(57)【要約】Ｔ細胞を活性化するための生分解性デバイスは、生分解性支持体およびこの生分解性支持体に取り付けられたバインダーを含み、このバインダーは、Ｔ細胞表面抗原に結合し得る１つ以上の抗原に対する反応性を有する。本発明はまた、Ｔ細胞を活性化するための方法を提供し、この方法は、１つ以上のＴ細胞アクティベーターをＴ細胞の集団に付着する工程、およびこれらＴ細胞を、上記Ｔ細胞アクティベーターに対する反応性を有する付着されたバインダーをもつ生分解性支持体と混合する工程を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ細胞を活性化するための生分解性デバイスであって：
生分解性支持体；および
Ｔ細胞表面抗原に結合し得る１つ以上の因子に対する反応性を有する、該生分解性支持体に付着されたバインダー、を備える、生分解性デバイス。
【請求項２】
前記生分解性支持体が、コラーゲン、ゼラチン、アルブミンまたは多糖類を含む、請求項１に記載の生分解性デバイス。
【請求項３】
前記生分解性支持体が、脂肪族ポリエステルを含む、請求項１に記載の生分解性デバイス。
【請求項４】
前記１つ以上の因子が、Ｔ細胞表面抗原に対する反応性を有する、請求項１に記載の生分解性デバイス。
【請求項５】
前記バインダーが、ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体、またはそれらのフラグメント、プロテインＡ、アビジンもしくはビオチンを含む、請求項１に記載の生分解性デバイス。
【請求項６】
前記バインダーが、グルタルアルデヒドで前記生分解性支持体に付着される、請求項１に記載の生分解性デバイス。
【請求項７】
ジアミノヘプタンスペーサー基をさらに含む、請求項６に記載の生分解性デバイス。
【請求項８】
前記１つ以上の因子が、マイトジェンタンパク質、モノクローナル抗体、融合タンパク質およびケモカインレセプターに結合し得る因子を含む、請求項１に記載の生分解性デバイス。
【請求項９】
前記マイトジェンタンパク質が、抗ＣＤ３モノクローナル抗体および抗ＣＤ２モノクローナル抗体を含む、請求項１に記載の生分解性デバイス。
【請求項１０】
１つ以上のＴ細胞表面分子に特異的である共起刺激タンパク質をさらに含む、請求項９に記載の生分解性デバイス。
【請求項１１】
Ｔ細胞を活性化するための方法であって：
１つ以上のＴ細胞アクティベーターをＴ細胞の集団に付着する工程；および
該Ｔ細胞を、該Ｔ細胞アクティベーターに対する反応性を有する付着されたバインダーを備えた生分解性支持体と混合する工程、を包含する、方法。
【請求項１２】
前記バインダーが、ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体、またはそれらのフラグメント、プロテインＡ、アビジンもしくはビオチンを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記バインダーが、グルタルアルデヒドで前記生分解性支持体に付着される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
まずバインダーが、前記Ｔ細胞と混合する工程の前に、前記生分解性支持体に付着される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記生分解性支持体への付着の後、前記バインダーにブロッキング剤を付与する工程をさらに包含し、該ブロッキング剤が、タンパク質の非特異的吸収をブロックするために用いられる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記付着されたバインダーをもつ生分解性支持体を、マイトジェンタンパク質、モノクローナル抗体、融合タンパク質およびケモカインレセプターに結合し得る因子を含む１つ以上の因子と混合する工程をさらに包含する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記マイトジェンタンパク質が、抗ＣＤ３モノクローナル抗体および抗ＣＤ２モノクローナル抗体を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記生分解性支持体が、実質的に球形の形態に成形される生分解性材料から作製される、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、細胞治療処置プロトコールにおける使用のための、Ｔ細胞を活性化、増殖および分化するための生分解性デバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
細胞治療方法は、腫瘍、ウイルス病原体および細菌病原体に対する宿主免疫応答を増大するために開発された。細胞治療方法は、しばしば、Ｔ細胞のエクスビボ活性化および増殖を含む。これらタイプの処置の例は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇに発行された特許文献１を参照のこと）、細胞傷害性Ｔ細胞（例えば、Ｃａｉらに発行された特許文献２；およびＣｅｌｉｓらに発行された特許文献３を参照のこと）、増殖された腫瘍排出リンパ節細胞（ｔｕｍｏｒ  ｄｒａｉｎｉｎｇ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ  ｃｅｌｌ）（Ｔｅｒｍａｎに発行された特許文献４）、および種々のその他のリンパ球調製物（Ｂｅｌｌらに発行された特許文献５；Ｏｃｈｏａらに発行された特許文献６；Ｒｉｄｄｅｌｌらに発行された特許文献７；Ｂａｂｂｉｔｔらに発行された特許文献８）の使用を含む。
【０００３】
