(57)【要約】本発明は、呼吸器系に直接的に抑制性核酸分子を送達することによる全ての型の呼吸器障害、例えば肺障害の治療方法に関する。ｓｉＲＮＡ又はその他の核酸が、疾患の治療のために肺／呼吸器系に送達される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺疾患に罹患している被験者の治療方法であって、被験者の肺内部にエーロゾルの形態で遺伝子の発現を抑制する有効量の裸の修飾ｓｉＲＮＡ化合物を被験者に投与することを包含する方法。
【請求項２】
ｓｉＲＮＡ化合物が23ヌクレオチド長又はそれ未満である請求項１記載の方法。
【請求項３】
化合物が0.1〜10 g／被験者の体重1 kg／日の範囲の用量で投与される請求項１記載の方法。
【請求項４】
遺伝子がＲＴＰ８０１、ｐ５３、ＴＰ５３ＢＰ２、ＬＲＤＤ、ＣＹＢＡ、ＡＴＦ３、ＣＡＳＰ２、ＮＯＸ３、ＨＲＫ、Ｃ１ＱＢＰ、ＢＮＩＰ３、ＭＡＰＫ８、ＭＡＰＫ１４、Ｒａｃ１、ＧＳＫ３Ｂ、Ｐ２ＲＸ７、ＴＲＰＭ２、ＰＡＲＧ、ＣＤ３８、ＳＴＥＡＰ４、ＢＭＰ２、ＧＪＡ１、ＴＹＲＯＢＰ、ＣＴＧＦ、ＳＰＰ１、ＲＴＮ４Ｒ、ＡＮＸＡ２、ＲＨＯＡ  ＤＵＯＸ１、ＮＲＦ２、ＲＥＤＤ２、ＮＯＸ４、ＭＹＣ、ＰＬＫ１、ＥＳＰＬ１、ＫＥＡＰ１、ＳＨＣ１  ＤＵＯＸ１、ＴＹＲＯＢＰ及びＣＴＧＦからなる群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項５】
遺伝子がＲＴＰ８０１、ｐ５３、ＤＵＯＸ１、ＴＹＲＯＢＰ及びＣＴＧＦからなる群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項６】
肺疾患がＣＯＰＤ、肺癌、喘息、嚢胞性線維症、肺気腫、気管支炎、気管支拡張症、間質性肺疾患、肺炎、急性肺損傷及び急性呼吸窮迫症候群からなる群から選択される疾患である請求項１記載の方法。
【請求項７】
エーロゾルが直径約1〜5 μmの平均粒子サイズを有する請求項１記載の方法。
【請求項８】
エーロゾルが直径約4.1〜4.9 μmの平均粒子サイズを有する請求項７記載の方法。
【請求項９】
エーロゾルが直径約4.4〜4.7 μmの平均粒子サイズを有する請求項８記載の方法。
【請求項１０】
エーロゾルが直径約4.5〜4.6 μmの平均粒子サイズを有する請求項９記載の方法。
【請求項１１】
エーロゾルが0.3 mL／分より大きい流速で投与される請求項１記載の方法。
【請求項１２】
エーロゾルが鼻投与により投与される請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
エーロゾルが経口投与により投与される請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
エーロゾルが口鼻投与により投与される請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国特許仮出願60/926559（2007年4月26日提出）（この記載内容はその全体が参照により本明細書中で援用される）の優先権を主張する。
【０００２】
本出願全体を通して、種々の特許及び科学出版物が引用される。全体としてのこれらの出版物に関する開示は、これにより本発明が関する当該分野の状態をさらに詳細に記載するために本出願中で参照により援用される。
【０００３】
本発明は、呼吸器系に直接的に抑制性核酸分子を送達することにより全ての型の呼吸器障害（肺障害を含めて）を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
肺疾患は、広範な症状発現及び病因を包含し、そして考え得る療法の全身投与で処置するのが特に困難であり得る。多数の型の線維症を含めて、肺胞間の組織である間質の150より多くの疾患が同定されている。他の肺疾患としては、ガス交換の障害、血液循環の障害、気道の障害及び胸膜の障害が挙げられる。肺癌は、原発性肺癌、並びに種々の他の器官又は組織の原発性癌からの転移の両方を包含する。肺の感染性疾患は、ウイルス、細菌及び真菌性感染因子を包含する。生物学的利用能を改善しようと及び／又は身体内の特定位置への送達を標的化しようと努力して、医学的に重要な分子、例えば小分子、核酸及び／又はタンパク質又はペプチド組成物を送達するための多数の一般的方法が記載されている。このような方法としては、プロドラッグの使用、リポソーム又は他の粒子中への封入、並びに取込み増強処方物における同時投与が挙げられる（再検討のためには、例えばCritical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, Stephen D. Bruck, ed., CRC Press, 1991参照）。
【０００５】
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）は、1600万人を超える米国人が罹患しており、米国における第四位の死因である。喫煙は衰弱性疾患の大部分の発生を引き起こすが、しかし他の環境因子は排除され得ない（Petty TL. 2003. Clin. Cornerstone, 5-10）。
【０００６】
肺気腫は、ＣＯＰＤの主な症状発現である。終末細気管支に遠位の末梢気腔の永久的破壊は、気腫の特徴である（Tuder RM, et al. Am J Respir Cell Mol Biol. 29: 88-97; 2003）。気腫は、細気管支及び肺胞構造におけるマクロファージ及び好中球のような炎症細胞の蓄積によっても特性化される（Petty, 2003）。
【０００７】
気腫の病因は、複雑で、多因性である。ヒトにおいて、炎症細胞により産生されるプロテアーゼの阻害剤、例えばアルファ１−アンチトリプシンの欠乏は、プロテアーゼ／アンチプロテアーゼ不均衡の一因となり、それにより喫煙（ＣＳ）誘導性気腫における肺胞細胞外マトリックスの破壊を促進することが示されている（Eriksson, S. 1964. Acta Med Scand 175: 197-205. Joos, L., Pare, P.D.及びSandford, A.J. 2002. Swiss Med Wkly 132: 27-37）。ＣＳの長期吸入により引き起こされる気腫に対するマクロファージ・メタロエラスターゼ・ノックアウトマウスの抵抗性により実証されるように、マトリックス・メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）は実験的気腫において中心的役割を演じる（Hautamaki, et al: Science 277: 2002-2004）。さらに、トランスジェニックマウスにおけるインターロイキン−１３の肺過剰発現は、ＭＭＰ−及びカテプシン−依存性気腫を生じる（Zheng, T., et al 2000. J Clin Invest 106: 1081-1093）。近年の研究は、気腫をもたらす肺組織破壊における中隔細胞アポトーシスの関与を記載する（Rangasamy T, et al. J. Clin. Invest. 114(9): 1248-1259 (2004)；Tuder RM et al. Am J Respir Cell Mol Biol, 29: 88-97; 2003；Yokohori N, Aoshiba K, Nagai A, Chest. 2004 Feb;125(2): 626-32；Aoshiba K, Yokohori N, Nagai A., Am J Respir Cell Mol Biol. 2003 May; 28(5): 555-62）。
【０００８】
気腫における肺破壊の両経路の基礎を成すメカニズムの中で、反応性酸素種（ＲＯＳ）の過剰生成は、言及される全てのうちの最初であるべきである。酸化促進剤／酸化防止剤の不均衡は、喫煙者の血液中にそして肺組織中に存在する、ということは十分に確立されている（Hulea SA, et al: J Environ Pathol Toxicol Oncol. 1995; 14(3-4): 173-80; Rahman I, MacNee W. Am J Physiol. 1999 Dec; 277(6 Pt 1): L1067-88;MacNee W. Chest. 2000 May; 117(5 Suppl 1): 303S-17S.; Marwick JA, Kirkham P, Gilmour PS, Donaldson K, MacNEE W, Rahman I. Ann N Y Acad Sci. 2002 Nov; 973: 278-83; Aoshiba K, Koinuma M, Yokohori N, Nagai A. Inhal Toxicol. 2003 Sep; 15(10): 1029-38;Dekhuijzen PN. Eur Respir J. 2004 Apr;23(4): 629-36; Tuder RM, Zhen L, Cho CY, Taraseviciene-Stewart L, Kasahara Y, Salvemini D, Voelkel NF, and Flores SC. Am J Respir Cell Mol Biol, 29: 88-97; 2003）。ＣＳへのマウスの1時間曝露後、特にタイプＩＩの、肺胞上皮細胞における８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシン（８−ＯＨｄＧ）の劇的増大が認められる（上記のInhal Toxicol. 2003 Sep; 15(10): 1029-38参照）。
【０００９】
過剰産生反応性酸素種は、直接ＤＮＡ損傷作用からそしてアポトーシス性シグナル伝達経路の活性化から生じるそれらの細胞毒性に関して知られている（Takahashi A, Masuda A, Sun M, Centonze VE, Herman B. Brain Res Bull. 2004 Feb 15; 62(6): 497-504；Taniyama Y, Griendling KK. Hypertension. 2003 Dec; 42(6): 1075-81. Epub 2003 Oct 27.；Higuchi Y. Biochem Pharmacol. 2003 Oct 15; 66(8): 1527-35；Punj V, Chakrabarty AM. Cell Microbiol. 2003 Apr; 5(4): 225-31；Ueda S, Masutani H, Nakamura H, Tanaka T, Ueno M, Yodoi J. 2002 Jun; 4(3): 405-14）。
【００１０】
ＲＯＳは、それ自体細胞傷害性であるだけでなく、前炎症性刺激であり、レドックス感受性転写因子ＮＦｋＢ及びＡＰ−１の顕著な活性剤である（Rahman I. Curr Drug Targets Inflamm Allergy. 2002 Sep; 1(3): 291-315で再検討）。両転写因子は、順次、前炎症性サイトカイン（Renard P, Raes M. Cell Biol Toxicol. 1999; 15(6): 341-4；Lentsch AB, Ward PA. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 2000; 48(2): 59-63で再検討）及びマトリックス分解プロテイナーゼ（Andela VB, Gordon AH, Zotalis G, Rosier RN, Goater JJ, Lewis GD, Schwarz EM, Puzas JE, O’Keefe RJ. NFkappaB: Clin Orthop. 2003 Oct; (415 Suppl): S75-85；Fleenor DL, Pang IH, Clark AF. Invest Ophthalmol Vis Sci 2003 Aug; 44(8): 3494-501；Ruhul Amin AR, Senga T, Oo ML, Thant AA, Hamaguchi M. Genes Cells 2003 Jun; 8(6): 515-23）の転写の刺激に強く関係する。前炎症性サイトカインは、順次、マトリックス分解酵素、サイトカイン及び反応性酸素種も分泌する炎症細胞の誘因物質として役立つ。したがって、病原性因子、例えばＣＳが、反応性酸素種が肺破壊の主要媒介物質として作用する病理学的網様構造を誘発する、ということは明らかである。
【００１１】
吸引されたタバコの煙からの反応性酸素種（ＲＯＳ）及び炎症細胞により内因的に形成されるものはともに、肺内酸化剤負荷増大の一因となる。
【００１２】
ＣＯＰＤの病因に関する一付加的病原性因子は、気腫性患者の肺におけるＶＥＧＦ及びＶＥＧＦＲＩＩの観察された発現低減である（Yasunori Kasahara, Rubin M. Tuder, Carlyne D. Cool, David A. Lynch, Sonia C. Flores, and Norbert F. Voelkel. Am J Respir Crit Care Med Vol 163. pp 737-744, 2001）。さらに、化学的ＶＥＧＦＲ阻害剤を用いたＶＥＧＦシグナル伝達の抑制は、肺胞内の両方の型の細胞の密接に関係のある構造的／機能的結合の破壊のために、肺胞中隔内皮細胞の、そして次に上皮細胞のアポトーシスをもたらす（Yasunori Kasahara, Rubin M. Tuder, Lamute Tarasevicience-Stewart, Timothy D. Le Cras, Steven Abman, Peter K. Hirth, Johannes Waltenberger, and Norbert F. Voelkel. J. Clin. Invest. 106: 1311-1319 (2000)；Voelkel NF, Cool CD. Eur Respir J Suppl. 2003 Nov; 46: 28s-32s）。
【００１３】
肺癌
肺癌は、肺の組織中に、通常は気道内部の細胞に生じる癌である。2つの主な型は、小細胞肺癌と非小細胞肺癌である。これらの型は、顕微鏡下での細胞の形態学に基づいて診断される。それは、年間300万例までの死亡に関与する世界中の全ての癌のうち、最も致死的である。非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）では、標準治療の結果は、最も限局性の癌を除いて、不十分である。外科手術は、この疾患のための最も潜在的に治効的な療法的選択肢である;放射線療法は、少数の患者において治癒を生じ、そして大半の患者において一時的緩和を提供し得る。アジュバント化学療法は、切除ＮＳＣＬＣを有する患者に付加的利益を提供し得る。進行段階疾患では、化学療法は中央値生存率の適度の改善を提供するが、しかし全体的生存率は不十分である。化学療法は、疾患関連症候における短期改善を生じた。
【００１４】
ｓｉＲＮＡ及びＲＮＡ干渉
本発明は、一般的に、2又はそれより多くの遺伝子の発現を下方制御する化合物に、特に新規な低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に、そして種々の疾患及び医学的症状の治療におけるこれら新規のｓｉＲＮＡの使用に関する。
【００１５】
本発明は、in vivoでの標的遺伝子の発現を抑制するための方法及び組成物を提供する。概して、該方法は、2又はそれより多くの特定ｍＲＮＡに標的され、そして生物学的条件下（細胞内）でそれをハイブリダイズするか又はそれと相互作用する低分子干渉ＲＮＡ（即ち、ｓｉＲＮＡ）、あるいは細胞中でｓｉＲＮＡを産生し得る核酸物質のようなオリゴリボヌクレオチドを、ＲＮＡ干渉メカニズムにより2又はそれより多くの標的遺伝子の発現を下方制御するのに十分な量で投与することを包含する。付加的には、本発明のｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡと競合するか又はその作用を克服する小化合物を探すための化合物スクリーニング系の一部としてin vitroで用いられ得る。
