(57)【要約】本発明は、微生物による油、燃料、オレオ化学製品および他の合成物の生産に役立つ方法および組成物を形成する。特に、本発明は、石油を含有している微生物およびこの種の微生物の低コスト培養の方法を提供する。本発明も、例えばリパーゼ、ショ糖輸送体、ショ糖インベルターゼ、フルクトキナーゼ、多糖分解酵素、脂肪族アシル-ACPチオエステラーゼ、脂肪アシルＣｏＡ/アルデヒドレダクターゼ、脂肪アシルＣｏＡ還元酵素、脂肪アルデヒド還元酵素、脂肪アルデヒド・デカルボニラーゼおよび／またはＡＣＰのような酵素をコードする外来遺伝子を含んでいる微生物細胞を提供する。本発明は、また、例えば再生できるディーゼル、バイオディーゼルおよび再生できるジェット燃料輸送燃料を製造する方法を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
再生可能なディーゼルを生産する方法であって、
(a)固定炭素源の存在下における微生物群の培養工程と、
(b)培養された微生物から脂質成分から単離する工程と、
及び(c)一つ以上の化学反応によって、単離された脂質成分から直鎖アルカンを生成する工程と、
を含み、
前記(a)の培養工程において、
(i)前記微生物がそれらの乾燥重量の少なくとも10%を脂質として蓄積し、
及び(ii)前記固定炭素源は、グリセロール、脱重合されたセルロース材料、ショ糖、糖蜜、ブドウ糖、アラビノース、ガラクトース、キシロース、フルクトース、アラビノース、マンノース、酢酸塩および前述の任意の組合せを備える群から選択される、
生産方法。
【請求項２】
前記微生物が微細藻類であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記微生物が表1にリストされる微細藻類を備えるグループから選択されることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記微生物がクロレラ属の種であることを特徴とする、請求項３に記載の方法
【請求項５】
前記微生物がクロレラ・アニトラタ（Chlorella anitrata）、クロレラ・アンタルクティカ（ Chlorella antarctica）、クロレラ・アウレオビリディス（ Chlorella aureoviridis）、クロレラ・キャンディダ（ Chlorella Candida）、クロレラ・キャプスラタ（Chlorella capsulata）、クロレラ・デシカッタ（Chlorella desiccata）、クロレラ・エリプソイデア（Chlorella ellipsoidea）、クロレラ・エメルソニイ（Chlorella emersonii）、クロレラ・フスカ（Chlorella fusca）、 クロレラ・フスカ・バー・バクオレタ（Chlorella fusca var. vacuolata）, クロレラ・グルコトロファ（Chlorella glucotropha）、クロレラ・インフシオナム（Chlorella infusionum）、クロレラ・インフシオナム・バー・アクトフィラ（Chlorella infusionum var. Actophila）、クロレラ・インフシオナム・バー・アウェノフィラ（Chlorella infusionum var.Auxenophila）, クロレラ・ケッセレリ（Chlorella kessleri）、クロレラ・ルテオビリディス（Chlorella luteoviridis）、クロレラ・ルテオビリディス・バー・アウレオビリディス（Chlorella luteoviridis var. aureoviridis）、クロレラ・ルテオヴィリディス・バー・ルテスセンス（Chlorella luteoviridis var.Lutescens）、クロレラ・ミニアタ（Chlorella miniata）、クロレラ・ミヌティッシマ（Chlorella minutissima）、クロレラ・ムタビリス（Chlorella mutabilis）、クロレラ・ノクツルナ（Chlorella nocturna）、クロレラ・パルバ（Chlorella parva）、クロレラ・ファトフィリア（Chlorella photophila）、クロレラ・プリングシェイミィ（Chlorella pringsheimii）、クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）、クロレラ・ピレノイドサ（Chlorella pyrenoidosa）、クロレラ・レグラリス（Chlorella regularis）、クロレラ・レグラリス・バー・ミニマ（Chlorella regularis var. minima）、クロレラ・レグラリス・バー・ウンブリカタ（Chlorella regularis var. umbricata）、クロレラ・レイシグリィ（Chlorella reisiglii）、クロレラ・サッカロフィア（Chlorella saccharophila）、クロレラ・サッカロフィア・バー・エリプソイデア（ Chlorella saccharophila var. ellipsoidea）、クロレラ・サリナ（Chlorella salina）、クロレラ・シンプレックス（Chlorella simplex）、クロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana）、クロレラ属の種（Chlorella sp.）、クロレラ・スファエリカ（Chlorella sphaerica）、クロレラ・スティグマトフォラ（Chlorella stigmatophora）、クロレラ・バニエリィ（Chlorella vanniellii）、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）、クロレラ・ブルガリス・エフ・テルシア（Chlorella vulgaris f. tertia）、クロレラ・ブルガリス・バー・アイリディス（Chlorella vulgaris var. airidis）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス（Chlorella vulgaris var. vulgaris）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・テルシア（Chlorella vulgaris var. vulgaris f. tertia）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・ビリディス（Chlorella vulgaris var. vulgaris f. viridis）、クロレラ・シャンセラ（Chlorella xanthella）及びクロレラ・ゾフィンジエンシス（Chlorella zofingiensis）を備える群から選択されることを特徴とする、請求項４に記載の方法
【請求項６】
前記微生物が油性の酵母であることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記油性酵母が、クリプトコッカス・クルバツス（Cryptococcus curvatus）、クリプトコッカス・テリコルス（Cryptococcus terricolus）、カンジタ属の一種（Candida sp.）、リポマイセス・スタルケィ（Lipomyces starkeyi）、リポマイセス・リポファ（Lipomyces lipofer）、エンドマイコプシス・バルナリス（Endomycopsis vernalis）、ロドトルラ・グルティニス（Rhodotorula glutinis）、ロドトルラ・グルシリス（Rhodotorula gracilis）およびヤロウィア・リポリティリカ（Yarrowia lipolytica）を備える群から選択されることを特徴とする、請求項６記載の方法
【請求項８】
前記微生物が真菌であることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記真菌が、モルティエレラ（Mortierella）属の一種、モルティエレラ・ビナセア（Mortierrla vinacea）、モルティエレラ・アルペン（Mortierella alpine）、フィリシウム・デバリアヌム（Pythium debaryanum）、ケカビ属シルシネロイデス（Mucor circinelloides）、アスペルギルス・オクラセウス（Aspergillus ochraceus）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）、ペネシリウム・イイラシヌム（Pennicillium iilacinum）、ヘンセヌロ（Hensenulo）属の一種、カエトミウム（Chaetomium）属の一種、クラドスポリウム（Cladosporium）属の一種、マルブランシェア（Malbranchea）属の一種、リゾプス（Rhizopus）属の一種およびフィシウム（Pythium）属の一種のを備える群から選択されることを特徴とする、請求項８記載の方法
【請求項１０】
前記微生物が、少なくとも一つの外来のショ糖資化性遺伝子を含むことを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記ショ糖資化性遺伝子が、ショ糖輸送体、ショ糖インベルターゼ、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼまたはフルクトキナーゼをコードすること特徴とする、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
前記微生物が、脂質経路酵素をコードする外来遺伝子を少なくとも一つ含むことを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
前記脂質経路酵素が、ステアロイルCoA不飽和酵素、グリセロ脂質不飽和酵素、ピルビン酸塩デヒドロゲナーゼ、アセチルCoAカルボキシラーゼ、アシル担体タンパク質およびグリセロール-3リン酸塩アシルトランスフェラーゼを備える群から選択されることを特徴とする、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
ジェット燃料を生産する方法であって、
(a)固定炭素源の存在下で、微生物群を培養する工程と、
(b)培養した微生物からの脂質を単離する工程と、
及び、(c)一つ以上の化学反応によって、単離された脂質成分から直鎖アルカンを生成する工程と、
を含み、
前記(a)工程において、
(i)前記微生物がそれらの乾燥重量の少なくとも10%を脂質として蓄積し
及び(ii)前記固定炭素源は、グリセロール、脱重合されたセルロース材料、ショ糖、糖蜜、ブドウ糖、アラビノース、ガラクトース、キシロース、フルクトース、アラビノース、マンノース、酢酸塩および前述の任意の組合せを備える群から選択される、
生産方法。
【請求項１５】
前記微生物が微細藻類であるであることを特徴とする、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記微生物が表1にリストされる微細藻類を備えるグループから選択されることを特徴とする、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記微生物が、クロレラ属の一種であることを特徴とする、請求項１６記載の方法
【請求項１８】
前記微生物が、クロレラ・アニトラタ（Chlorella anitrata）、クロレラ・アンタルクティカ（Chlorella antarctica）、クロレラ・アウレオビリディス（ Chlorella aureoviridis）、クロレラ・キャンディダ（ Chlorella Candida）、クロレラ・キャプスラタ（Chlorella capsulata）、クロレラ・デシカッタ（Chlorella desiccata）、クロレラ・エリプソイデア（Chlorella ellipsoidea）、クロレラ・エメルソニイ（Chlorella emersonii）、クロレラ・フスカ（Chlorella fusca）、 クロレラ・フスカ・バー・バクオレタ（Chlorella fusca var. vacuolata）, クロレラ・グルコトロファ（Chlorella glucotropha）、クロレラ・インフシオナム（Chlorella infusionum）、クロレラ・インフシオナム・バー・アクトフィラ（Chlorella infusionum var. Actophila）、クロレラ・インフシオナム・バー・アウェノフィラ（Chlorella infusionum var.Auxenophila）, クロレラ・ケッセレリ（Chlorella kessleri）、クロレラ・ルテオビリディス（Chlorella luteoviridis）、クロレラ・ルテオビリディス・バー・アウレオビリディス（Chlorella luteoviridis var. aureoviridis）、クロレラ・ルテオヴィリディス・バー・ルテスセンス（Chlorella luteoviridis var.Lutescens）、クロレラ・ミニアタ（Chlorella miniata）、クロレラ・ミヌティッシマ（Chlorella minutissima）、クロレラ・ムタビリス（Chlorella mutabilis）、クロレラ・ノクツルナ（Chlorella nocturna）、クロレラ・パルバ（Chlorella parva）、クロレラ・ファトフィリア（Chlorella photophila）、クロレラ・プリングシェイミィ（Chlorella pringsheimii）、クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）、クロレラ・ピレノイドサ（Chlorella pyrenoidosa）、クロレラ・レグラリス（Chlorella regularis）、クロレラ・レグラリス・バー・ミニマ（Chlorella regularis var. minima）、クロレラ・レグラリス・バー・ウンブリカタ（Chlorella regularis var. umbricata）、クロレラ・レイシグリィ（Chlorella reisiglii）、クロレラ・サッカロフィア（Chlorella saccharophila）、クロレラ・サッカロフィア・バー・エリプソイデア（ Chlorella saccharophila var. ellipsoidea）、クロレラ・サリナ（Chlorella salina）、クロレラ・シンプレックス（Chlorella simplex）、クロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana）、クロレラ属の種（Chlorella sp.）、クロレラ・スファエリカ（Chlorella sphaerica）、クロレラ・スティグマトフォラ（Chlorella stigmatophora）、クロレラ・バニエリィ（Chlorella vanniellii）、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）、クロレラ・ブルガリス・エフ・テルシア（Chlorella vulgaris f. tertia）、クロレラ・ブルガリス・バー・アイリディス（Chlorella vulgaris var. airidis）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス（Chlorella vulgaris var. vulgaris）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・テルシア（Chlorella vulgaris var. vulgaris f. tertia）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・ビリディス（Chlorella vulgaris var. vulgaris f. viridis）、クロレラ・シャンセラ（Chlorella xanthella）及びクロレラ・ゾフィンジエンシス（Chlorella zofingiensis）を備える群から選択されることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記微生物が、油性酵母であることを特徴とする、請求項１４記載の方法。
【請求項２０】
前記油性酵母が、クリプトコッカス・クルバツス（Cryptococcus curvatus）、クリプトコッカス・テリコルス（Cryptococcus terricolus）、カンジタ属の一種（Candida sp.）、リポマイセス・スタルケィ（Lipomyces starkeyi）、リポマイセス・リポファ（Lipomyces lipofer）、エンドマイコプシス・バルナリス（Endomycopsis vernalis）、ロドトルラ・グルティニス（Rhodotorula glutinis）、ロドトルラ・グルシリス（Rhodotorula gracilis）およびヤロウィア・リポリティリカ（Yarrowia lipolytica）を備える群から選択されることを特徴とする、請求項１９記載の方法
【請求項２１】
前記微生物が、真菌であることを特徴とする、請求項２１記載の方法。
【請求項２２】
前記真菌が、モルティエレラ（Mortierella）属の一種、モルティエレラ・ビナセア（Mortierrla vinacea）、モルティエレラ・アルペン（Mortierella alpine）、フィリシウム・デバリアヌム（Pythium debaryanum）、ケカビ属シルシネロイデス（Mucor circinelloides）、アスペルギルス・オクラセウス（Aspergillus ochraceus）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）、ペネシリウム・イイラシヌム（Pennicillium iilacinum）、ヘンセヌロ（Hensenulo）属の一種、カエトミウム（Chaetomium）属の一種、クラドスポリウム（Cladosporium）属の一種、マルブランシェア（Malbranchea）属の一種、リゾプス（Rhizopus）属の一種およびフィシウム（Pythium）属の一種のを備える群から選択されることを特徴とする、請求項２１記載の方法
【請求項２３】
前記微生物が、少なくとも一つの外来のショ糖資化性遺伝子を含むことを特徴とする、請求項１４記載の方法。
【請求項２４】
前記ショ糖資化性遺伝子が、ショ糖輸送体、ショ糖インベルターゼ、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼまたはフルクトキナーゼをコードすることを特徴とする、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記微生物が、脂質経路酵素をコードする外来遺伝子を少なくとも一つ含むことを特徴とする、請求項１４記載の方法。
【請求項２６】
前記脂肪経路酵素が、ステアロイルCoA不飽和酵素、グリセロ脂質不飽和酵素、ピルビン酸塩デヒドロゲナーゼ、アセチルCoAカルボキシラーゼ、アシル担体タンパク質およびグリセロール-3リン酸塩アシルトランスフェラーゼを備える群から選択されることを特徴とする、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
請求項１の方法によって製造される液体炭化水素の組成であって、前記組成がASTM D975の仕様に合致する組成物。
【請求項２８】
前記微生物が、微細藻類であることを特徴とする、請求項２７記載の組成物。
【請求項２９】
前記微生物が、表1にリストされる微細藻類を備える群から選択されることを特徴とする、請求項２８記載の組成物。
【請求項３０】
前記微生物が。クロレラ（Chlorella）属の一種であることを特徴とする、請求項２９記載の組成物。
【請求項３１】
前記微生物が、クロレラ・アニトラタ（Chlorella anitrata）、クロレラ・アンタルクティカ（ Chlorella antarctica）、クロレラ・アウレオビリディス（ Chlorella aureoviridis）、クロレラ・キャンディダ（ Chlorella Candida）、クロレラ・キャプスラタ（Chlorella capsulata）、クロレラ・デシカッタ（Chlorella desiccata）、クロレラ・エリプソイデア（Chlorella ellipsoidea）、クロレラ・エメルソニイ（Chlorella emersonii）、クロレラ・フスカ（Chlorella fusca）、 クロレラ・フスカ・バー・バクオレタ（Chlorella fusca var. vacuolata）, クロレラ・グルコトロファ（Chlorella glucotropha）、クロレラ・インフシオナム（Chlorella infusionum）、クロレラ・インフシオナム・バー・アクトフィラ（Chlorella infusionum var. Actophila）、クロレラ・インフシオナム・バー・アウェノフィラ（Chlorella infusionum var.Auxenophila）, クロレラ・ケッセレリ（Chlorella kessleri）、クロレラ・ルテオビリディス（Chlorella luteoviridis）、クロレラ・ルテオビリディス・バー・アウレオビリディス（Chlorella luteoviridis var. aureoviridis）、クロレラ・ルテオヴィリディス・バー・ルテスセンス（Chlorella luteoviridis var.Lutescens）、クロレラ・ミニアタ（Chlorella miniata）、クロレラ・ミヌティッシマ（Chlorella minutissima）、クロレラ・ムタビリス（Chlorella mutabilis）、クロレラ・ノクツルナ（Chlorella nocturna）、クロレラ・パルバ（Chlorella parva）、クロレラ・ファトフィリア（Chlorella photophila）、クロレラ・プリングシェイミィ（Chlorella pringsheimii）、クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）、クロレラ・ピレノイドサ（Chlorella pyrenoidosa）、クロレラ・レグラリス（Chlorella regularis）、クロレラ・レグラリス・バー・ミニマ（Chlorella regularis var. minima）、クロレラ・レグラリス・バー・ウンブリカタ（Chlorella regularis var. umbricata）、クロレラ・レイシグリィ（Chlorella reisiglii）、クロレラ・サッカロフィア（Chlorella saccharophila）、クロレラ・サッカロフィア・バー・エリプソイデア（ Chlorella saccharophila var. ellipsoidea）、クロレラ・サリナ（Chlorella salina）、クロレラ・シンプレックス（Chlorella simplex）、クロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana）、クロレラ属の種（Chlorella sp.）、クロレラ・スファエリカ（Chlorella sphaerica）、クロレラ・スティグマトフォラ（Chlorella stigmatophora）、クロレラ・バニエリィ（Chlorella vanniellii）、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）、クロレラ・ブルガリス・エフ・テルシア（Chlorella vulgaris f. tertia）、クロレラ・ブルガリス・バー・アイリディス（Chlorella vulgaris var. airidis）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス（Chlorella vulgaris var. vulgaris）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・テルシア（Chlorella vulgaris var. vulgaris f. tertia）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・ビリディス（Chlorella vulgaris var. vulgaris f. viridis）、クロレラ・シャンセラ（Chlorella xanthella）及びクロレラ・ゾフィンジエンシス（Chlorella zofingiensis）を備える群から選択されることを特徴とする、請求項３０記載の組成物。
【請求項３２】
前記微生物が、油性酵母であることを特徴とする、請求項２７記載の組成物。
【請求項３３】
前記油性酵母が、クリプトコッカス・クルバツス（Cryptococcus curvatus）、クリプトコッカス・テリコルス（Cryptococcus terricolus）、カンジタ属の一種（Candida sp.）、リポマイセス・スタルケィ（Lipomyces starkeyi）、リポマイセス・リポファ（Lipomyces lipofer）、エンドマイコプシス・バルナリス（Endomycopsis vernalis）、ロドトルラ・グルティニス（Rhodotorula glutinis）、ロドトルラ・グルシリス（Rhodotorula gracilis）およびヤロウィア・リポリティリカ（Yarrowia lipolytica）を備える群から選択されることを特徴とする、請求項３２記載の組成物。
【請求項３４】
前記微生物が、真菌であることを特徴とする、請求項２７記載の組成物。
【請求項３５】
前記真菌が、モルティエレラ（Mortierella）属の一種、モルティエレラ・ビナセア（Mortierrla vinacea）、モルティエレラ・アルペン（Mortierella alpine）、フィリシウム・デバリアヌム（Pythium debaryanum）、ケカビ属シルシネロイデス（Mucor circinelloides）、アスペルギルス・オクラセウス（Aspergillus ochraceus）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）、ペネシリウム・イイラシヌム（Pennicillium iilacinum）、ヘンセヌロ（Hensenulo）属の一種、カエトミウム（Chaetomium）属の一種、クラドスポリウム（Cladosporium）属の一種、マルブランシェア（Malbranchea）属の一種、リゾプス（Rhizopus）属の一種およびフィシウム（Pythium）属の一種のを備える群から選択されることを特徴とする、請求項３４記載の組成物。
【請求項３６】
前記微生物が、少なくとも一つの外来のショ糖資化性遺伝子を含むことを特徴とする、請求項２７記載の組成物。
【請求項３７】
前記ショ糖資化性遺伝子が、ショ糖輸送体、ショ糖インベルターゼ、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼまたはフルクトキナーゼをコードすることを特徴とする、請求項３６記載の組成物。
【請求項３８】
前記微生物が、脂質経路酵素をコードする外来遺伝子を少なくとも一つ含むことを特徴とする、請求項２７記載の組成物。
【請求項３９】
前記脂肪経路酵素が、ステアロイルCoA不飽和酵素、グリセロ脂質不飽和酵素、ピルビン酸塩デヒドロゲナーゼ、アセチルCoAカルボキシラーゼ、アシル担体タンパク質およびグリセロール-3リン酸塩アシルトランスフェラーゼを備える群から選択されることを特徴とする、請求項３８記載の組成物。
【請求項４０】
請求項１４の方法によって製造される液体炭化水素の組成であって、前記組成がASTM D1655の仕様に合致する組成物。
【請求項４１】
前記微生物が、微細藻類であることを特徴とする、請求項40記載の組成物。
【請求項４２】
前記微生物が、表1にリストされる微細藻類であることを特徴とする、請求項41の組成物。
【請求項４３】
前記微生物が、クロレラ（Chlorella）属の一種であることを特徴とする、請求項42記載の組成物。
【請求項４４】
前記微生物が、クロレラ・アニトラタ（Chlorella anitrata）、クロレラ・アンタルクティカ（ Chlorella antarctica）、クロレラ・アウレオビリディス（ Chlorella aureoviridis）、クロレラ・キャンディダ（ Chlorella Candida）、クロレラ・キャプスラタ（Chlorella capsulata）、クロレラ・デシカッタ（Chlorella desiccata）、クロレラ・エリプソイデア（Chlorella ellipsoidea）、クロレラ・エメルソニイ（Chlorella emersonii）、クロレラ・フスカ（Chlorella fusca）、 クロレラ・フスカ・バー・バクオレタ（Chlorella fusca var. vacuolata）, クロレラ・グルコトロファ（Chlorella glucotropha）、クロレラ・インフシオナム（Chlorella infusionum）、クロレラ・インフシオナム・バー・アクトフィラ（Chlorella infusionum var. Actophila）、クロレラ・インフシオナム・バー・アウェノフィラ（Chlorella infusionum var.Auxenophila）, クロレラ・ケッセレリ（Chlorella kessleri）、クロレラ・ルテオビリディス（Chlorella luteoviridis）、クロレラ・ルテオビリディス・バー・アウレオビリディス（Chlorella luteoviridis var. aureoviridis）、クロレラ・ルテオヴィリディス・バー・ルテスセンス（Chlorella luteoviridis var.Lutescens）、クロレラ・ミニアタ（Chlorella miniata）、クロレラ・ミヌティッシマ（Chlorella minutissima）、クロレラ・ムタビリス（Chlorella mutabilis）、クロレラ・ノクツルナ（Chlorella nocturna）、クロレラ・パルバ（Chlorella parva）、クロレラ・ファトフィリア（Chlorella photophila）、クロレラ・プリングシェイミィ（Chlorella pringsheimii）、クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）、クロレラ・ピレノイドサ（Chlorella pyrenoidosa）、クロレラ・レグラリス（Chlorella regularis）、クロレラ・レグラリス・バー・ミニマ（Chlorella regularis var. minima）、クロレラ・レグラリス・バー・ウンブリカタ（Chlorella regularis var. umbricata）、クロレラ・レイシグリィ（Chlorella reisiglii）、クロレラ・サッカロフィア（Chlorella saccharophila）、クロレラ・サッカロフィア・バー・エリプソイデア（ Chlorella saccharophila var. ellipsoidea）、クロレラ・サリナ（Chlorella salina）、クロレラ・シンプレックス（Chlorella simplex）、クロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana）、クロレラ属の種（Chlorella sp.）、クロレラ・スファエリカ（Chlorella sphaerica）、クロレラ・スティグマトフォラ（Chlorella stigmatophora）、クロレラ・バニエリィ（Chlorella vanniellii）、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）、クロレラ・ブルガリス・エフ・テルシア（Chlorella vulgaris f. tertia）、クロレラ・ブルガリス・バー・アイリディス（Chlorella vulgaris var. airidis）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス（Chlorella vulgaris var. vulgaris）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・テルシア（Chlorella vulgaris var. vulgaris f. tertia）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・ビリディス（Chlorella vulgaris var. vulgaris f. viridis）、クロレラ・シャンセラ（Chlorella xanthella）及びクロレラ・ゾフィンジエンシス（Chlorella zofingiensis）を備える群から選択されることを特徴とする、請求項43記載の組成物。
【請求項４５】
前記微生物が、油性酵母であることを特徴とする、請求項40記載の組成物。
【請求項４６】
前記油性酵母が、クリプトコッカス・クルバツス（Cryptococcus curvatus）、クリプトコッカス・テリコルス（Cryptococcus terricolus）、カンジタ属の一種（Candida sp.）、リポマイセス・スタルケィ（Lipomyces starkeyi）、リポマイセス・リポファ（Lipomyces lipofer）、エンドマイコプシス・バルナリス（Endomycopsis vernalis）、ロドトルラ・グルティニス（Rhodotorula glutinis）、ロドトルラ・グルシリス（Rhodotorula gracilis）およびヤロウィア・リポリティリカ（Yarrowia lipolytica）を備える群から選択されることを特徴とする、請求項45記載の組成物。
【請求項４７】
前記微生物が、真菌であることを特徴とする、請求項40記載の組成物。
【請求項４８】
前記真菌が、モルティエレラ（Mortierella）属の一種、モルティエレラ・ビナセア（Mortierrla vinacea）、モルティエレラ・アルペン（Mortierella alpine）、フィリシウム・デバリアヌム（Pythium debaryanum）、ケカビ属シルシネロイデス（Mucor circinelloides）、アスペルギルス・オクラセウス（Aspergillus ochraceus）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）、ペネシリウム・イイラシヌム（Pennicillium iilacinum）、ヘンセヌロ（Hensenulo）属の一種、カエトミウム（Chaetomium）属の一種、クラドスポリウム（Cladosporium）属の一種、マルブランシェア（Malbranchea）属の一種、リゾプス（Rhizopus）属の一種およびフィシウム（Pythium）属の一種のを備える群から選択されることを特徴とする、請求項47記載の組成物。
【請求項４９】
前記微生物が、少なくとも一つの外来のショ糖資化性遺伝子を含むことを特徴とする、請求項40記載の組成物。
【請求項５０】
前記ショ糖資化性遺伝子が、ショ糖輸送体、ショ糖インベルターゼ、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼまたはフルクトキナーゼをコードすること特徴とする、請求項49記載の組成物。
【請求項５１】
前記微生物が、脂質経路酵素をコードする外来遺伝子を少なくとも一つ含むことを特徴とする、請求項40記載の組成物。
【請求項５２】
前記脂質経路酵素が、ステアロイルCoA不飽和酵素、グリセロ脂質不飽和酵素、ピルビン酸塩デヒドロゲナーゼ、アセチルCoAカルボキシラーゼ、アシル担体タンパク質およびグリセロール-3リン酸塩アシルトランスフェラーゼを備える群から選択されることを特徴とする、請求項51記載の組成物。
【請求項５３】
同じ種の野生株細胞に比べて異なるレベルで、脂質経路酵素の発現するように、遺伝的に改変および/または選択された、微細藻類細胞または酵母細胞。
【請求項５４】
前記細胞が、前記細胞と野生株の細胞とを同一条件下で生育させた場合に、野生株の細胞と比べて多くの脂質を生産することを特徴とする、請求項53記載の細胞
【請求項５５】
前記細胞が、野生種の株より高いレベルで脂質経路酵素を発現するように、遺伝的に改変および/または選択されたことを特徴とする、請求項53の細胞。
【請求項５６】
前記脂質経路酵素が、ピルビン酸塩デヒドロゲナーゼ、アセチルCoAカルボキシラーゼ、アシル担体タンパク質およびグリセロール-3リン酸塩アシルトランスフェラーゼを備える群から選択されることを特徴とする、請求項55記載の細胞。
【請求項５７】
前記細胞が、野生種の株より低いレベルで脂質経路酵素を発現するように、遺伝的に改変および/または選択されたことを特徴とする、請求項53記載の細胞。
【請求項５８】
前記脂質経路酵素が、クエン酸塩シンターゼを備えることを特徴とする、請求項57記載の細胞。
【請求項５９】
前記細胞が、野生種の細胞と比べて複数の脂肪酸合成遺伝子の発現量が異なる細胞であって、遺伝的に改変および/または遺伝的に選択されることによって野生種の細胞と比べて脂肪酸合成系の調節因子の発現量が異なることを特徴とする、請求項53記載の細胞
【請求項６０】
前記脂質経路酵素が、脂肪酸を修飾する？酵素から成ることを特徴とする、請求項53記載の細胞。
【請求項６１】
前記脂質経路酵素が、ステアロイルCoA不飽和酵素およびグリセロ脂質不飽和酵素から選ばれることを特徴とする、請求項60に記載の細胞。
【請求項６２】
前記細胞が、前記微生物が表1にリストされる微細藻類を備えるグループから選択されることを特徴とする、請求項53に記載の細胞。
【請求項６３】
前記微細藻類がクロレラ属の種であることを特徴とする、請求項62記載の微細藻類細胞。
【請求項６４】
前記微細藻類細胞が、クロレラ・アニトラタ（Chlorella anitrata）、クロレラ・アンタルクティカ（ Chlorella antarctica）、クロレラ・アウレオビリディス（ Chlorella aureoviridis）、クロレラ・キャンディダ（ Chlorella Candida）、クロレラ・キャプスラタ（Chlorella capsulata）、クロレラ・デシカッタ（Chlorella desiccata）、クロレラ・エリプソイデア（Chlorella ellipsoidea）、クロレラ・エメルソニイ（Chlorella emersonii）、クロレラ・フスカ（Chlorella fusca）、 クロレラ・フスカ・バー・バクオレタ（Chlorella fusca var. vacuolata）, クロレラ・グルコトロファ（Chlorella glucotropha）、クロレラ・インフシオナム（Chlorella infusionum）、クロレラ・インフシオナム・バー・アクトフィラ（Chlorella infusionum var. Actophila）、クロレラ・インフシオナム・バー・アウェノフィラ（Chlorella infusionum var.Auxenophila）, クロレラ・ケッセレリ（Chlorella kessleri）、クロレラ・ルテオビリディス（Chlorella luteoviridis）、クロレラ・ルテオビリディス・バー・アウレオビリディス（Chlorella luteoviridis var. aureoviridis）、クロレラ・ルテオヴィリディス・バー・ルテスセンス（Chlorella luteoviridis var.Lutescens）、クロレラ・ミニアタ（Chlorella miniata）、クロレラ・ミヌティッシマ（Chlorella minutissima）、クロレラ・ムタビリス（Chlorella mutabilis）、クロレラ・ノクツルナ（Chlorella nocturna）、クロレラ・パルバ（Chlorella parva）、クロレラ・ファトフィリア（Chlorella photophila）、クロレラ・プリングシェイミィ（Chlorella pringsheimii）、クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）、クロレラ・ピレノイドサ（Chlorella pyrenoidosa）、クロレラ・レグラリス（Chlorella regularis）、クロレラ・レグラリス・バー・ミニマ（Chlorella regularis var. minima）、クロレラ・レグラリス・バー・ウンブリカタ（Chlorella regularis var. umbricata）、クロレラ・レイシグリィ（Chlorella reisiglii）、クロレラ・サッカロフィア（Chlorella saccharophila）、クロレラ・サッカロフィア・バー・エリプソイデア（ Chlorella saccharophila var. ellipsoidea）、クロレラ・サリナ（Chlorella salina）、クロレラ・シンプレックス（Chlorella simplex）、クロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana）、クロレラ属の種（Chlorella sp.）、クロレラ・スファエリカ（Chlorella sphaerica）、クロレラ・スティグマトフォラ（Chlorella stigmatophora）、クロレラ・バニエリィ（Chlorella vanniellii）、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）、クロレラ・ブルガリス・エフ・テルシア（Chlorella vulgaris f. tertia）、クロレラ・ブルガリス・バー・アイリディス（Chlorella vulgaris var. airidis）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス（Chlorella vulgaris var. vulgaris）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・テルシア（Chlorella vulgaris var. vulgaris f. tertia）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・ビリディス（Chlorella vulgaris var. vulgaris f. viridis）、クロレラ・シャンセラ（Chlorella xanthella）及びクロレラ・ゾフィンジエンシス（Chlorella zofingiensis）を備える群から選択されることを特徴とする、請求項63に記載の微細藻類細胞。
【請求項６５】
脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ、脂肪酸アシルCoA還元酵素、脂肪酸アルデヒド還元酵素、脂肪酸アシルCoA/アルデヒド還元酵素、脂肪酸アルデヒドデカルボキシラーゼおよびアシル担体タンパク質を備える群から選択される一つまたは複数のタンパク質をコードする外来遺伝子を、一以上含む石油生産微生物。
【請求項６６】
前記微生物が、微細藻類であることを特徴とする、請求項65記載の微生物
【請求項６７】
前記微生物が、油性酵母であることを特徴とする、請求項65記載の微生物。
【請求項６８】
前記油性酵母が、クリプトコッカス・クルバツス（Cryptococcus curvatus）、クリプトコッカス・テリコルス（Cryptococcus terricolus）、カンジタ属の一種（Candida sp.）、リポマイセス・スタルケィ（Lipomyces starkeyi）、リポマイセス・リポファ（Lipomyces lipofer）、エンドマイコプシス・バルナリス（Endomycopsis vernalis）、ロドトルラ・グルティニス（Rhodotorula glutinis）、ロドトルラ・グルシリス（Rhodotorula gracilis）およびヤロウィア・リポリティリカ（Yarrowia lipolytica）を備える群から選択されることを特徴とする、請求項67記載の微生物。
【請求項６９】
前記微生物が、真菌であることを特徴とする、請求項65記載の微生物。
【請求項７０】
前記真菌が、モルティエレラ（Mortierella）属の一種、モルティエレラ・ビナセア（Mortierrla vinacea）、モルティエレラ・アルペン（Mortierella alpine）、フィリシウム・デバリアヌム（Pythium debaryanum）、ケカビ属シルシネロイデス（Mucor circinelloides）、アスペルギルス・オクラセウス（Aspergillus ochraceus）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）、ペネシリウム・イイラシヌム（Pennicillium iilacinum）、ヘンセヌロ（Hensenulo）属の一種、カエトミウム（Chaetomium）属の一種、クラドスポリウム（Cladosporium）属の一種、マルブランシェア（Malbranchea）属の一種、リゾプス（Rhizopus）属の一種およびフィシウム（Pythium）属の一種のを備える群から選択されることを特徴とする、請求項69記載の微生物。
【請求項７１】
前記微生物が表1にリストされる微細藻類を備えるグループから選択されることを特徴とする、請求項65記載の微生物。
【請求項７２】
前記微生物がクロレラ属の種であることを特徴とする、請求項71記載の微生物。
【請求項７３】
前記微生物がクロレラ・アニトラタ（Chlorella anitrata）、クロレラ・アンタルクティカ（ Chlorella antarctica）、クロレラ・アウレオビリディス（ Chlorella aureoviridis）、クロレラ・キャンディダ（ Chlorella Candida）、クロレラ・キャプスラタ（Chlorella capsulata）、クロレラ・デシカッタ（Chlorella desiccata）、クロレラ・エリプソイデア（Chlorella ellipsoidea）、クロレラ・エメルソニイ（Chlorella emersonii）、クロレラ・フスカ（Chlorella fusca）、 クロレラ・フスカ・バー・バクオレタ（Chlorella fusca var. vacuolata）, クロレラ・グルコトロファ（Chlorella glucotropha）、クロレラ・インフシオナム（Chlorella infusionum）、クロレラ・インフシオナム・バー・アクトフィラ（Chlorella infusionum var. Actophila）、クロレラ・インフシオナム・バー・アウェノフィラ（Chlorella infusionum var.Auxenophila）, クロレラ・ケッセレリ（Chlorella kessleri）、クロレラ・ルテオビリディス（Chlorella luteoviridis）、クロレラ・ルテオビリディス・バー・アウレオビリディス（Chlorella luteoviridis var. aureoviridis）、クロレラ・ルテオヴィリディス・バー・ルテスセンス（Chlorella luteoviridis var.Lutescens）、クロレラ・ミニアタ（Chlorella miniata）、クロレラ・ミヌティッシマ（Chlorella minutissima）、クロレラ・ムタビリス（Chlorella mutabilis）、クロレラ・ノクツルナ（Chlorella nocturna）、クロレラ・パルバ（Chlorella parva）、クロレラ・ファトフィリア（Chlorella photophila）、クロレラ・プリングシェイミィ（Chlorella pringsheimii）、クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）、クロレラ・ピレノイドサ（Chlorella pyrenoidosa）、クロレラ・レグラリス（Chlorella regularis）、クロレラ・レグラリス・バー・ミニマ（Chlorella regularis var. minima）、クロレラ・レグラリス・バー・ウンブリカタ（Chlorella regularis var. umbricata）、クロレラ・レイシグリィ（Chlorella reisiglii）、クロレラ・サッカロフィア（Chlorella saccharophila）、クロレラ・サッカロフィア・バー・エリプソイデア（ Chlorella saccharophila var. ellipsoidea）、クロレラ・サリナ（Chlorella salina）、クロレラ・シンプレックス（Chlorella simplex）、クロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana）、クロレラ属の種（Chlorella sp.）、クロレラ・スファエリカ（Chlorella sphaerica）、クロレラ・スティグマトフォラ（Chlorella stigmatophora）、クロレラ・バニエリィ（Chlorella vanniellii）、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）、クロレラ・ブルガリス・エフ・テルシア（Chlorella vulgaris f. tertia）、クロレラ・ブルガリス・バー・アイリディス（Chlorella vulgaris var. airidis）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス（Chlorella vulgaris var. vulgaris）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・テルシア（Chlorella vulgaris var. vulgaris f. tertia）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・ビリディス（Chlorella vulgaris var. vulgaris f. viridis）、クロレラ・シャンセラ（Chlorella xanthella）及びクロレラ・ゾフィンジエンシス（Chlorella zofingiensis）を備える群から選択されることを特徴とする、請求項72に記載の微生物。
【請求項７４】
前記の種が、クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）、クロレラ・ミヌティッシマ（Chlorella minutissima）、クロレラ・エメルソニイ（Chlorella emersonii）、クロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana）、クロレラ・エリプソイデア（Chlorella ellipsoidea）またはクロレラ属の種（Chlorella sp.）であることを特徴とする、請求項７３記載の微生物
【請求項７５】
前記外来性遺伝子が、プロモーターと作動可能に結合する遺伝子であって、前記プロモーターが刺激への応答によって誘導又は抑制されることを特徴とする、請求項65記載の微生物。
【請求項７６】
前記刺激が、外部から投入された小さい分子、熱、寒さおよび光を備える群から選択されることを特徴とする、請求項75に記載の微生物。
【請求項７７】
前記外来遺伝子が、細胞区画で発現することを特徴とする、請求項65記載の微生物。
【請求項７８】
前記細胞区画が、葉緑体およびミトコンドリアを備えるグループから選択されることを特徴とする、請求項77に記載の微生物。
【請求項７９】
前記外来の遺伝子が脂肪酸アシルACPチオエステラーゼをコードすることを特徴とする、請求項65に記載の微生物。
【請求項８０】
外来遺伝子によってコードされる前記チオエステラーゼが、アシル担体タンパク質（ACP）より8からの18の炭素数の脂肪酸への切断を触媒することを特徴とする、請求項79に記載の微生物。
【請求項８１】
外来遺伝子によってコードされる前記チオエステラーゼは、ACPを10から14の炭素数の脂肪酸への切断を触媒することを特徴とする、請求項80に記載の微生物。
【請求項８２】
外来遺伝子によってコードされる前記チオエステラーゼは、12の炭素数の脂肪酸への切断を触媒すること特徴とする、請求項82に記載の微生物。
【請求項８３】
前記外来の遺伝子が、脂肪酸アシルCoA/アルデヒド還元酵素をコードすることを特徴とする、請求項65に記載の微生物。
【請求項８４】
前記還元酵素が、外来遺伝子によってコードされ、20から30の炭素数の脂肪酸アシルCoAより対応するアルコールへの還元を触媒することを特徴とする、請求項83記載の微生物。
【請求項８５】
前記還元酵素が、外来遺伝子によってコードされ、8から18の炭素数の脂肪酸アシルCoAからアルコールへの還元を触媒することを特徴とする、請求項83記載の微生物。
【請求項８６】
前記還元酵素が、外来遺伝子によってコードされ、10から14の炭素数の脂肪酸アシルCoAからアルコールへの還元を触媒することを特徴とする、請求項85記載の微生物。
【請求項８７】
前記還元酵素が、外来遺伝子によってコードされ、12の炭素数の脂肪酸アシルCoAからドデカノールへの還元を触媒することを特徴とする、請求項86に記載の微生物。
【請求項８８】
前記外来遺伝子が、脂肪酸アシルCoA還元酵素をコードすることを特徴とする、請求項65に記載の微生物。
【請求項８９】
前記還元酵素が、外来遺伝子によってコードされ、8から18の炭素数の脂肪酸アシルCoAより対応するアルデヒドへの還元を触媒することを特徴とする、請求項88記載の微生物。
【請求項９０】
前記還元酵素が、外来遺伝子によってコードされ、12の炭素数の脂肪酸アシルCoAからドデカノールへの還元を触媒することを特徴とする、請求項86に記載の微生物。
【請求項９１】
前記微生物が、少なくとも一つの外来のショ糖資化性遺伝子をさらに含むことを特徴とする、請求項65記載の微生物。
【請求項９２】
2つの外来遺伝子を含む微生物であって、前記外来遺伝子の第1遺伝子が脂肪酸アシルACPチオエステラーゼをコードし、前記外来遺伝子の第2の遺伝子が脂肪酸アシルCoA還元酵素、脂肪酸アシルCoA/アルデヒド還元酵素およびアシル担体タンパク質を備える群から選択されるタンパク質をコードする微生物。
【請求項９３】
前記微生物がクロレラ属の種であることを特徴とする、請求項92に記載の微生物。
【請求項９４】
前記微生物が油性の酵母であることを特徴とする、請求項92に記載の微生物。
【請求項９５】
前記油性酵母が、クリプトコッカス・クルバツス（Cryptococcus curvatus）、クリプトコッカス・テリコルス（Cryptococcus terricolus）、カンジタ属の一種（Candida sp.）、リポマイセス・スタルケィ（Lipomyces starkeyi）、リポマイセス・リポファ（Lipomyces lipofer）、エンドマイコプシス・バルナリス（Endomycopsis vernalis）、ロドトルラ・グルティニス（Rhodotorula glutinis）、ロドトルラ・グルシリス（Rhodotorula gracilis）およびヤロウィア・リポリティリカ（Yarrowia lipolytica）を備える群から選択されることを特徴とする、請求項94に記載の微生物
【請求項９６】
前記微生物が真菌であることを特徴とする、請求項92に記載の微生物。
【請求項９７】
前記真菌が、モルティエレラ（Mortierella）属の一種、モルティエレラ・ビナセア（Mortierrla vinacea）、モルティエレラ・アルペン（Mortierella alpine）、フィリシウム・デバリアヌム（Pythium debaryanum）、ケカビ属シルシネロイデス（Mucor circinelloides）、アスペルギルス・オクラセウス（Aspergillus ochraceus）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）、ペネシリウム・イイラシヌム（Pennicillium iilacinum）、ヘンセヌロ（Hensenulo）属の一種、カエトミウム（Chaetomium）属の一種、クラドスポリウム（Cladosporium）属の一種、マルブランシェア（Malbranchea）属の一種、リゾプス（Rhizopus）属の一種およびフィシウム（Pythium）属の一種のを備える群から選択されることを特徴とする、請求項96に記載の微生物
【請求項９８】
前記微生物が、表1にリストされる微細藻類を備えるグループから選択されることを特徴とする、請求項92に記載の方法。
【請求項９９】
前記微生物が、クロレラ属の種であることを特徴とする、請求項98に記載の方法。
【請求項１００】
前記の種が、クロレラ・アニトラタ（Chlorella anitrata）、クロレラ・アンタルクティカ（ Chlorella antarctica）、クロレラ・アウレオビリディス（ Chlorella aureoviridis）、クロレラ・キャンディダ（ Chlorella Candida）、クロレラ・キャプスラタ（Chlorella capsulata）、クロレラ・デシカッタ（Chlorella desiccata）、クロレラ・エリプソイデア（Chlorella ellipsoidea）、クロレラ・エメルソニイ（Chlorella emersonii）、クロレラ・フスカ（Chlorella fusca）、クロレラ・フスカ・バー・バクオレタ（Chlorella fusca var. vacuolata）, クロレラ・グルコトロファ（Chlorella glucotropha）、クロレラ・インフシオナム（Chlorella infusionum）、クロレラ・インフシオナム・バー・アクトフィラ（Chlorella infusionum var. Actophila）、クロレラ・インフシオナム・バー・アウェノフィラ（Chlorella infusionum var.Auxenophila）, クロレラ・ケッセレリ（Chlorella kessleri）、クロレラ・ルテオビリディス（Chlorella luteoviridis）、クロレラ・ルテオビリディス・バー・アウレオビリディス（Chlorella luteoviridis var. aureoviridis）、クロレラ・ルテオヴィリディス・バー・ルテスセンス（Chlorella luteoviridis var.Lutescens）、クロレラ・ミニアタ（Chlorella miniata）、クロレラ・ミヌティッシマ（Chlorella minutissima）、クロレラ・ムタビリス（Chlorella mutabilis）、クロレラ・ノクツルナ（Chlorella nocturna）、クロレラ・パルバ（Chlorella parva）、クロレラ・ファトフィリア（Chlorella photophila）、クロレラ・プリングシェイミィ（Chlorella pringsheimii）、クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）、クロレラ・ピレノイドサ（Chlorella pyrenoidosa）、クロレラ・レグラリス（Chlorella regularis）、クロレラ・レグラリス・バー・ミニマ（Chlorella regularis var. minima）、クロレラ・レグラリス・バー・ウンブリカタ（Chlorella regularis var. umbricata）、クロレラ・レイシグリィ（Chlorella reisiglii）、クロレラ・サッカロフィア（Chlorella saccharophila）、クロレラ・サッカロフィア・バー・エリプソイデア（ Chlorella saccharophila var. ellipsoidea）、クロレラ・サリナ（Chlorella salina）、クロレラ・シンプレックス（Chlorella simplex）、クロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana）、クロレラ属の種（Chlorella sp.）、クロレラ・スファエリカ（Chlorella sphaerica）、クロレラ・スティグマトフォラ（Chlorella stigmatophora）、クロレラ・バニエリィ（Chlorella vanniellii）、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）、クロレラ・ブルガリス・エフ・テルシア（Chlorella vulgaris f. tertia）、クロレラ・ブルガリス・バー・アイリディス（Chlorella vulgaris var. airidis）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス（Chlorella vulgaris var. vulgaris）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・テルシア（Chlorella vulgaris var. vulgaris f. tertia）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・ビリディス（Chlorella vulgaris var. vulgaris f. viridis）、クロレラ・シャンセラ（Chlorella xanthella）及びクロレラ・ゾフィンジエンシス（Chlorella zofingiensis）を備える群から選択されることを特徴とする、請求項99に記載の微生物。
【請求項１０１】
前記の種が、クロレラ・ミヌティッシマ（Chlorella minutissima）、クロレラ・エメルソニイ（Chlorella emersonii）、クロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana、クロレラ・エリプソイデア（Chlorella ellipsoidea）、クロレラ属の種（Chlorella sp.）またはクロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）であることを特徴とする、請求項100に記載の微生物。
【請求項１０２】
前記2つの外来遺伝子が、作動可能にプロモーターと連結する遺伝子であって、前記プロモーターが刺激に応答して誘導されることを特徴とする、請求項92に記載の微生物。
【請求項１０３】
前記各々のプロモーターが同一の刺激に応答して誘導されうることを特徴とする、請求項102に記載の微生物。
【請求項１０４】
前記チオエステラーゼが、第１の外来遺伝子によってコードされ、8から18の炭素数の脂肪酸のACPからの切断を触媒することを特徴とする、請求項92に記載の微生物。
【請求項１０５】
前記第2の外来遺伝子が、脂肪酸アシルCoA/アルデヒド還元酵素をコードする遺伝子であって、前記還元酵素が8から18炭素数の脂肪酸アシルCoAを対応するアルコールに還元することを特徴とする、請求項104に記載の微生物。
【請求項１０６】
前記チオエステラーゼと前記還元酵素とが同一炭素鎖に作用する微生物であって、前記チオエステラーゼが、第1の外来遺伝子にコードされ、10から14の炭素数の脂肪酸をACPから切断することを触媒し、前記還元酵素が第2の外来遺伝子にコードされ、10から14の炭素数の脂肪酸アシルCoAからアルコールへの還元を触媒することを特徴とする、請求項105に記載の微生物。
【請求項１０７】
前記チオエステラーゼが、第1外来遺伝子にコードされ、12炭素数の脂肪酸のACPからの切断を触媒し、前記還元酵素が、第2の外生の遺伝子にコードされ、12-カーボン脂肪酸アシルCoAからドデカノールへの還元を触媒することを特徴とする、請求項106に記載の微生物。
【請求項１０８】
前記第2の外来遺伝子が、脂肪アセチルCoA還元酵素をコードし、前記還元酵素が8から18の炭素数の脂肪酸アシルCoAから対応するアルデヒドへの還元を触媒する、請求項104に記載の微生物。
【請求項１０９】
前記第2の外来遺伝子が、脂肪酸アシルCoA還元酵素をコードする請求項92記載の微生物であって、さらに脂肪酸アルデヒドデカルボニラーゼをコードする第3の外来遺伝子を含む微生物。
【請求項１１０】
前記チオエステラーゼと前記還元酵素と前記デカボニラーゼとが同一炭素鎖長に作用する微生物であって、第１外来遺伝子にコードされ、8から18の炭素数の脂肪酸のACPからの切断を触媒する前記チオエステラーゼと、第二外来遺伝子にコードされ、8から18の炭素数の脂肪酸アシルCoAから対応する脂肪酸アルデヒドへの還元を触媒する前記還元酵素と、第3外来遺伝子にコードされ、8から18の炭素数の脂肪酸アルデヒドから対応するアルカンに転換する前記デカルボニラーゼを含む、請求項109に記載する微生物。
【請求項１１１】
前記微生物が、さらに一つ以上の外来のショ糖資化性遺伝子を含むことを特徴とする、請求項92に記載の微生物。
【請求項１１２】
前記第2の外来遺伝子が、アシル担体タンパク質をコードし、前記アシル担体タンパク質が自然に同時発現する、請求項92に記載の微生物。
【請求項１１３】
前記第2の外来遺伝子がアシル担体タンパク質をコードし、脂肪酸アシルCoA還元酵素および脂肪酸アシルCoA/アルデヒド還元酵素を備える群から選択した酵素をコードする第3の外来遺伝子をさらに含む、請求項92に記載の微生物。
【請求項１１４】
前記第3の遺伝子が脂肪酸アシルCoA還元酵素をコードし、脂肪酸アルデヒドデカルボニラーゼをコードする第4の外来遺伝子をさらに含む、請求項113に記載の微生物。
【請求項１１５】
微生物群で分子を生産する方法であって、前記培養方法は微生物群を培地で培養する工程からなり、前記微生物は、
(i) 脂肪酸アシルACPチオエステラーゼをコードしている第1の外来の遺伝子および（ii）脂肪酸アシルCoA/アルデヒド還元酵素をコードしている第2の外来の遺伝子を含み、
ならびに、前記微生物は、脂肪酸に結合されるアシル担体タンパク質（ACP）、ACPから脂肪酸を切断する反応を触媒する脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ、更なる処理で、脂肪酸アシルCoA、及びアシルCoAのアルコールへの還元を触媒する脂肪酸アシルCoA/アルデヒド還元酵素を合成する、生産方法。
【請求項１１６】
前記微生物が、微細藻類である、請求項115に記載の方法。
【請求項１１７】
前記微生物が、油性酵母である、請求項115に記載の方法。
【請求項１１８】
前記油性酵母が、クリプトコッカス・クルバツス（Cryptococcus curvatus）、クリプトコッカス・テリコルス（Cryptococcus terricolus）、カンジタ属の一種（Candida sp.）、リポマイセス・スタルケィ（Lipomyces starkeyi）、リポマイセス・リポファ（Lipomyces lipofer）、エンドマイコプシス・バルナリス（Endomycopsis vernalis）、ロドトルラ・グルティニス（Rhodotorula glutinis）、ロドトルラ・グルシリス（Rhodotorula gracilis）およびヤロウィア・リポリティリカ（Yarrowia lipolytica）を備える群から選択されることを特徴とする、請求項117記載の方法。
【請求項１１９】
前記微生物が、真菌であることを特徴そる、請求項115に記載のほう方法。
【請求項１２０】
前記真菌が、モルティエレラ（Mortierella）属の一種、モルティエレラ・ビナセア（Mortierrla vinacea）、モルティエレラ・アルペン（Mortierella alpine）、フィリシウム・デバリアヌム（Pythium debaryanum）、ケカビ属シルシネロイデス（Mucor circinelloides）、アスペルギルス・オクラセウス（Aspergillus ochraceus）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）、ペネシリウム・イイラシヌム（Pennicillium iilacinum）、ヘンセヌロ（Hensenulo）属の一種、カエトミウム（Chaetomium）属の一種、クラドスポリウム（Cladosporium）属の一種、マルブランシェア（Malbranchea）属の一種、リゾプス（Rhizopus）属の一種およびフィシウム（Pythium）属の一種のを備える群から選択されることを特徴とする、請求項119に記載の方法。
【請求項１２１】
前記微生物が、表1にリストされる微細藻類を備えるグループから選択されることを特徴とする、請求項115に記載の方法。
【請求項１２２】
前記微生物が、クロレラ属の種であることを特徴とする、請求項121記載の方法。
【請求項１２３】
前記の種が、クロレラ・アニトラタ（Chlorella anitrata）、クロレラ・アンタルクティカ（ Chlorella antarctica）、クロレラ・アウレオビリディス（ Chlorella aureoviridis）、クロレラ・キャンディダ（ Chlorella Candida）、クロレラ・キャプスラタ（Chlorella capsulata）、クロレラ・デシカッタ（Chlorella desiccata）、クロレラ・エリプソイデア（Chlorella ellipsoidea）、クロレラ・エメルソニイ（Chlorella emersonii）、クロレラ・フスカ（Chlorella fusca）、クロレラ・フスカ・バー・バクオレタ（Chlorella fusca var. vacuolata）, クロレラ・グルコトロファ（Chlorella glucotropha）、クロレラ・インフシオナム（Chlorella infusionum）、クロレラ・インフシオナム・バー・アクトフィラ（Chlorella infusionum var. Actophila）、クロレラ・インフシオナム・バー・アウェノフィラ（Chlorella infusionum var.Auxenophila）, クロレラ・ケッセレリ（Chlorella kessleri）、クロレラ・ルテオビリディス（Chlorella luteoviridis）、クロレラ・ルテオビリディス・バー・アウレオビリディス（Chlorella luteoviridis var. aureoviridis）、クロレラ・ルテオヴィリディス・バー・ルテスセンス（Chlorella luteoviridis var.Lutescens）、クロレラ・ミニアタ（Chlorella miniata）、クロレラ・ミヌティッシマ（Chlorella minutissima）、クロレラ・ムタビリス（Chlorella mutabilis）、クロレラ・ノクツルナ（Chlorella nocturna）、クロレラ・パルバ（Chlorella parva）、クロレラ・ファトフィリア（Chlorella photophila）、クロレラ・プリングシェイミィ（Chlorella pringsheimii）、クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）、クロレラ・ピレノイドサ（Chlorella pyrenoidosa）、クロレラ・レグラリス（Chlorella regularis）、クロレラ・レグラリス・バー・ミニマ（Chlorella regularis var. minima）、クロレラ・レグラリス・バー・ウンブリカタ（Chlorella regularis var. umbricata）、クロレラ・レイシグリィ（Chlorella reisiglii）、クロレラ・サッカロフィア（Chlorella saccharophila）、クロレラ・サッカロフィア・バー・エリプソイデア（ Chlorella saccharophila var. ellipsoidea）、クロレラ・サリナ（Chlorella salina）、クロレラ・シンプレックス（Chlorella simplex）、クロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana）、クロレラ属の種（Chlorella sp.）、クロレラ・スファエリカ（Chlorella sphaerica）、クロレラ・スティグマトフォラ（Chlorella stigmatophora）、クロレラ・バニエリィ（Chlorella vanniellii）、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）、クロレラ・ブルガリス・エフ・テルシア（Chlorella vulgaris f. tertia）、クロレラ・ブルガリス・バー・アイリディス（Chlorella vulgaris var. airidis）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス（Chlorella vulgaris var. vulgaris）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・テルシア（Chlorella vulgaris var. vulgaris f. tertia）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・ビリディス（Chlorella vulgaris var. vulgaris f. viridis）、クロレラ・シャンセラ（Chlorella xanthella）及びクロレラ・ゾフィンジエンシス（Chlorella zofingiensis）を備える群から選択されることを特徴とする、請求項122に記載の方法
