(57)【要約】精子をアデノシン５’−三リン酸に接触させることを含む、哺乳動物の精子の受精能を増強する方法、およびこの方法で処理した精子を用いた受精の方法が提供される。本発明は、ヒト精子無力症被験体由来の精子を、アデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）にインビトロで曝露させることは、精子の動きの進行速度および直線性を両方増強することを見出した。一局面において、本発明は、精子を細胞外ＡＴＰに接触させることによって、精子の運動性を増強する方法、およびＡＴＰで処理した精子を用いた人工授精および体外受精（ＩＶＦ）の方法を特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の精子の運動性を増強する方法であって、該方法は、哺乳動物被験体由来の精子と細胞外アデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）とを接触させる工程を包含する、方法。
【請求項２】
前記接触させる工程の前に、前記哺乳動物被験体由来の複数の精子が、運動性が低下しているとして特定されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記哺乳動物被験体がヒト被験体である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記哺乳動物被験体がウマ被験体である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記接触させる工程が、前記ＡＴＰが溶解された生理学的な培地において前記精子を培養する工程を包含する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記接触させる工程が、約１０分間〜約１２０分間である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記接触させる工程は、約６０分間である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記接触させる工程の開始時に、細胞外ＡＴＰの濃度が約１００ｕＭ〜約５ｍＭである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記接触させる工程の開始時に、細胞外ＡＴＰの濃度が約２．５ｍＭである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記接触させる工程が約１８℃〜約３７℃においてである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記接触させる工程が約３７℃においてである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記接触させる工程の前に、前記精子が、精漿から実質的に分離される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記接触させる工程の後に、前記精子の運動性が評価される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記接触させる工程が哺乳動物のメスの生殖器系で行われる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記哺乳動物のメスがヒトである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記哺乳動物のメスがウマ被験体である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
哺乳動物の卵を受精させる方法であって、該方法は、哺乳動物の卵と、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法を受けた哺乳動物の精子とを接触させる工程を包含する、方法。
【請求項１８】
