(57)【要約】  本発明は、Ｃ５ａＲに結合し、診断および治療方法で有用な改良された抗体に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：３［３Ｃ５  Ｖｈ］に示された可変重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３ループ配列に対して少なくとも８０％同一性を保有する少なくとも１つのＣＤＲループ配列を含む抗体であり、前記抗体はＣ５ａのＣ５ａＲへの結合を低下させ、または阻害する、抗体。
【請求項２】
前記抗体が、配列番号：３［３Ｃ５  Ｖｈ］に示された可変重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３ループ配列に対して少なくとも８０％同一性を保有する少なくとも２つのＣＤＲループ配列を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記抗体が、さらに、配列番号：４［３Ｃ５  Ｖｌ］に示された可変軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３ループ配列に対して少なくとも８０％同一性を保有する少なくとも１つのＣＤＲループ配列を含む、請求項１または請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体が、配列番号：４［３Ｃ５  Ｖｌ］に示された可変軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３ループ配列に対して少なくとも８０％同一性を保有する少なくとも２つのＣＤＲループ配列を含む、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体が、各々、配列番号：３［３Ｃ５  Ｖｈ］および配列番号：４［３Ｃ５  Ｖｌ］に示される重鎖および／または軽鎖配列に対して少なくとも８０％同一性を保有する配列を含み、前記抗体はＣ５ａのＣ５ａＲへの結合を低下させ、または阻害する、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項６】
（ｉ）同一条件下で決定された場合にＭＡｂ７Ｆ３のそれよりも少なくとも１．５倍低いＩＣ50値；または
（ｉｉ）同一条件下で決定された場合にＭＡｂ７Ｆ３のそれよりも少なくとも１．５倍高い会合定数（Ｋｏｎ）；または
（ｉｉｉ）同一条件下で決定した場合ＭＡｂ７Ｆ３のそれよりも少なくとも１．３倍低いＫD親和性定数；
でもって、ヒトＣ５ａＲまたはその断片に結合する、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項７】
（ｉ）５００ｐＭ未満、好ましくは３００ｐＭ未満、より好ましくは２００ｐＭ未満であるＩＣ50値；または
（ｉｉ）少なくとも６．８×１０5Ｍ-1ｓ-1である会合定数（Ｋｏｎ）；または
（ｉｉｉ）１．４ｎＭ未満であるＫD親和性定数；
でもって、ヒトＣ５ａＲまたはその断片に結合する、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項８】
Ｃ５ａＲの断片が、配列ＬＹＲＶＶＲＥＥＹＦＰＰＫＶＬＣＧＶＤＹＳＨＤＫＲＲＥＲＡＶＡＩＶ（配列番号：２）を含むペプチドである、請求項６または請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
配列番号：５［７Ｈ３  Ｖｈ］に示された可変重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３ループ配列に対して少なくとも８０％同一性を保有する少なくとも１つのＣＤＲループ配列を含む抗体であり、前記抗体はＣ５ａのＣ５ａＲへの結合を低下させ、または阻害する、抗体。
【請求項１０】
前記抗体が、配列番号：５［７Ｈ３  Ｖｈ］に示された可変重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３ループ配列に対して少なくとも８０％同一性を保有する少なくとも２つのＣＤＲループ配列を含む、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
前記抗体が、さらに、配列番号：６［７Ｈ３  Ｖｌ］に示された可変軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３ループ配列に対して少なくとも８０％同一性を保有する少なくとも１つのＣＤＲループ構造を含む、請求項９または請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
前記抗体が、配列番号：６［７Ｈ３  Ｖｌ］に示された可変軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３ループ配列に対して少なくとも８０％同一性を保有する少なくとも２つのＣＤＲループ配列を含む、請求項１１に記載の抗体。
【請求項１３】
前記抗体が、各々、配列番号：５［７Ｈ３  Ｖｈ］および配列番号：６［７Ｈ３  Ｖｌ］に示された重鎖および／または軽鎖配列に対して少なくとも８０％同一性を保有する配列を含み、前記抗体はＣ５ａのＣ５ａＲへの結合を低下させ、または阻害する、請求項９から１２のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１４】
配列番号：７［８Ｇ７  Ｖｈ］に示された可変重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３ループ配列に対して少なくとも８０％同一性を保有する少なくとも１つのＣＤＲループ配列を含む抗体であって、前記抗体はＣ５ａのＣ５ａＲへの結合を低下させ、または阻害することを特徴とする、抗体。
【請求項１５】
前記抗体が、配列番号：７［８Ｇ７  Ｖｈ］に示された可変重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３ループ配列に対して少なくとも８０％同一性を保有する少なくとも２つのＣＤＲループ配列を含む、請求項１４に記載の抗体。
【請求項１６】
前記抗体が、さらに、配列番号：８［８Ｇ７  Ｖｌ］に示された可変軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３ループ配列に対して少なくとも８０％同一性を保有する少なくとも１つのＣＤＲループ配列を含む、請求項１４または請求項１５に記載の抗体。
【請求項１７】
前記抗体が、配列番号：８［８Ｇ７  Ｖｌ］に示された可変軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３ループ配列に対して少なくとも８０％同一性を保有する少なくとも２つのＣＤＲループ配列を含む、請求項１６に記載の抗体。
【請求項１８】
前記抗体が、各々、配列番号：７および配列番号：８に示された重鎖および／または軽鎖配列に対して少なくとも８０％同一性を保有する配列を含み、前記抗体はＣ５ａのＣ５ａＲへの結合を低下させ、または阻害する、請求項１４から１７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１９】
前記抗体が、モノクローナル組換え抗体、キメラまたはヒト化抗体である、請求項１から１８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２０】
ＭＡｂ  ３Ｃ５、ＭＡｂ  ８Ｇ７およびＭＡｂ  ７Ｈ３からなる群より選択される、モノクローナル抗体。
【請求項２１】
前記抗体が、ヒトＣ５ａＲの第二の細胞外ループ（残基１７５から２０６）と反応性である、請求項１から２０のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２２】
前記抗体が、ヒトＣ５ａＲの残基１７９から１８４（ＥＥＹＦＰＰ）を含むエピトープに対して反応性である、請求項１から２１のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２３】
アクセション番号０６０８１８０１下でＥＣＡＣＣに寄託されたハイブリドーマ。
【請求項２４】
アクセション番号０６０８１８０２下でＥＣＡＣＣに寄託されたハイブリドーマ。
【請求項２５】
アクセション番号０６０８１８０３下でＥＣＡＣＣに寄託されたハイブリドーマ。
【請求項２６】
請求項１から２２のいずれか一項に記載の抗体、および治療剤を含むコンジュゲート。
【請求項２７】
請求項１から２２のいずれか一項に記載の抗体、および検出可能な標識を含むコンジュゲート。
【請求項２８】
請求項１から２２のいずれか一項に記載の抗体をコードする配列を含む単離された核酸分子。
【請求項２９】
請求項１から２２のいずれか一項に記載の抗体、および医薬上許容される担体を含む組成物。
【請求項３０】
医薬として用いられる、請求項１から２２のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３１】
対象において白血球または好中球の移動に関連する障害を診断する方法であって、前記方法は、インビトロにて対象から得られた試料を本発明のコンジュゲートと接触させ、次いで、前記コンジュゲートおよび前記試料の間の免疫特異的結合を検出することを含む方法。
【請求項３２】
白血球または好中球移動に関連する障害の治療用の医薬の調製で用いられる、請求項１から２２のいずれか一項に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ５ａＲに結合し、かつ診断および治療方法で有用な改良された抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
補体タンパク質Ｃ３〜Ｃ５の各々のタンパク質分解は、アナフィラトキシン(６−９)と呼ばれるシグナリング分子でアミノ末端カチオン性断片を生起させる。これらのうち最も優れたＣ５ａは、最も広い応答を誘導する。平滑筋を収縮させる能力と共に、白血球の辺縁趨向および浸潤としての炎症応答の成分、顆粒結合タンパク質分解酵素の放出、活性化された酸素および窒素由来ラジカルの生産、血流および毛細管漏出の変化を考慮すると、該Ｃ５ａ分子は「完全な」炎症促進性メディエーターである。ナノモル以下からナノモルレベルにおいて、Ｃ５ａ分子は全ての骨髄細胞系列（好中球、好酸球および好塩基球、マクロファージおよび単球）の化学走性を誘導し、血管透過性を引き起こし、これは、プロスタグランジンおよび循環白血球によって顕著に増強される。より高いナノモラー濃度は脱顆粒およびＮＡＤＰＨオキシダーゼの活性化を誘導する。生体活性のこの広さは、他の免疫メディエーターとは対照的である。Ｃ５ａは慢性関節リウマチ、乾癬、敗血症、再灌流負傷、および成人呼吸窮迫症候群の病因に関連付けられてきた(非特許文献１;非特許文献２)。
【０００３】
Ｃ５ａの活性はＣ５ａのその受容体(Ｃ５ａＲ)への結合によって媒介される。Ｃ５ａＲは７回膜貫通Ｇ−タンパク質共役受容体のファミリーに属する。Ｃ５ａＲは約１ｎＭのＫｄを持つＣ５ａに対する高親和性受容体であって、白血球を含めた多数の異なる細胞型に位置している。細胞当たりの受容体の数は極端に高く、白血球当たり２００，０００部位までである。受容体の生物学的活性化は、結合を飽和する範囲に渡って起こる。
【０００４】
Ｃ５ａＲ構造は７回膜貫通受容体ファミリーに適合し、細胞外Ｎ−末端には、細胞内および細胞外ループとして交互に存在するヘリックス間ドメインによって連結された７回の膜貫通ヘリックスが続き、細胞内Ｃ−末端ドメインで終わる。Ｃ５ａＲは伸長Ｎ−末端細胞外ドメインを含有する。この大きなＮ−末端ドメインは、ＩＬ−８およびｆＭｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ(ＦＭＬＰ)受容体ファミリーを含めた、ペプチドに結合するＧ−プロテイン共役受容体に典型的である。
【０００５】
Ｃ５ａ応答のＣ５ａＲアンタゴニストでの阻害は、他の補体成分に影響することなくＣ５ａを介して媒介される急性炎症応答を低下させるはずである。この目的で、Ｃ５ａＲペプチドアンタゴニストおよび抗Ｃ５ａ受容体抗体は従前に記載されている(非特許文献３;非特許文献４;非特許文献５;非特許文献６;非特許文献７)。例えば、特許文献１(Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔ.)は、Ｃ５ａ受容体のＮ−末端ペプチド（残基９〜２９）に対して向けられた抗体を記載する。
【０００６】
特許文献２（Ｇ２  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ）は、Ｃ５ａＲへのＣ５ａ結合を阻害するのに効果的なＮ−末端ドメイン以外のＣ５ａＲの細胞外ループに向けられた抗体を記載する。本出願に開示された特異的モノクローナル抗体はＭａｂ  ７Ｆ３、Ｍａｂ  １２Ｄ４およびＭａｂ  ６Ｃ１２である。これらのモノクローナル抗体のうち、Ｍａｂ  ７Ｆ３はＣ５ａＲに対して最高の結合親和性を有する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ９５／００１６４
【特許文献２】ＷＯ０３／０６２２７８
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Gerard and Gerard, 1994
【非特許文献２】Murdoch and Finn,2000
【非特許文献３】Watanabe et al., 1995
【非特許文献４】Pellas et al., 1998
【非特許文献５】Konteatis et al., 1994
【非特許文献６】Kaneko et al., 1995
【非特許文献７】Morgan et al., 1993
【発明の概要】
【０００９】
本発明者らは、今回、Ｍａｂ  ７Ｆ３と比較した場合、Ｃ５ａＲに対して実質的に改良された結合親和性を有し、かつマウス関節炎モデルにおいて炎症を逆行させるのにかなり効果的な新規なモノクローナル抗体を開発した。
【００１０】
従って、本発明は、配列番号：３[３Ｃ５  Ｖｈ]に示された可変重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３ループ配列に対して少なくとも８０％同一性を保有する少なくとも１つのＣＤＲループ配列を含む抗体を提供し、該抗体はＣ５ａのＣ５ａＲへの結合を低下させ、または阻害する。
【００１１】
好ましい実施形態において、該抗体は、配列番号：３[３Ｃ５  Ｖｈ]に示された可変重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３ループ配列に対して少なくとも８０％同一性を保有する少なくとも２つのＣＤＲループ配列を含む。
【００１２】
さらなる好ましい実施形態において、該抗体は、さらに、配列番号：４[３Ｃ５  Ｖｌ]に示された可変軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３ループ配列に対して少なくとも８０％同一性を保有する少なくとも１つのＣＤＲループ配列を含む。
【００１３】
さらなる好ましい実施形態において、該抗体は、配列番号：４[３Ｃ５  Ｖｌ]に示された可変軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３ループ配列に対して少なくとも８０％同一性を保有する少なくとも２つのＣＤＲループ配列を含む。
【００１４】
さらなる好ましい実施形態において、該抗体は、各々、配列番号：３および配列番号：４に示された重鎖および／または軽鎖配列に対して少なくとも８０％同一性を保有する配列を含み、該抗体はＣ５ａのＣ５ａＲへの結合を低下させ、または阻害する。
【００１５】
好ましい実施形態において、該抗体は、
（ｉ）同一条件下で決定した場合、Ｍａｂ７Ｆ３のそれよりも少なくとも１．５倍低いＩＣ50値；または
（ｉｉ）同一条件下で決定した場合、Ｍａｂ７Ｆ３のそれよりも少なくとも１．５倍高い会合定数(Ｋｏｎ)；または
（ｉｉｉ）同一条件下で決定した場合に、Ｍａｂ７Ｆ３のそれよりも少なくとも１．３倍低いＫD親和性定数；
でもって、ヒトＣ５ａＲまたはその断片に結合する。
【００１６】
好ましくは、該抗体は、同一条件下で決定した場合に、Ｍａｂ７Ｆ３のそれよりも少なくとも１．４倍低いＫD親和性定数でもって、ヒトＣ５ａＲまたはその断片に結合する。
【００１７】
さらなる好ましい実施形態において、該抗体は、
（ｉ）５００ｐＭ未満、好ましくは３００ｐＭ未満、より好ましくは２００ｐＭ未満であるＩＣ50値；または
（ｉｉ）少なくとも６．８×１０5Ｍ-1ｓ-1である会合定数(Ｋｏｎ)；または
（ｉｉｉ）１．４ｎＭ未満であるＫD親和性定数；
でもって、ヒトＣ５ａＲまたはその断片に結合する。
【００１８】
好ましくは、該抗体は、
（ｉｉ）少なくとも１０6Ｍ-1ｓ-1である会合定数(Ｋｏｎ)；または
（ｉｉｉ）０．５ｎＭ未満であるＫD親和性定数；
でもって、ヒトＣ５ａＲまたはその断片に結合する。
【００１９】
好ましくは、Ｃ５ａＲの断片は、配列ＬＹＲＶＶＲＥＥＹＦＰＰＫＶＬＣＧＶＤＹＳＨＤＫＲＲＥＲＡＶＡＩＶ（配列番号：２）を含むペプチドである。
【００２０】
本発明は、配列番号：５[７Ｈ３  Ｖｈ]に示された可変重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３ループ配列に対して少なくとも８０％同一性を保有する少なくとも１つのＣＤＲループ配列を含む抗体も提供し、該抗体はＣ５ａのＣ５ａＲへの結合を低下させ、または阻害する。
【００２１】
さらなる好ましい実施形態において、該抗体は、配列番号：５[７Ｈ３  Ｖｈ]に示された可変重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３ループ配列に対して少なくとも８０％同一性を保有する少なくとも２つのＣＤＲループ配列を含む。
【００２２】
