(57)【要約】  本明細書では、癌および他の疾患の予防および処置におけるサーチュインおよびサーチュイン調節剤の使用を含む、Ｗｎｔ経路シグナリングのサーチュイン調節に関する方法および組成物が提供される。
2010523720.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象におけるβ−カテニン活性の調節不全的活性化に関連する疾患を処置するための方法であって、治療上有効な量の、サーチュインのレベルまたは活性を増大する剤を、それが必要な対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項２】
サーチュインが、ＳＩＲＴ１である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
剤が、本明細書中に記載されている式の群から選択される式を有する化合物である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
疾患が、癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
疾患が、加齢に関係する癌である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
癌が、大腸癌である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
小腸および大腸内のアデノーマの数およびサイズを減少する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
大腸腫瘍の罹患率を低下させる、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
剤が、対象の腸管に作用する、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
剤を、対象の腸管に接触させる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
剤が、対象の腸管で発現するＳＩＲＴ１をコードする非相同な核酸である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
疾患が、外傷であり、方法が、外傷の治癒を改善する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
疾患が、線維腫症、デュピュイトラン病、多発性嚢胞腎疾患（ＡＤＰＫＤ）、へーリー・へーリー病、シェーグレン病からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
β−カテニンが調節不全的な活性化を有しているか否かを決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
生物学的サンプルを対象から得ること、および対象中のβ−カテニンの活性化のレベルを決定することを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
対象の腫瘍サンプルを得ること、その中のβ−カテニンの活性化レベルを決定すること、およびβ−カテニンの活性化レベルがコントロールレベルに対して高い場合はサーチュインのレベルまたは活性を増大させる剤を対象に投与することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１７】
対象中のβ−カテニンの活性を増大させることによって処置可能な疾患の処置のための方法であって、それが必要な対象に、治療上有効な量の、サーチュインのレベルまたは活性を減少させる剤を投与することを含む、前記方法。
【請求項１８】
剤が、本明細書中に記載されているＳＩＲＴ１の活性を阻害する化合物である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
癌を有する対象の、サーチュインのレベルまたは活性を増大させる剤による処置に対する応答の可能性を決定するための方法であって、対象の癌性細胞中のβ−カテニンの活性レベルを決定することを含み、ここで対象の癌性細胞中のβ−カテニン活性レベルがコントロールに中のものに対して高いことが、対象の処置に対する応答の可能性を示す、前記方法。
【請求項２０】
癌を有しており、かつサーチュインのレベルまたは活性を増大する剤によって処置されている対象の予後を決定するための方法であって、対象の癌性細胞中のβ−カテニンの活性レベルを決定することを含み、ここで対象の癌性細胞中のβ−カテニン活性レベルが処置以前の対象の癌性細胞中のものに対して低いことが、対象の処置に対する応答性を示す、前記方法。
【請求項２１】
癌を有しており、かつサーチュインのレベルまたは活性を増大する剤によって処置されている対象の予後を決定するための方法であって、対象の癌細胞中のβ−カテニンの細胞における位置を決定することを含み、ここで核以外の細胞コンパートメント中のβ−カテニンの存在が、対象の処置に対する応答性を示す、前記方法。
【請求項２２】
細胞のβ−カテニン駆動性の増殖を抑制するための方法であって、増殖がβ−カテニンによって駆動される細胞を提供すること、および該細胞とサーチュインレベルまたは活性を増大させる剤とを接触させることを含む、前記方法。
【請求項２３】
細胞を提供すること、
細胞の増殖がβ−カテニンによって駆動されているか否かを決定すること、および
その増殖がβ−カテニンによって駆動される細胞とサーチュインレベルまたは活性を増大させる剤とを接触させること
を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
β−カテニンタンパク質を脱アセチル化するための方法であって、β−カテニンタンパク質とβ−カテニンタンパク質を脱アセチル化するのに十分なサーチュインまたは生物学的に活性なそのホモログとを、サーチュインまたは生物学的に活性なそのホモログがβ−カテニンを脱アセチル化する条件下で接触させることを含む、前記方法。
【請求項２５】
サーチュインとβ−カテニンタンパク質との間の相互作用を調節する剤を同定するための方法であって、β−カテニンタンパク質と相互作用するのに十分なサーチュインまたはそのホモログおよびサーチュインと相互作用するのに十分なβ−カテニンタンパク質またはそのホモログを含む組成物と試験剤とを、サーチュインまたはそのホモログおよびβ−カテニンまたはそのホモログが試験剤の非存在下で相互作用する条件下で接触させることを含み、ここでサーチュインまたはそのホモログとβ−カテニンまたはそのホモログとの間の相互作用レベルの相違が、試験剤が該相互作用を調節することを示す、前記方法。
【請求項２６】
方法が、サーチュインとβ−カテニンタンパク質との間の相互作用を阻害する剤を同定するための方法であり、サーチュインまたはそのホモログとβ−カテニンまたはそのホモログとの間のより低い相互作用レベルが、試験剤が相互作用を阻害することを示す、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
方法が、サーチュインとβ−カテニンタンパク質との間の相互作用を刺激する剤を同定するための方法であり、サーチュインまたはそのホモログとβ−カテニンまたはそのホモログとの間の高い相互作用レベルが、試験剤が相互作用を刺激することを示す、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
サーチュインによるβ−カテニンの脱アセチル化を調節する剤を同定するための方法であって、β−カテニンタンパク質を脱アセチル化するのに十分なサーチュインまたはそのホモログおよびサーチュインと相互作用するのに十分なβ−カテニンタンパク質またはそのホモログを含む組成物と試験剤とを、サーチュインまたはそのホモログがβ−カテニンまたはそのホモログを試験剤の非存在下で脱アセチル化する条件下で接触させることを含み、ここで試験剤の非存在下に対して存在下におけるβ−カテニンまたはそのホモログの脱アセチル化レベルが相違することが、試験剤がサーチュインによるβ−カテニンの脱アセチル化を調節することを示す、前記方法。
【請求項２９】
β−カテニンの活性を調節する剤を同定するための方法であって、
β−カテニンと結合するサーチュインまたはそのホモログおよびサーチュインと結合するβ−カテニンまたはそのホモログをコードする１または２以上の非相同的な核酸を含む細胞と試験剤とを接触させること、および
β−カテニンの活性を決定すること、
を含み、ここで試験剤と接触させなかった細胞に対して試験剤と接触させた細胞中のβ−カテニンの活性レベルが低いことが、試験剤がβ−カテニンの活性を調節する剤であることを示す、前記方法。
【請求項３０】
β−カテニンの活性を調節する剤を同定する方法であって、
β−カテニンと結合するサーチュインまたはそのホモログおよびサーチュインと結合するβ−カテニンまたはそのホモログをコードする１または２以上の非相同的な核酸を含む細胞と試験剤とを接触させること、および
β−カテニンの細胞における位置を決定すること、
を含み、ここで、試験剤と接触させた細胞における、核以外の細胞における位置が、試験剤がβ−カテニンの活性を調節する剤であることを示す、前記方法。
【請求項３１】
β−カテニンと結合するために十分な単離されたサーチュインまたはそのホモログおよび、サーチュインと結合するために十分な単離されたβ−カテニンまたはそのホモログを含む組成物。
【請求項３２】
β−カテニンと結合するために十分なサーチュインまたはそのホモログおよび、サーチュインと結合するために十分なβ−カテニンまたはそのホモログを含む単離されたタンパク質複合体。
【請求項３３】
サーチュイン単体またはβ−カテニン単体には顕著に結合せず、請求項３２に記載の複合体と特異的に結合する抗体。
【請求項３４】
β−カテニンと結合するサーチュインまたはそのホモログおよびサーチュインと結合するβ−カテニンまたはそのホモログをコードする１または２以上の非相同的な核酸を含む組成物。
【請求項３５】
β−カテニンと結合するサーチュインまたはそのホモログおよびサーチュインと結合するβ−カテニンまたはそのホモログをコードする１または２以上の非相同的な核酸を含む細胞。
【請求項３６】
組織特異的およびコンディショナルなＳＩＲＴ１を含む、非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項３７】
細胞における分化を予防または低減する方法であって、細胞とサーチュインのレベルまたは活性を増大させる剤とを接触させることを含む、前記方法。
【請求項３８】
細胞における分化を増大する方法であって、細胞とサーチュインのレベルまたは活性を減少させる剤とを接触させることを含む、前記方法。
【請求項３９】
癌を罹患する哺乳動物対象を処置する方法であって、治療的に有効な量の、サーチュインのレベルまたは活性を減少させる剤を対象に投与するステップおよび細胞周期特異的細胞減少療法のステップを含む、前記方法。
【請求項４０】
細胞周期特異的細胞減少療法が、化学療法または放射線療法を含む、請求項３９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
キイロショウジョウバエアルマジロ／ベータ−カテニン（Drosophila Melanogaster Armadillo/beta-catenin）タンパク質は複数の細胞機能に関係している。このタンパク質は、ウィングレス（Ｗｇ）／Ｗｎｔシグナリング経路を介した細胞シグナリングにおいて機能する。また、細胞膜において、Ｅ−カドヘリンおよびアルファ−カテニンとの複合体として、細胞接着タンパク質としても機能する（Cox et al. (1996) J. Cell. Biol. 134: 133-148; Godt and Tepass (1998) Nature 395: 387-391; White et al. (1998) J. Cell Biol. 140: 183-195）。ベータ−カテニンのこれら二つの役割は、お互いに分離することができる（Orsulic and Peifer (1996) J. Cell Biol. 134: 1283-1300；Sanson et al. (1996) Nature 383: 627-630）。
【０００２】
ウィングレス細胞シグナリングにおいて、ベータ−カテニンレベルは、ＡＰＣ、アキシンおよびＧＳＫ３ベータ／ＳＧＧ／ＺＷ３を含む複合体によってしっかりと制御されている（Peifer et al. (1994) Development 120: 369-380）。
ウィングレス／ベータ−カテニンシグナリング経路は、ヒト癌、特に大腸癌中で、高頻度で変異を生じる。腫瘍抑制遺伝子ＡＰＣにおける変異およびベータ−カテニンそのものの点変異は、ベータ−カテニンタンパク質の安定化およびこの経路の不適切な活性化を招く。
【発明の概要】
【０００３】
本明細書には、Ｗｎｔ経路シグナリングを調節およびベータ−カテニンによって媒介される発癌性を抑制するための方法としてのＳＩＲＴ１の活性化が記載される。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１】カロリー制限によって誘導されるＳＩＲＴ１過剰発現を模倣したコンディショナルＳＩＲＴ１トランスジェニックマウスの発生。（Ａ）自由給餌群（ＡＬ）またはカロリー制限群（ＣＲ）ラットにおける、腸管上皮におけるＳＩＲＴ１の発現レベルを示すウェスタンブロット分析。全てのレーンでβ−アクチンをローディングコントロールとして用いた。（Ｂ）ＦＲＴホーミングによってＣｏｌ  Ａ１座位へ単コピーのｌｏｘＰを導入した（floxed）ＳＩＲＴ１トランスジェニックマウスの発生の図。（Ｃ）ＥＳ細胞におけるＳＩＲＴ１−ＳＴＯＰのＣｏｌ１Ａ座位への組み込みおよびＳＴＯＰカセットの除去のＰＣＲ確認。（Ｄ）ＳＩＲＴ１トランスジェニックマウスにおけるＣｏｌ１Ａ−ＦＲＴ座位の生殖系伝達を示すＤＮＡゲル。（Ｅ）トランスジェニックマウスにおけるＳＩＲＴ１の発現レベルを示すウェスタンブロット分析。全てのレーンでβ−アクチンをローディングコントロールとして用いた。（Ｆ）ＳＩＲＴ１トランスジェニック動物およびコントロールの小腸におけるＳＩＲＴ１発現のムチン染色および免疫組織化学分析。
【０００５】
【図２】Ａｐｃｍｉｎ／＋マウス中の、腸管腫瘍形成および増殖におけるＳＩＲＴ１過剰発現の効果。（Ａ）ＳＩＲＴ１トランスジェニックマウスにおける肉眼的腸管腫瘍を示す全十二指腸および回腸の断面図。実線は胃−十二指腸接合を示す。アスタリスクはアデノーマを示す。白いバーは１ｍｍスケールを示す。（Ｂ）Ａｐｃｍｉｎ／＋；ＳＩＲＴ１ＳＴＯＰ（ｎ＝８）およびＡｐｃｍｉｎ／＋；ＳＩＲＴ１；Ｖｉｌ−Ｃｒｅマウス（ｎ＝１１）の腸管部位による腫瘍の平均数。（Ｃ）アデノーマのＫｉ−６７染色像および増殖率。写真は、Ａｐｃｍｉｎ／＋；ＳＩＲＴ１ＳＴＯＰおよびＡｐｃｍｉｎ／＋；ＳＩＲＴ１；Ｖｉｌ−ＣｒｅマウスからのアデノーマのＫｉ−６７免疫組織化学染色像を表す。増殖指数はＫｉ−６７染色腫瘍細胞のパーセント（コホート毎に少なくとも１０のアデノーマの平均）で表現されている。分裂率は、１０の高倍率視野（４００×）毎の組織学的に同定可能な有糸分裂形態の数として計算されている。画像は４００×の倍率で取得された。ＢおよびＣの値は平均±ｓ．ｄ．である。
【０００６】
【図３】ＳＩＲＴ１はβ−カテニン駆動性細胞増殖および転写活性を阻害する。（Ａ〜Ｄ）ＬＮ−ＣＡＰ、ＤＬＤ１、ＨＣＴ１１６およびＲＫＯ細胞株を、示した過剰発現またはｓｈＲＮＡウィルスに感染させた。細胞を選択し、ＳＩＲＴ１、アクチンまたはβ−カテニン抗体でウェスタンブロット分析にかけた。細胞を播種し、示した時点で細胞数を監視した。（Ｅ）Ｔｏｐｆｌａｓｈ−ルシフェラーゼＰＥＳＴを発現するＤＬＤ１安定細胞株に示した構築物を感染させた。細胞をＳＩＲＴ１およびβ―カテニンのウェスタンブロット分析にかけた。ルシフェラーゼ活性は総サンプルタンパク質で標準化され、４通りの方法で行われた３つの独立した実験を表す。
【０００７】
【図４】β−カテニンと相互作用し及び脱アセチル化することによりβ−カテニン転写活性を抑制するＳＩＲＴ１。（Ａ）ヒト２９３Ｔ細胞を、ＨＡ−Ｓ３３Ｙ−β−カテニンとＦＬＡＧタグのついたＳＩＲＴ１またはベクターコントロールと組み合わせて一過性にトランスフェクトした。総タンパク質のアリコートを、抗ＦＬＡＧ抗体による免疫沈降（ＩＰ  ＦＬＡＧ）にかけた。免疫沈降したタンパク質を抗ＨＡ（上のパネル）および抗ＦＬＡＧ（下のパネル）でイムノブロットした。左のレーンは、ゲルに直接的に供された未加工の抽出物（ｉｎｐｕｔ）のアリコートを含む。（Ｂ）ヒト１９３Ｔ細胞を、パネルＡと同様にトランスフェクトした。タンパク質を抗ＨＡ抗体で免疫沈降し（ＩＰ  ＨＡ）、抗ＦＬＡＧ（上のパネル）および抗ＨＡ（下のパネル）でイムノブロットした。左のレーンは、ゲルに直接的に供された未加工の抽出物（ｉｎｐｕｔ）のアリコートを含む。（Ｃ）ＬＮ−ＣＡＰ細胞を抽出し、抗ＳＩＲＴ１抗体またはコントロールとして正常ラビットＩｇＧ（ＩｇＧ）で免疫沈降した。免疫沈降したタンパク質の１０％を、抗ＳＩＲＴ１（上のパネル）でブロットし、残りの９０％を抗β−カテニン抗体でブロットした。（Ｄ）２９３Ｔ細胞を示した構築物でトランスフェクトし、４８時間後に溶解した。比較可能なレベルのβ−カテニンを、ＨＡエピトープに対する抗体を用いてイムノブロットし、アセチル化リジン残基についてウェスタンブロットした（ＩＰ：ＨＡ  ＩＢ：Ａｃ−Ｋ、上のパネル）。ＨＡ免疫沈降物のブロットを、ほぼ同じレベルのＨＡ−β−カテニンタンパク質であることを立証するために、抗ＨＡ抗体を用いて再検出した（ＩＰ：ＨＡ  ＩＢ：ＨＡ、下のパネル）。（Ｅ〜Ｇ）２９３Ｔ細胞を、ＴＯＰ−ＦＬＡＳＨルシフェラーゼおよびＰＲＬ−ＴＫウミシイタケ（Renilla）ルシフェラーゼレポーター構築物で、示したようにトランスフェクトした。示した場合には、ニコチンアミド（ＮＡＭ）をトランスフェクトの８時間後に添加した。トランスフェクトの２４時間後、細胞を収集し、ルシフェラーゼアッセイにかけた。データをウミシイタケルシフェラーゼ活性に対して標準化した。データは３つのサンプルの平均±ｓ．ｄ．である。
【０００８】
【図５】図５は、ＳＩＲＴ１過剰発現Ａｐｃｍｉｎ／＋マウスおよびＡｐｃｍｉｎ／＋コントロール動物の間の体重差を示す。上の図は肢の色によって証明される、貧血の程度を図解する。
【０００９】
