(57)【要約】  本発明は、抗ＴＮＦα療法、特に抗ＴＮＦα抗体を用いた治療に対する患者の応答を予測するための方法であって、（ａ）患者由来のＴ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏサンプルを提供するステップと、（ｂ）前記Ｔ細胞を抗ＴＮＦα療法に曝すステップと、（ｃ）制御性Ｔ細胞が前記Ｔ細胞のサンプルにおいて誘導されるかどうかを決定するステップとを含み、制御性Ｔ細胞の誘導が、患者が前記抗ＴＮＦα療法を用いた治療に応答する可能性が高いことを示す方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＴＮＦα抗体を用いた治療に対する患者の応答を予測するための方法であって、
（ａ）患者由来のＴ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏサンプルを提供するステップと、
（ｂ）前記Ｔ細胞を抗ＴＮＦα抗体に曝すステップと、
（ｃ）制御性Ｔ細胞が前記Ｔ細胞のサンプルにおいて誘導されるかどうかを決定するステップと
を含み、制御性Ｔ細胞の誘導が、患者が前記抗ＴＮＦα抗体を用いた治療に応答する可能性が高いことを示す方法。
【請求項２】
前記患者が炎症性又は自己免疫疾患を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記患者が関節リウマチ、乾癬性関節炎、クローン病、乾癬、強直性脊椎炎又は潰瘍性大腸炎を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記抗ＴＮＦα抗体が抗ＴＮＦαモノクローナル抗体である、請求項１から３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記抗ＴＮＦα抗体がインフリキシマブ又はアダリムマブである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｔ細胞のサンプルがレスポンダーＣＤ４＋Ｔ細胞を含むサンプルである、請求項１から５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｔ細胞のサンプルがＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ１２７＋Ｔ細胞を含む、請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｔ細胞のサンプルを患者由来のサンプルのＦＡＣＳ選別によって得る、請求項１から７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｃ）が前記Ｔ細胞によるＦｏｘｐ３、ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２５、ＴＧＦβ、ＬＡＰ及びＣＤ１２７から選択される１つ又は複数のマーカーの発現を評価するステップを含む、請求項１から８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｃ）が、
（ａ）前記サンプル中のＦｏｘｐ３＋Ｔ細胞の存在を評価するステップ、
（ｂ）前記サンプル中のＦｏｘｐ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の存在を評価するステップ、
（ｃ）前記サンプル中のＦｏｘｐ３＋ＣＤ１２７−Ｔ細胞の存在を評価するステップ、
（ｄ）前記サンプル中のＣＤ２５＋ＣＤ１２７−Ｔ細胞の存在を評価するステップ、及び
（ｅ）前記サンプル中のＣＤ６２Ｌ−及びＣＣＲ７−Ｔ細胞の存在を評価するステップ
の１つ又は複数を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
制御性Ｔ細胞の存在をＦＡＣＳによって決定する、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｃ）が、
（ａ）レスポンダーＴ細胞の集団による炎症促進性サイトカイン産生を抑制する前記サンプル中のＴ細胞の能力を評価するステップ、
（ｂ）レスポンダーＴ細胞の集団の増殖を抑制する前記サンプル中のＴ細胞の能力を評価するステップ
の１つ又は複数を含む、請求項１から１１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記炎症促進性サイトカインがＴＮＦα、ＩＮＦγ、ＩＬ−６及びＩＬ−１から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
炎症性又は自己免疫疾患を治療するための方法であって、
（ａ）請求項１から１３までのいずれか一項に記載の方法により、抗ＴＮＦα抗体を用いた治療に応答する可能性が高いとして患者を同定するステップと、
（ｂ）前記抗ＴＮＦα抗体を用いて患者を治療するステップと
を含む方法。
【請求項１５】
患者における炎症性又は自己免疫疾患の治療において使用するための抗ＴＮＦα抗体であって、前記患者が、請求項１から１３までのいずれか一項に記載の方法により、抗ＴＮＦα抗体を用いた治療に応答する可能性が高いとして同定されている抗ＴＮＦα抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の抗ＴＮＦα療法に応答する患者の選択を可能にする方法に関する。この方法は、抗ＴＮＦα療法に応答する患者のみに対してこのような療法の使用を可能にし、このような療法に応答しない患者において被る可能性がある不必要なコスト及び潜在的な副作用を回避する。
【背景技術】
【０００２】
自己免疫病は、それ自体の構成成分を認識する生物の不全であり、これはその生物自体の細胞及び組織に対する免疫応答をもたらす。このような異常な免疫応答から生じる任意の疾患は自己免疫疾患と呼ばれる。
【０００３】
自己免疫疾患に対する現在の治療は、大部分が対症的であり、一般には免疫抑制性、又は抗炎症性である。ＴＮＦαアンタゴニストのエタネルセプト及び抗体系薬剤のインフリキシマブ及びアダリムマブなどの特定の免疫調節療法は、関節リウマチなどの自己免疫疾患を治療する際に有用であることが示されている。
【０００４】
関節リウマチ（ＲＡ）の病因において重要な炎症促進性メディエーターの理解の進展は、標的療法の新時代の到来を告げている。第一の最も成功した例は、ＴＮＦαと結合し、関節リウマチを有する患者の６０〜７０％において炎症を低下させ関節破壊を遅らせることにより実質的な治療有効性を示す、インフリキシマブの例である（Ｍａｉｎｉ、Ｒら、１９９９  Ｌａｎｃｅｔ．３５４：１９３２〜１９３９ページ；Ｍａｉｎｉ、Ｒ．Ｎら、２００４  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．５０：１０５１〜１０６５ページ）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、活動性関節リウマチを有する患者から単離した「天然の」制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）が、抑制能の低減を示すことを発見している。抗ＴＮＦα治療後、Ｔｒｅｇプールはそれらの抑制機能を取り戻すようである。しかしながら、これらのＴｒｅｇの欠損を回復させるのではなく、抗ＴＮＦα治療は、ＴＧＦβを介してレスポンダーＴ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５−）由来のＴｒｅｇの異なる有力な集団の分化を（ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏで）誘導することが発見されている。これらの発見は、インフリキシマブなどの抗ＴＮＦα作用物質の治療効果が、少なくとも部分的にはＴｒｅｇの誘導に基づく可能性があることを示し、インフリキシマブなどの抗ＴＮＦα療法は、関節リウマチを有する患者において耐性を回復させる潜在性があることを示唆する。
【０００６】
したがって、Ｔｒｅｇの分化は、関節リウマチなどの疾患における療法に対する患者の応答を予測するバイオマーカーとして使用することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
したがって、本発明は、抗ＴＮＦα抗体を用いた治療に対する患者の応答を予測するための方法であって、
（ａ）患者由来のＴ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏサンプルを提供するステップと、
（ｂ）前記Ｔ細胞を抗ＴＮＦα抗体に曝すステップと、
（ｃ）制御性Ｔ細胞が前記Ｔ細胞のサンプルにおいて誘導されるかどうかを決定するステップと
を含み、制御性Ｔ細胞の誘導が、患者が前記抗ＴＮＦα抗体を用いた治療に応答する可能性が高いことを示す方法を提供する。
【０００８】
これらの方法を使用して、どの患者を所与の抗ＴＮＦα抗体を用いて治療すべきか決定することができる。したがって、本発明は、炎症性又は自己免疫疾患を治療するための方法であって、
（ａ）本発明の方法を使用して、抗ＴＮＦα抗体を用いた治療に応答する可能性が高いとして患者を同定するステップと、
（ｂ）前記抗ＴＮＦα抗体を用いて患者を治療するステップと
を含む方法も提供する。
【０００９】
本発明は、患者における炎症性又は自己免疫疾患の治療において使用するための抗ＴＮＦα抗体であって、本発明の方法を使用して、前記患者が、抗ＴＮＦα抗体を用いた治療に応答する可能性が高いとして同定されている抗ＴＮＦα抗体も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】健常対照、活動性ＲＡを有する患者、及び抗ＴＮＦα療法で治療したＲＡ患者由来のＰＢＭＣにおける制御性Ｔ細胞（ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋）の百分率を示す図である。３つの抗ＴＮＦα治療群のそれぞれに関して応答する患者のみを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、予備試験の結果に基づいて、患者が特定の治療レジメに応答する可能性が高いかどうか予測することができるという、本発明者らの発見に由来する。特に本発明は、患者が抗ＴＮＦα療法に応答し得るかどうかの予測に関する。
【００１２】
幾つかのこのような抗ＴＮＦα療法が知られている。しかしながら、これらの療法は全ての患者において有効であるわけではない。例えば、以下でさらに論じるインフリキシマブは、幾つかの炎症性疾患及び自己免疫疾患の療法において使用されるが、全ての患者がインフリキシマブを用いた治療に応答するわけではない。例えば、関節リウマチの治療において、インフリキシマブは、炎症を低下させ患者の６０〜７０％において関節破壊を遅らせることにより実質的な治療有効性を示す。しかしながら、残りの３０〜４０％の患者では、この治療効果は見られない。特定の患者が、このような療法が有効であり得る６０〜７０％の個体、又はこのような療法が無効であり得る３０〜４０％の個体の範疇にあるかどうか確認することは明らかに有益であろう。
【００１３】
このような予測試験は金銭的利益があり得るが、これは、おそらく高価な抗ＴＮＦ薬剤を、それらに応答し得ない患者に使用することが不要となるからである。したがって、このことはこのような薬剤の成功率を有意に増大させる可能性があるが、これは、この薬剤を使用により効果を受けやすい患者を標的にすることができるからである。このような予測試験を使用して、疾患の初期段階での患者の治療の決定を手助けすることもできる。例えば、初期段階の関節リウマチを有する患者におけるインフリキシマブの使用は、寛解をもたらすことができる証拠が存在する。治療の決定前に本発明の予測試験を使用することによって得ることができる成功率が高くなるため、このような初期段階の患者に対する抗ＴＮＦα療法の使用はより実行可能でありより正当な選択肢となり、且つ有意な臨床的有益性をもたらすと予想することができる。予測試験は抗ＴＮＦα療法に応答しない患者にも特に有用である可能性があるが、これは、多くのこのような抗ＴＮＦα療法が、副作用に関連する可能性があるからである。本発明の予測試験を使用することによって、このような療法に応答し得ない患者を、不必要にこのような危険に曝さないことを確実にすることができる。
【００１４】
したがって本発明は、患者が特定の抗ＴＮＦα療法を用いた治療に応答する可能性があるかどうか決定するために使用することができる予測試験について記載するものである。したがって、抗ＴＮＦα療法を用いた治療に対する患者の応答を予測するための方法は、（ａ）患者由来のＴ細胞のサンプルを提供するステップと、（ｂ）前記Ｔ細胞を抗ＴＮＦα療法に曝すステップと、（ｃ）制御性Ｔ細胞が前記Ｔ細胞のサンプルにおいて誘導されるかどうかを決定するステップとを含み得、制御性Ｔ細胞の誘導が、患者が前記抗ＴＮＦα療法を用いた治療に応答する可能性が高いことを示す。
【００１５】
特に本発明は、抗ＴＮＦα抗体を用いた治療に対する患者の応答を予測するための方法であって、（ａ）患者由来のＴ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏサンプルを提供するステップと、（ｂ）前記Ｔ細胞を抗ＴＮＦα抗体に曝すステップと、（ｃ）制御性Ｔ細胞が前記Ｔ細胞のサンプルにおいて誘導されるかどうかを決定するステップとを含み、制御性Ｔ細胞の誘導が、患者が前記抗ＴＮＦα抗体を用いた治療に応答する可能性が高いことを示す方法を提供する。
【００１６】
抗ＴＮＦα療法
腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）は、単球及びマクロファージによって産生されるサイトカインである。それは、炎症部位への白血球細胞の輸送の増大によって、及び炎症を開始及び増幅させる追加的分子機構によって免疫応答を媒介する。ＴＮＦαに起因する生物活性には、ＩＬ−１及びＩＬ−６などの炎症促進性サイトカインの誘導、血管内皮層の透過性の増大による血管から組織への白血球の運動又は移動の増進、及び接着分子の放出の増大がある。
【００１７】
炎症の制御におけるその重要な役割のために、ＴＮＦαは、幾つかの療法、特に炎症又は自己免疫障害の予防又は低減を対象とする療法の重要な標的である。
【００１８】
本発明は、ＴＮＦα応答を対象とするこのような療法に関する。特に本発明は、抗ＴＮＦα療法に関する。抗ＴＮＦα療法とは、ＴＮＦαを対象とする療法又は治療を意味する。例えば、抗ＴＮＦα療法は、ＴＮＦαの産生又は放出を妨害又は低減することができる。抗ＴＮＦα療法は、ＴＮＦαの活性を妨害又は低減することができる。抗ＴＮＦα療法は、ＴＮＦαと特異的に結合する分子の使用を含むことができる。このような分子はＴＮＦαの活性を妨げることができる。抗ＴＮＦα療法は、細胞外ＴＮＦα及び／又は膜貫通ＴＮＦα及び／又は受容体結合ＴＮＦαを中和又は除去することができる。抗ＴＮＦα療法は、（例えば、血中に浮遊している）可溶性ＴＮＦα及び／又は（Ｔ細胞及び他の免疫細胞の表面に存在する可能性がある）膜貫通ＴＮＦαと結合する分子を利用することができる。抗ＴＮＦα療法は、ＴＮＦαとその受容体の有効な結合を阻害又は妨害する分子を利用することができる。例えば、一実施形態では、抗ＴＮＦα療法は、膜結合ＴＮＦαを中和するか、それと結合するか、又はそれを除去する。
【００１９】
抗ＴＮＦα療法はＴＮＦαに特異的であることが好ましく、それはＴＮＦαのみに作用する、又は他の分子に優先してＴＮＦαに作用することが好ましい。例えば、２つの型のＴＮＦが同じ受容体を利用することができるとしても、抗ＴＮＦα療法はＴＮＦβではなくＴＮＦαに作用することが好ましい。
【００２０】
本発明によれば、抗ＴＮＦα療法は、ＴＮＦαと結合、及び中和することができる分子を利用することが好ましい。好ましい分子は、全ての型のＴＮＦα、例えば細胞外ＴＮＦα、膜貫通ＴＮＦα及び受容体結合ＴＮＦαを中和することができる。特に、本発明によって使用するのに好ましい抗ＴＮＦ療法は、受容体結合ＴＮＦαを中和することができる。本発明によって使用するための抗ＴＮＦα療法は、炎症プロセスに関与する細胞を溶解する能力を有することが好ましい。
【００２１】
したがって、本発明によって使用するのに好ましい群の抗ＴＮＦα療法は抗ＴＮＦα抗体である。このような抗体はモノクローナル又はポリクローナルであってよく、又はその抗原結合断片であってよい。例えば、抗原結合断片は、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ若しくはＦｖ断片、即ち抗原結合断片を含む抗体の「可変」領域の断片であってよく、又はそれを含むことができる。抗体又はその断片は、単鎖抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体又はヒト化抗体であってよい。
【００２２】
抗体はＴＮＦα分子を対象とすることができる、即ち抗体は、ＴＮＦα上に存在するエピトープと結合することができ、したがってＴＮＦαと選択的及び／又は特異的に結合することができる。抗体は、ＴＮＦαの発現及び／又は活性に関与する他の分子を対象とすることができる。例えば、ＴＮＦα上の１つ又は複数のエピトープ及び／又はＴＮＦαの発現及び／又は活性に関与する１つ又は複数の他の分子に対して広範囲の影響を有する、ポリクローナル抗体を産生することができる。
【００２３】
抗体は任意の適切な方法によって産生することができる。抗体を調製及び特徴付けするための手段は当技術分野でよく知られており、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹを参照。例えば、完全ポリペプチド又はその断片、例えばその抗原性エピトープ、本明細書で以後「免疫原」に対する抗体を宿主動物中で産生することによって、抗体を産生することができる。
【００２４】
ポリクローナル抗体を産生するための方法は、適切な宿主動物、例えば実験動物を免疫原で免疫処置するステップと、その動物の血清から免疫グロブリンを単離するステップとを含む。したがって動物に免疫原を接種することができ、その後血液を動物から除去し、且つＩｇＧ分画を精製することができる。
【００２５】
モノクローナル抗体を産生するための方法は、所望の抗体を産生する細胞を不死化するステップを含む。ハイブリドーマ細胞は、接種した実験動物由来の脾細胞と腫瘍細胞を融合するによって産生することができる（Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６、４９５〜４９７ページ）。
【００２６】
所望の抗体を産生する不死化細胞は従来の手順によって選択することができる。ハイブリドーマは培養中に増殖させることが可能であり、或いは腹水形成のため、又は同種異系宿主若しくは免疫不全宿主の血流中に腹膜内注射することが可能である。ヒト抗体は、ヒトリンパ球のｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫処置、次にエプスタインバーウイルスによるリンパ球の形質転換によって調製することができる。
【００２７】
モノクローナル抗体とポリクローナル抗体の両方を産生するために、実験動物はヤギ、ウサギ、ラット又はマウスであることが適切である。望む場合、免疫原は、その中で免疫原が例えばアミノ酸残基の１つの側鎖によって、適切な担体と結合しているコンジュゲートとして投与することができる。担体分子は典型的には生理的に許容される担体である。得られた抗体は単離することができ、且つ望む場合、精製することができる。
【００２８】
タンパク質と「特異的に結合する」抗体、又は他の化合物は、それが特異的ではあるが実質的に結合するタンパク質と優先的又は高親和性で結合するとき、他のタンパク質とは結合しないか、又はごく低い親和性で結合する。抗体の特異的結合能力を決定するための競合結合又は免疫放射定量アッセイに関する様々なプロトコルは、当技術分野でよく知られている（例えば、Ｍａｄｄｏｘら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５８、１２１１〜１２２６ページ、１９９３参照）。このようなイムノアッセイは、特異的タンパク質とその抗体の間の複合体の形成、及び複合体形成の測定を典型的には含む。
【００２９】
インフリキシマブ及びアダリムマブは、全ての型（細胞外、膜貫通、及び受容体結合）のＴＮＦαを中和することができる抗体の例である。したがって、本発明の好ましい態様では、抗ＴＮＦα療法は、インフリキシマブ及び／若しくはアダリムマブの投与を含む、その投与から本質的になる、又はその投与からなる。エタネルセプトという別のＴＮＦαアンタゴニストは、異なる型の分子（受容体−コンストラクト融合タンパク質）であり、且つその修飾型のために、受容体結合ＴＮＦαを中和することができない。インフリキシマブ及びアダリムマブなどの抗ＴＮＦα抗体は炎症プロセスに関与する細胞を溶解する能力も有するが、一方受容体融合タンパク質であるエタネルセプトは一見するとこの能力を欠いている。
【００３０】
（商標名Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）で販売された）インフリキシマブは、炎症及び自己免疫障害を治療するために使用される薬剤である。インフリキシマブは、ネズミ結合ＶＫ及びＶＨドメイン並びにヒト定常Ｆｃドメインを含むキメラモノクローナル抗体である。
【００３１】
インフリキシマブは、可溶性（血中に浮遊している）及び膜貫通（Ｔ細胞及び類似の免疫細胞の外膜に位置する）型のＴＮＦαとの高い親和性での結合によってＴＮＦαの生物活性を中和し、ＴＮＦαとその受容体の有効な結合を阻害又は妨害する。インフリキシマブはＴＮＦαに対する高い特異性を有し、ＴＮＦβを中和しないが、ＴＮＦβはＴＮＦαと同じ受容体を利用する。
【００３２】
今日まで、インフリキシマブは乾癬、小児クローン病、強直性脊椎炎、クローン病、乾癬性関節炎、関節リウマチ、及び潰瘍性大腸炎の治療用に米国食品医薬品局によって認可されてきている。
【００３３】
（商標名Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）で販売された）アダリムマブもＴＮＦαと結合し、それがＴＮＦ受容体を活性化するのを妨げる。アダリムマブは完全ヒトモノクローナル抗体から構築されたが、一方インフリキシマブはマウス−ヒトキメラ抗体である。今日まで、アダリムマブは関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎及びクローン病の治療用に米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって認可されており、尋常性乾癬の治療における認可がＦＤＡに申し込まれている。
【００３４】
エタネルセプトは、組換えヒト可溶性ＴＮＦα受容体融合タンパク質である。エタネルセプトは、ＴＮＦαと結合し強直性脊椎炎、若年性関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチなどの自己免疫疾患を含めたヒト及び他の動物中、及びおそらく過度のＴＮＦαによって媒介される様々な他の障害中の、過度の炎症に関連する障害におけるその役割を低下させる、１５０ｋＤａの分子量を有する大分子である。
【００３５】
２つの型のＴＮＦ受容体：他のサイトカインを放出することによってＴＮＦに応答する白血球細胞中に埋没した状態で見られる受容体、及びＴＮＦを失活させ免疫応答を鈍らせるために使用される可溶性ＴＮＦ受容体が存在する。さらに、ＴＮＦ受容体はほぼ全ての有核細胞（赤血球細胞、これらは有核ではなく、その表面上にＴＮＦ受容体を含有しない）の表面上で見られる。エタネルセプトは天然に存在する可溶性ＴＮＦ受容体の阻害効果を模倣し、その違いは、エタネルセプトは、それが簡潔なＴＮＦ受容体ではなく融合タンパク質であるために、大幅に増大した血流中での半減期、したがって天然に存在する可溶性ＴＮＦ受容体より深く長時間持続する生物学的影響を有することである。
【００３６】
エタネルセプトは、ＩｇＧ１のＦｃ部分と結合した２つの天然に存在する可溶性ヒト７５キロダルトンＴＮＦ受容体の組合せから構成される。その影響は人為的に工学処理した二量体融合タンパク質である。実施例中に示したように、エタネルセプトを用いたサンプルの治療は、その療法に対する患者中の臨床応答にもかかわらずＴｒｅｇ数の変化をもたらさなかった。したがって、本明細書に記載するように使用する抗ＴＮＦα療法は、エタネルセプトのみを用いた治療を含むことは意図しないが、エタネルセプト療法は抗ＴＮＦα抗体などの別の抗ＴＮＦα療法と組み合わせて使用することができる。一実施形態では、抗ＴＮＦα療法は、天然に存在するＴＮＦ受容体を模倣する分子ではない。
【００３７】
治療する患者
本発明は特に、ＴＮＦαの存在に関連する疾患又は他の状態の治療又は予防に関する。例えば、本発明は、炎症性又は自己免疫疾患の治療又は予防に関する。治療する患者は、典型的にはこのような炎症性又は自己免疫疾患に罹患している。患者は典型的には、抗ＴＮＦα療法を使用する治療が考えられる個体である。例えば、抗ＴＮＦα療法は関節リウマチ、乾癬性関節炎、クローン病、乾癬、強直性脊椎炎及び潰瘍性大腸炎の治療において現在使用されている。本発明の方法を使用して、これらの疾患、又は抗ＴＮＦα療法を使用して治療可能である任意の他の疾患、状態若しくは症状のいずれか１つを有する患者の治療を支援することができる。
【００３８】
これらの治療は、このような疾患の影響を受けやすい任意の動物に使用することができる。治療する対象は、ヒト、並びにチンパンジー及び他の猿人類及びサル種などの非ヒト霊長類を含めた他の霊長類；ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ及びウマなどの家畜動物；イヌ及びネコなどの家畜哺乳類；マウス、ラット及びモルモットなどのげっ歯類を含めた実験動物；例えばニワトリ、七面鳥及び他の家禽鳥類、アヒル、ガチョウなどの家畜、野生型及び狩猟鳥を含めた鳥類を非制限的に含む脊索動物亜門の任意のメンバーであってよい。好ましい実施形態では、対象はヒトである。この用語は特定の年齢を示すわけではない。したがって、例えば、成人、若年及び新生児対象は、いずれも含まれるものとする。
【００３９】
本明細書に記載する方法は前述の脊椎動物種のいずれかにおける使用を意図するが、これは、これらの脊椎動物の全ての免疫系が同様に作動するからである。哺乳動物の場合、対象はヒトであることが好ましいが、家畜動物、実験対象又は愛玩動物であってもよい。したがって本明細書に記載する方法は、任意のこのような種の診断又は治療において使用することができる。
【００４０】
適切な療法は治療する種に基づいて選択することができる。例えば、特定の種を治療する際に使用するための抗ＴＮＦα抗体を修飾して、その種において活性又はより有効な状態にすることができる。ヒトの治療において使用するための抗ＴＮＦα抗体はヒトモノクローナル抗体であってよく、ヒト化抗体であってよく、ヒトドメインを含むキメラ抗体であってよく、又はＣＤＲ移植抗体であってよい。
【００４１】
患者由来のサンプル
