(57)【要約】  一般式（Ｉ）または（ＩＩ）（式中、Ｒ１およびＲ２がそれぞれ、アルキレン基、置換アルキレン基、芳香族基またはポリエーテル基等である）で表されるチオール修飾高分子誘導体、ならびにジスルフィド結合架橋材料およびチオール反応性架橋剤で架橋された材料を開示する。Ｒ１およびＲ２は、同一または異なる化学構造を有し、Ｐは、側鎖カルボキシル基を有する高分子の残基である。チオール修飾高分子誘導体は、分子量１０００〜５，０００，０００を有する。本発明の一般式（Ｉ）または（ＩＩ）で表されるチオール修飾高分子誘導体は、フレキシブルな化学構造の側鎖および調節可能な特性を有し、かつ穏やかな反応条件、高い製造歩留まり、高い修飾度、および制御可能な修飾度等の多くの利点を有する。本発明のチオール修飾高分子誘導体から製造される架橋材料は、細胞の付着を防ぐため使用することができ、かつ細胞増殖の基質として使用することができる。
2010512433.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）または（ＩＩ）で表される、分子量が１０００〜５，０００，０００であるチオール修飾高分子誘導体。
【化１】
2010512433.tif 000018
（式中、Ｒ１およびＲ２は、アルキレン基、置換アルキレン基、アリーレン基、ポリエーテル主鎖等でありうり；Ｐは、側鎖カルボキシル基を有する高分子の残基である）
【請求項２】
側鎖カルボキシル基を有する前記高分子は、多糖、タンパク質または合成高分子である、請求項１に記載のチオール修飾高分子誘導体。
【請求項３】
前記多糖は、コンドロイチン硫酸、デルマタン、ヘパリン、ヘパラン、アルギン酸、ヒアルロン酸、デルマタン硫酸、ペクチン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルキトサンまたはその塩である、請求項２に記載のチオール修飾高分子誘導体。
【請求項４】
前記合成高分子は、ポリアクリル酸、ポリアスパラギン酸、ポリ酒石酸、ポリグルタミン酸、ポリフマル酸またはその塩である、請求項２に記載のチオール修飾高分子誘導体。
【請求項５】
前記タンパク質は、コラーゲンタンパク質、アルカリ性ゼラチン、酸性ゼラチン、アルカリ性遺伝子組換えゼラチン、酸性遺伝子組換えゼラチン、エラスチン、デコリン、ラミニンまたはフィブロネクチンである、請求項２に記載のチオール修飾高分子誘導体。
【請求項６】
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ、アルキレン基である、請求項１に記載のチオール修飾高分子誘導体。
【請求項７】
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ、炭素数１〜８のアルキレン基である、請求項６に記載のチオール修飾高分子誘導体。
【請求項８】
請求項１から７に記載の１種または複数種のチオール修飾高分子誘導体で構成される、ジスルフィド結合架橋高分子材料。
【請求項９】
請求項１から７に記載の１種または複数種のチオール修飾高分子誘導体で構成され、かつ少なくとも２つの同一または異なるチオール反応性官能基を有する架橋剤によって架橋された、架橋高分子材料。
【請求項１０】
前記架橋剤は、チオール反応性官能基を有する２アーム、３アームおよびそれ以上のアームのＰＥＧ誘導体を含み、かつ前記ＰＥＧ誘導体は、分子量１００〜１，０００，０００を有する、請求項９に記載の架橋高分子材料。
【請求項１１】
前記チオール反応性官能基は、マレイミド、ビニルスルホン、α，β不飽和アクリル酸エステル、α，β不飽和メタクリル酸エステル、ハロゲン化プロピオン酸エステル、ハロゲン化プロピオンアミド、ジピリジルジスルフィド、またはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである、請求項１０に記載の架橋高分子材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化合物、特にチオール修飾高分子誘導体に関する。さらに、本発明は、チオール修飾高分子誘導体で構成される、ジスルフィド結合およびチオール反応性架橋剤で架橋された材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
チオール修飾高分子誘導体は、様々な架橋高分子材料等を製造するために様々な小分子薬物およびポリペプチド／タンパク質薬物を化学活性修飾するなど、生物医学において多くの重要な用途を有する。これらの新規な材料は、細胞増殖基質、創傷修復および再生基質、薬物送達担体、創傷被覆材、ｉｎ ｓｉｔｕでの細胞カプセル化基質等として使用することができる。これらは生物医学において重要な役割を担う。しかしながらこれまで、数種類のチオール修飾高分子誘導体しか報告されておらず、用途について見込みがあるのはＳｈｕらによって報告されているチオール修飾高分子誘導体だけである（非特許文献１）。この種類のチオール修飾高分子誘導体は下記の構造を有する。
【化１】
2010512433.tif 000003
（式中、Ｐは高分子の残基である）
【０００３】
しかしながら、これらのチオール修飾高分子誘導体の側鎖構造および特性は、単一であり、生物医学における様々な要求を十分に満たすことができない。さらに、これらのチオール修飾高分子誘導体の側鎖は非常に短いため、化学修飾後に更に架橋した場合、そのチオールと他の化学官能基とが衝突する確率が制限され、化学反応性が低下することがある。そのため、側鎖調節可能な分子構造および調節可能な化学的性質を有するチオール修飾高分子誘導体を製造することは極めて重要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２００４／０３７１６号パンフレット
【特許文献２】中国特許出願第２００６１０１１８７１５．２号明細書
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Shu et al., Biomacromolecules, 3, 1304, 2002
【非特許文献２】Shu et al., Biomaterials 24, 3825, 2003
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明が解決する技術的課題の１つは、調節可能な側鎖分子構造および化学的性質を有し、かつ重要な生物医学的用途を有する新規なチオール修飾高分子誘導体類を提供することである。
【０００７】
本発明の第２の技術的課題は、チオール修飾高分子誘導体で構成される、ある種類のジスルフィド結合架橋材料を提供することである。
【０００８】
本発明の第３の技術的課題は、チオール修飾高分子誘導体で構成され、かつチオール反応性架橋剤により架橋された、ある種類の架橋材料を提供することである。
【０００９】
本発明において、側鎖カルボキシル基を有する高分子が出発原料として使用され、かつ新規なチオール修飾高分子誘導体は化学修飾によって合成される。この種類の誘導体は、調節可能な側鎖分子構造および化学的性質を有し、生物医学において重要な用途を有する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明のチオール修飾高分子誘導体は、下記一般式（Ｉ）または（ＩＩ）で表される。
【化２】
2010512433.tif 000004
【００１１】
式中、Ｒ１およびＲ２は、アルキレン基、置換アルキレン基、アリーレン基、ポリエーテル主鎖等でありうり；Ｒ１およびＲ２は同一または異なる化学構造を有することができ；チオール修飾高分子誘導体の分子量は１０００〜５０００，０００である。
【００１２】
上記のＰは、側鎖カルボキシル基を有する高分子の残基であり、側鎖の少なくとも１つのカルボキシル基はチオールで修飾される。側鎖カルボキシル基を有する高分子としては、多糖、タンパク質、合成高分子等が挙げられる。ここで、多糖としては、コンドロイチン硫酸、デルマタン、ヘパリン、ヘパラン、アルギン酸、ヒアルロン酸、デルマタン硫酸、ペクチン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルキトサン等およびその塩が挙げられ；合成高分子としては、ポリアクリル酸、ポリアスパラギン酸、ポリ酒石酸、ポリグルタミン酸、ポリフマル酸等およびその塩が挙げられ；タンパク質としては、コラーゲンタンパク質、アルカリ性ゼラチン、酸性ゼラチン、アルカリ性遺伝子組換えゼラチン、酸性遺伝子組換えゼラチン、エラスチン、ゼラチン、ラミニン、フィブロネクチン等が挙げられる。側鎖カルボキシル基を有する好ましい高分子としては、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、ヘパラン、アルギン酸、ヒアルロン酸、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸およびその塩（ナトリウム塩、カリウム塩等）、アルカリ性ゼラチン、酸性ゼラチン、アルカリ性遺伝子組換えゼラチン、酸性遺伝子組換えゼラチンが挙げられる。ここで、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、ヒアルロン酸およびその塩（ナトリウム塩、カリウム塩等）およびアルカリ性ゼラチン、酸性ゼラチンが特に好ましい。
【００１３】
上記のアルキレン基は、−（ＣＨ２）ｎ−（ｎは１〜１５の整数である）を意味し、好ましいｎは１〜８の整数である。
【００１４】
上記の置換アルキレン基は、その少なくとも１つの水素原子が、低級アルキル、ヒドロキシル基、アミノ、アルコキシル、フェニル、およびエステル基等によって置換されている、アルキレン基を意味する。
【００１５】
上記のアリーレン基は、フェニレン基、ナフチレン基等を意味し、好ましくはフェニレン基を意味する。
【００１６】
上記のポリエーテル主鎖は、−［（ＣＨＲ）ｎＯ］ｍ−（Ｒは低級アルキルであり、ｎは１〜１０の整数であり、ｍは１〜５００の整数である）の基を意味する。好ましいＲは、水素原子であると同時に、ｎは２、３または４である。
【００１７】
上記の低級アルキルは、炭素数１〜８の直鎖または分枝鎖アルキル基、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ｓ−ブチル、アミル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル等を意味する。炭素数１〜４の直鎖または分枝鎖アルキル、特にメチル、エチルおよびプロピルが好ましい。
【００１８】
上記のアルコキシルは、炭素数１〜６の直鎖または分枝鎖アルコキシル基、例えばメトキシル、エトキシル、プロポキシル、イソ−プロポキシル、ブトキシル、イソブトキシル、ｔ−ブトキシル、ｓ−ブトキシル、ペントキシル、ネオペントキシル、ヘキソキシル（hexoxyl）等を意味する。炭素数１〜４の直鎖または分枝鎖アルコキシル基、特にメトキシルおよびエトキシルが好ましい。
【００１９】
上記のエステル基は、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ（Ｒは上記の低級アルキルである）を意味し、好ましくはメトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニルおよびブトキシカルボニルを意味する。
【００２０】
本発明の好ましい化合物は、Ｒ１およびＲ２がそれぞれアルキレン基である化合物である。最も好ましい化合物は、そのＲ１およびＲ２がそれぞれ、炭素数１〜８のアルキレン基である化合物である。
【００２１】
例えば、Ｐがヒアルロン酸の残基である場合には、本発明におけるチオール修飾高分子誘導体は、以下の化学構造の特徴を有する。
【化３】
2010512433.tif 000005
【００２２】
式中、Ｒ１およびＲ２は前記の定義と同様であり；ｉは０を超える整数であり；ｊは０以上の整数である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の実施例４における低置換度の誘導体の水素核磁気共鳴スペクトルおよび主要な化学シフトのピーク配置を示す図である（Ｄ２Ｏを溶媒として使用）。