前記哺乳動物の卵の接触させる工程がインビトロで行われる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記哺乳動物の卵の接触させる工程、そして接触された卵が受精され、胚になった後で、該哺乳動物の卵が、哺乳動物の子宮内に配置される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記哺乳動物の卵の接触させる工程がインビボで行われる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記哺乳動物の卵の接触させる工程が、メスの生殖器系で行われる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記哺乳動物の精子がヒトの精子であり、前記哺乳動物の卵がヒトの卵である、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記哺乳動物の精子がウマの精子であり、前記哺乳動物の卵がウマの卵である、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記精子が精子無力症の被験体から取得される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記精子が精子無力症の被験体から取得される、請求項１７〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、精子の運動性、そしてより詳しくは、精子の運動性を増強する方法に関連する。
【背景技術】
【０００２】
不適切な精子の運動性は、オス哺乳動物（例えばヒト）不妊症のよくある原因である。したがって、精子の運動性を増強する、簡単で、無毒性の方法は、そのような不妊症の高度に望ましい治療を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本発明は、ヒト精子無力症被験体由来の精子を、アデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）にインビトロで曝露させることは、精子の動きの進行速度および直線性を両方増強することを見出した。従って、本発明は、精子を細胞外ＡＴＰに接触させることによって、精子の運動性を増強する方法、およびＡＴＰで処理した精子を用いた人工授精および体外受精（ＩＶＦ）の方法を特徴とする。
【０００４】
より具体的には、本発明は、哺乳動物の精子の運動性を増強する方法を提供する。その方法は、哺乳動物被験体由来の精子を、細胞外アデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）と接触させることを含む。接触の前に、哺乳動物被験体由来の複数の精子を、減少した運動性を有するとして特定し得る。その哺乳動物被験体は、例えばヒト被験体またはウマ被験体であり得る。その精子を、精子無力症被験体から得ることができる。その接触は、精子を、ＡＴＰが溶解された生理学的な培地で培養することを含み得る。さらに、その接触は、約１０分から約１２０分、例えば約６０分間であり得る。接触の開始時の細胞外ＡＴＰの濃度は、約１００μＭから約５ｍＭ、例えば約２．５ｍＭであり得る。その接触は、約１８℃から約３７℃、例えば約３７℃であり得る。接触の前に、精子を精漿から実質的に分離し得る。接触の後、精子の運動性を評価し得る。さらに、その接触は、哺乳動物のメス生殖器系で起こり得、そしてこの哺乳動物のメスはヒトまたはウマ被験体であり得る。
【０００５】
本発明はまた、哺乳動物の卵を受精させる方法を特徴とする。その方法は、哺乳動物の卵を、哺乳動物の精子の運動性を増強する上記で記載された方法を受けた哺乳動物の精子と接触させることを含む。哺乳動物の卵の接触は、インビトロで起こり得る、そして哺乳動物の卵の接触、および接触した卵が受精し、そして胚になった後、哺乳動物の卵を哺乳動物子宮に配置され得る。あるいは、哺乳動物の卵の接触は、インビボで、例えばメス生殖器系で起こり得る。その哺乳動物の精子はヒト精子であり得、そしてその哺乳動物の卵はヒト卵であり得る。それに加えて、その哺乳動物の精子はウマ精子であり得、そしてその哺乳動物の卵はウマ卵であり得る。その精子は、精子無力症被験体から得たものであり得る。
【０００６】
本明細書中で使用される場合、「ＡＴＰ」という用語は、アデノシン５’−三リン酸を指す。それは酸形態、ならびに、制限無しに、アデノシン５’−三リン酸ビス（トリス）塩二水和物（５’−ＡＴＰ−Ｂｉｓ（ＴＲＩＳ））；アデノシン５’−三リン酸二カリウム塩二水和物（５’−ＡＴＰ−Ｋ２）；アデノシン５’−三リン酸二ナトリウム塩（ＡＴＰ二ナトリウム塩）；アデノシン５’−三リン酸二ナトリウム塩水和物（ＡＴＰ二ナトリウム水和物）；アデノシン５’−三リン酸マグネシウム塩（ＡＴＰマグネシウム塩）のような塩；およびアデノシン５’−（３−チオ三リン酸）四リチウム塩（ＡＴＰγＳ）およびアデノシン５’−（β，γ−イミド）三リン酸四リチウム塩（ＡｐｐＮＨｐ、ＡＭＰ−ＰＮＰ）のような加水分解抵抗性ＡＴＰアナログを含む。
【０００７】
本明細書中で記載された本発明の全ての方法において、ＡＴＰをウリジン−５’−三リン酸（ＵＴＰ）（ＡＴＰに関して上記で列挙したものに対応する化学的な形態を含む）で置換し得ることが理解される。