【００１６】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ依存性遺伝子特異的転写後サイレンシングを伴う現象である。最初は、この現象を試験する、そして哺乳類細胞を操作する試みは、実験的には、長いｄｓＲＮＡ分子に応答して活性化される活性非特異的抗ウイルス防御メカニズムにより無効にされた；Gil et al. 2000, Apoptosis, 5: 107-114参照。後に、21ヌクレオチドＲＮＡの合成二重鎖は一般的抗ウイルス防御メカニズムの刺激を伴わずに、哺乳類細胞における遺伝子特異的ＲＮＡｉに介在する、ということが発見された（Elbashir et al. Nature 2001, 411: 494-498及びCaplen et al. Proc Natl Acad Sci 2001, 98: 9742-9747参照）。その結果、短い二本鎖ＲＮＡである低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、遺伝子機能を理解しようとする場合の強力なツールになった。
【００１７】
したがってＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）（Fire et al, 1998, Nature 391, 806）又はミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）（Ambros V. Nature 431: 7006, 350-355 (2004)及びBartel DP. Cell. 2004 Jan 23; 116(2): 281-97）により媒介される哺乳類における配列特異的転写後遺伝子サイレンシングの過程を指す。植物における対応する過程は、特異的転写後遺伝子サイレンシング又はＲＮＡサイレンシングと一般に呼ばれ、そして真菌においてはクエリングとも呼ばれる。ｓｉＲＮＡは、遺伝子／その内因性（細胞性）同等物の発現を下方制御するか又は抑圧する（防止する）二本鎖ＲＮＡ分子である。ＲＮＡ干渉は、特定タンパク質複合体に進入するｄｓＲＮＡ種の能力に基づいており、この場合、それは次に相補的細胞ＲＮＡに標的化され、そして特定的にそれを分解する。したがってＲＮＡ干渉応答は、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＲＮＡの開裂を媒介するＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と一般に呼ばれるｓｉＲＮＡを含有するエンドヌクレアーゼ複合体を特徴づける。標的ＲＮＡの切断は、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖と相補的な領域の中央で起こり得る（Elbashir et al. 2001, Genes Dev., 15, 188）。さらに詳細には、より長いｄｓＲＮＡは、ＩＩＩ型ＲＮアーゼにより短い（17〜29 bp）ｄｓＲＮＡ断片（短い抑制ＲＮＡ  −  「ｓｉＲＮＡ」とも呼ばれる）に消化される（DICER, DROSHA, etc., Bernstein et al., Nature, 2001, v.409, p.363-6；Lee et al., Nature, 2003, 425, p.415-9）。ＲＩＳＣタンパク質複合体は、これらの断片及び相補的ｍＲＮＡを認識する。全体的過程は、標的ｍＲＮＡのエンドヌクレアーゼ切断により完結する（McManus & Sharp, Nature Rev Genet, 2002, v.3, p.737-47；Paddison & Hannon, Curr Opin Mol Ther. 2003 Jun; 5(3): 217-24）。これらの用語及び提案されたメカニズムに関する情報については、Bernstein E., Denli AM. Hannon GJ: 2001. RNA. I; 7(11): 1509-21；Nishikura K.: 2001 Cell. I16; 107(4): 415-8およびＰＣＴ公報WO 01/36646 (Glover等)を参照されたい。
【００１８】
既知の遺伝子に対応するｓｉＲＮＡの選択及び合成は、広範に報告されている；例えばChalk AM, Wahlestedt C, Sonnhammer EL. 2004 Biochem. Biophys. Res. Commun. Jun 18; 319(1): 264-74;Sioud M, Leirdal M., 2004, Methods Mol Biol.; 252: 457-69;Levenkova N, Gu Q, Rux JJ. 2004, I 12; 20(3): 430-2及びUi-Tei K, Naito Y, Takahashi F, Haraguchi T, Ohki-Hamazaki H, Juni A, Ueda R, Saigo K., Nucleic Acids Res. 2004 I9; 32(3): 936-48を参照。Liu Y, Braasch DA, Nulf CJ, Corey DR., Biochemistry, 2004 I 24; 43(7): 1921-7も参照されたい。ＰＣＴ公報WO 2004/015107 (Atugen)及びWO 02/44321 (Tuschl等)も、そして修飾された／より安定なｓｉＲＮＡの産生に関してはChiu YL, Rana TM. RNA 2003 Sep; 9(9): 1034-48並びに特許第5898031号及び第6107094号（Crooke）も参照。
【００１９】
いくつかのグループは、細胞内でｓｉＲＮＡを生成し得るＤＮＡベースのベクターの開発を記載している。該方法は一般的に、効率的にプロセシングして細胞内でｓｉＲＮＡを形成する短いヘアピンＲＮＡの転写を伴う（Paddison et al. PNAS 2002, 99: 1443-1448;Paddison et al. Genes & Dev 2002, 16: 948-958;Sui et al. PNAS 2002, 8: 5515-5520;及びBrummelkamp et al. Science 2002, 296: 550-553）。これらの報告は、多数の内因性及び外因性発現遺伝子を特異的にターゲッティングし得るｓｉＲＮＡを生成する方法を記載する。
【００２０】
ｓｉＲＮＡ療法は、哺乳類及びヒトの両方においてin vivoで有効である、ということをいくつかの研究は明示した。呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）ヌクレオキャプシドＮ遺伝子に対して向けられる特定のｓｉＲＮＡ分子は、鼻内に投与される場合、マウスを治療するのに有効である、ということをBitko等は示している（Bitko et al., Nat. Med. 2005, 11(1): 50-55）。ｓｉＲＮＡの治療的適用の再検討に関しては、例えばBarik (Mol. Med 2005, 83: 764-773)；Chakraborty (Current Drug Targets 2007 8(3): 469-82)及びDykxhoorn等(Gene Therapy 2006, 13, 541-552)を参照されたい。さらに、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）の治療のためにＶＥＧＦＲ１受容体を標的にする短いｓｉＲＮＡ分子を用いた第Ｉ相臨床試験が、ヒト患者において実行されている。試験において、硝子体内（眼内）注射により投与されるこのようなｓｉＲＮＡは、試験された14例の患者において有効で且つ安全であることが見出された（Kaiser, Am J Ophthalmol. 2006, 142(4): 660-8）。
【００２１】
喘息を治療するための低分子量薬、例えばベータ・アンドロゲン作動性アンタゴニストからなる治療用組成物の肺投与が、観察されている。肺で活性であるその他の治療薬は、全身投与され、そして肺吸収を介して標的化されている。呼吸器系への直接送達、任意に口−鼻又は気管送達は、以下の理由のために治療薬の投与のための有望な技法であると考えられ得る：鼻は、多数の微絨毛による上皮表面の被度のために、薬剤吸収に利用可能な大表面積を有し、上皮下層は高度に血管新生され、鼻からの静脈血は全身循環に直接進み、したがって肝臓における初回通過代謝による薬剤の損失を回避し、それが、より低い用量、治療薬血中レベルのより迅速な獲得、薬理学的活性のより迅速な開始、より少ない副作用、高い総血流量／cm3、多孔性内皮基底膜、並びにそれが容易に到達可能であること。
【００２２】
製剤又は薬剤の有効性は、当該標的細胞への効率的送達によっている。エーロゾル送達は非侵襲性であり、高濃度の治療用分子を送達するための可能性を有する。ウイルスベクター、ポリマー、界面活性剤又は賦形剤を用いた肺への核酸のエーロゾル送達が記載されている。McDonald等は、非ヒト霊長類への嚢胞性線維症膜貫通伝導度調節タンパク質（ＣＦＴＲ）をコードするアデノウイルスベクターのエーロゾル送達を記載する（McDonald, et al., Human Gene Therapy 8: 411-422 (1997)）。Canonico等は、ウサギへのエーロゾルによる、組換えヒトアルファ１−アンチトリプシン遺伝子及び陽イオン性リポソームと錯体形成されるサイトメガロウイルスプロモーターを含有するプラスミドのin vivo遺伝子移入を記載する（Canonico, et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 10: 24-29 (1994)）。Stribling等は、陽イオン性リポソーム担体と錯体形成されるクロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼレポーター遺伝子のエーロゾル送達がマウス肺におけるＣＡＴ遺伝子発現を生じ得る、ということを記載する（Stribling, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 11277-11281 (1992)）。Massaro等は、鼻開口部中への液体沈着を介したマウスにおける肺胞への、表面活性物質又はＳＡＭとして既知であるリポタンパク質肺界面活性剤と錯体形成される低分子抑制ＲＮＡ分子の送達を記載する（Massaro et al., Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 287: L 1066-L 1070 (2004)）。米国特許出願第2005/0008617号（Chen等）は、肺中への導入に適した陽イオン性ポリマー、修飾陽イオン性ポリマー、脂質及び／又は界面活性剤と錯体形成される短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）並びにＲＮＡｉ誘導性ベクターを含めたＲＮＡ誘導性作因の送達を記載する。米国特許出願第2003/0157030号（Davis等）は、鼻送達のためのｓｉＲＮＡのようなＲＮＡｉ構築物またはポリマーと錯体形成されるｓｉＲＮＡを生じる核酸の投与を記載する。
【００２３】
in vivoでのｓｉＲＮＡ投与に関する限定数のその他の報告の間では、全て、全身送達、トランスフェクション化学物質又はウイルスベクターを用いる（Hasuwa, et al., FEBS Lett., 532: 227-230 (2002);McCaffrey, et al., Nature, 418: 38-39 (2002);Reich, et al., Mol. Vis., 9: 210-216 (2003);Sorensen, et al., J. Mol. Biol., 327: 761-766 (2003);及びZender, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 100: 7797-7802 (2003)）。
【００２４】
内部肺への直接送達は、そのための一般療法が不適切であるＣＯＰＤ、気管支炎、喘息、嚢胞性線維症、肺癌、肺線維症及び急性呼吸窮迫症候群のような症状のための治療の可能性を提供する。核酸及び／又はトランスフェクション化学物質又はウイルスベクターの全身送達の使用と関連した毒性は、臨床的使用の懸念を生じる；さらに、プラスミドＤＮＡ構築物の使用は、潜在的治療薬としてのプラスミドＤＮＡの効能及び送達を限定する。したがって本発明は、潜在的副作用低下及び効能増大という利点を提供する。
【００２５】
したがって、種々の肺疾患の治療のための、ベクターを伴わない、そして好ましくはポリマー、界面活性剤又は賦形剤をほとんど又はまったく伴わない、核酸を含有する肺内投与のための組成物を提供することは、本発明の一目的である。疾患の治療のための化学薬剤に関する監督官庁の認可を確認しそして得るのが困難であるため、本発明の送達方式は、それらが安全で、副作用がなく、そして任意の疾患の治療のために種々の製剤組成物を送達するために用いられ得る。
【発明の概要】
【００２６】
ウイルス又はプラスミドベクターを伴わず、そして好ましくはポリマー、界面活性剤又は賦形剤をほとんど又はまったく伴わずに、核酸、特にｓｉＲＮＡを含有する肺内投与のための方法が、本明細書中で記載される。一実施形態では、送達のための組成物は、本質的には、少なくとも1つの核酸分子、並びに水性溶液からなる。鼻内送達のための適切な核酸としては、ｄｓＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｓｓＲＮＡ、短い干渉ＲＮＡ、ミクロＲＮＡ及びアンチセンスＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、核酸のサイズの範囲は30又は23ヌクレオチド長又はそれ未満であるが、しかし5〜60ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド分子が利用され得る。好ましい一実施形態では、核酸のサイズの範囲は19〜23ヌクレオチド長である。
【００２７】
組成物は、肺疾患の少なくとも1つの症候又は症状発現の治療、予防又は診断を必要とする患者に投与される。一実施形態では、口−鼻及び／又は肺内投与のための組成物は、好ましくは肺において、遺伝子発現を抑制するための有効量で投与される。組成物は、1〜10 g／被験者の体重1 kg／日の用量範囲で、0.1 kg/体重1 kg／日の上限用量で投与される。好ましい一実施形態では、組成物は1〜5 g／体重1 kg／日の用量範囲で投与される。一実施形態では、組成物は、肺におけるＲＴＰ８０１の発現を抑制するのに有効な量で投与される。別の実施形態では、組成物は、肺におけるｐ５３の発現を抑制するのに有効な量で投与される。さらなる情報に関しては、ＰＣＴ特許出願公報WO06/023544A及びWO06/035434（本発明の譲受人に譲渡）を参照されたい。その発現が好ましくは内部肺で抑制される付加的遺伝子としては、ＲＴＰ８０１、ｐ５３、ＴＰ５３ＢＰ２、ＬＲＤＤ、ＣＹＢＡ、ＡＴＦ３、ＣＡＳＰ２、ＮＯＸ３、ＨＲＫ、Ｃ１ＱＢＰ、ＢＮＩＰ３、ＭＡＰＫ８、ＭＡＰＫ１４、Ｒａｃ１、ＧＳＫ３Ｂ、Ｐ２ＲＸ７、ＴＲＰＭ２、ＰＡＲＧ、ＣＤ３８、ＳＴＥＡＰ４、ＢＭＰ２、ＧＪＡ１、ＴＹＲＯＢＰ、ＣＴＧＦ、ＳＰＰ１、ＲＴＮ４Ｒ、ＡＮＸＡ２、ＲＨＯＡ、ＤＵＯＸ１、ＮＲＦ２、ＲＥＤＤ２、ＮＯＸ４、ＭＹＣ、ＰＬＫ１、ＥＳＰＬ１、ＫＥＡＰ１及びＳＨＣ１、特にＤＵＯＸ１、ＴＹＲＯＢＰ及びＣＴＧＦが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】
