(57)【要約】本発明はイヌのライム病に対するワクチン並びにこのワクチンを作製する方法及びこのワクチンを単独又は他の防御因子との併用で使用する方法を提供する。本発明はワクチンに用いることができる新規免疫原性組成物を提供する。本発明の一態様において、ワクチンはライム病を防御する。この種の具体的な実施態様では、ワクチンのレシピエントはイヌである。別の実施態様では、ワクチンのレシピエントは飼いネコである。ウマ及び／又はウシなどの他の家畜哺乳類も本発明のワクチン及び／又は方法によって防御することができる。本発明はさらに、ライム病及び他の疾患、例えばイヌの他の感染症に対する防御免疫を誘導する混合ワクチンを提供する。本発明のワクチンの作製方法及び使用方法も提供する。
2010509217.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫学的有効量の、ボレリア遺伝種の第１又は単一の株の生物を含むワクチン組成物であって、
該第１又は該単一の株の生物は、標準的なボレリア遺伝種の増殖条件下で増殖させる場合、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ５０７７２（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４３９）を注射した動物において誘導されるＯｓｐＣ特異的抗体の存在下に死滅する、ワクチン組成物。
【請求項２】
前記免疫学的有効量の生物が不活化されている請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
前記第１又は前記単一の株がその細胞表面にＯｓｐＣ抗原を提示し、及び
イヌが前記ワクチン組成物で免疫化されると、ＯｓｐＣ殺ボレリア菌抗体が該イヌにおいて誘導される請求項１に記載のワクチン。
【請求項４】
かなりの割合の前記ＯｓｐＣ特異的殺ボレリア菌抗体がＯｓｐＣ７に特異的である請求項３に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
前記第１又は前記単一の株がＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ５０７７２（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４３９）である請求項３に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
免疫学的有効量の、ボレリア遺伝種由来の第２の株の不活化生物をさらに含み、該第２の株がその細胞表面にＯｓｐＡ抗原、ＯｓｐＢ抗原を提示し、又はＯｓｐＡ抗原及びＯｓｐＢ抗原の両者を提示する請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
イヌが前記ワクチン組成物で免疫化されると、ＯｓｐＣ殺ボレリア菌抗体及びＯｓｐＡ殺ボレリア菌抗体が該イヌにおいて誘導される請求項６に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
前記第２の株がＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓＳ−１−１０株（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１６８０）である請求項６に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
前記第１の株の生物を１ミリリットル当たり約１×１０４乃至約１×１０１０個及び前記第２の株の生物を１ミリリットル当たり約１×１０４乃至約１×１０１０個含む、請求項６に記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
前記第１の株の生物を１ミリリットル当たり約５．０×１０８乃至約５×１０９個及び前記第２の株の生物を１ミリリットル当たり約１．０×１０８乃至約５×１０８個含む、請求項９に記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
医薬用として許容可能なアジュバントをさらに含む請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項１２】
医薬用として許容可能な免疫刺激剤をさらに含む請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項１３】
非ボレリア病原体に対する防御免疫を誘導するための少なくとも１種の非ボレリア免疫原をさらに含む請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項１４】
前記非ボレリア免疫原がイヌジステンパーウイルス、イヌアデノウイルス、イヌパルボウイルス、イヌパラインフルエンザウイルス、イヌコロナウイルス、イヌインフルエンザウイルス、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ血清型、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ属生物、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ属菌、狂犬病ウイルス、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃａｎｉｓ、ａｎａｐｌａｓｍａ属生物及びこれらの組合せからなる群から選ばれる請求項１３に記載のワクチン組成物。
【請求項１５】
前記Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ血清型がＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｋｉｒｓｃｈｎｅｒｉ血清型ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ血清型ｃａｎｉｃｏｌａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ血清型ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ血清型ｐｏｍａｎａ及びこれらの組合せからなる群から選ばれる請求項１４に記載のワクチン組成物。
【請求項１６】
前記Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ属菌がＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｙｎｏｓを含む請求項１４に記載のワクチン組成物。
【請求項１７】
病原性ボレリア遺伝種に対してイヌを免疫化する方法であって、免疫学的有効量の請求項１に記載のワクチンを該イヌに注射することを含む方法。
【請求項１８】
病原性ボレリア遺伝種に対してイヌを免疫化する方法であって、免疫学的有効量の請求項６に記載のワクチンを該イヌに注射することを含む方法。
【請求項１９】
前記第２の株が狭義のＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉである請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記第２の株がＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓＳ−１−１０（ＡＴＣＣ番号：ＰＴＡ−１６８０）、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓＢ−３１（ＡＴＣＣ番号３５２１０）、Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ（ＡＴＣＣ番号５１５６７）及びＢ．ｇａｒｉｎｉｉ（ＡＴＣＣ番号５１３８３又は同５１９９１）、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓＤＫ７、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ６１ＢＶ３、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓＺＳ７、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓＰｋａ、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓＩＰ１、ＩＰ２、ＩＰ３、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓＨＩＩ、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓＰ１Ｆ、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓＭｉｌ、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ２０００６、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ２１２、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓＥＳＰ１、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓＮｅ−５６、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓＺ１３６、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ  ｉａ及び／又はこれらの組合せからなる群から選ばれる請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記免疫化されたイヌが殺ボレリア菌抗体を産生する請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記イヌがボレリア属の各それぞれの株の生物を約５×１０７乃至約５×１０９個注射される請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
請求項２１に記載の方法によって免疫化されたイヌから得られるＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ＯｓｐＣに結合する殺ボレリア菌抗体を含む血清。
【請求項２４】
請求項２１に記載の方法によって免疫化されたイヌから得られるＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ  ＯｓｐＣに結合する殺ボレリア菌抗体。
【請求項２５】
ＯｓｐＣ７特異的抗体を含む請求項２４に記載の殺ボレリア菌抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、２００６年１１月３日に出願された米国仮出願第６０／８６４，２５８号（この内容は、その全体が参考として本明細書に援用される）の優先権を主張する本出願である。
【０００２】
本発明は、イヌのライム病に対するワクチンに関する。このワクチンを作製する方法及びこのワクチンを単独又は他の防御因子との併用で使用する方法も提供する。
【背景技術】
【０００３】
イヌのライム病は、主に米国における狭義のＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｅｎｓｕ  ｓｔｒｉｃｔｏ（ｓｓ））並びに欧州におけるＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ、Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ及びＢ．ａｆｚｅｌｉｉを含むＢｏｒｒｅｌｉａ属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｓｐｐ．）スピロヘータによる感染が原因である（非特許文献１；非特許文献２）。これらのスピロヘータは感染したマダニ属のダニが血液を吸った時に伝染し、イヌに生じた感染は潜在性滑膜炎から急性関節炎及び関節痛に及ぶ臨床的症状をもたらす（非特許文献３；非特許文献４）。重要なことであるが、イヌのライム病の発生率は、ヒトの症例数の増加と一致して毎年増加し続けている（非特許文献５）。
【０００４】
ボレリア属による感染に対して産生される抗体には異なる２つの機能があるが、従来、いずれの反応も哺乳類の宿主から隔絶されたスピロヘータを除去するという点で無効であった。この自然感染に対する正常な免疫反応の欠如に関して、抗原変異（Ｓｃｈｗａｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２００３年、３１：ｐ．１０８−１１２；Ｔｏｋａｒｚほか、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．２００４年、７２：ｐ．５４１９−５４３２）、宿主模倣（Ｂａｒｂｏｕｒほか、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１９８６、５０：ｐ．３８１−４００）及び細胞内局在性（Ｍａほか、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．１９９１年、５９：ｐ．６７１−６７８）を含むいくつかの解釈が想定されている。
【０００５】
最も一般的な液性免疫反応は、食細胞による貪食のためにスピロヘータに「印を付ける」非特異的結合／オプソニン化（被覆）抗体の産生である。残念ながら、オプソニン化抗体は他の微生物に共通にみられる数種の蛋白質（即ち、細菌鞭毛を構成する４１ｋＤａ蛋白質）によって誘導され、このため、ワクチン接種誘導液性免疫におけるその価値はどうひいき目にみても疑わしいものとなる。
【０００６】
別の一般的な免疫反応は殺ボレリア菌（致死的）抗体の産生である。オプソニン化抗体とは対照的に、殺ボレリア菌抗体は僅か数種のボレリア属菌蛋白質のエピトープを認識する。殺ボレリア菌抗体は、スピロヘータ表面の特定の標的に結合した後、最も一般的には補体を誘導して、食細胞による除去を必要とすることなくこの菌を殺す細胞膜傷害複合体を形成する。
【０００７】
現在ワクチンとして用いられているイヌのライム病バクテリンが開発されて、感染されたダニが吸血する時にこの寄生虫中のＯｓｐＡ発現スピロヘータを殺すＯｓｐＡ殺ボレリア菌抗体（Ｈｓｉｅｎ−Ｃｈｕほか、ＪＡＶＭＡ  １９９２、２０１：ｐ．４０３−４１１；Ｍａほか、Ｖａｃｃｉｎｅ  １９９６年、１４：ｐ．１３６６−１３７４；Ｗｉｋｌｅほか、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｒｅｓ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．２００６年、４：ｐ．２３−２８；Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒほか、Ｖａｃｃｉｎｅ  ２００１年、２０：ｐ．１８１−１９３）を誘導することによる防御が可能となった（非特許文献６）。Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら（Ｖａｃｃｉｎｅ  ２００２，  ２０：１８１−１９３）は、全細胞ワクチンの方が組換えＯｓｐＡよりも有意に高い殺ボレリア菌抗体価を誘導したと報告している。このようなワクチンはほどほどに上出来であったが、ワクチン接種の失敗例が報告されている（Ｌｅｖｙほか、ＪＡＶＭＡ  １９９３年、２０２：ｐ．１８３４−１８３８；Ｍａほか、Ｖａｃｃｉｎｅ  １９９６年、１４：ｐ．１３６６−１３７４；Ｓｃｈｕｔｚｅｒほか、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．１９９７年、３３７：ｐ．７９４−７９５）。
【０００８】
生じたＯｓｐＡ殺ボレリア菌抗体はＯｓｐＡを発現しているＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓを認識するのみであり（Ｊｏｂｅほか、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９４、３２：ｐ．６１８−６２２；Ｌｏｖｒｉｃｈほか、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．１９９５、６３：ｐ．２１１３−２１１９）、通常、上記ダニはＯｓｐＡを発現していないＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓスピロヘータに感染する（Ｆｉｋｒｉｇほか、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．１９９５、６３：ｐ．１６５８−１６６２；Ｏｈｎｉｓｈｉほか、  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２００１年、９８：ｐ．６７０−  ６７５）ので、現在、こうした抗体は吸血している上記ダニを殺菌できない場合が多いと理解されている。さらに、上記ダニは、一般にＢ．ａｆｚｅｌｉｉ及びＢ．ｇａｒｉｎｉｉを含む他の病原性ボレリア属菌にも感染する（Ｏｍｓｔｅｉｎほか、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００１年、３９：ｐ．１２９４−１２９８）が、ＯｓｐＡ抗体は遺伝種特異的である（Ｌｏｖｒｉｃｈほか、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．１９９５年、６３：ｐ．２１１３−２１１９）。さらに、ダニの中腸への付着を媒介する（Ｐａｌほか、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２０００年、１０６：ｐ．５６１−５６９）ＯｓｐＡの発現は感染されたダニが吸血を始めた後まもなく下方制御される（Ｓｃｈｗａｎほか、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９５年、９２：ｐ．２９０９−２９１３）ので、ＯｓｐＡボレリア抗体による防御の「絶好の機会」はスピロヘータが感受性の場合でも限定される。
