(57)【要約】  本発明に基づく検出方法は、環境試料内の複数の低含量標的の同時の増幅を実現する。これは、遺伝子に特異的なプライマの混合液を利用する結合された逆転写及び第１の増幅ステップと、これに続く、先に生成された「ＲＴ増幅」生成物に対して実行される第２の増幅ステップとを含む２段階プロセスである。各標的の初期の増幅は、個々の増幅及び識別のための試料の分割の前に実行される。検出方法は、逆転写及び増幅のプロセスを単一の処理装置内で結合する。また、検出方法は、遺伝子に特異的なプライマを用いる遺伝子に特異的な逆転写を実現し、この結果、この逆転写ステップのプロセスにおける非特定の生成物を皆無にし、又は少なくとも低減する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の限定的なコピー標的を検出する検出方法において、
ａ．複数の異なる配列のＲＮＡ鎖を含む試料を準備する工程と、
ｂ．上記試料に、特定の遺伝子の塩基配列に対応する遺伝子に特異的なプライマの複数の異なる第１の対を加える工程と、
ｃ．上記試料に試薬を加える工程と、
ｄ．上記試料を第１の期間、第１の温度で培養し、該試料内に１つ以上の特定の遺伝子の塩基配列が存在している場合、対応する遺伝子に特異的なプライマが上記存在する特定の遺伝子の塩基配列の１つを含む各特定のＲＮＡ鎖に結合し、各特定のＲＮＡ鎖を、該特定の遺伝子の塩基配列を含む対応するｃＤＮＡ鎖に逆転写する工程と、
ｅ．第１の熱サイクルプロセスを実行し、リニア増幅に基づいてｃＤＮＡ鎖内の各特定の遺伝子の塩基配列を増幅する工程と、
ｆ．上記試料を試料部分に分割する工程と、
ｇ．上記各試料部分に、試薬と、上記特定の遺伝子の塩基配列の１つに対応する遺伝子に特異的なプライマの１つ以上の異なる第２の対とを加える工程と、
ｈ．上記各試料部分に第２の熱サイクルプロセスを実行し、該各試料部分内の１つ以上の特定の遺伝子の塩基配列を増幅する工程と、
ｉ．上記各試料部分内の１つ以上の特定の遺伝子の塩基配列の存在を検出する工程とを有する検出方法。
【請求項２】
最大Ｎ個の特定の遺伝子の塩基配列の存在が検出されるよう、上記試料に上記遺伝子に特異的なプライマのＮ個の異なる対を加えることを特徴とする請求項１記載の検出方法。
【請求項３】
上記試料は、Ｎ個の試料部分に分割され、該各試料部分に上記遺伝子に特異的なプライマの第２の対の１つを加えることを特徴とする請求項２記載の検出方法。
【請求項４】
上記準備される試料の最小量は、約２．５フェムトグラム以上であることを特徴とする請求項１記載の検出方法。
【請求項５】
上記第２の熱サイクルプロセスは、飽和まで実行されることを特徴とする請求項１記載の検出方法。
【請求項６】
第１の熱サイクルプロセスは、上記第１の期間の後に自動的に実行されることを特徴とする請求項１記載の検出方法。
【請求項７】
上記試料の培養及び上記第１の熱サイクルの実行は、単一の収容容器内で行われることを特徴とする請求項１記載の検出方法。
【請求項８】
上記第１の熱サイクルプロセス及び第２の熱サイクルプロセスは、それぞれポリメラーゼ連鎖反応を含むことを特徴とする請求項１記載の検出方法。
【請求項９】
上記第１の熱サイクルプロセスは、５乃至１５のサイクルを含むことを特徴とする請求項１記載の検出方法。
【請求項１０】
上記第２の熱サイクルプロセスは、少なくとも増幅の対数期に入るために十分な熱サイクルの数を含むことを特徴とする請求項１記載の検出方法。
【請求項１１】
限定的なコピー標的を検出する検出方法において、
ａ．１つ以上の異なる配列のＲＮＡ鎖を含む試料を準備する工程と、
ｂ．上記試料に、特定の遺伝子の塩基配列に対応する遺伝子に特異的なプライマの第１の対を加える工程と、
ｃ．上記試料に試薬を加える工程と、
ｄ．上記試料を第１の期間、第１の温度で培養し、該試料内に特定の遺伝子の塩基配列が存在している場合、上記遺伝子に特異的なプライマの第１の対の１つが特定の遺伝子の塩基配列を含む特定のＲＮＡ鎖に結合し、該特定のＲＮＡ鎖を、上記特定の遺伝子の塩基配列を含む対応するｃＤＮＡ鎖に逆転写する工程と、
ｅ．第１の熱サイクルプロセスを実行し、リニア増幅に基づいてｃＤＮＡ鎖内の特定の遺伝子の塩基配列を増幅する工程と、
ｆ．上記試料に、試薬及び上記特定の遺伝子の塩基配列に対応する遺伝子に特異的なプライマの第２の対を加える工程と、
ｇ．第２の熱サイクルプロセスを実行して上記特定の遺伝子の塩基配列を増幅する工程と、
ｈ．特定の遺伝子の塩基配列の存在を検出する工程とを有する検出方法。
【請求項１２】
第１の熱サイクルプロセスは、上記第１の期間の後に自動的に実行されることを特徴とする請求項１１記載の検出方法。
【請求項１３】
上記試料の培養及び上記第１の熱サイクルの実行は、単一の収容容器内で行われることを特徴とする請求項１１記載の検出方法。
【請求項１４】
上記第１の熱サイクルプロセス及び第２の熱サイクルプロセスは、それぞれポリメラーゼ連鎖反応を含むことを特徴とする請求項１１記載の検出方法。
【請求項１５】
上記第１の熱サイクルプロセスは、５乃至１５のサイクルを含むことを特徴とする請求項１１記載の検出方法。
【請求項１６】
上記第２の熱サイクルプロセスは、少なくとも増幅の対数期に入るために十分な熱サイクルの数を含むことを特徴とする請求項１１記載の検出方法。
【請求項１７】
上記第２の熱サイクルプロセスを実行する前に試料を中性溶液によって希釈する工程を更に有する請求項１１記載の検出方法。
【請求項１８】
上記第２の熱サイクルプロセスは、飽和まで実行されることを特徴とする請求項１１記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料内の低コピー標的（コピー数が少ない標的）の存在を検出する検出方法に関する。詳しくは、本発明は、試料内の複数の異なる種類の低コピー核酸（コピー数が少ない核酸）の存在を検出する検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、特定のＤＮＡ配列を酵素的に複製するための分子技術である。詳しくは、ＰＣＲは、所定のＤＮＡ鎖内の比較的短い、明確な（well-defined）ヌクレオチド配列を増幅するために使用されている。増幅される特定のＤＮＡ配列は、プライマを選択することによって決定される。プライマは、増幅される特定のＤＮＡ配列の始点と終点に対して相補的な、多くの場合、５０を超えず、通常１８〜２５の塩基対の長さを有する短い、人工のＤＮＡ鎖である。プライマは、これらの始点と終点においてＤＮＡ鎖に結合され、新たなＤＮＡ鎖の合成を開始する。
