(57)【要約】  本発明は、糖尿病又は肥満用薬物において使用する候補薬剤を同定するための方法であって、（ｉ）ＰＰＭホスファターゼの阻害剤候補を準備することと、（ii）ＰＰＭホスファターゼを含む第１及び第２の試料を準備することと、（iii）前記阻害剤候補を、ＰＰＭホスファターゼを含む前記第１の試料と接触させることと、（iv）前記第１及び第２の試料をＰＰＭホスファターゼ活性についてアッセイすることとを含み、前記ＰＰＭホスファターゼが、ＰＰＭ１Ｅ、ＰＰＭ１Ｆ、ＰＰＭ１Ｊ、ＰＰＭ１Ｋ、ＰＰＭ１Ｌ、及びＰＰＭ１Ｍからなる群から選択され、ＰＰＭホスファターゼ活性が前記第２の試料より前記第１の試料の方が低い場合、前記阻害剤候補が、糖尿病又は肥満用薬物、好ましくはII型糖尿病用薬物に使用する候補薬剤として同定される方法に関する。本発明は、ＰＰＭホスファターゼの阻害剤としてのメトホルミン及びフェンホルミンの使用にも関する。
2010510797.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖尿病又は肥満用薬物において使用する候補薬剤を同定するための方法であって、前記方法が、
（ｉ）ＰＰＭホスファターゼの阻害剤候補を準備することと、
（ii）ＰＰＭホスファターゼを含む第１及び第２の試料を準備することと、
（iii）前記阻害剤候補を、ＰＰＭホスファターゼを含む前記第１の試料と接触させることと、
（iv）前記第１及び第２試料をＰＰＭホスファターゼ活性についてアッセイすることとを含み、
前記ＰＰＭホスファターゼが、ＰＰＭ１Ｅ、ＰＰＭ１Ｆ、ＰＰＭ１Ｊ、ＰＰＭ１Ｋ、ＰＰＭ１Ｌ、及びＰＰＭ１Ｍからなる群から選択され、
前記ＰＰＭホスファターゼ活性が前記第２の試料より前記第１の試料の方が低い場合、前記阻害剤候補が糖尿病又は肥満用薬物において使用する候補薬剤であると同定される方法。
【請求項２】
ＰＰＭホスファターゼがＰＰＭ１Ｅ及び／又はＰＰＭ１Ｆである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
障害が糖尿病である、請求項１又は２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
糖尿病がII型糖尿病である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
阻害剤候補がメトホルミン又はフェンホルミンの類似体又は誘導体である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
対象のＰＰＭホスファターゼを阻害することを含む、糖尿病若しくは肥満を治療又は予防するための方法。
【請求項７】
ＰＰＭホスファターゼが、ＰＰＭ１Ｅ、ＰＰＭ１Ｆ、ＰＰＭ１Ｊ、ＰＰＭ１Ｋ、ＰＰＭ１Ｌ、及びＰＰＭ１Ｍからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＰＰＭホスファターゼがＰＰＭ１Ｅである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＰＰＭホスファターゼがＰＰＭ１Ｆである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
ＰＰＭ型タンパク質ホスファターゼの阻害におけるメトホルミン又はフェンホルミンの使用であって、前記ＰＰＭホスファターゼが、ＰＰＭ１Ｅ、ＰＰＭ１Ｆ、ＰＰＭ１Ｊ、ＰＰＭ１Ｋ、ＰＰＭ１Ｌ、及びＰＰＭ１Ｍからなる群から選択される使用。
【請求項１１】
ＰＰＭ型タンパク質ホスファターゼがＰＰＭ１Ｅ又はＰＰＭ１Ｆである、請求項１０に記載のメトホルミン又はフェンホルミンの使用。
【請求項１２】
ＰＰＭ１Ｅ、ＰＰＭ１Ｆ、ＰＰＭ１Ｊ、ＰＰＭ１Ｋ、ＰＰＭ１Ｌ、及びＰＰＭ１Ｍからなる群から選択されるＰＰＭホスファターゼの阻害に使用するメトホルミン又はフェンホルミン。
【請求項１３】
ＰＰＭホスファターゼ阻害剤として使用する組成物におけるメトホルミン又はフェンホルミンの使用。
【請求項１４】
ＡＭＰＫのリン酸化の亢進又は維持におけるフェンホルミン又はその類似体の使用。
【請求項１５】
ＡＭＰＫの脱リン酸化におけるＰＰＭ１Ｅ又はＰＰＭ１Ｆの使用。
【請求項１６】
ｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）の活性化におけるメトホルミン又はフェンホルミンの使用。
【請求項１７】
Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性キナーゼII（ＣａＭＫII）の脱リン酸化の阻害におけるメトホルミン又はフェンホルミンの使用。
【請求項１８】
薬物として使用する、請求項１〜５のいずれかに記載の方法により同定された薬剤。
【請求項１９】
糖尿病又は肥満用薬物を製造するための、請求項１〜５のいずれかに記載の方法により同定された薬剤の使用。
【請求項２０】
糖尿病又は肥満の治療に使用するための、請求項１〜５のいずれかに記載の方法により同定された薬剤。
【請求項２１】
糖尿病若しくは肥満を治療又は予防するための方法であって、請求項１８又は１９のいずれかに記載の薬物を含有する組成物を対象に投与することを含み、前記薬物がメトホルミン又はフェンホルミンを含まない方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホスファターゼの作用及び阻害の分野に属し、また、糖尿病及び肥満等のグルコース代謝／調節の障害に関する。
【背景技術】
【０００２】
メトホルミンは、糖尿病の治療薬として知られているビグアニド化合物である。メトホルミンの標的は未知である。メトホルミンはミトコンドリア毒素として作用し得る。
【０００３】
フェンホルミンは、メトホルミンの類似体であり、ビグアニド化合物でもある。フェンホルミンは、糖尿病の治療に使用されてきた。フェンホルミンの標的は未知である。フェンホルミンは、強力なミトコンドリア毒素である。フェンホルミンは、重症の乳酸アシドーシスを含む副作用を示す。これは致命的であり得るし、致命的であった。乳酸アシドーシスのようなこれらの副作用が存在するため、世界中の大多数の地域で、糖尿病治療薬としてのフェンホルミンが使用中止された。
【０００４】
ＡＭＰ活性化タンパク質キナーゼは、長い間、細胞エネルギーの重要な調節因子の１つと見なされ、少なくとも２つの上流キナーゼＬＫＢ１及びＣａＭＫＫβにより活性化されることが示されている。ＡＭＰＫの脱リン酸化の原因であるタンパク質ホスファターゼは、細菌で発現されたＰＰ２ＣαがＡＭＰＫのリン酸化状態を低減できた事実、ＡＭＰにより阻害された効果、並びにオカダ酸不感受性に関するデータから、ＰＰＭファミリータンパク質ホスファターゼのメンバーであると考えられた。
【０００５】
タンパク質ホスファターゼのＰＰＭファミリーのメンバーが多数特定されたが、ＡＭＰＫ脱リン酸化の原因であるＰＰＭファミリーメンバー（複数可）の同一性は、当技術分野において未知のままである。抗糖尿病薬メトホルミンは、その触媒性Ｔループ残基であるＴｈｒ１７２のリン酸化を強めることによりＡＭＰＫを活性化することが、多くの研究で示されている。メトホルミンは、ＡＭＰＫの活性化を介して肝性グルコース産生を減少させ、グルコース利用を増加させるが、メトホルミンがＡＭＰＫを活性化する機序は未知である。
【０００６】
Koh et al（2002 Current Biology vol 12 pp317-321）には、ｐ２１活性化キナーゼＰＡＫが、ＰＯＰＸ１及びＰＯＰＸ２、即ちＰＰ２Ｃファミリーの１対のセリン／トレオニンホスファターゼにより、負に調節されることが開示されている。
【０００７】
国際公開第２００６／０９１７０１号パンフレットには、生存若しくはデスキナーゼ又は生存若しくはデスホスファターゼを用いて細胞死を調節するための方法及び組成物が開示されている。本明細書は、アポトーシスの制御に何らかの役割を果たす場合に細胞死又は細胞生存を調節できる可能性のある代替キナーゼ及びホスファターゼの非常に大きな一覧を提示する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００６／０９１７０１号パンフレット
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Koh et al（2002 Current Biology vol. 12 pp317-321）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、従来技術に伴う問題の克服を探求する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明者らは、ホスファターゼ活性に対するビグアニド化合物の驚くべき効果を発見した。具体的には、糖尿病（II型糖尿病のような）及び肥満の治療に一般的に使用されるビグアニド化合物が、実際にタンパク質ホスファターゼ活性の阻害剤であることが示された。
【００１２】
特に、本発明者らは、ＰＰＭ型ホスファターゼとして影響を受けるホスファターゼのクラスを明確に定義し、それらの活性のどれが阻害されるかをこの酵素のファミリー内で特定した。
【００１３】
したがって、本発明者らは、タンパク質ホスファターゼ、特にある種のＰＰＭホスファターゼが、治療介入の核心であることを初めて開示する。
【００１４】
本発明はこれらの予想外の知見に基づく。
【００１５】
したがって広範な態様では、本発明は、タンパク質ホスファターゼ活性の阻害剤としてのビグアニド化合物の使用に関する。
【００１６】
別の広範な態様では、本発明は、糖尿病及び／又は肥満等のグルコース調節障害の治療又は予防における、ホスファターゼ阻害剤、特にＰＰＭホスファターゼ阻害剤の使用に関する。
【００１７】
１つの態様では、本発明は、糖尿病又は肥満用薬物において使用する候補薬剤を特定するための方法であって、前記方法が、
（ｉ）ＰＰＭホスファターゼの阻害剤候補を準備することと、
（ii）ＰＰＭホスファターゼを含む第１及び第２の試料を準備することと、
（iii）前記阻害剤候補を、ＰＰＭホスファターゼを含む前記第１の試料と接触させることと、
（iv）前記第１及び第２の試料をＰＰＭホスファターゼ活性についてアッセイすることとを含み、
前記ＰＰＭホスファターゼ活性が前記第２の試料より前記第１の試料の方が低い場合、前記阻害剤候補が糖尿病又は肥満用薬物において使用する候補薬剤であると同定される方法に関する。
【００１８】
好ましくは、ホスファターゼは、ＰＰＭ  ＢＩＧｉ（ビグアニド阻害）ファミリーメンバーである。好ましくは、ホスファターゼは、ＰＰＭ１Ｅ、ＰＰＭ１Ｆ、ＰＰＭ１Ｊ、ＰＰＭ１Ｋ、ＰＰＭ１Ｌ、ＰＨＬＰＰ、又はＰＨＬＰＰ２遺伝子によりコードされる。好ましくは、ホスファターゼは、ＰＰＭ１Ｅ、ＰＰＭ１Ｆ、ＰＰＭ１Ｊ、ＰＰＭ１Ｋ、又はＰＰＭ１Ｌ遺伝子によりコードされる。好ましくは、ＰＰＭホスファターゼはＰＰＭ１Ｅ及び／又はＰＰＭ１Ｆであり、好ましくは、ＰＰＭホスファターゼはＰＰＭ１Ｅである。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、「薬剤」又は「阻害剤候補」という用語は、単一の物質であってよく、又は物質の組合せであってよい。薬剤は、有機化合物又は他の化学薬品であってよい。薬剤は、天然か又は人工かにかかわらず、任意の好適な供給源から取得可能であるか又は任意の好適な供給源により産生された化合物であってよい。薬剤は、アミノ酸分子、ポリペプチド、若しくはその化学的誘導体、又はその組合せであってよい。薬剤は、さらにポリヌクレオチド分子であってよく、それはセンス又はアンチセンス分子であってよい。薬剤は、さらに抗体であってよい。薬剤は、低分子量有機分子のような他の化合物だけでなく、ペプチドも含み得る化合物のライブラリーから設計又は取得できる。
【００２０】
ＰＰＭホスファターゼ活性のアッセイを本明細書中で詳述し、好適なアッセイ形式の例は、特に実施例２において提供する。
【００２１】
試料は、ＰＰＭホスファターゼを含む任意の好適な試料であってよい。これは、組換え酵素の試料であってよく、又は精製された酵素の試料であってよく、又はＰＰＭホスファターゼを含む簡単な抽出物若しくは溶解物であってよい。明らかに、試料は活性ＰＰＭタンパク質ホスファターゼ／ＰＰＭタンパク質ホスファターゼ活性を含むことが重要であり、そうでなければ、阻害効果を有しない薬剤と阻害効果を有する薬剤とを識別することは可能ではないだろう。これは、本明細書中に記載のように、リン光体−カゼインアッセイのようなアッセイを使用して容易に検証できる。
【００２２】
好ましくは、障害は、糖尿病、より好ましくはII型糖尿病である。
【００２３】
好ましくは前記阻害剤候補はビグアニドであり、好ましくは前記阻害剤候補はメトホルミン又はフェンホルミンの類似体又は誘導体である。
【００２４】
別の態様では、本発明は、ＰＰＭ型タンパク質ホスファターゼの阻害におけるメトホルミン又はフェンホルミンの使用を提供する。
【００２５】
好ましくは、ＰＰＭ型タンパク質ホスファターゼは、本明細書中に示されたＰＰＭホスファターゼの特徴の１又は複数、好ましくは２以上、好ましくは３以上、好ましくは４以上、好ましくは本明細書中に示されたＰＰＭホスファターゼの特徴の全てを有する。好ましくは、前記ＰＰＭ型タンパク質ホスファターゼは、ＰＰＭ１Ｅ又はＰＰＭ１Ｆである。
【００２６】
別の態様では、本発明は、ＰＰＭホスファターゼの阻害に使用するメトホルミン又はフェンホルミンを提供する。
【００２７】
