(57)【要約】本発明は、ヒトＯＸ４０レセプター（ＣＤ１３４）およびそのフラグメントに対するアンタゴニスト抗体に関し、それにはアンタゴニスト抗体のアミノ酸配列およびその抗体をコードする核酸が包含される。前記抗体の軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域由来の抗原結合領域（ＣＤＲ）もまた、本発明に包含される。本発明の別の局面は、炎症性疾患および自己免疫疾患を処置する際の抗ＯＸ４０アンタゴニスト抗体の使用である。本発明は、アンタゴニスト抗体Ａ１０のヒト化配列、およびその抗体の結合部位のエピトープマッピングにも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＯＸ４０エピトープに特異的に結合する、単離されたアンタゴニスト抗体であって、該抗体は：
ａ．
ｉ．配列番号１７のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１８のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２；および／または
ｉｉｉ．配列番号１９のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３；
を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／あるいは
ｂ．
ｉ．配列番号１２、１５または６１のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１３のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２；および／または
ｉｉｉ．（３）配列番号１４または１６のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む、抗体。
【請求項２】
前記抗体が：
ａ．
ｉ．配列番号１７のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１８のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１９のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３；
を含む重鎖可変領域（ＶＨ）および／または
ｂ．
ｉ．配列番号１２のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１３のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．（３）配列番号１４のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記抗体が：
ａ．
ｉ．配列番号１７のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１８のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１９のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３；
を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または
ｂ．
ｉ．配列番号１２のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１３のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１６のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体が：
ａ．
ｉ．配列番号１７のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１８のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．（３）配列番号１９のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３；
を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または
ｂ．
ｉ．配列番号１５のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１３のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．（３）配列番号１４のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体が：
ａ．
ｉ．配列番号１７のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１８のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１９のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３；
を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または
ｂ．
ｉ．配列番号１５のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１３のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２；および配列番号１６のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体が：
ａ．配列番号１０もしくは１１のいずれか１つに示されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＶＨ）、および／または
ｂ．配列番号７、８もしくは９のいずれか１つに示されているアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体が：
ａ．配列番号２５、２６もしくは２７の核酸配列のいずれか１つによってコードされる重鎖可変領域（ＶＨ）；および／または
ｂ．配列番号２０、２１、２２、２３もしくは２４の核酸配列のいずれか１つによってコードされる軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項８】
前記抗体が：
ａ．配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ、および配列番号７もしくは８のいずれか１つに示されているアミノ酸配列を有するＶＬ；または
ｂ．配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ、および配列番号９に示されているアミノ酸配列を有するＶＬ
を含む、請求項６に記載の抗体。
【請求項９】
前記抗体が：
ａ．配列番号２５の核酸配列によってコードされるＶＨ、および配列番号２０もしくは２１の核酸配列によってコードされるＶＬ；
ｂ．配列番号２６の核酸配列によってコードされるＶＨ、および配列番号２２、２３もしくは２４の核酸配列によってコードされるＶＬ；または
ｃ．配列番号２７の核酸配列によってコードされるＶＨ、および配列番号２２、２３もしくは２４の核酸配列によってコードされるＶＬ
を含む、請求項７に記載の抗体。
【請求項１０】
