(57)【要約】  本明細書では、胎盤幹細胞由来の肝細胞の作製のための方法および組成物が提供される。さらに、本明細書では、例えば肝臓の外傷、炎症および変性障害の治療ならびに処置におけるそのような肝細胞の使用が提供される。また、本明細書では、ナノ繊維足場と接着性胎盤幹細胞の組合せに関する組成物および方法、ならびに軟骨修復においてそれを使用する方法が提供される。最後に、本明細書では、胎盤由来の非接着性ＣＤ３４＋ＣＤ４５−幹細胞に関する組成物および方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋およびＣＤ２００＋の胎盤幹細胞を、前記幹細胞が肝細胞の特徴を示すのに十分な条件下および時間で酪酸ナトリウムと接触させることを含む、肝細胞を作製する方法。
【請求項２】
前記特徴が、アシアロ糖タンパク質受容体、アルファ−１−アンチトリプシン、アルブミン、シトクロムＰ４５０活性の生成、または未分化の胎盤幹細胞と比べて増加したサイトケラチン１８の生成である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記培養が、前記幹細胞を、アルギネート−ポリ−Ｌ−リジン中に封入することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法により作製される肝細胞または肝細胞性細胞。
【請求項５】
請求項４に記載の肝細胞または肝細胞性細胞を前記対象に導入することを含む、肝臓炎症を伴う疾患、障害または状態を有する対象を治療する方法。
【請求項６】
前記疾患、障害または状態が、肝硬変またはウイルス感染である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ヒト胎盤幹細胞由来の肝細胞または肝臓形成細胞を含むマウスであって、前記マウスは、下記ステップ：
ａ．前記マウスに、実質的に全ての内因性骨髄細胞を死滅させるのに十分なガンマ線を照射するステップ；
ｂ．前記マウスに、マウスの造血系を再構築するのに十分なＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスからの骨髄細胞または骨髄由来細胞を投与するステップ；および
ｃ．前記マウスに、複数の肝細胞または肝臓形成細胞を移植するステップであって、前記肝細胞または肝臓形成細胞が、ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞から分化したものである；
を含む方法により作製される、マウス。
【請求項８】
前記胎盤幹細胞が、さらにサイトケラチン１８＋である、請求項７に記載のマウス。
【請求項９】
前記肝細胞または肝臓形成細胞を前記マウスの耳介に投与する、請求項７に記載のマウス。
【請求項１０】
前記肝細胞または肝臓形成細胞がウイルスに感染している、請求項８に記載のマウス。
【請求項１１】
前記ウイルスが、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルスまたはＥ型肝炎ウイルスである請求項１０に記載のマウス。
【請求項１２】
請求項１２に記載のマウスを対象化合物と接触させることを含む抗ウイルス剤を同定する方法であって、前記マウスからの血清が、検出可能なレベルのウイルスを有し、前記接触が、前記対象化合物と接触していないマウスからの血清と比較して、前記マウスからの血清中の前記ウイルスの量が検出可能な程度の低減をもたらす場合に、前記化合物が抗ウイルス剤である方法。
【請求項１３】
前記ウイルスが、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルスまたはＥ型肝炎ウイルスである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ウイルスの抗原が検出される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ウイルスの核酸が検出される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記ウイルスが、Ｂ型肝炎ウイルスである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗原が、ＨＢｅＡｇまたはＨＢｓＡｇである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
アルギネート中に封入された複数の細胞を含む組成物であって、前記細胞が、胎盤幹細胞から分化し、前記細胞が、ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋およびＣＤ２００＋である接着性胎盤幹細胞により発現されないか、または接着性胎盤幹細胞よりも検出可能に異なる程度で発現される肝細胞の少なくとも１つのマーカーを発現する組成物。
【請求項１９】
前記アルギネートが、ビーズの形である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ビーズが、約２００μｍ〜約８００μｍのサイズである、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記ビーズが、平均約５００μｍのサイズである、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２２】
単離された接着性ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞と、電気紡糸されたナノ繊維足場とを含む組成物。
【請求項２３】
前記ナノ繊維足場が、ポリ（Ｌ−乳酸）（ＰＬＬＡ）、ポリ乳酸−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、Ｉ型コラーゲン、フッ化ビニリデンとトリフルオロエチレンとの共重合体（ＰＶＤＦ−ＴｒＦＥ）、ポリ（−カプロラクトン）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−ε−カプロラクトン）［Ｐ（ＬＬＡ−ＣＬ）］（例えば７５：２５）、および／または（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシバレレート）（ＰＨＢＶ）とＩ型コラーゲンとの共重合体の繊維を含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記ナノ繊維足場が、平均で約２５０ナノメートル〜約１０μｍの厚さの繊維を含む請求項２２に記載の組成物。
【請求項２５】
前記組成物を、胎盤幹細胞が軟骨形成細胞または軟骨細胞に分化する条件で接触させる、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２６】
接着性ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞を、電気紡糸されたナノ繊維足場と接触させることを含む組成物を作製する方法であって、前記ナノ繊維足場を、約２０ｋＶにて、約３０ｃｍの針と収集板との距離で、約０．０５ｍＬ／分〜約０．１ｍＬ／分の流速でＰＬＬＡまたはＰＬＧＡを電気紡糸することにより作製し、前記ＰＬＬＡまたはＰＬＧＡが、約１０％ｗ／ｗ〜約２０％ｗ／ｗの溶液である、方法。
【請求項２７】
ＣＤ３４＋、ＣＤ４５−胎盤幹細胞の濃縮単離細胞集団。
【請求項２８】
前記集団の細胞の少なくとも５０％が、ＣＤ３４＋およびＣＤ４５−である、請求項２２に記載の細胞集団。
【請求項２９】
前記集団の細胞の少なくとも７０％が、ＣＤ３４＋およびＣＤ４５−である、請求項２２に記載の細胞集団。
【請求項３０】
前記集団の細胞の少なくとも９０％が、ＣＤ３４＋およびＣＤ４５−である、請求項２７に記載の細胞集団。
【請求項３１】
前記集団が、ＣＤ３４＋およびＣＤ４５−でない幹細胞を含む、請求項２７に記載の細胞集団。
【請求項３２】
前記ＣＤ３４＋およびＣＤ４５−でない幹細胞が、ＣＤ３４−接着性胎盤幹細胞である、請求項３１に記載の細胞集団。
【請求項３３】
前記接着性胎盤幹細胞が、ＣＤ２００＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−およびＣＤ４５−である、請求項３２に記載の細胞集団。
【請求項３４】
前記ＣＤ３４＋およびＣＤ４５−でない幹細胞が、骨髄由来間葉系幹細胞である、請求項３１に記載の細胞集団。
【請求項３５】
前記ＣＤ３４＋およびＣＤ４５−でない幹細胞が、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５＋造血性幹細胞である、請求項３１に記載の細胞集団。
【請求項３６】
前記ＣＤ３４＋およびＣＤ４５−でない幹細胞が、臍帯血または胎盤血内に含まれる、請求項８に記載の細胞集団。
【請求項３７】
ＣＤ３４＋胎盤細胞の集団を形成するために胎盤細胞の集団からＣＤ３４＋細胞を選択すること、および前記ＣＤ３４＋胎盤細胞の集団からＣＤ４５＋細胞を除去することを含む、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５−胎盤幹細胞集団を作製する方法であって、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５−胎盤幹細胞集団が作製される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００７年２月１２日に出願された米国仮出願第６０／９０１，０６６号、２００７年２月１２日に出願された米国仮出願第６０／９０１，０７６号、２００７年３月７日に出願された米国仮出願第６０／９０５，６６４号、２００７年３月８日に出願された米国仮出願第６０／９０６，０６４号、２００７年８月２８日に出願された米国仮出願第６０／９６６，５７７号の利益を主張するものであり、それぞれの開示は、その全体が本明細書に組み込まれている。
【０００２】
本明細書では、胎盤由来の幹細胞に関する方法および組成物が提供される。本明細書では、ヒト接着性胎盤幹細胞由来の肝細胞の作製方法、および例えば肝臓の外傷、炎症性障害および変性障害の治療ならびに処置におけるそのような肝細胞の使用が提供される。本明細書では、ナノ繊維状足場と接着性胎盤幹細胞の組合せに関する組成物および方法、ならびにそれを軟骨修復で使用する方法も提供される。最後に、本明細書では、胎盤由来の非接着性ＣＤ３４＋ＣＤ４５−幹細胞に関する組成物および方法が提供される。
【背景技術】
【０００３】
体細胞性幹細胞は、例えば細胞補充療法の動物モデルにおける使用を含む種々の治療上の使用が提案されている。移植された幹細胞の治療潜在性は、倫理的に許容される自己幹細胞の供給源が入手可能であり、それぞれの型の細胞への幹細胞の成熟をプログラムする自己再生および運命決定の制御が達成される場合にのみ、臨床的な使用に移すことができる。
【０００４】
いくつかの研究が、肝細胞系列へ向かう胚性幹細胞の分化について記載している（例えば、Ｓｈａｒｍａ，Ｎ．Ｓ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＆Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、９４（６）：１０５３〜９３（２００６）；Ｍａｇｕｉｒｅ，Ｔ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＆Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、９３（３）：５８１〜５９１（２００６）、およびＣｈｅｎ  Ｙら、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２００６；１５（１０）：８６５〜７１）。さらに、ヒト骨髄由来間葉系細胞は、機能的肝細胞への分化能力について調べられ、ある程度成功している（Ｏｎｇ  ＳＹ、Ｄａｉ  Ｈ、Ｌｅｏｎｇ  ＫＷ、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．２００６年１０月１日；Ｏｎｇ  ＳＹ、Ｄａｉ  Ｈ、Ｌｅｏｎｇ  ＫＷ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（２２）：４０８７〜９７（２００６）（ｅｐｕｂ  ２００６年４月１７日）；Ｓａｔｏ  Ｙ、Ａｒａｋｉ  Ｈ、Ｋａｔｏ  Ｊ、Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｋ、Ｂｌｏｏｄ．１０６（２）：７５６〜６３（２００５）（ｅｐｕｂ  ２００５年４月７日）。
【０００５】
肝臓障害は、著しい罹患率および死亡率の原因として増加している。環境的および病原性の原因による肝臓機能の破壊は、ともすれば健康な個体にとって、著しい公衆健康の危険性である。したがって、そのような損傷された器官の損傷または破壊された肝細胞の置き換えは、重要な臨床上の目標である。しかし、肝細胞に分化できる幹細胞の倫理的に許容される供給源は、依然として入手可能ではない。これらその他のまだ考慮されていない必要性が、本明細書において提供される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一態様では、本明細書で、接着性胎盤幹細胞由来の肝細胞の作製のための方法および組成物、ならびにこのような肝細胞を使用して、肝臓の外傷、炎症または全身障害が関与するものなどの疾患、障害または状態、例えば肝臓炎症を伴う疾患、障害または状態を治療する方法が提供される。一実施形態では、本明細書で、胎盤幹細胞を、前記幹細胞が肝細胞の特徴を示すのに十分な条件下および時間で培養することを含む肝細胞を作製する方法が提供される。具体的な実施形態では、前記特徴は、アルブミンの生成またはアルブミンをコードする遺伝子の発現である。別の具体的な実施形態では、前記特徴は、尿素の生成である。別の具体的な実施形態では、前記培養は、前記幹細胞を酪酸ナトリウムと接触させることを含む。別の具体的な実施形態では、前記培養は、前記幹細胞を、アルギネート−ポリ−Ｌ−リジン中に封入することを含む。別の実施形態では、本明細書で、胎盤由来幹細胞の分化により作製される幹細胞が提供される。また、本明細書では、異常肝機能を伴う疾患、障害または状態の対象を治療する方法であって、このような肝細胞を前記対象に導入することを含む方法が提供される。より具体的な実施形態では、疾患、障害または状態は、肝硬変である。一実施形態では、疾患または状態は、例えばアルコールまたはキノコ毒素のような毒素の摂取により引き起こされた肝臓毒性に起因する。一実施形態では、疾患または状態は、例えばＡ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型またはＥ型肝炎感染などのウイルス感染である。一実施形態では、疾患または状態は、劇症または亜劇症肝炎である。別の態様では、本明細書で、化合物が肝臓毒性活性を有するかを決定する方法であって、胎盤由来幹細胞の分化により作製された肝細胞を化合物と接触させることと、化合物が肝細胞に対して毒性であるかを決定することとを含む方法が提供される。
【０００７】
別の実施形態では、胎盤幹細胞は、サイトケラチン１８に対し陽性である。別の実施形態では、本明細書で、胎盤幹細胞またはその幹細胞から分化した細胞の集団であって、その少なくとも５０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％がサイトケラチン１８に対し陽性である集団が提供される。別の実施形態では、本明細書で、胎盤幹細胞またはその幹細胞から分化した細胞を含む細胞の集団であって、胎盤幹細胞またはその幹細胞から分化した細胞の少なくとも５０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％がサイトケラチン１８に対し陽性である集団が提供される。別の実施形態では、本発明は、１つの胎盤幹細胞または胎盤幹細胞もしくはその幹細胞から分化した細胞の集団を単離する方法であって、１つのサイトケラチン１８＋胎盤幹細胞または複数のサイトケラチン１８＋胎盤幹細胞を選択することと、前記１つまたは複数の幹細胞を他の胎盤細胞から単離することとを含む方法を提供する。
【０００８】
別の態様では、本明細書で、アルギネート中に封入された複数の細胞を含む組成物であって、前記細胞が胎盤幹細胞から分化した組成物が提供される。一実施形態では、前記細胞は、胎盤幹細胞によって発現されないか、または胎盤幹細胞よりも検出可能に異なる程度で発現される肝細胞の少なくとも１つのマーカーを発現する。別の実施形態では、前記アルギネートは、ビーズの形である。具体的な実施形態では、前記ビーズは、約２００μｍ〜約８００μｍのサイズである。別の具体的な実施形態では、前記ビーズは、平均で約５００μｍのサイズである。
【０００９】
別の実施形態では、本明細書で、ヒト胎盤幹細胞由来の肝細胞または肝臓形成細胞を含むマウスであって、前記マウスは、下記ステップ：（ａ）マウスに、実質的に全ての内因性骨髄細胞を死滅させるのに十分なガンマ線を照射するステップ；（ｂ）前記マウスに、マウスの造血系を再構築するのに十分なＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス由来の骨髄細胞または骨髄由来細胞を投与するステップ；および（ｃ）前記マウスに、複数の肝細胞または肝臓形成細胞を移植するステップであって、前記肝細胞または肝臓形成細胞が、ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ１１７−、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞から分化したものである；を含む方法により作製される、マウスが提供される。一実施形態では、前記胎盤幹細胞は、さらにサイトケラチン１８＋であり、分化した肝細胞により発現される少なくとも１つの他のサイトケラチンについて陰性である。一実施形態では、前記肝細胞または肝臓形成細胞は、マウスの耳介に投与される。別の実施形態では、前記肝細胞または肝臓形成細胞は、ウイルスに感染している。具体的な実施形態では、前記ウイルスは、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、またはＥ型肝炎ウイルスである。より具体的な実施形態では、ウイルスは、Ｂ型肝炎ウイルスである。
【００１０】
別の態様では、本明細書で、マウスを対象化合物と接触させることを含む、抗ウイルス剤を同定する方法であって、前記マウスからの血清が、検出可能なレベルのウイルスを有し、前記接触が、前記対象化合物と接触していないマウスからの血清と比較して、前記マウスからの血清中の前記ウイルスの量が検出可能な程度の低減をもたらす場合に、前記化合物が抗ウイルス剤であり、マウスが、ａ．前記マウスに、実質的に全ての内因性骨髄細胞を死滅させるのに十分なガンマ線を照射するステップ；ｂ．前記マウスに、マウスの造血系を再構築するのに十分なＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスからの骨髄細胞または骨髄由来細胞を投与するステップ；および、ｃ．前記マウスに、複数のＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ１１７−、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞から分化した複数の肝細胞または肝臓形成細胞を移植するステップ；を含む方法により作製されたマウスである方法が提供される。その方法の一実施形態では、前記ウイルスは、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、またはＥ型肝炎ウイルスである。その方法の具体的な実施形態では、前記ウイルスの抗原または核酸が検出される。より具体的な実施形態では、前記ウイルスは、Ｂ型肝炎ウイルスである。ウイルス抗原が検出される方法の具体的な実施形態では、前記抗原は、ＨＢｅＡｇまたはＨＢｓＡｇである。ウイルス核酸が検出される別の具体的な実施形態では、前記核酸は、Ｂ型肝炎ウイルスの共有結合で閉環した環形状である。より具体的な実施形態では、前記核酸は、Ｂ型肝炎ウイルスの共有結合で閉環した環形状に特異的なプライマーを用いるＰＣＲにより検出される。
【００１１】
別の態様では、本明細書で、マトリックスまたはそのようなマトリックスを含む組成物であって、肝臓形成性もしくは軟骨形成性の系列、または肝細胞もしくは軟骨細胞に分化した胎盤幹細胞を含むマトリックスまたは組成物が提供される。より具体的な実施形態では、前記マトリックスは、三次元足場である。別のより具体的な実施形態では、前記マトリックスは、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、フィブロネクチン、ペクチン、オルニチンまたはビトロネクチンを含む。別のより具体的な実施形態では、前記マトリックスは、例えば電気紡糸ナノ繊維足場などのナノ繊維足場であるか、またはナノ繊維足場を含む。より具体的な実施形態では、前記ナノ繊維足場は、ポリ（Ｌ−乳酸）（ＰＬＬＡ）、Ｉ型コラーゲン、フッ化ビニリデンとトリフルオロエチレンとの共重合体（ＰＶＤＦ−ＴｒＦＥ）、ポリ（−カプロラクトン）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−ε−カプロラクトン）［Ｐ（ＬＬＡ−ＣＬ）］（例えば７５：２５）、および／またはポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシバレレート）（ＰＨＢＶ）とＩ型コラーゲンとの共重合体を含む。別のより具体的な実施形態では、前記電気紡糸ナノ繊維足場は、胎盤幹細胞の軟骨細胞または肝細胞への分化を促進する。別の具体的な実施形態では、電気紡糸されたナノ繊維マトリックスまたは足場は、軟骨細胞性細胞および／または軟骨細胞、あるいは肝細胞性細胞および／または肝細胞に分化した胎盤幹細胞を含む。別のより具体的な実施形態では、マトリックスは、羊膜または羊膜由来の生物材料である。別のより具体的な実施形態では、前記マトリックスは、細胞外膜タンパク質を含む。別のより具体的な実施形態では、前記マトリックスは、合成化合物を含む。別のより具体的な実施形態では、前記マトリックスは、生物活性化合物を含む。別のより具体的な実施形態では、前記生物活性化合物は、成長因子、サイトカイン、抗体または５０００ダルトン未満の有機分子である。
【００１２】
別の実施形態では、本明細書で、単離された接着性ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞と、電気紡糸ナノ繊維足場とを含む組成物が提供される。具体的な実施形態では、前記ナノ繊維足場は、ポリ（Ｌ−乳酸）（ＰＬＬＡ）、ポリ乳酸−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、Ｉ型コラーゲン、フッ化ビニリデンとトリフルオロエチレンとの共重合体（ＰＶＤＦ−ＴｒＦＥ）、ポリ（−カプロラクトン）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−ε−カプロラクトン）［Ｐ（ＬＬＡ−ＣＬ）］（例えば７５：２５）、および／またはポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシバレレート）（ＰＨＢＶ）とＩ型コラーゲンとの共重合体の繊維を含む。別の具体的な実施形態では、前記ナノ繊維足場は、平均で約２５０ナノメートル〜約１０μｍの厚さの繊維を含む。別の具体的な実施形態では、前記組成物は、胎盤幹細胞が軟骨形成細胞または軟骨細胞に分化する条件で接触させる。別の実施形態では、本明細書で、組成物を作製する方法であって、接着性ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞を、電気紡糸されたナノ繊維足場と接触させることを含み、前記ナノ繊維足場を、約２０ｋＶにて、約３０ｃｍの針と収集板との距離で、約０．０５ｍＬ／分〜約０．１ｍＬ／分の流速でＰＬＬＡまたはＰＬＧＡを電気紡糸することにより作製し、前記ＰＬＬＡまたはＰＬＧＡが、約１０％ｗ／ｗ〜約２０％ｗ／ｗの溶液である方法が提供される。
【００１３】
別の態様では、本明細書で、ＣＤ３４＋およびＣＤ４５−である単離胎盤幹細胞が提供される。具体的な実施形態では、前記ＣＤ３４＋、ＣＤ４５−幹細胞は、造血性である。別の具体的な実施形態では、前記ＣＤ３４＋、ＣＤ４５−幹細胞は、例えばプラスチックなどの組織培養表面で培養されたときに、非接着性である。具体的な実施形態では、本明細書で、ＣＤ３４＋およびＣＤ４５−である胎盤幹細胞の濃縮単離細胞集団が提供される。具体的な実施形態では、前記集団の少なくとも５０％、７０％、９０％または９５％の細胞が、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５−胎盤幹細胞である。別の具体的な実施形態では、単離細胞集団は、胎盤灌流液（例えば、７５０ｍＬ  ０．９％塩溶液を用いる胎盤の灌流からの灌流液）より多い割合のＣＤ３４＋およびＣＤ４５−胎盤幹細胞を含む。別の実施形態では、単離細胞集団は、ＣＤ３４＋およびＣＤ４５−でない幹細胞を含む。より具体的な実施形態では、ＣＤ３４＋およびＣＤ４５−でない前記幹細胞は、ＣＤ３４−接着性胎盤幹細胞である。より具体的な実施形態では、前記接着性胎盤幹細胞は、ＣＤ２００＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−および／またはＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、ＣＤ３４＋およびＣＤ４５−でない前記幹細胞は、骨髄由来間葉系幹細胞である。別の具体的な実施形態では、ＣＤ３４＋およびＣＤ４５＋でない前記幹細胞は、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５＋造血幹細胞である。別の具体的な実施形態では、ＣＤ３４＋およびＣＤ４５−でない前記幹細胞は、臍帯血または胎盤血内に含まれる。
【００１４】
別の具体的な実施形態では、単離細胞集団は、胎盤灌流液由来の複数の全有核細胞（ＴＮＣ）である。具体的な実施形態では、胎盤灌流液由来のＴＮＣは、少なくとも、または多くて、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０または５００ｍＬの胎盤灌流液由来の胎盤細胞を含む。別の具体的な実施形態では、胎盤灌流液由来のＴＮＣは、少なくとも１種の非赤血球を除去する処理をされている。
【００１５】
別の実施形態では、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５−造血胎盤幹細胞は、胎性（非母系性）である。別の実施形態では、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５−造血胎盤幹細胞は、母系性である。別の実施形態では、造血胎盤幹細胞の単離集団は、胎性（非母系性）であるＣＤ３４＋、ＣＤ４５−造血胎盤幹細胞を含む。別の実施形態では、造血胎盤幹細胞の単離集団は、母系性であるＣＤ３４＋、ＣＤ４５−造血胎盤幹細胞を含む。
【００１６】
別の態様では、本明細書で、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５−造血胎盤幹細胞を単離する方法が提供される。一実施形態では、本発明は、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５−胎盤幹細胞集団を単離する方法であって、胎盤細胞の集団からＣＤ３４＋細胞を選択してＣＤ３４＋胎盤細胞の単離集団を形成することと、前記ＣＤ３４＋胎盤細胞の集団からＣＤ４５＋細胞を除去することとを含み、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５−胎盤幹細胞集団が作製される方法を提供する。具体的な実施形態では、前記ＣＤ３４＋細胞の選択は、免疫分離により行われる。別の具体的な実施形態では、前記ＣＤ４５＋細胞の除去は、免疫分離により行われる。別の具体的な実施形態では、前記選択または除去は、フローサイトメトリーにより行われる。
【００１７】
別の態様では、本明細書で、細胞集団を補充する方法であって、複数のＣＤ３４＋、ＣＤ４５−造血胎盤幹細胞を添加して、補充された細胞集団が補充前よりも実質的により多くのＣＤ３４＋、ＣＤ４５−細胞を含むように、補充された細胞集団を作製することを含む方法が提供される。この関係における種々の具体的な実施形態では、「実質的により多くの」とは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または少なくとも１０％より多いことを意味する。別の具体的な実施形態では、補充される細胞集団は、臍帯血、胎盤血、末梢血またはそれらの組合せを含む。より具体的な実施形態では、補充される細胞集団は、臍帯血、胎盤血、末梢血またはそれらの組合せである。別のより具体的な実施形態では、補充される細胞集団は、臍帯血、胎盤血、末梢血またはそれらの組合せから単離された有核細胞を含む。別の具体的な実施形態では、補充される幹細胞集団は、造血幹細胞の集団、成体幹細胞の集団、または胚性幹細胞の集団を含む。
【００１８】
本明細書において、用語「ＳＨ２」は、マーカーＣＤ１０５上のエピトープに結合する抗体のことをいう。よって、ＳＨ２＋と呼ばれる細胞は、ＣＤ１０５＋である。
【００１９】
本明細書において、用語「ＳＨ３」および「ＳＨ４」は、マーカーＣＤ７３上に存在するエピトープに結合する抗体のことをいう。よって、ＳＨ３＋および／またはＳＨ４＋と呼ばれる細胞は、ＣＤ７３＋である。
【００２０】
本明細書において、用語「単離幹細胞」は、幹細胞が由来する例えば胎盤などの組織の他の非幹細胞から実質的に分離された幹細胞を意味する。幹細胞は、幹細胞が天然に結合している非幹細胞または異なるマーカープロファイルを示す幹細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または少なくとも９９％が、例えば幹細胞の回収および／または培養の間に幹細胞から除去されると、「単離され」ている。
【００２１】
本明細書において、用語「単離細胞集団」は、細胞集団が由来する例えば胎盤などの組織の他の細胞から実質的に分離された細胞の集団を意味する。幹細胞は、細胞集団、または細胞集団が由来する細胞が天然に結合している細胞、すなわち異なるマーカープロファイルを示す幹細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または少なくとも９９％が、例えば幹細胞の回収および／または培養の間に幹細胞から除去されると、「単離され」ている。
【００２２】
本明細書において、用語「胎盤幹細胞」は、形態、細胞表面マーカーまたは初代培養後の継代数に関係なく、哺乳動物の胎盤に由来する幹細胞または始原細胞、例えば多分化能細胞のことをいう。しかし、本明細書における用語「胎盤幹細胞」は、トロホブラスト、トロホブラスト細胞層、胚性生殖細胞または胚性幹細胞のことではない。細胞が、幹細胞としての少なくとも１つの属性、例えば１種または複数種の肝細胞に関連するマーカーまたは遺伝子発現プロファイル；培養において少なくとも１０〜４０回複製する能力；多分化能、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはその両方のいずれかにおいて、３つの胚葉の１つまたは複数の細胞に分化する能力；成体（すなわち分化した）細胞の特徴の欠如などを保持する場合、その細胞は「幹細胞」であるとみなされる。用語「胎盤幹細胞」および「胎盤由来幹細胞」は、交換可能に用いてよい。本明細書中で別段に特定しない限り、用語「胎盤（の）」は、臍帯を含む。本明細書に開示される接着性胎盤幹細胞は、特定の実施形態において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで多分化性（つまり、細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化条件下で分化する）、ｉｎ  ｖｉｖｏで多分化性（つまり、細胞がｉｎ  ｖｉｖｏで分化する）、またはその両方である。
【００２３】
本明細書において、幹細胞は、あるマーカーがバックグラウンドを超えて検出可能である場合、その特定のマーカーについて「陽性」である。例えば、胎盤幹細胞は、例えばＣＤ７３陽性である。なぜなら、ＣＤ７３が、胎盤幹細胞上で、例えばフローサイトメトリーにより、バックグラウンドよりも検出可能な程度に大きい量で（例えば同一型の対照に比較して）検出可能だからである。細胞は、また、あるマーカーを、その細胞を少なくとも１種のその他の細胞から区別するために用いうるか、または細胞に存在するかもしくは発現されている場合にその細胞を選択または単離するために用いうる場合に、そのマーカーについて陽性である。例えば抗体により媒介される検出の関係において、特定の細胞表面マーカーが存在する指標としての「陽性」は、該マーカーに特異的な抗体、例えば蛍光標識抗体を用いて該マーカーが検出可能であることを意味する。「陽性」は、また、細胞が、バックグラウンドを超えて検出可能なシグナルを例えばサイトメーターにおいて生成する量で、そのマーカーを有することを意味する。例えば、細胞がＣＤ２００に特異的な抗体で検出可能な程度に標識され、抗体からのシグナルが対照（例えばバックグラウンド）よりも検出可能な程度に高い場合、その細胞は「ＣＤ２００＋」である。逆に、同様の関係において「陰性」は、細胞表面マーカーが、バックグラウンドに比較して、そのマーカーに特異的な抗体を用いて検出できないことを意味する。例えば、細胞がＣＤ３４に特異的な抗体で検出可能な程度に標識されない場合、その細胞は「ＣＤ３４−」である。本明細書中で別段に特定しない限り、分化のクラスター（「ＣＤ」）マーカーは、抗体を用いて検出される。ＯＣＴ−４は、存在が決定され、ＯＣＴ−４がＲＴ−ＰＣＲを用いて検出可能であれば、細胞は「ＯＣＴ−４＋」である。
【００２４】
本明細書において、胎盤幹細胞、例えば接着性胎盤幹細胞またはＣＤ３４＋、ＣＤ４５−幹細胞を「単離する」とは、インタクトな哺乳動物の胎盤において幹細胞が通常結合している細胞の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％が除去されることを意味する。器官からの幹細胞は、インタクトな器官において幹細胞が通常結合している細胞の５０％未満を含む細胞の集団内に該幹細胞が存在する場合に、「単離され」ている。細胞マーカーに関連する場合の「Ｄｉｍ」は、マーカーが、バックグラウンドを超えるが、バックグラウンドの約５％〜約１０％以内で検出可能な程度に存在することを示す。
【００２５】
本明細書において、「肝細胞」は、この用語が通常理解されることと同様に、視覚的、生化学的および／または遺伝子発現パターンにより肝細胞であるように見える細胞を意味する。本明細書において、胎盤幹細胞または臍帯幹細胞から分化した細胞について言及する「肝臓形成細胞」は、終末分化した肝細胞の１つまたは複数の特徴を示す細胞であって、その特徴が、肝細胞または肝臓形成細胞に分化する前に（例えば、拡大培養における胎盤幹細胞または臍帯幹細胞）、胎盤幹細胞もしくは臍帯幹細胞では見出されないか、または胎盤幹細胞もしくは臍帯幹細胞において同レベルで見出されない（例えば、その特徴について等しい条件下でアッセイした胎盤幹細胞または臍帯幹細胞に比較して、肝臓形成細胞において検出可能な程度に高いかまたは低い）細胞である。つまり、本出願の種々の組成物、方法およびその他の実施形態は、肝細胞に完全にまたは部分的に分化した胎盤幹細胞に由来する細胞も包含する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】灌流（Ａ）から、羊膜（Ｂ）から、絨毛膜（Ｃ）から、もしくは羊膜−絨毛膜板（Ｄ）から得た胎盤幹細胞、または臍帯幹細胞（Ｅ）の生存率を示す図である。Ｘ軸上の数字は幹細胞を得た胎盤を示している。
【図２】ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒにより決定された、灌流（Ａ）から、羊膜（Ｂ）から、絨毛膜（Ｃ）から、もしくは羊膜−絨毛膜板（Ｄ）から得たＨＬＡ  ＡＢＣ−／ＣＤ４５−／ＣＤ３４−／ＣＤ１３３＋細胞、または臍帯幹細胞（Ｅ）のパーセントを示す図である。Ｘ軸上の数字は幹細胞を得た胎盤を示している。
【図３】ＦＡＣＳ  Ａｒｉａにより決定した、灌流（Ａ）から、羊膜（Ｂ）から、絨毛膜（Ｃ）から、もしくは羊膜−絨毛膜板（Ｄ）から得たＨＬＡ  ＡＢＣ−／ＣＤ４５−／ＣＤ３４−／ＣＤ１３３＋細胞、または臍帯幹細胞（Ｅ）のパーセントを示す図である。Ｘ軸上の数字は幹細胞を得た胎盤を示している。
【図４】胎盤灌流液に由来する幹細胞における、ＨＬＡ−Ｇ、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１１７、ＣＤ２００の発現を示す図である。
【図５】羊膜に由来する幹細胞における、ＨＬＡ−Ｇ、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１１７、ＣＤ２００の発現を示す図である。
【図６】絨毛膜に由来する幹細胞における、ＨＬＡ−Ｇ、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１１７、ＣＤ２００の発現を示す図である。
【図７】羊膜−絨毛膜板に由来する幹細胞における、ＨＬＡ−Ｇ、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１１７、ＣＤ２００の発現を示す図である。
【図８】臍帯に由来する幹細胞における、ＨＬＡ−Ｇ、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１１７、ＣＤ２００の発現を示す図である。
【図９】灌流（Ａ）、羊膜（Ｂ）、絨毛膜（Ｃ）、羊膜−絨毛膜板（Ｄ）、または臍帯（Ｅ）に由来する幹細胞における、ＨＬＡ−Ｇ、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１１７、ＣＤ２００の発現の平均を示す図である。
【図１０】６つのマッチしたヒト胎盤灌流液単位および臍帯単位から得た全細胞の平均パーセンテージを示す図である。Ｘ軸は、Ｙ軸に示した表現型の全有核細胞のパーセント細胞を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
５．１  肝細胞の作製
以下の項および考察において、種々の組成物および方法の多くを、肝細胞系列まで分化した、または分化させた胎盤幹細胞もしくは臍帯幹細胞に対してまたはそれらを用いて行うことができることが、当業者に理解されるだろう。
【００２８】
一態様では、本明細書で、胎盤由来細胞、特に胎盤幹細胞または臍帯幹細胞からの肝細胞および／または肝臓形成細胞の作製のための方法および組成物が提供される。本明細書において、「胎盤幹細胞」または「臍帯幹細胞」は、別段に特定しない限り、接着性幹細胞を意味する。幹細胞は、灌流により、哺乳動物の胎盤または臍帯から得ることができる（例えば、本明細書にその全体が参照により組み込まれるＨａｒｉｒｉ、米国特許第７，０４５，１４８号および第７，２５５，８７９号を参照されたい。幹細胞は、胎盤またはその一部分の破壊（例えば浸解）により、胎盤または臍帯から得ることができる（例えば、以下の第６．２項を参照されたい）。肝細胞の特徴を示す細胞、例えば、肝細胞および／または肝臓形成細胞は、胎盤幹細胞から得ることができる。これらの細胞は、例えば、それだけに限られないが、アルコール摂取、例えばＡｍａｎｉｔａ属のキノコで見出されるような肝臓毒素の摂取により引き起こされるか、または例えばＡ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型もしくはＥ型肝炎感染などのウイルス感染に引き起こされる硬変を含む肝硬変を伴う疾患、障害または状態の治療に有用である。
【００２９】
一実施形態では、幹細胞のような分化可能な細胞は、以下のようにして胎盤または臍帯から得ることができる。単核細胞（ＭＮＣ）の初代培養物を、胎盤から、例えばヒト胎盤灌流液または物理的および／または酵素的に破壊した胎盤組織から単離する。胎盤は、ドナーのインフォームドコンセントの下で、臨月での幼児の誕生の後に得られる。簡単に、灌流のために、臍血管にカニューレを挿入し、次いで、流速を制御した循環に連結し、胎盤を、例えば１ｍＬ／分（室温、２４時間まで）にて、多量のグルコース、１％ヘパリンおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を用いて灌流する。次いで、胎盤灌流液（７５０ｍＬ）を貯留し、遠心分離し、細胞の沈澱物を、１％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）含有ＰＢＳに再懸濁し、次いで、ＬＹＭＰＨＯＰＲＥＰ（商標）（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を通して密度勾配分画遠心により分離する。接着性胎盤幹細胞を含む単核細胞を含有するバフィコート界面を回収し、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳに再懸濁し、フィブロネクチン被覆（Ｓｉｇｍａ）Ｆａｌｃｏｎプレートに播種し、３７℃にて、５％湿潤ＣＯ２を用いてインキュベートする。２４時間のインキュベーションの後に、非接着性細胞を破棄し、接着性細胞を、新鮮な培地中で維持して増殖させる。個別の細胞コロニーは１０〜１８日で出現し、胎盤幹細胞系列として増殖される。
【００３０】
ヒト接着性胎盤幹細胞は、培養において線維芽細胞様の形態を示し、ＨＬＡクラスＩ陽性である。ＦＡＣＳ分析を用いて、これらの細胞は、造血マーカーであるＣＤ３４もＣＤ４５も発現しない。しかし、これらは、多分化能細胞マーカーであるＣＤ１０（ＣＡＬＬＡ）、ＣＤ２９（β１インテグリン）、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）、ＣＤ９０（Ｔｈｙ−１）ならびにＳＨ２（ＣＤ１０５）、ＳＨ３（ＣＤ７３）およびＣＤ２００を発現する。標準的な増殖条件下では、胎盤幹細胞の倍加時間は、約１８〜３６時間であり、細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの４０回を超える集団倍加についてこの表現型を維持する。ヒト接着性胎盤幹細胞は、ヒト胚性幹細胞または胚性生殖細胞とは、ヒト胚性幹細胞または生殖細胞が、胎盤ではなく胞胚または胎児生殖腺の内部の細胞塊からしか得られないことにおいて、区別可能である。また、ヒト接着性胎盤幹細胞は、例えば骨髄、臍帯血もしくは末梢血からの間葉系幹細胞、または骨髄由来幹細胞とは、培養において胎盤幹細胞が胚様体を形成するのに対し、間葉系幹細胞または骨髄由来幹細胞は形成せず、胎盤幹細胞が、間葉系幹細胞に比較して、独特の遺伝子発現パターンを示すことにより、区別可能である。例えば、その開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる２００６年１２月２８日に出願された米国特許出願第１１／６４８，８１３号を参照されたい。
【００３１】
胎盤幹細胞は、酪酸ナトリウムを含む培地中で培養することにより、または細胞を適切なマイクロカプセルポリマー、例えばアルギネート−ポリ−Ｌ−リジンに封入することにより肝細胞に分化しうる。肝細胞は、上記に記載のように胎盤由来幹細胞から作製でき、以下に記載するように維持または培養できる。肝細胞分化は、フローサイトメトリーを用い、以下に記載するように特定の遺伝子発現または酵素活性をモニターすることにより評価できる。
【００３２】
５．２  胎盤幹細胞および胎盤幹細胞集団
一態様では、本明細書で提供される方法は、（１）組織培養基質に接着し、（２）１種または複数種の非胎盤細胞、および／または組織特異的細胞の特徴を有する細胞に、適切な分化条件下で分化する接着性胎盤幹細胞、つまり、胎盤またはその部分、例えば羊膜、絨毛膜、羊膜／絨毛膜板、臍帯などから得ることができる幹細胞を使用する。胎盤幹細胞は、血液、例えば胎盤血もしくは臍帯血、または骨髄に由来せず、それらから導くこともできない。
【００３３】
胎盤幹細胞は、胎児または母系由来のものでありうる（つまり、母系または胎児の遺伝子型のいずれかを有しうる）。胎盤幹細胞の集団、または胎盤幹細胞を含む細胞の集団は、胎児または母系のみに由来するものである胎盤幹細胞を含みうるか、あるいは胎児と母系の両方に由来する胎盤幹細胞の混合集団を含みうる。胎盤幹細胞、および胎盤幹細胞を含む細胞の集団は、以下で論じる形態、マーカーおよび培養の特徴により同定して選択できる。
【００３４】
５．２．１  物理的および形態学的特徴
本明細書に開示される方法において使用される胎盤幹細胞は、初代培養または細胞培養において培養する場合、組織培養基質、例えば組織培養容器表面（例えば組織培養プラスチック）に接着する。例えば組織培養表面上の培養中の胎盤幹細胞は、全般的に線維芽細胞様の外観を呈し、細胞の中心体からいくつかの細胞質内突起が延伸する。しかし、胎盤幹細胞は、同じ条件下で培養される線維芽細胞とは形態的に区別可能である。なぜなら、胎盤幹細胞は、線維芽細胞よりも多数のそのような突起を示すからである。形態学的に、胎盤幹細胞は、一般的により丸いまたは丸石の形態を培養において呈し、造血幹細胞からも区別可能である。
【００３５】
５．２．２  細胞表面の分子および遺伝子マーカー
本明細書に記載される方法および組成物において有用な接着性胎盤幹細胞、および接着性胎盤幹細胞集団は、幹細胞もしくは幹細胞を含む細胞集団を同定および／または単離するために用いうる複数のマーカーを発現する。本明細書に記載される胎盤幹細胞、および幹細胞集団（つまり、２つ以上の胎盤幹細胞）は、胎盤またはその任意の部分（例えば羊膜、絨毛膜、胎盤絨毛叢、臍帯など）から直接得られる幹細胞および幹細胞含有細胞集団を含む。胎盤幹細胞集団は、培養における胎盤幹細胞の集団（つまり、２つ以上）、および例えばバッグなどの容器内の集団も含む。しかし、胎盤幹細胞は、トロホブラストではない。
【００３６】
本明細書に記載される胎盤幹細胞は、３つの胚葉を代表する細胞、例えば脂肪細胞性細胞、軟骨細胞性細胞、肝臓細胞、神経原性細胞、心臓細胞などにｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化できる点において、多分化性である。しかし、本明細書に記載される胎盤幹細胞は、多分化性であるとみなされるか、または有用であるために、ｉｎ  ｖｉｖｏで分化する必要はない。よって、用語「胎盤幹細胞」は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化するが、ｉｎ  ｖｉｖｏで分化しない、またはｉｎ  ｖｉｖｏで分化するがｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化しない、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で分化する、本明細書に記載される細胞を包含する。一実施形態では、本明細書で提供される胎盤幹細胞は、３つの胚葉の１つまたは複数を代表する細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化できるが、ｉｎ  ｖｉｖｏ、例えばＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにおいて分化しない。
【００３７】