【０００８】
「精子（ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏｏｎ）」および「精子（ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ）」という用語は、本明細書中で「精子（ｓｐｅｒｍ）」という用語と交換可能に使用される。
【０００９】
他に定義されなければ、本明細書中で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。対立する場合には、定義を含めて本文書が支配する。好ましい方法および材料を下記で記載するが、本明細書中で記載されたものと同様の、または同等の方法および材料を、本発明の実施または試験において使用し得る。本明細書中で述べられた全ての出版物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全体として参考文献に組み込まれる。本明細書中で開示された材料、方法、および実施例は、説明のためのみであり、そして制限することを意図しない。
【００１０】
本発明の他の特徴および利点、例えば精子の運動性の増強は、以下の説明から、図面から、および請求から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、自動化細胞運動性分析器を用いて観察された、運動性の精子がとった軌跡の図式的な表示である。ＶＳＬ、ＶＣＬ、ＡＬＨ、ＶＡＰ、メジアン軌道、曲線軌道、および直線運動という用語は、図で説明される。
【図２Ａ】図２は、細胞外ＡＴＰありまたは無しで、１時間インキュベートした、精子（２７人の精子無力症の男性ヒト被験体由来）の、平均直線速度（ＶＳＬ）（図２Ａ）、平均曲線速度（ＶＣＬ）（図２Ｂ）、平均直線性（ＬＩＮ）（図２Ｃ）、および側方頭部変位（ｌａｔｅｒａｌ  ｈｅａｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）（ＡＬＨ）（図２Ｄ）を示す一連の棒グラフである。示したＰ値は、標準偏差からスチューデントｔ検定によって決定した。
【図２Ｂ】図２は、細胞外ＡＴＰありまたは無しで、１時間インキュベートした、精子（２７人の精子無力症の男性ヒト被験体由来）の、平均直線速度（ＶＳＬ）（図２Ａ）、平均曲線速度（ＶＣＬ）（図２Ｂ）、平均直線性（ＬＩＮ）（図２Ｃ）、および側方頭部変位（ＡＬＨ）（図２Ｄ）を示す一連の棒グラフである。示したＰ値は、標準偏差からスチューデントｔ検定によって決定した。
【図２Ｃ】図２は、細胞外ＡＴＰありまたは無しで、１時間インキュベートした、精子（２７人の精子無力症の男性ヒト被験体由来）の、平均直線速度（ＶＳＬ）（図２Ａ）、平均曲線速度（ＶＣＬ）（図２Ｂ）、平均直線性（ＬＩＮ）（図２Ｃ）、および側方頭部変位（ＡＬＨ）（図２Ｄ）を示す一連の棒グラフである。示したＰ値は、標準偏差からスチューデントｔ検定によって決定した。
【図２Ｄ】図２は、細胞外ＡＴＰありまたは無しで、１時間インキュベートした、精子（２７人の精子無力症の男性ヒト被験体由来）の、平均直線速度（ＶＳＬ）（図２Ａ）、平均曲線速度（ＶＣＬ）（図２Ｂ）、平均直線性（ＬＩＮ）（図２Ｃ）、および側方頭部変位（ＡＬＨ）（図２Ｄ）を示す一連の棒グラフである。示したＰ値は、標準偏差からスチューデントｔ検定によって決定した。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
部分的には、上記で記載した発明者らの発見に基づいて、この文書は、哺乳動物の精子の運動性を増強する方法、およびそのような精子を用いた哺乳動物の受精の方法を提供する。
【００１３】
哺乳動物の精子の運動性を増強する方法
哺乳動物の精子の運動性を増強する方法を提供する。本方法は、哺乳動物被験体由来の精子を、細胞外ＡＴＰの供給源と接触させることを含む。精子を、オス被験体によって射精された精液の成分としてを含む、当該分野で公知の方法によって、関連する種のオス被験体から得る。あるいは、精子を、そのようなオス被験体の精管、精巣上体、または精巣から吸引によって除去し得る。精液を、好ましくは射精を控えて一定の期間（例えば６時間、１２時間、１日、２日、３日、４日、５日、７日、１０日、１２日、１４日またはより長く）の後に得る。精子のＡＴＰとの接触が、実質的に精液を含まない溶液（例えば培地）中で起こるように、ＡＴＰとの接触の前に、精子を任意で標準的手順（例えば実施例１において記載されるもののような）によって洗浄し得る。本明細書中で使用される場合、「実質的に精液を含まない」は、その精子が得られた精液中にある精液由来の成分（例えばタンパク質、脂質、または核酸）の１０％未満（例えば８％未満；６％未満；４％未満；２％未満；１％未満；０．１％未満；または０．００１％未満）、を含むことを意味する。
