(57)【要約】本発明は、グリカンおよびそれらの相互作用パートナーを解析するためのシステムを提供する。本発明のシステムは、糖タンパク質結合相互作用の特定および解析に特に有用である。一実施形態において、本発明によって提供される方法は、グリカン構造物の特徴を決定する工程と、複数のグリカンに対するグリカン結合タンパク質の結合を、該グリカンに存在する該決定された特徴と相関させる工程とを含む。一局面において、上記の相関させる工程は、上記特徴を含む複数のグリカンに結合する上記グリカン結合タンパク質の結合データを比較することと、結合の度合いを特徴の存在または非存在と相関させることとを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリカン構造物の特徴を決定する工程と、
複数のグリカンに対するグリカン結合タンパク質の結合を、該グリカンに存在する該決定された特徴と相関させる工程とを含む、方法。
【請求項２】
前記相関させる工程が、前記特徴を含む複数のグリカンに結合する前記グリカン結合タンパク質の結合データを比較することと、結合の度合いを特徴の存在または非存在と相関させることとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記特徴が、単糖レベルの特徴、より高次の特徴、ＧＢＰ結合特徴、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記単糖レベルの特徴が、組成、明示的な組成、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記単糖レベルの特徴が末端組成を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記より高次の特徴が、ペア、トリプレット、クワドルプレット、クラスター、平均リーフ深度、リーフ数、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記ペアが、通常ペア、末端ペア、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記トリプレットが、通常、末端、表面、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記クワドルプレットが、通常、末端、表面、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＧＢＰ結合特徴が、グリカン毎の平均信号、信号対雑音比、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
グリカン構造物の特徴を決定する工程と、
複数のグリカンに対するグリカン結合タンパク質の結合を、該グリカンに存在する該決定された特徴と相関させる工程と、
該相関に基づき、該グリカン結合タンパク質により結合された一連のグリカンを決定する工程とを含む、方法。
【請求項１２】
前記決定された一連のグリカンを含むグリカン結合タンパク質特異的グリカンアレイを調製する工程をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（優先権主張）
この出願は、２００６年８月１４日に出願された同時係属中の米国仮特許出願第６０／８３７，８６８号および２００６年８月１４日に出願された同時係属中の米国仮特許出願第６０／８３７，８６９号への優先権を主張する。これら各々の先の出願の全体の内容は、参考として本明細書に援用される。
【０００２】
（政府支援）
本発明は、契約番号Ｕ５４ＧＭ６２１１６で米国総合医科学研究所から、および契約番号ＧＭ５７０７３で国立衛生研究所から与えられた米国政府の支援で行われた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
複合糖質またはグリカンの構造機能相関に対する統合的手法であるグリコミクスは、ポストゲノミクスの細胞生物学および分子生物学における重要なパラダイムとして出現しつつある。過去数年間で、細胞増殖および発生、腫瘍の増殖および転移、抗凝血、免疫認識／応答、細胞間情報交換、ならびに微生物病原性などの基本的な生物学的プロセスにおけるグリカンの公知の生物学的役割は劇的に増加した。グリカンは、細胞表面、ならびに細胞およびその細胞外環境間の界面の主要な構成要素である。その結果、グリカンは、増殖因子、サイトカイン、免疫受容体、および酵素など多数のタンパク質と相互作用してそれらの活動を調節し、したがって上記の生物学的プロセスに影響を及ぼす。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、グリカン結合能力を特定および／または特徴付ける必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
要旨
本発明は、グリカンおよびそれらの相互作用パートナーを解析するためのシステムを提供する。本発明のシステムは、糖タンパク質結合相互作用の特定および解析に特に有用である。本明細書において、本発明のシステムは、幾つかの異なる糖タンパク質解析に適用され、全ての場合で相互作用の特徴を特定することに成功した。したがって、本発明のシステムの原理は、グリカン相互作用の全域にわたって広く適用可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】本明細書で利用されるデータマイニングプラットフォームを示す図である。パネルＡで示されるのは、データマイニングプラットフォームの主要構成要素である。その特徴は、データベースから抽出されるデータオブジェクトから導出される。特徴は、パターンまたは規則を導出すための分類法により使用されるデータセット中に調製される。パネルＢは、ユーザがグリカンアレイデータにデータマイニングプロセスを適用することを可能にする、ある種のソフトウェアモジュールを示す。
【図２】特徴の模式的記述を示す図である。パネルＡで示されるのは、ペア（ｐａｉｒ）、トリプレット（ｔｒｉｐｌｅｔ）、およびクワドルプレット（ｑｕａｄｒｕｐｌｅｔ）の定義を例証する代表的な高マンノースモチーフである。パネルＢで示されるのは、異なる種類のトリプレットを例証する代表的なＯ結合グリカン［コア２型］モチーフである。単糖を表わすために、以下の記号命名法：
【数１】
2010501074.tif 000002
を使用した。
【図３】高親和性結合の分類を図示する。図中で示されるのは、グリカンアレイのグリカン［ｘ軸に連続的に付番されている］に対してスクリーニングされるガレクチン３の信号対雑音比［ｙ軸］である。赤色の点線は、高親和性結合体であるグリカンを分類するために自由裁量で定義される閾値を示す。これらの閾値は、解析に使用されたＧＢＰの各々について定義された。
【図４】ＤＣ‐ＳＩＧＮのＣＲＤ（灰色のリボントレース）に対する、Ｌｅｗｉｓｘモチーフを含有するグリカン構造物Ｇａｌβ４（Ｆｕｃα３）ＧｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌの結合を図示する。単糖および結合は、グリカン構造物上に標識化している。グリカン結合部位に近接するＧａｌの３‐ＯＨは、赤色の円で示している。したがって、この水酸基における任意の置換は結合に負の効果を示し、データマイニングから得られる分類指標規則と一致する。
【図５】野生型ＨＡの典型的な配列アラインメント。配列は、ＮＣＢＩインフルエンザウイルス配列データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ＦＬＵ／ＦＬＵ．ｈｔｍｌ）から取得した。
【図５Ａ】野生型ＨＡの典型的な配列アラインメント。配列は、ＮＣＢＩインフルエンザウイルス配列データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ＦＬＵ／ＦＬＵ．ｈｔｍｌ）から取得した。
【図５Ｂ】野生型ＨＡの典型的な配列アラインメント。配列は、ＮＣＢＩインフルエンザウイルス配列データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ＦＬＵ／ＦＬＵ．ｈｔｍｌ）から取得した。
【図５Ｃ】野生型ＨＡの典型的な配列アラインメント。配列は、ＮＣＢＩインフルエンザウイルス配列データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ＦＬＵ／ＦＬＵ．ｈｔｍｌ）から取得した。
【図６】グリカン受容体の特異性を理解するための枠組み。α２‐３および／またはα２‐６結合グリカンは、異なるトポロジーをとることができる。本発明によると、ＨＡポリペプチドがこれらのトポロジーのある種に結合する能力は、異なる宿主、例えばヒトの感染を媒介する能力をＨＡポリペプチドに授与する。この図で例証されているように、本発明は、２つの特に関連性のあるトポロジー、すなわち「円錐形」トポロジーおよび「傘形」トポロジーを定義する。円錐形トポロジーをとることができるのは、α２‐３および／またはα２‐６結合グリカンであり、コアに結合した短鎖オリゴ糖または分岐オリゴ糖に典型的である（しかし、ある種の長鎖オリゴ糖がこのトポロジーをとることができる）。傘形トポロジーをとることができるのは、α２‐６結合グリカンであり（おそらくは、α２‐６結合に存在する追加的なＣ５‐Ｃ６結合により許容されるコンフォメーションの多数性の増加による）、支配的に傘形トポロジーをとるのは、Ｎｅｕ５Ａｃα２‐６Ｇａｌβ１‐３／４ＧｌｃＮＡｃ‐のモチーフを特に含有する、長鎖オリゴ糖または長鎖オリゴ糖分岐部を有する分岐グリカンである。本明細書において、ＨＡポリペプチドが傘形グリカントポロジーに結合する能力は、ヒト受容体への結合および／またはヒト感染を媒介する能力を授与する。
【図７】ＨＡ残基と円錐形または傘形グリカントポロジーとの相互作用。ＨＡ‐グリカン共結晶を解析すると、ＨＡ結合部位に対するＮｅｕ５Ａｃの位置は、ほとんど不変であることが明らかになる。Ｎｅｕ５Ａｃとの接触には、Ｆ９８、Ｓ／Ｔ１３６、Ｗ１５３、Ｈ１８３、およびＬ／Ｉ１９４などの高度に保存された残基が関与する。他の糖との接触には、糖結合がα２‐３かまたはα２‐６かどうか、およびグリカントポロジーが円錐形かまたは傘形かどうかに依存して、異なる残基が関与する。例えば、円錐形トポロジーでは、Ｎｅｕ５ＡｃおよびＧａｌ糖と主に接触する。Ｅ１９０およびＱ２２６は、この結合に特に重要な役割を果たす。この図は、円錐形構造への結合に参加し得る他の位置（例えば、１３７、１４５、１８６、１８７、１９３、２２２）も例証する。ある場合において、異なる残基が異なるグリカン構造物と異なる接触することがある。これらの位置のアミノ酸の種類は、ＨＡポリペプチドが、グリカン構造物における異なる修飾および／または分岐パターンを有する受容体に結合する能力に影響を与えることがある。傘形トポロジーでは、Ｎｅｕ５ＡｃおよびＧａｌを越えた糖と接触する。この図は、傘形構造への結合に参加し得る残基（例えば、１３７、１４５、１５６、１５９、１８６、１８７、１８９、１９０、１９２、１９３、１９６、２２２、２２５、２２６）を例証する。ある場合ににおいて、異なる残基が異なるグリカン構造物と異なる接触することがある。これらの位置のアミノ酸の種類は、ＨＡポリペプチドが、グリカン構造物における異なる修飾および／または分岐パターンを有する受容体に結合する能力に影響を与えることがある。一部実施形態において、１９０位のＤ型残基および／または２２５位のＤ型残基が、傘形トポロジーに対する結合に寄与する。
【図８】典型的な円錐形トポロジー。この図は、円錐形トポロジーをとる、ある典型的な（しかし網羅的ではない）グリカン構造物を例証する。
【図９】典型的な傘形トポロジー。この図は、傘形トポロジーをとる、ある典型的な（しかし網羅的ではない）グリカン構造物を例証する。
【図１０−１】ＨＡグリカン結合ドメインの配列アラインメント。灰色：シアル酸に対する結合に関与する保存されたアミノ酸。赤色：Ｎｅｕ５Ａｃα２‐３／６Ｇａｌモチーフに対する結合に関与する特定のアミノ酸。黄色：Ｑ２２６（１３７、１３８）およびＥ１９０（１８６、２２８）の位置決めに影響を及ぼすアミノ酸。緑色：Ｎｅｕ５Ａｃα２‐３／６Ｇａｌモチーフに結合した他の単糖（または修飾）に対する結合に関与するアミノ酸。ＡＳＩ３０、ＡＰＲ３４、ＡＤＵ６３、ＡＤＳ９７、およびＶｉｅｔ０４についての配列は、それぞれの結晶構造から取得した。他の配列は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ（ｈｔｔｐ：／／ｕｓ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ）から取得した。略語：ＡＤＡ７６、Ａ／アヒル／Ａｌｂｅｒｔａ／３５／７６（Ｈ１Ｎ１）；ＡＳＩ３０、Ａ／ブタ／Ｉｏｗａ／３０（Ｈ１Ｎ１）；ＡＰＲ３４、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）；ＡＳＣ１８、Ａ／Ｓｏｕｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ／１／１８（Ｈ１Ｎ１）、ＡＴ９１、Ａ／Ｔｅｘａｓ／３６／９１（Ｈ１Ｎ１）；ＡＮＹ１８、Ａ／Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ／１／１８（Ｈ１Ｎ１）；ＡＤＵ６３、Ａ／アヒル／Ｕｋｒａｉｎｅ／１／６３（Ｈ３Ｎ８）；ＡＡＩ６８、Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８（Ｈ３Ｎ２）；ＡＭ９９、Ａ／Ｍｏｓｃｏｗ／１０／９９（Ｈ３Ｎ２）；ＡＤＳ９７、Ａ／アヒル／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／３／９７（Ｈ５Ｎ３）；Ｖｉｅｔ０４、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）。
【図１０−２】ＨＡグリカン結合ドメインの配列アラインメント。灰色：シアル酸に対する結合に関与する保存されたアミノ酸。赤色：Ｎｅｕ５Ａｃα２‐３／６Ｇａｌモチーフに対する結合に関与する特定のアミノ酸。黄色：Ｑ２２６（１３７、１３８）およびＥ１９０（１８６、２２８）の位置決めに影響を及ぼすアミノ酸。緑色：Ｎｅｕ５Ａｃα２‐３／６Ｇａｌモチーフに結合した他の単糖（または修飾）に対する結合に関与するアミノ酸。ＡＳＩ３０、ＡＰＲ３４、ＡＤＵ６３、ＡＤＳ９７、およびＶｉｅｔ０４についての配列は、それぞれの結晶構造から取得した。他の配列は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ（ｈｔｔｐ：／／ｕｓ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ）から取得した。略語：ＡＤＡ７６、Ａ／アヒル／Ａｌｂｅｒｔａ／３５／７６（Ｈ１Ｎ１）；ＡＳＩ３０、Ａ／ブタ／Ｉｏｗａ／３０（Ｈ１Ｎ１）；ＡＰＲ３４、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）；ＡＳＣ１８、Ａ／Ｓｏｕｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ／１／１８（Ｈ１Ｎ１）、ＡＴ９１、Ａ／Ｔｅｘａｓ／３６／９１（Ｈ１Ｎ１）；ＡＮＹ１８、Ａ／Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ／１／１８（Ｈ１Ｎ１）；ＡＤＵ６３、Ａ／アヒル／Ｕｋｒａｉｎｅ／１／６３（Ｈ３Ｎ８）；ＡＡＩ６８、Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８（Ｈ３Ｎ２）；ＡＭ９９、Ａ／Ｍｏｓｃｏｗ／１０／９９（Ｈ３Ｎ２）；ＡＤＳ９７、Ａ／アヒル／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／３／９７（Ｈ５Ｎ３）；Ｖｉｅｔ０４、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）。
【図１１−１】Ｈ１型ＨＡの保存される亜配列特徴を例証する配列アラインメント。
【図１１−２】Ｈ１型ＨＡの保存される亜配列特徴を例証する配列アラインメント。
