(57)【要約】マルチウェルプレートは、ある一定範囲のコンプライアント基質でローディングすることが可能である。50〜51200パスカルのせん断率を有するプレート全体にわたって細胞応答を試験するために、市販のアッセイを使用することが可能である。これらプレート中で細胞を成長させることが可能であり、操作・解析することが可能である。ウェルの底面にハイドロゲルを付着させることが可能である。これらのプレートは、異なる細胞種の付着および成長を支持することが可能であり、かつ標準的な96ウェルプレートアッセイおよび384ウェルプレートアッセイに適合可能である。基質の有効期間を増長させるように、ハイドロゲルの機械的性質は、再現性があり得て、かつ安定であり得る。ハイドロゲルは、様々な細胞種の成長、およびコラーゲンI、コラーゲンIV、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、またはRGDペプチド等の様々な付着リガンドに適合可能であり、ゲル表面に結合させることが可能である。2010537633.tif 000005
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、生理学的範囲を網羅する弾性的性質を有するハイドロゲルを製造するための方法：
第一重合溶液をウェル中に配置する段階；
プレート領域がウェル領域より小さいプレートで、第一重合溶液を被覆する段階；
第一重合溶液をリガンドとコンジュゲートさせる段階；
第二重合溶液をウェル中に配置する段階であって、これによって空気中の酸素が気液界面での重合を実質的に阻害する、段階；および
ウェルを解毒する段階。
【請求項２】
リガンド結合の均一性が、抗リガンドおよび抗IgG被覆された蛍光ビースを用いて評価される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
第二重合溶液が、ウェルをタッピングすることによって均一に分配される、請求項1記載の方法。
【請求項４】
第二重合溶液が、第一重合溶液の縁端およびウェルによって既定されるリング形の領域を実質的に被覆する、請求項1記載の方法。
【請求項５】
第二重合溶液が、第一重合溶液をウェルに固着させる、請求項1記載の方法。
【請求項６】
以下を含む装置：
ウェル；
ウェルに重合溶液を送達するように構成される分注システム；
ウェル中に挿入されるように構成されるペグ；および
ガラスプレートの領域がウェルの領域より小さく、かつウェル中で重合溶液に接触するように構成される、ペグの遠位末端に位置づけられるガラスプレート。
【請求項７】
ウェルがマルチウェルプレートである、請求項6記載の装置。
【請求項８】
ペグが複数のペグであり、かつ複数のペグの各々が、マルチウェルプレート中の対応する複数のウェル中に挿入されるように構成される、請求項7記載の装置。
【請求項９】
ペグをウェル中に出入りさせるように構成されるペグ挿入システムを含む、請求項6記載の装置。
【請求項１０】
第二重合溶液をウェル中に送達するよう構成される第二の分注システムを含む、請求項記載の装置。
【請求項１１】
分注システムが、第二重合溶液をウェル中に送達するように構成される、請求項6記載の装置。
【請求項１２】
ウェルが96ウェルプレートである、請求項6記載の装置。
【請求項１３】
ウェルが384ウェルプレートである、請求項6記載の装置。
【請求項１４】
少なくとも一つの軸でウェルを移動させるように構成されるウェルプレートステージを含む、請求項6記載の装置。
【請求項１５】
ウェルをタッピングするように構成されるウェルタッパーを含む、請求項6記載の装置。
【請求項１６】
以下を含む装置：
マルチウェルプレート；
プレートの少なくとも第一ウェル中に固着された第一ゲル；および
プレートの少なくとも第二ウェル中に固着された第二ゲル、
ここで、第一ゲルおよび第二ゲルのせん断率が異なる。
【請求項１７】
プレートの少なくとも第三ウェル中に位置づけられる第三ゲルを含み、第一ゲル、第二ゲル、および第三ゲルのせん断率が互いに異なる、請求項16記載の装置。
【請求項１８】
ウェルが列でプレート上に位置づけられ、かつ一列のウェル中のゲルのせん断率が実質的に同一である、請求項16記載の装置。
【請求項１９】
マルチウェルプレートが96ウェルプレートである、請求項16記載の装置。
【請求項２０】
一列のウェル中のゲルが、同一列のウェル中のゲルと実質的に類似のせん断率を有し、一列のウェルが空で、かつ11列のウェルがゲルを含むように、プレートが12列のウェルを包含する、請求項19記載の装置。
【請求項２１】
以下を含む装置：
マルチウェルプレート；および
ゲルの厚みが1 mm未満である、プレートの少なくとも第一ウェル中に固着されたゲル。
【請求項２２】
ゲルの厚みが100ミクロン未満である、請求項21記載の装置。
【請求項２３】
プレートの少なくとも第二ウェル中に位置づけられる第二ゲルを含み、第二ゲルの厚みが1 mm未満で、かつ第一および第二ゲルのせん断率が異なる、請求項21記載の装置。
【請求項２４】
第二ゲルの厚みが100ミクロン未満である、請求項23記載の装置。
【請求項２５】
ゲルがヘテロ二官能性架橋剤およびリガンドで誘導体化される、請求項21記載の装置。
【請求項２６】
細胞を請求項6、16、または22記載の装置と接触させる段階を含む、生理学的成長条件または環境をシミュレーションする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は、2007年8月30日出願の米国特許仮出願第60／969,104号の恩典を主張する。
【０００２】
助成金