Ｔ細胞は、増殖するため、エフェクター機能を実行するため、およびサイトカインを産生するために活性化されなければならない（Ｌｉｅｂｏｗｉｔｚ、Ｌｅｅら、１９８８）。Ｔ細胞は、活性化のために抗原呈示細胞（「ＡＰＣ」）との直接接触を必要とする。ＡＰＣは、タンパク質抗原をペプチドに変換し、そして次に、Ｔ細胞によって認識され得る形態にあるペプチド−ＭＨＣ複合体を呈示する。ＡＰＣ上のペプチド−ＭＨＣ複合体と、Ｔ細胞の表面上のＴ細胞レセプター（「ＴＣＲ」）との相互作用は、通常、活性化のために必要な２つのシグナルの第１番目を提供する。活性化のために必要なこの２つのシグナルの第２番目は、通常、ＡＰＣの膜結合産物または分泌産物によって提供される。
【０００４】
多数の天然ＡＰＣを培養で維持すること、ならびに疾患関連抗原を識別すること、および天然ＡＰＣによるＴ細胞に対するこれら抗原のプロセシングおよび呈示を制御することにおける困難性に起因して、代替方法が、細胞治療における使用のためにＴ細胞のエクスビボ活性化のために求められている。１つの方法は、ポリクローナルアクティベーターでＴＣＲを刺激する代わりに、固定化または架橋された抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ｍＡｂ）などにより、天然ＡＰＣ上のペプチド−ＭＨＣ複合体の必要性をバイパスし、Ｔ細胞に対する第１のシグナルを提供することである。その他の方法は、固定化または架橋された抗ＣＤ２ｍＡｂの使用のような、二次的なＴ細胞活性化経路を利用して第１のシグナルを提供する。
【０００５】
抗ＣＤ３ｍＡｂ（第１のシグナル）と抗ＣＤ２８ｍＡｂ（第２のシグナル）との組み合わせは、細胞治療プロトコールにおけるＴ細胞活性化を誘導することにおいて天然ＡＰＣを置換するために最も共通して用いられている。抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ｍＡｂによって提供されるシグナルは、これら抗体がプラスチックプレート（Ｂａｒｏｊａ、Ｌｏｒｒｅら、１９８９；ＤａｍｌｅおよびＤｏｙｌｅ  １９８９）またはセファロースビーズ（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｂｌｕｅら、１９８８）（Ｊｕｎｅらに発行された特許文献９もまた参照のこと）のような固体表面上に固定化されるとき、最も良くＴ細胞に送達される。
【０００６】
抗ＣＤ３ｍＡｂおよび抗ＣＤ２８ｍＡｂを、４．５ミクロン直径をもつトシル（ｔｏｓｙｌ）活性化常磁性ビーズ上に固定化し、続いてＴ細胞を刺激して増殖させ、かつ炎症促進性サイトカインを産生するためにこれらのビーズを使用する方法が記載されている（Ｌｅｖｉｎｅ、Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、１９９７）。これらビーズで活性化されたＴ細胞が、それらを養子免疫療法のために潜在的に有用にする、サイトカイン産生のような性質を示すことがまた示されている（Ｇａｒｌｉｅ、ＬｅＦｅｖｅｒら、１９９９；Ｓｈｉｂｕｙａ、Ｗｅｉら、２０００）。これらビーズは、今やＤｙｎａｌ、ＮＳ（Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）から商標名Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＣＤ３／ＣＤ２８Ｔ−ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎの下で市販され入手可能である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５，１２６，１３２号明細書
【特許文献２】米国特許第６，２５５，０７３号明細書
【特許文献３】米国特許第５，８４６，８２７号明細書
【特許文献４】米国特許第６，２５１，３８５号明細書
【特許文献５】米国特許第６，１９４，２０７号明細書
【特許文献６】米国特許第５，４４３，９８３号明細書
【特許文献７】米国特許第６，０４０，１７７号明細書
【特許文献８】米国特許第５，７６６，９２０号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
細胞治療プロトコールにおいてＴ細胞の増殖のための固定化ｍＡｂを備えた常磁性ビーズの使用は、患者注入の前にＴ細胞からビーズの分離および除去を必要とする。これは、非常に大きな労働力を必要として、そして細胞損失、細胞損傷、汚染の増加したリスクおよび処理の増加したコストを生じる。ビーズ上の固定化ｍＡｂの、標的Ｔ細胞の表面上の対応するリガンドとの密接な会合のため、Ｔ細胞からのビーズの除去は困難である。ビーズ：細胞結合体は、しばしば、Ｔ細胞が標的抗原に内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅ）するまで待つことにより、そして次にＴ細胞からビーズを分離するために機械的破壊技法を用いることにより分離される。この技法は、Ｔ細胞に損傷を引き起こし得、そしてまた、Ｔ細胞上の連結された抗原が、所定の時間の間、細胞表面から除去されることを引き起こし得る（Ｒｕｂｂｉ、Ｐａｔｅｌら、１９９３）。さらに、高度に活性化されたＴ細胞は、細胞治療プロトコールにおける使用のために最も所望され、そしてＴ細胞は、しばしば、Ｔ細胞が標的抗原に内在化する２４〜７２時間の待ち時間の間にこの所望の性質を失う。
【０００９】
Ｔ細胞からの分離後常磁性ビーズを除去するプロセスは、磁石上の細胞／ビーズ溶液の通過を必要とする。このプロセスは、Ｔ細胞とともに残るビーズの量を大いに低減し得るが、ビーズを完全には取り除かない。この不完全なビーズ除去は、毒性効果を引き起こし得る患者に注入されるいくらかのビーズを生じる。この磁性ビーズ除去プロセスはまた、治療のために利用可能なＴ細胞の数を低減する。なぜなら、多くのＴ細胞が、待ち時間および機械的解離の後でさえ、常磁性ビーズと会合されたままであり、そしてそれ故、磁場中にビーズとともに除去されるからである。ある程度の細胞損失がまた、ビーズに結合しないかも知れないＴ細胞が磁力源に隣接する表面に引かれるビーズにより捕獲されるようになるときに起こる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