別の態様では、本発明は、ＰＰＭホスファターゼ阻害剤として使用する組成物におけるメトホルミン又はフェンホルミンの使用を提供する。さらに、本発明は、ＰＰＭホスファターゼ阻害剤として使用する組成物の製造におけるメトホルミン又はフェンホルミンの使用を提供する。
【００２８】
別の態様では、本発明は、ＡＭＰＫのリン酸化の亢進又は維持におけるフェンホルミン又はその類似体の使用を提供する。
【００２９】
別の態様では、本発明は、ＡＭＰＫの脱リン酸化におけるＰＰＭ１Ｅ又はＰＰＭ１Ｆの使用を提供する。
【００３０】
別の態様では、本発明は、ｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ、p21-activated kinase）の活性化におけるメトホルミン又はフェンホルミンの使用を提供する。
【００３１】
別の態様では、本発明は、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性キナーゼII（ＣａＭＫII、Ca2+/Calmodulin dependent kinase II）の脱リン酸化の阻害におけるメトホルミン又はフェンホルミンの使用を提供する。
【００３２】
別の態様では、本発明は、上述の方法により、薬物として使用するために同定された薬剤を提供する。
【００３３】
別の態様では、本発明は、糖尿病又は肥満用薬物を製造するための、上述の方法により同定された薬剤の使用を提供する。
【００３４】
別の態様では、本発明は、糖尿病又は肥満の治療に使用する、上述の方法により薬剤された薬剤を提供する。
【００３５】
別の態様では、本発明は、糖尿病若しくは肥満を治療又は予防するための方法であって、上述された薬物を含有する組成物を対象に投与することを含み、前記薬物がメトホルミン又はフェンホルミンを含まない方法を提供する。
【００３６】
別の態様では、本発明は、対象のＰＰＭホスファターゼを阻害することを含む、糖尿病若しくは肥満を治療又は予防するための方法を提供する。好ましくは、前記ＰＰＭホスファターゼは、ＰＰＭ１Ｅ、ＰＰＭ１Ｆ、ＰＰＭ１Ｊ、ＰＰＭ１Ｋ、ＰＰＭ１Ｌ、ＰＰＭ１Ｍ、ＰＨＬＰＰ、及びＰＨＬＰＰ２からなる群から選択される。好ましくは、前記ＰＰＭホスファターゼは、ＰＰＭ１Ｅ、ＰＰＭ１Ｆ、ＰＰＭ１Ｊ、ＰＰＭ１Ｋ、ＰＰＭ１Ｌ、又はＰＰＭ１Ｍからなる群から選択される。好ましくは、前記ＰＰＭホスファターゼは、ＰＰＭ１Ｅ及び／又はＰＰＭ１Ｆである。好ましくは、そのような阻害は、メトホルミン又はフェンホルミンによってではない。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】未処理か又は１０ｍＭフェンホルミンで１時間処理されたかいずれかのＨＥＫ２９３細胞におけるＩ型タンパク質ホスファターゼの分析を示す図である。Ａ：４つの未処理試料及び４つの処理済試料のＴｈｒ１７２におけるＡＭＰＫのリン酸化レベル。負荷対照（loading control）として抗ＰＰ５ＴＰＲドメイン抗体を使用する。分子量（ｋＤａ）をパネルの左側に示す。Ｂ：４ｎＭオカダ酸の存在下でホスホリラーゼａを基質として使用した、処理済及び未処理のＨＥＫ２９３細胞溶解物中のＰＰ１ホスホリラーゼホスファターゼの活性。データは、三重反復で測定された４つの試料の平均±ＳＥＭである。Ｃ：２００ｎＭＩ−２の存在下でホスホリラーゼａを基質として使用した、処理済及び未処理のＨＥＫ２９３細胞溶解物中のＰＰ２Ａホスホリラーゼホスファターゼの活性。データは、三重反復で測定された４つの試料の平均±ＳＥＭである。
【図２】未処理か又は１０ｍＭフェンホルミンで１時間処理されたかのいずれかであるセル溶解物中のＭｇ２＋依存性でオカダ酸抵抗性のホスファターゼ（ＰＰＭホスファターゼ）活性を示す図である。Ａ：１０ｍＭＭｇＡｃ及び５μＭオカダ酸の存在下でカゼインを基質として使用した、処理済及び未処理のＨＥＫ２９３細胞溶解物中のＰＰＭホスファターゼの活性。データは、二重反復で測定された５つの独立した試料の平均±ＳＥＭである。（ｐ＜０．００１）。Ｂ：１０ｍＭＭｇＡｃ及び５μＭオカダ酸の存在下でカゼインを基質として使用した、処理済及び未処理のヒーラ細胞溶解物中のＰＰＭホスファターゼの活性。データは、二重反復で測定された５つの独立した試料の平均±ＳＥＭである。（ｐ＜０．００１）。
【図３】カゼインを基質として使用した、１ｍＭフェンホルミンでの事前インキュベーション後の組換えＰＰＭホスファターゼの活性を示す図である。細菌で発現されたＰＰＭホスファターゼを、１０ｍＭＭｇＡｃ及び５μＭオカダ酸の存在下で３２Ｐカゼインを基質として使用して実施されるアッセイに先立って、１ｍＭフェンホルミンと共に又はフェンホルミンなしで１５分間インキュベートした。アッセイは三重反復で実施した。
【図４】未処理か又はフェンホルミンで処理されたかいずれかのＨＥＫ２９３細胞におけるＰＰＭホスファターゼのレベルを示す図である。未処理か又は１０ｍＭフェンホルミンで１時間処理されたかいずれかのＨＥＫ２９３細胞溶解物のイムノブロッティング。指定のＰＰＭ酵素に対して誘発された抗体を使用して、細胞溶解物をイムノブロッティングした。２つの代表的な試料を各処理について示す。予測分子量をｋＤａで括弧内に示す。マーカータンパク質の分子量をｋＤａでパネルの左側に示す。
【図５】ＦＰＬＣによる分離後の、処理済及び未処理のＨＥＫ２９３細胞溶解産物からのＰＰＭホスファターゼの活性を示す図である。対照由来の溶解物、又はフェンホルミン処理済のＨＥＫ２９３細胞由来の溶解物を、０．４５及び０．２２μｍのフィルターを介してろ過し、HiTrap脱塩カラムを使用して脱塩した。HR5/5 Source 15-Qカラムを使用して、それらの正味電荷によりタンパク質を分離した。画分のタンパク濃度を分析し、１０ｍＭＭｇＡｃ及び５μＭオカダ酸の存在下で３２Ｐ標識カゼインを基質として使用して、各画分中のＰＰ２Ｃホスファターゼの活性を測定した。
【図６】未処理か又はフェンホルミンで処理されたかいずれかのＨＥＫ２９３細胞におけるＰＰＭホスファターゼの活性を示す図である。未処理か又は１０ｍＭフェンホルミンで１時間処理されたかのいずれかであるＨＥＫ２９３細胞溶解物中のＰＰＭホスファターゼの活性。個々のアイソフォームを対照又はフェンホルミン処理済の細胞溶解物から免疫沈降し、１０ｍＭＭｇＡｃ及び５μＭオカダ酸の存在下で３２Ｐ標識カゼインを基質として使用して、活性を測定した。データは、三重反復で実施されたアッセイの平均活性である。
【図７】ＰＰＭ１Ｅ及びＰＰＭ１Ｆのドメイン構造を示す図である。保存された領域を斜線区域で示し、黒色ボックスは、全ファミリーメンバーで保存されているＰＰ２Ｃの特徴的モチーフ（ＹＦＡＶＦＤＧＨＧ）を表し、灰色ボックスは、ＰＰＭ１には見られない酸性残基のクラスターを示す。
【図８】ＰＰＭホスファターゼがＦＰＬＣカラムから溶出する塩濃度の表を示す図である。ＨＥＫ２９３細胞溶解物をＦＰＬＣにより分離した後で、収集された画分に対してイムノブロッティングを実施した。各酵素が溶出する近似塩濃度は、検出されたバンドのｋＤａでの予測分子量及び観測分子量と一緒に示されている。
【図９】未処理か又はフェンホルミンで処理されたかいずれかのＨＥＫ２９３細胞中のＰＰＭホスファターゼ活性を表す棒グラフを示す図である（図６に表された絶対値データの％尺度）。
【図１０】棒グラフを示す図である。
【図１１】ウエスタンブロットの写真を示す。
【図１２】ウエスタンブロットの写真を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
メトホルミンは、その作用機序は不明であるが、２型糖尿病の治療に使用される主要薬剤の１つであり、ＡＭＰＫの活性を増加させる。ＡＭＰＫは、通常は、ＡＭＰレベルの増加に応答して、αサブユニットの触媒部位内のトレオニン残基のリン酸化により活性化される。メトホルミン類似体であるフェンホルミンと共にＨＥＫ２９３及びヒーラ細胞をインキュベートした後でタンパク質ホスファターゼ活性を検査すると、マグネシウムイオン依存性でオカダ酸抵抗性のカゼインホスファターゼ活性が、フェンホルミン又はメトホルミンに応答して約２０％減少したことが明らかになった。さらなる研究により、２つの密接に関連したＰＰＭファミリータンパク質ホスファターゼ、ＰＰＭ１Ｅ及びＰＰＭ１Ｆの活性が、ＨＥＫ２９３細胞をフェンホルミンと共にインキュベートした後で阻害されたことが示され、それらがフェンホルミンにより直接的及び／又は間接的に標的とされ、ＡＭＰＫ活性の増加に繋がり得ることが明らかになった。本発明はこれらの予想外の知見に基づく。
【００３９】
「薬剤」又は「阻害剤候補」という用語は、当技術分野におけるその通常の意味を有し、有機若しくは無機化合物又はその混合物のような任意の化学物質を指すことができる。好ましくは、前記薬剤は低分子量化学物質であってよい。好ましくは、物質は、生体高分子、例えば核酸又はポリペプチドのような高分子であってよい。例としては、前記薬剤は、天然物質、生体高分子、又は細菌、真菌、若しくは動物（特に哺乳類）の細胞若しくは組織のような生体材料から作製された抽出物、有機若しくは無機分子、合成薬剤、半合成薬剤、構造的若しくは機能的模倣剤、ペプチド、ペプチド模倣剤、誘導体化薬剤、全タンパク質から切断されたペプチド、又は人工的に合成されたペプチド（例としては、ペプチド合成機を使用するか、又は組換え技術によるか、又はその組合せによるかのいずれかの、組換え薬剤、抗体、天然若しくは非天然薬剤、融合タンパク質、又はその等価物、及びその変異体、誘導体、又はその組合せなど）である。典型的には、前記薬剤は有機化合物であろう。好ましい薬剤は水溶性である。好ましくは、本発明の薬剤は、メトホルミン類似体又はフェンホルミン類似体である。好ましくは、本発明の薬剤は、細胞内への輸送手段を備えており、ミトコンドリア内への輸送手段を備えていてよい。より好ましくは、本発明の薬剤はミトコンドリアから排除される。
【００４０】
［メトホルミン／フェンホルミン／類似体］
好ましくは、本発明によるＰＰＭ阻害剤はビグアニド化合物である。例としては、メトホルミン、フェンホルミン、又はブホルミンが含まれる。
【００４１】
好ましくは、本発明によるＰＰＭ阻害剤は、メトホルミン若しくはその類似体、又はフェンホルミン若しくはその類似体を含む。
【００４２】
メトホルミンの類似体には、そのＰＰＭホスファターゼ阻害活性のため本発明の好ましい化合物であるフェンホルミンが含まれる。
【００４３】
フェンホルミンは、フェニルエチルビグアニドである。フェンホルミンは、メトホルミンの特性に類似した特性を有するビグアニド血糖降下剤である。フェンホルミンは、多数の管轄範囲において、致死的であることが多い乳酸アシドーシスが許容できない高率で発生することと関連すると見なされていることに留意しなければならない。したがって好ましくは、フェンホルミンは、ヒト又は動物対象に投与されない。したがって本発明の医療応用の場合、好ましくは、ＰＰＭホスファターゼ阻害剤はフェンホルミンではない。
【００４４】
メトホルミン（Ｃ４Ｈ１１Ｎ５）とは、１−（ジアミノメチリデン）−３，３−ジメチル−グアニジンである。メトホルミンは、ビグアニドクラスに由来する抗糖尿病薬である。メトホルミンは、Glucophage、Diabex、Diaformin、Fortamet、Riomet、及びGlumetza等の商品名で広く入手可能である。メトホルミンは、そのＰＰＭホスファターゼ阻害活性、及びそのより低い毒性のため、本発明の好ましい化合物である。
【００４５】
［化学誘導体］
本発明は、化合物の誘導体、特にメトホルミン及び／又はフェンホルミンの誘導体にも関する。本明細書中で使用される場合、「誘導体」という用語は、薬剤の化学的修飾を含む。そのような化学的修飾の実例は、ハロ基、アルキル基、アシル基、又はアミノ基による水素の置換であろう。
【００４６】
［塩／エステル］
本発明の化合物は、塩又はエステル、特に薬学的に許容される塩又はエステルとして存在することができる。
【００４７】
本発明の化合物の薬学的に許容される塩には、好適なその酸付加塩又はその塩基塩が含まれる。好適な薬学的塩の総説は、Berge et al, J Pharm Sci, 66, 1-19 (1977)に見出すことができる。塩は、例えば、鉱酸、例えば硫酸、リン酸、若しくはハロゲン化水素酸のような無機強酸；酢酸のような、置換されていない若しくは置換されている（例えばハロゲンにより）１〜４個の炭素原子のアルカンカルボン酸のような強有機カルボン酸；飽和若しくは不飽和のジカルボン酸、例えばシュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸、若しくはテトラフタル酸；ヒドロキシカルボン酸、例えばアスコルビン酸、グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、若しくはクエン酸；アミノ酸、例えばアスパラギン酸若しくはグルタミン酸；安息香酸；又はメタンスルフォン酸若しくはｐ−トルエンスルフォン酸のような、置換されていない若しくは置換されている（例えばハロゲンにより）（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル若しくはアリールスルホン酸などの有機硫酸と形成される。
【００４８】
