(57)【要約】  本システム、方法および装置は、柔軟性を有しかつ効率の良いハイスループットエレクトロポレーションシステムを提供する。多重チャンネルサンプルプレートの任意の数のチャンネルにも電気パルスを送信する。ドライバがどのチャンネルに電気パルスを送信するかの選択を提供する。電気パルス間で効率的な遷移を提供するために、放電回路が所望の電圧を達成するための効率的な手段を提供する。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
静電容量と、
前記静電容量を充電するように構成された充電回路と、
それぞれのバンクが複数のウエルを有する複数のバンクを備えたサンプルプレートの共通パッドと接続するように適応された第１の電気コネクタであって、前記第１の電気コネクタが前記共通パッドと接続された場合、前記第１の電気コネクタは前記バンクのそれぞれのウエルの第１の電極に接続される、第１の電気コネクタと、さらに
それぞれのドライバが前記サンプルプレートの複数の個別パッドに接続するように適応された複数のドライバであって、一個のドライバが一個の個別パッドに接続された場合、該ドライバは１個のバンクのそれぞれのウエルの第２の電極と接続され、前記ドライバの状態が、このドライバと接続される１個のバンクに前記静電容量から電気パルスを送信するか否かを決定する、前記複数のドライバと、を備えるエレクトロポレーションシステム。
【請求項２】
請求項１に記載のシステムにおいて、前記ドライバは、電気パルスを前記全てのバンクに送信するように動作する、エレクトロポレーションシステム。
【請求項３】
請求項１に記載のシステムにおいて、前記ドライバは前記静電容量に接続され、かつ、前記第１の電気コネクタはグランドに接続されている、エレクトロポレーションシステム。
【請求項４】
請求項１に記載のシステムにおいて、前記ドライバはグランドに接続され、かつ、前記第１の電気コネクタは前記静電容量に接続されている、エレクトロポレーションシステム。
【請求項５】
請求項１に記載のシステムにおいて、更に、
サンプルプレートの前記バンクに配信されるそれぞれの電気パルスのためのパラメータを記憶するように構成されたメモリ素子であって、前記パラメータはどのバンクにそれぞれの電気パルスを配信するかを含む、前記メモリ素子を備える、エレクトロポレーションシステム。
【請求項６】
請求項１に記載のシステムにおいて、更に、
前記それぞれのドライバの状態を独立して制御するための制御プロセッサを備える、エレクトロポレーションシステム。
【請求項７】
請求項１に記載のシステムにおいて、更に、
前記バンクのウエル中のサンプルの抵抗を決定し、かつ、前記バンクのウエル中のサンプルの抵抗に基づいて前記ドライバの状態を制御するように構成された、制御プロセッサを備える、エレクトロポレーションシステム。
【請求項８】
複数のバンクを有するサンプルプレートに電気パルスを配信するための方法であって、
少なくとも１個のバンクの抵抗を測定し、
前記抵抗に基づいて、電気パルスを配信するための１個以上のバンクを選択し、更に
選択されたバンクに電気パルスを送信する、各ステップを備える、方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法において、前記抵抗の測定は、前記抵抗が抵抗値の２以上の範囲内にあるか否かを決定することを含む、方法。
【請求項１０】
請求項８に記載の方法において、少なくとも１個のバンクの抵抗を測定することは、選択されたそれぞれのバンクの抵抗を測定することを含む、方法。
【請求項１１】
請求項８に記載の方法において、少なくとも１個のバンクの抵抗を測定することは、それぞれのバンクの抵抗を測定することを含む、方法。
【請求項１２】
請求項８に記載の方法において、更に、選択されたバンクの抵抗を決定するステップを備える、方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法において、更に、選択されたバンクの抵抗に基づいて、前記選択されたバンクと並列に接続された可変抵抗素子の抵抗を決定するステップを備える、方法。
【請求項１４】
請求項８に記載の方法において、更に、選択されたそれぞれのバンクと結合されるドライバを“オン”にするステップを備える、方法。
【請求項１５】
請求項８に記載の方法において、更に、電気パルスのための１個以上のパラメータを受信するステップを備え、前記１個以上のバンクを選択することは前記パラメータに基づく、方法。
【請求項１６】
コンデンサのセットと、
所望の静電容量を達成するために、１個以上の前記コンデンサを選択するように構成された制御プロセッサと、
前記選択されたコンデンサを充電するように構成された充電回路と、
前記選択されたコンデンサにそれぞれ選択的に接続され、かつ、選択されたコンデンサに接続された場合に前記選択されたコンデンサ上の電荷を減少させるように構成されている、複数の放電回路と、を備えるエレクトロポレーションシステム。
【請求項１７】
請求項１６に記載のシステムにおいて、前記放電回路はパルス変調された抵抗を含む、エレクトロポレーションシステム。
【請求項１８】
請求項１６に記載のシステムにおいて、前記放電回路はスイッチ素子を含む、エレクトロポレーションシステム。
【請求項１９】
請求項１８に記載のシステムにおいて、前記スイッチ素子はシリコン制御整流器を含む、エレクトロポレーションシステム。
【請求項２０】
請求項１６に記載のシステムにおいて、更に、コンデンサセットにおけるそれぞれのコンデンサの静電容量を記憶するメモリ素子を備える、エレクトロポレーションシステム。
【請求項２１】
請求項１６に記載のシステムにおいて、それぞれの放電回路は、異なる範囲の静電容量に接続されるように指定される、エレクトロポレーションシステム。
【請求項２２】
