(57)【要約】  本発明は、トリパノソーマ・クルージ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）感染の診断に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトから採取した試験サンプルを４つの組換えポリペプチドＦＰ３、ＦＰ６、ＦＰ１０およびＴｃＦに接触させる段階と、および
前記試験サンプル中に存在する抗体が前記組換えポリペプチドの少なくとも２つに結合することを検出する段階と、
を含み、前記組換えポリペプチドの少なくとも２つに対する前記抗体の前記結合の存在が前記試験サンプル中のトリパノソーマ・クルージ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）の存在を示す指標となる、試験サンプル中のトリパノソーマ・クルージの同定方法。
【請求項２】
試験サンプルが血液、血清、血漿、唾液、脳脊髄液および尿から成るグループから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＪＬ８、ＴＣＲ２７、ＪＬ７、ＴＣＲ３９、ＰＥＰ−２、Ａｇ３６、ＪＬ９、ＴＣＮＡ、ＴｃＬｏ１．２、ＴＳ、ＴｃＤ、ＴｃＥ、ＦＣａＢＰ、Ｔｃ−２８、Ｔｃ−４０、ＦＬ−１６０、ＣＥＡ、ＣＲＰ、ＴｃＰ２βＮ−Ｃ２９およびＳＡ８５−１．１から成るグループから選択された少なくとも１つの追加の組換えポリペプチドに試験サンプルを接触させる段階をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
４つの組換えポリペプチドＦＰ３、ＦＰ６、ＦＰ１０およびＴｃＦと、第一対照および第二対照とが固定化されており、第一対照または第二対照のいずれか一方が他方の対照よりも低い濃度で固相に固定化されている固相。
【請求項５】
さらに、ＪＬ８、ＴＣＲ２７、ＪＬ７、ＴＣＲ３９、ＰＥＰ−２、Ａｇ３６、ＪＬ９、ＴＣＮＡ、ＴｃＬｏ１．２、ＴＳ、ＴｃＤ、ＴｃＥ、ＦＣａＢＰ、Ｔｃ−２８、Ｔｃ−４０、ＦＬ−１６０、ＣＥＡ、ＣＲＰ、ＴｃＰ２βＮ−Ｃ２９およびＳＡ８５−１．１から成るグループから選択された少なくとも１つの追加の組換えポリペプチドが固定化されている、請求項４に記載の固相。
【請求項６】
前記固相がニトロセルロース、ナイロン、プラスチックおよび紙から成るグループから選択される、請求項４に記載の固相。
【請求項７】
前記固相は前記ポリペプチドがその上に固定化されたストリップである、請求項４に記載の固相。
【請求項８】
前記ポリペプチドが前記固相に個別バンドとして配列されている、請求項４に記載の固相。
【請求項９】
個別試験バンドの形態で４つの組換えポリペプチドＦＰ３、ＦＰ６、ＦＰ１０およびＴｃＦがその上に固定化されておりおよび第一対照および第二対照が固定化され第一対照または第二対照のいずれか一方が低対照を構成するように他方の対照よりも低い濃度で固定化されている固相を用い、対象から採取した試験サンプルを固相に接触させる段階と、
固相を少なくとも１つの検出用試薬に接触させる段階と、
各試験バンドのシグナルの存在を同定することによって試験サンプル中に存在する抗体の結合を検出する段階と、
組換えポリペプチド試験バンドで同定されたシグナルの強度を低対照のシグナルの強度に比較する段階と、
を含み、組換えポリペプチド試験バンドで同定されたシグナルの少なくとも１つが低対照の強度と同等の強度を有するという条件付きで、少なくとも２つの組換えポリペプチド試験バンドにおけるシグナル同定が前記試験サンプル中のトリパノソーマ・クルージ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）の存在を示す指標となる、対象のトリパノソーマ・クルージの診断方法。
【請求項１０】
試験サンプルが血液、血清、血漿、唾液、脳脊髄液および尿から成るグループから選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記固相がニトロセルロース、ナイロン、プラスチックおよび紙から成るグループから選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
さらに、ＪＬ８、ＴＣＲ２７、ＪＬ７、ＴＣＲ３９、ＰＥＰ−２、Ａｇ３６、ＪＬ９、ＴＣＮＡ、ＴｃＬｏ１．２、ＴＳ、ＴｃＤ、ＴｃＥ、ＦＣａＢＰ、Ｔｃ−２８、Ｔｃ−４０、ＦＬ−１６０、ＣＥＡ、ＣＲＰ、ＴｃＰ２βＮ−Ｃ２９およびＳＡ８５−１．１から成るグループから選択された少なくとも１つの追加の組換えポリペプチドが固定化されている、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記固相は前記ポリペプチドがその上に固定化されたストリップである、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トリパノソーマ・クルージ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）感染の診断に関する。より特定的に本発明は、４つの組換えポリペプチドの新規な組合せを使用するトリパノソーマ・クルージ感染の同定および診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
トリパノソーマ・クルージ（“Ｔ．ｃｒｕｚｉ”）は、中南米およびメキシコの地域流行病であるシャガス病またはアメリカトリパノソーマ症を引き起こす原生寄生動物である。感染者の多くは、軽症の急性期の後、症状欠如、低寄生虫血症、および、様々なＴ．クルージ抗原に対する抗体を特徴とする終生の不確定期に入る。しかしながら、慢性Ｔ．クルージ感染者のほぼ１０から３０％は、寄生虫が持続的に存在する結果として心機能不全または胃腸機能不全を発症する。化学療法は、特に慢性感染症に対しては、概してあまり効果がない。流行地域諸国の慢性Ｔ．クルージ感染者は千二百万人と推定され、毎年そのうちのほぼ２５，０００人が典型的には心拍障害またはうっ血性心不全が原因で病死する（参照：Ｋｉｒｃｈｏｆｆ，Ｌ．Ｖ．，“Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｉａｓｉｓ（Ｃｈａｇａｓ’ｄｉｓｅａｓｅ）  ｉｎ  Ｔｒｏｐｉｃａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ”，Ｒ．Ｌ．Ｇｕｅｒａｎｔら，ｅｄｉｔｏｒｓ，ｐ．１０８２−１０９４，Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ２００６）。
【０００３】
流行地域においてＴ．クルージは主として吸血昆虫トリアトマ属によって伝搬される。また、慢性感染者が献血した血液の輸血によって伝搬が生じることもあり、歴史的には血液スクリーニングプログラム実施以前の流行地域諸国ではこの伝搬経路が主力であった（参照：Ｓｃｈｕｎｉｓ，Ｇ．Ａ．，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１８：１２−２９（２０００））。Ｔ．クルージの伝搬を防止するワクチンは存在しない。最近の数十年間に、シャガス病の流行地域諸国から合衆国への移民が著しく増加した。現在ではほぼ千三百万人のこれら移民が合衆国に在住しており、これらのうちのＴ．クルージ感染者は推定８０，０００から１２０，０００人である（参照：Ｋｉｒｃｈｏｆｆ，Ｌ．Ｖ．ら，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，４６：２９８−３０４（２００６））。かれらの存在が合衆国において輸血に関連した寄生虫伝搬の危険を生み出す。輸血関連シャガス病の５つの例が合衆国で既に報告されており、血液バンク当局は、はるかに多い数の未診断症例が生じている可能性を認めている（参照：Ｌｅｉｂｙ，Ｄ．Ａ．ら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３４１：１２３７−１２３９（１９９９）およびＹｏｕｎｇ，Ｃ．Ｔ．，“Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ａｃｑｕｉｒｅｄ  Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，”  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，Ｉｎ  ｐｒｅｓｓ（２００７））。現在、血液スクリーニングアッセイが食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認されていないので合衆国の血液資源はＴ．クルージのスクリーニングを行っていない。従って、Ｔ．クルージ感染は米国の血液資源に対する脅威となっている。Ｔ．クルージはまた、慢性感染者から得られた臓器の移植によって伝搬される。このような伝搬の多くの記録が流行地域諸国で報告されており、どれだけの人数の未検出者が合衆国に入ったかは明らかでない（参照：Ｍａｓｃｏｌａ，Ｌ．ら，ＭＭＷＲ，５５：７９８−７８０（２００６）およびＺａｙａｓ，Ｃ．Ｆ．，ら，ＭＭＷＰ，５１：２１０−２１２（２００１））。
【０００４】
慢性Ｔ．クルージの臨床検査診断は複雑である。血液培養または媒虫診断による寄生虫の証明は、時間がかかり、低感度で、高費用である。対照的に、Ｔ．クルージに対する抗体の血清学的アッセイは感染の迅速で廉価な診断に好適である。間接血球凝集反応アッセイ（“ＩＨＡ”）、間接免疫蛍光アッセイ（“ＩＦＡ”）および酵素結合免疫吸着剤アッセイ（“ＥＬＩＳＡ”）のような慣用の検査が流行地域諸国で広く使用されている。たいていは、無菌培養物中で増殖させたＴ．クルージ上鞭毛虫由来の全抗原性画分または半精製抗原性画分に基づく。慣用のアッセイで未解決の問題は、確定できない擬陽性結果が存在することである。（Ａｌｍｅｉｄａ，Ｉ．Ｃ．ら，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，３７：８５０−８５７（１９９７）；Ｋｉｒｃｈｏｆｆ，Ｌ．Ｖら，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，４６：２９８−３０４（２００６）；およびＬｅｉｂｙ，Ｄ．Ａ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３８：６３９−６４２（２０００））。Ｔ．クルージに対する抗体を検出するためにどの寄生虫抗原調製物が最適であるかについては意見の一致をみていない。全米保健機構（Ｐａｎ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）などの専門家グループは、並列処理を行う少なくとも２つの異なる方法によって献血された血液を試験することを勧告している（参照：“Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｃｈａｇａｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ”，Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，Ｇｅｎｅｖａ（２０００））。この方法は、血液バンクに膨大な業務と経済的負担を負わせることになる。