【図２】本発明の実施例４における高置換度の誘導体の水素核磁気共鳴スペクトルおよび主要な化学シフトのピーク配置を示す図である（Ｄ２Ｏを溶媒として使用）。
【図３】本発明の実施例２０におけるブランクの細胞培養プレートの表面で培養された細胞の形態学的写真である。
【図４】本発明の実施例２０におけるＰＥＧ−ビス−アクリル酸エステルにより架橋されたヒアルロン酸−ゼラチンヒドロゲルの表面で培養された細胞の形態学的写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明の一般式（Ｉ）または（ＩＩ）で表されるチオール修飾高分子誘導体は通常、ヒドラジド／カルボジイミド・カップリング化学法によって製造される。基本原理は以下のとおりである。まず、高分子の側鎖カルボキシル基をカルボジイミドによって活性化して反応性の中間体を形成し、次いでジスルフィド結合を有するジヒドラジドのアミノによってその反応性中間体を求核攻撃して付加物を形成し、最後に、付加物のジスルフィド結合を脱酸素して遊離チオールとし、精製後に生成物を回収する。
【００２５】
本発明の一般式（Ｉ）または（ＩＩ）で表されるチオール修飾高分子誘導体を製造するにあたって、ジスルフィド結合を有する以下の２種類の新規なジヒドラジドを、本出願と同一の出願人による出願に係る発明（特許文献２  発明の名称：Dihydrazide compounds, preparation and uses thereof）に従ってまず合成するべきである。
【化４】
2010512433.tif 000006
【００２６】
式中、Ｒ１およびＲ２は上記のように定義される。ジスルフィド結合、２つのアミド結合および２つのヒドラジド官能基を特徴とする、ジスルフィド結合を有する、これらの２種類の新規なジヒドラジドは、ジスルフィド結合を有する相当するジカルボン酸またはジスルフィド結合を有するジアミンから製造することができる。本発明の一般式（Ｉ）または（ＩＩ）で表されるチオール修飾高分子誘導体を製造するために使用することができる、ジスルフィド結合を有するジヒドラジドの一例の化学構造を以下に示す。
【化５】
2010512433.tif 000007
【００２７】
ここで、化合物（１）は、ジチオジエタンジイルジカルボニルジアミノ二酢酸ジヒドラジド（略称：ＤＧＤＴＰＤＨ）であり；化合物（２）は、ジチオジエタンジイルジカルボニルジアミノジメチル酢酸ジヒドラジド（略称：ＤＡＤＴＰＤＨ）であり；化合物（３）は、ジチオジエタンジイルジカルボニルジアミノジヒドロキシ酢酸ジヒドラジド（略称：ＤＨＡＤＴＰＤＨ）であり；化合物（４）は、ジチオジエタンジイルジカルボニルジアミノジプロピオン酸ジヒドラジド（略称：ＤＰＤＴＰＤＨ）であり；化合物（５）は、ジチオジエタンジイルジカルボニルジアミノジブタン酸ジヒドラジド（略称：ＤＢＤＴＰＤＨ）であり；化合物（６）は、ジチオジプロパンジイルジカルボニルジアミノ二酢酸ジヒドラジド（略称：ＤＧＤＴＢＤＨ）であり；化合物（７）は、ジチオジプロパンジイルジカルボニルジアミノジプロピオン酸ジヒドラジド（略称：ＤＰＤＴＢＤＨ）であり；化合物（８）は、ジチオジエタンジイルジアミノジカルボニル二酢酸ジヒドラジド（略称：ＤＰＣＤＨ）であり；化合物（９）は、ジチオジエタンジイルジアミノジカルボニルジプロピオン酸ジヒドラジド（略称：ＤＳＣＤＨ）であり；化合物（１０）は、ジチオジエタンジイルジアミノジカルボニルジイソブタン酸ジヒドラジド（略称：ＤＭＰＣＤＨ）であり；化合物（１１）は、ジチオジエタンジイルジアミノジカルボニルジブタン酸ジヒドラジド（略称：ＤＧＣＤＨ）であり；化合物（１２）は、ジチオジエタンジイルジアミノジカルボニルジペンタン酸ジヒドラジド（略称：ＤＡＣＤＨ）であり；化合物（１３）は、ジチオジエタンジイルジアミノジカルボニルジヘキサン酸ジヒドラジド（略称：ＤＨＣＤＨ）である。
【００２８】
本発明の一般式（Ｉ）または（ＩＩ）で表されるチオール修飾高分子誘導体を製造する方法は以下のとおりである。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩によって活性化した後、高分子の側鎖カルボキシル基が、ジスルフィド結合を有するジヒドラジドの１つまたは２つのヒドラジド官能基と反応して付加物を形成し；次いで、メルカプタンアルコール、ジチオスレイトール、水素化ホウ素ナトリウムまたは脱酸素剤によって、付加物のジスルフィド結合を還元して遊離チオールとし、最後に、不純物を除去するために透析精製後に、本発明の一般式（Ｉ）または（ＩＩ）で表されるチオール修飾高分子誘導体を回収する。この化学合成経路および化学構造（式中、Ｒ１およびＲ２は、アルキレン基、置換アルキレン基、アリーレン基、ポリエーテル主鎖等でありうる）を以下に示す。
【化６】
2010512433.tif 000008
【００２９】
本発明の一般式（Ｉ）または（ＩＩ）で表される好ましいチオール修飾高分子誘導体は、その式中、Ｒ１およびＲ２がそれぞれアルキレン基である高分子誘導体であり、その化学構造を以下に示す。
【化７】
2010512433.tif 000009
【００３０】
式（１）は、Ｒ１およびＲ２がそれぞれアルキレン基である一般式（Ｉ）または（ＩＩ）で表されるチオール修飾高分子誘導体の一般化学構造を表す。式（２）は、Ｒ１およびＲ２がそれぞれアルキレン基である一般式（Ｉ）または（ＩＩ）で表されるチオール修飾高分子誘導体の一般化学構造を表す（ｉ、ｊ、ｍ、ｎは１を超える整数である）。
【００３１】
本発明の一般式（Ｉ）または（ＩＩ）で表される最も好ましいチオール修飾高分子誘導体は、Ｒ２が炭素数２または３のアルキレン基であり、Ｒ１が炭素数１〜５のアルキレン基であり、Ｐがコンドロイチン硫酸、ヘパリン、ヒアルロン酸およびその塩（ナトリウム塩、カリウム塩）、またはアルカリ性ゼラチン、酸性ゼラチンのうちの１つの残基である、高分子誘導体である。その化学構造を以下に示す。
【化８】
2010512433.tif 000010
ここで、化合物（１）は、ジチオジエタンジイルジカルボニルジアミノ二酢酸ジヒドラジドによって修飾されたチオール修飾高分子誘導体（略称：Ｐ−ＤＧＤＴＰＤＨ）であり；化合物（２）は、ジチオジエタンジイルジカルボニルジアミノジプロピオン酸ジヒドラジドによって修飾されたチオール修飾高分子誘導体（略称：Ｐ−ＤＰＤＴＰＤＨ）であり；化合物（３）は、ジチオジプロパンジイルジカルボニルジアミノ二酢酸ジヒドラジドによって修飾されたチオール修飾高分子誘導体ド（略称：Ｐ−ＤＧＤＴＢＤＨ）であり；化合物（４）は、ジチオジプロパンジイルジカルボニルジアミノジプロピオン酸ジヒドラジドによって修飾されたチオール修飾高分子誘導体（略称：Ｐ−ＤＡＤＴＢＤＨ）であり；化合物（５）は、ジチオジエタンジイルジアミノジカルボニルジプロピオン酸ジヒドラジドによって修飾されたチオール修飾高分子誘導体（略称：Ｐ−ＤＳＣＤＨ）であり；化合物（６）は、ジチオジエタンジイルジアミノジカルボニルジブタン酸ジヒドラジドによって修飾されたチオール修飾高分子誘導体（略称：Ｐ−ＤＧＣＤＨ）であり；化合物（７）は、ジチオジエタンジイルジアミノジカルボニルジペンタン酸ジヒドラジドによって修飾されたチオール修飾高分子誘導体（略称：Ｐ−ＤＡＣＤＨ）であり；化合物（８）は、ジチオジエタンジイルジアミノジカルボニルジヘキサン酸ジヒドラジドによって修飾されたチオールチオール修飾高分子誘導体（略称：Ｐ−ＤＨＣＤＨ）である。
【００３２】
分子量およびその分布は、チオール修飾時に著しく変化しない。一般に、本発明の一般式（Ｉ）または（ＩＩ）で表されるチオール修飾高分子誘導体の分子量およびその分布は、出発原料（側鎖カルボキシル基を有する高分子）とほぼ同じである。種々の出発原料（側鎖カルボキシル基を有する高分子）は、１０００〜５，０００，０００のかなり幅広い分子量を有し、かなり幅広い分子量分布も有する。例えば、一般にゼラチンの分子量分布は広い。出発原料（側鎖カルボキシル基を有する高分子）の分子量および分布は、チオール修飾のプロセスに影響せず、本発明の一般式（Ｉ）または（ＩＩ）で表されるチオール修飾高分子誘導体の製造に影響しない。
【００３３】
本発明の一般式（Ｉ）または（ＩＩ）で表されるチオール修飾高分子誘導体は多くの有利な効果を有する。本発明のチオール修飾にヒドラジド・カップリング法を使用することにより、穏やかな製造条件、高い生産速度、高い修飾度、優れた制御性等の顕著な利点が得られる。非特許文献１および特許文献１においてＳｈｕらにより報告されているチオール修飾高分子誘導体の側鎖と本発明の一般式（Ｉ）または（ＩＩ）で表されるチオール修飾高分子誘導体の側鎖とを比較すると、双方のチオール修飾高分子誘導体がヒドラジド・カップリング法をチオール修飾に使用しているにもかかわらず、本発明の一般式（Ｉ）または（ＩＩ）で表されるチオール修飾高分子誘導体の側鎖は、アミド結合が独創的に導入されているために、よりフレキシブルな化学構造およびより調節可能な特性を有する。関連した研究によって、本発明における一般式（Ｉ）または（ＩＩ）で表されるチオール修飾高分子誘導体は、以下の２つの主要な有利な効果を有することが示されている。
【００３４】
（１）アミド結合を導入することによって、側鎖の長さおよび構造をフレキシブルに調節することができる。側鎖の長さは、チオールの反応性に非常に影響を及ぼす（非特許文献２）。側鎖が長くなると、末端のチオールと他の反応性官能基との衝突の確率が高くなるため、反応性がさらに大幅に向上する。
【００３５】
（２）アミド結合は高求電子性の基である。本発明の化合物の側鎖にアミド結合を導入することによって、末端のチオールのイオン化定数（ｐＫａ）は大いに影響を受けるが、これはアミド結合の結合様式に応じて異なる。本発明の一般式（Ｉ）のチオール修飾高分子誘導体において、側鎖のアミド結合のカルボニルは、末端チオールに近く、それによって、末端チオールのイオン化が強くなる（ｐＫａが減少する）；一方、本発明の一般式（ＩＩ）で表されるチオール修飾高分子誘導体については、側鎖のアミド結合の窒素原子が、末端チオールに近く、それによって、末端チオールのイオン化が弱まる（ｐＫａが高まる）。一般に、Ｓｈｕらによって非特許文献１および特許文献１において発見されている、側鎖のその結合セグメントがアルキレン基（炭素数２または３）であるチオール修飾誘導体と比較すると、本発明の一般式（Ｉ）で表されるチオール修飾高分子誘導体のチオールのイオン化定数（ｐＫａ）は、約０．１〜０．４減少し、本発明の一般式（ＩＩ）で表されるチオール修飾高分子誘導体のチオールのイオン化定数（ｐＫａ）は、約０．２〜０．７高まる。したがって、本発明における一般式（Ｉ）で表されるチオール修飾高分子誘導体の末端チオールは、活性が高く、本発明における一般式（ＩＩ）で表されるチオール修飾高分子誘導体の末端チオールは、安定性が高い。
【００３６】
報告されているチオール修飾誘導体と比較して、本発明の一般式（Ｉ）または（ＩＩ）で表されるチオール修飾高分子誘導体は、かなり多くの特殊な特性を有する。適切な化学構造の化合物が、実際の用途の要求条件に従って選択される。さらに、ヒアルロン酸（ＨＡ）の以下のチオール修飾誘導体が、本発明の一般式（Ｉ）または（ＩＩ）で表されるチオール修飾高分子誘導体の有利な効果を説明するために例として挙げられる。
【化９】
2010512433.tif 000011
【００３７】
上記の化合物は、同一の末端チオールセグメント構造を有する。ここで、化合物（ａ）は、非特許文献１および特許文献１によって報告されている高分子チオール化誘導体であり；化合物（ｂ）は、本発明の一般式（Ｉ）で表されるチオール修飾高分子誘導体であり；化合物（ｃ）は、本発明の一般式（ＩＩ）で表されるチオール修飾高分子誘導体である。チオール修飾高分子誘導体（ｂ）の反応能力は、化合物（ａ）よりもはるかに活性であり、ジスルフィド結合架橋ゲルを形成するその能力が約５０％増加する。チオール修飾高分子誘導体（ｃ）の反応能力は、化合物（ａ）よりもはるかに不活性であり、そのチオールの安定性は、１倍を超えて増加する。
【００３８】