エステルは、エステル化される官能基に依存して、有機酸又はアルコール／水酸化物のいずれかを使用して形成される。有機酸には、酢酸のような、置換されていない若しくは置換されている（例えばハロゲンにより）１〜１２個の炭素原子のアルカンカルボン酸のようなカルボン酸；飽和若しくは不飽和のジカルボン酸、例えばシュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸、若しくはテトラフマル酸；ヒドロキシカルボン酸、例えばアスコルビン酸、グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、若しくはクエン酸；アミノ酸、例えばアスパラギン酸若しくはグルタミン酸；安息香酸；又はメタンスルフォン酸若しくはｐ−トルエンスルフォン酸のような、置換されていない若しくは置換されている（例えばハロゲンにより）（Ｃ１〜Ｃ４）−アルキル若しくはアリールスルホン酸などの有機硫酸が含まれる。好適な水酸化物には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化アルミニウムのような無機水酸化物が含まれる。アルコールには、例えばハロゲンにより置換されていない又は置換されている１〜１２個の炭素原子のアルカンアルコールが含まれる。
【００４９】
［鏡像異性体／互変異性体］
全ての態様において、本発明は、適切な場合には、本発明の化合物の全ての鏡像異性体及び互変異性体を含む。当業者であれば、光学的性質（１又は複数のキラル炭素原子）又は互変異性特徴を有する化合物を認識しよう。対応する鏡像異性体及び／又は互変異性体は、当技術分野で公知の方法により単離／調製できる。
【００５０】
［立体異性体及び幾何異性体］
本発明の化合物の幾つかは、立体異性体及び／又は幾何異性体として存在してよく、例えばそれらは１又は複数の不斉中心及び／又は幾何学的な中心を有してよく、したがって２つ以上の立体異性形態及び／又は幾何学的形態が存在してよい。本発明は、それらの阻害薬剤の個々の立体異性体及び幾何異性体の全て、及びその混合物の使用を企図している。これらの形態が適切な機能的活性（必ずしも同程度とは限らないが）を保持する場合、特許請求の範囲で使用された用語は、前記形態を包含する。
【００５１】
本発明は、薬剤はその薬学的に許容される塩の全ての好適な同位体変異も含む。本発明の薬剤又はその薬学的に許容される塩の同位体変異とは、少なくとも１つの原子が、同一の原子番号を有するが自然界において通常見出される原子質量とは異なる原子質量を有する原子に置換されたものとして定義される。薬剤及びその薬学的に許容される塩に組み込むことができる同位体の例には、２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、１８Ｆ、及び３６Ｃｌのような、それぞれ水素、炭素、窒素、酸素、リン、硫黄、フッ素、及び塩素の同位体を含む。薬剤及びその薬学的に許容される塩のある種の同位体変異、例えば、３Ｈ又は４Ｃのような放射性同位体が組み込まれたものは、薬剤及び／又は基質の組織分布研究に有用である。トリチウム化、つまり３Ｈ同位体、及び炭素１４、つまり１４Ｃ同位体は、それらの調製及び検出性が容易なため特に好ましい。さらに、重水素、つまり２Ｈのような同位体との置換は、より大きな代謝安定性に起因するある種の治療上の利点、例えばインビボ半減期の増加又は必要用量の低減を提供することができ、したがって幾つかの状況で好ましいことがある。本発明の薬剤及び本発明のその薬学的に許容される塩の同位体変異は、好適な試薬の適切な同位体変異を使用して、従来の手順により一般的に調製できる。
【００５２】
［溶媒和物］
本発明は、本発明の化合物の溶媒和物形態の使用も含む。特許請求の範囲で使用された用語はこれらの形態を包含する。
【００５３】
［多形体］
本発明は、さらに、種々の結晶形態、多形形態、及び（無水）含水形態の本発明の化合物に関する。化学化合物は、そのような化合物の合成調製で使用される溶剤からの精製及び／又は単離の方法をわずかに変えることにより、そのような形態のいずれにも単離できることが、医薬品産業内で十分に確立されている。
【００５４】
［プロドラッグ］
本発明は、プロドラッグ形態の本発明の化合物をさらに含む。そのようなプロドラッグは、一般的に、ヒト又は哺乳類の対象への投与に際して修飾が元に戻り得るように、１又は複数の適切な基が修飾された本発明の化合物である。インビボでの転換を実施するために、そのようなプロドラッグと一緒に第２の薬剤を投与することは可能であるが、そのような転換は、通常、そのような対象に本来的に存在する酵素によって実施される。そのような修飾の例には、エステル（例えば上述したもののいずれか）が含まれ、転換はエステラーゼなどにより実行できる。他のそのような系は当業者には周知であろう。
【００５５】
［ＰＰＭファミリーのタンパク質ホスファターゼ］
ＰＰＭファミリーのタンパク質ホスファターゼは、一群のセリン／トレオニンホスファターゼを含み、それらの多くは、活性をＭｇ２＋又はＭｎ２＋に依存する。ＰＰＰとＰＰＭファミリータンパク質ホスファターゼとの間には配列同一性が存在しないが、それらは著しく類似した三次元構造及び触媒機序を有する。ＰＰＭファミリーのタンパク質ホスファターゼは、少なくとも１６のメンバーを含む（ＰＰＭをコードする１６の遺伝子；幾つかは選択的にスプライスされて様々なタンパク質変異体（例えばＢ１及びＢ２）を産生する）。これらのタンパク質ホスファターゼは、構造的にはむしろ分岐にわたるが、非常に類似した触媒機序で機能する。慣習に従って、タンパク質名及び遺伝子名は、例えば下記に示すように異なることがある（例えば、ＰＰＭ１Ｅ遺伝子はＰＯＰＸ１タンパク質をコードする）。しかしながら、タンパク質が遺伝子名により参照される場合、これは前記遺伝子によりコードされたホスファターゼを指すと了解されよう（例えば、「ＰＰＭ１Ｅホスファターゼ」は、ＰＰＭ１Ｅ遺伝子によりコードされたホスファターゼ、つまりＰＯＰＸ１タンパク質を指す）。
【００５６】
ＰＰＭ１Ａ
ＰＰ２Ｃαとも呼ばれるＰＰＭ１Ａは、２つのアイソフォーム、ＰＰ２Ｃα１（ＰＰＭ１Ａ１）及びＰＰ２Ｃα２（ＰＰＭ１Ａ２）からなり、それらは、それぞれ４２及び３６ｋＤａの分子量を有し、それらの両方が単量体として存在する。ＰＰ２Ｃαは、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）で最初に発現され、組換えＰＰ２Ｃαが、インビトロでＡＭＰ活性化タンパク質キナーゼ（ＡＭＰＫ、AMP-activated protein kinase）を脱リン酸化できたことが見出された。この脱リン酸化事象は、毒素であるオカダ酸に感受性がなく、Ｍｇ２＋の必要性を示した。さらに、ＰＰ２Ｃαは、脂肪細胞のＰＩ３キナーゼ活性の直接的活性化を介したインスリン感受性の正の調節因子であることが示され、ｐ３８ＭＡＰＫと同様に、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫ、mitogen-activated protein kinase kinase）の脱リン酸化及び不活性化を介したストレス応答経路の負の調節因子として示唆されている。細胞をストレスで刺激すると、ｐ３８及びＰＰ２Ｃα間の直接的相互作用が検出できた。
【００５７】
ＰＰＭ１Ｂ
ＰＰ２Ｃβとも呼ばれるＰＰＭ１Ｂは、それぞれ４３及び５３ｋＤａの分子量を有する、少なくとも２つのアイソフォーム、ＰＰ２Ｃβ１（ＰＰＭ１Ｂ１）及びＰＰ２Ｃβ２（ＰＰＭ１Ｂ２）からなり、ＰＰ２Ｃαのように、これらの酵素は単量体として存在する。ＰＰ２Ｃβは、ｐ３８の脱リン酸化を介したストレス応答経路の負の調節因子であることが示され、ＴＡＫ１、即ちＪＮＫ及びＭＡＰＫ経路の活性化に関与する酵素の脱リン酸化にも関与している。ＰＰ２Ｃβは、サイクリン依存性ホスファターゼの脱リン酸化に役割を果たすことが示された。
【００５８】
ＰＰＭ１Ｇ
ＰＰ２Ｃγ又はＦＩＮ１３とも呼ばれるＰＰＭ１Ｇは、Ｇ１／Ｓ期で細胞周期停止を引き起こすことにより、細胞増殖を負に調節できることが示された、分子量５９ｋＤａの融合コラーゲン相同ドメインを含有する単量体タンパク質ホスファターゼである。ＰＰＭ１Ｇは、成体組織では、主として精巣で発現されるが、増殖を起こしている多数の組織で高度に発現される。これらの組織には、発生中の胚、妊娠中の子宮、胎盤、及びジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ、diethylstilbestrol）で濾胞形成を刺激した後の性的に未熟なマウスの卵巣中が含まれる。ＰＰＭ１Ｇは、Ｃ末端核局在化シグナルを有し、ＰＰ２Ｃγが主として塩基性タンパク質に対する優先性を有すると考えられるため、基質特異性の付与に関与すると思われる大型の内部酸性ドメインを有する点で、ＰＰＭファミリーの他のメンバーと異なる。ＰＰＭ１Ｇは、カルシウムにより阻害されることが示されているが、マイクロモルの高い濃度が阻害に必要なため、これが調節の様式である可能性は少ない。ＰＰＭ１Ｇは、スプライセオソームの組立てと結びつけられ、ｍＲＮＡ前躯体スプライシング因子の構成要素と相互作用することが示されている。
【００５９】
ＩＬＫＡＰ
ＰＰ２Ｃδとも呼ばれるＩＬＫＡＰ（Integrin-linked kinase 1-associated phosphatase、インテグリン結合キナーゼ１関連ホスファターゼの略）は、分子量４３ｋＤａの単量体タンパク質であり、インテグリン結合キナーゼ１（ＩＬＫ１、integrin-linked kinase 1）で誘引された酵母ツーハイブリッドスクリーニング（yeast two-hybrid screen）で特定された。触媒的に不活性なＩＬＫＡＰの突然変異体ではないＩＬＫＡＰは、インスリン様増殖因子１で刺激されたＧＳＫ３βのＳｅｒ９におけるリン酸化を強く阻害したが、Ｓｅｒ４７３におけるＰＫＢのリン酸化には影響を及ぼさず、したがってＩＬＫＡＰはＩＬＫ媒介性ＧＳＫ３βシグナル伝達に選択的に影響を及ぼすことを示唆した。さらに、前立腺癌ＬＮＣａＰ細胞の足場非依存性増殖はＩＬＫＡＰにより阻害され、細胞形質転換の抑制におけるＩＬＫＡＰの重大な役割、及びＩＬＫＡＰが腫瘍化形質転換の阻害において重要な役割を果たすことを示唆する。
【００６０】
ＰＰＭ１Ｄ
Ｗｉｐ１（wildtype p53-induced phosphatase 1、野性型ｐ５３誘導ホスファターゼ１の略）とも呼ばれるＰＰＭ１Ｄは、６６ｋＤａの分子量を有する単量体タンパク質であり、ｐ５３標的遺伝子のスクリーニングにおいて最初に特定された。その発現は、電離放射線によりｐ５３依存的様式で迅速に誘導されることが示され、ｐ５３が、ＰＰＭ１Ｄ誘導を介した細胞周期抑制活性の一部分を媒介し得ることが示唆された。Ｗｉｐ１プロモーター領域は、従来のｐ５３応答エレメントのいずれをも含有しないが、その代わり、ＮＦ−κＢ、Ｅ２Ｆ、ｃ−Ｊｕｎ、及びＡＴＦ／ＣＲＥＢファミリーのメンバーを含む転写因子の潜在的結合部位を含有する。他のＰＰ２Ｃファミリーメンバーのように、ＰＰＭ１Ｄは、ｐ３８ＭＡＰＫファミリーのメンバーを脱リン酸化することができる。ＰＰＭ１Ｄは、ＵＶ照射により損傷を受けた細胞の回復期中に、ｐ３８−ｐ５３シグナル伝達を下流調節することに役割を有する。さらに、ＰＰＭ１Ｄは、アニソマイシン、過酸化水素、及びメチルメタンスルホン酸のような他の環境ストレスによっても誘導される。ＰＰＭ１ＤのＵＶ誘導の場合、ｐ３８活性がｐ５３と同様に必要であり、ＰＰＭ１Ｄは、その保存されたトレオニン残基における脱リン酸化によりｐ３８を不活性化する一方で、ｐ３８によりリン酸化されると報告されたそれらの残基におけるＵＶ誘導性ｐ５３リン酸化を減少させる。ＰＰＭ１Ｄ発現は、ＵＶ照射に応答したｐ５３媒介性の転写及びアポトーシスの両方も抑制する。
【００６１】
ＰＰＭ１Ｅ及びＰＰＭ１Ｆ
ＰＯＰＸ１とも呼ばれるＰＰＭ１Ｅは、融合ＰＡＫ相互作用性グアニンヌクレオチド交換因子（ＰＩＸ、PAK-interacting guanine nucleotide exchange factor）結合ドメインを含有する８３ｋＤａの単量体タンパク質であり、ＰＡＫの負の調節に関与すると示唆されている。ＰＰＭ１Ｅは、ＰＩＸを誘引物質として使用したツーハイブリッドスクリーニングで、ＰＩＸと相互作用するタンパク質であると特定された。ＰＯＰＸ２とも呼ばれるＰＰＭ１Ｆは同じスクリーニングで特定され、２つは、コアホスファターゼドメイン及び相同性フランキング配列で６６％の類似性を示す。ＰＰＭ１Ｅ及びＰＰＭ１Ｆの両方は、アクチン張力線維の分解を阻害する能力、及び活性ｃｄｃ４２により推進される形態学的変化を阻害する能力を有するだけでなく、ｐ２１（ｃｄｃ４２／Ｒａｃ）活性化キナーゼ（ＰＡＫ）を脱リン酸化及び不活性化することが示されており、ＰＰＭ１Ｆは、ＣａＭＫIIＰａｓｅ又はｈＦＥＭ２としても知られており、その自己リン酸化部位、Ｔｈｒ２８６におけるＣａ２＋／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼIIの脱リン酸化の原因である主要ホスファターゼであることが示されている。ＰＰＭ１Ｆがインビトロで直接的にＣａＭＫIIと相互作用することが示されてり、ＰＰＭ１Ｆがその調節に重要な役割を果たすことが示唆されている。
【００６２】
ＰＤＰＣ１及びＰＤＰＣ２