【図６】図６は、ｆｌｐリコンビナーゼ技術を用いたＣｏｌＡ１座位に対するＳＩＲＴ１−ＳＴＯＰプラスミドのターゲッティングを示す（Ａ）。ＳＩＲＴ１−ＳＴＯＰのＣｏｌ１Ａ座位への一体化をＰＣＲによって図解したＤＮＡゲル（Ｂ）、ＥＳ細胞におけるＳＴＯＰカセットの除去（Ｃ）およびＣｒｅ動物との交配によってＳＴＯＰカセットを削除されたトランスジェニックマウスにおけるＳＩＲＴ１発現（Ｄ）。
【００１０】
【図７Ａ】図７Ａは、ヒトＳＩＲＴ１およびヒトβ−カテニンのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す（配列番号１〜４）。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ヒトＳＩＲＴ１およびヒトβ−カテニンのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す（配列番号１〜４）。
【図７Ｃ】図７Ｃは、ヒトＳＩＲＴ１およびヒトβ−カテニンのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す（配列番号１〜４）。
【図７Ｄ】図７Ｄは、ヒトＳＩＲＴ１およびヒトβ−カテニンのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す（配列番号１〜４）。
【図７Ｅ】図７Ｅは、ヒトＳＩＲＴ１およびヒトβ−カテニンのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す（配列番号１〜４）。
【図７Ｆ】図７Ｆは、ヒトＳＩＲＴ１およびヒトβ−カテニンのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す（配列番号１〜４）。
【図７Ｇ】図７Ｇは、ヒトＳＩＲＴ１およびヒトβ−カテニンのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す（配列番号１〜４）。
【図７Ｈ】図７Ｈは、ヒトＳＩＲＴ１およびヒトβ−カテニンのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す（配列番号１〜４）。
【００１１】
【図８】図８は、ＳＩＲＴ１をトランスフェクトした細胞の細胞コロニーの一連の写真画像であり、野生型ＳＩＲＴ１の過剰発現が軟寒天におけるコロニー形成を減少させ、ドミナントネガティブＳＩＲＴ１の過剰発現はコロニー形成に影響がないことを示している。
【図９】図９は、ＳＩＲＴ１過剰発現細胞における病巣形成の減少を定量した棒グラフであり、病巣は５０の高倍率視野（「ＨＰＦ」）ごとに計測した。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書に記載される主題は、少なくとも一部において、ＳＩＲＴ１がβ−カテニンを脱アセチル化するという発見に基づいている。
定義
便宜のため、本明細書、実施例および添付の請求項で採用された特定の語をここに集める。その他の定義がない限り、本明細書で用いられた全ての技術的および科学的語は、本発明が属する分野の当業者が通常理解するのと同様の意味を有する。
【００１３】
本明細書で用いられる冠詞「ａ」および「ａｎ」は、１または１より大きい（すなわち、少なくとも１の）冠詞の文法的対象をいう。例として、「an element」は１の要素または２以上の要素を意味する。
「アセチラーゼ」という語は、本明細書において「アセチルトランスフェラーゼ」と互換的に用いられ、アミノ酸へのアセチル基（ＣＨ３ＣＯ−）の付加を触媒する酵素をいう。ヒストンアセチルトランスフェラーゼなど、典型的なアセチルトランスフェラーゼは、これに限定されるものではないが、ＣＲＥＢ−結合タンパク質（ＣＢＰ）、ｐ３００／ＣＢＰ関連因子（ＰＣＡＦ）、general control non-repressed 5（ＧＣＮ５）、ＴＢＰ関連因子（ＴＡＦ２５０）、ステロイド受容体共活性化因子（ＳＣＲ１）および単球性白血病ジンクフィンガータンパク質（ＭＯＺ）を含む。
【００１４】
本明細書で用いられる「剤」という語は、化学化合物、化学化合物の混合物、生物学的巨大分子（核酸、抗体、タンパク質またはそれらの一部、例えばペプチド、など）、または細菌、植物、糸状菌または動物（特に哺乳類）細胞または組織などの生物学的材料から作製される抽出物を表す。剤は、本明細書中以下に記載されるスクリーニングアッセイによって、特定の活性を有するものとして同定し得る。かかる剤の活性は、剤を、対象中で局所的にまたは全体的に働く生物学的、生理学的または薬学的に活性な基質である「治療剤」として好適なものとして提供し得る。
【００１５】
本明細書で用いられる「相互作用する」または「相互作用」という語は、天然におけるタンパク質−タンパク質、タンパク質−核酸、核酸−核酸およびタンパク質−小分子または核酸−小分子の間の相互作用など、分子の間の検出可能な関係または関連（例えば生化学的相互作用）を含むことを意味する。
組成物は、例えば本明細書にさらに記載されているものなどの薬学的に許容可能な緩衝剤またはビヒクルを含む、薬学的組成物であり得る。組成物は、アセチル化または脱アセチル化反応に必要な付加的な分子を含んでもよい。
【００１６】
「単離された」という語は、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドについて用いられた場合、他の細胞性タンパク質から単離されたポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質のことをいい、精製ポリペプチドおよび組換えポリペプチドの両方を包含することを意味する。
「天然の化合物」とは、天然において見出すことのできる化合物をいい、すなわちヒトによって設計されていない化合物である。天然の化合物はヒトによってまたは天然によって作られ得る。
【００１７】
「パーセント同一」という語は、２つのアミノ酸配列間または２つの核酸配列間の配列同一性をいう。同一性はそれぞれ、比較の目的で配置され得る各配列における位置を比較することによって決定することができる。比較配列における等価な位置が同じ塩基またはアミノ酸で占められている場合、分子はその位置において同一であり、等価な部位が同じまたは類似のアミノ酸残基で占められている（例えば立体的および／または電気的性質において類似である）場合、分子はその位置において相同的（類似）であるといえる。ホモロジー、類似性、同一性のパーセンテージとしての表現は、比較配列によって共有される位置における同一または類似のアミノ酸の数の関数をいう。ホモロジー、類似性、同一性のパーセンテージとしての表現は、比較配列によって共有される位置における同一または類似のアミノ酸の数の関数をいう。
【００１８】
ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＥＮＴＲＥＺを含む、様々な整列アルゴリズムおよび／またはプログラムを用いてよい。ＦＡＳＴＡおよびＢＬＡＳＴはＧＣＧ配列分析パッケージ（ウィスコンシン大学, Madison, Wis.）の一部として利用可能であり、例えばデフォルト設定とともに用いることができる。ＥＮＴＲＥＺは、国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information）、国立医学図書館（National Library of Medicine）、国立衛生研究所（National Institute of Health）、Bethesda, Md.を通じて利用可能である。1つの態様において、二つの配列のパーセント同一性はＧＣＧプログラムによって、ギャップウェイト１、例えば二つの配列間の各アミノ酸ギャップは単一アミノ酸またはヌクレオチドのミスマッチであるとして重み付けする、で決定することができる。
【００１９】
整列の他の技術はMethods in Enzymology, vol. 266: Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis (1996), Doolittle編, Academic Press, Inc., Harcourt Brace & Co., San Diego, California, USAの部に記載されている。好ましくは、配列中にギャップを許容する整列プログラムを、配列を整列するのに活用する。Smith-Watermanは、配列整列においてギャップを許容するアルゴリズムの１タイプである。Meth. Mol. Biol. 70: 173-187 (1997)参照。NeedlemanおよびWunsch整列法を用いたＧＡＰプログラムもまた、配列を整列するのに活用することができる。代替的な検索戦略は、ＭＡＳＰＡＲコンピュータ上で動作する、ＭＰＳＲＣＨソフトウェアを用いる。ＭＰＳＲＣＨは、大規模並列処理コンピュータ上で、配列を得点付けするのにSmith-Watermanアルゴリズムを用いる。このアプローチは、遠縁の一致を取り上げる能力を改善し、小さなギャップおよび核酸配列エラーに対して特に寛容である。核酸にコードされたアミノ酸配列を検索するのに、タンパク質およびＤＮＡデータベースの両方を用いることができる。
【００２０】
「ポリヌクレオチド」および「核酸」という語は、互換的に用いられる。これらはあらゆる長さのヌクレオチドのポリマー性形態をいい、デオキシリボ核酸またはリボ核酸あるいはそれらのアナログのどちらかである。ポリヌクレオチドはあらゆる三次元構造を有していてよく、既知のまたは未知のあらゆる機能を発揮し得る。以下はポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子ホモログのコードまたは非コード領域、連鎖解析によって定義される座位、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソーマルＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝鎖ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、あらゆる配列から単離されたＤＮＡ、あらゆる配列から単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。
【００２１】
ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログなどの修飾されたヌクレオチドも含み得る。存在する場合、ポリマーの集合の前または後に、ヌクレオチド構造への修飾が組込まれてよい。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構造物に割り込まれてもよい。ポリヌクレオチドは、例えば標識構造物との抱合などにより、さらに修飾されてもよい。「組換え」ポリヌクレオチドという語は、遺伝子起源、ｃＤＮＡ起源、半合成起源、または天然のものでないか天然でない配置で別のポリヌクレオチドと連結した合成起源のポリヌクレオチドを意味する。
【００２２】
「小分子」という語は、当該技術分野において承認されており、約２０００ａｍｕより小さい、または約１０００ａｍｕより小さい、およびさらには約５００ａｍｕより小さい分子量を有する合成物である。小分子は、例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド核酸、ペプチド類似物、炭水化物、脂質、または他の有機（炭素含有）または無機分子であってよい。多くの製薬会社が、化学および／または生物学的な混合物、しばしば糸状菌、細菌、または藻類の抽出物、の大規模なライブラリを有しており、本明細書に記載のあらゆるアッセイによってスクリーニング可能である。「小有機分子」という語は、しばしば有基または医薬化合物として同定される小分子をいい、もっぱら核酸、ペプチドまたはポリペプチドである分子は含まない。
【００２３】
「実質的に相同」という語は、核酸配列に関して用いられた場合、実質的に同一またはお互いに類似する配列をいい、コンフォメーションの相同性を生じ、したがって１または２以上の生物学的活性（免疫学的活性を含む）を有用な程度保存する。この語は、配列の共通進化を暗示することは意図しない。
【００２４】
「実質的に精製された」という語は、生来共にある成分から分離されたタンパク質をいう。好ましくは、タンパク質はサンプル中の総量の少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、およびもっとも好ましくは少なくとも約９９％（体積で、湿重量もしくは乾燥重量で、またはモルパーセントもしくはモル分率で）である。純度は、例えばポリペプチドの場合、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動またはＨＰＬＣ分析によってなど、あらゆる適切な方法によって計測することができる。
【００２５】
「転写制御配列」とは、本明細書の全体を通して、開始シグナル、エンハンサー、プロモーターなど、操作可能に結合したタンパク質コード配列の転写を誘導または調節するＤＮＡ配列のことをいう一般的な語である。好ましい態様において、１つの組換え遺伝子の転写は、発現が意図された細胞タイプにおいて組換え遺伝子の発現を調節するプロモーター配列（または他の転写制御配列）の調節下にある。組換え遺伝子は、本明細書に記載されたように、遺伝子の天然形態の転写を調節する配列と同じかまたは異なる転写制御配列の調節下にあることができることもまた理解されるだろう。
【００２６】
病態または疾患を「処置する」という語は、当該技術分野において承認されており、病態もしくは疾患の少なくとも１の兆候を治療および改善するまたは病態もしくは疾患の悪化を予防することを言う。
【００２７】
「ベクター」は、挿入された核酸分子を宿主細胞へおよび／または宿主細胞間を輸送する自己複製核酸分子である。この語は主に核酸分子を細胞へと挿入するのに機能するベクター、主に核酸の複製に機能するベクター複製物、およびＤＮＡまたはＲＮＡであるの転写および。または翻訳に機能する発現ベクターを含む。上記の機能の２以上を提供するベクターもまた含まれる。本明細書で用いられる場合、「発現ベクター」は、適切な宿主細胞に導入された場合、ポリペプチドへと転写および翻訳されることができるポリヌクレオチドとして定義される。「発現システム」とは、通常所望の発現産物を得るために機能することができる発現ベクターを含む適切な宿主細胞を暗示する。
【００２８】
「治療剤」という語は、当該技術分野において承認されており、対象中で局所的または全体的に働く、生物学的、生理学的または薬理学的に活性な基質であるあらゆる化学部位をいう。「薬剤」とも言われる治療剤の例は、メルクインデックス、米医薬品便覧、および薬理学の基礎と治療などの周知の参照文献に記載されており、これに限定することなく、医薬品、ビタミン、ミネラル補助剤、疾患または疾病の処置、予防、診断、治癒または軽減に用いられる基質、体の構造または機能に影響する基質、あるいは生理学的環境におかれた後に生物学的に活性となるまたはより活性となるプロドラッグを含む。
【００２９】
「治療的効果」という語は、当該技術分野において承認されており、薬理学的に活性な基質による動物、特に哺乳動物、さらに特にヒト、における局所的なまたは全体的な効果をいう。したがってこの語は、動物またはヒトにおいて、疾患の診断、治癒、軽減、処置または予防あるいは所望の肉体的または精神的進行または状態の増強に用いられることを意図するあらゆる基質を意味する。「治療上効果的な量」という語句は、いくつかの所望の局所的または全体的効果を、あらゆる処置に当てはまる適度なリスク・ベネフィット比において産生する、かかる基質の量を意味する。
【００３０】
かかる基質の治療上効果的な量は、処置される対象および病態、対象の体重および年齢、病態の重篤度、投与法などに依存して変化し、当業者にはすぐに決定可能である。例えば、本明細書に記載されている特定の組成物を、かかる処置においてあてはまる適度なリスク・ベネフィット比で産生するのに十分な量で投与し得る。
【００３１】
本明細書で「含む」という語を用いた場合、ある態様において、この語は「からなる」または「から本質的になる」に代替可能であることが理解されるだろう。
【００３２】
「小分子」という語は、当該技術分野において承認されており、約２０００ａｍｕより小さい、または約１０００ａｍｕより小さい、およびさらには約５００ａｍｕより小さい分子量を有する合成物である。小分子は、例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド核酸、ペプチド類似物、炭水化物、脂質、または他の有機（炭素含有）または無機分子であってよい。多くの製薬会社が、化学および／または生物学的な混合物、しばしば糸状菌、細菌、または藻類の抽出物、の大規模なライブラリを有しており、本明細書に記載のあらゆるアッセイによってスクリーニング可能である。「小有機分子」という語は、しばしば有基または医薬化合物として同定される小分子をいい、もっぱら核酸、ペプチドまたはポリペプチドである分子は含まない。
【００３３】
「予防的」または「治療的」処置という語は、当該技術分野において承認されており、ホストへの剤の投与をいう。望まれない病気の臨床症状（例えばホスト動物の疾患または他の望まれない状況）の前に投与した場合、処置は予防的、すなわち望まれない病気の進展からホストを守ることであり、一方で望まれない病気の兆候の後に投与した場合、処置は治療的（すなわち、存在する望まれない病気またはその副次的悪影響の縮小、改善または維持を意図すること）である。
【００３４】
「患者」、「対象」または主題の方法で処置される「ホスト」という語は、ヒトまたは非ヒト動物のどちらかを意味する。
「哺乳動物」という語は、当該技術分野において知られており、典型的には哺乳動物はヒト、霊長類、ウシ科、ブタ科、イヌ科、ネコ科、および齧歯類（例えばマウスおよびラット）を含む。
化合物に言及した場合の「生物学的に利用可能な」という語は、当該技術分野において承認されており、それまたは投与される化合物の量の一部が、それを投与される対象または患者に吸収され、取り込まれ、またはさもなければ生理学的に利用することができる化合物の形態をいう。
【００３５】
「薬学的に許容可能な塩」という語は、当該技術分野において承認されており、化合物の相対的に非毒性な、無機および有機酸付加塩をいい、例えば本明細書に記載されているような組成物中に含まれるものを含む。
【００３６】