米国政府は、NIH HL-82856、GM-073628契約の下で、本発明に対して一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
背景
生存細胞の物理的環境は、細胞が増殖、代謝、分化、および再構成する能力に影響を及ぼす。生存細胞は、細胞基底部に存在するマトリックスの剛性（すなわち、せん断率）に極端に応答して、系譜を特定し、異なる表現型状態および物理的状態を発現する。
【０００４】
硬質の基質は、多くの場合、細胞挙動を評価するためには不適切であり得るという一般的なコンセンサスが、生体工学研究者および生命科学者の間で生じている。より現実的に組織環境を模倣する初期の試みは、コラーゲン、フィブリン、およびマトリゲル等のハイドロゲルを形成する三次元的に再構成された生物学的構成要素に依存していた。より最近では、合成自己集合ペプチドゲル（PuraMatrix）、アルギン酸スポンジ（AlgiMatrix）、およびヒアルロナン由来のゲル（Glycosan）が市販されている。しかしながら、これらの方法は極めて高価であるか、技術的に実行不可能であるか、または2Dシステムを念頭において設計される多数の細胞ベースの高処理アッセイに適合しない可能性がある。また、三次元での培養は評価されるが、一般に、これらのシステムでは広範な弾性の制御が可能でない。さらに、多くの場合、薬学的化合物に対する細胞応答およびインビトロでの生物製剤によっては、インビボの機能性および毒性が正確に予測されない。
【発明の概要】
【０００５】
概要
本発明の実施によって、一つまたは複数の以下の可能性を提供することが可能である。様々なせん断率（すなわち、剛性）を有するウェル集合物を提供することが可能である。一つの態様において、ある一定範囲のコンプライアント（compliant）基質でマルチウェルプレートを製造することが可能である。50〜150,000パスカルの範囲の剛性を有するプレート全体にわたって、市販のアッセイまたはオーダーメイドのアッセイを、細胞応答を試験するために使用することが可能である。例えば、基質のせん断率に強く依存し得る肺線維芽細胞の増殖およびアポトーシスを試験することが可能である。細胞をプレート中で成長させることが可能であり、従来のマルチウェルプレートと一致した様式で操作および解析することが可能である。
【０００６】
一つの態様において、ウェル（例えば、24、96、384ウェルのプレート中のウェル）の底面に、ハイドロゲルを固着させる（すなわち、強固に付着させる）ことが可能である。強固な付着によって、長期の細胞培養、ならびにハイドロゲルの収縮および剥離を引き起こす可能性がある一部のアッセイ試薬に適合可能になる。プレートは、異なる細胞種の付着および成長を支持することが可能で、標準的なマルチウェルプレートアッセイに適合可能である。基質の有効期間を増加させるように、ハイドロゲルの機械的性質は、再現性があり得て、かつ安定であり得る。ハイドロゲルは、様々な細胞種の成長、およびコラーゲンI、コラーゲンIV、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、またはRGDペプチド等の様々な付着リガンドに適合可能であり、ゲル表面に結合させることが可能である。
【０００７】
マルチウェルガラス底面プレート中で、方向において変動する複数のせん断率のゲルを成形し、誘導体化することが可能である。細胞増殖、アポトーシス、シグナル伝達事象、ならびに可溶性因子および不溶性因子の検出を含むがこれらに限定されない剛性依存的な生態を高処理様式で評価することが可能であり、かつ標準的なマルチウェルプレートアッセイに供することが可能である。複数のせん断率のプレート中で成長させた細胞を固定して、免疫学的に染色することができ、あるいは遺伝子発現およびタンパク質解析のために単離することができる。線維芽細胞、平滑筋、内皮、上皮、腫瘍、類骨、および神経細胞を含む、付着依存性の細胞種を研究することが考えられる。プレートは、成体幹細胞または胚性幹細胞の分化を方向付ける手段としての役割を果たすことが可能である。
【０００８】
本明細書に記載される機器および方法は、胚性幹細胞および／もしくは成体幹細胞、例えば後者であれば正常組織もしくは腫瘍由来の組織から得られるもの等をプログラムするか、または再プログラムするために有用である。細胞をチャンバーで培養し、基質の剛性の変動に供することが可能である。再プログラムされた幹細胞は、他のパラメーターの中でも、その挙動（例えば、動きもしくはその欠如）、細胞基質の物理的状態、外観、遺伝子／タンパク質の発現における変化、または細胞内因子もしくは分泌因子の生産によって同定される。本方法および画像解析システムは、細胞の特性をモニタリングするために使用され、かつ所望の表現型の細胞に関して同定／スクリーニングするために使用される。例えば細胞とは、所望の分化状態または「幹性」状態での細胞であり、例えば表現型とは、細胞または複数の細胞に適用される培養基質の剛性変化における変動への応答としての表現型である。本方法は、非侵襲性、非撹乱性、自動化可能、および定量的な方法を包含し、かつ成体幹細胞または胚性幹細胞、ならびに全表現型の分化細胞等の細胞の検査に適用され、かつ様々な分化段階の細胞に適用される。細胞または細胞群が曝露される培養環境または物理的ストレスに応答して、保存された／固定されたものとしてか、またはリアルタイムにおいて、細胞の生存度、幹性、または可塑性が、培養の間の様々な時点でモニタリングされ、定量化される。
【０００９】
