(57)【要約】  本発明は、アテローム性動脈硬化症の治療および予防のための医薬の製造のための、特異的にＥＤ−Ｂフィブロネクチンを認識する抗体部分、エフェクター部分、および場合により、一またはそれ以上の融合タンパク質リンカー（複数）および／または抗体リンカー（複数）を含む、融合タンパク質の使用に関する。
2010508248.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アテローム性動脈硬化の治療および予防のための医薬の製造における、少なくとも一つの標的部分および少なくとも一つのエフェクター部分を含む融合タンパク質の使用であって、当該標的部分がＥＤ−Ｂフィブロネクチンを特異的に認識し、そして、当該エフェクター部分がサイトカインまたはその生物学的に活性のあるフラグメントである、前記使用。
【請求項２】
前記標的部分が、フィブロネクチンのエキストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）に結合する、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記標的部分が、抗体またはその生物学的に活性なフラグメントである、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記標的部分が、ヒトリコンビナント抗体Ｌ１９またはその生物学的に活性なフラグメントである、請求項２または３に記載の使用。
【請求項５】
前記抗体または抗体フラグメントが、Ｌ１９のＣＤＲ領域を含み、および／または、Ｌ１９抗体の少なくとも一つのＶｈと少なくとも一つのＶｌを含む、請求項３または４に記載の使用。
【請求項６】
前記抗体の重鎖および軽鎖が、抗体リンカーによって結合されている、請求項２〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
前記抗体リンカーが、配列番号３に従う配列を有する、請求項２〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
前記サイトカインが、インターロイキンまたはその生物学的に活性なフラグメントである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
前記サイトカインが、インターロイキン−２（ＩＬ２）またはその生物学的に活性なフラグメントである、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記インターロイキン−２が、配列番号４に従う配列を有する、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記融合タンパク質が
（ａ）Ｎ末端の標的部分およびＣ末端のエフェクター部分、または、
（ｂ）Ｎ末端のエフェクター部分およびＣ末端の標的部分
を有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
前記標的部分および当該エフェクター部分が、融合タンパク質リンカーによって結合されている、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１３】
前記融合タンパク質リンカーが、配列番号５に従う配列を有する、請求項１２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アテローム性動脈硬化症の治療および予防のための医薬の製造のための、フィブロネクチンのエキストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）を特異的に認識する抗体部分、エフェクター部分、および場合により一またはそれ以上の融合タンパク質リンカーおよび／または抗体リンカーを含む融合タンパク質の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アテローム性動脈硬化症は、心血管系イベントによって悪化した、大、中動脈の慢性炎症性脂質蓄積症として知られている。これらは一般に、心臓、脳、脚部そして他の組織中における突発性動脈血栓症の結果である。リン脂質とコレステロールの沈着の結果としての病的内膜肥厚は、最も早期の検知可能なアテローム性の変化を構成し、続いてマクロファージと、ＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞の浸潤が起こる(Ｖｉｒａｍｉ  Ｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ，  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ  ２００５，  ２５：２０５４−６１；  Ｘｕ  ＱＢ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｐａｔｈｏｌ，１９９０，５６：３４４−３５９)。その後、この過程は、アテローム性動脈硬化プラークをかん流させる栄養血管の増殖へとつながる（Ｒｏｓｅ  Ｒ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．