【０００９】
Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓのＯｓｐＣは殺ボレリア菌液性免疫の別の標的と考えられる（Ｒｏｕｓｓｅｌｌｅほか、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１９９８年、１７８：ｐ．７３３−７４１）。この蛋白質は、殺ボレリア菌抗体の誘導に関与し、病原性ボレリア属菌類間で保存されているエピトープを有すると考えられる（Ｌｏｖｒｉｃｈほか、Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５年、１２：ｐ．７４６−７５１）。ＯｓｐＣ蛋白質の具体的な機能は依然として不明であるが、ＯｓｐＣの発現は哺乳動物の感染には必要であるが、ダニの感染には必要とされないことが示唆されている（Ｇｒｉｍｍほか、２００４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０１（９）：ｐ．３１４２−３１４７）。いずれにしても、ライム病スピロヘータはダニが吸血を開始した後まもなくＯｓｐＣを発現する（Ｓｃｈｗａｎほか，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９５，９２：２９０９−２９１３）が、哺乳動物において感染が成立するためにはＯｓｐＣを発現し続ける必要がある（Ｓｔｅｗａｒｔほか、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．２００６年、７４：ｐ．３５４７−３５５３，Ｔｉｌｌｙほか、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．２００６年、７４：ｐ．３５５４−３５６４）。従って、ＯｓｐＣ殺ボレリア菌抗体の「有効性のウインドウ（ｗｉｎｄｏｗ  ｏｆ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ）」はＯｓｐＡ殺ボレリア菌抗体に比し、著しく増大する。
【００１０】
ＯｓｐＣ蛋白質が防御性殺ボレリア菌抗体を誘導することができることは分かっている（Ｒｏｕｓｓｅｌｌｅほか、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１９９８年、１７８：ｐ．７３３−７４１；Ｉｋｕｓｈｉｍａほか、ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０００年、２９：ｐ．１５−２１）が、これまでの一部の「マッピング」研究では上記エピトープはこの蛋白質の高度に不均一な領域に限局されている（Ｂｕｃｋｌｅｓほか、Ｃｌｉｎ．Ｖａｃｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６年、１３：ｐ．１１６２−１１６５）。従って、こうした領域に対する殺ボレリア菌ＯｓｐＣ抗体は少数種のボレリア属分離株に対する液性免疫をもたらすに過ぎないことになる。Ｌｏｖｒｉｃｈら（Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５年、１２：ｐ．７４６−７５１）は、上記蛋白質のＣ末端７アミノ酸（ＯｓｐＣ７）内にＯｓｐＣ殺ボレリア菌抗体エピトープをつきとめた。最も注目に値すべきなのは、このエピトープが上記病原性ボレリア菌類の間で保存されていることである。しかしながら、ＯｓｐＡを発現する（即ち、ｏｓｐＡ／ｏｓｐＢオペロンを含有する）通常の実験室Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ分離株は、ＯｓｐＡ殺ボレリア菌抗体誘導能を大きく損なうことなく有意なレベルのＯｓｐＣ殺ボレリア菌抗体をも誘導するように実験室で操作することができない。さらに、ＯｓｐＡを発現する通常の実験室Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ分離株の死菌体を用いてワクチン接種しても殺ボレリア菌ＯｓｐＣ抗体は誘導されない（Ｓｃｈｗａｎほか、１９９５年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９２：ｐ．２９０９−２９１３；Ｏｂｏｎｙｏほか、１９９９年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３７：ｐ．２１３７−２１４１）。
【００１１】
Ｃａｌｌｉｓｔｅｒら（本明細書に引用により組み込まれている特許文献１及び特許文献２）は、ＯｓｐＣの免疫原性ポリペプチド断片を単独又はＯｓｐＡポリペプチドとの併用で用いることによりライム病に対してヒト及び他の哺乳動物を防御するワクチンを調製することを提唱している。また、Ｌｉｖｅｙら（本明細書に引用により組み込まれている特許文献３）は、組換えＯｓｐＡ、ＯｓｐＢ及びＯｓｐＣ蛋白質の組合せから調製された、ライム病に対して免疫化するワクチンを提案した。しかしながら、現在に至るまで、組換え蛋白質ワクチンで、現在市販されているワクチンより改良されたものであることが示されたものはない。従って、当該分野では長年にわたり、ライム病から哺乳動物、特にイヌを防御するワクチンの改良が求められ続けている。
【００１２】
本明細書におけるいかなる文献の引用も、そのような文献が本願の「先行技術」として利用可能であるということを認めたものと解するべきではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】米国特許第６，２１０，６７６号明細書
【特許文献２】米国特許第６，４６４，９８５号明細書
【特許文献３】米国特許第６，８７２，５５０号明細書
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｂａｒａｎｔｏｎほか、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９２年、４２：ｐ．３７８−３８３
【非特許文献２】Ｈｏｖｉｕｓほか、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０００年、３８：ｐ．２６１１−２６２１
【非特許文献３】Ｊａｃｏｂｓｏｎほか、Ｓｅｍｉｎ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｕｒｇ．１９９６年、１１：ｐ．１７２−１８２
【非特許文献４】Ｓｕｍｍｅｒｓほか、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｐａｔｈ．２００５年、１３３：ｐ．１−１３
【非特許文献５】Ｈａｎｉｎｋｏｖａほか、Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２００６年、１２：ｐ．６０４−６１０
【非特許文献６】Ｆｉｋｒｉｇほか、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９２年、８９：ｐ．５４１８−５４２１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
従って、本発明はワクチンに用いることができる新規免疫原性組成物を提供する。本発明の一態様において、ワクチンはライム病を防御する。この種の具体的な実施態様では、ワクチンのレシピエントはイヌである。別の実施態様では、ワクチンのレシピエントは飼いネコである。ウマ及び／又はウシなどの他の家畜哺乳類も本発明のワクチン及び／又は方法によって防御することができる。本発明はさらに、ライム病及び他の疾患、例えばイヌの他の感染症に対する防御免疫を誘導する混合ワクチンを提供する。本発明のワクチンの作製方法及び使用方法も提供する。
【００１６】
本発明のワクチンは、免疫学的有効量の、ＯｓｐＣ抗原を発現する（任意選択的に不活化された）第１又は単一の株の生物を含む。この株は、標準的な培養条件で増殖させる場合、（任意選択的に補体を必要とする）ＯｓｐＣ特異的殺ボレリア菌抗体の存在下に死滅する株である。このような抗体としては、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ５０７７２（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４３９）によってワクチン接種した動物に誘導される、保存エピトープＯｓｐＣ７に対する殺ボレリア抗体が挙げられる。この種の具体的な実施態様では、ボレリア遺伝種（ｇｅｎｏｓｐｅｃｉｅ）の上記第１又は単一の株は上記ＯｓｐＣ抗原を構成的に発現する。より具体的な実施態様では、この第１の株はＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ５０７７２（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４３９）である。
【００１７】
本発明のワクチン組成物は、免疫学的有効量の、病原性ボレリア遺伝種からの１種以上の別の株（これらを総称して第２の株と名付ける場合がある）からの不活化生物をさらに含むことができる。具体的な実施態様では、この第２の株はＯｓｐＡ及びＯｓｐＢ抗原を提示する。
【００１８】
適切な第２の株の例としては、以下のうちの１種以上が挙げられる：Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓＳ−１−１０（ＡＴＣＣ番号：ＰＴＡ−１６８０）、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓＢ−３１（ＡＴＣＣ番号３５２１０）、Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ（例えば、ＡＴＣＣ番号５１５６７として入手可能）及びＢ．ｇａｒｉｎｉｉ（例えば、ＡＴＣＣ番号５１３８３及び同５１９９１として入手可能）、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓＤＫ７、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ６１ＢＶ３、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓＺＳ７、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓＰｋａ、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓＩＰ１、ＩＰ２、ＩＰ３、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓＨＩＩ、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓＰ１Ｆ、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓＭｉｌ、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ２０００６、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ２１２、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓＥＳＰ１、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓＮｅ−５６、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓＺ１３６、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ  ｉａ及び／又はこれらの任意の組合せ。
【００１９】
上記ワクチン組成物は、概して、各それぞれの株の生物を１ミリリットル当たり約１×１０４乃至約１×１０１０個含む。特定の実施態様では、このワクチンは各それぞれの株の生物を１ミリリットル当たり約１×１０６乃至約５×１０９個含む。別の実施態様では、このワクチンは上記（又は各）第２の株の生物を１ミリリットル当たり約１．０×１０８乃至約５×１０８個及び上記第１の株の生物を１ミリリットル当たり約５．０×１０８乃至約５×１０９個含む。
【００２０】
また、上記ワクチン組成物には、例えば、アルミニウム化合物（例えば、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム）、代謝性及び非代謝性油、ブロックポリマー、免疫刺激複合体、ビタミン、ミネラル、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）（例えば、ＣＡＲＢＯＰＯＬ９４１）などの医薬用として許容可能なアジュバントを含めることもできる。特定の実施態様では、この医薬用として許容可能なアジュバントは、（例えば、Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ（登録商標）として販売されているような）水中にミクロン径の油滴を均一分散させた乳剤を含む。
【００２１】
任意選択的に、上記ワクチン組成物は医薬用として許容可能な免疫刺激剤、例えば、サイトカイン、成長因子、ケモカイン、リンパ球、単球もしくはリンパ器官由来細胞の細胞培養液の上清、植物、細菌もしくは寄生虫からの細胞調製物及び／又は抽出物又はマイトジェンをも含む。
【００２２】
本発明はさらに、病原性ボレリア属菌、具体的にはＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓに対してイヌ又は他の哺乳動物を免疫化する方法であって、免疫学的有効量の上記本発明ワクチンをイヌに注射することを含む方法を提供する。例えば、このようなワクチンには各それぞれの株の生物を約１×１０８乃至３×１０９個を含ませることができる。ワクチンは、例えば、筋肉内注射、皮下注射、静脈内注射、皮内注射、経口投与、鼻腔内投与及びこれらの組合せなどの経路によって投与することができる。特定の実施態様では、ワクチン接種後、免疫化されたイヌは殺ボレリア抗体を産生する。
【００２３】
本発明はさらに、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ  ＯｓｐＣに結合する殺ボレリア菌抗体を含有する、ワクチン接種動物から得られる血清を提供する。同様に、本発明はＯｓｐＣに結合する精製抗体を提供する。特定の実施態様では、この血清はかなりの割合のＯｓｐＣ７特異的殺ボレリア菌抗体を含有する。
【００２４】
本発明はさらに、本発明のボレリア遺伝種の１種以上の株を１種以上の他のイヌ病原体及び／又は免疫原との組合せで含む混合ワクチンを提供する。この免疫原としては、例えば、イヌジステンパーウイルス、イヌアデノウイルス、イヌパルボウイルス、イヌパラインフルエンザウイルス、イヌコロナウイルス、イヌインフルエンザウイルス及び／又はＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ血清型（例えば、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｋｉｒｓｃｈｎｅｒｉ血清型ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ血清型ｃａｎｉｃｏｌａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ血清型ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ及び／又はＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ血清型ｐｏｍａｎａ）に対する免疫を誘導する免疫原が挙げられる。本発明の混合ワクチンに添加することができる別のイヌ病原体としては、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｉｎｆａｎｔｕｍなどのリーシュマニア属生物、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、マイコプラズマ属菌（例えば、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｙｎｏｓ）、狂犬病ウイルス及びａｎａｐｌａｓｍａ  ｐｈａｇｏｃｙｔｏｐｈｉｌｕｍ、ａｎａｐｌａｓｍａ  ｐｌａｔｙｓなどのａｎａｐｌａｓｍａ属生物及びＥｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃａｎｉｓが挙げられる。
【００２５】
本発明のこれらの態様及びそれ以外の態様については添付の図面及び詳細な説明によって一層よく理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】正常イヌ対照血清（ＮＳ）、試験品（ＴＰ：ｔｅｓｔ  ｐｒｏｄｕｃｔ）を用いたワクチン接種（試験４３日目）後のイヌからの血清又はＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ感染ダニ（ＮＩ）による感染（試験１３４日目）後のイヌからの血清のウエスタンブロットの写真である。分子量約２０ｋＤａの蛋白質に対する感染特異的抗体の存在に注目されたい。