前記ＶＨが、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の抗体。
【請求項１１】
前記ＶＨが、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の抗体。
【請求項１２】
前記ＶＨが、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の抗体。
【請求項１３】
定常領域をさらに含む、請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９に記載の抗体。
【請求項１４】
ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３ドメインを含む抗体定常領域をさらに含む、請求項１３に記載の抗体。
【請求項１５】
前記定常領域が、ＩｇＧ抗体由来である、請求項１４に記載の抗体。
【請求項１６】
前記ＩｇＧ抗体が、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体またはＩｇＧ４抗体である、請求項１５に記載の抗体。
【請求項１７】
前記抗体が、ヒト抗体である、請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９に記載の抗体。
【請求項１８】
前記抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、モノクローナル抗体または組換え抗体である、請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９に記載の抗体。
【請求項１９】
前記抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、一本鎖Ｆｖ、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ、単一ドメイン抗体、抗原結合フラグメント、ダイアボディ、トリアボディまたはミニボディである、請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９に記載の抗体。
【請求項２０】
標識をさらに含む、請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９に記載の抗体。
【請求項２１】
細胞毒または免疫毒素をさらに含む、請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９に記載の抗体。
【請求項２２】
請求項１に記載の抗体をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項２３】
請求項２２に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項２４】
請求項２３に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２５】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９に記載の抗体と、生理的に許容可能なキャリア、希釈剤、賦形剤および安定剤のうちの少なくとも１つとを含む組成物。
【請求項２６】
患者においてＯＸ−４０媒介性障害を処置する方法であって、該方法は、請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９のいずれか１項に記載の、有効量の抗体を該患者に投与する工程を包含し、ここで、該抗体は、ＯＸ４０に対するＯＸ４０Ｌの結合を阻止し、そして／またはＯＸ４０に対するＯＸ４０Ｌの結合に関連する１つ以上の機能を阻害する、方法。
【請求項２７】
前記ＯＸ４０媒介性障害が、炎症性疾患または自己免疫疾患である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記疾患が、アレルギー、喘息、または自己免疫および炎症に関連する疾患、例えば、多発性硬化症、関節リウマチ、炎症性腸疾患、移植片対宿主病、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、自己免疫性神経障害、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、重症筋無力症、実験的リーシュマニア症、コラーゲン誘発関節炎、大腸炎（例えば、潰瘍性大腸炎）、接触過敏症反応、糖尿病、クローン病、バセドウ病、サルコイドーシス、悪性貧血、側頭動脈炎、抗リン脂質症候群、血管炎（例えば、ウェゲナー肉芽腫症）、ベーチェット病、疱疹状皮膚炎、尋常性天疱瘡、白斑、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性肝炎、橋本甲状腺炎、自己免疫性の卵巣炎および睾丸炎、副腎の自己免疫疾患、全身性エリテマトーデス、強皮症、皮膚筋炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、脊椎関節症（例えば、強直性脊椎炎）、ライター症候群、またはシェーグレン症候群である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記疾患が、アレルギー、喘息、または自己免疫および炎症に関連する疾患、例えば、多発性硬化症、関節リウマチ、炎症性腸疾患、移植片対宿主病、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、実験的リーシュマニア症、コラーゲン誘発関節炎、大腸炎（例えば、潰瘍性大腸炎）、接触過敏症反応、糖尿病、クローン病またはバセドウ病である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記抗体が、静脈内、腹腔内、吸入、筋肉内、皮下および経口経路を含む経路のうちの１つ以上を介して前記患者に投与される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
患者においてＩｇＥ抗体産生を阻害することによって障害を処置するための方法であって、請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９のいずれか１項に記載の、有効量の抗体を該患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項３２】
前記障害が、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性皮膚炎、アナフィラキシー、じんま疹またはアトピー性皮膚炎である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
哺乳動物において喘息の重症度を低下させるための方法であって、該方法は、請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９のいずれか１項に記載の、有効量の抗体を該哺乳動物に投与する工程を包含し、ここで、該抗体は、以下の特性：（ａ）ヒトＯＸ４０に、約１×１０−１０乃至約１×１０−１２ＭのＫＤで結合する；（ｂ）ＯＸ４０への結合に関連する１つ以上の機能を阻害する；および（ｃ）ＯＸ４０に対するＯＸ４０Ｌの結合を阻害する、のうちの少なくとも１つを備えている、方法。
【請求項３４】