本発明の一般式（Ｉ）または（ＩＩ）で表されるチオール修飾高分子誘導体は、少なくとも１つの側鎖遊離チオールを含有し、適切な条件下で酸化されて、再びジスルフィド結合を形成することができる。酸素、低濃度過酸化水素、ヨウ素、三価鉄イオンおよび他の穏やかな酸化剤によって、遊離チオールがジスルフィド結合を形成することが可能となるため、架橋高分子材料が製造される。ジスルフィド結合の形成は一般に、溶液のｐＨ値に依存し、アルカリ性条件下では、チオールは、高い活性を有する負イオンにイオン化し、空気中の酸素でさえ、ジスルフィド結合の形成を急速に促進することができるが；酸性条件下では、チオールのイオン化は抑制され、反応性が低下し、チオールの安定性が高くなる。本発明の一般式（Ｉ）のチオール修飾高分子誘導体のチオールは、中性条件下または弱い酸化剤の作用下でさえ、活性が高く、ジスルフィド結合架橋材料を形成することができる。しかしながら、本発明の一般式（ＩＩ）のチオール修飾高分子誘導体のチオールは安定性が高く、弱アルカリ性条件下または強い酸化剤の作用下でのみ、ジスルフィド結合架橋材料を迅速に形成する。
【００３９】
本発明のチオール修飾高分子誘導体で構成されるジスルフィド結合架橋材料の製造方法は、簡単かつ信頼性があり、その製品はフレキシブルである。通常の製造方法は以下のとおりである。本発明の一般式（Ｉ）または（ＩＩ）で表されるチオール修飾高分子誘導体の水溶液または混合水溶液を調製し、中性または弱アルカリ性条件下にて室温で空気中の酸素で酸化することによって、ジスルフィド結合架橋材料を製造し；または弱酸性または酸性条件下にて低濃度過酸化水素、三価鉄イオンおよび他のより強い酸化剤で酸化することによって、ジスルフィド結合架橋材料を製造する。本発明の１種または２種類のチオール修飾高分子誘導体で構成されるジスルフィド架橋材料は、下記一般式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）または（Ｖ）で表される。
【化１０】
2010512433.tif 000012
式中、Ｐ１およびＰ２は、上記のように定義される側鎖カルボキシル基を有する高分子の残基であり；Ｒ３およびＲ４は、Ｒ１およびＲ２と同一に定義され；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、同一または異なる化学構造を有しうる。Ｐ１がＰ２と同じである場合、それは一成分架橋材料であり、Ｐ１がＰ２と同じではない場合、それは二成分架橋材料である。
【００４０】
３種類以上の高分子化合物を連結することによるジスルフィド結合の形成によって、その構造が特徴づけられる、本発明の３種類以上のチオール修飾高分子誘導体で構成されるジスルフィド架橋材料は、一般式（Ｉ）または（ＩＩ）で表される３種類以上のチオール修飾高分子誘導体を使用して製造される。
【００４１】
本発明のチオール修飾高分子誘導体で構成され、かつチオール反応性架橋剤によって架橋される架橋材料は、一般式（Ｉ）または（ＩＩ）で表される１種または複数種のチオール修飾高分子誘導体およびチオール反応性架橋剤を使用して製造される。本発明において使用されるチオール反応性官能基としては、マレイミド、ビニルスルホン、α，β不飽和アクリル酸エステル、α，β不飽和メタクリル酸エステル、ハロゲン化プロピオン酸エステル、ハロゲン化プロピオンアミド、ジピリジルジスルフィド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル等が挙げられる。ここで、マレイミド、ビニルスルホン、ヨードプロピオン酸エステル、ヨードプロピオンアミド、ジピリジルジスルフィド等が高いチオール反応性を有する。以下のように、チオールとこれらの官能基との間の化学反応式を説明するために、本発明における一般式（Ｉ）で表されるチオール修飾高分子誘導体が例として挙げられる。式中、Ｒ１およびＲ２は、アルキレン基、置換アルキレン基、アリーレン基、またはポリエーテル主鎖等でありうる。
【化１１】
2010512433.tif 000013
【００４２】
これらの反応は以下の３種類の反応を含む。（１）チオールと活性化不飽和二重結合との付加反応。この種類の反応に使用することができる官能基としては、マレイミド、ビニルスルホン、α，β不飽和アクリル酸エステル、α，β不飽和メタクリル酸エステル等が挙げられる。（２）チオールと活性化アルキルハロゲンとの置換反応。この種類の反応に使用することができる官能基としては、ヨードプロピオン酸エステル、臭素化プロピオン酸エステル、クロロプロピオン酸エステル、ヨードプロピオンアミド、臭素化プロピオンアミド、クロロプロピオンアミド、ジピリジルジスルフィド等が挙げられる。（３）最後の種類は、チオエステル化反応である。この種類の反応に使用することができる官能基としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなど様々なカルボン酸の活性化エステル等が挙げられる。
【００４３】
本発明で使用されるチオール反応性架橋剤は、以下の一般的な化学構造を有する２アーム、３アーム、４アーム、８アーム以上のＰＥＧ誘導体など、少なくとも２つの上記の反応官能基を有するポリエチレングリコール（略称：ＰＥＧ）の誘導体である。
【化１２】
2010512433.tif 000014
【００４４】
式中、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５、Ｇ６、Ｇ７およびＧ８は、上記のチオール反応性官能基、例えばマレイミド、ビニルスルホン、α，β不飽和アクリル酸エステル、α，β不飽和メタクリル酸エステル、ハロゲン化プロピオン酸エステル、ハロゲン化プロピオンアミド、ジピリジルジスルフィド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル等である。それらは、完全に同じ化学構造、または完全に異なる化学構造を有することができ、あるいはそれらの一部は同じ化学構造を有し、その他は異なる化学構造を有する。ＰＥＧは、分子量１００〜１，０００，０００を有する、反復単位ＣＨ２ＣＨ２Ｏからなる鎖セグメントである。
【００４５】
２アームＰＥＧを例として挙げ、本発明で使用される一般的な架橋剤（２アームＰＥＧチオール反応性架橋剤）の化学構造を以下に示す。
【化１３】
2010512433.tif 000015
【００４６】
本発明のチオール修飾高分子誘導体で構成され、かつチオール反応性架橋剤によって架橋される架橋材料を製造するための通常の方法は以下のとおりである：一般式（Ｉ）または（ＩＩ）で表される１種または複数種のチオール修飾高分子誘導体を含有する水溶液または混合水溶液を調製し、上記の溶液のｐＨ値を中性に調節し、次いで上記のチオール反応性架橋剤の水溶液を加え、均一に混合し、室温でしばらく静置しておいた後にゲルが形成し、架橋性材料が形成される。本発明の一般式（Ｉ）で表されるチオール修飾高分子誘導体のチオールは活性が高く、より迅速に架橋剤と反応する。しかしながら、本発明の一般式（ＩＩ）で表されるチオール修飾高分子誘導体のチオールは安定性が高く、よりゆっくりと架橋剤と反応する。
【００４７】
１種または２種類のチオール修飾高分子誘導体で構成され、かつ以下のようにチオール反応性架橋剤により架橋される架橋材料の構造を説明するために、本発明における一般式（Ｉ）で表されるチオール修飾高分子誘導体および上記の２アームＰＥＧチオール反応性架橋剤を例として挙げる。
【化１４】
2010512433.tif 000016
【００４８】
式中、Ｐ１およびＰ２は、上記のように定義される側鎖カルボキシル基を有する高分子の残基であり；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４もまた上記のように定義され；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、同一または異なる化学構造を有しうる。Ｐ１がＰ２と同じである場合、それは一成分架橋材料であり、Ｐ１がＰ２と同じではない場合、それは二成分架橋材料である。チオール修飾高分子誘導体で構成され、かつチオール反応性架橋剤によって架橋される架橋材料は、２種類以上の上記の２アームＰＥＧチオール反応性架橋剤で共架橋することによって製造することもできる。さらに、チオール修飾高分子誘導体で構成され、かつチオール反応性架橋剤によって架橋される架橋材料は、１種または複数種のマルチアームＰＥＧ誘導体架橋剤（３アームＰＥＧ誘導体架橋剤、４アームＰＥＧ誘導体架橋剤、８アームＰＥＧ誘導体架橋剤等）を使用して製造することもできる。一般式（ＩＩ）および（Ｉ）で表されるチオール修飾高分子誘導体で構成され、かつチオール反応性架橋剤によって架橋された架橋材料は、類似の構造を有する。
【００４９】
３種類以上のチオール修飾高分子誘導体で構成され、かつチオール反応性架橋剤によって架橋される架橋材料は、本発明の一般式（Ｉ）または（ＩＩ）で表される３種類以上のチオール修飾高分子誘導体を使用して製造することができる。通常の製造経路は以下のとおりである。最初に、一般式（Ｉ）または（ＩＩ）で表される３種類以上のチオール修飾高分子誘導体の混合溶液を調製し、次いでその溶液のｐＨ値を中性に調節し、１種または複数種の上記のＰＥＧチオール反応性架橋剤を加え、多成分架橋材料が製造される。
【実施例】
【００５０】
以下の実施例は、当業者が本発明をより包括的に理解できるようにすることを目的とするものであり、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００５１】
［実施例１］
ジチオジエタンジイルジカルボニルジアミノ二酢酸ジヒドラジド（略称：ＤＧＤＴＰＤＨ）の合成
１０００ｍｌビーカーに、ジチオジプロピオン酸（米国，Ａｌｄｒｉｃｈ社）１０ｇおよび無水ジメチルホルムアミド５０ｍｌを加え、室温で攪拌下にて溶解し、次いでカルボニルジイミダゾール（米国，Ａｌｄｒｉｃｈ社）１７．０ｇを上記の溶液に添加し、その溶液中で多くのＣＯ２気泡と白色の沈殿物が形成する。反応は、減圧下にて室温で３時間行われる。次いで、グリシンエチルエステル塩酸塩（米国，Ａｌｄｒｉｃｈ社）１４．７ｇを上記の溶液に添加し、１時間攪拌する。その後、エチルエーテル５００ｍｌを添加し、１時間静置し、次いで上層の有機相を注意深くデカンテーションで除去し、アルコール１００ｍｌおよびヒドラジン水和物１０ｍｌを添加し、室温で一晩攪拌する。白色の沈殿生成物を濾過により回収し、無水アルコール２００ｍｌで２回洗浄し、減圧下で乾燥させて、わずかに黄色の固形生成物ＤＧＤＴＰＤＨ約８．５ｇが得られる。収率は約５０％である。
【００５２】
［実施例２］
低置換度のＤＧＤＴＰＤＨにより修飾されたチオール修飾ヒアルロン酸誘導体（ＨＡ−ＤＧＤＴＰＤＨ）の合成
ヒアルロン酸ナトリウム（分子量６２〜１１５万，米国，ＮｏｖａＭａｔｒｉｘ  ＦＭＣ  ＢＩＯＰＯＬＹＭＥＲ社）１ｇを蒸留水２００ｍｌに溶解し、透明な溶液を得る。実施例１で製造されたＤＧＤＴＰＤＨ１．３２ｇを上記の溶液に添加し、攪拌下にて溶解する。０．１ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ溶液を添加することによって、溶液のｐＨを４．７５に調節し、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（米国，Ａｌｄｒｉｃｈ社）０．３６ｇを添加し、マグネティックスターラーで攪拌する。十分な０．１ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ溶液を継続的に添加することによって、溶液のｐＨを４．７５に維持する。溶液の粘度は徐々に高くなり、約１５分でゲルが形成する。ゲルが形成した後、静置しておき、室温で２時間反応を行う。次いで、ジチオスレイトール（米国，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｉｍｉｔｅｄ社）１０ｇおよび少量の０．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ溶液を添加し、攪拌する。ゲルは徐々に溶解し、十分な０．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ溶液を継続的に添加することによって、溶液のｐＨを８．５に維持する。ゲルが溶解した後、マグネティックスターラーで攪拌しながら、室温で２４時間反応を行う。ｐＨが約３．０になるまで、十分な６ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ溶液を添加する。上記の溶液を透析チューブ（カットオフ分子量３５００，米国，Ｓｉｇｍａ社）に入れる。０．００１ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌおよび０．３ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含有する水１０Ｌ中で５日間透析を行い、透析液を８時間ごとに交換する。次いで、０．００１ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ溶液１０Ｌ中でさらに３日間透析を行い、透析液を８時間ごとに交換する。最後に、透析チューブ中の溶液を回収し、凍結乾燥させて、白色の綿状固形物約０．７ｇが得られる。