【請求項１２４】
前記の種が、クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）、クロレラ・ミヌティッシマ（Chlorella minutissima）、クロレラ・エメルソニイ（Chlorella emersonii）、クロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana）、クロレラ・エリプソイデア（Chlorella ellipsoidea）またはクロレラ属の種（Chlorella sp.）であることを特徴とする、請求項123記載の微生物。
【請求項１２５】
前記培地が、グリセロールを含むことを特徴とする、請求項115に記載の方法。
【請求項１２６】
前記グリセロールが、エステル転移反応の工程の副産物である、請求項125記載の方法。
【請求項１２７】
前記培地が、グリセロール及び一つ以上のグリセロール以外の固定炭素源を含むことを特徴とする、請求項125記載の方法。
【請求項１２８】
少なくとも一つのグリセロール以外の固定された前記炭素源が、ショ糖であることを特徴とする、請求項127記載の方法。
【請求項１２９】
前記グリセロールの全ておよび少なくとも一つのグリセロール以外の前記炭素源の全てが、微生物の発酵の開始期に提供されることを特徴とする、請求項127に記載の方法。
【請求項１３０】
前記グリセロール及び少なくとも一つのグリセロール以外の固定された前記炭素源が、発酵期を過ぎて、予め定められた量を微生物に供給されることを特徴とする、請求項127に記載の方法。
【請求項１３１】
(a) グリセロールが、第1の期間に一つ以上のグリセロール以外の固定炭素源がない場合、微生物に提供される工程と、
(b) 一つ以上のグリセロール以外の固定された前記炭素源は、第1の期間の終わりに形成される工程と、
及び（c）微生物が、一つ以上のグリセロール以外の固定炭素源がある場合には、第2の期間中培養される工程と、を含むことを特徴とする、請求項127記載の方法。
【請求項１３２】
前記外来遺伝子が、作動可能にプロモーターと連結し、前記プロモーターが刺激に応答して誘導される、方法であって、
第1の刺激を提供する工程と、
及び、アルコールを生産するために、第1の刺激存在下で、第1の期間中の微生物群を培養する工程と、をさらに含む請求項115に記載の方法。
【請求項１３３】
水性バイオマスからアルコールを抽出する工程をさらに含む、請求項132に記載の方法。
【請求項１３４】
第1の外来の遺伝子によってコードされる前記チオエステラーゼが8から18の炭素数の脂肪酸をACPから切断することを触媒し、第2の外来遺伝子によってコードされる前記還元酵素が8から18の炭素数の脂肪酸アシルCoAを対応するアルコールに還元する反応し、前記チオエステラーゼと前記還元酵素が同一炭素鎖に作用することを特徴とする、請求項115に記載の方法。
【請求項１３５】
第1の外来の遺伝子によってコードされる前記チオエステラーゼがACPより10から14の炭素数の脂肪酸を切断することを触媒し、及び第2の外来遺伝子によってコードされる前記還元酵素が10から14の炭素数の脂肪酸アシルCoAを対応するアルコールに還元する反応し、前記チオエステラーゼと前記還元酵素が同一炭素鎖に作用することを特徴とする、請求項134に記載の方法。
【請求項１３６】
第1の外来遺伝子によってコードされる前記チオエステラーゼがACPより12炭素数の脂肪酸を切断することを触媒し、第2の外来遺伝子にコードされる前記還元酵素が12炭素数の脂肪酸アシルCoAよりドデカノールに還元することを触媒することを特徴とする、請求項135に記載の方法。
【請求項１３７】
前記微生物がアシル担体タンパク質をコードする第3の外来遺伝子をさらに含むことを特徴とする、請求項115記載の方法。
【請求項１３８】
前記第3の外来遺伝子がアシル担体タンパク質をコードし、前記アシル担体タンパク質が脂肪酸アシルACPチオエステラーゼと自然に共同発現することを特徴とする、請求項137記載の方法。
【請求項１３９】
微生物群で脂肪分子を生産する方法であって、前記培養方法は微生物群を培地で培養する工程を含み、前記微生物は、
(i) 脂肪酸アシルACPチオエステラーゼをコードしている第1の外来の遺伝子および（ii）脂肪酸アシルCoA還元酵素をコードしている第2の外来の遺伝子を含み、
ならびに、前記微生物は、脂肪酸に結合されるアシル担体タンパク質（ACP）、ACPから脂肪酸を切断する反応を触媒する脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ、更なる処理で、脂肪酸アシルCoA、及びアシルCoAのアルコールへの還元を触媒する脂肪酸アシルCoA/アルデヒド還元酵素を合成する、生産方法。
【請求項１４０】
前記微生物が、微細藻類であることを特徴とする、請求項139に記載の方法。
【請求項１４１】
前記微生物が、油性酵母であることを特徴とする、請求項139に記載の方法。
【請求項１４２】
前記油性酵母が、クリプトコッカス・クルバツス（Cryptococcus curvatus）、クリプトコッカス・テリコルス（Cryptococcus terricolus）、カンジタ属の一種（Candida sp.）、リポマイセス・スタルケィ（Lipomyces starkeyi）、リポマイセス・リポファ（Lipomyces lipofer）、エンドマイコプシス・バルナリス（Endomycopsis vernalis）、ロドトルラ・グルティニス（Rhodotorula glutinis）、ロドトルラ・グルシリス（Rhodotorula gracilis）およびヤロウィア・リポリティリカ（Yarrowia lipolytica）を備える群から選択されることを特徴とする、請求項139に記載の方法
【請求項１４３】
前記真菌が、真菌であることを特徴とする、請求項139に記載の方法。
【請求項１４４】
前記真菌が、モルティエレラ（Mortierella）属の一種、モルティエレラ・ビナセア（Mortierrla vinacea）、モルティエレラ・アルペン（Mortierella alpine）、フィリシウム・デバリアヌム（Pythium debaryanum）、ケカビ属シルシネロイデス（Mucor circinelloides）、アスペルギルス・オクラセウス（Aspergillus ochraceus）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）、ペネシリウム・イイラシヌム（Pennicillium iilacinum）、ヘンセヌロ（Hensenulo）属の一種、カエトミウム（Chaetomium）属の一種、クラドスポリウム（Cladosporium）属の一種、マルブランシェア（Malbranchea）属の一種、リゾプス（Rhizopus）属の一種およびフィシウム（Pythium）属の一種のを備える群から選択されることを特徴とする、請求項143に記載の方法
【請求項１４５】
前記微生物が、表1にリストされる微生物を備えるグループから選択されることを特徴とする、請求項139に記載の方法。
【請求項１４６】
前記微生物が、クロレラ属の種であることを特徴とする、請求項145記載の方法。
【請求項１４７】
前記種が、クロレラ・アニトラタ（Chlorella anitrata）、クロレラ・アンタルクティカ（ Chlorella antarctica）、クロレラ・アウレオビリディス（ Chlorella aureoviridis）、クロレラ・キャンディダ（ Chlorella Candida）、クロレラ・キャプスラタ（Chlorella capsulata）、クロレラ・デシカッタ（Chlorella desiccata）、クロレラ・エリプソイデア（Chlorella ellipsoidea）、クロレラ・エメルソニイ（Chlorella emersonii）、クロレラ・フスカ（Chlorella fusca）、クロレラ・フスカ・バー・バクオレタ（Chlorella fusca var. vacuolata）, クロレラ・グルコトロファ（Chlorella glucotropha）、クロレラ・インフシオナム（Chlorella infusionum）、クロレラ・インフシオナム・バー・アクトフィラ（Chlorella infusionum var. Actophila）、クロレラ・インフシオナム・バー・アウェノフィラ（Chlorella infusionum var.Auxenophila）, クロレラ・ケッセレリ（Chlorella kessleri）、クロレラ・ルテオビリディス（Chlorella luteoviridis）、クロレラ・ルテオビリディス・バー・アウレオビリディス（Chlorella luteoviridis var. aureoviridis）、クロレラ・ルテオヴィリディス・バー・ルテスセンス（Chlorella luteoviridis var.Lutescens）、クロレラ・ミニアタ（Chlorella miniata）、クロレラ・ミヌティッシマ（Chlorella minutissima）、クロレラ・ムタビリス（Chlorella mutabilis）、クロレラ・ノクツルナ（Chlorella nocturna）、クロレラ・パルバ（Chlorella parva）、クロレラ・ファトフィリア（Chlorella photophila）、クロレラ・プリングシェイミィ（Chlorella pringsheimii）、クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）、クロレラ・ピレノイドサ（Chlorella pyrenoidosa）、クロレラ・レグラリス（Chlorella regularis）、クロレラ・レグラリス・バー・ミニマ（Chlorella regularis var. minima）、クロレラ・レグラリス・バー・ウンブリカタ（Chlorella regularis var. umbricata）、クロレラ・レイシグリィ（Chlorella reisiglii）、クロレラ・サッカロフィア（Chlorella saccharophila）、クロレラ・サッカロフィア・バー・エリプソイデア（ Chlorella saccharophila var. ellipsoidea）、クロレラ・サリナ（Chlorella salina）、クロレラ・シンプレックス（Chlorella simplex）、クロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana）、クロレラ属の種（Chlorella sp.）、クロレラ・スファエリカ（Chlorella sphaerica）、クロレラ・スティグマトフォラ（Chlorella stigmatophora）、クロレラ・バニエリィ（Chlorella vanniellii）、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）、クロレラ・ブルガリス・エフ・テルシア（Chlorella vulgaris f. tertia）、クロレラ・ブルガリス・バー・アイリディス（Chlorella vulgaris var. airidis）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス（Chlorella vulgaris var. vulgaris）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・テルシア（Chlorella vulgaris var. vulgaris f. tertia）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・ビリディス（Chlorella vulgaris var. vulgaris f. viridis）、クロレラ・シャンセラ（Chlorella xanthella）及びクロレラ・ゾフィンジエンシス（Chlorella zofingiensis）を備える群から選択されることを特徴とする、請求項146に記載の方法。
【請求項１４８】
前記の種が、クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）、クロレラ・ミヌティッシマ（Chlorella minutissima）、クロレラ・エメルソニイ（Chlorella emersonii）、クロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana）、クロレラ・エリプソイデア（Chlorella ellipsoidea）またはクロレラ属の種（Chlorella sp.）であることを特徴とする、請求項147に記載の微生物。
【請求項１４９】
前記外来遺伝子が、作動可能にプロモーターと連結し、前記プロモーターが刺激に応答して誘導される、方法であって、
第1の刺激を提供する工程、
及び、アルデヒドを生産するために第1の刺激がある場合には、第1の期間の間の微生物群を培養する工程、をさらに含む請求項115に記載の方法。
【請求項１５０】
水性バイオマスからアルデヒドを抽出する工程をさらに含む、請求項149に記載の方法。
【請求項１５１】
第1の外来遺伝子によってコードされるチオエステラーゼが8から18の炭素数の脂肪酸のACPからの切断を触媒し、第2の外来遺伝子によってコードされる還元酵素が8から18の炭素数の脂肪酸アシルCoAより対応するアルデヒドに還元し、前記チオエステラーゼと前記還元酵素が同一炭素鎖上に作用することを特徴とする、請求項139に記載の方法。
【請求項１５２】
前記微生物が、アルデヒドよりアルカンへの転換を触媒する脂肪酸アルデヒドデカボニラーゼをコードする第3の遺伝子をさらに含むことを特徴とする、請求項139に記載の方法。
【請求項１５３】
前記外来遺伝子が、作動可能にプロモーターと連結し、前記プロモーターが刺激に応答して誘導される方法であって、
第1の刺激を提供する工程、
及びアルカンを生産するために第1の刺激がある場合には、第1の期間の間の微生物群を培養する工程、をさらに含む請求項152に記載の方法。
【請求項１５４】
水性バイオマスからアルカンを抽出する工程をさらに含む、請求項153に記載の方法。
【請求項１５５】
第1の外来の遺伝子によってコードされる前記チオエステラーゼが8から18の炭素数の脂肪酸をACPから切断することを触媒し、第2の外来遺伝子によってコードされる前記還元酵素が8から18の炭素数の脂肪酸アシルCoAを対応するアルコールに還元する反応を触媒し、第3の外来遺伝子によってコードされるデカルボニラーゼが8から18の炭素数のアルデヒドを対応するアルカンへ転換する反応を触媒し、前記チオエステラーゼ、前記還元酵素及び前記デカルボニラーゼが同一炭素鎖に作用することを特徴とする、請求項152に記載の方法。
【請求項１５６】
前記微生物が、アシル担体タンパク質をコードする第3の外来遺伝子をさらに含む、請求項139に記載の方法。
【請求項１５７】
第3の外来遺伝子にコードされる前記アシル担体タンパク質が、脂肪酸アシルACPチオエステラーゼと自然に共同発現する、請求項156に記載の方法。
【請求項１５８】
前記微生物が、アルデヒドよりアルカンへの転換を触媒する脂肪酸アルデヒドデカルボニラーゼをコードする第4の遺伝子をさらに含むことを特徴とする、請求項156に記載の方法。
【請求項１５９】
前記培地がグリセロールを含む、請求項139に記載の方法。
【請求項１６０】
前記グリセロールが、エステル転移反応の工程の副産物である、請求項159記載の方法。
【請求項１６１】
前記培地が、グリセロール及び一つ以上のグリセロール以外の固定炭素源を含むことを特徴とする、請求項159に記載の方法。
【請求項１６２】
一つ以上のグリセロール以外の固定された前記炭素源が、ショ糖であることを特徴とする、請求項127記載の方法。
【請求項１６３】
前記グリセロールの全ておよび少なくとも一つのグリセロール以外の前記炭素源の全てが、微生物の発酵の開始期に提供されることを特徴とする、請求項161に記載の方法。
【請求項１６４】
前記グリセロール及び少なくとも一つのグリセロール以外の固定された前記炭素源が、発酵時期を過ぎて、予め定められた量を微生物に供給されることを特徴とする、請求項161に記載の方法。
【請求項１６５】
(a) グリセロールが、第1の期間に一つ以上のグリセロール以外の固定炭素源がない場合に、微生物に提供される工程と、
(b) 一つ以上のグリセロール以外の固定炭素源が、第1の期間の終わりに提供される工程と、
及び(c)微生物が一つ以上のグリセロール以外の固定炭素源がある場合に、第2の期間中培養される工程と、を含むことを特徴とする、請求項161に記載の方法。
【請求項１６６】
培地中で脂肪を生産する微生物の群を培養する工程を含む、微生物群中の特定の炭素鎖を有する脂肪酸分子を生産する方法であって、
前記微生物が特定の炭素鎖への活性を有する脂肪酸アシルACPチオエステラーゼをコードする外来の遺伝子を含み、
並びに前記微生物がアシル担体タンパク質と及びチオエステラーゼを合成し、
前記アシル担体タンパク質は脂肪酸と結合し、
前記チオエステラーゼは脂肪酸を特定の炭素鎖へ合成するときにACPより脂肪酸を切断する反応を触媒する、生産方法。
【請求項１６７】
前記微生物が、微細藻類であることを特徴とする、請求項166に記載の方法。
【請求項１６８】
前記微生物が、油性酵母であることを特徴とする、請求項166に記載の方法。
【請求項１６９】
前記油性酵母が、クリプトコッカス・クルバツス（Cryptococcus curvatus）、クリプトコッカス・テリコルス（Cryptococcus terricolus）、カンジタ属の一種（Candida sp.）、リポマイセス・スタルケィ（Lipomyces starkeyi）、リポマイセス・リポファ（Lipomyces lipofer）、エンドマイコプシス・バルナリス（Endomycopsis vernalis）、ロドトルラ・グルティニス（Rhodotorula glutinis）、ロドトルラ・グルシリス（Rhodotorula gracilis）およびヤロウィア・リポリティリカ（Yarrowia lipolytica）を備える群から選択されることを特徴とする、請求項168に記載の方法。
【請求項１７０】
前記真菌が、真菌であることを特徴とする、請求項166に記載の方法。
【請求項１７１】
前記真菌が、モルティエレラ（Mortierella）属の一種、モルティエレラ・ビナセア（Mortierrla vinacea）、モルティエレラ・アルペン（Mortierella alpine）、フィリシウム・デバリアヌム（Pythium debaryanum）、ケカビ属シルシネロイデス（Mucor circinelloides）、アスペルギルス・オクラセウス（Aspergillus ochraceus）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）、ペネシリウム・イイラシヌム（Pennicillium iilacinum）、ヘンセヌロ（Hensenulo）属の一種、カエトミウム（Chaetomium）属の一種、クラドスポリウム（Cladosporium）属の一種、マルブランシェア（Malbranchea）属の一種、リゾプス（Rhizopus）属の一種およびフィシウム（Pythium）属の一種のを備える群から選択されることを特徴とする、請求項170に記載の方法。
【請求項１７２】
前記微生物が、表1にリストされる微生物を備えるグループから選択されることを特徴とする、請求項166に記載の方法。。
【請求項１７３】
前記微生物が、クロレラ属の種であることを特徴とする、請求項172に記載の方法。
【請求項１７４】
前記種が、クロレラ・アニトラタ（Chlorella anitrata）、クロレラ・アンタルクティカ（ Chlorella antarctica）、クロレラ・アウレオビリディス（ Chlorella aureoviridis）、クロレラ・キャンディダ（ Chlorella Candida）、クロレラ・キャプスラタ（Chlorella capsulata）、クロレラ・デシカッタ（Chlorella desiccata）、クロレラ・エリプソイデア（Chlorella ellipsoidea）、クロレラ・エメルソニイ（Chlorella emersonii）、クロレラ・フスカ（Chlorella fusca）、クロレラ・フスカ・バー・バクオレタ（Chlorella fusca var. vacuolata）, クロレラ・グルコトロファ（Chlorella glucotropha）、クロレラ・インフシオナム（Chlorella infusionum）、クロレラ・インフシオナム・バー・アクトフィラ（Chlorella infusionum var. Actophila）、クロレラ・インフシオナム・バー・アウェノフィラ（Chlorella infusionum var.Auxenophila）, クロレラ・ケッセレリ（Chlorella kessleri）、クロレラ・ルテオビリディス（Chlorella luteoviridis）、クロレラ・ルテオビリディス・バー・アウレオビリディス（Chlorella luteoviridis var. aureoviridis）、クロレラ・ルテオヴィリディス・バー・ルテスセンス（Chlorella luteoviridis var.Lutescens）、クロレラ・ミニアタ（Chlorella miniata）、クロレラ・ミヌティッシマ（Chlorella minutissima）、クロレラ・ムタビリス（Chlorella mutabilis）、クロレラ・ノクツルナ（Chlorella nocturna）、クロレラ・パルバ（Chlorella parva）、クロレラ・ファトフィリア（Chlorella photophila）、クロレラ・プリングシェイミィ（Chlorella pringsheimii）、クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）、クロレラ・ピレノイドサ（Chlorella pyrenoidosa）、クロレラ・レグラリス（Chlorella regularis）、クロレラ・レグラリス・バー・ミニマ（Chlorella regularis var. minima）、クロレラ・レグラリス・バー・ウンブリカタ（Chlorella regularis var. umbricata）、クロレラ・レイシグリィ（Chlorella reisiglii）、クロレラ・サッカロフィア（Chlorella saccharophila）、クロレラ・サッカロフィア・バー・エリプソイデア（ Chlorella saccharophila var. ellipsoidea）、クロレラ・サリナ（Chlorella salina）、クロレラ・シンプレックス（Chlorella simplex）、クロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana）、クロレラ属の種（Chlorella sp.）、クロレラ・スファエリカ（Chlorella sphaerica）、クロレラ・スティグマトフォラ（Chlorella stigmatophora）、クロレラ・バニエリィ（Chlorella vanniellii）、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）、クロレラ・ブルガリス・エフ・テルシア（Chlorella vulgaris f. tertia）、クロレラ・ブルガリス・バー・アイリディス（Chlorella vulgaris var. airidis）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス（Chlorella vulgaris var. vulgaris）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・テルシア（Chlorella vulgaris var. vulgaris f. tertia）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・ビリディス（Chlorella vulgaris var. vulgaris f. viridis）、クロレラ・シャンセラ（Chlorella xanthella）及びクロレラ・ゾフィンジエンシス（Chlorella zofingiensis）を備える群から選択されることを特徴とする、請求項173に記載の方法。
【請求項１７５】
前記の種が、クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）、クロレラ・ミヌティッシマ（Chlorella minutissima）、クロレラ・エメルソニイ（Chlorella emersonii）、クロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana）、クロレラ・エリプソイデア（Chlorella ellipsoidea）またはクロレラ属の種（Chlorella sp.）であることを特徴とする、請求項174に記載の微生物。
【請求項１７６】
前記外来遺伝子が、作動可能にプロモーターと連結し、前記プロモーターが刺激に応答して誘導される方法であって、
第1の刺激を提供する工程、
及び、第1の刺激がある場合には、第1の期間の間の微生物群を培養する工程、をさらに含む請求項152に記載の方法。
【請求項１７７】
水性バイオマスから脂肪酸を抽出することをさらに含む、請求項176に記載の方法。
【請求項１７８】
前記微生物が、アシル担体タンパク質をコードする第2の外来遺伝子をさらに含む、請求項166に記載の方法。
【請求項１７９】
脂肪酸アシル担体タンパク質をコードする前記第2の外来遺伝子が、脂肪酸アシルACPチオエステラーゼと自然に共同発現することを特徴とする、請求項178に記載の方法。
【請求項１８０】
前記アシルACPチオエステラーゼが、8から18の炭素数の脂肪酸のACPからの切断を触媒することを特徴とする、請求項166記載の方法。
【請求項１８１】
前記培地が、グリセロールを含むことを特徴とする、請求項166に記載の方法。
【請求項１８２】
前記グリセロールが、エステル転移反応の工程の副産物である、請求項181記載の方法。
【請求項１８３】
前記培地が、グリセロール及び少なくとも一つ以上のグリセロール以外の固定炭素源を含むことを特徴とする、請求項181記載の方法。
【請求項１８４】
一つ以上のグリセロール以外の固定された前記炭素源が、ショ糖であることを特徴とする、請求項183記載の方法。
【請求項１８５】
前記グリセロールの全ておよび少なくとも一つのグリセロール以外の前記炭素源の全てが、微生物の発酵の開始期に提供されることを特徴とする、請求項183に記載の方法。
【請求項１８６】
前記グリセロール及び少なくとも一つのグリセロール以外の固定炭素源が、発酵時期を過ぎて、予め定められた量を微生物に供給されることを特徴とする、請求項183に記載の方法。
【請求項１８７】
(a) グリセロールが、第1の期間に一つ以上のグリセロール以外の固定炭素源がない場合に微生物に提供される工程と、
(b) 一つ以上のグリセロール以外の固定炭素源が、第1の期間の終わりに提供される工程と、
及び（c）微生物が、一つ以上のグリセロール以外の固定炭素源がある場合に第2の期間中培養される、ことを特徴とする、請求項183に記載の方法。
【請求項１８８】
外来遺伝子を含む微細藻類細胞であって、前記外来遺伝子がコードするタンパク質が、リパーゼ、ショ糖輸送体、ショ糖インベルターゼ、フルクトキナーゼまたは多糖類分解酵素を備える群から選択される、微細藻類細胞。
【請求項１８９】
前記微細藻類が、表1にリストされる微生物を備えるグループから選択されることを特徴とする、請求項188に記載の微細藻類細胞。
【請求項１９０】
前記微細藻類が、クロレラ属の種であることを特徴とする、請求項189に記載の微細藻類細胞。
【請求項１９１】
前記種が、クロレラ・アニトラタ（Chlorella anitrata）、クロレラ・アンタルクティカ（ Chlorella antarctica）、クロレラ・アウレオビリディス（ Chlorella aureoviridis）、クロレラ・キャンディダ（ Chlorella Candida）、クロレラ・キャプスラタ（Chlorella capsulata）、クロレラ・デシカッタ（Chlorella desiccata）、クロレラ・エリプソイデア（Chlorella ellipsoidea）、クロレラ・エメルソニイ（Chlorella emersonii）、クロレラ・フスカ（Chlorella fusca）、クロレラ・フスカ・バー・バクオレタ（Chlorella fusca var. vacuolata）, クロレラ・グルコトロファ（Chlorella glucotropha）、クロレラ・インフシオナム（Chlorella infusionum）、クロレラ・インフシオナム・バー・アクトフィラ（Chlorella infusionum var. Actophila）、クロレラ・インフシオナム・バー・アウェノフィラ（Chlorella infusionum var.Auxenophila）, クロレラ・ケッセレリ（Chlorella kessleri）、クロレラ・ルテオビリディス（Chlorella luteoviridis）、クロレラ・ルテオビリディス・バー・アウレオビリディス（Chlorella luteoviridis var. aureoviridis）、クロレラ・ルテオヴィリディス・バー・ルテスセンス（Chlorella luteoviridis var.Lutescens）、クロレラ・ミニアタ（Chlorella miniata）、クロレラ・ミヌティッシマ（Chlorella minutissima）、クロレラ・ムタビリス（Chlorella mutabilis）、クロレラ・ノクツルナ（Chlorella nocturna）、クロレラ・パルバ（Chlorella parva）、クロレラ・ファトフィリア（Chlorella photophila）、クロレラ・プリングシェイミィ（Chlorella pringsheimii）、クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）、クロレラ・ピレノイドサ（Chlorella pyrenoidosa）、クロレラ・レグラリス（Chlorella regularis）、クロレラ・レグラリス・バー・ミニマ（Chlorella regularis var. minima）、クロレラ・レグラリス・バー・ウンブリカタ（Chlorella regularis var. umbricata）、クロレラ・レイシグリィ（Chlorella reisiglii）、クロレラ・サッカロフィア（Chlorella saccharophila）、クロレラ・サッカロフィア・バー・エリプソイデア（ Chlorella saccharophila var. ellipsoidea）、クロレラ・サリナ（Chlorella salina）、クロレラ・シンプレックス（Chlorella simplex）、クロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana）、クロレラ属の種（Chlorella sp.）、クロレラ・スファエリカ（Chlorella sphaerica）、クロレラ・スティグマトフォラ（Chlorella stigmatophora）、クロレラ・バニエリィ（Chlorella vanniellii）、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）、クロレラ・ブルガリス・エフ・テルシア（Chlorella vulgaris f. tertia）、クロレラ・ブルガリス・バー・アイリディス（Chlorella vulgaris var. airidis）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス（Chlorella vulgaris var. vulgaris）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・テルシア（Chlorella vulgaris var. vulgaris f. tertia）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・ビリディス（Chlorella vulgaris var. vulgaris f. viridis）、クロレラ・シャンセラ（Chlorella xanthella）及びクロレラ・ゾフィンジエンシス（Chlorella zofingiensis）を備える群から選択されることを特徴とする、請求項173に記載の方法。
【請求項１９２】
前記の種が、クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）、クロレラ・ミヌティッシマ（Chlorella minutissima）、クロレラ・エメルソニイ（Chlorella emersonii）、クロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana）、クロレラ・エリプソイデア（Chlorella ellipsoidea）またはクロレラ属の種（Chlorella sp.）であることを特徴とする、請求項191に記載の微細藻類細胞。
【請求項１９３】
前記外来遺伝子が、作動可能にプロモーターと連結することを特徴とする、請求項188に記載の微細藻類細胞。
【請求項１９４】
前記プロモーターが刺激に応答して誘導か抑制できることを特徴とする、請求項193に記載の微細藻類細胞。
【請求項１９５】
前記刺激が外部から投入された小さい分子、熱、寒さおよび光を備える群から選択されることを特徴とする、請求項194に記載された微細藻類細胞。
【請求項１９６】
前記外来遺伝子が、細胞区画において発現されることを特徴とする、請求項188に記載の微細藻類細胞。
【請求項１９７】
前記細胞区画が、葉緑体およびミトコンドリアを備えるグループから選択されることを特徴とする、請求項196に記載のの微細藻類細胞。
【請求項１９８】
前記遺伝子がリパーゼをコードし、前記リパーゼが表9から選択されるリパーゼと少なくとも70%以上のアミノ酸相同性を有する、請求項188記載の微細藻類細胞。
【請求項１９９】
前記リパーゼが、ノボザイム435（novozym-435）であることを特徴とする、請求項198に記載の微細藻類細胞。
【請求項２００】
前記遺伝子が、多糖類分解酵素をコードすることを特徴とする、請求項188に記載の微細藻類細胞。
【請求項２０１】
前記多糖類分解酵素が、クロレラウイルスに内在していることを特徴とする、請求項200に記載の微細藻類細胞。
【請求項２０２】
2つの外来遺伝子を含む微細藻類細胞であって、前記第一外来遺伝子がリパーゼをコードし、前記第1の遺伝子が多糖類分解酵素をコードする、微細藻類細胞。
【請求項２０３】
前記外来遺伝子が作動可能にプロモーターと連結することを特徴とする、請求項202に記載の微細藻類細胞。
【請求項２０４】
前記外来遺伝子が作動可能にプロモーターと連結し、前記プロモーターは刺激に応答して誘導されることを特徴とする、請求項203に記載の微細藻類細胞。
【請求項２０５】
前記外来遺伝子が作動可能にプロモーターと連結し、前記結合は同一の刺激に応答して誘導されることを特徴とする、請求項204に記載の微細藻類細胞。
【請求項２０６】
前記外来遺伝子が作動可能にプロモーターと連結し、前記結合は一つ以上の刺激に応答して誘導され、前記刺激はほかのプロモーターを誘導しないことを特徴とする、請求項204に記載の微細藻類細胞。
【請求項２０７】
脂質分子を微生物内で製造する方法であって、
(a) 細胞密度を増やすのに十分な第1の期間の間の微生物を培養する工程と、
(b) 刺激を加える工程と、
及び、(c)刺激が存在する第2の期間の間の微生物を培養する工程と、
を含む方法であって、
前記(a)の培養工程は、
(i) 外来遺伝子がリパーゼをコードし、
および/または(ii)外来遺伝子が多糖類分解酵素をコードし、
前記外来遺伝子は、作動可能にプロモーターと連結し、前記プロモーターは刺激に応答し誘導されることを含む、製造方法。
【請求項２０８】
微生物内で脂質分子を製造する方法であって、
(a) 細胞密度を増やすのに十分な第1の期間中に脂質を製造する微生物を培養する工程と、
(b) 微生物と直接接触したときに、微生物に感染し溶解させることができるウイルスを提供する工程と、
及び、(c)第2の期間中、水性バイオマスの溶解を生成するために微生物を培養する工程、を含む製造方法。
【請求項２０９】
溶解した水性バイオマスから脂質分子を抽出する工程を、さらに含んでいる請求項208に記載の方法。
【請求項２１０】
外来遺伝子を含む微細藻類細胞であって、前記外来遺伝子が脂質経路酵素のための補因子をコードする、または前記外来遺伝子が補因子の合成に関与するタンパク質をコードする、微細藻類細胞。
【請求項２１１】
脂質を生産する微生物を培養する方法であって、脂質経路酵素のための補因子の非存在下よりも微生物由来脂質を増やすために、前記補因子が十分な量があるときに微生物を培養する工程を含む方法。
【請求項２１２】
前記補因子が、一つ以上の脂質経路酵素に必要とされるビタミンであることを特徴とする、請求項211に記載の方法。
【請求項２１３】
前記補因子が、ビオチンであることを特徴とする、請求項211に記載の方法。
【請求項２１４】
前記補因子が培地中に含まれる微生物によって提供される工程を含み、前記微生物が補因子を製造するように遺伝的に改変されたことを特徴とする、請求項211に記載の方法。
【請求項２１５】
微生物にエネルギー源としてブドウ糖およびキシロースの混合物を提供する工程を含む、微生物での発酵方法。
【請求項２１６】
前記混合物がリグニンをさらに含む、請求項215に記載の方法。
【請求項２１７】
前記混合物がフルフラールの一種をさらに含む、請求項215に記載の方法。
【請求項２１８】
前記混合物が脱重合されたセルロース材料であることを特徴とする、請求項215に記載の方法。
【請求項２１９】
前記微生物が、微細藻類であることを特徴とする、請求項215に記載の方法。
【請求項２２０】
前記微細藻類が表1から選択される、請求項219に記載の方法
。
【請求項２２１】
前記微細藻類がクロレラ属の種であることを特徴とする、請求項220に記載の方法。
【請求項２２２】
前記微細藻類がクロレラ・アニトラタ（Chlorella anitrata）、クロレラ・アンタルクティカ（ Chlorella antarctica）、クロレラ・アウレオビリディス（ Chlorella aureoviridis）、クロレラ・キャンディダ（ Chlorella Candida）、クロレラ・キャプスラタ（Chlorella capsulata）、クロレラ・デシカッタ（Chlorella desiccata）、クロレラ・エリプソイデア（Chlorella ellipsoidea）、クロレラ・エメルソニイ（Chlorella emersonii）、クロレラ・フスカ（Chlorella fusca）、クロレラ・フスカ・バー・バクオレタ（Chlorella fusca var. vacuolata）, クロレラ・グルコトロファ（Chlorella glucotropha）、クロレラ・インフシオナム（Chlorella infusionum）、クロレラ・インフシオナム・バー・アクトフィラ（Chlorella infusionum var. Actophila）、クロレラ・インフシオナム・バー・アウェノフィラ（Chlorella infusionum var.Auxenophila）, クロレラ・ケッセレリ（Chlorella kessleri）、クロレラ・ルテオビリディス（Chlorella luteoviridis）、クロレラ・ルテオビリディス・バー・アウレオビリディス（Chlorella luteoviridis var. aureoviridis）、クロレラ・ルテオヴィリディス・バー・ルテスセンス（Chlorella luteoviridis var.Lutescens）、クロレラ・ミニアタ（Chlorella miniata）、クロレラ・ミヌティッシマ（Chlorella minutissima）、クロレラ・ムタビリス（Chlorella mutabilis）、クロレラ・ノクツルナ（Chlorella nocturna）、クロレラ・パルバ（Chlorella parva）、クロレラ・ファトフィリア（Chlorella photophila）、クロレラ・プリングシェイミィ（Chlorella pringsheimii）、クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）、クロレラ・ピレノイドサ（Chlorella pyrenoidosa）、クロレラ・レグラリス（Chlorella regularis）、クロレラ・レグラリス・バー・ミニマ（Chlorella regularis var. minima）、クロレラ・レグラリス・バー・ウンブリカタ（Chlorella regularis var. umbricata）、クロレラ・レイシグリィ（Chlorella reisiglii）、クロレラ・サッカロフィア（Chlorella saccharophila）、クロレラ・サッカロフィア・バー・エリプソイデア（ Chlorella saccharophila var. ellipsoidea）、クロレラ・サリナ（Chlorella salina）、クロレラ・シンプレックス（Chlorella simplex）、クロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana）、クロレラ属の種（Chlorella sp.）、クロレラ・スファエリカ（Chlorella sphaerica）、クロレラ・スティグマトフォラ（Chlorella stigmatophora）、クロレラ・バニエリィ（Chlorella vanniellii）、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）、クロレラ・ブルガリス・エフ・テルシア（Chlorella vulgaris f. tertia）、クロレラ・ブルガリス・バー・アイリディス（Chlorella vulgaris var. airidis）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス（Chlorella vulgaris var. vulgaris）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・テルシア（Chlorella vulgaris var. vulgaris f. tertia）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・ビリディス（Chlorella vulgaris var. vulgaris f. viridis）、クロレラ・シャンセラ（Chlorella xanthella）及びクロレラ・ゾフィンジエンシス（Chlorella zofingiensis）を備える群から選択されることを特徴とする、請求項221に記載の方法
【請求項２２３】
前記の微細藻類が、バクテリオコッカス・マイナー（Bracteococcus minor）、クロレラ・エリプソイデア（Chlorella ellipsoidea）、クロレラ・ケッセレリ（Chlorella kessleri）、クロレラ・ルテオビリディス（Chlorella luteoviridis）、バクテリオコッカス・メディオヌクレアトゥス（Bracteococcus medionucleatus）、クロレラ・ミヌティッシマ（Chlorella minutissima）、クロレラ・オバァリス（Chlorella ovalis）、クロレラ・プロトテコイデス（Chlorella protothecoides）、クロレラ・サッカロフィア（Chlorella saccharophila）、クロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana）、クロレラ属の種（Chlorella sp.）、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）、パラクロレラ・ケッセレリ（Parachlorella kessleri）、ｐロトテカ・モリフォルミス（Prototheca moriformis）、 及びシュードクロレラ・アクアティカ（Pseudochlorella aquatica）を備える群から選択されることを特徴とする、請求項220に記載の方法。
【請求項２２４】
前記微生物が、油性酵母であることを特徴とする、請求項215に記載の方法。
【請求項２２５】
前記油性酵母が、クリプトコッカス・クルバツス（Cryptococcus curvatus）、クリプトコッカス・テリコルス（Cryptococcus terricolus）、カンジタ属の一種（Candida sp.）、リポマイセス・スタルケィ（Lipomyces starkeyi）、リポマイセス・リポファ（Lipomyces lipofer）、エンドマイコプシス・バルナリス（Endomycopsis vernalis）、ロドトルラ・グルティニス（Rhodotorula glutinis）、ロドトルラ・グルシリス（Rhodotorula gracilis）およびヤロウィア・リポリティリカ（Yarrowia lipolytica）を備える群から選択されることを特徴とする、請求項224に記載の方法。
【請求項２２６】
前記微生物が真菌であることを特徴とする、請求項215に記載の方法。
【請求項２２７】
前記真菌が、モルティエレラ（Mortierella）属の一種、モルティエレラ・ビナセア（Mortierrla vinacea）、モルティエレラ・アルペン（Mortierella alpine）、フィリシウム・デバリアヌム（Pythium debaryanum）、ケカビ属シルシネロイデス（Mucor circinelloides）、アスペルギルス・オクラセウス（Aspergillus ochraceus）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）、ペネシリウム・イイラシヌム（Pennicillium iilacinum）、ヘンセヌロ（Hensenulo）属の一種、カエトミウム（Chaetomium）属の一種、クラドスポリウム（Cladosporium）属の一種、マルブランシェア（Malbranchea）属の一種、リゾプス（Rhizopus）属の一種およびフィシウム（Pythium）属の一種のを備える群から選択されることを特徴とする、請求項226に記載の方法。
【請求項２２８】
前記混合物がショ糖資化性酵素をさらに含む、請求項215に記載の方法。
【請求項２２９】
前記微生物がクロレラ属の種であることを特徴とする、請求項228に記載の方法。
【請求項２３０】
前記微生物が、脂質修飾酵素、炭化水素修飾酵素またはショ糖資化性酵素の少なくとも一つをコードする外来遺伝子を発現するように遺伝的に改変される、請求項215に記載の方法。
【請求項２３１】
前記混合物がショ糖インベルターゼを含む、請求項228に記載の方法。
【請求項２３２】
微細藻類を培養する方法であって、セルロース材料、五糖類、六糖類および酢酸塩を備えるグループから選択される少なくとも一つの炭素基質を含む培地で培養する工程を含む、培養方法。
【請求項２３３】
前記炭素基質はブドウ糖であり、前記微細藻類はクロレラ、パラクロレラ（Parachlorella）、シュードクロレラ（Pseudochlorella）、ブラクテオコッカス（Bracteococcus）、プロトテカ（Prototheca）およびセネデスムス（Scenedesmus）を備える群から選択される属であることを特徴とする、請求項232に記載の方法。
【請求項２３４】
前記炭素基質はキシロースであり、前記微細藻類はクロレラ、パラクロレラ（Parachlorella）、プロトテカ（Prototheca）を備える群から選択される属である、請求項232に記載の方法。
【請求項２３５】
前記炭素基質がショ糖であり、前記微細藻類は、クロレラおよびブラクテオコッカス（Bracteococcus）を備えるグループから選択される属である、請求項232に記載の方法。
【請求項２３６】
前記炭素基質がフルクトースであり、前記微細藻類がクロレラ、パラクロレラ（Parachlorella）、プロトテカ（Prototheca）およびセネデスムス（Scenedesmus）を備えるグループから選択される属である前記請求項232に記載の方法。
【請求項２３７】
前記炭素基質がアラビノースであり、前記微細藻類はクロレラ属の種である、請求項232に記載の方法。
【請求項２３８】
前記炭素基質がマンノースであり、前記微細藻類がクロレラ、パラクロレラ（Parachlorella）、シュードクロレラ（Pseudochlorella）、ブラクテオコッカス（Bracteococcus）、プロトテカ（Prototheca）およびセネデスムス（Scenedesmus）を備える群から選択される属であることを特徴とする、請求項232に記載の方法。
【請求項２３９】
前記炭素基質がガラクトースであり、前記微細藻類がクロレラ、パラクロレラ（Parachlorella）、シュードクロレラ（Pseudochlorella）、ブラクテオコッカス（Bracteococcus）、プロトテカ（Prototheca）およびセネデスムス（Scenedesmus）を備える群から選択される属の中であることを特徴とする、請求項232に記載の方法。
【請求項２４０】
前記炭素基質が酢酸塩であり、前記微細藻類がクロレラ、パラクロレラ（Parachlorella）およびプロトテカ（Prototheca）を備えるグループから選択される属であることを特徴とする、請求項232に記載の方法。
【請求項２４１】
前記培地が、ショ糖資化性酵素をさらに含む、請求項232に記載の方法。
【請求項２４２】
前記微細藻類は、クロレラ属である、請求項241に記載の方法。
【請求項２４３】
前記微細藻類が、脂質修飾酵素、炭化水素修飾酵素、ショ糖資化性酵素のうち少なくとも一つをコードする外来遺伝子を発現するように遺伝的に改変されていることを特徴とする、請求項242に記載の方法。
【請求項２４４】
前記培地が、ショ糖インベルターゼを含む、請求項241に記載の方法。
【請求項２４５】
前記微細藻類を表1から選ぶ、請求項232に記載の方法。
【請求項２４６】
微細藻類を培養する方法であって、脱重合されたセルロース材料存在下において、複数の微細藻類細胞を播種することを含む、培養方法。
【請求項２４７】
前記微細藻類が、グリセロール、ショ糖、ブドウ糖、アラビノース、ガラクトース、キシロース、フルクトース、アラビノース、マンノース、酢酸塩およびそれらの任意の組合せを備える群から選択される添加された固定炭素源存在下で、培養される、請求項246に記載の方法。
【請求項２４８】
前記微細藻類が、ブラクテオコッカス（Bracteococcus）属の種、クロレラ属の種、パラクロレラ（Parachlorella）属の種、シュードクロレラ（Pseudochlorella）属の種、プロトテカ（Prototheca）属の種、またはセネデスムス（Scenedesmus）属の種を備える群から選択される、請求項246に記載の方法。
【請求項２４９】
前記微細藻類は、バクテリオコッカス・マイナー（Bracteococcus minor）、クロレラ・エリプソイデア（Chlorella ellipsoidea）、クロレラ・ケッセレリ（Chlorella kessleri）、クロレラ・ルテオビリディス（Chlorella luteoviridis）、バクテリオコッカス・メディオヌクレアトゥス（Bracteococcus medionucleatus）、クロレラ・ミヌティッシマ（Chlorella minutissima）、クロレラ・オバァリス（Chlorella ovalis）、クロレラ・プロトテコイデス（Chlorella protothecoides）、クロレラ・サッカロフィア（Chlorella saccharophila）、クロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana）、クロレラ属の種（Chlorella sp.）、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）、パラクロレラ・ケッセレリ（Parachlorella kessleri）、プロトテカ・モリフォルミス（Prototheca moriformis）、 及びシュードクロレラ・アクアティカ（Pseudochlorella aquatica）を備える群から選択されることを特徴とする、請求項248に記載の方法。
【請求項２５０】
前記微細藻類が、ショ糖資化性酵素の存在下で培養される、請求項246に記載の方法。
【請求項２５１】
前記微細藻類が、クロレラ属である、請求項250に記載の方法。
【請求項２５２】
前記微細藻類が、脂質修飾酵素、炭化水素修飾酵素、またはショ糖資化性酵素のうち少なくとも一つをコードする外来遺伝子を発現するように遺伝的に改変されている、請求項246に記載の方法。
【請求項２５３】
少なくとも一つの前記ショ糖資化性酵素がショ糖インベルターゼであることを特徴とする、請求項250に記載の方法。
【請求項２５４】
少なくとも一つの前記脂質修飾酵素が、ステアロイルCoA不飽和酵素、グリセロ脂質不飽和酵素、ピルビン酸塩デヒドロゲナーゼ、アセチルCoAカルボキシラーゼ、アシル担体タンパク質およびグリセロール-3リン酸アシルトランスフェラーゼから選択されることを特徴とする、請求項252に記載の方法。
【請求項２５５】
少なくとも一つの前記炭化水素修飾酵素が、脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ、脂肪酸アシルCoA還元酵素、脂肪酸アルデヒド還元酵素、脂肪酸アシルCoA/アルデヒド還元酵素、脂肪酸アルデヒドデカルボニラーゼおよびアシル担体タンパク質から選択される、請求項252に記載の方法。
【請求項２５６】
脂質を製造する微生物を培養する方法であって、酢酸存在下で且つ固定された窒素源の不存在下において、微生物を培養する工程を含む方法。
【請求項２５７】
前記微生物が、酢酸不存在下よりも微生物由来脂質量を増やすために酢酸存在下で培養され、前記培養条件以外は二つの培地間で同一である、請求項256に記載の方法。
【請求項２５８】
(a) 微生物の群、
及び、（b）ブドウ糖、キシロースおよびリグニンを備える群から選択される分子、並びにフルフラールの種を備える培地、を含む微生物培養物。
【請求項２５９】
前記微生物が微細藻類であることを特徴とする、請求項258に記載の微生物培養物。
【請求項２６０】
前記微生物が表1にリストされる微細藻類を備える群から選択される、請求項259に記載の微生物培養物。
【請求項２６１】
前記微生物が、クロレラ属の種である、請求項260に記載の微生物培養物。
【請求項２６２】
前記微生物がクロレラ・アニトラタ（Chlorella anitrata）、クロレラ・アンタルクティカ（ Chlorella antarctica）、クロレラ・アウレオビリディス（ Chlorella aureoviridis）、クロレラ・キャンディダ（ Chlorella Candida）、クロレラ・キャプスラタ（Chlorella capsulata）、クロレラ・デシカッタ（Chlorella desiccata）、クロレラ・エリプソイデア（Chlorella ellipsoidea）、クロレラ・エメルソニイ（Chlorella emersonii）、クロレラ・フスカ（Chlorella fusca）、クロレラ・フスカ・バー・バクオレタ（Chlorella fusca var. vacuolata）, クロレラ・グルコトロファ（Chlorella glucotropha）、クロレラ・インフシオナム（Chlorella infusionum）、クロレラ・インフシオナム・バー・アクトフィラ（Chlorella infusionum var. Actophila）、クロレラ・インフシオナム・バー・アウェノフィラ（Chlorella infusionum var.Auxenophila）, クロレラ・ケッセレリ（Chlorella kessleri）、クロレラ・ルテオビリディス（Chlorella luteoviridis）、クロレラ・ルテオビリディス・バー・アウレオビリディス（Chlorella luteoviridis var. aureoviridis）、クロレラ・ルテオヴィリディス・バー・ルテスセンス（Chlorella luteoviridis var.Lutescens）、クロレラ・ミニアタ（Chlorella miniata）、クロレラ・ミヌティッシマ（Chlorella minutissima）、クロレラ・ムタビリス（Chlorella mutabilis）、クロレラ・ノクツルナ（Chlorella nocturna）、クロレラ・パルバ（Chlorella parva）、クロレラ・ファトフィリア（Chlorella photophila）、クロレラ・プリングシェイミィ（Chlorella pringsheimii）、クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）、クロレラ・ピレノイドサ（Chlorella pyrenoidosa）、クロレラ・レグラリス（Chlorella regularis）、クロレラ・レグラリス・バー・ミニマ（Chlorella regularis var. minima）、クロレラ・レグラリス・バー・ウンブリカタ（Chlorella regularis var. umbricata）、クロレラ・レイシグリィ（Chlorella reisiglii）、クロレラ・サッカロフィア（Chlorella saccharophila）、クロレラ・サッカロフィア・バー・エリプソイデア（ Chlorella saccharophila var. ellipsoidea）、クロレラ・サリナ（Chlorella salina）、クロレラ・シンプレックス（Chlorella simplex）、クロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana）、クロレラ属の種（Chlorella sp.）、クロレラ・スファエリカ（Chlorella sphaerica）、クロレラ・スティグマトフォラ（Chlorella stigmatophora）、クロレラ・バニエリィ（Chlorella vanniellii）、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）、クロレラ・ブルガリス・エフ・テルシア（Chlorella vulgaris f. tertia）、クロレラ・ブルガリス・バー・アイリディス（Chlorella vulgaris var. airidis）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス（Chlorella vulgaris var. vulgaris）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・テルシア（Chlorella vulgaris var. vulgaris f. tertia）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・ビリディス（Chlorella vulgaris var. vulgaris f. viridis）、クロレラ・シャンセラ（Chlorella xanthella）及びクロレラ・ゾフィンジエンシス（Chlorella zofingiensis）を備える群から選択されることを特徴とする、請求項262に記載の微生物培養物。
【請求項２６３】
前記微生物は、バクテリオコッカス・マイナー（Bracteococcus minor）、クロレラ・エリプソイデア（Chlorella ellipsoidea）、クロレラ・ケッセレリ（Chlorella kessleri）、クロレラ・ルテオビリディス（Chlorella luteoviridis）、バクテリオコッカス・メディオヌクレアトゥス（Bracteococcus medionucleatus）、クロレラ・ミヌティッシマ（Chlorella minutissima）、クロレラ・オバァリス（Chlorella ovalis）、クロレラ・プロトテコイデス（Chlorella protothecoides）、クロレラ・サッカロフィア（Chlorella saccharophila）、クロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana）、クロレラ属の種（Chlorella sp.）、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）、パラクロレラ・ケッセレリ（Parachlorella kessleri）、プロトテカ・モリフォルミス（Prototheca moriformis）、 及びシュードクロレラ・アクアティカ（Pseudochlorella aquatica）を備える群から選択されることを特徴とする、請求項248に記載の方法。
【請求項２６４】
前記微生物が油性酵母であることを特徴とする、請求項258に記載の微生物培養物。
【請求項２６５】
前記油性酵母が、クリプトコッカス・クルバツス（Cryptococcus curvatus）、クリプトコッカス・テリコルス（Cryptococcus terricolus）、カンジタ属の一種（Candida sp.）、リポマイセス・スタルケィ（Lipomyces starkeyi）、リポマイセス・リポファ（Lipomyces lipofer）、エンドマイコプシス・バルナリス（Endomycopsis vernalis）、ロドトルラ・グルティニス（Rhodotorula glutinis）、ロドトルラ・グルシリス（Rhodotorula gracilis）およびヤロウィア・リポリティリカ（Yarrowia lipolytica）を備える群から選択されることを特徴とする、請求項264に記載の微生物培養物。
【請求項２６６】
前記微生物が真菌であることを特徴とする、請求項258に記載の微生物培養物。
【請求項２６７】
前記真菌が、モルティエレラ（Mortierella）属の一種、モルティエレラ・ビナセア（Mortierrla vinacea）、モルティエレラ・アルペン（Mortierella alpine）、フィリシウム・デバリアヌム（Pythium debaryanum）、ケカビ属シルシネロイデス（Mucor circinelloides）、アスペルギルス・オクラセウス（Aspergillus ochraceus）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）、ペネシリウム・イイラシヌム（Pennicillium iilacinum）、ヘンセヌロ（Hensenulo）属の一種、カエトミウム（Chaetomium）属の一種、クラドスポリウム（Cladosporium）属の一種、マルブランシェア（Malbranchea）属の一種、リゾプス（Rhizopus）属の一種およびフィシウム（Pythium）属の一種のを備える群から選択されることを特徴とする、請求項266記載の微生物培養物。
【請求項２６８】
前記微生物が少なくともいつ以上の外来ショ糖資化性遺伝子を含む、請求項258に記載の微生物培養物。
【請求項２６９】
前記ショ糖資化性遺伝子が、ショ糖輸送体、ショ糖インベルターゼ、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼまたはフルクトキナーゼをコードすることを特徴とする、請求項258に記載の微生物培養物。
【請求項２７０】
前記微生物が脂質経路酵素をコードする少なくとも一つ以上の外来遺伝子を含むことを特徴とする、微生物培養物。
【請求項２７１】
前記脂質経路酵素が、ステアロイルCoA不飽和酵素、グリセロ脂質不飽和酵素、ピルビン酸塩デヒドロゲナーゼ、アセチルCoAカルボキシラーゼ、アシル担体タンパク質およびグリセロール-3リン酸アシルトランスフェラーゼを備える群から選択されることを特徴とする、請求項270に記載の微生物培養物。
【請求項２７２】
バイオディーゼルを製造する方法であって、
(a) 脂質を生産する微生物を第1の微生物培養で培養する工程と、
(b) 第1の微生物培養によってできるバイオマスから脂質を回収する工程と、
(c)脂質をエステル転移し、脂肪酸エステルおよびグリセロールを生産する工程と、
並びに(d)グリセロールを第2の微生物培養に加える工程、を備える製造方法。
【請求項２７３】
前記第1微生物培養方法および前記第2微生物培養方法が、同一種の微生物を培養することを特徴とする、請求項272に記載の方法。
【請求項２７４】
前記微生物が微細藻類であることを特徴とする、請求項272に記載の方法。
【請求項２７５】
前記微生物が表1にリストされる微細藻類を備える群から選択されることを特徴とする、請求項274に記載の方法。
【請求項２７６】
前記微生物がクロレラ属の種であることを特徴とする、請求項275に記載の方法。
【請求項２７７】
前記微生物がクロレラ・アニトラタ（Chlorella anitrata）、クロレラ・アンタルクティカ（ Chlorella antarctica）、クロレラ・アウレオビリディス（ Chlorella aureoviridis）、クロレラ・キャンディダ（ Chlorella Candida）、クロレラ・キャプスラタ（Chlorella capsulata）、クロレラ・デシカッタ（Chlorella desiccata）、クロレラ・エリプソイデア（Chlorella ellipsoidea）、クロレラ・エメルソニイ（Chlorella emersonii）、クロレラ・フスカ（Chlorella fusca）、クロレラ・フスカ・バー・バクオレタ（Chlorella fusca var. vacuolata）, クロレラ・グルコトロファ（Chlorella glucotropha）、クロレラ・インフシオナム（Chlorella infusionum）、クロレラ・インフシオナム・バー・アクトフィラ（Chlorella infusionum var. Actophila）、クロレラ・インフシオナム・バー・アウェノフィラ（Chlorella infusionum var.Auxenophila）, クロレラ・ケッセレリ（Chlorella kessleri）、クロレラ・ルテオビリディス（Chlorella luteoviridis）、クロレラ・ルテオビリディス・バー・アウレオビリディス（Chlorella luteoviridis var. aureoviridis）、クロレラ・ルテオヴィリディス・バー・ルテスセンス（Chlorella luteoviridis var.Lutescens）、クロレラ・ミニアタ（Chlorella miniata）、クロレラ・ミヌティッシマ（Chlorella minutissima）、クロレラ・ムタビリス（Chlorella mutabilis）、クロレラ・ノクツルナ（Chlorella nocturna）、クロレラ・パルバ（Chlorella parva）、クロレラ・ファトフィリア（Chlorella photophila）、クロレラ・プリングシェイミィ（Chlorella pringsheimii）、クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）、クロレラ・ピレノイドサ（Chlorella pyrenoidosa）、クロレラ・レグラリス（Chlorella regularis）、クロレラ・レグラリス・バー・ミニマ（Chlorella regularis var. minima）、クロレラ・レグラリス・バー・ウンブリカタ（Chlorella regularis var. umbricata）、クロレラ・レイシグリィ（Chlorella reisiglii）、クロレラ・サッカロフィア（Chlorella saccharophila）、クロレラ・サッカロフィア・バー・エリプソイデア（ Chlorella saccharophila var. ellipsoidea）、クロレラ・サリナ（Chlorella salina）、クロレラ・シンプレックス（Chlorella simplex）、クロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana）、クロレラ属の種（Chlorella sp.）、クロレラ・スファエリカ（Chlorella sphaerica）、クロレラ・スティグマトフォラ（Chlorella stigmatophora）、クロレラ・バニエリィ（Chlorella vanniellii）、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）、クロレラ・ブルガリス・エフ・テルシア（Chlorella vulgaris f. tertia）、クロレラ・ブルガリス・バー・アイリディス（Chlorella vulgaris var. airidis）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス（Chlorella vulgaris var. vulgaris）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・テルシア（Chlorella vulgaris var. vulgaris f. tertia）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・ビリディス（Chlorella vulgaris var. vulgaris f. viridis）、クロレラ・シャンセラ（Chlorella xanthella）及びクロレラ・ゾフィンジエンシス（Chlorella zofingiensis）を備える群から選択されることを特徴とする、請求項276に記載の方法
