(57)【要約】【課題】アナライトを操作し検出するための方法を提供する。【解決手段】本発明は、１つ以上の結合区域において各異なるアナライトを異なる機能性粒子に結合させ２つ以上の結合アナライトを生成する工程と、結合アナライトを分離導管を通して２つ以上の分離した機能性成区域に移動させる工程とを含む、流体中の２種以上のアナライトを分離する方法であって、各異なる機能性粒子が、流体中でその他の機能性粒子とは異なる機能を有し、又は有するように制御でき、そして分離導管が、２つ以上の機能性導管に分岐することを特徴とする方法、及び結合区域、２つ以上の機能性導管、前記結合区域を前記２つ以上の機能性導管に連結する分離導管、アナライトを前記分離導管を通して前記結合区域から前記２つ以上の機能性導管に運搬する運搬装置を含む、流体において２種以上のアナライトを分離する装置を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）１つ以上の結合区域においてそれぞれの異なるアナライトを異なる機能性粒子に結合させ２種以上の結合アナライトを生成する工程と、
（ｂ）前記結合アナライトを分離導管を通して２つ以上の分離した機能性区域に移動させる工程とを含む、
流体中の２種以上のアナライトを分離する方法であって、
それぞれの異なる機能性粒子が、流体においてその他の機能性粒子とは異なる機能を有し、または有するように制御でき、かつ、
前記分離導管が、前記結合アナライトを前記異なる機能性粒子の異なる機能によって、分離した機能性導管中へと分離するために、２つ以上の機能性導管に分岐することを特徴とする方法。
【請求項２】
分離導管がマイクロ流体分離導管であり機能性導管がマイクロ流体機能性導管である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
機能性粒子又はそれぞれの異なる機能性粒子が、アナライトに特異的な認識剤に結合している、請求項１及び２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
それぞれの機能性粒子が単一の認識剤に結合するか、異なる認識剤種の全てに結合する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
１つ以上の機能性導管が検出要素を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
機能性粒子又はそれぞれの異なる機能性粒子が、
（ａ）流体において浮揚性のある粒子；
（ｂ）浮揚性を磁場の印加によって制御できる磁性粒子、又は中立な浮揚性を有し磁場への誘引を制御できる磁性粒子；そして
（ｃ）流体よりも密度の高い粒子から選択される、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
１種以上の認識剤が抗体を含む、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
機能性粒子が流体において浮揚性のある中空のガラスビーズを含む、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
流体がアナライトを含有するサンプルを含む、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
サンプルが固形組織の可溶化液、細胞可溶化液、体液、血液、又は血液製剤を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
サンプルが全血又は血漿を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
サンプルが哺乳類からのものである、請求項９から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
サンプルがヒトからのものである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
アナライトを検出するための検出要素が、バイオセンサーアレイ、電気化学バイオセンサー要素、及び光バイオセンサー要素の１種以上を含む、請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
アナライトが生体分子、ウイルス又はウイルス成分、及び細胞又は細胞成分から選択される、請求項１から１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
アナライトがタンパク質、ポリペプチド、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
（ａ）請求項１から１６のいずれかに記載の方法によって１種以上のアナライトを分離する工程；及び