【００５３】
［実施例３］
高置換度のＤＧＤＴＰＤＨにより修飾されたチオール修飾ヒアルロン酸誘導体（ＨＡ−ＤＧＤＴＰＤＨ）の合成
ヒアルロン酸ナトリウム（分子量６２〜１１５万，米国，ＮｏｖａＭａｔｒｉｘ  ＦＭＣ  ＢＩＯＰＯＬＹＭＥＲ社）１ｇを蒸留水２００ｍｌに溶解し、透明な溶液を得る。実施例１で製造されたＤＧＤＴＰＤＨ２．６４ｇを上記の溶液に添加し、攪拌下にて溶解する。次いで、０．１ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ溶液を添加することによって、溶液のｐＨを４．７５に調節し、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（米国，Ａｌｄｒｉｃｈ社）０．９６ｇを添加し、マグネティックスターラーで攪拌する。十分な０．１ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ溶液を継続的に添加することによって、溶液のｐＨを４．７５に維持する。溶液の粘度は徐々に高くなり、約１０分でゲルとなる。ゲルが形成した後、静置しておき、室温で２時間反応を行う。次いで、ジチオスレイトール（米国，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｉｍｉｔｅｄ社）１０ｇおよび少量の０．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ溶液を添加し、攪拌する。ゲルは徐々に溶解し、十分な０．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ溶液を継続的に添加することによって、溶液のｐＨを８．５に維持する。すべてのゲルが溶解した後、マグネティックスターラーで攪拌しながら、室温で２４時間反応を行う。ｐＨが約３．０になるまで、十分な６ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ溶液を添加する。上記の溶液を透析チューブ（カットオフ分子量３５００，米国，Ｓｉｇｍａ社）に入れる。０．００１ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌおよび０．３ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含有する水１０Ｌ中で５日間透析を行い、透析液を８時間ごとに交換する。次いで、０．００１ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ溶液１０Ｌ中でさらに３日間透析を行い、透析液を８時間ごとに交換する。最後に、透析チューブ中の溶液を回収し、凍結乾燥させて、白色の綿状固形物約０．７ｇが得られる。
【００５４】
［実施例４］
ＤＧＤＴＰＤＨにより修飾されたチオール修飾ヒアルロン酸誘導体（ＨＡ−ＤＧＤＴＰＤＨ）の特性解析
ＨＡ−ＤＧＤＴＰＤＨの化学構造は以下のとおりである。
【化１５】
2010512433.tif 000017
【００５５】
実施例２および３で製造されたＨＡ−ＤＧＤＴＰＤＨの特性解析は以下の通りである。
１．ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ，移動相として純水を使用し、波長２１０ｎｍの紫外線で吸収を測定）したところ、小分子不純物のピークは検出されず、実施例２で製造した低置換度のＨＡ−ＤＧＤＴＰＤＨおよび実施例３で製造した高置換度のＨＡ−ＤＧＤＴＰＤＨは高度に精製されており、測定装置によって不純物を検出することができないことが示される。
【００５６】
２．水素核磁気共鳴（１Ｈ−ＮＭＲ，溶媒としてＤ２Ｏを使用）を用いた検出。
スペクトルおよび化学シフトピークの配置を図１および図２に示す。ＣＨ＊２ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ、ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ＊２ＣＨ２ＳＨ、ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ＊２ＳＨの側鎖における３つのメチレンの水素吸収に相当する、ＨＡ−ＤＧＤＴＰＤＨの新たな３つの吸収ピークがδ３．９６、２．７０、２．５６ｐｐｍで現れる。その化学シフトが約δ２．８ｐｐｍである小さな吸収ピークは、副反応の少量の生成物を表す。
【００５７】
ヒアルロン酸のアセチルにおけるメチルの固有吸収ピークを内標準とし、吸収ピークの面積に基づいて、実施例２において低く（２７％）、実施例３において高い（５９％）、ＨＡ−ＤＧＤＴＰＤＨの置換度を確認する。
【００５８】
３．分子量およびその分布の測定（ＧＰＣで測定。単分散ヒアルロン酸を用いて標準曲線を調節）
実施例２で製造された低置換度のＨＡ−ＤＧＤＴＰＤＨに関しては、重量平均分子量（Ｍｗ）は１，０２０，０００であり、数平均分子量（Ｍｎ）は５３０，０００であり、分子量分布は１．９２である；実施例３で製造された高置換度のＨＡ−ＤＧＤＴＰＤＨに関しては、重量平均分子量（Ｍｗ）は１，２３０，０００であり、数平均分子量（Ｍｎ）は５８０，０００であり、分子量分布は２．１２である。
【００５９】
４．実施例２および実施例３で製造された活性チオールの含有量は、非特許文献１で報告されている改良エルマン（Ellman）法を用いて測定される。実施例２で製造された低置換度のＨＡ−ＤＧＤＴＰＤＨの側鎖における活性チオールの含有量は、ヒアルロン酸における二糖の繰り返し単位１００個当たりチオール基２５．４個である。実施例３で製造された高置換度のＨＡ−ＤＧＤＴＰＤＨの側鎖における活性チオールの含有量は、ヒアルロン酸における二糖の繰り返し単位１００個当たりチオール基５５．１個である。この結果は、水素核磁気共鳴を用いて検出されたデータとほぼ一致する。
【００６０】
［実施例５］
ジチオジエタンジイルジカルボニルジアミノジプロピオン酸ジヒドラジド（略称：ＤＰＤＴＰＤＨ）の合成
１０００ｍｌビーカーに、ジチオジプロピオン酸（米国，Ａｌｄｒｉｃｈ社）１０ｇおよび無水ジメチルホルムアミド５０ｍｌを加え、室温で攪拌下にて溶解し、次いで、カルボニルジイミダゾール（米国，Ａｌｄｒｉｃｈ社）１７．０ｇを上記の溶液に添加し、その溶液中で多くのＣＯ２気泡と白色の沈殿物が形成される。反応を減圧下にて室温で３時間行う。次いで、アミノプロピオン酸エチルエステル塩酸塩（米国，Ａｌｄｒｉｃｈ社）１４．７ｇを上記の溶液に添加し、１時間攪拌する。エチルエーテル５００ｍｌを添加した後、１時間静置し、次いで上層の有機相を注意深くデカンテーションで除去する。アルコール１００ｍｌおよびヒドラジン水和物１０ｍｌを添加し、室温で一晩攪拌する。白色の沈殿生成物を濾過により回収し、無水アルコール２００ｍｌで２回洗浄し、減圧下で乾燥させて、わずかに黄色の固形生成物ＤＰＤＴＰＤＨ約７．３ｇが得られる。収率は約４０％である。
【００６１】
［実施例６］
ＤＰＤＴＰＤＨにより修飾されたチオール修飾ヒアルロン酸誘導体（ＨＡ−ＤＰＤＴＰＤＨ）の合成および特性解析
ヒアルロン酸ナトリウム（分子量６２〜１１５万，米国，ＮｏｖａＭａｔｒｉｘ  ＦＭＣ  ＢＩＯＰＯＬＹＭＥＲ社）１ｇを蒸留水２００ｍｌに溶解し、透明な溶液を得る。実施例５で製造されたＤＰＤＴＰＤＨ１．４３ｇを上記の溶液に添加し、攪拌下にて溶解する。次いで、０．１ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ溶液を添加することによって、溶液のｐＨを４．７５に調節し、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（米国，Ａｌｄｒｉｃｈ社）０．４８ｇを添加し、マグネティックスターラーで攪拌する。十分な０．１ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ溶液を継続的に添加することによって、溶液のｐＨを４．７５に維持する。溶液の粘度は徐々に高くなり、約１５分でゲルが形成する。ゲルが形成した後、静置しておき、室温で２時間反応を行う。次いで、ジチオスレイトール（米国，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｉｍｉｔｅｄ社）１２ｇおよび少量の０．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ溶液を添加し、攪拌する。ゲルは徐々に溶解し、十分な０．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ溶液を継続的に添加することによって、溶液のｐＨを８．５に維持する。すべてのゲルが溶解した後、マグネティックスターラーで攪拌しながら室温で２４時間反応を行う。次いで、ｐＨが約３．０になるまで、十分な６ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ溶液を添加する。上記の溶液を透析チューブ（カットオフ分子量３５００，米国，Ｓｉｇｍａ社）に入れる。０．００１ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌおよび０．３ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含有する水１０Ｌ中で５日間透析を行い、透析液を８時間ごとに交換する。次いで、０．００１ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ溶液１０Ｌ中でさらに３日間透析を行い、透析液を８時間ごとに交換する。最後に、透析チューブ中の溶液を回収し、凍結乾燥させて、白色の綿状固形物約０．７ｇが得られる。
【００６２】
ＧＰＣ（移動相として純水を使用。波長２１０ｎｍの紫外線における吸収を測定）を行ったところ、小分子不純物のピークは検出されず、合成されたＨＡ−ＤＰＤＴＰＤＨは高度に精製されており、測定装置によって不純物を検出することができないことが示される。
【００６３】
水素核磁気共鳴（１Ｈ−ＮＭＲ，溶媒としてＤ２Ｏを使用）を用いた検出
ＣＨ２ＣＨ＊２ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２ＳＨおよびＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ＊２ＳＨの側鎖における２つのメチレンの水素吸収に相当する、ＨＡ−ＤＰＤＴＰＤＨの新たな２つの吸収ピークがδ３．４、２．６６ｐｐｍで現れる。ＣＨ＊２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２ＳＨの側鎖におけるメチレンの水素吸収ピークに、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ＊２ＣＨ２ＳＨの側鎖におけるメチレンの水素吸収ピークがδ２．５ｐｐｍで重なる。その化学シフトが約δ２．８ｐｐｍである小さな吸収ピークは、副反応の少量の生成物を表す。
【００６４】
ヒアルロン酸のアセチルにおけるメチルの固有吸収ピークを内標準とし、吸収ピークの面積に基づいて、合成されたＨＡ−ＤＰＤＴＰＤＨにおける側鎖の置換度は６１％であることを確認する。
【００６５】
分子量およびその分布の測定（ＧＰＣで測定。単分散ヒアルロン酸を用いて標準曲線を調節）