少なくとも1つの症候を軽減するための、核酸分子、好ましくはｓｉＲＮＡを含有する有効量の組成物の内部肺への口−鼻あるいは経口又は鼻送達による投与からなる肺疾患の少なくとも1つの症候の治療、診断又は予防のための方法も記載される。組成物は、典型的には、口−鼻投与のために、エーロゾル又は他の許容可能な処方物として処方される。一実施形態では、口−鼻投与により送達される組成物は、肺における遺伝子発現の抑制を生じる。別の実施形態では、組成物の肺特異的送達は、肺疾患の少なくとも1つの症候を治療し、診断し又は予防するのに有効な量で送達される。治療、診断又は予防のための適切な肺疾患としては、肺癌；肺炎症性症状、例えば喘息、嚢胞性線維症、気腫、気管支炎及び気管支拡張症；間質性肺疾患及び間質性線維症；細菌、ウイルス、真菌、寄生生物又はマイコバクテリア感染により引き起こされる肺炎；職業性肺疾患、例えば石炭、シリカ、アスベスト及びイソシアネート関連疾患；全身性紅斑性狼瘡のような膠原血管病に続発する肺疾患；慢性関節リウマチ；強皮症；皮膚筋炎;混合性結合組織障害；血管炎関連肺疾患、例えばウェーゲナー肉芽腫症及びグッドパスチャー症候群；類肉腫;並びに急性肺損傷／急性呼吸窮迫症候群が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、核酸分子は、ＲＴＰ８０１又はｐ５３の発現を抑制する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】マウスへのＲＴＰ８０１発現プラスミドの気管内滴下注入を伴う実験の結果を示す。
【図２】ＲＴＰ８０１  ＫＯ及びＷＴマウスにおける短期（7日）喫煙モデルの結果を示す。
【図３】活性抗ＲＴＰ８０１（ＲＥＤＤ１４）及び対照（ＲＥＤＤ８）ｓｉＲＮＡを滴下注入されたＷＴマウスにおける短期喫煙モデルの結果を示す。
【図４】長期ＣＳモデルにおけるＲＴＰ８０１  ＫＯマウスを用いた実験の結果を示す。
【図５】ＡＲＥ−ルシフェラーゼ・レポーター腫瘍細胞を静脈内注射されたＳＣＩＤ−Ｂｅｉｇｅマウスに、肺腫瘍増殖の第4週の間に2回、Ｎｒｆ２  ｓｉＲＮＡを吸入させた。対照マウスには、ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡを吸入させた。ｓｉＲＮＡ吸入の前及び後に、マウスを画像処理した。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
「呼吸器障害」は、呼吸器系の症状、疾患又は症候を指し、例としては全ての型の肺障害、例えば慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、気腫、慢性気管支炎、喘息、肺癌、並びに本明細書中に開示される任意のその他の肺疾患又は呼吸器障害が挙げられるが、これらに限定されない。気腫及び慢性気管支炎は、ＣＯＰＤと一緒に又は独立して起こり得る。
【００３１】
したがって、一実施形態では、本発明は、肺疾患に罹患している被験者の治療方法であって、被験者の内部肺へのエーロゾルの形態での遺伝子の発現を抑制する有効量の裸の修飾ｓｉＲＮＡ化合物を被験者に投与することを包含する方法からなる。
【００３２】
「裸の」ポリヌクレオチド、ＤＮＡ又はＲＮＡという用語は、細胞への進入を手助けし、促進し又は助長するよう作用する任意の送達ビヒクル、例えばウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフェクチン又は沈殿剤等を有さない配列を指す。例えば水又はＰＢＳ中のｓｉＲＮＡは、裸のｓｉＲＮＡである。
【００３３】
さらに、ｓｉＲＮＡは、本明細書中に開示される1つまたは複数の修飾により修飾される。ｓｉＲＮＡ化合物は任意に23ヌクレオチド長又はそれ未満であり、そしてｓｉＲＮＡに適切であるとして本明細書中で特定された任意の長さを有し得る。さらに、ｓｉＲＮＡの代わりに、アンチセンスＲＮＡ又はｍｉＲＮＡが用いられ得る。ｄｓＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ又はｓｓＲＮＡを組合せる抑制性核酸分子も用いられ得るし、上記分子は、ｓｉＲＮＡ／抑制性ＲＮＡ分子の状況で本明細書中に開示される特徴のいずれかを含み得る。
【００３４】
化合物は、0.1〜10 g/被験者の体重1 kg／日の範囲の用量で投与され得る;付加的な考え得る用量は、本明細書中に開示されている。
【００３５】
本発明により抑制されるべき遺伝子は、好ましくは、ＲＴＰ８０１、ｐ５３、ＴＰ５３ＢＰ２、ＬＲＤＤ、ＣＹＢＡ、ＡＴＦ３、ＣＡＳＰ２、ＮＯＸ３、ＨＲＫ、Ｃ１ＱＢＰ、ＢＮＩＰ３、ＭＡＰＫ８、ＭＡＰＫ１４、Ｒａｃ１、ＧＳＫ３Ｂ、Ｐ２ＲＸ７、ＴＲＰＭ２、ＰＡＲＧ、ＣＤ３８、ＳＴＥＡＰ４、ＢＭＰ２、ＧＪＡ１、ＴＹＲＯＢＰ、ＣＴＧＦ、ＳＰＰ１、ＲＴＮ４Ｒ、ＡＮＸＡ２、ＲＨＯＡ  ＤＵＯＸ１、ＮＲＦ２、ＲＥＤＤ２、ＮＯＸ４、ＭＹＣ、ＰＬＫ１、ＥＳＰＬ１、ＫＥＡＰ１及びＳＨＣ１、特にＤＵＯＸ１  ＴＹＲＯＢＰ及びＣＴＧＦからなる群から、特にＲＴＰ８０１、ｐ５３、ＤＵＯＸ１、ＴＹＲＯＢＰ及びＣＴＧＦからなる群から選択される。
【００３６】
本発明に従って治療されるべき肺疾患は、ＣＯＰＤ、肺癌、喘息、嚢胞性線維症、気腫、気管支炎、気管支拡張症、間質性肺疾患、間質性線維症、細菌性肺炎、ウイルス性肺炎、真菌性肺炎、寄生生物性肺炎、マイコバクテリア誘発性肺炎、石炭、シリカ、アスベスト及びイソシアネートのような作因により引き起こされる職業性肺疾患；全身性紅斑性狼瘡のような膠原血管病に続発する続発性肺疾患、慢性関節リウマチ、強皮症、皮膚筋炎、混合性結合組織障害；血管炎関連肺疾患、例えばウェーゲナー肉芽腫症及びグッドパスチャー症候群；類肉腫;並びに急性肺損傷又は急性呼吸窮迫症候群からなる群から選択される疾患である。
【００３７】
本発明によるエーロゾルは、直径約1〜5 μm、任意に直径1又は2又は3又は4又は5 μmの平均粒子サイズを有し得る。さらに、本発明によるエーロゾルは、好ましくは、直径約4.1〜4.9 μm、任意に直径4.4〜4.7 μm又は4.5〜4.6 μmの平均粒子サイズを有する。付加的には、エーロゾルは、好ましくは、0.3 mL／分より大きい流速で投与される。エーロゾルは、好ましくは、経口的に、鼻に、又は口−鼻に投与される。本明細書中に開示されているように、付加的投与方式が考えられる。
【００３８】
経口、鼻又は口−鼻送達のための適切な核酸としては、ｄｓＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｓｓＲＮＡ、短い干渉ＲＮＡ、ミクロＲＮＡ及びアンチセンスＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の好ましい一実施形態では、裸の修飾ｓｉＲＮＡが用いられる。このような核酸は、それらが疾患の1つまたは複数の症候を予防するか又は治療する場合、あるいはそれらが診断に役立ち得る場合、治療用であり得る。口−鼻送達のための適切な核酸は、当業者に既知の種々の方法により構築され得る。核酸分子のサイズ範囲は、好ましくは30ヌクレオチド長又はそれ未満、さらに好ましくは23ヌクレオチド長又はそれ未満であるが、しかし60ヌクレオチド長までである分子が利用可能である。さらに好ましくは、核酸分子のサイズ範囲は19〜23ヌクレオチド長（23も含めて）である。
【００３９】
所望の作用を達成するために有用である任意のＤＮＡが、本明細書中に記載されるように用いられ得る。好ましくはＤＮＡは、二本鎖又は１本鎖である。さらに好ましくはＤＮＡは、１本鎖である。例えば核酸による遺伝子発現の不活性化は、ゲノム二本鎖ＤＮＡとオリゴヌクレオチドとの間の三重らせん形成によっても発揮され得る。これらのオリゴヌクレオチドは、ワトソン・クリック塩基対のプリン塩基間（即ち、チミジン及びＴＡ塩基対間、及びプロトン化シトシン及びＣＧ塩基対間）にフーグスティーン型結合を形成することにより、二重らせんＤＮＡの主溝と認識の高特異性で結合され得る。二本鎖ＤＮＡの三重らせん認識のための二次モチーフは、プリン高含有オリゴヌクレオチドがワトソン・クリックプリン鎖と逆平行のＤＮＡと結合するホモプリンモチーフにより構成される。ピリミジン非修飾オリゴデオキシヌクレオチド又は骨格修飾オリゴヌクレオチドは、配列特異的やり方で遺伝子転写を遮断し得る。二重らせんＤＮＡと特異的に結合して局所的三重らせん構造を形成し得るオリゴヌクレオチドは10年以上の間特性化されてきており、そしてそれらの構造及び安定性を左右するパラメーターに関する多数の情報が入手可能である（Sun, et al. Curr. Opin. Struct. Biol. 6: 327-333 (1996)）。プロモーター内の三重鎖形成は、in vitroでの遺伝子活性化に到達し、抑制する転写因子を遮断することが示されており、そしていくつかの研究は、三重らせん形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）が指示された方法で哺乳類細胞における遺伝子発現を低減し得る、ということを実証している（Seidman, et al., J Clin Invest. 112(4): 487-94 (2003)で再検討）。ＴＦＯは、ゲノム修飾を媒介して、標的配列における変化を生じるためにも用いられ得る。これは、標的配列における永久的変化を誘導するという利点を有する。それは、遺伝子ノックアウト・ツールとしての、そして遺伝子補正のための一手段としての能力も有する。
【００４０】
アンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）技術は、遺伝子発現の下方制御又はサイレンシングを伴う。「アンチセンス」ＲＮＡ分子は、細胞のタンパク質コードＲＮＡの相補体を含有し、したがってそれとハイブリダイズし得る。アンチセンス・オリゴマーは、特定部位でメッセンジャーＲＮＡと結合し、タンパク質へのＲＮＡの翻訳、ｍＲＮＡのスプライシング又はウイルスＲＮＡの逆転写、並びにｍＲＮＡ又はウイルスＲＮＡのその他のプロセシングを抑制することが示されている。
【００４１】
ＲＮＡサイレンシングは、広範囲の生物体中に保存される配列特異的ＲＮＡ分解系である。ＲＮＡサイレンシングは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が遺伝子発現を抑圧する過程である。ＲＮＡサイレンシングに関与するｄｓＲＮＡの2つの型としては、多数の生物体において見出される短い二本鎖リボ核酸である低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）及びミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が挙げられる（再検討のためにはDykxhoorn et al. 2003 Nature Reviews Mol Cell Biol 4: 457-466参照）。ｓｉＲＮＡ様遺伝子サイレンシング・メカニズムは、ヒトを含めて実質的に全ての種において機能的である。多数のｍｉＲＮＡの配列は既知であり、ゲノム又は染色体中のそれらの位置が発表されている。
【００４２】
ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの発現及び成熟において多少の差が認められるが、しかし最終及び活性産物は、両方の場合で、好ましくは短い、19〜22ヌクレオチド長の二本鎖ＲＮＡ分子である（Dykxhoorn et al. 2003 Nature Reviews Mol Cell Biol 4: 457-466及びSteinberg 2003 Scientist June 16: 22-24）。ｍｉＲＮＡは、非タンパク質コードＤＮＡから合成され、そして逆方向反復を収容する転写物から代謝される。フォールドバックにより形成される二本鎖ＲＮＡは、動物ではダイサー、植物ではダイサー様と呼ばれる酵母からヒト及び高等植物まで進化を通して高度に保存されたＲＮアーゼＩＩＩ様酵素によりプロセシングされる。これらの分子は、転写物の３’−ＵＴＲと相互作用し、そして翻訳を抑制し得る。
【００４３】
水性溶液
in vivo投与に薬学的に適している組成物を提供するために、核酸分子は任意の水性担体、ビヒクル又は溶液中に調製され得る。水溶液を調製する方法は、当業者によく知られている。好ましくは水溶液は、水、あるいは塩及び／又は緩衝剤を含有する生理学的に許容可能な水溶液、例えばリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、あるいは動物又はヒトへの投与のために許容可能な任意のその他の水溶液である。このような溶液は当業者に良く知られており、例としては蒸留水、脱イオン水、純水又は超純水、生理食塩水、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、並びに核酸と相溶性である他の緩衝剤を含有する溶液が挙げられるが、これらに限定されない。組成物は、溶液を等張にするために塩化ナトリウム及びグルコース又はマンニトールも含有し得る。組成物は、適切な補助化合物、例えばｐＨ、浸透圧及び張度調整剤を含有し得る。水溶液中に処方されるｓｉＲＮＡ化合物は、本発明による裸のｓｉＲＮＡと考えられる。
【００４４】
上気道を介した投与のために、組成物は、エーロゾルとしての口−鼻投与のための適切な濃度で、溶液中に、例えば水、あるいは緩衝された又は緩衝されない等張生理食塩水中に、あるいは懸濁液として、処方される。好ましくはこのような溶液又は懸濁液は、鼻分泌液に比して等張であり、そして例えば約ｐＨ4.0〜約ｐＨ7.4、又はｐＨ6.0〜ｐＨ7.0の範囲のほぼ同一ｐＨを有する。緩衝液は、生理学的に適合性であり、単なる例としては、リン酸塩緩衝液が挙げられる。例えば代表的な鼻うっ血除去薬は、約6.2のｐＨに緩衝されると記載されている（Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Ed. Arthur Osol, page 1445 (1980)）。鼻及び／又は上気道投与のための無害水溶液のための適切な生理食塩水含量及びｐＨを、当業者は容易に確定し得る。
【００４５】
その他の適切な水性ビヒクルとしては、リンガー溶液及び等張塩化ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されない。水性懸濁液は、懸濁化剤、例えばセルロース誘導体、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン及びトラガカントゴム、並びに湿潤剤、例えばレシチンを含み得る。水性懸濁液のための適切な防腐剤としては、エチル及びｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエートが挙げられる。
【００４６】
組成物は、少量のポリマー、界面活性剤又は当業者によく知られたその他の賦形剤を含有し得る。この状況では、「少量」は、肺の細胞中の核酸の取込みに影響を及ぼすか又は媒介し得る補助剤又は物質が存在しない、ということを意味する。
【００４７】
気道への組成物の投与
Ａ．  投与方法
本明細書中に記載されるようにポリマー、界面活性剤又は賦形剤をほとんど又は全く伴わない核酸分子処方物の肺特異的送達は、広範囲の肺疾患のための診断的、予防的及び治療的用途を有する。肺投与は、典型的には医療介入（自己投与）を必要とせずに完了され得るし、注射療法にしばしば伴う疼痛が回避され、そして経口療法でしばしば出くわす生体活性剤の酵素的及びｐＨ媒介性分解の量が有意に低減される。
【００４８】