請求項２１に記載のシステムにおいて、前記制御プロセッサは、前記所望の静電容量に基づいて、所望の電圧が得られるまで前記選択されたコンデンサ上の電荷を減少させるための一つの放電回路を選択するように構成されている、エレクトロポレーションシステム。
【請求項２３】
請求項１６に記載のシステムにおいて、前記充電回路は、所望の電圧よりも大きな電圧に前記選択されたコンデンサを充電するように構成され、更に、前記制御プロセッサは、前記所望の静電容量に基づいて、前記所望の電圧が得られるまで前記選択されたコンデンサ上の電荷を減少させるための一つの放電回路を選択するように構成されている、エレクトロポレーションシステム。
【請求項２４】
エレクトロポレーションシステムの所望の静電容量上に所望の電圧を達成するための方法であって、
前記所望の静電容量を達成するために１個以上のコンデンサを選択し、
前記所望の電圧よりも高い電圧に、前記選択されたコンデンサを充電し、
前記所望の静電容量に基づいて、前記選択されたコンデンサに接続するために複数の放電回路の内の一個を選択し、更に、
前記選択された放電回路によって、前記所望の電圧に到達するまで前記選択されたコンデンサから電荷を取り除く、各ステップを備える、方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法において、更に、パルス変調信号によって前記選択された一個の放電回路の抵抗を制御するステップを備える、方法。
【請求項２６】
請求項２４に記載の方法において、複数の放電回路の一個の選択は、前記所望の電圧に基づいている、方法。
【請求項２７】
請求項２４に記載の方法において、更に、電気パルスを前記選択されたコンデンサからサンプル負荷に送信するステップを備える、方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法において、更に、前記電気パルスの送信後に、
前記所望の静電容量に基づいて、前記選択されたコンデンサの少なくとも一部分に接続するために第２の放電回路を選択し、
前記選択された第２の放電回路によって、第２の所望電圧に到達するまで、選択されたコンデンサの一部分から電荷を取り除く、各ステップを備える、方法。
【請求項２９】
請求項２４に記載の方法において、更に、前記一個の放電回路の選択の前に、電気パルスを前記選択されたコンデンサからサンプル負荷に送信するステップを備える、方法。
【請求項３０】
請求項２９に記載の方法において、前記所望の電圧は次の電気パルスのための電圧より僅かに小さい電圧を有する、方法。
【請求項３１】
請求項３０に記載の方法において、更に、
他の所望の静電容量を達成するために一個以上の他のコンデンサを選択し、
前記選択した他のコンデンサを前記他の所望の電圧よりも高い電圧に充電し、
前記他の所望の静電容量に基づいて、前記選択された他のコンデンサに接続するために第２の放電回路を選択し、
前記選択された第２の放電回路によって、次の電気パルスのための電圧に到達するまで、前記選択された他のコンデンサから電荷を取り除く、各ステップを備える、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本発明は、以下の、Ｒａｇｓｄａｌｅ（以下、Ｒａｇｓｄａｌｅ  ＩＩ）による“ＭＥＡＳＵＲＩＮＧ  ＳＡＭＰＬＥ  ＲＥＳＩＳＴＡＮＣＥ  ＩＮ  ＥＬＥＣＴＲＯＰＯＲＡＴＩＯＮ”と題された、同一出願人による米国特許出願第１１／５６７，４３７号（代理人参照番号００２５５８−０７７７００ＵＳ）に関連しており、この出願は全ての目的に対して参照により、本出願に組み込まれる。
【０００２】
本出願は、同様に、Ｒａｇｓｄａｌｅ等によって２００６年２月１０日に出願された、同一出願人による“ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ  ＦＯＲ  ＨＩＧＨ−ＴＨＲＯＵＧＨＰＵＴ  ＥＬＥＣＴＲＯＰＯＲＡＴＩＯＮ”と題された米国仮特許出願第６０／７７１，９９４号（代理人参照番号００２５５８−０７４４００ＵＳ）、およびＲａｇｓｄａｌｅによって２００６年９月１２日に出願された“ＲＥＳＩＳＴＯＲ  ＰＵＬＳＥ  ＭＯＤＵＬＡＴＩＯＮ”と題された、米国仮特許出願第６０／８２６４２２号（代理人参照番号００２５５８−０７６８００ＵＳ）に関連しており、これらの出願はその全てが参照によって本出願に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
本発明は一般にエレクトロポレーションシステムに関し、特に、フレキシブルでハイスループットなエレクトロポレーションシステムを提供することに関する。
【０００４】
エレクトロポレーションとは、生体細胞、リポソームおよびベクシルに外因分子を含浸させるために、電界を使用する技術である。ハイスループットエレクトロポレーションは、ユーザが、複数のサンプルに、同時にあるいは自動的な順番で電界、即ちショック、を与えることを可能としている。ｓｉＲＮＡ実験、ｃＤＮＡを使用する研究および迅速にエレクトロポレーションを最適化することに対する要望が高まることによって、科学者はハイスループットエレクトロポレーションを必要としかつ要求している。
【０００５】
エレクトロポレーションは、例えば、パルス電圧およびパルス幅のようなパラメータの狭い範囲内で発生し、このようなパラメータは、感電死とエレクトロポレーションが殆ど発生しない状態の間の狭いウインドウによって示される。例えば、パルス幅が長すぎるパルス、あるいは電界強度が大きすぎるパルスが使用された場合、細胞は溶解（破壊）される可能性がある。パルス幅またはパルス強度が低すぎる場合、エレクトロポレーションの効率は失われる。エレクトロポレーションの効率は細胞、生物学的パラメータ、電圧、時定数（またはパルス幅）、波形、電流、加熱、アークおよびその他のパラメータに依存する。
