(57)【要約】  本発明は、ペントースリン酸経路の酵素が過剰発現するコリネ型細菌においてメチオニンを生産する方法に関する。また、本発明は、ペントースリン酸経路の少なくとも２種の酵素が過剰発現する、メチオニンを生産するためのコリネ型細菌に関する。
2010518827.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コリネ型細菌が出発生物と比較してペントースリン酸経路の少なくとも１種の酵素の量および／または活性が増加するように、出発生物から遺伝子組換えによって誘導される、少なくとも１種のコリネ型細菌を培養するステップを含むコリネ型細菌でメチオニンを生産する方法。
【請求項２】
少なくともトランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼまたは６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼの量および／または活性が出発生物と比較して増加する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくともトランスケトラーゼおよびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、トランスケトラーゼおよび６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、またはグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼおよび６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼの量および／または活性が出発生物と比較して増加する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
少なくともトランスケトラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼおよび６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼの量および／または活性が出発生物と比較して増加する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記酵素の量および／または活性が前記酵素をコードしている核酸配列のコピー数を増加させること、前記酵素をコードしている核酸配列の転写および／もしくは翻訳を増加させること、前記酵素をコードしている核酸配列に突然変異を導入することまたはその組合せによって増加する、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
遺伝子コピー数が前記酵素をコードしている核酸配列を含む自己複製ベクター使用することによっておよび／または前記酵素をコードしている核酸配列の更なるコピーを出発生物のゲノムに染色体組込みすることによって増加する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
転写が強力なプロモーターを使用することによって増加する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記強力なプロモーターがＰEFTu、ＰgroES、ＰSODおよびＰ？Rを含む群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記プロモーターＰSODが使用される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
トランスケトラーゼおよび６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼの量および／または活性が、強力なプロモーター（好ましくは、ＰSODである）とそれらのそれぞれの内因性プロモーターを置換することによって出発生物と比較して増加する、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
トランスケトラーゼが配列番号１２の２９３または３２７位に対応する位置で少なくとも１つの突然変異を有し、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼが配列番号６の１５０、２０９、２６９、２８８、３２９、３３０または３５３位に対応する位置で少なくとも１つの突然変異を有する、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
トランスケトラーゼおよび６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼの量および／または活性が強力なプロモーター（好ましくはＰSODである）とそれらのそれぞれの内因性プロモーターを置換することによって出発生物と比較して増加し、トランスケトラーゼが配列番号１２の２９３または３２７位に対応する位置で少なくとも１つの突然変異を有し、ならびに６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼが配列番号６の１５０、２０９、２６９、２８８、３２９、３３０または３５３位に対応する位置で少なくとも１つの突然変異を有する、請求項１０および１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記コリネ型細菌がＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｊｅｉｋｅｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａおよびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｆｆｉｚｉｅｎｓ種を含む群から選択される、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの菌株が使用される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％およびより好ましくは少なくとも約２倍、少なくとも約５倍および少なくとも約１０倍以上のメチオニンが出発生物と比較して生産される、請求項１から１４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記コリネ型細菌が出発生物と比較してペントースリン酸経路の少なくとも２種の酵素の量および／または活性が増加するように、コリネ型細菌が遺伝子組換えによって出発生物から誘導される、コリネ型細菌。
【請求項１７】
少なくともトランスケトラーゼおよびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、トランスケトラーゼおよび６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、またはグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼおよび６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼの量および／または活性が出発生物と比較して増加する、請求項１６に記載のコリネ型細菌。
【請求項１８】
少なくともトランスケトラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼおよび６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼの量および／または活性が出発生物と比較して増加する、請求項１７に記載のコリネ型細菌。
【請求項１９】
前記酵素の量および／または活性が前記酵素をコードしている核酸配列のコピー数を増加させること、前記酵素をコードしている遺伝子の転写および／もしくは翻訳を増加させること、前記酵素をコードしている核酸配列に突然変異を導入することまたはその組合せによって増加する、請求項１６から１８までのいずれか一項に記載のコリネ型細菌。
【請求項２０】
前記遺伝子コピー数が前記酵素をコードしている核酸配列を含む自己複製ベクター使用することによっておよび／または前記酵素をコードしている核酸配列の更なるコピーを出発生物のゲノムに染色体組込みすることによって増加する、請求項１９に記載のコリネ型細菌。
【請求項２１】
転写が強力なプロモーターを使用することによって増加する、請求項１９に記載のコリネ型細菌。
【請求項２２】
強力なプロモーターがＰEFTu、ＰgroES、ＰSODおよびＰ？Rを含む群から選択される、請求項２１に記載のコリネ型細菌。
【請求項２３】
プロモーターＰSODが使用される、請求項２２に記載のコリネ型細菌。
【請求項２４】
トランスケトラーゼおよび６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼの量および／または活性が、強力なプロモーター（好ましくは、ＰSODである）とそれらのそれぞれの内因性プロモーターを置換することによって出発生物と比較して増加する、請求項２１に記載のコリネ型細菌。
【請求項２５】
トランスケトラーゼが配列番号１２の２９３または３２７位に対応する位置で少なくとも１つの突然変異を有し、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼが配列番号６の１５０、２０９、２６９、２８８、３２９、３３０または３５３位に対応する位置で少なくとも１つの突然変異を有する、請求項１９に記載のコリネ型細菌。
【請求項２６】
トランスケトラーゼおよび６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼの量および／または活性が強力なプロモーター（好ましくはＰSODである）とそれらのそれぞれの内因性プロモーターを置換することによって出発生物と比較して増加し、トランスケトラーゼが配列番号１２の２９３または３２７位に対応する位置で少なくとも１つの突然変異を有し、および６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼが配列番号６の１５０、２０９、２６９、２８８、３２９、３３０または３５３位に対応する位置で少なくとも１つの突然変異を有する、請求項２４および２５に記載のコリネ型細菌。
【請求項２７】
コリネ型細菌がＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｊｅｉｋｅｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａおよびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｆｆｉｚｉｅｎｓ種を含む群から選択される、請求項１６から２６までのいずれか一項に記載のコリネ型細菌。
【請求項２８】
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの菌株が使用される、請求項２７に記載のコリネ型細菌。
【請求項２９】
少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％およびより好ましくは少なくとも約２倍、少なくとも約５倍および少なくとも約１０倍以上のメチオニンが出発生物と比較して生産される、請求項１６から２８までのいずれか一項に記載のコリネ型細菌。
【請求項３０】
メチオニンを生産するための請求項１６から２９までのいずれか一項に記載のコリネ型細菌の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌ−メチオニンを生産するための微生物および方法に関する。特に、本発明は、ホルメート−ＴＨＦ−シンテターゼ活性および／または機能的グリシン開裂系を示すコリネ型細菌に関する。特に、本発明は、ペントースリン酸経路の少なくとも１種の酵素の量および／または活性を増加させることによってコリネ型細菌においてメチオニンを生産する方法に関する。また、本発明は、ペントースリン酸経路の少なくとも２種の酵素の量および／または活性が増加するコリネ型細菌に関する。
【０００２】
現在、メチオニンの年間生産量は全世界で約５０万トンである。メチオニンは、家畜の家禽および飼料の第一制限アミノ酸であり、このため主に飼料の添加物として利用される。
【０００３】
他の工業的アミノ酸とは対照的に、メチオニンは、化学合成によって生産されるＤ−およびＬ−メチオニンのラセミ体として、ほぼ例外なく利用される。動物はメチオニンの両方の立体異性体を代謝することができるので、化学的に生産されたラセミ混合物の直接の給餌が可能である（Ｄ’Ｍｅｌｌｏ  ａｎｄ  Ｌｅｗｉｓ，Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ  ｉｎ  Ａｎｉｍａｌｓ：Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，Ｒｅｃｈｇｉｇｌ（Ｅｄ．），ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｓｅｒｉｅｓ  ｉｎ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ，４４１−４９０，１９７８）。
【０００４】
しかし、バイオテクノロジーのプロセスによりもっぱらＬ−メチオニンだけを生産する既存の化学生産を替えることに、依然として非常に関心が持たれている。このことは、低いレベルの補充Ｌ−メチオニンがＤ−メチオニンより硫黄アミノ酸の良好な供給源であるという事実による（Ｋａｔｚ  ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ（１９７５）Ｐｏｕｌｔ．Ｓｃｉ．５４５：１６６７−７４）。さらに、化学プロセスでは、むしろ有害化学物質を使用して、重大な廃棄物の流れを引き起こす。化学生産に関するこれら全ての不都合は、効率的なバイオテクノロジーのプロセスにより回避される可能性がある。
【０００５】
今日、アミノ酸、芳香族化合物、ビタミンおよび補因子などのファインケミカルの発酵生産は、典型的にＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｓｃｈｉｚｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｓ  ｐｏｍｂｅ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ａｓｈｂｙａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓまたはＧｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓなどの微生物において実施されている。
【０００６】
したがって、グルタミンなどのアミノ酸は、発酵法を使用して生産される。これらの目的のために、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）などの特定の微生物が特に適していることが証明されている。また、発酵によるアミノ酸の生産は、とりわけ、Ｌ−アミノ酸だけが生産され、化学合成において典型的に使用される溶媒などの環境的に問題のある化学物質は避けられるという利点を持つ。
【０００７】
Ｅ．ｃｏｌｉおよびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなどの微生物においてアミノ酸、脂質、ビタミンまたは炭水化物などの真の化学物質を生産するための先行技術のいくつかの試みでは、例えば、それぞれのファインケミカルの生合成経路に関係する遺伝子の発現を増加させることによって、この目的を達成しようと努めてきた。
【０００８】
例えば、リシンの生産を、リシン産生の生合成経路において関係する遺伝子の発現をアップレギュレーションすることによって増加させる試みが、例えば、国際特許出願公開第０２／１０２０９号、同第２００６００８０９７号、同第２００５０５９０９３号、またはＣｒｅｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，（１９９１），５７（６），１７４６−１７５２）に記載されている。
【０００９】
しかし、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなどの微生物におけるメチオニンの産生に有益に影響を与えるために使用することができる代謝経路における更なる標的を同定する強い必要性が残る。
【００１０】
この状況を考慮すると、本発明の１つの目的は、Ｌ−メチオニンを生産するために使用可能なコリネ型細菌を提供することである。本発明の更なる目的は、コリネ型菌においてＬ−メチオニンを生産するために使用可能な方法を提供することである。
【００１１】
これらおよび他の目的は、それらが続く記述からも明らかなように、独立請求項に記載のように本発明によって解決される。従属請求項は、本発明のいくつかの好ましい実施形態に関する。
【００１２】
一態様において、本発明は、少なくとも１種のコリネ型細菌において、Ｌ−メチオニン（またメチオニンとも呼ばれる）を生産する方法であって、前記コリネ型細菌が出発生物と比較してペントースリン酸経路の少なくとも１種の酵素の量および／または活性が高いように、前記コリネ型細菌が出発生物から遺伝子組換えによって誘導されるＬ−メチオニンを生産する方法に関する。
【００１３】
ペントースリン酸経路の酵素の量および／または活性は、前記酵素をコードしている核酸配列のコピー数を増加させることによって出発生物と比較して増加し得る。ペントースリン酸経路の酵素をコードしている核酸配列のコピー数は、例えば、前記酵素をコードしている核酸配列を含む自己複製ベクターを使用して、および／または前記酵素をコードしている核酸配列の更なるコピーを出発生物のゲノムに染色体組込みすることによって増加し得る。
【００１４】
また、ペントースリン酸経路の酵素の量および／または活性の増加は、前記酵素をコードしている核酸配列の転写および／または翻訳を増加させることによって達成できる。転写の増加は、強力なプロモーターおよび／またはエンハンサー要素を用いて達成できる。翻訳の増加は、前記酵素をコードしている核酸配列のコドン使用頻度が宿主生物における発現に対して最適化される場合、または、リボソームに対して改善された結合部位および翻訳開始部位が遺伝子のコード配列の上流領域に組み込まれる場合に達成し得る。
【００１５】
また、ペントースリン酸経路の酵素の活性は、前記酵素をコードしている遺伝子に突然変異を導入することによって、出発生物と比較して増加可能であり、導入する突然変異は、フィードバック阻害などの負の調節機構を遮断すること、または酵素の代謝回転速度を増加させることのいずれかによって前記酵素の活性を増加させる。
【００１６】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、ペントースリン酸経路の酵素の量および／または活性は、上述の方法の組合せによって出発生物と比較して増加する。
【００１７】
好ましい一実施態様において、本発明は、少なくともトランスケトラーゼ（ｔｋｔ）、トランスアルドラーゼ（ｔａｌ）、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）、ｏｃｐａ遺伝子、ラクトナーゼまたは６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（６ＰＧＤＨ）の量および／または活性が出発生物と比較して増加する、コリネ型細菌でメチオニンを生産する方法に関する。
【００１８】
本発明の更なる好ましい実施態様は、少なくともトランスケトラーゼおよび６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼまたはグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼおよび６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼの量および／または活性が出発生物と比較して増加する、コリネ型細菌でメチオニンを生産する方法に関する。
【００１９】
本発明のより好ましい実施態様の１つにおいて、トランスケトラーゼおよび６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼの量および／または活性は、強力なプロモーター（好ましくは、ＰSODである）とそれぞれの内因性プロモーターを置換することによって出発生物と比較して増加する。本発明のこの最後の態様の更なる詳細において、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ｏｐｃａタンパク質および６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼの突然変異型であって、それぞれの野生型酵素と比較して負の調節機構を起こしにくいおよび／または酵素の高い代謝回転を示すかのいずれである突然変異型をコードする核酸配列が使用される。