前記抗体が、約１×１０−１２乃至約１×１０−１１Ｍ、約１×１０−１１乃至約１×１０−１０Ｍ、約１×１０−１０乃至約１×１０−９Ｍ、約１×１０−９乃至約１×１０−８Ｍ、または約１×１０−８乃至約１×１０−７ＭのＫＯでヒトＯＸ４０に結合する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
請求項２４に記載の細胞を、抗体の産生に適した条件下で培養する工程および該抗体を単離する工程を包含する、抗体の生成方法。
【請求項３６】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９に記載されたような抗体を産生する、ハイブリドーマ。
【請求項３７】
医薬の調製における、請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９のいずれか１項に記載の抗体の使用。
【請求項３８】
ＯＸ４０に関連する疾患または障害を処置するための、請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９のいずれか１項に記載の抗体の使用。
【請求項３９】
前記疾患が、アレルギー、喘息、または自己免疫および炎症に関連する疾患、例えば、多発性硬化症、関節リウマチ、炎症性腸疾患、移植片対宿主病、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、自己免疫性神経障害、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、重症筋無力症、実験的リーシュマニア症、コラーゲン誘発関節炎、大腸炎（例えば、潰瘍性大腸炎）、接触過敏症反応、糖尿病、クローン病、バセドウ病、サルコイドーシス、悪性貧血、側頭動脈炎、抗リン脂質症候群、血管炎（例えば、ウェゲナー肉芽腫症）、ベーチェット病、疱疹状皮膚炎、尋常性天疱瘡、白斑、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性肝炎、橋本甲状腺炎、自己免疫性の卵巣炎および睾丸炎、副腎の自己免疫疾患、全身性エリテマトーデス、強皮症、皮膚筋炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、脊椎関節症（例えば、強直性脊椎炎）、ライター症候群またはシェーグレン症候群である、請求項３８に記載の使用。
【請求項４０】
前記疾患が、アレルギー、喘息、または自己免疫および炎症に関連する疾患、例えば、多発性硬化症、関節リウマチ、炎症性腸疾患、移植片対宿主病、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、実験的リーシュマニア症、コラーゲン誘発関節炎、大腸炎（例えば、潰瘍性大腸炎）、接触過敏症反応、糖尿病またはクローン病である、請求項３９に記載の使用。
【請求項４１】
ＯＸ４０を検出するための、請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９に記載の抗体の使用。
【請求項４２】
サンプル中のＯＸ４０を検出するための方法であって、該サンプルと、請求項２０に記載の抗体とを接触させる工程を包含する、方法。
【請求項４３】
容器に入った所定量の請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９に記載の抗体、および別個の容器に入った緩衝液を備えた、キット。
【請求項４４】
容器に入った所定量の請求項２５に記載の組成物、および別個の容器に入った緩衝液を備えた、キット。
【請求項４５】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９に記載の抗体を備えた、医療デバイス。
【請求項４６】
吸入デバイスである、請求項４５に記載の医療デバイス。
【請求項４７】
請求項２５に記載の組成物を備えた、医療デバイス。
【請求項４８】
吸入デバイスである、請求項４７に記載の医療デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．発明の分野
ヒトＯＸ４０ポリペプチド、ＯＸ４０ポリペプチドフラグメントまたは他のＯＸ４０エピトープに免疫特異的に結合する抗体が、本明細書中で提供される。本発明はまた、ヒトＯＸ４０ポリペプチド、ＯＸ４０ポリペプチドフラグメントまたはＯＸ４０エピトープに免疫特異的に結合するヒト化抗体にも関する。ＯＸ４０ポリペプチド、ＯＸ４０ポリペプチドフラグメントまたはＯＸ４０エピトープに免疫特異的に結合する抗体をコードする、単離された核酸もまた提供される。本発明はさらに、ヒトＯＸ４０ポリペプチド、ＯＸ４０ポリペプチドフラグメントまたはＯＸ４０エピトープに免疫特異的に結合する抗体をコードする核酸を含むベクターおよび宿主細胞、ならびにそれらの抗体を作製する方法を提供する。本明細書中に提供される抗ＯＸ４０抗体を使用して、ＯＸ４０の生物学的活性を阻害する方法、および／またはＯＸ４０媒介性疾患を処置もしくは予防する方法もまた提供される。
【背景技術】
【０００２】
２．発明の背景
われわれの免疫系は、外来性の病原体から自身の身体を防御するものであり、外来性物質に対する免疫の活性化と、自己組織に対する寛容とのバランスを必要とする機能である。例えば、ウイルス病原体が原因の急性感染症は、２つのタイプの長期間記憶：体液性免疫（Ｂリンパ球（Ｂ細胞）が、抗体を産生することにより、これらの外来性病原体による感染を防ぐ）；および細胞性免疫（特定の抗原によって活性化されたＴリンパ球（Ｔ細胞）が、感染細胞を殺滅し、サイトカインも産生する）を誘導する。Ｔ細胞は、主に細胞性免疫において機能し、リンパ球の約７０％を構成する。Ｔ細胞の大部分は、ＣＤ４＋「ヘルパー」Ｔ細胞であり、主にＢ細胞およびマクロファージの活性化に関与する。ＣＤ８＋Ｔ細胞、すなわち細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、細胞媒介性の細胞傷害性反応に関与し、Ｔ細胞集団の約３５％を構成する。Ｔ細胞は、３つの異なる集団：ナイーブ細胞、エフェクター細胞および記憶細胞に分けることができる。ナイーブＴ細胞は、抗原の存在下において活性化し、エフェクター細胞になる。主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ（ＭＨＣクラスＩ）分子は、侵入病原体の抗原をＴ細胞レセプターに「提示」することによって、このエフェクター応答において主要な役割を果たし、また、その病原体を認識し、それらを攻撃する。
【０００３】
多くのレセプター−リガンド相互作用は、外来抗原に対する免疫応答の誘導、確立および調節に関与する。少なくとも２つのシグナルが、ある１つの抗原に対するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞応答を活性化するために必要である。第１のシグナルは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上の主要組織適合（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩ分子に結合した抗原によって、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）を介して送達される。第２のシグナルは、Ｔ細胞の表面上の第２のレセプター分子と、ＡＰＣの表面上に存在するリガンドとの結合に関与する。この第２のシグナルは、共刺激と呼ばれ、ＡＰＣリガンドは、しばしば共刺激分子と呼ばれる（非特許文献１）。共刺激シグナル伝達分子としては、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバー、腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバー、およびサイトカインレセプターが挙げられる（総説の非特許文献２；非特許文献３参照）。これらの２つのシグナルは、組み合わされると、Ｔ細胞を活性化し、それによりサイトカインが分泌され、増殖する。
