(57)【要約】  本発明は、宿主細胞内でBMP-7ポリペプチドを発現する組換えベクターおよびこのような組換えベクターを含む医薬組成物に関する。本発明はまた、本発明の組換えベクターおよび医薬組成物の腎血管内投与による、哺乳動物、好都合にはヒト、イヌおよびネコにおける、急性および慢性の腎不全の予防および/または治療の方法も含む。
2010508867.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロモーターに作動可能に連結されているBMP-7ポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換えプラスミドベクターであって、前記BMP-7ポリペプチドが、ネコプレプロBMP-7ポリペプチド、ネコプロBMP-7ポリペプチド、ネコ成熟BMP-7ポリペプチド、ヒトプレプロBMP-7ポリペプチド、ヒトプロBMP-7ポリペプチドおよびヒト成熟BMP-7ポリペプチドを含む群から選択されるか;または
前記BMP-7ポリペプチドをコードする核酸配列が、BMP-7活性を有するポリペプチドをコードする、配列番号13、配列番号14、配列番号17、配列番号18ならびにそれらのフラグメント、変種、誘導体およびホモログを含む群から選択されるか;または
前記BMP-7ポリペプチドが、BMP-7活性を有する、配列番号15、配列番号19ならびにそれらのフラグメント、変種、誘導体およびホモログを含む群から選択されるアミノ酸配列を有するか;または
前記BMP-7ポリペプチドが、BMP-7シグナル配列、IGF-1シグナル配列およびtPAシグナル配列を含む群から選択されるシグナルペプチドを含むか;または
前記シグナルペプチドが、シグナルペプチド活性を有するペプチドをコードする、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号11ならびにそれらのフラグメント、変種、誘導体およびホモログを含む群から選択されるヌクレオチド配列によりコードされるか;または
前記シグナルペプチドが、シグナルペプチド活性を有する、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号12ならびにそれらのフラグメント、変種、誘導体およびホモログを含む群から選択されるアミノ酸配列を有するか;または
前記プラスミドがpMEB038であり、配列番号16のヌクレオチド配列を有するか;または
前記プラスミドがpMEB039であり、配列番号20のヌクレオチド配列を有する、
前記組換えプラスミドベクター。
【請求項２】
請求項1記載の組換えプラスミドベクターおよび場合により少なくとも1つの薬学的または獣医学的に許容される担体、賦形剤またはビヒクルを含む医薬組成物。
【請求項３】
腎不全を患っているかまたは発症する恐れがある哺乳動物被験者を治療する方法であって、プロモーターに作動可能に連結されているBMP-7ポリペプチドをコードする核酸配列を含むプラスミドの治療的有効量を前記哺乳動物被験者に投与することを含み、前記BMP-7ポリペプチドが、シグナルペプチド活性を有するペプチドをコードする、配列番号15、配列番号19ならびにそれらのフラグメント、変種、誘導体およびホモログを含む群から選択されるアミノ酸配列を有する、前記方法。
【請求項４】
腎不全の発症の恐れがある哺乳動物被験者における腎不全の発症を予防する方法であって、プロモーターに作動可能に連結されているBMP-7ポリペプチドをコードする核酸配列を含むプラスミドベクターの有効量を前記哺乳動物被験者に投与することを含み、前記BMP-7ポリペプチドが、BMP-7活性を有するポリペプチドをコードする、配列番号13、配列番号14、配列番号17、配列番号18ならびにそれらのフラグメント、変種、誘導体およびホモログを含む群から選択されるアミノ酸配列を有する、前記方法。
【請求項５】
腎不全を患っているかまたは発症する恐れがある哺乳動物被験者を治療する方法であって、プロモーターに作動可能に連結されているBMP-7ポリペプチドをコードする核酸配列を含むプラスミドの治療的有効量を前記哺乳動物被験者に投与することを含み、前記プラスミドが、腎臓内、筋肉内または血管内経路で前記哺乳動物被験者の腎臓に投与されるか;または
前記BMP-7ポリペプチドが、プレプロBMP-7ポリペプチド、プロBMP-7ポリペプチドおよび成熟BMP-7ポリペプチドを含む群から選択されるか;または
前記BMP-7ポリペプチドが、BMP-7活性を有する、配列番号3、配列番号15、配列番号19ならびにそれらのフラグメント、変種、誘導体およびホモログを含む群から選択されるアミノ酸配列を有するか;または
前記BMP-7ポリペプチドをコードする核酸配列が、BMP-7活性を有するポリペプチドをコードする、配列番号1、配列番号2、配列番号13、配列番号14、配列番号17、配列番号18ならびにそれらのフラグメント、変種、誘導体およびホモログを含む群から選択されるか;または
前記BMP-7ポリペプチドが、シグナルペプチドであって、BMP-7シグナル配列、IGF-1シグナル配列およびtPAシグナル配列を含む群から選択される前記シグナルペプチドを含むか;または
前記シグナルペプチドが、シグナルペプチド活性を有する、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号12ならびにそれらのフラグメント、変種、誘導体およびホモログを含む群から選択されるアミノ酸配列を有するか;または
前記シグナルペプチドが、シグナルペプチド活性を有するペプチドをコードする、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号11ならびにそれらのフラグメント、変種、誘導体およびホモログを含む群から選択されるヌクレオチド配列によりコードされるか;または
前記プラスミドがpMEB038であり、配列番号16のヌクレオチド配列を有するか;または
前記プラスミドがpMEB039であり、配列番号20のヌクレオチド配列を有するか;または
前記プラスミドがpNB292であり、配列番号10のヌクレオチド配列を有する、前記方法。
【請求項６】
哺乳動物被験者においてBMP-7ポリペプチドがin vivoで発現される、請求項5記載の方法。
【請求項７】
哺乳動物被験者がイヌ、ヒトおよびネコを含む群から選択される、請求項5記載の方法。
【請求項８】
腎不全の発症の恐れがある哺乳動物被験者における腎不全の発症を予防する方法であって、プロモーターに作動可能に連結されているBMP-7ポリペプチドをコードする核酸配列を含むプラスミドベクターの有効量を前記哺乳動物被験者に投与することを含み、前記プラスミドが、腎臓内、筋肉内または血管内経路で前記哺乳動物被験者の腎臓に投与される、前記方法。
【請求項９】
BMP-7ポリペプチドが、プレプロBMP-7ポリペプチド、プロBMP-7ポリペプチドおよび成熟BMP-7ポリペプチドを含む群から選択されるか;または
BMP-7ポリペプチドが、BMP-7活性を有する、配列番号3、配列番号15、配列番号19ならびにそれらのフラグメント、変種、誘導体およびホモログを含む群から選択されるアミノ酸配列を有するか;または
BMP-7ポリペプチドをコードする核酸配列が、BMP-7活性を有するポリペプチドをコードする、配列番号1、配列番号2、配列番号13、配列番号14、配列番号17、配列番号18ならびにそれらのフラグメント、変種、誘導体およびホモログを含む群から選択されるか;または
BMP-7ポリペプチドが、シグナルペプチドであって、BMP-7シグナル配列、IGF-1シグナル配列およびtPAシグナル配列を含む群から選択される前記シグナルペプチドを含むか;または
シグナルペプチドが、シグナルペプチド活性を有するペプチドをコードする、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号11ならびにそれらのフラグメント、変種、誘導体およびホモログを含む群から選択されるヌクレオチド配列によりコードされるか;または
シグナルペプチドが、シグナルペプチド活性を有する、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号12ならびにそれらのフラグメント、変種、誘導体およびホモログを含む群から選択されるアミノ酸配列を有するか;または
プラスミドがpMEB038であり、配列番号16のヌクレオチド配列を有するか;または
プラスミドがpMEB039であり、配列番号20のヌクレオチド配列を有するか;または
プラスミドがpNB292であり、配列番号10のヌクレオチド配列を有する、
請求項8記載の方法。
【請求項１０】
哺乳動物被験者がイヌ、ヒトおよびネコを含む群から選択される、請求項8記載の方法。
【請求項１１】
腎不全を患っているかまたは発症する恐れがある哺乳動物被験者を治療する方法であって、プロモーターに作動可能に連結されているBMP-7ポリペプチドをコードする核酸配列を含むプラスミドの治療的有効量を前記哺乳動物被験者に投与することを含み、前記プラスミドが腎臓内または血管内経路で前記哺乳動物被験者の腎臓に投与され、前記BMP-7ポリペプチドが哺乳動物被験者においてin vivoで発現される前記方法。
【請求項１２】
BMP-7ポリペプチドが、プレプロBMP-7ポリペプチド、プロBMP-7ポリペプチドおよび成熟BMP-7ポリペプチドを含む群から選択されるか;または
BMP-7ポリペプチドが、BMP-7活性を有する、配列番号3、配列番号15、配列番号19ならびにそれらのフラグメント、変種、誘導体およびホモログを含む群から選択されるアミノ酸配列を有するか;または
BMP-7ポリペプチドをコードする核酸配列が、BMP-7活性を有するポリペプチドをコードする、配列番号1、配列番号2、配列番号13、配列番号14、配列番号17、配列番号18ならびにそれらのフラグメント、変種、誘導体およびホモログを含む群から選択されるか;または
BMP-7ポリペプチドが、シグナルペプチドであって、BMP-7シグナル配列、IGF-1シグナル配列およびtPAシグナル配列を含む群から選択される前記シグナルペプチドを含むか;または
シグナルペプチドが、シグナルペプチド活性を有するペプチドをコードする、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号11ならびにそれらのフラグメント、変種、誘導体およびホモログを含む群から選択されるヌクレオチド配列によりコードされるか;または
シグナルペプチドが、シグナルペプチド活性を有する、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号12ならびにそれらのフラグメント、変種、誘導体およびホモログを含む群から選択されるアミノ酸配列を有するか;または
プラスミドがpMEB038であり、配列番号16のヌクレオチド配列を有するか;または
プラスミドがpMEB039であり、配列番号20のヌクレオチド配列を有するか;または
プラスミドがpNB292であり、配列番号10のヌクレオチド配列を有するか;または
哺乳動物被験者がイヌ、ヒトおよびネコを含む群から選択されるか;または
プラスミドが、VR1012プラスミドに挿入されたBMP-7ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、
請求項11記載の方法。
【請求項１３】
投与が血行力学ベースのプラスミドDNA遺伝子送達であるか;または
前記送達が腎静脈内注入による裸のプラスミドの送達である請求項11記載の方法。
【請求項１４】
(i)閉塞バルーンカテーテルを哺乳動物被験者の腎静脈に挿入し;(ii)腎静脈をバルーンの膨張により閉塞し;(iii) 約0.5〜約3ml/sの流量を確実にするために、プラスミド約0.0005〜0.5mg/kg量を、約5〜約25ml、すなわち約0.5〜約2.5ml/kgの生理食塩緩衝液を用いて腎静脈に急速に注入し;(iv)急速注入の間中バルーン閉塞を続け、注入後約10秒〜約3分で停止し;(v)閉塞バルーンを除去する;または(iii)プラスミド約0.2mg/kg量を生理食塩緩衝液約15mlを用いて静脈に急速に注入し;または(iii)約1ml/sの流量で強力注入器を用い;または(iv)急速注入の間中バルーン閉塞を続け、注入1分後に停止して投与を行う、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
哺乳動物被験者がイヌ科動物である、請求項13記載の方法。
【請求項１６】
BMP-7ポリペプチドが、イヌプレプロBMP-7ポリペプチド、イヌプロBMP-7ポリペプチド、イヌ成熟BMP-7ポリペプチドを含む群から選択される、請求項14記載の方法。
【請求項１７】
プラスミドがpNB292であり、配列番号10のヌクレオチド配列を有する、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
哺乳動物被験者がネコ科動物である、請求項13記載の方法。
【請求項１９】
BMP-7ポリペプチドが、ネコプレプロBMP-7ポリペプチド、ネコプロBMP-7ポリペプチド、ネコ成熟BMP-7ポリペプチドを含む群から選択されるか;またはプラスミドがpMEB039であり、配列番号20のヌクレオチド配列を有する、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
哺乳動物被験者がヒトである、請求項13記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、米国特許出願第11/803,991号(出願日:2007年5月16日);米国特許出願第11/801,798号(出願日:2007年5月11日)(米国特許出願第11/599,026号(出願日:2006年11月14日)の一部継続出願)の一部継続出願であり、米国仮出願第60/736,452号(出願日:2005年11月14日)に基づく優先権を主張する。
【０００２】
引用による取込
本明細書に引用または参照したすべての文献(“本明細書に引用した文献”)および本明細書に引用した文献において引用または参照されたすべての文献は、本明細書または本明細書に引用により組み込まれた任意の製品に関する任意の製造業者の使用説明書、説明書、製品仕様書および製品シートと共に参照により本願に組み込まれ、本発明の実施において用いることができる。
【０００３】
技術分野
本発明は、哺乳動物における急性および/または慢性腎不全の予防および/または治療のための、組換えベクター、このような組換えベクターを含む医薬組成物ならびに方法に関する。本発明はまた、骨原性因子タンパク質-1/骨形成タンパク質-7(OP-1/BMP-7)タンパク質ファミリーに属する生物活性ポリペプチドを宿主内で発現することができるベクターにも関する。本発明はまた、このようなベクターによる腎血管内遺伝子治療にも関する。
【背景技術】
【０００４】
哺乳動物の腎臓系は、血流からの異化老廃物の除去および体内での水分と電解質のバランスの維持の両方において主な役割を果たしている。従って、腎不全は、異化産物および他の毒素の蓄積ならびに/または電解質もしくは水分における顕著な不均衡の発生が、他の主要臓器系不全および死をもたらしうる、生命を危うくする状態である。一般に、腎不全は、“急性”または“慢性”として分類される。以下に詳述するように、急性および慢性の腎不全は、この疾患に付随する腎臓の構造変化を遅延および/または覆させる適切な治療が存在しない、衰弱させ、生命を危うくする疾患である。
【０００５】
急性腎不全(ARF)は、通例、腎機能の突然の低下をもたらす虚血または中毒性発作により引き起こされる。腎臓は、その独特の解剖学的および生理学的特徴により、虚血および毒物に大変影響を受けやすい。高い腎血流量(心拍出量のおおよそ25%)により、他の臓器と比較して、血液由来毒物の腎臓への送達強化がもたらされる。腎皮質は、腎血流量の90%を受け入れ、多数の糸球体毛細血管による大きな内皮表面積を有しているため、特に毒物暴露の影響を受けやすい。腎皮質内において、近位尿細管(S3セグメントまたは“直部”)およびヘンレ係蹄の太い上行脚の上皮細胞は、それらの溶質輸送機能および高い代謝速度により、虚血および毒物誘発障害に最も強く影響を受ける。糸球体濾液から水および電解質が再吸収されるので、尿細管上皮細胞はそれだけ高濃度の毒物に暴露されうる。同様に、髄質においては、対向流増幅系が毒物を濃縮しうる。尿細管上皮細胞により分泌または再吸収される毒物(ゲンタマイシンなど)は、これらの細胞内に高濃度に蓄積されうる。最後に、腎臓は、多くの薬物および毒物の生体内変換にも関与する。通例、生体内変換は、親化合物よりも毒性の低い代謝物の生成をもたらす。しかしながら、場合によっては(例えば、エチレングリコールのグリコール酸およびシュウ酸への酸化)、代謝物はより毒性が高い。
【０００６】
ARFは、3つの異なる期を有し、それらは開始期、維持期および回復期に分類される。開始期においては、腎障害を軽減する治療処置(例えば、補液療法)により、ARFの発症確定を予防することができる。維持期は、尿細管病変およびネフロン機能障害確定を特徴とする。ARFの回復期は、ネフロン修復および代償性肥大の後に腎機能が改善するとき現れる。尿細管基底膜が無傷であり、生存細胞が存在する場合、尿細管病変は修復できる。さらに、生存しているネフロンの機能的および形態学的肥大により、ネフロン数の減少を適切に補償できる場合がある。腎機能回復が不十分であっても、適切な機能を回復できる場合がある。しかしながら、より一般的には、尿細管障害は重篤かつ不可逆的であり、かなりの割合の動物は、ARFの維持期において死ぬかまたは安楽死させられる。
【０００７】
過去数10年間を通じての、ARFの分子細胞病因を解読するための膨大な努力にもかかわらず、現在有効な治療は存在せず、獣医学においては、死亡率は大変高いままである。少なくとも2つの後向き研究において、イヌのARFに関する予後不良が記録されている。院内感染性ARFの研究においては生存率38%であったが、すべてのタイプのARFの他の研究においては生存率24%であった。従って、ARFの予防および/または治療の改善のための、まだ満たされていない医療ニーズが存在する。
【０００８】
慢性腎不全(CRF)は、顕著で継続的なネフロンの減少による、糸球体濾過率(GFR)の進行性、恒久的で有意な減少として定義できる。典型的には、ネフロン機能単位の有意の減少を引き起こす腎組織へのある程度の障害により慢性腎機能障害(すなわち、腎機能における少なくとも50〜60%の恒久的低下)が生じた時点でCRFが開始される。初期障害は、急性腎不全のエピソードとは関連しない場合もあった。初期障害の性質にかかわらず、ネフロンが徐々に消失し、GFRが徐々に低下するため、CRFは徴候および症状の“最終共通路”を表す。このような腎機能の進行性喪失は、緩慢であり、一見したところ不可避であり、一般的には、イヌおよびネコの被験者においては数か月から数年におよび、ヒト患者においては数十年におよぶ。
【０００９】
CRFの初期段階は、典型的には、正常レベル(例えば、平均ヒト成人に関して30〜40ml/分)のおおよそ3分の1にGFRが低下したときに開始される。顕著なネフロン減少の結果として、かつより少ないネフロンにより全GFRを維持するためのみかけの“試み”において、構造的および機能レベルの両方での、残存ネフロンの適応により、平均単一ネフロンGFR(SNGFR)は増加する。生検試料の顕微鏡検査により容易に検出できるこの適応の構造発現の1つは、腎臓の糸球体および尿細管の両方の“代償性肥大”であり、糸球体および尿細管の文字通りの拡大により、それぞれの残存ネフロンによりつくることができる濾液量を実際に増すためのプロセスである。
【００１０】
集合管の肥大または拡張の結果として、CRF被験者の尿は、しばしば、正常直径の2〜6倍の円柱(本明細書においては、“ろう様円柱(broad cast)”または“腎不全円柱”と呼ぶ)を含有する。このようなろう様円柱の存在は、CRFの診断に役立つ。同時に、残存ネフロンにおける機能的変化、例えば正常に排出される溶質の吸収低下または分泌増大が見られるが、これらは体内の他の場所でのホルモンまたはパラクリンの変化(例えば、カルシウムおよびリン酸の血清レベルの変化に応じた副甲状腺ホルモン(PTH)レベルの上昇)への応答である可能性がある。
【００１１】
初期CRFにおけるこれらの適応では、GFRまたは腎機能の他のパラメータを完全には回復することはできず、実際、残存ネフロン減少のリスクは増加している。例えば、SNGFR上昇は、高血圧および過灌流による糸球体への機械的負荷と関連している。タコ足細胞連結の完全性の低下は、糸球体の高分子への透過性亢進または糸球体嚢の“漏れやすさ”をもたらす。コラーゲンおよび他のマトリックスタンパク質の沈着の増加ばかりでなく、メサンギウム細胞、上皮細胞および内皮細胞における増殖効果もまた見られる。糸球体および尿細管の両方の硬化症は肥大したネフロンのもう1つのよく見られる症状であり、糸球体の凝固のリスクは増加している。特に、SNGFRをその正常濃度よりもはるか上に押し上げることによる残存ネフロンのこれらの適応は、水、溶質または酸負荷の急激な変化に応答する残存ネフロンの能力を実際に低下させ、それによって、さらなるネフロン減少の確率を実際に高める。