重量平均分子量（Ｍｗ）は１，２２０，０００であり、数平均分子量（Ｍｎ）は６７０，０００であり、分子量分布は１．８２である。
【００６６】
非特許文献１に報告されている改良エルマン法を用いて測定したＨＡ−ＤＰＤＴＰＤＨの活性チオールの含有量は、ヒアルロン酸における二糖の繰り返し単位１００個当たりチオール基５３．６個である。この結果は、水素核磁気共鳴を用いて検出された結果よりもわずかに低い。
【００６７】
［実施例７］
ジチオジエタンジイルジアミノジカルボニルジプロピオン酸ジヒドラジド（略称：ＤＳＣＤＨ）の合成
シスタミン二塩酸塩（米国，Ａｌｄｒｉｃｈ社）１００ｇを蒸留水１５００ｍｌに溶解し、透明な溶液を得る。ｐＨが１０になるまで十分な４ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ溶液を添加する。次いで、マグネティックスターラーで攪拌しながら無水コハク酸（米国，Ａｌｄｒｉｃｈ社）１３３ｇを添加し、同時に、十分な４ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨを継続的に添加することによって、溶液のｐＨを７〜１０に維持する。室温で２時間反応させた後、６ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌを溶液に添加し、白色の沈殿生成物を濾過により回収し、２０００ｍｌ蒸留水で２回洗浄し、減圧下にて乾燥させて、白色の固形生成物ジチオジエタンジイルジアミノジカルボニルジプロピオン酸（略称：ＤＳＣ）約１５０ｇが得られる。収率は９０％を超える。
【００６８】
２５００ｍｌ三つ口丸底フラスコに、ＤＳＣ１００ｇ、無水アルコール１２００ｍｌ、濃硫酸１００滴を加える。窒素雰囲気下にて２時間還流した後、減圧下で溶液を体積２００ｍｌ未満に濃縮する。次いで、残った溶液を２５００ｍｌ滴下漏斗に移し、酢酸エチル６００ｍｌを添加する。次いで、水５００ｍｌで有機相を３回洗浄し、水相を除去し、減圧下で有機相を蒸留して、白色のラード状固形生成物ジチオジエタンジイルジアミノジカルボニルジプロピオン酸ジエチルエステル（略称：ＤＳＣＤＥ）約９３ｇが得られる。収率は８０％を超える。
【００６９】
１５０ｍｌビーカーに、ＤＳＣＤＥ１０ｇおよびアルコール８０ｍｌを加え、攪拌下で溶解し、次いでヒドラジン水和物（米国，Ａｌｄｒｉｃｈ社）１０ｍｌを添加する。一晩反応させた後、白色沈殿生成物を濾過により回収し、アルコール４０ｍｌで４回洗浄する。有機溶媒を換気フード内で室温にて蒸発させ、次いで減圧下で生成物を乾燥させて、白色の固形ＤＳＣＤＨ約８ｇが得られる。収率は７５％を超える。
【００７０】
［実施例８］
ＤＳＣＤＨにより修飾されたチオール修飾ヒアルロン酸誘導体（ＨＡ−ＤＳＣＤＨ）の合成および特性解析
ヒアルロン酸ナトリウム（分子量６２〜１１５万，米国，ＮｏｖａＭａｔｒｉｘ  ＦＭＣ  ＢＩＯＰＯＬＹＭＥＲ社）１ｇを蒸留水２００ｍｌに溶解し、透明な溶液を得る。実施例７で製造されたＤＳＣＤＨ０．９５ｇを上記の溶液に添加し、攪拌下にて溶解する。次いで、０．１ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ溶液を添加することによって、溶液のｐＨを４．７５に調節し、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（米国，Ａｌｄｒｉｃｈ社）０．２８８ｇを添加し、マグネティックスターラーで攪拌する。十分な０．１ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ溶液を継続的に添加することによって、溶液のｐＨを４．７５に維持する。溶液の粘度は徐々に高くなり、約１０分でゲルが形成する。ゲルが形成した後、静置しておき、室温で２時間反応を行う。次いで、ジチオスレイトール（米国，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｉｍｉｔｅｄ社）１０ｇおよび少量の０．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ溶液を添加し、攪拌する。ゲルは徐々に溶解し、同時に、十分な０．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ溶液を継続的に添加することによって、溶液のｐＨを８．５に維持する。すべてのゲルが溶解した後、マグネティックスターラーで攪拌しながら、室温で２４時間反応を行う。次いで、ｐＨが約３．０になるまで、十分な６ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ溶液を添加する。上記の溶液を透析チューブ（カットオフ分子量３５００，米国，Ｓｉｇｍａ社）に入れる。０．００１ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌおよび０．３ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含有する水１０Ｌ中で５日間透析を行い、透析液を８時間ごとに交換する。次いで、０．００１ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ溶液１０Ｌ中でさらに３日間透析を行い、透析液を８時間ごとに交換する。最後に、透析チューブ中の溶液を回収し、凍結乾燥させて、白色の綿状固形物約０．７ｇが得られる。
【００７１】
ＧＰＣ（移動相として純水を使用。波長２１０ｎｍの紫外線における吸収を測定）を行ったところ、小分子不純物のピークは検出されず、合成されたＨＡ−ＤＳＣＤＨは高度に精製されており、測定装置によって不純物を検出することができないことが示される。
【００７２】
水素核磁気共鳴（１Ｈ−ＮＭＲ，溶媒としてＤ２Ｏを使用）を用いた検出
ＨＡ−ＤＳＣＤＨの新たな２つの吸収ピークがδ３．２６、２．５ｐｐｍで現れる。ここで、δ３．２６のピークは、ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ＊２ＣＨ２ＳＨの側鎖におけるメチレンの水素吸収に相当する。ＣＨ＊２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＳＨ、ＣＨ２ＣＨ＊２Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＳＨおよびＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２ＣＨ＊２ＳＨの側鎖におけるメチレンの水素吸収の３つのピークがδ２．５ｐｐｍで重なる。
【００７３】
ヒアルロン酸のアセチルにおけるメチルの固有吸収ピークを内標準とし、吸収ピークの面積に基づいて、合成されたＨＡ−ＤＳＣＤＨにおける側鎖の置換度は３８％であることを確認する。
【００７４】
非特許文献１に報告されている改良エルマン法を用いて測定されたＨＡ−ＤＳＣＤＨの活性チオールの含有量は、ヒアルロン酸における二糖の繰り返し復単位１００個当たりチオール基３９．１個である。この結果は、水素核磁気共鳴を用いて検出されたデータとほぼ一致する。
【００７５】
［実施例９］
ＤＳＣＤＨにより修飾されたチオール修飾コンドロイチン硫酸誘導体（ＣＳ−ＤＳＣＤＨ）の合成および特性解析
コンドロイチン硫酸（Ｃ型，サメ軟骨由来，米国，Ｓｉｇｍａ社）１ｇを蒸留水１００ｍｌに溶解し、透明な溶液を得る。実施例７で製造されたＤＳＣＤＨ０．７０４ｇを上記の溶液に添加し、攪拌下で溶解する。次いで、０．１ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ溶液を添加することによって、溶液のｐＨを４．７５に調節し、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（米国，Ａｌｄｒｉｃｈ社）０．１９２ｇを添加し、マグネティックスターラーで攪拌する。十分な０．１ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ溶液を継続的に添加することによって、溶液のｐＨを４．７５に維持し、マグネティックスターラーで攪拌しながら、室温で２時間反応を行う。次いで、ジチオスレイトール（米国，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｉｍｉｔｅｄ社）１０ｇおよび少量の０．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ溶液を添加し、攪拌する。ゲルは徐々に溶解し、同時に十分な０．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ溶液を継続的に添加することによって、溶液のｐＨを８．５に維持する。すべてのゲルが溶解した後、マグネティックスターラーで攪拌しながら、室温で２４時間反応を行う。次いで、ｐＨが約３．０になるまで、十分な６ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ溶液を添加する。上記の溶液を透析チューブ（カットオフ分子量３５００，米国，Ｓｉｇｍａ社）に入れる。０．００１ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌおよび０．３ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含有する水１０Ｌ中で５日間透析を行い、透析液を８時間ごとに交換する。次いで、０．００１ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ溶液１０Ｌ中でさらに３日間透析を行い、透析液を８時間ごとに交換する。最後に、透析チューブ中の溶液を回収し、凍結乾燥させて、白色の綿状固形物約０．６ｇが得られる。
【００７６】
ＧＰＣ（移動相として純水を使用。波長２１０ｎｍの紫外線における吸収を測定）を行ったところ、小分子不純物のピークは検出されず、合成されたＣＳ−ＤＳＣＤＨは高度に精製されており、測定装置によって不純物を検出することができないことが示される。
【００７７】
水素核磁気共鳴（１Ｈ−ＮＭＲ，溶媒としてＤ２Ｏを使用）を用いた検出
ＣＳ−ＤＳＣＤＨの新たな２つの吸収ピークがδ３．２７、２．５４ｐｐｍで現れる。ここで、δ３．２７のピークは、ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ＊２ＣＨ２ＳＨの側鎖におけるメチレンの水素吸収に相当する。ＣＨ＊２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＳＨ、ＣＨ２ＣＨ＊２Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＳＨおよびＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２ＣＨ＊２ＳＨの側鎖におけるメチレンの水素吸収の３つのピークがδ２．５４ｐｐｍで重なる。
【００７８】
ヒアルロン酸のアセチルにおけるメチルの固有吸収ピークを内標準とし、吸収ピークの面積に基づいて、合成されたＣＳ−ＤＳＣＤＨにおける側鎖の置換度は４７％であることを確認する。
【００７９】
分子量およびその分布の測定（ＧＰＣで測定。単分散ヒアルロン酸を使用して標準曲線を調節）
重量平均分子量（Ｍｗ）は３８，０００であり、数平均分子量（Ｍｎ）は１７，０００であり、分子量分布は２．２３である。
【００８０】
非特許文献１に報告されている改良エルマン法を用いて測定されたＣＳ−ＤＳＣＤＨの活性チオールの含有量は、ヒアルロン酸における二糖の繰り返し単位１００個当たりチオール基４４．２個である。この結果は、水素核磁気共鳴を用いて検出された結果よりもわずかに低い。
【００８１】
［実施例１０］
ＤＳＣＤＨにより修飾されたチオール修飾ゼラチン誘導体（ＧＥＬ−ＤＳＣＤＨ）の合成および特性解析