（ｂ）前記１種以上のアナライトを検出する工程を含む、
１種以上のアナライトを検出する方法。
【請求項１８】
被検体からのサンプル中に病原体が存在するか否かを決定する方法、及びサンプルから被検体の遺伝子型を決定する方法のいずれかの方法であって、請求項１７に記載の方法によってサンプルにおいて、病原体の有無及び／又は量を検出する工程、又は遺伝子型に特徴的なタンパク質、ポリペプチド、又は核酸の有無及び／又は量を検出する工程を含む方法。
【請求項１９】
病原体が細菌及びウイルスから選択されるか、ポリペプチドがタンパク質又はタンパク質断片から選択されるもしくは核酸がＤＮＡ及びＲＮＡから選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
病原体がＨＣＶ、ＨＩＶ、又はヘルペスウイルスである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
被検体が哺乳類である、請求項１８から２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
被検体がヒトである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
（ａ）結合区域；
（ｂ）２つ以上の機能性導管；
（ｃ）前記結合区域を前記２つ以上の機能性導管に連結する分離導管；
（ｄ）アナライトを前記分離導管を通して前記結合区域から前記２つ以上の機能性導管に運搬する運搬装置；そして
（ｅ）随意に少なくとも１つの機能性導管と連結する１つ以上の濃縮区域を含む、流体において２つ以上のアナライトを分離する装置。
【請求項２４】
分離導管がマイクロ流体分離導管であり及び機能性導管がマイクロ流体機能性導管である、請求項２３に記載の装置。
【請求項２５】
少なくとも１つの機能性導管において少なくとも１つの検出要素を更に含む、請求項２３及び２４のいずれかに記載の装置。
【請求項２６】
１つ以上の濃縮区域の上方に１つ以上の検出要素を含む、請求項２５に記載の装置。
【請求項２７】
運搬装置が結合区域から流体を送り込むためのポンプを含む、請求項２３から２６のいずれかに記載の装置。
【請求項２８】
検出要素がバイオセンサー又はマイクロアレイである、請求項２３から２７のいずれかに記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特にマイクロ流体システムにおいて、アナライトを操作し検出するための方法に関する。この方法は、特に同じサンプルからの異なるアナライトを分離するための方法に関する。本発明は、その濃縮態様が複雑な従来の濃縮技術及び増幅技術なしでアナライトを検出することを可能にし、その分離態様が単一のサンプルにおいて複数の異なるアナライトを検出すること又は複数の異なるアナライトを分離して操作することを可能にするので、特に有利である。特に、本発明は、検出区域へのある程度の積極的運搬を行うことで、マイクロ流体装置が経験するデプレションレイヤの影響を低下させる。
【背景技術】
【０００２】
分析の方法において、特に生物学的検定法において、浮揚性粒子及び他の種類の粒子（例えば磁性粒子及び高密度粒子）を使用することが知られている。これに加えて、スイミングプールなどの大量の水の水面から浮揚性ビーズを使用して廃棄物を取り除く方法も周知である。通常は、浮揚性があり、粒子表面に結合した抗体を経て水中の細菌の汚染物質に付着することのできる中空粒子を水に混入し、水面に浮上したら、細菌と粒子の混合物を水面から「すくい取り」、プールの汚染物質を検出している。これは、スイミングプールのクリプトスポリジウムの検出のために行われてきた。
【０００３】
固形粒子、特に磁性ビーズ及びラテックスビーズを使用してアナライトを検出する方法が活躍するようになってしばらく経つ。例えば、一般的な検定方法で、磁性ビーズが使用され、検定されるサンプルに添加される。このビーズは、その表面にリガンドを有し、これによってビーズが標的アナライトに特異的に結合するのが可能になる。次に磁場が印加され、ビーズ及び結合した物質をサンプルの残りから分離することが可能になる。多くの場合、次にアナライトは、蛍光に基づく発光の検出によって測定され、そして連動するフローサイトメトリー分析に使用できる。このような方法は、細胞、核酸、タンパク質、及び他の種類の生体分子などの望まれる標的に対するインビトロの診断のために使用されてきた。
【０００４】