，１９９９，３４０：１１５−１２６；Ｗｉｌｓｏｎ  ＳＨ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．，２００２，１０５：４１５−４１８）。プラーク内出血をもたらす栄養血管の破裂は、無症候性のプラークを高リスクで不安定な損傷へ発展させる重要な過程である（Ｋｏｌｏｄｇｉｅ  ＦＤ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．，２００３，３４９：２３１６−２３２５）。プラーク内出血とプラーク破裂は、微小血管の密度の増加と関わりがある（Ｆｌｅｉｎｅｒ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２００４，１１０，２８４３−２８５０）。プラークの破裂は、急性心筋梗塞で死亡する患者の７５％で起こる急性冠動脈症候群における内腔の血栓の主要な原因である（Ｄａｖｉｅｓ  ＭＪ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，１９８４，３１０：１１３７−１１４０）。前述のアテローム性動脈硬化プラークの有効な画像法ならびにそれらについての治療法および予防法は、大きな関心事である。冠動脈疾患（ＣＡＤ）またはアテローム性動脈硬化症の予防は、一般的に、禁煙やダイエット、体重減少、運動のような治療上のライフスタイルの変化に関連する。すでにＣＡＤもしくは他の血管床におけるアテローム性動脈硬化症を罹患している患者またはＣＡＤを発症する高リスクにある患者において、より低い総コレステロールまたは低比重リポタンパクコレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）は、心血管罹患率、死亡率および全死亡率の減少に関与している。３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル  コエンザイムＡリダクターゼ阻害剤（たとえばアトロバスタチン（リピトール（登録商標））、プラバスタチン（プラバコール（登録商標））、シンバスタチン（ゾコール（登録商標）））を用いた治療法は、予防心臓病学に対して大きな影響があった。臨床試験は，血清中のコレステロールの減少が、コレステロールを減らすために使用された方法に関係なく、主要な心血管イベントの減少と相関していることを一貫して示している。しかし、急性冠不全症候群の患者に対して、これらの薬剤の早期臨床データを支持する試験ベースの証拠はほとんどない。たいてい、これらの患者は、血小板抑制薬（たとえばアスピリン（登録商標）またはクロピドグレル（プラビックス（登録商標）））、抗凝血薬（ヘパリンの皮下注射）、そして血管拡張薬（たとえばニトログリセリン、カルシウム拮��薬）で治療される。これらの全身療法は、ＣＡＤの患者の臨床症状を一時的に減少させるかもしれないが、それらが、プラークの大きさを小さくしたり、もしくはプラークの形態を改善し、または安定化をすること、あるいは進行性のアテローム性動脈硬化症に対して著しく即効性の効果があることは知られていない。明白な、および／または臨床的に症候性のＣＡＤにおいて、現在の選択され得る治療法には、バルーン冠動脈形成術や冠動脈バイパス手術が含まれる（Ｂｒａｕｎｗａｌｄ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｍｏｓｔ  ｒｅｃｅｎｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ（２００５），ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ）。これらの進襲性治療法は、急性または亜急性の症状を緩和するかもしれないが、本来的に局所的な治療法なので、それらには、潜在的な進行性の動脈硬化性疾患に対して大きな効果を有さない。
【０００３】
今のところ知られている、血管形成に関する最も選択的なマーカーの一つが、エキストラ  ドメイン  Ｂ（ＥＤ−Ｂ）フィブロネクチンである。ＦＮ（フィブロネクチン）は、健常組織と体液の一帯で豊富に発現している、高分子量の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）構成要素である。さまざまな異なるＦＮアイソフォームが、一次転写物のレベルでの選択的スプライシングにより生成し得る。ＥＤ−Ｂは、９１個のアミノ酸からなる小さいドメインであり、配列的にマウス、ラット、ヒトで同一であり、再生中の子宮内膜や卵巣のいくつかの血管を除いて、通常、血漿と組織フィブロネクチンのいずれにも存在しない（Ａｌｅｓｓｉ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，２００４，１６５４：３９−４９；Ｖｉｔｉ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１９９９，５９：３４７−３５２）。しかし、それは、血管新生に関わる活性化組織の再形成中にフィブロネクチン分子へと挿入され、それによりアテローム性動脈硬化プラーク中の新生血管のような新生血管構造の周辺に特異的に蓄積するようになるかもしれない。したがって、ＥＤ−ＢフィブロネクチンおよびとくにＥＤ−Ｂドメインはそれ自体、分子治療のターゲットとなる（Ｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９８７，６：２３３７−２３４２，Ｃａｒｎｅｍｏｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１９８９，１０８：１１３９−１１４８，Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１９９４，５９：６１２−６１８）。