【００１２】
CRFが進行し、GFRが正常値(すなわち、ヒトにおいてはおよそ5〜10ml/分)の10%未満に低下し続けたとき、被験者は末期の腎臓病(ESRD)に突入する。この期の間、残存ネフロンが老廃物を適切に除去し、水分と電解質のバランスを維持することができないことにより急速な衰えをもたらし、多くの臓器系、特に心血管系が機能しなくなり始める恐れがある。この時点で、患者が腎代替療法(すなわち、慢性血液透析、持続的腹膜透析または腎移植)を受けなければ、腎不全は急速に進行し、死に至る。
【００１３】
限定するものではないが、高窒素血症、栄養不足、低増殖性貧血、ミネラル代謝異常、電解質障害、代謝性アシドーシス、タンパク尿、水分代謝障害、全身性高血圧および特定の病因にかかわらず一般にCRFの収束結果と考えられる間質性線維症による腎障害の進行を含む、腎不全により引き起こされるすべての識別しうる臨床、代謝、内分泌および生化学的結果を改善するためにCRFの管理を行わなくてはならない。
【００１４】
この10年間に、CRFのいくつかの臨床、代謝、内分泌および生化学的結果と取り組むための大きな進歩が見られたにもかかわらず、臨床的に慢性線維症の療法はいまだに極めて難しく、従って、腎臓病の長期メディカルコントロールが、まだ満たされていない重要な医療ニーズであることは変わらない。現在のところ、腎臓病による線維症の軽減を対象とする最も進んだ療法は、レニン-アンジオテンシン系(RAS)の活性の抑制に焦点が合わされている。この戦略は、疾患の進行を遅らせることが示されているが、その効力は部分的であり、実験および臨床症状における慢性線維症の進行を完全には抑えない。このことは、RAS以外の多くの要素がCRFによる線維症の病因に寄与しているためと考えられる。
【００１５】
ネコおよびイヌにおけるCRFの有病率が増加している。米国においては、1980年に評価されたネコ1000例について4例は、年齢にかかわりなく腎不全を有していた。1990年までには、腎不全症例の報告件数は4倍に増加し、検査したネコ1000例について16例が確認された。15歳以上のネコについて、1990年には、1000例の検査について153例が腎不全と診断された。加齢ネコにおける腎不全の有病率の増加は、飼い主により求められる獣医療ばかりでなく、この疾患の発見するための獣医による大きな努力を反映している可能性がある。理由はどうあれ、これらの所見は、老齢動物におけるCRFの認知度および重要性の出現を際立たせている。ペット動物におけるCRFの最も主な病因は、限定するものではないが、特発性慢性間質性腎炎、不可逆的ARF、家族性髄質嚢胞または腎無形成、先天性多嚢胞腎疾患、アミロイドーシス、糸球体腎炎、高カルシウム血症、両側水腎症、レプトスピラ症、腎盂腎炎、両側性腎臓結石症、Falconi様症候群、高血圧、腎臓原発リンパ肉腫を含む。
【００１６】
ヒト医学において、米国では、毎年、100万人あたりおおよそ600名の患者が慢性血液透析受けており、患者1名につき1年あたりおおよそ60,000〜80,000ドルの平均コストがかかっている。毎年、末期の腎臓病の新患の中で、おおよそ28〜33%が糖尿病性腎症(または糖尿病性糸球体症または糖尿病性腎肥大)によるものであり、24〜29%は高血圧性腎硬化症(または高血圧性糸球体硬化症)によるものであり、15〜22%は糸球体腎炎によるものである。全慢性ヒト透析患者の5年生存率はおおよそ40%であるが、65歳を超える患者については、この割合はおおよそ20%まで低下する。従って、単独で、米国においておよそ200,000名のヒト患者が慢性血液透析になる原因となり、毎年数万の早死にをもたらす、腎機能の進行性喪失を予防するための治療法の必要性が残されている。
【００１７】
腎指向性(renotropic properties)を示し、尿細管修復および腎機能の回復を示す特定のモルフォゲンおよび/または増殖因子が最近同定されたことを考慮に入れると、これらの分子の一部がARFおよび/またはCRFの予防および/または治療のための治療剤として用いられる可能性を有しうることが考えられる。このような薬剤の1つが骨形成タンパク質-7(BMP-7または骨原性タンパク質-1(OP-1))であり、これはトランスフォーミング成長因子-β(TGF-β)スーパーファミリーのメンバーの1つである。BMP-7はアクチビン受容体I型およびII型には結合するが、TGF-β受容体I型、II型およびIII型には結合しない。BMP-7モノマーは、分子量17〜19kDaを有し、最初は、異所性骨形成を誘導するその能力に基づいて同定された。BMP-7ポリペプチドは、おおよそ35〜36kDaの見かけの分子量を有するホモ二量体として分泌される。最近、BMP-7は腎形成中の重要なモルフォゲンであることが示された。成熟腎、特に髄質集合管においては、BMP-7の腎発現は持続し、尿細管もまたBMP-7受容体を発現している。ARFおよびCRFの動物モデルにおいて、BMP-7の腎発現は著しくダウンレギュレートされており、組換えBMP-7タンパク質の投与は腎臓の回復を促進することが報告されており、これは間質性炎症およびプログラム細胞死の抑制と関連する効果であった。
【００１８】
しかしながら、BMP-7はin vivoでの半減期が短いため(おおよそ30分)、精製タンパク質の注入後の循環血液中における外因性タンパク質のレベル持続の維持には、複数の短い間隔の投与を必要とし、大変重要な実践課題が課されている。このような複数回注入療法を獣医学に適用するにはコストがかかりすぎる。種々の疾患治療のためのタンパク質療法に代わるものとして遺伝子送達が順調に進められているが、in vivoでのBMP-7ポリペプチド発現によるARFおよび/またはCRFの予防および/または治療のためのその利用可能性については、以前には提案されておらず、その潜在的効果はいまだ不明である。実際、低分子量のBMP-7ホモ二量体(すなわち、おおよそ35kDa)は、理論上は、急速に糸球体で濾過されるであろう。in vivoでのBMP-7発現レベルが治療上有効な血漿中濃度に到達しうるかどうかは、既存の文献からは予測または決定できない。in vivoで発現されるBMPタンパク質の評価をさらに複雑にすることには、免疫適格および不適格動物間の有意差を有する処置動物の免疫状態に応じて結果は変化しうることがある。従って、全体として総合的に考慮するとき、in vivoで発現されるBMP-7レベルが治療的に有用な血漿中濃度に到達しうるかどうかについて、文献は教示しない。
【００１９】
本願において、任意の文献の引用または特定は、このような文献が本発明に対する先行技術として利用可能であることの承認を構成するものではない。
【発明の概要】
【００２０】
本発明は、急性または慢性の腎不全を患っているかまたは発症する恐れがある哺乳動物被験者を予防および治療する方法ならびにこれらの方法に使用する組換えベクターおよび医薬組成物に関する。本発明の方法、ベクターおよび組成物は、死亡率および/または罹患率を低下させ、腎不全の特徴である進行性の腎機能低下を予防、抑制、遅延または軽減するのに有用である。本発明の方法、組換えベクターおよび組成物が有用な被験者は、限定するものではないが、すでに急性または慢性の腎不全に苦しんでいる被験者、すでに腎代替療法を受けている被験者ばかりでなく、ネフロン機能単位の進行性喪失と関連する急性または進行性の腎機能低下に苦しむことが合理的に予想される任意の被験者を含む。医学または獣医学分野の当業者は、特定の被験者が腎臓病の恐れがあるかどうか、または被験者が本発明の方法および/または組成物から利益を得ることができるかどうかをルーチンに決定することができる。
【００２１】
一実施形態において、本発明は、プレプロBMP-7遺伝子、プロBMP-7遺伝子または成熟BMP-7遺伝子を含み宿主内で発現するベクターに関する。プレプロBMP-7ポリペプチド、プロBMP-7ポリペプチドまたは成熟BMP-7ポリペプチドをコードするBMP-7遺伝子は、哺乳動物由来のものであることができる。好ましい実施形態において、発現ベクターは、イヌプレプロBMP-7、イヌプロBMP-7またはイヌ成熟BMP-7ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。他の好ましい実施形態において、発現ベクターは、ネコプレプロBMP-7、ネコプロBMP-7またはネコ成熟BMP-7ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。好ましい実施形態において、発現ベクターは、ヒトプレプロBMP-7、ヒトプロBMP-7またはヒト成熟BMP-7ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。BMP-7ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、プロモーターおよび場合によりエンハンサーに作動可能に連結されていることができる。
【００２２】
有利な実施形態において、本発明は、N末端で“プレ”ペプチドが除去され、異なる起源由来のペプチドシグナル配列を融合させたイヌプロBMP-7ポリペプチドを含み、これを発現するベクターに関する。他の有利な実施形態において、本発明は、N末端で“プレ”ペプチドが除去され、異なる起源由来のペプチドシグナル配列を融合させたネコプロBMP-7ポリペプチドを含み、これを発現するベクターに関する。他の有利な実施形態において、本発明は、N末端で“プレ”ペプチドが除去され、異なる起源由来のペプチドシグナル配列を融合させたヒトプロBMP-7ポリペプチドを含み、これを発現するベクターに関する。好都合には、ペプチドシグナル配列は、インスリン様成長因子1(IGF-1)または組織プラスミノーゲンアクチベーター(tPA)のペプチドシグナル配列であることができる。他の実施形態において、発現ベクターは、BMP-7、IGF-1またはtPA由来のペプチドシグナル配列を融合させたイヌ成熟BMP-7ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。他の実施形態において、発現ベクターは、BMP-7、IGF-1またはtPA由来のペプチドシグナル配列に融合させたネコ成熟BMP-7ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。他の実施形態において、発現ベクターは、BMP-7、IGF-1またはtPA由来のペプチドシグナル配列に融合させたヒト成熟BMP-7ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。
【００２３】
他の実施形態において、本発明は、プレプロBMP-7ポリペプチド、プロBMP-7ポリペプチドまたは成熟BMP-7ポリペプチドを発現するベクターおよび薬学的または獣医学的に許容される担体、賦形剤またはビヒクルを含む医薬組成物に関する。特定の実施形態において、医薬組成物は、宿主細胞へのベクターのトランスフェクションまたは形質導入の効力を改善する物質を含むことができる。
さらに他の実施形態において、本発明は、プレプロBMP-7ポリペプチド、プロBMP-7ポリペプチドまたは成熟BMP-7ポリペプチドをin vivoで発現することができるベクターを注入することを含むことができる、哺乳動物にBMP-7ポリペプチドを送達する方法に関する。有利な実施形態において、動物宿主はイヌまたはネコであることができる。本発明は、哺乳動物の慢性または急性の腎不全の予防および/または治療のためのこのようなベクターの使用に関する。本発明の医薬組成物は、限定するものではないが、筋肉内、皮下経路または血管内経路を含む任意の適切な投与経路に投与することができる。特定の実施形態において、無針注射器または電気的導入を用いて、宿主にベクターを投与することができる。
【００２４】
さらに他の実施形態において、本発明は、プレプロBMP-7ポリペプチド、プロBMP-7ポリペプチドまたは成熟BMP-7ポリペプチドをin vivoで発現することができるプラスミドを血管内経路で腎静脈に注入することを含むことができる、哺乳動物にBMP-7ポリペプチドを送達する方法に関する。有利な実施形態において、哺乳動物宿主は、ヒト、イヌ科動物またはネコ科動物であることができ、特に男性、女性、小児、イヌ、雌イヌ、子イヌ、ネコ、子ネコであることができる。本発明は、哺乳動物の慢性または急性の腎不全を予防および/または治療するためのこのようなプラスミドの使用に関する。特定の実施形態において、腎静脈への血行力学逆行性注入、特に非侵襲性インターベンションカテーテルを用いて、哺乳動物宿主にベクターを投与することができる。定義により、血行力学は大容量の急速注入を意味する。
他の実施形態において、本発明は、血清クレアチニン濃度の上昇および/または血清尿素窒素濃度の上昇を示す哺乳動物を治療するための、本発明による医薬組成物の使用に関する。血漿クレアチニン濃度が1.9mg/dlよりも高い場合および/または血漿尿素窒素濃度が35mg/dlより高い場合、ネコを好都合に治療することができる。血漿クレアチニン濃度が1.6mg/dlより高い場合および/または血漿尿素窒素濃度が30mg/dlより高い場合、イヌを好都合に治療することができる。3ヵ月以上にわたって機能的または構造的な腎臓の異常が存在する場合(これは、臨床的に有意な形態学的異常または組織学的異常または腎障害に続く血液および/もしくは尿中組成の変化であることができる)および/または3ヵ月以上にわたって糸球体濾過率(GRF)が60ml/分/1.73m2以下である場合、ヒトを好都合に治療することができる。
【００２５】
本開示、特にその特許請求の範囲および/またはパラグラフにおいて、用語“含む(comprises)”、“含んだ(comprised)”、“含むこと(comprising)”などは、米国特許法においてそれらに対して付与された意味を有しうることに注意されたい。例えば、それらは“含む(includes)”、“含んだ(included)”、“含むこと(including)”などを意味することができる。また、用語“本質的に〜からなること(consisting essentially of)”および“本質的に〜からなる(consists essentially of)”などは、米国特許法においてそれらに付与された意味を有することにも注意されたい。例えば、それらは、明記されていない要素を許容するが、先行技術中に存在するかまたは本発明の基本的または新規な特徴に影響を及ぼす要素を除外する。
これらおよび他の実施形態は、以下の詳細な説明に記載されているかまたはそれにより明らかであり、かつそれに含まれる。
例として挙げたものであり、記載されている特定の実施形態にのみ本発明を限定するものではない以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて、最もよく理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】050876pPCR-ScriptプラスミドマップおよびコードされるイヌBMP-7オープンリーディングフレーム(“ORF”)を示す図である。コードされるORFのヌクレオチド配列は、配列番号2のヌクレオチド配列であり、コードされるORFのアミノ酸配列は、配列番号3のアミノ酸配列である。
【図２】pNB292プラスミドマップおよびコードされるイヌBMP-7 ORFを示す図である。コードされるORFのヌクレオチド配列は、配列番号2のヌクレオチド配列であり、コードされるORFのアミノ酸配列は、配列番号3のアミノ酸配列である。
【図３】対照ラットおよびBMP-7を発現するプラスミドで処置したラットにおける、特定のグレードを示す腎臓病変の頻度を示すヒストグラムである。
【図４】対照ラットおよびBMP-7を発現するプラスミドで処置したラットにおける、重篤病変の頻度を示すヒストグラムである。
【図５】pMEB038プラスミドマップおよびコードされるヒトBMP-7 ORFを示す図である。コードされるORFのヌクレオチド配列は配列番号14のヌクレオチド配列であり、コードされるORFのアミノ酸配列は配列番号15のアミノ酸配列である。
【図６】pMEB039プラスミドマップおよびコードされるネコBMP-7のORFを示す図である。コードされるORFのヌクレオチド配列は配列番号18のヌクレオチド配列であり、コードされるORFのアミノ酸配列は配列番号19のアミノ酸配列である。
【図７】百分率で表した、D0〜D4での各群の動物の平均相対的体重変化のヒストグラムである。
【図８】ミリグラム/デシリットルで表した、D4における各群の動物の平均クレアチン血のヒストグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本願の一部として、配列表も含まれる:配列番号1はイヌプレプロBMP-7ポリペプチドのヌクレオチド配列であり、配列番号2はイヌプレプロBMP-7ポリペプチドのコドン最適化ヌクレオチド配列であり、配列番号3はイヌプレプロBMP-7ポリペプチドのアミノ酸配列であり、配列番号4はtPAからの短いシグナルペプチド(23アミノ酸)のヌクレオチド配列であり、配列番号5はtPAからの短いシグナルペプチド(23アミノ酸)のアミノ酸配列であり、配列番号6はtPAからの長いシグナルペプチド(28アミノ酸)のヌクレオチド配列であり、配列番号7はtPAからの長いシグナルペプチド(28アミノ酸)のアミノ酸配列であり、配列番号8はウマIGF-1シグナルペプチドのヌクレオチド配列であり、配列番号9はウマIGF-1シグナルペプチドのアミノ酸配列であり、配列番号10はpNB292プラスミドのヌクレオチド配列であり、配列番号11はイヌIGF-1シグナルペプチドのヌクレオチド配列であり、配列番号12はイヌIGF-1シグナルペプチドのアミノ酸配列であり、配列番号13はヒトプレプロBMP-7ポリペプチドのヌクレオチド配列であり、配列番号14はヒトプレプロBMP-7ポリペプチドのコドン最適化ヌクレオチド配列であり、配列番号15はヒトプレプロBMP-7ポリペプチドのアミノ酸配列であり、配列番号16はpMEB038プラスミドのヌクレオチド配列であり、配列番号17はネコプレプロBMP-7ポリペプチドのヌクレオチド配列であり、配列番号18はネコプレプロBMP-7ポリペプチドのコドン最適化ヌクレオチド配列であり、配列番号19はネコプレプロBMP-7ポリペプチドのアミノ酸配列であり、配列番号20はpMEB039プラスミドのヌクレオチド配列である。
【００２８】
詳細な説明
本発明の方法および組成物は、腎不全の予防処置に使用できる。腎不全に関していえば、そして本明細書ならびにヒトおよび獣医学の分野において用いるとき、用語“予防”、“防御”、“予防処置”および“防御処置”は、健常動物または関連のない疾患を患っている動物のいずれかであって、急性腎不全の恐れがあると考えられる前記動物のいずれかの治療に関連する。ネコおよびイヌにおける急性腎不全の主要な危険因子は、限定するものではないが、ショックおよび/または循環血液量減少(例えば出血、低血圧ショック、敗血症ショック、持続もしくは深麻酔、循環血液量減少、熱中症、外傷、熱傷または利尿剤乱用)、全身疾患(例えば膵炎、腹膜炎、肝不全、播種性血管内凝固症候群、副腎機能不全または血管炎)、虚血(例えば血栓塞栓閉塞または悪性高血圧により引き起こされるもの)、感染(例えばレプトスピラ症、腎盂腎炎、ネコ感染性腹膜炎、ボレリオ症、リーシュマニア症、バベシア症、敗血症または敗血症性塞栓症)、全身性腎臓病(例えば多臓器不全、糸球体腎炎、全身性エリテマトーデス、腎静脈血栓症、尿出口閉塞症、溶血性尿毒症症侯群、ヘム色素尿症-クラッシュ症候群または多血症)、高齢、先天性および/または遺伝性腎臓病ならびに他の多方面にわたる要素、例えば腎毒素(例えばアミノグリコシド、アンホテリシンB、シスプラチン、アドリアマイシン、非ステロイド系抗炎症薬、利尿薬、IL-2またはアロプリノール)への暴露、新生物(例えばリンパ腫)、高カルシウム血症、外傷(例えば剥離)、悪性高血圧、シュウ酸腎症などを含む。
【００２９】
予防目的の治療は、一般に前述の急性腎不全危険因子の1以上への健常動物の暴露の前数日以内(理想的には6〜8日以内)に行われる。また、関与する急性腎不全危険因子が同定された疾患動物において、腎代謝ならびに/または腎組織の構造および組織に対する危険因子である原疾患の任意の悪影響を抑える為に、できるだけ早く治療がおこなわれる。
予防処置に加えて、腎不全の治療処置のために、本発明の方法および組成物を使用することができる。腎不全に関していえば、そして本明細書および獣医学の分野において用いるとき、用語“療法”または“治療処置”は、急性腎不全をすでに患っているかまたは回復している(すなわち、回復期にある)動物の治療、または慢性腎不全を有すると診断されたかまたはその恐れがある動物において、病変進行を抑制および/または後退させることを目的とした治療の処置または維持および/または促進に関連する。療法の重要な目的は、ARF事象後にCRFに進行するリスクを軽減することである。本明細書において、ネフロン機能単位の進行性喪失と関連する進行性の腎機能低下を患うと被験者が合理的に予想される場合、被験者は、CRFを患っているかまたはCRFを発症する恐れがあるという。獣医学または医学分野の当業者は、特定の被験者がCRFを患っているかまたはCRFを発症する恐れがあるかどうかを容易に決定できる。
