(57)【要約】  粘膜疾患を治療するのに、免疫調節化合物を利用する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体において、粘膜の疾患による組織の崩壊、傷害又は損傷を治療、予防、阻害又は低減するため、又は該疾患によって悪影響を受けた組織を再生するための治療方法であって、該被験体に、有効量の式Ａ
【化１】
2010518160.tif 000030
（式中、ｎが１又は２であり、Ｒが水素、アシル、アルキル又はペプチド断片であり、Ｘが芳香族アミノ酸若しくは複素環アミノ酸、又はそれらの誘導体である）の免疫調節化合物を投与することを含む、治療方法。
【請求項２】
ＸがＬ−トリプトファン又はＤ−トリプトファンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記化合物がＳＣＶ−０７である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記化合物を約０．００１ｍｇ〜２０００ｍｇの範囲内の用量で投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記化合物を約０．０１ｍｇ〜１００ｍｇの範囲内の用量で投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記化合物を約０．１ｕｇ／ｋｇ（被験体の体重）〜１０，０００ｕｇ／ｋｇ（被験体の体重）の範囲内の用量で投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記化合物を約１ｕｇ／ｋｇ（被験体の体重）〜１，０００ｕｇ／ｋｇ（被験体の体重）の範囲内の用量で投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記疾患が、被験体への放射線又は化学療法の少なくとも１つによって生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記粘膜が口腔又は食道の少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記疾患が粘膜炎又は潰瘍性病変の少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記放射線を少なくとも約１５Ｇｙの累積線量で投与する、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記放射線を少なくとも約４０Ｇｙの累積線量で投与する、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記放射線を少なくとも約６０Ｇｙの累積線量で投与する、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記化学療法がシスプラチンを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
前記シスプラチンを０．１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲内の用量で投与する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記シスプラチンを約５ｍｇ／ｋｇの用量で投与する、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、粘膜疾患治療の分野に関する。
【０００２】
［関連出願の相互参照］
本願は、２００７年２月１３日に提出した米国仮特許出願第６０／９００９７７号明細書の利点を主張する。
【背景技術】
【０００３】
口腔潰瘍性粘膜炎は、一般的に疼痛を伴い、癌用の薬剤及び放射線療法の用量を制限する毒性がある。この障害は、潰瘍性病変の形成を引き起こす口腔粘膜の破壊を特徴とする。顆粒球減少患者において、粘膜炎に伴って起こる潰瘍形成が、しばしば敗血症又は菌血症を引き起こす固有の口腔細菌の侵入路となることが多い。抗新生物剤療法を受ける患者の３分の１超で或る程度、粘膜炎が起こる。白血病のために導入療法、又は骨髄移植のために移植前治療（conditioning regimens）の多くで治療される患者では、その頻度及び重症度が有意に大きくなる。これらの個体のうち、中度から重度の粘膜炎患者が４分の３を超えることは珍しいことではない。頭頸部の腫瘍のために放射線療法を受ける実質的に全ての患者で、中度から重度の粘膜炎が起こり、典型的に１５Ｇｙの累積暴露で発症した後、総線量が６０Ｇｙ以上になると悪化する。
【０００４】
臨床的に、粘膜炎は３つの段階にわたって進行する：
１．有痛性の粘膜紅斑に伴って起こる炎症、これは局部麻酔薬に影響され得る。
２．偽膜形成を伴う有痛性の潰瘍形成、及び骨髄抑制治療の場合、抗菌療法が要求される命を脅かす危険性がある敗血症。非経口の麻薬性鎮痛薬が要求されるような強度の疼痛があることが多い。
３．抗新生物療法の中止の約２週〜３週後で起こる自然治癒。
【０００５】
粘膜炎に標準的な療法は、大部分が苦痛緩和性であり、リドカイン等の局所鎮痛薬の適用及び／又は麻酔薬及び抗生物質の全身投与を含む。現在、口腔粘膜炎用の認可された唯一の治療、ケピバンス（パリフェルミン）が存在し、これは唯一、血液悪性腫瘍の治療のための造血幹細胞移植の前に移植前治療を受ける患者における口腔粘膜炎の治療に認可されている。
【０００６】
生物学的プロセスとしての粘膜炎の複雑性は、近年になってようやく認識されてきている。この状態は、口腔粘膜細胞及び組織と、活性酸素種と、炎症誘発性サイトカインと、アポトーシスの媒介因子と、唾液及び口腔微生物叢等の局所因子との連続的な相互作用を示すことが示唆されている。上皮の変性及び破壊が最終的に粘膜潰瘍形成を引き起こすが、放射線によって誘導された粘膜毒性に関連する早期変化は、内皮、及び粘膜下層の結合組織中で起こると考えられる。放射線照射の１週間以内の粘膜の電子顕微鏡評価によって、上皮ではなく、内皮及び結合組織の両方で損傷が示されている。このような傷害は、フリーラジカル形成によって媒介される可能性がある。粘膜炎発症の全体的な機構は、放射線及び化学療法の両方の場合で類似していると考えられる。
【０００７】
粘膜疾患を治療又は予防する方法における改善に対する必要性が、依然として当該技術分野に残っている。
【発明の概要】
【０００８】
一態様によれば、被験体において、粘膜の疾患による組織の崩壊、傷害又は損傷を治療、予防、阻害又は低減するため、又は該疾患によって悪影響を受けた組織を再生するための治療方法は、該標的被験体に、有効量の式Ａの免疫調節化合物を投与することを含む。
【０００９】
【化１】
2010518160.tif 000002
【００１０】
式Ａにおいて、ｎが１又は２であり、Ｒが水素、アシル、アルキル又はペプチド断片であり、Ｘが芳香族アミノ酸若しくは複素環アミノ酸、又はそれらの誘導体であり、前記少なくとも１つのインターフェロンを前記標的被験体に投与することなく、前記免疫調節化合物を該標的被験体に投与する。好ましくは、ＸがＬ−トリプトファン又はＤ−トリプトファンである。本発明は、粘膜疾患の治療用の薬物の調製における式Ａの化合物の使用にも関する。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、粘膜疾患又はその疾患徴候に適用可能である。好ましい実施形態では、粘膜疾患は、被験体、好ましくはヒト患者における放射線及び／又は化学療法によって引き起こされる。放射線は、急性であっても又は分割されていてもよい。粘膜疾患は、放射線と化学療法との組合せによって引き起こされ得る。或る特定の実施形態では、疾患（例えば粘膜炎及び／又は潰瘍性病変）は、口腔及び／又は食道の粘膜で起こる。
【００１２】
一実施形態によれば、本発明は、免疫調節化合物を哺乳動物被験体、好ましくはヒト患者に投与することによる粘膜炎の治療に関する。
【００１３】
或る特定の実施形態において、患者に放射線及び／又は化学療法剤を投与する前、投与中、及び／又は投与した後、本発明の免疫調節化合物を投与する。放射線は多くの場合、複数の線量で投与するが、頭頸部の腫瘍のために放射線療法を受ける実質的に全ての患者で粘膜疾患が起こり、これは典型的に、１５Ｇｙの放射線の累積暴露で発症した後、放射線の総累積線量が６０Ｇｙ以上になると悪化する。好ましい実施形態では、患者に７Ｇｙ〜８Ｇｙ（例えば７．５Ｇｙ）の放射線、又は患者に１５Ｇｙ、４０Ｇｙ、６０Ｇｙ以上の放射線を投与する前、投与中、及び／又は投与した後、本発明による免疫調節化合物を投与する。
【００１４】
シスプラチン等の化学療法剤の投与、例えば約０．１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲内、例えば約５ｍｇ／ｋｇの用量での投与によって引き起こされる粘膜疾患の治療又は予防のために、本発明の免疫調節化合物を投与することもできる。
【００１５】
本発明に従って使用する免疫調節化合物は、式Ａ：
【００１６】
【化２】
2010518160.tif 000003
【００１７】
の免疫調節剤を含む。
【００１８】
式Ａにおいて、ｎは１又は２であり、Ｒは水素、アシル、アルキル、又はペプチド断片であり、Ｘは芳香族アミノ酸若しくは複素環アミノ酸、又はこれらの誘導体である。好ましくは、ＸはＬ−トリプトファン又はＤ−トリプトファンである。「Ｘ」に対する芳香族アミノ酸又は複素環アミノ酸の適切な誘導体は、アミド、モノ−又はジ−（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル置換アミド、アリールアミド、及び（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルエステル又はアリールエステルである。「Ｒ」に適切なアシル部又はアルキル部は、炭素数１〜約６の分岐アルキル基又は非分岐アルキル基、炭素数２〜約１０のアシル基、及びカルボベンジルオキシ及びｔ−ブチルオキシカルボニル等の保護基である。ｎが２の時、式Ａに示されるＣＨ基の炭素は、Ｘの立体配置と異なる立体配置を有していることが好ましい。
【００１９】
好ましい実施形態では、γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン、γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン、γ−Ｌ−グルタミル−Ｎin−ホルミル−Ｌ−トリプトファン、Ｎ−メチル−γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン、Ｎ−アセチル−γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン、γ−Ｌ−グルタミル−Ｄ−トリプトファン、β−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−トリプトファン、及びβ−Ｄ−アスパルチル−Ｌ−トリプトファン等の化合物が利用される。特に好ましい実施形態では、γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン（ＳＣＶ−０７と称することもある）が利用される。これらの化合物、これらの化合物の調製方法、これらの化合物の薬学的に許容可能な塩、及びこれらの製剤処方は、米国特許第５，９１６，８７８号明細書に開示され、参照により本明細書中に援用される。