本発明は、対象とする患者由来のサンプルに実施する方法に関する。その方法は、患者から得られたサンプルにｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施することが好ましい。本明細書で論じるように、患者は典型的には炎症性又は自己免疫疾患に罹患している。患者は典型的には、抗ＴＮＦα療法を使用する治療が考えられる個体である。本発明の方法は、このような患者由来のサンプルに実施する。疾患又は状態の治療を開始する前に、患者からサンプルを入手することが好ましい。例えば、抗ＴＮＦα療法を用いた任意の治療を始める前に、患者からサンプルを入手することができる。
【００４２】
サンプルは、Ｔ細胞を含む任意の組織又は体液由来であってよい。例えばサンプルは、血液サンプル又は炎症関節などに由来する滑液のサンプルであってよい。
【００４３】
サンプルは本発明の方法で使用する前に処理して、方法に干渉する可能性がある構成要素を除去すること、又は方法の結果の評価をさらに容易にすることのいずれかが可能である。例えば、サンプルを処理して、Ｔ細胞以外の構成要素を除去すること、又はサンプルから特定の型の細胞を選択若しくは除外することが可能である。したがって、本発明の方法で使用するためのサンプルは、精製された、実質的に精製された、単離された又は実質的に単離されたＴ細胞集団を含むことができる。
【００４４】
本発明の方法で使用するためのＴ細胞のサンプルは、レスポンダーＴ細胞の集団を含むことができる。例えば、本発明の方法で使用するためのＴ細胞のサンプルは、レスポンダーＴ細胞の集団からなっていてよく、又は実質的にレスポンダーＴ細胞の集団からなっていてよい。Ｔ細胞のサンプルは、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又はそれより多くのレスポンダーＴ細胞などの、主にレスポンダーＴ細胞である集団であってよい。
【００４５】
レスポンダーＴ細胞は、制御性Ｔ細胞によって制御され得る細胞である。レスポンダーＴ細胞はＴ細胞受容体による刺激によって増殖し、炎症促進性サイトカインを分泌することができる。例えばレスポンダーＴ細胞は、ＩＬ−２を分泌するＴ細胞として同定することができる。レスポンダーＴ細胞は、制御性Ｔ細胞中に存在する特徴を欠くＴ細胞として同定することができる。したがってレスポンダーＴ細胞の集団は、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ２５−及び／又はＣＤ１２７＋及び／又はＦｏｘｐ３−であるサンプル内の細胞を選択することによって同定することができる。１、２、３又は４つ全てのこれらの特徴を評価することができる。レスポンダーＴ細胞の集団は、個々の特性を有する細胞に関するサンプル内の細胞を選別することによってサンプルから入手することができる。例えば、細胞中の１つ又は複数の同定分子の存在又は不在に基づく蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって細胞を選別することができる。レスポンダーＴ細胞の集団は、ＣＤ４＋及びＣＤ２５−及びＣＤ１２７＋である細胞に関するＦＡＣＳ選別によって同定することができる。
【００４６】
本発明に従って、本明細書に記載するサンプルを、抗ＴＮＦα抗体などの抗ＴＮＦα療法に曝す。抗ＴＮＦα療法への曝露は、試験する個々の療法に基づいて、任意の適切な条件の組を使用して実施することができる。この曝露は、サンプルと抗ＴＮＦα作用物質を接触させることによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施することが好ましい。サンプルをこのような曝露の前又は最中に処理して、療法に対する任意の応答を高めることができる。例えば、レスポンダーＴ細胞を含む集団を処理して細胞を活性化することができる。例えば、レスポンダーＴ細胞は、抗ＴＮＦα療法剤の存在又は不在下で抗ＣＤ３／ＣＤ２８を用いて、一晩などの一定時間活性化することができる。
【００４７】
本発明の方法は、実験サンプルと同じ方法であるが、抗ＴＮＦα療法剤の不在下などの抗ＴＮＦα療法を行わない条件下でさらなるサンプルを処理する対照を含めることもできる。適切な対照は、使用する個々の抗ＴＮＦα療法に応じて容易に確認することができる。これは抗ＴＮＦα療法の製剤に使用するための希釈剤（単数又は複数）を用いた治療を含むことができる。例えば、抗ＴＮＦα療法が抗ＴＮＦα抗体である場合、２つの同一なサンプル、１つは対象とする抗体で処理したサンプル、及びもう１つは同じ方法であるが、抗体の不在下で処理したサンプルを使用することができる。このような対照は一般には実験サンプルと平行して処理されるはずであり、これを使用して、療法によって引き起こされるＴｒｅｇ中の任意の誘導が、実際は抗ＴＮＦα療法剤の結果であり、治療に関連する他の条件又は物質によって引き起こされないことを保証することができる。
【００４８】
本発明に従って使用する抗ＴＮＦα療法の用量は、具体的な療法の性質に依存し得る。適切な用量は、当業者により、その共通の一般知識に基づいて、例えば、その療法を使用するｉｎ  ｖｉｖｏ治療に使用され得るレジメ及び用量を考慮して決定することができる。例えば、適切な用量を選択して、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与後に患者の血液循環系中に存在し得る療法剤のレベルを反映することができる。
【００４９】
制御性Ｔ細胞
本発明に従って、本明細書に記載するサンプルを抗ＴＮＦα療法に曝す。次いでこのような曝露の影響を評価する。特に、このような曝露の後、サンプルを評価して、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）が誘導されたかどうか、数及び／又は活性を決定する。Ｔｒｅｇの存在は本明細書に記載するように幾つかの方法で評価することができる。例えば、曝露前後のサンプル中のＴｒｅｇの数を比較することができ、又はＴｒｅｇに特徴的である、若しくはＴｒｅｇによって発現される分子の量を曝露前後に比較して、Ｔｒｅｇの数若しくは活性の何らかの増大が誘導されたかどうか決定することができる。これらの方法の任意の１つ又は複数を本発明の方法に従って使用して、抗ＴＮＦα療法を用いた治療に対するＴ細胞のサンプルの応答を評価することができる。
【００５０】
幾つかの実施形態では、本発明の方法はＴｒｅｇの存在を検出することを含み得る。例えば、患者由来のＴ細胞のサンプルが検出可能なＴｒｅｇを含有しない場合、本明細書に記載する型のＴｒｅｇ活性又はＴｒｅｇは検出不能であり、したがって抗ＴＮＦα療法を用いた治療によるこのようなＴｒｅｇの誘導は、このようなＴｒｅｇ又はＴｒｅｇ活性の存在又は不在を単に検出することによって決定することができる。他の実施形態では、本発明の方法は検出、及びＴｒｅｇ又はＴｒｅｇ活性の定量化も含むことができる。例えば、本発明の方法は、Ｔｒｅｇの数の変化、本明細書に記載する特定の型のＴｒｅｇの数の変化、サンプル中のＴｒｅｇの特性の変化、又はＴｒｅｇの１つ又は複数の活性の変化を検出することができる。このような数、特性又は活性の増大は、その療法の結果としてＴｒｅｇが誘導されたことを示し得る。
【００５１】
自己免疫において、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞は耐性の維持に必要不可欠である。マウスモデルにおけるＴｒｅｇ細胞の枯渇は、炎症性腸疾患及びコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）を含めた広範囲の臓器特異的疾患の自然発生に関連する。ヒトでは、胸腺中で生成する天然Ｔｒｅｇは末梢ＣＤ４＋Ｔ細胞の３〜５％を表し、ＣＤ２５、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ６２Ｌ及び転写因子Ｆｏｘｐ３を発現する。
【００５２】
本発明の方法によって誘導されるＴｒｅｇは、Ｆｏｘｐ３、ＣＤ４、ＣＤ２５及びＣＴＬＡ−４を発現する一方で、ＣＤ６２Ｌ−及び／又はＣＣＲ７−であってよい。これらのマーカーのいずれかの存在を、単独又は組み合わせて使用して、Ｔｒｅｇを同定することができる。例えば、Ｆｏｘｐ３発現細胞、Ｆｏｘｐ３及びＣＤ４を発現する細胞、ＣＤ６２Ｌ及び／又はＣＣＲ７を発現しないＴ細胞、又はＦｏｘｐ３＋、ＣＤ６２Ｌ−及びＣＣＲ７−である細胞の存在を評価することによって、ヒトＴｒｅｇの存在を決定することができる。ＣＤ２５及び／又はＦｏｘｐ３と併せたＣＤ１２７の発現を使用してヒトＴｒｅｇをさらに定義する（及び単離）することができるが、これは、Ｆｏｘｐ３＋ＴｒｅｇがＣＤ４＋Ｔ細胞のＣＤ２５＋ＣＤ１２７−分画内に局在するように見えるからである。したがってＴｒｅｇの存在は、サンプル中のＣＤ２５＋ＣＤ１２７−Ｔ細胞を検索すること、又はＣＤ２５＋ＣＤ１２７−Ｆｏｘｐ３＋細胞又はＣＤ１２７−Ｆｏｘｐ３＋細胞を検索することによって同定することができる。
【００５３】
本発明の方法は、以下のマーカー：Ｆｏｘｐ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ１２７−、ＣＤ６２Ｌ−、ＣＣＲ７−、ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲ、ＴＧＦβ及びＬＡＰのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ以上によって特徴付けられる細胞の存在を検出することを含むことができる。例えば、本発明の方法は、Ｆｏｘｐ３＋；Ｆｏｘｐ３＋及びＣＤ４＋；ＣＤ２５＋及びＣＤ１２７−；及び／又はＣＤ６２Ｌ−及びＣＣＲ７−である細胞の検出を含むことができる。
【００５４】
本発明の方法は、Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ１２７−である細胞の検出を含むことができる。本発明の方法は、さらにＣＤ６２Ｌ−及びＣＣＲ７−であるような細胞の同定をさらに含むことができる。
【００５５】
このようなＴ細胞マーカーの存在は、当技術分野で一般的な方法によって評価することができる。これらは発現又は機能系試験を含むことができる。例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して、１つ又は複数のこのような特性を示す細胞を単離及び同定することができる。したがってＦＡＣＳを使用して、特定の発現プロフィールを示す細胞に関するサンプルをスクリーニングすることができる。
【００５６】
インフリキシマブ療法後の関節リウマチ患者中のＴｒｅｇ数の増大の根底にある機構を検索することによって、この疾患を治療するための制御性Ｔ細胞の利用の仕方に関する識見を見出すことができる。同様に、このような分析は、療法に対する臨床応答を予測するために使用することができる様々なバイオマーカーの同定を可能にする。１つのこのような例は、一晩細胞培養物を使用して測定することができるＦｏｘｐ３発現である。
【００５７】
Ｔｒｅｇがその効果を媒介する機構は依然として完全には理解されておらず、且つ試験中の系に応じて変わるようであるが、ただし一般に天然Ｔｒｅｇは、直接的な細胞接触並びにおそらくＩＬ−１０及びＴＧＦβなどのサイトカインの関与を必要とする。
【００５８】
Ｔｒｅｇの誘導はＴＧＦβに依存することを本明細書で確定する。これは、レスポンダーＴ細胞からのＴｒｅｇの分化を誘導することができるＴＧＦβの作用と一致している。このプロセスはさらに、ＩＬ−２とＣＴＬＡ−４の両方の存在に頼る。理論によって縛られることは望まないが、インフリキシマブによるＴｒｅｇの誘導はＴＧＦβの産生及び応答性によって制御されると仮定する。この仮説をさらに広げると、インフリキシマブに応答しなかった患者中のＴｒｅｇ数の増大がない理由は、ＴＧＦβの産生又は機能の不全に原因があると予測することができる。
【００５９】
したがって本発明の方法は、本明細書で論じるＴｒｅｇの機能のいずれかなどの、Ｔｒｅｇの機能特性を検索することによってＴｒｅｇの存在を評価することができる。例えば本発明の方法は、レスポンダーＴ細胞の集団による前炎症性サイトカインの産生を抑制するＴ細胞の能力を評価することができる。抑制することができるサイトカインには、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ−６及びＩＬ−１がある。本発明の方法は、レスポンダーＴ細胞の集団の増殖を抑制するＴ細胞の能力を評価することができる。
【００６０】
本発明の方法は、Ｔｒｅｇにより産生又は誘導される分子を検索することによって、Ｔｒｅｇの存在を評価することができる。例えば本発明の方法では、ＴＧＦβ又はＩＬ−１０などの、Ｔｒｅｇに特徴的である１つ又は複数の炎症促進性サイトカインの存在を評価することができる。
【００６１】
診断法
したがって本発明は、患者が抗ＴＮＦα療法を用いた治療に応答するかどうか、及びその仕方の評価を可能にする診断法を提供する。以下でより詳細に説明するように、幾つかの実施形態中で、この情報は医師又は獣医師により使用されて、患者に適した治療過程を選択する際に彼らに手助けすることを可能にする。特にこの情報は、患者のｉｎ  ｖｉｖｏで、試験する特定の抗ＴＮＦα療法、又は類似の療法を使用するかどうかを、彼らが決定するのを手助けする際に有用である可能性がある。
【００６２】
本明細書に記載するＴｒｅｇ活性又は数の誘導の検出は、患者がその抗ＴＮＦα療法を用いた治療に応答する可能性が高いことを示す。これは、同じ患者が他の抗ＴＮＦα療法に応答することも示す可能性がある。例えば、抗ＴＮＦα抗体療法に応答したＴｒｅｇ活性又は数の誘導は、患者がその抗体を用いた治療に応答する可能性が高いことを示す可能性があるが、その患者が、ＴＮＦαと結合する他の抗体などの他の抗ＴＮＦα抗体を用いた治療に応答する可能性が高いことを示す可能性もある。したがって、本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験中でインフリキシマブに対する陽性応答を示す患者は、他の抗ＴＮＦα抗体などの、インフリキシマブと同様の経路によって作用する他の療法にも応答する可能性が高い。