【００３０】
イヌにおける慢性腎不全の主要な危険因子は、限定するものではないが、特発性慢性間質性腎炎、不可逆的ARF、家族性髄質嚢胞または腎無形成(ハイリスク品種は、ノルウェジアン・エルクハウンド(Norwegian elkhounds)、ラサ・アプソ(Lhasa apso)、サモエド(Samoyed)、コッカースパニエル(Cocker spaniel)、ドーベルマン・ピンシェル(Doberman pinsher)、スタンダード・プードル(Standard poodle)およびゴールデンレトリバー(Golden retriever)を含む)、先天性多嚢胞腎疾患(例えばケアン・テリア(Cairn terriers)において)、アミロイドーシス、糸球体腎炎、高カルシウム血症、両側水腎症、レプトスピラ症、腎盂腎炎、両側性腎臓結石症、Falconi様症候群および高血圧を含む。
ネコにおける慢性腎不全の主要な危険因子は、限定するものではないが、特発性慢性間質性腎炎、不可逆的ARF、腎臓原発リンパ肉腫、多発性嚢胞腎疾患(例えばペルシャネコの家族性疾患において)、糸球体腎炎、両側水腎症、アミロイドーシス、腎盂腎炎、高カルシウム血症および両側性腎臓結石症を含む。
【００３１】
CRFを患っているかまたはCRFを発症する恐れがあるかまたは腎代替療法の必要のあるヒト被験者は、限定するものではないが、末期の腎臓病、慢性糖尿病性腎症、高血圧性腎硬化症、慢性糸球体腎炎、遺伝性腎炎および/または腎形成異常を有する被験者、糸球体肥大、尿細管肥大、慢性糸球体硬化症および/または慢性尿細管間質性硬化症を示す生検所見が得られた被験者、腎線維症の存在を示す超音波、MRI CATスキャンまたは他の非侵襲性検査所見が得られた被験者、尿沈渣中に異常な数のろう様円柱が存在する被験者、糸球体濾過率(“GFR”)が、慢性的に、被験者の予想GFRの50%未満、より具体的には約40%、30%または20%未満である被験者、健常ではあるが、他の点では類似する被験者が有するネフロン機能単位数の約50%未満、より具体的には約40%、30%または20%未満のネフロン機能単位数を有する被験者、片腎のみを有する被験者および腎臓移植者である被験者を含む。
【００３２】
“糸球体濾過率”または“GFR”は、血清タンパク質には結合せず、糸球体を通過して自由に濾過され、尿細管により分泌または再吸収されない、血漿により運ばれる物質である“マーカー”物質の尿中へのクリアランス速度に比例する。従って、本明細書において、好ましくは、GFRは次の方程式:
【００３３】
【数１】
2010508867.tif 000003
(式中、Uconcはマーカー物質の尿中濃度であり、Pconcはマーカー物質の血漿中濃度であり、Vはml/分での尿流量である)により定義される。場合により、体表面積に対してGFRを補正することができる。従って、GFR値は、ml/分/1.73m2”の単位であるとみなすことができる。GFR測定のための好ましいマーカー物質はイヌリンである。しかしながら、この物質の濃度の測定が困難であるため、GFR測定のためのマーカーとして、臨床の場において、典型的にはクレアチニンが用いられる。
【００３４】
“予想GFR”または“GFRexp”の推定値は、被験者の年齢、体重、性別、体表面積および筋肉率ならびに血液検査により測定される一定のマーカー化合物(例えばクレアチニン)の血漿中濃度の考察に基づいて得ることができる。従って、例として、予想GFRは:
【００３５】
【数２】
2010508867.tif 000004
として推定することができる。
【００３６】
この推定値は、表面積、筋肉率または体脂肪率などの要素を考慮に入れていない。それにもかかわらず、この式は、マーカーとして血漿クレアチニンレベルを用いて、GFを予測する安価な手段として、ヒト男性に用いられてきた。クレアチニンは横紋筋で産生されるので、ヒト女性被験者の予想GFRは、予想される筋肉量の差異を説明する0.85を同じ方程式にかけることにより推定される(Lemann et al., 1990 Am. J. Kidney Dis. 16(3); 236-243を参照のこと)。
【００３７】
有形成分の存在に関する尿沈渣の顕微鏡検査は、尿分析における標準的方法である。尿中に存在しうる有形成分の中には、遠位曲尿細管または集合管の内腔の成型物または“円柱”を一般的に示す凝集物質の円筒形の塊がある。健常者において、このような円柱は、一般的には直径15〜25μmを有する。しかしながら、CRF被験者においては、直径が正常円柱の2〜6倍であり、多くは均一なろう様の外観を有する円柱の存在下で尿細管の肥大が見られる場合がある。これらは“ろう様円柱”または“腎不全円柱”と呼ばれる。本明細書において、用語“ろう様円柱”は、被験者に関して正常の2〜6倍の直径を有するかまたはヒト円柱に関して約30〜150μmの直径を有する尿沈渣円柱を指すために用いられる。
【００３８】
本明細書においては、臨床表示に関して、用語“急性”は、急速に、一般的には障害または危険因子への暴露の数時間または数日以内に発症する腎臓の病状を指すために用いられる。
本明細書においては、臨床表示に関して、用語“慢性”は、少なくとも3ヵ月間、より好ましくは少なくとも6ヶ月間持続することを意味する。従って、例えば、慢性的にGFRexpの50%以下の測定GFRを示す被験者は、少なくとも3ヵ月、より好ましくは少なくとも6ヶ月おいた少なくとも2回の測定において、GFRがGFRexpの50%以下であることが見出され、介在期間中にGFRが実質的により高い(例えば10%)、医学的に妥当な理由が存在しない被験者である。腎機能異常の他の指標、例えばろう様円柱の存在は、少なくとも3ヵ月、より好ましくは少なくとも6ヶ月おいた少なくとも2回の測定において、このような指標の存在が持続する場合、同様に慢性として記載することができる。
【００３９】
表1に、ARFとCRFとを識別するのに有用な可能性のあるパラメータの一部(全部ではない)を示す。
表１．ARFとCRFを識別するのに有用なパラメータ
2010508867.tif 000005
【００４０】
本発明は、BMP-7ポリペプチドをin vivoで発現することができるベクターを含む医薬組成物を用いる腎不全の療法および予防処置ならびに血漿BMP-7濃度の持続増加を誘導し、それによって上皮細胞におけるTGF-β経路の活性化を抑制する方法および組成物を提供する。TGF-β活性化は、とりわけ、上皮間葉移行の促進および間葉上皮移行の抑制を引き起こし、線維症の重要なトリガーとして働く、Smad2およびSmad3因子のリン酸化ならびにそれらの核内移行を引き起こす。BMP-7は成人の腎臓において発現されるが、腎不全に直面して、その発現はしばしばダウンレギュレートされている。従って、外因性in vivo産生BMP-7により、BMP-7レベルを生理的レベルに回復させ、尿細管間質性腎炎およびCRFと関連する線維症の抑制および退縮をもたらすことに役立てることができる。
本明細書において、組成物のその量の投与が、ARFまたはCRFを患っている哺乳動物被験者における疾患の臨床徴候または測定可能なマーカーの著明改善を引き起こすのに十分である場合、本発明による医薬組成物を“治療効果”を有するまたは“治療上有効”であると表現する。本明細書において、組成物のその量の投与が被験者におけるARFの発症の予防に十分である場合、本発明による医薬組成物を“予防効果”を有するまたは“有効である”と表現する。用語“治療上有効”は、本明細書において、ARFまたはCRFを患っている哺乳動物被験者における疾患の臨床徴候または測定可能なマーカーの著明改善を引き起こすのに十分であるかまたは被験者におけるARFの発症を予防するのに十分である組成物の量を指すために、より一般的な意味で用いることもできる。
【００４１】
被験者のARFまたはCRF状態を評価するのに有用でもある腎機能の測定可能なマーカーは医学および獣医学文献公知であり、当業者にも公知であり、限定するものではないが、血中尿素窒素または“BUN”レベル(BUNレベルの増減の静的測定および速度測定の両方)、血清クレアチニンレベル(血清クレアチニンレベルの増減の静的測定および速度測定の両方)、BUN/クレアチニン比の測定(BUN/クレアチニン比の静的測定および変化率測定)、クレアチニンの尿/血漿比、尿素の尿/血漿比、糸球体濾過率(GFR)、ナトリウム(Na+)の血清濃度、尿浸透圧、1日の尿量などを含む(例えば、Brenner and Lazarus (1994), in Harrison’s principles of internal medicine, 13th edition, Isselbacher et al. eds, McGraw Hill Text, NY; Luke and Strom (1994), in Internal Medicne, 4th Edition, J. H. Stein, ed., Mosby-Year Book, Inc. St Louisを参照のこと)。上記の中で、クレアチニンおよび/もしくは尿素血漿中濃度またはBUNの測定は特に重要であり、腎機能の有用な読み出し情報である。
【００４２】
血清クレアチニン濃度の正常値は、イヌにおいて約0.5〜約1.6mg/デシリットル(“dl”)であり、ネコにおいて約0.5〜約1.9mg/dlである。血清クレアチニンレベルの正常生理的範囲の上限は、イヌよりもネコにおいてやや高い。食餌を除いては、血清クレアチニン濃度の生理値に影響する要素はよくわかっていない。タンパク質に富む食餌は、一過性の高クレアチン血症を引き起こす潜在能力を有することが知られている。例えば、健常なイヌに市販の食物を与えた場合、6〜9時間にわたって血清クレアチニン濃度のおよそ25%の上昇が生じうる。クレアチン血症の小さい変化の関連性を解釈するのは困難な場合があるが、クレアチニンレベルの2回の連続測定間の関連する最小変化は、正常値からの35μmol/lの濃度変化であると考えられる。
【００４３】
空腹時のイヌおよびネコにおいて、BUNレベルの正常な生理的範囲の上限は、イヌにおいて約8.8〜約25.9mg/dlであり、ネコにおいて約15.4〜約31.2である。正常範囲の上限は、イヌよりもネコにおいてやや高い。クレアチニンレベルと同様に、BUNレベルも食餌に影響を受ける。BUNレベルの変化をもたらしうる他の要因は、長期糖質コルチコイド治療および/または肝細胞不全を含む。
その生理的範囲を超える血清クレアチニンレベルおよび/またはBUNレベルの任意の有意な上昇は、廃棄物およびカタボライトを排泄する腎臓の能力低下の徴候(すなわち排泄不全)である。
【００４４】
本発明の方法および組成物(例えばBMP-7またはBMP-7の機能的等価物を用いる遺伝子治療に有用な方法および組成物)の効力の実験的証明は、種々の方法、例えば、本発明の方法および組成物を用いて処置した動物が、例えば毒物(例えばグリセロール、HgCl2)または腎虚血(例えば、両側性腎動脈閉塞)を誘導する手順などのトリガーまたは危険因子に暴露されたとき、プラセボ処置動物と比較して血漿クレアチニンおよび/またはBUN上昇の著しい抑制を示すことを明らかにすることにより行うことができる。
【００４５】
同様に、本発明の方法および組成物の効力を明らかにするために、組織の読み出し情報を用いることができる。組織の適切な読み出し情報の例は、皮質腎実質内およびより低い程度で髄質腎実質内の尿細管間質性腎炎病変(“TIN”病変)の定量化を含む。尿細管間質性腎炎(TIN)と関連する間質性腎線維症が、異なった病因の幅広いスペクトルを有する腎疾患の最終共通経路であることの文献による十分な裏づけがある。腎機能低下は、多くの形態の腎臓病において、そしていくつかの実験動物モデルにおいても、主として尿細管間質性病変の程度により決定できる。よって、TIN線維症の進行を抑制または後退させることができる方法または組成物は、疾患修飾機構によりすべての腎疾患に利益をもたらす潜在性を有する(すなわち、腎組織の構造要素の分解および構成異常を抑制することにより)。本発明のBMP-7遺伝子治療法および組成物の効力の実験的証明は、片側尿管閉塞すなわち“UUO”モデルを用いて評価するとき、対照よりも、BMP-7処置動物は腎臓における尿細管間質性病変が著しく低下しているという観察から明らかにすることができる。UUOモデルは、進行性の尿細管委縮および間質へのコラーゲン蓄積と関連する腎線維症の慢性進行の確立された動物モデルである。UUOモデルは当業者に公知であり(例えば、R. Chevalier et al., Kidney Int. 2000, 57, 882-890を参照のこと)(その内容の全体が参照により本願に組み込まれる)、当業者は片側尿管閉塞手順を容易に実施できる。UUOモデルは、一般的には、大変顕著な尿細管間質性病状および微小糸球体病変と関連し、本発明の方法および組成物の効力を明らかにするのに有用な実験モデル、例えばBMP-7またはBMP-7の機能的等価物のin vivo発現に基づく、本明細書に開示された遺伝子治療戦略の効力を明らかにするのに有用な実験モデルに関連する。このモデルを用いて、固定組織の従来のヘマトキシリン・エオシン(または“H&E”)染色および/またはコラーゲン特異的マッソン・トリクローム染色を用いて腎皮質におけるTINの評価を行うことができる。病変の解析は、筋線維芽細胞活性化およびマトリックス沈着を伴う尿細管拡張、上皮委縮、および間質の拡張の程度に基づく。さらなる研究は、例えば組織における上皮間葉移行(または“EMT”)レベルを解析し定量する平滑筋αアクチン(“α-SMA”)特異抗体を用いる、免疫組織化学および組織形態計測技術に基づくものであることができる。I型コラーゲンまたはフィブロネクチンに特異的な抗体を用いて相補的免疫組織学的解析を行うこともできる。細胞浸潤の定量化は、病変を解析するために使用できるさらなる読み出し情報である。例えば、マクロファージに特異的な抗ED-1または抗mac-1抗体を用いて、後者の免疫組織学的解析を行うことができる。総じて言えば、上記の読み出し情報の結果は、病変のグレードを決定するために使用することができる。
【００４６】
上記に加えて、任意の他の適切な動物モデルを含む、腎疾患および/または腎機能を研究するための任意の他の適切な方法または読み出し情報もまた、本発明の方法および組成物の効力を明らかにするために、そしてこのような組成物の治療的有効量および投与方法を決めるために使用することができる。
【００４７】
一側面において、本発明は、宿主において骨形成タンパク質-7(BMP-7)ポリペプチドまたはその変種もしくはフラグメントをin vivoで発現することができるベクターに関する。本明細書において、“BMP-7ポリペプチド”は、プレプロ、プロまたは成熟BMP-7ポリペプチドを指すために用いることができ、ここでプロおよび成熟BMP-7ポリペプチドは、BMP-7、IGF-1またはtPAシグナルペプチドに融合させたものであることができる。本発明のBMP-7ポリペプチドは、好ましくはイヌ、ネコまたはヒト由来である。一実施形態において、ベクターは、プレプロBMP-7、プロBMP-7または成熟BMP-7のヌクレオチド配列または遺伝子を含み宿主内で発現することができる。プレプロBMP-7ポリペプチド、プロBMP-7ポリペプチドまたは成熟BMP-7ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列または遺伝子は、哺乳動物、例えばヒト、ネコまたはイヌ由来のものであることができる。好ましい実施形態において、BMP-7ヌクレオチド配列または遺伝子はイヌ由来のものであることができる。他の好ましい実施形態において、BMP-7ヌクレオチド配列または遺伝子はネコ由来のものであることができる。他の好ましい実施形態において、BMP-7ヌクレオチド配列または遺伝子はヒト由来のものであることができる。
【００４８】
BMP-7は、骨原性タンパク質-1または“OP-1”とも呼ばれ、トランスフォーミング成長因子βまたは“TGF-β”スーパーファミリーのメンバーである。これは、プロタンパク質からプロセッシングを受けてカルボキシ末端成熟タンパク質となった分泌タンパク質である。成熟タンパク質には、配列番号3、配列番号15および配列番号19のアミノ酸330からアミノ酸430にわたるドメインを特徴づける7個のシステイン残基の保存されたパターンが存在する。このタンパク質の活性体は、ジスルフィドで結合したホモ二量体である。その成熟した天然型において、天然に存在するBMP-7は、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(“SDS-PAGE”)で測定するとき、見かけの分子量約30〜36kDaを有するグリコシル化二量体である。還元されると、この30kDaタンパク質は、見かけの分子量約16kDaおよび18kDaを有する2つのグリコシル化ポリペプチドサブユニットを生じる。非グリコシル化タンパク質は、見かけの分子量約27kDaを有する。還元されると、この27kDa非グリコシル化タンパク質は、分子量約14kDaおよび16kDaを有する2つの非グリコシル化ポリペプチド鎖を生じる。
【００４９】
典型的には、天然に存在するBMP-7タンパク質は、N末端シグナルペプチド配列、“プロ”ドメインおよび“成熟”タンパク質ドメインを有する前駆体として翻訳される。シグナルペプチドは、長さ29残基であり、Von Heijne (1986), Nucleic acid Research, 14; 4683-4691 の方法を用いて予測できる切断部位で翻訳後速やかに切断除去される。“プロ”ドメインは、ヒト、イヌ、ネコ、ブタおよびウシBMP-7において264残基を有し、マウスBMP-7において263残基を有する。プロドメインは、切断されて139残基の“成熟”C末端ドメインを生じ、これは、102残基の、保存された7システインC末端ドメインを含む。本明細書においては、BMP-7ポリペプチドの“プロ型”は、BMP-7ポリペプチドの成熟ドメインと共有結合かまたは非共有結合したプロドメインをそれぞれが含む一組のポリペプチドを含むタンパク質のことを言う。このプロ型が、培養哺乳動物細から分泌される基本的形態であると考えられる。このタンパク質の“成熟型”は、共有結合的または非共有結合的にプロドメインと結合していない成熟C末端ドメインのことを言う。
本明細書において、用語“プレプロBMP-7”、“プロBMP-7”、“成熟BMP-7”および“BMP-7は、本明細書および添付の配列表に記載の特定のポリペプチドおよび配列を指すばかりでなく、限定するものではないが、誘導体、変異体、ホモログ、オルソログ、対立遺伝子変種、対立遺伝子多型、多型変種、系統発生的カウンターパートならびに、誘導体、変異体、フラグメント、融合タンパク質などを含むが限定されないこれらのタンパク質のありとあらゆる天然に存在しない変種も含む、これらのタンパク質のありとあらゆる既知の天然に存在する変種をも指す。本明細書において、用語“変種”は、このような天然に存在する変種および天然に存在しない変種をすべて含む。特に、本発明は、ARFおよびCRFを含む、腎臓病の治療または予防処置に有用な特徴を保持するおよび/またはBMP-7活性を保持する変種をすべて含む。
【００５０】
これらの機能的に同等な変種、誘導体およびフラグメントなどは、BMP-7活性を保持する能力を示す。本明細書において、機能的等価物は、以下の2つの基準(a)本明細書記載のBMP-7のタンパク質配列と有意水準のアミノ酸配列相同性を有する、または本明細書記載のBMP-7のタンパク質配列と有意水準のヌクレオチド配列相同性を有するヌクレオチドによりコードされる;または(b)げっ歯動物における腎不全の以下の実験モデル:(i)毒物誘発または虚血誘発腎不全モデル(対照/プラセボ群と比較して処置群において血漿クレアチニンまたはBUN上昇の抑制が予想される);(ii)腎不全のUUOモデル(対照/プラセボ群と比較して処置群において、病変のグレードの軽症化が予想される)の少なくとも1つにおいて、プラセボ群と比較して処置群において、統計的に有意差のある反応を示す能力を有する;のいずれかを満たす任意のBMP-7変種、誘導体、フラグメントなどのことを言う。
【００５１】
本発明に含むことができる変種、誘導体などの例は、限定するものではないが、本明細書に開示されたヌクレオチド配列と厳密には同じではないが、ヌクレオチド配列の変化が、コードされるアミノ酸配列を変化させない、あるいはアミノ酸残基の同類置換、1個または数個のアミノ酸欠失または付加、コードされるポリペプチドの性質に大きくは影響しないアミノ酸アナログによるアミノ酸残基の置換をもたらすヌクレオチド配列によりコードされるBMP-7変種、誘導体などを含む。保存的アミノ酸置換の例は、グリシン/アラニン置換;バリン/イソロイシン/ロイシン置換;アスパラギン/グルタミン置換;アスパラギン酸/グルタミン酸置換;セリン/トレオニン/メチオニン置換;リジン/アルギニン置換;およびフェニルアラニン/チロシン/トリプトファン置換を含む。前述のように、機能的BMP-7誘導体をもたらす他の種類の置換、変形、付加、欠失および誘導体もまた本発明に含まれ、このような変種または誘導体の製造法、同定法または選択法およびこれらの変種または誘導体のBMP-7活性の試験法を、当業者は容易にわかるであろう。発現を改善するために、潜在的スプライス部位を除去するか、開始コドンの前にKozakのコンセンサス配列を導入することによりコドン使用を適合させるか、コドン使用を変化させるかまたはそれらを組み合わせることにより、当業者は本発明のBMP-7ポリペプチドを最適化することができる。