本発明は、生分解性支持体およびこの生分解性支持体に取り付けられたバインダーを含むＴ細胞を活性化するための生分解性デバイスを含み、このバインダーは、Ｔ細胞表面抗原に結合し得る１つ以上の因子に対する反応性を有している。
【００１１】
本発明はまた、Ｔ細胞を活性化するための方法を含み、この方法は、１つ以上のＴ細胞アクティベーターをＴ細胞の集団に付着する工程、およびこれらＴ細胞を、上記Ｔ細胞アクティベーターに対する反応性を有する付着されたバインダーをもつ生分解性支持体と混合する工程を包含する。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（例示の実施形態の詳細な説明）
本発明は、Ｔ細胞の表面上構造物に対する反応性をもつ１つ以上の第２の物質を固定化または架橋し得る第１の物質で被覆された生分解性支持体材料を利用する。この支持体材料の生分解性性質は、患者中への注入の前にＴ細胞からこの支持体を分離および除去するプロセスを採用する必要性をなくする。
【００１３】
医療適用における生分解性材料の使用は周知である。これら材料は、ワクチン接種および制御薬物放出のためのタンパク質のカプセル化のために用いられている（例えば、Ｒｏｓｓｌｉｎｇらに発行された米国特許第６，５７２，８９４号を参照のこと）。生分解性材料はまた、縫合糸としての使用のために処方されており（例えば、Ｂｅｚｅｍｅｒら、米国特許第６，５００，１９３号を参照のこと）、そして組織エンジニアリング適用で用いられており（例えば、米国特許第４，２７９，２４９号におけるＶｅｒｔら、および米国特許第６，５１１，５１１号におけるＳｌｉｖｋａらを参照のこと）、そしてインプラントとして用いられている（例えば、米国特許第６，５１４，２８６号におけるＬｅａｔｈｅｒｂｕｒｙらを参照のこと）。これら先行技術出願における使用のための生分解性材料の物理的性質および化学的性質は、本発明の要求物とは顕著に異なる。先行技術出願は、活性成分の遅い、制御された分解およびカプセル化、および／または高い引っ張り強さおよび安定性を必要とする。本発明の適用には、制御された速度である必要のない迅速な分解を必要とし、そしてまた高い引っ張り強度は必要としない。第２に、材料は、シグナルをＴ細胞に送達するために４〜２４時間の間、架橋されることが必要であるに過ぎない。さらに、本発明は、生分解性マイクロスフェアを用いる大部分の先行技術の方法におけるように、活性成分のカプセル化を必要としない。
【００１４】
本発明における使用のために選択される生分解性材料は、ヒトにおいて非毒性でかつ非抗原性でなければならず、そして好ましくは、ヒトに、非経口的、好ましくは静脈内に送達され得なければならない。この生分解性材料は、生物学的流体中で分解する天然材料または合成材料に由来し得る。分解は、非酵素的手段を用いて起こることが好ましい。本発明の目的には、生物学的流体は、細胞培養培地および血液を含む。上記生分解性材料は迅速に分解しなければならない（すなわち、口内では、好ましくは２週間以内、より好ましくは１週間以内、そして最も好ましくは３日以内）。この生分解性材料の分解産物は、通常の生理学的経路を経由して代謝され得、そして／または排出され得る非毒性副産物を産生しなければならない。
【００１５】
本発明のデバイスを処方することで用いられる生分解性材料は、製造プロセスで有機溶媒を利用しないことがまた好ましい。なぜなら、これら溶媒は、ヒトにおける長期間曝露に際し、健康リスクを課すからである。しかし、好ましい実施形態は、その実質的にすべての製作プロセスがジクロロメタンのような有機溶媒の使用を必要とする合成ポリマーからのマイクロスフェアの処方である。有機溶媒が上記生分解性支持体の製造において利用される場合、最終処方物中の残存溶媒の量を低減するための試みがなされるべきである。受容可能な残存溶媒濃度は、監督官庁によって決定される。例えば、ＩＣＨ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｈａｒｍｏｎｉｚａｔｉｏｎ）ガイドラインは、血液中の最大許容可能ジクロロメタンレベルを６ｇｍ／日に設定している。
【００１６】
生分解性支持体としての使用のための適切な天然材料の例は、コラーゲン、ゼラチンおよびアルブミンのようなタンパク質、およびデンプン、デキストラン、イヌリン、セルロースおよびヒアルロン酸のような多糖類を含む。
【００１７】
生分解性支持体としての使用のための合成材料の例は、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ＰＬＡおよびＰＧＡのコポリマー（ＰＬＧＡ）またはポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）のような脂肪族ポリエステル、およびポリ酸無水物を含む。これら材料は、医療適用において生分解性ポリマーとして広く用いられている。合成ポリマーは、一般に、それらがより広い範囲の特性を与えるように仕立てられ、そしてより高く予測可能なロット毎の均一性を有する点で、天然材料に対しより大きな利点を提供する。
【００１８】
生分解性ポリマーの物理的性質および挙動に影響する要因は、周知である。これら要因は、モノマー選択、開始剤選択、プロセス条件および添加剤の存在を含む。これら要因は、次に、ポリマーの親水性、結晶性、融点およびガラス転移温度、分子量分布、末端基、配列分布（ランダム対ブロック状）および残存モノマー添加剤の存在に影響する。
【００１９】