【００６３】
患者は、彼又は彼女がその療法に応答する５０％を超える確率を有する場合、療法に応答する可能性が高いとして分類することができる。患者は、６０％を超える、７０％を超える、８０％を超える、９０％を超える、９５％を超える、又はそれより高い所与の療法に応答する確率を有することが好ましい。療法に応答する可能性が高いとして同定される患者は、試験しなかった患者より療法に応答する確率が高いことが好ましい。例えば、インフリキシマブは関節リウマチ（ＲＡ）を有する患者の６０〜７０％において有効である。本発明の方法によってインフリキシマブに応答する可能性があるとして同定されるＲＡ患者は、７０％を超える、７５％を超える、８０％を超える、９０％を超える、９５％を超える、又はそれより高い確率などの６０〜７０％を超える応答の確率を有し得ることが好ましい。
【００６４】
本明細書に記載するＴｒｅｇ活性又は数の誘導の不在は、患者がその抗ＴＮＦα療法を用いた治療に応答する可能性が低いことを示す。これは、同じ患者が他の抗ＴＮＦα療法に応答しないことも示す可能性がある。例えば、本発明に従って抗ＴＮＦα抗体がＴｒｅｇ活性又は数を誘導できないことは、患者がその抗体を用いた治療に応答する可能性が低いことを示す。それは、患者が他の抗ＴＮＦα抗体を用いた治療に応答する可能性が低いことを意味する可能性もある。したがって、本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験中でインフリキシマブに対する陰性応答を示す患者は、他の抗ＴＮＦα抗体などの、インフリキシマブと同様の経路によって作用する他の療法に応答する可能性も低い。
【００６５】
患者は、彼又は彼女がその療法に応答する５０％未満の確率を有する場合、療法に応答する可能性が低いとして分類することができる。患者は、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、又はそれより低い所与の療法に応答する確率を有することが好ましい。療法に応答する可能性が低いとして同定される患者は、試験しなかった患者より療法に応答する低い確率を有することが好ましい。例えば、インフリキシマブは関節リウマチ（ＲＡ）を有する患者の３０〜４０％において無効である。本発明の方法によってインフリキシマブに応答する可能性が低いとして同定されるＲＡ患者は、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、又はそれより低い確率などの３０〜４０％未満の応答の確率を有し得ることが好ましい。
【００６６】
治療の方法
本発明は抗ＴＮＦα療法にも関する。治療するのに適した療法及び条件は前に論じる。本発明は特に、患者がどの程度特定の抗ＴＮＦα療法に応答する可能性が高いかを決定するための方法に関する。これらの方法は治療法の一部分として使用することができる。即ち、抗ＴＮＦα療法を用いた患者の治療法は、患者がその療法に応答する可能性が高いかどうかを決定するために、本明細書に記載する予測試験を実施する追加的ステップを含むことができる。
【００６７】
したがって本発明は、ＴＮＦα活性に関連する疾患又は状態を治療するための方法を提供する。例えば本発明は、炎症性又は自己免疫疾患を治療するための方法であって、（ａ）本明細書に記載する予測法を使用して、抗ＴＮＦα療法を用いた治療に応答する可能性が高いとして患者を同定するステップと、（ｂ）前記抗ＴＮＦα療法を用いて患者を治療するステップとを含む方法を提供する。このような方法において使用するのに適した疾患、患者、及び療法は本明細書に記載する通りである。
【００６８】
抗ＴＮＦα抗体などの本明細書に記載する抗ＴＮＦα療法は、本明細書に記載する予測法により抗ＴＮＦα療法を用いた治療に応答する可能性が高いとして同定した患者中の、炎症性又は自己免疫疾患などのＴＮＦα活性に関連する疾患又は状態の治療における使用にも提供する。例えば、抗ＴＮＦα抗体などの本明細書に記載する抗ＴＮＦα療法剤は、このような患者中の炎症性又は自己免疫疾患などの、ＴＮＦα活性に関連する疾患又は状態を治療するための医薬品の製造において使用することができる。再度、適切な療法、患者及び疾患は本明細書に記載する通りである。
【００６９】
療法の投与は「予防」又は「療法」目的のいずれかであってよい。本明細書で使用する用語「療法」又は「治療」は、以下の：疾患又は疾患に関連する症状（単数又は複数）の予防、疾患又は症状（単数又は複数）の発生又は進行の低減又は予防、既存の疾患又は症状（単数又は複数）の低減又は排除のいずれかを含む。
【００７０】
予防又は療法は、有効な抗ＴＮＦα応答の誘導及び／又はＴＮＦαから生じるか又はＴＮＦαに関連する症状及び／又は合併症の軽減、低減、治癒又は少なくとも部分的な阻止を含むが、これらだけには限られない。予防的に与えるとき、療法は典型的には任意の症状に先立って与える。療法の予防的投与は、後の症状又は疾患を予防又は改善するためである。療法的に与えるとき、療法は典型的には疾患の症状の発症時又は直後に与える。このような療法的投与は、典型的には、疾患の症状の進行を予防若しくは改善するため、又はこのような症状若しくは疾患の重度を低減させるためである。
【００７１】
抗ＴＮＦα療法の投与の特異的経路、用量及び方法は、医療従事者によって通常通り決定することができる。
【００７２】
例えば、インフリキシマブは商標名Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）で現在販売されている。典型的には２カ月間隔及びクリニック又は病院での、静脈内注入による投与用のＲｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）が販売されている。関節リウマチを治療するためのＲｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）の推奨用量は３ｍｇ／ｋｇ、次に初回注入後第２週及び第６週並びに次いでその後８週毎で追加的な類似の用量である。クローン病、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、乾癬又は潰瘍性大腸炎に関して、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）の推奨用量は類似の投与スケジュールで５ｍｇ／ｋｇである。
【００７３】
アダリムマブは商標名Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）で現在販売されている。いずれも典型的には在宅患者による皮下注射用の、予め充填した０．８ｍｌシリンジ中と予め充填したペンデバイス中の両方のＨｕｍｉｒａ（登録商標）が販売されている。本発明に従って、抗ＴＮＦα療法は任意の適切な経路によって、任意の適切な用量で、及び任意の適切な投与レジメで投与することができる。関節リウマチ、乾癬性関節炎又は強直性脊椎炎を有する成人患者に関するＨｕｍｉｒａ（登録商標）の推奨用量は、１週間おきに投与する４０ｍｇである。クローン病を有する成人患者に関する、推奨されるＨｕｍｉｒａ（登録商標）の用量レジメンは、第０週において最初に１６０ｍｇ（用量は１日に４回の注射として、又は２日間連続で１日当たり２回の注射として投与することができる）、第２週に８０ｍｇ、次に第４週で始めて１週間おきに４０ｍｇの維持用量である。
【００７４】
抗ＴＮＦα療法剤は、医薬組成物又はワクチン組成物又は免疫療法組成物だけには限られないがこれらなどの、組成物の一部として単独で利用して、ＴＮＦα活性に関連する状態を予防及び／又は治療することができる。
【００７５】
本明細書に記載する抗ＴＮＦα療法は、同じ患者を治療することを目的とする１つ又は複数の他の療法と組み合わせて使用することができる。組合せによって、療法を同時に、組合せ又は別の形で患者に投与することができることを意味する。療法は同じ療法レジメンの一部として別々又は連続的に患者に投与することができる。例えば、本明細書に記載する抗ＴＮＦα療法は、炎症性又は自己免疫疾患の治療を目的とする別の療法と組み合わせて使用することができる。他の療法は、炎症性又は自己免疫疾患を有する患者の状態の治療又は改善を目的とする一般的な療法であってよい。例えば、メトトレキセート、グルココルチコイド、サリチル酸塩、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛薬、他のＤＭＡＲＤ、アミノサリチル酸塩、コルチコステロイド、及び／又は免疫調節薬（例えば、６−メルカプトプリン及びアザチオプリン）を用いた治療を抗ＴＮＦα療法と組み合わせることができる。例えば、インフリキシマブは一般に、関節リウマチの治療においてメトトレキセートと組み合わせて使用される。
【００７６】
他の療法は、患者が罹患する特定の疾患又は状態を対象とする、又はこのような疾患又は状態の特定の症状を対象とする、特異的治療であってよい。例えば、患者が関節リウマチを有する場合、本明細書に記載する治療は、抗ＴＮＦα療法を用いた治療、及び関節リウマチの症状の治療、予防又は低減を具体的に目的とするさらなる療法を用いた治療も含むことができる。
【００７７】
キット
本発明は、容器中のキットの形にパッケージされた、本発明の予測法中で使用するのに適した、本明細書に記載する構成要素の組合せにも関する。このようなキットは一連の構成要素を含み、本発明の方法を可能にすることができる。例えばキットは、抗ＴＮＦα抗体などの抗ＴＮＦα療法剤、及びサンプル中の制御性Ｔ細胞の存在又は活性を検出する手段を含むことができる。キットは他の適切な試薬（単数又は複数）、対照（単数又は複数）、又は説明書などを場合によっては含有し、本発明の方法を実施するのを可能にすることができる。このようなキットは、患者からサンプルを得るための手段も含むことができる。
【実施例】
【００７８】
（例１）
ｉｎ  ｖｉｖｏ法
材料及び方法
調査対象集団。
ＲＡに関するＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙの改訂分類基準を満たす、活動性関節リウマチ（ＲＡ）を有する２７人の患者を、抗ＴＮＦα療法（インフリキシマブを第０週、第２週、第６週に３ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内に、次いで８週毎に安定用量のメトトレキセート７．５〜１５ｍｇ／週と組み合わせて経口投与する）及び安定非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）の前後で評価した。プレドニゾロンを与えた患者は調査対象から除外したが、これは、ステロイドが、リンパ球機能及びＣＤ２５発現に影響を与えることが知られているからである。５．１を超える疾患活動性スコア（ＤＡＳ）を有する患者のみを、抗ＴＮＦα療法で治療した。応答は１．２を超えるＤＡＳの低下として定義した。従来用量のメトトレキセート（１５〜２５ｍｇ／週）に応答していた患者も、この調査対象に含めた。
【００７９】
抗体。
以下の抗体を使用した：ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ４（ＲＰＡＴ４）、サイクローム結合抗ＣＤ２５（Ｍ−Ａ２５１）；
【００８０】
細胞の単離。
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）の勾配遠心分離によって単離した。９６ウエルＵ底プレート（Ｎｕｎｃ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）内の、２ｎＭのＬ−グルタミン、５ｍＭのＨＥＰＥＳ、及び１００Ｕ／μｇ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、０．５ｍＭのピルビン酸ナトリウム、０．０５ｍＭの非必須アミノ酸（いずれもＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤから）、及び１０％のＦＣＳ（いずれもＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤから）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で細胞を培養した。非ＣＤ４＋Ｔ細胞はビオチン抗体カクテル（ｌ０μｌ／１０７個の合計細胞）を使用して染色し、４℃で１０分間インキュベートし、次いで抗ビオチンマイクロビーズ（２０μｌ／１０７個の合計細胞）で磁気標識し、４℃で１５分間インキュベートし、２回洗浄し、ＭＡＣＳ  ＬＤカラムで枯渇させた。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞は抗ＣＤ２５マイクロビーズ（ｌ０μｌ／１０７個のＣＤ４＋細胞）で直接標識し、４℃で１５分間インキュベートし、製造者の説明書（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）に従ってＭＡＣＳ  ＭＳカラムを使用して陽性選択した。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞のＴ細胞亜集団は単離直後に使用した。全てのプレート結合抗ＣＤ３培養物に１×１０４個の照射ＰＢＭＣを与えた。
【００８１】
統計分析。
統計上有意な差異に関する全ての分析はスチューデントのｔ検定で実施した。０．０５より小さいＰ値を有意であると考えた。