気道は、大気と血流との間のガス交換に関与する構造である。肺は、最終的にはガス交換が起きる肺胞に終わる分枝構造である。肺胞表面積は呼吸器系において最大であり、そして薬剤吸収が起きる場所である。肺胞は、繊毛又は粘液層を伴わない薄い上皮で被覆され、そして界面活性リン脂質を分泌する（J.S. Patton & R.M. Platz. Adv. Drug Del. Rev. 8: 179-196 (1992)）。
【００４９】
気道は、上気道、例えば中咽頭及び喉頭、その後の下気道（これは気管と、その後の気管支及び細気管支への二分岐を含む）を包含する。上及び下気道は、誘導気道と呼ばれる。終末細気管支は次に、呼吸細気管支に分かれ、これは次に、最終的呼吸帯、即ち肺胞、又は深部肺に導く（Gonda, I. in Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 6: 273-313 (1990)）。内部肺、例えば深部肺／肺胞は、全身薬剤送達のための吸入治療用エーロゾルの主要標的である。
【００５０】
吸入エーロゾルは、限局性肺障害、例えば喘息及び嚢胞性線維症の治療のために用いられてきたし（Anderson et al., Am. Rev. Respir. Dis., 140: 1317-1324 (1989)）、同様にペプチド及びタンパク質の全身送達のための可能性を有する（Patton and Platz, Advanced Drug Delivery Reviews, 8: 179-196 (1992)）。エーロゾル及び／又は噴霧化合物の送達は、とりわけ、鼻、経口又は口−鼻であり得る。
【００５１】
エーロゾル投与量、処方物及び送達系は、例えばGonda, I.（上記）に；そしてMoren, "Aerosol dosage forms and formulations," in: Aerosols in Medicine, Principles, Diagnosis and Therapy, Moren, et al., Eds. Esevier, Amsterdam, 1985に記載されているように、特定の治療用途のために選択され得る。エーロゾルという用語は、本明細書中で用いる場合、噴射剤を用いて生成されるか否かにかかわらず、溶液又は懸濁液中に存在し得る粒子の微細ミストの任意の調製物を指す。エーロゾルは、標準技法、例えば特に超音波処理又は高圧処理を用いて生成され得る。本発明の一実施形態によれば、エーロゾルはAeroneb噴霧器を用いて生成される（例えば米国特許第6,615,824号（Power）参照）。
【００５２】
処方物は、呼吸器系への投与のために製薬上許容可能である水溶液中で投与され得る。好ましい実施形態では、化合物は、液体粒子及び／又は固体粒子のような形態で吸入により投与される。適切な例としては、エーロゾル、噴霧剤、ミスト、霧化試料、及び液体滴剤が挙げられるが、これらに限定されない。ヒトへの投与のために用いられ得る典型的装置としては、定量噴霧式吸入器（ＭＤＩ）、噴霧器、例えばAeroneb、及び滴注技法が挙げられる。処方物は、肺疾患の1つまたは複数の症候に関して治療し、予防し又は診断するのに有効な量で投与される。ｓｉＲＮＡは、乾燥粉末吸入器を用いて乾燥粉末としても投与され得るが、この場合、粒子は肺分泌物内に溶解する。
【００５３】
患者の気道に粒子を投与するために用いられ得る吸入の種々の適切な用具及び方法は、当業界で既知である。噴霧器は、溶液又は懸濁液から微細なミストを作り出し、これが患者に吸入される。米国特許第5,709,202号（Lloyd等）に、又は米国特許第6,615,824号（Power）に記載された用具が用いられ得る。ＭＤＩは、典型的には、メーターバルブを有する加圧キャニスターを包含し、この場合、キャニスターは溶液又は懸濁液、及び噴射剤を充填される。溶媒それ自体は噴射剤として機能し、あるいは組成物は、噴射剤、例えばフレオンと併合され得る。組成物は、圧力の放出のためにキャニスターから放出される場合、微細ミストである。噴射剤及び溶媒は、圧力の減少のために全体的に又は部分的に蒸発され得る。
【００５４】
組成物は、好ましくは、有効用量の核酸の送達を生じる薬物動態プロフィールで、肺中に送達される。本明細書中で一般的に用いられるように、本発明の核酸の「有効量」は、化合物又は治療薬を摂取していない適合被験者と比較して、化合物又は治療薬が投与される被験者において肺疾患の1つまたは複数の症候を治療し、肺疾患の1つまたは複数の症候の進行を逆行させ、肺疾患の1つまたは複数の症候の進行を停止し、肺疾患の1つまたは複数の症候の発生を防止し、肺疾患の症状発現を低減し、あるいは肺疾患の1つまたは複数の症候を診断し得る量である。薬剤の実際の有効量は、利用されている特定の薬剤又はその組合せ、処方される個々の組成物、投与方式、並びに患者の年齢、体重、症状、そして治療されている症候又は症状の重症度によって変わり得る。個々の患者のための投与量は、慣用的考察を用いて（例えば適切な慣用的薬理学的プロトコールにより）、当業者により確定され得る。一実施形態では、組成物は、0.1〜10 g／体重1 kg／日の用量範囲で、0.1 kg/体重1 kg／日の上限用量で送達される。好ましい一実施形態では、組成物は1〜5 g／体重1 kg／日の用量範囲で投与される。
【００５５】
これらの分子のうちの1つまたは複数が動物（例えばヒト）に投与されて、1つまたは複数の標的ポリペプチドの発現又は活性を調整し得る。医者は、例えば最初に相対的に低用量を処方し、その後、適切な応答が得られるまで、用量を増大し得る。さらに、任意の個々の被験者に関する特定用量レベルは、用いられる特定化合物の活性、被験者の年齢、体重、全身の健康、性別及び食餌、投与時間、投与経路、排出速度、任意の薬剤組合せ、並びに調整されるべき発現又は活性の程度を含めた種々の因子によっている、と理解される。
【００５６】
治療の効能は、標的遺伝子ｍＲＮＡの量（例えば実時間ＰＣＲを用いて）又は標的遺伝子ｍＲＮＡによりコードされるポリペプチドの量（ウエスタンブロット分析）を測定することによりモニタリングされ得る。
【００５７】
Ｂ．  治療されるべき患者及び疾患
組成物は、治療、予防又は診断を必要とする患者に投与される。組成物は、動物又はヒトに投与され得る。肺疾患は、ＣＯＰＤ、肺癌、気道又は肺感染、間質の疾患、ガス交換又は血液循環の障害、気道の疾患又は胸膜の障害であり得る。本明細書中で用いる場合、「肺癌」は、原発性肺腫瘍（例えば気管支原性癌又は気管支カルチノイド）、あるいは別の器官又は組織（例えば乳房、結腸、前立腺、腎臓、甲状腺、胃、子宮頚部、直腸、精巣、骨又は黒色腫）の原発性腫瘍からの転移を指す。本明細書中で用いる場合、「気道又は肺感染」は、呼吸器系の任意の部分の任意の細菌、ウイルス、真菌又は寄生生物感染を指す。本明細書中で用いる場合、「間質の疾患」は、線維症を含めた間質の任意の障害（例えば間質性肺線維症、間質性肺炎、間質性肺疾患、ランゲルハンス細胞肉芽腫症、サルコイドーシス又は特発性肺血鉄症）を包含する。本明細書中で用いる場合、「ガス交換又は血液循環の障害」は、血液及び肺への／からのガスの分布及び／又は交換に影響を及ぼす任意の異常（例えば肺水腫、肺塞栓症、呼吸器不全（例えば弱い筋肉のため）、急性呼吸窮迫症候群又は肺高血圧症）を指す。本明細書中で用いる場合、「気道の疾患」としては、遺伝的及び環境的病因の障害を含めた規則的呼吸パターンの任意の障害（例えば喘息、慢性気管支炎、細気管支炎、嚢胞性線維症、気管支拡張症、気腫、慢性閉塞性肺疾患、びまん性汎細気管支炎又はリンパ管平滑筋腫症）が挙げられる。本明細書中で用いる場合、「胸膜の障害」としては、例えば胸水（例えば血胸症（胸膜腔への血液）又は気腫（胸膜腔への膿）、気胸（空気、例えば外傷性、自発性又は張力）、胸膜炎あるいは胸膜線維症又は石灰化が挙げられる。
【００５８】
肺疾患の少なくとも1つの症候の治療、診断又は予防のための適切な肺疾患としては、ＣＯＰＤ；肺癌；肺炎症性症状、例えば喘息、嚢胞性線維症、気腫、気管支炎及び気管支拡張症；間質性肺疾患及び間質性線維症；細菌、ウイルス、真菌、寄生生物及びマイコバクテリア感染により引き起こされる肺炎；石炭、シリカ、アスベスト及びイソシアネートのような作因により引き起こされる職業性肺疾患；全身性紅斑性狼瘡のような膠原血管病に続発する続発性肺疾患；慢性関節リウマチ；強皮症；皮膚筋炎；混合性結合組織障害；血管炎関連肺疾患、例えばウェーゲナー肉芽腫症及びグッドパスチャー症候群；類肉腫;並びに急性肺損傷の症候又は急性呼吸窮迫症候群が挙げられるが、これらに限定されない。全身送達のための好ましい一実施形態では、核酸は、以下の遺伝子のうちの1つまたは複数の発現を抑制する：ｐ５３、ＲＴＰ８０１、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１２、カスパーゼ１４、Ａｐａｆ−１、Ｎｏｄ１、Ｎｏｄ２、Ｉｐａｆ、ＤＥＦＣＡＰ、ＲＡＩＤＤ、ＲＩＣＫ、Ｂｃｌ１０、ＡＳＣ、ＴＵＣＡＮ、ＡＲＣ、ＣＬＡＲＰ、ＦＡＤＤ、ＤＥＤＤ、ＤＥＤＤ２、Ｃｒｙｏｐｉｒｉｎ、ＰＹＣ１、Ｐｙｒｉｎ、ＴＲＡＤＤ、ＵＮＣ５ａ、ＵＮＣ５ｂ、ＵＮＣ５ｃ、ＺＵＤ、ｐ８４Ｎ５、ＬＲＤＤ、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ５、ＣＤＫ９、ＰＩＴＳＬＲＥ  Ａ、ＣＨＫ２、ＬＡＴＳ１、Ｐｒｋ、ＭＡＰ４Ｋ１、ＭＡＰ４Ｋ２、ＳＴＫ４、ＳＬＫ、ＧＳＫ３アルファ、ＧＳＫ３ベータ、ＭＥＫＫ１、ＭＡＰ３Ｋ５（Ａｓｋ１）、ＭＡＰ３Ｋ７、ＭＡＰ３Ｋ８、ＭＡＰ３Ｋ９、ＭＡＰ３Ｋ１０、ＭＡＰ３Ｋ１１、ＭＡＰ３Ｋ１２、ＤＲＰ−１、ＭＫＫ６、ｐ３８、ＪＮＫ３、ＤＡＰＫ１、ＤＲＡＫ１、ＤＲＡＫ２、ＩＲＡＫ、ＲＩＰ、ＲＩＰ３、ＲＩＰ５、ＰＫＲ、ＩＲＥ１、ＭＳＫ１、ＰＫＣアルファ、ＰＫＣベータ、ＰＫＣデルタ、ＰＫＣイプシロン、ＰＫＣイータ、ＰＫＣミュー、ＰＫＣシータ、ＰＫＣゼータ、ＣＡＭＫ２Ａ、ＨＩＰＫ２、ＬＫＢ１、ＢＴＫ、ｃ−Ｓｒｃ、ＦＹＮ、Ｌcｋ、ＡＢＬ２、ＺＡＰ７０、ＴｒｋＡ、ＴｒｋＣ、ＭＹＬＫ、ＦＧＦＲ２、ＥｐｈＡ２、ＡＡＴＹＫ、ｃ−Ｍｅｔ、ＲＥＴ、ＰＲＫＡＡ２、ＰＬＡ２Ｇ２Ａ、ＳＭＰＤ１、ＳＭＰＤ２、ＳＰＰ１、ＦＡＮ、ＰＬＣＧ２、ＩＰ６Ｋ２、ＰＴＥＮ、ＳＨＩＰ、ＡＩＦ、ＡＭＩＤ、Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ、Ｓｍａｃ、ＨｔｒＡ２、ＴＳＡＰ６、ＤＡＰ−１、ＦＥＭ−１、ＤＡＰ−３、Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ、ＤＩＯ−１、ＤＡＸＸ、ＣＡＤ、ＣＩＤＥ−Ａ、ＣＩＤＥ−Ｂ、Ｆｓｐ２７、Ａｐｅ１、ＥＲＣＣ２、ＥＲＣＣ３、ＢＡＰ３１、Ｂｉｔ１、ＡＥＳ、Ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ、ＨＩＰ１、ｈＳｉｒ２、ＰＨＡＰ１、ＧＡＤＤ４５ｂ、ＧＡＤＤ３４、ＲＡＤ２１、ＭＳＨ６、ＡＤＡＲ、ＭＢＤ４、ＷＷ４５、ＡＴＭ、ｍＴＯＲ、ＴＩＰ４９、ジユビキチン／ＦＡＴ１０、ＦＡＦ１、ｐ１９３、Ｓｃｙｔｈｅ／ＢＡＴ３、Ａｍｉｄａ、ＩＧＦＢＰ−３、ＴＤＡＧ５１、ＭＣＧ１０、ＰＡＣＴ、ｐ５２／ＲＡＰ、ＡＬＧ２、ＡＬＧ３、プレセネリン−１、ＰＳＡＰ、ＡＩＰ１／Ａｌｉ��、ＥＳ１８、ｍｄａ−７、ｐ１４ＡＲＦ、ＡＮＴ１、ｐ３３ＩＮＧ１、ｐ３３ＩＮＧ２、ｐ５３ＡＩＰ１、ｐ５３ＤＩＮＰ１、ＭＧＣ３５０８３、ＮＲＡＧＥ、ＧＲＩＭ１９、リポカリン２、グリコデリンＡ、ＮＡＤＥ、ポリミン、ＳＴＡＧ１、ＤＡＢ２、ガレクチン-７、ガレクチン-９、ＳＰＲＣ、ＦＬＪ２１９０８、ＷＷＯＸ、ＸＫ、ＤＫＫ−１、Ｆｚｄ１、Ｆｚｄ２、ＳＡＲＰ２、アキシン１、ＲＧＳ３、ＤＶＬ１、ＮＦｋＢ２、ＩｋＢアルファ、ＮＦ−ＡＴＣ１、ＮＦ−ＡＴＣ２、ＮＦ−ＡＴＣ４、ｚｆ３／ＺＮＦ３１９、Ｅｇｒ１、Ｅｇｒ２、Ｅｇｒ３、Ｓｐ１、ＴＩＥＧ、ＷＴ１、Ｚａｃ１、Ｉｃａｒｏｓ、ＺＮＦ１４８、ＺＫ１／ＺＮＦ４４３、ＺＮＦ２７４、ＷＩＧ１、ＨＩＶＥＰ１、ＨＩＶＥＰ３、Ｆｌｉｚ１、ＺＰＲ９、ＧＡＴＡ３、ＴＲ３、ＰＰＡＲＧ、ＣＳＭＦ、ＲＸＲａ、ＲＡＲａ、ＲＡＲｂ、ＲＡＲｇ、Ｔ３Ｒａ、ＥＲベータ、ＶＤＲ、ＧＲ／ＧＣＣＲ、ｐ５３、ｐ７３アルファ、ｐ６３（ヒト［ｔａ  アルファ、ｔａ  ベータ、ｔａ  ガンマ、ｄａ  アルファ、ｄａベータ、ｄａ  ガンマ］）、５３ＢＰ２、ＡＳＰＰ１、Ｅ２Ｆ１、Ｅ２Ｆ２、Ｅ２Ｆ３、ＨＩＦ１アルファ、ＴＣＦ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｍａｘ、Ｍａｄ、ＭＩＴＦ、Ｉｄ２、Ｉｄ３、Ｉｄ４、ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−Ｆｏｓ、ＡＴＦ３、ＮＦ−ＩＬ６、ＣＨＯＰ、ＮＲＦ１、ｃ−Ｍａｆ、Ｂａｃｈ２、Ｍｓｘ２、Ｃｓｘ、Ｈｏｘａ５、Ｅｔｓ−１、ＰＵ１／Ｓｐｉ１、Ｅｔｓ−２、ＥＬＫ１、ＴＥＬ１、ｃ−Ｍｙｂ、ＴＢＸ５、ＩＲＦ１、ＩＲＦ３、ＩＲＦ４、ＩＲＦ９、ＡＰ−２アルファ、ＦＫＨＲ、ＦＯＸＯ１Ａ、ＦＫＨＲＬ１、ＦＯＸＯ３ａ、ＡＦＸ１、ＭＬＬＴ７、Ｔｉｐ６０、ＢＴＧ１、ＡＵＦ１、ＨＮＲＰＤ、ＴＩＡ１、ＮＤＧ１、ＰＣＢＰ４、ＭＣＧ１０、ＦＸＲ２、ＴＮＦＲ２、ＬＴｂＲ、ＣＤ４０、ＣＤ２７、ＣＤ３０、４−１ＢＢ、ＴＮＦＲＳＦ１９、ＸＥＤＡＲ、Ｆｎ１４、ＯＰＧ、ＤｃＲ３、ＦＡＳ、ＴＮＦＲ１、ＷＳＬ−１、ｐ７５ＮＴＲ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＤＲ６、ＥＤＡＲ、ＴＮＦアルファ、ＦＡＳリガンド、ＴＲＡＩＬ、リンフォトキシン・アルファ、リンフォトキシン・ベータ、４−１ＢＢＬ、ＲＡＮＫＬ、ＴＬ１、ＴＷＥＡＫ、ＬＩＧＨＴ、ＡＰＲＩＬ、ＩＬ−１−アルファ、ＩＬ−１−ベータ、ＩＬ−１８、ＦＧＦ８、ＩＬ−２、ＩＬ−２１、ＩＬ−５、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＬＩＦ、ＩＬ−１２、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１９、ＩＬ−２４、ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ、ＩＦＮガンマ、Ｍ−ＣＳＦ、プロラクチン、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＭｙＤ８８、ＴＲＩＦ、ＲＩＧ−１、ＣＤ１４、ＴＣＲアルファ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ１９、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、ＳＥＭＡ３Ａ、ＳＥＭＡ３Ｂ、ＨＬＡ-Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｌ、ＨＬＡ−ＤＭアルファ、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＡＬＬ、ＤＣＣ、ＩＣＡＭ１、ＩＣＡＭ３、ＣＤ６６ａ、ＰＶＲ、ＣＤ４７、ＣＤ２、Ｔｈｙ−１、ＳＩＲＰａ１、ＣＤ５、Ｅ−カドヘリン、ＩＴＧＡＭ、ＩＴＧＡＶ、ＣＤ１８、ＩＴＧＢ３、ＣＤ９、ＩｇＥ  Ｆｃ  Ｒベータ、ＣＤ８２、ＣＤ８１、ＰＥＲＰ、ＣＤ２４、ＣＤ６９、ＫＬＲＤ１、ガレクチン１、Ｂ４ＧＡＬＴ１、Ｃ１ｑアルファ、Ｃ５Ｒ１、ＭＩＰ１アルファ、ＭＩＰ１ベータ、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＤＦ１、ＸＣＬ１、ＣＣＣＫＲ５、ＯＩＡＳ／ＯＡＳ１、ＩＮＤＯ、ＭｘＡ、ＩＦＩ１６、ＡＩＭ２、ｉＮＯＳ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＭＩＦ、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ４、ＴＲＡＦ６、ＰＡＲ−４、ＩＫＫガンマ、ＦＩＰ２、ＴＸＢＰ１５１、ＦＬＡＳＨ、ＴＲＦ１、ＩＥＸ−１Ｓ、Ｄｏｋ１、ＢＬＮＫ、ＣＩＮ８５、Ｂｉｆ−１、ＨＥＦ１、Ｖａｖ１、ＲａｓＧＲＰ１、ＰＯＳＨ、Ｒａｃ１、ＲｈｏＡ、ＲｈｏＢ、ＲｈｏＣ、ＡＬＧ４、ＳＰＰ１、ＴＲＩＰ、ＳＩＶＡ、ＴＲＡＢＩＤ、ＴＳＣ−２２、ＢＲＣＡ１、ＢＡＲＤ１、５３ＢＰ１、ＭＤＣ１、Ｍｄｍ４、Ｓｉａｈ−１、Ｓｉａｈ−２、ＲｏＲｅｔ、ＴＲＩＭ３５、ＰＭＬ、ＲＦＷＤ１、ＤＩＰ１、Ｓｏｃｓ１、ＰＡＲＣ、ＵＳＰ７、ＣＹＬＤ、ＳＯＸ９、ＡＳＰＰ１、ＣＴＳＤ、ＣＡＰＮＳ１、ＦＡＳ、ＦＡＳリガンド、ＨＥＳ１、ＨＥＳＳ、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３  ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ２Ａ；並びに特にＲＴＰ８０１、ｐ５３、ＴＰ５３ＢＰ２、ＬＲＤＤ、ＣＹＢＡ、ＡＴＦ３、ＣＡＳＰ２、ＮＯＸ３、ＨＲＫ、Ｃ１ＱＢＰ、ＢＮＩＰ３、ＭＡＰＫ８、ＭＡＰＫ１４、Ｒａｃ１、ＧＳＫ３Ｂ、Ｐ２ＲＸ７、ＴＲＰＭ２、ＰＡＲＧ、ＣＤ３８、ＳＴＥＡＰ４、ＢＭＰ２、ＧＪＡ１、ＴＹＲＯＢＰ、ＣＴＧＦ、ＳＰＰ１、ＲＴＮ４Ｒ、ＡＮＸＡ２、ＲＨＯＡ  ＤＵＯＸ１、ＮＲＦ２、ＲＥＤＤ２、ＮＯＸ４、ＭＹＣ、ＰＬＫ１、ＥＳＰＬ１、ＫＥＡＰ１及びＳＨＣ１、特にＲＴＰ８０１、ｐ５３、ＤＵＯＸ１  ＴＹＲＯＢＰ及びＣＴＧＦ。