「薬学的に許容可能な担体」という語は、当該技術分野において承認されており、あらゆる対象組成物またはその構成成分を、一の器官または体の一部から他の器官または体の一部へ運搬することまたは輸送することにかかわる液体または固体、充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒または封入材料などの薬学的に許容可能な材料、組成物またはビヒクルをいう。各担体は、対象組成物およびその構成成分と混合可能であり、患者に対して有害でないという意味において「許容可能」でなければならない。
【００３７】
薬学的に許容可能な担体として役立ち得る材料のいくつかの例は、（１）ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖類、（２）コーンスターチおよびポテトスターチなどのスターチ類、（３）カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなどのセルロースおよびその誘導体、（４）粉末状トラガカント、（５）モルト、（６）ゼラチン、（７）タルク、（８）ココアバターおよび坐薬ワックスなどの賦形剤、（９）ピーナツオイル、綿実油、ベニバナ油、ごま油、オリーブオイル、モロコシ油および大豆油などの油類、（１０）プロピレングリコールなどのグリコール類、（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなどのポリオール、（１２）オレイン酸エチルおよびラウリル酸エチルなどのエステル、（１３）寒天、（１４）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤、（１５）アルギン酸、（１６）発熱物質を含まない水（pyrogen-free water）、（１７）等張食塩水、（１８）リンガー溶液、（１９）エチルアルコール、（２０）リン酸バッファ溶液、および（２１）製剤処方において採用される他の非毒性で混合可能な基質を含む。
【００３８】
「全身投与」、「全身的に投与する」、「末梢投与」および「末梢的に投与する」という語は、当該技術分野において承認されており、患者の全身に入り、代謝および他の同様のプロセスに従属し、直接的に中枢神経系に入らない治療的なまたは他の材料対象組成物の投与をいう。
【００３９】
「非経口投与」および「非経口的に投与する」という語は、当該技術分野において承認されており、しばしば注射による、腸内および局所ではない投与の方式をいい、これに限定するものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、および胸骨内注射および点滴を含む。
【００４０】
典型的な組成物
本明細書では、サーチュインタンパク質またはそのホモログおよびβ−カテニンタンパク質またはそのホモログを含む組成物が提供される。本明細書にはまた、タンパク質複合体、例えばサーチュインタンパク質またはそのホモログとβ−カテニンタンパク質またはそのホモログとのタンパク質複合体などの、単離されたタンパク質複合体が記載される。
【００４１】
本明細書に記載されたタンパク質および他の物質の組成物（composition of matter）は、真核生物または原核生物由来であってよく、単一細胞、単細胞生物由来であってよく、あるいは多細胞生物由来であってよい。物質の組成物は、哺乳動物、脊椎動物、酵母、ヒトまたは非ヒトのものであってよい。例えば、サーチュインタンパク質およびβ−カテニンタンパク質はヒト由来であってよい。
【００４２】
サーチュインはＳＩＲＴ１であってよい。サーチュインはまた、例えばＳＩＲＴ２、３、４、５、６または７など、他のサーチュインのファミリーメンバーであってよい。「サーチュイン脱アセチル化酵素タンパク質ファミリーメンバー」、「Ｓｉｒ２ファミリーメンバー」、「Ｓｉｒ２タンパク質ファミリーメンバー」および「サーチュインタンパク質」は本明細書において互換可能に用いられ、酵母Ｓｉｒ２、Ｓｉｒ−２．１およびヒトＳＩＲＴ１〜７を含む。ヒトＳＩＲＴ１のマウスホモログはＳｉｒｔ２αである。他のファミリーメンバーは、「ＨＳＴ遺伝子群」（homologues of Sir two）といわれる４つの付加的な酵母Ｓｉｒ２様遺伝子ＨＳＴ１、ＨＳＴ２、ＨＳＴ３およびＨＳＴ４（Branchmann et al. (1995) Genes Dev. 9: 2888およびFrye et al. (1999) BBRC 260: 273）を含む。
【００４３】
サーチュインのサブグループは、ヒトＳＩＲＴ２とよりも、ヒトＳＩＲＴ１および／または酵母Ｓｉｒ２とより類似性を共有するものであり、これらのメンバーは、ＳＩＲＴ３が有するような、ＳＩＲＴ１に存在しＳＩＲＴ２には存在しないＮ末端配列の少なくとも一部を有する。
【００４４】
ヒトサーチュインのヌクレオチドおよびアミノ酸配列および典型的な保存ドメインは以下に説明する。
【表１】
2010523720.tif 000003
【００４５】
ヒトサーチュイン、ＳＩＲＴ１（silent mating type information regulation 2 homolog）のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１および２として説明されている（GenBank受託番号ＮＭ＿０１２２３８およびＮＰ＿０３６３７０にそれぞれ対応）。
【００４６】
ヒトβ―カテニンヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれGenBank受託番号ＮＭ＿００１９０４．２→ＮＰ＿００１８９５．１（配列番号３および４）で提供されている。保存ドメインは、約アミノ酸３９９〜５１８、２２９〜３４８、４８３〜６２３、１０８〜２２２および３５０〜３９０を含む。
【００４７】
タンパク質または基準タンパク質、例えばサーチュインタンパク質またはβ−カテニンタンパク質、のホモログは、基準タンパク質とは異なるが基準タンパク質と同様の目的で用いることができるタンパク質をいう。例えば、基準タンパク質のホモログは、基準タンパク質または全長基準タンパク質のそれとあるいは基準タンパク質のホモログのそれと相同性のある特定のアミノ酸配列を有するタンパク質のホモログであってよい。
【００４８】
タンパク質のホモログは生物学的に活性なホモログであってよい。サーチュインの生物学的に活性なホモログはβ―カテニンタンパク質と結合する能力がある（または結合するのに十分な）ホモログであるか、またはβ−カテニンタンパク質を脱アセチル化する能力があるホモログであってよい。β−カテニンタンパク質の生物学的に活性なホモログは、サーチュインタンパク質と結合する能力がある（または結合するのに十分な）ホモログであるか、またはアセチル化されるアミノ酸領域を含むホモログであってよい。
【００４９】
二つのタンパク質間の結合は、例えば１つのタンパク質と別の無関係なタンパク質との間の結合親和性よりも高い親和性の結合など、顕著な結合であってよい。例えば、２つのタンパク質の間の結合親和性は、少なくとも約１０−６、１０−７、１０−８、１０−９または１０−１０Ｍであってよい。
【００５０】
タンパク質のホモログは、少なくとも約１０、２０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００またはそれ以上の（連続した）アミノ酸長であってよい。ホモログは、全長天然タンパク質よりもより少ないアミノ酸を含んでよい。例えばタンパク質のホモログは、例えば天然全長タンパク質などの全長タンパク質と比べて約１、２、３、４、５、１０、２５、５０、７５、１００、１５０、１７５、２００またはそれ以上の連続したアミノ酸をそのタンパク質のＮ−および／またはＣ−末端にて欠損したタンパク質またはペプチドであってよい。
【００５１】
タンパク質または全長タンパク質のホモログは、そのＮ−および／またはＣ−末端に１または２以上の非相同的なまたは無関係のアミノ酸を含んでいてよい。例えば、全長のサーチュインまたはβ−カテニンタンパク質のホモログは、約１、２、３、４、５、１０、２５、５０、７５、１００、１５０、１７５、２００またはそれ以上の連続したアミノ酸とそのタンパク質のＮ−またはＣ−末端で連結していてもよく、アミノ酸は、少なくとも同一の位置ではない、全長サーチュインまたはβ−カテニンタンパク質内にそれぞれ存在する配列とは無関係なアミノ酸配列を形成する。無関係なアミノ酸配列は、非相同であるといってもよい。
【００５２】
例えばサーチュインタンパク質のまたはβ−カテニンタンパク質のホモログなど、タンパク質のホモログは生物学的に活性なホモログであってよい。サーチュインの生物学的に活性なホモログは、β―カテニンタンパク質と結合する能力がある（または結合するのに十分な）ホモログであるか、またはβ−カテニンタンパク質を脱アセチル化する能力があるホモログであってよい。β−カテニンタンパク質の生物学的に活性なホモログは、サーチュインタンパク質と結合する能力がある（または結合するのに十分な）ホモログであるか、またはアセチル化されるアミノ酸領域を含むホモログであってよい。
【００５３】
サーチュインの生物学的に活性なホモログは、脱アセチル化に関与するその活性部位または触媒部位、例えばそのコアドメイン、を含んでよい。例えば、サーチュインの生物学的に活性なホモログは、上記表に列挙した保存ドメインの全てまたは一部を含む。サーチュインの生物学的に活性な一部分は、サーチュインのコアドメインを含んでいてよい。例えば、配列番号１のヌクレオチド２３７〜９３２によってコードされる、配列番号２を有するＳＩＲＴ１のアミノ酸６２〜２９３は、ＮＡＤ＋結合ドメインおよび基質結合ドメインを包含する。したがって、この領域は時にコアドメインといわれる。これもまた時にコアドメインといわれる他のＳＩＲＴ１の生物学的に活性な一部分は、配列番号１のヌクレオチド８３４から１３９４によってコードされる配列番号２の約アミノ酸２６１から４４７、配列番号１のヌクレオチド７７７から１５３２によってコードされる配列番号２の約アミノ酸２４２から４９３、配列番号１のヌクレオチド８１３から１５３８によってコードされる配列番号２の約アミノ酸２５４から４９５を含む。
【００５４】
β−カテニンタンパク質の生物学的に活性なホモログは、アセチル化されており、ＳＩＲＴ１によって脱アセチル化される部位を含んでよい。ヒトβ−カテニンの知られたアセチル化残基は、Ｋ４９およびＫ３４５である。したがって、β−カテニンタンパク質の生物学的に活性なホモログは、例えば、さらに本明細書に記載された特定の数のアミノ酸を有するもの１または両方のこれらの残基を包含するタンパク質またはペプチドであり得る。
【００５５】
基準タンパク質のホモログは、基準タンパク質のそれと少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％同一な配列を含んでよい。例えば、サーチュインタンパク質のホモログまたはそのホモログは、サーチュインタンパク質またはそのホモログのそれと少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％同一な配列を含むタンパク質であってよい。β−カテニンタンパク質のホモログまたはそのホモログは、β−カテニンタンパク質またはそのホモログのそれと少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％同一な配列を含むタンパク質であってよい。
【００５６】
タンパク質のアミノ酸配列は異なっていてもよく、例えば配列番号２または４から、１、２、３、５、１０、１５または２０アミノ酸が付加、欠失または置換されたものなどであってもよい。アミノ酸置換は同類のアミノ酸であってもよい。同類置換は本明細書において、以下の５グループのうちの１つによって交換されたものと定義される：Ｉ．小脂肪性、非極性またはわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ；ＩＩ．極性、負に帯電した残基およびそのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＩＩＩ．極性、正に帯電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、ＩＶ．大きな脂肪性非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ、およびＶ．大きな芳香性残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ。以上のグループにおいて、以下の５つの置換は「高度に保存的」と考えられる：Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｈｉｓ／Ａｒｇ／Ｌｙｓ；Ｐｈｅ／Ｔｙｒ／Ｔｒｐ、Ｍｅｔ／Ｌｅｕ／Ｉｌｅ／Ｖａｌ。準保存的置換は、上記（Ｉ）〜（Ｖ）の２つのグループの間での交換であって、上記グループ（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）を含む大グループ（Ａ）または上記グループ（ＩＶ）および（Ｖ）を含む大グループ（Ｂ）に限定された交換であると定義される。アミノ酸欠失、付加または置換は、好ましくは、例えばさらに本明細書に記載されたものなど、生物学的活性に求められないタンパク質の範囲に局在している。
【００５７】
基準タンパク質のホモログまたはそのホモログはまた、基準タンパク質またはそのホモログをコードする核酸と少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列からなる核酸によりコードされるタンパク質であってもよい。
基準タンパク質のホモログまたはそのホモログもまた、基準タンパク質またはそのホモログをコードする核酸とハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質であってよい。ハイブリダイゼーションは低いまたは高いストリンジェンシー条件で行うことができる。ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件、例えば約４５℃における６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、続いて５０℃の２．０×ＳＳＣでの洗浄など、は当業者に知られており、または分子生物学実験プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）１、John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1〜6.3.6に見出すことができる。例えば、洗浄ステップにおける塩濃度は、低いストリンジェンシーの約２．０×ＳＳＣから高いストリンジェンシーの約０．２×ＳＳＣまで選択することができる。さらに、洗浄ステップにおける温度は、低いストリンジェンシー条件の室温、約２２℃、から高いストリンジェンシー条件の約６５℃まで増加することができる。温度および塩の両方を変化させてよく、温度または塩濃度は、他の可変値を変化させる間一定に保たれてもよい。好ましい核酸は、配列番号１または３あるいはその一部を含む核酸と高いストリンジェンシー条件下、例えばハイブリダイゼーションおよび洗浄条件が０．２×ＳＳＣ、６５℃など、でハイブリダイズする核酸である。
【００５８】
サーチュインタンパク質またはそのホモログおよびβ−カテニンタンパク質またはそのホモログをコードする１または２以上の核酸を含む組成物もまた提供される。１つの態様において、核酸はサーチュインタンパク質またはそのホモログおよびβ−カテニンタンパク質またはそのホモログをコードする。組成物はまた、サーチュインタンパク質またはそのホモログをコードする１つの核酸およびβ―カテニンタンパク質またはそのホモログをコードする１つの核酸を含んでもよい。
【００５９】
タンパク質は、１または２以上のアミノ酸、たとえば非相同アミノ酸配列またはペプチドと直接または間接的に連結されてよく、融合タンパク質を形成してよい。非相同的なアミノ酸配列は、安定性、可溶性を提供するものであってよく、または単に検出および／または単離のためにタンパク質を標識するものでもよい。例えば、タンパク質はヒスチジンタグあるいは例えばヒンジ、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインなど、免疫グロブリン分子の一部と融合または連結されていてもよい。
【００６０】
例えばサーチュインまたはβ―カテニンあるいはそのホモログなどのタンパク質をコードする核酸は、例えばプロモーターなどの１または２以上の制御要素とさらに連結していてよい。核酸は、例えば発現ベクターなど、プラスミドまたはベクターの一部であってよい。典型的な発現ベクターは、アデノウィルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクターレトロウィルスベクター、レンチウィルスベクターおよびプラスミドベクターなどのウィルスまたは非ウィルスベクターを含む。典型的なウィルスのタイプは、ＨＳＶ（単純ヘルペスウィルス）、ＡＡＶ（アデノ随伴ウィルス）、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウィルス）、ＢＩＶ（ウシ免疫不全ウィルス）、およびＭＬＶ（マウス白血病ウィルス）を含む。核酸は、ウィルス粒子中、リポソーム中、ナノ粒子中、およびポリマーとの複合体を含む、十分効果的な送達レベルを提供するあらゆる所望の形式で投与されてよい。
【００６１】
１または２以上の核酸は、例えば単離された細胞または生物体中の細胞など、細胞中に含まれてよい。核酸はまた、動物またはそれについての形態、例えばトランスジェニック動物、の１または２以上の細胞中に存在してよい。典型的なトランスジェニック動物は、例えば実施例中にさらに記載されるような、組織特異的および条件的なＳＩＲＴ１を含む非ヒトトランスジェニック動物である。
【００６２】
さらに、サーチュインタンパク質およびβ−カテニンタンパク質を含む複合体と特異的に結合する抗体およびそのホモログが提供される。抗体は、抗体がサーチュインおよびβ−カテニンタンパク質間の複合体の特異検出に用い得るように、好ましくはサーチュイン単体またはβ−カテニン単体には特異的に結合しない。抗体は、１または２の分離したタンパク質よりも複合体とより親和的に結合し得る。抗体はポリクローナルまたはモノクローナル抗体であってよく、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＡまたはＩｇＥ抗体であってよい。抗体はヒト化、キメラ、単鎖またはヒト抗体であってよい。
【００６３】
治療的方法