【０００３】
図１は、試料内の特定の低コピーＤＮＡ塩基配列を増幅及び検出する従来の手法を示している。低コピーＤＮＡ鎖の特定の配列を検出するためには、試料内のＤＮＡを増幅する必要がある。元の低コピー状態では、ＤＮＡ配列は、検出可能な十分な量を含んでいない。ステップ５では、低コピーＤＮＡ鎖を含む試料を準備する。ここでの目的は、試料内に特定のＤＮＡ配列が存在しているかを検出することである。ステップ１０では、試薬と、増幅及び検出されるＤＮＡ配列に特定のＤＮＡプライマの第１の対とを試料溶液に加える。各プライマは、ＤＮＡ鎖に結合するように構成されており、所望のＤＮＡ配列の何れかの末端にプライマ対が結合する。ステップ１５では、試料溶液に対して第１の増幅ステップを実行する。通常、増幅は、熱サイクリング処理又はＰＣＲによって実行される。各熱サイクルは、加熱ステップ及び冷却ステップであるとみなされる。また、加熱ステップは、変性ステップとも呼ばれる。また、冷却ステップは、アニーリング及び伸長ステップとも呼ばれる。非特定の生成物を生成しない最大数の熱サイクルが実行される。非特定の生成物を生成することなく実行できる熱サイクルの最大数は、多くの場合、約４０〜４５熱サイクルである。この最大数より多くの熱サイクルを実行すると、更に多くの試料コピーを生成できるが、非特定の生成物が生成される確率も高まり、この結果、検出されるシグナルが妥当である信頼性が低下する。
【０００４】
ステップ２０では、ステップ１５において先に増幅された試料溶液に更なる試薬及びＤＮＡプライマの第２の対を加える。試薬は、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ等の検出化学物質（detection chemistry）を含む。プライマの第２の対のそれぞれは、プライマの第１の対の内側に入り、ネステッドＰＣＲと呼ばれる。殆どのアプリケーションでは、非特定の生成物の生成を避けるために、プライマの第２の対のそれぞれのヌクレオチド配列は、第１の対のそれぞれのヌクレオチド配列とは重複しない。しかしながら、幾つかのアプリケーションにおいては、プライマの第１及び第２の対のそれぞれのヌクレオチド配列の間に幾らかの重複がある場合もある。ステップ２５では、以前に増幅された試料溶液に対して第２の増幅ステップを実行する。第２の増幅ステップは、第１の増幅ステップと同様に、通常、熱サイクリングによって実行される。最大４０の熱サイクルが実行され、幾つかのアプリケーションにおいては、最大４５の熱サイクルが実行される。この結果、特定のＤＮＡ配列に対応する増幅された数のＤＮＡ鎖を含む試料溶液が得られる。ステップ３０では、増幅されたＤＮＡ鎖を検出する。通常、増幅ステップの間に、検出化学物質を刺激し、例えば、検出可能な蛍光プローブを放出して、周知の様々な検出手段を用いて検出を行う。
【０００５】
ある回数の熱サイクルによって、試薬が減少するため、２つの個別の増幅ステップが実行される。したがって、第１の増幅ステップの後に増幅された試料溶液は、更なる試薬で希釈され、これにより、第２の増幅ステップの間に更なる増幅が可能になる。
【０００６】
図１に関連して説明した増幅及び検出方法の目的は、所定のＤＮＡ配列の存在を検出することである。この方法は、特定のＤＮＡ配列の実数又は他の特定のＤＮＡ配列に対する特定のＤＮＡ配列の数の測定には有効ではない。また、この方法は、遺伝子発現アプリケーション等、ＲＮＡ試料に適用し、他の特定のＲＮＡ配列に対する特定のＲＮＡ配列の相対数を判定する場合にも効果的ではない。
【０００７】
図２は、試料内の特定のＲＮＡ配列の相対数を定量化する従来の手法を示している。図２の方法は、逆転写及びポリメラーゼ連鎖反応（reverse transcription and polymerase chain reaction：ＲＴ−ＰＣＲ）プロセスを含む。特定のＲＮＡ配列は、通常、低コピーであり、したがって、検出のために増幅する必要がある。低コピーＲＮＡ鎖の特定の配列を検出するために、元試料の全てのＲＮＡ鎖は、まず、対応するＤＮＡ鎖に逆転写される。このようにして、検出されるＲＮＡに特異的な配列が逆転写されるが、元試料内に存在している他の全てのＲＮＡ配列も逆転写される。複数の異なるＲＮＡ鎖について、異なるＲＮＡ鎖のそれぞれは、対応するＤＮＡ鎖に逆転写される。低コピーＲＮＡ鎖から逆転写されると、ＤＮＡ鎖及び何らかの特定のＤＮＡ配列は、検出できる十分な量を含まず、したがって、図１に関連して説明したものと同様の増幅が必要となる。ステップ５０では、複数の低コピーＲＮＡ鎖を含む試料を準備する。ここでの目的は、特定のＲＮＡ配列のそれぞれの相対数を定量化することである。ステップ５５では、試料に対して逆転写プロセスを実行し、これにより、試料に含まれている全てのＲＮＡ鎖は、相補的ＤＮＡ鎖に逆転写される。このようにして、定量化される特定のＲＮＡ配列に対応する何らかの特定のＤＮＡ配列に加えて非特定のＤＮＡ鎖が生成される。逆転写は、従来より、培養チャンバで行われている。一旦、逆転写プロセスが完了すると、培養チャンバから試料溶液が取り出され、熱サイクルチャンバに入れられる。
【０００８】
ステップ６０では、試薬及びＤＮＡプライマの第１の対を試料溶液に加える。ステップ６５では、試料溶液に対して、リニア増幅ステップ（linear phase amplification step）を実行する。リニア増幅は、熱サイクリングによって実行される。リニア増幅は、存在する異なるＤＮＡに特異的な配列のそれぞれの相対数を維持する増幅プロセスの一部である。すなわち、リニア増幅の間、異なるＤＮＡに特異的な配列のそれぞれは、同じレートで増幅され、この結果、数における相対的な差が維持される。リニア増幅は、通常、５〜１５の熱サイクルの間、維持される。
【０００９】