【００８２】
結果
ＣＤ４＋ＣＤ２５highＴ細胞の頻度は、治療前の同じ患者と比較して抗ＴＮＦα応答患者中で高い。
制御性Ｔ細胞の数を、治療の前後でＲＡを有する患者においてモニターした。ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＤ２５high／lowの発現を、ＦＡＣＳ分析を使用して治療の最初の３カ月間の間に、４人の応答患者及び４人の非応答患者において最初に調べた。ＣＤ４＋ＣＤ２５highＴ細胞の割合が抗ＴＮＦα療法に応答した患者中で経時的に増大した一方で、４人の非応答患者中ではＣＤ４＋ＣＤ２５highＴ細胞の割合は変化しなかった。この集団の割合はインフリキシマブの初回注入後６週間、４人の応答患者の３人において上昇し続け、治療の３カ月後安定状態であった。メトトレキセート療法に応答する患者を含めた、より大きな患者のコホートにおける後の分析は、ＣＤ４＋ＣＤ２５high or lowＴ細胞両方の割合は、活動性ＲＡを有する患者、メトトレキセート治療患者、及び健常対照中で測定したレベルと比較して抗ＴＮＦα応答患者中で有意に増大したことを明らかにした。活動性ＲＡ患者は、ＣＤ４＋ＣＤ２５lowＴ細胞の増大した割合も示した。
【００８３】
メトトレキセート治療した個体は、治療に対するそれらの応答に関して応答性抗ＴＮＦα治療患者と合致した。制御性Ｔ細胞の数の低減は、健常個体と比較して活動性ＲＡを有する患者中では測定しなかった。健常対照と比較して抗ＴＮＦα療法に応答しなかったＲＡを有する患者中では、ＣＤ４＋ＣＤ２５high／low発現の差異は検出しなかった。ＣＲＰ、リウマチ性疾患活動性の指標とＣＤ４＋ＣＤ２５highＴ細胞（ただしＣＤ４＋ＣＤ２５lowではない）の割合の間の有意な相関関係によって、抗ＴＮＦα療法に対する応答とこの細胞集団中の増殖の間の関係を確認した。治療前と抗ＴＮＦα治療後３カ月で、ＰＢＭＣ中のＣＤ４＋Ｔ細胞の絶対数の有意な変化はなかった。
【００８４】
（例２）
ＲＡ患者中のＴｒｅｇ
材料及び方法
患者集団。
ＲＡに関するＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙの改訂分類基準を満たす、活動性ＲＡを有する３１人の患者を、抗ＴＮＦα療法の前及びその４〜６カ月後に評価した。２０人の健常個体を対照として使用した。この調査対象はＵＣＬＨ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。
【００８５】
抗体。
以下の抗体を使用した：ＦＩＴＣ抗ＣＤ４（ＲＰＡ−Ｔ４）、ＰＥ−Ｃｙ５抗ＣＤ２５（Ｍ−Ａ２５１）、ＰＥ抗ＣＤ６２Ｌ（Ｄｒｅｇ−５６）、ＰＥ−ＣＹ７抗ＴＮＦ−α（Ｍａｂ１１）、ＰＥ−Ｃｙ７抗ＩＦＮ−γ（４５．Ｂ３）、ＰＥ−ＦｏｘＰ３（ＰＣＨ−１０１）、ＡＰＣ抗ＣＣＲ７（３Ｄ１２）、ＰＥ抗ＣＤ４５ＲＯ（ＵＣＬＨ１）。Ｔ細胞は示したように可溶性抗ＣＤ３（ＨＩＴ−３ａ）及び抗ＣＤ２８（ＣＤ２８．２）で活性化した。全ての抗体は（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからのＦｏｘＰ３以外は）ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅからであった。中和実験用に、抗ＴＧＦ−β１（９０１６．２）及び抗ヒトＩＬ−１０（２５２０９）を使用した（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）。インフリキシマブ、キメラＩｇＧＩ抗ＴＮＦαモノクローナル抗体は、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈによって寄贈された。
【００８６】
細胞の単離。
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって単離し、１００Ｕ／μｇ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び１０％のＦＣＳ（Ｓｅｒａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｌｔｄ）を含むＲＰＭＩ１６４０中で培養した。磁気ビーズの分離は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨから購入した全ての磁気カラム及び磁気標識ビーズを用いて実施した。ＦＡＣＳ選別（Ｍｏｆｌｏ）を使用して細胞を精製するために、前述の結合抗体（ＣＤ４、ＣＤ２５及びＣＤ６２Ｌ）を用いて細胞を染色した。補足図１中に示すようにゲートに従って細胞を選別した。
【００８７】
フローサイトメトリー分析及びサイトカイン検出。
前述の結合抗体（ＣＤ４、ＣＤ２５及びＣＤ６２Ｌ）を使用して、前に記載したように（１１）細胞を表面染色した。ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γ産生の細胞内分析のために、細胞は２×１０５で４８時間ＰＭＡと共に培養し、イオノマイシン及びゴルジプラグを培養の最後の５時間内に加えた。ＴＧＦ−β１はＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して定量化した。幾つかの実験では、０．４μｍの薄膜支持体を有する２４ウエルのトランスウエルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）を使用した。
【００８８】
増殖アッセイ。
全ての実験中で、制御性Ｔ細胞は２×１０５細胞／ｍｌで培養し、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞の数は比に関する実験に応じて調節した。細胞は９６ウエルＵ底プレート（Ｎｕｎｃ）中で５日間培養し、培養の最後の１８時間内に３Ｈ−チミジンを加えた。増殖は液体シンチレーションカウンターを使用して測定した。
【００８９】
統計分析。
統計的有意はスチューデントのｔ検定を使用して決定し、０．０５より小さいＰ値は統計上有意であるとみなした。
【００９０】
結果及び考察
インフリキシマブ治療患者由来のＴｒｅｇの増殖集団はＦｏｘｐ３＋及びＣＤ６２Ｌ−である
健常、活動性ＲＡ及びインフリキシマブ後患者から単離した末梢ＣＤ４＋Ｔ細胞を、細胞内染色によって転写因子Ｆｏｘｐ３の発現に関して分析した。活動性ＲＡ患者又は健常個体と比較して、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋細胞の割合の２〜３倍の増大をインフリキシマブ後患者のＰＢＭＣにおいて観察し、抗ＴＮＦα治療後患者中でのＣＤ２５発現の増大は、Ｔｒｅｇ数の増大を反映することを示唆した。健常対照と比較して、活動性ＲＡ患者由来のＣＤ４＋Ｔ細胞中でのＦｏｘＰ３発現の有意な差異はなかった。インフリキシマブ後のＴｒｅｇの表現型をさらによく特徴付けるために、本発明者らは、活性化、記憶及び調節の代表的な表面マーカーを測定した。ＣＤ４＋ＣＤ２５高ＣＤ６２−の割合の有意な増大を、インフリキシマブ前に活動性疾患を有していたＲＡ患者及び健常個体と比較して、インフリキシマブ患者由来のＰＢＭＣにおいて観察した。
【００９１】
本発明者らは、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋集団中のＣＤ６２Ｌの発現を次にアッセイした。健常個体及び活動性ＲＡを有する患者由来の大部分のＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋細胞がＣＤ６２Ｌを発現した一方で、発現のプロフィールはインフリキシマブ治療後に著しく異なり、この場合大部分のＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋細胞が低レベルのＣＤ６２Ｌを発現した。メトトレキセートに応答していた患者中で、Ｆｏｘｐ３＋細胞の割合の変化又はＣＤ６２Ｌ発現のシフトはなかった。健常個体及び活動性疾患、ＲＡを有する患者中で見られたＴｒｅｇと比較して、インフリキシマブ後ＴｒｅｇはＣＤ４５ＲＯを発現したが、ＣＣＲ７の発現が低減した。インフリキシマブ後のＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ６２Ｌ−ＲＡＴｒｅｇのさらなる調査は、これらの細胞はＣＣＲ７の発現を欠いておりＣＤ４５ＲＯ＋状態であったことを明らかにした。
【００９２】
インフリキシマブ治療ＲＡ患者由来のＣＤ６２Ｌ−ＴｒｅｇはＴＧＦβ及びＩＬ−１０を介してそれらの抑制作用を媒介する。
ＣＤ４＋ＣＤ２５highをＣＤ６２Ｌ＋及びＣＤ６２Ｌ−Ｔｒｅｇとして同定したＣＤ６２Ｌのそれらの発現に従ってＦＡＣＳ選別し、且つそれらの制御能力を、自己ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞による増殖の阻害、ＴＮＦα及びＩＦＮγ産生に関して評価した。健常個体から単離したＣＤ６２Ｌ＋Ｔｒｅｇは、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖を抑制する際にＣＤ６２Ｌ−Ｔｒｅｇより強力であった。逆に、インフリキシマブ後のＲＡ患者から単離したＣＤ６２Ｌ−Ｔｒｅｇは、それらのＣＤ６２Ｌ＋Ｔｒｅｇ対応物より、Ｔ細胞増殖のより強力な抑制を示した。同様に、本発明者らは、ＩＦＮγ及びＴＮＦα産生の阻害に関する、サプレッサー集団中での健常個体のＣＤ６２Ｌ＋Ｔｒｅｇからインフリキシマブ後患者のＣＤ６２Ｌ−Ｔｒｅｇへの「転換」を観察した。健常個体と比較して、活動性ＲＡを有する患者から単離したＣＤ６２Ｌ＋Ｔｒｅｇのサプレッサー能力の有意な低減があり、ＣＤ４＋ＣＤ２５highＴｒｅｇがＲＡ患者中で欠損していることを確認した。重要なことに、抗ＴＮＦα療法後のＣＤ６２Ｌ＋Ｔｒｅｇの能力は、健常個体中で見られたレベルには戻らなかった。
【００９３】
適応Ｔｒｅｇの抑制機構に関連する制御性サイトカインとして以前に認識されたＴＧＦβ及びＩＬ−１０に対する中和モノクローナル抗体の存在下で、自己ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞とＴｒｅｇを同時培養した。健常個体中では、ＣＤ６２Ｌ−Ｔｒｅｇの抑制効果は、ＴＧＦβ又はＩＬ−１０の中和によって不変であった。対照的に、ＴＧＦβ、及びある程度のＩＬ−１０の中和は、インフリキシマブ治療後患者由来のＣＤ６２Ｌ−Ｔｒｅｇの制御能力を著しく損ねた。ＴＧＦβとＩＬ−１０の両方の作用を遮断すると、これらのＣＤ６２Ｌ−Ｔｒｅｇの抑制作用はほぼ無効であった。健常個体由来のＣＤ６２Ｌ＋Ｔｒｅｇの能力は、ＩＬ−１０又はＴＧＦβの遮断によって不変であった。
【００９４】
本発明者らは、インフリキシマブ療法後のＲＡ患者から単離した精製ＣＤ６２Ｌ−Ｔｒｅｇの機能性をアッセイして、それらの作用形態を細かく調べた。ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞によるＴＮＦα及びＩＦＮγ産生の最大の抑制を実施するために細胞接触が必要とされたが、細胞接触が妨げられるとき、ある程度のサイトカイン抑制を依然として観察する。インフリキシマブ後患者から単離したＴｒｅｇが細胞接触とサイトカインの両方をそれらの抑制効果に必要とした事実は、優勢型のＴＧＦβが膜と結合するとき、ＴＧＦβは細胞接触を介して抑制を媒介することができることを示す、データによって説明することができる可能性がある。さらに、幾つかの実験系では、ＩＬ−１０産生はＴｒｅｇとＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞の間の細胞接触にも依存する。集合的にこれらの結果は、インフリキシマブ療法は、健常個体中又は活動性ＲＡを有する患者中に存在する天然Ｔｒｅｇと、表現型及び機能が異なる末梢Ｔｒｅｇ集団をもたらす、又は動員することを示唆する。
【００９５】
ＲＡ患者由来のＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでのインフリキシマブ刺激は、ＣＤ６２Ｌ−Ｔｒｅｇ集団を誘導した。
活動性ＲＡ又は健常個体から単離したＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞にインフリキシマブをｉｎ  ｖｉｔｒｏで加え、且つＦｏｘｐ３の発現は細胞内染色によって測定した。精製した活動性ＲＡＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞へのインフリキシマブの添加は、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋細胞の割合の実質的増大をもたらしたが、一方健常個体からＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞を単離したとき、このような影響は全く見られなかった。この培養系におけるＴＧＦβの中和は、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞由来のＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞集団の分化を完全に妨げた。さらにインフリキシマブは、健常個体ではなく、活動性ＲＡを有する患者由来のＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞からのＴＧＦβ産生の有意な増大を誘導した。インフリキシマブが天然ＴｒｅｇＦｏｘｐ３の発現を調節するかどうかを決定するために、ＣＤ４＋ＣＤ２５highＴ細胞を健常個体又は活動性ＲＡを有する患者から単離し、インフリキシマブと共に培養した。これらの結果は、インフリキシマブがＣＤ４＋ＣＤ２５highＴｒｅｇにおけるＦｏｘＰ３の発現に影響を与えなかったことを示し、この作用物質は既存のＴｒｅｇを調節するのではなく、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞を標的にする証拠を支持した。次に本発明者らは、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞とインフリキシマブの培養後のＣＤ６２Ｌ発現を測定した。健常個体由来ではなく、活動性ＲＡ患者由来のＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞へのインフリキシマブの添加は、ＣＤ６２Ｌ発現の低減をもたらした。したがって、これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏインフリキシマブ生成Ｔ細胞は、インフリキシマブ療法を施したＲＡ患者のＰＢＭＣ中に存在するＴｒｅｇとの共通の特徴として、低減したＣＤ６２Ｌ発現を共有する。
