(57)【要約】【課題】肝再生増強因子と呼ばれる蛋白質（Ａｌｒｐ）の新規な使用を提示する。【解決手段】アポトーシスの調節因子としてのＡｌｒｐを使用する。アポトーシスの調節が有用である疾患の処置及び／又は予防のための薬剤を調製するためにＡｌｒｐを使用することもできる。Ａｌｒｐは診断の分野でも使用でき、哺乳類の増殖性疾患の存在を検出するマーカとして使用する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アポトーシスの調節因子としての肝再生増強因子（Ａｌｒｐ）の使用。
【請求項２】
哺乳類のアポトーシスの調節因子用薬剤調製のための請求項１記載の使用。
【請求項３】
アポトーシスの調節が有用である、疾患の治療及び予防用の薬剤調製のための請求項２に記載の使用。
【請求項４】
アポトーシスのコントロールにおけるトラブルにより誘発される疾患の治療及び予防用の薬剤調製のための請求項２又は３に記載の使用。
【請求項５】
アポトーシスの上方調節が有用である、疾患の治療及び／又は予防用の薬剤調製のための請求項２から４までのいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
前記疾患が変性疾患である請求項３から５までのいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
活性成分としてＡｌｒｐを含む薬学的又は動物用組成物。
【請求項８】
増殖性疾患の存在を検出するためのマーカとしてのＡｌｒｐの使用。
【請求項９】
診断薬の調製のための請求項８記載の使用。
【請求項１０】
アポトーシスの下方調節が有用である、疾患の治療用の薬剤調製のための抗体反Ａｌｒｐの使用。
【請求項１１】
診断薬の調製のための抗体反Ａｌｒｐの使用。
【請求項１２】
細胞株の調製のためのＡｌｒｐの使用。
【請求項１３】
不死の細胞株の調製のための配列をエンコードするＡｌｒｐの使用。
【請求項１４】
アポトーシスの実験テスト用ＡＬＲ遺伝子配列で変換されたヒト以外の遺伝子組み換え用哺乳類の使用。
【請求項１５】
アポトーシスに関連した疾患の実験テストのモデルとしての請求項１４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、「肝再生増強因子」と呼ばれる蛋白質（Ａｌｒｐ）の新規な使用に関し、より詳細には本発明は、哺乳類のアポトーシスの調節及びコントロールにおけるＡｌｒｐの効果に起因する。
【背景技術】
【０００２】
近年、肝細胞アポトーシスの波は、７０％部分肝切除（ＰＨ）後の肝重の回復の微調整を行う細胞増殖を伴うことが発表されている。この事態は細胞成長を含む多くの生物的モデル中で起こり、そこでは増殖及びアポトーシスが組み合わされた、細胞再構築プロセスの「生理学的」コントロールが行われる。肝再生で、２種類の異なったアポトーシスのフェーズが特定されていることは周知である。早期フェーズ（ＰＨの６時間後、早期Ｇ1）では反アポトーシス遺伝子(Bcl-2, Bcl-x)が誘起され、後期フェーズ（ＰＨの２０−２４時間後）では親アポトーシス遺伝子(Bax )が上方調節される。これらのデータにもかかわらず、ＰＨ後の肝再生の異なったフェーズの間の血清中で通常増加する無数の因子の中で、アポトーシスの調節薬は特定されていない。これらは開始剤（Initiator）と増殖剤（Augmenter）に分けられる。開始剤は全細胞サイクルを保持できるイオン、ホルモン及び成長分子のような因子であり、増殖剤は、細胞サイクルのＧ1からＳフェーズの経過をサポートしかつインビトロでのみ更に犬におけるエックの瘻（Eck's fistula）及びラットにおける４０％ＰＨのように既に始まっている場合に、細胞増殖を促進する。最も知られかつ最も研究されている増殖剤は、インスリン状成長因子ーＩＩ(IGF-II), インスリン (Ins) 及び肝再生増強因子 (ALR)である。肝再生増強因子蛋白質（Ａｌｒｐ）は、ラットやヒトから単離されかつ肝細胞中のＤＮＡ合成を刺激するヌクレオチド配列により発現するポリペプチドである。当該蛋白質は特許文献１で初めて開示された。当該文献で、肝細胞増殖に対するＡｌｒｐの効果が報告されているが、可能な作用機構は説明されていない。
【０００３】
現在のところ、生理学的な肝再生の実験モデルにおいて、増殖剤はアポトーシスの調節因子としてテストされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】欧州特許第６６８２９１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、ラットの肝再生の実験モデルでのアポトーシスに対するＡｌｒｐの役割を研究し、Ａｌｒｐがアポトーシスのコントロールに深く関与していることを予期することなく発見した。
【０００６】
この発見は、Ａｌｒｐ及びそれをエンコードする配列が開発されている、幾つかの可能な薬学的、医学的及び治療的用途において特に有用である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一態様は、アポトーシスの調節因子としての肝再生増強因子蛋白質（本発明では、以降Ａｌｒｐという）に関する。
【０００８】
本発明の他の態様は、哺乳類のアポトーシスの調節用の薬剤調製のためのＡｌｒｐの使用に関する。
【０００９】
本発明の他の態様は、アポトーシスの調節が有用である疾患の処置及び／又は予防のための薬剤調製のためのＡｌｒｐの使用に関する。
【００１０】