【００５９】
Ｃ．  投与されるべきｓｉＲＮＡ
哺乳類遺伝子を下方制御する任意の二本鎖オリゴリボヌクレオチド（例えばｓｉＲＮＡ）は、本発明の方法に従って投与され得る。本発明に従って投与されるべきｓｉＲＮＡは、センス鎖が哺乳類遺伝子、任意に本明細書中に開示される遺伝子のｍＲＮＡ配列に由来し、そしてアンチセンス鎖がセンス鎖と相補的である二重鎖オリゴリボヌクレオチドである。概して、標的ｍＲＮＡ配列からの多少の逸脱はｓｉＲＮＡ活性を危うくすることなく耐容される（例えばCzauderna et al., 2003, NAR 31(11), 2705-2716参照）。本発明のｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡの破壊を伴って又は伴わずに、転写後レベルで遺伝子発現を抑制する。理論に縛られることなく、ｓｉＲＮＡは、特異的切断及び分解のためにｍＲＮＡを標的にし得るし、及び／又は標的化メッセージからの翻訳を抑制し得る。
【００６０】
本明細書中で用いる場合、「リボヌクレオチド」という用語は、天然及び合成、非修飾及び修飾リボヌクレオチドを包含する。修飾は、糖部分に対する、塩基部分に対する、及び／又はオリゴヌクレオチドにおけるリボヌクレオチド間の連結に対する変化を包含する。
【００６１】
いくつかの実施形態では、本発明によるオリゴリボヌクレオチドは修飾ｓｉＲＮＡを含む。種々の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、第一鎖及び第二鎖を含むＲＮＡ二重鎖を含み、それにより第一鎖は標的核酸の約18〜約40連続ヌクレオチドと少なくとも部分的に相補性であるリボヌクレオチド配列を含み、そして第二鎖は第一鎖と少なくとも部分的に相補性であるリボヌクレオチド配列を含み、この場合、上記第一鎖及び／又は上記第二鎖は、糖部分の２’位置に修飾を有する修飾リボヌクレオチドの複数の群を含み、それにより、各鎖内では、修飾リボヌクレオチドの各群は、フランキング・リボヌクレオチドの一群が片側又は両側に位置し、それによりフランキング・リボヌクレオチドの群を形成する各リボヌクレオチドが非修飾リボヌクレオチド又は修飾リボヌクレオチドの群の修飾と異なる修飾を有するリボヌクレオチドから選択される。
【００６２】
一実施形態では、修飾リボヌクレオチドの群及び／又はフランキング・リボヌクレオチドの群は、1〜12の整数からなる群から選択される多数のリボヌクレオチドを含む。したがって、群は、1つのヌクレオチド、2つのヌクレオチド、3つのヌクレオチド、4つのヌクレオチド、5つのヌクレオチド、6つのヌクレオチド、7つのヌクレオチド、8つのヌクレオチド、9つのヌクレオチド、10のヌクレオチド、11のヌクレオチド又は12のヌクレオチドを含む。
【００６３】
修飾ヌクレオチド及びフランキング・ヌクレオチドの群は、鎖のうちの少なくとも1つの上で一パターンで組織化され得る。いくつかの実施形態では、第一及び第二鎖は、修飾ヌクレオチドの一パターンを含む。別の実施形態では、1つの鎖のみが、修飾ヌクレオチドの一パターンを含む。種々の実施形態では、上記第一鎖の修飾ヌクレオチドのパターンは、第二鎖の修飾ヌクレオチドのパターンに比して同一である。
【００６４】
他の実施形態では、上記第一鎖の修飾ヌクレオチドのパターンは、第二鎖の修飾ヌクレオチドのパターンに比して1つまたは複数のヌクレオチドによりシフトされる。
【００６５】
いくつかの好ましい実施形態では、アンチセンス鎖中の中央リボヌクレオチドは非修飾ヌクレオチドである。例えば19−オリゴマーアンチセンス鎖において、リボヌクレオチド数10は非修飾である；21−オリゴマーアンチセンス鎖では、リボヌクレオチド数11は非修飾である;そして23−オリゴマーアンチセンス鎖では、リボヌクレオチド数12は非修飾である。ｓｉＲＮＡの修飾又は修飾のパターンは（もしあれば）、これを可能にするよう計画されなければならない。糖残基の２’部分における修飾としては、アミノ、フルオロ、アルコキシ、例えばメトキシ、アルキル、アミノ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ＣＮ、ＣＦ、イミダゾール、カルボキシレート、チオエート、Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル又はアラルキル、ＯＣＦ３、ＯＣＮ、Ｏ−、Ｓ−、又はＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ又はＮ−アルケニル;ＳＯＣＨ３；ＳＯ２ＣＨ３；ＯＮＯ２；ＮＯ２、Ｎ３；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリル;アミノアルキルアミノ;ポリアルキルアミノ又は置換シリル（特に、欧州特許EP 0 586 520 B1又はEP 0 618 925 B1に記載されたような）が挙げられる。
【００６６】
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、一端又は両端で平滑末端化される。さらに特定的には、ｓｉＲＮＡは、第一鎖の５’末端および第二鎖の３’末端により限定される末端で、あるいは第一鎖の３’末端及び第二鎖の５’末端により限定される末端で平滑末端化され得る。他の実施形態では、2つの鎖のうちの少なくとも1つは、５’末端に少なくとも1つのヌクレオチドのオーバーハングを有し得る。鎖のうちの少なくとも1つは、任意に、３’末端に少なくとも1つのヌクレオチドのオーバーハングも有し得る。オーバーハングは、約1〜約5連続ヌクレオチドで構成され得る。オーバーハングのヌクレオチドは、修飾又は非修飾リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドであり得る。
【００６７】
ＲＮＡ二重鎖の長さは、約18〜約40リボヌクレオチド、好ましくは19、21又は23リボヌクレオチドである。さらに、各鎖の長さは、独立して、約15〜約40塩基、好ましくは18〜23塩基、さらに好ましくは19、21又は23リボヌクレオチドからなる群から選択される長さを有する。
【００６８】
付加的には、上記第一鎖及び標的核酸間の相補性は、完全であり得る。いくつかの実施形態では、鎖は、実質的に相補性であり、即ち、上記第一鎖及び標的核酸間に1、2又は3つまでのミスマッチを有する。実質的に相補性とは、別の配列と約84％より大きい相補性を指す。例えば19塩基対からなる二重鎖領域では、1つのミスマッチは94.7％相補性を生じ、2つのミスマッチは約89.5％相補性を生じ、そして3つのミスマッチは約84.2％相補性を生じ、二重鎖領域を実質的に相補性にさせる。したがって実質的に同一であるとは、別の配列と約84％より大きい同一性を指す。
【００６９】
或る実施形態では、第一鎖及び第二鎖は各々、修飾リボヌクレオチドの少なくとも1つの群及びフランキング・リボヌクレオチドの少なくとも1つの群を含み、それにより修飾リボヌクレオチドの各群は少なくとも1つのリボヌクレオチドを含み、そしてそれによりフランキング・リボヌクレオチドの各群は少なくとも1つのリボヌクレオチドを含むが、この場合、第一鎖の修飾リボヌクレオチドの各群は第二鎖上のフランキング・リボヌクレオチドの一群と一列に並べられ、そしてこの場合、５’最末端リボヌクレオチドは修飾リボヌクレオチドの一群から選択され、そして第二鎖の３’最末端リボヌクレオチドはフランキング・リボヌクレオチドの群から選択される。いくつかの実施形態では、修飾リボヌクレオチドの各群は単一のリボヌクレオチドから成り、フランキング・リボヌクレオチドの各群は単一のヌクレオチドヌクレオチドからなる。
【００７０】
さらに別の実施形態では、第一鎖上のフランキング・リボヌクレオチドの群を形成するリボヌクレオチドは、修飾リボヌクレオチドの群を形成するリボヌクレオチドに比して３’方向に整列される非修飾リボヌクレオチドであり、そして第二鎖上の修飾リボヌクレオチドの群を形成するリボヌクレオチドは、フランキング・リボヌクレオチドの群を形成するリボヌクレオチドに比して５’方向に整列される修飾リボヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡの第一鎖は5〜約20、8〜12、好ましくは9〜12群の修飾リボヌクレオチドを含み、そして第二鎖は7〜11、好ましくは8〜11群の修飾リボヌクレオチドを含む。
【００７１】
第一鎖及び第二鎖は、非核酸ポリマー、例えば特にポリエチレングリコールで構成され得るループ構造により連結され得る。代替的には、ループ構造は、修飾及び非修飾リボヌクレオチド並びに修飾及び非修飾デオキシリボヌクレオチドを含めた核酸で構成され得る。
【００７２】
さらに、ｓｉＲＮＡの第一鎖の５’末端は第二鎖の３’末端と連結され得るし、あるいは第一鎖の３’末端は第二鎖の５’末端と連結され、上記連結は核酸リンカー又は非核酸リンカーを介している。或る実施形態では、核酸リンカーは約2〜100核酸、好ましくは約2〜約30核酸の長さを有する。
【００７３】
種々の実施形態において、本発明は、以下の構造を有する化合物の投与を提供する：
５’（Ｎ）ｘ−Ｚ      ３’      （アンチセンス鎖）
３’Ｚ’−（Ｎ’）ｙ  ５’      （センス鎖）
（ここで、Ｎ及びＮ’は各々、その糖残基で修飾されるか又は修飾され得ないリボヌクレオチドであり;そして（Ｎ）ｘ及び（Ｎ’）ｙの各々は、Ｎ又はＮ’が共有結合により次のＮ又はＮ’とつなげられ、ここで、ｘ及びｙの各々は、18から40の間の整数であり；
Ｚ及びＺ’は各々、存在するか又は存在せず、しかし存在する場合、それが存在する鎖の３’末端に共有結合される1〜5連続ヌクレオチドであり；そして
（Ｎ’）ｙの配列は、哺乳類ｍＲＮＡ中の約18〜約40連続リボヌクレオチドと実質的同一性を有するセンス配列を含む）。好ましい実施形態では、ｍＲＮＡは本明細書中に開示される遺伝子のうちのいずれか1つから転写されるｍＲＮＡから選択される。
【００７４】
いくつかの実施形態では、化合物はホスホジエステル結合を含む。
【００７５】
種々の実施形態では、化合物は、ｘ＝ｙであり、そしてｘが18、19、20、21、22及び23からなる群から選択される整数であるリボヌクレオチドを含む。或る実施形態では、ｘ＝ｙ＝19又はｘ＝ｙ＝23である。
【００７６】
いくつかの実施形態では、化合物は、平滑末端化され、例えばこの場合、Ｚ及びＺ’はともに存在しない。代替的一実施形態では、化合物は少なくとも1つの３’オーバーハングを含み、この場合、Ｚ又はＺ’のうちの少なくとも1つが存在する。Ｚ及びＺ’は、独立して、以下に記載されるような1つまたは複数の共有結合修飾又は非修飾ヌクレオチド、例えば逆方向ｄＴ又はｄＡ；ｄＴ、ＬＮＡ（ロックされた核酸）、鏡像体ヌクレオチド等を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｚ及びＺ’は、各々独立して、ｄＴ及びｄＴｄＴから選択される。
【００７７】
いくつかの実施形態では、化合物は、それらの糖残基中に修飾されない1つまたは複数のリボヌクレオチドを含む。他の実施形態では、化合物は、糖残基中に修飾された少なくとも1つのリボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、化合物は、糖残基の２‘位置に一修飾を含む。糖残基の２’位置における修飾は、アミノ、フルオロ、アルコキシ及びアルキル部分を包含する。或る好ましい実施形態では、アルコキシ修飾は、糖残基の２‘位置のメトキシ部分である（２’−Ｏ−メチル；２’−Ｏ−Ｍｅ；２’−Ｏ−ＣＨ３）。
【００７８】
いくつかの実施形態では、化合物は、アンチセンス及びセンス鎖の一方又は両方に修飾交互リボヌクレオチドを含む。或る実施形態では、化合物は、アンチセンス及びセンス鎖に修飾交互リボヌクレオチドを含む。いくつかの好ましい実施形態では、アンチセンス鎖の中央リボヌクレオチドは修飾されない;例えば19−ｍｅｒ鎖中の位置１０におけるリボヌクレオチド。
【００７９】
或る実施形態では、本発明は、以下の構造を有する化合物の投与を提供する：
５’（Ｎ）ｘ３’        （アンチセンス鎖）
３’（Ｎ’）ｙ５’      （センス鎖）
（ここで、各々のx及びy＝19であり、並びに（Ｎ）ｘ及び（Ｎ’）ｙは完全相補性であり；
（Ｎ）ｘ及び（Ｎ’）ｙ中の交互リボヌクレオチドはリボヌクレオチドの糖残基中に２’−Ｏ−メチル修飾を生じるよう修飾され；
（Ｎ）ｘの５’及び３’末端の各Ｎは修飾され；
（Ｎ）ｙの５’及び３’末端の各Ｎ’は修飾されず；
（Ｎ）ｘ及び（Ｎ’）ｙの各々は、哺乳類遺伝子、任意に本明細書中に開示される遺伝子の1つから転写されるｍＲＮＡ中に存在するか又はそれと相補的である。
（Ｎ）ｘ及び（Ｎ’）ｙは、３’及び５’末端でリン酸化されるか又は非リン酸化され得る）。
【００８０】
本発明の或る実施形態では、交互リボヌクレオチドは、化合物のアンチセンス及びセンス鎖の両方における糖残基の２’位置で修飾される。特に、例示的ｓｉＲＮＡは、２’−Ｏ−メチル（Ｍｅ）基がアンチセンス鎖の第１、第３、第５、第７、第９、第１１、第１３、第１５、第１７及び第１９ヌクレオチド上に存在し、それにより非常にぴったり同一の修飾、即ち２’−Ｏ−Ｍｅ基がセンス鎖の第２、第４、第６、第８、第１０、第１２、第１４、第１６及び第１８ヌクレオチドに存在した。付加的には、これらの特定のｓｉＲＮＡ化合物も平滑末端化される、ということが留意されるべきである。
【００８１】
或る実施形態では、化合物のアンチセンス及びセンス鎖の一方又は両方に修飾されたリボヌクレオチドを有する交互化合物が投与され、19−ｍｅｒ及び23−ｍｅｒに関しては、アンチセンス鎖の５’及び３’末端のリボヌクレオチドがそれらの糖残基で修飾され、そしてセンス鎖の５’及び３’末端のリボヌクレオチドはそれらの糖残基で修飾されない。21−ｍｅｒに関しては、センス鎖の５‘及び３’末端のリボヌクレオチドがそれらの糖残基で修飾され、そしてアンチセンス鎖の５’及び３’末端のリボヌクレオチドはそれらの糖残基で修飾されない。上記のように、アンチセンス鎖の中央ヌクレオチドは修飾されない、というのが好ましい。
【００８２】