しかし、これらの種類の既存の方法では、アナライトを導管の特定部位中へ濃縮するようなことはしないので、平面上でチップ又はマイクロアレイに基づく方法を使用してアナライトを検出することは困難である。また、アナライトに対する特異性の異なる粒子を溶液中で混合する方法には、一旦異なるペア間で結合しても、それらを区別できないので、用いることができない。更に、これらの方法は、水面結合型トランスデューサー及び検出器を使用するマイクロ流体装置における結合工程で生成されるアナライトデプレションレイヤの問題の程度を少しも低減させない。この固有の問題は、マイクロ流体装置において行われる検定及びテストの本来備わっている感度を制限し、そしてそれらの結果を出すのに要する時間を増加させる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、上述したものを含む既知の技術に付随する問題を解決することである。本発明の更なる目的は、アナライトを処理し（例えば濃縮し、積極的に運搬し、そして分離する）そして検出する改善された方法を開発することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
従って、本発明は、（ａ）１つ以上の結合区域においてそれぞれの異なるアナライトを異なる機能性粒子に結合させ２つ以上の結合アナライトを生成する工程と、（ｂ）前記結合アナライトを分離導管を通して２つ以上の分離した機能性区域に移動させる工程とを含む、流体中の２つ以上のアナライトを分離する方法であって、それぞれの異なる機能性粒子が、流体においてその他の機能性粒子とは異なる機能を有し、または有するように制御でき、かつ、前記分離導管が、前記結合アナライトを前記異なる機能性粒子の異なる機能によって、分離した機能性導管中へと分離するために、２つ以上の機能性導管に分岐することを特徴とする方法を提供する。
【０００７】
本発明の全ての実施形態において、特に好ましくは、分離導管はマイクロ流体分離導管であり機能性導管はマイクロ流体機能性導管である。
【０００８】
典型的な実施形態においては、前記機能性粒子はアナライトに特異的な認識剤に結合している。概して、流体はいかなる適切な流体であっても良い。好ましくは、流体は液体である。
【０００９】
本方法の好ましい実施形態においては、工程（ｂ）の後で、前記粒子結合アナライトは、流体中の１つ以上の検出要素の近傍の濃縮区域に運搬される。この工程は省略することもでき、ある種の実施形態では、検出要素は分離導管からの出口の上方又は下方に存在してもよく、粒子結合アナライトの検出要素への運搬及び濃縮の両方を行うためには、浮揚性粒子による自然な浮揚移動又は高密度粒子による自然な反浮揚移動だけで十分である。
【００１０】
本発明の方法のいくつかの実施形態では、流体は、複数の異なるアナライトを含有する。このような実施形態においては、好ましくは、それぞれの異なるアナライトを異なる機能性を有する粒子と結合させるために、それぞれの異なるアナライトについて異なる認識剤が与えられる。これは、異なるアナライトを機能性粒子の異なる機能性に基づいて分離することを可能にする。
【００１１】
上述したように、好ましくは本発明の方法において使用される個々の粒子は、認識剤に結合される。１つの実施形態では、個々の粒子は単一の認識剤を結合しても良い。この実施形態においては、全ての粒子が同じ認識剤に結合していても（単一のアナライトのみを検出する場合）、あるいは複数の粒子が異なる認識剤に結合していても良い（１つ以上のアナライトを検出する場合）。異なる認識剤の数は、調査をしているサンプル中のアナライトの数に依存する。別の実施形態においては、個々の粒子は２個以上の認識剤に結合していても良い。１個の粒子に結合する認識剤は、同一種でも（例えば粒子のアナライトへの結合能力を増加させることが望まれる場合、または１個の粒子に２種以上のアナライトを結合させることが望まれる場合）、あるいはまた異なっていても良い（例えば調査をしているアナライトをどれでもいずれかの粒子に結合することが望まれる場合）。後者の実施形態のいくつかにおいては、システム中の異なる種類の認識剤の全てをひとつの粒子に結合させて、可能なアナライトのいずれか又は全てがひとつの粒子に結合するようにさせても良い。
【００１２】
特に好ましくは、流体において機能性粒子は、異なる浮揚性を有するか、有するように制御できる。このような粒子は、浮揚性ビーズ、高密度ビーズ、及び／又は磁場によって浮揚性を制御可能な磁性ビーズ又は中立な浮揚性を有し磁場に制御された仕方で誘引される磁性ビーズを含んでいても良い。これらの実施形態において、本発明によって提供される好ましい方法は、（ａ）１つの結合区域においてそれぞれの異なるアナライトを異なる粒子に結合させ、２つ以上の結合アナライトを生成する工程と、（ｂ）前記結合アナライトを分離導管を通して２つ以上の分離した機能性区域に移動させる工程とを含む、流体中の２つ以上のアナライトを分離する方法であって、それぞれの異なる粒子が、異なるアナライトに特異的な異なる認識剤に結合し、それぞれの異なる粒子が、流体においてその他の粒子とは異なる浮揚性を有し、または有するように制御でき、そして前記分離導管が、前記結合アナライトを前記異なる粒子の異なる浮揚性によって分離した機能性導管中へと分離するために、それぞれの機能性導管が他の機能性導管とは異なる高さに位置する、２つ以上の機能性導管に分岐することを特徴とする方法である。