【０００４】
これに関連して、血管形成マーカーを選択的に標的とすることができる分子は、関節リウマチ、糖尿病性網膜症および加齢性黄斑編成症のような、血管増殖を特徴とする病気の診断や治療の臨床的な機会を作り出す。（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．，１９９６，２：６８９，Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１９９７，８８：２７７，Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５，２７０：１５００，Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９７，１５：５４２，Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９７２７５：５４７，Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９３，３６２：８４１，Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｅｒｆｕｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１９９７，７５：５４）．
【０００５】
近年、フィブロネクチンのＥＤ−Ｂに特異的な多くの良質な抗体が創製された。特に、ＥＤ−Ｂに対してピコモーラーの結合親和性を示すヒト一本鎖Ｆｖ抗体フラグメントであるＬ１９は、たとえば実験的腫瘍モデルにおいて（Ｖｉｔｉ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１９９９，５９：３４７−３５２；Ｔａｒｌｉ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１９９９，９４：１９２−１９８）、そして固形がん患者の腫瘍病巣において（Ｓａｎｔｉｍａｒｉａ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２００３，９：５７１−５７９）新たに形成された腫瘍血管を選択的に標的とすることができることが証明された。本発明に従って使われるかもしれない他の抗体は、ＢＣ１、ＣＧＳ−１およびＣＧＳ−２である。ＢＣ−１は、特異的にＥＤ−Ｂフィブロネクチンを認識するが、ＥＤ−ＢフィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメインとは結合しない。
【０００６】
サイトカインは、広範囲に細胞間の情報伝達に使われるたんぱく性のシグナル物質の一群である。免疫システムの発達と機能に対する重要性はさておき、サイトカインはまた、非常に多くの免疫疾患、炎症性疾患、感染症に大きな役割を果たす。サイトカインは、人体や動物の体の障害の治療のための非常に有効な化合物となり得ると従来からわかっている。インターフェロンαは、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）や有毛細胞白血病に対して単剤治療剤として活性があり、そしていくらかの患者には完全に持続的な寛解を誘導することができる（Ｋａｍｔａｒｊｉａｎ  ＨＭ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ２００６，１０８：１８３５−１８４０；Ｂａｋｅｒ  ＰＫ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ２００２，１００：６４７−６５３；Ｄａｍａｓｉｏ  ＥＥ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  ２０００，６４：４２−５２）。ペグインターフェロンαは、慢性Ｂ、Ｃ、Ｄ型肝炎に対する積極的治療剤として単剤、あるいはラミブジンまたはアデフォビルとの併用で広く用いられている（Ｗｕｒｓｔｈｏｒｎ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２００６，４４：６７５−６８４；Ｄｅｓｍｏｎｄ，ＣＰ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒａｌ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ２００６，１３：３１１−３１５；Ｎｉｒｏ  ＧＡ，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２００６，４４：７１３−７２０）。