(57)【要約】  本発明は、（ａ）（ｉ）疎水性物質と、（ｉｉ）内在性膜タンパク質の膜貫通ドメインの構造アナログであって、一方の末端に１以上の負荷電残基を有する単離されたペプチドとを、水溶液中で混合すること、および（ｂ）該ペプチドが自己凝集して、該疎水性物質を含有するナノ粒子になるようにすることを含む、疎水性物質の処理方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
疎水性物質の処理方法であって、
（ａ）（ｉ）疎水性物質と、（ｉｉ）内在性膜タンパク質の膜貫通ドメインの構造アナログであって、一方の末端に１以上の負荷電残基を有する単離されたペプチドとを、水溶液中で混合すること、および
（ｂ）該ペプチドが自己凝集して、該疎水性物質を含有するナノ粒子になるようにすること
を含む方法。
【請求項２】
内在性膜タンパク質が、Ｇタンパク質共役型レセプターまたはＡＢＣトランスポーターである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
疎水性物質が、抗癌剤である、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
さらに、腫瘍細胞において過剰発現する細胞表面レセプターに特異的に結合するリガンドを該ペプチドに付加することを含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
さらに、ポリエチレングリコール、ウンデカエチレングリコール、ポリグリシンおよびそれらの組み合わせからなる群から選ばれる親水性オリゴマーを、１以上の負荷電残基を含む、該ペプチドの末端に付加することを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ナノ粒子が、約３ｎｍ〜約５０ｎｍの直径を有する、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ナノ粒子が、約８ｎｍ〜約２０ｎｍの直径を有する、請求項６記載の方法。
【請求項８】
ペプチドが、内在性膜タンパク質の膜貫通ドメインのアミノ酸配列と同一である、少なくとも約１０のアミノ酸を含有する、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
ペプチドが、内在性膜タンパク質の膜貫通ドメインのアミノ酸配列と同一である、少なくとも約１５のアミノ酸を含有する、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ペプチドが、内在性膜タンパク質の膜貫通ドメインのアミノ酸配列と同一である、少なくとも約２０のアミノ酸を含有する、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
さらに、（ｃ）該疎水性物質を含む該ナノ粒子を対象に投与することを含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
対象が、ヒトである、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
疎水性物質が、癌細胞の増殖阻害、転移の阻害、血管新生の阻害、癌細胞の薬剤耐性阻害およびそれらの組み合わせからなる群から選ばれる第一の生物活性を有する、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
ナノ粒子が、癌細胞の薬剤耐性阻害、転移の阻害、血管新生の阻害およびそれらの組み合わせからなる群から選ばれる第二の生物活性を有する、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれかに記載の方法により製造されるナノ粒子の組成物。
【請求項１６】
疎水性物質が、抗癌剤である、請求項１５記載の組成物。
【請求項１７】
治療上有効な量の、請求項１６記載の組成物を対象に投与することを含む、該対象における腫瘍成長の阻害方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
疎水性物質を投与したり、ドキソルビシン、ビンクリスチン、アムホテリシン、およびレチノイド類等の抗癌剤の投与に伴う毒性作用を軽減したりするための送達システムとして、リポソームが臨床的にも実験的にも評価されてきている。リポソーム送達の潜在的利点としては、特異的なターゲッティングにより活性が増大すること、標的部位に薬剤を隔離すること、急速な代謝から薬剤を保護すること、各リポソーム内に多くの薬剤分子をパッケージングすることにより治療効果が増幅されること、および薬物動態の改変により毒性が軽減されることが挙げられる。
【０００２】
抗癌剤のリポソーム製剤は、「むき出し」の薬剤と比較して、毒性が軽減され、有効性が増すことが示されている。いくつかのリポソーム剤形の抗癌剤が、ＦＤＡによって抗癌治療を目的として承認されている。しかしながら、リポソームの安定性および再現性の不十分さに加え、リポソーム製造の工業化が困難なことが、リポソームをより広範囲に使用することを妨げている。
【０００３】
リポソームの有利な性質、ならびに優れた安定性、均一性、使いやすさ、および製剤の再現性を示し、またリポソームよりも小さな粒子を提供するという代替的な送達システムが、抗癌剤等の疎水性物質の投与のために必要である。本発明は、そのような送達システムおよびそのシステムの使用方法（例えば、抗癌剤等の疎水性物質の対象への送達）を提供する。本発明のこれらおよび他の目的と利点、ならびに更なる発明の特徴は、本明細書にて提供される本発明の説明から明らかになるであろう。
【０００４】
発明の簡単な要約