【０００５】
従って当業界では、臨床試験室および血液バンクで使用するための補助的アッセイが要望されている。Ｔ．クルージ感染の血清学的診断の信頼できる標準として一様に認められたアッセイは存在しない。ＰＣＲに基づくアッセイにはこの役割に必要な感度が不足している（参照：Ｇｏｍｅｓ，Ｍ．Ｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．，６０：２０５−２１０（１９９９））。極めて高い感度および特異度を有しており結果の解釈も容易な放射性免疫沈降アッセイ（“ＲＩＰＡ”）がほぼ２０年前に開発され、合衆国で確認試験として使用するように示唆されてきた（参照：Ｋｉｒｃｈｏｆｆ，Ｌ．Ｖ．ら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１５５：５６１−５６４（１９８７））。ＲＩＰＡは、現在までに報告された２０を超える研究プロジェクトで確認アッセイとして使用されてきたが（参照：Ｋｉｒｃｈｏｆｆ，Ｌ．Ｖ．ら，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，４６：２９８−３０４（２００６）およびＬｅｉｂｙ，Ｄ．Ａ．ら，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，４２：５４９−５５５（２００２））、その感度および特異度の妥当性検査が系統立てて行われたことはない。さらに、ＲＩＰＡは複雑であるため、研究機関外部で広く使用することは難しい（参照：Ｌｅｉｂｙ，Ｄ．Ａ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３８：６３９−６４２（２０００））。
【０００６】
Ｔ．クルージに対する抗体用の補助試験としてイムノブロットアッセイも研究された。数年前には、ニトロセルロース膜に結合した上鞭毛虫由来のＴ．クルージタンパク質抗原画分に基づくイムノブロットアッセイがシャガス病の補助試験として提案された（参照：Ｍｅｎｄｅｓ，Ｒ．Ｐ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３５：１８２９−１８３４（１９９７））。Ｔ．クルージに感染した哺乳類細胞の培養物中で産生された錐鞭毛虫の排泄−分泌抗原画分（“ＴＥＳＡ”）に基づくイムノブロットアッセイにも同様の役割が提案された（参照：Ｂｅｒｒｉｚｂｅｉｔｉａ，Ｍ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４４：２９１−２９６（２００６）；Ｕｍｅｚａｗａ，Ｅ．Ｓ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３４：２１４３−２１４７（１９９６））。これらの２つのアッセイのような培養物由来の抗原に基づくアッセイの重大な欠点は、生きた寄生虫の培養操作に固有のバイオハザードが存在すること、および、これらの複合抗原混合物をロット毎のむらが生じないように産生するのが難しいことである。さらに、これらの試験のうちで確認試験として採用されたものはなく、また、商業用に開発されたものもない。別のアッセイ、すなわち、ＩＮＮＯ−ＬＩＡシャガスアッセイは、プラスチックストリップ上に７つのＴ．クルージ単一ドメイン試験バンドを含む。しかしながら、異なる７つの組換え抗原が１つのストリップ上に存在することは感度の限定要因となる。さらに、７つの試験バンドの存在は解釈プロトコルを複雑にする。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｋｉｒｃｈｏｆｆ，Ｌ．Ｖ．，“Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｉａｓｉｓ（Ｃｈａｇａｓ’ｄｉｓｅａｓｅ）  ｉｎ  Ｔｒｏｐｉｃａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ”，Ｒ．Ｌ．Ｇｕｅｒａｎｔら，ｅｄｉｔｏｒｓ，ｐ．１０８２−１０９４，Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ２００６
【非特許文献２】Ｓｃｈｕｎｉｓ，Ｇ．Ａ．，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１８：１２−２９（２０００）
【非特許文献３】Ｋｉｒｃｈｏｆｆ，Ｌ．Ｖ．ら，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，４６：２９８−３０４（２００６）
【非特許文献４】Ｌｅｉｂｙ，Ｄ．Ａ．ら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３４１：１２３７−１２３９（１９９９）
【非特許文献５】Ｙｏｕｎｇ，Ｃ．Ｔ．，“Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ａｃｑｕｉｒｅｄ  Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，”  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，Ｉｎ  ｐｒｅｓｓ（２００７）
【非特許文献６】Ｍａｓｃｏｌａ，Ｌ．ら，ＭＭＷＲ，５５：７９８−７８０（２００６）
【非特許文献７】Ｚａｙａｓ，Ｃ．Ｆ．，ら，ＭＭＷＰ，５１：２１０−２１２（２００１）
【非特許文献８】Ａｌｍｅｉｄａ，Ｉ．Ｃ．ら，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，３７：８５０−８５７（１９９７）
【非特許文献９】Ｌｅｉｂｙ，Ｄ．Ａ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３８：６３９−６４２（２０００）
【非特許文献１０】“Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｃｈａｇａｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ”，Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，Ｇｅｎｅｖａ（２０００）
【非特許文献１１】Ｇｏｍｅｓ，Ｍ．Ｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．，６０：２０５−２１０（１９９９）
【非特許文献１２】Ｋｉｒｃｈｏｆｆ，Ｌ．Ｖ．ら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１５５：５６１−５６４（１９８７）
【非特許文献１３】Ｌｅｉｂｙ，Ｄ．Ａ．ら，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，４２：５４９−５５５（２００２）
【非特許文献１４】Ｍｅｎｄｅｓ，Ｒ．Ｐ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３５：１８２９−１８３４（１９９７）
【非特許文献１５】Ｂｅｒｒｉｚｂｅｉｔｉａ，Ｍ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４４：２９１−２９６（２００６）
【非特許文献１６】Ｕｍｅｚａｗａ，Ｅ．Ｓ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３４：２１４３−２１４７（１９９６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、当業界では依然として、高レベルの感度および特異度を示すことができ、解釈が容易であり、スクリーニングアッセイで境界にあるかまたは反応性である臨床標本および血液バンク標本の確認試験として使用するための適切なＴ．クルージ用アッセイが要望されている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の要旨
１つの実施態様において、本発明は試験サンプル中のトリパノソーマ・クルージの同定方法に関する。この方法は、
ヒトから採取した試験サンプルを４つの組換えポリペプチドＦＰ３、ＦＰ６、ＦＰ１０およびＴｃＦに接触させる段階と、および
該試験サンプル中に存在する抗体が該組換えポリペプチドの少なくとも２つに結合することを検出する段階と、
を含み、該組換えポリペプチドの少なくとも２つに対する該抗体の該結合の存在が該試験サンプル中のトリパノソーマ・クルージの存在を示す指標となる。
【００１０】
上記方法で接触させる試験サンプルは、血液、血清、血漿、唾液、脳脊髄液、尿または他の適切なサンプルでよい。加えて、上記方法は、ＪＬ８、ＴＣＲ２７、ＪＬ７、ＴＣＲ３９、ＰＥＰ−２、Ａｇ３６、ＪＬ９、ＴＣＮＡ、ＴｃＬｏ１．２、ＴＳ、ＴｃＤ、ＴｃＥ、ＦＣａＢＰ、Ｔｃ−２８、Ｔｃ−４０、ＦＬ−１６０、ＣＥＡ、ＣＲＰ、ＴｃＰ２βＮ−Ｃ２９およびＳＡ８５−１．１から成るグループから選択された少なくとも１つの追加の組換えポリペプチドに試験サンプルを接触させる段階をさらに含む。
【００１１】
別の実施態様において、本発明は、４つの組換えポリペプチドＦＰ３、ＦＰ６、ＦＰ１０およびＴｃＦと第一対照および第二対照とがその上に固定化された固相に関する。第一対照または第二対照のいずれか一方は他方の対照よりも低い濃度で固相に固定化されている。