【図２Ａ】正常イヌ対照血清（ＮＳ）又はプラセボ接種及びＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ感染ダニによる感染（試験１３４日目）後の個々のイヌの個別のコホートからの血清（１番から１５番まで番号が付けられている）のウエスタンブロットの写真である。
【図２Ｂ】正常イヌ対照血清（ＮＳ）又は試験品を用いたワクチン接種後の個々のイヌの個別のコホートからの血清（１番から１５番まで番号が付けられている）のウエスタンブロットの写真である。プラセボ接種した１４頭（９３％）のイヌでは感染特異的２０ｋＤａ抗体が存在し（図２Ａ）、試験品を用いてワクチン接種したイヌでは同抗体が存在しなかった（ｐ＜０．０００１）（図２Ｂ）ことに注目されたい。
【図３Ａ】プラセボ接種してＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓに感染させたイヌの関節における組織病理学的変化の代表的な１例を示す写真である。長方形内の領域はイヌのライム病関節炎に特有の好中球及び単核細胞の著しい浸潤を示している。
【図３Ｂ】試験品を用いてワクチン接種し、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓに感染させたイヌの関節において組織病理学的変化がみられない代表的な１例を示す写真である。長円形内の領域には好中球及び単核細胞の浸潤はみられない。
【図４】ライム症状もしくはライム関連症状の（カルテ審査による）既往歴がない個体（ｎ＝３６）からの正常血清（Ｎ）、献血者（ＢＤ、ｎ＝１００）もしくはコレステロール検診を受けた個体（ＣＳ、ｎ＝１００）からの特性化されていない血清、又は通常Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ抗原と交差反応する血液因子もしくは疾患、例えば、抗核抗体（ＡＮＡ、ｎ＝２０）、リウマチ因子（ＲＦ、ｎ＝２０）、単核球症（ＥＢＶ、ｎ＝１０）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ、ｎ＝１０）、梅毒（ＳＹＰＨ、ｎ＝１３）もしくはロッキー山熱（ＲＭＳＦ、ｎ＝４）を有するボランティアからの血清を用いたＯｓｐＣ７ＥＬＩＳＡ反応性の測定結果を示した図である。実線は、正常血清及び交差反応する可能性のある血清の平均吸光度値よりも上の３標準偏差値分を示す。この線よりも上にくる値は陽性に相当する確率が９９％となる（バックグランド値  １％）。
【図５】定型ライム病病変を有する患者である、遊走性紅斑を示すほぼ確かなライム病の患者（ｎ＝８６）、「非定型病巣」を有する、確からしいライム病の患者（ｎ＝２２）及び全身症状（初発臨床症状）を有する、ライム病の可能性のある患者（ｎ＝４９）からの血清を用いたＯｓｐＣ７ＥＬＩＳＡ反応性を示す図である。実線は、正常血清及び交差反応する可能性のある血清の平均吸光度値よりも上の３標準偏差値分を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明は、レシピエントのワクチン接種動物に効果的な殺ボレリア菌液性免疫を誘導するボレリア遺伝種の１種以上の株からの免疫学的有効量の生物を含むワクチン組成物を提供する。このような株の生物は、標準的なボレリア遺伝種の増殖条件下で増殖させる場合、ＯｓｐＣ特異的抗体、例えば、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ５０７７２（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４３９）を用いてワクチン接種した動物において誘導される一種の抗体又は複数種の抗体の存在下に死滅する。
【００２８】
本発明の一態様において、本発明のワクチンにより誘導される抗体の有効性のウインドウは、単にＯｓｐＡ殺ボレリア抗体に基づいた従来のワクチンに比し、著しく増大する。別の態様では、本発明のワクチンでは、例えばインビボでのＯｓｐＣの発現によるなどの有益な免疫記憶反応を促進する確率が改善され、及び／又はボレリア属菌の複数種の病原性株に対する防御が追加及び／又は増強される。
【００２９】
本発明の一実施態様において、そのような株の生物は、標準的なボレリア遺伝種増殖条件下で増殖させると、ＯｓｐＣ抗原を構成的に発現する。この種の特定の実施態様では、そのような株の生物は、標準的なボレリア遺伝種増殖条件下で増殖させると、補体特異的反応によって死滅する。さらに別の実施態様では、そのような株の生物を含むワクチンにより誘導される血清中のかなりの割合のＯｓｐＣ特異的殺ボレリア菌抗体は、保存エピトープＯｓｐＣ７に特異的であることにより、複数の病原性ボレリア遺伝種（例えば、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ、Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ及び／又はＢ．ｇａｒｉｎｉｉ）に対する防御を可能にする。さらに別の実施態様では、そのような株の生物はＯｓｐＡ抗原もＯｓｐＢ抗原も提示しない。さらに別の実施態様では、そのような株の生物はこれらの性質のうちの任意の２つ以上を有する。さらに別の実施態様では、そのような株の生物はこれらの性質のうちの任意の３つ以上を有する。さらに別の実施態様では、そのような株の生物はこれらの性質のうちの任意の４つ以上を有する。特定の実施態様では、そのような株の生物はこれらの性質の全てを有する。そのような特定の１種の株はＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ５０７７２（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４３９）である。
【００３０】
別の実施態様において、本発明のワクチンは、上記のような第１の株及び有効量の少なくとも第２の株の生物を含む組成物である。この第２の株は、本発明のワクチンの一部として投与された場合に殺ボレリア菌ＯｓｐＡ抗体を誘導する病原性ボレリア遺伝種からのものであることが好ましい。また、上記組成物には１種以上の別の適合性ワクチン遺伝種を含ませることもできる。さらに、本発明のワクチンには１種以上の他の哺乳動物（例えば、イヌ）病原体及び／又は免疫原を含ませることができる。
【００３１】
本発明の理解をさらに十分に進めるために、以下の定義を設ける。
【００３２】
原文の英文では、記載上の便宜のために単数形の用語を用いているが、これは決してそのように限定的なものではない。すなわち、例えば、「ポリペプチド（ａ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」を含む組成物に言及する場合、１種以上のそのようなポリペプチドに言及することを含む。さらに、生物（ｏｒｇａｎｉｓｍ）に言及する場合、特に示さない限り、複数種のそのような生物（ｏｒｇａｎｉｓｍｓ）に言及することを含む。
【００３３】
本明細書で使用される「ほぼ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語は「約（ａｂｏｕｔ）」と同じ意味で用いており、値がその示された値の５０％以内にあること、すなわち、１ミリリットル当たり「ほぼ」１×１０１０個の菌を含む組成物は１ミリリットル当たり５×１０９乃至５×１０１０個の菌を含むことを意味する。
【００３４】
「遺伝種」という用語は、Ｇ．Ｂａｒａｎｔｏｎら（１９９２年、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊ．ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  ４２：ｐ．３７８−３８３）によって最初に用いられ、定義されたが、本明細書でも、非ボレリア生物の分類を記載する際に「種」という用語を用いるのと同じ意味で用いている。
【００３５】
ボレリア遺伝種を培養するための「標準的な増殖条件」では、ＢＳＫ（Ｂａｒｂｏｕｒ−Ｓｔｏｅｎｎｅｒ−Ｋｅｌｌｙ）培地中約３３℃乃至約３５℃の範囲の温度で増殖させることが必要とされる。本明細書に記載したＢＳＫ培地は、Ｃａｌｌｉｓｔｅｒら［参考としてその全体が本明細書に援用されるＤｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｏｒｒｅｌｉａｃｉｄａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、セクション１１．５．１  −  １１．５．１２、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ２６、（２００３年）］に従って調製した。（ＢＳＫ培地は、例えば、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州から市販されてもいる。）
本明細書で使用される「ＯｓｐＣ７」とは、既知の病原性ボレリア属間で完全に保存されている、Ｃａｌｌｉｓｔｅｒら（参考としてその全体が本明細書に援用される米国特許第６，２１０，６７６Ｂ１号及び同６，４６４，９８５Ｂ１号）によって開示されているＯｓｐＣのＣ末端側５０アミノ酸内の７アミノ酸領域（参考としてその全体が本明細書に援用されるＬｏｖｒｉｃｈほか、２００５年、Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２：ｐ．７４６−７５１）にある免疫優勢ＯｓｐＣ殺ボレリア菌抗体エピトープである。この保存については、Ｌｏｖｒｉｃｈらによって報告された７アミノ酸セグメントをコードしているコドンセグメントのＢＬＡＳＴ探索により容易に確認できる。２００６年１０月９日に行ったこのような探索では、上記のＯｓｐＣ  ７−マーエピトープコードセグメントを含有する１００種のボレリア種の結果リストが得られた。
【００３６】
「ＯｓｐＣ特異的殺ボレリア菌抗体」とは、例えばＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ５０７７２（ＡＴＴＣ番号ＰＴＡ−４３９）でワクチン接種した動物の血清中に存在するものであり、ＯｓｐＣ抗原の任意のエピトープに選択的に結合してスピロヘータを補体依存性又は非依存性に死滅させるものである。「ＯｓｐＣ７特異的殺ボレリア菌抗体」とは、例えばＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ５０７７２（ＡＴＴＣ番号ＰＴＡ−４３９）でワクチン接種した動物の血清中に存在するものであり、Ｌｏｖｒｉｃｈら［参考としてその全体が本明細書に援用されるＬｏｖｒｉｃｈほか、Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２：ｐ．７４６−７５１、（２００５年）］によって報告されたＯｓｐＣの７個のＣ末端アミノ酸に選択的に結合してスピロヘータを（一般に補体媒介性細胞膜傷害複合体を誘導することにより）死滅させるものである。ＯｓｐＣ殺ボレリア菌抗体の特異性は十分立証されている。例えば、ＯｓｐＣ殺ボレリア菌抗体は、殺ボレリア菌抗体試験においてＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ５０７７２の感受性を測定することによって通常ライム病血清中に検出される。類縁疾患を有するヒト患者からの血清には、株５０７７２をも死滅させる交差反応性抗体はまれに（２％）しか含まれない（Ｃａｌｌｉｓｔｅｒほか、１９９６年、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３（４）：ｐ．３９９−４０２に詳細に報告されている）。さらに、ＯｓｐＣ７殺ボレリア菌エピトープを用いるペプチドＥＬＩＳＡ法ではライム病の血清中の殺ボレリア菌抗体が正確に捕捉されるが、他の類縁疾患を有する患者からの血清にはＯｓｐＣ７ペプチドにも結合する交差反応性抗体はまれに（＜２％）しか含まれない（図４及び５に示した）。
【００３７】
ワクチンにより誘導される血清中の「かなりの割合の」ＯｓｐＣ特異的殺ボレリア菌抗体が保存エピトープＯｓｐＣ７に特異的である場合、これは、ＯｓｐＣ７によるその血清の吸収後に血清中ＯｓｐＣ特異的殺ボレリア菌抗体が無視できないほど減少することを意味する。これは、好ましくはＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ５０７７２を用いて検出される血清の殺ボレリア菌抗体価の少なくとも２分の１、より好ましくはＯｓｐＣ７によるその血清の吸収後の血清の殺ボレリア菌抗体価の２分の１乃至４分の１又はこれ以下への低下と定義される。
【００３８】
「補体特異的反応」とは、ボレリア属の生物（類）を殺ボレリア菌抗体によって死滅させるために血清補体の存在を必要とする抗体反応である。
【００３９】
本発明では、「不活化」Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ生物とは、動物において免疫反応を誘導することができるが、その動物に感染することができない生物である。Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ分離株は、二成分エチレンイミン、ホルマリン、ベータ−プロピオラクトン、チメロサール又は熱からなる群から選ばれる作用因子によって不活化することができる。特定の実施態様では、このＢｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ分離株は二成分エチレンイミンによって不活化する。
【００４０】
「アジュバント」及び「免疫刺激剤」という用語は、本明細書では同じ意味で用いており、免疫系の亢進をもたらす１種以上の物質と定義される。これに関連して、アジュバントは１種以上のワクチン抗原／分離株に対する免疫反応を増強するために使用する。アジュバントは、ワクチンの投与の前、又はこの投与と組み合わせて、又はこの投与の後に対象動物に投与することができる。本発明のアジュバントは、例えば、天然供給源、組換え供給源を含むいくつかの供給源のいずれかから入手し、及び／又は化学的に合成することができる。アジュバントとして用いる化合物の例としては、アルミニウム化合物、代謝性及び非代謝性油、ブロックポリマー、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）、ビタミン及びミネラル（ビタミンＥ、ビタミンＡ、セレン、ビタミンＢ１２が挙げられるが、これらに限定されない）、キル（Ｑｕｉｌ）Ａ（サポニン）及びポリアルケニルエーテル又はジビニルグリコールで架橋したアクリル酸のポリマー、例えば、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。特に免疫刺激剤と呼ばれることがあるアジュバントの別の例としては、細菌及び真菌細胞壁成分（例えば、リポ多糖、リポ蛋白質、糖蛋白質、ムラミルペプチド、ベータ−１，３／１，６−グルカン）、植物由来の各種複合糖質（例えば、グリカン、アセマンナン（ａｃｅｍａｎｎａｎ））、動物由来の各種蛋白質及びペプチド（例えば、ホルモン、サイトカイン、共刺激因子）並びにウイルス及び他の供給源由来の新規核酸（例えば、二本鎖ＲＮＡ、ＣｐＧ）が挙げられる。さらに、上記の物質のいくつもの組合せがアジュバント効果をもたらすことができ、従って、これらは本発明のアジュバントを形成することができる。好ましいアジュバントの１つはＥｍｕｌｓｉｇｅｎ（登録商標）である。
【００４１】
米国特許第６，２１０，６７６号に記載されているＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ５０７７２（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４３９）及び米国特許第６，３１６，００５号に記載されているＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓＳ−１−１０（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１６８０）は、それぞれ１９９９年７月３０日及び２０００年４月１１日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１０８０１  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ大学、Ｍａｎａｓｓａｓ（ＶＡ）２０１１０に寄託された。本発明の共同権利者らは、個々に上記２特許に対する権利を保有している。
【００４２】
また、本発明が本明細書に開示した特定の構造、工程段階及び材料に限定されないことは、このような構造、工程段階及び材料はある程度変えることができるので、言うまでもないことである。また、本明細書に用いた用語は、単に特定の実施態様を説明するために用いたものであり、本発明の範囲が添付の特許請求の範囲及びその均等物によってのみ限定されることになるので、限定的なものではないことも言うまでもない。
【００４３】
他のワクチン株
・他のＯｓｐＣ株
一態様において、本発明は、単独又は他のボレリア遺伝種株との併用でライム病を防御するワクチンにおけるＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ５０７７２（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４３９）の使用を提供する。特に、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ５０７７２は、当初、ワクチンに有用な候補としては受け入れなかった。何故なら、この株はＯｓｐＣを発現しないと間違って報告されていた（Ａｎｄｅｒｓｏｎほか、１９９６年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３４：ｐ．５２４−５２９）からである。