さらなる好ましい実施形態において、該抗体は、さらに、配列番号：６[７Ｈ３  Ｖｌ]に示された可変軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３ループ配列に対して少なくとも８０％同一性を保有する少なくとも１つのＣＤＲループ配列を含む。
【００２３】
さらなる好ましい実施形態において、該抗体は、配列番号：６[７Ｈ３  Ｖｌ]に示された可変軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３ループ配列に対して少なくとも８０％同一性を保有する少なくとも２つのＣＤＲループ配列を含む。
【００２４】
さらなる好ましい実施形態において、該抗体は、各々、配列番号：５および配列番号：６に示された重鎖および／または軽鎖配列に対して少なくとも８０％同一性を保有する配列を含み、該抗体はＣ５ａのＣ５ａＲへの結合を低下させ、または阻害する。
【００２５】
本発明は、さらに、配列番号：７[８Ｇ７  Ｖｈ]に示された可変重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３ループ配列に対して少なくとも８０％同一性を保有する少なくとも１つのＣＤＲループ配列を含む抗体を提供し、該抗体はＣ５ａのＣ５ａＲへの結合を低下させ、または阻害する。
【００２６】
さらなる好ましい実施形態において、該抗体は、配列番号：７[８Ｇ７  Ｖｈ]に示された可変重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３ループ配列に対して少なくとも８０％同一性を保有する少なくとも２つのＣＤＲループ配列を含む。
【００２７】
さらなる好ましい実施形態において、該抗体は、さらに、配列番号：８[８Ｇ７  Ｖｌ]に示された可変軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３ループ配列に対して少なくとも８０％同一性を保有する少なくとも１つのＣＤＲループ配列を含む。
【００２８】
さらなる好ましい実施形態において、該抗体は、配列番号：８[８Ｇ７  Ｖｌ]に示された可変軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３ループ配列に対して少なくとも８０％同一性を保有する少なくとも２つのＣＤＲループ配列を含む。
【００２９】
さらなる好ましい実施形態において、該抗体は、各々、配列番号：７および配列番号：８に示された重鎖および／または軽鎖配列に対して少なくとも８０％同一性を保有する配列を含み、該抗体はＣ５ａのＣ５ａＲへの結合を低下させまたは阻害する。
【００３０】
本発明のさらなる実施形態において、該抗体は、ヒトＣ５ａＲの第二の細胞外ループ（残基１７５〜２０６）と反応性である。
【００３１】
さらなる好ましい実施形態において、該抗体は、ヒトＣ５ａＲの残基１７９〜１８４(ＥＥＹＦＰＰ)を含むエピトープと反応性である。
【００３２】
本発明のさらなる好ましい実施形態において、該抗体はモノクローナル組換え抗体、キメラまたはヒト化抗体である。
【００３３】
該抗体はいずれのアイソタイプのものであってもよい。しかしながら、本発明のさらなる好ましい実施形態において、該抗体はクラスＩｇＧ２ａまたはクラスＩｇＧ３抗体である。
【００３４】
本発明のもう１つの好ましい実施形態において、該抗体は、Ｍａｂ３ｃ５、Ｍａｂ８Ｇ７およびＭａｂ７Ｈ３からなる群より選択されるモノクローナル抗体である。
【００３５】
本発明は、アクセション番号０６０８１８０１の下で、ＥＣＡＣＣに寄託されたハイブリドーマも提供する。
【００３６】
本発明は、アクセション番号０６０８１８０２下でＥＣＡＣＣに寄託されたハイブリドーマも提供する。
【００３７】
本発明は、アクセション番号０６０８１８０３下でＥＣＡＣＣに寄託されたハイブリドーマも提供する。
【００３８】
本発明の抗体の種々の化学的誘導体も生産することができるのは認識される。例えば、放射性同位体または他のトレーサー分子のような標識に結合した本発明の抗体からなる免疫コンジュゲートは、当分野で公知の技術によって作成することができる。別法として、該抗体は、抗体の結合特異性によってその所望の作用部位に標的化される治療的に有用な分子に結合させてもよい。
【００３９】
従って、本発明は、本発明の抗体および治療剤を含むコンジュゲートも提供する。
【００４０】
ある範囲の治療剤を本発明との関係で用いることができるのは認識される。好ましい治療剤は、細胞死またはタンパク質不活化を媒介する薬剤を含む。治療剤は、当分野で公知の非常に多数のトキシンのいずれであってもよい。トキシンは、シュードモナス（Pseudomonas）エキソトキシンまたはその誘導体であってよい。好ましい実施形態において、トキシンはＰＥ４０である。
【００４１】
本発明は、本発明の抗体および検出可能な標識を含むコンジュゲートも提供する。
【００４２】
該検出可能な標識は、当分野で公知のいずれの適当な標識であってもよい。例えば、該標識は放射性標識、蛍光標識、酵素標識またはコントラスト媒体であってよい。
【００４３】
本発明は、単離された核酸分子も提供し、該拡散分子は本発明の抗体をコードする配列を含む。
【００４４】
本発明は、本発明による抗体および医薬上許容される担体を含む組成物も提供する。
【００４５】
本発明は、医薬として用いる本発明の抗体も提供する。
【００４６】
本発明は、対象において白血球または好中球移動に関連する障害を診断する方法も提供し、該方法は、インビトロにて対象から得られた試料を本発明のコンジュゲートと接触させ、次いで、該コンジュゲートおよび該試料の間の免疫特異的結合を検出することを含む。
【００４７】
本発明は、白血球または好中球移動に関連する障害の治療用の医薬の調製で用いる本発明の抗体も提供する。
【００４８】
本発明は、免疫病理学的疾病の治療用の医薬の調製で用いる本発明の抗体も提供する。
【００４９】
本発明の好ましい実施形態において、Ｃ５ａＲはヒトＣ５ａＲである。
【００５０】
本発明は、Ｃ５ａＲを担持する細胞とそのリガンドとの相互作用を阻害する方法も提供し、該方法は該細胞を本発明の抗体に暴露することを含む。
【００５１】
本発明は、細胞においてＣ５ａＲ活性を阻害する方法も提供し、該方法は、該細胞を本発明の抗体に暴露することを含む。
【００５２】
本発明は、対象における好中球移動に関する障害を治療する方法も提供し、該方法は、本発明の抗体を対象に投与することを含む。
【００５３】
本発明の抗体を用いて、Ｃ５ａＲを発現する細胞を検出し、定量し、および／または位置を特定することもできることは当業者によって認識される。
【００５４】
従って、本発明は、対象において好中球移動に関する障害を診断する方法も提供し、該方法は、対象から得られた試料を本発明のコンジュゲートと接触させ、該コンジュゲートおよび該試料の間の免疫特異的結合を検出することを含む。
【００５５】
種々の免疫アッセイを診断の方法で用いてもよい。そのような免疫アッセイは、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、「サンドイッチ」免疫アッセイ、プレシピチン反応、ゲル拡散プレシピチン反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体固定アッセイ、免疫ラジオメトリーアッセイ、蛍光イムノアッセイ等のような技術を用いる競合的および非競合的アッセイシステムを含む。インビトロおよびインビボアッセイの双方を用いることができる。
【００５６】
対象から得られた試料は、末梢血液、血漿、リンパ液、腹水、脳脊髄液、または胸膜液のようないずれかの体液、あるいはいずれかの体組織を含んでもよい。インビトロ結合は、組織または流体の組織学的検体またはサブ画分を用いて行ってもよい。イン・ビボ結合は、免疫特異的結合を検出できるように、（静脈内、腹腔内、動脈内などのような）当分野で公知のいずれかの手段によってコンジュゲートを投与することによって達成することができる。
【００５７】
加えて、イメージング技術を用いてもよく、そこでは、本発明の抗体は適当なイメージング標識に結合される。標識された抗体をイン・ビボで投与して、対象におけるＣ５ａＲの局所化を決定してもよい。
【００５８】
従って、本発明は、対象において好中球移動に関連する障害を診断する方法も提供し、該方法は、対象において抗体およびＣ５ａＲを提示する細胞との間の複合体を形成するような条件下で、イメージング剤で標識された本発明の抗体を対象に投与し、次いで、該複合体をイメージすることを含む。
【００５９】
本発明の１つの好ましい実施形態において好中球移動に関連する障害はＣ５ａＲ媒介障害である。好ましくは、障害は免疫病理学的障害である。
【００６０】
本発明は、対象において炎症の部位に治療剤を送達する方法も提供し、該方法は本発明のコンジュゲートを対象に投与することを含む。
【００６１】
本発明は、Ｃ５ａＲを提示する細胞に遺伝子材料を導入する方法も提供し、該方法は、細胞を本発明の抗体と接触させることを含み、該抗体は遺伝子材料に付着され、またはそれと会合される。
【００６２】
好ましい実施形態において、Ｃ５ａＲを提示する細胞は顆粒球、単球、マクロファージ、好塩基球および好酸球のような白血球、肥満細胞、およびＴ細胞を含むリンパ球、樹状細胞、および内皮細胞および平滑筋細胞のような非骨髄様細胞からなる群より選択される。
【００６３】
哺乳動物Ｃ５ａＲ機能の阻害および／または促進剤を含めた、Ｃ５ａＲに結合するさらなるリガンドまたは他の物質を同定する方法も本発明によって含まれる。例えば、本発明の抗体またはその機能的断片のそれと同一または同様な結合特異性を有する薬剤は、該抗体または断片との競合アッセイによって同定することができる。かくして、本発明は、受容体機能の阻害剤（例えば、アンタゴニスト）または促進剤（例えば、アゴニスト）を含めた、Ｃ５ａＲに結合するリガンドまたは他の物質を同定する方法も含む。１つの実施形態において、Ｃ５ａＲを天然に発現する細胞、または細胞に導入された核酸によってコードされるＣ５ａＲもしくは変異体を発現するように操作された適当な宿主細胞を、受容体機能のリガンド、阻害剤、または促進剤の効率を同定し、評価するためのアッセイで用いる。そのような細胞は、発現された受容体タンパク質またはポリペプチドの機能を評価するのにやはり有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】Ｌ１．２／ｈＣ５ａＲ細胞で免疫化されたマウスから作成した抗ヒトＣ５ａＲ  ｍＡｂは、125Ｉ−Ｃ５ａのヒト好中球への結合を種々の程度まで阻害した。誤差棒はＳＤを示す。
【図２】野生型マウスにおけるＣ５ａＲ遺伝子座のマッピング、およびｈＣ５ａＲノックインマウスを構築するのに用いられる標的化ベクターのマッピング。マウスＣ５ａＲ遺伝子エクソン３  ＣＤＳを、標的化ベクター中のヒトＣ５ａＲ遺伝子エクソン３ＣＤＳで正確に置き換えた。相同組換えを可能とするマウスＣ５ａＲ遺伝子フランキング配列。ｌｏｘＰ部位が近接する選択マーカーＰＧＫｎｅｏは第一のノックインマウスからＣｒｅを用いて欠失させた。３’および５’プローブを用いて、標的化ベクターがマウスＣ５ａＲ遺伝子座に正しく組み込まれたことを確認した。Ｘ、ＸｂａＩ；Ｖ、ＥｃｏＲＶ。
【図３】ヘテロ接合性ｈＣ５ａＲノックインマウス(ｈＣ５Ｒ1+/-)の間の交差からのマウスの尾からのＥｃｏＲＶ消化ゲノムＤＮＡのサザンブロット。該ブロットを、マウスＣ５ａＲ対立遺伝子(１０．０ｋｂ)およびｈＣ５ａＲノックイン対立遺伝子(８．１ｋｂ)の間を識別する３’プローブとハイブリダイズさせた。
【図４】ｈＣ５Ｒ１+/+、ｈＣ５Ｒ１+/-および野生型マウス好中球でのＣ５ａＲの発現。好中球をＦＩＴＣ結合抗ヒトＣ５ａＲ  ｍＡｂ(７Ｆ３)または抗マウスＣ５ａＲ  ｍＡｂ  ２０／７０で染色した。
【図５】ｈＣ５ａＲ+/+マウスの好中球から生じた抗体は、ｍＡｂクローンに依存して、完全な阻害から部分的阻害または阻害なしまでの範囲の、125Ｉ−Ｃ５ａ結合阻害の広いスペクトルを示した。結果は各抗体についての少なくとも２つの独立した実験の代表であって、誤差棒はｓ．ｅ．ｍ．を示す。
【図６】抗Ｃ５ａＲ  ｍＡｂはナノモル以下のＩＣ50値を有する。ｈＣ５Ｒ１+/+マウス好中球(３Ｃ５、７Ｈ３および８Ｇ７)を用いて作成した抗体は、Ｌ１．２／ｈＣ５ａＲトランスフェクタント(７Ｆ３)を用いて作成した最良のｍＡｂよりも５〜１０倍低いＩＣ50を示した。ＩＣ50値は、３または４の独立した競合125Ｉ−Ｃ５ａリガンド結合実験から決定した。
【図７】７Ｆ３または３Ｃ５での、ｈＣ５ａＲ−トランスフェクトＬ１．２細胞上のｈＣ５ａＲからの125Ｉ−Ｃ５ａ置換を示す競合リガンド結合アッセイ。ＥＣ50値は２〜３の独立した実験から決定した。
【図８】キメラヒト／マウスＣ５ａＲ受容体に対するＣ５ａＲ特異的ｍＡｂの相対的結合。キメラ受容体を模式的に示す（ｈＣ５ａＲから由来する領域は赤色で示し、ｍＣ５ａＲからのものは黒色で示す）。４つの細胞外ドメインの起源は４文字コードによって指定される（ＨＨＨＨは野生型ヒトＣ５ａＲであり、ｍＨＨＨはマウスＮ−末端細胞外ドメインおよびヒト第一、第二、および第三細胞外ループを有する、など）。キメラ受容体を発現する一過的にトランスフェクトされたＬ１．２細胞は種々の抗Ｃ５ａＲ  ｍＡｂで染色した。全ての抗ｈＣ５ａＲ  ｍＡｂは、ヒトＣ５ａＲ  Ｎ―末端または第二の細胞外ループを含有する受容体いずれかに結合する、区別されるドメイン−制限結合プロフィールを示した。抗マウスＣ５ａＲ  ｍＡｂ  ２０／７０は、マウスＣ５ａＲ第二細胞外ループを含有するキメラ受容体に結合する。
【図９】各個々の抗ｈＣ５ａＲ  ｍＡｂがヒト好中球へのＣ５ａ結合を阻害した程度を示すドットブロット。ｍＡｂは、それらが認識した受容体ドメインに従ってグループ分けされる。最も優れたブロッキングｍＡｂ（Ｃ５ａ結合を＞９０％だけ阻害するもの）は、全て、ｈＣ５ａＲの第二の細胞外ループにマッピングされた。
【図１０】ペプチドＥＬＩＳＡによるｈＣ５ａＲ第二細胞外ループ上の抗体結合部位のマッピング。ＭＡｂ  ７Ｆ３および３Ｃ５は、配列179ＥＥＹＦＰＰ184を含有するｈＣ５ａＲ第二細胞外ループからの重複ペプチドの全てに結合した。
【図１１ａ】１２マーペプチドのアラニン突然変異体を用いる抗体接触残基のマッピングは、ｍＡｂ  ７Ｆ３および３Ｃ５によって認識されたｈＣ５ａＲ上の臨界的残基を同定した。
【図１１ｂ】１２マーペプチドのアラニン突然変異体を用いる抗体接触残基のマッピングは、ｍＡｂ  ８Ｇ７および７Ｈ３によって認識されたｈＣ５ａＲ上の臨界的残基を同定した。
【図１２】Ｂｉａｃｏｒｅアッセイにおけるペプチド２３に対するｍＡｂ  ７Ｆ３、３Ｃ５、８Ｇ７および７Ｈ３の会合および解離速度、および結合親和性。
【図１３】抗ｈＣ５ａＲ  ｍＡｂの治療効率の比較。ｈＣ５ａＲｌ+/+マウスに、炎症が発生してから５日後に、（ＰＢＳ中１ｍｇ／ｋｇまたは３ｍｇ／ｋｇの）７Ｆ３、３Ｃ５または８Ｇ７を１回腹腔内注射した。対照群はＰＢＳを受けた。グラフは、０日からの足（踝）サイズの変化を示す。群平均（群当たりｎ＝５〜７）。
【図１４】抗ｈＣ５ａＲ  ｍＡｂの治療効率の比較。ｈＣ５Ｒｌ+/+マウスに、炎症が発生してから５日後に、（ＰＢＳ中の１ｍｇ／ｋｇまたは３ｍｇ／ｋｇの）７Ｆ３、３Ｃ５または８Ｇ７で１回腹腔内注射した。対照群はＰＢＳを受けた。グラフは臨床的スコアを示す。群の平均（群当たりｎ＝５〜７）。
【００６５】
配列表に対するＫＥＴ
配列番号：１  ヒトＣ５ａＲタンパク質配列
配列番号：２  ヒトＣ５ａＲペプチド
配列番号：３  ３Ｃ５可変重鎖（タンパク質）配列
配列番号：４  ３Ｃ５可変軽鎖（タンパク質）配列
配列番号：５  ７Ｈ３可変重鎖（タンパク質）配列
配列番号：６  ７Ｈ３可変軽鎖（タンパク質）配列
配列番号：７  ８Ｇ７可変重鎖（タンパク質）配列
配列番号：８  ８Ｇ７可変軽鎖（タンパク質）配列
配列番号：９  修飾されたヒトＣ５ａＲペプチド
配列番号：１０〜２５  キメラマウス／ヒトＣ５ａＲの構築のためのプライマー
配列番号：２６  ビオチニル化ヒトＣ５ａＲペプチド（第二の細胞外ループ）
配列番号：２７  ヒトＣ５ａＲの第二の細胞外ループの残基１７９〜１８４
配列番号：２８〜５０  配列ＥＥＹＦＰＰを含有するヒトＣ５ａＲの第二の細胞外ループからの重複する１２マーペプチド
配列番号：５１〜６２  ペプチド配列ＶＲＥＥＹＦＰＰＫＶＬＣのアラニン突然変異体
配列番号：６３  スクランブルド（scrambled）ＶＲＥＥＹＦＰＰＫＶＬＣペプチド
【００６６】
発明の詳細な説明
Ｃ５ａＲ構造
ヒトＣ５ａＲのアミノ酸配列を配列番号：１に掲げる。
【００６７】
ヒトＣ５ａＲの種々のドメインは以下のように定義される。
アミノ酸１〜３７  細胞外ドメインＮ−末端
アミノ酸３８〜６１  膜貫通ドメイン
アミノ酸６２〜７１  細胞内ドメイン
アミノ酸７２〜９４  膜貫通ドメイン
アミノ酸９５〜１１０  細胞外ドメイン−細胞外ループ１
アミノ酸１１１〜１３２  膜貫通ドメイン
アミノ酸１３３〜１４９  細胞内ドメイン
アミノ酸１５０〜１７４  膜貫通ドメイン
アミノ酸１７５〜２０６  細胞外ドメイン−細胞外ループ２
アミノ酸２０７〜２２７  膜貫通ドメイン
アミノ酸２２８〜２４２  細胞内ドメイン
アミノ酸２４３〜２６４  膜貫通ドメイン
アミノ酸２６５〜２８３  細胞外ドメイン−細胞外ループ３
アミノ酸２８４〜３０７  膜貫通ドメイン
アミノ酸３０８〜３５０  細胞外ドメインＣ−末端
【００６８】
微生物寄託の詳細
３Ｃ５と命名されたモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマは、アクセション番号０６０８１８０１下でＥＣＡＣＣに寄託された。
【００６９】
７Ｈ３と命名されたモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマは、アクセション番号０６０８１８０２下でＥＣＡＣＣに寄託された。
【００７０】
８Ｇ７と命名されたモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマは、アクセション番号０６０８１８０３下でＥＣＡＣＣに寄託された。