【００９６】
本発明者らは、インフリキシマブ刺激によって分化したＦｏｘｐ３＋Ｔ細胞が、サプレッサー活性を有することを確認しようと試みた。大部分の精製ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞は、抗ＣＤ３／ＣＤ２８、インフリキシマブ有り又はなしで刺激するとＣＤ２５発現が得られたので、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞を精製し、新たに単離した自己ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞と共に培養した。インフリキシマブと同時培養した、健常個体ではなく、活動性ＲＡ患者由来のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞のみが、新たに単離したＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞からのＩＦＮγ及びＴＮＦαの産生を抑制することができた。
【００９７】
これらのデータは、ＣＤ４＋ＣＤ２５highＣＤ６２Ｌ＋として定義する天然由来のＴｒｅｇは、抗ＴＮＦα療法での治療後に依然として欠損しているように思われることを示唆する。インフリキシマブ療法後のＣＤ４＋ＣＤ２５high集団の機能の回復は、新たに分化したＣＤ６２Ｌ−Ｔｒｅｇの抑制効果に原因がある可能性が最も高い。
【００９８】
（例３）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ予測法
患者の選択
Ｂｌｏｏｍｓｂｕｒｙ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  ＵｎｉｔのＮｅｗ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  Ｃｌｉｎｉｃで（インフリキシマブ及びエタネルセプトを含む）抗ＴＮＦα療法を始めようとしている、関節リウマチ（ＲＡ）を有する５０人の患者を試験に動員する。試験するＲＡ患者は、生物学的療法の導入に関するＢｒｉｔｉｓｈ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ（ＢＳＲ）の適格基準、及び５．１を超える疾患活動性スコア（ＤＡＳ）、抗環状シトルリン化ペプチド（ＣＣＰ）及び／又はリウマチ因子（ＲＦ）に関して血清反応陽性を満たす。ＲＡ患者における療法に対する応答はＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｌｅａｇｕｅ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍによって確立された基準を使用して定義し、３〜５カ月で２回測定した（ＤＡＳも応答を評価するための連続型変数として使用する）。ＣＲＰの変化も記録する。療法前、次いで療法後第２、第８週及び第４カ月で血液サンプルを採取する（血液は個々の患者から４回を越えずに採取する）。
【００９９】
乾癬性関節炎（末梢関節疾患のみ）を有する患者の群も試験する。療法に対するそれらの疾患活動性及び応答を、ＢＳＲ（Ｋｙｌｅら（２００５）  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  ４４：３９０〜３９７ページ）によって勧められたように評価する。
【０１００】
対照は、メトトレキセート（ＭＴＸ）治療前後のＲＡを有する３０人の患者、及び３０人の健常ボランティアを含む。患者は非ステロイド系抗炎症薬を継続して服用する。プレドニゾロンを与えた患者は調査対象から除外するが、これは、ステロイドが、リンパ球機能及びＣＤ２５発現に影響を与えることが知られているからである。患者及び健常個体は年齢及び性別を適合させる。
【０１０１】
静脈血（５０〜８０ｍｌ）を、療法を開始する前に患者から、抗凝固剤としてのＥＤＴＡに回収する。その後患者から、注入又は通常のフォローアップのいずれかのために、クリニックに出向いた際に血液を採取した。患者からは試験用に４回を超えて血液を採取しない。本発明者らは、細胞の１回の凍結／解凍サイクルが制御性又はレスポンダーＴ細胞の機能を害することはないことを、以前に決定している。承諾は全個人から得ている。倫理的承認はＵＣＬＨ倫理委員会から得ている。療法に対する患者の応答を評価し血液サンプルを採取し、それによってプロジェクトを大幅に容易にする、Ｎｅｗ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  Ｃｌｉｎｉｃに所属する２人の専門看護師が存在する。
【０１０２】
１．ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのインフリキシマブ又はアダリムマブによる制御性Ｔ細胞の誘導が臨床応答に関連するか、より重要なことにはＲＡ患者中の応答を予測することができるかどうかの確定。
レスポンダーＣＤ４＋Ｔ細胞を、インフリキシマブ又はアダリムマブ療法の開始前に活動性疾患を有するＲＡ患者から、ＦＡＣＳ選別（ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ１２７＋）によって単離する。レスポンダーＴ細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて１０μｇ／ｍｌのインフリキシマブ又はアダリムマブ有り又はなしで一晩活性化させ（２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３／ＣＤ２８）、且つＦｏｘｐ３の誘導はＦＡＣＳによってアッセイする（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。Ｔｒｅｇのｉｎ  ｖｉｔｒｏ誘導の程度は、第３カ月でのインフリキシマブ療法に対する同じ患者の臨床応答と相関関係がある。応答は次の注入前の８週後にも確認する。このｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおけるＴｒｅｇ数の増大は、療法に対する臨床応答を予測するはずである。
【０１０３】
ＰＢＭＣ中のｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋細胞の数をインフリキシマブ療法後に評価して、Ｔｒｅｇのｉｎ  ｖｉｖｏ誘導とｉｎ  ｖｉｔｒｏの誘導の間の相関関係を決定する。
【０１０４】
インフリキシマブ又はアダリムマブを用いた療法の前後（第６週、第３カ月及び第６カ月）に、ＲＡを有する患者からＰＢＭＣを単離した。ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋細胞の数はＦＡＣＳ染色によって測定した。治療に応答していた患者中のＦｏｘｐ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の数を、前治療、健常、及び非応答患者中で検出した数と比較した（図１参照）。図１中の結果は、インフリキシマブ又はアダリムマブの治療３カ月後の、関節リウマチを有する患者の末梢血中の（ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋として同定した）制御性Ｔ細胞の数を示す。インフリキシマブとアダリムマブの両方が、療法に応答する患者中での制御性Ｔ細胞の数の増大をもたらした。療法に応答した患者のみを図１中に示す。これは、インフリキシマブ又はアダリムマブで治療したＲＡ患者の血液中の制御性Ｔ細胞の刺激は、これらの患者が療法に応答するかしないかの予測指標であることを示す。
【０１０５】
本発明者らは、レスポンダーＴ細胞集団中のＦｏｘｐ３の誘導は、機能アッセイにより評価して制御性細胞の数の増大と相関関係があることを示している。Ｆｏｘｐ３に対する代替として、ＣＤ２５及びＣＤ１２７も使用してＴｒｅｇの数を数える。Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の制御性も、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養中に発生する結果として生じるＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７−Ｔ細胞を精製すること、及び新たに単離したレスポンダー（ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ１２７＋）Ｔ細胞によるＴＮＦα及びＩＦＮγの産生（細胞内サイトカイン産生によりアッセイ）及び増殖（ＣＦＳＥによりアッセイ）を抑制するそれらの能力を試験することによって評価する。９０％の強度、及び５％の有意性水準を使用して、この試験に必要とされる数を推定するために施した想定は、陽性試験（５％を超えるＴｒｅｇの増大）で細胞の９０％が治療に対するレスポンダーとなり、陰性試験で３０％が治療に対するレスポンダーとなるということである。
【０１０６】
２．ＲＡ患者中でのＴｒｅｇの誘導がｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏでエタネルセプトを用いても起こるかどうかの決定。
ＲＡ患者中でのＴｒｅｇの機能を治療の前後に評価して、エタネルセプト治療後にＴ細胞機能を抑制するＴｒｅｇの能力が変わるかどうか決定する。具体的には、この実験は、ＲＡ患者中でのＴｒｅｇ機能の欠損、即ち炎症促進性サイトカイン産生の抑制の不能が、エタネルセプト療法後に回復するかどうかを扱う。
【０１０７】
エタネルセプトを用いた療法の前後（第６週、第３カ月及び第６カ月）に、ＲＡを有する患者からＰＢＭＣを単離した。ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋細胞の数はＦＡＣＳ染色によって測定した。治療に応答していた患者中のＦｏｘｐ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の数を、前治療、健常、及び非応答患者中で検出した数と比較した。
【０１０８】
エタネルセプトを用いた３カ月の治療後の、関節リウマチを有する患者の末梢血中の（ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋として同定した）制御性Ｔ細胞の数を分析した。図１は、これらのサンプル由来のＰＢＭＣ中のこのような制御性Ｔ細胞の割合を示す。エタネルセプト治療群に関する応答する患者のみを示す。図１は、患者がインフリキシマブ又はアダリムマブを用いた治療と臨床的に同程度応答したにもかかわらず、エタネルセプト治療は制御性Ｔ細胞の数の変化をもたらさなかったことを示す。これは、エタネルセプトが、インフリキシマブ及びアダリムマブと比較して異なる作用機構を有する可能性があることを暗示する。これは、制御性Ｔ細胞の数又は活性の評価は、エタネルセプトを用いた治療に対する患者の考えられる応答性に適したマーカーではない可能性があることも暗示する。
【０１０９】
乾癬性関節炎を有する患者由来のＴｒｅｇの数に対するエタネルセプトの影響も評価する。
【０１１０】
本発明者らは、インフリキシマブによって誘導したＴｒｅｇは、それらが天然Ｔｒｅｇと比較してＣＤ６２Ｌ及びＣＣＲ７の低減した発現を有する点で表現型が異なることを示している。ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２５、ＣＤ１２７を含めた幾つかの関連マーカーを使用してエタネルセプト前後のＲＡ患者中のＴｒｅｇをさらに特徴付ける。
【０１１１】
エタネルセプト療法前後の、炎症促進性サイトカイン産生及びレスポンダーＴ細胞による増殖を抑制するＲＡ患者から単離したＴｒｅｇの能力を評価する。様々な細胞集団をＦＡＣＳにより選別する（Ａｒｉａ、ＢＤ）。ＦＡＣＳ選別によるＴｒｅｇの量及び純度を最大にするために、ＣＤ２５及びＣＤ１２７を対象とする抗体を使用する。したがって、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７−Ｔｒｅｇ、又はＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ１２７＋レスポンダーＴ細胞、又は混合物（１：１；１：３同時培養物）を抗ＣＤ３／ＣＤ２８で刺激し、チミジンの取り込み及びＣＦＳＥによって増殖をモニターする。サイトカイン産生（ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＴＧＦβ、ＩＬ−１０）は、これらのＴｒｅｇ抑制アッセイにおいて細胞内サイトカイン産生及び／又はＥＬＩＳＡ／ＣＢＡによって測定する。