【０００６】
ある会社（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｉｎｃ，ＢＴＸ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｈｉｌｌｉｓｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）がハイスループットエレクトロポレーション装置を提供しており、この装置は米国特許公開公報２００６／０１１５８８８号（およびＰＣＴ公報ＷＯ２００４／０５０８６６Ａ１）に記載されており、その内容は参照によってこの出願に組み込まれる。これらの特許出願に記載されたプレートは、めっき電極を有する矩形のウエルを有している。コラム毎に８個のウエルを有する１２個のコラムに配列された、９６個のウエルがある。
【０００７】
８個のウエルからなる一個のバンク（即ち一個のコラム）の一面上の電極全ては、それぞれのバンクに沿って、めっきされたトレースに共通に接続され、同じバンク内のウエルの他面上の電極全ても同様に共通に接続されている。めっきされたトレースは電気接点で終わり、各コラムに対して一個の陽極接点と陰極接点を形成する。エレクトロポレーションプレートは、プレートハンドラと呼ばれるデバイスの中に下げられ、プレートを使用状態に設定する。プレートハンドラは、ウエルを有する１２個のバンクの２４個の電気接点と接続され、１２個のバンクのそれぞれを順次、外部のエレクトロポレーション装置に接続するためのスイッチを有している。その後、電気パルスが順次、供給される。
【０００８】
殆どの細胞は生理食塩水中で最もよく生存し、ショックは通常、生理食塩水あるいはその他の高伝導性バッファ内に懸濁された細胞に対して与えられる。生理食塩水を含むウエルは比較的低い抵抗を示し、この抵抗は、エレクトロポレーション装置が８個のウエルに一度にショックを与えるように構成されているため、上記のエレクトロポレーション装置によって供給される電流を制限する。例えば、エレクトロポレーション装置に対して低抵抗負荷（約６．２５Ω）を引き起こす原因となる。８個の並列ウエルの抵抗が低いこと、および利用可能な最大のコンデンサが約３２００ｍｆｄの静電容量を有しているという事実によって、最大の時定数は約２０ｍｓｅｃに制限される。
【０００９】
エレクトロポレーション装置では、このように、バンク（コラム）の８個のウエル全てに同時にショックを与えるように限定されており、かつそれぞれのバンクは別個にショックが与えられる。上記で説明したように、この柔軟性のない操作は、多くのサンプルに対してパルス幅を制限する。その上、サンプルの数を８個に制限することによって、迅速なエレクトロポレーションをも妨げる。更に、１２個のバンクの全てがショックを受ける場合、多くのプロトコルに対して約１０分が必要となる。
【００１０】
従って、多くのサンプルに対して電気パルスを与える場合にフレキシビリティを持ったエレクトロポレーションシステムを提供することが望ましく、かつパルス列をより効率的に供給することが更に望まれる。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、フレキシブルで効率的な、ハイスループットエレクトロポレーションシステムを提供するためのシステムおよび方法を提供する。このシステムおよび方法は、例えば、同じ電気パルス（例えば、リターンドライバを用いて）を受信し、かつ特別な放電回路を使用して２個の電気パルス間により効率的な遷移を提供するために、同じサンプルプレートの任意の数のバンク（チャンネル）を共に接続するような、一以上の技術を使用する。
【００１２】
本発明の一実施形態では、エレクトロポレーションシステムは、コンデンサと、このコンデンサを充電するように構成された充電回路を有している。システムの第１の電気コネクタは、複数のバンクを有するサンプルプレートの共通パッドに接続されるように適応されている。各バンクは複数のウエルを有している。第１の電気コネクタが共通のパッドに接続される場合、第１の電気コネクタはバンクのそれぞれのウエルの第１の電極に接続される。第１の電気コネクタは、サンプルプレートの高電位側あるいは低電位側に接続することができる。
【００１３】
ドライバはそれぞれ、サンプルプレートのバンクに特有のパッドと接続するように適応されている。ドライバがバンクに固有のパッドと接続された場合、このドライバはその固有のバンクの各ウエルの第２の電極に接続される。このドライバの状態が、電気パルスがコンデンサからこのドライバに接続された特定のバンクに送出されるか否かを決定する。任意の数のドライバも、電気パルスを全てのバンクを含む任意の数のバンクに電気パルスを送出する状態にある。一実施形態では、ドライバはコンデンサ、即ち、サンプルプレートの一方の側の上の回路と接続される。別の実施形態では、ドライバは共通の復帰経路、即ちサンプルプレートの他方の側の上の回路、と接続される。
【００１４】
一実施形態では、メモリ要素が、バンクに配信されるそれぞれの電気パルスのパラメータを記憶するように構成されている。このパラメータは、どのバンクにそれぞれの電気パルスを配信するかを含んでいる。別の実施形態では、制御プロセッサが各ドライバの状態を独立して制御する。更に別の実施形態では、制御プロセッサがバンクの抵抗を決定し、この抵抗に基づいて各ドライバの状態を制御するように構成されている。
【００１５】
別の実施形態では、少なくとも１個のバンクの抵抗値が測定される。この抵抗は、電気パルスを配信する１個以上のバンクを選択するために使用される。電気パルスに対する１個以上のパラメータを同様に、そのバンクを選択するために用いても良い。電気パルスはその後、選択されたバンクに送出される。一実施形態では、この抵抗が抵抗値の２以上の範囲内にあるか否かを決定することによって、この抵抗を測定する。選択された各バンクの抵抗を測定しても良いし、さらに、全てのバンクの抵抗を測定しても良い。