本発明は、疎水性物質の処理方法を提供し、該方法は、（ａ）（ｉ）疎水性物質および（ｉｉ）内在性膜タンパク質の膜貫通ドメインの構造アナログであって、一方の末端に１以上の負荷電残基を有する単離されたペプチドを、水溶液中で混合すること、および（ｂ）該ペプチドを自己凝集させて該疎水性物質を含有するナノ粒子にすること、を含む。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】図１は、配列番号１−ＰＥＧ１１（丸で表される）または配列番号１−ＰＥＧ３８（白四角で表される）を含有するナノ粒子の濃度（ｍｇ／ｍｌ）に対する蛍光発光強度（ａ．ｕ．）のグラフである。
【０００６】
【図２】図２は、配列番号１−ＰＥＧ１１（丸で表される）または配列番号１−ＰＥＧ３８（白四角で表される）を含有するナノ粒子の濃度（μＭ）に対する最大波長（ｎｍ）のグラフである。
【０００７】
【図３】図３は、百万個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞を静脈内注射した３群のヌードマウスの処置からの日数に対する生存率（％）のグラフである。乳癌細胞を静脈内注射した翌日および継続して１週間に２回の頻度で、（１）ＰＢＳのみ（コントロール）；（２）ＰＢＳに溶解した配列番号１−ＰＥＧ２７のナノ粒子３ｍｇ／ｋｇ（Ｘ４−４−６，３ｍｇ／ｋｇ）；または（３）ＰＢＳに溶解した配列番号１−ＰＥＧ２７のナノ粒子１２ｍｇ／ｋｇ（Ｘ４−４−６，１２ｍｇ／ｋｇ）を、マウスの腹腔内に注射した。
【０００８】
【図４】図４は、高分解能ＮＭＲによって決定されたナノ粒子中のＣＸＣＲ４ペプチド（配列番号１−ＰＥＧ２７）の構造を表したものである。
【０００９】
発明の詳細な説明
本発明は、抗癌剤等の疎水性物質の送達のための、内在性膜タンパク質の膜貫通（ＴＭ）ドメインからなる自己凝集性ナノ粒子の使用に関する。内在性膜タンパク質の該ＴＭドメインは、従来は疎水性の高いペプチドであると考えられていた（例えば、国際特許出願公開ＷＯ９９／４３７１１およびＷＯ０１／３６４７７、ならびに米国特許第７，１０５，４８８号を参照）。しかしながら、驚くべきことに、水溶液中に存在させた場合には、内在性膜タンパク質のＴＭドメインに対応するペプチドは安定したナノ粒子（ミセル）に自己凝集するということが見出された。
【００１０】
該ナノ粒子は、内在性膜タンパク質のＴＭドメインの構造アナログである単離されたペプチドを自己凝集させてナノ粒子にすることにより形成される。「ＴＭドメインの構造アナログ」（本明細書では、「ＴＭペプチド」と呼ぶ）とは、内在性膜タンパク質のＴＭドメインの部分と同一または実質的に同一であるペプチドをいう。該ＴＭペプチドは、好ましくは、内在性膜タンパク質のＴＭドメインのアミノ酸配列と同一または実質的に同一である、少なくとも約１０（例えば、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、約５０、またはこれらの範囲）のアミノ酸を含有する。「実質的に同一」であるＴＭペプチドは、内在性膜タンパク質のＴＭドメインの部分における１以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはこれらの範囲）の保存的アミノ酸置換を含む。
【００１１】
該ＴＭペプチドは、好ましくは、１以上の負荷電残基（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはこれらの範囲）を有する一の末端を有する。該末端が２以上の負荷電残基を含有する場合は、それらの負荷電残基は連続していることが好ましい。この負電荷は、該ペプチドの一方の末端にアスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基を存在させる（例えば、該残基の付加）などの、任意の適当な方法によって提供され得る。該負電荷を正電荷に置き換えれば、極めて多様な直径を有するもっと大きな粒子を形成することとなる。このように、いかなる特定の理論によっても縛られることを望むものではないが、負荷電残基（例えば、２つのアスパラギン酸残基）の存在が該ナノ粒子の形と大きさを均一にすると考えられる。好ましくは、該負電荷は該ペプチドのＣ末端に存在している。
【００１２】
いかなる特定の理論によっても縛られることを望むものではないが、ＴＭペプチドは水溶液中でβループ構造を形成することによって自己凝集するものと考えられる。該ループは、アミロイド線維におけるアミロイドペプチドと類似した作用機序によって会合する。負電荷および短いＣ末端αヘリックスが屈曲させて、ＴＭペプチドのナノ構造の円形を決定する。ナノ粒子におけるＣＸＣＲ４ペプチドの構造を高分解能ＮＭＲにより描写したものを図４に示す。
【００１３】
好ましくは、該ＴＭペプチドは抗癌剤等の疎水性物質と組み合わされ、該物質は次いで該ナノ粒子の疎水性中心の中に包含される。疎水性物質の該ナノ粒子への封入は、生理的条件下では通常不溶性である疎水性物質（例えば、抗癌剤）の対象への投与を可能とし、該物質は透過性および保持性の効果の増強により腫瘍内に集中する。
【００１４】
したがって、本発明は、疎水性物質の処理方法に関し、該方法は、（ａ）（ｉ）疎水性物質および（ｉｉ）内在性膜タンパク質の膜貫通ドメインの構造アナログであって、一方の末端に１以上の負荷電残基を有する単離されたペプチドを、水溶液中で混合すること、および（ｂ）該ペプチドを自己凝集させて該疎水性物質を含有するナノ粒子にすること、を含む。
【００１５】