【００１２】
これらのポリペプチドは個別バンドとして（または、スポットまたはドットとして）固相に配列され得る。この固相は、ニトロセルロース、ナイロン、プラスチックおよび紙または他の適切な固相から成るグループから選択できる。加えて、この固相は、該ポリペプチドがその上に固定化されたストリップでもよい。この固相にはさらに、ＪＬ８、ＴＣＲ２７、ＪＬ７、ＴＣＲ３９、ＰＥＰ−２、Ａｇ３６、ＪＬ９、ＴＣＮＡ、ＴｃＬｏ１．２、ＴＳ、ＴｃＤ、ＴｃＥ、ＦＣａＢＰ、Ｔｃ−２８、Ｔｃ−４０、ＦＬ−１６０、ＣＥＡ、ＣＲＰ、ＴｃＰ２βＮ−Ｃ２９およびＳＡ８５−１．１から成るグループから選択された少なくとも１つの追加の組換えポリペプチドを固定化し得る。
【００１３】
また別の実施態様において、本発明は、対象のトリパノソーマ・クルージの診断方法に関する。該方法は、
個別試験バンドの形態で４つの組換えポリペプチドＦＰ３、ＦＰ６、ＦＰ１０およびＴｃＦがその上に固定化されおよび第一対照および第二対照が固定化され第一対照または第二対照のいずれか一方が低対照を構成するように他方の対照よりも低い濃度で固相に固定化されている固相を用い、対象から採取した試験サンプルを固相に接触させる段階と、
固相を少なくとも１つの検出用試薬に接触させる段階と、
各試験バンドのシグナルの存在を同定することによって試験サンプル中に存在する抗体の結合を検出する段階と、
組換えポリペプチド試験バンドで同定されたシグナルの強度を低対照のシグナルの強度に比較する段階と、
を含み、組換えポリペプチド試験バンドで同定されたシグナルの少なくとも１つが低対照の強度と同等の強度を有するという条件を伴うならば、組換えトリパノソーマ・クルージの少なくとも２つの試験バンドのシグナルの同定が該試験サンプル中のＴ．クルージの存在を示す指標となる。
【００１４】
上記方法で接触させる試験サンプルは、血液、血清、血漿、唾液、脳脊髄液、尿またはその他の適切なサンプルでよい。上記方法で使用される固相に固定化されるポリペプチドは個別バンドとして（または、たとえばスポットまたはドットとして）固相に配列され得る。なお、この固相は、ニトロセルロース、ナイロン、プラスチックおよび紙またはその他の適切な固相から成るグループから選択できる。加えて、固相は、該ポリペプチドがその上に固定化されたストリップでよい。この固相にはさらに、ＪＬ８、ＴＣＲ２７、ＪＬ７、ＴＣＲ３９、ＰＥＰ−２、Ａｇ３６、ＪＬ９、ＴＣＮＡ、ＴｃＬｏ１．２、ＴＳ、ＴｃＤ、ＴｃＥ、ＦＣａＢＰ、Ｔｃ−２８、Ｔｃ−４０、ＦＬ−１６０、ＣＥＡ、ＣＲＰ、ＴｃＰ２βＮ−Ｃ２９およびＳＡ８５−１．１から成るグループから選択された少なくとも１つの追加の組換えポリペプチドを固定化し得る。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、代表的イムノブロットストリップを示す。４つの組換え抗原（“ｒａｇ”）ＦＰ３、ＦＰ６、ＦＰ１０およびＴｃＦがＴ．クルージに対する抗体検出用試験バンドとして使用される。３つのオンボード対照（“ＣＴＬ”）バンド、すなわち、ヤギ抗−ヒトＩｇＧ（“Ａｎｔｉ−ｈＩｇＧ”）、ｈＩｇＧ−低（“ｈＩｇＧ−Ｌ”）およびｈＩｇＧ−高（“ｈＩｇＧ−Ｈ”）も使用できる。ヤギ抗−ヒトＩｇＧはサンプル添加を確認するために使用され、ｈＩｇＧ−Ｌはバンド強度のカットオフを設定するために使用され、ｈＩｇＧ−Ｈは高強度バンドの参照基準として使用される。ストリップを使用して予想される結果を以下のように記述できる。陰性対照では３つのオンボード対照バンドが視認され、試験バンドは視認されない。陽性対照では３つのオンボード対照バンドが視認されることに加えて、４つの試験バンドも視認される。
【図２】図２は、本発明の代表的イムノブロットアッセイにおいて、試験抗原ＦＰ３、ＦＰ６、ＦＰ１０およびＴｃＦまたは対照抗原ｈＩｇＧ−Ｈ、ｈＩｇＧ−Ｌまたはヤギ抗−ヒトＩｇＧとの反応性に関して得られた典型的結果を示す。ストリップ１は陰性対照（“ＮＣ”）であり、オンボード対照セクションの３つのバンドを示す（Ｂｏｘ  Ａ）；ストリップ２はＴ．クルージ抗体陽性対照（“ＰＣ”）であり、３つのオンボード対照バンド（Ｂｏｘ  Ａ）に加えて４つの試験バンド（Ｂｏｘ  Ｂ）を示す；ストリップ３から６はオンボード対照バンド（Ｂｏｘ  Ａ）に加えて１から４つの試験バンド（Ｂｏｘ  Ｂ）を含むサンプルを示す。
【図３】図３は、本発明のイムノブロットアッセイの読取値を解釈するための代表的アルゴリズムの概略図である。試験バンドは組換え抗原ＦＰ１０、ＦＰ６、ＦＰ３およびＴｃＦを含む試験バンドである。個々のアッセイのおのおのが有効であるためには、３つのオンボード対照バンドがイムノブロットに含まれており（たとえば、ストリップ上に存在し）、アッセイによって検出されなければならない。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
発明の詳細な説明
定義
この文中に使用した“抗体”という用語は、免疫グロブリン分子またはその免疫活性部分、すなわち、抗原結合性部分を表す。免疫グロブリン分子の免疫活性部分の例は、抗体をペプシンのような酵素で処理することによって生成できるＦ（ａｂ）フラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントを含む。本発明に使用できる抗体の例は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、組換え抗体、一本鎖Ｆｖｓ（“ｓｃＦｖ”）、アフィニティ成熟抗体、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、ジスルフィド連結Ｆｖｓ（“ｓｄＦｖ”）および抗イディオタイプ（“抗−Ｉｄ”）抗体ならびに上記のいずれかの機能的に活性なエピトープ結合性フラグメントである。
【００１７】
この文中に使用した“ＦＰ３”という用語は、表１に示す抗原性ドメインおよび配列１の配列に示すアミノ酸配列を有しているＴ．クルージに由来の組換え融合ポリペプチド（抗原）を表す。ＦＰ３の作製方法はたとえば米国特許出願公開Ｎｏ．２００４／０１３２０７７に記載されており、該特許出願の記載内容は参照によってここに組込まれるものとする。この文中に使用した“ＦＰ３”という用語はまた、保存性置換および／または修飾などが違っているこのアミノ酸配列の変異形を包含する。
【００１８】
この文中に使用した“ＦＰ６”という用語は、表１に示す抗原性ドメインおよび配列２の配列に示すアミノ酸配列を有しているＴ．クルージに由来の組換え融合ポリペプチド（抗原）を表す。ＦＰ６の作製方法はたとえば米国特許出願公開Ｎｏ．２００４／０１３２０７７に記載されており、該特許出願の記載内容は参照によってここに組込まれるものとする。この文中に使用した“ＦＰ６”という用語はまた、保存性置換および／または修飾などが違っているこのアミノ酸配列の変異形を包含する。
【００１９】
この文中に使用した“ＦＰ１０”という用語は、表１に示す抗原性ドメインおよび配列３の配列に示すアミノ酸配列を有しているＴ．クルージに由来の組換え融合ポリペプチド（抗原）を表す。ＦＰ１０の作製方法はたとえば米国特許出願公開Ｎｏ．２００４／０１３２０７７に記載されており、該特許出願の記載内容は参照によってここに組込まれるものとする。この文中に使用した“ＦＰ１０”という用語はまた、保存性置換および／または修飾などが違っているこのアミノ酸配列の変異形を包含する。
【００２０】
この文中に使用した“ＴｃＦ”という用語は、表１に示す抗原性ドメインおよび配列４の配列に示すアミノ酸配列を有しているＴ．クルージに由来の組換え融合ポリペプチド（抗原）を表す。ＴｃＦの作製方法はたとえば米国特許Ｎｏ．６，４１９，９３３に記載されており、該特許の記載内容は参照によってここに組込まれるものとする。この文中に使用した“ＴｃＦ”という用語はまた、保存性置換および／または修飾などが違っているこのアミノ酸配列の変異形を包含する。
【００２１】
【表１】
2010507100.tif 000002
【００２２】
この文中に使用した“対象”および“患者”という用語は互換的に使用されている。この文中に使用した“対象”および“患者”という用語は、ヒトまたは動物を含む哺乳動物を表す。好ましくは対象がヒトである。
【００２３】
この文中に使用した“試験サンプル”という用語は、血清、血漿、全血、唾液、脳脊髄液、尿または他の体内流体に由来の生物サンプルまたは対象の適切な試験サンプルを表す。試験サンプルは当業者に公知の常套技術を使用して調製できる。試験サンプルはまた、輸血用血液資源から得られたサンプルを含む。
【００２４】
ポリペプチド（たとえば、非限定的に組換え融合ポリペプチドＦＰ３、ＦＰ６、ＦＰ１０およびＴｃＦ）に関連してこの文中に使用した“（１つ以上の）変異体”という用語は、５個以下のアミノ酸の置換、欠失または付加によって同定アミノ酸配列から変化したポリペプチドを表す。このような変異体は一般に、ポリペプチド配列を修飾し、修飾ポリペプチドの抗原特性を評価することによって同定できる。ポリペプチド変異体は同定ポリペプチドに対して少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約９０％、もっとも好ましくは少なくとも約９５％の一致（この文中に記載のような）を示す。この文中に使用した“保存性置換”という用語は、１つのアミノ酸が同様の特性を有している別のアミノ酸に置換しておりその結果としてポリペプチドの二次構造および疎水親水性が実質的に変化しないとペプチド化学の当業者が予想できる置換を表す。一般に、以下のアミノ酸グループの内部における変化は保存性変化を表す：（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；（３）ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；および（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓ。付加的または代替的に、変異体はまた、ポリペプチドの抗原特性、二次構造および／または疎水親水性に対する影響が極めて小さいアミノ酸の欠失または付加を含む他の修飾を含み得る。
【００２５】
サンプル中のＴ．クルージの同定方法