ＰＤＰＣ１（ピルビン酸デヒドロゲナーゼホスファターゼ複合体１、Pyruvate Dehydrogenase Phosphatase Complex 1）及びＰＤＰＣ２は、それぞれ６１及び６０ｋＤａの分子量を有するヘテロ二量体タンパク質であり、糸粒体基質空間内に在留する少数の哺乳類ホスファターゼのうちの２つである。ＰＤＰＣ１はＣａ２＋に応答して活性化されることが示されている一方で、ＰＤＰＣ２は、Ｃａ２＋不感受性であるが、ＰＤＰＣ１に効果を示さない生物学的なポリアミン、スペルミンに感受性であることが示されている。ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体は、３つの触媒構成要素：ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ１）、ジヒドロリポアミドトランスアセチラーゼ（Ｅ２）、及びジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（Ｅ３）から構成される大きな多酵素複合体である。複合体は、３０サブユニットのＥ１及び６〜１２のＥ３サブユニットが結合された６０のＥ２サブユニットのコア周辺に構築される。複合体は、Ｅ１構成要素の３つのセリン残基におけるリン酸化により不活性化され、ＰＤＰＣアイソフォームによる脱リン酸化により再活性化される。ミトコンドリアにおいては、キナーゼ及びホスファターゼは両方とも、構成的に活性であり、これが不活性状態のＰＤＣの割合を決定する。ＰＤＰＣ１活性及びＰＤＰＣ２活性の調節は、明らかに非常に厳重に制御されなければならず、最近の研究では、飢餓及び糖尿病が心臓及び腎臓のＰＤＰレベルを減少させることが示唆されている。興味深いことには、インスリンでの治療はＰＤＰＣ２レベルを増加させることが示され、インスリンがピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の長期的調節に役割を果たし得るという事実を示唆している。
【００６３】
ＰＨＬＰＰ
ＰＨＬＰＰ（PH-domain leucine-rich protein phosphatase、ＰＨドメインロイシンリッチタンパク質ホスファターゼの略）は、ＰＨドメインに結合されたタンパク質ホスファターゼのヒトゲノムスクリーニングで特定された、ＰＫＢのＴｈｒ４７３を脱リン酸化する、約１４０ｋＤａの新規なホスファターゼである。ＰＫＢの脱リン酸化におけるその役割と一致して、多数の結腸癌及び膠芽腫の細胞系はＰＨＬＰＰレベルを減少させ、これらの細胞系へのＰＨＬＰＰの再導入はそれらの成長速度を減少させる。したがって、ＰＨＬＰＰは、アポトーシスの促進及び腫瘍増殖の抑制において役割を有する。ＰＨＬＰＰの第２のアイソフォームは、ヒトゲノムにコードされている。ＰＨＬＰＰ及びＰＨＬＰＰ２は、ＰＫＢとの結合によりあまり興味深いものではなく、したがって好適には、本発明のホスファターゼはＰＨＬＰＰ又はＰＨＬＰＰ２ではない。
【００６４】
ＰＰＭ１Ｋ
ＰＰＭ１Ｋは、ＮＰ＿６８９７５５、ＥＮＳＰ０００００２９５９０８、ＥＮＳＰ０００００３２４７６１、Ｑ５６ＡＮ８、Ｑ８ＩＵＺ７、Ｑ４９ＡＢ５といった識別番号で、ＮＣＢＩ及びＥＢＩデータベースにおいて近年特定及び提出されている、ＰＰＭセリン／トレオニンタンパク質ホスファターゼファミリーメンバーである。
【００６５】
要約すると、フェンホルミン／メトホルミンにより阻害されないＰＰＭには、ＰＰＭ１Ａ、ＰＰＭ１Ｂ（Ｂ１及びＢ２）、ＰＰＭ１Ｇ、ＩＬＫＡＰ、ＰＰＭ１Ｄ、ＮＥＲＰＰ−２Ｃ、ＰＤＰＣ１、及びＰＤＰＣ２が含まれる。
【００６６】
好ましくは、ＰＰＭは、ＰＰＭ  ＢＩＧｉ（ビグアニド阻害）ファミリーメンバーである。ＢＩＧｉファミリーには、ＰＰＭ１Ｅ、ＰＰＭ１Ｆ、ＰＰＭ１Ｊ、ＰＰＭ１Ｋ、ＰＰＭ１Ｌ、ＰＨＬＰＰ、及びＰＨＬＰＰ２遺伝子によりコードされたホスファターゼ、並びに本明細書中に開示されたようにアッセイされた、メトホルミン及び／又はフェンホルミンのようなビグアニドにより阻害される任意の他のホスファターゼが含まれる。好ましくは、ＰＰＭホスファターゼは、ＰＰＭ１Ｅ、ＰＰＭ１Ｆ、ＰＰＭ１Ｊ、ＰＰＭ１Ｋ、ＰＰＭ１Ｌ、ＰＰＭ１Ｍ、ＰＨＬＰＰ、及びＰＨＬＰＰ２からなる群から選択されるか、好ましくはＰＰＭホスファターゼは、ＰＰＭ１Ｅ、ＰＰＭ１Ｆ、ＰＰＭ１Ｊ、ＰＰＭ１Ｋ、ＰＰＭ１Ｌ、及びＰＰＭ１Ｍからなる群から選択されるか、又はそこから選択された１若しくは複数のホスファターゼの組合せであり、好ましくはＰＰＭホスファターゼはＰＰＭ１Ｅ又はＰＰＭ１Ｆであり、好ましくはＰＰＭホスファターゼはＰＰＭ１Ｅである。
【００６７】
【表１】
2010510797.tif 000003
【００６８】
ＰＰＭホスファターゼの好ましい特徴を提示する。
【００６９】
好ましくは、ＰＰＭホスファターゼは、マグネシウム（Ｍｇ２＋）又はマンガン（Ｍｎ２＋）依存性ホスファターゼであり、好ましくはマンガン依存性である。
【００７０】
好ましくは、ＰＰＭホスファターゼはオカダ酸抵抗性である。
【００７１】
好ましくは、ＰＰＭホスファターゼは、カゼイン（例えばホスホ−カゼイン）ホスファターゼ活性を有する。
【００７２】
好ましくは、ＰＰＭホスファターゼはＰＩＸ結合ドメインを含む。
【００７３】
好ましくは、ＰＰＭホスファターゼは、ＰＰＭ１Ｆ若しくはＰＰＭ１Ｅ、又はその混合物である。
【００７４】
好ましくは、ＰＰＭホスファターゼはＰＰＭ１Ｅである。
【００７５】
好ましくは、ＰＰＭホスファターゼは、以下から選択されるアミノ酸配列を有する。
ＰＰＭ１Ｅ．ＮＰ＿０５５７２１
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SYKIE
【００７６】
これらの２つのＰＰＭ１Ｅ配列、ＮＰ＿０５５７２１及びＥＮＳＰ０００００３１２４１１は９８％同一である。
【００７７】
或いは、ＰＰＭ１Ｅ配列は、Ｑ８ＷＹ５４＿２、Ｑ８ＷＹ５４＿１、又はＱ８ＷＹ５４＿３から選択されてよい。Ｑ８ＷＹ５４＿２は、上記に列挙された最も好適な配列と比較して、追加的ＥＰを有する（ＭＡＧＣＩＰＥＥＫＴＹＲＲＦＬＥＬＦＬＧＥＦＲＧＰＣＧＧＧＥＰ．．．）が、一方Ｑ８ＷＹ５４＿ｌ及びＱ８ＷＹ５４＿３は、アミノ末端領域に他の変異を有する。
ＰＰＭ１Ｆ．ＮＰ＿０５５４４９及びＥＮＳＰ０００００２６３２１２
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【００７８】
各々の場合でホスファターゼタンパク質がホスファターゼ活性を保持する限り、ホスファターゼタンパク質は、好ましくはこれらの配列の１つと少なくとも８０％同一である配列を有し、好ましくはこれらの配列の１つと少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一である配列を有する。これは、本明細書中に記載されたアッセイを使用して容易に確認できる。
【００７９】
［ＰＰＭホスファターゼ活性の阻害剤及びアッセイ］
ホスファターゼ阻害剤の場合、特にＰＰＭホスファターゼ阻害剤は、ホスファターゼに関する教示に従って解釈されるべきであり、つまり好ましくはホスファターゼ阻害剤（複数可）は、マグネシウム又はマンガン依存性ＰＰＭホスファターゼの阻害剤、好ましくはオカダ酸抵抗性ＰＰＭホスファターゼの阻害剤、好ましくはＰＰＭホスファターゼカゼインホスファターゼ活性の阻害剤、好ましくはＰＩＸ結合ドメインを含むＰＰＭホスファターゼの阻害剤、好ましくはＰＰＭ１Ｅ若しくはＰＰＭ１Ｆホスファターゼの阻害剤又はその混合物、好ましくはＰＰＭ１Ｆホスファターゼの阻害剤、好ましくはＰＰＭ１Ｅホスファターゼの阻害剤である。
【００８０】
好ましくは、本発明のホスファターゼ阻害剤は、ＰＰＭホスファターゼの阻害剤であり、ＰＰ２Ａホスファターゼ活性に対して著しい効果を示さず、好ましくはＰＰ２Ａホスファターゼ活性に対する検出可能な効果を示さず、好ましくは本明細書中に記載されたようにホスホリラーゼａを基質として使用してアッセイされた際に（特にＰＰ１がＩ−２阻害剤の使用により阻害される場合。実施例２を参照）、ＰＰ２Ａホスファターゼ活性に対する検出可能な効果を示さない。
【００８１】
好ましくは、ＰＰＭ阻害剤は、ＰＰ１活性に著しい効果を示さず、好ましくはＰＰ１活性に対する検出可能な効果を示さず、好ましくは実施例２に記載されたようにアッセイされた際にＰＰ１活性に対する検出可能な効果を示さない。
【００８２】
好ましくは、ＰＰＭ阻害剤は、ＰＰ５活性に著しい効果を示さず、好ましくはＰＰ５活性に対する検出可能な効果を示さず、好ましくは実施例２に記載されたようにアッセイされた際にＰＰ５活性に対する検出可能な効果を示さない。
【００８３】
ＰＰＭホスファターゼの阻害は、好ましくは、ＰＰＭ阻害剤の投与により達成される。「阻害」には、ＰＰＭ活性の低減若しくは排除又はＰＰＭホスファターゼレベルに関する干渉／介入が含まれてもよい。例えば、ＰＰＭホスファターゼ発現の抑制若しくは阻害、ＰＰＭホスファターゼの転写及び／若しくは翻訳の抑制若しくは阻害、又はＰＰＭホスファターゼ自体の下流調節（その活性化を防止又はその不活性化を引き起こすような酵素の調節によるか、又はその分解の促進若しくは他のそのような技術によるかによって）である。したがって、「阻害」とは、低下、鎮圧、除去、又はＰＰＭホスファターゼ活性を抑制若しくは低減する他のそのような様式を指す。阻害剤は、好ましくは、本明細書中に開示されたアッセイにより特定される阻害剤である。ＰＰＭホスファターゼの他の阻害様式が使用されてよい。これらには、ＰＰＭの活性化因子（複数可）又は調節因子（複数可）の操作が伴っていてよい。或いは、これらには、ＰＰＭ活性のｓｉＲＮＡノックダウンのようなＰＰＭノックダウンが伴っていてよい。好ましくは、ＰＰＭ活性の阻害に使用されるｓｉＲＮＡｓは、ＰＰＭ１Ｅ又はＰＰＭ１ＦのｓｉＲＮＡｓである。
【００８４】
ＰＰＭホスファターゼ活性のアッセイは、任意の好適なアッセイによるものでよい。考え得る形式が、実施例セクションに多数詳述されている。
【００８５】
アッセイの好ましい特徴は、アッセイが、Ｍｇ２＋イオン又はＭｎ２＋イオン、好ましくはＭｇ２＋イオン；好ましくはＭｇＡｃ（酢酸マグネシウム、magnesium acetate）；好ましくは１０ｍＭＭｇＡｃを含むことである。これは、ＰＰＭホスファターゼがＭｇ／Ｍｎ依存性であるため、活性に許容的であるという利点を有する。好適にはアッセイはＭｎ２＋イオン、好適にはＭｎＣｌ２（塩化マンガン）；好適には２ｍＭの塩化マンガン（II）を含む。好適には、アッセイは、Ｍｇ２＋イオン及びＭｎ２＋イオンの両方を含む。
【００８６】
好ましくは、アッセイは、オカダ酸、好ましくは５μＭのオカダ酸を含む。これは、ＰＰ２Ａを阻害するという利点を有する。
【００８７】
好ましくは、アッセイは、結果を混乱させないように、つまりアッセイが、非ＰＰＭホスファターゼのような別のホスファターゼの活性／阻害ではなく、ＰＰＭホスファターゼの活性／阻害を正確に読み取ることを保証するよう努めるために使用される特定の基質に作用し得る他のホスファターゼの１又は複数の阻害剤を含む。そのような阻害剤、及びそれらが阻害するホスファターゼは公知であり、典型的な阻害剤は、それらがどの酵素を阻害するかという表示とともに本明細書中に、特に実施例部分に記載されている。
【００８８】
好ましくは、アッセイは、カゼインを基質（ホスホ−カゼイン）として使用して実施される。好ましくは、このカゼインは、ＰＰＭの作用により取り除かれたリン酸の検出を容易にするために、３２Ｐで標識される。
【００８９】
好ましくは、アッセイは、ＦＰＬＣで精製されたホスファターゼについて行う。
【００９０】
好ましくは、アッセイは、哺乳動物細胞、細菌細胞、又は他の異種性発現系で発現されたＰＰＭ１Ｅ／ＰＰＭ１ＦホスファターゼのようなＰＰＭホスファターゼにについて行うが、そのような物質が活性（本明細書中で示されたように容易に試験される）を有する場合に限られる。
【００９１】
好ましくは、アッセイは、免疫精製されたホスファターゼにについて行う。好ましくは、ホスファターゼは、抗ＰＰＭ１Ｅ及び／若しくは抗ＰＰＭ１Ｆ抗体又は抗体断片（複数可）を使用して免疫精製される。
【００９２】
好ましくは、アッセイのＰＰＭホスファターゼ活性は、ＰＰＭ１Ｅ及び／又はＰＰＭ１Ｆである。
【００９３】
［一般的なタンパク質ホスファターゼアッセイ］
タンパク質ホスファターゼを、３０μｌの体積中で１μＭ〜１０μＭの３２Ｐ標識基質を用いて３０℃でアッセイする。３２Ｐ標識基質及びホスファターゼ阻害剤／活性化因子を、緩衝液Ｃで別々に希釈する。タンパク質ホスファターゼを、緩衝液Ｂで希釈する。１０μｌの希釈ホスファターゼ（又は１０μｌの緩衝液Ｂ中の免疫沈澱物）を１０μｌの阻害剤／活性化因子又は緩衝液Ｃと混合し、３０℃で１０分間混合物をインキュベートすることにより、アッセイを実施する。アッセイは、１０μｌの３２Ｐ標識基質の添加により開始される。その後、アッセイをさらなる時間（５〜３０分）３０℃でインキュベートし、１００μｌの２０％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸の追加により停止する。混合物を短時間ボルテックスし、１４，０００ｘｇで５分間遠心分離する。１００μｌの上澄みを回収し、Wallac社製1409型液体シンチレーション計数器でチェレンコフ計数法により、遊離した３２Ｐを測定する。免疫沈澱されたホスファターゼ活性のアッセイの場合、洗浄された免疫沈澱物を１０μｌの緩衝液Ｂに再懸濁し、３０℃、１２００ｒｐｍでアッセイを振とうしながらインキュベートしたことを除いて、手順は上記の記載と全く同じである。
緩衝液Ａ  ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ ＥＧＴＡ、０．１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール。
緩衝液Ｂ  １ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含有している緩衝液Ａ。
緩衝液Ｃ  ０．０１％（ｖ／ｖ）のＢｒｉｊ−３５を含有している緩衝液Ａ。
【００９４】
３２Ｐ標識カゼイン基質は、タンパク質キナーゼＡの触媒性サブユニットを使用して［γ３２Ｐ］ＡＴＰで標識された、部分的に加水分解にされたウシミルクカゼイン（Sigma社、Poole、英国）である。
【００９５】
所望のホスファターゼ（例えばＰＰＭ１Ｅ及びＰＰＭ１Ｆ）が作用して基質を脱リン酸化する限り、他の３２Ｐ標識基質を使用してよい。
【００９６】