一般に、一つの局面において、本発明は、生理学的範囲を網羅する弾性的性質を有するハイドロゲルを製造する方法を提供し、第一重合溶液をウェル中に配置する段階、プレート領域がウェル領域より小さくなるように第一重合溶液をプレートで被覆する段階、第一重合溶液をリガンドとコンジュゲートさせる段階、空気中の酸素が気液界面で重合を実質的に阻害するように第二重合溶液をウェル中に配置する段階、およびウェルを解毒する段階を含む。
【００１０】
本発明の実施は、一つまたは複数の以下の特徴を包含する可能性がある。抗リガンドおよび抗IgG被覆された蛍光ビースを用いて、リガンド結合の均一性を評価することが可能である。ウェルをタッピングすることによって、第二重合溶液を均等に分配することが可能である。第二重合溶液は、第一重合溶液の縁端およびウェルによって既定されるリング形の領域を実質的に被覆することが可能である。第二重合溶液は、第一重合溶液をウェルに固着させることが可能である。
【００１１】
一般に、別の局面において、本発明は、ウェル、重合溶液をウェルに送達するように構成される分注システム、ウェル中に挿入されるように構成されるペグ、およびガラスプレートの領域がウェルの領域より小さくなり、かつウェル中の重合溶液と接触して構成されるように、ペグの遠位末端に位置づけられるガラスプレート、を含む装置を提供する。
【００１２】
本発明の実施は、一つまたは複数の以下の特徴を包含する可能性がある。ウェルは、マルチウェルプレート中のウェルであり得て、各々のペグがマルチウェルプレート中の対応するウェル中に挿入されて構成され得るように、ペグは一つより多いペグであり得る。ペグをウェル中に出入りさせるようにペグ挿入システムを構成することが可能である。第二重合溶液をウェル中に送達するように、第二の分注システムを構成することが可能である。第二重合溶液をウェル中に送達するように、分注システムを構成することが可能である。ウェルは、96または384ウェルプレートであり得る。少なくとも一つの軸でウェルを移動させるように、ウェルプレートのステージを構成することが可能である。ウェルをタッピングするために、ウェルタッパーを構成することが可能である。
【００１３】
一般に、別の局面において、本発明は、マルチウェルプレート、少なくともプレートの第一ウェル中に固着された第一ゲル、ならびに第一ゲルおよび第二ゲルのせん断率が異なるように、少なくともプレートの第二ウェル中に固着された第二ゲルを含む装置を提供する。
【００１４】
本発明の実施は、一つまたは複数の以下の特徴を包含する可能性がある。第一ゲル、第二ゲル、および第三ゲルのせん断率が互いに異なるように、少なくともプレートの第三ウェル中に第三ゲルを位置づけることが可能である。ウェルは、プレート上に列で位置づけることができ、一列のウェル中のゲルのせん断率は実質的に同一であり得る。マルチウェルプレートは96ウェルプレートであり得て、かつ一列のウェル中のゲルが同一列のウェルのゲルと実質的に類似のせん断率を有し得る、一列のウェルが空で、かつ11列のウェルがゲルを含むような、12列のウェルを含み得る。
【００１５】
一般に、別の局面において、本発明は、マルチウェルプレート、および少なくともプレートの第一ウェル中に固着される厚みが1 mm未満であるゲルを含む装置を提供する。
【００１６】
本発明の実施は、一つまたは複数の以下の特徴を包含する可能性がある。ゲルの厚みは100ミクロン未満であり得る。第二ゲルの厚みが1 mm未満であるように、少なくともプレートの第二ウェル中に第二ゲルを位置づけることが可能であり、また、第一ゲルおよび第二ゲルのせん断率は異なる。第二ゲルの厚みは100ミクロン未満であり得る。ヘテロ二官能性架橋剤およびリガンドを用いて、ゲルを誘導体化することが可能である。
【００１７】
細胞を該機器または装置に接触させることによって生理学的成長条件をシミュレートする方法もまた、本発明の範囲内である。例えば、細胞は、心血管、胃腸管、腎臓、尿生殖器、筋骨格、神経系、口、胸部、歯周部、もしくは皮膚細胞、またはそれらの前駆体である。機器の細胞培養基質のせん断率は、評価される組織種の範囲内である。さらに、細胞挙動または細胞応答が、様々な剛性の基質との接触によって誘導される。例えば、幹細胞または前駆体細胞の分化経路は、細胞を培養する基質のせん断率に基づいて、特定の表現型に向けて駆動される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ハイドロゲルを製造するための集合物の側面図である。
【図２】二つの重合溶液でコンプライアント基質を創出するための方法および装置の、フローチャートおよび説明図である。
【図３】重合体表面の縁端効果の写真である。
【図４】単一の重合溶液でコンプライアント基質を創出するための方法および装置の、フローチャートおよび説明図である。
【図５】複数のゲルで構成される、例示的な96ウェルプレートである。
【図６】複数のゲルで構成される、例示的な384ウェルプレートである。
【図７】ある一定範囲のせん断率値を有するハイドロゲルを含む384ウェルプレート中での、ヒト肺線維芽細胞の成長を示すグラフである。
【図８】ある一定範囲のせん断率値を有するハイドロゲルを含む384ウェルプレート中で成長させたヒト肺線維芽細胞のアポトーシスを示すグラフである。
【図９】細胞を成長させるハイドロゲルのせん断率値の関数としての、異なる細胞種の細胞成長を比較するグラフを包含する。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
好ましい態様の詳細な説明
硬質のプラスチック上で成長された細胞は、軟部組織中に存在する同一の細胞とは異なる挙動を示す。例えば、硬質の基質は、典型的に高速度の増殖を支持することができるのみならず、細胞分化を減衰させる傾向があり、天然の環境における正常な細胞の機能を歪曲させうる。したがって、本明細書において記載される発明は、軟部組織の弾性を模倣する基質上での細胞の成長を提供し、かつインビトロシステムの簡便性を維持する一方で、組織環境の基礎的な局面を捕捉すると考えられるアプローチを提案する。