本発明の好ましい一実施形態によれば、投与されているｓｉＲＮＡのアンチセンス及びセンス鎖は、３’末端でのみリン酸化され、５’末端ではリン酸化されない。本発明の別の好ましい実施形態によれば、アンチセンス及びセンス鎖は非リン酸化される。本発明のさらに別の好ましい実施形態では、センス鎖の最５’リボヌクレオチドは、in vivo５’リン酸化の任意の可能性を無くすよう修飾される。
【実施例】
【００８３】
これ以上詳述しないが、当業者は、前述の説明を用いて、その最高程度まで本発明を利用し得ると考えられる。したがって以下の好ましい特定の実施形態は、単なる例証として意図されるべきであって、如何なる点でも本発明を限定するものではない。
【００８４】
本明細書中に特定的に記載されない当業界で知られた標準分子生物学プロトコールは、一般的に、Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New-York (1989, 1992)に、並びにAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1988)におけるのと本質的に同様に模範とされる。
【００８５】
本明細書中に特定的に記載されない当業界で知られた標準有機合成プロトコールは、一般的に、Organic syntheses: vol. 1-79, editors vary, J. Wiley, New-York (1941-2003)；Gewert et al., Organic synthesis workbook, Wiley-VCH, Weinheim (2000)； Smith & March, Advanced Ooganic Chemistry, Wiley-Interscience; 5th edition (2001)におけるのと本質的に同様に模範とされる。
【００８６】
本明細書中に特定的には記載されない当業界で既知の標準医学化学的方法は、一般的に、Pergamon Pressにより出版された種々の著者及び編集者によるシリーズ「総合医薬品化学（Comprehensive Medicinal Chemistry）」におけるのと本質的に同様に模範とされる。
【００８７】
明細書、特許請求の範囲及び／又は図面に開示された本発明の特徴は、別々に、そしてその任意の組合せで、その種々の形態で本発明を具体化するための材料であり得る。
【００８８】
別記しない限り、本明細書中で用いられる技術用語及び科学用語は全て、開示される本発明が属する当業界の当業者に一般に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書中に記載されるものと類似の又は等価の任意の方法及び材料が本発明の実施又は試験に用いられ得るが、しかし好ましい方法、用具及び材料は記載されるようなものである。本発明が従来の発明によるこのような開示に先行する権利を有さないことを認めると意図されるべきものは、本明細書中にはない。
【実施例１】
【００８９】
ＣＯＰＤ及び肺気腫に関するモデル及び結果
以下に示すように、遺伝子ＲＴＰ８０１（同時譲渡特許公報WO 06/023544A2及び同時譲渡出願PCT/US2007/01468参照）（これらの記載内容は参照により全体が本明細書中で援用される）に対して向けられる水溶液中の例示的ｓｉＲＮＡ（ＲＥＤＤ１４と呼ばれる）を、以下の動物モデルで試験した：
＊喫煙誘導性肺気腫モデル：  タバコの煙への長期曝露は、いくつかの動物、例えば特にマウス、モルモットにおいて肺気腫を引き起こす。
＊肺気腫の引き金としての肺プロテアーゼ活性。
＊肺気腫のＶＥＧＦＲ抑制モデル。
＊齧歯類におけるヒト好中球／膵臓エラスターゼによる気管支滴下注入。
＊ＭＭＰ（マトリックス・メタロプロテアーゼ）誘導性肺気腫。
＊炎症誘導性肺気腫。
【００９０】
付加的には、肺気腫モデルは、遺伝的手段により作られ得る（例えばＴＳＫ突然変異を保有するマウス）し、肺気腫動物は、肺気腫に対する感受性を有する既知の修飾因子、とりわけ肺損傷、肺胞形成不全、過酸素症、糖質コルチコイド処置及び栄養により作成され得る。
【００９１】
Ａ．  肺気腫のマウスモデル（ＲＴＰ８０１ノックアウトマウスを使用）における疾患発症に及ぼすＲＴＰ８０１の欠如の影響の評価
（１）喫煙（ＣＳ）誘導性炎症及びアポトーシスを、5匹のＲＴＰ８０１  ＫＯ及び5匹の対照野生型４月齢雄マウスで開始した。マウスを、7日間、強度のＣＳ（Rangasamy et al.（上記参照）に記載されたような）に付した。上記のＶＥＧＦＲ抑制実験からのＫＯ及びＷＴ非処置マウスも、この実験のための非処置対照群として役立てた。その後、肺をアガロース膨張し、固定し、そしてパラフィン中に包埋して、ＫＯマウスにおける発症酸化ストレスを、以下により査定した：
ａ）肺切片中の８−オキソ−ｄＧの免疫組織化学的局在及び定量；
ｂ）特異的抗体を用いた肺切片における活性カスパーゼ３の免疫組織化学的局在及び定量、あるいはＴＵＮＥＬ陽性細胞数の定量的評価；
ｃ）肺抽出物中のセラミド濃度の測定；
ｄ）肺抽出物中のカスパーゼ活性の測定。
【００９２】
（２）ＫＯマウスにおける長期喫煙
6匹のＫＯ及び6匹の月齢適合ＷＴ雌マウスを、6ヶ月の期間中、強度の喫煙（5時間／日）に付した。次にマウスを屠殺し、平均中隔間直径（肺気腫発症のパラメーター）を形態学的アプローチを用いて評価した。
【００９３】
Ｂ．  ＲＴＰ８０１不活性ｓｉＲＮＡの肺内送達を用いた内因性ＲＴＰ８０１を抑制することによる肺気腫のマウスモデルにおける疾患進行に及ぼすＲＴＰ８０１の欠如の影響の評価
ＣＳ誘導性炎症を、Ｃ５７ＢＬ６マウス、10匹／群の2群における7日喫煙により誘導した。群１：ＣＳ＋対照ｓｉＲＮＡ（ＲＥＤＤ８）ｓｉＲＮＡの送達；群２：ＣＳ＋ＲＴＰ８０１  ｓｉＲＮＡ（ＲＥＤＤ１４）。マウスの対照群にいずれかの型のｓｉＲＮＡを滴注したが、室内エアコンディション中に保持した。ノックアウトマウスを用いた上記の実験の場合と同様に、動物を評価した。
【００９４】
方法
喫煙（ＣＳ）への曝露
喫煙機（モデルＴＥ−１０、Teague Enterprises, Davis, CA, USA）を用いて、２Ｒ４Ｆ参照タバコ（2.45 mgニコチン／タバコ;米国ケンタッキー州レキシントン、ケンタッキー大学タバコ研究所から購入）を燃焼することにより、曝露を実行した（7 時間／日、7日／週）。各々のくすぶっているタバコを2秒間吐き出し、1.05 L／分の流速で、毎分1回、全部で8回吐き出して、35 cm3の標準吐出量を提供した。一度に5本のタバコを燃焼することにより、副流煙（89％）と主流煙（11％）の混合物を生じるよう、喫煙機を調整した。小室大気を総懸濁微粒子及び一酸化炭素に関してモニタリングし、それぞれ90 mg/m3及び350 ppmの濃度であった。
【００９５】
形態学的及び外形計測的分析
マウスのＣＳへの曝露又はＲＴＰ８０１発現プラスミドの滴注後、マウスをハロタンで麻酔して、以前に記載されたように肺を25 cmの定圧で0.5％低溶融アガロースで膨張させた。膨張肺を10％緩衝ホルマリン中で固定し、パラフィン中に包埋した。切片（5 μm）をヘマトキシリン及びエオシンで染色した。平均肺胞直径、肺胞長及び平均線形中隔を、Image Pro Plusソフトウェア（Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA）を用いたコンピューター援用外形計測により測定した。各群の肺切片を暗号化し、ニコンＥ８００顕微鏡、20×レンズを用いて、スライドの同一性を知らされていない研究者が代表的画像（15／肺切片）を得た。
【００９６】
気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）及び表現型分類
ＣＳへの曝露又はＲＴＰ８０１発現プラスミドの滴注後、マウスをペントバルビタールナトリウムで麻酔した。マウスの肺から収集したＢＡＬ液を遠心分離（4℃で500 g）し、細胞ペレットをリン酸塩緩衝生理食塩水中に再懸濁した。洗浄液中の細胞の総数を確定し、2×104細胞をガラススライド上で細胞遠心分離（Shandon Southern Products, Pittsburgh, PA, USA）して、ライト・ギムザ染色で染色した。標準細胞学的技法に従って、300細胞に関して鑑別細胞計数を実施した。
【００９７】
肺中の肺胞アポトーシス細胞集団の同定
肺中でアポトーシスを受けている異なる肺胞細胞型を同定するために、活性カスパーゼ３の免疫組織化学的染色を、室内空気（ＲＡ）並びにＣＳ曝露マウスからの肺切片で実施した。肺中のアポトーシスＩＩ型上皮細胞を同定するために、活性カスパーゼ３標識後、肺切片を抗マウス界面活性タンパク質Ｃ（ＳｐＣ）抗体とともに、次に抗ウサギテキサスレッド抗体とともにインキュベートした。先ず抗マウスＣＤ  ３１抗体とともに、次にビオチニル化ウサギ抗マウス二次抗体とともに切片をインキュベートすることにより、アポトーシス上皮細胞を同定した。肺切片をＰＢＳ中ですすぎ、次にストレプトアビジン−テキサスレッド共役複合体とともにインキュベートした。先ずラット抗マウスＭａｃ−３抗体とともに、次に抗ラットテキサスレッド抗体とともに切片をインキュベートすることにより、肺中のアポトーシスマクロファージを同定した。最後に、ＤＡＰＩを全ての肺切片に適用し、5分間インキュベートして、洗浄し、Vectashield HardSet封入剤で封入した。ＤＡＰＩ及びフルオレセインをそれぞれ330〜380 nm及び465〜495 nmで可視化した。ニコンＥ８００顕微鏡、40×レンズで、肺切片の画像を得た。
【００９８】
活性カスパーゼ−３の免疫組織化学的局在
活性カスパーゼ−３検定の免疫組織化学的染色を抗活性カスパーゼ−３抗体を用いて実施し、そして活性カスパーゼ−３陽性細胞をImage Pro Plusプログラムを用いてマクロで計数した。肺胞長と呼ばれる本明細書中の肺胞プロフィールの和により計数を正規化し、μmで表した。肺胞長は、平均線形中隔と逆相関し、即ち、肺胞中隔が破壊されると、平均線形中隔は総肺胞長として増大し、即ち総肺胞中隔長は低減する。
【００９９】
カスパーゼ３活性検定
カスパーゼ−３活性の活性を、メーカーの使用説明書に従って蛍光計測検定を用いて肺組織抽出物中で測定した。瞬間凍結肺組織（ｎ＝3／群）を検定緩衝液でホモジナイズし、その後、音波処理し、800 ×gで遠心分離した。核及び細胞破砕屑の除去後、上清（300 μgタンパク質）を次にプロ蛍光性基質とともに室温で1時間インキュベートし、蛍光強度をTyphoonホスホイメージャー（Amersham Biosciences, Inc., Piscataway, NJ, USA）を利用して測定した。結果を、カスパーゼ３酵素活性の単位で表現され、総タンパク質濃度により正規化される特定カスパーゼ−３基質切断の速度として表す。活性組換えカスパーゼ３を、検定標準（0〜4 U）として利用した。基質を伴わない組織溶解物、検定緩衝液単独、及びカスパーゼ３阻害剤を伴う溶解物を、陰性対照として利用した。
【０１００】
８−オキソ−ｄＧの免疫組織化学的局在
８−オキソ−ｄＧの免疫組織化学的局在及び定量化に関して、ＣＳに曝露されるか又はＲＴＰ８０１発現プラスミドで滴注されたマウスの肺切片を、抗８−オキソ−ｄＧ抗体とともにインキュベートし、マウス抗体を用いるInnoGenexTM Iso-IHC DABキットを用いて染色した。８−オキソ−ｄＧ陽性細胞をマクロ（Image Pro Plus使用）で計数し、記載したように肺胞長により計数を正規化した。
【０１０１】
マウス肺へのプラスミドＤＮＡの滴下注入
ＲＴＰ８０１発現及び対照ベクターのプラスミドＤＮＡを、内毒素無含有ＤＮＡ単離キット下で調製した。気管内滴下注入のために、50 ugのプラスミドＤＮＡを80 ul滅菌ペルフルオロカーボン中で送達した。ペルフルオロカーボンの酸素保有特性はこれらの容積でそれを良好耐容性にするが、一方、その物理化学的特性は、気管内に滴下注入されると、非常に効率的な遠位肺送達を可能にする。マウスを短時間吸入ハロタン曝露により麻酔して、舌を鉗子によりそっと前方に引き出して、鈍端血管カテーテルを用いて舌の基部に適用したペルフルオロカーボン溶液で気管を滴注した。
【０１０２】
マウス肺へのｓｉＲＮＡの滴下注入
ケタミン／キシラジン（115/22 mg/kg）の腹腔内注射により、マウスを麻酔した。5連続10 μl部分を送達することにより、0.9％ＮａＣｌの50 μl容積中で、50 μgのｓｉＲＮＡを鼻内滴注した。鼻内滴注の終了時に、マウスの頭部を1分間真直ぐに保持して、滴注溶液全てが内側に流れ込むのを保証した。
【０１０３】
さらなる情報に関しては、以下を参照されたい：Rangasamy T, Cho CY, Thimmulappa, RK, Zhen L, Srisuma SS, Kensler TW, Yamamoto M, Petrache I, Tuder RM, Biswal S. Submitted to Journal of Clinical Investigation；Yasunori Kasahara, Rubin M. Tuder, Carlyne D. Cool, David A. Lynch, Sonia C. Flores, and Norbert F. Voelkel.. Am J Respir Crit Care Med Vol 163. pp 737-744, 2001；Yasunori Kasahara, Rubin M. Tuder Lamute Teraseviciene-Stewart, Timothy D. Le Cras, Steven Abman, Peter K. Hirth, Johannes Waltenberger, and Norbert F. Voelkel. J. Clin. Invest. 106: 1311-1319 (2000)；並びに総論：Robin M. Tuder, Sharon McGrath and Enid Neptune, The Pathological mechanisms of emphysema models: what do they have in common?, Pulmonary Pharmacology & Therpaeutics 2002における再検討。
【０１０４】
結果
１．  ＲＴＰ８０１発現プラスミドの滴下注入は、マウス肺における肺気腫様表現型を生じ、これは、（１）気管支肺胞洗浄細胞数の増大（図１Ａ）;（２）肺中隔細胞のアポトーシス（図１Ｂ）及び肺胞直径の増大（図１Ｃ）により明らかである。
２．  ＲＴＰ８０１  ｓｉＲＮＡ（ＲＥＤＤ１４）の滴下注入は、肺におけるＲＴＰ８０１発現の低減を生じた（図３Ｂ）。
３．  肺胞直径の拡大の欠如により明らかなように、ＲＴＰ８０１  ＫＯマウスは６ヶ月の喫煙後に肺気腫発症から防護された（図４）。
４．  1週間の喫煙後の炎症気管支肺胞細胞数の低減により明らかなように、ＲＴＰ８０１  ＫＯマウスは喫煙誘導性炎症から防護された（図２、Ａ−Ｂ）。
５．  活性化カスパーゼに関する肺切片染色により明らかなように、ＲＴＰ８０１  ＫＯマウスは肺中隔細胞の喫煙誘導性アポトーシスから防護された（図２Ｃ）。
６．  1週間の喫煙後の炎症気管支肺胞細胞数の低減により明らかなように、ＲＥＤＤ１４滴注マウスは喫煙誘導性炎症から部分的に防護された（図３Ａ）。
７．  活性化カスパーゼに関する肺切片染色により、そして抗活性化カスパーゼ３抗体を用いた肺抽出物の免疫ブロッティングにより明らかなように、ＲＥＤＤ１４滴注マウスは肺中隔細胞の喫煙誘導性アポトーシスから部分的に防護された（図３Ｃ）。
したがってｓｉＲＮＡは首尾よく肺に送達され、肺気腫の種々のマウスモデルにおける疾患進行を防止した。
【実施例２】
【０１０５】
噴霧エーロゾル処方物の単回口鼻吸入投与後のカニクイザルにおけるｓｉＲＮＡ（ＲＥＤＤ１４Ｃｙ３．５及びＩ５ＮＰ）の薬物動態及び組織分布
要約