【００２０】
γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファンであるＳＣＶ−０７は、γ−グルタミル部又はβ−アスパルチル部を有する免疫調節剤群の成員であり、これはロシアの科学者によって発見され、SciClone Pharmaceuticals, Inc.により米国で幾つかの症状に対する有効性が試験されている。ＳＣＶ−０７は、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏで多くの免疫調節活性を有している。ＳＣＶ−０７はＣｏｎ−Ａにより誘導される胸腺細胞及びリンパ細胞の増殖を高め、Ｃｏｎ−Ａにより誘導されるインターロイキン−２（ＩＬ−２）の生成及び脾臓リンパ細胞によるＩＬ−２受容体の発現を高めて、骨髄細胞におけるＴｈｙ−１．２の発現を刺激する。ｉｎ  ｖｉｖｏでは、ＳＣＶ−０７は、５−ＦＵ免疫抑制動物及びヒツジの赤血球による免疫付与モデルにおける免疫刺激性の効果が強い。
【００２１】
約０．００１ｍｇ〜２０００ｍｇ、より好ましくは約０．０１ｍｇ〜１００ｍｇの範囲の調剤として、式Ａの化合物を投与することができる。１日に１回又は複数回の調剤の投与で、１週間に１回又は複数回、好ましくは毎日、調剤を投与してもよい。経口、鼻孔、経皮、舌下、注射による、定期的な注入、連続注入等を含む任意の好適な方法で、投与することができる。この調剤は、筋肉内注射で投与することができるが、他の形態の注射及び注入を利用することができ、経口吸入、鼻孔吸入、又は経口摂取等の他の投与形態を用いることができる。
【００２２】
投薬量はまた、１ｋｇ当たりのμｇで測定することができ、その調剤は約０．１ｕｇ／ｋｇ〜１００００ｕｇ／ｋｇの範囲内、より好ましくは約１．０ｕｇ／ｋｇ〜１０００μｇ／ｋｇの範囲内である。
【００２３】
置換部(substituted)、欠失部、伸長部、置き換え部(replaced)、又はそうでなければＳＣＶ−０７と実質的に同等の生物活性のある修飾部を有する生物学的に活性な類似体、例えばＳＣＶ−０７と実質的に同等の活性を伴って、実質的に同じ方法で機能するような、ＳＣＶ−０７と十分に相同性であるＳＣＶ−０７由来ペプチドが含まれる。
【００２４】
幾つかの実施形態において、式Ａの化合物は、注射用水、生理的濃度若しくは同等濃度の生理食塩水等の薬学的に許容可能な液体担体中、又は好適な乾燥担体（複数可）及び賦形剤（複数可）を有する錠剤形態中に存在する。
【００２５】
式Ａの化合物の有効量は、日常的な用量漸増実験によって確定することができる。
【実施例】
【００２６】
実施例１
ハムスターにおける急性放射線によって誘導された口腔粘膜炎の治療におけるＳＣＶ−０７の初期試験
１．  目的
この試験の目的は、急性放射線によって誘導されたハムスターの疾患モデルを使用する、口腔粘膜炎の治療におけるＳＣＶ−０７の有効性の予備評価を行うことであった。放射線照射の１日前から始まり、放射線照射の１６日後まで続く１８日間、１日１回皮下注射で、１ｕｇ／ｋｇ、１０ｕｇ／ｋｇ又は１００ｕｇ／ｋｇの用量でＳＣＶ−０７を与えた。処理群のいずれでも致死は観察されず、成長速度の統計的に有意な変化はなく、このことはＳＣＶ−０７がこれらの用量で十分に耐容性であったことを示唆している。−１日〜１６日に１０ｕｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７で処理した動物は、２２日での粘膜炎スコアにおいて統計的に有意な低減を示した（Ｐ＝０．０２４）。−１日〜１６日に１００ｕｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７で処理した動物は、スコアが３以上の日があった動物の数の統計的に有意な低減（Ｐ＝０．０２９）に加えて、１４日での粘膜炎スコアにおいて統計的に有意な低減を示した（Ｐ＝０．０２５）。これらのデータによって、ＳＣＶ−０７が、放射線によって誘導された粘膜炎の重症度及び経過に対する用量依存的な利点を示したことが示唆される。
【００２７】
急性放射線モデル
ハムスターにおける急性放射線モデルは、抗粘膜炎化合物の予備評価を与えるのに、正確で、効率的且つ費用効果がある技法であることが分かっている。このモデルでの粘膜炎の経過は十分に規定され、放射線照射のおよそ１４日〜１６日後でスコアがピークに達する。急性モデルには全身毒性がほとんどなく、少しのハムスターが死に至るだけであり、これにより初期有効性試験においてより小さい群（Ｎ＝７〜８）の使用が可能になる。粘膜炎の発病における特定の機構因子を研究するのにも急性モデルは使用されている。急性放射線モデルで有効性を示す分子は、分割化された放射線、化学療法、又は併用療法のより複雑なモデルでさらに評価してもよい。
【００２８】
この研究では、０日目で４０Ｇｙの急性放射線量を投与した。１２日目〜２８日目にかけて、臨床的に有意な粘膜炎が観察された。
【００２９】
２．  研究目的及び要約
研究目的
この研究の目的は、急性放射線によって誘導された口腔粘膜炎の頻度、重症度及び期間に対する、放射線照射の１日前と放射線照射の１６日後との間の様々なスケジュールで皮下注射で投与したＳＣＶ−０７の効果を評価することであった。
【００３０】
研究の要約
３２匹のシリアンゴールデンハムスターに、０日目に左側の頬袋に向けて４０Ｇｙの急性放射線量を与えた。１日１回、皮下注射によって試験材料を与えた。投与は、放射線照射の１日前から始め（−１日目）、１６日目まで続けた。６日目から始め、２８日目まで隔日で続けて粘膜炎を臨床的に評価した。
【００３１】
３．  評価
粘膜炎評価
６日目から始め、その後２日毎に２８日まで（２８日目を含む）粘膜炎の悪性度をスコア付けした。プラシーボと比較した、各薬剤処理の粘膜炎に対する効果を以下のパラメータに従って評価した：
【００３２】
各群におけるハムスターが潰瘍性（スコア≧３）粘膜炎になる日数の差
各評価日で、各薬剤処理群において盲検粘膜炎スコアが３以上の動物の数を対照群と比較した。累積ベースで差を比較し、カイ二乗解析によって、統計的有意性を求めた。この解析において、対照群と比較した場合の、動物群が潰瘍形成した（スコア≧３）日数の有意な低減によって有効性を定義する。
【００３３】
１日粘膜炎スコアの順位和の差
各評価日に対して、ノンパラメトリック順位和解析を用いて、対照群のスコアを処理群のスコアと比較した。処理の成功は、６日〜２８日の２日以上での処理群におけるスコアの統計的に有意な減少と見なした。
【００３４】
体重及び生存率
粘膜炎重症度及び／又は処理によって起こり得る毒性に対する指標として、処理群間での動物の体重の起こり得る差を評価するために、毎日全ての動物を秤量し、それらの生存率を記録した。
【００３５】
４．  研究設計
３２匹のシリアンゴールデンハムスターを各８匹の４つの動物群に分けた。全ての動物は、０日目に左側の頬袋に向けて４０Ｇｙの単一線量の急性放射線を受けた。動物を麻酔し、左側の頬袋をめくり、動物の残りの部分を鉛遮蔽物で保護することで、これを達成した。表１で詳述するように、１日１回の皮下注射で試験材料を与えた。６日目から始め２８日目まで隔日で続けて、粘膜炎を臨床的に評価した。
【００３６】
【表１】
2010518160.tif 000004
【００３７】
５．  材料及び方法
研究の実施場所
Cambridge MAにあるBiomodels AAALAC公認施設で研究を行った。Biomodels IACUCから、この研究に対する認可を得た。
【００３８】
動物
研究の開始時の平均体重が８５．３ｇであった５〜６週齢の雄のＬＶＧシリアンゴールデンハムスター（Charles River Laboratories）を使用した。耳パンチを使用して動物に個々に番号を付け、１つのケージ当たり８匹の小さい動物群で収容した。研究開始前に動物を順応させた。この５日の期間の間、状態不良を示す動物を排除するために、動物を毎日観察した。
【００３９】
ハウジング
７０華氏度±５華氏度の温度及び５０％±２０％相対湿度の濾過空気を与えた動物室で研究を行った。動物室は、１時間当たり最低１２回〜１５回の換気を維持するように設定した。動物室は、薄明のない１２時間の明期と１２時間の暗期との明／暗サイクルで自動タイマーにおいた。Ｂｅｄ−Ｏ−Ｃｏｂｓ（登録商標）敷料を使用した。敷料は、最低１週間に１回変えた。ケージ、上蓋（tops）、ボトル（bottles）等を市販の洗剤で洗い、空気乾燥させた。フード（hood）に導入される表面及び材料を消毒するのに、市販の消毒剤を使用した。フロアを毎日清掃し、市販の洗剤で最低１週間に２回モップ掛けした。壁及びケージラックを希釈漂白溶液で最低１ヶ月に１回スポンジ掛けした。研究、用量、動物番号及び処理群を識別するのに必要である適切な情報を備えるケージカード又はラベルで全てのケージを印付けした。温度及び相対湿度を研究中に記録し、その記録は残した。
【００４０】
食餌
動物に、Ｐｕｒｉｎａ  Ｌａｂｄｉｅｔ（登録商標）５０６１齧歯類用の食餌を与え、水を自由に与えた。
【００４１】
動物の無作為化及び配分
放射線照射前に動物を無作為に予め４つの処理群に分けた。個々の番号に対応して、耳パンチで各動物を識別した。タグは研究中に外れる可能性があるので、より一貫した識別のために、タグ付けではなく耳パンチによるナンバリングを使用した。各ケージを識別するのにケージカードを使用するか、又はラベルに研究番号（ＳＣＩ−０１）、処理群番号及び動物番号を印付けした。
【００４２】
皮下投与及び薬剤適用
試験化合物ＳＣＶ−０７を粉末で準備し、投与直前に滅菌ＰＢＳ中に溶解した。３つの希釈液を調製した：１００μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ及び１μｇ／ｍＬ。薬剤は、２７Ｇニードルを備えたツベルクリンシリンジを使用して、各群にＳＣＶ−０７の適切な希釈率で体重１００ｇ当たり０．１ｍＬの容量で与えた。背側又は腹側に皮下注射した。
【００４３】
粘膜炎誘導
標準化した急性放射線プロトコルを使用して、粘膜炎を誘導した。０日目に、単一線量の放射線（４０Ｇｙ／投与）を全ての動物に投与した。０．３５ｍｍ径のＣｕ濾過システムで硬化させた、焦点距離３０ｃｍの電位１６０ｋＶ(１５−ｍａ）の電源で放射線を発生させた。照射は、３．２Ｇｙ／分の速度で左側の頬袋の粘膜を標的とした。照射前に、ケタミン（１６０ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（８ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射によって動物を麻酔した。左側の頬袋をめくり、固定して、ハムスターの身体の他の部位を全て保護するのに鉛遮蔽物を使用して隔離した。
【００４４】
粘膜炎スコア付け