本明細書において、例えばβ−カテニン活性の調節不全的（dysregulated）活性化に伴う疾患など、β―カテニン活性またはレベルの低下により恩恵を受け得る疾患または病気を処置または予防する方法が提供される。方法は、それが必要な対象に治療上効果的な量の、サーチュイン、例えばＳＩＲＴ１、のレベルまたは活性を増加する剤を投与することを含んでよい。
【００６４】
１つの態様において、サーチュインレベルまたは活性を増加する剤は、サーチュインの活性を増加する小分子である。「サーチュインタンパク質の活性化」は、活性化されたサーチュインタンパク質、すなわち少なくとも１のその生物学的活性を実施することが可能なサーチュインタンパク質を少なくともある程度、例えば少なくとも１０％、５０％、２倍またはそれ以上の活性の増加とともに、産生する活動をいう。サーチュインタンパク質の生物学的活性は、例えばヒストン、ｐ５３およびβ−カテニンの脱アセチル化、寿命の延長、ゲノムの安定性の増加、転写のサイレンシング、および母細胞と娘細胞との間の酸化されたタンパク質の分離のコントロールを含む。
【００６５】
「サーチュイン活性化化合物」は、サーチュインタンパク質を活性化する、その活性を少なくともひとつ刺激もしくは増加する、またはサーチュインタンパク質のレベルを増加する、あるいはそれらを組み合わせて行う化合物のことをいう。典型的な態様において、サーチュイン活性化化合物は少なくとも１つのサーチュインタンパク質の生物学的活性を、少なくとも約１％、５％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％またはそれ以上増加させ得る。典型的なサーチュインタンパク質の生物学的活性は、例えばヒストンおよびｐ５３の脱アセチル化、寿命の延長、ゲノムの安定性の増加、転写のサイレンシング、および母細胞と娘細胞との間の酸化されたタンパク質の分離の制御を含む。
【００６６】
「サーチュイン阻害性化合物」は、サーチュインタンパク質のレベルを減少させるおよび／または少なくとも１つのサーチュインタンパク質の活性を減少させる化合物をいう。典型的な態様において、サーチュイン阻害性化合物は少なくとも１つのサーチュインタンパク質の生物学的活性を、少なくとも約１％、５％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％またはそれ以上減少させ得る。典型的なサーチュインタンパク質の生物学的活性は、例えばヒストンおよびｐ５３の脱アセチル化、寿命の延長、ゲノムの安定性の増加、転写のサイレンシング、および母細胞と娘細胞との間の酸化されたタンパク質の分離の制御を含む。
【００６７】
「サーチュイン調節化合物」は、本明細書に記載されたような化合物をいう。典型的な態様において、サーチュイン調節化合物は、サーチュインタンパク質の機能的特性または生物学的活性を、アップレギュレート（例えば活性化または刺激）、ダウンレギュレート（例えば阻害または抑制）、または他には変化させ得る。サーチュイン調節化合物は、サーチュインタンパク質を直接的にまたは間接的に調節するように働き得る。特定の態様において、サーチュイン調節化合物は、サーチュイン活性化化合物またはサーチュイン阻害性化合物であってよい。
【００６８】
サーチュイン活性化物質の恩恵を受け得る疾患または病気は、β―カテニン活性の調節不全的活性化に伴うものを含む。少なくとも一部において、上昇したβ−カテニン活性は細胞の増殖または超増殖を伴い、超増殖細胞を伴う、またはその存在によって特徴付けられる病気を、本明細書に記載されるように処置することができる。
【００６９】
β−カテニンの非制御活性化は、直腸結腸癌およびメラノーマ、グリオブラストーマ、前立腺癌および乳癌の９０％に関係している。β―カテニン活性のダウンレギュレーションは動物モデルにおいて癌細胞死および腫瘍退縮を導き、タンパク質が癌治療において重要な標的であることを提案する。したがって、処置し得る典型的な疾患または状態は、良性、悪性または転移性癌を含む、癌を含む。癌の特定の例は、加齢性の癌、例えば大腸、肺、皮膚（例えばメラノーマ）、肝臓（肝細胞癌および肝芽腫）および子宮の癌、である。他の癌には、前立腺癌、乳癌、髄芽腫、毛母腫およびグリオブラストーマを含む。
【００７０】
本明細書に記載された方法は、腫瘍の数および／または大きさを減少し得る。大腸癌の場合、本明細書に記載された方法は、例えば小腸および／または大腸内など腸管内の、腺癌の数および／または大きさを減少し得る。本方法はまた、大腸癌における大腸腫瘍罹患性など、腫瘍の罹患性も減少し得る。一般的に、ＳＩＲＴ１の小分子調節物質は、癌の化学療法、癌の化学予防および癌の存在する処置に対する補助療法として用いられ得る。
【００７１】
サーチュインのレベルまたは活性を増加させる剤は超増殖している細胞と接触させてよい。例えば、剤は腸、例えば大腸、のポリープまたは腫瘍を有する対象の腸管と接触させてよい。この局所送達を達成するため、剤は投与される対象の腸管または大腸に送達されるような形態で、経口で投与されてよい。
剤がＳＩＲＴ１または生物学的に活性なそのホモログをコードする非相同核酸である場合、核酸は対象の腸管を標的とし、およびその中で発現してよい。
【００７２】
β-カテニンがＥ−カドヘリンのシグナリングを制御するという事実に少なくとも一部基づいて、本明細書に記載された組成物および方法の使用は、癌、気管閉塞の疾患（ぜんそくおよび慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）など）、多発性嚢胞腎（ＡＤＰＫＤ）、へーリー・へーリー病、シェーグレン病をＳＩＲＴ１調節物質で処置することを含む。本明細書に記載されたように処置または予防し得る他の疾患は、外傷（外傷治癒）、線維腫症、骨粗鬆症、虚血性神経細胞死および子宮内膜症を含む。
【００７３】
本明細書ではまた、β−カテニンの活性の増加によって恩恵を受ける疾患、病気または状況に悩む対象中のそれを処置するための方法が提供される。それが必要な患者に、サーチュイン活性のある剤の治療的に効果のある量を投与することを含んでよい。剤はサーチュイン、例えばＳＩＲＴ１、の活性を阻害するものであってもよい。「サーチュインタンパク質を阻害すること」とはサーチュインタンパク質の生物学的活性の少なくとも１つを、少なくともある程度、例えば少なくとも約１０％、５０％、２倍またはそれ以上減少させる活動をいう。典型的な疾患は、細胞増殖を刺激するのが望ましいものを含む。
【００７４】
典型的なサーチュイン調節物質、活性化物質および阻害性物質を含む、は例えば、公報番号２００５００９６２５６、２００５０１３６５３７、２００５０１７１０２７、２００５０２６７０２３、２００６００２５３３７、２００６００８４０８５、２００６０１１１４３５、２００６０２２９２６５、２００６０２７６４１６、２００６０２７６３９３、２００７００１４８３３、２００７００３７８０９、２００７００３７８２７、２００７００３７８６５、２００７００４３０５０、２００７００１５８０９、２０００７００３７８１０、２００７００７７６５２、２００７００９９８３０、２００７０１０５１０９、２００７０１１７７６５、２００７０１４９４６６、２００７０１４９４９５、２００７０１６０５８６、２００７０１７３５２７、２００７０１８５０４９、２００７０１９７４５９、２００７０２１２３９５、２００７０２２５２４６、２００７０２４８５９０、２００８００１５２４７、２００８００２１０６３、２００８００３２９８７、２００８００４５６１０および２００８００７０９９１を有する米国特許出願中に、および公報番号ＷＯ２００７０１９３４４、ＷＯ２００７００８５４８、ＷＯ２００６１２７９８７、ＷＯ２００６１０５４４０、ＷＯ２００６０９４２４８、ＷＯ２００６０９４２４６、ＷＯ２００６０９４２３９、ＷＯ２００６０９４２３７、ＷＯ２００６０９４２３６、ＷＯ２００６０９４２３５、ＷＯ２００６０９４２３３、ＷＯ２００６０９４２１０、ＷＯ２００６０９４２０９、ＷＯ２００６０７９０２１、ＷＯ２００６０７８９４１、ＷＯ２００６０７６６８１、ＷＯ２００７００５４５３、ＷＯ２００６１３８４１８、ＷＯ２００６０９６７８０、ＷＯ２００６０６８６５６を有するＰＣＴ出願中に記載されている。
【００７５】
これらの公報に記載されているサーチュインの全ての活性化物質および阻害性物質は、特に参照として本明細書に組込まれる。典型的な活性化物質および阻害性物質もまた、本明細書に添付された別紙Ａ、ＢおよびＣに記載されている。別紙ＡおよびＢに記載されている化合物は特に参照として本明細書に組込まれる。
薬学的に許容可能な付加的な塩およびサーチュイン活性化物質と阻害性化合物との複合体もまた含まれる。化合物が１または２以上のキラル中心を有し得る場合、定めがなければ、本明細書で意図された化合物は単一のステレオイソマーまたはステレオイソマーのラセミ混合物であってよい。
【００７６】
化合物が不飽和な炭素−炭素二重結合を有する場合、シス（Ｚ）およびトランス（Ｅ）イソマーが本明細書で意図される。化合物が、ケト−エノール互変異体など、
【化１】
2010523720.tif 000004
および
【化２】
2010523720.tif 000005
など、互変異性形態で存在しうる場合、平衡状態で存在するかまたはＲ’による適切な置換によって１の形態に固定されているかどうかにかかわらず、各互変異性形態は本明細書に提案された方法の中に含まれると意図される。あらゆる１の発生においてあらゆる置換基の意味は、その意味において、または他のあらゆる発生について他のあらゆる置換基の意味において独立である。
【００７７】
化合物のプロドラッグもまた、本明細書に提案された方法に含まれる。プロドラッグは、in vivoにおいて活性な親薬剤を放出する、あらゆる共有結合した担体であると考えられる。in vivo分解産物などの化合物の代謝物もまた本願に含まれる。
【００７８】
上記化合物のアナログおよび誘導体もまた、サーチュインタンパク質ファミリーのメンバーを活性化するのに用いることができる。例えば、誘導体またはアナログは、化合物をより安定にし、またはそれらが細胞膜を横断するまたはファゴサイトーシスもしくはピノサイトーシスされる能力を改善する。典型的な誘導体は、例えばリスベラトロールについて米国特許６，３６１，８１５などに記載されているようなグリコシル化誘導体を含む。他のリスベラトロールの誘導体は、シス−およびトランス−リスベラトロールならびにグリコシドを形成するなどのその糖との抱合体（例えば米国特許６，４１４，０３７参照）を含む。ピセイドまたはリスベラトロール３−Ｏ−ベータ−Ｄ−グルコピラノシドといわれるグルコシドポリダチンもまた用いることができる。
【００７９】
化合物と抱合し得る糖類は、グルコース、ガラクトース、マルトース、ラクトースおよびスクロースを含む。グリコシル化スチルベンは、Regev-Shoshani et al. Biochemical J. (BJ20030141として4/16/03に出版)にさらに記載されている。本明細書に記載された他の化合物の誘導体は、エステル、アミドおよびプロドラッグである。リスベラトロールのエステルは、例えば米国特許６，５７２，８２２などに記載されている。リスベラトロールおよびその誘導体は、先行技術、例えば米国特許６，４１４，０３７、６，３６１，８１５、６，２７０，７８０、６，５７２，８８２、およびBrandolini et al. (2002) J. Agric. Food. Chem. 50: 7407などに記載されている。ヒドロキシフラボンの誘導体は、例えば米国特許４，５９１，６００などに記載されている。リスベラトロールおよび他の活性化化合物は、例えばSigmaから市販で得ることもできる。
【００８０】
剤は天然であっても非天然であってもよい。天然の場合、それらはその通常の環境から単離されてよい。例えば、サーチュイン活性を調節する剤を含む組成物は、他の分子または他のタンパク質など、他の構成成分と比較して少なくとも約８０％、９０％、９５％、９８％または９９％（例えば重量％）の剤を含んでよい。剤は、その天然の環境から単離または精製されてもよい。したがって、活性化化合物が天然の場合、使用に先立ってその天然の環境から少なくとも一部単離されてよい。例えば、植物ポリフェノールは、植物から単離されてもよく、および本明細書に記載された方法に使用する前に一部または大いに単離されてもよい。活性化化合物はまた、合成的に調製されてもよく、この場合、生来付随する他の化合物を含まない。例示的態様において、活性化組成物は生来付随する化合物を約５０％、１０％、１％、０．１％、１０−２％、または１０−３％未満含む、または活性化化合物は生来付随する化合物を約５０％、１０％、１％、０．１％、１０−２％、または１０−３％未満付随する。
【００８１】
細胞は、約０．１μＭ、０．５μＭ未満、約１μＭ未満、約１０μＭまたは約１００μＭ、約１、１０、１００または５００μＭ以上、約１ｍＭ、あるいは約１ｍＭ、１０ｍＭまたは１００ｍＭの活性化または阻害化合物濃度を有する溶液と接触されてよい。活性化化合物の濃度はまた、約０．１から１μＭ、約１から１０μＭ、約１０から１００μＭ、約１００μＭから１ｍＭ、または約１ｍＭから１００ｍＭであってよい。好適な濃度は、用いる特定の化合物および特定の細胞ならびに所望の効果に依存し得る。例えば、細胞を、「サーチュインを活性化する」または「サーチュインを阻害する」濃度、例えばサーチュインを少なくともそれぞれ１０％、３０％、５０％、１００％、３、１０、３０または１００倍、活性化または阻害するのに十分な濃度の、活性化性または阻害性化合物とそれぞれ接触させてもよい。
【００８２】
ある態様において、方法はサーチュインの活性を増大させる剤の使用を含むが、剤は本明細書に記載されたような分子などの特定の分子ではない。例えば、ある方法において、剤はリスベラトロールではなく、ある方法において、剤はリスベラトロールまたはその誘導体、例えば代謝産物、ではなく、ある方法において、剤はフラボン、スチルベン、またはカルコンではなく、およびある態様において、剤は天然ではない。
【００８３】
ある態様において、ＳＩＲＴ１活性化物質などの対象サーチュイン活性化物質は、サーチュイン、例えばＳＩＲＴ１、の脱アセチル化活性を活性化するのに効果的な濃度（例えばin vivo）において、ＰＩ３−キナーゼを阻害する、アルドリダクターゼ（aldoreductase）を阻害するおよび／またはチロシンタンパク質キナーゼを阻害する、実質的な能力を全く有さない。例えば、好ましい態様において、サーチュイン活性化物質は、サーチュイン脱アセチル化活性を活性化するためのＥＣ５０が、アルドリダクターゼおよび／またはチロシンタンパク質キナーゼの１または２以上を阻害するためのＥＣ５０より少なくとも５倍小さく（5 fold less）、さらにより好ましくは少なくとも１０倍、１００倍またはさらに１０００倍小さくなるように選択される。
【００８４】
特定の態様において、対象のサーチュイン活性化物質は、サーチュインの脱アセチル化活性を活性化するのに効果的な濃度（例えばin vivo）において、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性を転写活性化する実質的な能力を全く有さない。例えば、好ましい態様において、サーチュイン活性化物質は、サーチュイン脱アセチル化活性を活性化するためのＥＣ５０が、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性を転写活性化するためのＥＣ５０より少なくとも５倍小さく（5 fold less）、さらにより好ましくは少なくとも１０倍、１００倍またはさらに１０００倍小さくなるように選択される。
【００８５】
特定の態様において、対象のサーチュイン活性化物質は、サーチュインの脱アセチル化活性を活性化するのに効果的な濃度（例えばin vivo）において、冠血管拡張を起こす実質的な能力を全く有さない。例えば、好ましい態様において、サーチュイン活性化物質は、サーチュイン脱アセチル化活性を活性化するためのＥＣ５０が、冠血管拡張を起こすためのＥＣ５０より少なくとも５倍小さく、さらにより好ましくは少なくとも１０倍、１００倍またはさらに１０００倍小さくなるように選択される。
【００８６】
特定の態様において、対象のサーチュイン活性化物質は、サーチュインの脱アセチル化活性を活性化するのに効果的な濃度（例えばin vivo）において、実質的な鎮痙活性を全く有さない。例えば、好ましい態様において、サーチュイン活性化物質は、サーチュイン脱アセチル化活性を活性化するためのＥＣ５０が、鎮痙効果（胃腸の筋肉においてなど）のためのＥＣ５０より少なくとも５倍小さく、さらにより好ましくは少なくとも１０倍、１００倍またはさらに１０００倍小さくなるように選択される。
【００８７】
特定の態様において、対象のサーチュイン活性化物質は、サーチュインの脱アセチル化活性を活性化するのに効果的な濃度（例えばin vivo）において、肝チトクロームＰ４５０  １Ｂ１（ＣＹＰ）を阻害する実質な能力を全く有さない。例えば、好ましい態様において、サーチュイン活性化物質は、サーチュイン脱アセチル化活性を活性化するためのＥＣ５０が、Ｐ４５０  １Ｂ１の阻害ためのＥＣ５０より少なくとも５倍小さく、さらにより好ましくは少なくとも１０倍、１００倍またはさらに１０００倍小さくなるように選択される。
【００８８】
特定の態様において、対象のサーチュイン活性化物質は、サーチュインの脱アセチル化活性を活性化するのに効果的な濃度（例えばin vivo）において、核因子カッパＢ（ＮＦ−κＢ）を阻害する実質的な能力を全く有さない。例えば、好ましい態様において、サーチュイン活性化物質は、サーチュイン脱アセチル化活性を活性化するためのＥＣ５０が、ＮＦ−κＢの阻害のためのＥＣ５０より少なくとも５倍小さく、さらにより好ましくは少なくとも１０倍、１００倍またはさらに１０００倍小さくなるように選択される。
【００８９】
特定の態様において、対象のＳＩＲＴ１活性化物質は、ヒトＳＩＲＴ１の脱アセチル化活性を活性化するのに効果的な濃度（例えばin vivo）において、低級真核生物、特に酵母またはヒトの病原体、におけるＳＩＲＴ１のオルソログを活性化する実質的な能力を全く有さない。例えば、好ましい態様において、ＳＩＲＴ１活性化物質は、ヒトＳＩＲＴ１の脱アセチル化活性を活性化するためのＥＣ５０が、酵母Ｓｉｒ２（Candida、S. cerevisiaeなどの）を活性化するためのＥＣ５０より少なくとも５倍小さく、さらにより好ましくは少なくとも１０倍、１００倍またはさらに１０００倍小さくなるように選択される。
【００９０】
