のリファンピシン介在による誘導に対する感受性が高く、及び／又は
（ｉｉ）対応する野生型マウス、該マウス由来の組織又は細胞に比べて、シトクロムＰ４５０の発現及び／又は活性のデキサメタゾン介在、プレグネノロン−１６αカルボニトリル介在又はクロトリマゾール介在による誘導に対する感受性が低い、トランスジェニックマウス、該マウス由来の組織又は細胞を提供する。
【００６６】
シトクロムＰ４５０はＣｙｐ３ａ１１等のＣｙｐ３ａ酵素であるのが好ましい。
【００６７】
また、本発明は、内在性プロモーターの制御下でＣＡＲをコードするヒトＤＮＡ配列を含み、その等価内在性マウスＣＡＲ遺伝子が必要に応じて無効化されているトランスジェニックマウス、該マウス由来の組織又は細胞であって、
（ｉ）対応する野生型マウス、該マウス由来の組織又は細胞に比べて、シトクロムＰ４５０の発現及び／又は活性のＣＩＴＣＯ介在による誘導に対する感受性が高く、及び／又は
（ｉｉ）対応する野生型マウス、該マウス由来の組織又は細胞に比べて、シトクロムＰ４５０の発現及び／又は活性のＴＣＰＯＢＯＰ介在による誘導に対する感受性が低い、トランスジェニックマウス、該マウス由来の組織又は細胞も提供する。
【００６８】
シトクロムＰ４５０はＣｙｐ２ｂ１０等のＣｙｐ２ｂ酵素であるのが好ましい。
【００６９】
シトクロムＰ４５０の発現及び活性レベルは、本明細書の他の箇所で記載のように適切なアッセイによって求めることができる（図４８参照）。例えば、シトクロムＰ４５０（例えば、Ｃｙｐ３ａ１１やＣｙｐ２ｂ１０）の発現レベルはウェスタンブロッティングによって求めることができる。シトクロムＰ４５０の活性は、７−ベンジルオキシキノリン（ＢＱ）活性アッセイ（Ｃｙｐ３ａの場合）又はペントキシレゾルフィン−Ｏ−脱エチル化（ＰＲＯＤ）活性アッセイ（Ｃｙｐ２ｂの場合）によって求めることができる。
【００７０】
また、本発明は、本明細書に記載の機能特性の組合せを有するトランスジェニックマウス、該マウス由来の組織又は細胞も提供する。従って、本発明は、内在性プロモーターの制御下でＰＸＲ及びＣＡＲをコードするヒトＤＮＡ配列を含み、その等価内在性ＰＸＲ遺伝子及びＣＡＲ遺伝子が必要に応じて無効化されているトランスジェニックマウス、該マウス由来の組織又は細胞であって、
（ｉ）対応する野生型マウス、該マウス由来の組織又は細胞に比べて、シトクロムＰ４５０の発現及び／又は活性のリファンピシン介在による誘導に対する感受性が高いか、又は、
（ｉｉ）対応する野生型マウス、該マウス由来の組織又は細胞に比べて、シトクロムＰ４５０の発現及び／又は活性のデキサメタゾン介在、プレグネノロン−１６αカルボニトリル介在又はクロトリマゾール介在による誘導に対する感受性が低く、且つ、
（ｉｉｉ）対応する野生型マウス、該マウス由来の組織又は細胞に比べて、シトクロムＰ４５０の発現及び／又は活性のＣＩＴＣＯ介在による誘導に対する感受性が高いか、又は、
（ｉｖ）対応する野生型マウス、該マウス由来の組織又は細胞に比べて、シトクロムＰ４５０の発現及び／又は活性のＴＣＰＯＢＯＰ介在による誘導に対する感受性が低い、トランスジェニックマウス、該マウス由来の組織又は細胞を提供する。
【００７１】
また、本発明は、内在性プロモーターの制御下でＰＸＲをコードするヒトＤＮＡ配列を含み、その等価内在性ＰＸＲ遺伝子が必要に応じて無効化されているトランスジェニックマウス、該マウス由来の組織又は細胞であって、対応する野生型マウスに比べて、デキサメタゾン介在による肝毒性が高いトランスジェニックマウス、該マウス由来の組織又は細胞も提供する。デキサメタゾン介在による肝毒性は、適切なアッセイ及び適用量のデキサメタゾン（例えば、少なくとも２０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも３０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも４０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも５０ｍｇ／ｋｇ又は少なくとも６０ｍｇ／ｋｇ）を用いてＡＬＴレベルを測定することによって求めることができる。好適なアッセイについては本明細書の他の箇所に記載する。
【００７２】
変化した転写因子遺伝子を含む好ましいトランスジェニック（ノックイン及びノックアウト）マウスについては、本明細書の他の箇所でより詳細に記載する。
【００７３】
Ma et al. (Drug Metab Dispos. 2007 Feb; 35(2): 194-200）は、５’及び３’フランキング配列を含む完全ヒトＰＸＲ遺伝子を、バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）遺伝子組換えによってＰＸＲノックアウトマウスに導入した。肝臓及び腸においてヒトＰＸＲの選択的発現が観察された。ＰＸＲリガンドによるＰＸＲヒト化マウスの処理によってヒト応答が模倣された。即ち、肝臓と腸のＣｙｐ３ａ１１ｍＲＮＡ及びタンパク質の両方がリファンピシン（即ち、ヒト特異的ＰＸＲリガンド）によって強く誘導されたが、プレグネノロン１６α−カルボニトリル（ＰＣＮ）（即ち、げっ歯類特異的ＰＸＲリガンド）によっては誘導されなかった。野生型マウスにおいては、Ｃｙｐ３ａ１１ｍＲＮＡはＰＣＮによって強く誘導されたが、リファンピシンによっては誘導されなかった。しかし、マ（Ma）らの説明は、専らＰＸＲヒト化に関するものであり、更には、本発明の多くの様相、例えば、混合ｃＤＮＡ／ゲノム構築物の使用や、様々なトランスジェニック非ヒト動物の比較、レポーター構築物（後述参照）の使用、非ヒト動物調節配列の制御下でのヒト配列の発現等についての開示や示唆を行っていない。マ（Ma）らによって記載されたモデルの他の問題点は、一動物内における他の遺伝子の改変と組合せるのに適していないことであるが、これは、ＰＸＲヒト化が２種の独立したゲノム変化、即ち、（ｉ）内在性ＰＸＲ遺伝子のノックアウト、及び（ｉｉ）異なるゲノム位置におけるヒトＰＸＲ遺伝子による遺伝子組換えによって成されているためである。
【００７４】
第１相薬物代謝酵素
本発明は、上述の本発明のいずれか一様相に係る非ヒト動物、組織又は細胞を提供するが、少なくとも１個の第１相薬物代謝酵素はシトクロムＰ４５０アイソフォームであり、必要に応じてＣＹＰ１Ａ、ＣＹＰ３Ａ、ＣＹＰ２Ｂ、ＣＹＰ２Ｃ、ＣＹＰ２Ｄ及びＣＹＰ２Ｅアイソフォームから成る群から選択され、必要に応じてＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ３Ａ９、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｂ１０、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６及びＣＹＰ２Ｅ１の一以上から選択され、及び／又は、第１相薬物代謝酵素をコードするヒトＤＮＡ配列はシトクロムＰ４５０遺伝子クラスター含み、必要に応じてＣＹＰ３Ａクラスター、ＣＹＰ２Ｄクラスター、ＣＹＰ２Ｃクラスター及び／又はＣＹＰ１Ａクラスターから選択される。
【００７５】
第１相薬物代謝酵素をコードするヒトＤＮＡは、シトクロムＰ４５０（例えば、ＣＹＰ１Ａ、ＣＹＰ３Ａ、ＣＹＰ２Ｂ、ＣＹＰ２Ｃ、ＣＹＰ２Ｄ及びＣＹＰ２Ｅアイソフォームが挙げられるが、これらに限定されない）から成る群から選択されるのが好ましい。好ましいアイソフォームは、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ３Ａ９、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｂ１０、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６及びＣＹＰ２Ｅ１の一以上である。当然のことながら、第１相薬物代謝酵素をコードする他のＤＮＡも、生体異物分子上に極性基を付加又は露出させることによって生体異物を改変することができるのであれば本発明に含めることができる。
【００７６】
Ｐ４５０ヒト化非ヒト動物に導入するヒトＰ４５０アイソフォームの選択は主に、関連組織での代謝における各種Ｐ４５０アイソフォームについて知られている相対的な重要度によって行う。例えば、これまでにヒト肝臓内で認識された最重要Ｐ４５０アイソフォームはＣＹＰ３Ａ４であるため、恐らく、ＣＹＰ３Ａ４が肝臓のＰ４５０ヒト化に際し第１に選択されるヒトＰ４５０アイソフォームとなる。本発明の多重Ｐ４５０ヒト化マウス用のヒトＰ４５０の選択は、ユーザーの必要性によって決まる。この点で、次のヒトアイソフォーム、即ち、３Ａ４、２Ｄ６、２Ｂ６、２Ｃ９、２Ｃ１９、１Ａ１、１Ａ２及び２Ｃ８のいずれか一以上が好ましいことが予想される。しかし、当然のことながら、動物細胞に組み込まれるアイソフォームはユーザーの要求によって決まる。このように、ヒト化トランスジェニック動物を「デザイン」して代謝プロセスにおける特定のアイソフォームの役割を調べることができる。
【００７７】
本発明の教示によれば、単一遺伝子、遺伝子クラスター、又は単一遺伝子や遺伝子クラスターの組合せを交換することができる。可能であれば、個々の遺伝子を単に交換するのではなく、遺伝子クラスター全体を交換するのが好ましい。これによって、いずれの遺伝子クラスターにおいても遺伝子の発現レベルの割合（ratios）がこの遺伝子のin vivoでの発現割合と同じであるという状態が生み出される。これは、先行技術では注目されなかった現象である。本発明においては、置換用の第１相薬物代謝酵素の好ましいクラスターはＣＹＰ３Ａクラスター、ＣＹＰ２Ｃクラスター、ＣＹＰ２Ｄクラスター及びＣＹＰ１Ａクラスターである。本発明においては、これらの遺伝子クラスターの内の１個、ＣＹＰ３ＡとＣＹＰ２Ｃの両方、他のいずれかの組合せ、又はこれらの遺伝子クラスターの全てをも置換することができる。
【００７８】
従って、本発明においては、特定の経路に関与する遺伝子のカスケードの一部（好ましくは全体）を置換するのが好ましい。これによって遺伝子機能の部分的冗長性が確実に保持されるため、実際の生理学的状態が反映される。一例としてＣＹＰ３Ａ  Ｐ４５０クラスター（群）を挙げることができる。ヒトの場合、このクラスターには４種類の機能性遺伝子が存在し、これらは基質特異性が重複している。例えば、ＣＹＰ３Ａ５タンパク質はＣＹＰ３Ａ４基質を代謝する。従って、薬物代謝モデルを作出しようとする場合、ＣＹＰ３Ａ５遺伝子をその遺伝子クラスター全体の一部として以外の状態で組み込むと、作出したモデルは実際とはかけ離れたものになる。
【００７９】
これに対して、先行技術の教示によると、ある研究者がＣＹＰ３Ａ５遺伝子のトランスジェニック動物を作出するのが得策であると考えた場合、その研究者は該遺伝子を組み込むことしか知らず、該遺伝子が一部を成す遺伝子クラスター全体を組み込もうとは思わないであろう。また、先行技術を用いた場合、ゲノムにおいて該遺伝子をその自然構造位置（natural contextual position）ではなく任意の部位に挿入するであろう。更に悪いことに、該遺伝子の発現は、肝臓に対して特異的な強力なプロモーターの指示の下で生じるであろう。この戦略では多量のＣＹＰ３Ａ５タンパク質が肝臓で産生する可能性が非常に高く、こうして多量のタンパク質が得られるため、このタンパク質はin vivoで作用するのに比べて高い割合で基質を代謝するであろう。これら全ての理由から、本発明の方法は上述の系に比べて有利である。
【００８０】
ヒト化に用いる第１相薬物代謝酵素のクラスターは、ＣＹＰ３Ａクラスター及びＣＹＰ２Ｃクラスターであるのが好ましい。
【００８１】
ヒトと一般に用いる標的トランスジェニック動物（例えば、マウス）との間のタンパク質機能の冗長性を考慮すると、第１相薬物代謝酵素のヒト化は、標的動物の第１相薬物代謝酵素のごく一部（例えば、１、２、３、４又は５個）がかなりのレベルで発現している（好ましくは、該酵素のいずれも発現していない）欠失バックグラウンドに対して行うのが好ましい。
【００８２】
変化した第１相薬物代謝酵素遺伝子を含む好ましいトランスジェニック（ノックイン及びノックアウト）マウスについては、本明細書の他の箇所でより詳細に記載する。
【００８３】
第２相薬物代謝酵素
第２相薬物代謝酵素をコードするヒトＤＮＡは、グルクロニルトランスフェラーゼ（例えば、ＵＧＴ１Ａ遺伝子や遺伝子クラスター）、グルタチオントランスフェラーゼ（例えば、ＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ））、スルホニルトランスフェラーゼ及びアセチルトランスフェラーゼから成る群から選択するのが好ましい。当然のことながら、第２相薬物代謝酵素をコードする他のＤＮＡも、第１相代謝産物を抱合することができるのであれば本発明に含めることができる。
【００８４】
ヒト化に用いる第２相薬物代謝酵素のクラスターは、ＵＧＴ１Ａ遺伝子クラスターであるのが好ましい。
【００８５】
変化した第２相薬物代謝酵素遺伝子を含む好ましいトランスジェニック（ノックイン及びノックアウト）マウスについては、本明細書の他の箇所でより詳細に記載する。
【００８６】
薬物輸送体
薬物輸送タンパク質をコードするヒトＤＮＡは、ＡＴＰ結合カセットタンパク質（多剤耐性タンパク質（例えば、ＭＤＲ−１）や多剤耐性関連タンパク質（ＭＲＰ）（例えば、ＭＲＰ１及び／又はＭＲＰ２）等が挙げられるがこれらに限定されない）から成る群から選択されるか、或いは有機アニオン輸送ポリペプチド（ＯＡＴＰ）から選択されるのが好ましい。当然のことながら、薬物輸送タンパク質をコードする他のＤＮＡも、薬物や他の生体異物分子の形質膜経由の輸送を促進することができるのであれば本発明に含めることができる。
【００８７】
多剤耐性タンパク質はＭＤＲ１であるのが好ましい。
【００８８】
多剤耐性関連タンパク質はＭＲＰ２であるのが好ましい。
【００８９】
変化した薬物輸送タンパク質を含む好ましいトランスジェニック（ノックイン及びノックアウト）マウスについては、本明細書の他の箇所でより詳細に記載する。
【００９０】
調節配列
本発明は、トランスジェニック非ヒト動物細胞、組織又は動物について特に転写因子をヒト化することにもあるが、転写因子導入遺伝子は転写因子プロモーターによって駆動される（即ち、該遺伝子は異種アルブミン／組織特異的プロモーターを利用するのではなく「ノックイン」される）。従って、本発明の動物はヒトタンパク質を適切な生理学的レベルで発現させることができるだけでなく、先行技術によって知られているものとは異なり肝臓だけでなく全ての組織で発現させることができる。
【００９１】
当然のことながら、ヒトＤＮＡ配列はいずれも、ヒト第１相代謝酵素、ヒト第２相代謝酵素、ヒト薬物輸送体及びヒト転写因子のクラスから成る群から選択されるタンパク質のコード配列を含んでおり、理想的にはヒト調節ＤＮＡ配列と作用的に連結(operatively linked)していてもよい。しかし、ヒト調節配列の使用は必須ではなく、他の内在性調節配列（例えば、マウス配列）を用いることができる。
【００９２】
上述の転写因子及び他のタンパク質のヒトＤＮＡ配列は全遺伝子であるか、或いはヒト又は動物由来の調節配列を含むＤＮＡ構築物であるのが好ましい。調節配列がヒトに由来しない場合、この調節配列は標的動物（例えば、マウス）に由来していてもよい。調節配列とは、対象遺伝子の転写に必要な、又は対象遺伝子の発現を調節する、プロモーター配列やエンハンサー配列、５’ＵＴＲや３’ＵＴＲ、ポリＡ終結配列、又は他のＤＮＡ配列を含むことを意味する。ヒト配列の挿入に用いる転写物はポリＡモチーフによって終結するのが好ましい。
【００９３】
先行技術では異種プロモーターが一般に用いられているが、このように用いられているプロモーター（例えば、アルブミンプロモーター）は、通常強力なプロモーターであり、リガンド非依存的に作用し、構造的にスイッチオンされる。通常の発達においては、アルブミンは新生児期に発現されるのみである。このことから、遺伝子の転写及びそれに続くｍＲＮＡ産物の翻訳を指示する調節シグナルがトランスジェニック系で保持されないという点で、遺伝子によってコードされるタンパク質の発現が実際の自然状態から切り離される。先行技術における研究者らは、様々な理由からこのようなプロモーターを用いることになった。そうする必要があると感じた一理由は、内在性プロモーターによってもたらされる転写シグナルが十分に強力ではないと考えたことである。また、マウスにおいて有効であることが示されたプロモーターを用いる必要があると考えられた。
【００９４】
これに対して、本発明では、発生学的に（developmentally）、時間的（temporally）に且つ組織特異的に野生型ヒト発現の忠実度が保持されるように内在性プロモーターをヒト遺伝子と組合せるのが好ましい。
【００９５】
「内在性プロモーター」とは、対象遺伝子の発現を自然に指示するプロモーターを意味する。従って、内在性プロモーターはヒトプロモーターであってもよく、或いはトランスジェニック被験動物に導入された遺伝子に対して内在的なプロモーターであってもよい。例えば、トランスジェニックマウスの場合、ヒト遺伝子の発現は、該遺伝子の内在性マウスプロモーターによって指示されることがある。よって、ヒト調節配列（例えば、ヒトプロモーター）を挿入することは必須ではない。プロモーター活性に必要な５’上流配列の全て（好ましくはいずれのエンハンサーをも含む）を組み込むことによって、自然状態と同様に内在性プロモーターの全体が関連タンパク質の発現を生理学的に関連するように完全に指示することができるため、強力な構成的プロモーターを実際に用いる必要がないことを見出した。一例としてはＣＹＰ３Ａ４遺伝子が挙げられるが、これは、転写開始点の最大１３ｋｂ上流に強力なエンハンサー要素を有する。この配列全てを組み込むことによって適切な転写機序を生じさせることができるが、このような上流配列の脱落によってもたらされる系においては、遺伝子発現の忠実度を保持させることが可能な調節配列の存在が不完全又は不十分になる。
【００９６】
本発明のある実施形態においては、非ヒト動物の内在性調節配列を用いることが好ましい場合がある。このような実施形態においては、非ヒト動物の内在性調節配列の制御下でヒトＤＮＡ配列の発現が可能となり、非ヒト動物の遺伝子発現経路の構成要素（例えば、調節配列や転写因子）が相互作用し得るようになる。ある場合（例えば、関連するヒト調節配列が非ヒト動物の転写因子と相互作用できない場合や、前記相互作用によって相当レベルのヒトＤＮＡ配列の発現が得られない場合）には、このような実施形態はヒトにおけるin vivo状態をより詳細に反映し得る。本明細書においては、ヒトＤＮＡ配列がマウスプロモーターの制御下で発現する実施形態を開示する。従って、本発明は、薬物代謝に関与するタンパク質をコードするヒトＤＮＡ配列を含むトランスジェニック非ヒト動物（例えば、マウス）、該動物由来の組織又は細胞であって、前記ヒトＤＮＡ配列は非ヒト動物の内在性調節配列と作用的に連結されており、非ヒト動物における内在性等価遺伝子が必要に応じて無効化されている、トランスジェニック非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞も提供する。
【００９７】
先行技術で専ら用いられているプロモーター（例えば、アルブミンプロモーター）を用いた場合、遺伝子の発現の作用は特定の組織（アルブミンプロモーターの場合には肝臓）でしかモニターすることができない。先行技術の研究者はこのような制限に落胆することはなかったが、それは、肝臓が薬物代謝を研究する上で唯一の重要な組織であると一般に考えられており、よって肝臓における発現しか望まれなかったからである。肝臓以外の組織での発現は人為的であると見なされたため、有効なモデルに対しても、多少なりとも有利であるとは見られず、何らかの妨げがあった。卵白（albumen）プロモーターの使用に基づく先行技術系の他の欠点は、その系を作動させる際にマウスＰＸＲヌルバックグラウンドが必要であることである。このことは、ＰＸＲが、薬物代謝に対して広範な作用を有する肝臓内の導入遺伝子以外の如何なる場所でも発現されないことを意味し、即ち、このようなマウスは、もはや天然マウスの自然な組織分布を反映しない。
【００９８】
本発明者らは、薬物代謝に重要な組織は肝臓だけではないと考えている。従って、先行技術研究者が利点として考えていること（即ち、肝臓特異的発現のみによって実際の生理学的状態の正確な評価が可能になるということ）については、本発明者らは、他の潜在的に重要な組織が無視されている点で明らかに不都合であると見なしている。本発明によって、薬物代謝プロセスの包括的でホリスティックなスナップショットを得ることができる。
【００９９】
また、内在性プロモーターを用いることによって他の利点ももたらされる。特に、発生過程での発現（developmental expression）の忠実度が保持される。先行技術の系では肝臓発現のみを保障する肝臓特異的プロモーターを用いたが、天然内在性プロモーターを用いることによって、タンパク質をそれが自然発生する組織内で確実に発現させ、しかも成体動物だけでなく各発達段階においても発現させる。これによって、トランスジェニック動物を生育できる可能性が高くなるため、該動物が薬物のスクリーニングや下流交雑種（downstream crosses）の開発において有用であるという利点ももたらされる。また、転写因子や薬物代謝酵素の胎盤発現が保持されるため、該動物を用いて試験化合物を催奇形作用についてスクリーニングすることもできる。
【０１００】
また、本発明者らは、潜在的な「抑制」作用の存在によって、特定の薬物化合物が特定の薬物輸送体や代謝酵素のレベルを低下させて体内動態（disposition）の速度や経路を変えることも見出した。例えば、従来のヒト転写因子パートナーではなくマウスＰＸＲが抑制されてヒトＣＹＰ３Ａ４のレベルが低下した場合、別の体内動態経路が誇張（exaggerated）され得る。これにより、生物内で特定の薬物によって誘導される酵素レベルについて紛らわしい結果となるであろう。また、この特定の薬物への曝露によってヒト内で進行する代謝の速度や種類についても紛らわしい結果となるであろう。
【０１０１】
また、本発明者らは、特定の薬物によって誘導される発現の持続期間が非常に重要であることも見出した。例えば、ヒトに用いる候補薬の一部はマウスにおいて効率的に代謝されないことがある。これは、このような薬物がかなりの期間、全身的に高濃度で残存していることを意味する。このことは、ＰＸＲ等の転写因子がこの期間活性状態であり、この期間常に活性化されることを意味する。その結果、これに伴うレベルの薬物代謝酵素や薬物輸送体、他のこのような酵素も、該薬物が動物内で残存している期間中ずっと高度に発現される。これは明らかに誤解を招く恐れがあり、該薬物の代謝がかなり効率的になり得るヒトにおける等価状態（equivalent situation）とは対照的である。
【０１０２】
ヒトプロモーターによってヒト発現系の特異性を保持することができるため、マウスプロモーターではなくヒトプロモーターを用いることは、転写因子、第１相薬物代謝酵素、第２相薬物代謝酵素及び／又は薬物輸送体の発現を作動させる上で好ましい場合もある。再びマウスＣＹＰ３Ａ遺伝子を例にとると、この遺伝子が有するＰＸＲ及びＣＡＲ反応要素の数はヒトＣＹＰ３Ａ４遺伝子に存在する数とは異なる。等価なマウスプロモーターを用いる場合、マウスを薬物へ曝露することによるＰＸＲ転写活性化に対する反応は、ヒト系において明らかな反応とは異なる。多くの場合、真のマウスオルソログが存在しないことがヒトプロモーターを用いる利点であるというのも真実である。これにより、特定の薬物に反応して薬物代謝タンパク質が多少は産生され、該薬物の代謝における該タンパク質の役割が潜在的に肥大又は減少する。例えば、先行技術で知られている特定のマウス系においては、不適切なプロモーターによって作動される不適切に高いレベルのＣＹＰ３Ａ４発現のため、試験薬物があまりにも速く代謝され、潜在的に有益な作用が明らかにならない場合がある。これは当然ながら誤解を招く恐れがある。
【０１０３】
対照的に、天然ヒトプロモーターを用いることは、この例によると、適当量のＣＹＰ３Ａ４が薬物の活性化に反応して産生され、尚且つ正しい組織で産生されることを意味する。その際、特定の薬物に対する自然生理学的反応は、肝臓だけでなく、例えば消化管でも産生されるＣＹＰ３Ａ４の量について模倣される（mimicked）。該薬物が実際にＣＹＰ３Ａ４の基質である場合には、ヒトにおける状態を反映する速度及び方法で代謝される。これに対し、アルブミンプロモーターを用いて不適切に多量のＣＹＰ３Ａ４の発現を指示する先行技術方法では、このタンパク質の役割が曲解され、誤解を招くような結果がもたらされる。例えば、薬物が実際にはＣＹＰ３Ａ４の弱い基質にすぎなくても、このタンパク質が多量に存在すればこの薬物は積極的に代謝される。
【０１０４】
従って、調節配列はヒト由来又は非ヒト動物由来であるのが好ましい。より好ましい実施形態においては、調節配列はヒト由来又は標的非ヒト動物（例えば、マウス）由来である。これにより、野生型発現パターンを（発生学的に（developamentally）、時間的に（temporally）且つ空間的に（spatially）保持することができる。
【０１０５】
その結果、ヒトタンパク質は正しい場所で正しい時間産生される。これにより、先行技術の系ではどうしても得られなかったモデルへのリアリズムが付与される。
【０１０６】
好ましい構築物
ある状況下においては、標的遺伝子と組み込まれたヒト遺伝子とがリーダー配列を共有することがある。これは、前記構築物において標的非ヒト動物遺伝子から少なくとも１個のイントロンを保持することによってなされ得るが、通常良好な発現がもたらされる。また、この戦略によって、遺伝子産物が正しい細胞内位置に確実に導かれるようにもなる。ヒトリーダー配列がその機能をも果たすことができるかもしれないが、代わりにマウスリーダーを用いる方が安全であることが多い。例えば、ＭＲＰ２の場合、エクソン１によってコードされるマウスタンパク質の「リーダー配列」を保持することができる。そして、エクソン１由来の配列を持たないヒトｃＤＮＡをマウスゲノム配列のエクソン２に導入する。マウスイントロン１の元のスプライス部位が保持されるため、この構築物は、マウスエクソン１及びヒトエクソン２〜３２に由来するアミノ酸の融合タンパク質をコードする。この構築物によって高レベルの発現が確実になると共に、ＭＲＰ２がその正しい位置（即ち、形質膜）に確実に導かれる。
【０１０７】
他の場合においては、組み込まれたヒト遺伝子を適切な標的動物遺伝子のプロモーターの制御下に置くことができる。例えば、ＭＤＲ１の場合、ヒトＭＤＲ１のｃＤＮＡを対応するマウス遺伝子（Ｍｄｒ１ａ又はＭｄｒ１ｂ）の翻訳開始部位に融合することができる。ＰＸＲを例にとると、ヒトＰＸＲｃＤＮＡとゲノム配列のハイブリッドをマウスＰＸＲ遺伝子の翻訳開始部位に融合することができ、これによってマウスの開始ＡＴＧが保持される。ＣＡＲの場合には、ヒト配列をマウスＣＡＲ遺伝子の翻訳開始部位に融合することができる。
【０１０８】
上述のように、部分ヒトゲノムＤＮＡ配列又は全ヒトゲノムＤＮＡ配列を用いると、例えば、スプライスバリアントの産生が可能になることによって大きな利益がもたらされる。
【０１０９】
従って、更なる様相において、本発明は、内在性調節配列の制御下で薬物代謝に関与するタンパク質をコードするヒトＤＮＡ配列を含むトランスジェニック非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞であって、ヒトＤＮＡ配列は少なくとも１個のイントロンを含んでおり、ヒトＤＮＡ配列がトランスジェニック非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞に転写された場合に少なくとも１個のスプライスバリアントが産生するようになっている、トランスジェニック非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞を提供する。本発明のこの様相においては、非ヒト動物におけるタンパク質をコードする内在性等価遺伝子は必要に応じて無効化される。
【０１１０】
本発明のこの様相のある実施形態においては、薬物代謝に関与するタンパク質は、本明細書の他の箇所で記載のように、転写因子、第１相薬物代謝酵素、第２相薬物代謝酵素及び／又は薬物輸送タンパク質である。本発明のこの様相の他の実施形態においては、薬物代謝に関与するタンパク質は、本明細書の他の箇所で記載のように、第１相薬物代謝酵素又は第２相薬物代謝酵素である。本発明のこの様相の他の実施形態においては、薬物代謝に関与するタンパク質は、本明細書の他の箇所で記載のように、薬物輸送タンパク質である。
【０１１１】
上述のように、単に個々の遺伝子を置換するのではなく、可能であれば全遺伝子クラスターを置換するのが好ましいが、これは、得られる薬物代謝経路がヒトにおけるin vivo状態と酷似しているためである。
【０１１２】
従って、更なる様相において、本発明は、内在性調節配列の制御下で薬物代謝に関与するタンパク質のクラスターをコードするヒトＤＮＡ配列を含むトランスジェニック非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞を提供する。本発明のこの様相においては、対応する内在性等価遺伝子のクラスターは必要に応じて無効化される。本発明のこの様相の好ましい実施形態においては、ヒトＤＮＡ配列のイントロン−エクソン構造は維持される（即ち、本明細書の他の箇所で記載のように、ｃＤＮＡ配列ではなくゲノム配列が用いられる）。
【０１１３】
本発明は、薬物代謝に関与するタンパク質をコードするヒトＤＮＡ配列が挿入されていると共に、薬物代謝に関与するタンパク質をコードする内在性遺伝子が必要に応じて無効化される非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞を提供する。しかし、薬物代謝に関与するタンパク質の内在性遺伝子が無効化されていると共に、薬物代謝に関与するタンパク質をコードするヒトＤＮＡ配列を更に含まない非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞も本発明においては有用である。このような「ノックアウト」非ヒト動物、組織又は細胞は、本発明の「ノックイン」（ヒト化）非ヒト動物、組織又は細胞と並行して用いると特に有用であるが、これは、ノックインマウス及びノックアウトマウスを用いて得た実験データの比較によって、薬物代謝経路に関する更に有用な情報を示すことができるためである。
【０１１４】
従って、更なる様相において、本発明は、生体異物の代謝又は毒性を調べるための方法であって、
（ｉ）内在性調節配列の制御下で薬物代謝に関与するタンパク質をコードするヒトＤＮＡ配列を含み、必要に応じてその内在性等価遺伝子が無効化されている非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞と、
（ｉｉ）内在性等価遺伝子は無効化されているが、薬物代謝に関与するタンパク質をコードするヒトＤＮＡ配列を含まない対応する非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞と、
（ｉｉｉ）必要に応じて、対応する野生型非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞とを用いることを含む方法を提供する。
【０１１５】
タイプ（ｉ）の好ましい非ヒト動物としては、本明細書の他の箇所で記載の動物（例えば、次の遺伝子型、ｈｕＰＸＲ、ｈｕＣＡＲ、ｈｕＰＰＡＲα、ｈｕＡｈＲ、ｈｕＣＹＰ３Ａ４、ｈｕＣＹＰ３Ａクラスター、ｈｕＣＹＰ２Ｃ９、ｈｕＣＹＰ２Ｃクラスター、ｈｕＣＹＰ２Ｄ６、ｈｕＣＹＰ１Ａ１／１Ａ２、ｈｕＵＧＴ、ｈｕＭＤＲ１／ｍｄｒ１ａ-/-、ｈｕＭＤＲ１／ｍｄｒ１ｂ-/-、ｈｕＭＤＲ１／ｍｄｒ１ａ-/-／ｍｄｒ１ｂ-/-又はｈｕＭＲＰ２を有する動物）が挙げられる。
【０１１６】
タイプ（ｉｉ）の好ましい非ヒト動物としては、本明細書の他の箇所で記載の動物（例えば、次の遺伝子型、ｋｏＰＸＲ、ｋｏＣＡＲ、ｋｏＰＰＡＲα、ｋｏＡｈＲ、ｋｏＣｙｐ３ａ１１、ｋｏＣｙｐ３ａクラスター、ｋｏＣｙｐ２ｃクラスター、ｋｏＣｙｐ１ａ１／Ｃｙｐ１ａ２、ｋｏＣｙｐ２ｄクラスター又はｋｏＵＧＴを有する動物）が挙げられる。
【０１１７】
従って、このような方法は、例えば、（ｉ）遺伝子型ｈｕＰＸＲを有する非ヒト動物と（ｉｉ）遺伝子型ｋｏＰＸＲを有する非ヒト動物（更には必要に応じて、（ｉｉｉ）野生型非ヒト動物）における薬物代謝を比較することを含むことができる。
【０１１８】
このような方法は、
（ｉ）内在性調節配列の制御下で薬物代謝に関与する異なるタンパク質をコードする２以上、３以上、４以上又は５以上のヒトＤＮＡ配列をそれぞれ含む２以上、３以上、４以上又は５以上の非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞であって、その各々において、必要に応じてその内在性等価遺伝子が無効化されている非ヒト動物、組織又は細胞と、
（ｉｉ）内在性等価遺伝子は無効化されているが、関連する薬物代謝タンパク質をコードするヒトＤＮＡ配列を含まない２以上、３以上、４以上又は５以上の対応する非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞と、
（ｉｉｉ）必要に応じて、対応する野生型非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞とを用いることを含むのが好ましい。
【０１１９】
このような方法は、例えば、（ｉ）遺伝子型ｈｕＰＸＲ、ｈｕＣＡＲ、ｈｕＣＹＰ２Ｃクラスター及びｈｕＵＧＴを有する非ヒト動物と（ｉｉ）遺伝子型ｋｏＰＸＲ、ｋｏＣＡＲ、ｋｏＣｙｐ２ｃクラスター及びｋｏＵＧＴを有する非ヒト動物（更には必要に応じて、（ｉｉｉ）野生型非ヒト動物）における薬物代謝を比較することを含むことができる。
【０１２０】
異なるトランスジェニック非ヒト動物を比較する本発明の他の方法においては、異なる調節配列の作用が調べられる。
【０１２１】
従って、更なる様相において、本発明は、生体異物の代謝又は毒性を調べるための方法であって、
（ｉ）内在性ヒト調節配列の制御下で薬物代謝に関与するタンパク質をコードするヒトＤＮＡ配列を含み、必要に応じてその内在性等価遺伝子が無効化されている第１の非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞と、
（ｉｉ）内在性非ヒト動物調節配列の制御下で薬物代謝に関与するタンパク質をコードするヒトＤＮＡ配列を含み、必要に応じてその内在性等価遺伝子が無効化されている第２の非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞と、
（ｉｉｉ）必要に応じて、内在性等価遺伝子は無効化されているが、薬物代謝に関与するタンパク質をコードするヒトＤＮＡ配列を含まない対応する非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞と、
（ｉｖ）必要に応じて、対応する野生型非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞とを用いることを含む方法を提供する。
【０１２２】