ＴＭペプチドはまた、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ウンデカエチレングリコール、ポリスチレン、ポリアミノ酸（例えば、ポリグリシン）、およびこれらの混合物等の親水性オリゴマーを含有することもできる。好ましくは、親水性樹脂は、負電荷を含む同じ末端に付加される。いかなる特定の理論によっても縛られることを望むものではないが、親水性オリゴマーのＴＭペプチドへの付加は凝集を防ぎ、均一な形でかつ、例えば、腫瘍を透過するのに理想的に適合した大きさの粒子の形成を促進すると考えられる。
【００１６】
ＴＭペプチドに付加された該親水性オリゴマーは、任意の適当な長さとすることができる。付加される親水性オリゴマーがＰＥＧである場合は、好ましくはＰＥＧ５またはそれ以上のもの（例えば、ＰＥＧ１０、ＰＥＧ１１、ＰＥＧ１２、ＰＥＧ１５、ＰＥＧ２０、ＰＥＧ２５、ＰＥＧ２７、ＰＥＧ３０、ＰＥＧ３５、ＰＥＧ３８、ＰＥＧ３９、ＰＥＧ４０、ＰＥＧ４５、およびこれらの範囲）が用いられる。理想的には、ＰＥＧは約１２から約２７のモノマー単位から構成される。付加される親水性オリゴマーがポリグリシンである場合は、好ましくは３またはそれ以上（例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、またはこれらの範囲）のポリグリシンが用いられる。理想的には、約１０から約２０残基のポリグリシンが用いられる。特に、同程度の長さにおいては、ポリグリシンテールの方がＰＥＧテールよりも凝集性を低減するのに効果的である。
【００１７】
該ナノ粒子は、任意の適当な直径を有することができる。好ましくは、該ナノ粒子は約３ｎｍから約５０ｎｍ（例えば、約４ｎｍ、約５ｎｍ、約６ｎｍ、約７ｎｍ、約８ｎｍ、約９ｎｍ、約１０ｎｍ、約１１ｎｍ、約１２ｎｍ、約１３ｎｍ、約１４ｎｍ、約１５ｎｍ、約１６ｎｍ、約１７ｎｍ、約１８ｎｍ、約１９ｎｍ、約２０ｎｍ、約２５ｎｍ、約３０ｎｍ、約３５ｎｍ、約４０ｎｍ、約４５ｎｍ、およびこれらの範囲）の直径を有する。さらに好ましくは、該ナノ粒子は約８ｎｍから約２０ｎｍの直径を有する。
【００１８】
該ナノ粒子を形成するＴＭペプチドは、任意の適当な長さとすることができる。好ましくは、該ＴＭペプチドは、長さとして約１０から約５０（例えば、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、またはこれらの範囲）のアミノ酸を含む。より好ましい態様においては、該ＴＭペプチドは約１０から約３０（例えば、約１５から約３０）のアミノ酸長である。いっそう好ましい態様においては、該ＴＭペプチドは約２０から約２５アミノ酸長であり、最も好ましい態様においては、該ＴＭペプチドは約２２から約２５アミノ酸長である。実施例３に示されるように、ナノ粒子の凝集性はＴＭペプチドの長さの減少に応じて低下する。
【００１９】
該ＴＭペプチドは、任意の適当な内在性膜タンパク質の部分であり得る。適当な内在性膜タンパク質の例としては、Ｇタンパク質共役型レセプター（ＧＰＣＲ）ファミリーのメンバー、例えばＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＫＡＲ、ドーパミントランスポーター（ＤＡＴ）、Ｄ１ドーパミンレセプター（Ｄ１ＤＲ）、Ｄ２ドーパミンレセプター、α１−アドレナリンレセプター、β１−アドレナリンレセプター、β２−アドレナリンレセプター、およびＶ２バソプレシンレセプター（例えば、Herbert et al., J. Biol. Chem., 271: 16384-16392 (1996)；George et al., J. Biol. Chem., 273:30244-30248 (1998)；Tarasova et al., J. Biol. Chem., 274(49): 34911-34915 (1999)；およびGeorge et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 307: 481-489 (2003)；米国特許第７，１０５，４８８号；および国際特許出願公開ＷＯ９９／４３７１１を参照）、ならびにＡＢＣトランスポータータンパク質、例えばＰ−グリコプロテイン（Ｐ−ｇｐまたはＭＤＲ１）、ＭＲＰ１、ＭＲＰ２、およびＢＣＲＰ／ＡＢＣＧ２（例えば、Tarasova et al., J. Med. Chem., 48: 3768-3775 (2005)；国際特許出願公開ＷＯ０１／３６４７７）が挙げられる。
【００２０】
ある特定のレセプターやトランスポーターのＴＭドメインから構築されるナノ粒子は、転移および／または血管新生の阻害能（例えば、ＣＸＣＲ４のＴＭドメイン）、あるいは癌細胞の薬剤耐性の阻害能（Ｐ−ｇｐおよびＡＢＣＧ２のＴＭドメイン）等の、独自の生物活性を有している。したがって、本発明のナノ粒子は、単独で投与することもでき、あるいは該ナノ粒子の疎水性中心の中に封入した疎水性物質とともに投与することもできる。該ナノ粒子を疎水性物質（例えば、抗癌剤）とともに投与する場合は、その２つの生物活性物質（該ナノ粒子自身および封入された疎水性物質）の併用により二重の活性という利点が提供される。つまり、送達デバイスのみを提供するリポソームとは異なり、本発明のナノ粒子は、癌細胞の薬剤耐性の低減、癌細胞の転移阻害、および腫瘍環境における血管成長の阻害等の、それ独自の活性を有している。
【００２１】
適当なＴＭペプチドとしては、国際特許出願公開ＷＯ９９／４３７１１およびＷＯ０１／３６４７７ならびに米国特許第７，１０５，４８８号に記載されたもの、ならびに、
Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｓｐ（配列番号１；ＣＸＣＲ４−８）、
Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ（配列番号２；ＭＤＲ１−２）、
Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｓｐ（配列番号３；ＭＤＲ１−５）、
Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ（配列番号４；ＭＤＲ１−１２）、および
Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ａｓｐ（配列番号５；ＭＤＲ１−１１）が挙げられる。
【００２２】
任意の適当な疎水性物質を、該ナノ粒子と併せて使用することができる。適当な疎水性物質としては、医薬的、農業的、または工業的に使用されるものが含まれる。これらのものとしては、生物活性または他の有用性を有する分子、医薬、造影剤、および工業試薬、ならびにそのような物質の前駆体およびプロドラッグが挙げられる。好ましい疎水性物質は、ヒトおよび他の生物、例えばヒトにおいて、生物活性または他の有用性を有するものである。これらの中には、医学分野における治療薬である薬剤が含まれる。そのような薬剤の例としては、鎮痛剤、抗炎症剤、麻酔剤、抗アドレナリン剤、不整脈治療剤、抗生物質、抗コリン作用剤、コリン様作用剤、鎮痙剤、抗鬱剤、抗癲癇剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、降圧剤、抗ムスカリン剤、ムスカリン剤、抗腫瘍剤（つまり、抗癌剤）、抗精神病剤、抗不安剤、ホルモン、睡眠剤、鎮静剤、免疫抑制剤、免疫活性剤、神経弛緩剤、ニューロン遮断剤、および栄養剤、ならびにこれらの組み合わせが挙げられる。
【００２３】
好ましくは、本発明の方法に用いるための疎水性物質は抗癌剤である。適当な抗癌剤としては、タキサン（例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル）、ドキソルビシン、ビンクリスチン、アムホテリシン、シスプラチン、カルボプラチン、レチノイド類、イミダゾアクリドン、ビスイミダゾアクリドン、カンプトテシン、トポテカン、ゲルダナマイシン、エトポシド、アゾニフィド（azonifide）、およびこれらの組み合わせが挙げられる。
【００２４】
該ナノ粒子は、該ナノ粒子を特定の位置に向かわせるためのターゲッティング物質（例えば、リガンドまたは細胞レセプター）を含有することができる。例えば、特定の腫瘍細胞を標的とするために、腫瘍細胞で過剰発現する細胞表面レセプターに結合するリガンドを該ナノ粒子に付加することができる。適当なリガンドとしては、例えば、上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）、ソマトスタチンレセプター（ＳＳＴＲ）、インスリン様成長因子レセプター、葉酸レセプター、ＨＥＲ２レセプター、インターロイキン−１３レセプター、ガストリン放出ペプチドレセプター、ＣＤ３０、血管作動性腸管ペプチドレセプター、ガストリンレセプター、前立腺特異抗原、およびエストロゲンレセプターに結合する抗体およびポリペプチドが挙げられる。
【００２５】
本発明の方法はまた、疎水性物質（例えば、抗癌剤）を含有するナノ粒子を対象に投与することも含み得る。適当な対象としては、マウス、ラット、ウサギ、フェレット、モルモット、ハムスター、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ、霊長類、およびヒト等の哺乳動物が挙げられる。
【００２６】
該ナノ粒子は単独で、あるいは組成物として投与することができる。該ナノ粒子が組成物として投与される場合は、該組成物は、好ましくは医薬（例えば、生理学的に許容される）組成物である。該組成物は、担体（例えば、医薬上または生理学的に許容される担体）および該ナノ粒子を含有する。本発明においては、任意の適当な担体（例えば、水、生理食塩水、およびＰＢＳ）を使用することができ、そのような担体は当該技術分野において周知である。担体の選択は、該組成物が投与されるべき特定の部位および該組成物を投与するのに用いられる特定の方法によって、ある程度は決定されるであろう。適当な担体、ならびに本発明の組成物における使用に適した他の成分は、当該技術分野において公知である（例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences 第１７版、（Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa.: 1985））。また、該組成物は、抗癌剤等の更なる活性物質を含有することもできる。
【００２７】
該ナノ粒子およびその組成物を、特定の障害および疾患を治療または予防するために対象に投与することができる。例えば、疎水性物質が抗癌剤である場合、本発明は、腫瘍成長を阻害（例えば、腫瘍細胞の増殖、侵襲、または転移の阻害、腫瘍成長の遅延、腫瘍成長の完全停止、および腫瘍の縮小）する方法、および癌細胞が薬剤耐性を発現する能力を阻害することにより癌（例えば、腫瘍細胞）の薬剤感受性を促進する方法などによる、癌の化学療法を包含する。当業者であれば、治療または予防すべき疾患または障害に基づいて、ナノ粒子に含有させるべき特定の疎水性物質（例えば、抗癌剤）を容易に決定することができる。好ましくは、該疾患または該障害は、癌、例えば、肺癌、乳癌、前立腺癌、頭頸部癌、卵巣癌、皮膚癌、精巣癌、膵臓癌、食道癌、結腸直腸癌、腎臓癌、子宮頸癌、消化管癌、およびこれらの組み合わせである。
【００２８】