【０００４】
共刺激分子の１つの例は、ＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーのＯＸ４０レセプター（ＣＤ１３４）であり、これは、膜結合型であり、主に活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞上で（すなわち、炎症部位において）発現される（非特許文献４）。そのリガンド（ＯＸ４０Ｌ）は、ＴＮＦファミリーに属するＩＩ型膜タンパク質であり、抗原提示細胞（例えば、活性化Ｂ細胞、樹状細胞および内皮細胞）上で発現される（Ｓｔｕｂｅｒら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２：５０７（１９９５）；Ｗｅｉｎｂｅｒｇら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６２：１８１８（１９９９）；Ｎｏｈａｒａら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６６：２１０８（２００１）；Ｍａｌｍｓｔｒｏｍら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６６：６９７２（２００１））。ＯＸ４０レセプター（本明細書中以後「ＯＸ４０」）を介するシグナル伝達は、エフェクターＴ細胞に対する共刺激であり、Ｔ細胞の増殖を引き起こす（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５２：４７１２（１９９４）；総説のＷａｔｔｓ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２３：２３（２００５）参照）。ＯＸ４０の研究によって、その主な役割が、主要な免疫応答において蓄積するエフェクターＴ細胞の数を決定し、その結果、その後発達し、生存する記憶Ｔ細胞の数を管理することであると示唆されている（総説の非特許文献２参照）。
【０００５】
いくつかのインビトロ研究では、ＯＸ４０が、Ｔ細胞増殖およびサイトカイン産生の増強をもたらす共刺激シグナルを提供すると示されている（Ｂａｕｍ  ＰＲら、ＥＭＢＯ  Ｊ，１９９４；Ａｋｉｂａ  Ｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃ  Ｒｅｓ，１９９８）。ＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌ相互作用は、ある特定の状況において、Ｔｈ２細胞の発達において優先的な役割を果たし得ることが示唆されている（Ｏｈｓｈｉｍａら、Ｂｌｏｏｄ  ９２：３３３８（１９９８）；Ｆｌｙｎｎら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８８：２９７（１９９８））。免疫活性化が、過剰であるか、または制御されていないとき、異常なアレルギー、喘息、炎症、自己免疫性疾患および他の関連疾患が生じることがある。そのような場合において、Ｔ細胞の活性化および分化は、重要な役割を果たす。ＯＸ４０は、免疫応答を増強するように機能するので、自己免疫性疾患および炎症性疾患を悪化させることがある。ＯＸ４０−ＯＸ４０Ｌの相互作用は、いくつかの疾患モデルの病原に結びつけられている。大多数の証拠から、ＯＸ４０−ＯＸ４０Ｌ相互作用が、アレルギー、喘息、ならびに自己免疫および炎症に関連する疾患（それらとしては、多発性硬化症、関節リウマチ、炎症性腸疾患、移植片対宿主病、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、実験的リーシュマニア症（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｌｅｉｓｈｍａｎｉａｓｉｓ）、コラーゲン誘発関節炎、大腸炎（例えば、潰瘍性大腸炎）、接触過敏症反応、糖尿病、クローン病およびバセドウ病が挙げられる）において重要な役割を果たすことが示唆されている（Ａｒｅｓｔｉｄｅｓら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３２：２８７４（２００２）；Ｊｅｍｂｅｒら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９３：３８７（２００１）；非特許文献３；Ｐａｋａｌａら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３４：３０３９（２００４）；Ｘｉａｏｙａｎら、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４３：１１０（２００６）；Ｗｅｉｎｂｅｒｇら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５２：４７１２（１９９４）；Ｗｅｉｎｂｅｒｇら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２：１８３（１９９６）；Ｍａｌｓｔｒｏｍら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６６：６９７２（２００１）；Ｈｉｇｇｉｎｓら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６２：４８６（１９９９）；Ａｋｉｂａら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９１：３７５（２０００）；Ｓｔｕｂｅｒら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １１５：１２０５（１９９８）；Ｔｓｕｋａｄａら、Ｂｌｏｏｄ  ９５：２４３４（２０００）；Ｙｏｓｈｉｏｋａら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３０：２８１５（２０００）；Ｓｔｕｂｅｒら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ３０：５９４（２０００）；Ｂｏｓｓｏｗｓｋｉら、Ｊ  Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  １８：１３６５（２００５）；総説のＷａｔｔｓ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２３：２３（２００５）参照）。
【０００６】
自己免疫性疾患および炎症性疾患に対する現在の治療としては、ステロイド単独の長期間の投与、または細胞傷害性薬物および／もしくは生物製剤との併用でのステロイドの長期間の投与が挙げられる。ＴＮＦ−αに対する抗体は、現在、関節リウマチ、クローン病および炎症性腸疾患をはじめとしたいくつかの疾患に対して処方されている。さらに、臨床評価における新規の実験的治療は、関節リウマチに対する、融合タンパク質ＣＴＬＡ４−Ｉｇ（可溶型の細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原−４）である。これらの代替物が出現してきたにもかかわらず、ほとんどの免疫抑制性の治療は、患者の免疫無防備状態をはじめとした重篤な副作用を引き起こす。Ｔ細胞媒介性疾患の処置は、理想的には、疾患を引き起こす［抗原特異的］細胞を標的化するものであるが、残りのＴ細胞レパートリーを残しうるものであろう（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２３：１０２（２００２））。ゆえに、自己免疫性疾患および炎症性疾患に対する代替療法が強く求められている。