接着性（非造血性）胎盤幹細胞は、一般に、マーカーＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ２００、ＨＬＡ−Ｇおよび／またはＯＣＴ−４を発現し、ＣＤ３４、ＣＤ３８またはＣＤ４５を発現しない。胎盤幹細胞は、ＨＬＡ−ＡＢＣ（ＭＨＣ−１）も発現できるが、一般に、ＨＬＡ−ＤＲを発現しない。具体的な実施形態では、接着性胎盤幹細胞は、ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋およびＣＤ２００＋である。これらのマーカーを使用して、胎盤幹細胞を同定し、胎盤幹細胞を他の種類の幹細胞から区別することができる。胎盤幹細胞はＣＤ７３およびＣＤ１０５を発現できるので、これらは、間葉系幹細胞様の特徴を有しうる。しかし、胎盤幹細胞は、ＣＤ２００および胎児特異的マーカーであるＨＬＡ−Ｇを発現できるので、これらは、ＣＤ２００もＨＬＡ−Ｇも発現しない例えば骨髄由来間葉系幹細胞などの間葉系幹細胞から区別できる。同様に、ＣＤ３４、ＣＤ３８および／またはＣＤ４５の発現の欠如から、胎盤幹細胞が、非造血幹細胞として同定される。このような胎盤幹細胞、およびそのような胎盤幹細胞を含む細胞集団は、肝細胞、肝臓形成細胞、肝細胞の集団、肝臓形成細胞の集団、およびそれらの組合せに分化できる。
【００３８】
一実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物は、ＣＤ２００＋およびＨＬＡ−Ｇ＋である単離胎盤幹細胞を使用する。具体的な実施形態では、前記幹細胞は、ＣＤ７３＋およびＣＤ１０５＋でもある。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−またはＣＤ４５−でもある。より具体的な実施形態では、前記幹細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＣＤ７３＋およびＣＤ１０５＋でもある。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞は、例えば、少なくとも１回、少なくとも３回、少なくとも５回、少なくとも１０回、少なくとも１５回、または少なくとも２０回の継代で増殖されている。
【００３９】
別の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物は、ＣＤ２００＋、ＨＬＡ−Ｇ＋である複数の胎盤幹細胞を含む単離細胞集団を使用する。様々な実施形態では、前記集団中の前記胎盤幹細胞の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％が、前記ＣＤ２００＋、ＨＬＡ−Ｇ＋幹細胞である。単離集団の具体的な実施形態では、前記幹細胞は、ＣＤ７３＋およびＣＤ１０５＋でもある。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−またはＣＤ４５−でもある。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＣＤ７３＋およびＣＤ１０５＋でもある。別の実施形態では、前記単離集団は、胚様体の形成を可能にする条件下で培養したときに、１つまたは複数の胚様体を形成する。別の実施形態では、前記集団は、例えば、少なくとも１回、少なくとも３回、少なくとも５回、少なくとも１０回、少なくとも１５回、または少なくとも２０回の継代で増殖されている。
【００４０】
別の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物は、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋である単離胎盤幹細胞を使用する。前記集団の具体的な実施形態では、前記幹細胞は、ＨＬＡ−Ｇ＋でもある。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−またはＣＤ４５−でもある。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−およびＣＤ４５−でもある。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、およびＨＬＡ−Ｇ＋でもある。別の実施形態では、前記幹細胞は、例えば、少なくとも１回、少なくとも３回、少なくとも５回、少なくとも１０回、少なくとも１５回、または少なくとも２０回の継代で増殖されている。
【００４１】
別の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物は、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋である複数の胎盤幹細胞を含む単離細胞集団を使用する。様々な実施形態では、前記集団中の前記胎盤幹細胞の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％が、前記ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋細胞である。前記集団の具体的な実施形態では、前記幹細胞は、ＨＬＡ−Ｇ＋である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−またはＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−およびＣＤ４５−である。より具体的な実施形態では、前記幹細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、およびＨＬＡ−Ｇ＋である。別の具体的な実施形態では、前記細胞集団は、胚様体の形成を可能にする条件下で培養したときに、１つまたは複数の胚様体を形成する。別の具体的な実施形態では、前記集団は、例えば、少なくとも１回、少なくとも３回、少なくとも５回、少なくとも１０回、少なくとも１５回、または少なくとも２０回の継代で増殖されている。
【００４２】
別の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物は、ＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋である単離胎盤幹細胞を使用する。具体的な実施形態では、前記幹細胞は、ＣＤ７３＋およびＣＤ１０５＋でもある。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞は、ＨＬＡ−Ｇ＋でもある。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−およびＣＤ４５−でもある。より具体的な実施形態では、前記幹細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋およびＨＬＡ−Ｇ＋でもある。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞は、例えば、少なくとも１回、少なくとも３回、少なくとも５回、少なくとも１０回、少なくとも１５回、または少なくとも２０回の継代で増殖させている。
【００４３】
別の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物は、ＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋である複数の胎盤幹細胞を含む単離細胞集団を使用する。様々な実施形態では、前記集団中の前記胎盤幹細胞の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％が、前記ＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋細胞である。具体的な実施形態では、前記幹細胞は、ＣＤ７３＋およびＣＤ１０５＋である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞は、ＨＬＡ−Ｇ＋である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−およびＣＤ４５−である。より具体的な実施形態では、前記幹細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋およびＨＬＡ−Ｇ＋である。別の具体的な実施形態では、集団は、胚様体の形成を可能にする条件下で培養したときに、１つまたは複数の胚様体を形成する。別の具体的な実施形態では、前記集団は、例えば、少なくとも１回、少なくとも３回、少なくとも５回、少なくとも１０回、少なくとも１５回、または少なくとも２０回の継代で増殖させている。
【００４４】
別の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物は、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋およびＨＬＡ−Ｇ＋である単離胎盤幹細胞を使用する。前記複数の具体的な実施形態では、前記幹細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−またはＣＤ４５−でもある。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−およびＣＤ４５−でもある。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞は、ＯＣＴ−４＋でもある。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞は、ＣＤ２００＋でもある。より具体的な実施形態では、前記幹細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＯＣＴ−４＋およびＣＤ２００＋でもある。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞は、例えば、少なくとも１回、少なくとも３回、少なくとも５回、少なくとも１０回、少なくとも１５回、または少なくとも２０回の継代で増殖させ    ている。
【００４５】
別の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物は、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋およびＨＬＡ−Ｇ＋である複数の胎盤幹細胞を含む単離細胞集団を使用する。様々な実施形態では、前記集団中の前記胎盤幹細胞の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％が、前記ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋およびＨＬＡ−Ｇ＋細胞である。前記複数の具体的な実施形態では、前記幹細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−またはＣＤ４５−でもある。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−およびＣＤ４５−でもある。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞は、ＯＣＴ−４＋でもある。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞は、ＣＤ２００＋でもある。より具体的な実施形態では、前記幹細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＯＣＴ−４＋およびＣＤ２００＋でもある。別の具体的な実施形態では、前記集団は、例えば、少なくとも１回、少なくとも３回、少なくとも５回、少なくとも１０回、少なくとも１５回、または少なくとも２０回の継代で増殖されている。
【００４６】
別の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物は、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋幹細胞である複数の胎盤幹細胞を含む単離細胞集団であって、前記複数の細胞が、胚様体の形成を可能にする条件下で、１つまたは複数の胚様体を形成する集団を使用する。様々な実施形態では、前記集団中の前記胎盤幹細胞の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％が、前記ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋幹細胞である。具体的な実施形態では、前記幹細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−またはＣＤ４５−でもある。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−およびＣＤ４５−でもある。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞は、ＯＣＴ−４＋でもある。より具体的な実施形態では、前記幹細胞は、ＯＣＴ−４＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−およびＣＤ４５−でもある。別の具体的な実施形態では、前記集団は、例えば、少なくとも１回、少なくとも３回、少なくとも５回、少なくとも１０回、少なくとも１５回、または少なくとも２０回の継代で増殖させている。
【００４７】
別の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物は、ＯＣＴ−４＋幹細胞である複数の胎盤幹細胞を含む単離細胞集団であって、前記複数の細胞が、胚様体の形成を可能にする条件下で培養したときに、１つまたは複数の胚様体を形成する集団を使用する。様々な実施形態では、前記集団中の前記胎盤細胞の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％が、前記ＯＣＴ４＋幹細胞である。前記集団の具体的な実施形態では、前記幹細胞は、ＣＤ７３＋およびＣＤ１０５＋である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−またはＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞は、ＣＤ２００＋である。より具体的な実施形態では、前記幹細胞は、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−およびＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、前記集団は、例えば、少なくとも１回、少なくとも３回、少なくとも５回、少なくとも１０回、少なくとも１５回、または少なくとも２０回の継代で増殖されている。
【００４８】
別の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物は、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ７３＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋、ＣＤ３４−およびＣＤ１３３−である１つの単離胎盤幹細胞、または複数の胎盤幹細胞を含む細胞集団を使用する。
【００４９】
別の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物は、ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋およびＣＤ２００＋である単離胎盤幹細胞を使用する。さらに、本明細書では、細胞、例えば胎盤幹細胞の単離集団であって、前記胎盤幹細胞の少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％がＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋およびＣＤ２００＋である集団が提供される。上記の実施形態の具体的な実施形態では、前記幹細胞は、さらに、ＣＤ９０＋およびＣＤ４５−である。具体的な実施形態では、前記幹細胞または胎盤幹細胞の集団は、幹細胞でない胎盤細胞から単離されている。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞または胎盤幹細胞の集団は、これらの特徴を示さない胎盤幹細胞から単離されている。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤幹細胞は非母系由来のものである。別の具体的な実施形態では、前記胎盤幹細胞の単離集団中の前記細胞の少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％が非母系由来のものである。
【００５０】
別の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物は、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ−、ＣＤ４５−、ＣＤ１３３−およびＣＤ３４−である単離胎盤幹細胞を使用する。さらに、本明細書では、胎盤幹細胞の単離集団の使用であって、前記胎盤幹細胞の少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％がＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ−、ＣＤ４５−、ＣＤ１３３−およびＣＤ３４−である使用が提供される。具体的な実施形態では、前記幹細胞または胎盤幹細胞の集団は、幹細胞でない胎盤細胞から単離されている。別の具体的な実施形態では、前記胎盤幹細胞の集団は、これらの特徴を示さない胎盤幹細胞から単離されている。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤幹細胞は非母系由来のものである。別の具体的な実施形態では、前記胎盤幹細胞の単離集団中の前記細胞の少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％が非母系由来のものである。別の実施形態では、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ−、ＣＤ４５−、ＣＤ１３３−およびＣＤ３４−胎盤幹細胞は、胎盤灌流液から単離された幹細胞である。別の実施形態では、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ−、ＣＤ４５−、ＣＤ１３３−およびＣＤ３４−胎盤幹細胞は、胎盤組織の物理的および／または酵素的な破壊により単離された幹細胞である。
【００５１】
別の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物は、ＣＤ１０＋、ＣＤ１３＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ４５−、ＣＤ１１７−およびＣＤ１３３−である単離胎盤幹細胞を使用する。さらに、本明細書では、胎盤幹細胞の単離集団であって、前記胎盤幹細胞の少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％がＣＤ１０＋、ＣＤ１３＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ４５−、ＣＤ１１７−およびＣＤ１３３−である集団が提供される。具体的な実施形態では、前記幹細胞または胎盤幹細胞の集団は、幹細胞でない胎盤細胞から単離されている。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤幹細胞は非母系由来のものである。別の具体的な実施形態では、前記胎盤幹細胞の単離集団中の前記細胞の少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％が非母系由来のものである。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞または胎盤幹細胞の集団は、これらの特徴を示さない胎盤幹細胞から単離されている。別の実施形態では、本明細書で、ＣＤ１０＋、ＣＤ１３＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ４５−、ＣＤ１１７−およびＣＤ１３３−である胎盤幹細胞を得る方法であって、前記細胞を胎盤灌流液から単離することを含む方法が提供される。別の実施形態では、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ−、ＣＤ４５−、ＣＤ１３３−およびＣＤ３４−胎盤幹細胞は、胎盤組織の物理的および／または酵素的な破壊により単離された幹細胞である。
【００５２】
別の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物は、ＣＤ１０−、ＣＤ３３−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−およびＣＤ１１７−である単離胎盤幹細胞を使用する。さらに、本明細書では、胎盤幹細胞の単離集団であって、前記胎盤幹細胞の少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％がＣＤ１０−、ＣＤ３３−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−およびＣＤ１１７−である集団が提供される。具体的な実施形態では、前記幹細胞または胎盤幹細胞の集団は、幹細胞でない胎盤細胞から単離されている。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤幹細胞は非母系由来のものである。別の具体的な実施形態では、前記胎盤幹細胞の単離集団中の前記細胞の少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％が非母系由来のものである。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞または胎盤幹細胞の集団は、これらの特徴を示さない胎盤幹細胞から単離されている。別の実施形態では、本明細書で、ＣＤ１０−、ＣＤ３３−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ１１７−である胎盤幹細胞を得る方法であって、前記細胞を胎盤灌流液から単離することを含む方法が提供される。別の実施形態では、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ−、ＣＤ４５−、ＣＤ１３３−およびＣＤ３４−胎盤幹細胞は、胎盤組織の物理的および／または酵素的な破壊により単離された幹細胞である。
【００５３】
別の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物は、ＣＤ１０−、ＣＤ１３−、ＣＤ３３−、ＣＤ４５−およびＣＤ１１７−である単離胎盤幹細胞を使用する。さらに、本明細書では、胎盤幹細胞の単離集団であって、前記胎盤幹細胞の少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％がＣＤ１０−、ＣＤ１３−、ＣＤ３３−、ＣＤ４５−およびＣＤ１１７−である集団が提供される。具体的な実施形態では、前記幹細胞または胎盤幹細胞の集団は、幹細胞でない胎盤細胞から単離されている。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤幹細胞は非母系由来のものである。別の具体的な実施形態では、前記胎盤幹細胞の単離集団中の前記細胞の少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％が非母系由来のものである。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞または胎盤幹細胞の集団は、これらの特徴を示さない胎盤幹細胞から単離されている。別の実施形態では、本明細書で、ＣＤ１０−、ＣＤ１３−、ＣＤ３３−、ＣＤ４５−およびＣＤ１１７−である胎盤幹細胞を得る方法であって、前記細胞を胎盤灌流液から単離することを含む方法が提供される。別の実施形態では、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ−、ＣＤ４５−、ＣＤ１３３−およびＣＤ３４−胎盤幹細胞は、胎盤組織の物理的および／または酵素的な破壊により単離された幹細胞である。
【００５４】
別の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物は、ＨＬＡ  Ａ，Ｂ，Ｃ−、ＣＤ４５−、ＣＤ３４−、ＣＤ１３３−であり、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ２００および／またはＨＬＡ−Ｇについて陽性であり、および／またはＣＤ１１７について陰性である単離胎盤幹細胞を使用する。別の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物において使用される胎盤幹細胞の単離集団は、ＨＬＡ  Ａ，Ｂ，Ｃ−、ＣＤ４５−、ＣＤ３４−、ＣＤ１３３−であり、集団中の幹細胞の少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または約９９％が、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ２００および／またはＨＬＡ−Ｇについて陽性であり、および／またはＣＤ１１７について陰性である。具体的な実施形態では、前記幹細胞または胎盤幹細胞の集団は、幹細胞でない胎盤細胞から単離されている。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤幹細胞は非母系由来のものである。別の具体的な実施形態では、前記胎盤幹細胞の単離集団中の前記細胞の少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％が非母系由来のものである。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞または胎盤幹細胞の集団は、これらの特徴を示さない胎盤幹細胞から単離されている。別の実施形態では、本明細書で、ＨＬＡ  Ａ，Ｂ，Ｃ−、ＣＤ４５−、ＣＤ３４−、ＣＤ１３３−であり、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ２００および／またはＨＬＡ−Ｇについて陽性であり、および／またはＣＤ１１７について陰性である胎盤幹細胞を得る方法であって、前記細胞を胎盤灌流液から単離することを含む方法が提供される。
【００５５】
別の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物は、抗体結合により決定されるようにＣＤ２００＋およびＣＤ１０＋、および抗体結合およびＲＴ−ＰＣＲの両方により決定されるようにＣＤ１１７−である胎盤幹細胞、またはそのような細胞の集団、またはそのような単離胎盤幹細胞を含む細胞の集団を使用する。別の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物は、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９−、ＣＤ５４＋、ＣＤ２００＋、ＨＬＡ−Ｇ＋、ＨＬＡクラスＩ−およびβ−２−ミクログロブリン−である胎盤幹細胞を使用する。別の実施形態では、本明細書で、胎盤幹細胞であって、少なくとも１つのマーカーの発現が、間葉系幹細胞（例えば骨髄由来間葉系幹細胞）についてよりも少なくとも２倍高い胎盤幹細胞が提供される。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤幹細胞は非母系由来のものである。別の具体的な実施形態では、前記胎盤幹細胞の単離集団中の前記細胞の少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％が非母系由来のものである。
【００５６】
別の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物において使用される胎盤幹細胞は、サイトケラチン１８について陽性である。別の実施形態では、本明細書で、胎盤幹細胞またはその幹細胞から分化した細胞の集団であって、その少なくとも５０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％がサイトケラチン１８について陽性である集団が提供される。別の実施形態では、本明細書で、胎盤幹細胞またはその幹細胞から分化した細胞を含む細胞の集団であって、胎盤幹細胞またはその幹細胞から分化した細胞の少なくとも５０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％がサイトケラチン１８について陽性である集団が提供される。別の実施形態では、本発明は、１つの胎盤幹細胞、または胎盤幹細胞もしくはその幹細胞から分化した細胞の集団を単離する方法であって、１つのサイトケラチン１８＋胎盤幹細胞、または複数のサイトケラチン１８＋胎盤幹細胞を選択することと、前記１つの幹細胞または複数の幹細胞を他の胎盤細胞から単離することとを含む方法を提供する。
【００５７】
別の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物は、胎盤幹細胞の単離集団であって、前記複数の胎盤幹細胞が、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性アッセイにより評価されるように、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）について陽性である集団を使用する。このようなアッセイは、当技術分野において知られている（例えば、ＢｏｓｔｉａｎおよびＢｅｔｔｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、１７３、７８７、（１９７８）を参照されたい）。具体的な実施形態では、前記ＡＬＤＨアッセイは、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ（登録商標）（Ａｌｄａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ａｓｈｌａｎｄ、Ｏｒｅｇｏｎ）を、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性のマーカーとして用いる。別の具体的な実施形態では、前記複数の細胞は、前記細胞集団中の細胞の約３％〜約２５％である。別の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物は、胎盤幹細胞の集団を用い、前記複数の胎盤幹細胞が、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の指標としてＡＬＤＥＦＬＵＯＲ（登録商標）を使用するアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性アッセイにより評価されるように、アルデヒドデヒドロゲナーゼについて陽性である。具体的な実施形態では、前記複数とは、前記細胞集団中の細胞の約３％〜約２５％である。別の実施形態では、胎盤幹細胞または臍帯幹細胞の前記集団は、細胞数が同じでかつ同じ条件下で培養された骨髄由来間葉系幹細胞の集団よりも、少なくとも３倍、または少なくとも５倍高いＡＬＤＨ活性を示す。
【００５８】
上記に挙げた胎盤幹細胞の具体的な実施形態では、胎盤幹細胞は、ＩＬ−６、ＩＬ−８および単球走化性タンパク質（ＭＣＰ−Ｉ）を恒常的に分泌する。
【００５９】
上記で言及した各胎盤幹細胞、または複数の胎盤幹細胞は、哺乳動物の胎盤から直接得られ、単離胎盤幹細胞、または、少なくとも１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１２回、１４回、１６回、１８回、２０回、２５回、３０回、３５回、４０回もしくはそれより多く培養し継代された胎盤幹細胞、またはそれらの組合せを含みうる。
【００６０】
複数の胎盤幹細胞は、約１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、１×１０１１もしくはそれより多く、または少なくともこれらの数、またはこれらの数以下の胎盤幹細胞を含みうる。
【００６１】
５．２．３  胎盤幹細胞集団の選択および作製
別の実施形態では、本明細書で、肝細胞および／または肝臓形成細胞に分化しうる複数の胎盤幹細胞を複数の胎盤細胞から選択する方法であって、前記細胞の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％がＣＤ２００＋、ＨＬＡ−Ｇ＋胎盤幹細胞である胎盤細胞の集団を選択することを含む方法が提供される。具体的な実施形態では、前記選択は、ＣＤ７３＋およびＣＤ１０５＋でもある幹細胞を選択することを含む。別の具体的な実施形態では、前記選択は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−またはＣＤ４５−でもある幹細胞を選択することを含む。別の具体的な実施形態では、前記選択は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＣＤ７３＋およびＣＤ１０５＋でもある胎盤幹細胞を選択することを含む。別の具体的な実施形態では、前記選択は、胚様体の形成を可能にする条件下で培養したときに、１つまたは複数の胚様体を形成する複数の胎盤幹細胞を選択することも含む。
【００６２】
別の実施形態では、本明細書で、複数の胎盤細胞から複数の胎盤幹細胞を選択する方法であって、前記細胞の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％がＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞である複数の胎盤細胞を選択することを含む方法が提供される。具体的な実施形態では、前記選択は、ＨＬＡ−Ｇ＋でもある幹細胞を選択することを含む。別の具体的な実施形態では、前記選択は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−またはＣＤ４５−でもある胎盤幹細胞を選択することを含む。別の具体的な実施形態では、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−およびＣＤ４５−でもある胎盤幹細胞を選択することを含む。別の具体的な実施形態では、前記選択は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−およびＨＬＡ−Ｇ＋でもある胎盤幹細胞を選択することを含む。別の具体的な実施形態では、前記選択は、胚様体の形成を可能にする条件下で集団を培養したときに、１つまたは複数の胚様体を形成する胎盤細胞の集団を選択することをさらに含む。
【００６３】
別の実施形態では、本明細書で、複数の胎盤細胞から複数の胎盤幹細胞を選択する方法であって、前記細胞の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％がＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋胎盤幹細胞である複数の胎盤細胞を選択することを含む方法が提供される。具体的な実施形態では、前記選択は、ＣＤ７３＋およびＣＤ１０５＋でもある胎盤幹細胞を選択することを含む。別の具体的な実施形態では、前記選択は、ＨＬＡ−Ｇ＋でもある胎盤幹細胞を選択することを含む。別の具体的な実施形態では、前記選択は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−およびＣＤ４５−でもある胎盤幹細胞を選択することを含む。別の具体的な実施形態では、前記選択は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋およびＨＬＡ−Ｇ＋でもある胎盤幹細胞を選択することを含む。
【００６４】
別の実施形態では、本明細書で、複数の胎盤細胞から複数の胎盤幹細胞を選択する方法であって、前記細胞の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％がＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋およびＨＬＡ−Ｇ＋胎盤幹細胞である複数の胎盤細胞を選択することを含む方法が提供される。具体的な実施形態では、前記選択は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−またはＣＤ４５−でもある胎盤幹細胞を選択することを含む。別の具体的な実施形態では、前記選択は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−およびＣＤ４５−でもある胎盤幹細胞を選択することを含む。別の具体的な実施形態では、前記選択は、ＣＤ２００＋でもある胎盤幹細胞を選択することを含む。別の具体的な実施形態では、前記選択は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＯＣＴ−４＋およびＣＤ２００＋でもある胎盤幹細胞を選択することを含む。
【００６５】
別の実施形態では、本明細書で、複数の胎盤細胞から複数の胎盤幹細胞を選択する方法であって、前記細胞の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％がＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋胎盤幹細胞である複数の胎盤細胞を選択することを含み、前記複数の細胞が、胚様体の形成を可能にする条件下で、１つまたは複数の胚様体を形成する方法が提供される。具体的な実施形態では、前記選択は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−またはＣＤ４５−でもある胎盤幹細胞を選択することを含む。別の具体的な実施形態では、前記選択は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−およびＣＤ４５−でもある胎盤幹細胞を選択することを含む。別の具体的な実施形態では、前記選択は、ＯＣＴ−４＋でもある胎盤幹細胞を選択することを含む。より具体的な実施形態では、前記選択は、ＯＣＴ−４＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−およびＣＤ４５−でもある胎盤幹細胞を選択することを含む。
【００６６】
別の実施形態では、本明細書で、複数の胎盤細胞から複数の胎盤幹細胞を選択する方法であって、前記単離胎盤細胞の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％がＯＣＴ４＋幹細胞である複数の胎盤細胞を選択することを含み、前記複数の細胞が、胚様体の形成を可能にする条件下で、１つまたは複数の胚様体を形成する方法が提供される。具体的な実施形態では、前記選択は、ＣＤ７３＋およびＣＤ１０５＋でもある胎盤幹細胞を選択することを含む。別の具体的な実施形態では、前記選択は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−またはＣＤ４５−でもある胎盤幹細胞を選択することを含む。別の具体的な実施形態では、前記選択は、ＣＤ２００＋でもある胎盤幹細胞を選択することを含む。より具体的な実施形態では、前記選択は、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−およびＣＤ４５−でもある胎盤幹細胞を選択することを含む。
【００６７】
本明細書では、胎盤幹細胞の集団、または複数の胎盤幹細胞を作製する方法も提供される。このような細胞は、本明細書で提供される方法および組成物で使用することができる。例えば、本明細書では、細胞集団を作製する方法であって、上記に記載の複数の胎盤幹細胞のいずれかを選択することと、複数の胎盤幹細胞を、その他の細胞、例えばその他の胎盤細胞から単離することとを含む方法が提供される。具体的な実施形態では、本明細書で、細胞集団を作製する方法であって、胎盤細胞を選択することを含み、前記胎盤細胞が（ａ）基質に接着し、（ｂ）ＣＤ２００およびＨＬＡ−Ｇを発現し、またはＣＤ７３、ＣＤ１０５およびＣＤ２００を発現し、またはＣＤ２００およびＯＣＴ−４を発現し、またはＣＤ７３、ＣＤ１０５およびＨＬＡ−Ｇを発現し、またはＣＤ７３およびＣＤ１０５を発現し、胚様体の形成を可能にする条件下で幹細胞を含む胎盤細胞の集団を培養したときに１つもしくは複数の胚様体の形成を促進し、またはＯＣＴ−４を発現し、胚様体の形成を可能にする条件下で幹細胞を含む胎盤細胞の集団を培養したときに１つもしくは複数の胚様体の形成を促進する方法が提供される。
【００６８】
より具体的な実施形態では、本明細書で、細胞集団を作製する方法であって、（ａ）基質に接着し、（ｂ）ＣＤ２００およびＨＬＡ−Ｇを発現する胎盤幹細胞を選択すること；および、細胞集団を形成するために前記胎盤幹細胞をその他の細胞から単離すること；を含む方法が提供される。別の具体的な実施形態では、本明細書で、細胞集団を作製する方法であって、（ａ）基質に接着し、（ｂ）ＣＤ７３、ＣＤ１０５およびＣＤ２００を発現する胎盤幹細胞を選択すること；および、細胞集団を形成するために前記胎盤幹細胞をその他の細胞から単離すること；を含む方法が提供される。別の具体的な実施形態では、本明細書で、細胞集団を作製する方法であって、（ａ）基質に接着し、（ｂ）ＣＤ２００およびＯＣＴ−４を発現する胎盤幹細胞を選択すること；および、細胞集団を形成するために前記胎盤幹細胞をその他の細胞から単離すること；を含む方法が提供される。別の具体的な実施形態では、本明細書で、細胞集団を作製する方法であって、（ａ）基質に接着し、（ｂ）ＣＤ７３およびＣＤ１０５を発現し、（ｃ）胚様体の形成を可能にする条件下で培養したときに胚様体を形成する胎盤幹細胞を選択すること；および、細胞集団を形成するために前記胎盤幹細胞をその他の細胞から単離すること；を含む方法が提供される。別の具体的な実施形態では、本明細書で、細胞集団を作製する方法であって、（ａ）基質に接着し、（ｂ）ＣＤ７３、ＣＤ１０５およびＨＬＡ−Ｇを発現する胎盤幹細胞を選択すること；および、細胞集団を形成するために前記胎盤幹細胞をその他の細胞から単離すること；を含む方法が提供される。細胞集団を作製する方法であって、（ａ）基質に接着し、（ｂ）ＯＣＴ−４を発現し、および（ｃ）胚様体の形成を可能にする条件下で培養したときに胚様体を形成する胎盤幹細胞を選択すること；および、細胞集団を形成するために前記胎盤幹細胞をその他の細胞から単離すること；を含む方法が提供される。
【００６９】
５．２．４  培養における増殖
任意の哺乳動物細胞の場合と同様に、本明細書に記載される胎盤幹細胞の増殖は、増殖のために選択される特定の培地に部分的に依存する。最適条件下において、胎盤幹細胞は、典型的には、３〜５日間で数が倍加する。培養の間に、本明細書で提供される胎盤幹細胞は、培養における基質、例えば組織培養容器（例えば組織培養皿のプラスチック、フィブロネクチン被覆プラスチックなど）の表面に接着して、単層を形成する。
【００７０】
本明細書で提供される胎盤幹細胞を含む単離胎盤細胞の集団は、適切な条件下で培養したときに、胚様体を形成し、つまり、接着性幹細胞層の頂上に細胞の三次元クラスターが増殖する。胚様体中の細胞は、例えばＯＣＴ−４、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ３およびＳＳＥＡ４などの非常に初期の幹細胞に関連するマーカーを発現すると予測される。胚様体中の細胞は、典型的には、本明細書に記載される胎盤幹細胞と同様に、培養基質に接着しないが、培養の間は接着性細胞に付着したままである。胚様体は接着性幹細胞の不在下では形成されないので、胚様体の細胞の生存性は、接着性胎盤幹細胞に依存する。このように、接着性胎盤幹細胞は、接着性胎盤幹細胞を含む胎盤細胞の集団において、１つまたは複数の胚様体の増殖を促進する。理論に拘泥するものではないが、胚様体の細胞は、胚性幹細胞が支持細胞層上で増殖するのと同程度に接着性胎盤幹細胞上で増殖すると考えられる。例えば骨髄由来間葉系幹細胞などの間葉系幹細胞は、培養において胚様体を生じない。
【００７１】
５．２．５  分化
本明細書で提供される方法において有用な胎盤幹細胞は、異なる関係の細胞系列に分化可能である。例えば、胎盤幹細胞は、肝細胞性系列の細胞に分化できる。そのような分化は、例えば骨髄由来間葉系幹細胞を同様の細胞系列へ分化させることについて当技術分野において知られる任意の方法によって実現することができる。その開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる２００６年１２月２８日に出願された米国特許出願第１１／６４８，８１３号を参照されたい。
【００７２】
分化させる胎盤幹細胞は、例えばアルギネートなどのポリマー担体に含有させることができる。一実施形態では、本明細書で、アルギネートに封入された複数の細胞を含む組成物が提供される。細胞は、胎盤幹細胞の肝細胞または肝臓形成細胞への分化を引き起こす条件に接触していない胎盤幹細胞でありうる。細胞は、肝臓形成細胞または肝細胞でもありうる。細胞は、上記のもののいずれかの組合せでもありうる。例えばアルギネートなどのポリマー中に含有される肝臓形成細胞および／または肝細胞は、胎盤幹細胞から分化した細胞である。一実施形態では、前記細胞は、胎盤幹細胞により発現されないか、または胎盤幹細胞とは検出可能に異なる程度で発現される肝細胞の少なくとも１つのマーカーを発現する。好ましくは、例えばアルギネートなどのポリマーは、複数の胎盤幹細胞、肝臓形成細胞、肝細胞、またはこれらの組合せを封入したビーズの形である。ビーズは、種々のサイズでありうる。例えば、ビーズは、約（例えば、±１０％）１００μｍ〜約１０００μｍまで変動できる。具体的な実施形態では、前記ビーズは、約２００μｍ〜約８００μｍのサイズである。別の具体的な実施形態では、前記ビーズは、平均で約５００μｍのサイズである。
【００７３】
５．３  ＣＤ３４＋ＣＤ４５−胎盤幹細胞およびそれらを含む細胞集団
別の態様では、本明細書で、単離造血ＣＤ３４＋、ＣＤ４５−胎盤幹細胞および／またはＣＤ３４＋、ＣＤ４５ｄｉｍ胎盤幹細胞、ならびにＣＤ３４＋、ＣＤ４５−胎盤幹細胞の濃縮単離細胞集団が提供される。本明細書において、「ＣＤ３４＋、ＣＤ４５−胎盤幹細胞」は、胎盤から得られるが、胎盤血または臍帯血からは得られない、成熟血液細胞または成熟血液細胞の前駆体の少なくとも１つのタイプに分化できる細胞を示し、特定の実施形態では、ＣＤ３４＋ＣＤ４５ｄｉｍ胎盤幹細胞を含む。ＣＤ３４＋、ＣＤ４５−胎盤幹細胞は、例えばＣＤ３４に対する標識抗体を用いて、マーカーＣＤ３４について検出可能な程度に陽性であり、ＣＤ４５についてわずかに陽性または陰性であり、例えば、ＣＤ４５に対する蛍光標識抗体を用いて、細胞がバックグラウンドを超えて検出可能であるように標識されない。ＣＤ３４＋、ＣＤ４５−胎盤幹細胞およびＣＤ３４＋ＣＤ４５ｄｉｍ胎盤幹細胞は、典型的には、非接着性であり、すなわち、これらは、組織培養表面に接着しない。
【００７４】
また、本明細書では、ＣＤ３４＋ＣＤ４５−胎盤幹細胞および／またはＣＤ３４＋ＣＤ４５ｄｉｍ胎盤幹細胞の濃縮胎盤細胞の集団も提供される。本明細書において、「濃縮された」とは、胎盤幹細胞集団が、胎盤灌流液が、胎盤から臍帯血および胎盤血を排出させ、約１００ｍＬの灌流溶液で予備灌流した後に、約５０ｍＬ／分の速度でヒト胎盤を通過させた約７５０ｍＬの灌流溶液（例えば０．９％  ＮａＣｌ）を含むときに、胎盤灌流液で見出されるよりも多数のまたは高いパーセンテージのＣＤ３４＋ＣＤ４５−細胞を含むことを示す。具体的な実施形態では、ＣＤ３４＋ＣＤ４５−胎盤幹細胞は、胎盤灌流液で見出されるよりも高いパーセンテージで細胞集団中に存在し、例えば胎盤幹細胞は、細胞集団中の細胞の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、７％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％を構成する。別の具体的な実施形態では、幹細胞集団は、約、または少なくとも１×１０３、５×１０３、１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６または１×１０７のＣＤ３４＋ＣＤ４５−胎盤幹細胞を含む。