他の態様において、対象のサーチュイン活性化物質は、サーチュインの脱アセチル化活性を活性化するのに効果的な濃度（例えばin vivo）において、分裂促進因子活性化タンパク質（ＭＡＰ）のリン酸化を阻害する、シクロオキシゲナーゼ、ＣＯＸ−２など、の触媒または転写活性を阻害する、一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）を阻害する、またはタイプＩコラーゲンへの血小板粘着を阻害する実質的な能力を全く有さない。例えば、好ましい態様において、サーチュイン活性物質は、サーチュイン脱アセチル化活性を活性化するためのＥＣ５０が、これらの活性のいずれかが機能するためのＥＣ５０より少なくとも５倍小さく、さらにより好ましくは少なくとも１０倍、１００倍またはさらに１０００倍小さくなるように選択される。
【００９１】
他の態様において、本明細書に記載された化合物、例えばサーチュイン活性化物質または阻害性物質、は、当業者に知られたあらゆる標準的なアッセイによって決定される、顕著なまたは検出可能な抗酸化活性を有さない。例えば化合物は、Ｏ２ラジカルなどのフリーラジカルを顕著に取り除かない。化合物は、他の化合物、例えばリスベラトロール、と比べて約２倍、３倍、５倍、１０倍、３０倍または１００倍小さい酸化活性を有していてもよい。
【００９２】
化合物はまた、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍまたはそれより小さい、サーチュインに対する結合親和力を有していてもよい。化合物はサーチュインの基質またはＮＡＤ＋に対するＫｍを少なくとも約２、３、４、５、１０、２０、３０、５０または１００倍減少させてもよい。化合物は、約１ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約１μＭ未満、約１０μＭ未満、約１００μＭ未満、または約１〜１０ｎＭ未満、約１０〜１００ｎＭ、約０．１〜１μＭ、約１〜１０μＭまたは約１０〜１００μＭの、サーチュインの脱アセチル化活性を活性化するためのＥＣ５０を有していてよい。化合物は、実施例において記載されているような無細胞アッセイまたは細胞ベースアッセイにおいて計測される、少なくとも約５、１０、２０、３０、５０または１００倍のサーチュインの脱アセチル化活性を活性化してもよい。化合物は、同濃度のリスベラトロールまたは本明細書に記載された他の化合物と比べて、少なくとも１０％、３０％、５０％、８０％、２倍、５倍、１０倍、５０倍または１００倍大きなＳＩＲＴ１の脱アセチル化活性の誘導を起こしてもよい。化合物は、ＳＩＲＴ１活性化のためのものよりも少なくとも約１０倍、２０倍、３０倍、５０倍大きなＳＩＲＴ５の活性化についてのＥＣ５０を有していてもよい。
【００９３】
化合物は細胞の細胞質膜を横断してもよい。例えば、少なくとも約２０％、５０％、７５％、８０％、９０％または９５％の細胞浸透性を有していてもよい。
【００９４】
本明細書に記載された化合物はまた、１または２以上の次の特性を有していてもよい：化合物は細胞または対象に対して本質的に非毒性であってよく、化合物は有機分子あるいは２０００ａｍｕまたはそれ未満、１０００ａｍｕまたはそれ未満の小分子であってよく、化合物は少なくとも約３０日、６０日、１２０日、６ヶ月または１年の、通常の雰囲気条件下での半減期を有していてもよく、化合物は、溶液中においてリスベラトロールよりも、少なくとも約５０％、２倍、５倍、１０倍、３０倍、５０倍または１００倍安定性が高くてもよく、化合物はＤＮＡ修復因子Ｋｕ７０の脱アセチル化を促進してもよく、化合物はＲｅｌＡ／ｐ６５の脱アセチル化を促進してもよく、化合物は全体的な代謝回転率を増大し、細胞のＴＮＦ誘導アポトーシスに対する感受性を増強してもよい。
【００９５】
本明細書に記載された方法に用いられる剤は、タンパク質、例えばサーチュインまたは生物学的に活性なそのホモログ、またはそれをコードする核酸であってもよい。核酸は少なくとも１つの制御エレメントと連結していてもよく、ベクター、例えば発現ベクター、の一部であってもよい。ベクターは特定の組織、例えば結腸、に対する発現を目的としていてよく、組織特異的プロモーターを用いてもよい。
他のサーチュイン阻害性物質は、サーチュインの発現レベルを特異的に低下させるｓｉＲＮＡ分子を含む。
【００９６】
本明細書に記載された少なくとも２、３、４、５またはそれ以上の化合物を含む組成物がまた提供され、および本明細書に記載された１、２、３、４、５またはそれ以上の化合物および他の剤、例えば化学療法剤、を含む組成物もまた本明細書で提供される。公開番号２００６／００２５３３７を有する米国特許出願において説明されている化学療法剤は特に参照として本明細書に組み込まれる。
【００９７】
本明細書に記載された処置または予防方法は、対象中の細胞におけるβ−カテニンのレベルおよび／または活性の決定を伴ってもよい。この計測は、本明細書に記載された方法のいずれかにより、処置あるいは処置または予防の代替的な方法の前、その間、および／またはその後に行われてよい。１つの態様において、生物学的資料を対象から獲得し、サンプル中のβ−カテニンの活性化レベルを決定する。β―カテニンの活性化レベルの決定は、アセチル化のレベルの決定を含んでよい。β―カテニン活性の計測が未処置の対象中で行われた場合、通常のβ−カテニン活性レベルを有するコントロールに比べてより高いアセチル化レベルは、対象が本明細書に記載されたように処置可能であることを示す。β―カテニン活性の計測が、例えば本明細書に記載されたように、すでに処置されたの対象中で行われた場合、通常のβ−カテニン活性レベルを有するコントロールに比べてより高いアセチル化レベルは、対象の処置を継続すべきであることを示す。β―カテニン活性の計測が、処置が終了したと考えられる対象中で行われた場合、通常のβ−カテニン活性レベルを有するコントロールに比べてより高いアセチル化レベルは、対象の処置を再開すべきであることを示す。
【００９８】
β−カテニン活性が計測されるコントロールは、本明細書に記載された疾患を有しないと信じられているまたは知られている顕著なまたは十分な数の対象、例えば健康であると信じられている対象、中における、β−カテニン活性のレベルの統計学的計測を含んでよい。コントロールと比べて、対象からのサンプル中の統計的に異なる、例えばより高い、レベルのβ−カテニン活性は、対象が本明細書に記載されたように処置可能であることを示す。
【００９９】
１つの態様において、対象の組織、例えば腫瘍、のサンプルを獲得し、その中のβ−カテニンの活性化レベルを決定し、β−カテニンの活性化レベルがコントロールレベルと比べて上昇していた場合、対象はサーチュイン、例えばＳＩＲＴ１、のレベルまたは活性を増大する剤を投与することで処置されるだろう。
【０１００】
１つの態様において、方法は、癌など調節不全的なβ−カテニン活性を伴う疾患を有する対象の、サーチュインのレベルまたは活性を増大する剤による処置に対する応答の見込みを決定するために用いられる。方法は、細胞、例えば対象の癌性細胞、中のβ−カテニンの活性化レベルを決定することを含んでよく、ここで対象の癌性細胞中の、コントロールと比べてより高いレベルのβ−カテニン活性は、対象が処置に対して応答する可能性があることを示す。
【０１０１】
本明細書で提供される他の方法は、予後または予測方法である。方法は、疾患、例えば癌、を有する対象の予後を決定するためであってもよいし、サーチュインのレベルまたは活性を増大する剤によって処置するためであってもよい。方法は、対象の細胞、例えば癌性細胞、中のβ−カテニン活性のレベルを決定することを含んでよく、ここで対象の癌性細胞中のβ−カテニン活性レベルが、処置開始前の対象の癌性細胞中のそれと比べてより低いことは、対象が処置に応答性であることを示す。
【０１０２】
疾患、例えば癌、を有する対象の予後を決定し、サーチュインのレベルまたは活性を増大する剤によって処置するための方法もまた提供される。方法は、対象の癌性細胞中のβ−カテニンの細胞内局在を決定することを含んでよく、ここでβ−カテニンが核以外の細胞コンパートメント内に存在することは、対象が処置に対して応答性であることを示す。
【０１０３】
さらに、少なくともカロリー制限（ＣＲ）の間ＳＩＲＴ１レベルが上昇する、およびトランスジェニックマウスにおけるＳＩＲＴ１のＣＲレベルの過剰発現がβ−カテニン駆動性腫瘍を遅らせるという観察に基づいて、対象の特定の組織におけるＳＩＲＴ１レベルまたは活性の計測は、対象における疾患、例えば癌、の発症の見込みを予測し得る。１つの態様において、方法は、対象の組織においてサーチュイン、例えばＳＩＲＴ１、の活性またはレベルを決定することを含み、ここでサーチュインのより高いレベルまたは活性は、サーチュインのレベルまたは活性がより低い場合より、対象が組織内で癌を発症させる見込みがより少ないことを示す。腫瘍におけるサーチュイン活性のレベルまたはタンパク質レベルが、組織においてＣＲ条件下で観察されるレベルと類似していることは、その組織における癌の発症の見込みは、ＳＩＲＴ１活性またはタンパク質レベルがより低い場合より低いことを示す。ＣＲにおけるＳＩＲＴ１のレベルは、非ＣＲ条件下よりも約５０％、２倍、３倍、５倍またはそれ以上高い。図解的態様において、ＳＩＲＴ１活性のレベルまたはタンパク質レベルは、対象の小腸または大腸からの組織サンプル中で決定される。コントロールと比べてＳＩＲＴ１活性またはタンパク質のより高いレベルは、レベルがより低い場合よりも、対象が大腸癌を発症する見込みがより低いことを示す。
【０１０４】
ＳＩＲＴ１調節物質によるヒト疾患の予防および治療
β−カテニン活性の誤制御は、Ｗｎｔシグナリング経路の混乱を招き、それはサーチュイン（例えばＳＩＲＴ１）およびサーチュインのレベルまたは活性を調節（例えば増大）する剤によって逆転される。したがって、サーチュイン調節物質はＷｎｔシグナリング関連疾患の処置に有用である。表Ｄ１およびそこの参照文献に提供されており、それらはその全体において参照として本明細書に組み込まれる。Moon et al., Nat Rev. Genet. (2004) 5(9):691-701も参照。
【０１０５】
【表２】
2010523720.tif 000006
【０１０６】
【表３】
2010523720.tif 000007
【０１０７】
いくつかの態様において、Ｗｎｔシグナリング関連疾患の処置方法は、それを必要とするヒトなどの哺乳類対象に、サーチュイン、例えばＳＩＲＴ１、レベルまたは活性を増大する剤を、治療上効果的な量投与することを含む。哺乳類対象は疾患を有していると臨床的に診断されてよい。対象はまた、１または２以上の興味ある細胞、組織または器官においてβ−カテニン活性化の異常なレベルを有していてもよい。処置は疾患を回復する、あるいは１または２以上の疾患の兆候を軽減する結果となってもよい。代替的に、疾患の進行が停止してもよいし、または進行の速度が減少してもよい。効力は当業者に知られた方法を用いて決定され、未処置の疾患または他の化合物で処置した疾患と比べて決定されてよい。対象の処置は他の処置様式と組み合わせて行われてもよい。例えば癌を罹患した対象の処置は、サーチュイン調節物質および細胞周期特異性細胞減少性治療、例えばＳ期特異性剤による化学療法、および放射線療法など、を含んでもよい。
【０１０８】
他の態様において、本発明は、それが必要なヒトなどの哺乳類対象に、効果的な量のサーチュイン、例えばＳＩＲＴ１、のレベルまたは活性を増大する剤を投与することを含む、ヒト対象をＷｎｔシグナリング関連疾患の発症を予防する方法を提供する。哺乳類対象は、疾患を発症するリスクを有すると臨床的に診断されてもよいし、対象または対象の家族中における１または２以上の、上述の表Ｄ１に列挙された遺伝子などの、遺伝子変異の存在に基づいて、増大した発症のリスクを有してもよい。対象はまた、１または２以上の興味ある細胞、組織または器官においてβ−カテニン活性化の異常なレベルを有していてもよい。
【０１０９】
他の方法
本明細書で提供される付加的な方法は、β−カテニン活性を調節する方法を含む。方法は、β−カテニンアセチル化レベルを調節することを含んでよい。方法は、例えばin vitro、in vivo、in situまたはex vivoであってよい。ひとつの態様において、方法はβ−カテニンタンパク質またはそのホモログとサーチュインまたは生物学的に活性なそのホモログとを、サーチュインまたは生物学的に活性なそのホモログがβ−カテニンタンパク質またはそのホモログを脱アセチル化し、その結果β−カテニンアセチル化レベルおよびβ―カテニン活性が減少するような条件下で接触することを含む。方法はまた、内因性または異種性どちらかのβ−カテニンタンパク質またはそのホモログを含む細胞を、サーチュインもしくは生物学的に活性なそのホモログまたはそれらをコードする核酸あるいはサーチュインを活性化する剤と接触させることを含む。典型的な剤は本明細書にさらに記載されたものである。
【０１１０】
β−カテニンの脱アセチル化を妨げ、それによりβ−カテニンの活性の低下を妨げる方法もまた提供される。方法は、β−カテニンタンパク質を含む溶液、抽出物、細胞抽出物または細胞をサーチュイン、例えばＳＩＲＴ１、の活性を阻害するまたはレベルを低下させる剤と接触することを含んでよい。典型的な剤は本明細書にさらに記載されたものである。
【０１１１】
β−カテニンタンパク質の活性の調節はまた、β−カテニン活性を媒介するまたは随伴する生物学的活性を調節してもよい。したがって、本明細書に記載されたβ−カテニン活性を調節する方法は、β−カテニン駆動性の細胞の増殖を制御するのに用い得る。方法は、その増殖がβ−カテニンによって駆動されている細胞を提供すること、および該細胞をサーチュインレベルまたは活性を増大させる剤と接触させることを含んでよい。.方法はまた、細胞を提供すること、細胞の増殖がβ−カテニンによって駆動されているかを決定すること、およびその増殖がβ−カテニンによって駆動されている細胞を、サーチュインレベルまたは活性を増大させる剤と接触させることを含んでもよい。
【０１１２】
スクリーニングアッセイ
少なくともＳＩＲＴ１がβ−カテニンを脱アセチル化し、その結果β−カテニンが不活性化するという観察に基づいて、β−カテニン活性を調節する剤、例えば小分子、を同定する方法を考案することができる。
【０１１３】
ある方法は、サーチュインおよびβ−カテニンタンパク質の間の相互作用を調節する剤を同定することを含んでよい。典型的な方法は、β−カテニンタンパク質と相互作用するのに十分なサーチュインまたはそのホモログを、サーチュインと相互作用するのに十分なβ−カテニンタンパク質またはそのホモログおよび試験剤と、サーチュインまたはそのホモログとβ−カテニンまたはそのホモログとが試験剤の非存在下において反応する条件下で接触させることを含み、ここでサーチュインまたはそのホモログおよびβ−カテニンまたはそのホモログの、試験剤の非存在下と比べた存在下の相互作用のレベルが異なることが、試験剤が相互作用を調節することを示す。方法は、サーチュインおよびβ−カテニンタンパク質間の相互作用を阻害する剤を同定するための方法であってよく、ここでサーチュインまたはそのホモログおよびβ−カテニンまたはそのホモログの間の相互作用のより低いレベルは、試験剤が相互作用を阻害することを示す。方法は、サーチュインおよびβ−カテニンタンパク質間の相互作用を刺激する剤を同定するための方法であってよく、ここでサーチュインまたはそのホモログおよびβ−カテニンまたはそのホモログの間の相互作用のより高いレベルは、試験剤が相互作用を刺激することを示す。
【０１１４】
ある方法は、β−カテニンのサーチュインによる脱アセチル化を調節する剤を同定するために用いることができる。方法は、β−カテニンタンパク質を脱アセチル化するのに十分なサーチュインまたはそのホモログを、サーチュインに脱アセチル化されるのに十分なβ−カテニンタンパク質またはそのホモログおよび試験剤と、サーチュインまたはそのホモログがβ−カテニンまたはそのホモログを試験剤の非存在下において脱アセチル化する条件下で接触させることを含み、ここでサーチュインまたはそのホモログおよびβ−カテニンまたはそのホモログの、試験剤の非存在下と比べた存在下の脱アセチル化のレベルが異なることが、試験剤がβカテニンのサーチュインによる脱アセチル化を調節することを示す。本方法は、β−カテニンタンパク質の脱アセチル化を阻害する剤を同定する方法であってよく、ここで試験剤の非存在下に比べて存在下のβ−カテニンタンパク質またはそのホモログの脱アセチル化のレベルがより高いことは、試験剤がβ−カテニンのサーチュインによる脱アセチル化を阻害している（または脱アセチル化を促進または維持している）ことを示す。本方法は、β−カテニンタンパク質の脱アセチル化を促進する剤を同定する方法であってよく、ここで試験剤の非存在下に比べて存在下のβ−カテニンタンパク質またはそのホモログの脱アセチル化のレベルがより低いことは、試験剤がβ−カテニンのサーチュインによる脱アセチル化を刺激している（または脱アセチル化を阻害している）ことを示す。
【０１１５】
二つのタンパク質の間の相互作用は様々な技術によって検出され得る。複合体形成の調節は、例えば、放射線標識、蛍光性標識または酵素的標識されたポリペプチドなど、検出可能に標識されたタンパク質を用いて、イムノアッセイによって、クロマトグラフィー検出によって、またはアセチルトランスフェラーゼまたは脱アセチル化酵素の本質的な検出によって定量化できる。
【０１１６】
概して、非複合体形態の１つまたは両方のタンパク質からの複合体の分離を促進するために、およびアッセイの自動化に順応するために、タンパク質の１つを固定化することが求められる。候補剤の存在下および非存在下におけるタンパク質の結合は、反応物を含有するのに適したあらゆる器中で達成することができる。例はマイクロタイタープレート、試験管、およびマイクロ遠心管を含む。
【０１１７】
１つの態様において、サーチュインまたはそのホモログおよび／またはβ−カテニンタンパク質またはそのホモログは、マトリクスとタンパク質を結合させることができるドメインを含む融合タンパク質の形態で提供される。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（Sigma Chemical, St. Louis, Mo.）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上に吸着され、そこで標識されていてもよい他のタンパク質および試験剤と組み合わされ、混合物は複合体形成を導く条件下、例えば塩およびｐＨについての生理学的条件など、でインキュベートされるが、わずかによりストリンジェントな条件が要求されてもよい。インキュベーション後、あらゆる未結合標識を取り除くためにビーズは洗浄され、マトリクスは固定化され、存在する放射線標識が直接または複合体が解離された後の上清中で決定される。代替的に、複合体はマトリクスから解離され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、および標準の電気泳動技術を用いてビーズ画分に見出される結合タンパク質のレベルをゲルから定量化することができる。