ゼラチン（Ｂ型，ブタの皮膚由来，米国，Ｓｉｇｍａ社）１ｇを蒸留水１００ｍｌに溶解し、透明な溶液を得る。実施例７で製造されたＤＳＣＤＨ０．７５ｇを上記の溶液に添加し、攪拌下で溶解する。次いで、０．１ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ溶液を添加することによって、溶液のｐＨを４．７５に調節し、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（米国，Ａｌｄｒｉｃｈ社）１ｇを添加し、マグネティックスターラーで攪拌する。十分な０．１ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ溶液を継続的に添加することによって、溶液のｐＨを４．７５に維持する。溶液の粘度は徐々に高くなり、約１０分でゲルとなる。室温で２時間反応を行う。次いで、ジチオスレイトール（米国，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｉｍｉｔｅｄ社）１０ｇおよび少量の０．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ溶液を添加し、攪拌する。ゲルは徐々に溶解し、同時に十分な０．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ溶液を継続的に添加することによって、溶液のｐＨを８．５に維持する。すべてのゲルが溶解した後、マグネティックスターラーで攪拌しながら、室温で２４時間反応を行う。次いで、ｐＨが約３．０になるまで、十分な６ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ溶液を添加する。上記の溶液を透析チューブ（カットオフ分子量３５００，米国，Ｓｉｇｍａ社）に入れる。０．００１ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌおよび０．３ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含有する水１０Ｌ中で５日間透析を行い、透析液を８時間ごとに交換する。次いで、０．００１ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ溶液１０Ｌ中でさらに３日間透析を行い、透析液を８時間ごとに交換する。最後に、透析チューブ中の溶液を回収し、凍結乾燥させて、白色の綿状固形物約０．６ｇが得られる。
【００８２】
ＧＰＣ（移動相として純水を使用。波長２１０ｎｍの紫外線における吸収を測定）を行ったところ、小分子不純物のピークは検出されず、合成されたＧＥＬ−ＤＳＣＤＨは高度に精製されており、測定装置によって不純物を検出することができないことが示される。
【００８３】
水素核磁気共鳴（１Ｈ−ＮＭＲ，溶媒としてＤ２Ｏを使用）を用いた検出
ＧＥＬ−ＤＳＣＤＨの新たな２つの吸収ピークがδ３．２７、２．５４ｐｐｍで現れる。ここで、δ３．２８のピークは、ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ＊２ＣＨ２ＳＨの側鎖におけるメチレンの水素吸収に相当する。ＣＨ＊２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＳＨ、ＣＨ２ＣＨ＊２Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＳＨおよびＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２ＣＨ＊２ＳＨの側鎖におけるメチレンの水素吸収の３つのピークがδ２．５３ｐｐｍで重なる。
【００８４】
分子量およびその分布の測定（ＧＰＣで測定。単分散ヒアルロン酸を使用して標準曲線を調節）：重量平均分子量（Ｍｗ）は５６，０００であり、数平均分子量（Ｍｎ）は２１，０００であり、分子量分布は２．６７である。
【００８５】
非特許文献１に報告されている改良エルマン法を用いて測定されたＧＥＬ−ＤＳＣＤＨの活性チオールの含有量は、ＧＥＬ−ＤＳＣＤＨ１ｇ当たりチオール基０．５７ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００８６】
［実施例１１］
ジチオジエタンジイルジアミノジカルボニルジブタン酸ジヒドラジド（略称：ＤＧＣＤＨ）の合成
シスタミン二塩酸塩（米国，Ａｌｄｒｉｃｈ社）１００ｇを蒸留水１５００ｍｌに溶解し、透明な溶液を得る。ｐＨが１０になるまで十分な４ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ溶液を添加する。次いで、マグネティックスターラーで攪拌しながら、グルタル酸無水物（米国，Ａｌｄｒｉｃｈ社）１５２ｇを添加し、同時に十分な４ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨを継続的に添加することによって、溶液のｐＨを７〜１０に維持する。室温で２時間反応させた後、６ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌを溶液に添加し、白色の沈殿生成物を濾過により回収し、２０００ｍｌ蒸留水で２回洗浄し、次いで減圧下にて乾燥させて、白色の固形生成物ジチオジエタンジイルジアミノジカルボニルジブタン酸（略称：ＤＧＣ）約１５５ｇが得られる。収率は９０％を超える。
【００８７】
２５００ｍｌ三つ口丸底フラスコに、ＤＧＣ１００ｇ、無水アルコール１２００ｍｌ、濃硫酸１００滴を加える。窒素雰囲気下にて２時間還流した後、減圧下で溶液を体積２００ｍｌ未満に濃縮する。次いで、残った溶液を２５００ｍｌ滴下漏斗に移し、酢酸エチル６００ｍｌを添加する。次いで、水５００ｍｌで有機相を３回洗浄し、減圧下で有機相を蒸留して、白色のラード状固形生成物ジチオジエタンジイルジアミノジカルボニルジブタン酸ジエチルエステル（略称：ＤＧＣＤＥ）約９４ｇが得られる。収率は８０％を超える。
【００８８】
１５０ｍｌビーカーに、ＤＧＣＤＥ１０ｇおよびアルコール８０ｍｌを加え、攪拌下で室温で溶解し、次いでヒドラジン水和物（米国，Ａｌｄｒｉｃｈ社）１０ｍｌを添加する。一晩反応させた後、白色沈殿物を濾過により回収し、アルコール４０ｍｌで４回洗浄する。有機溶媒を換気フード内で室温にて蒸発させ、次いで減圧下で生成物を乾燥させて、白色の固形ＤＧＣＤＨ約７．１ｇが得られる。収率は７５％を超える。
【００８９】
［実施例１２］
ＤＧＣＤＨにより修飾されたチオール修飾ヒアルロン酸誘導体（ＨＡ−ＤＧＣＤＨ）の合成および特性解析
ヒアルロン酸ナトリウム（分子量６２〜１１５万，米国，ＮｏｖａＭａｔｒｉｘ  ＦＭＣ  ＢＩＯＰＯＬＹＭＥＲ社）１ｇを蒸留水２００ｍｌに溶解し、透明な溶液を得る。実施例１１で製造されたＤＳＣＤＨ１．５３ｇを上記の溶液に添加し、攪拌下で溶解する。次いで、０．１ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ溶液を添加することによって、溶液のｐＨを４．７５に調節し、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（米国，Ａｌｄｒｉｃｈ社）０．４８ｇを添加し、マグネティックスターラーで攪拌する。十分な０．１ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ溶液を継続的に添加することによって、溶液のｐＨを４．７５に維持する。溶液の粘度は徐々に高くなり、約１０分でゲルが形成する。ゲルが形成した後、静置し、室温で２時間反応を行う。次いで、ジチオスレイトール（米国，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｉｍｉｔｅｄ社）１０ｇおよび少量の０．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ溶液を添加し、攪拌する。ゲルは徐々に溶解し、同時に、十分な０．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ溶液を継続的に添加することによって、溶液のｐＨを８．５に維持する。すべてのゲルが溶解した後、マグネティックスターラーで攪拌しながら、室温で２４時間反応を行う。次いで、ｐＨが約３．０になるまで、十分な６ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ溶液を添加する。上記の溶液を透析チューブ（カットオフ分子量３５００，米国，Ｓｉｇｍａ社）に入れる。０．００１ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌおよび０．３ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含有する水１０Ｌ中で５日間透析を行い、透析液を８時間ごとに交換する。次いで、０．００１ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ溶液１０Ｌ中でさらに３日間透析を行い、透析液を８時間ごとに交換する。最後に、透析チューブ中の溶液を回収し、凍結乾燥させて、白色の綿状固形物約０．７ｇが得られる。
【００９０】
ＧＰＣ（移動相として純水を使用。波長２１０ｎｍの紫外線における吸収を測定）を行ったところ、小分子不純物のピークは検出されず、合成されたＨＡ−ＤＧＣＤＨは高度に精製されており、測定装置によって不純物を検出することができないことが示される。
【００９１】
水素核磁気共鳴（１Ｈ−ＮＭＲ，溶媒としてＤ２Ｏを使用）を用いた検出。ＨＡ−ＤＳＣＤＨの新たな２つの吸収ピークがδ３．２３、２．５６、２．３ｐｐｍで現れる。ここで、δ３．２３、２．５６ｐｐｍのピークは、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ＊２ＣＨ２ＳＨおよびＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２Ｃ＊Ｈ２ＳＨの側鎖におけるメチレンの水素吸収に相当する。ＣＨ＊２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＳＨおよびＣＨ２ＣＨ２ＣＨ＊２Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＳＨの側鎖におけるメチレンの水素吸収の２つのピークがδ２．３ｐｐｍで重なる。ＣＨ２ＣＨ＊２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＳＨの側鎖におけるメチレンの水素吸収のピークは、ヒアルロン酸のアセチルにおけるメチルの固有吸収ピークとδ３．２３ｐｐｍで重なる。
【００９２】
ヒアルロン酸のアセチルにおけるメチルの固有吸収ピークを内標準とし、吸収ピークの面積に基づいて、合成されたＨＡ−ＤＧＣＤＨにおける側鎖の置換度は５２％であることを確認する。
【００９３】
非特許文献１に報告されている改良エルマン法を用いて測定されたＨＡ−ＤＧＣＤＨの活性チオールの含有量は、ヒアルロン酸における二糖の繰り返し単位１００個当たりチオール基４９．４個である。この結果は、水素核磁気共鳴を用いて検出されたデータとほぼ一致する。
【００９４】
［実施例１３］
一成分ジスルフィド結合架橋ヒドロゲルの製造
１．ヒアルロン酸のジスルフィド結合架橋ヒドロゲルの製造
本発明の実施例３で製造されたチオール修飾ヒアルロン酸誘導体（ＨＡ−ＤＧＤＴＰＤＨ）０．１ｇを０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍｌに溶解し、透明な溶液を得る。溶液のｐＨが７．４になるまで、十分な０．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨを上記の溶液に添加する。次いで、その溶液を２５ｍｌガラスビーカーに移し、室温で１２時間静置する。溶液の粘度が徐々に高くなり、ゲルが形成する。
【００９５】
２．ゼラチンのジスルフィド結合架橋ヒドロゲルの製造
本発明の実施例１０で製造されたチオール修飾ゼラチン誘導体（ＧＥＬ−ＤＳＣＤＨ）０．３ｇを０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍｌに溶解し、透明な溶液を得る。溶液のｐＨが７．４になるまで、十分な０．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨを上記の溶液に添加する。次いで、その溶液を２５ｍｌガラスビーカーに移し、室温で１２時間静置する。溶液の粘度が徐々に高くなり、ゲルが形成する。