【図１２−１】Ｈ３型ＨＡの保存される亜配列特徴を例証する配列アラインメント。
【図１２−２】Ｈ３型ＨＡの保存される亜配列特徴を例証する配列アラインメント。
【図１３−１】Ｈ５型ＨＡの保存される亜配列特徴を例証する配列アラインメント。
【図１３−２】Ｈ５型ＨＡの保存される亜配列特徴を例証する配列アラインメント。
【図１３−３】Ｈ５型ＨＡの保存される亜配列特徴を例証する配列アラインメント。
【図１３−４】Ｈ５型ＨＡの保存される亜配列特徴を例証する配列アラインメント。
【図１３−５】Ｈ５型ＨＡの保存される亜配列特徴を例証する配列アラインメント。
【図１３−６】Ｈ５型ＨＡの保存される亜配列特徴を例証する配列アラインメント。
【図１３−７】Ｈ５型ＨＡの保存される亜配列特徴を例証する配列アラインメント。
【図１３−８】Ｈ５型ＨＡの保存される亜配列特徴を例証する配列アラインメント。
【図１３−９】Ｈ５型ＨＡの保存される亜配列特徴を例証する配列アラインメント。
【図１４】Ｎｅｕ５Ａｃα２‐３ＧａｌおよびＮｅｕ５Ａｃα２‐６Ｇａｌモチーフのコンフォメーション地図および溶媒露出度。パネルＡは、Ｎｅｕ５Ａｃα２‐３Ｇａｌ結合のコンフォメーション地図を示す。丸で囲まれた領域２は、ＡＰＲ３４＿Ｈ１＿２３、ＡＤＵ６３＿Ｈ３＿２３、およびＡＤＳ９７＿Ｈ５＿２３の共結晶構造に観察されたトランス型コンフォメーションである。丸で囲まれた領域１は、ＡＡＩ６８＿Ｈ３＿２３の共結晶構造に観察されたコンフォメーションである。パネルＢは、Ｎｅｕ５Ａｃα２‐６Ｇａｌのコンフォメーション地図を示し、シス型コンフォメーション（丸で囲まれた領域３）が全てのＨＡ‐α２‐６シアル酸含有グリカン共結晶構造に観察された。パネルＣは、それぞれのＨＡ‐グリカン共結晶構造における、Ｎｅｕ５Ａｃα２‐３とα２‐６シアル酸含有オリゴ糖との溶媒露出面積（ＳＡＳＡ）の差を示す。赤色および青色バーは、それぞれα２‐６（正の値）またはα２‐３（負の値）シアル酸含有グリカンのＮｅｕ５Ａｃが、グリカン結合部位とより多く接触することを示す。パネルＤは、ブタおよびヒトＨ１に結合したα２‐３シアル酸含有グリカンのＮｅｕＡｃのＳＡＳＡの差（Ｈ１α２−３）、トリおよびヒトＨ３に結合したα２‐３シアル酸含有グリカンのＮｅｕＡｃのＳＡＳＡの差（Ｈ３α２−３）、ならびにブタおよびヒトＨ１に結合したα２‐６シアル酸含有グリカンのＮｅｕＡｃのＳＡＳＡの差（Ｈ１α２−６）を示す。Ｈ３α２−３の青色バーが負であるのは、トリＨ３の接触と比較して、ヒトＨ３型ＨＡのＮｅｕ５Ａｃα２‐３Ｇａｌとの接触がより少ないことを示す。ねじれ角‐φ：Ｃ２‐Ｃ１‐Ｏ‐Ｃ３（Ｎｅｕ５Ａｃα２‐３／６結合について）；ψ：Ｃ１‐Ｏ‐Ｃ３‐Ｈ３（Ｎｅｕ５Ａｃα２‐３Ｇａｌについて）またはＣ１‐Ｏ‐Ｃ６‐Ｃ５（Ｎｅｕ５Ａｃα２‐６Ｇａｌについて）；ω：Ｏ‐Ｃ６‐Ｃ５‐Ｈ５（Ｎｅｕ５Ａｃα２‐６Ｇａｌについて）結合。φ、ψ地図は、Ｍａｒｔｉｎ  Ｆｒａｎｋ博士およびＣｌａｕｓ‐Ｗｉｌｈｅｌｍ  ｖｏｎ  ｄｅｒ  Ｌｉｅｔｈ博士（Ｇｅｒｍａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により開発されたＧｌｙｃｏＭａｐｓ  ＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｄｅ／ｍｏｄｅｌｉｎｇ／ｇｌｙｃｏｍａｐｓｄｂ／）から取得した。高エネルギーから低エネルギーへの着色体スキームは、それぞれ明るい赤から明るい緑へである。
【図１５Ａ】α２‐３／６シアル酸含有グリカンに対する、Ｈ１型、Ｈ３型、およびＨ５型ＨＡの結合に関与する残基。パネルＡ〜Ｄは、それぞれＡＳＩ３０＿Ｈ１、ＡＰＲ３４＿Ｈ１、ＡＤＵ６３＿Ｈ３、およびＡＤＳ９７＿Ｈ５共結晶構造における、α２‐３およびα２‐６シアル酸含有グリカンと相互作用する残基の溶媒露出面積（ＳＡＳＡ）の差（横座標におけるΔ）を示す。緑色バーは、グリカンと直接相互作用する残基に対応し、明橙色バーは、Ｇｌｕ／Ａｓｐ１９０およびＧｌｎ／Ｌｅｕ２２６に近位する残基に対応する。緑色バーのΔ値が正であることは、その残基がα２‐６シアル酸含有グリカンとより多く接触することを示すが、Δ値が負であることは、α２‐３シアル酸含有グリカンとより多く接触することを示す。パネルＥは、α２‐３／６シアル酸含有グリカンへの結合に関与する、Ｈ１型、Ｈ３型、およびＨ５型ＨＡの残基を表形式で要約する。α２‐３シアル酸含有グリカンに対する結合に関与するある種の重要な残基は青色に着色され、α２‐６シアル酸含有グリカンに対する結合に関与するある種の重要な残基は赤色に着色されている。
【図１５Ｂ】α２‐３／６シアル酸含有グリカンに対する、Ｈ１型、Ｈ３型、およびＨ５型ＨＡの結合に関与する残基。パネルＡ〜Ｄは、それぞれＡＳＩ３０＿Ｈ１、ＡＰＲ３４＿Ｈ１、ＡＤＵ６３＿Ｈ３、およびＡＤＳ９７＿Ｈ５共結晶構造における、α２‐３およびα２‐６シアル酸含有グリカンと相互作用する残基の溶媒露出面積（ＳＡＳＡ）の差（横座標におけるΔ）を示す。緑色バーは、グリカンと直接相互作用する残基に対応し、明橙色バーは、Ｇｌｕ／Ａｓｐ１９０およびＧｌｎ／Ｌｅｕ２２６に近位する残基に対応する。緑色バーのΔ値が正であることは、その残基がα２‐６シアル酸含有グリカンとより多く接触することを示すが、Δ値が負であることは、α２‐３シアル酸含有グリカンとより多く接触することを示す。パネルＥは、α２‐３／６シアル酸含有グリカンへの結合に関与する、Ｈ１型、Ｈ３型、およびＨ５型ＨＡの残基を表形式で要約する。α２‐３シアル酸含有グリカンに対する結合に関与するある種の重要な残基は青色に着色され、α２‐６シアル酸含有グリカンに対する結合に関与するある種の重要な残基は赤色に着色されている。
【図１５Ｃ】α２‐３／６シアル酸含有グリカンに対する、Ｈ１型、Ｈ３型、およびＨ５型ＨＡの結合に関与する残基。パネルＡ〜Ｄは、それぞれＡＳＩ３０＿Ｈ１、ＡＰＲ３４＿Ｈ１、ＡＤＵ６３＿Ｈ３、およびＡＤＳ９７＿Ｈ５共結晶構造における、α２‐３およびα２‐６シアル酸含有グリカンと相互作用する残基の溶媒露出面積（ＳＡＳＡ）の差（横座標におけるΔ）を示す。緑色バーは、グリカンと直接相互作用する残基に対応し、明橙色バーは、Ｇｌｕ／Ａｓｐ１９０およびＧｌｎ／Ｌｅｕ２２６に近位する残基に対応する。緑色バーのΔ値が正であることは、その残基がα２‐６シアル酸含有グリカンとより多く接触することを示すが、Δ値が負であることは、α２‐３シアル酸含有グリカンとより多く接触することを示す。パネルＥは、α２‐３／６シアル酸含有グリカンへの結合に関与する、Ｈ１型、Ｈ３型、およびＨ５型ＨＡの残基を表形式で要約する。α２‐３シアル酸含有グリカンに対する結合に関与するある種の重要な残基は青色に着色され、α２‐６シアル酸含有グリカンに対する結合に関与するある種の重要な残基は赤色に着色されている。
【図１５Ｄ】α２‐３／６シアル酸含有グリカンに対する、Ｈ１型、Ｈ３型、およびＨ５型ＨＡの結合に関与する残基。パネルＡ〜Ｄは、それぞれＡＳＩ３０＿Ｈ１、ＡＰＲ３４＿Ｈ１、ＡＤＵ６３＿Ｈ３、およびＡＤＳ９７＿Ｈ５共結晶構造における、α２‐３およびα２‐６シアル酸含有グリカンと相互作用する残基の溶媒露出面積（ＳＡＳＡ）の差（横座標におけるΔ）を示す。緑色バーは、グリカンと直接相互作用する残基に対応し、明橙色バーは、Ｇｌｕ／Ａｓｐ１９０およびＧｌｎ／Ｌｅｕ２２６に近位する残基に対応する。緑色バーのΔ値が正であることは、その残基がα２‐６シアル酸含有グリカンとより多く接触することを示すが、Δ値が負であることは、α２‐３シアル酸含有グリカンとより多く接触することを示す。パネルＥは、α２‐３／６シアル酸含有グリカンへの結合に関与する、Ｈ１型、Ｈ３型、およびＨ５型ＨＡの残基を表形式で要約する。α２‐３シアル酸含有グリカンに対する結合に関与するある種の重要な残基は青色に着色され、α２‐６シアル酸含有グリカンに対する結合に関与するある種の重要な残基は赤色に着色されている。
【図１５Ｅ】α２‐３／６シアル酸含有グリカンに対する、Ｈ１型、Ｈ３型、およびＨ５型ＨＡの結合に関与する残基。パネルＡ〜Ｄは、それぞれＡＳＩ３０＿Ｈ１、ＡＰＲ３４＿Ｈ１、ＡＤＵ６３＿Ｈ３、およびＡＤＳ９７＿Ｈ５共結晶構造における、α２‐３およびα２‐６シアル酸含有グリカンと相互作用する残基の溶媒露出面積（ＳＡＳＡ）の差（横座標におけるΔ）を示す。緑色バーは、グリカンと直接相互作用する残基に対応し、明橙色バーは、Ｇｌｕ／Ａｓｐ１９０およびＧｌｎ／Ｌｅｕ２２６に近位する残基に対応する。緑色バーのΔ値が正であることは、その残基がα２‐６シアル酸含有グリカンとより多く接触することを示すが、Δ値が負であることは、α２‐３シアル酸含有グリカンとより多く接触することを示す。パネルＥは、α２‐３／６シアル酸含有グリカンへの結合に関与する、Ｈ１型、Ｈ３型、およびＨ５型ＨＡの残基を表形式で要約する。α２‐３シアル酸含有グリカンに対する結合に関与するある種の重要な残基は青色に着色され、α２‐６シアル酸含有グリカンに対する結合に関与するある種の重要な残基は赤色に着色されている。
【図１６】二分岐α２‐６シアル酸含有グリカン（円錐形トポロジー）に対する、Ｖｉｅｔ０４＿Ｈ５型ＨＡの結合。伸長型コンフォメーションにあるＮｅｕ５Ａｃα２‐６Ｇａｌ結合を伴ったＶｉｅｔ０４＿Ｈ５のグリカン結合部位を表面レンダリングした立体像である（百日咳トキシン共結晶構造から取得した；ＰＤＢ  ＩＤ：１ＰＴＯ）。Ｌｙｓ１９３（橙色）は、このコンフォメーションにあるグリカンとの任意の接触も有しない。このコンフォメーションにあるグリカンに対する結合に潜在的に関与する追加的なアミノ酸は、Ａｓｎ１８６、Ｌｙｓ２２２、およびＳｅｒ２２７である。しかしながら、シス型コンフォメーションにあるα２‐６シアル酸含有オリゴ糖に対するＨＡの結合に観察されるある種の接触は、伸長型コンフォメーションにおいては存在しない。任意の特定の理論により束縛されることは望まないが、これは、伸長型コンフォメーションがシス型コンフォメーションほど至適にはＨＡに結合できないことを示唆することに、発明者らは留意する。Ｎｅｕ５Ａｃα２‐６Ｇａｌβ１‐４ＧｌｃＮＡｃｂ分岐部がＭａｎα１‐３Ｍａｎ（ＰＤＢ  ＩＤ：１ＬＧＣ）およびＭａｎα１‐６Ｍａｎ（ＰＤＢ  ＩＤ：１ＺＡＧ）に結合した分岐Ｎ結合グリカンの構造を、この結合のシス型および伸長型コンフォメーションの両方について、Ｖｉｅｔ０４＿Ｈ５型ＨＡ結合部位のＮｅｕ５Ａｃα２‐６Ｇａｌ結合にスーパーインポーズした。このスーパーインポーズにより、Ｎｅｕ５Ａｃα２‐６Ｇａｌβ１‐４ＧｌｃＮＡｃ分岐部がコアのＭａｎα１‐６Ｍａｎに結合した構造は、結合部位との好ましくない立体重複を有することが示される（両コンフォメーションにおいて）。一方では、この分岐部がコアのＭａｎαｌ‐３Ｍａｎに結合した構造（図中、トリマンノースコアは紫色で示されている）は、シス型コンフォメーションではＬｙｓ１９３との立体重複を有するが、伸長型コンフォメーションではＬｙｓ１９３と任意の接触もせず、至適というほどではないが結合が可能である。
【図１７】野生型のＨ１型、Ｈ３型、およびＨ５型ＨＡの産生。パネルＡは、Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｓｏｕｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ／１／１９１８）、Ｈ３Ｎ２（Ａ／Ｍｏｓｃｏｗ／１０／１９９９）、およびＨ５Ｎ１（Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４）に由来する可溶性形態のＨＡタンパク質を、４〜１２％のＳＤＳ‐ポリアクリルアミドゲル上で流し、ニトロセルロース膜にブロットしたことを示す。Ｈ１Ｎ１型ＨＡは、ヤギ抗Ａ型インフルエンザ抗体および抗ヤギＩｇＧ‐ＨＲＰを使用して探索した。Ｈ３Ｎ２は、フェレット抗Ｈ３Ｎ２型ＨＡ抗血清および抗フェレットＨＲＰを使用して探索した。Ｈ５Ｎ１は、抗トリＨ５Ｎ１型ＨＡ抗体および抗ウサギＩｇＧ‐ＨＲＰを使用して探索した。Ｈ１Ｎ１型ＨＡおよびＨ３Ｎ２型ＨＡはＨＡ０として存在するが、Ｈ５Ｎ１型ＨＡは、ＨＡ０およびＨＡｌの両方として存在する。パネルＢは、全長Ｈ５Ｎ１型ＨＡおよび２つの変異体（Ｇｌｕｌ９０Ａｓｐ、Ｌｙｓ１９３Ｓｅｒ、Ｇｌｙ２２５Ａｓｐ、Ｇｌｎ２２６Ｌｅｕ、すなわち「ＤＳＤＬ」、およびＧＬｕｌ９０Ａｓｐ、Ｌｙｓｌ９３Ｓｅｒ、Ｇｌｎ２２３Ｌｅｕ、Ｇｌｙ２２８Ｓｅｒ、すなわち「ＤＳＬＳ」）を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で流し、ニトロセルロース膜にブロットしたこと示す。ＨＡは、抗トリＨ５Ｎ１型抗体および抗ウサギＩｇＧ‐ＨＲＰを使用して探索した。
【図１８】上気道組織切片のレクチン染色。ジャカリン（緑色）およびＣｏｎＡ（赤色）で気管組織を共染色すると、ジャカリンが気管の頂端面上の杯状細胞と優先的に結合する（Ｏ結合グリカンに特異的に結合する）こと、およびｃｏｎＡが繊毛性気管上皮細胞と優先的に結合する（Ｎ結合グリカンに特異的に結合する）ことが明らかになる。任意の特定の理論により束縛されることは望まないが、発明者らは、この知見が、杯状細胞はＯ結合グリカンを支配的に発現し、繊毛性上皮細胞はＮ結合グリカンを支配的に発現することを示唆することに留意する。ジャカリンおよびＳＮＡ（赤色；α２‐６と特異的に結合する）で気管を共染色すると、ＳＮＡが杯状細胞および繊毛細胞の両方と結合することが示される。一方では、ジャカリン（緑色）およびα２‐３シアル酸含有グリカンに特異的に結合するＭＡＬ（赤色）で共染色すると、ＭＡＬは多列気管上皮と極弱く結合するか無結合であるが、組織の下部領域とは広範に結合することが示される。まとめると、レクチン染色データは、Ｎ結合およびＯ結合の両グリカンの一部としてのα２‐６シアル酸含有グリカンが、それぞれ気管上皮頂端側の繊毛細胞および杯状細胞において支配的に発現され、広範に分布することを示した。
【図１９】組換え野生型および突然変異型ＨＡの組織切片に対する結合。気管組織切片、気管支組織切片、および肺胞組織切片に結合する野生型（ＷＴ）、ＤＳＬＳ、およびＤＳＤＬが示されている。ＷＴの場合、白色矢印は肺胞組織切片に結合するＨＡ（緑色）を示す。ＤＳＬＳ突然変異体の場合、気管および気管支組織切片の白色矢印は、組織の頂端側に結合するこの突然変異体ＨＡ（緑色）を示す。ＤＳＤＬ突然変異体は任意の組織切片とも結合しないことに留意されたい。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
定義
親和性：当該技術分野で公知のように、「親和性」とは、特定のリガンド（例えば、ＨＡポリペプチド）がそのパートナー（例えば、ＨＡ受容体）に結合する緊密さの尺度である。親和性は様々な方法で測定できる。
【０００８】
生物学的に活性がある：本明細書において、「生物学的に活性のある」という語句は、生体システム、および特に生物において活性を示す任意の薬剤の特徴を指す。例えば、生物に投与された際にその生物に生物学的効果を示す薬剤は、生物学的に活性があると見なされる。タンパク質またはポリペプチドが生物学的に活性である特定の実施形態において、タンパク質またはポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を共有するそのタンパク質またはポリペプチドの部分は、典型的には「生物学的に活性のある」部分と呼ばれる。
【０００９】
広域性ヒト結合（ＢＳＨＢ）Ｈ５型ＨＡポリペプチド：本明細書において、「広域性ヒト結合Ｈ５型ＨＡ」という語句は、ヒト上皮組織に見出されるＨＡ受容体、および特にα２‐６シアル酸含有グリカンを有するヒトＨＡ受容体に結合するＨ５型ＨＡポリペプチドの型を指す。さらに、発明のＢＳＨＢ性Ｈ５型ＨＡは、複数の異なるα２‐６シアル酸含有グリカンに結合する。一部実施形態において、ＢＳＨＢ性Ｈ５型ＨＡは、ヒト試料に見出される十分な数のα２‐６シアル酸含有グリカンに結合し、そのためそれらを含有するウイルスはヒト集団に感染する広範な能力、および特にそれらの集団の上気道受容体に結合する広範な能力を有する。一部実施形態において、ＢＳＨＢ性Ｈ５型ＨＡは、本明細書において、傘形グリカン（例えば、長鎖α２‐６シアル酸含有グリカン）に結合する。
【００１０】