インターフェロンβは、多発性硬化症の治療に広く使われている（Ｋａｐｐｏｓ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ２００６，６７：９４４−９５３）。腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）は、四肢分離かん流法（ＩＬＰ；Ｇｒｕｎｈａｇｅｎ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  ２００６，１０６：１７７６−８４）に関連して、肉腫の患者のための患肢温存治療としてメルファランとの併用療法において承認されている。それはまた、メラノーマ患者に対して同様の手法で首尾よく使用されている（Ｌｅｊｅｕｎｅ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２００６，６：１−１７）。特に、インターロイキン−２（ＩＬ２）は、とりわけ抗腫瘍試験において最も強いサイトカインの一つとして特徴付けられた。それは、種々の抗腫瘍エフェクター細胞の刺激を含めて、一そろいの感染制御効果を示す（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  Ｓ．Ａ．，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，２００１，２５０：４６２−４７５）。しかし、転移性腎細胞癌患者の臨床的治療のために承認されているにも関わらず、全身的に適用されたＩＬ２は、期待したほどの成功が認められなかった。全身的に適用されたＩＬ２の治療効果は、投与量の上昇を制限して治効量の投与を阻止する、深刻な、本質的に生死に関わる副作用（たとえば起立性低血圧、血管漏出症候群や深い倦怠感）により妨げられる（Ｂｕｂｅｎｉｋ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２０００，４９：１１６−１２２；Ｂａｌｕｎａ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９９，９６：３９５７−３９６２）。加えて、全身に送達されたＩＬ２の早い分解または排出が、さらにその有効性を減少させる。一方、ＩＬ２の局所的投与は、より成功しており、悪性滲出液の調整およびすでに罹患している腫瘍病��の著しい寛解へと進展する（Ｂｕｂｅｎｉｋ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２０００，４９：１１６−１２２；Ｄｅｎ  Ｏｔｔｅｒ  Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｕｒｏｌ．，１９９８，１５９：１１８３−１１８６；Ｂａｓｅｌｍａｎｓ  Ａ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２００２，５１：４９２−４９８；Ｋｒａｓｔｅｖ  Ｚ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，２００３，５０：１６４７−１６４９，Ｒａｄｎｙ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００３，８９：１６２０−１６２６）。
【０００７】
ＩＬ２は、ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞とも呼ばれるレギュラトリーＴ細胞（Ｔreg）の発達と制御に重要である（Ｔｈｏｒｎｔｏｎ  Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００４，１７２：６５１９−６５２３）。ＩＬ２／ＩＬ２受容体経路は、ＩＬ２、ＩＬ２ＲαまたはＩＬ２Ｒβのような経路の一構成要素を遺伝子欠失させると、マウスが深刻なリンパ増殖と自己免疫疾患によって早期に死ぬことから、優秀な免疫システムにとって基本となるものである。一般に、Ｔregは、インビトロでＴ細胞の増殖を抑制するために、そしてインビボにおいて自己−およびアロ抗原、腫瘍抗原および感染性因子に対する免疫応答を抑制するために重要である（Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｅ．Ｍ．，２００２，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：３８９）。Ｔregは、アテローム性動脈硬化症の発症に影響を及ぼす（ＡｉｔＯｕｆｅｌｌａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，２００６，１２：１７８）。
【０００８】