一般に、本発明の目的には、ポリマーは、高親水性のために選択されるべきてあり、ポリマーは半晶質またはアモルファスのいずれか、好ましくはアモルファスであり得、好ましくは３７℃をかなり超えるガラス転移温度を備え、このポリマーが体温でゴムよりガラスのように作用することを可能にする。ポリマーは、加速された分解のために低い分子量分布および低い固有粘度を有するべきであり、そして同じ理由のために優先度は、ブロック状組成物よりもランダム組成物である。
【００２０】
生分解性ポリマーは、フィルム、細片、ファイバー、ゲル、メッシュ、スポンジおよび（ナノスフェアまたはマイクロスフェアのような）スフェアのような種々の形状に処方され得る。それらはまた、押し出され、射出成形され、圧縮成型され、または溶媒もしくはスパンキャストされ得る。この一次加工の次にはまた、最終パーツへの引き続く機械加工が続く。
【００２１】
形状の選択は、細胞治療適用に依存する。例えば、上記生分解性材料がＴ細胞をエクスビボで培養するだけに用いられるべきであるが、患者中に注入されないように分解する場合、広い表面積をもつマトリックスの処方物が好ましい。このようなマトリックスは、好ましくは、リンパ節中の樹状細胞の構造を模し、相互連結するたこ足（ｓｔａｒ−ｂｕｒｓｔ）様構造形状またはハニカム構造形状を提供する。
【００２２】
マイクロスフェアは好ましい処方物である。なぜなら、製造の単純さ、および球形形状が細胞レセプターとの相互作用のための増加した表面積を可能にするからである。１〜約５００μｍの小さなマイクロスフェアの粒子サイズは、従来方法による身体中への直接注入を可能にする。それ故、球形形状のデバイスは、細胞治療プロトコールの細胞培養および注入ステップの両方のために用いられ得る。ナノスフェアもまた利用され得るが、ナノスフェアは、ナイーブなＴ細胞を活性化するために十分な架橋を提供せず、そしてそれ故、先に活性化されたＴ細胞とともに用いられ得るに過ぎない。好ましい実施形態では、サイズが１μｍ〜１０μｍの範囲にあるマイクロスフェアが処方される。
【００２３】
本発明の方法によれば、生分解性支持体は、最初、マイクロスフェアのような形状に処方される。この生分解性支持体は、次いで、１つ以上の第２の物質に結合し得る反応性表面を提供する第１の物質で被覆される。この第２の物質は、細胞上の表面構造物への結合を可能にする反応性表面を有する。好ましい実施形態では、第２の物質は、表面発現された細胞レセプターとの相互作用を通じて細胞にシグナルを伝達し得る。
【００２４】
本発明の実施において、この第２の物質は、最初、生分解性支持体上の第１の物質に結合され得、そして次に、標的Ｔ細胞と混合され、それによって、第２の物質は、Ｔ細胞上の表面構造物に結合する。あるいは、この第２の物質は、最初、Ｔ細胞の表面構造物に結合され得、そして次に、結合された第２の物質をもつＴ細胞は、第１の物質で被覆された生分解性支持体と混合される。両方の場合において、最終混合物は、第１の物質で被覆された生分解性支持体を含み、このような第１の物質は１つ以上の第２の物質に結合され、そしてこのような第２の物質は、Ｔ細胞上の表面構造物に結合される。
【００２５】
第１の物質は、吸収、反応性基により、またはカップリング剤もしくはリンカーにより生分解性支持体に取り付けられ得る。本明細書で用いられるとき、用語「カップリング剤」もしくは「リンカー」は、スペーサーによって分離され得る２つの反応性基を含む分子のような二官能性架橋剤またはカップリング剤をいう。
【００２６】
適切な第１の物質は、第２の物質の一部分に結合し得る任意の生分解性材料である。適切な第１の物質の例は、ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体、またはそれらのフラグメント、および、プロテインＡ、アビジンもしくはビオチンのような生物活性物質を含む。第２の物質がマウス抗体のようなマウス由来のタンパク質である実施形態では、適切な第１の物質は、ヒツジもしくはヤギ由来の抗マウスポリクローナル抗体のようなマウス免疫グロブリンに対する特異性をもつポリクローナル抗体、またはラット由来抗マウスＦｃ抗体のような抗マウスモノクローナル抗体である。第２の物質がビオチンで被覆される実施形態では、適切な第１の物質はアビジンまたはビオチンに特異的な抗体である。あるいは、第２の物質がアビジンで被覆される場合は、適切な第１の物質は、ビオチンまたは抗アビジン抗体である。さらに、第２の物質がＩｇＧ分子であるとき、第１の物質は、プロテインＧまたはプロテインＡのような、ＩｇＧに対して高親和性をもつ因子であり得る。
【００２７】
第１の物質は、生分解性支持体へのジアミノヘプタンスペーサー基の第１の付着とともに、またはその付着なくして、グルタルアルデヒドまたはその他のジアルデヒドで、生分解性支持体に化学的に結合され得る。ブロモシアン活性化によるトシル基（ｐ−トルエンスルホニル）で活性化された生分解性支持体への求核置換による共有結合、またはその他の類似の方法がまた用いられ得る。生分解性支持体はまた、アビジンまたはビオチンで直接被覆され得、反対の対応するビオチンまたはアビジンで被覆されたマイトジェンタンパク質のような第２の物質と相互作用する。
【００２８】
適切な第２の物質は、細胞表面構造物に結合し得る生分解性物質である。好ましくは、第２の物質のＴ細胞表面への結合は、第２の因子が第１の物質によって固定化または架橋されるとき、Ｔ細胞にシグナルを伝達する。シグナル伝達は、増殖する、サイトカインを産生する、分化する、そして／またはＦａｓＬ、ＴＲＡＩＬおよびＣＤ４０Ｌのようなエフェクター分子を発現するなど、標的Ｔ細胞が細胞治療適用で所望される機能を実施するようにする効果を有する。
【００２９】