【００７５】
典型的には、胎盤灌流液中の約１億個の全有核細胞の集団のうち、約５％がＣＤ３４＋細胞であり、生存率を考慮に入れて、胎盤からの最終収率は、約１００万個のＣＤ３４＋幹細胞である。回収したときに、ＣＤ３４＋幹細胞は、見かけが丸く、細胞の複雑さが低い。
【００７６】
ＣＤ３４＋ＣＤ４５−胎盤幹細胞を含む胎盤幹細胞の集団は、ＣＤ３４＋細胞の他の集団、例えばＣＤ３４＋ＣＤ３８＋細胞および／またはＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞も含みうる。具体的な実施形態では、前記ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ｌｉｎ−幹細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記ＣＤ３４＋胎盤幹細胞は、ＡＬＤＨ＋である細胞、すなわちＣＤ３４＋、ＡＬＤＨ＋胎盤幹細胞を含む。
【００７７】
別の実施形態では、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５−胎盤幹細胞は、第２のタイプの幹細胞と組み合わせる。一実施形態では、第２のタイプの幹細胞は、ＯＣＴ−４＋またはＡＢＣ−ｐ＋である接着性胎盤幹細胞を含む。別のより具体的な実施形態では、前記接着性胎盤幹細胞は、ＯＣＴ４＋ＡＢＣ−ｐ＋である細胞を含む。別のより具体的な実施形態では、前記造血胎盤幹細胞は、赤血球および細胞破壊物を実質的に欠く胎盤灌流液内に含まれる。
【００７８】
別の実施形態では、造血胎盤幹細胞と組み合わせる接着性胎盤幹細胞、例えばＣＤ３４＋ＣＤ４５−胎盤幹細胞は、マーカーＣＤ１０、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ９０、ＣＤ７３もしくはＣＤ１０５のうち１つまたは複数を発現し、マーカーＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＳＳＥＡ３およびＳＳＥＡ４の１つまたは複数の発現を欠く細胞を含む。別の実施形態では、接着性胎盤幹細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ９０、ＣＤ７３またはＣＤ１０５について陽性であり、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＳＳＥＡ３およびＳＳＥＡ４について陰性である細胞を含む。別の実施形態では、接着性胎盤幹細胞は、マーカーＣＤ１０、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ９０、ＣＤ７３およびＣＤ１０５のうち１つまたは複数を含み、マーカーＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＳＳＥＡ３およびＳＳＥＡ４のうち１つまたは複数を欠く細胞を含む。別の実施形態では、接着性胎盤幹細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ９０、ＣＤ７３およびＣＤ１０５について陽性であり、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＳＳＥＡ３およびＳＳＥＡ４について陰性である細胞を含む。別の実施形態では、接着性胎盤幹細胞は、ＣＤ３４−細胞を含む。具体的な実施形態では、接着性胎盤幹細胞は、ＣＤ３４−ＣＤ３８−胎盤幹細胞である。別の実施形態では、接着性胎盤幹細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ２９、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１１７およびＣＤ１３３の少なくとも１つについて陽性であり、ＣＤ３４またはＣＤ４５の少なくとも１つについて陰性である細胞を含む。別の実施形態では、接着性胎盤幹細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ２９、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１１７およびＣＤ１３３について陽性であり、ＣＤ３４またはＣＤ４５について陰性である細胞を含む。より具体的な実施形態では、接着性胎盤幹細胞は、ＨＬＡ−ＡＢＣ＋である細胞を含む。より具体的な実施形態では、接着性胎盤幹細胞は、ＨＬＡ−ＡＢＣ−である細胞を含む。より具体的な実施形態では、接着性胎盤幹細胞は、ＨＬＡ−ＤＲ＋である細胞を含む。より具体的な実施形態では、接着性胎盤幹細胞は、ＨＬＡ−ＤＲ−である細胞を含む。別の具体的な実施形態では、接着性胎盤幹細胞は、ＣＤ２００＋またはＨＬＡ−Ｇ＋である細胞を含む。別の具体的な実施形態では、接着性胎盤幹細胞は、ＣＤ２００＋およびＨＬＡ−Ｇ＋である細胞を含む。別の具体的な実施形態では、接着性胎盤幹細胞は、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋およびＣＤ２００＋である細胞を含む。別の具体的な実施形態では、接着性胎盤幹細胞は、ＣＤ２００＋およびＯＣＴ−４＋である細胞を含む。別の具体的な実施形態では、接着性胎盤幹細胞は、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋であり、胚様体の形成を可能にする条件下で前記幹細胞を含む単離胎盤細胞の集団を培養したときに前記集団における胚様体の形成を促進する細胞を含む。別の具体的な実施形態では、接着性胎盤幹細胞は、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋およびＨＬＡ−Ｇ＋である細胞を含む。別の具体的な実施形態では、接着性胎盤幹細胞は、胚様体の形成を可能にする条件下で前記幹細胞を含む単離胎盤細胞の集団を培養したときに、前記集団における胚様体の形成を促進する細胞を含む。
【００７９】
別の実施形態では、幹細胞の第２の集団は、臍帯血幹細胞および／または骨髄幹細胞を含む。
【００８０】
組み合わせるＣＤ３４＋ＣＤ４５−胎盤幹細胞およびその他の幹細胞は、ＨＬＡが完全に適合するものでよく、すなわち、これらは、同じ個体に由来してよい。別の実施形態では、ＣＤ３４＋ＣＤ４５−胎盤幹細胞およびその他の幹細胞は、ＨＬＡが適合しないものでよく、すなわち、これらは別の個体に由来してよい。ＣＤ３４＋ＣＤ４５−胎盤幹細胞とその他の幹細胞の組合せは、意図されるレシピエントに対して、ＨＬＡが適合し、部分的にＨＬＡが適合し、および／またはＨＬＡが適合しない幹細胞を含みうる。非臍帯血幹細胞を含む、組み合わせる幹細胞集団について、少なくとも第２の供給源からの幹細胞は、意図されるレシピエントに対して、ＨＬＡが適合し、または部分的にＨＬＡが適合するものであることが好ましい。
【００８１】
様々な実施形態では、第２のタイプの幹細胞に対するＣＤ３４＋ＣＤ４５−胎盤幹細胞の比率は、各集団中の全有核細胞数を比較して、または各集団中の幹細胞の総数を比較して、約１００，０００，０００：１、５０，０００，０００：１、２０，０００，０００：１、１０，０００，０００：１、５，０００，０００：１、２，０００，０００：１、１，０００，０００：１、５００，０００：１、２００，０００：１、１００，０００：１、５０，０００：１、２０，０００：１、１０，０００：１、５，０００：１、２，０００：１、１，０００：１、５００：１、２００：１、１００：１、５０：１、２０：１、１０：１、５：１、２：１、１：１；１：２；１：５；１：１０；１：１００；１：２００；１：５００；１：１，０００；１：２，０００；１：５，０００；１：１０，０００；１：２０，０００；１：５０，０００；１：１００，０００；１：５００，０００；１：１，０００，０００；１：２，０００，０００；１：５，０００，０００；１：１０，０００，０００；１：２０，０００，０００；１：５０，０００，０００；または約１：１００，０００，０００でありうる。種々の好ましい実施形態では、比率は、約１：１０〜約１０：１であり、または約３：１〜約１：３である。
【００８２】
本明細書では、ＣＤ３４＋ＣＤ４５−胎盤幹細胞と、第２のタイプの幹細胞とを含む幹細胞の集団であって、ＣＤ３４＋ＣＤ４５−胎盤幹細胞、第２のタイプの幹細胞またはその両方の治療有効量を含む集団がさらに提供される。種々の組合せにおいて、集団は、少なくとも１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、もしくは１×１０１１のＣＤ３４＋ＣＤ４５−胎盤幹細胞、第２のタイプの幹細胞またはその両方を含むか、あるいは１×１０４以下、５×１０４以下、１×１０５以下、５×１０５以下、１×１０６以下、５×１０６以下、１×１０７以下、５×１０７以下、１×１０８以下、５×１０８以下、１×１０９以下、５×１０９以下、１×１０１０以下、５×１０１０以下、もしくは１×１０１１以下のＣＤ３４＋ＣＤ４５−胎盤幹細胞、第２のタイプの幹細胞またはその両方を含むか、あるいは胎盤幹細胞集団および第２のタイプの幹細胞の両方から、全有核細胞の３、５、１０、２０、３０、４０または５０単位以上を含む。
【００８３】
５．４  胎盤幹細胞を得る方法
５．４．１  幹細胞回収組成物
本明細書で提供される方法および組成物で使用される胎盤幹細胞、例えば接着性胎盤幹細胞および／またはＣＤ３４＋、ＣＤ４５−胎盤幹細胞は、組織から細胞を回収するための当技術分野において知られる任意の手段により、例えば、胎盤の灌流により、および／または胎盤組織の物理的および／または破壊により回収できる。一般的に、幹細胞は、生理的に許容される溶液、例えば幹細胞回収組成物を用いて哺乳動物の胎盤から得られる。幹細胞回収組成物は、２００６年１２月２８日に出願された「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ  Ｐｌａｃｅｎｔａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ  Ｏｒｇａｎｓ」という各称の関連する米国特許出願第２００７／０１９００４２号に詳細に記載されている。
【００８４】
幹細胞回収組成物は、幹細胞の回収および／または培養に適する任意の生理的に許容される溶液、例えば塩溶液（例えばリン酸緩衝塩水、クレブス溶液、改変クレブス溶液、イーグル溶液、０．９％  ＮａＣｌなど）、培地（例えば、ＤＭＥＭ、Ｈ．ＤＭＥＭなど）などを含みうる。
【００８５】
幹細胞回収組成物は、回収時から培養時まで胎盤幹細胞を保存する傾向にある、すなわち、胎盤幹細胞の死滅を妨げるか、胎盤幹細胞の死滅を遅延させるか、死滅する細胞の集団中の胎盤幹細胞の数を低減するなどの１つまたは複数の成分を含みうる。このような成分は、例えば、アポトーシス阻害剤（例えばカスパーゼ阻害剤またはＪＮＫ阻害剤）；血管拡張剤（例えば硫酸マグネシウム、降圧剤、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、副腎皮質刺激ホルモン、コルチコトロピン放出ホルモン、ニトロプルシドナトリウム、ヒドララジン、アデノシン３リン酸、アデノシン、インドメタシンまたは硫酸マグネシウム、ホスホジエステラーゼ阻害剤など）；壊死阻害剤（例えば２−（１Ｈ−インドール−３−イル）−３−ペンチルアミノ−マレイミド、ピロリジンジチオカルバメートまたはクロナゼパム）；ＴＮＦ−α阻害剤；および／または酸素保持ペルフルオロカーボン（例えばペルフルオロオクチルブロミド、ペルフルオロデシルブロミドなど）でありうる。
【００８６】
幹細胞回収組成物は、１つまたは複数の組織分解酵素、例えばメタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、ヒアルロニダーゼ、ＲＮアーゼまたはＤＮアーゼなどを含みうる。このような酵素には、それだけに限られないが、コラゲナーゼ（例えばコラゲナーゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍからのコラゲナーゼなど）；ジスパーゼ、サーモリシン、エラスターゼ、トリプシン、リベラーゼ、ヒアルロニダーゼなどがある。
【００８７】
幹細胞回収組成物は、抗生物質の殺菌有効量または静菌有効量を含みうる。特定の非限定的な実施形態では、抗生物質は、マクロライド（例えばトブラマイシン）、セファロスポリン（例えばセファレキシン、セファラジン、セフロキシム、セフプロジル、セファクロル、セフィキシムまたはセファドロキシル）、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、ペニシリン（例えばペニシリンＶ）またはキノロン（例えばオフロキサシン、シプロフロキサシンまたはノルフロキサシン）、テトラサイクリン、ストレプトマイシンなどである。特定の実施形態では、抗生物質は、グラム（＋）および／またはグラム（−）細菌、例えばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓなどに対して活性である。
【００８８】
幹細胞回収組成物は、以下の化合物の１つまたは複数も含みうる：アデノシン（約１ｍＭ〜約５０ｍＭ）；Ｄ−グルコース（約２０ｍＭ〜約１００ｍＭ）；マグネシウムイオン（約１ｍＭ〜約５０ｍＭ）；一実施形態では、内皮の完全性および細胞の生存性を維持するのに十分な量で存在する２０，０００ダルトンを超える分子量の巨大分子（例えば、約２５ｇ／ｌ〜約１００ｇ／ｌ、または約４０ｇ／ｌ〜約６０ｇ／ｌで存在する合成もしくは天然のコロイド、デキストランのような多糖類またはポリエチレングリコール）；抗酸化剤（例えば約２５μＭ〜約１００μＭで存在するブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、グルタチオン、ビタミンＣまたはビタミンＥ）；還元剤（例えば約０．１ｍＭ〜約５ｍＭで存在するＮ−アセチルシステイン）；カルシウムの細胞への進入を妨げる因子（例えば約２μＭ〜約２５μＭで存在するベラパミル）；ニトログリセリン（例えば約０．０５ｇ／Ｌ〜約０．２ｇ／Ｌ）；一実施形態では、残存血液の凝固の妨害を助けるのに十分な量で存在する抗凝固剤（例えば、約１０００単位／ｌ〜約１００，０００単位／ｌの濃度で存在するヘパリンまたはヒルジン）；またはアミロライド含有化合物（例えば約１．０μＭ〜約５μＭで存在するアミロライド、エチルイソプロピルアミロライド、ヘキサメチレンアミロライド、ジメチルアミロライドまたはイソブチルアミロライド）。
【００８９】
５．４．２  胎盤の回収および取扱い
一般的に、ヒト胎盤は、出生後のその娩出後すぐに回収される。好ましい実施形態では、胎盤は、インフォームドコンセントを行った後で、患者の完全な病歴を聴取した後に、胎盤に関連する患者から回収される。好ましくは、病歴は、分娩後も継続される。このような病歴を使用して、胎盤またはそこから採集した幹細胞のその後の使用を調整することができる。例えば、ヒト胎盤幹細胞を、病歴に鑑みて、胎盤に関連する幼児、または幼児の両親、兄弟姉妹もしくは他の親類についての個別の医療に使用することができる。
【００９０】
胎盤幹細胞を回収する前に、臍帯血および胎盤血を除去する。特定の実施形態では、分娩後に、胎盤内の臍帯血を回収する。胎盤は、通常の臍帯血回収プロセスにかけることができる。典型的には、針またはカニューレを用いて、重力の助けにより、胎盤を放血させる（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ、米国特許第５，３７２，５８１号；Ｈｅｓｓｅｌら、米国特許第５，４１５，６６５号を参照されたい）。針またはカニューレは、臍静脈内に配置され、胎盤を穏やかにマッサージして、胎盤から臍帯血が排出されるのを補助する。このような臍帯血の回収は、商業的に、例えばＬｉｆｅｂａｎｋＵＳＡ、Ｃｅｄａｒ  Ｋｎｏｌｌｓ、Ｎ．Ｊ．；ＶｉａＣｏｒｄ；Ｃｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ；Ｃｒｙｏｃｅｌｌなどで行うことができる。好ましくは、胎盤は、臍帯血回収の間の組織の破壊を最小限にするように、さらなる操作を行わずに重力で排出させる。
【００９１】
典型的には、胎盤は、分娩室または出生室から例えば実験室などの別の場所に、臍帯血の回収および例えば灌流または組織の分解などによる幹細胞の回収のために輸送される。胎盤は、好ましくは、滅菌され断熱された輸送デバイス（胎盤の温度を２０〜２８℃に保つ）中で、例えば近位臍帯がクランプされた胎盤を、滅菌されたジップロックプラスチック袋中に入れ、これを次いで、断熱容器に入れることにより輸送される。別の実施形態では、胎盤は、米国特許第７，１４７，６２６号または米国特許出願第２００６／００６０４９４号に実質的に記載されるような臍帯血回収キット中で輸送される。好ましくは、胎盤は、実験室に、分娩後４〜２４時間で送達される。一実施形態では、近位臍帯は、臍帯血回収の前に、盤状胎盤（placental disc）内への好ましくは４〜５ｃｍ（センチメートル）の挿入によりクランプされる。別の実施形態では、近位臍帯は、臍帯血回収の後であるが、胎盤をさらに処理する前にクランプされる。
【００９２】
幹細胞回収前の胎盤は、滅菌条件下で、室温または５〜２５℃の温度（セ氏温度）のいずれかで貯蔵できる。胎盤は、胎盤を灌流させていずれの残存臍帯血も除去する前に４８時間より長い期間、好ましくは４〜２４時間貯蔵してよい。胎盤は、好ましくは、抗凝固溶液中で、５〜２５℃（セ氏温度）の温度で貯蔵される。適切な抗凝固溶液は、当技術分野において公知である。例えば、ヘパリンまたはワルファリンナトリウムの溶液を用いることができる。好ましい実施形態では、抗凝固溶液は、ヘパリンの溶液（例えば、１：１０００溶液中に１％ｗ／ｗ）を含む。放血させた胎盤は、好ましくは、胎盤幹細胞を回収する前に、３６時間以下貯蔵される。
【００９３】
上記のように一旦回収して一般的に調製された哺乳動物の胎盤またはその一部分は、任意の当技術分野において知られる様式で処理でき、例えば、灌流させるかまたは破壊して、例えば１つまたは複数の組織破壊酵素を用いて消化して、幹細胞を得ることができる。
【００９４】
５．４．３  胎盤組織の物理的破壊および酵素消化
一実施形態では、幹細胞は、哺乳動物の胎盤から、該器官の物理的破壊、例えば酵素消化により回収される。例えば、胎盤またはその一部分は、例えば、本明細書に記載される幹細胞回収組成物と接触させている間に、粉砕するか、せん断するか、みじん切りにするか、さいの目に切るか、乱切りにするか、浸解させてよく、その後、組織を１つまたは複数の酵素で消化する。胎盤、またはその一部は、物理的に破壊して、１つまたは複数の酵素で消化し、得られた物質を、次いで、本明細書に記載される幹細胞回収組成物に浸漬するか、または混合することもできる。破壊の方法が、例えばトリパンブルー排除により決定される、上記の器官中の細胞の複数、より好ましくは大部分、より好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％を生存したままにするという条件の下で、任意の物理的破壊方法を用いることができる。
【００９５】
胎盤は、物理的破壊および／または酵素消化ならびに幹細胞回収の前に、各要素に解剖できる。例えば、胎盤幹細胞は、全体、または羊膜、絨毛膜、胎盤絨毛叢もしくはそれらの任意の組合せである部分から得ることができる。好ましくは、胎盤幹細胞は、羊膜および絨毛膜を含む胎盤組織から得られる。典型的には、胎盤幹細胞は、胎盤組織の小さいブロック、例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または約１０００立方ミリメートルの容量である胎盤組織のブロックの破壊により得ることができる。
【００９６】
好ましい幹細胞回収組成物は、１つまたは複数の組織破壊酵素を含む。酵素消化は、好ましくは、酵素の組合せ、例えばマトリックスメタロプロテアーゼと中性プロテアーゼの組合せ、例えばコラゲナーゼとジスパーゼの組合せを用いる。一実施形態では、胎盤組織の酵素分解は、ヒアルロン酸の消化のために、コラゲナーゼとジスパーゼとヒアルロニダーゼの組合せまたはリベラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄ．）とヒアルロニダーゼの組合せのようなマトリックスメタロプロテアーゼと、中性プロテアーゼと、粘液溶解酵素の組合せを用いる。胎盤組織を破壊するのに使用することができるその他の酵素は、パパイン、デオキシリボヌクレアーゼ、トリプシン、キモトリプシンまたはエラスターゼのようなセリンプロテアーゼを含む。セリンプロテアーゼは、血清中のアルファ２ミクログロブリンにより阻害されうるので、消化に使用される培地は、通常、血清を含まない。ＥＤＴＡおよびＤＮアーゼは、細胞回収効率を増大させるために、酵素消化手順において、通常、用いられる。消化物は、好ましくは、粘性の消化物中で幹細胞がトラップされることを防ぐように希釈される。
【００９７】
組織消化酵素の任意の組合せを用いることができる。組織消化酵素についての典型的な濃度は、例えばコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＶについて５０〜２００Ｕ／ｍＬ、ジスパーゼについて１〜１０Ｕ／ｍＬ、およびエラスターゼについて１０〜１００Ｕ／ｍＬを含む。プロテアーゼは、胎盤幹細胞を遊離させるために、組み合わせて、すなわち、２種以上のプロテアーゼを同じ消化反応において使用することもでき、または逐次的に使用することもできる。例えば、一実施形態では、胎盤またはその一部分は、まず、２ｍｇ／ｍｌでの適切な量のコラゲナーゼＩを用いて３０分間、次いで、０．２５％のトリプシンを用いて１０分間、３７℃での消化により消化される。セリンプロテアーゼは、他の酵素の使用後に連続して使用することが好ましい。
【００９８】
別の実施形態では、組織は、キレート化剤、例えばエチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−４酢酸（ＥＧＴＡ）またはエチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）を、幹細胞を含む幹細胞回収組成物に、または幹細胞回収組成物を用いる幹細胞の単離前に、組織を破壊および／または消化する溶液に加えることによりさらに破壊できる。
【００９９】
胎盤全体、または胎児と母系の両方の細胞を含む胎盤の部分（例えば胎盤の部分が絨毛膜または絨毛叢を含む場合）の場合、回収された胎盤幹細胞が、胎性と母系性の両方の供給源に由来する胎盤幹細胞の混合物を含むことが認識されるだろう。胎盤の部分が母系性細胞（例えば羊膜）を全く含まないか、または無視できる数で含む場合、回収された胎盤幹細胞は、ほぼ独占的に胎性の胎盤幹細胞を含む。
【０１００】
５．４．４  胎盤灌流
本明細書で提供される方法および組成物において有用な胎盤幹細胞は、哺乳動物の胎盤の灌流により得ることもできる。哺乳動物の胎盤を灌流して幹細胞を得る方法は、例えばＨａｒｉｒｉ、米国特許第７，０４５，１４８号および第７，２５５，８７９号、ならびに「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ  Ｏｒｇａｎｓ」という名称の米国特許出願公開第２００７／０１９００４２号に開示されている。
【０１０１】
胎盤幹細胞は、例えば幹細胞回収組成物を灌流溶液として使用して、例えば胎盤の脈管構造を通して灌流することにより回収できる。一実施形態では、哺乳動物の胎盤を、臍動脈および臍静脈のいずれかまたは両方を通して灌流溶液を流すことにより灌流する。胎盤を通しての灌流溶液の流れは、例えば胎盤への重力流れを用いて行ってよい。好ましくは、灌流溶液は、例えば蠕動ポンプなどのポンプを用いて胎盤を強制的に通過させる。臍静脈には、滅菌配管のような滅菌連結装置に連結された、例えばＴＥＦＬＯＮ（登録商標）またはプラスチックのカニューレなどのカニューレを挿入できる。滅菌連結装置は、灌流マニホルドに接続される。
【０１０２】
灌流の準備において、胎盤は、臍動脈および臍静脈が胎盤の最高点に位置するような様式で配向させる（例えば懸垂させる）ことが好ましい。胎盤は、例えば本明細書で提供される幹細胞回収組成物などの灌流流体を、胎盤脈管構造に、または胎盤脈管構造および周囲の組織に通過させることにより灌流できる。一実施形態では、臍動脈および臍静脈は、可撓性の連結器を介して灌流溶液の貯蔵器に連結されたピペットに同時に連結される。灌流溶液を、臍静脈および動脈に通す。灌流溶液は、胎盤の周囲の組織中に、血管壁から滲出し、および／または血管壁を通過し、妊娠中に母体の子宮に接着していた胎盤の表面から、適切な開放容器に回収される。灌流溶液は、臍帯の開口を通して導入し、母体の子宮壁と連結していた胎盤壁の開口から流出または浸出させてもよい。別の実施形態では、灌流溶液は、臍静脈を通過させて、臍動脈から回収するか、または臍動脈を通過させて、臍静脈から回収する。すなわち、灌流溶液は、胎盤の脈管構造（胎性組織）のみを通過させる。このことは、灌流の「閉鎖回路」法と呼ぶことができる。閉鎖回路灌流法は、一実施形態では、以下のようにして行うことができる。分娩後の胎盤を、出生の約４８時間以内に得る。臍帯をクランプし、クランプの上で切断する。臍帯は破棄することもでき、または処理して、例えば臍帯幹細胞を回収するか、かつ／もしくは生物材料の生成のために臍帯膜を処理することもできる。羊膜は、灌流の間に保持することもでき、または例えば指を用いる鈍い切開により絨毛膜から分離することもできる。灌流の前に羊膜を絨毛膜から分離する場合、これは、例えば破棄することもでき、または処理して、例えば酵素消化により幹細胞を得るか、もしくは例えば羊膜生物材料、例えば米国特許出願公開第２００４／００４８７９６号に記載される生物材料を得ることもできる。胎盤の全ての目に見える血液凝固物および残存血液を、例えば滅菌ガーゼを用いて洗浄した後に、例えば臍帯膜を部分的に切断して臍帯の横断面を露出させることにより、臍血管を露出させる。血管を同定し、各血管の切断末端を通して閉じたワニ口クランプを前に送ることにより開放する。例えば灌流デバイスまたは蠕動ポンプに連結されたプラスチックの配管などの装置を、次いで、それぞれの胎盤動脈に挿入する。ポンプは、この目的に適する任意のポンプ、例えば蠕動ポンプでありうる。滅菌回収貯蔵器、例えば２５０ｍＬの回収バッグのような血液バッグに連結されたプラスチックの配管を、次いで、胎盤静脈に挿入する。あるいは、ポンプに連結された配管を胎盤静脈に挿入し、（１つまたは複数の）回収貯蔵器へのチューブを胎盤動脈の一方または両方に挿入する。胎盤を、次いである容量の灌流溶液、例えば約７５０ｍｌの灌流溶液を用いて灌流する。灌流液中の細胞を、次いで、例えば遠心分離により回収する。
【０１０３】
一実施形態では、近位臍帯は、灌流の間にクランプし、より好ましくは、盤状胎盤への臍帯の挿入の４〜５ｃｍ（センチメートル）以内でクランプする。
【０１０４】
放血プロセスの間の哺乳動物の胎盤からの灌流流体の最初の回収は、臍帯血および／または胎盤血の残存赤血球により、通常、着色している。灌流流体は、灌流が進むにつれてより無色になり、残存臍帯血細胞は、胎盤から洗い出される。通常、胎盤を最初に放血させるのに適当な灌流流体は、３０〜１００ｍＬであるが、観察される結果に応じて、より多くあるいは少ない灌流流体を用いてよい。
【０１０５】
胎盤幹細胞の回収に使用される灌流液体の容量は、回収される幹細胞の数、胎盤のサイズ、単独の胎盤から行う回収の回数などに応じて変動してよい。様々な実施形態では、灌流液体の容量は、５０ｍＬ〜５０００ｍＬ、５０ｍＬ〜４０００ｍＬ、５０ｍＬ〜３０００ｍＬ、１００ｍＬ〜２０００ｍＬ、２５０ｍＬ〜２０００ｍＬ、５００ｍＬ〜２０００ｍＬ、または７５０ｍＬ〜２０００ｍＬであってよい。典型的には、胎盤は、７００〜８００ｍＬの灌流液体を用いて、放血後に灌流される。
【０１０６】
胎盤は、数時間または数日の期間にわたって複数回灌流できる。胎盤を複数回灌流する場合、容器またはその他の適切な器の中で、無菌条件下で胎盤を維持または培養することができ、幹細胞回収組成物または標準的な灌流溶液（例えば、抗凝固剤（例えばヘパリン、ワルファリンナトリウム、クマリン、ビスヒドロキシクマリン）を含むかもしくは含まず、および／または抗菌剤（例えばβ−メルカプトエタノール（０．１ｍＭ）；ストレプトマイシン（例えば４０〜１００μｇ／ｍｌ）、ペニシリン（例えば４０Ｕ／ｍｌ）、アンホテリシンＢ（例えば０．５μｇ／ｍｌ）のような抗生物質を含むかもしくは含まないリン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）のような通常の塩溶液を用いて灌流することができる。一実施形態では、灌流および灌流液の回収前に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３もしくは２４時間、または２もしくは３日以上胎盤を維持または培養するように、単離された胎盤を、灌流液を回収せずにある期間にわたって維持または培養する。灌流した胎盤は、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４時間以上、１つまたは複数回にわたって維持でき、例えば７００〜８００ｍＬの灌流流体を用いて２回目の灌流を行う。胎盤は、例えば１、２、３、４、５または６時間ごとに１回のように１、２、３、４、５回以上灌流できる。好ましい実施形態では、胎盤の灌流および灌流溶液、例えば幹細胞回収組成物の回収は、回収される有核細胞数が１００細胞／ｍｌ未満になるまで繰り返される。異なる時点での灌流液は、細胞、例えば幹細胞の時間依存的な集団を回収するためにさらに個別に処理できる。異なる時点からの灌流液を貯留することもできる。
【０１０７】
いずれの理論にも拘泥するものではないが、放血および十分な時間の胎盤の灌流の後に、胎盤幹細胞は、本明細書に記載される方法によって、好ましくは灌流により回収器中に洗い出されることにより、胎盤幹細胞が、回収される胎盤の放血および灌流された微小環境中に移動すると考えられる。単離された胎盤を灌流することは、残存臍帯血を除去する役に立つだけでなく、酸素を含む適切な栄養分を胎盤に提供もする。胎盤は、好ましくは抗凝固剤を添加しない、残存臍帯血細胞を除去するのに使用した類似の溶液を用いて培養および灌流することができる。
【０１０８】
本明細書に記載される方法に従う灌流により、典型的には、上記の溶液で灌流されず、幹細胞を得るために（例えば組織破壊、例えば酵素的消化により）他に処理されない哺乳動物の胎盤から得ることができる数よりも著しく多い数の胎盤幹細胞が回収される。この関係において、「著しく多い」とは、少なくとも１０％より多いことを意味する。本明細書に記載される灌流により、例えば胎盤またはその一部分が培養された培養液から得ることができる胎盤幹細胞の数よりも著しく多い数の胎盤幹細胞が得られる。
【０１０９】
幹細胞は、１もしくは複数のプロテアーゼまたはその他の組織破壊性酵素を含む溶液を用いて灌流により胎盤から単離できる。具体的な実施形態では、胎盤またはその一部分（例えば羊膜、羊膜および絨毛膜、胎盤葉または絨毛叢、あるいはこれらの任意の組合せ）を、２５〜３７℃にし、２００ｍＬの培地中の１つまたは複数の組織破壊性酵素とともに３０分間インキュベートする。灌流液からの細胞を回収し、４℃にし、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭジチオスレイトールおよび２ｍＭベータ−メルカプトエタノールを含む冷阻害剤混合物で洗浄する。幹細胞は、数分後に、冷（例えば４℃）幹細胞回収組成物を用いて洗浄される。
【０１１０】
当然のことながら、Ｐａｎ法を用いる灌流、すなわち胎盤の母体側から滲出した後に灌流液を回収することにより、胎性および母系性細胞の混合物が得られる。その結果、この方法により回収される細胞は、胎性および母系性の起源の両方の胎盤幹細胞の混合集団を含む。これとは対照的に、灌流流体を１または２つの胎盤血管に通し、残りの血管のみを通して回収する、胎盤脈管構造のみを通す灌流により、ほとんど胎児由来のみの胎盤幹細胞の集団が回収される。
【０１１１】
５．４．５  胎盤幹細胞の単離、選別および特徴付け
哺乳動物胎盤からの幹細胞は、灌流または酵素消化のいずれにより得られても、フィコール勾配遠心分離により他の細胞から純化（すなわち単離）できる。このような遠心分離は、遠心分離速度などについて、任意の標準的なプロトコルに従うことができる。一実施形態では、例えば、胎盤から回収される細胞は、室温にて５０００×ｇで１５分間の遠心分離により灌流液から回収され、これにより、例えば混入した破片および血小板から細胞が分離される。別の実施形態では、胎盤灌流液を、約２００ｍｌまで濃縮し、フィコールを静かに重層し、約１１００×ｇにて２０分間、２２℃にて遠心分離し、細胞の低密度界面層をさらなる処理のために回収する。
【０１１２】
細胞沈澱物は、新鮮な幹細胞回収組成物、または幹細胞の維持に適する培地、例えば２Ｕ／ｍｌヘパリンおよび２ｍＭ  ＥＤＴＡ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、ＮＹ）を含有するＩＭＤＭ無血清培地に再懸濁できる。全単核細胞の画分は、例えばＬＹＭＰＨＯＰＲＥＰ（商標）（Ｎｙｃｏｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａ、Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）を、製造者の推奨する手順に従って用いて単離できる。
【０１１３】
本明細書において、胎盤幹細胞を「単離する」とは、インタクトな哺乳動物胎盤において幹細胞が通常結合している細胞の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％を除去することを意味する。器官由来の幹細胞は、インタクトな器官において幹細胞が通常結合している細胞の５０％未満を含む細胞集団中に幹細胞が存在する場合に、「単離され」ている。
【０１１４】
灌流または消化により得られる胎盤細胞は、例えば、さらにまたは最初に、例えば０．２％  ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）を含む０．０５％トリプシン溶液を用いる示差的なトリプシン処理により単離できる。胎盤幹細胞は、典型的には約５分以内でプラスチック表面から脱着されるが、他の接着性の集団は、典型的には２０〜３０分を超えるインキュベーションを必要とするので、示差的なトリプシン処理は可能である。脱着された胎盤幹細胞は、例えばＴｒｙｐｓｉｎ  Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＴＮＳ、Ｃａｍｂｒｅｘ）を使用して、トリプシン処理およびトリプシン中和の後に収集できる。接着性細胞の単離の一実施形態では、例えば約５〜１０×１０６細胞の一定量をいくつかのＴ−７５フラスコ、好ましくはフィブロネクチン被覆Ｔ７５フラスコのそれぞれに入れる。このような実施形態において、細胞は、商業的に入手可能なＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＳＣＧＭ（商標））（Ｃａｍｂｒｅｘ）を用いて培養でき、組織培養インキュベータ（３７℃、５％ＣＯ２）に入れることができる。１０〜１５日後に、ＰＢＳでの洗浄により非接着性細胞をフラスコから除去する。次いで、ＰＢＳをＭＳＣＧＭ（商標）に置き換える。好ましくは、種々の接着性細胞の型の存在について、特に線維芽様細胞のクラスターの同定および拡大について、毎日、フラスコを調べる。
【０１１５】
哺乳動物胎盤から回収される細胞の数および型は、例えば、フローサイトメトリー、細胞分離、免疫細胞化学（例えば組織特異的または細胞マーカー特異的抗体を用いる染色）、蛍光標示式細胞分離（ＦＡＣＳ）、磁気標示式細胞分離（ＭＡＣＳ）のような標準的な細胞検出法を用いて形態および細胞表面マーカーの変化を測定することにより、細胞の形態を光学もしくは共焦顕微鏡を使用して調べることにより、および／またはＰＣＲおよび遺伝子発現プロファイリングのような当技術分野において公知の技術を用いて遺伝子発現の変化を測定することによりモニターできる。これらの技術を用いても、１つまたは複数の特定のマーカーについて陽性である細胞を同定できる。例えば、ＣＤ３４に対する抗体を使用して、上記の技術を用いて、細胞が、検出可能な量のＣＤ３４を含むかについて決定できる。もしそうであれば、細胞はＣＤ３４＋である。同様に、細胞が、ＲＴ−ＰＣＲにより検出できる十分なＯＣＴ−４  ＲＮＡを生成するか、または成体細胞よりも著しく多いＯＣＴ−４  ＲＮＡを生成する場合、細胞は、ＯＣＴ−４＋である。細胞表面マーカー（例えばＣＤ３４のようなＣＤマーカー）に対する抗体、およびＯＣＴ−４のような幹細胞特異的遺伝子の配列は、当技術分野において公知である。
【０１１６】
胎盤細胞、特にフィコール分離、接着性の差またはそれらの組合せにより単離された細胞は、蛍光標示式細胞分離（ＦＡＣＳ）により選別できる。蛍光標示式細胞分離（ＦＡＣＳ）は、細胞を含む粒子を、粒子の蛍光特性に基づいて分離する、公知の方法である（Ｋａｍａｒｃｈ、１９８７、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ、１５１：１５０〜１６５頁）。個々の粒子の蛍光部分のレーザー励起により小さい電荷が生じ、混合物から正および負の粒子の電磁気的分離が可能になる。一実施形態では、細胞表面マーカーに特異的な抗体またはリガンドは、別個の蛍光標識で標識される。細胞を、細胞分離器を通して処理し、使用した抗体に結合するそれらの能力に基づいて細胞の分離が可能になる。ＦＡＣＳで選別された粒子は、分離およびクローニングを促進するために、９６ウェルまたは３８４ウェルプレートのそれぞれのウェルに直接入れてよい。
【０１１７】
ある選別スキームにおいて、胎盤由来の幹細胞は、マーカーＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１１７、ＣＤ２００、ＯＣＴ−４および／またはＨＬＡ−Ｇの発現に基づいて選別される。このことは、培養におけるそれらの接着特性に基づいて幹細胞を選択する手順を伴って達成できる。例えば、幹接着性選択は、マーカー発現に基づく選別の前または後に達成できる。一実施形態では、例えば、細胞は、それらのＣＤ３４発現に基づいてまず選別される。ＣＤ３４−細胞を保持し、ＣＤ２００＋ＨＬＡ−Ｇ＋である細胞を、他の全てのＣＤ３４−細胞から分離する。別の実施形態では、胎盤由来の細胞は、マーカーＣＤ２００および／またはＨＬＡ−Ｇのそれらにおける発現に基づく。例えば、これらのマーカーのいずれかを提示する細胞は、さらなる使用のために単離される。例えばＣＤ２００および／またはＨＬＡ−Ｇを発現する細胞は、具体的な実施形態では、それらのＣＤ７３および／またはＣＤ１０５の発現、または抗体ＳＨ２、ＳＨ３もしくはＳＨ４により認識されるエピトープ、またはＣＤ３４、ＣＤ３８もしくはＣＤ４５の発現の欠如に基づいてさらに選別される。例えば、一実施形態では、胎盤細胞は、ＣＤ２００、ＨＬＡ−Ｇ、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ３４、ＣＤ３８およびＣＤ４５の発現またはその欠如により選別され、ＣＤ２００＋、ＨＬＡ−Ｇ＋、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−およびＣＤ４５−である胎盤細胞が、さらなる使用のために他の胎盤細胞から単離される。
【０１１８】
胎盤幹細胞の抗体により媒介される検出および選別に関して、特定のマーカーに特異的な任意の抗体を、任意の蛍光体または細胞の検出および選別（例えば蛍光標示式細胞分離）に適するその他の標識と組み合わせて使用することができる。特異的マーカーに対する抗体／蛍光体の組合せは、それだけに限られないが、ＨＬＡ−Ｇ（Ｓｅｒｏｔｅｃ、Ｒａｌｅｉｇｈ、Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａから入手可能）、ＣＤ１０（ＢＤ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手可能）、ＣＤ４４（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手可能）およびＣＤ１０５（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、Ｍｉｎｎｅｓｏｔａから入手可能）に対する、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合モノクローナル抗体；ＣＤ４４、ＣＤ２００、ＣＤ１１７およびＣＤ１３（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に対するフィコエリスリン（ＰＥ）結合モノクローナル抗体；ＣＤ３３およびＣＤ１０（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に対するフィコエリスリン−Ｃｙ７（ＰＥ  Ｃｙ７）結合モノクローナル抗体；アロフィコシアニン（ＡＰＣ）結合ストレプトアビジンおよびＣＤ３８（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に対するモノクローナル抗体；ならびにビオチン標識ＣＤ９０（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を含む。使用できる他の抗体には、それだけに限られないが、ＣＤ１３３−ＡＰＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、ＫＤＲ−Ｂｉｏｔｉｎ（ＣＤ３０９、Ａｂｃａｍ）、ＣｙｔｏｋｅｒａｔｉｎＫ−Ｆｉｔｃ（ＳｉｇｍａまたはＤａｋｏ）、ＨＬＡ  ＡＢＣ−Ｆｉｔｃ（ＢＤ）、ＨＬＡ  ＤＲＤＱＤＰ−ＰＥ（ＢＤ）、β−２−ミクログロブリン−ＰＥ（ＢＤ）、ＣＤ８０−ＰＥ（ＢＤ）およびＣＤ８６−ＡＰＣ（ＢＤ）がある。
【０１１９】
使用できるその他の抗体／標識の組合せには、それだけに限られないが、ＣＤ４５−ＰｅｒＣＰ（ペリジンクロロフィルタンパク質）；ＣＤ４４−ＰＥ；ＣＤ１９−ＰＥ；ＣＤ１０−Ｆ（フルオレセイン）；ＨＬＡ−Ｇ−Ｆおよび７−アミノ−アクチノマイシン−Ｄ（７−ＡＡＤ）；ＨＬＡ−ＡＢＣ−Ｆなどがある。
【０１２０】
胎盤幹細胞は、例えば、フィコエリスリン−Ｃｙ５（ＰＥ  Ｃｙ５）結合ストレプトアビジンと、ＣＤ１１７またはＣＤ１３３に対するビオチン結合モノクローナル抗体とを使用して、ＣＤ１１７またはＣＤ１３３についてアッセイできる。しかし、この系を使用すると、細胞は、比較的高いバックグラウンドのために、ＣＤ１１７またはＣＤ１３３のそれぞれについて陽性であるように見える可能性がある。
【０１２１】
胎盤幹細胞を、単独のマーカーに対する抗体を用いて標識し、検出および／または選別できる。胎盤幹細胞は、異なるマーカーに対する複数の抗体を用いて同時に標識することもできる。
【０１２２】
別の実施形態では、磁性ビーズを使用して細胞を分離できる。細胞は、磁性ビーズ（直径０．５〜１００μｍ）に結合する粒子の能力に基づいて粒子を分離する方法である磁気標示式細胞分離（ＭＡＣＳ）法を使用して選別することができる。特定の細胞表面分子またはハプテンを特異的に認識する抗体の共有結合を含む種々の有用な改変を、磁性微粒子に対して行うことができる。次いで、ビーズを、細胞と混合して結合を可能にする。次いで、細胞を、磁界に通して、特定の細胞表面マーカーを有する細胞を分離する。一実施形態では、次いで、これらの細胞を単離して、さらなる細胞表面マーカーに対する抗体と結合した磁性ビーズと再混合できる。細胞を再び磁界に通し、両方の抗体に結合した細胞を単離する。次いで、このような細胞を、クローン単離のために、マイクロタイター皿のような別の皿の中で希釈できる。
【０１２３】
胎盤幹細胞は、細胞の形態および増殖の特徴に基づいて特徴付けおよび／または選別することもできる。例えば、胎盤幹細胞は、例えば培養において線維芽様の外観を有すると特徴付けるか、および／またはそのような外観に基づいて選択することができる。胎盤幹細胞は、胚様体を形成する能力を有すると特徴付けるか、および／またはそのような能力に基づいて選択することができる。一実施形態では、例えば、線維芽様の形状であり、ＣＤ７３およびＣＤ１０５を発現し、培養において１つまたは複数の胚様体を形成する胎盤細胞が、他の胎盤細胞から単離される。別の実施形態では、培養において１つまたは複数の胚様体を形成するＯＣＴ−４＋胎盤細胞が、他の胎盤細胞から単離される。
【０１２４】
別の実施形態では、胎盤幹細胞は、コロニー形成単位アッセイにより同定および特徴付けできる。コロニー形成単位アッセイは、ＭＥＳＥＮＣＵＬＴ（登録商標）培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ）のように、当技術分野において通常知られている。
【０１２５】
胎盤幹細胞は、生存性、増殖能力および寿命について、トリパンブルー排除アッセイ、フルオレセイン二酢酸取り込みアッセイ、ヨウ化プロピジウム取り込みアッセイ（生存性を評価するため）；およびチミジン取り込みアッセイ、ＭＴＴ細胞増殖アッセイ（ＡＴＣＣ；増殖を評価するため）のような当技術分野において知られる標準的な方法を用いて評価できる。寿命は、長期培養における集団倍加の最大数を決定することなどによる当技術分野において公知の方法により決定してよい。
【０１２６】
胎盤幹細胞は、例えば所望の細胞の選択的増殖（ポジティブ選択）、不要な細胞の選択的破壊（ネガティブ選択）；例えば大豆凝集素を用いるような、混合集団における異なる細胞凝集性に基づく選択；凍結−融解法；濾過；通常の遠心分離およびゾーン遠心分離；遠心水簸法（向流遠心分離）；単位重力分離；向流分配；電気泳動などの当技術分野において知られるその他の技術を使用して、他の胎盤細胞から分離することもできる。
【０１２７】
５．５  胎盤幹細胞の培養
５．５．１  培地
単離胎盤幹細胞もしくは胎盤幹細胞集団、またはそこから胎盤幹細胞が増殖する細胞もしくは胎盤組織を使用して、細胞培養を開始し、または細胞培養物を播種することができる。一般に、ラミニン、コラーゲン（例えば、天然または変性）、ゼラチン、フィブロネクチン、オルニチン、ビトロネクチン、および細胞外膜タンパク質（例えば、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（ＢＤ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌａｂｗａｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、Ｍａｓｓ））などの細胞外マトリックスまたはリガンドでコートされたまたはコートされない、無菌の組織培養容器に細胞を移す。
【０１２８】