本発明の他の態様は、アポトーシスのコントロールにおけるトラブルにより誘発される疾患の治療及び予防用の薬剤調製のためのＡｌｒｐの使用に関する。
【００１１】
本発明の他の態様は、アポトーシスの上方調節が有用である、疾患の治療及び／又は予防用の薬剤調製のためのＡｌｒｐの使用に関する。
【００１２】
本発明の他の態様は、投与を必要とする対象に効果的な量のＡｌｒｐを投与することを含む、アポトーシスに関連した疾患の処置方法に関する。
【００１３】
本発明では、「Ａｌｒｐ」という用語は、任意の肝再生増強因子蛋白質、つまり哺乳類から誘導されるＡｌｒｐを意味する。
【００１４】
好ましい態様では、Ａｌｒｐは組み換えＡｌｒｐ、より好ましくはヒト組み換えＡｌｒｐである。
【００１５】
Ａｌｒｐ蛋白質及びそれをエンコードするヌクレオチド配列は特許文献１に開示されている。
【００１６】
本発明の「調節因子」又は「調節」という用語は、アポトーシス条件の変化をコントロールすることを意味する。
【００１７】
本発明の「アポトーシス」という用語は、細胞の生理学的にプログラムされた死を意味する。
【００１８】
本発明の「疾患」という用語は、哺乳類に悪影響を及ぼす障害、不調及び症候群を意味する。
【００１９】
本発明の「アポトーシスコントロールでのトラブルにより誘発される疾患」という用語は、哺乳類のアポトーシスの不適切な又は不正確なコントロールで少なくとも部分的に生じる任意の疾患を意味する。
【００２０】
アポトーシスコントロールでのトラブルにより誘発される典型的な疾患は、例えば。神経性及び／又は筋肉性変性疾患のような変性疾患、及び紅顔に悪影響を及ぼす疾患である。
【００２１】
本発明での使用の際に、Ａｌｒｐは任意の通常経路により哺乳類に投与しなければならない。
【００２２】
例えば好ましい投与経路は、経口又は、静脈、筋肉、皮下、腹腔などの非経口の経路である。
【００２３】
Ａｌｒｐの投与は、所望の効果が達成されるまで、必要に応じて繰り返しても良い。
【００２４】
投与の際は、Ａｌｒｐを周知の方法で薬学的又は獣医学的組成物に製剤することが好ましい。
【００２５】
このように定義した処置のための薬学的又は獣医学的組成物は、本発明の他の対象を構成する。
【００２６】
Ａｌｒｐの投与量は、処置される対象の状態、年齢及び体重、投与経路、投与形態などによって変化し、専門医により適宜選択される。蛋白質が非常に活性であるため、その投与範囲は、１日当たり、通常ピコグラムとナノグラムの間である。
【００２７】
本発明の他の態様は、診断の分野でＡｌｒｐを使用することに関し、例えば哺乳類の増殖性疾患の存在を検出するマーカに関する。
【００２８】
本発明の他の態様は、インビトロの実験テストで有用な不死の細胞株の調製用の配列をエンコードするＡｌｒｐの使用に関する。
【００２９】
本発明の他の態様は、細胞株の調製におけるＡｌｒｐの使用に関する。
【００３０】
この目的のため、所望の細胞を、既知の方法に従って、対応するＡｌｒｐを発現する都合の良いＡＬＲ配列で形質変換できる。
【００３１】
その代わりに、必要に応じて、Ａｌｒｐ自身を所望の細胞又は細胞株に与えてそれを増殖させても良い。
【００３２】
Ａｌｒｐ遺伝子配列は、アポトーシス調節を含む疾患の研究に非常に価値のある、既知方法によるヒト以外の哺乳類の形質変換にも使用できる。
【００３３】
従って、本発明の他の態様は、ＡＬＲ遺伝子で形質変換されたヒト以外の遺伝子組替え哺乳類、例えばアポトーシスに関連する疾患に関する実験テスト用モデルの使用に関する。
【００３４】
ヒト以外の遺伝子組替え哺乳類は、例えばラット又はマウスである。
【００３５】
アポトーシスに対するＡｌｒｐの効果は、組織再生プロセスに含まれる成長因子（ＧＦｓ）の「増殖」及び「アポトーシス」に関する性質を別々に評価することを許容する実験動物モデルを使用して、本発明者らにより明らかにされた。
【００３６】
下記の実験の項目に記述したように、実行されたテストで得られたデータは、テストしたＧＦｓの中で、増殖剤ファミリのうち、Ａｌｒｐのみが、組織再生プロセスでアポトーシスを抑制することを示している。特に、アポトーシスに対するＡｌｒｐの効果は、スタット（Ｓｔａｔ）３活性化（二量化及びリン酸化）、反アポトーシス遺伝子及び、より適切には、親アポトー３ス遺伝子の下方調節を含むことが示されている。類似効果は、増殖剤ファミリの他の２つのメンバーであるＩｎｓ及びＩＧＦ−ＩＩについては示されていない。
【００３７】
本発明の他の態様は、アポトーシスの下方調節が有用である、疾患の処置用の薬剤調製のための抗体反Ａｌｒｐの使用に関する。
【００３８】
アポトーシスの下方調節が有用である典型的な疾患は、例えばガンや、あるいは乾癬や強皮症などの他の増殖性疾患である。
【００３９】
本発明の他の態様は、Ａｌｒｐの存在を検出するための、診断分野における抗体反Ａｌｒｐの使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１Ａは、Ａｌｒｐ血清濃度とＰＨ後の経過時間の関係を示すグラフである。図１Ｂは、ＨＧＦ血清濃度とＰＨ後の経過時間の関係を示すグラフである。
【図２】Ａｌｒｐ及びＨＧＦ血清濃度とＰＨ後の経過時間の関係を示すグラフである。
【図３】アポトーシス肝細胞／１０００細胞とＰＨ後の経過時間の関係を示すグラフである。
【図４】肝細胞増殖とＰＨ後の経過時間の関係を示すグラフである。
【図５】アポトーシス肝細胞／１０００細胞とＰＨ後の経過時間の関係を示すグラフである。
【図６】肝細胞増殖とＰＨ後の経過時間の関係を示すグラフである。