【００７１】
これらの寄託は、特許手続きのための微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約およびその下での規則の規定に従ってなされた。これは、寄託の日から３０年の間の生きた培養の維持を保証する。微生物は、関連特許の発行に際して公衆に対する培養の子孫の永久的かつ制限されない入手可能性を保証するブダペスト条約の条項の下でＥＣＡＣＣによって入手可能とされる。
【００７２】
本出願の譲受人は、もし適当な条件下で培養された場合に培養寄託が死滅し、または失われ、または破壊されれば、それは同一培養の生きた検体に関する通知によって迅速に交換されることに同意した。寄託された株の入手可能性は、その特許法に従っていずれかの政府の権限の下で許可された権利に違反して本発明を実施するライセンスとして解釈されるべきではない。
【００７３】
抗体
本発明の抗体はポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二特異的、およびヘテロコンジュゲート抗体を含む。
【００７４】
本発明で用いる用語「抗体」は、無傷分子、ならびにエピトープ決定基に結合することができるＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、およびＦｖのようなその断片を含む。これらの抗体断片は、その抗原または受容体と選択的に結合するいくらかの能力を保有し、以下のように定義される。
（１）抗体分子の一価抗原結合断片を含有する断片であるＦａｂは、全抗体を酵素パパインで消化して、無傷軽鎖および１つの重鎖の一部を得ることによって生産することができる；
（２）抗体分子の断片であるＦａｂ’は、全抗体をペプシンで処理し、続いて還元して、無傷軽鎖および重鎖の一部を生じさせることによって得ることができる；２つのＦａｂ’断片は抗体分子当たりで得られる；
（３）引き続いての還元なくして全抗体を酵素ペプシンで処理することによって得ることができる抗体の断片である（Ｆａｂ’）2；Ｆ（ａｂ）2は２つのジスルフィド結合によって一緒に保持される２つのＦａｂ’断片のダイマーである；
（４）２つの鎖として発現された、軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含有する遺伝子操作された断片として定義されるＦｖ；
（５）遺伝子的に融合された単一鎖の分子としての、適当なポリペプチドリンカーによって連結された、軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域を含有する遺伝子操作された分子として定義される単一鎖抗体（「ＳＣＡ」）；および
（６）単一ドメイン抗体、典型的には、軽鎖が欠如した可変重鎖ドメイン。
【００７５】
本発明の好ましい抗体は、Ｍａｂ  ３Ｃ５、７Ｈ３または８Ｇ７のそれと実質的に同一である、可変領域または１以上のＣＤＲループを含む。
【００７６】
Ｍａｂ  ３Ｃ５、７Ｈ３または８Ｇ７についての可変領域の配列は配列番号：３〜８に記載されている。これらの可変領域の各々についてのＣＤＲループは以下の通りに定義される。
Ｍａｂ  ３Ｃ５
ＣＤＲ  Ｈ１：配列番号：３の残基２６〜３６(包括的)
ＣＤＲ  Ｈ２：配列番号：３の残基５１〜６６(包括的)
ＣＤＲ  Ｈ３：配列番号：３の残基９７〜１０８(包括的)
ＣＤＲ  Ｌ１：配列番号：４の残基２４〜３９(包括的)
ＣＤＲ  Ｌ２：配列番号：４の残基５５〜６１(包括的)
ＣＤＲ  Ｌ３：配列番号：４の残基９４〜１０２(包括的)。
Ｍａｂ  ７Ｈ３
ＣＤＲ  Ｈ１：配列番号：５の残基２６〜３５(包括的)
ＣＤＲ  Ｈ２：配列番号：５の残基５０〜６８(包括的)
ＣＤＲ  Ｈ３：配列番号：５の残基９９〜１０８(包括的)
ＣＤＲ  Ｌ１：配列番号：６の残基２４〜３９(包括的)
ＣＤＲ  Ｌ２：配列番号：６の残基５５〜６１(包括的)
ＣＤＲ  Ｌ３：配列番号：６の残基９４〜１０２(包括的)。
Ｍａｂ  ８Ｇ７
ＣＤＲ  Ｈ１：配列番号：７の残基２６〜３６(包括的)
ＣＤＲ  Ｈ２：配列番号：７の残基５１〜６６(包括的)
ＣＤＲ  Ｈ３：配列番号：７の残基９７〜１０８(包括的)
ＣＤＲ  Ｌ１：配列番号：８の残基２４〜３９(包括的)
ＣＤＲ  Ｌ２：配列番号：８の残基５５〜６１(包括的)
ＣＤＲ  Ｌ３：配列番号：８の残基９４〜１０２(包括的)。
【００７７】
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＨ２  ＣＤＲはＫａｂａｔによって定義される通りである。Ｈ１およびＨ３  ＣＤＲの制限はＫａｂａｔ定義から修飾され、それらのＮ−末端においてさらなる残基を含む。ＣＤＲ  Ｈ１は、ＣＤＲ−Ｈ１の一部であるＣｈｏｔｈｉａによって定義された残基を含むように伸長される。ＣＤＲ  Ｈ３は２つの「接触」残基を含むように伸長される。ＣＤＲ、およびＡｂおよび抗原の間の接触残基を定義する、Ｋａｂａｔナンバリングについての情報に関してはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ参照。
【００７８】
ｍＡｂ  ３Ｃ５および８Ｇ７のＣＤＲループは配列同一性の以下のレベルを保有することに注意するのは興味深い。
【表１】
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【００７９】
配列表に示された可変領域またはＣＤＲループは本発明で用いるために修飾してもよいのは理解される。典型的には、配列の結合特異性を維持する修飾がなされる。保存的置換は、例えば、抗体の結合特異性に影響することなくなすことができる。本発明は、配列番号：３〜８のいずれか１つ内のＣＤＲループに対して、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％同一性を有する少なくとも１つのＣＤＲループを含む抗体を含む。例えば、１、２、３または４のアミノ酸置換をＣＤＲループ内でなすことができ、但し、修飾された配列は実質的に同一の結合特異性を保有するものとする。
【００８０】
別の実施形態において、本発明の抗体のアミノ酸配列に対する修飾を意図的に行って、抗体の生物学的活性を低下させてもよい。例えば、Ｃ５ａＲへ結合することができるままであるが、機能的エフェクタードメインを欠如する修飾された抗体は、Ｃ５ａＲの生物学的活性の阻害剤として有用である。
【００８１】
アミノ酸置換は、例えば、治療で投与された抗体の血漿中半減期を増大させるための天然に生じないアナログの使用を含んでもよい。
【００８２】
一般に、好ましくは、変異体または誘導体のアミノ酸残基の２０％、１０％、または５％未満が、配列表に描かれた対応する可変領域またはＣＤＲループと比較して改変される。
【００８３】
本発明との関係では、配列表に示された可変領域の１つと「実質的に同一の」配列は、その可変領域に対して、少なくとも２０、好ましくは少なくとも５０アミノ酸にわたってアミノ酸レベルにおいて、少なくとも８０％、８５％、９０％同一、好ましくは少なくとも９５または９８％同一であるアミノ酸配列を含んでもよい。相同性は、典型的には、非必須隣接配列よりはむしろ結合特異性にとって必須であることが公知の配列の領域に関して考えるべきである。
【００８４】
相同性の比較は、目視により、より通常には、容易に入手可能な配列比較プログラムの助けを借りて行うことができる。これらの商業的に入手可能なコンピュータプログラムは、２以上の配列の間の％相同性を計算することができる。
【００８５】
パーセンテージ相同性は連続配列にわたって計算することができ、すなわち、１つの配列を他の配列と整列させ、１つの配列中の各アミノ酸を、一度に１つの残基にて、他の配列中の対応するアミノ酸と直接的に比較する。これを「ギャップなしの」整列と呼ぶ。典型的には、そのようなギャップなしの整列は、比較的短い数の残基（例えば、５０未満の連続アミノ酸）にわたってのみ行われる。
【００８６】
これは非常に単純かつ一貫した方法であるが、それは、例えば、配列のそうでなければ同一の対において、１つの挿入または欠失が、続いてのアミノ酸残基が整列から外されるようにし、かくして、全体的整列が行われた場合に％相同性のかなりの低下を潜在的にもたらすことを考慮していない。結果として、ほとんどの配列比較方法は、総じて相同性スコアに不当にペナルティーを科すことなく可能な挿入および欠失を考慮する最適な整列を生じさせるように設計されている。これは、配列整列において「ギャップ」を挿入して、局所的な相同性を最大化するように試みることによって達成される。
【００８７】
ほとんどの整列プログラムは、ギャップペナルティーが修飾されるようにする。しかしながら、配列比較のためのそのようなソフトウエアを用いる場合にデフォルト値を用いるのが好ましい。例えば、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎベストフィットパッケージ（後期参照）を用いる場合、アミノ酸配列に対するデフォルトギャップペナルティーはギャップについて−１２、および各伸長について−４である。
【００８８】
最大％相同性の計算は、従って、最初に、ギャップペナルティーを考慮して、最適な整列の生成を要求する。そのような整列を行うための適当なコンピュータプログラムはＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎベストフィットパッケージである(University of Wisconsin, U.S.A.; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12:387)。配列比較を実行することができる他のソフトウエアの例は、限定されるものではないが、ＢＬＡＳＴパッケージ(Ausubel et al., 1999 ibid-Chapter 18参照)、ＦＡＳＴＡ(Atschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 403-410)および比較ツールのＧＥＮＥＷＯＲＫＳスイートを含む。ＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡの両者は、オフラインおよびオンラインサーチングで入手可能である(Ausubel et al., 1999 ibid, page 7-58 to 7-60参照)。しかしながら、ＧＣＧベストフィットプログラムを用いるのが好ましい。
【００８９】
最終％同一性が同一性の点で測定することができるが、整列プロセスそれ自体は、典型的には、オールオアナッシング対比較に基づかない。その代わり、一定基準で判断した同様性スコアマトリックスが一般には用いられ、これは、化学的同様性または進化の距離に基づいてスコアを各対様式の比較に割り当てる。通常用いられるそのようなマトリックスの例はＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス−プログラムのＢＬＡＳＴスイートに対するデフォルトマトリックスである。ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは、一般には、もし供給されれば、公のデフォルト値または慣用的な記号比較表いずれかを用いる（さらなる詳細についてはユーザーマニュアルを参照されたい）。ＧＣＧパッケージについての公のデフォルト値、あるいは他のソフトウエアの場合には、ＢＬＯＳＵＭ６２のようなデフォルトマトリックスを用いるのが好ましい。
【００９０】
一旦ソフトウエアが最適な整列を生じさせたならば、％相同性、好ましくは％配列同一性を計算することが可能である。ソフトウエアは、典型的には、これを、配列比較の一部として行い、数値の結果を生じさせる。
【００９１】
ポリクローナル抗体
本発明の抗体はポリクローナル抗体であってよい。ポリクローナル抗体を調製する方法は当業者に公知である。ポリクローナル抗体は、例えば、トランスジェニック動物に由来する第一の種のポリペプチドを発現する細胞および、所望ならば、アジュバントの１回以上の注射によって哺乳動物において生起されることができる。典型的には、細胞および／またはアジュバントは、多数の皮下または腹腔内注射によって哺乳動物において注射される。使用してもよいアジュバントの例はフロイント完全アジュバントおよびＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコレート）を含む。免疫化プロトコルは、過度な実験なくして当業者によって選択され得る。
【００９２】
モノクローナル抗体
本発明の方法によって生産された抗体は、別法として、モノクローナル抗体であってよい。モノクローナル抗体は、Kohler and Milstein, Nature, 256:495(1975)によって記載されたもののようなハイブリドーマ方法を用いて調製することができる。ハイブリドーマ方法において、マウス、ハムスター、または他の適当な宿主動物を、典型的には、トランスジェニック哺乳動物に由来する第一の種のポリペプチドを発現する細胞で免疫化して、第一の種のポリペプチドに特異的に結合する抗体を生産し、または生産することができるリンパ球を誘導する。
【００９３】
一般に、もしヒト起源の細胞が望まれるならば、末梢血液リンパ球（「ＰＢＬ」）を用いて、あるいはもし非ヒト哺乳動物源が望まれるならば、脾臓細胞またはリンパ節細胞が用いられる。次いで、ポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いてリンパ球を不滅化細胞系と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press (1986) pp.59-103)。不死化細胞系は、通常、形質転換された哺乳動物細胞、特にげっ歯類、ウシおよびヒト起源のミエローマ細胞である。通常、ラットまたはマウスミエローマ細胞系が使用される。ハイブリドーマ細胞が、好ましくは、融合していない不死化細胞の成長または生存を阻害する１以上の物質を好ましくは含有する適当な培養培地中で培養することができる。例えば、もし親細胞が酵素ヘポキサンチングアニンホスホシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠如するならば、ハイブリドーマのための培養培地は、典型的には、ヘポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含み、（「ＨＡＴ」培地）を含み、それらの物質はＨＧＰＲＴ欠乏細胞の成長を妨げる。
【００９４】
好ましい不死化細胞系は、効果的に融合し、選択抗体生産細胞による抗体の安定な高レベルの発現を支持し、およびＨＡＴ培地の様な培地に対して感受性であるものである。より好ましい不死化細胞系はネズミミエローマ細胞系であり、これは、例えば、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．およびＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓｍ，Ｖａ．から得ることができる。ヒトミエローマおよびマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞系もまた、ヒトモノクローナル抗体の生産のために記載されている(Kozbor, J.Immunol., 133:3001(1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp.51-63)。
【００９５】
次いで、ハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、第一の種のポリペプチドに対して向けられたモノクローナル抗体の存在についてアッセイすることができる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生産されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって、あるいはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）のようなインビトロ結合アッセイによって決定される。そのような技術およびアッセイは当分野で公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220(1980)のScatchard分析によって決定することができる。
【００９６】
所望のハイブリドーマ細胞を同定した後、クローンは、限界希釈法によってサブクローンし、標準的方法によって成長させることができる。この目的に適した培養培地は、例えば、ダルベッコの修飾イーグル培地およびＲＰＭＩ−１６４０培地を含む。別法として、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物において腹水としてイン・ビボで成長させることができる。
【００９７】
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーのような慣用的な免疫グロブリン精製手法によって培養培地または腹水液から単離し、または精製することができる。
【００９８】