【００２０】
本発明の態様は、生理学的に関連する広範な範囲を網羅する弾性的性質を有するハイドロゲルを製造するための技術を提供する。ガラス底面のマルチウェルプレートを使用することが可能である。適切な弾性環境において細胞を研究することが可能である。マルチウェルプレートには、生理学的範囲のせん断率値にわたって、合成マトリックスに被覆されたハイドロゲルを使用することが可能である。例えば、生物学的アッセイに関して一般に使用されるフォーマットである96ウェルプレートを使用することが可能である。本システムはまた、高処理スクリーニング（384ウェルプレート）、または細胞培養（ペトリディッシュ）に改めることが可能な、他のフォーマットに拡張することが可能である。一般に、軟部組織の弾性を再現するために、各ウェルの底面に固着される、薄く、視覚的に透明な層として、ポリアクリルアミドハイドロゲルを重合する。ハイドロゲルネットワークを相互連結する架橋の数を制御することによって、弾性率が約20パスカル（脂肪）〜約100,000パスカル（骨格筋）の典型的な軟部組織（心臓、肺、腎臓、肝臓、筋肉、神経等）の範囲全体にわたって、弾性を調整することが可能である。それと比較して、ポリスチレンプラスチックで作製される先行技術の細胞培養ディッシュは、約3,000,000,000パスカルの剛性を有する。
【００２１】
図1に関して、ハイドロゲルを製造するための集合物10が示される。集合物10は、少なくとも一つのペグ12、ウェル14、重合溶液16、ガラスウェル底面18、およびガラスプレート20を包含する。ウェル14は、プレート中に12×8マトリックスのウェルを含む96ウェルの集合物（例えば、Matrical 96ウェル集合物）等の、マルチウェル構成であり得る。ウェル14はまた、6ウェル、24ウェル、384ウェルの構成でもあり得る。一般に、ウェル14は、異なる介入下において様々な生物学的終点を研究するために使用される標準的なマルチウェルプレートを包含することが可能である。ウェル14内に配置された細胞の観察を可能にするために、ウェル底面18の底面はガラスであり得る。ウェル底面18は、重合溶液16中に酸素が流入するのを阻害するよう構成される他の材料であり得る。一つの態様において、様々な比率のアクリルアミド：ビスアクリルアミドで、重合溶液16を構成することが可能であり、分注システム（例えば、ピペット、自動化された液体分注システム）によって、重合溶液16をウェル中に送達することが可能である。重合溶液16は、ポリアルキルイミド、ポリ（N-ビニルホルムアミド）、ポリビニルアルコール、ポリ（エチレングリコール）等の重合体ハイドロゲルであり得る。また、ポリジメチルシロキサン、シリコーン、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、多糖類、自己集合性ペプチド、コラーゲン、ゼラチン、フィブリン、メチルセルロース、アガロースでもあり得る。384ウェルの集合物に関して、各ウェルは、典型的に1〜2μlの重合溶液16を収容することが可能である。96ウェルの集合物は、典型的に約5μlを収容すると考えられる。重合溶液の量は、結果として得られるゲルの所望の厚みに基づいて変動し得る。送達システムは、ピペットまたは類似の液体分注システム（例えば、BioTek Microplate Liquid分注システム）であり得る。ガラスプレート20は、疎水性ガラスであり得て、かつペグ12の遠位末端に位置づけられる。限定ではなく一つの例として、環状ウェル14に関して、ガラスプレート20の直径はウェル14の直径より小さい。ウェル14、ペグ12、ウェル底面18、およびガラスプレート20は、他の形状であり得る。
【００２２】
操作の際には、ガラスプレート20が重合溶液16と接触し得るように、ウェル14内部でペグ12を下降および上昇させることが可能である。例えば、重合溶液16がウェル14の直径全体にわたって均一な厚みに圧縮されるように、ウェル底面18の50ミクロンの範囲内に、ガラスプレート20を位置づけることが可能である。しかしながら、ガラスプレート20は均一な表面である必要はない。重合溶液16の表面で、しわおよび他の不規則性を創出するため、プレート20は、陽性および陰性設計（例えば、出っ張り、へこみ、穴）を包含し得る。例えば、ウェル14を分注システムに提示するため、ウェル14をペグ12の下に配置するため、およびウェル底面18およびガラスプレート20が共に近接するよう移動させるため、ウェル14およびペグ12を独立的に移動させることが可能であるように、それらを直線および回転式のアクチュエータに結合することが可能である。
【００２３】
図2に関して、さらに図1に関して、コンプライアント基質を創出するための方法および装置100が示される。しかしながら、プロセス100は例示的であるのみであり、限定的ではない。プロセス100は、例えば、段階を添加するか、除去するか、または再編成することにより、改変されてもよい。
【００２４】