【０１１２】
この実験は、遮断抗体を使用して、エタネルセプト療法後に存在するＴｒｅｇの阻害効果が細胞接触（トランスウエル膜を使用）に依存するか、又はＴＧＦβ若しくはＩＬ−１０などの阻害性サイトカインの影響によるかどうかを調べる。近年の関心が重要な炎症促進性サイトカインとしてのＩＬ−１７に集中しているので、Ｔｒｅｇが存在する阻害アッセイにおいても、ＲＡ患者由来のレスポンダーＴ細胞によるこのサイトカインの産生をさらに測定する。適切な場合、これらの実験の結果は、健常個体及びインフリキシマブを用いて治療したＲＡ患者で得た結果と比較する。
【０１１３】
これらの実験は、エタネルセプトがｉｎ  ｖｉｔｒｏでレスポンダーＴ細胞からのＴｒｅｇの生成を誘導することができるかどうかも調べる。ＲＡを有する患者及び健常対照由来のレスポンダー（ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ１２７＋）Ｔ細胞はＦＡＣＳ選別によって精製し、インフリキシマブに関して前に記載したようにｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴｒｅｇを誘導するエタネルセプトの能力を評価する。
【０１１４】
エタネルセプトの様々な濃度及び異なる活性化条件（±ＩＬ−２、抗ＣＤ３）を使用する。Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇを誘導する場合、それらを精製し、自己レスポンダーＴ細胞を用いた抑制アッセイにおいてそれらの表現型及び抑制能力を評価する。これらの結果は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのエタネルセプト療法後のＴｒｅｇの試験から収集した情報と比較する。次のステップは、遮断抗体を使用すること、及びＥＬＩＳＡ及び表面染色によりＴＧＦβの産生をアッセイすることによって、（インフリキシマブに関して示したように）ＴＧＦβがこの影響に重要であるかどうか決定することを含む。ＦＡＣＳ選別によるそれらの単離後の、天然Ｔｒｅｇに対するエタネルセプトの影響（Ｆｏｘｐ３発現）も評価する。
【０１１５】
これらの実験は、エタネルセプトと比較してインフリキシマブの作用機構を差別化するのに光明を投じ、それらの分化効率に関する説明及びそれらの異なる治療的使用に関する理論的根拠を与えた。インフリキシマブ療法によるＴｒｅｇの誘導は、ＲＡにおける耐性の回復を特異的にもたらすことができる。したがって本発明者らは、インフリキシマブは初期ＲＡを有する患者に与えた場合、疾患の寛解をもたらすことができる一方で、エタネルセプトはこのような影響を有し得ないと予想することが可能である。
【０１１６】
３．インフリキシマブ療法後に、活動性乾癬性関節炎を有する患者が欠損Ｔｒｅｇを有し、末梢血Ｔｒｅｇの数が増大するかどうかの決定。
前に記載したように標準的なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを使用して、乾癬性関節炎を有する患者におけるＴｒｅｇの機能を測定して、任意の機能障害を決定する。乾癬を有する患者由来のＴｒｅｇが欠損し、乾癬性関節炎を有する患者由来のＴｒｅｇもこの異常を示す可能性が高いことが報告されている。インフリキシマブ療法によるＴｒｅｇの誘導は、３カ月の治療後のＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞の数を数えることによって試験する。平行して、ＲＡ患者由来のレスポンダーＴ細胞に関して確定したのと同様に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのレスポンダーＴ細胞におけるインフリキシマブによるＦｏｘｐ３発現の誘導、及び任意のこのような誘導Ｔｒｅｇのサプレッサー活性も評価する。
【０１１７】
４．インフリキシマブによるＴｒｅｇの誘導の根底にある機構の検索。
実験の次のセットは前項中で得た結果によって導く。予備データは、Ｔｒｅｇの誘導はインフリキシマブ療法に応答するＲＡ患者に特異的であることを示す。本発明者らは、インフリキシマブによるＴｒｅｇの誘導に影響を与える重要な識別要因はＴＧＦβの産生であることを提唱する。これはＦｏｘｐ３誘導の代用指標として働くことができ、インフリキシマブに対する臨床応答を予測するためのより簡単な試験を示すことができる。
【０１１８】
本発明者らは、インフリキシマブによるＴｒｅｇの誘導は、ＴＧＦβ、Ｔｒｅｇの誘導に関与することが知られている制御性サイトカインに依存することを既に示している。この実験は、ＦＡＣＳによって、健常対照、ＲＡ患者及び乾癬性関節炎を有する患者由来の（ｅｘ  ｖｉｖｏ又は抗ＣＤ３／ＣＤ２８で一晩活性化した）レスポンダー、ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ１２７＋、Ｔ細胞におけるＴＧＦβ潜伏関連ペプチド（ＬＡＰ）の発現を決定する。異なる患者群由来のレスポンダーＴ細胞からＴｒｅｇを誘導するインフリキシマブの能力を比較することによって、レスポンダーＴ細胞におけるＴＧＦβ（ＬＡＰ）の発現とＴｒｅｇの誘導の間の相関関係を関連付ける。ＴＧＦβの産生もＥＬＩＳＡによって測定する。対立仮説として、その発現ではなくＴＧＦβに対する分化応答性が、Ｆｏｘｐ３の誘導に影響を与えると考えられる。したがって、異なる患者群中のレスポンダーＴ細胞におけるＴＧＦβのシグナル伝達の結果を洞察するために、ＴＧＦβＲの発現をＦＡＣＳによりアッセイし、Ｓｍａｄシグナル伝達カスケードの活性化はウエスタンブロッティングによりアッセイする。後者はＳｍａｄ２及び３のリン酸化に焦点を当てる。ＴＧＦαは、ＴＧＦβＲＩＩ発現及び下流シグナル伝達に対する影響によって、ＴＧＦβ介在性シグナル伝達に干渉することも知られている。（異なる患者群由来の）レスポンダーＴ細胞単独における、これらのシグナル伝達タンパク質の誘導を、この経路を標的にするＴＧＦβ遮断抗体を使用して、インフリキシマブの添加有り又はなしで評価する。さらに、ＴＧＦβをレスポンダーＴ細胞に加えて、異なる患者群由来のレスポンダーＴ細胞におけるＦｏｘｐ３発現を誘導する、このサイトカインの能力を確定する。
【０１１９】
ＣＴＬＡ−４とＩＬ−２はどちらも、レスポンダー（ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ１２７＋）Ｔ細胞からのＴｒｅｇのＴＧＦβ依存性誘導に必要とされる（３０〜３２）。したがって、異なる患者群（ＲＡレスポンダー、非レスポンダー、乾癬性関節炎レスポンダー）由来のレスポンダーＴ細胞の活性化中、ＦＡＣＳによりＣＴＬＡ−４発現、及びＦＡＣＳ（細胞内染色）及び／又はＥＬＩＳＡによりＩＬ−２産生を、培養中に存在するインフリキシマブ有り又はなしで評価する。これらの発見は、インフリキシマブ療法前後のＲＡ患者由来のＴｒｅｇにおけるＣＴＬＡ−４発現と相関関係がある。ＴＧＦβはレスポンダーＴ細胞におけるＣＤ８０発現を上方制御することが示されているので（３２）、活性化レスポンダーＴ細胞におけるＣＤ８０発現もこの実験中に評価する。
【０１２０】
インフリキシマブのＴｒｅｇ誘導とＴＧＦβの間の関係を確定したので、本発明者らは次に、ＲＡの状況で炎症促進性Ｔｈ１７細胞と対照的なＴｒｅｇの生成におけるＴＧＦβ応答の柔軟性に対処する。ＩＬ−２、ＴＧＦβ、及びＩＬ−６を含めた幾つかの因子がＴｈ１７の分化を制御するようである（３３〜３５）。本発明者らは、インフリキシマブは、ＴＮＦαとＩＬ−６の両方を下方制御することによって、制御性の表現型に対する炎症性Ｔｈ１７応答を誘導すると仮定する。本発明者らは、ＲＡを有する患者由来のＴｒｅｇとレスポンダーＴ細胞の同時培養においてＩＬ−１７が産生される予備的証拠を有する。これらの同時培養物は抗ＣＤ３／ＣＤ２８で、ただし単球の不在下において刺激した。同時培養中のＩＬ−１７の生成に必要とされる条件の全体像を得るために、活動性ＲＡを有する患者から単離したレスポンダーＴ細胞及びＴｒｅｇ（別々又はレスポンダーＴ細胞／Ｔｒｅｇの組合せ）によるＴＧＦβ、ＩＬ−６、ＩＬ−２、ＴＮＦα及びＩＬ−１７の産生を、健常個体及びインフリキシマブで治療したＲＡを有する患者と比較する。サイトカインの産生はＥＬＩＳＡ及び／又は細胞内染色によって測定する。ＩＬ−１７産生に対するＩＬ−６、ＴＮＦα、ＴＧＦβ、及びＩＬ−２の個々の貢献を、適切な遮断抗体を使用して評価する。Ｔ細胞増殖の抑制及びＴＮＦα／ＩＦＮγの産生も決定する。これらの培養物中のＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞の数を測定する。したがって、レスポンダーＴ細胞を単独でインキュベートする場合、これらの実験はインフリキシマブによるＴｒｅｇのｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖を模倣し、例えばＩＬ−６阻害も、インフリキシマブと同様の方法でＦｏｘｐ３＋ＣＤ６２Ｌ−Ｔｒｅｇの生成を誘導するかどうか試験する。少なくともマウスでは、炎症性環境中でのＴｒｅｇとレスポンダーＴ細胞の同時培養は、Ｔｈ１７細胞の形成を促進することは明らかである。したがってこの実験は、健常個体と対照的な活動性ＲＡを有する患者由来のＴｒｅｇの能力を試験して、同時培養実験中のＩＬ−１７の産生をサポートする。これらの結果は、Ｔｈ１７産生に対する、ＴＧＦβ及びＩＬ−１０を介してＴｈ１応答を抑制するインフリキシマブ後患者由来のＴｒｅｇの影響と比較する。ＩＬ−１０とＴＧＦβの一緒の組合せはＴｈ１７の分化を抑制することができ、又は、近年明らかになったように、これらの影響はＩＬ−２によって調節することが可能であった。実際、インフリキシマブは、刺激型レスポンダーＴ細胞によるＩＬ−２産生を増大させることが知られている。
【０１２１】
５．抗ＴＮＦα治療後に制御性Ｔ細胞の数が二次リンパ器官中で変わるかどうかの確定。
本発明者らは、ＲＡにおける本発明者らのデータと同様に、抗ＴＮＦαを用いた治療後のコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）を有するマウス中でのＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ数の増大を示している。以前に記載されたような（Ｆｅｌｄｍａｎｎら、（１９９６）Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４：３９７〜４４０ページ）完全フロイントアジュバンド（ＣＦＡ）に溶かしたＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ）で免疫感作したＤＢＡ／１マウスを使用して、Ｔｒｅｇ数の増大が二次リンパ器官中でも観察されるかどうかを確定する。
【０１２２】
関節炎発症の日に、マウスを抗ＴＮＦα（ヤギ抗マウスＴＮＦ中和抗体、腹膜内、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；又はモノクローナル抗ＴＮＦクローンＴＮ３−１９．１２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、アイソタイプ適合対照又はＰＢＳ対照を用いて、本来記載されたプロトコル（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、（１９９２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ８９：９７８４〜９７８８ページ）の後に２週間の間週に２回治療する。ＰＢＭＣ中のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇのレベルは、疾患発症の日から始めて疾患消散（治療後第０、７、１４及び２１日）まで、ＦＡＣＳ染色を使用して定期的間隔で測定する。実験の最後（疾患発症後第２１日）に、胸腺、脾臓及びリンパ節をマウスから切除し、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞のレベルを測定する。
【０１２３】
抗ＴＮＦα後の増大したＴｒｅｇは、表面マーカー（ＣＴＬＡ−４、ＣＤ６２Ｌ、ＧＩＴＲなど）の発現及びそれらの免疫調節（ＴＧＦβ、ＩＬ−１０）サイトカインのプロフィールを調べることによって特徴付ける。様々な区画（即ち、関節対ＬＮ又は脾臓）及びそれらの表現型（非投薬対記憶）の分析において決定したＴｒｅｇの絶対数の比較は、誘導したＴｒｅｇの起源を示す（即ち、ｄｅ  ｎｏｖｏ生成と対照的に炎症の部位から動員した）。この実験は、Ｔｒｅｇ数の有意な変化は疾患のいずれかの段階（早期関節炎、急性又は寛解期）に関連するかどうかも評価する。ＣＩＩ±ＩＬ−２、及び抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激に対するＴｒｅｇ細胞の応答も評価し、且つＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖及び炎症促進性サイトカインの産生を抑制する能力によってそれらの制御能力を試験する。
【０１２４】
６．抗ＴＮＦαを用いて治療したＤＢＡ／１マウス中の炎症性関節炎の消散に対するＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの貢献の評価。