【０１１８】
マトリクス上のタンパク質またはペプチドを固定化するための他の技術は、後続のアッセイに用いることも可能である。例えばビオチンおよびストレプトアビジンの抱合体を使ってタンパク質を固定化することができる。例えばビオチン化サーチュインまたはβ−カテニン分子は、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から、当業者に周知の技術を用いて調製でき（例えばビオチン化キット、Pierce Chemicals, Rockford, Ill.）、およびストレプトアビジンコートされた９６ウェルプレート（Pierce Chemicals）のウェル中で固定化される。代替的に、アセチル化されたまたは脱アセチル化されたβ−カテニンタンパク質またはその一部のどちらかに反応性であるが、好ましくはβ−カテニン分子および結合タンパク質との相互作用を邪魔しない抗体をプレートのウェルに誘導体化し、β−カテニンを抗体抱合体によってウェル内に捕捉することができる。
【０１１９】
上述のように、結合タンパク質および試験剤の製剤は、プレートのβ−カテニン存在ウェル中でインキュベートされ、ウェル内に捕捉された複合体の量を定量できる。ＧＳＴ固定化複合体についての上記方法に加えて、かかる複合体を検出する典型的な方法は、結合タンパク質と反応性の、またはβ−カテニンタンパク質と反応性であって結合タンパク質と競合する抗体を用いた複合体の免疫検出、および内因性または外因性の、結合タンパク質に関連する酵素活性を検出することに基づいた酵素結合アッセイを含む。後者の例において、酵素は結合タンパク質と化学的に抱合されて、または融合タンパク質として提供される。説明すると、結合タンパク質は、西洋ワサビペルオキシダーゼと化学的に架橋または遺伝子的に融合（それがポリペプチドの場合）されており、複合体に捕捉されているポリペプチドの量を、例えば３，３’−ジアミノ−ベンジジンテトラヒドロクロリドまたは４−クロロ−１−ナフトールなど、酵素の色源体基質によって査定できる。同様に、ポリペプチドおよびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼを含む融合タンパク質を提供し、１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼンを用いたＧＳＴ活性検出によって、複合体形成を定量できる（Habig et al (1974) J Biol Chem 249:7130）。
【０１２０】
複合体中に捕捉されたタンパク質の定量のための免疫検出に基づく手順について、抗β−カテニン抗体などタンパク質に対する抗体を用いることができる。かかる抗体は、本明細書の他の場所に記載されたような様々な市販の供給元から獲得可能である。代替的に、検出される複合体中のタンパク質は、β−カテニンの配列に加えて、交代が容易に利用可能な第２のポリペプチド（例えば商業的給源から）を含む融合タンパク質の形態で「エピトープ標識」されていてもよい。例えば、上記のＧＳＴ融合タンパク質は、ＧＳＴ部位に対する抗体を用いた結合の定量に用いることもできる。他の有用なエピトープ標識は、ｃ−ｍｙｃからの１０残基配列を含むｍｙｃエピトープ（例えばEllison et al., J. Biol Chem. 266:21150-21157 (1991) 参照）、およびｐＦＬＡＧシステム（International Biotechnologies, Inc.）またはｐＥＺＺタンパク質Ａシステム（Parmacia, N.J.）を含む。
【０１２１】
試験化合物の効力は、様々な濃度の試験化合物を用いて得られたデータから用量応答曲線を作成することにより査定可能である。さらに、コントロールアッセイもまた、比較のための基準を提供するために行うことができる。典型的なコントロールアッセイは、β−カテニンタンパク質またはそのホモログおよびサーチュインタンパク質またはそのホモログの相互作用を、試験剤の非存在下で定量する。
【０１２２】
特定の態様において、β−カテニンの活性を調節する剤を同定する方法は、β−カテニンと結合するサーチュインまたはそのホモログおよび／またはサーチュインと結合するβ−カテニンまたはそのホモログをコードする１または２以上の異種核酸を含む細胞または細胞抽出物または細胞溶解物と試験剤とを接触させること、およびβ−カテニンの活性を決定することを含み、ここで試験剤と接触された細胞または細胞抽出物または細胞溶解物中のβ−カテニンの異なる活性は、試験剤がβ−カテニンの活性を調節する剤であることを示す。
【０１２３】
β−カテニンの活性を調節する剤を同定する方法はまた、β−カテニンと結合するサーチュインまたはそのホモログおよび／またはサーチュインと結合するβ−カテニンまたはそのホモログをコードする１または２以上の異種核酸を含む細胞と試験剤とを接触させること、およびβ−カテニンの細胞内局在を決定することを含み、ここで試験剤と接触した細胞内における核以外の細胞内局在は試験剤がβ−カテニンの活性を調節する剤であることを示す。
【０１２４】
β−カテニンタンパク質またはそのホモログの活性を決定することは、細胞増殖などのβ−カテニン活性によって媒介される生物学的活性を決定することを含む。
本明細書に記載されたような、その様々な方法またはステップは組み合わせてもよい。本明細書に記載されたあらゆるスクリーニングアッセイはさらに、例えばヌードマウスなどの動物モデルを用いてなど、腫瘍のサイズまたは成長に対する試験剤の効果を決定することを含んでよい。
【０１２５】
医薬組成物および方法
本方法にしたがって使用するための医薬組成物は、１または２以上の薬学的に許容可能な担体または賦形剤を用いた従来の方法で剤型化されてよい。したがって、化合物、例えばサーチュイン活性化化合物、およびその薬学的に許容可能な塩および溶媒和物は投与、例えば注射、吸入または送気（口または鼻を通してのいずれか）または経口、口腔、非経口または直腸投与、のために剤型化されてよい。ひとつの態様において、化合物は、標的細胞、例えば疾患細胞、が存在する場所、すなわち血中または関節に局所的に投与される。
【０１２６】
化合物は、全身性および局所（topical）または限局（localized）投与を含む様々な投与の負荷について剤型化されることができる。技術および剤型は一般的に、Remington’s Pharmaceutical Sciences, Meade Publishing Co., Easton, PA.中に見出し得る。全身性投与について、筋肉内、静脈内、腹腔内、および皮下を含む注射が好ましい。注射について、化合物は液体溶液中、好ましくはハンクス液またはリンガー液など薬学的に両立しうる緩衝液に剤型化される。加えて、化合物は固体形態に剤型化され、使用直前に再溶解または懸濁されてもよい。凍結乾燥した形態もまた含まれる。
【０１２７】
経口投与について、医薬組成物は例えば錠剤、トローチ剤またはカプセル剤などの形態をとることができ、結合剤（例えばアルファ化トウモロコシスターチ、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシルプロピルメチルセルロース）、充填剤（例えばラクトース、微結晶セルロース、またはリン酸水素カルシウム）、潤滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）、崩壊剤（例えばポテトスターチまたはグリコール酸ナトリウムスターチ）、湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に許容可能な賦形剤とともに慣習的な方法で調製される。錠剤は当業者に周知の方法でコートされてもよい。経口投与のための液体製剤は、例えば溶液、シロップまたは懸濁液の形態をとり得、または使用の前に水または他の適切なビヒクルで構築するための乾燥製品として存在してもよい。かかる液体製剤は、懸濁剤（例えばソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用油）、乳化剤（例えばレシチンまたはアカシア）、非水性ビヒクル（例えばアチオンドオイル（ationd oil）、油性エステル、エチルアルコールまたは分画植物油）および防腐剤（例えばメチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾアートまたはソルビン酸）などの薬学的に許容可能な付加物とともに慣習的な方法で調製することができる。製剤はまた、緩衝塩、香味料、着色料および甘味料剤を適切に含有していてよい。経口投与のための調製剤は活性化合物の制御された放出を与えるために適するように剤型化されてよい。
【０１２８】
吸入投与について、化合物は、加圧パックまたは噴霧器から提供されるエアロゾルスプレーの形態で、適切な高圧ガス、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切な気体、の使用とともに便宜的に供給される。加圧されたエアロゾルの場合、投与単位は定量を供給するバルブを提供することにより決定されてよい。吸入器または送気器に用いるための、例えばゼラチンのカプセルまたはカートリッジは、化合物およびラクトースまたはスターチなどの適切な粉末ベースの粉末混合物を含むように剤型化されてよい。
【０１２９】
化合物は、注射、例えばボーラス注入または持続注入、による非経口投与のために剤型化されてもよい。注入のための剤型化は、例えばアンプル内またはマルチドーズコンテナ（multi-dose container）内などの単位投薬形態で、添加保存料とともに提供される。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液または乳液形態をとり得、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの処方剤（formulatory agent）を含有してよい。代替的に、活性成分は、使用の前に適切なビヒクル、例えば滅菌ピロゲンフリー水、とともに構築される粉末形態であってよい。
【０１３０】
化合物はまた、坐薬または例えば慣習的なココアバターまたは他のグリセリドなどの坐薬基剤を含む停留浣腸などの直腸用組成物として剤型化されてもよい。
前述の剤型に加えて、化合物はまた持続性薬剤製剤として剤型化されてもよい。かかる持続時間の長い剤型は、移植（例えば皮下または筋肉内）によって投与されてもよく、または筋肉内注射によって投与されてもよい。したがって、例えば化合物は適切なポリマー性または疎水性材料（例えば許容可能な油剤中の乳液として）またはイオン交換樹脂、または例えば難溶性塩などの難溶性誘導体として剤型化されてよい。
【０１３１】
医薬組成物（化粧料製剤を含む）は、重量で、０．００１から１０%または０．１％から５%など、約０．００００１から１００％の１または２以上の本願明細書に記載された化合物を含んでよい。
【０１３２】
１つの態様において、本明細書に記載された化合物は、一般的に局所性薬剤投与に適した局所性担体を含有し、当業者に知られたあらゆるかかる材料を含む、局所性製剤に組み込まれてよい。局所性担体は所望の形態、たとえば軟膏、ローション、クリーム、マイクロエマルジョン、ゲル、油剤、溶液など、で組成物を提供するために選択されてよく、天然または合成起源どちらかの材料から構成されていてよい。好ましくは選択された担体は、活性剤または局所性製剤の他の構成成分に悪影響を及ぼさない。本明細書で用いられる適切な局所性担体の例は、水、アルコールおよび他の非毒性有機溶媒、グリセリン、ミネラルオイル、シリコーン、ワセリン、ラノリン、脂肪酸、植物油、パラベン、ロウなどを含む。
【０１３３】
剤型は、無色、無臭軟膏、ローション、クリーム、マイクロエマルジョンおよびゲルであってよい。
化合物は軟膏中に組み込まれてよく、一般的に、典型的にはワセリンまたは他の石油誘導体に基づく、半固体製剤である。当業者には適切に理解されるであろう、用いられる特定の軟膏基剤は、最適な薬剤伝達のために提供されるものであり、好ましくは他の所望の特性、例えば軟化性など、も同様に提供するものである。他の担体またはビヒクルのように、軟膏基剤もまた不活性、安定、非刺激性および非感受性であるべきである。前のセクションにおいて参照したRemington’sに説明されているように、軟膏基剤は４つのクラスに分類されてよい：油性基剤、乳性基剤、乳化基剤、および水溶性基剤。油性軟膏基剤は、例えば植物油、動物から得られる脂肪、および石油から得られる半固体炭化水素を含む。吸収性軟膏基剤としても知られている乳性軟膏基剤は、ほとんどまたはまったく水を含まず、例えばヒドロキシステアリンスルフェート、無水ラノリン、および親水性ワセリンを含む。乳化軟膏基剤は油中水（Ｗ／Ｏ）乳液または水中油（Ｏ／Ｗ）乳液であり、例えばセチルアルコール、モノステアリン酸グリセリル、ラノリンおよびステアリン酸を含む。典型的な水溶性軟膏基剤は、様々な分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧｓ）から調製され、再度更なる情報のために上記Remington’sを参照すべきであろう。
【０１３４】
化合物はローションの中に組み込まれてもよく、一般的には摩擦なしで皮膚表面に適用される製剤であり、典型的には活性剤を含む固体粒子が水またはアルコール基剤中に存在する液体または半固体製剤である。ローションは通常固体の懸濁液であり、水中油タイプの液体油性乳液を含んでもよい。より流体の剤型の適用の容易性から、ローションは好ましくは大きな体の領域を処置するための剤型である。一般的には、ローション中の不溶性の物質がよく分離されることが必要である。よりよい分散液を産生するため、ローションは典型的には懸濁剤および皮膚に接触した活性剤を局在化および担持するのに有用な化合物、例えばメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなど、を含有する。本方法とともに用いるための典型的なローション剤型は、Beiersdorf, Inc.（Norwalk, Conn.）から商標AquaphorRTMの下に獲得し得るなどの、親水ワセリンと混合したプロピレングリコールを含有する。
【０１３５】
化合物はクリームの中に組み込まれてもよく、一般的には粘性液体または水中油または油中水どちらかの半固体乳液である。クリーム基剤は水洗可能であり、油相、乳化剤および水性相を含有する。油相は一般的にワセリンおよびセチルまたはステアリルアルコールなどの脂肪アルコールから構成され、水相は通常、必須ではないが、油相の体積を拡張し、一般的には保湿剤を含有する。クリーム製剤中の乳化剤は、上記Remington’sで説明されているように、一般的には非イオン性、陰イオン性、陽イオン性または両性の界面活性剤である。
【０１３６】
化合物はマイクロエマルジョンの中に組み込まれてもよく、一般的に熱力学的に安定で等方的に透明な、油および水などの二つの混合しない液体の分散液であり、界面活性剤分子の界面フィルムで安定化されている（Encyclopedia of Pharmaceutical Technology (New York: Marcel Dekker, 1992), volume 9）。マイクロエマルジョン製剤について、界面活性剤（乳化剤）、共界面活性剤（共乳化剤）、油相および水相が必要である。適切な界面活性剤は、例えばクリーム製剤において典型的に使用される乳化剤など、乳液製剤に有用なあらゆる界面活性剤を含む。共界面活性剤（または「共乳化剤」）は一般的にポリグリセロール誘導体、グリセロール誘導体および脂肪アルコールの群から選択される。好ましい乳化剤／共乳化剤の組み合わせは、必須ではないが一般的に、モノステアリン酸グリセリルおよびステアリン酸ポリオキシエチレン、ポリエチレングリコールおよびパルミトステアリン酸エチレングリコール、ならびにカプリル酸およびカプリン酸トリグリセリドおよびオレオイルマクロゴールグリセリドからなる群から選択される。水相は水だけではなく典型的には緩衝剤、グルコース、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、好ましくは低分子量ポリエチレングリコール（例えばＰＥＧ３００およびＰＥＧ４００）、および／またはグリセロールなども含み、油相は一般的に、例えば脂肪酸エステル、修飾植物油、シリコーン油、モノ−、ジ−およびトリグリセリドの混合物。ＰＥＧのモノ−およびジエステル（例えばオレオイルマクロゴールグリセリド）などを含む。
【０１３７】
化合物はゲル製剤の中に組み込まれてもよく、一般的には小無機粒子によって作られる懸濁液（二相系）か、または担体液体を通して顕著に規則的に分配された大有機分子（単相ゲル）のいずれかからなる半固体系である。単相ゲルは、例えば、活性剤、担体液体および適切なゲル化剤、例えばトラガカント（２〜５％で）、アルギン酸ナトリウム（２〜１０％で）ゼラチン（２〜１５％で）、メチルセルロース（３〜５％で）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（２〜５％で）、カルボマー（０．３〜５％で）またはポリビニルアルコール（１０〜２０％で）など、を一緒に組み合わせて、特徴的な半固体産物が産生されるまで混合することにより、作ることができる。他の適切なゲル化剤はメチルヒドロキシセルロース、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン、ヒドロキシエチルセルロースおよびゼラチンを含む。ゲルは、一般的には水性担体液体を使用するが、アルコールおよび油剤も同様に担体液体として使用できる。
【０１３８】
当業者に知られた様々な添加物を、例えば局所用製剤などの剤型に含んでもよい。添加物の例は、これに限定されるものではないが、可溶化剤、皮膚浸透増強剤、乳白剤、保存剤、（例えば抗生物質）、ゲル化剤、緩衝剤、界面活性剤（特に非イオン性および両性界面活性剤）乳化剤、皮膚軟化剤、増粘剤、安定化剤、保湿剤、着色剤、香料、などを含む。可溶化剤および／または皮膚浸透増強剤の含有は、乳化剤、皮膚軟化剤および保存剤と並んで特に好ましい。最適な局所性製剤は、約２重量％から６０重量％、好ましくは２重量％から５０重量％の可溶化剤および／または皮膚浸透増強剤、２重量から５０重量％、好ましくは２重量％から２０重量％の乳化剤、２重量％から２０重量％の皮膚軟化剤、および０．０１重量％から０．２重量％の保存剤を、製剤の残りを形成する活性剤および担体（例えば水）とともに含有する。