【請求項２７８】
第2の微生物培養方法が、パラクロレラ・ケッセリ（Parachlorella kessleri）、クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）、バクテリオコッカス・メディオヌクレタス（Bracteococcus medionucleatus）、プロトテカ・モリフォルミス（Prototheca moriformis）、クロレラ・ミヌティッシマ（Chlorella minutissima）、クロレラ属の種（Chlorella sp.）およびクロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana）を備えるグループから選択される微生物を含む、請求項272に記載の方法。
【請求項２７９】
微生物が油性酵母であることを特徴とする、請求項272に記載の方法。
【請求項２８０】
前記油性酵母が、クリプトコッカス・クルバツス（Cryptococcus curvatus）、クリプトコッカス・テリコルス（Cryptococcus terricolus）、カンジタ属の一種（Candida sp.）、リポマイセス・スタルケィ（Lipomyces starkeyi）、リポマイセス・リポファ（Lipomyces lipofer）、エンドマイコプシス・バルナリス（Endomycopsis vernalis）、ロドトルラ・グルティニス（Rhodotorula glutinis）、ロドトルラ・グルシリス（Rhodotorula gracilis）およびヤロウィア・リポリティリカ（Yarrowia lipolytica）を備える群から選択されることを特徴とする、請求項279に記載の方法
【請求項２８１】
前記微生物が、真菌であることを特徴とする、請求項272に記載の方法。
【請求項２８２】
前記真菌が、モルティエレラ（Mortierella）属の一種、モルティエレラ・ビナセア（Mortierrla vinacea）、モルティエレラ・アルペン（Mortierella alpine）、フィリシウム・デバリアヌム（Pythium debaryanum）、ケカビ属シルシネロイデス（Mucor circinelloides）、アスペルギルス・オクラセウス（Aspergillus ochraceus）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）、ペネシリウム・イイラシヌム（Pennicillium iilacinum）、ヘンセヌロ（Hensenulo）属の一種、カエトミウム（Chaetomium）属の一種、クラドスポリウム（Cladosporium）属の一種、マルブランシェア（Malbranchea）属の一種、リゾプス（Rhizopus）属の一種およびフィシウム（Pythium）属の一種のを備える群から選択されることを特徴とする、請求項281に記載の方法
【請求項２８３】
前記微生物が少なくとも一つの外来のショ糖資化性遺伝子を含む、請求項272に記載の方法。
【請求項２８４】
前記ショ糖資化性遺伝子が、ショ糖輸送体、ショ糖インベルターゼ、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼまたはフルクトキナーゼをコードする、請求項283に記載の方法。
【請求項２８５】
微生物が脂質経路酵素をコードしている少なくとも一つの外来遺伝子を含む、請求項272に記載の方法。
【請求項２８６】
前記脂質経路酵素が、ステアロイルCoA不飽和酵素、グリセロ脂質不飽和酵素、ピルビン酸塩デヒドロゲナーゼ、アセチルCoAカルボキシラーゼ、アシル担体タンパク質およびグリセロール-3リン酸アシルトランスフェラーゼを備える群から選択されることを特徴とする、請求項285に記載の方法。
【請求項２８７】
グリセロールおよびグリセロール以外の固定炭素源存在下で微生物を培養することを含む、発酵方法。
【請求項２８８】
前記グリセロールおよびグリセロール以外の固定された前記炭素源が、予め定められた比率で同時に微生物に提供される、請求項287に記載の方法。
【請求項２８９】
前記グリセロールおよびグリセロール以外の固定された前記炭素源の全部が、発酵の開始期に微生物に提供される、請求項288に記載の方法。
【請求項２９０】
前記グリセロールおよびグリセロール以外の固定された前記炭素源の全部が発酵期を経過して、あらかじめ定められた率で微生物に与えられる、請求項288に記載の方法。
【請求項２９１】
(a) グリセロールが、第1の期間中、グリセロール以外の固定炭素源がない場合、微生物に提供する工程と、
(b) グリセロール以外の固定炭素源が、第1の期間の終わりに提供される工程と、
及び、（c）微生物が、グリセロール以外の固定炭素源存在下において、第2の期間中、培養される工程を含む、請求項287に記載の方法。
【請求項２９２】
グリセロール以外の固定された前記炭素源が、第2の期間中、予め定められた率で微生物に供給される、請求項291に記載の方法。
【請求項２９３】
グリセロール以外の固定された前記炭素源の全てが、第1の期間の終わりに微生物に提供される、請求項291に記載の方法。
【請求項２９４】
(a) グリセロール以外の固定された前記炭素源が、第1の期間中、グリセロール不存在下、微生物に提供される工程と、
(b) グリセロールが、第1の期間の終わりに提供される工程と、
及び（c）微生物が、グリセロール存在下、第2の期間の間培養される工程を含む、請求項287に記載の方法。
【請求項２９５】
前記微生物が、微細藻類であることを特徴とする、請求項287に記載の方法。
【請求項２９６】
前記微細藻類が、表1から選ばれることを特徴とする、請求項295に記載の方法。
【請求項２９７】
前記微細藻類が、クロレラ属であることを特徴とする、請求項295に記載の方法。
【請求項２９８】
前記微生物が、クロレラ・アニトラタ（Chlorella anitrata）、クロレラ・アンタルクティカ（ Chlorella antarctica）、クロレラ・アウレオビリディス（ Chlorella aureoviridis）、クロレラ・キャンディダ（ Chlorella Candida）、クロレラ・キャプスラタ（Chlorella capsulata）、クロレラ・デシカッタ（Chlorella desiccata）、クロレラ・エリプソイデア（Chlorella ellipsoidea）、クロレラ・エメルソニイ（Chlorella emersonii）、クロレラ・フスカ（Chlorella fusca）、クロレラ・フスカ・バー・バクオレタ（Chlorella fusca var. vacuolata）, クロレラ・グルコトロファ（Chlorella glucotropha）、クロレラ・インフシオナム（Chlorella infusionum）、クロレラ・インフシオナム・バー・アクトフィラ（Chlorella infusionum var. Actophila）、クロレラ・インフシオナム・バー・アウェノフィラ（Chlorella infusionum var.Auxenophila）, クロレラ・ケッセレリ（Chlorella kessleri）、クロレラ・ルテオビリディス（Chlorella luteoviridis）、クロレラ・ルテオビリディス・バー・アウレオビリディス（Chlorella luteoviridis var. aureoviridis）、クロレラ・ルテオヴィリディス・バー・ルテスセンス（Chlorella luteoviridis var.Lutescens）、クロレラ・ミニアタ（Chlorella miniata）、クロレラ・ミヌティッシマ（Chlorella minutissima）、クロレラ・ムタビリス（Chlorella mutabilis）、クロレラ・ノクツルナ（Chlorella nocturna）、クロレラ・パルバ（Chlorella parva）、クロレラ・ファトフィリア（Chlorella photophila）、クロレラ・プリングシェイミィ（Chlorella pringsheimii）、クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）、クロレラ・ピレノイドサ（Chlorella pyrenoidosa）、クロレラ・レグラリス（Chlorella regularis）、クロレラ・レグラリス・バー・ミニマ（Chlorella regularis var. minima）、クロレラ・レグラリス・バー・ウンブリカタ（Chlorella regularis var. umbricata）、クロレラ・レイシグリィ（Chlorella reisiglii）、クロレラ・サッカロフィア（Chlorella saccharophila）、クロレラ・サッカロフィア・バー・エリプソイデア（ Chlorella saccharophila var. ellipsoidea）、クロレラ・サリナ（Chlorella salina）、クロレラ・シンプレックス（Chlorella simplex）、クロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana）、クロレラ属の種（Chlorella sp.）、クロレラ・スファエリカ（Chlorella sphaerica）、クロレラ・スティグマトフォラ（Chlorella stigmatophora）、クロレラ・バニエリィ（Chlorella vanniellii）、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）、クロレラ・ブルガリス・エフ・テルシア（Chlorella vulgaris f. tertia）、クロレラ・ブルガリス・バー・アイリディス（Chlorella vulgaris var. airidis）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス（Chlorella vulgaris var. vulgaris）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・テルシア（Chlorella vulgaris var. vulgaris f. tertia）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・ビリディス（Chlorella vulgaris var. vulgaris f. viridis）、クロレラ・シャンセラ（Chlorella xanthella）及びクロレラ・ゾフィンジエンシス（Chlorella zofingiensis）を備える群から選択されることを特徴とする、請求項297に記載の方法。
【請求項２９９】
前記微生物が、油性酵母であることを特徴とする、請求項287に記載の方法。
【請求項３００】
前記油性酵母が、クリプトコッカス・クルバツス（Cryptococcus curvatus）、クリプトコッカス・テリコルス（Cryptococcus terricolus）、カンジタ属の一種（Candida sp.）、リポマイセス・スタルケィ（Lipomyces starkeyi）、リポマイセス・リポファ（Lipomyces lipofer）、エンドマイコプシス・バルナリス（Endomycopsis vernalis）、ロドトルラ・グルティニス（Rhodotorula glutinis）、ロドトルラ・グルシリス（Rhodotorula gracilis）およびヤロウィア・リポリティリカ（Yarrowia lipolytica）を備える群から選択されることを特徴とする、請求項299に記載の方法
【請求項３０１】
前記微生物が真菌である、請求項287に記載の方法。
【請求項３０２】
前記真菌が、モルティエレラ（Mortierella）属の一種、モルティエレラ・ビナセア（Mortierrla vinacea）、モルティエレラ・アルペン（Mortierella alpine）、フィリシウム・デバリアヌム（Pythium debaryanum）、ケカビ属シルシネロイデス（Mucor circinelloides）、アスペルギルス・オクラセウス（Aspergillus ochraceus）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）、ペネシリウム・イイラシヌム（Pennicillium iilacinum）、ヘンセヌロ（Hensenulo）属の一種、カエトミウム（Chaetomium）属の一種、クラドスポリウム（Cladosporium）属の一種、マルブランシェア（Malbranchea）属の一種、リゾプス（Rhizopus）属の一種およびフィシウム（Pythium）属の一種のを備える群から選択されることを特徴とする、請求項301に記載の方法
【請求項３０３】
前記微生物が少なくとも一つの外来のショ糖資化性遺伝子を含む、請求項287に記載の方法。
【請求項３０４】
前記ショ糖資化性遺伝子が、ショ糖輸送体、ショ糖インベルターゼ、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼまたはフルクトキナーゼをコードする、請求項303の方法。
【請求項３０５】
前記微生物が、脂質経路酵素をコードしている少なくとも一つの外来遺伝子を含む、請求項287に記載の方法。
【請求項３０６】
前記脂質経路酵素が、ステアロイルCoA不飽和酵素、グリセロ脂質不飽和酵素、ピルビン酸塩デヒドロゲナーゼ、アセチルCoAカルボキシラーゼ、アシル担体タンパク質およびグリセロール-3リン酸アシルトランスフェラーゼを備える群から選択されることを特徴とする、請求項305に記載の方法。
【請求項３０７】
前記グリセロールが、エステル転移反応の工程の副産物である、請求項287に記載の方法。
【請求項３０８】
前記グリセロールが酸性であることを特徴とする、請求項307に記載の方法。
【請求項３０９】
前記グリセロールが非酸性であることを特徴とする、請求項307に記載の方法。
【請求項３１０】
他の固定炭素源が、ブドウ糖であることを特徴とする、請求項287に記載の方法。
【請求項３１１】
他の固定炭素源が、脱重合されたセルロース材料であることを特徴とする、請求項287に記載の方法。
【請求項３１２】
他の固定炭素源が、ショ糖であることを特徴とする、請求項287に記載の方法。
【請求項３１３】
(a) 微生物の群、
(b) グリセロール、
及び、(c)少なくとも一つの糖がキシロース、ブドウ糖およびショ糖を備える群から選択された、から成る発酵槽。
【請求項３１４】
前記グリセロールが、エステル転移反応の工程の副産物であることを特徴とする、請求項313に記載の発酵槽。
【請求項３１５】
前記微生物が微細藻類である、請求項の中で発酵槽。
【請求項３１６】
前記微生物が表1にリストされる微細藻類を備える群から選択される、請求項315に記載の発酵槽。
【請求項３１７】
前記微生物が、クロレラ属の種であることを特徴とする、請求項316に記載の発酵槽。
【請求項３１８】
前記微生物がクロレラ・アニトラタ（Chlorella anitrata）、クロレラ・アンタルクティカ（ Chlorella antarctica）、クロレラ・アウレオビリディス（ Chlorella aureoviridis）、クロレラ・キャンディダ（ Chlorella Candida）、クロレラ・キャプスラタ（Chlorella capsulata）、クロレラ・デシカッタ（Chlorella desiccata）、クロレラ・エリプソイデア（Chlorella ellipsoidea）、クロレラ・エメルソニイ（Chlorella emersonii）、クロレラ・フスカ（Chlorella fusca）、クロレラ・フスカ・バー・バクオレタ（Chlorella fusca var. vacuolata）, クロレラ・グルコトロファ（Chlorella glucotropha）、クロレラ・インフシオナム（Chlorella infusionum）、クロレラ・インフシオナム・バー・アクトフィラ（Chlorella infusionum var. Actophila）、クロレラ・インフシオナム・バー・アウェノフィラ（Chlorella infusionum var.Auxenophila）, クロレラ・ケッセレリ（Chlorella kessleri）、クロレラ・ルテオビリディス（Chlorella luteoviridis）、クロレラ・ルテオビリディス・バー・アウレオビリディス（Chlorella luteoviridis var. aureoviridis）、クロレラ・ルテオヴィリディス・バー・ルテスセンス（Chlorella luteoviridis var.Lutescens）、クロレラ・ミニアタ（Chlorella miniata）、クロレラ・ミヌティッシマ（Chlorella minutissima）、クロレラ・ムタビリス（Chlorella mutabilis）、クロレラ・ノクツルナ（Chlorella nocturna）、クロレラ・パルバ（Chlorella parva）、クロレラ・ファトフィリア（Chlorella photophila）、クロレラ・プリングシェイミィ（Chlorella pringsheimii）、クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）、クロレラ・ピレノイドサ（Chlorella pyrenoidosa）、クロレラ・レグラリス（Chlorella regularis）、クロレラ・レグラリス・バー・ミニマ（Chlorella regularis var. minima）、クロレラ・レグラリス・バー・ウンブリカタ（Chlorella regularis var. umbricata）、クロレラ・レイシグリィ（Chlorella reisiglii）、クロレラ・サッカロフィア（Chlorella saccharophila）、クロレラ・サッカロフィア・バー・エリプソイデア（ Chlorella saccharophila var. ellipsoidea）、クロレラ・サリナ（Chlorella salina）、クロレラ・シンプレックス（Chlorella simplex）、クロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana）、クロレラ属の種（Chlorella sp.）、クロレラ・スファエリカ（Chlorella sphaerica）、クロレラ・スティグマトフォラ（Chlorella stigmatophora）、クロレラ・バニエリィ（Chlorella vanniellii）、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）、クロレラ・ブルガリス・エフ・テルシア（Chlorella vulgaris f. tertia）、クロレラ・ブルガリス・バー・アイリディス（Chlorella vulgaris var. airidis）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス（Chlorella vulgaris var. vulgaris）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・テルシア（Chlorella vulgaris var. vulgaris f. tertia）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・ビリディス（Chlorella vulgaris var. vulgaris f. viridis）、クロレラ・シャンセラ（Chlorella xanthella）及びクロレラ・ゾフィンジエンシス（Chlorella zofingiensis）を備える群から選択されることを特徴とする、請求項317に記載の方法。
【請求項３１９】
前記微生物が、パラクロレラ・ケッセリ（Parachlorella kessleri）、クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）、バクテリオコッカス・メディオヌクレタス（Bracteococcus medionucleatus）、プロトテカ・モリフォルミス（Prototheca moriformis）、クロレラ・ミヌティッシマ（Chlorella minutissima）、クロレラ属の種（Chlorella sp.）およびクロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana）を備えるグループから選択されることを特徴とする、請求項313に記載の発酵槽。
【請求項３２０】
前記微生物が油性の酵母であることを特徴とする、請求項313記載の方法。
【請求項３２１】
前記油性酵母が、クリプトコッカス・クルバツス（Cryptococcus curvatus）、クリプトコッカス・テリコルス（Cryptococcus terricolus）、カンジタ属の一種（Candida sp.）、リポマイセス・スタルケィ（Lipomyces starkeyi）、リポマイセス・リポファ（Lipomyces lipofer）、エンドマイコプシス・バルナリス（Endomycopsis vernalis）、ロドトルラ・グルティニス（Rhodotorula glutinis）、ロドトルラ・グルシリス（Rhodotorula gracilis）およびヤロウィア・リポリティリカ（Yarrowia lipolytica）を備える群から選択されることを特徴とする、請求項320に記載の方法
【請求項３２２】
前記微生物が、真菌であることを特徴とする、請求項313に記載の発酵槽。
【請求項３２３】
前記真菌が、モルティエレラ（Mortierella）属の一種、モルティエレラ・ビナセア（Mortierrla vinacea）、モルティエレラ・アルペン（Mortierella alpine）、フィリシウム・デバリアヌム（Pythium debaryanum）、ケカビ属シルシネロイデス（Mucor circinelloides）、アスペルギルス・オクラセウス（Aspergillus ochraceus）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）、ペネシリウム・イイラシヌム（Pennicillium iilacinum）、ヘンセヌロ（Hensenulo）属の一種、カエトミウム（Chaetomium）属の一種、クラドスポリウム（Cladosporium）属の一種、マルブランシェア（Malbranchea）属の一種、リゾプス（Rhizopus）属の一種およびフィシウム（Pythium）属の一種のを備える群から選択されることを特徴とする、請求項322記載の発酵槽。
【請求項３２４】
前記微生物が、少なくとも一つの外来ショ糖資化性遺伝子を含むことを特徴とする、請求項313に記載の発酵槽。
【請求項３２５】
前記ショ糖資化性遺伝子が、ショ糖輸送体、ショ糖インベルターゼ、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼまたはフルクトキナーゼをコードすることを特徴とする、請求項324に記載の発酵槽。
【請求項３２６】
前記微生物が、脂質経路酵素をコードしている少なくとも一つの外来遺伝子を含むことを特徴とする、請求項313に記載の発酵槽。
【請求項３２７】
前記脂質経路酵素が、ステアロイルCoA不飽和酵素、グリセロ脂質不飽和酵素、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、アセチルCoAカルボキシラーゼ、アシル担体タンパク質およびグリセロール-3リン酸アシルトランスフェラーゼを備える群から選択されることを特徴とする、請求項326の中で発酵槽。
【請求項３２８】
固定炭素源を唯一の原料として、エステル転移反応の工程の副産物であるグリセロールを提供する工程、を含む微生物での発酵方法。
【請求項３２９】
光のエネルギーが微生物に提供されないことを特徴とする、請求項328に記載の方法。
【請求項３３０】
光のエネルギーが微生物に提供されることを特徴とする、請求項328に記載の方法。
【請求項３３１】
前記微生物が微細藻類であることを特徴とする、請求項328に記載の方法。
【請求項３３２】
前記微生物が表1にリストされる微細藻類を備える群から選択されることを特徴とする、請求項331に記載の方法。
【請求項３３３】
前記微生物がクロレラ属の種であることを特徴とする、請求項332に記載の方法
【請求項３３４】
前記微生物が、クロレラ・アニトラタ（Chlorella anitrata）、クロレラ・アンタルクティカ（ Chlorella antarctica）、クロレラ・アウレオビリディス（ Chlorella aureoviridis）、クロレラ・キャンディダ（ Chlorella Candida）、クロレラ・キャプスラタ（Chlorella capsulata）、クロレラ・デシカッタ（Chlorella desiccata）、クロレラ・エリプソイデア（Chlorella ellipsoidea）、クロレラ・エメルソニイ（Chlorella emersonii）、クロレラ・フスカ（Chlorella fusca）、クロレラ・フスカ・バー・バクオレタ（Chlorella fusca var. vacuolata）, クロレラ・グルコトロファ（Chlorella glucotropha）、クロレラ・インフシオナム（Chlorella infusionum）、クロレラ・インフシオナム・バー・アクトフィラ（Chlorella infusionum var. Actophila）、クロレラ・インフシオナム・バー・アウェノフィラ（Chlorella infusionum var.Auxenophila）, クロレラ・ケッセレリ（Chlorella kessleri）、クロレラ・ルテオビリディス（Chlorella luteoviridis）、クロレラ・ルテオビリディス・バー・アウレオビリディス（Chlorella luteoviridis var. aureoviridis）、クロレラ・ルテオヴィリディス・バー・ルテスセンス（Chlorella luteoviridis var.Lutescens）、クロレラ・ミニアタ（Chlorella miniata）、クロレラ・ミヌティッシマ（Chlorella minutissima）、クロレラ・ムタビリス（Chlorella mutabilis）、クロレラ・ノクツルナ（Chlorella nocturna）、クロレラ・パルバ（Chlorella parva）、クロレラ・ファトフィリア（Chlorella photophila）、クロレラ・プリングシェイミィ（Chlorella pringsheimii）、クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）、クロレラ・ピレノイドサ（Chlorella pyrenoidosa）、クロレラ・レグラリス（Chlorella regularis）、クロレラ・レグラリス・バー・ミニマ（Chlorella regularis var. minima）、クロレラ・レグラリス・バー・ウンブリカタ（Chlorella regularis var. umbricata）、クロレラ・レイシグリィ（Chlorella reisiglii）、クロレラ・サッカロフィア（Chlorella saccharophila）、クロレラ・サッカロフィア・バー・エリプソイデア（ Chlorella saccharophila var. ellipsoidea）、クロレラ・サリナ（Chlorella salina）、クロレラ・シンプレックス（Chlorella simplex）、クロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana）、クロレラ属の種（Chlorella sp.）、クロレラ・スファエリカ（Chlorella sphaerica）、クロレラ・スティグマトフォラ（Chlorella stigmatophora）、クロレラ・バニエリィ（Chlorella vanniellii）、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）、クロレラ・ブルガリス・エフ・テルシア（Chlorella vulgaris f. tertia）、クロレラ・ブルガリス・バー・アイリディス（Chlorella vulgaris var. airidis）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス（Chlorella vulgaris var. vulgaris）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・テルシア（Chlorella vulgaris var. vulgaris f. tertia）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・ビリディス（Chlorella vulgaris var. vulgaris f. viridis）、クロレラ・シャンセラ（Chlorella xanthella）及びクロレラ・ゾフィンジエンシス（Chlorella zofingiensis）を備える群から選択されることを特徴とする、請求項333に記載の方法。
【請求項３３５】
前記微生物がパラクロレラ・ケッセリ（Parachlorella kessleri）、クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）、バクテリオコッカス・メディオヌクレタス（Bracteococcus medionucleatus）、プロトテカ・モリフォルミス（Prototheca moriformis）、クロレラ・ミヌティッシマ（Chlorella minutissima）、クロレラ属の種（Chlorella sp.）およびクロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana）から選ばれることを特徴とする、請求項328に記載の方法。
【請求項３３６】
前記微生物が油性酵母であることを特徴とする、請求項336に記載の方法。
【請求項３３７】
前記油性酵母が、クリプトコッカス・クルバツス（Cryptococcus curvatus）、クリプトコッカス・テリコルス（Cryptococcus terricolus）、カンジタ属の一種（Candida sp.）、リポマイセス・スタルケィ（Lipomyces starkeyi）、リポマイセス・リポファ（Lipomyces lipofer）、エンドマイコプシス・バルナリス（Endomycopsis vernalis）、ロドトルラ・グルティニス（Rhodotorula glutinis）、ロドトルラ・グルシリス（Rhodotorula gracilis）およびヤロウィア・リポリティリカ（Yarrowia lipolytica）を備える群から選択されることを特徴とする、請求項336に記載の方法
【請求項３３８】
前記微生物が、真菌であることを特徴とする、請求項328に記載の方法。
【請求項３３９】
前記真菌が、モルティエレラ（Mortierella）属の一種、モルティエレラ・ビナセア（Mortierrla vinacea）、モルティエレラ・アルペン（Mortierella alpine）、フィリシウム・デバリアヌム（Pythium debaryanum）、ケカビ属シルシネロイデス（Mucor circinelloides）、アスペルギルス・オクラセウス（Aspergillus ochraceus）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）、ペネシリウム・イイラシヌム（Pennicillium iilacinum）、ヘンセヌロ（Hensenulo）属の一種、カエトミウム（Chaetomium）属の一種、クラドスポリウム（Cladosporium）属の一種、マルブランシェア（Malbranchea）属の一種、リゾプス（Rhizopus）属の一種およびフィシウム（Pythium）属の一種のを備える群から選択されることを特徴とする、請求項338に記載の方法
【請求項３４０】
前記微生物が少なくとも一つの外来ショ糖資化性遺伝子を含む、請求項328に記載の方法。
【請求項３４１】
前記ショ糖資化性遺伝子が、ショ糖輸送体、ショ糖インベルターゼ、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼまたはフルクトキナーゼをコードする、請求項340に記載の方法。
【請求項３４２】
前記微生物が脂質経路酵素をコードする外来遺伝子を含む、請求項328に記載の方法。
【請求項３４３】
前記脂質経路酵素が、ステアロイルCoA不飽和酵素、グリセロ脂質不飽和酵素、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、アセチルCoAカルボキシラーゼ、アシル担体タンパク質およびグリセロール-3リン酸アシルトランスフェラーゼを備える群から選択されることを特徴とする、請求項342に記載の方法。
【請求項３４４】
外来のショ糖資化性遺伝子を含む微生物。
【請求項３４５】
前記遺伝子がショ糖輸送体をコードすることを特徴とする、請求項344に記載の微生物。
【請求項３４６】
前記遺伝子が、ショ糖インベルターゼをコードすることを特徴とする、請求項344に記載の微生物。
【請求項３４７】
前記遺伝子がフルクトキナーゼをコードすることを特徴とする、請求項347に記載の微生物。
【請求項３４８】
前記微生物が微細藻類であることを特徴とする、請求項344に記載の微生物。
【請求項３４９】
前記微生物が表1にリストされる微細藻類を備える群から選択されることを特徴とする、請求項348に記載の微生物。
【請求項３５０】
前記微生物がクロレラ属の種であることを特徴とする、請求項349に記載の微生物
【請求項３５１】
前記微生物がクロレラ・ミヌティッシマ（Chlorella minutissima）、クロレラ・エメルソニイ（Chlorella emersonii）、クロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana、クロレラ・エリプソイデア（Chlorella ellipsoidea）、クロレラ属の種（Chlorella sp.）またはクロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）を備えるグループから選択される種であることを特徴とする、請求項350に記載の微生物。
【請求項３５２】
クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）、クロレラ・エメルソニイ（Chlorella emersonii）またはクロレラ・ミヌティッシマ（Chlorella minutissima）の種の細胞であって、前記細胞が外来の遺伝子を含む細胞。
【請求項３５３】
前記外来遺伝子がショ糖輸送体、ショ糖インベルターゼ、脂質修飾酵素、炭化水素修飾酵素およびフルクトキナーゼを備える群から選択されるタンパク質をコードする、請求項352に記載の細胞
【請求項３５４】
前記タンパク質が、細胞外間隙に分泌されるショ糖インベルターゼであることを特徴とする、請求項353に記載の細胞。
【請求項３５５】
前記タンパク質が、細胞質を目標とされるショ糖インベルターゼであることを特徴とする、請求項353に記載の細胞。
【請求項３５６】
(a) 微生物の群
並びに（b）(i)ショ糖および（ii）ショ糖インベルターゼ酵素から成る培地
を含む、微生物培地。
【請求項３５７】
前記微生物が微細藻類である、請求項356に記載の微生物培地。
【請求項３５８】
前記微生物が、表1にリストされる微細藻類を備える群から選択されることを特徴とする、請求項357に記載の微生物培地。
【請求項３５９】
前記微生物はクロレラ属の種であることを特徴とする、請求項358に記載の微生物培地。
【請求項３６０】
前記微生物が、クロレラ・アニトラタ（Chlorella anitrata）、クロレラ・アンタルクティカ（ Chlorella antarctica）、クロレラ・アウレオビリディス（ Chlorella aureoviridis）、クロレラ・キャンディダ（ Chlorella Candida）、クロレラ・キャプスラタ（Chlorella capsulata）、クロレラ・デシカッタ（Chlorella desiccata）、クロレラ・エリプソイデア（Chlorella ellipsoidea）、クロレラ・エメルソニイ（Chlorella emersonii）、クロレラ・フスカ（Chlorella fusca）、クロレラ・フスカ・バー・バクオレタ（Chlorella fusca var. vacuolata）, クロレラ・グルコトロファ（Chlorella glucotropha）、クロレラ・インフシオナム（Chlorella infusionum）、クロレラ・インフシオナム・バー・アクトフィラ（Chlorella infusionum var. Actophila）、クロレラ・インフシオナム・バー・アウェノフィラ（Chlorella infusionum var.Auxenophila）, クロレラ・ケッセレリ（Chlorella kessleri）、クロレラ・ルテオビリディス（Chlorella luteoviridis）、クロレラ・ルテオビリディス・バー・アウレオビリディス（Chlorella luteoviridis var. aureoviridis）、クロレラ・ルテオヴィリディス・バー・ルテスセンス（Chlorella luteoviridis var.Lutescens）、クロレラ・ミニアタ（Chlorella miniata）、クロレラ・ミヌティッシマ（Chlorella minutissima）、クロレラ・ムタビリス（Chlorella mutabilis）、クロレラ・ノクツルナ（Chlorella nocturna）、クロレラ・パルバ（Chlorella parva）、クロレラ・ファトフィリア（Chlorella photophila）、クロレラ・プリングシェイミィ（Chlorella pringsheimii）、クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）、クロレラ・ピレノイドサ（Chlorella pyrenoidosa）、クロレラ・レグラリス（Chlorella regularis）、クロレラ・レグラリス・バー・ミニマ（Chlorella regularis var. minima）、クロレラ・レグラリス・バー・ウンブリカタ（Chlorella regularis var. umbricata）、クロレラ・レイシグリィ（Chlorella reisiglii）、クロレラ・サッカロフィア（Chlorella saccharophila）、クロレラ・サッカロフィア・バー・エリプソイデア（ Chlorella saccharophila var. ellipsoidea）、クロレラ・サリナ（Chlorella salina）、クロレラ・シンプレックス（Chlorella simplex）、クロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana）、クロレラ属の種（Chlorella sp.）、クロレラ・スファエリカ（Chlorella sphaerica）、クロレラ・スティグマトフォラ（Chlorella stigmatophora）、クロレラ・バニエリィ（Chlorella vanniellii）、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）、クロレラ・ブルガリス・エフ・テルシア（Chlorella vulgaris f. tertia）、クロレラ・ブルガリス・バー・アイリディス（Chlorella vulgaris var. airidis）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス（Chlorella vulgaris var. vulgaris）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・テルシア（Chlorella vulgaris var. vulgaris f. tertia）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・ビリディス（Chlorella vulgaris var. vulgaris f. viridis）、クロレラ・シャンセラ（Chlorella xanthella）及びクロレラ・ゾフィンジエンシス（Chlorella zofingiensis）を備える群から選択されることを特徴とする、請求項359に記載の微生物培地。
【請求項３６１】
前記微生物が油性酵母であることを特徴とする、請求項356に記載の微生物培地。
【請求項３６２】
前記油性酵母が、クリプトコッカス・クルバツス（Cryptococcus curvatus）、クリプトコッカス・テリコルス（Cryptococcus terricolus）、カンジタ属の一種（Candida sp.）、リポマイセス・スタルケィ（Lipomyces starkeyi）、リポマイセス・リポファ（Lipomyces lipofer）、エンドマイコプシス・バルナリス（Endomycopsis vernalis）、ロドトルラ・グルティニス（Rhodotorula glutinis）、ロドトルラ・グルシリス（Rhodotorula gracilis）およびヤロウィア・リポリティリカ（Yarrowia lipolytica）を備える群から選択されることを特徴とする、請求項361記載の微生物培地。
【請求項３６３】
前記微生物が、真菌であることを特徴とする、請求項356に記載の微生物培地。
【請求項３６４】
前記真菌が、モルティエレラ（Mortierella）属の一種、モルティエレラ・ビナセア（Mortierrla vinacea）、モルティエレラ・アルペン（Mortierella alpine）、フィリシウム・デバリアヌム（Pythium debaryanum）、ケカビ属シルシネロイデス（Mucor circinelloides）、アスペルギルス・オクラセウス（Aspergillus ochraceus）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）、ペネシリウム・イイラシヌム（Pennicillium iilacinum）、ヘンセヌロ（Hensenulo）属の一種、カエトミウム（Chaetomium）属の一種、クラドスポリウム（Cladosporium）属の一種、マルブランシェア（Malbranchea）属の一種、リゾプス（Rhizopus）属の一種およびフィシウム（Pythium）属の一種を備える群から選択されることを特徴とする、請求項363に記載の微生物培地。
【請求項３６５】
前記微生物が、外来のショ糖資化性遺伝子を含む、請求項356に記載の微生物培地。
【請求項３６６】
前記ショ糖資化性遺伝子が、ショ糖輸送体、ショ糖インベルターゼ、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼまたはフルクトキナーゼをコードすることを特徴とする、請求項365に記載の微生物培地。
【請求項３６７】
前記ショ糖資化性遺伝子が、ショ糖輸送体をコードすることを特徴とする、請求項366に記載の微生物培地。
【請求項３６８】
前記ショ糖インベルターゼが、外来のショ糖インベルターゼ遺伝子によってコードされる分泌型のショ糖インベルターゼであり、微生物群によって発現されることを特徴とする、請求項356に記載の微生物培地。
【請求項３６９】
前記微生物は、脂質経路酵素をコードしている少なくとも一つの外来遺伝子を含むことを特徴とする、請求項356に記載の微生物培地。
【請求項３７０】
前記脂質経路酵素が、ステアロイルCoA不飽和酵素、グリセロ脂質不飽和酵素、ピルビン酸塩デヒドロゲナーゼ、アセチルCoAカルボキシラーゼ、アシル担体タンパク質およびグリセロール-3リン酸アシルトランスフェラーゼを備える群から選択されることを特徴とする、請求項369に記載の微生物培地。
【請求項３７１】
(a)微生物の群と、
並びに(b)(i)糖蜜および（ii）ショ糖インベルターゼ酵素、
を備える微生物培地。
【請求項３７２】
前記微生物が微細藻類であることを特徴とする、請求項371に記載の微生物培地。
【請求項３７３】
前記微生物が表1にリストされる微細藻類を備える群から選択されることを特徴とする、請求項372に記載の微生物培地。
【請求項３７４】
前記微生物が、クロレラ属の種であることを特徴とする、請求項373に記載の微生物培地。
【請求項３７５】
前記微生物が、クロレラ・アニトラタ（Chlorella anitrata）、クロレラ・アンタルクティカ（ Chlorella antarctica）、クロレラ・アウレオビリディス（ Chlorella aureoviridis）、クロレラ・キャンディダ（ Chlorella Candida）、クロレラ・キャプスラタ（Chlorella capsulata）、クロレラ・デシカッタ（Chlorella desiccata）、クロレラ・エリプソイデア（Chlorella ellipsoidea）、クロレラ・エメルソニイ（Chlorella emersonii）、クロレラ・フスカ（Chlorella fusca）、クロレラ・フスカ・バー・バクオレタ（Chlorella fusca var. vacuolata）, クロレラ・グルコトロファ（Chlorella glucotropha）、クロレラ・インフシオナム（Chlorella infusionum）、クロレラ・インフシオナム・バー・アクトフィラ（Chlorella infusionum var. Actophila）、クロレラ・インフシオナム・バー・アウェノフィラ（Chlorella infusionum var.Auxenophila）, クロレラ・ケッセレリ（Chlorella kessleri）、クロレラ・ルテオビリディス（Chlorella luteoviridis）、クロレラ・ルテオビリディス・バー・アウレオビリディス（Chlorella luteoviridis var. aureoviridis）、クロレラ・ルテオヴィリディス・バー・ルテスセンス（Chlorella luteoviridis var.Lutescens）、クロレラ・ミニアタ（Chlorella miniata）、クロレラ・ミヌティッシマ（Chlorella minutissima）、クロレラ・ムタビリス（Chlorella mutabilis）、クロレラ・ノクツルナ（Chlorella nocturna）、クロレラ・パルバ（Chlorella parva）、クロレラ・ファトフィリア（Chlorella photophila）、クロレラ・プリングシェイミィ（Chlorella pringsheimii）、クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）、クロレラ・ピレノイドサ（Chlorella pyrenoidosa）、クロレラ・レグラリス（Chlorella regularis）、クロレラ・レグラリス・バー・ミニマ（Chlorella regularis var. minima）、クロレラ・レグラリス・バー・ウンブリカタ（Chlorella regularis var. umbricata）、クロレラ・レイシグリィ（Chlorella reisiglii）、クロレラ・サッカロフィア（Chlorella saccharophila）、クロレラ・サッカロフィア・バー・エリプソイデア（ Chlorella saccharophila var. ellipsoidea）、クロレラ・サリナ（Chlorella salina）、クロレラ・シンプレックス（Chlorella simplex）、クロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana）、クロレラ属の種（Chlorella sp.）、クロレラ・スファエリカ（Chlorella sphaerica）、クロレラ・スティグマトフォラ（Chlorella stigmatophora）、クロレラ・バニエリィ（Chlorella vanniellii）、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）、クロレラ・ブルガリス・エフ・テルシア（Chlorella vulgaris f. tertia）、クロレラ・ブルガリス・バー・アイリディス（Chlorella vulgaris var. airidis）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス（Chlorella vulgaris var. vulgaris）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・テルシア（Chlorella vulgaris var. vulgaris f. tertia）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・ビリディス（Chlorella vulgaris var. vulgaris f. viridis）、クロレラ・シャンセラ（Chlorella xanthella）及びクロレラ・ゾフィンジエンシス（Chlorella zofingiensis）を備える群から選択されることを特徴とする、請求項374に記載の微生物培地。
【請求項３７６】
前記微生物は油性酵母である、請求項371記載の微生物培地。
【請求項３７７】
前記油性酵母が、クリプトコッカス・クルバツス（Cryptococcus curvatus）、クリプトコッカス・テリコルス（Cryptococcus terricolus）、カンジタ属の一種（Candida sp.）、リポマイセス・スタルケィ（Lipomyces starkeyi）、リポマイセス・リポファ（Lipomyces lipofer）、エンドマイコプシス・バルナリス（Endomycopsis vernalis）、ロドトルラ・グルティニス（Rhodotorula glutinis）、ロドトルラ・グルシリス（Rhodotorula gracilis）およびヤロウィア・リポリティリカ（Yarrowia lipolytica）を備える群から選択されることを特徴とする、請求項376に記載の微生物培地。
【請求項３７８】
前記微生物が真菌であることを特徴とする、請求項371に記載の微生物培地。
【請求項３７９】
前記真菌が、モルティエレラ（Mortierella）属の一種、モルティエレラ・ビナセア（Mortierrla vinacea）、モルティエレラ・アルペン（Mortierella alpine）、フィリシウム・デバリアヌム（Pythium debaryanum）、ケカビ属シルシネロイデス（Mucor circinelloides）、アスペルギルス・オクラセウス（Aspergillus ochraceus）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）、ペネシリウム・イイラシヌム（Pennicillium iilacinum）、ヘンセヌロ（Hensenulo）属の一種、カエトミウム（Chaetomium）属の一種、クラドスポリウム（Cladosporium）属の一種、マルブランシェア（Malbranchea）属の一種、リゾプス（Rhizopus）属の一種およびフィシウム（Pythium）属の一種のを備える群から選択されることを特徴とする、請求項378に記載の微生物培地。
【請求項３８０】
前記微生物が、少なくとも一つの外来のショ糖資化性遺伝子を含む、請求項371に記載の微生物培地。
【請求項３８１】
前記ショ糖資化性遺伝子が、ショ糖輸送体、ショ糖インベルターゼ、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼまたはフルクトキナーゼをコードする、請求項380に記載の微生物培地。
【請求項３８２】
前記ショ糖資化性遺伝子が、ショ糖輸送体をコードする、請求項381に記載の微生物培地。
【請求項３８３】
前記ショ糖インベルターゼが、微生物群によって発現する外来のショ糖インベルターゼ遺伝子にコードされ、分泌型の酵素であることを特徴とする、請求項371に記載の微生物培地。
【請求項３８４】
前記微生物が少なくとも一つの脂質経路酵素をコードする外来遺伝子を含むことを特徴とする、請求項371に記載の微生物培地。
【請求項３８５】
前記脂質経路酵素が、ステアロイルCoA不飽和酵素、グリセロ脂質不飽和酵素、ピルビン酸塩デヒドロゲナーゼ、アセチルCoAカルボキシラーゼ、アシル担体タンパク質およびグリセロール-3リン酸アシルトランスフェラーゼを備える群から選択されることを特徴とする、請求項384に記載の微生物培地。
【請求項３８６】
(a) 微生物の群
及び(b)培地を備える微生物培地であって、
前記培地が
(i)ショ糖を備える培地と、
(ii)リグニンと、
及び(iii)ショ糖インベルターゼ酵素と、を備える微生物培地。
【請求項３８７】
前記微生物が微細藻類であることを特徴とする、請求項386に記載の微生物培地。
【請求項３８８】
前記微生物が、表1にリストされる微細藻類を備える群から選択される、請求項387に記載の微生物培地。
【請求項３８９】
前記微生物がクロレラ属の種であることを特徴とする、請求項388に記載の微生物培地。
【請求項３９０】
前記微生物が、クロレラ・アニトラタ（Chlorella anitrata）、クロレラ・アンタルクティカ（ Chlorella antarctica）、クロレラ・アウレオビリディス（ Chlorella aureoviridis）、クロレラ・キャンディダ（ Chlorella Candida）、クロレラ・キャプスラタ（Chlorella capsulata）、クロレラ・デシカッタ（Chlorella desiccata）、クロレラ・エリプソイデア（Chlorella ellipsoidea）、クロレラ・エメルソニイ（Chlorella emersonii）、クロレラ・フスカ（Chlorella fusca）、クロレラ・フスカ・バー・バクオレタ（Chlorella fusca var. vacuolata）, クロレラ・グルコトロファ（Chlorella glucotropha）、クロレラ・インフシオナム（Chlorella infusionum）、クロレラ・インフシオナム・バー・アクトフィラ（Chlorella infusionum var. Actophila）、クロレラ・インフシオナム・バー・アウェノフィラ（Chlorella infusionum var.Auxenophila）, クロレラ・ケッセレリ（Chlorella kessleri）、クロレラ・ルテオビリディス（Chlorella luteoviridis）、クロレラ・ルテオビリディス・バー・アウレオビリディス（Chlorella luteoviridis var. aureoviridis）、クロレラ・ルテオヴィリディス・バー・ルテスセンス（Chlorella luteoviridis var.Lutescens）、クロレラ・ミニアタ（Chlorella miniata）、クロレラ・ミヌティッシマ（Chlorella minutissima）、クロレラ・ムタビリス（Chlorella mutabilis）、クロレラ・ノクツルナ（Chlorella nocturna）、クロレラ・パルバ（Chlorella parva）、クロレラ・ファトフィリア（Chlorella photophila）、クロレラ・プリングシェイミィ（Chlorella pringsheimii）、クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）、クロレラ・ピレノイドサ（Chlorella pyrenoidosa）、クロレラ・レグラリス（Chlorella regularis）、クロレラ・レグラリス・バー・ミニマ（Chlorella regularis var. minima）、クロレラ・レグラリス・バー・ウンブリカタ（Chlorella regularis var. umbricata）、クロレラ・レイシグリィ（Chlorella reisiglii）、クロレラ・サッカロフィア（Chlorella saccharophila）、クロレラ・サッカロフィア・バー・エリプソイデア（ Chlorella saccharophila var. ellipsoidea）、クロレラ・サリナ（Chlorella salina）、クロレラ・シンプレックス（Chlorella simplex）、クロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana）、クロレラ属の種（Chlorella sp.）、クロレラ・スファエリカ（Chlorella sphaerica）、クロレラ・スティグマトフォラ（Chlorella stigmatophora）、クロレラ・バニエリィ（Chlorella vanniellii）、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）、クロレラ・ブルガリス・エフ・テルシア（Chlorella vulgaris f. tertia）、クロレラ・ブルガリス・バー・アイリディス（Chlorella vulgaris var. airidis）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス（Chlorella vulgaris var. vulgaris）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・テルシア（Chlorella vulgaris var. vulgaris f. tertia）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・ビリディス（Chlorella vulgaris var. vulgaris f. viridis）、クロレラ・シャンセラ（Chlorella xanthella）及びクロレラ・ゾフィンジエンシス（Chlorella zofingiensis）を備える群から選択されることを特徴とする、請求項389に記載の微生物培地。
【請求項３９１】
前記微生物が油性酵母であることを特徴とする、請求項386に記載の微生物培地。
【請求項３９２】
前記油性酵母が、クリプトコッカス・クルバツス（Cryptococcus curvatus）、クリプトコッカス・テリコルス（Cryptococcus terricolus）、カンジタ属の一種（Candida sp.）、リポマイセス・スタルケィ（Lipomyces starkeyi）、リポマイセス・リポファ（Lipomyces lipofer）、エンドマイコプシス・バルナリス（Endomycopsis vernalis）、ロドトルラ・グルティニス（Rhodotorula glutinis）、ロドトルラ・グルシリス（Rhodotorula gracilis）およびヤロウィア・リポリティリカ（Yarrowia lipolytica）を備える群から選択されることを特徴とする、請求項391に記載の微生物培地。
【請求項３９３】
前記微生物が、真菌であることを特徴とする、請求項386に記載の微生物培地。
【請求項３９４】
前記真菌が、モルティエレラ（Mortierella）属の一種、モルティエレラ・ビナセア（Mortierrla vinacea）、モルティエレラ・アルペン（Mortierella alpine）、フィリシウム・デバリアヌム（Pythium debaryanum）、ケカビ属シルシネロイデス（Mucor circinelloides）、アスペルギルス・オクラセウス（Aspergillus ochraceus）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）、ペネシリウム・イイラシヌム（Pennicillium iilacinum）、ヘンセヌロ（Hensenulo）属の一種、カエトミウム（Chaetomium）属の一種、クラドスポリウム（Cladosporium）属の一種、マルブランシェア（Malbranchea）属の一種、リゾプス（Rhizopus）属の一種およびフィシウム（Pythium）属の一種を備える群から選択されることを特徴とする、請求項393に記載の微生物培地。
【請求項３９５】
前記微生物が、少なくとも一つの外来のショ糖資化性遺伝子を含むことを特徴とする、請求項386に記載の微生物培地。
【請求項３９６】
前記ショ糖資化性遺伝子が、ショ糖輸送体、ショ糖インベルターゼ、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼまたはフルクトキナーゼをコードする、請求項395に記載の微生物培地。
【請求項３９７】
前記ショ糖資化性遺伝子が、ショ糖輸送体をコードすることを特徴とする、請求項396に記載の微生物培地。
【請求項３９８】
前記ショ糖インベルターゼが、微生物群によって発現する外来のショ糖インベルターゼ遺伝子にコードされ、分泌型の酵素であることを特徴とする、請求項386に記載の微生物培地。
【請求項３９９】
前記微生物が少なくとも一つの脂質経路酵素をコードする外来遺伝子を含むことを特徴とする、請求項386に記載の微生物培地。
【請求項４００】
前記脂質経路酵素が、ステアロイルCoA不飽和酵素、グリセロ脂質不飽和酵素、ピルビン酸塩デヒドロゲナーゼ、アセチルCoAカルボキシラーゼ、アシル担体タンパク質およびグリセロール-3リン酸アシルトランスフェラーゼを備える群から選択されることを特徴とする、請求項399に記載の微生物培地。
【請求項４０１】
(a) ショ糖資化性遺伝子をコードしているcDNA、
及び（b）ハイグロマイシン抗生物質またはG418抗生物質に対する耐性タンパク質をコードしているcDNA、を備える核酸。
【請求項４０２】
微細藻類を播種する方法であって、
(a)従属栄養性の増殖を実行することができる微細藻類細胞を提供する工程と、
(b)セルロース材料を含む増殖培地に微細藻類を播種する工程と、
及び(c)細胞が増殖すること可能な十分な期間、微細藻類を培養する工程を含む、培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
2007年6月1日付け出願の米国仮特許出願第60/941,581号、2007年7月10日付け出願の米国仮特許出願の第60/959,174号、2007年8月27日付け出願の米国仮特許出願の第60/968,291号及び2008年1月28日付け出願の米国仮特許出願第61/024069号に基づいて優先権を主張するものであり、これらの出願はこの参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、微生物から作られる油、燃料および油脂化学製品の生産に関する。本発明は、特に、微細藻類、酵母および真菌類を含む石油を生産する微生物、及び工業、エネルギーまたは食品原料のために、脂質、脂肪酸エステル、脂肪酸、アルデヒド、アルコール類およびアルカンを含む有用な物質を生産する微生物を培養する方法について説明する。本発明の微生物は、本願明細書において説明されている方法の他、本発明の実施形態のために選抜または遺伝子組み換えをすることができる。
【背景技術】
【０００３】
化石燃料は、埋設された可燃性の有機物である地質学的堆積物の一般用語であり、数億年にもわたる地球の熱および圧力によって、死んだ動植物から原油、石炭、天然ガスまたは重油が形成される。
【０００４】
一般文献において、化石燃料（別名鉱物燃料）が、他の炭化水素を含有する天然資源（例えば石炭、油および天然ガス）によって、同義的に用いられる。化石燃料の利用は、大規模な産業開発を可能にして、熱を得るための木または泥炭の燃焼と同様に、主に水力駆動工場を代替した。化石燃料は、有限であり、再生不能資源である。
【０００５】
電気を発生させるときに、化石燃料の燃焼によるエネルギーはタービンを動かすためにしばしば用いられる。以前の発電ではしばしば、タービンを回すために燃料の燃焼によって発生する蒸気を使用したが、より最近の発電所では、燃料の燃焼によってできるガスは直接ガスタービンを回す。20世紀および21世紀の世界的な近代化とともに、特に石油に由来するガソリン等の化石燃料からのエネルギーの枯渇は、主要な地域紛争および国際紛争の原因のうちの1つである。
【０００６】
人間が化石燃料を燃焼させることは、温室効果ガスの一つであって放射強制力を引き起こして地球温暖化に作用する二酸化炭素の放出の最大の原因である。米国において、90%以上の温室効果ガス排出は、化石燃料の燃焼に由来する。さらに、他の空気汚染物質、例えば酸化窒素、二酸化硫黄、揮発性有機化合物（VOCs)および重金属が生じる。
【０００７】
人間の活動は、主に二酸化炭素を化石燃料の燃焼に由来する二酸化炭素を放出することによって温室効果ガスのレベルを上げるが、例えばメタンなどの他のガスも無視できない存在である。いくつかの温室効果ガスの濃度は、より高い二酸化炭素濃度につながっている化石燃料の燃焼や森林伐採等の人間の活動によって、時間とともに増加している。地球温暖化の仮説によれば、工業および農業由来の温室効果ガスは、近年観測されている地球温暖化の主役である。
【０００８】
グローバル経済によるエネルギーの需要増大は、また、炭化水素のコスト増大圧力を増やすと認識されている。エネルギーだけではなく、プラスチック工業および化学工業を含む多くの産業は、それらの製造プロセスのための供給原料として、炭化水素が入手できるかどうかに大きく依存する。近年の費用対効果に優れた供給源の代替物は、エネルギーおよびこれらの原料のコストの上昇圧力を緩和することに貢献してきた。
【発明の概要】
【０００９】
（発明を解決する手段）
一つの方法では、本発明は、本発明を目的とする各種実施態様として、リパーゼ、ショ糖輸送体、ショ糖インベルターゼ、フルクトキナーゼ、ポリサッカロイド分解酵素、脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ、脂肪酸アシルＣｏＡ/アルデヒド還元酵素、脂肪酸アシルＣｏＡ還元酵素、脂肪酸アルデヒド還元酵素、脂肪酸アルデヒドデカルボニラーゼおよびアシル担体タンパク質（ACP）を備えるグループから選択されるタンパク質をコードする外来遺伝子を含んでいる微細藻類細胞、油性酵母、または真菌類等の微生物を提供する。この微生物（例えば微細藻類細胞）は、例えば、表1から選ぶことができる。具体例として、この細胞はクロレラ属の種であり、例えばクロレラ・フスカ（Chlorella fusca）、クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）、クロレラ・ピレノイドサ（Chlorella pyrenoidosa）、クロレラ・ケッセレリ（Chlorella kessleri）、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）、クロレラ・サッカロフィア（Chlorella saccharophila）、クロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana）またはクロレラ・エリプソイデア（Chlorella ellipsoidea）の種である。
他の実施態様において、この微生物は、クリプトコッカス・クルバツス（Cryptococcus curvatus、クリプトコッカス・テリコルス（Cryptococcus terricolus）、カンジダ属の種（Candida sp.）、リポマイセス・スタルケィ（Lipomyces starkeyi）、リポマイセス・リポファ（Lipomyces lipofer）、エンドマイコプシス・バルナリス（Endomycopsis vernalis）、ロドトルラ・グルティニス（Rhodotorula glutinis）、ロドトルラ・グラシリス（Rhodotorula gracilis）およびヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）を備える群から選択される油性の酵母である。
さらに他の実施態様において、この微生物は、モルティエレラ（Mortierella）属の一種、モルティエレラ・ビナセア（Mortierrla vinacea）、モルティエレラ・アルペン（Mortierella alpine）、フィシウム・デバリアヌム（Pythium debaryanum）、ケカビ属シルシネロイデス（Mucor circinelloides）、アスペルギルス・オクラセウス（Aspergillus ochraceus）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）、ペネシリウム・イイラシヌム（Pennicillium iilacinum）、ヘンセヌロ（Hensenulo）属の一種、カエトミウム（Chaetomium）属の一種、クラドスポリウム（Cladosporium）属の一種、マルブランシェア（Malbranchea）属の一種、リゾプス（Rhizopus）属の一種およびフィシウム（Pythium）属の一種のを備える群から選択される、真菌である。
他の実施態様において、本発明は、例えば大腸菌及びバチラ（Bacilla）のような細菌宿主で炭化水素修飾酵素を発現し、再生可能なディーゼルを生産する方法を含む。
実施態様の一つとして、(a)(i)微生物が、脂質として乾燥細胞重量の少なくとも10％を蓄積し （ii）固定炭素源が、グリセロール、分解されたセルロース材料、ショ糖、糖蜜、ブドウ糖、アラビノース、ガラクトース、キシロース、フルクトース、アラビノース、マンノース、酢酸塩およびそれらの任意の組み合わせから選択される条件のもとで、固定化された炭素源の存在下で微生物群を培養する工程と、（b）培養した微生物から脂質成分を分離する工程と、(c)単離した脂質成分を一つ以上の化学反応に投入して直鎖アルカンを生成する工程と、を含む、再生可能なディーゼルを生産する方法がある。
【００１０】
別の態様においては、本発明は上記の方法に従って作られる液体炭化水素の組成物を目的とする。なお、その組成物はASTM（米国材料試験協会） D975の規格に合致する。
【００１１】
別の態様においては、本発明は、ジェット燃料を生産する方法を目的とする。ある実施態様において、その方法は、ジェット燃料を生産する方法であって、 (a)固定炭素源の存在下で、微生物群を培養する工程と、 (b)培養した微生物からの脂質を単離する工程と、 及び、(c)一つ以上の化学反応によって、単離された脂質成分から直鎖アルカンを生成する工程と、 を含み、 前記(a)工程において、 (i)前記微生物がそれらの乾燥重量の少なくとも10%を脂質として蓄積し 及び(ii)前記固定炭素源は、グリセロール、脱重合されたセルロース材料、ショ糖、糖蜜、ブドウ糖、アラビノース、ガラクトース、キシロース、フルクトース、アラビノース、マンノース、酢酸塩および前述の任意の組合せを備える群から選択される、 生産方法である。