胎盤幹細胞は、当技術分野で幹細胞培養用に許容されると認められる任意の培地中および任意の条件下で培養することができる。培地は血清を含むことが好ましい。胎盤幹細胞は、例えば、ＩＴＳ（インスリン−トランスフェリン−セレニウム）、ＬＡ＋ＢＳＡ（リノール酸−ウシ血清アルブミン）、デキストロース、Ｌ−アスコルビン酸、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＩＧＦ−１、およびペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ−ＬＧ培地（低グルコースのダルベッコ改変基礎培地）／ＭＣＤＢ  ２０１培地（ニワトリ線維芽細胞用基礎培地）；１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ−ＨＧ（高グルコース）培地；１５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ−ＨＧ培地；１０％ＦＢＳ、１０％ウマ血清、およびヒドロコルチゾンを含むＩＭＤＭ培地（イスコフ改変ダルベッコ培地）；１０％ＦＢＳ、ＥＧＦ、およびヘパリンを含むＭ１９９培地；１０％ＦＢＳ、ＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）、およびゲンタマイシンを含むα−ＭＥＭ培地（最小基礎培地）；１０％ＦＢＳ、ＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）、およびゲンタマイシンを含むＤＭＥＭ培地などの中で培養することができる。好ましい培地は、２％ＦＢＳ、ＩＴＳ、ＬＡ＋ＢＳＡ、デキストロース、Ｌ−アスコルビン酸、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、およびペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ−ＬＧ／ＭＣＤＢ−２０１培地である。
【０１２９】
胎盤幹細胞を培養するのに使用できる他の培地は、ＤＭＥＭ（高グルコースまたは低グルコース）培地、イーグル基礎培地、ハムＦ１０培地（Ｆ１０）、ハムＦ−１２培地（Ｆ１２）、イスコフ改変ダルベッコ培地、間葉系幹細胞用増殖培地（ＭＳＣＧＭ）、リーボビッツＬ−１５培地、ＭＣＤＢ培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ  １６４０培地、アドバンストＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）、ＤＭＥＭ／ＭＣＤＢ２０１培地（Ｓｉｇｍａ）、およびＣＥＬＬＧＲＯ  ＦＲＥＥ（商標）培地を含む。
【０１３０】
培地には、例えば、血清（例えば、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、好ましくは、約２〜１５％（ｖ／ｖ）；ウマ（馬）血清（ＥＳ）；ヒト血清（ＨＳ）；ベータ−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、好ましくは、約０．００１％（ｖ／ｖ）；１つまたは複数の成長因子、例えば、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、およびエリスロポエチン（ＥＰＯ）；Ｌ−バリンを含むアミノ酸；例えば、単独または組合せでのペニシリンＧ、硫酸ストレプトマイシン、アムホテリシンＢ、ゲンタマイシン、およびニスタチンなど、微生物汚染を抑制する１つまたは複数の抗生剤および／または抗真菌剤；１つまたは複数の神経外胚葉特異化因子、例えば、ソニックヘッジホッグ（ｓｈｈ）および／またはレチノイン酸（ｒａ）を含む、１つまたは複数の成分を補充することができる。
【０１３１】
胎盤幹細胞は、標準的な組織培養条件において、例えば、組織培養皿またはマルチウェルプレート内で培養することができる。胎盤幹細胞はまた、懸滴法を用いて培養することもできる。この方法では、約５ｍＬの培地に１ｍＬ当たり約１×１０４個の胎盤幹細胞を懸濁させ、培地の１つまたは複数の液滴を組織培養容器、例えば、１００ｍＬペトリ皿のふたの内側に滴下する。液滴は、例えば、単一種類の液滴でもよく、例えば、マルチチャネルピペッターからの複数種類の液滴でもよい。ふたを注意深く裏返し、ある容量の液体、例えば、皿の雰囲気中における水分含量を維持するのに十分な無菌のＰＢＳを含有し、幹細胞が培養される、皿本体の上部にかぶせる。
【０１３２】
一実施形態では、胎盤幹細胞は、胎盤幹細胞内における未分化の表現型を維持するように作用する化合物の存在下で培養される。具体的な実施形態では、化合物は、置換された３，４−ジヒドロピリジモール［４，５−ｄ］ピリミジンである。より具体的な実施形態では、化合物は、以下の化学構造を有する化合物である。
【０１３３】
【化１】
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化合物は、例えば、約１μＭ〜約１０μＭの濃度で、胎盤幹細胞または胎盤幹細胞集団と接触させることができる。
【０１３４】
５．５．２  胎盤幹細胞の拡大培養および増殖
胎盤幹細胞または幹細胞集団が単離された後（例えば、幹細胞または幹細胞集団が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて幹細胞または幹細胞集団が通常結合する胎盤細胞の少なくとも５０％から分離された後）、幹細胞または幹細胞集団をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて増殖し拡大培養することができる。例えば、幹細胞が７０〜９０％のコンフルエンスまで増殖するのに十分な時間にわたり、すなわち、幹細胞およびその子孫細胞が組織培養容器の培養表面積の７０〜９０％を占めるまで、組織培養容器、例えば、皿、フラスコ、マルチウェルプレートなどにおいて胎盤幹細胞集団を培養することができる。
【０１３５】
胎盤幹細胞は、細胞増殖を可能とする密度で培養容器内に播種することができる。例えば、細胞は、低密度（例えば、約１，０００〜約５，０００個／ｃｍ２）〜高密度（例えば、約５０，０００個／ｃｍ２以上）で播種できる。好ましい実施形態では、細胞は、空気中のＣＯ２容量約０〜約５パーセントで培養される。一部の好ましい実施形態では、細胞は、空気中に約２〜約２５パーセントのＯ２で、好ましくは、空気中に約５〜約２０パーセントのＯ２で培養される。細胞は、好ましくは、約２５℃〜約４０℃、好ましくは、３７℃で培養される。細胞は、インキュベータ内で培養されることが好ましい。培地は、静置してもよく、例えば、培養槽を用いて撹拌してもよい。胎盤幹細胞は、低度の酸化ストレス（例えば、グルタチオン、アスコルビン酸、カタラーゼ、トコフェロール、Ｎ−アセチルシステインなどの添加による）下で増殖させることが好ましい。
【０１３６】
７０％〜９０％のコンフルエンスが得られた後、細胞を継代することができる。例えば、細胞を酵素的に処理、例えば、当技術分野で周知の技術を使用してトリプシン処理し、組織培養表面から分離することができる。ピペッティングにより細胞を除去し、細胞をカウントした後、約２０，０００〜１００，０００個の幹細胞、好ましくは、約５０，０００個の幹細胞を、新鮮な培地を含有する新規の培養容器に継代する。典型的には、新規の培地は、幹細胞を除去した培地と同じ種類である。本明細書ではまた、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、または２０倍以上継代された胎盤幹細胞集団が提供される。
【０１３７】
５．５．３  胎盤幹細胞集団
一態様では、胎盤幹細胞および胎盤幹細胞集団は、分化した細胞、例えば、肝細胞および／または肝臓形成細胞、または軟骨細胞および／または軟骨形成細胞の供給源として使用される。胎盤幹細胞集団は、１つまたは複数の胎盤から直接に単離することができる、すなわち、胎盤幹細胞集団は、灌流液から得られるもしくは灌流液中に含有される、または、消化物（すなわち、胎盤またはその一部の酵素的消化により得られる細胞回収物）から得られるもしくは消化物中に含有される、胎盤幹細胞を含む胎盤細胞集団でありうる。本明細書に記載の単離胎盤幹細胞はまた、培養および拡大培養して、胎盤幹細胞集団を作製することもできる。胎盤幹細胞を含む胎盤細胞集団または培養および拡大培養して胎盤幹細胞集団を作製することもできる。
【０１３８】
本明細書で提供される胎盤幹細胞集団は、胎盤幹細胞、例えば、本明細書に記載の胎盤幹細胞を含む。様々な実施形態では、単離胎盤幹細胞集団中で少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の細胞が、胎盤幹細胞である。すなわち、胎盤幹細胞集団は、例えば、最大で１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％の非幹細胞を含みうる。
【０１３９】
本明細書ではさらに、例えば、酵素的な消化または灌流のいずれに由来するのであれ、特定のマーカーおよび／または特定の培養特徴もしくは特定の形態的特徴を発現する胎盤幹細胞を選択することにより、単離胎盤幹細胞集団を作製する方法が提供される。このような胎盤幹細胞を使用して、例えば、肝細胞および／または肝臓形成細胞、または未分化の胎盤幹細胞と胎盤幹細胞から分化した肝臓形成細胞および／または肝細胞との混合集団、あるいは軟骨細胞および／または軟骨形成細胞、または、未分化の胎盤幹細胞と軟骨細胞および／または軟骨形成細胞との混合集団を作製することができる。
【０１４０】
胎盤幹細胞を含む細胞集団は、種々の異なる形で作製することができる。一実施形態では、例えば、胎盤幹細胞を含む細胞集団は、（ａ）基質に接着し、（ｂ）ＣＤ２００およびＨＬＡ−Ｇを発現する胎盤細胞を選択すること；および、細胞集団を形成するために前記細胞を他の細胞から単離すること；により作製することができる。別の実施形態では、細胞集団を作製する方法は、（ａ）基質に接着し、（ｂ）ＣＤ７３、ＣＤ１０５、およびＣＤ２００を発現する胎盤細胞を選択すること；および、細胞集団を形成するために前記細胞を他の細胞から単離すること；を含む。別の実施形態では、細胞集団を作製する方法は、（ａ）基質に接着し、（ｂ）ＣＤ２００およびＯＣＴ−４を発現する胎盤細胞を選択すること；および、細胞集団を形成するために前記細胞を他の細胞から単離すること；を含む。別の実施形態では、細胞集団を作製する方法は、（ａ）基質に接着し、（ｂ）ＣＤ７３およびＣＤ１０５を発現し、（ｃ）胚様体の形成を可能とする条件下で前記幹細胞を含む胎盤細胞集団を培養したときに前記集団における１つまたは複数の胚様体の形成を促進する胎盤細胞を選択すること；および、細胞集団を形成するために前記細胞を他の細胞から単離すること；を含む。別の実施形態では、細胞集団を作製する方法は、（ａ）基質に接着し、（ｂ）ＣＤ７３、ＣＤ１０５、およびＨＬＡ−Ｇを発現する胎盤細胞を選択すること；および、細胞集団を形成するために前記細胞を他の細胞から単離すること；を含む。別の実施形態では、細胞集団を作製する方法は、（ａ）基質に接着し、（ｂ）ＯＣＴ−４を発現し、（ｃ）胚様体の形成を可能とする条件下で前記幹細胞を含む胎盤細胞集団を培養したときに、前記集団における１つまたは複数の胚様体の形成を促進する胎盤細胞を選択すること；および、細胞集団を形成するために前記細胞を他の細胞から単離すること；を含む。上記の実施形態のいずれにおいても、その方法は、ＡＢＣ−ｐ（胎盤特異的なＡＢＣトランスポータータンパク質；例えば、Ａｌｌｉｋｍｅｔｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、第５８巻、第２３号、５３３７〜９頁（１９９８）を参照されたい）を発現する胎盤細胞を選択することをさらに含んでよい。その方法はまた、例えば、間葉系幹細胞に特異的な少なくとも１つの特徴、例えば、ＣＤ２９の発現、ＣＤ４４の発現、ＣＤ９０の発現、または前出の組合せの発現を示す細胞を選択することを含んでもよい。
【０１４１】
細胞集団を作製する上記の実施形態のいずれにおいても、結果として生じる細胞集団は、細胞または集団の、例えば、肝細胞、肝臓形成細胞、軟骨細胞、または軟骨細胞性細胞を作製する能力をさらに評価されうる。
【０１４２】
上記の実施形態において、基質は、細胞（例えば、胎盤幹細胞）の培養および／または選択の任意の表面でありうる。典型的には、基質はプラスチック、例えば、プラスチック製の組織培養皿またはマルチウェルプレートである。プラスチック製組織培養器具は、生体分子、例えば、ラミニンまたはフィブロネクチンでコートすることができる。
【０１４３】
細胞、例えば、胎盤幹細胞は、当技術分野で知られる細胞選択の任意の手段により、胎盤幹細胞集団用に選択することができる。例えば、細胞は、例えば、フローサイトメトリー法またはＦＡＣＳ法における１つまたは複数の細胞表面マーカーに対する１つまたは複数の抗体を用いて選択することができる。選択は、磁性ビーズと組み合わせた抗体を用いて実施することができる。当技術分野では、特定の幹細胞関連マーカーに特異的な抗体が知られている。例えば、ＯＣＴ−４に対する抗体（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、ＣＤ２００に対する抗体（Ａｂｃａｍ）、ＨＬＡ−Ｇに対する抗体（Ａｂｃａｍ）、ＣＤ７３に対する抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＣＤ１０５に対する抗体（Ａｂｃａｍ；ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｓａｃｏ、ＭＥ）などである。他のマーカーに対する抗体もまた市販され、例えば、ＣＤ３４、ＣＤ３８、およびＣＤ４５は、例えば、ＳｔｅｍＣｅｌｌ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓまたはＢｉｏＤｅｓｉｇｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから入手できる。
【０１４４】
単離胎盤幹細胞集団は、幹細胞でない胎盤細胞、または胎盤細胞でない細胞を含みうる。
【０１４５】
単離胎盤幹細胞集団は、１つまたは複数の非幹細胞集団または非胎盤細胞集団と組み合わせることができる。例えば、単離胎盤幹細胞集団は、血液（例えば、胎盤血または臍帯血）、血液由来幹細胞（例えば、胎盤血または臍帯血に由来する幹細胞）、血液由来有核細胞集団、骨髄由来間葉系細胞、骨由来幹細胞集団、粗骨髄、成体（体性）幹細胞、組織内に含有される幹細胞集団、培養幹細胞、完全に分化した細胞（例えば、軟骨細胞、線維芽細胞、羊膜細胞、骨芽細胞、筋細胞、心臓細胞など）の集団などと組み合わせることができる。単離胎盤幹細胞集団内の細胞は、各集団内における総有核細胞数を比較して、約１００，０００，０００：１、５０，０００，０００：１、２０，０００，０００：１、１０，０００，０００：１、５，０００，０００：１、２，０００，０００：１、１，０００，０００：１、５００，０００：１、２００，０００：１、１００，０００：１、５０，０００：１、２０，０００：１、１０，０００：１、５，０００：１、２，０００：１、１，０００：１、５００：１、２００：１、１００：１、５０：１、２０：１、１０：１、５：１、２：１、１：１、１：２、１：５、１：１０、１：１００、１：２００、１：５００、１：１，０００、１：２，０００、１：５，０００、１：１０，０００、１：２０，０００、１：５０，０００、１：１００，０００、１：５００，０００、１：１，０００，０００、１：２，０００，０００、１：５，０００，０００、１：１０，０００，０００、１：２０，０００，０００、１：５０，０００，０００、または約１：１００，０００，０００の比率で、複数の別の種類の細胞と組み合わせることができる。単離胎盤幹細胞集団内における細胞は、複数の細胞種類の複数の細胞とも同様に組み合わせることができる。
【０１４６】
一態様では、単離胎盤幹細胞集団を、複数の造血幹細胞と組み合わせる。このような造血幹細胞は、例えば、未加工の胎盤血、臍帯血、または末梢血中；胎盤血、臍帯血、または末梢血からの総有核細胞中；胎盤血、臍帯血、または末梢血から単離されたＣＤ３４＋細胞集団内；未加工の骨髄中；骨髄からの総有核細胞中；骨髄から単離されたＣＤ３４＋細胞集団内などに含有されうる。
【０１４７】
本明細書で提供される組成物および方法と関連して使用できるさらなる胎盤幹細胞および胎盤幹細胞集団は、例えば、各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願第１１／６４８，８１３号および米国仮出願第６０／８４６，６４１号中で説明されている。
【０１４８】
５．５．４  肝臓細胞への分化の誘導
胎盤幹細胞の肝臓細胞への分化は、例えば、胎盤幹細胞を、肝臓細胞への分化を誘導する細胞培養条件下に置くことにより達成することができる。具体的な実施形態では、胎盤幹細胞が肝細胞または肝臓形成細胞の１つまたは複数の特徴を示すのに十分な時間にわたり、胎盤幹細胞を酪酸ナトリウムと接触させる。
【０１４９】
肝臓形成培地の例は、酪酸ナトリウムを補充したＤＭＥＭ培地を含む。細胞は、例えば、１４〜２８日間にわたり培養し、３〜４日ごとにリフィーディングした。分化は、例えば、（未分化の胎盤幹細胞と比べて）増加したサイトケラチン１８の生成についてアッセイすることにより確認することができる。典型的には、胎盤幹細胞は、サイトケラチン１８を発現するが、肝細胞により発現される少なくとも１つの他のサイトケラチンを発現しない。分化はまた、アシアロ糖タンパク質受容体、アルファ−１−アンチトリプシン、アルブミン、およびシトクロムＰ４５０活性の１つまたは複数の存在によっても確認することができる。胎盤幹細胞がこれらの特徴の１つまたは複数を示すとき、その細胞は肝臓細胞に分化したと考えられる。
【０１５０】
一態様では、本明細書で、例えば、酵素的な消化または灌流のいずれに由来するのであれ、特定のマーカーおよび／または特定の培養特徴もしくは特定の形態的特徴を発現する複数の胎盤幹細胞を選択することと、前記胎盤幹細胞の少なくとも一部の肝細胞および／または肝臓形成細胞への分化を引き起こす条件にこのような細胞を曝露することとにより、肝細胞および／または肝臓形成細胞集団を作製し単離する方法が提供される。一実施形態では、例えば、本明細書では、（１）（ａ）基質に接着し、（ｂ）ＣＤ２００およびＨＬＡ−Ｇを発現し、またはＣＤ７３、ＣＤ１０５、およびＣＤ２００を発現し、またはＣＤ２００およびＯＣＴ−４を発現し、またはＣＤ７３、ＣＤ１０５およびＨＬＡ−Ｇを発現し、またはＣＤ７３およびＣＤ１０５を発現し、胚様体の形成を可能とする条件下で前記幹細胞を含む胎盤細胞集団を培養したときに前記集団における１つまたは複数の胚様体の形成を促進し、またはＯＣＴ−４を発現し、（ｃ）胚様体の形成を可能とする条件下で前記幹細胞を含む胎盤細胞集団を培養したときに前記集団における１つまたは複数の胚様体の形成を促進する、胎盤細胞を選択すること；（２）前記胎盤細胞を他の胎盤細胞から単離；検出可能な数の前記肝細胞および／または肝臓形成細胞を作製するのに十分な時間にわたり前記細胞を酪酸ナトリウムに曝露すること；を含む、肝細胞および／または肝臓形成細胞を作製する方法が提供される。特定の実施形態では、胎盤幹細胞は、ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋およびＣＤ２００＋である。
【０１５１】
上記方法の種々の具体的な実施形態では、少なくとも、または約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の前記胎盤幹細胞が、前記肝細胞および／または肝臓形成細胞に分化する。その方法の上記の任意の実施形態の別の具体的な実施形態では、複数の前記胎盤細胞が、未分化の胎盤幹細胞と比べて検出可能なサイトケラチン１８の生成の増加、検出可能な量のアシアロ糖タンパク質受容体、または検出可能な量のシトクロムＰ４５０  ７Ａ１活性、検出可能な量のアルブミン、またはアルブミンをコードする遺伝子の検出可能な量の発現を示すのに十分な時間にわたり、前記細胞を酪酸ナトリウムに曝露する。別の特定の実施形態では、
【０１５２】
５．５．５  軟骨細胞性細胞への分化の誘導
接着性胎盤幹細胞の軟骨形成分化は、例えば、軟骨細胞への分化を誘導する細胞培養条件下に胎盤幹細胞を置くことにより達成することができる。好ましい軟骨形成培地は、１５％の臍帯血血清を補充したＭＳＣＧＭ培地（Ｃａｍｂｒｅｘ）またはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を含む。一実施形態では、胎盤幹細胞を無菌のポリプロピレン製チューブに分注し、（例えば、１５０×ｇで５分間にわたり）遠心分離し、不完全軟骨形成培地（Ｃａｍｂｒｅｘ）中で２回洗浄した。細胞は、０．０１μｇ／ｍｌの形質転換成長因子ベータ−３（ＴＧＦ−β３）を含有する完全軟骨形成培地（Ｃａｍｂｒｅｘ）中に、約１〜２０×１０５個／ｍｌの濃度で再懸濁させた。他の実施形態では、胎盤幹細胞を、アスコルビン酸を伴いまたは伴わずに、外因性成長因子、例えば、ＧＤＦ−５またはＴＧＦ−β３と接触させた。
【０１５３】
軟骨形成培地の別の例は、ＤＭＥＭ、１％ＦＢＳ、インスリン、アスコルビン酸−２−リン酸、およびＴＧＦ−β１を含む。同様の軟骨形成培地は、１Ｌ中に、ＤＭＥＭ、１％ＦＢＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、３７．５μｇ／ｍｌのアスコルビン酸−２−リン酸、ＩＴＳプレミックス（例えば、１００ｍｇのインスリン、１００ｍｇのトランスフェリン、および１００ｐｇのセレン酸ナトリウムを含む）、および１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−１を含む。軟骨形成培地の別の例は、１００ｎＭのデキサメタゾンおよび１０ｎｇ／ｍｌの形質転換成長因子β３（ＴＧＦ−β３）を含む規定培地（哺乳動物の細胞培養に適する任意の標準的な規定培地）である。
【０１５４】
軟骨形成培地には、プロリンおよびグルタミンを含むアミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、デキサメタゾン、アスコルビン酸、およびインスリン／トランスフェリン／セレニウムを補充することができる。軟骨形成培地には、水酸化ナトリウムおよび／またはコラーゲンを補充することができる。
【０１５５】
接着性胎盤幹細胞は、高密度または低密度で培養しうる。細胞は、血清の不在下で培養することが好ましい。胎盤幹細胞は、静的な軟骨細胞分化誘導条件下、または動的な軟骨細胞分化誘導条件下、例えば、培地を細胞の周囲で循環させる条件下で培養することができる。細胞培養は、検出可能な量の分化が生じるように行うことができる。具体的な実施形態では、接着性胎盤幹細胞は、軟骨細胞分化誘導条件下で、約２８日間〜約５６日間にわたり培養される。
【０１５６】
接着性胎盤幹細胞は、電気紡糸されたマイクロ繊維またはナノ繊維の不織マット上に該細胞を播種することと、細胞を軟骨細胞分化誘導条件下で培養することとにより、軟骨細胞または軟骨細胞性細胞に分化するよう誘導することができる。このようなマットおよびこれらの作製は、本明細書の第５．７．１．４節で説明する。
【０１５７】
軟骨形成は、例えば、グリコサミノグリカン発現に対するサフラニン−Ｏ染色による好酸性基質生成の観察、グリコサミノグリカン発現を判定するメチレンブルー染料の結合、細胞形態を評価するヘマトキシリン／エオシン染色、ならびに／またはコラーゲン２およびコラーゲン９遺伝子発現のＲＴ／ＰＣＲ法による確認またはこれに対する染色により評価することができる。軟骨細胞分化はまた、例えば、懸濁液中の幹細胞をゆるやかに遠心分離（例えば、約８００ｇで約５分間にわたり）することにより形成されるペレット中で幹細胞を増殖させることにより観察することができる。約１〜２８日後には、幹細胞のペレットが強固なマトリックスを形成し始め、負荷をかけるとそのペレットが脱落しがちである非誘導細胞株または非軟骨形成細胞株では見出されない、構造的な完全性を示す。軟骨細胞分化はまた、例えば、コラーゲンを染色する染料、例えば、シリウスレッド、および／またはグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を染色する、例えば、アルシアンブルー（また、アルシアンブルー８ＧＸ、イングレインブルー１、またはＣ．Ｉ．７４２４０とも呼ばれる）などの染料により染色することにより、このような細胞ペレット中でも実証することができる。胎盤幹細胞がこれらの特徴の１つまたは複数を示す場合に、該細胞は軟骨細胞性細胞に分化したと考えられる。軟骨細胞分化はまた、遺伝子発現の判定、例えば初期段階の軟骨細胞分化マーカーであるフィブロモジュリンおよび軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質に対する遺伝子発現；中期段階の軟骨細胞分化マーカーであるアグレカン、ベルシカン、デコリン、およびビグリカンに対する遺伝子発現；ならびに、成熟軟骨細胞のマーカーであるＩＩ型およびＸ型コラーゲンとコンドロアドヘリンとに対する遺伝子発現；リアルタイムＰＣＲ法によっても評価することができる。
【０１５８】
５．６  胎盤幹細胞の保存
胎盤幹細胞およびこれらから分化した細胞、例えば、肝細胞および／または肝臓形成細胞、軟骨細胞および／または軟骨細胞性細胞は、保存することができ、すなわち、長期保存を可能とする条件下、または、例えば、アポトーシスもしくは壊死による細胞死を阻害する条件下に置くことができる。
【０１５９】
胎盤幹細胞およびこれらから分化した細胞、例えば、肝細胞および／または肝臓形成細胞、軟骨細胞および／または軟骨細胞性細胞は、例えば、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ  Ｐｌａｃｅｎｔａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ  Ｏｒｇａｎｓ」という名称の２００６年１２月２８日に出願された関連する米国出願第１１／６４８，８１２号で説明される通り、アポトーシス阻害剤、壊死阻害剤、および／または酸素運搬ペルフルオロカーボンを含む組成物を使用して保存することができる。一実施形態では、本明細書で、細胞、例えば、胎盤幹細胞、ならびに／または、これらから分化した肝細胞および／または肝臓形成細胞、軟骨細胞および／または軟骨細胞性細胞の集団を保存する方法であって、前記細胞をアポトーシス阻害剤および酸素運搬ペルフルオロカーボンを含む幹細胞回収組成物と接触させることを含み、アポトーシス阻害剤と接触していない幹細胞集団と比較して、幹細胞集団におけるアポトーシスを低減または阻止するのに十分な量で十分な時間にわたり前記アポトーシス阻害剤が存在する方法が提供される。具体的な実施形態では、前記アポトーシス阻害剤は、カスパーゼ阻害剤である。別の具体的な実施形態では、前記アポトーシス阻害剤は、ＪＮＫ阻害剤である。より具体的な実施形態では、前記ＪＮＫ阻害剤は、前記細胞の分化または増殖を調節しない。別の実施形態では、前記幹細胞回収組成物は、前記アポトーシス阻害剤および前記酸素運搬ペルフルオロカーボンを個別の相で含む。別の実施形態では、前記幹細胞回収組成物は、前記アポトーシス阻害剤および前記酸素運搬ペルフルオロカーボンを乳剤中に含む。別の実施形態では、前記幹細胞回収組成物は、乳化剤、例えば、レシチンをさらに含む。別の実施形態では、前記アポトーシス阻害剤および前記ペルフルオロカーボンは、細胞への接触時において、約０℃〜約２５℃である。別のより具体的な実施形態では、前記アポトーシス阻害剤および前記ペルフルオロカーボンは、細胞への接触時において、約２℃〜約１０℃、または約２℃〜約５℃である。別のより具体的な実施形態では、前記接触は、前記幹細胞集団の移送時に実施する。別のより具体的な実施形態では、前記接触は、前記幹細胞集団の凍結および融解時に実施する。
【０１６０】
別の実施形態では、本明細書で、胎盤幹細胞集団、ならびに／または、これらから分化した肝細胞および／または肝臓形成細胞、軟骨細胞および／または軟骨細胞性細胞を保存する方法であって、前記細胞集団をアポトーシス阻害剤および臓器保存化合物と接触させることを含み、アポトーシス阻害剤と接触していない細胞集団と比較して、細胞集団におけるアポトーシスを低減または阻止するのに十分な量で十分な時間にわたり前記アポトーシス阻害剤が存在する方法が提供される。具体的な実施形態では、臓器保存化合物は、ＵＷ溶液（米国特許第４，７９８，８２４号に説明され、ＶＩＡＳＰＡＮ（登録商標）としても知られる；Ｓｏｕｔｈａｒｄら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、第４９巻、第２号、２５１〜２５７頁（１９９０）もまた参照されたい）またはＳｔｅｒｎら、米国特許第５，５５２，２６７号に説明される溶液である。別の実施形態では、前記臓器保存化合物は、ヒドロキシエチルデンプン、ラクトビオン酸、ラフィノース、またはこれらの組合せである。別の実施形態では、幹細胞回収組成物は、２相でまたは乳剤として、酸素運搬ペルフルオロカーボンをさらに含む。
【０１６１】
その方法の別の実施形態では、灌流時に、胎盤幹細胞をアポトーシス阻害剤および酸素運搬ペルフルオロカーボン、臓器保存化合物、またはこれらの組合せを含む幹細胞回収組成物と接触させる。別の実施形態では、組織破壊、例えば、酵素的消化の工程中に、前記細胞を接触させる。別の実施形態では、胎盤幹細胞を、灌流による回収後、または組織破壊、例えば、酵素的消化による回収後における前記幹細胞回収化合物と接触させる。
【０１６２】
典型的には、胎盤細胞の回収、濃縮、および単離時において、低酸素ストレスおよび機械的ストレスに起因する細胞ストレスを最小化または除去することが好ましい。したがって、その方法の別の実施形態では、幹細胞または幹細胞集団が回収、濃縮、または単離時に低酸素状態に曝露されるのは、６時間未満の前記保存時であり、ここで低酸素状態とは、通常の血中酸素濃度未満の酸素濃度である。より具体的な実施形態では、該幹細胞集団が該低酸素状態に曝露されるのは、２時間未満の該保存時である。別のより具体的な実施形態では、前記幹細胞集団が回収、濃縮、または単離時に該低酸素状態に曝露されるのは１時間未満、もしくは３０分間未満であるか、または、前記細胞集団は低酸素状態に曝露されない。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞集団は、回収、濃縮、または単離時にせん断応力に曝露されない。
【０１６３】
本明細書で提供される組成物および方法において用いられる胎盤幹細胞は、例えば、小型容器、例えば、アンプル内における低温保存用培地中で低温保存することができる。適切な低温保存培地は、例えば、増殖培地、または細胞凍結培地、例えば、市販される細胞凍結培地、例えば、Ｃ２６９５培地、Ｃ２６３９培地、またはＣ６０３９培地（Ｓｉｇｍａ）を含む培地を含むがこれらに限られない。低温保存培地は、例えば、約１０％（ｖ／ｖ）の濃度でＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を含むことが好ましい。低温培地は、さらなる作用物質、例えば、メチルセルロースおよび／またはグリセロールを含みうる。胎盤幹細胞は、低温保存時に約１℃／分で冷却されることが好ましい。好ましい低温保存温度は、約−８０℃〜約−１８０℃、好ましくは、約−１２５℃〜約−１４０℃である。低温保存された細胞は、融解して使用する前に液体窒素に移すことができる。一部の実施形態では、例えば、アンプルが約−９０℃に達した後、その細胞を液体窒素による保存領域に移す。低温保存された細胞は、約２５℃〜約４０℃の温度、好ましくは約３７℃の温度で融解させることが好ましい。
【０１６４】
５．７  胎盤幹細胞の使用
５．７．１  胎盤幹細胞を含む組成物
本明細書に記載の方法では、胎盤幹細胞、またはそれ由来の生体分子を含む組成物を使用することができる。同様にして、本明細書に記載の複数の胎盤幹細胞集団は、例えば、研究または治療において用いる、任意の生理的に許容されるまたは医療的に許容される化合物、組成物、または機器と組み合わせることができる。
【０１６５】
５．７．１．１  低温保存された胎盤幹細胞
本明細書に記載の胎盤幹細胞集団は、保存する、例えば、後の使用のために低温保存することができる。幹細胞などの細胞の低温保存法は、当技術分野でよく知られている。胎盤幹細胞集団は、個体に容易に投与される形態で調製することができる。例えば、本明細書では、医療用に適する容器内に含有される胎盤幹細胞集団が提供される。このような容器は、例えば、無菌のプラスチック製バッグ、フラスコ、ジャー、または、胎盤幹細胞集団を容易に分注しうる他の容器でありうる。例えば、このような容器は、レシピエントに対する液体の静脈内投与に適する血液バッグ、または他のプラスチック製の医療的に許容されるバッグでありうる。容器は、複合幹細胞集団の低温保存を可能とする容器であることが好ましい。
【０１６６】
低温保存された胎盤幹細胞集団は、単独のドナー、または複数のドナーに由来する胎盤幹細胞を含みうる。胎盤幹細胞集団は、意図されるレシピエントに対してＨＬＡが完全に適合してもよく、ＨＬＡが部分的に適合してもよく、ＨＬＡが適合しなくてもよい。
【０１６７】
低温保存された胎盤幹細胞は、例えば、容器内に胎盤幹細胞集団を含む組成物の形態でありうる。具体的な実施形態では、幹細胞集団は、低温保存される。別の具体的な実施形態では、容器は、バッグ、フラスコ、またはジャーである。より具体的な実施形態では、前記バッグは、無菌のプラスチック製バッグである。より具体的な実施形態では、前記バッグは、前記胎盤幹細胞集団の静脈内投与に適する、またはこれを可能もしくは容易にする。前記バッグは、相互に接続されて胎盤幹細胞と、１つまたは複数の他の溶液、例えば、薬剤とを投与前、または投与時に混合することを可能とする、複数の管腔または区画を含みうる。別の具体的な実施形態では、組成物は、複合幹細胞集団の低温保存を容易とする１つまたは複数の化合物を含む。別の具体的な実施形態では、前記胎盤幹細胞集団は、生理的に許容される水溶液中に含有される。より具体的な実施形態では、前記生理的に許容される水溶液は、０．９％のＮａＣｌ溶液である。別の具体的な実施形態では、前記胎盤幹細胞集団は、前記幹細胞集団レシピエントに対してＨＬＡが適合する胎盤細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記複合幹細胞集団は、前記幹細胞集団レシピエントに対してＨＬＡが少なくとも部分的に適合する胎盤細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記胎盤幹細胞は、複数のドナーに由来する。
【０１６８】
５．７．１．２  医薬組成物
胎盤幹細胞集団または胎盤幹細胞を含む細胞集団は、ｉｎ  ｖｉｖｏで用いる医薬組成物に製剤化することができる。このような医薬組成物は、薬学的に許容される担体、例えば、生理食塩液、または、ｉｎ  ｖｉｖｏでの投与に許容される、他の生理的に許容される溶液中に胎盤幹細胞集団または胎盤幹細胞を含む細胞集団を含む。本明細書で提供される胎盤幹細胞を含む医薬組成物は、本明細書の他の箇所で説明される任意の胎盤幹細胞集団、または胎盤幹細胞型を含みうる。医薬組成物は、胎性胎盤幹細胞、母系胎盤幹細胞、または胎性と母系両方の胎盤幹細胞を含みうる。医薬組成物は、単独の個体もしくは胎盤、または複数の個体もしくは胎盤から得られる胎盤幹細胞をさらに含みうる。
【０１６９】
医薬組成物は、任意の個数の胎盤幹細胞を含みうる。例えば、単回用量単位の胎盤幹細胞は、様々な実施形態では、少なくとも、約１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、ｌ×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、１×１０１１個以上またはこれ以下の胎盤幹細胞を含みうる。
【０１７０】
医薬組成物は、５０％以上の生細胞（すなわち、集団内で少なくとも５０％の細胞が機能的であるかまたは生存している）を含む細胞集団を含みうる。集団内で少なくとも６０％の細胞が生細胞であることが好ましい。医薬組成物中の集団内で少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の細胞が生細胞であることがより好ましい。
【０１７１】
本明細書で提供される医薬組成物は、例えば、生着を容易にする１つまたは複数の化合物（例えば、抗Ｔ細胞受容体抗体、免疫抑制剤など）；アルブミン、デキストラン４０、ゼラチン、ヒドロキシエチルデンプンなどの安定剤を含みうる。
【０１７２】
５．７．１．３  胎盤幹細胞馴化培地
本明細書で提供される胎盤幹細胞を用いて、馴化培地、すなわち、幹細胞により分泌または排出される１つまたは複数の生体分子を含む培地を作製することができる。様々な実施形態では、馴化培地は、胎盤幹細胞が少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日間以上にわたり増殖した培地を含む。他の実施形態では、馴化培地は、胎盤幹細胞が少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％のコンフルエンス、または１００％までのコンフルエンスに増殖した培地を含む。このような馴化培地を用いて、別個の胎盤幹細胞集団または別の種類の幹細胞集団の培養を支援することができる。別の実施形態では、馴化培地は、胎盤幹細胞が成体細胞型に分化した培地を含む。別の実施形態では、馴化培地は、胎盤幹細胞および非胎盤幹細胞が培養された培地を含む。
【０１７３】
したがって、一実施形態では、本明細書で、培地、例えば、接着性胎盤幹細胞培養物からの馴化培地を含む組成物であって、前記接着性胎盤幹細胞が（ａ）基質に接着し、（ｂ）ＣＤ２００およびＨＬＡ−Ｇを発現し、またはＣＤ７３、ＣＤ１０５、およびＣＤ２００を発現し、またはＣＤ２００およびＯＣＴ−４を発現し、またはＣＤ７３、ＣＤ１０５、およびＨＬＡ−Ｇを発現し、またはＣＤ７３およびＣＤ１０５を発現し、該集団が胚様体の形成を可能とする条件下で胎盤幹細胞を含む胎盤細胞集団を培養したときに前記集団における１つまたは複数の胚様体の形成を促進し、またはＯＣＴ−４を発現し、胚様体の形成を可能とする条件下で胎盤幹細胞を含む胎盤細胞集団を培養したときに前記集団における１つまたは複数の胚様体の形成を促進し、前記胎盤幹細胞の培養物が２４時間以上にわたって前記培地中で培養された組成物が提供される。具体的な実施形態では、前記組成物は、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５−胎盤幹細胞により馴化された培地を含む。別の具体的な実施形態では、組成物は、複数の前記胎盤幹細胞、例えば、複数の接着性胎盤幹細胞および／または複数の非接着性ＣＤ３４＋、ＣＤ４５−胎盤幹細胞をさらに含む。別の具体的な実施形態では、組成物は、複数の非胎盤細胞を含む。より具体的な実施形態では、前記非胎盤細胞は、ＣＤ３４＋細胞、例えば、末梢血造血前駆細胞、臍帯血造血前駆細胞、または胎盤血造血前駆細胞などの非胎盤供給源に由来する造血前駆細胞を含む。非胎盤細胞はまた、間葉系幹細胞、例えば、骨髄由来間葉系幹細胞などの他の幹細胞も含みうる。非胎盤細胞はまた、１つまたは複数の型の成体細胞または細胞株でもありうる。別の具体的な実施形態では、組成物は、抗増殖剤、例えば、抗ＭＩＰ−１α抗体または抗ＭＩＰ−１β抗体を含む。
【０１７４】
別の実施形態では、馴化培地は、胎盤幹細胞から分化した肝細胞、肝臓形成細胞、軟骨細胞、および／または軟骨細胞性細胞の集団により馴化された培地であるかまたはこれを含む。このような集団は、胎盤幹細胞、胎盤幹細胞から分化した肝臓形成細胞もしくは軟骨形成細胞、胎盤幹細胞から分化した肝細胞もしくは軟骨細胞、または以上の任意の組合せを含みうる。したがって、一実施形態では、本明細書で、胎盤幹細胞から分化した肝細胞、肝臓形成細胞、軟骨細胞、および／または軟骨細胞性細胞の培養物からの培地を含む組成物であって、該胎盤幹細胞が（ａ）基質に接着し；（ｂ）ＣＤ２００およびＨＬＡ−Ｇを発現し、またはＣＤ７３、ＣＤ１０５、およびＣＤ２００を発現し、またはＣＤ２００およびＯＣＴ−４を発現し、またはＣＤ７３、ＣＤ１０５、およびＨＬＡ−Ｇを発現し、またはＣＤ７３およびＣＤ１０５を発現し、胚様体の形成を可能とする条件下で胎盤幹細胞を含む胎盤細胞集団を培養したときに前記集団における１つまたは複数の胚様体の形成を促進するか、またはＯＣＴ−４を発現し、胚様体の形成を可能とする条件下で胎盤幹細胞を含む胎盤細胞集団を培養したときに前記集団における１つまたは複数の胚様体の形成を促進し、前記肝細胞、肝臓形成細胞、軟骨細胞、および／または軟骨細胞性細胞の培養物が２４時間以上にわたって前記培地中で培養された組成物が提供される。具体的な実施形態では、組成物は、複数の前記胎盤幹細胞をさらに含む。別の具体的な実施形態では、組成物は、複数の非胎盤細胞、例えば、初代培養物からの肝細胞、肝細胞株の細胞、肝癌細胞などを含む。より具体的な実施形態では、前記非胎盤細胞は、ＣＤ３４＋細胞、例えば、末梢血造血前駆細胞、臍帯血造血前駆細胞、または胎盤血造血前駆細胞などの造血前駆細胞を含む。非胎盤細胞はまた、間葉系幹細胞、例えば、骨髄由来間葉系幹細胞などの他の幹細胞も含みうる。非胎盤細胞はまた、１つまたは複数の成体細胞または細胞株でありうる。別の具体的な実施形態では、組成物は、抗増殖剤、例えば、抗ＭＩＰ−１α抗体または抗ＭＩＰ−１β抗体を含む。
【０１７５】
５．７．１．４  胎盤幹細胞を含むマトリックス
別の態様では、本明細書で、本明細書に記載の接着性胎盤幹細胞から分化した肝細胞、肝臓形成細胞、軟骨細胞、および／または軟骨細胞性細胞の集団を含む、マトリックス、ヒドロゲル、足場などが提供される。
【０１７６】
胎盤幹細胞または、胎盤幹細胞から分化した肝細胞、肝臓形成細胞、軟骨細胞、および／または軟骨細胞性細胞は、天然のマトリックス、例えば、羊膜材料などの胎盤生物材料上に播種することができる。このような羊膜材料は、例えば、哺乳動物胎盤から直接に切除された羊膜、固定または熱処理された羊膜、実質的に乾燥した（すなわち、＜２０％Ｈ２Ｏの）羊膜、絨毛膜、実質的に乾燥した絨毛膜、実質的に乾燥した羊膜および絨毛膜などでありうる。胎盤幹細胞を播種しうる好ましい胎盤生物材料については、Ｈａｒｉｒｉ、米国出願公開第２００４／００４８７９６号において説明されている。
【０１７７】
胎盤幹細胞またはこれらから分化した細胞、例えば、肝細胞、肝臓形成細胞、軟骨細胞、および／または軟骨細胞性細胞は、例えば、注入に適するヒドロゲル溶液中に懸濁させることができる。このような組成物に適するヒドロゲルは、ＲＡＤ１６などの自己集合ペプチドを含む。一実施形態では、細胞を含むヒドロゲル溶液は、例えば鋳型内で固めて、その中に細胞を分散させて移植するためのマトリックスを形成させることができる。このようなマトリックス内の細胞はまた、移植前に分裂により拡大培養できるように培養することができる。ヒドロゲルは、例えば、共有結合、イオン結合、または水素結合を介して架橋され、水分子を取り込んでゲルを形成する三次元的開格子構造を形成する有機重合体（天然または合成）でありうる。ヒドロゲル形成材料は、アルギネートおよびその塩などの多糖類、ペプチド、ポリホスファジン、および、イオン的に架橋されるポリアクリレート、または、それぞれ、温度もしくはｐＨにより架橋される、ポリエチレンオキシド−ポリプロピレングリコールブロック共重合体などのブロック重合体を含む。一部の実施形態では、ヒドロゲルまたはマトリックスは、生体分解性である。
【０１７８】
一部の実施形態では、製剤は、ｉｎ  ｓｉｔｕで重合化されるゲル（例えば、米国特許出願公開第２００２／００２２６７６号；Ａｎｓｅｔｈら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ、第７８巻、第１−３号、１９９〜２０９頁（２００２）；Ｗａｎｇら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、第２４巻、第２２号、３９６９〜８０頁（２００３）を参照されたいを含む。
【０１７９】
一部の実施形態では、重合体は、水、緩衝塩溶液、または帯電した側鎖基もしくはその１価イオン塩を有する水性アルコール溶液などの水溶液中で少なくとも部分的に可溶性である。陽イオンと反応しうる酸性の側鎖基を有する重合体の例は、ポリ（ホスファゼン）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、アクリル酸とメタクリル酸との共重合体、ポリ（酢酸ビニル）、およびスルホン化ポリスチレンなどのスルホン化重合体である。アクリル酸またはメタクリル酸と、ビニルエーテルの単量体または重合体との反応によって形成される酸性の側鎖基を有する共重合体を使用することもできる。酸性基の例は、カルボン酸基、スルホン酸基、ハロゲン化（好ましくはフッ素化）アルコール基、フェノール性ＯＨ基、および酸性ＯＨ基である。
【０１８０】
胎盤幹細胞、または、胎盤幹細胞から分化した肝細胞、肝臓形成細胞、軟骨細胞、および／または軟骨細胞性細胞、あるいはこれらの共培養物は、三次元的なフレーム構造または足場上に播種し、ｉｎ  ｖｉｖｏで移植することができる。このようなフレーム構造は、組織形成を刺激する、任意の１つまたは複数の成長因子、細胞、薬剤、または他の成分と組み合わせて移植することができる。
【０１８１】
使用できる足場の例は、不織マット、多孔質発泡体、または自己集合ペプチドを含む。不織マットは、グリコール酸と乳酸との合成吸収性共重合体（例えば、ＰＧＡ／ＰＬＡ）（ＶＩＣＲＹＬ、Ｅｔｈｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．、Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ、Ｎ．Ｊ．）を含む繊維を用いて形成することができる。例えば、フリーズドライ法または凍結乾燥法（例えば、米国特許第６，３５５，６９９号を参照されたい）などの工程により形成される、ポリ（ε−カプロラクトン）／ポリ（グリコール酸）（ＰＣＬ／ＰＧＡ）共重合体からなる発泡体もまた、足場として使用することができる。
【０１８２】
別の実施形態では、足場は、ナノ繊維足場、例えば、電気紡糸されたナノ繊維足場であるかまたはこれを含む。より具体的な実施形態では、前記ナノ繊維足場は、ポリ（Ｌ−乳酸）（ＰＬＬＡ）、ポリ乳酸−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、Ｉ型コラーゲン、フッ化ビニリデンとトリフルオロエチレンとの共重合体（ＰＶＤＦ−ＴｒＦＥ）、ポリ（−カプロラクトン）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−ε−カプロラクトン）［Ｐ（ＬＬＡ−ＣＬ）］（例えば、７５：２５）、および／またはポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシバレレート）（ＰＨＢＶ）とＩ型コラーゲンとの共重合体を含む。別のより具体的な実施形態では、前記足場は、胎盤幹細胞の軟骨細胞への分化を促進する。ナノ繊維足場、例えば、電気紡糸されたナノ繊維足場を作製する方法は、当技術分野で知られている。例えば、Ｘｕら、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第１０巻、第７号、１１６０〜１１６８頁（２００４）、Ｘｕら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、第２５巻、８７７〜８８６頁（２００４）；Ｍｅｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｓｃｉ、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、第１８巻、第１号、８１〜９４頁（２００７）を参照されたい。
【０１８３】