【０１３９】
皮膚浸透増強剤は、非破壊の皮膚の適度な大きさの領域を通過する治療的なレベルの活性剤の通過を促進する役割を果たす。適切な増強剤は当業者に周知であり、例えばメタノール、エタノールおよび２−プロパノールなどの低級アルカノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、デシルメチルスルホキシド（Ｃ．ｓｕｂ．１０ＭＳＯ）およびテトラデシルメチルスルホキシドなどのアルキルメチルスルホキシド、２−ピロリドン、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、およびＮ−(ヒドロキシエチル）ピロリドンなどのピロリドン類、尿素、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｍ−トルアミド、Ｃ．ｓｕｂ．２−Ｃ．ｓｕｂ．６アルカンジオール類、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）およびテトラヒドロフルフリルアルコールなどの諸溶媒、および１−置換−アザシクロヘプタン−２−オン類、特に１−ｎ−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン（ラウロカプラム、AzoneRTMの商標の下にWhitby Reserch Incorporated, Richmond, Vaから入手可能）を含む。
【０１４０】
可溶化剤の例は、これに限定されるものではないが、次のものを含む：ジエチレングリコールモノエチルエーテル（エトキシジグリコール、TranscutolRTMとして商業的に入手可能）、およびオレイン酸ジエチレングリコールモノエチルエーテル（SoftcutolRTMとして商業的に入手可能）などの親水性エーテル類、ポリオキシ３５ヒマシ油、ポリオキシ４０水添ヒマシ油などのポリエチレンヒマシ油誘導体、ポリエチレングリコール、特にＰＥＧ３００およびＰＥＧ４００などの低分子量ポリエチレングリコール、およびＰＥＧ−８カプリル酸／カプロン酸グリセリド（LabrasolRTMとして市販で入手可能）などのポリエチレングリコール誘導体、ＤＭＳＯなどのアルキルメチルスルホキシド、２−ピロリドンおよびＮ−メチル−２−ピロリドンなどのピロリドン類、およびＤＭＡ。多くの可溶化剤が吸収増強剤として作用する。単一の可溶化剤が剤型中に組み込まれてもよく、または可溶化剤の混合物が組み込まれてもよい。
【０１４１】
適切な乳化剤および共乳化剤は、これに限定するものではないが、マイクロエマルジョン剤型に関して記載されている乳化剤および共乳化剤を含む。皮膚軟化剤は、例えば、プロピレングリコール、グリセロール、ミリスチル酸イソプロピル、ポリプロピレングリコール−２（ＰＰＧ−２）、プロピオン酸ミリスチルエーテルなどを含む。
【０１４２】
例えば他の抗炎症剤、鎮痛剤、抗菌剤、抗真菌剤、抗生物質、ビタミン類、抗酸化剤および通常サンスクリーン剤型中に見出される、これに限定するものではないが、アントラニル酸塩類、ベンゾフェノン類（特にベンゾフェノン−３）、カンファー誘導体類、桂皮酸塩類（例えばメトキシ桂皮酸オクチル）、ジベンゾイルメタン類（例えばブチルメトキシジベンゾイルメタン）、ｐ−アミノベンゼン酸（ＰＡＢＡ）およびその誘導体類、およびサリチル酸塩類（例えばサリチル酸オクチル）などを含むサンブロック剤などの他の活性剤もまた剤型中に含まれてよい。
【０１４３】
ある局所用製剤において、活性剤は製剤の約０．２５重量％から７５重量％の範囲、好ましくは製剤の約０．２５重量％から３０重量％の範囲、より好ましくは製剤の約０．５重量％から１５重量％の範囲、およびもっとも好ましくは製剤の約１．０重量％から１０重量％の範囲の量で存在する。
【０１４４】
局所皮膚処置組成物は、その粘度および消費者の使用目的に適合するように適切な容器に包装される。例えば、ローションまたはクリームはビンまたはロールボールアプリケーター（roll-ball applicator）、あるいは高圧ガス駆動性エアロゾルデバイスまたは指での操作に適したポンプを備えた容器に包装される。組成物がクリームの場合、変形しないビンまたは絞り出せる容器、例えばチューブまたはふたのある広口ビン、に単純に貯蔵される。組成物はまた、米国特許第５，０６３，５０７号に記載されているように、カプセル内に含まれてもよい。したがって、本明細書で定義される、化粧品として許容可能な組成物を含む密閉された容器もまた提供される。
【０１４５】
代替的な態様として、医薬製剤は経口または非経口投与で提供され、その場合製剤は上記のような活性剤含有マイクロエマルジョンを含んでよいが、特に経口または非経口薬剤投与に適した、代替的な薬学的に許容可能な担体、ビヒクル、添加剤などを含んでもよい。代替的に、実質的に上記のように、変形せずに、活性化化合物含有マイクロエマルジョンを経口または非経口で投与してもよい。
【０１４６】
リン脂質複合体、例えばリスベラトロールリン脂質複合体およびその製剤はＵＳ２００４１１６３８６に記載されている。ポリオール／ポリマーマイクロカプセルを用いた活性構成成分を安定化させる方法、およびその製剤はＵＳ２００４０１０８６０８に記載されている。親油性両親媒性コポリマー化合物を用いて水性溶液中に溶解させる方法は、ＷＯ０４／０３５０１３に記載されている。
【０１４７】
本明細書に記載された化合物を例えば全身、局所、眼内注射することにより、または本明細書に記載された化合物を放出する、持続性放出デバイスの挿入により、目の状態を処置または予防できる。
本明細書に記載された化合物は、当該技術分野の方法にしたがって、酸素のない環境に貯蔵されてよい。例えばリスベラトロールまたはそのアナログは、Pfizer, Inc.からのCapsugelなどの経口投与のための気密性カプセル内に調製される。
【０１４８】
例えば本明細書に記載の化合物によりex vivoで処置された細胞を、対象に移植片を投与する方法にしたがって投与することができ、それは例えば免疫抑制剤、例えばシクロスポルチンＡ、の投与を伴う。医薬製剤の一般的な原則について、読者はCell Therapy: Stem Cell Transplantation, Gene Therapy and Cellular Immunotherapy, by G.morstyn&W. Sheridan eds, Cambridge University Press, 1996およびHematopoietic Stem Cell Therapy, E. D. Ball, J. Lister & P. law, Chuchill Livingstone, 2000を参照されている。
【０１４９】
化合物の毒性および治療的効力は、細胞培養または実験動物中で、標準的な薬学的手順によって決定することができる。ＬＤ５０は集団の５０％にとって致命的な用量である。ＥＤ５０は集団の５０％にとって治療的に効果のある用量である。毒性および治療的効果の間の用量率（ＬＤ５０／ＥＤ５０）は治療的指数である。大きな治療的指数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物を用いてもよく、非感染細胞に対する潜在的な損傷を最小化し、その結果副作用を減少させるために、かかる化合物の標的とする罹患した組織の部位への送達システムの設計について注意すべきである。
【０１５０】
細胞培養アッセイおよび動物の研究から獲得されたデータは、ヒトにおいて使用するための用量の範囲を策定するのに用いることができる。かかる化合物の用量は、ほとんどまたはまったく毒性がないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にあってよい。用量は採用された用法形態および利用する投与経路に依存して、この範囲内において変化してもよい。あらゆる化合物について、最初は細胞培養アッセイから治療上効果的な用量を見積もることができる。用量は、ＩＣ５０（すなわち兆候の最大阻害値の半値を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を得るために、細胞培養において決定されたように動物モデルにおいて策定されてもよい。かかる情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために用いられる。例えば高速液体クロマトグラフィーによって、血漿中のレベルが計測され得る。
【０１５１】
細胞中のサーチュインのタンパク質レベルを増大させる方法はまた、遺伝子の発現レベルの増大も含む。加えて、細胞内のサーチュインタンパク質のレベルを増大するために、１または２以上のサーチュインをコードする核酸が細胞内に導入されてよい。典型的な態様において、サーチュインをコードするベクターを細胞内に導入する。ベクターはウィルスベクターであってよい。対象に投与されるウィルスベクターは当該技術分野において周知であり、アデノウィルスベクターを含む。例えば、導入遺伝子は、形質転換レトロウィルス、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）、および単純ヘルペスウィルス−１、または形質転換細菌性または原核細胞性プラスミドなど、遺伝子治療において有用なあらゆる多様なウィルスベクターに取り込まれる。多様なウィルスベクターが本明細書に記載された方法の実施に用いられ得るものの、ＡＡＶ−およびアデノウィルス−ベースのアプローチが特に重要である。かかるベクターは一般的に、in vivoにおける、特にヒトに対する、異種性遺伝子の輸送のための選択肢の形質転換遺伝子送達システムとして理解されている。
【０１５２】
ウィルス粒子表面のウィルスパッケージングタンパク質を改変することにより、ウィルスの感染範囲を制限することが可能である（例えばＰＣＴ公報ＷＯ９３／２５２３４、ＷＯ９４／０６９２０およびＷＯ９４／１１５２４参照）。例えば、ウィルスベクターの感染範囲の改変は、細胞表面抗特異的抗体と連結すること（Roux et al.,(1989) PNAS USA 86 9079-9083; Julan et al., (1992) J. Gen Virol 73: 3251-3255およびGoud et al., (1983) Virology 163: 251-254）、または細胞表面リガンドとウィルス封入タンパク質とを連結すること（Neda et al., (1991) J. Biol. Chem. 266: 14143-14146）を含む。連結はタンパク質または他の種（例えば封入タンパク質をアシアロ糖タンパク質に変換するためのラクトース）との化学的架橋、および融合タンパク質（例えば一本鎖抗体／封入融合タンパク質）の作製によってなすことができる。この技術は、感染を特定の組織タイプに制限または他に向けるために有用であるが、同種指向性ウィルスを両種性ウィルスに変換するのにも用いられる。
【０１５３】
核酸およびタンパク質を、他の構成成分、例えば標的組織または器官への送達を促進する剤、細胞膜または腸管を通しての輸送を促進する剤、との複合体の形態で投与することもできる。例えばタンパク質は、例えばトランスサイトーシスペプチドと融合した、融合タンパク質の形態であってもよい。核酸およびタンパク質はリポソームとともに投与されてもよい。
【０１５４】
サーチュイン活性化物質またはサーチュインの活性またはタンパク質レベルを増大させる他の剤の投与に引き続いて、サーチュインの活性の計測など、対象中の因子の計測を行ってもよい。例示的態様において、対象への活性化化合物の投与に引き続いて、バイオプシーを得ることなどによって対象から細胞を獲得し、バイオプシー中のサーチュインの活性またはサーチュイン発現レベルを決定する。代替的に、血漿バイオマーカーなどのバイオマーカーを追いかけてもよい。細胞は対象のいかなる細胞でもよいが、活性化化合物が局所的に投与される場合には、細胞は好ましくは投与部位の近傍に存在する細胞である。
【０１５５】
キット
例えば治療目的またはスクリーニングアッセイのためのキットなど、キットも本明細書において開示される。キットは、例えばあらかじめ計測された用量において、本明細書に記載された１または２以上の活性化または阻害性化合物を含んでよい。キットは随意に細胞を化合物と接触させるためのデバイスおよび取扱説明書を含んでもよい。デバイスは、シリンジ、ステントおよび化合物を対象中に導入するためのまたは対象の皮膚に適用するための他のデバイスを含む。
【０１５６】
さらに、キットはまた、例えば上述の、例えば組織サンプル中のサーチュインタンパク質の活性など、因子を計測するための構成要素を含んでもよい。
他のキットは、障害を有するまたは発症する見込みを診断するためのキットを含む。キットはサーチュインの活性および発現レベルを計測するための剤を含んでよい。
【０１５７】
スクリーニングアッセイのためのキットもまた提供される。典型的なキットは、サーチュインまたは生物学的に活性なその一部分、またはそれを含む細胞または細胞抽出物などの、スクリーニングアッセイを行うための１または２以上の剤を含む。あらゆるキットはまた、取扱説明書を含んでもよい。
【０１５８】
本発明はここに一般的に記載されたが、後述の例を参照することにより、より簡単に理解されるだろう。例は、単に本発明の特定の側面および態様の説明を目的として含まれ、本発明を制限することを意図しない。
【実施例】
【０１５９】
例１：ＳＩＲＴ１は大腸癌を抑制するＣＲの能力を模倣する。
カロリー制限（ＣＲ）は、哺乳類において寿命を延長し、自発性の腫瘍を減少するもっとも効果的な方法の１つであるが、そのメカニズムはまだわかっていない。ＳＩＲＴ１は、ＣＲの健康上の利益の根底にあると提案される、ＮＡＤ＋依存の脱アセチル化酵素である。ここに我々は、ＣＲ食事制限中の齧歯類の小腸において、ＳＩＲＴ１がより高度に発現し、腫瘍易発性マウスモデルの腸管におけるＳＩＲＴ１の過剰発現が小腸腫瘍成長および罹患率を抑制し、このモデルにおけるＣＲの利益的効果に酷似していることを示す。我々はＳＩＲＴ１がβ−カテニンの発癌性形態と相互作用および脱アセチル化し、β−カテニン駆動性転写を抑制し、細胞分裂を減少させる結果となることを見出した。これらの発見は、ＣＲの癌予防性効果においてＳＩＲＴ１およびβ−カテニン経路を重要な効果因子として関連付け、様々なヒトの癌の処置に新たなアプローチを提起する。
【０１６０】
ＣＲを模倣するレベルで腸管中に発現した場合、ＳＩＲＴ１は脱アセチル化してβ−カテニン活性を抑制し、その結果、ＡＰＣｍｉｎ／＋マウスモデルにおける腫瘍形成を抑制する。
【０１６１】
低級種において、ＳＩＲ２遺伝子がＣＲによる寿命延長を媒介することが提案されている（１）。ヒトＳｉｒ２遺伝子ファミリーは、ＳＩＲＴ１〜７の７種のメンバーで構成されている。もっとも特定されているサーチュインであるＳＩＲＴ１はＣＲによって誘導され、インスリン産生および脂肪代謝などのプロセスを制御しており、サーチュインはまた哺乳類におけるＣＲの効果も媒介しているのではないかという推測を導く（レビューとして（２）参照）。ＣＲは癌を阻害することが知られているが、存在するデータはＳＩＲＴ１がこの保護的効果を媒介するかどうかに対して相克する（３）。例えば、ＳＩＲＴ１はＨＩＣ１を欠損した腫瘍中において高度に発現しており（４）、アポトーシスを阻害し（５〜７）、腫瘍抑制遺伝子の発現をダウンレギュレートし、多くの人をＳＩＲＴ１が癌遺伝子であるという結論へと導いた（４、８）。一方で、ＳＩＲＴ１はアポトーシスを促進し得、抗増殖性であり得（１０、１１）、それが腫瘍抑制活性を有することと一致する。この疑問を解決することは、特に低級生物における長寿促進遺伝子が哺乳類において癌遺伝子であるのかまたは腫瘍抑制遺伝子であるのかという包括的疑問を提供する点で、重要である。
【０１６２】
この議論の解決を助けるため、我々はマウス癌モデルにおけるＳＩＲＴ１のアップレギュレートが、ＣＲの腫瘍抑制効果を概括するかどうかを試験した。我々は様々な理由から、大腸癌のＡＰＣｍｉｎ／＋モデルを解析することを選択した：それが多くの側面においてヒトにおける大腸癌を概括していること、腫瘍形成のメカニズムがよく特定されていること、およびＣＲが腫瘍形成率を約４倍減少させること（１２）。
【０１６３】
ＡＰＣｍｉｎ／＋マウスは腫瘍抑制ＡＰＣ（大腸腺腫症）において構造遺伝子変異を有する。第２アレルにおける体性欠損は、β−カテニンの構造的核局在および腺腫様ポリープの形成に導く（１３）。β−カテニンはＷｎｔシグナリング経路のキーエフェクターであり、幹細胞維持、発生および発癌において顕著な役割を果たす（１４）。β−カテニン経路の構造的活性化は、結腸直腸癌の９０％において見出される。加えて、前立腺癌、乳癌およびメラノーマなどの、多くの他の加齢関連癌においても異常活性化されている。
【０１６４】
我々はＣＲ食事制限中の齧歯類が、自由に給餌したコントロールに比べて、腸管上皮においてＳＩＲＴ１タンパク質を２倍高レベルに有していることを観察した（図１Ａ）。腸管上皮細胞におけるこのレベルのＳＩＲＴ１アップレギュレーションを模倣するため、我々は、ＳＩＲＴ１ＳＴＯＰといわれるｌｏｘＰ導入されたＳＩＲＴ１トランスジェニックマウスを作製した（図１Ｂ）。ＳＩＲＴ１は構造的ＣＡＡＧＳプロモーターおよび転写性ｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰカセットの下流にクローニングされ、ＥＳ細胞のコラーゲン座位（ＣｏｌＡ１）におけるＦＲＴサイト内に、Ｆｌｐリコンビナーゼ（１５）を用いて組込まれた（図１Ｃおよび１Ｄ）。ＳＩＲＴＳＴＯＰトランスジェニックマウスはＥＳ細胞から作製され、Ｃ５７ＢＬ／６Ｖｉｌｌｉｎ−Ｃｒｅ（Ｖｉｌ−Ｃｒｅ）系統（１６）と交差し、これはＳＴＯＰカセットが腸管絨毛において特異的に削除されている子孫を産む（ＳＩＲＴ１ΔＳＴＯＰ）。Ｖｉｌ−Ｃｒｅ；ＳＩＲＴ１ΔＳＴＯＰマウスは、ＳＩＲＴ１を腸管上皮細胞においてＣＲ条件下と類似のレベルで発現する（図１Ｅ）。ＳＩＲＴ１を過剰発現する絨毛の形態は、他の点では正常に見受けられた（図Ｆ）。Ｖｉｌ−ＣｒｅＳＩＲＴ１ΔＳＴＯＰマウスはＡＰＣｍｉｎ／＋マウスと交配し、三重トランスジェニックＳＩＲＴ１ΔＳＴＯＰ；Ｖｉｌ−Ｃｒｅ；ＡＰＣｍｉｎ／＋系統を作製した。
【０１６５】