上記の研究を通して、粘膜炎スコア、体重変化及び生存率を測定した。粘膜炎の評価のために、吸入麻酔薬によって動物を麻酔し、左側の頬袋をめくった。有効写真尺度との比較によって、粘膜炎を視覚的にスコア付けした。スコアは正常の０から、重度の潰瘍形成の５までの範囲であった（臨床的なスコア付け）。記述用語において、この尺度は以下のように定義する：
【００４５】
【表２】
2010518160.tif 000005
【００４６】
１〜２のスコアは、軽度の段階の疾患を表すと考えられるが、３〜５のスコアは、中度から重度の粘膜炎を示すと考えられる。視覚的なスコア付けの後、標準化技法を用いて、各動物の粘膜を撮影した。実験の結果、全てのフィルムを現像し、無作為に写真に番号を付けた。少なくとも２つの独立した熟練の（trained）観察者等が、上記の尺度（盲検スコア付け）を用いて盲検様式で写真を格付けした。
【００４７】
６．  結果及び考察
６．１  生存率
この研究中に、致死は観察されなかった。
【００４８】
６．２  体重変化
１日平均の体重変化率のデータを評価した。生理食塩水（ＰＢＳ）処理した対照ハムスターは、研究中、平均して出発体重の７０．４％増加した。−１日〜１６日に１ｕｇ／ｋｇでＳＣＶ−０７を受けた群におけるハムスターは、研究中、平均して出発体重の６８．４％増加した。−１日〜１６日に１０ｕｇ／ｋｇでＳＣＶ−０７を受けた群におけるハムスターは、研究中、平均して出発体重の７０．３％増加した。−１日〜１６日に１００ｕｇ／ｋｇでＳＣＶ−０７を受けた群におけるハムスターは、研究中、平均して出発体重の８２．０％増加した。各動物の体重増加に対する曲線下面積（ＡＵＣ）を算出した後、一方向ＡＮＯＶＡ検定を用いて異なる処理群を比較することによって、これらの有意差を評価した。この解析の結果は、異なる処理群間で有意差がなかったことを示していた（Ｐ＝０．１９１）。
【００４９】
６．３  粘膜炎（表３及び表４）
各群に対する１日平均の粘膜炎スコアを算出した。生理食塩水処理した対照群では、粘膜炎のピークレベルは２０日目に見られ、平均スコアが３．８に達した。−１日〜１６日に１ｕｇ／ｋｇでＳＣＶ−０７を受けた群では、１６日目で３．８のピーク平均粘膜炎スコアであった。−１日〜１６日に１０ｕｇ／ｋｇでＳＣＶ−０７を受けた群では、１６日目で３．７のピーク平均粘膜炎スコアであった。−１日〜１６日に１００ｕｇ／ｋｇでＳＣＶ−０７を受けた群では、１８日目で３．４のピーク平均粘膜炎スコアであった。各群に対してスコアが３以上であった日数を算出し、カイ二乗検定を用いてこれらの日数を比較することによって、異なる処理群間で見られた有意差を評価した。この解析の結果を表２に示す。生理食塩水処理した対照群におけるハムスターは、評価した日数（animal days）の４６．９％でスコアが３以上であった。−１日〜１６日に１ｕｇ／ｋｇでＳＣＶ−０７を受けた群でも、評価した日数の４６．９％で３以上の粘膜炎スコアが観察された。−１日〜１６日に１０ｕｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７で処理した群におけるハムスターは、それぞれ日数の３７．５％でスコアが３以上であったが、これは対照とは統計的に有意な差はなかった（Ｐ＝０．０７９）。−１日〜１６日に、１００ｕｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７で処理した群は、日数の３５．４％でスコアが３以上であり、これは対照と有意な差があった（Ｐ＝０．０２９）。
【００５０】
マンホイットニー順位和解析を用いて粘膜炎スコアのさらなる解析を行い、それぞれの日のそれぞれの群に対するスコアを比較した。この解析の結果を表４に示す。この解析では、粘膜炎の顕著な低減と見なす前に、一般的に２日の粘膜炎スコアの有意な低減を必要とする。−１日〜１６日に１ｕｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７で処理した群は、生理食塩水対照と比較して、研究のいずれの日でも全く統計的に有意な改善を示さなかった。−１日〜１６日に１０ｕｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７で処理した群は、２２日目で対照と比較して有意な改善を示した（Ｐ＝０．０２４）。−１日〜１６日に１００ｕｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７で処理した群は、対照と比較して１４日目で有意な改善を示した（Ｐ＝０．０２５）。
【００５１】
【表３】
2010518160.tif 000006
【００５２】
【表４】
2010518160.tif 000007
【００５３】
結論
１．致死率及び体重増加の観察に基づく、この研究におけるＳＣＶ−０７による毒性の痕跡は全く存在しなかった。
２．−１日〜１６日に１０ｕｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７で処理した動物は、２２日目に粘膜炎スコアの統計的に有意な低減を示し（Ｐ＝０．０２４）、これは用量に依存していた。
３．−１日〜１６日に１００ｕｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７で処理した動物は、スコアが３以上の日数の統計的に有意な低減に加えて（Ｐ＝０．０２９）、１４日目に粘膜炎スコアの統計的に有意な低減を示した（Ｐ＝０．０２５）。
４．粘膜炎の重症度及び経過に対するＳＣＶ−０７の有益な用量依存的効果が見られた。投与頻度の増大又は１日用量の倍増によって、上記の効果が高まり得る。
【００５４】
別表
別表１−動物の体重
【表５】
2010518160.tif 000008
【００５５】
別表２−粘膜炎スコア
【表６】
2010518160.tif 000009
【００５６】
実施例２
ハムスターにおける急性放射線によって誘導された口腔粘膜炎の治療におけるＳＣＶ−０７の二次研究
この研究の目的は、急性放射線によって誘導されたハムスター疾患モデルを使用して、口腔粘膜炎の治療におけるＳＣＶ−０７の有効性の予備評価を行うことであった。放射線照射の１日前から始まり放射線照射の２０日後まで続く２２日間、皮下注射によって１日１回又は２回、１ｍｇ／ｋｇ又は１００μｇ／ｋｇの用量でＳＣＶ−０７を与えた。いずれの処理群でも致死は観察されず、成長速度に統計的に有意な増大があり、このことはＳＣＶ−０７がこれらの用量で十分に耐容性であり、粘膜炎に関連する体重減少を実質的に低減し得ることを示唆している。対照のハムスターは、この研究で評価した日数の２８．１％で粘膜炎スコアが３以上であった。−１日〜２０日に１日１回１００μｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７で処理した動物は、スコアが３以上の日数の６．３％への統計的に有意な低減（Ｐ＜０．００１）、並びに１４日目（Ｐ＝０．０１１）、１６日目（Ｐ＝０．００２）及び１８日目（Ｐ＝０．００１）での個々の１日スコアの統計的に有意な低減を示した。−１日〜２０日に１日２回１００μｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７で処理した動物は、スコアが３以上の日数の８．９％への統計的に有意な低減（Ｐ＜０．００１）、並びに１８日目（Ｐ＜０．００１）及び２０日目（Ｐ＝０．００３）での個々の１日スコアの統計的に有意な低減を示した。−１日〜２０日に１日２回１ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７で処理した動物は、スコアが３以上の日数の１２．５％への統計的に有意な低減（Ｐ＜０．００１）、並びに１６日目（Ｐ＝０．０４３）、１８日目（Ｐ＝０．００９）及び２０日目（Ｐ＝０．００７）での個々の１日スコアの統計的に有意な低減を示した。−１日〜２０日に１日２回１ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７で処理した動物は、粘膜炎スコアの有意な低減を全く示さなかった。１日１回１００μｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７で処理した群と、１日２回１ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７で処理した群との間に、スコアが３以上の日数において統計的に有意な差は存在しなかった（Ｐ＝０．０５４）。個々の１日スコアをこれらの２つの群間で比較した場合、１日の有意差が１４日目で観察された（Ｐ＝０．００５）。これらの観察は、１日１回の１００μｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７での処理が、１日２回の１ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７での処理より有意に良好であるということに非常に近いことを示唆している。この観察は、１日１回１００μｇ／ｋｇが、この研究及び前の研究ＳＣＩ−０１で調べた最適投与用量に最も近い用量であることを示唆している。
【００５７】
導入
１．１  背景
口腔潰瘍性粘膜炎は、一般的に疼痛を伴い、癌用の薬剤及び放射線療法の用量を制限する毒性がある。この障害は、潰瘍性病変の形成を引き起こす口腔粘膜の破壊を特徴とする。顆粒球減少患者において、粘膜炎に伴って起こる潰瘍形成が、しばしば敗血症又は菌血症を引き起こす固有の口腔細菌の侵入路となることが多い。抗新生物剤療法を受ける患者の３分の１超で或る程度、粘膜炎が起こる。白血病のために導入療法、又は骨髄移植のために移植前治療の多くで治療される患者では、その頻度及び重症度が有意に大きくなる。これらの個体のうち、中度から重度の粘膜炎患者が４分の３を超えることは珍しいことではない。頭頸部の腫瘍のために放射線療法を受ける実質的に全ての患者で、中度から重度の粘膜炎が起こり、典型的に１５Ｇｙの累積暴露で発症した後、総線量が６０Ｇｙ以上になると悪化する。
【００５８】
臨床的に、粘膜炎は３つの段階にわたって進行する：
１．有痛性の粘膜紅斑に伴って起こる炎症、これは局部麻酔薬に影響され得る。
２．偽膜形成を伴う有痛性の潰瘍形成、及び骨髄抑制治療の場合、抗菌療法が要求される命を脅かす危険性がある敗血症。非経口の麻薬性鎮痛薬が要求されるような強度の疼痛があることが多い。
３．抗新生物療法の中止の約２週〜３週後で起こる自然治癒。
【００５９】
粘膜炎に標準的な療法は、大部分が苦痛緩和性であり、リドカイン等の局所鎮痛薬の適用及び／又は麻酔薬及び抗生物質の全身投与を含む。現在、口腔粘膜炎用の認可された唯一の治療、ケピバンス（パリフェルミン）が存在し、これは唯一、血液悪性腫瘍の治療のための造血幹細胞移植の前に移植前治療を受ける患者における口腔粘膜炎の治療に認可されている。
【００６０】