【０００７】
これらの方法に加えて、Ｔ細胞集団を増加させるようにレセプターを刺激する多くのアゴニスト抗ＯＸ４０抗体が開発されている。初めて公開された抗ＯＸ４０モノクローナル抗体（ｍＡｂ）のＭＲＣ  ＯＸ−４０は、活性化ラットＣＤ４＋Ｔ細胞上の細胞表面抗原としてレセプターを認識するマウス抗体だった（非特許文献４）。この抗体は、Ｔ細胞増殖アッセイを刺激する際に、中程度の作用を有していた。それ以来、多くのアゴニスト抗ＯＸ４０ｍＡｂが作製され、免疫応答を高めるために用いられている（Ｗｅａｔｈｅｒｉｌｌら、Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０９：６３（２００１）；Ｂａｎａｌ−Ｐａｋａｌａら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ７：９０７（２００１）；Ｄｅ  Ｓｍｅｄｔら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６８：６６１（２００２）；Ｐａｎら、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ６：５２８（２００２）；Ｃｕｒｔｉら、Ｂｌｏｏｄ  １０１：５６８（２００３）；Ｎａｋａｅら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００：５９８６（２００３）；Ｌｕｓｔｇａｒｔｅｎら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３４：７５２（２００４）；Ｓｏら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７２：４２９２（２００４）；Ｋｏｇａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ  ９５：４１１（２００４）；Ｌａｎｔｈｒｏｐら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７２：６７３５（２００４）；Ｐｏｌｙｍｅｎｉｄｏｕら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１  Ｓｕｐｐｌ  ２：１４６７０（２００４）；Ｌｕｓｔｇａｒｔｅｎら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７３：４５１０（２００４）；Ｖａｌｚａｓｉｎａら、Ｂｌｏｏｄ  １０５：２８４５（２００５）；Ｃｕａｄｒｏｓら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １１６：９３４（２００５）；Ｓｈａｒｍａら、Ｅｘｐ  Ｇｅｒｏｎｔｏｌ  ４１：７８（２００６））。しかしながら、先に述べた自己免疫性疾患および炎症性疾患では、Ｔ細胞集団の刺激は、望まれる結果ではない。
【０００８】
抗ＯＸ４０Ｌ抗体を使用することによってＯＸ４０−ＯＸ４０Ｌシグナル伝達を阻止することが、１つの治療法である。ＯＸ４０Ｌを標的化するいくつかのｍＡｂが生成され、ＯＸ４０シグナル伝達経路、他の経路に対するその作用、および様々な疾患におけるＯＸ４０の役割を解明するために試験された（例えば、Ｂｌａｚａｒら、Ｂｌｏｏｄ  １０１：３７４１（２００３）；Ｕｋｙｏら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １０９：２２６（２００３）；Ｗａｎｇら、Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ６４：５６６（２００４）；Ｃｈｏｕら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７４：４３６（２００５）参照）。ＯＸ４０シグナルを阻害する他の方法としては、抗ＯＸ４０免疫毒素、ＯＸ４０−ＩｇＧ融合タンパク質、およびＯＸ４０リポソームの使用が挙げられる（Ｗｅｉｎｂｅｒｇら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２：１９３（１９９６）；Ｈｉｇｇｉｎｓら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６２：４８６（１９９９）；Ｓａｔａｋｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２７０：１０４１（２０００）；Ｔａｙｌｏｒら、Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  ７２：５２２（２００２）；Ｂｏｏｔら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ  ７：Ｒ６０４（２００５））。
【０００９】
上記リガンドを標的化する別の方法は、ＯＸ４０レセプター（ＣＤ１３４）に対する治療を開発することである。アンタゴニスト抗ＯＸ４０抗体を作製する試みがなされている。Ｓｔｕｂｅｒおよび共同研究者らは、ポリクローナルウサギ抗マウスＯＸ４０抗体を用いることにより、ＯＸ４０とＯＸ４０Ｌとの相互作用を阻害した（Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８３：９７９（１９９６））。Ｉｍｕｒａらは、ＯＸ４０経路によって媒介されるプロセスである、血管内皮細胞に対するＣＤ４＋Ｔ細胞の接着およびＴ細胞の増殖を阻害する抗マウスＯＸ４０抗体１３１および３１５を作製した。Ｗｅｉｎｂｅｒｇによって開示された抗ヒトＯＸ４０抗体は、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞を枯渇させる能力を示した；しかしながら、その抗体は、リシン−Ａ鎖などの毒性分子への抗体の結合体化に依存するものであった（特許文献１）。市販されているＬ１０６などの、開示されている他の抗ＯＸ４０抗体は、機能的な活性を有しなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第５，７５９，５４６号明細書
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｌｅｎｓｃｈｏｗら、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９６）１４：２３３
【非特許文献２】Ｃｒｏｆｔ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ（２００３）１４：２６５
【非特許文献３】Ｋｒｏｃｚｅｋら、Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００５）１１６：９０６