ステップ７０では、第１の増幅された試料溶液に更なる試薬及びＤＮＡプライマの第２の対を加える。試薬は、通常、検出化学物質を含む。プライマの第２の対のそれぞれは、プライマの第１の対の内側に入る。ステップ７５では、第１の増幅された試料溶液に対して第２の増幅ステップを実行する。ステップ６５で実行される増幅ステップと同様に、第２の増幅ステップは、通常、熱サイクリングによって実行される。最大４０の熱サイクルが実行され、幾つかのアプリケーションにおいては、最大４５の熱サイクルが実行される。この結果、増幅された数の複数の特定のＤＮＡ配列を含む試料溶液が得られる。増幅された各ＤＮＡに特異的な配列の数の相対的な差は、理論上、元のＲＮＡ試料と同じである。ステップ８０では、増幅されたＤＮＡに特異的な配列を検出する。通常、第２の増幅ステップの間に、検出化学物質を刺激し、例えば、各特定のＤＮＡ配列について、特定の検出可能な蛍光プローブを放出して、周知の様々な検出手段を用いて検出を行う。また、それぞれのプローブの強度も検出し、これにより、特定のＤＮＡ配列のそれぞれの数量を判定する。また、この方法は、特定のＲＮＡ配列のそれぞれの相対数量を判定することなく、複数の異なるＲＮＡに特異的な配列の存在を検出するために用いることもできる。
【００１０】
特定のＲＮＡ配列又は特定のＤＮＡ配列の存在の検出には、生物学的脅威の検出等、様々な用途がある。極低レベルの生体物質（bio-agent）が深刻な影響を有することもあるので、環境内の脅威の検出には、非常に精度が高い検出要求が必要である。しかしながら、ＴａｑＭａｎ（商標）及びＤＮＡマイクロアレイを含む現在の検出法は、比較的大量（１〜１０μｇ）の開始原料を必要とし、したがって、バイオセンサに直接適用することができない。更に、ハイブリダイゼーションベースのマイクロアレイ法は、ＰＣＲベースの手法と比べて感度及び特異度が低い。ＲＴ−ＰＣＲ法は、使用可能な全ての手法のうち、最も特異度及び感度が高いが、この手法は、スループットが低く、比較的大量の開始ＲＮＡを必要とする。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の実施の形態は、環境試料内の複数の低含量標的の同時の増幅を実現する方法を提供する。これは、遺伝子に特異的なプライマの混合液を利用する結合された逆転写及び第１の増幅ステップと、これに続く、逆転写及び第１の増幅ステップの間に生成された生成物に対して実行される第２の増幅ステップとを含む２段階プロセスである。幾つかの実施の形態においては、各増幅ステップは、ＰＣＲを用いて実行される。第２の増幅ステップのために加えられる試薬は、例えば、ネステッドＴａｑＭａｎ（商標）プライマ及びプローブ等、周知の如何なる検出化学物質も含むことができる。
【００１２】
精製されたＲＮＡ及び／又はＤＮＡは、一工程に統合されたＲＴ−ＰＣＲ反応において、複数の遺伝子に特異的なプライマによって逆転写され、所定の回数の熱サイクルによって増幅される。ＰＣＲ反応による増幅は、個々の反応、すなわち数回の繰り返し反応で、ネステッドプライマによって生成された「ＲＴ−増幅」生成物の小さいアリコートに対して実行される。検出の信頼性は、ＰＣＲにおけるコピーの初期の数に依存し、したがって、統計的には、結合されたＲＴ−ＰＣＲ増幅を全体に対して行う方が分割された試料に対して行うよりも好ましい。これにより、個々の増幅及び識別のための試料の分割の前に、存在する標的のコピーを、最大１０００倍（第１の増幅ステップで実行された熱サイクルの数による）に初期的に増幅することができる。これにより、標的が元試料に存在していれば、十分な量の標的を増幅できる可能性が大いに高まる。
【００１３】
試料を分割する前に標的を増幅することに加えて、検出方法は、単一の処理装置内で逆転写ステップ及び第１の増幅ステップのプロセスを結合し、これにより、培養チャンバから熱サイクルチャンバに試料を移す必要性をなくすことができる。また、検出方法は、遺伝子に特異的なプライマを用いる遺伝子に特異的な逆転写を可能にする。このようにして、１つ以上の特定の遺伝子配列が逆転写され、この逆転写ステップのプロセスにおける非特定の生成物を皆無にし、又は少なくとも低減することができる。
【００１４】
増幅及び検出方法は、特に標的が低コピー標的である場合に、少ない試料から、１つ以上の標的を特定する必要がある如何なるアプリケーションにおいても用いることができる。この検出方法は、多くの標的を含む可能性がある未知試料に対して有効であり、例えば、潜在的な生物学的脅威物質のための診断アプリケーション及び試料のスクリーニングに有用である。
【００１５】
幾つかの実施の形態においては、増幅及び検出方法は、増幅及び検出装置内で実現される。増幅及び検出装置は、単一の機器内に統合された増幅装置及び検出装置を含む。これに代えて、検出装置をスタンドアロン機器として構成し、増幅装置に接続してもよい。増幅及び検出装置は、増幅及び検出方法のステップの１つ、幾つか又は全てを自動的に実行するように構成できる。これにより、増幅及び検出方法のステップの１つ、幾つか又は全てを自動化することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】試料内の特定の低コピーＤＮＡ配列を増幅及び検出する従来の手法を示すフローチャートである。
【図２】試料内の特定のＲＮＡ配列の相対数を定量化する従来の手法を示すフローチャートである。
【図３】低コピー標的の存在を検出するための第１の増幅及び検出方法を示すフローチャートである。
【図４】複数の異なる低コピー標的の存在を検出するための第２の増幅及び検出方法を示すフローチャートである。
【図５】低コピー標的の存在を検出するための第３の増幅及び検出方法を示すフローチャートである。
【図６】複数の異なる低コピー標的の存在を検出するための第４の増幅及び検出方法を示すフローチャートである。
【図７】例示的な増幅及び検出装置の機能的ブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
幾つかの図面を参照して、増幅及び検出方法及び装置の実施の形態について説明する。同じ要素が複数の図面に示されている場合にのみ、適切であれば、これらの同じ要素に同じ参照符号を付している。
【００１８】