特徴部分：本明細書において、タンパク質またはポリペプチドの「特徴部分」という語句は、共にタンパク質またはポリペプチドの特徴であるアミノ酸の連続的な伸長、またはアミノ酸の連続的な伸長の集まりを含有する部分である。そのような連続的な伸長の各々は、一般的に少なくとも２個のアミノ酸を含む。さらに、当業者であれば、タンパク質の特徴であるためには、典型的には少なくとも５個、１０個、１５個、２０個、またはそれより多くのアミノ酸が必要とされることを認識しよう。一般的に、特徴部分は、上記で特定した配列同一性に加えて、少なくとも１つの機能的な特徴を、関連する完全なタンパク質と共有する部分である。
【００１１】
特徴配列：「特徴配列」とは、ポリペプチドまたは核酸ファミリーの全メンバーに見出され、したがって当業者がファミリーのメンバーを定義するために使用できる配列である。
【００１２】
円錐形トポロジー：「円錐形トポロジー」という語句は、ある種のグリカンおよび特にＨＡ受容体上のグリカンがとる３次元配置を指すために本明細書で使用する。図６に例証したように、円錐形トポロジーをとることができるのは、α２‐３シアル酸含有グリカンまたはα２‐６シアル酸含有グリカンであり、幾つかの長鎖オリゴヌクレオチドもこのコンフォメーションをとることができるが、短鎖オリゴヌクレオチド鎖に典型的である。円錐形トポロジーは、約−６０、６０、または１８０のφ値（Ｃ１‐Ｃ２‐Ｏ‐Ｃ３／Ｃ６）により決定される最小エネルギーコンフォメーションの３つ領域をサンプリングするＮｅｕ５Ａｃα２‐３Ｇａｌ結合のグリコシドのねじれ角によって特徴付けられ、ψ（Ｃ２‐Ｏ‐Ｃ３／Ｃ６‐Ｈ３／Ｃ５）は−６０から６０をサンプリングする（図１４）。図８は、円錐形トポロジーをとるグリカンのある代表的な（しかし網羅的でない）例を表す。
【００１３】
対応する：本明細書において、「対応する」という用語は、ＨＡポリペプチドのアミノ酸残基の位置／同一性を指定するために使用されることが多い。当業者であれば、標準付番方式（野生型のＨ３型ＨＡに基づく）が簡潔さのために本明細書で使用され（例えば図５および図１０〜１３に例証されているように）、そのため１９０位の残基に「対応する」のアミノ酸は、例えば実際に特定のアミノ酸鎖の１９０番目のアミノ酸である必要はなく、むしろ野生型のＨ３型ＨＡの１９０位に見出される残基に対応することを理解し、当業者であれば、対応するアミノ酸を特定する方法を容易に理解する。
【００１４】
離隔度離れた：本明細書において、「離隔度離れた」アミノ酸とは、グリカン結合に間接的な影響を及ぼすＨＡアミノ酸である。例えば、１離隔度離れたアミノ酸とは、（１）直接結合するアミノ酸と相互作用する；および／または（２）そうでなければ、直接結合するアミノ酸が宿主細胞ＨＡ受容体に会合するグリカンと相互作用する能力に影響を及ぼすかのいずれかであってよく、そのような１離隔度離れたアミノ酸は、グリカン自体に直接結合してもよく、結合しなくてもよい。２離隔度離れたアミノ酸は、（１）１離隔度離れたアミノ酸と相互作用する；および／または（２）そうでなければ、１離隔度離れたアミノ酸が、直接結合するアミノ酸などと相互作用する能力に影響を及ぼすかのいずれかである。
【００１５】
直接結合するアミノ酸：本明細書において、「直接結合するアミノ酸」という語句は、宿主細胞ＨＡ受容体と会合する１つ以上のグリカンと直接的に相互作用するＨＡポリペプチドアミノ酸を指す。
【００１６】
操作された：「操作された」という用語は、本明細書において、そのアミノ酸配列が人為的に選択されたポリペプチドを表す。例えば、操作されたＨＡポリペプチドは、天然のインフルエンザ分離株に見出されるＨＡポリペプチドのアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有する。一部実施形態において、操作されたＨＡポリペプチドは、ＮＣＢＩデータベースに含まれているＨＡポリペプチドのアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有する。
【００１７】
Ｈ１ポリペプチド：「Ｈ１ポリペプチド」とは、その用語が本明細書で使用されているように、そのアミノ酸配列が、Ｈ１の特徴でありＨ１を他のＨＡ亜型と区別する少なくとも１つの配列エレメントを含むＨＡポリペプチドである。代表的なそのような配列エレメントは、例えば図５および図１０〜１１に例証されるものなどのようにアラインメントにより決定でき、例えばＨＡ配列エレメントのＨ１特異的な実施形態に関して本明細書に記載したものなどを含むことができる。
【００１８】
Ｈ３ポリペプチド：「Ｈ３ポリペプチド」とは、その用語が本明細書で使用されているように、そのアミノ酸配列が、Ｈ３の特徴でありＨ３を他のＨＡ亜型と区別する少なくとも１つの配列エレメントを含むＨＡポリペプチドである。代表的なそのような配列エレメントは、例えば図５、図１０、および図１２に例証されたものなどのようにアラインメントにより決定でき、例えばＨＡ配列エレメントのＨ３特異的な実施形態に関して本明細書に記載したものなどを含むことができる。
【００１９】
Ｈ５ポリペプチド：「Ｈ５ポリペプチド」とは、その用語が本明細書で使用されているように、そのアミノ酸配列が、Ｈ５の特徴でありＨ５を他のＨＡ亜型と区別する少なくとも１つの配列エレメントを含むＨＡポリペプチドである。代表的なそのような配列エレメントは、例えば図５、図１０、および図１３に例証されたものなどのようにアラインメントにより決定でき、例えばＨＡ配列エレメントのＨ５特異的な実施形態に関して本明細書に記載したものなどを含むことができる。
【００２０】
赤血球凝集素（ＨＡ）ポリペプチド：本明細書において、「赤血球凝集素ポリペプチド」（「またはＨＡポリペプチド」）という用語は、そのアミノ酸配列がＨＡの特徴配列を少なくとも１つ含むポリペプチドを指す。インフルエンザ分離株に由来する多種多様なＨＡ配列は、当該技術分野において公知であり、実際に、米国バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）は、データベース（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ＦＬＵ／ｆｌｕ．ｈｔｍｌ）を維持しており、本出願の出願時点で９７９６個のＨＡ配列が含まれている。このデータベースを参照すると、当業者であれば、一般的にＨＡポリペプチドの特徴である配列、および／または特定のＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１Ｏ、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、またはＨ１６ポリペプチド）の特徴である配列；または特定の宿主、例えばトリ、ラクダ、イヌ、ネコ、ジャコウネコ、環境、ウマ、ヒト、ヒョウ、ミンク、マウス、アザラシ、イワツバメ、ブタ、トラ、クジラなどの感染を媒介するＨＡの特徴である配列を容易に特定できる。例えば、一部実施形態において、ＨＡポリペプチドは、インフルエンザウイルスの天然分離株に見出されるＨＡタンパク質のおよそ残基９７および１８５、３２４および３４０、９６および１００、ならびに／あるいは１３０〜２３０間に見出される１つ以上の特徴配列を含む。一部実施形態において、ＨＡポリペプチドは、本明細書で定義したように、少なくとも１つのＨＡ配列エレメント１および２を含むアミノ酸配列を有する。一部実施形態において、ＨＡポリペプチドは、一部実施形態において、約１００〜２００、または約１２５〜１７５、または約１２５〜１６０、または約１２５〜１５０、または１２９〜１３９、または約１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、もしくは１３９個のアミノ酸分だけ互いに隔てられているＨＡ配列エレメント１および２を含むアミノ酸配列を有する。一部実施形態において、ＨＡポリペプチドは、グリカン結合に参加する領域９６〜１００および／または１３０〜２３０内に位置する残基を含むアミノ酸配列を有する。例えば、多くのＨＡポリペプチドは、以下の残基：Ｔｙｒ９８、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ１３６、Ｔｒｐ１５３、Ｈｉｓ１８３、およびＬｅｕ／Ｉｌｅ１９４を１つ以上含む。一部実施形態において、ＨＡポリペプチドは、これらの残基の少なくとも２個、３個、４個、または５個全てを含む。
【００２１】
単離された：「単離された」という用語は、本明細書において、（ｉ）（自然界であろうと、または実験的設定であろうとも）最初に産生された際に会合していた構成要素の少なくとも一部から分離された；または（ｉｉ）人為的に産生されたかのいずれかである薬剤または実体を指す。単離された薬剤または実体は、それらが最初に会合していた他の構成要素の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれより多くから分離されていてよい。一部実施形態において、単離された薬剤は、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を超えて純粋である。
【００２２】
長鎖オリゴ糖：本開示の目的では、オリゴ糖は、少なくとも４つの単糖残基を有する少なくとも１つの直鎖を含む場合、典型的には「長鎖」と見なされる。
【００２３】
非天然アミノ酸：「非天然アミノ酸」という語句は、アミノ酸の化学構造（すなわち、
【００２４】
【化１】
2010501074.tif 000003
）を有し、したがって少なくとも２つのペプチド結合に参加できるが、自然界において見出されるものとは異なるＲ基を有する実体を指す。一部実施形態において、非天然アミノ酸は、水素以外の第２のＲ基を有してもよく、かつ／またはアミノ部分もしくはカルボン酸部分に１つ以上の他の置換を有してもよい。
【００２５】
ポリペプチド：「ポリペプチド」とは、一般的に言えば、ペプチド結合により互いに結合された少なくとも２つのアミノ酸の鎖である。一部実施形態において、ポリペプチドは、各々が少なくとも１つのペプチド結合により他と結合された少なくとも３〜５個のアミノ酸を含んでいてよい。当業者であれば、ポリペプチドは、ともかくもポリペプチド鎖に組込み可能な「非天然」アミノ酸または他の実体を場合により含むことが時にはあることを認識する。
【００２６】
純粋である：本明細書において、薬剤または実体は、他の構成要素が実質的になければ「純粋である」。例えば、約９０％を超えた特定の薬剤または実体を含有する調製物は、典型的には純粋な調製物であると見なされる。一部実施形態において、薬剤または実体は、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％＜、または９９％純粋である。
【００２７】
短鎖オリゴ糖：本開示の目的では、オリゴ糖は、任意の直鎖において４個未満の、またはもちろん３個未満の残基を有する場合、典型的には「短鎖」と見なされる。
【００２８】
特異性：当該技術分野で公知のように、「特異性」とは、特定のリガンド（例えばＨＡポリペプチド）が、その結合パートナー（例えばヒトＨＡ受容体、および特にヒト上気道ＨＡ受容体）を他の潜在的な結合パートナー（例えば、トリＨＡ受容体）から区別する能力の尺度である。
【００２９】
治療剤：本明細書において、「治療剤」という語句は、所望の生物学的または薬理学的効果を誘発する任意の薬剤を指す。
【００３０】
治療：本明細書において、「治療」という用語は、疾病、障害、または状態の１つ以上の徴候もしくは態様の緩和、発症遅延、重症度もしくは発生率の低下、または予防をもたらすために使用される任意の方法を指す。本発明の目的では、治療は、徴候の発症前、発症中、および／または発症後に施すことができる。
【００３１】
傘形トポロジー：「傘形トポロジー」という語句は、ある種のグリカンおよび特にＨＡ受容体上のグリカンがとる３次元配置を指すために本明細書で使用する。本発明は、傘形トポロジーのグリカンに対する結合が、ヒト宿主の感染を媒介するＨＡタンパク質の特徴であるという認識を包含する。図６で例証したように、典型的にはα２‐６シアル酸含有グリカンだけが傘形トポロジーをとり、長鎖（例えば、四糖を超えた）オリゴ糖に典型的である。傘形トポロジーの一例は、約−６０のＮｅｕ５Ａｃα２‐６Ｇａｌ結合のφ角度により与えられる（例えば、図１４を参照）。図９は、傘型トポロジーをとるグリカンのある代表的な（しかし網羅的ではない）例を表す。
【００３２】
ワクチン接種：本明細書において、「ワクチン接種」という用語は、例えば疾病を引き起こす薬剤について免疫応答を生じさせるための組成物の投与を指す。本発明の目的では、ワクチン接種は、疾病を引き起こす薬剤への曝露前、曝露中、および／または曝露後に、ある実施形態において、薬剤への曝露前、曝露中、および／または曝露直後に投与できる。一部実施形態において、ワクチン接種は、適切に時間間隔をおいた、ワクチン接種組成物の多回投与を含む。
【００３３】
変異体：本明細書において、「変異体」という用語は、目的とする特定のＨＡポリペプチドと、その配列が比較される「親」ＨＡポリペプチドとの関係性を記述する相対的な用語である。目的とするＨＡポリペプチドが、特定の位置での少数の配列変更がなければ親のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する場合、目的とするＨＡポリペプチドは、親ＨＡポリペプチドの「変異体」であると見なされる。典型的には、親と比較して、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満の変異体の残基が置換される。一部実施形態において、変異体は、親と比較して１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１個の置換された残基を有する。変異体は、非常に少数（例えば、５、４、３、２、または１個未満）の置換された機能的残基（すなわち、特定の生物学的活性に参加する残基）を有することが多い。さらに変異体は、典型的には、親と比較して、５、４、３、２、または１つを超えない付加または欠失を有するが、付加または欠失を有しないことが多い。さらに、任意の付加または欠失は、典型的には、２５、２０、１９、１８１、１７、１６、１５、１４、１３、１０、９、８、７、６個未満であり、一般には約５、４、３、または２個未満の残基である。一部実施形態において、親ＨＡポリペプチドは、インフルエンザウイルスの天然分離株に見出されるポリペプチドである（例えば、野生型ＨＡ）。
【００３４】
ベクター：本明細書において、「ベクター」とは、それが連結されている別の核酸を輸送可能な核酸分子のことを指す。一部実施形態において、ベクターは、真核生物または原核細胞などの宿主細胞において、追加的な染色体複製および／またはそれが連結されている核酸の発現を可能にする。作用可能な連結された遺伝子の発現を指令できるベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。
【００３５】
野生型：当該技術分野において理解されるように、「野生型」という語句は、一般的に、自然界に見出されるようなタンパク質または核酸の通常形態を指す。例えば、野生型ＨＡポリペプチドは、インフルエンザウイルスの天然分離株に見出される。多様な異なる野生型ＨＡ配列は、ＮＣＢＩインフルエンザウイルス配列データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ＦＬＵ／ＦＬＵ．ｈｔｍｌ）に見出すことができる。
【００３６】
発明のある特定の実施形態の詳細な説明
グリカン‐ＧＢＰ相互作用の定義および特徴付け
グリカン結合タンパク質（ＧＢＰ）と呼ばれることが多いタンパク質の重要なファミリーは、種々の糖タンパク質のＮ結合およびＯ結合グリカンに結合し、免疫応答における細胞間接着、シグナリング、および輸送事象を媒介する。ＧＢＰの主要な種類には、Ｃ型レクチン、ガレクチン、およびＳＩＧＬＥＣが含まれる。ＧＢＰは、典型的には、単量体または多量体の形態で、複数のグリカン結合部位を有する可溶性または膜結合性タンパク質のいずれかとして発現する。また、ＧＢＰは、細胞表面上に分散、または微小環境に局所化され得る。
【００３７】