【００１４】
上記哺乳動物オス被験体は、ヒト（例えばヒト患者）、非ヒト霊長類（例えばサル、ゴリラ、またはチンパンジー）、ウマ被験体（例えばウマ、ロバ、またはシマウマ）、ブタ、ヤギ、ウシ動物（例えば雄ウシ）、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ハムスター、スナネズミ、ラット、またはマウスを含む、あらゆる哺乳動物であり得る。
【００１５】
一般的に、哺乳動物被験体は、その精子が通常より低い直線速度（進行速度）を有し、そして従って比較的不妊であるものである。本明細書中で使用される場合、「正常な直線速度」は、その種の繁殖性のオス被験体（すなわち、精子がその精子と同じ種の卵と受精する能力が明らかに損なわれていない被験体）由来の精子によって示される直線速度である。しかし、その方法を、明らかに全体的に正常な被験体、例えばその精子は適当な卵と受精する能力が明らかに損なわれていないが、その妊娠の機会を増加させたいと考える被験体由来の精子にも適用し得ることが理解される。
【００１６】
接触の前に、被験体由来の複数の（例えば、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、７０、１００、２００、５００、８００、１０００、２０００、５０００、１００００、またはさらに多くの）精子を、任意で運動性、すなわち正常な、増加した、または減少した運動性に関して試験し得る。この方法において試験する精子は、ＡＴＰと接触させるための精子を得るために使用した同じ精液サンプルから、または被験体由来の精液の別のサンプルから得ることができる。さらに、接触後、接触の効果を試験するために、多くの精子を任意で運動性に関して試験し得る。本明細書中で使用される場合、精子に適用される「運動性」という用語は、直線速度または進行速度を指し、どちらも「ＶＳＬ」という頭字語によって呼ばれる（実施例１を参照のこと）。運動性の代わりに、直線性（すなわち、精子の軌跡の直線性の程度）を、接触の前および後に測定し得る。
【００１７】
上記接触を、インビトロまたはインビボで行い得る。インビトロで行われる場合、精子を、一般的に複数の精子のうちの１つとして、様々な温度のいずれかで（例えば、約１５℃から約３９℃で、約１７℃から約３８℃で、約１８℃から約３７℃で、約３４℃で、約３５℃で、約３６℃で、約３７℃で、または約３８℃で）、生理学的な培地（例えば組織培養培地）中で培養する。これらの温度の文脈において使用される場合、「約」という用語は、その温度が示した温度から２℃まで変動し得ることを示す。生理学的な培地は、哺乳動物の精子が生存したままであり、そしてその受精能力を保持し得るあらゆる培養培地であり得る。適当な培地の例は、ＢＷＷ培地またはダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）を含む。様々な培地添加物のいずれかを、培地に加え得る。そのような添加物は、細菌および殺真菌性抗生物質（例えばペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、および／またはアムホテリシンＢ）および精液ドナーと同じ種であるが異なる個体由来の血清（すなわち同種血清）、精液ドナー由来の血清（すなわち自己血清）、または精液ドナーとは異なる種の１つまたはそれ以上の個体由来の血清（すなわち異種血清）を含む。異種血清は、例えば胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、ウマ血清（例えばウマ血清）、ヤギ血清、ヒツジ血清、またはブタ血清であり得る。組織培養培地に添加するために使用される血清は、好ましくは同種または自己血清である。従って、精液ドナーがヒトである場合、その血清は好ましくはヒト血清であり、そして精液ドナーがウマである場合は、その血清は好ましくはウマ血清である。ヒト血清が使用される場合、それは好ましくはＡＢ血液型を有する１人またはそれ以上の個人由来である。培地添加物として使用される血清をまた、使用の前に抗精子抗体の存在に関してスクリーニングし得る。検出可能なレベルのそのような抗体を含むものは、使用から除かれる。さらなる培地添加物は、様々な非必須または必須アミノ酸（例えばグルタミン）、タンパク質（例えば、ヒトまたはウシ血清アルブミン、インスリン、およびトランスフェリン）、炭水化物（例えばグルコースのような糖）、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、および／または脂質を含む。