【非特許文献４】Ｐａｔｅｒｓｏｎら、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８７）２４：１２８１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、ＯＸ４０経路を干渉することができ、ヒトＯＸ４０を標的化する、真の機能性アンタゴニスト抗体が求められている。そのような抗体は、現在、ニーズがあり、まだ対処されていない多くの疾患を処置する可能性を有する。本発明は、このまだ対処されていない医療ニーズを解決するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
３．発明の概要
１つの局面において、本発明は、ヒトＯＸ４０レセプター（ＣＤ１３４）およびそのフラグメントに対するアンタゴニスト抗体に関する。別の実施形態は、アンタゴニスト抗体のアミノ酸配列およびその抗体をコードする核酸を包含する。
【００１４】
前記抗体の軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域由来の抗原結合領域（ＣＤＲ）もまた本発明に包含される。本発明の抗体は、組換え抗体であり得る。本発明の抗体は、モノクローナルであり得、モノクローナル抗体は、ヒト抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体であり得る。
【００１５】
本発明は、配列番号１７のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１；配列番号１８のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２；および／または配列番号１９のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに／あるいは配列番号１２、１５もしくは６１のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１；配列番号１３のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２；および／または配列番号１４もしくは１６のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体を包含する。ある実施形態において、本抗体は、配列番号１７、１８もしくは１９から選択されるアミノ酸配列を有する２つのＶＨ  ＣＤＲ、および／または配列番号１２、１３、１４、１５、１６もしくは６１から選択されるアミノ酸配列を有する２つのＶＬ  ＣＤＲを含む。
【００１６】
本発明は、配列番号１７のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１；配列番号１８のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２；および配列番号１９のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに／または配列番号１２のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１；配列番号１３のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２；および配列番号１４のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体を包含する。
【００１７】
本発明は、配列番号１７のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１；配列番号１８のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２；および配列番号１９のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに／または配列番号１２のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１；配列番号１３のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２；および配列番号１６のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体を包含する。
【００１８】
本発明は、配列番号１７のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２；および配列番号１９のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに／または：配列番号１５のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１；配列番号１３のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２；および配列番号１４のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体を包含する。
【００１９】
本発明は、配列番号１７のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１；配列番号１８のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２；および配列番号１９のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに／または配列番号１５のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１；配列番号１３のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２；および配列番号１６のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体を包含する。
【００２０】
本発明は、配列番号１０もしくは１１のいずれか１つに示されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＶＨ）、および／または配列番号７、８もしくは９のいずれか１つに示されているアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体を包含する。
【００２１】
本発明は、配列番号２５、２６もしくは２７の核酸配列のいずれか１つによってコードされる重鎖可変領域（ＶＨ）；および／または配列番号２０、２１、２２、２３もしくは２４のいずれか１つの核酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体を包含する。
【００２２】
本発明は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するＶＨおよび配列番号７もしくは８のいずれか１つに示されているアミノ酸配列を有するＶＬ；配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有するＶＨおよび配列番号９に示されるＶＬ；配列番号２５の核酸配列によってコードされるＶＨおよび配列番号２０もしくは２１の核酸配列によってコードされるＶＬ；配列番号２６の核酸配列によってコードされるＶＨおよび配列番号２２、２３もしくは２４の核酸配列によってコードされるＶＬ；または配列番号２７の核酸配列によってコードされるＶＨおよび配列番号２２、２３もしくは２４の核酸配列によってコードされるＶＬを含む抗体を包含する。
【００２３】