増幅及び検出方法の実施の形態は、選択された遺伝子配列が逆転写され、この結果、検出しようとしていない遺伝子配列である非特定の生成物の逆転写を皆無にし、又は少なくとも低減する逆転写ステップを含む。そして、逆転写された遺伝子に特異的な配列は、増幅及び検出される。増幅及び検出方法は、複数の異なる遺伝子に特異的な配列に同時に適用できる。説明を簡潔にするために、遺伝子に特異的なＲＮＡ配列を対応する遺伝子に特異的なｃＤＮＡ配列に逆転写し、次に、遺伝子に特異的なｃＤＮＡ配列を増幅する増幅及び検出方法について説明する。なお、増幅及び検出方法は、如何なる種類の遺伝子配列にも適用できる。
【００１９】
図３は、低コピー標的の存在を検出するための第１の増幅及び検出方法を示している。幾つかの実施の形態においては、標的は、遺伝子に特異的なＤＮＡ配列又は遺伝子に特異的なＲＮＡ配列等の特定の遺伝子の塩基配列である。図３の方法は、逆転写及びポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）プロセスを含む。但し、元試料に存在する全てのＲＮＡ鎖が逆転写される図２に関連して説明したＲＴ−ＰＣＲプロセスとは異なり、図３の方法においては、ＲＮＡ内の特定の遺伝子の塩基配列だけが逆転写される。これにより、非特定の生成物の逆転写が皆無になり、又は少なくとも低減され、後の第１の増幅ステップで用いられる増幅試薬の競合が皆無になり、又は少なくとも低減される。これにより、増幅プロセスの効率が向上する。検出される特定の遺伝子の塩基配列は、通常、低コピーであり、多くの場合、検出可能となる十分な量が含まれていない。したがって、遺伝子に特異的な配列から対応する遺伝子に特異的なｃＤＮＡへの逆転写の後に、遺伝子に特異的なｃＤＮＡは、検出できるように増幅される。
【００２０】
ステップ１００では、低コピーＲＮＡ鎖を含む試料を準備する。ここでの目的は、ＲＮＡ内の特定の遺伝子の塩基配列が試料内に存在しているかを検出することである。ステップ１０５では、遺伝子に特異的なプライマの対を試料に加える。一例として、標的となり、増幅される特定の遺伝子の塩基配列を遺伝子１と呼ぶこととする。この場合、遺伝子に特異的なプライマの対は、遺伝子１について特異的である。遺伝子に特異的なプライマの対の１つは、この場合、遺伝子１逆転写（ＲＴ）プライマと呼ばれ、遺伝子の一方の末端において、ＲＮＡ鎖に結合される。ステップ１１０では、試料に試薬を加える。なお、ステップ１０５及びステップ１１０を単一のステップとして結合してもよい。増幅及び検出方法は、単一の処理チャンバ内で逆転写ステップ及び第１の増幅ステップを結合する。遺伝子１ＲＴプライマを含む遺伝子に特異的なプライマの対、逆転写ステップのための試薬、第１の増幅ステップのための試薬は、全て、逆転写ステップを実行する前に元試料に加えられる。ステップ１１５では、試料、遺伝子に特異的なプライマの対及び試薬を含む混合液を、第１の期間、第１の温度で培養する。この培養期間の間、ＲＮＡ鎖が遺伝子１を含んでいる場合、遺伝子１ＲＴプライマがＲＮＡ鎖に結合する。結合した遺伝子１ＲＴプライマは、ＲＮＡ内の遺伝子１の、遺伝子１を含む対応するｃＤＮＡ配列への逆転写を開始する。この培養ステップの間、ＲＮＡの遺伝子に特異的な配列が特定され、対応する特定のｃＤＮＡ配列に逆転写される。
【００２１】
第１の期間の後、ステップ１２０において、逆転写された試料溶液に対して第１の増幅ステップを実行する。第１の増幅ステップは、熱サイクリング処理又はＰＣＲによって実行される。第１の増幅及び検出方法においては、第１の増幅ステップは、リニア増幅に限定される。リニア増幅は、約５〜１５回の熱サイクルの間、維持される。幾つかの実施の形態においては、逆転写が行われる培養ステップ及び第１の増幅ステップは、単一の処理チャンバで実行される。遺伝子に特異的なプライマの対及び逆転写と第１の増幅に必要である試薬は、先に加えられているため、培養ステップと第１の増幅ステップとの間に試料溶液に試薬及び／又は更なるプライマを加える必要はない。
【００２２】
ステップ１２５では、第１の増幅された試料溶液に更なる試薬を加え、これによって、第１の増幅された試料溶液を希釈する。幾つかの実施の形態においては、更なる希釈ステップを実行し、ステップ１２５で加えた試薬に加えて、更なる中性溶液、例えば水を加える。試薬は、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ等の検出化学物質を含む。ステップ１３０では、第１の増幅された試料溶液に遺伝子１を標的とする遺伝子に特異的なプライマの対を加える。ステップ１３０で加えられる遺伝子に特異的なプライマの対は、ステップ１０５で加えられる遺伝子に特異的なプライマの対と同じであってもよい。これに代えて、ステップ１３０で加えられる遺伝子に特異的なプライマの対は、ステップ１０５で加えられる遺伝子に特異的なプライマの対と同じでなくてもよい。或いは、ステップ１３０で加えられる遺伝子に特異的なプライマの対は、ステップ１０５で加えられる遺伝子に特異的なプライマの対の内側に入ってもよい。ステップ１３０で加えられる遺伝子に特異的なプライマの対は、通常、ステップ１０５で加えられる遺伝子に特異的なプライマの対と同じか、又は内側にある。ステップ１３５では、第１の増幅された試料溶液に第２の増幅ステップを実行する。第２の増幅ステップは、第１の増幅ステップと同様に、熱サイクリングによって実行される。幾つかの実施の形態においては、最大４０の熱サイクルが実行される。これに代えて、４０より多い熱サイクルを実行してもよい。通常、第２の増幅ステップの間に実行される熱サイクルの数は、対数期増幅に入り、飽和に達するために十分な数とする。飽和とは、更なる熱サイクルを行っても特定の生成物の収量が増加しなくなる点である。この結果、遺伝子に特異的な配列を含む増幅された数のｃＤＮＡ鎖を含む試料溶液が得られる。ステップ１４０では、増幅された特定の遺伝子の塩基配列が存在する場合、これを検出する。通常、第２の増幅ステップの間に、検出化学物質を刺激し、例えば、各特定のＤＮＡ配列について、特定の検出可能な蛍光プローブを放出して、周知の様々な検出手段を用いて検出を行う。
【００２３】