段階102で、重合溶液16がウェル中に配置される。限定ではなく一つの例として、384ウェルトレイの各ウェルは、およそ1〜2μlの重合体ハイドロゲルを含む。例えば、アクリルアミド／ビスアクリルアミド混合物を使用することが可能である。例えば、20〜100,000 Paの範囲の異なるせん断率のゲルを産生するために、異なる濃度のアクリルアミド／ビスアクリルアミド混合物を使用することが可能である。ポリアルキルイミド、ポリ（N-ビニルホルムアミド）、ポリビニルアルコール、ポリ（エチレングリコール）、ポリジメチルシロキサン、シリコーン、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、多糖類、自己集合性ペプチド、コラーゲン、ゼラチン、フィブリン、メチルセルロース、およびアガロース等の他の重合体ハイドロゲルを使用することが可能である。各々のウェル14のゲルのせん断率は、一定の範囲を網羅する必要はない。一つの態様において、マルチウェルトレイは、各ウェル中に標準的なせん断率（例えば、5000、10,000、17,000 Pa）を有するゲルを包含することが可能である。
【００２５】
段階104で、ガラスプレート20が重合溶液16に接触するように、ペグ12とウェル14との相対的な位置を変更する。限定ではなく一つの例として、重合溶液16を50ミクロン未満の厚みに圧縮する。ガラスプレート20は、重合溶液16と、およそ5〜10分間接触状態のままである。より厚いゲルは、より長い設定時間を要する可能性がある。
【００２６】
段階106で、酸素阻害のため、重合溶液16がウェル14の壁で完全には重合しない可能性がある。一般に、重合はフリーラジカル生成システムに依存し、したがって、他の因子の影響を受けやすい可能性がある。例えば、酸素はフリーラジカルトラップであり、酸素を吸収するか、または酸素に浸透性のある表面は重合を阻害すると考えられ、局所的なゲル歪曲または未重合ゲルがもたらされ得る。したがって、ペグ12およびガラスプレート20が段階108で除去される際、非重合領域16aが存在する可能性がある。図3中の写真Aに関して、重合溶液16の非均一縁端が、ギャップ16aおよびウェル壁14に関連して示される。
【００２７】
段階110で、重合溶液16（すなわち、ゲル）は、リガンドとのコンジュゲーションによって機能化される。ゲル16への細胞接着を改善するために、一般に表面リガンド22を添加する。例えば、所望のリガンドをゲルに共有的に結合することが可能なヘテロ二官能性架橋剤（例えば、sulfo-SANPAH）を用いて、ゲル16の表面を処置する。アミン反応性の光反応性基（例えば、NHS／ニトロフェニルアジド架橋剤：ANB-NOS、sulfo-SBED）、アミンカルボキシル反応性基、アミンスルフヒドリル反応性基、およびアクリル酸エステル等の他のヘテロ二官能性架橋剤を使用することが可能である。例示的なリガンドには、コラーゲン（タイプIコラーゲン）、ラミニン、フィブロネクチン、またはそれらの組み合わせ等の細胞外マトリックス（ECM）タンパク質が包含される。コラーゲン（タイプIII、IV）、ビトロネクチン、ポリ-d-リジン、環状および線状RGDペプチド、ペプチド配列、ならびに陰性電荷基または陽性電荷基等の他の細胞付着リガンド／プロモーターを使用することが可能である。限定ではなく一つの例として、200 mM HEPES中に溶解された1 mMスルホスクシンイミジル-6-（4-アジド-2-ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエートを含む溶液をおおよそ添加することにより、ゲル16の表面を活性化することが可能である。ディッシュを紫外光線に5分間曝露し、0.1 M HEPES溶液で2回洗浄し、PBSで1回洗浄し、タイプIコラーゲン溶液（0.1 mg／ml）で被覆し、4℃で一晩貯蔵することが可能である。次の日に、ゲル16を洗浄し、無血清培養液で水和し、37℃および5% CO2でインキュベーターにおいて貯蔵することが可能である。例えば、異なるウェル中に複数種の重合溶液16を用いて、96ウェルプレートをロードすることが可能である。ペグ14およびプレート20のアレイによって、ウェルを被覆することが可能であり、均一な厚みで、様々なせん断率（例えば、100、200、400、800、1600、3200、6400、12800、25600、および51200 Pa）のゲル16を産生するために、同時にウェルを重合させることが可能である。
【００２８】
段階112で、送達システム24によって、第二重合溶液26を添加することが可能である。送達システム24は、ピペット、または類似の液体分注システムであり得る。酸素阻害によって引き起こされる縁端効果（すなわち、16a）を解消するために、第二重合溶液26を使用することが可能である。一般に、第二重合溶液26は、ウェルに接着することが可能な、より柔軟なポリアクリルアミド（すなわち、比較的弾性のある重合体）である。
【００２９】
段階114で、第二重合溶液26を均一に分配するためにウェル14をタッピングすることによって、メニスカスを形成することが可能である。機械的タッパーによってか、または手動で、タッピングを遂行することが可能である。段階116で、空気中の酸素は、空気と第二重合溶液26との界面で重合を阻害する。すなわち、重合は、メニスカスの深さが最も深いゲル／ウェル縁端でのみ起こる。段階118で、ウェル14の周囲に均一な環状の境界線が形成される。第二重合溶液26のリングは、機能化されたゲル16をウェル中に固着させる（すなわち、場所を固定する）手助けとなる。また、第二重合溶液26は非機能化される（かつ柔軟になる）ことが可能で、リング26上での細胞の付着および成長が最小化され得る。図3の写真Bに関して、第二重合溶液26によって輪郭が示された、第一重合溶液16の均一な縁端の写真が示される。
【００３０】
アクリルアミドおよび他の重合体溶液は、細胞に対して極めて有毒である可能性があり、したがって一般に解毒プロセスを包含することが必要である。段階120で、遊離型の未重合アクリルアミドを解毒するために、グルタチオン32を添加することが可能である。例えば、ウェル14中にグルタチオン32の溶液を分注し、細胞をウェル14に播種する前に、数時間保温することが可能である。