ＧＢＰのグリカン結合部位は、糖質認識ドメイン（ＣＲＤ）としても知られている。ＧＢＰのＣＲＤは、典型的には、単糖〜四糖グリカンリガンドモチーフを収容する。単一ＣＲＤおよびグリカンモチーフ間の相互作用は、典型的には、μＭ範囲の値を有する低親和性である。しかしながら、ほとんどの生理学的なグリカン‐ＧＢＰ相互作用は多価性であり、グリカンモチーフの集団が、ＧＢＰの会合により形成される多量体ＣＲＤに結合することを伴う。したがって、タンパク質の機能を活性化するかまたは阻害するかのいずれかであるタンパク質間相互作用（デジタル制御）と異なり、グリカン‐ＧＢＰ相互作用は、結合活性、段階的親和性、および多価性を介して、タンパク質の機能を微調整（アナログ調節）する。
【００３８】
生物学的機能に結びつく生化学的経路との関連で、グリカン‐タンパク質相互作用の構造機能相関を解読することは、特有の課題を提示する。これらの課題の一態様は、その幾つかが追加的な組織特異的イソ型を有する複数のグリコシルトランスフェラーゼの協調的な発現に伴うグリカンの非テンプレート性生合成による、グリカンの不均質性および化学的多様性から生じる。さらに、タンパク質上に複数ある糖鎖付加部位などのグリカンの生合成および細胞位置を考慮すると、グリカンは通常、細胞および組織から単離された際に、異なる化学構造の不均質な混合物と見なされるべきである。グリカン生合成が非テンプレート性であるという性質により、生体供給源由来の特定のグリカン構造物を増幅することも困難となる。
【００３９】
上記の課題を解決するために、数多くの進展があった。化学合成戦略に重要な進歩があり、細胞表面に存在するグリカンの多様性を捕捉する数百のグリカン構造物の合成に結びついた。これらの戦略を使用して、グリカンモチーフの様々な形態、すなわちクラスター、デンドロマー、ポリマーなどが、タンパク質上のグリカン結合部位の異なる型の多価性会合と一致するように構築される。これらの多価性複合糖質は、様々なＧＢＰの相対結合親和性を評価する競合アッセイ、および生理学的なグリカン‐ＧＢＰ相互作用に対する阻害剤を設計するための競合アッセイにおいて、主として使用されている。これらの進展にもかかわらず、様々なＧＢＰによる個々の生理学的グリカンモチーフの特異性または認識性、およびこれらの相互作用により調節される生物学的機能の選択性については、あまりよく知られていない。
【００４０】
公知である特異的なグリカン‐ＧＢＰ相互作用に関する現在の知識を急速に拡張するために、国際共同研究構想であるＣｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｌｙｃｏｍｉｃｓ（ＣＦＧ；ｗｗｗ．ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｌｙｃｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ）は、新規グリカンリガンド特異性についてのＧＢＰのハイスループットスクリーニングを可能にした幾つかのグリカン構造物を含むグリカンアレイを開発した。これらのグリカンアレイは、グリカンモチーフの多様性を増加させるために絶え間なく拡張されており、グリカンの生理学的多様性を最も良好に模倣する。ＣＦＧアレイ上のグリカンのほとんどは、化学的および化学酵素的合成に由来した。
【００４１】
また、ＣＦＧグリカンアレイは、一価性および多価性のグリカンモチーフ（すなわち、ポリアクリルアミド主鎖に結合した）の両方を含み、糖質生物学者が目的のＧＢＰの新しいグリカンリガンドを発見するために広く使用されている資源として出現しつつある。グリカンアレイデータに加えて、ＣＦＧは、グリカン生合成酵素およびＧＢＰの遺伝子発現から全生物グリコームおよびフェノーム解析に及ぶ多様なデータセットを生成するための、最先端の資源に進歩しつつある。
【００４２】
使い易いインターフェースを介するＣＦＧデータセットの公開普及は、これらの複合データセットの解析により興味深いパターンを見出するための、または有意義な予測をするためのデータマイニングツールの開発に意欲を与え始めた。データマイニングツールは、ゲノミクスおよびプロテオミクスの領域で一般的になりつつある。多数の構成要素（遺伝子およびタンパク質）および生化学経路を代表する複雑なネットワークにおけるそれらの相互作用を扱うハイスループットデータは、統計的に有意な相関および予測を行うために解析される。グリコミクスの場合には、グリカン‐ＧＢＰ相互作用のアナログ的な性質を考慮すると、特定のＧＢＰに対する結合を決定する構造集団の共通特徴を理解するためには、単一グリカンと単一ＧＢＰの相互作用の先を行くことが必要である。
【００４３】
ハイスループットグリコミクスデータ解析用のデータマイニングツール構築への第一歩として、発明者らは、本研究において、規則帰納法に基づくデータマイニング方法論を用いて、ＣＦＧグリカンアレイデータを解析するための新規手法を使用した。柔軟なソフトウェアアーキテクチャおよびＣＦＧのリレーショナルデータベースを駆使して、発明者らは自らの手法を使用して、グリカンの集団が特定のＧＢＰに結合する能力を決定するパターンを特定した。３つの異なるファミリーのＧＢＰの具体例：（１）ＤＣ‐ＳＩＧＮおよびＳＩＧＮＲ；（２）ガラクチン；および（３）赤血球凝集素を使用して、発明者らは、これらのタンパク質との相互作用を決定する、アレイ上のグリカンの特異的なパターンを特定する。発明者らは、結晶構造を使用することにより特定され、かつグリカンアレイに見られないＧＢＰとグリカンとの結合レベルを予測することにより特定されたパターンを確認する。これらのパターンは、グリカン構造物の集団（共通した一連の特徴を含む）と所定のＧＢＰとの相互作用についての理解を初めて可能にし、それによりグリカン‐ＧＢＰ相互作用の構造機能相関の解析および定義が可能になる。
【００４４】
したがって、本発明は、グリカン‐ＧＢＰ相互作用の構造機能相関を理解するためのシステムを提供する。特に本発明は、グリカン構造物の集団とＧＢＰの多価性ＣＲＤとの相互作用が、どのようにして基本的生物学的プロセスを調節するのかを理解するためのシステムを提供する。本発明は、所定の相互作用の特異性を決定する、グリカンまたはそれらの結合パートナーの特徴を特定する。本発明は、例えば解析情報（例えば、Ｘ線結晶解析、ＮＭＲなどから）に基づく特徴により提供される制約も定義した。そのような制約は単独で使用でき、または場合により機能情報もしくは他の情報と結び付けることができる。適切な機能情報は、例えば、グリカン結合の研究から取得できる。
【００４５】
本発明は、様々なＧＢＰに対する新規グリカンリガンド候補を特定するためにますます利用されているＣＦＧにより開発されたものなどのグリカンアレイから得られたデータセットを解析するための計算方法を提供する。これらのグリカンアレイが拡張し続けると共に、これらのグリカンアレイから得られたデータセットを解析し、グリカン‐ＧＢＰ相互作用における特異性の基本を理解するためのそのような計算方法の価値は増加する一方である。
【００４６】
例えば、グリカンアレイデータ全体（高親和性、中親和性、低親和性、および非結合を含む）を解析するための規則に基づくデータマイニング方法論を使用して、本発明は、ＧＢＰに対する結合に正および負の効果を有するグリカンのパターンを特定するための新規手法を提供する。そのような規則に基づく手法の１つの利点は、これらの規則を満たす他の潜在的なグリカンを特定するために容易に適用できる一連の単純明快な規則として、最終パターンを提供することである。
【００４７】
本明細書において、本発明の原理は３つの多様なＧＢＰファミリーに適用され、それらの有効性の原理証明が確立された。最初の例、すなわちＤＣ‐ＳＩＧＮおよびＳＩＧＮＲシステムにおいて、規則は、ＤＣ‐ＳＩＧＮについては３つの広範な特徴、すなわち高マンノース、ルイスｘ（Ｌｅｗｉｓｘ）［Ｇａｌｂ４（Ｆｕｃａ３）ＧｌｃＮＡｃ］、およびＦｕｃａ４ＧｌｃＮＡｃを含有するモチーフを示し、ＤＣ‐ＳＩＧＮＲについては高マンノース特徴のみを示した。高親和性結合を決定する共通特徴の捕捉に加えて、規則は、ルイスｘ含有モチーフについてはＧａｌに任意の３‐Ｏ置換も存在しないことなど、結合に有害であった特徴も捕捉した。これらの負の結果はＤＣ‐ＳＩＧＮＲの結晶構造の解析と一致し、したがって発明者らの手法の価値が強調される。
【００４８】
ガレクチンの場合には、規則はより複雑であった。ガレクチン１およびガレクチン３による高親和性リガンド結合に必要である主要な特徴（Ｇａｌｂ４ＧｌｃＮＡｃ）の特定に加えて、発明者らは、鎖長に関連して、グリカンリガンドとの相互作用決定におけるこの単位への置換の役割も決定した。ＤＣ−ＳＩＧＮの例と同様に、発明者らの知見は、ガレクチンの結晶構造の解析と一致した。上記の特徴に基づいて、ガレクチン１およびガレクチン３のグリカン結合間の主要な相異は、ガレクチン３が、Ｎ結合グリカンの様々な分岐部に存在するこれらの単位ではなく、Ｇａｌｂ４ＧｌｃＮＡｃの直鎖反復単位を好んだということだった。ガレクチン１は、典型的には非共有結合的に会合されたＣＲＤｓを有するホモ二量体として生じるため、異なる分岐部上のＧａｌｂ４ＧｌｃＮＡｃの存在は、高親和性の多価性結合を強化する。その一方でガレクチン３は、Ｎ末端リンカー領域を有する単量体で、これらの単位の分岐出現と比較して、ラクトサミン単位の直鎖反復への優先性を有する可能性が最も高い。
【００４９】
発明者らの規則に基づく帰納法的手法の全体的な精度は、上記規則が８０％の高結合体（ＤＣ‐ＳＩＧＮの場合）から１００％の高結合体（ガレクチン３およびＤＣ‐ＳＩＧＮＲ）を正確に特定し、全ての場合で偽陽性がなかったことを考慮すると、良好である。グリカンアレイは多様な一連のグリカンを有するが、まだグリカンの全体的な多様性を系統的に捕捉していない。その結果、スクリーニングデータに単集合データポイントがあり、すなわち、共通した一連の特徴により定義された任意の特定の群に当てはまらない高親和性グリカン構造物がある。そのような単集合データポイントは、発明者らの予測結果では偽陰性に結びつく。各規則は、高親和性結合を示す一連のグリカンにより共有されている主要なグリカンモチーフを含むことが、表２および表３から認められるべきである。さらに、主要なモチーフは、他のモチーフまたは鎖長の必要条件の非存在などの他の制約と併せて特定される。
【００５０】
データマイニングの全体的プロセスの一部として、これらの主要なパターンに基づく追加的な特徴が定義でき、グリカン結合におけるこれらの特徴の役割をさらに研究できる。例えば、還元末端または非還元末端からの距離、および直鎖の一部として出現するのかまたは分岐鎖の一部としての出現するのかという点におけるＧａｌｂ４ＧｌｃＮＡｃの位置は、結合におけるそれらの影響を評価するための追加的な特徴として定義できる。また、ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌ［３‐Ｏ‐ＳＯ３］、Ｇａｌ［６‐Ｏ‐ＳＯ３］などの各単糖に対する修飾を全て組み合わせる追加的なグリカン特徴は、結合に対するこれらの修飾の各々の重要性を評価するために、単一の特徴に統合できる。
【００５１】
要約すると、ＣＦＧグリカンアレイデータをモデルシステムとして使用して、発明者らは、有意義な解釈を容易にする、複雑なデータセットにおける規則またはパターンを特定するための手法を概説した。数多くの大規模グリコミクス構想は、グリカン生合成酵素、ＧＢＰの遺伝子発現から、特定の細胞型および様々な供給源から単離された組織に由来するグリカンのレパートリーの特定に及ぶ多様なデータセットを取得するために、自らの資源を振り向けている。これらのデータセットが拡張する場合、本明細書で概説した規則に基づく帰納法的方法を使用して、グリカン‐ＧＢＰ相互作用および生物学的機能に対する遺伝子発現を決定するパターンの組合せが取得できる。
【００５２】
応用
本発明は、グリカン‐ＧＢＰ結合相互作用の詳細な特徴付けを可能にする。したがって、本発明は、所定のＧＢＰと相互作用する（またはしない）一連のグリカンの定義を提供する。したがって、本発明は、ＧＢＰ特異的グリカンアレイ、すなわち特定のＧＢＰの存在または同一性を確立または定義するのに十分な一連のグリカンを含むアレイの調製を可能にする。
【００５３】
例えば、本明細書で提示したように特定のＧＢＰのグリカン結合特徴が定義されれば、結合したグリカン、結合しないグリカン、および／またはその組合せを含有するアレイが組立てられ、例えば、試料中のその特定のＧＢＰの検出、および／またはそのＧＢＰの誘導体の特徴付けに使用できる。
【００５４】
特定の一例を挙げると、ＧＢＰの１つは、赤血球凝集素（ＨＡ）Ｈ５タンパク質であり、その結合解析は下記で例証される。一般的に言えば、ＨＡは、糖タンパク質受容体に結合することにより細胞表面と相互作用する。ＨＡ受容体に対するＨＡの結合は、ＨＡ受容体上のＮ結合グリカンが支配的に媒介する。具体的には、インフルエンザウイルス粒子表面上のＨＡは、細胞宿主表面上のＨＡ受容体と会合しているシアル酸含有グリカンを認識する。認識および結合の後、宿主細胞はウイルス細胞を貪食し、ウイルスは自己複製してさらに数多くのウイルス粒子を産生でき、近隣の細胞に分散する。
【００５５】
ＨＡ受容体は、受容体のＨＡ結合部位付近でα２‐３またはα２‐６シアル酸含有グリカンのいずれかにより修飾され、受容体に結合したグリカンの結合型は、受容体のＨＡ結合部位のコンフォメーションに影響を与え、したがって様々なＨＡ亜型に対する受容体の特異性に影響を及ぼす。さらに、本発明者は、結合されたグリカンのトポロジー（傘形様または円錐形様）が、様々なＨＡに対する受容体の特異性に影響を及ぼすことを特定した。
【００５６】
例えば、トリＨＡのグリカン結合ポケットは狭い。本発明によれば、このポケットは、α２‐３シアル酸含有グリカンのトランス型コンフォメーション、および／またはα２‐３結合かまたはα２‐６結合かに関わらず、円錐形トポロジーのグリカンに結合する。
【００５７】
トリ組織、ならびにさらにヒトの肺深部組織および胃腸管（ＧＩ）組織のＨＡ受容体は、α２‐３シアル酸含有グリカン結合により特徴付けられ、さらに（本発明により）、支配的に円錐形トポロジーをとるα２‐３シアル酸含有グリカンおよび／またはα２‐６シアル酸含有グリカンを含むグリカンにより特徴付けられる。
【００５８】
対照的に、上気道の気管支および気管のヒトＨＡ受容体は、α２‐６シアル酸含有グリカンにより修飾されている。α２‐３モチーフと異なり、α２‐６モチーフは、Ｃ６‐Ｃ５結合によるコンフォメーションの追加的な自由度を有する（Ｒｕｓｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ，  Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ  Ｊ  ２３：８５，２００６）。そのようなα２‐６シアル酸含有グリカンに結合するＨＡは、このコンフォメーションの自由度から生じる構造の多様性を収容するために、より開放的な結合ポケットを有する。さらに本発明によると、ＨＡは、ヒト上気道組織の感染を効果的に媒介するためには、傘形トポロジーのグリカン（例えば、α２‐６シアル酸含有グリカン）に結合する必要があり得、強い親和性および／または特異性でそのような傘形トポロジーのグリカンに結合する必要が特にあり得る。
【００５９】
これらの空間に制限されたグリコシル化特性の結果、ヒトは、数多くの野生型トリＨＡ（例えば、トリＨ５）を含有するウイルスにより通常は感染しない。具体的には、ウイルスに遭遇する可能性が最も高いヒトの気道部分（すなわち、気管と気管支）が、円錐形グリカン（例えば、α２‐３シアル酸含有グリカン、および／または短鎖グリカン）に対する受容体を欠如し、野生型トリＨＡは、円錐形グリカン（例えば、α２‐３シアル酸含有グリカン、および／または短鎖グリカン）と会合した受容体に、主としてまたは排他的に結合するため、ヒトがトリウイルスに感染するのは稀有になる。ウイルスと十分に密接な接触をして、ウイルスが、傘形グリカン（例えば、長鎖α２‐６シアル酸含有グリカン）を有する肺深部および／または胃腸管の受容体に接近できる場合に限り、ヒトは感染する。
【００６０】
本明細書において、本発明は、Ｈ５型ＨＡタンパク質の検出、および／または変化した結合特異性で出現する可能性のあるタンパク質の変異体を検出するために使用できる一連のグリカンの特定を可能にする。特に、そのような発明のアレイは、上気道のヒトＨＡ受容体に結合する能力および／または傘形トポロジーのグリカンに結合する能力（場合によりは高親和性および／または特異性で、好ましくは高親和性で）を有する、任意のＨ５変異体または実際に任意のＨＡタンパク質もしくはその変異体を検出するために使用できる。