例えば、（ｉ）ＰＸＲをコードするヒトＤＮＡ配列が内在性ヒト調節配列の制御下にある、遺伝子型ｈｕＰＸＲを有する第１の非ヒト動物と、（ｉｉ）ＰＸＲをコードするヒトＤＮＡ配列が内在性非ヒト動物調節配列の制御下にある、遺伝子型ｈｕＰＸＲを有する第２の非ヒト動物（更に必要に応じて、（ｉｉｉ）ノックアウト非ヒト動物及び／又は（ｉｖ）野生型非ヒト動物）との間で薬物代謝を比較することができる。このような方法によって、ヒトとモデル生物（例えば、マウス）との間における遺伝子の制御や発現レベルの微妙な差異を解明することができる。
【０１２３】
他の比較方法も可能である。当業者であれば、本明細書で開示の非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞の適切な「パネル」を容易に選択することができるであろう。比較のために必要な非ヒト動物、組織又は細胞の種類や数は、必要な解析の種類（例えば、対象となる薬物代謝経路及び／又は対象となる薬物）によって決まる。本発明は、様々な遺伝子型のトランスジェニック非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞を提供する（本明細書の他の箇所を参照）。本発明は、当業者が所望の解析に必要なツールを選択することができるツールキットを提供する。従って、本発明は、生体異物の代謝又は毒性を調べるための方法であって、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種又は少なくとも１０種の非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞を用いることを含む方法において、非ヒト動物、組織又は細胞の各々の種が、薬物代謝に関与するタンパク質のアミノ酸配列又は発現に影響を及ぼす異なる遺伝子改変（例えば、ノックイン、ノックアウト又は調節配列の変化）を含む方法を提供する。多数の異なる種類のトランスジェニック非ヒト動物、組織又は細胞を比較する本明細書に開示の「ホリスティックな」方法によって、少数の種類のトランスジェニック非ヒト動物、組織又は細胞を用いる先行技術の方法と比べて、薬物の代謝や毒性についてより厳密に解析することができる。
【０１２４】
異なるトランスジェニック非ヒト動物を比較する本発明の方法は、異なる種の非ヒト動物（例えば、「ノックイン」や「ノックアウト」、野生型調節配列、ヒト調節配列、非ヒト調節配列）に対して同一薬物を同用量で投与することと、異なる動物間における該薬物の代謝や毒性について比較することを含むことができる。
【０１２５】
トランスジェニック動物
上述及び後述の本発明の好ましい実施形態においては、トランスジェニック非ヒト動物及び該動物由来の組織又は細胞はマウスであるのが好ましいが、他の哺乳類、例えば、ラットやハムスター、モルモット等の他のげっ歯動物や、サルやブタ、ウサギ、イヌ、ネコ等の他種、或いはヒツジやヤギ、ウマ、ウシ等の有蹄類であってもよく、非哺乳動物種であってもよい。より好ましくは、トランスジェニック非ヒト動物（哺乳動物）及び組織又は細胞はげっ歯動物（より好ましくはマウス）に由来する。
【０１２６】
トランスジェニック動物の使用は倫理的性質の問題を呈するが、本明細書に記載した種類の研究から得られるヒトにとっての利益は、トランスジェニック動物の産生や試験に課せられるであろう如何なる苦労をも大きく上回ると考えられる。当業者には明らかなように、薬物療法の場合、ヒトにおいて治験を始める前に、現在の規制の下、現在入手可能なモデル系を用いて動物実験を行う必要があり、動物実験なしで済ますことはできない。いずれの新薬も少なくとも２種類の生きた哺乳動物に対して試験を行う必要があり、その内の１種類は大型の非げっ歯動物でなければならない。体内で非常に特異的に作用する現在開発中の新しいクラスの薬物の場合、今後においてより多くの動物を用い、また、より多くの霊長類を用いることになるであろうと専門家は考えている。例えば、「高齢者（greying population）」を悩ます神経疾患に科学が取り組もうとするに従って、次世代薬剤の安全性や有効性を試験するためのサルを安定供給する必要があると考えられる。即ち、本明細書に記載のようなトランスジェニックモデルから得られるヒトにとっての利益は、一般には決してマウスやげっ歯動物に限られるものではなく、霊長類を含む他の哺乳動物をも網羅する。このような新規な薬物が特異的に作用するということは、脳構造が我々と非常に類似している点から霊長類のみが実験に適した動物となり得ることを意味する。
【０１２７】
本発明は、創薬における消耗（attrition）の程度を減少させることを目的としている。薬物が試験後期で失敗に終わる場合には、動物実験全てがある意味で無駄になる。よって、薬物の失敗を阻止することは実験動物の命を救うことになる。従って、本発明はトランスジェニック動物に関するものであるが、このような動物を用いれば、薬物試験プログラムで用いるのに必要な動物の数を減らすことになるであろう。
【０１２８】
本発明の利点は、ヒトと従来試験モデルとして用いられている他の哺乳動物との種の相違に関する問題を回避することにある。一例としてペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）のファミリーが挙げると、これに対しては過去、各種薬物が低脂血症剤として開発された。それら薬物はマウスモデルにおいて後成的な発癌物質であることが確認されたため、その開発は中止された。結局、種間の毒性の差は、肝臓内のＰＰＡＲαレベルの差に起因し得ることが分かった。マウスでは明らかな現象が、ヒトにおいては肝臓に存在するＰＰＡＲαタンパク質のレベルが低いために生じない。人体に存在するタンパク質を反映する真のタンパク質発現レベルを示すモデルにとっては非常に明白な利点である。
【０１２９】
ヒトＤＮＡ配列は各々、ヒト又は非ヒト動物調節ＤＮＡ配列（例えば、内在性ヒト又は非ヒトプロモーター）に対して非依存的に連結していることが好ましい。この連結が先行技術との明確な相違点であり、in vivoでのヒトの状態の反映が更に向上するため、先行技術モデルに対する改良の利点が得られる。
【０１３０】
特に、本発明のヒト化トランスジェニック動物、細胞及び組織の利点は、これらによって、単一の系において通常の実験動物モデルの利益とヒト細胞又は組織培養物の利益とが組合わせられることにある。この系或いはヒト化トランスジェニック動物によって、全ての前臨床における代謝、毒性及び薬物動態研究で利用可能な改善された選択肢が製薬業界にもたらされる。
【０１３１】
細胞
本発明の他の様相は、本発明の上述のいずれか一様相における特性を有するように改変された細胞に関する。本発明に係る好ましい細胞型は肝細胞及び神経細胞である。該細胞は、哺乳動物細胞（例えば、非ヒト細胞やげっ歯類細胞）等の動物細胞であることができ、より好ましくはマウス細胞である。
【０１３２】
本発明のこの様相における細胞は、本発明の知見を十分体得した当業者には明らかなように、本発明に係るトランスジェニック動物から標準的な技法を用いて産生することができる。好適な方法は多くの標準的な実験マニュアル、例えば、Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986)、 Sambrook Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Third Edition (2000)、Ausubel et al., 1991（上掲）、Spector, Goldman & Leinwald, 1998)に記載されている。
【０１３３】
一様相において、このような細胞は、本発明の上述のいずれか一様相において産生される非ヒト動物細胞（例えば、マウス細胞）であることができる。このような細胞を作出する好ましい一方法は、上述のようにヒト化マウスをＳＶ４０不死化マウス（例えば、不死マウス（タコニクス（Taconix）））と交雑させることである。次に、当該技術分野で周知の技法によってこのような動物から細胞を単離することができる。肝臓でのみ活性であるため肝細胞しか産生することができないアルブミンプロモーターを用いる先行技術のトランスジェニック系とは対照的に、本発明において作出されるトランスジェニック動物由来の細胞は、薬物動態解析にかなり重要な細胞（例えば、肝細胞や神経細胞）等の様々な細胞型から選択することができる。
【０１３４】
上述の特性を有する、本発明に係るトランスジェニック動物から単離された幹細胞も本発明の有用な様相である。このような細胞は多能性であってもよく、部分的に分化していてもよい。幹細胞は成体幹細胞であってもよく、胚性幹細胞であってもよい。より一般には、用いる幹細胞は後胚発達段階（例えば、胎生期や新生期、幼若期、成体期）で得られることができる。このように単離された幹細胞を用いて特定の細胞型（例えば、肝細胞や神経細胞）を作出することができる。このような細胞も本発明の一様相を構成する。
【０１３５】
置換遺伝子（replaced genes）の好ましい選択
本発明はその更なる様相において、
（ｉ）転写因子をコードする少なくとも１個のヒトＤＮＡ配列と、
（ｉｉ）薬物輸送タンパク質をコードする少なくとも１個のヒトＤＮＡ配列とを含み、その内在性等価遺伝子が必要に応じて無効化されている非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞を提供する。
【０１３６】
本発明者らは、薬物代謝モデルの場合には、特定の薬物代謝酵素についてトランスジェニックである動物を作出するだけでなく、薬物輸送体であるタンパク質（即ち、薬物輸送タンパク質）をこのようなモデルに組み込むことも重要であると考えている。例えば、ＰＸＲ（核内転写因子）を活性化する多くの化合物はＭＤＲ１の基質でもあるため、このタンパク質によって細胞の外へ輸送される。従って、in vivoでの状態を忠実に反映するモデルを作出するためには、薬物輸送タンパク質のトランスジェニック動物であることが好ましい。さもなければ、特定濃度の薬物の細胞内作用について、その濃度が如何なる場合であっても紛らわしい結果が得られる。薬物輸送タンパク質の中ではＭＤＲ１が好ましい。先行技術のトランスジェニックマウスモデルの場合には、当然のことながら、ｍｄｒ１ａ及びｍｄｒ１ｂ両方の存在によって産生される薬物輸送体の冗長性によって紛らわしい結果がもたらされ得るため、これらのマウス遺伝子両方をノックアウトし、ヒトｍｄｒ１遺伝子で置換することが好ましい。
【０１３７】
薬物輸送タンパク質（例えば、ＭＤＲ１）をコードする遺伝子の発現は、ＰＸＲベースの情報伝達系によっても活性化される。従って、第Ｉ相、第ＩＩ相及び薬物輸送体遺伝子の発現はＰＸＲとリンクしているため、これらの遺伝子の産物が薬物やその代謝物のレベルや代謝に対して異なる作用を及ぼすという事実に加え、本発明によって保持される協調的調節（co-ordinated regulation）の完全性は、特に先行技術の系に比べると著しく有利である。
【０１３８】
本発明に係る非ヒト動物が転写因子ＰＸＲをコードするヒトＤＮＡ配列を含む場合、ＰＸＲをコードするヒトＤＮＡ配列は、ヒトＰＸＲ遺伝子のイントロン６及び／又はイントロン７の少なくとも一部を含むか、又は特許請求の範囲及び本明細書においてより詳細に記載したように更に特徴付けられるのが好ましい。
【０１３９】
また、ＭＤＲは消化管及び血液脳関門の環境にてかなりの程度発現される。消化管及び血液脳関門はいずれも血流への重要な薬物輸送源であるため、生理学的に関連するＭＤＲの発現レベルが存在すると、薬物モデルに対し薬理活性を示す上で薬物代謝プロセスの重要な様相が付与される。例えば、消化管にＭＤＲが存在すると、経口送達された薬物が体内で利用されなくなる場合がある。ＭＤＲは脳の内外で薬物輸送に対し非常に重要である。また、ＭＤＲは肝臓内の体細胞から胆汁への薬物輸送も行う。
【０１４０】
薬物代謝遺伝子の他の好ましい組合せは次の通りである。
【０１４１】
本発明はその更なる様相において、
（ｉ）転写因子をコードする少なくとも１個のヒトＤＮＡ配列、及び
（ｉｉ）第１相薬物代謝酵素をコードする少なくとも１個のヒトＤＮＡ配列、及び／又は
（ｉｉｉ）薬物輸送タンパク質をコードする少なくとも１個のヒトＤＮＡ配列を含み、その内在性等価遺伝子が必要に応じて無効化されている非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞を提供する。
【０１４２】
本発明はその更なる様相において、
（ｉ）転写因子をコードする少なくとも１個のヒトＤＮＡ配列、及び
（ｉｉ）第２相薬物代謝酵素をコードする少なくとも１個のヒトＤＮＡ配列、及び／又は
（ｉｉｉ）薬物輸送タンパク質をコードする少なくとも１個のヒトＤＮＡ配列を含み、その内在性等価遺伝子が必要に応じて無効化されている非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞を提供する。
【０１４３】
本発明はその更なる様相において、
（ｉ）転写因子をコードする少なくとも１個のヒトＤＮＡ配列と、
（ｉｉ）第１相薬物代謝酵素をコードする少なくとも１個のヒトＤＮＡ配列と、
（ｉｉｉ）第２相薬物代謝酵素をコードする少なくとも１個のヒトＤＮＡ配列と、
（ｉｖ）薬物輸送タンパク質をコードする少なくとも１個のヒトＤＮＡ配列とを含み、その内在性等価遺伝子が必要に応じて無効化されている非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞を提供する。
【０１４４】
これらの様相は上述の特徴のいずれか一以上を含むのが好ましい。これらの様相の好ましい実施形態においては、本明細書の他の箇所で記載のように、ヒトＤＮＡ配列の一以上は部分ゲノム配列又は全ゲノム配列である。
【０１４５】
本発明はその更なる様相において、ＰＸＲ及びＣＡＲ転写因子をコードするヒトＤＮＡ配列と、第１相薬物代謝酵素をコードする少なくとも１個のヒトＤＮＡ配列と、第２相薬物代謝酵素をコードする少なくとも１個のヒトＤＮＡ配列と、薬物輸送タンパク質をコードする少なくとも１個のヒトＤＮＡ配列とを含む非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞であって、その内在性等価遺伝子が必要に応じて無効化されている非ヒト動物、組織又は細胞を提供する。本発明はその更なる様相において、
（ｉ）ＰＸＲ及び／又はＣＡＲ転写因子をコードするヒトＤＮＡ配列と、
（ｉｉ）ＣＹＰ３Ａ４酵素をコードするヒトＤＮＡ配列と、
（ｉｉｉ）ＭＤＲ１タンパク質をコードするヒトＤＮＡ配列とを含む、非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞を提供する。
【０１４６】
本発明のこの様相は、ＣＹＰ３Ａ４酵素が消化管において特に重要であるため、このアイソフォームについてヒト化した動物が腸内での薬物のバイオアベイラビリティにおける薬物代謝の役割を調べる上で重要であるという点で特に有用である。また、上述のように、ＭＤＲ１タンパク質は血液脳関門にて発現することが知られており、上述のヒト化マウスに組み込むと、ヒトの脳内への薬物／生体異物の摂取や脳外への排出に関する真の典型的なシナリオが得られる。
【０１４７】
本発明はその更なる様相において、
（ｉ）ＰＸＲ及び／又はＣＡＲ転写因子をコードするヒトＤＮＡ配列と、
（ｉｉ）ＣＹＰ３Ａ４酵素をコードするヒトＤＮＡ配列と、
（ｉｉｉ）ＵＧＴ１Ａ酵素をコードするヒトＤＮＡ配列と、
（ｉｖ）ＭＤＲ１タンパク質をコードするヒトＤＮＡ配列とを含む、非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞を提供する。
【０１４８】
本発明はその更なる様相において、
（ｉ）転写因子ＰＸＲをコードするヒトＤＮＡ配列と、
（ｉｉ）転写因子ＣＡＲをコードするヒトＤＮＡ配列と、
（ｉｉｉ）転写因子ＡｈＲをコードするヒトＤＮＡ配列と、
（ｉｖ）転写因子ＰＰＡＲαをコードするヒトＤＮＡ配列とを含む、非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞を提供する。
【０１４９】
ＰＰＡＲαをヒト化した非ヒト動物、また、好ましくは、更なる転写因子及び／又は第１相薬物代謝酵素及び／又は第２相薬物代謝酵素及び／又は薬物輸送タンパク質を更にヒト化した非ヒト動物は、非遺伝毒性発癌（過形成）作用を評価、モニタリング又は調べるのに用いる上で特に有利である。前記ＰＰＡＲαをヒト化した非ヒト動物が転写因子ＰＸＲをコードするヒトＤＮＡ配列を更に含む場合、ＰＸＲをコードするヒトＤＮＡ配列は、ヒトＰＸＲ遺伝子のイントロン６及び／又はイントロン７の少なくとも一部を含むか、又は特許請求の範囲及び本明細書においてより詳細に記載したように更に特徴付けられるのが好ましい。
【０１５０】
他の好ましい組合せとしては、ＰＸＲ及び／又はＣＡＲ転写因子と、ＭＤＲ１タンパク質をコードするヒトＤＮＡ配列と、ＣＹＰ２Ａ９、ＣＹＰ３Ａクラスター、ＣＹＰ２Ｃクラスター及びＵＧＴ又はＵＧＴ０クラスターの一以上との組合せが挙げられる。
【０１５１】
本発明の特に好ましいトランスジェニック非ヒト動物、組織及び細胞は、以下のリストで明記した遺伝子型を有する。接頭辞「ｈｕ」は関連する内在性非ヒト動物遺伝子のヒト化を意味し、接頭辞「ｋｏ」は関連する内在性非ヒト動物遺伝子のノックアウトを意味する。
【０１５２】
コンテクストによって特に明記しない限り、本明細書にて大文字で示した遺伝子や遺伝子型（例えば、ＣＹＰ３Ａ４）はヒト遺伝子や遺伝子クラスターを意味し（非ヒト動物の遺伝子や遺伝子クラスターを意味する場合もある）、大文字を用いないで示した遺伝子や遺伝子型（例えば、Ｃｙｐ３ａ１１）は非ヒト動物（例えば、マウス）の遺伝子や遺伝子クラスターを意味する。
【０１５３】
転写因子
ｈｕＰＸＲ；
ｋｏＰＸＲ；
ｈｕＣＡＲ；
ｋｏＣＡＲ；
ｈｕＰＰＡＲα；
ｋｏＰＰＡＲα；
ｈｕＡｈＲ：及び
ｋｏＡｈＲ
【０１５４】
薬物代謝酵素
ｈｕＣＹＰ３Ａ４；
ｋｏＣｙｐ３ａ１１；
ｈｕＣＹＰ３Ａクラスター；
ｋｏＣｙｐ３ａクラスター；
ｈｕＣＹＰ２Ｃ９；
ｈｕＣＹＰ２Ｃクラスター；
ｋｏＣｙｐ２ｃクラスター；
ｈｕＣＹＰ２Ｄ６；
ｋｏＣｙｐ２ｄクラスター；
ｈｕＣｙｐ２ｄクラスター；
ｈｕＣＹＰ１Ａ１／１Ａ２（ＣＹＰ１Ａ１及びＣＹＰ１Ａ２の両方がヒト化されていることを意味する）；
ｋｏＣｙｐ１ａ１／Ｃｙｐ１ａ２（Ｃｙｐ１ａ１及びＣｙｐ１ａ２の両方がノックアウトされていることを意味する）；
ｈｕＵＧＴ；ｈｕＵＧＴ１Ａ；ｈｕＵＧＴ１Ａクラスター；ｈｕＧＳＴ及び
ｋｏＵＧＴ
【０１５５】
薬物輸送タンパク質
ｈｕＭＤＲ１／ｍｄｒ１ａ-/-；
ｈｕＭＤＲ１ａ；
ｋｏＭＤＲ１ａ；
ｈｕＭＤＲ１／ｍｄｒ１ｂ-/-；
ｈｕＭＤＲ１ｂ；
ｋｏＭＤＲ１ｂ；
ｈｕＭＤＲ１／ｍｄｒ１ａ-/-／ｍｄｒ１ｂ-/-；
ｈｕＭＤＲ１ａ／ｈｕＭＤＲ１ｂ（即ち、ｈｕＭＤＲ１ａ／ｂ）；
ｋｏＭＤＲ１ａ／ｋｏＭＤＲ１ｂ；
ｈｕＭＲＰ２；
ｈｕＢＣＲＰ（膜貫通ＡＢＣ型半輸送体ＡＢＣＧ２）及び
ｋｏＭＲＰ２
【０１５６】
本発明の特に好ましいトランスジェニック非ヒト動物、組織及び細胞は本明細書に記載の遺伝子型の２種以上から成る組合せを含むが、その例の一部を以下のリストに明記する。リスト内において、記号「／」は関連する遺伝子型の組合せを示す。
【０１５７】
複合遺伝子型
ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；
ｋｏＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；
ｈｕＰＸＲ／ｋｏＣＡＲ；
ｋｏＰＸＲ／ｋｏＣＡＲ；
ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ／ｈｕＡｈＲ／ｈｕＰＰＡＲα；
ｋｏＰＸＲ／ｋｏＣＡＲ／ｋｏＡｈＲ／ｋｏＰＰＡＲα；
ｈｕＣｙｐ１Ａクラスター／ｈｕＡｈＲ；
ｈｕＣＹＰ２Ｃ９／ｈｕＰＸＲ；
ｋｏＣｙｐ２ｃクラスター／ｈｕＰＸＲ；
ｈｕＣＹＰ２Ｄ６／ｈｕＰＸＲ；
ｈｕＣｙｐ２ｄクラスター／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；
ｈｕＣＹＰ３Ａ４／ｈｕＰＸＲ；
ｋｏＣｙｐ３ａ１１／ｈｕＰＸＲ；
ｈｕＣＹＰ３Ａ４／ｋｏＣｙｐ３ａ１１／ｈｕＰＸＲ；
ｋｏＣｙｐ３ａクラスター／ｈｕＰＸＲ；
ｈｕＭＤＲ１／ｍｄｒ１ａ-/-／ｈｕＰＸＲ；
ｈｕＭＤＲ１／ｍｄｒ１ｂ-/-／ｈｕＰＸＲ；
ｈｕＭＤＲ１／ｍｄｒ１ａ-/-／ｍｄｒ１ｂ-/-／ｈｕＰＸＲ；
ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ／ｈｕＭＤＲ１ａ／ｂ；
ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ／ｋｏＭＤＲ１ａ／ｂ；
ｈｕＭＲＰ２／ｈｕＰＸＲ；
ｈｕＣＹＰ３Ａクラスター／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；
ｈｕＣＹＰ３Ａ４／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；
ｈｕＣＹＰ３Ａ４／ｋｏＣｙｐ３ａ１１／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；
ｈｕＣＹＰ３Ａクラスター／ｈｕＭＤＲ１／ｍｄｒ１ａ-/-／ｍｄｒ１ｂ-/-／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；
ｈｕＣＹＰ３Ａクラスター／ｈｕＭＤＲ１／ｍｄｒ１ａ-/-／ｍｄｒ１ｂ-/-／ｈｕＵＧＴ／ｈｕＭＲＰ２／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；
ｈｕＣＹＰ３Ａクラスター／ｈｕＣＹＰ２Ｃクラスター／ｈｕＭＤＲ１／ｍｄｒ１ａ-/-／ｍｄｒ１ｂ-/-／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；
ｈｕＣＹＰ３Ａクラスター／ｈｕＣＹＰ２Ｃクラスター／ｈｕＭＤＲ１／ｍｄｒ１ａ-/-／ｍｄｒ１ｂ-/-／ｈｕＵＧＴ／ｈｕＭＲＰ２／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；
ｈｕＣＹＰ２Ｃクラスター／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；
ｈｕＣＹＰ２Ｃ９／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；
ｈｕＵＧＴ／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；
ｈｕＵＧＴ／ｈｕＭＲＰ２／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；
ｈｕＭＤＲ１／ｍｄｒ１ａ-/-／ｍｄｒ１ｂ-/-／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；及び
ｈｕＭＲＰ２／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ
【０１５８】
本明細書に記載の２以上の遺伝子操作の組合せを有するトランスジェニック非ヒト動物、組織及び細胞は特に好ましいが、これは、このような非ヒト動物、組織及び細胞における薬物代謝経路がヒトのin vivo状態と酷似しているためである。このような非ヒト動物、組織及び細胞は、本明細書に記載の遺伝子操作の２種以上、３種以上、４種以上、５種以上、６種以上、７種以上、８種以上、９種以上又は１０種以上を含んでいてもよい。
【０１５９】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物、組織又は細胞を作出するための好適な方法及びターゲティングベクターについては本明細書の他の箇所に記載しており、また、具体的なターゲティング戦略については本明細書の実施例に記載すると共に、図面にて概略的に示す。本明細書に記載（及び図示）の具体的なターゲティング戦略及びターゲティングベクターの各々によって本発明の更なる様相が構成される。従って、本発明は、実質的に本明細書で記載（又は図示）されたターゲティング戦略又はターゲティングベクターを用いて、薬物代謝に関与するタンパク質をコードする少なくとも１個のヒトＤＮＡ配列を非ヒト動物細胞に導入する方法を提供する。
【０１６０】
特に、本発明は、次の特徴の一以上を有するトランスジェニックマウス、該マウス由来の組織又は細胞を提供する。
【０１６１】
【表２】
2010528644.tif 000003
【０１６２】
【表３】
2010528644.tif 000004
【０１６３】
【表４】
2010528644.tif 000005
【０１６４】
【表５】
2010528644.tif 000006
【０１６５】
本明細書においては、イントロン「ｎ」とはエクソン「ｎ」とエクソン「ｎ＋１」との間のイントロンを意味する。従って、例えば、イントロン４はエクソン４とエクソン５との間のイントロンであり、イントロン５はエクソン５とエクソン６との間のイントロンである。
【０１６６】
本明細書の他の箇所で記載のように、当業者であれば、本明細書で開示の非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞の適切な「パネル」を容易に選択することができるであろう。本発明は、当業者が所望の解析に必要なツールを選択することができるツールキットを提供する。従って、本発明は、生体異物の代謝又は毒性を調べるための方法であって、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種又は少なくとも１０種の非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞を用いることを含む方法において、非ヒト動物、組織又は細胞の各々の種は、実質的に本明細書で記載（又は図示）されたターゲティング戦略又はターゲティングベクターを用いて導入された異なる遺伝子改変を含む方法を提供する。
【０１６７】
好ましいターゲティング戦略及び構築物については本明細書の実施例及び図面において更に詳細に説明する。特に、好ましいターゲティング戦略については図１〜１４及び図６２〜８３において概略的に示す。
【０１６８】
Ma et al. (Drug Metab Dispos. 2007 Feb; 35(2): 194-200)は、５’及び３’フランキング配列を含む完全ヒトＰＸＲ遺伝子を、バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）遺伝子組換えによってＰＸＲノックアウトマウスに導入した。肝臓及び腸においてヒトＰＸＲの選択的発現が観察された。ＰＸＲリガンドによるＰＸＲヒト化マウスの処理によってヒト応答が模倣された。即ち、肝臓と腸のＣｙｐ３ａ１１ｍＲＮＡ及びタンパク質の両方がリファンピシン（即ち、ヒト特異的ＰＸＲリガンド）によって強く誘導されたが、プレグネノロン１６α−カルボニトリル（ＰＣＮ）（即ち、げっ歯類特異的ＰＸＲリガンド）によっては誘導されなかった。野生型マウスにおいては、Ｃｙｐ３ａ１１ｍＲＮＡはＰＣＮによって強く誘導されたが、リファンピシンによっては誘導されなかった。しかし、Ma et al.の説明は、専らＰＸＲヒト化に関するものであり、更には、本発明の多くの様相、例えば、混合ｃＤＮＡ／ゲノム構築物の使用や、様々なトランスジェニック非ヒト動物の比較、レポーター構築物（後述参照）の使用、非ヒト動物調節配列の制御下でのヒト配列の発現等についての開示も示唆もしていない。Ma et al.によって記載されたモデルの他の問題点は、一動物内における他の遺伝子の改変と組合せるのに適していないことであるが、これは、ＰＸＲヒト化が２種の独立したゲノム変化、即ち、（ｉ）内在性ＰＸＲ遺伝子のノックアウト、及び（ｉｉ）異なるゲノム位置におけるヒトＰＸＲ遺伝子による遺伝子組換えによって成されているためである。
【０１６９】
好ましい配列
好ましいターゲティング戦略及び構築物を本明細書に記載する。非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞に挿入するための好ましい核酸配列は配列番号１〜４に示す。
【０１７０】
配列番号１は、本発明のターゲティングベクターを用いて得ることが可能なヒトＰＸＲヌクレオチド配列である。配列番号１の最初の３個のヌクレオチド（ａｔｇ）はマウスＰＸＲ遺伝子由来の翻訳開始点であり、ヒトＰＸＲ遺伝子の開始点（ｃｔｇ）は存在しない。配列番号１はヒトＰＸＲ遺伝子のイントロン４及び５由来の配列を含み、図２、７及び６５において概略的に示すターゲティング戦略を用いて得ることが可能である。
【０１７１】
配列番号２は、本発明の他のターゲティングベクターを用いて得ることが可能なヒトＰＸＲヌクレオチド配列である。配列番号２の最初の３個のヌクレオチド（ａｔｇ）はマウスＰＸＲ遺伝子由来の翻訳開始点であり、ヒトＰＸＲ遺伝子の開始点（ｃｔｇ）は存在しない。配列番号２はヒトＰＸＲ遺伝子のイントロン４、５、６及び７由来の配列を含み、図６２において概略的に示すターゲティング戦略を用いて得ることが可能である。
【０１７２】
配列番号３は、本発明のターゲティングベクターを用いて得ることが可能なヒトＰＸＲヌクレオチド配列である。配列番号３の最初の３個のヌクレオチド（ａｔｇ）はマウスＰＸＲ遺伝子由来の翻訳開始点であり、ヒトＰＸＲ遺伝子の開始点（ｃｔｇ）は存在しない。配列番号３はヒトＰＸＲ遺伝子のイントロン２、３、４、５、６、７及び８由来の配列を含み、図６４において概略的に示すターゲティング戦略を用いて得ることが可能である。
【０１７３】
配列番号４は、本発明のターゲティングベクターを用いて得ることが可能なヒトＣＡＲヌクレオチド配列である。配列番号４は、ヒトＣＡＲ遺伝子のイントロン２に挿入された５３ｂｐのＰｈｉ−Ｃ３１認識部位（ａｔｔＢ５３）を含む。配列番号４はヒトＣＡＲ遺伝子のイントロン２、３、４、５、６、７及び８由来の配列を含み、図３、８及び６６において概略的に示す戦略を用いて得ることが可能である。
【０１７４】
従って、本発明はその一様相において、配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４に示すＤＮＡ配列を含むトランスジェニック非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞を提供する。ＤＮＡ配列は、内在性等価遺伝子の遺伝子座（即ち、マウスＰＸＲ又はＣＡＲ遺伝子座内）において安定的に組み込まれているのが好ましい。また、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４に示すＤＮＡ配列を含み、内在性等価遺伝子の遺伝子座における５’及び３’領域と相同である５’及び３’フランキング核酸配列を更に含み、更に必要に応じて、内在性等価遺伝子の遺伝子座内へのヒトＤＮＡ配列の組み込み後に該配列の条件的欠失を可能とする核酸配列要素を含む核酸ターゲティングベクターも提供する。また、本発明は、このような核酸ターゲティングベクターを含む非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞も提供する。
【０１７５】
好ましい非ヒト動物、組織又は細胞、及びターゲティングベクターは、配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４に示す核酸分子に対しその全長に亘って少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である核酸分子を含むか、或いはこのような核酸分子と相補的なＤＮＡ配列を含む。
【０１７６】
置換遺伝子（replacement genes）を導入するための方法
本発明はその更なる様相において、少なくとも１個の機能性ヒト転写因子と、少なくとも１個の第１相薬物代謝酵素と、少なくとも１個の第２相薬物代謝酵素と、少なくとも１個の薬物輸送タンパク質とを、前記タンパク質を発現する内在性等価遺伝子が必要に応じて不活性化された非ヒト細胞に導入する方法であって、該細胞の内在性等価遺伝子が不活性であっても、前記ヒト発現産物が機能性を保持するように前記ヒト転写因子と、第１相及び第２相薬物代謝酵素と、薬物輸送タンパク質とをコードするＤＮＡを導入することを含む方法を提供する。本発明の上述のいずれか一様相の構築物を用いることができる。
【０１７７】
導入されるヒトＤＮＡ配列のタンパク質産物と類似するタンパク質産物を発現する内在性非ヒト遺伝子を欠失させることが好ましい。これは好ましくは、この遺伝子のヒトカウンターパートで直接ターゲティングするか、又はこの遺伝子又は遺伝子クラスターを認識部位に隣接させた後、リコンビナーゼ介在欠失（例えば、Ｃｒｅ介在欠失又はＰｈｉ−Ｃ３１介在欠失）によって行うことができる。
【０１７８】
本発明においては、トランスジェニックモデルに挿入される遺伝子は、内在性等価遺伝子又は遺伝子クラスターが自然に生じるゲノム内の部位に挿入するのが好ましい。これは、遺伝子座のコンテクストが保持される、即ち、この部位からの転写の忠実度が野生型の系で生じる転写レベルにできるだけ近くなるという点で有利である。
【０１７９】
また、本発明においては、トランスジェニック系に挿入される遺伝子の内在性等価遺伝子が必要に応じて無効化される。「無効化」とは、非ヒト動物の内在性等価遺伝子が遺伝子産物を発現できないように、サイレント化、欠失或いは不活性化すること等を意味する。内在性等価遺伝子の発現を無効化すると同時に置換遺伝子をそれが自然に生じる部位に挿入する方法としては、上述の相同的組換えプロセスによるものが好ましい。この方法においては、標的ゲノム内の部位に相補的な配列の相同アームが挿入配列に隣接しており、これらを用いて所望のヒト遺伝子を直接挿入する。
【０１８０】
例えば、ＭＤＲ１（薬物輸送タンパク質）の場合、様々な動物種はそれぞれ異なるＭＤＲ１アイソタイプや発現プロファイルを有する。マウスの場合、活性薬物輸送体（ＭＤＲ１ａ及びＭＤＲ１ｂ）をコードする２種類の遺伝子を有し、これらの組織発現は相互排他的である。これに対し、ヒトに存在する２種類のＭＤＲ遺伝子（ＭＤＲ１及びＭＤＲ３）の内、ＭＤＲ１のみが機能性薬物輸送体である。従って、ＭＤＲのトランスジェニックマウスを作出する場合には、内在性ＭＤＲ遺伝子の両方（即ち、ＭＤＲ１ａ及びＭＤＲ１ｂ）をＭＤＲ１で置換するのが好ましい。
【０１８１】
他の例としてはＣＹＰ２Ｄ６を挙げることができるが、この場合、マウスには９種類の遺伝子が存在するが、これに対し、ヒトにおいては１種類の機能性遺伝子しか存在しない。ヒト遺伝子のスパンは約４０ｋｂ未満のゲノム配列であるため、マウス遺伝子クラスターをヒト遺伝子で置換するのは比較的容易である。
【０１８２】
ＤＮＡ配列は、例えば、Ｃｒｅ／ｌｏｘ介在欠失によって欠失させることができる。この種の欠失は、大きなＤＮＡ断片（２００ｋｂ〜数メガ塩基対）を欠失させるのに適している。この方法は次の論文に記載されている（Li ZW, Stark G, Gotz J, Rulicke T., Gschwind M, Huber G, Muller U, Weissmann C., Generation of mice with a 200-kb amyloid percursor protein gene deletion by Cre recombinase-mediated site-specific recombination in embryonic stem cells Proc Natl Acad Sci USA, 1996 Jun 11; 93(12): 6158-62、Proc Natl Acad Sci USA 1996 Oct 15; 93(21): 12052及びSu H, Wang X, Bradley A. Nested chromosomal deletions induced with retroviral vectors in mice. Nat Genet. 2000 Jan; 24(1): 92-5の正誤表（Erratum））。