第１の増幅及び検出方法は、複数の異なる種類の特定の低コピー標的の増幅及び検出に適用されるように拡張できる。図４は、複数の異なる低コピー標的の存在を検出するための第２の増幅及び検出方法を示す。図４の第２の増幅及び検出方法は、図３の第１の増幅及び検出方法と同様であり、逆転写及びポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）プロセスを含む。第２の増幅及び検出方法においても、特定の遺伝子の塩基配列だけが逆転写される。ステップ１５０では、複数の低コピーＲＮＡ鎖を含む試料を準備する。ここでの目的は、試料内に複数の異なる特定の遺伝子の塩基配列が存在しているかを検出することである。ステップ１５５では、遺伝子に特異的なプライマの複数の異なる対を試料に加える。一般化して言えば、この処理では、「ｎ」個の異なる特定の遺伝子の塩基配列の存在を判定した場合、「ｎ」組の遺伝子に特異的なプライマの異なる対を加える。各遺伝子に特異的なプライマ対は、逆転写され、増幅され、最終的に検出される特定の遺伝子の塩基配列に対応している。例えば、遺伝子１ＲＴプライマを含む遺伝子に特異的なプライマの第１の対は、特定の遺伝子の塩基配列遺伝子１に対応し、遺伝子２ＲＴプライマを含む遺伝子に特異的なプライマの第２の対は、特定の遺伝子の塩基配列遺伝子２に対応するといった具合である。各遺伝子に特異的なプライマ対の１つのプライマは、対応する特定の遺伝子の塩基配列を含むＲＮＡ鎖に結合するように構成されており、これにより、特定の遺伝子の塩基配列の一方の末端に遺伝子に特異的なプライマが結合する。
【００２４】
ステップ１６０では、逆転写及び第１の増幅ステップのために用いられる試薬を試料に加える。なお、ステップ１５５及びステップ１６０は、単一のステップとして結合してもよい。ステップ１６５では、試料、遺伝子に特異的なプライマの複数の異なる対及び試薬を含む混合液を、所定の期間、設定された温度で培養する。この培養期間の間、ＲＮＡ鎖が、特定の遺伝子に特異的なプライマに対応する特定の遺伝子の塩基配列を含む場合、特定の遺伝子に特異的なプライマがＲＮＡ鎖に結合する。結合された遺伝子に特異的なプライマは、ＲＮＡ内の特定の遺伝子の塩基配列の、特定の遺伝子の塩基配列を含む対応するｃＤＮＡ鎖への逆転写を開始する。この培養ステップの間、存在する各特定の遺伝子の塩基配列が特定され、ｃＤＮＡ内の対応する特定の遺伝子の塩基配列に逆転写される。
【００２５】
所定の期間の後、逆転写された試料溶液に対して、ステップ１７０において、第１の増幅ステップを実行する。第１の増幅ステップは、熱サイクリング又はＰＣＲによって実行される。第２の増幅及び検出方法においては、第１の増幅ステップは、リニア増幅に限定されている。リニア増幅は、約５〜１５の熱サイクルの間、維持される。幾つかの実施の形態においては、逆転写が行われる培養ステップ及び第１の増幅ステップは、単一の処理チャンバで実行される。複数の遺伝子に特異的なプライマの対及び逆転写と第１の増幅に必要である試薬は、先に加えられているため、培養ステップと第１の増幅ステップとの間に試料溶液に試薬及び／又は更なるプライマを加える必要はない。
【００２６】
ステップ１７５では、第１の増幅された試料溶液を試料部分に分割する。幾つかの実施の形態においては、試料部分の数は、検出する標的（遺伝子に特異的な配列）の数に等しい。例えば、増幅及び検出方法が、２０個の異なる標的の存在を検出するように構成されている場合、第１の増幅された試料溶液は、２０個の試料部分に分割される。これに代えて、試料溶液は、検出される標的の数より少ない数に分割してもよい。ステップ１８０では、各試料部分に更なる試薬を加える。幾つかの実施の形態で試料部分の１つ以上に水等の中性溶液を加えることによって更なる希釈を行うことができる。試薬は、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ等の検出化学物質を含む。ステップ１８５では、遺伝子に特異的なプライマの１つ以上の異なる対を各試料部分に加える。遺伝子に特異的なプライマの各対は、特定の遺伝子の塩基配列を標的とする。遺伝子に特異的なプライマの異なる対の総数は、検出される標的の数に等しい。ステップ１８５で加えられる遺伝子に特異的なプライマの各異なる対は、ステップ１５５で加えられる遺伝子に特異的なプライマの対と同じ特定の遺伝子の塩基配列に対応する。例えば、特定の遺伝子の塩基配列が遺伝子２である場合、ステップ１５５で加えられる遺伝子に特異的なプライマの対及びステップ１８５で加えられる遺伝子に特異的なプライマの対は、それぞれ遺伝子２を標的とする。ステップ１８５で加えられる遺伝子に特異的なプライマの各対は、ステップ１５５で加えられる遺伝子に特異的なプライマの対応する対と同じであってもよい。これに代えて、ステップ１８５で加えられる遺伝子に特異的なプライマの各対は、ステップ１５５で加えられる遺伝子に特異的なプライマの対応する対の内側に入ってもよい。試料部分の数が検出される標的の数に等しい場合、遺伝子に特異的なプライマの異なる対の１つが各試料部分に加えられる。試料溶液が検出された標的の数より少ない数に分割される場合、遺伝子に特異的なプライマの異なる対は、グループに分割され、プライマ対の１つのグループが各試料部分に加えられる。
【００２７】
ステップ１９０では、各試料部分に第２の増幅ステップを実行する。第２の増幅ステップは、第１の増幅ステップと同様に、熱サイクリングによって実行される。幾つかの実施の形態においては、最大４０の熱サイクルが実行される。これに代えて、４０より多い熱サイクルを実行してもよい。通常、第２の増幅ステップの間に実行される熱サイクルの数は、対数期増幅に入り、飽和に達するために十分な数とする。この結果、ステップ１８５で試料部分に加えられた特定の遺伝子に特異的なプライマ対に対応する増幅された数の特定の遺伝子の塩基配列を含む試料部分が得られる。ステップ１９５では、各サンプル部分において、増幅された特定の遺伝子の塩基配列が存在する場合、これを検出する。通常、第２の増幅ステップの間に、検出化学物質を刺激し、例えば、各特定のＤＮＡ配列について、特定の検出可能な蛍光プローブを放出して、周知の様々な検出手段を用いて検出を行う。
【００２８】