【図７】ｍＲＮＡアポトーシス遺伝子／ＧＡＰＤＨとＰＨ後の経過時間の関係を示すグラフである。
【図８】吸光度と波長の関係を示すグラフである。
【図９】チオール濃度と時間の関係を示すグラフである。
【図１０】ｒＡｌｒｐの存在下に培養される際の、スタットー３（ライン１）のホモダイマ形成を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
［実験の項目］
【００４２】
本願は、２つの異なった実験的アプローチで支えられている。第１は、（ｉ）肝細胞アポトーシス現象に対するＡｌｒｐの生物学的効果を視覚化するために必要な「生理学的」動物モデルを構築することで、第２は、（ｉｉ）Ａｌｒｐでコントロールされる生物学的プロセスに含まれる生化学的経路を示すことである。
【００４３】
（ｉ）モデルを構築するために、７０％部分肝切除（ＰＨ）のラットのＨＧＦ及びＡｌｒｐの血清の輪郭を決定し(Tomiya T et al., 1998, Am. J. Pathol. 153,955-61; Gandhi CR et al, 1999, Hepatology 29(5), 1435-4)、手術後１８時間の両ＧＦｓのピーク、及び７２時間後まで続く定常的で迅速な低下を記録した（図１）。これに基づいて、異なった７０％ＰＨラットのグループで、観察の全時間（ＰＨ後４８時間）を通して、ｒＨＧＦ又はｒＡｌｒｐを６時間ごとに投与した。それらの最大発現の時間ポイント（１８時間後）を有する血清レベルを維持する「生理学的な」下降が見られた（図２）。
【００４４】
ｒＨＧＦのみを投与すると、肝細胞アポトーシスへの効果なしに（図５）、適度に肝細胞増殖が増加したが、ｒＨＧＦを注射すると、細胞増殖への緩やかな効果のみを伴って（図６）、プログラムされた細胞死が劇的に減少した（図５）。ｒＡｌｒｐの反アポトーシス効果の更なるサポートは、反アポトーシス遺伝子（Bcl-2）の上方調節を有するアポトーシス関連遺伝子、及びその効果がスタットー３によることが知られている、親アポトーシス遺伝子(Bax及びCaspase 3),の顕著な下方調節から生じる。
【００４５】
（ｉｉ）スタット蛋白質は、多くのタイプの細胞に存在し、かつIL-6、IL-2及びandIL-IO、 顆粒球CSF、EGF、PDGF、IFN-γ及びレプチンのような多数のサイトカインによって活性化される細胞質の転写因子のファミリである(タケダ Ｋ．ら、 1998, シュナイダー  Ｃ．及びダニエル JE Jr., 1995, Akira S. 1997)。スタット活性化は、アポトーシス、細胞成長及び関連する生存に含まれる多くの遺伝子の転写調節を誘起する(ダニエルJ.E, Jr 1997; スターク  ＧＲら、1998;  レビDEら、 J. Clin. Invest., May;109(9):1143-8.2002; ヒラノT、ら. Oncogene, 2000 May 15;19(21):2548-56)。スタット蛋白質ファミリのうち、スタット−１及びスタット−３が最も研究されている。これら２種の蛋白質は、４０％の類似性を有し(シェン Yら、PNAS, 2001 13, 98)、かつしばしば同じリガンドで活性化されるが、異なった遺伝子調節を行う。特にスタット１はカスパーゼー１、−２、−３のような親アポトーシス遺伝子発現をコントロールし、スタット−３は、細胞増殖、及びＢｃｌ−２、サバイビング（Surviving）、Ｂｃｌ−ＸＬのようなアポトーシス抑制剤をエンコードする上方調節遺伝子によるアポトーシスを調節する(ブロンベルクJFら、1999; ハガSら、 2003, J Clin Invest. 2003 Oct;112(7):989- 98; タウプR, J Clin Invest. 2003 Oct;112(7):978-80; ドルドーフィルハート、Clin Cancer Res. 2003 Feb;9(2):594-600, ダーネルら、1994;   ブロンベルクら、 1998; サートーら、1997; ガーシャーら、2001; ソン H、Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Mar 29;102(13):4700-5)。
【００４６】
最近、スタットー３活性化も、細胞増殖を刺激しかつアポトーシス耐性を与えることによる腫瘍形成含まれることが提案されている (カトレットーファルコンら、1999a, 1999b; アランら、 2003; ウェイら、2003)。実際、活性化されたスタットー３の封鎖は、ガン細胞成長を抑制し (アラスら、2003; アオキら、2003; エプリングーバーネット、2001)、かつスタットー３活性の遮断は、アポトーシスに導かれる (ダニエルら、2005; ブロンベルグら、1999)。
【００４７】
スタット蛋白質は、通常、リガンドがそれらの特定の細胞表面受容体に結合しかつチロシン・キナーゼを活性化したときに、活性化される（レビら、２００２）。スタットはチロシンリン酸化により活性化され、ＳＨ２−ホスホチロシン相互作用を通して二量化し、遺伝子転写が活性化される核に蓄積する。それにもかかわらず、最近の研究は、スタット３の二量化は、先行するリン酸化なしに起こることに言及し、多くの文献はスタット蛋白質が二量体として存在することの証拠を提供している。特に、クレツシュマーは、リン酸化されていないスタット３二量体の存在を明らかにしている。シェンとその仲間は、スタットー３二量化生成物であるスタットー３の積極的な活性化形態（スタットー３Ｃ）は、線維芽細胞の細胞形質変換を生じさせることができ、これにより非形質変換細胞より、親アポトーシス刺激に対する耐性が大きくなることを明らかにした。ノバクらは、１９９８年から、スルフィドリル・オキシダーゼ酵素による酵素的コントロールに起因する、システインーシステイン交差結合を許容する、細胞中の非リン酸化二量体であるスタット−３の存在を報告してきた。