【００３１】
別の態様において、アッセイは、プロセス100で使用される第二重合溶液に対してとりわけ感受性の高い細胞を包含する可能性があり、段階120での清浄化段階は、必要とされるレベルにウェル14を解毒するには不十分である可能性がある。図4に関して、さらに図1および2に関して、単一の重合体溶液を用いてコンプライアント基質を創出するための方法および装置200が示される。しかしながら、プロセス200は例示的であるのみであり、限定的ではない。プロセス200は、例えば、段階を添加するか、除去するか、または再編成することにより改変されてもよい。
【００３２】
本方法および装置200は、複数のガラスプレート20に機能的に連結された複数のピン集合物210を含むマルチウェルピンブロック201を包含することが可能である。ウェル14内にガラスプレート20を位置づけることが可能であるように、各々のガラスプレートの寸法は、マルチウェルプレート上の各々のウェル14の寸法よりわずかに小さい。一つの態様において、マルチウェルプレートは、ガラス底面18をウェルに結合させるために非細胞傷害性接着剤を使用するMatrical Inc.製の96ウェルプレートであり得る。典型的に、ガラスの厚みは、蛍光ベースのアッセイならびに高倍率顕微鏡法および共焦点顕微鏡法に適合性がある（すなわち、約170ミクロンの厚み）。
【００３３】
段階220で、マルチウェルピンブロック201を構築し、清浄することが可能である。疎水化剤（例えば、Surfasil, Pierce）を用いて、ピンブロックガラス20を処置することが可能であり、ゲル成形に先立ちメタノールで徹底的に清浄することが可能である。一つの態様において、プレート20の四隅の各々にスペーサーを配置することによって、ゲルの厚みを制御することが可能である。
【００３４】
段階222で、その後添加される重合体溶液がウェルに固着されることを確実にするために、マルチウェルプレートの各々のウェル14を50μlのシラン水溶液で処置することが可能である。一般に、以下の式の置換プロピルトリメトキシシランであり得る薬剤で、ウェル14を処置する：
2010537633.tif 000003
式中、Rは、NR1R2またはOR3であり、
R1およびR2は独立して、水素またはC1−C6アルキルであり；
R3は、アルキル、アルケニル、アルキニル、またはアシル（例えば、C(O)R4、ここで、R4は、水素、アルキル、アルケニル、もしくはアルキニルである）。
【００３５】
特定の化合物には、以下のものが包含される：
2010537633.tif 000004
。
【００３６】
例えば、ポリアクリルアミドハイドロゲルに関して、およそ0.004〜0.4%の3-メタクリルオキシプロピルトリメトキシシランの溶液を、ウェル14中に約10分間配置することが可能である。段階224で、各々のウェル14を蒸留水中でリンスし、乾燥する（例えば、マルチウェルプレート全体を蒸留水中に配置し、空気乾燥または送風乾燥することが可能である）。処置されたガラス表面18は、その後添加されるポリアクリルアミドと反応し、ポリアクリルアミドをウェルに固着させる共有的で長期的な結合を形成する。
【００３７】
一つの態様において、段階222で、マルチウェルプレートの各々のウェルを、3-アミノプロピルトリメトキシシランで処置することが可能である。例えば、ポリアクリルアミドハイドロゲルに関して、およそ97%の3-アミノプロピルトリメトキシシラン溶液で、ウェルをおよそ10分間被覆することが可能である。段階224で、各々のウェルを蒸留水中でリンスし、乾燥する（例えば、マルチウェルプレート全体を蒸留水中に配置し、空気乾燥または送風乾燥することが可能である）。続いて、処置されたガラス表面を、水中の0.5%グルタルアルデヒドで30分間被覆し、続いてリンスし、乾燥する。完全に機能化されたガラスは、その後添加されるポリアクリルアミドと反応して、ポリアクリルアミドをウェルに固着させる共有的で長期的な結合を形成する。
【００３８】
段階226で、少量（例えば、96ウェルトレイ中の各々のウェルに関して、およそ5μl）の重合溶液16をウェル14の各々の底面に添加する。限定ではなく一つの例として、重合溶液16は、アクリルアミドおよびビスアクリルアミドの混合物であり得る。プロセス100に関して上で議論されたような他の重合溶液も使用されてもよい。アクリルアミドおよびビスアクリルアミドの比率は、完成されるハイドロゲルの所望の剛性に基づいて変動し得る。混合物はまた、0.15% TEMED、0.075%過硫酸アンモニウム、および1 mM重亜硫酸ナトリウム（脱酸素剤として作用する）も含む可能性がある。
【００３９】
段階228で、各々のウェル14が、ピンおよびガラス集合物210、20を収容するように、マルチピンアレイブロック201をマルチウェルトレイに対して整列させる。一つの態様において、第二のマルチウェルトレイとともにマルチピンアレイブロックを構築することが可能であり、ガラスプレートに固着された棒の末端が第二マルチウェルトレイから伸張するように、各々のウェルが棒およびガラスプレート集合物210、20に固着されている。操作の際には、ウェル14中にガラスプレート20を下降させることが可能であるように、第二マルチウェルトレイを反転することが可能であり、重合溶液16を含むマルチウェルトレイ上に第二マルチウェルトレイを整列させることが可能である。
【００４０】