インビトロＰＰＭアッセイ
ＰＰＭホスファターゼ活性は、ＰＰ１活性及びＰＰ２Ａ様活性を阻害するためにオカダ酸の存在下で、グルタチオニン−Ｓ−トランスフェラーゼ−ペプチド基質、ＧＳＴ−（ＧＧＧＧＲＲＡＴ［ｐ］ＶＡ）３基質からの［３２Ｐ］オルトリン酸を遊離により決定できる。
【００９７】
ホスファターゼは、実施例１０におけるように免疫沈澱することにより準備でき、又はより便利には、ＰＰＭ１Ｅを発現し、標準的技術（ＰＰＭ１Ｅポリペプチドに融合された６ｈｉｓ又はＧＳＴのような精製タグ（複数可）を使用するような）により発現されたタンパク質を精製することにより準備できる。任意の助言が必要な場合に備えて、好ましいＰＰＭ１Ｅ変異体のアミノ酸配列（複数可）を本明細書中に提供する。
【００９８】
ＧＳＴ−（ＧＧＧＧＲＲＡＴ［ｐ］ＶＡ）３ホスファターゼ基質は、タンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ、protein kinase A）でリン酸化することにより好適に調製できる。細菌で発現された２ｍｇのＧＳＴ−（ＧＧＧＧＲＲＡＴＶＡ）３を、１〜２ｍＵのＰＫＡと共に、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、０．１ｍＭＥＧＴＡ、１０％グリセロール、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、０．１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ［ｇａｍｍａ３２Ｐ］ＡＴＰからなる緩衝液中で穏やかに振とうしながら、３０℃で終夜インキュベートする。
【００９９】
ＧＳＴ−（ＧＧＧＧＲＲＡＴＶＡ）３タンパク質配列（前切断プロテアーゼ部位は下線付きである）：
MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGL
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AGGGGRRATVAGGG
【０１００】
グルタチオン−セファロースカラムでのカラムクロマトグラフィーにより、組み込まれなかった放射性ヌクレオチドから、標識ＧＳＴ−（ＧＧＧＧＲＲＡＴ［ｐ］ＶＡ）３を分離し、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．０、０．１ｍＭＥＧＴＡ、１０％グリセロール、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、０．１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール、２０ｍＭグルタチオンで溶出した。アッセイ中の添加に先立って、ＧＳＴ−（ＧＧＧＧＲＲＡＴ［ｐ］ＶＡ）３を１〜４μＭに希釈した。
【０１０１】
３０μｌの全体積中で、一定に振とうしたまま１０分間３０℃でホスファターゼをアッセイする。アッセイには、２０μｌの緩衝液に希釈されたホスファターゼが含有されており、１０μｌの３２Ｐ標識ＧＳＴ（ＧＧＧＧＲＲＡＴ［ｐ］ＶＡ）３ホスファターゼ基質の添加に先立って、２分間３０℃でインキュベートした。１０分後、１００μｌの２０％トリクロル酢酸の添加により反応を終了させた。その後、さらに１分間チューブをボルテックスして完全な混合を保証し、室温で５分間１６，０００ｘｇで遠心分離した。各反応物から１００μｌの上澄みを新しいエッペンドルフチューブに取り出し、液体シンチレーション計数器でチェレンコフ計数法により計数した。
【０１０２】
酸−モリブデン酸塩抽出により、汚染プロテアーゼ活性がほとんどないことを明らかする。
【０１０３】
ホスファターゼアッセイの組成（終濃度）：
５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．０
０．１ｍＭＥＧＴＡ
１０ｍＭ酢酸マグネシウム
２ｍＭ塩化マンガン（II）
５μＭオカダ酸
０．１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール
【０１０４】
アッセイで使用されるホスファターゼの質量は、調製に依存して、典型的には１０ｎｇ〜１０μｇである。
【０１０５】
非放射性アッセイ
１０分間のアッセイ後（トリクロル酢酸の添加前）のリン酸の遊離は、１０ｍｇ／ｍｌのモリブデン酸アンモニウム及び０．３８ｍｇ／ｍｌのマラカイトグリーンを含有する１５０μｌの１Ｎ塩酸を、１００μｌのアッセイに添加することにより測定できる。室温（例えば１８〜２５℃）で２０分後、６２０ｎｍの吸光度を測定する。２５０μｌあれば、プレートリーダ上で吸光度を読み取ることができる。しかしながら、このアッセイは、放射性に基づくアッセイより感受性が１０〜１００倍低く、したがって必要があればアッセイに１０〜１００倍多くのホスファターゼを使用して補償してよく、又は単に、結果を評価する際により低い読み取りを考慮に入れてよい。
【０１０６】
ＰＰＭ１Ｅのアッセイ
アミノ酸配列ＫＴＨＤＩＰＣＰＤＬＰＷＳＹに対して誘発された抗体でＰＰＭ１Ｅを免疫沈澱し、１０ｍＭＭｇ２＋イオン又はＭｎ２＋イオン及び５μＭオカダ酸の存在下で３２Ｐ標識カゼインを基質として使用したタンパク質ホスファターゼアッセイで、免疫沈澱物中のホスファターゼ活性を測定する。
【０１０７】
遺伝子ＥＮＳＧ０００００１７５１７５によりコードされたＰＰＭ１Ｅタンパク質（複数可）を認識する他の抗体を使用できる。
【０１０８】
ＰＰＭ１Ｆのアッセイ
アミノ酸配列ＬＰＳＳＬＰＥＰＥＴＱＡＰＰＲＳに対して誘発された抗体でＰＰＭ１Ｆを免疫沈澱し、１０ｍＭＭｇ２＋イオン又はＭｎ２＋イオン及び５μＭオカダ酸の存在下で３２Ｐ標識カゼインを基質として使用したタンパク質ホスファターゼアッセイで、免疫沈澱物中のホスファターゼ活性を測定する。
【０１０９】
遺伝子ＥＮＳＧ０００００１０００３４によりコードされたＰＰＭ１Ｆタンパク質（複数可）を認識する他の抗体を使用できる。
【０１１０】
［ＡＭＰ活性化タンパク質キナーゼ（ＡＭＰＫ）］
ＡＭＰＫは、細胞エネルギーのセンサーとして機能し、ＡＴＰ消費経路のスイッチを切り、ＡＴＰを産生する異化過程のスイッチを入れる。多数の異なる代謝過程の作用がＡＭＰＫの支配下にあり、それらにはグルコース恒常性、脂質代謝、及びミトコンドリアバイオジェネシスが含まれる。この酵素はヘテロ三量体でできており、触媒性αサブユニット並びに調節性βサブユニット及びγサブユニットからなり、その各々は多数の遺伝子によりコードされている。各々のスプライスバリアントが多数存在し、それはヘテロ三量体には幾つかの組合せが可能であることを意味する。ＡＭＰＫのαサブユニットは、触媒性キナーゼドメイン、並びにβサブユニット及びγサブユニットとの複合体の形成に必要であると共に十分であるＣ末端に近接するドメインを含有する。βサブユニットは、糖結合ドメインを含有しており、複合体とグリコーゲン粒子との結合に関与すると考えられている。上記で考察したように、ＡＭＰＫの生理学的標的の１つは、グリコーゲン粒子にも常在するグリコーゲンシンターゼであり、高細胞グリコーゲンはＡＭＰＫ活性の減少に帰着するという多数の根拠が増加しつつある。ＡＭＰＫのγサブユニットは、ＣＢＳドメインと命名された約６０残基のモチーフの４つの繰り返しを含有する。これらのモチーフは対で機能し、相互に排他的な様式でＡＭＰ又はＡＴＰの１分子と各々結合し、高濃度のＡＴＰが、ＡＭＰによるＡＭＰＫの活性化を阻害するという見解と一致している。
【０１１１】
ＡＭＰＫは、運動及び関連したＡＴＰ利用の増加に応答して活性化できる。運動の期間中、ＡＭＰＫはＡＴＰ消費経路を阻害し、その一方でＡＴＰレベルを回復しようとして糖及び脂肪酸代謝を活性化する。ＡＭＰＫは、ＡＭＰにより、及びαサブユニットの触媒性「Ｔループ」内のトレオニン残基、Ｔｈｒ１７２のリン酸化によりアロステリック的に活性化できる。ＡＭＰＫがＡＭＰ：ＡＴＰの細胞内比率の変化に応答することは十分に確証されている。腫瘍抑制因子キナーゼＬＫＢ１は、インビボでＴｈｒ１７２のリン酸化の原因である酵素である。ＬＫＢ１は、マウスタンパク質２５（ＭＯ２５、mouse protein 25）及びＳＴＥ２０関連アダプタータンパク質（ＳＴＲＡＤ、STE20-related adaptor protein）との相互作用を介して活性化され、ＳＴＲＡＤは擬似キナーゼであり、その一方でＭＯ２５はＬＫＢ１及びＳＴＲＡＤ間の相互作用を安定させる。さらに、ＭＯ２５及びＳＴＲＡＤは、細胞質においてＬＫＢ１を局在化するように機能する。興味深いことには、ＬＫＢ１は、ＡＭＰＫを活性化する刺激によっては調節されず、ＡＭＰによっても活性化されない。多数の研究者が、ＬＫＢ１調節の考え得る様式を現在研究している。ＡＭＰＫの活性化に加えて、ＬＫＢ１は、１１の他のＡＭＰＫ関連キナーゼもそれらのＴループ残基で活性化できる。Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼキナーゼベータ（ＣａＭＫＫβ、Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase kinase beta）は、インビボでＡＭＰＫの上流キナーゼとしても機能し、筋収縮とＡＭＰＫの活性化との間の潜在的関連を特定する。根拠は限定されているが、ＡＭＰＫの脱リン酸化は、インビボではＰＰ２Ｃ様酵素により実行されると考えられる。
【０１１２】
ＡＭＰＫは、肝性グルコース産生の減少及びグルコース利用の増加を介して、２型糖尿病に有益である抗糖尿病薬メトホルミンの間接的標的である。メトホルミンは、肝細胞のＡＭＰＫを活性化し、Ｓｅｒ７９におけるリン酸化の増加を介してＡＣＣ活性を結果的に減少させ、脂肪酸酸化を増加させ、脂質生成に関与する酵素を抑制できる。メトホルミンは、ビグアニドファミリーの薬剤のメンバーであり、呼吸鎖の複合体１を阻害できることが示されている。
【０１１３】
ＡＭＰＫの下流標的が多数特定されており、それらにはアセチルｃｏ−Ａカルボキシラーゼ及びＧＬＵＴ４が含まれている。最も重要な効果の１つは、グリコーゲンシンターゼ（ＧＳ、glycogen synthase）に対してであり、活性ＡＭＰＫを有しない動物モデルの使用により、これが、ＧＳの部位２のリン酸化の原因である一次的キナーゼであったことが証明された。ＡＭＰＫの非特異的活性化因子、５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミド−１−β−Ｄ−リボフラノシド（ＡＩＣＡＲ、5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-3-β-ribofuranoside）は、ＧＳ活性を減少させることが示されている。ＡＩＣＡＲ刺激後に検査すると、ＧＳは、ラット筋肉において、部位３ａ又は３ｂに対していかなる効果も及ぼさずに、部位２におけるリン酸化を増加させた。対照的に、ＡＩＣＡＲでの処理後、マウスはグリコーゲンレベルを増加させ、それは、グルコース取込みを増加させるＡＩＣＡＲの効果、及びリン酸化状態と無関係のアロステリックな活性化によるＧＳ活性の同時増加による可能性が最も高い。運動に応答してＧＳ活性が増加し、この増加は、運動期間後にグリコーゲン貯蔵が迅速に再充填されることを可能にしようと考えられている。しかしながら、非常に激しい運動中は、グリコーゲン分解が極度に高い速度に達することがあり、したがって増加したＧＳ活性の効果を減弱することがある。したがって、ＧＳに対するＡＭＰＫの効果は、ＡＭＰＫが運動中に強度依存的様式で活性化されるため、運動の期間及び強度に依存すると考えられる可能性が高い。優性阻害のＡＭＰＫを発現するマウスモデルでは、ＧＳ活性が、通常は１０分間のインビトロ収縮に応答して増加した。これは、ＡＭＰＫが収縮中のこの時点でのＧＳ活性化に大きな役割を果たさないが、運動が継続されれば、部位２におけるＧＳのリン酸化が増加することを強く示唆する。部位３ａ及び３ｂのリン酸化が減少するまで、部位２のこのリン酸化は基底レベルのＧＳ活性を維持する。ＡＭＰＫに対するその効果に加えて、骨格筋のＡＩＣＡＲ処理は、ＡＭＰＫ活性化の程度に従ってＧＬＵＴ４の動員を増加させる。本発明は、ＡＭＰＫリン酸化及びしたがってその活性化を維持又は亢進し、それによってその下流効果を増加又は維持／保持することにより、そのような応用に有用である。
【０１１４】
メトホルミンは、ＡＭＰＫを活性化する、２型糖尿病の治療で広く用いられている薬剤である。ＡＭＰレベルの上昇に応答した、その触媒性Ｔループ残基、Ｔｈｒ１７２におけるＡＭＰＫのリン酸化の増加は、ＡＭＰＫがその上流キナーゼによってより良好にリン酸化されるようにＡＭＰＫのコンフォメーションが変化することにより生じると考えられている。したがって、ＡＭＰＫの脱リン酸化の原因であるタンパク質ホスファターゼ（複数可）の特定と、フェンホルミン、及びメトホルミンのようなその類似体に対する、ＡＭＰＫに応答したこれらのホスファターゼ（複数可）の役割（複数可）とを含み、本明細書中に開示されている、ＡＭＰＫの脱リン酸化に関与する機序を理解することは重要である。
【０１１５】
ＰＰＭ１Ｆは、優先的にＡＭＰＫα１と結合できる。したがって幾つかの態様では、本発明は、ＡＭＰＫα１の脱リン酸化におけるＰＰＭ１Ｆの使用に関する。１つの実施形態では、本発明は、ＰＰＭ１Ｆの濃縮又は精製を含む、ＡＭＰＫα１を精製するための方法に関する。
【０１１６】
ＰＰＭ１Ｅは、優先的にＡＭＰＫα２と結合できる。１つの実施形態では、本発明は、ＰＰＭ１Ｅの濃縮又は精製を含む、ＡＭＰＫα２を精製するための方法に関する。
【０１１７】