【００４８】
これら全てのデータは、その活性化に必要な２つの事項であるスタット―３リン酸化及び二量化は、細胞質で別個に起こるが、この配列では必ずしも必要でない２種類の生化学的プロセスであるという考え方を支持している。スタットー３は、スルフィドリル・オキシダーゼ活性を有する専用酵素によりＳＨ−基で特定的に酸化される非リン酸化ホモダイマとして細胞質中に存在できる。これに関連する唯一の問題は、スタットー３二量化の原因である特定のスルフィドリル・オキシダーゼ酵素の存在が、今日まで特定されていないことである。
【００４９】
最近本発明者らは、ラット及びヒトＡｌｒｐが、還元された蛋白性基質中のジスルフィド結合の形成を触媒するフラビン関連のスルフィドリル・オキシダーゼであることを報告した (レソウスキ T、Dig. Liv. Dis., 2001, 33:173-80)。 実際、本発明者らは、酵母からヒトへの相同蛋白質中に存在するカルボキシ末端領域中の保存ＣＸＸＣモチーフと関連するＡｌｒｐ―スルフィドリル・オキシダーゼ酵素活性を既に報告した(ポリメノ L. Ital. J. of Gastroenter. 及びヘパト,1999; リソウスキT., Dig. Liv. Dis., 2001, 33:173-80)。それにもかかわらず、Ａｌｒｐ酵素活性のための生理学的基質は、今日でも依然として発見されていない。
【００５０】
本発明では、次のことが明らかにされる。  
１）スタットー３は、Ａｌｒｐスルフィドリル・オキシダーゼ酵素活性用の生理学的基質であること、本発明にとって更に重要なのは、
２）スタットー３は、Ａｌｒｐの存在下で培養されると二量化する。
【００５１】
両者を考え合わせると、これらの結果は、非リン酸化スタットー３二量体の存在を報告する文献に存在するデータを確認し、スルフィドリル・オキシダーゼ活性を有する因子は、Ａｌｒｐ中で、スタットー３―ＳＨ酸化及び二量化、リン酸化されるのに適した分子（スタットー３ホモダイマ）を生じさせる細胞の行動をコントロールでき、更に遺伝子をエンコードするアポトーシス抑制剤を上方調節できることを示す。
【００５２】
結論として、本発明者らは、肝細胞アポトーシス及びスタットー３二量化に対するｒＡｌｒｐの効果に関する全てのデータから、Ａｌｒｐは、スタットー３の二量化及び活性化を、次いで肝細胞アポトーシスをコントロールし、これはＰＨ後の組織再生プロセス中のアポトーシスの生理学的成分を意味することを明らかにする。
【００５３】
物質及び方法
［試薬］
核酸を導入されたＣＯＳ−Ｉ細胞で発現された組み換えＡｌｒｐ（Ａｌｒｐ）を、アメリカ合衆国ジョージア州アトランタのジョージア大学の生化学及び分子生物学実験室で生産した。組み換えスタットー３全長を、シグナル・ケム社（カナダのリッチモンド）から購入した。スタットー３の主要な特定抗体はアップステート社（アメリカ合衆国ニューヨーク州）から購入した。アルブミン、ｒ−ＨＧＦ及びｒ−ＩＧＦ−ＩＩは、イタリア国ミラノのシグマ―アルドリッチ社から購入した。特記していない化学試薬は、イタリア国ミラノのシグマ―アルドリッチ社から購入した。
【００５４】
［動物］
これらの実験のために、チャールズ・リバー社から購入した、１８０〜２００ｇの２２５匹のＦ３４４の雄のラットを使用した。動物は、光をコントロールし（午前７時から午後７時）、温度をコントロール（２１±１℃）した部屋に入れた。動物は、自由に飲食させ、国立衛生研究所により発行された「実験動物への配慮と使用に関するガイド」（ＮＨ  ８０−２３）に示される標準操作に従って飼育した。部分肝切除（７０％）は、エーテルで深く麻酔を行いながら、ヒギンス法(ヒギンス GM及びアンダーソンRM 1931, Arch.  Pathol. 12, 186-202)に従って行った。動物は、瀉血で殺し、肝臓と血液のサンプルをプロトコールに述べるように作製した。
【００５５】
プロトコール、方法及び結果
［スタットー３リン酸化に対する増殖剤の効果］
20匹の雄のラットを使用した。全ての動物に７０％ＰＨを行った（ヒギンス GM及びアンダーソンRM 1931)。５匹は手術直後に殺し（時間ゼロ群）、１５匹（５匹ずつの３群に分けた）を、手術後１８時間に、Ａｌｒｐ（５００ng／各動物、i.p.）、組み換えＩＧＦ−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ、１０００ng／各動物、i.ｍ）又はアルブミン（５００ng／各動物、腹腔内）の単一注射で処置し、６時間後に（ＰＨ後２４時間）殺した。殺す際、肝臓のサンプルを取り出し、免疫組織化学によるスタットー３リン酸化を評価した（チャンら、２００４）。
【００５６】
強い細胞質の及び核のスタットー３陽性が、Ａｌｒｐで処置したラットの肝細胞で明確であり、逆に弱い陽性がアルブミン又はＩＧＦ−ＩＩラットからの肝細胞で検出された。本実験では、増殖剤の中で、ＩＧＦ−ＩＩのみを使用した。これは、ＰＨラットのインスリン血清レベルは、スタットー３リン酸化に対する明らかな効果がないまま、我々の観察時間（ＰＨ後２４時間）で既に評価しているからである（コントロール動物）。
【００５７】
スタットー３二量化に対するＡｌｒｐの効果
［方法］
［組替えＡｌｒｐの分光学］