段階230で、重合溶液16およびガラス底面18に対してガラスプレート20を強く加圧する。限定ではなく一つの例として、圧縮後の溶液16（すなわち、ゲル）の厚みは、100ミクロン未満であり得る（例えば、10、25、50、70、80ミクロン）。アッセイによっては、ゲル16の厚みがより大きい可能性もある（例えば、0.3、0.5、.75、1.0 mm）。添加される重合体溶液の容量は、結果として得られるゲルの厚みに影響を与える可能性がある。ガラスプレート20は、溶液16が完全に重合化するまで（例えば、およそ10〜15分であるが、より厚いゲルに関してはより長い時間が要される可能性がある）、位置にとどまる。一つの態様において、例えば窒素環境等の無酸素チャンバー中に、マルチウェルトレイおよびピンアレイ集合物を配置することが可能である。
【００４１】
段階232で、ガラスプレート20をウェル14から除去する。典型的には、プレート20がゲル16から剥がれるように横力を作用させつつプレート20を持ち上げることにより除去する。プレート20が各々のウェル14から除去された後、ゲル16を水和させるため、およそ100μlの蒸留水212をウェルに添加する。
【００４２】
段階234で、蒸留水212を除去し、ヘテロ二官能性架橋剤、続いてリンカーを用いて、ゲル16を誘導体化する。一つの態様において、50 mM HEPESバッファー中の35μlの0/5 mg/mlのSulfo-SANPAH（N-スルホスクシンイミジル-6-[4’-アジド-2’-ニトロフェニルアミノ]-ヘキサノエート）を、各々のウェル14（すなわち、96ウェルトレイ中のウェルに関して）に添加する。続いて、ウェル14をUV光におよそ5分間曝露することが可能である。UV光への曝露後に、sulfo-SANPAH溶液を除去することが可能であり、100μlの50 mM HEPESでゲル16をリンスすることが可能である。続いて、PBS中の100μlの100μg/mlコラーゲンI（ペプシン可溶化）を各ウェルに添加することが可能であり、続いて室温でおよそ4時間保温することが可能である。続いて、コラーゲンI溶液をウェルから除去する。プロセス100に関連して上で議論されたような他の架橋剤およびリガンドを使用することが可能である。一つの態様において、ウェル14への添加に先立ち、重合溶液16を誘導体化することが可能である。
【００４３】
段階236で、ウェル14およびゲル16を滅菌する。一つの態様において、各ウェル14に200μlのPBSを添加する。続いて、UV光216の下で、ウェル14をおよそ2時間滅菌する。PBSを除去し、およそ200μlの培地中に細胞を播種することが可能である。
【００４４】
図5に関して、さらに図2および4に関して、一つの態様において、各々のウェル14の弾性ゲル16のせん断率が列方向で変動するように、96ウェルプレートを構成することが可能である。例えば、昇順に増加するせん断率（すなわち、各々50、100、200、400、800、1600、3200、6400、12800、25600、および51200 Pa）のゲル16でウェル列をロードすることが可能である。さらに、非誘導体化ゲルは、各せん断率値に関するバックグラウンド対照としての役割を果たすことが可能である。プレートの行は、試験プロトコールのために要される異なる試験細胞およびブランクを包含する可能性がある。一つの態様において、マルチウェルプレート全域のゲルのせん断率値は、実質的に類似している可能性がある。例えば、ウェル中でせん断率が一貫しているアッセイに関しては、細胞種が変動する。
【００４５】
図6に関して、さらに図2および4に関して、一つの態様において、各々のウェル14の弾性ゲル16の弾性率およびせん断率が列方向に変動するように、384ウェルプレートを構成することが可能である。例えば、ゲル16は、150、300、600、1200、2400、4800、9600、19200、38400、76800、および153600 Paの弾性率、ならびに50、100、200、400、800、1600、3200、6400、12800、25600、および51200 Paのせん断率を有する可能性がある。
【００４６】
図7に関して、さらに図2、4、および6に関して、一定の範囲のせん断率値を有するハイドロゲル16を含む384ウェルプレート中での、ヒト肺線維芽細胞成長を示すグラフが示される。グラフは、細胞を成長させるゲルのせん断率を示すx軸302を包含する。x軸302のスケールは対数性であり、10〜1,000,000パスカル（Pa）の範囲である。グラフのy軸304は、細胞数の変化倍率（すなわち、2倍、3倍）を示し、0〜6倍の範囲を有する。0%血清306、0.1%血清308、1%血清310、10%血清312を含む4つの群のデータを、グラフ300にプロットする。グラフ300にプロットされた結果は、異なるせん断率値のゲルを含む384ウェルプレート中に播種され、かつ示された血清濃度に48時間曝露された成人ヒト肺線維芽細胞（CCL-151）に基づく。結果は、細胞数が、およそ800 Paでピークに達して、中程度のせん断率で増加したことを実証する。右端のデータ点314は、硬質のガラス基質上で成長させた細胞を示す。
【００４７】
図8に関して、さらに図2、4、および6に関して、一定の範囲のせん断率値を有するハイドロゲル16を含む384ウェルプレート中で成長されたヒト肺線維芽細胞におけるアポトーシスを示すグラフ320が示される。グラフは、細胞を成長させたゲルのせん断率を示すx軸302を包含する。x軸302のスケールは対数性であり、10〜1,000,000パスカル（Pa）の範囲である。グラフのy軸322は、細胞当たりの相対的カスペース3/7活性を示し、0〜0.035の範囲を有する。0%血清306、0.1%血清308、1%血清310、10%血清312を含む4つの群のデータを、グラフ300にプロットする。グラフ320にプロットされた結果は、異なるせん断率値のゲルを含む384ウェルプレート中に播種され、かつ示された血清濃度に48時間曝露された成人ヒト肺線維芽細胞（CCL-151）に基づく。結果は、アポトーシスのマーカーであるカスペース3/7活性が、より柔軟なゲル上で成長された細胞において上昇することを実証する。細胞を無血清培地中で成長させる場合、該効果は増強される。右端のデータ点314は、硬質のガラス基質上で成長させた細胞を示す。