上記で列挙した組成物は、制御可能な多孔性を有するナノ繊維メッシュを含む不織マットに電気紡糸することができる。電気紡糸では、高電圧を用いて帯電した重合体溶液の噴流を創出し、これが乾燥または固体化して重合体繊維が残る。例えば、チューブまたは毛細管、例えば、針内の重合体溶液中に一方の電極を配置し、他方の電極を収集板に取り付ける。液面上の電荷を含むチューブまたは毛細管の端部まで電界を通した。電荷の相互反発により、液体の表面張力と正反対の力が生じる。電界の強度が増すにつれて、静電反発力が表面張力を上回り、チューブまたは毛細管の先端の溶液から帯電した流体の噴流が射出される。放出された重合体溶液噴流内の溶媒は蒸発し、帯電した重合体繊維が後に残り、これが、接地された回収用金属製スクリーン上に不規則に集積する。マットの厚さおよびマット内の繊維の厚さは、チューブと収集スクリーンとの間の距離を増加もしくは減少させることにより（距離を増加させると、一般に、繊維が細くマットが低密度となる）、キロボルト単位の電位差を増加もしくは減少させることにより（電位差を増加させると、一般に、繊維の厚さが減少する）、流速を増加もしくは減少させることにより（流速を増加させると、一般に、より厚い繊維となる）、または、溶液中の重合体濃度を上昇もしくは低下させることにより（重合体濃度を上昇させると、一般に、繊維の厚さが増加する）調整することができる。先端部におけるチューブの直径もまた、変化させることができる。具体的な実施形態では、任意の重合体、例えば、電気紡糸によりナノスケールの不織繊維メッシュまたはマットを創出するのに適する、本明細書で開示される任意の重合体、例えば、ＰＬＬＡまたはＰＬＧＡは、例えば、約５ｋＶ、１０ｋＶ、１５ｋＶ、２０ｋＶ、２５ｋＶ、３０ｋＶ、３５ｋＶ、または約４０ｋＶの電圧で電気紡糸することができ、針の距離は、例えば、針の先端部と収集スクリーンとの間が約１、２、３、４、５、６、７、８、９、０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、または約５０ｃｍで変化しうる。針のゲージは、例えば、約８Ｇ〜約２４Ｇ、例えば、１２Ｇまたは２２Ｇで変化しうる。流速は、例えば、約０．０１〜約１．０ｍＬ／分、例えば、約０．０５〜約０．１ｍＬ／分で変化しうる。任意の重合体を用いる溶液の濃度は、溶液中に約５％〜約５０％ｗ／ｗ、例えば、約１０％〜約２５％ｗ／ｗの範囲でありうる。具体的な実施形態では、１２Ｇの針または２２Ｇの針を用い、先端部から収集スクリーンまでの３０ｃｍの距離および約０．０５ｍＬ／分〜約０．１ｍＬ／分の流速を用いて、溶液中に約１０％〜約２５％ｗ／ｗのＰＬＬＡまたはＰＬＧＡを電気紡糸し、約２５０ｎｍ〜約１０μｍの平均直径の繊維を含む電気紡糸されたマットを作製することができる。
【０１８４】
本発明の胎盤幹細胞はまた、モノリン酸カルシウム、ジリン酸カルシウム、トリリン酸カルシウム、アルファ−トリリン酸カルシウム、ベータ−トリリン酸カルシウム、およびテトラリン酸カルシウム、ヒドロキシアパタイト、フルオロアパタイト、硫酸カルシウム、フッ化カルシウム、酸化カルシウム、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムマグネシウム、ＢＩＯＧＬＡＳＳ（登録商標）などの生物活性ガラス、およびこれらの混合物を含むがこれらに限られない、生理的に許容されるセラミック製材料上に播種してもよく、またはこれらと接触させてもよい。現在市販される多孔質の生体適合性のセラミック製材料は、ＳＵＲＧＩＢＯＮＥ（登録商標）（ＣａｎＭｅｄｉｃａ  Ｃｏｒｐ．、Ｃａｎａｄａ）、ＥＮＤＯＢＯＮ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ  Ｆｒａｎｃｅ、Ｆｒａｎｃｅ）、ＣＥＲＯＳ（登録商標）（Ｍａｔｈｙｓ，ＡＧ、Ｂｅｔｔｌａｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ならびに、ＨＥＡＬＯＳ（商標）（ＤｅＰｕｙ，Ｉｎｃ．、Ｒａｙｎｈａｍ、ＭＡ）およびＶＩＴＯＳＳ（登録商標）、ＲＨＡＫＯＳＳ（商標）およびＣＯＲＴＯＳＳ（登録商標）（Ｏｒｔｈｏｖｉｔａ、Ｍａｌｖｅｒｎ、ＰＡ）などの鉱化コラーゲンによる骨移植用生成物を含む。フレーム構造は、天然材料および／または合成材料の混合物、ブレンド、または複合物でありうる。
【０１８５】
別の実施形態では、胎盤幹細胞、または、胎盤幹細胞から分化した肝細胞および／または肝臓形成細胞は、例えば、ＰＧＡ、ＰＬＡ、ＰＣＬの共重合体もしくはブレンド、またはヒアルロン酸などの生物吸収材料から作製されたマルチフィラメント糸からなりうるフェルト上に播種してもよく、またはこれらと接触させてもよい。
【０１８６】
別の実施形態では、胎盤幹細胞、または胎盤幹細胞から分化した肝細胞、肝臓形成細胞、軟骨細胞、および／または軟骨細胞性細胞は、複合構造でありうる発泡体の足場上に播種することができる。このような発泡体の足場は、修復、置換、または増強される体内の特定の構造の一部の形状などの有用な形状に鋳型成形することができる。一部の実施形態では、フレーム構造は、例えば、細胞の接着を増強するため、細胞の接種の前に、０．１Ｍの酢酸による処理に続き、ポリリジン、ＰＢＳ、および／またはコラーゲン中でインキュベートする。マトリックスをプラズマ被覆すること、あるいは、１つもしくは複数のタンパク質（例えば、コラーゲン、弾性繊維、網状繊維）、糖タンパク質、グリコサミノグリカン（例えば、ヘパリン硫酸、コンドロイチン−４−スルフェート、コンドロイチン−６−スルフェート、デルマタン硫酸、ケラチン硫酸など）、細胞マトリックス、ならびに／または、ゼラチン、アルギネート、寒天、アガロース、および植物ガムなどであるがこれらに限られない他の材料の添加などにより、マトリックスの外面を改変して、細胞の接着または増殖および組織の分化を改善しうる。
【０１８７】
一部の実施形態では、足場は、それを非血栓形成性とする材料を含むか、またはこれにより処理される。これらの処理および材料はまた、内皮の増殖、移動、および細胞外マトリックスの沈着を促進および維持しうる。これらの材料および処理の例は、ラミニンおよびＩＶ型コラーゲンなどの基底膜タンパク質などの天然材料、ＥＰＴＦＥなどの合成材料、および、ＰＵＲＳＰＡＮ（商標）（Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、Ｃａｌｉｆ．）などのセグメント化されたポリウレタン尿素シリコーンを含むがこれらに限られない。足場はまた、へパリンなどの抗血栓剤を含むこともあり、足場はまた、胎盤幹細胞を播種する前に、表面電荷を変化させるように処理される（例えば、プラズマ被覆される）こともある。
【０１８８】
したがって、別の態様では、本明細書で、単離された接着性のＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞と電気紡糸されたナノ繊維足場とを含む組成物が提供される。具体的な実施形態では、前記ナノ繊維足場は、ポリ（Ｌ−乳酸）（ＰＬＬＡ）、ポリ乳酸−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、Ｉ型コラーゲン、フッ化ビニリデンとトリフルオロエチレンとの共重合体（ＰＶＤＦ−ＴｒＦＥ）、ポリ（−カプロラクトン）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−ε−カプロラクトン）［Ｐ（ＬＬＡ−ＣＬ）］（例えば、７５：２５）、および／またはポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシバレレート）（ＰＨＢＶ）とＩ型コラーゲンとの共重合体の繊維を含む。別の具体的な実施形態では、前記ナノ繊維足場は、厚さが平均約２５０ナノメートル〜約１０μｍである繊維を含む。別の具体的な実施形態では、前記組成物を、胎盤幹細胞が軟骨形成細胞または軟骨細胞に分化する条件と接触させる。別の実施形態では、本明細書で、組成物を作製する方法であって、接着性ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞を電気紡糸されたナノ繊維足場と接触させることを含み、前記ナノ繊維足場を、約２０ｋＶ、約３０ｃｍの針から収集板までの距離、約０．０５ｍＬ／分〜約０．１ｍＬ／分の流速でＰＬＬＡまたはＰＬＧＡを電気紡糸することによって作製し、前記ＰＬＬＡまたはＰＬＧＡが約１０％ｗ／ｗ〜約２０％ｗ／ｗの溶液中にある方法が提供される。
【０１８９】
５．７．２  遺伝子改変された胎盤幹細胞
別の態様では、本明細書に記載の胎盤幹細胞および臍帯幹細胞を、例えば、対象の核酸またはポリペプチドを生成するように遺伝子改変することもでき、分化した細胞、例えば、対象の核酸またはポリペプチドを生成する肝細胞、肝臓形成細胞、軟骨細胞、および／または軟骨細胞性細胞を生成するように遺伝子改変することもできる。遺伝子改変は、例えば、非組込み型複製ベクター、例えば、パピローマウイルスベクター、ＳＶ４０ベクター、アデノウイルスベクター；組込み型ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター、またはアデノ関連ウイルスベクター；または、複製欠損型ウイルスベクターを含むがこれらに限られないウイルスベースのベクターを用いて達成することができる。ＤＮＡを細胞内に導入する他の方法は、リポソーム、電気穿刺、粒子銃、直接のＤＮＡ注入などの使用を含む。
【０１９０】
幹細胞は、例えば、１つまたは複数の適切な発現制御エレメント、例えば、プロモーター配列またはエンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、内部リボソーム侵入部位との作動的な関連により、またはその関連において制御されるＤＮＡにより形質転換することができ、または幹細胞にそのＤＮＡをトランスフェクトすることができる。このようなＤＮＡには、選択可能なマーカーを組み込むことが好ましい。外来ＤＮＡの導入後、遺伝子操作された幹細胞は、例えば、濃縮培地中で増殖させ、次いで、選択培地に切り替えることができる。一実施形態では、胎盤幹細胞を遺伝子操作するのに使用されるＤＮＡは、対象のポリペプチド、例えば、サイトカイン、成長因子、分化作用物質、または治療用ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１９１】
幹細胞を遺伝子操作するのに使用されるＤＮＡは、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞におけるヌクレオチド配列の発現を駆動する、当技術分野で知られる任意のプロモーターを含みうる。例えば、プロモーターは、ＣＭＶプロモーター／エンハンサー、ＳＶ４０プロモーター、パピローマウイルスプロモーター、エプスタイン−バーウイルスプロモーター、エラスチン遺伝子プロモーターなどを含むがこれらに限られない。具体的な実施形態では、プロモーターは、ヌクレオチド配列が所望の場合に限り発現するように調節される。プロモーターは、誘導的プロモーター（例えば、メタロチオネインおよび熱ショックタンパク質と関連するプロモーター）または構成的プロモーターでありうる。
【０１９２】
別の具体的な実施形態では、プロモーターは、組織特異的プロモーターであるか、または、組織特異性を示す。このようなプロモーターの例は、ミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら、１９８７年、Ｃｅｌｌ、第４８巻、７０３頁）（希突起膠細胞）、エラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｔら、１９８４年、Ｃｅｌｌ、第３８巻、６３９頁；Ｏｒｎｉｔｚら、１９８６年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．、第５０巻、３９９頁；ＭａｃＤｏｎａｌｄ、１９８７年、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、第７巻、４２５頁）（膵臓腺房細胞）、インスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ、１９８５年、Ｎａｔｕｒｅ、第３１５巻、１１５頁）（膵臓ベータ細胞）、ミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓｈａｎｉ、１９８５年、Ｎａｔｕｒｅ、第３１４巻、２８３頁）（骨格筋）を含むがこれらに限られない。
【０１９３】
本発明の細胞を遺伝子操作して、１つまたは複数の遺伝子の発現を「ノックアウト」または「ノックダウン」することができる。例えば、遺伝子を完全に不活化することによる、例えば、相同組換えによる発現の阻害により、細胞にとって天然の遺伝子の発現を低下させることができる。一実施形態では、例えば、タンパク質の重要な領域をコードするエクソン配列、または、その領域に対する５’側のエクソン配列に、正の選択マーカー、例えば、ｎｅｏを割り込ませて、標的遺伝子からの正常なｍＲＮＡの生成を阻止し、遺伝子の不活化をもたらす。遺伝子の一部に欠失を作製する、または、遺伝子全体を欠失させることによっても遺伝子を不活化しうる。ゲノム内で遠く離れた標的遺伝子に対する２つの相同領域を伴う構築物を使用することにより、２つの領域の間に介在する配列を欠失させることができる（Ｍｏｍｂａｅｒｔｓら、１９９１年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、第８８巻、３０８４頁）。標的遺伝子の発現を阻害するアンチセンス、ＤＮＡザイム、小分子干渉ＲＮＡ、およびリボザイム分子も用いて、幹細胞内における標的遺伝子の活性レベルを低下させることができる。例えば、主要組織適合遺伝子複合体（ＨＬＡ）の発現を阻害するアンチセンスＲＮＡ分子は、免疫反応に関して最も多用途であることが示されている。三重らせん分子は、標的遺伝子活性のレベルを低下させるのに用いることができる。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＬ．Ｇ．Ｄａｖｉｓら（編）、１９９４年、「ＢＡＳＩＣ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ」、第２版、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ、Ｎｏｒｗａｌｋ、Ｃｏｎｎを参照されたい。
【０１９４】
具体的な実施形態では、本発明の胎盤幹細胞または臍帯幹細胞は、対象ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子により遺伝子改変することができ、該対象ポリペプチドの発現は、外因性因子、例えば、ポリペプチド、有機小分子などにより制御される。このようなポリペプチドは、治療用ポリペプチドでありうる。より具体的な実施形態では、対象ポリペプチドは、ＩＬ−１２またはインターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）である。別のより具体的な実施形態では、対象ポリペプチドは、インターロイキン−１受容体アンタゴニストとジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）との融合体であり、外因性因子は、抗葉酸物質、例えば、メトトレキサートである。このような構築物は、メトトレキサートとの接触時にＩＬ−１Ｒａ、またはＩＬ−１ＲａとＤＨＦＲとの融合体を発現する胎盤幹細胞または臍帯幹細胞の遺伝子操作に有用である。このような構築物は、例えば、関節リウマチの治療に用いることができる。この実施形態では、メトトレキサートなどの抗葉酸物質への曝露時に、ＩＬ−１ＲａとＤＨＦＲとの融合体の翻訳が上方調節される。したがって、別の具体的な実施形態では、胎盤幹細胞または臍帯幹細胞を遺伝子操作するのに使用される核酸は、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことができ、前記第１および第２のポリペプチドは、外因性因子の存在下において翻訳が上方調節される融合タンパク質として発現される。前記ポリペプチドは、一過性または長期的に（例えば、何週間かまたは何カ月間かにわたり）発現させることができる。
【０１９５】
このような核酸分子は、遺伝子操作された幹細胞の正の選択を可能とする、または遺伝子操作された幹細胞を可視化することを可能とするポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含みうる。別のより具体的な実施形態では、ヌクレオチド配列は、例えば、適切な可視化条件下で蛍光性であるポリペプチド、例えば、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）をコードする。より具体的な実施形態では、このような核酸分子は、ＩＬ−１Ｒａ−ＤＨＦＲ−ＩＲＥＳ−Ｌｕｃを含んでよく、ここで、ＩＬ−１Ｒａはインターロイキン−１受容体アンタゴニスト、ＩＲＥＳは内部リボソーム侵入部位、および、ＤＨＦＲはジヒドロ葉酸レダクターゼである。
【０１９６】
５．７．３  不死化胎盤幹細胞株
増殖促進遺伝子、すなわち、トランスフェクトされた細胞の増殖を適切な条件下で促進するタンパク質をコードする遺伝子を含有する任意の適切なベクターとのトランスフェクションにより、該増殖促進タンパク質の生成および／または活性が、外因性因子により制御されるように、哺乳動物胎盤細胞を条件付きで不死化させることができる。好ましい実施形態では、増殖促進遺伝子は、ｖ−ｍｙｃ、Ｎ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｃ、ｐ５３、ＳＶ４０ラージＴ抗原、ポリオーマラージＴ抗原、Ｅ１ａアデノウイルス、またはヒトパピローマウイルスＥ７タンパク質などであるがこれらに限られない癌遺伝子である。
【０１９７】
増殖促進タンパク質の外的な制御は、増殖促進遺伝子を外的に制御されるプロモーター、例えば、その活性を、例えば、トランスフェクトされた細胞の温度または細胞と接触する培地の組成を改変させることにより制御しうるプロモーターの制御下に置くことにより達成することができる。一実施形態では、テトラサイクリン（ｔｅｔ）制御型遺伝子発現系（Ｇｏｓｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８９巻、５５４７〜５５５１頁、１９９２年；Ｈｏｓｈｉｍａｒｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９３巻、１５１８〜１５２３頁、１９９６年を参照されたい）を使用することができる。ｔｅｔの不在下において、このベクター内におけるｔｅｔ制御型転写活性化因子（ｔＴＡ）は、ｔｅｔオペレーター配列と融合させたヒトサイトメガロウイルスからの最小プロモーターであるｐｈＣＭＶ＊−１からの転写を強力に活性化する。ｔＴＡは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）のトランスポゾン−１０由来ｔｅｔ耐性オペロンのリプレッサー（ｔｅｔＲ）と、単純ヘルペスウイルスのＶＰ１６の酸性ドメインとの融合タンパク質である。非毒性の低濃度（例えば、０．０１〜１．０μｇ／ｍＬ）のｔｅｔで、ｔＴＡによる転写活性化はほぼ完全に無効化される。
【０１９８】
一実施形態では、ベクターは、選択マーカー、例えば、薬剤耐性を賦与するタンパク質をコードする遺伝子をさらに含有する。細菌性のネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏＲ）は、用いうるこのようなマーカーの１つである。ｎｅｏＲを有する細胞は、例えば、増殖培地への１００〜２００μｇ／ｍＬのＧ４１８の添加など、当業者に知られる手段により選択しうる。
【０１９９】
トランスフェクションは、レトロウイルス感染を含むがこれに限られない、当業者に知られた種々の手段のいずれかにより達成することができる。一般に、細胞培養物には、ベクターの産生細胞株から回収された馴化培地およびＮ２栄養補充物質を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地の混合物とのインキュベーションによりトランスフェクトすることができる。例えば、上述の通りに調製された胎盤細胞培養物には、例えば、１容量の馴化培地およびＮ２栄養補充物質を含有する２容量のＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中における約２０時間にわたるインキュベーションによりｉｎ  ｖｉｔｒｏで５日後に感染させることができる。次いで、選択マーカーを有するトランスフェクトされた細胞を、上述の通りに選択することができる。
【０２００】
トランスフェクション後、例えば、２４時間で少なくとも３０％の細胞が倍加することを可能とする増殖を許容する表面上に培養物を継代する。該基質は、ポリオルニチン（１０μｇ／ｍＬ）および／またはラミニン（１０μｇ／ｍＬ）でコートされたプラスチック製組織培養器具からなるポリオルニチン／ラミニン基質、ポリリジン／ラミニン基質、またはフィブロネクチンで処理された表面であることが好ましい。次いで、１つまたは複数の増殖増強因子を補充することもありしないこともある増殖培地を、３〜４日ごとに培養物に流加する。培養物が５０％未満のコンフルエントである場合は、増殖増強因子を増殖培地に添加することがある。
【０２０１】
条件付きで不死化させた胎盤幹細胞株は、８０〜９５％のコンフルエントの場合、トリプシン処理などによる標準的な技法を用いて継代することができる。一部の実施形態では、約２０代の継代までは、選択を維持する（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子を含有する細胞に対するＧ４１８の添加による）ことが有益である。長期保存用には、細胞を液体窒素中で凍結しうる。
【０２０２】
上述の通りに調製された、条件付きで不死化させたヒト胎盤幹細胞株から、クローン細胞株を単離することができる。一般に、このようなクローン細胞株は、限界希釈法などの標準的な技法を用いて、または、クローニングリングを用いて単離し、拡大培養することができる。クローン細胞株は、一般に、上述の通りに流加および継代しうる。
【０２０３】
クローン細胞でありうるがそうである必要はない、条件付きで不死化されたヒト胎盤幹細胞株は、分化を促進する培養条件下において、増殖促進タンパク質の生成および／または活性を抑制することにより、分化するように誘導できる。例えば、増殖促進タンパク質をコードする遺伝子が外的に制御されるプロモーターの制御下にある場合、条件、例えば、温度または培地の組成を改変して、増殖促進遺伝子の転写を抑制できる。上記で論じたテトラサイクリン制御型遺伝子発現系の場合、分化は、増殖促進遺伝子の転写を抑制するテトラサイクリンの添加により達成することができる。一般に、分化を開始するには、４〜５日間にわたる１μｇ／ｍＬのテトラサイクリンで十分である。さらなる分化を促進するためには、増殖培地中にさらなる作用物質を含めることができる。
【０２０４】
５．７．４  アッセイ
本明細書に記載の胎盤幹細胞、または肝細胞および／または肝臓形成細胞をアッセイで使用して、このような細胞の増殖、拡大培養、および／または分化に対する、培養条件、環境因子、分子（例えば、生体分子、無機小分子など）などの影響を、このような条件に曝露されない細胞と比較して判定することができる。
【０２０５】
一実施形態では、本明細書に記載の肝細胞および／または肝臓形成細胞を、分子との接触時における増殖、拡大培養、または分化の変化についてアッセイする。一実施形態では、例えば、本明細書で、胎盤幹細胞から分化した複数の肝細胞および／または肝臓形成細胞の増殖を調節する化合物を同定する方法であって、増殖を可能とする条件下で前記細胞を該化合物と接触させることを含み、前記化合物が、これと接触していないこのような細胞と比較して、前記細胞の増殖の検出可能な変化を引き起こす場合、前記化合物が肝細胞および／または肝臓形成細胞の増殖を調節する化合物であると同定される方法が提供される。具体的な実施形態では、前記化合物は、増殖阻害剤として同定される。別の具体的な実施形態では、前記化合物は、増殖増強剤として同定される。
【０２０６】
別の実施形態では、本明細書で、胎盤幹細胞から分化した複数の肝細胞および／または肝臓形成細胞の拡大培養を調節する化合物を同定する方法であって、拡大培養を可能とする条件下で前記肝細胞および／または肝臓形成細胞を前記化合物と接触させることを含み、前記化合物が、これと接触していない複数の肝細胞および／または肝臓形成細胞と比較して、前記肝細胞および／または肝臓形成細胞の拡大培養の検出可能な変化を引き起こす場合、前記化合物が肝細胞および／または肝臓形成細胞の拡大培養を調節する化合物であると同定される方法が提供される。具体的な実施形態では、前記化合物は、拡大培養阻害剤として同定される。別の具体的な実施形態では、前記化合物は、拡大培養増強剤として同定される。
【０２０７】
別の実施形態では、本明細書で、胎盤幹細胞の分化、例えば、肝細胞および／または肝臓形成細胞への分化を調節する化合物を同定する方法であって、肝細胞または肝臓形成細胞への分化を可能とする条件下で前記幹細胞を前記化合物と接触させることを含み、前記化合物が、これと接触していない幹細胞と比較して、前記幹細胞の分化の検出可能な変化を引き起こす場合、前記化合物が胎盤幹細胞の増殖を調節する化合物であると同定される方法が提供される。具体的な実施形態では、前記化合物は、分化阻害剤として同定される。別の具体的な実施形態では、前記化合物は、分化増強剤として同定される。
【０２０８】
５．７．５  細胞バンク
分娩後の胎盤からの幹細胞を多数の異なる方法で培養して、胎盤幹細胞の一連のロット、例えば、個体に投与される胎盤幹細胞の一連の用量を作製することができる。このようなロットは、例えば、胎盤灌流液または酵素で消化した胎盤組織からの幹細胞から得ることができる。複数の胎盤から得られる胎盤幹細胞の一連のロットは、例えば、長期保存用の胎盤幹細胞バンク内に配置することができる。一般に、接着性幹細胞を胎盤物質の初代培養物から得て、種培養物を形成し、これを制御された条件下で拡大培養して、ほぼ同等回数の倍加から細胞集団を形成する。ロットは、単一の胎盤組織に由来することが好ましいが、複数の胎盤組織に由来することも可能である。
【０２０９】
一実施形態では、以下の通りに幹細胞ロットを得る。まず、例えば、みじん切りにし、適切な酵素、例えば、コラゲナーゼ（上記の第５．２．３節を参照されたい）で消化することにより胎盤組織を破壊する。胎盤組織は、例えば、単一の胎盤に由来する全羊膜、全絨毛膜、またはその両方を含むことが好ましいが、羊膜または絨毛膜の一部のみを含むことも可能である。消化された組織は、例えば、約１〜３週間、好ましくは約２週間にわたり培養する。非接着性細胞の除去後、形成される高密度コロニーを、例えば、トリプシン処理により回収する。これらの細胞を回収し、適量の培地中に再懸濁させ、継代０細胞と定める。
【０２１０】
次いで、継代０細胞を用いて、拡大培養物に播種する。拡大培養物は、別個の細胞培養装置、例えば、ＮＵＮＣ（商標）のＣｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｙの任意の配置でありうる。継代０培養物中の細胞は、例えば、１×１０３、２×１０３、３×１０３、４×１０３、５×１０３、６×１０３、７×１０３、８×１０３、９×１０３、ｌ×１０４、ｌ×１０４、２×１０４、３×１０４、４×１０４、５×１０４、６×１０４、７×１０４、８×１０４、９×１０４、または１０×１０４個の幹細胞を拡大培養物に播種するように、任意の程度に分割することができる。約２×１０４〜約３×１０４個の継代０細胞を用いて、各拡大培養物に播種することが好ましい。拡大培養物の数は、継代０細胞の数に依存し、そこから幹細胞を得る（１つまたは複数の）特定の胎盤に依存して多くも少なくもなりうる。
【０２１１】
拡大培養物は、培養物中の細胞密度が特定の値、例えば、約１×１０５個／ｃｍ２に達するまで増殖させる。細胞は、この時点で回収し低温保存することもでき、上記の通りに新規の拡大培養物中に継代することもできる。細胞は、使用前に、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０回継代することができる。集団の累積分裂回数記録は、拡大培養（複数可）時において維持することが好ましい。継代０培養物からの細胞は、拡大培養して、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、または４０回の倍加、または６０回までの倍加を行うことができる。しかし、個別用量に細胞集団を分割する前における集団の倍加回数は、約１５〜約３０回であることが好ましく、約２０回の倍加であることが好ましい。細胞は、拡大培養工程を通して連続的に培養することもでき、拡大培養中の１つまたは複数の時点で凍結することもできる。
【０２１２】
個別用量に用いうる細胞は、凍結、例えば、後の使用のために低温保存することができる。個別用量は、例えば、１ｍＬ当たり約１００万個〜約１億個の細胞を含むことができ、合計で約１０６〜約１０９個の細胞を含むことができる。
【０２１３】
その方法の具体的な実施形態では、約４回の倍加で継代０細胞を培養し、次いで、第１の細胞バンクにおいて凍結する。第１の細胞バンクからの細胞を凍結し、第２の細胞バンクに播種し、さらに約８回の倍加でその細胞を拡大培養する。この段階における細胞を回収および凍結し、約８回のさらなる分裂に進むことを可能とする新規の拡大培養物に播種するのに用い、細胞倍加の累積回数を約２０回とする。継代の中間点における細胞は、後続の拡大培養物中で使用する、１ｍＬ当たり約１００，０００〜約１０００万個、好ましくは、１ｍＬ当たり約１００万個の単位で凍結させることができる。約２０回の倍加時における細胞は、投与または幹細胞を含有する組成物の作製時における使用のために、１ｍＬ当たり約１００万〜約１億個の個別用量で凍結させることができる。
【０２１４】
好ましい実施形態では、そこから胎盤が得られるドナー（例えば、母体）を、少なくとも１種類の病原体について検査する。検査した病原体について母体が陽性である場合、その胎盤からの全ロットを廃棄する。このような検査は、継代０細胞確立の前もしくは後、または拡大培養時を含む、胎盤幹細胞ロットの作製中の任意の時点において実施することができる。その存在について検査される病原体は、限定されないが、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全症ウイルス（Ｉ型およびＩＩ型）、サイトメガロウイルス、ヘルペスウイルスなどを含みうる。
【０２１５】
上記バンクの改変では、バンク内における複数、または全ての胎盤幹細胞、例えば、単一の胎盤または複数の胎盤からの胎盤幹細胞を、その細胞の肝細胞および／または肝臓形成細胞への分化を引き起こす条件に曝露する。このような細胞は、胎盤幹細胞中には存在しないか、または、これらに検出可能な程度に異なるレベルで存在する１つまたは複数の肝細胞マーカーの発現に基づいて選択することができる。このような実施形態において、細胞バンクは、単独で、または肝細胞または肝臓形成細胞に分化していない胎盤幹細胞の組合せでの肝細胞および／または肝臓形成細胞の集団を含みうる。
【０２１６】
５．７．６  肝疾患の治療
別の態様では、本明細書で、肝機能の異常と関連する疾患、障害、または状態を有する対象を治療する方法であって、胎盤幹細胞を肝細胞に分化させる本明細書に開示の方法により作製された肝細胞、または肝細胞集団を、前記対象に導入することを含む方法が提供される。より具体的な実施形態では、疾患、障害、または状態は、肝硬変である。特定の実施形態では、疾患または状態は、例えば、アルコールまたは、例えば、キノコ毒などの毒素の摂取により引き起こされる肝臓毒性から生じる。特定の実施形態では、疾患または状態は、ウイルス感染、例えば、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、またはＥ型肝炎の感染である。
【０２１７】
肝機能の異常に関連する疾患を有する個体、例えば、肝硬変を有すると診断された個体は、その疾患の進行中の任意の時点において、複数の胎盤幹細胞、および、場合によって、１つまたは複数の治療剤によって治療することができる。例えば、個体は、診断直後、または、診断から１、２、３、４、５、６日以内、または、診断後１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０週間もしくはこれを超える期間以内、または診断後１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０年間もしくはこれを超える期間以内に治療することができる。個体は、疾患の臨床経過中に１回または複数回治療されうる。一実施形態では、個体には、用量約３億個の胎盤幹細胞を投与する。しかし、用量は、個体の物理的特徴、例えば、体重により変化させることができ、投与当たり１００万〜１００億個の胎盤幹細胞、好ましくは、投与当たり１０００万〜１０億個の胎盤幹細胞、または、投与当たり１億〜５０００万個の胎盤幹細胞の範囲でありうる。
【０２１８】
投与は静脈内であることが好ましいが、生細胞投与について当技術分野で許容される任意の経路でありうる。胎盤幹細胞、例えば、肝細胞の１つまたは複数の特徴を発現する細胞に分化した胎盤幹細胞は、例えば、緩衝液または培地溶液、ヒドロゲル、アルギネート中において、肝臓の１つまたは複数の部位に直接に移植することができる。一実施形態では、胎盤幹細胞は、細胞バンク由来の細胞である。
【０２１９】
別の実施形態では、複数の胎盤幹細胞を、胎盤幹細胞の肝細胞または肝臓形成細胞への分化を促進する１つまたは複数の作用物質と接触させている。このような複数の細胞において、細胞の一部は未分化の胎盤幹細胞（すなわち、肝細胞への分化を開始していない胎盤幹細胞）でありえ、細胞の一部は肝細胞の１つまたは複数の特徴を発現し始めた胎盤幹細胞でもありえ、また、一部は終末分化した肝細胞の複数、大半、または全ての特徴を発現し始めた、胎盤幹細胞からの分化細胞でもありうる。
【０２２０】
５．７．７  胎盤幹細胞由来肝細胞の使用による抗ウイルス剤の同定
本明細書に記載の肝細胞および肝細胞培養物をｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイで使用して、化合物が抗ウイルス剤であるかどうかを決定することができる。
【０２２１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ：以下の一実施形態では、複数の胎盤幹細胞（例えば、胎盤幹細胞集団）を使用して抗ウイルス剤を同定することができる。胎盤幹細胞集団は、本明細書の他の箇所に記載の通りに確立する。胎盤幹細胞集団を、胎盤幹細胞の肝細胞への分化を促進する１つまたは複数の化合物または作用物質と接触させる。次いで、少なくとも複数の胎盤幹細胞が、例えば、サイトケラチン１８の場合、肝細胞に特徴的なレベルで、肝細胞に特徴的な１つまたは複数のマーカーを発現するまで、胎盤幹細胞を培養する。
【０２２２】
次いで、胎盤由来の肝細胞または肝臓形成細胞にウイルスを感染させる。ウイルスは、肝組織に特異的に感染するウイルス、例えば、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、またはＥ型肝炎ウイルスであることが好ましい。ウイルスストックは、ウイルスに感染し、検出可能なレベルのウイルスをその血清中に有する１つまたは複数の個体の血清から得ることができる。ウイルスはまた、感染した動物、例えば、感染したげっ歯動物、ウサギなどから、市販の供給源から、またはウイルスに感染した細胞株からも得ることができる。
【０２２３】
供給源にかかわらず、ウイルスを胎盤由来の肝細胞、または肝細胞および／または肝臓形成細胞を含む胎盤幹細胞集団と接触させ、感染するのに十分な時間を与える。肝細胞または胎盤細胞集団は、例えば、組織培養皿またはフラスコ内における感染時に少なくともまたは多くとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のコンフルエントでありうる。種々の実施形態では、胎盤幹細胞から分化した肝細胞もしくは肝臓形成細胞、または肝細胞もしくは肝臓形成細胞集団にウイルス、例えば、肝栄養性ウイルス、例えば、約１×１０８〜１×１０９個のウィルスを感染させる。
【０２２４】
具体的な実施形態では、トリプシン処理および遠心分離により、細胞培養物から胎盤由来の肝細胞、または肝細胞および／または肝臓形成細胞を含む胎盤幹細胞集団を回収し、洗浄し、培地中に再懸濁させる。１２ウェルプレート内のカバースリップ上に細胞のアリコートを入れ、２％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）により、場合によっては６〜１０日間にわたり処理する。次いで、例えば、３７℃で１０〜２０時間にわたり、感染した血清中でビリオンと共に細胞をインキュベートする。別の実施形態では、ウイルスを排泄するウイルス感染細胞株、例えば、ＨＢＶに感染した肝癌細胞株ＨＢ  ６１１（Ｏｃｈｉｙａら、「Ａｎ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  Ｖｉｒｕｓ  Ｔｈａｔ  Ｕｓｅｓ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｈｕｍａｎ  Ｆｅｔａｌ  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、第８６巻、１８７５〜１８７９頁（１９８９）を参照されたいとの共培養により、胎盤幹細胞由来の肝細胞、または肝細胞および／または肝臓形成細胞を含む胎盤幹細胞集団に感染させる。
【０２２５】
感染の２〜５日後、細胞を回収し、存在するウイルスレベルを決定する。ウイルスレベルは、例えば、ウイルス性抗原、例えば、Ａ型肝炎ウイルス表面抗原を認識する１つまたは複数の抗体（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ社から市販される抗体）；Ｂ型肝炎ウイルスＨＢｅＡｇのＨＢｓＡｇ、Ｃ型肝炎ウイルスコア抗原、Ｄ型肝炎コア抗原、またはＥ型肝炎コア抗原を認識する１つまたは複数の抗体を用いて決定することができる。別の実施形態では、定量的または半定量的ＰＣＲ法により、感染細胞内におけるウイルスレベルを決定する。具体的な実施形態では、使用されるプライマーは、ウイルスの複製形態を検出するか、またはこれに特異的である、例えば、ＨＢＶの共有結合的に閉じた円環形態（ｃｃｃＨＢＶ）に特異的である。別の具体的な実施形態では、使用されるプライマーは、ｃｃｃＨＢＶ、および、ＨＢＶの弛緩した円環形態の両方を増幅しうる。
【０２２６】
上記で概括した手順では、複数の時点において、化合物または作用物質を抗ウイルス活性について調べることができる。例えば、培養物からの回収時、遠心分離後ではあるがウイルスとの接触前、ウイルスとの接触と同時（例えば、同時または数分間以内）、またはウイルスとの接触後において、化合物を本明細書で提供される肝細胞または肝臓形成細胞と接触させることができる。例えば、一実施形態では、化合物と本明細書で提供される肝細胞または肝臓形成細胞との間の接触をウイルスとの接触前に実施して、初回の感染に対して化合物が及ぼす効果を判定することができる。別の実施形態では、化合物を本明細書で提供される肝細胞または肝臓形成細胞と感染の約１〜約５日後に接触させ、例えば、該化合物が、化合物と接触していない細胞と比較して、ウイルスの生成に対して効果を及ぼすかどうかを判定することができる。別の実施形態では、感染した細胞を対象化合物と接触させ、本明細書で提供される未感染の肝細胞もしくは肝臓形成細胞、または初代肝細胞培養物と共に共培養し、該化合物が未感染細胞の感染に対して効果を及ぼすかどうかを判定することができる。
【０２２７】
具体的な実施形態では、任意の時点、例えば、化合物との接触後１、２、３、４、５、６、または７日以内において、化合物が、その化合物と接触していない肝細胞または肝臓形成細胞と比較して、本明細書で提供される感染した肝細胞または肝臓形成細胞により生成されるウイルス量を検出可能な程度に低減する場合、その化合物は抗ウイルス化合物である。別の具体的な実施形態では、化合物が、その化合物の不在下にある共培養物と比較して、その化合物の存在下にある感染した肝細胞と未感染の肝細胞との共培養物中における感染した肝細胞数を検出可能な程度に減少させる場合、その化合物は抗ウイルス化合物である。
【０２２８】
ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ：胎盤幹細胞から分化した肝細胞または肝臓形成細胞をｉｎ  ｖｉｖｏアッセイの一部として使用して、抗ウイルス化合物を同定することができる。そのアッセイでは、肝細胞または肝臓形成細胞にウイルス、例えば、Ｂ型肝炎ウイルスを感染させ、特定のマウス宿主内に移植し、マウス内でウイルス血症を惹起させる。次いで、マウスに化合物を投与し、結果として生じるウイルス量またはウイルス複製に対するその化合物の効果を判定する。このようなアッセイについては、実施例１０で詳述する。
【０２２９】
一実施形態では、保管しなければ致死量のガンマ線照射を受けた、免疫抑制マウス、例えば、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスからの骨髄の投与により防護された正常な宿主マウスをアッセイに用いる。宿主マウスに骨髄が投与されるのと同時に、または骨髄の投与後６〜７日以内に、複数の感染した胎盤幹細胞由来の肝細胞または肝臓形成細胞を宿主マウスに、例えば、腹腔内、腎被膜下、宿主マウスの肝臓、耳介などに投与する。移植後６〜２０日以内に、対象化合物をマウスに投与する。このような投与は、医学的に許容される任意の経路を介して行うことができるが、腹腔内投与または局所的投与が好ましい。
【０２３０】
化合物投与後の任意の時点において、宿主マウスを評価し、例えば、血清中のウイルス量、またはウイルスの存在もしくは複製についての他の徴候を判定することができる。種々の実施形態では、マウスの組織を、ビリオン、例えば、ウイルスの複製形態の存在についてアッセイする。上記の通り、ウイルスレベルは、例えば、ウイルス性抗原、例えば、Ａ型肝炎ウイルス表面抗原を認識する１つまたは複数の抗体（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ社から市販される抗体）；Ｂ型肝炎ウイルスＨＢｅＡｇのＨＢｓＡｇ、Ｃ型肝炎ウイルスコア抗原、Ｄ型肝炎コア抗原、またはＥ型肝炎コア抗原を認識する１つまたは複数の抗体を用いて決定することができる。例えば、具体的な実施形態では、Ｂ型肝炎ウイルスの外被タンパク質、表面抗原、またはコア抗原に対する１つまたは複数の抗体を用いて、宿主マウス由来の血清試料中におけるＢ型肝炎ウイルスの存在を検出する。別の実施形態では、定量的または半定量的ＰＣＲ法により、感染した細胞内におけるウイルスレベルを決定する。具体的な実施形態では、使用されるプライマーは、ウイルスの複製形態を検出するか、またはこれに特異的である、例えば、ＨＢＶの共有結合的に閉じた円環形態（ｃｃｃＨＢＶ）に特異的である。別の具体的な実施形態では、使用されるプライマーは、ｃｃｃＨＢＶ、および、ＨＢＶの弛緩した円環形態の両方を増幅しうる。
【０２３１】
５．７．８  軟骨損傷の治療
他の実施形態では、単離した胎盤幹細胞、単離した胎盤幹細胞集団、および／または、これらから分化した軟骨細胞性細胞もしくは軟骨細胞を、軟骨組織の修復を含むがこれに限られない、自家組織または同種異系組織の再生または置換の療法またはプロトコールに使用できる。具体的な実施形態では、胎盤幹細胞を使用して、軟骨への外傷（例えば、骨折、断裂など）を含む、軟骨に影響を及ぼす疾患、障害、または状態を治癒または修復することができる。より具体的な実施形態では、軟骨は、関節軟骨である。胎盤幹細胞は、例えば、細胞懸濁液中で軟骨に直接投与することもでき、マトリックス、例えば、上記の第５．７．１．４節で説明した電気紡糸されたナノ繊維足場などの電気紡糸されたナノ繊維足場と組み合わせて軟骨に投与することもできる。足場を伴いまたは伴わずに軟骨と接触させた（例えば、軟骨上に播種された）胎盤幹細胞は、ＣＤ２００＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ４５−胎盤幹細胞であることが好ましいが、本明細書に記載の任意の胎盤幹細胞でありうる。軟骨における疾患、障害、または状態を治療するのに用いられる全てまたは複数の胎盤幹細胞は、軟骨への投与前に軟骨細胞性細胞に分化させることもでき、または未分化状態で投与することもできる。軟骨細胞性細胞または軟骨細胞は、単独で、または胎盤幹細胞および／または他の型の幹細胞の組合せで、細胞懸濁液として投与することもでき、マトリックス、例えば、電気紡糸されたナノ繊維足場の組合せで軟骨に投与することもできる。
【０２３２】
単独で、または足場、例えば、電気紡糸されたナノ繊維足場の組合せでの特定の胎盤幹細胞集団の有効性は、軟骨外傷が自然治癒しない動物モデル、例えば、下記の実施例１４に記載の、例えば、ウサギ骨軟骨欠損モデルにおいて評価することができる。
【０２３３】
５．７．９  ＣＤ３４＋、ＣＤ４５−胎盤幹細胞の使用
本明細書で提供されるＣＤ３４＋、ＣＤ４５−胎盤幹細胞、およびＣＤ３４＋、ＣＤ４５−胎盤幹細胞の濃縮細胞集団を使用して、造血幹細胞を必要とする個体、例えば、化学療法または骨髄除去後における、例えば、造血再構成を必要とする個体を治療することができる。一実施形態では、ＣＤ３４＋ＣＤ４５−幹細胞を単独で使用してこのような個体を治療することができる。別の実施形態では、ＣＤ３４＋ＣＤ４５−幹細胞を第２の型の幹細胞または第２の幹細胞集団の組合せで使用し、またはこれを補充する。このような第２の集団中の幹細胞は、造血幹細胞、非造血幹細胞、またはこれらの両方を含みうる。一実施形態では、第２の幹細胞集団は、臍帯血中の幹細胞を含む。別の実施形態では、第２の幹細胞集団は、骨髄中の幹細胞を含む。具体的な実施形態では、幹細胞を個体に移植する。
【０２３４】
通常、例えば骨髄移植で幹細胞の注入を受ける患者は、約１×１０９個の有核細胞（１〜２×１０６個のＣＤ３４＋幹細胞に対応する）である１単位の有核細胞を投与される。したがって、一実施形態では、個体に投与されるＣＤ３４＋ＣＤ４５−胎盤幹細胞を含む有核細胞の数は、骨髄置換において通常投与される細胞数の少なくとも５倍である。その方法の別の具体的な実施形態では、個体に投与される有核細胞数は、骨髄置換において通常投与される細胞数の少なくとも１０倍である。別の具体的な実施形態では、個体に投与される有核細胞数は、骨髄置換において通常投与される細胞数の少なくとも１５倍である。その方法の別の実施形態では、個体に投与されるＣＤ３４＋ＣＤ４５−胎盤幹細胞を含む有核細胞総数は、体重１キログラム当たり１〜１０００×１０８個である。
【０２３５】
他の実施形態では、ＣＤ３４＋ＣＤ４５−胎盤幹細胞、例えば、ＣＤ３４＋ＣＤ４５−胎盤幹細胞の濃縮細胞集団により、ＣＤ３４＋ＣＤ４５−胎盤幹細胞の濃縮造血幹細胞集団を投与されていない個体における生着と比較して、幹細胞、例えば、造血幹細胞を必要とする個体における生着が改善される。様々な実施形態では、生着は、移植後少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１日以内で改善される。別のより具体的な実施形態では、ＣＤ３４＋ＣＤ４５−胎盤幹細胞により移植後少なくとも２１日、またはそれ以上で幹細胞を必要とする個体における移植が改善される。具体的な実施形態では、ＣＤ３４＋ＣＤ４５−胎盤幹細胞により、移植後２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５週間以内もしくは以上、または１年以上で幹細胞を必要とする個体における生着が改善される。
【０２３６】
ＣＤ３４＋ＣＤ４５−胎盤幹細胞、およびこのような幹細胞を含む幹細胞集団は、個体に対して容易に投与される形態で調製することができる。例えば、細胞または細胞集団は、医療上の使用に適する容器内に含有されうる。このような容器は、例えば、無菌のプラスチック製バッグ、フラスコ、ジャー、または、複合幹細胞集団を容易に分注しうる他の容器でありうる。容器は、複合幹細胞集団の静脈内投与を可能とする、または容易とする容器であることが好ましい。容器、例えば、バッグは、胎盤由来幹細胞と第２の供給源からの幹細胞とを、例えば、混合細胞集団として共に保持することも可能であり、２つの幹細胞集団を個別に保持することも可能である。後者の実施形態において、バッグは、投与前または投与時において、胎盤由来幹細胞と第２の供給源からの幹細胞との混合を可能とするように相互接続された複数の管腔または区画を含むことが好ましい。容器は、複合幹細胞集団の低温保存を可能とする容器であることが好ましい。
【０２３７】