【０１８３】
また、Ｃｒｅ／ｌｏｘ介在で大きな断片の挿入を用い、Call LM, Moore CS, Stetten G, Gearhart JD. A cre-lox recombination system for the targeted integration of circular yeast artificial chromosomes into embryonic stem cells. Hum Mol. Genet. 2000 Jul 22; 9(12): 1745-51に記載の方法によってヒトＤＮＡ配列を挿入することもできる。
【０１８４】
非ヒトトランスジェニック動物は、添付した図１、２及び３の概略図に示すように、従来開示されていない「ノックイン」アプローチによって薬物輸送タンパク質をヒト化するのが好ましい。
【０１８５】
本発明の非ヒトトランスジェニック動物は、ＰＸＲ又はＣＡＲのみ或いはこの両方の組合せをヒト化するのが好ましく、この両方の組合せをヒト化するのがより好ましい。
【０１８６】
ヒト遺伝子は、構築物内に少なくとも一部保存されているのが好ましい。
【０１８７】
ヒトＰＸＲ遺伝子を発現するトランスジェニック動物の場合、ＰＸＲ構築物はエクソン４と６との間にイントロン−エクソン構造を保持するのが好ましい。これによって、多くのスプライスバリアントが見られ、都合よくリガンド結合ドメイン内に位置する配列が有利に保持される。従って、好ましいヒトＰＸＲ配列は、エクソン１〜４から成るｃＤＮＡと、イントロン４、エクソン５及びイントロン５から成るゲノム配列と、エクソン６〜９から成るｃＤＮＡとを含む。
【０１８８】
当然のことながら、リガンド結合能が異なるタンパク質を占める、これらのエクソン間の他のスプライス産物は本発明の構築物によってカバーされている。
【０１８９】
ＣＡＲ構築物はエクソン２と９との間にイントロン−エクソン構造を保持するのが好ましい。これによって、ターゲティングベクター内で全ゲノム構造が有利に保持され、ヒトＣＡＲの全てのスプライスバリアントをカバーすることができる。
【０１９０】
他の好ましい構築物については上述の通りである。
【０１９１】
本発明の一実施形態においては、トランスジェニック動物を上述の特徴を全て含むよう新たに作出するが、その際、次の方法を用いる（例えば、ｃｒｅ／ｌｏｘ介在によって大きなＤＮＡ断片（２００ｋｂ〜数メガ塩基対）を欠失させる方法（Li ZW, et al., Generatio of mice with a 200-kb amyloid precursor protein gene geletion by Cre recombinase-mediated site-specific recombination in embryonic stem cells, Proc Natl Acad Sci USA, 1996 Jun 11; 93(12):6158-62、Proc Natl Acad Sci USA 1996 Oct 15; 93(21): 12052及びSu H et al., Nested chromosomal deletions induced with retroviral vectors in mice. Nat Genet. 2000 Jan; 24(1): 92-5の正誤表や、Call et al. A cre-lox recombination system for the trargeted integration of circular yeast artificial chromosomes into embryonic stem cells. Hum Mol Genet. 2000 Jul 22; 9(12): 1745-51の記載によるｃｒｅ／ｌｏｘ媒介によって大きな断片を挿入する方法）。
【０１９２】
本発明の他の実施形態においては、本発明のトランスジェニック非ヒト動物を交雑によって作出する。例えば、ＷＯ２００４／００７７０８に記載の動物をＰＸＲ及び／又はＣＡＲをヒト化したトランスジェニック動物と交雑することができ、また、非ヒト動物のいずれかのトランスジェニック系における第２相薬物代謝酵素や薬物輸送タンパク質に対する更なる改変を含むことができる。
【０１９３】
本発明の更なる実施形態においては、後に開示する方法によってトランスジェニック非ヒト動物を上述の特徴を全て含むよう新たに作出する。
【０１９４】
当然のことながら、導入されたヒトＤＮＡ全てが実質的にヒトプロモーターの制御下にあることが理想的である。
【０１９５】
モデル系
有利なことに、本発明は、薬物や他の生体異物化合物のヒト代謝や体内動態（disposition）、毒性に関与する一以上のタンパク質の調節や機能を再現するのに必要なコード配列及び調節配列を含む一以上のヒトＤＮＡ配列を非ヒト動物細胞に導入することによって、非ヒト動物細胞上で薬物や他の生体異物化合物の代謝や体内動態、毒性のヒトメカニズムを模倣する非ヒトトランスジェニック動物であって、前記非ヒト動物細胞においては、導入されたヒトＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質と類似の機能を有するタンパク質をコードする内在性遺伝子が欠失しており、該非ヒト動物細胞をモデル系として用いて相同的ヒト細胞における薬物や他の生体異物化合物の代謝や体内動態、毒性を確認できるようになっている、非ヒトトランスジェニック動物を提供する。
【０１９６】
本発明においては、特定のトランスジェニック系を「パーソナル化」して検討に値する現象に合わせることが可能である。例えば、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子の発現レベルは個体間で６０倍も変わる場合があり、また、各個体においても経時的に変わり得る。この一因として固有の遺伝的差異が挙げられるが、より重要なのは薬物や毒物、食品その他の環境的変動要因に曝露した際の変動性（variability）に起因することである。この系は、必要なだけ長く高い酵素レベルを維持するのみの適応反応系である。よって、他に何を行っても無駄になるであろう。これは、ＣＹＰ３Ａ４の一レベルで特定薬物濃度の作用を試験するだけでは、一般にいずれの試験系においても適切ではないことを意味する。高Ｐ４５０環境及び低Ｐ４５０環境の両方で反応が試験されるように、薬物の作用の評価は高ＣＹＰ３Ａ４レベル及び低ＣＹＰ３Ａ４レベルの両方で行うのが理想的である。当然のことながら、アルブミンプロモーターを用いた先行技術による系は、in vivoで見出される真の状態を全く反映することができない。
【０１９７】
他の例としてＣＹＰ２Ｄ６タンパク質が挙げられるが、このタンパク質は神経遮断薬（例えば、抗うつ薬や統合失調症治療用薬物）の代謝における主要な役割を果たすため、かなり重要である。製薬会社はＣＹＰ２Ｄ６によって代謝される薬物を撤退（back）させたがらないため、薬物を開発している間にその薬物のＣＹＰ２Ｄ６ライアビリティーの有無をできるだけ早く知る必要がある。この遺伝子は個体間でばらつきを示し、実際にコーカソイドの約６％ではその発現が見られない。高ＣＹＰ２Ｄ６レベル及び低ＣＹＰ２Ｄ６レベル両方の環境で薬物（特に抗うつ薬）の代謝について研究できることは大きな利益となるであろう。
【０１９８】
このような利点によって、発癌性試験を行うことができると共に、上述の急性薬理学的試験を行うことができる。例えば、本発明においては、Ｐ４５０レベル（単一遺伝子又は同義遺伝子、好ましくは遺伝子クラスターとして）を代謝産物の潜在的な発癌作用について試験するために人為的に高レベルへ上げることができる。生理学的に正常なレベルでは、このような代謝産物の作用は明らかではないであろう。げっ歯動物とヒトとの間での化合物の発癌性の顕著な種差は、他の薬物動態や分布の差と共に、毒性代謝産物や変異原性代謝産物が異なる速度で産生される要点となる。クラスター全体で遺伝子レベルを上昇させる能力は、それによって該クラスターの遺伝子により発現されるタンパク質間の基質クロストークが保持されるため重要である。
【０１９９】
また、この種のオーダーメードの系（Bespoke systems）を利用して疾患を研究することもできる。一例としてはジルベール症候群が挙げられるが、これは、薬物代謝に関与するＵＧＴ１Ａ１遺伝子の多型によって生じる現象である。本発明においては、この症候群を評価できるようにするため、トランスジェニックモデル動物に多型含有遺伝子を組み込むことができる。
【０２００】
本発明はその更なる様相において、本発明の上述のいずれか一様相における核酸構築物をトランスフェクトした宿主細胞を提供する。細胞型はヒト又は非ヒト哺乳動物に由来するのが好ましいが、他の動物や植物、酵母、細菌に由来してもよい。
【０２０１】
本発明はその更なる様相において、その細胞が本発明の上述のいずれか一様相における核酸構築物によってコードされるタンパク質を発現する、トランスジェニック非ヒト動物を提供する。該トランスジェニック動物は、現在入手可能な技術という理由からマウスであるのが好ましいが、他の哺乳類、例えば、ラットやモルモット等の他のげっ歯動物や、ウサギやブタ、イヌ、ネコ等の他種、或いはヒツジやウマ、ウシ等の有蹄類であってもよく、非哺乳動物種であってもよい。
【０２０２】
上述の核酸構築物の使用を含む、トランスジェニック宿主細胞又はトランスジェニック非ヒト動物の作出に関する本発明の実施形態においては、該細胞又は非ヒト動物を更なる遺伝子組換え、即ち、遺伝子又はタンパク質をコードする核酸配列を更に導入する遺伝子組換えに付すことができる。この遺伝子組換えは、細胞や細胞株の一過性の又は安定なトランスフェクションや、細胞や細胞株のエピソーム発現系、又は前核マイクロインジェクションや、非胚性幹（ＥＳ）細胞における組換えイベント、非ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞におけるランダム遺伝子組換え、その核を核移植クローニング法でドナー核として用いる細胞のトランスフェクションによるトランスジェニック非ヒト動物の作出であることができる。
【０２０３】
細胞や細胞株の一過性の又は安定なトランスフェクションや、細胞や細胞株のエピソーム発現系の発現、前核マイクロインジェクション、ＥＳ細胞や他の細胞株における組換えイベント、或いは、様々な発達経路で分化し得る細胞株であって、その核を核移植のドナーとして用いる細胞株のトランスフェクションを含む、トランスジェニック細胞や細胞株、又はトランスジェニック非ヒト動物を作出する方法においては、更なる核酸配列や構築物の発現を用いて本発明の上述の様相におけるトランスフェクションや遺伝子組換えをスクリーニングする。その例としては、細胞の成長培地に添加された抗生物質に対して耐性を付与する選択可能マーカー（例えば、Ｇ４１８に耐性を付与するネオマイシン耐性マーカー）の使用が挙げられる。他の例としては、本発明の上述の様相における核酸配列又はその一部に相補的であり、それに対してハイブリダイズする核酸配列を用いた検出が挙げられる。例えば、サザンブロット解析やノーザンブロット解析、ＰＣＲが挙げられる。
【０２０４】
本発明の方法によって作出される非ヒト動物細胞又はトランスジェニック非ヒト動物をモデル系として用いて、ヒトにおける薬物や他の生体異物化合物の代謝を確認することができる。
【０２０５】
本発明はその更なる様相において、少なくとも１個の機能性ヒト転写因子、少なくとも１個の第１相薬物代謝酵素、少なくとも１個の第２相薬物代謝酵素及び少なくとも１個の薬物輸送タンパク質をコードするＤＮＡを含み且つ発現するように改変された上述のトランスジェニック動物、該動物由来の組織及び／又は細胞の使用であって、前記トランスジェニック動物、該動物由来の組織及び／又は細胞における生体異物の代謝や毒性、又は内因性化合物の代謝及び／又は生合成等の導入ヒトタンパク質の他の特性や機能を調べるための使用を提供する。
【０２０６】
本発明の系によって、生体異物の代謝や体内動態、毒性についてのヒトメカニズムの機能や調節を、いずれの組織や細胞型（例えば、単一動物の消化管や血液脳関門、肝臓、腎臓、該動物由来の組織や細胞）においても検討することができる。
【０２０７】
非ヒト移植腫瘍細胞株及び／又は宿主動物でヒト化代謝経路を発現することにより、動物異種移植実験において薬物の抗腫瘍作用に対するヒト代謝、体内動態又は毒性の影響を検討するために本発明の系を適用することができる。
【０２０８】
レポーター
有利なことに、本発明は、レポーター遺伝子の発現産物の簡便なアッセイによりヒト細胞において薬物や他の生体異物化合物の代謝経路を把握するために用いることができるようにレポーター遺伝子が導入された、非ヒト動物細胞及びトランスジェニック非ヒト動物も提供する。
【０２０９】
本発明の方法によって作出された非ヒト動物細胞又はトランスジェニック非ヒト動物にレポーター遺伝子を組み込んだ場合（後述参照）、該細胞又は動物を用いれば、レポーター遺伝子ＤＮＡ配列の発現をアッセイすることによって遺伝子の調節を確認することができると共に、相同的ヒト細胞において生じ得る薬物や他の生体異物化合物の機序や代謝を把握することができる。また、該細胞又は動物を用いて、薬物や他の生体異物化合物の代謝の程度を把握することもできる。例えば、特定の組織内でのレポーター遺伝子発現の分布を解析することによって、特定の薬物化合物に応じた遺伝子発現の誘導の程度をモニターすることができる。
【０２１０】
本発明はその更なる様相において、
（ｉ）転写因子、及び
（ｉｉ）第１相薬物代謝酵素をコードするＤＮＡ配列、及び／又は
（ｉｉｉ）第２相薬物代謝酵素をコードするＤＮＡ配列、及び／又は
（ｉｖ）薬物輸送タンパク質をコードするＤＮＡ配列
をコードするヒトＤＮＡ配列と転写的に連結しているプロモーターを含む、非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞を提供する。
【０２１１】
転写因子及び／又は第１相薬物代謝酵素及び／又は第２相薬物代謝酵素及び／又は薬物輸送タンパク質のプロモーターは、薬物／生体異物の体内動態に関与する少なくとも１個の酵素の相対的調節のモニタリングを可能とするレポーターと連結させることができる。有利なことには、このような実施形態によって、酵素の相対的調節が可能になるだけでなく、トランスジェニック動物又は全動物自体（the whole animal itself）において組織特異的且つ非侵襲的に遺伝子誘導の程度や効力を調節することが可能になる。上述の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）の２以上のプロモーターにレポーターを連結させることができる。
【０２１２】
レポーター遺伝子は、直接的又は間接的にアッセイ可能なタンパク質をコードする核酸配列である。これらを用いて、予想されるアッセイが不適切であるか或いは容易に行えないタンパク質産物に対応する他のコード領域を置換する。当該技術分野で知られていて本発明で用いることのできる好適なレポーター遺伝子は次のタンパク質（例えば、クロラムフェニコール−アセチルトランスフェラーゼやβ−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質、分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、主要尿タンパク質（ＭＵＰ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）等が挙げられるが、これらに限定されない）をコードする遺伝子から選択される。当然のことながら、上述の好適なレポーター遺伝子は網羅的でも排他的でもなく、適用の範囲を制限するものではない。当業者ならば、本発明に同様に適用し得る他のレポーター系を選択することができるであろう。
【０２１３】
本発明においては、レポーター遺伝子に連結させる好ましい標的であるプロモーターはＰＸＲ、ＣＡＲ、ＣＹＰ３Ａ４、Ｃｙｐ３ａ１１、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｄ６、ＵＧＴ１Ａ、ＭＲＰ２及びＭＤＲ１である。
【０２１４】
本発明のレポーターの実施形態は比較方法において用いることができる。当業者であれば、本明細書に開示のレポーター非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞の適切な「パネル」を容易に選択することができるであろう。比較のために必要な非ヒト動物、組織又は細胞の種類や数は、必要な解析の種類（例えば、対象となる薬物代謝経路及び／又は対象となる薬物）によって決まる。本発明は、様々なレポーター遺伝子型のトランスジェニック非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞を提供する（本明細書の他の箇所を参照）。本発明は、当業者が所望の解析に必要なツールを選択することができるツールキットを提供する。
【０２１５】
従って、本発明は、生体異物の代謝又は毒性を調べるための方法であって、
（ｉ）転写産物及び／又は翻訳産物のアッセイによってその発現が簡便に測定できるＤＮＡ配列と作用的に連結した第１の内在性調節配列（例えば、マウスプロモーターやヒトプロモーター）を含む第１の非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞と、
（ｉｉ）転写産物及び／又は翻訳産物のアッセイによってその発現が簡便に測定できるＤＮＡ配列と作用的に連結した前記第１の内在性調節配列とは異なる第２の内在性調節配列（例えば、マウスプロモーターやヒトプロモーター）を含む第２の非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞を用いることを含む方法において、第１及び第２の内在性調節配列は、薬物代謝に関与するタンパク質をコードする遺伝子に通常関連する調節配列である方法を提供する。
【０２１６】
また、本発明は、生体異物の代謝又は毒性を調べるための方法であって、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種又は少なくとも１０種の非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞を用いることを含む方法において、非ヒト動物、組織又は細胞の各々の種は、転写産物及び／又は翻訳産物のアッセイによってその発現が簡便に測定できるＤＮＡ配列（即ち、レポーター配列）と作用的に連結した異なる内在性調節配列（例えば、マウスプロモーターやヒトプロモーター）を含み、且つ、各内在性調節配列は、薬物代謝に関与するタンパク質をコードする遺伝子に通常関連する調節配列である方法も提供する。
【０２１７】
ある実施形態においては、転写産物及び／又は翻訳産物のアッセイによってその発現が簡便に測定できるＤＮＡ配列は、異なる非ヒト動物、組織又は細胞において同一であるが、他の実施形態においては、異なるレポーター配列を用いる。
【０２１８】
異なるトランスジェニック非ヒト動物を比較する本発明のこのような方法は、異なる種の非ヒト動物（即ち、異なる種のレポーター）に対して同一薬物を同用量で投与することと、異なる動物間における該薬物の代謝又は毒性について比較することを含むことができる。
【０２１９】
本発明の特に好ましいトランスジェニック非ヒト動物、組織及び細胞は、以下のリストにて明記した遺伝子型を有する。接頭辞「ｈｕ」は関連する内在性非ヒト動物遺伝子のヒト化を意味する。接頭辞「ｒ」は、関連する遺伝子の内在性調節配列（例えば、マウスプロモーターやヒトプロモーター）が、転写産物及び／又は翻訳産物のアッセイによってその発現が簡便に測定できるＤＮＡ配列（即ち、レポーター配列）と作用的に連結していることを示す。
【０２２０】
レポーター構築物
ｒＣＹＰ３Ａ４；
ｒＣＹＰ２Ｄ６；
ｒＣＹＰ２Ｂ６；
ｒＣｙｐ３ａ１１；及び
ｒＭＤＲ１
【０２２１】
本発明の特に好ましいトランスジェニック非ヒト動物、組織及び細胞は本明細書に上述の遺伝子型の２種以上から成る組合せを含むが、その例の一部を以下のリストに明記する。リスト内において、記号「／」は遺伝子改変の組合せを示す。
【０２２２】
以下の複合遺伝子型においては単一レポーターのみが存在する。しかし、単一の非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞内で複数のレポーターを用いることも予想される。
【０２２３】
複合レポーター構築物
ｒＣＹＰ２Ｂ６／ｈｕＣＡＲ；
ｒＣｙｐ３ａ１１／ｈｕＰＸＲ；
ｒＣｙｐ３ａ１１／ｈｕＰＸＲ；
ｒＣＹＰ３Ａ４／ｈｕＰＸＲ；
ｒＣＹＰ２Ｃ９／ｈｕＰＸＲ；
ｒＣＹＰ２Ｄ６／ｈｕＰＸＲ；
ｒＣＹＰ２Ｃ１９／ｈｕＰＸＲ；
ｒＭＤＲ１／ｈｕＰＸＲ；
ｒＣＹＰ３Ａ４／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；
ｒＣＹＰ２Ｃ９／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；
ｒＣＹＰ２Ｄ６／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；
ｒＣＹＰ２Ｃ１９／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；
ｒＣＹＰ２Ｂ６／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；
ｒＣＹＰ３Ａ４／ｈｕＣＹＰ２Ｂ６／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；
ｒＭＤＲ１／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；
ｒＣＹＰ３Ａ４／ｈｕＣＹＰ２Ｃ９／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；
ｒＣＹＰ２Ｄ６／ｈｕＣＹＰ２Ｃ１９／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；
ｒＣＹＰ２Ｂ６／ｈｕＭＤＲ１／ｍｄｒ１ａ-/-／ｍｄｒ１ｂ-/-／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；
ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ／ｒＣＹＰ２Ｂ６／ｒＣＹＰ２Ｄ６／ｒＣＹＰ３Ａ４／ｒＭＤＲ１；
ｒＣＹＰ３Ａ４／ｈｕＣＹＰ２Ｃ９／ｈｕＣＹＰ２Ｄ６／ｈｕＣＹＰ２Ｃ１９／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；
ｒＣＹＰ３Ａ４／ｈｕＣＹＰ２Ｄ６／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；
ｒＣＹＰ３Ａ４／ｈｕＣＹＰ２Ｃ９／ｈｕＣＹＰ２Ｂ６／ｈｕＭＤＲ１／ｍｄｒ１ａ-/-／ｍｄｒ１ｂ-/-／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；
ｒＣＹＰ３Ａ４／ｈｕＣＹＰ２Ｂ６／ＭＤＲ１／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；
ｒＣＹＰ３Ａ４／ｈｕＣＹＰ２Ｃ９／ｈｕＣＹＰ２Ｄ６／ｈｕＣＹＰ２Ｃ１９／ｈｕＣＹＰ２Ｂ６／ＭＤＲ１／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ；及び
ｒＣＹＰ３Ａ４／ｈｕＣＹＰ２Ｄ６／ｈｕＣＹＰ２Ｂ６／ｈｕＭＤＲ１／ｍｄｒ１ａ-/-／ｍｄｒ１ｂ-/-／ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ
【０２２４】
上述の複合遺伝子型を有するトランスジェニック非ヒト動物、組織及び細胞は特に好ましいが、これは、このような非ヒト動物、組織及び細胞における薬物代謝経路がヒトのin vivo状態と酷似しているためである。
【０２２５】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物、組織又は細胞を作出するための好適な方法及び構築物については本明細書の他の箇所に記載しており、また、具体的なターゲティング戦略については本明細書の実施例に記載すると共に、図面にて概略的に示す。本明細書に記載（及び図示）の具体的なターゲティング戦略及び構築物の各々によって本発明の更なる様相が構成される。従って、本発明は、実質的に本明細書で記載（又は図示）されたターゲティング戦略又はベクターを用いて、本明細書に記載のレポーター構築物を含む非ヒト動物細胞を作出する方法を提供する。
【０２２６】
特に、本発明は、以下の遺伝子操作の一以上を含むトランスジェニックマウス、該マウス由来の組織又は細胞を提供する。
【０２２７】
【表６】
2010528644.tif 000007
【０２２８】
好ましいレポーター戦略及び構築物については本明細書の実施例及び図面において更に詳細に説明する。
【０２２９】
本発明のこれらの様相における動物、組織及び細胞によって、薬物代謝における遺伝子調節プロセスの非常に有用な要素を解明することができる。例えば、ＰＸＲはＣＹＰ３Ａ４遺伝子の転写制御において非常に重要であることが知られているが、他の重要な活性機序が存在する可能性が高い。ヒト化ＰＸＲ又はＰＸＲヌルバックグラウンドにおいてＣＹＰ３Ａ４レポーター動物又は細胞を薬物化合物に曝露することは、ＰＸＲ経由以外にＣＹＰ３Ａ４を調節する方法を検討する上で有用となるであろう。他に注目される例は、ヒト化ＰＸＲ及びＰＸＲヌルバックグラウンドの両方においてｍｄｒ１レポーター動物又は細胞を薬物化合物に曝露して、ＰＸＲ調節から独立したｍｄｒ１発現の様相を検出することであろう。
【０２３０】
従って、本発明のこの様相における動物、組織及び細胞は、ＰＸＲ、ＣＡＲ又は他の転写因子のヌルバックグラウンドにおいて第１相薬物代謝酵素をコードするヒトＤＮＡ配列、第２相薬物代謝酵素をコードするＤＮＡ配列、及び／又は薬物輸送タンパク質をコードするＤＮＡ配列と転写的に連結しているプロモーターを含むことができる。「ヌルバックグラウンド」とは、上述の定義に従い、遺伝子が無効化されたことを意味する。このような動物、細胞又は組織は、ヒト化ＰＸＲ又はＣＡＲバックグラウンドと同様の条件下（例えば、薬物の存在下及び非存在下）で比較されるであろう。従って、本発明のこの様相における動物、組織及び細胞は、転写因子のヒト化バックグラウンドにおいて第１相薬物代謝酵素をコードするヒトＤＮＡ配列、第２相薬物代謝酵素をコードするＤＮＡ配列、及び／又は薬物輸送タンパク質をコードするＤＮＡ配列と転写的に連結しているプロモーターを含むことができる。このような転写因子は、ＰＸＲ単独、ＣＡＲ単独、ＰＸＲ及びＣＡＲ、又は他の単一転写因子であってもよく、本明細書に記載の転写因子の組合せであってもよい。
【０２３１】
「転写的に連結している」とは、プロモーターの活性がレポータータンパク質の発現レベルを決定することを意味する。レポーター遺伝子は、調査対象のプロモーターを有する対応ヒト遺伝子の翻訳開始部位に融合するのが好ましい。ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｃ９及びＣＹＰ２Ｃ１９プロモーターの場合、レポーター遺伝子の転写物はポリＡモチーフによって終結されないこともあるが、構築物は内在性ポリＡモチーフが潜在的に用いられるようにデザインされている。従って、このような構築物は、レポーターへのエクソン３’の正しいスプライシングに依存している（図１２参照）。ＣＹＰ２Ｄ６及びＣＹＰ２Ｂ６の場合、レポーター遺伝子の転写物は、合成イントロンを有するレポーター遺伝子に連結しているポリＡモチーフによって終結するのが好ましい（図１３参照）。ＭＤＲ１の場合、レポーター遺伝子の転写物は、付加的イントロンを有しないポリＡモチーフによって終結するのが好ましい（図１４参照）。
【０２３２】
本発明はその更なる様相において、転写因子プロモーターの制御下で少なくとも１種の転写因子をコードする少なくとも１個のヒトＤＮＡ配列を含み、その内在性等価遺伝子が必要に応じて無効化された非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞であって、
（ｉ）第１相薬物代謝酵素をコードするＤＮＡ配列、及び／又は
（ｉｉ）第２相薬物代謝酵素をコードするＤＮＡ配列、及び／又は
（ｉｉｉ）薬物輸送タンパク質をコードするＤＮＡ配列
をコードするヒトＤＮＡ配列と転写的に連結しているプロモーターを更に含む、非ヒト動物、組織又は細胞を提供する。
【０２３３】
本発明のこの様相の非ヒト動物及び組織又は細胞は、第１相薬物代謝酵素をコードするＤＮＡ配列及び第２相薬物代謝酵素をコードするＤＮＡ配列と転写的に連結しているプロモーターを含むことができる。前記非ヒト動物及び組織又は細胞は、第１相薬物代謝酵素をコードするＤＮＡ配列及び薬物輸送タンパク質をコードするＤＮＡ配列と転写的に連結しているプロモーターを含むことができる。前記非ヒト動物及び組織又は細胞は、第２相薬物代謝酵素をコードするＤＮＡ配列及び薬物輸送タンパク質をコードするＤＮＡ配列と転写的に連結しているプロモーターを含むことができる。好適な第１相薬物代謝酵素、第２相薬物代謝酵素及び薬物輸送タンパク質の例としては本明細書に記載のものが挙げられる。
【０２３４】
他の様相においては、例えば、ｍｄｒ１遺伝子のプロモーター活性を調べることができる。このシナリオでは、動物、組織及び細胞は、ｍｄｒ１のヒト化バックグラウンド又はヌルバックグラウンドにおいて、転写因子をコードするヒトＤＮＡ配列と転写的に連結しているプロモーター、第１相薬物代謝酵素をコードするヒトＤＮＡ配列と転写的に連結しているプロモーター、及び／又は第２相薬物代謝酵素をコードするＤＮＡ配列と転写的に連結しているプロモーターを含むことができる。
【０２３５】
本発明のこの様相においては、薬物輸送体プロモーターの制御下で少なくとも１個の薬物輸送タンパク質をコードする少なくとも１個のヒトＤＮＡ配列を含み、その内在性等価遺伝子が必要に応じて無効化されている非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞であって、
（ｉ）転写因子をコードするＤＮＡ配列、及び／又は
（ｉｉ）第１相薬物代謝酵素をコードするＤＮＡ配列、及び／又は
（ｉｉｉ）第２相薬物代謝酵素をコードするＤＮＡ配列
をコードするヒトＤＮＡ配列と転写的に連結しているプロモーターを更に含む、非ヒト動物、組織又は細胞を提供する。
【０２３６】
本発明のこの様相の非ヒト動物及び組織又は細胞は、第１相薬物代謝酵素をコードするＤＮＡ配列及び第２相薬物代謝酵素をコードするＤＮＡ配列と転写的に連結しているプロモーターを含むことができる。前記非ヒト動物及び組織又は細胞は、第１相薬物代謝酵素をコードするＤＮＡ配列及び転写因子をコードするＤＮＡ配列と転写的に連結しているプロモーターを含むことができる。前記非ヒト動物及び組織又は細胞は、第２相薬物代謝酵素をコードするＤＮＡ配列及び転写因子をコードするＤＮＡ配列と転写的に連結しているプロモーターを含むことができる。好適な第１相薬物代謝酵素、第２相薬物代謝酵素及び転写因子タンパク質の例としては本明細書に記載のものが挙げられる。
【０２３７】
本発明はその更なる様相において、実質的に図１〜１４及び図６２〜８３のいずれかに示すターゲティングベクターを含む核酸構築物を提供する。
【０２３８】
該構築物は、少なくとも１個の第１相薬物代謝酵素、少なくとも１個の第２相薬物代謝酵素及び少なくとも１個の薬物輸送タンパク質を、ヒト化及び対応するノックアウトのために、同一の構築物内に又は更に独立した構築物内に更に含むのが好ましい。
【０２３９】
細胞
本発明の他の様相においては、本発明の上述のいずれか一様相によって動物細胞を産生する。好ましい様相においては、薬物や他の生体異物化合物のヒト代謝や体内動態、分布、毒性の決定に関与するタンパク質をコードする遺伝子に関する少なくとも１個のヒト調節ＤＮＡ配列を、転写産物や翻訳産物のアッセイによってその発現が簡便に測定可能なＤＮＡ配列と作用的に連結させて、非ヒト動物細胞に導入するレポーター遺伝子ＤＮＡ配列を産生する。この実施形態においては、一以上のレポーター配列（例えば、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ））と連結される。
【０２４０】
アッセイ
本発明の動物、組織及び細胞を用いて、薬物化合物がヒトによってどのように代謝されるか確認することができる。特に、薬物化合物が転写因子や薬物代謝酵素、薬物輸送タンパク質の活性や発現レベルを調節するかどうか調べることができる。また、薬物化合物によって誘導される転写因子や薬物代謝酵素、薬物輸送タンパク質の活性化や発現のレベルの割合を調べることができる。また、体組織内での転写因子や薬物代謝酵素、薬物輸送タンパク質の体内動態や分布に薬物化合物が影響を及ぼすかどうか調べることができる。また、転写因子や薬物代謝酵素、薬物輸送タンパク質の発現の持続期間に薬物化合物が影響を及ぼすかどうか調べることができる。
【０２４１】
動物における表現型の変化（例えば、生理学的作用）を測定することができる。このような生理学的作用としては、例えば、病態（胆管壊死等）や中毒性副作用を挙げることができる。
【０２４２】
薬物化合物の代謝速度を調べることができる。この代謝速度は、該化合物の投与によってもたらされる毒性や活性を測定するか、該化合物の半減期を測定するか、又は薬物代謝酵素のレベルを測定することによって求めることができる。例えば、該化合物の代謝速度は、酸化生成物の生成速度や酸化中間体から次に産生される生成物の生成速度として測定することができる。或いは、この代謝速度は、最初の化合物（initial compound）の半減期や消失速度として、又は最初の化合物や最初の化合物から産生される代謝物の毒性や活性の変化として表わすことができる。半減期は、様々な時点で採取したサンプルに存在する薬物化合物の量を求めることによって測定することができる。薬物化合物の量は、標準的な方法（例えば、高速液体クロマトグラフィーや質量分析、化合物特異的抗体を用いたウェスタンブロット解析、他の適切な方法）によって測定することができる。
【０２４３】
また、薬物化合物が毒性代謝物や発癌性代謝物に代謝されるかどうかを、例えば、該化合物の組織やタンパク質、ＤＮＡへの共有結合を測定するか、又はグルタチオンの欠乏を測定することによって調べることもできる。
【０２４４】
上述の種の測定は、薬物化合物投与後、２以上の時点、３時点、５時点又は１０以上の時点で行うのが好ましい。
【０２４５】
従って、本発明の更なる様相は、転写因子や薬物代謝酵素、薬物輸送タンパク質の活性や発現レベルに対する薬物化合物の作用を確認するために提供されるスクリーニング方法に関する。このような方法は、本発明の上述のいずれか一様相におけるトランスジェニック動物、又は該動物由来の組織又は細胞に薬物化合物を投与することを含む。
【０２４６】
スクリーニング工程は、転写因子や薬物代謝酵素、薬物輸送タンパク質をコードする遺伝子の誘導を測定することを含むことができる。また、スクリーニング工程は、転写因子や薬物代謝酵素、薬物輸送タンパク質の発現のレベル、又はこのような発現の持続期間を測定することを含むことができる。また、スクリーニング工程は、転写因子や薬物代謝酵素、薬物輸送タンパク質の発現の分布を測定することを含むことができる。