蛍光標識ＲＥＤＤ１４Ｃｙ３．５及び／又はＩ５ＮＰ  ｓｉＲＮＡの噴霧エーロゾル処方物の単回口鼻吸入用量を、雄カニクイザルに投与した。用量投与後、血漿中のＩ５ＮＰの濃度、血漿中のＩ５ＮＰの非区画素因動態、肺におけるＲＥＤＤ１４Ｃｙ３．５の定性的分布、並びに肺中のＩ５ＮＰの半定量的分布を確定した。
【０１０６】
試験に用いられるｓｉＲＮＡの配列：
【０１０７】
【表１】
2010527914.tif 000002
【０１０８】
ＲＥＤＤ１４は、例示的ＲＴＰ８０１抑制ｓｉＲＮＡである；Ｉ５ＮＰは例示的ｐ５３抑制ｓｉＲＮＡである。
【０１０９】
3つの別個の用量処置を、以下で詳述するように動物に施した。理論的吸入達成用量のｓｉＲＮＡを毎分呼吸量（前処置中に測定）、試験品のエーロゾル濃度（噴霧器の前処置較正中に重量計測的に測定）、処置時間、総エーロゾル沈着分画（100％と仮定される）、並びに各用量投与前日の動物の体重から算定した。
【０１１０】
【表２】
2010527914.tif 000003
【０１１１】
Ｉ５ＮＰ又はＩ５ＮＰとＲＥＤＤ１４Ｃｙ３．５  ｓｉＲＮＡの混合物の吸入用量投与後のサルのいずれにおいても、処置関連臨床徴候は観察されなかった。
【０１１２】
処置１（Ｉ５ＮＰのみで用量投与）後、血液試料を用量投与後種々の時点で採取し、Ｉ５ＮＰ濃度をハイブリダイゼーション検定を用いて血漿中で測定した。血漿中のＩ５ＮＰの最高平均濃度（21.0±5.01 ng/mL）は、用量投与後分析した最初の時点（用量投与終了の15分後）で観察されたが、これは、吸入用量からの全身循環中へのＩ５ＮＰの吸収が迅速であった、ということを示す。血漿中濃度は低く、用量投与終了の8時間又は24時間後まで急速に減少し、その後、それらは定量限界より低かった（0.1 ng/mL）。
【０１１３】
サル血漿中のＩ５ＮＰ濃度に関して非区画薬物動態パラメーターを算定し、これらを以下に示す：
【０１１４】
【表３】
2010527914.tif 000004
【０１１５】
排出半減期（即ち1.5〜5.7時間）及びＡＵＣ0-inf（16.1〜72.0 ng.h/mL）の変動により実証されるように、個々の動物間のかなりの程度の変動が認められた。
【０１１６】
処置２（9:1の比でのＩ５ＮＰ及び蛍光標識ＲＥＤＤ１４Ｃｙ３．５  ｓｉＲＮＡの混合物）を、約2週間の洗浄期間後に動物１０１及び１０２に投与した。動物を安楽死させて、肺を用量投与終了の約30分後に採取した。動物１０２からの肺及び右腎臓を無傷で採取して、4％（v/v）パラホルムアルデヒド中で固定し、蛍光分析に出した。全ての肺葉から採取した切片全てにおいて、蛍光物質を検出した。細気管支から外側に肺胞壁に放射する蛍光標識を観察した。最強シグナルは、右尾状葉、並びに左頭葉の尾状切片と関連していると思われた。右腎で観察された標識はほとんどなく、せいぜい、わずかな残留染色が腎尿細管の管腔で観察された。
【０１１７】
動物１０１からの肺を取り出し、肺の各葉を切断して、細気管支組織と残りの末梢肺組織の試料を提供した。ハイブリダイゼーション分析によるＩ５ＮＰ濃度の分析のために必要になるまで、これらの試料を凍結保存した（約−80℃）。結果は、サル肺に関する特定検定が開発されていないため、半定量的であると考えられた。用量投与終了の約30分後、Ｉ５ＮＰは、各肺の全葉の細気管支と末梢組織の両方で、高濃度で見出された。濃度は肺葉全てを通して同様であり、そして一般的に細気管支試料より末梢組織の方が高かった。
【０１１８】
Ｉ５ＮＰのみを含む処置３を、処置２の約3週間後に動物１０３、１０４及び１０５に投与した。全動物から用量投与終了15分後に、そして各々個々のサルに関して最終時点で、血液試料を採取した。用量投与終了の6、24及び72時間後にＩ５ＮＰ濃度のハイブリダイゼーション検定のために、肺試料を採取した。用量投与終了の15分後のＩ５ＮＰの平均血漿濃度は、40.3±14.5 ng/mLであった。用量投与終了の6時間後、Ｉ５ＮＰレベルは11.1 ng/mL（動物１０３）で、24時間後では、0.192 ng/mL（動物１０４）であった。Ｉ５ＮＰの濃度は、用量投与終了の72時間後では血漿における定量限界（0.10 ng/mL）より低かった（動物１０５）。
【０１１９】
肺の左頭及び右尾状葉から採取した細気管支及び末梢肺組織において、Ｉ５ＮＰの相対濃度を測定した。相対濃度は各時点で採取した組織試料では同様であって、これらは時間の経過に伴って減少したが、しかしこれらは用量投与終了の72時間後に依然として検出可能であった。
【０１２０】
肺組織におけるｓｉＲＮＡのレベルは、全時点で、全身循環中のレベルよりはるかに高かった。Ｉ５ＮＰレベルは、用量投与後の各時点で肺の全葉において非常に良く似ていたが、これは、試験物質が全葉に送達されていた、ということを示す。用量投与終了の約30分後に、細気管支領域より高レベルのＩ５ＮＰが肺の末梢域に存在したが、これは、吸入用量投与により細気管支に送達された試験物質が迅速に吸収され、残りの肺組織に分布した、ということを示唆する。
【０１２１】
要するに、雄カニクイザルへの、蛍光標識ＲＥＤＤ１４Ｃｙ３．５及び／又はＩ５ＮＰ  ｓｉＲＮＡの噴霧エーロゾル処方物の単回口−鼻吸入用量の投与後、ｓｉＲＮＡの肺中分布及び全身曝露（血漿中）を確定した。血漿中のＩ５ＮＰの最高平均濃度は、用量投与終了後に分析した最初の時点で観察されたが、これは、吸入用量投与から全身循環中へのＩ５ＮＰの吸収が迅速であった、ということを示す。血漿中濃度は低く、急速に減少した。肺中のＩ５ＮＰのレベルは、全ての時点で血漿中のレベルより大きく、そしてレベルは用量投与終了後72時間でも依然として検出可能であった。肺中の両ｓｉＲＮＡの分布は、全面的で且つ広範囲に及んだ。Ｉ５ＮＰは投与部位（細気管支）から迅速に吸収されることが判明し、そして用量投与終了の30分後までに肺の末梢組織で高濃度で見出された。
【０１２２】
実験手順
用量処方物の調製
処置１及び処置３処方物の調製
用量投与当日に、各用量処方物を調製した。処方物は、清浄技法を用いて層流式フード下で調製した。
【０１２３】
Ｉ５ＮＰ  ｓｉＲＮＡを計量し、注射用滅菌水ＵＳＰ中に溶解して、40 mg/mL溶液を調製した。Ｉ５ＮＰ  ｓｉＲＮＡの取扱いは全て、光を遮断して、又は黄色光条件下で実施した。
【０１２４】
その結果生じた溶液を、滅菌容器中に濾過（0.22 μmフィルター）した。
【０１２５】
処置２処方物の調製
用量投与当日に、各用量処方物を調製した。処方物は、清浄技法を用いて層流式フード下で調製した。Ｉ５ＮＰ  ｓｉＲＮＡを計量し、注射用滅菌水ＵＳＰ中に溶解して、40 mg/mL溶液を調製した。ＲＥＤＤ１４Ｃｙ３．５  ｓｉＲＮＡを計量し、注射用滅菌水ＵＳＰ中に溶解して、40 mg/mL溶液を調製した。Ｉ５ＮＰおよびＲＥＤＤ１４Ｃｙ３．５の取扱いは全て、光を遮断して、又は黄色光条件下で実施した。
【０１２６】
ＲＥＤＤ１４Ｃｙ３．５（40 mg/mL）及びＩ５ＮＰ（40 mg/mL）溶液を1:9の比で混合し、滅菌容器中に濾過（0.22 μmフィルター）した。
【０１２７】
前処置及び処置手順
吸入曝露用具
流入及び流出管並びに呼吸ループを装備した小児麻酔型口鼻マスクを用いて、試験エーロゾルで動物を処置した。処置中、動物を拘束スリングに入れた。Aeroneb（Aerogen）噴霧器を用いて試験大気を発生させて、下記のように出力に関して査定した。試験物質への曝露のレベルを、曝露継続時間を変えることにより達成した。
【０１２８】
処置の開始前に、動物を、時間を漸次増大しながら、スリングおよび曝露マスクに順化させた。順化の後期段階中、注射用0.9％（w/v）滅菌塩化ナトリウム、ＵＳＰのエーロゾルに動物を曝露して、曝露系の全構成成分をそれらに提示した。
【０１２９】
前試験大気特性化
処置開始前に、試験エーロゾルの大気特性化を、Ｉ５ＮＰ  ｓｉＲＮＡ処方物のみを用いて実施した。
【０１３０】
2つのAerogen Aeroneb（登録商標）Pro Laboratory噴霧器系（1つは試験用そして1つはバックアップ用器具）に関して、呼吸帯での試験品出力の評価を重力測定的に実施した。物品エーロゾルの粒子サイズ分布分析を1つのマスクを通して実施し、Cascade Impactorを用いて重力測定データから質量中央値空気力学的直径（ＭＭＡＤ）±幾何標準偏差（ＧＳＤ）を算定した。
【０１３１】
達成投与量の算定
各処置レベルに関する活性成分の達成用量（mg/kg/回）を、以下のように確定した：
活性成分の達成用量（mg/kg/日）＝ＲＭＶ×活性濃度×Ｔ×Ｄ／ＢＷ
ここで、ＲＭＶ（Ｌ／分）＝前処置期間中に2回測定される毎分呼吸量＊
活性濃度（mg/L）＝前処置期間中に重力測定的分析により確定される活性成分のエーロゾル濃度
Ｔ（分）＝処置時間
Ｄ  ＝総エーロゾル沈着分画は100％であると仮定された
ＢＷ（kg）＝体重／処置前動物
＊  Buxco Bio System XAを用いて前処置期間中に測定
【０１３２】
ｓｉＲＮＡの理論的吸入達成用量を、以下のように算定した：
【０１３３】
【表４】
2010527914.tif 000005
【０１３４】
毎分呼吸量査定
前処置中2回、各サルの毎分呼吸量を15分間継続的に記録した。15分間隔の全体的平均を各動物に関して確定し、このパラメーターは処置による影響を及ぼされない、と仮定した。Buxco Bio System XAを用いて測定を行なった。
【０１３５】
処置
動物を以下のように処置した：
【０１３６】
【表５】
2010527914.tif 000006
【０１３７】
処置１に関して
試験1日目に、Aeroneb用具により生成される噴霧エーロゾルとして口鼻マスクを介して35 mg/kgの標的用量のＩ５ＮＰ  ｓｉＲＮＡを、利用可能なサルのうちの4匹（１０１〜１０４）に投与した。2.0 L／分希釈気流を用いた。動物の体重及び測定毎分呼吸量に、並びに40 mg/mLの処方物濃度を用いたAeroneb用具の達成出力に基づいて、投与された総用量を算定した。動物に関する曝露時間を変更することにより、投与用量を調整した。動物は、単回較正試験Aeronebを用いて、平行してというよりむしろ、順次、処置を受けた。
【０１３８】
処置２に関して
試験１５日目に、Aeroneb用具により生成される噴霧エーロゾルとして口鼻マスクを介して35 mg/kgの標的用量のＩ５ＮＰ及びＲＥＤＤ１４Ｃｙ３．５（蛍光標識）ｓｉＲＮＡの混合物を、利用可能な動物のうちの2匹（１０１及び１０２）に投与した。2.0 L／分希釈気流を用いた。動物の体重及び測定毎分呼吸量に、並びにｓｉＲＮＡの40 mg/mLの処方物濃度を用いたAeroneb用具の達成出力に基づいて、投与されたｓｉＲＮＡの総用量を算定した。動物に関する曝露時間を変更することにより、投与用量を調整した。
【０１３９】
処置３に関して
試験３５日目に、Aeroneb用具により生成される噴霧エーロゾルとして口鼻マスクを介して35 mg/kgの標的用量のＩ５ＮＰ  ｓｉＲＮＡを、3匹の残りの主要試験動物（１０３〜１０５）に投与した。2.0 L／分希釈気流を用いた。動物の体重及び測定毎分呼吸量に、並びに40 mg/mLの処方物濃度を用いたAeroneb用具の達成出力に基づいて、投与された総用量を算定した。動物に関する曝露時間を変更することにより、投与用量を調整した。
【０１４０】
分析のための試料採取
血液／血漿（処置１）
用量投与前、吸入終了の15分後、30分後、1、2、4、6、8及び24時間後に、全用量を摂取した各動物（１０１、１０２、１０３及び１０６）の左又は右大腿静脈から、血液試料（0.5 mL）を採取した。抗凝血剤としてＫ３ＥＤＴＡを有する試験管中に血液を収集し、次に遠心分離を待つ間、湿潤氷上に載せた。
【０１４１】
血液／血漿及び組織（処置２）
用量投与前、吸入終了の15分後及び30分後に、血液試料（0.5 mL）を採取した。各動物（１０１及び１０２）の左大腿静脈からＫ３ＥＤＴＡ試験管中に血液を収集し、遠心分離を待つ間、湿潤氷上に載せた。
【０１４２】
30分血液採取後できるだけ直ぐに、前麻酔剤（ケタミン／キシラジン・カクテル）の筋肉内注射を動物に施し、剖検域に移した。次に動物をペントバルビタールナトリウムの静脈内注射により麻酔し、その後、腋窩動脈又は大腿動脈の切開により失血させた。
【０１４３】
血液／血漿及び組織（処置３）
用量投与前、吸入終了の15分後に、血液試料（0.5 mL）を全動物（１０３、１０４及び１０５）から採取した。第３血液試料は、吸入終了の6時間後（動物１０３）、24時間後（動物１０４）又は72時間後（動物１０５）に採取した。各動物（１０３〜１０５）の左又は右大腿静脈からＫ３ＥＤＴＡ試験管中に血液を収集し、遠心分離を待つ間、湿潤氷上に載せた。
【０１４４】
最終血液採取直後に、前麻酔剤（ケタミン／キシラジン・カクテル）の筋肉内注射を動物に施し、剖検域に移した。次に動物をペントバルビタールナトリウムの静脈内注射により麻酔し、その後、腋窩動脈又は大腿動脈の切開により失血させた。以下の組織及び器官を各動物から採取した：ハイブリダイゼーション検定のために両肺；肝臓、腎臓（両側）、脾臓、心臓、脳及び精巣。
【０１４５】
試料処理
血液／血漿に関する試料処理（処置１、２及び３）
血液を、それが遠心分離されるまで、4℃で2700 rpmで約10分間、湿潤氷上に保持して、血漿を分離した（採取1時間以内）。血漿試料を分離し、適切に標識したバイアルに移し、ドライアイス上に載せた後、約−80℃で保存した。
【０１４６】
ワトソンＬＩＭＳ系を用いて、血漿試料をトラッキングした。
【０１４７】
肺に関する試料処理（処置２）
処置２の後の剖検時に、動物１０１の肺を動物から取り出した。肺を、個々の肺葉に分離した。気管支／細気管支並びに各肺葉の直周囲領域をできるだけ注意して切り出し、肺葉毎にプールした。残りの組織域を、肺葉毎にプールした。各プール試料（即ち、気管支／細気管支及び各肺葉に関する残りの組織）を、ハイブリダイゼーション検定による分析のために急速冷凍（−80℃）保存した。動物１０１からの肺試料を、ワトソンＬＩＭＳ系を用いてトラッキングした。
【０１４８】
処置２の後の剖検時に、動物１０２の肺、気管支および気管を動物から取り出した。肺を、気管及び／又は気管支を介して注射器を用いて導入した4％パラホルムアルデヒドで灌流し、この固定液中に、周囲温度で約21時間、保存した。この後、できるだけ多くの元の固定液を、気管／気管支を介して注射器により引抜いて、0.2％パラホルムアルデヒドと入れ替えた。固定肺を、蛍光分布に関して分析した。
【０１４９】
腎臓に関する試料処理（処置２）
処置２の後の剖検時に、動物１０２の右腎臓を動物から取り出した。腎臓を、各々が門部を通るよう、縦方向に1回、横方向に1回切断して４半分に切断した後、4％パラホルムアルデヒド中に浸漬して、約21時間冷蔵した。この後、固定液を0.2％パラホルムアルデヒドに変えて、蛍光分布に関して腎臓を分析した。
【０１５０】
肺に関する試料処理（処理３）
処置３の後の剖検の各特定時間に、動物１０３、１０４又は１０５の肺を動物から取り出した。各組の肺を、個々の肺葉に分離した。気管支／細気管支並びに各肺葉の直周囲領域をできるだけ注意して切り出し、肺葉毎にプールした。残りの組織域を、肺葉毎にプールした。各プール試料（即ち、気管支／細気管支及び各肺葉に関する残りの組織）を、ハイブリダイゼーション検定による分析のために急速冷凍（−80℃）保存した。動物１０３、１０４及び１０５からの肺試料を、ワトソンＬＩＭＳ系を用いてトラッキングした。
【０１５１】
試料分析
血漿及び肺ハイブリダイゼーション分析
処置１及び３の後、認証ハイブリダイゼーション法に従ってＰＣＳ−ＭＴＬでのＩ５ＮＰ  ｓｉＲＮＡ濃度に関して、血漿試料を分析した。
【０１５２】