該ナノ粒子またはその組成物は、治療上有効な量を対象に投与するのが好ましい。治療上有効な量とは、特定の疾患または障害を治療または予防するのに必要な該ナノ粒子の量をいう。例えば、該ナノ粒子が抗癌剤を含有する場合は、治療上有効な量とは、癌の化学療法、例えば、腫瘍細胞の増殖、侵襲もしくは転移の阻害、腫瘍成長の阻害、および／または癌細胞の薬剤耐性発現能の阻害による癌の薬剤感受性の阻害などに必要な、抗癌剤含有ナノ粒子の量をいう。該ナノ粒子またはその組成物の適切な用量は、該ナノ粒子の疎水性中心に包含される特定の抗癌剤、および／または該ナノ粒子を形成する特定のＴＭペプチドに依存する。
【００２９】
該ナノ粒子を対象に送達するために、任意の投与経路を用いることができる。適当な投与経路としては、筋肉内注射、経皮投与、吸入、組織（例えば、腫瘍組織）への局所投与、腫瘍内投与、および非経口投与（例えば、静脈内投与、腹膜投与、動脈内投与、皮下投与、直腸投与、または膣内投与）が挙げられる。医師や研究者は、適切な投与経路を容易に決定することができる。皮下投与はナノ粒子を注入部位からゆっくりと拡散させることができ、静脈内投与はナノ粒子を素早く拡散させ、腎臓を通して素早く除去することができる。
【００３０】
以下の実施例は本発明をさらに説明するものであるが、当然、その範囲を限定するものとして決して解釈されるべきではない。
【００３１】
実施例１
本実施例は、本発明のナノ粒子が均一な形および直径を有することを示すものである。
【００３２】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５のアミノ酸配列を含むペプチドを合成した。また、配列番号１の末端の２つの負荷電アスパラギン酸残基を２つの正荷電リシン残基に置換した、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号６）のアミノ酸配列を含むペプチドを合成した。
【００３３】
ペプチドをＤＭＳＯに溶解させて、３２ｍｇ／ｍｌの溶液とした。ＤＭＳＯストックをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて希釈し、０．０５〜０．５ｍｇ／ｍｌの溶液を作製した。試料２μｌを顕微鏡のグリッドに直接乗せ、風乾、０．５％（ｗ／ｖ）四酸化オスミウム（ＯｓＯ４）で染色し、Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｈ−７０００電子顕微鏡により可視化した。
【００３４】
負に帯電した末端を有するペプチドは、透過型電子顕微鏡観察によって示されたように、全て小さなナノ粒子（直径４〜１５ｎｍ）を形成していた。しかしながら、そのナノ粒子は、より高次の凝集体を形成していた。高次構造の形態は配列が異なれば異なっており、著しい程度の変動性を示していた。
【００３５】
（配列番号６のように）負電荷を正電荷で置換すると、極めて多様な直径を有する非常に大きい粒子を形成した。このように、ＴＭペプチドの一方の末端に負荷電残基を存在させると、比較的均一な形と直径のナノ粒子が形成される。
【００３６】
実施例２
本実施例は、親水性オリゴマーの付加がナノ粒子の凝集に影響を与えることを示すものである。
【００３７】
親水性オリゴマーを、配列番号１のアミノ酸配列を有するＴＭペプチドに付加して、以下のもの：配列番号１−ＰＥＧ１１；配列番号１−ＰＥＧ２７；配列番号１−ＰＥＧ３８；および配列番号１−ＧＧＧＧＧを形成させた。
【００３８】
親水性オリゴマー（例えば、ＰＥＧ）を有するペプチドを形成するために、ＡＢＩ４３３ペプチド合成装置でＦｍｏｃアミド樹脂（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を脱保護させた。Ｆｍｏｃ−ＮＨ−（ＰＥＧ）１１−ＣＯＯＨ（ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ）またはＦｍｏｃ−ＮＨ−（ＰＥＧ）２７−ＣＯＯＨ（ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ）１ｇをＮ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）１０ｍｌに溶解し、０．５Ｍ  ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ（Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウム−ヘキサフルオロ−ホスフェート／１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール）  ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液を等モル量加えて活性化した。脱保護された樹脂（ＰＥＧに対して８０％のモル量）を活性化されたＰＥＧに加え、１８時間振盪機の上で放置した。Ｆｍｏｃ−ＮＨ−（ＰＥＧ）３８−ＣＯＯＨのようなさらに長いＰＥＧ分子については、該合成装置による脱保護から始めて、この手順を繰り返した。ＰＥＧ３８は、ＰＥＧ１１とＰＥＧ２７との逐次結合により取得した。所望の長さのＰＥＧ分子を有する樹脂を、ＮＭＰおよびジクロロメタンで洗浄し、乾燥させて、その後の、伝導度モニタリングユニットを備えた４３３Ａ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓペプチド合成装置を用いてのＦｍｏｃアミノ酸誘導体を利用した固相ペプチド合成によるＴＭドメイン鎖の構築に使用した。全てのペプチドが、脱保護の間のピペリジン処理の際にアスパルトアミドを形成しやすいＡｓｐ残基を含んでいるため、０．２５Ｍ  ＨＯＢｔを含むＮＭＰ中で５０％ピペリジンを用いるように、該合成装置を再プログラム化した。溶媒送達時間は、脱保護の間、ＨＯＢｔの最終濃度が０．１Ｍに到達するように調整した。
【００３９】