本発明における使用のために適切な第２の物質の例は、合成化合物、核酸、ならびに、ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体、およびそれらのフラグメントもしくは誘導体、および融合タンパク質のような生物工学的に処理されたタンパク質（ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を含むタンパク質のような因子を含む。１つの例では、第２の物質は、マイトジェンタンパク質である。マイトジェンタンパク質は、Ｔ細胞が活性化されるようにするために必要な最小で２つのシグナルをＴ細胞に送達し得る２つ以上のタンパク質である。マイトジェンタンパク質の例は、以下のＴ細胞表面分子：ＣＤ２８、ＣＤ５、ＣＤ４、ＣＤ８、ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ、ＰＤ−１、ＯＸ４０、ＣＤ２７Ｌ（ＣＤ７０）、４−１ＢＢＬ、ＣＤ３０ＬおよびＬＩＧＨＴ（これら表面構造物への対応するリガンド、もしくはそれらのフラグメントを含む）の１つ以上に特異的なタンパク質のような、そしてこれらを含む共起刺激性タンパク質と組み合わせた、抗ＣＤｍＡｂ３および抗ＣＤ２ｍＡｂである。
【００３０】
その他の適切な第２の物質は、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−１２Ｒ、ＩＬ−１Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＦＮ−γＲ、ＴＮＦ−αＲ、ＩＬ−４Ｒ、およびＩＬ−１０Ｒ（これらレセプターに対するｍＡｂ、これらレセプターに特異的な反応性末端をもつ融合タンパク質およびこれらレセプターに対する対応するリガンドまたはそれらの一部を含む）のようなサイトカインレセプターを通じてＴ細胞にシグナルを伝達し得る因子を含む。その他の適切な第２の物質は、以下のカテゴリー：カドヘリン、ＩＣＡＭ、インテグリン、およびセレクチン、にある接着分子に対するｍＡｂ、融合タンパク質およびその対応するリガンドまたはそれらの一部のようなＴ細胞上の細胞接着分子に結合し得る任意の因子を含む。Ｔ細胞上の接着分子の例は：ＣＤ４４、ＣＤ３１、ＣＤ１８／ＣＤ１１ａ（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２９、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）、ＣＤ６２Ｌ（Ｌ−セレクチン）、およびＣＤ２９／ＣＤ４９ｄ（ＶＬＡ−４）である。その他の適切な第２の物質は、Ｃ−ＣおよびＣ−Ｘ−Ｃカテゴリーにあるものを含むケモカインレセプターに結合し得る任意の因子を含む。Ｔ細胞機能に関連するケモカインレセプターの例は、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、およびＣＸＣＲ３を含む。
【００３１】
本発明の１つの実施形態では、生分解性支持体材料は、乳酸およびグリコール酸の混合物を含む直線状ポリエステルポリマーから構築される。このクラスのポリマーは、生体適合性および無害な最終産物への生分解の要件に合致する。本明細書で以後ＰＬＧＡと称されるこれらポリマーは、エステル加水分解によって乳酸およびグリコール酸に分解される。ＰＬＧＡは、優れた生体適合性を所有することが示されている。ＰＬＧＡの無害性質は、これらポリマーに基づくいくつかの非経口遅延放出調製物の、米国食品医薬品局を含む監督機関による認可により例示され得る。ＰＬＧＡに基づき、そして現在市販されている非経口的に投与可能な遅延放出製品は、ＤｅｃａｐｅｐｔｙＴＭ（Ｉｂｓｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、Ｐｒｏｓｔａｐ  Ｓ（登録商標）（Ｌｅｄｅｒｌｅ）、Ｄｅｃａｐｅｐｔｙｌ（登録商標）、Ｄｅｐｏｔ（Ｆｅｒｒｉｎｇ）およびＺｏｌａｄｅｘ（登録商標）（Ｚｅｎｅｃａ）を含む。
【００３２】
Ｌ−ラクテートおよびグリコリドよりむしろＤＬ−ラクテートおよびグリコリドのコポリマーが好ましい。なぜなら、Ｌ−ラクテートが主成分であるとき半晶質であるとは対照的に、ＤＬ−ラクテートが主成分であるとき、それらはアモルファスだからである。この性質は、ポリマーの分解時間を低減する。ポリマーの固有粘度（「Ｉ．Ｖ．」と略され；単位はデシリットル／グラムである）はその分子量の尺度である。好ましくは、ポリマーの固有粘度は、約０．１０ｄＬ／ｇ〜約１．０ｄＬ／ｇ（クロロホルム中で測定されるとき）、より好ましくは約０．１０ｄＬ／ｇ〜約０．５０ｄＬ／ｇそして最も好ましくは０．１０〜０．３０ｄＬ／ｇである。
【００３３】
適切な生分解性ポリマー材料は、ポリ（ＤＬ−ラクチド  コ−グリコリド）の５０／５０混合物である。このポリマーは、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｉｎｃ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）のような商業的供給者から、商標名Ｌａｃｔｅｌ（登録商標）の下、購入することができる。０．１５〜０．２５ｄｌ／ｇの固有粘度をもつ５０／５０  ＤＬ−ＰＬＧ製品番号５０ＤＧ０２０は、本発明における使用のために好ましい材料である。別の好ましい材料は、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ（Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって商標名Ｒｅｓｏｍｅｒ（登録商標）ＲＧ５０３の下で製造される０．３２〜０．４４ｄｌ／ｇの固有粘度をもつ５０／５０  ＤＬ−ＰＬＧである。別の好ましい材料は、０．２６〜０．５４の固有粘度をもつＬａｃｔｅｌ（登録商標）５０／５０  ＤＬ−ＰＬＧ製品番号５０Ｄ０４０（Ｂｉｒｍｉｇｈａｍ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）である。その他の好ましい実施形態では、ポリマーの親水性を増加し、そしてそれ故、分解時間を増加し、そしてポリマーへの第１の物質の共有結合のための活性基を提供するために、一官能性アルコール、水またはαヒドロキシ酸、またはＰＥＧのようなポリマー末端基が、生分解性ポリマーに付加され得る。