Ｍａｔｔｅｒらは、たとえば、放射活性の、または赤外線感受性のマーカーによりラベル化されたフィブロネクチンＥＤ−Ｂ特異的抗体を用いてＡｐｏＥ−／−マウス（アテローム性動脈硬化症のモデル）におけるアテローム性動脈硬化プラークを表示するための画像法について記述した（Ｍａｔｔｅｒ  Ｃ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４，２４：１２２５−１２３３を参照）。しかし、Ｍａｔｔｅｒらにより提案された、Ｌ１９をベースとした融合タンパクの中でもインターロイキン１２（ＩＬ１２）を融合したＬ１９ヒトモノクローナル抗体が、最終的に前述のアテローム性動脈硬化プラークに対して臨床的に効果的であるという、臨床段階における漠然とした見解は、他の者の科学的指摘とは合致しない（Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２００３，２０：２６４−２６９；Ｚｈａｏ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，ＪＢＣ，２００２，２７７：３５３５０−３５３５６；Ｌｅｅ  Ｔ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．，１９９９，１９：７３７−７４２；Ｚｈｏｕ  Ｒ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．，２００１，８：３０−３２；Ｈａｕｅｒ  Ａ．Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，２００５，１６：１０５４−１０６２を参照）。したがって、アテローム性動脈硬化プラークにおけるＩＬ１２の存在が、タイプ１ヘルパーＴ細胞型サイトカイン産生パターンの鍵誘導因子であると確認され、そしてそれは、Ｍａｔｔｅｒらの提案とは著しく対照的なのだが、アテローム性動脈硬化症の発症を予防、治癒するというよりもむしろその発症に寄与していると考えられる。特に、Ｄａｖｅｎｐｏｒｔらは、ＡｐｏＥ−／−マウスにおけるＩＬ１２のノックアウトがプラーク形成の著しい減少へと導くことを示した。この結果は、Ｚｈａｏらによって支持され、彼らは（アポリポタンパクＥあるいは低比重リポタンパク受容体の欠如という背景の下）、マウスの１２／１５−リポキシゲナーゼの標的遺伝子破壊、あるいは過剰発現技術を用いて、固形飼料を８ヶ月与えたマウスにおいて大動脈病変の５０％の減少を確認した（コレステロール量に差異はない）。これらのマウスの培養されたマクロファージにおいて彼らは、ＩＬ１２産生の７５％〜９０％の著しい減少を発見した。Ｌｅｅらは、Ａｐｏ−Ｅ欠如マウスの大動脈のプラークのマクロファージにおけるＩＬ１２の発現を調べ、そしてこれらのマウスにおけるＩＬ１２の毎日の投与は、アテローム性動脈硬化症を促進させることを見出した。同様に、Ｚｈｏｕらは、急性心筋梗塞の患者において血清中のＩＬ−１２レベルが上昇するが、不安定狭心症の患者では上昇しないことを見出したが、それらはＩＬ１２がＣＡＤの発症に関与していることを示している。最終的に、これらの指摘は、ＨａｕｅｒらにマウスにおけるＩＬ１２の生物学的活性を完全に阻害するワクチン技術の計画を促した。ＬＤＬ受容体欠如マウス（ＬＤＬｒ−／−；アテローム性動脈硬化症についての別の動物モデル）への、ＩＬ１２の生物学的活性に対するワクチンの接種により、アテローム性動脈硬化の６８．５％もの著し���減少が生じた。
【０００９】
Ｓｕｂｒａｍａｎｙａ  Ｕｐａｄｈｙａらによる刊行物（２００４；Ａｐｏ−Ｅ欠如マウスにおける、インターロイキン−２のアテローム生成における効果およびインターロイキン−２抗体の抗アテローム性動脈硬化効果，Ａｎｇｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５５  Ｎｏ．３，２８９−２９４ページ）では、アテローム性動脈硬化を増強する働きがあるインターロイキン−２による動脈硬化促進効果を実証している。さらに抗ＩＬ−２抗体はアテローム性動脈硬化に対して予防効果がある。
【００１０】
上記の観点から、前述のアテローム性動脈硬化プラークに対する特定の治療に用いられる組成物および／または医薬への早急な必要性があり、そして科学的データが示すところによると、ＩＬ１２あるいは標的とされたＩＬ１２は明らかにこの治療に関する問題への可能な解決手段とは考えられない。
【発明の概要】
【００１１】
したがって、本発明に内在する技術的課題は、ヒトおよび動物におけるアテローム性動脈硬化プラーク、およびそれに関連する他の病気の特定の治療および予防のための新規医薬を提供することにより、上記で言及した問題を克服することである。
【００１２】
その課題は、特許請求の範囲および明細書に記載されたとおりの実施形態により解決される。
【００１３】
本発明は、アテローム性動脈硬化症の治療および予防のための医薬の製造における、少なくとも一つの標的部分および少なくとも一つのエフェクター部分を含む融合タンパク質の使用であって、当該標的部分が、特異的にＥＤ−Ｂフィブロネクチンを認識し、および当該エフェクター部分が、サイトカインまたはその生物学的に活性のあるフラグメントである、融合タンパク質の使用に関する。
【００１４】
好ましい実施形態において、標的部分はフィブロネクチンのエキストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）と結合する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、ＡｐｏＥ（−／−）マウスにおけるＬ１９−ＩＬ２融合タンパク質の実験の経過図を示す。