【００９６】
［実施例１４］
多成分ジスルフィド結合架橋ヒドロゲルの製造
１．ヒアルロン酸−ゼラチンの二成分ジスルフィド結合架橋ヒドロゲルの製造
本発明の実施例３で製造されたチオール修飾ヒアルロン酸誘導体（ＨＡ−ＤＧＤＴＰＤＨ）０．１ｇを０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍｌに溶解し、透明な溶液を得る。溶液のｐＨが７．４になるまで、十分な０．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨを上記の溶液に添加する。本発明の実施例１０で製造されたチオール修飾ゼラチン誘導体（ＧＥＬ−ＤＳＣＤＨ）０．３ｇを０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍｌに溶解し、透明な溶液を得る。溶液のｐＨが７．４になるまで、十分な０．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨを上記の溶液に添加する。上記の２種類の溶液を共に５０ｍＬガラスビーカーに移し、１０分間マグネティックスターラーで攪拌し、室温で１２時間静置する。溶液の粘度が徐々に高くなり、ゲルが形成する。
【００９７】
２．コンドロイチン硫酸−ゼラチンの二成分ジスルフィド結合架橋ヒドロゲルの製造
本発明の実施例９で製造されたチオール修飾コンドロイチン硫酸誘導体（ＣＳ−ＤＳＣＤＨ）０．３ｇを０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍｌに溶解し、透明な溶液を得る。溶液のｐＨが７．４になるまで、十分な０．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨを上記の溶液に添加する。本発明の実施例１０で製造されたチオール修飾ゼラチン誘導体（ＧＥＬ−ＤＳＣＤＨ）０．３ｇを０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍｌに溶解し、透明な溶液を得る。溶液のｐＨが７．４になるまで、十分な０．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨを上記の溶液に添加する。次いで、上記の２種類の溶液を共に５０ｍＬガラスビーカーに注ぎ、１０分間マグネティックスターラーで攪拌し、室温で１２時間静置する。溶液の粘度が徐々に高くなり、ゲルが形成する。
【００９８】
３．ヒアルロン酸−コンドロイチン硫酸−ゼラチンの三成分ジスルフィド結合架橋ヒドロゲルの製造
本発明の実施例３で製造されたチオール修飾ヒアルロン酸誘導体（ＨＡ−ＤＧＤＴＰＤＨ）０．１ｇを０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍｌに溶解し、透明な溶液を得る。溶液のｐＨが７．４になるまで、十分な０．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨを上記の溶液に添加する。実施例９で製造されたチオール修飾コンドロイチン硫酸誘導体（ＣＳ−ＤＳＣＤＨ）０．３ｇを０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍｌに溶解し、透明な溶液を得る。溶液のｐＨが７．４になるまで、十分な０．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨを上記の溶液に添加する。本発明の実施例１０で製造されたチオール修飾ゼラチン（ＧＥＬ−ＤＳＣＤＨ）０．３ｇを０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍｌに溶解し、透明な溶液を得る。溶液のｐＨが７．４になるまで、十分な０．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨを上記の溶液に添加する。次いで、上記の３種類の溶液を共に５０ｍＬガラスビーカーに移し、１０分間マグネティックスターラーで攪拌し、室温で１２時間静置する。溶液の粘度が徐々に高くなり、ゲルが形成する。
【００９９】
［実施例１５］
一成分ポリエチレングリコール−ビス−ビニルスルホン架橋ヒドロゲルの製造
１．ヒアルロン酸のＰＥＧ−ビス−ビニルスルホン架橋ヒドロゲルの製造
本発明の実施例３において製造されたチオール修飾ヒアルロン酸誘導体（ＨＡ−ＤＧＤＴＰＤＨ）０．１ｇを０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍｌに溶解し、透明な溶液を得る。溶液のｐＨが７．４になるまで、十分な０．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨを上記の溶液に添加する。ＰＥＧ−ビス−ビニルスルホン（分子量３４００，米国，Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社）０．１ｇを０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２．５ｍｌに溶解し、透明な溶液を得る。次いで、上記のＰＥＧ−ビス−ビニルスルホン溶液２．５ｍｌを上記のＨＡ−ＤＧＤＴＰＤＨ溶液１０ｍｌに添加し、即座に３０秒間マグネティックスターラーで攪拌し、室温で３０分間静置する。溶液の粘度が徐々に高くなり、ゲルが形成する。
【０１００】
２．コンドロイチン硫酸のＰＥＧ−ビス−ビニルスルホン架橋ヒドロゲルの製造
本発明の実施例９において製造されたチオール修飾コンドロイチン硫酸誘導体（ＣＳ−ＤＳＣＤＨ）０．３ｇを０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍｌに溶解し、透明な溶液を得る。溶液のｐＨが７．４になるまで、十分な０．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨを上記の溶液に添加する。ＰＥＧ−ビス−ビニルスルホン（分子量３４００，米国，Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社）０．１ｇを０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２．５ｍｌに溶解し、透明な溶液を得る。次いで、上記のＰＥＧ−ビス−ビニルスルホン溶液２．５ｍｌを上記のＣＳ−ＤＳＣＤＨ溶液１０ｍｌに添加し、即座に３０秒間マグネティックスターラーで攪拌し、室温で３０分間静置する。溶液の粘度が徐々に高くなり、ゲルが形成する。
【０１０１】
３．ゼラチンのＰＥＧ−ビス−ビニルスルホン架橋ヒドロゲルの製造
本発明の実施例１０において製造されたチオール修飾ゼラチン誘導体（ＧＥＬ−ＤＳＣＤＨ）０．３ｇを０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍｌに溶解し、透明な溶液を得る。溶液のｐＨが７．４になるまで、十分な０．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨを上記の溶液に添加する。ＰＥＧ−ビス−ビニルスルホン（分子量３４００，米国，Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社）０．１ｇを０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２．５ｍｌに溶解し、透明な溶液を得る。次いで、上記のＰＥＧ−ビス−ビニルスルホン溶液２．５ｍｌを上記のＧＥＬ−ＤＳＣＤＨ溶液１０ｍｌに添加し、即座に３０秒間マグネティックスターラーで攪拌し、室温で３０分間静置する。溶液の粘度が徐々に高くなり、ゲルが形成する。
【０１０２】
［実施例１６］
多成分ＰＥＧ−ビス−アクリル酸エステル架橋ヒドロゲルの製造
１．ヒアルロン酸−ゼラチンの二成分ＰＥＧ−ビス−アクリル酸エステル架橋ヒドロゲルの製造
本発明の実施例３において製造されたチオール修飾ヒアルロン酸誘導体（ＨＡ−ＤＧＤＴＰＤＨ）０．１ｇを０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍｌに溶解し、透明な溶液を得る。溶液のｐＨが７．４になるまで、十分な０．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨを上記の溶液に添加する。本発明の実施例１０において製造されたチオール修飾ゼラチン誘導体（ＧＥＬ−ＤＳＣＤＨ）０．３ｇを０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍｌに溶解し、透明な溶液を得る。溶液のｐＨが７．４になるまで、十分な０．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨを上記の溶液に添加する。ＰＥＧ−ビス−アクリル酸エステル（分子量３４００，米国，Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社）０．２ｇを０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍｌに溶解し、透明な溶液を得る。次いで、上記のＨＡ−ＤＧＤＴＰＤＨ溶液１０ｍｌ、ＧＥＬ−ＤＳＣＤＨ溶液１０ｍｌおよびＰＥＧ−ビス−アクリル酸エステル溶液５ｍｌを共に５０ｍｌガラスビーカーに注ぎ、即座に３０秒間マグネティックスターラーで攪拌し、室温で３０分間静置する。溶液の粘度は徐々に高くなり、ゲルが形成する。
【０１０３】
２．コンドロイチン硫酸−ゼラチンの二成分ＰＥＧ−ビス−アクリル酸エステル架橋ヒドロゲルの製造
本発明の実施例９において製造されたチオール修飾コンドロイチン硫酸誘導体（ＣＳ−ＤＳＣＤＨ）０．３ｇを０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍｌに溶解し、透明な溶液を得る。溶液のｐＨが７．４になるまで、十分な０．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨを上記の溶液に添加する。本発明の実施例１０において製造されたチオール修飾ゼラチン誘導体（ＧＥＬ−ＤＳＣＤＨ）０．３ｇを０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍｌに溶解し、透明な溶液を得る。溶液のｐＨが７．４になるまで、十分な０．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨを上記の溶液に添加する。ＰＥＧ−ビス−アクリル酸エステル（分子量３４００，米国，Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社）０．２ｇを０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍｌに溶解し、透明な溶液を得る。次いで、上記のＣＳ−ＤＳＣＤＨ溶液１０ｍｌ、ＧＥＬ−ＤＳＣＤＨ溶液１０ｍｌおよびＰＥＧ−ビス−アクリル酸エステル溶液５ｍｌを共に５０ｍｌガラスビーカーに移し、即座に３０秒間マグネティックスターラーで攪拌し、室温で３０分間静置する。溶液の粘度は徐々に高くなり、ゲルが形成する。
【０１０４】
３．ヒアルロン酸−コンドロイチン硫酸−ゼラチンの三成分ＰＥＧ−ビス−アクリル酸エステル架橋ヒドロゲルの製造