【０２４７】
薬物化合物の存在下及び非存在下でアッセイを行って、分布や代謝、毒性の差を確認することができる。様々なトランスジェニック動物や細胞、組織に対する薬物化合物の作用を評価することによって、特定の遺伝子の存在下及び非存在下における薬物化合物の作用を確認することができる。例えば、ヌルバックグラウンドを有する動物と対象遺伝子（例えば、ＰＸＲやＣＡＲ、ＭＤＲ１、第１相代謝酵素、第２相代謝酵素）をヒト化した動物との間で薬物化合物の作用を評価することも可能である。
【０２４８】
従って、更なる様相において、本発明は、本明細書に記載の生体異物の代謝又は毒性を調べるための方法であって、本明細書に記載の非ヒト動物、組織又は細胞の２種以上、３種以上、４種以上、５種以上、６種以上、７種以上、８種以上、９種以上又は１０種以上に対して薬物化合物を投与することを含む方法を提供する。このような方法は、異なる非ヒト動物、組織又は細胞について得られた実験結果を比較する工程を更に含むのが好ましい。
【０２４９】
複数の薬物化合物を投与することができる。例えば、ある薬物化合物がＣＡＲ遺伝子の誘導をもたらす場合、該化合物はＣＡＲ転写因子を活性化することが確認される。また、対照としてのヒトＣＡＲ受容体を発現する動物にＣＡＲ受容体インバースアゴニスト（例えば、クロトリマゾール）を投与することもできる。
【０２５０】
本発明の更なる様相におけるアッセイによって、第１の薬物化合物の代謝が第２の薬物化合物で調節されるかどうか確認するためのスクリーニング方法を提供することができる。この方法は、第２の化合物の存在下及び非存在下で第１の化合物を本発明の上述のいずれか一様相におけるトランスジェニック動物、又は該動物由来の組織又は細胞に投与することと、表現型効果をモニタリングすることとを含む。或いは、上述のように、スクリーニング工程は、遺伝子の誘導、転写因子や薬物代謝酵素、薬物輸送タンパク質の発現のレベルや持続期間、分布を測定することを含むことができる。第２の化合物がこれらの試験因子のいずれか一因子の変化をもたらす場合、第２の化合物は第１の化合物の代謝を調節することが確認される。例えば、第１の化合物の投与によってもたらされる毒性や活性を測定するか、又は第１の薬物化合物の半減期を測定することによって生理学的作用をアッセイすることができる。
【０２５１】
このように、アッセイを用いて、特定のタンパク質の発現を活性化又は誘導する能力が低いか又は検出できないために、副作用が少ないか又はin vivoでの半減期が長いことが期待される薬物化合物の類似体を容易に同定することができる。
【０２５２】
以下、次の図面を参照しつつ本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【０２５３】
【図１】図１は、ＰＸＲ／ＣＡＲのヒト化及びノックアウトの概略図を示す。
【図２】図２は、ＰＸＲヒト化戦略のためのゲノム配列を有する複合ｃＤＮＡの概略図を示す。
【図３】図３は、ＣＡＲヒト化戦略のためのゲノム配列を有する複合ｃＤＮＡの概略図を示す。
【図４】図４は、可能なマウスｍｄｒ１ａターゲティングベクターを示す。
【図５】図５は、可能なマウスｍｄｒ１ｂターゲティングベクターを示す。
【図６】図６は、ＭＲＰ２ヒト化のための可能な構築物を示す。
【図７】図７は、ＰＸＲヒト化のための可能なターゲティング戦略を示す。
【図８】図８は、ＣＡＲヒト化のための可能なターゲティング戦略を示す。
【図９】図９は、ＣＹＰ３Ａ４ヒト化のための可能な戦略を示す。
【図１０】図１０は、ＣＹＰ２Ｃ９ヒト化のための可能な戦略を示す。
【図１１】図１１は、クラスター交換のための可能な全体的戦略を示す。
【図１２】図１２は、レポーター構築物のための可能な全体的戦略を示す。
【図１３】図１３は、ＣＹＰ２Ｄ６及びＣＹＰ２Ｂ６のための可能なレポーター計画戦略（reporter project strategy）を示す。
【図１４】図１４は、ＭＤＲ１のための可能なレポーター計画戦略を示す。
【図１５】図１５は、ＰＸＲタイピング用ＰＣＲの例を示す。
【図１６Ａ】図１６は、野生型及びトランスジェニックマウスのＴａｑｍａｎタイピングを示す。用いた全てのプローブ及びプライマーは、予め最適化されたＴａｑＭａｎ(登録商標）ゲノムアッセイキットであり、アプライド・バイオシステムズから購入した。用いたアッセイは全てアプライド・バイオシステムズのものである。マウスＰＸＲｍＲＮＡ転写物（Ａ、Ｃ）又はヒトＰＸＲｍＲＮＡ転写物（Ｂ、Ｄ）に特異的なアッセイを用いて９匹の野生型マウス及び４匹のｈＰＸＲマウスの肝臓（Ａ、Ｂ）及び小腸（Ｃ、Ｄ）のＴａｑＭａｎ解析によって得られた結果を示す。
【図１６Ｂ】図１６は、野生型及びトランスジェニックマウスのＴａｑｍａｎタイピングを示す。用いた全てのプローブ及びプライマーは、予め最適化されたＴａｑＭａｎ(登録商標）ゲノムアッセイキットであり、アプライド・バイオシステムズから購入した。用いたアッセイは全てアプライド・バイオシステムズのものである。マウスＰＸＲｍＲＮＡ転写物（Ａ、Ｃ）又はヒトＰＸＲｍＲＮＡ転写物（Ｂ、Ｄ）に特異的なアッセイを用いて９匹の野生型マウス及び４匹のｈＰＸＲマウスの肝臓（Ａ、Ｂ）及び小腸（Ｃ、Ｄ）のＴａｑＭａｎ解析によって得られた結果を示す。
【図１６Ｃ】図１６は、野生型及びトランスジェニックマウスのＴａｑｍａｎタイピングを示す。用いた全てのプローブ及びプライマーは、予め最適化されたＴａｑＭａｎ(登録商標）ゲノムアッセイキットであり、アプライド・バイオシステムズから購入した。用いたアッセイは全てアプライド・バイオシステムズのものである。マウスＰＸＲｍＲＮＡ転写物（Ａ、Ｃ）又はヒトＰＸＲｍＲＮＡ転写物（Ｂ、Ｄ）に特異的なアッセイを用いて９匹の野生型マウス及び４匹のｈＰＸＲマウスの肝臓（Ａ、Ｂ）及び小腸（Ｃ、Ｄ）のＴａｑＭａｎ解析によって得られた結果を示す。
【図１６Ｄ】図１６は、野生型及びトランスジェニックマウスのＴａｑｍａｎタイピングを示す。用いた全てのプローブ及びプライマーは、予め最適化されたＴａｑＭａｎ(登録商標）ゲノムアッセイキットであり、アプライド・バイオシステムズから購入した。用いたアッセイは全てアプライド・バイオシステムズのものである。マウスＰＸＲｍＲＮＡ転写物（Ａ、Ｃ）又はヒトＰＸＲｍＲＮＡ転写物（Ｂ、Ｄ）に特異的なアッセイを用いて９匹の野生型マウス及び４匹のｈＰＸＲマウスの肝臓（Ａ、Ｂ）及び小腸（Ｃ、Ｄ）のＴａｑＭａｎ解析によって得られた結果を示す。
【図１７】図１７は、トランスジェニックマウスにおけるｈｕＰＸＲ転写物のＲＴ−ＰＣＲを示す。
【図１８】図１８は、野生型及びｈＰＸＲマウス由来のＰＸＲタンパク質のウェスタンブロッティングを示す。処理した野生型マウス及びｈｕＰＸＲマウスの肝臓由来のタンパク質をＰＸＲタンパク質に特異的な抗体でプローブした。標準（＋ｖｅ）はｈｉｓタグマウスＰＸＲである。
【図１９】図１９は、リファンピシンによるＣｙｐ３ａ及びＣｙｐ２ｂの誘導のウェスタンブロッティングを示す。リファンピシンで処理した野生型マウス及びｈｕＰＸＲマウスの肝臓由来のミクロソームタンパク質をＣｙｐ３ａ１１タンパク質（上部パネル）及びＣｙｐ２ｂ１０（下部パネル）の抗体でプローブした。
【図２０】図２０は、リファンピシン（１００ｍｇ／ｋｇ）によるＣｙｐ３ａ及びＣｙｐ２ｂ１０誘導の酵素活性アッセイを示す。Ｃｙｐ２ｂ１０の発現レベルによるペントキシレゾルフィン−Ｏ−脱エチル化（ＰＲＯＤ）の活性と、Ｃｙｐ３ａの発現レベルによる７−ベンジルオキシキノリン（ＢＱ）の活性とを用いた肝臓ミクロソームに対する酵素活性アッセイから得た結果を示す。
【図２１】図２１は、リファンピシン（３ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ）による誘導後の肝臓ミクロソームにおける酵素活性アッセイを示す（７−ベンジルオキシキノリン）。７−ベンジルオキシキノリンの活性を用いた肝臓ミクロソームに対する酵素活性アッセイから得た結果を示す。
【図２２】図２２は、リファンピシン（３ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ）による誘導後の肝臓ミクロソームにおける酵素活性アッセイを示す（テストステロンの６−β−ヒドロキシル化）（ｐ＜０．０１）。
【図２３】図２３は、リファンピシン（３ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ）による誘導後の肝臓ミクロソームにおける酵素活性アッセイを示す（テストステロンの１６−β−ヒドロキシル化）（ｐ＜０．０５）。
【図２４】図２４は、ＴＣＰＯＢＯＢ（０．３ｍｇ／ｋｇ及び１．０ｍｇ／ｋｇ）による誘導後の肝臓ミクロソームにおける酵素活性アッセイを示す（テストステロンの７−α−ヒドロキシル化）。これは、野生型に比べてｈｕＰＸＲマウスで構成的に高かった。
【図２５】図２５は、ＴＣＰＯＢＯＢ（０．３ｍｇ／ｋｇ及び１．０ｍｇ／ｋｇ）による誘導後の肝臓ミクロソームにおける酵素活性アッセイを示す（テストステロンの６−β−ヒドロキシル化）。
【図２６】図２６は、ＴＣＰＯＢＯＢ（０．３ｍｇ／ｋｇ及び１．０ｍｇ／ｋｇ）による誘導後の肝臓ミクロソームにおける酵素活性アッセイを示す（テストステロンの１６−α−ヒドロキシル化）。この活性は野生型マウスでは有意に誘導された（ｐ＜０．０５）が、ｈｕＰＸＲマウスでは誘導されなかったことが分かる。
【図２７】図２７は、ＴＣＰＯＢＯＢ（０．３ｍｇ／ｋｇ及び１．０ｍｇ／ｋｇ）による誘導後の肝臓ミクロソームにおける酵素活性アッセイを示す（テストステロンの１６−β−ヒドロキシル化）。この活性はｈｕＰＸＲマウスと比べて野生型マウスで遥かに顕著であったことが分かる。
【図２８】図２８は、２種類の二重ホモ接合ＰＸＲ／ＣＡＲヒト化マウスにおいてマウスＰＸＲ遺伝子がヒトカウンターパートと交換されたことのＰＣＲ確認を示す。
【図２９】図２９は、野生型マウス及びｈｕＰＸＲマウスにおけるリファンピシン処理に応じたＣｙｐ３ａ１１誘導プロファイルを示す。
【図３０】図３０は、野生型マウス及びｈｕＰＸＲマウスにおけるデキサメタゾン処理に応じたＣｙｐ３ａ１１誘導プロファイルを示す。
【図３１】図３１は、野生型マウス及びｋｏＰＸＲマウスの肝臓のＰＸＲｍＲＮＡのＴａｑＭａｎ(登録商標）解析の結果を示す。
【図３２】図３２は、野生型マウス、ｈｕＰＸＲマウス又はｋｏＰＸＲマウスにおけるＣｙｐ３ａ１１の発現及び活性に対するリファンピシン投与の作用を示す。
【図３３】図３３は、野生型マウス及びｈｕＰＸＲマウスにおいてはリファンピシンはＣｙｐ２ｂ１０発現を誘導しないことを示す。
【図３４】図３４は、野生型マウス、ｈｕＰＸＲマウス及びｋｏＰＸＲマウスにおけるＣｙｐ３ａ１１及びＣｙｐ２ｂ１０の発現及び活性に対するデキサメタゾン投与の作用を示す。
【図３５】図３５は、野生型マウス、ｋｏＰＸＲマウス及びｈｕＰＸＲマウスにおけるＣｙｐ３ａ１１の発現及び活性に対するデキサメタゾン投与の作用を示す。
【図３６】図３６は、ｈｕＰＸＲマウス及びｋｏＰＸＲマウスにおけるデキサメタゾン介在による肝毒性の種特異的差異を示す。
【図３７】図３７は、６０ｍｇ／ｋｇのリファンピシン又はデキサメタゾンを投与した後の野生型マウス、ｈｕＰＸＲマウス及びｋｏＰＸＲマウスの肝臓／身体重量比を示す。
【図３８】図３８は、野生型マウス、ｈｕＰＸＲマウス及びｋｏＰＸＲマウスにおけるＣｙｐ３ａ１１及びＣｙｐ２ｂ１０の発現に対するリファンピシン及びデキサメタゾンの作用についての概要を示す。媒体処理マウスと比べて中程度の増加の場合は「＋＋」で表し、媒体処理マウスと比べて強い増加の場合は「＋＋＋」で表し、媒体処理マウスと比べて変化が無い場合は「ＮＣ」で表す。
【図３９】図３９は、非処理野生型マウス及びｋｏＣＡＲマウスの肝臓及び腸のＣＡＲｍＲＮＡのＴａｑＭａｎ(登録商標）解析の結果を示すが、この結果から、ｋｏＣＡＲマウスではＣＡＲｍＲＮＡの基礎発現が完全に消失したことが分かる。
【図４０】図４０は、デキサメタゾン又はフェノバルビタールで処理後の野生型マウス、ｋｏＣＡＲマウス及びｋｏＰＸＲマウスの肝毒性データを示す。
【図４１】図４１は、ｋｏＣＡＲマウス及びｋｏＰＸＲマウスの肝臓に対するデキサメタゾン及びフェノバルビタール投与の作用を示す。
【図４２】図４２は、ｋｏＣＡＲマウス及びｋｏＰＸＲマウスの腸及び肝臓に対するデキサメタゾン及びフェノバルビタール投与の作用を示す。
【図４３】図４３は、野生型マウス及びｋｏＣＡＲマウスのＴＣＰＯＢＯＰ処理肝臓から得たウェスタンブロットバンドの濃度定量を示す。
【図４４】図４４は、ｈｕＣＡＲマウスの肝臓においては、マウスＣＡＲｍＲＮＡではなくヒトＣＡＲｍＲＮＡが発現することを示す（ＴａｑＭａｎ(登録商標）解析）。
【図４５】図４５は、野生型マウス及びｈｕＣＡＲマウスの肝臓及び小腸におけるＣＡＲｍＲＮＡ解析（ＴａｑＭａｎ(登録商標）解析による）の更なる結果を示す。
【図４６】図４６は、野生型マウス及びｈｕＣＡＲマウスのＣＩＴＣＯ肝毒性データを示す。
【図４７】図４７は、野生型マウス及びｈｕＣＡＲマウスにおけるＣＩＴＣＯの作用を示す。
【図４８】図４８は、ＰＸＲ及びＣＡＲ活性のスクリーニングアッセイの原理の概略図である。
【図４９】図４９は、野生型マウス及びｈｕＣＡＲマウスにおけるＣｙｐ２ｂ１０の発現及び活性に対するＴＣＰＯＢＯＰの作用を示す。
【図５０】図５０は、野生型マウス及びｈｕＣＡＲマウスにおけるＣＩＴＣＯの作用とＴＣＰＯＢＯＰの作用との比較を示す。
【図５１】図５１は、野生型マウス及びｈｕＣＡＲマウスにおけるＣｙｐ２ｂ１０の発現及び活性に対するフェノバルビタール処理の作用を示す。
【図５２】図５２は、野生型マウス及びｈｕＣＡＲマウスにおけるＣｙｐ２ｂ１０の発現及び活性に対するデキサメタゾン処理の作用を示す。
【図５３】図５３は、野生型マウス、ｈｕＣＡＲマウス、ｋｏＣＡＲマウス、ｈｕＰＸＲマウス及びｋｏＰＸＲマウスにおけるＣｙｐ２ｂ１０の発現及び活性に対するＣＩＴＣＯ又はＴＣＰＯＢＯＰ処理の作用を示す。
【図５４】図５４は、野生型マウス及びｈｕＣＡＲマウスにおけるＣｙｐ３ａ１１の発現及び活性に対するＴＣＰＯＢＯＰ処理の作用を示す。
【図５５】図５５は、マウスやヒトにおけるＣｙｐ３ａ１１及びＣｙｐ２ｂ１０の発現に対する選択された薬物代謝誘導剤の作用の概要を示す。
【図５６】図５６は、野生型マウス、ｈｕＰＸＲマウス、ｋｏＰＸＲマウス及びｈｕＣＡＲマウスの肝臓におけるＰＸＲ及びＣＡＲ標的遺伝子に対する様々な誘導剤の作用についての概要を示す。同一株の媒体処理マウスと比べて発現の増加が僅かな場合は「＋」で表し、同一株の媒体処理マウスと比べて発現の増加が中程度の場合は「＋＋」で表し、同一株の媒体処理マウスと比べて発現の増加が強い場合は「＋＋＋」で表し、同一株の媒体処理マウスと比べて変化が無い場合は「ＮＣ」で表す。
【図５７】図５７は、野生型マウスとｈｕＣＡＲマウスとのＣＡＲアクチベーターに対する過形成反応の種特異的差異を示す。
【図５８】図５８は、ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ二重ヒト化マウス、野生型マウス、ｈｕＰＸＲマウス及びｈｕＣＡＲマウスにおけるＰＸＲ及びＣＡＲｍＲＮＡのレベルを示す。二重ヒト化マウスではヒトＰＸＲ及びＣＡＲｍＲＮＡの発現が維持される。
【図５９】図５９は、二重ヒト化ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウス、野生型マウス、ｈｕＰＸＲマウス及びｈｕＣＡＲマウスにおけるリファンピシン及びフェノバルビタール処理の作用を示すと共に、ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウス、野生型マウス、ｈｕＰＸＲマウス及びｈｕＣＡＲマウスにおけるＣｙｐ２ｂ１０及びＣｙｐ３ａｌｌタンパク質の基礎レベルを示す。
【図６０】図６０は、野生型マウス及びｒＣｙｐ２Ｂ６／ｈｕＣＡＲレポーターマウスから得た組織サンプルを示し、肝ミクロソーム中のＣｙｐ２Ｂ６の空間発現パターンを示す。
【図６１】図６１は、野生型マウス及びｒＣｙｐ２Ｄ６／ｈｕＰＸＲレポーターマウスから得た組織サンプルを示し、肝ミクロソーム中のＣｙｐ２Ｄ６の空間発現パターンを示す。
【図６２】図６２は、ＰＸＲヒト化（遺伝子型ｈｕＰＸＲのマウスの作出）のための更に可能なターゲティング戦略を示す。
【図６３】図６３は、ＰＸＲヒト化に有用なターゲティングベクターの概略図を示す。
【図６４】図６４は、ＰＸＲヒト化（遺伝子型ｈｕＰＸＲのマウスの作出）のための更に可能なターゲティング戦略を示す。
【図６５】図６５は、ＰＸＲヒト化及びノックアウト（遺伝子型ｈｕＰＸＲ及びｋｏＰＸＲのマウスの作出）のための可能なターゲティング戦略を示す。
【図６６】図６６は、ＣＡＲヒト化及びノックアウト（遺伝子型ｈｕＣＡＲ及びｋｏＣＡＲのマウスの作出）のための可能なターゲティング戦略を示す。
【図６７】図６７は、ＣＡＲヒト化及びノックアウトに有用なターゲティングベクターの概略図を示す。
【図６８】図６８は、マウスにおけるＰＰＡＲαヒト化及びノックアウト（遺伝子型ｈｕＰＰＡＲα及びｋｏＰＰＡＲαのマウスの作出）のための可能なターゲティング戦略を示す。
【図６９】図６９は、マウスにおけるＡｈＲヒト化及びノックアウト（遺伝子型ｈｕＡｈＲ及びｋｏＡｈＲのマウスの作出）のための可能なターゲティング戦略を示す。
【図７０】図７０は、マウスにおけるＣＹＰ３Ａ４ヒト化（遺伝子型ｈｕＣＹＰ３Ａ４のマウスの作出）のための可能なターゲティング戦略を示す。
【図７１】図７１は、マウスにおけるＣｙｐ３ａ１１ノックアウト（遺伝子型ｋｏＣｙｐ３ａ１１のマウスの作出、同時に（遺伝子型ｒＣｙｐ３ａ１１の）レポーター構築物の作出）のための可能なターゲティング戦略を示す。
【図７２Ａ】図７２：パネルＡ〜Ｃは、ＣＹＰ３Ａクラスターをヒト化した、又はＣＹＰ３Ａクラスターをノックアウトしたマウスの作出（遺伝子型ｈｕＣＹＰ３Ａクラスター及びｋｏＣｙｐ３Ａクラスターのマウスの作出）のための可能なターゲティング戦略を示す。図７２Ａは、マウスＣｙｐ３ａクラスターの５’ターゲティングのための戦略を示す。
【図７２Ｂ】図７２：パネルＡ〜Ｃは、ＣＹＰ３Ａクラスターをヒト化した、又はＣＹＰ３Ａクラスターをノックアウトしたマウスの作出（遺伝子型ｈｕＣＹＰ３Ａクラスター及びｋｏＣｙｐ３Ａクラスターのマウスの作出）のための可能なターゲティング戦略を示す。図７２Ｂは、（Ｃｙｐ３ａ２５遺伝子座における）マウスＣｙｐ３ａクラスターの３’ターゲティングのための戦略を示す。
【図７２Ｃ】図７２：パネルＡ〜Ｃは、ＣＹＰ３Ａクラスターをヒト化した、又はＣＹＰ３Ａクラスターをノックアウトしたマウスの作出（遺伝子型ｈｕＣＹＰ３Ａクラスター及びｋｏＣｙｐ３Ａクラスターのマウスの作出）のための可能なターゲティング戦略を示す。図７２Ｃは、クラスター交換戦略の概要を示す。
【図７３】図７３は、マウスにおけるＣＹＰ２Ｃ９ヒト化（遺伝子型ｈｕＣＹＰ２Ｃ９のマウスの作出）のための可能なターゲティング戦略を示す。
【図７４Ａ】図７４：パネルＡ〜Ｃは、ＣＹＰ２Ｃクラスターをヒト化した、又はＣＹＰ２Ｃクラスターをノックアウトしたマウスの作出（遺伝子型ｈｕＣＹＰ２Ｃクラスター及びｋｏＣｙｐ２Ｃクラスターのマウスの作出）のための可能なターゲティング戦略を示す。図７４Ａは、マウスＣｙｐ２ｃクラスターの５’ターゲティングのための戦略を示す。
【図７４Ｂ】図７４：パネルＡ〜Ｃは、ＣＹＰ２Ｃクラスターをヒト化した、又はＣＹＰ２Ｃクラスターをノックアウトしたマウスの作出（遺伝子型ｈｕＣＹＰ２Ｃクラスター及びｋｏＣｙｐ２Ｃクラスターのマウスの作出）のための可能なターゲティング戦略を示す。図７４Ｂは、マウスＣｙｐ２ｃクラスターの３’ターゲティングのための戦略を示す。
【図７４Ｃ】図７４：パネルＡ〜Ｃは、ＣＹＰ２Ｃクラスターをヒト化した、又はＣＹＰ２Ｃクラスターをノックアウトしたマウスの作出（遺伝子型ｈｕＣＹＰ２Ｃクラスター及びｋｏＣｙｐ２Ｃクラスターのマウスの作出）のための可能なターゲティング戦略を示す。図７４Ｃは、クラスター交換戦略の概要を示す。
【図７５Ａ】図７５：パネルＡ〜Ｃは、Ｕｇｔ１クラスターをヒト化した、又はＵｇｔ１クラスターをノックアウトしたマウスの作出（遺伝子型ｈｕＵＧＴクラスター及びｋｏＵＧＴクラスターのマウスの作出）のための可能なターゲティング戦略を示す。図７５Ａは、マウスＵＧＴクラスターの５’ターゲティングのための戦略を示す。
【図７５Ｂ】図７５：パネルＡ〜Ｃは、Ｕｇｔ１クラスターをヒト化した、又はＵｇｔ１クラスターをノックアウトしたマウスの作出（遺伝子型ｈｕＵＧＴクラスター及びｋｏＵＧＴクラスターのマウスの作出）のための可能なターゲティング戦略を示す。図７５Ｂは、マウスＵＧＴクラスターの３’ターゲティングのための戦略を示す。
【図７５Ｃ】図７５：パネルＡ〜Ｃは、Ｕｇｔ１クラスターをヒト化した、又はＵｇｔ１クラスターをノックアウトしたマウスの作出（遺伝子型ｈｕＵＧＴクラスター及びｋｏＵＧＴクラスターのマウスの作出）のための可能なターゲティング戦略を示す。図７５Ｃは、クラスター交換戦略の概要を示す。
【図７６】図７６は、マウスＭｄｒ１ａ遺伝子座におけるＭＤＲ１ヒト化（遺伝子型ｈｕＭＤＲ１／ｍｄｒ１ａ-/-のマウスの作出）のための可能なターゲティング戦略を示す。
【図７７】図７７は、マウスＭｄｒ１ｂ遺伝子座におけるＭＤＲ１ヒト化（遺伝子型ｈｕＭＤＲ１／ｍｄｒ１ｂ-/-のマウスの作出）のための可能なターゲティング戦略を示す。
【図７８】図７８は、ＭＲＰ２ヒト化（遺伝子型ｈｕＭＲＰ２のマウスの作出）のための可能なターゲティング戦略を示す。
【図７９】図７９は、マウスにおけるＣＹＰ２Ｂ６レポーター系の作出（遺伝子型ｒＣＹＰ２Ｂ６のマウスの作出）のための可能なターゲティング戦略を示す。
【図８０】図８０は、マウスにおけるＣＹＰ２Ｄ６レポーター系の作出（遺伝子型ｒＣＹＰ２Ｄ６のマウスの作出）のための可能なターゲティング戦略を示す。
【図８１】図８１は、マウスにおけるＣＹＰ３Ａ４レポーター系の作出（遺伝子型ｒＣＹＰ３Ａ４のマウスの作出）のための可能なターゲティング戦略を示す。
【図８２】図８２は、マウスにおけるＣｙｐ３ａ１１レポーター系の作出（遺伝子型ｒＣｙｐ３ａ１１のマウスの作出）のための可能なターゲティング戦略を示す。
【図８３】図８３は、マウスにおけるＭＤＲ１レポーター系の作出（遺伝子型ｒＭＤＲ１のマウスの作出）のための可能なターゲティング戦略を示す。
【図８４】図８４は、デキサメタゾンの量を増加させて投与した際のＣｙｐ３ａ１１タンパク質発現の誘導を野生型マウスとｈｕＰＸＲマウスで比較したものを示す。
【図８５】図８５は、配列番号１（ｈｕＰＸＲ）及び配列番号３（ｈｕＰＸＲ．１）を用いて作出したｈｕＰＸＲマウスの比較を示す。
【図８６】図８６は、ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ二重ヒト化マウスはヒトＰＸＲｍＲＮＡ及びＣＡＲｍＲＮＡの発現を維持することを示す。
【図８７】図８７は、野生型マウス、ｈｕＰＸＲマウス、ｋｏＰＸＲマウス、ｈｕＣＡＲマウス、ｋｏＣＡＲマウス、ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウス、ｋｏＰＸＲ／ｋｏＣＡＲマウス、ｈｕＰＸＲ／ｋｏＣＡＲマウス及びｋｏＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウスにおけるフェノバルビタール誘導の比較研究を示す。
【図８８】図８８は、野生型マウス、ｈｕＰＸＲマウス、ｋｏＰＸＲマウス、ｈｕＣＡＲマウス、ｋｏＣＡＲマウス、ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウス、ｋｏＰＸＲ／ｋｏＣＡＲマウス、ｈｕＰＸＲ／ｋｏＣＡＲマウス及びｋｏＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウスにおけるデキサメタゾン誘導の比較研究を示す。
【図８９】図８９は、野生型マウス、ｈｕＰＸＲマウス、ｋｏＰＸＲマウス、ｈｕＣＡＲマウス、ｋｏＣＡＲマウス、ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウス、ｋｏＰＸＲ／ｋｏＣＡＲマウス、ｈｕＰＸＲ／ｋｏＣＡＲマウス及びｋｏＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウスにおけるデキサメタゾン介在肝毒性（ＡＬＴレベル及び肝臓重量）のＰＸＲ依存性についての比較研究の結果を示す。
【図９０】図９０は、代謝経路と核内受容体と非遺伝毒性発癌との関係を概略的にまとめたものである。
【図９１】図９１は、マウス肝臓におけるフェノバルビタール誘導による発癌の現象を概略的にまとめたものである。
【図９２】図９２は、野生型マウス、ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ二重ヒト化マウス及びｋｏＰＸＲ／ｋｏＣＡＲ二重ノックアウトマウスを用いた、フェノバルビタールに対する過形成反応のマウス対ヒトの種特異的差異についての研究結果をまとめたものである。
【図９３】図９３は、リファンピシン介在による薬物−薬物相互作用の種特異的差異（薬物動態）の測定値を示す。
【図９４】図９４は、生体異物剤の非存在下とデキサメタゾン投与の両方の場合のｋｏＣｙｐ３ａ１１マウスにおけるＣｙｐ３ａ１１ｍＲＮＡ発現の消失を示す。
【図９５】図９５は、野生型マウスと比べて雄性ｋｏＣｙｐ３ａ１１マウスにおいてはミダゾラム代謝が変化することを示す。
【図９６】図９６は、ＣＹＰ３Ａ４特異的プライマーを用いてｈｕＣＹＰ３Ａ４／ｈｕＰＸＲマウスから得た定量ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）データを示す。
【図９７】図９７は、ＣＹＰ３Ａ４特異的プライマーを用いてヒト肝臓サンプルから得た定量ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）データを示す。
【図９８】図９８は、ｈｕＣＹＰ３Ａ４／ｈｕＰＸＲ／ｋｏＣｙｐ３ａ１１マウスにおける４種類の異なる生体異物剤によるＣｙｐ３Ａ４タンパク質発現の誘導を示す。
【図９９】図９９は、ｋｏＣｙｐ３Ａクラスターマウスについての検証結果を示す。
【図１００】図１００は、ｈｕＣＹＰ３Ａクラスター交換マウスを作出するためのターゲティング戦略をまとめたものである。
【図１０１】図１０１は、ｈｕＣＹＰ３Ａクラスター交換マウス作出の工程を概略的に示し、Ｃｙｐ３ａクラスター交換ＥＳ細胞クローンの生殖系列伝達（germline transmission）を確認するジェノタイピングデータを示す。
【図１０２】図１０２は、マウスＣｙｐ２ｄクラスターの部位においてヒトＣＹＰ２Ｄ６発現カセットを挿入するためのターゲティング戦略をまとめたものである。
【図１０３】図１０３は、ヘテロ接合体ｈｕＣＹＰ２Ｄ６マウスの肝臓で測定したヒトＣＹＰ２Ｄ６タンパク質の発現を示す。
【図１０４】図１０４は、ｌｏｘＰ隣接マウスＣｙｐ２ｃクラスターを欠失させるためのターゲティング戦略をまとめたものである。
【図１０５】図１０５は、マウスＣｙｐ２ｃクラスターにおいてヒトＣＹＰ２Ｃ９発現カセットを挿入するためのターゲティング戦略（「Ｃｙｐ２ｃ５５内ＣＹＰ２Ｃ９ヒト化」マウス）をまとめたものである。
【図１０６】図１０６は、ＲＴ−ＰＣＲによるｈｕＭＲＰ２マウスの特徴付けを示す。
【図１０７】図１０７は、野生型マウスとｈｕＰＸＲ／ｈｕＭＲＰ２マウスの尿中ビリルビンレベル（総ビリルビン及び直接ビリルビン）の測定値を示す。
【図１０８】図１０８は、ｒＣＹＰ２Ｂ６レポーターマウスについての検証を示す。
【図１０９】図１０９は、ｒＣＹＰ２Ｄ６レポーターマウスについての検証を示す。
【図１１０】図１１０は、ｒＣＹＰ３Ａ４レポーターマウスについての検証を示す。
【図１１１】図１１１：トランスジェニックマウスを作出するための方法。トランスジェニックマウスは、発育胚盤胞に一以上の変化した胚性幹細胞を挿入することによって作出する。その後、胚盤胞を偽妊娠マウスに移植し、発育させてキメラを作出する。キメラを欠失株と交雑させてマウス標的遺伝子を除去し、ヒト化遺伝子に対してヘテロ接合性のマウスを作出する。２種の前記へテロ接合体を交雑させて、ヒト化イベントに対してホモ接合性のマウスを作出する。
【図１１２】図１１２：ＣＹＰ３Ａ４をヒト化したマウスを作出するための対応するヒトプロモーターＡ標的戦略を用いたＣＹＰ３Ａ４ヒト化の方法（該方法においては、マウスＣＹＰ３Ａクラスターを欠失させ、その後、ヒト発現カセットをノックアウトすることができる）。
【図１１３】図１１３：ＣＹＰ２Ｃ９をヒト化したマウスを作出するための対応するヒトプロモーターＡ標的戦略を用いたＣＹＰ２Ｃ９ヒト化の方法（該方法においては、マウスＣＹＰ２Ｃクラスターを欠失させ、その後、ヒト発現カセットをノックアウトすることができる）。
【図１１４】図１１４：ＣＹＰ２Ｄ６をヒト化したマウスを作出するための対応するヒトプロモーターＡ標的戦略を用いたＣＹＰ２Ｄ６ヒト化の方法（該方法においては、ＣＹＰ２Ｄクラスターを欠失させ、その後、ヒト発現カセットをノックアウトすることができる）。
【図１１５】図１１５：ＰＣＲ解析から、ヘテロ接合体ＣＹＰ２Ｄヒト化マウスの作出が成功したことが分かる。特定のプライマーを用いて、ＰＣＲによるマウス染色体の解析を行うことができる。その結果から、所望のヒト置換ＣＹＰ２Ｄ遺伝子配列の導入及びマウスＣＹＰ２Ｄクラスターの欠失が成功したことが分かる。
【図１１６】図１１６：Ｃｙｐ３ａ１１プロモーターを用いてＣＹＰ３Ａ４をヒト化したマウスを作出するためのマウスＣｙｐ３ａ１１プロモーターＡ標的戦略を用いたｈｕＣＹＰ３Ａ４ヒト化の方法（該方法においては、マウスＣＹＰ３Ａクラスターを欠失させる）。
【図１１７】図１１７：マウスＣｙｐ３ａクラスター欠失のための戦略。（Ａ）マウスＣｙｐ３ａクラスター内の機能性遺伝子の染色体の構成及び方向の概略図（出典：ネルソン（Nelson）ら、２００４、Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ  １４（１）：１）。偽遺伝子は示されていない。（Ｂ）Ｃｙｐ３ａ５７及びＣｙｐ３ａ５９のエクソン／イントロン構造。エクソンは黒い棒で示し、ＡＴＧは両遺伝子の翻訳開始点を示す。相同組換えのターゲティングアームの位置をそれぞれ、薄灰色（Ｃｙｐ３ａ５７系）及び濃灰色（Ｃｙｐ３ａ５９系）でハイライトする。（Ｃ）相同組換えによりＣｙｐ３ａ５７（左）及びＣｙｐ３ａ５９（右）のターゲティングに用いたベクター。ＬｏｘＰ部位、ｌｏｘ５１７１部位、ｆｒｔ部位及びｆ３部位をそれぞれ、白い三角、縞模様の三角、点模様の三角、及び黒い三角で示す。（Ｄ）Ｃｙｐ３ａ５７及びＣｙｐ３ａ５９遺伝子座における同一対立遺伝子上での相同組換え後の二重標的ＥＳ細胞内のＣｙｐ３ａクラスターのゲノム構成。（Ｅ）ｌｏｘＰ部位におけるＣｒｅ介在組換え後のマウスＣｙｐ３ａクラスターの欠失。Ｃｙｐ３ａ５７、Ｃｙｐ３ａ１６、Ｃｙｐ３ａ４１、Ｃｙｐ３ａ１１及びＣｙｐ３ａ２５由来の全てのエクソンとイントロンは完全に欠失し、エクソン１〜４及びＣｙｐ３ａ５９のプロモーターも欠失する。従って、Ｃｒｅ介在欠失後に残存する唯一の機能性Ｃｙｐ３ａ遺伝子はＣｙｐ３ａ１３であり、これは、＞８００ｋｂのゲノムＤＮＡやＣｙｐと無関係の多数の機能性遺伝子によってクラスターの残りから離れている。マウスＣｙｐ３ａクラスターの欠失が成功したことを実証するのに用いたプライマーを矢印で示す。分かり易くするため、配列は一定の縮尺率では示していない。ＴＫ＝チミジンキナーゼ発現カセット、Ｈｙｇｒｏ＝ハイグロマイシン発現カセット、ＺｓＧｒｅｅｎ＝ＺｓＧｒｅｅｎ発現カセット、Ｐ＝ネオマイシンの発現を促進するプロモーター、５’ΔＮｅｏ＝ＡＴＧ欠損ネオマイシン。
【図１１８Ａ】図１１８は、Ｃｙｐ２ｃクラスター交換のための方法を示す。Ａ）マウスＣｙｐ２ｃクラスターの５’ターゲティング。
【図１１８Ｂ】図１１８は、Ｃｙｐ２ｃクラスター交換のための方法を示す。Ｂ）マウスＣｙｐ２ｃクラスターの３’ターゲティング。
【図１１８Ｃ】図１１８は、Ｃｙｐ２ｃクラスター交換のための方法を示す。Ｃ）概要：Ｃｙｐ２ｃクラスターノックアウト。
【図１１９Ａ】図１１９は、Ｃｙｐ２ｄクラスター交換のための方法を示す。Ａ）マウスＣｙｐ２ｄ２６の３’ターゲティング。
【図１１９Ｂ】図１１９は、Ｃｙｐ２ｄクラスター交換のための方法を示す。Ｂ）マウスＣｙｐ２ｄクラスターの５’ターゲティング。
【図１１９Ｃ】図１１９は、Ｃｙｐ２ｄクラスター交換のための方法を示す。Ｃ）概要：Ｃｙｐ２ｄノックアウト。
【図１２０Ａ】図１２０は、ＣＹＰ１Ａノックアウトのための方法を示す。Ａ）マウスＣｙｐ１ａの５’ターゲティング。
【図１２０Ｂ】図１２０は、ＣＹＰ１Ａノックアウトのための方法を示す。Ｂ）マウスＣｙｐ１ａの３’ターゲティング。
【図１２０Ｃ】図１２０は、ＣＹＰ１Ａノックアウトのための方法を示す。Ｃ）概要：Ｃｙｐ１ａノックアウト。
【図１２１】図１２１は、ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ二重ヒト化マウス、野生型マウス、ｈｕＰＸＲマウス及びｈｕＣＡＲマウスにおけるＰＸＲ及びＣＡＲｍＲＮＡのレベルを示す。二重ヒト化マウスではヒトＰＸＲ及びＣＡＲｍＲＮＡの発現が維持される。
【図１２２】図１２２は、二重ヒト化ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウス、野生型マウス、ｈｕＰＸＲマウス及びｈｕＣＡＲマウスにおけるリファンピシン及びフェノバルビタール処理の作用を示すと共に、ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウス、野生型マウス、ｈｕＰＸＲマウス及びｈｕＣＡＲマウスにおけるＣｙｐ２ｂ１０及びＣｙｐ３ａｌｌタンパク質の基礎レベルを示す。
【図１２３】図１２３は、マウスにおけるＰＰＡＲαヒト化及びノックアウト（遺伝子型ｈｕＰＰＡＲα及びｋｏＰＰＡＲαのマウスの作出）のための可能なターゲティング戦略を示す。
【図１２４】図１２４は、マウスにおけるＡｈＲヒト化及びノックアウト（遺伝子型ｈｕＡｈＲ及びｋｏＡｈＲのマウスの作出）のための可能なターゲティング戦略を示す。
【図１２５】図１２５は、ヒト化マウス、ノックアウトマウス及び野生型マウスをＰＢ処理に曝露する実験の結果を示す。モニターする生理的作用としては、肝腫、Ｐ４５０誘導及び肝細胞増殖が挙げられる。
【図１２６】図１２６は、ＷＴマウス、ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウス及びＰＸＲＫＯ／ＣＡＲＫＯマウスにおける肝臓／身体重量比を示す。値は平均±ＳＤ（％自身対照平均（mean own control）±％ＳＤ）（ｎ＝３）で表す。結果についてＳｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定（両側）を行った（＊及び＊＊はそれぞれｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１で対照マウスとは統計的に有意差があることを示す）。
【図１２７】図１２７は、ＰＢ処理マウスにおける肝臓Ｓ期標識指数を示す。ＢｒｄＵ（１５ｍｇ／ｍＬ／ＰＢＳ）を含有する浸透圧ポンプをＷＴマウス、ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウス及びＰＸＲＫＯ／ＣＡＲＫＯマウスに埋め込んだ後、ＰＢ処理を行った（８０ｍｇ／ｋｇ／４日／ＩＰ）。Ｂｒｄｕ抗体（Ｄａｋｏ）を用いて肝臓切片を標識した。顕微鏡像は全て×４０の倍率で得た。データは、Ｐａｔ−００１３−００１４に従い、細胞（約１８万個）／マウス群を含む葉（２）当り１０個の像のランダムサンプリングを表す。値は平均±ＳＤ（ｎ＝９〜１０（対照マウス）、ｎ＝８〜９（ＰＢ処理マウス））で表す。結果についてＳｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定（両側）を行った（＊＊＊はｐ＜０．０１で対照マウスとは統計的に有意差があることを示す）。