【図２】図２は、ＡｐｏＥ（−／−）マウスから調製された胸部大動脈の写真を示す。暗領域は、スーダン染料を用いて視覚化された脂肪性病変を示す。これらの病変は、アテローム性動脈硬化プラークに相当する。
【図３】図３は、高脂肪食を与えた、５ヶ月齢のＡｐｏＥ（−／−）マウスの胸部大動脈中のアテローム性動脈硬化プラーク形成におけるＬ１９−ＩＬ２融合タンパク質の効果を表すグラフを示す。
【図４】図４は、標準固形飼料（ｎｏｒｍａｌ  ｃｈｏｗ）（正常食）を与えた、生後６ヶ月のＡｐｏＥ（−／−）マウスの大動脈基部のアテローム性動脈硬化プラークにおけるＥＤ−Ｂの組織形態の写真を示す。暗領域は、特にプラークの栄養血管周辺およびプラークキャップの内膜中にある、フィブロネクチンバインダーのＥＤ−Ｂの高い蓄積を示す。
【図５】図５は、標準脂肪食を与えたＡｐｏＥ（−／−）マウス（生後６ヶ月）の大動脈基部の、ＥＤ−Ｂ陽性プラーク領域の形成におけるＬ１９−ＩＬ２の効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
具体的には、アテローム性動脈硬化症の治療および予防のための医薬の製造における、少なくとも一つの標的部分および少なくとも一つのエフェクター部分を含む融合タンパク質の使用であって、当該標的部分が、フィブロネクチンのエキストラドメイン  Ｂ（ＥＤ−Ｂ）を特異的に認識し、および当該エフェクター部分が、サイトカインまたはその中の生物学的に活性のあるフラグメントである、融合タンパク質の使用が提供される。
【００１７】
本明細書で使用される用語「融合タンパク質」は、人工的なタンパク性の構造物に関するものであり、そして、その起源および／または特別な機能によって定義される、少なくとも二つの異なるアミノ酸配列を含むタンパク質を意味する。さらに、本発明の融合タンパク質という用語は、また、核酸、糖、および放射活性および蛍光標識マーカーのような、非タンパク質分子部分を含む融合タンパク質を含む。
【００１８】
さらに、本発明に従って使用される用語「標的部分」は、受容体、抗原またはそれらのフラグメントのような、所望の標的分子の少なくとも一部分と選択的に結合するすべての分子、または分子の一群を意味する。前述の標的部分の例は、ホルモン、神経伝達物質、抗体ならびにそのフラグメントおよび抗体模倣薬を含む。
【００１９】
本明細書で使用される表現「フラグメント」または「生物学的に活性のあるフラグメント」は、標的への活性または生物学的および薬理的活性のような所望の効果が維持される限り、分子の一部分、または分子もしくは分子群の部分の組み合わせを意味する。
【００２０】
本発明の好ましい実施形態によれば、上記で定義されたような使用において、標的部分は、抗体またはそのフラグメントである。
【００２１】
本発明で使用される用語「抗体」は、特に限定されず、たとえば、完全長の抗体、天然の抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体、完全なＩｇＧ抗体、少なくとも二つの完全な抗体から形成される多重特異性抗体（たとえば二重特異性抗体）を含む。
【００２２】
前述の用語「抗体」は、さらに最も広い意味で使用され、特に、それらが所望の生物学的標的活性を示す限り、完全なモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも二つの完全な抗体から形成される多重特異性抗体（たとえば二重特異性抗体）、およびそれらの抗体フラグメントを含む。
【００２３】
本明細書で使用される用語「抗体フラグメント」は、所望の生物学的標的活性を示す限り、完全な抗体の一部分を含み、好ましくは、その抗体結合領域または可変領域もしくはそのＣＤＲ領域を含む。
【００２４】
そのような抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2およびＦｖフラグメント、二重特異性抗体、ミニボディー、リニアー抗体、一本鎖抗体分子、小免疫タンパク質（ｓｍａｌｌ  ｉｍｍｕｎｏｐｒｏｔｅｉｎｓ）（ＳＩＰｓ），「ｓｃＦｖ」、ならびに抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体および多価抗体を含む。
【００２５】
特に好ましい実施形態によれば、標的部分は、ヒトリコンビナント抗体Ｌ１９またはそのフラグメントもしくはその誘導体である。
【００２６】
別の実施形態によれば、標的部分は、ＢＣ−１抗体またはそのフラグメントもしくはその誘導体である。
【００２７】
好ましい実施形態によれば、Ｌ１９抗体または抗体フラグメントは，ｓｃＦｖ、ＳＩＰ、ＩｇＧ、またはＦａｂ形態であり、好ましくは、ｓｃＦｖ形態である。
【００２８】
抗体または抗体フラグメントは、単量体または多量体、たとえば二量体の状態で存在し得る。多量体は、ホモマーまたはヘテロマーであってもよい。多量体は、共有結合によって、または非共有結合性の会合によって形成されてもよい。たとえば、ｓｃＦｖ形態のＬ１９−ＩＬ２は、非共有結合性のホモダイマーを形成する。別の例は、Ｌ１９−ＳＩＰであって、共有結合性のホモマー二量体を形成する。
【００２９】
具体的には、抗体または抗体フラグメントは、Ｌ１９のＣＤＲ領域を含み、および／または、Ｌ１９抗体の少なくとも一つのＶｈ鎖、および少なくとも一つのＶｌ鎖を含む。