【００６１】
本明細書で実証したように、そのようなアレイは、様々なＨＡタンパク質およびそれらのグリカン結合特徴の特定および／または特徴付けのために有用である。ある実施形態において、発明のＨ５型ＨＡ変異体タンパク質をそのようなアレイ上で検査して、それらが傘形トポロジー（例えば、α２‐６グリカン、および特に長鎖α２‐６グリカン）に結合する能力を評価し、そのような複数のグリカンに結合する能力を特に評価する。
【００６２】
実際、本発明は、ＨＡ結合能力の特徴付けおよび／または例えばヒト結合性ＨＡを検出するための特徴として使用できる、傘形グリカン（例えば、α２‐６グリカン、および特に長鎖α２‐６グリカン）および場合によりは円錐形トポロジーのグリカン（例えば、α２‐３シアル酸含有グリカン）のアレイを提供する。当業者には明白であるが、そのようなアレイは、Ｈ５型ＨＡを特徴付けるまたは検出するためだけでなく、実際は、α２‐６グリカンに結合する能力が望ましく評価されるＨ７および／またはＨ９を例えば含む任意のＨＡを検出するためにも有用である。
【実施例】
【００６３】
（実施例１）データマイニング方法論
グリカンアレイの説明およびグリカンアレイデータ供給源
ＣＦＧは、２種類のグリカンアレイ：（１）ウェルに基づくマイクロアレイおよび（２）固相に印刷したアレイを開発した。印刷されたアレイはより最近になって開発されたため、初期のリガンドスクリーニングのほとんどはウェルに基づくマイクロアレイを使用して行なわれた。ＣＦＧにより開発されたウェルに基づくマイクロアレイの最初の型は、各グリカンの３重反復提示で約６０個の異なるグリカンを含んでいた。各後続型のアレイは追加的なグリカンを組込み、現行型は、各グリカンの４重反復提示で１９５個のグリカンを含む（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｌｙｃｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ／ｓｔａｔｉｃ／ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｃｏｒｅｈ５．ｓｈｔｍｌを参照）。アレイは、Ｎ結合およびＯ結合グリカンの生理学的多様性を捕捉する合成グリカンを支配的に含む。アレイは、ポリアクリルアミド骨格に結合した多価性グリカンリガンドも含む。合成グリカンに加えて、様々な哺乳類糖タンパク質に由来するＮ結合グリカン混合物も、アレイ上に提示されている。
【００６４】
本研究の解析用に選ばれたデータセットは、ＣＦＧウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｌｙｃｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ／ｇｌｙｃｏｍｉｃｓ／ｐｕｂｌｉｃｄａｔａ／ｐｒｉｍａｒｙｓｃｒｅｅｎ．ｊｓｐから取得した。現在、４０個の哺乳類ＧＢＰが、様々な型のグリカンアレイに対してスクリーニングされている。スクリーニングデータは、アレイ上の各グリカンリガンドについてのＧＢＰの平均信号および信号対雑音比だけでなく、所定のウェルの所定のＧＢＰの強度信号を含む生の書式でも両方で利用可能である。グリカンアレイが現行型へと進化したため、旧型のアレイを使用してスクリーニングされたＧＢＰが、最新型を使用して再スクリーニングされることは一般的になかったことを指摘しておくことは重要である。これらのデータポイントの非存在は、あるＧＢＰのグリカンリガンドの結合を別のＧＢＰのグリカンリガンドの結合と区別した特徴の特定に関する含意を有している（本明細書で考察したように）。ＤＣ‐ＳＩＧＮ、‐ＳＩＧＮＲ、ヒトガレクチン１およびガレクチン３（およびその個々の糖質認識ドメイン）、ならびに赤血球凝集素Ｈ５のスクリーニングに対応するデータセットが取得された。これらのデータセットは、下記に記載したデータマイニングプラットフォームを使用して解析した。
【００６５】
データマイニングプラットフォーム
データマイニングプロセスに含まれる主要な工程を図１に例証する。これらの工程は、データオブジェクト、特徴、および分類指標という３つのエレメントに対する操作を含む。「データオブジェクト」とは、データベースに保存されている生データである。グリカンアレイデータの場合において、単糖および結合に関するグリカン構造物の化学的記述ならびにスクリーニングされた様々なＧＢＰとの結合信号が、データオブジェクトを構成する。データオブジェクトの重要な特性が「特徴」である。データオブジェクトを記述する特徴の選択は、規則またはパターンの取得を可能にする。「分類指標」は、データオブジェクトを特定の種類にクラスター化させるか、または特徴間の関係性を決定するかいずれかのために使用される規則またはパターンである。発明者らの下記の実施例で考察したように、分類指標は、高親和性でＧＢＰに結合するグリカンにより満たされる特異的な特徴を提供する。これらの規則は：（１）結合を強化すると考えられる一連の高親和性グリカンリガンドに存在する特徴、および（２）結合に好ましくないと考えられる高親和性グリカンリガンドに存在すべきでない特徴の２種類である。
【００６６】
データマイニングプラットフォームは、上述の操作を実施するために互いに相互作用するソフトウェアモジュール（図１）を含む。１つの構成要素は、特徴を抽出するためにＣＦＧデータベースに接続する特徴抽出部である。ＣＦＧにより使用される、オブジェクトに基づくリレーショナルデータベースは、特徴の柔軟な定義を容易にする。
【００６７】
特徴抽出およびデータ調製：
上記のように、特徴は、グリカンおよび／またはそれらの結合パートナーから抽出できる。本明細書で例証された特定の応用において、表１に列挙したように、ある種の特徴がグリカンアレイ上のグリカンから抽出された。
【００６８】
表１．グリカンアレイ上のグリカンから抽出された特徴
この表に記載した特徴は、規則に基づく分類アルゴリズムによって使用され、特定のＧＢＰに対する結合を特徴付けたパターンを特定した。
【００６９】
【表１】
2010501074.tif 000004
示された特徴を選ぶことの背後にある論理的根拠は、ＧＢＰのグリカン結合部位が典型的には二糖〜四糖を収容するということだった。ツリーに基づく表示は、グリカン構造物における単糖および結合に関する情報を捕捉するために使用された（還元末端がツリーの根）。この表示は、連接する一連の単糖トリプレットなど、より高次の特徴を含む種々の特徴の抽出を容易にした（図２）。データ調製は、各グリカンについて抽出した特徴（表１）と共に、最新型のグリカンアレイの全グリカンを列方向に列挙したリストの生成を含む。特定のＧＢＰまたは一連のＧＢＰに対する結合を決定する特定のパターンを決定するため、グリカンおよびそれらの特徴に関するこの基本表から、規則に基づく分類（下記を参照）のためのサブセットを選んだ。
【００７０】
分類指標：
様々な種類の分類指標が開発され、多くの応用で使用されてきた。それらは、主として３つの主要な範疇：数学法、間隔法、および論理法に分類される。これらの異なる方法ならびにそれらの利点および欠点は、Ｗｅｉｓｓ＆Ｉｎｄｒｕｋｈｙａ（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｄａｔａ  ｍｉｎｉｎｇ−Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ｇｕｉｄｅ．Ｍｏｒｇａｎ  Ｋａｕｆｍａｎｎ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９９８）で詳細に考察されている。この特定の応用の場合、発明者らは、論理的方法に該当する規則帰納法と呼ばれる方法を選ぶ。規則帰納法の分類指標は、ＩＦ−ＴＨＥＮ規則の形態のパターンを生成する。
【００７１】
ＩＦ−ＴＨＥＮ（もし〜ならば、〜である）規則を生成する規則帰納法などの論理的方法および特に分類指標の主要な利点の１つは、他の統計的または数学的方法と比較した際、分類指標の結果がより容易に説明できることである。これにより、発見された規則またはパターンの構造的および生物学的意義を探求することが可能になる。前述した特徴（表１を参照）を使用して生成される規則の例は、ＩＦグリカンが「Ｇａｌｂ４ＧｌｃＮＡｃｂ３Ｇａｌ［Ｂ］」を含有し、かつ「Ｆｕｃａ３ＧｌｃＮＡｃ［Ｂ］」を含有しないならば、ＴＨＥＮグリカンはより高い親和性でガレクチン３に結合しよう、というものである。
【００７２】
この場合に使用された特定の規則帰納アルゴリズムは、Ｗｅｉｓｓ＆Ｉｎｄｒｕｋｙａ（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｄａｔａ  ｍｉｎｉｎｇ−Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ｇｕｉｄｅ．Ｍｏｒｇａｎ  Ｋａｕｆｍａｎｎ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９９８）により開発されたアルゴリズムである。
【００７３】
結合レベル
グリカンアレイスクリーニングデータセットの各々について、低親和性結合と高親和性結合とを区別する閾値を定義した（図３）。
【００７４】
ハイスループットＣＦＧグリカンアレイデータにデータマイニング法を適用することにより、発明者らは、様々なＧＢＰに結合するグリカンの一連の特徴を特定した。３つの特定のシステム：（１）ＤＣ‐ＳＩＧＮおよび‐ＳＩＧＮＲ、（２）ガレクチン；ならびに（３）赤血球凝集素Ｈ５を例として選んだ。これらのＧＢＰファミリーの各々は、グリカンリガンドの優先性の点で合理的に十分定義される。最近の研究により、ＤＣ‐ＳＩＧＮおよび‐ＳＩＧＮＲの特徴的なリガンド特異性の構造的基盤がグリカンアレイデータに基づいて概説されたため、第１の例は、発明者らの方法論の追加的な実証を提供する。過去の研究により、様々なガレクチンのリガンド特異性が系統的に評価されている。しかしながら、ＣＦＧグリカンアレイは、様々なガレクチンのリガンド特異性をスクリーニングするために使用されてきた、はるかに大きなドメインのグリカン構造物を提供する。したがって、発明者らの方法論をガレクチンデータセットに応用すると、様々なガレクチンのグリカンリガンドに対する結合を決定する追加的な規則が提供される。
【００７５】
（実施例２）ＤＣ‐ＳＩＧＮおよびＤＣ‐ＳＩＧＮＲへの方法論の応用
ＤＣ‐ＳＩＧＮおよびＤＣ‐ＳＩＧＮＲは、Ｃａ２＋に依存する様式でグリカンリガンドを認識し結合する、Ｃ型レクチンのＩＩ型膜貫通受容体サブファミリーに属する。ＤＣ‐ＳＩＧＮは、樹状細胞において豊富に発現され、ＩＣＡＭ‐３分子を介して樹状細胞を提示する抗原へのＴ細胞の接着に重要な役割を果たし、それによって免疫応答を惹起する。加えて、ＤＣ‐ＳＩＧＮは、樹状細胞によるＨＩＶなどの病原体の認識に重要な役割を果たすことも示されている。実際、樹状細胞のＤＣ‐ＳＩＧＮに対するＨＩＶの結合は、Ｔ細胞の感染を強化することが実証されている。他方では、ＤＣ‐ＳＩＧＮと７７％の配列同一性を共有するＤＣ−ＳＩＧＮＲは、肝臓、リンパ節、および胎盤の内皮細胞に見出される。
【００７６】
これらのタンパク質の各々は、Ｃ末端に単一の糖質認識ドメイン（ＣＲＤ）を含有する。両タンパク質の細胞外アルファヘリックスドメイン（ＣＲＤに隣接している）は、ＣＲＤの四量体化を促進し、したがってグリカンリガンドとの多価性相互作用を可能にする。ＤＣ‐ＳＩＧＮおよび‐ＳＩＧＮＲについては、様々なグリカンリガンドとの結晶構造を含む豊富な結晶構造情報がある。より最近では、これらのタンパク質は、ＣＦＧグリカンアレイを使用してスクリーニングされ、特徴的なリガンド特異性および信号伝達特性を有することが実証された。したがって、これらのタンパク質のグリカンアレイデータは、データマイニング方法論を実証にするための良好な枠組みを提供した。
【００７７】
上記の実施例１で概説したように、ＤＣ‐ＳＩＧＮおよびＤＣ‐ＳＩＧＮＲのグリカンスクリーニング解析に対応するグリカン特徴（表１）は、ＣＦＧデータベースから要約した。主要な目的関数が、２つのタンパク質の各々に対する各グリカンの結合の平均信号対雑音比であったこれらの特徴を使用して、規則に基づく分類法を実施した。前記分類法による結果を表２に集約する。
【００７８】
表２．ＤＣ‐ＳＩＧＮおよびＤＣ‐ＳＩＧＮＲに対するグリカン結合を決定する規則
特徴［表１］に基づいて規則が導出され、＃［］は出現数を特定するために使用される。ＤＣ‐ＳＩＧＮ結合を決定する最後の規則は、個々の規則の各々が満たされなければならないことを示唆する、複数の特徴のより複雑な「＆」を含む組合せである。ＤＣ‐ＳＩＧＮについては、規則にクラスター化できなかったグリカン［偽陰性］も示す。
【００７９】
【表２】
2010501074.tif 000005
規則に基づく分類法の全体的な成績は、ＤＣ‐ＳＩＧＮＲについては高マンノース構造候補の１００％を予測し、ＤＣ‐ＳＩＧＮについては２０個の高結合体のうち１６個を予測したことを考慮すると、良好であった。偽陽性がなかったこと、つまり結合すると予測されたが結合しなかったグリカンの実例がなかったこと留意することが重要である。結果を見て最初に明白になる含意は、ＤＣ‐ＳＩＧＮおよびＤＣ‐ＳＩＧＮＲの両方が、高マンノース構造に対する共通の高親和性結合を共有することである。Ｍａｎａ３（Ｍａｎａ６）Ｍａｎａ６Ｍａｎの存在は、グリカンアレイデータに基づき、高親和性で結合する６つの異なる高マンノースグリカンリガンドを捕捉する強力な規則である。この観察は、過去の結晶構造研究と一致する。
【００８０】
ＤＣ‐ＳＩＧＮは、高マンノースリガンドに加えて、明確な特徴により特徴付けられた追加的な一連のフコシル化リガンドに結合した。これらのフコシル化リガンドは、ＤＣ‐ＳＩＧＮＲには結合しなかった。Ｆｕｃａ４ＧｌｃＮＡｃは、ルイスａ［Ｆｕｃａ４（Ｇａｌｂ３）ＧｌｃＮＡｃ］を含有するグリカン構造物に一般に観察されるモチーフである。Ｆｕｃａ３（Ｇａｌｂ４）ＧｌｃＮＡｃは、Ｎ結合およびＯ結合グリカンの非還元末端に存在する、別の一般的に観察されるルイスｘモチーフである。これらの両特徴は、ＤＣ‐ＳＩＧＮに対する高親和性結合体に特徴的だった。この観察は、ルイスｘを含有するグリカン構造物を伴ったＤＣ‐ＳＩＧＮの初期の結晶構造において観察された、フコシル化リガンドに対するＤＣ‐ＳＩＧＮの特徴的な結合と一致する。高マンノースおよびフコシル化リガンドを伴ったＤＣ‐ＳＩＧＮおよびＳＩＧＮＲの結晶構造の詳細な研究に基づき、これらの両タンパク質が、高マンノースリガンドに対する同様の結合様式を共有する一方で、フコシル化リガンドに対する結合は完全に異なり、ＤＣ‐ＳＩＧＮのＣＲＤにあるアミノ酸によってのみ達成され得ることが示された。
【００８１】
発明者らの解析により提供された別の興味深い観察は、特定の特徴の非存在が、高親和性で結合するのために必要とされることである。つまり、ルイスｘモチーフと共にＮｅｕａ３Ｇａｌｂ４ＧｌｃＮＡｃおよびＧａｌａ３Ｇａｌが存在すると、ＤＣ‐ＳＩＧＮに対するこれらのリガンドの結合に有害である。発明者らのデータマイニング手法の価値は、ルイスｘを含有するグリカンリガンドを伴ったＤＣ‐ＳＩＧＮの結晶構造の研究によりこの規則が確認されることによって強調される。Ｆｕｃａ３（Ｇａｌｂ４）ＧｌｃＮＡｃのＧａｌにおける３‐ＯＨの位置は、ＤＣ‐ＳＩＧＮのＣＲＤに近接しており（図４）、硫酸化、シアル酸付加などを含むこの位置への任意のかさ高い置換は、タンパク質との好ましくない立体接触に結びつき、したがって結合を破壊する。
【００８２】
ＤＣ‐ＳＩＧＮおよび‐ＳＩＧＮＲを伴ったルイスｘ含有グリカンの結晶構造に基づくと、フコシル化リガンドの主要な結合には、Ｃａ２＋イオンとの配位を形成するＦｕｃのエクアトリアル酸素３‐ＯＨおよび４‐ＯＨが関与する。したがって、ルイスａ抗原Ｆｕｃａ４（Ｇａｌｂ３）ＧｌｃＮＡｃの場合でさえ、主要な結合には、Ｆｕｃの３‐ＯＨ、および４‐ＯＨが関与する（図４）。興味深いことには、このモチーフを含む規則である＃［Ｆｕｃａ４ＧｌｃＮＡｃ］＞０は、Ｇａｌｂ３ＧｌｃＮＡｃ結合の存在を明示的に含まなかった。したがって、この解析は、Ｇａｌが存在すると、ルイスａ含有モチーフを含有するものよりもルイスｘ含有モチーフの場合において、フコシル化リガンドに対するＤＣ‐ＳＩＧＮの結合により良好な影響を及ぼすことを示す。