【００５２】
他の実施形態において、本発明は、配列番号3の残基1-431と少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%の相同性または同一性を有するイヌプレプロBMP-7ポリペプチド変種を含むことができる。
他の実施形態において、本発明は、配列番号15の残基1-431と少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%の相同性または同一性を有するヒトプレプロBMP-7ポリペプチド変種を含むことができる。
他の実施形態において、本発明は、配列番号19の残基1-431と少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%相同性または同一性を有するネコプレプロBMP-7ポリペプチド変種を含むことができる。
他の実施形態において、本発明は、配列番号3の残基293-残基431と少なくとも97%、少なくとも97.5%、少なくとも98%、少なくとも98.5%または少なくとも99%の相同性または同一性を有するイヌ成熟BMP-7ポリペプチド変種を含むことができる。
他の実施形態において、本発明は、配列番号15の残基293-残基431と少なくとも97%、少なくとも97.5%、少なくとも98%、少なくとも98.5%または少なくとも99%の相同性または同一性を有するヒト成熟BMP-7ポリペプチド変種を含むことができる。
他の実施形態において、本発明は、配列番号19の残基293-残基431と少なくとも97%、少なくとも97.5%、少なくとも98%、少なくとも98.5%または少なくとも99%相同性または同一性を有するネコ成熟BMP-7ポリペプチド変種を含むことができる。
【００５３】
本発明においては、配列ギャップを最小限にしながらオーバーラップおよび同一性が最大限となるようにアラインメントして配列を比較することにより、配列同一性または相同性を決定することができる。特に、いくつかの数学的アルゴリズムのいずれかを用いて配列同一性を決定することができる。限定するものではないが、2つの配列の比較のために用いられる数学的アルゴリズムの例には、Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990, 87, 2264-2268(これはKarlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993, 90, 5873-5877 で修正された)のアルゴリズムがある。
配列の比較のために用いられる数学的アルゴリズムの他の例には、Myers & Miller, CABIOS 1988,4, 11-17のアルゴリズムがある。このようなアルゴリズムは、GCG配列のアラインメントソフトウェアパッケージの一部である、ALIGNプログラム(バージョン2.0)に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためのALIGNプログラムを用いるとき、PAM120重み付き残基表、12のギャップ長ペナルティおよび4のギャップペナルティーを用いることができる。局所的配列類似性およびアラインメントの領域を同定するためのさらに他の有用なアルゴリズムには、Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988, 85, 2444-2448 に記載されているFASTAアルゴリズムがある。
WU-BLAST(ワシントン大学BLAST)バージョン2.0ソフトウェアは、本発明による使用に有利である。いくつかのUNIX（登録商標）プラットフォームのためのWU-BLASTバージョン2.0実施可能プログラムは、ftp ://blast. wustl. edu/blast/executablesからダウンロードすることができる。このプログラムは、WU-BLASTバージョン1.4をベースとし、これもまた、パブリックドメインNCBI-BLASTバージョン1.4をベースとしている(Altschul & Gish, 1996, Local alignment statistics, Doolittle ed., Methods in Enzymology 266, 460-480; Altschul et al., Journal of Molecular Biology 1990, 215, 403-410; Gish & States, Nature Genetics, 1993, 3: 266-272; Karlin & Altschul, 1993,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5873-5877、これらすべてが、参照により本願に組み込まれる)。
【００５４】
一般に、アミノ酸配列の比較は、既知の構造のポリペプチドのアミノ酸配列と未知の構造のポリペプチドのアミノ酸配列をアラインメントすることにより達成できる。ついで配列中のアミノ酸を比較し、相同のアミノ酸をひとまとめにする。この方法により、ポリペプチドの保存された領域が検出され、アミノ酸挿入および欠失が説明される。アミノ酸配列間の相同性は、市販アルゴリズムを用いて決定できる(上記の相同性の説明もまた参照このと)。本明細書において他に記載したものに加えて、国立バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Information)から提供されている、BLAST、ギャップ有りBLAST、BLASTN、BLASTPおよびPSI-BLASTプログラムも挙げられる。これらのプログラムはこのために当該技術分野で広く使用されており、2つのアミノ酸配列の相同の領域をアラインメントすることができる。
一連の検索プログラムのすべてにおいて、ギャップ有りアラインメントルーチンは、データベース検索自体と一体をなす。ギャッピングは、必要に応じて止めることができる。長さ1のギャップに対するギャップペナルティ(Q)は、タンパク質とBLASTPについてQ=9であり、BLASTNについてはQ=10であるが、任意の整数に変えることもできる。1残基あたりのギャップ伸長デフォルトペナルティ(R)は、タンパク質およびBLASTPについてR=2であり、BLASTNについてR=10であるが、任意の整数に変えることもできる。配列ギャップを最小限にしながらオーバーラップおよび同一性が最大限となるように配列をアラインメントするために、QおよびRの値の任意の組み合わせを用いることができる。デフォルトアミノ酸比較マトリックスはBLOSUM62であるが、PAMなどの他のアミノ酸比較マトリックスを用いることができる。
【００５５】
好ましい実施形態において、本発明は、イヌプレプロBMP-7ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、発現するベクターを提供し、より好ましくは配列番号1のヌクレオチド1-1296を含み、発現するベクターを提供する。好ましくは、このベクターは、配列番号3のアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現する。
他の好ましい実施形態において、本発明は、ヒトプレプロBMP-7ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、発現するベクターを提供し、より好ましくは、配列番号13のヌクレオチド1-1296を含み、発現するベクターを提供する。好ましくは、このベクターは、配列番号15のアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現する。
他の好ましい実施形態において、本発明は、ネコプレプロBMP-7ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、発現するベクターを提供し、より好ましくは、配列番号17のヌクレオチド1-1296を含み、発現するベクターを提供する。好ましくは、このベクターは、配列番号19のアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現する。
一実施形態において、ペプチドシグナル(プレペプチド)配列は、配列番号3、15または19として示したプレプロBMP-7配列の番号付けをアミノ酸残基の番号付けとして用いるとき、位置(1)のMet残基から位置(29)のAla残基までにわたる。シグナルペプチドの切断は、Ala(29)残基の後で生じうる。プレBMP-7ペプチドの切断後、プロBMP-7ポリペプチドは、配列Arg-X-X-Arg(292)の後で二次的に切断されて成熟BMP-7ポリペプチドを生じる。
【００５６】
用語“タンパク質”、“ポリペプチド”および“ポリペプチドフラグメント”は、本明細書において、任意の長さのアミノ酸残基のポリマーを指すために同義で使用される。
特定の実施形態において、発現ベクターは、成熟BMP-7ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、BMP-7シグナルペプチドであるか、BMP-7シグナルペプチドを含むか、BMP-7シグナルペプチド由来であるペプチドシグナル配列に融合させた前記ポリペプチドを含むことができる。他の実施形態において、シグナルペプチド配列は、シグナルペプチドであるか、シグナルペプチドを含むか、またはシグナルペプチド由来であることができる。
【００５７】
本発明は、さらに、プレ-BMP-7シグナルペプチドが除去され、異なる起源由来のペプチドシグナル配列を融合させたプロBMP-7ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、これを発現するベクターに関する。例えば、特定の実施形態において、ペプチドシグナル配列は、インスリン様成長因子1(IGF-1)または組織プラスミノーゲンアクチベーター(tPA)のペプチドシグナル配列であることができる。好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドによりコードされるプロBMP-7は、イヌプロBMP-7ポリペプチドである。好都合には、プロBMP-7は、配列番号3のアミノ酸残基30-431に対応するアミノ酸配列をコードするするかまたは含む、配列番号1のヌクレオチド88-1296であるか、それを含むかまたはそれに由来するヌクレオチドであるポリヌクレオチドによりコードされる。他の好ましい実施形態において、配列番号2に対応するコドン最適化イヌヌクレオチド配列が用いられる。
他の好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドによりコードされるプロBMP-7はヒトプロBMP-7ポリペプチドである。好都合には、プロBMP-7は、配列番号15のアミノ酸残基30-431に対応するアミノ酸配列をコードするかまたは含む、配列番号13のヌクレオチド88-1296であるか、それを含むかまたはそれに由来するヌクレオチドであるポリヌクレオチドによりコードされる。他の好ましい実施形態において、配列番号14に対応するコドン最適化ヒトヌクレオチド配列が用いられる。
他の好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドによりコードされるプロBMP-7はネコプロBMP-7ポリペプチドである。好都合には、プロBMP-7は、配列番号19のアミノ酸残基30-431に対応するアミノ酸配列をコードするかまたは含む、配列番号17のヌクレオチド88-1296であるか、それを含むか、それに由来するポリヌクレオチドによりコードされる。他の好ましい実施形態において、配列番号18に対応するコドン最適化ネコヌクレオチド配列が用いられる。
【００５８】
シグナルペプチドがIGF-Iシグナルペプチドに由来する実施形態において、ペプチドシグナルが、ウマIGF-1ペプチドシグナルであって、好ましくは配列番号9アミノ酸残基1-25により定義され、配列番号8のヌクレオチド1-75によりコードされるウマIGF-1ペプチドシグナルであるか、それを含むかまたはそれに由来することが好ましい。代替実施形態において、IGF-1ペプチドシグナルは、イヌIGF-1ペプチドシグナルであるか、それを含むかまたはそれ由来であることができ、好ましくは、配列番号12のアミノ酸残基1-25により定義され、配列番号11のヌクレオチド1-75によりコードされるイヌIGF-1ペプチドシグナルであるか、それを含むかまたはそれ由来である。
他の実施形態において、ペプチドシグナルは、tPAペプチドシグナル、例えばヒトtPAシグナルペプチドであるか、それを含むかまたはそれ由来であることができる。好ましい実施形態において、用いられるtPAシグナルペプチドは、配列番号5のヒトtPAシグナルペプチド配列のアミノ酸残基1-23であるか、それを含むかまたはそれ由来であり、配列番号4のヌクレオチド1-69によりコードされる。別の実施形態において、ヒトtPAシグナルペプチドは、配列番号7のアミノ酸残基1-28であるか、それを含むかまたはそれ由来であることができ、配列番号6のヌクレオチド1-84によりコードされるものを使用できる。
【００５９】
本発明の有利な実施形態によれば、発現ベクターは、シグナルペプチド(残基30-残基431に対応する)を欠失させたプレプロBMP-7ポリペプチドに融合させた配列番号5、7、9または12によるIGF1またはtPAシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。本発明の他の実施形態によれば、発現ベクターは、成熟BMP-7(残基293-残基431に対応する)に融合させた、IGF1またはtPAのシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。望ましい配列を含むポリヌクレオチドは、適切な発現ベクターに挿入することができ、ついで、複製および増幅のために、適切な宿主細胞、例えば大腸菌(E. coli)にこのベクターを導入することができる。
いくつかの実施形態において、本発明は、イヌプレプロBMP-7、イヌプロBMP-7、イヌ成熟BMP-7、ヒトプレプロBMP-7、ヒトプロBMP-7、ヒト成熟BMP-7、ネコプレプロBMP-7、ネコプロBMP-7、ネコ成熟BMP-7またはそれらの変種もしくはフラグメントを発現できるベクターを含む。成熟BMP-7またはプロBMP-7については、細胞外培地へのBMP-7の分泌を促進するために、このペプチドをコードするヌクレオチド配列に、ペプチドシグナルをインフレームでコードするヌクレオチド配列を隣接して先行させることが好ましい。シグナル配列は、プレプロBMP-7由来の天然配列であることができ、あるいは分泌タンパク質由来のペプチドシグナル、例えば、組織プラスミノーゲンアクチベータータンパク質(tPA)、特にヒトtPA由来のシグナルペプチド(S. Friezner Degen et al J. Biol. Chem. 1996, 261, 6972-6985; R. Rickles et al J. Biol. Chem. 1988, 263, 1563-1569; D. Berg. et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991, 179, 1289-1296)、またはインスリン様成長因子1(IGF1)、特にウマIGF1(K. Otte et al. Gen. Comp. Endocrinol. 1996, 102(1), 11-15)、イヌIGF1(P. Delafontaine et al. Gene 1993, 130, 305-306)、ネコIGF1(WO-A-03/022886)、ウシIGF1(S. Lien et al. Mamm. Gene 2000, 11(10), 877-882)、ブタIGF1(M. Muller et al. Nucleic Acids Res. 1990, 18(2), 364)、ニワトリIGF1(Y. Kajimoto et al. Mol. Endocrinol. 1989, 3(12), 1907-1913)、シチメンチョウIGF1(GenBankアクセッション番号AF074980)由来のシグナルペプチドであることができる。IGF1由来のシグナルペプチドは、天然のまたは最適化したものであることができ、特に、潜在的スプライス部位を除去するおよび/またはコドン使用を適合させることにより最適化したものであることができる。
【００６０】
本明細書において、用語“ポリヌクレオチド”は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含む、任意の長さのヌクレオチドの重合体を指すために用いられる。
本発明は、プロモーター配列に作動可能に連結され、場合によりエンハンサーにも結合されているBMP-7ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、これを発現するベクターをさらに含む。有利な実施形態において、プロモーターは、サイトメガロウイルス(CMV)の前初期遺伝子(immediate early gene)のプロモーターであり、好ましくは、ヒトまたはマウス由来CMVのプロモーターである。他の実施形態において、エンハンサーおよび/またはプロモーターは、当該技術分野で公知であり、本発明のベクターでのBMP-7の発現に適したプロモーターの中から選択されることができる。多くのこのようなプロモーターは当該技術分野で公知であり、当業者は適切なプロモーターを容易に選択することができる。例えば、種々の細胞および/または組織特異的プロモーター(例えば、筋肉、内皮細胞、肝臓、体細胞および幹細胞特異的プロモーター)ならびに種々のウイルスプロモーターおよびエンハンサーならびにBMP-7プロモーター、例えば各動物種に同質遺伝子的に特異的なBMP-7プロモーターが存在する。例えば、一実施形態において、イヌBMP-7がイヌ筋肉細胞内で発現される場合、望ましい適用にイヌBMP-7の発現を最適化するために、イヌ筋細胞に特異的なエンハンサーおよび/またはプロモーターを使用することができる。筋特異的プロモーターおよびエンハンサーの例は記載されており、当業者に公知である(例えば、Li et al., Gene Ther. 1999 Dec, 6(12), 2005-11; Li et al., Nat Biotechnol. 1999 Mar, 17(3), 241-5 and Loirat et al., Virology. 1999, Jul 20,260(1), 74-83を参照のこと;これらの開示は、参照によりその全体が組み込まれる)。
【００６１】
本発明に使用可能なプロモーターおよびエンハンサーは、限定するものではないが、ラウス肉腫ウイルス、HSV-1のTK遺伝子、SV40の初期および後期プロモーター、アデノウイルス主後期プロモーター(MLP)、ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子、メタロチオネイン遺伝子、α-1アンチトリプシン遺伝子、アルブミン遺伝子、コラゲナーゼ遺伝子、エラスターゼI遺伝子、β-アクチン遺伝子、β-グロビン遺伝子、γ-グロビン遺伝子、αフェトプロテイン遺伝子および筋クレアチンキナーゼ遺伝子のLTRのプロモーターおよびエンハンサーを含む。
一般に、真核細胞内で機能する強力なプロモーターを用いるのが有利である。好ましい強力なプロモーターは、ヒトまたはマウス起源の前初期サイトメガロウイルスプロモーター(CMV-IE)であり、場合によりラットまたはモルモットなどの他の起源のものも用いられる。CMV-IEプロモーターは、実際のプロモーター部分を含むことができるが、これは、エンハンサー部分と関連することも関連しないこともある。EP-A-260148、EP-A-323597、米国特許第5,168,062号、第5,385,839号および第4,968,615号ならびにPCT出願公開WO87/03905を参照することができる。好都合には、CMV-IEプロモーターは、ヒトCMV-IE(Boshart M. et al., Cell., 1985, 41, 521-530)またはマウスCMV-IEである。
【００６２】
より一般的には、プロモーターは、ウイルス起源か細胞起源のいずれかのものである。本発明の実施に役に立つことができるCMV-IE以外の強力なウイルスプロモーターは、SV40ウイルスの初期/後期プロモーターまたはラウス肉腫ウイルスのLTRプロモーターである。本発明の実施に役に立つことができる強力な細胞プロモーターは、細胞骨格の遺伝子のプロモーター、例えばデスミンプロモーター(Kwissa M. et al., Vaccine, 2000, 18, 2337-2344)またはアクチンプロモーター(Miyazaki J. et al., Gene, 1989, 79, 269-277)である。