本発明は、試験サンプル中のＴ．クルージに対する抗体の同定方法に関する。方法は、Ｔ．クルージに接触したかまたはＴ．クルージに感染している疑惑のある対象から試験サンプルを採取する段階を含む。必要な試験サンプルの採取後、試験サンプルを４つの組換えポリペプチド（または抗原）ＦＰ３、ＦＰ６、ＦＰ１０およびＴｃＦに接触させる。試験サンプルを４つの組換えポリペプチドに接触させた後、試験サンプル中に各ポリペプチドに対する抗体が存在するか否かを判定し、（１）所定のカットオフ値、または、（２）１つ以上の対照から発生したシグナルの強度と比較する。代替実施態様において、血液資源中のＴ．クルージ感染を検出するためにこの文中に記載の方法を使用する。また別の代替的実施態様において、対象のＴ．クルージ感染を診断するためにこの文中に記載の方法を使用する。
【００２６】
この文中に記載の４つの組換えポリペプチドＦＰ３、ＦＰ６、ＦＰ１０およびＴｃＦを用いて試験サンプル中のＴ．クルージに対する抗体を検出するために、当業者に公知の様々な異なるアッセイフォーマットを使用できる。たとえば、１つのアッセイフォーマットにおいて、試験サンプルの１つ以上の抗体に結合して該抗体を試験サンプルから除去できるように１つ以上の組換えポリペプチドを固体支持体に固定化する。次に、ポリペプチド／抗体複合体に結合できかつ検出可能な標識を含有している検出可能な標識を使用して結合した１つ以上の抗体を検出できる。あるいは、１つ以上のポリペプチドに結合する抗体を利用する競合アッセイを使用できる。競合アッセイでは、１つ以上のポリペプチドに結合する抗体を検出可能な標識で標識し、試験サンプル中で組換えポリペプチドと共に温置を行って固定化組換えポリペプチドに結合させる。試験サンプルの成分が標識抗体と１つ以上の組換えポリペプチドとの結合をどのぐらい阻害したかという程度が１つ以上の固定化ポリペプチドに対するサンプルの反応性の指標となる。
【００２７】
検出可能な標識に関しては、当業界で公知のいかなる検出可能な標識も使用できる。たとえば、検出可能な標識は、放射性標識（たとえば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３２Ｐおよび３３Ｐなど）、酵素性標識（たとえば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリペルオキシダーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼなど）、化学発光性標識（たとえば、アクリジニウムエステル類、ルミナール、イソルミノール、チオエステル類、スルホンアミド類、フェナントリジニウムエステル類など）、蛍光標識（たとえば、フルオレセイン（たとえば、５−フルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、３’６−カルボキシフルオレセイン、５（６）−カルボキシフルオレセイン、６−ヘキサクロロ−フルオレセイン、６−テトラクロロフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナートなど））、ローダミン、フィコビリタンパク質、Ｒ−フィコエリトリン、量子ドット（たとえば、硫化亜鉛を被せたセレン化カドミウム）、温度測定標識または免疫ポリメラーゼ連鎖反応標識でよい。標識類、標識手順および標識の検出に関する概説は、Ｐｏｌａｋ  ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｎｏｏｒｄｅｎ，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９９７）、および、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎによって刊行されたハンドブックとカタログの統合版であるＨａｕｇｌａｎｄ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（１９９６）に見出される。
【００２８】
固体支持体は４つの組換えタンパク質が結合できる平均的な当業者に公知のいかなる材料でもよい。使用できる固体支持体の例は、マイクロタイタープレートの試験ウェル、ニトロセルロース、ナイロン、ビーズまたはディスク（ガラス、繊維ガラス、ラテックス、プラスチックまたは紙材料製）、ゲル（たとえば、ポリペプチドを流し込みその後乾燥されるゲル）、または、ストリップ、ディスクもしくはシート（ニトロセルロース、ナイロン、プラスチックまたは紙製）である。本発明の方法に好ましいアッセイフォーマットは、フロースルーフォーマットまたはストリップ試験フォーマットのイムノブロットアッセイである。フロースルーフォーマットまたはストリップ試験フォーマットでは、固体支持体がニトロセルロース、ナイロン、プラスチックまたは紙から製造されたストリップ、ディスクまたはシートの形態である。より好ましくは、この文中に記載の組換えポリペプチドがこのようなストリップ、ディスクまたはシートに固定化される。もっとも好ましくは、組換えタンパク質が平行な個別のバンド、スポットまたはドットとしてストリップ、ディスクまたはシート上に配列される（おのおのが単数の“試験”バンド、スポットまたはドットと表されるか、または、集合的に複数の“試験”バンド、スポットまたはドットと表される。）。組換えタンパク質は、当業界で公知の常套技術、たとえば、該ストリップ、ディスクもしくはシートに組換えタンパク質を噴射する（Ｂｉｏ−Ｄｏｔから入手できるような噴射器具（たとえば、ＡＪＱ３０００  Ａｉｒ  Ｊｅｔ  ＱｕａｎｔｉまたはＲＲ  ４２００−Ｄｉｐ  Ｔａｎｋ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）の使用）などの全自動技術、または、該ストリップ、ディスクまたはシートに組換えタンパク質をピペット滴下するような手動技術を使用して該ストリップ、ディスクまたはシートに固定化できる。シートを使用する場合、全部の組換えタンパク質をシートに固定化した後、当業界で公知の常套技術によってシートをアッセイに使用するためのストリップに裁断する。ストリップ、ディスクまたはシート上の組換えタンパク質（および、場合により何らかの対照）の位置は重要でない。加えて、ストリップ、ディスクまたはシートは接着、貼り合せなどのような当業界で公知の常套技術を使用してより強力に支持層に固定化できる。支持層はプラスチック、ボール紙などから製造できる。たとえばニトロセルロースのストリップまたはディスクは感圧プラスチックフィルムに貼り合せることができる。さらに、ストリップ、ディスクまたはシートが場合によっては、オンボード対照または試験バンド、スポットもしくはドットの配置に使用される不連続領域に加えて、サンプルの標識に使用される認識領域（図１の“ＩＤ＃”）を含み、これによって該サンプルを他のサンプルから識別できる（たとえば、名称、番号、英数字符号、バーコードまたは他の適切な手段）。
【００２９】
組換えポリペプチド（すなわち、ＦＰ３、ＦＰ６、ＦＰ１０およびＴｃＦ）は当業者に公知のいずれかの技術（たとえば、当業者に公知の方法であるウェスタンブロット法）を使用して固体支持体に結合または固定化され得る。さらに場合によっては、１つ以上の対照を固体支持体に固定化できる（たとえばイムノブロットアッセイに使用するため、すなわち、フロースルーフォーマットまたはストリップ試験フォーマットで使用するため）。この文中で互換的に使用した“結合した”または“固定化した”という用語は、吸着のような非共有的会合および共有結合（固体支持体上の組換えタンパク質と官能基との間の直接連鎖でもよくまたは架橋剤を介して得られる連鎖でもよい。）の双方を表す。ストリップ、ディスクまたはシートへの吸着による結合が好ましい。このような場合、適切なバッファ中の各組換えポリペプチドおよび場合により何らかの対照の溶液をストリップ、ディスクまたはシートに適切な総時間で接触させることによって吸着させる。接触時間は温度次第で変わるであろうが、約１時間から約２４時間までの範囲である。
【００３０】
必要ならば、支持体と組換えポリペプチドのヒドロキシル基またはアミノ基のような官能基との双方に反応性の二官能試薬に固体支持体を反応させることによって最初に組換えポリペプチド（および場合により何らかの対照）を固体支持体に共有結合させる。たとえば、適切なポリマーコーティングを有している支持体にベンゾキノンを使用してポリペプチドを結合させてもよく、または、支持体のアルデヒド基とポリペプチドのアミンおよび活性水素との縮合によって結合させてもよい。
【００３１】
組換えポリペプチド（および場合により何らかの対照）を支持体に固定化した後、支持体の残りのタンパク質結合部位を普通のやり方でブロックする。平均的な当業者に公知の適切なブロッキング剤を使用できる。たとえば、ウシ血清アルブミン（“ＢＳＡ”）、リン酸塩緩衝生理食塩水（“ＰＢＳ”）、カゼインのＰＢＳ溶液、トゥイーン２０ＴＭ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）およびその他のブロッキング剤を使用できる。後で乾燥させるゲルを含む支持体を使用する場合には支持体のブロッキングが場合によっては不要であろう。ブロッキングの完了後、支持体を場合によりＰＢＳなどで洗浄し、適切な総時間で乾燥させる（たとえば風乾によって）。乾燥時間は温度次第で変わるであろうが、約１時間から約２４時間までの範囲である。
【００３２】
固定化した組換えポリペプチド（および場合により１つ以上の対照）を次に試験サンプルと共に温置する。この温置に先立って、試験サンプルをＰＢＳのような適切な希釈剤で希釈するとよい。この温置中に、試験サンプル中に何らかの抗体が存在するならば、これらの抗体は固体支持体上の組換えポリペプチドの１つ以上に結合するであろう。温置期間は一般に、試験サンプル中のＴ．クルージ抗体の存在を検出できる十分な時間的期間である。好ましくは、温置期間は約１５分から約６時間の範囲である。もっとも好ましくは、温置期間は約１時間から約４時間の範囲である。
【００３３】