そのスルフィドリル・オキシダーゼ活性がそれに依存するｒＡｌｒｐに結合したＦＡＤ残基の存在を評価するというゴールに向けて、９μＭ最終濃度に対応する１３８μｇのｒＡｌｒｐを、１ｍｌの１００ｍＭのＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ７，５）に溶解し、ベックマンＤＵ７４００分光光度計を使用して、３００から６００ｎｍの吸光度を測定した。
【００５８】
［スルフィドリル・オキシダーゼの酵素アッセイ］
Ａｌｒｐスルフィドリル・オキシダーゼ活性を決定するために、エルマンの試薬法を追試した (リソウスキ T., Dig. Liv. Dis., 2001, 33:173-80) 。酵素アッセイの前に、ＤＴＴを、遠心濾過器（ミリポア・ミクロコン、ＹＭ−５０）により、市販のスタットー３溶液から除去した。次いで、０．９ｎモルの還元されたチオール基に対応する濃縮したスタットー３溶液を１ｍｌの測定緩衝液（２Ｍ尿素、１ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７，５）中に希釈し、０．６７ピコモルのｒＡｌｒｐ有り又は無しで３７℃で培養した。異なった時間インターバルのチオール含有量を、１０μＭ（最終濃度）のエルマン試薬を添加しかつ４１２ｎｍにおける14.15 mM"1 cm'1 at 412 nmの減衰係数を使用して決定した。
【００５９】
［スタットー３ホモダイマの評価］
ｒＡｌｒｐスルフィドリル・オキシダーゼ活性に起因する、Ｓ−Ｓ架橋形成の結果生じるスタットー３ホモダイマを特定するために、ｒＡｌｒｐを存在させ又は存在させずに、ＤＴＴを除去したスタットー３の５分間培養後に、ウェスタンブロット分析を行った。遠心濾過器（ミリポア・ミクロコン、ＹＭ−５０）により得られた、ＤＴＴを除去したスタットー３（８μｇ）を、２００ｎｇのｒＡｌｒｐを存在させ又は存在させずに、１ｍＭのＥＤＴＡ，１００ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ7.5中、３７℃で５分間培養した（最終容量３０μｌ）。培養後、反応混合物を７．５％のナトリウム・ドデシル硫酸−ポリアクリルアミド・ゲル（アメリカ合衆国カリフォルニア州のバイオラッド社）に負荷した。２種類の別個の電気泳動ラインで、ＤＴＴを除去したスタットー３（８μｇ）と蛋白質ＭＷマーカ（アメリカ合衆国カリフォルニア州のバイオラッド社）を同時に負荷した。電気泳動操作の終わりに、蛋白質をニトロセルロース膜に移し、次いでそれをスタットー３に特異的な主要な抗体（ウサギ、アメリカ合衆国ニューヨーク州のアップステート社）で調べた。主要な抗体は、アルカリ・フォスファターゼ接合した二次的な抗体（アメリカ合衆国カリフォルニア州のバイオラッド社）及び科学発光体（イングランドのアマーシャム社）を使用して検出した。
【００６０】
結果
ｒＡｌｒｐのスペクトルを図８に示す。当該スペクトルは、それぞれ蛋白質結合フラビンに特異的な３６０ｎｍ及び４５０ｎｍの２つの最大値を示す（リソウスキT.ら, DLD, 2001, 33:173-80)。４６０ｎｍにおける仮想の減衰係数である４６０ｎｍにおぇる10 mM-1cm-1を使用して、蛋白質のモノマユニット当たり０．５フラビン分子が存在することを見い出し、ここではヒトの細胞と同じように、蛋白質サブユニット／ＦＡＤの化学量論は１：１である。組み換えＡｌｒｐのＦＡＤ含有量は、蛋白質発現及び精製操作に依存する。これらの結果は、ＡｌｒｐにリンクしたＦＡＤの存在を確認する。
【００６１】
図９は、ｒＡｌｒｐの存在下で培養すると、スタットー３チオール基が消失することを示している。得られたデータは、スタットー３が新規なＡｌｒｐスルフィドリル・オキシダーゼ酵素活性のための卓越した基質であることを明確にしている。半分の酸化は１７秒で完了し、４５秒の培養後には、２０％のチオール基が残っている。プログレス曲線への正接から、初期速度0.037 nモルーチオール（s-1）が見積もられ、１活性蛋白質当たり及び１秒当たり、９７個のＳ−Ｓ架橋形成に対応する。Ａｌｒｐが存在しない場合も精製されたＦＡＤ単独の場合も、チオール酸化は検出されなかった。
【００６２】
図１０は、ｒＡｌｒｐの存在下に培養される際の、スタットー３（ライン１）のホモダイマ形成を示す。ライン３は、ｒＡｌｒｐ無しに培養した際のスタットー３輪郭を示す。ライン３は、会社（コントロール）で販売されるスタットー３の電気泳動の輪郭を示し、ライン４は、ＭＷ輪郭を示す。ライン１でのみ、スタットー３蛋白質の約２倍のＭＷを有する反スタットー３抗体により、免疫学的に認識された蛋白質、及びＡｌｒｐスルフィドリル・オキシダーゼ酵素活性下のスタットー３ホモダイマ形成の効果が同定される。
【００６３】
、
肝再生の間、アポトーシスへのガスの影響（ＲＡＬＲＰ及びＲＨＧＦ）を研究するために使用される実験モデル
（Ａ）  未処置の７０％ＰＨラット中のＡｌｒｐ及びＨＧＦ血清レベル  
３０匹の雄ラットを使用した。５種類の６群に分けた動物を、それぞれ７０％ＰＨを行わせ、手後、０、１２時間、１８時間、２４時間、４８時間、１８時間及び７２時間の手術経過後に、殺した。犠牲時に、深いエーテル麻酔下で、動物は腹壁切開手術を受け、血液サンプルを採ってＡｌｒｐ及びＨＧＦ血清レベルを受ける。
【００６４】
血清Ａｌｒｐ濃度の顕著な増加（＊ｐ＜０．００１）が、手術後１２時間で観察され（手術前値の５倍大きい）、手術後１８時間で最大発現に達し（手術前値の７倍大きい）、  次いで２４時間で減少し始め、４８及び７２時間で手術前レベルに戻った（図１Ａ）。
【００６５】