【００１８】
好ましくは実質的に精液を除去するために少なくとも１回洗浄した、精子を含む精子のサンプルを、培地と組み合わせる。精子と混合する前に、ＡＴＰを培地に加え得る、または混合の後に加え得る。約１００μＭから約１０ｍＭ、すなわち約１００μＭから約５ｍＭ、約５００μＭから約５ｍＭ、約１ｍＭから約５ｍＭ、約１ｍＭから約２．５ｍＭ、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約２．５ｍＭ、または約３ｍＭの、初期濃度（すなわちＡＴＰ／精子／生理学的溶液混合物のインキュベーション前の濃度）を与えるようにＡＴＰを加える。これらのＡＴＰ濃度の文脈において、「約」という用語は、その濃度は示した値の約１０％まで変動し得ることを示す。使用し得るＡＴＰの化学的な形態は、上記で列挙したもの全てを含む。
【００１９】
精子、ＡＴＰ、および生理学的な培地を混合した後、生じた混合物を、広い範囲の時間のいずれか、例えば約５分から約１８０分、約１０分から約１５０分、約１０分から約１２０分、約２０分から約１２０分、約３０分から９０分、約３０分から約６０分、約１２０分、約９０分、約６０分、または約３０分間、１つまたはそれ以上の上記で列挙した温度でインキュベートする。これらの時間の文脈において、「約」という用語は、その時間が、示した値の２０％まで変動し得ることを示す。インキュベーション後、精子を含む精子の集団を、任意で生理学的溶液、例えば通常の生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、または組織培養培地で洗浄した後、様々な受精手順（下記を参照のこと）のいずれかに使用し得る。
【００２０】
インビボにおいて精子をＡＴＰと接触させることを、ＡＴＰを含む組成物および精子を含む精子のサンプルを、メスの生殖系へ送達することによって達成し得る。従って、例えば、関心のある種のオスおよびメス被験体間の性交の前、または直後に、ＡＴＰを含む組成物を、メス被験体の膣に挿入し得る。あるいは、精液、または実質的に精液を含まないように洗浄した精子を、メス被験体の膣に人工的に注入または注射し得る。一般的に、その組成物を、精子をメス生殖管に送達する前または後、約６０分、約４５分、３０分、２０分、１０分、５分、２分、または１分だけ挿入する。これらの時間の文脈において、「約」という用語は、その時間が示した値の１０％まで変動し得ることを示す。これらの方法において、メス膣に送達された精子は、ＡＴＰと接触する。当然、メスの種は、精子の供給源としての精液のドナーとして上記で列挙した種のいずれかであり得る。精子の供給源であるオス、およびその生殖管に精子が送達されるメスは、一般的に同じ種であるが、必ずしもそうではない。
【００２１】
メス生殖器に送達される（例えば、塗布、注入、または注射によって）ＡＴＰ組成物は、例えば、粉末、顆粒、錠剤、カプセル、トローチ、液体（例えばローション）、ゲル、軟膏、クリーム、またはエマルションの形態であり得る。液体、ゲル、軟膏、クリーム、またはエマルションにおいて、ＡＴＰを溶解し得る、または懸濁物中であり得、そして一般的に精子のＡＴＰとのインビトロ接触に関して上記で列挙した同じ濃度で、組成物中に存在する。その組成物は、典型的にはＡＴＰおよび薬剤学的に許容可能な担体を含む。本明細書中で使用される場合、「薬剤学的に許容可能な担体」は、薬剤学的な投与に適合性の、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤、および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤等を含む。補助的な活性化合物も、組成物に組み込み得る。
【００２２】
上記組成物は、好ましくは滅菌である。それは製造および保存の条件下で安定でなければならず、そして細菌および真菌のような微生物の混入作用に対して保存されなければならない。その担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、および適当なその混合物を含む、溶媒または分散媒であり得る。例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散物の場合には必要な粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤の使用によって、適当な流動性を維持し得る。微生物の活動の防止を、様々な抗菌および抗真菌薬剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等によって達成し得る。多くの場合において、等張剤、例えば糖、マンニトールのようなポリアルコール、ソルビトール、塩化ナトリウムを組成物に含むことが望ましい。粉末の場合、調製の方法は、真空乾燥または凍結乾燥を含み得、それはその溶液から活性成分プラスあらゆるさらなる望ましい成分の粉末を生じる。