【００３４】
好ましい実施形態では、この５０／５０  ＤＬ−ＰＬＧは、マイクロスフェアに処方され得る。
【００３５】
マイクロスフェアは、種々の公知の方法（溶媒蒸発、相分離、噴霧乾燥、または低温での溶媒抽出を含む）によって調製され得る。選択されるプロセスは、単純で、再現性があって、かつ拡張性があるべきである。得られるマイクロスフェアは、均一で注射可能な懸濁物を生成するために、自由に流動し、そして凝集しないようであるべきである。これらマイクロスフェアはまた、無菌でなければならない。これは、熱滅菌ステップにより、そして／または無菌処理により確実にされ得る。
【００３６】
好ましい実施形態では、溶媒蒸発法がマイクロスフェアを生成するために利用される（ＭｃＧｉｎｉｔｙおよびＯ’Ｄｏｎｎｅｌｌ  １９９７）。この方法でマイクロスフェアを生成するために、疎水性５０／５０  ＤＬ−ＰＬＧポリマーは、水混和性有機溶媒中に溶解され、ポリマー溶液を得る。この溶液を、次いで界面活性剤の水性溶液中に添加し、エマルジョン系を形成し、そして撹拌する。撹拌速度がより速いほど、マイクロスフェアのサイズは小さい。マイクロスフェアは、次に、減圧または加熱下であり得る連続的撹拌によって溶媒を蒸発することにより得られる。
【００３７】
本発明の水混和性有機溶媒は、身体に非毒性である必要がある。有機溶媒の代表的な例は、酢酸、乳酸、ギ酸、アセトン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、ジオキサン、およびＮ−メチルピロリドンならびにそれらの混合物からなる群から選択されるメンバーである。好ましくは、この水混和性有機溶媒は、酢酸、乳酸、Ｎ−メチルピロリドン、またはそれらの混合物からなる群から選択されるメンバーである。この水混和性有機溶媒は、単独または水との混合物で用いられ得る。
【００３８】
水相は、好ましくは水およびアルコールに可溶性であり、媒体中に溶解されるとき懸濁媒体（水混和性アルコール）の粘度を増加し得、身体に非毒性であり、そして環境問題を引き起こさないエマルジョン安定化剤を含み得る。エマルジョン安定化剤溶液の代表的な例は：ポリビニルピロリドン、ポリ（エチレングリコール）、およびポロキサマーのような水溶性の合成ポリマー；ヒドロキシプロピルセルロースおよびヒドロキシプロピルメチルセルロース、そして好ましくは、ポリビニルピロリドンおよびヒドロキシプロピルセルロースのようなセルロース誘導体である。水混和性アルコール中のエマルジョン安定化剤の含量は、好ましくは、０．１〜約５０％（ｗ／ｖ）の範囲内、そしてより好ましくは０．２〜約２０％（ｗ／ｖ）の範囲内である。エマルジョン安定化剤の含量は、必要な水混和性アルコールの粘度に従って変動され得る。
【００３９】
本発明によれば、エマルジョン安定化剤が溶解される水混和性アルコールは、１０〜約８０℃、好ましくは２０〜約６０℃、そして最も好ましくは室温で、２００〜約２０，０００ｒｐｍの速度で、好ましくは８００〜１０００ｒｐｍの速度で撹拌される。ポリマー溶液は、エマルジョン安定化剤が溶解される水混和性アルコールにゆっくり添加され、そしてこの混合物は、５分〜約６０分撹拌される。撹拌は５時間までの間継続され得、有機溶媒の蒸発を可能にする。得られるマイクロスフェアは、次に、遠心分離によって集められ、そして徹底的に洗浄される。洗浄されたマイクロスフェアは、次に、第１の物質の付着の準備が整う。
【００４０】
調製されるマイクロスフェアの直径は、好ましくは０．０１〜３００μｍの範囲内、そしてより好ましくは０．１〜１００μｍの範囲内、そして最も好ましくは１〜１０μｍの間であるべきである。粒子サイズ（マイクロスフェアの直径）は、処理の間の撹拌速度、水混和性アルコールの粘度、およびポリマー溶液の粘度を調節することにより制御され得る。
【００４１】
第１の物質での生分解性支持体の後被覆は、第１の物質の性質に依存して種々の標準的な方法によって達成され得る。第１の物質がタンパク質である大部分の適用には、受動的吸収技法が、生分解性支持体へのタンパク質付着のために適切である。その他の適用は、直接的共有結合、生分解性支持体に対して低い親和性をもつ第１の物質を用いるとき、またはＤＮＡ、レクチン、酵素および薬物のような第１の物質の使用、または生分解性デバイスが、受動的に吸収された第１の物質を置換する材料が用いられる環境において使用される適用におけるように連結基による共有結合を必要とし得る。生分解性支持体の表面に対する改変の種々のスキームが、共有結合タンパク質固定化のために適用可能な官能基を導入するために用いられ得、これらとしては：カルボン酸基を形成するための加水分解（固定化は、縮合剤を用いてタンパク質のアミノ基を通じて実行される）、ヒドラジド基を形成するためのヒドラジン分解（過ヨウ素酸塩で酸化された糖タンパク質の炭水化物フラグメントのアルデヒド基による固定化）、二官能性アミンでのアミノ分解（タンパク質のカルボン酸基との縮合）、グルタルアルデヒドでの改変（タンパク質のアミノ基およびスルフヒドリル基による固定化）（Ｅｒｔｌ，Ｂ．，Ｆ．  Ｈｅｉｇｌら、（２０００）．“Ｌｅｃｔｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｉｏａｄｈｅｓｉｏｎ：ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｃａｃｏ−２  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｗｈｅａｔ  ｇｅｒｍ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  Ｐｏｌｙ（Ｄ，Ｌ−ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）−ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ．”  