【００１３】
本発明の方法においては、１種類の粒子の機能が別の種類の粒子の機能を過度に損なわないならば、機能性粒子は特に限定されない。上述したように、機能性粒子は好ましくは、（ａ）流体において浮揚性のある粒子；（ｂ）浮揚性を磁場の印加によって制御できる磁性粒子、又は中立な浮揚性を有し磁場への誘引を制御できる磁性粒子；そして（ｃ）流体よりも密度の高い粒子から選択される。
【００１４】
本発明の方法においては、粒子が浮揚性を有する場合、粒子は機能性区域に向かって浮上し得る。粒子が磁性を有する場合、粒子は望ましい機能性区域に向かって、浮上し、降下し、又は側方移動するように制御し得る。粒子が高密度である場合、粒子は機能性区域に向かって降下し得る。同様に、粒子の機能性は、粒子のそれぞれの望ましい機能性導管に向かった移動を引き起こし得る。
【発明の効果】
【００１５】
本発明による方法は、サンプルに対して行われる処理工程の数を減少させることによりサンプルにおけるアナライトのより迅速な検出を可能にするので、有利である。本発明による方法は、検出器の近傍にアナライトを分離し濃縮し、マイクロ流体装置において経験されるデプレションレイヤの影響を低減する方法を提供する。多重化が可能になるおかげで、本発明による方法は、使用者が行わなければならない実験回数を減らし、そして同じサンプルを異なる試験のために処理するために作動させなければならない機器の数を減らす。更に、本発明の方法は、必要とされる実験装置の量を減らし、この方法の実行をより容易にそしてより低コストにする。本発明は、その濃縮態様がアナライトを複雑な従来の濃縮及び増幅技術なしで検出することを可能にし、アナライトを検出区域に積極的に運搬し、その分離態様が単一サンプル中の複数の異なるアナライトを検出する又は分離して操作することを可能にするので、特に有利である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
本発明は、更に、ほんの１例として以下の図を参照して説明される。図は：
【図１】本発明の１つの実施形態における分離装置のレイアウトの１例を、略図として示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明がここでより詳細に説明される。
本発明の方法は、アナライトが粒子に結合し得るならば、あらゆる種類のアナライトを検出するのに使用し得る。しかし、好ましくは本方法は、アナライトを含有するサンプルを含む流体を使用して行われる。通常、サンプルは、固形組織の粗可溶化液、単一もしくは複数の細胞の粗可溶化液、又は体液を含む。より好ましくは、サンプルは、血液又は血液製剤もしくは血液成分を含む。最も好ましくは、サンプルは全血又は血漿を含む。概して、サンプルはヒトなどの哺乳類からのものである。用語「アナライト」は、特に限定されない。適切なアナライトは、サンプルにおいて検出されることが望まれるいずれの種類の生体分子であって良い。例えば、アナライトはタンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、又は全細胞、ウイルスもしくは細菌であって良い。特に、アナライトは、抗原、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、抗体、特異的ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ配列、又は特定の細胞種であって良い。本発明の具体的実施形態では、アナライトはＣ型肝炎の診断及び処置(テラノスティック情報の決定を含む)に関している。本方法は、ＨＩＶなどの他のヒトウイルス、癌バイオマーカー及び癌細胞、心臓マーカー、並びに細菌感染のマーカー及び多アナライト情報が重要であるあらゆる疾病兆候のマーカーに拡張される。
【００１８】
用語「サンプル」は、特に限定は無く、アナライトが存在し得るあらゆる被検査物をいう。特に、既に述べたように、サンプルは、全血、尿もしくは他の体液、又は固形組織もしくは細胞の粗可溶化液であって良い。サンプルは、本発明の方法において使用される前に、処理工程にかけられても良い。
【００１９】