【００８３】
（実施例３）ガレクチンへの方法論の応用
ガレクチンは、活性に還元性チオールを必要とするため以前はＳ型レクチンと定義されていたβガラクトシドに結合することが知られている可溶性ＧＢＰのファミリーに属する。Ｃ型レクチン（ＤＣ‐ＳＩＧＮおよび‐ＳＩＧＮＲなど）と異なり、ガレクチンはリガンド結合にＣａ２＋を必要としない。ガレクチンは、多数の生物学的役割、すなわち細胞発生、アポトーシス、癌、および免疫応答に関わるとされている。ガレクチンは、一般的にＩ型（Ｇａｌｂ３ＧｌｃＮＡｃ）およびＩＩ型（Ｇａｌｂ４ＧｌｃＮＡｃ）ラクトサミン単位に結合することが知られているが、多数の生物学的役割についてのより細かい基質特異性およびその含意はあまり理解されていない。ヒトガレクチン１および３のデータセットを、規則に基づくデータマイニング手法を使用して解析した。これらの２つのガレクチンは、ＣＲＤの組織の点で基本的に異なる。ガレクチン１および３の両方は、類似したＣ末端Ｆ３型ＣＲＤを共有する。ガレクチン１は典型的にはＣＲＤのホモ二量体であるが、ガレクチン３はＮ末端リンカードメインを有する単一ＣＲＤから構成される。ガレクチン３のＮ末端ドメインは、グリカンリガンドに対する親和性の強化に関わるとされている。
【００８４】
上記の例と同様に、グリカンアレイ上のグリカンリガンドの、ガレクチン１および３に対する結合を強化および減退させる特徴を、規則に基づくデータマイニング手法を使用して同定した（表３）。
【００８５】
表３．ガレクチン１および３に対するグリカン結合を決定する規則
特徴［表１］に基づいて規則を導出し、＃［］は出現数を特定するために使用され、＆は各々が満たされなければならない規則の組合せを意味する。！［］はパターンの非存在を意味する。ａ２／３およびａ３／６における／は、それぞれａ２またはａ３、およびａ３またはａ６を表わす。
【００８６】
【表３】
2010501074.tif 000006
ガレクチン１および３の高親和性リガンド結合を決定する規則は、ＤＣ‐ＳＩＧＮおよび‐ＳＩＧＮＲについて導出されたものより複雑である。ガレクチン１および３は、ＩＩ型およびＩ型の両ラクトサミン単位に同様の親和性で結合することが知られているが、グリカンアレイからのデータでは、高結合体を区別するために使用された閾値強度に基づいて、任意のＩ型（Ｇａｌｂ３ＧｌｃＮＡｃ）結合体も明らかにならなかった。
【００８７】
ガレクチン１の場合、９つの高結合体のうち８つを捕捉した第１の規則（表３）は、鎖長が少なくとも単糖３つである少なくとも１つのラクトサミン単位の存在を含んでいた。かさねて、偽陽性がなかったことに留意することが重要である。低親和性および高親和性結合体の解析に基づき、規則１の幾つかのパターンは、結合に負の効果を有すると意味づけられた。ＧｌｃＮＡｃのフコシル化、Ｇａｌの末端フコシル化、Ｇａｌのシアル酸付加、およびＩＩ型ラクトサミン単位と併せてＧａｌａ３ＧａｌまたはＧａｌａ４Ｇａｌが存在することも、結合に負の効果を有した。さらに、コア２型（またはコア４型）Ｏ結合コア上のＩＩ型ラクトサミンを含む‐Ｇａｌｂ４ＧｌｃＮＡｃｂ６ＧａｌＮＡｃ‐単位は、結合に負の効果を有した。
【００８８】
第２の規則は、グリカンモチーフが少なくとも２つのＧａｌｂ４ＧｌｃＮＡｃ単位を有するＩＩ型ポリラクトサミン反復を含む場合、シアル酸付加は高親和性結合に影響を与えないことを示す興味深いパターンを示した。過去の研究では、末端にシアル酸が付加されたグリカンは、ガレクチン１に対するリガンド候補であるとされている。本研究で使用されたシアル酸含有グリカンは少なくとも２つのＧａｌｂ４ＧｌｃＮＡｃ単位を含んでいたため、これらの結果は発明者らの規則と一致する。さらに発明者らの規則は、ガレクチン１が内部Ｇａｌｂ４ＧｌｃＮＡｃ単位に結合し、非還元末端に対して鎖のはるか遠方にある他の任意のパターンも高親和性結合に影響を及ぼさないことも示す。Ｇａｌ［３‐Ｏ‐ＳＯ３］ｂ３ＧａｌＮＡｃを含む偽陰性が１つだけがあった。
【００８９】
ガレクチン３結合の規則はガレクチン１に類似していたが、幾つかの違いがあった。これらの違いは表４に捕捉されている。
【００９０】
表４．ガレクチン１およびガレクチン３の結合の比較
【００９１】
【表４】
2010501074.tif 000007
主な違いは、他のパターンと併用した、Ｍａｎａ３（Ｍａｎａ６）Ｍａｎ単位の非存在の組合せを有する第１の規則にあった。この規則が全てのＮ結合グリカンを排除するのではないことを指摘することは重要である。その代わりに、ガレクチン３は、コアのＭａｎａ３（Ｍａｎａ６）Ｍａｎに結合した様々な分岐部に出現するＧａｌｂ４ＧｌｃＮＡｃと比較して、Ｇａｌｂ４ＧｌｃＮＡｃ（ポリラクトサミン）の直鎖反復を好むことを意味する。別の違いは、ガレクチン３に対する結合は、ラクトサミンにおけるＧａｌのフコシル化により阻害されなかったが、ガレクチン１に対する結合はそれにより阻害されたことであった。
【００９２】
ＤＣ‐ＳＩＧＮおよび‐ＳＩＧＮＲの例と同様に、ガレクチンデータの発明者らの解析結果を、リガンド結合の構造的態様と比較した。Ｇａｌｂ４ＧｌｃＮＡｃ、Ｎｅｕ５Ａｃａ３Ｇａｌｂ４ＧｌｃＮＡｃ、Ｎｅｕ５Ａｃａ３Ｇａｌｂ４（Ｆｕｃａ３）ＧｌｃＮＡｃ、Ｎｅｕ５Ａｃａ６Ｇａｌｂ４ＧｌｃＮＡｃなどのような様々なリガンドと、ガレクチン１および３との構造複合体を解析した。Ｇａｌｂ４ＧｌｃＮＡｃリガンドを伴ったガレクチン１および３の結晶構造は、他のリガンドの構造をスーパーインポーズし、様々な構造複合体を構築するための枠組みとして、それぞれ使用した。Ｇａｌｂ４ＧｌｃＮＡｃ単位におけるＧａｌの４‐ＯＨ基および６‐ＯＨ基ならびにＧｌｃＮＡｃの３‐ＯＨは、ガレクチン１および３のＣＲＤのアミノ酸との相互作用に関与していた。したがって、これらの酸素のいずれかが置換されても、タンパク質との好ましくない立体接触に帰着した。
【００９３】
発明者らの手法により導出されたガレクチン結合の規則は、Ｇａｌａ４Ｇａｌ、ＮｅｕＡｃａ６Ｇａｌ、およびＦｕｃａ３ＧｌｃＮＡｃが結合に有害であることを示し、構造複合体の解析と一致した。結晶構造は、非還元側のＧａｌｂ４ＧｌｃＮＡｃを別のそのような単位で伸長させること（ｂ３結合を介して）が可能であることも示し、ガレクチン１および３の両方が内部Ｇａｌｂ４ＧｌｃＮＡｃ単位に結合できることを示唆した。これにより、Ｇａｌｂ４（Ｆｕｃａ３）ＧｌｃＮＡｃまたはＮｅｕ５Ａｃａ３／６Ｇａｌｂ４ＧｌｃＮＡｃなどの末端単位を有するより長い鎖は、高親和性結合に影響を及ぼさなかったという規則が確認される。
【００９４】
ガレクチン１およびガレクチン３に対する結合の規則をさらに確認にするために、前記規則を使用して、ガレクチン１およびガレクチン３に対する、グリカンアレイに存在しなかった２つの異なるグリカンの相対結合を予測した（表５）。
【００９５】
表５．ガレクチン１およびガレクチン３に対する相対結合の予測
【００９６】
【表５】
2010501074.tif 000008
上記で観察されたように、この規則は、ガレクチン３はラクトースアミンの直鎖反復を好むが、ガレクチン１は分岐配置に見出されるラクトースアミンを好むと予測した。これは、Ｈｉｒａｂａｙａｓｈｉら（２００２）で観察されたリガンド結合特性と一致している。
【００９７】
（実施例４）赤血球凝集素への方法論の応用
α２‐３／６シアル酸含有グリカンに対するＨ５Ｎ１亜型の結合のための枠組みを開発した（図７）。この枠組みは２つ補完的な解析を含む。第１番目は、Ｈ１型、Ｈ３型、およびＨ５型ＨＡ‐グリカン共結晶構造を使用して、ＨＡグリカン結合部位ならびにα２‐３およびα２‐６シアル酸含有グリカンとの相互作用を系統的に解析することを含む（表６）。
【００９８】
この解析は、傘形または円錐形トポロジーのいずれかのグリカンを含む様々なα２‐３／６シアル酸含有グリカンと、ＨＡグリカン結合部位との相互作用についての重要な洞察を提供する。第２番目は、様々なＨ１型、Ｈ３型、およびＨ５型ＨＡに関するグリカンアレイデータを解析するためのデータマイニング手法を含む。このデータマイニング解析は、様々な野生型および突然変異型ＨＡの強結合体、弱結合体、および非結合体を、マイクロアレイのグリカンの構造的特徴とを相関させる（表７）。
【００９９】
重要なことには、これらの相関（分類指標）は、α２‐３／６シアル酸含有結合および／または様々なＨＡに対する結合の際の様々なトポロジーの、微妙な構造変化の影響を捕捉する。下記で考察するように、データマイニング解析から得られるグリカン特徴の相関は、ＨＡグリカン結合部位上にマッピングされ、異なるトポロジーのグリカンを含むα２‐３およびα２‐６シアル酸含有グリカンに対する、Ｈ１型、Ｈ３型、およびＨ５型ＨＡの結合を系統的に研究するための枠組みを提供する。
【０１００】
一例を挙げると、本発明によってこの枠組みをＨ５型ＨＡに応用すると、特に分岐度との関連で、α２‐６オリゴ糖鎖の長さが、いかにしてグリカン周辺の構造変化の微妙な違いより重要になるかが例証される。例えば、より長鎖のα２‐６モチーフを有する二分岐構造と比較して、単一のα２‐６モチーフを有する三分岐構造は、個々のα２‐６モチーフ周辺での構造変化に比べて、ＨＡ‐グリカン結合に影響を及す。これは、本明細書でデータマイニングから得られた、α２‐６モチーフについての特徴的な鎖長依存性分類指標により確認される（表７）。
【０１０１】
α２‐３およびα２‐６シアル酸含有グリカンに対する、Ｈ１型、Ｈ３型、およびＨ５型ＨＡの結合特異性のための枠組み
Ｈ１（ＰＤＢ  ＩＤ：１ＲＤ８、１ＲＵ７、１ＲＵＹ、１ＲＶ０、１ＲＶＴ、１ＲＶＸ、１ＲＶＺ）、Ｈ３（ＰＤＢ  ＩＤ：１ＭＱＬ、１ＭＱＭ、１ＭＱＮ）、およびＨ５（１ＪＳＮ、１ＪＳＯ、２ＦＫ０）に由来するＨＡの結晶構造、ならびにα２‐３および／またはα２‐６シアル酸含有オリゴ糖とＨＡとの複合体の結晶構造は、特定のＨＡ‐グリカン相互作用に関与する残基についての分子的洞察を提供した。より最近では、トリおよびヒトのＨ１亜型およびＨ３亜型のグリカン受容体特異性は、多様なα２‐３およびα２‐６シアル酸含有グリカンを含むグリカンアレイ上で、野生型および突然変異体をスクリーニングすることにより詳説された。
【０１０２】
１９１８年のヒト汎流行性ウイルスのＨＡにおけるＡｓｐ１９０Ｇｌｕ突然変異は、α２‐６シアル酸含有グリカンからα２‐３シアル酸含有グリカンへとその特異性を逆転させた（Ｓｔｅｖｅｎｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３５５：１１４３，２００６；Ｇｌａｓｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７９：１１５３３，２００５）。他方では、トリＨ１（Ａ／アヒル／Ａｌｂｅｒｔａ／３５／１９７６）の二重突然変異Ｇｌｕ１９０ＡｓｐおよびＧｌｙ２２５Ａｓｐは、α２‐３シアル酸含有グリカンからα２‐６シアル酸含有グリカンへとその特異性を逆転させた。Ｈ３亜型の場合、１９６３年のトリＨ３Ｎ８型株および１９６７〜６８年の汎流行性ヒトＨ３Ｎ２型株間での、Ｇｌｎ２２６からＬｅｕへのアミノ酸変化およびＧｌｙ２２８からＳｅｒへのアミノ酸変化は、α２‐３シアル酸含有グリカンからα２‐６シアル酸含有グリカンへの優先性の変化と相関する（Ｒｏｇｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３０４：７６，１９８３）。ＨＡ‐グリカン結合の特異性と伝染効率との関係は、高病原性で伝染力の強い１９１８年のＨ１Ｎ１型ウイルスを使用して、フェレットモデルで実証された（Ｔｕｍｐｅｙ，Ｔ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１５：６５５，２００７）。受容体結合特異性が、親のヒトα２，６シアル酸含有グリカン（ＳＣ１８）受容体優先性からトリα２，３シアル酸含有受容体優先性（ＡＶ１８）に切り替わると、その結果として伝染不能であるウイルスがもたらされた。他方では、α２，３／α２，６混合シアル酸含有グリカン特異的ウイルス（Ａ／Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ／１／１８（ＮＹ１８））は伝染性を示さず、驚くべきことに、α２，３／α２，６混合シアル酸含有グリカン特異性でもあるＡ／Ｔｅｘａｓ／３６／９１（Ｔｘ９１）ウイルスは、効率的に伝染可能であった。さらに、上述のように、高病原性Ｈ５Ｎ１型ウイルスの種々の株は、α２，３／α２，６混合シアル酸含有グリカン特異性も示すが（Ｙａｍａｄａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４４４：３７８，２００６）、ヒトからヒトに伝染可能である。ＨＡのシアル酸含有グリカン特異性および伝染性に関する混乱した結果は、以下の疑問を提起した。まず、ヒトの上気道に見出されるシアル酸含有グリカンに多様性があるのか、それはウイルスの特異性および組織指向性を説明できるのか。次に、α２‐３および／またはα２‐６シアル酸含有グリカンの両方が、いかにしてＨＡグリカン結合ポケットに結合するのかに関して役割を果たし得るグリカンのコンフォメーションに微妙な違いがあるのか。まとめると、ヒトに適応するための、インフルエンザＡ型ウイルスＨＡのグリカン結合の必要条件は何か。
【０１０３】
グリカントポロジーと、α２‐３シアル酸含有グリカンに結合するＨ１型、Ｈ３型、およびＨ５型ＨＡにおける置換とにより課された構造的制約。
【０１０４】
全てのＨＡグリカン共結晶構造を解析すると、Ｎｅｕ５Ａｃ糖（ＳＡ）の配向性がＨＡグリカン結合部位に対して固定されていることが示される。様々なＨＡ亜型にわたって高度に保存されている一連のアミノ酸、Ｐｈｅ９５、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ１３６、Ｔｒｐ１５３、Ｈｉｓ１８３、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ１９４は、ＳＡの係留に関与する。したがって、α２‐３またはα２‐６に対するＨＡの特異性は、ＳＡを越えたグリコシドの酸素原子および糖とＨＡグリカン結合部位との相互作用により決定される。
【０１０５】
Ｎｅｕ５Ａｃα２‐３Ｇａｌ結合のコンフォメーションは、α２‐３のＧａｌおよびＧａｌを越えた糖の位置決めが、この結合におけるグリコシドのねじれ角により決定される円錐形領域内に当てはまる状態である（図６）。最小エネルギーコンフォメーションの典型的な領域は、ψが−６０から６０をサンプリングする約−６０または６０または１８０のφ値により示される（図１４）。これらの最小エネルギー領域では、α２‐３のＧａｌを越えた糖が、ＨＡグリカン結合部位から突き出ている。これは、φ値が典型的には約１８０（トランス型コンフォメーションと呼ぶ）であるα２‐３モチーフ（Ｎｅｕ５Ａｃα２‐３Ｇａｌβ１‐３／４ＧｌｃＮＡｃ‐）とＨＡとの共結晶構造からも明らかである。トランス型コンフォメーションは、α２‐３モチーフがポケットから突き出る原因となる。これは、３つの糖（または三糖）のα２‐３モチーフの中央にあるＧａｌおよび／またはＧｌｃＮＡｃ（もしくはＧａｌＮＡｃ）糖で分岐する構造変化（硫酸化およびフコシル化）が、ＨＡ結合に最も影響を与えることを示唆する（図７）。この構造的含意は、データマイニング解析から得られた、α２‐３シアル酸含有グリカンに対するＨＡ結合の３つの特徴的な分類指標と一致している（表７）。これらの３種類の全てに共通する特徴は、Ｎｅｕ５Ａｃα２‐３ＧａｌがＧａｌＮＡｃα／β１‐４Ｇａｌ）と共に存在すべきでないということである。結晶構造の解析は、Ｎｅｕ５Ａｃα２‐３ＧａｌのＧａｌに結合したＧａｌＮＡｃがタンパク質との好ましくない立体接触をしたことを示し、それは分類指標と一致した。
【０１０６】