【００２３】
上記粉末、顆粒、錠剤、カプセル、およびトローチは、１％から９５％（ｗ／ｗ）の活性化合物を含む。ある実施態様において、その活性化合物は、５％から７０％（ｗ／ｗ）の範囲である。適当な担体は、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、デンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融点ワックス、カカオバター等である。「調製」という用語は、活性化合物の、カプセルを提供する担体としての封入物質との処方物を含むよう意図され、その中で他の担体を含むまたは含まない活性成分は、担体に囲まれ、それは従ってそれと結合する。
【００２４】
水性溶液を、ＡＴＰを水に溶解し、そして適当な着色剤、安定剤、および濃化剤を望ましいように加えることによって調製し得る。水性懸濁物を、細かく分割した活性成分を、天然または合成ゴム、樹脂、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および他の周知の懸濁剤のような、粘性の物質と共に水に分散することによって作製し得る。
【００２５】
上記組成物をまた、（例えばカカオバターおよび他のグリセリドのような従来の坐剤基剤と共に）坐剤の、または膣内送達のための貯留浣腸の形態で調製し得る。
【００２６】
１つの実施態様において、ＡＴＰを、インプラントおよびマイクロカプセル化送達システムを含む徐放性処方物のような、化合物を体からの迅速な排除に対して保護する担体と共に調製する。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸のような、生物分解性、生体適合性のポリマーを使用し得る。そのような処方物を調製する方法は、当業者に明らかである。その材料をまた、Ａｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から市販で入手し得る。リポソーム懸濁物も、薬剤学的に許容可能な担体として使用し得る。これらを、例えば米国特許第４，５２２，８１１号において記載されたような、当業者に公知の方法によって調製し得る。
【００２７】
投与の容易さおよび投与量の均一性のために、組成物を投与量単位形態で処方することが有利であり得る。本明細書中で使用される投与量単位形態は、治療される被験体に関して単位投与量として適当な、物理的に分離した単位を指す；各単位は、必要な薬剤学的担体と共に、望ましい運動性増強効果を生ずるように計算された、前もって決定した量のＡＴＰを含む。投与量単位はまた、使用のための説明書を伴い得る。
【００２８】
この文書は、製造の記事を提供し、それはＡＴＰおよび包装材料および／または精子の運動性を増強する上記で記載した方法のいずれかをどのように行うかについての説明書を含む包装挿入物を含む、容器および／または送達媒体（例えばボトル、バイアル、カプセル、または錠剤）を含む。
【００２９】
受精の方法
上記で示したように、インビトロでＡＴＰに接触させた精子の集団中の精子を、当該分野で公知の様々なＩＶＦおよび人工授精手順のいずれかにおいて使用し得る。そのような手順の例は、Ｈａｌｌら（１９９７）Ｂａｉｌｌｉｅｒｅｓ  Ｃｌｉｎ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎａｅｃｏｌ．１１：７１１−２４；Ｖａｎ  Ｓｔｅｉｒｔｅｇｈｅｍ（１９９４）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．６：１７３−１７７；およびＶａｎ  Ｖｏｏｒｈｉｓ（２００７）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５６：３７９−３８６において詳細に記載され、その開示は本明細書中でその全体として参考文献に組み込まれる。
【００３０】
これらの手順において使用する前に、ＡＴＰを含む生理学的な培地を含まない、または実質的に含まないように、精子を任意で洗浄し得る（しかし必ずしもそうではない）。本明細書中で使用される場合、「ＡＴＰを含む生理学的な培地を実質的に含まない」は、精子のＡＴＰとの接触に使用されたＡＴＰを含む生理学的な培地の１０％未満（例えば８％未満；６％未満；４％未満；２％未満；１％未満；０．１％未満；または０．００１％未満）、を含むことを意味する。