【図１２８】図１２８は、ＰＢ処理マウスにおける肝アポトーシス指数を示す。ＴＵＮＥＬin situ細胞検出キット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて肝臓切片を標識した。顕微鏡像は全て×４０の倍率で得た。データは、細胞（約３８万個）／マウス群を含む葉（２）当り２０個の像のランダムサンプリングを表す。値は平均±ＳＤ（ｎ＝９〜１０（対照マウス）、ｎ＝８〜９（ＰＢ処理マウス））で表す。結果についてＳｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定（両側）を行ったが、統計的な有意差は見出されなかった。
【図１２９】図１２９は、対照マウス、及びＰＢで処理したＷＴマウス、ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウス及びＰＸＲＫＯ／ＣＡＲＫＯマウスから得た肝臓切片に対するＨ＆Ｅ染色を示す。門脈（Ｐ）及び中心静脈（Ｃ）を標識する。×２０の対物レンズを用いて像を得た。
【図１３０Ａ】図１３０Ａは、ＭＲＯＤアッセイによる酵素活性測定値を示す。各アッセイは、個々の肝ミクロソームに対して行った。値は平均±ＳＤ（ｎ＝９／１０）を表す。結果についてＳｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定（両側）を行った（＊、＊＊及び＊＊＊はそれぞれ、ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、ｐ０．００１で自身対照マウスとは統計的な差がある）。
【図１３０Ｂ】図１３０Ｂは、ＥＲＯＤアッセイによる酵素活性測定値を示す。各アッセイは、個々の肝ミクロソームに対して行った。値は平均±ＳＤ（ｎ＝９／１０）を表す。結果についてＳｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定（両側）を行った（＊、＊＊及び＊＊＊はそれぞれ、ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、ｐ０．００１で自身対照マウスとは統計的な差がある）。
【図１３０Ｃ】図１３０Ｃは、ＢＱアッセイによる酵素活性測定値を示す。各アッセイは、個々の肝ミクロソームに対して行った。値は平均±ＳＤ（ｎ＝９／１０）を表す。結果についてＳｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定（両側）を行った（＊、＊＊及び＊＊＊はそれぞれ、ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、ｐ０．００１で自身対照マウスとは統計的な差がある）。
【図１３０Ｄ】図１３０Ｄは、ＰＲＯＤアッセイによる酵素活性測定値を示す。各アッセイは、個々の肝ミクロソームに対して行った。値は平均±ＳＤ（ｎ＝９／１０）を表す。結果についてＳｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定（両側）を行った（＊、＊＊及び＊＊＊はそれぞれ、ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、ｐ０．００１で自身対照マウスとは統計的な差がある）。
【図１３０Ｅ】図１３０Ｅは、ＢＲＯＤアッセイによる酵素活性測定値を示す。各アッセイは、個々の肝ミクロソームに対して行った。値は平均±ＳＤ（ｎ＝９／１０）を表す。結果についてＳｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定（両側）を行った（＊、＊＊及び＊＊＊はそれぞれ、ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、ｐ０．００１で自身対照マウスとは統計的な差がある）。
【図１３１Ａ】図１３１は、肝臓Ｃｙｐ２ｂｌ０及びＣｙｐ３ａｌｌタンパク質の発現に対するＰＢの作用を示す。野生型マウス、ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウス及びＰＸＲＫＯ／ＣＡＲＫＯマウスの各々から得た肝ミクロソーム（０．３ｕｇ）をプールし（ｎ＝９／１０）、Ｃｙｐ２ｂｌ０及びＣｙｐ３ａｌｌの特徴付けにはそれぞれ、ウサギポリクローナルＣＨ４（１：２０００希釈）及びＣＨ３２抗体（１：２０００希釈）を用いたイムノブロッティングを行った（Ｃ．ヘンダーソン（C. Henderson）、ダンディー大学、英国）。＋ｖｅ（対照）としては、精製した組換えｈｉｓ標識Ｃｙｐ３ａｌｌ膜（０．１ｐｍｏｌ／μＬ）又は精製した組換えｈｉｓ標識Ｃｙｐ２ｂｌ０膜（０．０１ｐｍｏｌ／μＬ）を用いた。ブロットはＥＣＬを用いて展開し、３０秒間曝露した。
【図１３１Ｂ】図１３１は、肝臓Ｃｙｐ２ｂｌ０及びＣｙｐ３ａｌｌタンパク質の発現に対するＰＢの作用を示す。野生型マウス、ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウス及びＰＸＲＫＯ／ＣＡＲＫＯマウスの各々から得た肝ミクロソーム（０．３ｕｇ）をプールし（ｎ＝９／１０）、Ｃｙｐ２ｂｌ０及びＣｙｐ３ａｌｌの特徴付けにはそれぞれ、ウサギポリクローナルＣＨ４（１：２０００希釈）及びＣＨ３２抗体（１：２０００希釈）を用いたイムノブロッティングを行った（Ｃ．ヘンダーソン（C. Henderson）、ダンディー大学、英国）。＋ｖｅ（対照）としては、精製した組換えｈｉｓ標識Ｃｙｐ３ａｌｌ膜（０．１ｐｍｏｌ／μＬ）又は精製した組換えｈｉｓ標識Ｃｙｐ２ｂｌ０膜（０．０１ｐｍｏｌ／μＬ）を用いた。ブロットはＥＣＬを用いて展開し、３０秒間曝露した。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【０２５４】
実施例１：ヒト化ＰＸＲ／ＣＡＲマウス
この方法によって、ＰＸＲやＣＡＲのみをヒト化したマウス、又は各遺伝子を二重ヒト化したマウスが得られる（図１参照）。本発明者らは、従来の繁殖によるものではなく、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の段階的形質転換による様々なヒト化を組合せたため、ＰＸＲ／ＣＡＲ二重ヒト化ＥＳ細胞を作出することができる。この細胞は、引き続き行う第１相又は第２相薬物代謝酵素をコードするＤＮＡ配列や薬物輸送タンパク質をコードするヒトＤＮＡ配列による改変に用いることができる。
【０２５５】
ＰｈｉＣ３１組換え部位の適用により、ヒト化マウスをＰｈｉ３１欠失株と交雑させることによって両方の遺伝子をノックアウトすることができる。
【０２５６】
既存のモデルとは対照的に、本発明者らは「ノックイン」アプローチを用いて内在性遺伝子をそのヒトオルソログで置換する（図２及び３）。従って、ＰＸＲ及びＣＡＲ遺伝子はその正常なゲノムコンテクスト及び発現レベルの下で維持され、転写物の分布は有利に生理学的に調節又は制御される。この結果、本発明のモデルは、先行技術の試みに比べてヒトの状態に酷似するようになる。
【０２５７】
更に、本発明の構築物内ではヒト遺伝子のゲノム構造が少なくとも部分的に保存されている。ＰＸＲの場合、本発明者らはｃＤＮＡとゲノム配列との複合構築物を用いた（図２参照）。ヒトＰＸＲ遺伝子のサイズは３５ｋｂ超と大きいため、４と６との間のイントロン−エクソン構造のみを保持したが、これは、このゲノム領域がリガンド結合ドメイン内に位置するために、このゲノム領域で多くのスプライスバリアントが見られるからである。ヒトＣＡＲのサイズは比較的小さい（エクソン２〜９由来の約７ｋｂ）ため、ターゲティングベクター内で全ゲノム構造を保持することができた（図３）。
【０２５８】
薬物代謝酵素（第１相及び第２相）及び／又は薬物輸送タンパク質を調節するヒト遺伝子を用いて、ヒト化ＰＸＲ及び／又はＣＡＲを含むＥＳ細胞を更に改変することができる。ヒト化ＰＸＲ／ＣＡＲを有するマウス細胞を後述のＨＲＮマウスと交雑したり、上述の基準全てを満たす新しい非ヒトトランスジェニック動物を作出することができる。
【０２５９】
実施例２：ＨＲＮ（商標）マウス
全てのＰ４５０は、酵素シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）による供給電子の減少を必要とする。従って、ＣＰＲが欠失すると、同時にＰ４５０全てが不活性化される。ＣＰＲの欠失は胚において致命的であるが、ＨＲＮ（商標）マウスは、出生後肝細胞を標的とした発達的に調節される条件的ＣＰＲ欠失を用いる。従って、ＨＲＮ（商標）マウスは成体期まで生存し、肝Ｐ４５０による代謝が完全に不足しているにも関わらず繁殖することができる（Henderson CJ et al., J Biol Chem. 278: 13480-6, 2003）。従って、ＨＲＮ（商標）マウスによって、Ｐ４５０をヒト化するためにヒトＰ４５０活性を発現させる好適なバックグラウンドが得られる。
【０２６０】
トランスジェニックマウスの作出
アデノウイルスベクターを用いてヒトＰ４５０／ＣＰＲの組合せをＨＲＮ（商標）細胞に導入することができる。或いは、同じ導入遺伝子を組み込んだ生殖系列トランスジェニックマウスを作出することができる。これは先ず、選択されたＣＹＰ３Ａ４／ＣＰＲヒト化導入遺伝子を組み込んだトランスジェニックマウスを作出し、次にこのマウスをＨＲＮ（商標）マウスと交雑してＣＹＰ３Ａ４ヒト化マウスを作出することによってなされる。ＣＹＰ３Ａ４／ＣＰＲトランスジェニックマウスの作出は、胚性幹細胞の標的トランスフェクションとそれに続く胚盤胞注入によってなされる。ＣＹＰ３Ａ４／ＣＰＲトランスジェニックマウスをＨＲＮ（商標）マウスと交雑してＰ４５０ヒト化マウスを作出することによって多重Ｐ４５０ヒト化マウスを作出することができる。或いは、ＣＰＲ遺伝子にｌｏｘＰ部位が隣接し、標的ヒトＰ４５０及びＣＰＲの発現配列又はヒトＰ４５０−ＣＰＲ融合タンパク質の発現配列が導入された胚性幹細胞を作出することができる。次に、このような胚性幹細胞に由来するマウスを、様々なプロモーターの制御下でｃｒｅリコンビナーゼを発現する各種マウス株と交雑し、ｃｒｅリコンビナーゼ発現を制御するプロモーターの組織特異性や誘導能に応じて様々な組織又は様々な誘導条件下でヒト化Ｐ４５０を有する子孫を作出することができる。
【０２６１】
ヒト化戦略
ＨＲＮ（商標）細胞で機能性ヒトＰ４５０活性を発現させる最適な方法を確立するため、別々の細胞質Ｐ４５０を有する標的ＣＰＲや標的融合タンパク質、細胞質融合タンパク質をコードする実験導入遺伝子を比較し、評価する。いずれの場合にも、これらの選択肢を適切な細胞培養系で発現させた後、ＨＲＮ（商標）マウスのアデノウイルストランスフェクションによりin vivoで試験することによってＰ４５０がＣＰＲ成分と相互作用する能力を確認する。
【０２６２】
実施例３：ヒト化計画
タイプ１：ヒトｃＤＮＡの対応するマウスプロモーターからの発現
計画：ＭＤＲ１のヒト化
方法：標準的な分子クローニング手順によってターゲティングベクターを構築する。このベクターは、ヒトＭＤＲ１のｃＤＮＡが対応するマウス遺伝子（Ｍｄｒ１ａ及びＭｄｒ１ｂ）の翻訳開始部位に融合されるようにデザインする。Ｍｄｒ１ａターゲティングベクターはＦＲＴ隣接ハイグロマイシン耐性カセットを有し、Ｍｄｒ１ｂターゲティングベクターはＦ３隣接ネオマイシン耐性カセットを有する。両方の場合において、転写物はポリＡモチーフによって終結する。Ｍｄｒ１ａの場合、ターゲティングイベントによってエクソン２の３’部分が除去され、Ｍｄｒ１ｂの場合、エクソン２〜エクソン４の３’部分が欠失する。図４及び５を参照。
【０２６３】
Ｃ５７ＢＬ／６ＮマウスＥＳ細胞での標準的なエレクトロポレーションの連続する２ラウンドにおいて、両方のマウス遺伝子を相同的組換えによって改変する。トランスフェクションの各ラウンドに由来するクローンをＧ４１８及びハイグロマイシンでそれぞれ選択し、陽性クローンをサザンブロット解析によって同定する。標準的な操作手順に従って、選択したクローンを拡大し、ＢＡＬＢｃ胚盤胞に注入し、フォスターマザー（foster mothers）に導入する。このフォスターマザーの同腹仔を目視検査し、体毛色によってキメリズムを確認する。高キメラマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ遺伝的バックグラウンドにおいて更なる繁殖に用いる。選択マーカーは、ＦＬＰ欠失株との交雑によってin vivoで除去する。
【０２６４】
タイプ２：マウス遺伝子とヒトｃＤＮＡとの融合物の対応するマウスプロモーターからの発現
計画：ＭＲＰ２のヒト化
方法：標準的な分子クローニング手順によってターゲティングベクターを構築する。このベクターは、エクソン１によってコードされるマウスタンパク質の「リーダー配列」が保持されるようにデザインする。エクソン１に由来する配列を有しないヒトｃＤＮＡをエクソン２に導入する。マウスイントロン１の本来のスプライス部位を保持し、この構築物がマウスエクソン１及びヒトエクソン２〜３２に由来するアミノ酸の融合タンパク質を潜在的にコードするようにする。転写物はポリＡモチーフによって終結する。ターゲティングベクターはＦＲＴ隣接ネオマイシン耐性カセットを有する（図６参照）。
【０２６５】
ターゲティングベクターを標準的なエレクトロポレーションによってＣ５７ＢＬ／６ＮマウスＥＳ細胞にトランスフェクトする。クローンをＧ４１８で選択し、陽性クローンをサザンブロット解析によって同定する。標準的な操作手順に従って、選択したクローンを拡大し、ＢＡＬＢｃ胚盤胞に注入し、フォスターマザーに導入する。このフォスターマザーの同腹仔を目視検査し、体毛色によってキメリズムを確認する。高キメラマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ遺伝的バックグラウンドにおいて更なる繁殖に用いる。選択マーカーは、ＦＬＰ欠失株との交雑によってin vivoで除去する。
【０２６６】
タイプ３：ヒトｃＤＮＡとゲノム配列とのハイブリッドの対応するマウスプロモーターからの発現
計画：ＰＸＲのヒト化
方法：標準的な分子クローニング手順によってターゲティングベクターを構築する。このベクターは、ヒトＰＸＲｃＤＮＡとゲノム配列とのハイブリッドがマウスＰＸＲ遺伝子の翻訳開始部位に融合されてマウスの開始ＡＴＧが保持されるようにデザインする。ヒトＰＸＲ配列は、エクソン１〜４のｃＤＮＡと、イントロン４、エクソン５及びイントロン５のゲノム配列と、エクソン６〜９のｃＤＮＡとを含む。このヒトＰＸＲ配列は本明細書の配列番号１に示す。転写物はポリＡモチーフによって終結する。ターゲティングベクターはＦＲＴ隣接ハイグロマイシン耐性カセットと、選択カセットに対するスプライス受容体ポリＡモチーフ３’とを有する。更に、スプライス受容体ポリＡモチーフに対するマウスイントロン１及び３’にａｔｔ部位を挿入したが、これによって、部位特異的Ｐｈｉ−Ｃ３１リコンビナーゼを用いた中間配列の除去によるＰＸＲノックアウトの作出が可能となる（図７参照）。
【０２６７】
ターゲティングベクターを標準的なエレクトロポレーションによってＣ５７ＢＬ／６ＮマウスＥＳ細胞にトランスフェクトする。クローンをハイグロマイシンで選択し、陽性クローンをサザンブロット解析によって同定する。標準的な操作手順に従って、選択したクローンを拡大し、ＢＡＬＢｃ胚盤胞に注入し、フォスターマザーに導入する。このフォスターマザーの同腹仔を目視検査し、体毛色によってキメリズムを確認する。高キメラマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ遺伝的バックグラウンドにおいて更なる繁殖に用いる。選択マーカーは、ＦＬＰ欠失株との交雑によってin vivoで除去する。
【０２６８】
マウスＰＸＲ遺伝子がヒトカウンターパートと交換されたことの確認
ＰＸＲヒト化マウスを上述の戦略を用いて作出したが、該マウスは目視検査の結果、表現型が正常である。ＰＣＲを用いて該マウスをタイピングした（図１５参照）。該マウスは少なくとも３月齢まで生存する。その例としては、雄「３０６４３」（出生日２００４年１２月１２日、２００５年４月１９日時点で生存中）、及び雌「３０７９２」（出生日２００４年１２月１９日、２００５年４月１９日時点で生存中）が挙げられる。これらのマウスをうまく交配することができる。
□  ２００４年２月１日、３０６４３×３０７９２セットアップ
□  ２００５年２月２２日同腹仔出生−６匹−２００５年３月３０日離乳
□  ２００５年４月６日同腹仔出生−７匹−離乳未定
【０２６９】
更なるタイピングはＴａｑｍａｎ(登録商標）解析を用いて行った（図１６参照）。この解析から、野生型マウスのみにマウスＰＸＲ転写物が存在し、トランスジェニックマウス系列（lines）のみにヒト転写物が存在することが明示されたが、これによって、遺伝子交換が生じ、遺伝子構築物が正しい組織で活発に転写されたことが分かった。
【０２７０】
次に、ＲＴ−ＰＣＲを行い、ヒト化マウスに全長ヒトＰＸＲ転写物が存在することを確認した（図１７参照）。この解析から、サイズが１．３キロ塩基対及び１．１キロ塩基対の２種類の転写物の存在が示されたが、これによって、ヒト化ＰＸＲ遺伝子全体が転写されたことが分かる。得られた断片のサイズから、正しい（correct）スプライスバリアントと共に選択的スプライスバリアントが存在することが分かった。
【０２７１】
全長転写物の配列解析によって、ＰＸＲｍＲＮＡ全体のオープンリーディングフレームが産生されたことを確認した。次に、マウスＰＸＲに対して産生された抗体を用いたウェスタンブロット解析によってＰＸＲの存在を確認した。
【０２７２】
ヒトＰＸＲが機能的であることの証明
ヒトＰＸＲタンパク質が機能的であることを実証するため、プレグネノロン−１６αカルボニトリル（ＰＣＮ）やデキサメタゾン、ＴＣＰＯＢＯＰ、リファンピシン（Ｒｉｆ）等のＰＸＲ活性化化合物をマウスに投与した。リファンピシンはヒトにおいてより強力なＰＸＲ誘導剤であることが報告されている一方、デキサメタゾンやＰＣＮはマウスにおいてより強力な誘導剤であることが報告されている。従って、これらの誘導剤によって、本発明の非ヒト動物、組織及び細胞のＰＸＲ表現型を区別することができる。
【０２７３】
投与溶液の調製は投与日に行い、必要量の試験物質にコーン油を添加し撹拌して溶液又は微細懸濁液（fine suspension）を得た。供給物質中のＰＣＮ濃度は１０ｍｇ／ｍＬ、Ｒｉｆ濃度は２．５ｍｇ／ｍＬで、純度の補正は行わなかった。調製の記録を残した。
【０２７４】
対照マウスに対しては媒体（コーン油）を毎日腹腔内投与した。投与した媒体及び誘導剤溶液の量は１０ｍＬ／ｋｇ体重であった。この投与経路は、先に公表された研究との一貫性を保つように選択した。
【０２７５】
マウスに４日間投与し、最終投与から約２４時間後に殺した。
【０２７６】
マウスサンプル全ての肝ミクロソーム中のＣｙｐ３ａ１１、Ｃｙｐ２ｂ１０及びＰＸＲタンパク質の定量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティングによって行った。マウス及びヒトＰＸＲタンパク質を検出するため、抗体（ＲＦ８）を用いた。Ｃｙｐ３ａ及びＣｙｐ２ｂを同定するため、抗ｃｙｐ２ｂ抗体（ＣＨ３２及びＣＨ４）をぞれぞれ用いた。結果を図１８に示す。
【０２７７】
このデータから、野生型マウス及びヒト化ＰＸＲマウスの両方で正しい分子量のタンパク質が同定されたことが分かった。この２種類のタンパク質の分子量は同じであることが示されたが、これは、予測されるアミノ酸配列から計算した分子量と一致する。また、興味深いことには、野生型マウス（the murine）とヒト化マウスのＰＸＲの発現レベルが酷似しており、これは、同じプロモーターによって発現が開始する（driven off）という事実と一致する。
【０２７８】
シトクロムＰ４５０  Ｃｙｐ３ａ遺伝子ファミリー内のＰＸＲ誘導性タンパク質の解析によって、ヒト化ＰＸＲマウスにおける顕著な誘導が示された（図１９参照）。興味深いことに、シトクロムＰ４５０  Ｃｙｐ２ｂ１０はこの処理では顕著に誘導されなかったが、このことから、この誘導がＰＸＲタンパク質を経由するものであって他の転写因子、即ち、構成的アンドロスタン受容体（ＣＡＲ）によるものではないことが分かる。この実験において、野生型マウスではＣｙｐ３ａ１１もリファンピシンによって誘導された。リファンピシンはＰＸＲと相互作用する能力において種差を示すことが報告されているが、ここで差が見られなかったという事実は高用量の化合物を用いたことで説明されるであろう。
【０２７９】
酵素活性アッセイ
肝ミクロソームに対する酵素活性アッセイによって、ウェスタンブロット結果を確認することができた。ペントキシレゾルフィン−Ｏ−脱エチル化（ＰＲＯＤ）における活性はＣｙｐ２ｂ１０の発現レベルに起因し、７−ベンジルオキシキノリン（ＢＱ）の活性はＣｙｐ３ａの発現レベルに起因する。リファンピシンによるＣｙｐ３ａ及びＣｙｐ２ｂ誘導についての酵素活性データは図２０に示す。
【０２８０】
低用量のリファンピシン及びＴＣＰＯＢＯＰを用いたｈｕＰＸＲマウスにおける誘導研究
野生型マウスとｈｕＰＸＲマウスとの系統差を実証するため、マウスに対して低用量のリファンピシン又はＴＣＰＯＢＯＰを投与した。このような化合物を選択した理由としては、リファンピシンの場合、マウス転写因子に比べてより効率的なヒトＰＸＲの誘導剤であることが報告されているからであり、また、ＴＣＰＯＢＯＰの場合、シトクロムＰ４５０遺伝子発現の誘導剤としてヒト系よりもマウスにおいてより効率的であることが報告されているからである。
【０２８１】
研究は各群３匹のマウスで行った。対照群はコーン油で毎日４日間処理したマウス又はコーン油を単回投与したマウスで構成した。処理群のマウスに対しては、表３．１に詳述するように誘導剤を投与した。
【０２８２】
【表７】
2010528644.tif 000008
【０２８３】
ＰＸＲ活性は、様々なシトクロムＰ４５０酵素により様々な程度代謝される複数のシトクロムＰ４５０基質の代謝を測定することによって求めた。次のアッセイを行った。
・肝ミクロソーム内で７−ベンジルオキシキノリン（ＢＱ）活性を求めた。
・肝ミクロソーム内でテストステロンヒドロキシラーゼ活性を求めた（ＬＭＳ  ＨＰＬＣ−００６）。
・これらの反応の比活性は、ローリー法によって求めたｍｇタンパク質当りの値で表わした（ＬＭＳ  Ｓｐｅｃ−０００１）。
【０２８４】
第１の実験では７−ベンジルオキシキノリンを基質として用いた。リファンピシン処理マウスにおいて、第１の例では、野生型とヒト化ＰＸＲマウスとの間でバックグラウンドＣＹＰ３Ａ酵素活性に明らかな差があった（図２１）。また、この酵素活性はリファンピシンによって誘導可能ではなかったが、用量３ｍｇ／ｋｇにおいて野生型とヒト化ＰＸＲマウスとの間で酵素活性に顕著な差があった。
【０２８５】
次の実験においては、野生型及びｈｕＰＸＲマウス由来の肝ミクロソーム画分内でテストステロンヒドロキシル化を測定した。興味深いことに、用量１０ｍｇ／ｋｇの場合、野生型マウスにおいてはテストステロンの６−β−ヒドロキシル化の誘導がない一方で、ヒトＰＸＲマウスにおいてはかなりの誘導があったが、このことから、野生型と比べてヒトＰＸＲマウスのリファンピシンに対する感受性が変化したことが分かる（図２２）。
【０２８６】
７−ベンジルオキシキノリン脱メチル化の場合と同様に対照において高い活性を示したテストステロンの１６−β−ヒドロキシル化の測定についても同様の知見が得られた（図２３）。この活性についても、ｈｕＰＸＲマウスでは誘導されたが野生型では誘導されなかった。実際に、ｈｕＰＸＲマウスでは活性が約３倍であった。
【０２８７】
テストステロンの２−α−ヒドロキシル化においても同様の知見が得られた。また、リファンピシンによるＣｙｐ３ａ１１の誘導から、ｈｕＰＸＲがｈｕＰＸＲマウスにおいて機能的に活性であることが分かる。
【０２８８】
誘導剤ＴＣＰＯＢＯＰを用いた実験においても、テストステロンの肝ミクロソーム代謝を測定した。この場合にも、野生型とｈｕＰＸＲマウスとの間には明らかな差が見られた。特に、テストステロンの７−α−ヒドロキシル化については、野生型と比べてｈｕＰＸＲマウスでは構成的に高かった（図２４）。
【０２８９】
テストステロンの６−β−ヒドロキシル化については両方のマウス系で誘導可能であった。野生型とｈｕＰＸＲマウスとの間で有意差はなかったが、ここでもヒトＰＸＲが活性であることが分かる（図２５）。
【０２９０】
野生型とヒトＰＸＲとの系統差に合致して、ＴＣＰＯＢＯＰによる誘導に対するマウス系の感受性においては顕著な差があった。テストステロンの１６−α−ヒドロキシル化の場合、この活性は野生型マウスでは有意に誘導されたが、ｈｕＰＸＲマウスでは誘導されなかった。特に興味深いのは、テストステロンの１６−β−ヒドロキシル化の誘導が、ｈｕＰＸＲマウスに比べて野生型で遥かに顕著に見られたことである（図２６及び図２７をそれぞれ参照のこと）。実際に用量１ｍｇ／ｋｇの場合、テストステロンの１６−β−ヒドロキシル化の誘導は野生型マウスでは約６倍であったが、ｈｕＰＸＲマウスでは１．７倍にすぎなかった。ここでも、対照に比べてヒト化マウスの感受性が低下したことが分かる。
【０２９１】
ｈｕＰＸＲマウスにおけるリファンピシン誘導プロファイルについての更なる検討
リファンピシン（Ｒｉｆ）投与に対するｈｕＰＸＲマウスの反応を、誘導研究において野生型マウスと更に比較した。野生型マウス及びｈｕＰＸＲマウスに対しリファンピシンの量を増加させて（０、３、１０、２０、４０、６０ｍｇ／ｋｇマウス体重）投与した（図２９）。各用量についての観察を三重で行った（即ち、各用量を３匹のマウスに投与した）。
【０２９２】
Ｃｙｐ３ａ１１発現の定量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとそれに続くウェスタンブロッティング及び濃度測定によって行った（図２９）。ｈｕＰＸＲマウスと野生型マウスとの間には明らかな差が見られた。野生型マウスに比べてｈｕＰＸＲマウスにおいては、低用量のリファンピシンでＣｙｐ３ａ１１タンパク質発現の誘導が明らかに増加し始めた。
【０２９３】
この結果は、リファンピシンで処理したｈｕＰＸＲマウス及び野生型マウスにおけるＢＱ活性測定（Ｃｙｐ３ａ１１についてのアッセイ）と一致する。即ち、ＢＱアッセイにおいては、野生型マウスの場合と比べて、ｈｕＰＸＲマウスで生成する７−ＨＱ産物の量がリファンピシンの用量増加に伴って急速に増加した（図２９）。
【０２９４】
リファンピシンに関するこれらの結果は、ｈｕＰＸＲマウスにおけるＣｙｐ３ａ１１誘導のヒト化が成功したことと一致する。
【０２９５】
ｈｕＰＸＲマウスにおけるデキサメタゾン誘導プロファイルについての検討
デキサメタゾン投与に対するｈｕＰＸＲマウスの反応を、誘導研究において野生型マウスと比較して評価した。野生型マウス及びｈｕＰＸＲマウスに対しデキサメタゾンの量を増加させて（０、１、３、１０ｍｇ／ｋｇマウス体重）投与した（図３０）。
【０２９６】
Ｃｙｐ３ａ１１発現の測定は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとそれに続くウェスタンブロッティングによって行った（図３０）。ｈｕＰＸＲマウスと野生型マウスとの間には明らかな差が見られた。野生型マウスにおいてのみデキサメタゾンの用量増加によってＣｙｐ３ａ１１発現が誘導された（即ち、ｈｕＰＸＲマウスにおいては誘導されなかった）。
【０２９７】
この結果は、デキサメタゾンで処理したｈｕＰＸＲマウス及び野生型マウスにおけるＢＱ活性測定（Ｃｙｐ３ａ１１についてのアッセイ）と一致する。ＢＱアッセイにおいては、ｈｕＰＸＲマウスで生成する７−ＨＱ産物の量が、野生型マウスにおいてのみデキサメタゾンの用量に応じて増加したが、ｈｕＰＸＲマウスでは増加しなかった（図３０）。
【０２９８】
リファンピシンに関して得られた誘導プロファイル（上述参照）と共に、これらの結果によって、ｈｕＰＸＲマウスにおいてＰＸＲヒト化が達成されたことが更に確認された。
【０２９９】
これは、ヒトＰＸＲ遺伝子と内在性マウスタンパク質を交換したマウスモデルの最初の報告である。他のＰＸＲヒト化マウスと比べてこのようなモデルの利点は次の事実にある。
・構築物を用いて検討を行い、ＰＸＲ発現レベルを制御する上でのＰＸＲの選択的スプライシングの役割を把握することができる。
・内在性遺伝子と同様に全ての組織で内在性マウスプロモーターＰＸＲの使用が発現する。
・ＰＸＲ発現のレベルが内在性遺伝子と酷似するようであり、従って、潜在的な過剰発現／低発現に伴う問題が減少する。
・現在入手可能なヒト化ＰＸＲモデルでは、アルブミンプロモーターを用いて、ＰＸＲヌルバックグラウンドにクロスしたヒトＰＸＲを作動させている。従って、ＰＸＲはこのようなモデルでは非常に高いレベルで発現するが、肝臓以外のいずれの組織にもＰＸＲは存在しない。このことは、消化管や血液脳関門、或いは実際に他の組織で遺伝子発現を制御するｈＰＸＲの役割を把握するためにこのようなモデルを使用する上で大幅に妥協することになる。
【０３００】
ヒト化ＰＸＲマウスは多くの有用性を有する。例えば、このようなマウスを用いて、マウス組織における遺伝子発現の制御に関するヒトＰＸＲの役割を把握することができる。また、ヒト化ＰＸＲマウスを用いて、開発中の薬物や環境化学物質が有益又は有害となり得るようにヒトＰＸＲ機能を調節する能力を有するかどうか評価することもできる。また、このモデルによって、例えば、胆汁酸ホメオスタシスの撹乱によって生じ得る薬物や化学物質の潜在的毒性作用、ひいてはそのヒトとの関係を仲介する上でのヒトＰＸＲの役割を把握するための検討を行うこともできる。また、このモデルを用いて、この情報伝達経路に拮抗的又は作用的となり得る化学物質を評価することもできる。
【０３０１】
ｋｏＰＸＲマウス
野生型マウス及びｋｏＰＸＲマウスにおけるＰＸＲｍＲＮＡのＴａｑＭａｎ(登録商標）解析（いずれの場合も、ＰＸＲ誘導薬の非存在下、１０ｍｇ／ｋｇのデキサメタゾン投与後に行った）によって、ｋｏＰＸＲマウスにおいてはＰＸＲｍＲＮＡの発現が完全に消失したことが確認された（図３１）。
【０３０２】
ｈｕＰＸＲ系及びｋｏＰＸＲ系についての更なる検証
本発明者らは更に実験を多数行い、ｈｕＰＸＲマウス及びｋｏＰＸＲマウスについて機能的な検証（functional validation）を行った。
【０３０３】
ｈｕＰＸＲ系及びｋｏＰＸＲ系における遺伝子発現のマイクロアレイ解析
毒物学的に関連する経路における遺伝子発現に対するＰＸＲノックアウト及びヒト化の作用をマイクロアレイ解析によって評価した。ｋｏＰＸＲマウスの肝臓でアップレギュレートされた遺伝子の多くは、毒物学的に関連する経路に関与する遺伝子であることが分かった。ｋｏＰＸＲマウスでアップレギュレートされた遺伝子の多くは、ｈｕＰＸＲマウスにではそのアップレギュレーションが逆であった。
【０３０４】
マイクロアレイデータを次の表にまとめる。表中、空白のセルは遺伝子発現が変化しなかったことを示し、灰色のセルは遺伝子発現が１．５倍未満だけ変化したことを示す。また、負の数はダウンレギュレートされた発現を示し、正の数はアップレギュレートされた発現を示す。
【０３０５】
【表８】
2010528644.tif 000009
【０３０６】
ｈｕＰＸＲ系、ｋｏＰＸＲ系及び野生型系におけるリファンピシンの作用
野生型マウス、ｈｕＰＸＲマウス又はｋｏＰＸＲマウスに対してリファンピシンを投与（６０ｍｇ／ｋｇ体重）した際、Ｃｙｐ３ａ１１の発現は野生型マウス及びｈｕＰＸＲマウスの両方で増加したが、ｋｏＰＸＲマウスでは増加しなかった。実験は三重で行った。Ｃｙｐ３ａ１１発現レベルはＳＤＳ−ＰＡＧＥとそれに続くウェスタンブロッティングによって測定した。ウェスタンブロッティング実験のプールした結果と個別化した結果の両方を図３２に示す。
【０３０７】
これらの結果はＢＱ脱アルキル化アッセイの結果と一致する。このアッセイはリファンピシン処理後、ウェスタンブロッティング実験と並行して行ったが、これによって、野生型マウスとｈｕＰＸＲマウスとｋｏＰＸＲマウスとの間には対応する顕著な差が見られた（図３２）。このＢＱアッセイにおいては、リファンピシン投与により、ｋｏＰＸＲ（ＰＸＲ  ＫＯ）株ではごく最少量の７−ヒドロキシキノリンが生成し、ｈｕＰＸＲでは中程度量の７−ヒドロキシキノリンが生成した。ＢＱ脱アルキル化は、ｈｕＰＸＲやｋｏＰＸＲに比べて野生型においてより強く誘導された。これらの結果から、リファンピシン用量が低い場合に野生型マウスとｈｕＰＸＲマウスとｋｏＰＸＲマウスとの間におけるＣｙｐ３ａ１１誘導プロファイルの差が如何に容易に識別できるかが分かる（図３０参照）。
【０３０８】
Ｃｙｐ３ａ１１に関する上述の結果とは対照的に、Ｃｙｐ２ｂ１０の発現や活性は、野生型マウス及びｈｕＰＸＲマウスのいずれにおいてもリファンピシン処理によって誘導されなかった（図３３）。
【０３０９】
ｈｕＰＸＲ系、ｋｏＰＸＲ系及び野生型系におけるデキサメタゾンの作用
野生型マウス、ｈｕＰＸＲマウス又はｋｏＰＸＲマウスに対してデキサメタゾン（Ｄｅｘ）を投与（６０ｍｇ／ｋｇ体重）した際、Ｃｙｐ３ａ１１の発現は野生型マウスでは実質的に増加し、ｈｕＰＸＲマウスでは幾分少なく増加し、ｋｏＰＸＲマウスではごく僅かに増加した。実験は三重で行った。Ｃｙｐ３ａ１１発現レベルはＳＤＳ−ＰＡＧＥとそれに続くウェスタンブロッティングによって測定した。ウェスタンブロッティング実験のプールした結果と個別化した結果の両方を図３４に示す。
【０３１０】
更なる実験においては、野生型マウス及びｈｕＰＸＲマウスに対しデキサメタゾンの量を増加させて（０、１、３、１０及び３０ｍｇ／ｋｇ体重）投与した。その結果を図８４に示す。ＰＸＲヒト化マウスにおいては、Ｃｙｐ３ａ１１の誘導は明らかに有意に弱かった。
【０３１１】
これらの結果はＢＱ脱アルキル化アッセイの結果と一致する。このアッセイはデキサメタゾン処理後、ウェスタンブロッティング実験と並行して行ったが、これによって、野生型マウスとｈｕＰＸＲマウスとＰＸＲマウスとの間には対応する顕著な差が見られた（図３４）。このＢＱアッセイにおいては、デキサメタゾン投与の際、ｋｏＰＸＲ（ＰＸＲ  ＫＯ）株では７−ヒドロキシキノリンの生成が見られなかったが、ｈｕＰＸＲ株では中程度の７−ヒドロキシキノリンの生成が見られた。野生型ではデキサメタゾンによってＢＱ脱アルキル化が最も強く誘導された。これらの結果は独立した反復実験によって確認した（図３５）。
【０３１２】
ウェスタンブロッティングから、野生型マウス、ｈｕＰＸＲマウス及びｋｏＰＸＲマウスではデキサメタゾン投与（６０ｍｇ／ｋｇ）後にＣｙｐ２ｂ１０が誘導されることが分かった（図３４にプールした結果と個別化した結果の両方を示す）が、対応する結果がＰＲＯＤ活性アッセイによって得られた（図３４）。
【０３１３】
ｈｕＰＸＲマウス、ｋｏＰＸＲマウス及び野生型マウスにおける肝毒性の評価
リファンピシン又はデキサメタゾンの投与後、肝毒性指標の評価によって種特異的差異が明らかになった。デキサメタゾンの投与後、マウス血漿中のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルは、ｈｕＰＸＲマウスでは約２２倍増加し、ｋｏＰＸＲマウスでは約４０倍増加したが、野生型マウスでは増加が見られなかった（図３６）。これらの結果は、ｋｏＰＸＲやｈｕＰＸＲにおいてマウスＰＸＲ介在によるデキサメタゾン代謝がないことに因る肝毒性作用に起因していると思われる。１匹のデキサメタゾン処理ｈｕＰＸＲマウスが実験終了前に死亡した。