【００２０】
本発明の別の態様は、コリネ型細菌が出発生物と比較してペントースリン酸経路の少なくとも２種の酵素の量および／または活性が高くなるように遺伝子組換えによって出発生物から誘導されるコリネ型細菌に関する。
【００２１】
前記の少なくとも２種の酵素の量および／または活性は、上述のアプローチ、すなわち、前記酵素をコードしている核酸配列のコピー数を増加させること、前記酵素をコードしている核酸配列の転写および／もしくは翻訳を増加させること、ならびに／または前記酵素をコードしている前記核酸配列に突然変異を導入し、それぞれの酵素をより活性型にすることによって出発生物と比較して増加し得る。
【００２２】
好ましい実施態様において、本発明は、少なくともトランスケトラーゼおよび６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼの、または少なくともグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼおよび６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼの量および／または活性が出発生物と比較して増加するコリネ型細菌に関する。
【００２３】
より好ましい実施態様の１つにおいて、コリネ型細菌は、トランスケトラーゼおよび６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼの量および／または活性が、好ましくは、強力なプロモーター（例えば、ＰSOD）とそれらのそれぞれの内因性プロモーターを置換することによって出発生物と比較して増加することを特徴とする。
【００２４】
本発明のこの後者の態様の更なる詳細において、トランスケトラーゼおよび６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼの核酸配列は、これら酵素の突然変異型をコードし、ここで突然変異型は、それぞれの野生型酵素と比較して負の調節機構を起こしにくく、および／または酵素の高い代謝回転を示す。
【００２５】
本発明の上述のすべての実施態様において、コリネ型菌が選択され、好ましくは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ種から選択される。本発明の目的のために使用できる好ましいＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株は、ＡＴＣＣ１３０３２などの野生株またはすでにメチオニン生産に最適化されている菌株である。そのような後者の菌株は、以下に記載のＤＳＭ１７３２２、Ｍ２０１４もしくはＯＭ４６９株または国際特許出願公開第２００７０１２０７８号に記載のような菌株などの遺伝子改変を示す。
【００２６】
本発明の一態様において、本発明による方法およびコリネ型細菌は、出発生物と比較して少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％または少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％、ならびにより好ましくは少なくとも２倍、少なくとも５倍および少なくとも１０倍以上メチオニンを生産することを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】プラスミドｐＣＬＩＫ  ｉｎｔ  ｓａｃＢ  ＰＳＯＤ  ＴＫＴおよびｐＣＬＩＫ  ｉｎｔ  ｓａｃＢ  ＰＳＯＤ  ６ＰＧＤＨを概略的に示す図である。
【００２８】
一態様において、本発明は、少なくとも１種のコリネ型細菌においてメチオニンを生産する方法であって、前記コリネ型細菌が出発生物と比較してペントースリン酸経路の少なくとも１種の酵素の量および／または活性が高いように、前記コリネ型細菌が出発生物から遺伝子組換えによって誘導されるメチオニンを生産する方法に関する。
【００２９】
本発明の別の実施形態は、コリネ型細菌が出発生物と比較してペントースリン酸経路の少なくとも２種の酵素の量および／または活性が高いように、遺伝子組換えによって出発生物から誘導されるコリネ型細菌に関する。
【００３０】
驚いたことに、メチオニン合成の代謝経路に直接関わらない酵素の量および／または活性を増加させることが、コリネ型細菌におけるメチオニン産生の増加につながりうることが発見されている。したがって、本発明の発明者は、ペントースリン酸経路の少なくとも１種の酵素、例えば、コリネ型細菌のトランスケトラーゼまたは６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼを過剰発現させると、これら２種の酵素のいずれかがコリネ型細菌における典型的な内因性レベルを超えて発現していない状況と比較して、より多くのメチオニン量が産生されることを観察している。
【００３１】
本発明の様々な態様およびいくつかの好ましい実施形態をより詳細に述べる前に、以下の定義を提供し、それぞれの文脈で別途に明確に示されない限り、本発明の記述を通してこの定義の意味を有する。
【００３２】
コリネ型細菌は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｊｅｉｋｅｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａおよびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｆｆｉｚｉｅｎｓなどの種を含む。好ましい種は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである。
【００３３】
本発明の好ましい実施形態においてコリネ型細菌は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＫＦＣＣ１００６５、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ２１６０８、Ｃ．ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１５８０６、Ｃ．ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１３８７０、Ｃ．ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ  ＦＥＲＭＢＰ−１５３９、Ｃ．ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ  ＡＴＣＣ１７９６５、Ｃ．ｅｆｆｉｚｉｅｎｓ  ＤＳＭ４４５４７およびＣ．ｅｆｆｉｚｉｅｎｓ  ＤＳＭ４４５４９を含む菌株、ならびに例えば、古典的突然変異誘発および選択によってならびに定方向突然変異誘発によって誘導されるその菌株の群から誘導し得る。
【００３４】
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの他の特に好ましい菌株は、ＡＴＣＣ１３０５８、ＡＴＣＣ１３０５９、ＡＴＣＣ１３０６０、ＡＴＣＣ２１４９２、ＡＴＣＣ２１５１３、ＡＴＣＣ２１５２６、ＡＴＣＣ２１５４３、ＡＴＣＣ１３２８７、ＡＴＣＣ２１８５１、ＡＴＣＣ２１２５３、ＡＴＣＣ２１５１４、ＡＴＣＣ２１５１６、ＡＴＣＣ２１２９９、ＡＴＣＣ２１３００、ＡＴＣＣ３９６８４、ＡＴＣＣ２１４８８、ＡＴＣＣ２１６４９、ＡＴＣＣ２１６５０、ＡＴＣＣ１９２２３、ＡＴＣＣ１３８６９、ＡＴＣＣ２１１５７、ＡＴＣＣ２１１５８、ＡＴＣＣ２１１５９、ＡＴＣＣ２１３５５、ＡＴＣＣ３１８０８、ＡＴＣＣ２１６７４、ＡＴＣＣ２１５６２、ＡＴＣＣ２１５６３、ＡＴＣＣ２１５６４、ＡＴＣＣ２１５６５、ＡＴＣＣ２１５６６、ＡＴＣＣ２１５６７、ＡＴＣＣ２１５６８、ＡＴＣＣ２１５６９、ＡＴＣＣ２１５７０、ＡＴＣＣ２１５７１、ＡＴＣＣ２１５７２、ＡＴＣＣ２１５７３、ＡＴＣＣ２１５７９、ＡＴＣＣ１９０４９、ＡＴＣＣ１９０５０、ＡＴＣＣ１９０５１、ＡＴＣＣ１９０５２、ＡＴＣＣ１９０５３、ＡＴＣＣ１９０５４、ＡＴＣＣ１９０５５、ＡＴＣＣ１９０５６、ＡＴＣＣ１９０５７、ＡＴＣＣ１９０５８、ＡＴＣＣ１９０５９、ＡＴＣＣ１９０６０、ＡＴＣＣ１９１８５、ＡＴＣＣ１３２８６、ＡＴＣＣ２１５１５、ＡＴＣＣ２１５２７、ＡＴＣＣ２１５４４、ＡＴＣＣ２１４９２、ＮＲＲＬ  Ｂ８１８３、ＮＲＲＬ  Ｗ８１８２、Ｂ１２ＮＲＲＬＢ１２４１６、ＮＲＲＬＢ１２４１７、ＮＲＲＬＢ１２４１８およびＮＲＲＬＢ１１４７６を含む群から選択し得る。
【００３５】
略語のＫＦＣＣはＫｏｒｅａｎ  Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎを表し、ＡＴＣＣはＡｍｅｒｉｃａｎ−Ｔｙｐｅ  Ｓｔｒａｉｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎを表し、略語のＤＳＭはＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎを表す。略語のＮＲＲＬは、ＡＲＳ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｅｏｒｅａ，ＥＬ，ＵＳＡを表す。
【００３６】
本発明の目的のために、好ましい野生型株は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２である。
【００３７】
特に好ましいのは、すでにメチオニンを産生可能な微生物のＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである。したがって、同様な効果を有する遺伝子改変を示す菌株、例えば、後述のＤＳＭ１７３２２、Ｍ２０１４またはＯＭ４６９などは特に好ましい。
【００３８】
本発明の文脈の範囲内で「出発物質」という用語は、後述するようにペントースリン酸経路の少なくとも１種の酵素の量および／または活性を増加させるために、遺伝子組換えに使用されるコリネ型細菌をいう。
【００３９】
本発明の意味の範囲内における「遺伝子組換え」および「遺伝子改変」ならびにこれらの文法的変化は、それぞれの微生物に自然に存在し得る１種以上のタンパク質、それぞれの微生物に自然に存在しない１種以上のタンパク質、またはそれぞれの非組換え微生物のタンパク質と比較して活性が変えられた１種以上のタンパク質の量を変えるように、微生物が遺伝子工学によって組み換えられていることを意味するものと意図される。非組換え微生物は、「出発生物」と考えられ、遺伝子改変の結果、本発明による微生物を生じる。
【００４０】
したがって、出発生物は、ＡＴＣＣ１３０３２などの野生型Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株であり得る。
【００４１】
しかし、出発生物は、好ましくは、メチオニン生産のためにすでに最適化されている例えばＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株でもあり得る。
【００４２】
そのようなメチオニン産生出発生物は、例えば、野生型コリネ型細菌から誘導することができ、ならびに好ましくは以下のａｓｋfbr、ｈｏｍfbrおよびｍｅｔＨ遺伝子の少なくとも１つで遺伝子改変を含む野生型Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細菌から誘導することができ、この場合、遺伝子改変はこれら遺伝子のいずれかの過剰発現を引き起こし、したがって、遺伝子改変がない場合に産生するメチオニンと比較してメチオニンの産生が増加する。好ましい実施形態において、そのようなメチオニン産生出発生物は、ａｓｋfbr、ｈｏｍfbrおよびｍｅｔＨで同時に遺伝子改変を含み、したがって、遺伝子改変がない場合に産生するメチオニンと比較してメチオニンの産生が増加する。
【００４３】
これらの出発生物において、ａｓｋおよびｈｏｍの内因性コピーは、リシン、スレオニン、メチオニンによる、またはこれらアミノ酸の組合せによるフィードバック阻害をもはや受けないフィードバック耐性対立遺伝子に典型的に変化する。これは、突然変異および選択によるか、またはフェードバック阻害が低下もしくは減少されたタンパク質をコードする突然変異対立遺伝子との遺伝子の規定された遺伝子置換のいずれかにより行うことができる。これらの遺伝子改変を含むＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株は、例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＤＳＭ１７３２２である。当業者は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＤＳＭ１７３２２の発生に関して以下に記述されている遺伝子改変の代わりの遺伝子改変を、ａｓｋfbr、ｈｏｍfbrおよびｍｅｔＨの過剰発現を達成するためにも使用できることに気づくであろう。
【００４４】
本発明の目的において、ａｓｋfbrは、フィードバック耐性アスパラギン酸キナーゼを意味する。ｈｏｍfbrは、フィードバック耐性ホモセリンデヒドロゲナーゼを意味する。ｍｅｔＨは、ビタミンＢ１２依存性メチオニンシンターゼを意味する。
【００４５】
他の好ましい実施形態において、メチオニン産生出発生物は、野生型コリネ型細菌から誘導することができ、ならびに好ましくは以下のａｓｋfbr、ｈｏｍfbr、ｍｅｔＨ、ｍｅｔＡ（またｍｅｔＸとも呼ばれる）、ｍｅｔＹ（またｍｅｔＺとも呼ばれる）およびｈｓｋ（突然変異）遺伝子の少なくとも１つで遺伝子改変を含む野生型Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細菌から誘導することができ、この場合、遺伝子改変はこれら遺伝子のいずれかの過剰発現を引き起こし、したがって、遺伝子改変がない場合に産生するメチオニンと比較してメチオニンの産生が増加する。好ましい実施形態において、そのようなメチオニン産生出発生物は、ａｓｋfbr、ｈｏｍfbr、ｍｅｔＨ、ｍｅｔＡ（またｍｅｔＸとも呼ばれる）、ｍｅｔＹ（またｍｅｔＺとも呼ばれる）およびｈｓｋ（突然変異）で同時に遺伝子改変を含み、したがって、遺伝子改変がない場合に産生するメチオニンと比較してメチオニンの産生が増加する。
【００４６】
これらの出発生物において、ａｓｋ、ｈｏｍおよびｈｓｋの内因性コピーは、ａｓｋfbrおよびｈｏｍfbrに関して先に述べたように、典型的にａｓｋfbr、ｈｏｍfbrおよびｈｓｋ（突然変異）によって置換される。これらの遺伝子改変を含むＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株は、例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  Ｍ２０１４である。当業者は、特にＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  Ｍ２０１４の発生に関して以下に記述されている遺伝子改変の代わりの遺伝子改変を、ａｓｋfbr、ｈｏｍfbr、ｍｅｔＨ、ｍｅｔＡ（またｍｅｔＸとも呼ばれる）、ｍｅｔＹ（またｍｅｔＺとも呼ばれる）およびｈｓｋ（突然変異）の過剰発現を達成するためにも使用できることに気づくであろう。
【００４７】
本発明の目的において、ｍｅｔＡは、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のホモセリンサクシニルトランスフェラーゼを意味する。ｍｅｔＹは、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼを意味する。ｈｓｋ（突然変異）は、酵素活性を減少させるために突然変異させたホモセリンキナーゼを意味する。これは、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｃｇｌ１１８４）のｈｓｋのＴ１９０に対応する位置でセリンまたはアラニンとスレオニンを交換することによって達成することができる。代わりにまたは付加的に、ＴＴＧ開始コドンとＡＴＧ開始コドンを置換することができる。そのような突然変異は、非突然変異ｈｓｋ遺伝子と比較して、得られたｈｓｋタンパク質の酵素活性の減少を引き起こす。
【００４８】
他の好ましい実施形態において、メチオニン産生出発生物は、野生型コリネ型細菌から誘導することができ、ならびに好ましくは以下のａｓｋfbr、ｈｏｍfbr、ｍｅｔＨ、ｍｅｔＡ（またｍｅｔＸとも呼ばれる）、ｍｅｔＹ（またｍｅｔＺとも呼ばれる）、ｈｓｋ（突然変異）およびｍｅｔＦ遺伝子の少なくとも１つで遺伝子改変を含む野生型Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細菌から誘導することができる。ここで、遺伝子改変は、以下のｍｃｂＲおよびｍｅｔＱ遺伝子の少なくとも１つの遺伝子改変（遺伝子改変がこれら遺伝子のいずれかの発現を減少させる）と組み合わせて、これら遺伝子のいずれかの過剰発現を引き起こす。そして、この組合せは、組合せがない場合のメチオニンの産生と比較して微生物によるメチオニンの産生を増加させる。好ましい実施形態において、そのようなメチオニン産生出発生物は、ａｓｋfbr、ｈｏｍfbr、ｍｅｔＨ、ｍｅｔＡ（またｍｅｔＸとも呼ばれる）、ｍｅｔＹ（またｍｅｔＺとも呼ばれる）、ｈｓｋ（突然変異）およびｍｅｔＦで同時に遺伝子改変を含み、ここで、遺伝子改変は、ｍｃｂＲおよびｍｅｔＱの遺伝子改変（遺伝子改変がこれら遺伝子のいずれかの発現を減少させる）と組み合わせて、これら遺伝子のいずれかの過剰発現を引き起こす。そして、この組合せは、組合せがない場合のメチオニンの産生と比較して微生物によるメチオニンの産生を増加させる。
【００４９】
これらの出発生物において、ａｓｋ、ｈｏｍおよびｈｓｋの内因性コピーは上記の通りに典型的に置換されるが、一方、ｍｃｂＲおよびｍｅｔＱの内因性コピーは典型的に機能的に阻害または除去される。これらの遺伝子改変を含むＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株は、例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＯＭ４６９である。当業者は、特にＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＯＭ４６９Ｃの発生に関して以下に記述されている遺伝子改変の代わりの遺伝子改変を、ａｓｋfbr、ｈｏｍfbr、ｍｅｔＨ、ｍｅｔＡ（またｍｅｔＸとも呼ばれる）、ｍｅｔＹ（またｍｅｔＺとも呼ばれる）、ｈｓｋ（突然変異）およびｍｅｔＦの過剰発現、ならびにｍｃｂＲおよびｍｅｔＱの発現減少を達成するためにも使用できることに気づくであろう。
【００５０】
本発明の目的において、ｍｅｔＦは、Ｎ５，１０−メチレン−テトラヒドロ葉酸レダクターゼ（ＥＣ  １．５．１．２０）を意味する。ｍｃｂＲは、硫黄代謝のＴｅｔＲ型転写調節因子を意味する（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＡＡＰ４５０１０）。ｍｅｔＱは、Ｄ−メチオニン結合リポタンパク質を意味する。
本発明の文脈において「ペントースリン酸経路の酵素」という用語は、標準的テキストによるとペントースリン酸経路で関与する７つの酵素のセットをいう。ペントースリン酸経路などの代謝経路の概要は、Ｋｙｏｔｏ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｋｅｇｇ／）で見ることができる。また、このデータベースは、代謝経路の種に特異的な改変についての概要を提供している。本発明の目的において、以下の酵素は、ペントースリン酸経路の一部を形成する。
【００５１】
・グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ、ｇ６ｐｄｈ）（ＥＣ１．１．１．４９）
・６−ホスホグルコノラクトナーゼ（６ｐｇｌ）（ＥＣ３．１．１．３１）
・６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（６ｐｇｄｈ）（ＥＣ１．１．１．４４）
・リブロース−５−リン酸エピメラーゼ（ｒｐｅ）（ＥＣ５．１．３．１）
・リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉ）（ＥＣ５．３．１．６．）
・トランスケトラーゼ（ｔｋｔ）（ＥＣ２．２．１．１．）
・トランスアルドラーゼ（ｔａｌ）（ＥＣ２．２．１．２．）