生物学的プロセスとしての粘膜炎の複雑性は、近年になってようやく認識されてきている。この状態は、口腔粘膜細胞及び組織と、活性酸素種と、炎症誘発性サイトカインと、アポトーシスの媒介因子と、唾液及び口腔微生物叢等の局所因子との連続的な相互作用を示すことが示唆されている。上皮の変性及び破壊が最終的に粘膜潰瘍形成を引き起こすが、放射線によって誘導された粘膜毒性に関連する早期変化は、内皮、及び粘膜下層の結合組織中で起こると考えられる。放射線照射の１週間以内の粘膜の電子顕微鏡評価によって、上皮ではなく、内皮及び結合組織の両方で損傷が示されている。このような傷害は、フリーラジカル形成によって媒介される可能性がある。粘膜炎発症の全体的な機構は、放射線及び化学療法の両方の場合で類似していると考えられる。
【００６１】
１．２  急性放射線モデル
研究責任者によって開発されたハムスターにおける急性放射線モデルは、抗粘膜炎化合物の予備評価を与えるのに、正確で、効率的且つ費用効果がある技法であることが分かっている。このモデルでの粘膜炎の経過は十分に規定され、放射線照射のおよそ１４日〜１６日後でスコアがピークに達する。急性モデルには全身毒性がほとんどなく、少しのハムスターが死に至るだけであり、これにより初期有効性試験においてより小さい群（Ｎ＝７〜８）の使用が可能になる。粘膜炎の発病における特定の機構因子を研究するのにも急性モデルは使用されている。急性放射線モデルで有効性を示す分子は、分割化された放射線、化学療法、又は併用療法のより複雑なモデルでさらに評価してもよい。
【００６２】
この研究では、０日目で４０Ｇｙの急性放射線量を投与した。１２日目〜２８日目にかけて、臨床的に有意な粘膜炎が観察された。
【００６３】
２．  研究目的及び要約
２．１  研究目的
この研究の目的は、急性放射線によって誘導された口腔粘膜炎の頻度、重症度及び期間に対する、放射線照射の１日前と放射線照射の２０日後との間の様々なスケジュールで皮下注射で投与したＳＣＶ−０７の効果を評価することであった。ＳＣＶ−０７によるこれまでの研究（研究ＳＣＩ−０１、実施例１）は、−１日〜１６日に１日１回１００μｇ／ｋｇの用量で、粘膜炎に対して幾らかの活性を示した。この研究では、これまでの研究で見られた部分効果を拡大することができるかどうかを見るために、−１日〜２０日に１日１回又は２回、１００μｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇでＳＣＶ−０７を投与した。
【００６４】
２．２  研究の要約
４０匹のシリアンゴールデンハムスターに、０日目に左側の頬袋に向けて４０Ｇｙの急性放射線量を与えた。１日１回又は２回、１００μｇ／ｋｇ又は１ｍｇ／ｋｇで皮下注射によって試験材料ＳＣＶ−０７を与えた。投与は、放射線照射の１日前から始め（−１日目）、２０日目まで続けた。６日目から始め、２８日目まで隔日で続けて粘膜炎を臨床的に評価した。
【００６５】
３．  評価
３．１  粘膜炎評価
６日目から始め、その後２日毎２８日まで（２８日目を含む）粘膜炎の悪性度をスコア付けした。プラシーボと比較した、各薬剤処理の粘膜炎に対する効果を以下のパラメータに従って評価した：
【００６６】
３．１．１  各群におけるハムスターが潰瘍性粘膜炎になる（スコア≧３）日数の差
各評価日で、各薬剤処理群において盲検粘膜炎スコアが３以上の動物の数を対照群と比較した。累積ベースで差を比較し、カイ二乗解析によって、統計的有意性を求めた。この解析において、対照群と比較した場合に動物群が潰瘍形成した（スコア≧３）日数の有意な低減によって有効性を定義する。様々な薬剤処理群間の差を評価するのにも、これと同じ検定を使用した。
【００６７】
３．１．２  １日粘膜炎スコアの順位和の差
各評価日に対して、ノンパラメトリック順位和解析を用いて、対照群のスコアを処理群のスコアと比較した。処理の成功は、６日〜２８日の２日以上での処理群におけるスコアの統計的に有意な減少と見なした。
【００６８】
３．２  体重及び生存率
粘膜炎重症度及び／又は処理によって起こり得る毒性に対する指標として、処理群間での動物の体重の起こり得る差を評価するために、毎日全ての動物を秤量し、それらの生存率を記録した。
【００６９】
４．  研究設計
４０匹のシリアンゴールデンハムスターを各８匹の５つの動物群に分けた。全ての動物は、０日目に左側の頬袋に向けて４０Ｇｙの単一線量の急性放射線を受けた。動物を麻酔し、左側の頬袋をめくり、動物の残りの部分を鉛遮蔽物で保護することで、これを達成した。表５で詳述するように、１日１回の皮下注射で試験材料を与えた。６日目に始め２８日まで隔日で続けて、粘膜炎を臨床的に評価した。
【００７０】
【表７】
2010518160.tif 000010
【００７１】
５．  材料及び方法
５．１  研究の実施場所
Watertown MAにあるBiomodels AAALAC公認施設で研究を行った。Biomodels IACUCから、この研究に対する認可を得た。
【００７２】
５．２  動物
研究の開始時の平均体重が８１．９ｇであった５〜６週齢の雄のＬＶＧシリアンゴールデンハムスター（Charles River Laboratories）を使用した。耳パンチを使用して動物に個々に番号を付け、１つのケージ当たり８匹の小さい動物群に収容した。研究開始前に動物を順応させた。この５日の期間の間、状態不良を示す動物を排除するために、動物を毎日観察した。
【００７３】
５．３  ハウジング
７０華氏度±５華氏度の温度及び５０％±２０％相対湿度の濾過空気を与えた動物室で研究を行った。動物室は、１時間当たり最低１２回〜１５回の換気を維持するように設定した。動物室は、薄明のない１２時間の明期と１２時間の暗期との明／暗サイクルで自動タイマーにおいた。Ｂｅｄ−Ｏ−Ｃｏｂｓ（登録商標）敷料を使用した。敷料は、最低１週間に１回変えた。ケージ、上蓋、ボトル等を市販の洗剤で洗い、空気乾燥させた。フードに導入される表面及び材料を消毒するのに、市販の消毒剤を使用した。フロアを毎日清掃し、市販の洗剤で最低１週間に２回モップ掛けした。壁及びケージラックを希釈漂白溶液で最低１ヶ月に１回スポンジ掛けした。研究、用量、動物番号及び処理群を識別するのに必要である適切な情報を備えるケージカード又はラベルで全てのケージを印付けした。温度及び相対湿度を研究中に記録し、その記録は残した。
【００７４】
５．４  食餌
動物に、Ｐｕｒｉｎａ  Ｌａｂｄｉｅｔ（登録商標）５０６１齧歯類用の食餌を与え、水を自由に与えた。
【００７５】
５．５  動物の無作為化及び配分
放射線照射前に動物を無作為に予め５つの処理群に分けた。個々の番号に対応して、耳パンチで各動物を識別した。タグは研究中に外れる可能性があるので、より一貫した識別のために、タグ付けではなく耳パンチによるナンバリングを使用した。各ケージを識別するのにケージカードを使用するか、又はラベルに研究番号（ＳＣＩ−０２）、処理群番号及び動物番号を印付けした。
【００７６】
５．６  皮下投与及び薬剤適用
試験化合物ＳＣＶ−０７を粉末で準備し、投与直前に滅菌ＰＢＳ中に溶解した。３つの希釈液を調製した：１００μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ及び１μｇ／ｍＬ。薬剤は、２７Ｇニードルを備えたツベルクリンシリンジを使用して、各群にＳＣＶ−０７の適切な希釈率で体重１００ｇ当たり０．１ｍＬの容量で与えた。背側又は腹側に皮下注射した。
【００７７】
５．７  粘膜炎誘導
標準化した急性放射線プロトコルを使用して、粘膜炎を誘導した。０日目に、単一線量の放射線（４０Ｇｙ／投与）を全ての動物に投与した。０．３５ｍｍ径のＣｕ濾過システムで硬化させた、焦点距離３０ｃｍの電位１６０ｋＶ(１５−ｍａ）の電源で放射線を発生させた。照射は、３．２Ｇｙ／分の速度で左側の頬袋の粘膜を標的とした。照射前に、ケタミン（１６０ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（８ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射によって動物を麻酔した。左側の頬袋をめくり、固定して、鉛遮蔽物を使用してハムスターの身体の他の部位を全て保護して隔離した。
【００７８】
５．８  粘膜炎スコア付け
上記の研究を通して、粘膜炎スコア、体重変化及び生存率を測定した。粘膜炎の評価のために、吸入麻酔薬によって動物を麻酔し、左側の頬袋をめくった。有効写真尺度との比較によって、粘膜炎を視覚的にスコア付けした。スコアは正常の０から、重度の潰瘍形成の５までの範囲であった（臨床的なスコア付け）。記述用語において、この尺度は以下のように定義する：
【００７９】
【表８】
2010518160.tif 000011
【００８０】
１〜２のスコアは、中度の段階の疾患を表すと考えられるが、３〜５のスコアは、中度から重度の粘膜炎を示すと考えられる。視覚的なスコア付けの後、標準化技法を用いて、各動物の粘膜を撮影した。実験の結果、全てのフィルムを現像し、無作為に写真に番号を付けた。少なくとも２人の独立した熟練の観察者等が、上記の尺度（盲検スコア付け）を用いて盲検様式で写真を格付けした。
【００８１】
６．  結果及び考察
６．１  生存率
この研究中に、致死は観察されなかった。
【００８２】
６．２  体重変化
１日平均の体重変化データを評価した。生理食塩水処理した対照ハムスターは、研究中、平均して出発体重の４４．１％増加した。−１日〜２０日に１日１回１００μｇ／ｋｇでＳＣＶ−０７を受けた群におけるハムスターは、研究中、平均して出発体重の４９．９％増加した。−１日〜２０日に１日２回１００μｇ／ｋｇでＳＣＶ−０７を受けた群におけるハムスターは、研究中、平均して出発体重の６１．３％増加した。−１日〜２０日に１日１回、１ｍｇ／ｋｇでＳＣＶ−０７を受けた群におけるハムスターは、研究中、平均して出発体重の６３．４％増加した。−１日〜２０日に１日２回、１ｍｇ／ｋｇでＳＣＶ−０７を受けた群におけるハムスターは、研究中、平均して出発体重の６９．１％増加した。各動物の体重増加に対する曲線下面積（ＡＵＣ）を算出した後、一方向ＡＮＯＶＡ検定を用いて異なる処理群を比較することによって、これらの有意差を評価した。この解析の結果は、ＳＣＶ−０７処理群と対照群との間に有意差があったことを示していた（Ｐ＝０．０１２）。１日２回の１００μｇ／ｋｇ、１日１回及び２回の１ｍｇ／１ｋｇのＳＣＶ−０７で処理した群は全て、生理食塩水対照よりも有意に大きく体重が増加した（それぞれ、Ｐ＝０．０１４、Ｐ＝０．００９及びＰ＝０．００４）。
【００８３】
６．３  粘膜炎（表７及び表８）