ＨＯＢｔの添加により、通常は質量スペクトルにおいて−１８および＋６０（ピペリジン付加物）の分子量の生成物の出現を伴うアスパルトアミドの形成が完全に抑制された。ペプチドを、５％水、５％チオアニゾール、２．５％トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）を含む８７．５％トリフルオロ酢酸を用いて樹脂から分離し、冷ジエチルエーテルで沈殿させ、エーテルで５回洗浄し、一晩真空乾燥した。ＤＭＦに溶解したペプチドを、分取（１９×２５０ｍｍ）Ａｔｌａｎｔｉｓ  Ｃ３逆相カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）上のＨＰＬＣにより、０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液と０．０５％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルとのグラジエントで精製した。フラクションは、Ｚｏｒｂａｘ  Ｃ３  Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌカラム、および０．１酢酸水溶液とアセトニトリルとのグラジエントを用い、Ａｇｉｌｅｎｔ１１００シリーズ機器（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）でのイオンスプレーＬＣ／ＭＣにより分析した。９５％超の純産物を含むフラクションのみを合わせて、凍結乾燥を行った。純度および構造を、Ｚｏｒｂａｘ  Ｃ３分析カラムで分離したイオンスプレーＬＣ／ＭＣにより、さらに確認した。
【００４０】
ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ活性化を含む標準Ｆｍｏｃプロトコールを利用した逐次合成法により、所望の長さのポリグリシンオリゴマーをペプチド合成装置で作製した。あらかじめ組み込まれていたＧｌｙ樹脂（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を合成に用いた。
【００４１】
ナノ粒子凝集に及ぼす親水性テール長の影響を調べるため、配列番号１；配列番号１−ＰＥＧ１１；配列番号１−ＰＥＧ２７；配列番号１−ＰＥＧ３８；および配列番号１−ＧＧＧＧＧのアミノ酸配列を有するＴＭペプチドについて、多角度光散乱によりその凝集度を測定した。
【００４２】
該ペプチドをＤＭＳＯに溶解し、０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）で希釈して、０．４ｍｇ／ｍｌのペプチド溶液を調製した。これを更なる希釈に用いた。ＤＭＳＯの最終濃度は、２．５％または１．２５％とした（一連の全ての希釈を一定とした）。試料を最大強度で１０分間超音波処理し、室温で一晩（測定前約２０時間）放置した。翌日、該試料を１３２００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。
【００４３】
光散乱（ＬＳ）研究を、ＤＡＷＮ  ＥＯＳ多角度検出器（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐ．，  Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）により６９０ｎｍのレーザー波長で行った。ＬＳ検出器を、Ａｇｉｌｅｎｔ１１００  ＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）に接続した。ＭＡＬＳ検出器を、ＨＰＬＣグレードのトルエン（９９．８％（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、０．０２μＭのＡｎｏｔｏｐ−２５無機メンブレンフィルターを通して濾過した後、アルブミン（ウシ）９８％モノマー（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で標準化されたもの）を用いて調整した。データを、Ａｓｔｒａソフトウェア（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐ．；ｖｅｒｓｉｏｎ４．９０．０４）を用いて収集、処理した。
【００４４】
ペプチド凝集体の分子量およびその凝集状態を調べるために、ＬＳマイクロバッチ（ｍｉｃｒｏ−ｂａｔｃｈ）測定を行った。概要としては、カラム部分を通さずに、溶媒を０．０５ｍｌ／ｍｉｎの流速でＨＰＬＣシステムを通液させた。異なるペプチド濃度の試料９００μｌを、ＨＰＬＣオートサンプラーを通して注入した。４種のペプチド濃度（つまり、０．０５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、および０．４ｍｇ／ｍｌ）を解析した。強力な光散乱は従来のＵＶ吸光度測定を不正確なものとするため、重量測定から濃度を決定した。各濃度についてＬＳシグナルを収集した。分子量は、Ａｓｔｒａソフトウェアを用いてＤｅｂｙｅプロットとＺｉｍｍの式により、各濃度について別個に測定した。最小誤差を与える収集シグナルの一部分を、各濃度での分子量計算のために選択した。
その結果を表１に示す。
【００４５】
【表１】
2010509241.tif 000003
【００４６】
表１に示されたデータによって実証されるように、ナノ粒子の凝集性はＰＥＧの長さが増加するに従って低下した。どちらのタイプの親水性テール（つまり、ＰＥＧおよびポリアミノ酸）も、該ナノ粒子の凝集の軽減に有効であった。同程度の長さにおいては、ＰＥＧの方がポリグリシンよりも効果が低かった。さらに、ポリアミノ酸伸長は生分解性であるため有利であり、従って、ナノ粒子が細胞膜と融合する能力を微調整するのにさらなる柔軟性を提供する。