未結合の試験サンプルは、ＰＢＳまたはトリスバッファ（たとえば、２０ｍＭのトリス、０，１５％のトゥイーン２０ＴＭおよび０．１％のナトリウムアジドを含有するトリスバッファ）のような適切なバッファで固体支持体を洗浄することによって除去し得る。１種類以上の検出可能試薬を固体支持体に添加できる。適切な検出可能試薬は、固定化ポリペプチド−抗体複合体（および場合により固定化された何らかの対照）に結合し当業者に公知の様々な手段のいずれかによって検出できるいかなる化合物でもよい。好ましくは、検出可能試薬は、検出可能な標識とコンジュゲート形成された結合剤（プロテインＡ、プロテインＧ、免疫グロブリン、レシチンまたは遊離抗原等）を含有している。検出可能な標識と結合剤とのコンジュゲート形成は当業者に公知の標準方法を使用して行う。常用の結合剤は、Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）およびＰｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を非限定的に含む複数の市販ソースから様々な検出可能な標識とコンジュゲート形成された形態で購入できる。
【００３４】
１つ以上の検出用試薬を固定化ポリペプチド−抗体複合体（および場合により１つ以上の対照）と共に、１つまたは複数の結合抗体（および場合により１つ以上の対照）を検出するために十分な総時間で温置する。適切な温置時間は一般に製造業者の使用説明書から決定する、または、１つの時間的期間中に生じる結合のレベルを検定することによって決定できる。次に未結合の検出用試薬を除去し、結合した検出用試薬は検出可能な標識を使用して検出する。検出可能な標識の検出に使用される方法は、アッセイに使用される検出可能な標識の種類に従属する。たとえば、放射性標識の場合、シンチレーションカウンティングまたはオートラジオグラフ法を使用できる。化学発光性または蛍光性標識の場合には、分光分析法を使用できる。酵素性標識は一般に、基質を（通常は特定の時間的期間で）添加し、次いで反応生成物の分光分析または他の分析を行うことによって検出できる。
【００３５】
試験サンプル中のＴ．クルージ抗体の有無を判定するために、固体支持体に結合維持されている（１つ以上の）検出可能な標識から検出された（１つ以上の）シグナルを所定のカットオフ値に比較する。具体的には、このカットオフ値は、固定化組換えタンパク質をＴ．クルージ非感染対象から採取したサンプルと共に温置したときに得られた平均シグナルである。一般的に標準偏差が平均よりも３以上高いシグナルを発生する試験サンプルをＴ．クルージ抗体およびＴ．クルージ感染に陽性であると考える。
【００３６】
あるいは、数値を生成し得る濃度計のような明、暗または色の読取装置を使用するならば、受信動作特性曲線（“ＲＯＣ”）を使用し、Ｓａｃｋｅｔｔら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｂａｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｐ．１０６−１０７（Ｌｉｔｔｌｅ  Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｃｏ，１９８５）の方法を使用してカットオフ値を決定できる。簡単に説明すると、カットオフ値は、診断テスト結果に関する可能なカットオフ値のおのおのに対応する真陽性率（すなわち、感度）および擬陽性率（すなわち、１００％特異度）の対のプロットから決定され得る。左上隅に最も近いプロット上のカットオフ値（すなわち、最大面積を包囲する値）は最も正確なカットオフ値であり、この方法によって決定されたカットオフ値よりも高いシグナルを発生するサンプルは陽性であると考えてよい。あるいは、擬陽性率を最小にするためにカットオフ値をプロットに沿って左にシフトさせてもよい。一般に、この方法によって決定されたカットオフ値よりも高いシグナルを発生するサンプルはＴ．クルージ感染陽性であると考えられる。好ましくは、４つの組換えタンパク質ＦＰ３、ＦＰ６、ＦＰ１０およびＴｃＦのうちの少なくとも２つに抗体結合を示すシグナルの同定が該試験サンプル中のＴ．クルージ存在を示す指標となる。
【００３７】
この文中で先に論議したように、好ましいアッセイフォーマットはイムノブロットアッセイ、すなわち、４つの組換えポリペプチドＦＰ３、ＦＰ６、ＦＰ１０およびＴｃＦがストリップ、ディスクまたはシート、たとえばニトロセルロース、ナイロン、プラスチックまたは紙製のストリップ、ディスクまたはシートに、少なくとも４つの個別試験バンド、スポットまたはドットとして固定化されているフロースルーまたはストリップフォーマットである。これらの４つの組換えポリペプチドのおのおのはこの文中で前述した技術を使用してストリップ、ディスクまたはシート上に固定化できる。場合によっては、これらの４つのポリペプチド（すなわち、ＦＰ３、ＦＰ６、ＦＰ１０およびＴｃＦ）に加えて別の組換えポリペプチドをストリップ、ディスクまたはシートにさらに含ませてもよい。なお、ストリップ、ディスクまたはシートは、４つの組換えポリペプチドに加えて、個別の試験バンド、スポットまたはドットとしてその上に固定化された少なくとも１つの対照を含有する（おのおのが単数の“オンボード対照”バンド、スポットまたはドットと表される、または、集合的に複数の“オンボード対照”バンド、スポットまたはドットと表される）。ストリップ、ディスクまたはシートは、その上に固定化された２つの不連続個別対照（すなわち、第一対照および第二対照）を含有するのが好ましいと考えられ、もっとも好ましくはストリップ、ディスクまたはシートがその上に固定化された３つの不連続個別対照（すなわち、第一対照、第二対照および第三対照）を含有する。２つ以上の対照が存在するとき、対照は互いに同じものでも異なるものでもよい。好ましくは、対照の少なくとも２つ（たとえば、第一対照および第二対照など）が同じである。対照の２つが同じのとき、ストリップ、ディスクまたはシートに固定化された一方の対照（第一対照もしくは第二対照、３つの対照が存在するときは第一対照もしくは第三対照または第二対照もしくは第三対照）の濃度が、ストリップ、ディスクまたはシートに固定化された他方の対照の濃度よりも高いのが好ましい。他方の対照よりも高い濃度でストリップ、ディスクまたはシートに固定化された対照を“高対照”と呼ぶ。高対照よりも低い濃度でストリップ、ディスクまたはシートに固定化された対照を“低対照”と呼ぶ。ストリップ、ディスクまたはシート上に存在する低対照対高対照の濃度比は約１：２から約１：１０、好ましくは約１：５から約１：６にできる。たとえば、第一対照を低対照、第二対照を高対照にするとよい。あるいは、第一対照を高対照、第二対照を低対照にしてもよい。別の例として、ストリップ、ディスクまたはシートが３つの対照、すなわち、低対照、高対照および第三対照（たとえば、サンプル添加の確認に使用できる対照）を含有することもできる。低対照および高対照の双方がヒトＩｇＧであり（この場合低対照対高対照の比は約１：２から約１：１０）、第三対照がヤギ抗−ヒトＩｇＧであってもよい。
【００３８】
フロースルーフォーマットにおいて、組換えポリペプチドが結合されているストリップ、ディスクまたはシートの一端を試験サンプル含有溶液に浸漬させる。あるいは、ストリップ、ディスクまたはシート全体を希釈剤と共に反応トレーに配置し、次に試験サンプルを反応トレーに加えてもよい。この文中に前述した同じ時間および技術を使用して試験サンプルとストリップとを十分な時間的期間で温置する。未結合の試験サンプルはこの文中に前述した技術を使用して除去できる。このフォーマットにおいては、試験サンプルが膜を通過するときに試験サンプル中の抗体が固定化ポリペプチド（および少なくとも１つの対照）に結合する。少なくとも１種類の検出用試薬（たとえば、この文中で前述したような検出可能な標識含有検出用試薬）を添加できる。少なくとも１種類の検出用試薬は、検出用試薬を含有する溶液がストリップに沿って流れるときに、各ポリペプチドおよび形成されたポリペプチド−抗体複合体に結合する。試験サンプル中のＴ．クルージ抗体の有無を判定するための結合した検出用試薬の検出は、上述のようにカットオフ値を使用するかまたは以下に詳述するように１つ以上の対照から発生した１つ以上のシグナルを比較することによって行うことができる。
【００３９】
上述のように低対照および高対照をフロースルーフォーマットに使用するとき、試験サンプル中のＴ．クルージ抗体の有無は、ポリペプチド試験バンド（またはスポットまたはシート）のおのおのに存在する検出可能な標識からのシグナルを同定することによって判定するのが好ましい。もし１つのポリペプチドの１つの試験バンドで１つのシグナルが同定されるならば、検出されたこのシグナルの強度を次に低対照バンド（またはスポットまたはシート）および高対照バンド（またはスポットまたはシート）からのシグナルの強度に０から４＋の評価段階を使用して比較する。視認できるバンドが全く存在しないとき読取値は０である。低対照バンドおよび高対照バンドの強度をそれぞれ１＋（低対照）および３＋（高対照）と定義する。低対照バンドと同等の強度をもつ試験バンドを１＋と評価する。低対照バンドと高対照バンドとの間の強度をもつバンドを２＋と評価する。高対照バンドと同等の強度をもつバンドを３＋と評価する。高対照バンドよりも高い強度をもつバンドを４＋と評価する。低対照バンドよりも低い強度の不鮮明バンドを＋／−と評価する（表２参照）。表３に図解の代表的アルゴリズムに示すように、イムノブロットアッセイの結果として、（１）（低対照、高対照および陰性対照のバンド以外に）視認できるバンドが存在しないか、または、（２）（低対照、高対照および陰性対照のバンド以外に）視認できるバンドが１つだけが存在するならば、試験サンプルをＴ．クルージ陰性と考える。同じく表３に図解の代表的アルゴリズムに示すように、イムノブロットアッセイの結果として２つ以上の組換えポリペプチドバンドがシグナルを示すならば、以下の分析を行う必要がある。具体的には、もし全部のバンドが低対照よりも弱い強度を示すならば、すなわち、全部のバンドが＋／−と評価されたときは、試験サンプルをＴ．クルージ感染不確定と考える。しかしながら、バンドのうちの少なくとも１つが１＋以上と評価されたならば、試験サンプルをＴ．クルージ陽性と考える。
【００４０】
【表２】
2010507100.tif 000003
【００４１】