図５は、低コピー標的の存在を検出するための第３の増幅及び検出方法を示している。第３の増幅及び検出方法は、第１の増幅及び検出方法を修正したものである。第３の増幅及び検出方法においては、第１の増幅ステップは、リニア増幅に限定されず、第２の増幅ステップの間に実行される熱サイクルの数は、検出可能なレベルの標的を生成するために十分な最小数に抑えられる。これにより、検出可能なシグナルを生成するために必要な熱サイクルの数を少なくすることができる。
【００２９】
ステップ３００では、低コピーＲＮＡ鎖を含む試料を準備する。ここでの目的は、ＲＮＡ内の特定の遺伝子の塩基配列が試料内に存在しているかを検出することである。ステップ３０５では、遺伝子に特異的なプライマの対を試料に加える。一例として、標的となり、増幅される特定の遺伝子の塩基配列を遺伝子１と呼ぶこととする。この場合、遺伝子に特異的なプライマの対は、遺伝子１について特異的である。遺伝子に特異的なプライマの対の１つは、遺伝子１逆転写（ＲＴ）プライマと呼ばれ、遺伝子の一方の末端において、ＲＮＡ鎖に結合される。ステップ３１０では、試料に試薬を加える。なお、ステップ３０５及びステップ３１０を単一のステップとして結合してもよい。第３の増幅及び検出方法は、単一の処理チャンバ内で逆転写ステップ及び第１の増幅ステップを結合する。遺伝子１ＲＴプライマを含む遺伝子に特異的なプライマの対、逆転写ステップのための試薬、第１の増幅ステップのための試薬は、全て、逆転写ステップを実行する前に元試料に加えられる。ステップ３１５では、試料、遺伝子に特異的なプライマの対及び試薬を含む混合液を、第１の期間、第１の温度で培養する。この培養期間の間、ＲＮＡ鎖が遺伝子１を含んでいる場合、遺伝子１ＲＴプライマがＲＮＡ鎖に結合する。結合した遺伝子１ＲＴプライマは、ＲＮＡにおいて遺伝子１の、遺伝子１を含む対応するｃＤＮＡ配列への逆転写を開始する。この培養ステップの間、ＲＮＡの遺伝子に特異的な配列が特定され、対応する特定のｃＤＮＡ配列に逆転写される。
【００３０】
第１の期間の後、ステップ３２０において、逆転写された試料溶液に対して第１の増幅ステップを実行する。第１の増幅ステップは、熱サイクリング処理又はＰＣＲによって実行される。第１の増幅ステップの間に実行される熱サイクルの数は、リニア増幅を超え、対数期に入る十分な数とする。但し、第１の増幅ステップの間に実行される熱サイクルの数は、飽和に達するために十分な熱サイクルの数より少ない。飽和とは、更なる熱サイクルを行っても特定の生成物の収量が増加しなくなる点である。例えば、第１の増幅ステップにおいては、２０〜２５の熱サイクルを実行する。幾つかの実施の形態においては、逆転写が行われる培養ステップ及び第１の増幅ステップは、単一の処理チャンバで実行される。遺伝子に特異的なプライマの対及び逆転写と増幅に必要である試薬は、先に加えられているため、培養ステップと第１の増幅ステップとの間に試料溶液に試薬及び／又は更なるプライマを加える必要はない。
【００３１】
ステップ３２５では、第１の増幅された試料溶液に更なる試薬を加え、これによって、第１の増幅された試料溶液を希釈する。幾つかの実施の形態においては、更なる希釈ステップを実行し、ステップ３２５で加えた試薬に加えて、更なる中性溶液、例えば水を加える。試薬は、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ等の検出化学物質を含む。ステップ３３０では、第１の増幅された試料溶液に遺伝子１を標的とする遺伝子に特異的なプライマの対を加える。ステップ３３０で加えられる遺伝子に特異的なプライマの対は、ステップ３０５で加えられる遺伝子に特異的なプライマの対と同じであってもよい。これに代えて、ステップ３３０で加えられる遺伝子に特異的なプライマの対は、ステップ３０５で加えられる遺伝子に特異的なプライマの対と同じでなくてもよい。或いは、ステップ３３０で加えられる遺伝子に特異的なプライマの対は、ステップ３０５で加えられる遺伝子に特異的なプライマの対の内側に入ってもよい。ステップ３３０で加えられる遺伝子に特異的なプライマの対は、通常、ステップ３０５で加えられる遺伝子に特異的なプライマの対と同じか、又は内側にある。
【００３２】
ステップ３３５では、第１の増幅された試料溶液に第２の増幅ステップを実行する。第２の増幅ステップは、第１の増幅ステップと同様に、熱サイクリングによって実行される。幾つかの実施の形態においては、２０〜２５の熱サイクルが実行される。これに代えて、熱サイクルの数は、２０〜２５より多くても少なくてもよい。第２の増幅ステップの間に実行される熱サイクルの数は、通常、検出可能なレベルのコピー標的（標的とされる各遺伝子に特異的な配列）を生成するために十分な最小数である。殆どのアプリケーションでは、この熱サイクルの最小数は、飽和に達する数より小さい。第３の増幅及び検出方法の利点は、第２の増幅ステップの間に非特定の生成物が生成されない点である。この結果、遺伝子に特異的な配列を含む増幅された数のｃＤＮＡ鎖を含む試料溶液が得られる。ステップ３４０では、増幅された特定の遺伝子の塩基配列が存在する場合、これを検出する。通常、第２の増幅ステップの間に、検出化学物質を刺激し、例えば、各特定のＤＮＡ配列について、特定の検出可能な蛍光プローブを放出して、周知の様々な検出手段を用いて検出を行う。
【００３３】
図６は、複数の異なる低コピー標的の存在を検出するための第４の増幅及び検出方法を示す。第４の増幅及び検出方法は、第２の増幅及び検出方法を修正したものである。第４の増幅及び検出方法においては、第１の増幅ステップは、リニア増幅に限定されず、第２の増幅ステップの間に実行される熱サイクルの数は、検出可能なレベルのコピー標的を生成するために十分な最小数に抑えられる。これにより、検出可能なシグナルを生成するために必要な熱サイクルの数を少なくすることができる。
【００３４】