【００４４】
本発明はさらに、本発明のワクチン用の他のそのような有用分離株を選択／特定する独自の特異的な基準を提供する。特に、ＯｓｐＣ特異的抗体により死滅させられやすく、好ましくは、以下の属性のうちの１つ以上又は全てをも有する分離株を選択／特定することができる。即ち、その属性とは、（ｉ）補体特異的反応を介してＯｓｐＣ特異的抗体により死滅させられやすいこと、（ｉｉ）この分離株でワクチン接種したレシピエントにおいてＯｓｐＣ殺ボレリア菌抗体を誘導することができること、（ｉｉｉ）そのように誘導されたかなりの割合のＯｓｐＣ殺ボレリア菌抗体がＣ末端７アミノ酸（Ｏｓｐ７）内の保存エピトープに特異的であること、（ｉｖ）ＯｓｐＡ及びＯｓｐＢ発現能を欠くこと、及び／又は（ｖ）インビトロで構成的にＯｓｐＣを発現することができること、である。
【００４５】
Ａ．培養条件によるＯｓｐＡ／Ｂ発現の抑制及びＯｓｐＣ発現の増強
通常の病原性ボレリア属菌株（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓの株ＪＭＮＴ及びＮ４０）をダニ細胞株（Ｉｘｏｄｅｓ  ｓｃａｐｕｌａｒｉｓＩＳＥ６）と共培養することにより５日間にわたって、ＯｓｐＡ発現を下方制御することができ、ＯｓｐＣ発現を上方制御することができることをＯｂｏｎｙｏら（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１９９９年、３７：ｐ．２１３７−２１４１）は明らかにしている。最も著しい効果は３７℃で培養することで認められた。従って、この方法によって１種以上の通常の病原性ボレリア菌株が本発明のワクチンに有用な形態に変換されることになる。
【００４６】
Ｂ．突然変異によるＯｓｐＡ／Ｂ発現の抑制及びＯｓｐＣ発現の増強
別の実施態様において、元々ＯｓｐＡ及びＯｓｐＢを発現するボレリア属菌株に対して遺伝子操作を行ってＯｓｐＡ及びＯｓｐＢの発現をコードする遺伝子を下方制御又は削除することによりＯｓｐＣ発現を上方制御する。当該分野で既知の全ての遺伝子操作方法をこの目的に使用することを想定している。例えば、入手できるボレリア属菌株の複数の菌体にＯｓｐＡ／ＯｓｐＢ遺伝子の不活性化アナログを、抗生物質選択マーカを用いて調製したボレリア属菌適合性プラスミドの形で導入する（例えば、ＯｓｐＣ不活性化及び相補プラスミドをＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉＢ３１−Ａ３株に挿入することによりボレリア属菌におけるＯｓｐＣの発現をブロックすることができると報告しているＧｒｉｍｍほか、２００４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  １０１（９）：ｐ．３１４２−３１４７を参照されたい）。この導入プラスミドとＯｓｐＡ／ＯｓｐＢを含む天然プラスミドとの間に組換え現象がおこることによって突然変異ＯｓｐＡ／ＯｓｐＢプラスミドを含む一定数の組換えがうまくいったボレリア属菌が得られる。選択は、例えば、対応抗生物質の存在下における関連する抗生物質耐性と増殖とによることを前提とすることができる。ＯｓｐＡ／ＯｓｐＢが選択的に発現されなくなったボレリア属菌はＯｓｐＣの発現を上方制御することが想定されている。
【００４７】
別の任意選択的な実施態様では、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＢ及び／又は１種以上の別のＯｓｐ抗原を発現する１種以上の別のＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ又はボレリア属生物を別の生物として前記ワクチン組成物に含ませることができる。
【００４８】
各それぞれの不活化生物は約１×１０４乃至約１×１０１０個／ｍＬの範囲の濃度で上記ワクチンに存在させることが好ましい。特に、このワクチンは、１．０×１０８個／ｍＬ以上のＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓＳ−１−１０及び５．０×１０８個／ｍＬ以上のＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ５０７７２の用量でイヌに投与することが好ましい。
【００４９】
・他のＯｓｐＡ株
ＯｓｐＡ抗原を有する第２の株をＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓＢ−３１（ＡＴＣＣ番号３５２１０）などの通常の病原性実験室Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ分離株（Ｂａｒｂｏｕｒほか、１９８５年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５２：ｐ．４７８−４８４）とすることができる。特定の第２の生物は上記に例示したＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓＳ−１−１０株（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１６８０）である。北米以外の地域に対して最適化されたワクチン組成物の第２の生物として用いるのに適した別の株としては、例えば、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓＢ−３１（ＡＴＣＣ番号３５２１０）、Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ（例えば、ＡＴＣＣ番号５１５６７として入手可能）及びＢ．ｇａｒｉｎｉｉ（例えば、ＡＴＣＣ番号５１３８３及び同５１９９１として入手可能）並びに下記の表１に示した株が挙げられる。
【００５０】
【表１】
2010509217.tif 000003
前記ワクチン組成物には医薬用として許容可能なアジュバントを含ませることができる。「アジュバント」とは、特定の抗原に対する免疫反応を非特異的に増大させることにより所与のワクチンにおいて必要な抗原量及び／又は対象抗原に対して十分な免疫反応を生じるのに必要な注射頻度を減少させる作用物質である。動物のワクチン接種に好適なアジュバントとしては、（ピーナッツ油、モノオレイン酸マンノイド及びモノステアリン酸アルミニウムを含有する）アジュバント６５；完全又は不完全フロイントアジュバント；水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、ミョウバンなどのミネラルジェル；ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、リゾレシチン、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’，Ｎ７−ビス（２−ヒドロキシメチル）プロパンジアミン、メトキシヘキサデシルグリセロール、プルロニックポリオールなどの界面活性剤；ピラン、硫酸デキストラン、ポリＩＣ、ポリアクリル酸、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）（例えば、ＣＡＲＢＯＰＯＬ９４１）などのポリアニオン；ムラミルジペプチド、ジメチルグリシン、タフトシンなどのペプチド；及び油乳濁液が挙げられるが、これらに限定されるものではない。アジュバントに関する情報は、例えば、引用により本明細書に組み込まれているＰ．Ｔｉｊｓｓｅｎ  によるシリーズ［Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ、第３版１９８７年、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ］に開示されている。
【００５１】
任意選択的に、上記ワクチン組成物には、細菌及び真菌細胞壁成分（例えば、リポ多糖、リポ蛋白質、糖蛋白質、ムラミルペプチド）、植物由来の各種複合糖質（例えば、グリカン、アセマンナン）、動物由来の各種蛋白質及びペプチド（例えば、ホルモン、サイトカイン、共刺激因子）、ウイルス及び／又は他の供給源由来の新規核酸（例えば、二本鎖ＲＮＡ、ＣｐＧ）などの医薬用として許容可能な免疫刺激剤をさらに含ませることができる。
【００５２】
上記ワクチン組成物は、静脈内、筋肉内、皮下、経口、鼻腔内、皮内及び／又は腹腔内ワクチン接種を含む任意の標準的経路によって容易に投与することができる。このワクチン組成物がレシピエント動物及び投与経路の各種類に対して適切に製剤化されることが好ましいことは当業者なら理解するであろう。
【００５３】
従って、本発明はＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ及び他のボレリア属菌に対してイヌを免疫化する方法をも提供する。そのような方法の１つは、イヌに免疫学的有効量の本発明ワクチンを注射することによりイヌに適切なＯｓｐＡ及びＯｓｐＣ殺ボレリア菌抗体を産生させることを含む。
【００５４】
一実施態様において、本発明の皮下投与によってＯｓｐＣ７に特異的な殺ボレリア菌抗体を含む高濃度のＯｓｐＡ及びＯｓｐＣ殺ボレリア菌抗体が産生される。別の実施態様では、本発明は、有害なボレリア属菌に対して有効な各Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ株を特定の最小限の量で含むワクチンを提供する。別の実施態様では、本発明のワクチンは、イヌにおいてＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ及び他の病原性ボレリア属感染を防御するのに有効である。特定の実施態様では、上記ワクチンは、本発明の２種のＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ株と医薬用として許容可能なアジュバントとの安全で免疫学的に有効な組合せを含む。
【００５５】
本発明は、２種のＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ分離株を特定の最低限の量で含むワクチンがダニ感染後のボレリア属菌からイヌを防御することを開示する。本発明はさらに、ワクチン接種したイヌにおいて特定の最小限の量のＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ特異的ＯｓｐＡ及びボレリア属菌特異的ＯｓｐＣ殺ボレリア菌抗体を誘導するワクチンを開示する。また、本発明のワクチンは、許容可能な免疫刺激剤及び／又アジュバントと共に投与することもできる。
【実施例】
【００５６】
以下の実施例は、本発明の理解をさらに進めるのに役立つものであるが、本発明の有効範囲を何ら限定するものではない。
【００５７】
（実施例１）
組換えＯｓｐＡを用いたワクチン接種
Ａ．材料及び方法
・動物
Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、マサチューセッツ州）から５乃至１０週齢のＬＶＧハムスターを入手した。ハムスターは２１℃の室温でケージ当たり３乃至４匹を収容し、餌と水を自由に与えた。
【００５８】
・ハムスターのワクチン接種及び血清の採取
ハムスターの頸背部皮下に市販組換えＯｓｐＡ（ｒＯｓｐＡ）ワクチンＲＥＣＯＭＢＩＴＥＫ（登録商標）ライム（Ｌｙｍｅ）（Ｍｅｒｉａｌ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｄｕｌｕｔｈ、ジョージア州）を０．５ｍＬ接種し、この初回ワクチン接種の３週後に追加免疫を行った。初回ワクチン接種の３、７、９及び１５週後に、１群５匹の各ハムスター群をノーズ・アンド・マウス・カップに含ませたエーテルの吸入により軽く麻酔し、心臓内穿刺により放血させた。この血液を凝固させ、血清を分離して、使用するまで−７０℃で貯蔵した。さらに、ワクチン接種していないハムスター３匹からのハムスター血清をプールして対照正常血清として用いた。別の対照として、２０匹のハムスターの両大腿後部に、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓＳ−１−１０を含有する市販のイヌライム病全細胞ワクチン（Ｇａｌａｘｙ、Ｓｏｌｖａｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｉｎｃ．、Ｍｅｎｄｏｔａ  Ｈｅｉｇｈｔｓ、ミネソタ州、現Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｅｌｋｈｏｒｎ、ネブラスカ州）を０．２５ｍＬ接種した。これらのハムスターに追加免疫した後、上述のようにして血液を採取した。
【００５９】
・ＢＳＫ培地の調製
Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉのインビトロ培養のためにＢａｒｂｏｕｒ−Ｓｔｏｅｎｎｅｒ−Ｋｅｌｌｙ（ＢＳＫ）肉汁培地を用い、これを殺ボレリア菌抗体試験及び本発明全体にわたって記載した方法に用いる一次培地（ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）とした。ＢＳＫ培地は、Ｃａｌｌｉｓｔｅｒら［参考としてその全体が本明細書に援用されるＤｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｏｒｒｅｌｉａｃｉｄａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、セクション１１．５．１  −  １１．５．１２、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ２６、（２００３年）］により報告されたものと同様にして調製した。つまり、以下の方法によってＢＳＫ培地を調製した。
【００６０】
材料：
ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ）
ネオペプトン（Ｎｅｏｐｅｐｔｏｎｅ）（Ｄｉｆｃｏ）
クエン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）
グルコース（Ｓｉｇｍａ）
炭酸水素ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）
ＴＣイーストレート（ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ）（Ｄｉｆｃｏ）
ピルビン酸（Ｓｉｇｍａ）
Ｎ−アセチルグルコサミン（Ｓｉｇｍａ）
ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）
ゼラチン（微生物学用グレード；Ｄｉｆｃｏ）
５Ｎ  ＮａＯＨ  。
【００６１】
Ｌ−グルタミンを含有するが、炭酸水素ナトリウムを含有しないＩＯｘコンノート・メディカル・リサーチ・ラボラトリーズ（ＣＭＲＬ）１０６６（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）又はローズウェル・パーク・メモリアル・インスティテュート（ＲＰＭＩ）１６４０培地（Ｓｉｇｍａ）
ウサギ血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、５６℃４５分間加熱不活化
５６℃水浴
陽圧ポンプ
ミリポアフィルターマニフォールド（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ｆｉｌｔｅｒ  ｍａｎｉｆｏｌｄ）
プレフィルター（ｐｒｅｆｉｌｔｅｒ）（１２４ｍｍ）
０．２−、０．４５−及び０．８−μｍフィルター（１４２−ｍｍ径）
０．２−μｍベル・フィルター（ｂｅｌｌ  ｆｉｌｔｅｒ）
滅菌１００−ｍｌ容器
暗視野顕微鏡  。
【００６２】
ＢＳＫ培地の調製
１．以下のものを２−リットルフラスコ中で混合し、２乃至４時間混和した。９００ｍＬミニＱ二重濾過又は脱イオン蒸留水：
６．０ｇ  ＨＥＰＥＳ
５．０ｇ  ネオペプトン
０．７ｇ  クエン酸ナトリウム
５．０ｇ  グルコース
２．２ｇ  炭酸水素ナトリウム
２．５ｇ  ＴＣイーストレート
０．８ｇ  ピルビン酸
０．４ｇ  Ｎ−アセチルグルコサミン
５０ｇ  ウシ血清アルブミン（フラクションＶ）  。
【００６３】
２．これらの成分は攪拌板を最も低速の設定にしてゆっくりと混和した。何故なら、激しく攪拌すると、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉに毒性のある分解産物が生じる場合があるからである。
【００６４】
３．上記ＢＳＫ成分を混和している間に、ゼラチン溶液を以下の通り調製する。即ち、５００−ｍＬフラスコ中で、ミリＱ二重濾過又は脱水蒸溜水２００ｍＬとゼラチン１４ｇとを混合し、中程度の設定値で加熱し、攪拌して溶解させた。次いで、この溶液を１２１℃で１５分間加圧滅菌した後、５６℃の水浴に入れた。
【００６５】
４．ＢＳＫ成分が完全に溶解したとき、この溶液を５Ｎ  ＮａＯＨでｐＨ７．５に調整した。
【００６６】
５．次に、上記ゼラチン溶液２００ｍＬ、１０ｘＣＭＲＬ１０６６培地１００ｍＬ及び（５６℃４５分間）加熱不活化ウサギ血清６４ｍＬをその他のＢＳＫ成分と混合し、よく混和した。
【００６７】
ＢＳＫ培地の滅菌