ＰＰＭ１Ｅ及びＰＰＭ１Ｆは結合できる。したがって幾つかの実施形態では、本発明は、ＰＰＭ１Ｆの濃縮又は精製を含む、ＰＰＭ１Ｅを精製するための方法に関していてよい。逆に幾つかの実施形態では、本発明は、ＰＰＭ１Ｅの濃縮又は精製を含む、ＰＰＭ１Ｆを精製するための方法に関していてよい。
【０１１８】
［さらなる応用］
好ましくは、本発明の使用はインビトロでの使用である。より好ましくは、メトホルミンに関する本発明の使用は、インビトロでの使用である。より好ましくは、フェンホルミンに関する本発明の使用は、インビトロでの使用である。
【０１１９】
本発明の幾つかの実施形態は、ホスファターゼ活性の活性化因子である薬剤のスクリーニングを伴っていてよく、その場合には、ＰＰＭホスファターゼ活性の比較ステップ（例えば、ＰＰＭホスファターゼ活性が、本発明の方法の前記第２の試料より前記第１の試料でより低いかどうか判断すること）は、前記第２の試料と比較した前記第１の試料における活性の増加が、薬剤を活性化因子であると特定するように、単に逆にされる。ホスファターゼ活性の阻害剤である候補薬剤のような化合物が、特に好ましい。好適には、薬剤は、実施例で言及されたような細胞における（例えば細胞溶解物中の）ホスファターゼ活性の阻害剤である。
【０１２０】
ホスファターゼ活性に対する（阻害のような）効果は、直接的でも又は間接的でもよい。薬剤は、ホスファターゼ又はＡＭＰＫに直接的に結合しても又はしなくてもよい。薬剤は、例えば相互作用の低減若しくは阻害により、又は解離を促進することにより、ホスファターゼ及びＡＭＰＫ間の相互作用に影響を及ぼしてもよい。したがって、本発明は、ＡＭＰＫ及びホスファターゼ間の相互作用に影響を及ぼすことが可能な薬剤（複数可）のアッセイにも関する。これは、実施例で示されたように、アッセイされる薬剤（複数可）の存在下における共免疫沈降の阻害又は促進によってであってもよく、又は当業者に公知の他の技術によってでもよい。
【０１２１】
ホスファターゼ活性がインビトロで影響を受けるかどうか、及び必要に応じてには例えば細胞中で（例えば細胞溶解物中で）この効果が検証されるかどうかを試験することが重要である。
【０１２２】
本発明の目的は、対象（複数可）においてそれらのホスファターゼを阻害することを視野に入れて、ＡＭＰＫのリン酸化及びしたがって（例えば）糖尿病の治療に有用な活性を増加又は維持するために、重要なホスファターゼの阻害剤を特定することである。
【０１２３】
好適には、ホスファターゼはＰＰＭ１Ｅである。
【０１２４】
好適には、ホスファターゼはＰＰＭ１Ｆである。
【０１２５】
好適には、ホスファターゼは、ＰＰＭ１Ｅ及びＰＰＭ１Ｆ（例えば、ＰＰＭ１Ｅ及びＰＰＭ１Ｆの両方を含む混合物、又は会合体若しくは複合体）である。
【０１２６】
下記で本発明を実施例により説明する。これらの実施例は説明が目的であり、添付の特許請求の範囲を制限することを意図していない。
［実施例］
【実施例１】
【０１２７】
［ＡＭＰＫのリン酸化に対するビグアニドの効果］
ビグアニド（メトホルミン又はフェンホルミンのような）の効果がタンパク質ホスファターゼに対する効果により部分的に仲介され得るかどうかを決定するために、メトホルミン類似体フェンホルミンが、ＡＭＰＫを脱リン酸化し得るタンパク質ホスファターゼの活性に影響を及ぼすかどうかを調べることを目的に実験を実施した。タンパク質ホスファターゼに対するフェンホルミンの効果を記述する。
【０１２８】
ＡＭＰＫ活性に対するフェンホルミンの効果を研究するために、血清飢餓ＨＥＫ２９３細胞を、１０ｍＭフェンホルミンで１時間３７℃で刺激した。ＡＭＰＫのリン酸化状態を保存するために、１μＭミクロシスチン−ＬＲを含有する溶解緩衝液で細胞を溶解した。ＡＭＰＫの触媒性Ｔｈｒ１７２残基周囲の区域に対応するリンペプチドに対して誘発された抗体を使用して、イムノブロッティングを実施した。フェンホルミンでの刺激後、Ｔｈｒ１７２におけるＡＭＰＫのリン酸化の増加が観察できた。（図１Ａ、上段パネル）。
【実施例２】
【０１２９】
［タンパク質ホスファターゼの活性に対するビグアニドの効果］
タンパク質ホスファターゼの活性に対するビグアニドの効果を研究するために、未処理か又はビグアニド（この実施例では上述のように１０ｍＭフェンホルミン）で処理されたかいずれかのＨＥＫ２９３細胞溶解物を、イムノブロッティングしたか、又は様々なリン酸化基質だけでなく、ホスファターゼ阻害剤及び活性化因子の組合せを使用することにより特定のタンパク質ホスファターゼ活性についてアッセイした。
【０１３０】
ＨＥＫ２９３細胞のＰＰ５活性は低いため、ＰＰ５レベルは、タンパク質のＴＰＲドメインに対する抗体を使用したイムノブロッティングにより評価した。フェンホルミンに応答したＰＰ５レベルの変化は観察できなかった（図１Ａ、下段パネル）。
【０１３１】
フェンホルミンに応答したＰＰ１活性は、ＰＰ２Ａの活性を阻害するために反応液に含まれていた４ｍＭオカダ酸、及び金属イオン活性化タンパク質ホスファターゼを阻害するためのＥＧＴＡ（０．１〜２ｍＭ）と共に、３２Ｐ標識ホスホリラーゼａを基質として使用して評価した。非刺激細胞溶解物と１０ｍＭフェンホルミンで刺激された細胞溶解物との間で、ＰＰ１ホスホリラーゼホスファターゼ活性の変化は検出できなかった（図１Ｂ）。
【０１３２】
フェンホルミンに応答したＰＰ２Ａの活性も、３２Ｐ標識ホスホリラーゼａを基質として使用して評価したが、このアッセイの場合、２００ｎＭのＩ−２、及び金属イオン活性化タンパク質ホスファターゼを阻害するためのＥＧＴＡ（０．１〜２ｍＭ）が、ＰＰ１を阻害するために含まれていた。非刺激細胞溶解物と１０ｍＭフェンホルミンで刺激された細胞溶解物との間で、ＰＰ２Ａホスホリラーゼホスファターゼ活性の変化は検出できなかった（図１Ｃ）。
【０１３３】
ＰＰＭ阻害剤アッセイ
ＰＰ２Ｃ（ＰＰＭ１）及びＰＰＭファミリー関連メンバーの活性は、ＰＰ２Ａを阻害するために反応液に含まれていた５μＭオカダ酸、及びＰＰ２Ｃの活性に必要であることが知られている１０ｍＭ酢酸マグネシウムと共に、３２Ｐ標識カゼインを基質として使用して評価した（Ingebritsen and Cohen, 1983 Science vol 221, pp331-338; Ingebritsen et al., 1983 Eur J Biochem vol 132, pp263-274）。
【０１３４】
ＨＥＫ２９３細胞では、Ｍｇ２＋依存性でオカダ酸抵抗性のカゼインホスファターゼ活性（以後ＰＰＭホスファターゼ活性と称する）は、未処理の対照細胞と比較してフェンホルミンで処理された細胞で約２０％減少し（図２Ａ）、細胞における、つまりインビボでの、この活性に対するフェンホルミンの阻害効果を実証する。
【０１３５】
ＬＫＢ１（ＡＭＰＫの上流活性化因子の１つ）を欠如するヒーラ細胞では、フェンホルミンはＡＭＰＫを活性化できなかった（Hawley et al., 2003 J. Biol vol 2, p28）。フェンホルミンがこの細胞系で類似の効果を示すことができるかどうかを試験するために、未処理か又は１０ｍＭフェンホルミンで処理されたかいずれかのヒーラ細胞のＰＰＭホスファターゼ活性を評価した。同様に、ＰＰＭホスファターゼ活性の約２０％減少が、フェンホルミンで処理された細胞において観察できた（図２Ｂ）。この実験では多くのＰＰ２Ｃアイソフォームの活性が測定されており、観察された２０％の減少は、たった１つのそのようなアイソフォームの活性がより激しく減少したことを表している可能性がある。
【０１３６】
１０ｍＭフェンホルミンの代りに２ｍＭメトホルミンを用いて、同じ実験を実施した。ＰＰＭホスファターゼ活性でも同じ２０％減少が、メトホルミンで処理された細胞において観察された。
【０１３７】
したがって、フェンホルミン及びメトホルミンのようなビグアニドがＰＰＭホスファターゼ活性の阻害剤であり、前記活性の特異的阻害剤であると考えられることが初めて実証される。
【実施例３】
【０１３８】
［ＰＰＭファミリーメンバーの活性に対するビグアニドの効果］
ＰＰＭファミリーのタンパク質ホスファターゼは、様々な基質特異性を有する少なくとも１６の構造的に異なるアイソフォームを含む。これらのホスファターゼのどれがビグアニドに応答して活性を変化させ得るのかを決定するために、細菌で発現されたＰＰＭ酵素を試験した。緩衝液のみで事前インキュベーションした後、又は１ｍＭビグアニド（この実施例では、フェンホルミン）で事前インキュベーションした後で、各酵素に結合したＰＰＭホスファターゼ活性を評価した。活性型で発現できるそれらの酵素（ＰＰＭ１Ａ、ＰＰＭ１Ｂ、ＰＤＰＣ１、ＰＤＰＣ２、及びＮｅｒｐｐ）では、対照試料と、フェンホルミンで事前インキュベートされた試料との間で、違いを検出できなかった。細菌で発現されたＰＰＭ１Ｆ及びＩＬＫＡＰは、これらのアッセイ条件下ではホスホカゼイン（phosphocasein）に対する活性を示さず（図３）、ＰＰＭ１Ｄ、ＰＰＭ１Ｅ、及びＰＰＭ１Ｇは、この実験では試験されなかった。
【実施例４】
【０１３９】
［ＰＰＭファミリーメンバーのレベルに対するビグアニドの効果］
ＰＰＭホスファターゼのいずれかのレベルに対してビグアニドが任意の効果を有し得たかどうかを決定するために、抗体を使用してイムノブロッティングを実施した。ＰＰＭ１Ａ、ＰＰＭ１Ｂ１、ＰＰＭ１Ｂ２、ＰＰＭ１Ｄ、ＰＰＭ１Ｆ、ＰＰＭ１Ｇ、及びＩＬＫＡＰに対して誘発された抗体は、酵素の予測分子量に近いバンドを生じさせたが、ＰＰＭ１Ｄは他のバンドも多数生じさせた。未処理の細胞と、ビグアニド（この実施例では、フェンホルミン）で刺激された細胞との間では、これらのいずれの酵素レベルでも違いが検出できなかった（図４）。ＰＰＭ１Ｅ及びＰＤＰＣ１に対する抗体は、いかなるシグナルも生成しなかったが、ＰＤＰＣ２及びＮｅｒｐｐは、それぞれ正しくない分子サイズの微かなバンド及び一般的な背景染色を生じさせた。
【実施例５】
【０１４０】
［ＦＰＬＣにより分離された、処理済及び未処理の細胞溶解物のＰＰＭ活性］
フェンホルミンのようなビグアニドにより阻害されたＰＰＭホスファターゼを正確に同定するために、処理済及びフェンホルミン処理済の細胞に由来するＨＥＫ２９３細胞溶解物を、ＦＰＬＣによって正味電荷により分離する前に、ろ過及び脱塩した。５００μｌの画分を収集し、各画分の総ＰＰＭホスファターゼ活性を測定した。タンパク質ホスファターゼ活性における幾つかのわずかな相違は、約１５０ｍＭ及び５００ｍＭのＮａＣｌでＦＰＬＣカラムから溶出する未処理試料とフェンホルミン処理済試料との間で検出可能だった（図５）。図５で視認可能な最大ピークはこの方法によっては特定されなかったが、ＦＰＬＣカラムからの画分をイムノブロッティングすることにより、幾つかのＰＰＭホスファターゼ、及びそれらが溶出する塩濃度が特定された（表−図８を参照）。
【０１４１】
この実験では、ＰＰＭ１Ｇ及びＩＬＫＡＰに対する抗体が、不正確なサイズのバンドを特定した一方で、ＰＰＭ１Ｄ、ＰＰＭ１Ｅ、Ｎｅｒｐｐ、及びＰＤＰＣ１は検出できなかった。フェンホルミンにより阻害されるＰＰＭ活性が、１５０又は５００ｍＭＮａＣｌのいずれかの付近でＦＰＬＣカラムから溶出することはあり得ることである。理論により束縛されることは望まないが、この結果は、ＰＰＭアイソフォームの１つに結合した低分子がカラム内で洗い流され、したがって以前は観察された活性の変化の検出を妨げた可能性を除外しない。
【実施例６】
【０１４２】
［特定のＰＰＭ酵素の活性に対するビグアニドの効果］
どのＰＰＭホスファターゼがビグアニドにより影響を受けたかをより高い確実性で決定するために、ＰＰＭ酵素の各々に結合したＰＰＭホスファターゼ活性を評価した。この実施例では、ビグアニドはメトホルミン及びフェンホルミンである。
【０１４３】
未処理又は１０ｍＭフェンホルミンで処理されたＨＥＫ２９３細胞溶解物由来のペプチド抗体を使用して、ＰＰＭホスファターゼの免疫沈降を実施した（図６／図９；図９では、図６の絶対値は３２Ｐ標識の組込みレベルのような非本質的な実験要因に依存して変動し得るため、尺度は比較を容易にするためのパーセンテージ尺度である）。ＰＰＭ１Ａ１、ＰＰＭ１Ｂ１、ＰＰＭ１Ｂ２、ＰＰＭ１Ｄ、ＰＰＭ１Ｇ、ＩＬＫＡＰ、Ｎｅｒｐｐ、ＰＤＰＣ１、又はＰＤＰＣ２と結合したＰＰＭホスファターゼにおいて、変化は検出できなかった。興味深いことには、しかしながら、密接に関連したＰＰＭ１Ｆの活性が約４０％減少した一方で、ＰＰＭ１Ｅ活性は、フェンホルミンでの処理後ほとんど完全に除去された（図６）。未処理のＨＥＫ２９３細胞からのＰＰＭ１Ｅ免疫沈降物を免疫沈降及びイムノブロッティングした後では、ＰＰＭ１Ｅ対する抗体を使用してシグナルを検出できなかった。
【実施例７】
【０１４４】
［ビグアニドはＰＰＰホスファターゼに効果を示さないが、ＰＰＭホスファターゼを阻害する］
フェンホルミンのようなビグアニドは、Ｔｈｒ１７２残基におけるαサブユニットのリン酸化を増加させることにより、ＨＥＫ２９３細胞のＡＭＰＫ活性化を引き起こす。ヒーラ細胞は、ＡＭＰＫの上流キナーゼの１つであるＬＫＢ１を欠如するため、この効果は、これらの細胞では減少する。ＬＫＢ１自体の活性はフェンホルミンにより影響を受けないため、したがって、フェンホルミンが、ＡＭＰＫの脱リン酸化の原因であるタンパク質ホスファターゼの活性に影響を及ぼし得る可能性があるかどうかを評価することは重大な重要性を有する。発明者らは、オカダ酸に不感受性であるタンパク質ホスファターゼが、生菌中のＡＭＰＫ脱リン酸化の原因であると考えた。ＰＰ２Ａ及びＰＰ２Ｃα（ＰＰＭ１Ａ）の両方はインビトロでこの役割を行うことができるが、金属イオン依存性ＰＰ２Ｃ（ＰＰＭ１）が、インビボでのＡＭＰＫ脱リン酸化の原因であり得ることを示唆する根拠が報告されている。
【０１４５】