【００１２】
別の態様においては、本発明は、上述されている方法に従って生産される液体炭化水素の組成を目的とする。なお、その組成物はASTM（米国材料試験協会） D 1655の規格に合致する。
【００１３】
もう一つの態様において、本発明は、同じ種の野生株細胞に比べて異なるレベルで、脂質経路酵素を発現するように、遺伝的に改変および/または選抜された微細藻類細胞または酵母細胞がことを目的とする。場合によっては、この細胞は、両細胞を同一の条件下で増殖させた場合に、野生株の細胞に比べて多くの脂質を生産する。場合によっては、この細胞は、野生種の株より高いレベルで脂質経路酵素を発現するように、遺伝的に改変および/または選抜される。場合によっては、この脂質経路酵素は、ステアロイルCoA不飽和酵素、グリセロ脂質不飽和酵素、ピルビン酸塩デヒドロゲナーゼ、アセチルCoAカルボキシラーゼ、アシル担体タンパク質およびグリセロール−3リン酸塩アシルトランスフェラーゼを備える群から選択される。場合によっては、この細胞は、野生種の株より低いレベルで脂質経路酵素を発現するように、遺伝的に改変および/または選抜される。少なくとも一つの実施態様において、この細胞は、低いレベルで脂質経路酵素を発現し、脂質経路酵素はクエン酸塩シンターゼを含む。
【００１４】
いくつかの実施態様では、上述した微細藻類または酵母細胞は、野生種の細胞と比べて複数の脂肪酸合成遺伝子の発現量が異なる細胞であって、遺伝的に改変および/または遺伝的に選抜されることによって野生種の細胞と比べて脂肪酸合成系の調節因子の発現量が異なる。その結果、複数の脂肪酸生合成遺伝子の発現レベルは野生株の細胞と比較して異なる。場合によっては、脂質経路酵素は、脂肪酸を修飾する酵素を含む。場合によっては、脂質経路酵素は、ステアロイルACP不飽和化酵素およびグリセロ脂質不飽和化酵素から選ばれる。
【００１５】
別の態様においては、本発明は一つ以上の外来遺伝子を含んでいる石油生産微生物を目的とする。この外来遺伝子は、脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ、脂肪酸アシルＣｏＡ還元酵素、脂肪酸アルデヒド還元酵素、脂肪酸アシルCoA/アルデヒド還元酵素、脂肪酸アルデヒドデカルボニラーゼおよびアシル担体タンパク質を備える群から選択されるタンパク質をコードする。場合によっては、この微生物は、クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）、クロレラ・ミヌティッシマ（Chlorella minutissima）、クロレラ・エメルソニイ（Chlorella emersonii）、クロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana、クロレラ・エリプソイデア（Chlorella ellipsoidea）またはクロレラ属の種（Chlorella sp.）である。他の場合には、この微生物は本願明細書において説明されている他の種である。ある実施態様において、外来遺伝子はプロモーターと作動可能に連結する遺伝子であって、前記プロモーターが刺激への応答によって誘導又は抑制される。場合によっては、この刺激は、外部から投入された低分子、熱、寒さおよび光を備える群から選択される。場合によっては、外来遺伝子が、細胞内区画において発現される。いくつかの実施態様では、細胞内区画は、葉緑体およびミトコンドリアを備える群から選択される。
【００１６】
ある実施態様において、この外来遺伝子は、脂肪酸アシルACPチオエステラーゼをコードする。場合によっては、外来遺伝子によってコードされるチオエステラーゼは、8から18の炭素数の脂肪酸をアシル担体タンパク質（ACP）から切断する反応を触媒する。場合によっては、外来遺伝子によってコードされるチオエステラーゼは、10から14の炭素数の脂肪酸をACPから切断する反応を触媒する。一実施態様において、外来遺伝子によってコードされるチオエステラーゼは、12の炭素数の脂肪酸をACPから切断する反応を触媒する。
【００１７】
ある実施態様において、この外来遺伝子は、脂肪酸アシルＣｏＡ/アルデヒド還元酵素をコードする。場合によっては、外来遺伝子である還元酵素が、20から30の炭素数の脂肪酸アシルCoAを対応する一級アルコールへ還元する反応を触媒する。場合によっては、外来遺伝子によってコードされる還元酵素は、8から18の炭素数の脂肪酸アシルCoAを対応する一級アルコールへ還元する反応を触媒する。場合によっては、外来遺伝子によってコードされる還元酵素は、10から14の炭素数の脂肪酸アシルCoAを対応する一級アルコールへ還元する反応を触媒する。ある実施態様において、外来遺伝子によってコードされる還元酵素は、12の炭素数の脂肪酸アシルCoAをドデカノールへ還元する反応を触媒する。
【００１８】
ある実施態様において、この外来遺伝子は、脂肪酸アシルＣｏＡ還元酵素をコードする。場合によっては、外来遺伝子によってコードされる還元酵素は、8から18の炭素数の脂肪酸アシルCoAを対応するアルデヒドへ還元する反応を触媒する。ある実施態様において、外来遺伝子によってコードされる還元酵素は、12の炭素数の脂肪酸アシルCoAをドデカナールへ還元する反応を触媒する。
【００１９】
少なくとも一つの実施態様において、本発明の微生物は、一つ以上の外来のショ糖資化性遺伝子をさらに含む。
【００２０】
別の態様においては、本発明は2つの外来遺伝子を含む微生物であって、前記外来遺伝子の第1の遺伝子が脂肪酸アシルACPチオエステラーゼをコードし、前記外来遺伝子の第2の遺伝子が脂肪酸アシルＣｏＡ還元酵素、脂肪酸アシルＣｏＡ/アルデヒド還元酵素およびアシル担体タンパク質を備える群から選択されるタンパク質をコードする微生物。場合によっては、微生物は、クロレラ・ミヌティッシマ（Chlorella minutissima）、クロレラ・エメルソニイ（Chlorella emersonii）、クロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana、クロレラ・エリプソイデア（Chlorella ellipsoidea）、クロレラ属の種（Chlorella sp.）またはクロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）である。他の場合には、微生物は本願明細書において説明されている他の種である。場合によっては、2つの外来遺伝子は、作動可能にプロモーターと連結する遺伝子であって、前記プロモーターは刺激によって応答し、誘導される。場合によっては、各々のプロモーターは、同一の刺激に応答して誘導されうる。
【００２１】
ある実施態様において、第1の外来遺伝子によってコードされるチオエステラーゼは、ACPから8から18の炭素数の脂肪酸を切断する反応を触媒する。いくつかの実施態様では、第2の外来遺伝子は、8から18炭素数の脂肪酸アシルCoAを対応するアルコールに還元する反応を触媒する脂肪酸アシルCoA/アルデヒド還元酵素をコードする。場合によっては、チオエステラーゼと還元酵素とが同一炭素鎖に作用し、前記チオエステラーゼが、第1の外来遺伝子にコードされ、10から14の炭素数の脂肪酸をACPから切断することを触媒し、前記還元酵素が第2の外来遺伝子にコードされ、10から14の炭素数の脂肪酸アシルCoAから対応するアルコールへの還元を触媒する。ある実施態様において、チオエステラーゼは第1外来遺伝子にコードされ、12炭素数の脂肪酸のACPからの切断を触媒し、還元酵素は、第2の外来遺伝子にコードされ、12炭素数のカーボン脂肪酸アシルCoAからドデカノールへの還元を触媒する。いくつかの実施態様では、第２の外来遺伝子は、8から18の炭素数の脂肪酸アシルCoAから対応するアルデヒドへの還元を触媒する脂肪酸アシルCoA還元酵素をコードする。
【００２２】
いくつかの実施態様では、第2の外来遺伝子は脂肪酸アシルCoA還元酵素をコードし、微生物はさらに脂肪酸アルデヒドデカルボニラーゼをコードする第3の外来遺伝子を含む。場合によっては、チオエステラーゼと還元酵素とデカボニラーゼとが同一炭素鎖長に作用し、前記チオエステラーゼは第１外来遺伝子にコードされ、8から18の炭素数の脂肪酸のACPからの切断を触媒し、前記還元酵素は第2外来遺伝子にコードされ、8から18の炭素数の脂肪酸アシルCoAから対応する脂肪酸アルデヒドへの還元を触媒し、前記デカルボニラーゼは第3外来遺伝子にコードされ、8から18の炭素数の脂肪酸アルデヒドから対応するアルカンに転換することを触媒する。
【００２３】
いくつかの実施態様では、第2の外来遺伝子は、脂肪酸アシルACPチオエステラーゼと自然に共同発現するアシル担体タンパク質をコードする。
【００２４】
いくつかの実施態様では、第2の外来遺伝子はアシル担体タンパク質をコードし、そして、微生物はさらに脂肪酸アシルCoA還元酵素および脂肪酸アシルCoA/アルデヒド還元酵素を備える群から選択されるタンパク質をコードする第3の外来遺伝子を含む。場合によっては、第3の外来遺伝子は脂肪酸アシルCoA還元酵素をコードし、そして、微生物はさらに脂肪酸アルデヒドデカルボニラーゼをコードする第4の外来遺伝子を含む。
【００２５】
別の態様においては、本発明は、微生物群において、分子を生産する方法を目的とする。ある実施態様においては、微生物群で分子を生産する方法であって、前記培養方法は微生物群を培地で培養する工程からなり、前記微生物は、 (i) 脂肪酸アシルACPチオエステラーゼをコードしている第1の外来の遺伝子および（ii）脂肪酸アシルCoA/アルデヒド還元酵素をコードしている第2の外来の遺伝子を含み、 ならびに、前記微生物は、脂肪酸に結合されるアシル担体タンパク質（ACP）、ACPから脂肪酸を切断する反応を触媒する脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ、更なる処理で、脂肪酸アシルCoA、及びアシルCoAのアルコールへの還元を触媒する脂肪酸アシルCoA/アルデヒド還元酵素を合成する、生産方法である。
【００２６】
微生物群で分子を生産する方法の一つの実施態様において、微生物は、クロレラ・ミヌティッシマ（Chlorella minutissima）、クロレラ・エメルソニイ（Chlorella emersonii）、クロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana）、クロレラ・エリプソイデア（Chlorella ellipsoidea）、クロレラ属の種（Chlorella sp.）またはクロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）である。他の場合には、微生物は、本願明細書において説明されているほかの種である。場合によっては、培地は、グリセロールを含む。ある実施態様において、グリセロールは、エステル転移反応の工程の副産物である。場合によっては、培地は、グリセロールおよび少なくとも一つのグリセロール以外の固定炭素源を含む。ある実施態様において、少なくとも一つのグリセロール以外の固定炭素源は、ショ糖である。場合によっては、グリセロールの全ておよび少なくとも一つのグリセロール以外の固定炭素源の全ては、発酵の開始期に微生物に提供される。場合によっては、グリセロールおよび少なくとも一つのグリセロール以外の固定炭素源は、発酵期を過ぎて予め定められた率で、微生物に供給される。本発明のいくつかの培養方法において、グリセロールは第1の期間に一つ以上のグリセロール以外の固定炭素源がない場合に微生物に提供され、一つ以上のグリセロール以外の固定炭素源は第1の期間の終わりに形成され、微生物が一つ以上のグリセロール以外の固定炭素源がある場合には、第2の期間中培養される。
【００２７】
いくつかの実施態様では、外来遺伝子は、プロモーターと作動可能に連結し、前記プロモーターは第1の刺激に応答して誘導されうる。場合によっては、この方法は、第1の刺激を提供する工程と、 及び、アルコールを生産するために第1の刺激存在下で第1の期間中の微生物群を培養する工程と、をさらに含む。場合によっては、この方法は、培地および微生物を備える水性バイオマスからアルコールを抽出する工程をさらに含む
【００２８】
いくつかの実施態様では、第1の外来の遺伝子によってコードされるチオエステラーゼが8から18の炭素数の脂肪酸をACPから切断することを触媒し、第2の外来遺伝子によってコードされる還元酵素が8から18の炭素数の脂肪酸アシルCoAを対応するアルコールに還元し、前記チオエステラーゼと前記還元酵素が同一炭素鎖に作用する。場合によっては、第1の外来の遺伝子によってコードされるチオエステラーゼが10から14の炭素数の脂肪酸をACPから切断することを触媒し、及び第2の外来遺伝子によってコードされる還元酵素が10から14の炭素数の脂肪酸アシルCoAを対応するアルコールに還元し、前記チオエステラーゼと前記還元酵素が同一炭素鎖に作用する。ある実施態様においては、第1の外来遺伝子によってコードされるチオエステラーゼが12炭素数の脂肪酸をACPから切断することを触媒し、第2の外来遺伝子にコードされる還元酵素が12炭素数の脂肪酸アシルCoAをドデカノールに還元することを触媒する。場合によっては、微生物は、アシル担体タンパク質をコードしている第3の外来遺伝子をさらに含む。いくつかの実施態様では、第3の外来遺伝子は、脂肪酸アシルACPチオエステラーゼと自然に共同発現するアシル担体タンパク質をコードする。
【００２９】
別の態様においては、本発明は、微生物群で脂質分子を生産する方法を目的とする。ある実施態様においては、前記培養方法は微生物群を培地で培養する工程を含み、前記微生物は、 (i) 脂肪酸アシルACPチオエステラーゼをコードしている第1の外来の遺伝子および（ii）脂肪酸アシルCoA還元酵素をコードしている第2の外来の遺伝子を含み、 ならびに、前記微生物は、脂肪酸に結合されるアシル担体タンパク質（ACP）、脂肪酸をACPから切断する反応を触媒する脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ、更なる処理で、脂肪酸アシルCoA、及びアシルCoAのアルコールへの還元を触媒する脂肪酸アシルCoA/アルデヒド還元酵素を合成する、生産方法である。 場合によっては、微生物は、クロレラ・ミヌティッシマ（Chlorella minutissima）、クロレラ・エメルソニイ（Chlorella emersonii）、クロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana）、クロレラ・エリプソイデア（Chlorella ellipsoidea）、クロレラ属の種（Chlorella sp.）またはクロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）である。他の場合には、微生物は、本願明細書において説明されている微生物の種である。
【００３０】
いくつかの実施態様では、外来遺伝子が、作動可能にプロモーターと連結し、前記プロモーターが刺激に応答して誘導され、この方法は、さらに 第1の刺激を提供する工程、 及びアルデヒドを生産するために第1の刺激がある場合に第1の期間中微生物群を培養する工程、を含む方法である。 ある実施態様において、この方法は、培地および微生物群を含む水性バイオマスからアルデヒドを抽出することをさらに含む。
【００３１】
いくつかの実施態様では、第1の外来遺伝子によってコードされるチオエステラーゼが8から18の炭素数の脂肪酸のACPからの切断を触媒し、第2の外来遺伝子によってコードされる還元酵素が8から18の炭素数の脂肪酸アシルCoAを対応するアルデヒドに還元し、前記チオエステラーゼと前記還元酵素が同一炭素鎖上に作用する。場合によっては、微生物は、アルデヒドよりアルカンへの転換を触媒する脂肪酸アルデヒドデカボニラーゼをコードする第3の遺伝子をさらに含む。
【００３２】
場合によっては、外来遺伝子は、作動可能にプロモーターと連結し、前記プロモーターが刺激に応答して誘導される方法であって、 第1の刺激を提供する工程、 及びアルカンを生産するために第1の刺激がある場合に第1の期間の間の微生物群を培養する工程、をさらに含む方法である。場合によっては、この方法は、培地および微生物群を含む水性バイオマスからアルカンを抽出することをさらに含む。
【００３３】
場合によっては、第1の外来の遺伝子によってコードされるチオエステラーゼが8から18の炭素数の脂肪酸をACPから切断することを触媒し、第2の外来遺伝子によってコードされる還元酵素が8から18の炭素数の脂肪酸アシルCoAを対応するアルコールに還元する反応を触媒し、第3の外来遺伝子によってコードされるデカルボニラーゼが8から18の炭素数のアルデヒドを対応するアルカンへ転換する反応を触媒し、前記チオエステラーゼ、前記還元酵素及び前記デカルボニラーゼが同一炭素鎖に作用する。いくつかの実施態様では、微生物はアシル担体タンパク質をコードしている第3の外来遺伝子をさらに含む。場合によっては、第3の外来遺伝子は、脂肪酸アシルACPチオエステラーゼと自然に共同発現するアシル担体タンパク質をコードする。場合によっては、微生物がアルデヒドよりアルカンへの転換を触媒する脂肪酸アルデヒドデカルボニラーゼをコードする第4の遺伝子をさらに含む。
【００３４】
いくつか方法において、培地は、グリセロールを含む。実施態様において、グリセロールが、エステル転移反応の工程の副産物である。場合によっては、培地は、グリセロールおよび少なくとも一つのグリセロール以外の固定炭素源を含む。実施態様において、少なくとも一つの他のグリセロール以外の固定炭素源は、ショ糖である。場合によっては、グリセロールの全ておよび少なくとも一つのグリセロール以外の固定炭素源の全ては、発酵の開始期に微生物に提供される。場合によっては、グリセロール及び少なくとも一つのグリセロール以外の固定された前記炭素源が、発酵時期を過ぎて、予め定められた率で微生物に提供される。ある実施態様は、グリセロールが第1の期間に一つ以上のグリセロール以外の固定炭素源がない場合に微生物に提供される工程と、 一つ以上のグリセロール以外の固定炭素源が第1の期間の終わりに提供される工程と、 及び微生物が一つ以上のグリセロール以外の固定炭素源がある場合に第2の期間中培養される工程と、を含む。
【００３５】
別の態様においては、本発明は、微生物群で特定の炭素鎖長を有する脂肪酸分子を生産する方法を目的とする。実施態様においては、その方法は培地中で脂肪を生産する微生物の群を培養する工程を含み、前記微生物は特定の炭素鎖への活性を有する脂肪酸アシルACPチオエステラーゼをコードする外来の遺伝子を含み、 並びに前記微生物がアシル担体タンパク質と及びチオエステラーゼを合成し、 前記アシル担体タンパク質は脂肪酸と結合し、 前記チオエステラーゼは脂肪酸を特定の炭素鎖へ合成するときに脂肪酸をACPから切断する反応を触媒する。場合によっては、微生物は、クロレラ・ミヌティッシマ（Chlorella minutissima）、クロレラ・エメルソニイ（Chlorella emersonii）、クロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana）、クロレラ・エリプソイデア（Chlorella ellipsoidea）、クロレラ属の種（Chlorella sp.）またはクロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）である。他の場合には、微生物は本願明細書において記載される、他の種の微生物である。
【００３６】
いくつかの実施態様では、外来遺伝子が、作動可能にプロモーターと連結し、前記プロモーターが刺激に応答して誘導される方法であって、 第1の刺激を提供する工程、 及び、第1の刺激がある場合には、第1の期間の間の微生物群を培養する工程をさらに含む。場合によっては、その方法は、培地および微生物群から成る水性バイオマスから脂肪酸を抽出することをさらに含む。
【００３７】
場合によっては、微生物は、アシル担体タンパク質をコードしている第2の外来遺伝子をさらに含む。いくつかの実施態様では、第2の外来遺伝子は、脂肪酸アシルACPチオエステラーゼと自然に共同発現するアシル担体タンパク質をコードする。ある実施態様において、8から18の炭素数の脂肪酸のACPからの切断を触媒する。
【００３８】
場合によっては、培地は、グリセロールを含む。ある実施態様において、グリセロールは、エステル転移反応の工程の副産物である。いくつかの実施態様では、培地は、グリセロールおよび少なくとも一つのグリセロール以外の固定炭素源を含む。実施態様において、少なくとも一つのグリセロール以外の炭素源は、ショ糖である。場合によっては、グリセロールの全ておよび少なくとも一つのグリセロール以外の固定炭素源の全ては、発酵の開始期に微生物に提供される。場合によっては、グリセロールおよび少なくとも一つのグリセロール以外の固定炭素源は、発酵時期を過ぎて、予め定められた量を微生物に供給される。ある実施態様においては、グリセロールが第1の期間に一つ以上のグリセロール以外の固定炭素源がない場合に微生物に提供される工程と、一つ以上のグリセロール以外の固定炭素源が第1の期間の終わりに提供される工程と、 及び微生物が一つ以上のグリセロール以外の固定炭素源がある場合に第2の期間中培養される工程である。
【００３９】
別の態様においては、本発明は外来遺伝子を含んでいる微細藻類細胞を目的とし、前記外来遺伝子がコードするタンパク質が、リパーゼ、ショ糖輸送体、ショ糖インベルターゼ、フルクトキナーゼまたは多糖類分解酵素を備える群から選択される。場合によっては、細胞は、クロレラ・ミヌティッシマ（Chlorella minutissima）、クロレラ・エメルソニイ（Chlorella emersonii）、クロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana）、クロレラ・エリプソイデア（Chlorella ellipsoidea）、クロレラ属の種（Chlorella sp.）またはクロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）である。他の場合には、細胞は本願明細書において説明されている、微細藻類の他の種である。
【００４０】
場合によっては、外来遺伝子は、作動可能にプロモーターと連結する。場合によっては、プロモーターは、刺激に応答して、誘導または抑制される。各種実施態様において、刺激は、外部から投入された小さい分子、熱、寒さおよび光を備える群から選択される。場合によっては、外来遺伝子は、細胞内区画において発現される。いくつかの実施態様では、細胞内区画は、葉緑体およびミトコンドリアを備える群から選択される。
【００４１】
場合によっては、遺伝子がリパーゼをコードし、前記リパーゼが表9から選択されるリパーゼと少なくとも70%以上のアミノ酸の同一性を有する。実施態様において、リパーゼはノボザイム435（novozym-435）である。実施態様において、多糖類分解酵素は、クロレラウイルスに内在性である。
【００４２】
別の態様においては、本発明は2つの外来遺伝子を含んでいる微細藻類細胞を目的とする。そこにおいて、第1の外来遺伝子はリパーゼをコードし、第2の外来遺伝子は多糖類分解酵素をコードする。場合によっては、外来遺伝子は、作動可能にプロモーターと連結する。場合によっては、外来遺伝子は、刺激に応答して誘導され、作動可能にプロモーターと連結する。場合によっては、外来遺伝子は、同じ刺激に応答して誘導され、作動可能にプロモーターと連結する。場合によっては、外来遺伝子は一つ以上の刺激に応答して誘導され、作動可能にプロモーターと連結し、前記刺激はほかのプロモーターを誘導しない。
【００４３】
別の態様においては、本発明は、微生物内で脂質分子を製造する方法を目的とする。実施態様において、脂質分子を微生物内で製造する方法であって、 (a) 細胞密度を増やすのに十分な第1の期間の間の微生物を培養する工程と、 (b) 刺激を加える工程と、 及び(c)刺激が存在する第2の期間の間の微生物を培養する工程と、 を含む方法であって、 前記(a)の培養工程は、 (i) 外来遺伝子がリパーゼをコードし、 および/または(ii)外来遺伝子が多糖類分解酵素をコードし、 前記外来遺伝子は、作動可能にプロモーターと連結し、前記プロモーターは刺激に応答し誘導されることを含む、製造方法である。
【００４４】
別の態様においては、本発明は、微生物内で脂質分子を製造する方法を目的とする。ある実施態様においては、(a) 細胞密度を増やすのに十分な第1の期間中に脂質を製造する微生物を培養する工程と、 (b) 微生物と直接接触したときに、微生物に感染し溶解させることができるウイルスを提供する工程と、 及び、(c)第2の期間中、水性バイオマスの溶解物を生産するために微生物を培養する工程、を含む製造方法である。ある実施態様においては、この方法は、溶解する水性バイオマスから脂質分子を抽出する工程をさらに含む。
【００４５】
別の態様においては、本発明は外来遺伝子を含んでいる微細藻類細胞を目的とし、前記外来遺伝子が脂質経路酵素のための補因子をコードする、または前記外来遺伝子が補因子の合成に関与するタンパク質をコードする。
【００４６】
別の態様においては、本発明は、脂質を生産する微生物を培養する方法を目的とする。実施態様において、この方法は、脂質経路酵素のための補因子の非存在下よりも微生物由来脂質を増やすために、前記補因子が十分な量があるときに微生物を培養する工程を含む。場合によっては、脂質経路酵素に要求される補因子は、ビタミンである。ある実施態様においては、補因子は、ビオチンである。場合によっては、補因子が培地中に含まれる微生物によって提供される工程を含み、前記微生物が補因子を製造するように遺伝的に改変される。
【００４７】
別の態様においては、本発明は微生物での発酵方法を目的とする。前記発酵方法は微生物にエネルギー源としてブドウ糖およびキシロースを含む混合物を提供することを含む。ある実施態様においては、混合物は、リグニンをさらに含む。ある実施態様において、混合物は、フルフラールの一種をさらに含む。場合によっては、混合物は、脱重合されたセルロース材料をさらに含む。場合によっては、混合物は、一つ以上のショ糖資化性酵素をさらに含む。実施態様において、混合物は、ショ糖インベルターゼを含む。
【００４８】
場合によっては、微生物は、バクテリオコッカス・マイナー（Bracteococcus minor）、クロレラ・エリプソイデア（Chlorella ellipsoidea）、クロレラ・ケッセレリ（Chlorella kessleri）、クロレラ・ルテオビリディス（Chlorella luteoviridis）、バクテリオコッカス・メディオヌクレアトゥス（Bracteococcus medionucleatus）、クロレラ・ミヌティッシマ（Chlorella minutissima）、クロレラ・オバァリス（Chlorella ovalis）、クロレラ・プロトテコイデス（Chlorella protothecoides）、クロレラ・サッカロフィア（Chlorella saccharophila）、クロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana）、クロレラ属の種（Chlorella sp.）、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）、パラクロレラ・ケッセレリ（Parachlorella kessleri）、プロトテカ・モリフォルミス（Prototheca moriformis）、 及びシュードクロレラ・アクアティカ（Pseudochlorella aquatica）を備える群から選択される。
他の場合には、微生物は、本願明細書において説明されている、微生物の他の種である。場合によっては、微生物は、脂質修飾酵素、炭化水素修飾酵素またはショ糖資化性酵素の少なくとも一つをコードする外来遺伝子を発現するように遺伝的に改変される。
【００４９】
別の態様においては、本発明は、微細藻類を培養する方法を目的とし、セルロース材料、五炭糖、六炭糖および酢酸塩を備えるグループから選択される少なくとも一つの炭素基質を含む培地で微細藻類を培養する工程を含む。場合によっては、炭素基質はブドウ糖であり、微細藻類はクロレラ、パラクロレラ（Parachlorella）、シュードクロレラ（Pseudochlorella）、ブラクテオコッカス（Bracteococcus）、プロトテカ（Prototheca）およびセネデスムス（Scenedesmus）を備える群から選択される属である。場合によっては、炭素基質はキシロースであり、微細藻類はクロレラ、パラクロレラ（Parachlorella）、プロトテカ（Prototheca）を備える群から選択される属である。場合によっては、炭素基質がショ糖であり、微細藻類は、クロレラおよびブラクテオコッカス（Bracteococcus）を備えるグループから選択される属である。場合によっては、炭素基質がフルクトースであり、微細藻類がクロレラ、パラクロレラ（Parachlorella）、プロトテカ（Prototheca）およびセネデスムス（Scenedesmus）を備えるグループから選択される属である。場合によっては、炭素基質がアラビノースであり、微細藻類はクロレラ属の種である。場合によっては、炭素基質がマンノースであり、微細藻類がクロレラ、パラクロレラ（Parachlorella）、シュードクロレラ（Pseudochlorella）、ブラクテオコッカス（Bracteococcus）、プロトテカ（Prototheca）およびセネデスムス（Scenedesmus）を備える群から選択される属である。場合によっては、炭素基質がガラクトースであり、微細藻類がクロレラ、パラクロレラ（Parachlorella）、シュードクロレラ（Pseudochlorella）、ブラクテオコッカス（Bracteococcus）、プロトテカ（Prototheca）およびセネデスムス（Scenedesmus）を備える群から選択される属の中である場合によっては、炭素基質が酢酸塩であり、微細藻類がクロレラ、パラクロレラ（Parachlorella）およびプロトテカ（Prototheca）を備えるグループから選択される属である。
【００５０】
実施態様において、培地は、少なくとも一つのショ糖資化性酵素をさらに含む。ある場合には、脂質修飾酵素、炭化水素修飾酵素、ショ糖資化性酵素のうち少なくとも一つをコードする外来遺伝子を発現するように遺伝的に改変されている。場合によっては、培地は、ショ糖インベルターゼを含む。
【００５１】
別の態様においては、本発明は、微細藻類を培養する方法を目的とし、脱重合されたセルロース材料存在下において、複数の微細藻類細胞を播種することを含む。場合によっては、微細藻類は、グリセロール、ショ糖、ブドウ糖、アラビノース、ガラクトース、キシロース、フルクトース、アラビノース、マンノース、酢酸塩およびそれらの任意の組合せを備える群から選択される添加された固定炭素源存在下で、培養される。実施態様において、微細藻類は、少なくとも一つのショ糖資化性酵素がある場合には、培養される。
【００５２】
ある場合には、ブラクテオコッカス（Bracteococcus）属の種、クロレラ属の種、パラクロレラ（Parachlorella）属の種、シュードクロレラ（Pseudochlorella）属の種、プロトテカ（Prototheca）属の種、またはセネデスムス（Scenedesmus）属の種を備える群から選択される。ある場合には、微細藻類はバクテリオコッカス・マイナー（Bracteococcus minor）、クロレラ・エリプソイデア（Chlorella ellipsoidea）、クロレラ・ケッセレリ（Chlorella kessleri）、クロレラ・ルテオビリディス（Chlorella luteoviridis）、バクテリオコッカス・メディオヌクレアトゥス（Bracteococcus medionucleatus）、クロレラ・ミヌティッシマ（Chlorella minutissima）、クロレラ・オバァリス（Chlorella ovalis）、クロレラ・プロトテコイデス（Chlorella protothecoides）、クロレラ・サッカロフィア（Chlorella saccharophila）、クロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana）、クロレラ属の種（Chlorella sp.）、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）、パラクロレラ・ケッセレリ（Parachlorella kessleri）、プロトテカ・モリフォルミス（Prototheca moriformis）、 及びシュードクロレラ・アクアティカ（Pseudochlorella aquatica）を備える群から選択される。他の場合には、細胞は本願明細書において説明されている、微細藻類の他の種である。
【００５３】
いくつかの実施態様では、微細藻類は脂質修飾酵素、炭化水素修飾酵素、またはショ糖資化性酵素のうち少なくとも一つをコードする外来遺伝子を発現するように遺伝的に改変されている。実施態様において、少なくとも一つのショ糖資化性酵素は、ショ糖インベルターゼである。場合によっては、少なくとも一つの脂質修飾酵素は、ステアロイルCoA不飽和酵素、グリセロ脂質不飽和酵素、ピルビン酸塩デヒドロゲナーゼ、アセチルCoAカルボキシラーゼ、アシル担体タンパク質およびグリセロール−3リン酸アシルトランスフェラーゼから選択される。場合によっては、少なくとも一つの炭化水素修飾酵素は、脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ、脂肪酸アシルCoA還元酵素、脂肪酸アルデヒド還元酵素、脂肪酸アシルCoA/アルデヒド還元酵素、脂肪酸アルデヒドデカルボニラーゼおよびアシル担体タンパク質から選択される。
【００５４】
別の態様においては、本発明は、脂質を生産する微生物を培養する方法を目的とし、固定された窒素源が不存在下であって酢酸が存在する場合に、微生物を培養することを含む。場合によっては、前記微生物が、酢酸不存在下よりも微生物由来脂質量を増やすために酢酸存在下で培養され、前記培養条件以外は二つの培地間で同一である。
【００５５】
別の態様においては、本発明は、微生物培地を提供することを目的とし、 微生物の群、並びにブドウ糖、キシロースおよびリグニンを備える群から選択される分子、並びにフルフラールの種を備える培地を含む。場合によっては、微生物は、バクテリオコッカス・マイナー（Bracteococcus minor）、クロレラ・エリプソイデア（Chlorella ellipsoidea）、クロレラ・ケッセレリ（Chlorella kessleri）、クロレラ・ルテオビリディス（Chlorella luteoviridis）、バクテリオコッカス・メディオヌクレアトゥス（Bracteococcus medionucleatus）、クロレラ・ミヌティッシマ（Chlorella minutissima）、クロレラ・オバァリス（Chlorella ovalis）、クロレラ・プロトテコイデス（Chlorella protothecoides）、クロレラ・サッカロフィア（Chlorella saccharophila）、クロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana）、クロレラ属の種（Chlorella sp.）、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）、パラクロレラ・ケッセレリ（Parachlorella kessleri）、プロトテカ・モリフォルミス（Prototheca moriformis）、 及びシュードクロレラ・アクアティカ（Pseudochlorella aquatica）を備える群から選択される。他の場合には、微生物は本願明細書において説明されている、微生物の他の種である。
【００５６】
別の態様においては、本発明は、微細藻類を播種する方法を目的とする。ある実施態様において、この方法は、(a)従属栄養性の増殖を実行することができる微細藻類細胞を提供する工程と、 (b)セルロース材料を含む増殖培地に微細藻類を播種する工程と、 及び(c)細胞が増殖すること可能な十分な期間、微細藻類を培養する工程を含む、培養方法である。
【００５７】
別の態様においては、本発明は、バイオディーゼル製造の方法を目的とする。実施態様において、この方法は、(a) 脂質を生産する微生物を第1の微生物培地で培養する工程と、 (b) 第1の微生物培養によってできるバイオマスから脂質を回収する工程と、 (c)脂質をトランスエステル化し、脂肪酸エステルおよびグリセロールを生産する工程と、 並びに(d)グリセロールを第2の微生物培養に加える工程、を備える製造方法である。場合によっては、第1微生物培養方法および第2微生物培養方法が、同一種の微生物を培養する。場合によっては、第2の微生物培養方法は、パラクロレラ・ケッセリ（Parachlorella kessleri）、クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）、バクテリオコッカス・メディオヌクレタス（Bracteococcus medionucleatus）、プロトテカ・モリフォルミス（Prototheca moriformis）、クロレラ・ミヌティッシマ（Chlorella minutissima）、クロレラ属の種（Chlorella sp.）およびクロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana）を備えるグループから選択される微生物を含む。他の場合には、第2の微生物培養方法は、本願明細書において説明されている他の種の微生物である。
【００５８】
別の態様においては、本発明は、グリセロールおよびグリセロール以外の固定炭素源存在下で微生物を培養することを含む発酵方法を目的とする。場合によっては、グリセロールおよびグリセロール以外の固定炭素源が、予め定められた比率で同時に微生物に提供される。場合によっては、グリセロールおよびグリセロール以外の固定炭素源の全部が、発酵の開始期に微生物に提供される。場合によっては、グリセロールおよびグリセロール以外の固定された前記炭素源の全部が発酵期を経過して、あらかじめ定められた率で微生物に与えられる。ある実施態様の方法においては、グリセロールが、第1の期間中、グリセロール以外の固定炭素源がない場合、微生物に提供する工程と、 グリセロール以外の固定炭素源が、第1の期間の終わりに提供される工程と、 及び、微生物が、グリセロール以外の固定炭素源存在下において、第2の期間中、培養される工程を含む。実施態様において、グリセロール以外の固定された前記炭素源が、第2の期間中、予め定められた率で微生物に供給される。場合によっては、グリセロール以外の固定された前記炭素源の全てが、第1の期間の終わりに微生物に提供される。ある実施態様の方法においては、グリセロール以外の固定された前記炭素源が、第1の期間中、グリセロール不存在下に微生物に提供される工程と、グリセロールが第1の期間の終わりに提供される工程と、 及び微生物がグリセロール存在下に第2の期間の間培養される工程を含む。
実施態様において、グリセロールは、エステル転移反応の工程の副産物である。実施態様において、グリセロールは酸化されている。他の実施態様では、前記グリセロールは酸化されていない。場合によっては、少なくとも一つの他の固定炭素源は、ブドウ糖である。場合によっては、少なくとも一つの他の固定炭素源は、脱重合されたセルロース材料である。実施態様において、少なくとも一つの他の固定炭素源は、ショ糖である。
【００５９】
別の態様においては、本発明は、微生物の群、グリセロール、並びにキシロース、ブドウ糖およびショ糖を備える群から選択されている少なくとも一つの糖、から成る発酵槽を目的としている。実施態様において、グリセロールは、エステル転移反応の工程の副産物である。場合によっては、パラクロレラ・ケッセリ（Parachlorella kessleri）、クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）、バクテリオコッカス・メディオヌクレタス（Bracteococcus medionucleatus）、プロトテカ・モリフォルミス（Prototheca moriformis）、クロレラ・ミヌティッシマ（Chlorella minutissima）、クロレラ属の種（Chlorella sp.）およびクロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana）を備えるグループから選択される。他の場合には、微生物は、本願明細書において説明されている、他の種である。
【００６０】
別の態様においては、本発明は、微生物で発酵させる方法を目的とする。実施態様において、この方法は、固定炭素源を唯一の原料として、エステル転移反応の工程の副産物であるグリセロールを提供する工程、を含む微生物での発酵方法である。実施態様において、光のエネルギーが微生物に提供されない。他の実施態様では、光のエネルギーが微生物に提供される。場合によっては、微生物は、パラクロレラ・ケッセリ（Parachlorella kessleri）、クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）、バクテリオコッカス・メディオヌクレタス（Bracteococcus medionucleatus）、プロトテカ・モリフォルミス（Prototheca moriformis）、クロレラ・ミヌティッシマ（Chlorella minutissima）、クロレラ属の種（Chlorella sp.）およびクロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana）から選ばれる。他の場合には、微生物は、本願明細書において説明されている、他の種である。
【００６１】
別の態様においては、本発明は、外来のショ糖資化性遺伝子を含んでいる微生物を目的とする。実施態様において、遺伝子は、ショ糖輸送体をコードする。実施態様において、遺伝子は、ショ糖インベルターゼをコードする。実施態様において、遺伝子は、フルクトキナーゼをコードする。場合によっては、微生物は、クロレラ・ミヌティッシマ（Chlorella minutissima）、クロレラ・エメルソニイ（Chlorella emersonii）、クロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana、クロレラ・エリプソイデア（Chlorella ellipsoidea）、クロレラ属の種（Chlorella sp.）またはクロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）を備える群から選択される種である。他の場合には、微生物は、本願明細書において説明されている、他の種である。
【００６２】
別の態様においては、本発明は、クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）、クロレラ・エメルソニイ（Chlorella emersonii）またはクロレラ・ミヌティッシマ（Chlorella minutissima）の種の細胞であって、前記細胞が外来の遺伝子を含む細胞を目的とする。
場合によっては、外来遺伝子がショ糖輸送体、ショ糖インベルターゼ、脂質修飾酵素、炭化水素修飾酵素およびフルクトキナーゼを備える群から選択されるタンパク質をコードする。いくつかの実施態様では、タンパク質が、細胞外間隙に分泌されるショ糖インベルターゼである。いくつかの実施態様では、タンパク質が、細胞質を目標とされるショ糖インベルターゼである。
【００６３】
別の態様においては、本発明は、微生物の群と、並びに(i)ショ糖および（ii）ショ糖インベルターゼ酵素、 を備える微生物培地を目的とする。
【００６４】
別の態様においては、本発明は、微生物の群と、並びに(i)糖蜜および（ii）ショ糖インベルターゼ酵素、 を備える微生物培地を目的とする。
【００６５】
別の態様においては、本発明は、微生物の群並びに培地を備える微生物培地であって、 前記培地が (i)ショ糖を備える培地と、 (ii)リグニンと、 及び(iii)ショ糖インベルターゼ酵素と、を備える微生物培養物を目的とする。
【００６６】
上で説明されているさまざまな微生物培地において、微生物は、少なくとも一つの外来のショ糖資化性遺伝子を含む。いくつかの実施態様では、ショ糖資化性遺伝子が、ショ糖輸送体、ショ糖インベルターゼ、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼまたはフルクトキナーゼをコードする。実施態様において、ショ糖インベルターゼが、微生物群によって発現する外来のショ糖インベルターゼ遺伝子にコードされ、分泌型の酵素である。場合によっては、微生物は、脂質経路酵素または炭化水素修飾酵素をコードしている少なくとも一つの外来遺伝子を含む。
【００６７】
別の態様においては、本発明は、ショ糖資化性遺伝子をコードしているcDNA、 並びにハイグロマイシン抗生物質またはG418抗生物質に対する耐性タンパク質をコードしているcDNA、を備える核酸を目的とする。
【００６８】
特に明記しない限り、方法、組成物、細胞、微生物、微生物、微生物培地、発酵槽等のさまざまな実施態様において、上述した微生物は、微細藻類、油性の酵母、真菌または細菌である。場合によっては、微生物は、表1にリストされる微細藻類を備える群から選択される。場合によっては、微生物は、クロレラ属の種である。場合によっては、微生物は、クロレラ・アニトラタ（Chlorella anitrata）、クロレラ・アンタルクティカ（ Chlorella antarctica）、クロレラ・アウレオビリディス（ Chlorella aureoviridis）、クロレラ・キャンディダ（ Chlorella Candida）、クロレラ・キャプスラタ（Chlorella capsulata）、クロレラ・デシカッタ（Chlorella desiccata）、クロレラ・エリプソイデア（Chlorella ellipsoidea）、クロレラ・エメルソニイ（Chlorella emersonii）、クロレラ・フスカ（Chlorella fusca）、クロレラ・フスカ・バー・バクオレタ（Chlorella fusca var. vacuolata）, クロレラ・グルコトロファ（Chlorella glucotropha）、クロレラ・インフシオナム（Chlorella infusionum）、クロレラ・インフシオナム・バー・アクトフィラ（Chlorella infusionum var. Actophila）、クロレラ・インフシオナム・バー・アウェノフィラ（Chlorella infusionum var.Auxenophila）, クロレラ・ケッセレリ（Chlorella kessleri）、クロレラ・ルテオビリディス（Chlorella luteoviridis）、クロレラ・ルテオビリディス・バー・アウレオビリディス（Chlorella luteoviridis var. aureoviridis）、クロレラ・ルテオヴィリディス・バー・ルテスセンス（Chlorella luteoviridis var.Lutescens）、クロレラ・ミニアタ（Chlorella miniata）、クロレラ・ミヌティッシマ（Chlorella minutissima）、クロレラ・ムタビリス（Chlorella mutabilis）、クロレラ・ノクツルナ（Chlorella nocturna）、クロレラ・パルバ（Chlorella parva）、クロレラ・ファトフィリア（Chlorella photophila）、クロレラ・プリングシェイミィ（Chlorella pringsheimii）、クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）、クロレラ・ピレノイドサ（Chlorella pyrenoidosa）、クロレラ・レグラリス（Chlorella regularis）、クロレラ・レグラリス・バー・ミニマ（Chlorella regularis var. minima）、クロレラ・レグラリス・バー・ウンブリカタ（Chlorella regularis var. umbricata）、クロレラ・レイシグリィ（Chlorella reisiglii）、クロレラ・サッカロフィア（Chlorella saccharophila）、クロレラ・サッカロフィア・バー・エリプソイデア（ Chlorella saccharophila var. ellipsoidea）、クロレラ・サリナ（Chlorella salina）、クロレラ・シンプレックス（Chlorella simplex）、クロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana）、クロレラ属の種（Chlorella sp.）、クロレラ・スファエリカ（Chlorella sphaerica）、クロレラ・スティグマトフォラ（Chlorella stigmatophora）、クロレラ・バニエリィ（Chlorella vanniellii）、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）、クロレラ・ブルガリス・エフ・テルシア（Chlorella vulgaris f. tertia）、クロレラ・ブルガリス・バー・アイリディス（Chlorella vulgaris var. airidis）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス（Chlorella vulgaris var. vulgaris）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・テルシア（Chlorella vulgaris var. vulgaris f. tertia）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・ビリディス（Chlorella vulgaris var. vulgaris f. viridis）、クロレラ・シャンセラ（Chlorella xanthella）及びクロレラ・ゾフィンジエンシス（Chlorella zofingiensis）を備える群から選択される。場合によっては、微生物は、クリプトコッカス・クルバツス（Cryptococcus curvatus）、クリプトコッカス・テリコルス（Cryptococcus terricolus）、カンジタ属の一種（Candida sp.）、リポマイセス・スタルケィ（Lipomyces starkeyi）、リポマイセス・リポファ（Lipomyces lipofer）、エンドマイコプシス・バルナリス（Endomycopsis vernalis）、ロドトルラ・グルティニス（Rhodotorula glutinis）、ロドトルラ・グルシリス（Rhodotorula gracilis）およびヤロウィア・リポリティリカ（Yarrowia lipolytica）を備える群から選択される油性の酵母である。場合によっては、微生物は、モルティエレラ（Mortierella）属の一種、モルティエレラ・ビナセア（Mortierrla vinacea）、モルティエレラ・アルペン（Mortierella alpine）、フィリシウム・デバリアヌム（Pythium debaryanum）、ケカビ属シルシネロイデス（Mucor circinelloides）、アスペルギルス・オクラセウス（Aspergillus ochraceus）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）、ペネシリウム・イイラシヌム（Pennicillium iilacinum）、ヘンセヌロ（Hensenulo）属の一種、カエトミウム（Chaetomium）属の一種、クラドスポリウム（Cladosporium）属の一種、マルブランシェア（Malbranchea）属の一種、リゾプス（Rhizopus）属の一種およびフィシウム（Pythium）属の一種を備える群から選択される真菌である。
【００６９】
上述されている各種実施態様において、微生物は、少なくとも一つの外来のショ糖資化性遺伝子を含むことができる。場合によっては、ショ糖資化性遺伝子は、ショ糖輸送体、ショ糖インベルターゼ、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼまたはフルクトキナーゼをコードする。
【００７０】
上述されている各種実施態様において、微生物は、脂質経路酵素をコードしている少なくとも一つの外来遺伝子を含むことができる。場合によっては、脂質経路酵素は、ステアロイルCoA不飽和酵素、グリセロ脂質不飽和酵素、ピルビン酸塩デヒドロゲナーゼ、アセチルCoAカルボキシラーゼ、アシル担体タンパク質およびグリセロール-3リン酸アシルトランスフェラーゼを備える群から選択される。
【００７１】
上で説明されている各種実施態様において、微生物は、炭化水素修飾酵素をコードしている少なくとも一つの外来の遺伝子を含むことができる。場合によっては、炭化水素修飾酵素は、脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ、脂肪酸アシルCoA還元酵素、脂肪酸アルデヒド還元酵素、脂肪酸アシルCoA/アルデヒド還元酵素、脂肪酸アルデヒドデカルボニラーゼおよびアシル担体タンパク質から選択される。
【００７２】
各種実施態様のうちの2つ以上が上述したいずれでも、本発明の範囲内で含まれる付加的な実施態様を生じるために、一緒に結合されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】図1は、ブドウ糖存在下または非存在下で、且つ各種のグリセロール存在下で培養される時、各種のクロレラの種・株の１リットル中の細胞乾燥重量を示す。
【００７４】
【図２】図2は、添加されたブドウ糖と各種のグリセロール存在下で培養される時、各種のクロレラの種・株の1リットル中の細胞乾燥重量を示す。
【００７５】
【図３】図3は、添加されたブドウ糖と各種のグリセロール存在下で培養される時、各種クロレラの種・株の相対的な脂質濃度を示す。
【００７６】
【図４】図4は、ブドウ糖存在下または非存在下で、且つ各種のグリセロール存在下で培養される時、各種クロレラの種・株の脂質濃度を示す。
【００７７】
【図５】図5は、添加されたブドウ糖と各種のグリセロール存在下で、グリセロールはグルコースの後に加えて培養される時、クロレラの2つの種の乾燥重量の脂質％を示す。
【００７８】
【図６】図6は、添加されたブドウ糖と各種のグリセロール存在下で、グリセロールはグルコースの後に加えて培養される時、クロレラの2つの種の乾燥重量の脂質％を示す。
【００７９】
【図７】図7は、 1%のブドウ糖+1%の試薬級グリセロールおよび2%のブドウ糖、がある場合に培養される時、いくつかのクロレラ種・株の細胞乾燥重量の相対的な脂質濃度を示す。
【００８０】
【図８】図8は、添加されたブドウ糖と各種のグリセロール存在下で、グリセロールはグルコースと順次または同時に添加されて、培養される時、いくつかのクロレラ種・株の細胞乾燥重量の脂質％を示す。
【００８１】
【図９】図9は、添加されたブドウ糖と各種のグリセロール存在下で、グリセロールはグルコースと順次または同時に添加されて、培養される時、いくつかのクロレラ種・株の培養物の相対的脂質濃度を示す。
【００８２】
【図１０】図10は、添加されたブドウ糖と各種のグリセロール存在下で、グリセロールはグルコースと順次または同時に添加されて、培養される時、いくつかのクロレラ種・株の1リットルあたりの細胞乾燥重量を示す。
【００８３】
【図１１】図11の(a)は、ブドウ糖、試薬級グリセロール、非酸化バイオディーゼルの副産物のグリセロールと、グリセロール及びブドウ糖存在下で培養される時、スピルリナ・プラテンシス（Spirulina platensis）の細胞乾燥重量の脂肪％を示す。
【００８４】
図11の(b)は、 各種のグリセロール存在下及びグリセロールとブドウ糖の組み合わせで培養される時、ナビクラ・ペリクロサ（Navicula pelliculosa）の乾燥細胞重量の脂肪％を示す。
【００８５】
【図１２】図12の(a)は、各種のグリセロール存在下、及びグリセロールとブドウ糖の組み合わせがある存在下で培養された時、セネデスムス・アルマツス（Scenedesmus armatus）の細胞乾燥重量の脂肪％を示す。
【００８６】
図12の(b)は、バイオディーゼルの副産物のグリセロールとブドウ糖存在下及び各種のグリセロール存在下で培養された時の、セネデスムス・アルマツス（Scenedesmus armatus）の1リットル中の細胞乾燥重量を示す。
【００８７】
【図１３】図13は、非酸化バイオディーゼルの副産物のグリセロールとブドウ糖存在下及び各種のグリセロール存在下で培養される時の、ナビクラ・ペリクロサ（Navicula pelliculosa）のリットルあたりの細胞乾燥重量を示す。
【００８８】
【図１４】図14は、酸化と非酸化バイオディーゼルの副産物であるグリセロールとブドウ糖の組み合わせで培養され、グリセロールが順次に同時に加えられる時に、ナビクラ・ペリクロサ（Navicula pelliculosa）とセネデスムス・アルマツス（Scenedesmus armatus）のリットルあたりの細胞乾燥重量を示す。
【００８９】
【図１５】図15は、ブドウ糖単独、キシロース単独と比較したキシロースとグルコースの同時投与の、クロレラの増殖への相乗効果を示す。
【００９０】
【図１６】図16は、外来遺伝子を含むクロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）形質転換体の遺伝子型を示す。
【００９１】
【図１７】図17は、クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）のコドン出現頻度を示す。
【００９２】
【図１８】図18は、ディー・サリナ(D.salina)およびクロレラ・ピレノイドサ（Chlorella pyrenoidosa）のコドン出現頻度を示す。
【００９３】
【図１９】図19は、(a)試薬グレード・グリセロール、(b)非酸化バイオディーゼル副産物グリセロール、及び(c)実施例に説明されている実験において使われた、酸化バイオディーゼル副産物グリセロールを示す。
【００９４】
【図２０】図20は、ブドウ糖およびフルクトースでの、クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）の増殖を示す。
【００９５】
【図２１】図21は、1%のショ糖でのクロレラ・フスカ（Chlorella fusca）の増殖を示す。
【００９６】
【図２２】図22は、1%のショ糖でのクロレラ・ケッセレリ（Chlorella kessleri）の増殖を示す。
【００９７】
【図２３】図23は、ショ糖インベルターゼの存在下、非存在下で、ブドウ糖、ショ糖、又はいくつかのサンプル（指定されたBSl、BS2およびHTM）で培養される時の、クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）のリットルあたりの細胞乾燥重量を示す。
【００９８】
【図２４】図24は、ショ糖インベルターゼの存在下、非存在下で、ブドウ糖、ショ糖、又はいくつかのサンプル（指定されたBSl、BS2およびHTM）で培養される時の、クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）の増殖を示す。
【００９９】
【図２５】図25は、サブクローニングに有用な制限部位と同様に、3つの異なるプロモーター（指定されたCMV、CVおよびHUPl）を有する酵母インベルターゼ（SUC2）のさまざまなプラスミド構成概念の実例を示す。
【０１００】
【図２６】図26は、外来ショ糖インベルターゼ遺伝子を含む、暗所でショ糖上のクロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）形質転換体の遺伝子型を示す。
【０１０１】
【図２７】図27は、エス・セレビシアエ（S. cerevisiae）から分泌されたショ糖インベルターゼをコードしている遺伝子によって形質転換されたクロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）細胞の遺伝子型を示す。
【０１０２】
【図２８】図28は、酵母（S. cerevisiae）から分泌されたショ糖インベルターゼをコードしている遺伝子によって形質転換されたクロレラ・ミヌティッシマ（Chlorella minutissima）とクロレラ・エメルソニイ(Chlorella emersonii)細胞の遺伝子型を示す。
【０１０３】
【図２９】図29は、実施例27に説明されているガスクロマトグラフィの本発明の方法に従って生産される再生可能なディーゼル製品の分析結果を例示する。
【０１０４】
【図３０】図30は、本発明の方法による、実施例27に説明されている再生可能なディーゼル製品の沸点分布プロット線を例示する。
【発明を実施するための形態】
【０１０５】
（発明の詳細な説明）
I.定義
特に定められない限り、本願明細書において用いられる全ての専門的で科学的な用語は本発明が属する当業者によって共通に理解される意味を有する。
以下の参照は、技術のうちの1つに本発明において使用する条件の多数の一般の定義を提供する。
Singleton et ai, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994)、The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988)、The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991)、及び、Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。
ここで使用しているように、特に特定されない限り、次の用語は以下の意味を有する。
【０１０６】
核酸に関して使われるように、「微細藻類で活性がある」とは、微細藻類内で機能性を有する核酸を意味する。例えば、トランスジェニック微細藻類に抗生物質耐性を与える抗生物質耐性遺伝子を作動するプロモーターは、微細藻類で活性がある。微細藻類で活性があるプロモーターの実施例は、特定の藻類種に内在性プロモーターおよび植物ウイルスで見つかるプロモーターである。
【０１０７】
「アシル担体タンパク質」または「ACP」とは、脂肪合成の間、4'-ホスホパンテテイン部分のチオール末端で、チオールエステルとしてアシル鎖と結合するタンパク質であり、脂肪酸合成酵素複合体の構成要素から成るタンパク質である。脂肪酸アシルACPチオエステラーゼと連携したアシル担体タンパク質に関して「自然に共同発現された」という用語は、ACPおよびチオエステラーゼが、たとえば遺伝子が同一制御配列下で管理される二つの酵素をコードするか、または、それらが同じ刺激に応答して発現されることによって、組織または生物において共同発現することを意味する。
【０１０８】
「アシルＣｏＡ分子」または「アシルＣｏＡ」は、補酵素Ａの4'-ホスホパンテテイン部の末梢部のチオールで共有結合してチオールエステル結合による補酵素Ａに結合するアシル部を備える分子である。
【０１０９】
「純粋培養」とは、他の生きている生物による汚染がない生物の培養物を意味する。
【０１１０】
「バイオディーゼル」は、ディーゼルエンジンの燃料としての用途に適している、生物学上生産された脂肪酸アルキルエステルである。
【０１１１】
用語「バイオマス」とは、細胞の増殖および/または細胞の増殖によってできる材料をいう。バイオマスは、細胞外物質と同様に、細胞および/または細胞内の内容物を含むことができる。細胞外物質は、細胞によって分泌される合成物を含むが、これに限定されるものではない。
【０１１２】
「バイオリアクター」とは、場合によっては浮遊培養で細胞が培養される、密閉体または部分的な部分的密閉体を意味する。
【０１１３】
本願明細書で使用される、「触媒」とは、生成物の部分とならずに、反応体の化学反応を容易にするかまたは促進することができる物質、例えば分子または高分子複合体である。
触媒は、生成物を形成するために他の反応体と作用したり、反応効率を増加したりする。
触媒は一般的に、それがより急速にまたは低い温度で反応するように、反応のために必要な全体の活性化エネルギーを下げる。このように、平衡反応は、より急速に到達されることが可能である。触媒の実施例には、生物的触媒である酵素、非生物学的触媒である熱、化石の石油精製プロセスで用いられる金属触媒を含む。
【０１１４】
「セルロース材料」とは、セルロースの消化物を意味し、ブドウ糖、キシロースおよび任意に添加された合成物（例えば二炭糖、オリゴ糖類、リグニン、フルフラールおよび他の合成物）を含む。セルロース材料の供給源の非制限する実施例は、サトウキビバガス、テンサイ・パルプ、トウモロコシわら、木のチップ、おがくずおよびスイッチグラスを含む。
【０１１５】
「共同培養」とは、同一のバイオリアクターで2種類以上の細胞の存在することをいう。
2種類以上の細胞が、両方とも微生物（例えば微細藻類細胞）であり、または微細藻類細胞と微細藻類細胞と異なる細胞とが培養される。培養条件は、2つ以上の細胞タイプの増殖および/または増殖を促進するものまたは継体のための細胞増殖を維持すると共に、2つ以上の細胞の一つ（またはサブセット）の増殖および/または激増を促進するものであってもよい。
【０１１６】
「補因子」とは、本願明細書におけるいくつかの分子をいい、酵素がその酵素活性に必要とする基質をいう。
【０１１７】
本願明細書で使用する、「相補的DNA」（「cDNA」）とは、メッセンジャーRNA（mRNA）またはそれを増幅したもの（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（「PCR」）を経て）を逆転写によって得られたDNAをいう。
【０１１８】
「培養される」とは、意図された培養状況を用いて増殖（細胞サイズ、細胞内含有量および/または細胞活性の増加）および/または一つ以上の細胞の増殖（有糸分裂を経た細胞数の増加）を意図的に促進することに関連する。増殖および繁殖の組合せは、増殖ともいう。一つ以上の細胞は、微生物（例えば微細藻類）であってもよい。目的とする条件の実施例は、定義済み培地（周知の特徴（例えばpH、イオン強度および炭素源）を有する）、指定された温度、酸素分圧、二酸化炭素レベルの使用法、バイオリアクターでの増殖を含む。用語は、生物が自然に増殖して最終的に化石化されて地中の原油を生産するように、自然にまたは人間が直接介入しないで微生物が増殖または増殖することを指すものではない。
【０１１９】
ここで使用しているように、「細胞溶解」とは、低張性環境の細胞の溶解に関連する。細胞溶解は、細胞の内部への過剰浸透または水の動きによっても生じる。細胞は、内部の水の浸透圧に耐えることができず、崩壊する。
【０１２０】
本願明細書で使用する、「発現ベクター」または「発現構造物」とは、宿主細胞の特定の核酸の転写ができるようにする一連の特定の核酸を有する核酸構造物（遺伝子組み換えによってまたは化学合成によって作成される）に関連する。発現ベクターは、プラスミド、ウイルスまたは核酸断片の一部でありえる。典型的には、発現ベクターは、プロモーターに作動可能な状態で連結されて転写される核酸を含む。
【０１２１】
「外来遺伝子」とは、細胞に導入される核酸をいう。遺伝子導入される細胞は、組換体細胞ということができ、その細胞に添加された外来遺伝子を導入することができる。外来遺伝子は、異なる種、または形質転換体に関連する同一種由来であってもよい。相同遺伝子の場合では、それは、遺伝子の内在性コピーに対して細胞のゲノムの異なる場所を占領する。外来遺伝子は、細胞内で複数のコピーとして存在してもよい。外来遺伝子は、ゲノムへの挿入としてまたはエピソーム性の分子として細胞において維持されうる。
【０１２２】
「外因的に提供される」とは、細胞培養の培地に提供される分子について説明する。
【０１２３】
本願明細書で使用する、「脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ」とは、脂質合成の間、アシル担体タンパク質（ACP）から脂肪酸を切断する反応に触媒作用を及ぼす酵素である。
【０１２４】
本願明細書で使用する、「脂肪酸アシルCoA/アルデヒド還元酵素」は、アシルＣｏＡ分子から主要なアルコールへ還元する反応に触媒作用を及ぼす酵素である。
【０１２５】
本願明細書で使用する、「脂肪酸アシルCoA還元酵素」は、アシルＣｏＡ分子からアルデヒドへ還元する反応に触媒作用を及ぼす酵素である。
【０１２６】
本願明細書で使用する、「脂肪酸アルデヒドデカルボニラーゼ」は、アルカンを脂肪酸アルデヒドに転換する反応に触媒作用を及ぼす酵素である。
【０１２７】
本願明細書で使用する、「脂肪酸アルデヒド還元酵素」は、アルデヒドから主要なアルコールへ還元する反応に触媒作用を及ぼす酵素である。
【０１２８】
「固定炭素源」とは、固体または液体状態の外気温および外圧で固体または液体状態で存在する（好ましくは有機的な）炭素を含んでいる。
【０１２９】
本願明細書で使用する、「真菌」とは真菌界に属するキチン質の細胞壁によって特徴づけられる有機栄養生物を意味する。
【０１３０】
「ホモジネート」は、物理的に崩壊したバイオマスを意味する。
【０１３１】
本願明細書で使用する、「炭化水素」とは、(a)水素原子と炭素原子だけを含んでいる分子および前記炭素原子が共有結合して、線形、分岐、環状または部分的に環状である主鎖を形成し、その主鎖に水素原子が付着する分子、または（b）分子が主に水素原子と炭素原子だけを含み、かつ1〜4の化学反応によって水素および炭素原子だけを含む形に変換される分子である。
後者の非限定的な実施例は、単一の酸素原子を含んでいるアルデヒドと同様に、アルコール分子を形成するために1つの炭素原子および1つの水素原子間の酸素原子を含んでいる炭化水素を含む。アルコール類を炭素原子および水素原子だけを含んでいる炭化水素に還元する方法は周知である。炭化水素の他の実施例は、エステルであって、酸素酸中で有機基が（１またはそれ以上の）水素原子に置換する。炭化水素化合物の分子構造は、天然ガスの成分であるメタン（CH4）のような最も単純なものから、原油、石油およびビチューメンで見つかるアスファルテンのようないくつかの分子のように非常に重い複合体に変化する。炭化水素は、ガスであるか、液状であるか、固形物またはこれらの形のいかなる組合せであってもよく、主鎖と隣接した炭素原子との間に一つ以上の二重または三重結合を有することができる。したがって、「炭化水素」という用語は、線形、分枝、環状または部分的に環状のアルカン、アルケン、脂質およびパラフィンを含む。具体例としては、プロパン、ブタン、ペンタン、ヘキサン、オクタン、トリオレイン、及びスクアレンを含む。
【０１３２】
「炭化水素修飾酵素」は、炭化水素の共有結合構造を変える酵素に関連する。炭化水素修飾酵素の具体例は、リパーゼ、脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ、脂肪酸アシルCoA/アルデヒド還元酵素、脂肪酸アシルCoA還元酵素、脂肪酸アルデヒド還元酵素及び脂肪酸アルデヒドデカルボニラーゼを含む。脂肪酸、アルコール類、アルデヒド、アルカンまたはそこから誘導される他の合成物を含む、炭化水素修飾酵素の酵素活性によってできる化合物は、ほとんど同じ意味で本明細書において、炭化水素または脂質と称される。