シアル酸結合のための保存された係留ポイントに加えて、２つの重要な残基、すなわちＧｌｎ２２６およびＧｌｕ１９０が、Ｎｅｕ５Ａｃα２‐３Ｇａｌモチーフに対する結合に関与する。結合部位の基部に位置するＧｌｎ２２６は、Ｎｅｕ５Ａｃα２‐３Ｇａｌ結合のグリコシド酸素原子と相互作用する（図１５、パネルＣ、Ｄ）。Ｇｌｎ２２６の反対側に位置するＧｌｕ１９０は、Ｎｅｕ５ＡｃおよびＧａｌ単糖と相互作用する（図１５、パネルＣ、Ｄ）。さらに、トリＨＡにおいて高度に保存されている残基Ａｌａ１３８（Ｇｌｎ２２６の近位）およびＧｌｙ２２８（Ｇｌｕｌ９０の近位）は、α２‐３シアル酸含有グリカンと至適に相互作用するためのＧｌｎ２２６およびＧｌｕ１９０の正しいコンフォメーションの促進に関与し得る（図１５）。ヒトＨ１亜型であるＡＰＲ３４は、Ａｌａ１３８、Ｇｌｕ１９０、Ｇｌｎ２２６、およびＧｌｙ２２８の４つのアミノ酸を全て含み、その結晶構造で観察されるようにα２‐３シアル酸含有グリカンに結合する（図１４、パネルＢ）。
【０１０７】
ＡＡＩ６８＿Ｈ３＿２３、ＡＤＵ６７＿Ｈ３＿２３、およびＡＰＲ３４＿Ｈ１＿２３の結晶構造中のグリカン結合部位をスーパーインポーズすると、Ｇｌｕ１９０側鎖の位置決め、およびα２‐３シアル酸含有グリカンへのＨＡ結合に対するその影響についての洞察がさらに得られる。Ｈ１型ＨＡのＧｌｕ１９０の側鎖は、Ｈ３型ＨＡのＧｌｕ１９０側鎖と比較して、さらに（およそ１Å）結合部位寄りである。これは、Ｇｌｕ１９０残基の近位にある、Ｈ３型ＨＡのＳｅｒ１８６と比べたＨ１型ＨＡのアミノ酸の違いであるＰｒｏ１８６に起因し得る。Ｇｌｕ１９０の側鎖コンフォメーションにおけるこの変化は、グリカンマイクロアレイデータのデータマイニング解析により示されたように（表７）、トリＨ１型（および非トリＨ３型）の、中程度の親和性で幾つかのα２‐６シアル酸含有グリカンへの結合と相関し得る。さらに、トリおよびヒトＨ３亜型間の特徴的な変化である、Ｇｌｙ２２８のＳｅｒへの置換は、Ｇｌｕ１９０のコンフォメーションを変化させ、トランス型コンフォメーションのＮｅｕ５Ａｃα２‐３ＧａｌとヒトＨ３型ＨＡとの相互作用を妨害する。これは、ヒトＡＡＩ６８＿Ｈ３＿２３共結晶構造に観察されるＮｅｕ５Ａｃα２‐３Ｇａｌモチーフの特徴的なコンフォメーション（トランス型ではない）により、さらに詳説される。このコンフォメーションのＮｅｕ５Ａｃα２‐３Ｇａｌモチーフは、トランス型コンフォメーションのこのモチーフによりトリＨ３型ＨＡにもたらされたものと比較して、あまり至適ではない接触をヒトＨ３型ＨＡ結合部位にもたらす。（図１４）。この接触の喪失の結果として、ヒトＨ３型ＨＡのＧｌｙ２２８Ｓｅｒ突然変異は、そのグリカン結合部位を、α２‐３シアル酸含有グリカンとの相互作用にそれほど好ましくないものにする。この構造的観察は、ヒトＨ３型ＨＡが幾つかのα２‐３シアル酸含有グリカンに対して中程度の親和性のみを有することを示すデータマイニング解析の結果と一致する（表７）。
【０１０８】
Ｎｅｕ５Ａｃα２‐３Ｇａｌ周辺の構造変化は、どのようにＨＡ‐グリカン相互作用に影響を及ぼすか。トリＨ５において高度に保存されているＬｙｓ１９３（図５）は、Ｎｅｕ５ａα２‐３Ｇａｌβ１‐４ＧｌｃＮＡｃの６‐Ｏ硫酸化Ｇａｌおよび／または６‐Ｏ硫酸化ＧｌｃＮＡｃと相互作用するように配置されている。この観察は、トリＨ５だけがＧａｌまたはＧｌｃＮＡｃで硫酸化されたα２‐３シアル酸含有グリカンに高親和性で結合するというデータマイニング解析により確認される（表７）。同様に、２２２位の塩基性アミノ酸は、Ｎｅｕ５Ａｃα２‐３Ｇａｌβ１‐３ＧｌｃＮＡｃモチーフの４‐Ｏ硫酸化ＧｌｃＮＡｃ、またはＮｅｕ５Ａｃα２‐３Ｇａｌβ１‐４ＧｌｃＮＡｃモチーフの６‐Ｏ硫酸化ＧｌｃＮＡｃと相互作用し得る。他方では、Ｈ１およびＨ５のＬｙｓ２２２ならびにＨ３のＴｒｐ２２２などのかさ高い側鎖は、Ｎｅｕ５Ａｃα２‐３Ｇａｌβ１‐４（Ｆｕｃα１‐３）ＧｌｃＮＡｃモチーフのフコシル化ＧｌｃＮＡｃを潜在的に妨害する。この構造的観察は、トリＨ３型株およびＨ５型株に観察される分類指標規則α２‐３タイプＣ（表７）を実証し、ＧｌｃＮＡｃにおけるフコシル化が結合に有害であることを示す。α２‐３シアル酸含有グリカンに対するＶｉｅｔ０４＿Ｈ５型ＨＡの結合は、それぞれのグリカン結合部位のアミノ酸がほとんど同一であることを考慮すると、ＡＤＳ９７＿Ｈ５型ＨＡの結合に類似している（表７）。
【０１０９】
したがって、α２‐３シアル酸含有グリカンに対する結合に関しては、Ｎｅｕ５Ａｃを係留する残基とは別に、トリＨ１亜型、Ｈ３亜型、およびＨ５亜型の全てにおいて高度に保存されているＧｌｕ１９０およびＧｌｎ２２６が、Ｎｅｕ５Ａｃα２‐３Ｇａｌモチーフに対する結合に重要である。ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃとの接触、ならびにα２‐３モチーフにおける硫酸化およびフコシル化などの置換は、１３７位、１８６位、１８７位、１９３位、および２２２位のアミノ酸を含む。Ｈ１、Ｈ３、およびＨ５に由来するＨＡは、グリカンマイクロアレイに存在する多様なα２‐３シアル酸含有グリカンに対する異なる結合特異性を示す。これらの位置のアミノ酸残基は、様々なＨＡにわたって保存されているわけではなく、それが異なる結合特異性を説明する。
【０１１０】
グリカントポロジーと、α２‐６シアル酸含有グリカンに結合するＨ１型、Ｈ３型およびＨ４型ＨＡにおける置換とにより課された構造的制約
Ｎｅｕ５Ａｃα２‐６Ｇａｌ結合の場合には、追加的なＣ６‐Ｃ５結合がコンフォメーションの追加的な柔軟性を提供する。α２‐６のＧａｌおよびそれに続く糖の位置は、α２‐３の場合の円錐形様領域と比較して、はるかに大きな傘形様領域にわたる（図６）。α２‐６に対する結合は、そのような傘形トポロジーの基部にあるＮｅｕ５ＡｃおよびＧａｌ糖との至適な接触を伴い、オリゴ糖の長さに依存してそれに続く糖とも至適な接触を伴う。Ｎｅｕ５Ａｃα２‐６Ｇａｌβ１‐３／４Ｇｌｃなどの短鎖α２‐６オリゴ糖は、潜在的に円錐形様のトポロジーをとる。他方では、α２‐６モチーフであるＮｅｕ５Ａｃα２‐６Ｇａｌβ１‐４ＧｌｃＮＡｃ‐にＧｌｃの代わりにＧｌｃＮＡｃが存在すると、ＧｌｃＮＡｃおよびＮｅｕ５Ａｃの両方のアセチル炭素間の至適なファンデルワールス接触により安定する傘形トポロジーが潜在的に好まれる。しかしながら、α２‐６モチーフは、分岐およびＨＡ結合などの追加要因が、傘形トポロジーにより提供される安定性を補償できるような円錐形トポロジーをとることもできる。α２‐６モチーフの円錐形トポロジーは、糖内の相互作用により安定され得るＮ結合グリカンにおける複数の短鎖オリゴ糖分岐部の一部として存在する。他方では、傘形トポロジーは、長鎖オリゴ糖分岐部（少なくとも１つの四糖）におけるα２‐６モチーフにより好まれる。Ｈ１型およびＨ３型ＨＡとα２‐６モチーフ（Ｎｅｕ５Ａｃα２‐６Ｇａｌβ１‐４ＧｌｃＮＡｃ‐）との共結晶構造は、φ〜−６０（シス型コンフォメーションと呼ぶ）が、Ｎｅｕ５Ａｃα２‐６Ｇａｌを越える糖をＨＡタンパク質に向かって屈曲させて、結合部位と至適に接触させるという上記の概念を支援する（図７）。
【０１１１】
Ｈ１型ＨＡにおいては、ヒトＨ１Ｎ１（Ａ／Ｓｏｕｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ／１／１９１８）亜型に由来するＨＡのグリカン結合ドメインと、ＡＳＩ３０＿Ｈ１＿２６およびＡＰＲ３４＿Ｈ１＿２６の結合ドメインとのスーパーインポーズが、α２‐６シアル酸含有グリカンへの特異性をもたらすことに関与するアミノ酸についての洞察を提供した。Ｌｙｓ２２２およびＡｓｐ２２５は、Ｎｅｕ５Ａｃα２‐６ＧａｌモチーフにおけるＧａｌの酸素原子と相互作用するように配置されている。Ａｓｐ１９０およびＳｅｒ／Ａｓｎ１９３は、Ｎｅｕ５Ａｃα２‐６Ｇａｌα１‐４ＧｌｃＮＡｃα１‐３Ｇａｌモチーフの追加的な単糖であるＧｌｃＮＡｃα１‐３Ｇａｌと相互作用するように配置されている（図１５、パネルＡ、Ｂ）。
【０１１２】
Ａｓｐ１９０、Ｌｙｓ２２２、およびＡｓｐ２２５は、１９１８年のヒト汎流行性株に由来するＨ１型ＨＡの中で高度に保存されている。アミノ酸Ｇｌｎ２２６は、トリおよびヒトＨ１亜型の全てにおいて高度に保存されているが、α２‐３シアル酸含有グリカン（トリＨ１亜型の）に対する結合における役割と比較して、α２‐６シアル酸含有グリカン（ヒトＨ１亜型の）に対する結合に関与しないと考えられる。トリおよびヒトＨ１型ＨＡの野生型および突然変異型についてのグリカンアレイ結果のデータマイニング解析は、α２‐６シアル酸含有グリカンに対する結合における上記のアミノ酸の役割をさらに実証する（表７）。トリＨ１型ＨＡのＧｌｕ１９０Ａｓｐ／Ｇｌｙ２２５Ａｓｐ二重突然変異体は、α２‐６シアル酸含有グリカンに対する結合を逆転させる（表７）。さらに、ヒトＡＮＹ１８＿Ｈ１のＬｙｓ２２２Ｌｅｕ突然変異体は、アレイ上のシアル酸含有グリカンに対するその結合を全て取り除き、グリカン結合におけるＬｙｓ２２２の必須な役割と一致する。
【０１１３】
α２‐６シアル酸含有グリカンに結合するＨ３Ｎ２型ＨＡに特異性をもたらすアミノ酸を特定するため、ヒトＨ３Ｎ２型（ＡＡＩ６８＿Ｈ３）、ＡＤＵ６３＿Ｈ３＿２６、およびＡＳＩ３０＿Ｈ１＿２６に由来するＨＡのグリカン結合ドメインをスーパーインポーズした。これらのスーパーインポーズされた構造を解析すると、Ｌｅｕ２２６は、Ｎｅｕ５α２‐６ＧａｌモチーフのＣ６原子との至適なファンデルワールス接触をもたらすように配置され、Ｓｅｒ２２８は、シアル酸のＯ９と相互作用するように配置されていることが示された。ヒトＨ３のＳｅｒ２２８は、Ｇｌｕ１９０とも相互作用し（相互作用しないトリＡＤＵ６３＿Ｈ３のＧｌｙ２２８とは異なる）、それによりその側鎖コンフォメーションに影響を与える。ヒトＨ３型ＨＡのＧｌｕ１９０の側鎖は、トリＨ３型ＨＡのＧｌｕ１９０の側鎖と比較して、約０．７Åだけわずかに結合部位に向かって移動されている。これらの違いは、ヒトＨ３型ＨＡがα２‐３シアル酸含有グリカンに結合し、α２‐６シアル酸含有グリカンに対するその優先的結合と相関する能力を制限する。したがって、Ｇｌｎ２２６ＬｅｕおよびＧｌｙ２２８Ｓｅｒ突然変異は、１９６７年の大流行中に、トリＨ３亜型のグリカン受容体特異性をヒトＨ３亜型に逆転させる原因となった。
【０１１４】
１９６７〜６８年の汎流行性Ｈ３Ｎ２型に由来するＨＡと、より最近のＨ３亜型（１９９０年以降）に由来するＨＡとを比較すると、最近の亜型では、Ｇｌｕ１９０がＡｓｐに突然変異していることが示される。ヒトＨ３のＡｓｐ１９０がこれらのグリカンと好ましく相互作用するように位置しているため、この突然変異は、ヒトＨ３のα２‐６シアル酸含有グリカンに対する結合をさらに強化する。この構造的含意は、ヒトＨ３亜型（Ａ／Ｍｏｓｃｏｗ／１０／１９９９）に関するグリカンアレイデータのデータマイニング解析によりさらに確認される。このＨＡは、Ａｓｐ１９０、Ｌｅｕ２２６、およびＳｅｒ２２８を含み（図１０）、α２‐６シアル酸含有グリカンに強い優先性を示す（表７）。
【０１１５】
上記の観察は、α２‐６シアル酸含有グリカンに結合するＨ１型およびＨ３型ＨＡ間の差違だけでなく類似性も両方とも強調する。Ｈ１型およびＨ３型ＨＡの両方において、Ａｓｐ１９０およびＳｅｒ／Ａｓｎ１９３は、Ｎｅｕ５Ａｃα２‐６Ｇａｌモチーフを越えた単糖と好ましい接触をするように位置する（図１５、パネルＡ、Ｂ）。アミノ酸およびそれらとα２‐６シアル酸含有グリカンとの接触における、Ｈ１型ＨＡとＨ３型ＨＡとの違いは、性をこれらのグリカンを結合するための特徴的な表面補完性およびイオン補完を提供する。Ｎｅｕ５Ａｃα２‐６Ｇａｌ結合は、Ｎｅｕ５Ａｃα２‐３Ｇａｌに比べて追加的なコンフォメーションの自由度を有する。したがって、α２‐６シアル酸含有グリカンに結合するＨＡは、このコンフォメーション自由度を収容するためにより開放的な結合ポケットを有する。ヒトＨ３型ＨＡのＬｅｕ２２６は、Ｎｅｕ５Ａｃα２‐６Ｇａｌとの至適なファンデルワールス接触をもたらすように位置しているが、Ｈ１型ＨＡのＧｌｎ２２６によりこのモチーフにもたらされるイオン性接触は、それほど至適ではない。その一方で、Ｈ１においては、アミノ酸Ｌｙｓ２２２およびＡｓｐ２２５は、Ｈ３のＴｒｐ２２２およびＧｌｙ２２５と比較して、より至適なイオン性接触をα２‐６シアル酸含有グリカンにもたらす。
【０１１６】
α２‐６シアル酸含有グリカンに対する、野生型および突然変異体Ｈ５型ＨＡの結合についての構造的制約
Ｈ１型およびＨ３型ＨＡの異なるアミノ酸によりもたらされるα２‐６シアル酸含有グリカンとの相互作用は、現在のトリＨ５Ｎ１型ＨＡが、そのグリカン受容体特異性を逆転するために、Ｈ１様またはＨ３様グリカン結合部位に変異し得ることを示唆した。上記の枠組みに基づき、Ｈ５型ＨＡについての仮想的なＨ１様およびＨ３様突然変異を、下記で考察したようにさらに詳述し、試験した。
【０１１７】
スーパーインポーズされたＡＳＩ３０＿Ｈ１＿２６、ＡＰＲ３４＿Ｈ１＿２６、ＡＤＳ９７＿Ｈ５＿２６、およびＶｉｅｔ０４＿Ｈ５構造の解析は、α２‐６シアル酸含有グリカンに対する、Ｈ５型ＨＡのＨ１様結合に関する洞察をもたらした。Ｈ１型およびＨ５型ＨＡは同一の構造クレードに属するため、それらのグリカン結合部位は、類似のトポロジーおよびアミノ酸分布を共有する（Ｒｕｓｓｅｌｌら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３２５：２８７，２００４）。トリＨ５型ＨＡに高度に保存されているＬｙｓ２２２は、Ｈ１型ＨＡの類似性Ｌｙｓと同様に、Ｎｅｕ５Ａｃα２‐６ＧａｌモチーフのＧａｌに至適な接触をもたらすように位置する。Ｖｉｅｔ０４＿Ｈ５のＧｌｕ１９０およびＧｌｙ２２５（Ｈ１のＡｓｐ１９０およびＡｓｐ２２５の代わり）は、Ｈ１と同様に、Ｎｅｕ５Ａｃα２‐６Ｇａｌβ１‐４ＧｌｃＮＡｃモチーフに必要な接触をもたらさない。したがって、Ｈ５型ＨＡのＧｌｕ１９０ＡｓｐおよびＧｌｙ２２５Ａｓｐ突然変異は、α２‐６シアル酸含有グリカンとの接触を、潜在的に改善し得る。
【０１１８】
Ｎｅｕ５Ａｃα２‐６Ｇａｌβ１‐４ＧｌｃＮＡｃβ１‐３Ｇａｌβ１‐４Ｇｌｃオリゴ糖のＧｌｃＮＡｃを越える相互作用、ならびにＨ１型およびＨ５型ＨＡのグリカン結合ポケットを解析すると、Ｈ１型ＨＡのＳｅｒ／Ａｓｎ１９３は最後から二番目のＧａｌとの好ましい接触をもたらすが、Ｈ５の類似性Ｌｙｓ１９３は、ＧｌｃＮＡｃβ１‐３Ｇａｌモチーフとの好ましくない立体重複を有することが示された。したがって、Ｌｙｓ１９３Ｓｅｒ突然変異は、α２‐６シアル酸含有グリカンとの追加的な好ましい接触を（Ｇｌｕ１９０ＡｓｐおよびＧｌｙ２２５Ａｓｐ突然変異と共に）もたらすことができる。
【０１１９】
Ｈ１型ＨＡに高度に保存されているＧｌｎ２２６は、トリＨ５型ＨＡにも保存されている。Ｇｌｎ２２６がα２‐６シアル酸含有グリカンに対するＨ１型ＨＡの結合に積極的な役割をあまり果たさないとすれば（上記で考察したように）、このアミノ酸がＬｅｕなどの疎水性アミノ酸に突然変異すると、Ｎｅｕ５Ａｃα２‐６ＧａｌモチーフにおけるＧａｌのＣ６原子とのファンデルワールス接触が潜在的に強化され得る。
【０１２０】
ＡＤＵ６３＿Ｈ３＿２６、ＡＡＩ６８＿Ｈ３、ＡＤＳ９７＿Ｈ５＿２６、およびＶｉｅｔ０４＿Ｈ５をスーパーインポーズすると、α２‐６シアル酸含有グリカンに対するＨ５型ＨＡのＨ３様結合についての洞察がもたらされる。このスーパーインポーズは、Ｈ５型およびＨ３型ＨＡのグリカン結合部位を構造的にアラインメントしたが、Ｈ５およびＨ１間の構造的なアラインメントほど良好ではなかった。Ｈ３型ＨＡのＬｅｕ２２６およびＳｅｒ２２８によりそれぞれもたらされるＮｅｕ５α２‐６Ｇａｌモチーフとの好ましいファンデルワールス接触およびイオン性接触は、Ｈ５型ＨＡには存在しなかった（Ｇｌｎ２２６およびＧｌｙ２２８とは）。ヒトＨ３型ＨＡにおいては、Ｌｅｕ２２６およびＳｅｒ２２８がα２‐６シアル酸含有グリカンに対する結合に重要であるとすれば、Ｈ５型ＨＡのＧｌｎ２２６ＬｅｕおよびＧｌｙ２２８Ｓｅｒ突然変異は、潜在的にα２‐６シアル酸含有グリカンとの至適な接触をもたらすことができる。さらに、Ｈ３とＨ５との比較においてでさえ、Ｌｙｓ１９３は、好ましい接触をもたらすように位置しているヒトＨ３型ＨＡのＳｅｒ１９３に比べて、Ｎｅｕ５Ａｃα２‐６Ｇａｌモチーフを越えた単糖との好ましくない立体接触を有するように位置している。１９６７〜６８年の汎流行性Ｈ３Ｎ２型に由来するＨＡはＧｌｕ１９０を含むが、Ｈ５型ＨＡのＡｓｐ１９０は、より長いオリゴ糖のＮｅｕ５Ａｃα２‐６Ｇａｌモチーフとのより良好なイオン性接触をもたらすように位置する。
【０１２１】