Ｊ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ  ８（３）：１７３−８４、Ｍｕｌｌｅｒ，Ｍ．，Ｊ．  Ｖｏｒｏｓら、（２００３）．“Ｓｕｒｆａｃｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＬＧＡ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ．”  Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  ６６Ａ（１）：５５−６１、Ｔｅｓｓｍａｒ，Ｊ．，Ａ．  Ｍｉｋｏｓら、（２００３）．“Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）−ｂｌｏｃｋ−ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ）  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒａｐｉｄ  ｃｒｅａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃ  ｓｕｒｆａｃｅｓ．”  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２４（２４）：４４７５−８６）が挙げられる。タンパク質は、このようなマトリックス上でそれらの安定性を十分に保持することが知られている。
【００４２】
生分解性支持体の表面に直接的またはリンカーにより第１の物質を被覆した後、細胞培養の間、または患者への注入に際して存在し得るタンパク質の非特異的吸着をブロックすることが所望される。任意の無害なタンパク質がこの目的のために用いられ得る。ウシまたはヒト血清アルブミンは、所望されるブロッキング剤である。大きなサイズのアルブミンが、より小さい、活性な第１の物質のタンパク質の活性を隠す場合には、グリシンまたは小さなポリペプチドが、代替的なブロッキング剤として用いられ得る。
【００４３】
生分解性支持体が、０．５μｍより小さい粒子に処方される場合、生分解性支持体への付着の化学的局面は同じままであるが、機械的局面は適合されなければならない。大部分のプロトコールは、第１の因子の付着プロセスで用いられる試薬から粒子を分離するために遠心分離を用いる。しかし、これは、約０．５μｍより小さいサイズの粒子には実際的でない。なぜなら、大部分の微小遠心分離は、このサイズの粒子を３０分以内にスピンダウンできず、そして極度に高いＧ−力は、これら粒子を再懸濁するには非常に困難になるので推奨されないからである。この状況では、透析または強制的膜濾過のような代替の分離技法が示される。中空ファイバー濾過技法を用いる市販のキットがまた、０．１〜０．５μｍ粒子の有効な分離のために利用可能である。
【００４４】
１つの実施形態では、タンパク質である第１の物質は、標準的な公知の方法での吸着により生物学的支持体材料に結合され得る。タンパク質を、支持体がマイクロスフェアに処方される生分解性支持体に吸着するための１つの方法は、これらマイクロスフェアをｐＨ８．５で０．１Ｍホウ酸緩衝液中に懸濁し、スピンダウンし、そしてこれらマイクロスフェアを２または３回再懸濁することである。第１の物質のタンパク質を、次いで、このホウ酸緩衝液中に懸濁し、マイクロスフェアに添加する。この混合物は、徹底的に少なくとも４時間、そして２４時間までの間混合される。この混合は、好ましくは４℃で行われる。混合後、これらマイクロスフェアをスピンし、そして上清を除き、そしてタンパク質決定のために分析される。被覆されたマイクロスフェアは、次に、１〜５％のウシ血清アルブミンおよび／または０．０５％ｗ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ２０のようなブロッキング剤を含むリン酸緩衝化生理食塩水のような、生理学的緩衝液中に再懸濁される。
【００４５】
被覆された生分解性支持体は、次いで、標的Ｔ細胞に結合し得る所望の第２の物質または第２の物質と合わせられ得、そして次に第１の物質−被覆された生分解性支持体と混合される。
【００４６】
処理の間に、使用前に加水分解により生分解性支持体の過剰な分解を避けるために湿気の存在を最小にすることが必要である。加水分解による分解を避けるために、処理の間で特別の注意が必要である。処理の間で生分解性ポリマーを乾燥するためのステップが採られるべきである。ポリマーは、ポリマーを８０℃で２４時間インキュベートすることにより乾燥され得る。乾燥はまた、減圧乾燥または再循環空気乾燥機内での乾燥によって達成され得る。ポリマーを室温を超えて乾燥するとき、いくつかのアモルファス組成物は乾燥温度がガラス転移温度を超えるとき溶融し得るので注意しなければならない。
【００４７】
生分解性デバイスは、一旦パッケージが開かれると材料が迅速に用いられるように、小アリコートで最良にパッケージされる。パッケージングは、乾燥した防湿バッグ中にあるべきである。上記デバイスは、アルコール中の貯蔵、γ線照射またはエチレンオキシドガスのような種々の方法によって滅菌され得る。生分解性デバイスはオートクレーブによって滅菌されるべきでない。なぜなら、高温が分解を引き起こし得るからである。
【００４８】
本発明のデバイスはまた、瞬間冷凍によって貯蔵され得、そして次に液体窒素中に貯蔵され得、そしてまた貯蔵の前に凍結乾燥され得る。
【実施例】
【００４９】
以下の実施例は、例示目的のみのために含められ、そして本発明の範囲を制限することは意図されない。
【００５０】
（実施例１：）
（マイクロスフェア調製）