各群に対する１日平均の粘膜炎スコアを求めた。生理食塩水処理した対照群では、粘膜炎のピークレベルは１８日目に見られ、平均スコアが３．０に達した。−１日〜２０日に１日１回１００μｇ／ｋｇでＳＣＶ−０７を受けた群では、１６日目で２．２のピーク平均粘膜炎スコアであった。−１日〜２０日に１日２回１００μｇ／ｋｇでＳＣＶ−０７を受けた群では、ピーク平均粘膜炎スコアが２．５であり、これは１４日目及び１６日目で起こった。−１日〜２０日に１日１回、１ｍｇ／ｋｇでＳＣＶ−０７を受けた群では、１４日目で２．９のピーク平均粘膜炎スコアであった。−１日〜２０日に１日２回、１ｍｇ／ｋｇでＳＣＶ−０７を受けた群では、１４日目で２．６のピーク平均粘膜炎スコアであった。各群に対してスコアが３以上であった日数を算出し、カイ二乗（χ2）検定を用いてこれらの日数を比較することによって、異なる処理群間で見られた有意差を評価した。この解析の結果を表７に示す。生理食塩水処理した対照群におけるハムスターは、評価した日数の２８．１％でスコアが３以上であった。−１日〜２０日に１日１回１００μｇ／ｋｇでＳＣＶ−０７を受けた群では、評価した日数の６．３％で３以上の粘膜炎スコアが見られ、これは対照とは統計的に有意に異なっていた（Ｐ＜０．００１）。−１日〜２０日に１日２回１００μｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７で処理した群では、日数の８．９％で３以上のスコアであり、これは対照とは統計的に有意に異なっていた（Ｐ＜０．００１）。−１日〜２０日に１日１回、１ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７で処理した群では、日数の２８．１％で３以上のスコアであり、これは対照とは有意に異なっていなかった（Ｐ＝１．０００）。−１日〜２０日に１日２回１ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７で処理した群では、日数の１２．５％で３以上のスコアであり、これは対照とは有意に異なっていた（Ｐ＜０．００１）。１日１回１００μｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７で処理した群と、１日２回１ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７で処理した群との間で、スコアが３以上の日数において統計的に有意な差はなかった（Ｐ＝０．０５４）。
【００８４】
マンホイットニー順位和解析を用いて粘膜炎スコアのさらなる解析を行い、それぞれの日のそれぞれの群に対するスコアを比較した。この解析の結果を表８に示す。この解析では、粘膜炎の顕著な低減と見なす前に、一般的に２日間の粘膜炎スコアの有意な低減を必要とする。−１日〜２０日に１日１回１００μｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７で処理した群は、生理食塩水対照と比較して、研究の１４日目（Ｐ＝０．０１１）、１６日目（Ｐ＝０．００２）及び１８日目（Ｐ＝０．００１）で統計的に有意な改善を示した。−１日〜２０日に１日２回１００μｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７で処理した群は、対照と比較して１８日目（Ｐ＜０．００１）及び２０日目（Ｐ＝０．００３）で有意な改善を示した。−１日〜２０日に、１日１回１ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７で処理した群は、対照と比較して、研究のいずれの日でも粘膜炎において全く有意な改善を示さなかった。−１日〜２０日に１日２回、１ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７で処理した群は、対照と比較して、１６日目（Ｐ＝０．０４３）、１８日目（Ｐ＝０．００９）及び２０日目（Ｐ＝０．００７）で有意な改善を示した。１日１回１００μｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７で処理した群と、１日２回１ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７で処理した群との間での比較は、１４日目での１日の統計的に有意な差を示した（Ｐ＝０．００５）。
【００８５】
【表９】
2010518160.tif 000012
【００８６】
【表１０】
2010518160.tif 000013
【００８７】
７．  結論
１．致死率及び体重増加の観察に基づく、この研究におけるＳＣＶ−０７による毒性の痕跡は全く存在しなかった。
２．１日２回１００μｇ／ｍｌのＳＣＶ−０７又は１日１回若しくは２回１ｍｇ／ｍｌのＳＣＶ−０７で処理した群は、生理食塩水対照と比較して、体重増加において有意な増大を示した（それぞれ、Ｐ＝０．０１４、Ｐ＝０．００９及びＰ＝０．００４）。
３．−１日〜２０日に１日１回１００μｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７で処理した動物は、スコアが３以上の日数の統計的に有意な低減（Ｐ＜０．００１）、並びに１４日目（Ｐ＝０．０１１）、１６日目（Ｐ＝０．００２）及び１８日目（Ｐ＝０．００１）での個々の１日スコアの統計的に有意な低減を示した。
４．−１日〜２０日に１日２回１００μｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７で処理した動物は、スコアが３以上の日数の統計的に有意な低減（Ｐ＜０．００１）、並びに１８日目（Ｐ＜０．００１）及び２０日目（Ｐ＝０．００３）での個々の１日スコアの統計的に有意な低減を示した。
５．−１日〜２０日に１日２回１ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７で処理した動物は、スコアが３以上の日数の統計的に有意な低減（Ｐ＜０．００１）、並びに１６日目（Ｐ＝０．０４３）、１８日目（Ｐ＝０．００９）及び２０日目（Ｐ＝０．００７）での個々の１日スコアの統計的に有意な低減を示した。
６．−１日〜２０日に１日２回１ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７で処理した動物は、粘膜炎スコアの有意な低減を全く示さなかった。
７．１日１回１００μｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７で処理した群と、１日２回１ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７で処理した群との間で、スコアが３以上の日数において統計的に有意な差はなかった（Ｐ＝０．０５４）。個々の１日スコアをこれらの２つの群間で比較した場合、１日の有意差が１４日目で観察された（Ｐ＝０．００５）。これらの観察は、１日１回の１００μｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７での処理が、１日２回の１ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７での処理より有意に良好であるということに非常に近いことを示唆している。
【００８８】
９．  別表
９．１  別表３−動物の体重
【表１１】
2010518160.tif 000014
【００８９】
９．２  別表４−粘膜炎スコア
【表１２−１】
2010518160.tif 000015
【表１２−２】
2010518160.tif 000016
【００９０】
実施例３
ハムスターにおける分割放射線によって誘導された口腔粘膜炎の治療におけるＳＣＶ−０７の効果の有効性試験
１．導入
１．１  背景
ＫＧＦ−１及び他のＦＧＦファミリー成員が、ＢＤＦ−１において口腔粘膜表面及び食道粘膜表面の上皮肥厚化を誘導することが示されている。ＳＣＶ−０７及び誘導ＳＣＶ−０７ペプチドは、ＫＧＦ−１と重複し得る機構を有すると考えられ、他の粘膜傷害モデルにおいて保護的であることが分かっている。
【００９１】
口腔潰瘍性粘膜炎は、一般的に疼痛を伴い、癌用の薬剤及び放射線療法の用量を制限する毒性がある。この障害は、潰瘍性病変の形成を引き起こす口腔粘膜の破壊を特徴とする。顆粒球減少患者において、粘膜炎に伴って起こる潰瘍が、しばしば敗血症又は菌血症を引き起こす固有の口腔細菌の侵入路となることが多い。抗新生物剤療法を受ける患者の３分の１超で或る程度、粘膜炎が起こる。白血病のために導入療法、又は骨髄移植のために移植前治療の多くで治療される患者では、その頻度及び重症度が有意に大きくなる。これらの個体のうち、中度から重度の粘膜炎患者が４分の３を超えることは珍しいことではない。頭頸部の腫瘍のために放射線療法を受ける実質的に全ての患者で、中度から重度の粘膜炎が起こり、典型的に１５Ｇｙの累積暴露で発症した後、総線量が６０Ｇｙ以上になると悪化する。
【００９２】
臨床的に、粘膜炎は３つの段階にわたって進行する：
１．一般的に局部麻酔薬又は非麻酔性鎮痛薬によって管理することができる有痛性の紅斑。
２．偽膜形成を伴うことが多い有痛性の潰瘍形成。同時に骨髄抑制が起こる場合、口腔由来の菌血症及び敗血症も珍しいことではない。頻繁に非経口の麻酔性鎮痛薬が要求されるような強度の疼痛があることが多い。
３．抗新生物療法の中止の約２週〜３週後で起こる自然治癒。
【００９３】
現在、唯一認可された生物製剤、又は粘膜炎の予防及び／又は治療用の薬剤は、ケピバンス（パリフェルミン）である。ケピバンスの使用は、血液悪性腫瘍のために幹細胞移植を受けた患者における粘膜炎に限定される。結果として粘膜炎に標準的な療法は、生理食塩水等の苦痛緩和剤リンス、重炭酸溶液、うがい薬、リドカイン等の局所鎮痛薬及び／又は麻酔薬の全身投与から成る。
【００９４】
生物学的プロセスとしての粘膜炎の複雑性は、近年になってようやく認識されてきている。この状態は、口腔粘膜細胞及び組織と、活性酸素種と、炎症誘発性サイトカインと、アポトーシスの媒介因子と、或る範囲のシグナル伝達経路と、唾液及び口腔微生物叢等の局所因子との連続的な相互作用を示すことが示唆されている。上皮の変性及び破壊が最終的に粘膜潰瘍形成を引き起こすが、放射線によって誘導された粘膜毒性に関連する早期変化は、内皮、及び粘膜下層の結合組織中で起こると考えられる。粘膜炎発症の全体的な機構は、放射線及び化学療法の両方の場合で類似していると考えられる。
【００９５】
１．２  分割放射線モデル
研究責任者によって開発されたハムスターにおける分割放射線モデルは、抗粘膜炎化合物の予備評価を与えるのに、正確で、効率的且つ費用効果がある技法であることが分かっている。このモデルでは、ハムスターは、急性放射線試験で使用する０日目での４０Ｇｙの単一線量ではなく、０日目、１日目、２日目、３日目、７日目、８日目、９日目及び１０日目に左側の頬袋への７．５Ｇｙの線量を８回受ける。放射線照射にこのスケジュールを使用する根拠は、これが癌患者に与える放射療法の臨床経過により酷似していることにある。このモデルでの粘膜炎の経過は十分に規定され、放射線照射のおよそ１４日〜１６日後で粘膜炎スコアがピークに達する。分割放射線モデルにおける致死率（一般的に麻酔薬の副作用による）は、急性放射線モデルで見られるものよりもわずかに高く、これを考慮して、群の大きさを増大させる（１群当たり１０匹まで）。
【００９６】
２．  研究目的及び要約
２．１  研究目的
この研究の目的は、分割放射線プロトコルによって誘導された口腔粘膜炎の頻度、重症度及び期間に対する、皮下注射で投与したＳＣＶ−０７の効果を評価することであった。
【００９７】
２．２  研究の要約