【０１３３】
「炭化水素比率」の用語は、分子中での原子−対−原子の基準での炭素原子に、水素原子の比率に関連する。比率は、炭化水素分子中での炭素原子および水素原子の数を示すために用いてもよい。例えば、最高比率を有する炭化水素は、メタンCH4（4:1）である。
【０１３４】
「疎水性断片」とは、水相と比較して疎水相においてより可溶性である、部分、画分、材料をいう。疎水性画分は、水に実質的に溶解しなくて、通常無極性である。
【０１３５】
本願明細書で使用する、「脂質収量を増やす」とは、例えば、1リットルあたりの細胞の乾燥重量を増やすことによって、例えば細胞を構成する脂質の割合を増やすことによって、または例えば単位時間あたりの培養量1リットルあたりの脂質の全体量を増やすことによって、培養物中の脂質生産量を増加させることをいう。
【０１３６】
「誘導性プロモーター」とは、特定の刺激に応答して作動可能な状態で連結された遺伝子の転写を媒介するものである。
【０１３７】
本願明細書で使用する、「作動可能な連結において」とは、制御配列（典型的にはプロモーター）及び連結される配列のように、2つの配列間の機能的な結合をいう。プロモーターが遺伝子の転写を媒介することができる場合、プロモーターは外来遺伝子と作動可能な連結をしている。
【０１３８】
「生物内で」とは、「その場所で」または「その本来の位置において」を意味する。例えば、培養物は、触媒を分泌する第一の微細藻類及び基質を分泌する第二の微生物を含むことができる。この場合、前期第一および第二の細胞は、さらなる分離または材料の処理を伴わずに、特定の化学反応を生物内で共同培養で起こすのに必要な化合物を生成する。
【０１３９】
「栄養分の制限的濃度」とは、培養された生物の増殖を制限する培地の濃度である。
「栄養分の非制限的濃度」は、特定の培養期間の間に最大限の増殖を支える濃度である。
このように、特定の培養期間の間に生産される細胞の数は、栄養分の非制限的濃度の場合より栄養分の制限する濃度である場合の方がより低い。栄養分が培地中に「過度に」存在するとは、栄養分が最大限の増殖を支える濃度より濃い濃度存在する場合をいう。
【０１４０】
本願明細書で使用する、「リパーゼ」とは、不溶性脂質基質のエステル結合の加水分解を触媒する水溶性酵素である。リパーゼは、脂質をグリセロールおよび脂肪酸に加水分解する反応に触媒作用を及ぼす。
【０１４１】
本願明細書で使用する、「脂質経路酵素」とは、脂質合成、修飾、分解を含む脂質代謝で役割を果たすいかなる酵素をもいう。この用語は、担体タンパク質と同様に、化学的に脂質を修正するタンパク質を含む。
【０１４２】
「脂質」とは、例えばエーテル及びクロロホルムなどの無極性溶媒に溶解し、水に相対的にまたは完全に溶解しない炭化水素のクラスである。それらが主に天然下で疎水性である長い炭化水素末端部を有するので、脂質分子がこれらの性質を有する。脂質の具体例は、（飽和又は不飽和）脂肪酸、グリセリドまたはグリセロ脂質（例えばモノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリドまたは中性油および燐酸グリセリドまたはグリセロリン脂質）、非グリセリド（スフィンゴ脂質、コレステロールおよびステロイド・ホルモン類を含むステロール脂質、テルペノイドを含むプレノール脂質、脂肪アルコール、ワックスおよびポリケタイド）、そして、複合脂質誘導体（糖結合脂質または糖脂質およびタンパク質結合脂質）である。「脂肪」とは、脂質のサブグループである、「トリアシルグリセリド」をいう。
【０１４３】
本願明細書で使用する、「溶解物」の用語は、溶解する細胞の内容を含んでいる溶液をいう。
【０１４４】
本願明細書で使用する、「溶解」の用語は、生物体の細胞膜及び場合によっては細胞壁から細胞内の内容物を遊離するのに十分な崩壊をいい、しばしば機械式であるか、ウイルスであるか、浸透圧機構による。
【０１４５】
本願明細書で使用する、「溶解している」の用語は、生物体または細胞の細胞膜および場合によっては細胞壁を細胞内の内容物を遊離するのに十分な破壊をしていることをいう。
【０１４６】
「微細藻類」とは、場合によっては光合成を行うことができる葉緑体を含む真核生物、または光合成を行うことができる原核生物をいう。微細藻類には、エネルギーとして炭素源を代謝することができない光合成独立栄養生物、固定炭素源に依存することができる従属栄養生物を含む。微細藻類は、例えばクラミドモナス（Chlamydomonas）のように細胞分裂直後に姉妹細胞と分離する単細胞生物をいい、また、ボルボクス（Volvox）のように2つの異なった細胞種を含むことができる。「微細藻類」は、また、クロレラ属及びドナリエラ（Dunaliella）のような細胞をいうことこができる。「微細藻類」は、また、アグメネルム（Agmenellum）、アナバエナ（Anabaena）およびピロボツリス（Pyrobotrys）のような細胞間接着を示す他の光合成微生物も含む。「微細藻類」は、また、例えば特定の渦鞭毛虫藻類種のような、光合成を実行する能力を失った絶対従属栄養微生物を含む。
【０１４７】
「微生物」および「最近」の用語は、本願明細書において互換的に使われ、顕微鏡的な単細胞生物をいう。
【０１４８】
本願明細書において使われる、「油性酵母」とは、自然に、その乾燥細胞重量の10%以上を脂質として蓄積することができるか、または遺伝子改変の結果として、そうすることができる酵母を意味する。油性酵母には、ヤロウィア・リポリティリカ（Yarrowia lipolytica）のような生物と同等に、その乾燥細胞重量の10%以上を脂質として蓄積することができるように改変されたサッロカロマイセス・セルビジア（Saccharomyces cerevisiae）のような酵母の種を含む。
【０１４９】
本願明細書で使用する、「浸透圧ショック」の用語は、浸透圧の突然の減少に伴う溶液中の細胞の破裂のことをいう。浸透圧ショックは、時々、溶液にこの種の細胞の細胞成分を遊離するために誘導される。
【０１５０】
「フォトバイオリアクター」とは、少なくとも部分的に透明であるか、部分的に開口しているかし、光を透過する、その中で微細藻類細胞が培養される容器をいう。フォトバイオリアクターは、ポリエチレンバッグまたはエルレンマイヤーフラスコの例のように閉じてもよいし、屋外の池のように環境を受け入れてもよい。
【０１５１】
本願明細書で使用する、「多糖類分解酵素」とは、任意の多糖類を、加水分解または脱重合する触媒作用を及ぼすことができるいかなる酵素をもいう。例えば、セルラーゼは、セルロースの加水分解に触媒作用を及ぼす。
【０１５２】
「多糖類」（または、「グリカン」と呼ばれる）は、グリコシド結合によって結合される単糖類から成り立つ炭水化物である。セルロースは、特定の植物細胞壁を占める多糖類の具体例である。セルロースは、より大きな二糖類およびオリゴ糖類と同様に、キシロースおよびブドウ糖のような単糖類を産生するために、酵素によって脱重合させることができる。
【０１５３】
「ポート」とは、バイオリアクターの構成において、ガス、液体および細胞等の材料の流入または流出を可能にするバイオリアクターの開口部をいう。ポートは、通常、フォトバイオリアクターから通じている管に接続している。
【０１５４】
「プロモーター」とは、核酸の転写を導く核酸制御配列のアレイとして定義される。本願明細書で定義する、ポリメラーゼIIタイプ・プロモーター（TATA要素）の場合、例えば、プロモーターは、転写の出発点領域の近くで、必要な核酸配列を含む。プロモーターは場合によっては転写の開始位置から数千ベースペアに位置する末端部のエンハンサーまたはリプレッサー要素も含む。
【０１５５】
本願明細書で使用する、例えば、細胞、核酸、タンパク質またはベクターに関して用いられる「組換」の用語は、を意味する、細胞、核酸、タンパク質またはベクターが外来の核酸またはタンパク質の導入または天然の核酸またはタンパク質の変化によって修飾されていること、または、細胞が修飾された細胞に由来することを示す。このように、例えば、組換細胞は、天然の細胞では見出せない遺伝子を発現し、または天然で発現する遺伝子が異常に発現したり、天然の発現量以下で発現したり、まったく発現しない。本願明細書の「組換核酸」とは、通常、天然には観察されない核酸を意味し、核酸の処理によって、例えばポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼを使用して、生物外で形成される。この方法で、異なる配列の作動可能な連結が実現される。このような単離された（鎖状の）核酸または試験管内で通常は連結していないDNAを連結して形成される発現ベクターは、本発明の目的に照らして、両方とも組換体とみなされる。一度、組換核酸が作られて宿主細胞または生物に再導入されるならば、例えば試験管内処理よりもむしろ宿主細胞の生物内機構を使用して、非組換的に繁殖されると理解される。しかしながら、この種の核酸は、一度、組換的にできて、その後非組換的に繁殖される場合も、本発明の目的に照らして、組換体とみなす。同様に、「組換タンパク質」は、例えば、上述の組換核酸の発現を通して組換技術を利用して作られる。
【０１５６】
本願明細書で使用する、「再生可能なディーゼル」とは、脂質の水素化処理および脱酸素化で作られるアルカンのことをいう。（例えばC：10：0、C12：0、C：14：0、C16：0およびC18：0）。
【０１５７】
本願明細書で使用する、「超音波処理」の用語は、音波エネルギーを用いて、例えば細胞のような生物学的材料を崩壊させる工程をいう。
【０１５８】
「フルフラールの種」とは、2-フランカルボキシアルデヒドまたは、同一基本的構造特徴を保持する誘導体をいう。
【０１５９】
本願明細書で使用する、「茎葉」とは、穀物が収穫された後、残っている、乾燥した茎および葉をいう。
【０１６０】
「ショ糖資化性遺伝子」とは、発現した時に、細胞がエネルギー源としてショ糖を利用する能力を補助する遺伝子である。ショ糖資化性遺伝子によってコードされるタンパク質は、本願明細書において、「ショ糖資化性酵素」といい、ショ糖輸送体、ショ糖インベルターゼおよびヘキソキナーゼ（例えばグルコキナーゼおよびフルクトキナーゼ）を含む。
【０１６１】
「廃水」は、典型的には洗浄水、洗濯物排水、糞便、尿および他の液体であるか半流動体の液体を含む水溶性廃棄物をいう。それは、２次処理した汚水のようないくつかの形態の都市廃棄物を含む。
【０１６２】
ヌクレオチドの割合またはアミノ酸相同性を決定する配列比較のために、典型的には、1つの配列が試験配列が比較される参照配列として用いられる。比較配列アルゴリズムを使用した時に、試験および参照配列がコンピュータに入力され、示されたサブ配列が配位され、必要に応じて、配列アルゴリズムプログラムのパラメーターが示される。指定されたプログラムのパラメーターに基づいて、配列比較アルゴリズムは、それから参照配列に対する試験配列の割合配列同一性を算出する。
【０１６３】
比較のための配列の最適な並べ方は、例えば、the local homology algorithm of Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)によって、 the homology alignment algorithm of Needleman & Wunsch, J. MoI. Biol. 48:443 (1970)によって、the search for similarity method of Pearson & Lipman, Proc. Nat'l.Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)によって、これらのアルゴリズム（GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI）の実装によって、または外観検査（一般的に見られるAusubel et al, supra）によって、導くことができる。
【０１６４】
他の具体例のアルゴリズムは、配列の類似性・配列の相同性の割合を決定するために適しており、Altschul et al, J. MoI. Biol. 215:403-410 (1990) に説明されているブラスト（BLAST）アルゴリズムである。ブラスト（BLAST）分析を実行するためのソフトウェアは、国立生物工学情報センター(ウェブ・アドレスwww.ncbi.nlm.nih.gov )を通して、入手可能である。このアルゴリズムは、まず、データベース配列の同じ長さの文字列と並べたときに、正の値の閾値Tに一致するか超える、問い合わせ配列における長さWの短い文字列を特定することにより、高いスコアの配列対（HSPs）を特定する工程を含む。Tとは近隣語スコアの閾値をいう（Altschul et al, supra.）。これらの初期近隣文字列ヒットは、それらを含むより長いＨＳＰの検索開始のきっかけとして機能する。文字列ヒットは、累積的なアライメントスコアが増加する限り、両方の配列に沿って各々の方向に向かって拡張する。累積的なスコアは、ヌクレオチド配列の場合、パラメーターM（一対の一致している残基のための報酬スコア;常に>0）、パラメーターN（残基が一致しない場合の罰則スコア;常に<0）を使用して算出される。アミノ酸配列の場合、スコア算出行列が、累積的なスコアを算出するために用いる。累積的なアライメントスコアは、その最大到達値から量X落ちる時、累積的なスコアが一つ以上の負の値の残基配列の蓄積のためにゼロまたはそれ以下になる時、またはいずれかの配列の端に達した時に、それぞれの方向への単語ヒットの拡張が停止する。ある核酸またはポリペプチドが本発明の範囲内かどうか識別するためには、ブラスト（BLAST）プログラムのデフォルト・パラメーターを用いることが適切である。（ヌクレオチド配列のための）ブラスト（BLASTN）プログラムは、標準として、単語長(W) 11、期待値(E) 10、M=5、N=-4および両方のストランドの比較を使用する。
アミノ酸配列の場合には、BLASTPプログラムがデフォルトとして文字列長さ（W）3、期待値（E）10およびBLOSUM62スコア算出行列を使用する。TBLATNプログラム（ヌクレオチド配列に対応するタンパク質配列を使用する）は、デフォルトとして文字列長さ（W）3、期待値（E）10およびBLOSUM 62スコア算出行列（Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. ScL USA 89:10915 (1989) を参照）を使用する。
【０１６５】
相同性の割合を算出することに加えて、BLASTアルゴリズムは、2つの配列（例えば、Karlin & Altschul, Proc. Nat 'I. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)を参照。）の類似点の統計分析も実行する。BLASTアルゴリズムによって提供される類似性の1つの基準は、最小合計確率（P（N））である。そして、それは2つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然に起こる確率の指標を提供する。例えば、もし試験核酸と参照核酸とを比較し、最も少ない合計が、約0.1、より好ましくは、約0.01未満および最も好ましくは約0.001未満の場合には、核酸は、参照配列と類似するとみなされる。
【０１６６】
II 一般
本発明は、輸送燃料、石油化学産業および/または食品および美容産業、さらにはほかの応用分野においても、特定の微生物が経済的に油、燃料および他の炭化水素または脂質組成物を生産するために用いることができるという洞察を前提の一部としている。適切な微生物は、微細藻類、油性酵母、真菌を含む。本発明に用いられる微細藻類の適している属は、脂質生産微細藻類のクロレラが好ましい。脂質のエステル転移反応は、バイオディーゼルとして有効な長鎖脂肪酸エステルを産生する。他の酵素及び化学的処理は、脂肪酸、アルデヒド、アルコール類、アルカンおよびアルケンを生産するように改変することができる。本出願は、複数種の微生物の系統の遺伝子改変のため方法を記載し、油、燃料および油脂化学製品への転換に適している脂質の生産を容易にする特徴を有する微生物を提供するためにクロレラおよび類似した微生物を含む。ある用途では、再生できるディーゼル、ジェット燃料または他の炭化水素化合物が生産される。本出願も、生産性および脂質収量を増加するための、および/または上記の組成物をより費用対効果よく生産するのための微細藻類培養方法について説明する。
【０１６７】
具体例において、本出願では、一つ以上の外来遺伝子を有する微細藻類の遺伝的に改変された種について説明する。例えば、バイオディーゼルに適しているトリセリグリセリド（TAGs）を高水準に生産する微細藻類は、TAGsのエステル転移反応を容易にすることができるリパーゼを発現するように改変されている。リパーゼは誘導性プロモーターを使用して、任意に発現させることができる。その結果、細胞は、最初に発酵槽で望ましい密度に増殖することができ、その後、プロモーターの誘導によってリパーゼが発現され、十分なアルコールがある場合には、任意にTAGsの脂肪酸エステルへの転移を促進する。
【０１６８】
いくつかの微細藻類脂質は、細胞膜および細胞の他の非水溶部分において隔離される。従って、エステル転移反応の収量を増やすためには、脂質へのリパーゼの接触性を増やすために細胞を溶解させることが有益である。例えば、機械的に、加圧された蒸気を加えて、または微細藻類細胞を溶解させるウイルスを使用するか、細胞の溶解タンパク質を生産する遺伝子を発現するか、または微細藻類細胞を溶解させる薬品で培地を処理することによって、細胞破砕がなされる。細胞破砕のための微細藻類の蒸気処理は、例えば、米国特許6,750,048に説明されている。
【０１６９】
また、本願明細書は、例えば溶解ウイルスの遺伝子のように、微細藻類を溶解させる遺伝子を発現しTAGsを高水準で生産する微細藻類の遺伝子改変について説明する。この遺伝子は誘導性プロモーターを使用して発現することができる。その結果、細胞は最初に発酵槽で望ましい密度に増殖してもよく、それから細胞を溶解させる遺伝子を発現するためにプロモーターが誘導されることに続いて収集されてもよい。その後、。例えば、多糖類分解酵素をコードしている遺伝子は、細胞を溶解させるために発現させてもよい。
【０１７０】
場合によっては、リパーゼは、エステル転移反応まで大部分の微細藻類脂質と区分けされたままの状態で、細胞内区画において発現させてもよい。通常、水が標本から実質的に取り除かれるか、および/または、過剰なアルコールが加えられた後、エステル転移反応を実行することが好ましい。リパーゼは、エステル転移の基質として、アルコールと同様に水を使用することができる。水がある場合には、脂質は、ヒドロキシ基部に接合され、エステルよりむしろ極性の脂肪酸を生産する。例えばメタノールのようなアルコールがある場合には、脂質はメチル基に接合され、輸送燃料のために典型的に好ましい無極性脂肪酸エステルを生産する。脂肪酸エステルを生産するためのエステル転移反応に適するようになるまで微細藻類脂質へリパーゼが接触することを制限するために、リパーゼは、例えば、葉緑体、ミトコンドリアまたは他の細胞小器官において発現されてもよい。このように区別して発現することによって、細胞が破砕された後、細胞脂質の大部分をリパーゼから隔離することができる。
【０１７１】
他の実施態様において、本出願は、さまざまな炭化水素化合物を生産するために、一つ以上の外来遺伝子を有するように遺伝的に改変された微細藻類、油性酵母、細菌または真菌の種について説明する。例えば、微細藻類は、天然にまたは遺伝子組み替えによって、脂質を高水準に生産する。外来の脂肪酸アシルACPチオエステラーゼを発現する微細藻類は、脂質合成の間、アシル担体タンパク質（ACP）から脂肪酸の切断を促進することができる脂肪酸アシルACPチオエステラーゼを発現するように改変（または更に改変）されてもよい。これらの脂肪酸は回収され、またはさらに細胞内の酵素処理を介して、他の炭化水素化合物を生産する。場合によっては、脂肪酸アシルACPチオエステラーゼは、作動可能な状態で誘導性プロモーターに連結される遺伝子から発現してもよく、および/または細胞内区画において発現してもよい。
【０１７２】
脂肪酸アシルACPチオエステラーゼは、特定の炭素鎖長を有する脂肪酸の伸長（脂肪酸合成の間）のためのその特異性に基づいて選択されてもよい。例えば、脂肪酸アシルACPチオエステラーゼは、8から34の炭素数の長さの炭素鎖に特異性を有していてもよく、8から18の炭素数に特異性を有することが好ましく、10から14の炭素数に特異性を有することがより好ましく、12の炭素数に特異性を有することが最も好ましい。
【０１７３】
さらに、本発明は例えば多糖類分解酵素をコードする１つの外来遺伝子、例えばリパーゼおよび溶解遺伝子のように2つ以上の外来遺伝子を発現するように改変された微細藻類の種を提供する。一方または両方の遺伝子が、脂質収量および脂肪酸エステルへの変換を増幅するようにこれらの遺伝子の発現する相対的タイミングを制御することができる誘導性プロモーターを使用して発現してもよい。本発明は、また、脂質を生産する微生物をショ糖を代謝するように改変するのためのベクター及び方法を提供する。ショ糖が代謝できれば有利である。なぜなら、このように改変された細胞がサトウキビまたは他の栄養源を、油、燃料、油脂化学製品などの生産に適当な脂質に変換することができるためである。
【０１７４】
他の実施態様において、本発明は、例えば脂肪酸アシルACPチオエステラーゼおよび脂肪酸アシルCoA/アルデヒド還元酵素、またはそれらの混合反応によってアルコール製品を産生するように、2つ以上の外来遺伝子を発現するように改変された、例えば微細藻類、油性酵母、バクテリアまたは真菌のような微生物を提供する。本発明はさらに、外来遺伝子の他の組合せとして、特に限定するものではないが、特異的な長さの脂肪酸を生成するために自然に共同発現する脂肪酸アシルACPチオエステラーゼおよびアシル担体タンパク質、またはアルデヒドを生成するための脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ及びアシルCoA還元酵素を提供する。本発明は、また、アルカンまたはアルケンを生成するための脂肪酸アルデヒドデカルボニラーゼ、脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ、脂肪酸アシルCoA還元酵素の組合せを提供する。外来遺伝子の一つ以上は、誘導性プロモーターを使用して発現させることができる。
【０１７５】
本発明は、 例えば微細藻類に望ましい増殖特徴を提供し、および/または生産される脂質の量および/または品質を強化するために、微細藻類の更なる改変を提供する。例えば、微細藻類は、細胞によって生産される脂質の比率または特性をより効果的に変えるために脂質経路を改変することができ、および/または、脂質経路の炭素フラックスを増やすために改変されてもよい。
【０１７６】
本出願は、2つ以上の外来遺伝子を発現するために、遺伝的に改変された微細藻類の種について説明する。第1の遺伝子が固定炭素源（例えばショ糖）の輸送体、第2がショ糖インベルターゼ酵素をコードする。結果として得られる発酵可能な微生物は、周知の生物学的炭化水素生産の方法によって得られるよりも低い製造費用で、炭化水素を生産する。上で説明されている2つの外来遺伝子の挿入は、誘導されたおよび/またはランダムな突然変異を通して糖類生合成系の破壊につながり、炭化水素生産にさらに大量の炭素フラックスを導入することになる。栄養転換、炭化水素生産系を変える改変および外来酵素を用いる処理は、個々にまたは共に、微生物によって精算される炭化水素組成物を変える。この変化は、生産される炭化水素の量、生産される一つ以上の炭化水素種の他の炭化水に対する量および/または微生物において生産される炭化水素種の種類の変化であってもよい。例えば、微細藻類は、より多くの量および/または割合のTAGsを生成するように改変されても良い。
【０１７７】
III 油または脂質を生産する微生物
好適な脂質または炭化水素を生産するいかなる種類の微生物であっても使用することができ、自然に高水準の好適な脂質または炭化水素を生産する微生物が好ましい。微生物による炭化水素の生産は、Metzger et al. Appl Microbiol Biotechnol (2005) 66:486-496及びA Look Back at the U.S. Department of Energy's Aquatic Species Program:Biodiesel from Algae, NREL/TP-580-24190, John Sheehan, Terri Dunahay, John Benemann and Paul Roessler (1998)  によってまとめられている。
【０１７８】
油、燃料、油脂化学製品の生産のための脂質または炭化水素の生産に適合していることに加え、以下の点が考慮されて、本発明の使用する微生物の選択に影響を与える。
(1)細胞重量の割合として、高い脂質含有量。
(2)増殖の容易さ。
(3)遺伝的改変の容易さ。
及び、(4)バイオマス処理の容易さ。
具体的態様において、野生型または遺伝的に改変された微生物細胞は、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%または少なくとも70%以上の脂質を産生する。
微生物は、（光がない場合、糖に）従属栄養的であることが好ましく、または、例えば、本願明細書において説明される方法を使用してそのように改変されてもよい。選択可能なマーカーおよび微生物内で機能を有する（構造性のおよび/または誘導性の）プロモーターの形質転換の容易さおよび入手可能性が、遺伝的改変の容易さに影響を与える。作成工程を考慮する際には、例えば、細胞を溶解させるための有効な手段を入手することが可能
かどうかを含めて考慮される。
【０１７９】
A.藻類
本発明の一実施形態では、微生物は、微細藻類である。本発明によれば、特に限定するものではないが、使用可能な微細藻類の実施形態は、表1で見つけることができる。
【０１８０】
（表1）  微細藻類の実施形態。
アクナンセス・オリエンタイルス（Achnanthes orientalis）、アグメヌルム（Agmenellum）、アンフィプロラ・ヒアリン（Amphiprora hyaline）、アンフォラ・コフェイフォルミス（Amphora coffeiformis）、アンフォラ・コフェイフォルミス・リネア（Amphora coffeiformis linea）、アンフォラ・コフェイフォルミス・プンクタタ（Amphora coffeiformis punctata）、アンフォラ・コフェイフォルミス・タヨロリ（Amphora coffeiformis taylori）、アンフォラ・コフェイフォルミス・テヌイス（Amphora coffeiformis tenuis）、アンフォラ・デリカティッシマ（Amphora delicatissima）、アンフォラ・デリカティッシマ・キャピタタ（Amphora delicatissima capitata）、アンフォラ属の種（Amphora sp.）、アナバエナ（Anabaena）、アンキストロデスムス（Ankistrodesmus）、アンキストロデスムス・ファルカタス（Ankistrodesmus falcatus）、ボエケロヴィア・ホオグランディ（Boekelovia hooglandii）、ボロディネラ属の種（Borodinella sp.）、ボツリョコッキス・ブラウニイ（Botryococciis braunii）、ボツリョコッカス・スデティクス（Botryococcus sudeticus）、バクテリオコッカス・マイナー（Bracteococcus minor）、バクテリオコッカス・メディオヌクレタス（Bracteococcus medionucleatus）、カルテリア（Carteria）、カエトセロス・グラシリス（Chaetoceros gracilis）、カエトセロス・ムエレリ（Chaetoceros muelleri）、カエトセロス・ムエレリ・スブサルスム（Chaetoceros muelleri subsalsum）、カエトセロス属の一種（Chaetoceros sp.）、クロレラ・アニトラタ（Chlorella anitrata）、クロレラ・アンタルクティカ（Chlorella Antarctica）、クロレラ・アウレオビリディス（ Chlorella aureoviridis）、クロレラ・キャンディダ（ Chlorella Candida）、クロレラ・カプスレイト（Chlorella capsulate）、クロレラ・デシカート（Chlorella desiccate）、クロレラ・エリプソイデア（Chlorella ellipsoidea）、クロレラ・エメルソニイ（Chlorella emersonii）、クロレラ・フスカ（Chlorella fusca）、クロレラ・フスカ・バー・バクオレタ（Chlorella fusca var. vacuolata）、クロレラ・グルコトロファ（Chlorella glucotropha）、クロレラ・インフシオナム（Chlorella infusionum）、クロレラ・インフシオナム（Chlorella infusionum）バール。クロレラ・インフシオナム・バー・アクトフィラ（Chlorella infusionum var. actophila）、クロレラ・インフシオナム・バー・アウゼノフィラ（Chlorella infusionum auxenophila）、クロレラ・ケッセレリ（Chlorella kessleri）、クロレラ・ロボフォラ（Chlorella lobophora）（SAG 37.88株）、クロレラ・ルテオビリディス（Chlorella luteoviridis）、クロレラ・ルテオビリディス・バー・アウレオビリディス（Chlorella luteoviridis var. aureoviridis）、クロレラ・ルテオビリディス・バー・ルテスセンス（Chlorella luteoviridis var. lutescens）、クロレラ・ミニアタ（Chlorella miniata）、クロレラ・ミヌティッシマ（Chlorella minutissima）、クロレラ・ムタビリス（Chlorella mutabilis）、クロレラ・ノクツルナ（Chlorella nocturna）、クロレラ・オヴァリス（Chlorella ovalis）、クロレラ・パルバ（Chlorella parva）、クロレラ・ファトフィリア（Chlorella photophila）、クロレラ・プリングシェイミィ（Chlorella pringsheimii）、クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）（UTEX株1806、411、264、256、255、250、249、31、29、25のいずれかを含む）、クロレラ・プロトセコイデス・バー・アシジコラ（Chlorella protothecoides var.acidicola）、クロレラ・レグラリス（Chlorella regularis）、クロレ���・レグラリス・バー・ミニマ（Chlorella regularis var. minima）、クロレラ・レグラリス・バー・ウンブリカタ（Chlorella regularis var. umbricata）、クロレラ・レイシグリィ（Chlorella reisiglii）、クロレラ・サッカロフィア（Chlorella saccharophila）、クロレラ・サッカロフィア・バー・エリプソイデア（ Chlorella saccharophila var. ellipsoidea）、クロレラ・サリナ（Chlorella salina）、クロレラ・シンプレックス（Chlorella simplex）、クロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana、クロレラ属の種（Chlorella sp.）、クロレラ・スファエリカ（Chlorella sphaerica）、クロレラ・スティグマトフォラ（Chlorella stigmatophora）、クロレラ・バニエリィ（Chlorella vanniellii）、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）、クロレラ・ブルガリス・エフ・テルティア（Chlorella vulgaris f tertia）、クロレラ・ブルガリス・バー・アウトトロフィカ（Chlorella vulgaris var. autotrophica）、クロレラ・ブルガリス・バーヴィリディス（Chlorella vulgaris var.viridisu）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス（Chlorella vulgaris var. vulgaris）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・テルティア（Chlorella vulgaris var. vulgaris f tertia）、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・ヴィリディス（Chlorella vulgaris var. vulgaris f viridis）、クロレラ・シャンセラ（Chlorella xanthella）、クロレラ・ゾフィンジエンシス（Chlorella zofingiensis）、クロレラ・ツレボウシオイデス（Chlorella trebouxioides）、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）、クロロコッカム・インフシオヌム（Chlorococcum infusionum）、クロロコッカム属の一種（Chlorococcum sp.）、クロゴニウム（ Chlorogonium）、クロオモナス属の一種（Chroomonas sp.）、クリソスファエラ属の一種（Chrysosphaera sp.）、 クリコスファエラ属の一種（Cricosphaera sp.）、クリプテコディニウム・コーニィ（ Crypthecodinium cohnii）、クリプトモナス属の一種（ Cryptomonas sp.）、サイクロテラ・クリプティカ（Cyclotella cryptica）,サイクロテラ・メネグヒニアナ（Cyclotella meneghiniana）、サイクロテラ属の一種（Cyclotella sp.）、ドナリエラ属の一種（Dunaliella sp.）、ドナリエラ・バルダウィル（Dunaliella bardawil）、ドナリエラ・バイオクラタ（Dunaliella bioculata）、ドナリエラ・グラヌラテ（Dunaliella granulate）、 ドナリエラ・マリタイム（Dunaliella maritime）、ドナリエラ・ミヌタ（Dunaliella minuta）、ドナリエラ・パルヴァ（Dunaliella parva）、ドナリエラ・ペイルセイ（Dunaliella peircei）、ドナリエラ・プリモレクタ（Dunaliella primolecta）、ドナリエラ・サリナ（Dunaliella salina）、 ドナリエラ・テリコラ（Dunaliella terricola）、ドナリエラ・テルチオレクタ（Dunaliella tertiolecta）、ドナリエラ・ヴィリディス（Dunaliella viridis）、ドナリエラ・テルチオレクタ（Dunaliella tertiolecta）、エレモスファエラ・ヴィリディス（Eremosphaera viridis）、エレモスファエラ属の一種（Eremosphaera sp.）、エリプソイデン属の一種（Ellipsoidon sp.）、エウグレナ（Euglena）、フランセイア属の一種（Franceia sp.）、フラギラリア・クロトネンシス（Fragilaria crotonensis）、フラギラリア属の一種（Fragilaria sp.）、グレオカプサ属の一種（Gleocapsa sp.）、グロエオサムニオン属の一種（Gloeothamnion sp.）、ヒメノモナス属の一種（Hymenomonas sp.）、イソクリシス・エーエフエフ・ガルバナ（Isochrysis aff galbana）、イソクリシス・ガルバナ（Isochrysis galbana）、レポシンク��ス（Lepocinclis）、ミクル・アクチニウム（Micr actinium）、ミクル・アクチニウム（Micr actinium）(UTEXLB 2614), モノラフィディウム・ミヌツム（Monoraphidium minutum）、モノラフィディウム属の一種（Monoraphidium sp.）、ナンノクロリス属の一種（Nannochloris sp.）、ナンノクロロプシス・サリナ（Nannochloropsis salina）、ナンノクロロプシス属の一種（Nannochloropsis sp.）、ナビクラ・アクセプタタ（Navicula acceptata）、ナビクラ・ビスカンテラエ（Navicula biskanterae）、ナビクラ・シュードテネロイデス（Navicula pseudotenelloides）、 ナビクラ・ペリクロサ（Navicula pelliculosa）, ナビクラ・サプロフィラ（Navicula saprophila）、ナビクラ属の一種（Navicula sp.）、ネフロクロリス属の一種（Nephrochloris sp.）、ネフロセルミス属の一種（Nephroselmis sp.）、ニツスチア・コムニス（Nitschia communis）、ニツスチア・アレカンヅフナ（Nitzschia alexandfna）、ニツスチア・コムニス（Nitzschia communis）、ニツスチア・デイシパタ（Nitzschia dissipata）、ニツスチア・フルスツルム（Nitzschia frustulum）、ニツスチア・ハンツスチアナ（Nitzschia hantzschiana）、ニツスチア・インコンスピクア（Nitzschia inconspicua）、ニツスチア・インテルメディア（Nitzschia intermedia）、ニツスチア・マイクロセファラ（Nitzschia microcephala）、ニツスチア・プシラ （Nitzschia pusilla）、ニツスチア・プシラ・エリプティカ（Nitzschia pusilla elliptica）、ニツスチア・プス・イリア・モノエンシス（Nitzschia pus ilia monoensis）、ニツスチア・クアヅラングラー（Nitzschia quadrangular）、ニツスチア属の一種（Nitzschia sp.）、オクロモナス属の一種（Ochromonas sp.）、オオサイスティス・パルバ（Oocystis parva）、オオサイスティス・プシラ（Oocystis pusilla）、オオサイスティス属の一種（Oocystis sp.）、オスシラトリア・リムネティカ（Oscillatoria limnetica）、オスシラトリア属の一種（Oscillatoria sp.）、オスシラトリア・スブレヴィス（Oscillatoria subbrevis）、パラクロレラ・ケッセリ（Parachlorella kessleri）、パスケリア・アシドフィラ（Pascheria acidophila）、パブロバ属の一種（Pavlova sp.）、ファングス（Phagus）、フォルミディウム（Phormidium）、プラティモナス属の一種（Platymonas sp.）、プレウロクリシス・カーター・アエ（Pleurochrysis carter ae）、プレウロクリシス・デンタテ（Pleurochrysis dentate）、プレウロクリシス属の一種（Pleurochrysis sp.）、プロトテカ・ウィクケルハミイ（Prototheca wickerhamii）、プロトテカ・スタグノラ（Prototheca stagnora）、プロトテカ・ポルトリセンシス（Prototheca portoricensis）、 プロトテカ・モリフォルミス（Prototheca moriformis）、プロトテカ・ゾフィ（Prototheca zopfii）、シュードクロレラ・アクアティカ（Pseudochlorella aquatica）、ピラミモナス属の一種（Pyramimonas sp.）、ピロボツリス（Pyrobotrys）、ロドコッカス・オパクス（Rhodococcus opacus）、サルシノイド・クリソフィテ（Sarcinoid chrysophyte）、セネデスムス・アルマツス（Scenedesmus armatus）、シゾシツリウム（Schizochytrium）、スピロギラ（Spirogyra）、スピルリナ・プラテンシス（Spirulina platensis）、スチココッカス属の一種（Stichococcus sp.）、シネココッカス属の一種（Synechococcus sp.）、テツラエヅロン（Tetraedron）、テツラセルミス属の一種（Tetraselmis sp.）、テツラセルミス・スエシカ（Tetraselmis suecica）、タラッシオシラ・ウェイッスフロギィ（Thalassiosira weissflogii）及びヴィリデイエラ・フリデリシアナ（Viridiella fridericiana）。
【０１８１】
１．クロレラ
本発明の実施態様において、微生物は、クロレラ属であることが好ましく、クロレラ・プロトテコイデス（Chlorella protothecoides）クロレラ・エリプソイデア（Chlorella ellipsoidea）、クロレラ・ミヌティッシマ（Chlorella minutissima）またはクロレラ・エメルソニィ（Chlorella emersonii）であることがより好ましい。
【０１８２】
クロレラは、単細胞の緑藻の属である。そして、クロロフィタ（Chlorophyta）門に帰属する。それは、直径2〜10μmであり、球形の形状で、鞭毛なしである。クロレラのいくつかの種は、天然で従属栄養である。
【０１８３】
クロレラ、特にクロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）は、脂質（特にバイオディーゼルに適している長鎖を含む脂質）の高濃度組成のため、本発明に用いられる好適な微生物である。そのほかに、この微細藻類は、従属栄養的に増殖し、本願明細書において実施形態において示されるように遺伝子的に改変することができる。
【０１８４】
本発明の実施態様において、好ましくは、トランス遺伝子の発現のために使用する微生物は、クロレラ属であり、クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）、クロレラ・ミヌティッシマ（Chlorella minutissima）またはクロレラ・エメルソニイ（Chlorella emersonii）であることがより好ましい。実施形態のクロレラの導入遺伝子の発現の例は、文献において見つかる（例えばCurrent Microbiology Vol. 35 (1997), pp. 356-362、Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 2000 Jul;16(4): 443-6、Current Microbiology Vol. 38 (1999), pp. 335-341 、Appl Microbiol Biotechnol (2006) 72: 197-205、Marine Biotechnology 4, 63-73, 2002、Current Genetics 39:5, 365-370 (2001)、Plant Cell Reports 18:9, 778-780, (1999)、Biologia Plantarium 42(2): 209-216, (1999)、Plant Pathol. J 21(1): 13-20, (2005)を参照する)。
また、実施形態を本願明細書において参照する。他の脂質を生産する微細藻類は同様に改変されてもよく、原核生物の微細藻類（Kalscheuer st al., Applied Microbiology and Biotechnology, Volume 52, Number 4 / October, 1999を参照）を含む。
【０１８５】
2. クロレラ種の識別
本発明に用いられるクロレラの種は、ゲノムの特定の目標領域の増幅によって識別されてもよい。例えば、特定のクロレラの種または株の識別は、例えばWu et al, Bot. Bull. Acad. Sin. (2001) 42:115-121に記載されるように、プライマーを使用し及びゲノムの任意の領域を使用して、核および/または葉緑体DNAの配列の増幅および配列決定を実行することができる。クロレラ属の種の識別は、リボソームDNA配列を単離し使用する。リボソームの内部転写されたスペーサ（ITSlおよびITS2 rDNA）、18SのrRNAおよび他の保存されたゲノム領域のように、系統学的な分析の方法は、これらの技術によって種の識別技術だけではなく、クロレラの種を識別することにより使用することができる。しかし、他の炭化水素及び脂質を生産する微生物に、本願明細書に説明される方法も使用することが可能である。藻類の識別及び分類の方法の実施形態のために、例えばGenetics, 2005 Aug;170(4): 1601-10 及び RNA, 2005 Apr;11(4): 361-4を参照する。
B.油性酵母
【０１８６】
本発明の一実施形態では、微生物は、油性酵母である。本発明によれば、特に限定するものではないが、使うことができる油性酵母の実施形態は、表2で見つけることができる。
【０１８７】
（表2）  油性のイーストの実施形態。
クリプトコッカス・クルバツス（Cryptococcus curvatus）、クリプトコッカス・テリコルス（Cryptococcus terricolus）、カンジタ属の一種（Candida sp.）、リポマイセス・スタルケィ（Lipomyces starkeyi）、リポマイセス・リポファ（Lipomyces lipofer）、エンドマイコプシス・バルナリス（Endomycopsis vernalis）、ロドトルラ・グルティニス（Rhodotorula glutinis）、ロドトルラ・グルシリス（Rhodotorula gracilis）およびヤロウィア・リポリティリカ（Yarrowia lipolytica）
【０１８８】
C.その他菌類
本発明の一実施形態では、微生物は、真菌である。本発明によれば、特に制限するものではないが、使うことができる菌類の実施形態は、表3で見つけることができる。
【０１８９】
（表3）  真菌の実施形態。
モルティエレラ（Mortierella）属の一種、モルティエレラ・ビナセア（Mortierrla vinacea）、モルティエレラ・アルペン（Mortierella alpine）、フィリシウム・デバリアヌム（Pythium debaryanum）、ケカビ属シルシネロイデス（Mucor circinelloides）、アスペルギルス・オクラセウス（Aspergillus ochraceus）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）、ペネシリウム・イイラシヌム（Pennicillium iilacinum）、ヘンセヌロ（Hensenulo）属の一種、カエトミウム（Chaetomium）属の一種、クラドスポリウム（Cladosporium）属の一種、マルブランシェア（Malbranchea）属の一種、リゾプス（Rhizopus）属の一種およびフィシウム（Pythium）属の一種
【０１９０】
D.バクテリア
本発明の一実施形態では、微生物は、バクテリアである。
【０１９１】
バクテリア（例えば大腸菌）の外来遺伝子の発現の実施形態は、周知である。
例えば、Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Sambrook et al. (3d edition, 2001, Cold Spring Harbor Press)を参照する。
IV微生物を培養する方法
【０１９２】
微生物は、遺伝子操作を実行すること及び炭化水素（例えば脂質、脂肪酸、アルデヒド、アルコール類およびアルカン）を生産する目的の双方のために培養される。前培養は、小規模且つ少なくとも初期には当初の微生物が増殖することができる状況下で実行される。例えば、当初の微生物が光合成無機栄養生物である場合、最初の培養は光がある場合に実行される。培養条件は、微生物が光の中で増殖するために進化するか、または改変される場合、それぞれに変えることができる。炭化水素生産のための培養は、通常大規模に実行される。固定炭素源はあることが好ましい。培地は、また、一定時間または全時間、光照射するために露出してもよい。
【０１９３】
微細藻類は、液体培地で培養してもよい。培養物は、バイオリアクターの内部に格納することができる。場合によっては、バイオリアクターは、光が入るのを許さない。代わりに、微細藻類は、固定炭素源を含み光が細胞に当たるようにしたフォトバイオリアクターで培養してもよい。細胞が輸送して利用する固定炭素源（すなわち混合栄養増殖）がある場合であっても、微細藻類細胞に光を照射することは、暗闇で細胞を培養することと比較して、増殖を加速する。培養条件のパラメーターは、炭化水素の全体的な生産量、生産される炭化水素種の組合せおよび/または炭化水素の製造を最適化するために調整されてもよい。いくつかの場合では、暗闇で培養される方が好ましい。例えば、光が培養物に当たるのを許さない極めて大きい（40,000リットル以上の）発酵槽を使用する場合である。
【０１９４】
微細藻類培養培地は、典型的には固定窒素源、微量元素、場合によってはpH維持のための緩衝液およびリン酸塩のような成分を含む。他の成分としては、例えば酢酸またはブドウ糖のような固定炭素源、特に海水微細藻のためにはNaCｌのような塩類を含むことができる。微量元素の実施形態は、亜鉛、ホウ素、コバルト、銅、マンガン及びモリブデンを含み、例えばそれぞれ、ZnCl2、 H3BO3、 CoCl2-OH2O、 CuCl2-2H2O、MnCl2-4H2O 及び (NH4)6Mo7O24-4H2O  のような形態である。
【０１９５】
固定炭素源で増殖することが可能な生物のために、固定炭素源は、例えば、ブドウ糖、フルクトース、ショ糖、ガラクトース、キシロース、マンノース、ラムノース、N-アセチルグルコサミン、グリセロール、フロリドシドおよび/またはグルクロン酸でありえる。一つ以上の外部から投入された固定炭素源の中で、一つ以上の炭素源は、少なくとも約50μM、少なくとも約100μM、少なくとも約500μM、少なくとも約5mM、少なくとも約50mMおよび少なくとも約500mMの濃度で供給されてもよい。いくつかの微細藻類種は、固定炭素源（例えば光がない場合、ブドウ糖または酢酸）を利用することによって増殖することができる。この種の増殖は、従属栄養増殖として公知である。クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）のために、例えば、有機栄養増殖は、バイオマスの高い生産および細胞の高い脂質含有量の蓄積に影響する。
【０１９６】
いくつかの微生物は、自然に増殖するか、または例えば都市廃棄物、２次処理した汚水、廃水他の固定炭素源のような固定炭素源および例えば硫酸塩、リン酸塩および硝酸塩のような多の栄養素で増殖するように改変される。汚水の成分は、炭化水素の生産で栄養源として役立ち、その培養物は炭化水素の安価な供給源を提供する。
【０１９７】
培地のpH、微量元素の同定および濃度、並びに多の培地条件のような、他の培養パラメーターは調整することができる。
【０１９８】
A. 光合成による増殖
微細藻類は、光がある場合に、増殖することができる。例えば、波長スペクトルおよび一日毎の明暗時間の比率のような他のパラメーターと同様に、微細藻類細胞の培地を照射する光量は、コントロールすることができる。微細藻類は、また、自然光で培養されてもよく、同様に、自然光および人工光の組合せを同時または交互に照射してもよい。例えば、クロレラ属の微細藻類は、昼間の自然光の下で、または夜間の人工光の下で培養してもよい。
【０１９９】
微細藻類のような微生物を育てるフォトバイオリアクターのガス含有量は、コントロールすることができる。フォトバイオリアクター内容量の一部は、液体よりむしろガスを含むことができる。ガス入口は、ガスをフォトバイオリアクターにポンプで送りこむために用いることができる。いかなるガスもフォトバイオリアクターにポンプで送りこむことができ、ガスには、空気、空気/CO2混合物、例えばアルゴン等の希ガスを含む。フォトバイオリアクターへのガスの流入率もまた、コントロールすることができる。フォトバイオリアクターへのガス流入量を増やすことは、微細藻類の培養物の濁度を増やす。フォトバイオリアクターへのガスを伝達するポートの配置は、所与のガス流入量で、培地の濁度に影響を及ぼす場合がある。空気/CO2混合物は、特定の生物にとっての最大限の増殖のためのCO2の最適量を生み出すために調整してもよい。微細藻類は、例えば、100%の空気よりも、3%のCO2/97%の空気の下であって、光の下でかなり急速に増殖する。3%のCO2/97%の空気は、天然の空気中よりもほぼ100倍多いCO2である。例えば、約99.75%の空気と0.25%のCO2、約99.5%の空気と0.5%のCO2、約99.0%の空気と1.00%のCO2、約98.0%の空気と2.0%のCO2、約97.0%の空気と3.0%のCO2、約96.0%の空気と4.0%のCO2および約95.00%の空気と5.0%のCO2、等の空気とCO2との混合物を、バイオリアクターまたはフォトバイオリアクターに吹き込んでもよい。
【０２００】
微細藻類培地は、また、加圧ガスの注入、かき混ぜ棒、培地の小石、羽根車、刃及び他の器具を備える装置によって混合する工程で処理することができる。
【０２０１】
フォトバイオリアクターは、微細藻類を含んでいるチャンバーにガス、固体、半固体および液体の流入を許しているポートを有することができる。ポートは、通常、物質を運搬する管または他の手段に取り付けられる。ガスポートは、例えば、培地にガスを運搬する。ガスをフォトバイオリアクターにポンプで送りこむことによって、CO2および他のガスの両方が細胞に与えられ、培養物を生成し濁度を生成することに役立でてもよい。培地の濁度はガスポートの数および位置が変わると、それに伴って変化する。例えば、ガスポートは、円筒状ポリエチレンバッグの一番下に沿って配置されてもよい。CO2が空気に加えられて、フォトバイオリアクターを泡立たせるときに、微細藻類はより急速に増殖する。例えば、5%のCO2と95%の空気の混合は、ボツリオコッカス（Botryococcus）細胞を含んでいるフォトバイオリアクターに吹き込まれる（例えば、J Agric Food Chem. 2006 Jun 28;54(13): 4593-9、 J Biosci Bioeng. 1999;87(6): 811-5及び J Nat Prod. 2003 Jun;66(6): 772-8を参照)。
【０２０２】
フォトバイオリアクターは、フォトバイオリアクターの表層にあてられる光を介してエネルギー源として微細藻類に光を提供するために、一つ以上の光源を照射されてもよい。光源は、増殖する細胞に十分であるが、酸化性損害を与えるかまたは光阻害反応を引き起こすほどではない強度を提供することが好ましい。いくつかの場合では、光源は、太陽の波長帯を模倣またはほぼ模倣する波長帯を有する。他の例においては、異なる波長帯が用いられる。フォトバイオリアクターは屋外または日光が表層に照射され得る温室または他の施設に配置されてもよい。ボツリオコッカス（Botryococcus）属の種のための好適な光子強度は、25から500μE m-2 s-1の間である（例えばPhotosynth Res. 2005 Jun;84(l-3): 21-7を参照)。
【０２０３】
フォトバイオリアクターは、培地の流入を可能にする一つ以上のポートを有する方が好ましい。1つの物質だけがポートを出入する必要はない。例えば、ポートが、フォトバイオリアクターに培地を流入する際に使われてもよく、それからサンプリング、ガス入力、ガス出口または他の目的のために後で使われてもよい。いくつかの場合では、フォトバイオリアクターは、培養期の始めに培地で満たされ、そして培養期に播種されたあとどんな増殖因子も注入されない。つまり、微細藻類バイオマスは、しばらくの間水性培地で培養され、その間微細藻類は繁殖して増殖する。しかしながら水性培地の量は、全時間を通じて、フォトバイオリアクターを通過して流れることはない。このように実施形態によっては、水性培地は植菌の後フォトバイオリアクターを通過して流れることはない。
【０２０４】
他の例において、培地は、微細藻類が繁殖して増殖する全時間にわたってフォトバイオリアクターを通過して流れてもよい。いくつかの実施形態において、培地は、植菌し細胞が望まれる密度に達した後、フォトバイオリアクターに流入する。つまり、上記の微細藻類が望まれる数に増加するまで、ガス流入および培地の流入は微細藻類の繁殖のために維持されない。
【０２０５】
フォトバイオリアクターは、好ましくは、ガスの流入を可能にする一つ以上のポートを有する。ガスは、例えばCO２のように栄養源として提供され、同様に乱流を提供するように双方の形で役立つことができる。乱流は、フォトバイオリアクターに入っているガスが培地の表面を泡立てるために、水性培地の下方にガス流入ポートを配置することによって実現することができる。一つ以上のガス流出ポートによって、ガスが漏れ出ることができる。それによって、フォトバイオリアクターの圧力が増すことを予防する。ガス流出ポートは、フォトバイオリアクターに入る微生物の汚染を妨げる「一方向の」弁を設けることが好ましい。いくつかの場合では、細胞は、微細藻類が繁殖し増殖する間、フォトバイオリアクターで培養される。しかしながら培地の至る所生じる渦を有する乱流は、ガスの流入によって引き起こされるが、全期間は維持されない。他の例において、培地の全体にわたる渦を有する乱流は、主にガス流入によって生じ、微細藻類が繁殖・増殖する全期間、維持されてもよい。いくつかの場合では、フォトバイオリアクターのスケールおよび渦のスケール間の比率の予め定められた範囲は、微細藻類が繁殖・増殖する間維持されない。他の例において、この種の範囲は維持されてもよい。
【０２０６】
フォトバイオリアクターは、培養物のサンプルをとるために使われてもよい少なくとも一つのポートを有することが好ましい。サンプリングポートが、培養物の無菌培養を含む性質を変えずに、繰り返し使われてもよいことが好ましい。サンプリングポートは、サンプルの流れが止められて、始まることができる弁または他の装置で構成されてもよい。あるいは、サンプリングポートは、連続サンプリングを可能にすることができる。フォトバイオリアクターは、培養物の播種を可能にする少なくとも一つのポートを有することが好ましい。このようなポートが、また、例えば培地またはガスの入力のような他の目的のために使われてもよい。
【０２０７】
B.従属栄養増殖
微生物の光合成による増殖に代わるものとして、上記の通りに、いくつかの微生物は、固定炭素源が増殖および脂質蓄積のためのエネルギーを提供する有機栄養増殖条件の下で培養されてもよい。
【０２０８】
本発明の1つの有機栄養培養方法において、バイオディーゼル生産の費用、原油、脂質エステル転移反応の副産物として生産される部分的に精製または精製されたグリセロールは、例えば、脂質を生産する微生物培養物を発酵させるための栄養源として使用されてもよい。このように、本発明は、例えば微細藻類のような微生物を第1の微生物培養で培養する工程、培養組織から微生物脂質を取り出す工程、微生物脂質をエステル転移反応に供して脂肪酸エステルおよびグリセロールを生産する工程、及び、栄養源としてグリセロールを第2の微生物培養に加える工程、を含む。第１および第２の微生物培養は、同じ微生物の培養でもよいが、同じである必要はない。必要に応じて、培養物から回収される脂質から作り出されるグリセロールを同じ培養物に戻すことができるような連続システムを考案してもよい。
【０２０９】
本発明は、クロレラ属、ナビクラ（Navicula）属、セネデスムス（ Scenedesmus）属及びスピルリナ（Spirulina）属を含む微生物である原核及び真核生物両方の多数の属での発酵のためにグリセロールを使用することを含む、著しく進歩した培養のパラメーターを提供する。実施例で実証するように、クロレラ、ナビクラ（Navicula）、セネデスムス（ Scenedesmus）及びスピルリナ（Spirulina）含む極めて異なる進化の系統である微生物が、多くの異なるクロレラ種および株と同様に、試薬級のグリセロールだけではなくバイオディーゼルエステル転移反応からの副産物である酸性グリセロール及び非酸性グリセロール上で非常によく増殖できる。いくつかの場合では、例えばクロレラ種のような微細藻類は、ブドウ糖がある場合よりもグリセロールがある場合により速い細胞分裂が行われる。これらの例において、細胞が最初に急速に細胞密度を増やすためにグリセロールを与えられて、それから、脂質を蓄積するためにブドウ糖を与えられるという二段階増殖プロセスによって、脂質が生じる効率を改善することができる。エステル転移反応の副産物であるグリセロールを製造工程に戻して使用することは重要な経済的利点を提供する。グリセロールおよびブドウ糖の混合物のような他の供給方法も同様に提供される。この種の混合物を供給することも同じ経済的利点を有する。加えて、本発明は、例えばグリセロールにさまざまな組合せでショ糖を加えるように、微細藻類に代わりの糖を供給する方法を提供する。本発明によって提供される利益は本願明細書において原核生物および真核生物を含んだ極めて異なる進化の系統の微生物を用いて実証されており、本発明を微生物発酵に用いることの利益が実証されている。
【０２１０】
クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）の増殖および播種のための標準の方法は公知である（例えばMiao and Wu, J. Biotechnology, 2004, 11 : 85-93 及び Miao and Wu, Biosource Technology (2006) 97:841-846を参照）。本発明も、新しい増殖条件をクロレラに提供する。例えば、クロレラの多数の種および株は、バイオディーゼルのエステル転移反応からのグリセロール副産物を含むグリセロールの存在下で増殖させることができる。
【０２１１】
炭化水素生産のために、本願明細書で説明する本発明の組換細胞は、大容量で培養されるかまたは発酵されることが好ましい。培養工程は、実施形態の懸濁培地のように大規模な培地であってもよい。他の実施形態は、炭化水素の生産と同様に、細胞の増殖と増殖との組み合わせで小さな細胞培養から始めて、大きいバイオマスに拡大することを含む。バイオリアクターまたは鋼鉄の発酵槽は、かなりの培養量を収めるために用いることができる。発酵槽は、ビールおよび/またはワインの製造に好適に用いられる発酵槽と類似している。きわめて大きいエタノールの生産に使用する大きい発酵槽も同様である。
【０２１２】
発酵槽の培養に適当な栄養源が提供される。
これらの原料は例えば以下の一つ以上を含む。ブドウ糖、穀物澱粉、脱重合したセルロース材料、ショ糖、サトウキビ、テンサイ、ラクトース、牛乳乳漿または糖蜜のような固定炭素源。例えば脂肪または植物油のような脂肪源。例えばタンパク質、大豆ミール、コーンスティープ液、アンモニア（純粋なまたは塩の形）、硝酸または硝酸塩または分子窒素のような窒素源。そして、リン酸塩類のようなリン源。加えて、発酵槽は、例えば温度、pH、酸素分圧および二酸化炭素濃度などの培養状況の制御を考慮に入れる。場合によっては、酸素または窒素のようなガス成分は、培地を泡立たせることができる。例えば、小麦、ジャガイモ、米およびトウモロコシのような他のデンプン（ブドウ糖）源。他の炭素源は、例えば工業水準グリセロール、黒液、例えば酢酸塩のような有機酸、糖蜜のようなプロセス・ストリームを含む。炭素源は、また、例えばショ糖および脱重合されたテンサイ・パルプの混成として混合物を形成してもよい。
【０２１３】
発酵槽は、細胞がそれらの増殖サイクルのさまざまな相を経る際に用いることができる。例えば、炭化水素産生細胞の播種が、細胞が増殖を開始する前の遅延期間（遅滞期）に培地へ行われる。遅延期間後の、増殖率は、着実に増加して、対数増殖期に入る。対数増殖期に続いて、栄養分の減少および/または有毒な物質の増加によって順次増殖が減速する。この減速後、増殖が停止し、細胞のさらされている特定の環境に依存して細胞が静止期または定常期に入る。
【０２１４】
本願明細書によって説明される細胞による炭化水素の生産は、対数増殖期の間または栄養分が供給又は利用できる定常期を含む対数増殖の後に生産され、細胞分裂がない場合炭化水素の生産が継続される。
【０２１５】
本願明細書または従来技術において説明されている状況を用いて増殖した微生物は少なくとも約20重量％の脂質から成り、好ましくは少なくとも40重量％、より好ましくは、少なくとも約50重量％、および最も好ましくは少なくとも約60重量％であることが好ましい。
【０２１６】
多数のクロレラ種およびクロレラ種の多数の株が、等価量の試薬級グリセロールより、エステル転移反応から得られるグリセロール副産物が存在する場合に、よりよく活動することは、予想外の発見であった。エステル転移反応からの副産物であるグリセロールは、通常グリセロールに加えて残留するメタノールおよび他の夾雑物を含む。例えば、図1-6は、クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）およびクロレラ・ケッセレリ（Chlorella kessleri）の株が純粋な試薬級グリセロールで増殖する時より、脂質エステル転移反応から得られる酸性および非酸性グリセロール副産物の方がより良好な生産性を呈することを証明する。他の微生物、例えばナビクラ（Navicula）、セネデスムス（ Scenedesmus）である微細藻類もまた、試薬級グリセロールの等価量よりも、エステル転移反応からのグリセロール副産物がある場合に、よりよく活動することができる。
【０２１７】
リットル中の細胞乾燥重量
図1は、細胞乾燥重量が純粋なグリセロールよりバイオディーゼルグリセロール副産物で高いことを証明し、この傾向は細胞がグリセロール単独およびグルコースとの組み合わせで増殖される場合にも有効だったと証明する。
図2は、クロレラの他の株で同様の傾向であることを示す。
図12（b）は、そのセネデスムス・アルマツス（Scenedesmus armatus）のリットル中の乾燥細胞重量は、純粋な試薬級グリセロールより、バイオディーゼル副産物の酸性及び非酸性グリセロールの中での方が高いことを証明する。
図13は、ナビクラ・ペリクロサ（Navicula pelliculosa）のリットル中の乾燥細胞重量が純粋な試薬グレード・グリセロールよりバイオディーゼルの副産物である非酸性のグリセロールの中で高いことを証明する。
【０２１８】
リットル中の脂質含有量
図3および4が、多様なクロレラの種及び株で、リットル中の脂質量は、細胞が純粋な試薬級グリセロールの等価濃度で培養される時よりも、バイオディーゼルの副産物であるグリセロールで培養される方が高いことを証明する。
【０２１９】
細胞重量のパーセンテージとしての脂質。
図5および6は、多様なクロレラの種及び株は、細胞が純粋な試薬級グリセロールの等価濃度で培養される時よりも、バイオディーゼルの副産物であるグリセロールで培養される方が、乾燥細胞重量の脂質として高い割合で蓄積することを証明する。
図11は、スピルリナ・プラテンシス（Spirulina platensis）とナビクラ・ペリクロサ（Navicula pelliculosa）の双方が、細胞が純粋な試薬級グリセロールの等価濃度で培養される時よりも、バイオディーゼルの副産物であるグリセロールで培養される方が、乾燥細胞重量の脂質として高い割合で蓄積することを証明する。
図12(a)は、セネデスムス・アルマツス（Scenedesmus armatus）では細胞が純粋な試薬級グリセロールの等価濃度で培養される時よりも、バイオディーゼルの副産物であるグリセロールで培養される方が、乾燥細胞重量の脂質として高い割合で蓄積できることを証明する。
【０２２０】
他の驚くべき結果は、多様なクロレラの種及び株、セネデスムス（Scenedesmus）、ナビクラ（Navicula）、スピルリナ（Spirulina）のような他の微細藻類を含む多様な微生物は、ブドウ糖だけの存在下よりも、グリセロールおよびブドウ糖の混合物がある場合には、バイオディーゼルを生産する上で良好な特徴を呈する。
【０２２１】
リットル中の脂質含有量
図7は、クロレラは、2%のブドウ糖がある場合よりも、1%のグリセロール/1%のブドウ糖がある場合の方が、培地のリットル中のより高い脂質量を蓄積することができる。
【０２２２】
リットル中の乾燥細胞重量
図12（b）は、そのセネデスムス・アルマツス（Scenedesmus armatus）のリットル中の乾燥細胞重量は、2%のブドウ糖がある場合よりも、1%のバイオディーゼル副産物グリセロール/1%のブドウ糖がある場合に存在するときに、より高いことを示す。
図13は、ナビクラ・ペリクロサ（Navicula pelliculosa）のリットル中の乾燥細胞重量が、2%のブドウ糖がある場合より1%のバイオディーゼルの副産物であるグリセロール/1%のブドウ糖がある場合に培養された方が、より高いことを証明する。
【０２２３】
細胞重量のパーセンテージとしての脂質
図8は、クロレラが、グルコース存在下で培養されるよりもグリセロールとグルコースの等しい濃度の混合物が存在する場合に培養される方が、より高い乾燥細胞重量の脂質として高い割合で蓄積することを証明する。
図11(a)は、スピルリナ・プラテンシス（Spirulina platensis）が、グルコースだけの存在下で培養されるよりもバイオディーゼルの副産物であるグリセロールとグルコースの等しい濃度の混合物が存在する場合に培養される方が、より高い乾燥細胞重量の脂質として高い割合で蓄積することを証明する。
図11(b)は、ナビクラ・ペリクロサ（Navicula pelliculosa）が、グルコースだけの存在下で培養されるよりも、試薬級のグリセロールとグルコースの等しい濃度の混合物が存在する場合、バイオディーゼルの副産物であるグリセロールとグルコースの等しい濃度の混合物が存在する場合に培養される方が、より高い乾燥細胞重量の脂質として高い割合で蓄積することを証明する。
図12（b）は、セネデスムス・アルマツス（Scenedesmus armatus）がグルコースだけの存在下で培養されるよりもバイオディーゼルの副産物であるグリセロールとグルコースの等しい濃度の混合物が存在する場合に培養される方が、より高い乾燥細胞重量の脂質として高い割合で蓄積することを証明する。
【０２２４】
クロレラ、ナビクラ（Navicula）、及びセネデスムス（ Scenedesmus）のような微細藻類を含む微生物には、グリセロールおよびブドウ糖をむしろ連続して加えるほうが、ブドウ糖及びグリセロールの混合物を単一バッチで添加するよりも更なる収率増加を起こすことができることは付加的で予想外の発見だった。多様なクロレラの種及びクロレラの株の属性は、バイオディーゼルの副産物であるグリセロールおよび試薬級のグリセロールの双方がある場合に試験された。
【０２２５】
脂質の細胞重量に対する割合。