動物１０１からの全ての肺試料（即ち、左頭葉、細気管支及び残り部分；左尾状葉、細気管支及び残り部分；右頭葉、細気管支及び残り部分；右中葉、細気管支及び残り部分；右尾状葉、細気管支及び残り部分；ならびに右副葉、細気管支及び残り部分）を、Ｉ５ＮＰ  ｓｉＲＮＡ濃度に関して分析した。動物１０３、１０４及び１０５に関して、左頭葉（細気管支及び残り部分）及び右尾状葉（細気管支及び残り部分）を、Ｉ５ＮＰ  ｓｉＲＮＡ濃度に関して分析した。ハイブリダイゼーション法を用いて分析を実施し、濃度値をラット腎臓較正曲線から外挿した。肺試料に関して得られた結果は、半定量的であると考えられた。
【０１５３】
肺及び腎臓蛍光分析
処置２の後、動物１０２からの肺及び腎臓試料を、蛍光（ＲＥＤＤ１４Ｃｙ３．５  ｓｉＲＮＡから）の分布に関して分析した。結果は、定量的であるとみなされた。
【０１５４】
データ分析
血漿濃度及び統計学的分析
平均血漿濃度値及び標準偏差を、適切な場合、算定した。
【０１５５】
薬物動態
血漿における非区画素因動態を、処置１の後の個々の動物からの濃度データに関して実施した。以下のパラメーターを、適用可能な場合、概算した：
Ｃmax          最高観察血漿濃度
tmax            最高濃度が生じた時間
ｋ            対数血漿対時間曲線の見掛けの最終相における選択時点の線形回帰分析により確定される最終速度定数
ｔ1/2            1ｎ2/kとして算定される最終半減期
ＡＵＣ０-tlast      0時間から最終定量可能値までの血漿濃度対時間曲線下面積
ＡＵＣ０-inf        0時間から無限時間までの血漿濃度対時間曲線下面積
外挿ＡＵＣ０-inf％            （ＡＵＣ０-inf−ＡＵＣ０-tlast）／×100
【０１５６】
WinNonlinバージョン３．２コンピューターソフトウェアを用いて、全ての薬物動態パラメーターを概算した。
【０１５７】
結果
動物及び用量特性
処置１を用量投与する前日、雄サルの平均体重は2.9±0.46 kg（2.6 kg〜3.6 kgの範囲）であった。処置２に関して、動物１０１及び１０２の体重は各動物に関して2.8 kgであったが、一方、処置３に関しては、平均体重は3.0±0.76 kg（2.3 kg〜3.8 kgの範囲）であった。
【０１５８】
投与したｓｉＲＮＡの用量曝露時間及び概算用量レベル：処置１に関しては、用量曝露時間は15分（１０１、１０２）又は10分（１０３、１０６）であった。平均算定投与用量は、30.9±0.98 mg/kg（29.45〜31.56 mg/kgの範囲）であった。処置２に関しては、動物１０１は29.45 mg/kgの算定用量を15分に亘って摂取し、そして動物１０２は25.14 mg/kgの算定用量を13分に亘って摂取した。処置３に関しては、用量曝露時間は10分（１０３、１０４）又は12分（１０５）であった。平均算定投与用量は、30.4±2.17 mg/kg（29.13〜32.93 mg/kgの範囲）であった。
【０１５９】
臨床観察
Ｉ５ＮＰ又はＩ５ＮＰとＲＥＤＤ１４Ｃｙ３．５  ｓｉＲＮＡの混合物の吸入用量投与後のサルのいずれにおいても、処置関連臨床徴候は観察されなかった。種々の器官及び組織で観察された多種多様な肉眼的知見は、性的未熟性に関連し、死の直前であるか又は偶発的なものであると、そして毒物学的有意性を有さないと見なされた。
【０１６０】
血漿中のＩ５ＮＰ  ｓｉＲＮＡの濃度及び薬物動態
血漿中のＩ５ＮＰ  ｓｉＲＮＡの濃度
処置１の後、雄サルの血漿中のＩ５ＮＰの最高平均濃度は21.0±5.01 ng/mLで、用量投与終了の15分後（測定された最初の時点）に観察された。その後、血漿Ｉ５ＮＰレベルは、用量投与終了の8時間後まで減少した（0.588±0.561 ng/mL、Ｃmax値の約3％）。動物１０１では、Ｉ５ＮＰは用量投与終了の24時間後に依然として検出可能であった（0.205 ng/mL）が、しかし値は他のすべての動物においてこの時点で定量限界（ＬＬＱＱ）より低かった。検定のためのＬＬＱＱは0.10 ng/mlであった。
【０１６１】
処置３の後、用量投与終了の15分後に全ての動物から、そして最終的には単一動物／時点（用量投与終了の6時間後、14時間後及び72時間後）から、血液試料を採取した。用量投与終了の15分後のＩ５ＮＰの平均血漿濃度は、40.3±14.5 ng/mLであった。用量投与終了後6時間目に、Ｉ５ＮＰレベルは11.1 ng/mL（動物１０３）、24時間目では0.192 ng/mL（動物１０４）であった。Ｉ５ＮＰの濃度は、用量投与終了の72時間後には血漿中で定量限界（0.10 ng/mL）未満であった（動物１０５）。
【０１６２】
血漿中のＩ５ＮＰ  ｓｉＲＮＡの薬物動態（処置１）
ＡＵＣ0-tlastに関する平均値は、38.9±23.6 ng・h/mL（15.8〜70.3の範囲）であった。排出相は4動物全てに関して明瞭に定義されると考えられ、したがって排出速度定数（ｋel）、排出半減期（ｔ1/2）及びＡＵＣ0-infを、各サルに関して概算した。平均ｋelは0.279±0.143 h-1、平均ｔ1/2は3.12±1.83 h、そして平均ＡＵＣ0-infは40.6±24.5 ng・h/mL（16.1〜72.0 ng・h/mLの範囲）であった。ｔlastから無限時間までの外挿％は、0.82〜9.40％の範囲であった。
【０１６３】
肺及び腎臓におけるＲＥＤＤ１４Ｃｙ３．５  ｓｉＲＮＡの定量的分布
肺の全肺葉から採取した全切片において、蛍光標識を検出した。細気管支から外側に肺胞壁に放射する蛍光標識を観察した。最強シグナルは、右尾状葉、並びに左頭葉の尾状切片と関連していると思われた。
【０１６４】
右腎で観察された標識はほとんどなく、せいぜい、わずかな残留染色が腎尿細管の管腔で観察された。
【０１６５】
肺中のＩ５ＮＰ  ｓｉＲＮＡの半定量的分布
動物１０１（処置２の後）からの肺組織に関して、各肺葉を、細気管支及び直周囲組織並びに残りの部分、末梢肺葉組織に分離した。両組織型で、そして肺の6つの肺葉全てに関して、測定を行なった。用量投与終了の約30分後、Ｉ５ＮＰは細気管支並びに各肺の全肺葉の末梢組織の両方において高濃度であることが判明した。濃度は肺葉全てを通して同様であり、そして一般的に細気管支試料より末梢組織の方が高かった。
【０１６６】
これらの結果に従って、動物１０３、１０４及び１０５に吸入用量のＩ５ＮＰを投与し、用量投与終了の6、24及び72時間後の肺の左頭葉および右尾状葉から採取した細気管支および末梢肺組織で相対濃度を測定した。Ｉ５ＮＰの相対濃度は、各時点で採取された組織試料において類似した。Ｉ５ＮＰの濃度は用量投与終了後時間の増大に伴って減少したが、しかし用量投与終了の72時間後で依然として検出可能であった。
【０１６７】
考察
血漿中のＩ５ＮＰの最高平均濃度は、用量投与後分析した最初の時点（用量投与終了の15分後）で観察されたが、これは、吸入用量からの全身循環中へのＩ５ＮＰの吸収が迅速であった、ということを示す。血漿中濃度は低く、用量投与終了の8時間又は24時間後まで急速に減少し、その後、それらは定量限界より低かった。排出半減期（即ち1.5〜5.7時間）並びにＡＵＣ０-inf（16.1〜72.0 ng.h/mLの範囲）における変動により実証されるように、個々の動物間にかなりの程度の変動が認められた。
【０１６８】
肺組織におけるｓｉＲＮＡのレベルは、全身循環中のレベルよりはるかに高かった。Ｉ５ＮＰレベルは、用量投与後の各時点で肺の全葉において非常に良く似ていたが、これは、試験物質が全葉に送達されていた、ということを示す。用量投与終了の約30分後に、細気管支領域より高レベルのＩ５ＮＰが肺の末梢域に存在したが、これは、吸入用量投与により細気管支に送達された試験物質が迅速に吸収され、残りの肺組織に分布した、ということを示唆する。肺組織中のＩ５ＮＰのレベルは、用量投与終了後時間の増大に伴って減少したが、しかし用量投与終了の72時間後で依然として検出可能であった。全時点で、肺中のＩ５ＮＰレベルは血漿中よりも高かった。
【０１６９】
Ｉ５ＮＰ及びＲＥＤＤ１４Ｃｙ３．５  ｓｉＲＮＡの分布の比較（後者は蛍光検出により定量的に分析した）は、肺における2つの試験物質の分布にほとんど差はなかった、ということを示した。
【０１７０】
結論
雄カニクイザルへの蛍光標識ＲＥＤＤ１４Ｃｙ３．５及び／又はＩ５ＮＰ  ｓｉＲＮＡの噴霧エーロゾル処方物の単回口−鼻吸入用量の投与後、ｓｉＲＮＡの肺中分布及び全身曝露（血漿中）を確定した。
【０１７１】
血漿中のＩ５ＮＰの最高平均濃度は、用量投与終了後に分析した最初の時点で観察されたが、これは、吸入用量投与から全身循環中へのＩ５ＮＰの吸収が迅速であった、ということを示す。血漿中濃度は低く、急速に減少した。肺中のＩ５ＮＰのレベルは、全ての時点で血漿中のレベルより大きく、そしてレベルは用量投与終了後72時間でも依然として検出可能であった。肺中の両ｓｉＲＮＡの分布は、全面的で且つ広範囲に及んだ。Ｉ５ＮＰは投与部位（細気管支）から迅速に吸収されることが判明し、そして用量投与終了の30分後までに肺の末梢組織で高濃度で見出された。
【０１７２】
ＲＴＰ８０１、ｐ５３、ＴＰ５３ＢＰ２、ＬＲＤＤ、ＣＹＢＡ、ＡＴＦ３、ＣＡＳＰ２、ＮＯＸ３、ＨＲＫ、Ｃ１ＱＢＰ、ＢＮＩＰ３、ＭＡＰＫ８、ＭＡＰＫ１４、Ｒａｃ１、ＧＳＫ３Ｂ、Ｐ２ＲＸ７、ＴＲＰＭ２、ＰＡＲＧ、ＣＤ３８、ＳＴＥＡＰ４、ＢＭＰ２、ＧＪＡ１、ＴＹＲＯＢＰ、ＣＴＧＦ、ＳＰＰ１、ＲＴＮ４Ｒ、ＡＮＸＡ２、ＲＨＯＡ及びＤＵＯＸ１に対して向けられる修飾ｓｉＲＮＡ（水溶液中に処方される）を、2つの記載ｓｉＲＮＡに関して本質的に上記と同様に試験し、同様の結果を得たが、これは、ｓｉＲＮＡが肺に首尾よく送達される、ということを示す。
【実施例３】
【０１７３】
in vivoでの腫瘍増殖に及ぼすＮｒｆ２  ｓｉＲＮＡ肺投与の作用
方法：
腫瘍異種移植：  Ａ５４９細胞（5×106）を雄無胸腺ヌードマウスの後肢に注射し、腫瘍を毎週測定した。以下の式を用いて腫瘍容積を測定した：［長さ（mm）×幅（mm）×幅（mm）×0.52］肺転移実験において、2×106のＡ５４９−Ｃ８−ｌｕｃ細胞をSCID-Beigeマウス（Charles River, MA）に静脈内注射した。
【０１７４】
in vivo実験のために、全てのｓｉＲＮＡ化合物を化学的に合成して、両鎖上の２−Ｏ’−Ｍｅ修飾を変更することにより安定化した。in vivo実験のために用いられるヒトＮｒｆ２をターゲッティングするｓｉＲＮＡの配列は、5’-UCCCGUUUGUAGAUGACAA-3’（センス）及び5’-UUGUCAUCUACAAACGGGA-3’（アンチセンス）である。ＧＦＰをターゲッティングする対照ｓｉＲＮＡの配列は、5’-GGCUACGUCCAGGAGCGCACC-3’（センス）及び5’-GGUGCGCUCCUGGACGUAGCC-3’（アンチセンス）である。
【０１７５】
肺腫瘍送達のために、雌Ｃ５７Ｂ６マウスにルイス肺癌（ＬＬＣ）細胞（0.5×106）を送達実験の24日前に静脈内注射した。肺転移の発症時に、3連続日に噴霧器吸入により100 μg／マウスのＣｙ３標識裸の化学的安定化参照ｓｉＲＮＡをマウスに投与した。最終吸入の24時間後に、マウスを安楽死させた。終了時に、肺を氷冷4％パラホルムアルデヒドで膨張させて、その後、剃刀の刃を用いて手で切片にした。明らかに目に見える大きな表面腫瘍を別々に切片にした。その結果生じた切片を、20×Water対物レンズと、合計40×倍率を生じるよう組合された2×ズームレンズを用いて、Bio-Rad共焦点顕微鏡により分析した。対照非ｓｉＲＮＡ処理肺を用いて、バックグラウンド蛍光レベルを設定した。
【０１７６】
肺腫瘍へのＮｒｆ２又はＧＦＰ  ｓｉＲＮＡのエーロゾル送達のために、ＰＢＳ中に希釈した100 μgのｓｉＲＮＡ二重鎖を噴霧器を用いてエーロゾル化した。噴霧器を用いて4週間、毎週、3用量のｓｉＲＮＡ（100 μg／用量）をマウスに与えた。カルボプラチンの腹腔内注射を、30 mg/体重1 kgの用量で週2回投与した。
【０１７７】
In vivo画像診断：ルシフェラーゼ・レポーター遺伝子を発現するＡ５４９−Ｃ８−ｌｕｃ細胞を接種した動物を麻酔して、発光基質（15 mg/ml）Ｄ−ルシフェリンFirefly（Xenogenカタログ番号ＸＲ−１００１）250 ulを腹腔内注射した。次に、ジョンズ・ホプキンス腫瘍学センターのXenogenＩＶＩＳ光学画像診断装置を用いて、動物を画像診断し、分析した。
【０１７８】
統計学的分析−スチューデントｔ検定により、統計学的比較を実施した。ｐ<0.05という値は、統計学的に有意であるとみなされた。腫瘍重量及び腫瘍容積の変化を、記述統計学を用いて要約した。一般化推定方程式（ＧＥＥ）とともに線形回帰モデルを用いて、処置群間の腫瘍測定値における差を検査した。両腫瘍測定値の分布は非対称にされ、そこで対数変換を用いた。
【０１７９】
肺腫瘍によるｓｉＲＮＡの取込みを実証するために、噴霧器を用いて、肺腫瘍を保有するマウスにＣｙ３標識化ＲＴＰ８０１  ｓｉＲＮＡ（ＲＥＤＤ１４−上記参照）を送達した。小型実質内腫瘍は、強いＣｙ３シグナルを明示した。大型表面突出腫瘍もＣｙ３シグナルを示したが、しかしその強度は数倍低かった。
【０１８０】
同所性肺腫瘍中への裸のｓｉＲＮＡ二重鎖の送達を調べた。ルイス肺癌細胞をマウスに注射し、24日後（マウスがより大きな腫瘍を発症した時）、3連続日の間、噴霧器を用いて、100 μg／日／マウスのＣｙ３標識裸の化学的安定化参照ｓｉＲＮＡをマウスに吸入させた。最終ｓｉＲＮＡ投与の24時間後に、マウスを屠殺した；肺を採取し、切片作製した。その結果生じた切片を、20×  Water対物レンズと、合計40×倍率を生じるよう組合された2×ズームレンズを用いて、Bio-Rad共焦点顕微鏡により分析した。対照、非ｓｉＲＮＡ処理肺を用いて、バックグラウンド蛍光レベルを設定した。蛍光結果は、大型表面腫瘍中の、特に実質内腫瘍中のＣｙ３標識化ｓｉＲＮＡの局在を明示した。大型表面突出腫瘍はＣｙ３シグナルを示したが、しかしその強度は小型実質内腫瘍で観察されたものより数倍低かった。
【０１８１】
次のステップにおいて、ＡＲＥ−Ｌｕｃ  Ｎｒｆ２依存性レポーターを発現する同所性増殖腫瘍を有するマウスを用いた。Ａ５４９肺腫瘍を有するマウスを、噴霧器を用いて鼻内的にＮｒｆ２  ｓｉＲＮＡで処置し、その後、カルボプラチン処置した。図５で実証されるように、鼻内投与されたＮｒｆ２  ｓｉＲＮＡはin vivoでＮｒｆ２レポーター活性を抑制したが、これは、鼻内投与後のＮｒｆ２  ｓｉＲＮＡを用いたＮｒｆ２発現の特異的抑制を示す。Ｎｒｆ２  ｓｉＲＮＡをカルボプラチンと一緒に摂取しているマウスは、ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡをカルボプラチンと一緒に摂取している対照マウスと比較して、より高い増殖抑制を実証した（表６）。終了時の平均肺重量、並びに光束強度（in vivo画像診断により評価）は、Ｎｒｆ２  ｓｉＲＮＡ＋カルボプラチンで処置したマウスにおいては最低であった。したがってＮｒｆ２とカルボプラチン／放射線の組合せは、いずれかの作因単独と比較して、4週間の処置後、腫瘍増殖の低減をもたらした。
【０１８２】
Ｎｒｆ２  ｓｉＲＮＡ単独で、並びにカルボプラチンと組合せての鼻内処置後の肺腫瘍重量の平均（ＳＤ）
【表６】
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【０１８３】
さらなる情報は、ＰＣＴ出願PCT/IL2008/000391（本出願の譲受人に譲渡）（この記載内容は参照によりその全体が本明細書中で援用される）に含まれている。
【０１８４】
本明細書中に開示される遺伝子のいずれかに向けられる付加的ｓｉＲＮＡ分子は同様のやり方で試験されるが、この場合、それらは類似の作用を有し、そして肺腫瘍の増殖を抑制することが示されている。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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