抗ＴＮＦα療法はＴｒｅｇの誘導によって部分的に働く可能性があるという仮説を試験するために、ＤＢＡ／１マウスからＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を枯渇させ、抗ＴＮＦα療法に対するそれらの応答を非枯渇ＤＢＡ／１マウスの応答と比較する。
【０１２５】
以前に記載されたのと同様に（Ｍｏｒｇａｎら、（２００３）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．４８：１４５２〜１４６０ページ）細胞系ＰＣ６１由来の枯渇抗ＣＤ２５モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の腹膜内注射を使用して、（抗ＴＮＦα療法の開始前に）マウスからＣＤ２５発現細胞を枯渇させる。ＣＤ２５発現Ｔ細胞の完全な枯渇は抗ＣＤ２５の単回注射後第３日で通常起こり、３週間後５０％の細胞が回復し、完全な回復は典型的には４週間後である。
【０１２６】
このレジメは、抗ＴＮＦα治療に応答してレスポンダーＴ細胞から生成する可能性がある「誘導型」Ｔｒｅｇを残しながら、内生Ｔｒｅｇを除去することができる。実際、本発明者らのヒトにおける試験は、インフリキシマブはレスポンダーＴ細胞からのＴｒｅｇ分化を誘導することを示唆する。内生よりはむしろ誘導型Ｔｒｅｇが、抗ＴＮＦαの保護効果の中心となるかどうかを処理するために、追加的な２つの用量の抗ＣＤ２５枯渇抗体を、抗ＴＮＦαを用いた治療後約５日及び１０日で投与する。疾患発症の日に、枯渇マウスと非枯渇マウスの両方を、抗ＴＮＦα、アイソタイプ適合対照又はＰＢＳ対照を用いて治療する。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞が枯渇したマウスにおける疾患の重度は、いずれも抗ＴＮＦαで治療した非枯渇マウスにおける疾患の重度と比較する。疾患の重度は以前に記載されたのと同様に評価する（Ｍａｕｒｉら、（１９９６）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２６：１５１１〜１５１８ページ）。
【０１２７】
抗ＣＤ２５モノクローナル抗体の長い半減期（２〜３週間）のため、内生Ｔｒｅｇの重要性と誘導型Ｔｒｅｇの重要性の境界を区別することは困難である可能性がある。この問題点を回避するために、本発明者ら及び他が以前に実証した（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、（１９９２）Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ８８：４５５〜４６０ページ；Ｍａｕｒｉら、（２０００）Ｎａｔ  Ｍｅｄ６：６７３〜６７９ページ）関節炎のＳＣＩＤモデルを使用して、移植実験を実施する。
【０１２８】
ＳＣＩＤマウスは最初に、関節炎発症脾細胞、又は内生Ｔｒｅｇが枯渇した関節炎発症脾細胞（Ｍｉｌｔｅｎｙｉキット）で再構成する。再構成の翌日、マウスは抗ＴＮＦαで治療する。関節炎の重度、及びＴｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋）の生成を評価し、対照マウスと比較する。Ｔｒｅｇが生じる場合、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞の増大により決定して、血液、ＬＮ、脾臓、及び関節中のＴｒｅｇの分布を次いで評価する。
【０１２９】
それらの抑制能力を確認するために、（異なる治療をしたＳＣＩＤマウスから単離した）ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＣＩＩ又は抗ＣＤ３／ＣＤ２８の存在下で、新たに単離した野生型関節炎発症ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞（Ｔレスポンダー）と同時培養する。抗ＴＮＦαが内生又は誘導型Ｔｒｅｇを介して働くかどうかをさらに細かく調べるために、ＳＣＩＤマウスは抗ＴＮＦα投与の開始後３〜５日間抗ＣＤ２５枯渇抗体でさらに処理して、偶発的な「新しい」Ｔｒｅｇを除去する。
【図１】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年6月16日(2009.6.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＴＮＦα抗体を用いた治療に対する患者の応答を予測するための方法であって、
（ａ）患者由来のＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞を含むＴ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏサンプルを提供するステップと、
（ｂ）前記Ｔ細胞を抗ＴＮＦα抗体に曝すステップと、
（ｃ）制御性Ｔ細胞が前記Ｔ細胞のサンプルにおいて誘導されるかどうかを決定するステップと
を含み、制御性Ｔ細胞の誘導が、患者が前記抗ＴＮＦα抗体を用いた治療に応答する可能性が高いことを示す方法。
【請求項２】
前記患者が炎症性又は自己免疫疾患を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記患者が関節リウマチ、乾癬性関節炎、クローン病、乾癬、強直性脊椎炎又は潰瘍性大腸炎を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記抗ＴＮＦα抗体が抗ＴＮＦαモノクローナル抗体である、請求項１から３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記抗ＴＮＦα抗体がインフリキシマブ又はアダリムマブである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｔ細胞のサンプルがレスポンダーＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ１２７＋Ｔ細胞を含むサンプルである、請求項１から５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｔ細胞のサンプルを患者由来のサンプルのＦＡＣＳ選別によって得る、請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｃ）が前記Ｔ細胞によるＦｏｘｐ３、ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２５、ＴＧＦβ、ＬＡＰ及びＣＤ１２７から選択される１つ又は複数のマーカーの発現を評価するステップを含む、請求項１から７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｃ）が、
（ａ）前記サンプル中のＦｏｘｐ３＋Ｔ細胞の存在を評価するステップ、
（ｂ）前記サンプル中のＦｏｘｐ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の存在を評価するステップ、
（ｃ）前記サンプル中のＦｏｘｐ３＋ＣＤ１２７−Ｔ細胞の存在を評価するステップ、
（ｄ）前記サンプル中のＣＤ２５＋ＣＤ１２７−Ｔ細胞の存在を評価するステップ、及び
（ｅ）前記サンプル中のＣＤ６２Ｌ−及びＣＣＲ７−Ｔ細胞の存在を評価するステップ
の１つ又は複数を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
制御性Ｔ細胞の存在をＦＡＣＳによって決定する、請求項１から９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｃ）が、
（ａ）レスポンダーＴ細胞の集団による炎症促進性サイトカイン産生を抑制する前記サンプル中のＴ細胞の能力を評価するステップ、
（ｂ）レスポンダーＴ細胞の集団の増殖を抑制する前記サンプル中のＴ細胞の能力を評価するステップ
の１つ又は複数を含む、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記炎症促進性サイトカインがＴＮＦα、ＩＮＦγ、ＩＬ−６及びＩＬ−１から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
炎症性又は自己免疫疾患を治療するための方法であって、
（ａ）請求項１から１２までのいずれか一項に記載の方法により、抗ＴＮＦα抗体を用いた治療に応答する可能性が高いとして患者を同定するステップと、
（ｂ）前記抗ＴＮＦα抗体を用いて患者を治療するステップと
を含む方法。
【請求項１４】
患者における炎症性又は自己免疫疾患の治療において使用するための抗ＴＮＦα抗体であって、前記患者が、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の方法により、抗ＴＮＦα抗体を用いた治療に応答する可能性が高いとして同定されている抗ＴＮＦα抗体。
【手続補正書】
【提出日】平成21年7月2日(2009.7.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＴＮＦα抗体を用いた治療に対する患者の応答を予測するための方法であって、
（ａ）患者由来のＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞を含むＴ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏサンプルを提供するステップと、
（ｂ）前記Ｔ細胞を抗ＴＮＦα抗体に曝すステップと、
（ｃ）制御性Ｔ細胞が前記Ｔ細胞のサンプルにおいて誘導されるかどうかを決定するステップと
を含み、制御性Ｔ細胞の誘導が、患者が前記抗ＴＮＦα抗体を用いた治療に応答する可能性が高いことを示す方法。
【請求項２】
前記患者が炎症性又は自己免疫疾患を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記患者が関節リウマチ、乾癬性関節炎、クローン病、乾癬、強直性脊椎炎又は潰瘍性大腸炎を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記抗ＴＮＦα抗体が抗ＴＮＦαモノクローナル抗体である、請求項１から３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記抗ＴＮＦα抗体がインフリキシマブ又はアダリムマブである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｔ細胞のサンプルがレスポンダーＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ１２７＋Ｔ細胞を含むサンプルである、請求項１から５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｔ細胞のサンプルを患者由来のサンプルのＦＡＣＳ選別によって得る、請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｃ）が前記Ｔ細胞によるＦｏｘｐ３、ＣＤ４、ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２５、ＴＧＦβ、ＬＡＰ及びＣＤ１２７から選択される１つ又は複数のマーカーの発現を評価するステップを含む、請求項１から７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｃ）が、
（ａ）前記サンプル中のＦｏｘｐ３＋Ｔ細胞の存在を評価するステップ、
（ｂ）前記サンプル中のＦｏｘｐ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の存在を評価するステップ、
（ｃ）前記サンプル中のＦｏｘｐ３＋ＣＤ１２７−Ｔ細胞の存在を評価するステップ、
（ｄ）前記サンプル中のＣＤ２５＋ＣＤ１２７−Ｔ細胞の存在を評価するステップ、及び
（ｅ）前記サンプル中のＣＤ６２Ｌ−及びＣＣＲ７−Ｔ細胞の存在を評価するステップ
の１つ又は複数を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
制御性Ｔ細胞の存在をＦＡＣＳによって決定する、請求項１から９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｃ）が、
（ａ）レスポンダーＴ細胞の集団による前炎症性サイトカイン産生を抑制する前記サンプル中のＴ細胞の能力を評価するステップ、
（ｂ）レスポンダーＴ細胞の集団の増殖を抑制する前記サンプル中のＴ細胞の能力を評価するステップ、
の１つ又は複数を含む、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記前炎症性サイトカインがＴＮＦα、ＩＮＦγ、ＩＬ−６及びＩＬ−１から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
炎症性又は自己免疫疾患を治療するための方法であって、
（ａ）請求項１から１２までのいずれか一項に記載の方法により、抗ＴＮＦα抗体を用いた治療に応答する可能性が高いとして患者を同定するステップと、
（ｂ）前記抗ＴＮＦα抗体を用いて患者を治療するステップと
を含む方法。
【請求項１４】
患者における炎症性又は自己免疫疾患の治療において使用するための抗ＴＮＦα抗体であって、前記患者が、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の方法により、抗ＴＮＦα抗体を用いた治療に応答する可能性が高いとして同定されている抗ＴＮＦα抗体。
【国際調査報告】
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