【００３１】
本質において、ＩＶＦ手順は、上記で列挙した種のいずれかのメス被験体由来の卵を、同じ種のいずれかのオス被験体由来であり、そして上記で記載した運動性増強方法を経験した精子とインキュベートすることを含む。インキュベーション後、１つまたはそれ以上の卵の精子進入後に発達した１つまたはそれ以上の胚を、メス被験体（一般的にその被験体は卵がもともと得られた被験体であるが、必ずしもそうではない）の子宮に挿入する。再び、精子のオスドナーおよび卵のメスドナーは、上記で列挙した種のいずれかであり得る。通常、そのオスおよびメスは同じ種であるが、必ずしもそうではない。一般的に、精子による卵の進入の１６−２４時間後、精子および卵の核の融合（すなわち接合体の形成）が存在する。卵の精子進入の約４８時間後、胚、すなわち一般的に２つの細胞を含む構造の形成が存在する。胚をこの段階で、または胚成熟のより後の段階で（卵の精子進入の５日後まで）メス被験体の子宮に移し得る。移動の前に、卵の受精および続く胚形成を、当業者に公知の方法によって試験し得る。
【００３２】
人工授精手順は、例えば、上記で記載した運動性増強手順を経験した精子を、メス被験体の生殖器系（例えば膣および／または子宮）に送達することを含む。この場合、精子がメス被験体によって産生された卵と接触し、そして受精することが期待される。再び、精子のオスドナーおよびメス被験体は、上記で列挙した種のいずれかであり得る。一般的に、そのオスおよびメスは同じ種であるが、必ずしもそうではない。
【００３３】
以下の実施例は、本発明を制限するためではなく、説明するために役立つ。
【実施例】
【００３４】
実施例１．材料および方法
精子の運動性
精子の運動性を、以下のような、世界保健機関（ＷＨＯ）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ［Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（１９９９）  ＷＨＯ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｍｅｎ  ａｎｄ  ｓｐｅｒｍ−ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｍｕｃｕｓ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ、１２８頁。Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、この開示は、その全体が参考として本明細書に援用される］基準によって、ａからｄまでのスケールで格付けした：
グレードａ（速い前進）  直線で速く前進する精子；  
グレードｂ（遅い前進）  精子は前進するが、曲線または曲がった線のいずれかで、または遅く前進する（遅い直線または非直線運動性）；
グレードｃ（非前進）  精子はその尾部を動かすが、前進しない（局所的運動性のみ）；および
グレードｄ（不動）  精子は全く動かない。
【００３５】
「速い」および「遅い」は、精子の調査における操作者の経験に基づいて、サンプルを調査する操作者によって定義された、精子運動の定性的な特徴である。
【００３６】
低いパーセンテージのグレードａおよびｂの運動性、および高いパーセンテージのグレードｃおよびｄは、低い精子受精能力の指標と考えられる。
【００３７】
患者の選択
不妊症のためにＡｎｄｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐａｄｏｖａ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｄｃｒｉｎｏｌｏｇｙ）に来た、他は健康な精子無力症の２７人の男性由来の精子を分析した。本明細書中で使用される場合、「精子無力症の」という用語は、運動性グレードａを有する精子のパーセンテージとグレードｂを有する精子とのパーセンテージが５０％より低い男性被験体を指す。全ての被験体由来の精液サンプルのアリコートの培養は、サンプルの細菌の混入を示さず、そしていずれの被験体の血清においても、抗精子抗体は検出されなかった。
【００３８】
精子の特徴は、以下のようであった：
精子の運動性：％グレードａ＋％グレードｂ（光学顕微鏡によって評価した）＜５０％
精液中の精子濃度：≧２０×１０６／ｍｌ
正常な形態を有する精子：≧３０％
精子生存能：≧５０％  。
【００３９】
実験プロトコール
精液サンプルを、３日間の禁欲後に、滅菌容器に採取した。室温で３０分間液化した後、ＷＨＯ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ［前出］によって、標準的な精液のパラメーターを調査した。