本発明の方法において参照される認識剤は特に限定されない。粒子はこの認識剤で被覆され得る。認識剤の性質は、認識剤が粒子を標的アナライトに特異的に結合させるのであれば、特に限定されない。認識剤は、それ自身が標的アナライトであり得る抗原に特異的な抗体、又は標的アナライトの表面上に存在し得る抗原に特異的な抗体であり得る。また、標的アナライトがポリヌクレオチドである場合、認識剤は、このアナライトの配列の一部分に相補的なポリヌクレオチド配列であっても良い。更なる実施形態においては、アナライトが炭水化物であるである場合、認識剤はレクチンであっても良い。認識剤としては以下のシステムのものも挙げられる：アプタマー−ポリヌクレオチド；レセプター−リガンド；ＰＮＡ−ポリヌクレオチド；そして細胞表面抗原−ウイルス抗原。調査されるアナライトが２つ以上ある場合、それぞれのアナライトに特異的な抗体を使用して、１種類の粒子が１つのアナライトに結合し、異なる種類の粒子は別のアナライトに結合するようにすることができる。このようにして、複数のアナライトを同じサンプルにおいて処理できる。
【００２０】
本発明の方法においては、流体中で浮揚性のある粒子は、特に限定されない。本発明における使用に適した浮揚性粒子としては、市販品も利用可能である。特に浮揚性粒子としては、マイクロ流体の用途のための浮揚性粒子を供給するＭｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄあるいは他社から入手可能な中空のガラスビーズがあげられる。
【００２１】
本発明における使用に適した磁性粒子は、当技術分野で周知である。特に、様々なサイズの磁性ビーズの市販品が利用可能である。１つの実施形態では、ビーズは超常磁性ビーズである。このようなビーズが好ましいのは、普通の磁性ビーズは磁場が無い場合に凝集する傾向にあり、これによりビーズを洗い移動させるのが困難になるためである。超常磁性ビーズは、磁場の中でだけ磁性を有し、磁場が無い場合には凝集による悪影響は受けない。それゆえ、好ましくは粒子はいかなる残余磁性も保持しない。
【００２２】
粒子は、その検出を促進するために標識を含んでも良い。標識は、酵素的検出方法、電気化学的（例えばインピーダンス）検出方法、光学的（例えば蛍光）検出方法又は他の検出方法を促進し得るものである。
【００２３】
アナライトを検出する検出要素は、要素が調査されるアナライトを検出するのに適していれば、いかなる検出要素を含んでも良い。好ましくは、要素は、１つ以上のバイオセンサーアレイ、電気化学バイオセンサー要素、そして光バイオセンサー要素を含む。
【００２４】
この方法の更に好ましい実施形態においては、１つ以上の検出導管において、アナライトは、上述した濃縮方法に従って濃縮され得る。
【００２５】
本発明は、（ａ）上述の方法によってアナライトを分離する工程；及び（ｂ）１つ以上のアナライトを検出する工程を含む、１つ以上のアナライトを検出する方法も提供する。
【００２６】
更に本発明は、被検体からのサンプル中に病原体が存在するか否かを決定する方法、及びサンプルから被検体の遺伝子型を決定する方法のいずれかの方法であって、上述の方法によってサンプルにおいて、病原体の有無及び／又は量を検出する工程、又は遺伝子型に特徴的なタンパク質、ポリペプチド、又は核酸の有無及び／又は量を検出する工程を含む方法を提供する。
【００２７】
この方法の特に好ましい例は、被検体における病原体の有無を検出する方法、及び被検体における遺伝子型の有無を検出する方法のいずれかの方法であって、（ａ）被検体からサンプルを採取する工程；（ｂ）上述の方法によってサンプルにおいて、病原体の有無及び／又は量を検出する工程、及び遺伝子型に特徴的なタンパク質、ポリペプチド、又は核酸の有無及び／又は量を検出する工程のいずれかの工程；そして（ｃ）病原体の有無及び／又は量に基づき、又は遺伝子型に特徴的なポリペプチド、又は核酸の有無及び／又は量に基づき、被検体を診断する工程、及び遺伝子型の有無を決定する工程のいずれかの工程を含む方法である。
【００２８】
本発明の方法においては、通常病原体は、細菌及びウイルスから選択され、ポリペプチドはタンパク質又はタンパク質断片から選択され、又は核酸はＤＮＡ及びＲＮＡから選択される。より好ましくは、病原体はＨＣＶ、ＨＢＶ、ＨＡＶ、ＨＩＶ、又は単純ヘルペスウイルスである。典型的には、被検体は、ヒトなどの哺乳類である。
【００２９】
なお更に本発明は、（ａ）結合区域；（ｂ）２つ以上の検出区域；（ｃ）前記結合区域を、それぞれが１つ以上の検出要素を含む前記２つ以上の検出区域に連結する分離導管；（ｄ）アナライトを前記分離導管を通して前記結合区域から前記２つ以上の検出区域に運搬する運搬装置；そして（ｅ）随意に１つ以上の検出要素の近傍に位置する濃縮区域を含む、流体において２つ以上のアナライトを分離する装置を提供する。
【００３０】
上で強調したように、本発明の全ての実施形態において、特に好ましくは、分離導管はマイクロ流体分離導管であり、機能性導管はマイクロ流体機能性導管である。
【００３１】
本発明の装置は、典型的にはフローセル型装置である。本発明の装置においては、概して運搬装置が、結合区域から検出要素へと流体を送り込むためのポンプを含む。典型的には、しかし限定はされないが、検出要素はバイオセンサー又はマイクロアレイを含む。
【００３２】
本発明を、ここでほんの１例として、以下の具体的実施形態を参照して説明する。