図8は、クロレラが、実験の当初にグリセロールとグルコースを同時に同量加えられた場合よりも、最初の期間グリセロールが加えて培養され、続いてグルコースが加えられて第２の期間培養され続けた方が、脂質の細胞重量に対する割合がより高いことを証明する。
【０２２６】
リットル中の脂質含有量。
図9は、クロレラが、グリセロールおよびブドウ糖を同時に開始期に加えられるよりもむしろ連続して加えるほうが、培地中のリットル中の脂質含有量はより高いことを示す。
この傾向は、酸性バイオディーゼル副産物のグリセロール、バイオディーゼル副産物の非酸性グリセロールまたは試薬級グリセロールが用いられるときに、観察された。
【０２２７】
リットル中の乾燥細胞重量。
図10は、2つの異なる種のクロレラの4つの異なる株が、実験の開始時期にグリセロールとグルコースを同時に投与される場合より、グリセロールとグルコースが連続して投与された方が、培地のリットル中の乾燥細胞重量がより高いことを証明している。
この傾向は、酸性バイオディーゼル副産物のグリセロール、非酸性バイオディーゼル副産物のグリセロールまたは試薬級グリセロールが用いられるときに、観察された。
図14(a)及び（b）は、セネデスムス・アルマツス（Scenedesmus armatus）およびナビクラ・ペリクロサ（Navicula pelliculosa）の両方が、発酵期の最初にグリセロールとグルコースの同一量を加えることに比較して、バイオディーゼル副産物のグリセロールが第1の期間に培地に加えられた方が、リットル中の細胞乾燥重量の増加を示すことができることを証明する。
【０２２８】
微生物脂質生産の3つの異なるマーカー（リットル中の乾燥細胞重量、リットル中の脂質のグラムおよび脂質としての乾燥細胞重量の割合）は、バイオディーゼルの副産物の使用および炭素源の時間的分離によって改善される。本発明は従って、系統樹の非常に互いに異なる領域からの原核生物および真核生物を含む微生物の多数の種の単位時間につき、脂質のより高い量を生み出す新規な方法を提供する。グリセロールを使用して本願明細書において説明される脂質および炭化水素を製造する方法は、微細藻類に限定されず、エネルギー源としてグリセロールを利用することができるいかなる微生物にも用いることができる。
【０２２９】
本発明の交互の有機栄養増殖方法において、微生物は、栄養源として脱重合されたセルロースバイオマスを使用して培養されてもよい。セルロースバイオマス（例えば、茎葉、例えばトウモロコシ茎葉）は、安価で直ちに利用できる。しかしながら、酵母のための栄養源としてこの材料を使用する試みは失敗した。特にこの種の栄養源が酵母の増殖を抑制することがわかった上に、酵母はセルロース材料（例えば、ヘミセルロースからのキシロース）から作り出される5炭糖を使用することができない。一方、微細藻類は、処理されたセルロース材料で増殖することができる。したがって、本発明は、セルロース材料および/または5炭糖がある場合には、微細藻類を培養する方法を提供する。
セルロース材料は、一般に以下から成る。
40-60%の乾燥重量のセルロース、20-40%の乾燥重量のヘミセルロース、10-30%の乾燥重量のリグニン。
【０２３０】
適切なセルロース材料には、例えば植物の一部、主に茎および葉等を含む農作物と同様に、草本性及び木本性のエネルギー作物の残りカスが含まれるが、主要な食品または繊維製品を含む分野を除くものではない。実施形態は、例えばサトウキビ・バガス、米外皮、穀物繊維（軸、葉、外皮およびコッブを含む）、小麦わら、米わら、テンサイ・パルプ、柑橘類のパルプ、柑橘類の皮のような農作物の残留物、広葉樹または針葉樹の間伐材、広葉樹または針葉樹の林業から得られる残材などの林業廃棄物、紙パルプ、工場廃棄物（木材チップ、おがくず）に見られる木材廃棄物、市町村の芝生の切り抜きなどの都市部木材廃棄物や都市の緑の廃棄物、都市固形廃棄物の紙分数などの都市廃棄物。木材の建設廃棄物を含む。その他のセルロース材料には、スイッチグラス、複合型ポプラ材およびオギ、繊維茎、繊維モロコシのような専用のセルロース作物が含まれる。そのような材料等から生産される5炭糖には、キシロースが含まれる、。
【０２３１】
驚くべきことに、いくつかのクロレラの種は、本願明細書で説明されるように、ブドウ糖かキシロース単独で培養される時よりも、ブドウ糖及びキシロースの組み合わせで培養される方が高収量を提示する。この相乗効果は、それが例えばセルロース材料のようなキシロースおよびブドウ糖の組合せで、クロレラの培養を可能にする重要な利点を提供し、図15に示される。
【０２３２】
本発明に基づくさらに別の代わりの従属栄養性の増殖方法において、それ自体が任意に、上述した方法、ショ糖、サトウキビまたはテンサイから実施形態による製造を組み合わせて使用することができ、栄養源として使用される。下記の「微生物工学」と名付けられる章において更に詳細に記載され、脂質生産は容易に行うことができるかまたは炭素源としてショ糖を利用するクロレラのような微生物の改変によってより効率的にすることができる。例えば、ショ糖輸送体およびショ糖インベルターゼの発現によって、クロレラが培地から細胞にショ糖を輸送して、ブドウ糖およびフルクトースを産生するためにショ糖を加水分解することができる。任意に、フルクトキナーゼは、内因性ヘキソキナーゼ活性がフルクトースの最大リン酸化のために不十分である場合と同様に発現することができる。
適切なショ糖輸送体の実施形態は、ジェンバンクの登録番号CAD91334、CAB92307およびCAA53390である。適切なショ糖インベルターゼの実施形態は、ジェンバンク登録番号CAB95010、NP 012104およびCAA06839である。適切なフルクトキナーゼの実施形態は、ジェンバンク登録番号P26984、P26420およびCAA43322である。クロレラを含む微細藻類の形質転換のためのベクターは、本願明細書で記載されるようにデザインされたような遺伝子を一つ以上コードする。
【０２３３】
ショ糖インベルターゼの分泌は、細胞にショ糖を輸送することができる輸送体の発現の必要を不要にすることができる。これは分泌されたインベルターゼが、ブドウ糖の分子およびフルクトースの分子にショ糖の分子の転換に触媒作用を及ぼすという理由である。そして、その両方は輸送されることができて、本願明細書において説明される微生物によって利用されてもよい。実施形態において、ショ糖インベルターゼの発現（例えば配列番号：14）で、分泌信号を有する（例えば配列番号：15（酵母から）、配列番号：16（高等植物から）、配列番号：17（真核生物に共通のシグナル配列）および配列番号：18（高等植物および真核生物共通からのシグナル配列の組合せ））は、細胞の外側でインベルターゼ活性を生成する。活発なシグナル配列の実施形態のために、Hawkins et al., Current Microbiology Vol. 38 (1999), pp. 335-341を参照する。本願明細書において説明される遺伝子工学方法論によって可能になる、このようなタンパク質の発現は、エネルギー源として細胞外のブドウ糖を利用することがすでにできる細胞を、細胞外エネルギー源としてショ糖を利用することができるようにする。クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）、クロレラ・ミヌティッシマ（Chlorella minutissima）、クロレラ・エメルソニイ（Chlorella emersonii）のような細胞においては、本願明細書において示すように、エネルギー源としての細胞外フルクトースおよび細胞外ブドウ糖を使用することができ、インベルターゼの分泌が効率的な安価なエネルギー源として、ショ糖の資化性のために必要な唯一の触媒活性を提供することができる。
【０２３４】
例えば、図26に示すように、クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）は、3つのプロモーター（カリフラワー・モザイク・ウイルス・35Sプロモーター（CMV）、クロレラウイルス・プロモーター（CV）または、クロレラHUPlプロモーター（HUPl））のうちの1つの制御で、ショ糖インベルターゼ遺伝子を有するように改変されてもよい。
使用するショ糖インベルターゼ遺伝子は、この実施形態において、S・セレビシエ（S. cerevisiae）SUC2遺伝子をC・プロトテコイデス（C protothecoides）のコドン使用のために最適化された変更態様から成る。最適化された遺伝子のcDNAおよびアミノ酸配列は、配列番号：8および配列番号：19、にそれぞれ対応する。形質転換に使用するプラスミドの構成の実例は、図25に示される。例えば本願明細書において記載されるように、分泌可能なショ糖インベルターゼの発現は、細胞発酵のための栄養源を含んでいる糖蜜、サトウキビ液および他のショ糖含有原材料を使用できるようにする。
【０２３５】
同様に、図27および28は、それぞれに、CMVプロモーターの管理下のS・セレビシエ（S. cerevisiae）からのショ糖インベルターゼ遺伝子を有するように、クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）、クロレラ・ミヌティッシマ（Chlorella minutissima）およびクロレラ・エメルソニイ（Chlorella emersonii）を、形質転換した結果を示す。
【０２３６】
実施例の更なる詳細にて説明したように、外来の分泌可能なショ糖インベルターゼを発現している微生物の増殖可能性は、インベルターゼのクロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）の培地への追加で例示される。
図23および24は、クロレラ細胞が、純粋な試薬級のブドウ糖と同様に、サトウキビを処理して得られた廃物の糖蜜で、増殖するという驚くべき結果を例示する。
サトウキビの処理工程で低価値廃棄物を使用することによって、炭化水素および他の油の生産に重要なコスト削減を実現することができる。リグニンおよび他のセルロース廃棄物を含む糖蜜は、多くの微生物に毒性を有し、それらの増殖を遅延させるが、クロレラ細胞がこの種の毒がある場合にも繁殖するということを見出した。
図23-24は、細胞外ショ糖インベルターゼの存在または不存在下のブドウ糖またはショ糖と比較して、３つのユニークな原料の糖蜜（指定されたBSl、BS2およびHTM）での細胞の増殖を示す。
【０２３７】
あるいは、ショ糖インベルターゼは、ショ糖輸送体を発現する細胞においても細胞内に発現させることができ、また、ショ糖を細胞に取り込むことができるいかなる炭水化物輸送体が発現する細胞でも同様である。
【０２３８】
実施例12に記載したように、外来遺伝子が、クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）に形質転換されて発現した。ショ糖資化性遺伝子の発現は、同じであるか類似した方法およびベクターの改変を使用して達成されてもよい。
【０２３９】
バイオリアクターは、従属栄養性の増殖方法のために、用いられてもよい。既に明らかにしたように、本願明細書において説明されている従属栄養性の増殖方法で固定炭素源を使用するときに、光合成による増殖方法の細胞が利用できる光を作るために用意しておくことは不必要である。
【０２４０】
本願明細書において説明されている有機栄養増殖方法および処理条件の具体例は、微生物増殖および脂質生産の効率を改善するために、いかなる適切な方法にも組み込まれることができる。加えて、上記の方法のために、さらにより適切である微生物を生産するために、本発明は、例えば微細藻類微生物の遺伝的な改変および/または遺伝的な選抜を含む。例えば、上述の栄養源のいずれかを、増殖能及び/または脂質（例えば脂肪酸）生産能を増加するために、より優れた利用能力を有する微生物は、本発明の範囲内である。
【０２４１】
C. 混合栄養増殖
混合栄養性の増殖は、細胞の増殖と炭化水素の生産のために、光と炭素源の双方をエネルギー源として使用する。混合栄養性の増殖は、フォトバイオリアクターにおいて実行されてもよい。微細藻類は、異なる種類の透明または半透明の材料でできている閉ざされたフォトバイオリアクターにおいて維持されることができ、増殖することができる。
この種の材料は、プレキシグラス（Plexiglas）（R）エンクロージャ、ガラスエンクロージャ、透明または半透明のパイプ例えばポリエチレンのような材料から作られるバックおよび他の材料を含むことができる。微細藻類は増殖することができて、水路池、池のような環境、他の閉ざされていない容器のような、開かれたフォトバイオリアクターにおいて維持および増殖することができる。
【０２４２】
D.増殖培地
本発明の方法において役立つ微生物は、世界の全体にわたってさまざまな場所および環境で見つかる。他の種およびそれらの結果として生じる進化の相違からのそれらの隔離の結果として、最適な増殖および脂質および/または炭化水素成分の生成のための特定の増殖培地は、予測が困難である。場合によっては、微生物の特定の種は、ある抑制成分の存在または微生物の特定の種によって必要なある必須栄養的な必要条件の欠如を原因として、特定の増殖培地で増殖することができないかもしれない。
【０２４３】
固体および液体増殖培地は、通常、多種多様なソースから入手可能である、そして、微生物の多種多様な種に適している特定の培地の準備のための指示が、例えば、藻類（UTEX）のその培養収集のための、オースティンにあるテキサス大学によって維持されるサイト http://www.utex.org/ のオンライン上で見つけることができる。例えば、下で、さまざまな淡水および塩水培地は、表4に示すそれらを含む。
【０２４４】
典型的な藻類の培地。
【表４】
2010528627.tif 000002
【０２４５】
特定の例では、クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）（UTEX 31）を培養することに適している培地は、プロテオース培地を含む。この培地は純粋培養に適しており、培地（pH-6.8）のIL量は1リットルのブリストル培地にプロテオース・ペプトンのIgの追加によって準備されてもよい。ブリストル培地は、2.94mMのNaNO3、0.17mMのCaCl22H2O、0.3mMのMgSO47H2O、0.43mM、1.29mMのKH2PO4、及び1.43mMのNaClを水溶液中に含む。1.5%の寒天培地のために、15gの寒天は、溶液の1Lに加えられることができる。溶液は、カバーされて、オートクレーブで処理されて、そして、使用する前に冷温で保管される。
【０２４６】
本発明の方法としての他の適切な培地は、例えばSAG、CCAPまたはCCALAのような微生物の培地を維持する他の団体と協議すること、または特定のURLに相談することによって、直ちに特定されてもよい。SAGはGottingen大学（Gottingen 、ドイツ）の藻類のカルチャーコレクションを参照し、CCAPは、海洋科学のためのスコットランド連合（スコットランド、英国）によって管理される藻類および原生動物のカルチャーコレクションを参照し、そして、CCALAは、Botany（Torebon、チェコ共和国）研究所で藻類の研究所のカルチャーコレクションを参照する。
【０２４７】
E.脂質の収率を増やす工程
プロセス条件は、特定の用途に適している脂質の収率を増やし、および/または生産コストを減らすように調整されてもよい。例えば、特定の実施形態では、微生物（例えば微細藻類）は、例えば炭素および/または窒素、リンまたは硫黄等の一つ以上の栄養源の限界濃度があり、その一方で、例えばブドウ糖のような固定炭素エネルギーが過剰に提供された条件で培養される。窒素を制限することによって、窒素が過剰に提供されている培地の微生物の脂質収率以上に微生物脂質の収率が増加する傾向がある。具体例において、脂質収率の増加は、少なくとも約10%、20%、30%、40%、50%、75%、100%、200%、300%、400%または500%である。微生物は、一部の全体の培養期間の間のまたは全ての期間の間に、栄養分の極限量の存在下で、培養されてもよい。ある特定の実施形態では、栄養分の濃度は、培養期間全体の間に少なくとも二回限界濃度および非限界濃度の間で循環する。
【０２４８】
脂質収率を増やすために、酢酸は、脂質産生微生物（例えば微細藻類）のための栄養源として使用されてもよい。酢酸は、脂肪酸合成を始める代謝の位置（すなわちアセチルＣｏＡ）に、直接供給される。このように、培地に酢酸を供給することによって、脂肪酸産生を増やすことができる。通常、微生物は、酢酸がない場合の微生物脂質（例えば脂肪酸）収率以上に、酢酸の十分な量がある場合に微生物脂質収率および/または微生物脂肪酸収率を増やすために、培養される。
【０２４９】
他の実施形態では、脂質収率は、脂質経路酵素（例えば脂肪酸合成酵素）のための一つ以上の補因子がある状態で脂質を生産する微生物（例えば微細藻類）を培養することによって増加する。通常、補因子の濃度は、補因子の非存在下の微生物脂質収率以上に、微生物脂質（例えば脂肪酸）収率を増やすのに十分である。特定の実施形態では、補因子は、補因子をコードしている外来遺伝子を含んでいる微生物（例えば微細藻類）を含むことによって、培地に提供される。あるいは、補因子は、補因子の合成に関与するタンパク質をコードする外因性遺伝子を含んでいる微生物（例えば微細藻類）を含むことによって、培地に提供されてもよい。ある種の実施形態では、適切な補因子は、例えば、ビオチン、パントテナートのような脂質経路酵素によって必要ないかなるビタミンも含む。本発明の適切な補因子をコードしている遺伝子またはこのような補因子の生合成に関与する遺伝子は周知であり、上述した構成および技術を用いて微生物（例えば微細藻類）に導入されてもよい。
【０２５０】
V脂質経路工学
本発明のいくつかの実施形態において、本発明の微生物は、生産する脂質の特性および/または比率を変え、および/または脂質への炭素フラックスを増やすために修飾される。さらに、あるいは代わりに、この経路は脂質の酵素の処理によって生産されるさまざまな炭化水素分子の特性および/または比率を変えるために修飾される。
【０２５１】
A.生産される脂質または炭化水素の比率または特性の変更
微細藻類の場合、いくつかの野生型細胞は、すでに良好な増殖特性を有するが、所望の種類または量の脂質を生じない。具体例としては、ピロボツリス（Pyrobotrys）、フォルミディウム（Phormidium）、アグメネルム（Agmenellum）、カルテリア（Carteria）、レポシンシス（Lepocinclis）、ピロボツリス（Pyrobotrys）、ニッツチア（Nitzschia）、レポシンシス（Lepocinclis）、アナバエナ（Anabaena）、エウグレナ（Euglena）、スピロギラ（Spirogyra）、コロコッカム（Chlorococcum）、テトラエドロン（Tetraedron）、オスシラトリア（Oscillatoria）、ファンガス（Phagus）およびクロロゴニウム（Chlorogonium）を含み、それらは地方の汚水または廃水で増殖する上で望ましい増殖特性を有する。
この種の細胞は、クロレラおよび他の微生物の種と同様に、脂質生産特性を改善するために改変されてもよい。望まれる特性は、単位量および/または単位時間の脂質収量、炭素鎖長（例えば、バイオディーゼル生産のために、または炭化水素栄養源を必要としている工業的応用のために）、二重結合または三重結合を減少させ可能であればゼロに、リングおよび環状構造を取り除くかまたは除去して、異なった脂質群のうち特定の種の脂質の水素：炭素比率を増やすことである。加えて、適当な炭化水素を生じる微細藻類は、また、より望ましい炭化水素生成物を得るために改変されてもよい。この種の微細藻類の実施形態は、クロレラ属の種を含む。
【０２５２】
1. 脂肪酸合成の枝分かれ部位を制御する酵素の調節
特定の実施形態において、枝分かれを制御する一つ以上の鍵となる酵素が、脂質生産を改善するために正の制御または負の制御されてもよい。正の制御は、例えば、転写を増やす強いプロモーターおよび／またはエンハンサー要素を使用し、有益な酵素をコードしている遺伝子が発現される発現コンストラクトを有するように細胞を形質転換することによって実現されてもよい。このようなコンストラクトは、このような選択を目的とすることができるような選択マーカーを含むことができ、コンストラクトを増幅して、コードする酵素の発現量を増加させることができる。本発明の方法に従う正の制御に適している酵素の実施形態は、ピルビン酸をアセチルＣｏＡに変換する役割を担うピルビン酸デヒドロゲナーゼを含む（微細藻類のいくつかの具体例としては、ジェンバンク登録番号 NP_415392、AAA53047、QlXDMl及びCAF05587を含む）。ピルビン酸デヒドロゲナーゼの正の制御は、アセチルＣｏＡの生産を増やすことができて、このことにより脂肪酸合成を増やすことができる。アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼは、脂肪酸合成の初期段階に触媒作用を及ぼす。したがって、この酵素は脂肪酸の製造を増やすために正の制御させることができる（微細藻類のいくつかの具体例は、ジェンバンク登録番号BAA94752、AAA75528、AAA81471、YP_537052、YP_536879、NP_045833、及びBAA57908）。脂肪酸産生はまた、脂肪酸合成の間伸長するアシル鎖を担持するアシル担体タンパク質（ACP）の正の制御によって増加させることができる（微細藻類のいくつかの具体例は、ジェンバンク登録番号A0T0F8、P51280、NP_849041、YP 874433を含む）。グリセロール-3-リン酸アシルトランスフェラーゼは、脂肪酸合成の律速段階に触媒作用を及ぼす。この酵素の正の制御は、脂肪酸産生を増やすことができる（微細藻類のいくつかの具体例は、ジェンバンク登録番号AAA74319、AAA33122、AAA37647、P44857、及びABO94442）。上述のタンパク質は、クロレラ属の種を含む微細藻類での発現の候補である。
【０２５３】
有用な酵素の負の制御は、例えば、アンチセンス、触媒RNA/DNA、RNA干渉（RNAｉ）、「ノックアウト」、「ノックダウン」であり、または他の突然変異生成技術を使用して実現する。また、酵素発現／機能が細胞内抗体を使用して阻害されてもよい。本発明の方法に従う負の制御に適している酵素の具体例は、クエン酸シンターゼを含み、それはトリカルボン酸（TCA）サイクルの一部としてアセチルＣｏＡを消費する。クエン酸シンターゼの負の制御は、より多くのアセチルCoAを脂肪酸合成系に強制移行させることができる。
【０２５４】
2. 脂肪酸合成遺伝子の包括的な制御因子の変更
包括的な制御因子は、脂肪酸生合成経路の遺伝子の発現度を調整する。したがって、一つ以上の脂肪酸合成の包括的な制御因子は、最終的には脂質の生産を増加するために、必要に応じて、脂肪酸合成遺伝子の複数の発現をそれぞれ抑制したり増幅したりすることが可能である。具体例としては、例えばSREBP-IaおよびSREBP-Ic（具体的には、ジェンバンク登録番号NP_035610およびQ9WTN3を参照）のようなステロール調節因子結合タンパク質（SREBPs）を含む。包括的な制御因子は、コントロールポイント酵素の調節に関して上述したように正または負の制御を受けることが可能である。
【０２５５】
3. 炭化水素修飾酵素の制御
本発明の方法も、例えば脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ（ジェンバンク登録番号を有する表5の具体例を参照）、脂肪酸アシルCoA/アルデヒド還元酵素（ジェンバンク登録番号表6の具体例を参照）、脂肪酸アシルCoA還元酵素（ジェンバンク登録番号表7の具体例を参照）、脂肪酸アルデヒドデカルボニラーゼ（ジェンバンク登録番号を有する表8の具体例を参照）、脂肪酸アルデヒド還元酵素またはスクアレンシンターゼ遺伝子（ジェンバンク登録番号AF205791を参照）のような炭化水素修飾酵素をコードしている一つ以上の遺伝子を有する形質転換した細胞を含む。いくつかの実施形態では、脂肪酸アシルACPチオエステラーゼおよび自然に共同発現されたＡＣＰをコード化している遺伝子、場合によっては他の炭化水素修飾酵素をコードしている一つ以上の遺伝子は、細胞に形質転換することができる。他の実施形態において、ACP及び脂肪酸アシルACPチオエステラーゼが、それらが特定の組織か生物において自然に共同発現するかまたは発現しないかどうかにかかわりなく、2つが微生物および本発明の方法で一緒に使われるときに、他の一つに有利な効果をもたらす親和性を持つ。このように、本発明は、特定の長さの炭素鎖をACPから切断する反応を促進するために相互に親和性を共有する一組の酵素と同様に、自然に共同発現するこれらの一組の酵素を目的としている。
【０２５６】
さらに他の実施形態において、不飽和酵素をコードしている外来遺伝子は、飽和炭化水素に関して修飾を施すために、他の炭化水素修飾酵素をコードしている一つ以上の遺伝子とともに細胞に形質転換するができる。ステアロイルACP脱飽和酵素（ジェンバンク登録番号AAFl 5308、ABM45911、及び、AAY86086を参照）は、例えば、ステアロイルACPからオレオイルACPへの転換反応に触媒作用を及ぼす。この遺伝子の正の制御は、細胞における一不飽和脂肪酸の比率を増やすことができる。ところが、負の制御は、一不飽和の比率を減らすことができる。同様に、一つ以上のグリセロ脂質不飽和酵素の発現は、例えばω-6脂肪酸不飽和酵素、ω-3脂肪酸不飽和酵素またはω-6-オレアート不飽和酵素のように、飽和脂肪酸の不飽和比率の変化を制御される場合もある。いくつかの実施形態では、不飽和酵素は所望の長さの炭素鎖に関連して選ばれる場合がある。そうすると、不飽和酵素は特定の炭素鎖長の基質の範囲内で、または特定の範囲内の炭素鎖長を有する基質に対して特定の部位特異的修飾を行うことができる。
【０２５７】
具体例において、本発明の微生物は、脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ、脂肪酸アシルCoA/アルデヒド還元酵素、脂肪酸アシルCoA還元酵素、脂肪酸アルデヒド還元酵素、脂肪酸アルデヒドデカルボニラーゼまたは自然に共同発現されたＡＣＰから選ばれる一つ以上の外来遺伝子を発現するように遺伝子改変されている。適切な発現方法は、誘導発現、区分発現、その他の方法を含む上述したリパーゼ遺伝子の発現である。
【０２５８】
いかなる特定の理論または細胞機構に束縛される意図でもなく、脂肪酸アシルACPチオエステラーゼは、脂質合成の間、脂肪酸をアシル担体タンパク質（ACP）から切断する。更なる酵素の処理によって、切断された脂肪酸は、それから、アシルＣｏＡ分子を産生するために、補酵素と結合される。このアシルＣｏＡは、アルコールを産生する脂肪酸アシルCoA/アルデヒド還元酵素と同様に、アルデヒドを産生する脂肪酸アシルCoA還元酵素の酵素活性の基質である。上述の特定の脂肪酸アシルCoA還元酵素の動作によってできるアルデヒドは、アルコールを産生する脂肪酸アルデヒド還元酵素またはアルカンまたはアルケンを産生する脂肪酸アルデヒドデカルボニラーゼによる更なる酵素活性の基質である。
【０２５９】
上記のとおり説明されている酵素は、特定の炭素原子数を含む基質に作用するための特異性を有する。例えば、脂肪酸アシルACPチオエステラーゼは、12の炭素原子を有する脂肪酸をACPから切断するための特異性を有することが可能である。ある実施形態では、ACP及び長さ特異性を有するチオエステラーゼは、互いに親和性を有する場合があり、その結果特に好適な組合せになる（例えば、外来のACPおよびチオエステラーゼ遺伝子は、それらが由来する特定の組織または生物において自然に共同発現してもよい）。従って、ある実施形態では、微生物は、基質に含まれる炭素原子数に関してある酵素活性を特異的に触媒するタンパク質をコードする外来遺伝子を含むことが可能である。（例えばACPからの脂肪酸の切断、アシルＣｏＡのアルデヒドまたはアルコールへの還元またはアルデヒドのアルカンへの転換）。酵素の特異性は、各種実施形態において、8から34の炭素原子に、好ましくは8から18の炭素原子まで、そしてより好ましくは10から14の炭素原子を有する基質であることが可能である。最も好適な特異性は、12の炭素原子を有する基質である。他の実施形態において、特異性は、20〜30の炭素原子間であることが可能である。
【０２６０】
微生物に用いるのに適している脂肪酸アシルACPチオエステラーゼおよび本発明の方法としては、表5にリストされるものが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０２６１】
（表5）脂肪族アシル-ACPチオエステラーゼおよびジェンバンク登録番号。
ウンベルラリア・カリフォルニカ（Umbellularia californica）脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ（ジェンバンク#AAC49001）
キナモムム・キャンフォラ（Cinnamomum camphora）-ACPチオエステラーゼ（ジェンバンク#Q39473）
ウンベルラリア・カリフォルニカ（Umbellularia californica）脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ（ジェンバンク#Q41635）
ミリスティカ・フラグランス（Myristica fragrans）脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ（ジェンバンク#AAB71729）
ミリスティカ・フラグランス（Myristica fragrans）脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ（ジェンバンク#AAB71730）
アブラヤシ脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ（ジェンバンク#ABD83939）
アブラヤシ脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ（ジェンバンク#AAD42220）
ポピュラス・トメントサ（Populus tomentosa）脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ（ジェンバンク#ABC47311）
シロイヌナズナ脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ（ジェンバンク#NP_172327）
シロイヌナズナ脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ（ジェンバンク#CAA85387）
シロイヌナズナ脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ（ジェンバンク#CAA85388）
ゴッシピウム・ヒルスツム（Gossypium hirsutum）脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ（ジェンバンク#Q9SQI3）
クフェア・ランセオラタ（Cuphea lanceolata）脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ（ジェンバンク#CAA54060）
クフェア・ホケリアナ（Cuphea hookeriana）脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ（ジェンバンク#AAC72882）
クフェア・カロフィラ・サブSP・メソステモン（Cuphea calophylla subsp.mesostemon）脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ（ジェンバンク#ABB71581）
クフェア・ランセオレイト（Cuphea lanceolata）脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ（ジェンバンク#CAC19933）
アブラヤシ脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ（ジェンバンク#AAL15645）
クフェア・ホケリアナ（Cuphea hookeriana）脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ（ジェンバンク#Q39513）
ゴッシピウム・ヒルスツム（Gossypium hirsutum）脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ（ジェンバンク#AAD01982）
ブドウ脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ（ジェンバンク#CAN81819）
マンゴスチン脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ（ジェンバンク#AAB51525）
カラシナ脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ（ジェンバンク#ABI18986）
マドフカ・ロンギフォリア（Madhuca longifolia）脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ（ジェンバンク#AAX51637）
アブラナ脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ（ジェンバンク#ABH11710）
イネ（インディカ栽培品種-グループ）脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ（ジェンバンク#EAY86877）
イネ（ツバキ栽培品種-グループ）脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ（ジェンバンク#NP_001068400）
イネ（インディカ栽培品種-グループ）脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ（ジェンバンク#EAY99617）
クフェア・ホケリアナ（Cuphea hookeriana）脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ（ジェンバンク#AAC49269）
【０２６２】
本発明の微生物および方法に用いるのに適している脂肪酸アシルCoA/アルデヒド還元酵素は、表6にリストされ挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０２６３】
（表6）
ジェンバンク登録番号によって一覧を示す脂肪酸アシルCoA/アルデヒド還元酵素。
AAC45217, YPJD47869, BAB85476, YP_001086217, YP 580344, YP 001280274, YP_264583, YP_436109, YP_959769, ZP_01736962, ZP 01900335, ZP_01892096, ZP_01103974, ZP_01915077, YP_924106, YPJ30411, ZP 01222731, YP_550815, YP_983712, YP_001019688, YP_524762, YP_856798, ZP Ol 115500, YPJ)Ol 141848, NP_336047, NP_216059, YP_882409, YP_706156, YP_001136150, YP_952365, ZP 01221833, YP 130076, NP_567936, AAR88762, ABK28586, NP_197634, CAD30694, NP_001063962, BAD46254, NP 001030809, EAZ10132, EAZ43639, EAZ07989, NP_001062488, CAB88537, NP_001052541, CAH66597, CAE02214, CAH66590, CAB88538, EAZ39844, AAZ06658, CAA68190, CAA52019, 及び BAC84377
【０２６４】
脂肪酸アシルCoA還元酵素としては、表7にリストされ挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０２６５】
（表7）
ジェンバンク登録番号によって一覧を示す脂肪酸アシルCoA還元酵素。
NP_187805, ABO14927, NP_001049083, CAN83375, NP_191229, EAZ42242, EAZ06453, CAD30696, BAD31814, NP_190040, AAD38039, CAD30692, CAN81280, NP_197642, NP_190041, AAL_15288, 及び NP_190042
【０２６６】
本発明の方法の微生物に用いるのに適している脂肪酸アルデヒドデカルボニラーゼは、表8にリストされ挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０２６７】
（表8）
ジェンバンク登録番号によって一覧を示す脂肪酸アルデヒドデカルボニラーゼ。
NP 850932, ABN07985, CAN60676, AAC23640, CAA65199, AAC24373, CAE03390, ABD28319, NP 181306, EAZ31322, CAN63491, EAY94825, EAY86731, CAL55686, XP_001420263, EAZ23849, NP_200588, NP 001063227, CAN83072, AAR90847, 及び AAR97643
【０２６８】
自然に共同発現された脂肪族アシル-ACPチオエステラーゼおよびＡＣＰの組み合わせは、微生物および本発明の方法に用いるのに適している。
【０２６９】
炭化水素修飾酵素の付加的な実施形態は、以下の米国の特許のいずれかに含まれるアミノ酸一次配列または核酸配列によってコードされるものを含む：6,610,527; 6,451,576; 6,429,014; 6,342,380; 6,265,639; 6,194,185; 6,114,160; 6,083,731 ; 6,043,072 ; 5,994,114; 5,891,697; 5,871,988; 6,265,639、そして、更に、ジェンバンク登録番号に説明されている：AAOl 8435;ZP_00513891; Q38710; AAK60613; AAK60610; AAK60611; NP_113747; CAB75874; AAK60612; AAF20201; BAAl 1024; AF205791;及びCAA03710を含む。
【０２７０】
微生物用としての他の適切な酵素および本発明の方法は、表5-8にリストされるタンパク質のうちの1つを有する少なくとも70%のアミノ酸相同性を有し、対応する所望の酵素活性（例えばＡＣＰからの脂肪酸の切断、アシルＣｏＡのアルデヒドまたはアルコールへの還元またはアルデヒドのアルカンへの転換）を呈するものを含む。付加的な実施形態において、酵素活性は上記した配列のうちの1つを有する少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%または少なくとも約99%の相同性を有する配列に存在する。そして、その全ては完全にあたかも記載されるかのように、本願明細書に引用したものとする。
【０２７１】
上で説明されている炭化水素修飾酵素は、微生物（例えば微細藻類、油性の酵母または真菌）または微生物の群によるさまざまな炭化水素の生産に役立つ。それによって、脂肪酸アシルACPチオエステラーゼは脂質合成の間に脂肪酸をアシル担体タンパク質（ACP）から切断する。更なる酵素の処理によって、切断された脂肪酸は、それからアシルＣｏＡ分子を産生するために補酵素と結合される。このアシルＣｏＡは、アルコールを産生する脂肪酸アシルCoA/アルデヒド還元酵素と同様に、アルデヒドを産生する脂肪酸アシルCoA還元酵素の酵素活性のための基質である。上述のように特定される脂肪酸アシルCoA還元酵素の活性によってできるアルデヒドは、アルコールを産生する脂肪酸アルデヒド還元酵素またはアルカンかアルケンを産生する脂肪酸アルデヒドデカルボニラーゼによる更なる酵素活性のための基質である。
【０２７２】
炭化水素修飾酵素は、特定の炭素原子数を含む基質に作用するための特異性を有する。
例えば、脂肪酸アシルACPチオエステラーゼは、12の炭素原子を有する脂肪酸をACPから切断するための特異性を有する場合がある。従って、各種実施形態で、微生物は、基質に含まれる炭素原子数に関して酵素活性（例えばACPからの脂肪酸の切断、アシルＣｏＡのアルデヒドまたはアルコールへの還元またはアルデヒドのアルカンへの転換）に触媒作用を及ぼすための特異性を有するタンパク質をコードする外来遺伝子を含むことが可能である。酵素の特異性は、各種実施形態において、8から34の炭素原子に、好ましくは8から18の炭素原子まで、そして、より好ましくは、10から14の炭素原子までを有する基質である可能性がある。最も好適な特異性は、12の炭素原子を有する基質である。他の実施形態において、特異性は、20〜30の炭素原子である可能性がある。
【０２７３】
ある実施形態では、本願明細書において説明されている方法によって発生する、脂肪酸または対応する一級アルコールにおいて、アルデヒド、アルカンまたはアルケンは、少なくとも約8か、少なくとも約10か、少なくとも約12か、少なくとも約14か、少なくとも約16か、少なくとも約18か、少なくとも約20か、少なくとも約22か、少なくとも約24か、少なくとも約26か、少なくとも約28か、少なくとも約30か、少なくとも約32か、少なくとも約34かより多くの炭素原子を含む。バイオディーゼル、再生できるディーゼルまたはジェット燃料の生産物または工業的応用のための対応する一級アルコール、アルデヒド、アルカンおよびアルケンのための脂肪酸は、少なくとも約8つまたはより多くの炭素原子を含むことが好ましい。ある種の実施形態では、他の対応する炭化水素分子と同様に上記の脂肪酸は、飽和され（炭素-炭素の二重または三重結合がなく）、ひとつの不飽和（1つの二重結合）であり、多数の不飽和（2つ以上の二重結合）であり、線形（環式でない）であり、および/または、それらの構造がほとんど枝分れを有しない。
【０２７４】
外来遺伝子の望ましい組合せを選ぶことによって、一つは微生物によって生成される生成物を調整することができる。そして、それは水性のバイオマスから抽出されてもよい。例えば、微生物は、(i)脂肪酸アシルACPチオエステラーゼをコードしている外来遺伝子、場合によっては、（ii）自然に共同発現されたアシル担体タンパク質またはもしくは脂肪酸アシルACPチオエステラーゼに親和性を有するアシル担体タンパク質（またはその逆）、場合によっては、(iii)脂肪酸アシルCoA/アルデヒド還元酵素または脂肪酸アシルCoA還元酵素をコードしている外来遺伝子、場合によっては、（iv）脂肪酸アルデヒド還元酵素または脂肪酸アルデヒドデカルボニラーゼをコードしている外来遺伝子を含むことができる。
後述するように培養されるときに、微生物は、ACPに結合される脂肪酸を合成し、脂肪酸アシルACPチオエステラーゼはACPから脂肪酸の切断をし、更なる酵素の処理で、脂肪酸アシルCoA分子を産生する。それが存在するときには、脂肪酸アシルCoA/アルデヒド還元酵素は、アシルＣｏＡからアルコールへの還元を触媒する。同様に、あるときに、脂肪酸アシルCoA還元酵素はアシルＣｏＡのアルデヒドへの還元を触媒する。それらの実施形態において、外来の遺伝子でコードされる脂肪酸アシルCoA還元酵素は、アルデヒド生成物を生産するために存在しまたは発現し、第3の外来遺伝子によってコードされる脂肪酸アルデヒド還元酵素は、アルデヒドからアルコールへの還元を触媒する。同様に、あるときに、脂肪酸アルデヒドデカルボニラーゼは、アルデヒドのアルカンまたはアルケンへの転換反応に触媒作用を及ぼす。
【０２７５】
この種の酵素をコードしている遺伝子は、すでに有意な脂質生産高を呈することが知られているクロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）のような細胞から得ることができる。すでに、脂質生産で役割を有することが既に知られている遺伝子（例えば二重結合を飽和させる酵素をコードしている遺伝子）は、個々に受容細胞に形質転換することができる。しかしながら、本発明を実施するために、遺伝子が必要であるという演繹的な仮定をすべきではない。例えば良好な脂質を生産する生物由来の相補ＤＮＡのような異なる遺伝子を含んでいるDNAのライブラリは、受容細胞に形質転換することができる。相補ＤＮＡは、微細藻類において活性プロモーターとの作動可能な連結をすることが好ましい。異なる微細藻類の受容細胞は、ライブラリから異なる遺伝子を受けることによって形質転換される。脂質生産性を改善した形質転換体は、例えば、炭化水素の分析ためののHPLC、ガスクロマトグラフィ、マススペクトルのような公知技術のスクリーニング法（この種の分析の実施形態のために、Biomass and Bioenergy Vol. 6. No. 4. pp. 269-274 (1994)、Experientia 38; 47-49 (1982)、及び Phytochemistry 65 (2004) 3159-3165を参照する。）によって識別される。これらの形質転換体は、それからオリジナルライブラリによる更なる形質転換を受けておよび/または場合によっては交配して、更なる段階の脂質生産性が改善された生物を生成することができる。例えば、所望の性質を得るために生物まるごとを進化させるための一般の手順は、US 6,716,631に説明されている。この種の方法は、例えば、ＤＮＡフラグメントのライブラリを複数の細胞に導入することを伴う。それによって、断片のうちの少なくとも1つは改変細胞を生産するために遺伝子の部分または細胞のエピソームとの間で遺伝子組換えを受ける。改変細胞は、それから、所望の機能の獲得の方へ進化した改変細胞の有無に関してスクリーニングされる。ベクターおよび形質転換のための方法は、リパーゼ遺伝子の発現と関連して述べられるものに類似している。
【０２７６】
さらにまた、サブトラクティブライブラリは、転写が異なる状況の下で誘導される遺伝子を識別するために用いることができ、特に状況がバイオディーゼル生産のための、または工業的応用のための栄養源として有効な炭化水素の生産のための微生物を培養する際に使用される。サブトラクティブライブラリは、2つの異なるサンプルの違いを反映しているヌクレオチド配列を含む。この種のライブラリは、各々のサンプルからポリヌクレオチド（例えばメッセンジャーＲＮＡ、ｃＤＮＡ、増幅された配列）群をハイブリダイズさせて、変性させる工程を含む手順によって準備される。両方のサンプルに共通の配列はハイブリダイズして、取り除かれ、サンプル間で異なる配列を残す。このように、特定の状況の下で誘発される配列を識別することができる。例えば、この技術は、例えば、いかなる所望の培養条件の下でも脂質（例えば脂肪酸）生産および、特に、脂質生産を増やすことに役立つ遺伝子を識別するために、使用されてもよい。サブトラクティブハイブリダイゼーション技術はまた、本発明に役立つ発現構造、プロモーター（例えば誘導性プロモーター）を識別するために使用されてもよい。
【０２７７】
このように、例えば、サブトラクティブライブラリは、自動栄養性（固定炭素源のない光照射条件）または従属栄養性（暗がりで固定炭素源がある条件）で増殖する微生物培養物から調整することが可能である。特に、従属栄養性の遺伝子は、固定炭素源がある場合には暗闇での増殖の間に誘導することができて、従って、暗闇での従属栄養性の細胞から得られる配列から自動栄養性の細胞から得られる配列を除去してなるライブラリにも存在していることになる。サブトラクティブライブラリは、また、その基質の代謝において役割を果たす遺伝子を識別するために加えられた特定の炭素基質（例えばブドウ糖）を有する培地から調整することができる。制限量に対して過剰な窒素がある条件の増殖培地から調整されるサブトラクティブライブラリは、炭化水素蓄積生産の邪魔をする細胞分割を制御する遺伝子を識別するために用いることが可能である。脂質（例えば脂肪酸）が加えられた培地からサブトラクティブライブラリを調整することは、過剰発現することによって脂肪酸産生を増やす遺伝子を識別する上で役に立つ。より詳しくは、脂肪酸を資化することができる細胞の培地への脂肪酸の添加は、脂肪酸合成遺伝子の負の制御につながり、脂肪酸産生の刺激に対する反応が抑制される。一つ以上のこの種の遺伝子の過剰発現は、逆の効果を有する。
【０２７８】
B.炭素フラックスを増やした脂質経路
いくつかの微細藻類は、大量の非脂質代謝物（例えば多糖）を生じる。多糖類合成は細胞が利用できる全代謝エネルギーの重要な一部を使用することができるので、スクリーニングによって、多糖類生産能を減少または除去され、脂質のより高い収率を生じることができる新しい株を用いる。
【０２７９】
フェノール
フェノール分析法は炭水化物を検出する（Hellebust, Handbook of Phycological Methods, Cambridge University Press, 1978。及び、Cuesta G., et al., J Microbiol Methods. 2003 Jan;52(l): 69-73を参照)。
1,6ジメチル・メチレンブルー分析は、アニオン性多糖を検出する（例えば、Braz J Med Biol Res. 1999 Mayや32(5): 545-50。Clin Chem. 1986 Nov; 32(11): 2073-6を参照) 。
【０２８０】
多糖類は、また、ＨＰＬＣ、分子ふるいクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィのよう手法を通じて分析することができる。（例えば、Prosky L, Asp N, Schweizer TF, DeVries JW & Furda I (1988) Determination of insoluble, soluble and total dietary fiber in food and food products: Interlaboratory study. Journal of the Association of Official Analytical Chemists 71, 1017±1023。Int J Biol Macromol. 2003 Nov;33(l-3): 9- 18を参照)。
多糖類は、また、ゲル電気泳動を使用して検出されてもよい（例えば、Anal Biochem. 2003 Oct 15; 321(2): 174-82; Anal Biochem. 2002 Jan l;300(l): 53-68を参照)。
VI脂質および炭化水素を回収する方法
【０２８１】
いかなる便利な手段にもよって、細胞によって生産される本発明の炭化水素（例えば脂質、脂肪酸、アルデヒド、アルコール類およびアルカン）は、いかなる便利な手段によっても収穫することできるか、収集することができる。例えば、細胞から分泌される炭化水素は、疎水層の炭化水素を水性の層の夾雑物から、必要に応じて遠心分離の後沈殿した固定成分からの沈殿物としてのいかなる固体成分から、遠心分離し切り離すことができる。細胞または細胞分画を含む材料は、遠心分離の前か後に混在タンパク質を分解させるプロテアーゼで処理することができる。いくつかの場合では、混在タンパク質は、おそらく共有結合して、タンパク質の除去に応じて炭化水素を形成する炭化水素または炭化水素前駆体に関連する。他の例において、炭化水素分子は、また、タンパク質を含む準備においてある。
プロテアーゼは、タンパク質を分解させるために、タンパク質を含んでいる炭化水素標品に加えられることができる（例えば、ストレプトマイセス・グリセウスからのプロテアーゼが、使われてもよい（SigmaAldrichのカタログ番号 P5147））。
分解後、炭化水素は、残余タンパク質、ペプチド断片およびアミノ酸から精製されることが好ましい。この精製は、例えば、上述するような遠心分および濾過のような方法によって達成されてもよい。
【０２８２】
細胞外の炭化水素はまた、細胞の露光によってバイオリアクターに戻され、無菌環境で、非毒性抽出溶剤によって、抽出溶剤と炭化水素の疎水性の分画と生きた細胞の分離に続いて、生きた微細藻類細胞の生物内から抽出される。そして、分離された生細胞はそれからステンレス発酵槽またはフォトバイオリアクターのような培養容器に戻される（Biotechnol Bioeng. 2004 Dec 5;88(5): 593-600 及び Biotechnol Bioeng. 2004 Mar 5;85(5): 475-81を参照する)。
【０２８３】
炭化水素は、また、全部の細胞抽出によって分離されてもよい。
「細胞を溶解させる」という章の題名にて説明したように、細胞は最初に崩壊する、そうすると、細胞外の炭化水素と同様に細胞内及び細胞膜/細胞壁に結合される炭化水素は、上述したような遠心分離を用いて細胞量の全体から集めることができる。
【０２８４】
さまざまな方法は、炭化水素および脂質を上記方法によってできる細胞溶菌液から切り離すことに利用できる。例えば、炭化水素はヘキサンのような疎水溶媒によって抽出されてもよい（Frenz et al. 1989, Enzyme Microb. Technol., 11 : 717を参照)。
炭化水素はまた、液化（Sawayama et al. 1999, Biomass and Bioenergy 17:33-39 and Inoue et al. 1993, Biomass Bioenergy 6(4): 269-274を参照)、油化（例えば、Minowa et al. 1995, Fuel 74(12): 1735-1738を参照)、及び、超臨界CO2抽出（例えば、Mendes et al. 2003, Inorganica Chimica Acta 356:328-334を参照）を使用して抽出されてもよい。
【０２８５】
クロレラ・プロトテオコイデス（Chlorella prototheocoides）の培地から微細藻類脂質の回収のMiao and Wu が述べるプロトコルは、細胞が遠心によって収集されて、蒸留水によって洗われて、凍結乾燥によって乾燥したと解説する。結果として生じる細胞粉は、微粉状にされて、n-ヘキサンによって抽出された。（Miao and Wu, Biosource Technology (2006) 97:841-846を参照）。
A.細胞を溶解される
【０２８６】
微生物において生じられる細胞内の脂質および炭化水素は、若干の実施形態において、微生物の細胞を溶解させた後に抽出される。
一度抽出されると、脂質および/または炭化水素は油、燃料または油脂化学製品を生産するために精製される。
【０２８７】
培養工程の完成の後、微生物は、培地から分離することができる。
場合によっては、分離は、濃縮した沈殿を生成するために、遠心分離によって行われる。
遠心分離は、微生物から細胞内水の有意な量を取り除かなくて、乾燥工程ではない。バイオマスは、それから、培地および破片を取り除くために、洗浄水（例えば脱イオン水）によって洗われることができる。任意に、洗われた微生物菌は、また、細胞破壊の前に乾燥することができる（オーブンで乾燥され、凍結乾燥されて等）。あるいは、発酵が完全なときに、細胞は培地の一部または全てからの分離なしで溶解することができる。例えば、細胞が溶解するときに、細胞が細胞外の液体に1:1より少ないv：vの細胞の比率であることができない。
【０２８８】
脂質および/または炭化水素を含んでいる微生物は、溶菌液を生じるために溶解することができる。本願明細書において詳述されるように、微生物を溶解される工程（または溶菌と称する）は、熱によって誘発された細胞溶解、塩基を加える、浸透圧ショック、溶菌ウイルスへの感染および/または一つ以上の溶解遺伝子の発現を使用して、超音波（機械の細胞溶解）を使用して、プロテアーゼのような酵素およびアミラーゼのような多糖類分解酵素を使用して、酸を加える、を含むいかなる便利な手段にもよって提供されてもよい。細胞溶解は、微生物によって生じた細胞内の分子を放出するために実行される。微生物を溶解させる各々のこれらの方法が、同時にまたは順次、単一の方法としてまたは組合せにおいて用いられることができる。
【０２８９】
細胞破壊の範囲は、顕微鏡分析によって観察されてもよい。本願明細書において説明されている方法の一つ以上を使用して、典型的に70%以上の細胞破損は、観察される。細胞破損は80%以上であることが好ましく、90%以上がより好ましく、および約100%であることがより好ましい。
【０２９０】
具体例において、例えば細胞脂質の露顕および/または抽出または更なる処理のための炭化水素を増やすために、微生物は、増殖の後、溶解する。リパーゼの発現のタイミング（例えば、誘導性プロモーターを経て）または溶菌のタイミングは、脂質および/または炭化水素の収率を最適化するように調整されてもよい。多くの細胞溶解技術は、以下に説明されている。これらの技術が、個々にまたは共に用いられることができる。
1. 熱によって誘発された細胞溶解
【０２９１】
本発明の好ましい実施態様において、微生物を溶解させる工程は、微生物を含んでいる細胞懸濁液の加温を含む。本実施形態において、微生物（または培地から分離される微生物懸濁液）を含んでいる培地は、微生物が（すなわち微生物の壁および膜が）分解または破壊されるまで加熱される。典型的には、適用される温度は、少なくとも５０℃である。例えば、少なくとも３０℃、少なくとも６０℃、少なくとも７０℃、少なくとも８０℃、少なくとも９０℃、少なくとも１００℃、少なくとも１１０℃、少なくとも１２０℃で、少なくとも１３０℃またはそれ以上が、効率的な細胞溶解に使用される。
【０２９２】
熱処理によって細胞を溶解させることは、微生物を沸騰させることによって実行されてもよい。あるいは、熱処理（沸騰せずに）は、オートクレーブにおいて実行されてもよい。熱処理溶菌液は、さらに処理のために冷やされてもよい。
【０２９３】
細胞破壊は、また、すなわち、加圧された蒸気の追加による水蒸気処理によって実行されてもよい。細胞破壊のための微細藻類の水蒸気処理は、例えば、米国特許第6,750,048号に説明されている。
2. 塩基を使用している細胞溶解
【０２９４】
他の本発明の好ましい実施形態において、微生物を溶解させる工程は、塩基を、微生物を含んでいる細胞懸濁液に加えることを含む。
【０２９５】
塩基は、少なくとも使用する微生物の一部のタンパク質性の合成物を加水分解するのに十分強くなければならない。タンパク質を可溶化することに役立つ塩基は、化学で従来技術において周知である。本発明の方法に役立つ典型的な塩基は、それについてリチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウムおよび混合物の水酸化物、炭酸塩および重炭酸塩を含むが、これに限定されるものではない。好適な塩基は、KOHである。細胞破壊のための微細藻類の塩基処置は、例えば、米国特許第6,750,048号に説明されている。
3. 酸性の細胞溶解
【０２９６】
他の本発明の好ましい実施形態において、微生物を溶解させる工程は、酸を、微生物を含む細胞懸濁液に加えることを含む。酸性の細胞溶解は、10-500mNまたは好ましくは40-160nMの濃度で酸を使用して遂行されてもよい。酸性の細胞溶解は、上記の室温で好ましくは実行される（例えば、40-160°および好ましくは50-130℃の温度で）。中温（例えば、室温から１００℃及び好ましくは室温から６５度）で、酸処理は音波処理または他の細胞破壊方法と有用に併用されてもよい。
4. 酵素を使用している細胞を溶解させること
【０２９７】
他の本発明の好ましい実施形態において、微生物を溶解させる工程は、酵素を用いて微生物を溶解させることを含む。微生物を溶解させるための好適な酵素は、ヘミセルラーゼ（例えば、黒色麹菌由来のヘミセルラーゼ、シグマアルドリッチ, St. Louis, MO; #H2125）、ペクチナーゼ（例えば、リゾプス（Rhizopusu）属由来のペクチナーゼ、シグマアルドリッチ, St. Louis, MO; #P2401）、マンナウェイ4.0L（ノボザイム）、セルラーゼ（例えばトリコデルマ・ヴィリデ（Trichoderma viride）由来のセルラーゼ、シグマアルドリッチ, St. Louis, MO; #C9422）、ドリセラーゼ（バシディオマイセテ属の種（Basidiomycetes sp.）由来のドリセラーゼ、シグマアルドリッチ, St. Louis, MO; #D9515）のようなプロテアーゼおよび多糖類分解酵素である。
a)セルラーゼ
【０２９８】
本発明の好ましい実施態様において、微生物を溶解させるためのセルラーゼは、多糖類分解酵素であり、場合によってはクロレラまたはクロレラウイルス由来である。
b)プロテアーゼ
【０２９９】
ストレプトマイセスグリセウスプロテアーゼ、キモトリプシン、プロテイナーゼＫ、Degradation of Polylactide by Commercial Proteases, Oda Yet al., Journal of Polymers and the Environment, Volume 8, Number 1, January 2000 , pp. 29-32(4)にリストされるプロテアーゼ、その他のプロテアーゼのようなプロテアーゼは、微生物を溶解させるために用いることができる。
使われてもよい他のプロテアーゼは、アルカラーゼ2.4 FG（ノボザイム）及びフラボウルザイム 100L（ノボザイム）を含む。
c)組み合わせ
【０３００】
プロテアーゼおよび多糖類分解酵素の組合せが、また、使われることができ、前述のプロテアーゼおよび多糖類分解酵素のいかなる組合せも含む。
5. 超音波を使用している細胞を溶解工程
【０３０１】
他の本発明の好ましい実施形態において、微生物を溶解させる工程は、超音波（すなわち音波処理）を用いて実行される。このように、細胞は、高周波音波によって溶解することができる。音波は、電気的に生じることができて、適切に濃縮細胞懸濁剤に、金属的先端によって伝達されてもよい。この音波処理（または超音波処理）は、細胞懸濁液の空洞の作成に基づいて、細胞完全性を崩壊させる。
6. 機械細胞溶解
【０３０２】
他の本発明の好ましい実施形態において、微生物を溶解させるステップは、機械的な細胞溶解によって実行される。細胞は、機械的に溶解することができて、炭化水素（例えば脂質）収集を容易にするために、任意に均質にされてもよい。たとえば、圧力分裂させるものには、制限オリフィス弁を通ってスラリーを含むポンプに使用することができる。高圧（最高1500バー）は適用され、出ているノズルによる即時の展開が続く。細胞破壊は、3つの異なる機構によって達成される。弁上の衝突、開口部の高い液剪断および放出に応じて落ちる突然の圧力は、細胞の爆発を引き起こす。方法は、細胞内の分子を放出する。
【０３０３】
あるいは、ボールミルが、使われてもよい。ボールミルにおいて、細胞は、小さい研磨粒子（例えばビード）を有する中止において煽動される。細胞は剪断力を原因として生じるので壊れ、ビードおよびビードとの衝突の間で挽く。ビードは、細胞内容を放出するために、細胞を崩壊させる。例えば、細胞を崩壊させるために、弱い細胞壁の場合にはブレンディング（例えば実施形態としての高速またはワーリングブレンダによって）、フレンチプレスまたは遠心さえ用いて、細胞は、また、剪断力によって崩壊することができる。
7. 浸透圧ショック（細胞崩壊）によって細胞を溶解させること
【０３０４】
他の本発明の好ましい実施形態において、微生物を溶解させる工程は、浸透圧ショックを適用することによって実行される。
8. 溶菌ウイルスへの感染
【０３０５】
本発明の好ましい実施態様において、微生物を溶解させるステップは、溶菌ウイルスを有する微生物の感染を含む。多種多様なウイルスは本発明ために、適切な微生物を溶解させることは公知である、そして、選択および特定の微生物のための特定の溶菌ウイルスの使用は従来技術において技術の中にある。
【０３０６】
例えば、パラメシウム・ブルサリア（Paramecium bursaria）クロレラウイルス（PBCV-I）は、原型のグループ（フィコドナヴィリダエ（Phycodnaviridae）のファミリーであるクロロウイルス属）であり、正二十面体であり、プラーク形成、真核生物クロレラのような緑藻類のような特定の単細胞の中で繁殖して、溶解する二本鎖ＤＮＡウイルスである。
したがって、感受性の微細藻類も、培地を適切なクロレラウイルスで感染することによって溶解することができる。クロレラの種をクロレラウイルスに感染させる方法は、公知である。例えば、Adv. Virus Res. 2006;66:293-336、 Virology, 1999 Apr 25;257(l): 15-23、Virology, 2004 Jan 5;318(l): 214-23、Nucleic Acids Symp. Ser. 2000;(44): 161-2、J Virol. 2006 Mar;80(5): 2437-44、及び Annu. Rev. Microbiol. 1999;53:447- 94  を参照。
9. 自己消化（溶解遺伝子の表現度）
【０３０７】
他の本発明の好ましい実施形態において、微生物を溶解させる工程は、自己消化を含む。
本実施形態において、本発明による微生物は、微生物を溶解させる溶解タンパク質を生産するために遺伝子工学による。この溶解遺伝子は、細胞が発酵槽の望ましい密度に最初に増殖することができるために、誘導性プロモーターを使用して発現することができる。そして、細胞を溶解させるために溶解遺伝子を発現するためにプロモーターの誘導が続く。
実施形態において、溶解遺伝子は、多糖類分解酵素をコードする。
【０３０８】
特定の他の実施形態において、溶解遺伝子は、溶菌ウイルスからの遺伝子である。このように、例えば、クロレラウイルスからの溶解遺伝子は、クロレラ属（例えばC.プロテコイデス（C. protothecoides））の藻類の細胞において発現されてもよい。
【０３０９】
適切な発現方法は、リパーゼ遺伝子の発現に関して、本願明細書において説明されている。溶解遺伝子の発現は、例えば小分子、光、熱および他の刺激の存在のような刺激によって誘導される、微細藻類において活性を有するプロモーターである誘導性プロモーターを使用されることが、好ましい。
クロレラウイルスからの溶解遺伝子は、公知である。例えば、Virology 260, 308-315 (1999)、FEMS Microbiology Letters 180 (1999) 45- 53、Virology 263, 376-387 (1999)、及び Virology 230, 361-368 (1997)を参照。
B.脂質および炭化水素の抽出
【０３１０】
本発明の微生物によって発生する脂質および炭化水素は、有機溶媒を有する抽出によって回収されてもよい。場合によっては、好適な有機溶媒は、ヘキサンである。典型的には、有機溶媒は、溶菌の要素の従来の分離を除いて、溶菌液に直接加えられる。実施形態において、上述されている一つ以上の方法によって発生する溶菌液は、脂質および/または炭化水素成分が溶液を有機溶媒により形成することができるのに十分な期間の間の有機溶媒によって接触する。場合によっては、溶液は、それから、特定の所望の脂質または炭化水素成分を回復するために、更に精密でありえる。ヘキサン抽出方法は、公知技術である。
VII 脂質および炭化水素処理の方法
A.酵素の変更態様
【０３１１】
本願明細書において記載された細胞によって生産される炭化水素（例えば脂質、脂肪酸、アルデヒド、アルコール類およびアルカン）は、上記の通りリパーゼを含む、一つ以上の酵素を使うことによって修飾されてもよい。炭化水素が細胞の細胞外の環境においてあるときに、一つ以上の酵素は酵素が炭化水素を修正するかまたは炭化水素前駆体からその合成を完了する状況の下にその環境に加えられることができる。あるいは、炭化水素は、あるいは、完全に、一つ以上の触媒（例えば酵素）の追加の前に、細胞形質成分から部分的に分離されてもよい。この種の触媒は外来的に加えられる、そして、それらの活性は細胞の外側でまたは生物外で起こる。
B.温熱性および他の触媒の変更態様
【０３１２】
本願明細書において記載されるように、生物内で細胞によって、または生物外で修飾される酵素処理で、生産される炭化水素は、さらに従来の手段によって任意に処理されてもよい。工程は、炭化水素の、サイズを減らすために「割れ」を、及びこのように水素：炭素比率を増やすことができる。触媒および熱分解方法が、炭化水素およびトリグリセリド油処理において通常用いられる。触媒法は、例えば固体酸触媒触媒を使う能力を含む。
触媒は、違方性のまたは非対称の結果としてなるシリカアルミナまたはゼオライト、あるいは、カルボカチオンおよび水素化物アニオンに結果としてなる炭素-炭素結合の破損であることができる。これらの反応中間体は、他の炭化水素で、水素移転か転移を起こす。この反応は、このように、自殖性連鎖機構に結果としてなるために、中間体を再生させることができる。炭化水素は、また、任意にはゼロまで、その中の炭素間の二重結合または三重結合の数を減らすために処理されてもよい。炭化水素は、また、リングまたは環状構造をその中で取り除くかまたは除去するために処理されてもよい。炭化水素は、また、水素：炭素比率を増やすために処理されてもよい。これは、水素（「水素化」）の追加および/または炭化水素の「割れ」によるより小さい炭化水素すること、を含むことができる。
【０３１３】
熱的方法は、炭化水素サイズを減らすために、高い温度および圧力を使う能力を含む。約800℃の高い温度および約700kPaの圧力が、使われてもよい。これらの条件は「軽い」を生成する、用語は、水素の豊富な炭化水素分子を意味するように用いられ（光子流動を区別される）、また、相対的に水素の枯渇した重い炭化水素分子を濃縮することによって生産される。方法論は、等方性の、又は対照的な破損を提供して、アルケンを生じる。そして、それは任意に、上記の通りに飽和する酵素処理でであってもよい。
【０３１４】
触媒及び熱処理方法は、炭化水素処理および石油精製のための植物において標準的に用いられるである。このように、本願明細書において記載される、細胞による炭化水素の生産は、集められることができて、処理されてもよいかまたは従来の手段を経て精製されてもよい。炭化水素を生産する微生物の水素化分解での報告のために、Hillen et al. (Biotechnology and Bioengineering, Vol. XXIV: 193-205 (1982))を参照する。
他の実施形態では、分画は、例えば有機化合物、熱および/または無機化合物のような他の触媒を有する無機化合物である。バイオディーゼルへの脂質の処理のために、エステル転移反応プロセスが、本願明細書において第IV節にて説明したように、用いられる。
【０３１５】
本発明の方法を経て生じる炭化水素は、種々の工業的応用に役立つ。例えば、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩（LAS）、ほとんど全ての種類の洗剤および清掃準備において使用するアニオン界面活性剤の生産は、通常、10-14の炭素原子鎖から成っている炭化水素を利用する。例えば、米国特許番号：6,946,430、5,506,201、6,692,730、6,268,517、6,020,509、6,140,302、5,080,848及び5,567,359を参照する。例えばLASのような界面活性剤は、例えば米国特許に説明されている 5,942,479、6,086,903、5,833,999、6,468,955、及び、6,407,044のような個人介護製品および洗剤において使われてもよい。