【００４７】
また、薬剤耐性関連トランスポーターＡＢＣＧ２をターゲッティングするナノ粒子について行った構造−活性研究により、２７単位を超えるＰＥＧ長の伸長はペプチド阻害剤の生物活性を損なわせ、おそらくは膜融合を妨げることが示唆された。したがって、二重の活性を有する理想的なナノ粒子は、超巨大構造の形成を防ぐのに十分な長さの親水性テールを有するが、該テールは、膜融合を可能にするために標的組織（例えば、腫瘍）においてサイズが減少（分解）し、そうしてナノ粒子を形成するＴＭペプチドが標的膜タンパク質に対してその阻害効果（例えば、癌細胞の薬剤耐性阻害、腫瘍環境における血管成長の阻害、または腫瘍細胞の転移阻害）を発揮し、組み込まれた疎水性物質（例えば、細胞毒性薬剤）が放出され得るようにすべきである。
【００４８】
実施例３
本実施例は、ＴＭペプチドの長さがナノ粒子の凝集に影響を与えることを示すものである。
【００４９】
ナノ粒子の凝集に及ぼすＴＭペプチド長の影響を調べるために、配列番号１−ＰＥＧ２７；配列番号７−ＰＥＧ２７；配列番号８−ＰＥＧ２７；および配列番号９−ＰＥＧ２７のＴＭペプチドについて、多角度光散乱により凝集度を測定した。配列番号７、８、および９は配列番号１に関する欠失変異体であり、配列番号７は配列番号１のＮ末端アミノ酸残基を２つ欠失しており、配列番号８は配列番号１のＮ末端アミノ酸残基を５つ欠失しており、配列番号９は配列番号１のＮ末端アミノ酸残基を１２個欠失しているものである。それらのペプチドは実施例２に記載したようにして作製した。
その結果を表２に示す。
【００５０】
【表２】
2010509241.tif 000004
【００５１】
表２に示されたデータによって実証されるように、ナノ粒子の凝集性はＴＭペプチドの長さが減少するに従って低下した。しかしながら、１１アミノ酸残基に短縮されたＴＭ部分を有するペプチドは、ナノ粒子に自己凝集できなかった。
【００５２】
実施例４
本実施例は、腫瘍組織におけるナノ粒子の細胞内および腫瘍内取り込みを示すものである。
【００５３】
Ａｌｅｘａ５４６蛍光色素でラベルしたＣＸＣＲ４−ＴＭドメイン２由来ＰＥＧ化ペプチドを調製した。以下の配列を合成した：配列番号１−Ｐｅｇ１１−Ｈｃｙ−Ｐｅｇ２７（Ｈｃｙはホモシステインを表わす）。該ペプチドを、２倍過剰のＡｌｅｘａ５４６  ５−マレイミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とＤＭＳＯ中で（濃度は１２８ｍｇ／ｍｌ）一晩反応させ、分取（１９×２５０ｍｍ）Ｃ３カラムで精製した。（２ｍｇ／ｍｌのペプチド溶液を作製するため）ペプチド１０μｌをＰＢＳ６３０μｌで希釈して、１０分間超音波処理を行い、腫瘍内投与に使用した。
【００５４】
ヌードマウスの乳房パッド（breast pad）に１００万個のＭＤＡ−２３１乳癌細胞を接種した。６週間後、腫瘍が直径約５ｍｍの大きさになったときに、２ｍｇ／ｍｌ蛍光ナノ粒子ＰＢＳ溶液０．１ｍｌを腫瘍付近の乳房パッド（breast pad）に注入した。
【００５５】
動物全体および切除した腫瘍を、Ｍａｅｓｔｒｏ  ４２０インビボスペクトル画像化システム（Ｉｎ−Ｖｉｖｏ  Ｓｐｅｃｔｒａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  ａｎｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．)を用いて撮像した。その結果、ナノ粒子は注入部位から広範囲に拡散せずに、効果的に腫瘍血管系を透過することがわかった。動物全体においては、注射後３０分間、該ナノ粒子は腫瘍組織に局在していた。同様に、２４時間後、該ナノ粒子は注入部位から拡散せずに腫瘍組織に局在していた。注射から２４時間後に切除した腫瘍の分析から、該ナノ粒子は効果的に腫瘍血管系を透過することが示された。
【００５６】
これらの結果により、本発明のナノ粒子を用いて、抗癌剤等の疎水性薬剤を腫瘍組織等の標的組織に送達させ得ることが確認された。
【００５７】
実施例５
本実施例は、ある特定のレセプター（例えば、ＣＸＣＲ４）およびトランスポーターのＴＭドメインから構築されるナノ粒子が独自の生物活性を有し、転移を抑制し得ることを示すものである。
【００５８】
０日目に、１００万個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞をヌードマウスに静脈内注射した。１日目および継続して１週間に２回、マウスの腹腔内に（１）配列番号１−ＰＥＧ２７のＴＭペプチドのナノ粒子のＰＢＳ溶液を３ｍｇ／ｋｇ；（２）配列番号１−ＰＥＧ２７のＴＭペプチドのナノ粒子のＰＢＳ溶液を１２ｍｇ／ｋｇ；または（３）コントロール（ＰＢＳのみ）を注射した。
【００５９】
犠牲死または自然死したコントロール群における動物は全て、多数の肺腫瘍を有していた。図３に示したとおり、コントロール群の動物は７５日目までに約２０％しか生存していなかった。一方、３ｍｇ／ｋｇのナノ粒子を投与した動物は７５日目までに約４０％が生存していた。１２ｍｇ／ｋｇのナノ粒子を投与した全ての動物は７５日目まで１００％が生存し、またこれらの動物では体重が増え続けた。このことは、転移が発生していないことを示している。
【００６０】
コントロール群における動物、または３ｍｇ／ｋｇのナノ粒子を投与した動物において、９１日目までに生存しているものはなかったが、１２ｍｇ／ｋｇのナノ粒子を投与した動物ではかなりの数が試験最終日（１４０日目）まで生存した。このことは、乳癌のマウスモデルにおいて、ナノ粒子の投与が肺転移を著しく遅延させ、生存期間を延長し得ることを示している。