【実施例】
【００３３】
（ＨＣＶについて試験されるサンプルのためのプロトコル（このプロトコルはＨＢＶ、ＨＡＶ、ＨＩＶ、又は単純ヘルペスにも適用でき、そして一般に個別の体液から分離可能な他の病原体にも適用できる））
（サンプルの性質）
通常は、サンプルは、全血、血清、血漿、細胞可溶化液もしくは細胞抽出物（例えばＢ細胞又は肝細胞）、又は尿である。サンプルは、サンプルの種類とその個別の性質によって、ある種の緩衝液組成を有するように調節され得る。
【００３４】
（ビーズの調製）
１００μｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中のＨＣＶ  Ｅ１タンパク質結合性ビオチン化抗体１μｇ（オリゴヌクレオチド、ＰＣＲ断片、アプタマー、ＰＮＡ、レクチン、抗体断片、組み換えレセプターもしくは精製レセプター、及びタンパク質などの他の認識剤も望まれるならば使用し得る）を、メーカーによりストレプトアビジンで被覆された、２０×１０６ビーズ／ｍｌの割合の３００μｌの浮揚性ビーズ（ＭＳＴ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）及び３００μｌの磁性ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＤｙｎａｌ）に連結させた。ビオチンはストレプトアビジンに対して高い親和性を有する（解離定数[ＫＤ]〜１０−１４Ｍ）ので、反応は確実に成功しそして抗体でビーズ表面は被覆される。ビーズを１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄みを捨て新たなＰＢＳと入れ替えることで、反応物から過剰の未連結抗体を洗い去った。この洗浄工程は２回繰り返した。
【００３５】
（結合工程）
１ｍｌ〜５ｍｌの容量を有するサンプルを、ＨＣＶに対して産生された抗体と連結させられたビーズと数分間インキュベートした。これは、サンプルを、サンプルを保持できるが(フリット材料又はフィルター)、溶液の流動も可能である室中のビーズの上を０．１ｍｌ／分〜５ｍｌ／分の速度で流すことによって、オンラインでも達成できる（好ましい方法として）。同じ導管を通して、サンプルに続いて洗浄溶液が、サンプルの容量の３〜５倍の容量で流され、非特異的結合が除去される。この洗浄溶液は、抗体−抗原相互作用において観察できる非特異的結合を減少させる０．０１％〜１％の濃度のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ、Ｔｗｅｅｎ  ２０又はＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０などの洗剤を含み得る。
【００３６】
（選別機構又は検出部位への流動）
マイクロ流体システムのバルブが開かれ、粒子が選別部位又はバイオセンシング部位へと流動させられる。低流速（０．０１ｍｌ／分〜１ｍｌ／分）で、ビーズはシステム中を流される。流動工程の間、関連する構成要素に結合させられた粒子は、導管の配置及びビーズの浮揚性によって、関連する導管に選別され、検出及び／又は分離される。機構が純粋にビーズを分離するために使用される場合、ビーズは収容室に運ばれ、そこで必要ならば更なる処理がなされる。
【００３７】
ビーズが検出地点又はバイオセンサーまで運ばれる場合、ビーズは再び低流速でそれらを通過する。このバイオセンサーは、ウイルス外皮に見られるＥ２タンパク質などのウイルスの別のエピトープ、又はＥ１外皮タンパク質の別のエピトープに対して産生された抗体を備える。一旦結合すると、いずれのバイオセンサー認識地点にも結合しなかったビーズが、上記したのと同様にして、洗浄溶液によって洗い流される。
【００３８】
（検出）
ビーズが蛍光性を有する場合、ビーズは顕微鏡又はＣＣＤカメラを用いてすぐに検出及びカウントできる。ビーズが蛍光性を有さない場合、ビーズに用いられた１次抗体に対して産生される２次抗体であって、蛍光性分子又は化学発光シグナルを発生することのできる酵素(例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）など)で標識された２次抗体が使用できる（インピーダンス法、又は酵素電気化学検出法も使用できる）。これは、ビーズ複合体の上をおよそ０．５μｇ／ｍｌの濃度で流される。重要なことは、この２次抗体が、バイオセンサーの認識構成要素と交差反応しない又は認識構成要素を認識しないようにすることである。検出は、顕微鏡又はＣＣＤカメラを用いて、反応物によって発せられる蛍光を測定することによって達成される。
【図１】
2010501844.tif 000003
【国際調査報告】
2010501844.tif 000004
2010501844.tif 000005
2010501844.tif 000006