４０匹の雄のシリアンゴールデンハムスターに、０日目、１日目、２日目、３日目、６日目、７日目、８日目及び９日目にそれぞれ左側の頬袋に向けて８回、７．５Ｇｙの線量の放射線を与えた。動物を麻酔し、左側の頬袋をめくり、動物の身体の残りを鉛遮蔽物で保護することで、これを達成した。表９で詳述するように、１日１回の皮下注射で試験材料を与えた。７日目に始め３５日目まで隔日で続けて、粘膜炎を臨床的に評価した。表９で概説するように試験物質を与え、群１及び群２は、−１日〜２９日に投与し、群３は放射線照射した日のみに投与し、群４は、−１５日〜２９日の間で放射線を与えない日（−１日、４日、５日及び１０日〜２９日）に投与した。
【００９８】
３．  評価
３．１  粘膜炎評価
６日目から始め、その後２日毎３４日まで（３４日を含む）粘膜炎の悪性度をスコア付けした。プラシーボと比較した、各薬剤処理の粘膜炎に対する効果を以下のパラメータに従って評価した：
【００９９】
３．１．１  各群におけるハムスターが潰瘍性粘膜炎になる（スコア≧３）日数の差
各評価日で、各薬剤処理群において盲検粘膜炎スコアが３以上の動物の数を対照群と比較した。累積ベースと比べて差を比較し、カイ二乗解析によって、統計的有意性を求めた。この解析において、対照群と比較した場合に動物群が潰瘍形成した（スコア≧３）日数の有意な低減によって有効性を定義する。
【０１００】
３．１．２  １日粘膜炎スコアの順位和の差
各評価日に対して、ノンパラメトリック順位和解析を用いて、対照群のスコアを処理群のスコアと比較した。処理の成功は、６日〜２８日の２日以上での処理群におけるスコアの統計的に有意な減少と見なした。
【０１０１】
３．２  体重及び生存率
粘膜炎重症度及び／又は処理によって起こり得る毒性に対する指標として、処理群間での動物の体重の起こり得る差を評価するために、毎日全ての動物を秤量し、それらの生存率を記録した。
【０１０２】
４．  研究設計
４０匹の雄のシリアンゴールデンハムスターに、０日目、１日目、２日目、３日目、６日目、７日目、８日目及び９日目にそれぞれ左側の頬袋に向けて８回、７．５Ｇｙの線量の放射線を与えた。動物を麻酔し、左側の頬袋をめくり、動物の身体の残りを鉛遮蔽物で保護することで、これを達成した。表９で詳述するように、午前８時に１日１回の皮下注射で試験材料を与えた。６日目に始め３４日まで隔日で続けて、粘膜炎を臨床的に評価した。表９で概説するように試験物質を与え、群１及び群２は、−１日〜２９日に投与し、群３は放射線照射した日（０日〜３日及び６日〜１０日）のみに投与し、群４は、−１日〜２９日の間で放射線を与えない日（−１日、４日、５日及び１０日〜２９日）に投与した。
【０１０３】
【表１３】
2010518160.tif 000017
【０１０４】
５．  材料及び方法
５．１  研究の実施場所
Watertown, MAにあるBiomodels AAALAC公認施設で研究を行った。
【０１０５】
５．２  動物
研究の開始時の平均体重が８１．０ｇであった５〜６週齢の雄のＬＶＧシリアンゴールデンハムスター（Charles River Laboratories）を使用した。耳パンチを使用して動物に個々に番号を付け、１つのケージ当たりおよそ１０匹の小さい動物群に収容した。研究開始前の５日間、動物を順応させ、この期間の間、状態不良を示す動物を排除するために、動物を毎日観察した。
【０１０６】
５．３  ハウジング
７０華氏度±５華氏度の温度及び５０％±２０％相対湿度の濾過空気を与えた動物室で研究を行った。動物室は、１時間当たり最低１２回〜１５回の換気を維持するように設定した。動物室は、薄明のない１２時間の明期と１２時間の暗期との明／暗サイクルで自動タイマーにおいた。Ｂｅｄ−Ｏ−Ｃｏｂｓ（登録商標）敷料を使用した。敷料は、最低１週間に１回変えた。ケージ、上蓋、ボトル等を市販の洗剤で洗い、空気乾燥させた。フードに導入される表面及び材料を消毒するのに、市販の消毒剤を使用した。フロアを毎日清掃し、市販の洗剤で最低１週間に２回モップ掛けした。壁及びケージラックを希釈漂白溶液で最低１ヶ月に１回スポンジ掛けした。研究、用量、動物番号及び処理群を識別するのに必要である適切な情報を備えるケージカード又はラベルで全てのケージを印付けした。温度及び相対湿度を研究中に記録し、その記録は残した。
【０１０７】
５．４  食餌
動物に、Ｐｕｒｉｎａ  Ｌａｂｄｉｅｔ（登録商標）５０６１齧歯類用の食餌を与え、水を自由に与えた。
【０１０８】
５．５  動物の無作為化及び配分
放射線照射前に動物を無作為に予め４つの処理群に分けた。個々の番号に対応して、耳パンチで各動物を識別した。タグは研究中に外れる可能性があるので、より一貫した識別のために、タグ付けではなく耳パンチによるナンバリングを使用した。各ケージを識別するのにケージカードを使用するか、又はラベルに研究番号（ＳＣＩ−０３）、処理群番号及び動物番号を印付けした。
【０１０９】
５．６  皮下投与及び薬剤適用
試験化合物であるヒトＳＣＶ−０７ペプチドを粉末で準備し、投与直前に滅菌ＰＢＳ中に溶解した。薬剤は、２７Ｇニードルを備えたツベルクリンシリンジを使用して、０．１の容量で与えた。背側又は腹側に皮下注射した。
【０１１０】
５．７  粘膜炎誘導
３．０ｍｍ径の硬化Ａｌ濾過システムによって、Philips製の焦点距離３０ｃｍの電位１６０ｋＶｐ（キロボルト電位）(１８．７５−ｍａ）のＸ線電源で放射線を発生させた。照射は、３．３２Ｇｙ／分の速度で左側の頬袋の粘膜を標的とした。Ｖｉｃｔｏｒｅｅｎモデル５３０線量計によるこの電源の較正は、線量率が２８．５７ｎＣ／分であることを示した。この較正を用いて、各放射線量で各動物が受けたエネルギーが、各時点でおよそ６４．５ｎＣ（ナノクーロン）であった。照射前に、ケタミン（１６０ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（８ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射によって動物を麻酔した。左側の頬袋をめくり、固定して、鉛遮蔽物を使用して隔離した。
【０１１１】
５．８  粘膜炎スコア付け
上記の研究を通して、粘膜炎スコア、体重変化及び生存率を測定した。粘膜炎の評価のために、吸入麻酔薬によって動物を麻酔し、左側の頬袋をめくった。有効写真尺度との比較によって、粘膜炎を視覚的にスコア付けした。スコアは正常の０から、重度の潰瘍形成の５までの範囲であった（臨床的なスコア付け）。記述用語において、この尺度は以下のように定義する：
【０１１２】
【表１４】
2010518160.tif 000018
【０１１３】
１〜２のスコアは、中度の段階の疾患を表すと考えられるが、３〜５のスコアは、中度から重度の粘膜炎を示すと考えられる。視覚的なスコア付けの後、標準化技法を用いて、各動物の粘膜を撮影した。実験の結果、全てのフィルムを現像し、無作為に写真に番号を付けた。少なくとも２人の独立した熟練の観察者等が、上記の尺度（盲検スコア付け）を用いて盲検様式で写真を格付けした。
【０１１４】
６．  結果
６．１  生存率
放射線照射のための麻酔の結果として、この研究中、対照群で８日目に１匹の致死が起こった。
【０１１５】
６．２  体重変化
研究群間で体重変化の有意な差はなかった。１日平均の体重変化データを評価した。生理食塩水処理した対照ハムスターは、研究中、平均して出発体重の７６．３％増加した。−１日〜２９日に１００μｇ／ｋｇでＳＣＶ−０７を受けた群におけるハムスターは、研究中、平均して出発体重の８０．７％増加した。放射線照射した日のみに１００μｇ／ｋｇでＳＣＶ−０７を受けた群におけるハムスターは、研究中、平均して出発体重の６６．３％増加した。−１日、４日、５日及び１０〜２９日に１００μｇ／ｋｇでＳＣＶ−０７を受けた群におけるハムスターは、研究中、平均して出発体重の６９．７％増加した。各動物の体重増加に対する曲線下面積（ＡＵＣ）を算出した後、一方向ＡＮＯＶＡ検定を用いて異なる処理群を比較することによって、これらの有意差を評価した。この解析の結果は、これらの処理群の間に有意差がなかったことを示していた（Ｐ＝０．４９０）。
【０１１６】
６．３  粘膜炎（表１１及び表１２）
対照動物間の粘膜炎進行の速度及び重症度は、予測されたものと一致していた。
【０１１７】
各群に対する１日平均の粘膜炎スコアを評価した。生理食塩水処理した対照群では、ピーク平均粘膜炎スコアが３．２であり、これは１９日目に起こった。−１日〜２９日にＳＣＶ−０７を受けた群では、ピーク平均粘膜炎スコアが３．３であり、これは１９日目に起こった。放射線照射日（０日〜３日及び６日〜９日）にＳＣＶ−０７を受けた群では、ピーク平均粘膜炎スコアが３．０であり、これは１７日目に起こった。１日、４日、５日及び１０〜２９日にＳＣＶ−０７を受けた群では、ピーク平均粘膜炎スコアが２．９であり、これは１７日目、１９日目及び２３日目に起こった。各群に対してスコアが３以上であった日数を算出し、カイ二乗（χ2）検定を用いてこれらの日数を比較することによって、異なる処理群間で見られた有意差を評価した。この解析の結果を表１１に示す。生理食塩水処理した対照群におけるハムスターは、評価した日数の３６％でスコアが３以上であった。−１日〜２９日にＳＣＶ−０７を受けた群では、評価した日数の３２．７％で３以上の粘膜炎スコアが見られ、これは対照とは統計的に有意に異なっていなかった（Ｐ＝０．４４８）。０日〜３日及び６日〜９日にＳＣＶ−０７を受けた群では、評価した日数の２４％で３以上の粘膜炎スコアが見られ、これは対照とは統計的に有意に異なっていた（Ｐ＝０．００２）。−１日、４日、５日及び１０日〜２９日にＳＣＶ−０７を受けた群では、評価した日数の３０．７％で３以上の粘膜炎スコアが見られ、これは対照とは統計的に有意に異なっていなかった（Ｐ＝０．２０４）。マンホイットニー順位和解析を用いて粘膜炎スコアのさらなる解析を行い、それぞれの日のそれぞれの群に対するスコアを比較した。この解析の結果を表１２に示す。この解析では、低減が顕著であると見なす前に、一般的に２日間の粘膜炎スコアの有意な低減を必要とする。−１日〜２９日にＳＣＶ−０７で処理した群は、生理食塩水対照と比較して、２９日目（Ｐ＝０．００４）、３１日目（Ｐ＝０．０１７）及び３３日目（Ｐ＝０．００２）で有意な改善を示した。０日〜３日及び６日〜９日にＳＣＶ−０７で処理した群は、生理食塩水対照と比較して、２１日目（Ｐ＝０．０４７）、２３日目（Ｐ＜０．００１）、２５日目（Ｐ＝０．００９）、２９日目（Ｐ＜０．００１）、３１日目（Ｐ＝０．０１５）及び３３日目（Ｐ＜０．００１）で有意な改善を示した。−１日、４日、５日及び１０日〜２９日にＳＣＶ−０７で処理した群は、生理食塩水対照と比較して、２９日目（Ｐ＜０．００１）、３１日目（Ｐ＝０．００４）及び３３日目（Ｐ＜０．００１）で有意な改善を示した。
【０１１８】
【表１５】
2010518160.tif 000019
【０１１９】
【表１６】
2010518160.tif 000020
【０１２０】
７．  結論
１．致死率及び体重増加の観察に基づく、この研究におけるＳＣＶ−０７による毒性の痕跡は全く存在しなかった。