ＡＰＣｍｉｎ／＋マウスは、１６週齢の野生型コントロールと比較して、罹患率において顕著な増大を示し、それは顕性貧血および体重の減少によって裏付けられ、ＳＩＲＴ１トランスジェニックＡＰＣｍｉｎ／＋マウスはこれらの兆候を全く示さなかった（図Ｓ１）。４月齢で並べられた腸管の検査は、ＳＩＲＴ１トランスジェニックマウスは、十二指腸および回腸の両方において、顕著に小さな腫瘍およびその数の少なさを示した（図２Ａ）。腫瘍重量の定量は、ＳＩＲＴ１ΔＳＴＯＰトランスジェニックの小腸および大腸内にて、その腺腫の数およびサイズにおいて３から４倍の減少を示した（図２Ｂ）。Ｋｉ−６７は分裂細胞において独占的に発現する核小体の粒子状成分であり、ヒト新生物における前兆マーカーとして利用されている。ＳＩＲＴ１ΔＳＴＯＰマウスは、有糸分裂の数において顕著な減少を示し（高倍率視野毎）、Ｋｉ−６７染色は、トランスジェニックマウスの腫瘍において細胞分裂がより少ないことを実証した（図２Ｃ）。したがって、ＣＲによって誘導されるのと類似のレベルの腸管におけるＳＩＲＴ１の過剰発現は、ＡＰＣｍｉｎ／−マウスにおける腫瘍形成においてのＣＲの効果を模倣するのに十分であった。
【０１６６】
ＳＩＲＴ１が細胞分裂を減少させるメカニズムについての見識を得るために、いくつかのよく特定された癌細胞株の生育速度におけるＳＩＲＴ１の効果を検査した。ＬＮ−ＣＡＰは異常なβ−カテニン活性によって駆動されるヒト大腸癌細胞株である。ＬＮ−ＣＡＰ細胞の分裂は、ＳＩＲＴ１の過剰発現によって大いに減少され、効果はβ−カテニン自身のノックダウンと類似であった（図３Ａ）。この結果はＳＩＲＴ１がβ−カテニン活性を抑制することによって細胞分裂を減少しているであろうことを示唆する。さらにこの可能性を模索するため、我々は構造的に活性なβ−カテニンによって成長が駆動されている様々な他の細胞株（ＬＮ−ＣＡＰ、ＨＣＴ１１６、およびＤＬＤ１）において、ＳＩＲＴ１および触媒的に非活性なＳＩＲＴ１変異体（ＳＩＲＴ１ΔＨＹ）を発現させた。β−カテニンが非活性な細胞株がネガティブコントロールとしての役目を果たした。増大したＳＩＲＴ１発現は、構造的に活性なβ−カテニンを有する３つの細胞株全てにおいて分裂を大いに減少させたが、β−カテニン非活性な細胞株においてはそうではなかった（図３Ａ〜Ｄ）。ＳＩＲＴ１ΔＨＹ触媒的変異体は、細胞増殖においてどの細胞株でも顕著な効果を有さなかった（図３Ｂ〜Ｄ）。したがって、ＳＩＲＴ１はβ−カテニン駆動性分裂を抑制し、その効果にはその触媒活性が必要である。
【０１６７】
ＳＩＲＴ１がβ−カテニン駆動性分裂を抑制するメカニズムをさらに理解するため、我々はＤＬＤ１ヒト大腸癌細胞株に、β−カテニン応答性要素（Super8XTopflash-LuciferasePEST）に安定的に組み込まれたレポーターを含むように設計した。β−カテニンのノックダウンはレポーター活性を劇的に減少させ、レポーター活性は内因性β−カテニンによって駆動されていたことを実証した（図３Ｅ）。ＳＩＲＴ１ΔＨＹ触媒的変異体は効果がなかったのに対し、ＳＩＲＴ１の過剰発現はレポーター活性を２倍まで減少させ、このことはＳＩＲＴ１の抗分裂効果が、その内因性β−カテニンの転写活性を抑制する能力によって媒介されること、およびそれにはＳＩＲＴ１の脱アセチル化活性が求められることを示唆する。
【０１６８】
近年の研究は、β−カテニンが、ＴＣＦ／ＬＥＦ−１についての高い親和性およびそのために標的遺伝子を活性化する高い能力を有するアセチル化された形態で存在することを示してきた（１７〜１９）。これらの観察から我々は、ＳＩＲＴ１はβ−カテニンを脱アセチル化することにより、その阻害効果を及ぼしているのだろうと推測した。この可能性を模索するため、我々は最初にＳＩＲＴ１およびβ−カテニンが物理的に相互作用するかどうかを試験した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、構造的に核に局在するβ−カテニンの変異体型（Ｓ３３Ｙ−β−カテニン）（２０）でトランスフェクトした。これらの細胞において、ＳＩＲＴ１はβ−カテニンと共免疫沈降し(図４Ａ)、逆もまた同様であった（図４Ｂ）。内因性ＳＩＲＴ１およびβ−カテニンの共免疫沈降はまた、二つのタンパク質間の直接的な相互作用を明らかにした（図４Ｃ）。
【０１６９】
次に、我々はＳＩＲＴ１がβ−カテニンを脱アセチル化可能であるかどうかを試験した。２９３Ｔ細胞をＳ３３Ｙ−β−カテニン、アセチルトランスフェラーゼｐ３００および増大する量のＳＩＲＴ１でトランスフェクトした。アセチル化β−カテニンは、ｐ３００をコトランスフェクトした細胞中で検出され、ＳＩＲＴ１発現はこのシグナルをほとんど完全に無効にし（一番上のパネル）、ＳＩＲＴ１はβ−カテニンを脱アセチル化できることを示唆する（図４Ｄ）。
【０１７０】
ＳＩＲＴ１に媒介されるβ−カテニンの脱アセチル化の効果を試験するため、我々は「ｐＴＯＰＦＬＡＳＨ」β−カテニンレポーター（２１）を使用した。前に示したように（１８）、β−カテニンの発現はルシフェラーゼ活性を増大し、ｐ３００発現プラスミドとのコトランスフェクションはさらにルシフェラーゼ活性を増大させた（図４Ｅ）。β−カテニンまたはβカテニンおよびｐ３００のいずれかとコトランスフェクトした場合、ＳＩＲＴ１は顕著にルシフェラーゼ活性を減少させた（図４Ｅ）。逆に、ＳＩＲＴ１阻害剤ニコチンアミド（ＮＡＭ）（２２）で細胞を処置するか、またはレトロウィルス性ｓｉＲＮＡベクターでＳＩＲＴ１をノックダウンすると、ルシフェラーゼレポーター活性が増加した（図４Ｆ、４Ｇ）。ともに、これらのデータは、ＳＩＲＴ１がβ−カテニンを脱アセチル化し、その結果その転写活性因子として働く能力を減少させることを示す。
【０１７１】
この研究において、我々はＳＩＲＴ１がβ−カテニン陽性細胞株の細胞増殖を阻害し、ＡＰＣｍｉｎ／＋マウスモデルにおける腫瘍形成を抑制することを示してきた。我々はまた、ＳＩＲＴ１がβ−カテニンを脱アセチル化し、その遺伝子転写を転写活性化する能力を減少させること、このモデルにおいてＳＩＲＴ１のin vivo効果を説明できることも示した。ＳＩＲＴ１トランスジェニックにおける腫瘍の数およびサイズの減少および腫瘍内での減少した分裂は、腫瘍の発生後であってもＳＩＲＴ１が腫瘍成長を抑制できることを示唆する。このデータに基づいて、我々は、ＳＩＲＴ１アップレギュレーションが、ＡＰＣｍｉｎ／＋モデルにおけるＣＲの腫瘍抑制効果の基礎となっていること、およびＳＩＲＴ１の活性化は、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナリング経路における変異によって駆動されるヒト癌の処置における有用な手段であると判明し得ることを提案する。
【０１７２】
道具および方法
齧歯類
Ｃｒｅ−誘導可能なＳＩＲＴ１発現構築物は、ｌｏｘＰ導入された転写性ＳＴＯＰ要素がＣＡＧＧＳプロモーターおよびＳＩＲＴ１ｃＤＮＡの間に挿入されるように作製した。この構築物はマウスコラーゲン１Ａ座位中に、ｆｌｐリコンビナーゼ媒介ゲノム統合を用いて前述のように（１）標的した。ＳＩＲＴ１−ＳＴＯＰの単一コピー構築物を担持するＥＳ細胞を、抗生物質マーカーヒグロマイシンおよびサザンブロッティングによって同定した。ＰＣＲプライマーおよび構築物マップは、要求に応じて利用可能である。二つのクローンを胚盤包に注入し、両方とも仔（pups）となり、〜９０％のそれは生殖細胞形伝達を示した。分析された腫瘍耐性マウスはＣ５７／ＢＬ６．ＡＰＣｍｉｎ／＋へと少なくとも４世代戻し交配され、Ｖｉｌｌｉｎ−Ｃｒｅトランスジェニックマウス系統を、Jackson Labs（Bar Harbor, ME）からのＣ５７／ＢＬ６バックグラウンドにおいて得た。ＳＩＲＴ１ＳＴＯＰ動物を、Ｃ５７／ＢＬ６へと２世代戻し交配し、その後、第一に、ＡＰＣｍｉｎ／＋動物と交配し、ＳＩＲＴ１ＳＴＯＰ；ＡＰＣｍｉｎ／＋二重トランスジェニックを作製した。これらの動物を、Ｖｉｌｌｉｎ−Ｃｒｅトランスジェニックマウスと交配して、ＳＩＲＴ１ΔＳＴＯＰ；Ｖｉｌ−Ｃｒｅ；ＡＰＣｍｉｎ／＋動物のコホートを得た。動物をHarvard Medical Schoolで維持し、実験をAnimal Care Committee of Harvard Medical Schoolの認可を受けて行った。
【０１７３】
オスのＦｉｓｃｈｅｒ−３４４（Ｆ３４４）ラットを交配し、Gerontology Research Center（GRC, Baltimore, MD）のビバリウム（vivarium）で飼育した。離乳（２週齢）から、ラットをベータチップウッドベッド（beta chip wood bedding）付きの標準的なプラスチックケージに独立して収容した。コントロール動物にＮＩＨ−３１標準餌を自由に（ＡＬ）給餌した。１月齢時に、カロリー制限（ＣＲ）動物に、ビタミンおよびミネラル強化版の同じ餌を、ＡＬラットが前の週の間に消費した量よりも４０％（重量で）少ないレベルで与えた。濾過および酸性化した水は両群ともに自由に利用可能であった。ビバリウムは２５℃の温度および相対湿度５０％で、１２／１２時間点灯／消灯サイクル（６：００ａｍに点灯）に維持された。全ての動物が６月齢時に、９：００から１１：００の間に安楽死させた。小腸を速やかに取り除き、氷冷ＰＢＳで完全に洗浄し、液体窒素中に置き、標準的な手続を用いたウェスタンブロッティングのための手順まで−８０℃で保存した。
【０１７４】
病理学、組織病理学、および免疫組織化学分析
全体腫瘍分析のため、全腸を安楽死後すぐに活性化し、縦方向に切開し、固相支持体でピン留めする間冷たいリン酸緩衝塩液（ＰＢＳ）で洗浄した。近位小腸（幽門から１０ｃｍ遠位）、遠位小腸（盲腸から１０ｃｍ近位）および中位小腸（腸全長の〜５０％）ならびに大腸からの０．５ｍｍよりも大きな腺腫を点数付けした。腸は、ガラスピペットチップの周囲を回転させることで、スイスロール法を用いて調製した。組織を固定化し、標準的な組織学手法を用いてパラフィン中に埋め込んだ。ヘマトキシリン／エオシン染色されたマウス腸を、接眼レンズマイクロメーター付きの顕微鏡を用いて、正確な腫瘍サイズを顕微鏡的に点数付けした。免疫組織化学分析を、ウサギ抗ＳＩＲＴ１抗体（Upstate Bitechnology, cat#07-131）、ウサギ抗β−カテニン（abcam #2982）およびラット抗マウスＫｉ−６７（Dako）で行った。
【０１７５】
プラスミド
ｐｃＤＮＡ３−ＦＬＡＧ−ＳＩＲＴ１、ｐＢＡＢＥ−Ｐｕｒｏ−ｈＳｉｒ２（ＳＩＲＴ１）、ｐＢＡＢＥ−Ｐｕｒｏ−ＳＩＲＴ１ΔＨＹ、ｐｃＤＮＡ−ＨＡ−Ｓ３３Ｙ−β−カテニンおよびｐＢＡＢＥ−Ｐｕｒｏ−Ｓ３３Ｙ−β−カテニンは前述した。Ｓｉｒｔ１ＲＮＡｉプラスミドは配列をｐＳＵＰＥＲ．ｒｅｔｒｏプラスミド（oligoEngine, Seattle, WA）中にクローニングすることにより構築した。１つのＴＯＰＦＬＡＳＨプラスミドはUpstate Biotechnology（Lake Placid, NY）より購入したが、第２のものは、SUPER8xTOPFLASH（Randall Moonからの親切な贈り物）からのタンデムＴＣＦ結合サイトおよびＴＡ−プロモーターをルシフェラーゼ−ＰＥＳＴプラスミドｐＧＬ４．１５（Promega, Madison, WI）中にクローニングすることにより作製した。
【０１７６】
細胞トランスフェクションおよび感染
２９３Ｔ、ＬＮ−ＣＡＰ、ＤＬＤ１、ＨＣＴ１１６およびＲＫＯ細胞を推奨された組織培養培地（American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA）中で維持し、３７℃でＣＯ２（５％ｖ／ｖ）を含む加湿したインキュベーター内で生育した。過剰発現実験のため、プラスミドをＦｕｇｅｎｅ６法（Roche）を用いてトランスフェクションした。安定化細胞株作製のため、ＤＬＤ１細胞を２週に渡ってヒグロマイシン中で選択し、単一コロニーを選び、拡張した。レトロウィルスの産生のため、２９３Ｔ細胞を過剰発現またはＲＮＡｉプラスミド、および同時にパッケージングプラスミドｇａｇ−ｐｏｌおよびＶＳＶ−ＧまたはｐＣＬ−ａｍｐｈｏでトランスフェクトした。２９３Ｔ細胞から放出された子孫ウィルスを含む培地を採集し、８μｇ／ｍｌのポリブレン（Sigma Aldrich, St. Louis, MO）の存在下で３〜６時間の間細胞を感染させるために用いた。培地を変更し、細胞をさらに２４〜４８時間インキュベートした。それをピューロマイシン（Sigma Aldrich）で２４〜４８時間の間選択し、トリプシン処理し、実験のために播種した。
【０１７７】
タンパク質抽出物および免疫沈降
ウェスタンブロッティングによって直接分析された細胞抽出物は、１×ＳＤＳローディングバッファ中で細胞を溶解し、その後煮沸することによって調製され、ウェスタン分析した。免疫沈降のための細胞抽出物はリン酸バッファ塩液で洗浄した細胞ペレットを、１ｍｌのNonidet P-40（ＮＰ−４０）抽出バッファ（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および１％のNonidet P-40）中に再懸濁し、ＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤カクテルタブレット（Roche）を１０ｍＭのニコチンアミド（ＮＡＡ）および５μＭのトリコスタチン−Ａ（ＴＳＡ）とともに添加した。続いて氷上で３０分間インキュベートし、抽出不可能な物質を１７０００ｇで１０分間４℃で遠心分離し、きれいな上清を免疫沈降に使用した。溶解物を免疫沈降（２時間）し、ＮＰ−４０バッファで４回洗浄し、ウェスタンブロッティングに進んだ。
【０１７８】
増殖アッセイ
適切な構築物で感染させたＤＬＤ１ＨＣＴ１１６およびＲＫＯ細胞株を２４ウェルプレートに、１００００個の密度で播種した。細胞をトリプシン処理し、Coulter Countingによって所与の時点で分析した。
【０１７９】
ルシフェラーゼアッセイ
ルシフェラーゼアッセイはデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステムまたはファイヤーフライルシフェラーゼアッセイシステム（Promega, Madison, WI）により指示されているように行った。
【０１８０】
ウェスタンブロッティングおよびＲＮＡ分析
発現研究のため、動物の腸を冷ＰＢＳで洗浄し、全体をホモジナイズするかまたはひっかいて腸細胞を濃縮した。タンパク質抽出物を、標準の溶解バッファ中で加圧型細胞破砕（dounce homogenization）で調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ＰＶＤＦ膜上に転移させた。膜をＳＩＲＴ１に対するウサギポリクローナル抗体（Upstate Biotechnology, cat#07-131）およびβ−アクチンに対するラビットポリクローナル抗体（Abcam cat #8226）でイムノブロットした。ブロットのスキャンイメージに対して、ImageJソフトウェア（NIH Image分析ウェブサイト http://rsb.info.nih.gov/ij/）を用いて濃度測定分析を行った。
【０１８１】
【表４】
2010523720.tif 000008
【０１８２】
例２：ＳＩＲＴ１およびβ−カテニンの細胞局在
実験結果は、高いＳＩＲＴ１と膜性β−カテニンとの間の正の傾向の存在、および高いＳＩＲＴ１および核β−カテニンの逆相関を示している。ＳＩＲＴ１が大腸癌細胞において過剰発現した場合、より多くのベータカテニンが膜および核周辺領域に存在する。
【０１８３】
例３：ＳＩＲＴ１の過剰発現
本明細書で立証されているのは、ＳＩＲＴ１およびβ−カテニンの間の相互作用であり、ここでＳＩＲＴ１がβ−カテニン関連遺伝子転写を抑制し、細胞増殖を減少させる。細胞増殖の増加に加え、癌性細胞は異常な細胞−細胞および細胞−マトリクス接着によって特徴付けられる。ここで、ＳＩＲＴ１はまた細胞接着能力を増大させることが示されている。図８に示されているように、ＳＩＲＴ１の過剰発現（図８Ｂ中の「ＳＩＲＴ１  ＯＥ」）は軟寒天中のコロニー形成を減少させるが、ドミナントネガティブである触媒的不活性ＳＩＲＴ１の過剰発現（図８Ｃ中の「ＳＩＲＴ（ＤＮ）  ＯＥ」）は、空（empty）ベクターコントロール（「空ベクター」）と比較してコロニー形成の減少は見られなかった。図９はＳＩＲＴ１の過剰発現（「Ｓｉｒｔ１  ＯＥ」）が、空ベクターコントロール（「ｐＢＡＢＥ」）と比較して病巣形成を減少させたことを定量的に立証している。
【０１８４】
例４：サーチュイン剤による幹細胞動態の調節
胚形成、組織再生、および成熟細胞再生を通して、正常組織内において、Ｗｎｔ経路、特にベータ−カテニン、は幹／前駆細胞機能、増殖および維持にとって重要である（Gregorieff and Clevers (2005) Genes & Dev. 19: 877-890参照）。サーチュイン活性化物質は、幹細胞における多能性の延長にとって有用であり、ある癌においてなど、異常幹細胞分裂を妨げる。サーチュイン阻害物質はしたがってＷｎｔシグナリングを活性化するのに有用であり、したがって幹／前駆細胞を分化することにより組織再生を誘導する。例えば、サーチュイン阻害性物質は、炎症性腸疾患によって損傷を受けた腸上皮組織、糖尿病の対象において損傷を受けたかまたは破壊された島細胞、およびアルコール乱用または肝炎ウィルスによって悪影響を受けた対象における肝組織の再生において有用である。
【０１８５】
本明細書で言及された全ての公報、特許、特許出願およびGenBank受託番号は、各個の出願または特許において特におよび個別に、参照によって組込まれるように示されたように、その全体が参照として本願に組込まれる。矛盾がある場合、本明細書中のあらゆる定義を含め、本出願が支配する。
【０１８６】
等価物
当業者は、慣用的な実験のみを用いて、本明細書に記載された本発明の特定の態様と多くが等価であることを理解するまたは確認することができるだろう。かかる等価物は、後述の請求項に包含されるものと意図される。
【図１】
2010523720.tif 000009
【図２】
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2010523720.tif 000011
【図３】
2010523720.tif 000012
【図４】
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【図５】
2010523720.tif 000014
【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図７Ｈ】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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