【００４０】
精子運動の分析に関して、精液アリコート（１０μｌ）を、Ｍａｋｌｅｒチャンバーに置き、チャンバーあたり１０個の異なる視野を無作為に調査し、そしてチャンバーの各フィールドに関して少なくとも１００個の精子を評価した。運動性精子のパーセンテージおよび運動の特徴を、３７℃で自動化分析器（ＣｅｌｌＴｒａｃｋ  ＶＰ１１０、Ｍｏｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて分析した。精子の速度および動力学的パラメーターを、運動性の精子のみに関して評価し、そして平均値として表した。標準偏差を計算し、そして有意性のＰ値を、スチューデントｔ検定によって決定した。
【００４１】
以下の精子パラメーターを決定した：
曲線速度（ＶＣＬ）（軌跡速度とも呼ばれ、そして個々の軌跡に沿った精子の速度（μｍ／ｓｅｃ）である；
直線前進速度（ＶＳＬ）（軌跡の最初から終わりまでの直線で測定した平均速度（μｍ／ｓｅｃ））；
側方頭部変位の振幅（ＡＬＨ）（精子頭部振動の平均幅（μｍ）；および
直線性係数（ＬＩＮ＝ＶＳＬ／ＶＣＬ×１００）（精子軌跡の直線性の程度（％））。
【００４２】
これらのパラメーターを、図１で図式的に説明する。図１において、ＶＡＰは、なめらかにした精子の通り道の平均速度を指す（μｍ／ｓｅｃ）。
【００４３】
精子無力症被験体由来の精子の運動性パラメーターに対する、細胞外ＡＴＰの効果を分析するために、被験体由来の精子サンプルを、ＢＷＷ培地（Ｂｉｇｇｅｒｓ−Ｗｈｉｔｔｅｎ−Ｗｈｉｔｔｉｎｇｈａｍ培地；９５ｍＭのＮａＣｌ、４．８ｍＭのＫＣｌ、１．７ｍＭのＣａＣｌ２、１．２ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１．２  ＭｇＳＯ４、２５  ＮａＨＣＯ３、５．６ｍＭのフルクトース、０．２５ｍＭのピルビン酸ナトリウム、３．７ｍｌ／ｌの６０％乳酸ナトリウムシロップ、１０４ＩＵ／ｍｌのペニシリン、および１０ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン）の添加および８００×ｇにおける１０分間の遠心によって１回洗浄した。遠心し、そして上清を捨てた後、精子ペレットをＢＷＷ培地に懸濁し（１０×１０６精子／ｍｌの濃度で）、２つの等価なアリコートに分け、そして１５分間回復させた。次いで１つのアリコートを、３７℃でＡＴＰ（ＡＴＰを生理学的溶液（蒸留水中０．９％のＮａＣｌ）で希釈することによって作製した１００ｍＭのストック溶液から、２．５ｍＭの最終濃度）と共にインキュベートし、そして２番目のアリコートを、３７℃で同じ量の生理学的溶液のみと共にインキュベートした（ネガティブコントロールとして）。６０分のインキュベーション後、精子の運動性パラメーターを、上記で記載したように決定した。
【００４４】
実施例２．細胞外ＡＴＰによる精子無力症被験体由来の精子の処理
精液からの洗浄およびＢＷＷ培地への再懸濁（１０×１０６精子／ｍｌ）後、精子無力症被験体由来の精子の精子の運動性パラメーターに対する細胞外ＡＴＰの効果を調査した。
【００４５】
精子無力症被験体の精子を、２．５ｍＭのＡＴＰ存在下で６０分間インキュベートすることは、前進速度（コントロール２３．８１±６．０４μＭ／ｓｅｃ、ＡＴＰ２８．８５±７．２７μｍ／ｓｅｃ；ｐ＝０．００２４）、および直線性（コントロール２９．５９±６．２５、ＡＴＰ３７．７±７．９；ｐ＝０．０００４）を含む精子の運動性パラメーターを変化させた（図２）。ＡＴＰ処理（２．５ｍＭ）後、曲線速度および側方精子頭部変位（ｌａｔｅｒａｌ  ｓｐｅｒｍ  ｈｅａｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）に対しては、ＡＴＰ処理の有意な効果は観察されなかった。
【００４６】
従って、精子無力症被験体由来の精子のＡＴＰ処理は、精子の運動性の特徴を改善するようである。これらの発見は、どのようにＡＴＰがヒトＩＶＦの成功を改善するかに関する機構的支持を提供し、そして精子インキュベーションの細胞外ＡＴＰへの接触は、有用であり、そして不妊症の無毒性治療であり得ることを示す。
【００４７】
本発明の多くの実施態様が記載された。それにも関わらず、本発明の意図および範囲から離れることなく、様々な修飾を行い得ることが理解される。よって、他の実施態様が以下の請求の範囲内である。
【図１】
2010518876.tif 000002
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
2010518876.tif 000006