【００１６】
一実施形態では、選択されたバンクの抵抗が決定される。この抵抗に基づいて、選択されたバンクに並列に接続された可変抵抗装置の抵抗を決定しても良い。別の実施形態では、選択された各バンクに結合されたドライバを“オン”として、そのバンクに電気パルスを送信する。
【００１７】
別の実施形態によれば、エレクトロポレーションシステムは、コンデンサのセットと、所望の静電容量を達成するために１個以上のコンデンサを選択するように構成された制御プロセッサと、選択されたコンデンサを充電するための充電回路とを有している。選択されたコンデンサ上の電荷を効率的に減少させるために、選択されたコンデンサに放電回路を選択的に接続しても良い。各放電回路を、異なる範囲の静電容量と接続されるように、指定しても良い。一実施形態では、放電回路はパルス変調抵抗を含んでいる。別の実施形態では、放電回路はスイッチ装置を含み、これはシリコン制御整流器であっても良い。
【００１８】
一実施形態では、メモリ素子は、コンデンサセットにおける各コンデンサの静電容量を記憶する。別の実施形態では、所望の静電容量に基づいて、制御プロセッサは、所望の電圧が達成されるまで選択されたコンデンサ上の電荷を減少させるために、１個以上の放電回路を選択するように構成されている。別の実施形態では、充電回路は、選択されたコンデンサを、所望の電圧よりも高い電圧に充電するように、構成されている。
【００１９】
別の実施形態では、所望の容量を達成するために、１個以上のコンデンサが選択される。選択されたコンデンサは、所望の電圧よりも高い電圧に充電される。所望の静電容量に基づいて、複数の放電回路のうちの一個が選択され、選択されたコンデンサに接続される。放電回路の選択は、例えば所望の電圧のような、その他の数値に基づいていても良い。選択された放電回路は、所望の電圧に達するまで、選択されたコンデンサから電荷を取り除く。選択された放電回路の抵抗をパルス変調信号によって制御するようにしても良い。
【００２０】
一実施形態では、電気パルスは選択されたコンデンサからサンプル負荷に送信される。一形態では、電気パルスの送信後、所望の静電容量に基づいて第２の放電回路が選択されて、選択されたコンデンサの少なくとも一部分に接続される。選択された第２の放電回路は、その後、第２の所望電圧に到達するまで、選択されたコンデンサの一部分から電荷を取り除くために使用される。
【００２１】
その他の実施形態では、一個の放電回路の選択に先立って、選択されたコンデンサからサンプル負荷に電気パルスが送信される。一形態では、所望の電圧は、次の電気パルスの電圧より僅かに小さい電圧である。一実施形態では、別の所望の静電容量を達成するために、別の一個以上のコンデンサが選択される。選択された別のコンデンサは、別の所望の電圧よりも高い電圧に充電される。別の所望の静電容量に基づいて、選択された別のコンデンサに接続するために、第２の放電回路が選択され、次の電気パルスに対する電圧に到達するまで、選択された第２の放電回路によって、選択された別のコンデンサから電荷が取り除かれる。
【００２２】
図面、請求の範囲および付属書を含む本明細書の残りの部分を参照することによって、本発明の他の特徴および利点を理解することができる。本発明の更なる特徴および利点は、本発明の種々の実施形態の構造および作用と同様に、添付の図面に関連して以下に詳細に記載されている。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の一実施形態に係るエレクトロポレーションシステムを示す図。
【図２】本発明の実施形態に使用されるサンプルプレートを示す図。
【図３】本発明の実施形態に使用される接続リッドを示す図。
【図４】リターンドライバを有する本発明の一実施形態に係るエレクトロポレーションシステムを示す図。
【図５】電気パルスを送達するバンクの数を決定するための、本発明の一実施形態に係る方法を示す図。
【図６】供給回路を有する、本発明の一実施形態に係るエレクトロポレーションシステムを示す図。
【図７】電荷排出回路を有する、本発明の一実施形態に係るエレクトロポレーションシステムを示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明の実施形態では、フレキシブルで効率的なハイスループットエレクトロポレーションシステムを提供するためのシステムおよび方法を提供する。ある形態において、これらのシステムおよび方法は、サンプルプレートの多くのバンク（チャンネル）にパルスを供給する能力を提供し、かつ２個の電気パルスの供給の間で更に効率的な遷移を提供する。
【００２５】
図１は、本発明の一実施形態に係るエレクトロポレーションシステム１００を示す。システム１００はサンプル負荷１２０に対して電気信号を生成する。充電回路１０５はコンデンサ１１０に接続されており、スイッチ１１５、例えば高電圧（ＨＶ）スイッチ、がオープンするとコンデンサ１１０を充電する。一形態において、充電回路１０５は電源またはその他の定電力源または定電流原である。コンデンサ１１０はまた異なる値に設定することができる。ＨＶスイッチ１１５はコンデンサ１１０をサンプル負荷Ｒｓ１２０と可変抵抗Ｒｖに接続する。この可変抵抗Ｒｖは負荷Ｒｓと並列に接続されている。
【００２６】
充電回路１０５がいったんコンデンサ１１０を所望の電圧まで充電すると、ＨＶスイッチ１１５はクローズされる。ＨＶスイッチ１１５は、例えば、パルス数、パルス幅、およびパルスバースト等のプログラム可能なパラメータを有するドライバでもある。この時点において、電気信号が負荷Ｒｓ１２０およびＲｖ１２５に送信される。一形態では、この電気信号は、指数関数的に減衰するパルス、切断指数関数的に減衰するパルスあるいはドループを有する矩形波である。