フェンホルミンを用いたＨＥＫ２９３細胞の刺激は、インビトロのホスファターゼアッセイで測定されるようなＰＰ１又はＰＰ２Ａの活性に対する効果、又はＰＰ５のレベルに対する効果を示さなかった。しかしながら、ＨＥＫ２９３細胞及びヒーラ細胞の両方において、フェンホルミンは、ＰＰＭホスファターゼ活性を約２０％阻害できる。ＰＰＭ酵素がＡＭＰＫ脱リン酸化の原因である一次的ホスファターゼであり得るという根拠と併せると、これは、フェンホルミンが、ＰＰＭ酵素の活性を阻害し、したがってＡＭＰＫ活性を増加させるように機能している可能性があるという興味深い可能性を提起した。フェンホルミンがＡＭＰＫを活性化する正確な機序（複数可）は当技術分野において未知であるため、タンパク質ホスファターゼ活性の阻害は、抗糖尿病薬によるＡＭＰＫ活性化の新規な機序を表す。したがって、ＰＰＭホスファターゼは、そのような障害における治療介入の標的であることが実証される。
【実施例８】
【０１４６】
［ＰＰＭ酵素に対するビグアニドの効果］
ＰＰＭ酵素には様々なアイソフォームが多数存在し、細菌で発現された多数のＰＰＭホスファターゼのカゼインホスファターゼ活性は、フェンホルミンのようなビグアニドでの事前インキュベーションにより影響を受けなかった。ＰＰＭ１Ａ、ＰＰＭ１Ｂ、ＰＰＭ１Ｆ、ＰＤＰＣ１、ＰＤＰＣ２、ＩＬＫＡＰ、及びＮｅｒｐｐは、発現及び精製が可能であった。カゼインホスファターゼ活性が、ＰＰＭ１Ａ１、ＰＰＭ１Ｂ、ＰＤＰＣ１、ＰＤＰＣ２、及びＮｅｒｐｐの調製物で検出されたが、これは、１ｍＭ濃度のフェンホルミンでの事前インキュベーションにより影響を受けなかったため、これらの酵素への直接的結合及びこれらの酵素の阻害におけるフェンホルミンの役割を否定するものであった。これらの精製された酵素は、ホスホカゼインに対する活性を示さなかったため、この特定の実験からＰＰＭ１Ｆ又はＩＬＫＡＰに関する結論を導き出すことはできない。
【０１４７】
個々のＰＰＭ酵素に対する特異的抗体は、多くのＰＰＭホスファターゼのレベルにおける変化を検出しなかった。これらのイムノブロッティング実験は、フェンホルミンが、ＰＰＭ１Ａ１、ＰＰＭ１Ｂ１、ＰＰＭ１Ｂ２、ＰＰＭ１Ｄ、ＰＰＭ１Ｆ、ＰＰＭ１Ｇ、又はＩＬＫＡＰのレベルを変化させるように機能するということを否定する。これらの特定のイムノブロッティング実験では、ＰＰＭ１Ｅ、ＰＤＰＣ１、ＰＤＰＣ２、又はＮｅｒｐｐのレベルがフェンホルミンにより影響を受けたかどうかを決定することはできない。
【０１４８】
ＦＰＬＣによるＰＰＭ活性の分離は、ホスファターゼ活性の２つの主要なピークに帰着した。ＨＥＫ２９３細胞では、各ピークは複数のＰＰＭホスファターゼ活性を含有しているが、骨格筋溶解物に由来する活性の２つのピークは、ＰＰ２Ｃα（ＰＰＭ１Ａ）及びＰＰ２Ｃβ（ＰＰＭ１Ｂ）を表していたことが示唆された。
【０１４９】
ＰＰＭホスファターゼに対する特異的抗体を使用して、ＰＰＭ酵素の各々に結合したカゼインホスファターゼ活性の免疫沈降及びアッセイを実施した。興味深いことには、ビグアニドフェンホルミン又はメトホルミンで処理された細胞では、ＰＰＭ１Ｅの活性がほとんど完全に除去され、ＰＰＭ１Ｆの活性は未処理細胞のレベルの約６０％にまで減少した。ＰＰＭ１Ｅ及びＰＰＭ１Ｆは密接に関連した２つの酵素であり、コアホスファターゼドメイン及び相同性フランキング配列において６６％の類似性を共有し、融合ＰＩＸ結合ドメインを各々含有している。ＰＰＭ１Ｅは、ｐ２１活性化キナーゼＰＡＫの脱リン酸化に関与する。ＰＰＭ１Ｆは、自己リン酸化型カルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼII（ＣａＭＫII）並びにＣａＭＫＩ及びＣａＭＫIVの触媒性Ｔｈｒ２８６残基を脱リン酸化できることが示された。
【０１５０】
図１０は、未処理又は２ｍＭメトホルミンで処理されたＨＥＫ２９３細胞におけるＰＰＭホスファターゼ、ＰＰＭ１Ａ１及びＰＰＭ１Ｅの活性を示す。溶解に先立って、２ｍＭメトホルミンで１０分間ＨＥＫ２９３細胞を処理した。未処理又はメトホルミン処理済のＨＥＫ２９３細胞溶解物から、ＰＰＭ１Ａ１及びＰＰＭ１Ｅのアイソフォームを三重反復で免疫沈降し、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び５μＭオカダ酸の存在下で３２Ｐ標識カゼインを基質として使用して、活性を測定した。対照免疫沈降物を、各溶解物について免疫前抗体を使用して三重反復で実施し、ＰＰＭホスファターゼ免疫沈降について算出された活性から減算した。活性は、未処理のＰＭ１Ａ１との比較で示される。メトホルミン処理によるＰＰＭ１Ｅ活性の実質的な特異的ノックダウンが実証される。
【０１５１】
ヒトキノーム（http://www_kinase.com/human/kinome）内で、プロテインキナーゼは、それらの触媒性ドメインの配列類似性、触媒性ドメイン外部のドメイン構造、それらの既知の生物学的機能、及び他の種におけるそれらの分類の比較により、多数の異なるキナーゼファミリーに分類される。プロテインキナーゼのＡＭＰＫファミリー及びＣａＭＫＫファミリーの両方は、ＣａＭＫスーパーファミリー内に含有されている。ＡＭＰＫ及びＣａＭＫの調節は、両方とも興味をそそられるほど類似している。両酵素は、それらの適切なリガンド（ＡＭＰＫにはＡＭＰ、及びＣａＭＫＫにはＣａ２＋／カルモジュリン）によるアロステリックな活性化を必要とし、その後で活性化ループ内のトレオニン残基がリン酸化される。
【０１５２】
ここに記載された結果は、少なくとも２つの考え得る意味を有する。第１には、ＣａＭＫと、それらの上流キナーゼＣａＭＫＫα及びＣａＭＫＫβとの間の構造的類似性を考慮すると、ＰＰＭ１Ｅ及びＰＰＭ１Ｆは、ＣａＭＫＫアイソフォームを脱リン酸化するように機能することができ、したがってそれらの活性を減少させ、それによりＡＭＰＫの活性を減少させる。第２には、上記で考察されたように、ＣａＭＫ及びＡＭＰＫの両方の活性化機序が保存されていることと、ＡＭＰＫ及びＣａＭＫの両方が同一のタンパク質キナーゼスーパーファミリー内に存在するという事実とを考慮すると、ＰＰＭ１Ｅ及びＰＰＭ１Ｆは、ＡＭＰＫを直接的に脱リン酸化するように機能できる。いずれのシナリオでも、フェンホルミンのようなビグアニドが、ＡＭＰＫの脱リン酸化に関与するタンパク質ホスファターゼ活性を阻害することができることが実証される。したがって、ＰＰＭホスファターゼは、ＡＭＰＫ活性を調節するための有効な治療上の標的であり、ＰＰＭホスファターゼの阻害剤は、そのための優れた治療法候補であることが実証される。
【実施例９】
【０１５３】
［ＰＰＭファミリータンパク質ホスファターゼのメンバーに対するビグアニドの効果］
ここで提示されたデータは、ＡＭＰＫの脱リン酸化の原因であるタンパク質ホスファターゼと、メトホルミン及びフェンホルミンのような抗糖尿病薬の標的との両方を特定する研究の結果である。これらの化合物が血糖レベルを低下させる機序の１つは、ＡＭＰＫ活性を増加させることによってであり、この作用機序についての理解は、当分技術分野には存在しなかった。発明者らは、ＰＰＭファミリーのタンパク質セリン／トレオニンホスファターゼの１又は複数のメンバーが、ビグアニド化合物に応答したＡＭＰＫ活性の増加に関与していることを開示する。
【０１５４】
ＰＰＭファミリータンパク質ホスファターゼＰＰＭ１Ｅ及びＰＰＭ１Ｆが、メトホルミン／フェンホルミンに応答してＡＭＰＫを脱リン酸化するように機能できることは、重要な進歩である。ＡＭＰＫα２含有複合体は、ＡＭＰに対するより大きな依存性を有し、ＡＭＰＫα１含有複合体と比較して核内に多く含まれており、そこで遺伝子転写における役割を果たすと仮定されている。運動がＡＭＰＫα２の核内へのトランスロケーションを誘導することは知られていたが、それが起こる機序は当技術分野において不明であった。ＰＰＭ１Ｅ及びＰＰＭ１Ｆは、それらのホスファターゼドメインにおいて６４％の相同性を共有するが、ＰＰＭ１Ｅは、Ｎ末端及びＣ末端の両方において相同性のない大きな領域を有する（図７）。ＰＰＭ１ＥのＣ末端における２つの核局在化シグナルが、それらの機能にとって不可欠な塩基性残基のクラスターと共に特定されている。ＰＰＭ１Ｆ、ＣａＭＫＩ、ＣａＭＫII、及びＣａＭＫＫβは、特異的に細胞質に局在化する一方で、ＰＰＭ１Ｅ、ＣａＭＫIV、及びＣａＭＫＫαは、特異的に核に局在化しており、２つのＣａＭＫ調節系が細胞内に存在し、ＰＰＭ１Ｅ及びＰＰＭ１Ｆが細胞内で補完的な役割を果たし得ることを示唆している。この研究で使用されたものと類似した、タンパク質のＣ末端残基に対して誘発された抗体を使用したイムノブロッティング実験において、ＰＰＭ１Ｅは脳内で最も豊富に発現される。理論によって束縛されることは望まないが、したがって、このタンパク質の発現が他の組織では低い可能性があり、これらの特定の実験ではイムノブロッティングによりタンパク質を検出できないという事実を説明できる。
【０１５５】
脳内に存在する大多数のＰＰＭ１Ｅは、細胞質で最も豊富な切断型で存在しており、ＰＰＭ１Ｅが、細胞質内及び核内ＣａＭＫファミリープロテインキナーゼの両方を脱リン酸化できるかもしれないという可能性を提起する。
【０１５６】
メトホルミンは、肝性グルコース産生の減少と、骨格筋グルコース取込みの増加との両方により、グルコース及び脂質を低下させることが知られており、ＡＭＰＫは、薬剤効果の潜在的媒介物質として最初に仮定されたが、メトホルミンがＡＭＰＫを活性化する機序は、長い間当技術分野における謎であった。メトホルミンは、呼吸鎖の複合体Ｉを阻害できることが示されており、したがってミトコンドリア機能及び細胞呼吸を損傷し、それにより肝性グルコース産生を阻害し、グルコース利用を増加させる。メトホルミンは、主として肝性グリコーゲン分解の阻害によりグルコース産生を阻害する。細胞内のＡＭＰ：ＡＴＰ比率の増加におけるメトホルミンの関与をめぐっては幾つかの論争がある。メトホルミンは、アデニンヌクレオチド非依存的な機序によってＡＭＰＫを活性化することが報告されているが、別の報告では、より有力なビグアニドであるフェンホルミンと共に一連の細胞タイプをインキュベートすると、ＡＭＰ：ＡＴＰ比率が増加することが記述されている。ＡＭＰ：ＡＴＰ比率に対するメトホルミンの効果は、より長い期間にわたってより低い効力で生じ、検出するのがより難しい可能性が高いと考えられる。ＰＰＭ１Ｅ活性及び／又はＰＰＭ１Ｆ活性のメトホルミン阻害、及びこの阻害がＡＭＰ：ＡＴＰ比率の変化に依存するかどうかは、重要である場合がある。
【０１５７】
カルシウム及びカルモジュリンがＣａＭＫファミリー及びしたがってＡＭＰＫの活性を調節するため、カルシウム及びカルモジュリンが、ＰＰＭ１Ｅ及びＰＰＭ１Ｆに対しても効果を有し得る可能性が存在する。ここに示された実験で使用されたアッセイ条件下では、カルシウムイオンは、反応混合液中に存在すべきではない。カルシウム及び／又はＥＧＴＡが反応混合液に添加された実験をさらに行って、カルシウムが、これらの酵素の活性と、メトホルミン／フェンホルミンによるこれらの酵素の阻害とに対して任意の効果を有したかどうか評価できる。さらに、ホスファターゼＰＰＭ１Ｅ及びＰＰＭ１Ｆが、ＣａＭＫタンパク質キナーゼスーパーファミリーの特定のメンバーを脱リン酸化できるかどうかを理解するために、ホスホカゼインよりも特異的な基質を使用することは有用であり得る。非刺激の細胞抽出液から酵素を免疫沈降した後で、ＰＰＭ１Ｅの活性に対するメトホルミン／フェンホルミンの効果を直接評価することも役に立ち得る。
【０１５８】
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ、short interfering RNA）を使用する研究は、ＰＰＭ１Ｅ又はＰＰＭ１Ｆのレベルのノックダウンが、ＡＭＰＫ活性に多大な効果を示すかどうか、及びメトホルミン／フェンホルミンが、ホスファターゼの非存在下でＡＭＰＫを活性化するかどうかを実証することに有用である。そのような研究は、基質の脱リン酸化に対するこれらの酵素の各々のインビボの相対的寄与率を評価するのに応用される。
【実施例１０】
【０１５９】
［アッセイ／スクリーニング］
糖尿病又は肥満の薬物において使用する候補薬剤を特定するための方法を実証する。本方法は、ＰＰＭホスファターゼの阻害剤候補を準備することと、ＰＰＭホスファターゼを含む第１及び第２の試料を準備することと、前記阻害剤候補を、ＰＰＭホスファターゼを含む前記第１の試料と接触させることと、前記第１及び第２試料をＰＰＭホスファターゼ活性についてアッセイすることとを含む。この実施例では、ＰＰＭホスファターゼはＰＰＭ１Ｅである。
【０１６０】
アミノ酸配列ＫＴＨＤＩＰＣＰＤＬＰＷＳＹに対する抗体で、ＰＰＭ１Ｅを免疫沈澱する。
【０１６１】
１０ｍＭＭｇ２＋又はＭｎ２＋イオン及び５μＭオカダ酸の存在下で３２Ｐ標識カゼインを基質として使用したタンパク質ホスファターゼアッセイで、免疫沈澱物中のホスファターゼ活性を測定する。この実施例では、以下のようにアッセイを実施する。
【０１６２】
洗浄された免疫沈澱物を、１０μｌの緩衝液Ｂに再懸濁する。タンパク質ホスファターゼを、３０μｌの体積中で１μＭ〜１０μＭの３２Ｐ標識基質を用いて３０℃でアッセイする。この実施例では、３２Ｐ標識カゼイン基質は、タンパク質キナーゼＡの触媒性サブユニットを使用して［γ３２Ｐ］ＡＴＰで標識された、部分的に加水分解にされたウシミルクカゼイン（Sigma社、Poole、英国）である。
【０１６３】