２．放射線を投与した日（０日〜３日及び６日〜９日)に１００μｇ／ｋｇのヒトＳＣＶ−０７で処理した動物は、粘膜炎スコアが３以上の日数における統計的に有意な低減（Ｐ＝０．００２）、並びに２１日目（Ｐ＝０．０４７）、２３日目（Ｐ＜０．００１）、２５日目（Ｐ＝０．００９）、２９日目（Ｐ＜０．００１）、３１日目（Ｐ＝０．０１５）及び３３日目（Ｐ＜０．００１）での粘膜炎スコアにおける有意な低減を示した。この結果は、ＳＣＶ−０７が、粘膜炎の全体的な重症度を低減するのに効果的であり得ることを示唆し、結果として粘膜傷害の回復を高めることになる。
３．−１日〜２９日又は放射線を投与しなかった日（−１日、４日、５日、１０日〜２９日）にＳＣＶ−０７で処理したハムスターは、スコアが３以上の日数において有意な低減を示さなかったが、２９日目、３１日目及び３３日目で粘膜炎スコアにおいて有意な低減を示した。
４．放射線投与スケジュールに基づくＳＣＶ−０７の効果における対比は、その作用機構に対する幾つかの見識を与え得るが、さらなる評価を必要とする。非放射線照射日に薬剤を投与したＳＣＶ−０７スケジュールが効果的ではなかったという事実は、特に連日処理した動物にとって興味深い。さらに、ＳＣＶ−０７で処理した全ての動物が、研究の後期に同じように反応するという観察は、全体的な発病に対するＳＣＶ−０７の複合的な効果及び放射線によって誘導された粘膜炎の回復を示唆し得る。
【０１２１】
９．  別表
９．１  別表５−動物の体重
【表１７】
2010518160.tif 000021
【０１２２】
９．２  別表６−粘膜炎スコア
【表１８−１】
2010518160.tif 000022
【表１８−２】
2010518160.tif 000023
【０１２３】
実施例４
ハムスターにおけるシスプラチンと急性放射線との組合せによって誘導された口腔粘膜炎の治療でのＳＣＶ−０７の研究
導入
ＳＣＶ−０７によるこれまでの研究によって、ＳＣＶ−０７は、急性放射線及び分割放射線の両方によって誘導されたハムスターの疾患モデルにおいて口腔粘膜炎を治療するのに効果的であることが示されている。この研究では、化学療法と放射線との組合せ、具体的にシスプラチンと放射線との組合せによって誘導されたハムスターの口腔粘膜炎モデルにおいて、ＳＣＶ−０７の有効性を評価した。
【０１２４】
方法
４０匹のシリアンゴールデンハムスターを無作為に予め４つの等しい大きさの処理群に分けた。−１日目に与えた５ｍｇ／ｋｇでのシスプラチンの単一用量、及び０日目に３５Ｇｙの線量で投与した放射線の単一線量によって、シリアンゴールデンハムスターの左側の頬袋で粘膜炎を誘導した。−１日目から始め、２０日目まで１日１回続けて、容量１００μＬ中、１０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ又は１ｍｇ／ｋｇの用量の皮下注射によってＳＣＶ−０７を与えた。動物の活性及び体重を毎日評価した。６日から始め、研究期間中、隔日で続けて、標準スコアリング６点尺度（standard scoring six point scale）を用いて、口腔粘膜炎を評価した。研究を通じてスコアが３以上のカイ二乗検定を用いて、潰瘍性粘膜炎を評価し、個々の１日群スコアを順位和検定によって評価した。
【０１２５】
結果
粘膜炎は、全ての試験群におけるＳＣＶ−０７で処理した動物で有益且つ一貫して影響を受けた。重度の粘膜炎は、ビヒクル対照で評価した日数の５０％からＳＣＶ−０７処理動物でのおよそ３０％まで低減した。粘膜炎のピーク後、疾患プロセスの後期に最も有意な影響が見られた。体重の変化に対して、群間では有意差が観察されなかった。実験経過中には動物は致死しなかった。
【０１２６】
結論
１．致死率及び体重増加の観察に基づく、この研究におけるＳＣＶ−０７による毒性の痕跡は全く存在しなかった。
２．−１日〜２０日に１０μｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７で処理した動物は、粘膜炎スコアが３以上の日数の統計的に有意な低減（Ｐ＜０．００１）、並びに２２日目（Ｐ＝０．０１０）、２４日目（Ｐ＝０．０２２）、２６日目（Ｐ＝０．０１５）及び２８日目（Ｐ＜０．００１）に粘膜炎スコアの統計的に有意な低減を示した。
３．−１日〜２０日に１００μｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７で処理した動物は、スコアが３以上の日数の統計的に有意な低減（Ｐ＜０．００１）、並びに６日目（Ｐ＝０．０１５）、２２日目（Ｐ＝０．００３）、２４日目（Ｐ＝０．００５）、２６日目（Ｐ＜０．００１）及び２８日目（Ｐ＜０．００１）に粘膜炎スコアの統計的に有意な低減を示した。
４．−１日〜２０日に１ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７で処理した動物は、スコアが３以上の日数の統計的に有意な低減（Ｐ＜０．００１）、並びに６日目（Ｐ＝０．０１５）、２０日目（Ｐ＝０．０２９）、２２日目（Ｐ＝０．０１２）、２４日目（Ｐ＝０．００１）、２６日目（Ｐ＝０．００３）及び２８日目（Ｐ＜０．００１）に粘膜炎スコアの統計的に有意な低減を示した。
【０１２７】
１．１  背景
ＫＧＦ−１及び他のＦＧＦファミリー成員が、ＢＤＦ−１において口腔粘膜表面及び食道粘膜表面の上皮肥厚化を誘導することが示されている。ＳＣＶ−０７及び誘導ＳＣＶ−０７ペプチドは、ＫＧＦ−１と重複し得る機構を有すると考えられ、他の粘膜傷害モデルにおいて保護的であることが分かっている。
【０１２８】
口腔潰瘍性粘膜炎は、一般的に疼痛を伴い、癌用の薬剤及び放射線療法の用量を制限する毒性がある。この障害は、潰瘍性病変の形成を引き起こす口腔粘膜の破壊を特徴とする。顆粒球減少患者において、粘膜炎に伴って起こる潰瘍が、しばしば敗血症又は菌血症を引き起こす固有の口腔細菌の侵入路となることが多い。抗新生物剤療法を受ける患者の３分の１超で或る程度、粘膜炎が起こる。白血病のために導入療法、又は骨髄移植のために移植前治療の多くで治療される患者では、その頻度及び重症度が有意に大きくなる。これらの個体のうち、中度から重度の粘膜炎患者が４分の３を超えることは珍しいことではない。頭頸部の腫瘍のために放射線療法を受ける実質的に全ての患者で、中度から重度の粘膜炎が起こり、典型的に１５Ｇｙの累積暴露で発症した後、総線量が６０Ｇｙ以上になると悪化する。
【０１２９】
臨床的に、粘膜炎は３つの段階にわたって進行する：
１．一般的に局部麻酔薬又は非麻酔性鎮痛薬によって管理することができる有痛性の紅斑。
２．偽膜形成を伴うことが多い有痛性の潰瘍形成。同時に骨髄抑制が起こる場合、口腔由来の菌血症及び敗血症も珍しいことではない。頻繁に非経口の麻酔性鎮痛薬が要求されるような強度の疼痛があることが多い。
３．抗新生物療法の中止の約２週〜３週後で起こる自然治癒。
【０１３０】
現在、唯一認可された生物製剤、又は粘膜炎の予防及び／又は治療用の薬剤は、ケピバンス（パリフェルミン）である。ケピバンスの使用は、血液悪性腫瘍のために幹細胞移植を受けた患者における粘膜炎に限定される。結果として粘膜炎に標準的な療法は、生理食塩水等の苦痛緩和剤リンス、重炭酸溶液、うがい薬、リドカイン等の局所鎮痛薬及び／又は麻酔薬の全身投与から成る。
【０１３１】
生物学的プロセスとしての粘膜炎の複雑性は、近年になってようやく認識されてきている。この状態は、口腔粘膜細胞及び組織と、活性酸素種と、炎症誘発性サイトカインと、アポトーシスの媒介因子と、或る範囲のシグナル伝達経路と、唾液及び口腔微生物叢等の局所因子との連続的な相互作用を示すことが示唆されている。上皮の変性及び破壊が最終的に粘膜潰瘍形成を引き起こすが、放射線によって誘導された粘膜毒性に関連する早期変化は、内皮、及び粘膜下層の結合組織中で起こると考えられる。粘膜炎発症の全体的な機構は、放射線及び化学療法の両方の場合で類似していると考えられる。
【０１３２】
１．２  シスプラチンによる口腔粘膜炎の化学放射線モデル
研究責任者によって開発されたハムスターにおける化学放射線モデルは、抗粘膜炎化合物の予備評価を与えるのに、正確で、効率的且つ費用効果がある技法であることが分かっている。このモデルでは、ハムスターは、急性放射線試験で利用する０日目での４０Ｇｙの単一線量ではなく、−１日目に５ｍｇ／ｋｇの単一用量のシスプラチン、その後０日目に左側の頬袋への３５Ｇｙの単一線量の放射線を受けた。このモデルにおける粘膜炎経過は、急性放射線モデルに酷似しており、放射線照射のおよそ１６日〜１８日後で粘膜炎スコアがピークに達する。
【０１３３】
２．  研究目的及び要約
２．１  研究目的
この研究の目的は、分割放射線プロトコルによって誘導された口腔粘膜炎の頻度、重症度及び期間に対する、皮下注射で投与したＳＣＶ−０７の効果を評価することであった。
【０１３４】
２．２  研究の要約
ハムスターは、腹膜内注射によって−１日目に５ｍｇ／ｋｇの単一用量のシスプラチン、その後０日目に左側の頬袋への３５Ｇｙの単一線量の放射線を受けた。動物を麻酔し、左側の頬袋をめくり、動物の身体の残りを鉛遮蔽物で保護することで、これを達成した。表１３で詳述するように、１日１回の皮下注射で試験材料を与えた。６日目に始め２８日目まで隔日で続けて、粘膜炎を臨床的に評価した。−１日〜２０日までと同様に試験物質を与えた。
【０１３５】
３．  評価
３．１  粘膜炎評価
６日目から始め、その後２日毎２８日まで（２８日目を含む）粘膜炎の悪性度をスコア付けした。プラシーボと比較した、各薬剤処理の粘膜炎に対する効果を以下のパラメータに従って評価した：
【０１３６】
３．１．１  各群におけるハムスターが潰瘍性粘膜炎になる（スコア≧３）日数の差
各評価日で、各薬剤処理群において盲検粘膜炎スコアが３以上の動物の数を対照群と比較した。累積ベースと比べて差を比較し、カイ二乗解析によって、統計的有意性を求めた。この解析において、対照群と比較した場合に動物群が潰瘍形成した（スコア≧３）日数の有意な低減によって有効性を定義する。
【０１３７】
３．１．２  １日粘膜炎スコアの順位和の差
各評価日に対して、ノンパラメトリック順位和解析を用いて、対照群のスコアを処理群のスコアと比較した。処理の成功は、６日〜２８日の２日以上での処理群におけるスコアの統計的に有意な減少と見なした。
【０１３８】
３．２  体重及び生存率
粘膜炎重症度及び／又は処理によって起こり得る毒性に対する指標として、処理群間での動物の体重の起こり得る差を評価するために、毎日全ての動物を秤量し、それらの生存率を記録した。
【０１３９】
４．  研究設計
４０匹の雄のシリアンゴールデンハムスターに、−１日目に５ｍｇ／ｋｇのシスプラチンの腹膜内注射を与えた。０日目に、全ての動物に左側の頬袋に向けて３５Ｇｙの急性放射線量を与えた。動物を麻酔し、左側の頬袋をめくり、動物の残りの部分を鉛遮蔽物で保護することで、これを達成した。表１３で詳述するように、１日１回の皮下注射で試験材料を与えた。６日目に始め２８日まで隔日で続けて、粘膜炎を臨床的に評価した。
【０１４０】
【表１９】
2010518160.tif 000024
【０１４１】
５．材料及び方法
５．１  研究の実施場所
Watertown, MAにあるBiomodels AAALAC公認施設で研究を行った。Biomodels IACUCから、この研究に対するＩＡＣＵＣ認可番号０７−０６２０−０１を得た。
【０１４２】
５．２  動物