類似するパターンが、ＨＧＦ血清プロフィールでも得られた。顕著な増加（＊ｐ＜０．００１）が、手術後６時間から始まり（手術前値の２倍大きい）、手術後１８時間で最大発現に達した（手術前値の４倍大きい）。次いで一定割合で徐々に減少し、手術後４８及び７２時間でベースライン値に達した（図１Ｂ）
【００６６】
（Ｂ）  ７０％部分肝切除ラットの投与後のＡｌｒｐ及びＨＧＦ血清レベル  
前記データに基づいて、成長因子の血清レベルを、文献及び本明細書に記載した最大発現と同程度に高く維持することを目標にして、７０％ＰＨ動物に、ｒＡｌｒｐ又は組替えＨＧＦ（ｒＨＧＦ）の注射を、手術後１８時間経過時から始めることを決定した。ｒＡｌｒｐ及びｒＨＧＦを前回の実験と同じ投与量で与え、それぞれの生物活性を生じさせた。４０匹のラットに７０％ＰＨを行った。そのうちの１０匹を各５匹の２群に分けた。 ５匹を手術直後に殺し、時間ポイント「０時間」として使用し、残りの５匹を手術後１８時間で殺して時間ポイント「１８時間」として使用した。残りの３０匹は各１５匹の２群に分けた。１群は、Ａｌｒｐ（５００ｎｇ／ラット／各注射）を複数回、手術後１８、３６及び４２時間に、注射で投与し、ＰＨ後２４、３６及び４８時間に各５匹を殺した。他の群も、５００ｎｇ／ラット／各注射の投与量のｒＨＧＦを使用して同じプロトコルで処置した。血液サンプルを全動物から採取してＡｌｒｐ及びＨＧＦ血清レベルを決定した。得られた結果（図２）から、ＰＨ後１８時間から肝切除したラットへ２種類の成長因子を投与すると、少なくとも我々が観察した期間（ＰＨ後４８時間まで）血清レベルをそれらの最大発現で観察されるものと同程度に高く維持できたことが分かる（＊ｐ＜０．００１対０時間値)。
【００６７】
未処置及びＧＦｓ処置７０％ＰＨラットの肝細胞増殖及びアポトーシス
１）未処置７０％部分肝切除ラットにおける決定
本実験では、３５匹の雄ラットを使用した。全てのラットに７０％ＰＨを行い、ラット各５匹の７群に分け、手術後、０、６、１２、１８、２４、３６及び４８時間で殺した。  殺される時点で、ラットは深いエーテル麻酔下にあり、開腹し、肝臓を切除し、次の測定のために使用した。
−ＴＵＮＥＬ分析による肝細胞アポトーシス
−ＢｒｄＵ導入による肝細胞増殖。
【００６８】
「肝細胞アポトーシス」
アポトーシスの増加をＰＨ後６時間から記録し（１．８±０．７アポトーシス体／１０００肝細胞）、２４時間でそのピークに達した（７．５±１．８アポトーシス体／１０００肝細胞）。減少が３６及び４８時間で記録された（図３、（＊ｐ＜０．００１対０時間)。
【００６９】
「肝細胞増殖」
ＰＨ後の肝細胞増殖の典型的なパターンを観察した。０時間ポイント（ラベル指標＝ＢｒｄＵ+  肝細胞／１０００肝細胞；Ｌ．Ｉ．＝２．５±２）と比較すると、ＰＨ後１２時間で増加し（L.I.=5.5±3)、２４時間でその最大発現に到達し（L.I.=２１±５、ｐ＜０．００１）、次いで手術後３６時間(Ｌ．Ｉ．＝ ２０±４．７； ｐ＜０．００１) 及び48時間(Ｌ．Ｉ．＝ １４±３； ｐ＜０．００１）で着実に減少した（図４）。
【００７０】
２）Ａｌｒｐ又はｒＨＧＦ注射した７０％部分肝切除ラットにおける決定
本実験では、４５匹の雄ラットを使用し、全てのラットに７０％ＰＨを行い、次いでラット各１５匹の３群に分けた。１群は、Ａｌｒｐ（５００ｎｇ／各時間／各動物、腹腔内）を、他の１群には、ｒＨＧＦ（１０００ｎｇ／各時間／各動物、i.ｖ.）を、そして最後の１群にはアルブミンを注射した。注射は、手術後、１８、３０及び４２時間で行った。殺される時点で、ラットは深いエーテル麻酔下にあり、開腹し、肝臓を切除し、次の分析のために使用した。
−ＴＵＮＥＬ分析による肝細胞アポトーシス
−ＢｒｄＵ導入による肝細胞増殖。
【００７１】
「肝細胞アポトーシス」
結果を図５に示した。アルブミン処置動物（コントロール）は、未処置ＰＨラットで記録したものと一致するアポトーシスプロフィールを示した。rHGFで処置されたＰＨ動物でも類似パターンが観察された。逆に、rＡｌｒｐでの処置は、２４時間(１．２±０．５アポトーシス体／1000 肝細胞)及び４８時間（２．２±０．７アポトーシス体／1000肝細胞; p<0.01対コントロールラット)でアポトーシスの大きな減少を誘起した。この減少は明確であるが、３６時間では統計的に重要ではない（２±０．８アポトーシス体／1000 肝細胞)。
【００７２】
［ＢｒｄＵ導入］
アルブミン処置された動物の肝細胞増殖は、未処置７０％ＰＨラットで記録された典型的なプロフィールを示す (24時間−Ｌ．Ｉ．＝ ２２±３．５， ３６時間−Ｌ．Ｉ ＝ ２１±２．４及び48 時間-L.I.＝１３±２．５)(図６)。手術後の同じ時間ポイントでのコントロールと比較すると、ｒＡｌｒｐ及びｒＨＧＦの投与は、２４時間（ｒＡｌｒｐ−Ｌ．Ｉ．＝ ２９±４．２；ＨＧＦ−Ｌ．Ｉ．＝３３±４； ＊ｐ＜０．０１;   §＝ｐ＜０．００１)、３６時間（ｒＡｌｒｐ−Ｌ．Ｉ．＝２２±３．５；  ｒＨＧＦ＝２８±３；  §ｐ＜０．００１)及び４８時間（ｒＡｌｒｐ−Ｌ．Ｌ＝１７±３．９； ｒＨＧＦ−Ｌ．Ｉ ＝ １８±２．７， ｎ．ｓ．）における肝細胞増殖(BrdU＋ 肝細胞)を増加させる (図６)。
【００７３】
７０％ＰＨラットのＢｃｌ−２ファミリの遺伝子に対するｒＡｌｒｐ投与の効果  