VIII ディーゼル車およびジェットエンジンでの使用に適した燃料を生産する方法
【０３１６】
生物由来の炭化水素成分を燃料（例えばバイオディーゼル、再生可能なディーゼルおよびジェット燃料）に使用することに関心が高まっている。なぜなら、化石由来の出発材料を代替しうる再生可能な生物的な出発物質が入手可能であり、その利用が望まれているからである。炭化水素成分を生物物質から作り出す方法は、緊急に必要である。本発明は、本願明細書に記載された方法によって生産された脂質（バイオディーゼル、再生可能なディーゼル、ジェット燃料を生産するための生物材料）を使用してバイオディーゼル、再生可能なディーゼルおよびジェット燃料を生産する方法を提供することによって、このニーズを満たす。
【０３１７】
従来のディーゼル燃料は、パラフィン系炭化水素が豊富な石油蒸留物である。これは、370°から780°Fという広い沸点範囲を有しており、圧縮点火エンジン（例えばディーゼルエンジン車両）の燃焼に適している。米国材料試験協会（ASTM）は、沸点範囲と、他の燃料特性（例えばセタン価、曇り点、発火点、粘性、アニリン点、硫黄含有量、含水量、強熱残分、銅片腐食および残留炭素）の許容範囲に従ってディーゼルの等級を決める。技術的には、バイオマス又は適切なASTM仕様を規格に適うものに由来するいかなる炭化水素蒸留物材料も、ディーゼル燃料（ASTM D975）、ジェット燃料（ASTM Dl 655）またはバイオディーゼル（ASTM D6751）として定義されてもよい。
【０３１８】
抽出の後、本願明細書において説明されている微生物バイオマスから回収される脂質および/または炭化水素成分に対して、ディーゼル車およびジェットエンジン用の燃料を製造するために、化学処理を行うことができる。
A.バイオディーゼル
【０３１９】
バイオディーゼルは、生産原料に依存して（金色から濃い茶色の間で）色が変化する液体である。それは、実質的に水と混ざらず、高い沸点および低い蒸気圧を有する。バイオディーゼルは、ディーゼルエンジン車両用の、ディーゼルに等価なプロセス燃料を指す。
バイオディーゼルは、生物分解可能であり、毒性がない。従来のディーゼル燃料を超える、バイオディーゼルの付加的な利点は、低いエンジン摩耗性である。
【０３２０】
一般に、バイオディーゼルは、C14-C18アルキルエステルを包含する。様々なプロセスにより、本願明細書に記載のように生産及び単離されたバイオマスまたは脂質がディーゼル燃料に変化する。バイオディーゼルを生産する好ましい方法は、本願明細書において説明されている、脂質のエステル交換反応によるものである。バイオディーゼルとして使用するための好ましいアルキルエステルは、メチルエステル又はエチルエステルである。
【０３２１】
本願明細書に記載される方法によって生産されるバイオディーゼルは、大部分のディーゼルエンジン車において、単独で又は任意の濃度で従来のディーゼル燃料と混合して使用可能である。従来のディーゼル燃料（石油ディーゼル）との混合時には、バイオディーゼルは、約0.1%から約99.9%存在してもよい。世界の多くは、任意の燃料混合物でのバイオディーゼルの量を述べるために「B」因子として知られている体系を用いる。例えば、20%のバイオディーゼルを含む燃料は、B20とラベルがついている。純粋なバイオディーゼルは、B100と呼ばれる。
【０３２２】
バイオディーゼルは、家庭用及び商業用のボイラーの暖房用燃料としても使用可能である。既存のオイルボイラーは、ゴム部品を含む場合があり、バイオディーゼルで動作させるには改造が必要である場合がある。改造プロセスは、通常は比較的簡単である（バイオディーゼルが強溶剤であるので、ゴム部品を合成部品に交換することを含む）。その強い溶解力のために、バイオディーゼルの燃焼によってボイラーの効率が増す。
【０３２３】
バイオディーゼルは、純粋な超低硫黄ディーゼル（ULSD）燃料の潤滑性を増やすために、ディーゼルの調製の添加物として使用可能であり、このことは、バイオディーゼルが実質的に硫黄含有量を有しないので都合が良い。
【０３２４】
バイオディーゼルは、石油ディーゼルより良好な溶媒であって、以前に石油ディーゼルで動いた車両の燃料ラインの残留堆積物を分解するために使用可能である。
1. バイオディーゼルの生産
【０３２５】
バイオディーゼルは、油分が多いバイオマスに含まれるトリグリセリドのエステル交換反応によって生産可能である。このように、本発明の別の観点では、バイオディーゼルの生産方法が提供される。好ましい実施形態において、バイオディーゼルの生産方法は、(a)本願明細書で開示する方法を用いて脂質含有微生物を培養する工程と、(b)脂質を含む微生物を溶解し溶菌液を生産する工程と、(c)溶解した微生物から脂質を単離する工程、及び(d)脂質組成をエステル交換反応させることによってバイオディーゼルを生産する方法、を包含する。
【０３２６】
微生物を増殖させ、微生物を溶解させて溶菌液を生じさせ、有機溶媒を含む培地中で溶菌液を処理して有機異種混合物を形成し、処理した溶菌液を脂質組成に分離方法は、上述した通りであり、バイオディーゼルの生産方法としても利用可能である。。
【０３２７】
脂質組成に対してエステル交換反応を施して、バイオディーゼルとして利用可能な長鎖脂肪酸エステルを生産可能である。好ましいエステル交換反応は、後で概説するが、塩基よ触媒エステル交換反応、及び組換リパーゼを使用するエステル交換反応を含む。
【０３２８】
塩基触媒エステル交換反応プロセスにおいて、トリアシルグリセリドは、アルカリ触媒（一般的には水酸化カリウム）の存在下で、アルコール（例えばメタノールまたはエチルアルコール）と反応する。この反応は、メチルまたはエチルエステルと、副産物としてグリセリンを生成する。
a).一般的な化学プロセス
【０３２９】
動物および植物油は、典型的に、三価アルコール（グリセリン）を有する遊離脂肪酸のエステルであるトリグリセリドでできている。エステル交換反応において、トリアシルグリセリド（TAG）のグリセリンは、短鎖アルコール（例えばメタノールまたはエチルアルコール）と交換される。典型的な反応式は、以下の通りである。
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【０３３０】
この式において、アルコールが塩基によって脱プロトン化されて、より強い求核基となる。一般に、エチルアルコールまたはメタノールが、大過剰（最高50倍）で使われる。通常は、この反応は、非常にゆっくり進行するか、全く進行しない。反応速度を高めるために、酸または塩基と共に、熱が使用可能である。酸または塩基はエステル交換反応によって消費されない。従って、これらは反応物質ではなく触媒である。ほとんど全てのバイオディーゼルは、塩基触媒技術を用いて生産されてきた。なぜなら、この技術には、低い温度と圧力のみが必要であり、転換率が９８％以上になるからである（但し、出発オイルの水分及び遊離脂肪酸が低い場合である。）
b)組換リパーゼの使用
【０３３１】
エステル交換反応は、塩基の代わりに酵素（例えばリパーゼ）を使用して、実験的に実行されてきた。リパーゼに触媒されるエステル交換反応は、例えば、室温から80℃の間の温度、低級アルコールに対するTAGのモル比が1：1以上、より好ましくは3:1で、実行可能である。
【０３３２】
エステル交換反応に適したリパーゼは、表9にリストされるものを含むが、これらに限定されるものではない。エステル交換反応に役立つリパーゼの他の例は、例えば米国特許第4,798,793号、4,940,845号、5,156,963号、5,342,768号、5,776,741号およびWO89/01032号で、見出される。
【０３３３】
(表9)
エステル交換反応に適したリパーゼ。
黒色麹菌リパーゼABG73614、カンジダ・アンタルクチカ（Candida antarctica）リパーゼB（novozym-435）CAA83122、カンジダ・サイリンドゥラセア（Candida cylindracea）リパーゼAAR24090、カンジタ・リポリティカ（Candida lipolytica）リパーゼ（リパーゼL、天野製薬(株)）、カンジダ・ルゴサ（Candida rugosa）リパーゼ（例えば、リパーゼ-OF、名糖産業）、ムカー・ミエヘイ（Mucor miehei）リパーゼ（リポ酵母IM 20）、蛍光菌リパーゼAAA25882、A-IOFGリパーゼ（Lilipase A-IOFG）Q7M4U7_1、リゾムカー・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）リパーゼB34959、リゾープス・オリザエ（Rhizopus oryzae）リパーゼ（リパーゼF）AAF32408、セラチア・マルセスセンス  リパーゼ（SM Enzyme）ABI13521、テルモマイセス・ラヌギノーサ（Thermomyces lanuginosa）リパーゼCAB58509、リパーゼ P（ナガセChemteX社）およびリパーゼ QLM（名糖産業（株）、名古屋、日本）
【０３３４】
バイオディーゼルに適している脂肪酸エステルの生産のためのリパーゼを使用することへの１つの問題は、リパーゼの価格が強塩基プロセスによって使用される水酸化ナトリウム（NaOH）の価格よりもはるかに高いということである。
この問題は、固定化リパーゼを用いることによって解決された。固定化リパーゼが再利用可能であるからである。しかしながら、リパーゼベースのプロセスが生産コストに関して強塩基プロセスと競合するために、固定化リパーゼの活性は、最小限のサイクル数の間に再利用された後にまで維持されなければならない。
固定化リパーゼは、エステル交換反応において典型的に使用される低級アルコールによって被毒される。米国特許第6,398,707号（2002年6月4日発行、 Wu et al.）は、固定化リパーゼの活性を高めて、活性が低下した固定化リパーゼを再生させる方法について説明する。
【０３３５】
具体的な実施形態において、組換え型リパーゼは、そのリパーゼが作用する脂質を生産する同じ微生物において発現される。適切な組換え型リパーゼは、上記の表9でリストされているか、および/または上記の表9でリストされたジェンバンク登録番号(GenGank Accession numbers)を有するもの、又は上記の表9でリストされたリパーゼのうちの1つと少なくとも70%のアミノ酸同一性を有し且つリパーゼ活性を有するポリペチドを含む。
付加的な実施形態において、酵素活性は、上記した配列のうちの1つと少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%または少なくとも約99%の同一性を有する配列に存在する。そして、これらの全ては、ここで完全に記述したように、本願明細書に参照取り込みされる。
このリパーゼと選択可能なマーカーをコードするDNAは、好ましくは、コドンを最適化したcDNAである。微細藻類で発現のために遺伝子を再コードする方法は、米国特許7,135,290に説明されている。
2. 標準規格
【０３３６】
バイオディーゼルのための一般の国際規格は、EN 14214である。ASTM D6751は、米国およびカナダにおいて参照される最も一般的なバイオディーゼルの標準規格である。ドイツではDIN EN14214を使用し、英国ではBS EN14214を法令順守することを必要とする。
【０３３７】
製品がこれらの標準に合致するかどうか決定する基本的工業試験は、典型的には、ガスクロマトグラフィ、HPLCなどを含む。品質規格を満たしているバイオディーゼルは、非常に非毒性であり、毒性評価（50％致死量, LD50）が50mL/kgを超える。
B.再生可能なディーゼル
【０３３８】
再生可能なディーゼルは、アルカン（例えばC16：0およびC18：0）を含み、バイオディーゼルとは識別可能である。高品質で再生可能なディーゼルは、ASTM D975標準に合致する。
【０３３９】
本発明の方法によって生産される脂質は、再生可能なディーゼルを生産するためための原料となりうる。このように、本発明の別の観点では、再生可能なディーゼルの生産方法が提供される。再生可能なディーゼルは、少なくとも3つのプロセス（熱水処理、水素化処理、間接液化）によって生産可能である。である。これらの方法は、非エステル蒸留物を産生する。これらのプロセスの間に、本願明細書において説明されているように生産及び分離されるトリアシルグリセリドは、アルカンに変わる。
【０３４０】
好ましい実施形態において、再生可能なディーゼルの生産方法は、(a)本願明細書で開示される方法を使用して脂質を含む微生物を培養し、(b)微生物を溶解して溶菌液を製造し、(c)溶解された微生物から脂質を単離し、及び(d)脂質を脱酸化または水素処理してアルカンを生産して、再生可能なディーゼルを生産することを含む。
再生可能なディーゼルを製造するのに適した脂質は、有機溶媒（例えばヘキサン）を使用して微生物バイオマスから抽出するか、又は他の方法（例えば米国特許5,928,696に説明されているもの）によって入手可能である。
【０３４１】
いくつかの方法において、微生物脂質は、炭素鎖長を減らして、それぞれ、二重結合を飽和させるために、水素処理法と連動して最初に分解される。水素処理法と連動しても、材料はそれから異性化される。ネプタ分画はそれから蒸留によって取り除かれることができる。そして、標準規格のD 975を満たすために要求されるより重い成分である間は、D975標準を満たすためにディーゼル燃料において要求される構成要素を蒸発させて、蒸留するために付加的な蒸留が続く。水素処理法、水素化分解、脱酸素および化学的に油を修正する異性化方法は、トリグリセリド油を含んで、公知技術である。
例えば、欧州特許出願EP1741768 (A1)、 EP1741767 (A1)、 EP1682466 (A1)、 EP1640437 (A1)、 EP1681337 (A1)、 EP1795576 (A1)、そして、アメリカ特許7,238,277、 6,630,066、 6,596,155、 6,977,322、 7,041,866、 6,217,746、 5,885,440;、6,881,873を参照する
1. 水素処理法
【０３４２】
再生できるディーゼルを生産する方法の好ましい実施形態においては、アルカンを生じるために脂質を処理することは、脂質組成の水素処理法によって実行される。水熱処理において、典型的には、バイオマスは、油および残余固体を形成するために、高い温度および圧力で水において反応を起こす。転換温度は、100〜170の標準大気（気圧）の溶液として液体を維持するのに十分な圧力で、一般に300°Fから660°Fである。反応時間は、15〜30分のオーダーにある。反応が完了されたあと、有機物は水から切り離される。このことにより、ディーゼルに適している蒸留物が生産される。
2. ハイドロ処理
【０３４３】
再生可能なディーゼルは、「グリーンディーゼル」と称され、従来のハイドロ処理技術によって脂肪酸から生じることができる。トリグリセライドを含有する油は、石油を有する共同供給としてまたは専用の供給としてハイドロ処理されていることがありえる。製品は、ASTM D975仕様に合致するディーゼル燃料である。このように、再生できるディーゼルを生産する方法の他の好ましい実施形態では、アルカンを生じるために脂質組成を処理することは、脂質組成のハイドロ処理によって実行される。
【０３４４】
再生できるディーゼルを製造するいくつかの方法において、トリグリセライドを処理する第一段階は二重結合を飽和させるハイドロ処理である。そして、水素および触媒がある場合には、高い温度で脱酸素が続く。
いくつかの方法において、水素化および脱酸素は、同じ反応で起こる。他の方法において、脱酸素は、水素化の前に起こる。水素および触媒もある場合には、異性化は、それから任意に実行される。ナフサ成分は、蒸留によって好ましくは取り出される。
実施形態のために、アメリカ特許5,475,160（トリグリセライドの水素化）、5,091,116（脱酸素、水素化およびガス除去）、6,391,815（水素化）、そして、5,888,947（異性化）を参照する。
【０３４５】
処理によって不純物を除去する石油精製者が使用するハイドロ処理は、水素によって供給される。ハイドロ処理転移温度は、一般的に300°Fから700°Fである。圧力は、一般的に40〜100気圧である。反応時間は、典型的には10〜60分のオーダーにある。
【０３４６】
固体触媒は、特定の反応速度を増やすために使用されて、特定の製品のための選択性を改良して、水素の消費を最適化する。
【０３４７】
水素処理法およびハイドロ処理は、最終的に供給の分子量の減少につながる。トリグリセライドを含有する油の場合、トリグリセライド分子は、ハイドロ加工条件の下で4つの炭化水素分子にされる。プロパン分子および3つのより重い炭化水素分子は一般的にC8からC18の範囲である。
3. 間接的な融解
【０３４８】
従来の超低硫黄ディーゼルは、二段法によってバイオマスのいかなる形からも生じることができる。第一に、バイオマスは、水素および一酸化炭素が豊富な気体混合物のような合成ガスに変わる。それから、合成ガスは、液体に触媒的に変わる。代表例として、液体の生産は、フィッシャー-トロプシュ（FT）合成を使用して達成される。この技術は、石炭、天然ガスおよび重質油にあてはまる。このように、更新できるディーゼルを生産する方法のさらにもう一つの好ましい実施形態で、アルカンを生じるために脂質組成を処理することは、脂質組成の間接的な融解によって実行される。
C.ジェット燃料
【０３４９】
2006年のジェット燃料の一年のアメリカ使用は、約210億ガロン（約800億リットル）であった。飛行機燃料は、淡黄色から透明である。最も一般の燃料はAeroplane AIとして分類される無鉛/パラフィン油を主成分とする燃料であり、国際的標準規格である。飛行機燃料は、おそらく1000以上の多数の異なる炭化水素の混合物である。それらのサイズ（分子量または炭素数）の範囲は、例えば氷点または煙点のような製品の必要条件によって制限される。Kerosoneタイプ飛行機燃料（ジェットAおよびジェットAIを含む）は、約8から16の炭素数の炭素数分布を有する。広い切断またはナプタタイプ飛行機燃料（ジェットBを含む）は、典型的には約5から15の炭素数の炭素分布を有する。
【０３５０】
両方の飛行機（ジェットAおよびジェットB）は、多くの添加物を含むことができる。
役立つ添加物は、抗酸化剤、静電防止剤、腐食抑制剤および燃料系統糖衣インヒビター（FSII）剤を含むが、これに限定されるものではない。抗酸化剤は、ゴム状になるのを妨げて、通常、例えばAO30、AO31またはAO37のようなアルキル化フェノールに基づく。
静電防止剤は、静電気を消して、スパークするのを妨げる。活性成分としてのジノニルナフタレンスルホン酸（DINNSA）を有するStadis 450が例として挙げられる。例えば、腐食抑制剤、DCI-4Aが一般人で軍の燃料のために使われる、そして、DCI-6Aが軍の燃料のために使われる。FSII剤は、例えば、Di-EGMEを含む。
【０３５１】
溶液は、藻類燃料と既存のジェット燃料を混ぜ合わせている。本発明は、この種の溶液を提供する。本発明の方法によってできる脂質は、ジェット燃料を生じるために、栄養源として役立つことができる。このように、本発明の別の態様で、ジェット燃料を生産のための方法が提供される。これと共に、本発明の方法によってできる脂質からの生成ジェット燃料のための流動接触分解（FCC）及び流動接触分解（FCC）という2つの方法が提供される。
1. 流動接触分解
【０３５２】
流動接触分解（FCC）は、特に重い天然断片からのプロピレンのようなオレフィンを生じるために用いる1つの方法である。報告が、カノーラ油のような植物油がガソリン燃料として有効な炭化水素流を与えるためにFCCを使用して処理されることができた文献にある。
【０３５３】
本発明の方法によってできる脂質は、オレフィンに変わることができる。工程は、FCCゾーンを通じて生産される脂質を流す工程及びジェット燃料として有用なオレフィンを含む生成物の流れを集める工程を含む。生産される脂質は、分解触媒と接触し、ジェット燃料に役立つオレフィンと炭化水素を含む生成物流を提供する分解状態となる。
【０３５４】
好ましい実施形態において、ジェット燃料を生成するのための方法は、(a)本願明細書で説明される方法で使用する脂質を含む微生物の培養工程、(b)溶解液を生産するために脂質を含む微生物を溶解する工程、(c)溶解液から脂質を単離する工程、及び(d)脂質成分を処理する工程を含む、生産されるジェット燃料。
【０３５５】
ジェット燃料を生じる方法の好ましい実施形態において、脂質組成は流動接触分解ゾーンによって流されてもよい。そして、それは、実施形態において、C2-C5オレフィンから成る生成物流を提供するために、脂質組成をクッラキング触媒に接触させることで分解状態にすること、を含めることができる。
【０３５６】
この方法の特定の実施形態において、脂質組成に存在してもよいいかなる夾雑物も除去することが望ましい。このように、流動接触分解ゾーンによる脂質組成を流す前に、脂質組成は、前もって処理される。前処理は、イオン交換樹脂を有する脂質組成を接触させることを含むことができる。イオン交換樹脂は、例えばアンバーリスト（Amberlyst）（R）-15のような酸性のイオン交換樹脂であることができる、脂質組成がアップフローまたはダウンフローで流されるリアクターの土台として、用いられることができる。
他の前処理は、例えば硫黄であるか、酢であるか、窒素であるか、塩化水素酸のような酸を有する脂質組成を接触させることによって、軽度の酸洗浄剤を含むことができる。
接触させることは、外界温度および大気圧で通常希釈した酸性溶液によってなされる。
【０３５７】
脂質組成は、任意には前もって処理され、炭化水素の成分にオレフィンに分解されるFCCゾーンに流される。接触分解は、微細に分かれた分散粒子から成る触媒を有する反応帯の脂質組成を接触させることによって達成される。反応は、水素化分解に対して接触分解であって、添加水素または水素の消費がない場合に実行される。分解反応が進行するにつれて、コークスの相当量は触媒に置かれる。触媒は、再生帯の触媒から、燃えるコークスによって高温で再生する。本明細書において、「コークスにされた触媒」と称される、コークスを含有する触媒は、絶えず反応域から再生する再生帯まで輸送されて、再生帯から基本的にコークスのない再生する触媒と交換される。さまざまなガス状の流れによる触媒粒子の流動は、反応帯および再生帯間の触媒の輸送を可能にする。触媒の流動化された流れの、例えば本願明細書において説明されている脂質組成物のような炭化水素を分解して、反応および再生帯間の触媒を輸送して、再生器のコークスを燃焼させる方法は、FCCプロセスの当業者によって周知である。C2-C5オレフィンを生じるために脂質組成を分解することに役立つ典型的なFCCアプリケーションおよび触媒は米国特許番号6,538,169、7,288,685に説明されている。そして、それは参照によってそれらの全部に取り入れられる。
【０３５８】
実施形態において、FCC帯の中で、本発明の脂質組成を分解することは、ライザセクションあるいは、リフトセクションにおいて起こる。脂質組成物は、脂質組成の急速な蒸発に結果としてなっているノズルによって、ライザーにもたらされる。触媒を接触させる前に、脂質組成は、通常約149℃〜約316℃（300°F〜600°F）の温度におかれる。触媒は、それがおいて、ブレンディング容器から脂質組成物と2秒またはそれ以下の時間接触するライザーに流される。
【０３５９】
混合された触媒および反応された脂質組成蒸気は、それから放出口によるライザーの最上部から排出されて、オレフィンを含んでいる分解油蒸気流および相当量のコークスでおおわれている一まとまりの触媒粒子に、そして、「コークスにされた触媒」と一般に呼ばれる切り離される。望ましい製品へさらに変換する触媒と脂質組成物の接触時間を最小化し、渦腕装置のような分離器のいかなる配置も、速やかに生成物流からコークスにされた触媒を除去するために用いることができるように努める。分離器（例えば渦腕分離器）は、室の低い部分に位置しているストリッピング・ゾーンを有する室の上部に位置する。渦腕装置によって分離される触媒は、ストリッピング・ゾーンに下に落ちる。軽オレフィンを含む分解された炭化水素から成る分解油蒸気流および若干の触媒は、サイクロンと連絡する導管を経て、室を出る。サイクロンは、分子濃度を極めて低レベルに下げるために、製品蒸気流から残留する触媒粒子を除去する。製品蒸気流は、それから分離容器の上部を出る。
サイクロンによって分離される触媒は、分離容器に戻され、それからストリッピング・ゾーンに戻される。ストリッピング・ゾーンは、蒸気との逆電流接触によって、触媒の表面から、吸着炭化水素を取り除く。
【０３６０】
低い炭化水素分圧は、軽オレフィンの生産を支持するために作動する。したがって、ライザー圧は、約172〜241kPa（25〜35psia）でセットされ、約35〜172kPa（5〜25psia）の炭化水素分圧を有し、約69〜138kPa（10〜20psia）の炭化水素分圧であることが好ましい。希釈液が10〜55重量％の脂質組成および好ましくは約15重量％の脂質組成である程度まで、炭化水素のためのこの比較的低い分圧は希釈液として蒸気を用いて達成される。乾性ガスのような他の希釈液は、等価な炭化水素分圧に至るために用いることができる。
【０３６１】
ライザー放出口の分解流の温度は、約510℃〜621℃（950°F〜1150°F）である。しかしながら、566℃（1050°F）より上のライザー放出口温度は、より多くの乾性ガスおよびより多くのオレフィンを作る。ところが、566℃（1050°F）以下のライザー放出口温度は、より少ないエチレンおよびプロピレンを作る。したがって、FCC工程の作動は、好ましくは約566℃〜約630℃の温度であることが、好ましくは約138kPa〜約240kPa（20〜35psia）の圧力であることが好ましい。工程のための他の条件は、触媒・脂質組成物の比率は、約5〜約20から、そして、好ましくは約10〜約15に変動することができる。
【０３６２】
ジェット燃料を生じる方法のある実施形態において、脂質組成は、FCCリアクターのリフト部分にもたらされる。リフト部の温度は、約100〜約150の触媒・脂質組成物比で、約700℃（1292°F）から約760℃（1400°F）の範囲で熱せられる。脂質組成をリフト部にもたらすことがプロピレンおよびエチレンの相当な量を生じることを予期される。
【０３６３】
生産されるガスおよび液化炭化水素製品は、ガスクロマトグラフィ、HPLC、などによって分析されてもよい。
2. ハイドロ脱酸素
【０３６４】
本願明細書において説明されている、生産される脂質または脂質組成物を使用するジェット燃料を生産されるための方法の他の実施形態において、脂質または脂質組成物の構造は、ハイドロ脱酸素（HDO）と称される工程によって、壊される。
【０３６５】
HDOは水素による酸素の除去を意味する、すなわち、材料の構造をこわすと共に、酸素は除去される。オレフィン二重結合は水素化され、いかなる硫黄および窒素化合物も取り除かれる。硫黄除去は、水素化脱硫（HDS）と呼ばれている。前処理および原材料（脂質組成または脂質）の純度は、触媒の活性期間に関与する。
【０３６６】
通常、HDO/HD工程で水素は、供給原料（脂質組成または脂質）を混ぜ合わせ、単一の相か二相の供給原料として、混合は並流して触媒層に通される。HDO/MDS工程の後、製品分画は、切り離されて、別々の異性化リアクターに渡される。生物学的出発原料のための異性化リアクターは、並流リアクターとして文献（FI 100 248）に説明されている。
【０３６７】
例えば本願明細書の脂質組成または脂質のような炭化水素源を水素化することによって燃料を生産する工程はまた、第1の水素化ゾーンによる水素ガスを有する並流として脂質組成または脂質を通過することによって実行することができ、その後、炭化水素廃水は、第2の水素化領域で、水素ガスを経由してさらに水素化される。
C2-C5オレフィンを生じるために脂質組成を分解することに役立つ典型的なHDOアプリケーションおよび触媒は、米国特許第7,232,935号に記載され、本参照によって完全に組み込まれる。
【０３６８】
代表例として、ハイドロ脱酸素の工程で、例えば本願明細書における脂質組成または脂質のような生物学的部品の構造は分解され、ガスとしての酸素、窒素、リンおよび硫黄化合物並びに軽質炭化水素は取り除かれる、そして、オレフィン結合は水素化される。
方法の第二段階、すなわちいわゆる異性化工程においては、異性化は、炭化水素鎖の枝分れのために実行され、低温でのパラフィンのパフォーマンスを高める。
【０３６９】
第一段階、すなわち分解法のHDO工程において、本願明細書に記載の水素化された脂質または脂質組成物並びに水素ガスは、そして、脂質組成または本願明細書において脂質、水素化されるどのアールが、並流か逆電流フロー、一つ以上の触媒層から成る前記触媒層システム、好ましくは1-3の触媒層としてHDO触媒層システムに通過する。HDOステップは、並流方法で典型的に操作される。HDO触媒層システムの場合には、2枚以上の触媒層を含み、層の一つ以上は、逆電流フロー原理を使用して操作されてもよい。
【０３７０】
HDOステップにおいて、圧力は、20から150バーの間を変化し、好ましくは50から100バーの間であり、及び温度は200および500℃の間を変化し、好ましくは300から400℃の範囲である。
【０３７１】
HDOステップにおいて、周期表のVII族および/またはVIB族から金属を含んでいる周知の水素化触媒を、用いることができる。
好ましくは、水素化触媒はPd、Pt、Ni、NiMoまたはCoMo触媒に支持され、支持はアルミナおよび/または二酸化ケイ素である。
代表例として、NiMo/Al2O3およびCoMo/Al2O3触媒が用いられる。
【０３７２】
HDO工程の前に、本願明細書の脂質組成物または脂質は、任意に、二重結合の副反応を除く工程のように緩やかな条件下で水酸化によって処理することができる。この種の前水素化は、前水素化触媒の存在下で、50から400℃の温度及び1から200バーの水素圧力で、好ましくは150および250℃間の温度及び10および100バーの水素圧力で実行される。触媒は、周期表のVIII族および/またはVIB族の金属を含むことができる。好ましくは、前水素化触媒は、Pd、Pt、Ni、NiMoまたはCoMo触媒に補助され、補助はアルミナおよび/または二酸化ケイ素である。
【０３７３】
HDOステップからのガス状の流れは、冷やされ、一酸化炭素、二酸化炭素、窒素、リンおよび硫黄合成物、ガス状の軽質炭化水素および他の不純物がそこから除去される工程を含む。圧縮した後に、精製された水素または再利用された水素は、回収されたガス流体を補うために、第一触媒層におよび/または製造された触媒層間に戻される。水は、濃縮された液体から取り除かれる。液体は、第一触媒層にまたは触媒層間で通過する。
【０３７４】
HDO工程の後、製品は異性化工程におかれる。炭化水素が異性化触媒に接触する前に、不純物ができるだけ完全に除去される方が、工程のために適切である。異性化工程は、任意の除去工程を含む。除去工程において、HDOステップからの反応生成物は、水蒸気または例えば軽質炭化水素、窒素または水素のような適切なガスによる除去によって純化されてもよい。任意の除去工程は、異性化触媒の上流で装置の逆流方法で実行される。除去工程において、ガスおよび液体は各々によって、または対向流の原理を利用している別々の除去装置の実際の異性化リアクターの前に接触する。
【０３７５】
除去工程の後、水素ガスおよび本願明細書に記載された水素化された脂質組成物又は脂質、任意にはn-パラフィン混合物は、進む、または、本願明細書において脂質および任意にノルマルパラフィン混合は、一つ以上の触媒層を含む異性化反応ユニットに移動される。
異性化工程の触媒層は、並流か逆流方法で作動することができる。
【０３７６】
逆流フロー原理が異性化工程で適用されることは、方法にとって重要である。異性化工程において、これは、逆流方法で任意の除去工程または異性化反応段階か両方とも実行することによってされる。
【０３７７】
異性化工程およびHDO工程は、同じ圧力容器においてまたは別々の圧力容器において実行されてもよい。任意の前水素化は、HDO及び異性化工程と、別々の圧力容器においてまたは同じ圧力容器において実行されてもよい。
【０３７８】
異性化工程において、圧力は20から150バーの範囲で変化し、好ましくは20から100の範囲であり、温度は200から500℃の間であり、好ましくは300から400℃の間である。
【０３７９】
異性化工程において、公知技術の異性化触媒が用いられることができる。適切な異性化触媒は、分子ふるいおよび/またはVIII族の金属および/またはキャリアを含む。好ましくは、異性化触媒は、SAPO-11またはSAPO41またはZSM-22またはZSM-23またはフェリエ沸石及びPt、PdまたはNiおよびAl2O3またはSiO2を含む。典型的な異性化触媒は、例えば、Pt/SAPO-11/Al2O3, Pt/ZSM-22/Al2O3, Pt/ZSM-23/Al2O3及びPt/SAPO-l l/SiO2である。
【０３８０】
製品として、ディーゼル燃料またはそれの構成要素として有効な生物学的起源の高品質炭化水素成分は得られる。そして、前記炭化水素成分では密度、セタン価および低温でのパフォーマンスが優れている。
IX. 微生物工学
【０３８１】
上記の如く、本発明の特定の実施形態で、製造が微生物によって発生するコンポーネントのプロパティまたは比率を修正することは一般的に脂質を強化するために微生物を変更することまたは、種々のフィードストック材料上の新規の増殖要素を改良するかまたは提供することは、より好ましいものである。
クロレラ、特にクロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）、クロレラ・ミヌティッシマ（Chlorella minutissima）、クロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana、クロレラ・エリプソイデア（Chlorella ellipsoidea）、クロレラ属の種（Chlorella sp.）およびクロレラ・エメルソニイ（Chlorella emersonii）は、本願明細書において説明されている遺伝子工学方法に用いられる好適な微生物である。但し、他のクロレラ種が微生物の他の種類と同様に使われてもよい。
【０３８２】
プロモーター、cDNAおよび3'UTRsは、ベクターの他の要素と同様に、自己の起源から分離される断片を使用してクローン技術で生成することができる（例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al. (3d edition, 2001, Cold Spring Harbor Press  及び  アメリカ特許番号 4,683,202  を参照する）。あるいは、要素は周知の方法を使用して、総合的に発生することができる（例えば、Gene. 1995 Oct 16;164(1): 49-53を参照する).
A.発現のためのコドン最適化
【０３８３】
DNAが微生物において発現するポリペチドをコードして、例えば、リパーゼおよび選択マーカーのような微生物で発現するポリペプチドをコードするDNAは、好ましくはコドンを最適化されたcDNAである。微細藻類の発現のための再コード遺伝子の方法は、アメリカ特許7,135,290に説明されている。例えば、ジェンバンクのコドンの選択性データベースで、コドン最適化のための付加的情報を利用できる。限定されない実施形態として、それぞれ、クロレラ・ピレノイドサ（Chlorella pyrenoidosa）、ドナリエラ・サリナ（Dunaliella salina）及びクロレラ・プロトテコイデス（Chlorella protothecoides）は、表10、11および12に示される。
【０３８４】
クロレラ・ピレノイドサ（Chlorella pyrenoidosa）のコドンの選択性。
【表１０】
2010528627.tif 000004
【０３８５】
ドナリエラ・サリナ（Dunaliella salina）の好適なコドンの選択性。
【表１１】
2010528627.tif 000005
【０３８６】
クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）の好適なコドンの選択性。
【表１２】
2010528627.tif 000006
B.プロモーター
【０３８７】
多くのプロモーターは、微細藻類において活発で、変わっている（すなわち他の藻からのプロモーター、高等植物からのプロモーターおよび植物ウイルスまたは藻類ウイルスからのプロモーター）藻に内因性でないプロモーターと同様に変わっている藻に内因性であるプロモーターを含む。外来のおよび/または内因性のプロモーターは微細藻類において非常に活性があり、例えば（Curr Microbiol. 1997 Dec;35(6): 356-62 (Chlorella vulgaris)、Mar Biotechnol (NY). 2002 Jan;4(l): 63-73 (Chlorella ellipsoidea)、 MoI Gen Genet. 1996 Oct 16;252(5): 572-9 (Phaeodactylum tricornutum)、Plant MoI Biol. 1996 Apr;31(l): l-12 (Volvox carteri)、 Proc Natl Acad Sci U S A. 1994 Nov 22;91 (24): 11562-6 (Volvox carteri)、 Falciatore A, Casotti R, Leblanc C, Abrescia C, Bowler C, PMID: 10383998, 1999 May;l(3): 239-251 (Laboratory of Molecular Plant Biology, Stazione Zoologica, Villa Comunale, 1-80121 Naples, Italy) (Phaeodactylum tricornutum and Thalassiosira weissflogii)、 Plant Physiol. 2002 May;129(l): 7-12. (Porphyridium sp.)、Proc Natl Acad Sci USA. 2003 Jan 21;100(2): 438-42. (Chlamydomonas reinhardtii)、 Proc Natl Acad Sci U S A. 1990 Feb;87(3): 1228-32. (Chlamydomonas reinhardtii)、 Nucleic Acids Res. 1992 Jun 25;20(12): 2959-65; Mar Biotechnol (NY). 2002 Jan;4(l): 63-73 (Chlorella)、 Biochem MoI Biol Int. 1995 Aug;36(5): 1025-35 (Chlamydomonas reinhardtii); J Microbiol. 2005 Aug;43(4): 361-5 (Dunaliella)、Yi Chuan Xue Bao. 2005 Apr;32(4): 424-33 (Dunaliella)、 Mar Biotechnol (NY). 1999 May;l(3): 239-251. (Thalassiosira and Phaedactylum)、 Koksharova, Appl Microbiol Biotechnol 2002 Feb;58(2): 123-37 (various species)、 MoI Genet Genomics. 2004 Feb;271(l): 50-9 (Thermosynechococcus elongates)、 J. Bacterid. (2000), 182, 211-215、 FEMS Microbiol Lett. 2003 Apr 25;221(2): 155-9、 Plant Physiol. 1994 Jun;105(2): 635-41 、 Plant MoI Biol. 1995 Dec;29(5): 897-907 (Synechococcus PCC 7942)、 Mar Pollut Bull. 2002;45(1-12): 163-7 (Anabaena PCC 7120)、 Proc Natl Acad Sci U S A. 1984 Mar;81(5): 1561-5 (Anabaena (various strains))、 Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Mar 27;98(7): 4243-8 (Synechocystis)、 Wirth, MoI Gen Genet 1989 Mar;216(l): 175-7 (various species)、 MoI Microbiol, 2002 Jun;44(6): 1517-31 and Plasmid, 1993 Sep;30(2): 90-105 (Fremyella diplosiphon)、 Hall et al. (1993) Gene 124: 75-81 (Chlamydomonas reinhardtii)、 Gruber et al. (1991). Current Micro. 22: 15-20; Jarvis et al. (1991) Current Genet. 19: 317- 322 (Chlorella)、加えて、 プロモーターは米国特許 6,027,900の表１）に参照されるような微細藻類における機能的な抗生物質耐性遺伝子。
【０３８８】
外因性遺伝子を発現するために使用するプロモーターは、当然その遺伝子に結合されるプロモーターでありえるかまたは、異種遺伝子でありえる。いくつかのプロモーターは、微細藻類の複数の種において活性がある。他のプロモーターは、種特異的である。好適なプロモーターは、Chlamydomonas reinhardtii由来RBCS2および微細藻類多数の種で見られるウイルス・プロモーター（例えば、Plant Cell Rep. 2005 Mar;23(10-11): 727-35、 J Microbiol. 2005 Aug;43(4): 361-5、 Mar Biotechnol (NY). 2002 Jan;4(1): 63-73を参照).
他の実施形態では、配列番号：３またはクラミドモナス・レインハルヅティ（Chlamydomonas reinhardtii）RBCS2プロモーター（配列番号：4）のいくつかの一部を含む核酸のような、ボツリオコッカス（Botryococcus malate）リンゴ酸酵素のプロモーターである。場合によっては、プロモーターを含んでいる少なくとも10か、20か、30か、40か、50か、60のヌクレオチドまたはより多くのプロモーターを含むの配列が、使われる。クロレラ属の種に内因性の好適なプロモーターは、配列番号：1および配列番号：2である。
【０３８９】
クロレラの外因性遺伝子の発現に役立つ好適なプロモーターは、クロレラHUPl遺伝子のプロモーターのような（配列番号１である）、そして、クロレラ・エリプソイデア（Chlorella ellipsoidea）硝酸レダクターゼプロモーター（配列番号2である)のような、本出願の配列表にリストされる。クロレラウイルス・プロモーターは、また、例えばアメリカ特許6,395,965の配列番号1-7のようなクロレラの遺伝子を発現することに用いることができる。
クロレラにおいて活性添加されたプロモーターは、例えば、in Biochem Biophys Res Commun. 1994 Oct 14;204(l): 187-94; Plant MoI Biol. 1994 Oct;26(l): 85-93; Virology. 2004 Aug 15;326(l): 150-9; and Virology. 2004 Jan 5;318(l): 214-23  で参照することができる。
C.選択マーカー
【０３９０】
多種多様な選択マーカーのいずれかは、クロレラの形質転換のために役立つトランス遺伝子構造物において使用されてもよい。適切な選択マーカーの実施形態は、硝酸還元酵素遺伝子、ハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（HPT）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子およびble遺伝子を含む。そして、それはフレオマイシンに対する抵抗を与える。抗生物質に対する微細藻類の感受性を決定する方法は、周知である。
例えば、MoI Gen Genet. 1996 Oct 16;252(5): 572-9  である。
【０３９１】
具体的には、Dawson et al. (1997), Current Microbiology 35:356-362 (本願明細書において完全に引用したものとする)には、NRを欠乏したクロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana）変異体のための、選択マーカーとしてクロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）から硝酸還元酵素遺伝子の使用が記載される。
Kim et al. (2002), Mar. Biotechnol. 4:63-73 (本願明細書において完全に引用したものとする)には、クロレラ・エリプソイデア（Chorella ellipsoidea）形質転換体のための選択マーカーとして、HPT遺伝子の使用が記載される。
Huang et al. (2007), Appl. Microbiol. Biotechnol. 72: 197-205 (本願明細書において完全に引用したものとする)には、クロレラ属の種のDTのための選択マーカーとして、Sh bleの使用が報告される。
D.誘導性の発現
【０３９２】
本発明も、目的とする遺伝子を発現するために、誘導性プロモーターを用いることを提供する。特に、条件が適合した時に微生物の増殖後リパーゼの生産をできるようにするリパーゼ遺伝子の発現のための誘導プロモーターの使用し、必要であれば、例えば、細胞の崩壊後の反応混合の内容液の減少または/および脂肪エステルへTAGsの変換のために十分なアルコールを加えられるように、エステル転移反応を増幅する。
【０３９３】
本発明に有用である誘導性プロモーターは、外因的に提供された小分子のような（例えば、ブドウ糖、配列番号：１）、温度（熱または寒さ）、光、その他の刺激に応答して作動可能な状態で連結された遺伝子の転写を介在するものを含む。適切なプロモーターは、基本的に静的な遺伝子の転写を起動させることができるかまたは、好ましくは実質的に、低レベルで転写される使用可能な状態である結合された遺伝子の転写をアップレギュレートすることができる。後者の場合、リパーゼの転写のレベルは、好ましくは、それが発現される微生物の増殖に、干渉しない。
【０３９４】
クロレラの導入遺伝子の発現度は、クロレラ・ヘキソース輸送体遺伝子をドライブするプロモーターのようなプロモーターで、誘導的に実行されてもよい（配列番号：1)。このプロモーターは、培地のブドウ糖の存在下で、強く起動する。
E.2つ以上の外来遺伝子の発現
【０３９５】
さらに、遺伝子工学による、例えば、微細藻類のような微生物は、2つ以上の外来遺伝子、例えば、例えばリパーゼおよび溶解遺伝子（例えば多糖類分解酵素をコードしているもの）を含むことができて、発現することができる。一方または両方の遺伝子は誘導性プロモーターを使用して発現することができる。そして、それによってこれらの遺伝子の発現の相対的タイミングが脂質収率および脂肪酸エステルへの転換を強化するために制御されてもよい。2つ以上の外来遺伝子の発現は、同じ誘導性プロモーターの制御下でもよいし、異なる誘導性プロモーターの制御下でもよい。後の状況において、第1の外来遺伝子の発現は第1の期間（それの間、第2の外因性遺伝子の発現は、誘発されてもよいか、または誘発されることができない）の間誘発されてもよい、そして、第2の外来遺伝子の発現は第2の期間（それの間、第1の外因性遺伝子の発現は、誘発されてもよいか、または誘発されることができない）の間誘発されてもよい。本願明細書では、ショ糖の代謝によって微生物の脂質生産を改変するためのベクター及び方法であり、サトウキビを脂質の栄養源として変換するように改変された細胞であるため有利な特徴である。
【０３９６】
また、本願明細書において提供することは、例えば脂肪酸アシルACPチオエステラーゼおよび脂肪酸アシルCoA/アルデヒドレダクターゼ、アルコール製品を産生する結合された動作のような2つ以上の外来遺伝子を発現する微生物（例えば微細藻類、油性の酵母、バクテリアまたは菌類）の遺伝的に改変された種である。さらに提供されることは、脂肪酸アシルACPチオエステラーゼおよびアルデヒドを生成する脂肪酸アシルCoAレダクターゼを含まれるがそれに限定されない外来遺伝子の他の結合である。加えて、本出願は、アルカンを生成するために、脂肪酸アシルACPチオエステラーゼ、脂肪酸アシルCoAレダクターゼおよび脂肪酸アルデヒドデカルボニラーゼの組合せを提供する。外来遺伝子の一つ以上は、誘導性プロモーターを使用して発現されてもよい。
【０３９７】
本発明に使用するために適切な更なる変更態様の実施形態は、一つは固定炭素源の輸送体をコードし、二つ目はショ糖インベルターゼである2つ以上の外来遺伝子を発現する、微細藻類の遺伝的に改変されている種を含む。結果として生じる発酵可能な生物は、生物学的炭化水素生産の周知の方法によって獲得することより低いコストで、炭化水素を生産する。上述される2つの外来遺伝子の挿入は、誘導されたおよび/またはランダムな突然変異による多糖類の分解の生合成と結合されることができ、それは炭化水素生産のためにこれまでより大きな炭素フラックスを進める。個々に、及び、共に、栄養の転換、炭化水素生産を変える改変および酵素剤による処理は、微生物によってできる炭化水素組成物を変える。
変更は、生産される炭化水素、他の炭化水素と関連して生産される一つ以上の炭化水素種の量および/または微生物において生産される炭化水素種のタイプの量の変化がありえる。
例えば、微細藻類は、TAGsのより高い量および/または割合を生じるために改変されてもよい。
F.区分化された発現
【０３９８】
本発明は、また、目的とする遺伝子の区分化された発現を提供する。特に、具体例において、一つ以上の細胞区画にリパーゼの発現を目標とすることは有利でありえる。ここで、それは大多数の細胞脂質からエステル転移反応反応の開始まで隔離される。ターゲッティングのために好ましい細胞小器官は、葉緑体、ミトコンドリアおよび小胞体である。
1. 葉緑体での発現
【０３９９】
本発明の一つの実施形態では、微生物のポリペチドの表示は、葉緑体に目標とされる。葉緑体に対する異種遺伝子のターゲッティング発現のための方法は、公知で、本発明において使用されてもよい。葉緑体へのターゲッティング異種遺伝子製品のための方法は、Shrier et al., EMBO J. (1985) 4:25 32  に記載される。また、葉緑体に核遺伝子産物を転位させるための輸送ペプチドの用途のために、Tomai et al. Gen. Biol. Chem. (1988) 263:15104 15109 及び米国特許番号 4,940,835を参照する。葉緑体にタンパク質の輸送ことを目的とするための方法は、また、Kenauf TIBTECH (1987) 5:40 47においてチェックされる。葉緑体に目標とされるタンパク質をコードするクロレラ核ゲノムの遺伝子のような、クロレラに内因性のクロロプラストを目標としている配列は、公知である。例えば、ジェンバンク登録番号がAY646197およびAF499684を参照する。
【０４００】
ワーヘニンゲン大学国際植物研究所が販売する4つのベクター、そして、それはクロロプラスト・ストローマ（細胞質の）環境に異種タンパク質を届けるためにキク小サブユニット・タンパク質の分泌シグナルを使用すし、それは、二重膜系全体に作用する。タンパク質はシグナルペプチドの適当な処理を許すために成熟したルビスコタンパク質の最初の11のアミノ酸に溶解する（Wong et al., Plant Molecular Biology 20: 81-93 (1992))。シグナルペプチドは、RbcS遺伝子から天然のイントロンを含む。
【０４０１】
他の方法において、葉緑体遺伝子は、異種タンパク質を発現するために遺伝子工学による。
外来ＤＮＡでおおわれている高速度タングステン・マイクロ発射体を有する受容細胞の衝撃を使用しているクラミドマナス・レインハルドティ（Chlamydomonas reinhardtii）（緑藻）の葉緑体の安定した形質転換は、記載されていた。
例えば、Boynton et al., Science (1988) 240: 1534 1538、Blowers et al. Plant Cell (1989) 1 : 123 132 and Debuchy et al., EMBO J. (1989) 8: 2803 2809を参照する。
形質転換の技術は、タングステン・マイクロ発射体を使用し、それはKlein et al., Nature (London) (1987) 7:70 73を参照する。
植物および微細藻類のための葉緑体の形質転換の他の方法は、公知である。
例えばアメリカ特許5,693,507、6,680,426並びにPlant Physiol. 2002 May;129(l): 7-12及びPlant Biotechnol J. 2007 May;5(3): 402-12を参照する。
【０４０２】
米国特許第6,320,101号（2001年11月20日発行、カプラン他。それは、本願明細書に引用したものとする）にて説明したように、細胞は、細胞1つあたりの葉緑体の数を減らすために、化学的な処理でも良い。それから、異種の核酸は、少なくとも一つの異種の核酸分子を葉緑体に導入する目的で、粒子衝撃を経て細胞に導入することができる。異種の核酸は、葉緑体に固有の酵素によって直ちに遂行される相同組み換えを経て葉緑体のゲノムに組み込み可能なように、選ばれる。この目的で、異種の核酸は、目的とする遺伝子に加えて、葉緑体のゲノムに由来する少なくとも一つの核酸一次構造を含む。加えて、異種の核酸は、典型的には選択可能なマーカーを含む。この技術に関する更なる詳細は、アメリカ特許番号4,945,050および5,693,507を参照し、本願明細書に引用したものとする。ポリペチドが、このように葉緑体のタンパク質発現系によって生産することができる。
【０４０３】
米国特許第7,135,620号（2006年11月14日発行、ダニエルその他。それは、本願明細書に引用したものとする）、葉緑体発現ベクターおよび関連した方法について説明する。発現カセットは、コード配列を含むDNA構造物および葉緑体のコード配列の適当な発現を提供する適切な制御配列である。典型的発現カセットは、例えば転写を提供するpsbAおよびクロロプラストにおいて目的とするポリペチドをコードするDNAの塩基配列の翻訳のような、微生物遺伝子または葉緑体遺伝子由来の5'非翻訳領域と、目的とするポリペチドをコードするDNAの塩基配列と、遺伝子を導入しRNAを安定し、外来遺伝子の発現を増幅する葉緑体遺伝子の3'逆位反復領域のような、翻訳能と転写能の終端領域との、構成要素を含む。カセットは、抗生物質耐性遺伝子を任意に含むことができる。
【０４０４】
代表例として、発現カセットは、適当なゲノムに挿入のための便利な制限サイトが隣接される。発現カセットは、特に相同組み換えによって、発現カセットの葉緑体遺伝子への安定した組み込みを促進するために、葉緑体DNAのDNA配列に隣接されてもよい。あるいは、発現カセットは組み込まれないままであることができる。その場合には、発現カセットは、一般的に葉緑体の繁殖開始点を含み、それは葉緑体の異種のDNAの繁殖を提供することができる。
【０４０５】
発現カセットは、一般に葉緑体で発現ができる遺伝子からプロモーター領域を含む。プロモーター領域は、例えばホウレンソウまたはエンドウ由来のpsbA遺伝子、若しくはトウモロコシ由来のrbcLおよびatpBプロモーター領域並びにRrnaプロモーターのような葉緑体遺伝子から入手できるプロモーターを含むことができる。プロモーターの実施形態は、Hanley- Bowdoin and Chua, TIBS (1987) 12:67 70; Mullet et al, Plant Molec Biol. (1985) 4: 39 54、 Hanley-Bowdoin (1986) PhD. Dissertation, the Rockefeller University、Krebbers et al., Nucleic Acids Res. (1982) 10: 4985 5002、Zurawaki et al., Nucleic Acids Res. (1981) 9:3251 3270、及び Zurawski et al., Proc. Nat'l Acad Sci. U.S.A. (1982) 79: 7699 7703で述べられている。他のプロモーターは、識別され、そして、特に識別されるプロモーターの相対的強度は、プロモーターのないマーカー遺伝子のために目的の5'のプロモーターに位置することによって評価され、例えばpsbA遺伝子からのプロモーターのような相対的に強い葉緑体プロモーターから得られる転写のそれの相対的効果を観察している。異種の遺伝子形質発現の効率は、加えて、種々の技術のいずれかによって強化されてもよい。これらは、異種の遺伝子のために5'に直列して挿入される、例えば倍のpsbAプロモーター、エンハンサー配列の加算などの複数のプロモーターの使用を含む。
【０４０６】
ジェンバンク登録番号NC_001865で見つかるそれらのような（クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）葉緑体、完全なゲノム）、クロレラ葉緑体において活性のある多数のプロモーターが、クロレラ葉緑体で外来遺伝子の発現のために用いられることができる。
【０４０７】
ここでは、それが異種遺伝子の誘導発現を提供することが望まれ、誘導性プロモーターおよび/または転写及び/又は翻訳のレベルを調節するために提供される配列を含む5'非翻訳領域は、発現カセットに含まれることができる。例えば、5'非翻訳領域は、発現が光によって調節可能な遺伝子を備えることができる。同様に、3'逆位反復領域は、異種遺伝子のリボゾームRNAを安定させるために用いることがありえた。誘導性の遺伝子は、刺激の不存在下に発現が低いか存在しないこと、及び目的の特定の刺激に応答して発現が増強されることによって、識別することができる。例えば、光誘導性の遺伝子は、発現増強が光を有する照射の間、発現の増強が引き起こされ、その一方で、光がないか少ないと発現を大幅に減少するか、全く発現がないところで識別される。緑の微細藻類からの光制御プロモーターは公知である（例えば、MoI Genet Genomics. 2005 Dec;274(6): 625-36  を参照。
【０４０８】
末端領域が葉緑体とバクテリア間で比較的交換可能のように見えるから、使用される末端領域は主に便宜のうちの1つである。末端領域は、未変性の転写開始領域でもよいし、目的とするDNAの塩基配列固有でもよいし、または、他由来から獲得できてもよい。例えば、Chen and Orozco, Nucleic Acids Res. (1988) 16:8411を参照する。
【０４０９】
発現カセットは、多くの方法のいずれかによって、目的とする植物細胞に形質転換することができる。これらの方法は、例えば、遺伝子銃の方法を含む（Sanford, Trends In Biotech. (1988) 6:299 302 、米国特許番号 4,945,050、 エレクトレポーション (Fromm et al, Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) (1985) 82:5824 5828)、DNAを葉緑体にもたらすことができるレーザー光線、マイクロインジェクションまたは他のいかなる方法もの活用法）。
【０４１０】
微細藻類のような微生物ために、適切な葉緑体発現ベクターの付加的な説明は、米国特許第7,081,567号（2006年7月25日に発行、Xueその他）、 6,680,426（2004年1月20日発行、ダニエルその他）及び5,693,507（1997年12月2日発行、ダニエルその他）を参照する。
【０４１１】
クロレラの核ゲノムにおいて発現するタンパク質は、葉緑体を目標としているシグナルを使用している葉緑体に目標とされてもよい。葉緑体に目標とされるタンパク質をコードするクロレラ核ゲノムの遺伝子のような、クロレラに内因性の葉緑体を目標とする配列は、公知である。例えば、ジェンバンク登録番号AY646197およびAF499684を参照する。タンパク質は、また、葉緑体遺伝子に直接目的遺伝子を挿入することによって、クロレラ葉緑体で発現されてもよい。葉緑体形質転換は、通常、相同組み換えで起こる。そして、葉緑体の形質転換は葉緑体遺伝子配列が知られていればターゲッティング・ベクター（例えばクロレラ・クロロプラストの完全な遺伝子配列、ジェンバンク登録番号NC_001865を参照）の作成により実行することができる。葉緑体の形質転換の詳細については、前のセクションを本願明細書の前のセクションを参照。
2. ミトコンドリアの発現
【０４１２】
本発明の他の実施形態において、微生物でポリペチドの発現は、ミトコンドリアを目標とされる。ミトコンドリアへのターゲッティング異種遺伝子産物のための方法（Boutry et al. Nature (London) (1987) 328:340 342）は記載されており、緑の微細藻類を含む（例えばMoI Gen Genet. 1993 Jan;236(2-3): 235-44を参照)。
【０４１３】
例えば、適切な分泌シグナルをコードしている発現ベクターは、ミトコンドリアに異種タンパク質を目標とすることができる。ワーヘニンゲン大学国際植物研究所のIMP ACTVECTOR 1.5ベクターは、酵母CoxIV分泌シグナルに使用し、ミトコンドリア構造のタンパク質に到達することが知られている。タンパク質は、シグナルペプチド（Kohler et al. Plant J I l : 613-621 (1997)）の適当な処理を許すために、酵母CoxIVタンパク質の最初の4つのアミノ酸に溶解する。他のミトコンドリア・ターゲッティング配列は公知である。そして、緑の微細藻類において機能的なそれらを含む。例えば、FEBS Lett. 1990 Jan 29;260(2): 165-8  及び J Biol Chem. 2002 Feb 22;277(8): 6051-8.を参照
【０４１４】
クロレラの核ゲノムにおいて発現するタンパク質は、ミトコンドリア・ターゲッティング信号を使用しているミトコンドリアに目標とされてもよい。ミトコンドリア・タンパク質ターゲッティングおよび形質転換の詳細について、本願明細書の前のセクションを参照。
3. 小胞体での発現
【０４１５】
本発明の他の実施形態において、微生物のポリペチドの発現は、小胞体を目標とされる。発現ベクターでの適切な保持または強いシグナルの包含が、タンパク質が小胞体（ER）において保持されて、ゴルジに下流に行かないことを保証する。例えば、ワーヘニンゲン大学国際植物研究所のIMPACTVECTOR1.3ベクターは、公知のKDEL保持または局在化シグナルを含む。このベクターについては、それは5倍以上の発現量を改良することが報告されたという点で、小胞体保持は実際的な効果がある。これの主な理由は、細胞質に存在するより、小胞体が発現されるタンパク質の翻訳後の分解の原因である低い濃度および/または異なるプロテアーゼを含むことであるように見える。緑の微細藻類において機能的な小胞体保持シグナルは、公知である。例えば、Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Apr 26;102(17): 6225-30  を参照する。
G.形質転換
【０４１６】
細胞は、例えば、遺伝子銃、エレクトロポレーション、ガラスビーズ変換および炭化ケイ素ウィスカー形質転換を含んでいるいかなる適切な技術にもよって形質転換することができる。本願明細書の実施形態において参照。
【０４１７】
トランス遺伝子をクロレラに導入するいかなる有益な技術も、本発明において使用されてもよい。Dawson et al. (1997) （上記）は、硝酸レダクターゼを欠乏したクロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana）変異体にクロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）由来の硝酸レダクターゼ（NR）遺伝子を導くために遺伝子銃の使用を記載した。そして、安定な形質転換に結果としてなった。
簡潔には、0.4ミクロン・タングステン・ビードは、プラスミドでおおわれていた。 3X 107クロレラ・ソロキニアナ（C. sorokiniana）細胞は、選択的でない寒天培地の3枚の中心で広げて、PDS-1000/He バイオリスティック・バーティカル・デリバリー（Biolistic Particle Delivery）（R）システム（バイオラド）で照射される。
【０４１８】
トランス遺伝子をクロレラにもたらすことのための好適な方法はKim et al. (2002), Mar. Biotechnol.4:63-73.に説明されている方法である。キムは、CaCl2およびポリエチレングリコール（PEG）を使用するクロレラ・エリプソイデア(Chorella ellipsoidea)プロトプラストの形質転換を報告する。特に、プロトプラストは、1-2のX 108/Mlの密度に、増殖するクロレラ・エリプソイデア(C. ellipsoidea)細胞によって準備された。細胞は、回収されて、1600gで5分の間の遠心によって洗浄され、0.6Mのソルビトール、0.6Mのマンニトール、4%の（重量/ボリューム）セルロース（Calbiochem）、2%の（重量/ボリューム）マセラーゼ（Calbiochem）および50ユニットのペクチナーゼ（シグマ）を含んでいる5Mlのリン酸緩衝液（Ph 6.0）の中に再懸濁された。細胞懸濁液は、暗所で穏やかな振盪を有する16時間の25℃でインキュベートされた。結果として生じるプロトプラストは、5分間、400gで、遠心によって回復された。ペレットは、穏やかに0.6Mのソルビトールおよび0.6Mのマンニトールを含んでいるf/2培地の5Mlの中に再懸濁されて、5分間、400gで遠心分離された。この沈殿物は、50mMCaCl2を含んでいる0.6Mのソルビトール/マンニトール溶液の1つのMlの中に再懸濁された。それから、0.4Mlの107-108のプロトプラストに、25μg仔ウシ胸腺DNA（シグマ）に加えて、5mgのトランス遺伝子DNAは、加えられた。
室温で15分後に、200μLのPNC（40%のポリエチレングリコール4000、0.8MのNaCl、50Mm CaCl2）が加えられて、室温で30分間穏やかに混合された。この後に、0.6Mのソルビトール/マンニトール溶液、1%のイースト抽出物および1%のブドウ糖で補充される0.6のMlのf/2培地は加えられた、そして、形質転換された細胞は細胞壁再生のために、暗所で12時間25°Cでインキュベートされた。類似した方法は、Huang et al. (2007)（上記） によってクロレラ属の種（Chlorella sp.）DTに第二水銀還元酵素をコードしているトランス遺伝子を導入するために用いた。
【０４１９】
エレクトロコーポレーションは、また、クロレラを形質転換するために用いられた。
丸山その他(2004)によって報告された、Biotechnology Techniques 8:821-826（本願明細書において完全に引用したものとする）、この技術は、安定期の細胞からトランス遺伝子をクロレラ・サッカロフィア（Chlorella saccharophila）c-211-1のプロトプラストにもたらすために用いた準備をする。導かれたプラスミドの一時的発現は、600および900V/cmおよび約400ms間のパルス持続時間で観察され、ここで70-kDaのFITC-デキストランの高い膜透過性で観察された。
【０４２０】
クロレラのトランス遺伝子の表現度の実施形態は文献において見つかる（例えば、実施形態として、Current Microbiology Vol. 35 (1997), pp. 356-362、Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 2000 Jul;16(4): 443-6、Current Microbiology Vol. 38 (1999), pp. 335-341、Appl Microbiol Biotechnol (2006) 72:197-205、Marine Biotechnology 4, 63-73, 2002、Marine Biotechnology 4, 63-73, 2002、Current Genetics 39:5, 365-370 (2001)、Plant Cell Reports 18:9, 778-780, (1999)、Biologia Plantarium 42(2): 209-216, (1999)、Plant Pathol. J 21(1): 13-20, (2005)を参照する。）
また、実施形態を本願明細書において参照。
【０４２１】
油性の酵母（例えばヤロウィア・リポリティリカ（Yarrowia lipolytica））のトランス遺伝子の発現の実施形態は、文献（実施形態として、Bordes et al., J Microbiol Methods, Jun 27 (2007)を参照する）で見つけることができる。
菌類（例えば、モルチエレラ・アルパイン（Mortierella alpine）、ムカー・シルシネロイデス（Mucor circinelloides）およびアスペルギルス・オクラセウス（Aspergillus ochraceus））のトランス遺伝子の発現の実施形態はまた、文献で見つけることができる（例えば、Microbiology, Jul; 153(Pt. 7): 2013-25 (2007)、Mol Genet Genomics, Jun; 271(5): 595-602 (2004)、Curr Genet, Mar;21(3): 215-23 (1992)、Current Microbiology, 30(2): 83-86 (1995)、Sakuradani, NISR Research Grant, "Studies of Metabolic Engineering of Useful Lipid-producing Microorganisms" (2004)、及び国際特許出願 PCT/JP2004/012021  を参照する。）
大腸菌のようなバクテリアの外来遺伝子の発現の実施形態は、周知である。例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al. (3d edition, 2001, Cold Spring Harbor Press  を参照する。
【０４２２】