本発明の文脈において、出発生物と比較してペントースリン酸経路の少なくとも１種の酵素の「量を増加させる」という用語は、コリネ型細菌を遺伝子組換えして、上述のペントースリン酸経路の少なくとも１種の酵素をより多量に発現させることを意味する。ペントースリン酸経路の少なくとも１種の酵素の量を増加させることが、機能的酵素の量が増加する状況をいうことが理解される。本発明の文脈においてペントースリン酸経路の酵素は、それぞれの反応を触媒できるならば、機能的であると考えられる。コネリ型細菌において酵素の量を増加させる様々な選択肢が存在し、これらは当業者に周知である。これらの選択肢は、上述の酵素をコードする核酸配列のコピー数を増加させること、そのような核酸配列の転写および／または翻訳を増加させることを含む。これらの様々な選択肢を、以下でさらに詳細に検討する。
【００５２】
ペントースリン酸経路の少なくとも１種の酵素の「活性を増加させる」という用語は、少なくとも１つの突然変異が上述の酵素のそれぞれの野生型配列に導入され、これにより同一量の野生型酵素が発現する状況と比較して、より多くのメチオニンの生産に至る状況をいう。ペントースリン酸経路の酵素の突然変異型を導入することによる生産の増加は、例えば、フィードバック阻害が低下した結果であり得る。したがって、酵素は、例えば、本酵素が高度に関与する代謝経路で最終生成物が産生されるならば、これらの触媒活性を減少することが知られている。例えば、酵素のそれぞれの調節結合部位でアミノ酸置換、挿入または欠失を導入することによって、そのようなフィードバック阻害を抑制できることは周知である。したがって、酵素のそのようなフィードバック耐性またはフィードバック不感性型は、例えば、それ以外では酵素の活性がダウンレギュレートされるであろう、ある量の代謝産物が産生されている場合ですら、高い活性を示し続ける。さらに、酵素の活性は、酵素の触媒代謝回転を増加させる突然変異を導入することによって増加させることができる。
【００５３】
ＰＰＰの酵素が小分子によって酵素の濃度に対して制御されることが知られている（Ｆ  Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，ＪＬ  Ｉｎｇｒａｈａｍ，ＫＢ  Ｌｏｗ，Ｂ  Ｍａｇａｓａｎｉｋ，Ｍ  Ｓｃｈａｅｃｈｔｅｒ  ａｎｄ  ＨＥ  Ｕｍｂａｒｇｅｒ，ｅｄｓ．Ｉｎ：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ（１９８７）。これらの酵素は、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼおよび６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼを含み、これらはエフェクター、例えば、Ｓ  Ｍｏｒｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２０００），２６７，３４４２−５２）およびＯｎｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｉｃｏｒｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．（２００５），２４２，２６５−７４）に記載されるようなＮＡＤＰ、ＮＡＤＰＨ、ＡＴＰ、フラクトース１，６−２リン酸（Ｆｒｕ１、６Ｐ２）、Ｄ−グリセルアルデヒド３−リン酸、エリスロース４−リン酸およびリブロース５−リン酸（Ｒｉｂ５Ｐ）による阻害によって制御されることが示されている。この手元の知識により、当業者は例えば、上述のエフェクターの結合部位を同定することが可能で、これらの部位に突然変異を導入し、それぞれの調節因子に対する酵素の親和性を増加または減少することができる。調節因子の作用に応じて、酵素活性は増加し得る。
【００５４】
したがって、少なくとも１種の酵素の「活性を増加させる」という用語は、フィードバック阻害などの負の調節機構を減少および／または酵素の触媒代謝回転を増加させるために、突然変異をペントースリン酸経路における上述のいずれかの酵素の野生型配列に導入する状況をいう。
【００５５】
当然、少なくとも１種の酵素の量および／または活性を増加させるアプローチを組み合わせることができる。したがって、例えば、コネリ型細菌におけるペントースリン酸経路の少なくとも１種の酵素の内因性コピーを、そのフィードバック非感受性型をコードする突然変異体と置換することが可能である。この突然変異したコピーの転写が強力なプロモーターの制御下に置かれた場合、それぞれの酵素の量および活性は増加する。この場合、酵素が通常関与する反応を触媒することが依然として可能であるはずであると考えられる。
【００５６】
本発明により量および／または活性が増加される酵素に関して、それぞれのコリネ型細菌および好ましくはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの内因性核酸配列を使用するか、または他の生物由来のその機能的相同体を使用することができる。
【００５７】
したがって、例えば、自己複製ベクター、もしくは追加的に挿入した染色体コピー（以下参照）のいずれか由来の、それぞれのＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ配列を過剰発現させることによってＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいてグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの量を増加させることができるか、または例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｉｓもしくはＥ．ｃｏｌｉ由来の対応する酵素を使用して、例えば、自己複製可能なベクターの使用によりこの酵素を過剰発現させることができる。
【００５８】
ある状況においては、例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの内因性コード配列が、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ発現のためのコドン使用頻度に関してすでに最適化されているので、内因性酵素を使用することが好ましい可能性がある。
【００５９】
本発明の好ましい実施例において、ペントースリン酸経路の少なくとも１種の酵素の量および／または活性が、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいて増加する。
【００６０】
本発明の本態様の更なる詳細において、それぞれのＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ配列を使用して、ペントースリン酸経路の少なくとも１種の酵素の量および／または活性を増加させる。
【００６１】
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの核酸配列は、配列番号１で示される。対応するアミノ酸配列は、配列番号２で示される。ジーンバンク登録番号（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）は、Ｃｇｌ１５７６である。
【００６２】
６−ホスホグルコノラクトナーゼの核酸配列は、配列番号３で示される。対応するアミノ酸配列は、配列番号４で示される。ジーンバンク登録番号は、Ｃｇｌ１５７８である。
【００６３】
６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼの核酸配列は、配列番号５で示される。アミノ酸配列は、配列番号６で示される。ジーンバンク登録番号は、Ｃｇｌ１４５２である。
【００６４】
リブロース−５−リン酸エピメラーゼの核酸配列は、配列番号７で示される。アミノ酸配列は、配列番号８で示される。ジーンバンク登録番号は、Ｃｇｌ１５９８である。
【００６５】
リボース−５−リン酸イソメラーゼの核酸配列は、配列番号９で示される。アミノ酸配列は、配列番号１０で示される。ジーンバンク登録番号は、Ｃｇｌ２４２３である。
【００６６】
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍトランスケトラーゼの核酸配列は、配列番号１１で示される。アミノ酸配列は、配列番号１２で示される。ジーンバンク登録番号は、Ｃｇｌ１５７４である。
【００６７】
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍトランスアルドラーゼの核酸配列は、配列番号１３で示される。対応するアミノ酸配列は、配列番号１４で示される。ジーンバンク登録番号は、Ｃｇｌ１５７５である。
【００６８】
ペントースリン酸経路の上述のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ酵素に対応する機能的相同体は、相同性分析を用いて他の生物に対して当業者が容易に同定し得る。これは、推定上の相同体のアミノ酸または核酸配列と遺伝子またはこれらによってコードされるタンパク質の配列（例えば、トランスケトラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼならびに他の上記または下記の遺伝子およびこれらによってコードされるタンパク質のいずれかの核酸配列）との間の同一性率を測定することによって行うことができる。
【００６９】
同一性率は、例えば、目視検査によって、または、アルゴリズムベースの相同性を使用することによって測定することができる。
【００７０】
例えば、２つのアミノ酸配列の同一性率を測定するために、アルゴリズムでは、最適の比較目的のために配列を整列させる（例えば、別のタンパク質のアミノ酸配列との最適なアラインメントのために、ギャップを１つのタンパク質のアミノ酸配列に導入し得る）。その次に、対応するアミノ酸位置のアミノ酸残基が比較される。１つの配列の位置が、他の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基によって占められるときに、その時、分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性率は、配列により共有される同一位置数の関数である（すなわち、％同一性＝同一位置の数／位置の総数×１００）。
【００７１】
様々なコンピュータプログラムが、これらの目的に関して当技術分野で公知である。例えば、２つの核酸またはアミノ酸配列の同一性率は、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１２：３８７に記述され、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＵＷＧＣＧ）から入手できるＧＡＰコンピュータプログラムを使用して配列情報を比較することによって決定することができる。また、同一性率は、Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ（商標））プログラム（Ｔａｔｕｓｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１７４：２４７に記載されているように）を使用して２つの核酸またはアミノ酸配列を整列させることによって決定することができる。
【００７２】
本特許出願の出願日に、ＢＬＡＳＴプログラムを提供している標準的ソフトウェアパッケージを、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）のＢＬＡＳＴウェブサイトに見つけることができる。例えば、上述の配列番号のいずれかを使用する場合、核酸配列またはアミノ酸配列ベースのＢＬＡＳＴ検索を実施し、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓ．ｃｅｒｖｉｓｉａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓなどにおけるそれぞれの酵素の極めて近縁の相同体を同定することができる。例えば、ＢＬＡＳＴ（商標）プログラムを使用する核酸配列アラインメントでは、デフォルト設定は以下のようになる：ｒｅｗａｒｄ  ｆｏｒ  ｍａｔｃｈが２、ｐｅｎａｌｔｙ  ｆｏｒ  ｍｉｓｍａｔｃｈが−２、ｏｐｅｎ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙおよびｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙがそれぞれ５および２、ｇａｐ×ｄｒｏｐｏｆｆが５０、予測が１０、文字サイズが１１、フィルターがオフ。
【００７３】
類似の配列の検索および分析を、ＥＭＢＬデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｍｂｌ．ｏｒｇ）またはＥｘｐａｓｙホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／）で実施することができる。全ての上記の配列の検索は、本出願の出願日にデーターベースプロバイダーによってプレインストールされているので、典型的にデフォルトパラメータによって実施される。また、相同性検索は、ＣＬＵＳＴＡＬ方法（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９），Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，５（２）１５１）を使用するＤＮＡ  Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．（米国ウィスコンシン州マディソン）のレーザー遺伝子ソフトウェアなどのソフトウエアプログラムを使用してルーチン的に実施し得る。
【００７４】
当業者は、２種のタンパク質が、上述のようなある程度の同一性を共有する場合、同じ機能を発揮し得る（例えば、同じ酵素活性を提供する）ことを理解する。アミノ酸レベルに関する典型的な下限は、典型的に少なくとも約２５％の同一性である。核酸レベルでは、下限は典型的に少なくとも４５％である。
【００７５】
両方のタイプの配列に関する好ましい同一性グレードは、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％または少なくとも約７０％である。より好ましい同一性グレードは、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％である。これらの同一性レベルは、有意であると考えられる。
【００７６】
本明細書で使用する「相同性」および「相同の」は、理論的に共通な遺伝子の祖先を有するタンパク質を表すだけに限定されるものではなく、それでもやはり、同様な機能を発揮および／または同様な構造を有するように進化した遺伝的に無関係でありうるタンパク質を含む。相同体が機能的であるべきであるという要求は、本明細書に記載の相同体が比較タンパク質と実質的に同じ活性を有するタンパク質を含むことを意味する。機能的相同性を有するタンパク質では、必ずしも、これらがこれらのアミノ酸配列において有意な同一性を有する必要がなく、むしろ、機能的相同性を有するタンパク質が同様または同一の活性（例えば、酵素活性）を有することによってそのように定義される。
【００７７】
好ましくは、例えば、宿主のコリネ型細菌より別の生物由来の酵素は、少なくとも有意な類似性（すなわち、アミノ酸レベルで約５０％の配列同一性）を示し、コリネ型細菌におけるその対応物と同じ反応を触媒する場合、機能的相同体であると考えられる。同じ酵素活性をもたらし、アミノ酸レベルで少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％または少なくとも約９０％の配列相同性などの高度の同一性を共有する機能的相同体がさらに好ましい機能的相同体である。
【００７８】
当業者は、コリネ型細菌由来の上述の酵素および他の生物におけるこれらの機能的相同体の断片または突然変異型も、これらの断片および突然変異型が同じタイプの機能的活性を示す限り使用できることを知っている。典型的な機能的活性断片は、Ｎ末端および／またはＣ末端欠失を示すが、一方、突然変異型は典型的に欠失、挿入または点突然変異を含む。
【００７９】
一例として、Ｅ．ｃｏｌｉの配列は、配列番号２に対してアミノ酸レベルで上述した同一性レベルを示し、同じ酵素活性を示す場合、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの機能的相同体をコードすると考えられる。例はＥ．ｃｏｌｉ対応物である（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＰ_００２４７２）。また、得られたタンパク質が完全長酵素と同じタイプの反応を依然として触媒する限り、これら配列の断片または例えば点突然変異体を使用することができる。
【００８０】
本発明によれば、ペントースリン酸経路の少なくとも１種の酵素の量および／または活性を増加することで、コリネ型細菌のメチオニン産生を改善することができる。
【００８１】
コリネ型細菌のメチオニンの産生を改善することは、とりわけメチオニン合成の効率を上昇させ、生産されるメチオニンの量を増加させることを意味する。
【００８２】
「メチオニン合成の効率」という用語は、メチオニンの炭素収率を述べている。この効率は、炭素基質の形態で系に入るエネルギー入力の百分率として算出される。本発明の全体を通じて、この値は、パーセント値で示す（（モルメチオニン）（モル炭素基質（−1×１００）。「メチオニン合成の効率の増加」という用語は、したがって、出発生物とペントースリン酸経路の少なくとも１種の酵素の量および／または活性が増加している実際のコリネ型細菌との比較に関する。
【００８３】
本発明による好ましい炭素源は、単糖類、二糖類または多糖類などの糖類である。例えば、グルコース、フルクトース、ハノース、ガラクトース、リボース、ソルボース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、デンプンまたはセルロースを含む群から選択される糖類は、特に好ましい炭素源として機能し得る。
【００８４】
また、本発明による方法およびコネリ型細菌は、出発生物と比較してより多くのメチオニンを生産するために使用することができる。
【００８５】
また、本発明による方法およびコネリ型細菌は、出発生物と比較して、より速い速度でメチオニンを生産するために使用することができる。例えば、典型的な生産期間を考える場合、本方法およびコネリ型細菌は、より早い速度でメチオニンを生産することを可能にする（すなわち、同量のメチオニンが出発生物と比較して、より早い時点で生産される）。これは、特に対数増殖期にあてはまる。
【００８６】
本発明による方法およびコリネ型細菌は、菌株を振盪フラスコインキュベーションでインキュベートする場合、少なくとも約３ｇのメチオニン／Ｌ培養量を生産することを可能にする。菌株を振盪フラスコインキュベーションでインキュベートする場合、少なくとも約４ｇのメチオニン／Ｌ培養量、少なくとも約５ｇのメチオニン／Ｌ培養量または少なくとも約７ｇのメチオニン／Ｌ培養量の力価が好ましいと思われる。菌株を振盪フラスコインキュベーションでインキュベートする場合、より好ましい値は、少なくとも約１０ｇのメチオニン／Ｌ培養量およびなお一層好ましくは少なくとも約２０ｇのメチオニン／Ｌ細胞量になる。
【００８７】
本発明による方法およびコリネ型細菌は、菌株を、撹拌および炭素源フィード発酵槽を使用した発酵試験においてインキュベートする場合、少なくとも約２５ｇのメチオニン／Ｌ培養量を生産することを可能にする。菌株を、撹拌および炭素源フィード発酵槽を使用した発酵試験においてインキュベートする場合、少なくとも約３０ｇのメチオニン／Ｌ培養量、少なくとも約３５ｇのメチオニン／Ｌ培養量または少なくとも約４０ｇのメチオニン／Ｌ培養量の力価が好ましいと思われる。菌株を、撹拌および炭素源フィード発酵槽を使用した発酵試験においてインキュベートする場合、より好ましい値は、少なくとも約５０ｇのメチオニン／Ｌ培養量およびなお一層好ましくは少なくとも約６０ｇのメチオニン／Ｌ細胞量になる。
【００８８】
好ましい実施形態において、本発明の方法および微生物は、メチオニン合成の効率ならびに／またはメチオニンの量ならびに／またはメチオニン合成の力価および／もしくは速度を、出発生物と比較して少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％または少なくとも約２０％増加させることを可能にする。好ましい実施形態において、メチオニン合成の効率ならびに／またはメチオニンの量ならびに／または力価および／もしくは速度は、出発生物と比較して少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％増加する。なお一層好ましいのは、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約５倍および少なくとも約１０倍の増加である。しかし、すでに約５％の増加が有意な改善であると考慮し得る。