これらのプロモーターの機能的サブフラグメント、すなわち、十分な促進活性を維持するこれらのプロモーターの部分は、本発明の範囲内であり、例えば、PCT出願公開WO98/00166または米国特許第6,156,567号記載の短縮型CMV-IEプロモーターを本発明の実施に用いることができる。本発明の実施におけるプロモーターは、結果として、十分な促進活性を維持し、それによりプロモーターとして機能し、誘導体またはサブフラグメントが由来する実際のまたは完全長プロモーターと好ましくは促進活性が実質的に同様であり、例えば、完全長CMV-IEプロモーターの活性に対する米国特許第6,156,567号の短縮型CMV-IEプロモーターの活性と同様である、完全長プロモーターの誘導体およびサブフラグメントを含む。従って、本発明の実施におけるCMV-IEプロモーターは、完全長プロモーターのプロモーター部分および/または完全長プロモーターのエンハンサー部分ならびに誘導体およびサブフラグメントを含む、または本質的にそれらからなる、またはそれらからなることができる。
【００６３】
好ましくは、本プラスミドは、他の発現調節因子を含む。安定化配列(単数または複数)、例えば、イントロン配列(単数または複数)、好ましくは、hCMV-IEの第1イントロン(PCT出願公開WO89/01036)、ウサギβ-グロビン遺伝子の第2イントロン(van Ooyen et al., Science, 1979, 206, 337-344)を組み込むことが特に有利である。プラスミドおよびポックスウイルス以外のウイルスベクターのポリアデニル化シグナル(ポリA)に関しては、ウシ成長ホルモン(bGH)遺伝子のポリ(A)シグナル(米国特許第5,122,458号参照)またはウサギβ-グロビン遺伝子のポリ(A)シグナルまたはSV40ウイルスのポリ(A)シグナルをさらに使用できる。
本明細書において、用語“ベクター”は、in vivoなどで標的細胞に送達される異種ポリヌクレオチドを含む組換えDNAまたはRNAのプラスミドまたはウイルスのことを言う。異種ポリヌクレオチドは、療法の目的上対象とする配列を含むことができ、場合により発現カセットの形であることができる。本明細書において、“ベクター”は、最終的な標的細胞または被験者において複製できる必要はない。
【００６４】
本明細書において、用語“組換えは、自然界に存在しないかまたは自然界に見られない配置で他のポリヌクレオチドに結合されている、半合成または合成起源のポリヌクレオチドを意味する。
本明細書において、用語“異種”は、比較される残りの存在とは遺伝的に異なる存在に由来する。例えば、ポリヌクレオチドは遺伝子工学技術により異なる供給源由来のプラスミドまたはベクター中に配置することができるが、従ってこれは異種ポリヌクレオチドである。元のコード配列から除去されて、元の配列以外のコード配列に作動可能に連結されているプロモーターは、それゆえに異種プロモーターである。
本発明のポリヌクレオチドは、同じ転写ユニット内のさらなるコード配列、プロモーターなどの調節領域、リポソーム結合部位、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、同一または異なるプロモーターの調節下にあるさらなる転写ユニット、宿主細胞のクローニング、発現、相同組換えおよび形質転換を可能にする配列ならびに本発明の実施形態を提供するために望ましい可能性がある任意の構築物などのさらなる配列を含むことができる。
【００６５】
イヌBMP-7またはネコBMP-7またはヒトBMP-7の発現のための領域は、発明ベクター中に好都合に存在する。最小限として、この領域は、開始コドン(ATG)、終止コドンおよびプロモーター、ならびに場合によりプラスミドなどの特定のベクターおよびポックスウイルス以外のウイルスベクターなどの特定のウイルスベクターのためのポリアデニル化配列を含むことができ、本質的にそれらからなることができ、あるいはそれらからなることができる。ポリヌクレオチドがポリペプチドフラグメント、例えばイヌBMP-7をベクター中に好都合にコードする場合、リーディングフレームの5'にATGを配置し、3'に終止コドンを配置することができる。発現を調節する他の領域、例えばエンハンサー配列、安定化配列(例えばイントロン)およびタンパク質の分泌を可能にするシグナル配列を存在させることができる。
【００６６】
本発明の遺伝子の遺伝子産物のin vivoでの発現のためのベクターまたは組換え体またはプラスミドの製造方法および/または投与方法は、任意の望ましい方法であることができ、例えば:米国特許第4,603,112号;第4,769,330号;第4,394,448号;第4,722,848号;第4,745,051号;第4,769,331号;第4,945,050号;第5,494,807号;第5,514,375号;第5,744,140号;第5,744,141号;第5,756,103号;第5,762,938号;第5,766,599号;第5,990,091号;第5,174,993号;第5,505,941号;第5,338,683号;第5,494,807号;第5,591,639号;第5,589,466号;第5,677,178号;第5,591,439号;第5,552,143号;第5,580,859号;第6,130,066号;第6,004,777号;第6,130,066号;第6,497,883号;第6,464,984号;第6,451,770号;第6,391,314号;第6,387,376号;第6,376,473号;第6,368,603号;第6,348,196号;第6,306,400号;第6,228,846号;第6,221,362号;第6,217,883号;第6,207,166号;第6,207,165号;第6,159,477号;第6,153,199号;第6,090,393号;第6,074,649号;第6,045,803号;第6,033,670号;第6,485,729号;第6,103,526号;第6,224,882号;第6,312,682号;第6,348,450号および第6;312,683号;米国特許出願番号第920,197号(出願日:1986年10月16日);WO90/01543;W091/11525;WO94/16716;WO96/39491;WO98/33510;EP265785;EP0370573; Andreansky et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93:11313-11318; Ballay et al., EMBO J. 1993;4:3861-65; Felgner et al., J. Biol. Chem. 1994;269, 2550-2561; Frolov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93, 11371-11377; Graham, Tibtech 1990, 8, 85-87; Grunhaus et al., Sem. Virol. 1992, 3, 237-52; Ju et al., Diabetologia 1998, 41, 736-739; Kitson et al., J. Virol. 1991, 65, 3068-3075; McClements et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93, 11414-11420; Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93, 11341-11348; Paoletti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93, 11349-11353; Pennock et al., Mol. Cell. Biol. 1984, 4, 399-406; Richardson (Ed), Methods in Molecular Biology 1995, 39, “Baculovirus Expression Protocols,” Humana Press Inc.; Smith et al. (1983) Mol. Cell. Biol. 1983, 3, 2156-2165; Robertson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93, 11334-11340; Robinson et al., Sem. Immunol. 1997, 9, 271; and Roizman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93, 11307-11312 に開示されている、または引用されている文献に開示されている方法もしくは類似の方法による方法であることができる。従って、本発明におけるベクターは、任意の適切な組換えウイルスまたはウイルスベクター、例えばポックスウイルス(例えば、ワクシニアウイルス、トリポックスウイルス、カナリアポックスウイルス、鶏痘ウイルス、アライグマポックスウイルス、豚痘ウイルスなど)、アデノウイルス(例えば、ヒトアデノウイルス、イヌアデノウイルス)、ヘルペスウイルス(例えばイヌヘルペスウイルス)、バキュロウイルス、レトロウイルスなど(参照により本願に組み込まれた文献中に存在)であることができ、あるいはベクターはプラスミドであることができる。ベクターの例の提供に加えて、引用および参照により本願に組み込まれる文献は、本発明の実施に有用である。
【００６７】
本発明の一実施形態によれば、発現ベクターは、ウイルスベクター、特にin vivo発現ベクターであることができる。有利な実施形態において、発現ベクターはアデノウイルスベクターであることができる。好都合には、アデノウイルスは、ヒト5型アデノウイルス(hAd5)ベクターであることができ、E1欠失および/またはE3欠失アデノウイルスであることができる。
特定の一実施形態において、ウイルスベクターは、ポックスウイルス、例えばワクシニアウイルスまたは弱毒化ワクシニアウイルス(例えば、ニワトリ胚繊維芽細胞でアンカラワクチン株を570回を超えて継代培養した後得られたアンカラ(Ankara)改変株であるMVA;Stickl & Hochstein-Mintzel, Munch. Med. Wschr., 1971, 113, 1149-1153; Sutter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1992, 89, 10847-10851を参照のこと;ATCC VR-1508として入手可能;またはNYVAC(米国特許第5,494,807号、例えば米国特許第5,494,807号の実施例1〜6以下を参照のこと;NYVACの構築、コペンハーゲン(Copenhagen)株ワクシニアウイルスゲノムからさらにORFを欠失したNYVACの変形、この組換え体の部位への異種コード核酸分子の挿入および適合したプロモーターの使用を議論している;WO96/40241も参照のこと)、トリポックスウイルスまたは弱毒化トリポックスウイルス(例えば、カナリアポックス、鶏痘ウイルス、鳩痘(dovepox)ウイルス、ピジョンポックスウイルス(pigeonpox)、ウズラ痘ウイルス、ALVACまたはTROVAC;例えば、米国特許第5,505,941号、第5,494,807号を参照のこと)、豚痘、アライグマポックス、ラクダ痘または粘液腫ウイルスであることができる。
【００６８】
本発明の他の実施形態によれば、ポックスウイルスベクターは、カナリアポックスウイルスまたは鶏痘ウイルスベクターであり、好都合には弱毒化カナリアポックスウイルスまたは鶏痘ウイルスであることができる。これに関しては、アクセス番号VR-111としてATCCから入手できるカナリアポックスを参照されたい。弱毒化カナリアポックスウイルスは、米国特許第5,756,103号(ALVAC)およびPCT出願公開WO01/05934に記載されている。多数の鶏痘ウイルスワクチン接種株、例えばMERIALより販売されているDIFTOSEC CT株およびINTERVETより販売されているNOBILIS VARIOLEワクチンもまた利用可能であり、同様に、弱毒化鶏痘株TROVACに関する米国特許第5,766,599号もまた参照のこと。
それらの組換え体の作製方法およびそれらの組換え体の投与方法に関する情報については、当業者は、本明細書およびPCT出願公開WO90/12882に引用されている文献を参照することができ、例えば、ワクシニアウイルスに関しては、特に米国特許第4,769,330号、第4,722,848号、第4,603,112号、第5,110,587号、第5,494,807号および第5,762,938号が言及され;鶏痘に関しては、特に米国特許第5,174,993号;第5,505,941号および第5,766,599号が言及され;カナリアポックスに関しては、特に米国特許第5,756,103号が言及され;豚痘に関しては、特に米国特許第5,382,425号が言及され;アライグマポックスに関しては、特にPCT出願公開WO00/03030が言及される。
【００６９】
発現ベクターがワクシニアウイルスである場合、発現されるポリヌクレオチド(単数または複数)の挿入部位(単数または複数)は、好都合には、チミジンキナーゼ(TK)遺伝子または挿入部位、赤血球凝集素(HA)遺伝子または挿入部位、A型封入体(ATI)をコードする領域であることができる。本明細書に引用されている文献、特にワクシニアウイルスに関するものも参照されたい。カナリアポックスの場合は、好都合には、挿入部位(単数または複数)はORF(単数または複数)C3、C5および/またはC6である。本明細書に引用されている文献、特にカナリアポックスウイルスに関するものも参照されたい。鶏痘の場合は、好都合には、挿入部位(単数または複数)はORF F7および/またはF8である。本明細書に引用されている文献、特に鶏痘ウイルスに関するものも参照されたい。MVAウイルスの挿入部位(単数または複数)は、好都合には、限定するものではないが、Carroll M. W. et al., Vaccine, 1997, 15 (4), 387-394; Stittelaar K. J. et al., J. Virol. 2000, 74 (9), 4236-4243; Sutter G. et al., 1994, Vaccine, 12 (11), 1032-1040 を含む種々の出版物におけるものであることができ、これに関して、他の挿入部位および他のプロモーターを使用する手段を当業者に与える完全MVAゲノムがAntoine G., Virology, 1998, 244, 365-396 に記載されていることも指摘される。好都合には、発現されるポリヌクレオチドは、特定のポックスウイルスプロモーター、例えば、特にワクシニアプロモーター7.5kDa(Cochran et al., J. Virology, 1985, 54, 30-35)、ワクシニアプロモーターI3L(Riviere et al., J. Virology, 1992, 66, 3424-3434)、ワクシニアプロモーターHA(Shida, Virology, 1986, 150, 451-457)、牛痘プロモーターATI(Funahashi et al., J. Gen. Virol., 1988, 69, 35-47)、ワクシニアプロモーターH6(Taylor J. et al., Vaccine, 1988, 6, 504-508; Guo P. et al. J. Virol., 1989, 63, 4189-4198; Perkus M. et al., J. Virol., 1989, 63, 3829-3836) の調節下に挿入されることができる。
【００７０】
特定の実施形態において、ウイルスベクターは、アデノウイルス、例えばヒトアデノウイルス(HAV)またはイヌアデノウイルス(CAV)であることができる。
一実施形態において、ウイルスベクターは、ヒトアデノウイルス、特に、アクセッション番号M73260としてGenbankに開示され、引用文献J. Chroboczek et al Virol. 1992, 186, 280-285に開示されているhAd5の配列を参照して、ウイルスゲノムのE1領域、特にヌクレオチド約459〜ヌクレオチド約3510を欠失させて複製能力をなくしたアデノウイルス5型であることができる。この欠失アデノウイルスは、E1発現293(F. Graham et al J. Gen. Virol. 1977, 36, 59-72) またはPER細胞、特にPER.C6(F. Falloux et al Human Gene Therapy 1998, 9, 1909-1917)内で増殖する。ヒトアデノウイルスは、E3領域、特にヌクレオチド約28592〜ヌクレオチド約30470を欠失させたものであることができる。E3領域の欠失をE1領域の欠失と組み合わせて行うことができる(例えば、J. Shriver et al. Nature, 2002, 415, 331-335, F. Graham et al Methods in Molecular Biology Vol .7: Gene Transfer and Expression Protocols Edited by E. Murray, The Human Press Inc, 1991, p 109-128; Y. Ilan et al Proc. Natl. Acad. Sci. 1997, 94, 2587-2592;米国特許第6,133,028号;米国特許第6,692,956号; S. Tripathy et al Proc. Natl. Acad. Sci. 1994, 91, 11557-11561; B. Tapnell Adv. Drug Deliv. Rev.1993, 12, 185-199;X. Danthinne et al Gene Thrapy 2000, 7, 1707-1714; K. Berkner Bio Techniques 1988, 6, 616-629; K. Berkner et al Nucl. Acid Res. 1983, 11, 6003-6020; C. Chavier et al J. Virol. 1996, 70, 4805-4810 を参照のこと)。E1および/またはE3領域部分または完全欠失後、最終的に、挿入部位はE1および/またはE3遺伝子座(領域)であることができる。発現ベクターがアデノウイルスである場合、好都合には、発現されるポリヌクレオチドは、真核細胞内で機能するプロモーター、例えば強力なプロモーター、好ましくはサイトメガロウイルス前初期遺伝子プロモーター(CMV-IEプロモーター)、特にM. Boshart et al Cell 1985, 41, 521-530におけるヌクレオチド約-734〜ヌクレオチド約+7のエンハンサー/プロモーター領域またはPROMEGA Corp.社製のpCIベクター由来のエンハンサー/プロモーター領域の調節下に挿入される。CMV-IEプロモーターは、好都合にはマウスまたはヒト由来である。伸長因子1αのプロモーターもまた使用できる。特定の一実施形態において、筋特異的プロモーターを使用できる(X. Li et al Nat. Biotechnol. 1999, 17, 241-245)。本明細書において、プラスミドベクターに関連する強力なプロモーターもまた議論される。一実施形態において、スプライシング配列はエンハンサー/プロモーター領域の下流にあることができる。例えば、CMV-IE遺伝子(R. Stenberg et al J. Virol. 1984, 49, 190)から単離される第1イントロン、ウサギまたはヒトβ-グロビン遺伝子から単離されるイントロン、特にβ-グロビン遺伝子由来の第2イントロン、免疫グロブリン遺伝子から単離されるイントロン、SV40初期遺伝子由来のスプライシング配列または、Promega Corp.社製のpCIベクターから単離される、マウス免疫グロブリン受容体配列に融合させたヒトβ-グロビンドナー配列を含むキメライントロン配列(Genbankアクセッション番号CVU47120のヌクレオチド約890〜ヌクレオチド約1022)。ポリ(A)配列およびターミネーター配列、例えば、ウシ成長ホルモン遺伝子(特にGenbankアクセッション番号BOVBMP-7のヌクレオチド約2339〜ヌクレオチド約2550)、ウサギβ-グロビン遺伝子またはSV40後期遺伝子のポリアデニル化シグナルを、発現されるポリヌクレオチドの下流に挿入することができる。
【００７１】
他の実施形態において、ウイルスベクターは、イヌアデノウイルス、特にCAV-2であることができる(例えば、L. Fischer et al. Vaccine, 2002, 20, 3485-3497;米国特許第5,529,780号;米国特許第5,688,920号;PCT出願公開WO95/14102を参照のこと)。CAVについては、挿入部位は、E3領域および/またはE4領域と右ITR領域の間に位置する領域内であることができる(米国特許第6,090,393号;米国特許第6,156,567号を参照のこと)。一実施形態において、インサートは、プロモーター、例えばサイトメガロウイルス前初期遺伝子プロモーター(CMV-IEプロモーター)またはヒトアデノウイルスベクターについて前述したプロモーターの調節下にあることができる。ポリ(A)配列およびターミネーター配列、例えばウシ成長ホルモン遺伝子またはウサギβ-グロビン遺伝子のポリアデニル化シグナルを、発現されるポリヌクレオチドの下流に挿入することができる。