本発明の微生物の形質転換のためのベクターは、当業者に知られた技術によって準備されてもよい。多数のクロレラ種の形質転換のために使用する構造物のヌクレオチド配列は、配列番号:25に対応する。実施形態において、典型的なベクターは、例えば微生物のリパーゼ遺伝子の表現度のために改変する微細藻類リパーゼを微細藻類において活性プロモーターとの作動可能な連結にコード化している遺伝子を含む。あるいは、ベクターが目的の遺伝子との作動可能な連結のプロモーターを含まない場合、それがベクターの組込みと内因性プロモーターに作動可能な状態で連結されるように、遺伝子は細胞へ形質転換することができる。形質転換のプロモーターのない方法は、微細藻類（例えばPlant Journal 14:4, (1998), pp.441-447を参照）の働きによって証明された。ベクターは、また、例えば、抗生物質または除草剤の抵抗を与えるタンパク質（すなわち選択可能なマーカー）をコードする第2の遺伝子を含むことができる。場合によっては、一方または両方の遺伝子は、ポリアデニル化シグナルを含む3'末端非翻訳配列によって伴うことができる。2つの遺伝子をコードしている発現カセットは、一つのベクターにまたは別々のベクターに物理的に結合されてもよい。微細藻類の同時形質転換がまた、使われてもよい、異なったベクター分子は同時に、細胞を変えるために用いる（例えば、Protist 2004 Dec; 155(4): 381-93を参照)。形質転換細胞は、抵抗カセットを欠いている細胞が増殖しない状況の下で抗生物質または他の選択可能なマーカーがある場合には、増殖する能力に基づいて、任意に選ばれることができる。
【０４２３】
以前特に組み込まれるかどうか、本願明細書において全ての引例は、特許、特許出願および刊行物を含んで、全体として本願明細書に引用したものとする。本願明細書において言及される刊行物は、本発明と関連して使われてもよい試薬、方法論および概念を記載して、開示するために引用される。本願明細書において何も、これらの参照が本願明細書において説明されている本発明に関する従来技術であるという承認として解釈されることになっていない。
【０４２４】
本発明が本発明の特定の実施形態と関連して記載されていたにもかかわらず、それが更なる変更態様ができると理解される。本出願は、いかなるバリエーション、用途、または後述の発明の適用、一般の章の部分、本発明の原理、及び周知であるか慣例である技術である及び既存の出願の本質的特徴として現在の開示からのズレのようなものも含むものの原理を包含することを目的とする。
X.実施例
【０４２５】
以下の実施例は、説明のために言及され、請求された本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【０４２６】
テキサス大学微生物コレクションからのクロレラ株は、グリセリンおよびブドウ糖上の成育のために検証された。
以下のクロレラ種および株は、培養された。
クロレラ・ケッセレリ（Chlorella kessleri）（263、397、398、2228株）。クロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana（1663、1665、1669、1671、1810株）。クロレラ・サッカロフィア（Chlorella saccharophila）（2911、2469株)。クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）（31、249、250、264株）。
各々の株は、固体培地から液体培地（2g/Lイースト抽出物、2.94mMのNaNO3、0.17mMのCaCl2'2H2O、0.3mMのMgSO4"7H2O、0.4mMのK2HPO4、1.28mMのKH2PO4、0.43mMのNaCl）に植菌され、75μEm-2s-1の光強度の下で、72時間27℃で、25mlで振盪培養される。これらの培養方法は、2mlの以下のメディアを含む24穴プレートに、mlあたり1x105の細胞の最終的な密度に各々の株に植菌をするために用いた。
（a）基礎培地のみ。（b）基礎培地にさらに0.1%のブドウ糖を加えた。（c）基礎培地に0.5%の試薬級のグリセリン（EM Scienceのカタログ#GX0185-6）。
プレートは、暗所に置かれ、27℃、74時間で振盪培養された。3通りの条件で成育されたそれぞれの株のサンプルは、蒸留水で1.9:1に希釈され、吸光度がMolecular Devices SpectraMax 340PCの600nmで計測された。全ての株は、基礎培地のみと比較してブドウ糖およびグリセリンがある場合に、増殖を示した。
【実施例２】
【０４２７】
株及び培地。
クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）#1（250株）、#2（264株）およびクロレラ・ケッセレリ（Chlorella kessleri）#1（398株）は、テキサス大学（オースティン、TX、米国）で、藻類の培養コレクションから得られた。保存種は、改質したプロテオース培地で維持された。改質プロテオース培地は、0.25gのNaNO3、0.09gのK2HPO4、0.025g 0.175gのKH2PO4、0.025gのCaCl22H2O、0.075gのMgSO47H2Oおよび1リットルにつき2gイースト抽出物から成った（g/L）。バイオディーゼル生産（酸性グリセリン（AG）及び非酸性グリセリン（NAG））からのグリセリン廃棄物は、Imperial Western Products （セルマ、CA、米国）から得られた。「純粋な」または「試薬用」グリセリンは、EM Science（メルクKGAの部門）カタログ#GX0185-6から得られた。
【０４２８】
実験計画法および増殖測定値。
各々の株のために、1mlの以下の異なる培地は、24穴プレートにおいて準備された。
1. プロテオース+1%の純粋なグリセリン
2. プロテオース+1%の酸性グリセリン
3. プロテオース+1%の非酸性グリセリン
4. プロテオース+1%の純粋なグリセリン+ 1 %ブドウ糖（72時間の後に加えられた）
5. プロテオース+1%の酸性グリセリン+ 1 %ブドウ糖（72時間の後で加えられた）
6. プロテオース+1%の非酸性グリセリン+ 1 %ブドウ糖（72時間の後で加えられた）
【０４２９】
各々の株は、5×105細胞/mlの濃度に、異なるメディアに植菌された。培地は、暗闇に保たれて、430回転数/分で、Labnet（バークシア、英国）の軌道振盪機によって撹拌された。72時間の最初の増殖の後、1%（w/v）ブドウ糖が、サンプル#4、5および6に加えられ、さらに24時間培養された。乾燥菌体重量を測定するために、各々の培地の1mlは、エッペンドルフ5415C遠心管で5分間5,000回転数/分で、遠心分離によって沈殿される。
上澄みを取り除いた後に、細胞沈殿物は、-80℃で、研究室スケール凍結乾燥器（Labconco、MO、米国）において凍結乾燥された。結果は、図1に示される。
【実施例３】
【０４３０】
株および培地。
クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）#1（250株）、#3（249株）およびクロレラ・ケッセレリ（Chlorella kessleri）#2（397株）は、テキサス大学（オースティン、TX、米国）で、藻類の培養コレクションから得られた。保存種は、改質プロテオース培地で（実施例2を参照する）に維持された。
【０４３１】
実験計画法および増殖測定値。
各々の株のために、1mlの以下の異なるメディアは、24穴プレートにおいて準備された。
1. プロテオース+1%純粋なグリセリン+1 %ブドウ糖
2. プロテオース+1%の酸性グリセリン+1 %ブドウ糖に酸味を加えた
3. プロテオース+1%の非酸性グリセリン+1 %ブドウ糖
【０４３２】
各々の株は、5×105セル/mlの濃度で、異なる培地に植菌された。培地は、暗所に保持されて、430回転数/分で、Labnet（バークシア、英国）の軌道振盪機によって撹拌された。96時間の後、細胞増殖は、乾燥菌体重量（実施例2を参照）により測定された。結果は、図2に示される。
【実施例４】
【０４３３】
株及び培地。
クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）#3（249株）、#4（31株）およびクロレラ・ケッセレリ（Chlorella kessleri）#2（397株）は、テキサス大学（オースティン、TX、米国）で、微細藻類の培養コレクションから得られた。保存種は、改質プロテオース培地（実施例2を参照）で維持される。
【０４３４】
実験計画及び脂質分析。
各々の株のために、1mlの以下の異なる培地は、24穴プレートにおいて準備された。
1. プロテオース+1%純粋なグリセリン+1%ブドウ糖
2. プロテオース+1%の酸性グリセリン+1%ブドウ糖
3. プロテオース+1%の非酸性グリセリン+1%ブドウ糖
【０４３５】
各々の株は、5×105細胞/mlの濃度で、異なるグリセリン（純粋であるか、酸性、非酸性）を含んでいる培地に植菌された。培地は、暗所に保持されて、430回転数/分で、Labnet（バークシア、英国）の軌道振盪機によって撹拌された。96時間後、脂質含有量が計測された。細胞の脂質含有量の量を計量するために、100μlの培地は集められて、同一量の培地で一度洗浄される。各々の管に、5μlの洗浄細胞および18Mの硫酸200μlが加えられた。管は30分の間の水浴の90℃でインキュベートされ、そして、1mlのリン酸バニリン試薬が管に加えられて、15分間37℃でインキュベートされた。リン酸バニリン試薬を調合するために、0.12gのバニリンは20mlの水に加えられた、そして、体積が85%のリン酸を有する100mlに適応した。530nmの光学濃度は、サンプルとして5μl水を有する管に対して、ガラス・キュベットにおいて計測された。結果は、図3に示される。
【実施例５】
【０４３６】
株及び培地。
クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）#2（264株）およびクロレラ・ケッセレリ（Chlorella kessleri）#1（398株）は、テキサス大学（オースティン、TX、米国）で、藻類の培養コレクションから得られた。保存種は、改質プロテオース培地（実施例2を参照）に維持された。
【０４３７】
実験計画および脂質分析。
各々の株のために、以下の異なる培地の1mlは、24穴プレートに準備された。
1. プロテオース+1%の純粋なグリセリン
2. プロテオース+1%の非酸性グリセリン
3. プロテオース+1%純粋なグリセリン+1%ブドウ糖（72時間の後で加えられた）
4. プロテオース+1%の非酸性グリセリン+ 1 %ブドウ糖（72時間の後で加えられた）
【０４３８】
各々の株は、5×105細胞/mlの濃度で異なるグリセリン（純粋なまたは非酸性）を含んでいる培地に植菌された。培地は、暗所に保持されて、430回転数/分で、Labnet（バークシア、英国）の軌道振盪機によって撹拌された。72時間の最初の増殖の後、1%のブドウ糖はサンプル#3および#4に加えられて、さらに24時間培養された。脂質含有量は、全てのサンプル（実施例4参照）において計量された。600nmの光学濃度は、また、非特異的吸光度について調べるために測定されて、脂質の量を算出するために、O.D.530nmから減算された。参照カーブは、1から10のμgまで変動しているクロロホルムにおいて溶かされるトリオレインから成る。結果は、図4に示される。
【実施例６】
【０４３９】
株及び培地。
クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）#3（249株）およびクロレラ・ケッセレリ（Chlorella kessleri）#2（397株）は、テキサス大学（オースティン、TX、米国）で、微細藻類の培養コレクションから得られた。保存種は、改質プロテオース培地（実施例2を参照）で維持された。
【０４４０】
実験計画および脂質分析。
各々の株のために、1mlの以下の異なる培地は、24穴プレートで準備された。
1. プロテオース+1%純粋なグリセリン+1%ブドウ糖（72時間の後で加えられた）
2. プロテオース+1%の酸性グリセリン+1%ブドウ糖（72時間の後で加えられた）
3. プロテオース+1%の非酸性グリセリン+1%ブドウ糖（72時間の後で加えられた）
【０４４１】
各々の株は、5×105細胞/mlの濃度で異なるグリセリン（純粋であるか、酸性か、非酸性か）を含んでいる培地に植菌された。培地は、暗所に保持されて、430回転数/分で、Labnet（バークシア、英国）の軌道振盪機によって撹拌された。72時間の最初の増殖の後、1%のブドウ糖は、加えられて、さらに24時間培養した。乾燥細胞重量および脂質含有量は、全てのサンプル（実施例2および5を参照）において計量された。
脂質%は、乾燥菌体重量によって分離される総脂質量から算出された。結果は、図5に示される。
【実施例７】
【０４４２】
株及び培地。
クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）#2（264株）およびクロレラ・ケッセレリ（Chlorella kessleri）#1（398株）は、テキサス大学（オースティン、TX、米国）で、藻類の培養コレクションから得られた。保存種は、改質プロテオース培地（実施例2参照）で維持された。
【０４４３】
実験計画および脂質分析。
各々の株のために、1mlの以下の異なる培地は、24穴プレートで準備された。
1. プロテオース+1%純粋なグリセリン+1%ブドウ糖（72時間の後で加えられた）
2. プロテオース+1%の非酸性グリセリン+1%ブドウ糖（72時間の後で加えられた）
【０４４４】
各々の株は、5×105細胞/mlの濃度で1%純粋な、又は1%の非酸性グリセリンを含んでいる培地に植菌された。培地は、暗所に保持された、430回転数/分で、Labnet（バークシア、英国）の軌道振盪機によって撹拌された。72時間の最初の増殖の後、1%のブドウ糖が加えられて、さらに24時間培養した。乾燥細胞重量および脂質含有量は、全てのサンプル（実施例1及び4を参照）において計測された。脂質%は、乾燥細胞重量によって分離される総脂質量から算出された。結果は、図6に示される。
【実施例８】
【０４４５】
株及び培地。
クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）#1（250株）、#4（31株）およびクロレラ・ケッセレリ（Chlorella kessleri）#2（397株）は、テキサス大学（オースティン、TX、米国）で、微細藻類の培養コレクションから得られた。保存種は、改質プロテオース培地（実施例2を参照する）に維持された。
【０４４６】
実験計画および脂質分析。
各々の株のために、1mlの以下の異なる培地は、24穴プレートに準備された。
1. プロテオース+2%ブドウ糖
2. プロテオース+1%グリセリン+1%ブドウ糖
【０４４７】
各々の株は、5×105セル/mlの濃度に、異なる培地に植菌された。培地は、暗所に保持されて、430回転数/分で、Labnet（バークシア、英国）の軌道振盪機によって撹拌された。96時間の最初の増殖の後、脂質含有量は、計量された（実施例5を参照）。結果は、図7に示される。
【実施例９】
【０４４８】
株及び培地。
クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）#3（249株）、#4（31株）およびクロレラ・ケッセレリ（Chlorella kessleri）#1（398株）は、テキサス大学（オースティン、TX、米国）で、微細藻類の培養コレクションから得られた。保存種は、改質プロテオース培地（実施例2を参照）に維持された。
【０４４９】
実験計画および脂質分析。
各々の株のために、1mlの以下の異なる培地は、24穴プレートで準備された。
1. プロテオース+2%ブドウ糖
2. プロテオース+ 1%グリセリン+1%ブドウ糖
3. プロテオース+ 1%グリセリン+1%ブドウ糖（72時間の後で加えられた）
【０４５０】
各々の株は、5×105セル/mlの濃度で、異なる培地に植菌された。培地は、暗所に保持されて、430回転数/分で、Labnet（バークシア、英国）の軌道振盪機によって撹拌された。72時間の最初の増殖の後、1%の（w/v）ブドウ糖は、#3培地に加えられて、さらに24時間培養した。乾燥細胞重量および脂質含有量は、全てのサンプル（実施例2および5を参照する）において計量された。脂質%は、乾燥細胞重量によって分けられる総脂質量から算出された。結果は、図8に示される。
【実施例１０】
【０４５１】
株および培地。
クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）#1（250株）、#3（249株）およびクロレラ・ケッセレリ（Chlorella kessleri）#2（397株）は、テキサス大学（オースティン、TX、米国）で、微細藻類の培養コレクションから得られた。保存種は、改質プロテオース培地（実施例2を参照）に維持された。
【０４５２】
実験計画および脂質分析。
各々の株のために、1mlの以下の異なる培地は、24穴プレートに準備された。
1. プロテオース+1%純粋なグリセリン+1%ブドウ糖
2. プロテオース+1%純粋なグリセリン+1%ブドウ糖（72時間の後で加えられた）
3. プロテオース+1%の酸性グリセリン+1%ブドウ糖
4. プロテオース+1%の酸性グリセリン+1%ブドウ糖（72時間の後で加えられた）
5. プロテオース+1%の非酸性グリセリン+1%ブドウ糖
6. プロテオース+1%の非酸性グリセリン+ブドウ糖（72時間の後で加えられた）
【０４５３】
各々の株は、5×105セル/mlの濃度に、異なる培地に植菌された。培地は、暗所に保持された、430回転数/分で、Labnet（バークシア、英国）の軌道振盪機によって撹拌された。
72時間の最初の増殖の後、1%の（w/v）ブドウ糖は、#2、#4および#6培地に加えられて、さらに24時間培養した。脂質含有量は、全てのサンプル（実施例4を参照）において計量された。結果は、図9に示される。
【実施例１１】
【０４５４】
株及び培地。
クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）#1（STRAIN 250）、#3（STRAIN 249）、#4（STRAIN 31）およびクロレラ・ケッセレリ（Chlorella kessleri）#2（STRAIN 397）は、テキサス大学（オースティン、TX、米国）で、微細藻類の培養コレクションから得られた。保存種は、改質プロテオース培地（実施例2を参照）に維持された。
【０４５５】
実験計画および脂質分析。
各々の株のために、1mlの以下の異なる培地は、24穴プレートに準備された。
1. プロテオース+ 1%純粋なグリセリン+1%ブドウ糖
2. プロテオース+ 1%純粋なグリセリン+1%ブドウ糖（72時間の後で加えられた）
3. プロテオース+1%酸性グリセリン+1%ブドウ糖
4. プロテオース+1%酸性グリセリン+1%ブドウ糖（72時間の後で加えられた）
5. 1%プロテオース+ 1%の非酸性グリセリン+1%ブドウ糖
6. 1%プロテオース+ 1%の非酸性グリセリン+1%ブドウ糖（72時間の後で加えられた）
【０４５６】
各々の株は、5×105セル/mlの濃度に、異なる培地に植菌された。培地は、暗闇に保たれて、430回転数/分で、Labnet（バークシア、英国）の軌道振盪機によって撹拌された。72時間の最初の増殖の後、1%の（w/v）ブドウ糖は、#2、#4および#6培地に加えられて、さらに24時間培養した。乾燥細胞重量は、全てのサンプル（実施例2を参照）において計量された。結果は、図10に示される。
【実施例１２】
【０４５７】
ベクター構造
CMVプロモーター、ハイグロマイシン抵抗cDNAおよびCMV 3'UTR（配列番号：5、pCAMBIA138Oベクターの結果、Cambia、キャンベラ、オーストラリア）を含んでいる A BamHI-SacII断片は、pBluescriptのBamHIおよびSacIIサイトにクローンをつくられて、本明細書において、pHygと称される。
クロレラの遺伝子銃による形質転換。
【０４５８】
Seashell Technologyからの S550d金キャリアは、メーカーのプロトコルに従って準備された。線形にされたpHygプラスミド（20μg）は、結合用緩衝液の50のμlおよびS550d金キャリアの60μl（30mg）を混ぜ合わせられて、1分の間の氷においてインキュベートされた。沈殿バッファ（100μl）は加えられた、そして、混合はさらに1分の間の氷においてインキュベートされた。ボルテックス後、DNAコートの分子は、エッペンドルフチューブ5415Cで、10秒の間、10,000回転数/分で、沈殿させられた。金の沈殿物は、冷たい100%のエチルアルコールの500のμlを有する一度洗われて、微量遠心管の短い紡績によって小球をぶつけられて、氷冷エチルアルコールの50のμlによって再懸濁された。
短時間（1-2秒）音波処理の後、DNAコートの分子の10のμlは、キャリア膜に直ちに伝達された。
【０４５９】
それが2×106細胞/mlの菌体密度に到達するまで、クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）培地（テキサス大学培養コレクション250）は、75μmol光子m-2 sec-1で連続照明の下で旋回振盪機上のプロテオース培地（2g/lイースト抽出物、2.94mMのNaNO3、0.17mMのCaCl2・2H2O、0.3mMのMgSO4・7H2O、0.4mMのK2HPO4、1.28mMのKH2PO4、0.43mMのNaCl）で増殖された。細胞は、収集されて、滅菌蒸留水で一度洗浄され、培地の50μlの中に再懸濁された。1×107セルは、選択的でないプロテオース培地プレートの3番目に、中心において広げられた。細胞は、PDS-1000/He Biolistic Particle Deliveryシステム（バイオラド）で衝突された。破裂板（1100および1350psi）が使われた、そして、プレートはスクリーン/マクロ・キャリヤ組立体の下に9および12cm配置された。細胞は、12-24時間、25℃でリカバーすることができた。回復に応じて、細胞は、ゴム舌圧子を有するプレートからこすり落されて、培地の100μlを混ぜ合わせられて、ハイグロマイシンの含まれたプレート（200μg/ml）に広げられた。25℃の培養の7-10日間後に、形質転換細胞を発現しているコロニーは、1100および1350psi破裂板から、そして、9および12cmの距離からプレートに見えた。コロニーは、選ばれて、２回のセレクションのために選択的な寒天プレートに植菌された。
エレクトロポレーションによるクロレラの形質転換。
【０４６０】
クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）培養は、75μmol光子m-2 sec-1の連続照明の下で2x106 細胞/mlの菌体密度に至るまで、旋回振盪機上のプロテオース培地で培養された。細胞は、集められ、滅菌蒸留水で一度洗浄された。そして、4x10 cells/mlの密度に50mMのショ糖を含むトリス-リン酸緩衝液（20mのMトリス-HCl（pH 7.0）; 1mMのリン酸カリウム）に再懸濁した。約250μl細胞懸濁液（1x108cells）は、4mmのすきまの使い捨てのエレクトロポレーション・キュベットにおいて配置された。細胞懸濁液に、5μgの線形にされたpHygプラスミドＤＮＡおよび200μgのキャリアDNA（サーモンスペルマDNAをせん断した）が加えられた。エレクトロポレーション・キュベットは、それから10分間の16℃で、水浴においてインキュベートされた。電気的パルス（1100V/cm）は、それから、Gene Pulser II（バイオラドLabs、ヘラクレス、CA）エレクトロポレーション装置を使用し、25μF（シャント抵抗が、エレクトロポレーションのために用いられなかった）のキャパシタンスで、キュベット用いられた。キュベットは、それから5分（細胞懸濁液が50mlのプロテオース・メディアへ転送された）の間の室温でインキュベートされ、2日間旋回振盪機に振りかけられた。リカバリーの後、細胞は、低速の遠心によって集められ、プロテオース培地に再懸濁され、さらに、プレートに低濃度で固定され、200μg/mlハイグロマイシンを補充された。プレートは、75μmol光子m-2 sec-1の連続照明の下でインキュベートされた。形質転換体は、1- 2週でのコロニーとして現れた。コロニーは、選ばれて、２回のセレクションのために選択的な寒天プレートに植菌された。
ジェノタイピング
【０４６１】
２回のセレクションを生き残ったコロニーのAサブセットは、小体積で培養されて、集められた。ほぼ5-10uL体積の沈殿物は、ボルテックスによって50uLの1OmM NaEDTAの中に再懸濁されて、そうすると、10の間100℃でインキュベートした。チューブは、それから短時間にボルテックスされて、10秒間超音波で破壊されて、そして1分の間の12,000のxgで遠心分離された。テンプレートとしての2uLの上澄みが、50uL PCR反応において使われた。ジェノタイピングのために使用するプライマーは、配列番号：6および配列番号：7であった。
PCR状況は、以下の通りだった。
95℃ 5分のx 1サイクル、
95℃ 30秒の−58℃30秒の−72℃ 1分30秒のx 35サイクル、
72℃ 10分のx 1サイクル。
予想される992bp断片は、遺伝子銃の方法で及び単一のエレクトロポレーションのコロニーから、10のコロニーのうちの6つで見つかった。より低いサイズの非特異性のバンドは、全てのレーンに存在した。結果は、図16に示される。
増幅された992bp断片、2つの遺伝子銃のバンドおよびエレクトロポレーションバンドの同一性の確認は、ゲルから切除されて、個々に配列決定された。全3つのバンドの配列は、予想される992bp断片に対応した。（DNA ladder: Bionexus（R）、All Purpose Hi-Lo（R）DNA ladder catalog # BN2050）。
【実施例１３】
【０４６２】
株及び培地。
(a)スピルリナ・プラテンシス（Spirulina platensis）（UTEX 2340）および（b）ナビクラ・ペリクロサ（Navicula pelliculosa）（UTEX 667）は、テキサス大学（オースティン、TX、米国）で、藻類の培養コレクションから得られた。スピルリナ（Spirulina）の保存種は、スピルリナ（Spirulina）培地で維持された、そして、ナビクラ（Navicula）は土壌抽出物培地（SEM）で維持された。スピルリナ（Spirulina）培地は、162mMのNaHCO3、38mMのNa2CO3、1.9mMのK2HPO4、29mMのNaNO3、5.75mMのK2SO4、17.1mMのNaCl、0.8mMのMgSO47H2O、0.25mMのCaCl22H2O、2mMのNa2EDTA、0.36mMのFeCl3-OH2O、0.21mMのMnCl2-4H2O、0.037mMのZnCl2、0.0085mMのCoCl2-OH2O、0.017mMのNaMoO4-2H2O、0.78のμM CuSO4-5H2O、0.15のμM ZnSO4-7H2O、10のμM H3BO3および0.001mMのビタミンB12から成った。土壌抽出物培地は、2.94mMのNaNO3、0.17のmMCaCl2-2H2O、0.3mMのMgSO47H2O、0.43mMのK2HPO4、1.29mMのKH2PO4、0.43mMのNaClおよび土壌抽出物から成った。バイオディーゼル生産（酸性グリセリン（AG）及び非酸性グリセリン（NAG））からのグリセリン廃棄物は、Imperial Western Products（セルマ、CA、米国）から得られた。
【０４６３】
実験計画および増殖測定。
各々の株のために、1mlの以下の異なる培地は、24穴プレートに準備された。
(a)
7.スピルリナ（Spirulina）培地+2%ブドウ糖
8.スピルリナ（Spirulina）培地+2%試薬用グリセリン
9.スピルリナ（Spirulina）培地+2%の非酸性グリセリン
10.スピルリナ（Spirulina）培地+1%の非酸性グリセリン+1%ブドウ糖
（b）
1. SEM+2%ブドウ糖
2. SEM+2%試薬用グリセリン
3. SEM+1%試薬用グリセリン+ 1 %ブドウ糖
4. SEM+2%の酸性グリセリン
5. SEM+1%の酸性グリセリン+1%ブドウ糖
6. SEM+2%の非酸性グリセリン
7. SEM+1%の非酸性グリセリン+1%ブドウ糖
【０４６４】
各々の株は、5×105セル/mlの濃度で、異なる培地に植菌された。培地は、暗所に保持されて、430回転数/分で、Labnet（バークシア、英国）の軌道振盪機によって撹拌された。96時間後、脂質含有量は、計量された。細胞の脂質含有量の量を計量するために、培地100μlが集められて、培地と同じ量で一度洗浄された。各々のチューブに、5μlの洗浄細胞および200のμlの18M硫酸が加えられた。チューブは、30分間90℃水浴でインキュベートされた、そして、1mlのリン酸バニリン試薬はチューブに加えられた。リン酸バニリン試薬を調合するために、0.12gのバニリンが20mlの水に加えられ、体積が100mlに85%のリン酸を有する調整した。530nmの光学濃度は、サンプルとして5μlの水を有するサンプルチューブに対して、ガラス・キュベットにおいて計測された。参照カーブは、1から10μgまで変動しているクロロホルムにおいて溶かされるトリオレインから成る。
【０４６５】
乾燥細胞重量を計量するために、各々の培地の0.5mlは、5分の間の5000回転数/分で、遠心によって沈殿させられた。上澄みを取り除いた後に、細胞沈殿物は、-80℃で凍って、フリーズドライシステム（Labconco、MO、米国）で、終夜乾燥した。脂質パーセンテージは、乾燥菌体重量によって分けられる総脂質量から算出された。結果は、図11に示される。
【実施例１４】
【０４６６】
株及び培地。
セネデスムス・アルマツス（Scenedesmus armatus）（UTEX 2552）は、テキサス大学（オースティン、TX、米国）で、藻類の培養コレクションから得られた。保存種は、改質プロテオース培地に維持された。改質プロテオース培地は、0.25gのNaNO3、0.09gのK2HPO4、0.025g 0.175gのKH2PO4、0.025gのCaCl22H2O、0.075gのMgSO47H20および1リットルにつき2gイースト抽出物から成った（g/L）。
【０４６７】
実験計画及び増殖と脂質の測定。
各々の増殖条件のために、1mlの以下の異なる培地は、24穴プレートにおいて準備された。
(a)（b）
1. Proteose +2%ブドウ糖
2. Proteose +2%グリセリン
3. Proteose +2%の酸性グリセリン
4. Proteose +2%の非酸性グリセリン
5. Proteose +1%の酸性グリセリン+ 1 %ブドウ糖
【０４６８】
セネデスムス・アルマツス（Scenedesmus armatus）（UTEX 2552）は、5×105セル/mlの濃度で、異なる培地に植菌された。培地は、暗所に保持されて、430回転数/分で、Labnet（バークシア、英国）の軌道振盪機によって撹拌された。96時間後、細胞発育は乾燥細胞重量で測定され、脂質含有量は蛍光体-バニリン分析（実施例13を参照）で測定された。脂質パーセンテージは、乾燥菌体重量によって分けられる総脂質量から算出された。結果は、図12に示される。
【実施例１５】
【０４６９】
株および培地。
ナビクラ・ペリクロサ（Navicula pelliculosa）（UTEX 667）は、テキサス大学（オースティン、TX、米国）で、藻類の培養コレクションから得られた。保存種は、土壌抽出物培地（実施例13を参照）
【０４７０】
実験計画および増殖測定。
各々の増殖条件のために、1mlの以下の異なる培地は、24穴プレートで準備された。
1. SEM +2%ブドウ糖
2. SEM +2%グリセリン
3. SEM +2%の酸性グリセリン
4. SEM +1%の酸性グリセリン+ 1 %ブドウ糖
5. SEM +2%の非酸性グリセリン
6. SEM +1%の非酸性グリセリン+ 1 %ブドウ糖
ナビクラ・ペリクロサ（Navicula pelliculosa）（UTEX 667）は、5×105セル/mlの濃度で、ブドウ糖または異なるグリセリン（純粋であるか、酸性か、非酸性）を含んでいる培地に植菌された。培地は、暗所に保持されて、430回転数/分で、Labnet（バークシア、英国）の軌道振盪機によって撹拌された。96時間の後、細胞発育は、乾燥細胞重量（実施例13を参照）で測定された。結果は、図13に示される。
【実施例１６】
【０４７１】
株および培地。
セネデスムス・アルマツス（Scenedesmus armatus）（UTEX 2552）およびナビクラ・ペリクロサ（Navicula pelliculosa）（UTEX 667）は、テキサス大学（オースティン、TX、米国）で、微細藻類の培養コレクションから得られた。保存種は、セネデスムス・アルマツス（Scenedesmus armatus）の改質プロテオース培地およびナビクラ・ペリクロサ（Navicula pelliculosa）（実施例1を参照）の土壌抽出物培地で維持された。
【０４７２】
実験計画および増殖測定。
各々の株のために、1mlの以下の異なる培地は、24穴プレートで準備された。
セネデスムス・アルマツス（Scenedesmus armatus）
5. プロテオース+1%の酸性グリセリン+ 1 %ブドウ糖
6. プロテオース+1%の酸性グリセリン+ 1 %ブドウ糖（72時間の後で加えられた）
ナビクラ・ペリクロサ（Navicula pelliculosa）
1. SEM +1%の酸性グリセリン+ 1 %ブドウ糖
2. SEM +1%の酸性グリセリン+ 1 %ブドウ糖（72時間の後で加えられた）
【０４７３】
それぞれの株は、5×105セル/mlの濃度で、培地に植菌された。培地は、暗所に保持されて、430回転数/分で、Labnet（バークシア、英国）の軌道振盪機によって撹拌された。72時間の最初の増殖の後、1%のブドウ糖は、サンプル#2に加えられて、さらに24時間を培養した。細胞発育は、乾燥細胞重量（実施例13を参照）で測定された。結果は、図14に示される。
【実施例１７】
【０４７４】
株および培地。
クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）（UTEX 31）は、テキサス大学（オースティン、TX、米国）で、AlgaeのCulture Collectionから得られた。保存種は、改質プロテオース培地（実施例1を参照）で維持された。
【０４７５】
実験計画。
各々の状態のために、1mlの以下の異なる培地は、24穴プレートに準備された。
4. プロテオース
5. プロテオース+0.5%ブドウ糖
6. プロテオース+0.5%キシロース
7. プロテオース+0.25%ブドウ糖+0.25 %キシロース
【０４７６】
クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）#4（UTEX 31）は、3×105細胞/mlの濃度に異なる糖（ブドウ糖またはキシロース）を含んでいる培地に植菌された。培地は、暗所に保持されて、430回転数/分で、Labnet（バークシア、英国）の軌道振盪機によって撹拌された。72時間の増殖の後、細胞発育は、各々の培地の菌体数を測定した。
結果は、図15に示される。
【実施例１８】
【０４７７】
クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）の株#1、#3、及び#4はテキサス大学（オースティン、TX、米国）で、藻類の培養コレクションから得られた。保存種は、改質プロテオース培地（実施例1を参照）で維持された。
各々の状態のために、1mlの以下の異なる培地は、24穴プレートに準備された。
1. プロテオース
2. プロテオース+1%ブドウ糖
3. プロテオース+1%フラクトース
【０４７８】
各々の株は、1×106セル/mlの濃度に異なる糖（ブドウ糖またはフラクトース）を含んでいる培地に植菌された。培地は、暗所に保持されて、430回転数/分で、Labnet（バークシア、英国）の軌道振盪機によって撹拌された。96時間の増殖の後、菌体密度は、各々の培地の計数菌体数で測定された。結果は、図20に示される。
【実施例１９】
【０４７９】
ショ糖上のクロレラ
材料および方法。
クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）（UTEX 249）は、3つの50mlのフラスコ中の1%のショ糖を有するプロテオース培地（2.94mMのNaNO3、0.428mMのK2HPO4、1.28mMのKH2PO4、0.427mMのNaCl、0.17mMのCaCl22H2O、0.3mMのMgSO47H2O、プロテオーゼペプトンlg/L）に、4x105細胞/mlの最終的な菌体密度になるように、摂取された。インベルターゼ（シグマ#14504）は、0.01のU/mlおよび0.05U/mlで培地2つに加えられた。全3つ培地は、暗所で150回転数/分60時間振盪のために大きくなった。
【０４８０】
結果。
最終的な体細胞数は、暗所で60hrsの振盪後で、全3つの培地で実行された。0.01U/mlおよび0.05U/mlフラスコがそれぞれ1x108および3x108の菌体密度に至るともにに、コントロールフラスコは4.4x105細胞/mlに到達した。各々のフラスコは顕微鏡分析によって実験終了後コンタミネーションを検査されたが、全てがきれいだった。
【実施例２０】
【０４８１】
クロレラの株のショ糖上での増殖。
クロレラ・ケッセレリ（Chlorella kessleri）（(a) UTEX 397および（b）UTEX 398）およびクロレラ・フスカ（Chlorella fusca）（(a) UTEX 251および（b）UTEX 1801）の培地は、自動栄養の液体培地から50mlのフラスコの10mlのプロテオース+1%のショ糖培地に1×106細胞/mlで植菌された。コントロール培地は、また、プロテオース培地だけを有する同じ密度で植菌された。培地は、暗所で7日間、28℃、250回転数/分で振盪培養され大きくなった。その位置では、菌体密度は血球計数器で測定された。図21-22に示すように、全4つの株は、最初の菌体密度およびプロテオースのみのコントロールと比較してショ糖で増殖した。
【実施例２１】
【０４８２】
ショ糖インベルターゼを有する糖蜜上でのクロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）の増殖
植菌のためのクロレラ細胞の準備
クロレラの10mlの液体培地での培養は、固体プロテオースプレートから植菌物を取り出し始められた。培地は、26℃でほぼ2日の間の光において大きくなった。増殖は、750nmの光学濃度計（OD）を使用して細胞乾燥重量を決定することによって測定された。
【０４８３】
糖蜜および糖溶液の準備。
以下の表13に示すように、5%の原液は、糖に砂糖きびの商業処理から得られるブドウ糖、ショ糖および3つの異なる糖蜜サンプル（BSl、BS2およびHTMにラベルをつけた）によって準備された。全ての株のpHは6-6.6の範囲であることを確かめられた、そして、株はそれからオートクレーブで処理された。
【０４８４】
糖蜜および糖溶液。
【表１３】
2010528627.tif 000007
【０４８５】
インベルターゼ解決手段の準備
インベルターゼの40単位/mlの原液は、10ミリリットルの蒸留水の400単位/mgのインベルターゼ（シグマ）の1mgを再構成することによって準備された。
【０４８６】
実験条件および準備。
10mlの培地は、プロテオースを基礎とする培地で、それぞれが1%の最終的な糖蜜/糖の濃度、0.05単位/mlのインベルターゼ、及びクロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）の1.0×106細胞/mlで、準備された。
培地は、以下の通りに番号をつけられた。
(1)培地のみのコントロール、
(2)1%のHTM、
(3)1%のBSl、
(4)1%のBS2、
(5)1%のブドウ糖、
(6)1%の蔗糖。
類似したコントロールセットは、また、インベルターゼの追加なしで準備された。培地は、暗所で28℃、250回転数/分、5日間の振盪で大きくなった。
【０４８７】
結果。
クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）細胞の増殖は、暗所でそれぞれの栄養源上の5日間の培養に続いて評価された。図23-24に示すように、細胞は、純粋な試薬用ブドウ糖上の増殖のそれと同等の収率を有するショ糖インベルターゼがある場合には、糖蜜に増殖することができる。外来ショ糖インベルターゼを発現するために、クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）の22の遺伝子工学を例示する
【実施例２２】
【０４８８】
外来ショ糖インベルターゼ発現のためのクロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）の遺伝的改変株および培地。
クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）（UTEX 250）は、テキサス大学（オースティン、TX、米国）で、藻類の培養コレクションから得られた。保存種は、改質プロテオース培地で維持された。改質プロテオース培地は、0.25gのNaNO3、0.09gのK2HPO4、0.175gのKH2PO4、0.025gのCaCl22H2O、0.075gのMgSO47H2Oおよび1リットルにつき2つのgイースト抽出物（g/L）から成る。
【０４８９】
プラスミド構造
クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）のインベルターゼの分泌を発現するために、サッカロマイセス・セルビジア（Saccharomyces cerevisiae）SUC2遺伝子は、3つの異なるプロモーターの制御の下に配置された。
35Sカリフラワーモザイクウイルス・プロモーター（CMV）、クロレラウイルス・プロモーター（NC-IA）及びクロレラHUPlプロモーター。
酵母SUC2遺伝子は、クロレラ・プロトセコイデス（C. protothecoides）のために最適化されるコドンの選択性を適応させるために合成されて、インベルターゼの細胞外の分泌を導くために必要なシグナル配列を含む。
各々の構造物は、pBluescript KS+、EcoRI/AscI、Ascl/XholおよびXhoI/BamHIサイトを組み込まれ、特定のプライマーを使用しているPCR ampilicationによって、各々のプロモーター、インベルターゼ遺伝子およびCMV 3'UTRを導入された。
精製されたPCR製品は、順次クローンをつくられた。最終的な構成概念の実例は、図25に示される。
【０４９０】
クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）の形質転換
それが6xl06細胞/mlの菌体密度に到達するまで、クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）培養は、75μmol光子m-2sec-1の連続照明下で旋回振盪機上の改質プロテオース培地で大きくなった。
【０４９１】
遺伝子銃の形質転換のために、Seashell TechnologyからのS550d金キャリアは、メーカーのプロトコルに従って準備された。一時的に、Bsalによる線形にされた構造物（20μg）は、60μl（3mg）のS550d金キャリア及び50μlの結合用緩衝液を混ぜ合わせられて、1分の間の氷の中でインキュベートされた。沈殿バッファ（100のμl）が加えられ、混合物はさらに1分の間の氷においてインキュベートされた。軽度のボルテックスの後、DNAコートの分子は、10秒の間のエッペンドルフマイクロチューブの10,000回転数/分で遠心し沈殿させた。金の沈殿物は、500μlの冷たい100%のエチルアルコールで一度洗浄されて、微量遠心管の遠心によって沈殿された、50μlの氷冷エチルアルコールによって再懸濁された。
短い（1-2秒）音波処理の後、10μlのDNAコートの分子は、キャリア膜に直ちに移転された。
細胞は、滅菌蒸留水で一度洗浄されて、50のμlの培地（1×107セル）で再懸濁されて収集されて、選択的でないプロテオースプレートの3番目の中心に広げられた。細胞は、PDS-1000/He Biolistic Particle Deliveryシステム（バイオラド）で衝突された。破裂板（1100および1350psi）が使われた、そして、プレートはスクリーン/マクロ・キャリヤ組立体の下に9-12cm配置された。細胞は、12-24時間の25℃にリカバーすることができた。
リカバーに応じて、細胞は、ゴムベラでプレートからこすり落されて、培地の100μlを混ぜ合わせられて、1%のショ糖を有する改質プロテオースプレートに広げられた。暗所で25℃7-10日間のインキュベートの後に、形質転換された細胞を発現しているコロニーは、プレートに現れた。
【０４９２】
エレクトロポレーションでの形質転換のために、細胞が収集されて、滅菌蒸留水を有する一度洗浄され、50mMのショ糖を含むトリス-リン酸緩衝液（20mのMトリス-HCl（pH 7.0）、1mMのリン酸カリウム）で4xl08細胞/mlの密度に再懸濁した。約250μl細胞懸濁液（lxl08cells）は、4mmのすきまの使い捨てのエレクトロポレーション・キュベットにおいて配置された。細胞懸濁液に、線形にされたプラスミドＤＮＡの5μgおよびキャリアDNA（サーモン精液DNAをせん断した）の200μgは、加えられた。エレクトロポレーション・キュベットは、それから10分間、16℃で、氷水浴においてインキュベートされた。電気的パルス（1100V/cm）は、それから、Gene Pulser II（バイオラドLabs、ヘラクレス、CA）エレクトロポレーション装置を使用し25μF（シャント抵抗が、エレクトロポレーションのために用いられなかった）のキャパシタンスで、キュベットに適用された。キュベットは、それから5分（細胞懸濁液が50mlの改質プロテオース培地へ転送された）の間の室温で暖められて、2日の間の旋回振盪機に振りかけられた。リカバー後、細胞は、低速（4000回転数/分）で収集されて、改質プロテオース培地で再懸濁されて、1%のショ糖を有する改質プロテオースプレート上の低密度で植菌された。暗所で25℃の培養の7-10日間後に、形質転換細胞を発現しているコロニーは、プレートに見えた。
【０４９３】
形質転換体のスクリーニングおよびジェノタイプ
コロニーは、暗所で培養した1%ショ糖を有する改質プロテオースプレートから拾い上げられ、細胞の同一量は1%のショ糖を有する1mlの改質プロテオース液体培地を含んでいる24枚のウェルプレートに移転された。培地は、暗所に保持されて、430回転数/分で5日間、Labnet（バークシア、英国）の軌道振盪機によって撹拌された。
【０４９４】
クロレラ・トランスフォーマントにおいて導かれるインベルターゼ遺伝子の存在を検査するために、各々の形質転換体のDNAは、分離されて、一組の遺伝子に特有の下塗りで増幅された（CMV構造物：順方向プライマー（CAACCACGTCTTCAAAGCAA)(配列番号：6）/逆方向プライマー（TCCGGTGTGTTGTAAGTCCA）（配列番号：9）、CV構造物：順方向プライマー（TTGTCGGAATGTCATATCAA)(配列番号：10）/逆方向プライマー（TCCGGTGTGTTGTAAGTCCA)(配列番号：11）及びHUPl構造物：順方向プライマー（AACGCCTTTGTACAACTGCA)(配列番号：12）/逆方向プライマー（TCCGGTGTGTTGTAAGTCCA)(配列番号：13))。
速いDNA隔離のために、細胞（サイズのほぼ5-10uL）の量は、50uLの10mMのNa-EDTAにおいて再懸濁された。細胞懸濁液は、10分の間の100℃でインキュベートされて、10秒超音波で破壊された。1分の間の12000gの遠心の後、3uLの上澄が、PCR反応のために使われた。PCR増幅は、DNAサーマルサイクラー（パーキン-エルマーGeneAmp 9600）において実行された。反応混合物（50uL）は、製造業者の指示に従って3uL抽出されたDNA、上述されているそれぞれのプライマー100pmol、200uM dNTP、Taq ＤＮＡポリメラーゼ（NEB）の0.5ユニットおよびTaqＤＮＡポリメラーゼ・バッファを含んだ。DNAの変性は、第1のサイクルの間の5分の間の95℃で実行され、それから30秒間実行された。プライマー・アニーリングおよび伸張反応は、それぞれ58℃30秒間、72℃位分間で実行された。PCR製品は、それから、1%のアガロースゲル上でエチジウムブロマイドを用いて着色され視覚化された。図26は、上で識別される遺伝子に特有のプライマーを使用しているクロレラ・プロテコイデス（C. protothecoides）形質転換体のPCR遺伝子型の結果を示す。矢印はPCR製品の予想される寸法を示す、そして、星印は各々のトランスフォーマントからDNAサンプルが予想されるサイズと合うPCR生産物を示していることを表す（V：ベクターのみ、WT：野生型）。
【０４９５】
液体培養での増殖
暗所で5日培養の後、遺伝子型が陽性の形質転換体は、暗所で最小の液体プロテオース培地+1%のショ糖上で増殖を示した。その一方で、野生型細胞は暗所の同じ培地でも増殖を示さなかった。
【実施例２３】
【０４９６】
酵母（S. cerevisiae）に由来する分泌されたインベルターゼを有する藻類の株への形質転換
分泌されたインベルダーゼ。
分泌されたショ糖インベルターゼ（サッカロマイセス・セルビジア（Saccharomyces cerevisiae）由来でジェンバンク登録番号 NP_012104）をコードしている遺伝子は、Cauliflower Mosaic Virus 35sプロモーターを所有しているpUC19誘導体と、EcoR I/Asc I及びXho/Sac Iカセットとしての3'UTRからサブクローニングされたpUC191599bp Asc I-Xho断片として新たに合成された。
【０４９７】
藻類の細胞の増殖
これらの実験において使用する培地は、液体培地（実施例１を参照）及び最終的な濃度が1%となるショ糖またはブドウ糖で形成する固定炭素源を含む固体培地（+1.5%寒天）であった。この実験において使用する株は、付加的な固定炭素源の非存在下の暗所で基本培地上では増殖しなかった。種は、プレートに打ち出されて、28℃の暗所で増殖される。
一つのコロニーは選ばれて、1%のブドウ糖を含んでいる500mLの液体ベース培地に植菌するために用いて、対数期の半ばまで暗所で培養され、毎日、細胞数を測定した。各々の以下の株は、以前暗所唯一の炭素源としてショ糖上の増殖を見つけるため検査され、増殖を示さなくて、このように分泌されたインベルターゼを有する形質転換体を選択された。
(1)クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）（UTEX 31）
(2)クロレラ・ミヌティッシマ（Chlorella minutissima）（UTEX 2341）
及び(3)クロレラ・エメルソニイ（Chlorella emersonii）（CCAP 211/15）。
【０４９８】
粒子衝撃を経た藻類の細胞の形質転換体
充分な培地は、ほぼ1-5x108の全細胞を与えるために遠心分離された。結果として生じる沈殿物は、加算固定炭素源なし基本培地で洗浄された。細胞は再び遠心分離され、沈殿物は5x107から2×108細胞/mlを与えるのに十分な基本培地の量において再懸濁された。250-1000μlの細胞は、それから、1%のショ糖で補充された固体基本培地に植菌され、無菌のフードのプレート上へ乾燥することができた。プラスミドＤＮＡは、メーカーの推奨（Seashell Technology、ラ・ホーヤ、CA）に従って、金の分子上へ誘発された。形質転換体は、破裂板ホルダから9cmでセットされるマクロ・キャリヤ組立体を有する1350psi破裂板を使用しているバイオラドPDS He-1000の分子デリバリー系を使用して行われた。
形質転換後の、プレートは、２８℃暗所でインキュベートされた。全ての株は、多数の形質転換体のコロニーを生成した。コントロールプレートは、インベルターゼを挿入せずに形質転換されるが、同一方法で準備されてもコロニーを含まなかった。
【０４９９】
クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）形質転換体の分析
ゲノムＤＮＡは、以下の通りにクロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）野生型細胞および形質転換体のコロニーから引き出された。細胞は、100ul抽出緩衝液（87.5mMのトリスCl、pH 8.0、50mMのNaCl、5mMのEDTA、pH 8.0、0.25%のSDS）の中に再懸濁し、逆位を経た混合物と60℃30分間でインキュベートされた。PCRのために、サンプルは、20mMのトリスCl（pH 8.0）で1：100に希釈された。
【０５００】
ジェノタイプは、野生株からのゲノムDNA、形質転換体及びプラスミドにされた。
サンプルは、マーカー遺伝子のためにジェノタイプされた。
プライマー2383（5'CTGACCCGACCTATGGGAGCGCTCTTGGC 3'）（配列番号：20）及び2279（5'CTTGACTTCCCTCACCTGGAATTTGTCG 3'）（配列番号：21）は、このジェノタイピングで使用する。
使用するPCRプロフィールは、以下の通りだった。5分間94℃の変性。94℃-30秒、60℃−30秒、72℃−3分、72℃−5分の35サイクル。
図27に示すように、同一のサイズのＡ帯は、クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）（UTEX 31）のポジティブコントロール（プラスミド）および2つの形質転換体から増幅された。
【０５０１】
クロレラ・ミヌティッシマ（Chlorella minutissima）およびクロレラ・エメルソニイ（Chlorella emersonii）形質転換体の分析
ゲノムＤＮＡは、以下の通りにクロレラ野生株および形質転換体から抽出された。
細胞は、100ul抽出緩衝液（87.5mMのトリスCl、pH 8.0、50mMのNaCl、5mMのEDTA、pH 8.0、0.25%のSDS）の中に再懸濁されて、逆位を経た混合物と60℃30分間でインキュベートされた。PCRのために、サンプルは、20mMのトリスCl（pH 8.0）で1：100に希釈された。ジェノタイプは、野生株からのゲノムDNA、形質転換体及びプラスミドにされた。サンプルは、マーカー遺伝子のためにジェノタイプにされた。
プライマー2336（5'GTGGCCATATGGACTTACAA 3'）（配列番号：22）及び2279（5'CTTGACTTCCCTCACCTGGAATTTGTCG 3'）（配列番号：21）は、指定されたプライマセット2（1215bpと予想される産物）であった、一方でプライマ2465（5'CAAGGGCTGGATGAATGACCCCAATGGACTGTGGTACGACG 3'）（配列番号：23）及び2470（5'CACCCGTCGTCATGTTCACGGAGCCCAGTGCG 3'）（配列番号：24）は、指定されたプライマセット4（1442bpである予想される産物）であった。
使用するPCRプロフィールは、以下の通りだった。2分の間の94℃の変性。94℃-30秒、60℃-30秒、72℃−1分、30秒、72℃-5分の29サイクル。
分泌されたインベルターゼを含んでいるコントロールプラスミドが、PCRのコントロールとして使われた。図28は、クロレラ・ミヌティッシマ（Chlorella minutissima）（UTEX 2341）の形質転換体および分泌されたインベルターゼをコードしている遺伝子を有する微細藻類のクロレラ・エメルソニイ（Chlorella emersonii）（CCAP 21 1/15）種を示す。
【０５０２】
インベルターゼ構造物の配列は、配列番号：25に対応する。
【実施例２４】
【０５０３】
藻類の種の増殖が、セルクラスト（R）を伴うセルロース栄養源上での、酵母（S. cerevisiae）と比較された。
株及び培養条件
この研究において使用する藻類の種は、下記の表14にリストされて、ブドウ糖の形で外因的に提供されたセルロース系材料および場合によっては付加的な固定炭素を有するProteoseメディアで大きくなった。24の藻類の株がこの研究において使われ、そして、クロレラ、2つのパラクロレラ（Parachlorella）および2つのプロトテカ（Prototheca）および各々の一つのバクテオコッカス（Bracteococcus）及びシュードクロレラ（Pseudochlorella）を含んでいる。酵母（Saccharomyces cerevisiae)(PJ-69-4A株）は、YPD培地（リットルあたり、10g バクトイースト抽出物、20gバクトペプトンおよび20gブドウ糖）で大きくなった。藻類および酵母は、暗所28℃で大きくなった。暗所のセルロース系材料または他の付加的な固定炭素の非存在下でプロテオース培地に対するこれらの株の増殖は、発生しなかったか、極めて最小限であった。
【０５０４】
酵素の脱重合処理を経たセルロース系材料からのブドウ糖の遊離
湿式の、爆発されたトウモロコシ茎葉材料は、1.4%の硫黄の酸性溶液のトウモロコシ茎葉を料理して、National Renewable Energy Laboratory（Golden, CO）によって準備され、結果として生じる懸濁液を脱水する。メットレール・トレド・モイスチュアー・アナライザを使用して、湿式のトウモロコシ茎葉の乾燥した固体は、24%であると同定された。
100gの湿式のサンプルは最終的な420ml量に脱イオン水の中に再懸濁し、pHは、10N NaOHを使用して4.8に調整した。セルクラスト（R）（ノボザイム）（セルラーゼ）は、 4%の最終濃度になるように加えられ、結果として生じる懸濁液は、50℃72時間で振盪でインキュベートされた。この材料のpHは、それからNaOH（ごくわずかなボリューム変化）で7.5に調整し、0.22umフィルタで殺菌されて濾過されて、-20°Cで保存した。サンプルは、後述するように、Sigmaからヘキソキナーゼ・ベースのキットを使用しているグルコース濃度の決定のために用意されていた。
【０５０５】
湿式のトウモロコシ茎葉のセルクラスト(R)の処理によって遊離されるグルコース濃度の同定
グルコース濃度は、Sigma Glucose Assay Reagent #G3293を使用して決定された。サンプルは、上述されるように処置され、400倍に希釈された、そして、40μlは反応に加えられた。トウモロコシ茎葉・セルロース化合物準備は、ほぼ23gの/Lのブドウ糖を含むために同定された。
【０５０６】
セルロースの栄養源で増殖する藻類の株。
【表１４】
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【０５０７】
表14において、そして、本願明細書において使われるように、UTEXはテキサス大学（オースティン、テキサス、米国）で藻の微生物収集に関連する、SAGはGottingen（Gottingen、ドイツ）大学で藻の微生物収集に関連する、CCAPは藻の微生物収集に関連する、そして、海洋科学（スコットランドは、キングダムを結合させた）およびCCALAのためのスコットランドの連合によって管理される原生動物は植物学（Tfebon、チェコ共和国）研究所で藻類の研究所の微生物収集に関連する。
【０５０８】
セルロース系材料上の増殖の決定
ブドウ糖、キシロースおよび他の単糖糖に対するセルロースの酵素処理および糖化の後、上で準備される材料は、それぞれ24の藻類の株の増殖またはプロテオース培地またはYPD培地の酵母（S. cerevisiae）のための栄養源として評価された。プロテオース培地は、23g/Lの最終的なグルコース濃度（トウモロコシ茎葉のセルロース分解性処置を経て発生するブドウ糖の終濃度）にされ、そして、純粋なブドウ糖および/または脱重合されたセルロース系材料の様々な量を加えることによって、酵母（S. cerevisiae）の培養のためのYPDとした。セルロース系材料の様々な濃度が含まれた。そして、各々の培地で23g/Lのブドウ糖の0、12.5、25、50および100%を提供した。これらの構成要素は下記の表15に示される。適切な培地の1mlは、24穴プレートのウェルに加えられた。YPDの28℃で従属栄養的に増殖する酵母（S. cerevisiae）は、酵母ウェルのための植菌材料（20ul）として用いられた。24の藻類の株のための20マイクロリットルの植菌材料は、20gの/Lのブドウ糖を含んでいるプロテオース培地で混合栄養的に増殖する藻類細胞によって供給された。
【０５０９】
セルロース栄養源の準備
【表１５】
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【０５１０】
表15は、脱重合されたトウモロコシ茎葉の容量が、プロテオースまたはYPD培地にはそれぞれマスメディアセルロースの指定された割合で含む収量に追加されたプロテオースまたはYPD培地成分を含むように変更されることを示す。培地は、全ての場合に23g/Lの最終的なグルコース濃度を得るように準備された。対数増殖期の中期に増殖した酵母または藻細胞のいずれの20μlの追加より前の培地の容量は、1mlであった。細胞は、28℃の振盪（300回転数/分）で、暗所のセルロースの栄養源の様々な濃度で2日間インキュベートされた。増殖は、UV分光光度計の750nmで、吸光度の測定によって評価された。驚くべきことに、全ての株は、セルクラストによって準備されるセルロース系材料で増殖した。そして、100%の発酵性糖が引き出されるセルロース材料であった培地状況を含んだ。
【実施例２５】
【０５１１】
さまざまなセルロース栄養源上の24の藻類株および酵母（S. cerevisiae）の増殖は、アセレラーゼ1000（R）およびセルクラスト（R）によって備えた
株および培養条件
この実施例において使用する藻類の株は、表14（上記）にリストされて、脱重合されたセルロース系材料を備える固定炭素および/または純粋なブドウ糖を加えたプロテオース培地で増殖された。酵母（Saccharomyces cerevisiae）（pJ69-4a株）は、脱重合されたセルロース系材料を備える固定炭素および/または純粋なブドウ糖を加えたYPD培地で増殖した。藻および酵母は、暗所28℃で増殖した。
【０５１２】
酵素的脱重合処理を経たセルロース系材料からのブドウ糖の遊離
湿式の、爆発されたトウモロコシ茎葉材料は、1.4%の硫黄の酸性溶液のトウモロコシ茎葉を料理して、結果として生じる泥漿を脱水することによって、国立Renewable Energy Laboratory（Golden、CO）によって準備された。スイッチグラスは、また、トウモロコシ茎葉のために同じ方法を利用している国立Renewable Energy Laboratory（Golden、CO）によって準備された。テンサイ・パルプ（ペクチナーゼ処理を経て発生する）は、フレデリック博士のAtlantic Biomass社によって供給された。Mettler Toledo Moisture analyzerを使用して、乾燥した固体は、湿式のトウモロコシ茎葉の24%、スイッチ草の26%およびテンサイ・パルプの3.5%であった。トウモロコシ茎葉またはスイッチグラスの100gの湿式のサンプルは最終的な420ml量に脱イオン水の中に再懸濁された、そして、pHはNaOHイオンを使用して4.8に調整した。ビート・パルプのために、8.8グラムの乾燥した固体は、脱イオン水で350mlに調整した、そして、pHはNaOHイオンで4.8に調整した。全ての栄養源のために、アセレラーゼ1000（R)(Genencor）（セルラーゼ酵素複合体）は、グラム乾燥したバイオマスにつき0.25mlの酵素の比率で使用した。サンプルは、72時間の50℃で振動（110回転数/分）によってインキュベートされた。この材料のpHはそれからNaOH（ごくわずかなボリューム変化を伴う）で7.5に調整された。そして、フィルタが0.22umフィルタによって殺菌されて、下で概説される増殖実験で用いられた。サンプルは、後述するように、Sigmaからヘキソキナーゼ・ベースのキットを使用しているグルコース濃度の決定のために用意された。セルロースの栄養源の同一セットは、また、前記の実施例で上述したセルクラスト（R)(ノボエンザイム）（セルラーゼ）を使用して用意された。
【０５１３】
Accellerase 1000でのさまざまなセルロースの栄養源の処理後のグルコース濃度の決定
グルコース濃度は、Sigma Glucose Assay Reagent #G3293を使用して決定された。サンプルは、上述する処理をされ、400倍に希釈し40ulは反応に加えられた。トウモロコシ茎葉、スイッチ草およびビート・パルプからのセルロースの準備は、それぞれ、ほぼ23.6、17.1および13.7gの/Lのブドウ糖を含むと同定された。
【０５１４】
セルロース系材料上の増殖の決定
セルロース源の酵素の脱重合後のブドウ糖、キシロースおよび他の単糖、上で準備される材料は、プロテオースまたはYBD培地で酵母（S. cerevisiae）及び表14にリストされる24の藻類の株の増殖のための栄養源として、評価される。トウモロコシ茎葉、スイッチグラスまたはビート・パルプ由来のセルロース材料の量を変化させた間、培地は、ブドウ糖を一定濃度含むように改変されていた。プロテオースおよびYPD培地の第1セットは、23.6g/Lの純粋なブドウ糖を含み、一方、培地の第2セットは、トウモロコシ茎葉、スイッチグラスおよびビート・パルプを脱重合した。そして、それぞれは23.6gの/Lのブドウ糖を含んだ。スイッチグラスおよびビート・パルプ培地は、全てのセルロース培地中のブドウ糖を23.6g/Lに維持するために、6.5および9.9gの/Lの純粋なブドウ糖を補充された。適切な培地の1mlは、24穴プレートのウェルに加えられた。28℃のYPDで従属栄養的に増殖する酵母（S. cerevisiae）は、酵母ウェルのための植菌物（20ul）として役立った。
20μlの24藻類の株の植菌物は、20g/lのグルコースを含むプロテオース培地で混合栄養的に増殖される藻類の細胞によって備え、全ての細胞は、二日間暗所でセルロース栄養源の様々な濃度で振盪（300回転数/分）によりインキュベートされた。増殖は、UV分光光度計の750nmで、吸光度の測定によって評価された。驚くべきことに、全ての藻類の株は、アセレラーゼ1000（R）またはセルクラスト（R）によって準備されるトウモロコシ茎葉、スイッチグラスおよびビート・パルプ材に増殖した。そして、100%の発酵性糖がセルロース由来だった培地条件を含んだ。セルロース栄養源および脱重合酵素の組み合わせのない下で、酵母（S. cerevisiae）は、同量の純粋なブドウ糖上での増殖より効率が良く、セルロース系材料の酵母の増殖に対する阻害剤が発酵の生産性に大きな影響を与えることを示す。
藻類の株、脱重合酵素及び100%セルロースから派生した単糖の栄養源の組み合わせは、表16で示すように100%純粋なブドウ糖より効率が良い。
【０５１５】
藻、酵素および栄養源の組合せ
【表１６】
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【実施例２６】
【０５１６】
有用な炭素源のスクリーニング
株及び培養条件
下で特定される微細藻類のさまざまな株の種培養は、24穴プレートの1mlの液体培養で始まり、光源下で48時間350回転数/分で撹拌し自動栄養的に増殖した。プレートは、唯一の固定炭素源として1%のブドウ糖、グリセリン、キシロース、蔗糖、フラクトース、アラビノース、マンノース、ガラクトースまたは酢酸塩を含んでいる1.5%のアガロース・ベースの中実のプロテオース培地を有する準備であった。各々の株のために、自動栄養性の24穴プレートからの5μlの培地は、固定培地に植菌された。プレートは、28℃の暗所で7日間インキュベートされ、付加的な固定炭素を含んでいないコントロールプレートと比較しての増殖を調べた。下記の表17に示すように、増殖は、各々のそれぞれの栄養源でテストされる各々の種のために観察された。暗所で付加的な固定炭素の非存在下でプロテオース培地に対するこれらの株の増殖は、発生しなかったか、極めて最小限しかなかった。
【０５１７】
さまざまな固定炭素栄養源上で増殖する藻類の種
【表１７】
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【実施例２７】
【０５１８】
再生産できるディーゼルの生産
細胞製造
クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）（UTEX 250）のF-Tankバッチ（約1,200ガロン）は、抽出過程の間のバイオマスを生成するために用いた。バッチ（#ZA07126）は、100時間動作することができた、その間コーンシロップが終了した後に16g/Lでブドウ糖レベルを制御した。残余のブドウ糖レベルは、 2時間後、<0g/Lに落ちた。
これは、最後には102時間齢の結果になった。最終的なブロス容量は、1,120ガロンであった。製造過程の汚染検査および最終的なブロスサンプルの徹底的な分析は、汚染の徴候を示すことに失敗した。培地は、遠心分離され、ドラムは乾燥した。ドラム乾燥細胞は、ヘキサンの中に再懸濁されて、ほぼ1000本バーで均質にされた。ヘキサン抽出は、それから、標準分析法を使用して実行された、そして、結果として生じる藻類のトリグリセリド油は残余のヘキサンで自由であると決定された。
【０５１９】
再生産できるディーゼルの生産
藻類のトリグリセリド油は、ほぼ3%のC18:0、71%のC18：1、15%のC18：2、1%のC18：3、8%のC16：0および2%のその他であった。油は、最初に加水分解を受け、水およびガスに近似の20%の収率損失に結果としてなった。水素異性化は、ガスに対する収率の近似の10%の損失としてそれから実行された。第1の蒸留はそれから、ナフタ分画を取り除くために実行し、目的とする産物を残した。材料のほぼ20%は、この第1の蒸留のナフタを失った。第2の蒸留は、それから、ASTM D975仕様を満たすのに必要な分画を取り除くが、D975蒸留のための90%の位置を満たさなかった底の分画を残すのに十分な温度で実行された。材料のほぼ30%は、第2の蒸留の底の断片に残された。結果として生じる材料は、それから全てのASTM D975仕様を見つけるため検査された。
【０５２０】
図29および30は、ガスクロマトグラフおよび沸点配布が、それぞれ、本発明の方法によってできる最終的な更新できるディーゼル製品の中で座標によって位置が決定することを示す。
表18は結果として生じる再生産できるディーゼル製品の沸点配布を示す、そして、表19はASTM D975仕様の遵守のための最終産物の分析の結果を示す。
【０５２１】
再生産できるディーゼル製品の沸点配布。
【表１８】
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【０５２２】
D975仕様で使用する再生できるディーゼル製品の分析報告書
【表１９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2010528627.tif 000019
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2010528627.tif 000023
【図１１】
2010528627.tif 000024
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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