【００８９】
本発明によれば、上述の７種の酵素の少なくとも１種の量および／または活性がそれぞれの出発生物と比較して増加すると、コリネ型細菌におけるメチオニンの産生は改善し得る。
【００９０】
一態様において、トランスアルドラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼまたは６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼの量および／または活性が増加することが好ましい。これがＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいて実行されることがなお一層好ましい。
【００９１】
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいてグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの量および／または活性が増加すると、当業者は、コード配列がＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるゲノム内のグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子の３’末端に位置するＯＣＰＡタンパク質の量および／または活性も同時に増加することに気付くであろう。ＯＣＰＡは、機能的グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼが組み立てられるプラットフォームとして機能するように見えるので、同時に過剰発現すると思われる（Ｍｏｒｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ（上記参照））。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのＯＣＰＡの核酸配列は、配列番号１５で示される。対応するアミノ酸配列は、配列番号１６で示される。ジーンバンク登録番号は、Ｃｇｌ１５７７である。
【００９２】
別の実施形態において、ペントースリン酸経路の少なくとも２種の酵素の量および／または活性は、それぞれの出発生物と比較して増加する。
【００９３】
好ましい一実施形態において、トランスケトラーゼおよびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、トランスケトラーゼおよび６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、またはグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼおよび６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼの量および／または活性は同時に増加する。この後者態様の更なる詳細において、これは、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいて行われる。
【００９４】
本発明の一態様において、トランスケトラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼおよび６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼの量および／または活性を同時に増加させることが好ましいことがある。これは、好ましくはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいて実行可能である。
【００９５】
コリネ型細菌におけるペントースリン酸経路の少なくとも４種の酵素の量および／または活性を増加させる場合、これは好ましくはトランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼおよび６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼの量および／または活性を同時に増加させることによって行われる。これは、好ましくはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいて実行可能である。
【００９６】
ペントースリン酸経路の上述の好ましい酵素の組合せの量および／または活性は、好ましくはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいて増加する。このためには、ＡＴＣＣ１３０３２などの野生型株または更なる遺伝子組換えを有する菌株のいずれかを使用して、メチオニン合成を増加および改善することができる。
【００９７】
そのような菌株は、例えば、フィードバック耐性ホモセリンデヒドロゲナーゼ（ｈｏｍfbr）を発現し得る。そのような菌株は、フィードバック耐性アスパラギン酸キナーゼ（ａｓｋfbr）をさらに発現し得る。そのような菌株は、メチオニンシンターゼ（ｍｅｔＨ）の発現増加を付加的に示しうる。メチオニン生産のために適しており、フィードバック耐性ホモセリンデヒドロゲナーゼ、フィードバック耐性アスパラギン酸キナーゼおよびメチオニンシンターゼを過剰発現する菌株は、例えば、上述の実施例のＤＳＭ１７３２２である。
【００９８】
本発明の目的のために好ましく使用できる他のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ出発株は、ＤＳＭ１７３２２の上述の改変を有し、メチオニン合成に関してさらに最適化される。そのような菌株は、例えば、突然変異したホモセリンキナーゼ（ｈｓｋ（突然変異））、ホモセリンサクシニルトランスフェラーゼ（ｍｅｔＡ）およびＯ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ（ｍｅｔＹ）のレベルが増加し得る。これらすべての遺伝子改変を有する菌株は例えば実施例１のＭ２０１４である。したがって、本発明の目的におけるＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの特に有望な出発生物は、ｍｅｔＨ、ｍｅｔＹおよびｍｅｔＡ、ｈｏｍfbr、ａｓｋfbrおよびｈｓｋ（突然変異）レベルの増加を示す。
【００９９】
フィードバック耐性ホモセリンデヒドロゲナーゼの例は、配列番号１７の３９３位にＳ３９３Ｆの突然変異を持つ。このｈｏｍfbrは、スレオニンおよび／またはメチオニンによるフィードバック阻害の減少を示す。フィードバック耐性アスパラギン酸キナーゼの例は、配列番号１８の３１１位にＴ３１１Ｉの突然変異を持つ。このａｓｋfbrは、リシンおよび／またはスレオニンによるフィードバック阻害の減少を示す。上述の機能的突然変異を有するホモセリンキナーゼは、配列番号１９の１９０位にＴ１９０Ａ突然変異または１９０位もしくはＴＴＧ開始コドンにＴ１９０Ｓ突然変異を有する。
【０１００】
Ｍ２０１４などの上述の遺伝子改変を保有し得るＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ出発生物は、負の調節因子（ｍｃｂＲ）（Ｒｅｙ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５６．８７１−８８７，Ｒｅｙ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０３．５１−６５，米国特許第ＵＳ２００５０７４８０２号）およびＤ−メチオニン結合リポタンパク質（ｍｅｔＱ）の核酸配列を欠失させることによって、ならびにＮ５，１０−メチレン−テトラヒドロ葉酸レダクターゼ（ｍｅｔＦ）の発現を増加させることによってさらに改善し得る。対応する菌株は、実施例５においてＯＭ４６９として述べる。これらのＤＳＭ１７３２２、Ｍ２０１４またはＯＭ４６９と同一または同等である遺伝子改変を示す菌株は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ出発生物として好ましいことがある。
【０１０１】
コリネ型細菌におけるペントースリン酸経路の酵素量を、例えば、遺伝子コピー数（すなわち、前記酵素をコードしている核酸配列のコピー数）を増加させることによって、転写を増加させることによって、翻訳を増加させることによっておよび／またはその組合せによって増加させることができる。
【０１０２】
当業者は、核酸配列の遺伝子コピー数を増加させるために、転写を増加させるためにおよび／または翻訳を増加させるために必要な遺伝子改変の種類に精通している。
【０１０３】
一般に、ポリペチドをコードしている核酸配列のコピー数を、前記ポリペチドをコードしている核酸配列を含むコリネ型細菌においてベクターを発現させることによって増加させることができる。そのようなベクターは、それらがコリネ型細菌内で安定して保持できるように自己複製可能であり得る。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるペントースリン酸経路のポリペプチドおよび酵素を発現させるための典型的ベクターは、Ｂｏｔｔ，Ｍ．ａｎｄ  Ｅｇｇｅｌｉｎｇ，Ｌ．，ｅｄｓ．Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ．ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  ＬＬＣ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ；Ｄｅｂ，Ｊ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．（１９９９），１７５（１），１１−２０）、Ｋｉｒｃｈｎｅｒ  Ｏ．ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００３），１０４（１−３），２８７−２９９）、国際特許出願公開第ＷＯ２００６０６９７１１号および同第２００７０１２０７８号に記載されているようにｐＣｌｉＫ、ｐＢおよびｐＥＫＯを含む。
【０１０４】
コリネ型細菌のポリペプチドをコードしている核酸配列のコピー数を増加させるための別のアプローチでは、そのようなポリペプチドをコードしている核酸配列の更なるコピーをＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの染色体に組み込むことができる。染色体組込みは、例えば、それぞれのポリペプチドの内因性コピーが局在化する座で起こり得る。付加的におよび／または代わりに、ポリペプチドをコードしている核酸配列の染色体増殖は、コリネ型細菌のゲノムの他の座で起こり得る。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの場合には、染色体組込みによって遺伝子コピー数を増加させるための当業者に公知の様々な方法がある。１つのそのような方法は、例えば、ベクターｐＫ１９  ｓａｃＢを使用することであり、これはＳｃｈａｆｅｒ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９４  １７６（２３）：７３０９−７３１９の出版物に詳細に記述されている。ポリペプチドをコードしている核酸配列の染色体組込み用の他のベクターは、国際特許出願公開第２００５０５９０９３号または同第２００７０１１８４５号に記述されるようなｐＣＬＩＫ  ｉｎｔ  ｓａｃＢを含む。
【０１０５】
また、ペントースリン酸経路の少なくとも１種の酵素の量を増加させることを、それぞれの酵素をコードしている核酸配列の転写を増加させることによって達成し得る。転写の増加により、より多くのｍＲＮＡが生じ、最終的に翻訳されたタンパク質量が増加する。
【０１０６】
当業者は、数多くのアプローチによってコリネ型細菌のコード配列の転写を増加させることができることを承知している。したがって、強力なプロモーターおよび／または強力なエンハンサー要素を使用することによって転写を増加させることができる。また、例えば、アプタマーなどの転写活性化因子を使用するか、転写因子を過剰発現させることができる。本発明の文脈において、強力なプロモーターの使用が好ましいことがある。
【０１０７】
本発明の文脈において、野生型の状況でそれぞれの核酸配列の前にある内因性プロモーターより、それぞれのポリペプチドをコードする核酸配列を高度に転写する場合、プロモーターは「強力なプロコーター」と考えられる。
【０１０８】
本発明の目的のために、以下のプロモーターの使用を考慮することができる：ＰSOD（配列番号２０）、ＰgroES（配列番号２１）、ＰEFTu（配列番号２２）および？PR（配列番号２３）。これらのプロモーターは、一般にＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいてペプチドを過剰発現させるために使用され、プロモーターの強さは以下の順序であると考えられる：Ｐ?R＞ＰEFTu＞ＰSOD＞ＰGRoES。
【０１０９】
当業者は、上述のリストの？PRなどの最も強力なプロモーターを使用することが何時でも望ましいというわけではないことを十分に承知している。ある場合では、最初の酵素の量を、例えば、ほんのわずかに増加させることが必要かつ十分であり、一方、２番目の酵素の量はできるだけ増加させることが望ましいことがある。したがって、そのような状況では、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおける最初および２番目の酵素の内因性プロモーターをそれぞれＰEFTuおよび？PRと置換することが考えられる。強力な転写活性のあるプロモーターを使用することに加えて、いわゆる「リボゾーム結合部位」の選択および配列により、上述の酵素などの酵素の量を有意に増加し得る。例えば、開始コドンの１５ｂｐ上流などの開始コドンに隣接する５’末端配列は、酵素活性に著しく影響を及ぼし、ＰEFTu（配列番号２２）、ＰgroES（配列番号２１）、ＰSOD（配列番号２０）および？PR（配列番号２３）の配列で見ることができる。
【０１１０】
翻訳の改善は、例えば、それぞれの酵素をコードしている核酸配列のコドン使用頻度を最適化することによって達成することができる。宿主酵素の核酸配列を使用する場合、典型的にコドン使用頻度の適合は必要ではないが、適用してもよい。しかし、例えばグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（およびＯＣＰＡ）の量がＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ内でＥ．ｃｏｌｉのそれぞれの酵素を過剰発現させることによって増加される場合、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのコドン使用頻度にＥ．ｃｏｌｉの酵素のコード配列を適合させることは考慮するに値すると思われる。
【０１１１】
本発明のいくつかの実施形態において、それぞれのコリネ型細菌および好ましくはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの染色体の内因性遺伝子の位置で、複数のコピーにそれぞれの核酸配列を組み込むことによって、ペントースリン酸経路の酵素をコードしている核酸配列のコピー数を増加させることが好ましい。このアプローチは、通常、可能な限りゲノムのゲノム完全性を保存する。
【０１１２】
当然、当業者は、上述のアプローチの組合せも想定し、したがって、例えば、強力なプロモーターのＰSODを使用し、同時にＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼのコピー数を増加させることによって、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの量を増加させることを考えるであろう。
【０１１３】
ペントースリン酸経路の酵素をコードしているいくつかの遺伝子は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるオペロンで組織化される。このオペロンは、トランスケトラーゼ、６−ホスホグルコノラクトナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子およびＯＣＰＡと呼ばれる遺伝子を含む。６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ内でこのオペロンの一部を形成しない。
【０１１４】
本発明のいくつかの上述の好ましい実施形態によれば、トランスケトラーゼおよび６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、トランスケトラーゼおよびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ならびにグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼおよび６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼの組合せの量および／または活性を増加させることが好ましい。また、これらの３種の酵素が同時に増加することが好ましい。
【０１１５】
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるこれら３種の酵素のゲノム構造および位置からみると、本発明の好ましい実施形態は、したがって、メチオニンを生産するための方法およびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ生物に関し、ここではＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるトランスケトラーゼ遺伝子の前の内因性プロモーターが、上記定義の通り強力なプロモーターによって置換される。
【０１１６】
本発明のなお一層好ましい実施形態において、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのトランスケトラーゼの前の内因性プロモーターは、上記定義の通り強力なプロモーターと置換され、上記の通りに６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼの量および／または活性は増加する。そのようなアプローチを用いて、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいて最小の遺伝子組換えをすることにより酵素のトランスケトラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼおよび場合によって６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼの量の増加を達成し得る。
【０１１７】
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるトランスケトラーゼ遺伝子の前の内因性プロモーターを置換する際に、好ましくはＰSODを使用できることがさらに発見されている。なぜなら、このプロモーターが、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるペントースリン酸経路のオペロンのメチオニン生産に関係するトランスケトラーゼおよび他の遺伝子の量を増加させる目的のために、効率的な転写活性を確実にするためである。同様に、強力なプロモーターの使用によって６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼの量を増加させる場合、ＰSODプロモーターが好ましい。
【０１１８】
したがって、特に好ましい実施態様において、本発明は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるｔｋｔの前の内因性プロモーターが強力なプロモーターによって置換され、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の前の内因性プロモーターが強力なプロモーターによって置換され、強力なプロモーターが好ましくはＰSODである、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ生物に関する。
【０１１９】
これらの酵素のコード配列に突然変異を導入することによって、例えば、それぞれの酵素をフィードバック耐性型にして、ペントースリン酸経路の酵素の活性を増加し得ることが上述されている。トランスケトラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼおよび６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼに関する特定の例を以下に提供する。
【０１２０】