研究の開始時の平均体重が９０ｇであった５〜６週齢の雄のＬＶＧシリアンゴールデンハムスター（Charles River Laboratories）を使用した。耳パンチを使用して動物に個々に番号を付け、１つのケージ当たり１０匹の小さい動物群に収容した。研究開始前の５日間、動物を順応させ、この期間の間、状態不良を示す動物を排除するために、動物を毎日観察した。
【０１４３】
５．３  ハウジング
７０華氏度±５華氏度の温度及び５０％±２０％相対湿度の濾過空気を与えた動物室で研究を行った。動物室は、１時間当たり最低１２回〜１５回の換気を維持するように設定した。動物室は、薄明のない１２時間の明期と１２時間の暗期との明／暗サイクルで自動タイマーにおいた。Ｂｅｄ−Ｏ−Ｃｏｂｓ（登録商標）敷料を使用した。敷料は、最低１週間に１回変えた。ケージ、上蓋、ボトル等を市販の洗剤で洗い、空気乾燥させた。フードに導入される表面及び材料を消毒するのに、市販の消毒剤を使用した。フロアを毎日清掃し、市販の洗剤で最低１週間に２回モップ掛けした。壁及びケージラックを希釈漂白溶液で最低１ヶ月に１回スポンジ掛けした。研究、用量、動物番号及び処理群を識別するのに必要である適切な情報を備えるケージカード又はラベルで全てのケージを印付けした。温度及び相対湿度を研究中に記録し、その記録は残した。
【０１４４】
５．４  食餌
動物に、Ｐｕｒｉｎａ  Ｌａｂｄｉｅｔ（登録商標）５０６１齧歯類用の食餌を与え、水を自由に与えた。
【０１４５】
５．５  動物の無作為化及び配分
放射線照射前に動物を無作為に予め４つの処理群に分けた。個々の番号に対応して、耳パンチで各動物を識別した。タグは研究中に外れる可能性があるので、より一貫した識別のために、タグ付けではなく耳パンチによるナンバリングを使用した。各ケージを識別するのにケージカードを使用するか、又はラベルに研究番号（ＳＣＩ−０４）、処理群番号及び動物番号を印付けした。
【０１４６】
５．６  皮下投与及び薬剤適用
試験化合物であるヒトＳＣＶ−０７ペプチドを粉末で準備し、投与直前に滅菌ＰＢＳ中に溶解した。薬剤は、２７Ｇニードルを備えたツベルクリンシリンジを使用して、０．１ｍＬの容量で与えた。背側又は腹側に皮下注射した。
【０１４７】
５．７  粘膜炎誘導
この研究では、シスプラチンと放射線との組合せによって粘膜炎を誘導した。−１日目に、５ｍｇ／ｋｇの単一注射（腹腔内）としてシスプラチンを与えた。０日目に、３５Ｇｙの単一病巣線量の放射線として放射線を与えた。３．０ｍｍ径の硬化Ａｌ濾過システムによって、焦点距離３０ｃｍのPhilips製の電位１６０ｋＶｐ（キロボルト電位）(１８．７５−ｍａ）Ｘ線電源で放射線を発生させた。照射は、３．３２Ｇｙ／分の速度で左側の頬袋の粘膜を標的とした。Ｖｉｃｔｏｒｅｅｎモデル５３０線量計によるこの電源の較正は、線量率が２８．５７ｎＣ／分であることを示した。この較正を用いて、各放射線量で各動物が受けたエネルギーは、およそ６８８．６ｎＣ（ナノクーロン）であった。照射前に、ケタミン（１６０ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（８ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射によって動物を麻酔した。左側の頬袋をめくり、固定して、鉛遮蔽物を使用して隔離した。
【０１４８】
５．８  粘膜炎スコア付け
上記の研究を通して、粘膜炎スコア、体重変化及び生存率を測定した。粘膜炎の評価のために、吸入麻酔薬によって動物を麻酔し、左側の頬袋をめくった。有効写真尺度との比較によって、粘膜炎を視覚的にスコア付けした。スコアは正常の０から、重度の潰瘍形成の５までの範囲であった（臨床的なスコア付け）。記述用語において、この尺度は以下のように定義する：
【０１４９】
【表２０】
2010518160.tif 000025
【０１５０】
１〜２のスコアは、中度の段階の疾患を表すと考えられるが、３〜５のスコアは、中度から重度の粘膜炎を示すと考えられる。視覚的なスコア付けの後、標準化技法を用いて、各動物の粘膜を撮影した。実験の結果、全てのフィルムを現像し、無作為に写真に番号を付けた。少なくとも２人の独立した熟練の観察者等が、上記の尺度（盲検スコア付け）を用いて盲検様式で写真を格付けした。
【０１５１】
６．  結果及び考察
６．１  生存率
この研究中に、致死は観察されなかった。
【０１５２】
６．２  体重変化
研究群間で体重変化の有意な差はなかった。１日平均の体重変化データを評価した。生理食塩水処理した対照ハムスターは、研究中、平均して出発体重の４６．５％増加した。−１日〜２０日に１０μｇ／ｋｇでＳＣＶ−０７を受けた群におけるハムスターは、研究中、平均して出発体重の５１．３％増加した。−１日〜２０日に１００μｇ／ｋｇでＳＣＶ−０７を受けた群におけるハムスターは、研究中、平均して出発体重の４６．７％増加した。−１日〜２０日に１ｍｇ／ｋｇでＳＣＶ−０７を受けた群におけるハムスターは、研究中、平均して出発体重の４８．８％増加した。各動物の体重増加に対する曲線下面積（ＡＵＣ）を算出した後、一方向ＡＮＯＶＡ検定を用いて異なる処理群を比較することによって、これらの有意差を評価した。この解析の結果は、これらの処理群の間に有意差がなかったことを示していた（Ｐ＝０．６６３）。
【０１５３】
６．３  粘膜炎（表１５及び表１６）
対照動物間の粘膜炎進行の速度及び重症度は、予測されたものと一致していた。
【０１５４】
各群に対する１日平均の粘膜炎スコアを評価した。生理食塩水処理した対照群では、ピーク平均粘膜炎スコアが３．１であり、これは１８日目に起こった。−１日〜２０日に１０μｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７を受けた群では、ピーク平均粘膜炎スコアが２．９であり、これは１６日目に起こった。−１日〜２０日に１００μｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７を受けた群では、ピーク平均粘膜炎スコアが２．８であり、これは１４日目及び１６日目に起こった。−１日〜２０日に１ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７を受けた群では、ピーク平均粘膜炎スコアが３．２であり、これは１６日目に起こった。各群に対してスコアが３以上であった日数を算出し、カイ二乗（χ2）検定を用いてこれらの日数を比較することによって、異なる処理群間で見られた有意差を評価した。この解析の結果を表１５に示す。生理食塩水処理した対照群におけるハムスターは、評価した日数の５０％でスコアが３以上であった。−１日〜２０日に１０μｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７を受けた群では、評価した日数の３４．２％で３以上の粘膜炎スコアが見られ、これは対照とは統計的に有意に異なっていなかった（Ｐ＜０．００１）。−１日〜２０日に１００μｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７を受けた群では、評価した日数の２９．２％で３以上の粘膜炎スコアが見られ、これは対照とは統計的に有意に異なっていた（Ｐ＜０．００１）。−１日〜２０日に１００μｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７を受けた群では、評価した日数の３０．８％で３以上の粘膜炎スコアが見られ、これは対照とは統計的に有意に異なっていなかった（Ｐ＜０．００１）。マンホイットニー順位和解析を用いて粘膜炎のさらなる解析を行い、それぞれの日のそれぞれの群に対するスコアを比較した。この解析の結果を表１６に示す。この解析では、低減が顕著であると見なす前に、一般的に２日間の粘膜炎スコアの有意な低減を必要とする。−１日〜２０日に１０μｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７で処理した群は、生理食塩水対照と比較して、２２日目（Ｐ＝０．０１０）、２４日目（Ｐ＝０．０２２）、２６日目（Ｐ＝０．０１５）及び２８日目（Ｐ＜０．００１）で有意に粘膜炎が低減した。−１日〜２０日に１００μｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７で処理した群は、生理食塩水対照と比較して、６日目（Ｐ＝０．０１５）、２２日目（Ｐ＝０．００３）、２４日目（Ｐ＝０．００５）、２６日目（Ｐ＜０．００１）及び２８日目（Ｐ＜０．００１）で有意に粘膜炎が低減した。−１日〜２０日に１ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７で処理した群は、生理食塩水対照と比較して、６日目（Ｐ＝０．０１５）、２０日目（Ｐ＝０．０２９）、２２日目（Ｐ＝０．０１２）、２４日目（Ｐ＝０．００１）、２６日目（Ｐ＝０．００３）、及び２８日目（Ｐ＜０．００１）で有意に粘膜炎が低減した。
【０１５５】
【表２１】
2010518160.tif 000026
【０１５６】
【表２２】
2010518160.tif 000027
【０１５７】
７．  結論
１．致死率及び体重増加の観察に基づく、この研究におけるＳＣＶ−０７による毒性の痕跡は全く存在しなかった。
２．−１日〜２０日に１０μｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７で処理した動物は、粘膜炎スコアが３以上の日数の統計的に有意な低減（Ｐ＜０．００１）、並びに２２日目（Ｐ＝０．０１０）、２４日目（Ｐ＝０．０２２）、２６日目（Ｐ＝０．０１５）及び２８日目（Ｐ＜０．００１）に粘膜炎スコアの有意な低減を示した。
３．−１日〜２０日に１００μｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７で処理した動物は、粘膜炎スコアが３以上の日数の統計的に有意な低減（Ｐ＜０．００１）、並びに６日目（Ｐ＝０．０１５）、２２日目（Ｐ＝０．００３）、２４日目（Ｐ＝０．００５）、２６日目（Ｐ＜０．００１）及び２８日目（Ｐ＜０．００１）に粘膜炎スコアの有意な低減を示した。
４．−１日〜２０日に１ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７で処理した動物は、粘膜炎スコアが３以上の日数の統計的に有意な低減（Ｐ＜０．００１）、並びに６日目（Ｐ＝０．０１５）、２０日目（Ｐ＝０．０２９）、２２日目（Ｐ＝０．０１２）、２４日目（Ｐ＝０．００１）、２６日目（Ｐ＝０．００３）及び２８日目（Ｐ＜０．００１）に粘膜炎スコアの有意な低減を示した。
【０１５８】
９．  別表
９．１  別表７−動物の体重
【表２３】
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【０１５９】
９．２  別表８−粘膜炎スコア
【表２４】
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【国際調査報告】
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