【００２７】
Ｒｖ１２５の抵抗値を、電気信号を制御するために調整しても良い。例えば、Ｒ＝（Ｒｓ×Ｒｖ）／（Ｒｓ＋Ｒｖ）およびＣをコンデンサ１１０の容量とするとき、指数関数的に減衰するパルスに対して、所望の時定数τ＝ＣＲが実質的に所望のパルス幅に等しくなるように、Ｒｖ１２５の抵抗値を自動的に決定するようにしても良い。
【００２８】
時定数は、サンプル負荷中の細胞あるいは他のタイプの生体分子に基づいて、具体的に選択することが可能である。幾つかの細胞はトランスフェクトに対して敏感でありまたはトランスフェクトが難しいため、時定数を正確に制御することによりエレクトロポレーションを成功させることができる。米国仮特許出願第６０／８２６４２２号に記載するように、Ｒｖ１２５に対して異なる抵抗値を実現することもできる。
【００２９】
例えば、複数のサンプルをテストする場合あるいはパラメータを最適化する場合などでは、サンプル負荷Ｒｓ１２０は、その個々が電気パルスを受信する複数の生体サンプルを含むことがある。このような実施形態では、例えば、２：３の矩形行列に配置されたマイクロタイタープレートのようなサンプルプレート上に、複数の異なるサンプルを存在させても良い。
【００３０】
図２は、本発明の実施形態で使用されるサンプルプレート２００を示す。上述した出願第６０／７７１，９９４号に、他のサンプルプレートを見出すことができる。サンプル生体分子はウエル２１０中に存在しエレクトロポレーションパルスを受信する。サンプルプレートは、好ましくは複数のファミリーに分類され、１個のプレートファミリー中のメンバーはサイズが異なっている場合もある。各ウエル２１０は例えば対向する壁の上に電極を有しており、この電極によってウエル中に存在するサンプル生体分子に電気パルスを供給する。典型的なプレートファミリーでは、９６−ウエル（８個のウエルを１２列）、２４−ウエルおよび１２−ウエルフォーマットおよびその他のサイズのエレクトロポレーションが可能であり、更に接着細胞および非接着細胞を効率的に使用することが可能である。（接着細胞は表面上に成長し、非接着細胞は浮遊中に、あるいは溶液中でよく成長する。）
【００３１】
これらのエレクトロポレーションプレートは、燐酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の細胞懸濁液に有益であり、好ましくは、少なくとも３０ｍ秒の時定数（全抵抗値×容量）を必要とする標準プロトコルを含む、全ての標準５００Ｖ（哺乳動物）プロトコルに適応するように設計される。一実施形態では、このようなプレートを使用するエレクトロポレーションシステムでは、１個のプレート上に２４プロトコルまでを可能とし、これらのプロトコルは以下のパラメータ、（ａ）波形（指数あるいは矩形波）、（ｂ）電圧１０−５００Ｖ、（ｃ）容量（２５−３２７５−ｍｆｄ）、および（ｄ）並列抵抗（５０−１５００Ω）、において異なっていても良い。
【００３２】
ウエルは、１２列（１−１２）と８行（Ａ−Ｈ）に体系化されていても良い。ここで、最も上部の左側のウエルをＡ１とする。バンク毎に４個のウエルを有する一実施形態では、一列の最初の４個のウエル（ウエルＡ−Ｄ）は１個のバンクの一部であり、次の４個のウエル（Ｅ−Ｈ）は他のバンクに属する。バンクの各ウエルは、同じパラメータに基づいた同じ電気パルスを受信する。従って、２４個の異なるプロトコルが１個のプレートに対して実行される。２４個のプロトコルとは更に、エレクトロポレーション装置に対して提示された各バンクに対する抵抗を、電子装置上の負荷を実用レベルまで減少させるＢＴＸシステムに比べて、２倍にすることを意味する。
【００３３】
本発明の一形態では、電気接続によって、どのウエルに電気パルスを供給するかを選択する能力が与えられる。これらの電気接続はプレート上、プレートに接続されたリッド上、あるいはその他の適切な位置にあっても良い。一実施形態では、電気パルスに対して、共通入力パッドと複数の出力パッドがある。他の実施形態では、リッドの外観によって接触が形成されるように、各電極は、エレクトロポレーションプレート９の上面上のパッド２２０に終端する。
【００３４】
図３に、本発明の実施形態で使用される接続リッド３００を示す。サンプルプレートの他の例は、上記の出願６０／７７１，９９４に見出すことができる。矩形ボックス３０５はウエル２１０の位置を示す。一実施形態では、それぞれのボックス３０５は物理ボックスであり、ボックスの外側平面がウエル２１０の上面と一致するようなサイズを有している。
【００３５】
接続リッド３００は、リッド３００の末端縁３１２，３１４のいずれかあるいは両方に少なくとも１個の共通パッド３１０を有している。中央ワイヤ３２０は共通パッド３１０を共通コラムワイヤ３２５に接続する。この共通コラムワイヤ３２５は、例えば、サンプルプレート２００上のパッド２２０に接続されている。共通パッド３１０は、例えば充電回路１０５のような外部電源あるいはグランドのような低電位源への、如何なるタイプのプラグまたは接続体を受け入れるように適応されていても良い。一実施形態では、共通パッド３１０は全てのウエルの１個の電極に接続されている。この接続は、図示するようにウエルの各コラムの同じ側に沿っていてもよく、あるいはウエルの交互の側に沿っていてもよく、あるいはその他の形状であっても良い。ワイヤ３２０および他のワイヤは、ベイン、トレースあるいは電気パルスを搬送する全ての適切な媒体である。
【００３６】