上述の残基の役割は、野生型および突然変異型のＶｉｅｔ０４＿Ｈ５についてのグリカンアレイデータのデータマイニング解析により、さらに確認された（表７）。二重突然変異体、Ｇｌｕ１９０Ａｓｐ／Ｇｌｙ２２５Ａｓｐは、α２‐３シアル酸含有グリカンを結合するためのアミノ酸Ｇｌｕ１９０を欠如し、α２‐６シアル酸含有グリカンに結合するためのＬｙｓ１９３に由来する立体障害を有するため、任意のグリカン構造物とも結合しない。同様に、二重突然変異体、Ｇｌｎ２２６Ｌｅｕ／Ｇｌｙ２２８Ｓｅｒは、幾つかのα２‐３シアル酸含有グリカンに結合するが（α２‐３タイプＢ分類指標）、たった１つの二分岐α２‐６シアル酸含有グリカンにしか結合しない（α２‐６タイプＡ分類指標）。
【０１２２】
二分岐α２‐６シアル酸含有グリカンに対するこの結合を解析すると、このグリカンのＮｅｕ５Ａｃα２‐６Ｇａｌ結合は、接触がより少ないにもかかわらず、伸長型コンフォメーションで二重突然変異体に潜在的に結合できることが示された（図１６）。さらに、Ｍａｌα１‐３Ｍａｎ分岐部のＮｅｕ５Ａｃα２‐６Ｇａｌは、Ｈ５型ＨＡのグリカン結合部位との好ましくない立体接触を有するＭａｎα１‐６Ｍａｎ分岐部の同一モチーフと比較して、より好ましく結合する（図１６）。Ｇｌｎ２２６Ｌｅｕ／Ｇｌｙ２２８Ｓｅｒ二重突然変異体の、α２‐６シアル酸含有グリカンに対する特異性が限られていることは、Ｌｙｓ１９３が結合を妨害することと一致する。
【０１２３】
任意の特定の理論により束縛されることは望まないが、本発明者らは、インフルエンザＡ型ウイルスＨＡのヒト適応に必要な条件は、長鎖α２‐６（支配的にヒト上気道で発現される）に高親和性で結合する能力を獲得することであると提唱する。例えば、グリカン多様性の一態様は、シアル酸でキャッピングされるラクトサミン分岐部の長さである。これは、データマイニング解析から導出されたα２‐６シアル酸含有グリカンの２つの明確な特徴により捕捉される（表７）。１つの特徴は、Ｎ結合コアのＭａｎに結合するＮｅｕ５Ａｃα２‐６Ｇａｌβ１‐４ＧｌｃＮＡｃにより特徴付けられ、もう１つは、より長い分岐部（典型的には傘形トポロジーをとる）を形成する別のラクトースアミン単位に結合するこのモチーフにより特徴付けられる。したがって、上気道に対する突然変異体Ｈ５型ＨＡの広範な結合は、これらの突然変異体が、傘形トポロジーをとる長鎖α２‐６を有するグリカンに高親和性で結合する場合のみ可能であり得る。例えば、本発明によれば、望ましい結合パターンは、図９に示す傘形グリカンに対する結合を含む。
【０１２４】
対照的に、発明者らは、修飾Ｈ５型ＨＡタンパク質（Ｇｌｙ２２８ＳｅｒおよびＧｌｎ２２６Ｌｅｕ／Ｇｌｙ２２８Ｓｅｒ置換を含む）が、グリカンアレイ上のたった１つの二分岐α２‐６スアリルラクトサミングリカン構造物に対する結合を示したという最近の報告に留意する（Ｓｔｅｖｅｎｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１２：４０４，２００６）。したがって、本明細書において、そのような修飾Ｈ５型ＨＡタンパク質は、ＢＳＨＢ性Ｈ５型ＨＡではない。
【０１２５】
α２‐６シアル酸含有グリカンに対する、野生型および突然変異体Ｈ５型ＨＡの結合
したがって、本発明は、これらのグリカンとヒトＨ１型またはＨ３型ＨＡとの相互作用に基づき、現在のトリＨ５Ｎ１型ＨＡが、α２‐６グリカンに対するその特異性を変更する突然変異を起こし得ることを実証する。Ｇｌｕ１９０Ａｓｐ、Ｌｙｓ１９３Ｓｅｒ、Ｇｌｙ２２５Ａｓｐ、およびＧｌｎ２２６Ｌｅｕ突然変異（「ＤＳＤＬ突然変異体」）は、Ｈ５型ＨＡ結合部位をヒトＨ１型ＨＡの結合部位に類似させることが潜在的に可能である一方、Ｇｌｕ１９０Ａｓｐ、Ｌｙｓ１９３Ｓｅｒ、Ｇｌｎ２２６Ｌｅｕ、およびＧｌｙ２２８Ｓｅｒ（「ＤＳＬＳ突然変異体」）は、α２‐６シアル酸含有グリカンとの至適な相互作用のために、Ｈ５型ＨＡ結合部位をヒトＨ３型ＨＡの結合部位に類似させることが潜在的に可能である。ＤＳＤＬ性およびＤＳＬＳ性Ｈ５型ＨＡ突然変異体を設計し、上記の枠組みに基づき試験した。野生型および突然変異体ＢＳＨＢ性Ｈ５型ＨＡは、過去に報告されているようにバキュロウイルスで発現させ、精製した（図１０ＸＸＸＹ）。
【０１２６】
発明者らは、α２‐３シアル酸含有グリカンに対するトリＨ５型ＨＡの結合と一致して、組換え野生型Ｈ５型ＨＡのみが肺胞領域に広範に結合し、気管または気管支には結合するとしてもほんのわずかしか結合しないことを見出した。対照的に、ＤＳＬＳ突然変異体（Ｈ３様）だけが上気道の気管および気管支組織に結合し、さらにこの突然変異体は、肺深部の肺胞組織に結合しない。
【０１２７】
組織結合実験の場合、組織切片を脱パラフィンし、再水和し、ＷＴおよび突然変異体ＨＡタンパク質（ＰＢＳで希釈）と共に３時間にわたってインキュベートした。精製後の所定ロットのタンパク質濃度に基づき、１：１０〜１：１００の範囲の適切な連続希釈が試験された。ＰＢＳで入念に洗浄した後、切片を２％ＢＳＡ‐ＰＢＳで３０分間ブロッキングし、次にウサギ抗トリＨ５Ｎ１型赤血球凝集素抗体（Ｐｒｏ‐Ｓｃｉ  Ｉｎｃ、２％ＢＳＡ‐ＰＢＳ中で１：１０００）で３時間インキュベートした。ＰＢＳで切片を洗浄し、次にヤギ抗ウサギ２次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；２％ＢＳＡ‐ＰＢＳ中で１：５００）で９０分間インキュベートした。ヨウ化プロピジウムで切片を対比染色（赤色；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ＰＢＳ中で１：２００）した後、共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０レーザー走査型共焦点顕微鏡）で観察した。インキュベーションはすべて室温であった。
【０１２８】
発明者らの枠組みに基づき、ＤＳＤＬおよびＤＳＬＳ突然変異の両方が、上気道のα２‐６シアル酸含有グリカンに広範に結合すると予想されたことを考慮すると、ＤＳＤＬ型ではなくＤＳＬＳ型のＨ５型ＨＡが、気管および気管支切片に結合した（しかし肺胞には結合しなかった）という観察は興味深い。これらの両突然変異体においてＬｙｓ１９３がＳｅｒ１９３に換わると、Ｌｙｓ１９３（野生型Ｈ５型ＨＡの）により課された立体障害が取り除かれ、両突然変異体にα２‐６シアル酸含有グリカンへの幅広い特異性をもたらす。さらに、Ｈ５およびＨ１が同一の構造クレードに属することを考慮すると、Ｈ５型ＨＡがＨ１様グリカン結合部位に変異する可能性はより高い。
【０１２９】
ＤＳＤＬ突然変異体がα２‐６シアル酸含有グリカンに結合不能であることをさらに理解するために、ＡＳＩ３０＿Ｈ１＿２６およびＡＰＲ３４＿Ｈ１＿２６結晶構造とさらにスーパーインポーズされたＶｉｅｔ０４＿Ｈ５結晶構造上にこの突然変異をマッピングした。このマッピングは、α２‐６シアル酸含有オリゴ糖との接触が全て、Ｈ１型ＨＡおよびＤＳＤＬ突然変異体間で保存されていることを示した。しかしながら、トリＨ５型ＨＡに高度に保存されているＡｐｓ１８７は、ＤＳＤＬ突然変異体のＡｓｐ１９０に緊密に近接していた。３つのアスパラギン酸（Ａｓｐ１８７、Ａｓｐ１９０、およびＡｓｐ２２５）の存在は、ＤＳＤＬ突然変異体のｐＩが（ＷＴおよびＤＳＬＳ突然変異体の７．３と比較して）６．８であることをさらに説明した。Ａｓｐ１８７およびＡｓｐ１９０間の相互作用は、Ｈ３型ＨＡにおけるＳｅｒ２２８のＧｌｕ１９０に対する影響と同様に、Ａｓｐ１９０のコンフォメーションを潜在的に変化させ得る。１８７位のアミノ酸がＡｓｐ１９０に近接することの影響は、α２‐６シアル酸含有グリカンと比べてα２‐３シアル酸含有グリカンと相互作用するＡＳＩ３０＿Ｈ１のＴｈｒ１８７のＳＡＳＡの差からも明白である。Ａｓｐ１９０が、Ｈ１型ＨＡのα２‐６シアル酸含有グリカンとの至適な接触の形成に関与するとすれば、Ａｓｐ１８７のＡｓｐ１９０に対する影響は、潜在的にこの相互作用を破壊できる。恐らくは、Ｈ１型ＨＡに高度に保存されているＧｌｎ２２６がＤＳＤＬ突然変異体のＬｅｕに突然変異すると、この突然変異体のＨＡ結合部位の環境が他のＨ１様突然変異との関連で影響を受け、α２‐６シアル酸含有グリカンに対する結合にはそれほど至適ではなくなった。
【０１３０】
Ｇｌｎ２２６を保持するＧｌｕ１９０Ａｓｐ／Ｌｙｓ１９３ＳｅｒまたはＤＳ突然変異体を使用して、Ｈ５型ＨＡのＨ１様結合におけるＧｌｎ２２６の役割をさらに試験した。ＤＳ突然変異体の肺深部組織に対する結合の欠如は、（Ｇｌｕ１９０Ａｓｐ突然変異による）α２‐３シアル酸含有グリカンに対する結合の喪失と一致している。同様に、この突然変異体の上気道組織に対する結合の欠如は、この突然変異のα２‐６シアル酸含有グリカンに対する結合を低下させ得る、Ａｓｐ１８７のＡｓｐ１９０に対する破壊的な影響をさらに支援する。したがって、現在のトリＨ５Ｎ１型ＨＡの突然変異は、α２‐６シアル酸含有グリカンに幅広い特異性を有するＨ３様グリカン結合部位をもたらすことを好む（Ｈ１様と比較して）。
【０１３１】
ＤＳＬＳ突然変異体の肺上部に対する結合は、上気道のα２‐６シアル酸含有グリカンの多様性に関する疑問を提起する。ヒト気管支上皮（ＨＢＥ）細胞のレクチン染色は、これらの細胞が、Ｎ結合、Ｏ結合、および糖脂質などの様々なα２‐６シアル酸含有グリカンに豊富であることを示す（図１８）。これらのα２‐６シアル酸含有グリカンの多様性は、ＨＢＥ細胞の細胞表面からＮ結合グリカンを単離し、ＭＡＬＤＩ‐ＭＳ解析を使用してそれらを特徴付けることにより、さらに詳説した。
【０１３２】
具体的には、１００ｍＭのクエン酸緩衝生理食塩水で＞９０％集密的になった際に、約７０×１０６の１６ＨＢＥ１４ｏ‐細胞（Ｄ．Ｃ．Ｇｒｕｅｎｅｒｔ博士提供；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）を回収し、プロテアーゼ阻害剤（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）で処理し均質化した後で、細胞膜を単離した。ＰＮＧａｓｅＦ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で細胞膜画分を処理し、反応混合液を３７℃で終夜インキュベートした。酵素を失活させるために反応混合液を１０分間煮沸し、Ｓｅｐ‐Ｐａｋ  Ｃ１８  ＳＰＥカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ）を使用して、脱グリコシル化されたペプチドおよびタンパク質を取り除いた。さらにグリカンを脱塩し、黒鉛化炭素の固相抽出カラム（Ｓｕｐｅｌｃｏ）を使用して、中性（２５％アセトニトリル画分）および酸性（０．０５％のトリフルオロ酢酸を含む５０％アセトニトリル）画分へと精製した。酸性画分（シアル酸含有グリカンを含む）は、ソフトイオン化条件で陰イオンモードのＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ  ＭＳで解析した（加速電圧２２ｋＶ、グリッド電圧９３％、ガイドワイヤー０．３％、および１５０ｎｓの抽出遅延時間）。代表的な質量ピークのこのＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ‐ＴＯＦ断片解析は、Ｎ結合グリカンの分岐パターンおよび分岐鎖長の増加の点での多様性を例証した。グリカン特性で観察されたより高次の分岐に比べてより長い分岐鎖長は、Ｈ５型ＨＡのこれらのグリカンに対する結合に影響を及ぼすことができる。
【０１３３】
例えば、グリカン多様性の一態様は、シアル酸でキャッピングされるラクトサミン分岐部の長さである。これは、データマイニング解析から導出されたα２‐６シアル酸含有グリカンの２つの明確な特徴により捕捉される（表７）。１つの特徴は、Ｎ結合コアのＭａｎに結合するＮｅｕ５Ａｃα２‐６Ｇａｌβ１‐４ＧｌｃＮＡｃにより特徴付けられ、もう１つは、より長い分岐部を形成する別のラクトースアミン単位に結合するこのモチーフにより特徴付けられる。したがって、突然変異体Ｈ５型ＨＡの上気道に対する広範な結合は、これらの突然変異体がα２‐６シアル酸含有グリカンに対する幅広い結合特異性を有する場合のみ可能である。例えば、本発明によれば、望ましい結合パターンには、図９に示すものならびに／あるいは：
【０１３４】
【化２】
2010501074.tif 000009
が含まれる。
【０１３５】
対照的に、発明者らは、修飾Ｈ５型ＨＡタンパク質（Ｇｌｙ２２８ＳｅｒおよびＧｌｎ２２６Ｌｅｕ／Ｇｌｙ２２８Ｓｅｒ置換を含む）が、グリカンアレイ上のたった１つの二分岐α２‐６スアリルラクトサミングリカン構造物に対する結合を示したという最近の報告に留意する（Ｓｔｅｖｅｎｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１２：４０４，２００６）。したがって、本明細書において、そのような修飾Ｈ５型ＨＡタンパク質は、ＢＳＨＢ性Ｈ５型ＨＡではない。
【０１３６】
等価物
当業者であれば、単なる定常的な実験法を使用して、本明細書に記載した本発明の特定の実施形態に対する多数の等価物を認識または確認できよう。本発明の範囲は、上記の明細書に限定されることを意図するものではなく、むしろ以下の特許請求の範囲に記載した通りである。
【０１３７】
【表６】
2010501074.tif 000010
【０１３８】
【表７−１】
2010501074.tif 000011
【０１３９】
【表７−２】
2010501074.tif 000012
【０１４０】
【表７−３】
2010501074.tif 000013
【図１】
2010501074.tif 000014
【図２】
2010501074.tif 000015
【図３】
2010501074.tif 000016
【図４】
2010501074.tif 000017
【図５】
2010501074.tif 000018
【図５Ａ】
2010501074.tif 000019
【図５Ｂ】
2010501074.tif 000020
【図５Ｃ】
2010501074.tif 000021
【図６】
2010501074.tif 000022
【図７】
2010501074.tif 000023
【図８】
2010501074.tif 000024
【図９】
2010501074.tif 000025
【図１０−１】
2010501074.tif 000026
【図１０−２】
2010501074.tif 000027
【図１１】
2010501074.tif 000028
【図１１Ａ】
2010501074.tif 000029
【図１１Ｂ】
2010501074.tif 000030
【図１２】
2010501074.tif 000031
【図１２Ａ】
2010501074.tif 000032
【図１２Ｂ】
2010501074.tif 000033
【図１３Ａ】
2010501074.tif 000034
【図１３Ａ−１】
2010501074.tif 000035
【図１３Ａ−２】
2010501074.tif 000036
【図１３−４】
2010501074.tif 000037
【図１３−５】
2010501074.tif 000038
【図１３−６】
2010501074.tif 000039
【図１３−７】
2010501074.tif 000040
【図１３−８】
2010501074.tif 000041
【図１３−９】
2010501074.tif 000042
【図１４】
2010501074.tif 000043
【図１５Ａ】
2010501074.tif 000044
【図１５Ｂ】
2010501074.tif 000045
【図１５Ｃ】
2010501074.tif 000046
【図１５Ｄ】
2010501074.tif 000047
【図１５Ｅ】
2010501074.tif 000048
【図１６】
2010501074.tif 000049
【図１７】
2010501074.tif 000050
【図１８】
2010501074.tif 000051
【図１９】
2010501074.tif 000052
【配列表】
2010501074000001.app
【国際調査報告】
2010501074.tif 000053
2010501074.tif 000054
2010501074.tif 000055