６．前記陽圧ポンプを用いて、１２４−ｍｍプレフィルター及び最小孔径（底部）から最大孔径（最上部）まで積み重ねられた１４２−ｍｍ０．２−、０．４５−及び０．８−μｍ孔径フィルターを装着したミリポアフィルターマニフォールドを通してＢＳＫ培地を送り出した。［このＢＳＫ培地は加圧滅菌によって滅菌することができない。前濾過は、滅菌濾過の前に大きな粒子を除去しておくのに必要であった。］
７．次いで、前記陽圧ポンプ及び滅菌０．２−μｍベル・フィルターを用いて上記ＢＳＫ培地を滅菌容器中へ滅菌濾過した。
【００６８】
滅菌性の確認
８．滅菌ＢＳＫの１−ｍＬ分量を無菌的に取り出し、滅菌した１．５−ｍＬ微小遠心管に移して３５℃で一夜インキュベートした。残る滅菌濾過したＢＳＫは４℃で貯蔵した。
【００６９】
９．インキュベーション後、暗視野顕微鏡を用いてこの滅菌ＢＳＫを調べ、滅菌性を確認した。
【００７０】
１０．次に、この滅菌ＢＳＫを滅菌貯蔵容器中に移した。［滅菌ＢＳＫ培地の酸化を低減させるためにこの貯蔵容器に充填する際、その上部にできる空間を最小限に保った。］
Ｂａｒｂｏｕｒ−Ｓｔｏｅｎｎｅｒ−Ｋｅｌｌｙ（ＢＳＫ）培地の品質管理
ＢＳＫ培地を使用する前に、ＢＳＫが少数のボレリア属菌を増殖させるのに有利であること、及び生育可能なスピロヘータが凝集せずに増殖することを確認することは重要である。ＢＳＫ培地の極めて変化しやすい成分はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。本明細書で用いている品質管理プロトコルは、Ｃａｌｌｉｓｔｅｒほか、２００３年、上記文献に詳細に記載されているものと同様に、得られた培養物をインキュベートして検査する試験培養を利用したものである。
【００７１】
・ＯｓｐＡ殺ボレリア菌抗体の検出
ＯｓｐＡ殺ボレリア菌抗体は、フローサイトメトリー法及びＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓＳ−１−１０を用いて検出した（Ｃａｌｌｉｓｔｅｒほか、Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１９９４年、１５４：ｐ．１６２５−１６３２）。スピロヘータの新鮮培養液を新鮮なＢＳＫでほぼ５×１０６個／ｍＬのスピロヘータ濃度に希釈した。同時に、血清試料を新鮮ＢＳＫで４０倍希釈し、０．２ミクロン（μｍ）孔径微小遠心フィルターを通して滅菌した。次いで、２００μＬの分量を滅菌された１．５ｍＬねじ口微小遠心管に移し、ＢＳＫで８０倍から２０，４８０倍まで連続希釈した。血清試料を５６℃で１０分間加熱不活化した後、上記スピロヘータ懸濁液の１００μＬ分量（スピロヘータ：５×１０５個）及び滅菌モルモット補体（Ｓｉｇｍａ）１０μＬを添加した。こうした分析試料をよく混和し、３５℃で１６乃至２４時間インキュベートした。
【００７２】
インキュベーション後、ＰＢＳ４００μＬ及びアクリジンオレンジ１μｇ／ｍＬを入れたポリプロピレン管に各分析試料懸濁液１００μＬを移した。次いで、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメータ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ｌｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、カリフォルニア州）を用いて殺ボレリア菌活性を検出した。スピロヘータは、ゲート処理（ｇａｔｉｎｇ）（ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって単離し、流速を低く設定して１乃至２分間分析した。ＯｓｐＡ殺ボレリア菌抗体は、アクリジンオレンジが水疱状の生育不能スピロヘータ中に入り込む時に生じる蛍光強度の増大を観察することによって間接的に検出した。対照正常血清との比較における平均蛍光強度の１３％以上のシフトを陽性と見なした（Ｃａｌｌｉｓｔｅｒほか、Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２年、９：ｐ．９０８−９１２）。次に、暗視野顕微鏡によって水疱状の運動能力のないＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの存在を確認した。各分析試料に対して陽性対照を含め、ラン毎の反応性を同一（＋／−１希釈）にするには分析法間の変動をできるだけ少なくすることが必要であった。さらに、各イヌから採取した血液試料を同時に分析した。
【００７３】
Ｂ．結果
ｒＯｓｐＡワクチンを用いてワクチン接種すると、７週後にごくわずかな量（平均力価：＜６１）のＯｓｐＡ殺ボレリア菌抗体が誘導されたが、１５週後では検出されなかった（表２）。これに対して、通常の（Ｂａｒｂｏｕｒほか、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１９８５年、１５２：ｐ．４７８−４８４）Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ株（Ｓ−１−１０）を含有するイヌのワクチンを用いてハムスターにワクチン接種すると、高レベルの殺ボレリア菌ＯｓｐＡ抗体が誘導され、７週目にピーク（力価：＞２５６０）に達し、実験期間中、高値を維持した。
【００７４】
表２：  ｒＯｓｐＡ又はＧＡＬＡＸＹ（商標）（Ｓ−１−１０）イヌライム病ワクチンを用いたワクチン接種後のＯｓｐＡ殺ボレリア菌抗体ｂの平均力価ａ
【００７５】
【表２】
2010509217.tif 000004
従って、イヌの組換えＯｓｐＡワクチンではハムスターにおいて有意な力価のＯｓｐＡ殺ボレリア菌抗体を誘導できない。
【００７６】
（実施例２）
組換えＯｓｐＣを用いたワクチン接種
Ａ．材料及び方法
・動物
Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、マサチューセッツ州）から５乃至１０週齢のＬＶＧハムスターを入手した。ハムスターは２１℃の室温でケージ当たり３乃至４匹を収容し、餌と水を自由に与えた。
【００７７】
・組換え（「ｒ：ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ」）ＯｓｐＣワクチンの調製
ｒＯｓｐＣは、以前に報告されたもの（Ｒｏｕｓｓｅｌｌｅほか、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１９９８年、１７８：ｐ．７３３−７４１）と同様にして、ｐＸ３−２２を含有するＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９から回収した。つまり、このＥ．ｃｏｌｉをアンピシリンを含有する２ｘＴＹブロス中３７℃で培養し、これにイソプロピル−β−ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（０．１ｍＭ）を指数増殖期の間に添加した。次いで、細胞を遠心分離によりペレット化し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁して超音波処理により溶解させた。次に、トリトンＸ−１００（１％容積／容積）を添加した後、溶解物を１０，０００×ｇで５分間遠心した。次いで、この超音波処理したＥ．ｃｏｌｉを遠心によりペレット化し、上清を、アミノ末端のビオチン化精製タグを介してＯｓｐＣに結合したＳｏｆｔＬｉｎｋ樹脂（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含有するカラム上を通した。次に、５ｍＭビオチン（Ｓｉｇｍａ）をも含有する精製緩衝液でこの結合ＯｓｐＣを溶出させた。
【００７８】
・ハムスターのワクチン接種及び血清の採取
ハムスターの頸背部皮下に、７５μｇのｒＯｓｐＣを含有するフロイント完全アジュバントを０．１ｍＬ接種し、この初回ワクチン接種の３週後に７５μｇのｒＯｓｐＣを含有するフロイント不完全アジュバントで追加免疫を行った。初回ワクチン接種の５週後に、各ハムスターをノーズ・アンド・マウス・カップに含ませたエーテルの吸入により軽く麻酔し、心臓内穿刺により放血させた。この血液を凝固させ、血清を分離して、使用するまで−７０℃で貯蔵した。さらに、正常なハムスター３匹からのハムスター血清をプールして対照正常血清として用いた。
【００７９】
・ＯｓｐＣ抗体の検出
ｒＯｓｐＣをコーティング緩衝液（０．０１５Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３、０．０３５Ｍ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）で１０００ｎｇ／ｍＬとなるように希釈し、各１００μＬ量を個々の平底アミン結合マイクロタイター・ウェル（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、マサチューセッツ州）に添加した。マイクロタイター・プレートを４℃で一夜インキュベートした。インキュベーション後、プレートをＰＢＳ（ｐＨ７．２）で３回洗浄し、０．０５％ＴＷＥＥＮ２０（Ｓｉｇｍａ）及び１％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）を含有するＰＢＳで振盪しながら室温で１時間ブロックした。ブロックの後、プレートを再びＰＢＳで洗浄した。次いで、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで８０倍から２０，４８０倍まで連続希釈したハムスター血清各１００μＬ量を個々のウェルに添加し、これらのプレートを室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートをＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで３，０００倍希釈した抗ハムスターＩｇＧホースラディッシュペルオキシダーゼ結合体（Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋｎｉｋａ  Ｃａｐｐｅｌ）１００μＬを各ウェルに添加し、これらのプレートを室温で１時間再度インキュベートした。次に、プレートをＰＢＳで３回洗浄し、リン酸ｏ−フェニレンジアミン（０．４ｍｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）１００μＬを各ウェルに添加して室温で３０分間インキュベートさせた。１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を１００μＬ添加して反応を止め、直ちに４９０ｎｍ（モデルＥＬ３１１；Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｉｎｃ．、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、バーモント州）での吸光度を測定した。
【００８０】
・ＯｓｐＣ殺ボレリア菌抗体の検出
Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ５０７７２を用いた以外は前述（実施例１）と同様にして、ＯｓｐＣ殺ボレリア菌抗体を検出した。
【００８１】
Ｂ．結果
ｒＯｓｐＣワクチンを用いてワクチン接種すると、ＥＬＩＳＡにより検出される高レベルのＯｓｐＣ抗体が誘導されたが（以下の表３）、殺ボレリア菌活性は低レベル（力価：８０）で存在するに過ぎなかった。従って、ｒＯｓｐＣを用いてワクチン接種すると、高濃度のＯｓｐＣ抗体が誘導されたが、その反応は、感染に対する防御をもたらさない抗体（例えば、オプソニン化抗体）でほとんど構成された。このことは、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ５０７７２ワクチン中の蛋白質の７５μｇ濃度が多数の別の非ＯｓｐＣ蛋白質の存在を計上しないで算出されることを考慮すると、特に重要であった。従って、全体的な結果（実施例１及び２）から、組換えＯｓｐでは完全な状態のＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓよりも殺ボレリア菌抗体誘導の量が相当に少ないというこれまでの知見（Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒほか、Ｖａｃｃｉｎｅ  ２００３年、２０：ｐ．１８１−１９３）が裏付けられた。
【００８２】
表３：  ｒＯｓｐＣによるワクチン接種後のＯｓｐＣＥＬＩＳＡ又はＯｓｐＣ殺ボレリア菌抗体試験ｂによって検出された抗体の平均力価ａ
【００８３】
【表３】
2010509217.tif 000005
従って、イヌの組換えＯｓｐＣワクチンではハムスターにおいて有意な力価のＯｓｐＣ殺ボレリア菌抗体を誘導できない。
【００８４】
（実施例３）
Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ分離株Ｓ−１−１０を用いたワクチン接種
Ａ．材料及び方法
・生物
Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ分離株Ｓ−１−１０は、通常Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓＢ３１と区別できない代表的な病原性株である（Ｂａｒｂｏｕｒほか、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，  １９８５年、１５２：ｐ．４７８−４８４）。この分離株は元々、ウィスコンシン州Ｌａ  Ｃｒｏｓｓｅ付近から１９９８年２月に捕獲されたシロアシネズミＰｅｒｏｍｙｓｃｕｓ  ｌｅｕｃｏｐｕｓの腎臓からウィスコンシン州Ｌａ  ＣｒｏｓｓｅのＧｕｎｄｅｒｓｅｎ  Ｌｕｔｈｅｒａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＦｏｕｎｄａｔｉｏｎのＳｔｅｖｅｎ  Ｍ．Ｃａｌｌｉｓｔｅｒ博士によって回収され、イヌのライム病ワクチンに組み入れるためにＳｏｌｖａｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈによりライセンス供与されたものである。その後の市販品（ＧＡＬＡＸＹ（商標）ライム（Ｌｙｍｅ））は１９９７年４月１７日にＳｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈによって獲得された。この菌はＯｓｐＡ、ＯｓｐＢ及びＯｓｐＣを発現する。しかしながら、感染性Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ分離株に特有であるが、スピロヘータを実験室ＢＳＫ培地で培養すると、有意により高濃度のＯｓｐＡ及びＯｓｐＢが産生される。ＯｓｐＣの発現は３５℃でのインキュベーションによって最大化することができることが分かっている（Ｓｃｈｗａｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２００３年、３１：ｐ．１０８−１１２）。
【００８５】
・動物
８週齢のビーグル幼犬（Ｒｉｄｇｌａｎ  Ｆａｒｍｓ、Ｍｏｕｎｔ  Ｈｏｒｅｂ、ウィスコンシン州）を共同飼育し、餌と水を自由に与えた。実験はＳｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ：Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって審査され、承認された。
【００８６】
・Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓＳ−１−１０ワクチンの調製
３５℃のＢＳＫにおけるインキュベーションにより対数増殖期に達したＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓＳ−１−１０の新鮮培養物を、二成分エチレンイミン（ＢＥＩ：ｂｉｎａｒｙ  ｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ）を最終濃度１０ｍＭとなるように添加してさらに４８時間インキュベートすることによって不活化した。不活化後、滅菌チオ硫酸ナトリウムを添加して３５℃で６乃至１２時間インキュベートすることによりＢＥＩを中和した。次いで、スピロヘータを遠心によりペレット化し、≦３０μｇ／ｍＬのゲンタマイシン及び≦３０単位／ｍＬのナイスタチンを含有する滅菌平衡塩類溶液に再懸濁した。次に、このスピロヘータに５％Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ（登録商標）（ＭＶＰ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）及び１％ＨＥＰＥＳを混合することによって１．０ｍＬ用量が≧２．５×１０７個のスピロヘータを含有するようにした。
【００８７】
・ワクチン接種及び血清の採取
イヌの頚部皮下に１ｍＬ用量の上記Ｓ−１−１０ワクチンを接種し、２１日後にさらに１ｍＬ用量を追加免疫した。追加免疫ワクチン接種（試験２１日目）の直前並びに試験２８、３５、４７、８３及び１１３日目に頚静脈穿刺によって全血を採取した。次いで、遠心により血清を分離し、これを試験するまで−２０℃で貯蔵した。
【００８８】
・殺ボレリア菌抗体の検出
上記の実施例１及び２と同様に、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓＳ−１−１０及び５０７７２を用いてフローサイトメトリーによりＯｓｐＡ及びＯｓｐＣ殺ボレリア菌抗体を検出した。
【００８９】
Ｂ．結果
Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓＳ−１−１０を用いてワクチン接種することにより高レベルの殺ボレリア菌ＯｓｐＡ抗体が確実に誘導された。この抗体は試験２１日目には検出可能であり、試験２８日目にピークに達し、試験１１３日目でも依然として検出可能であった（以下の表４）。これに対して、ＯｓｐＣ殺ボレリア菌抗体は検出されなかった（力価：１：８０未満）。すなわち、通常のＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ株では、スピロヘータを３５℃でインキュベートすることによりＯｓｐＣ発現を最大化したにもかかわらず、ＯｓｐＣ殺ボレリア菌抗体の産生を誘導できなかった。
【００９０】
表４：  Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓＳ−１−１０によるワクチン接種後のＯｓｐＡ又はＯｓｐＣ殺ボレリア菌抗体の平均力価ａ（＝８）
【００９１】
【表４】
2010509217.tif 000006
従って、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ分離株Ｓ−１−１０を用いたワクチンでは有意な力価のＯｓｐＣ殺ボレリア菌抗体を誘導できなかった。
【００９２】
（実施例４）
Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ分離株５０７７２を用いたワクチン接種
Ａ．材料及び方法
・菌
Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ５０７７２は元々Ａｎｄｅｒｓｏｎほか、Ｊ．ｏｆ  Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９６年、３４：ｐ．５２４−５２９に報告されたユニークなｏｓｐＡ−／ｏｓｐＢ−株であり、著者らがＯｓｐＣ抗原を発現するものとみなすことができなかった株である。この５０７７２株はＯｓｐＣ抗原を発現するものとして米国特許第６，４６４，９８５号に開示されており、これは引用により本明細書に組み込まれているが、この株はＰＴＡ−４３９の番号でＡＴＣＣに寄託されているとこの特許に記載されている。
【００９３】
・動物
８週齢のビーグル幼犬（Ｒｉｄｇｌａｎ  Ｆａｒｍｓ、Ｍｏｕｎｔ  Ｈｏｒｅｂ、ウィスコンシン州）を共同飼育し、餌と水を自由に与えた。実験はＳｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ：Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって審査され、承認された。
【００９４】
・Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ５０７７２ワクチンの調製
上記の実施例３で説明したものと同様にして、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ５０７７２ワクチンを調製した。
【００９５】
・ワクチン接種及び血清の採取
イヌの頚部皮下に１ｍＬ用量の上記５０７７２ワクチンを接種し、２１日後にさらに１ｍＬ用量を追加免疫した。追加免疫ワクチン接種（試験２１日目）の直前並びに試験２８、３５、４７、８３及び１１３日目に頚静脈穿刺によって全血を採取した。次いで、遠心により血清を分離し、これを試験するまで−２０℃で貯蔵した。
【００９６】
・殺ボレリア菌抗体の検出
上記の実施例１及び２と同様に、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ５０７７２を用いてフローサイトメトリーによりＯｓｐＣ殺ボレリア菌抗体を検出した。
【００９７】
Ｂ．結果
Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ５０７７２を用いてワクチン接種することにより高レベルの殺ボレリア菌ＯｓｐＣ抗体が確実に誘導された。この抗体は試験３５日目にピークに達し、試験１１３日目でも依然として検出可能であった（以下の表５）。すなわち、ｒＯｓｐＣ又はＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ分離株（Ｓ−１−１０）によるワクチン接種とは対照的に、上記のユニークなＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ株５０７７２を用いてワクチン接種すると、有意なレベルのＯｓｐＣ殺ボレリア菌抗体が誘導された。
表５：  Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ５０７７２によるワクチン接種後のＯｓｐＣ殺ボレリア菌抗体の平均力価ａ（＝８）
【表５】
2010509217.tif 000007
【００９８】
従って、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ分離株５０７７２を含むワクチンは高濃度のＯｓｐＣ殺ボレリア菌抗体を誘導する。
【００９９】
（実施例５）
Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ分離株Ｓ−１−１０及び５０７７２を含むワクチンの調製
Ａ．材料及び方法
・増殖
Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ分離株Ｓ−１−１０及び５０７７２の凍結保存培養物を標準的な条件下で培養した。すなわち、これらの保存培養物を、５％ＣＯ２を混入させた空気の雰囲気下で［本明細書にその全体が引用により組み込まれているＣａｌｌｉｓｔｅｒほか、１９９０年、Ｊ．ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２８：ｐ．３６３−３６５に準じて調製した］ＢＳＫ（Ｂａｒｂｏｕｒ−Ｓｔｏｅｎｎｅｒ−Ｋｅｌｌｙ）培地５乃至１７ｍＬを含有する個々のねじ口培養管中、それぞれ３３±２℃及び３５±２℃で増殖させた。対数増殖に達した後、これらの培養物を用いて１５０乃至２００ｍＬの新鮮ＢＳＫ培地に植菌し、次に、これを培養物が対数増殖に達するまでインキュベートした。次いで、得られた懸濁液を用いて、１０乃至２０リットルジャグに入れた５乃至１０リットルの新鮮ＢＳＫに植菌し（生産培養）た後、さらに、上記のようにしてインキュベートした。
【０１００】
・不活化
生産培養物中のスピロヘータを、ＢＥＩを１０ｍＭの濃度となるように添加して２４乃至４８時間ゆっくりと攪拌しながらインキュベートすることによって不活化した。スピロヘータの不活化後、１０．６ｍＬの滅菌済３．０１５Ｍチオ硫酸ナトリウムを各１リットルのＢＳＬ／スピロヘータ懸濁液に添加して６乃至１２時間ゆっくりと攪拌しながらインキュベートすることによりＢＥＩを中和した。
【０１０１】
・濃縮及び混合
不活化スピロヘータを遠心によりペレット化し、３０．０μｇ／ｍＬのゲンタマイシン及び３０単位／ｍＬのナイスタチンを含有する滅菌平衡塩類溶液に再懸濁した。この試験ワクチンに５％Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ（登録商標）（ＭＶＰ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を混合し、２．０ｍＬガラスバイアルに充填して各用量（１．０ｍＬ）に≧２．５×１０７個／ｍＬのＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓＳ−１−１０、≧５．０×１０８個／ｍＬのＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ５０７７２、１％ＨＥＰＥＳ、２９μ／ｍＬゲンタマイシン及び２９単位／ｍＬナイスタチンを含有させた。
【０１０２】
（実施例６）
Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ分離株Ｓ−１−１０及び５０７７２を含むワクチンの安全性及び有効性
Ａ．材料及び方法
・動物
８週齢のビーグル幼犬（Ｒｉｄｇｌａｎ  Ｆａｒｍｓ、Ｍｏｕｎｔ  Ｈｏｒｅｂ、ウィスコンシン州）を個別又は共同飼育し、餌と水を自由に与えた。実験はＳｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）によって審査され、承認された。
【０１０３】
・ワクチン接種及び血清の採取
イヌの頚部皮下に１ｍＬ用量の上記ワクチンを接種し、２１日後にさらに１ｍＬ用量を追加免疫した。初回（試験−３日目）及び追加免疫ワクチン接種（試験２１日目）の前並びに試験２８、３５、４３、７８、１０６、１３４、１６２及び１９７日目にも頚静脈穿刺によって全血を採取した。次いで、遠心により血清を分離し、これを試験するまで−２０℃で貯蔵した。
【０１０４】
・ワクチン接種後の観察
各ワクチン接種後、注射部位を反応が感じられなくなるまで毎日触診し、直腸温をワクチン接種後４乃至６時間及びワクチン接種後１乃至３日目に記録した。
【０１０５】
・ダニ感染
２回目のワクチン接種の３週後に、イヌを胸腔の右側で剃毛し、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ感染Ｉ．ｓｃａｐｕｌａｒｉｓ  ｔｉｃｋの雌１０匹及び雄１０匹を入れたラバーカップを剃毛部にテープ及び包帯ラップ（ｂａｎｄａｇｅ  ｗｒａｐ）で固定した。これらのダニに７日間吸血させた。
【０１０６】
・ダニにおけるＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓの検出
ダニの口器をメスで除去し、中腸を掻き裂き、スライドガラスになすりつけて室温で一夜乾燥させた。乾燥後、このスライドをアセトンで８乃至１０分間固定し、風乾した。種特異的マウスＯｓｐＡモノクロナール抗体Ｈ５３３２をＰＢＳ（ｐＨ７．２）で４０倍希釈し、ＰＢＳで５００倍希釈したヒツジ抗マウスフルオレセインイソチオシアネート標識免疫グロブリンＧ抗体を重層した。インキュベーション後、スライドをＰＢＳですすぎ、風乾して蛍光顕微鏡により調べた。各スライドは経験豊かな二名の微生物学者により独立に調べた。
【０１０７】
・血液試料
試験７８、１０６、１３４、１６２及び１９７日目に全血を血清分離輸送（ＳＳＴ）管に採取し、血清を分離して試験するまで−２０℃で貯蔵した。
【０１０８】
・ＯｓｐＡ抗体の除去
以前に報告されたもの（Ｃａｌｌｉｓｔｅｒほか、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１９９３年、１６７：ｐ．１５８−１６４）と同様にして、ＯｓｐＡ−グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合蛋白質を発現するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（「Ｅ．ｃｏｌｉ」）ＤＨ５αから組換え（ｒ）ＯｓｐＡを回収した。つまり、この大腸菌を、アンピシリンを含有する２ｘＴＹブロス中３７℃で培養し、指数増殖期中にイソプロピル−β−ガラクトピラノシド（「ＩＰＴＧ」）（０．１ｍＭ）を添加した。次いで、細胞を遠心によりペレット化し、リン酸緩衝食塩水（「ＰＢＳ」）に再懸濁して超音波処理により溶解させた。次に、トリトンＸ−１００（１％容積／容積）を添加した後、溶解液を１０，０００×ｇで５分（ｍｉｎ．）間遠心した。次に、上記融合蛋白質を含有する上清をグルタチオン−セファロース４Ｂカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に通し、５０ｍＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ８．０）プラス５ｍＭ還元グルタチオンで組換えＯｓｐＡを溶出し、これを精製緩衝液（５０ｍＭトリス［ｐＨ８］、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％トリトンＸ−１００）に再懸濁した。
【０１０９】
次に、ｒＯｓｐＡ融合蛋白質を臭化シアン（ＣＮＢｒ）活性化によりセファロース４Ｂに結合させた。具体的には、０．８ｇのＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）をカップリング緩衝液（０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３−０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．３）で洗浄し、カップリング緩衝中の２ｍｇ量のＯｓｐＡをこのゲルに添加し、この混合液を室温で２時間静かに振盪した。ゲルをカップリング緩衝液で２回洗浄した後、４ｍＬのエタノールアミン（ｐＨ９）を添加し、ゲルを２時間インキュベートして未結合部位をブロックした。次いで、ゲルを５０ｍＬの０．１Ｍ酢酸ナトリウム−０．５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ４．０）で３回洗浄した後、ＰＢＳ中で平衡化した。ＰＢＳで１０倍希釈した免疫血清の試料１ｍＬを４回上記カラムに通した。
【０１１０】
・ＯｓｐＣ抗体の除去
以前に報告された（Ｒｏｕｓｓｅｌｌｅほか、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１９９８年、１７８：ｐ．７３３−７４１）ようにして、ｐＸ３−２２を含有するＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９からｒＯｓｐＣを回収した。この組換え蛋白質の産生は上記のｒＯｓｐＡで述べたものと同様にして誘導された。次いで、超音波処理したＥ．ｃｏｌｉ細胞を遠心によりペレット化し、上清を、ＯｓｐＣとそのアミノ末端のビオチン化精製タグを介して結合したＳｏｆｔＬｉｎｋ樹脂（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含有するカラム上を通した。次に、５ｍＭビオチン（Ｓｉｇｍａ）をも含有する精製緩衝液でこの結合ＯｓｐＣを溶出させた。
【０１１１】
次に、１ｍＬ容量のテトラリンク四量体アビジン樹脂（Ｐｒｏｍｅｇａ）を洗浄し、４０ｍＬのＰＢＳに懸濁し、１０ｍｍ×７０ｍｍのポリエチレンカラムにロードした。１ｍＬ容量のＰＢＳ中の０．５ｍｇ量の透析ｒＯｓｐＣを上記カラムに通し、タンパク質測定（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により結合を確認した。次いで、ＰＢＳで１０倍希釈した１ｍＬ容量の免疫血清を４回このカラムに通した。
【０１１２】
・ＯｓｐＣ７特異的抗体の除去
以前に報告された（本明細書にその全体が引用により組み込まれているＬｏｖｒｉｃｈほか、Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５年、１２：ｐ．７４６−７５１）ようにして、ｐＸＴ７を含有するＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９から、ＯｓｐＣの７個のＣ末端アミノ酸（ＯｓｐＣ７）を含有する融合蛋白質を回収した。この組換え蛋白質の産生は上記のｒＯｓｐＡで述べたものと同様にして誘導された。次いで、超音波処理したＥ．ｃｏｌｉ細胞を遠心によりペレット化し、上清を、ＯｓｐＣ７とそのアミノ末端のビオチン化精製タグを介して結合したＳｏｆｔＬｉｎｋ樹脂（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含有するカラムに通した。次に、５ｍＭビオチン（Ｓｉｇｍａ）をも含有する精製緩衝液でこの結合ＯｓｐＣ７を溶出させた。次に、１ｍＬ容量のテトラリンク四量体アビジン樹脂（プロメガ社）を洗浄し、４０ｍＬのＰＢＳに懸濁し、１０ｍｍ×７０ｍｍのポリエチレンカラムにロードした。１ｍＬ容量のＰＢＳ中の０．５ｍｇ量の透析ｒＯｓｐＣを上記カラムに通し、タンパク質測定（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により結合を確認した。次いで、ＰＢＳで１０倍希釈した１ｍＬ容量の免疫血清を４回このカラムに通した。
【０１１３】
・殺ボレリア菌抗体の検出
上記の実施例１及び２と同様に、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓＳ−１−１０及び５０７７２を用いてフローサイトメトリーによりＯｓｐＡ及びＯｓｐＣ殺ボレリア菌抗体を検出した。
【０１１４】
・皮膚生検
試験７８、１０６、１３４、１６２及び１９７日目にダニ付着の近傍部位から使い捨ての４ｍｍ穿刺器具を用いて皮膚生検材料を採取した。これらの生検材料は、９ｍｌのゼラチンを補ったＢＳＫ（Ｃａｌｌｉｓｔｅｒほか、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９０年、２８：ｐ．３６３−３６５）（ＢＳＫ＋Ｇ）、４０乃至５０マイクログラム（μｇ）／ｍＬリファンピン及び８μｇ／ｍＬカナマイシンを含有する別々の管に入れた。培養物は３５±２℃で３週間インキュベートし、暗視野顕微鏡検査法により週１回スピロヘータを調べた。
【０１１５】
・免疫抑制
イヌにおいて、感染後１３日から始めて５日間デキサメタゾン（０．４ｍｇ／ｌｂ体重）の連日投与により免疫を抑制した。
【０１１６】
・臨床的観察
イヌを、こわばり（足に全体重をかけたがらないこと）、跛行（歩行又は走行中足をかばうこと）又は歩行困難（免荷（ｎｏｎ−ｗｅｉｇｈｔ  ｂｅａｒｉｎｇ））を含む肢／関節障害について毎日観察した。採点は少なくとも２名の観察者の合意によって行い、イヌは、他の外傷を全て除外するために担当獣医によって観察した。
【０１１７】
・剖検