この文中に記載した４種類よりも多い組換えポリペプチドを使用して上述のアッセイを行うこともできる。使用できる他の組換えＴ．クルージポリペプチドの例は非限定的に、ＪＬ８、ＴＣＲ２７、ＪＬ７、ＴＣＲ３９、ＰＥＰ−２、Ａｇ３６、ＪＬ９、ＴＣＮＡ、ＴｃＬｏ１．２、ＴＳ、ＴｃＤ、ＴｃＥ、ＦＣａＢＰ、Ｔｃ−２８、Ｔｃ−４０、ＦＬ−１６０、ＣＥＡ、ＣＲＰ、ＴＣＰ２βＮ−Ｃ２９およびＳＡ８５−１．１を含む。これらの各組換えポリペプチドのアミノ酸配列およびその作製方法は当業者に公知である。たとえば、ＰＥＰ−２、ＴｃＤおよびＴｃＥのアミノ酸配列は、米国特許Ｎｏ．６，０５４，１３５に開示されている。ポリペプチドＪＬ８、ＴＣＲ２７、ＴＣＲ３９、Ａｇ３６、ＪＬ９、ＴＣＮＡおよびＦＣａＢＰは、Ｆｒａｓｃｈ，Ａ．Ｃ．Ｃ．ら，“Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ  ａｎｔｉｇｅｎｓ，”Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ７：１４８−１５１（１９９１）に論議されている。ポリペプチドＴｃ−２８は、Ａｂａｔｅ，Ｔ．ら，“Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｐａｒｔｉａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ２８ｋＤａ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ，”Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．，２６：１２１−１３０（１９９３）に論議されている。Ｔｃ−４０  ｃＤＮＡのヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列は、Ｌｅｓｅｎｅｃｈａｌ，Ｍ．ら，“Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｆ  Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ，”Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．，８７：１９３−２０４（１９９７）に記載されている。ポリペプチドＦＬ−１６０およびＳＡ８５−１．１は、Ｃｅｎｔｒｏｎ，Ｍ．Ｓ．ら，“Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｔｒｙｐｏｍａｓｔｉｇｏｔｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｏｆ  Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ  ｉｎ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｓｅｒａ  ｆｒｏｍ  ａ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｕｒａｌ  Ｎｏｒｔｈｅａｓｔｅｒｎ  Ｂｒａｚｉｌ  ｅｎｄｅｍｉｃ  ｆｏｒ  Ｃｈａｇａｓ  ｄｉｓｅａｓｅ，”Ａｃｔａ  Ｔｒｏｐ．，５０：２５９−２６６（１９９２）に論議されている。ポリペプチドＣＥＡは、Ｊａｚｉｎ，Ｅ．Ｅ．ら，“Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ  ｅｘｏａｎｔｉｇｅｎ  ｉｓ  ａ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ａ  １６０  ｋＤａ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ，”Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．，１１０：６１−６９（１９９５）に論議されている。ＣＲＰのアミノ酸配列（ＣＲＰ−１０として同定）は、Ｎｏｒｒｉｓ，Ｋ．Ａ．ら，“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  １６０−ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ  Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ，”Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６５：３４９−３５７（１９９７）に記載されている。ポリペプチドＪＬ７は、Ｕｍｅｚａｗａ，Ｅ．Ｓ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，３７：１５５４−１５６０（１９９９）およびＣｏｔｒｉｍ，Ｐ．Ｃ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２８：５１９−５２４（１９９０）に論議されている。ポリペプチドＴｃＬｏ１．２は、Ｈｏｕｇｈｔｏｎ，Ｒ．Ｌ．ら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，１７９：１２２６−１２３４（１９９９）に論議されている。ポリペプチドＴｃＰ２βＮ−Ｃ２９は、Ａｇｕｉｒｒｅ，Ｓ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，４４（１０）：３７６８−３７７４（Ｏｃｔ  ２００６）に記載されている。
【００４２】
加えて、他の疾患、障害または状態を検出するため、特に他の寄生虫疾患を検出するためのポリペプチド抗原をさらに含むようにイムノアッセイを設計できる。シャガス病（アメリカトリパノソーマ症）を引き起こす寄生虫と同様に、アフリカ睡眠病（アフリカトリパノソーマ症）およびリーシュマニア症を引き起こす寄生虫は５億人におよぶ世界の最貧民にとって命にかかわる疾患の原因となっている。従って場合によっては本発明によるイムノブロットが、アフリカ睡眠病および／またはリーシュマニア症のような他の寄生虫疾患を検出するためのポリペプチドをさらに含む。
【００４３】
非限定的な例として本発明の実施例を以下に示す。
【実施例１】
【００４４】
イムノブロットアッセイフォーマット
イムノストリップ調製。ヒトＩｇＧ−高濃度（“ＩｇＧ−Ｈ”）、ヒトＩｇＧ−低濃度（“ＩｇＧ−Ｌ”）、ヤギ抗−ヒトＩｇＧの溶液（３つのオンボード対照バンド）ならびに組換え抗原（“ｒＡｇ”）ＦＰ１０、ＦＰ６、ＦＰ３およびＴｃＦ（４つの試験バンド）の溶液を調製した。具体的には、各タンパク質を、ｐＨ７の２０ｍＭの３−（Ｎ−モルホリノール−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸ナトリウムバッファに溶解した。Ｂｉｏ−Ｄｏｔ（Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）製のマイクロプロセッサ制御ＸＹＺ３０５０計量供給システムを使用し、１ｃｍあたり１マイクロリットルの各タンパク質をニトロセルロース膜シート（０．４５ミクロン，５×３０ｃｍ；Ｗｈａｔｍａｎ  Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｅｌｌ，Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）の図１に示した相対位置に平行線として噴射した。噴射溶液は以下の濃度を有していた：ＴｃＦは７５マイクログラム／ｍｌ；ＦＰ３は０．４マイクログラム／ｍｌ；ＦＰ６は０．７マイクログラム／ｍｌ；ＦＰ１０は６マイクログラム／ｍｌ；ヤギ抗−ヒトＩｇＧは２５マイクログラム／ｍｌ；ＩｇＧ−Ｌは２５マイクログラム／ｍｌおよびＩｇＧ−Ｈは１５マイクログラム。乾燥後（３７℃、３０分）、１％のカゼインを含むリン酸塩緩衝生理食塩水（“ＰＢＳ”）で膜をブロックし、ＰＢＳ中で数回洗浄し、再度風乾した。最終段階として、膜シートを感圧プラスチックフィルムに貼り合せ、４ｍｍ幅のストリップに裁断した。タンパク質の充填量は、陰性対照標本（図２、ストリップ１）がいかなる試験バンドも（対照バンドであるヤギ抗−ヒトＩｇＧ、ＩｇＧ−ＬおよびＩｇＧ−Ｈ以外には）呈示せず、陽性対照標本（図２、ストリップ２）が４つの試験バンドを呈示し、どちらの場合にも３つの対照バンドが反応性であるように調整した。反応性サンプルのパネル（図２、ストリップ３から６）は３つの対照バンドに加えて１から４つの試験バンドを呈示した。
【００４５】
対照標本。陰性対照は、Ｂ型肝炎表面抗原（“ＨＢｓＡｇ”）アッセイ、ならびに、Ｂ型肝炎ウイルスのコアタンパク質（“ＨＢｃｏｒｅ”）、Ｃ型肝炎ウイルス（“ＨＣＶ”）、ヒト免疫不全ウイルス（“ＨＩＶ”）およびヒトＴ細胞リンパ親和性ウイルス（“ＨＴＬＶ”）に対する抗体アッセイで陰性を示したカルシウム再沈着正常ヒト血漿であった。Ｔ．クルージ抗体陽性対照は、シャガス病と診断された血液ドナーから採取した数単位の血漿のプールから得られた。陽性血漿は、ＥＬＩＳＡ−Ｉ（ラテンアメリカで市販されている溶菌液に基づく試験）、ＥＬＩＳＡ−ＩＩ（５１０（ｋ）で認可された組換え抗原に基づく試験）およびＲＩＰＡを含む複数のＴ．クルージ抗体試験によって陽性を確認した。
【００４６】
試験手順。陽性および陰性の対照標本を各処理に含ませた。粒状物質を除去するために予め凍結した血清または血漿のサンプルを試験に先立って１．５ｍｌのエッペンドルフ管で微量遠心した（１４，０００ｒｐｍ、５分）。一度も凍結しなかったサンプルは遠心しなかった。１ｍｌの希釈剤とイムノストリップとをイムノブロット反応トレー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）の各トラフに配置し、５分間温置した。各温置段階中は、揺動装置に載せてトラフの中味をゆるやかにかき混ぜた。希釈剤中のストリップを収容した各トラフに２０μｌのサンプルを加えて、周囲温度で２時間温置し、次いで吸引し、トリスバッファ（ｐＨ８．０，２０ｍＭのトリス、０．１５％のトゥイーン−２０および０．１％のナトリウムアジド）で３回洗浄した。１ｍｌのアルカリホスファターゼ共役ヤギ抗−ｈＩｇＧ抗体溶液を各トラフに添加した。１時間の温置後、各トラフを吸引し、３回洗浄した。この後、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム（“ＢＣＩＰ／ＮＢＴ”；２０ｍｌ蒸留水中に１錠；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の基質溶液を各ウェルに０．７ｍｌずつ添加し、周囲温度で１０分間温置して発色させた。次いで、吸引し、蒸留水で３回洗浄することによって発色を停止させた。その後、ストリップをトラフから取出し、風乾して、目視で読取を行った。アッセイ総時間は約４時間であった。