それぞれのウエルの別の電極は共通パッドの反対の極に接続されている。例えば、個々のコラムワイヤ３３０は４個のウエル（１個のバンク）の反対の電極をバンクパッド３３５に接続する。このバンクパッド３３５は、共通パッド３１０の反対の極に接続されていても良い。一実施形態では、それぞれの個別コラムワイヤ３３０は、共通パッド３１０よりもむしろ反対の極性を有するパッドに接続されている。このように、電極の極性は、共通コラムワイヤ３２５と個別コラムワイヤ３３０の構造によって、＋となりあるいは−となる。交流ベインは、プレートを製造する場合の電極めっきの＋と−との分離を容易にし、隣接するコラム間での放電を防止する。一実施形態では、個別コラムワイヤ３３０は共通パッドへの接続のために使用することができるが、これによって共通パッドの数が増加し、そのために別のスペース問題が発生する。他の実施形態では、電極はそれぞれのプレートコラム終端、例えばプレート基部、を通して、プレートを支持するチャンバ内のコンタクトに接触するようにされている。
【００３７】
従って、電極のための全ての配線および電気接続は、接続リッド３００によってもたらされる。この結果、単にリッドを取り替えることによって、全ての形状の電極に接続できるという柔軟性が発生する。一旦、エレクトロポレーションプレート上に適切な接続リッドが設置されると、組立て体は、高スループットボックスとして言及される電子ボックスのスロット中に滑り込む。ボックス中のコンタクトによって共通パッド３１０およびコネクションリッド３００の端部上のバンクパッド３３５との電気接触が達成される。
【００３８】
種々の数のバンクに電気パルスを供給するために、特定の数のバンクパッド３３５が、その電気パルスに対して、例えばグランドに共通に接続されている。一実施形態では、この接続はリターンドライバによって達成される。このドライバは、ＩＧＢＴ、パワーＦＥＴまたはバイポーラトランジスタのようなどのような半導体によっても形成することができる。ＳＣＲも同様に使用することができる。一形態では、ドライバの“オン”状態がバンクを回路中に組み入れ、その結果、バンクが、充電されたコンデンサに接続されることによって、電気パルスを受信するようになる。それぞれのチャンネルにリターンドライバがあっても良い。このリターンドライバは例えばＩＧＢＴのような固体デバイスである。ＣＰ４３０はそれぞれのドライバを独立に制御することが可能であり、この場合、ドライバのどのような組み合わせも、“オフ”または“オン”と成りうる。
【００３９】
一実施形態では、図３に示すように、４個ずつの単位で４から９６のウエルを選択して、同時に電気パルスを供給することができる。電気パルスを供給するウエルの数を選択する場合のこの柔軟性のために、幾つかの場合でより高速の動作が可能となる。例えば、ウエルの抵抗が非常に大きい場合、電気パルスを一度に全てのウエルに供給することができる。一形態では、全てのバンクが一個のバンクの場合と同じ電圧でショックを受けることを確実にするために、図１の抵抗１２５とＣ１１０はその抵抗値と容量においてそれぞれに変化することが要求される。ＨＶスイッチ１１５および配線／接触における電圧降下を補償するために、Ｃ１１０上の電圧を増加させることも可能である。
【００４０】
他の例では、この柔軟性は、パラメータを操作する場合に大きなバリエーションを与える。例えば、生理食塩水の環境で細胞を使用する場合、もしウエルが半分充填されているとすると、電極間スペースが約４ｍｍのウエルは約６０Ωの低い抵抗を持つことができる。このように、多くのウエルを並列にすることによって、サンプル負荷は、例えば６０／９６Ωの非常に低い抵抗値を持つようになる。５００Ｖを印加する場合、引き起こされる電流は約７００ａｍｐとなり、この値は標準部品の範囲外であり、かつ規制上の問題を引き起こす。５００Ｖのパルスを４個のウエル（〜１５Ω）のみに印加することによって、３５ａｍｐのみとなる。
【００４１】
図４は、本発明の一実施形態に係る、リターンドライバ４６０を有するエレクトロポレーションシステム４００を示す。例えばサンプルプレート２００上の、サンプルプレート４２０のアレイの前あるいは後ろに、リターンドライバを配置することができる。ラインは電気接続を示し、矢印は、例えば制御信号あるいはデータのような情報の流れを示す。
【００４２】
エレクトロポレーションシステム４００において、制御プロセッサ（ＣＰ）４３０はコンデンサセット４１０から選択する。一形態において、コンデンサ４１０は電解性であり時間と共に大きく変動しない。従って、コンデンサは製造時に測定することができ、その電圧を、エレクトロポレーションシステムの例えばフラッシュＲＡＭのようなメモリ４３２に記憶することができる。従って、メモリ４３２中の利用可能なコンデンサの容量を調べ、所望の容量に最も近いコンデンサの組み合わせを選択することによって、容量の正確な選択が可能となる。他の実施形態では、例えば、コンデンサ４１０を充電し放電して時定数を測定することによって、容量をシステムによって測定することができる。
【００４３】
一実施形態では、ＣＰ４３０はグラフィカルユーザインターフェース（ＧＵＩ）プロセッサ４３５と通信し、例えばキーボードのような入力装置４４０および／または例えば不揮発性ＲＡＭのようなメモリ４４５から、パラメータを獲得する。メモリ４４５とメモリ４３２は同じメモリモジュールであってもよく、異なるメモリモジュールであっても良い。ＧＵＩプロセッサ４３５から受信した情報をディスプレイ４５０上に表示しても良い。ＧＵＩプロセッサ４３５またはＣＰ４３０は、データをダウンロードしあるいはアップロードするために、外部のコンピュータ４５５と通信することもできる。
【００４４】
ＣＰ４３０は、選択された１個以上のコンデンサ４１０を充電回路４０５を介して充電するように指令する。一実施形態では、充電回路４０５はコンデンサ４１０を過充電する。次に、ＣＰ４３０は充電を停止し、電圧が所望のレベルに減少するまで待機する。ＣＰ４３０はコンデンサ４１０上の電圧をモニタし、何時、所望の電圧に達したかを決定することができる。コンデンサ４１０を充電しサンプルプレート４２０に接続する間で、ある時間を経過させることにより、電気パルス中のノイズを減少させることができる。これは、ノイズが例えば高周波スイッチングレギュレータから来るためである。