【００７２】
他の特定の実施形態において、ウイルスベクターは、イヌヘルペスウイルス(CHV)またはネコヘルペスウイルス(FHV)などのヘルペスウイルスであることができる。CHVについては、挿入部位は、特にチミジンキナーゼ遺伝子、ORF3またはUL43 ORF内であることができる(米国特許第6,159,477号参照)。一実施形態において、発現されるポリヌクレオチドは、真核細胞内で機能するプロモーター、好都合にはCMV-IEプロモーター(マウスまたはヒト)の調節下に挿入されることができる。特定の一実施形態において、低酸素症で制御されるプロモーター、例えばBoast et al Human Gene Therapy 1999, 13, 2197-2208) に記載されているプロモーターHREを使用できる。ポリ(A)配列およびターミネーター配列、例えば例えばウシ成長ホルモンまたはウサギβ-グロビン遺伝子のポリアデニル化シグナルを、発現されるポリヌクレオチドの下流に挿入することができる。
【００７３】
本発明のよりさらなる実施形態によれば、発現ベクターは、プラスミドベクターまたはDNAプラスミドベクター、特にin vivo発現ベクターであることができる。限定するものではないが、特定の例として、pVR1020または1012プラスミド(VICAL Inc.; Luke C. et al., Journal of Infectious Diseases, 1997, 175, 91-97; Hartikka J. et al., Human Gene Therapy, 1996, 7, 1205-1217) を、ポリヌクレオチド配列の挿入のためのベクターとして用いることができる。pVR1020プラスミドはpVR1012に由来し、ヒトtPAシグナル配列を含む。一実施形態において、ヒトtPAシグナルは、Genbankアクセッション番号HUMTPA14におけるアミノ酸Met(1)-アミノ酸Ser(23)またはAla(28)を含む。限定するものではないが、他の特定の例として、ポリヌクレオチド配列の挿入のためのベクターとして使用されるプラスミドは、Genbankアクセッション番号U28070におけるアミノ酸Met(24)-アミノ酸Ala(48)のウマIGF1シグナルペプチド配列を含むことができる。
用語プラスミドは、本発明によるポリヌクレオチドおよび望ましい宿主または標的の細胞(単数または複数)内でのそのin vivo発現に必要な領域を含む任意のDNA転写ユニットを含み、その際、スーパーコイルまたは非スーパーコイル環状プラスミドばかりでなく直鎖状形もまた本発明の範囲内であるものとすることに注意されたい。
各プラスミドは、プレプロBMP-7、プロBMP-7または成熟BMP-7ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに加えて、好ましくはイヌ由来、ネコ由来、ヒト由来の、プロモーターに作動可能に連結されたまたはプロモーターの調節下にある、またはプロモーターに依存する、BMP-7ポリペプチド変種、アナログまたはフラグメントを含む、含有する、または本質的にそれらからなることができる。
【００７４】
本発明はまた、適切なまたは適当な条件下、あるいは適切な宿主細胞内で、in vivoで発現するベクターを含む医薬組成物に関する。薬学的または獣医学的に許容される担体、賦形剤またはビヒクル中に、場合によりBMP-7、IGF-1またはtPAシグナルペプチドに融合させた、BMP-7ポリペプチドをコードする1以上のポリヌクレオチドを含む、本質的にそれらからなる、またはそれからなり、かつ発現する1以上のベクター、例えば、発現ベクター、例えばin vivo発現ベクターを医薬組成物は含む、本質的にそれらからなる、またはそれらからなることができる。好都合には、薬学的または獣医学的に許容される担体、賦形剤またはビヒクル中に、場合によりBMP-7、IGF-1またはtPAシグナルペプチドに融合させた、イヌBMP-7ポリペプチドまたはネコBMP-7ポリペプチドまたはヒトBMP-7ポリペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドをベクターは含む、本質的にそれらからなる、またはそれらからなり、かつ発現することができる。従って、本発明の実施形態によれば、組成物中の他のベクター(単数または複数)は、イヌBMP-7ポリペプチドまたはネコBMP-7ポリペプチドまたはヒトBMP-7ポリペプチド以外の1以上のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードし、適切な環境下で発現するポリヌクレオチドを含むことができる。
1以上のベクターを含む組成物は、イヌBMP-7ポリペプチドまたはネコBMP-7ポリペプチドまたはヒトBMP-7ポリペプチドまたはそれらの融合タンパク質をコードし、好都合にはin vivoで発現するポリヌクレオチドを含む、本質的にそれらからなるまたはそれらからなることができる。
【００７５】
有利な実施形態において、本発明は、標的細胞におけるBMP-7ポリペプチドの送達および発現のための製剤の治療的有効量の投与を提供することができる。治療的有効量の決定は、当業者にはルーチン試験である。一実施形態において、製剤は、BMP-7ポリペプチドを発現するポリヌクレオチドを含む発現ベクターおよび薬学的または獣医学的に許容される担体、ビヒクルまたは賦形剤を含む。有利な実施形態において、薬学的または獣医学的に許容される担体、ビヒクルまたは賦形剤は、トランスフェクションを促進するおよび/またはベクターの保護を改善することができる。
薬学的または獣医学的に許容される担体またはビヒクルまたは賦形剤は当業者に公知である。例えば、薬学的または獣医学的に許容される担体またはビヒクルまたは賦形剤は、水または0.9%NaCl(例えば生理食塩水)溶液またはリン酸緩衝液であることができる。本発明の方法に使用できる他の薬学的または獣医学的に許容される担体またはビヒクルまたは賦形剤は、限定するものではないが、ポリ(L-グルタメート)またはポリビニルピロリドンを含む。薬学的または獣医学的に許容される担体またはビヒクルまたは賦形剤は、ベクターの投与を容易にするか、発現レベルを上昇させるか、または発現期間を延長させる任意の化合物または化合物の組み合わせであることができる。本明細書において、投与量および投与容量は、一般的な記載で説明するが、当業者は、過度の実験を要することなく、当該技術分野の知識と共に本開示から決定することもできる。
【００７６】
好都合には、プラスミドに適するが、限定ではない、第四級アンモニウム塩を含むカチオン性脂質は、好都合には次式:
2010508867.tif 000006
(式中、R1は、12〜18炭素原子を有する飽和または不飽和の直鎖脂肪族基であり、R2は2または3炭素原子を含有する他の脂肪族基であり、Xは、アミンまたはヒドロキシル基である(例えばDMRIE))を有するカチオン性脂質である。他の実施形態において、カチオン性脂質は、中性脂質、例えばDOPEと会合させることができる。
【００７７】
これらのカチオン性脂質の中で、DMRIE(N-(2-ヒドロキシエチル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(テトラデシルオキシ)-1-プロパンアンモニウム;PCT出願公開WO96/34109)が好ましい。このカチオン性脂質は、中性脂質、好都合にはDOPE(ジオレイルホスファチジルエタノールアミン; Behr J. P., 1994, Bioconjugate Chemistry, 5, 382-389)と好都合に会合してDMRIE-DOPEを形成することができる。
好都合には、賦形剤とのプラスミド混合物は、その場で、好都合には製剤の投与と同時に、または製剤の直前に調製することができる。例えば、好都合には投与前に混合物が複合体を形成するのに十分な時間、例えば投与前約10〜約60分間、例えば投与前おおよそ30分間を与えるように、投与の直前または前にプラスミド-賦形剤混合物が調製される。
DOPEが存在する場合、DMRIE:DOPEモル比は、好都合には約95:約5〜約5:約95であり、より好都合には約1:約1であり、例えば1:1である。
DMRIEまたはDMRIE-DOPEアジュバント:プラスミド重量比は、約50:約1〜約1:約10であり、例えば約10:約1〜約1:約5であり、好都合には約1:約1〜約1:約2であり、例えば1:1〜1:2であることができる。
【００７８】
特定の実施形態において、医薬組成物は、in vivoで直接に投与され、コードされた産物は宿主内でベクターにより発現される。BMP-7ポリペプチド、好都合にイヌBMP-7ポリペプチド(例えば、米国特許第6,423,693号;EP-A-1052286、EP-A-1205551、米国特許出願2004/0057941、PCT出願公開WO9905300およびDraghia-Akli et al., Mol Ther. 2002 Dec、6(6)、830-6 を参照のこと;その開示の全体が参照により組み込まれる)またはネコBMP-7ポリペプチドまたはヒトBMP-7ポリペプチドをコードするベクターをin vivoで送達する方法を、本発明のBMP-7ポリペプチドを、ヒト、イヌ科動物またはネコ科動物、特に男性、女性、小児、イヌ、雌イヌ、子イヌ、ネコ、子ネコに送達するために修飾することができる。前記の参照文献の教示を考慮すれば、当業者は、本明細書記載のBMP-7をコードし、発現するベクターのin vivo送達を達成することができる。
好都合には、本発明による医薬組成物および/または製剤は、本明細書において先に述べたように、治療反応を誘発する1以上の発現ベクターの有効量を含み、または本質的にそれらからなり、またはそれらからなり;過度の実験を要することなく、本明細書に組み込まれている文献および当該技術分野の知識を含む本開示から有効量を決定することができる。
【００７９】
プラスミドベクターベースの治療および/または医薬組成物の場合は、一般的には、投与量は、BMP-7ポリペプチドを発現するプラスミドを約1μg〜約2000μg、好都合には約50μg〜約1000μg、そしてより好都合には約100μg〜約800μg含む、本質的にそれからなる、またはそれからなることができる。プラスミドベクターベースの医薬組成物が電気的導入(electrotransfer)で投与される場合、プラスミドの投与量は、一般に約0.1μg〜1mg、好都合には約1μg〜100μg、好都合には約2μg〜50μgである。
【００８０】
有利な実施形態において、本発明によるプラスミドベクター(単数または複数)を含む医薬組成物は、宿主細胞によるベクターの取り込みを改善するために、好ましくは電気的導入を用いて筋肉内経路で投与できる。単独または組み合わせでの電気的導入の特徴は以下であることができる:(1)単極または双極電場、好ましくは単極;(2)10〜250V/cm、好ましくは50〜200V/cmの電場;(3)10〜50m秒、好ましくは15〜25m秒の電気パルス継続時間;(4)10〜990m秒、好ましくは50〜250m秒のパルス間隔;(5)1〜50Hz、好ましくは4〜20Hz、最も好ましくは6〜10Hzの周波数;(6)1〜15、好ましくは4〜10のパルス回数;(7)処置時間は、0.1〜5秒、好ましくは0.5〜2.5秒、最も好ましくは0.75〜1.5秒である;(8)電極は、侵襲性または非侵襲性のどちらでもよい;(9)処置1回あたりの電気的導入の回数は、1〜10回、好ましくは1〜5回、最も好ましくは1〜2回を含み、処置の頻度は、誘導されたBMP-7ポリペプチドの血漿中濃度に基づいて決められる;(10)麻酔または鎮静剤の使用の有り無しで電気的導入を行うことができる。腎臓に直接電気的導入を行うこともできる。
【００８１】
あるいは、ソノポレーションにより、プラスミドベクター(単数または複数)またはアデノウイルスベクター(単数または複数)を含む医薬組成物を投与できる:(1)超音波暴露により引き起こされる剪断を防止するように条件を定める;ポリマー、好ましくはカチオン性ポリマーによりプラスミド(単数または複数)を保護できる;(2)音響キャビテーション機構(または別のもの)に基づく効力を改善するために、心エコー図に用いられる市販の造影剤(例えば、PESDAパーフルオロカーボンまたはOptison)を用いることができる;(3)腎臓などの内部臓器を標的とするための対象とする投与経路は好ましくは筋肉内または血管内である;(4)連続波システムよりも、診断用パルスUSが優れている;(5)プラスミド(単数または複数)がカチオン化ゼラチンで複合体化されるとき、効力は増強される。
あるいは、組織損傷を最小にしてin vivoでの遺伝子送達を促進するために、フェムト秒赤外レーザー(LBGT技術)を用いて医薬組成物を投与することができる。
【００８２】
好都合には、血管内送達により腎臓に医薬組成物を投与することができる。血行力学ベースのプラスミドDNA遺伝子送達方法は、短時間内での大量のDNA溶液注射に続くレシピエント動物における血液循環の血行力学の変化に基づくことができる。門脈内または肝内静脈注射による裸のDNA送達は、高レベルの遺伝子発現をもたらすことが明らかにされている。腎静脈への直接逆行性注入後に、哺乳動物の腎臓内での特異的発現を達成することができる。好ましくは、左腎静脈への直接逆行性注入後に、哺乳動物の腎臓における特異的発現を達成することができる。血栓症の副作用を防ぐために、動物は抗凝血薬(例えばアセチルサリチル酸(例えばAspegic)を用いて)で前処置される。一般に、動物は、イソフルランによる古典的麻酔技術を用いて麻酔にかけられる。特に大腿静脈または頚静脈(例えば血管カテーテルシースを用いて)から腎静脈に、特にX線透視ナビゲーション下で、閉塞バルーンカテーテル(例えば、Ulltra-thin Diamond Balloon Dilationカテーテル (Boston Scientific, Boston, MA, USA))を挿入できる。場合により、腎臓の血液を洗浄するために、約0.1〜約0.5ml/秒の流速で10ml(すなわち、10kgのイヌに対して1ml/動物体重kg)の生理食塩緩衝液を注入することができる。続いて、バルーンの膨張により、腎静脈を閉塞することができる。典型的なプラスミドDNA投与量は約0.0005〜約0.5mg/動物体重kgであり、好ましくは約0.005〜約0.05mg/動物体重kgであり、より好ましくは約0.2mg/動物体重kgである。生理食塩緩衝液約5〜約25ml、好ましくは約10〜約20ml、より好ましくは約12.5〜約17.5ml、最も好ましくは約15mlを用いて、腎静脈にプラスミドDNAを急速に注入することができる。約0.5〜約3ml/秒、好ましくは約0.5〜約2ml/秒、より好ましくは約0.75〜約1.5ml/秒、最も好ましくは約1ml/秒の流量を確実にするために、可能性としては強力注入器を用いて、腎静脈にプラスミドDNAを急速に注入することができる。
【００８３】
急速注入の間中バルーン閉塞を続け、注入後約10秒〜約3分で停止することができる。好ましくは、注入後約1分でこの閉塞を停止することができる。その後、閉塞バルーンを除去することができる。
典型的な15kgのイヌについては、腎臓の血液の洗浄のために、0.5ml/秒の流速で生理食塩緩衝液15mlを注入することができる。典型的な15kgのイヌについては、1ml/sの流量を確実にするために、強力注入器を用い、生理食塩緩衝液15mlを用いて、典型的な0.2mg/kg量のプラスミドDNAが腎静脈内に急速に注入される。
電気的導入、ソノポレーションまたはフェムト秒赤外レーザー投与については、投与容量は約0.1〜約2mlであることができ、好都合には約0.2〜約1mlであることができる。これらの投与量および投与容量は、イヌおよび他の哺乳動物の標的種、例えばヒト、ウマおよびネコの治療に適している。
【００８４】
ウイルスベクター系を用いる場合、治療および/または医薬組成物は、1回あたり、BMP-7ポリペプチドを発現する組換えアデノウイルスのウイルス粒子を約104〜約1011個、好都合には約105〜約1010個、より好都合には約106〜約109個含む。ポックスウイルスベースの治療および/または医薬組成物の場合は、投与量は約102pfu〜約109pfuであることができる。本医薬組成物は、BMP-7ポリペプチドを発現するポックスウイルスまたはヘルペスウイルス組換え体を、1回あたり約105〜109pfu、好都合には約106〜108pfu含む。哺乳動物である標的種のための組成物の投与容量、例えばウイルスベクターベースのイヌ組成物、例えば非ポックスウイルス-ウイルスベクターベースの組成物の投与容量は、一般に約0.1〜約2.0mlであることができ、好ましくは約0.1〜約1.0mlであることができ、より好ましくは約0.5ml〜約1.0mlであることができる。この投与は、限定するものではないが、筋肉内(IM)、皮下(SC)、血管内(IV)または腎臓内注入であることができる。腎臓に到達させるための代替経路は、腎動脈、腎被膜下空間への注入、尿管注入からの逆行性注入である。
【００８５】
本発明は、本発明により製造される治療用組成物の有効量の、動物への少なくとも1回の投与を考えることができる。動物は、雄、雌、妊娠雌および新生児であることができる。有利な実施形態において、動物は哺乳動物であることができる。より有利な実施形態において、哺乳動物は、ヒト、イヌ科動物またはネコ科動物であることができ、特に男性、女性、小児、イヌ、雌イヌ、子イヌ、ネコ、雌ネコまたは子ネコであることができる。
本発明による治療用組成物は、無針装置で投与することもできる(例えばPigjet、BiojectorまたはVitajet装置(BIOJECT, Oregon, USA)を用いて)。プラスミド組成物を投与するための他のアプローチは、電気的導入の使用であることができる(例えば、S. Tollefsen et al. Vaccine, 2002, 20, 3370-3378; S. Tollefsen et al. Scand. J. Immunol., 2003, 57, 229-238; S. Babiuk et al., Vaccine, 2002, 20, 3399-3408; PCT出願公開WO99/01158を参照のこと)。
本発明の組成物の投与に関する本明細書の開示は、例として挙げたものであり、本発明が記載されている具体例に限定されないことは、当業者には明らかであろう。本明細書における開示および当該技術分野での知識から、当業者は、過度の実験を要することなく、投与回数、投与経路および本発明の組成物の各投与に用いる投与量を決定することができる。
【００８６】
好ましい実施形態において、本発明は、腎臓内注入による、ARFまたはCRFの治療および/または予防のための、イヌプレプロBMP-7、イヌプロBMP-7、イヌ成熟BMP-7ポリペプチド、ヒトプレプロBMP-7、ヒトプロBMP-7、ヒト成熟BMP-7、ネコプレプロBMP-7、ネコプロBMP-7、ネコ成熟BMP-7またはそれらの変種、誘導体もしくはフラグメントをコードし、発現することができるウイルスベクターまたはプラスミドベクターを含む組成物およびそれらの使用に関する。しかしながら、本発明の他の実施形態において、本明細書に開示された方法および組成物は、限定するものではないが、他の腎臓状態、障害および疾患、食欲不振、体重減少、脱水症、うつ病、嘔吐、多尿ならびに/または多飲症を含む他の疾患および状態を治療および/または予防するために使用できる。
【００８７】
好ましい実施形態において、本発明は、その血清クレアチニン濃度および/もしくはそのBUN濃度の増加またはその尿比重の増加を示す哺乳動物を治療するための本発明による医薬組成物の使用に関する。
好都合には、血漿クレアチニン濃度が1.9mg/dlより高い場合および/または血漿尿素窒素濃度が35mg/dlより高い場合、ネコを治療できる。好都合には、血漿クレアチニン濃度が1.6mg/dlよりも高い場合および/または血漿尿素窒素濃度が30mg/dlよりも高い場合、イヌを治療できる。
3ヵ月以上にわたって機能的または構造的な腎臓の異常が認められる場合(これは、臨床的に有意な形態学的異常または組織学的異常または腎障害に続く血液および/もしくは尿中組成の変化であることができる)および/または3ヵ月以上にわたって糸球体濾過率(GRF)が60ml/分/1.73m2以下である場合、ヒトを好都合に治療することができる。
【００８８】
ヒトにおいては、Cockcroft-Gaultの式:
GFR(ml/mm)=k x[140-年齢(歳))x体重(kg)]/クレアチン血(μmol/l)
(ただし、男性の場合はk=1.23であり、女性の場合はk=1.04である)に基づいてGFRを算出できる。
体表面積で正規化し、1.73m2で割って、結果を示すことができる(体表面積=√体重(kg)x身長(m)/3600)。
【００８９】
GFR推定値(ml/分/1.73m2)に基づいて、CRFグレードを以下のように指定することができる:
グレード1:正常な機能性を有するCRF:GFR≧90
グレード2:軽症CRF:GFR60〜90
グレード3:中等度CRF:GFR30〜59
グレード4:重症CRF:GFR15〜29
グレード5:終末期CRF:GFR<15
【００９０】
非限定的な以下の実施例によって本発明をさらに詳しく説明する。
【実施例１】
【００９１】
プラスミドpNB292の構築
コドン最適化イヌBMP7オープンリーディングフレーム(“ORF”)は、1296bpからなり、431アミノ酸のポリペプチド(配列番号2)をコードする。配列番号3のポリペプチド配列をコードし、SalIおよびXbaI制限部位に隣接するコドン最適化cDNAを、オーバーラップするオリゴヌクレオチドから合成し、ハイブリダイゼーションによりアッセンブルし、pCR-Scriptベクター(Invitrogen社製)にクローニングして、プラスミドpPCR-Script050876(図1)を作製した。
SalIおよびlXbaI消化を用いて、対象とするORFに対応するDNAフラグメントを切り離し、さらにpVR1012プラスミド(J. Hartikka et al. Human Gene Therapy 1996, 7, 1205-1217)にクローニングして、コドン最適化イヌBMP-7の発現が、サイトメガロウイルス前初期(CMV IE)プロモーター/エンハンサーにより駆動されるpNB292プラスミド(図2)を作製した。pNB292プラスミドのヌクレオチド配列は、配列番号10のヌクレオチド配列である。pNB292プラスミドを大腸菌DH5αに形質転換し、続いて、製造業者(QIAGEN)が推奨する市販キットを用いて精製した。最終プラスミド濃度は、TE緩衝液中2mg/mlであった。
【００９２】
Lipofectamin2000(INVITROGEN社製)を用いてCHO-K1細胞をトランスフェクションした後、pNB292プラスミドによりコードされるポリペプチドの、一過性のin vitro発現が確認・観察された。製造業者の使用説明書に従って、プラスミド5μgおよびリポフェクタミン10μlをそれぞれ用いて、直径6cmのプレート中で90%コンフルエンスに達したCHO-K1細胞をトランスフェクトした。トランスフェクション後、1%ウシ胎児血清を含有するMEM-glutamax培地中で細胞を24時間培養した。ガラス製カバースリップ上で増殖した細胞をPBSで洗浄し、冷アセトン中で10分間インキュベートして、さらに固定化および透過処理を行い、再度PBSで洗浄した。抗ヒトBMP7ポリクローナル血清(ABCAM社製、英国ケンブリッジ)を用いる間接免疫蛍光法により、組換えタンパク質産生を分析した。この免疫化学的方法により、pNB292によりコードされるプレプロBMP-7ポリペプチドがCHO-K1細胞内で発現されることが確認された。
【実施例２】
【００９３】
BMP-7プラスミドベースの遺伝子治療の治療効果
ラットにおいて、慢性腎不全の片側尿管閉塞(UUO)実験モデルの進行と関連する尿細管間質性病変の程度を抑制するBMP-7遺伝子治療の能力を明らかにするための研究を行った。
研究開始時に体重おおよそ200gの20匹の雄のスプラーグ・ドーリー・ラットをIFFACREDO社(L’Arbresle, France) から購入した。部屋の温度および湿度測定の両方の最大値および最小値を毎日記録した。対象の温度および湿度測定範囲は、それぞれ20〜24℃および20〜70%であった。明12時間および暗12時間のサイクルで、自動タイマーを用いて光をあてた。健常ラットのみを研究に含めた。ラットを、1群動物数5匹の4群(群1〜4)に無作為に割りつけた。
確立された処置(R. Chevalier et al., Kidney Int. 2000, 57, 882-890)を用いて、群2、3および4からのラットに片側尿管閉塞(UUO)を行った。簡潔に言えば、チレタミン-ゾラゼパム(ZOLETIL(登録商標)100-20〜50mg/kg-VIRBAC社製、フランス)の筋注によりラットに麻酔をかけた。腹部の毛を刈り込み、腹部皮膚にポビドンヨードをこすりつけた。皮膚および腹腔膜の中央切開を行った。左尿管を露出し、2本の5.0絹製縫合糸を用い、互いにおおよそ5mm離して管を締めることにより閉塞した。腹腔膜および皮膚の縫合には、絹糸を用いて行った(Silk dec. 0、ETHICON社製、フランス)。群2のラットには擬似手術を施した。すなわち、これらの動物は、尿管を手術で露出し、結紮せずに操作した。群1のラットは対照として維持し、手術は行わなかった。
【００９４】
対照導入遺伝子SEAPを発現するプラスミドgWIZ-SEAP(登録商標)は、GTS Inc.社(米国サンディエゴ)から購入し、プラセボとして用いた。実施例1に従ってpNB292プラスミドを構築した。最終プラスミド濃度は、TE緩衝液中2mg/mlであった。
手術2日前(D-2)および手術5日後(D+5)に各動物を処置し、手術日をD0とした。プラスミド注入の2時間前に、対象とする筋肉のそれぞれに、30U/100μlのヒアルロニダーゼ100μlを用いて筋肉内前処置を行った。続いて、ラットに麻酔をかけ(チレタミン-ゾラゼパムの筋注による:ZOLETIL(登録商標)100-20〜50mg/kg-VIRBAC社製、フランス)、D-2において各前頸骨筋領域に、そしてD+5において各半膜様筋領域に、筋肉内(IM)注入によりプラスミド溶液の半量(すなわち200μL)を投与した。各注入200μlは、プラスミドの半量、すなわち400μgに対応した。プラスミドを注入した各ラットには、処置1日当たり総量800μgのDNAが投与された。以下の表に、注入したプラスミドの容量および重量の概要を示す。
【００９５】
表２．プラスミド注入
2010508867.tif 000007
各群に投与した特定のプラスミド組成物を表3に示す。
【００９６】
表３．投与したプラスミド組成
2010508867.tif 000008
【００９７】
プラスミドの筋肉内送達に続き、5分以内に、皮膚と電極との間の導電性ゲルの存在下で、非侵襲性プラーク電極(それぞれおおよそ0.8cm2)を用いて、注入した各筋肉に電気的導入(ET)を行った。電極間距離を測定して、おおよそ0.8cmにした。1.3秒にわたる、周波数8Hzの、それぞれ20m秒の連続8回の電気パルスをかけた。印加電圧は、175V/cmの電界を目標とする140Vを用いた。
【００９８】
術後13日目(D+13)に、すべてのラットを安楽死させた。病理組織学的分析のために、各左腎を10%緩衝化ホルマリンで固定した。固定後、漸増濃度のアルコール溶液で各試料を脱水し、イソパラフィンH中で透明にし、パラフィン中に包埋した。ミクロトーム(MICROM(登録商標)、フランス)を用いて、包埋試料を5μmの切片にした。1つの部位に対して4つの切片を作成し、ヘマトキシリン-エオシン-サフラニン(“HES”)およびマッソン・トリクロームで染色した。x2、x4、x10、x25およびx40の対物レンズを備えた顕微鏡(ECLIPSE E600)を用いて組織切片を観察した。上皮委縮を伴う尿細管拡張およびマトリックス沈着を伴う間質の拡張により特徴付けられる腎臓の形態学的障害を、盲検法で、0(無)、1(軽微)、2(中等度)、3(軽度)および4(重篤)の尺度に基づいてスコアを付けた。1群あたりラット6匹、ラット1匹あたり10領域について決定した各値に基づいて、全平均スコアおよび各グレードの頻度を算出した。
プラスミドで発現されるBMP-7により、片側尿管閉塞(UUO)後13日目に、間質性腎線維症が軽減されることが見出された。
【００９９】
図3に、対照群対処置群における病変グレードの頻度のヒストグラムを示す。非閉塞性対照群1のラット5匹のいずれにおいても腎組織の変化は観察できず、全てのラットは、グレード“0”の、完全に正常な腎臓を維持していた。対照的に、閉塞したが、非処置の対照群2のラット5匹のうち4匹は、グレード4の重篤な病変を有していた。この群において1匹のラットはグレード3に評価されたが、これはこの実験モデルの過酷さを示している。SEAP処置群(群4)におけるラット4匹のうち4匹すべてが、同様に、グレード4の重篤な病変を示し、従って、関連のない導入遺伝子で処置したこの群におけるこのチャレンジの過酷さが確認された。対照的に、BMP-7処置群3(群3)におけるラット5匹のうち4匹は、スコア3の病変を有し、この群においてラット1匹のみが、グレード4の重篤な病変を有していた。従って、BMP-7処置群における重篤(グレード4)病変の割合は、無処置対照群(群2)における80%、プラセボ群(群4)における100%と比較して20%であった(図4)。
このデータは、尿細管間質性腎炎の大変過酷な実験モデルにおいて、BMP-7プラスミドベースの遺伝子治療の治療効果をはっきりと示している。
【実施例３】
【０１００】
プラスミドpMEB038の構築
コドン最適化ヒトBMP7オープンリーディングフレーム(“ORF”)は1296bpからなり、431アミノ酸のポリペプチド(配列番号15)をコードする。配列番号14のポリペプチド配列をコードし、EcoRVおよびXbaI制限部位に隣接するコドン最適化cDNAを、オーバーラップするオリゴヌクレオチドから合成し、ハイブリダイゼーションにより集め、pVR1012プラスミドにクローニングし(J. Hartikka et al. Human Gene Therapy 1996, 7, 1205-1217)、コドン最適化ヒトBMP-7の発現が、サイトメガロウイルス前初期(CMV IE)プロモーター/エンハンサーにより駆動される、pMEB038プラスミド(図5)を作製した。pMEB038プラスミドのヌクレオチド配列は、配列番号16のヌクレオチド配列である。pMEB038プラスミドを大腸菌DH5αに形質転換し、続いて、製造業者が推奨する市販キット(Pure Yield(登録商標)Plasmid Midiprep、Promega社)を用いて精製した。最終プラスミド濃度は、TE緩衝液中2mg/mlであった。
【０１０１】
Lipofectamin2000(INVITROGEN社製)を用いてCHO-K1細胞をトランスフェクションした後、pMEB038プラスミドによりコードされるポリペプチドの、一過性のin vitro発現が確認・観察された。製造業者の使用説明書に従って、プラスミド5μgおよびリポフェクタミン10μlをそれぞれ用いて、直径6cmのプレート中で90%コンフルエンスに達したCHO-K1細胞をトランスフェクトした。トランスフェクション後、1%ウシ胎児血清を含有するMEM-glutamax培地中で細胞を24時間培養した。ガラス製カバースリップ上で増殖した細胞をPBSで洗浄し、冷アセトン中で10分間インキュベートして、さらに固定化および透過処理を行い、再度PBSで洗浄した。抗ヒトBMP7ポリクローナル血清およびモノクローナル抗体(MAB3542、BAM354およびAF354をR&D Systems社から入手し、SC-9305およびSC-6899をSanta Cruz社から入手した)を用いる間接免疫蛍光法により組換えタンパク質産生を分析した。この免疫化学的方法により、pMEB038によりコードされるプレプロBMP-7ポリペプチドがCHO-K1細胞内で発現されることが確認された。
【実施例４】
【０１０２】
プラスミドpMEB039の構築
コドン最適化ネコBMP7オープンリーディングフレーム(“ORF”)は1296bpからなり、431アミノ酸のポリペプチド(配列番号19)をコードする。配列番号18のポリペプチド配列をコードし、EcoRVおよびXbaI制限部位に隣接するコドン最適化cDNAを、オーバーラップするオリゴヌクレオチドから合成し、ハイブリダイゼーションにより集め、pVR1012プラスミドにクローニングし(J. Hartikka et al. Human Gene Therapy 1996, 7, 1205-1217)、コドン最適化ヒトBMP-7の発現が、サイトメガロウイルス前初期(CMV IE)プロモーター/エンハンサーにより駆動される、pMEB039プラスミド(図6)を作製した。pMEB039プラスミドのヌクレオチド配列は配列番号20のヌクレオチド配列である。pMEB039プラスミドを大腸菌DH5αに形質転換し、続いて、製造業者が推奨する市販キット(Pure Yield(登録商標)Plasmid Midiprep、Promega社)を用いて精製した。最終プラスミド濃度は、TE緩衝液中2mg/mlであった。
【０１０３】
Lipofectamin2000(INVITROGEN社製)を用いてCHO-K1細胞をトランスフェクションした後、pMEB039プラスミドによりコードされるポリペプチドの、一過性のin vitro発現が確認・観察された。製造業者の使用説明書に従って、プラスミド5μgおよびリポフェクタミン10μlをそれぞれ用いて、直径6cmのプレート中で90%コンフルエンスに達したCHO-K1細胞をトランスフェクトした。トランスフェクション後、1%ウシ胎児血清を含有するMEM-glutamax培地中で細胞を24時間培養した。ガラス製カバースリップ上で増殖した細胞をPBSで洗浄し、冷アセトン中で10分間インキュベートして、さらに固定化および透過処理を行い、再度PBSで洗浄した。抗ヒトBMP7ポリクローナル血清およびモノクローナル抗体(MAB3542、BAM354およびAF354をR&D Systems社から入手し、SC-9305およびSC-6899をSanta Cruz社から入手した)を用いる間接免疫蛍光法により組換えタンパク質産生を分析した。この免疫化学的方法により、pMEB039によりコードされるプレプロBMP-7ポリペプチドがCHO-K1細胞内で発現されることが確認された。
【実施例５】
【０１０４】
腎血管内プラスミド送達後のBMP-7プラスミドベースの遺伝子治療の治療効果
研究開始時に体重おおよそ300〜350gの10匹の雄のスプラーグ・ドーリー・ラットをIFFACREDO社(L’Arbresle, France) から購入した。部屋の温度および湿度測定の両方の最大値および最小値を毎日記録した。対象の温度および湿度測定範囲は、それぞれ20〜24℃および20〜70%であった。明12時間および暗12時間のサイクルで、自動タイマーを用いて光をあてた。健常ラットのみを研究に含めた。表4に記載されているように、ラットを、1群動物数5匹の4群(群1〜4)に無作為に割りつけた。
【０１０５】
表４．研究計画
2010508867.tif 000009
*腎血管内注入日
【０１０６】
対照導入遺伝子SEAPを発現するプラスミドgWIZ-SEAP(登録商標)は、GTS Inc.社(米国サンディエゴ)から購入し、プラセボとして用いた。実施例3に従ってpMEB038プラスミドを構築した。
イソフルラン(AERANE(登録商標)、フランス、0〜5%)と酸素の混合物の吸入によりラットを麻酔にかけた。手術の前に、鎮痛のために、ブプレノルフィン(TEMGESIC(登録商標)、ファイザー社、フランス、0.1mg/kg)の皮下注射を行った。
手術領域上の皮膚にポビドンヨードをこすりつけた。中央開腹を行った。腹部臓器を穏やかに右側に移した。角度付きタイプDiethrichブルドッグクランプを用いて左腎静脈を挟んだ。副腎静脈は閉塞しなかった。24口径SURFLO(登録商標)静脈内カテーテルを用いて、適切な組成物(表4参照)1mLを左腎静脈に急速に注入した(全注入時間は2秒未満とすべきである)。注入後、直ちに血流を回復させた。腎静脈の内径を狭くする可能性を避けるために、針を挿入するときに、腎臓に引っ張る力を加えなかった。注入部位に10秒間軽い圧力を加えて止血を行った。分解性縫合糸を用いて、腹壁および皮膚を層をなして縫合した。創傷に包帯をして、麻酔から完全に回復するまで、動物をしっかりモニターした。
筋肉内経路を用いて、7mL/kgの用量で動物にグリセロール(50%)の注入を行った。両方の硬くなった筋肉にグリセロールの全量を分配した。D1およびD2にブプレノルフィンの皮下注射を行った。
D4に、全群の動物の体重をはかり、チレタミン-ゾラゼパム(ZOLETIL(登録商標)100-20〜50mg/kg、Virbac社、France)の筋注により麻酔をかけた。血液試料を採取し、血清クレアチニン検査(Laboratoire VETFRANCE, Evry, France) および血漿採取のために用いた。できるだけ早く血漿を調製し、直ちに-20℃で保存した。ついで、ペントバルビタール(DOLETHAL(登録商標)、Vetoquinol社、フランス)の静脈内注射により、動物を安楽死させた。腎臓を採取し、肉眼的に検査した。
【０１０７】
図7は、百分率で表した、D0〜D4での各群の動物の平均相対的体重変化のヒストグラムを示す。逆行性血行力学腎静脈内注入技術によりBMP7プラスミドで処置したラットにおいて、体重減少に対する部分的な保護が達成されている。
図8は、ミリグラム/デシリットルで表した、D4における各群の動物の平均クレアチン血のヒストグラムを示す。逆行性血行力学腎静脈内注入技術によりBMP7プラスミドで処置したラットにおいて、クレアチン血増加に対する部分的な保護が達成されている。
関連する腎臓病理学モデルにおいて、逆行性血行力学腎静脈内注入技術を用いて投与したBMP-7プラスミドベースの遺伝子治療の臨床効果を、このデータは明らかに示している。
【０１０８】
以下の番号付けしたパラグラフにより、本発明をさらに説明する:
1.腎不全を患っているかまたは発症する恐れがある哺乳動物被験者を治療する方法であって、プロモーターに作動可能に連結されているBMP-7ポリペプチドをコードする核酸配列を含むプラスミドの治療的有効量を前記哺乳動物被験者に投与することを含み、BMP-7ポリペプチドが哺乳動物被験者においてin vivoで発現される前記方法。
2.哺乳動物被験者がヒト、イヌ科動物およびネコ科動物からなる群から選択される、パラグラフ1記載の方法。
3.哺乳動物被験者がイヌ、雌イヌまたは子イヌである、パラグラフ1記載の方法。
4.哺乳動物被験者がネコまたは子ネコである、パラグラフ1記載の方法。
5.哺乳動物被験者が急性腎不全を患っているかまたは発症する恐れがある、パラグラフ1記載の方法。
6.哺乳動物被験者が慢性腎不全を患っているかまたは発症する恐れがある、パラグラフ1記載の方法。
7.BMP-7ポリペプチドが、プレプロBMP-7ポリペプチド、プロBMP-7ポリペプチドおよび成熟BMP-7ポリペプチドからなる群から選択される、パラグラフ1記載の方法。
8.BMP-7ポリペプチドが、イヌプレプロBMP-7ポリペプチド、イヌプロBMP-7ポリペプチド、イヌ成熟BMP-7ポリペプチド、ネコプレプロBMP-7ポリペプチド、ネコプロBMP-7ポリペプチド、ネコ成熟BMP-7ポリペプチド、ヒトプレプロBMP-7ポリペプチド、ヒトプロBMP-7ポリペプチドおよびヒト成熟BMP-7ポリペプチドからなる群から選択される、パラグラフ1記載の方法。
9.BMP-7ポリペプチドをコードする核酸配列が、BMP-7活性を有するポリペプチドをコードする、配列番号1、配列番号2、配列番号13、配列番号14、配列番号17、配列番号18ならびにそれらのフラグメント、変種、誘導体およびホモログからなる群から選択される、パラグラフ1記載の方法。
10.BMP-7ポリペプチドが、BMP-7活性を有する、配列番号3、配列番号15、配列番号19ならびにそれらのフラグメント、変種、誘導体およびホモログからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、パラグラフ1記載の方法。
11.BMP-7ポリペプチドが、シグナルペプチドを含む、パラグラフ1記載の方法。
12.シグナルペプチドが、BMP-7シグナル配列、IGF-1シグナル配列およびtPAシグナル配列からなる群から選択される、パラグラフ11記載の方法。
13.シグナルペプチドが、シグナルペプチド活性を有するペプチドをコードする、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号11ならびにそれらのフラグメント、変種、誘導体およびホモログからなる群から選択されるヌクレオチド配列によりコードされる、パラグラフ11記載の方法。
14.シグナルペプチドが、シグナルペプチド活性を有する、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号12ならびにそれらのフラグメント、変種、誘導体およびホモログからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、パラグラフ11記載の方法。
15.プロモーターが、CMV IEプロモーター、RSVプロモーター、HSV-1 TKプロモーター、SV40初期プロモーター、SV40後期プロモーター、アデノウイルス主後期プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子プロモーター、メタロチオネイン遺伝子プロモーター、α-1アンチトリプシン遺伝子プロモーター、アルブミン遺伝子プロモーター、コラゲナーゼ遺伝子プロモーター、エラスターゼI遺伝子プロモーター、β-アクチン遺伝子プロモーター、β-グロビン遺伝子プロモーター、γ-グロビン遺伝子プロモーター、αフェトプロテイン遺伝子プロモーターおよび筋クレアチンキナーゼ遺伝子プロモーターからなる群から選択される、パラグラフ1記載の方法。