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのトランスケトラーゼの場合には、配列番号１２のＡ２９３に対応する位置のアラニンのＲへの交換および／または配列番号１２のＡ３２７に対応する位置のアラニンのＴへの交換の突然変異により、酵素の酵素活性が改善される。当業者は、提供される情報に基づき更なるまたは代わりの突然変異を開発することができる。
【０１２１】
本発明の特に好ましい実施形態は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのトランスケトラーゼ遺伝子の前で内因性プロモーターを強力なプロモーターおよび好ましくはＰSODプロモーターと置換することによって、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるペントースリン酸経路の酵素の活性および量が増加する微生物および方法に関する。本実施例において、トランスケトラーゼは、上述のＡ２９３Ｒおよび／またはＡ３２７Ｔ突然変異と同じ効果をもたらす突然変異を持つことができる。
【０１２２】
代わりにおよび／または付加的に、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、トランスケトラーゼのための上述のＡ２９３ＲおよびＡ３２７Ｔ突然変異と同様の効果をもたらす突然変異をさらに持つことができる。これらの突然変異は、配列番号２の２４３および／または２６１および／または２８８および／または２８９および／または３７１位に対応する位置であり得るが、これらに限定されるものではない。これらの位置を、得られたタンパク質がＡ２４３、Ａ２６１、Ｑ２８８、Ｌ２８９、Ｖ３７１以外の他のアミノ酸（例えば、限定されるものではないＴ２４３、Ｐ２６１、Ａ２８８、Ｒ２８９、Ａ３７１）を持つように突然変異させることができる。
【０１２３】
本発明のこの好ましい実施形態の更なる詳細において、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼの量および活性が増加する。好ましくは、量は強力なプロモーターを用いて、および好ましくはＰSODによって増加する。活性は、トランスケトラーゼの上述のＡ２９３ＲおよびＡ３２７Ｔ突然変異と同様の効果をもたらす６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子のコード配列に突然変異を導入することによって増加する。６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（配列番号６）において、配列番号６の１５０、２０９，２６９、２８８、３２９，３３０および／または３５３位に対応するアミノ酸を、得られたタンパク質がＰ１５０、Ｒ２０９、Ｒ２６９、Ａ２８８、Ｄ３２９、Ｖ３３０、Ｓ３５３以外の他のアミノ酸（例えば、限定されるものではない１５０Ｓ、２０９Ｐ、２６９Ｋ、２８８Ｒ、３２９Ｇ、３３０Ｌ、３５３Ｆ）を持つように突然変異させることができる。
【０１２４】
当業者は、そのような点突然変異を、例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの内因性配列に導入する方法を知っている。このことは、例えば、修飾された核酸配列（例えば、トランスケトラーゼの突然変異型をコードする核酸配列）をＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるトランスケトラーゼの天然の座に染色体組込みすることによって達成できる。元の座での染色体組込みは、Ｓｃｈａｅｆｅｒ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９４  １７６（２３）：７３０９−７３１９およびＷＯ２００７０１１８４５の方法に従って達成できる。当然、例えば、突然変異を有するＥ．ｃｏｌｉトランスケトラーゼをコードしている遺伝子から誘導された配列を使用することもできる。この場合、突然変異は、例えば、配列番号１２の２９３および／または３２７位に対応する位置で導入すべきである。
【０１２５】
したがって、一般に本発明は、コリネ型細菌およびメチオニン合成が増加したコリネ型細菌のメチオニン合成を増加させるための方法に関する。両方の本発明の態様は、ペントースリン酸経路の酵素の量および／または活性が増加することを特徴とする。本発明の方法に関する限りでは、ペントースリン酸経路の少なくとも１種の酵素の量および／または活性が、コリネ型細菌において増加する。コリネ型細菌に関する限り、本発明は、ペントースリン酸経路の少なくとも２種の酵素の量および／または活性が増加することが想定される。
【０１２６】
本発明の好ましい実施形態において、ペントースリン酸経路の酵素の量は、好ましくはＰSODプロモーターである強力なプロモーターとトランスケトラーゼ遺伝子の前の内因性プロモーターを置換することによってＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいて増加する。この好ましい実施形態の更なる発展において、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼの量はさらに上昇し、これも強力なプロモーターを使用することによって達成し得る。なお一層好まれる実施形態において、トランスケトラーゼ遺伝子の前の内因性プロモーターが置換されるだけでなく、トランスケトラーゼ遺伝子および場合によってグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のコード配列に突然変異も導入され、さらにこれら酵素の活性が増加する。本発明のこの好ましい態様の更なる発展は、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼの量がＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいて、例えば、強力なプロモーター、好ましくはＰSODと内因性６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼのプロモーターを置換することによって増加し、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼの活性が上記の突然変異を導入することによって増加する特徴を含む。これらの好ましい遺伝子改変を、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのいずれかの菌株に導入することができる。野生型株が使用される場合、ＡＴＣＣ１３０３２が好ましいと思われる。しかし、いくつかの実施形態において、ＤＳＭ１７３２２などのすでにメチオニン産生株と考えられる菌株を使用することが好ましい。さらに好ましい菌株は、上記の通りの遺伝子改変のタイプ、すなわちｍｅｔＹ、ｍｅｔＡ、ｍｅｔＨ、ｈｓｋfbr、ａｓｋfbrおよびｈｏｍ（突然変異）の増加を含む。対応する遺伝子改変を有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株は、例えば、Ｍ２０１４である。そのような菌株は、ｍｃｂＲ調節因子の欠失、ｍｅｔＱのダウンレギュレーションおよびｍｅｔＦの発現増加によってさらに改善し得る。対応する遺伝子改変を反映する菌株は、ＯＭ４６９である。
【０１２７】
以下の第１表は、異なる生物におけるペントースリン酸経路の酵素に関するＧｅｎｂａｎｋ登録番号の概要を示す。第２表は、異なる生物における前述のいくつかの他の酵素のＧｅｎｂａｎｋ登録番号を示す。
【０１２８】
第１表  ペントースリン酸経路の酵素
【表１】
2010518827.tif 000003
【０１２９】
第２表  メチオニン産生生物の酵素
【表２】
2010518827.tif 000004
【０１３０】
【表３】
2010518827.tif 000005
【０１３１】
上記の登録番号は、Ｇｅｎｂａｎｋの公式登録番号であるか、またはＧｅｎｂａｎｋに相互参照を持つ登録番号の同物異名である。これらの番号は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／．で検索して見つけることができる。
【０１３２】
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるポリペプチドおよび遺伝子の量および／または活性を増加および減少させる方法について一般的な概要を以下に示す。当業者は、以下の実施例に開示されたもの以外の実施形態を実践に移す際に、これらの情報を参考にすることができる。
【０１３３】
量および／または活性の増加または導入
量を増加させることに関しては、２つの基本的なシナリオを識別することができる。第１のシナリオでは、酵素の量を、それぞれのタンパク質の外因性異形の発現によって増加させる。もう一方のシナリオでは、内因性のタンパク質の発現を、例えば、プロモーターおよび／もしくはエンハンサーリボソーム結合部位エレメントの活性ならびに／または転写、翻訳もしくは翻訳後のいずれかのレベルでそれぞれのタンパク質の活性を調節する他の調節活性に影響を及ぼすことによって増加させる。
【０１３４】
したがって、タンパク質の活性および量の増加は、異なる経路を通して達成することが可能であり、これらは、例えば、転写、翻訳およびタンパク質のレベルで抑制調節機構を切断するか、または例えば、強力なプロモーターにより内因性トランスケトラーゼを誘発することおよび／もしくはトランスケトラーゼをコードしている核酸を導入することによって出発生物と比較してこれらタンパク質をコードしている核酸の遺伝子発現を増加させることによるものである。
【０１３５】
一実施形態において、第１表または第２表の酵素の量および／または活性の増加は、第１表または第２表の酵素をコードしている核酸をコリネ形細菌、好ましくはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍに導入することによって達成される。
【０１３６】
原則として、第１表に一覧にされたタンパク質の酵素活性を有する異なる生物のいずれかのタンパク質を使用することができる。イントロンを含む真核生物の供給源由来のそのような酵素のゲノム核酸配列については、宿主生物が対応するｍＲＮＡをスプライシング可能ではない、またはスプライシング可能にすることができないような場合、対応するｃＤＮＡのようなすでにプロセシングされた核酸配列が使用されることになる。記述の中で挙げた全ての核酸は、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはｃＤＮＡ配列であり得る。
【０１３７】
本発明によれば、タンパク質の量を増加または導入することは、典型的に以下のステップを含む：
ａ）以下の核酸配列、好ましくは５’−３’方向のＤＮＡ配列を含むベクターを生産するステップ：
−本発明の生物において機能的なプロモーター配列
−例えば、第１表のタンパク質、機能的相同体、機能的断片またはその機能的な突然変異型をコードしている、それに機能可能に結合したＤＮＡ配列
−本発明の生物において機能的な終止配列
ｂ）ステップａ）で得たベクターを本発明の生物（例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）に移入および場合によってそれぞれのゲノムに組み込むステップ。
【０１３８】
先に述べたように、機能的断片は、例えば、第１表または第２表の酵素をコードしている核酸配列の断片に関し、その発現が依然としてそれぞれの完全長タンパク質の酵素活性を有するタンパク質となる断片である。
【０１３９】
上述の方法は、例えば、第１表の酵素またはその機能的断片をコードしているＤＮＡ配列の発現を増加させるために使用することができる。プロモーターおよび終止配列がそうであるように、調節配列を含むそのようなベクターの使用は当業者に公知である。さらに、当業者は、どのようにステップａ）で得たベクターをＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍまたはＥ．ｃｏｌｉなどの生物に移入し、ベクターがこれらのゲノムに組み込み可能であるためにどの特性を持つ必要があるかを知っている。
【０１４０】
また、本発明によれば、第１表または第２表の酵素をコードしている核酸の遺伝子発現の増加は、生物、特にＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの内因性のそれぞれの内因性酵素における発現の操作であると理解される。これは、例えば、これらの酵素をコードしている遺伝子のプロモーターＤＮＡ配列を改変することによって達成することができる。これらの酵素の発現率の改変、好ましくは増加を引き起こすそのような改変は、強力なプロモーターとの置換によって、ならびにＤＮＡ配列の欠失および／または挿入によって達成することができる。
【０１４１】
内因性遺伝子のプロモーター配列の改変によって、通常、遺伝子の発現量の変化が生じ、したがって、細胞または生物において検出可能な活性の変化も生じる。
【０１４２】
さらに、それぞれ内因性遺伝子の発現の変化および増加は、形質転換された生物では生じない、これらの遺伝子のプロモーターと相互作用する調節タンパク質によって達成することができる。そのような調節因子は、例えば、国際特許出願公開第９６／０６１６６号において記述されるようなＤＮＡ結合ドメインおよび転写アクチベータードメインから成るキメラタンパク質であり得る。
【０１４３】
内因性遺伝子の活性および含量を増加させるための更なる可能性は、例えば、過剰発現によって内因性遺伝子の転写に関係する転写因子をアップレギュレートすることである。転写因子の過剰発現のための手段は、当業者に公知である。
【０１４４】
第１表の内因性酵素のような内因性酵素の発現は、例えば、特に遺伝子のプロモーター配列に結合するアプタマーの発現を介して調節することができる。刺激または抑制するプロモーター領域に結合するアプタマーによって、第２表の酵素量は、例えば、増加し得る。
【０１４５】
さらに、内因性遺伝子の活性の改変は、内因性遺伝子コピーの標的突然変異誘発によって達成することができる。
【０１４６】
また、例えば、第１表の酵素をコードしている内因性遺伝子の改変は、酵素の翻訳後修飾に影響を与えることによって達成することができる。これは、例えば、過剰発現または遺伝子サイレンシングのような対応する手段によって酵素の翻訳後修飾に関係するキナーゼまたはホスファターゼのような酵素の活性を調節することによって起こり得る。
【０１４７】
別の実施形態において、酵素を、効率において、またはそのアロステリック制御領域を化合物産生のフィードバック阻害を防止するというように破壊することで改善し得る。同様に、分解酵素を、細胞の生存度を損なうことなく、その分解活性を第１表の所望の酵素に対して下げるというように、置換、欠失または付加によって欠失または改変し得る。いずれの場合にも、メチオニンの全収率、産生率または量が増加する。
【０１４８】
また、例えば第１表のタンパク質におけるそのような改変がシステインまたはグルタチオンなどの他の硫黄含有化合物、他のアミノ酸、ビタミン、補因子、機能性食品、核酸、ヌクレオシドおよびトレハロースなどの他のファインケミカルの産生を改善し得る。いずれか１つの化合物の代謝は、細胞内の他の生合成および分解経路と絡み合っている可能性があり、１つの経路の必要な補因子、中間体または基質は、別のそのような経路によって供給または限定されていることがある。したがって、第１表の１種以上のタンパク質の活性を調整することによって、メチオニン以外の他のファインケミカルの量、効率および速度は、正の影響を受ける可能性がある。
【０１４９】
第１表の酵素の量および／または活性を増加または導入するためのこれら上述の方法は、制限することを意図するものではなく、これらの方法の変動は当業者に容易に理解される。
【０１５０】
酵素の量および／または活性の減少
メチオニン産生のためにすでに最適化されている出発生物を使用するのが好ましい可能性があることについて上記で掲示している。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいて、例えば、ｍｅｔＱの活性をダウンレギュレートすることができる。
【０１５１】
酵素の量および／または活性を減少させるために、様々な方法が利用できる。
【０１５２】
第２表の内因性酵素などの内因性酵素の発現は、例えば、遺伝子のプロモーター配列に特異的に結合するアプタマーの発現を介して調節することができる。刺激または抑制するプロモーター領域へのアプタマーの結合によって、第２表の酵素の量およびこの場合活性は、例えば、減少し得る。
【０１５３】
また、アプタマーは、特に酵素自体に結合し、例えば、それぞれの酵素の触媒中心に結合することによって酵素の活性を減少させるという方法でデザインすることができる。アプタマーの発現は、通常、ベクターベースの過剰発現（上記参照）によって達成され、これは、アプタマーのデザインおよび選択と共に、当業者に周知である（Ｆａｍｕｌｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２４３，１２３−３６）。
【０１５４】
さらに、第２表の内因性酵素の量および活性の減少は、当業者に周知である様々な実験的な手段によって達成することができる。これらの手段は、通常、「遺伝子サイレンシング」という用語で要約される。例えば、内因性遺伝子の発現は、アンチセンスの順序で酵素またはその一部をコードしているＤＮＡ配列を有する上述したベクターを生物（例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）に移入することによってサイレンシングすることができる。これは、細胞におけるそのようなベクターの転写により、内因性遺伝子によって転写されるｍＲＮＡとハイブリッド形成することが可能で、したがって、その翻訳を防ぐＲＮＡを生じるという事実に基づく。
【０１５５】
原則として、アンチセンス方法は、リボザイム方法と併用することができる。リボザイムは触媒的に活性なＲＮＡ配列であり、アンチセンス配列に連結する場合、触媒作用で標的配列を切断する（Ｔａｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．２３（３），２５７−７５）。これは、アンチセンス方法の有効性を高めることができる。
【０１５６】
相同の組換え微生物を構築するために、欠失、付加または置換を導入することによって、内因性遺伝子が改変されている（例えば、機能的に損なわれた）、第１表の酵素をコードしている遺伝子の少なくとも一部を含むベクターを調製する。
【０１５７】
一実施形態において、ベクターは、相同組換えされると同時に、内因性遺伝子が機能的に阻害される（すなわち、機能タンパク質をもはやコードしない）ようにデザインされる。この代わりに、ベクターを、相同組換えされると同時に、内因性遺伝子が突然変異するか、または改変されるが、依然として機能タンパク質をコードするというようにデザインすることができる（例えば、上流の調節領域を改変して、これによって第２表の内因性酵素の発現を変更することができる）。このアプローチは、酵素の発現が完全に無効にされず、しかし、必要な最小レベルに減少されるという利点を持ち得る。当業者は、ベクターが内因性配列を置換するか、または欠失させるために使用できることを知っている。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍでは、そのようなベクターは、ｐＫ１９およびｐＣＬＩＫ  ｉｎｔ  ｓａｃＢを含む。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの染色体配列を阻害するための具体的な説明を以下に提供する。
【０１５８】
さらに、遺伝子抑制が転写因子の量を減少することによって可能である。
【０１５９】
また、標的タンパク質自体を阻害する因子を、細胞に導入することができる。タンパク質結合因子は、例えば、上述のアプタマーあり得る（Ｆａｍｕｌｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４３，１２３−３６）。
【０１６０】
更なるタンパク質結合因子で、発現されると、第１表の酵素の量および／または活性の減少を引き起こすことができる因子として、酵素特異的抗体を考慮することができる。単鎖抗体などの組換え酵素特異的抗体の産生は、当技術分野で公知である。また、抗体の発現は、文献から公知である（Ｆｉｅｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３，２０５−２１６；Ｍａｙｎａｒｄ  ａｎｄ  Ｇｅｏｒｇｉｏｕ（２０００）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．２，３３９−７６）。
【０１６１】
前述の技術は、当業者に周知である。したがって、当業者は、例えば、アンチセンス方法のために使用される核酸構築物が持たなければならい典型的な大きさ、およびそれぞれの核酸配列が持たなければならない相補性、相同性または同一性を知っている。相補性、相同性および同一性という用語は、当業者に公知である。