少なくとも３連続観察期間の間、肢／関節障害を有したイヌは安楽死させて剖検した。肘、手根、膝、足根、心臓、脾臓、膀胱及び両腎臓からの組織試料を採取し、培養によるＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの単離のために処理した。関節組織は９ｍＬのＢＳＫ＋Ｇを含有する個々の管中で培養した。他の組織（心臓、脾臓、膀胱及び腎臓）は９ｍＬのＢＳＫ＋Ｇと混合し、ストマッチャーでよくホモジナイズし、１ｍＬ量を９ｍＬの新鮮ＢＳＫ＋Ｇを含有する別の管に移した。培養物は３５±２℃でインキュベートとした。
【０１１８】
残りのイヌは試験終了時に安楽死させて剖検した。これらのイヌからの組織試料は肘、手根、膝及び足根の関節包及び腱から採取し、組織病理検査のために１０％緩衝ホルマリン中に貯蔵した。さらに、肘、手根、膝及び足根の関節包及び腱からの試料を９ｍＬのＢＳＫ＋Ｇ又は抗生物質含有ＢＳＫ＋Ｇを入れた個々の管に入れ、３５±２℃で３週間インキュベートした。
【０１１９】
・ウエスタンブロッティング
ウエスタンブロッティングは標準的な技術を用いて実施した。Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ２９７を試料緩衝液中で５分間煮沸し、１５０μｇの全蛋白質を０．１％ＳＤＳ−１２％ポリアクリルアミドゲル（櫛を含まない４％ポリアクリルアミド濃縮用ゲル）上にロードした。蛋白質濃度は蛋白質測定キットで測定し、電気泳動装置において２つのゲルを同時に泳動させた。電気泳動後、蛋白質をニトロセルロースに移し、このニトロセルロースを細片に切ってＰＢＳ−０．３％ＴＷＥＥＮ２０で２２℃３０分間ブロックした。次いで、細片を１００倍希釈したイヌ血清と共に２２℃で１時間インキュベートした後、ＰＢＳ−０．３％ＴＷＥＥＮ２０で３回洗浄した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗イヌＩｇＧ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、メリーランド州）を添加し、これらの細片を２２℃で３０分間インキュベートした後、ＴＭＢ膜ペルオキシダーゼ基質システム（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、メリーランド州）で発色させた
Ｂ．結果
・ワクチンの安全性
イヌは、ワクチン接種後、直腸温の上昇がないなど、臨床的に正常な状態を維持した。しかしながら、ワクチンを接種されたイヌは注射部位に軽度の腫脹を生じ、これは８日以内に消散した。その最大の反応は（ワクチン接種後２４時間の）１×１×０．５ｃｍの大きさであった。
【０１２０】
・ワクチン接種後の血清
プラセボ接種では、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓに特異的な抗体を誘導することができなかった。これに対し、上記ワクチンの接種では、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ分離株Ｓ−１−１０又は５０７７２を用いることで検出される殺ボレリア菌抗体が有意なレベルで誘導された。Ｓ−１−１０を用いて検出される殺ボレリア菌抗体の平均力価は追加免疫ワクチン接種（試験２８日目）の１週後にピークに達し、試験１９７日目でも依然として検出可能であった（下記表６）。同様に、分離株５０７７２に特異的な高濃度の殺ボレリア菌抗体が試験２８日目までに存在し、試験４３日目ではなお高く、試験１９７日目でも依然として検出可能であった（下記表７）。
【０１２１】
表６：  ワクチン接種後の殺ボレリア菌活性ｂの平均力価ａ（ｎ＝１５）
【０１２２】
【表６】
2010509217.tif 000008
表７：  ワクチン接種後の殺ボレリア菌活性ｂの平均力価ａ（ｎ＝１５）
【０１２３】
【表７】
2010509217.tif 000009
・ＯｓｐＡ及びＯｓｐＣ殺ボレリア菌抗体の確認
上記殺ボレリア菌活性がＯｓｐＡ及びＯｓｐＣ殺ボレリア菌抗体によるものであることを確認するために、上記ワクチンを用いてワクチン接種した５頭のイヌからの免疫血清をｒＯｓｐＡ又はｒＯｓｐＣを含有する別々のカラムに通し、殺ボレリア菌活性に及ぼす影響を調べた。これらの組換え蛋白質で上記血清を吸収させることによりＯｓｐＡ特異的又はＯｓｐＣ特異的抗体を除去すると、それぞれＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓＳ−１−１０又は５０７７２分離株を用いて検出される殺ボレリア菌抗体が著しく（４分の１以下に）減少した。従って、こうした全体的な知見から、上記ワクチンが有意なレベルのＯｓｐＡ及びＯｓｐＣ殺ボレリア菌抗体を誘導し、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓＳ−１−１０又は５０７７２により検出される殺ボレリア菌活性が、それぞれＯｓｐＡ又はＯｓｐＣ殺ボレリア菌抗体にほとんど限定されたものであることが確認された。下記の表８を参照されたい。
【０１２４】
表８：ワクチンを用いてワクチン接種したイヌ（ｎ＝５）からの血清における殺ボレリア菌活性に及ぼすＯｓｐＡ又はＯｓｐＣ抗体除去の影響
【０１２５】
【表８】
2010509217.tif 000010
・ＯｓｐＣ７特異的殺ボレリア菌抗体の確認
上記ＯｓｐＣ殺ボレリア菌抗体がかなりの割合のＯｓｐＣ７特異的殺ボレリア菌抗体を含有することを確認するために、上記ワクチンを用いてワクチン接種した５頭のイヌからの免疫血清をｒＯｓｐＣ７含有カラムに通し、殺ボレリア菌活性に及ぼす影響を調べた。この組換えＯｓｐＣ７蛋白質で上記血清を吸収させることによりＯｓｐＣ７特異的抗体を除去すると、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ５０７７２分離株を用いて検出される殺ボレリア菌抗体が著しく（２乃至４分の１に）減少した。従って、これらの知見から、上記ワクチンにより、保存ＯｓｐＣ７エピトープに特異的なＯｓｐＣ殺ボレリア菌抗体が有意なレベルで誘導されることが確認された。下記の表９を参照されたい。
【０１２６】
表９：  ワクチンを用いてワクチン接種したイヌ（ｎ＝５）からの血清における殺ボレリア菌活性に及ぼすＯｓｐＣ７抗体除去の影響
【０１２７】
【表９】
2010509217.tif 000011
・感染ダニに対するＯｓｐＡ及びＯｓｐＣ殺ボレリア菌抗体の滅菌能
ワクチン接種又は対照イヌにおいて吸血したダニの中腸を調べることによって、ワクチンにより誘導されたＯｓｐＡ及びＯｓｐＣ殺ボレリア菌抗体がダニを滅菌したことが確認された。プラセボ接種したイヌ１５頭中１３頭において吸血した雌性ダニ１０６匹中３４匹（３２％）からのダニ塗抹においてＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓが検出された（下記の表１０）。これに対して、ワクチン接種したイヌにおいて吸血した雌性ダニからの中腸ではスピロヘータは検出されなかった（９９匹中０）（ｐ＜０．０００１）。
【０１２８】
表１０：  ワクチン接種又は対照イヌから取り出した雌性ダニにおけるＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓの検出
【０１２９】
【表１０】
2010509217.tif 000012
・皮膚からＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓが回収されないようにする上記ワクチンの能力
上記ワクチンにより誘導された殺ボレリア菌抗体はスピロヘータが皮膚にコロニーを形成するのも防止した。ダニ感染後１ヶ月おきにプラセボ接種イヌから採取した７１個の生検材料のうち５６個（７９％）からＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓが回収され（下記の表１１）、これら１５頭のイヌのうちの１４頭（９３％）の少なくとも１個の皮膚生検材料からスピロヘータが回収された。これに対して、上記ワクチンを接種したイヌから採取したどの皮膚生検材料からもＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓは回収されなかった（ｐ＜０．０００１）。
【０１３０】
表１１：  ワクチン接種又は非ワクチン接種対照イヌの皮膚からのＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓの単離
【０１３１】
【表１１】
2010509217.tif 000013
・感染の血清学的証拠をもたらさないようにする上記ワクチンの能力
上記ワクチンはライム病特有の抗体の発生をも阻止した。これまでの研究（ＳＰＡＨＣ  Ｒｅｐｏｒｔ  Ｂ０１−１８４−０１  Ｒ）によって、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓによる感染はほぼ２０ｋＤａの蛋白質に結合するイヌ抗体を確実に誘導することが確認されたが、この反応は上記ワクチンにより誘導されなかった（図１）。今回の試験では、感染特異的２０ｋＤａ蛋白質に結合する抗体は１５頭のプラセボ接種対照イヌのうちの１４頭（９３％）からの免疫血清中に容易に検出することができた（図２Ａ）。さらに、２０ｋＤａ蛋白質の抗体を含有しない血清が、皮膚からスピロヘータも得られない対照イヌから採取された。これに対して、上記ワクチンを接種したイヌのいずれによっても２０ｋＤａ蛋白質の抗体は産生されなかった（ｐ＜０．０００１）（図２Ｂ）。
【０１３２】
さらに、ライム病を有するイヌは、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ５０７７２分離株を用いても検出できる非ＯｓｐＣ殺ボレリア菌抗体を産生する（Ｃａｌｌｉｓｔｅｒほか、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０００年、３８：ｐ．３６７０−３６７４）。この反応の明確な標的は不明であるが、こうした抗体によって感染の高度に特異的な血清診断的確認が可能になる。上記ワクチンを接種したイヌは既にＯｓｐＣ殺ボレリア菌抗体を産生していたが、ダニ感染後Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ５０７７２特異的抗体のレベルの著しい（≧４倍の）上昇を生じたイヌはいなかった。従って、これらのワクチン接種イヌがスピロヘータに感染することは全くありそうになかった。これに対して、殺ボレリア菌抗体はダニ感染前のプラセボ接種イヌにより産生されなかったが、ダニに吸血させた後では１５頭中１０頭（６７％；ｐ＝０．０００２）が、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ５０７７２を用いて検出される殺ボレリア菌抗体を顕著なレベル（力価：≧１：６４０）で生じた（下記の表１２）。
【０１３３】
表１２：  ダニ感染後における殺ボレリア菌抗体ｂの平均力価ａ
【０１３４】
【表１２】
2010509217.tif 000014
・明白な肢／関節障害に対する上記ワクチンの防止能
以前の研究（Ｓｕｍｍｅｒｓほか、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｐａｔｈ．２００５年、１３３：ｐ．１−１３、Ｗｉｋｌｅほか、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｒｅｓ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．２００６年、４：ｐ．２３−２８）によって、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓのみの感染では明白な肢／関節障害が生じることはまれであることが明らかにされたが、我々の知見でもこのことが裏付けられた。１頭（８％）のプラセボ接種対照イヌのみが関節異常を生じた。ダニ感染の９週後に左前肢がこわばり、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓスピロヘータが肘から回収された。しかしながら、こうした知見は重要ではなかった。何故なら、上記ワクチンを接種したイヌ２頭も１肢以上にこわばりを生じたが、プラゼボ接種イヌとは対照的に、どの組織からもスピロヘータは回収されなかったからである。
【０１３５】
明白な症状の発症を増幅させるために、残りのイヌに対して免疫を抑制した。その後、プラセボ接種対照イヌ３頭が歩行困難になり、これらのイヌのうち２頭からＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓが回収された。これに対して、上記ワクチンを接種した免疫抑制イヌは歩行困難を生じなかった。従って、これらの知見全体から、上記ワクチンはライム関節炎の発症を防止することが示唆されたが、こうした結果は有意ではなかった（ｐ＝０．０９９６）。しかしながら、以下に示し、説明した別のデータを参照されたい。
【０１３６】
・Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ感染に伴うびらん性変化に対する上記ワクチンの防止能
しかしながら、上述のイヌの関節を顕微鏡で調べたときの所見では、上記ワクチンの効果が明らかに示された。上記ワクチンを接種した残りのイヌ（ｎ＝１３）からの関節包は正常であった。これに対して、プラセボ接種した残りの対照イヌ１１頭（上記の表７）のうちの６頭（ｐ＝０．００３４）からの１個以上の関節組織は、好中球及び単核細胞の浸潤を特徴とする著しい炎症を示した（図３）。さらに、上記ワクチンを接種したイヌからのどの組織からもＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓは回収されなかったが、びらん性変化を有するプラセボ接種対照イヌ６頭のうちの５頭（８３％）の関節組織からスピロヘータが回収された。従って、これらの知見全体から、上記ワクチンがイヌライム病関節炎を防止することが確認され、この症状が、ほとんどの場合、潜在性滑膜炎を特徴とするという以前の報告（Ｓｕｍｍｅｒｓほか、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｐａｔｈ．２００５年、１３３：ｐ．１−１３；Ｗｉｋｌｅほか、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｒｅｓ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．２００６年、４：ｐ．２３−２８）も裏付けられた。
【０１３７】
（実施例７）
ＯｓｐＣ７エピトープに対する天然殺ボレリア菌抗体の特異性
ＯｓｐＣ７に対して哺乳動物に誘導される殺ボレリア菌抗体が特異的であることを裏付けるデータは、以下の通り、ライム病の病歴又はライム関連症状の有無とは無関係に個体（ヒト）の血清を分析することによって得られた。
【０１３８】
Ａ．材料及び方法
１．血清
ライム病の既往歴（カルテ審査）もしくはライム関連症状を有しない個体（ｎ＝３６）からの正常血清、献血者（ｎ＝１００）もしくはコレステロール検診を受けた個体（ｎ＝１００）からの特性化されていない血清又は通常Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ抗原と交差反応する血液因子もしくは疾患、例えば、抗核抗体（ｎ＝２０）、リウマチ因子（ｎ＝２０）、単核球症（ｎ＝１０）、サイトメガロウイルス（ｎ＝１０）、梅毒（ｎ＝１３）もしくはロッキー山熱（ｎ＝４）を有するボランティアからの血清は２０℃で貯蔵された保管試料からのものとした。ライム病血清は２００３年又は２００４年にＧｕｎｄｅｒｓｅｎ  Ｌｕｔｈｅｒａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒで診断された患者から採取した。ＣＤＣサーベイランス基準（米国疾病対策予防センターＭｏｒｂ．Ｍｏｒｔ．Ｗｋｌｙ．Ｒｅｐ．１９９０、３９：ｐ．１９−２１）を満たす遊走性紅斑（ＥＭ）を有する患者からの血清（ｎ＝８６）を確からしいライム病と分類し、何度もダニに暴露されて非定型皮膚病巣を有する患者からの血清（ｎ＝２２）をほぼ確かなライム病（ｎ＝４９）と分類し、ダニに暴露されて主に頭痛、発熱、筋肉痛及び関節痛を含む全身症状を有する患者からの血清を可能なライム病と分類した。これらの血清は初診時に採取し、−２０℃で貯蔵し、試験前に盲検化（ｂｌｉｎｄｅｄ）した。
【０１３９】
ＯｓｐＣ７ペプチド。７−ａａＯｓｐＣ７ペプチド（ＡＥＳＰＫＫＰ；配列番号１）は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州）で自動合成器（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びＦｍｏｃ法（Ｆｉｅｌｄｓほか、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓ．１９９１年、４：ｐ．９５−１０１）を用いて合成された。合成後、このペプチドのアミノ末端をＨＢＴＵ活性化により手動でビオチン化し、高圧液体クロマトグラフィーによって精製した。組成は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−ｔｉｍｅ  ｏｆ  ｆｌｉｇｈｔ）質量分析法（予測質量：１０９５．４；実測質量：１０９５．８）を用いて確認した。
【０１４０】