16.プラスミドがpNB292であり、配列番号10のヌクレオチド配列を有する、パラグラフ1記載の方法。
17.プラスミドがpMEB038であり、配列番号16のヌクレオチド配列を有する、パラグラフ1記載の方法。
18.プラスミドがpMEB039であり、配列番号20のヌクレオチド配列を有する、パラグラフ1記載の方法。
19.プラスミドが、VR1012プラスミドに挿入されたBMP-7ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、パラグラフ1記載の方法。
20.腎不全を患っているかまたは発症する恐れがあるイヌを治療する方法であって、プロモーターに作動可能に連結されているBMP-7ポリペプチドをコードする核酸配列を含むプラスミドの治療的有効量を前記イヌに投与することを含む前記方法。
21.腎不全を患っているかまたは発症する恐れがあるネコを治療する方法であって、プロモーターに作動可能に連結されているBMP-7ポリペプチドをコードする核酸配列を含むプラスミドの治療的有効量を前記ネコに投与することを含む前記方法。
22.腎不全を患っているかまたは発症する恐れがあるヒトを治療する方法であって、プロモーターに作動可能に連結されているBMP-7ポリペプチドをコードする核酸配列を含むプラスミドの治療的有効量を前記ヒトに投与することを含む前記方法。
23.BMP-7ポリペプチドが、プレプロBMP-7ポリペプチド、プロBMP-7ポリペプチドおよび成熟BMP-7ポリペプチドからなる群から選択される、パラグラフ20〜22のいずれか1つに記載の方法。
24.BMP-7ポリペプチドをコードする核酸配列が、BMP-7活性を有するポリペプチドをコードする、配列番号1、配列番号2ならびにそれらのフラグメント、変種、誘導体およびホモログからなる群から選択される、パラグラフ20記載の方法。
25.BMP-7ポリペプチドが、BMP-7活性を有する、配列番号3ならびにそのフラグメント、変種、誘導体およびホモログからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、パラグラフ20記載の方法。
26.BMP-7ポリペプチドをコードする核酸配列が、BMP-7活性を有するポリペプチドをコードする、配列番号17、配列番号18ならびにそれらのフラグメント、変種、誘導体およびホモログからなる群から選択される、パラグラフ21記載の方法。
27.BMP-7ポリペプチドが、BMP-7活性を有する、配列番号19ならびにそのフラグメント、変種、誘導体およびホモログからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、パラグラフ21記載の方法。
28.BMP-7ポリペプチドをコードする核酸配列が、BMP-7活性を有するポリペプチドをコードする、配列番号13、配列番号14ならびにそれらのフラグメント、変種、誘導体およびホモログからなる群から選択される、パラグラフ22記載の方法。
29.BMP-7ポリペプチドが、BMP-7活性を有する、配列番号15ならびにそのフラグメント、変種、誘導体およびホモログからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、パラグラフ22記載の方法。
【０１０９】
30.BMP-7ポリペプチドがシグナルペプチドを含む、パラグラフ23記載の方法。
31.シグナルペプチドが、BMP-7シグナル配列、IGF-1シグナル配列およびtPAシグナル配列からなる群から選択される、パラグラフ30記載の方法。
32.シグナルペプチドが、シグナルペプチド活性を有するペプチドをコードする、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号11ならびにそれらのフラグメント、変種、誘導体およびホモログからなる群から選択されるヌクレオチド配列によりコードされる、パラグラフ30記載の方法。
33.シグナルペプチドが、シグナルペプチド活性を有する、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号12ならびにそれらのフラグメント、変種、誘導体およびホモログからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、パラグラフ30記載の方法。
34.プロモーターが、CMV IEプロモーター、RSVプロモーター、HSV-1 TKプロモーター、SV40初期プロモーター、SV40後期プロモーター、アデノウイルス主後期プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子プロモーター、メタロチオネイン遺伝子プロモーター、α-1アンチトリプシン遺伝子プロモーター、アルブミン遺伝子プロモーター、コラゲナーゼ遺伝子プロモーター、エラスターゼI遺伝子プロモーター、β-アクチン遺伝子プロモーター、β-グロビン遺伝子プロモーター、γ-グロビン遺伝子プロモーター、αフェトプロテイン遺伝子プロモーターおよび筋クレアチンキナーゼ遺伝子プロモーターからなる群から選択される、パラグラフ20記載の方法。
35.プラスミドがpNB292であり、配列番号10のヌクレオチド配列を有する、パラグラフ20記載の方法。
36.プラスミドがpMEB038であり、配列番号16のヌクレオチド配列を有する、パラグラフ20記載の方法。
37.プラスミドがpMEB039であり、配列番号20のヌクレオチド配列を有する、パラグラフ20記載の方法。
38.プラスミドが、VR1012プラスミドに挿入されたBMP-7ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、パラグラフ20記載の方法。
39.腎不全の発症の恐れがある哺乳動物被験者における腎不全の発症を予防する方法であって、プロモーターに作動可能に連結されているBMP-7ポリペプチドをコードする核酸配列を含むプラスミドベクターの有効量を前記哺乳動物被験者に投与することを含む前記方法。
40.哺乳動物被験者が、急性腎不全を発症する恐れがある、パラグラフ39記載の方法。
41.哺乳動物被験者が、慢性腎不全を発症する恐れがある、パラグラフ39記載の方法。
42.BMP-7ポリペプチドが、プレプロBMP-7ポリペプチド、プロBMP-7ポリペプチドおよび成熟BMP-7ポリペプチドからなる群から選択される、パラグラフ39記載の方法。
43.BMP-7ポリペプチドをコードする核酸配列が、BMP-7活性を有するポリペプチドをコードする、配列番号1、配列番号2、配列番号13、配列番号14、配列番号17、配列番号18ならびにそれらのフラグメント、変種、誘導体およびホモログからなる群から選択される、パラグラフ39記載の方法。
44.BMP-7ポリペプチドが、BMP-7活性を有する、配列番号3、配列番号15、配列番号19ならびにそれらのフラグメント、変種、誘導体およびホモログからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、パラグラフ39記載の方法。
45.BMP-7ポリペプチドがシグナルペプチドを含む、パラグラフ39記載の方法。
46.シグナルペプチドが、BMP-7シグナル配列、IGF-1シグナル配列およびtPAシグナル配列からなる群から選択される、パラグラフ39記載の方法。
47.シグナルペプチドが、シグナルペプチド活性を有するペプチドをコードする、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号11ならびにそれらのフラグメント、変種、誘導体およびホモログからなる群から選択されるヌクレオチド配列によりコードされる、パラグラフ46記載の方法。
48.シグナルペプチドが、シグナルペプチド活性を有する、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号12ならびにそれらのフラグメント、変種、誘導体およびホモログからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、パラグラフ46記載の方法。
49.プロモーターが、CMV IEプロモーター、RSVプロモーター、HSV-1 TKプロモーター、SV40初期プロモーター、SV40後期プロモーター、アデノウイルス主後期プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子プロモーター、メタロチオネイン遺伝子プロモーター、α-1アンチトリプシン遺伝子プロモーター、アルブミン遺伝子プロモーター、コラゲナーゼ遺伝子プロモーター、エラスターゼI遺伝子プロモーター、β-アクチン遺伝子プロモーター、β-グロビン遺伝子プロモーター、γ-グロビン遺伝子プロモーター、αフェトプロテイン遺伝子プロモーターおよび筋クレアチンキナーゼ遺伝子プロモーターからなる群から選択される、パラグラフ39記載の方法。
50.プラスミドがpNB292であり、配列番号10のヌクレオチド配列を有する、パラグラフ39記載の方法。
51.プラスミドがpMEB038であり、配列番号16のヌクレオチド配列を有する、パラグラフ39記載の方法。
52.プラスミドがpMEB039であり、配列番号20のヌクレオチド配列を有する、パラグラフ39記載の方法。
53.プラスミドが、VR1012プラスミドに挿入されたBMP-7ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、パラグラフ39記載の方法。
54.プロモーターに作動可能に連結されているBMP-7ポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換えプラスミドベクター。
55.BMP-7ポリペプチドが、プレプロBMP-7ポリペプチド、プロBMP-7ポリペプチドおよび成熟BMP-7ポリペプチドからなる群から選択される、パラグラフ54記載の組換えプラスミドベクター。
56.BMP-7ポリペプチドをコードする核酸配列が、BMP-7活性を有するポリペプチドをコードする、配列番号1、配列番号2、配列番号13、配列番号14、配列番号17、配列番号18ならびにそれらのフラグメント、変種、誘導体およびホモログからなる群から選択される、パラグラフ54記載の組換えプラスミドベクター。
57.BMP-7ポリペプチドが、BMP-7活性を有する、配列番号3、配列番号15、配列番号19ならびにそれらのフラグメント、変種、誘導体およびホモログからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、パラグラフ54記載の組換えプラスミドベクター。
58.BMP-7ポリペプチドがシグナルペプチドを含む、パラグラフ54記載の組換えプラスミドベクター。
59.シグナルペプチドが、BMP-7シグナル配列、IGF-1シグナル配列およびtPAシグナル配列からなる群から選択される、パラグラフ58記載の組換えプラスミドベクター。
60.シグナルペプチドが、シグナルペプチド活性を有するペプチドをコードする、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号11ならびにそれらのフラグメント、変種、誘導体およびホモログからなる群から選択されるヌクレオチド配列によりコードされる、パラグラフ58記載の組換えプラスミドベクター。
【０１１０】
61.シグナルペプチドが、シグナルペプチド活性を有する、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号12ならびにそれらのフラグメント、変種、誘導体およびホモログからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、パラグラフ58記載の組換えプラスミドベクター。
62.プロモーターが、CMV IEプロモーター、RSVプロモーター、HSV-1 TKプロモーター、SV40初期プロモーター、SV40後期プロモーター、アデノウイルス主後期プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子プロモーター、メタロチオネイン遺伝子プロモーター、α-1アンチトリプシン遺伝子プロモーター、アルブミン遺伝子プロモーター、コラゲナーゼ遺伝子プロモーター、エラスターゼI遺伝子プロモーター、β-アクチン遺伝子プロモーター、β-グロビン遺伝子プロモーター、γ-グロビン遺伝子プロモーター、αフェトプロテイン遺伝子プロモーターおよび筋クレアチンキナーゼ遺伝子プロモーターからなる群から選択される、パラグラフ54記載の組換えプラスミドベクター。
63.プラスミドがpNB292であり、配列番号10のヌクレオチド配列を有する、パラグラフ54記載の組換えプラスミドベクター。
64.プラスミドがpMEB038であり、配列番号16のヌクレオチド配列を有する、パラグラフ54記載の組換えプラスミドベクター。
65.プラスミドがpMEB039であり、配列番号20のヌクレオチド配列を有する、パラグラフ54記載の組換えプラスミドベクター。
66.プラスミドが、VR1012プラスミドに挿入されたBMP-7ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、パラグラフ54記載の組換えプラスミドベクター。
67.パラグラフ54〜66のいずれか1つに記載の組換えプラスミドベクターおよび少なくとも1つの薬学的または獣医学的に許容される担体、賦形剤またはビヒクルを含む医薬組成物。
68.腎不全を患っているかまたは発症する恐れがある哺乳動物被験者を治療する方法であって、プロモーターに作動可能に連結されているBMP-7ポリペプチドをコードする核酸配列を含むプラスミドの治療的有効量を前記哺乳動物被験者に投与することを含む前記方法において、プラスミドが腎臓内または血管内経路で前記哺乳動物被験者の腎臓に投与され、BMP-7ポリペプチドが哺乳動物被験者においてin vivoで発現される前記方法。
69.哺乳動物被験者が、ヒト、イヌ科動物およびネコ科動物からなる群から選択される、パラグラフ1記載の方法。
70.哺乳動物被験者が、イヌ、雌イヌまたは子イヌである、パラグラフ1記載の方法。
71.哺乳動物被験者が、ネコまたは子ネコである、パラグラフ1記載の方法。
72.哺乳動物被験者が、急性腎不全を患っているかまたは発症する恐れがある、パラグラフ1記載の方法。
73.哺乳動物被験者が、慢性腎不全を患っているかまたは発症する恐れがある、パラグラフ1記載の方法。
74.BMP-7ポリペプチドが、プレプロBMP-7ポリペプチド、プロBMP-7ポリペプチドおよび成熟BMP-7ポリペプチドからなる群から選択される、パラグラフ1記載の方法。
75.BMP-7ポリペプチドが、イヌプレプロBMP-7ポリペプチド、イヌプロBMP-7ポリペプチド、イヌ成熟BMP-7ポリペプチド、ネコプレプロBMP-7ポリペプチド、ネコプロBMP-7ポリペプチド、ネコ成熟BMP-7ポリペプチド、ヒトプレプロBMP-7ポリペプチド、ヒトプロBMP-7ポリペプチドおよびヒト成熟BMP-7ポリペプチドからなる群から選択される、パラグラフ1記載の方法。
76.BMP-7ポリペプチドをコードする核酸配列が、BMP-7活性を有するポリペプチドをコードする、配列番号1、配列番号2、配列番号13、配列番号14、配列番号17、配列番号18ならびにそれらのフラグメント、変種、誘導体およびホモログからなる群から選択される、パラグラフ1記載の方法。
77.BMP-7ポリペプチドが、BMP-7活性を有する、配列番号3、配列番号15、配列番号19ならびにそれらのフラグメント、変種、誘導体およびホモログからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、パラグラフ1記載の方法。
78.BMP-7ポリペプチドがシグナルペプチドを含む、パラグラフ68記載の方法。
79.シグナルペプチドが、BMP-7シグナル配列、IGF-1シグナル配列およびtPAシグナル配列からなる群から選択される、パラグラフ78記載の方法。
80.シグナルペプチドが、シグナルペプチド活性を有するペプチドをコードする、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号11ならびにそれらのフラグメント、変種、誘導体およびホモログからなる群から選択されるヌクレオチド配列によりコードされる、パラグラフ78記載の方法。
81.シグナルペプチドが、シグナルペプチド活性を有する、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号12ならびにそれらのフラグメント、変種、誘導体およびホモログからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、パラグラフ78記載の方法。
82.プロモーターが、CMV IEプロモーター、RSVプロモーター、HSV-1 TKプロモーター、SV40初期プロモーター、SV40後期プロモーター、アデノウイルス主後期プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子プロモーター、メタロチオネイン遺伝子プロモーター、α-1アンチトリプシン遺伝子プロモーター、アルブミン遺伝子プロモーター、コラゲナーゼ遺伝子プロモーター、エラスターゼI遺伝子プロモーター、β-アクチン遺伝子プロモーター、β-グロビン遺伝子プロモーター、γ-グロビン遺伝子プロモーター、αフェトプロテイン遺伝子プロモーターおよび筋クレアチンキナーゼ遺伝子プロモーターからなる群から選択される、パラグラフ68記載の方法。
83.プラスミドがpNB292であり、配列番号10のヌクレオチド配列を有する、パラグラフ68記載の方法。
84.プラスミドがpMEB038であり、配列番号16のヌクレオチド配列を有する、パラグラフ68記載の方法。
85.プラスミドがpMEB039であり、配列番号20のヌクレオチド配列を有する、パラグラフ68記載の方法。
86.プラスミドが、VR1012プラスミドに挿入されたBMP-7ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、パラグラフ68記載の方法。
87.投与が、血行力学ベースのプラスミドDNA遺伝子送達である、パラグラフ68記載の方法。
88.送達が、腎静脈内注入による裸のプラスミドの送達である、パラグラフ87記載の方法。
89.(i)閉塞バルーンカテーテルを哺乳動物被験者の腎静脈に挿入し;(ii)腎静脈をバルーンの膨張により閉塞し;(iii)約0.5〜約3ml/sの流量を確実にするために、プラスミド約0.0005〜0.5mg/kg量を、約5〜約25ml、すなわち約0.5〜約2.5ml/kgの生理食塩緩衝液を用いて腎静脈に急速に注入し;(iv)急速注入の間中バルーン閉塞を続け、注入後約10秒〜約3分で停止し;(v)閉塞バルーンを除去して投与を行う、パラグラフ87または88記載の方法。
90.(iii)プラスミド約0.2mg/kg量を生理食塩緩衝液約15mlを用いて静脈に急速に注入する、パラグラフ89記載の方法。
【０１１１】
91.(iii)約1ml/sの流量で強力注入器を用いる、パラグラフ89記載の方法。
92.(iv)急速注入の間中バルーン閉塞を続け、注入1分後に停止する、パラグラフ89記載の方法。
93.哺乳動物被験者がイヌ科動物である、パラグラフ87〜92のいずれかに記載の方法。
94.BMP-7ポリペプチドが、イヌプレプロBMP-7ポリペプチド、イヌプロBMP-7ポリペプチド、イヌ成熟BMP-7ポリペプチドからなる群から選択される、パラグラフ93記載の方法。
95.プラスミドがpNB292であり、配列番号10のヌクレオチド配列を有する、パラグラフ94記載の方法。
96.哺乳動物被験者がネコ科動物である、パラグラフ87〜92のいずれかに記載の方法。
97.BMP-7ポリペプチドが、ネコプレプロBMP-7ポリペプチド、ネコプロBMP-7ポリペプチド、ネコ成熟BMP-7ポリペプチドからなる群から選択される、パラグラフ96記載の方法。
98.プラスミドがpMEB039であり、配列番号20のヌクレオチド配列を有する、パラグラフ97記載の方法。
99.哺乳動物被験者がヒトである、パラグラフ87〜92のいずれかに記載の方法。
100.BMP-7ポリペプチドが、ヒトプレプロBMP-7ポリペプチド、ヒトプロBMP-7ポリペプチド、ヒト成熟BMP-7ポリペプチドからなる群から選択される、パラグラフ99記載の方法。
101.プラスミドがpMEB038であり、配列番号16のヌクレオチド配列を有する、パラグラフ100記載の方法。
102.哺乳動物被験者がヒトである、パラグラフ1記載の方法。
【０１１２】
上記に、本発明の好ましい実施形態を詳細に説明してきたが、本発明の精神または範囲を逸脱することなく多くの見かけの変形が可能なので、上記パラグラフにより定義される本発明は、上記の説明中に示される特定の詳細に限定されるべきではないと解されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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