【００４８】
図9に関して、さらに図2、4、および6に関して、細胞を成長させるハイドロゲル16の剛性の関数として、異なる細胞種の細胞成長を比較するグラフ330、332、334、336、338、340を示す。各々のグラフは、細胞を成長させたゲルのせん断率を示すx軸を包含する。x軸のスケールは対数性であり、10〜1,000,000パスカル（Pa）の範囲である。グラフのy軸は細胞数の変化倍率（すなわち、2倍、3倍）を示し、0〜10倍の範囲を有する。384ウェルプレートにおいて、100細胞/mm2の密度で細胞を播種し、10%血清を含む培地中で48時間培養した。細胞は、胎児肺線維芽細胞330、成人肺線維芽細胞332、正常ヒト肺線維芽細胞334、皮膚線維芽細胞336、筋芽細胞338、およびメイディン・ダービー（Madin-Darby）イヌ腎臓340を包含する。結果は、細胞数の変化が、せん断率および細胞種に基づくことを示す。
【００４９】
コンプライアント表面のマルチウェル培養プレートは、従来の2D細胞培養に対する改良物であると見なされ得る。一般に、コンプライアント表面のマルチウェル培養プレートは、より現実的な細胞培養に関する要求を満たし得る。例えば、細胞外の剛性を単に調整することによって、異なる系譜をたどる間葉系幹細胞の分化が達成され得ることを、研究者らは実証している。コンプライアント表面のマルチウェル培養プレート技術は、分化の剛性に関してスクリーニングするために使用され得て、同定された後には、全ての将来の研究に関する基質としての役割を果たすと考えられる。さらに、強力な開発マトリックスを創出するために、機械的因子および生化学的因子が、コンビナトリアル様式において評価され得る。
【００５０】
生理学的条件のシミュレーション
大多数の薬物スクリーニング、とりわけがんに関するものは、硬質のマルチウェルプレート上にプレーティングされた細胞を用いて遂行される。しかしながら、硬質のプレート上での増殖を阻害することはできないが、柔軟な基質上では成功する多数の化学療法薬物が存在し、逆の例もまた存在する。一般に、どのような機械的性質（すなわち、弾性率）が所望の細胞表現型を引き起こすと考えられるかの知識は、組織工学に関する3D骨格の設計において、組織工学技術者にとって極めて大きな価値があり得る。
【００５１】
コンプライアント表面のマルチウェル培養プレートはまた、疾患ベースの研究に関しても使用することが可能である。一般に、硬皮症、粥状動脈硬化症、気腫、ならびに肺、肝臓、および腎臓の線維増多等の多数の疾患において生じ得る、組織の明確な硬化（または柔軟化）が存在する。コンプライアント表面のマルチウェル培養プレート技術は、現在のところ可能でない詳細なレベルでの剛性依存性の細胞挙動の評価へと当該分野を開放する。例えば、脂肪組織と接触する細胞の成長／挙動のシミュレーションは、脂肪のせん断率（およそ10パスカル）を特徴とする表面上で細胞を成長させることによって実行される。例えば、正常な脳組織はおよそ200パスカルのせん断率を有するように、異なる組織種は異なる剛性を特徴とする。細胞の成長／挙動はまた、所定の組織の疾患状態に比例して相違し、例えば、正常な乳房組織のせん断率はおよそ100パスカルであるが、乳房腫瘍組織のものはおよそ2000パスカルである。同様に、およそ800パスカルのせん断率を特徴とする線維性肝臓組織と比較して、正常な肝臓組織はおよそ300パスカルのせん断率を有する。成長、シグナル伝達、遺伝子またはタンパク質の発現／分泌、および他の生理学的パラメーターは、異なる基質の剛性との接触に応じて改変され、異なる組織種または疾患状態をシミュレートする機械的性質を特徴とする基質との接触に応じて評価される。
【００５２】
幹細胞の分化は、培養基質の機械的性質によって影響される。例えば、およそ300パスカルのせん断率を有する基質で培養された、例えば間葉系幹細胞等の幹細胞は、神経原性表現型の細胞への分化が誘導される。例えば3000パスカル等の中程度の剛性へ曝露された幹細胞は、筋原性組織への分化が誘導される。別の例において、相対的に堅いせん断率（例えば、10〜15,000パスカル）を特徴とする基質上で成長させた幹細胞は、骨原性表現型を有する細胞への分化が誘導される。したがって、本明細書に記載される変動性剛性の基質およびそれらの基質を含む機器はまた、幹細胞もしくは前駆細胞の分化を、の機械的性質との接触に基づいて、異なる表現型と比較して、一つの表現型に向けて影響を与えるか、または駆動するためにも有用である。
【００５３】
さらに、表現型を標的とする細胞培養において、一般的なプラスチックの硬度は極端な条件であって、望ましくない可能性があるか、または天然の環境において一般的でない可能性がある細胞表現型を誘導し得る。コンプライアント表面のマルチウェル培養プレート技術は、柔軟な基質上での分岐形成の増加および成長の増加を示す神経細胞の培養にとりわけ適している可能性がある。
【００５４】
上の記載は本発明に言及するが、該記載は、一つより多い発明を包含する可能性がある。
【図１】
2010537633.tif 000006
【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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