本実験では、２５匹の雄ラットを使用し、全てのラットに７０％ＰＨを行い、次いでラットを３群に分けた。１群の５匹のラットは手術直後に殺し（時間「ゼロ」群）、第２群の１０匹のラットには、Ａｌｒｐ（５００ｎｇ／ラット／各注射）を手術後の１８及び４２時間に複数回行い、各時間について６時間後（それぞれ２４時間及び４８時間）に５匹ずつ殺した。第３群の１０匹のラットには、アルブミン（５００ｎｇ／ラット／各注射、腹腔内）を同じプロトコルに従って注射した。殺される時点で、ラットは深いエーテル麻酔下にあり、開腹し、肝臓を切除し、マルチーＰＣＲによるアポトーシス遺伝子(Bcl-2, BcI-XL, BcI-XS, Bax, Casp-3)のためのｍＲＮＡ発現を決定するために使用した。
【００７４】
親アポトーシス遺伝子(Bax及びCasp-3)ｍＲＮＡ発現の減少を、アルブミン処置ラットと比較してｒＡｌｒｐ処置ラットに記録した（図７Ａ）。Ｂａｘ  ｍＲＮＡのデンシトメトリ分析により、２４及び４８時間の両時間ポイントで成長因子を注射された動物に、手術後４８時間ポイントで統計的に強い減少が現れた (*p<0.001対アルブミンー処置ラット) （図７Ｂ）。類似で、そして幾つかの面ではより強いプロフィールが現れて、Casp-3 mRNA発現のデンシトメトリ分析を評価する。この場合、手術後２４及び４８時間に、劇的で、統計的で大きな(*p<0.001対アルブミン処置ラット)遺伝子発現の減少が記録された。前記結果(Bax及びCasp-3 mRNA発現)を合わせると、７０％ＰＨ後のｒＡｌｒｐ処置ラット中の親アポトーシスｍＲＮＡ遺伝子発現の劇的な下方調節が明らかに示される。
【００７５】
反アポトーシス遺伝子であるＢｃｌ−２のｍＲＮＡ発現のパターンは全く逆である。実際に、Ｂｃｌ−２の発現の上方調節を、アルブミン処置ラットと比較したｒＡｌｒｐ処置ラット中で、ＰＨ後２４時間及び４８時間で記録した（図７Ａ）。
【００７６】
増殖した遺伝子のシグナルをデンシトメトリ分析すると、４８時間ポイントで２つの動物群間に統計的に大きな増加(*p<0.001)が生じたことが分かった（図７Ｂ）。
【００７７】
これらの結果から、ＰＨ後の再生肝臓のｒＡｌｒｐ注射に対する応答は、反アポトーシス遺伝子の上方調節で、親アポトーシス遺伝子の下方調節であることが明らかである。
【００７８】
全ＲＮＡ抽出。ＲＮＡ調製及び一本鎖ｃＤＮＡ合成
生産者の指示に従って、ルヌージ（Rneasy）・ミニキット（キアゲン・ゲーエムベーハー）を使用して、肝臓組織から全ＲＮＡを抽出した。最後のｍＲＮＡ濃縮物を２６０ｎｍの紫外線（ＵＶ）吸光度で評価した。ランダム・ヘキサマ及び、３１２５Ｕ／μｌのマルチスクライブ・リバース・トランスクリプターゼを有しかつ最終容量が５０μｌであるタクマン（TaqMan）逆転写試薬（イタリア国モンツァのアプライド・バイオシステムズ社）を使用して、全ＲＮＡ（１μｇ）のアリコートを逆転写した。
【００７９】
アポトーシス遺伝子ｍＲＮＡ決定のためのＭＵＬＴＩ−ＰＣＲ  
マルチプレックスＲＴ−ＰＣＲ  ＡＰＯ２Ｂ（イタリア国ミラノのエッペンドルフ社）市販キットを使用して、マルチＰＣＲを行った。ハウスキーピング遺伝子として使用される研究されたアポトーシス遺伝子(Casp-3, Bcl-2, Bax , BcI-XL, BcI-XS) 及び GAPDH (グルコースー６−フォスフェート・デハイドロゲナーゼ)のＯＲＦ領域に特異的な混合プライマの最適量がキット中に存在する。
【００８０】
各サンプルのｃＤＮＡ（１μｌ）を、最終容量が５０μｌである次の試薬混合物中で増殖させた。１０ＸrAPO2B MPCR 緩衝液、10x rAPO2Bプライマ, Taq DNAポリメラーゼ (アメリカ合衆国カリフォルニア州エルマー・セタスのパーキンーエルマー社) 5U/μ\ochl、 dNTPs (各１ｍＭ)。これらの遺伝子の同時増殖が生産者の指示に従って行う、次の反応プロフィールを有する「ホット・スタット」ＰＣＲ法を使用して得られる。94℃x 3', 2 サイクル (96℃  １‘，  ６８  ℃ x ４')，  ３３サイクル （９４℃ｘ１’，６８℃ｘ２．５‘）,７０℃ ｘ  １０’，  ７０℃から２０℃まで30'で徐々に行う。次いでＰＣＲで得られた各サンプルのアリコート（１０μｌ）を臭化｛しゅうか｝エチジウムの存在下、アガロース・ゲル（４％）上で電気泳動させ、ＵＶトランス発光体(アメリカ合衆国セントルイスのシグマ社)を使用するポラロイドで写真撮影した。
【００８１】
各増殖遺伝子のシグナルのデンシトメトリ分析を、オプティラブ・システム（イタリア国パヴィアのグラフテック社）で評価した。データは、各アポトーシス遺伝子のデンシトメトリ値とＧＡＰＤＨのデンシトメトリ値間の比として報告した。
【００８２】
［血清ＧＦｓの決定］  
標準的なＥＬＩＳＡ法を使用し、かつ主として文献(ガンディCRら、1999, Hepatology 29(5), 1435-4)に先行記載された操作に従って、Ａｌｒｐの血清レベルを評価した。特定のウサギポリクロナール抗体反Ａｌｒｐを使用した。
【００８３】
ＨＧＦ血清評価のため、会社(アメリカ合衆国９４０４３カリフォルニア州マウンテン・ビューのＢ−ブリッジ・インターナショナル・インコーポレイテッドエルマー・セタスのパーキンーエルマー社)により記述された操作に従って市販キットを使用した。
【００８４】
アポトーシス評価：ＴＵＮＥＬ