【０３１４】
これに対し、リファンピシン処理によってはＡＬＴレベルは増加しなかった（図３６）。
【０３１５】
図３６においては、同用量のデキサメタゾンで得たＢＱ脱メチル化活性アッセイの結果を比較のために示す（黒棒：非処理対照、白棒：６０ｍｇ／ｋｇデキサメタゾン）。
【０３１６】
野生型マウス、ｈｕＰＸＲマウス及びｋｏＰＸＲマウスの肝臓／身体重量比をリファンピシン又はデキサメタゾン投与後に測定した。いずれの薬物の場合においても、肝臓／身体重量比はｋｏＰＸＲ株において最も高かった（図３７）。
【０３１７】
図３８は、野生型マウス、ｈｕＰＸＲマウス及びｋｏＰＸＲマウスにおけるＣｙｐ３ａ１１及びＣｙｐ２ｂ１０の発現に対するリファンピシン及びデキサメタゾン（各６０ｍｇ／ｋｇ）の作用についてのまとめである。
【０３１８】
タイプ４：ヒトゲノム配列の対応するマウスプロモーターからの発現
計画：ＣＡＲのヒト化
方法：標準的な分子クローニング手順によってターゲティングベクターを構築する。このベクターは、ゲノムヒトＣＡＲ配列がマウスＣＡＲ遺伝子の翻訳開始部位に融合されるようにデザインする。ヒトＣＡＲ配列は、５’及び３’ＵＴＲ（これらはマウスゲノムから保持されている）を除く、エクソン１〜９から成るゲノム配列全てを含む。このヒトＣＡＲ配列は本明細書の配列番号４に示す。マウスＣＡＲ遺伝子のコード配列の他の部分は全て欠失させる。転写物はポリＡモチーフによって終結する。ターゲティングベクターはＦＲＴ隣接ネオマイシン耐性カセットを有する。更に、選択マーカーに対するヒトイントロン２及び３’にａｔｔ部位を挿入したが、これによって、部位特異的Ｐｈｉ−Ｃ３１リコンビナーゼを用いた中間配列の除去によるＣＡＲノックアウトの産生が可能となる（図８参照）。
【０３１９】
ターゲティングベクターを標準的なエレクトロポレーションによってＰＸＲヒト化Ｃ５７ＢＬ／６ＮマウスＥＳ細胞にトランスフェクトする。クローンをハイグロマイシンで選択し、陽性クローンをサザンブロット解析によって同定する。標準的な操作手順に従って、選択したクローンを拡大し、ＢＡＬＢｃ胚盤胞に注入し、フォスターマザーに導入する。このフォスターマザーの同腹仔を目視検査し、体毛色によってキメリズムを確認する。高キメラマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ遺伝的バックグラウンドにおいて更なる繁殖に用いる。選択マーカーは、ＦＬＰ欠失株との交雑によってin vivoで除去する。
【０３２０】
ターゲティングベクターを標準的なエレクトロポレーションによってＣ５７ＢＬ／６ＮマウスＥＳ細胞にトランスフェクトする。クローンをハイグロマイシンで選択し、陽性クローンをサザンブロット解析によって同定する。標準的な操作手順に従って、選択したクローンを拡大し、ＢＡＬＢｃ胚盤胞に注入し、フォスターマザーに導入する。このフォスターマザーの同腹仔を目視検査し、体毛色によってキメリズムを確認する。高キメラマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ遺伝的バックグラウンドにおいて更なる繁殖に用いる。選択マーカーは、ＦＬＰ欠失株との交雑によってin vivoで除去する。
【０３２１】
ｋｏＣＡＲマウス
上述のように、スプライスアクセプターポリＡモチーフ（ａｔｔＰ５０）に対しマウスのイントロン１（ａｔｔＢ５３）及び３’にａｔｔ部位を挿入することによってＣＡＲノックアウトマウスを作出することができるが、本明細書においてはｋｏＣＡＲやＣＡＲ  ＫＯ等のように互いに交換可能に示す。このようなノックアウトマウスを作出するために、部位特異的Ｐｈｉ−Ｃ３１リコンビナーゼを用いてａｔｔ部位間の配列を除去した（図６６参照）。
【０３２２】
非処理野生型マウス及びｋｏＣＡＲマウスの肝臓及び腸におけるＣＡＲｍＲＮＡのＴａｑＭａｎ(登録商標）解析によって、ｋｏＣＡＲマウスにおいてはＣＡＲｍＲＮＡの基礎発現が完全に消失したことが確認された（図３９）。
【０３２３】
ｋｏＰＸＲマウス及びｋｏＣＡＲマウスの機能的検証
野生型マウス、ｋｏＣＡＲマウス及びｋｏＰＸＲマウス（非処理マウス、及びデキサメタゾン又はフェノバルビタールで処理したマウス）の肝臓／身体重量比を図４０に示す。同種マウスにおいては、血漿中のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベル、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）レベル及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）レベルも測定した（図４０参照）。試験したデキサメタゾン及びフェノバルビタールの用量では野生型マウス、ｋｏＰＸＲマウス又はｋｏＣＡＲマウスにおいて肝毒性は検出されなかった。いずれの化合物も４０ｍｇ／ｋｇで投与した。
【０３２４】
野生型マウス、ｋｏＣＡＲマウス及びｋｏＰＸＲマウス（非処理マウス、及びデキサメタゾン（４０ｍｇ／ｋｇ）又はフェノバルビタール（４０ｍｇ／ｋｇ）で処理したマウス）の肝臓におけるＣｙｐ３ａ１１及びＣｙｐ２ｂ１０の発現はウェスタンブロッティングで解析した。Ｃｙｐ２ｂ１０発現及びＣＡＲ活性を反映するペントキシレゾルフィン−Ｏ−脱エチル化（ＰＲＯＤ）活性を同種マウスにおいて解析した。これらの解析結果を図４１に示す。ｋｏＣＡＲマウスにおいては、フェノバルビタール誘導によるＣｙｐ３ａ１１及びＣｙｐ２ｂ１０両方の発現は有意に低下した。しかし、ｋｏＣＡＲマウスにおいては、Ｃｙｐ３ａ１１及びＣｙｐ２ｂ１０両方の発現は、ＰＲＯＤ活性と同様に、デキサメタゾン処理によって更に誘導された。
【０３２５】
また、野生型マウス、ｋｏＣＡＲマウス及びｋｏＰＸＲマウス（非処理マウス、及びデキサメタゾン（４０ｍｇ／ｋｇ）又はＰＢ（４０ｍｇ／ｋｇ）で処理したマウス）の腸におけるＣｙｐ２ｂ１０の発現についてもウェスタンブロッティングで解析した。これらの結果を肝臓における同等の検討の結果と比較したものを図４２に示す。ｋｏＣＡＲマウスの肝臓で見られたデキサメタゾンによるＣｙｐ２１０発現の誘導が腸組織では見られなかった。
【０３２６】
また、ｋｏＣＡＲマウス及び野生型マウスの肝臓におけるＣｙｐ２ｂ１０発現の比較をＴＣＰＯＢＯＰ（１ｍｇ／ｋｇ）で処理した後にも行った。肝臓サンプルから得たウェスタンブロットバンドの濃度定量結果を図４３に示す。野生型マウスとは対照的に、ｋｏＣＡＲマウスにおいては１ｍｇ／ｋｇのＴＣＰＯＢＯＰでＣｙｐ２ｂ１０は誘導されなかった。
【０３２７】
ｈｕＣＡＲ系及びｋｏＣＡＲ系についての更なる検証
マウス及びヒト特異的プローブを用いたＴａｑＭａｎ(登録商標）解析によって、（マウスＣＡＲｍＲＮＡではなく）ヒトＣＡＲｍＲＮＡのみが、本発明によって作出されたｈｕＣＡＲマウスの肝臓で発現することが分かった（図４４）。
【０３２８】
ＣＡＲ転写物のＰＣＲ解析によって、Auerbach et al. の報告(Nucleic Acids Res. 2003 Jun 15; 31(12): 3194-207)のように、ｈｕＣＡＲマウスにおいては全長ヒトｍＲＮＡ及び全ヒトスプライスバリアントが発現することが確認された。エクソン６、７及び８の基準スプライシングアイソフォームに加えて、Auerbach et al. に記載された３種の更なるアイソフォーム、即ち、（ａ）エクソン７の５’伸張を導く１２塩基対の挿入を含むバリアント、（ｂ）エクソン８の５’伸張を導く１５塩基対の挿入を含むバリアント、及び（ｃ）エクソン７が欠失した（３９個のアミノ酸のインフレーム欠失をもたらす）バリアントが確認された。
【０３２９】
野生型マウス及びｈｕＣＡＲマウスの肝臓及び小腸の両方におけるＣＡＲｍＲＮＡの更なるＴａｑＭａｎ(登録商標）解析については図４５に示す。ｈｕＣＡＲマウスにおいては、ヒトＣＡＲｍＲＮＡのみが観察された（この場合もマウスＣＡＲ転写物は観察されなかった）。
【０３３０】
野生型マウス及びｈｕＣＡＲマウス（非処理マウス、及び１、１０、又は５０ｍｇ／ｋｇのヒトＣＡＲアクチベーターＣＩＴＣＯ（６−（４−クロロフェニル）イミダゾ［２，１−ｂ］［１，３］チアゾール−５−カルバルデヒド  Ｏ−（３，４−ジクロロベンジル）オキシム；Maglich et al., J Biol Chem. 2003 May 9; 278(19): 17277-83）で処理したマウス）の肝臓／身体重量比を図４６に示す。血漿中のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベル、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）レベル及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）レベルも測定した（図４６参照）。試験したＣＩＴＣＯの用量（１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ及び５０ｍｇ／ｋｇ）では野生型マウス及びｈｕＣＡＲのいずれにおいても肝毒性は検出されなかった。野生型マウス及びｈｕＣＡＲマウス（非処理マウス、及びヒトＣＡＲアクチベーターＣＩＴＣＯの量を増加させて処理したマウス）の肝臓におけるＣｙｐ３ａ１１及びＣｙｐ２ｂ１０の発現はウェスタンブロッティングで解析した。単回注射にて様々な用量のＣＩＴＣＯ（０、１、１０、５０ｍｇＣＩＴＣＯ／ｋｇマウス体重）を投与し、４８時間後にマウスを殺した。
【０３３１】
このＣＩＴＣＯ研究の結果を図４７に示す。ＣＩＴＣＯ処理に対するｈｕＣＡＲマウスの反応は、野生型マウスの場合と比べて明らかに異なった。野生型マウスではＣｙｐ２ｂ１０及びＣｙｐ３ａ１１のいずれの発現もＣＩＴＣＯによって誘導されなかったが、ｈｕＣＡＲマウスではこれら両方のタンパク質の発現がＣＩＴＣＯによって明らかに誘導された（図４７における１０及び５０ｍｇＣＩＴＣＯ／ｋｇマウス体重のバンドを参照）。
【０３３２】
上述のｈｕＰＸＲマウス及びｋｏＰＸＲマウスについての検証と同様に、ウェスタンブロッティングによる誘導解析を酵素活性アッセイによって補足した。ＰＸＲはＣｙｐ３ａ１１の発現を誘導する一方、ＣＡＲはＣｙｐ３ａ１１及びＣｙｐ２ｂ１０の両方の発現を誘導する。Ｃｙｐ３ａ１１及びＣｙｐ２ｂ１０の発現はそれぞれ、７−ベンジルキノリン（ＢＱ）アッセイ及びペントキシレゾルフィン−Ｏ−脱エチル化（ＰＲＯＤ）アッセイによって特異的に評価することができる。従って、ＰＲＯＤ（Ｃｙｐ２ｂ１０）活性の非存在下でのＢＱ（Ｃｙｐ３ａ１１）活性がＰＸＲ活性を示す一方、如何なるＰＲＯＤ（Ｃｙｐ２ｂ１０）活性もＣＡＲ活性を示す（図４８参照）。
【０３３３】
ＣＩＴＣＯの影響下でのＣｙｐ２ｂ１０誘導プロファイルのウェスタンブロッティングによる上述の可視化は、Ｃｙｐ２ｂ１０発現、引いてはＣＡＲ活性を反映するＰＲＯＤ活性アッセイにおいて得た結果と一致する。ｈｕＣＡＲマウスにおいては、ヒト特異的誘導剤ＣＩＴＣＯの量を増加させて投与した場合、顕著に用量依存的なＰＲＯＤ活性の誘導がもたらされたが、野生型ではそのような誘導が見られなかった（図４７）。
【０３３４】
野生型マウスにおいては、１ｍｇ／ｋｇのＴＣＰＯＢＯＰによりＣｙｐ２ｂ１０の発現が誘導されることがウェスタンブロッティング及びＰＲＯＤ活性アッセイによって示されたが、ｈｕＣＡＲマウスにおいてはそのような誘導が見られなかった（図４９、実験は三重で行った）。これは、ＴＣＰＯＢＯＰがヒトに比べてマウスにおいてより強くシトクロムＰ４５０代謝を誘導するという結果と一致する。
【０３３５】
ヒト特異的ＣＩＴＣＯによる処理及びマウス特異的ＴＣＰＯＢＯＰによる処理に応じた野生型マウス及びｈｕＣＡＲマウスにおけるＣｙｐ２ｂ１０の誘導プロファイルの解析を更に行った。ＣＩＴＣＯ又はＴＣＰＯＢＯＰの量を増加させた場合の肝ミクロソームサンプルから得たウェスタンブロッティング及びＰＲＯＤアッセイの結果を図５０において比較する。ｈｕＣＡＲマウスと比べて野生型マウスにおいてはＴＣＰＯＢＯＰによってＣｙｐ２ｂ１０がより強く誘導されたが、ヒト特異的誘導剤ＣＩＴＣＯの場合には状況が逆転し、野生型マウスに比べてｈｕＣＡＲマウスにおける反応が強くなった。これらのデータから、ＣＡＲ誘導に対するヒト化反応がｈｕＣＡＲマウスにおいて得られたことが確認された。
【０３３６】
これに対し、マウス及びヒトにおいてシトクロムＰ４５０代謝を同程度に誘導することが報告されているフェノバルビタール（４０ｍｇ／ｋｇ）の場合、野生型マウス及びｈｕＣＡＲマウスの両方においてＣｙｐ２ｂ１０の発現が誘導された。これは、肝臓におけるウェスタンブロッティング解析及びＰＲＯＤ活性アッセイ両方の結果によって示される（図５１）。
【０３３７】
ヒトに比べてマウスにおいてより強くシトクロムＰ４５０代謝を誘導することが報告されているデキサメタゾンの場合、１０ｍｇ／ｋｇで投与すると、野生型マウス及びｈｕＣＡＲマウスの両方でＣｙｐ２ｂ１０発現が誘導された。しかし、野生型マウスに比べてｈｕＣＡＲマウスでは誘導が顕著でないことがウェスタンブロットによって示され（図５２）、また、ＰＲＯＤ活性アッセイによって、デキサメタゾンによるＣｙｐ２ｂ１０誘導が野生型マウスに比べてｈｕＣＡＲマウスでは弱いことが確認された。この結果から更に、ｈｕＣＡＲマウスにおいてシトクロムＰ４５０誘導剤に対するＣＡＲ介在反応のヒト化が成功したことが確認される。
【０３３８】
野生型マウス、ｈｕＣＡＲマウス、ｋｏＣＡＲマウス、ｈｕＰＸＲマウス（ＣＩＴＣＯのみ）及びｋｏＰＸＲマウスにおけるＣＩＴＣＯ又はＴＣＰＯＢＯＰによるＣｙｐ２ｂ１０誘導については図５３で比較する。ヒト化ｈｕＣＡＲマウスではヒト特異的ＣＩＴＣＯ（１０ｍｇ／ｋｇ）によってＣｙｐ２ｂ１０が強く誘導されることがウェスタンブロット及びＰＲＯＤ活性試験（レゾルフィン生成）の両方から明らかになったが、これは、これらのマウスでヒト化が成されたという結論と一致する（図５３左）。これに対し、野生型マウスにではＣｙｐ２ｂ１０はＣＩＴＣＯＯによって実質的に誘導されなかった。ｋｏＰＸＲマウスにおいても多少の誘導が見られたが、これは、Ｃｙｐ２ｂ１０がＰＸＲではなくＣＡＲに依存することと一致する。
【０３３９】
予想通り、野生型マウスにおいては、ＴＣＰＯＢＯＰ（１ｍｇ／ｋｇ）によってＣｙｐ２ｂ１０タンパク質の発現とＰＲＯＤ活性が強く誘導された（図５３右）。ｋｏＰＸＲマウスにおいては、ＴＣＰＯＢＯＰによってＣｙｐ２ｂ１０タンパク質の発現とＰＲＯＤ活性が野生型マウスの場合と同程度に誘導されたが、これによって、Ｃｙｐ２ｂ１０誘導がＰＸＲではなくＣＡＲに依存することが確認された。しかし、ヒト化ｈｕＣＡＲマウスにおいては、ＴＣＰＯＢＯＰによってＣｙｐ２ｂ１０タンパク質の発現やＰＲＯＤ活性が有意に誘導されなかった。この結果は、この誘導剤がヒトよりもマウスに対して相対的な特異性を示すことと一致する。
【０３４０】
野生型マウスにおいては、１ｍｇ／ｋｇのＴＣＰＯＢＯＰによりＣｙｐ３ａ１１の発現が多少誘導されることがウェスタンブロッティング及びＢＱ活性アッセイによって示されたが、ｈｕＣＡＲマウスにおいてはそのような誘導が見られなかった（図５４、実験は三重で行った）。これは、ＴＣＰＯＢＯＰがヒトに比べてマウスにおいてより強くシトクロムＰ４５０代謝を誘導するという結果と一致し、これによって更に、ｈｕＣＡＲマウスにおいてシトクロムＰ４５０誘導剤に対するＣＡＲ介在反応のヒト化が成功したことが確認される。
【０３４１】
野生型マウスやヒトにおけるＣｙｐ３ａ１１及びＣｙｐ２ｂ１０の発現に対する選択された薬物代謝誘導剤の作用の概要については図５５に示す。
【０３４２】
野生型マウス、ｈｕＰＸＲマウス、ｋｏＰＸＲマウス、ｈｕＣＡＲマウス及びｋｏＣＡＲマウスにおけるＰＸＲ標的遺伝子及びＣＡＲ標的遺伝子に関する様々な誘導剤の概要については図５６に示す。
【０３４３】
ｈｕＣＡＲマウスにおける非遺伝毒性発癌性研究：野生型マウス及びｈｕＣＡＲマウスにおけるＣＡＲ依存的種特異的差異の実証
ｈｕＣＡＲマウスにおける過形成性反応を評価するため、ＣＡＲアクチベーターで処理しいた野生型マウス及びｈｕＣＡＲマウスにおいて肝臓内のＢｒｄＵ陽性細胞の割合を測定した。マウスをＴＣＰＯＢＯＰ（マウス特異的誘導剤）又はＣＩＴＣＯ（ヒト特異的誘導剤）で処理した。マウスに対し、ＴＣＰＯＢＯＰ（３ｍｇ／ｋｇ）の単回投与、又は１日４回のＣＩＴＣＯ（２０ｍｇ／ｋｇ）投与を行った。処理マウスの肝臓内のＢｒｄＵ陽性細胞の割合は単回投与又は最終投与の１日後に測定し、非処理マウスから得た対応する測定値と比較した。図５７に示すように、マウス特異的誘導剤ＴＣＰＯＢＯＰの場合には、野生型マウスのみにおいてＢｒｄＵ陽性肝細胞数が増加したが、ヒト特異的誘導剤ＣＩＴＣＯの場合には、ｈｕＣＡＲマウスのみにおいてＢｒｄＵ陽性肝細胞数が増加し、野生型マウスでは増加しなかった。
【０３４４】
これらの結果から更に、ＣＡＲアクチベーターに対する反応の種依存的差異がｈｕＣＡＲマウス系によって再現されることが確認される。特に、これらの結果から、ｈｕＣＡＲマウスは、非遺伝毒性発癌物質に対する過形成反応に対してヒト化されていることが分かる。
【０３４５】
２種類の二重ホモ接合ＰＸＲ／ＣＡＲヒト化マウスにおいてマウスＰＸＲ遺伝子がヒトカウンターパートと交換されたことのＰＣＲ確認
ＰＸＲ及びＣＡＲをヒト化したマウス（「ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ」）の作出の際には、ヒト化ＰＸＲを含むマウスを用い、このマウスをヒト化ＣＡＲを含むマウスと交雑し、ヒト化ＰＸＲ及びヒト化ＣＡＲの両方を含むマウスを作出した。該マウスは目視検査の結果、表現型が正常である。ＰＣＲを用いて該マウスをタイピングした（図２８参照）が、ＰＸＲ及びＣＡＲがホモ接合的にヒト化されている。その例としては、「４２７４９」及び「４２７５２」と称されるマウスが挙げられる。
【０３４６】
ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウスにおいてＰＸＲｍＲＮＡ及びＣＡＲｍＲＮＡの転写はＲＴ−ＰＣＲによって定量し、野生型マウス、ｈｕＰＸＲマウス及びｈｕＣＡＲマウスにおける対応するｍＲＮＡ発現の相対レベルと比較した（図５８）。これによって、ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウスは、単一遺伝子をヒト化したマウスで見られるヒトＰＸＲ及びヒトＣＡＲの発現のレベルを維持することが確認された。
【０３４７】
図８６に示すように、肝臓及び小腸についての更なるＰＣＲデータから、ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウスは、単一遺伝子をヒト化したマウスで見られるヒトＰＸＲ及びヒトＣＡＲの発現のレベルを維持することが分かる。
【０３４８】
野生型マウス、ｈｕＰＸＲマウス及びｈｕＣＡＲマウスと同様に、二重ヒト化ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウスを誘導剤リファンピシン及び／又はフェノバルビタールで処理した。これらの誘導剤処理マウスにおけるＣｙｐ２ｂ１０及びＣｙｐ３ａ１１の発現は、対応する非処理マウスと同様に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとそれに続くウェスタンブロッティングによって可視化し、比較した（図５９）。図５９においては、ｈｕＰＸＲマウス、ｈｕＣＡＲマウス及びｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウスにおけるＣｙｐ２ｂ１０とＣｙｐ３ａ１１の基礎レベルを、野生型マウスで見られる基礎レベルと比較する。この相対的定量から、基礎Ｃｙｐ２ｂ１０レベルは、ｈｕＰＸＲ→ｈｕＣＡＲ→ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲの順で増加することが分かる。しかし、基礎Ｃｙｐ３ａ１１レベルはｈｕＣＡＲマウスではあまり顕著に増加しなかった。Ｃｙｐ３ａ１１レベルはｈｕＰＸＲマウス及び二重ヒト化ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウスの両方においてほぼ同程度（２倍超）に増加した。
【０３４９】
ヒト特異的誘導剤リファンピシンによる処理によって、全てのマウスでＣｙｐ３ａ１１のレベルが増加した。リファンピシンとフェノバルビタールを併用投与した場合、野生型マウスでは付加的作用は見られなかったが、ｈｕＰＸＲマウスではＣｙｐ３ａ１１が多少強く誘導された。
【０３５０】
ペントバルビトン睡眠試験
この実験においては、バルビツール酸塩誘導睡眠時間を測定することによってこれらの転写因子の組合せの活性を求めた。長年、睡眠時間は肝シトクロムＰ４５０活性に正比例することが知られており、この活性は、ＣＡＲ及びＰＸＲの機能によって決まる肝臓内のＰ４５０レベルに少なくとも一部起因し得る。
【０３５１】
マウスに対して、Ｎａｒｃｏｒｅｎ（ペントバルビトンナトリウム；ドイツ、メリアル社で販売、Veterinary Consultant経由で購入）を腹腔内単回投与した（２５ｍｇ／ｋｇ体重）。マウスが正向反射を消失した後、回復するまでの時間を測定した。結果は下表４．１に示す。
【０３５２】
【表９】
2010528644.tif 000010
【０３５３】
麻酔量のペントバルビトンを投与した野生型マウスの睡眠時間は２１分間であったが、ＣＡＲ及びＰＸＲの二重ヒト化マウスの睡眠時間は３４分間であった。従って、二重ヒト化マウスは野生型対照に対して有意差を示したが、この結果から、二重ヒト化マウスは野生型マウスに比べて薬物に対する反応が顕著に異なることが分かる。
【０３５４】
様々なＰＸＲ及び／又はＣＡＲヒト化及び／又はノックアウト系の更なる比較検証
フェノバルビタール
野生型マウス、ｈｕＰＸＲマウス、ｋｏＰＸＲマウス、ｈｕＣＡＲマウス、ｋｏＣＡＲマウス、ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウス、ｋｏＰＸＲ／ｋｏＣＡＲマウス、ｈｕＰＸＲ／ｋｏＣＡＲマウス及びｋｏＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウスにおいて、Ｃｙｐ３ａ１１及びＣｙｐ２ｂ１０の誘導に対するフェノバルビタールの作用を比較した（図８７参照）。４０ｍｇ／ｋｇ体重のフェノバルビタールを投与し、Ｃｙｐ３ａ１１及びＣｙｐ２ｂ１０タンパク質の発現、ベンジルオキシキノリン（ＢＱ）活性及びＰＲＯＤ活性について同じ遺伝子型の非曝露マウス（対照）と比較した。フェノバルビタールはインビトロではＰＸＲアクチベーターとして示されるが、in vivoでのフェノバルビタール介在によるＣｙｐ３ａ１１及びＣｙｐ２ｂ１０の活性化は主にＣＡＲ依存的である。ＣＡＲがノックアウトされたマウスにおけるＣｙｐ３ａ１１及びＣｙｐ２ｂ１０タンパク質の発現や活性の誘導は、ＢＱアッセイ及びＰＲＯＤアッセイにおいて殆ど又は全く観察されなかった。一方、ＰＸＲがノックアウトされた（ＣＡＲはノックアウトされていない）マウスにおけるＣｙｐ３ａ１１及びＣｙｐ２ｂ１０タンパク質の発現や活性は、ＢＱアッセイ及びＰＲＯＤアッセイにおいて観察された。
【０３５５】
デキサメタゾン
野生型マウス、ｈｕＰＸＲマウス、ｋｏＰＸＲマウス、ｈｕＣＡＲマウス、ｋｏＣＡＲマウス、ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウス、ｋｏＰＸＲ／ｋｏＣＡＲマウス、ｈｕＰＸＲ／ｋｏＣＡＲマウス及びｋｏＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウスにおいて、Ｃｙｐ３ａ１１及びＣｙｐ２ｂ１０の誘導に対するデキサメタゾンの作用を比較した（図８８参照）。３０ｍｇ／ｋｇ体重のデキサメタゾンを投与し、Ｃｙｐ３ａ１１及びＣｙｐ２ｂ１０タンパク質の発現、ベンジルオキシキノリン（ＢＱ）活性及びＰＲＯＤ活性について同じ遺伝子型の非曝露マウス（対照）と比較した。デキサメタゾンによるＣｙｐ３ａ１１の誘導はマウスＰＸＲに依存していることが分かったが、この誘導はｋｏＰＸＲマウスでは消失し、ヒトＰＸＲによって補償できなかった。これは、マウスはヒトと比べてデキサメタゾンに対する感受性が高いという結果と一致する。一方、デキサメタゾンによるＣｙｐ２ｂ１０の誘導はＰＸＲやＣＡＲに対してある程度非依存的であった。ＰＲＯＤ活性と共にデキサメタゾンによるＣｙｐ２ｂ１０タンパク質発現の誘導が、この研究における試験マウス全て（ｋｏＰＸＲ／ｋｏＣＡＲ二重ノックアウトマウスを含む）においてある程度観察された。
【０３５６】
肝毒性
野生型マウス、ｈｕＰＸＲマウス、ｋｏＰＸＲマウス、ｈｕＣＡＲマウス、ｋｏＣＡＲマウス、ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウス、ｋｏＰＸＲ／ｋｏＣＡＲマウス、ｈｕＰＸＲ／ｋｏＣＡＲマウス及びｋｏＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウスにおいて、血漿中ＡＬＴレベル及び肝臓重量に対するデキサメタゾン（３０ｍｇ／ｋｇ体重）の作用を比較した（図８９参照）。ＡＬＴレベル及び肝臓重量の増加は、マウスＰＸＲが欠如したマウス（即ち、ｈｕＰＸＲ、ｋｏＰＸＲ、ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ、ｋｏＰＸＲ／ｋｏＣＡＲ、ｈｕＰＸＲ／ｋｏＣＡＲ及びｋｏＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ）において明らかにより顕著であった。この研究から更に、マウスＰＸＲ介在によるデキサメタゾン代謝が無い場合には肝毒性作用がより高いことが分かる。
【０３５７】
非遺伝毒性発癌
図９０には、代謝経路と核内受容体と非遺伝毒性発癌との関係を概略的にまとめる。このような発癌は、代謝物誘導による肥大や過形成の中間段階に続いて起こる。
【０３５８】
マウスやラットにおいては、フェノバルビタールによって肝臓癌が生じる。１〜２週間以内に細胞複製や肝臓重量が増加し、１〜２年後に肝臓腫瘍が観察される（図９１参照）。しかし、このような作用はヒトでは見られない。
【０３５９】
従って、本発明者らは、野生型マウス、ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ二重ヒト化マウス及びｋｏＰＸＲ／ｋｏＣＡＲ二重ノックアウトマウスの肝臓におけるフェノバルビタールの作用について研究し、比較した（図９２参照）。肝腫（肝臓／身体重量比）、Ｐ４５０誘導（ＰＲＯＤアッセイ／Ｃｙｐ２ｂ１０活性）及び過形成（肝細胞増殖、％ＢｒｄＵ陽性細胞）について測定し、同じ遺伝子型の非曝露マウス（対照）と比較した。野生型マウス及び二重ヒト化ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウスの両方ではフェノバルビタールによって肝腫とＰ４５０誘導の両方が生じたが、このようなフェノバルビタールの作用はｋｏＰＸＲ／ｋｏＣＡＲ二重ノックアウトマウスでは見られなかった。しかし、野生型マウスのみにおいては、フェノバルビタールによって肝細胞増殖が生じた。ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ二重ヒト化マウスやｋｏＰＸＲ／ｋｏＣＡＲ二重ノックアウトマウスではＢｒｄＵ陽性細胞の増加は見られなかった。
【０３６０】
フェノバルビタールに対するｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウスの過形成反応は、野生型マウスの反応に比べてよりヒトの状態に類似している。従って、ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ二重ヒト化マウスは、ヒトに対する非遺伝毒性げっ歯類の「肝成長発癌物質」の真の危険性を評価する上で価値が高いと考えられる。同じことが本発明の他のヒト化マウス（特に、例えば、ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ／ｈｕＰＰＡＲａマウス）にも当てはまる。このようなヒト化マウスは通常、生体異物誘導による肝成長（図９０参照）や該成長における種特異的差異の複雑さを解明することのできる有用なツールでもある。
【０３６１】
非遺伝毒性発癌作用に関する本発明者らによる検討については、後述の実施例８にて更に詳細に説明する。
【０３６２】
薬物−薬物相互作用における種特異的差異
本発明者らは、野生型マウス及びｈｕＰＸＲ（＝ｈＰＸＲ）マウスにおけるミダゾラム（ＭＤＺ）の薬物動態に対するリファンピシン前処理の作用について比較した（図９３参照）。マウスに対してリファンピシンを１０ｍｇ／ｋｇ体重／日で３日間前投与した後、ミダゾラムを投与し、薬物動態データを記録した。野生型マウスでは有意な作用は見られなかった。しかし、ｈｕＰＸＲマウスにおいては、リファンピシン前処理によって最大ミダゾラム濃度（Ｃｍａｘ）が６４％低下し、濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ0-180min）が６０％低下した。このように、有意なヒト化依存的薬物動態作用（ここでは、薬物−薬物相互作用）はマウスＰＸＲの存在下では評価できないが、マウスＰＸＲをヒトＰＸＲ遺伝子と置換した場合にのみ明らかになる。
【０３６３】
上述のタイプ３及び４に関する研究の概要
ヒトＰＸＲを内在性遺伝子と等価なレベルで予測されたようにマウスの肝臓及び消化管の両方において発現するモデルを開発した。この経路によって遺伝子発現を誘導することが知られている化合物にマウスが反応するため、ＰＸＲタンパク質は機能的であることが示された。また、ＣＡＲ遺伝子についての等価なヒト化も成された（ｈｕＣＡＲマウス）。野生型マウスとヒト化マウスとの系統差が示され、ヒト化マウスは、マウスよりもヒトにおいて高い活性を示す（即ち、マウスＰＸＲやマウスＣＡＲよりもヒトＰＸＲやヒトＣＡＲに対する活性の高い）ことが知られている化合物に対する反応性が高いことが示された。ノックアウト系の構築はＰＸＲ遺伝子及びＣＡＲ遺伝子の両方についても確認された（ｋｏＰＸＲ及びｋｏＣＡＲ）。更に、ヒト化ＰＸＲを含んだマウスをヒト化ＣＡＲを含んだマウスと交雑させて、ヒト化ＰＸＲ及びヒト化ＣＡＲの両方を含むマウスを作出した。
【０３６４】
タイプ５：ＲＯＳＡ２６遺伝子座への挿入によるヒトｃＤＮＡとゲノム配列とのハイブリッドの対応するヒトプロモーターからの発現
計画：ＣＹＰ３Ａ４及びＣＹＰ２Ｃ９のヒト化
方法：標準的な分子クローニング手順によってターゲティングベクターを構築する。基本ＲＯＳＡ２６ターゲティングベクターは、ネオマイシン遺伝子が正しい標的ＥＳクローンにおいて内在性ＲＯＳＡ２６プロモーターから発現されるようにデザインする。Ｎｅｏ転写物はポリＡモチーフによって終結する。
【０３６５】
ＣＹＰ３Ａ４の場合、ヒト化カセット（３’〜選択マーカー）は、１３ｋｂのヒトＣＹＰ３Ａ４プロモーターと、通常のゲノム構成同様にエクソン１及びイントロン１と、エクソン２〜１３から成るヒトｃＤＮＡとを含む。転写物はポリＡモチーフによって終結する（図９参照）。
【０３６６】
ＣＹＰ２Ｃ９の場合、ヒト化カセット（３’〜選択マーカー）は、１２ｋｂのヒトＣＹＰ２Ｃ９プロモーターと、エクソン１〜４から成るヒトｃＤＮＡと、イントロン４と、エクソン５〜９から成るｃＤＮＡとを含む。転写物はポリＡモチーフによって終結する（図１０参照）。
【０３６７】
ターゲティングベクターを標準的なエレクトロポレーションによってＣ５７ＢＬ／６ＮマウスＥＳ細胞にトランスフェクトする。クローンをＧ４１８で選択し、陽性クローンをサザンブロット解析によって同定する。標準的な操作手順に従って、選択したクローンを拡大し、ＢＡＬＢｃ胚盤胞に注入し、フォスターマザーに導入する。このフォスターマザーの同腹仔を目視検査し、体毛色によってキメリズムを確認する。高キメラマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ遺伝的バックグラウンドにおいて更なる繁殖に用いる。
【０３６８】
ｈｕＣＹＰ３Ａ４／ｈｕＰＸＲマウス
Ｃｙｐ３Ａ４及びＰＸＲを二重ヒト化したマウス（ｈｕＣＹＰ３Ａ４／ｈｕＰＸＲ）を作出し、該マウスが肝臓において全長ＣＹＰ３Ａ４ｍＲＮＡを発現することを確認した。ＣＹＰ３Ａ４特異的プライマーを用いて野生型マウス及びｈｕＣＹＰ３Ａ４／ｈｕＰＸＲマウスの３種類の異なるサンプル（雄肝臓、雄小腸及び雌肝臓）から得た定量ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）データを図９６に示す。
【０３６９】
６０ｍｇ／ｋｇのリファンピシンで誘導した雄肝臓においては、ＣＹＰ３Ａ４ｍＲＮＡの増幅はＣＴサイクル数２７によって特徴付けられるが、対応する非誘導サンプルの場合はＣＴ値が３１〜３４であった。雌肝臓サンプル及び雄小腸サンプルにおいては、高い非誘導ｍＲＮＡレベルが見られた（低ＣＴ値、即ち、ＣＴはそれぞれ２５〜２７及び２４であった）。このように、誘導ＣＹＰ３Ａ４ｍＲＮＡ発現レベルの性別及び器官依存的差異が見られた（雄肝臓＜雌肝臓＜雌腸）。野生型マウスにおいては、ＣＹＰ３Ａ４ｍＲＮＡの増幅は常に、高いＣＴサイクル数（即ち、低ｍＲＮＡレベル）によって特徴付けられた。
【０３７０】
ヒト肝臓サンプル（ｎ＝２０）に関する同等な定量ＰＣＲ実験から、ｈｕＣＹＰ３Ａ４／ｈｕＰＸＲマウスにおけるＣＹＰ３Ａ４発現レベルはヒト肝臓での発現レベルに匹敵することが分かる（図９７と図９６のＣＴサイクル数を比較）。
【０３７１】
ｈｕＣＹＰ３Ａ４／ｈｕＰＸＲ／ｋｏＣｙｐ３ａ１１マウス
図９８は、４種類の異なる生体異物剤（xenobiotic agents）で誘導した際のｈｕＣＹＰ３Ａ４／ｈｕＰＸＲ／ｋｏＣｙｐ３ａ１１マウスにおけるＣＹＰ３Ａ４タンパク質発現を示す。
【０３７２】
【表１０】
2010528644.tif 000011
【０３７３】
各々の場合において雄性マウスと雌性マウスを処理し、比較した。非誘導マウスにおいてはＣｙｐ３Ａ４タンパク質は殆ど検出できなかった。
【０３７４】
ｈｕＣＹＰ２Ｃ９マウス
ＣＹＰ２Ｃ９ｃＤＮＡ／ゲノム構築物をＲｏｓａ２６遺伝子座にノックインしてＣＹＰ２Ｃ９をヒト化したマウスを作出した。ヒトＣＹＰ２９Ｃの発現はヒトＣＹＰ２９Ｃプロモーターによって促進される。このｈｕＣＹＰ２Ｃ９マウスについての検証結果は、ＣＹＰ３Ａ４をヒト化したマウスにおいて得た検証結果と同等である（上述参照）。
【０３７５】
タイプ６：大規模ゲノム領域の置換（クラスター交換）
計画：ＣＹＰ３Ａクラスターの交換、ＣＹＰ２Ｃクラスターの交換、マウスＣｙｐ２ＤクラスターとヒトＣＹＰ２Ｄ６発現カセットとの置換、及びＵＧＴのヒト化
方法：標準的な分子クローニング手順によってターゲティングベクターを構築する。原則としては、２種類のターゲティングベクターを構築し、標準的なエレクトロポレーションによるＣ５７ＢＬ／６ＮマウスＥＳ細胞へのトランスフェクションの連続する２ラウンドに用いる。第１のベクターは、機能性ＴＫカセットと、ｗｔ−ｌｏｘＰ部位によってその翻訳開始ＡＴＧ及びプロモーターから中断された５’欠失Ｎｅｏ遺伝子とを含む。第２のベクターは、機能性ＴＫカセット及びハイグロマイシンカセットと、ｗｔ−ｌｏｘＰと、ｌｏｘ５１１部位とを有する。各クラスター交換のための最終ターゲティングベクターは、正しい標的ＥＳクローンにおいてｗｔ−ｌｏｘＰ部位間のゲノム配列がＣｒｅ介在欠失によって除去できるようにデザインする。これによって、ｌｏｘＰに隣接する遺伝子クラスターがノックアウトされる。改変細菌人工染色体（ＢＡＣ）を用いて、Ｃｒｅ介在挿入によりヒト配列を再誘導（re-derived）ＥＳ細胞に導入する。ヒト化クラスターに隣接する選択カセットは、ＦＬＰ介在欠失によって除去することができる（図１１参照）。