溶媒蒸発法をマイクロスフェアの調製のために使用した。０．１５〜０．２５ｄｌ／ｇの固有粘度をもつ、Ｌａｃｔｅｌ（登録商標）（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）５０／５０  ＤＬ−ＰＬＧ製品番号５０ＤＧ０２０を、ポリマーとして用いた。このＤＬ−ＰＬＧ粉末を、２０ｍｌの塩化メチレン中に溶解し、最終５％のＤＬ−ＰＬＧ  ｗ／ｖ比とした。この５％のＤＬ−ＰＬＧ溶液を、次いで、０．１Ｍグリシン／Ｈｃｌ緩衝液ｐＨ１．１中の２．４％ヒドロキシプロピルメチルセルロースの１２５ｍｌに、１０００ｒｐｍでの一定の撹拌下、室温（２５±２℃）で滴下して添加した。撹拌は、有機溶媒の完全な蒸発まで（約３時間）維持する。マイクロスフェアは、１０００ｒｐｍで５分４℃での遠心分離により集め、次いで、３サイクル、蒸留水で洗浄し、濾過および一晩乾燥した。マイクロスフェアサイズは、≦１０％のＣＶ最大で３．０から７．０μｍの範囲であった。
【００５１】
（第１の物質での被覆）
ポリクローナルヤギ抗マウスポリクローナル抗体を、１０μｇ／ｍｌの濃度で５％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む３０ｍｌのＰＢＳ溶液中に懸濁した。この溶液を、約２×１０８粒子／ｍｌの濃度で乾燥マイクロスフェアを再懸濁するために用いた。これらマイクロスフェアおよびポリクローナル抗体を、４℃で回転させて８時間混合した。これらマイクロスフェアを、次いで、ＨＳＡを含むＰＢＳ中で３回洗浄し、濾過し、そして乾燥した。
【００５２】
（第２の物質の付与）
実験の１つの群のために、第２の物質を、ヤギ抗マウス抗体被覆マイクロスフェアに直接添加した。この目的のために、１０μｇ／ｍｌの最終濃度で抗ヒトＣＤ３ｍＡｂおよび抗ヒトＣＤ２８ｍＡｂの５０／５０混合物を、５％ＨＳＡを含むＰＢＳ中に調製した。この溶液を、次いで、被覆されたマイクロスフェアを２×１０８粒子／ｍｌの最終濃度で再懸濁するために用いた。この混合物を、室温で徹底的に４時間の間激しく混合し、３回洗浄し、濾過し、そして一晩乾燥した。
【００５３】
（結果）
（マイクロスフェアサイズ）
マイクロスフェアのサイズ分布を決定するために、これらスフェアのアリコートを、レーザー回折（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｔｙｐｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）により、および位相差顕微鏡により分析した。レーザー回折研究のためには、これらマイクロスフェアは、湿潤剤として０．２％Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳ中に懸濁した。この混合物を、１分間超音波処理し、そして凝集物形成を最小にするために撹拌条件下で分析した。示されたスフェアの分布（凝集物をなくした後）は、７ミクロンの平均で４〜２４ミクロンの範囲であった。
【００５４】
（第１の物質の結合）
第１の物質の被覆を確認するために、ヤギ抗マウスポリクローナル抗体で被覆されたマイクロスフェア吸収体を、１％ＨＳＡを含むＰＢＳ中に懸濁し、そしてＦＩＴＣ結合体化マウスＩｇＧ  ｍＡｂで染色した。コントロールとして、非被覆マイクロスフェアを、同じ条件下で染色した。ビーズを次いでフローサイトメトリーにより分析した。被覆されたビーズは強い染色を示し、第１の物質での成功した被覆を示した。
【００５５】
（実施例２：第２の物質の生物学的効果）
先行技術の刺激方法と比較して、本発明の方法で刺激されたＴ細胞の炎症促進性サイトカイン産生に対する効果を決定するために、以下の研究を行った：
ＰＢＬを、健常ドナーのアフェレーシスによって得られた白血球パック（ｌｅｕｋｏｐａｃｋ）からＰｅｒｃｏｌｌグラジエント遠心分離によって単離した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ４マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いるポジティブ選択によって精製した。細胞を、グルタミンを補充したＸ−Ｖｉｖｏ  １５（ＢｉｏＷｈｉｔｔｉｋｅｒ）中で培養した。
【００５６】
精製されたＣＤ４＋細胞を、２４ウェルプレートに置き、そして５０：５０の比にある抗ＣＤ３ｍＡｂおよび抗ＣＤ２８ｍＡｂで直接被覆されたヤギ抗マウス被覆マイクロスフェアとインキュベートしたか（直接方法）、または細胞を、最初抗ＣＤ３ｍＡｂおよび抗ＣＤ２８ｍＡｂで標識し、そして次に被覆されたマイクロスフェアとインキュベートした。ネガティブコントロールとして、非標識細胞を、ポリクローナルヤギ抗マウス被覆マイクロスフェアとインキュベートした。ポジティブコントロールとして、細胞を、ＣＤ３／ＣＤ２８被覆Ｄｙｎａｂｅａｄとインキュベートした。すべての群は、３：１のビーズ：細胞比に調節した。
【００５７】
精製したＣＤ４＋細胞を、０．５×１０６／ｍｌの細胞密度でウェル中に置いた。７２時間後細胞を含まない上清中のサイトカインの濃度をＥＬＩＳＡによって測定した。
【００５８】
サイトカインデータは、６つの異なる血液サンプルの平均＋／−ＳＤを表す。
【００５９】
【表１】
2010509914.tif 000002
これらのデータは、本発明の間接的方法が、主要（ｐｒｉｍａｒｙ）Ｔ細胞からのＴｈ１サイトカイン産生を増大することを示す。
【００６０】
（実施例３：増殖）
ＣＤ４＋細胞を、培養を９日間継続したことを除いて上記の実施例に記載のように調製した。新鮮なビーズおよび／または抗体を、培養物を０．５〜１×１０６細胞／ｍｌの濃度に分割するとき、３日毎に添加した。細胞は、各実験の開始時に３連で接種した。
【００６１】
【表２】
2010509914.tif 000003
本発明を、好ましい実施形態を参照して記載したが、当業者は、本発明の思想および範囲から逸脱することなく形態および詳細において変更がなされ得ることを認識する。
【国際調査報告】
2010509914.tif 000004
2010509914.tif 000005