【００４５】
一実施形態では、インターロック４１８がＣＰ４３０に、プレートを保持するチャンバにケーブルがプラグ−インされたとき、リッドが閉鎖されたとき、サンプルプレート４２０が配置されたとき、更に、いつ高電圧がプレートに印加されたかを、通知する。コンデンサ４１０上の電圧は、例えばインターロック４１８からの監視ラインによって、プレートに供給される電圧と比較することができる。一形態では、このインターロックは、インターロックシリーズである。リッドが僅かに開けられ、かつ、プレートがそこにない場合に、１個のインターロックがインターロックラインに電圧を開放する。更に、電力がオフとされた場合、あるいはチャンバからシステム４００へのケーブルを僅かにプラグから引き抜いた場合、電力がケーブルを切り離すことによって取り除かれるので、電気機械式スイッチ（リレー）が開となる。これによって、その制御のための電子部品を不要とし、安全／規制要求を満足させる。
【００４６】
コンデンサ４１０上の電圧が所望の電圧に達したとき、高電圧（ＨＶ）スイッチ４１５は“オン”（閉）となる。ＨＶスイッチ４１５は同様に、例えば、パルス数、パルス幅およびパルスバーストのような、プログラム可能なパラメータを有するドライバである。コンデンサ４１０から１個以上のサンプルプレート４２０に電気パルスが送信される。ＣＰ４３０はラッチ４７０とリターンドライバ４６０に制御信号を送信することにより、どのバンクが電気パルスを受信するかを制御する。一形態では、ラッチ４７０はドライバ４６０をオンまたはオフに保持する。一形態では、ラッチ４７０は、制御プロセッサ４３０の出力数を増やすために使用される。例えば、多重ラッチは、１個の付加的なラインによって制御されるそれぞれのラッチと同じ８ビットデータバスを共有する。従って、プロセッサに対して１６の出力ラインを望む場合、１６本のラインに対して、８ビットデータバスプラス２個のラインの全１０ラインが必要である。更に８本のラインを追加することによって、１個の追加のプロセッサラインが使用される。
【００４７】
一実施形態では、例えば図３では共通パッド３１０である、サンプルの共通パッド４２４が接続されている、電気コネクタ４２２を介して、電気パルスが送信される。電気コネクタ４２２は、高電圧側あるいは低電圧側（例えばグランド）に接続することが可能である。リターンドライバ４６０も同様に、サンプルプレート４２０の何れの側にも接続可能である。
【００４８】
１個の電気パルスの送出に続いて、ＣＰ４３０は入力パラメータに基づいて接続すべきリターンドライバの新しいセットを選択することが可能であり、これによって、次の電気パルスを受信するために新しいバンクセット（即ち、チャンネル）が選択される。ＣＰ４３０は、次の電気パルスの期間にどのリターンドライバがクローズ（オン）すべきかについて、ラッチ４７０と通信する。いずれかの電気パルスの期間において、いずれかの時間に１個以上のドライバ４６０が“オン”となることができる。ドライバ４６０はどのような順序でも更にどのような数でも選択することが可能である。
【００４９】
一実施形態では、システム４００は電流迂回回路を含んでいる。この回路は、米国特許第６，２５８，５９２号に記載するように、アークあるいは低サンプル抵抗が検出された場合に、キュベットから電流を迂回させるものである。一実施形態では、負荷を流れる電流が充分に高くなった場合（アークが起こった場合）、ＨＶスイッチ４１５は高速でオフとされる。さもなければ、ドライバ４６０は損傷されるであろう。
【００５０】
サンプル抵抗は、選択されたバンクの数に基づいて変化する。従って、電気パルスに対して適正な波形を提供するために、並列抵抗４２５を変化させることができる。このように、一形態では、ＣＰ４３０はパルス変調抵抗（ＲＰＭ）４２５に対して制御信号を供給し並列抵抗を変更する（例えば、仮特許出願第６０／８２６４２２号に記載された記述を使用して）。
【００５１】
一実施形態では、システム４００は２４個までの異なるチャンネルを許容し、それぞれのチャンネルは、波形、電圧、時定数、容量および並列抵抗４２５に対して異なる設定を有する。一形態では、これによって遺伝子のターンオフと実験の最適化を容易にする。
【００５２】
一実施形態では、それぞれの電気パルスを何個のウエルが受信するかを選択すること、更にまた、所定のサンプルプレートに対して実施されるべき全ての電気パルスに対してパラメータを一度に入力することにおいて、システム４００は柔軟性を持つことができる。次にこのシステムは全ての電気パルスを自動的に供給する。
【００５３】
図５は、電気パルスを配信するバンクの数を決定するための方法を示している。ステップ５１０において、複数のバンクを有するプレートが受理される。ステップ５２０において、バンクの抵抗が測定される。この測定は、例えば、Ｒａｇｓｄａｌｅ  １のいずれかの方法によって行われる。一形態では、これは、サンプル負荷が高抵抗あるいは低抵抗であるかを見積もることによって行われ、従って、高い精度が要求されることはない。例えば、この測定は、抵抗がある値より高いか低いかを決定することのみを含んでいる。ステップ５３０において、パルスのためのパラメータが受信される。ステップ５４０において、パルスを受信するバンクの数が、パラメータと抵抗値に基づいて決定される。
【００５４】
ハイスループットのためには、全ての電気パルスを可能な限り迅速に配信することが有利である。従って、それぞれの電気パルス間の時間を可能な限り小さくすることが好ましい。通常、特に２４７５μファラッドを５００Ｖに充電する場合、殆どの時間を充電に要する。
【００５５】