ＯｓｐＣ７  ＥＬＩＳＡ。マイクロタイター・プレート（イムノロン（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｎ）２ＨＢ、（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ、マサチューセッツ州）の個々のウェルを、ストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、イリノイ州）を炭酸塩緩衝液（９０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、６０ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３；ｐＨ９．６）に含有させた４μｇ／ｍｌ懸濁液１００μＬで被覆し、４℃で一夜インキュベートした。インキュベーション後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ−Ｔ；１３ｍＭトリスＨＣｌ、３ｍＭトリス塩基、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ；ｐＨ７．４）で５回洗浄した。洗浄後、１μｇ／ｍＬのビオチン化ＯｓｐＣ７ペプチドを含有するブロッキング緩衝液（１５ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭトリスＨＣｌ、３％ウシ胎仔血清、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）２００μＬを各ウェルに添加し、室温で１時間回転（１５０ｒｐｍ）させながらインキュベートした。次いで、プレートをＴＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ブロッキング緩衝液で２００倍希釈した１００μＬ量の血清と室温で１時間反応させた。第２の抗体は、ブロッキング緩衝液で１５，０００倍希釈したペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＭ及びＩｇＧ（Ｋｉｒｋｅｇａａｄ  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、メリーランド州）とした。１時間のインキュベーション後、結合された上記第２の抗体をｏ−フェニレンジアミン及び過酸化水素のクエン酸緩衝液（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州、）溶液を添加し、４９０ｎｍでのＯＤを測定（スペクトラマックス（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ）２５０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、カリフォルニア州）して定量した。
【０１４１】
Ｂ．結果
以前の研究（Ｊｏｂｅほか、Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏ．２００３年、１０：ｐ．５７３−５７８、Ｌｏｖｒｉｃｈほか、Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５年、１２：ｐ７４６−７５１）では、高度に保存された免疫優勢ＯｓｐＣ殺ボレリア菌抗体エピトープはそのＣ末端に最も近い７アミノ酸（ＯｓｐＣ７）内の領域に限局していた。このエピトープがボレリア属菌による感染に特異的な抗体を誘導することを確認するために、ライム病患者からの血清（図５）及び正常対象者又はボレリア属菌蛋白質とも結合することができる抗体を産生する可能性の高い他の疾患を有する患者からの血清（図４）を用いたＥＬＩＳＡの反応性を比較した。図４及び５では、吸光度１．２５の線は正常血清及び交差反応する可能性のある血清の平均吸光度の３標準偏差分だけ上の値を設定したものである。従って、この線よりも上にくる結果はいずれもその反応性が有意である確率が９９％である（真陽性）。有意な反応性は正常血清又は交差反応する可能性のある血清ではまれにのみ検出された（図４）。陽性結果の大部分はライム病患者由来のものであったかも知れない血清を用いて得られたことにも注目されたい。何故なら、これらの血清（ＣＳ）は種々の病気に関してＧｕｎｄｅｒｓｅｎ  Ｌｕｔｈｅｒａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒで診察されている１００名の患者のグループから得られたものであるからである。この地方はライム病の高度流行地であり、患者の個人情報及び病歴が不明である。これに対して、ウィスコンシン州の非流行地であるミルウォーキー（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ）の献血者（ＢＤ）から無作為に採取された血清試料（ｎ＝１００）では陽性血清は検出されなかった。
【０１４２】
さらに、一般にライム病患者からの血清では陽性の結果（非反応性であるべき血清の平均値の３標準偏差分だけ上の値−図４）が検出され、吸光度の値は高かった（図５）。従って、これらの知見全体から、ＯｓｐＣ７エピトープに対する上記抗体の高度の特異性及びヒトライム病におけるこの反応の免疫優勢が裏付けられた。
【０１４３】
上記に例示したデータをまとめると、８週齢の幼犬のグループ群（１５匹）に５．０×１０８個のＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ５０７７２、２．５×１０７個のＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  Ｓ−１−１０  ＳＳ及び５％Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ（登録商標）を含有するワクチン又は５％Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ（登録商標）のみを含有するプラセボを接種及び追加接種を行った。このワクチンにより注射部位に軽度の腫張が生じたが、速やかに消散した。より注目に値すべきなのは、このワクチンが高濃度の殺ボレリア菌ＯｓｐＡ及びＯｓｐＣ抗体を誘導し、これらの抗体の濃度が追加免疫ワクチン接種後１週間でピークに達し、試験期間の間検出可能なレベルを維持したことである。さらに、かなりの割合のＯｓｐＣ殺ボレリア菌抗体がＯｓｐＣ７内の高度に保存されたエピトープに特異的であった。
【０１４４】
次に、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ感染雌性シカダニ（Ｉ．ｓｃａｐｕｌａｒｉｓ  ｔｉｃｋ）にワクチン接種したイヌに対して吸血させ、ダニの中腸を調べることによって吸われた血液中のＯｓｐＡ及びＯｓｐＣ殺ボレリア菌抗体がＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓを完全に除去することが確認された。具体的には、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓは、プラセボを接種した対照イヌから採取した３４匹（３２％）のダニで検出されたが、上記ワクチンを接種したイヌに対して吸血したダニ（ｎ＝９９）では検出されなかった（ｐ＜０．０００１）。さらに、ワクチンのレシピエントは、感染の確認に通常用いられるいくつかの間接的及び直接的方法でライム病に対して陰性の状態を維持した。これに対して、対照イヌでは、１０頭（６７％）が「感染特有の」２０ｋＤａＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ蛋白質に対する抗体を産生し、８頭（５３％）が「感染特異的」殺ボレリア菌抗体を産生した。さらに、４頭（２７％）のイヌが持続性の歩行困難を生じ、これら４頭の歩行困難なイヌのうちの３頭（７５％）の関節からＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓが回収された。さらに、調べたプラセボ接種イヌ１１頭のうちの６頭（５５％）の関節包に炎症性浸潤が生じた。より説得力あることには、１４頭（９３％）及び８頭（５３％）の対照イヌにおいて、それぞれ皮膚及び関節からＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓが回収されたのに対し、上記試験品を接種したイヌからスピロヘータは回収されなかった。すなわち、本発明のライム病ワクチンは生じた副作用がごく僅かであり、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓによる感染に対して完全に防御した。
【０１４５】
（実施例８）
Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ分離株Ｓ−１−１０及び５０７７２を含むワクチンの免疫性持続期間
Ａ．材料及び方法
・動物
材料及び方法は上記の実施例６で述べた通りである。
【０１４６】
・ワクチン接種及び血清の採取
イヌの頚部皮下に１ｍＬ用量の上記ワクチンを接種し、２１日後にさらに１ｍＬ用量を追加免疫した。初回（試験−４日目）及び追加免疫ワクチン接種（試験２１日目）の前並びに試験２８、３５、４９、７９、１１４、１４２、１７５、２１０、２３８、２６６、３０２、３２２、３５７及び３９４日目にも頚静脈穿刺によって全血を採取した。次いで、遠心により血清を分離し、これを試験するまで−２０℃で貯蔵した。
【０１４７】
・ワクチン接種後の観察
イヌは毎日観察した。
【０１４８】
・ダニ感染
上記２回目のワクチン接種の１年後に、イヌを胸腔の右側で剃毛し、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ感染シカダニ（Ｉ．ｓｃａｐｕｌａｒｉｓ  ｔｉｃｋ）の雌１０匹及び雄１０匹を入れたラバーカップを剃毛部にテープ及び包帯ラップで固定した。これらのダニに７日間吸血させた。
【０１４９】
・ダニにおけるＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓの検出
検出は上記の実施例６に記載の方法で実施した。
【０１５０】
・血液試料
感染後（ＰＣ）試験４３日目、ＰＣ試験７７日目、ＰＣ試験１１２日目、ＰＣ試験１４７目、ＰＣ試験１７４目及びＰＣ試験２４１日目に全血を血清分離輸送管に採取し、血清を分離して試験するまで−２０℃で貯蔵した。
【０１５１】
・殺ボレリア菌抗体の検出
上記の実施例１及び２に記載したものと同様にして、フローサイトメトリーによりＯｓｐＡ及びＯｓｐＣ殺ボレリア菌抗体を検出した。
【０１５２】
・皮膚生検
感染後（ＰＣ）試験４３日目、ＰＣ試験７７日目、ＰＣ試験１１２日目、ＰＣ試験１４７目、ＰＣ試験１７４目及びＰＣ試験２４１日目にダニ付着の近傍部位から使い捨ての４ｍｍ穿刺器具を用いて皮膚生検材料を採取した。これらの生検材料は、上記の実施例６に記載したものと同様に処理した。
【０１５３】
・免疫抑制
イヌに対して、感染のほぼ２０週後から始めて５日間デキサメタゾン（０．４ｍｇ／ｌｂ体重）の連日投与により免疫を抑制した。
【０１５４】
・臨床的観察
臨床的観察は上記の実施例６と同様にして実施した。
【０１５５】
・剖検
剖検は上記の実施例６と同様にして実施した。
【０１５６】
Ｂ．結果
・ワクチン接種後の血清
プラセボ接種では、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓに特異的な抗体を誘導することができなかった。これに対し、上記ワクチンの接種では、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ分離株Ｓ−１−１０及び５０７７２を用いることで検出される殺ボレリア菌抗体が有意なレベルで誘導された。Ｓ−１−１０に対する平均殺ボレリア菌抗体価は追加免疫ワクチン接種の１週後（試験２８日目）にピークに達し、この反応は試験３９４日目まで依然として検出可能であった（表１３）。同様に、分離株５０７７２に特異的な高濃度の殺ボレリア菌抗体が試験２８日目に検出され、力価は試験４９日目でも依然として高く、７９日後でも低レベルではあるが、依然として検出可能であった（表１４）。
【０１５７】
表１３：  上記ワクチン接種後の殺ボレリア菌活性ｂの平均力価ａ（ｎ＝１５）
【０１５８】
【表１３】
2010509217.tif 000015
表１４：  上記ワクチン接種後の殺ボレリア菌活性ｂの平均力価ａ（ｎ＝１５）
【０１５９】
【表１４】
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・感染ダニに対するＯｓｐＡ及びＯｓｐＣ殺ボレリア菌抗体の滅菌能
ワクチン接種又は対照イヌにおいて吸血したダニの中腸を調べることによって、上記ワクチンにより誘導されたＯｓｐＡ及びＯｓｐＣ殺ボレリア菌抗体がダニを滅菌したことが確認された。プラセボ接種したイヌ１５頭中１２頭において吸血した雌性ダニ９５匹中１５匹（１６％）からのダニ塗抹においてＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓが検出された（表１５）。これに対して、ワクチン接種イヌ１５頭のうちの２頭において吸血した７５匹の雌性ダニのうちのわずか２匹（３％）からのダニ塗抹でＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓが検出された（ｐ＝０．０００３）。
【０１６０】
表１５：  ワクチン接種又は対照イヌから取り出した雌性ダニにおけるＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓの検出
【０１６１】
【表１５】
2010509217.tif 000017
・皮膚からＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓが回収されないようにする上記ワクチンの能力
上記ワクチンにより誘導された殺ボレリア菌抗体は皮膚におけるＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ菌の持続感染を防止した。ダニ感染後１ヶ月おきにプラセボ接種イヌから採取した７５個の生検材料のうち３３個（４４％）からＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓが回収された（表１６）。これに対して、上記ワクチンを接種したイヌから採取した７５個の生検材料のうちわずか６個（８％）からＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓが回収された（ｐ＜０．０００１）。スピロヘータは、ワクチン接種イヌ１５頭中６頭（４０％）に対し、対照イヌ１５頭中１０頭（６７％）から少なくとも１個の皮膚生検材料から回収された。しかしながら、ワクチン接種イヌからの単離はダニ感染後最初の１ヶ月に限定されたのに対して、培養陽性対照イヌ１０頭中８頭（８０％）はその後の試験月数全体を通して皮膚生検材料培養物がＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ陽性であった。
【０１６２】
表１６：  ワクチン接種又は非ワクチン接種対照イヌの皮膚からのＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓの単離
【０１６３】
【表１６】
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・感染の血清学的証拠をもたらさないようにするワクチンの能力
上記ワクチンはライム病特有の抗体の発生をも阻止した。ライム病を有するイヌは、（実施例６で述べたように）Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ５０７７２分離株を用いても検出できる非ＯｓｐＣ殺ボレリア菌抗体を産生する。１５頭のプラセボ接種対照イヌのうちの５頭（３３％）でダニ感染後に５０７７２株に対する殺ボレリア菌抗体のレベルの著しい上昇（≧４倍の上昇）が認められたのに対し、上記試験ワクチンを接種したイヌでは全く認められなかった。
【０１６４】
表１７：  ダニ感染後の殺ボレリア菌抗体ｂの平均力価ａ
【０１６５】
【表１７】
2010509217.tif 000019
・明白な肢／関節障害及びＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓ感染に伴うびらん性変化に対する上記ワクチンの防止能
以前の研究によって、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｓのみの感染では明白な肢／関節障害（実施例６）が生じることはまれであることが明らかにされ、ダニ感染モデルはイヌの年齢が高いほど効果が低いことが分かっている。明白な症状の発症を増幅させるために、ダニ感染のほぼ３ヶ月後にデキサメタゾンによりイヌの免疫を抑制した。４頭のプラセボ接種対照イヌが歩行困難になるか、関節組織にびらん性病変を生じた。これに対して、本発明のワクチンを接種したイヌはいずれも肢／関節障害の臨床的症状や関節組織によくみられるびらん性病変を生じなかった。
【０１６６】
本発明は、本明細書に記載した特定の実施態様によって範囲が限定されるものではない。事実、本明細書に記載したものの他に本発明の様々な変形例があり得ることは、前記の説明から当業者には明らかであろう。このような変形例は添付の特許請求の範囲に包含されるものである。
【０１６７】
さらに、核酸又はポリペプチドに関して示した全ての塩基の大きさ又はアミノ酸の大きさ及び分子量値は近似値であり、説明のために示したものであることは理解されるべきである。
【０１６８】
本明細書では種々の刊行物が引用されているが、これらの開示内容はその全体が引用により本明細書に組み込まれている。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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