【００６１】
これらの結果により、特定のレセプター（例えば、ＣＸＣＲ４）のＴＭドメインから構築されるナノ粒子は転移を阻害し得ることが確認された。
【００６２】
実施例６
本実施例は、本発明のナノ粒子が水溶液中で疎水性物質と会合する能力があることを示すものである。
【００６３】
ＣＸＣＲ４レセプターをターゲッティングするＴＭドメイン部分から形成されたナノ粒子について、可溶化した疎水性細胞毒性物質との会合能の試験を行った。イミダゾアクリドンおよびビスイミダゾアクリドンは水溶液に難溶性で、環境感受性の蛍光を有することから（Tarasov et al., Photochem. Photobiol., 70(4): 568-578 (1999)を参照）、これらの抗腫瘍剤を用いた。特に、強力な抗腫瘍活性を有する１，８−ナフタルイミドイミダゾ（４，５，１−デ）アクリドン誘導体であるＨＫＡ４０Ａ（米国特許第６，６６４，２６３号を参照）、および環境感受性の蛍光特性を有するイミダゾアクリドン（５−｛３−［４−（アミノプロピル）−ピペラジン−１−イル］−プロピルアミノ｝−２，１０ｂ−ジアザ−アセアントリレン−６−オン）であるＷＭＣ７７（米国特許第６，１８７，７７５号を参照）を用いた。
【００６４】
得られた０．０３８ｍｇ／ｍｌ  ＨＫＡ４０Ａ溶液の外観は、オレンジ色の沈殿物を有する無色透明の液体であった。対照的に、０．４ｍｇ／ｍｌナノ粒子（配列番号１−ＰＥＧ２７）ＰＢＳ溶液中の等濃度のＨＫＡ４０Ａは、沈殿物のない黄色の透明な溶液であった。
【００６５】
様々な量のナノ粒子（配列番号１−ＰＥＧ１１または配列番号１−ＰＥＧ３８）をＷＭＣ７７溶液に添加した。その蛍光発光強度および発光最大値の変化を測定し、結果を図１および２に示した。これらの結果は、蛍光発光強度および発光最大値の変化が該ナノ粒子の量の増加に伴って増大することを示した。このことは、蛍光色素分子が疎水性環境の中に移動していることを示している。
【００６６】
さらに、表３のデータに示されたように、ＷＭＣ７７（最終濃度３００ｎＭ）をＡｌｅｘａ５４６でラベルしたナノ粒子（実施例４に示したとおりに作製）と混合させると、ナノ粒子とＷＭＣ７７との間の緊密な相互作用が示す蛍光エネルギー転移が観察された。
【００６７】
【表３】
2010509241.tif 000005
【００６８】
これらの実験結果から、本発明のナノ粒子は水溶液中で疎水性物質と会合し、該物質に疎水性環境を提供することが確認された。
【００６９】
本明細書において引用された、刊行物、特許出願、および特許を含む全ての参考文献は、各参考文献が、参照することにより本明細書に含まれることを個別におよび具体的に示され、また本明細書にその全体が示されているのと同じ程度に、参照することにより本明細書に含まれる。
【００７０】
用語「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」および同様の指示語の、本発明を説明する文脈（特に以下の特許請求の範囲の文脈）における使用は、本明細書中に他に示されていないか、または明らかに文脈に矛盾しない限り、単数および複数の両方に及ぶものと解釈されるべきである。用語「含有する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、他に留意されていない限り、自由に開放された用語（つまり、「含むが、特に限定されない」という意味）として解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書中に他に示されていない限り、単に該範囲に収まるそれぞれの別個の値に個別に言及する簡単な方法として目的を果たすものであり、それぞれの別個の値は、個別に本明細書中に列挙されているかのように本明細書の中に含まれる。本明細書中で説明される方法は全て、本明細書中に他に示されていない限り、または他に明らかに文脈に矛盾しない限り、任意の適当な順序で行われることができる。本明細書において提供される、任意のおよび全ての例または例となる用語（例えば、「そのような」）の使用は、単に本発明をより明らかにするよう意図されているものであり、他に要求されない限り、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書における言葉遣いは、任意のクレームされていない要素が本発明の実施に必要不可欠であることを示すものとして解釈すべきではない。
【００７１】
本発明の好ましい実施態様は本明細書の中に説明されており、本発明の実施について本発明者らに知られている最良の形態を含んでいる。これらの好ましい実施態様を変形したものは、前述の説明を読んだ上で当業者にとって明白になり得る。本発明者らは、そのような変形を適切なものとして当業者が用いることを予期し、そして本発明者らは、本明細書中に具体的に説明されているものとは別に本発明が実施されることを意図する。したがって、本発明は、本明細書に添付された特許請求の範囲に列挙される主題を改良したものおよび同等のものを全て、適用法により認められたものとして包含する。さらに、上記の要素の任意の組み合わせは、全ての可能性のあるその変形において、本明細書中に他に示されておらず、または明らかに文脈に他に矛盾しない限り、本発明により包含される。
【図１】
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【図２】
2010509241.tif 000007
【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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