【０１６２】
相補性という用語は、２つの相補的な塩基間で水素結合によってもう１つの核酸分子とハイブリッド形成する核酸分子の特性をいう。当業者は、２つの核酸分子が互いにハイブリッド形成できるために１００％の相補性を示す必要のないことを知っている。もう１つの核酸配列とハイブリッド形成する核酸配列は、それぞれ、好ましくは少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、特に好ましくは少なくとも８０％、また特に好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％で、最も好ましくは少なくとも９８または１００％前記のもう１つの核酸配列と相補性である。
【０１６３】
内因性ｍＲＮＡ配列とアンチセンス配列のハイブリッド形成は、細胞条件下のｉｎ  ｖｉｖｏまたは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで典型的に起こる。本発明によれば、ハイブリッド形成は、特定のハイブリッド形成を確実にするのに十分にストリンジェントな、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏの条件下で実施される。
【０１６４】
ストリンジェントなｉｎ  ｖｉｔｒｏでのハイブリッド形成条件は、当業者に公知あって、文献から入手することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）参照）。「特異的ハイブリッド形成」という用語は、核酸配列が例えばＤＮＡまたはＲＮＡ分子の複合混合物の部分である場合、分子がストリンジェントな条件の下で優先的に特定の核酸配列と結合する場合をいう。
【０１６５】
したがって「ストリンジェントな条件」という用語は、核酸配列が優先的に標的配列と結合するが、しかし他の配列には結合しないか、少なくともかなり少ない程度で結合する条件をいう。
【０１６６】
ストリンジェントな条件は状況に依存する。長い配列は、特に高い温度でハイブリッド形成する。一般に、ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度および定義されたｐＨ値でハイブリッド形成温度が特定の配列の融点（Ｔｍ）の約５°Ｃ以下であるというような方法で選択される。Ｔｍは、（定義されたｐＨ値、定義されたイオン強度および定義された核酸濃度で）標的配列と相補的である分子の５０％が前記の標的配列とハイブリット形成する温度である。典型的に、ストリンジェントな条件は、０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン（または別の塩イオン）の塩濃度と７．０〜８．３のｐＨ値を含む。温度は、短い分子では（例えば、１０〜５０の核酸を含むそのような分子では）少なくとも３０°Ｃである。さらに、厳密な条件は、例えば、ホルムアミドのような不安定化剤の添加を含み得る。典型的なハイブリッド形成および洗浄緩衝液は、以下の組成物である。
【０１６７】
プレハイブリダイゼーション溶液：
０．５％  ＳＤＳ
５×ＳＳＣ
５０ｍＭ  ＮａＰＯ4、ｐＨ６．８
０．１％  Ｎａ−ピロリン酸塩
５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ試薬
１００μｇ／サケ精液
ハイブリッド形成溶液：プレハイブリダイゼーション溶液
１×１０6ｃｐｍ／ｍｌプローブ（５〜１０秒  ９５℃）
２０×ＳＳＣ：３Ｍ  ＮａＣｌ
０．３Ｍクエン酸ナトリウム
ＨＣｌでｐＨ７に調製
５０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ試薬：フィコール  ５ｇ
ポリビニルピロリドン５ｇ
ウシ血清アルブミン５ｇ
ａｄ  ５００ｍｌ  Ａ．ｄｅｓｔ
ハイブリッド形成のための典型的手順は、以下の通りである：
任意：６５℃で、１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で３０分間洗浄ブロット、
プレハイブリダイゼーション：５０〜５５℃で少なくとも２時間
ハイブリッド形成：５５〜６０℃で終夜
洗浄：０５分間、２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ
ハイブリッド形成温度
３０分間、２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ
ハイブリッド形成温度
３０分間、１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ
ハイブリッド形成温度
４５分間、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、６５℃
５分間、０．１×ＳＳＣ、室温
【０１６８】
アンチセンスの目的では、１００核酸、８０核酸、６０核酸、４０核酸および２０核酸の配列の長さを超える相補性で十分であり得る。また、より長い核酸長では、間違いなく十分である。また、上述の方法の併用が考えられる。
【０１６９】
本発明に従って、生物内で活性なプロモーターに５’−３’方向で機能可能に結合しているＤＮＡ配列が使用される場合、一般に生物の細胞への移入後に、コード配列の過剰発現を可能にするか、それぞれ、内因性核酸配列およびこれより発現するタンパク質の抑制または競合および遮断を引き起こすことができるベクターを構築し得る。
【０１７０】
また、特定の酵素の活性は、生物内でその非機能的突然変異体を過剰発現させることによって減少し得る。ゆえに、当該反応を触媒することはできないが、例えば、基質または補因子を結合することができる非機能的突然変異体は、過剰発現を介して、内因性酵素を打ち負かし、したがって、この反応を阻害することができる。宿主細胞の酵素の量および／または活性を減少させるための更なる方法は、当業者に周知である。
【０１７１】
本発明によれば、非機能的酵素は、基本的に、機能的酵素およびその機能的断片と、それぞれ同じ核酸配列およびアミノ酸配列を持つが、ある位置で、非機能的酵素がそれぞれの反応を触媒できないか、または非常に限られた程度でしか触媒できない影響を持つ核酸またはアミノ酸の点突然変異、挿入または欠失を有する。これらの非機能的酵素は、それぞれの反応を依然として触媒することできるが、これ以上フィードバック制御されない酵素と混同してはならない。本発明によれば、「非機能的酵素」という用語は、それぞれアミノ酸レベルおよび核酸レベルで、それぞれの機能的酵素に対して実質的な配列相同性を持たないそのようなタンパク質を含まない。それぞれの反応を触媒することができず、それぞれの酵素と実質的な配列相同性を持たないタンパク質は、したがって、定義上、本発明の「非機能的酵素」という用語によって表されない。本発明の範囲内では、非機能的酵素は、不活化または不活性酵素とも呼ばれる。
【０１７２】
したがって、上述の点突然変異、挿入および／または欠失を有する本発明による例えば第２表の非機能的酵素は、本発明による例えば第２表の野生型酵素またはその機能的に同等の部分に対する実質的な配列相同性によって特徴付けられる。実質的な配列相同性を決定するために、上述の同一性グレードが適用される。
【０１７３】
ベクターおよび宿主細胞
本発明の一態様は、上記のように修飾された核酸配列を含む、ベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本明細書で使用する、「ベクター」という用語は、結合されている別の核酸を運ぶことが可能な核酸分子をいう。
【０１７４】
あるタイプのベクターは「プラスミド」であり、更なるＤＮＡ断片を連結し得る環状の二本鎖ＤＮＡループをいう。ベクターの別のタイプは、更なるＤＮＡ断片がウイルスのゲノムに連結し得るウイルス性ベクターである。
【０１７５】
特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞内で自律複製が可能である（例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクトルおよびエピソーム性哺乳類ベクター）。他のベクターは、宿主細胞への導入と同時に宿主細胞のゲノムに組み入れられ、それによって、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクターは、機能可能なように結合する遺伝子の発現を誘導することができる。
【０１７６】
そのようなベクターは、本明細書において、「発現ベクター」という。
【０１７７】
一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドが最も一般的に使用されるベクターの形態であるので、交換可能なように使用されることがある。しかし、本発明は、同等の機能を発揮するウイルスベクターなどの他の形態の発現ベクターを含むことを意図している。
【０１７８】
本発明の組換え発現ベクターは、上記のように宿主細胞内でそれぞれの核酸の発現に適した形態で核酸を含むことがあり、これは組換え発現ベクターが、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択され、発現される核酸配列に機能可能に結合されている１つ以上の調節配列を含むことを意味する。
【０１７９】
本発明の目的において、機能的な結合は、コード配列を発現するときに、それぞれの調節エレメントがその決定に従ってその機能を果たすことができるような、プロモーター、コード配列、ターミネーターおよび場合によって更なる調節エレメントの連続配置であることが理解される。
【０１８０】
したがって、組換え発現ベクターの範囲内で、「作動可能に結合した」は、関心対象の核酸配列が核酸配列の発現を可能にするという様式で（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系において、またはベクターが宿主細胞に導入される場合は宿主細胞において）調節配列に結合していることを意味するよう意図されている。「調節配列」という用語は、プロモーター、リプレッサー結合部位、アクチベーター結合部位、エンハンサーおよび他の発現調節領域（例えば、ターミネーター、またはｍＲＮＡ二次構造の他のエレメント）を含むよう意図されている。そのような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に記述されている。調節配列は、多くのタイプの宿主細胞において核酸配列の構成的発現を誘導する配列、および特定の宿主細胞のみで核酸配列の発現を誘導する配列を含む。好ましい調節配列は、例えば、ｃｏｓ−、ｔａｃ−、ｔｒｐ−、ｔｅｔ−、ｔｒｐ−、ｔｅｔ−、ｌｐｐ−、ｌａｃ−、ｌｐｐ−ｌａｃ−、ｌａｃＩｑ−、Ｔ７−、Ｔ５−、Ｔ３−、ｇａｌ−、ｔｒｃ−、ａｒａ−、ＳＰ６−、ａｒｎｙ、ＳＰ０２、ＳＯＤ、ＥＦＴu、ＥＦＴs、ＧｒｏＥＬ、ＭｅｔＺ（全てＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍから）などのプロモーターであり、これらは好ましくは細菌において使用される。また、人工プロモーターを使用することも可能である。発現ベクターのデザインが形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの因子によって決定し得ることは当業者によって理解されるであろう。本発明の発現ベクターを、宿主細胞に導入し、このことによって、上述の修飾された核酸配列によってコードされた融合タンパクまたはペプチドを含むタンパク質またはペプチドを産生させることができる。
【０１８１】
原核生物におけるタンパク質の発現は、多くの場合、融合タンパク質または非融合タンパク質の発現を誘導する構成的または誘導性プロモーターを含むベクターによって実施される。
【０１８２】
融合ベクターは、多くのアミノ酸を、その中にコードされるタンパク質に加え、通常は、組換えタンパク質のアミノ末端に加えられるが、Ｃ末端にも加えられ、またはタンパク質の適切な領域内に融合させる。そのような融合ベクターは、典型的に、１）組換えタンパク質の発現を増加させること、２）組換えタンパク質の溶解性を増加させること、および３）親和性精製におけるリガンドとして作用することによって組換えタンパク質の精製を助けること、４）後のタンパク質の検出のために"タグ"を提供することの４つの役目を果たす。しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク分解による切断部位を、融合部分と組換えタンパク質の接合部に導入し、融合タンパク質の精製後に融合部分から組換えタンパク質を分離することを可能にする。そのような酵素およびそれらのコグネイト認識配列は、第Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼを含む。
【０１８３】
典型的融合発現ベクターは、それぞれグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質またはタンパク質Ａを融合させるｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を含む。
【０１８４】
コリネ型細菌に適した誘導性非融合発現ベクターの例は、ｐＨＭ１５１９、ｐＢＬ１、ｐＳＡ７７またはｐＡＪ６６７を含む（Ｐｏｕｗｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（１９８５）Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ＩＢＳＮ  ０  ４４４  ９０４０１８）。適したＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍおよびＥ．ｃｏｌｉシャトルベクターの例は、例えば、ｐＫ１９、ｐＣｌｉｋ５ａＭＣＳ  ｐＣＬＩＫｉｎｔ  ｓａｃＢであるか、Ｅｉｋｍａｎｎｓ  ｅｔ  ａｌ（Ｇｅｎｅ．（１９９１）１０２，９３−８）ならびに以下の出版物および特許出願で見つけることができる（Ｓｃｈａｅｆｅｒ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９４  １７６：７３０９−７３１９、Ｂｏｔｔ，Ｍ．ａｎｄ  Ｅｇｇｅｌｉｎｇ，Ｌ．，ｅｄｓ．Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ．  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  ＬＬＣ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ  国際特許出願公開第２００６０６９７１１、同第２００６０６９７１１号）。原核生物および真核生物細胞のための他の適した発現系については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００３の１６および１７章を参照のこと。
【０１８５】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換または形質移入技術を介して原核生物に導入することができる。本明細書で使用する「形質転換」および「形質移入」、「抱合」および「形質導入」という用語は、外部の核酸（例えば、直鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、線状化ベクターまたはベクターなしに遺伝子構築物単独））またはベクターの形態における核酸（例えば、プラスミド、ファージ、ファスミッド、ファージミド、トランスポゾンまたは他のＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための様々な当業者に認識された技術をいうことを意図し、これらはリン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介形質移入、リポフェクション、天然コンピテンス、化学物質介在移入または電気穿孔法を含む。宿主細胞を形質転換または形質移入させるための適した方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００３）および他の研究室マニュアルで見つけることができる。
【０１８６】
これらの要素を同定および選択するために、一般に、選択可能なマーカー（例えば、抗生物質耐性の）をコードする遺伝子を、関心対象の遺伝子と共に宿主細胞に導入する。好ましい選択可能なマーカーは、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、アンピシリンおよびメトトレキセートなどの、薬物に耐性を与えるマーカーを含む。選択可能なマーカーをコードしている核酸を、上述の修飾された核酸配列をコードしている核酸と同じベクターで宿主細胞へ導入することができるか、別のベクターで導入することができる。導入された核酸で安定して形質移入された細胞は、薬物選択によって同定することができる（例えば、選択可能なマーカー遺伝子を取り込んだ細胞は生存するが、他の細胞は死滅する）。
【０１８７】
別の実施形態において、導入された遺伝子の調節発現を可能にする選択系を含む、組換え微生物を作製することができる。例えば、上述の核酸配列の１つをベクターに含ませ、ｌａｃオペロンの制御下に配置すると、ＩＰＴＧの存在下でのみ遺伝子の発現を可能にする。そのような調節系は、当技術分野で周知である。
【０１８８】
本発明の別の態様は、本発明の組換え発現ベクターが導入されている生物または宿主細胞に関する。「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」という用語は、本明細書において交換可能なように使用される。そのような用語は、特定の対象細胞をいうだけでなく、そのような細胞の子孫または潜在的子孫についてもいうことが理解される。特定の修飾が突然変異または外界の影響のため続く生成で起こり得るので、そのような子孫は、実際には、親細胞と同一ではありえないが、依然として本明細書で使用する用語の範囲内である。
【０１８９】
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの増殖−培地および培養条件
一般的な教示は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの培養に関して、以下で示す。応用は当業者にとって明らかである。対応する情報は、Ｅ．ｃｏｌｉの培養のための標準的テキストから得ることができる。
【０１９０】
遺伝子組換えコリネ型細菌は、典型的に合成または天然の増殖培地で培養される。コリネ型細菌のための多くの異なる増殖培地は、周知で、容易に入手できる（Ｌｉｅｂ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３２：２０５−２１０；ｖｏｎ  ｄｅｒ  Ｏｓｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ，（１９９８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１１：１１−１６；独国特許第４，１２０，８６７号；Ｌｉｅｂｌ（１９９２）"Ｔｈｅ  Ｇｅｎｕｓ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ，ｉｎ：Ｔｈｅ  Ｐｒｏｃａｒｙｏｔｅｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  ＩＩ，Ｂａｌｏｗｓ，Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）。
【０１９１】
これらの培地は、１種以上の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミンおよび微量元素から成る。好ましい炭素源は、単糖類、二糖類または多糖類などの糖類である。例えば、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、リボース、ソルボース、リボース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、デンプンまたはセルロースは、非常に良好な炭素源として用いられる。
【０１９２】
糖蜜または砂糖精製から得られる他の副産物などの錯化合物を介して培地に糖を供給することも可能である。また、異なる炭素源の混合物を供給することも有利であり得る。他の可能な炭素源は、メタノール、エタノール、酢酸または乳酸などのアルコールおよび有機酸である。窒素源は、通常有機もしくは無機の窒素化合物、またはこれらの化合物を含む物質である。典型的な窒素源は、アンモニアガスまたはアンモニア塩、例えばＮＨ4Ｃｌまたは（ＮＨ4）2ＳＯ4、ＮＨ4ＯＨ、硝酸塩、尿素、アミノ酸または複合窒素供給源、例えばコーンスティープリカー、ダイズ粉、ダイズタンパク質、酵母抽出物、肉抽出物等を含む。