ステップ３５０では、複数の低コピーＲＮＡ鎖を含む試料を準備する。ここでの目的は、試料内に複数の異なる特定の遺伝子の塩基配列が存在しているかを検出することである。ステップ３５５では、遺伝子に特異的なプライマの複数の異なる対を試料に加える。ステップ３６０では、逆転写及び第１の増幅ステップのために用いられる試薬を試料に加える。なお、ステップ３５５及びステップ３６０は、単一のステップとして結合してもよい。ステップ３６５では、試料、遺伝子に特異的なプライマの複数の異なる対及び試薬を含む混合液を、所定の期間、設定された温度で培養する。この培養期間の間、ＲＮＡ鎖が、特定の遺伝子に特異的なプライマに対応する特定の遺伝子の塩基配列を含む場合、特定の遺伝子に特異的なプライマは、ＲＮＡ鎖に結合する。結合された遺伝子に特異的なプライマは、ＲＮＡ内の特定の遺伝子の塩基配列の、特定の遺伝子の塩基配列を含む対応するｃＤＮＡ鎖への逆転写を開始する。この培養ステップの間、存在する各特定の遺伝子の塩基配列が特定され、ｃＤＮＡ内の対応する特定の遺伝子の塩基配列に逆転写される。
【００３５】
所定の期間の後、逆転写された試料溶液に対して、ステップ３７０において、第１の増幅ステップを実行する。第１の増幅ステップは、熱サイクリング又はＰＣＲによって実行される。第１の増幅ステップの間に実行される熱サイクルの数は、リニア増幅を超え、対数期に入る十分な数とする。但し、第１の増幅ステップの間に実行される熱サイクルの数は、飽和に達するために十分な熱サイクルの数より少ない。例えば、第１の増幅ステップにおいては、２０〜２５の熱サイクルを実行する。幾つかの実施の形態においては、逆転写が行われる培養ステップ及び第１の増幅ステップは、単一の処理チャンバで実行される。複数の遺伝子に特異的なプライマの対及び逆転写と第１の増幅に必要である試薬は、先に加えられているため、培養ステップと第１の増幅ステップとの間に試料溶液に試薬及び／又は更なるプライマを加える必要はない。
【００３６】
ステップ３７５では、第１の増幅された試料溶液を試料部分に分割する。幾つかの実施の形態においては、試料部分の数は、検出する標的（遺伝子に特異的な配列）の数に等しい。これに代えて、試料溶液は、検出される標的の数より少ない数に分割してもよい。ステップ３８０では、各試料部分に更なる試薬を加える。幾つかの実施の形態で試料部分の１つ以上に水等の中性溶液を加えることによって更なる希釈を行うことができる。試薬は、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ等の検出化学物質を含む。ステップ３８５では、遺伝子に特異的なプライマの１つ以上の異なる対を各試料部分に加える。遺伝子に特異的なプライマの各対は、特定の遺伝子の塩基配列を標的とする。遺伝子に特異的なプライマの異なる対の総数は、検出される標的の数に等しい。ステップ３８５で加えられる遺伝子に特異的なプライマの各異なる対は、ステップ３５５で加えられる遺伝子に特異的なプライマの対と同じ特定の遺伝子の塩基配列に対応する。例えば、特定の遺伝子の塩基配列が遺伝子２である場合、ステップ３５５で加えられる遺伝子に特異的なプライマの対及びステップ３８５で加えられる遺伝子に特異的なプライマの対は、それぞれ遺伝子２を標的とする。ステップ３８５で加えられる遺伝子に特異的なプライマの各対は、ステップ３５５で加えられる遺伝子に特異的なプライマの対応する対と同じであってもよい。これに代えて、ステップ３８５で加えられる遺伝子に特異的なプライマの各対は、ステップ３５５で加えられる遺伝子に特異的なプライマの対応する対の内側に入ってもよい。試料部分の数が検出される標的の数に等しい場合、遺伝子に特異的なプライマの異なる対の１つが各試料部分に加えられる。試料溶液が検出された標的の数より少ない数に分割される場合、遺伝子に特異的なプライマの異なる対は、グループに分割され、プライマ対の１つのグループが各試料部分に加えられる。
【００３７】
ステップ３９０では、各試料部分に第２の増幅ステップを実行する。第２の増幅ステップは、第１の増幅ステップと同様に、熱サイクリングによって実行される。幾つかの実施の形態においては、第２の増幅ステップの間に２０〜２５の熱サイクルが実行される。これに代えて、熱サイクルの数は、２０〜２５より多くても少なくてもよい。第２の増幅ステップの間に実行される熱サイクルの数は、通常、検出可能なレベルのコピー標的（標的とされる各特定の遺伝子配列）を生成するために十分な最小数である。殆どのアプリケーションでは、この熱サイクルの最小数は、飽和に達する数より小さい。第３の増幅及び検出方法の利点は、第２の増幅ステップの間に非特定の生成物が生成されない点である。この結果、ステップ３８５で試料部分に加えられた特定の遺伝子に特異的なプライマ対に対応する増幅された数の特定の遺伝子の塩基配列を含む試料部分が得られる。ステップ３９５では、各サンプル部分において、増幅された特定の遺伝子の塩基配列が存在する場合、これを検出する。通常、第２の増幅ステップの間に、検出化学物質を刺激し、例えば、各特定のＤＮＡ配列について、特定の検出可能な蛍光プローブを放出して、周知の様々な検出手段を用いて検出を行う。
【００３８】
幾つかの実施の形態においては、増幅及び検出方法は、増幅及び検出装置内で実現される。増幅及び検出方法を実現するように構成された例示的な増幅及び検出装置の機能的ブロック図を図７に示す。なお、図７に示し、以下で説明する増幅及び検出装置の構成は、例示的なものに過ぎない。増幅及び検出装置は、増幅装置２００及び検出装置２３０を備える。図７に示すように、増幅装置２００は、スタンドアロン機器として構成され、検出装置２３０に接続される。これに代えて、増幅装置及び検出装置は、単一の機器として統合してもよい。
【００３９】
増幅装置２００は、マイクロ流体回路を介して相互に接続された収集容器２０５、培養及び第１の増幅チャンバ２１０、第２の増幅チャンバ２１５及び混合溶液モジュール２２５を備える。また、増幅装置２００は、マイクロ流体回路、収集容器２０５、培養及び第１の増幅チャンバ２１０、第２の増幅チャンバ２１５及び混合溶液モジュール２２５に接続され、これらの動作を制御するコントローラ２２０を備える。また、コントローラ２２０は、増幅装置２００への及び増幅装置２００からの流体フローを制御する。幾つかの実施の形態においては、コントローラ２２０は、検出装置２３０にも接続され、検出装置２３０の動作を制御する。
【００４０】