したがって、一実施形態では、本明細書で、ＣＤ３４＋ＣＤ４５−胎盤幹細胞の濃縮細胞集団を容器内に含む組成物が提供される。別の実施形態では、本明細書で、幹細胞集団を含む組成物であって、前記幹細胞集団がＣＤ３４＋ＣＤ４５−胎盤由来幹細胞と第２の型の幹細胞とを容器内に含む組成物が提供される。具体的な実施形態では、容器は、バッグ、フラスコ、またはジャーである。より具体的な実施形態では、前記胎盤由来幹細胞および前記第２の型の幹細胞は、前記バッグ内に共に含有される。別のより具体的な実施形態では、前記胎盤由来幹細胞および第２の供給源由来の前記第２の型の幹細胞は、前記バッグ内に別個に含有される。別の具体的な実施形態では、組成物は、複合幹細胞集団の低温保存を容易とする１つまたは複数の化合物を含む。別の具体的な実施形態では、前記複合幹細胞集団は、生理的に許容される水溶液中に含有される。より具体的な実施形態では、前記生理的に許容される水溶液は、０．９％ＮａＣｌ溶液である。別のより具体的な実施形態では、前記バッグは、無菌のプラスチック製バッグである。より具体的な実施形態では、前記バッグは、前記幹細胞の静脈内投与を可能とし、または容易にする。より具体的な実施形態では、幹細胞は、第２の供給源由来の前記幹細胞にＨＬＡが適合するＣＤ３４＋ＣＤ４５−胎盤細胞を含む。別の具体的な実施形態では、幹細胞は、第２の型の幹細胞にＨＬＡが少なくとも部分的に適合しないＣＤ３４＋ＣＤ４５−胎盤幹細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記胎盤由来幹細胞は、複数のドナーに由来する。別の具体的な実施形態では、第２の供給源由来の前記幹細胞は、複数のドナーに由来する。
【０２３８】
ＣＤ３４＋ＣＤ４５−幹細胞、および、ＣＤ３４＋ＣＤ４５−胎盤幹細胞を含む細胞集団は、個体への投与前の期間にわたり培養することができる。例えば、一実施形態では、幹細胞は、Ｎｏｔｃｈアゴニスト、例えば、基本的にＮｏｔｃｈタンパク質またはＤｅｌｔａタンパク質の細胞内ドメインからなるＮｏｔｃｈタンパク質の欠失形態を含む培地中で培養することができる。Ｕ．Ｓ．２００４／００６７５８３を参照されたい。
【０２３９】
別の実施形態では、本明細書で提供されるＣＤ３４＋ＣＤ４５−胎盤幹細胞集団と臍帯血細胞集団とを、これらを必要とする患者に逐次的に投与する。一実施形態では、胎盤幹細胞集団を一番目に投与し、第２の型の幹細胞集団を二番目に投与する。別の実施形態では、第２の型の幹細胞を一番目に投与し、ＣＤ３４＋ＣＤ４５−胎盤幹細胞を二番目に投与する。
【０２４０】
ＣＤ３４＋ＣＤ４５−胎盤幹細胞と、第２の型の幹細胞、例えば、臍帯血由来幹細胞もしくは前駆細胞、またはバンク化もしくは低温保存された臍帯血を含む臍帯血との複合集団は、医学的に許容される任意の手段により、移植前に混合することができる。一実施形態では、２つの集団を物理的に混合する。その方法の別の実施形態では、前記個体への投与直前（すなわち、１、２、３、４、５、７、１０分以内）に集団を混合する。別の実施形態では、前記個体へ投与する５分より前の時点において集団を混合する。その方法の別の実施形態では、ＣＤ３４＋ＣＤ４５−胎盤幹細胞、および／または第２の型の幹細胞を、前記個体への投与前に低温保存および融解する。別の実施形態では、幹細胞集団の一方または両方を前記投与前に低温保存および融解しておいて、前記個体への投与の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４時間より前の時点において幹細胞を混合する。別の実施形態では、幹細胞集団を複数回投与することができる。
【０２４１】
別の実施形態では、ＣＤ３４＋ＣＤ４５−胎盤幹細胞、および／または第２の型の幹細胞を、移植前にプレコンディショニングする。好ましい実施形態では、プレコンディショニングは、一般に、約−５℃〜約２３℃、約０℃〜約１０℃、または好ましくは、約４℃〜約５℃で、ある期間にわたり細胞をガス透過性容器内で保存することを含む。細胞は、１８時間〜２１日間、４８時間〜１０日間、好ましくは、３〜５日間にわたり保存しうる。細胞は、プレコンディショニングの前に低温保存することができ、投与直前にプレコンディショニングすることができる。
【０２４２】
幹細胞を必要とする個体に接触させる前に、ＣＤ３４＋ＣＤ４５−胎盤幹細胞、または第２の型の幹細胞の一方または両方を分化させることができる。例えば、造血生着の目的で接触させる場合、幹細胞を造血系列内の細胞に分化させることができる。一部の実施形態では、幹細胞集団の移植法は、（ａ）ＣＤ３４＋ＣＤ４５−胎盤幹細胞の分化を誘導することと、（ｂ）胎盤幹細胞を第２の型の幹細胞、例えば、複合細胞集団を形成するために臍帯血幹細胞の集団と混合することと、（ｃ）複合細胞集団のそれを必要とする個体への投与とを含む。別の実施形態では、移植法は、（ａ）第２の型の幹細胞の分化の誘導；（ｂ）複合細胞集団を形成するために分化した細胞をＣＤ３４＋ＣＤ４５−胎盤幹細胞と混合すること；、および（ｃ）複合細胞集団のそれを必要とする個体への投与とを含む。別の実施形態では、複合幹細胞集団の移植法は、（ａ）ＣＤ３４＋ＣＤ４５−胎盤幹細胞を臍帯血細胞集団と混合すること；（ｂ）臍帯血細胞とＣＤ３４＋ＣＤ４５−胎盤幹細胞との混合物の分化の誘導、および（ｃ）該混合物のそれを必要とする患者への投与とを含む。
【０２４３】
本明細書で提供される幹細胞集団、ＣＤ３４＋ＣＤ４５−胎盤幹細胞の濃縮は、注射、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、眼球内注射、特定組織内への直接の注射、輸血などを含む、薬学的または医学的に許容される任意の方式で患者に移植しうる。例えば、複合幹細胞集団、例えば、臍帯血由来幹細胞の組合せでの胎盤幹細胞は、静脈内注入により移植しうる。別の実施形態では、胎盤幹細胞と心臓幹細胞とを懸濁液中に含む複合幹細胞集団は、心臓組織、例えば、心臓内の虚血領域に直接に注射しうる。複合幹細胞集団は、薬学的に許容される任意の担体を含んでもよく、この中に懸濁させてもよい。複合幹細胞集団は、薬学的または医学的に許容される任意の容器、例えば、血液バッグ、輸血バッグ、プラスチック製のチューブまたはバイアル内において保有、保存、または移送しうる。
【０２４４】
移植後、例えば、核酸もしくはタンパク質の検出法または解析法を用いて、ヒトレシピエントにおける生着を評価しうる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、ＳＴＲ法、ＳＳＣＰ法、ＲＦＬＰ解析、ＡＦＬＰ解析などを用いて、レシピエントからの組織試料中における生着された細胞に特異的なヌクレオチド配列を同定することができる。このような核酸の検出法および解析法は、当技術分野で周知である。一実施形態では、レシピエントからの組織試料中における、生着された細胞に特異的な核酸のバックグラウンドから識別される出現により生着を判定しうる。組織試料は、例えば、生検（例えば、骨髄吸引物）または血液試料でありうる。
【０２４５】
一実施形態では、医療処置、例えば、骨髄除去の直前に、末梢血試料を患者から採取する。処置後、本明細書で提供される複合幹細胞を患者に投与する。投与後に少なくとも１回、末梢血の第２の試料を採取する。例えば、ＬａｂＣｏｒｐ（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）社から市販される、マーカー（対立遺伝子）用のＰＣＲプライマーを用いて、両方の試料に対するＳＴＲプロファイルを得る。投与後におけるマーカー（対立遺伝子）の数または特徴の違いにより、生着が生じたことが示される。
【０２４６】
生着はまた、好中球の再出現の検出によっても実証することができる。
【０２４７】
別の例では、生着細胞特異的マーカーを、移植された幹細胞、または移植された幹細胞が分化すると予期される細胞に特異的なマーカーに対する抗体を用いて、レシピエントからの組織試料中において検出しうる。一実施形態では、適切な抗体を追加して結合を可能とすることと、（例えば、ＰＢＳにより）洗浄することと、（例えば、１％パラホルムアルデヒドにより）細胞を固定することと、適切なＦＡＣＳ法装置（例えば、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））上で解析することとにより、胎盤幹細胞と臍帯血由来幹細胞の組合せの生着をＦＡＣＳ解析により評価して、ＣＤ４５＋、ＣＤ１９＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ７＋および／またはＣＤ３＋細胞の存在を判定しうる。胎盤幹細胞、および／または第２の供給源由来の幹細胞が、レシピエントとは異なる性別の個体由来の細胞である場合、例えば、男性のドナーおよび女性のレシピエントの場合、生着は、性別に特異的なマーカー、例えば、Ｙ染色体に特異的なマーカーの検出により判定することができる。胎盤幹細胞、および／または第２の供給源由来の幹細胞はまた、同定を容易にする固有のマーカーまたは核酸配列、例えば、ＲＦＬＰマーカー、β−ガラクトシダーゼの発現、または緑色蛍光タンパク質などを発現するように遺伝子改変することもできる。
【０２４８】
生着の程度は、当技術分野で知られる任意の手段により評価しうる。一実施形態では、生着の程度は、移植レシピエントからの、固定され抗体を結合させた組織の薄い切片を用いて、以下のグレード付けシステムにより評価する。このグレード付けシステムの例において、生着は、以下の通りにグレード付けされる：０＝陽性細胞なし（すなわち、生着細胞に特異的な抗体が結合する細胞なし）；０．５＝１または２個の陽性細胞がおそらくは陽性であるが、バックグラウンドからの識別が困難であるか、または非特異的な染色である；１＝２〜２０個の陽性細胞が散乱する；２＝約２０〜１００個の陽性細胞が、組織全体に散乱または凝集する；３＝１００個を超える陽性細胞が組織の５０％未満を占める；４＝５０％を超える細胞が陽性である。具体的な実施形態では、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、７．５％  １０％、１５％、２０％以上の細胞が陽性に染色される場合に生着と判定される。
【０２４９】
別の実施形態では、生着の程度は、生着細胞が果たす１つまたは複数の生物学的機能の獲得の解析により判定する。例えば、骨髄除去療法を受けたレシピエントが、胎盤幹細胞と臍帯血由来幹細胞とを含む複合幹細胞集団の生着を受ける場合、移植の程度は、造血、血球集団、および血液機能が正常に戻る程度により判定しうる。
【０２５０】
複合幹細胞集団が、全体または部分において、目的とするレシピエントに対してＨＬＡが適合しない場合、レシピエントを治療して、ドナー細胞に対する免疫拒絶反応を軽減することが必要となりうる。免疫拒絶反応を軽減する方法は、例えば、そのいずれもが参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，８００，５３９号および同第５，８０６，５２９号において開示される。
【０２５１】
したがって、一実施形態では、造血幹細胞を含む複合幹細胞集団を使用して、リンパ腫、白血病（慢性または急性の骨髄性白血病、急性リンパ球性白血病、ホジキン病など）、骨髄異形成、骨髄異形成性症候群などの血液癌を有する患者を治療することができる。別の実施形態では、疾患、障害、または状態は、慢性肉芽腫性疾患である。
【０２５２】
貧血の治療に造血再構成を使用できるので、本明細書では、本発明のＣＤ３４＋、ＣＤ４５−胎盤幹細胞による個体の治療であって、貧血症または血液ヘモグロビンの障害を有する固体の治療がさらに提供される。貧血症または障害は、自然の場合（例えば、遺伝的特徴または疾患により生じる）でもありえ、人工的に誘導された場合（例えば、偶発的または故意の中毒、化学療法などによる）でもありうる。別の実施形態では、疾患または障害は、骨髄不全症候群（例えば、無形成性貧血、コストマン症候群、ダイアモンド−ブラックファン貧血、無巨核球性血小板減少症など）、骨髄障害、または造血疾患もしくは障害である。具体的な実施形態では、複数の間葉系幹細胞および／または複数の接着性胎盤幹細胞と共に、ＣＤ３４＋ＣＤ４５−胎盤幹細胞を投与する。
【０２５３】
別の実施形態では、本明細書で提供されるＣＤ３４＋ＣＤ４５−胎盤幹細胞を、単独で、または第２の型の幹細胞、例えば、間葉系幹細胞もしくは接着性胎盤幹細胞の組合せで損傷した臓器内に導入し、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける臓器の新生および外傷の修復をもたらすことができる。このような外傷は、心筋梗塞、発作性障害、多発性硬化症、脳卒中、低血圧、心停止、虚血、炎症、年齢に関連する認知機能の喪失、脳神経麻痺、神経変性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、リー病、ＡＩＤＳによる認知症、記憶喪失、筋萎縮性側索硬化症、虚血性腎疾患、脳または脊髄の外傷、心肺バイパス、緑内障、網膜虚血、または網膜外傷を含むがこれらに限られない状態および障害に起因しうる。
【０２５４】
他の実施形態では、疾患、障害、または状態は、テイ−サックス病、ニーマン−ピック病、ファブリー病、ゴーシェ病（例えば、グルコセレブロシダーゼ欠損症）、ハンター症候群、およびハーラー症候群などのリソソーム蓄積症、マロトー−ラミー症候群、フコシドーシス（フコシダーゼ欠損症）、バッテン病（ＣＬＮ３）のほか、他のガングリオシドーシス、ムコ多糖症、および糖原病を含むがこれらに限られない。
【０２５５】
他の実施形態では、本明細書で提供されるＣＤ３４＋ＣＤ４５−胎盤幹細胞を、遺伝子療法における自家または異種のトランス遺伝子担体として用いて、例えば、先天的代謝障害、副腎白質ジストロフィー（例えば、ｃｏ−Ａリガーゼ欠損症）、異染性白質萎縮症（アリールスルファターゼＡ欠損症）（例えば、症候性または前症候性の遅発性小児型または若年型）、球様細胞白質萎縮症（クラッベ病、ガラクトセレブロシダーゼ欠損症）、酸リパーゼ欠損症（ウォルマン病）、嚢胞性線維症、グリコーゲン蓄積症、甲状腺機能低下症、鎌状赤血球貧血症、サラセミア（例えば、ベータサラセミア）、ピアソン症候群、ポンペ病、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、ポルフィリン症、メープルシロップ尿症、ホモシスチン尿症、ムコ多糖症、慢性肉芽腫性疾患およびチロシン血症、ならびにテイ−サックス病を是正する、または、固形腫瘍もしくは他の病態を治療することができる。
【０２５６】
他の実施形態では、疾患、障害、または状態は、１つまたは複数の組織の置換または修復を必要とする疾患、障害、または状態である。例えば、本明細書で提供されるＣＤ３４＋ＣＤ４５−胎盤幹細胞を、単独で、または第２の型の幹細胞、例えば、間葉系幹細胞もしくは接着性胎盤幹細胞の組合せで治療的な移植プロトコールにおいて用いて、例えば、肝臓、膵臓、腎臓、肺、神経系、筋肉系、骨、骨髄、胸腺、脾臓、粘膜組織、生殖腺、または毛髪の幹細胞または前駆細胞を増強または置換することができる。本明細書で提供される複合幹細胞集団はまた、例えば、軟骨、腱、または靭帯の増強、修復、または置換にも用いることができる。例えば、特定の実施形態では、人工装具（例えば、腰部人工装具）を、本明細書で提供される複合幹細胞集団から増殖させた置換用軟骨組織構築物で被覆する。他の実施形態では、関節（例えば、膝関節）を、複合幹細胞集団から増殖させた軟骨組織構築物により再構築する。軟骨組織構築物はまた、異なる種類の関節の主な再構築術においても使用することができる（プロトコールについては、例えば、Ｒｅｓｎｉｃｋ，Ｄ．およびＮｉｗａｙａｍａ，Ｇ．編、１９８８年、「ＤＩＡＧＮＯＳＩＳ  ＯＦ  ＢＯＮＥ  ＡＮＤ  ＪＯＩＮＴ  ＤＩＳＯＲＤＥＲＳ」、第２版、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ社を参照されたい）。複合幹細胞集団を使用して、外傷、代謝障害、または疾患から生じる組織および臓器の損傷を修復することができる。一実施形態では、患者に複合幹細胞集団を投与して、疾患の結果として損傷した組織または臓器を再生または回復する、例えば、心筋梗塞後の心臓組織を修復することができる。
【０２５７】
別の実施形態では、本明細書で提供されるＣＤ３４＋ＣＤ４５−胎盤幹細胞は、単独で、または第２の型の幹細胞、例えば、間葉系幹細胞もしくは接着性胎盤幹細胞の組合せで用いて、致死量または亜致死量の放射線を受けた個体を治療しうる。例えば、業務関連もしくは攻撃関連、または、例えば、医療処置の一部としての治療的な場合のいずれであれ、核事故ではこのような放射線を偶発的に受ける場合がある。放射線の特定の種類（例えば、アルファ線、ベータ線、ガンマ線）は、重要でない。本明細書で提供される複合幹細胞集団を用いて、放射線疾患の１つまたは複数の症状、例えば、悪心、食欲不振、倦怠感、呼吸窮迫（ｄｙｓｐｎｅａ）、白血球数減少、慢性貧血症、疲労、脱力感、顔面蒼白、呼吸困難（ｄｉｆｆｉｃｕｌｔｙ  ｂｒｅａｔｈｉｎｇ）、不快感など、可逆性の放射性疾患であれ、致死性の放射線疾患であれ、このような症状を改善しうる。別の実施形態では、個体は、急性放射線症候群（ＡＲＳ）と関連する１つまたは複数の症状を有する。本明細書で提供される複合幹細胞集団はまた、致死量または亜致死量の放射線を受けた個体の造血系を部分的または完全に再構成して、個体が部分的または完全にキメラとなるように用いることもできる。このようなキメラ化は、一次的または恒久的でありうる（例えば、１、２、３週間以上にわたり、または、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１カ月以上にわたり持続しうる）。好ましい実施形態では、本明細書で提供される複合幹細胞集団は、曝露後最初の２４時間以内に個体へと提供される。個体には、放射線への曝露後１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、９時間、１２時間、１５時間、１８時間、または２１時間以内に複合幹細胞集団を投与しうる。本明細書で提供される複合幹細胞集団はまた、放射線への曝露後２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間、４週間、または５週間以内にも投与しうる。
【０２５８】
疾患、障害、または状態が、測定可能な何らかの形で改善される場合、本明細書で提供されるＣＤ３４＋ＣＤ４５−胎盤幹細胞による個体の治療的または予防的処置は、有効であると考えうる。このような改善は、いくらかの指標により示しうる。測定可能な指標は、例えば、特定の疾患、障害、または状態と関連する生理的状態または一連の生理的状態（血圧、心拍数、呼吸数、種々血球カウント、特定のタンパク質の血中レベル、炭水化物、脂質、もしくはサイトカイン、または疾患、障害、もしくは状態と関連する遺伝子マーカーの発現調節を含むがこれらに限られない）の検出可能な変化を含む。このような指標の任意の１つが、正常な値の内にあるかまたはこれに近接する値へと変化することによりこのような処置に応答する場合、本明細書で提供されるＣＤ３４＋ＣＤ４５−胎盤幹細胞による個体の処置は、有効であると考えられる。正常値は、種々の指標について当技術分野で知られている正常な範囲により、または対照におけるこのような値との比較により確立しうる。複合幹細胞集団が導入される個体が、生着の任意の指標（例えば、生検試料もしくは組織試料、または血液試料中に出現する生着細胞のマーカー；生着細胞が果たす１つまたは複数の生化学的機能の検出など）を示す場合、移植、例えば、造血移植のために本明細書で提供される複合幹細胞集団の導入は、成功であると考えられる。医学において、処置の有効性はまた、個体の健康状態に関する個体の印象および主観的感覚との関連でも特徴付けられることが多い。したがって、改善はまた、本明細書で提供される幹細胞または補充細胞集団の投与後における個体の、主観的感覚などの改善、健康の増進、健康状態の増進、活力レベルの向上などに関する個体の主観的な指標によっても特徴付けることができる。
【実施例１】
【０２５９】
６．１  実施例１：胎盤幹細胞の取得
６．１．１  組織破壊／酵素消化
酵素消化により胎盤組織から幹細胞を得るための典型的なプロトコルは以下の通りである。凍結した胎盤組織（それぞれ約１×１×０．５ｃｍを３片）を得る。組織は、臍帯、胎盤の母体側面、または羊膜である。用いた消化酵素としては、トリプシン−ＥＤＴＡ（０．２５％、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）、コラゲナーゼＩＡ（Ｓｉｇｍａ）、コラゲナーゼＩ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）、コラゲナーゼ１Ａ（Ｓｉｇｍａ）＋トリプシン−ＥＤＴＡ、コラゲナーゼ１（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）＋トリプシン−ＥＤＴＡ、またはエラスターゼ＋コラゲナーゼＩ＋コラゲナーゼＩＶ＋ダスパーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）が挙げられる。胎盤組織の消化は以下の通りである。酵素（５０ｍｌのチューブにおいて１０ｍｌ中に１ｇ）の存在下において、３７℃で組織を細かく切断し、チューブを４５度の角度に置き、１時間、２５０ｒｐｍで振とうする（Ｃ２５  Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ  Ｓｈａｋｅｒ、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｅｄｉｓｏｎ、ＮＪ、ＵＳＡ）。次に上清を捨てる。ペレットを２０ｍｌのハンクス液＋５％のＦＣＳで洗浄し（３回）、１２ｍｌの培地中に再懸濁する。３ｍｌの得られた懸濁液を、それぞれに１０ｍｌの培地が入っているＴ−７５フラスコ（消化当たり４つのフラスコ）に等分する。場合により、１０ｍｌのトリプシン／ＥＤＴＡを３７℃で３０分間、２５０ｒｐｍで振とうしながら加え、再び遠心分離し、１０ｍｌのハンクス液＋５％ＦＣＳでさらなる洗浄をする。細胞を播種し、培養し、接着性細胞を選択する。
【０２６０】
以下の方法も用いることができる。胎盤を娩出後２４時間未満に得る。胎盤を清掃した後、止血鉗子を臍帯の遠位端にクランプする。臍帯を胎盤との接合部で切断し、無菌皿に移す。止血鉗子の下で臍帯を切断した後、臍帯を揉んで血塊を取り除き、ゲンタマイシンおよびアンホテリシンＢを含む５００ｍｌのＰＢＳに移す。この臍帯を５ｇ用いる。メスを用いて、臍帯の付着点から半径約３インチを切断することにより、残っている胎盤材料を切り揃える。残っている材料から血塊を取り除き、臍帯の根部に集中している羊膜−絨毛膜を５ｇ、臍帯と同じ容器に移す。臍帯および羊膜−絨毛膜の組織をスライスし、次に、約１ｍｍ３のサイズの切片に細かく切断する。次に、組織を１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ１Ａ（２０ｍｌ／組織ｇ）を用いて３７℃で１時間消化し、その後、トリプシン−ＥＤＴＡ（１０ｍｌ／組織ｇ）を用いて３７℃で３０分間消化する。ＰＢＳ内の５％ＦＢＳ内で３回洗浄した後、組織を培地（２０ｍｌ／組織ｇ）中に再懸濁し、約０．２２ｍｌ／ｃｍ２でＴフラスコに移す。
【０２６１】
６．１．２  灌流
分娩後の胎盤を出産の２４時間以内に得る。臍帯を胎盤の約３から４インチのところで臍帯クランプでクランプし、臍帯をクランプの上部で切断する。臍帯は、捨てるか、または、例えば臍帯幹細胞を回収するための、および／または生物材料の生産のために臍帯膜を処理するための処理を行う。余剰の羊膜および絨毛膜を、胎盤の端の周りの約４分の１インチを残して胎盤から切り取る。切り揃えた材料を捨てる。
【０２６２】
胎盤膜の端から開始して、指で鈍的剥離を行って絨毛膜から羊膜を分離する。羊膜が完全に絨毛膜から分離したら、鋏を用いて羊膜を臍帯の基部の周りで切断し、胎盤から切り離す。羊膜は、捨てるか、または、例えば酵素消化によって幹細胞を得るための、もしくは例えば羊膜生物材料を生産するための処理を行うことができる。
【０２６３】
残っている胎盤材料の胎児側から全ての視認可能な血塊および残余の血液を無菌ガーゼを用いて取り除き、次に、胎盤材料を、アルコール綿よりもむしろヨウ素綿で拭くことで滅菌する。次に、臍帯クランプの真下で無菌の止血鉗子を用いて十字に臍帯をクランプし、クランプ上に臍帯を引っ張りながら止血鉗子を回転させて遠ざけ、折りたたみを形成する。次に臍帯を止血鉗子の下で部分的に切断し、クランプに支えられている臍帯の横断面を露出させる。あるいは、臍帯を、無菌の止血鉗子でクランプする。次に、臍帯を無菌ガーゼの上に置き、止血鉗子で掴んで張力を加える。次に、止血鉗子の真下で、臍帯を真っ直ぐに横に切断し、血管付近の臍帯の端を再びクランプする。
【０２６４】
通常は１つの静脈および２つの動脈である、上述したように露出させた血管を同定し、以下のようにして切開する。閉じたワニ口クランプを、血管壁にクランプで穴を開けないように注意しながら、それぞれの血管の切断端を通して前進させる。クランプの先端が臍帯の基部からわずかに上になったら、挿入を中止する。次に、クランプをわずかに開き、血管からゆっくりと引き出して血管を広げる。
【０２６５】
灌流装置または蠕動ポンプに接続されたプラスチックチューブを、それぞれの胎盤動脈内に挿入する。２５０ｍＬの収集袋に接続されたプラスチックチューブを胎盤静脈内に挿入する。チューブは所定の位置にテープで止める。
【０２６６】
少量の、無菌の注入グレードの０．９％ＮａＣｌ溶液による、漏出のチェック。漏出がなければ、ポンプのスピードを上げ、約７５０ｍＬの注入グレードの０．９％ＮａＣｌ溶液を、胎盤血管系を通してポンプで送り込む。灌流は、胎盤を外側端から臍帯に向かって穏やかに揉むことにより促進することができる。収集袋が一杯になったら、チューブを袋に接続している連結器から袋を取り外し、別の袋をチューブに接続する。
【０２６７】
収集が終了したら、収集袋を秤量し、遠心分離のために釣り合わせる。遠心分離の後、それぞれの袋を、細胞のペレットを乱さずに血漿抽出器の内部に置く。次に、袋内の上清を取り除き、捨てる。次に、袋を穏やかに揉んで、残っている上清に細胞を再懸濁させる。１ｍＬの無菌シリンジを用いて、約３００〜５００μＬの細胞を、試料採取部位連結器を介して収集袋から引き出し、１．５ｍＬの遠心分離管に移す。残っている灌流液の重量および容積を測定し、３分の１の容積のヘタスターチを灌流液に加え、十分に混合する。１ｍＬ当たりの細胞数を測定する。血漿抽出器を用いて、赤血球を灌流液から除去する。
【０２６８】
次に、胎盤細胞を速やかに培養して胎盤幹細胞を単離するか、または後の使用のために冷凍保存する。
【０２６９】
６．１．３  単離した幹細胞の培養
初代培養：初代培養の目的は、消化された胎盤組織から細胞を樹立することである。消化された組織を培地に懸濁し、コーニングＴ−フラスコ内に置き、それを３７℃、５％ＣＯ２に維持した加湿室内でインキュベートする。培地の半分を培養の５日後に補充する。２週間の培養によって、高密度の細胞コロニーが形成される。トリプシン−ＥＤＴＡを用いてコロニーを採取し、次にトリプシン−ＥＤＴＡをＰＢＳ内の２％ＦＢＳでクエンチする。細胞を遠心分離し、拡大培養物を播種するための培地中に再懸濁する。これらの細胞を、分裂が０回である継代０細胞と定義する。
【０２７０】
拡大培養。初代培養物から採取した細胞、拡大培養物から採取した細胞、または細胞バンクから解凍した細胞を、拡大培養物の播種に用いる。Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ（ＮＵＮＣ（商標））を空気中５％のＣＯ２で、無菌フィルターを通して５０ｍｌ／分／トレイで１０分間処理し、３７℃、５％ＣＯ２に維持した加湿インキュベータ内において温める。細胞播種物をトリパンブルーを用いて血球計上で計数し、細胞の数、生存率、継代数、および分裂の累積数を記録する。細胞を培地内に約２．３×１０４個細胞／ｍｌまで懸濁し、１１０ｍｌ／トレイをＣｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ内に播種する。３〜４日の培養の後、また、５〜６日の培養の後、培地を除去し、新鮮な培地で置き換え、その後、空気中５％のＣＯ２でもう一度処理を行う。細胞が約１０５個／ｃｍ２に達したら、トリプシン−ＥＤＴＡを用いて細胞を採取し、その後、ＰＢＳ内の２％ＦＢＳでクエンチする。次に細胞を遠心分離し、培地中に再懸濁する。
【実施例２】
【０２７１】
６．２  実施例２：灌流液からの胎盤幹細胞の単離および特徴付け
この実施例は、いくつかの異なる灌流実験からの胎盤幹細胞の収集および特徴付けを示すものである。
【０２７２】
材料および方法
胎盤のドナーは、民間の臍帯血バンクプログラムに登録し、かつ、臍帯血の回収の後に、放血した胎盤を調査目的のために使用することを許可するインフォームドコンセントを提供している妊婦から採用した。これらのドナーはまた、冷凍保存のための自らの臍帯血試料の通常の処理で得られる盲検データの使用も許可していた。このことにより、収集された臍帯血の組成と、以下に記載するこの実験方法を用いて回収された流出灌流液の組成との間を比較することが可能になった。全てのドナーのデータは機密とした。
【０２７３】
臍帯および胎盤の放血の後、胎盤を無菌の絶縁容器内に室温で置き、出産の４時間以内に実験室に運んだ。検査の際に胎盤が器官の破砕または臍血管の剥離などの物理的損傷の跡を有していた場合は、胎盤を廃棄した。胎盤は、無菌容器で２から２０時間、室温（２３±２℃）で維持するかまたは冷蔵（４℃）した。定期的に、胎盤を２５±３℃の生理食塩水に浸し、その中で洗浄し、あらゆる視認可能な表面の血液または残渣物を取り除いた。臍帯を、胎盤へのその挿入部分から約５ｃｍのところで横に切断し、臍血管に、胎盤の双方向性の灌流および流出液の回収を可能にする無菌の流体経路に接続されたテフロンまたはポリプロピレン製のカテーテルをカニューレ挿入する。
【０２７４】
胎盤の馴化
胎盤は、書面上の親の同意を得た後に、臍帯血と共に分娩室から入手し、分娩後１２から２４時間以内に室温で処理した。処理の前に、膜を取り除き、母体側の部位を洗浄して、残っている血液を取り除いた。胎盤は、残っている細胞の増殖および動員のための生理的に適合する環境をシミュレートし、かつ持続させるために、様々な条件の下で維持した。臍血管に、２０ゲージの翼状針で作製されたカテーテルをカニューレ挿入し、血液試料の収集に用いる。カニューレに、２Ｕ／ｍｌのヘパリン（ＥＪｋｉｎｓ−Ｓｉｎｎ、Ｎ．Ｊ．）を含むＩＭＤＭ無血清培地（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、ＮＹ）を流した。次に、胎盤を、ヘパリン化した（２Ｕ／ｍＬ）ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いて、１５ｍＬ／分の速度で１０分間灌流し、灌流液を１時間以内に母体側の部位から収集し、有核細胞を計数した。胎盤の灌流は、毎分５０ｍＬの速度で、およそ１５０ｍＬの灌流液が収集されるまで継続した。この用量の灌流液は「初期画分」とラベル付けした。灌流および収集の手順は、回収される有核細胞の数が１００個／μＬを下回るようになるまで１回または２回反復した。同じ速度で継続して胎盤を灌流すると、約１５０ｍＬの二次画分の収集物が得られ、それには「後期画分」とラベル付けした。手順の過程において、胎盤を穏やかに揉んで、灌流プロセスを促進し、細胞材料の回収を促した。重力排水および動脈カニューレを介した吸引の両方によって、流出液を灌流回路から収集した。
【０２７５】
灌流液をプールし、軽い遠心分離にかけて、血小板、残渣物、および除核細胞の膜を取り除いた。次に、有核細胞をＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離により単離し、洗浄の後、ＤＭＥＭに再懸濁した。接着性細胞の単離のために、５〜１０×１０６個の細胞のアリコートをいくつかのＴ−７５フラスコのそれぞれの中に入れ、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒから入手した、市販の間葉系幹細胞増殖培地（ＭＳＣＧＭ）と共に培養し、組織培養物インキュベータ（３７℃、５％ＣＯ２）の中に入れた。１０から１５日後、非接着性細胞をＰＢＳで洗浄することにより取り除き、次にＰＢＳをＭＳＣＧＭで置き換えた。フラスコを、様々な接着性細胞型の存在について、とりわけ、接着性線維芽細胞様細胞塊の同定および拡大について、毎日調べた。
【０２７６】
細胞の回収および単離
４００×ｇで１５分間、室温で遠心分離することにより、灌流液から細胞を回収する。２Ｕ／ｍｌのヘパリンおよび２ｍＭのＥＤＴＡを含むＩＭＤＭ無血清培地（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、ＮＹ）に、細胞ペレットを再懸濁した。全単核細胞画分を、製造者の推奨する手順に従ってＬＹＭＰＨＯＰＲＥＰ（商標）（Ｎｙｃｏｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａ、Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）を用いて単離し、単核細胞画分を再懸濁した。細胞は血球計を用いて計数した。生存率を、トリパンブルー排除によって評価した。０．０５％のトリプシンと０．２％のＥＤＴＡとの溶液（Ｓｉｇｍａ）を用いて示差的にトリプシン処理することによって、間葉系細胞の単離を行った。接着性胎盤幹細胞を含む線維芽細胞様細胞が約５分以内にプラスチック表面から離れた一方で、他の接着性集団は２０〜３０分を超えるインキュベーションが必要であったため、示差的なトリプシン処理が可能であった。
【０２７７】
離れた線維芽細胞様細胞を、トリプシン処理およびトリプシン中和溶液（ＴＮＳ、ＢｉｏＷｈｉｔａｋｅｒ）を用いたトリプシン中和の後に採取した。細胞をＤＭＥＭ内で洗浄し、ＭＳＣＧＭ中に再懸濁した。Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ機器と、ＣＤ１０、ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ４５、およびＣＤ９０に対する抗体を含む、骨髄由来ＭＳＣ（間葉系幹細胞）に対する既知のマーカーに基づいて選択された、ＦＩＴＣ標識モノクローナル抗体およびＰＥ標識モノクローナル抗体とを用いて、フローサイトメトリーを行った。抗体はＢｅｃｔｏｎ−ＤｉｃｋｉｎｓｏｎおよびＣａｌｔａｇ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆ．）から購入し、ＳＨ２、ＳＨ３、およびＳＨ４抗体産生ハイブリドーマは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手した。ＭｏＡｂの、それらの培養上清における反応性を、ＦＩＴＣ標識またはＰＥ標識したＦ（ａｂ）’２ヤギ抗マウス抗体によって検出した。系列分化は、市販の誘導および維持培地（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）を製造者の指示のように用いて実施した。
【０２７８】
胎盤幹細胞の単離
培養フラスコにおける接着性細胞の顕微鏡試験により、紡錘状の細胞、巨大な核および多くの核周辺の小さな空胞を有する円形の細胞、ならびにいくつかの突起を有し、その１つを介して細胞がフラスコに付着している星状の細胞を含む、形態的に異なる細胞型が明らかになった。これらの接着性細胞をさらに特徴付けるための試みは行わなかったが、同様の細胞が、骨髄、臍帯、および末梢血の培養物においても見られ、したがって、本質的に幹細胞ではないと考えられる。
【０２７９】
塊として現れる線維芽細胞様接着性細胞は、外見が間葉系幹細胞（ＭＳＣ）と類似しており、それを、示差的なトリプシン処理により単離し、第２のフラスコに継代培養した。細胞は、トリプシン処理の後、丸く見えた。トリプシン処理の後に円形の細胞の位相顕微鏡観察を行うと、この細胞が、高度に粒状であり、実験室で生産されるかまたは例えばＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒのような商業的供給源から購入される骨髄由来のＭＳＣに類似していることが示された。継代培養すると、接着性胎盤細胞は、それらの初期相とは異なって、数時間内に接着し、特徴的な線維芽細胞様の形態を取り、かつ、参考の骨髄由来のＭＳＣに似た増殖パターンを形成した。さらに、継代培養およびリフィーディングの際、緩く結合した単核細胞は洗い落とされ、培養物は均質の状態を保ち、あらゆる視認可能な非線維芽細胞様細胞の汚染がないものであった。
【０２８０】
フローサイトメトリー
初期画分および後期画分の精製された単核細胞上の、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＳＨ２、ＳＨ３、ＳＨ４、および他幹細胞結合型他の表面マーカーの発現を、フローサイトメトリーによって評価した。特定のケースにおいて、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、次に、抗ＣＤ３４フィコエリスリンと抗ＣＤ３８フルオレセインイソチオシアネート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆ．）とを用いて二重染色を行った。
【０２８１】
別の実験において、ＰＬＳＣ−１からＰＬＳＣ−２９と称する、別の灌流から得られた胎盤幹細胞を、ＣＤ１０、ＣＤ２９、ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５４、ＣＤ９０、ＳＨ２（ＣＤ１０５）、ＳＨ３（ＣＤ７３）、ＳＨ４（ＣＤ７３）、およびＨＬＡ−１の発現について、フローサイトメトリーによって評価した。ＰＬＳＣ−１からＰＬＳＣ−３、ＰＬＳＣ−５からＰＬＳＣ−１０、ＰＬＳＣ−１５からＰＬＳＣ−２１、ＰＬＳＣ−２３、ＰＬＳＣ−２６、およびＰＬＳＣ−２７と称する接着性細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ２９、ＣＤ５４、ＳＨ２、ＳＨ３、およびＳＨ４に陽性であり、ＣＤ３４およびＣＤ４５には陰性であることが見出された。ＰＬＳＣ−１５からＰＬＳＣ−２１、ＰＬＳＣ−２３、ＰＬＳＣ−２６、およびＰＬＳＣ−２７と称する接着性細胞は、さらに、ＣＤ４４、ＣＤ９０、およびＨＬＡ１に陽性であることが見出された。以下の表１を参照されたい。
【０２８２】
ｍＲＮＡを、ＰＬＳＣ−３およびＰＬＳＣ−６からＰＬＳＣ−１０細胞からの接着性細胞から収集し、ＯＣＴ−４（ＰＯＵ５Ｆ）に特異的なプライマーを用いてｒｔＰＣＲを実施した。試験した細胞集団の全てはＯＣＴ−４のｍＲＮＡに陽性であった。
【０２８３】
【表１】
2010518812.tif 000003
【０２８４】
分化
個別の実験において、接着性線維芽細胞様細胞は幹細胞であることが示された。細胞はインビトロで脂肪細胞系列の細胞に分化し、このことは、オイルレッド染色液によって検出可能な油滴の形成により証明された。細胞はまた、インビトロで神経原性系列の細胞に分化し、このことは、神経細胞の特徴である樹状突起様の紡錘体の発達と、共に神経細胞のマーカーであるグリア線維性酸性タンパク質および神経フィラメントタンパク質の出現とにより証明された。細胞はまた、インビトロで軟骨形成系列の細胞に分化し、このことは、過ヨウ素酸シッフ試薬により検出可能な、軟骨産生細胞により産生されるグリコサミノグリカンの出現によって証明された。別の実験において、胎盤幹細胞はＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスモデルにおいては分化しないことが示された。
【実施例３】
【０２８５】
６．３  実施例３：胎盤構造からの胎盤幹細胞の単離
６．３．１  材料および方法
６．３．１．１  胎盤幹細胞を含む胎盤細胞集団の単離
異なる胎盤細胞集団を、正常な満期妊娠の胎盤から得た。全てのドナーは、調査目的のための自らの胎盤の使用について完全な書面での同意を提供した。胎盤幹細胞は以下の供給源（１）胎盤灌流液（胎盤血管系の灌流から得たもの）、ならびに、（２）羊膜、（３）絨毛膜、（４）羊膜−絨毛膜板、および（５）臍帯の酵素消化から得た。様々な胎盤組織を無菌ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中で清掃し、個別の無菌ペトリ皿に置いた。様々な組織を、無菌外科用メスを用いて細かく切断し、５０ｍＬのＦａｌｃｏｎコニカルチューブ内に置いた。細かく切断した組織を１×コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で２０分間、３７℃の水浴中で消化し、遠心分離し、次に、０．２５％のトリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ）で１０分間、３７℃の水浴中で消化した。様々な組織を消化の後に遠心分離し、無菌ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ）で１回すすいだ。次に、再構成された細胞を、１回は１００μｍの細胞ストレーナーを、１回は３０μｍの分離フィルターを用いて２回濾過し、あらゆる残余の細胞外マトリックスまたは細胞残渣物を除去した。
【０２８６】
６．３．１．２  細胞生存率の評価および細胞計数
手作業のトリパンブルー排除法を消化の後に行って細胞数を計算し、細胞生存率を評価した。細胞をトリパンブルー染料（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と１：１の比率で混合し、細胞を血球計で読み取った。
【０２８７】
６．３．１．３  細胞表面マーカーの特徴付け
ＨＬＡ  ＡＢＣ−／ＣＤ４５−／ＣＤ３４−／ＣＤ１３３＋である細胞を特徴付けのために選択した。この表現型を有する細胞を同定し、定量化し、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎフローサイトメーター、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、およびＦＡＣＳ  Ａｒｉａ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）のうちの２つによって特徴付けした。様々な胎盤細胞を、１００万個の細胞当たり約１０μＬの抗体の割合で、室温で３０分間、振とう器上で染色した。以下の抗ヒト抗体：ＨＬＡ−Ｇ（Ｓｅｒｏｔｅｃ、Ｒａｌｅｉｇｈ、ＮＣ）、ＣＤ１０（ＢＤ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）、ＣＤ４４（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）、およびＣＤ１０５（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）に対するフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合モノクローナル抗体；ＣＤ４４、ＣＤ２００、ＣＤ１１７、およびＣＤ１３（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に対するフィコエリスリン（ＰＥ）結合モノクローナル抗体；ＣＤ１１７（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に対するフィコエリスリン−Ｃｙ５（ＰＥ  Ｃｙ５）結合ストレプトアビジンおよびモノクローナル抗体；ＣＤ３３およびＣＤ１０（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に対するフィコエリスリン−Ｃｙ７（ＰＥ  Ｃｙ７）結合モノクローナル抗体；ＣＤ３８（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に対するアロフィコシアニン（ＡＰＣ）結合ストレプトアビジンおよびモノクローナル抗体；ならびに、ビオチン化ＣＤ９０（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いた。インキュベーションの後、細胞を１回すすいで未結合の抗体を取り除き、４％パラホルムアルデヒド（ＵＳＢ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）を用いて４℃で一晩固定した。翌日、細胞を２回すすぎ、３０μｍの分離フィルターを通して濾過し、１つまたは複数のフローサイトメーターにかけた。
【０２８８】
抗マウスＩｇＧ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色した試料を陰性対照として使用し、光電子増倍管（ＰＭＴ）を調節するために用いた。抗ヒト抗体で単染色した試料を陽性対照として使用し、スペクトルのオーバーラップ／補償を調節するために用いた。
【０２８９】
６．３．１．４  細胞の選別および培養
あらゆる培養の前に、１組の胎盤細胞（灌流液、羊膜、または絨毛膜から得たもの）を、７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）および目的の表現型に特異的なモノクローナル抗体で染色した。１００万個の細胞当たり１０μＬの抗体の割合で細胞を染色し、室温で３０分間、振とう器上でインキュベートした。次に、これらの細胞に、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ａｒｉａで、目的の表現型を発現している生細胞について正の選別を行い、播種して培養した。選別された（目的の集団）および「全ての」（選別されていない）胎盤細胞集団を、比較のために播種した。細胞は、フィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で被覆した９６ウェルプレート上に、表２に記載した細胞密度（細胞／ｃｍ２）で播種した。細胞密度、および、その細胞型を二重または三重のどちらで播種したかは、目的の表現型を発現している細胞の数によって決定および管理した。
【０２９０】
【表２】
2010518812.tif 000004
【０２９１】
完全培地（６０％ＤＭＥＭ−ＬＧ（Ｇｉｂｃｏ）および４０％ＭＣＤＢ−２０１（Ｓｉｇｍａ）、２％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｓ．）、１×インスリン−トランスフェリン−セレニウム（ＩＴＳ）、１×リノール酸−ウシ血清アルブミン（ＬＡ−ＢＳＡ）、１０−９Ｍのデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）、１０−４Ｍのアスコルビン酸２−リン酸塩（Ｓｉｇｍａ）、１０ｎｇ／ｍＬの上皮成長因子（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ならびに１０ｎｇ／ｍＬの血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ−ＢＢ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ））を９６ウェルプレートのそれぞれのウェルに加え、プレートを５％ＣＯ２／３７℃のインキュベータ内に置いた。７日目に、１００μＬの完全培地をそれぞれのウェルに加えた。９６ウェルプレートを約２週間観察し、培養の最終的な評価を１２日目に完了した。これは胎盤幹細胞の培養において極めて初期であり、継代０細胞に相当する。
【０２９２】
６．３．１．５  データ分析
ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒデータは、標準的なゲート作成技術を用いてＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ  ｓｔａｒ，Ｉｎｃ）において分析した。ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ａｒｉａデータは、ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析した。ＦＡＣＳ  Ａｒｉａデータは、ダブレットを最小化するためのダブレット識別ゲート作成および標準的なゲート作成技術を用いて分析した。全ての結果はマイクロソフト社のエクセルにコンパイルし、ここでの全ての値は、平均±標準偏差（数、平均の標準誤差）として表す。