モノクローナル抗体は、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されたもののような組換えＤＮＡ方法によって作製することもできる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、（例えば、ネズミ抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）慣用的な手法を用いて容易に単離し、配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい源として働く。一旦単離されたならば、ＤＮＡを発現ベクターに入れることができ、次いで、これを、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはそうでなければ免疫グロブリンタンパク質を生じることのないミエローマ細胞のような宿主細胞にトランスフェクトして、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を得る。ＤＮＡは、例えば、相同ネズミ配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常ドメインについてのコーディング配列で置換することによって（米国特許第４，８１６，５６７号）、あるいは非免疫グロブリンポリペプチドについてのコーディング配列の全てまたは一部を免疫グロブリンコーディング配列に共有結合により連結することによって、修飾してもよい。そのような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに代えて置換することができるか、あるいは本発明の抗体の１つの抗原−組合せ部位の可変ドメインに代えて置換してキメラ二価抗体を作成することができる。
【００９９】
抗体は一価抗体であってよい。一価抗体を調製するための方法は当分野で周知である。例えば、１つの方法は、免疫グロブリン軽鎖および修飾された重鎖の組換え発現を含む。重鎖は、一般には、Ｆｃ領域におけるいずれかの地点で切形して、重鎖架橋を妨げる。別法として、関連システイン残基は別のアミノ酸残基で置換し、あるいは欠失して、架橋を妨げる。
【０１００】
インビトロ方法は、一価抗体を調製するのにやはり適当である。その断片、特にＦａｂ断片を生産するための抗体の消化は、当分野で公知のルーチン的技術を用いて達成することができる。
【０１０１】
ヒトおよびヒト化抗体
本発明の抗体はヒト化抗体またはヒト抗体であってよい。非ヒト（例えば、ネズミ）抗体のヒト化形態はキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、または非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、または抗体の他の抗原結合サブ配列のような）その断片である。ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラットまたはウサギのような非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基によって置き換えられたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を含む。いくつかの具体例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は対応する非ヒト残基によって置き換えられる。ヒト化抗体は、レシピエント抗体においても、または輸入ＣＤＲまたはフレームワーク配列においても見出されない残基を含んでもよい。一般に、ヒト化抗体は少なくとも１、典型的には２の可変ドメインの実質的に全てを含み、そこでは、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的には全ては非ヒト免疫グロブリンのそれに対応し、かつＦＲ領域の全てまたは実質的に全てはヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のそれである。ヒト化抗体は、最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれをやはり含む(Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988);およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992))。
【０１０２】
非ヒト抗体をヒト化するための方法は当分野で周知である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである源からそれに導入された１以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、「輸入」残基といい、これは、典型的には、「輸入」可変ドメインから取られる。ヒト化は、ヒト抗体の対応する配列に代えてげっ歯ＣＤＲまたはＣＤＲ配列で置き換えることによって、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法に従って実質的に行うことができる(Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988))。従って、そのような「ヒト化」抗体は、キメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）であり、実質的に無傷ではないヒト可変ドメインが非ヒト種からの対応する配列によって置換されている。実践的には、ヒト化抗体は、典型的には、いくらかのＣＤＲ残基および、恐らくは、いくらかのＦＲ残基がげっ歯類抗体における類似部位からの残基によって置き換えられたヒト抗体である。
【０１０３】
ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーを含めた、当分野で公知の種々の技術を用いて生産することもできる(Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991))。Cole et al.およびBoermer et al.の技術もまた、ヒトモノクローナル抗体調製のために入手可能である(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77(1985)およびBoermer et al., J.Immunol., 147(1):86-95(1991))。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をトランスジェニック動物、例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的にまたは完全に不活化されているマウスに導入することによって作製することができる。抗原投与に際して、ヒト抗体生産が観察され、これは、遺伝子再編成、組立て、および抗体レパートリーを含めた、全ての点においてヒトで見られるものに非常に似ている。このアプローチは、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号；第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，６６１，０１６号において、および以下の科学文献：Marks et al., Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995)において記載されている。
【０１０４】
抗体は、当分野で公知のように、公知の選択および／または突然変異誘発方法を用いてアフィニティー突然変異することもできる。好ましいアフィニティー突然変異抗体は、成熟した抗体がそれから調製される出発抗体（一般に、ネズミ、ヒト化またはヒト）よりも５倍、より好ましくは１０倍、なおより好ましくは２０または３０倍大きい親和性を有する。
【０１０５】
二特異的抗体
二特異的抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル、好ましくはヒトまたはヒト化抗体である。例えば、結合特異性の１つはＣ５ａＲに対するものであり得、他の１つはいずれかの他の抗原に対するものであり得、好ましくは、細胞−表面タンパク質または受容体もしくは受容体サブユニットに対するものであり得る。
【０１０６】
二特異的抗体を作成するための方法は当分野で公知である。伝統的には、二特異的抗体の組換え生産は２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の共発現に基づき、そこでは２つの重鎖は異なる特異性を有する(Milstein and Cuello, Nature, 305:537-539 (1983))。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダム分類のため、これらのハイブリドーマ（クワドローマ）は、そのうち１つのみが正しい二特異的構造を有する１０の異なる抗体分子の潜在的混合物を生じる。正しい分子の精製は、通常、アフィニティークロマトグラフィー工程によって達成される。同様な手法は、１９９３年５月１３日に公開されたＷＯ９３／０８８２９に、およびTraunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)において開示されている。
【０１０７】
所望の結合特異性を持つ抗体可変ドメイン（抗体−抗原組合せ部位）を免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合させることができる。該融合は、好ましくは、ヒンジの少なくとも一部、ＣＨ２、およびＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとである。融合の少なくとも１つに存在する軽鎖結合で必要な部位を含有する第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有するのが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合および、所望により、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に共−トランスフェクトする。二特異的抗体を作製するさらなる詳細については、例えば、Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)参照。
【０１０８】
ＷＯ９６／２７０１１に記載されたもう１つのアプローチに従い、抗体分子の対の間の界面は、組換え細胞培養から回収されたヘテロダイマーのパーセンテージを最大化されるように作製することもできる。好ましい界面は抗体定常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法において、第一の抗体分子の界面からの１以上の小さなアミノ酸側鎖はより大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置き換えられている。より大きな側鎖に対する同一または同様なサイズの補償「キャビティ」は、大きなアミノ酸側鎖をより小さなもの（例えば、アラニンまたはスレオニン）で置き換えることによって、第二の抗体分子の界面で作成される。これは、ホモダイマーのような他の望まない最終産物よりもヘテロダイマーの収率を増大させるためのメカニズムを提供する。
【０１０９】
二特異的抗体は全長抗体または抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）2二特異的抗体）として調製することができる。抗体断片からの二特異的抗体を生じさせるための技術は文献に記載されている。例えば、二特異的抗体は化学結合を用いて調製することができる。Brennan et al., Science 229:81 (1985)は、無傷抗体がタンパク質分解により切断されて、Ｆ（ａｂ’）2断片を生じさせる手法を記載する。これらの断片はジチオール複合体化剤亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元して、隣接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を妨げる。次いで、生じたＦａｂ’断片をチオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換する。次いで、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の１つを、メルカプトエチルアミンでの還元によってＦａｂ’−チオールに再度変換し、等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して二特異的抗体を形成する。生じた二特異的抗体は、酵素の選択的固定化のための薬剤として用いることができる。
【０１１０】
Ｆａｂ’断片をＥ．ｃｏｌｉから直接的に回収し、化学的にカップリングさせて、二特異的抗体を形成することができる。Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)は、十分にヒト化された二特異的抗体Ｆ（ａｂ’）．ｓｕｂ．２分子の生産を記載する。各Ｆａｂ’断片はＥ．ｃoｌｉから別々に分泌され、インビトロにて指向性化学的カップリングに付され、二特異的抗体を形成させた。そのように形成された二特異的抗体は、ＥｒｂＢ２受容体および正常ヒトＴ細胞を過剰発現する細胞に結合し、ならびにヒト乳癌標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性をトリガーすることができた。
【０１１１】
組換え細胞培養から直接的に二特異的抗体断片を作成し、単離するための種々の技術もまた記載されている。二特異的抗体はロイシンジッパーを用いて生産されてきた。Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合によって２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結された。抗体ホモダイマーをヒンジ領域において還元して、モノマーを形成し、次いで、再度酸化して抗体ヘテロダイマーを形成させた。この方法は、抗体ホモダイマーの生産のために利用することもできる。Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)に記載された「ダイヤボディ」技術は、二特異的抗体断片を作成するための代替メカニズムを提供している。該断片は、余りにも短くて、同一鎖上の２つのドメインの間の対合を可能とできないリンカーによって軽鎖可変ドメイン（ＶL）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶH）を含む。従って、１つの断片のＶHおよびＶLドメインは、強制的に、もう１つの断片の相補的ＶLおよびＶHドメインと対合させられ、それにより、２つの抗原結合部位を形成する。単一鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーの使用によって二特異的抗体断片を作成するためのもう１つの戦略もまた報告されている。Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994)参照。
【０１１２】
２を超える価数を持つ抗体が考えられる。例えば、三特異的抗体を調製することができる。Tutt et al., Immunol. 147:60 (1991)。
【０１１３】
ヘテロコンジュゲート抗体
ヘテロコンジュゲート抗体もまた、本発明の範囲内にある。ヘテロコンジュゲート抗体は２つの共有結合により連結された抗体から構成される。そのような抗体は、例えば、望まない細胞に免疫系細胞を標的化するのに（米国特許第４，６７６，９８０号）、およびＨＩＶ感染の治療のために（ＷＯ  ９１／００３６０；ＷＯ  ９２／２００３７３；ＥＰ  ０３０８９）提案されている。抗体は、架橋剤が関連するものを含めた、合成タンパク質化学における公知の方法を用いてインビトロで調製することができる。例えば、イムノトキシンはジスルフィド交換反応を用いて、あるいはチオエーテル結合を形成することによって構築することができる。この目的に適した試薬の例はイミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデートおよび、例えば、米国特許第４，６７６，９８０号に開示されたものを含む。
【０１１４】
エフェクター機能エンジニアリング
エフェクター機能に関して本発明の抗体を修飾して、例えば、癌を治療する際に抗体の有効性を増強させるのが望ましい。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入し、それにより、この領域における鎖間ジスルフィド結合形成を可能とすることができる。そのように生じたホモダイマー抗体は、改良された内部化能力および／または増大した補体媒介細胞殺傷および抗体−依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を有することができる。Caron et al., J. Exp Med., 176:1191-1195 (1992)およびShopes, J.Immunol., 148: 2918-2922 (1992)参照。増強された抗腫瘍活性を持つホモダイマー抗体はWolff et al., Cancer Research, 53:2560-2565 (1993)に記載されているヘテロ二官能性架橋剤を用いて調製することもできる。別法として、デュアルＦｃ領域を有し、それにより、増強された補体溶解およびＡＤＣＣ能力を有することができる抗体を作製することができる。Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)参照。
【０１１５】
免疫コンジュゲート
本発明は、化学治療剤、トキシン（例えば、細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素活性トキシンまたはそれらの断片）または放射性同位体（すなわち、放射性コンジュゲート）のような細胞傷害性剤にコンジュゲートした抗体を含む免疫コンジュゲートにも関する。
【０１１６】