収集容器２０５は、入力試料を受け取るように構成されている。増幅及び検出装置は、入力試料に含まれている可能性がある１つ以上の低コピー標的を増幅し、その存在を検出するように構成されている。そして、試料は、培養及び第１の増幅チャンバ２１０に供給される。培養及び第１の増幅チャンバ２１０は、上述した培養及び第１の増幅ステップを実行するように構成されている。混合溶液モジュール２２５は、培養及び第１の増幅チャンバ２１０に接続され、遺伝子に特異的なプライマの１つ以上の異なる対及び培養及び第１の増幅ステップを実行するために必要な試薬を供給する。混合溶液モジュール２２５は、遺伝子に特異的なプライマ及び試薬を収容するための複数の格納容器を備える。様々なプライマ及び試薬は、個別に又は任意の予め混合された組合せとして収容できる。幾つかの実施の形態においては、培養及び第１の増幅チャンバ２１０は、収集容器２０５であり、入力試料は、培養及び第１の増幅チャンバ２１０に供給される。
【００４１】
培養及び第１の増幅チャンバ２１０は、第１の増幅された試料溶液を第２の増幅チャンバ２１５に供給する。第２の増幅チャンバ２１５は、上述した第２の増幅ステップを実行するように構成されている。増幅及び検出方法が第１の増幅された試料溶液を試料部分に分割する場合、マイクロ流体回路は、第１の増幅された試料溶液を分割し、各試料部分を第２の増幅チャンバ２１５に供給するように構成される。この場合、第２の増幅チャンバ２１５は、複数の個別の増幅チャンバを備え、これらには、それぞれ試料部分が供給される。これに代えて、増幅及び検出装置は、第１の増幅された試料溶液を試料部分に分割するように構成された計量及び分配モジュールを備えていてもよい。
【００４２】
混合溶液モジュール２２５は、第２の増幅チャンバ２１５に接続され、遺伝子に特異的なプライマの１つ以上の異なる対及び第２の増幅ステップを実行するために必要な試薬を供給する。第２の増幅チャンバ２１５は、第２の増幅された試料溶液又は第２の増幅された試料部分を検出装置２３０に供給する。検出装置２３０は、第２の増幅された試料溶液内又は第２の増幅された試料部分内に１つ以上の特定の標的が存在しているかを検出するように構成されている。
【００４３】
幾つかの実施の形態においては、増幅及び検出装置は、上述した増幅及び検出方法のステップの１つ、幾つか又は全てを自動的に実行するように構成されている。これにより、増幅及び検出方法のステップの１つ、幾つか又は全てを自動化することができる。
【００４４】
増幅及び検出装置は、スタンドアロン機器として実現してもよく、より大きいシステム、例えば、引用によって本願に援用される、同じ出願人による係属中の米国特許出願、代理人整理番号ＭＦＳＩ−００７００、発明の名称「An Integrated Substance Collection and Detection System」に開示されているような粒子収集及び検出システムの一部として実現してもよい。
【００４５】
増幅及び検出方法は、複数の低含量標的を検出するための２段階のＲＴ−ＰＣＲ法を含む。この方法においては、必要とする開始原料を従来の手法より大幅に少なくすることができる。このように感度を高めることによって、例えば１〜１００細胞の小試料における検出が可能になる。幾つかの実施の形態においては、１つ以上の低コピー標的の検出は、制御されたホットスタートマルチプレックスＲＴ−ＰＣＲによって生成された「ＲＴ増幅」生成物を用いるリアルタイムＰＣＲによって実現される。ＴａｑＭａｎ（商標）等の従来の手法と比べて、この方法は、開始原料の量が少なくて済み、したがって、環境試料内の複数の発現量が少ない標的を検出するために用いることができる。従来の分析評価は、１反応あたり通常１０ｎｇ〜１ｕｇ程度の実質的に大量の核酸を必要とするが、本発明の増幅及び検出方法は、僅かに２．５ｆｇ程度の試料を用いて数百もの標的を同時に定量化できる。従来の遺伝子マイクロアレイは、更に大量の開始ＲＮＡ（１〜１０μｇ）を必要とし、標識が付された複合ｃＤＮＡ／ｃＲＮＡ混合液内の個々の遺伝子プローブは、固有の２次構造、融解温度及び再会合レートを有する場合があり、このため、全ての遺伝子プローブのハイブリダイゼーションを最適な条件下で行うことが殆ど不可能である。現在、小試料（１〜１００細胞）内の複数の標的を同時に、速やかに、正確に、高い信頼度で定量化できる能力を提供する他の如何なる技術も存在しない。
【００４６】
以上では、１つ以上の異なるＲＮＡ配列を含む試料に対して増幅を行う増幅及び検出方法について説明した、また、幾つかの実施の形態においては、初期試料は、１つ以上の異なるＤＮＡ配列も含む。他の実施の形態においては、試料は、ＲＮＡ配列を含まず、１つ以上の異なるＤＮＡ配列だけを含む。このような場合、試料に存在する如何なるＤＮＡ配列も、逆転写ステップの間、変化しない。例えば、試料がＲＮＡ配列及びＤＮＡ配列の両方を含む場合、又はＤＮＡ配列のみを含む場合、培養ステップが実行されると、遺伝子に特異的なＲＮＡ配列は、対応するｃＤＮＡ配列に逆転写されるが、このプロセスは、試料内に含まれるＤＮＡ配列には影響を与えない。試料内にＲＮＡ配列及びＤＮＡ配列の両方が存在している場合、遺伝子に特異的なＲＮＡ配列は、逆転写され、ＤＮＡ配列は、変化しない。ＤＮＡ配列だけが試料に存在している場合、ＲＮＡ配列が存在していないため、培養ステップは、如何なる変化ももたらさない。いずれの場合も、試料がＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列又はこれらの両方を含んでいるかを最初に判定し、次に、その知識に基づいてプロセスを変更する必要はない。第１の増幅ステップ及び第２の増幅ステップの間、遺伝子に特異的なプライマに対応する元のＤＮＡ配列は、上述のように、遺伝子に特異的な、逆転写されたｃＤＮＡ配列と同様に増幅される。
【００４７】
本発明の構成及び動作原理を明瞭に説明するために、様々な詳細を含む特定の実施の形態を用いて本発明を説明した。このような特定の実施の形態の説明及びその詳細は、特許請求の範囲を制限するものではない。本発明の主旨及び範囲から逸脱することなく、例示的に選択された実施の形態を変更できることは、当業者にとって明らかである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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