【０１９３】
培地に含有し得る無機塩化合物は、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、コバルト、水鉛、カリウム、マンガン、亜鉛、銅および鉄の塩化塩、亜リン酸塩または硫酸塩を含む。キレート化合物を、金属イオンを溶液状態のまま維持するために培地に加えることができる。特に有用なキレート化合物は、カテコールもしくはプロトカテキュエートのようなジヒドロキシフェノール、またはクエン酸などの有機酸を含む。また、培地がビタミンまたは増殖プロモーターなどの他の増殖因子を含むことはよくあることであり、例として、ビオチン、リボフラビン、チアミン、葉酸、ニコチン酸、パントテン酸塩およびピリドキシンを含む。増殖因子および塩類は、しばしば酵母抽出物、糖蜜、コーンスティープリカーなどの天然培地成分に由来する。化合物の正確な組成は、目前の実験に強く依存し、特定の場合ごとに個々に決定される。培地最適化に関する情報は、テキスト"Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｅｄｓ．Ｐ．Ｍ．Ｒｈｏｄｅｓ，Ｐ．Ｆ．Ｓｔａｎｂｕｒｙ，ＩＲＬ  ｐｒｅｓｓ（１９９７）ｐｐ．５３−７３，ＩＳＢＮ  ０  １９  ９６３５７７  ３）で入手できる。増殖培地を、ｓｔａｎｄａｒｄ  １（Ｍｅｒｃｋ）またはＢＨＩ（ｇｒａｉｎ  ｈｅａｒｔ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ、ＤＩＦＣＯ）などのような商業的な供給業者から選択することも可能である。
【０１９４】
全ての培地成分は、熱（１．５バールおよび１２１℃で２０分間）または濾過殺菌法のいずれかにより滅菌すべきである。成分は、一緒に、または必要に応じて別々に滅菌することができる。
【０１９５】
全ての培地成分は、増殖の初期に存在させるか、または場合によって連続的にもしくはバッチ式に加えることができる。培養条件は、実験ごとに別々に定められる。
【０１９６】
温度は、１５℃〜４５℃の範囲であるべきである。温度を一定に保つか、実験中に変えることができる。培地のｐＨは、５〜８．５、好ましくは７．０前後の範囲でよく、培地に緩衝液を添加することで一定に保つことができる。この目的のための典型的な緩衝液は、リン酸カリウム緩衝液である。ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＡＣＥＳなどの合成緩衝液を代わりに、または同時に使用することができる。増殖中にＮａＯＨまたはＮＨ4ＯＨなどを添加することより一定の培養ｐＨを保つことも可能である。酵母抽出物などの天然培地成分が使用される場合、多くの錯化合物は高い緩衝能力があるという事実によって、追加の緩衝液の必要性が減少し得る。微生物の培養に発酵槽を使用する場合、ｐＨはアンモニアガスを使用して制御することもできる。
【０１９７】
インキュベーション時間は通常数時間から数日の範囲である。この時間は、ブロス中にできるだけ大量の産物が蓄積されるように選択される。開示される増殖実験は、ミクロタイタープレート、ガラス管、ガラスフラスコ、または異なる大きさのガラスもしくは金属発酵槽などの種々の容器の中で行なうことができる。多数のクローンのスクリーニングのためには、微生物をミクロタイタープレート、ガラス管、振盪フラスコ中、バッフルの有無のいずれかで培養が行われる。好ましくは１００ｍｌまたは２５０ｍｌの振盪フラスコを使用し、これに約１０容量％の必要な増殖培地を装填する。フラスコを約１００〜３００‘ｒｐｍの速さの範囲を使用して、ロータリーシェーカー（振幅約２５ｍｍ）で振盪すべきである。蒸発減は湿潤雰囲気中に保つことによって少なくすることができる。或いは、蒸発減の数学的補正を行うべきである。
【０１９８】
遺伝子組換えクローンを実験する場合、組換えされていない対照のクローンまたはいかなる挿入もなされていない基本的なプラスミドを含む対照クローンの実験も行うべきである。３０℃でインキュベートしているＣＭプレート（１０ｇ／Ｌのグルコース、２．５ｇ／ＬのＮａＣｌ、２ｇ／Ｌの尿素、１０ｇ／Ｌのポリペプトン、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、５ｇ／Ｌの肉抽出物、２ｇ／Ｌの尿素、１０ｇ／Ｌのポリペプトン、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、５ｇ／Ｌの肉抽出物、２２ｇ／Ｌの寒天、ｐＨは２Ｍ  ＮａＯＨにより６．８に調整）などの寒天プレート上で増殖させた細胞を用いて、培地を０．５−１．５のＯＤ６００まで接種する。ＣＭプレートからのＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞の塩水性懸濁液の導入、またはこの細菌の前培養液の添加のいずれかにより培地の接種が達成される。その他のインキュベーション方法は国際特許出願公開第２００７０１２０７８から得ることができる。
【０１９９】
一般的な方法
一般的な方法のためのプロトコールは、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ，（２００５）ｅｄｓ．：Ｌ．Ｅｇｇｅｌｉｎｇ，Ｍ．Ｂｏｔｔ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，ａｔ  Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８７）５，１３７−１４６），Ｇｕｅｒｒｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｅｎｅ（１９９４），１３８，３５−４１），Ｔｓｕｃｈｉｙａ  ｕｎｄ  Ｍｏｒｉｎａｇａ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８），６，４２８−４３０），Ｅｉｋｍａｎｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｅｎｅ（１９９１），１０２，９３−９８），欧州特許第０  ４７２  ８６９号，米国特許第４，６０１，８９３号，Ｓｃｈｗａｒｚｅｒ  ａｎｄ  Ｐｕｅｈｌｅｒ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９１），９，８４−８７，Ｒｅｉｎｓｃｈｅｉｄ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４），６０，１２６−１３２），ＬａＢａｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（１９９３），１７５，１００１−１００７），国際特許出願公開第９６／１５２４６号，Ｍａｌｕｍｂｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｅｎｅ（１９９３），１３４，１５−２４），日本特許出願公開第１０−２２９８９１号，ａｔ  Ｊｅｎｓｅｎ  ｕｎｄ  Ｈａｍｍｅｒ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（１９９８），５８，１９１−１９５），Ｍａｋｒｉｄｅｓ（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ（１９９６），６０，５１２−５３８）、国際特許出願公開第２００６０６９７１１、同第２００７０１２０７８および遺伝学および分子生物学の周知のテキストにおいて見つけることができる。
【０２００】
菌株、培地およびプラスミド
菌株は、例えば、以下のリストから得られる。
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２、
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１５８０６、
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１３８７０、
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１５３９、
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ  ＡＴＣＣ１７９６５、
Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６７、
Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９および
Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ  ＡＴＣＣ  １４０２０もしくはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＫＦＣＣ１００６５、ＤＳＭ１７３２２など、それから誘導された菌株または
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ２１６０８。
【０２０１】
組換えＤＮＡ技術
プロトコールは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３rd  ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，Ｖｏｌ．１，２，３、およびＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（２００５）ｅｄｓ．Ｌ．Ｅｇｇｅｌｉｎｇ，Ｍ．Ｂｏｔｔ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓにおいて見つけることができる。
【０２０２】
アミノ酸およびメチオニン中間体の定量
分析は、保護カートリッジおよびＳｙｎｅｒｇｉ４μｍカラム（ＭＡＸ−ＲＰ  ８０Å，１５０＊４．６ｍｍ）（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、ドイツ国アシャッフェンブルク）を備えたＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００、Ａｇｉｌｅｎｔ、ドイツ国ヴァルトブロン）によって行う。注入前に、ｏ−フタルジアルデヒド（ＯＰＡ）および還元剤としてメルカプトエタノール（２−ＭＣＥ）を使用して分析物を誘導体化する。さらにスルフヒドリル基をヨード酢酸でブロックする。極性相として４０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4（溶出剤Ａ、ｐＨ＝７．８、ＮａＯＨで調整）および非極性相としてメタノール水混合物（１００／１）（溶出剤Ｂ）を使用して流速１ｍｌ／分で分離を実施する。以下の勾配を適用する：開始時０％、Ｂ；３９分、３９％、Ｂ；７０分、６４％、Ｂ；１００％、Ｂ、３．５分間；２分、０％、Ｂ（平衡化）。室温での誘導体化は下記のように自動化する。まずビシン（０．５Ｍ、ｐＨ８．５）中の０．５μｌの０．５％２−ＭＣＥを０．５μｌの細胞抽出物と混合する。続いて、ビシン（０．５Ｍ、ｐＨ８．５）中の５０ｍｇ／ｍｌヨード酢酸１．５μｌを加えた後、２．５μｌのビシンバッファー（０．５Ｍ、ｐＨ８．５）を加える。誘導体化を、１／４５／５４ｖ／ｖ／ｖの２−ＭＣＥ／ＭｅＯＨ／ビシン（０．５Ｍ、ｐＨ８．５）に溶解した１０ｍｇ／ｍｌ  ＯＰＡ試薬０．５μｌを加えることによって行う。最後に混合物を３２μｌのＨ2Ｏで希釈する。上記各ピペッティングステップの間に、１分間の待ち時間を設ける。３７．５μｌの総容量をカラムに注入する。留意すべきは、サンプル調製中（例えば、待ち時間中）およびその後にオートサンプラーの針を定期的に掃除すれば、分析結果を大きく改善できることである。検出は蛍光検出器によって実施する（励起３４０ｎｍ，発光４５０ｎｍ，Ａｇｉｌｅｎｔ、ドイツ国ヴァルトブロン）。定量に関しては、α−アミノ酪酸（ＡＢＡ）を内部標準とする。
【０２０３】
組換えプロトコールの定義
以下で、どのように、向上したメチオニン生産効率を増加させるＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株を構築して、上記予測の知見を実現することができるかを記述する。菌株の構築を記述する前に、以下で使用される組換えイベント／プロトコールの定義を挙げる。
【０２０４】
本明細書で使用する「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｉｎ」とは、環状二本鎖ＤＮＡ分子（例えば、プラスミドがｐＣＬＩＫ  ｉｎｔ  ｓａｃＢまたはｐＫ１９に基づく）全体が単一の相同組換えイベント（クロスインイベント）によって染色体に組み込まれていて、線状化形式の前記環状ＤＮＡ分子が、前記環状ＤＮＡ分子の第一のＤＮＡ配列に相同的な染色体の第１のＤＮＡ配列に効果的に挿入される、元の宿主細胞の形質転換体をいう。「Ｃａｍｐｂｅｌｌｅｄ  ｉｎ」とは、「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｉｎ」形質転換体の染色体に組み込まれている線状化ＤＮＡ配列をいう。「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｉｎ」は、第一の相同ＤＮＡ配列の重複を含有し、その各コピーは相同組換え交差点のコピーを含み、かつ取り巻く。この名称は、この種類の組換えを最初に提唱したＡｌａｎ  Ｃａｍｐｂｅｌｌ教授に由来する。
【０２０５】
本明細書で使用する「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｏｕｔ」とは、「Ｃａｍｐｂｅｌｌｅｄ  ｉｎ」ＤＮＡの線状化挿入済みＤＮＡ上に含有される第２のＤＮＡ配列と、前記線状化挿入の第２のＤＮＡ配列と相同である染色体起点の第２のＤＮＡ配列との間で第２の相同組換えイベント（クロスアウトイベント）が生じている「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｉｎ」形質転換体に由来する細胞を表し、この第２の組換えイベントは組み込み済みＤＮＡ配列の一部分の欠失（放棄）を生じさせるが、重要なことに、染色体中に残留する組み込み済みＣａｍｐｂｅｌｌｅｄ  ｉｎ  ＤＮＡの一部分（これはわずか一塩基でもよい）も生じさせ、元の宿主細胞と比較して、「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｏｕｔ」細胞が染色体中に１つ以上の意図的な変化を含有するようにする（例えば、一塩基置換、多塩基置換、異種遺伝子もしくはＤＮＡ配列の挿入、相同遺伝子または組換え相同遺伝子の追加コピーもしくはコピー群の挿入、または２つ以上の上記で列挙されるこれらの前述の例を含むＤＮＡ配列の挿入）。
【０２０６】
「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｏｕｔ」細胞または菌株は、通常、必ずしもではないが、「Ｃａｍｐｂｅｌｌｅｄ  ｉｎ」ＤＮＡ配列の一部分（放棄されることが望ましい部分）に含有される遺伝子、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、ｓａｃＢ遺伝子（約５％〜１０％スクロースの存在下で培養された細胞で発現されると致死である）に対する対抗選択によって得られる。対抗選択を用いても用いなくても、所望の「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｏｕｔ」細胞は、任意のスクリーニング可能な表現型を使用して所望の細胞に関してスクリーニングすることによって取得または同定することができ、このスクリーニング可能な表現型は、例えば、コロニーの形態、コロニーの色、抗生物質耐性の存在または不存在、ポリメラーゼ連鎖反応に基づく特定のＤＮＡ配列の存在または不存在、栄養素要求性の存在または不存在、酵素の存在または不存在、コロニー核酸ハイブリダイゼーション、抗体スクリーニングなどを含むが、これらに限定されるものではない。また、「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｉｎ」および「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｏｕｔ」という用語は、上記方法またはプロセスをいうために動詞として様々な時制で使用することもできる。
【０２０７】
「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｉｎ」または「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｏｕｔ」を生じさせる相同組換えイベントが相同ＤＮＡ配列内のＤＮＡ塩基の範囲にわたり生じる可能性があること、および相同配列がこの範囲の少なくとも一部分に関して互いに同一であるので、通常、クロスオーバーイベントが生じた位置を正確に特定することは可能でないことが理解される。いいかえれば、どの配列が最初は挿入ＤＮＡ由来であり、どの配列が最初は染色体ＤＮＡ由来であったかを正確に特定することは不可能である。さらに、第１の相同ＤＮＡ配列および第２の相同ＤＮＡ配列は、通常、部分的に非相同性の領域によって分離され、「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｏｕｔ」細胞の染色体中に沈着したままになるのはこの非相同性の領域である。
【０２０８】
実用性においては、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍでは、典型的に第１および第２の相同ＤＮＡ配列は、長さが少なくとも約２００塩基対であり、数千塩基対までの長さであり得るが、手順はより短いか、またはより長い配列に関して機能させることができる。例えば、第１および第２の相同配列の長さは約５００〜２０００塩基の範囲であることが可能で、「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｉｎ」から「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｏｕｔ」を得ることは、第１および第２の相同配列がほぼ同一の長さであり、好ましくは差が２００塩基対未満あり、最も好ましくは塩基対において２配列のうちの短い配列が長い配列の長さの少なくとも７０％であるように調整することによって促進される。「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ＩｎおよびＣａｍｐｂｅｌｌ  Ｏｕｔ法」は、国際特許出願公開第２００７０１２０７８号において記述されている。
【０２０９】
実施例
以下の実験は、ｌｉｐＢまたはｌｐｌと同様にＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍトランスケトラーゼの過剰発現がどのようにメチオニン生産の増加につながるか実証している。しかし、これらの実験は、いかなる形であれ本発明を限定することを意味するものではない。
【０２１０】
振盪フラスコ実験およびＨＰＬＣアッセイ
標準糖蜜培地を用いる振盪フラスコ実験を二重または四重で菌株で実施した。糖蜜培地は、１リットルの培地中に以下の成分を含有していた。４０ｇのグルコース、６０ｇの糖蜜、２０ｇの（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．４ｇのＭｇＳＯ4＊７Ｈ2Ｏ、０．６ｇのＫＨ2ＰＯ4、１０ｇの酵母抽出物（ＤＩＦＣＯ）、５ｍｌの４００ｍＭスレオニン、２ｍｇのＦｅＳＯ4．７Ｈ2Ｏ、２ｍｇのＭｎＳＯ4．Ｈ2Ｏ、および５０ｇのＣａＣＯ3（Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ  Ｈａｅｎ）（ｄｄＨ2Ｏで容量を補う）。ｐＨは、２０％のＮＨ4ＯＨで７．８まで調整した。２０ｍｌの連続撹拌培地（ＣａＣＯ3を懸濁状態で維持するため）を２５０ｍｌバッフル付きＢｅｌｌｃｏ振盪フラスコに加え、フラスコを２０分間オートクレーブした。オートクレーブ処理に続いて、基本培地１リットルあたり４ｍｌの「４Ｂ溶液」を加えた（または８０μｌ／フラスコ）。「４Ｂ溶液」は、１リットルあたり、０．２５ｇの塩酸チアミン（ビタミンＢ１）、５０ｍｇのシアノコバラミン（ビタミンＢ１２）、２５ｍｇのビオチン、１．２５ｇの塩酸ピリドキシン（ビタミンＢ６）を含有し、ビオチンを溶解するために１２．５ｍＭ  ＫＰＯ4、ｐＨ７．０で緩衝化し、濾過滅菌した。Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃフロアシェーカー内に２００または３００ｒｐｍで、ゴムバンドよって固定されたＢｉｏｓｈｉｅｌｄペーパーでカバーされたバッフル付きフラスコ中で、２８℃または３０℃で約４８時間、培養物を増殖させた。試料は、２４時間および／または４８時間で採取した。細胞を遠心によって除去し、次いで上清を等容量の６０％アセトニトリルで希釈し、次にＣｅｎｔｒｉｃｏｎ  ０．４５μｍスピンカラムを使用して溶液混合物を膜濾過した。ＨＰＬＣを使用して、濾液を、メチオニン、グリシンおよびホモセリン、Ｏ−アセチルホモセリン、スレオニン、イソロイシン、リシン、および他の指定アミノ酸の濃度に関して測定した。