【０２９３】
６．３．２  結果
６．３．２．１  細胞生存率
消化後の生存率を、手作業のトリパンブルー排除法を用いて評価した（図１）。消化した組織の大部分から得た細胞（羊膜、絨毛膜、または羊膜−絨毛膜板から得たもの）の平均生存率は約７０％であった。羊膜は７４．３５％±１０．３１％（ｎ＝６、ＳＥＭ＝４．２１）の平均生存率を有し、絨毛膜は７８．１８％±１２．６５％（ｎ＝４、ＳＥＭ＝６．３２）の平均生存率を有し、羊膜−絨毛膜板は６９．０５％±１０．８０％（ｎ＝４、ＳＥＭ＝５．４０）の平均生存率を有し、臍帯は６３．３０％±２０．１３％（ｎ＝４、ＳＥＭ＝１０．０６）の平均生存率を有していた。消化を行っていない、灌流から得た細胞は、８９．９８±６．３９％（ｎ＝５、ＳＥＭ＝２．８６）の最も高い平均生存率を保持していた。
【０２９４】
６．３．２．２  細胞の定量化
胎盤細胞および臍帯細胞の集団を分析し、ＨＬＡ  ＡＢＣ−／ＣＤ４５−／ＣＤ３４−／ＣＤ１３３＋細胞の数を決定した。ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒデータの分析から、羊膜、灌流液、および絨毛膜が、それぞれ３０．７２±２１．８０個細胞（ｎ＝４、ＳＥＭ＝１０．９０）、２６．９２±２２．５６個細胞（ｎ＝３、ＳＥＭ＝１３．０２）、および１８．３９±６．４４個細胞（ｎ＝２、ＳＥＭ＝４．５５）の最大総数の、これらの細胞を含むことが観察された（データは図示していない）。羊膜−絨毛膜板および臍帯は、それぞれ４．７２±４．１６個細胞（ｎ＝３、ＳＥＭ＝２．４０）および３．９４±２．５８個細胞（ｎ＝３、ＳＥＭ＝１．４９）の最小総数の、目的の表現型を発現する細胞を含んでいた（データは図示していない）。
【０２９５】
同様に、目的の表現型を発現する全細胞のパーセントを分析すると、羊膜および胎盤灌流液が、それぞれ（０．０３１９％±０．０２０２％（ｎ＝４、ＳＥＭ＝０．０１０１）および０．２６９％±０．０２２６％（ｎ＝３、ＳＥＭ＝０．０１３０）の最大パーセンテージの、この表現型を発現する細胞を含むことが観察された（図２）。臍帯は少数の、目的の表現型を発現する細胞を含んでいたが（図２）、臍帯は、０．０２０±０．０２２６％（ｎ＝３、ＳＥＭ＝０．０１３１）の三番目に高いパーセンテージの、目的の表現型を発現する細胞を含んでいた（図２）。絨毛膜および羊膜−絨毛膜板は、それぞれ０．０１８４±０．００６４％（ｎ＝２、ＳＥＭ＝０．００４６）および０．０１７７±０．０１７３％（ｎ＝３、ＳＥＭ＝０．０１０）の最小パーセンテージの、目的の表現型を発現する細胞を含んでいた（図２）。
【０２９６】
ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ分析の結果と一致して、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ａｒｉａデータによってもまた、羊膜、灌流液、および絨毛膜が、残りの供給源よりも多い数のＨＬＡ  ＡＢＣ−／ＣＤ４５−／ＣＤ３４−／ＣＤ１３３＋細胞を供給すると同定された。羊膜、灌流液、および絨毛膜の間の、目的の表現型を発現する細胞の平均総数は、それぞれ１２６．４７±５５．６１個細胞（ｎ＝１５、ＳＥＭ＝１４．３６）、８１．６５±３４．６４個細胞（ｎ＝２０、ＳＥＭ＝７．７５）、および５１．４７±３２．４１個細胞（ｎ＝１５、ＳＥＭ＝８．３７）であった（データは図示していない）。羊膜−絨毛膜板および臍帯は、それぞれ４４．８９±３７．４３個細胞（ｎ＝９、ＳＥＭ＝１２．４８）、１１．００±４．０３個細胞（ｎ＝９、ＳＥＭ＝１．３４）の最小総数の、目的の表現型を発現する細胞を含んでいた（データは図示していない）。
【０２９７】
ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ａｒｉａデータにより、灌流液および羊膜が、それぞれ０．１５２３±０．０２２７％（ｎ＝１５、ＳＥＭ＝０．００５９）および０．０９２９±０．０４１９％（ｎ＝２０、ＳＥＭ＝０．００９４）の最大パーセンテージの、ＨＬＡ  ＡＢＣ−／ＣＤ４５−／ＣＤ３４−／ＣＤ１３３＋細胞を産生することが明らかになった（図３）。羊膜−絨毛膜板は、０．０６３２±０．０３３３％（ｎ＝９、ＳＥＭ＝０．０１１１）の三番目に高いパーセンテージの、目的の表現型を発現する細胞を含んでいた（図３）。絨毛膜および臍帯は、それぞれ０．０６２３±０．０２４９％（ｎ＝１５、ＳＥＭ＝０．００６４）および０．０４５７±０．００５５％（ｎ＝９、ＳＥＭ＝０．００１８）の最小パーセンテージの、目的の表現型を発現する細胞を含んでいた（図３）。
【０２９８】
それぞれの細胞源からＨＬＡ  ＡＢＣ−／ＣＤ４５−／ＣＤ３４−／ＣＤ１３３＋細胞を同定および定量化した後、その細胞をさらに、細胞表面マーカーであるＨＬＡ−Ｇ、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１１７、ＣＤ２００、およびＣＤ１０５の発現について分析および特徴付けした。
【０２９９】
６．３．２．３  胎盤灌流液由来の細胞
灌流液由来の細胞は、概して、ＨＬＡ−Ｇ、ＣＤ３３、ＣＤ１１７、ＣＤ１０、ＣＤ４４、ＣＤ２００、ＣＤ９０、ＣＤ３８、ＣＤ１０５、およびＣＤ１３に陽性であると示された（図４）。灌流液由来の細胞についてのそれぞれのマーカーの平均発現は以下の通りであった。３７．１５％±３８．５５％（ｎ＝４、ＳＥＭ＝１９．２８）の細胞がＨＬＡ−Ｇを発現し、３６．３７％±２１．９８％（ｎ＝７、ＳＥＭ＝８．３１）の細胞がＣＤ３３を発現し、３９．３９％±３９．９１％（ｎ＝４、ＳＥＭ＝１９．９６）の細胞がＣＤ１１７を発現し、５４．９７％±３３．０８％（ｎ＝４、ＳＥＭ＝１６．５４）の細胞がＣＤ１０を発現し、３６．７９％±１１．４２％（ｎ＝４、ＳＥＭ＝５．７１）の細胞がＣＤ４４を発現し、４１．８３％±１９．４２％（ｎ＝３、ＳＥＭ＝１１．２１）の細胞がＣＤ２００を発現し、７４．２５％±２６．７４％（ｎ＝３、ＳＥＭ＝１５．４４）の細胞がＣＤ９０を発現し、３５．１０％±２３．１０％（ｎ＝３、ＳＥＭ＝１３．３４）の細胞がＣＤ３８を発現し、２２．８７％±６．８７％（ｎ＝３、ＳＥＭ＝３．９７）の細胞がＣＤ１０５を発現し、２５．４９％±９．８４％（ｎ＝３、ＳＥＭ＝５．６８）の細胞がＣＤ１３を発現した。
【０３００】
６．３．２．４  羊膜由来の細胞
羊膜由来の細胞は、常に、ＨＬＡ−Ｇ、ＣＤ３３、ＣＤ１１７、ＣＤ１０、ＣＤ４４、ＣＤ２００、ＣＤ９０、ＣＤ３８、ＣＤ１０５、およびＣＤ１３に陽性であった（図５）。羊膜由来の細胞についてのそれぞれのマーカーの平均発現は以下の通りであった。５７．２７％±４１．１１％（ｎ＝３、ＳＥＭ＝２３．７３）の細胞がＨＬＡ−Ｇを発現し、１６．２３％±１５．８１％（ｎ＝６、ＳＥＭ＝６．４６）の細胞がＣＤ３３を発現し、６２．３２％±３７．８９％（ｎ＝３、ＳＥＭ＝２１．８７）の細胞がＣＤ１１７を発現し、９．７１％±１３．７３％（ｎ＝３、ＳＥＭ＝７．９２）の細胞がＣＤ１０を発現し、２７．０３％±２２．６５％（ｎ＝３、ＳＥＭ＝１３．０８）の細胞がＣＤ４４を発現し、６．４２％±０．８８％（ｎ＝２、ＳＥＭ＝０．６２）の細胞がＣＤ２００を発現し、５７．６１％±２２．１０％（ｎ＝２、ＳＥＭ＝１５．６３）の細胞がＣＤ９０を発現し、６３．７６％±４．４０％（ｎ＝２、ＳＥＭ＝３．１１）の細胞がＣＤ３８を発現し、２０．２７％±５．８８％（ｎ＝２、ＳＥＭ＝４．１６）の細胞がＣＤ１０５を発現し、５４．３７％±１３．２９％（ｎ＝２、ＳＥＭ＝９．４０）の細胞がＣＤ１３を発現した。
【０３０１】
６．３．２．５  絨毛膜由来の細胞
絨毛膜由来の細胞は、常に、ＨＬＡ−Ｇ、ＣＤ１１７、ＣＤ１０、ＣＤ４４、ＣＤ２００、ＣＤ９０、ＣＤ３８、およびＣＤ１３に陽性であったが、ＣＤ３３およびＣＤ１０５の発現は変化した（図６）。絨毛膜細胞についてのそれぞれのマーカーの平均発現は以下の通りであった。５３．２５％±３２．８７％（ｎ＝３、ＳＥＭ＝１８．９８）の細胞がＨＬＡ−Ｇを発現し、１５．４４％±１１．１７％（ｎ＝６、ＳＥＭ＝４．５６）の細胞がＣＤ３３を発現し、７０．７６％±１１．８７％（ｎ＝３、ＳＥＭ＝６．８６）の細胞がＣＤ１１７を発現し、３５．８４％±２５．９６％（ｎ＝３、ＳＥＭ＝１４．９９）の細胞がＣＤ１０を発現し、２８．７６％±６．０９％（ｎ＝３、ＳＥＭ＝３．５２）の細胞がＣＤ４４を発現し、２９．２０％±９．４７％（ｎ＝２、ＳＥＭ＝６．７０）の細胞がＣＤ２００を発現し、５４．８８％±０．１７％（ｎ＝２、ＳＥＭ＝０．１２）の細胞がＣＤ９０を発現し、６８．６３％±４４．３７％（ｎ＝２、ＳＥＭ＝３１．３７）の細胞がＣＤ３８を発現し、２３．８１％±３３．６７％（ｎ＝２、ＳＥＭ＝２３．８１）の細胞がＣＤ１０５を発現し、５３．１６％±６２．７０％（ｎ＝２、ＳＥＭ＝４４．３４）の細胞がＣＤ１３を発現した。
【０３０２】
６．３．２．６  羊膜−絨毛膜板由来の細胞
羊膜−絨毛膜板から得た細胞は、常に、ＨＬＡ−Ｇ、ＣＤ３３、ＣＤ１１７、ＣＤ１０、ＣＤ４４、ＣＤ２００、ＣＤ９０、ＣＤ３８、ＣＤ１０５、およびＣＤ１３に陽性であった（図７）。羊膜−絨毛膜板由来の細胞についてのそれぞれのマーカーの平均発現は以下の通りであった。７８．５２％±１３．１３％（ｎ＝２、ＳＥＭ＝９．２９）の細胞がＨＬＡ−Ｇを発現し、３８．３３％±１５．７４％（ｎ＝５、ＳＥＭ＝７．０４）の細胞がＣＤ３３を発現し、６９．５６％±２６．４１％（ｎ＝２、ＳＥＭ＝１８．６７）の細胞がＣＤ１１７を発現し、４２．４４％±５３．１２％（ｎ＝２、ＳＥＭ＝３７．５６）の細胞がＣＤ１０を発現し、３２．４７％±３１．７８％（ｎ＝２、ＳＥＭ＝２２．４７）の細胞がＣＤ４４を発現し、５．５６％（ｎ＝１）の細胞がＣＤ２００を発現し、８３．３３％（ｎ＝１）の細胞がＣＤ９０を発現し、８３．５２％（ｎ＝１）の細胞がＣＤ３８を発現し、７．２５％（ｎ＝１）の細胞がＣＤ１０５を発現し、８１．１６％（ｎ＝１）の細胞がＣＤ１３を発現した。
【０３０３】
６．３．２．７  臍帯由来の細胞
臍帯由来の細胞は、常に、ＨＬＡ−Ｇ、ＣＤ３３、ＣＤ９０、ＣＤ３８、ＣＤ１０５、およびＣＤ１３に陽性であったが、ＣＤ１１７、ＣＤ１０、ＣＤ４４、およびＣＤ２００の発現は変化した（図８）。臍帯由来の細胞についてのそれぞれのマーカーの平均発現は以下の通りであった。６２．５０％±５３．０３％（ｎ＝２、ＳＥＭ＝３７．５０）の細胞がＨＬＡ−Ｇを発現し、２５．６７％±１１．２８％（ｎ＝５、ＳＥＭ＝５．０４）の細胞がＣＤ３３を発現し、４４．４５％±６２．８５％（ｎ＝２、ＳＥＭ＝４４．４５）の細胞がＣＤ１１７を発現し、８．３３％±１１．７９％（ｎ＝２、ＳＥＭ＝８．３３）の細胞がＣＤ１０を発現し、２１．４３％±３０．３０％（ｎ＝２、ＳＥＭ＝２１．４３）の細胞がＣＤ４４を発現し、０．０％（ｎ＝１）の細胞がＣＤ２００を発現し、８１．２５％（ｎ＝１）の細胞がＣＤ９０を発現し、６４．２９％（ｎ＝１）の細胞がＣＤ３８を発現し、６．２５％（ｎ＝１）の細胞がＣＤ１０５を発現し、５０．０％（ｎ＝１）の細胞がＣＤ１３を発現した。
【０３０４】
マーカーの発現の全平均の概要を図９に示す。
【０３０５】
６．３．２．８  ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ選別の報告
最大パーセンテージのＨＬＡ  ＡＢＣ、ＣＤ４５、ＣＤ３４、およびＣＤ１３３を発現した胎盤細胞の３つの異なる集団（灌流液、羊膜、および絨毛膜に由来する細胞）を、７ＡＡＤおよびこれらのマーカーに対する抗体で染色した。３つの集団に、目的の表現型を発現している生細胞について正の選別を行った。ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ａｒｉａの選別の結果を表３に記載する。
【０３０６】
【表３】
2010518812.tif 000005
【０３０７】
正に選別された細胞（「選別されたもの」）の３つの異なる集団およびそれらの対応する選別されていない細胞を播種し、培養の結果を１２日目に評価した（表３）。４０６００個／ｃｍ２の細胞密度で播種された、選別された灌流液由来の細胞は、小さな円形の非接着性細胞となった。共に４０６００個／ｃｍ２の細胞密度で播種された、３組の選別されていない灌流液由来の細胞のうち２組は、大部分は小さな円形の非接着性細胞となり、いくつかの接着性細胞がウェルの全周にあった。９３８００個／ｃｍ２の細胞密度で播種された、選別されていない灌流液由来の細胞は、大部分は、小さな円形の非接着性細胞となり、いくつかの接着性細胞がウェルの全周にあった。
【０３０８】
６３００個／ｃｍ２の細胞密度で播種された、選別された羊膜由来の細胞は、小さな円形の非接着性細胞となった。６３００個／ｃｍ２の細胞密度で播種された、選別されていない羊膜由来の細胞は、小さな円形の非接着性細胞となった。６２５００個／ｃｍ２の細胞密度で播種された、選別されていない羊膜由来の細胞は、小さな円形の非接着性細胞となった。
【０３０９】
６３００個／ｃｍ２の細胞密度で播種された、選別された絨毛膜由来の細胞は、小さな円形の非接着性細胞となった。６３００個／ｃｍ２の細胞密度で播種された、選別されていない絨毛膜由来の細胞は、小さな円形の非接着性細胞となった。６２５００個／ｃｍ２の細胞密度で播種された、選別されていない絨毛膜由来の細胞は、小さな円形の非接着性細胞となった。
【０３１０】
上記の非接着性細胞の大部分は、培養すると、組織培養物の表面に接着し、線維芽細胞様の形態を取った。
【０３１１】
上記に関する実験を実施し、胎盤幹細胞をさらに培養した後、ストレプトアビジン結合抗体がビオチン結合フィコエリスリン（ＰＥ）で標識されている、ＣＤ１１７およびＣＤ１３３に対する抗体の標識が、正の読み取りに酷似するのに十分に大きなバックグラウンドを産生することが明らかになった。このバックグラウンドのため、最初は、胎盤幹細胞は両方のマーカーに対して陽性であると考えられた。異なる標識であるＡＰＣまたはＰｅｒＣＰを用いると、バックグラウンドは減少し、胎盤幹細胞はＣＤ１１７およびＣＤ１３３の両方に対して陰性であると正確に決定された。
【実施例４】
【０３１２】
６．４  実施例４：胎盤幹細胞マーカーの発現の特徴付け
この実施例は、ＣＤ２００＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０＋、サイトケラチン１８＋、ＣＤ３４−、およびＣＤ４５−の胎盤幹細胞による様々なタンパク質発現マーカーの発現をさらに特徴付けることを目的とする実験について記載するものである。さらに、例えばサイトケラチン１８の発現、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）の分泌、およびアシアロ糖タンパク質受容体の発現を含む、非誘導性の胎盤幹細胞上での肝細胞マーカーの基礎発現を評価する。
【０３１３】
胎盤幹細胞マーカーの発現を、以下の典型的なフローサイトメトリープロトコルに従って評価する。胎盤幹細胞をまずトリプシン処理し、次に、氷上で蛍光色素結合抗体と共に３０分間、暗所でインキュベートし、冷ＰＢＳ−２％ＢＳＡで２回すすぎ、次に、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析する。これらのアッセイに適している典型的な抗体は、ＰｅｒＣＰ結合抗ＣＤ３４、ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ１０５、ＡＰＣ結合抗ＣＤ１０、およびＰＥ結合ＣＤ２００である。他の適切な抗体試薬としては、適当なフルオロフォアの組合せ、すなわち、ＡＰＣ結合抗ＨＬＡ−ＡＢＣ、ＰＥ結合抗ＣＤ３１、ＰｅｒＣＰ結合抗ＣＤ４５、ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ３８、ＰＥ結合抗ＣＤ４４、ＦＩＴＣ結合抗サイトケラチンＫ（またはサイトケラチン１８）、ＡＰＣ結合抗ＣＤ９０、ＡＰＣ結合抗ＣＤ８６、ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ８０、ＦＩＴＣ結合抗ＨＬＡ  ＤＲ、ＤＱ、ＤＰ、ＰＥ結合抗β−２−ミクログロブリン、ＡＰＣ結合抗ＣＤ１３３、およびＰｅｒＣＰ結合抗ＣＤ１１７が挙げられる。別段の記載がある場合を除き、これらの抗体はＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから入手可能である。フローサイトメトリーのデータの分析および統計は、Ｆｌｏｗｊｏ（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を用いて行う。
【０３１４】
胎盤幹細胞により産生されるサイトカインを、ＬｉｎｃｏＰｌｅｘ脂肪生成分析キットおよびＬｕｍｉｎｅｘの機器を製造者の指示に従って用いて、培養細胞物の上清を収集することにより分析する。
【実施例５】
【０３１５】
６．５  実施例５：酪酸ナトリウムを用いた、肝細胞への胎盤細胞の分化の誘導
この実施例は、酪酸ナトリウムを用いた、胎盤幹細胞の肝細胞への分化を誘導するための典型的な方法を記載するものである。この方法は、様々なタンパク質発現マーカー、肝細胞特異的遺伝子の発現、ならびにサイトケラチン１８（未分化胎盤幹細胞においてすでに発現している分子）およびアシアロ糖タンパク質受容体などの肝細胞特異的マーカーの発現を用いて、酪酸Ｎａ誘導性の胎盤幹細胞を特徴付けることを目的とするものである。誘導性の胎盤幹細胞の、細胞内アルブミンを産生し、尿素を分泌する能力を評価する。
【０３１６】
分化を誘導するため、胎盤幹細胞を、０．１％ゼラチンで被覆した６ウェルプレート内の、２０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）、４ｍＭのＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００Ｕ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、および１０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含むイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号３１９８０−０３０）内に約１０５個細胞／ウェルの密度で播種する。０．５ｇｍのブタゼラチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｇ−２５００）を５００ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２００１２−０２７）に穏やかに加熱しながら溶解することで、ゼラチン溶液（０．１％）を調製する。ゼラチンでプレートを被覆するために、２ｍｌの０．１％ゼラチン溶液を、ポリスチレン製の組織培養処理プレートのそれぞれのウェルに加える。プレートを２時間インキュベートし、その後、ゼラチン溶液を吸引する。プレートをＰＢＳで１回洗浄し、次に２．５ｍｌのＩＭＤＭを加え、その後、約１０５個細胞／ウェルを加える。場合により、その後４日間、細胞を１％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）にさらし、その後、異なる濃度（１、２．５、５、１０ｍＭ）の酪酸Ｎａ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｂ５８８７）に６日間さらす。培地は毎日取り替える。
【０３１７】
分化した細胞の機能を測定するために二次培養を開始するが、ここで、細胞を初代培養皿から取り出し、Ｉ型コラーゲンで被覆した（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）ポリスチレン製の１２ウェルプレートに約１０５個細胞／ウェルの密度で置き換える。置き換えた２４時間後に培地を交換し、置き換えた４８時間後に細胞を試験して機能的アッセイを行う。
【実施例６】
【０３１８】
６．６  実施例６：肝細胞への分化のための、調製物へのアルギネート−ポリ−Ｌ−リジンマイクロ封入による、胎盤幹細胞の凝集
この実施例は、細胞を肝細胞へ分化させるための、調製物へのアルギネートマイクロ封入技術を用いた、胎盤幹細胞を凝集させるための典型的な方法を記載するものである。
【０３１９】
アルギネートポリ−Ｌ−リジン封入
加熱した磁気撹拌プレートを４５℃の温度で用いて、Ｃａ２＋を含まない１００ｍＬのＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）に２．２ｇのアルギネート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＭＷ：１０万〜２０万ｇ／ｍｏｌ、Ｇ含量：６５％〜７０％）を溶解することにより、アルギネート溶液を作製する。次に、溶液を２５μｍのシリンジフィルター（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｂｒａｎｄ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ、ＰＡ）を用いて濾過する。接着性細胞のコンフルエントな単層をトリプシンインキュベーションの後に取り出し、１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ＰＢＳ中に再懸濁する。細胞をＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）でさらに２回洗浄し、２ｍＬのそれら各々の培地中に再懸濁し、細胞数および生存率の両方をトリパンブルー（Ｇｉｂｃｏ）排除法を用いて評価する。細胞−アルギネート混合物を作製するために、約５×１０７個細胞／ｍｌの播種密度を有する細胞懸濁液の１ｍＬのアリコートを９ｍＬの２．２％（ｗ／ｖ）アルギネート溶液に加え、約５×１０６個細胞／ｍｌの最終細胞播種密度および２．０％（ｗ／ｖ）の最終アルギネート濃度とする。この溶液を１０ｍｌのシリンジ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に移し、それを次にシリンジポンプ（ＫＤ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）に接続する。静電気ビーズ作製機（Ｎｉｓｃｏ、Ｚｕｒｉｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を４０ｍｌ／時間の流速で、６．５ｋＶの電圧を印加して用いて、アルギネートビーズを作製し、５００μｍの直径を有するビーズを得る。１４５ｍＭのＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および１０ｍＭのＭＯＰＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む、ＣａＣｌ２（１００ｍＭ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の２００ｍＬの槽にビーズを押し出し、室温で１０分間、重合に付す。重合段階の後、組織培養物で処理したＴ−２５フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にビーズを移す。ＣａＣｌ２溶液を５ｍＬのピペットを用いて取り除き、ビーズを５ｍＬのＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ）で洗浄する。緩衝液を取り除き、ビーズを５ｍｌのポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＭＷ：６８６００ｇ／ｍｏｌ）（０．０５％ｗ／ｖ）中に２分間再懸濁する。次に、ＰＬＬを穏やかに取り除き、ＨＥＰＥＳで置き換えてビーズを洗浄し、最終的に、ビーズを５ｍｌの細胞培地中に再懸濁する。培地は、封入の例えば４、８、１１、１４、および１７日後に交換する。
【０３２０】
カプセル内の生存率の評価
ビーズ内での生存率を、封入の直後に、カルセイン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）、エチジウムホモ二量体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）染色液で評価する。カルセインは、開裂されて生細胞において蛍光生成物を形成するのみであり、一方、エチジウムホモ二量体は、死細胞の核内に組み込まれるのみである。カルセインおよびエチジウムホモ二量体の画像を、４９５ｎｍの励起フィルターならびにそれぞれ５１５ｎｍおよび６３５ｎｍの発光フィルターを取り付けたＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ＬＳＭレーザー共焦点走査型顕微鏡（Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて得る。具体的には、直径５００ｕｍのビーズのｚ断面を、１０ｕｍの間隔で、全体で２５０ｕｍの厚さについて取得する。３回の実験は、１回の実験当たり１５個のビーズの分析を合わせたものである。デジタル化した画像を、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＭＩＣＲＯＳＵＩＴＥ（商標）を用いて定量化する。全てのビーズのそれぞれの横断面について生存率を評価する。
【０３２１】
脱重合後の細胞の回収および評価
機能的分析および凝集サイズの計算を、ビーズからの細胞の放出の後、それぞれの分析日に実施する。１つの条件につき１反復当たり最低１５００個のビーズを分析する。ビーズをＰＢＳで洗浄し、１０ｍＭのＭＯＰＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および２７ｍＭのＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む１００ｍＭのクエン酸ナトリウム（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を３７℃で３０分間加え、脱重合を誘発する。脱重合の後の回収量を決定するために、既知の濃度の細胞を封入し、迅速に脱重合する。遠心分離の後、細胞ペレットおよび上清（これはビーズ粒子を含むがインタクトなビーズは含まない）の両方を、トリパンブルー排除（これはカプセルを染色しない）を用いて計数し、質量収支の後、開始集団におけるものとほぼ同数の細胞が存在することを確認する。この方法により、封入された細胞集団が９８％回収されることが示される。放出された細胞を１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、クエン酸ナトリウム溶液を吸引し、細胞ペレットをＰＢＳ（３×）で洗浄し、細胞特異的培地中に再懸濁する。次に、上述のトリパンブルー法を用いて細胞を計数する。
【０３２２】
カプセル内凝集物のサイズの決定
組織培養物で処理したＴ−２５フラスコからビーズを試料採取し、封入の直後（０日目）、および分析の８、１１、１４、１７、２０日目に、３５ｍｍのＭａｔｔｅｋ皿（Ｍａｔｔｅｋ、Ａｓｈｌａｎｄ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）に移す。Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ＬＳＭ共焦点走査型レーザー顕微鏡（Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて明視野像を得る。具体的には、直径５００ｕｍのビーズのｚ断面を、同一の凝集物を重複して定量化することを避けるため、５０ｕｍの間隔で、全体で２５０ｕｍの厚さについて取得する。画像を、Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｍｉｃｒｏｓｕｉｔｅを用いて定量化する。要するに、色の閾値をまず利用して、画像のバックグラウンドから細胞凝集物を区別する。次に、凝集物の直径を、粒子の平均直径の測定を用いて決定する。
【実施例７】
【０３２３】
６．７  実施例７：サイトケラチン−１８および細胞内アルブミンのＩｎ  Ｓｉｔｕでの間接的な免疫蛍光分析
この実施例は、分化した胎盤幹細胞から得た肝細胞によるサイトケラチン−１８およびアルブミンの発現を評価するための典型的な方法を記載するものである。分化した細胞（然るべき場合は、脱重合の後に回収されたもの）を、組織培養物で処理した２４ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に移す。具体的には、単離された細胞集団を、０．７５ｍｌの培地内で約６×１０４個の細胞に希釈し、３７℃で１時間インキュベートして、細胞の付着を可能にする。次に、細胞を冷ＰＢＳ中で１０分間洗浄し、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で、室温で１５分間固定する。細胞を冷ＰＢＳ中で１０分間、２回洗浄し、次に、１％ウシ胎児血清（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．５％サポニン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、および０．１％アジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む冷サポニン／ＰＢＳ（ＳＡＰ）膜透過化緩衝液中で１０分間、２回洗浄する。細胞内アルブミンを検出するために、その後、ウサギ抗マウスアルブミン抗体（１５０μｇ／ｍｌ）（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）を含むかまたはアイソタイプの対照として正常なウサギ血清（１５０μｇ／ｍｌ）（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を含むＳＡＰ溶液中、４℃で３０分間、細胞をインキュベートし、冷ＳＡＰ緩衝液中で１０分間、２回洗浄し、次に、１：５００に希釈した二次抗体のＦＩＴＣ結合ロバ抗ウサギ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｌａｂｓ、Ｗｅｓｔｇｒｏｖｅ、ＰＡ）で、４℃で３０分間処理する。サイトケラチン１８を検出するために、ウサギ抗マウスサイトケラチン１８抗体（ＩｇＧ１）（１：５０希釈）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を含むかまたはアイソタイプの対照として正常なウサギ血清のＩｇＧ１画分（１：１００希釈）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を含むＳＡＰ溶液中、４℃で３０分間、細胞をインキュベートし、次に、１：２００に希釈した二次抗体のＦＩＴＣ結合ヤギ抗ウサギ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｌａｂｓ、Ｗｅｓｔｇｒｏｖｅ、ＰＡ）で、４℃で３０分間処理する。次に、両方の染色について、細胞を冷ＳＡＰ緩衝液で１回洗浄し、冷ＰＢＳで１回洗浄する。コンピューターインターフェース倒立Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７０顕微鏡を用いて、蛍光画像を得る。試料は、５１５ｎｍのフィルターを用いて励起させる。蛍光強度値を、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＭＩＣＲＯＳＵＩＴＥ（商標）を用いてそれぞれの細胞について決定する。それぞれの細胞についての実験上の強度値を、アイソタイプの対照の平均強度を差し引いた後に計算する。
【実施例８】
【０３２４】
６．８  実施例８：グリコーゲンの染色
この実施例は、分化した胎盤幹細胞から得た肝細胞によるグリコーゲンの産生を評価するための典型的な方法を記載するものである。脱重合の後、組織培養物で処理した２４ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に細胞を移し、１０％ホルマリン−エタノール固定溶液を用いて室温で１５分間固定し、その後、ＰＢＳで洗浄する。固定した細胞を、１ウェル当たり０．２５ｍｌの過ヨウ素酸溶液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）に室温で５分間さらす。この過程において、グリコールがアルデヒドに酸化される。細胞をＰＢＳで洗浄してＰＡＳを除去した後、１ｍｌのシッフ試薬をウェルごとに加え、細胞を室温で１５分間さらす。パラローザニリンとメタ重亜硫酸ナトリウムとの混合物であるシッフ試薬は、反応して、グリコールを含有する細胞エレメントを染色するパラローザニリン生成物を放出する。試薬を取り除くためにＰＢＳで３回目の洗浄を行った後、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７０顕微鏡およびＯｌｙｍｐｕｓデジタルカメラを用いて画像を得る。
【実施例９】
【０３２５】
６．９  実施例９：グルコースおよび乳酸塩の測定
この実施例は、分化した胎盤幹細胞から得た肝細胞によるグルコースおよび乳酸塩の消費および／または産生を評価するための典型的な方法を記載するものである。上清（１ｍｌ）を二次培養物におけるそれぞれの細胞型について３重で収集し、次に、Ｂｉｏｐｒｏｆｉｌｅ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ４００（Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて試験して、グルコースおよび乳酸塩の代謝産物の測定を行った。分析の各日に、基本培地のグルコースおよび乳酸塩の測定値を測定し、平均値を試験値から差し引いて、取り込み量または産生量を得た。細胞をそれぞれの条件について計数し、最終的な消費率または産生率を得た。
【実施例１０】
【０３２６】
６．１０  実施例１０：尿素の分析
この実施例は、分化した胎盤幹細胞から得た肝細胞による尿素の産生を評価するための典型的な方法を記載するものである。培地試料を細胞培養物から直接収集し、後の尿素含量の分析のために−２０℃で保存する。尿素の合成を、市販のキット（ＳｔａｎＢｉｏ、Ｂｏｅｒｎｅ、Ｔｅｘａｓ）を用いてアッセイする。尿素標準品の３００μｇ／ｍｌから０μｇ／ｍｌまでの連続希釈物を作製することにより、検量線を作成する。吸光度の読み取りは、５８５ｎｍの蛍光フィルターを備えたＢｉｏｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）モデル６８０プレートリーダーを用いて行う。尿素の値は、培地試料を収集した日に記録した細胞数に対して標準化する。
【実施例１１】
【０３２７】
６．１１  実施例１１：アルブミンの分泌を検出するためのサンドウィッチＥＬＩＳＡ
この実施例は、分化した胎盤幹細胞から得た肝細胞によるアルブミンの分泌を評価するための典型的な方法を記載するものである。それぞれの分析日に得られた培地上清内において分泌されたアルブミンを検出するために、市販のマウスアルブミンＥＬＩＳＡキット（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、＃Ｅ９０−１３４）を用いる。アルブミン標準品の７．８から１００００ｎｇ／ｍＬまでの連続希釈物を作製することにより、検量線を作成する。吸光度の読み取りは、４５０ｎｍの蛍光フィルターを備えたＢｉｏｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）モデル６８０プレートリーダーを用いて行う。アルブミンの値は、培地試料を収集した日に記録した細胞数に対して標準化する。
【実施例１２】
【０３２８】
６．１２  実施例１２：Ｂ型肝炎感染のマウスモデル
この実施例は、本明細書の他の箇所で記載した胎盤幹細胞から分化した肝細胞を使用する、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染のマウスモデルを記載するものである。マウスは、（１）マウスに放射線照射し、次にＳＣＩＤマウスの骨髄を投与することによってマウスを保護する、（２）胎盤幹細胞から分化したＨＢＶ感染肝細胞を投与すること、によって作製する。次に、ウイルスの複製またはウイルス量を低減させる能力について試験するための化合物をマウスに投与する。
【０３２９】
胎盤幹細胞。接着性胎盤幹細胞を、上記の実施例１に記載の方法の１つまたは複数によって得る。
【０３３０】
肝細胞の調製。胎盤幹細胞を、上記の実施例４に記載の方法に従って分化させる。
【０３３１】
胎盤幹細胞由来の肝細胞のＨＢＶ感染。アルギネート内の胎盤幹細胞由来の肝細胞を遠心分離により収集し、３μｇの臭化ヘキシドメントリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｈ−９２６８、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）および０．５μｇのヒトインターロイキン６（ＩＬ−６、Ｐｒｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｌｏｎｄｏｎ、Ｅｎｇｌａｎｄ）を補充した、１ｍＬの高力価ＨＢＶ  ＤＮＡヒト血清中に再懸濁する。
【０３３２】
マウスの準備。６〜１０週齢のＣＢ１６ＦまたはＢＮＸ（ベージュ／ヌード／ｘｉｄ）マウスおよびＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを用いる。マウスには無菌の飼料およびシプロフロキサシン（２０μｇ／ｍＬ）を含む酸性水を与える。ＣＢ１６Ｆマウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｉｔｚｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ａｎｉｍａｌ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｒｅｈｏｖｏｔ、Ｉｓｒａｅｌ）を約４Ｇｙの線量の全身照射に曝露し、その３日後に、約０．７Ｇｙ／分の照射率で、ガンマビーム１５０−Ａ６０Ｃｏ源（Ａｔｏｍｉｃ  Ｅｎｅｒｇｙ  ｏｆ  Ｃａｎａｄａ、Ｋａｎａｔａ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）からの約１１Ｇｙの線量に曝露する。０．２ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水中の、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス由来の約４×１０６から約６×１０６個の骨髄細胞を、放射線照射したマウス内に迅速に移植する。リン酸緩衝生理食塩水中においてＯｍｎｉ−Ｍｉｘｅｒで大腿骨および脛骨を破壊して骨髄細胞を得、その後、得られた細胞懸濁液からＴ細胞を除去することによって、骨髄細胞を調製する。Ｌｅｖｉｔｅら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ８：１−３（１９９１）を参照されたい。マウスに、骨髄の移植の後５日間にわたり毎日、１ｍｇのＦｏｒｔｕｍ（Ｇｌａｘｏ）を腹腔内注射する。次に、骨髄細胞の移植の直後、ＨＢＶ感染した胎盤幹細胞由来の肝細胞（約５×１０７個）を、放射線照射したマウスの腎臓皮膜下または耳介内に移植する。肝細胞の生着は、生検およびヘマトキシリン−エオシン染色、ならびに、移植した組織におけるヒト血清アルブミンをコードするｍＲＮＡの発現の検出により評価することができる。
【０３３３】
ＢＮＸマウスに１１Ｇｙの線量で１回放射線照射することを除き、ＢＮＸマウスをＣＢ１６Ｆマウスのように準備し、ＨＢＶ感染肝細胞の移植を骨髄細胞の移植の少なくとも１０日後に行う。
【０３３４】
ＨＢＶ感染血清からのＤＮＡの抽出。０．２５％のドデシル硫酸ナトリウム、５ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ、１０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ  ＨＣＬ（ｐＨ８．０）、および２５０μｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含む４００μＬの反応混合物におけるプロテイナーゼＫによる消化により、１００μＬの血清からＤＮＡを抽出する。２．５時間後、６５℃で、１μｇのＤＮＡキャリアーおよび０．５ｍｇのＢＳＡを加える。次に、ＤＮＡをフェノール−クロロホルムにより抽出し、−２０℃で一晩、エタノール内に沈殿させる。２００００ｇで１５分間遠心分離した後、ＤＮＡペレットを７０％エタノールで洗浄し、乾燥させ、５０μＬの水に再懸濁する。
【０３３５】
マウス血清におけるＨＢＶ  ＤＮＡレベルの測定。ＨＢＶのＤＮＡのコピー数を、ＨＢＶ特異的プライマーを用いて、半定量ＰＣＲによって測定する。ＰＣＲ産物を標準的な２％アガロースゲル上で分離する。５０μＬの産物をドットブロットし、［３２Ｐ］で標識した適切なＤＮＡ断片（Ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ標識システム、Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）と４２℃で一晩ハイブリダイズする。次に、ブロットを０．１×０．１５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌおよび０．０１５ｍｏｌ／Ｌのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、ならびに１％ＳＤＳ中で５５℃で洗浄し、Ｘ線フィルムに曝露する。ドットの強度を、例えばＤｙｎａｔｅｃｈなどのＥＬＩＳＡリーダーで６３０ｎｍで読み取るか、または、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓコンピューター密度計モデル３００Ａで読み取る。ウイルス量は、１００μＬの試料当たり１０２から１０７個のコピー数を含む、正常なマウス血清内に希釈した、較正したヒト血清から得たＤＮＡ試料からなる検量線を用いて決定する。約５×１０３個／血清ｍＬ未満のウイルス量を有するマウスは、感染していないものであると考える。この手順において用いたプライマーは、共有結合により閉環したＨＢＶおよび緩んだ形態のＨＢＶの両方を認識する。
【０３３６】
ＨＢＶウイルス量は、その代わりにまたはそれに加えて、ＨＢＶの表面抗原を認識する１つまたは複数の抗体を用いてＥＬＩＳＡによって決定することができる。
【０３３７】
生着肝細胞におけるＨＢＶの、共有結合により閉環したＤＮＡの決定。この段階は、ウイルス複製の確認が必要な場合に行うことができる。遠心分離によって収集した肝細胞（約１×１０５個）からＤＮＡを抽出し、１００μＬのＨ２Ｏ中に再懸濁する。５０μＬを、１３Ｔａｑ  Ｐｏｌ緩衝液、２．５ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ２、０．２ｍｍｏｌ／Ｌの各ｄＮＴＰ、５０ｐｍｏｌの各プライマー、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、および２．５ＵのＴａｑ  Ｐｏｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含む１００μＬの反応混合物におけるＨＢＶ特異的プライマーを用いるＰＣＲに付す。ＰＣＲ反応は、９４℃で２分間、その後、９４℃で１分間および７２℃で３分間を３０サイクル、そして７２℃で５分間の最後の伸長反応にプログラムする。
【０３３８】
ＰＣＲ産物は、２％アガロースゲル上で、コア配列の部分に対応するＤＮＡ断片を用いるドットブロットハイブリダイゼーションによって分析する。この手順では、共有結合により閉環した形態のＨＢＶのみを認識するプライマーを用いる。
【０３３９】
化合物の抗ウイルス活性の測定。ウイルス血症が確立された後、抗ＨＢＶ活性について試験する化合物をマウスに投与する。投与経路は化合物ごとを基準にして決定するが、通常は腹腔内または静脈内である。化合物の投与は、感染した肝細胞での移植後６〜１７日目に行う。投与後２日目および９日目に、血清をマウスから採取し、ＨＢｓＡｇ（ＨＢＶ表面抗原）に対する抗体と、ＨＢＶの共有結合により閉環したＤＮＡ（ｃｃｃＨＢＶ）を検出するためのＰＣＲとを用いて、ウイルス量について評価する。ウイルス量が、化合物を投与していないマウスにおけるウイルス量と比較して検出可能に減少している（例えば、統計上有意に減少している）場合、化合物は抗ウイルス性化合物であると決定される。ウイルス量をｃｃｃＨＢＶの存在量と比較して、ウイルス量を減少させる化合物がＨＢＶ複製の阻害剤であるかを決定することができる。
【実施例１３】
【０３４０】
６．１３  実施例１３：胎盤幹細胞の軟骨細胞への分化の誘導
６．１３．１  全般的な方法
胎盤幹細胞の軟骨形成性の分化は、概して以下のようにして得る。
１．胎盤幹細胞を、１５％臍帯血清を補充したＭＳＣＧＭ（Ｃａｍｂｒｅｘ）またはＤＭＥＭ内に維持する。
２．胎盤幹細胞を無菌ポリプロピレンチューブ内に等分する。細胞を遠心分離し（１５０×ｇで５分間）、不完全軟骨形成培地（Ｃａｍｂｒｅｘ）中で２回洗浄する。
３．最後の洗浄の後、細胞を、０．０１μｇ／ｍｌのＴＧＦ−ベータ−３を含む完全軟骨形成培地（Ｃａｍｂｒｅｘ）中に、５×１０（５）個細胞／ｍｌの密度で再懸濁する。
４．０．５ｍｌの細胞を、１５ｍｌのポリプロピレン培養チューブ内に等分する。細胞を１５０×ｇで５分間ペレット化する。ペレットは培地内でインタクトなままとする。
５．緩く栓をしたチューブを、３７℃、５％ＣＯ２で、２４時間インキュベートする。
６．細胞ペレットに、新たに調製した完全軟骨形成培地を２〜３日ごとに与える。
７．ペレットを、低速のボルテックスを用いて毎日撹拌することにより、培地内に懸濁した状態で維持する。
８．軟骨形成細胞ペレットを、培養の１４〜２８日後に採取する。
９．軟骨形成を、例えば、好酸性基質の産生を観察すること、細胞の形態を評価すること、かつ／あるいは、コラーゲン２および／またはコラーゲン９の遺伝子発現、ならびに／またはアルシアンブルーによる細胞化学的染色によって確認されるような軟骨基質酸性ムコ多糖の産生をＲＴ／ＰＣＲで確認することによって、特徴付ける。
【０３４１】
軟骨形成はまた、初期段階の軟骨形成マーカーであるフィブロモジュリンおよび軟骨オリゴマー基質タンパク質についての遺伝子発現、中期段階の軟骨形成マーカーであるアグリカン、バーシカン、デコリン、およびバイグリカンについての遺伝子発現、ならびに成熟軟骨細胞のマーカーであるＩＩ型およびＸ型コラーゲンならびにコンドロアドヘリンについての遺伝子発現により評価することができる。
【０３４２】
胎盤幹細胞はまた、上記の方法によって、軟骨形成するように誘導することができ、この場合、胎盤幹細胞を、段階３から開始して、遠心分離の段階４を行わずに、ポリ（Ｌ−乳酸）（ＰＬＬＡ）、Ｉ型コラーゲン、またはフッ化ビニリデンとトリフルオロエチレンとの共重合体（ＰＶＤＦ−ＴｒＦＥ）などのナノ繊維足場上で培養する。
【０３４３】
６．１３．２  軟骨形成細胞への胎盤幹細胞および臍帯幹細胞の分化
この実施例は、軟骨形成細胞への胎盤幹細胞の分化およびこのような細胞からの軟骨様組織の発生を示すものである。
【０３４４】
軟骨は、神経支配のない、無血管性の無リンパ組織である。軟骨は軟骨細胞密度が低い（＜５％）が、これらの細胞は驚くべきことに、それらの周りにある細胞外マトリックスの維持に効率的である。これらの主要なタイプの軟骨は、体内の、（１）関節における関節潤滑を促進する関節軟骨、（２）例えば半月板および椎間板における衝撃の吸収をもたらす線維軟骨、ならびに（３）例えば鼻および耳における解剖学的構造をもたらす弾性軟骨に存在する。全てのこれらのタイプの軟骨は、生化学的構造が類似している。