【００３０】
本発明の好ましい実施態様において、Ｌ１９抗体またはＬ１９抗体フラグメントの重鎖は配列番号１に従った配列を有し、および／または前述の抗体の軽鎖は、配列番号２に従った配列を有する。
【００３１】
別の好ましい実施形態において、抗体または抗体フラグメントは、Ｌ１９抗体またはＬ１９抗体フラグメントＣＤＲ領域を含む。特に、Ｌ１９のＣＤＲの配列は、配列番号８から１３に示される。
【００３２】
別の好ましい実施形態によれば、上記で定義された使用において、抗体または抗体フラグメントの重鎖および軽鎖は、抗体リンカーによって結合されている。
【００３３】
本明細書で使用される用語「抗体リンカー」は、特に限定されるものではなく、アミノ酸、ペプチドまたは脂肪族性もしくは芳香族性有機分子のような、当技術分野で知られているいずれの抗体リンカーであってもよい。そのようなリンカーの例は、欧州特許第０５７３５５１号明細書、欧州特許第０６２３６７９号明細書、および欧州特許第０３１８５５４号明細書に記載されている。
【００３４】
上記で定義された使用の特定の実施例において、抗体リンカーは、配列番号３に従った配列を有する。
【００３５】
「抗体模倣薬」は、標的に特異的に結合し、抗体および抗体フラグメントとは異なる、タンパクの骨格（ｆｒａｍｅｗｏｒｋｓ）（「骨格（ｓｃａｆｆｏｌｄｓ）」）に基づいた結合分子として知られている。そのような骨格（ｓｃａｆｆｏｌｄｓ）は、Ｂｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３，１２５７−１２６８に記載されている。ＥＤ−Ｂフィブロネクチンに特異的に結合する抗体模倣薬は、Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００７，２８２：３１９６−３２０４に記載されている。
【００３６】
本発明によれば、用語「エフェクター部分」は、特に限定されず、インターロイキン−１２（ＩＬ１２）を除いた、当技術分野で知られているすべてのサイトカインを意味する。そのようなサイトカインの例は、ＩＬ１αおよびＩＬ１β、ＩＬ２からＩＬ１１またはＩＬ１３からＩＬ２２のようなインターロイキン（ＩＬ）、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、またはＩＦＮ−γのようなインターフェロン（ＩＦ）、および腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）である。
【００３７】
本発明での上記で定義された使用のさらなる実施態様において、サイトカインは、ＩＬ１２を除いたインターロイキンまたは生物学的に活性のあるフラグメントもしくはそれらの誘導体である。
【００３８】
本発明の好ましい実施態様によれば、上記で定義された使用におけるサイトカインは、インターロイキン−２（ＩＬ２）またはそのフラグメントもしくはその誘導体である。好ましくは、インターロイキン−２は、ヒトのものである。
【００３９】
本発明の別の実施形態によれば、上記で定義された使用におけるサイトカインは、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）またはそのフラグメントもしくはその誘導体である。好ましくは、ＴＮＦαは、ヒトのものである。
【００４０】
本発明の一実施例によれば、インターロイキン−２は、配列番号４に従った配列を有する。
【００４１】
本発明の一実施例によれば、ＴＮＦαは、配列番号６、または配列番号７に従った配列を有する。
【００４２】
本発明の好ましい実施形態によれば、融合タンパク質は、Ｌ１９−ＩＬ２を含み、そして、（Ｎ末端からＣ末端の方向で）配列番号１、配列番号３、配列番号２、配列番号５、および配列番号４、を順に付加した配列を有する。
【００４３】
別の実施態様によれば、融合タンパク質Ｌ１９−ＴＮＦアルファは、以下の要素の連続を含む：（Ｎ末端からＣ末端への方向に）配列番号１、配列番号３、配列番号２、配列番号５、および配列番号６。別の実施形態において、融合タンパク質Ｌ１９−ＴＮＦアルファは、以下の要素の連続を含む：（Ｎ末端からＣ末端への方向に）配列番号１、配列番号３、配列番号２、配列番号５、および配列番号７。
【００４４】
本発明の一実施形態において、上記で定義された使用における融合タンパク質は、（ａ）Ｎ末端の標的部分およびＣ末端のエフェクター部分、または（ｂ）Ｎ末端のエフェクター部分およびＣ末端の標的部分を持つ。
【００４５】
本発明の別の実施形態によれば、標的部分は、癌胎児性ＥＤ−Ｂフィブロネクチンと特異的に結合する。
【００４６】
上記で定義された使用の別の実施形態において、標的部分とエファクター部分は、融合タンパク質リンカーによって結合されている。この融合タンパク質リンカーの好ましい実施形態は、配列番号５に記載されている。
【００４７】
本明細書で使用される用語「融合タンパク質リンカー」は、特に制限されず、アミノ酸、ペプチドまたは脂肪族性もしくは芳香族性有機分子のような、本発明に従った標的部分およびエフェクター部分を結合するのに使用できる全てのリンカーを含めてもよい。融合タンパク質リンカーの具体例は、欧州特許第０５７３５５１号明細書、欧州特許第０６２３６７９号明細書、および欧州特許第０３１８５５４号明細書に記載されている。