本発明は、ＶＨが配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含み、ＶＬが配列番号７に示されるアミノ酸配列を含む、抗体を包含する。
【００２４】
本発明は、ＶＨが配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含み、ＶＬが配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む、抗体を包含する。
【００２５】
本発明は、ＶＨが配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含み、ＶＬが配列番号９に示されるアミノ酸配列を含む、抗体を包含する。
【００２６】
本発明は、ＶＨが、ストリンジェントな条件下で、配列番号１０、１１、１７、１８または１９のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の相補鎖（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）にハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされ；そして／またはＶＬが、ストリンジェントな条件下で、配列番号７、８、９、１２、１３、１４、１５、１６または６１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の相補鎖にハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされる、抗体を包含する。
【００２７】
本発明は、ＶＨが、ストリンジェントな条件下で、配列番号２５、２６もしくは２７のうちのいずれか１つに示されるようなヌクレオチド配列の相補鎖にハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされ；そして／またはＶＬが、ストリンジェントな条件下で、配列番号２０、２１、２２、２３もしくは２４のうちのいずれか１つに示されるようなヌクレオチド配列の相補鎖にハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされる、抗体を包含する。
【００２８】
本発明は、約１×１０−１２〜約１×１０−１１Ｍ、約１×１０−１１〜約１×１０−１０Ｍ、約１×１０−１０〜約１×１０−９Ｍ、約１×１０−９〜約１×１０−８Ｍ、約１×１０−８〜約１×１０−７Ｍの解離定数でヒトＯＸ４０エピトープに特異的に結合する、単離されたアンタゴニスト抗体を包含する。
【００２９】
本発明は、配列番号７に示される配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、および配列番号１０に示される配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列を包含する。
【００３０】
本発明は、配列番号８に示される配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、および配列番号１０に示される配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列を包含する。
【００３１】
本発明は、配列番号９に示される配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、および配列番号１１に示される配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列を包含する。
【００３２】
本発明はまた、配列番号１７（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号１８（ＣＤＲ−Ｈ２）および配列番号１９（ＣＤＲ−Ｈ３）を含む重鎖可変領域、ならびに／または配列番号１２、配列番号１５もしくは配列番号６１（ＣＤＲ−Ｌ１）；配列番号１３（ＣＤＲ−Ｌ２）；および配列番号１４もしくは配列番号１６（ＣＤＲ−Ｌ３）を含む軽鎖可変領域を含む抗体分子も包含する。
【００３３】
本発明は、本発明の抗体のヒト抗原結合抗体フラグメントを包含し、そのようなフラグメントとしては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、ダイアボディ、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）またはミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）が挙げられるがこれらに限定されない。本発明はまた、ＶＬドメインまたはＶＨドメインのいずれかを含む単一ドメイン抗体も包含する。
【００３４】
本発明は、モノクローナル抗体Ａ１０（ＴＨ）ｈｕ３３６Ｆおよびそのバリアントのヒト化配列を包含する。これらのバリアントをコードする核酸は、配列番号２０〜２７を含む。Ａ１０（ＴＨ）ｈｕ３３６Ｆは、配列番号９を含む軽鎖可変領域および配列番号１１を含む重鎖可変領域を含む。その可変重鎖領域は、定常領域のＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインのうちの少なくとも１つのドメインをさらに含んでもよい。その重鎖定常領域は、ＩｇＧ抗体であり得、ここで、そのＩｇＧ抗体は、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体またはＩｇＧ４抗体である。
【００３５】
本発明の抗体は、ＯＸ４０に対する結合活性が実質的に保持されている場合、任意の適当なフレームワーク可変ドメイン配列を含むことができる。例えば、いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、ヒトサブグループＩＩＩ重鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。これらの抗体の１つの実施形態において、そのフレームワークコンセンサス配列は、７１位、７３位および／または７８位に置換を含む。これらの抗体のいくつかの実施形態において、７１位は、Ａであり、７３位は、Ｔであり、そして／または７８位は、Ａである。１つの実施形態において、これらの抗体は、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標），Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）（米国特許第６，４０７，２１３号および同第５，８２１，３３７号ならびにＬｅｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００４），３４０（５）：１０７３−９３においても言及されている）の重鎖可変ドメインフレームワーク配列を含む。１つの実施形態において、これらの抗体は、ヒトκＩ軽鎖フレームワークコンセンサス配列をさらに含む。１つの実施形態において、本抗体は、図１２Ｂ（ＩＧＨＶ１−４６配列）に示される、サブグループＶ１のＩＧＨＶ１−４６（ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号Ｘ９２３４３）と、生殖系列ＩＧＨＪ４（ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号Ｊ００２５６）との組み合わせを含む。１つの実施形態において、上記フレームワーク配列は、６９位に置換を含む。いくつかの実施形態において、６９位は、Ｌである。ＶＬ鎖について選択されたヒト鋳型は、図１２Ａ（ＩＧＫＶ４−１配列）に示される、ＩＧＫＶ４−１（ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号Ｚ０００２３）と、生殖系列Ｊ鋳型ＩＧＨＪ１（ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号Ｊ００２４２）との組み合わせだった。