【０３４５】
関節の痛みは、身体障害の主要な原因であり、整形外科の分野において、それを緩和する、いまだ満たされていないニーズがある。一次性変形性関節症（関節の変性の原因となりうる）および外傷は、痛みの２つの一般的な原因である。アメリカ合衆国の人口の約９％が臀部または膝の変形性関節症を有しており、２００万件を超える膝の手術が毎年行われている。不運にも、現在の治療は、軟骨を修復するよりも症状を治療することを対象としている。自然な修復は、線維芽細胞様細胞がその領域に侵入し、正常な組織ほどには張りも弾力性もない線維組織でその領域を満たすと生じ、その結果、さらなる損傷を生じさせる。治療の選択肢としては、歴史的に、組織移植、軟骨下の掘削、または全関節の取り替えが挙げられる。しかし、より最近の治療としては、自己軟骨細胞の注入であるＣＡＲＴＩＣＥＬ（登録商標）、一時的な痛みの緩和のためのヒアルロン酸の注入であるＳＹＮＶＩＳＣ（登録商標）およびＯＲＴＨＯＶＩＳＣ（登録商標）、ならびに、半月板の修復のための成体間葉系幹細胞の注入であるＣＨＯＮＤＲＯＧＥＮ（商標）が挙げられる。概して、流行は、細胞治療、および／または軟骨細胞もしくは幹細胞を用いる組織工学生成物の方に向かっていると思われる。
【０３４６】
材料および方法。
ＡＣ６１６６５，Ｐ３（継代３）およびＡＣ６３９１９，Ｐ５と称する、羊膜／絨毛膜から得た２つの胎盤幹細胞系、ならびにＵＣ６７２４９，Ｐ２およびＵＣ６７４７７，Ｐ３と称する、臍帯から得た２つの胎盤幹細胞系を、以下に概要する研究に用いた。ヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を陽性対照として用い、骨肉種細胞系であるＭＣ３Ｔ３およびヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）を陰性対照として用いた。
【０３４７】
胎盤幹細胞および臍帯幹細胞を、酵素消化によって臨月のヒト胎盤から単離および精製した。ヒトＭＳＣ細胞およびＨＤＦ細胞はＣａｍｂｒｅｘから購入し、ＭＣ３Ｔ３細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから購入した。用いた全ての細胞系をポリプロピレン製の遠心分離管において８００ＲＰＭで５分間遠心分離してペレットとし、軟骨形成誘導培地（Ｃａｍｂｒｅｘ）および非誘導性の基本ＭＳＣ培地（Ｃａｍｂｒｅｘ）の両方において増殖させた。ペレットを採取し、７、１４、２１、および２８日目に、アルシアンブルーを用いたグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の染色および／またはシリウスレッドを用いたコラーゲンの染色によって組織学的に分析した。コラーゲンのタイプを免疫染色によってさらに評価した。軟骨特異的遺伝子についてのＲＮＡ分析を、７日目および１４日目に行った。
【０３４８】
結果
実験１：軟骨形成の研究は、３つの主要な目的、すなわち、（１）胎盤幹細胞および臍帯幹細胞が分化して軟骨組織を形成しうることを実証すること、（２）胎盤幹細胞および臍帯幹細胞が機能的に軟骨細胞に分化しうることを実証すること、および（３）対照細胞系を評価することにより、幹細胞で得られた結果を検証することを達成するために設計した。
【０３４９】
目的１のために、予備研究において、５００ｎｇ／ｍＬの最終濃度の骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）の存在下または不在下で、１つの胎盤幹細胞系を細胞ペレットの形態で軟骨形成誘導培地において培養した。ペレットを、４週間にわたり毎週、軟骨形成誘導の形跡について評価した。結果は、ペレットが経時的にサイズを増大させることを示した。しかし、ＢＭＰ＋試料とＢＭＰ−試料との間で視覚的な差異は認められなかった。ペレットはまた、アルシアンブルーで染色することにより、軟骨組織の指標であるＧＡＧについても組織学的にも分析した。ＢＭＰ＋細胞は概して、代謝がより活性で、淡い色の空胞を有しており、一方、ＢＭＰ−細胞は、より小さく、色濃く染色された核を有し、細胞質が少ない（代謝活性が低いことを反映している）ことが示された。７日目、ＢＭＰ＋細胞は濃い青に染色され、一方、ＢＭＰ−はかすかに染色されただけであった。誘導の２８日目までに、ＢＭＰ＋細胞およびＢＭＰ−細胞の両方はアルシアンブルーでほぼ等しく染色された。全体としては、細胞密度は経時的に減少し、マトリックスはペレットを上回った。逆に、ＭＣ３Ｔ３陰性細胞系は、アルシアンブルーで染色すると、ＧＡＧの存在を全く示さなかった。
【０３５０】
実験２：実験１の結果に基づいて、２つの胎盤幹細胞系および２つの臍帯幹細胞系の軟骨形成性の分化能を評価するため、より詳細な研究を設計した。アルシアンブルーでの組織学に加え、細胞を、ＩＩ型コラーゲンに特異的なシリウスレッドでも染色した。誘導培地の存在下または不在下で、複数のペレットを各細胞系について形成させた。
【０３５１】
ペレット化した、培養した細胞系をまず、顕微鏡レベルでの軟骨形成についての巨視的観察によって評価した。全体として、幹細胞系は、早くも１日目にペレットを形成することが観察された。これらのペレットは経時的に増殖し、白く見え、輝きを有し、かつ軟骨様の堅いマトリックスを形成し、機械的に強くなった。視覚的な検査によると、胎盤幹細胞または臍帯幹細胞から得たペレットはＭＳＣ対照よりもはるかに大きかった。非誘導性培地における対照ペレットは、１１日目までに崩壊し始め、２８日目には、軟骨形成誘導培地において培養された細胞により生じたペレットよりもはるかに小さかった。視覚的には、胎盤幹細胞または臍帯により形成されたペレットの間で差異はなかった。しかし、デキサメタゾンを含まない培地において開始されたＵＣ６７２４９幹細胞系は、より大きなペレットを形成した。陰性対照であるＭＣ３Ｔ３細胞はペレットを形成しなかったが、ＨＤＦはペレットを形成した。
【０３５２】
次に、全ての試験群から得た代表的なペレットを、ＧＡＧおよびコラーゲンについての組織学的分析にかけた。概して、誘導条件下において幹細胞により形成されたペレットは、非誘導条件下において形成されたペレットよりもはるかに大きく、かつ、より良好にインタクトな状態を維持した。誘導条件下において形成されたペレットは、早くも７日目にはＧＡＧの産生と経時的なコラーゲン含量の増大とを示し、一方、非誘導条件下において形成されたペレットは、弱いアルシアンブルー染色により示されたように、コラーゲン産生をほとんど示さないに等しかった。概して、胎盤幹細胞および臍帯幹細胞は、間葉系幹細胞よりも、視覚的な検査によると、より強く、より大きなペレットを産生することが示され、また、多くのコラーゲンを経時的に産生することが示された。さらに、研究の間にわたって、コラーゲンが濃くなることが示され、偏光下における繊維の色の変化によって証明されるように（色は、コラーゲンのタイプの指標でありうる繊維の厚さと相関する）、コラーゲンのタイプが変化することが示された。非誘導性の胎盤幹細胞は、もし存在するならば、誘導性幹細胞と比較して非常に少ないＩＩ型コラーゲンを産生した。２８日間の期間にわたり、細胞密度は、軟骨組織の特徴であるマトリックスの産生が増大するにつれて減少した。
【０３５３】
これらの結果は、胎盤幹細胞および臍帯幹細胞が軟骨形成経路に従って分化しうること、および軟骨組織を形成するように容易に誘導されうることを確認するものである。最初の観察は、このような幹細胞が、ＭＳＣによる軟骨組織の形成に好ましいことを示している。
【実施例１４】
【０３５４】
６．１４  実施例１４：ナノ繊維足場による軟骨細胞への分化の誘導
この実施例は、ナノ繊維足場を用いた、胎盤幹細胞または骨髄から得た間葉系幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）を含む幹細胞の、軟骨細胞への分化を誘導するための方法を記載するものである。この実施例の目的は３つからなり、すなわち、１）インビトロでの胎盤幹細胞の軟骨形成性の分化を特徴付けること、２）インビトロでの胎盤幹細胞の軟骨形成性の分化を刺激するための最適な足場を決定すること、および３）胎盤幹細胞−足場構築物を用いて、ウサギモデルにおいて骨軟骨欠損のインビボでの修復を評価することからなる。
【０３５５】
目的１を達成するために、動的なペレット胎盤幹細胞培養を用いて、培養期間を２８日以上に延ばす。静的および動的なペレット培養における胎盤幹細胞について、一時的な遺伝子発現、ならびに軟骨形成の初期段階および後期段階のマーカーの生化学的および組織学的な分析を評価する。最大５６日間、静的または動的な条件下のペレット培養において、ＴＧＦ−β３の存在下または不在下で、胎盤幹細胞を培養する。リアルタイムＰＣＲによって、初期段階のマーカーであるフィブロモジュリンおよび軟骨オリゴマー基質タンパク質について定量的遺伝子発現を実施する。中期段階のマーカーであるアグリカン、バーシカン、デコリン、およびバイグリカンも評価する。成熟軟骨細胞の特徴であるＩＩ型およびＸ型コラーゲンならびにコンドロアドヘリンの遺伝子も評価する。生化学的アッセイを、ＩＩ型コラーゲン、グリコサミノグリカン、およびプロテオグリカンの合成について実施する。軟骨形成性ペレットの組織形態も、時間経過の間の組織学的染色によって特徴付ける。
【０３５６】
目的２を達成するために、電気紡糸されたナノ繊維足場の、胎盤幹細胞の軟骨細胞への分化を促進する能力を評価する。ポリ（Ｌ−乳酸）（ＰＬＬＡ）、Ｉ型コラーゲン、およびフッ化ビニリデンとトリフルオロエチレンとの共重合体（ＰＶＤＦ−ＴｒＦＥ）からなる足場を評価する。胎盤幹細胞を、これらの材料から生成された足場に添加し、静的条件および動的条件の両方において培養する。研究の時間経過の間に、定量的遺伝子発現、生化学的および組織学的な分析、ならびに機械的試験を行う。
【０３５７】
目的３を達成するために、胎盤幹細胞による軟骨の修復を、例えばウサギの骨軟骨欠損モデルのような、軟骨の欠損が自然には治癒しない動物モデルにおいて、インビボでの機能的評価によって評価する。このモデルにおいて、軟骨形成性の分化を支持する足場を、胎盤幹細胞と組み合わせて評価する。修復を、組織化学的染色によって、具体的にはインタクトな軟骨と修復された軟骨との間の軟骨結合の程度を評価することによって、評価する。骨軟骨の修復も、本来の欠損の部位から摘出した試料の機械的評価によって測定する。
【０３５８】
６．１４．１  繊維足場の製造
この実施例は、典型的なナノ繊維性不織メッシュの製造および特徴付けについて記載するものである。電気紡糸技術を用いて、ナノスケールの繊維メッシュを生産した。得られたメッシュは広い表面積、調節可能な空隙率、構造、および機械的特性を有する。この技術を用いて生産された繊維はＥＣＭの繊維と同じスケールである。ポリ（Ｌ−乳酸）（ＰＬＬＡ）およびポリ乳酸グリコール酸（ＰＬＧＡ）は組織工学分野において最も広く用いられている生物材料の１つであるため、それらを重合体組成物として用いた。次に、これらの足場を組織工学足場として使用できる可能性を、ヒトＭＳＣの細胞の増殖および分化によって評価した。
【０３５９】
電気紡糸のプロセスは、電位、流速、溶液濃度、毛細管と収集板との距離、針の直径、および例えば温度などの環境パラメーターの変化により影響を受ける。４つの異なる繊維直径の、すなわち２９０ｎｍ、１μｍ、５μｍ、および９μｍのＰＬＬＡ足場およびＰＬＧＡ足場を製造するために、電圧［２０ＫＶ］および収集板から針までの距離［３０ｃｍ］は一定に保った。針のゲージサイズ［１２Ｇ、２２Ｇ］、流速［０．０５〜０．１ｍＬ／分］、および溶液濃度［１０〜２５ｗ／ｗ％］は変化させた。
【０３６０】
ＰＬＬＡおよびＰＬＧＡにより生成されたＰＬＬＡ電気紡糸マットおよびＰＬＧＡ電気紡糸マットの平均直径の分布を表４に示す。ＰＬＬＡおよびＰＬＧＡの両方のマイクロ繊維足場およびナノ繊維足場は、それぞれ３９％および４７％の空隙率を有していた。電気紡糸された繊維の形態を、走査型電子顕微鏡によって観察した。検査の結果、繊維はビーズを有しておらず、丸い形状であり、不織の形でランダムに整列していた。
【０３６１】
【表４】
2010518812.tif 000006
【０３６２】
６．１４．２  ナノ繊維足場へのヒトＭＳＣの播種
全骨髄から単離し継代培養したヒトＢＭ−ＭＳＣを、マイクロ繊維足場およびナノ繊維足場に播種した。細胞培養プラスチックを対照表面として用いた。ナノ繊維足場およびマイクロ繊維足場の両方で増殖したＢＭ−ＭＳＣは、類似した増殖速度を有していた。細胞の形態および細胞層の均一性をＳＥＭによって観察した。組成物にかかわらず、ナノ繊維に播種した細胞は足場表面全体に均一に広がり、一方で、マイクロ繊維足場上の細胞は、小繊維に沿って広がり、あまり均一でなく分布した。この所見をまた、アクチンによる細胞骨格の染色を用いて確認し、共焦点顕微鏡によって観察した。
【０３６３】
静的な組織培養条件におけるＢＭ−ＭＳＣの軟骨形成性の分化も、培地内に誘導因子を有さない状態でナノ繊維足場に播種された細胞について、ＩＩ型コラーゲンの発現を示した。したがって、これらの所見は、培地内に誘導因子が存在していなくても、ナノ繊維の構造が軟骨形成性の分化を促進することを示唆している。
【０３６４】
６．１４．３  インビトロでの胎盤幹細胞の軟骨形成性の分化
典型的な条件下において単離され拡大した胎盤幹細胞の軟骨形成能力を試験するために、胎盤幹細胞を、軟骨形成誘導培地の存在下でペレット培養において増殖させた。静的な細胞培養実験の期間は、ペレットの細胞含量の減少のために、２８日間に制限された。組織切片を採取して、機能的分化ならびにグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）およびコラーゲンの存在についてペレットを試験した。定量的なタンパク質および遺伝子の発現の分析を用いて、ペレットをさらに特徴付けた。分化した胎盤幹細胞上の免疫マーカーを、免疫抑制的であることが知られている、分化していない胎盤幹細胞と比較した。
【０３６５】
組織切片から、胎盤幹細胞がＢＭ−ＭＳＣよりも堅いペレットを形成することが明らかになった。胎盤幹細胞およびＢＭ−ＭＳＣの両方がＧＡＧおよびコラーゲンについて染色されたが、対照細胞系（ヒト皮膚線維芽細胞、ＨＤＦ）は、ＧＡＧの発現がなくコラーゲンの発現がほとんどない、緩くまとまったペレットを形成した。
【０３６６】
タンパク質および遺伝子の発現を用いて、それぞれＥＬＩＳＡおよびＲＴ−ＰＣＲによって軟骨形成を定量した。ＥＬＩＳＡのデータにより、胎盤幹細胞から生成されたペレットにおけるＧＡＧおよびＩ型コラーゲンの存在が確認された。ＥＬＩＳＡによってはペレットにおいてＩＩ型コラーゲンは見られなかったが、低レベルのＩＩ型コラーゲン遺伝子の発現が見られた。さらに、遺伝子発現のデータにより、誘導された胎盤幹細胞ペレットにおいて、誘導されていないペレットと比較して、多くの軟骨形成性マーカーの上方調節が確認された（表５）。
【０３６７】
【表５】
2010518812.tif 000007
【０３６８】
分化していない胎盤幹細胞および軟骨形成性の分化した胎盤幹細胞の潜在的な免疫原性を、免疫系分子であるＭＨＣ  Ａ、Ｂ、Ｃ、ＭＨＣ  ＤＲ、ＤＰ、ＤＱ、β−２−ミクログロブリン、およびＣＤ８６の存在について染色するためのフローサイトメトリーを用いて比較した。ＭＨＣ  ＩＩおよびＣＤ８６の発現の欠如ならびに少量のＭＨＣ  Ａ、Ｂ、Ｃおよびβ−２−ミクログロブリンの正の発現は、分化していない胎盤幹細胞と軟骨形成条件下で培養された胎盤幹細胞との間で同様であった（表６）。
【０３６９】
【表６】
2010518812.tif 000008
【０３７０】
６．１４．４  インビトロでの胎盤幹細胞の軟骨形成性の分化の特徴付け
この実施例は、上記の６．１１項に説明した目的１を達成するための典型的な方法を提供するものである。この実施例において、動的なペレット培養を用いることで、培養期間を長くすることが可能になる。この延長により、一時的な遺伝子発現の評価、ならびに、最長５６日間の静的および動的なペレット培養における胎盤幹細胞についての軟骨形成の初期段階および後期段階のマーカーの生化学的および組織学的分析が可能になる。
【０３７１】
分娩後の胎盤から、例えば上記の実施例１に従って胎盤幹細胞を単離する。胎盤幹細胞を、上記の実施例１に従って、例えば、低濃度のウシ胎児血清および限定された成長因子を含む完全培地において破壊した組織から樹立する。８０〜８５％のコンフルエンスに達した後、胎盤幹細胞を、本明細書の他所で記載したように継代培養および／または冷凍保存する。例えば上記の実施例３に開示された方法に従って、フローサイトメトリー分析を実施して、少なくとも７０％またはそれ以上の単離された細胞、例えばＣＤ２００＋ＣＤ１０５＋ＣＤ７３＋ＣＤ３４−ＣＤ４５−を確保する。胎盤幹細胞の機能的特徴付けとしてはさらに、軟骨形成性の分化のアッセイが挙げられる。
【０３７２】
６．１４．５  静的系および動的系におけるペレット培養
胎盤幹細胞の軟骨形成性の分化は以下のように行うことができる。胎盤幹細胞をほぼコンフルエントになるまで培養し、トリプシン処理し、不完全軟骨形成培地（Ｃａｍｂｒｅｘ）中で２回洗浄し、上述したように完全軟骨形成培地中に約５０万個細胞／ｍＬで再懸濁する。５００μＬのアリコートを１５ｍＬのポリプロピレン性の遠心分離管にピペットで移し、遠心分離して（８００ｒｐｍ、５分間）ペレット形成を誘導する。ＤＭＥＭ低グルコースに溶解した、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）、０．１ｍＭのアスコルビン酸−２−リン酸塩（Ｗａｋｏ）、１×１０７Ｍのデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）、１％ＩＴＳ（インスリン−トランスフェリン−セレニウム）（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、および１０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＴＧＦ−β３（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）からなる無血清軟骨形成完全培地（ＣＣＭ）を、遠心分離管に加える。いくつかのペレットを、無血清ＣＣＭを含むバイオリアクター（Ｓｙｎｔｈｅｃｏｎ、モデル＃ＲＣＣＳ−４Ｈ）に移し、動的培養を行う。静的または動的な培養条件下のペレットを３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートし、培地を２〜３日ごとに交換する。７、１４、２８、および５６日目に、培養物からペレットを取り出し、遺伝子発現、生化学的または組織学的分析のために処理する。静的または動的な培養条件下で増殖したＭＳＣで比較を行う。
【０３７３】
分化した軟骨細胞を特徴付けるために、カルシウムおよびマグネシウムを含んでいないＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水でペレットを洗浄し、３ｍｇ／ｍｌの２型コラゲナーゼ、１ｍｇ／ｍｌのヒアルロニダーゼ、および０．２５％のクエン酸トリプシンを用いて３７℃で消化する。消化の後、細胞を遠沈させ、１ｍｌのＤＰＢＳ緩衝液中に再懸濁し、洗浄する。回収された細胞の量を、トリパンブルー染料での細胞計数によって決定する。溶解緩衝液を用いて細胞を溶解することでＲＮＡを回収する。Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮＥＡＳＹ（登録商標）キットを用いてＲＮＡを単離し、Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計を用いて定量化する。軟骨形成性遺伝子の発現についてのＲＴ−ＰＣＲを、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）遺伝子発現プローブを用いて実施する。初期段階のマーカーであるフィブロモジュリンおよび軟骨オリゴマー基質タンパク質について、定量的遺伝子発現を実施する。中期段階のマーカーであるアグリカン、バーシカン、デコリン、およびバイグリカンも試験する。成熟軟骨細胞の特徴であるＩＩ型およびＸ型コラーゲンならびにコンドロアドヘリンの遺伝子も試験する。
【０３７４】
分化した軟骨細胞をさらに特徴付けるために、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて、軟骨に分化した胎盤幹細胞のタンパク質発現を試験する。まず、ペレットを可溶化する。乾燥重量を得た後、水で戻したペレットを、ペプシンおよび膵エラスターゼを用いて消化する。収集した上清を、ＩＩ型コラーゲンおよびプロテオグリカンのＥＬＩＳＡに用いる。グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を、メチレンブルー染料結合アッセイによって測定する。
【０３７５】
分化した軟骨細胞をまた、以下のような組織学的分析に付す。ペレットを１０％ホルマリン内で固定し、段階的なアルコールを介して脱水し、パラフィンに包埋する。５μｍの厚さで断片を切断し、グリコサミノグリカンに対する染色液（例えば、アルシアンブルーおよび／またはサフラニン−Ｏ、ならびにコラーゲンに対する染色液、例えばシリウスレッドを用いて染色する。アルシアンブルーは、水溶性の銅フタロシアニンに基づく染料であり、銅を含有しているため青色である。３％酢酸溶液（ｐＨ２．５）において用いると、アルシアンブルーは、硫酸化およびカルボキシル化された酸性ムコ多糖、ならびに硫酸化およびカルボキシル化されたシアロムチンの両方を染色する。正染性の形態のサフラニンＯは、ホルマリンで固定された、パラフィン包埋された組織断片上の、関節軟骨、ムチン、および肥満細胞粒子を染色する。プロテオグリカンは赤く染色され、細胞質は灰緑色に染色され、核は黒く染色される。シリウスレッド染料は、組織断片における異なるコラーゲンのタイプを識別するために用いることができる。偏光下では、繊維は、一見したところ、黒のバックグラウンドに対して明るい色で輝いている。繊維の色はそれらの厚さに依存し、厚さが増大すると、色は、緑、黄色、オレンジ、赤の順に変化する。密集して束になっている厚い小繊維からなる厚いコラーゲン繊維を形成しやすいＩ型コラーゲンは、濃い黄色から赤の色として現れる。ＩＩＩ型コラーゲンは、緩く並んでいる薄い小繊維からなる薄い繊維を形成し、弱い緑の複屈折性を有する。したがって、現れる色は、繊維の厚さおよびコラーゲン分子の配置の結果である。
【０３７６】
４つの実験群をこの研究において用いる。細胞を、標準増殖培地またはＣＣＭのいずれかで、静的または動的な培養系において増殖させる。７、１４、および２８、および５６日目に、定量的アッセイを実施する。４である試料サイズｎを、全ての定量的生化学アッセイ（グリコサミノグリカン、ＩＩ型コラーゲン、およびプロテオグリカン）、遺伝子発現、ならびに組織学的分析に用いる。一元配置および二元配置ＡＮＯＶＡを実施して、それぞれｐ＜０．０５で、各時点での、および経時的な群間の統計的差異について試験する。Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ法、ｐ＜０．０５を用いて、群間の多重比較を実施する。
【０３７７】
６．１４．６  インビトロでの胎盤幹細胞の軟骨形成性の分化を刺激するための足場の最適化
この実施例は、上記に説明した目的２を達成するために設計された実験を記載するものである。簡潔に述べると、胎盤幹細胞の軟骨細胞への分化を促進するナノ繊維足場の能力を試験する。組成物に関係なく、電気紡糸されたナノ繊維足場は、上記に示したように、インビトロでの間葉幹細胞の軟骨細胞への分化を促進する。足場基質として試験する物質としては、ポリ（Ｌ乳酸）（ＰＬＬＡ）、Ｉ型コラーゲン、およびフッ化ビニリデンとトリフルオロエチレンとの共重合体（ＰＶＤＦ−ＴｒＦＥ）がある。これらの材料から作製された足場に胎盤幹細胞を添加し、静的条件および動的条件の両方において培養する。定量的遺伝子発現、生化学分析および組織学的分析、ならびに機械的な試験を、研究の経過中に実施する。
【０３７８】
６．１４．６．１  足場の製造および特徴付け
上述したように、電気紡糸装置は、ハーバードシリンジポンプモデル９０１上に搭載された針（１６〜２２ゲージ）を取り付けたシリンジを含む。シリンジに重合体溶液を満たす。高電圧電源（Ｇａｍｍａ  Ｈｉｇｈ  Ｖｏｌｔａｇｅ  Ｐｏｗｅｒ  Ｓｕｐｐｌｙ  ＥＳ３０Ｐ）の正の出力リードを針に取り付ける。収集板は、電気的に接地された、寸法が２５×３０ｃｍのステンレス鋼プレートである。電気紡糸のプロセスは、流速、溶液濃度、および針の直径を変化させることにより影響を受ける。溶液に印加する電圧は２０ｋＶであり、収集板から針までの距離は２０ｃｍである。足場は収集板で不織マットとして収集される。これらの足場／マットは、約２００〜４００ｎｍの直径を有する繊維から作られる。
【０３７９】
６．１４．６．２  足場の調製のための重合体溶液
最初の足場は、塩化メチレン中のポリＬ−乳酸（Ａｌｋｅｒｍｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｍｅｄｉｓｏｒｂ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  ７５／２５  ＤＬ  ＨＩｇｈ  ＩＶ）の溶液から電気紡糸されたものである。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中にコラーゲンを溶解することで、Ｉ型コラーゲン（ウシの腱由来のもの）の類似の足場を生成する。圧電性重合体であるｐ（ＶＤＦ−ＴｒＦＥ）を、先に示されているように、メチルエチルケトンにおける重合体の１０％溶液から紡糸する。Ｓａｃｈｌｏｓ  ａｎｄ  Ｃｚｅｒｎｕｓｚｋａ、２００３、Ｅｕｒ．Ｃｅｌｌｓ  Ｍａｔｅｒ．５：２９−４０を参照されたい。
【０３８０】
６．１４．６．３  足場の特徴付け
全ての足場を以下のプロトコルによって試験する。足場を偏光光学顕微鏡および走査型電子顕微鏡で画像化する。画像分析技術を用いて、繊維の平均直径および変動係数、ならびに繊維間の領域分布を決定する。繊維のパラメーターであるアレイの孔の容積および孔のサイズの平均は、水銀ポロシメトリーによるものである。内部足場構造を、必要に応じて、ＤＳＣ、ＴＧＡ、ＤＭＡ、ＴＭＡ、およびＴＳＣを含む様々な熱分析技術によってモニターする。
【０３８１】
ｐ（ＶＤＦ−ＴｒＦＥ）足場について、Ｓａｗｙｅｒ−Ｔｏｗｅｒ回路での、印加電界に対する電流のスキャンを用いて、ｐ（ＶＤＦ−ＴｒＦＥ）材料の分極率の指標となる特性を同定する。これらの特性としては、残留分極率および飽和分極率、ならびに抗電場（極性切り替えが生じる電界）が挙げられる。これらの特性は、ｐ（ＶＤＦ−ＴｒＦＥ）材料について周知の値を有する。振動電極を有する電気紡糸されたｐ（ＶＤＦ−ＴｒＦＥ）マットにより注入または放出される小電流もまた、電位計で測定することができる。放熱電流（ＴＳＣ）機器をこれらの研究のために用いる。高振幅の（１０〜１００ＭＶ／ｍ）周期電界に付すと、電極を有するｐ（ＶＤＦ−ＴｒＦＥ）フィルムは、長さ、幅、厚さにおいて１〜１０％の歪みを受ける。強誘電性結晶含有物の寸法としての歪みの結果は、印加界に影響される。電極を有する電気紡糸されたｐ（ＶＤＦ−ＴｒＦＥ）マットは類似の歪みを受けることが予想されうる。
【０３８２】
６．１４．６．４  足場の播種および分化のプロトコル
胎盤幹細胞の軟骨形成性の分化を、上述の、および本明細書の他所で記載した培地を用いて実施する（上記の５．４．５項参照）。全ての足場に、従来の技術を用いて２０万個の細胞を真空添加する。例えば、Ｄａｎｎｉｓら、１９９８、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  １９：１３２３−８を参照されたい。細胞を添加した足場を、ＣＣＭを含むバイオリアクター内に置く（Ｓｙｎｔｈｅｃｏｎ、モデル＃ＲＣＣＳ−４Ｈ）。細胞を最大５６日間、培養状態に維持する。培地は２〜３日ごとに交換する。陽性対照である、上述したＣＣＭと共に標準的なペレット培養条件を用いて足場の不在下で増殖させた胎盤幹細胞と、陰性対照である、ＣＣＭの不在下において足場の存在下または不在下で増殖させた胎盤幹細胞（標準的な増殖培地を用いる）とで比較を行う。
【０３８３】
６．１４．６．５  軟骨特異的細胞外マトリックスの構成要素および細胞数の定量的測定
軟骨形成性ペレットと細胞を有する足場とを、７、１４、２８、および５６日目に採取し、グリコサミノグリカン、ＩＩ型コラーゲン、およびプロテオグリカンの合成について分析する。これらのアッセイにより、９６ウェルプレートフォーマットを用いた、軟骨マーカーについての迅速なハイスループットスクリーニングが可能になる。これを行うために、試料をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、２００μＬのパパイン溶液（２ｍＭのＮ−アセチルシステインおよび２ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）内に１μｇ／ｍＬ）を用いて６５℃で１６時間消化する。グリコサミノグリカンおよびプロテオグリカンの合成を、ＥＬＩＳＡキット（ＢＬＹＳＣＡＮ（商標）キット、Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹ）を用いて、定量的に測定する。ＩＩ型コラーゲンの合成を、ＥＬＩＳＡキット（Ａｒｔｈｒｏｇｅｎ−ＣＩＡ、Ｃｈｏｎｄｒｅｘ，Ｉｎｃ．）によって測定する。細胞数を、ピコグリーン蛍光アッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて、ＤＮＡ測定によって定量化する。
【０３８４】
６．１４．６．６  組織学的分析による組織の形態
２１および３５日目の組織学的な染色および観察を用いて、軟骨形成性足場の細胞および組織の形態を特徴付ける。細胞ペレットと細胞を有する足場とを採取し、１０％緩衝ホルマリン内において室温で２時間固定する。ペレットおよび足場を、一連の段階的なアルコールで処理することにより脱水し、キシレンおよびキシレン代替物で処理することによりきれいにし、そしてパラフィンを浸潤させる。薄い断片をスライドに載せ、トルイジンブルーおよびサフラニンＯで染色する。
【０３８５】
６．１４．６．７  分化からのｍＲＮＡの変化の分析
ペレット培養について先に記載したように、試料を、カルシウムおよびマグネシウムを含んでいないＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水で洗浄し、３ｍｇ／ｍｌの２型コラゲナーゼ、１ｍｇ／ｍｌのヒアルロニダーゼ、および０．２５％クエン酸トリプシンを用いて３７℃で消化する。消化の後、細胞を遠沈させ、１ｍＬのＤＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水）緩衝液中に再懸濁し、洗浄する。回収された細胞の量を、トリパンブルー染料での細胞計数によって決定する。溶解緩衝液を用いて細胞を溶解することでＲＮＡを回収する。Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮＥＡＳＹ（登録商標）キットを用いてＲＮＡを単離し、Ｎａｎｏｄｒｏｐを用いて定量化する。軟骨形成性遺伝子の発現についてのＲＴ−ＰＣＲを、ＡＢＩから入手したＴＡＱＭＡＮ（登録商標）遺伝子発現プローブを用いて実施する。初期段階のマーカーであるフィブロモジュリンおよび軟骨オリゴマー基質タンパク質について、定量的遺伝子発現を実施する。中期段階のマーカーであるアグリカン、バーシカン、デコリン、およびバイグリカンも試験する。成熟軟骨細胞の特徴であるＩＩ型およびＸ型コラーゲンならびにコンドロアドヘリンの遺伝子も試験する。
【０３８６】
６．１４．６．８  群の数および統計分析
６つの実験群をこの研究において用いる。３つの材料組成物（ＰＬＬＡ、Ｉ型コラーゲン、およびｐＶＤＦ−ＴｒＦＥ）ならびに細胞を、標準増殖培地またはＣＣＭにおいて増殖させる。７、１４、２１、および２８日目に、定量的アッセイを実施する。４である試料サイズｎを、全ての定量的アッセイ（グリコサミノグリカン、ＩＩ型コラーゲン、およびプロテオグリカン）に用いる。一元配置および二元配置ＡＮＯＶＡを実施して、それぞれｐ＜０．０５で、各時点での、および経時的な群間の統計的差異について試験する。Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ法、ｐ＜０．０５を用いて、群間の多重比較を実施する。
【０３８７】
６．１４．７  胎盤幹細胞−足場構築物を用いたウサギモデルにおける骨軟骨欠損のインビボでの修復の評価
この実施例は、上記に説明した目的３を達成するために設計された実験を記載するものである。簡潔に述べると、軟骨形成性の分化を支持するとして同定される足場を、ウサギにおける骨軟骨欠損の修復において、胎盤幹細胞の組合せで評価する。
【０３８８】
６．１４．７．１  動物モデル
部分的に体重を支える関節軟骨の修復モデルであるウサギを、細胞／足場構築物の軟骨形成効果を研究するために用いる。胎盤幹細胞の軟骨形成を支持する足場の数に依存して、ウサギの数を決定する。ニュージーランド系のウサギをランダムに群に割り当てる。１群当たり４であるｎに移植を行う。動物の平均体重は３〜５ｋｇの間であり、動物は特定の病原体を有していないものである（ＳＰＦ）。
【０３８９】
３．５ｍｍの円筒状の欠損を、それぞれの動物の大腿遠位の顆間溝内に生じさせ、円筒状の細胞／足場構築物を、圧入の様式でその欠損内に移植する。それぞれのウサギの反対側の膝を内部対照として用いる。同一の欠損を生じさせ、細胞を有さない、同一の組成物および構造の足場を挿入する。手順の前に、内部対照として用いる膝を、対照の膝が左また右であると記載されている不透明な封筒を選ぶことによりランダム化する。
【０３９０】
足場を移植するために、静脈注射用のペントバルビタール（４５ｍｇ／ｋｇ）を投与して麻酔を開始する。麻酔は、酸素に混ぜた状態で送られる０．５〜２％のイソフルランの吸入を介して維持する。ウサギを仰臥位に置き、それぞれの膝の毛を剃り、無菌の状態で切開部位にわたり７０％アルコールでこすって前処理を行う。手術部位を無菌ドレープで隔離する。
【０３９１】
外側傍膝蓋の切開および関節切開を行う。大腿顆を膝蓋の内側脱臼によって露出させる。３．５ｍｍのドリルビットを用いて、大腿遠位の顆間溝内に欠損を生じさせる。欠損の深さは３〜５ｍｍである。細胞を有するかまたは有さない足場を、小さな吸収性縫合糸材料を用いて、欠損内に縫合する（６−０／７−０  ｖｉｃｒｙｌ）。次に、吸収性縫合糸で傷を層状に閉じる。同じ手順を上記に概説したようにして反対側の膝に実施し、内部対照として用いる。
【０３９２】
手術後、全ての動物は、それらのケージの中で耐えられるまでの体重を支えることが可能となる。手術後の疼痛管理のために、手術後の最初の５〜７日間、０．０３ｍｇ／ｋｇのブプレノルフィンを１２時間ごとに皮下投与する。通常の飼料を与える。
【０３９３】
手術の１２週間後に、致死量のペントバルビタールを用いてウサギを安楽死させる。それぞれのウサギの大腿遠位を採取する。修復部位の巨視的な評価を、正常な周辺組織と比較した色および外見について記録し、関節症の形跡も同様に記録する。試料（１群当たりｎ＝４）を脱灰およびパラフィン包埋し、組織学的評価および染色を行う。組織学的評価を、修正されたＯ’Ｄｒｉｓｃｏｌｌスコアを用いてグレード付けする。１群当たりＮ＝８の試料を機械的試験に用いる。ナノ繊維足場について、先に報告されているプロトコルに基づいて圧縮試験を実施する。
【実施例１５】
【０３９４】
６．１５  実施例１５：胎盤灌流液におけるＣＤ３４＋ＣＤ４５−細胞集団の同定
この研究の目的は、マッチした胎盤灌流液（ＨＰＰ）単位および臍帯血（ＨＵＣＢ）単位（ｎ＝１０）から得た細胞を表現型で特徴付けし、比較すること、ならびに多重パラメーターフローサイトメトリーを用いて、胎盤灌流液についてのさらなる有用な細胞表面マーカーを同定することである。細胞の質を評価するために、全有核細胞（ＴＮＣ）および細胞生存率も測定した。解凍後の試料は、前臨床研究および臨床研究において用いられる前の細胞の状態に近いため、胎盤灌流液の特徴付けはこれらの試料に焦点を合わせたものであった。比較の目的のために、それぞれの胎盤単位に対する、ドナーの適合した臍帯血を試験した。適合したＨＵＣＢ単位をこの計画に含めることにより、胎盤灌流液における細胞集団と、同一のドナーから収集される臍帯血との間の差異の評価が可能になった。
【０３９５】
材料および方法。０．９％ＮａＣｌを用いて、正常な出産に由来する胎盤の灌流から胎盤灌流液を得た。マッチした臍帯血単位を収集し、標準的な方法で冷凍保存し、使用する前に速やかに解凍した。凍結したＨＰＰ試料およびＨＵＣＢ試料を液体窒素タンクから取り出し、３７℃の水浴で速やかに解凍した。２％ウシ胎児血清を含むＰＢＳ中で細胞を洗浄し、結合抗体で染色し、ＢＤ  ＦａｃｓＣａｌｉｂｕｒまたはＢＤ  ＡＲＩＡ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いて分析することにより、細胞をフローサイトメトリーによって評価した。用いた抗体としては、ＰＥ−ＣＤ３４（ＢＤカタログ番号３４８０５７）およびＰｅｒＣＰ−ＣＤ４５（ＢＤカタログ番号３４０６６５）が挙げられる。細胞選別実験を、適切な抗体で染色した後に実施し、ＭｅｔｈｏＣｕｌｔを用いた標準的なＣＦＵアッセイ系内に細胞を置いた。
【０３９６】
結果：フローサイトメトリーにより、ＣＤ３４＋ＣＤ４５−の表現型を有する細胞が、ＨＵＣＢと比較して、ＨＰＰに４倍富んでいることが明らかになった（図１０）。表７のデータは、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎについて選別されたＦＡＣＳ  ＡＲＩＡ細胞を用いて選別されたＨＰＰ細胞およびＨＵＣＢ細胞に由来するものであった。胎盤灌流液の幹細胞は、ＣＤ３４−ＣＤ４５−、ＣＤ３４＋ＣＤ４５−、およびＣＤ３４＋ＣＤ４５＋の表現型に基づいて選別した。二重陰性の細胞型は、あらゆるＣＦＵを生成することも選別の純度の対照として利用されることも期待されなかった。ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋細胞型は従来のＣＢ幹細胞であり、選別およびＣＦＵアッセイの陽性対照として利用される。ＣＤ３４＋ＣＤ４５−の試験表現型は、選別およびＣＦＵを可能にするほどに十分な量ではＨＵＣＢには存在しなかったが、ＨＰＰ細胞からは得られた。表１で見られるように、ＨＰＰから得られた細胞はより多くのＣＦＵ−ＥおよびＢＦＵ−Ｅを生じさせ、また、ＨＵＣＢで見られたものと同じＣＦＵのパターンをもたらした。さらに、ＨＰＰ  ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋細胞は、ＨＵＣＢで検出されずＨＵＣＢにおけるＣＤ３４＋ＣＤ４５＋細胞によっても産生されない集団である、ＣＦＵ−ＧＥＭＭをもたらした。
【０３９７】
【表７】
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【０３９８】
別の研究において、ＣＤ３４遺伝子、ＣＤ４５遺伝子、ＣＤ３１遺伝子、およびＣＤＨ５遺伝子の発現レベルを、同一の胎盤灌流液（ＨＰＰ）から単離したＣＤ３４＋ＣＤ４５−細胞集団およびＣＤ３４＋ＣＤ４５＋細胞集団において比較した。
【０３９９】
材料および方法：ＣＤ３４＋ＣＤ４５−細胞集団およびＣＤ３４＋ＣＤ４５＋細胞集団を、上述のようにして、９０％超の細胞純度で得、ＲＮＡＱＵＥＯＵＳ（登録商標）−４ＰＣＲキット（Ａｍｂｉｏｎ、カタログ番号ＡＭ１９１４）を用いるＲＮＡ調製にかけた。簡潔に述べると、単離した細胞（５×１０５個細胞）をグアニジン溶解溶液において溶解した。次に、試料溶解物をエタノール溶液と混合し、選択的かつ定量的にｍＲＮＡおよび大きなリボソームＲＮＡを結合するシリカベースのフィルターに塗布した。ｔＲＮＡおよび５ＳリボソームＲＮＡなどの非常に小さなＲＮＡは定量的に結合されなかった。次に、フィルターを洗浄して、残っているＤＮＡ、タンパク質、および他の汚染物質を除去し、微量のＥＤＴＡを含む、ヌクレアーゼを含まない水にＲＮＡを溶出して、重金属をキレート化した。キットに同梱されている、ＲＮａｓｅを含まないマイクロチューブ内に取り付けられている小さなカートリッジ内に、シリカフィルターを収納した。試料溶解物、洗浄溶液、および溶出溶液を、遠心分離または減圧によってフィルターを通して移動させる。フィルターから溶出した後、キットに同梱されている超高純度ＤＮａｓｅ１でＲＮＡを処理し、微量のＤＮＡを除去した。最後に、ＤＮａｓｅおよび二価陽イオンを、同様にキットに同梱されている試薬によって除去した。回収したＲＮＡの濃度および純度を、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍでのその吸光度を測定することにより決定した。次に、ＲＮＡを、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）逆転写試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号Ｎ８０８０２３４）を用いたｃＤＮＡ合成に使用し、その後、ＣＤ３４（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号Ｈｓ００９９０７３２＿ｍ１）、ＣＤ４５（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号Ｈｓ００２３６３０４＿ｍ１）、ＣＤ３１（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号Ｈｓ０１０６５２８９＿ｍ１）、およびＣＤＨ５（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号Ｈｓ００１７４３４４＿ｍ１）のＴａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイを用いた７９００ＨＴ  ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲシステムによるリアルタイムＰＣＲ分析を行うことができる。
【０４００】
結果：リアルタイムＰＣＲ分析により、ＣＤ３４＋ＣＤ４５−細胞およびＣＤ３４＋ＣＤ４５＋細胞におけるＣＤ３４の発現は同程度であることが明らかになった。予想した通り、ＣＤ４５の発現はＣＤ３４＋ＣＤ４５−細胞においては検出不可能であったが、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋細胞においては検出可能であった。ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋細胞におけるＣＤ３１の発現は、ＣＤ３４＋ＣＤ４５−細胞における発現の０．０５％であった。ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋細胞におけるＣＤＨ５の発現はＣＤ３４＋ＣＤ４５−細胞における発現の１３．６６％であった。
【実施例１６】
【０４０１】
６．１６  実施例１６：ヒト胎盤灌流液から得たＣＤ３４＋細胞の濃縮
この実施例は、磁気抗体被覆ビーズ分離（ＭＡＣＳ）を用いた、ヒト胎盤から得たＣＤ３４＋細胞の濃縮を記載するものである。
【０４０２】
ヒト胎盤灌流液に由来する細胞懸濁液を得、ＡＣＤ（抗凝血性クエン酸デキストロース）を含むＭＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ（ｐＨ７．２）、および０．５％ＢＳＡ、および２ｍｍｏｌのＥＤＴＡ）中に再懸濁する。最初の流入試料のためにアリコートを収集する。６ｍＬのフィコールを別の１５ｍＬのチューブに加え、細胞懸濁液をフィコール上に非常にゆっくりと層状にする。フィコール内の細胞懸濁液を、２０℃で３００×ｇ（平均）で３５分間、ＳＣ４７５０ローターを有するＢｅｃｋｍａｎ  ｃｏｕｌｔｅｒ  Ａｌｌｅｇｒａ  Ｘ１２Ｒ遠心分離機において、ブレーキを用いずに遠心分離する。遠心分離が完了すると、上清を慎重に吸引し、界面に定着している単核細胞を別のチューブに収集する。この材料を再懸濁し、ＡＣＤを含むＭＡＣＳ緩衝液と共に１０ｍＬの最終容積とする。第２の流入試料のためにアリコートを収集する。細胞を計数し、生存率について確認する。次に、細胞を、ＳＣ４７５０ローターにおいて、４℃で４００×ｇ（平均）で１５分間、遠心分離する。遠心分離が完了すると、上清を吸引し、ＡＣＤを含む１００μＬのＭＡＣＳ緩衝液に細胞を再懸濁する。ＳＴＥＭＳＥＰ（商標）選択カクテル（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ  Ｃａｎａｄａ）を１００μＬ／細胞１ｍＬの濃度（１μＬ／２×１０６個細胞の濃度）で加える。細胞およびカクテルをよく混合し、４〜８℃で１０分間インキュベートする。磁気コロイドを６０μＬ／細胞１ｍＬ（１μＬ／３．３３×１０６個細胞の濃度）で加える。細胞およびコロイドをよく混合し、４〜８℃で１０分間インキュベートする。次に、１０×容積の、ＡＣＤを含む冷凍保存したＭＡＣＳ緩衝液を細胞に加え、得られた溶液をＳＣ４７５０ローターにおいて室温で４００×ｇ（平均）で８分間、遠心分離する。上清を吸引し、ＡＣＤを含む２ｍＬのＭＡＣＳ緩衝液内に細胞を再懸濁する。場合により、懸濁液をこの時点で濾過する。第３のアリコートを流入試料として収集する。次に細胞を、ＰＯＳＳＥＬＤ２プログラムを用いて、ＡＵＴＯＭＡＣＳ（商標）自動磁気細胞選別機（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）で分析し、収集チューブは「ＰＯＳ２」および「ＮＥＧ１」の位置に置く。約２ｍＬの正に選択された細胞が収集される。次に、細胞懸濁液を洗浄し、室温で４００×ｇ（ＳＣ４７５０ローター）で１０分間遠心分離し、１％ＦＢＳを含む１ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁する。
【実施例１７】
【０４０３】
６．１７  実施例１７：インビトロでのコロニー形成単位アッセイ
全有核細胞をヘタスターチ分離によって臍帯血の単位から単離する。全有核胎盤細胞を、フィコール分離によって７５０ｍｌの胎盤灌流液から得る。胎盤および臍帯血から得た全有核細胞を、３５ｍｍの培養皿内の、Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ  ＧＦ＋Ｈ４４３５培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）または２％ウシ胎児血清および１％Ｓｔｅｍｓｐａｎ  ＣＣ１００サイトカインカクテル（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）を補充したＲＰＭＩ  １６４培地内で、３組混合する。細胞は少なくとも２つの比率（例えば、２×１０５：２×１０５、１×１０５：３×１０５、３×１０５：１×１０５）で混合し、１４日間培養する。次に、細胞の形態を位相差顕微鏡で調べ、コロニー形成単位（例えば、ＣＦＵ−ＧＭ、ＣＦＵ−Ｌ、ＣＦＵ−Ｍ、ＣＦＵ−Ｇ、ＣＦＵ−ＤＣ、ＣＦＵ−ＧＥＭＭ、ＣＦＵ−Ｅ）の総数を記録する。次に、どの比率により最も多数のコロニー形成単位が生じるかについて決定する。
【０４０４】
均等物：本発明は、本明細書に記載した特定の実施形態によって範囲を限定されるものではない。実際、記載されているものに加えた、本発明の様々な変更が、上記の記載および添付の図面から当業者には明らかとなろう。このような変更は、添付の特許請求の範囲の範囲内にあるものとする。
【０４０５】
様々な刊行物、特許、および特許出願が本明細書において引用され、その開示は、参照によりその全体が組み込まれている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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