厚さ３ミクロンの肝臓部分を使用して、ターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼ・メディエーティッド・ｄＵＴＰ・ニック・エンド・ラベリング（ＴＵＮＥＬ）法(アメリカ合衆国ニューヨークのライフ・サイエンシーズ社のエンゾ・キット)によるアポトーシス細胞のＤＮＡ断片を検出した。脱パラフィン化及び水補給後に、組織部分を、３７℃で１５分間、プロテイナーゼＫ(10 μ\ochg/ml)で消化した。平衡緩衝液を加えた後、前記部分を使用強度を有しかつデオキシウリジン三リン酸塩（ｄ−ＵＴＰ）―ビオチンを含むＴｄＴ酵素中で、カバースリップを使用して、３７℃、３０分間培養した。カバースリップの除去後、スライドを、ストレプトアビジン接合したアルカリ性フォスファターゼで、３７℃、３０分間、次いでニトロブルーテトラゾリウムで３７℃、３０分間培養した。通常のリンパ節の部分をＴＵＮＥＬ法の陽性対照として使用した。陰性対照では、ＴｄＴ酵素をヌクレオチド混合物から除いた。拡散型又は粒状
の濃青核染色が明らかであるときに陽性と記録されたアポトーシスシグナルも、特性的な形態的な外観、近くに大きな炎症がないこと、及びアポトーシス体の分離した細胞やクラスターとして生じていることにより同定される。
【００８５】
アポトーシスの肝細胞は、２０の異なった分野（倍率１００倍）のアポトーシスシグナルをチェックする、２つの異なったオペレータにより深く考慮せずに決定される。得られたデータは、アポトーシス肝細胞の数／１０００個の観察された肝細胞のパーセント数として表される。
【００８６】
［細胞増殖：ブロモ−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の導入］
殺す２時間前に、動物に、120 mg/kg b.w.のBrdU（アメリカ合衆国ミズーリ州セントルイスのシグマ社）を腹腔内に注射した。異なったローブからの５ｍｍ厚の肝臓サンプルを、緩衝ホルマリン中に固定し、パラフィン中に埋め込み、４μｍに区切り、かつヘマトキシリン・エオジンで染色した。ＢｒｄＵ導入を、１：２０に希釈した、モノクロナール反ＢｒｄＵ抗体（アメリカ合衆国カリフォルニア州カーピンテリアのダコ・コーポレーション）で検出した。反応生成物を、３−アミノー９−エチルカルバゾールのベクタシュタイン（Vectastain）ＡＢＣキットＰＫ４００２（アメリカ合衆国カリフォルニア州バーリンゲームのベクターズ・ラボラトリーズ・インコーポレーテッド）により、明らかにした。肝細胞増殖を、多くのラベルされ及びラベルされていない核が評価される全肝臓の小葉領域で評価された。肝葉当たり、最小１０００の肝細胞を２種類の異なったオペレータによりカウントした。
【００８７】
［スタットー３ーＰの免疫組織化学的評価］
Ａｌｒｐ、ｒＩＧＦ−ＩＩ又はアルブミンで処置されかつ手術後２４時間で殺された
た７０％ＰＨラットからのパラフィンを埋めた肝臓サンプルのブロックを、標準的な回転式ミクロトーム(ライチャートーユンク 1130/バイオカット)で４μｍに区画し、それらの部分を、水浴からＡＰＴＳ（３−アミノープロピルートリメトキシーシラン）（アメリカ合衆国セントルイスのシグマーアルドリッチ社）製ガラススライドに回収した。当該スライドをキシレン中、１時間室温で脱パラフィンし、更にエタノールの濃度を下げながら(１００％エタノールに１０分、９５％エタノールに１０分、７０％エタノールに１０分、純水に５分)水分補給を行った。抗原性サイトをアンマスクするために、スライドを、クエン酸緩衝液（ｐＨ＝６．０）中で、７００Ｗの超音波に３分ずつ３回露出した。ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ＝７．４）で５分ずつ３回洗浄した後、スライドを１０分間トライトン０．２５％で処理した。ＰＢＳ中で５分ずつ３回洗浄した後、内因性パーオキシダーゼを、メタノール中のＨ2Ｏ2（１０；１ｖ／ｖ）で、７分間室温で遮断した。ＰＢＳ中で５分ずつ３回洗浄した後、スライドを、３％のヤギ血清（アメリカ合衆国セントルイスのシグマーアルドリッチ社）を含むＰＢＳ（遮断溶液）中に、３０分間室温で位置させた。内因性ビオチンを、アビジンービオチンブロッキングキット（カナダ国バーリンゲームのベクター・ラボラトリーズ社）で遮断し、それらの部分を主要なポリクロナールウサギ反スタットー３抗体（アメリカ合衆国ニューヨーク州レークプラシッドのアップステート社）を含み、かつ生産者の指示に従って、１：３００で希釈された遮断溶液中で４℃（o.n.）で培養した。次いでスライドをＰＢＳ中で５分間ずつ３回洗浄し、生産者の指示に従って、１：４００で希釈された二次的なビオチン化反ウサギ抗体（カナダ国バーリンゲームのベクター・ラボラトリーズ社）を含むＰＢＳで室温下で１時間培養した。組織中のＰ−スタットー３の最適な視覚化のためのベストの実験条件がある（チャン  ＫＳら、２００４）。ＰＢＳ中で、５分間ずつ３回洗浄した後、スライドを、パーオキシダーゼに関連するＡＢＣ（カナダ国バーリンゲームのベクター・ラボラトリーズ社のＡＢＣキット）溶液で室温下４０分間培養し、ＰＢＳで３回洗浄し、次いでクロモゲン３−アミノー９−エチルカルバゾール（カナダ国バーリンゲームのベクター・ラボラトリーズ社のＡＥＣキット）で室温下１４分間培養した。ＰＢＳ中で、５分間ずつ３回洗浄した後、前記部分を、クリスタル／マウント（カナダ国フォスターシティのバイオメダ・コーポレーション）で設置した。
【００８８】
［統計的分析］
得られた結果は、平均・標準偏差（Ｍ ± Ｓ．Ｄ．）で示した。群の統計的比較を、分散検定（ＡＮＯＶＡ）の分析を使用して行った。示したように、個々の比較は、  スチューデント検定を使用して行った。統計的重要性は、p < 0.05であるときのデータに帰せられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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