所望の電圧を達成するための時間の一部分は、過充電の後でコンデンサ４１０がその電荷を減少させて正しい電圧に至るために必要な時間であり、この時間はかなり長い。もしこの時間を小さくすることができれば、全充電時間が小さくなる。一実施形態では、この時間を小さくするために、放電回路として作動する一個以上のブリード回路が含まれている。
【００５６】
図６は、本発明の一実施形態に係る、ブリード回路６８０を有するエレクトロポレーションシステム６００を示す。表示を明確にするために、この議論に必要でない他の構成部材は、図６から取り除かれている。充電回路６０５がコンデンサ６１０を所望の電圧よりも高い電圧に過充電した後、電圧が所望のレベルに達するまでコンデンサ６１０から電荷を取り除くために、ブリード回路６８０が使用される。このようにして充電時間を短くすることにより、サンプルプレートの全てのバンクの電気穿孔（エレクトロポレーション）がより早く行われる。
【００５７】
一実施形態では、米国特許仮出願第６０／８２６４２２号に記載されているように、ブリード回路はパルス変調抵抗である。従って、ブリード回路の抵抗を変更することにより、ブリードを制御することができる。
【００５８】
異なる静電容量は異なる速度で電荷を放出する。従って、大きな静電容量は小さな静電容量とは異なるブリード回路を必要とする。さもなければ、場合によって、電荷の減少が早すぎて所望の電圧を逃してしまうか、あるいは電荷の減少が効果を得るためには遅すぎるようになる。従って、一実施形態では、異なる範囲の電圧に対して異なるブリード回路がある。ブリード回路は更に、静電容量と電圧値との組み合わせに基づいて選択が可能である。
【００５９】
従って、ＣＰ６３０は適正なコンデンサ６１０を選択し、充電回路６０５にコンデンサ６１０を過充電するように命令する。次にＣＰ６３０は、選択されたコンデンサに基づいて電荷を放電するために適切なブリード回路６８０を選択することができる。次に、ＨＶスイッチ６１５が“オン”となってサンプル６２０に電気パルスを供給しうる。
【００６０】
エレクトロポレーションシステムの幾つかでは、選択されたコンデンサの別のセットが充電される前に、コンデンサの電圧が非常に低いレベルまで減少する。電圧が低下するためのこの時間は、特に、単一プレートの多くのバンクに多くの電気パルスを配信する必要がある場合に、かなり大きくなる。このために、２個の電気パルス間の時間を減少させるために、エレクトロポレーションシステムにおいて、電荷減衰回路が設けられている。例えば、矩形波または指数状の短パルスの後で、コンデンサに残った電荷を減衰させることができる。
【００６１】
図７は、本発明の一実施形態に係る、電荷減衰回路７９０を有するエレクトロポレーションシステム７００を示す。電荷減衰回路７９０は同様に放電回路としても動作し、コンデンサ７１０上の電荷を非常に迅速な方法で低下させる。一実施形態では、電荷減衰回路７９０は、制御プロセッサによってトリガされる抵抗に取り付けられた、例えば、シリコン制御整流器（ＳＣＲ）あるいは絶縁ゲートバイポーラトランジスタ（ＩＧＢＴ）のようなスイッチ素子を含んでいる。
【００６２】
充電回路７０５がコンデンサ７１０を充電しさらに電気パルスが配信された後、依然としてコンデンサ７１０は所望の値より高い電圧を有している場合がある。この所望の電圧はゼロ（グランド）、ほぼゼロ、あるいは単に、次の電気パルスのために設定した電圧に近い低電圧である。このようにして、１個の電気パルスが配信された後、電荷減衰回路７９０がコンデンサ７１０上の電荷を除去する。
【００６３】
ある実施形態では、スマート（コンピュータによる）減衰を実施することができる。この場合、コンデンサ７１０は、再充電される前に、電荷が低いレベルである必要はない。同様に、電気パルスはコンデンサ７１０上の電圧をゼロに減少させない。スマート減衰では、パルスの終わりの時点でのコンデンサ上の電荷が利用される。次の電圧がコンデンサ上の現在の電圧よりも低い場合、減衰回路は、電圧を所望の値あるいはそれに近い値にするために充分な電荷のみを減衰させる。その後、ＨＶスイッチ７１５が“オフ”となって、次の電気パルスをサンプル７２０に供給する。コンデンサ７１０の現在の電圧がＣＰ７３０によってモニタされていることに注意する必要がある。例えば、次のチャンネルは、２００Ｖの矩形波の後で５０Ｖであり得る。
【００６４】
一形態では、減衰回路７９０は電圧を正しい値より僅かに低い値まで減少させ、その後過充電およびブリードによってその電圧を所望の値に至らせる。一実施形態では、所望の電圧が以前の電圧より大きい場合、減衰は必要とされない。
【００６５】
一実施形態では、ブリード回路６８０と電荷減衰回路７９０は同じ回路セットである。他の実施形態では、異なる回路が使用される。どちらの場合も、異なる静電容量および／または電圧に対して、異なる電荷減衰回路を使用することができる。更に、実施すべき電圧低下が非常に大きい場合、１個以上のより多い減衰回路を使用することができる。例えば、１個の電荷減衰回路を使用して電圧を第１の大きさだけ減少させるが、しかし、所望の電圧を通り過ぎないようにするために、所望の電圧に到達するための最後の電圧量を減少させるために第２の電荷減衰回路を使用することができる。その他の実施形態では、パルス変調抵抗の抵抗値は、電圧における減少を制御するために変更することが可能である。
【００６６】
本発明を一例によってかつ具体的な実施形態として記載したが、本発明は開示された実施形態に限定されるものでないことを理解すべきである。反対に、上述の記載に加えて、当業者にとって明らかな種々の修正および変形をカバーすることを意図する。従って、請求の範囲に記載した範囲がこのような修正および変更を網羅するものであることを理解すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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