３２Ｐ標識基質及びホスファターゼ阻害剤／活性化因子を、緩衝液Ｃで別々に希釈する。１０μｌの緩衝液Ｂ中の免疫沈澱物を、１０μｌの阻害剤／活性化因子又は緩衝液Ｃと混合し、３０℃で１０分間混合物をインキュベートすることにより、アッセイを実施する。アッセイは、１０μｌの３２Ｐ標識基質の添加により開始される。その後、アッセイを、３０℃でさらなる時間（１５分）１２００ｒｐｍで振とうさせてインキュベートし、１００μｌの２０％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸の添加により停止させる。混合物を短時間ボルテックスし、１４，０００ｘｇで５分間遠心分離する。１００μｌの上澄みを回収し、Wallac社製1409型液体シンチレーション計数器を用いてチェレンコフ計数法により、遊離された３２Ｐを測定する。
緩衝液Ａ  ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、０．１ｍ ＭＥＧＴＡ、０．１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール。
緩衝液Ｂ  １ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含有している緩衝液Ａ。
緩衝液Ｃ  ０．０１％（ｖ／ｖ）のＢｒｉｊ−３５を含有している緩衝液Ａ。
【０１６４】
その後、ＰＰＭホスファターゼ活性を前記第１及び第２試料で比較し、活性が前記第２の試料より前記第１の試料の方が低い場合、前記阻害剤候補は、糖尿病又は肥満の薬物に使用する候補薬剤として特定される。
【実施例１１】
【０１６５】
［標的としてのＰＰＭの検証］
本明細書中で考察したシグナル伝達経路のエレメント間の関係をさらに特徴づけるために、及び本発明の方法（複数可）により特定された化合物候補を検証するためのさらなる方法を提供するために、発明者らは分子間相互作用を研究した。
【０１６６】
セファロースビーズに共有結合で結合されたＡＭＰＫα１、ＡＭＰＫα２、幾つかのＰＰＭ、及び対照ＩｇＧを使用して、それぞれの抗原をＨＥＫ２９３細胞溶解物から免疫吸着した。結果を図１１及び１２に示す。免疫沈澱物（ＩＰ、immuno-pellet）を洗浄し、２０μｌのＳＤＳゲルローディング緩衝液に溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び指定された抗体を用いたイムノブロッティングにより分析した。バンドのサイズ（キロダルトンでの）を右側に示す。
【０１６７】
材料及び方法
ＨＥＫ２９３細胞を、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ１  ｐＨ７．５、１ｍＭＥＧＴＡ、１ｍＭＥＤＴＡ、１％（ｖ／ｖ）Igepal CA-630（Np-40の代用品）、１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、１０ｍＭβ−グリセロリン酸ナトリウム、５０ｍＭフッ化ナトリウム、５ｍＭピロリン酸ナトリウム、０．２７Ｍスクロース、５ｍＭＮ−エチルマレイミド、「完全」プロテアーゼ阻害剤カクテル（１錠／５０ｍｌ）中に溶解した。溶解物を、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、「完全」プロテアーゼ阻害剤カクテル（１錠／５０ｍｌ）で、およそ５倍に希釈して１ｍｇ／ｍｌにした。抗体−セファロース（１０μｌセファロースビーズ及び１０μｇの抗体から調製された）を添加した、１００μｇのタンパク質を含有する希釈細胞溶解物を使用して、免疫吸着を実施した。４℃で３時間免疫吸着した後、免疫沈澱物を１３，０００ｘｇで５分間遠心分離し、氷冷した５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ塩化ナトリウムで２回洗浄した。
【０１６８】
抗体は、それぞれのヒト抗原に対してアフィニティ精製し、１μｇ／ｍｌの濃度でブロッティングに使用し、増強された化学発光により検出した。ＡＭＰＫα１（３４４−ＣＴＳＰＰＤＳＦＬＤＤＨＨＬＴＲ−３５８）に対して誘発された抗ＡＭＰＫα１、及びＡＭＰＫα２（３５２−ＣＭＤＤＳＡＭＨＩＰＰＧＬＫＰＨ−３６６）に対して誘発された抗ＡＭＰＫα２は、D.G. Hardie（University of Dundee）教授からのものだった。ＰＰＭ１Ａ１（３６９−ＫＮＤＤＴＤＳＴＳＴＤＤＭＷ−３８２）に対して誘発された抗ＰＰＭ１Ａ１、ＩＬＫＡＰ（３７３−ＫＡＶＱＲＧＳＡＤＮＶＴＶＭＶ−３８７）に対して誘発された抗ＩＬＫＡＰ、ＰＰＭ１Ｅ（７２８−ＲＳＳＬＰＷＲＱＮＳＷＫ−７３９）に対して誘発された抗ＰＰＭ１Ｅ、及びＰＰＭ１Ｆ（４３９−ＬＰＳＳＬＰＥＰＥＴＱＡＰＰＲＳ−４５４）に対して誘発された抗ＰＰＭ１Ｆ、ＰＰＭ１Ｋ（３５９−ＦＳＦＳＲＳＦＡＳＳＧＲＷＡ−３７２）に対して誘発された抗ＰＰＭ１Ｋは、Hilary McLauchlan博士及びJames Hastie博士により管理されたDivision of Signal Transduction Therapy（University of Dundee）で調製された。抗ＰＨＬＩＰＰ−Ｌは、Novus Biologicals社製（Littleton、コロラド）だった。対照ＩｇＧは、免疫応答が誘発されなかったヒツジの血清に由来する免疫前ＩｇＧ画分だった。
【０１６９】
図１１は、内因性ＰＰＭ１Ｆが、内因性ＡＭＰＫα１の免疫沈澱物（レーン２）には存在したが、ＡＭＰＫα２（レーン３）には存在しなかったことを示す。相互免疫沈澱物により、ＰＰＭ１Ｆ免疫沈澱物中には、ＡＭＰＫα１は存在するが（レーン７）、ＡＭＰＫα２は存在しないことが示された。幾つかの環境ではＰＰＭ１Ｅ及びＰＰＭ１Ｆが結合し、ＰＰＭ１Ｅ免疫沈澱物中にある程度のＰＰＭ１Ｆが存在することに繋がり得る（レーン６）ことに留意されたい。内因性ＰＰＭ１Ｅの免疫沈澱物は、内因性ＡＭＰＫα２のバンドの存在を示したが、ＡＭＰＫα１のバンドの存在は示さなかった（図１２）。
【０１７０】
【表２】
2010510797.tif 000004
【０１７１】
上記の表中のデータは、ＡＭＰＫアルファ１のＩＰに存在しなかった、実験で試験されたＰＰＭを列挙する。さらに、ＡＭＰＫアルファ１のＩＰにＰＰＭ１Ｆを見出すことができることを示唆するデータが存在する。
【０１７２】
ＡＭＰＫアルファ２のＩＰでＰＰＭ１Ｅについて得られたシグナルは、非常に低い。理論によって束縛されることは望まないが、ＰＰＭ１Ｅ抗体は十分にＩＰしないことがあり、したがってＩＰ中のＡＭＰＫアルファ２は、この理由で低い（イムノブロッティングにより検出可能なように）可能性がある。いずれにせよ、図１１及び図１２に提示されたＩＰは、内因性タンパク質（過剰発現されたタンパク質ではなく）であり、技術的に実施が困難であることに留意すべきである。しかしながら、提示されたような内因性タンパク質でのデータは、相互作用に関して科学的に非常に強い裏づけを提供し、したがって本明細書中で開示された標的及び方法を実証する。
【実施例１２】
【０１７３】
［インビトロＰＰＭアッセイ］
糖尿病又は肥満用薬物に使用する候補薬剤を同定するための方法を示す。本方法は、ＰＰＭホスファターゼの阻害剤候補を準備することと、ＰＰＭホスファターゼを含む第１及び第２の試料を準備することと、前記阻害剤候補を、ＰＰＭホスファターゼを含む前記第１の試料と接触させることと、前記第１及び第２試料をＰＰＭホスファターゼ活性についてアッセイすることとを含む。この実施例では、ＰＰＭホスファターゼはＰＰＭ１Ｅである。
【０１７４】
この実施例では、１９９５年のDavisらに記述されているように、大腸菌でＰＰＭ１Ａ１を産生させる（Davies, S.P., Helps, N.R., Cohen, P. T. W. and Hardie, D. G. (1995) FEBS Lett. 377, 421-425.*5*-AMP inhibits dephosphorylation, as well as promoting phosphorylation of the AMP-activated protein kinase; studies using bacterially expressed human protein phosphatase-2Calpha and homogeneous native bovine protein phosphatase-2AC.*）。
【０１７５】
より詳細には、１５℃で発現を誘導したことを除いてDaviesら（同書）における教示のように、Ｍｎ２＋の非存在下又は存在下で、ＧＳＴ−ＰＰＭ１（２３０〜７５５）｛カルボキシ末端側の３分の２｝及びＧＳＴ−ＰＰＭ１Ｆ（２〜４５４）｛全長｝を大腸菌で発現させた。
【０１７６】
ＰＰＭホスファターゼ活性は、ＰＰ１様活性及びＰＰ２Ａ様活性を阻害するためにオカダ酸の存在下で、グルタチオニン−Ｓ−トランスフェラーゼ−ペプチド基質ＧＳＴ−（ＧＧＧＧＲＲＡＴ［ｐ］ＶＡ）３基質からの［３２Ｐ］オルトリン酸の遊離により決定する。
【０１７７】
ＧＳＴ−（ＧＧＧＧＲＲＡＴ［ｐ］ＶＡ）３ホスファターゼ基質は、タンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）でリン酸化することにより調製する。細菌で発現された２ｍｇのＧＳＴ−（ＧＧＧＧＲＲＡＴＶＡ）３を、１〜２ｍＵのＰＫＡと共に、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．０、０．１ｍＭ ＥＧＴＡ、１０％グリセロール、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、０．１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ［ｇａｍｍａ３２Ｐ］ＡＴＰからなる緩衝液中で穏やかに振とうしながら、３０℃で終夜インキュベートする。
【０１７８】
グルタチオン−セファロースカラムでのカラムクロマトグラフィーにより、組み込まれなかった放射性ヌクレオチドから、標識ＧＳＴ−（ＧＧＧＧＲＲＡＴ［ｐ］ＶＡ）３を分離し、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．０、０．１ｍＭＥＧＴＡ、１０％グリセロール、１０ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール、２０ｍＭ グルタチオンで溶出した。アッセイ中での添加に先立って、ＧＳＴ−（ＧＧＧＧＲＲＡＴ［ｐ］ＶＡ）３を１〜４μＭに希釈した。
【０１７９】
３０μｌの全体積中で、一定に振とうしたまま１０分間３０℃でホスファターゼをアッセイする。アッセイの第１及び第２の試料には、第１の試料中の阻害剤候補と一緒に、２０μｌの緩衝液に希釈されたホスファターゼが含有されており、その後第１及び第２の試料を、１０μｌの３２Ｐ標識ＧＳＴ−（ＧＧＧＧＲＲＡＴ［ｐ］ＶＡ）３ホスファターゼ基質の添加に先立って、３０℃で２分間インキュベートする。１０分後、１００μｌの２０％トリクロル酢酸の添加により反応を終了させる。その後、さらに１分間チューブをボルテックスして完全な混合を保証し、室温で５分間１６，０００ｘｇで遠心分離した。各反応物から１００μｌの上澄みを新しいエッペンドルフチューブに取り出し、液体シンチレーション計数器でチェレンコフ計数法により計数した。
【０１８０】
酸−モリブデン酸塩抽出により、汚染プロテアーゼ活性がほとんどないことを明らかする。
ホスファターゼアッセイ組成（終濃度）：
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．０
０．１ｍＭ ＥＧＴＡ
１０ｍＭ 酢酸マグネシウム
２ｍＭ 塩化マンガン（II）
５μＭ オカダ酸
０．１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール
【０１８１】
アッセイで使用されたホスファターゼの質量は、調製に依存して、典型的には１０ｎｇ〜１０μｇである。
【０１８２】
その後、ＰＰＭホスファターゼ活性を前記第１及び第２試料で比較し、活性が前記第２の試料より前記第１の試料の方が低い場合、前記阻害剤候補は、糖尿病又は肥満の薬物に使用する候補薬剤として特定される。
【実施例１３】
【０１８３】
［ハイスループットアッセイ］
実施例１０又は１２のアッセイは、ハイスループット形式で実施できる。この実施例では、非放射性の形式でアッセイを読み取る。以下を除いて、他の詳細は実施例１０又は１２の通りである。
【０１８４】
１０分間のアッセイ後（トリクロル酢酸の添加前）のリン酸の遊離は、１０ｍｇ／ｍｌのモリブデン酸アンモニウム及び０．３８ｍｇ／ｍｌのマラカイトグリーンを含有する１５０μｌの１Ｎ塩酸を、１００μｌのアッセイに添加することにより測定する。室温（１８〜２５℃）で２０分後、６２０ｎｍの吸光度を測定する。この形式では、２５０μｌの試料の吸光度をプレートリーダ上で読み取る。
【０１８５】
その後、ＰＰＭホスファターゼ活性を前記第１及び第２試料で比較し、活性が前記第２の試料より前記第１の試料の方が低い場合、前記阻害剤候補は、糖尿病又は肥満の薬物に使用する候補薬剤として特定される。
【０１８６】
上記の明細書中で言及された刊行物は全て、参照により本明細書中に組み込まれる。記載された本発明の態様及び実施形態の種々の改変及び変更は、当業者であれば、本発明の範囲から逸脱せずに明白であろう。本発明は特定の好ましい実施形態と関連して記載されたが、特許請求された本発明は、そのような特定の実施形態に不当に限定されないことが理解されるべきである。実際、当業者にとって明白である、本発明を実行するための記載された様式の種々の改変は、以下の特許請求の範囲内にあることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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