本発明の実施例３において製造されたチオール修飾ヒアルロン酸誘導体（ＨＡ−ＤＧＤＴＰＤＨ）０．１ｇを０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍｌに溶解し、透明な溶液を得る。溶液のｐＨが７．４になるまで、十分な０．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨを上記の溶液に添加する。本発明の実施例９において製造されたチオール修飾コンドロイチン硫酸誘導体（ＣＳ−ＤＳＣＤＨ）０．３ｇを０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍｌに溶解し、透明な溶液を得る。溶液のｐＨが７．４になるまで、十分な０．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨを上記の溶液に添加する。本発明の実施例１０において製造されたチオール修飾ゼラチン誘導体（ＧＥＬ−ＤＳＣＤＨ）０．３ｇを０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍｌに溶解し、透明な溶液を得る。溶液のｐＨが７．４になるまで、十分な０．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨを上記の溶液に添加する。ＰＥＧ−ビス−アクリル酸エステル（分子量３４００，米国，Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社）０．３ｇを０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）７．５ｍｌに溶解し、透明な溶液を得る。次いで、上記のＨＡ−ＤＧＤＴＰＤＨ１０ｍｌ、ＣＳ−ＤＳＣＤＨ溶液１０ｍｌ、ＧＥＬ−ＤＳＣＤＨ溶液１０ｍｌおよびＰＥＧ−ビス−アクリル酸エステル溶液７．５ｍｌを共に５０ｍｌガラスビーカーに移し、即座に３０秒間マグネティックスターラーで攪拌し、室温で３０分間静置する。溶液の粘度は徐々に高くなり、ゲルが形成する。
【０１０５】
［実施例１７］
ヒアルロン酸のジスルフィド結合架橋ヒドロゲルを使用した細胞付着の防止
実施例１３に従って、１ｍｌ／ウェルで標準２４ウェル細胞培養プレートにおいて、ヒアルロン酸のジスルフィド結合架橋ヒドロゲルを製造する。１２時間後、７５％アルコール溶液に２時間浸すことによって、細胞培養プレート全体を滅菌する。次いで、細胞培養プレートを通常の滅菌生理食塩水で３回浸漬洗浄する。細胞培地（ＤＭＥＭ，１０％ウシ血清）１ｍｌおよびＮＩＨ ３Ｔ３線維芽細胞２０，０００個を各ウェルに播種する。ＣＯ２細胞インキュベータ内にて３７℃で細胞培養プレートを２４時間インキュベートする。線維芽細胞の絶対的大部分が、ヒアルロン酸のジスルフィド結合架橋ヒドロゲルの表面に浮遊しており、細胞は付着および分散できないことが、顕微鏡によって観察される。しかしながら、細胞培養プレートのブランクのウェルにおいて、線維芽細胞は底に付着し、紡錘状である。この結果から、ヒアルロン酸のジスルフィド結合架橋ヒドロゲルは細胞の付着を防ぐことができ、かつ手術後の付着の予防および処置に使用することができることが示される。
【０１０６】
［実施例１８］
細胞付着および細胞増殖の基質とした、ヒアルロン酸−ゼラチンのジスルフィド結合架橋二成分ヒドロゲルの使用
実施例１４に従って、１ｍｌ／ウェルで標準２４ウェル細胞培養プレートにおいて、ヒアルロン酸−ゼラチンのジスルフィド結合架橋二成分ヒドロゲルを製造する。１２時間後、７５％アルコール溶液に２時間浸すことによって、細胞培養プレート全体を滅菌する。次いで、細胞培養プレートを通常の滅菌生理食塩水で３回浸漬洗浄する。細胞培地（ＤＭＥＭ，１０％ウシ血清）１ｍｌおよびＮＩＨ ３Ｔ３線維芽細胞２０，０００個を各ウェルに播種する。ＣＯ２細胞インキュベータ内にて３７℃で細胞培養プレートを２４時間インキュベートする。ヒアルロン酸−ゼラチンのジスルフィド結合架橋二成分ヒドロゲル表面の細胞の付着および分散は、ブランクの細胞培養プレートと同様であり、細胞は紡錘状である顕微鏡によって観察される。この結果から、ヒアルロン酸−ゼラチンのジスルフィド結合架橋二成分ヒドロゲルは、細胞付着および細胞増殖の優れた基質であることが示される。
【０１０７】
［実施例１９］
ヒアルロン酸のＰＥＧ−ビス−ビニルスルホン架橋ヒドロゲルを使用した細胞付着の防止
実施例１５に従って、１ｍｌ／ウェルで標準２４ウェル細胞培養プレートにおいて、ヒアルロン酸−ゼラチンのＰＥＧ−ビス−ビニルスルホン架橋ヒドロゲルを製造する。１２時間後、７５％アルコール溶液に２時間浸すことによって、細胞培養プレート全体を滅菌する。次いで、細胞培養プレートを通常の滅菌生理食塩水で３回浸漬洗浄する。細胞培地（ＤＭＥＭ，１０％ウシ血清）１ｍｌおよびＮＩＨ ３Ｔ３線維芽細胞２０，０００個を各ウェルに播種する。ＣＯ２細胞インキュベータ内にて３７℃で細胞培養プレートを２４時間インキュベートする。線維芽細胞の絶対的大部分が、ヒアルロン酸のＰＥＧ−ビス−ビニルスルホン架橋ヒドロゲルの表面に浮遊しており、細胞は付着および分散できないことが、顕微鏡によって観察される。しかしながら、細胞培養プレートのブランク・ウェルにおいて、線維芽細胞は、底に付着し、紡錘状である。この結果から、ヒアルロン酸のＰＥＧ−ビス−ビニルスルホン架橋ヒドロゲルは細胞の付着を防ぐことができることが示される。
【０１０８】
［実施例２０］
細胞付着および細胞増殖の基質とした、ヒアルロン酸−ゼラチンの二成分ＰＥＧ−ビス−アクリル酸エステル架橋ヒドロゲルの使用
実施例１６に従って、１ｍｌ／ウェルで標準２４ウェル細胞培養プレートにおいて、ヒアルロン酸−ゼラチンの二成分ＰＥＧ−ビス−アクリル酸エステル架橋ヒドロゲルを製造する。１２時間後、７５％アルコール溶液に２時間浸すことによって、細胞培養プレート全体を滅菌する。次いで、細胞培養プレートを通常の滅菌生理食塩水で３回浸漬洗浄する。細胞培地（ＤＭＥＭ，１０％ウシ血清）１ｍｌおよびＮＩＨ ３Ｔ３線維芽細胞２０，０００個を各ウェルに播種する。ＣＯ２細胞インキュベータ内にて３７℃で細胞培養プレートを２４時間インキュベートする。ヒアルロン酸−ゼラチンの二成分ＰＥＧ−ビス−アクリル酸エステル架橋ヒドロゲル表面の細胞の付着および分散は、ブランクの細胞培養プレートと同様であり、細胞は紡錘状であることが顕微鏡によって観察される。この結果から、ヒアルロン酸ゼラチンの二成分ポリエチレン−グリコール−ビス−アクリル酸エステル架橋ヒドロゲルは、細胞付着および細胞増殖の優れた基質であることが示される。
【産業上の利用可能性】
【０１０９】
本発明における一般式（Ｉ）または（ＩＩ）で表されるチオール修飾高分子誘導体は、多くの有益な効果を有する。本発明におけるヒドラジド・カップリング法の使用は、穏やかな製造条件、高い生産速度、高い修飾度、優れた制御性等の注目に値する利点を有する。
【０１１０】
多糖で構成されるジスルフィド結合架橋材料、タンパク質で構成されるジスルフィド結合架橋材料、２種類の多糖で構成されるジスルフィド結合架橋材料、２種類のタンパク質で構成されるジスルフィド結合架橋材料、多糖とタンパク質とで構成されるジスルフィド結合架橋材料等の、様々なジスルフィド結合架橋高分子材料を本発明に従って容易に製造することができる。これらのジスルフィド結合架橋材料は、フィルム、スポンジ、ゲルおよび他の形状に製造することができ、細胞の付着を防ぐために、または細胞増殖の基質として使用することができる。
【０１１１】
一般に、チオール反応性架橋剤と、本発明の一般式（Ｉ）または（ＩＩ）で表されるチオール修飾高分子誘導体との架橋プロセスは非常に速く、ゲル化速度は、ジスルフィド結合架橋の５倍を超える速度に向上する。これらの材料は、ｉｎ ｓｉｔｕでの細胞の包埋等の、生物医学における重要な用途を有する。多糖で構成される架橋材料、タンパク質で構成される架橋材料、２種類の多糖で構成される架橋材料、２種類のタンパク質で構成され架橋材料、多糖とタンパク質とで構成される架橋材料等の様々なチオール反応性架橋剤で架橋される高分子材料を本発明に従って容易に製造することができる。チオール反応性架橋剤で架橋されるこれらの高分子材料は、フィルム、スポンジ、ゲルおよび他の形状に製造することができ、細胞の付着を防ぐために、または細胞増殖の基質として使用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年8月11日(2009.8.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８１】
［実施例１０］
ＤＳＣＤＨにより修飾されたチオール修飾ゼラチン誘導体（ＧＥＬ−ＤＳＣＤＨ）の合成および特性解析
ゼラチン（Ｂ型，ブタの皮膚由来，米国，Ｓｉｇｍａ社）１ｇを蒸留水１００ｍｌに溶解し、透明な溶液を得る。実施例７で製造されたＤＳＣＤＨ０．７５ｇを上記の溶液に添加し、攪拌下で溶解する。次いで、０．１ｍｏｌ／Ｌ  ＨＣｌ溶液を添加することによって、溶液のｐＨを４．７５に調節し、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（米国，Ａｌｄｒｉｃｈ社）１ｇを添加し、マグネティックスターラーで攪拌する。十分な０．１ｍｏｌ／Ｌ  ＨＣｌ溶液を継続的に添加することによって、溶液のｐＨを４．７５に維持し、次いで室温で２時間反応を行う。次いで、ジチオスレイトール（米国，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｉｍｉｔｅｄ社）１０ｇおよび少量の０．１ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＯＨ溶液をｐＨ８．５になるまで添加する。次いで、ｐＨが約３．０になるまで、十分な６ｍｏｌ／Ｌ  ＨＣｌ溶液を添加する。上記の溶液を透析チューブ（カットオフ分子量３５００，米国，Ｓｉｇｍａ社）に入れる。０．００１ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌおよび０．３ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含有する水１０Ｌ中で５日間透析を行い、透析液を８時間ごとに交換する。次いで、０．００１ｍｏｌ／Ｌ  ＨＣｌ溶液１０Ｌ中でさらに３日間透析を行い、透析液を８時間ごとに交換する。最後に、透析チューブ中の溶液を回収し、凍結乾燥させて、白色の綿状固形物約０．６ｇが得られる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
水素核磁気共鳴（１Ｈ−ＮＭＲ，溶媒としてＤ２Ｏを使用）を用いた検出
ＧＥＬ−ＤＳＣＤＨの新たな２つの吸収ピークがδ３．２８、２．５３ｐｐｍで現れる。ここで、δ３．２８のピークは、ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ＊２ＣＨ２ＳＨの側鎖におけるメチレンの水素吸収に相当する。ＣＨ＊２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＳＨ、ＣＨ２ＣＨ＊２Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＳＨおよびＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２ＣＨ＊２ＳＨの側鎖におけるメチレンの水素吸収の３つのピークがδ２．５３ｐｐｍで重なる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０８】
［実施例２０］
細胞付着および細胞増殖の基質とした、ヒアルロン酸−ゼラチンの二成分ＰＥＧ−ビス−アクリル酸エステル架橋ヒドロゲルの使用
実施例１６に従って、１ｍｌ／ウェルで標準２４ウェル細胞培養プレートにおいて、ヒアルロン酸−ゼラチンの二成分ＰＥＧ−ビス−アクリル酸エステル架橋ヒドロゲルを製造する。１２時間後、７５％アルコール溶液に２時間浸すことによって、細胞培養プレート全体を滅菌する。次いで、細胞培養プレートを通常の滅菌生理食塩水で３回浸漬洗浄する。細胞培地（ＤＭＥＭ，１０％ウシ血清）１ｍｌおよびＮＩＨ  ３Ｔ３線維芽細胞２０，０００個を各ウェルに播種する。ＣＯ２細胞インキュベータ内にて３７℃で細胞培養プレートを２４時間インキュベートする。ヒアルロン酸−ゼラチンの二成分ＰＥＧ−ビス−アクリル酸エステル架橋ヒドロゲル表面の細胞の付着および分散は、ブランクの細胞培養プレートと同様であり、細胞は紡錘状であることが顕微鏡によって観察される。この結果から、ヒアルロン酸ゼラチンの二成分ＰＥＧ−ビス−アクリル酸エステル架橋ヒドロゲルは、細胞付着および細胞増殖の優れた基質であることが示される。
【国際調査報告】
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