【００４７】
試験結果の解釈。試験標本中のＴ．クルージ抗体反応性は４つの試験バンドの強度をストリップの頂上部の２つのＩｇＧ対照バンドの強度に目視で比較することによって０から４＋の評価段階を使用して判定する。視認できるバンドが全く存在しないとき、読取値は０であり、対照バンドＩｇＧ−ＬおよびＩｇＧ−Ｈの強度をそれぞれ１＋および３＋と定義する。これらの指標に基づいて、ヒトＩｇＧ−Ｌ対照の強度と同等の強度をもつ試験バンドを１＋と評価し、ＩｇＧ−Ｌ対照とＩｇＧ−Ｈ対照との中間の強度をもつバンドを２＋と評価し、ＩｇＧ−Ｈ対照の強度と同等の強度をもつバンドを３＋と評価し、ＩｇＧ−Ｈ対照の強度より高い強度をもつバンドを４＋と評価する。最後に、ＩｇＧ−Ｌ対照の強度よりも弱い強度をもつ不鮮明なバンドを＋／−と評価する。
【００４８】
他の血清学的アッセイ。Ａｂｂｏｔｔ  ＰＲＩＳＭ（Ｒ）シャガスアッセイ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）は、以前にＣｈａｎｇ，ＣＤら，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ４６：１７３７−１７４４（２００６）に記載されたようにして行った。ＲＩＰＡは、従来の文献に記載されたようにして行った（参照：Ｋｉｒｃｈｏｆｆ，Ｌ．Ｖ．ら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１５５：５６１−５６４（１９８７）およびＫｉｒｃｈｏｆｆ，Ｌ．Ｖ．ら，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，４６：２９８−３０４（２００６））。また、すべてのＲＩＰＡ試験は盲検で行った。
【００４９】
シャガス病標本。合計３４５のＴ．クルージ抗体陽性ヒト血清または血漿標本は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒｅｄ  Ｃｒｏｓｓ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｕｒｓｔ，ＴＸ）、ＢｉｏＣｌｉｎｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＭＡ）、Ｂｉｏｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ，Ｉｎｃ．（Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）、Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ，Ｉｎｃ．（ＢＢＩ，Ｗｅｓｔ  Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＭＡ）、Ｇｏｌｄｆｉｎｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．（Ｉｏｗａ  Ｃｉｔｙ，ＩＡ）、Ｔｅｒａｇｅｎｉｘ  Ｃｏｒｐ．（Ｆｔ．Ｌａｕｄｅｒｄａｌｅ，ＦＬ）およびＦｅｄｅｒａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂａｈｉａ（Ｓａｌｖａｄｏｒ，Ｂａｈｉａ，Ｂｒａｚｉｌ）から入手した。これらの標本は、多くの中南米諸国、メキシコおよび合衆国のＴ．クルージ感染者から採取した（以下の表３参照）。すべての標本が２または３種類の慣用のＴ．クルージイムノアッセイ（ＩＨＡ、ＩＦＡおよびＥＬＩＳＡ）で陽性であり、ＲＩＰＡでも陽性であった。
【００５０】
【表３】
2010507100.tif 000004
【００５１】
無作為ドナー集団。無作為に選択されたドナーから採取した合計５００の標本（血清（１５０）およびＥＤＴＡ血漿（３５０））は、Ｇｕｌｆ  Ｃｏａｓｔ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）から得られた。これらの非関連標本は無作為ドナーから収集され、献血施設（ｄｏｎａｔｅｄ  ｕｎｉｔｓ）で行った６つの常套試験のいずれかで陽性結果が得られたという理由でこのグループから除去された標本はなかった。全部の標本を収集後１０日以内にイムノブロットアッセイおよびＡｂｂｏｔｔ  ＰＲＩＳＭ（Ｒ）シャガスアッセイの双方で試験した。Ａｂｂｏｔｔ  ＰＲＩＳＭ（Ｒ）シャガスアッセイで０．９０以上のＳ／ＣＯ値を有していたすべての反応性サンプルをＥＬＩＳＡ−Ｉ、ＥＬＩＳＡ−ＩＩおよびＲＩＰＡで試験した。
【００５２】
疑惑のある標本。他の疾患に血清学的に陽性であるかまたは干渉性物質を含有する疑惑のある合計２７１の保存血清または血漿標本をイムノブロットアッセイにかけた。このグループは以下を保有する個体から採取した標本を含んでいた：サイトメガロウイルス（“ＣＭＶ”）（ｎ＝４）、エプスタイン・バーウイルス（“ＥＢＶ”）（ｎ＝１４）、Ａ型肝炎ウイルス（“ＨＡＶ”）（ｎ＝１０）、ぜん虫または腸原虫（ｎ＝５）、ＨＩＶ（ｎ＝１０）、単純疱疹ウイルス（“ＨＳＶ”）（ｎ＝１５）、らい病（ｎ＝１５）、風疹（ｎ＝１０）、梅毒（ｎ＝１０）、トキソプラズマ症（ｎ＝５）、結核（ｎ＝３）、酵母（ｎ＝１０）、水痘−帯状疱疹ウイルス（“ＶＺＶ”）（ｎ＝１０）、ホモリシス（ｎ＝２０）、高−ＩｇＧ（ｎ＝１０）、高−ＩｇＭ（ｎ＝１０）、高ビリルビン血症（ｎ＝１０）、高トリグリセリド血症（ｎ＝１５）、ワクチン化インフルエンザ（ｎ＝１５）、多発性骨髄腫（ｎ＝１５）、多発性硬化症（ｎ＝５）、リウマトイド因子（ｎ＝１５）、ヒト抗−マウス抗体（ｎ＝１５）、全身性ループス・エリテマトーデス（ｎ＝１１）およびリーシュマニア症（ｎ＝９）。これらの標本は、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）、ＰｒｏＭｅｄＤｘ（Ｎｏｒｔｏｎ，ＭＡ）、ＳｅｒａＣａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｗｅｓｔ  Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＭＡ）およびＨｅｍａｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｆｔ．Ｌａｕｄｅｒｄａｌｅ，ＦＬ）を含む多くの販売業者から購入した。これらの２７１のサンプルを本発明のイムノブロットアッセイおよび原形Ａｂｂｏｔｔ  ＰＲＩＳＭ（Ｒ）シャガスアッセイで試験した。後者で繰り返して反応性であった全部の標本をＥＬＩＳＡ−Ｉ、ＥＬＩＳＡ−ＩＩで試験し、次いでＲＩＰＡでさらに確認した。
【００５３】
結果。本発明のイムノブロットアッセイで得られた結果を図１に示す。図１では、３つのオンボード対照バンドおよび４つのｒＡｇ（ＦＰ１０、ＦＰ６、ＦＰ３およびＴｃＦ）試験バンドの位置が明示されている。３４５のＴ．クルージ抗体陽性標本の全部がイムノブロットアッセイで２つ以上の試験バンドを呈示した。これらの標本のうちの合計２７７標本が４つの試験バンドを呈示し、６０標本が３つのバンドを呈示し、８標本が２つのバンドを呈示し、注目すべきことに単一バンドを呈示したかまたは完全に陰性であった標本はなかった。陽性サンプルに伴う試験バンドのほとんどがＩｇＧ−Ｌ対照バンド（１＋）以上の強度を示した。なお、３４５標本全部がＡｂｂｏｔｔ  ＰＲＩＳＭ（Ｒ）シャガスアッセイおよびＥＬＩＳＡ−ＩＩに反応性であった。対照的に、この３４５標本グループ中のＥＬＩＳＡ−Ｉで試験した２７２標本のうちの６標本は、これら全部がベースラインを上回る０．６０から０．８９の範囲のＳ／ＣＯ値を有していたにもかかわらず陰性であった（以下の表４参照）。これらの一致を欠くサンプルはＲＩＰＡで弱陽性と確認され、イムノブロットアッセイで２または３の試験バンドを呈示し、少なくとも１つのバンド強度が１＋以上であった。最初の２７２の陽性標本の試験で観察されたＥＬＩＳＡ−Ｉの検出レベルが低いので、ＥＬＩＳＡ−ＩはＡｂｂｏｔｔ  ＰＲＩＳＭ（Ｒ）シャガスアッセイに繰り返して反応性のサンプルのクロスチェックには使用したが、新たに取得したシャガス病サンプルに対する他のアッセイとの以後の感度比較からは除外した。
【００５４】
【表４】
2010507100.tif 000005
【００５５】
５００の無作為ドナー標本を本発明のイムノブロットアッセイおよび原形Ａｂｂｏｔｔ  ＰＲＩＳＭ（Ｒ）シャガスアッセイで試験した。本発明のイムノアッセイでは、１標本が単一の１＋試験バンドを呈示し、他の２つの標本が不鮮明な（＋／−）試験バンドを呈示した。これらのサンプルのうちにはＡｂｂｏｔｔ  ＰＲＩＳＭ（Ｒ）シャガスアッセイに反応性のサンプルも２つのＥＬＩＳＡのいずれかに反応性のサンプルもなかった。従ってこれらのサンプルは、ＲＩＰＡに送らなかった。これらの標本について３つの比較アッセイで得られた陰性結果を考えると、本発明のイムノブロットアッセイで観察される低い反応性は非特異的であると考えられる。
【００５６】
本発明のイムノブロットアッセイで試験した様々な疾患状態または干渉性物質の疑惑のある２７１標本のうちで、２６５標本が試験バンドを呈示せず、４標本が単一１＋バンドを呈示し、２標本が３つの試験バンドを呈示した。単一試験バンドを呈示した４標本はＡｂｂｏｔｔ  ＰＲＩＳＭ（Ｒ）シャガスアッセイで非反応性であった。しかしながら、３つの試験バンドを呈示した標本はＡｂｂｏｔｔ  ＰＲＩＳＭ（Ｒ）シャガスアッセイ、ＥＬＩＳＡ−ＩおよびＥＬＬＳＡ−ＩＩでも反応性であり、ＲＩＰＡで陽性であると確認された（以下の表５参照）。さらに、以下の表５に示すように、Ａｂｂｏｔｔ  ＰＲＩＳＭ（Ｒ）シャガスアッセイで０．９０を上回るＳ／ＣＯ値を与えた３標本はＲＩＰＡによって確認されず、イムノブロットアッセイで試験バンドを示さなかった。
【００５７】
【表５】
2010507100.tif 000006
【００５８】