そのような免疫コンジュゲートの作成で有用な化学治療剤は前記した。用いることができる酵素的に活性なトキシンおよびその断片は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリアトキシンの非結合性活性断片、（Ｐｓｅｉｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａからの）エキソトキシンＡ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、アルファ−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチミンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、マイトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセンを含む。種々の放射性核種が放射性コンジュゲート抗体の生産で入手可能である。その例は．ｓｕｐ．２１２Ｂｉ、．ｓｕｐ．１３１Ｉ、．ｓｕｐ．１３１Ｉｎ、．ｓｕｐ．９０Ｙ、および．ｓｕｐ．１８６Ｒｅを含む。抗体および細胞傷害性剤のコンジュゲートは、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、（ジメチルアジピミデートＨＬＣのような）イミドエステルの二官能性誘導体、（ジスクシンイミジルスベレートのような）活性エステル、（グルタルアルデヒドのような）アルデヒド、（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンのような）ビス−アジド化合物、（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンのような）ビス−ジアゾニウム誘導体、（トリレン２，６−ジイソシアネートのような）ジイソシアネート、および（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンのような）ビス−活性フッ素化合物のような種々の二官能性タンパク質カップリング剤を用いて作成される。例えば、リシンイムノトキシンは、Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987)に記載されたように調製することができる。炭素−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体に対する放射性ヌクレオチドのコンジュゲーションのための例示的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６参照。
【０１１７】
もう１つの実施形態において、抗体は腫瘍プレ標的化における利用のために（ストレプトアビジンのような）「受容体」にコンジュゲートさせることができ、抗体−受容体コンジュゲートは患者に投与され、続いて、キレート化剤を用いて循環から未結合コンジュゲートを除去し、次いで、細胞傷害性剤（例えば、放射性ヌクレオチド）にコンジュゲートされた「リガンド」（例えば、アビジン）を投与する。
【０１１８】
抗体アイソタイプ
ある状況下では、１つのアイソタイプのモノクローナル抗体は、診断または治療効果の点で他のものよりもより好ましい。例えば、抗体媒介細胞溶解についての研究から、アイソタイプガンマ−２ａおよびガンマ−３の修飾されていないマウスモノクローナル抗体は、一般には、ガンマ−１アイソタイプの抗体である標的細胞を溶解させるのにより効果的であることが公知である。この異なる効率は、標的細胞の細胞溶解破壊により活動的に参画するガンマ−２ａおよびガンマ−３アイソタイプの能力によるものと考えられる。モノクローナル抗体の特定のアイソタイプは、クラス−スイッチ変異体を単離するためのｓｉｂ選択技術を用いることによって、異なるアイソタイプのモノクローナル抗体を分泌する親ハイブリドーマから二次的に調製することができる(Steplewski et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 82:8653, 1985; Spira, et al., J. Immunol. Methods, 74:307, 1984)。
【０１１９】
結合特徴
本発明の１つの実施形態において、抗体はその阻害濃度５０値の点で規定される。
【０１２０】
用語「阻害濃度５０％」（「ＩＣ50」と略される）は、阻害剤標的の分子の所与の活性（例えば、Ｃ５ａのＣ５ａＲまたはその断片への結合）の５０％阻害に必要な阻害剤（例えば、本発明の抗体）の濃度を表わす。より小さなＩＣ50値がより優れた阻害剤に対応するのは当業者に理解される。
【０１２１】
１つの実施形態において、本発明の抗体は、同一条件下で測定した場合に、ＭＡｂ７Ｆ３のそれよりも少なくとも１．５倍低いＩＣ50の値でもって、Ｃ５ａのＣ５ａＲへの結合を阻害する。
【０１２２】
もう１つの実施形態において、本発明の抗体は、５００ｐＭ未満、より好ましくは４００ｐＭ未満、より好ましくは３００ｐＭ未満、より好ましくは２００ｐＭ未満のＩＣ50でもって、Ｃ５ａのＣ５ａＲへの結合を阻害する。好ましくは、これらのＩＣ50値は、本明細書中の実施例に記載されたようにヒト好中球を用いて行われる結合アッセイによって決定される。
【０１２３】
本発明のもう１つの実施形態は、同一条件下で測定した場合、ＭＡｂ７Ｆ３のそれよりも少なくとも１．３倍低い、好ましくは１．４倍低いＫD（親和性定数）でもって、Ｃ５ａＲまたはその断片に結合する抗体に関する。
【０１２４】
もう１つの実施形態において、本発明の抗体は、１．４ｎＭ未満、より好ましくは０．７ｎＭ未満、より好ましくは０．５ｎＭ未満、より好ましくは０．３ｎＭ未満のＫDでもって、Ｃ５ａＲまたはその断片に結合する。
【０１２５】
本発明のもう１つの実施形態は、同一条件下で測定した場合、ＭＡｂ７Ｆ３のそれよりも少なくとも１．５倍高い会合定数またはｋa速度でもって、Ｃ５ａＲまたはその断片に結合する抗体に関する。
【０１２６】
もう１つの実施形態において、本発明の抗体は、少なくとも６．８×１０5Ｍ-1ｓ-1、より好ましくは少なくとも１０6Ｍ-1ｓ-1、好ましくは少なくとも３×１０6Ｍ-1ｓ-1の会合定数またはｋa速度でもって、Ｃ５ａＲまたはその断片に結合する。
【０１２７】
好ましい実施形態において、結合親和性は、ヒトＣ５ａＲに由来するペプチドへの抗体の結合のＢＩＡＣｏｒｅ分析によって決定される。好ましくは、ヒトＣ５ａＲに由来するペプチドは配列ＬＹＲＶＶＲＥＥＹＦＰＰＫＶＬＣＧＶＤＹＳＨＤＫＲＲＥＲＡＶＡＩＶ（配列番号：２）を含む。より好ましくは、結合分析は、本明細書中における実施例に記載された条件下でＢＩＡＣｏｒｅ結合アッセイによって行われる。
【０１２８】
インビトロアッセイ
本発明のモノクローナル抗体は、例えば、それらが液相で利用できる、または固相担体に結合させることができるイムノアッセイにおいてインビトロで用いるのに適している。抗体は、試料中のＣ５ａＲのレベルをモニターするのに有用であり得る。同様に、抗イディオタイプ抗体は試料中のＣ５ａのレベルを測定するのに有用である。加えて、これらのイムノアッセイにおけるモノクローナル抗体は種々の方法で検出可能に標識することができる。本発明のモノクローナル抗体を利用することができるイムノアッセイのタイプの例は、直接的または間接的いずれかの様式の競合および非競合イムノアッセイである。そのようなイムノアッセイの例はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）およびサンドイッチ（イムノメトリー）アッセイである。本発明のモノクローナル抗体を用いる抗原の検出は、生理学的試料についての免疫組織化学アッセイを含めた、順方向、逆方向、または同時のいずれかのモードで実行させるイムノアッセイを利用してなすことができる。当業者であれば、過度の実験なくして他のイムノアッセイ様式を知っているか、あるいは容易に認識することができる。
【０１２９】
本発明の抗体は、多くの異なる担体に結合させ、それを用いて、Ｃ５ａＲの存在を検出することができる。周知の担体の例はガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および修飾されたセルロース、ポリアクリルアミド、アガロースおよびマグネタイトを含む。担体の性質は、本発明の目的では、可溶性または不溶性いずれかであり得る。当業者は、モノクローナル抗体を結合させるための他の適当な担体を知っているか、あるいはルーチン的実験を用いてそれを確認することができる。
【０１３０】
１つの実施形態において、Ｃ５ａＲを天然で発現する細胞、またはＣ５ａＲまたはその変異体をコードする組換え核酸配列を、本発明の結合アッセイで用いる。細胞は、受容体の発現に適した条件下で維持される。細胞は（例えば、適当な結合緩衝液中で）結合に適した条件下で抗体または断片と接触させ、標準的な技術によって結合を検出する。結合を決定するために、結合の程度を、適当な対照に対して決定することができる（例えば、抗体の不存在下で決定されたバックグラウンドと比較し、第二の抗体（すなわち、標準）の結合と比較し、トランスフェクトされていない細胞に対する抗体の結合と比較することができる）。受容体を含有する膜画分のような細胞画分、または受容体を含むリポソームを全細胞の代わりに用いることができる。
【０１３１】
結合阻害アッセイを用いて、Ｃ５ａＲに結合し、およびＣ５ａのＣ５ａＲまたは機能的変異体への結合を阻害する抗体またはその断片を同定することもできる。例えば、結合アッセイを行うことができ、抗体の不存在下におけるＣ５ａの結合と比較した、（抗体の存在下における）Ｃ５ａの結合の低下を検出し、または測定する。単離されたおよび／または組換え哺乳動物Ｃ５ａＲまたはその機能的変異体を含む組成物をＣ５ａおよび抗体に同時に、またはいずれかの順序で一方を先に一方を後に接触させることができる。抗体の存在下におけるリガンドの結合の程度の低下は、抗体による結合の阻害を示す。例えば、リガンドの結合は減少し、または無くなり得る。
【０１３２】
他の適当な結合アッセイ、またはシグナリング機能および／または細胞応答の刺激（例えば、白血球トラフィッキング）を含めた、受容体結合によってトリガーされる事象をモニターする方法のような、Ｃ５ａＲに結合する抗体の存在を同定する他の方法が利用可能である。このようにして同定された抗体をさらに評価して、結合に引き続いて、それらがＣ５ａＲの他の機能を阻害し、および／またはそれらの治療的利用性を評価するように働くか否かを決定することができる。
【０１３３】
シグナリングアッセイ
Ｃ５ａＲへの、アゴニストのようなリガンドまたは促進剤の結合の結果、このＧタンパク質結合受容体によるシグナリングをもたらすことができ、Ｇタンパク質ならびに他の細胞内シグナリング分子の活性が刺激される。化合物（例えば、抗体またはその断片）によるシグナリング機能の誘導は、いずれかの適当な方法を用いてモニターすることができる。そのようなアッセイを用いて、Ｃ５ａＲの抗体アゴニストを同定することができる。抗体またはその機能的断片の阻害活性は、アッセイにおいてリガンドまたは促進剤を用い、かつリガンドまたは促進剤によって誘導される活性を阻害する抗体の能力を評価して決定することができる。
【０１３４】
ＧＴＰのＧＤＰへの加水分解のようなＧタンパク質活性、または細胞内（サイトゾル）遊離カルシウムの濃度の迅速かつ一過的な増加の誘導のような受容体結合によってトリガーされる後のシグナリング事象は、当分野で公知の方法、または他の適当な方法によってアッセイすることができる（例えば、Neote, K. et al., Cell, 72: 415-425, 1993; Van Riper et al., J. Exp. Med., 177:851-856, 1993; Dahinden, C. A. et al., J. Exp. Med., 179: 751-756, 1994参照）。
【０１３５】
例えば、ハイブリッドＧタンパク質結合受容体を用いるSledziewski et al.の機能的アッセイを用いて、受容体に結合し、かつＧタンパク質を活性化するリガンドまたはプロモーターの能力をモニターすることができる(Sledziewski et al., 米国特許第５，２８４，７４６号)。
【０１３６】
そのようなアッセイは抗体またはその断片の存在下で行って、評価することができ、リガンドまたは促進剤によって誘導される活性を阻害する抗体または断片の能力は、公知の方法および／または本明細書中に記載された方法を用いて決定される。
【０１３７】
化学走性および細胞刺激のアッセイ
化学走性アッセイを用いて、リガンドのＣ５ａＲへの結合をブロックし、および／またはリガンドの受容体への結合に関連する機能を阻害する抗体またはその機能的断片の能力を評価することもできる。これらのアッセイは、化合物によって誘導されたインビトロまたはイン・ビボでの細胞の機能的移動に基づく。化学走性は、例えば、９６−ウエル化学走性プレートを利用し、あるいは化学走性を評価するための他の分野で認められた方法を用い、アッセイにおいていずれかの適当な手段によって評価することができる。例えば、インビトロトランス内皮化学走性アッセイの使用は、Springer et al. (１９９４年９月１５日に公開されたSpringer et al.のWO 94/20142；また、Berman et al., Immunol. Invest. 17:625-677 (1988)参照)によって記載されている。内皮を横切ってのコラーゲンゲルへの移動もまた記載されている(Kavanaugh et al., J. Immunol., 146:4149-4156 (1991))。マウスＬ１−2プレ−Ｂ細胞の、または化学走性が可能な他の適当な宿主細胞の安定なトランスフェクタントを、化学走性アッセイで用いることができる。
【０１３８】
一般に、化学走性アッセイは、バリアー（例えば、内皮、フィルター）への、またはそれを通っての、化合物の増大したレベルに向けての、反対の第二の表面に向けてのバリアーの第一の表面からの、（白血球（例えば、リンパ球、好酸球、好塩基球）のような）適当な細胞の方向性運動または移動をモニターする。膜またはフィルターは、フィルターへの、またはそれを通っての、化合物の増大したレベルに向けての、フィルターの反対の第二の表面へのフィルターの第一の表面からの、適当な細胞の方向性運動また移動がモニターされるような、便宜なバリアーを提供する。いつくかのアッセイにおいて、膜を、ＩＣＡＭ−１、フィブロネクチンまたはコラーゲンのような、接着を容易とする物質でコートする。そのようなアッセイは、白血球の「ホーミング」のインビトロ近似を供する。
【０１３９】
例えば、第一のチャンバーから、微多孔性膜への、またはそれを通っての、テストすべき抗体を含有し、かつ膜によって第一のチャンバーから分割された第二のチャンバーへの、適当な容器（含有手段）中の細胞の移動の阻害を検出し、または測定することができる。例えば、ニトロセルロース、ポリカルボネートを含めた、化合物に応答しての特異的移動をモニターするための適当なポアサイズを有する適当な膜が選択される。例えば、約３〜８ミクロン、好ましくは約５〜８ミクロンのポアサイズを用いることができる。ポアサイズはフィルター上で均一であるか、または適当なポアサイズの一定範囲内であり得る。
【０１４０】
移動および移動の阻害を評価するためには、フィルターへの移動の距離、フィルターの第二の表面に接着したままであるフィルターを横切る細胞の数、および／または第二のチャンバーに蓄積する細胞の数は、標準的な技術（例えば、顕微鏡）を用いて決定することができる。１つの実施形態において、細胞を検出可能な標識（例えば、放射性同位体、蛍光標識、抗原またはエピトープ標識）で標識し、（例えば、放射能、蛍光、イムノアッセイを検出することによって）適当な方法を用いて、膜に接着した、および／または第二のチャンバーに存在する標識の存在を決定することによって、抗体または断片の存在下および不存在下で移動を評価することができる。抗体アゴニストによって誘導された移動の程度は、（例えば、抗体の不存在下で決定されたバックグラウンド移動と比較し、第二の化合物（すなわち、標準）によって誘導された移動の程度と比較し、抗体によって誘導されたトランスフェクトされていない細胞の移動と比較して）適当な対照に対して決定することができる。１つの実施形態において、特に、Ｔ細胞、単球、またはＣ５ａＲを発現する細胞について、経内皮移動をモニターすることができる。この実施形態において、内皮細胞層を通じての貫通移動が評価される。細胞層を調製するために、内皮細胞を、場合により、コラーゲン、フィブロネクチン、または他の細胞内マトリックスタンパク質のような物質でコートされた微多孔性フィルターまたは膜上で培養して、内皮細胞の付着を容易とすることができる。好ましくは、密集単層が形成されるまで内皮細胞を培養する。例えば、ヒト臍静脈内皮細胞のような静脈、動脈または微小血管内皮を含めた、種々の哺乳動物内皮細胞を単層形成のために入手することができる(Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．)。特定の哺乳動物受容体に応答しての化学走性をアッセイするために、同一哺乳動物の内皮細胞が好ましい；しかしながら、異種哺乳動物種または属からの内皮細胞を用いることもできる。
【０１４１】
一般に、アッセイは、フィルターの第一の表面から、フィルターの反対の第二の表面への、化合物の増大するレベルに向けての方向の、膜またはフィルターへのまたはそれを通っての細胞の方向性移動を検出することによって行われ、フィルターは第一の表面に内皮細胞層を含有する。方向性移動は、第一の表面に隣接する領域から、膜へ、または膜を通って、フィルターの反対側に位置した化合物に向けて起こる。第二の表面に隣接する領域に存在する化合物の濃度は、第一の表面に隣接する領域におけるそれよりも大きい。
【０１４２】
抗体阻害剤についてテストするのに用いる１つの実施形態において、移動が可能であり、かつＣ５ａＲを発現する細胞を含む組成物を第一のチャンバーに入れることができる。（化学誘引剤機能を有する）第一のチャンバー中の細胞の化学走性を誘導することができる１以上のリガンドまたは促進剤を含む組成物は第二のチャンバーに入れられる。好ましくは、細胞を第一のチャンバーに入れて間もなく、または細胞と同時に、テストすべき抗体を含む組成物が、好ましくは、第一のチャンバーに入れられる。このアッセイにおいて、Ｃ５ａＲを発現する細胞の、リガンドまたは促進剤による、受容体に結合し、かつ化学走性の誘導を阻害することができる抗体またはその機能的断片は、受容体機能の阻害剤（例えば、刺激因子の阻害剤）である。抗体または断片の存在下でリガンドまたは促進剤によって誘導される移動の程度の低下は、阻害活性を示す。別々の結合実験を行って、阻害が抗体の受容体への結合の結果であるか、あるいは異なるメカニズムを介して起こるかを決定することができる。