【０３７６】
ｋｏＣｙｐ３Ａクラスターマウス
次の遺伝子、Ｃｙｐ３ａ５７、Ｃｙｐ３ａ１６、Ｃｙｐ３ａ４１、Ｃｙｐ３ａ４４、Ｃｙｐ３ａ１１、Ｃｙｐ３ａ２５及びＣｙｐ３ａ５９が欠如しているｋｏＣｙｐ３Ａクラスターマウス。本発明者らは、ｋｏＣｙｐ３Ａクラスターマウスがタンパク質レベルでＣｙｐ３Ａ１１を発現しなかったことを確認した（図９９）。リファンピシンを投与した場合（６０ｍｇ／ｋｇ体重）でも、野生型対照においてはタンパク質の誘導が明らかに示されたが、いずれのＣｙｐ３Ａ１１タンパク質の発現も誘導できなかった（図９９）。同様に、野生型対照ではＢＱ活性が明らかに誘導されたが、ｋｏＣｙｐ３Ａクラスターマウスにおいては、非処理の場合でもリファンピシン投与（６０ｍｇ／ｋｇ体重）の場合でもベンジルオキシキノリン（ＢＱ）アッセイにおいて活性が見られなかった（図９９）。
【０３７７】
ｋｏＣｙｐ３Ａクラスターマウスは通常の血漿臨床化学値を示し、また、通常の肝臓、小腸及び腎臓組織を示した。
【０３７８】
６０ｍｇ／ｋｇ体重のリファンピシンの非存在下及び存在下における野生型に対する第Ｉ相（シトクロムＰ４５０、Ｃｙｐ４５０）酵素発現の変化のマイクロアレイ解析結果を図９９に示す。
【０３７９】
ｈｕＣＹＰ３Ａクラスターマウス
図１００に示す戦略に従い、約２００ｋｂのヒトＣＹＰ３Ａクラスター（ＣＹＰ３Ａ４及びＣＹＰ３Ａ７を含み、必要に応じてＣＹＰ３Ａ５を含む）を有するバクテリア人工染色体（ＢＡＣ）を用いて、前記ヒトＣＹＰ３ＡクラスターをマウスＣｙｐ３ａクラスターのｌｏｘＰ隣接部位に挿入した。このようなマウスにおけるＣＹＰ３Ａ遺伝子発現はヒトプロモーターによって促進される。２００ｋｂのｈｕＣＹＰ３Ａクラスターに対するＰＣＲジェノタイピングによって、Ｃｙｐ３ａクラスター交換ＥＳ細胞クローンの生殖系列伝達（germline transmission）が確認された（図１０１、マウス１及び２参照）。
【０３８０】
ｈｕＣＹＰ２Ｄ６マウス
図１０２に示すターゲティング戦略に従い、ヒトＣＹＰ２Ｄ６発現カセットをマウスＣｙｐ２ｄクラスター部位に挿入すると共に、ｌｏｘＰ隣接マウスＣｙｐ２ｄクラスターのＣｒｅ介在欠失を行った。図１０２に示すように、ヒト遺伝子ＣＹＰ２Ｄ６は必要に応じてＦＬＰ欠失株と交雑させ、ＦＬＰ介在組換えによって欠失させることができる。
【０３８１】
ヒトＣＹＰ２Ｄ６タンパク質はヘテロ接合体雄性ｈｕＣＹＰ２Ｄ６マウスの肝臓で発現することが本発明者らによって示された。対応するタンパク質バンドがヒト肝ミクロソームで見られたが、野生型マウスでは見られなかった（図１０３参照）。
【０３８２】
ｋｏＣｙｐ２ｃクラスターマウス
図１０４に示すターゲティング戦略に従い、内在性Ｃｙｐ２ｃクラスター（Ｃｙｐ２ｃ５５、２ｃ６５、２ｃ６６、２ｃ２９、２ｃ３８、２ｃ３９、２ｃ６７、２ｃ６８、２ｃ４０、２ｃ６９、２ｃ３７、２ｃ５４、２ｃ５０及び２ｃ７０）を欠失させたマウスを作出した（ヘテロ接合体マウス）。
【０３８３】
「Ｃｙｐ２ｃ５５内ＣＹＰ２Ｃヒト化」マウス
このようなマウス（一般にヘテロ接合性）を作出するため、図１０５に示すターゲティング戦略に従い、ヒトＣＹＰ２Ｃ９発現カセットをマウスＣｙｐ２ｃクラスターにおいて挿入し、Ｃｒｅ介在組換えによってｌｏｘＰ隣接の１２００ｋｂ（約）のＣｙｐ２ｃマウスクラスターを欠失させた。図１０５に示すように、ヒトＣＹＰ２Ｃ９カセットは必要に応じてＦＬＰ欠失株と交雑させ、ＦＬＰ介在組換えによって欠失させることができる。
【０３８４】
実施例４：レポーター計画
計画：ＣＹＰ３Ａ４レポーター、ＣＹＰ２Ｃ９レポーター、ＣＹＰ２Ｃ１９レポーター、ＣＹＰ２Ｂ６レポーター、ＣＹＰ２Ｄ６レポーター及びＭＤＲ１レポーター
方法：標準的な分子クローニング手順によってターゲティングベクターを構築する。全てのレポーターにおいて、レポーター遺伝子が対応するヒト遺伝子の翻訳開始部位に融合されるようにヒトＢＡＣを改変する。改変ＢＡＣはＦＲＴ隣接Ｋｅｏカセットを有しており、細菌コロニーをカナマイシンで選択し、マウスＥＳ細胞クローンをＧ４１８で選択することができる。ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｃ９及びＣＹＰ２Ｃ１９の場合、レポーター遺伝子の転写物はポリＡモチーフによって終結せず、内在性ポリＡモチーフが潜在的に用いられるように構築物をデザインする。従って、このような構築物は、エクソン３’のレポーターへの正しいスプライシングに依存している（図１２参照）。
【０３８５】
ＣＹＰ２Ｄ６及びＣＹＰ２Ｂ６の場合、レポーター遺伝子の転写物は、合成イントロンを有するレポーター遺伝子に連結しているポリＡモチーフによって終結する（図１３参照）。
【０３８６】
ＭＤＲ１の場合、レポーター遺伝子の転写物は、付加的イントロンを有しないポリＡモチーフによって終結する（図１４参照）。
【０３８７】
改変ＢＡＣをＮｏｔＩで直線化し、標準的なエレクトロポレーション又はリポフェクタミン２０００を用いたリポフェクションによってＣ５７ＢＬ／６ＮマウスＥＳ細胞にトランスフェクトする。複合遺伝子型を構築する際には、直線化した改変ＢＡＣを適切な遺伝的バックグラウンドにトランスフェクトする。例えば、ＰＸＲ又はＣＡＲのヒト化と所望のレポーター遺伝子発現とを組合せた系を構築する際には、ＰＸＲ又はＣＡＲヒト化Ｃ５７ＢＬ／６ＮマウスＥＳ細胞に該ＢＡＣをトランスフェクトする。クローンをＧ４１８で選択し、ＤＮＡをランダムに組み込んだ陽性クローンをＰＣＲ解析によって同定する。標準的な操作手順に従って、選択したクローンを拡大し、ＢＡＬＢｃ胚盤胞に注入し、フォスターマザーに導入する。このフォスターマザーの同腹仔を目視検査し、体毛色によってキメリズムを確認する。高キメラマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ遺伝的バックグラウンドにおいて更なる繁殖に用いる。選択マーカーは、ＦＬＰ欠失株との交雑によってin vivoで除去する。
【０３８８】
レポーター株の検証
当業者に周知の標準的な方法を用い、本明細書に記載の方法及びターゲティング戦略に従って複合遺伝子型株ｒＣｙｐ２Ｂ６／ｈｕＣＡＲを作出した（好ましいｒＣｙｐ２Ｂ６株の更なる詳細については後述の実施例５を参照）。ｌａｃＺレポーター遺伝子の発現はｈｕＣＡＲバックグラウンド内でＣｙｐ２Ｂ６プロモーターの制御下に置かれた。図６０は、野生型マウス及びｒＣｙｐ２Ｂ６／ｈｕＣＡＲレポーターマウスから得た組織サンプル（肝ミクロソーム）を示す。フェノバルビタール（４０ｍｇ／ｋｇ体重）の投与後、ｌａｃＺレポーター遺伝子によってＣｙｐ２Ｂ６プロモーター活性を直接局在化させることができる。
【０３８９】
当業者に周知の標準的な方法を用い、本明細書に記載の方法及びターゲティング戦略に従って複合遺伝子型株ｒＣｙｐ２Ｄ６／ｈｕＰＸＲを作出した（好ましいｒＣｙｐ２Ｄ６株の更なる詳細については後述の実施例５を参照）。こうして、ＺｓＹｅｌｌｏｗレポーター遺伝子の発現はｈｕＰＸＲバックグラウンド内でＣｙｐ２Ｄ６プロモーターの制御下に置かれた。図６１は、野生型マウス及びｒＣｙｐ２Ｄ６／ｈｕＰＸＲレポーターマウスから得た組織サンプル（肝ミクロソーム）を示す。ＺｓＹｅｌｌｏｗレポーター遺伝子によってＣｙｐ２Ｄ６プロモーター活性を明らかに局在化させることができた。
【０３９０】
実施例５：ターゲティング戦略に関する付加的情報
Ａ．転写因子
ｈｕＰＸＲ及びｋｏＰＸＲ
ＰＸＲヒト化及びノックアウトについての更なる戦略が本発明者らによって確認された。上述のＰＸＲヒト化戦略と同様に、ヒトＰＸＲｃＤＮＡとゲノム配列のハイブリッドがマウスＰＸＲ遺伝子の翻訳開始部位に融合され、エクソン２内のマウスの開始部位（ＡＴＧ）が保持されるようにベクターをデザインする。
【０３９１】
一戦略においては、ヒトＰＸＲ配列は、エクソン２〜４のｃＤＮＡと、イントロン４、エクソン５、イントロン５、エクソン６、イントロン６、エクソン７及びイントロン７のゲノム配列と、エクソン８〜９のｃＤＮＡとを含む（図６２参照）。このヒトＰＸＲ配列は本明細書の配列番号２に示す（この配列においては、ヒト「ＣＴＧ」が欠失されており、配列番号３の最初の「ＡＴＧ」がマウスの翻訳開始部位に相当する）。このｈｕＰＸＲマウスをｈｕＰＸＲ．１と称する（その特徴付けについては図８５及び後述参照）。転写物はポリＡモチーフによって終結する。ターゲティングベクターはＦＲＴ隣接ハイグロマイシン耐性カセットを有する。更に、マウスイントロン１及び３’相同アームの５’末端にａｔｔ部位を挿入し、これによって、部位特異的Ｐｈｉ−Ｃ３１リコンビナーゼを用いた中間配列の除去によるＰＸＲノックアウトの作出が可能となる（後述参照）。上述の特徴を有する完全ターゲティングベクターを図６３に示す。
【０３９２】
この戦略によって、マウスＰＸＲを発現させずにマウスプロモーターの制御下でヒトＰＸＲを発現させることができる。マウスにおけるスプライシングがヒトの状態を模倣すると仮定すれば、エクソン４とエクソン８との間の公知のヒトスプライスバリアントは発現し、予期しない隠れたスプライス部位によって生成する異常なバリアントは回避されるであろう。
【０３９３】
ターゲティングベクターを標準的なエレクトロポレーションによってＣ５７ＢＬ／６ＮマウスＥＳ細胞にトランスフェクトする。クローンをハイグロマイシンで選択し、陽性クローンをサザンブロット解析によって同定する。標準的な操作手順に従って、選択したクローンを拡大し、ＢＡＬＢｃ胚盤胞に注入し、フォスターマザーに導入する。このフォスターマザーの同腹仔を目視検査し、体毛色によってキメリズムを確認する。高キメラマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ遺伝的バックグラウンドにおいて更なる繁殖に用いる。選択マーカーは、ＦＬＰ欠失株との交雑によってin vivoで除去する。
【０３９４】
ターゲティング構築物がＰＸＲイントロン６及びイントロン７を含むこのようなＰＸＲヒト化戦略によって、ＰＸＲをヒト化したマウス系が得られるが、ヒトの正常なスプライシングパターンを完全に反映できないこともある（例えば、エクソン７と８の融合によって隠れたスプライス部位が生成した場合）。必要に応じて、更なるヒトＰＸＲイントロン及びエクソン配列をターゲティングベクターに含有させてスプライシングパターンを改善することができる。例えば、ターゲティングベクターは、エクソン２下流のヒトＰＸＲゲノム配列の全て（即ち、イントロン２、エクソン３、イントロン３、エクソン４、イントロン４、エクソン５、イントロン５、エクソン６、イントロン６、エクソン７、イントロン７、エクソン８及びイントロン８（図６４参照））を保持することができる。これらの更なるゲノム配列を含むヒトＰＸＲ配列を本明細書の配列番号４に示す（この配列においては、ヒト「ＣＴＧ」が欠失されており、配列番号４の最初の「ＡＴＧ」がマウスの翻訳開始部位に相当する）。
【０３９５】
図２に示す種類のターゲティング構築物は、更なるスプライスアクセプターポリＡモチーフを含んでおり、未欠失マウスＰＸＲエクソンの発現を防ぐため、ＰＸＲノックアウトマウスの作出には好ましい。
【０３９６】
スプライスアクセプターポリＡモチーフ（ａｔｔＰ５０）に対しマウスのイントロン１（ａｔｔＢ５３）及び３’にａｔｔ部位を挿入することによってＰＸＲノックアウトマウスを作出することができるが、本明細書においてはｋｏＰＸＲやＰＸＲ  ＫＯ等のように互いに交換可能に示す。このようなノックアウトマウスを作出するために、部位特異的Ｐｈｉ−Ｃ３１リコンビナーゼを用いてａｔｔ部位間の配列を除去した（図６５参照）。
【０３９７】
本実施例で上述のｈｕＰＸＲ．１マウス、即ち、ヒトＰＸＲ配列がエクソン２〜４のｃＤＮＡと、イントロン４、エクソン５、イントロン５、エクソン６、イントロン６、エクソン７及びイントロン７のゲノム配列と、エクソン８〜９のｃＤＮＡとを含む（図６２及び配列番号２参照）マウスを作出し、その特徴付けを行った（図８５参照）。
【０３９８】
配列解析によって、ｈｕＰＸＲ．１マウスはＰＸＲの公知のヒトスプライスバリアントのみを発現することが分かった。図８５に示すように、イントロン４及びイントロン５や他のｃＤＮＡ（配列番号１のエクソン／イントロン構造）を含むｈｕＰＸＲマウスと比べて、イントロン６及び７（配列番号２のエクソン／イントロン構造）を更に含むｈｕＰＸＲ．１マウスにおいては、リファンピシンによってＣｙｐ３ａ１１の誘導やベンジルオキシキノリン（ＢＱ）アッセイ活性が更に強く誘導された。このようなリファンピシンに対する感受性の更なる増加は、ヒトのリファンピシンに対する感受性がマウスに比べて高いことと一致する。本発明者らは、ｈｕＰＸＲ．１マウスはヒトにおけるＰＸＲの発現や活性を特に正確に反映するという立場を取る。
【０３９９】
また、高濃度のリファンピシンによってｈｕＰＸＲ．１マウスでのみＣｙｐ２ｂ１０発現やＰＲＯＤ活性が誘導され、野生型マウスや配列番号１のエクソン／イントロン構造を含むｈｕＰＸＲマウスでは誘導されなかった（図８５参照）。このように、ヒト化ＰＸＲはＣｙｐ３ａ１１に作用するだけでなく、リファンピシン用量が高い場合にはＣｙｐ２ｂ１０の発現を誘導することもできる。ＣＡＲもＣｙｐ３ａ１１遺伝子及びＣｙｐ２ｂ１０遺伝子の両方を活性化することができるため、ｈｕＰＸＲ．１配列を用いたこの結果は、受容体間のクロストークの重要性を強調すると共に、複数の受容体（好ましくは、少なくともＰＸＲ及びＣＡＲ、より好ましくは、更に他の受容体や上述の第１相薬物代謝酵素及び／又は第２相薬物代謝酵素及び／又は薬物輸送体）の配列や発現がヒト化される「パネル」アプローチの価値を示す。
【０４００】
ｈｕＣＡＲ及びｋｏＣＡＲ
上述の他の箇所で記載のように、好ましいヒトＣＡＲ配列を本明細書の配列番号４に示す。この配列はイントロン２内に５３ｂｐのＰｈｉ−Ｃ３１認識部位（ａｔｔＢ５３）を含む。好ましいターゲティング戦略を図６６に示す。好ましいターゲティングベクターを図６７に示す。
【０４０１】
ｈｕＰＰＡＲα及びｋｏＰＰＡＲα
図６８に示すように、ヒトＰＰＡＲαをコードするＤＮＡ配列をマウスＰＰＡＲα遺伝子座に挿入して、マウスＰＰＡＲαプロモーターの制御下でヒトＰＰＡＲαを発現させることができる。ヒトＰＰＡＲαをコードするＤＮＡ配列は、ヒトＰＰＡＲα遺伝子のイントロン５及びイントロン６の少なくとも一部を含む（図６８）。ターゲティングベクターは、Ｃｒｅ介在によるＰＰＡＲαノックアウトによってｋｏＰＰＡＲαの産生を可能とする配列要素を含む（図６８）。
【０４０２】
ｈｕＡｈＲ及びｋｏＡｈＲ
図６９に示すように、ヒトＡｈＲをコードするＤＮＡ配列をマウスＡｈＲ遺伝子座に挿入して（ノックイン）、マウスＡｈＲプロモーターの制御下でヒトＡｈＲを発現させることができる。ヒトＡｈＲをコードするＤＮＡ配列は、ヒトＡｈＲ遺伝子のエクソン３〜１１を含む（図６９）。ターゲティングベクターは、Ｃｒｅ介在によるＡｈＲノックアウトによってｋｏＡｈＲの産生を可能とする配列要素を含む（図６９）。
【０４０３】
Ｂ．薬物代謝酵素
ｈｕＣＹＰ３Ａ４
図７０に示すように、ヒトＣＹＰ３Ａ４をコードするＤＮＡ配列をマウスＲｏｓａ２６遺伝子座に挿入して（ノックイン）、ヒトＣＹＰ３Ａ４プロモーターの制御下でヒトＣＹＰ３Ａ４を発現させることができる。ヒトＣＹＰ３Ａ４をコードするＤＮＡ配列は、ヒトＣＹＰ３Ａ４遺伝子のイントロン１を含むのが好ましい。
【０４０４】
ｋｏＣｙｐ３ａ１１
図７１に示すように、ＺｓＧｒｅｅｎレポーター遺伝子を相同組換えによってマウスＣｙｐ３ａ１１遺伝子座に挿入して、マウスＣｙｐ３ａ１１の発現を排除し、マウスＣｙｐ３ａ１１プロモーターの制御下でＺｓＧｒｅｅｎを発現させることができる。
【０４０５】
ｋｏＣｙｐ３ａ１１マウスにおけるＣｙｐ３ａ１１ｍＲＮＡ発現の消失
図９４は、生体異物剤が存在しない場合、又はデキサメタゾン（６０ｍｇ／ｋｇ体重）を投与した場合にはｋｏＣｙｐ３ａ１１マウスの肝臓でＣｙｐ３ａ１１ｍＲＮＡが発現しないことを示す。
【０４０６】
ｋｏＣｙｐ３ａ１１マウスにおける変化したミダゾラム代謝
本発明者らは、雄性ｋｏＣｙｐ３ａ１１マウスにおけるミダゾラムの薬物動態（ＭＤＺ、即ち、１−ヒドロキシミダゾラムを生成する代謝）についても、雄性野生型マウスと比較して研究した。図９５にプロットされたデータから明らかなように、１−ヒドロキシミダゾラムの生成は、ｋｏＣｙｐ３ａ１１（即ち、この場合にはｒＣｙｐ３ａ１１）マウスにおいて有意に抑制された。
【０４０７】
ｈｕＣＹＰ３Ａクラスター及びｋｏＣｙｐ３Ａクラスター
図７２に示すように、ヒトＣＹＰ３ＡクラスターをコードするＤＮＡ配列をｌｏｘＰ隣接マウスＣＹＰ３Ａクラスターに挿入して、ヒトＣＹＰ３Ａプロモーターの制御下でヒトＣＹＰ３Ａクラスターを発現させることができる。ターゲティングベクターは、マウスＣＹＰ３ＡクラスターのＣｒｅ介在欠失によってｋｏＣｙｐ３Ａの産生を可能とするｌｏｘＰ配列要素を含む（図７２Ｃ参照）。マウスＣＹＰ３ＡクラスターのＣｒｅ介在欠失の後にヒトＣＹＰ３ＡクラスターのＣｒｅ介在挿入を行い、ｈｕＣＹＰ３Ａを産生させる（図７２Ｃ）。ヒトＣＹＰ３ＡクラスターをマウスＣＹＰ３Ａクラスターに挿入した後、ターゲティングベクターにも存在するＦＲＴ部位を用いて選択カセットを欠失させる（図７２Ｃ）。
【０４０８】
ｈｕＣＹＰ３Ａ４及びｋｏＣｙｐ３ａクラスター
ヒトＣＹＰ３Ａ４をコードするＤＮＡ配列をＣｙｐ３ａ２５遺伝子座においてマウスＣｙｐ３ａクラスターに挿入して、１３ｋｂのヒトＣＹＰ３Ａ４プロモーターの制御下でヒトＣＹＰ３Ａ４を発現させることができる。マウスＣｙｐ３ａクラスターが欠失したマウスも作出することができる。
【０４０９】
ｈｕＣＹＰ２Ｃ９
図７３に示すように、ヒトＣＹＰ２Ｃ９をコードするＤＮＡ配列をマウスＲｏｓａ２６遺伝子座に挿入して、１２ｋｂのヒトＣＹＰ２Ｃ９プロモーターの制御下でヒトＣＹＰ２Ｃ９を発現させることができる。ヒトＣＹＰ２Ｃ９をコードするＤＮＡ配列は、１，２ｋｂのヒトＣＹＰ２Ｃ９イントロン４配列を含む（図７３）。
【０４１０】
ｈｕＣＹＰ２Ｃクラスター及びｋｏＣｙｐ２Ｃクラスター
図７４に示すように、ヒトＣＹＰ２ＣクラスターをコードするＤＮＡ配列をマウスＣＹＰ２Ｃクラスターに挿入して、ヒトＣＹＰ２Ｃプロモーターの制御下でヒトＣＹＰ２Ｃクラスターを発現させることができる。ターゲティングベクターは、マウスＣＹＰ２ＣクラスターのＣｒｅ介在欠失によってｋｏＣｙｐ２Ｃの産生を可能とするｌｏｘＰ配列要素を含む（図７４Ｃ）。マウスＣＹＰ２ＣクラスターのＣｒｅ介在欠失の後にヒトＣＹＰ２ＣクラスターのＣｒｅ介在挿入を行い、ｈｕＣＹＰ２Ｃを産生させる（図７４Ｃ）。ヒトＣＹＰ２ＣクラスターをマウスＣＹＰ２Ｃクラスターに挿入した後、ターゲティングベクターにも存在するＦＲＴ部位を用いて選択カセットを欠失させる（図７４Ｃ）。
【０４１１】
ｈｕＣＹＰ２Ｃ９及びｋｏＣｙｐ２ｃクラスター
ヒトＣＹＰ２Ｃ９をコードするＤＮＡ配列をマウスＣｙｐ２ｃクラスターに挿入して、１２ｋｂのヒトＣＹＰ２Ｃ９プロモーターの制御下でヒトＣＹＰ２Ｃ９を発現させることができる。マウスＣｙｐ２ｃクラスターが欠失したマウスも作出することができる。
【０４１２】
ｈｕＣＹＰ２Ｄ６及びｋｏＣｙｐ２Ｄクラスター
ヒトＣＹＰ２Ｄ６をコードするＤＮＡ配列をマウスＣｙｐ２ｄクラスターに挿入して、９ｋｂのヒトＣＹＰ２Ｄ６プロモーターの制御下でヒトＣＹＰ２Ｄ６を発現させることができる。マウスＣｙｐ２ｄクラスターが欠失したマウスも作出することができる。
【０４１３】
ｈｕＣＹＰ３Ａ４及びｋｏＣｙｐ３ａ１１
ヒトＣＹＰ３Ａ４をコードするＤＮＡ配列をＣｙｐ３ａ１１遺伝子座においてマウスＣｙｐ３ａクラスターに挿入して、マウスＣｙｐ３ａ１１プロモーターの制御下でヒトＣＹＰ３Ａ４を発現させることができる。マウスＣｙｐ３ａクラスターが欠失したマウスも作出することができる。
【０４１４】
ｈｕＣＹＰ１Ａ１／ＣＹＰ１Ａ２及びｋｏＣｙｐ１Ａ１／ＣＹＰ１Ａ２
ヒトＣＹＰ１Ａ１及びヒトＣＹＰ１Ａ２をコードするＤＮＡ配列をマウスＣｙｐ１ａクラスターに挿入して、ヒトＣＹＰ１Ａ１及びＣＹＰ１Ａ２プロモーターの制御下でヒトＣＹＰ１Ａ１及びヒトＣＹＰ１Ａ２を発現させることができる。マウスＣｙｐ１ａクラスターが欠失したマウスも作出することができる。
【０４１５】
ｈｕＵＧＴクラスター及びｋｏＵＧＴクラスター
図７５に示すように、ヒトＵｇｔ１クラスターをコードするＤＮＡ配列をマウスＵｇｔ１クラスターに挿入して、ヒトＵｇｔ１プロモーターの制御下でヒトＵｇｔ１クラスターを発現させることができる。ターゲティングベクターは、マウスＵｇｔ１クラスターのＣｒｅ介在欠失によってｋｏＵＧＴの産生を可能とするｌｏｘＰ配列要素を含む（図７５Ｃ）。マウスＵｇｔ１クラスターのＣｒｅ介在欠失の後にヒトＵｇｔ１クラスターのＣｒｅ介在挿入を行い、ｈｕＵＧＴを産生させる（図７５Ｃ）。ヒトＵｇｔ１クラスターをマウスＵｇｔ１クラスターに挿入した後、ターゲティングベクターにも存在するＦＲＴ部位を用いて選択カセットを欠失させる（図７５Ｃ）。
【０４１６】
Ｃ．薬物輸送タンパク質
ｈｕＭＤＲ１／ｍｄｒ１ａ-/-
図７６に示すように、ヒトＭＤＲ１をコードするＤＮＡ配列をマウスＭｄｒ１ａ遺伝子座に挿入して、マウスＭｄｒ１ａプロモーターの制御下でヒトＭＤＲ１を発現させることができる。ヒトＭＤＲ１をコードするＤＮＡ配列は、最初のＡＴＧから開始するヒトＭＤＲ１ｃＤＮＡ配列である。
【０４１７】
ｈｕＭＤＲ１／ｍｄｒ１ｂ-/-
図７７に示すように、ヒトＭＤＲ１をコードするＤＮＡ配列をマウスＭｄｒ１ｂ遺伝子座に挿入して、マウスＭｄｒ１ｂプロモーターの制御下でヒトＭＤＲ１を発現させることができる。ヒトＭＤＲ１をコードするＤＮＡ配列は、最初のＡＴＧから開始するヒトＭＤＲ１ｃＤＮＡ配列である。
【０４１８】
ｈｕＭＤＲ１／ｍｄｒ１ａ-/-／ｍｄｒ１ｂ-/-
最初のＡＴＧから開始するヒトＭＤＲ１のｃＤＮＡ配列をマウスＭｄｒ１ａ遺伝子座及びＭｄｒ１ｂ遺伝子座の両方に挿入して、マウスＭｄｒ１ａ及びＭｄｒ１ｂプロモーターの制御下でヒトＭＤＲ１を発現させることができる。このターゲティングは、Ｍｄｒ１ａ及びＭｄｒ１ｂの単一ヒト化の場合と同様に、即ち、図７６に示す戦略に従いＭｄｒ１ａ遺伝子座で予め操作されたＥＳ細胞において図７７に示すようにＭｄｒ１ｂを標的にするのと同様に成される。
【０４１９】
ｈｕＭＲＰ２
図７８に示すように、ヒトＭＰＲ２をコードするｃＤＮＡ配列をマウスＭｒｐ２遺伝子座に挿入し、マウスＭｒｐ２プロモーターの制御下でヒトＭＲＰ２を発現させることができる。この戦略においては、（ｉ）エクソン１によってコードされるマウスリーダーを保持し、（ｉｉ）ヒトｃＤＮＡをエクソン２上に導入してスプライス部位を保持し、（ｉｉｉ）ヒト転写物をポリＡモチーフによって終結させ、（ｉｖ）全イントロン２配列を保持する。
【０４２０】
図１０６はＲＴ−ＰＣＲによるｈｕＭＲＰ２マウスの特徴付けを示す。ヒトＭＲＰ２導入遺伝子から生じる予測サイズのＰＣＲ産物が見られた。
【０４２１】
また、本発明者らはｈｕＰＸＲ／ｈｕＭＲＰ２マウスも作出した。ｈｕＰＸＲ／ｈｕＭＲＰ２マウスと野生型マウスの尿中ビリルビンレベルを比較したが、総ビリルビン及び直接ビリルビンのいずれについても有意差が見られなかった（図１０７参照）。これに対し、ＭＲＰ２-/-マウスにおいては、直接ビリルビンレベルが野生型マウスに比べて６倍高い（総ビリルビンについては差がない）ことが先に報告されている（Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 317: 579(2006)参照）。ｈｕＰＸＲ／ｈｕＭＲＰ２マウスにおいてこのような差がないことは、ｈｕＭＲＰ２が機能的であることを示す。
【０４２２】
Ｄ．レポーター戦略
ｒＣＹＰ２Ｂ６
図７９に示すように、ＬａｃＺレポーター遺伝子及び転写的に連結しているヒトＣＹＰ２Ｂ６プロモーター（最大７０ｋｂ、ＢＡＣ挿入の程度によって決まる）をＢＬ６ＥＳ細胞におけるマウスＣｙｐ２ｂ６遺伝子座のエクソン１に挿入する。図７９に示すように、ＦＲＰ部位及びＦＬＰリコンビナーゼを用いて選択マーカーｋｅｏを欠失させる。この戦略によって、ヒトＣＹＰ２Ｂ６プロモーターの制御下でマウスにおいてＬａｃＺレポーター遺伝子を発現させることができる。
【０４２３】
ｒＣＹＰ２Ｂ６レポーターマウスの検証については図１０８に示す。
【０４２４】
ｒＣＹＰ２Ｄ６
図８０に示すように、ＺｓＹｅｌｌｏｗレポーター遺伝子及び転写的に連結しているヒトＣＹＰ２Ｄ６プロモーター（最大５０ｋｂ、ＢＡＣ挿入の程度によって決まる）をＢＬ６ＥＳ細胞におけるマウスＣｙｐ２ｄ６遺伝子座のエクソン１に挿入する。図８０に示すように、ＦＲＰ部位及びＦＬＰリコンビナーゼを用いて選択マーカーｋｅｏを欠失させる。この戦略によって、ヒトＣＹＰ２Ｄ６プロモーターの制御下でマウスにおいてＺｓＹｅｌｌｏｗレポーター遺伝子を発現させることができる。
【０４２５】
ＣＹＰ２Ｄ６レポーターマウスの検証については図１０９に示す。
【０４２６】
ｒＣＹＰ３Ａ４
図８１に示すように、ｈＣＧ−ＺｓＧｒｅｅｎレポーター遺伝子及び転写的に連結しているヒトＣＹＰ３Ａ４プロモーター（最大４０ｋｂ、ＢＡＣ挿入の程度によって決まる）をＢＬ６ＥＳ細胞におけるマウスＣｙｐ３ａ４遺伝子座のエクソン１に挿入する。図８１に示すように、ＦＲＰ部位及びＦＬＰリコンビナーゼを用いて選択マーカーｋｅｏを欠失させる。この戦略によって、ヒトＣＹＰ３Ａ４プロモーターの制御下でマウスにおいてｈＣＧ−ＺｓＧｒｅｅｎレポーター遺伝子を発現させることができる。
【０４２７】
ＣＹＰ３Ａ４レポーターマウスの検証については図１１０に示す。
【０４２８】
ｒＣｙｐ３ａ１１
図８２に示すように、ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子をマウスＣｙｐ３ａ１１遺伝子座のエクソン１に挿入する。この戦略によって、マウスＣｙｐ３ａ１１プロモーターの制御下でマウスにおいてｈＣＧ−ＺｓＧｒｅｅｎレポーター遺伝子を発現させることができる。或いは、ＺｓＧｒｅｅｎレポーター遺伝子を用いてこの手順を行う（図７１）。
【０４２９】
ｒＭＤＲ１
図８３に示すように、エクソン１を含む１０ｋｂのヒトＭＤＲ１上流プロモーター（ＵＳＰ）とエクソン２及び３を含む１５ｋｂの下流プロモーター（ＤＳＰ）をホタルルシフェラーゼの開始ＡＴＧに融合させる。ＵＳＰ及びＤＳＰは、ＭＤＲ１発現の必須要素として幾つかの刊行物に記載されている（Ueda K, Pastan I and Gottesman MM, 1987, Isolation and sequence of the promoter region of the human multidrug-resistance (P-glycoprotein) gene., J Biol Chem., Dec 25; 262(36): 17432-6、Chen CJ, Clark D, Ueda K, Pastan I, Gottesman MM and Roninson IB, 1990, Genomic organization of the human multidrug resistance (MDR1) gene and origin of P-glycoproteins, J Biol Chem., Jan 5; 265(1): 506-14、Raguz S, Tamburo De Bella M, Tripuraneni G, Slade MJ, Higgins CF, Coombes RC and Yague E, 2004, Activation of the MDR1 upstream promotor in breast carcinoma as a surrogate for metastatic invasion, Clin Cancer Res. Apr 15; 10(8): 2776-83）。図８３に示すように、ターゲティングベクターは、相同組換えによるＲＯＳＡ２６遺伝子座への標的遺伝子組換えに用いる。
【０４３０】
これらの具体的なターゲティング戦略は、本明細書に記載の遺伝子型（複合遺伝子型を含む）を有するトランスジェニックマウス、該マウス由来の組織又は細胞を作出するのに好ましい戦略である。
【０４３１】
実施例６：２段階のクラスター欠失及びヒト化
６．１：対応するヒトプロモーターを用いたＣＹＰ３Ａ４ヒト化及びマウスＣＹＰ３Ａクラスターのノックアウト
図１１１に示すように、マウスＣＹＰ３ＡクラスターをｌｏｘＰ部位及びＦＲＴ部位に隣接させ、ＣＹＰ３Ａ４発現カセットをマウスクラスターの一端において挿入して、１３ｋｂのヒトＣＹＰ３Ａ４プロモーターの制御下でヒトＣＹＰ３Ａ４を発現させることができた。
【０４３２】
ターゲティングベクターに含まれるｌｏｘＰ配列要素によって、マウスＣＹＰ３ＡクラスターのＣｒｅ介在欠失が可能となり、対応するマウス遺伝子の非存在下でＣＹＰ３Ａ４を発現させることができる（図１１１参照）。
【０４３３】
次に、ＦＲＴ配列要素によって、ヒト発現カセットのＦｌｐ介在欠失が可能となり、その結果、マウスＣＹＰ３Ａ遺伝子座における完全なノックアウトがもたらされる（図１１１）。
【０４３４】
６．２：対応するヒトプロモーターを用いたＣＹＰ２Ｃ９ヒト化及びマウスＣＹＰ２Ｃクラスターのノックアウト
図１１２に示すように、マウスＣＹＰ２ＣクラスターをｌｏｘＰ部位及びＦＲＴ部位に隣接させ、ＣＹＰ２Ｃ９発現カセットをマウスクラスターの一端において挿入して、１２ｋｂのヒトＣＹＰ２Ｃ９プロモーターの制御下でヒトＣＹＰ２Ｃ９を発現させることができた。
【０４３５】
ターゲティングベクターに含まれるｌｏｘＰ配列要素によって、マウスＣＹＰ２ＣクラスターのＣｒｅ介在欠失が可能となり、対応するマウス遺伝子の非存在下でＣＹＰ２Ｃ９を発現させることができる（図１１２）。
【０４３６】
次に、ＦＲＴ配列要素によって、ヒト発現カセットのＦｌｐ介在欠失が可能となり、その結果、マウスＣＹＰ２Ｃ遺伝子座における完全なノックアウトがもたらされる（図１１２）。
【０４３７】
６．３：対応するヒトプロモーターを用いたＣＹＰ２Ｄ６ヒト化及びマウスＣＹＰ２Ｄクラスターのノックアウト
図１１３に示すように、マウスＣＹＰ２ＤクラスターをｌｏｘＰ部位及びＦＲＴ部位に隣接させ、ＣＹＰ２Ｄ６発現カセットをマウスクラスターの一端において挿入して、９ｋｂのヒトＣＹＰ２Ｄ６プロモーターの制御下でヒトＣＹＰ２Ｄ６を発現させることができた。
【０４３８】
ターゲティングベクターに含まれるｌｏｘＰ配列要素によって、マウスＣｙｐ２ｄクラスターのＣｒｅ介在欠失が可能となり、対応するマウス遺伝子の非存在下でＣＹＰ２Ｄ６を発現させることができる。
【０４３９】
特定のプライマーを用いて、ＰＣＲによるマウス染色体の解析を行うことができた。その結果から、所望のヒト置換ＣＹＰ２Ｄ遺伝子配列の導入及びマウスＣｙｐ２ｄクラスターの欠失が成功したことが分かる（図１１４参照）。
【０４４０】
次に、ＦＲＴ配列要素によって、ヒト発現カセットのＦｌｐ介在欠失が可能となり、その結果、マウスＣＹＰ２Ｄ遺伝子座における完全なノックアウトがもたらされる（図１１３）。
【０４４１】
６．４：マウスＣｙｐ３ａ１１プロモーターを用いたＣＹＰ３Ａ４ヒト化及びマウスＣＹＰ３Ａクラスターのノックアウト
図１０に示すように、ヒトＣＹＰ３Ａ４をコードするＤＮＡ配列をＣｙｐ３ａ１１遺伝子座においてマウスＣｙｐ３ａクラスターに挿入して、マウスＣｙｐ３ａ１１プロモーターの制御下でヒトＣＹＰ３Ａ４を発現させることができる。このターゲティング戦略は、ＣＹＰ３Ａ４プロモーターを用いて行うことができない場合もある、雄性マウスにおけるＣＹＰ３Ａ４の発現を可能にするようにデザインされる。
【０４４２】
ヒトＣＹＰ３Ａ４をコードするＤＮＡ配列は、ヒトＣＹＰ３Ａ４遺伝子のイントロン１の少なくとも一部を含む（図１１５参照）。
【０４４３】
図１０に示すように、ターゲティングベクターにはＦＲＴ部位が含まれているため、選択マーカー（図１１５のｎｅｏR）は、野生型のマウスＣｙｐ３ａ１１遺伝子座へヒトＣＹＰ３Ａ４を挿入した後、ＦＬＰ欠失株と交雑させることによって欠失させることができる。
【０４４４】
図示のように、ターゲティングベクターにはｌｏｘＰ部位及びＦＲＴ部位の両方が含まれているため、ヒトＣＹＰ３Ａ４をＣｙｐ３ａクラスター５’標的細胞に挿入する場合、マウスＣｙｐ３ａ１１クラスターの多くはＦＬＰ欠失株又はＣｒｅ欠失株と交雑させることによって欠失させることができる。
【０４４５】
実施例７：複数のクラスターのノックアウト及び／又は置換
７．１：Ｃｙｐ３ａクラスター交換
相同組換えによってマウスＣｙｐ３ａクラスターの５’末端を標的にして、図１１７ａに示すように、ｆｒｔ、ｌｏｘ５１７１及び野生型ｌｏｘＰ部位がＣｙｐ３ａ５７遺伝子のエクソン１の下流に挿入されるようにした。更に、図示のように、ハイグロマイシン耐性カセットとチミジンキナーゼ（ＴＫ）発現カセットを共導入した。
【０４４６】
マウスＣｙｐ３ａクラスターの３’末端における次の相同組換え工程によって、正しく標的されたＥＳ細胞を更に改変して、野生型ｌｏｘＰ及びｆ３部位がＣｙｐ３ａ５９遺伝子のエクソン４の下流に挿入されるようにした。図１１７ｂに示すように、５’欠損ネオマイシン耐性カセットとＴＫ発現カセットを共導入した。翻訳開始ＡＴＧは、ｌｏｘＰ部位によって５’欠損ネオマイシン耐性カセットからインフレームで分離させて、ｌｏｘＰ部位によってコードされる他のアミノ酸がネオマイシンタンパク質のＮ末端に付着するようにする。
【０４４７】
Ｃｒｅ介在組換えによってマウスＣｙｐ３ａクラスターの欠失を可能とするためには、クラスター両端におけるターゲティングを同一対立遺伝子上で行う必要がある。これについては、Ｃｒｅを用いた二重標的ＥＳ細胞のトランスフェクションとそれに続くガンシクロビルを用いた選択によってインビトロで試験した。図１１７ｅに示すように、同一対立遺伝子上でターゲティングを行った細胞においてのみ、ＴＫ遺伝子はクラスターの両端で欠失し、ヌクレオシド類似体ガンシクロビルから毒性三リン酸類似体へのＴＫ介在転化が防止される。従って、同一対立遺伝子上でターゲティングを行ったＥＳ細胞のみがガンシクロビル選択後も生存する。
【０４４８】
生存ＥＳ細胞クローンをＰＣＲで更に解析し、マウスＣｙｐ３ａクラスターが欠失し、ＰＣＲ陽性クローンが胚盤胞に注入されてキメラマウスが作出されたことを確認した。その後の交雑によって、Ｃｙｐ３ａクラスターがホモ欠損したマウスを最終的に作出した。
【０４４９】
その後、ＥＳ細胞に残存する野生型ｌｏｘＰ及びｌｏｘ５１７１部位を用い、Ｃｒｅ介在挿入によって置換遺伝子（例えば、ヒトＣＹＰ３Ａクラスター）をマウスクラスターの前の位置において挿入することができる。残存プロモーター、ＡＴＧ及びインフレーム野生型ｌｏｘＰ部位を用いて、５’欠損選択カセット（例えば、５’欠損ネオマイシン）を再度挿入し、高効率で正しく挿入されたクローンを選択することができる。更なるｆｒｔ部位及びｆ３部位が正しい方向に置換カセットと共に共導入されている場合には、両端におけるｆｒｔ部位及びｆ３部位を用い、Ｆｌｐ介在欠失によって、置換遺伝子と共に導入された選択カセットを欠失させることができる。
【０４５０】
Ｃｙｐ３ａ５７の８００ｂｐ上流に位置し、Ｃｙｐと無関係の多数の遺伝子によってマウスＣｙｐ３ａクラスターから離れているＣｙｐ３ａ１３遺伝子は、上述のマウスＣｙｐ３ａクラスターの欠失に影響されない。
【０４５１】
７．２：Ｃｙｐ２ｃクラスター交換