【００４８】
本発明の別の態様は、患者中のアテローム性動脈硬化プラークおよびそれに関連する病気の治療方法であって、前述の患者に本発明に従って融合タンパク質を投与する段階を含む、治療方法に関する。
【００４９】
本発明の融合タンパク質は、典型的には、一またはそれ以上の、薬理的に許容される担体、緩衝液または塩のような、助剤との併用で投与されてもよい。
【００５０】
本発明の組成物の投与経路は、特定の限定を示さず、そして、たとえば、皮下投与または静脈内投与であり得る。好ましい投与経路は、皮下適用および静脈内適用である。本発明で使用される「患者」という語は、哺乳動物、特にヒトを含む。
【００５１】
本発明の、ＩＬ２を有する融合タンパク質は、ヒト患者への一回投与につき約０．５から６０Ｍｉｏ  ＩＵ  ＩＬ２当量（０．８３５ｍｇから１０．０２ｍｇの融合タンパク質に対応する）投与してもよく、好ましくは、ヒト患者への一回投与につき５から６０Ｍｉｏ  ＩＵ  ＩＬ２当量（０．８３５ｍｇから１０．０２ｍｇの融合タンパク質に対応する）である。治療は、ｉｖまたはｓｃのいずれかで、非経口で、繰り返して投与してもよい（たとえば、１日目、３日目、５日目そして２２日目に投与する、または可能な限り毎日投与する）。異なる適用計画は、完全な臨床的利益を得るためには必要である。予防は、アテローム性動脈硬化症を発症する危険性のあるヒトに対して、同様の方法を適用することによりなし得る。
【００５２】
本発明は、アテローム性動脈硬化症の治療および予防のための医薬の製造における、少なくとも一つの標的部分と、少なくとも一つのエフェクター部分を含む融合タンパク質であって、当該標的部分がＥＤ−Ｂフィブロネクチンを特異的に認識し、特にフィブロネクチンのエキストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）に結合する融合タンパク質を提供する。ＥＤ−Ｂの発現は、ヒトおよび動物の体において非常にわずかの組織および／または部位でのみ見られ得るため、そして、それは、健康で成熟したヒトの器官の大部分で発現していないので、本発明の使用は、これらの組織および／または部位を標的とする、高い特異性を有する医薬の製造を有利に可能とする。したがって、本発明に従った融合タンパク質の使用を通じて、得られた医薬は、エフェクター部分を所望の組織または部位へ輸送することを可能にする。フィブロネクチンのＥＤ−Ｂへの、融合タンパク質の驚くほど高い特異性のため、サイトカインＩＬ２またはＴＮＦα、特にＩＬ２のような、適切なエフェクター部分の使用により、標的とされた組織および／または部位の、直接的および非常に効率的な治療を可能とする医薬が提供される。
【００５３】
たとえば、フィブロネクチンのＥＤ−Ｂに特異的なホモダイマーｓｃＦｖ  Ｌ１９抗体と接合することによって、アテローム性動脈硬化プラーク微小環境における、ＩＬ２のようなサイトカインの目標濃度は、サイトカインの治療指数を高め、そして同時に、その毒性副作用を減らし、それにより、アテローム性動脈硬化プラークおよびそれに関連したさらなる疾患の治療および予防のための価値ある臨床ツールを提供する。
【００５４】
本発明は、以下の実施例にさらに記載されており、それらに制限されるものではない。
【実施例】
【００５５】
実施例１：融合タンパク質Ｌ１９−ＩＬ２を用いたＡｐｏＥマウスの治療
アテローム性動脈硬化の進行、心筋イベント、およびの死亡率の評価のため、６ヶ月齢から７ヶ月齢のＡｐｏＥマウスに、標準固形飼料および高脂肪食を与えた。融合タンパク質Ｌ１９−ＩＬ２を、滅菌済みのリン酸緩衝生理食塩水に溶かして、ｉ．ｖ．注射で、１０6ＩＵ／ｋｇ  ＩＬ２当量で、３回／週、適用した。血液を、後眼窩採血（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ  ｂｌｅｅｄｉｎｇ）により採取した。実験経過を示す図は、図１に記載されている。
これらの実験結果は、意外にも、Ｌ１９−ＩＬ２を加えるとプラーク形成の減少につながることが分かったことを示す（図３）。
【００５６】
実施例２：心臓の組織学
心臓の組織学におけるＬ１９−ＩＬ２融合タンパク質の影響を決定するために、Ｌ１９−ＩＬ２で処置した動物およびコントロールの動物の両方の心臓の、梗塞の領域、単核細胞の浸潤および閉塞した冠動脈を分析した。この目的のため、組織サンプルを液体窒素中で瞬間凍結（ｓｎａｐ−ｆｒｏｚｅｎ）し、ＯＣＴに包埋し、免疫組織化学的検査のために−８０℃で保管した。この目的のために、５〜１０μＭの組織切片を固定し、標準的な免疫組織化学的手法に従ってそれぞれの抗体を用いて染色した。
組織学的実験は、コントロールとＬ１９−ＩＬ２で処置した動物との間で有意差がないことを実証している。
【００５７】
実施例３：血清のパラメーター
これらの血清学的実験によれば、コントロール群およびＬ１９−ＩＬ２を適用した群の両者において、トロポニンのレベル（心筋梗塞の高感度かつ高特異性の標識）に差がないことを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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