【０１４３】
組織中での化合物（例えば、ケモカインまたは抗体）の注射に応答しての、組織の白血球浸潤をモニターするインビボアッセイは、以下に記載する（炎症のモデル参照）。イン・ビボホーミングのこれらのモデルは、炎症の部位への移動および化学走性によりリガンドまたは促進剤に応答し、およびこの移動をブロックする抗体またはその断片の能力を評価する細胞の能力を測定する。
【０１４４】
記載された方法に加えて、Ｃ５ａＲの刺激機能に対する抗体または断片の効果は、受容体を含有する適当な宿主細胞を用い、活性な受容体によって誘導される細胞応答をモニターすることによって評価することができる。
【０１４５】
Ｃ５ａＲのさらなるリガンド、阻害剤および／または促進剤の同定
本発明の抗体および断片の結合および機能を評価するのに用いることができる前記したアッセイを適合させて、Ｃ５ａＲまたはその機能的変異体に結合するさらなるリガンドまたは他の物質、ならびにＣ５ａＲ機能の阻害剤および／または促進剤を同定することができる。例えば、本発明の抗体またはその機能的部分のそれと同一または同様な結合特性を有する薬剤は、該抗体またはその部分との競合アッセイによって同定することができる。かくして、本発明は、Ｃ５ａＲに結合する受容体または他の物質のリガンド、ならびに受容体機能の阻害剤（例えば、アゴニスト）またはプロモーター（例えば、アゴニスト）を同定する方法も含む。１つの実施形態において、Ｃ５ａＲタンパク質またはその機能的変異体を担う細胞（例えば、哺乳動物Ｃ５ａＲタンパク質、または当該細胞に導入された核酸によってコードされた機能的変異体を発現するように作製された白血球、細胞系または適当な宿主細胞）をアッセイで用いて、受容体機能の阻害剤または促進剤を含めた、受容体に結合するリガンドまたは他の物質の効率を同定し、評価する。そのような細胞は、発現された受容体タンパク質またはポリペプチドの機能を評価する際において有用でもある。
【０１４６】
本発明によると、受容体に結合するリガンドおよび他の物質、受容体機能の阻害剤および促進剤を、適当なアッセイで同定し、さらに、治療効果について評価することができる。受容体機能のアンタゴニストを用いて、受容体活性を阻害する（低下させ、または妨げる）ことができ、およびリガンドおよび／またはアゴニストを用いて、示される場合、正常な受容体機能を誘導する（トリガーし、または増強する）ことができる。かくして、本発明は、受容体機能のアンタゴニストを個体（例えば、哺乳動物）に投与することを含む、自己免疫疾患および移植片拒絶を含めた、免疫疾患を治療する方法を提供する。本発明は、さらに、受容体機能の新規なリガンドまたはアゴニストを個体に投与することによって受容体機能を刺激する方法を提供し、これは、例えば、感染症および癌の治療において有用な白血球機能の選択的刺激に対する新しいアプローチを提供する。
【０１４７】
本明細書中で用いるように、Ｃ５ａＲタンパク質の「リガンド」とは、天然リガンドおよび天然リガンドの合成および／または組換え形態を含めた、哺乳動物Ｃ５ａＲタンパク質に結合する物質の特定のクラスをいう。好ましい実施形態において、Ｃ５ａＲタンパク質のリガンド結合が高い親和性にて起こる。
【０１４８】
本明細書中で用いるように、「アンタゴニスト」は、結合活性（例えば、リガンド結合、促進剤結合、抗体結合）、シグナリング活性（例えば、哺乳動物Ｇタンパク質の活性化、サイトゾル遊離カルシウムの濃度の迅速かつ一過的な増加の誘導）および／または細胞応答機能（例えば、化学走性の刺激、エクソサイトーシス、または白血球の炎症メディエーター放出）のような、Ｃ５ａＲタンパク質の特徴的な少なくとも１つの機能特徴を阻害する（減少させ、または妨げる）物質である。用語アンタゴニストは、受容体に結合する物質（例えば、抗体、天然リガンドの突然変異体、小分子量有機分子、リガンド結合の他の競合阻害剤）、およびそれに対する結合なくして受容体機能を阻害する物質（例えば、抗イディオタイプ抗体）を含む。
【０１４９】
本明細書中で用いるように、「アゴニスト」は、結合活性（例えば、リガンド、阻害剤および／またはプロモーター結合）、シグナリング活性（例えば、哺乳動物Ｇタンパク質の活性化、サイトゾル遊離カルシウムの濃度の迅速かつ一過性の増加の誘導）、および／または細胞応答機能（例えば、化学走性、エクソサイトーシス、または白血球による炎症メディエーター放出）のようなＣ５ａＲタンパク質に特徴的な少なくとも１つの機能を促進する（誘導する、引き起こす、増強させる、または増加させる）物質である。用語アゴニストは、受容体（例えば、抗体、もう１つの種からの天然リガンドのホモログ）に結合する物質、および（例えば、関連するタンパク質を活性化することによる）それに対する結合なくして受容体機能を促進する物質を含む。好ましい実施形態において、アゴニストは天然リガンドのホモログ以外である。
【０１５０】
かくして、本発明は、リガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、およびＣ５ａＲまたは機能的変異体に結合する他の物質を含めた、Ｃ５ａＲまたはそのリガンド結合変異体に結合する薬剤を検出し、または同定する方法に関する。該方法に従い、テストすべき薬剤、本発明の抗体または抗原結合断片（例えば、７Ｆ３のそれと同一または同様なエピトープ特異性を有する抗体、およびその抗原結合断片）、およびＣ５ａＲまたはそのリガンド結合変異体を含む組成物を組合せることができる。これまでの成分は、抗体または抗原特異的断片のＣ５ａＲへの結合に適した条件下で組み合わせ、該抗体または断片のＣ５ａＲへの結合は、本明細書中に記載された方法、または他の適当な方法に従って、直接的または間接的に検出され、または測定される。（例えばテストすべき薬剤の不存在下における）適当な対照に対する形成された複合体の量の減少は、該薬剤が外受容体または変異体に結合することを示す。Ｃ５ａＲを含む組成物は、組換えＣ５ａＲタンパク質またはそのリガンド結合変異体を有する細胞の膜画分であり得る。該抗体またはその断片は、放射性同位体、スピン標識、抗原またはエピトープ標識、酵素標識、蛍光基およびケミルミネセント基のような標識で標識することができる。
【０１５１】
抗Ｃ５ａＲ  ｍＡｂの置換がＣ５ａ受容体アンタゴニストをより容易に同定することができる理由がある。Ｃ５ａのＣ５ａＲへの結合は、Ｃ５ａＲの異なる領域に関する２行程プロセスであり (Kloc et al., 2005参照)、他方、抗Ｃ５ａＲモノクローナル抗体、すなわち、７Ｆ３または３Ｃ５は、第二の細胞外ループにおける阻害のための単一の臨界的領域を認識する。
【０１５２】
炎症のモデル
治療剤としてのイン・ビボでの本発明の抗体および断片の効果を評価するのに用いることができる炎症のイン・ビボモデルが入手可能である。例えば、白血球浸潤は、ケモカイン、およびＣ５ａＲと反応性である抗体またはその断片の、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、またはアカゲザルのような適当な動物への皮内注射に際して、モニターすることができる（例えば、Van Damme, J. et al., J. Exp. Med., 176:59-65 (1992); Zachariae, C. O. C. et al., J. Exp. Med. 171:2177-2182 (1990); Jose, P. J. et al., J. Exp. Med. 179:881-887 (1994)参照)。１つの実施形態において、皮膚バイオプシーは、白血球（例えば、好酸球、顆粒球）の浸潤について組織学的に評価される。もう１つの実施形態において、化学走性および管外遊出が可能である標識された細胞（例えば、Ｃ５ａＲを発現する安定にトランスフェクトされた細胞）を動物に投与する。評価すべき抗体または断片を、標識された細胞がテスト動物に投与される前に、それと同時に、またはその後に投与することができる。阻害剤の不存在下における浸潤の程度と比較した、抗体の存在下における浸潤の程度の減少は阻害を示す。
【０１５３】
使用
本発明の抗体は、研究、診断および治療的適用を含めた、種々の適用で有用である。
【０１５４】
Ｃ５ａＲは、白血球トラフィッキングにおいて重要な役割を有する。かくして、Ｃ５ａＲはある炎症部位への好中球、好酸球、Ｔ細胞またはＴ細胞サブセットまたは単球の移動のための化学誘引剤受容体であり、従って、抗Ｃ５ａＲ抗体を用いて、白血球移動、特に、再灌流負傷および発作のような好中球組織負傷、自己免疫疾患のようなＴ細胞機能不全、またはアレルギー反応に、あるいはアテローム性動脈硬化症のような単球媒介障害に関連するものを阻害することができる（低下させ、または妨げることができる）。
【０１５５】
本明細書中に記載された抗体は阻害剤として作用して、（ａ）受容体への（例えば、リガンド、阻害剤またはプロモーターの）結合、（ｂ）受容体シグナリング機能、および／または（ｃ）阻害性機能を阻害することができる（低下させ、または妨げることができる）。受容体機能の阻害剤として作用する抗体は、（例えば、立体配座変化を引き起こすことによって）直接的にまたは間接的にリガンドまたは促進剤の結合をブロックすることができる。例えば、抗体は、リガンドの結合を妨げることによって、または（リガンドの結合の阻害と共に、またはそれなくして）脱感受性化することによって受容体の機能を阻害することができる。
【０１５６】
かくして、本発明は、有効量の本発明の抗体を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物（例えば、ヒト患者）における白血球トラフィッキングを阻害する方法を提供する。本発明は、好塩基球からのヒスタミン放出および好酸球、好塩基球および好中球からの顆粒放出のようなＣ５ａＲ活性に関連する他の効果を阻害する方法も提供する。本発明の抗体の投与の結果、病気状態の緩和または排除をもたらすことができる。
【０１５７】
モノクローナル抗体を、免疫病理学的関連疾患のために免疫治療的に用いることもできる。本発明の抗体と組合せて本明細書中で用いる用語「免疫治療的に」または「免疫治療」は、予防的ならびに治療的双方の投与を示す。かくして、抗体を高い危険性の患者に投与して、免疫病理学的疾患の確立および／または重症度を低下することができ、あるいは活性な病気、例えば、グラム陰性細菌感染による敗血症を既に証明している患者に投与することができる。
【０１５８】
抗体を用いて、アレルギー、アテローム発生、アナフィラキシー、悪性疾患、慢性および急性炎症、ヒスタミンおよびＩｇＥ媒介アレルギー反応、ショック、および慢性関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、多発性硬化症、同種移植片拒絶、線維性疾患、喘息、炎症性糸球体症またはいずれかの免疫複合関連障害を治療することができる。
【０１５９】
本発明の抗体で治療することができるヒトまたは他の種の病気または疾患は、限定されるものではないが、
（ａ）喘息、アレルギー性鼻炎、過敏肺病、過敏肺炎、間質性肺疾患（ＩＬＤ）（例えば、特発性肺線維症、または慢性関節リウマチに関連するＩＬＤ、全身エリテマトーデス、強直性脊椎炎、全身硬化症、シェーグレン症候群、多発性筋炎または皮膚筋炎）；アナフィラキシーまたは過敏応答、（例えば、ペニシリン、セファロスポリンに対する）薬物アレルギー、昆虫毒牙アレルギー；クローン病および潰瘍性結腸炎のような炎症性腸障害；脊椎関節症；強皮症；乾癬、および皮膚炎、湿疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、蕁麻疹のような炎症性皮膚病；血管炎（例えば、壊死性、皮膚、および過敏血管炎）のような呼吸器系アレルギー障害を含めた、炎症性またはアレルギー病および疾患；
（ｂ）関節炎（例えば、慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎）、多発性硬化症、全身エリテマトーデス、重症筋無力症、若年性開始糖尿病、糸球体腎炎のような腎炎、自己免疫甲状腺炎、ベーチェット病のような自己免疫疾患；
（ｃ）同種移植片拒絶、または移植片対宿主病を含めた（例えば、移植における）移植片拒絶；
（ｄ）アテローム性動脈硬化症；
（ｅ）皮膚または器官の白血球浸潤を伴う癌；
（ｆ）限定されるものではないが、再灌流負傷、発作、成人呼吸窮迫症候群、ある種の皮膚化学的悪性疾患、サイトカイン−誘導毒性（例えば、敗血症ショック、エンドトキシンショック）、多発性筋炎、皮膚筋炎、類天疱瘡、アルツハイマー病、およびサルコイドーシスを含めた肉芽腫性疾患、白血病性滑膜炎および年齢−関連黄班変性を含めた、阻害すべき望ましくない炎症応答を治療することができる他の病気または疾患（Ｃ５ａＲ媒介病または疾患を含む）を含む。
【０１６０】
本発明の抗Ｃ５ａＲ抗体は、１以上のリガンドの結合をブロックすることができ、それにより、前記障害に導く１以上の事象の下流カスケードをブロックする。
好ましい実施形態において、本発明の抗体は、敗血症、発作または成人呼吸窮迫症候群の治療で用いられる。
もう１つの実施形態において、本発明の種々の抗体を用いて、Ｃ５ａＲを検出し、例えば、白血球（例えば、好中球、単球、Ｂ細胞）、内皮細胞上での、および／またはレポーター遺伝子でトランスフェクトされた細胞上の受容体の発現を測定することができる。かくして、それらは、診断または研究目的で、細胞ソーティング（例えば、フローサイトメトリー、蛍光活性化細胞ソーティング）のような適用において有用性をやはり有する。
【０１６１】
本発明の抗Ｃ５ａＲ抗体は、診断適用において価値を有する。典型的には、診断アッセイは、抗体またはその断片のＣ５ａＲへの結合からの複合体の形成を検出することを含む。診断目的で、抗体または抗原結合断片を標識することができ、または標識しないでおくことができる。抗体または断片は直接的に標識することができる。限定されるものではないが、放射性核種、発蛍光体、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤およびリガンド（例えば、ビオチン、ハプテン）を含めた種々の標識を使用することができる。多数の適当な免疫アッセイが当業者に公知である（例えば、米国特許第３，８１７，８２７号；第３，８５０，７５２号；第３，９０１，６５４号；および第４，０９８，８７６号参照）。組織試料の免疫組織化学を本発明の診断方法で用いることもできる。標識しない場合、抗体または断片は、例えば、凝集アッセイにおけるように適当な手段を用いて検出することができる。標識されていない抗体または断片を、第一の抗体（例えば、抗イディオタイプ抗体、または標識されていない免疫グロブリンに対して特異的な他の抗体）または他の適当な試薬（例えば、標識されたプロテインＡ）と反応性である標識された抗体（例えば、第二の抗体）のような抗体を検出することができる別の（すなわち、１以上の）適当な試薬と組合せて用いることもできる。
【０１６２】
生物学的試料中でのＣ５ａＲタンパク質の存在を検出するのに用いるキットを調製することもできる。そのようなキットは、Ｃ５ａＲに結合する抗体またはその機能的断片、ならびに抗体または断片とＣ５ａＲとの間の複合体の存在を検出するのに適当な１以上の付属試薬を含む。本発明の抗体組成物は、単独で、あるいは他のエピトープに特異的なさらなる抗体と組合せた、凍結乾燥形態で供することができる。標識できる、または標識しないでおくことができる抗体は、補助的成分（例えば、トリス、リン酸および炭酸のような緩衝液、安定化剤、賦形剤、殺生物剤および／または不活性なタンパク質、例えば、ウシ血清アルブミン）と共にキットに含むことができる。例えば、抗体は、補助的成分との凍結乾燥混合物として供することができるか、あるいは補助的成分はユーザーによる組合せのために別々に供することができる。一般的に、これらの補助的物質は活性な抗体の量に基づいて約５％重量未満で存在させ、通常、抗体濃度に基づいて少なくとも約０．００１重量％の合計量で存在させる。モノクローナル抗体に結合させることができる第二の抗体を使用する場合、そのような抗体は、例えば、別々のバイアルまたは容器中でキットにて供することができる。第二の抗体は、もし存在すれば、典型的には標識され、前記した抗体処方にて同様な方法で処方することができる。
【０１６３】
同様に、本発明は、細胞によるＣ５ａＲの発現を検出し、および／または定量する方法にも関し、細胞またはその画分（例えば、膜画分）を含む組成物を、該抗体または断片のそれに対する結合に適した条件下で本発明の抗体と接触させ、結合をモニターする。抗体およびＣ５ａＲの間の複合体の形成を示す抗体の検出は、受容体の存在を示す。抗体の細胞への結合は、ＷＯ  ０３／０６２２７８に記載されたもののような技術を用いて決定することができる。該方法を用いて、（例えば、血液、唾液または他の適当な試料のような体液のような試料中での）個体からの細胞上でのＣ５ａＲの発現を検出することができる。Ｔ細胞または単球の表面でのＣ５ａＲの発現のレベルは、例えば、フローサイトメトリーによって決定することもでき、発現のレベル（例えば、染色強度）を病気罹患性、進行または危険性に相関させることができる。
【０１６４】
投与の様式
治療すべき病気または疾患に依存して、必ずしも限定されるものではないが、経口、食事により、局所、非経口（例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下注射で）、吸入（例えば、気管支内、眼内、鼻内または経口吸入、点鼻剤）を含めた種々の投与の経路が可能である。他の投与の適当な方法は、再充填可能または生分解性デバイスおよび遅延放出ポリマーデバイスを含むこともできる。本発明の医薬組成物は、他の薬剤とのコンビナトーリアル療法の一部として投与することもできる。
【０１６５】