相同組換えによってマウスＣｙｐ２ｃクラスターの５’末端を標的にして、野生型ｌｏｘＰ及びｆ３部位がＣｙｐ２ｃ５５遺伝子のエクソン１の下流に挿入されるようにした。図２ａに示すように、５’欠損ネオマイシン耐性カセットとＴＫ発現カセットを共導入した。翻訳開始ＡＴＧは、ｌｏｘＰ部位によって５’欠損ネオマイシン耐性カセットからインフレームで分離させて、ｌｏｘＰ部位によってコードされる他のアミノ酸がネオマイシンタンパク質のＮ末端に付着するようにする。
【０４５２】
マウスＣｙｐ２ｃクラスターの３’末端における次の相同組換え工程によって、正しく標的されたＥＳ細胞を更に改変して、図２ｂに示すように、ｆｒｔ、ｌｏｘ５１７１及び野生型ｌｏｘＰ部位がＣｙｐ２ｃ７０遺伝子のエクソン５の下流に挿入されるようにした。更に、図示のように、ハイグロマイシン耐性カセットとチミジンキナーゼ（ＴＫ）発現カセットを共導入した。
【０４５３】
Ｃｒｅ介在組換えによってマウスＣｙｐ２ｃクラスターの欠失を可能とするためには、クラスター両端におけるターゲティングを同一対立遺伝子上で行う必要がある。これについては、Ｃｒｅを用いた二重標的ＥＳ細胞のトランスフェクションとそれに続くガンシクロビルを用いた選択によってインビトロで試験した。図１１８ｃに示すように、同一対立遺伝子上でターゲティングを行った細胞においてのみ、ＴＫ遺伝子はクラスターの両端で欠失し、ヌクレオシド類似体ガンシクロビルから毒性三リン酸類似体へのＴＫ介在転化が防止される。従って、同一対立遺伝子上でターゲティングを行ったＥＳ細胞のみがガンシクロビル選択後も生存する。生存ＥＳ細胞クローンをＰＣＲで更に解析し、マウスＣｙｐ２ｃクラスターが欠失し、ＰＣＲ陽性クローンが胚盤胞に注入されてキメラマウスが作出されたことを確認した。その後の交雑によって、Ｃｙｐ２ｃクラスターがホモ欠損したマウスを最終的に作出した。
【０４５４】
その後、ＥＳ細胞に残存する野生型ｌｏｘＰ及びｌｏｘ５１７１部位を用い、Ｃｒｅ介在挿入によって置換遺伝子（例えば、ヒトＣＹＰ２Ｃクラスター）をマウスクラスターの前の位置において挿入することができる。残存プロモーター、ＡＴＧ及びインフレーム野生型ｌｏｘＰ部位を用いて、５’欠損選択カセット（例えば、５’欠損ネオマイシン）を再度挿入し、高効率で正しく挿入されたクローンを選択することができる。更なるｆｒｔ部位及びｆ３部位が正しい方向に置換カセットと共に共導入されている場合には、両端におけるｆｒｔ部位及びｆ３部位を用い、Ｆｌｐ介在欠失によって、置換遺伝子と共に導入された選択カセットを欠失させることができる。
【０４５５】
７．３：Ｃｙｐ２ｄクラスター欠失
相同組換えによってマウスＣｙｐ２ｄクラスターの３’末端を標的にして、図１１９ａに示すように、ｆｒｔ、ｌｏｘ５１７１及び野生型ｌｏｘＰ部位がＣｙｐ２ｄ２６遺伝子のエクソン１の下流に挿入されるようにした。更に、図示のように、ハイグロマイシン耐性カセットを共導入した。続くマウスクラスターの欠失によって無傷のＣｙｐ２ｄ２６プロモーターとＣｙｐ２ｄ２６遺伝子のエクソン１が残るが、これらは、後述のようにクラスターの５’末端において挿入されるヒトＣＹＰ２Ｄ６の発現を妨げる可能性があるため、Ｃｙｐ２ｄ２６プロモーターからの発現を終結させる３’ターゲティングベクターにスプライスアクセプターポリアデニル化モチーフ（ｓＡｐＡ）を含有させた。
【０４５６】
マウスＣｙｐ２ｄクラスターの５’末端における次の相同組換え工程によって、正しく標的されたＥＳ細胞を更に改変して、図１１９ｂに示すように、ｆｒｔ部位、野生型ｌｏｘＰ部位及びネオマイシン耐性カセット３’によってｌｏｘＰ部位に隣接させたヒトＣＹＰ２Ｄ６発現カセットがＣｙｐ２ｄ２２遺伝子のエクソン３の下流に挿入されるようにした。
【０４５７】
ｌｏｘＰ部位におけるＣｒｅ介在組換えによってヒト発現カセットを維持しながらマウスＣｙｐ２ｄクラスターを欠失させることができるが、Ｃｙｐ２ｄ遺伝子座の完全なノックアウト（図３ｃに示す）をもたらすマウスクラスターとヒト発現カセットの同時欠失は、ｆｒｔ部位におけるＦｌｐ介在組換えの結果である。
【０４５８】
Ｃｒｅ介在又はＦｌｐ介在組換えによってマウスＣｙｐ２ｄクラスターの欠失を可能とするためには、クラスター両端におけるターゲティングを同一対立遺伝子上で行う必要がある。従って、Ｃｒｅを用いたインビトロ欠失によって二重標的ＥＳクローンを更に解析した後、クラスターの欠失を可能とするプライマー対を用いてＰＣＲ解析を行った。インビトロＣｒｅ欠失はトランスフェクト細胞の一部でしか生じず、また、欠失が成功した個々の細胞を選択することができないため、ＰＣＲ解析は欠失クローン及び未欠失クローンのプールに対して行った。ＰＣＲ陽性未欠失親クローンを胚盤胞に注入してキメラマウスを作出した。Ｃｒｅ又はＦｌｐ欠失株、或いは各リコンビナーゼを組織特異的に発現する株と交雑させた後に交雑受精させることによって、全身又は特定の組織において欠失し、ヒト発現カセットを含む（又は含まない）ホモ接合Ｃｙｐ２ｄクラスター欠失マウスが作出される。
【０４５９】
実施例８：非遺伝毒性発癌作用の検討
８．１：二重ホモ接合ＰＸＲ／ＣＡＲヒト化マウスにおいてマウスＰＸＲ遺伝子がヒトカウンターパートと交換されたことのＰＣＲ確認
ＰＸＲ及びＣＡＲをヒト化したマウス（「ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ」）の作出の際には、ヒト化ＰＸＲを含むマウスを用い、このマウスをヒト化ＣＡＲを含むマウスと交雑し、ヒト化ＰＸＲ及びヒト化ＣＡＲの両方を含むマウスを作出した。該マウスは目視検査の結果、表現型が正常である。ＰＣＲを用いて該マウスをタイピングした（図２８参照）が、ＰＸＲ及びＣＡＲがホモ接合的にヒト化されている。その例としては、「４２７４９」及び「４２７５２」と称されるマウスが挙げられる。
【０４６０】
ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウスにおいてＰＸＲｍＲＮＡ及びＣＡＲｍＲＮＡの転写はＲＴ−ＰＣＲによって定量し、野生型マウス、ｈｕＰＸＲマウス及びｈｕＣＡＲマウスにおける対応するｍＲＮＡ発現の相対レベルと比較した（図１２１）。これによって、ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウスは、単一遺伝子をヒト化したマウスで見られるヒトＰＸＲ及びヒトＣＡＲの発現のレベルを維持することが確認された。
【０４６１】
野生型マウス、ｈｕＰＸＲマウス及びｈｕＣＡＲマウスと同様に、二重ヒト化ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウスを誘導剤リファンピシン及び／又はフェノバルビタールで処理した。これらの誘導剤処理マウスにおけるＣｙｐ２ｂ１０及びＣｙｐ３ａ１１の発現は、対応する非処理マウスと同様に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとそれに続くウェスタンブロッティングによって可視化し、比較した（図１２２）。図１２２においては、ｈｕＰＸＲマウス、ｈｕＣＡＲマウス及びｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウスにおけるＣｙｐ２ｂ１０とＣｙｐ３ａ１１の基礎レベルを、野生型マウスで見られる基礎レベルと比較する。この相対的定量から、基礎Ｃｙｐ２ｂ１０レベルは、ｈｕＰＸＲ→ｈｕＣＡＲ→ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲの順で増加することが分かる。しかし、基礎Ｃｙｐ３ａ１１レベルはｈｕＣＡＲマウスではあまり顕著に増加しなかった。Ｃｙｐ３ａ１１レベルはｈｕＰＸＲマウス及び二重ヒト化ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウスの両方においてほぼ同程度（２倍超）に増加した。
【０４６２】
ヒト特異的誘導剤リファンピシンによる処理によって、全てのマウスでＣｙｐ３ａ１１のレベルが増加した。リファンピシンとフェノバルビタールを併用投与した場合、野生型マウスでは付加的作用は見られなかったが、ｈｕＰＸＲマウスではＣｙｐ３ａ１１が多少強く誘導された。
【０４６３】
８．２：二重ホモ接合ＰＸＲ／ＣＡＲヒト化マウスにおけるペントバルビトン睡眠試験
この実験においては、バルビツール酸塩誘導睡眠時間を測定することによってこれらの転写因子の組合せの活性を求めた。長年、睡眠時間は肝シトクロムＰ４５０活性に正比例することが知られており、この活性は、ＣＡＲ及びＰＸＲの機能によって決まる肝臓内のＰ４５０レベルに少なくとも一部起因し得る。
【０４６４】
マウスに対して、Ｎａｒｃｏｒｅｎ（ペントバルビトンナトリウム；ドイツ、メリアル社で販売、Veterinary Consultant経由で購入）を腹腔内単回投与した（２５ｍｇ／ｋｇ体重）。マウスが正向反射を消失した後、回復するまでの時間を測定した。結果を下表１に示す。
【０４６５】
【表１１】
2010528644.tif 000012
【０４６６】
麻酔量のペントバルビトンを投与した野生型マウスの睡眠時間は２１分間であったが、ＣＡＲ及びＰＸＲの二重ヒト化マウスの睡眠時間は３４分間であった。従って、二重ヒト化マウスは野生型対照に対して有意差を示したが、この結果から、二重ヒト化マウスは野生型マウスに比べて薬物に対する反応が顕著に異なることが分かる。
【０４６７】
上述の８．１及び８．２における研究の概要
予測されたように内在性遺伝子と等価なレベルでマウスの肝臓及び消化管の両方においてヒトＰＸＲを発現するモデルを開発した。この経路によって遺伝子発現を誘導することが知られている化合物にマウスが反応するため、ＰＸＲタンパク質は機能的であることが示された。
【０４６８】
また、ＣＡＲ遺伝子についての等価なヒト化も成された（ｈｕＣＡＲマウス）。野生型マウスとヒト化マウスとの系統差が示され、ヒト化マウスは、マウスよりもヒトにおいて高い活性を示す（即ち、マウスＰＸＲやマウスＣＡＲよりもヒトＰＸＲやヒトＣＡＲに対する活性の高い）ことが知られている化合物に対する反応性が高いことが示された。ノックアウト系の構築はＰＸＲ遺伝子及びＣＡＲ遺伝子の両方についても確認された（ｋｏＰＸＲ及びｋｏＣＡＲ）。
【０４６９】
更に、ヒト化ＰＸＲを含んだマウスをヒト化ＣＡＲを含んだマウスと交雑させて、ヒト化ＰＸＲ及びヒト化ＣＡＲの両方を含むマウスを作出した。
【０４７０】
８．３：ｈｕＰＰＡＲα及びｋｏＰＰＡＲα
図１２３に示すように、ヒトＰＰＡＲαをコードするＤＮＡ配列をマウスＰＰＡＲα遺伝子座に挿入して、マウスＰＰＡＲαプロモーターの制御下でヒトＰＰＡＲαを発現させることができる。ヒトＰＰＡＲαをコードするＤＮＡ配列は、ヒトＰＰＡＲα遺伝子のイントロン５及びイントロン６の少なくとも一部を含む（図１２３）。ターゲティングベクターは、Ｃｒｅ介在によるＰＰＡＲαノックアウトによってｋｏＰＰＡＲαの産生を可能とする配列要素を含む（図１２３）。
【０４７１】
８．４：ｈｕＡｈＲ及びｋｏＡｈＲ
図１２４に示すように、ヒトＡｈＲをコードするＤＮＡ配列をマウスＡｈＲ遺伝子座に挿入して（ノックイン）、マウスＡｈＲプロモーターの制御下でヒトＡｈＲを発現させることができる。ヒトＡｈＲをコードするＤＮＡ配列は、ヒトＡｈＲ遺伝子のエクソン３〜１１を含む（図１２４）。ターゲティングベクターは、Ｃｒｅ介在によるＡｈＲノックアウトによってｋｏＡｈＲの産生を可能とする配列要素を含む（図１２４）。
【０４７２】
８．５：概念の証明：げっ歯動物における非遺伝毒性発癌物質（ＰＢ）の作用
フェノバルビタール（以下「ＰＢ」とする）は、マウスやラットにおいて肝臓癌を引き起こすことが知られているが、ヒトにおいてはそのようなことはない。ＰＢに対して長期間処理を行った後、げっ歯動物では肝腫瘍が発生する。まず、ＰＢによって過形成反応や細胞複製が引き起こされ、処理の最初の２週間で肝臓重量が増加する。しかし、約２年後、ＰＢ処理動物においては肝腫瘍が明らかになる。この種の解析から、ＰＢをヒトにおいて用いるのは危険だと考えられるだろう。しかし、実際にはＰＢは安全であり、長年に亘って販売されており、ＰＢ処理患者において肝腫瘍が発生した記録も無い。このことは、ヒトにおける薬物の安全性を試験する上で現在の動物モデルが不十分であることを示しており、また、安全性試験プロセスのこの段階で不必要に薬物を削減していることを意味する。製薬会社が試験段階のできるだけ早期に答えるべき問題は、動物において見られる化学薬品に対する過形成反応が実際にヒトと関連するのか？ということである。
【０４７３】
転写因子ＣＡＲは、ＰＢ様の誘導剤に対する反応に必須であることが知られている。ウェイ（Wei）らは２０００年（Ｎａｔｕｒｅ）に、野生型マウスにおいて、細胞肥大や過形成反応を反映する肝臓質量がＣＡＲアクチベーターによって増加したことを示した。これに対し、ＣＡＲ  ＫＯマウスにおいては、ＣＡＲアクチベーター処理後も肝臓質量の増加が見られなかった。また、ＣＡＲ  ＫＯマウスにおいては、野生型マウスでＢｒｄＵ取り込みの増加によって確認されるＤＮＡ合成の誘導も見られなかった。同様に、チェウン（Cheung）らは２００４年に、野生型マウスにおいて様々な薬剤による処理で生じる肝臓重量の増加が、マウスのＰＰＡＲαのヒト化によって抑制されたことを示した。また、ヒト化マウスにおいては、野生型マウスで見られるような複製ＤＮＡ合成の増加も欠如していることが分かった。
【０４７４】
ヒトにおけるＰＢに対する反応をヒト化ＰＸＲ／ＣＡＲマウスが模倣するかどうか評価するため、ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウスモデルとＰＸＲＫＯ／ＣＡＲＫＯマウスモデルを用いた。変異マウス株はアーテミス（Artemis）から入手した。野生型（ＷＴ）マウス株Ｃ５７ＢＬ／６Ｊはハーラン（Harlan）（英国）から入手した。マウスは全て１０〜１６週齢であった。次のパラメータについて研究した。
・肝臓／身体重量比
・細胞増殖の基準として解析したＢｒｄＵ取り込み
・ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）肝臓病理組織学
・肝ミクロソームにおけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティングによるＰ４５０類の発現及び活性
・肝臓においてＴＵＮＥＬアッセイで解析されたアポトーシス指数
【０４７５】
研究には６群のマウス（１０匹のＷＴマウス／群、９〜１０匹のＰＸＲＫＯ／ＣＡＲＫＯマウス／群、及び９匹のｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウス／群）を用いた（表２）。ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ、１５ｍｇ／ｍＬリン酸緩衝食塩水［ＰＢＳ］溶液、ｐＨ７．４）を含む浸透圧ポンプ（Ａｌｚｅｔ  ２００１）を全てのマウスに埋め込み（１日目）、５日後全てのマウスについて終了させた。施術後、どのマウスにも異常は見られなかった。表２に詳述するように、埋め込み１日後から全てのマウスに８０ｍｇ／ｋｇのＰＢ／生理食塩水又は生理食塩水のみを腹腔内注射によって４日間投与した。
【０４７６】
【表１２】
2010528644.tif 000013
【０４７７】
ＰＢによるＰＸＲ／ＣＡＲ依存的肝腫
ＰＢ又は媒体によって処理した後、マウスを殺し、その肝臓を取り出して重量を測った。ＰＢ処理に対し、ＷＴマウス及び「ヒト化」マウスの両方で肝腫が見られた（肝臓／身体重量比がそれぞれ１１８％及び１２２％増加したことによって分かる）が、ＰＸＲＫＯ／ＣＡＲＫＯマウスでは見られなかった（表３、図１２６）。
【０４７８】
【表１３】
2010528644.tif 000014
【０４７９】
肝細胞増殖
全てのマウスの肝臓切片及び十二指腸切片に対し、細胞増殖の基準としてのＢｒｄＵ取り込みについて解析した。方法としては間接ＢｒｄＵ標識アッセイを用いた。ＷＴマウスではＰＢによって肝細胞標識指数（Ｓ期）が約５倍増加したが、ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウスやＰＸＲＫＯ／ＣＡＲＫＯマウスでは細胞増殖に対するＰＢの作用が見られなかった（図１２７、表４）。
【０４８０】
肝臓in situ細胞死
非遺伝毒性発癌物質による肝細胞アポトーシスの５０％抑制については、ラットでは既に一貫して示されている。しかし、マウスではそのような一貫性が見られない。間接ＴＵＮＥＬ標識アッセイを用いて、肝臓in situ死を解析した（図１２８／表４）。本研究によって、マウス肝臓におけるアポトーシス指数のマーカー変化（marker variation）が分かった。このように、低バックグラウンドにおける低い（例えば５０％）化合物誘導による抑制は容易に実証できなかった。
【０４８１】
Ｈ＆Ｅ解析
２個の肝臓サンプル（一方は葉から、もう一方は中葉から）と１個の小腸サンプルを取り出し、４％中性緩衝ホルムアルデヒド（ＮＢＦ）中で保存した。全群の全てのマウスの保存肝臓サンプルを整え、処理し、パラフィンに包埋した。パラフィン包埋サンプルをProgenix社（英国、Inverkeithing）に送付した。そこでは、サンプルを約５Åの公称厚さで切断した後、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。各臓器サンプルの一切片は、Ortwin Vogel博士（顧問病理学者、ドイツ、キール）によって調べられた。Ｈ＆Ｅで染色した全てのマウス肝臓及び小腸を病理組織学的に解析した後、フォーゲル博士は次の知見を報告した。
【０４８２】
微視的には、ＰＢで処理したｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウス及びＷＴマウスにおいて軽度から中程度の小葉中心性肝細胞肥大が認められた（図１２９）。この知見はＰＢ処理と関連すると考えられる。これに対し、ＰＸＲＫＯ／ＣＡＲＫＯマウスにおいては、ＰＢ処理後に肝細胞肥大の明らかな証拠は認められなかった。更に、肝細胞増殖を示す有糸分裂の様子がＰＢ処理のＷＴマウスで主に認められたが、「ヒト化」マウスやヌルマウス系でも頻度は低いが認められた。
【０４８３】
【表１４】
2010528644.tif 000015
【０４８４】
肝臓において記録された他の全ての微視的知見からはＰＢ処理マウスと対照マウスを有意に区別できず、これらの差はランダムな事象とみなされた。これらの知見は全て、本来自発的なものであり、マウスにおいて通常見られる正常なバックグラウンド病理学の範囲内であると考えられる。小腸においては微視的な知見は記録されなかった。この研究の条件下では、ＰＢ（８０ｍｇ／ｋｇ／４日／ＩＰ）により、ＷＴ株マウス及びｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ株マウスにおいて肝細胞肥大／過形成の病理学的証拠がもたらされた。ＰＢ処理のＰＸＲＫＯ／ＣＡＲＫＯ株マウスにおいては肝細胞過形成の証拠が見出された。
【０４８５】
肝Ｐ４５０の誘導
肝ミクロソーム部分におけるＰ４５０の触媒活性を定量した。マウスＣｙｐ２ｂ１０及びＣｙｐ３ａ１１の活性を定量化するために、ペントキシレゾフリン（pentoxyresofurin）（ＰＲＯＤ）の脱アルキル化活性及びベンジルオキシキノリン（ＢＱ）の脱ベンジル化活性をそれぞれ求めた。更に、ベンジルオキシレゾルフィン−Ｏ−デメチラーゼ（ＢＲＯＤ）活性、メトキシレゾルフィン−Ｏ−デメチラーゼ（ＭＲＯＤ）活性及び７−エトキシレゾルフィン−）−デエチラーゼ（ＥＲＯＤ）活性も測定し、評価した（図１３０参照）。
【０４８６】
ＥＲＯＤ活性はマウスにおいてはＣｙｐ１ａ１／１ａ２及びＣｙｐ１ｂ１を示すが、ＭＲＯＤはＣｙｐ１ａ２の基質である。しかし、測定した活性に他のアイソフォームが寄与する場合もある。２種類の酵素アッセイから得た結果は、互いにある程度良く一致する（図１３０ａ〜ｂ）。Ｃｙｐ１ａ２遺伝子は構成的に発現するため、これによって、両方の活性アッセイにおいて見られる活性の基礎レベルを説明することができる。Ｃｙｐ１ａ１はマウスにおいて誘導後にのみ発現し（Ikeya et al., 1989）、フェノバルビタールはこのＰ４５０をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスで誘導しないことが報告されている（Sakuma et al., 1999）。ＭＲＯＤデータ及びＥＲＯＤデータから、酵素活性はＷＴマウス及びｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウスにおいてＰＢ処理によって増加することが分かった。両方のアッセイにおいて、ＰＸＲＫＯ／ＣＡＲＫＯ系におけるＰＢ処理による増加は見られなかった。ＰＸＲ／ＣＡＲマウスパネルを用いた初期のデータから、ＰＢ（４０ｍｇ／ｋｇ／４日）がＣＡＲ介在経路によってＣｙｏ１ａ２を活性化し得ることが分かったが、他のデータはこのような初期の知見と一致する。
【０４８７】
ＰＢで処理したｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウスではＢＱ活性の５倍増加が見られたが、ＷＴマウスでは僅かな増加が認められた（図１３０ｃ）。これらのデータからマウス系間の明らかな種差が分かるが、これによって、ヒトレポーターはそのマウスカウンターパートと比べてＰＢに対する感受性が高いことが示される。更に、ＰＢで処理したＰＸＲＫＯ／ＣＡＲＫＯマウスではＣｙｐ３ａ１１の誘導が無いことからも実証されるように、このメカニズムはレポーターの存在に依存することが分かる。
【０４８８】
ＢＲＯＤ及びＰＲＯＤはマウスにおけるＣｙｐ２ｂ１０活性のマーカーである。ＷＴマウス系及びｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウス系の両方においては、ＰＢで処理した後に同等レベルでマーカーＣｙｐ２ｂ１０誘導が見られた（図１３０ｄ〜ｅ）。しかし、ＰＸＲＫＯ／ＣＡＲＫＯマウスにおいては、ＰＢに曝露した際、ＰＲＯＤ活性やＢＲＯＤ活性は変化しなかった。概して、ＷＴマウス系やｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウス系ではＰＢはＰ４５０触媒活性を誘導したが、このようなレポーターを欠いたマウスでは誘導しなかった。これによって、ＰＢ介在によるＰ４５０誘導がＣＡＲ／ＰＸＲ依存的であることがはっきりと分かる。
【０４８９】
Ｐ４５０活性データによると、プールされたマウス肝ミクロソーム中のＣｙｐ２ｂ１０及びＣｙｐ３ａ１１タンパク質のウェスタンブロッティングによる定量から、両方のＰ４５０がＷＴマウス系やヒト化マウス系ではＰＢで誘導されるが、ＰＸＲＫＯ／ＣＡＲＫＯマウスでは誘導されないことが分かった（図１３１）。更に、Ｃｙｐ３ａ１１誘導の種差がタンパク質レベルで確認されるが、これによって、ＰＢのヒト受容体に対する感受性がそのマウス等価物に比べて高いことが示唆される。
【０４９０】
結論として、肝腫はＷＴマウス及びｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウスにおいてのみ生じたということができる。ＫＯ  ＰＸＲ／ＫＯ  ＣＡＲでは作用が見られなかった。同じパターンがＰ４５０誘導についても見られた。しかし、最も顕著な結果は、肝細胞増殖（ＤＮＡ前駆体であるＢｒｄＵの取り込みによって確認）についてマウスを試験した際に見出された。即ち、ＷＴマウスにおいてのみ肝細胞増殖が示されることが見出された。ＫＯマウス及びヒト化マウスの両方においては何の増殖作用も見られなかった。
【０４９１】
従って、重要な結論は以下の通りである。
・ＷＴマウスにおいては、ＰＢは肥大や過形成を誘導した。
・ＰＸＲＫＯ／ＣＡＲＫＯマウスにおいては、ＰＢは肝腫を誘導しなかった（肥大も過形成も誘導しなかった）。
・ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウスにおいては、ＰＢは肥大を誘導したが、過形成を誘導しなかった。
【０４９２】
これらのマウス及びｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ／ｈｕＰＰＡＲａは、ヒトに対する非遺伝毒性げっ歯類の「肝成長発癌物質」の真の危険性を評価する上で価値が高いであろう。また、これらは、生体異物誘導による肝成長や該成長における種差の複雑さを解明する上で有用なツールも提供するであろう。
【０４９３】
参考文献
Ikeya, K., Jaiswal, A.K., Owens, R.A., Jones, J.E., Nebert, D.W. & S. Kimura (1989) Human CYP1A2: sequence, gene structure, comparison with the mouse and rat orthologous gene, and differences in liver CYP1A2 mRNA expression. Mol. Endocrinol. 3: 1399-1408
Sakuma T., Ohtake, M., Katsurayama, Y., Jarukamjorn, K. & N. Nemoto (1999) Induction of CYP1A2 by phenobarbital in the livers of Aryl hydrocarbon-responsive and -nonresponsive mice. DrugMetab. Dispos. 27: 379-384
【図１】
2010528644.tif 000016
【図２】
2010528644.tif 000017
【図３】
2010528644.tif 000018
【図４】
2010528644.tif 000019
【図５】
2010528644.tif 000020
【図６】
2010528644.tif 000021
【図７】
2010528644.tif 000022
【図８】
2010528644.tif 000023
【図９】
2010528644.tif 000024
【図１０】
2010528644.tif 000025
【図１１】
2010528644.tif 000026
【図１２】
2010528644.tif 000027
【図１３】
2010528644.tif 000028
【図１４】
2010528644.tif 000029
【図１５】
2010528644.tif 000030
【図１６Ａ】
2010528644.tif 000031
【図１６Ｂ】
2010528644.tif 000032
【図１６Ｃ】
2010528644.tif 000033
【図１６Ｄ】
2010528644.tif 000034
【図１７】
2010528644.tif 000035
【図１８】
2010528644.tif 000036
【図１９】
2010528644.tif 000037
2010528644.tif 000038
【図２０】
2010528644.tif 000039
【図２１】
2010528644.tif 000040
【図２２】
2010528644.tif 000041
【図２３】
2010528644.tif 000042
【図２４】
2010528644.tif 000043
【図２５】
2010528644.tif 000044
【図２６】
2010528644.tif 000045
【図２７】
2010528644.tif 000046
【図２８】
2010528644.tif 000047
【図２９】
2010528644.tif 000048
【図３０】
2010528644.tif 000049
【図３１】
2010528644.tif 000050
【図３２】
2010528644.tif 000051
【図３３】
2010528644.tif 000052
【図３４】
2010528644.tif 000053
【図３５】
2010528644.tif 000054
【図３６】
2010528644.tif 000055
【図３７】
2010528644.tif 000056
【図３８】
2010528644.tif 000057
【図３９】
2010528644.tif 000058
【図４０】
2010528644.tif 000059
【図４１】
2010528644.tif 000060
【図４２】
2010528644.tif 000061
【図４３】
2010528644.tif 000062
【図４４】
2010528644.tif 000063
【図４５】
2010528644.tif 000064
【図４６】
2010528644.tif 000065
【図４７】
2010528644.tif 000066
【図４８】
2010528644.tif 000067
【図４９】
2010528644.tif 000068
【図５０】
2010528644.tif 000069
【図５１】
2010528644.tif 000070
【図５２】
2010528644.tif 000071
【図５３】
2010528644.tif 000072
【図５４】
2010528644.tif 000073
【図５５】
2010528644.tif 000074
【図５６】
2010528644.tif 000075
【図５７】
2010528644.tif 000076
【図５８】
2010528644.tif 000077
【図５９】
2010528644.tif 000078
【図６０】
2010528644.tif 000079
【図６１】
2010528644.tif 000080
【図６２】
2010528644.tif 000081
【図６３】
2010528644.tif 000082
【図６４】
2010528644.tif 000083
【図６５】
2010528644.tif 000084
【図６６】
2010528644.tif 000085
【図６７】
2010528644.tif 000086
【図６８】
2010528644.tif 000087
【図６９】
2010528644.tif 000088
【図７０】
2010528644.tif 000089
【図７１】
2010528644.tif 000090
【図７２Ａ】
2010528644.tif 000091
【図７２Ｂ】
2010528644.tif 000092
【図７２Ｃ】
2010528644.tif 000093
【図７３】
2010528644.tif 000094
【図７４Ａ】
2010528644.tif 000095
【図７４Ｂ】
2010528644.tif 000096
【図７４Ｃ】
2010528644.tif 000097
【図７５Ａ】
2010528644.tif 000098
【図７５Ｂ】
2010528644.tif 000099
【図７５Ｃ】
2010528644.tif 000100
【図７６】
2010528644.tif 000101
【図７７】
2010528644.tif 000102
【図７８】
2010528644.tif 000103
【図７９】
2010528644.tif 000104
【図８０】
2010528644.tif 000105
【図８１】
2010528644.tif 000106
【図８２】
2010528644.tif 000107
【図８３】
2010528644.tif 000108
【図８４】
2010528644.tif 000109
【図８５】
2010528644.tif 000110
【図８６】
2010528644.tif 000111
【図８７】
2010528644.tif 000112
【図８８】
2010528644.tif 000113
【図８９】
2010528644.tif 000114
【図９０】
2010528644.tif 000115
【図９１】
2010528644.tif 000116
【図９２】
2010528644.tif 000117
【図９３】
2010528644.tif 000118
【図９４】
2010528644.tif 000119
【図９５】
2010528644.tif 000120
【図９６】
2010528644.tif 000121
【図９７】
2010528644.tif 000122
【図９８】
2010528644.tif 000123
【図９９】
2010528644.tif 000124
【図１００】
2010528644.tif 000125
【図１０１】
2010528644.tif 000126
【図１０２】
2010528644.tif 000127
【図１０３】
2010528644.tif 000128
【図１０４】
2010528644.tif 000129
【図１０５】
2010528644.tif 000130
【図１０６】
2010528644.tif 000131
【図１０７】
2010528644.tif 000132
【図１０８】
2010528644.tif 000133
【図１０９】
2010528644.tif 000134
【図１１０】
2010528644.tif 000135
【図１１１】
2010528644.tif 000136
【図１１２】
2010528644.tif 000137
【図１１３】
2010528644.tif 000138
【図１１４】
2010528644.tif 000139
【図１１５】
2010528644.tif 000140
【図１１６】
2010528644.tif 000141
【図１１７】
2010528644.tif 000142
【図１１８Ａ】
2010528644.tif 000143
【図１１８Ｂ】
2010528644.tif 000144
【図１１８Ｃ】
2010528644.tif 000145
【図１１９Ａ】
2010528644.tif 000146
【図１１９Ｂ】
2010528644.tif 000147
【図１１９Ｃ】
2010528644.tif 000148
【図１２０Ａ】
2010528644.tif 000149
【図１２０Ｂ】
2010528644.tif 000150
【図１２０Ｃ】
2010528644.tif 000151
【図１２１】
2010528644.tif 000152
【図１２２】
2010528644.tif 000153
【図１２３】
2010528644.tif 000154
【図１２４】
2010528644.tif 000155
【図１２５】
2010528644.tif 000156
【図１２６】
2010528644.tif 000157
【図１２７】
2010528644.tif 000158
【図１２８】
2010528644.tif 000159
【図１２９】
2010528644.tif 000160
【図１３０Ａ】
2010528644.tif 000161
【図１３０Ｂ】
2010528644.tif 000162
【図１３０Ｃ】
2010528644.tif 000163
【図１３０Ｄ】
2010528644.tif 000164
【図１３０Ｅ】
2010528644.tif 000165
【図１３１Ａ】
2010528644.tif 000166
【図１３１Ｂ】
2010528644.tif 000167
【配列表】
2010528644000001.app
【国際調査報告】
2010528644.tif 000168
2010528644.tif 000169
2010528644.tif 000170
2010528644.tif 000171
2010528644.tif 000172