合計１，１１６となるこれらの３つの標本グループを試験することによって得られた結果に基づいて、イムノストリップに出現する試験バンドのパターンを解釈するために以下のスキームを使用できる：ａ）バンドなしまたは単一バンド−陰性；ｂ）少なくとも１つのバンドが１＋以上の強度をもつ２つ以上のバンド−陽性；ｃ）多数の不鮮明なバンド（＋／−）−不確定（図３参照）。
【００５９】
このスキームを３４５のＴ．クルージ抗体陽性標本で得られた試験バンドのパターンに当てはめると、全部が陽性であると考えられ、従って１００％の感度を与えている（３４５／３４５）。５００の無作為ドナー標本について、４９７標本は試験バンドを呈示せず、２標本は単一の１＋バンドを呈示し、１標本は不鮮明バンド（＋／−）を呈示した。従って、全部が陰性であり、確定特異度は１００％（５００／５００）である。結局、このスキームを使用すると、本発明のイムノブロットアッセイは疾患状態または干渉性物質を伴う２７１標本で１００％（２６９／２６９）の確定特異度を示した。
【００６０】
Ａｂｂｏｔｔ  ＰＲＩＳＭ（Ｒ）シャガスアッセイおよびイムノブロットアッセイの開発中に、合衆国の無作為ドナーの約４２，０００の非関連血清および血漿標本を試験し、Ａｂｂｏｔｔ  ＰＲＩＳＭ（Ｒ）シャガスアッセイで繰り返して反応性であったかまたはグレーゾーンにあった２１標本を見出した。このグループの６標本はＥＬＩＳＡ−ＩおよびＥＬＩＳＡ−ＩＩに反応性であり、ＲＩＰＡによって陽性であると確認された（以下の表６参照）。これらの６標本のうちの５標本はイムノブロットアッセイで３または４つの試験バンドを示し、従って陽性であると解釈された。このグループの６番目の標本＃５０６０はイムノブロットアッセイの開発を始める前に足りなくなったのでイムノブロットアッセイで試験できなかった。
【００６１】
【表６】
2010507100.tif 000007
【００６２】
残りの１５のＡｂｂｏｔｔ  ＰＲＩＳＭ（Ｒ）シャガスアッセイ反応性標本は、そのほとんどが比較的低いＳ／ＣＯを有しており、全部がＲＩＰＡ陰性であった（以下の表７参照）。全部がＥＬＩＳＡ−Ｉ陰性であったが、ＥＬＩＳＡ−ＩＩでは２標本が反応性であり、２標本がグレーゾーンに存在した。イムノブロットアッセイでは、これらの１５標本のうちの８標本が試験バンドを呈示せず、他の７標本が単一バンドを呈示し、このうちには、図２のストリップ３のような単一ＦＰ３バンドを呈示した＃１６６０が含まれていた。従って、上述の解釈スキームを当てはめると１５標本全部が陰性であると確定された。
【００６３】
【表７】
2010507100.tif 000008
【００６４】
本発明のイムノブロットシャガスアッセイは、４つの試験バンドにだけ反復的および非反復的セグメントを含む１４の別々の抗原性ドメインを提供する（表１参照）。この編制は偽陰性反応の危険を顕著に低下させる可能性を保持しており、同時に、図３に示した簡単な解釈スキームを可能にする。この解釈スキームは、上述の陽性および陰性の３つの標本グループを本発明のイムノブロットアッセイにかけて得られた結果を分析することによって開発された。結果は、陽性判定には２つの試験バンドの反応性が必要であることを明らかに示す。抗−Ｔ．クルージ抗体の確認に２つの反応性試験バンドが必要な解釈スキームの採用は、ＨＩＶ（参照：Ｍａｌｄａｒｅｌｌｉ，Ｆ．，“Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，”ｐ．１５０６−１５２７，Ｇ．Ｌ．Ｍａｎｄｅｌｌ，Ｊ．Ｅ．ＢｅｎｎｅｔｔおよびＲ．Ｄｏｌｉｎ（ｅｄｓ．），Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、および、ライム病（Ｌｙｍｅ  ｂｏｒｒｅｌｉｏｓｉｓ）（参照：Ａｇｕｅｒｏ−Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｍ．Ｅ．，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１８：４８４−５０９（２００５））を確認するために使用されたウェスタンブロットの解釈と同じ方針であり、また、ＨＣＶに対する抗体の組換えイムノブロットアッセイの解釈と同じ方針である（参照：Ｔｏｂｌｅｒ，Ｌ．Ｈ．，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，４０：９１７−９２３（２０００））。これらの３つのアッセイすべてが、特異的感染を陽性同定するために２つ以上の試験バンドを必要とする。
【００６５】
なお、Ｔ．クルージ抗体陽性であることがわかっている３４５標本のグループの上述のような本発明のイムノブロットアッセイに関しては、アッセイ感度は１００％であった。標本の地理的分散度（前出の表３参照）および高力価予選択が存在しないことを考えるとこの結果は特に重要である。このグループの全部の標本がＡｂｂｏｔｔ  ＰＲＩＳＭ（Ｒ）シャガスアッセイおよび組換えＥＬＩＳＡ−ＩＩに反応性であったが、溶菌液に基づくＥＬＩＳＡ−Ｉで試験した２７２標本のうちの６標本が陰性であった。６標本全部がＲＩＰＡで弱陽性であり、これらの結果は、３４５陽性標本のグループにＴ．クルージ抗原に対する広範囲の反応性が存在したことおよびイムノブロットアッセイが低力価陽性を検出できることを示唆する。
【００６６】
Ｔ．クルージ抗体陰性と推定される２つの標本グループでは、図３に示した上述の解釈スキームを使用したときの本発明のイムノブロットアッセイの特異度は１００％であった。テキサスから入手した５００の無作為ドナー標本は全部がイムノブロットアッセイで陰性であり、Ａｂｂｏｔｔ  ＰＲＩＳＭ（Ｒ）シャガスアッセイおよび２種類のＥＬＩＳＡでも陰性であり、従ってＲＩＰＡで試験しなかった。試験した潜在的に交差反応性の２７１標本のうちの、らい病および腸原虫感染のある患者から採取した２つのブラジル人の標本はイムノブロットアッセイで陽性であり（３つの試験バンド）、また、ＲＩＰＡを含む他のアッセイでも明らかに陽性であり、従って、それらが真陽性であることを示唆した（前出の表５参照）。合衆国から採取した３標本はＡｂｂｏｔｔ  ＰＲＩＳＭ（Ｒ）シャガスアッセイで陽性であり、１標本がＥＬＩＳＡ−ＩＩで反応性であった。しかしながら、ＥＬＩＳＡ−ＩおよびＲＩＰＡでは全部が陰性であった。重視すべきは、これらの標本がいずれも本発明のイムノブロットアッセイで試験バンドを呈示しなかったことであり、従って、本発明のイムノブロットアッセイは他のアッセイで不一致の標本を確定するための有効なツールであることが示唆される。結局、この疑惑標本のグループに対するイムノブロットアッセイの確定特異度は１００％（２６９／２６９）であった。
【００６７】
最終標本グループの試験もまた、本発明のイムノブロットアッセイが確認試験として有効であることを示す。上記に説明したように、約４２，０００の非関連合衆国無作為ドナー標本のうちで２１標本がＡｂｂｏｔｔ  ＰＲＩＳＭ（Ｒ）シャガスアッセイまたはイムノブロットアッセイで反応性であった。６サンプルは総合的に陽性であり、十分な量が残っていた５サンプルはイムノブロットアッセイで明らかに陽性であり、３または４つの試験バンドを呈示した（前出の表６参照）。他の１５標本についてＡｂｂｏｔｔ  ＰＲＩＳＭ（Ｒ）シャガスアッセイで得られた結果に関しては（前出の表７参照）、これらの標本全部がＡｂｂｏｔｔ  ＰＲＩＳＭ（Ｒ）シャガスアッセイで比較的低いＳ／ＣＯを有しており、ＥＬＩＳＡ−Ｉではある程度反応性であったが最終的には陰性であった。１５標本のうちの４標本はＥＬＩＳ−ＩＩで反応性であった。重視すべきは、１５標本全部がＲＩＰＡで陰性であったことであり、また、全部のＲＩＰＡ試験が盲検であったことも言及に値する。最後に、１５標本全部がイムノブロットアッセイで陰性であった。表７から明らかなように、ほぼ半数の標本が何らかの反応性を示したが、図３に示した上述の解釈スキームを使用したときに陽性の標本はなかった。これらの１５標本が恐らくは合計４２，０００試験標本中で最も難題であることを考慮に入れると、これらの標本全部が本発明のイムノブロットアッセイでＲＩＰＡの結果に１００％一致するように確定されたことは予想外であった。結論として、これらの知見およびこの実施例で試験した他の標本グループを試験することによって得られた知見は、本発明のイムノブロットアッセイが慢性Ｔ．クルージ感染の正確な血清学的確認試験を提供できることを示す。
【００６８】
本発明が、その目的の実行、また、上記の目的および利点ならびに本発明に固有の目的および利点の獲得に適応可能であることを当業者は容易に理解されるであろう。この文中に記載した分子複合体、方法、手順、処理、分子、具体的化合物は、好ましい実施態様の現在の代表であり、好適例であり、本発明の範囲を限定するものではない。本発明の範囲および要旨を逸脱することなくこの文中に開示した本発明に対する様々な置換および変更が可能であることは当業者に容易に理解されよう。
【００６９】
明細書において言及したすべての特許および刊行物は、本発明が所属する分野の当業者のレベルを示す。個々の刊行物のおのおのが具体的かつ個別的に参照によって組込まれるとする指示と同様に、すべての特許および刊行物は参照によってこの文中に組込まれるものとする。
【００７０】
この文中に例示的に記載した本発明は、この文中に具体的に開示しなかった１つまたは複数の要素、１つまたは複数の限定が存在しない場合にも適切に実施されるであろう。従って、たとえばこの文中ではどの場合にも“含む”、“本質的にから構成されている”および“から構成されている”という用語は他の２つの用語のいずれかで置換できる。使用した用語および表現は、記述目的で使用したものであって限定目的で使用したものではなく、このような用語および表現を使用することによって図示および記載の特徴に等価の特徴またはその部分を排除する意図はなく、特許請求の範囲に記載の本発明の範囲内で多様な修正が可能であると理解される。従って、本発明は好ましい実施態様および選択自在な特徴によって具体的に開示されたが、当業者がこの文中に開示された概念の修正および変更を援用できること、および、このような修正および変更は特許請求の範囲に定義された本発明の範囲内に存在すると考えるべきであることを理解されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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