【０２１１】
ＨＰＬＣアッセイでは、濾過した上清を０．４５μｍの濾過済み１ｍＭ  Ｎａ2ＥＤＴＡで１：１００に希釈し、１μｌの溶液をホウ酸バッファー（８０ｍＭ  ＮａＢＯ3、２．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ１０．２）中のＯＰＡ試薬（ＡＧＩＬＥＮＴ）で誘導体化し、２００×４．１ｍｍのＨｙｐｅｒｓｉｌ  ５μ  ＡＡ−ＯＤＳカラムに注入し、Ｇ１３２１Ａ蛍光検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズＨＰＬＣ（ＡＧＩＬＥＮＴ）上で泳動した。励起波長は３３８ｎｍであり、モニターした発光波長は４２５ｎｍであった。アミノ酸標準溶液をクロマトグラフィーにかけ、それを使用して、種々のアミノ酸の保持時間および標準ピーク領域を測定した。Ａｇｉｌｅｎｔによって提供される添付のソフトウェアパッケージであるＣｈｅｍ  Ｓｔａｔｉｏｎを、機器コントロール、データ収集およびデータ処理に使用した。ハードウェアは、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｉｎｄｏｗｓ  ＮＴ４．０（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｐａｃｋ（ＳＰ６ａ）でアップデート）をサポートしているＨＰ  Ｐｅｎｔｉｕｍ  ４コンピュータであった。
【０２１２】
（実施例１）Ｍ２０１４株の作製
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株ＡＴＣＣ１３０３２をＤＮＡ  Ａ（ｐＨ２７３とも呼ばれる）（配列番号２４）で形質転換し、「Ｃａｍｐｂｅｌｌｅｄ  ｉｎ」して「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｉｎ」株を得た。次に「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｉｎ」株を「Ｃａｍｐｂｅｌｌｅｄ  ｏｕｔ」して、フィードバック耐性ホモセリンデヒドロゲナーゼ酵素（ｈｏｍfbr）をコードしている遺伝子を含有する「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｏｕｔ」株Ｍ４４０を得た。得られたホモセリンデヒドロゲナーゼタンパク質は、Ｓ３９３がＦ３９３に変化しているアミノ酸変化を含んでいた（Ｈｓｄｈ  Ｓ３９３Ｆと呼ばれる）。
【０２１３】
続いてＭ４４０株を、ＤＮＡ  Ｂ（ｐＨ３７３とも呼ばれる）（配列番号２５）で形質転換して、「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｉｎ」株を得た。次に「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｉｎ」株を「Ｃａｍｐｂｅｌｌｅｄ  ｏｕｔ」して、フィードバック耐性アスパラギン酸キナーゼ酵素（Ａｓｋfbr）（ｌｙｓＣによってコードされる）をコードしている遺伝子を含有する「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｏｕｔ」株Ｍ６０３を得た。得られたアスパラギン酸キナーゼタンパク質では、Ｔ３１１がＩ３１１に変化した（ＬｙｓＣ  Ｔ３１１Ｉと呼ばれる）。
【０２１４】
Ｍ６０３株が約１７．４ｍＭのリシンを産生したが、一方、ＡＴＣＣ１３０３２株は測定可能な量のリシンを産生しなかったことが判明した。さらに第３表に要約するように、ＡＴＣＣ１３０３２株によっては測定可能な量が産生されないのに比較して、Ｍ６０３株は約０．５ｍＭのホモセリンを産生した。
【０２１５】
第３表  菌株ＡＴＣＣ１３０３２およびＭ６０３によって産生されたホモセリン、Ｏ−アセチルホモセリン、メチオニンおよびリシンの量
【表４】
2010518827.tif 000006
【０２１６】
Ｍ６０３株をＤＮＡ  Ｃ（ｐＨ３０４とも呼ばれる）（配列番号２６）によって形質転換して、「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｉｎ」株を得た後、「Ｃａｍｐｂｅｌｌｅｄ  ｏｕｔ」して、「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｏｕｔ」株Ｍ６９０を得た。Ｍ６９０株は、ｍｅｔＨ遺伝子（Ｐ497  ｍｅｔＨと呼ばれる）の上流のＰｇｒｏＥＳプロモーターを含有していた。Ｐ497プロモーターの配列を配列番号２１に示す。以下の第４表に示すように、Ｍ６９０株は約７７．２ｍＭのリシンおよび約４１．６ｍＭのホモセリンを産生した。
【０２１７】
第４表  菌株Ｍ６０３およびＭ６９０によって産生されたホモセリン、Ｏ−アセチルホモセリン、メチオニンおよびリシンの量
【表５】
2010518827.tif 000007
【０２１８】
続いてＭ６９０株を以下のように突然変異させた。ＢＨＩ培地（ＢＥＣＴＯＮ  ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ）中で培養したＭ６０３の一晩培養物を５０ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ５．５で洗浄し、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソグアニジン（５０ｍＭクエン酸ｐＨ５．５中１０ｍｇ／ｍｌ）で３０℃で２０分間処理した。処理後、細胞を５０ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ５．５で再度洗浄し、以下の成分を含有する培地にまいた。（全ての記述される量は５００ｍｌ培地に関して算出される）１０ｇの（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．５ｇのＫＨ2ＰＯ4、０．５ｇのＫ2ＨＰＯ4、０．１２５ｇのＭｇＳＯ４＊７Ｈ2Ｏ、２１ｇのＭＯＰＳ、５０ｍｇのＣａＣｌ2、１５ｍｇのプロトカテク酸、０．５ｍｇのビオチン、１ｍｇのチアミン、および５ｇ／ＬのＤ，Ｌ−エチオニン（ＳＩＧＭＡ  ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ，ＣＡＴＡＬＯＧ  ＃Ｅ５１３９）（ＫＯＨでｐＨ７．０に調整）。さらに、培地は、１０ｇ／ＬのＦｅＳＯ4＊７Ｈ2Ｏ、１ｇ／ＬのＭｎＳＯ4＊Ｈ2Ｏ、０．１ｇ／ＬのＺｎＳＯ4＊７Ｈ2Ｏ、０．０２ｇ／ＬのＣｕＳＯ4、および０．００２ｇ／ＬのＮｉＣｌ2＊６Ｈ2Ｏから構成される０．５ｍｌの微量金属溶液を含有していた（全て０．１Ｍ  ＨＣｌ中に溶解）。最終培地を濾過によって滅菌し、培地に、４０ｍｌの滅菌５０％グルコース溶液（４０ｍｌ）および滅菌寒天を１．５％の最終濃度まで加えた。最終の寒天含有培地を寒天プレートに注ぎ、最少エチオニン培地とラベルをつけた。突然変異株をプレート（最少エチオニン）にまき、３０℃で３から７日間インキュベートした。培地上で増殖したクローンを単離し、同一の最少エチオニン培地上に再度画線した。メチオニン生産分析のためにいくつかのクローンを選択した。
【０２１９】
メチオニン生産を、以下のように分析した。菌株をＣＭ寒天培地上で３０℃で２日間培養した。培地は、１０ｇ／ＬのＤ−グルコース、２．５ｇ／ＬのＮａＣｌ、２ｇ／Ｌの尿素、１０ｇ／Ｌのバクトペプトン（ＤＩＦＣＯ）、５ｇ／Ｌの酵母抽出物（ＤＩＦＣＯ）、５ｇ／Ｌの牛肉抽出物（ＤＩＦＣＯ）、２２ｇ／Ｌの寒天（ＤＩＦＣＯ）を含有し、約１２１℃で２０分間オートクレーブした。
【０２２０】
菌株を増殖させた後、細胞をかき取り、０．１５Ｍ  ＮａＣｌに再懸濁した。本培養では、かき取った細胞の懸濁液を、０．５ｇの固形およびオートクレーブしたＣａＣＯ3（ＲＩＥＤＥＬ  ＤＥ  ＨＡＥＮ）とともに、出発ＯＤ６００ｎｍで約１．５〜１０ｍｌの培地ＩＩ（下記参照）に加え、細胞を、軌道振盪プラットフォーム（約２００ｒｐｍ、３０℃）上で、バッフルのない１００ｍｌ振盪フラスコ中で７２時間インキュベートした。培地ＩＩは、４０ｇ／Ｌのスクロース、６０ｇ／Ｌの全糖（糖蜜由来）（糖度に関して算出）、１０ｇ／Ｌの（ＮＨ4）4ＳＯ4、０．４ｇ／ＬのＭｇＳＯ4＊７Ｈ2Ｏ、０．６ｇ／ＬのＫＨ2ＰＯ4、０．３ｍｇ／Ｌのチアミン＊ＨＣｌ、１ｍｇ／Ｌのビオチン、２ｍｇ／ＬのＦｅＳＯ4および２ｍｇ／ＬのＭｎＳＯ4を含んでいた。培地を、ＮＨ4ＯＨでｐＨ７．８に調整し、約１２１℃で約２０分間オートクレーブした。オートクレーブおよび冷却後、濾過滅菌ストック溶液（２００μｇ／ｍｌ）からビタミンＢ12（シアノコバラミン）（ＳＩＧＭＡ  ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ）を加えて、１００μｇ／Ｌの最終濃度にした。
【０２２１】
試料を培地から採取し、アミノ酸含量に関して測定した。生成アミノ酸（メチオニンを含む）を、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  Ｓｅｒｉｅｓ  ＬＣ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＨＰＬＣ（ＡＧＩＬＥＮＴ）でＡｇｉｌｅｎｔアミノ酸法を使用して測定した。オルト−フタルアルデヒドでの試料のプレカラム誘導体化により、Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  ＡＡ−ｃｏｌｕｍｎ（ＡＧＩＬＥＮＴ）での分離後に、産生アミノ酸の定量が可能になった。
【０２２２】
Ｍ６９０の少なくとも２倍のメチオニン力価を示したクローンを単離した。追加実験で使用されるそのような１クローンをＭ１１９７と命名し、２００５年５月１８日にＤＳＭＺ  ｓｔｒａｉｎ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに菌株番号ＤＳＭ１７３２２として寄託した。以下の第５表に要約したように、この菌株によるアミノ酸産生をＭ６９０株による産生と比較した。
【０２２３】
第５表  菌株Ｍ６９０およびＭ１１９７によって産生されたホモセリン、Ｏ−アセチルホモセリン、メチオニンおよびリシンの量
【表６】
2010518827.tif 000008
【０２２４】
Ｍ１１９７株をＤＮＡ  Ｆ（ｐＨ３９９とも呼ばれる、配列番号２７）によって形質転換して、「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｉｎ」株を得て、続いて、これを「Ｃａｍｐｂｅｌｌｅｄ  ｏｕｔ」してＭ１４９４株を得た。この菌株はホモセリンキナーゼの遺伝子中に突然変異を含有し、この突然変異は、得られるホモセリンキナーゼ酵素にＴ１９０からＡ１９０へのアミノ酸変化を生じさせる（ＨｓｋＴ１９０Ａと呼ばれる）。以下の第６表に要約したように、Ｍ１４９４株によるアミノ酸産生をＭ１１９７株による産生と比較した。
【０２２５】
第６表  菌株Ｍ１１９７およびＭ１４９４によって産生されたホモセリン、Ｏ−アセチルホモセリン、メチオニンおよびリシンの量
【表７】
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【０２２６】
Ｍ１４９４株をＤＮＡ  Ｄ（ｐＨ４８４とも呼ばれる、配列番号２８）によって形質転換して「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｉｎ」株を得て、続いて、これを「Ｃａｍｐｂｅｌｌｅｄ  ｏｕｔ」してＭ１９９０株を得た。Ｍ１９９０株は、ｇｒｏＥＳプロモーターおよびＥＦＴＵ（伸長因子Ｔｕ）プロモーターの両者を使用してｍｅｔＹ対立遺伝子を過剰発現する（Ｐ497Ｐ1284ｍｅｔＹと呼ばれる）。Ｐ497Ｐ1284プロモーターの配列を配列番号２９に記載する。以下の第７表に要約したように、Ｍ１４９４株によるアミノ酸産生をＭ１９９０株による産生と比較した。
【０２２７】
第７表  菌株Ｍ１４９４およびＭ１９９０によって産生されたホモセリン、Ｏ−アセチルホモセリン、メチオニンおよびリシンの量
【表８】
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【０２２８】
ＤＮＡ  Ｅ（ｐＨ４９１とも呼ばれる、配列番号３０）によってＭ１９９０株を形質転換して、「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｉｎ」株を得て、次に、これを「Ｃａｍｐｂｅｌｌｅｄ  ｏｕｔ」して、「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｏｕｔ」株のＭ２０１４を得た。Ｍ２０１４株は、スーパーオキシドジスムターゼプロモーターを使用してｍｅｔＡ対立遺伝子を過剰発現する（Ｐ3119  ｍｅｔＡと呼ばれる）。Ｐ3119プロモーターの配列を配列番号２０に記載する。以下の第８表に要約したように、Ｍ２０１４株によるアミノ酸産生をＭ１９９０株による産生と比較した。
【０２２９】
第８表  菌株Ｍ１４９４およびＭ１９９０によって産生されたホモセリン、Ｏ−アセチルホモセリン、メチオニンおよびリシンの量
【表９】
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【０２３０】
（実施例２）Ｍ２０１４からのｍｃｂＲの欠失
ＲＸＡ００６５５欠失を含有するプラスミドｐＨ４２９（配列番号３１）を使用して、組込みおよび除去によってｍｃｂＲ欠失をＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍに導入した（国際特許出願公開第２００４／０５０６９４（Ａ１）号参照）。
【０２３１】
プラスミドｐＨ４２９を、カナマイシン耐性に対する選択によってＭ２０１４に形質転換した（Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｉｎ）。ｓａｃＢ対抗選択を使用して、おそらく除去によって組込みプラスミドが失われた（Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｏｕｔ）形質転換株のカナマイシン感受性誘導体を単離した。形質転換株は、小さなコロニーおよび大きなコロニーを作成したカナマイシン感受性誘導体を産生した。両方の大きさのコロニーを、ｍｃｂＲ欠失の存在を検出するために、ＰＣＲによってスクリーニングした。大きなコロニーで欠失を含有したものはなかったが、一方、小さなコロニーの６０〜７０％が予期したｍｃｂＲ欠失を含有していた。
【０２３２】
元の分離物をＢＨＩプレート上で単一コロニーに対して画線すると、ごく小さなコロニーと小さなコロニーが混合して現れた。ごく小さなコロニーをＢＨＩ上で再度画線すると、ふたたびごく小さなコロニーと小さなコロニーが混合して現れた。小さなコロニーをＢＨＩ上で再度画線すると、コロニーの大きさは、通常小さく、均一であった。２つの小さな単一コロニーの分離物（ＯＭ４０３−４およびＯＭ４０３−８と呼ばれる）を、追加研究のために選択した。
【０２３３】
振盪フラスコによる実験（第９表）は、ＯＭ４０３−８が親のＭ２０１４の少なくとも２倍のメチオニン量を産生することを示した。また、この菌株は、産生したリシンの量がＭ２０１４の５分の１未満であり、このことは炭素フラックスのアスパラギン酸セミアルデヒドからホモセリンへの転換を示唆している。３番目の著しい違いとして、Ｍ２０１４と比較して、ＯＭ４０３によるイソロイシンの蓄積に１０倍を超える増加が見られた。培養株は、標準糖蜜培地で４８時間増殖させた。
【０２３４】
第９表  新規増殖細胞を接種された振盪フラスコ培養におけるＯＭ４０３株の分離物によるアミノ酸産生
【表１０】
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【０２３５】
また、第１０表に示すように、Ｍ２０１４と比較して、ＯＭ４０３によるＯ−アセチルホモセリンの蓄積に１５倍を超える減少が見られた。この結果の最も有望な説明は、Ｍ２０１４中に蓄積する大部分のＯ−アセチルホモセリンがＯＭ４０３のメチオニン、ホモシステインおよびイソロイシンに変換されているということである。培養株は、標準糖蜜培地で４８時間増殖させた。
【０２３６】
第１０表  新規増殖細胞を接種された振盪フラスコ培養におけるＯＭ４０３の２つの分離物によるアミノ酸産生
【表１１】
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【０２３７】
（実施例３）ｍｅｔＱ発現の減少
ＯＭ４０３−８のメチオニンの移入を減少させるために、ｍｅｔＱ遺伝子のプロモーターおよび５’部分を欠失させた。ｍｅｔＱ遺伝子は、複合体が機能するために必要とされるメチオニン移入複合体のサブユニットをコードしている。これは、プラスミドｐＨ４４９（配列番号３２）での標準的Ｃａｍｐｂｅｌｌｉｎｇ  ｉｎおよびＣａｍｐｂｅｌｌｉｎｇ  ｏｕｔ技術を使用して達成した。ＯＭ４０３−８およびＯＭ４５６−２を、振盪フラスコアッセイにおいてメチオニン産生について測定した。この結果（第１１表）は、ＯＭ４５６−２がＯＭ４０３−８より多くのメチオニンを産生したことを示している。培養株は、標準糖蜜培地で４８時間増殖させた。
【０２３８】
第１１表  ＯＭ４５６−２の振盪フラスコアッセイ
【表１２】
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【０２３９】
（実施例４）ＯＭ４６９の構築
ＯＭ４５６−２のファージラムダＰRプロモーターとｍｅｔＦプロモーターを置換することによって、ｍｅｔＱの欠失およびｍｅｔＦの過剰発現の両方を含むＯＭ４６９と呼ばれる菌株を構築した。これは、プラスミドｐＯＭ４２７（配列番号３３）での標準的Ｃａｍｐｂｅｌｌｉｎｇ  ｉｎおよびＣａｍｐｂｅｌｌｉｎｇ  ｏｕｔ技術を使用して達成した。ＯＭ４６９の４つの分離物を、振盪フラスコ培養アッセイにおいてメチオニン産生について測定したところ、第１２表に示すように、これらは全てでＯＭ４５６−２よりメチオニンを多く産生していた。培養株は、２ｍＭスレオニンを含む標準糖蜜培地で４８時間増殖させた。
【０２４０】
第１２表  ｍｅｔＦプロモーターの代わりにファージラムダＰRプロモーターを含むＯＭ４５６−２の誘導体であるＯＭ４６９の振盪フラスコアッセイ
【表１３】
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【０２４１】
（実施例５）Ｍ２５４３の構築
ＯＭ４６９−２株を、プラスミドｐＣＬＩＫ５Ａ  ｉｎｔ  ｓａｃＢ  ＰＳＯＤ  ＴＫＴ（配列番号３４（図１ａ）に示す）を用いて電気穿孔法によって形質転換した。これは、標準的Ｃａｍｐｂｅｌｌｉｎｇ  ｉｎおよびＣａｍｐｂｅｌｌｉｎｇ  ｏｕｔ技術を使用して達成した。
【０２４２】
Ｍ２５４３とラベルを付けたＯＭ  ４６９  ＰＳＯＤ  ＴＫＴの分離物を、振盪フラスコ培養アッセイでメチオニン産生に関して測定したところ、これらはＯＭ４６９−２より多くのメチオニンを産生していた。Ｍ２５４３株の結果を第１３表に示す。
【０２４３】
第１３表  ＯＭ４６９およびＭ２５４３の振盪フラスコアッセイ
【表１４】
2010518827.tif 000016
【０２４４】
（実施例６）６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼにおいてプロモーターおよび／または突然変異を含む菌株の構築
菌株ＯＭ４６９−２またはＭ２５４３は、配列番号３５（図１ｂ）にて図示するように、プラスミドｐＣＬＩＫ５Ａ  ＰＳＯＤＨ６６１  ＰＳＯＤ  ６ＰＧＤＨを用いて電気穿孔法によって形質転換した。これは、標準的Ｃａｍｐｂｅｌｌｉｎｇ  ｉｎおよびＣａｍｐｂｅｌｌｉｎｇ  ｏｕｔ技術を使用して達成した。得られた菌株は、第１４表に記載したように、ＰSODプロモーター単独および１または２つの突然変異も含有するＰSODプロモーターのいずれかを含む。
【０２４５】
ＧＫ１５０８、１５１１およびＧＫ１５１３とラベルを付けたＭ２５４３  ＰＳＯＤ  ６ＰＧＤＨの分離物を、振盪フラスコ培養アッセイでメチオニン産生に関して測定したところ、これらはＭ２５４３より多くのメチオニンを産生していた。結果を表１４に示す。
【０２４６】
第１４表  ＯＭ４６９およびＭ２５４３の振盪フラスコアッセイ
【表１５】
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【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2010518827.tif 000020
2010518827.tif 000021