投与すべき抗体の処方は、投与の経路および選択された処方（例えば、溶液、エマルジョン、カプセル）に従って変化する。投与すべき抗体を含む適当な医薬組成物は、生理学的に許容される賦形剤または担体中で調製することができる。抗体の混合物を用いることもできる。溶液またはエマルジョンでは、適当な担体は、例えば、生理食塩水および緩衝化媒体を含めた、水性またはアルコール性／水性溶液、エマルジョンまたは懸濁液を含む。非経口賦形剤は塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸化リンゲルまたは不揮発性油を含むことができる。水、緩衝化水、緩衝化生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）、デキストロース溶液およびグリシンを含めた、種々の適当な水性担体は当業者に公知である。静脈内賦形剤は種々の添加剤、保存剤、または流体、栄養または電解質補充物を含むことができる（一般に、Remington's Pharmaceutical Science, 16th Edition, Mack, Ed. 1980参照）。組成物は、場合により、ｐＨ調整のような生理学的条件を近似するのに必要な医薬上許容される補助的物質、ならびに緩衝剤および毒性調製剤、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、および乳酸ナトリウムを含有することもできる。本発明の抗体および断片は、当分野で公知の凍結乾燥および復元技術に従い、貯蔵のために凍結乾燥し、使用に先立って適当な担体中に復元することができる。選択された培地中の有効成分の最適濃度は、当業者に周知の手法に従い経験的に決定することができ、これは、所望の最終医薬処方に依存する。吸入のために、抗体または断片を可溶化し、投与のために適当な分注器（例えば、アトマイザー、ネビュライザーまたは圧縮エアロゾル分注器）に負荷することができる。
【０１６６】
本発明の抗体の投与のための用量範囲は、免疫病理学的病気の兆候が緩和され、あるいは感染の、または免疫系の刺激についての確率が減少する所望の効果を生じさせるのに十分大きい。用量は過粘稠度症候群、肺浮腫、うっ血性心不全などのような有害な副作用を引き起こすのに十分大きくないはずである。一般に、用量は患者における年齢、状態、性別および病気の程度で変化し、当業者によって決定することができる。用量はいずれの合併症の事象においても個々の医師によって調整することができる。用量は１または数日間の、毎日の１以上の用量投与において、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約３００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇで変化し得る。
【０１６７】
本発明の１以上の抗体は、適当な経路によって、単独で、あるいは別の薬物または薬剤と組合せて（前、同時に、または後に）、個体に投与することができる。例えば、本発明の抗体は、他のモノクローナルまたはポリクローナル抗体と組合せて（例えば、限定されるものではないが、ＣＣＲ２およびＣＣＲ３を含めたケモカイン受容体に結合する抗体と組合せて）、あるいは抗ＴＮＦまたは他の抗炎症剤と共に、または予防的または治療的処理で用いる商業的に入手可能なガンマグロブリンおよび免疫グロブリン製品のような現存の血漿産物と共に用いることもできる。本発明の抗体は、抗生物質および／または抗微生物剤と組合せて与えられる別々に投与される組成物として用いることができる。
【０１６８】
本発明の抗体は、抗体をコードする配列を含む核酸分子を投与することによって対象に導入してもよいのは当業者によって認識される。核酸分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいはＤＮＡまたはＲＮＡ双方を含むキメラ分子の形態としてもよい。抗体をコードするヌクレオチド配列は、薬剤をコードする配列が発現制御エレメントに操作可能に連結された発現ベクターにクローン化することができる。発現調節エレメントは当分野で周知であり、例えば、プロモーター、エンハンサーおよび適当な開始および停止コドンを含む。
【０１６９】
種々の方法を、抗体をコードする核酸をイン・ビボにて標的細胞に導入するのに用いることができる。例えば、裸の核酸を標的部位において注射してもよく、リポソームにカプセル化してもよく、あるいはウイルスベクターによって導入してもよい。
【０１７０】
単独の、あるいは例えば、カチオン性リポソームにカプセル化された核酸分子の直接的注射を、イン・ビボでの、非分裂または分裂細胞への、ＴＳＰ−１をコードする核酸の安定な遺伝子導入で用いてもよい(Ulmer et al., 1993)。加えて、粒子衝突方法を用い、イン・ビボにて、核酸を種々の組織に導入することができる(Williams et al., 1991)。
【０１７１】
ウイルスベクターは、イン・ビボでの特異的細胞型への、抗体をコードする核酸分子の遺伝子導入で有用である。ウイルスは、感染し、特定の細胞型において増殖することができる特殊化された感染剤である。特別な細胞型に感染するためのこの特異性は、イン・ビボで選択された細胞へ抗体を標的化するのに特に適している。ウイルスベクターの選択は、部分的には、標的化すべき細胞型に依存する。
【０１７２】
特定の細胞型に標的化することができる特殊化されたウイルスベクターは当分野で周知である。そのようなベクターは、例えば、一般的なまたは組織特異的プロモーターを有する組換えアデノ−関連ウイルスベクターを含む（米国特許第５，３５４，６７８号）。組換えアデノ関連ウイルスベクターは、組換えウイルスが休止非増殖細胞さえのクロマチンに安定して組み込むことができる付加された利点を有する(Lebkowski et al., 1988)。
【０１７３】
ウイルスベクターは、組織特異的プロモーターまたはエンハンサーをベクターに取り込むことによって、コードされた抗体を発現する細胞型をさらに制御するように構築することができる(Dai et al., 1992)。
【０１７４】
レトロウイルスベクターは、イン・ビボにて抗体をコードする核酸分子を送達する方法にも適している。そのようなベクターは、感染性粒子として、あるいは単一の感染初期ラウンドのみを受ける非感染性粒子として機能するように構築することができる。
【０１７５】
受容体媒介ＤＮＡ送達アプローチを用いて、ブリッジング分子を介する核酸分子と非共有結合的に複合体化された組織特異的リガンドまたは抗体を用い、抗体をコードする核酸分子を組織特異的に細胞に送達することもできる(Curiel et al., 1992; Wu and Wu, 1987)。
【０１７６】
例えば、オートロガス細胞のエクス・ビボトランスフェクションによって、対象において抗体の発現を得るための遺伝子導入を行うこともできる。そのようなエクス・ビボトランスフェクションに適した細胞は血液細胞を含む。というのは、当分野で周知の方法によって、これらの細胞は操作、および対象へ戻す再導入のために容易に接近可能だからである。
【０１７７】
エクス・ビボでの細胞のトランスフェクションを通じての遺伝子導入は、例えば、リン酸カルシウム沈澱、ジエチルアミノエチルデキストラン、エレクトロポレーション、リポフェクションまたはウイルス感染を含めた、種々の方法によって行うことができる。そのような方法は当分野で周知である（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989)参照）。一旦、細胞がトランスフェクトされたならば、ついで、それらを、治療すべき対象に移植し、または移植して戻す。一旦身体に導入された細胞は、抗体を生産することができ、これは、循環に入ることができ、病気または疾患の部位において血小板凝集を阻害することができる。
【０１７８】
本明細書を通じて、用語「含む」、または「を含む」、または「含む」のような変形は、述べられたエレメント、整数または工程、あるいは複数のエレメント、複数の整数または複数の工程の群の包含を意味するが、いずれかの他のエレメント、整数または工程、あるいは複数のエレメント、複数の整数または複数の工程の群の排除を意味しないと理解される。
【０１７９】
本明細書に含まれている書類、行動、材料、デバイス、製品などのいずれの議論も、本発明についての関連を供する目的のためだけのものである。これらの事項のいずれかまたは全ては先行技術の基礎の一部を形成し、あるいは本出願の各請求項の優先日前にオーストラリアにおいて存在したかのように、本発明に関連する分野において通常の一般的知識であったことを自認するものと解釈されるべきではない。
【０１８０】
さて、本発明を以下の実施例によって説明するが、それは断じて限定的なものと解釈されるべきでない。本明細書中で引用した全ての文献の教示はここに参照により組み込む。
【実施例】
【０１８１】
実験の詳細
ヒトＣ５ａＲノックインマウスの作製
ノックアウト／ノックイン戦略を採用して、ヒトＣ５ａＲを発現するが、マウスＣ５ａＲを発現しないトランスジェニックマウスを、マウスＣ５ａＲ遺伝子プロモーターの制御下で構築した。標的化ベクターは、ベクターｐＬＯｚ（Ｏｚｇｅｎｅ，Ｐｅｒｔｈ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）中に、Ｃ５ａＲ遺伝子エクソン３の上流のマウスＣ５７ＢＬ／６ゲノムＤＮＡの３．５ｋｂの領域、ヒトＣ５ａＲ遺伝子エクソン３コーディング配列、マウスＣ５ａＲ遺伝子３’非翻訳領域、ｌｏｘＰ部位によって挟まれたホスホグルコキナーゼプロモーターおよびネオマイシン耐性遺伝子、ならびにＣ５ａＲ遺伝子の下流のマウスゲノムＤＮＡの３ｋｂ領域を含むものであった。ＰＣＲ増幅を用い、ゲノムＤＮＡ断片を作製した。該ベクターをＣ５７ＢＬ／６胚性幹細胞にトランスフェクトし、Ｇ４１８耐性コロニーからのＤＮＡをサザンブロットによってスクリーニングした。Ｘｂａ  ＩおよびＥｃｏＲ  Ｖ消化ＤＮＡを、各々、５’および３’プローブでハイブリダイズして、５’および３’両末端における正しい相同組換え事象にてクローンを同定した。正しく標的化されたＥＳクローンを注入した胚盤胞から作製されたキメラを、Ｃ５７ＢＬ／６雌と交配させた。ヒトＣ５ａＲ遺伝子の生殖系伝達は、マウス尾ゲノムＤＮＡのサザンブロットによって確認した。ヒトＣ５ａＲ遺伝子（ｈＣ５Ｒ１+/+）についてホモ接合性のマウスが作製され、ＰＣＲ、サザンブロットおよびＦＡＣＳ染色はｍＣ５ａＲの不存在を確認した。
【０１８２】
好中球の単離
ヒト好中球を、修飾を施して従前に記載されているように（Haslett et al.,(1985)）、健康なボランティアの末梢静脈血液から単離した。簡単に述べると、ＥＤＴＡ−被覆バキュテイナーに収集された血液試料を４００ｘｇにおいて１５分間遠心し、次いで、血漿およびバフィーコートを除去した。３０分間の１％デキストラン沈積に続き、白血球細胞を３００×ｇにおける５分間の遠心によってペレット化し、ＰＢＳで洗浄した。次いで、細胞を６５％パーコールのクッション（密度、１．０９３  ｇ／ｍｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）上にて５００ｘｇで３０分間遠心した。遠心の後、好中球をＰＢＳに再懸濁させた。１０％胎児仔ウシ血清を含む５ｍｌ  ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）培地をシリンジで骨を通すことによって、マウス好中球を双方の後脚大腿骨から単離した。好中球を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）での密度遠心によって分離した。赤血球細胞を低張緩衝液（１５５ｍＭ  ＮＨ4Ｃｌ、１０ｍＭ  ＫＨＣＯ3、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）によって溶解させた。細胞生存率を、トリパンブルー排除によって決定し、好中球ペレットをＰＢＳに再懸濁させた。
【０１８３】
モノクローナル抗体の作製
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、高レベルのｈＣ５ａＲ（Campbell et al.(1996)）を発現する約２ｘ１０7Ｌ１．２トランスフェクタントで、２週間間隔で５回腹腔内、次いで、一回静脈内免疫化した。最終静脈内免疫化から４日後に、脾臓を摘出し、標準的手法を用い、細胞をＳＰ２／０細胞系と融合させた。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ｈＣ５ＲＩ+/+マウスの大腸から摘出した約１ｘ１０7好中球で同様に、２回静脈内、１回腹腔内免疫化し、最後に静脈内免疫化した。ハイブリドーマを、１０％Ｆｅｔａｌｃｌｏｎｅ（ＨｙＣｌｏｎｅ）およびＨＡＴ補足物（ＳＩＧＭＡ）を含有するＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）中で成長させ、細胞上清を初期スクリーニングのために採取した。選択された抗体の生産をスケールアップし、プロテインＡまたはＧクロマトグラフィーによってｍＡｂを精製し、濃縮し、緩衝液を交換し、エンドトキシンを除去した。ＭＡｂ濃度を、マウスＩｇＧ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて決定した。
【０１８４】
フローサイトメトリー
トランスフェクトされた細胞または白血球に対するｍＡｂの反応性を評価するために、本発明者らは、間接的免疫蛍光染色およびフローサイトメトリーを用いた。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、２％ヒト血清および０．１％アジ化ナトリウム（染色緩衝液）、精製された抗体、５０μｌハイブリドーマ培養上澄みを含有する１００μｌ  ＰＢＳに再懸濁させた。４℃における２０分後、細胞を染色緩衝液で２回洗浄し、染色緩衝液に１：２００で希釈した５０μｌ  ＦＩＴＣコンジュゲートアフィニティ精製Ｆ（ａｂ’）2ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に再懸濁させた。４℃で２０分間インキュベートした後、細胞を染色緩衝液で２回洗浄し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析して表面発現のレベルを決定した。ヨウ化プロピジウム染色を用いて死滅細胞を排除した。
【０１８５】
結合アッセイ
ヒト好中球を洗浄し、結合緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および０．５％ＢＳＡ）に１ｘ１０7／ｍｌで再懸濁させた。（１２０μｌの最終用量中の）各結合反応では、適当な量の抗ｈＣ５ａＲ  ｍＡｂ、アイソタイプがマッチした対照ｍＡｂまたは標識されていないヒトＣ５ａ（ＳＩＧＭＡ）を含む４０μｌの細胞懸濁液（４ｘ１０5細胞）を室温にて１５分間インキュベートした。125Ｉ標識ヒトＣ５ａ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を０．４ｎＭの最終濃度で加え、反応を室温にて６０分間インキュベートした。次いで、細胞を収集し、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する結合緩衝液で３回洗浄した。次いで、細胞を、ＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ２０シンチレーション流体を用いるＯｐｔｉプレート（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）に移し、放射能をＴｏｐＣｏｕｎｔ（Ｐａｃｋａｒｄ）でカウントした。各試料を三連でアッセイした。
【０１８６】
ＢＩＡＣｏｒｅ分析
１．機器試薬、
１．１ハードウェア／ソフトウエア：ＢＩＡＣｏｒｅ  ２０００／ＢＩＡＣｏｒｅ  ２０００対照ソフトウエア
実行緩衝液：ＨＢＳ−ＥＰ（ＢＩＡＣｏｒｅ，＃ＢＲ−１００１−８８）
再生緩衝液：１００ｍＭ  ＨＣｌ
センサーチップ：センサーチップＳＡ（ストレプトアビジン）；ＢＩＡＣｏｒｅ，＃ＢＲ−１００３−９８）
ビオチニル化ヒトＣ５ａＲペプチド（第二のループ）：ビオチン−ＳＧＳＧＬＹＲＶＶＲＥＥＹＦＰＰＫＶＬＣＧＶＤＹＳＨＤＫＲＲＥＲＡＶＡＩＶ−ＯＨ（配列番号：２６）。
【０１８７】
２．アッセイ手法／機器の設定、
２．１アッセイの流速：３０μｌ／分
２．２  ３×１の条件ＳＡチップ（Ｆｃ１およびＦｃ２）−５０ｍＭ  ＮａＯＨ中の１Ｍ  ＮａＣｌの微量な注入
【０１８８】
２．３試料調製
ＨＢＳ−ＥＰ（ＢＩＡＣｏｒｅ，＃ＢＲ−１２００１−８８）中の抗体試料を希釈する。
各抗体について以下の濃度を用いる。
ｉ）１００ｎＭ
ｉｉ）５０ｎＭ
ｉｉｉ）２５ｎＭ
ｉｖ）１２．５ｎＭ
ｖ）６．２５ｎＭ
ｖｉ）３．１２５ｎＭ
【０１８９】
２．４対照アッセイ、
動的実験での継続前におけるストレプトアビジン（Ｆｃ１）への非特異的結合について抗体をテストする。動的アッセイで用いるべき抗体の最高濃度（ＨＢＳ−ＥＰ中１００ｎＭ）を用いる。
２．５ビオチニル化−ペプチド２３（Ｃ５ａＲペプチド）のＳＡセンサーチップＦｃ２への固定化、
１μｇ／ｍＬにおいてＨＢＳ−ＥＰ中でＢｉｏt−ペプチドを調製する。手動注入約１０００  ＲＵにてＦｃ２に固定化する。
【０１９０】
２．６抗体動的アッセイ
動的分析Ｗｉｚａｒｄを用い、プロンプトに従い、以下に概説するようにアッセイパラメーターをエンターする。
２．６．１濃度シリーズをエンターして実行する。
すなわち、３．１２５、６．２５、１２．５、２５、５０、１００ｎＭ。二連で試料を実行する。
【０１９１】
２．６．２「直接的結合アッセイ」を選択する。
２．６．３「濃度シリーズ」を選択する。
【０１９２】
２．６．４以下のパラメーターをダイアログボックスにエンターする。
参照としてのＦｃ１と共にＦｃ２を用いる。
流速：３０μｌ／分
注入時間：２分
安定化時間：１０分
解離時間：２０分
「エンターされた試料の実行」を選択する。
「次」を選択する。
【０１９３】
２．６．５再生方法、
単一注入
流速：３０μｌ／分
再生緩衝液：１００ｍＭ  ＨＣｌ
注入時間：２分
再生後安定化時間：２分
【０１９４】
２．６．６抗体および再生緩衝液を指定されたラック位置に入れる。
【０１９５】
２．６．７Ｗｉｚａｒｄを実行する。
【０１９６】
カルシウムフラックスアッセイ
新たに単離されたヒト好中球に、従前に記載されているように（Ponath et al.(1996)）、Ｆｌｕｏ−３ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を３７℃にて３０分間負荷した。試料をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターにかけ、直線的蛍光強度を経時的に測定した。
【０１９７】
化学走性アッセイ
５０％Ｍ１９９（ＳＩＧＭＡ）および２％胎児仔牛血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）を含む化学走性緩衝液（ＲＰＭＩ  １６４０）に懸濁させたヒトまたはマウス好中球（ウエル当たり１〜２ｘ１０5細胞）を１２−ウエルのトランス−プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ  Ｃｏ．）の上方チャンバーに入れ、３μｍフィルターを横切って、ヒトまたはマウスＣ５ａを含有する下方チャンバーに３０分間で移動させた。移動した細胞の数を、６０秒間カウントすることによってＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒで数えた。急な前角および側方散乱ゲートを、デブリスまたは無関係な細胞を排除するように設定した。
【０１９８】
キメラヒト／マウスＣ５ａＲを発現する細胞系の構築
キメラヒト／マウスＣ５ａ受容体を、修飾されたＰＣＲベースの重複延長技術を用いて構築した（Wurch et al.(1998)）。簡単に述べると、ヒトまたはマウスＣ５ａＲ遺伝子の異なる断片をＰＣＲによって増幅した。重複する断片を組み合わせ、変性させ、再度アニールし、第二ラウンドのＰＣＲによって増幅した。適当な制限酵素部位を持つ全長キメラ受容体配列を第三のＰＣＲ工程で増幅し、発現のためにｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した。ＰＣＲプライマーは、ヒトＣ５ａＲおよびマウスＣ５ａＲ遺伝子配列（各々、ＧｅｎｅＢａｎｋアクセション番号Ｍ６２５０５およびＳ４６６６５）に従って設計した。プライマーは隣接ヒトおよびマウスＣ５ａＲ配列を含むものであった（表１）。
【０１９９】
表1
キメラマウス／ヒトＣ５ａ受容体を構築するのに用いたＰＣＲプライマーの配列を示す。各々、赤色の配列はヒトＣ５ａＲ遺伝子からのものであって、青色配列はマウスＣ５ａＲに対応する。Ｃ５ａＲ遺伝子５’末端順方向プライマーはＫｏｚａｋ配列（下線を施す）を、ＡＴＧおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位（太線）の上流に組み込む。３’逆プライマーはＸｂａＩ部位（太線）を組み込んで、発現ベクターへのクローニングを容易とする。
【表２】
2010501164.tif 000003
【０２００】
合成ペプチドでのエピトープ分析
Ｎ−末端ビオチンおよびスペーサーＧＳＧＳを持つペプチドの２つの組を、プラスチックピン（Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ  Ｐｔｙ  Ｌｔｄ，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）上にて固定化された形態で合成した。第一の組はヒトＣ５ａＲの第二の細胞外ループからの全ての可能な１２マーを含有し、各々は１つのアミノ酸だけ食い違っている。第二の組は、各々がアラニンで置換された１つの残基を持つ、配列ＶＲＥＥＹＦＰＰＫＶＬＣの１２マーであった。ペプチドは最初に２００μｌ  ６０％ＤＭＳＯ中で復元させ、引き続いて、ＰＢＳ中に希釈して、直接的にＥＬＩＳＡについて１０μｇ／ｍｌ最終濃度を与えた。
【０２０１】
ペプチドＥＬＩＳＡ
ストレプトアビジン−被覆マイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ）を２００μｌの用量中の１０μｇ／ｍｌのペプチド／ウエルで被覆し、４℃にて一晩インキュベートした。プレートをＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液（ＰＢＳ中の０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）で３回洗浄した。ＭＡｂを２．５μｇ／ｍｌで加え、プレートを室温にて３時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液中に１：１０００希釈した、ＨＲＰ結合ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体を検出で用いた。ＴＭＢ（３．３’，５．５’テトラメチルベンチジン、ＳＩＧＭＡ）を用いてプレートを発色させ、Ａ540ｎｍで読んだ。
【０２０２】
発現ベクターのＬ１．２細胞へのトランスフェクション
マウスＬ１．２細胞を、１０％胎児仔ウシ血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）を補足したＲＰＭＩ  １６４０（ＧＩＢＣＯ）中で成長させ、製造業者の指令に従って、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてトランスフェクトした。
【０２０３】
Ｋ／ＢｘＮ慢性関節リウマチモデル
血清を、従前に記載されているように（Korganow et al.(1999)）、Ｋ／ＢｘＮ関節炎マウスから収集した。実験的関節炎は、０日および２日に１５０μｌ血清を腹腔内注射することによって受容者マウスで誘導し、病気の進行を記載されているようにモニターした（Lee et al.(2002)）。踝の厚みおよび臨床的スコアを毎日決定した。臨床スコアは、４つの脚についてのスコアを合計することによって各マウスについて計算した。０−正常、１−僅かな赤み、２−赤く、かつ僅かな腫れ、３−赤く、かつ広範囲にわたる腫れ。抗ｈＣ５ａＲまたはアイソタイプ対照ｍＡｂ（ＰＢＳ中１〜１０ｍｇ／ｋｇ）を−１日および１日に（予防的処置）または５日に（治療的処置）腹腔内注射した。
【０２０４】
統計学的分析
ＫｘＢ／Ｎモデルにおける独立した対照および処置群の間の差の統計学的有意性は、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定、続いての、ダンの多重比較検定を伴う事後分析を用いて決定した。
【０２０５】
実施例１
トランスフェクトされたＬ１．２細胞を用いるＣ５ａＲに対するｍＡｂの作成（比較例）
本発明者らは、最初に、化学誘引剤受容体に対する公知のアプローチを用いてｈＣ５ａＲに対するｍＡｂを生起させた（Heath et al.(1997);Qin et al.(1998);Wu et al.(1997);Qin,et al.(1996)）。マウスを、非常に高レベルのｈＣ５ａＲ（細胞当たり約８０，０００受容体）を発現するＬ１．２細胞（マウスＢ細胞リンパ腫系）で免疫化した。５回の融合を行い、ｈＣ５ａＲトランスフェクタントと特異的に反応するが、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、または他のＣ５ａ結合受容体、Ｃ５Ｌ２（Gerard et al.(2005)）のような他の密接に関連する化学誘引剤受容体を発現するトランスフェクタントとは特異的に反応しない４０を超える異なるｍＡｂを同定した。多数のこれらのｍＡｂは、ｈＣ５ａＲトランスフェクタントへの125Ｉ−標識ヒトＣ５ａ結合を阻害した。同定されたリードｍＡｂである７Ｆ３は、Ｃ５ａ結合の優れた阻害を示し（図１）、化学走性アッセイにおいてヒト好中球のＣ５ａへの化学走性を阻害し、ヒト好中球においてＣ５ａ−誘導カルシウムフラックスをブロックした（データは示さず）。
【０２０６】
実施例２
ｈＣ５ａＲノックインマウスからの好中球を用いるＣ５ａＲに対するｍＡｂの作成
優れた抗Ｃ５ａＲ  ｍＡｂを開発するための第二のアプローチにおいて、ヒトＣ５ａＲノックインマウスは、マウスＣ５ａＲ遺伝子（Ｃ５Ｒ１）における標的化−相同組換えによって作製した。内因性Ｃ５ａＲコーディング配列の同時欠失、およびｈＣ５ａＲコーディング配列でのその置換は、マウス胚性幹細胞（ＥＳ）細胞を標的化構築体でトランスフェクトすることによって達成した（図２）。スクリーニングされた６７２のうち２つのＥＳクローンを、正しく標的化されたｈＣ５ａＲ配列を含有するものとして同定した。ｈＣ５ａＲ導入遺伝子の生殖系伝達が達成され、５匹のキメラマウスがこれらのＥＳ細胞から生産され、かくして、ｈＣ５ａＲノックイン系を確立した。ｌｏｘＰ部位によって近接挟まれたＰＧＫ−ｎｅｏ遺伝子を、ＢＬ／６  Ｃｒｅデリーター株を用いてノックイン遺伝子座から欠失した。ヒトＣ５ａＲ導入遺伝子（ｈＣ５Ｒ１+/+）に対してホモ接合性のマウスは、サザンブロットによって同定した（図３）。これらのマウスからの好中球は、抗ｈＣ５ａＲ  ｍＡｂでのＦＡＣＳ染色によって判断して、非常に高レベルのｈＣ５ａＲを発現することが示された（図４）。野生型マウスからの好中球は、抗ヒトＣ５ａＲ  ｍＡｂ  ７Ｆ３によって染色されなかったが、抗マウスＣ５ａＲ  ｍＡｂ、２０／７０によって強く染色された（Soruri et al.(2003)）（図４）。ヒトおよびマウスＣ５ａＲは６５％相同性を保有するに過ぎないが、重要なことには、ｈＣ５ａＲノックインマウスの開発のためには、マウスおよびヒトＣ５ａは同様な親和性でもってヒトＣ５ａＲに結合する（Gerard et al.(1992)）（および本発明者らの未公表の観察）。ｈＣ５Ｒ１+/+マウスからの好中球は、ヒトおよびマウスＣ５ａ双方に対して同様に移動した。
【０２０７】
１つの融合より、本発明者らは、多数のｈＣ５ａＲ特異的ｍＡｂを作成した。ｈＣ５Ｒ１+/+マウスからの好中球での野生型マウスの免疫化によって作成された抗Ｃ５ａＲ  ｍＡｂは、全て、重鎖可変領域のアミノ酸配列が全て区別される点で全て区別され、それらが別々のクローンに由来したことを示す。
【０２０８】
リガンド結合アッセイは、これらのｍＡｂの多くが、ｍＡｂ  ７Ｆ３よりも、ヒト好中球に対する125Ｉ−標識Ｃ５ａ結合の優れた阻害を示したことを明らかとした。ｈＣ５ａＲ+/+マウスの好中球から生じた抗体は、ｍＡｂクローンに依存して、実質的に完全な阻害（例えば、３Ｃ５，８Ｇ７，７Ｈ３）から部分的阻害、またはほとんど少ない阻害までの範囲の、好中球に対する125Ｉ−Ｃ５ａ結合の阻害の広いスペクトルを示した（図５）。最も優れた阻害剤であるｍＡｂ  ３Ｃ５は、５０３  ｐＭのｍＡｂ  ７Ｆ３についてのＩＣ50に対する比較において、１７１  ｐＭのＩＣ50値を有した（図６）。さらなる競合リガンド結合実験を行って、７Ｆ３または３Ｃ５での、ｈＣ５ａＲ−トランスフェクトＬ１．2細胞上のｈＣ５ａＲからの125Ｉ−Ｃ５ａ置換を測定した。再度、３Ｃ５（ＥＣ５０：０．０２１ｎＭ）は、７Ｆ３よりもＣ５ａＲに対して実質的に高い親和性を示した（ＥＣ５０：０．４８ｎＭ）（図７）。
【０２０９】
実施例３
ｍＡｂによって結合されたＣ５ａＲエピトープの特徴付け
ｈＣ５ａＲトランスフェクタント、およびｈＣ５ａＲを発現するマウス好中球の使用は、潜在的に、細胞外ドメイン、ならびに三次構造に頼っているエピトープのいずれかを認識するｍＡｂの作成を可能とした。従って、本発明者らは、本発明者らが作成したｍＡｂをブロックすることによって認識されたｈＣ５ａＲ上の臨界的エピトープを決定した。これらの抗体はヒトＣ５ａＲを認識するが、マウスＣ５ａＲを認識しないので、本発明者らは、ヒト／マウスＣ５ａＲキメラ受容体のパネルを構築した（図８）。ヒトＣ５ａＲの単一または多数の細胞外ドメインは、順次、重複伸長ＰＣＲ方法（Shevchuk et al.(2004)）を用い、マウスＣ５ａＲからの相同領域によって置き換えた。キメラ受容体はマウスＬ１．２細胞において発現され、ｍＡｂ反応性はＦＡＣＳ染色によって決定された。ｍＡｂ  ７Ｆ３、３Ｇ５、７Ｈ３および８Ｇ７を含めたほとんどの優れたブロッキング活性を持つ全ての抗体は、ｈＣ５ａＲの第二の細胞外ループに結合した（図９）。Ｃ５ａＲの第二の細胞外ループ上の最も優れたブロッキング抗体の正確な接触残基を規定するために、本発明者らは、ｈＣ５ａＲの第二の細胞外ループをカバーする、各々が１１アミノ酸だけ重複する、１２マーペプチドの組、およびＥＬＩＳＡを用いてペプチド走査分析を行った。ｍＡｂ  ３Ｃ５および７Ｆ３は、共通のヘキサペプチド配列179ＥＥＹＦＰＰ184を含有する、Ｎｏ.1〜Ｎｏ．７の７つのペプチドに対して強力な結合を示した（図１０）。エピトープ179ＥＥＹＦＰＰ184を、このペプチド領域にわたるあらゆるアミノ酸のアラニン置換を用いてさらに実験した。図１１Ａおよび１１Ｂは、アミノ酸Ｅ179、Ｅ180、Ｙ181、およびＦ182は、ｍＡｂ  ７Ｆ３、３Ｃ５、８Ｇ７および７Ｈ３によるペプチド認識にとって臨界的であることを示す。かくして、ｈＣ５ａＲに対して本発明者らが作成した多くのｍＡｂのうち、Ｃ５ａ結合または機能の最も優れた阻害剤は、全て、Ｃ５ａＲの第二の細胞外ループにおける非常に特異的な領域にマッピングされた。
【０２１０】
実施例４
ｍＡｂ結合親和性
ＢＩＡＣｏｒｅ分析を用いて、抗体７Ｆ３、３Ｃ５、８Ｇ７および７Ｈ３のペプチド２３（第二の細胞外ループ、ヒトＣ５ａＲの残基１７５〜２０５−ＬＹＲＶＶＲＥＥＹＦＰＰＫＶＬＣＧＶＤＹＳＨＤＫＲＲＥＲＡＶＡＩＶ）への結合親和性を決定した。結果を図１２に示し、表２にまとめる。
【０２１１】
【表３】
2010501164.tif 000004
さらなるＢＩＡＣｏｒｅ分析を行って、変化させる条件下で、抗体７Ｆ３および３Ｃ５のペプチド２３に対する結合親和性を比較した。これらのさらなる分析の結果を表３に示す。これらのさらなるＢＩＡＣｏｒｅ実験についての条件を、以下のように修飾を施して、「実験の詳細」下で前記したような通りとした。
実験２：動的分析に含まれた抗体の濃度−１００ｎＭ〜０．７８ｎＭ；２０分の解離
【０２１２】
実験３：動的分析に含まれた抗体の濃度−７Ｆ３：２５ｎＭ〜０．７８ｎＭ，；３Ｃ５：６．２５ｎＭ〜０．７８ｎＭ；５分の解離
【０２１３】
実験４：動的分析に含まれた抗体の濃度−７Ｆ３：２５ｎＭ〜１．５６ｎＭ，；３Ｃ５：６．２５ｎＭ〜０．４ｎＭ；１分の会合、３分の解離
【０２１４】
【表４】
2010501164.tif 000005
これらの結果は、３Ｃ５が、７Ｆ３よりも、Ｃ５ａＲペプチドに対するほぼ１．５倍改良された親和性を有することを示す。
【０２１５】
実施例５
マウス関節リウマチモデルにおける抗ｈＣ５ａＲ  ｍＡｂテスト
ヒト分子を発現するトランスジェニックマウスの開発は、適当な動物モデルにおいて、ヒトでの使用について設計された、新しいヒト治療剤をテストするための便宜な手段である。Ｃ５ａＲは、マウスにおける炎症性関節炎の病因において必須の役割を演じる。例えば、Ｃ５ａＲ欠乏マウスは、抗グルコース６−リン酸イソメラーゼ自己−抗体（Ji et al.(2002)）、またはタイプＩＩコラーゲンｍＡｂいずれかによって誘導された関節炎から保護される（Grant et al.(2002)）。抗ｈＣ５ａＲ  ｍＡｂを、ｈＣ５Ｒ１+/+マウスにおける実験的関節炎の進行を保護し、または逆行させるそれらの能力についてテストした。関節炎Ｋ／ＢｘＮマウスからの血清の健康なマウスへの導入は、Ｋ／ＢｘＮ病を模倣する間接特異的炎症反応を誘導する（Kouskoff et al.(1996);Korganow et al.(1999)）。ｈＣ５Ｒ１+/+マウスを−１日および１日に抗ｈＣ５ａＲ  ｍＡｂまたはアイソタイプがマッチした対照ｍＡｂいずれかで予備処理し、およびＫ／ＢｘＮ血清を０日および２日に腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。血清導入後に、対照抗体で処理したマウスは関節の腫れおよび炎症性浸潤物を伴う典型的な慢性関節炎を呈し、他方、抗ｈＣ５ａＲ  ｍＡｂで処理したマウスは臨床的にもまたは組織学的にも炎症の完全な不存在を示した。病気の発生におけるｈＣ５Ｒ１+/+マウスおよび対照同腹子の間に観察可能な差はなく（データは示さず）、Ｋ／ＢｘＮモデルにおける病気はＣ５ａＲに依存するように、ヒトＣ５ａＲが十分に機能的であることを示す（Ji et al.(2002);Grant et al.(2002)）。最も重要なことには、抗体を病気誘導から５日後に投与すると、本発明者らは、確立された炎症の有意な逆行を観察した。ｈＣ５ａＲ−発現マウス好中球（３Ｃ５および８Ｇ７）に対して生起されたｍＡｂの効果はｍＡｂ  ７Ｆ３よりも長く続いた（図１３および１４）。１ｍｇ／ｋｇと少ないｍＡｂ  ３Ｃ５は炎症を逆行させ、維持された阻害を供することができた。
【０２１６】
広く記載された本発明の精神および範囲から逸脱することなく、特別な実施形態において示すように、多数の変形および／または修飾を本発明に対してなすことができるのは当業者によって認識される。従って、本実施形態は、全ての点において、説明的かつ制限的でないと考えられるべきである。
【０２１７】
文献
【表５】
2010501164.tif 000006
2010501164.tif 000007
【図１】
2010501164.tif 000008
【図２】
2010501164.tif 000009
【図３】
2010501164.tif 000010
【図４】
2010501164.tif 000011
【図５】
2010501164.tif 000012
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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