【００３６】
１つの実施形態において、本発明の抗体は、フレームワーク配列が、配列番号３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７および／または４８の配列を含む重鎖可変ドメインを含む。１つの実施形態において、本発明の抗体は、フレームワーク配列が配列番号４９、５０、５１および／または５２の配列を含む、軽鎖可変ドメインを含む。
【００３７】
１つの実施形態において、本発明の抗体は、フレームワーク配列が配列番号５７、５８、５９および／または６０の配列を含む、重鎖可変ドメインを含む。１つの実施形態において、本発明の抗体は、フレームワーク配列が配列番号５３、５４、５５および／または６０の配列を含む、軽鎖可変ドメインを含む。
【００３８】
１つの実施形態において、本発明の抗体は、フレームワーク配列が配列番号３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７および／または４８の配列を含み、ＨＶＲ  Ｈ１、Ｈ２およびＨ３配列がそれぞれ配列番号１７、１８および／または１９である、重鎖可変ドメインを含む。１つの実施形態において、本発明の抗体は、フレームワーク配列が配列番号４９、５０、５１および／または５２の配列を含み、ＨＶＲ  Ｌ１、Ｌ２およびＬ３配列がそれぞれ配列番号１２、１３および／または１６である、軽鎖可変ドメインを含む。
【００３９】
１つの実施形態において、本発明の抗体は、フレームワーク配列が配列番号５７，５８，５９および／または６０の配列を含み、ＨＶＲ  Ｈ１、Ｈ２およびＨ３配列が、それぞれ配列番号１７、１８および／または１９である、重鎖可変ドメインを含む。１つの実施形態において、本発明の抗体は、フレームワーク配列が配列番号５３、５４、５５および／または５６の配列を含み、ＨＶＲ  Ｌ１、Ｌ２およびＬ３配列がそれぞれ配列番号１２、１３および／または１６である、軽鎖可変ドメインを含む。
【００４０】
本発明は、検出可能なタグをさらに含んでいる抗ＯＸ４０抗体を包含する。本発明は、インビボにおいて、またはサンプル中の、ＯＸ４０を検出する方法をさらに包含する。そのような方法は、ＯＸ４０抗体を、被験体または被験体から得たサンプルと接触させる工程を包含する
本発明は、標識をさらに含んでいる抗体を包含する。
【００４１】
本発明は、細胞毒または免疫毒素をさらに含む、上に記載した抗ＯＸ４０抗体、および以下に記載する疾患または状態を処置する際のそれらの使用を包含する。
【００４２】
本発明は、抗体Ａ１０（ＴＨ）ｈｕ３３６Ｆと同じエピトープに結合する抗体も包含する。
【００４３】
本発明は、本発明の抗体をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子を包含する。
【００４４】
本発明は、本発明の核酸分子を含むベクターを包含する。
【００４５】
本発明は、本発明のベクターを含む宿主細胞を包含する。
【００４６】
本発明は、本発明の抗体を産生するハイブリドーマを包含する。
【００４７】
本発明は、本発明の抗体をコードする、単離された核酸分子を包含し、ここで、そのヌクレオチド配列は、配列番号２０、２１、２２、２３もしくは２４のうちのいずれか１つを含む。
【００４８】
本発明は、配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９のアミノ酸配列を含む本発明の抗体をコードする、単離された核酸分子を包含する。
【００４９】
本発明は、配列番号１０、１１、１７、１８もしくは１９のうちのいずれか１つに示されるか、または配列番号２５、２６もしくは２７の核酸配列によってコードされる重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列、および／あるいは、配列番号７、８、９、１２、１３、１４、１５もしくは１６のいずれか１つに示されるか、または配列番号２０、２１、２２、２３もしくは２４の核酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列、をコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子を包含する。
【００５０】
本発明は、特許請求される本発明の抗体を生理的に許容可能なキャリア、希釈剤、賦形剤または安定剤とともに含む組成物を包含する。
【００５１】
本発明は、特許請求される本発明の抗体を作製するための方法を包含し、この方法は、本発明の細胞を、抗体の作製および抗体の単離に適した条件下で培養する工程を包含する。
【００５２】
本発明の別の局面は、炎症性疾患および自己免疫疾患の処置における抗ＯＸ４０アンタゴニスト抗体の使用である。
【００５３】
本発明は、患者においてＩｇＥ抗体産生を阻害することによって障害を予防するための方法を包含し、この方法は、患者に本発明の有効量の抗体を投与する工程を包含する。上記障害としては、喘息（例えば、アレルギー性喘息）、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、移植拒絶反応およびアテローム性動脈硬化症が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５４】
本発明は、患者においてＩｇＥ抗体産生を阻害するための方法を包含し、この方法は、患者に特許請求される本発明のアンタゴニスト抗ＯＸ４０抗体を投与する工程を包含する。ＩｇＥ抗体産生の阻害によって、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性皮膚炎、アナフィラキシー、じんま疹およびアトピー性皮膚炎が予防され得る。
【００５５】
本発明は、患者においてＯＸ−４０媒介性障害を処置する方法を包含し、この方法は、患者に特許請求される本発明の有効量の抗体または抗原結合フラグメントを投与する工程を包含し、ここで、前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＯＸ４０に対するＯＸ４０Ｌの結合を阻止し、そして／またはＯＸ４０に対するＯＸ４０Ｌの結合に関連する１つ以上の機能を阻害する。
【００５６】
本発明は、喘息の症状に苦しんでいる被験体を処置する方法を包含し、この方法は、被験体、例えば、そのような処置の必要のある被験体に、喘息の症状を減少させるのに有効な、特許請求される本発明のある量の抗体を投与する工程を包含する。
【００５７】
本発明の抗体は、静脈内、腹腔内、吸入、筋肉内、皮下および経口経路を含む経路のうちの１つ以上によって投与され得る。本発明は、特許請求される本発明の治療有効量の抗体を患者に送達する吸入デバイスを包含する。
【００５８】
本発明は、哺乳動物において喘息の重症度を低下させるための方法を包含し、この方法は、以下の特性：約１×１０１０〜約１×１０１２ＭのＫＤでヒトＯＸ４０に結合する能力；ＯＸ４０レセプターへの結合および前記レセプターに対するＯＸ４０Ｌの結合の阻害に関連する１つ以上の機能を阻害する能力、のうちの少なくとも１つを有する、治療有効量の抗ＯＸ４０抗体を哺乳動物に投与する工程を包含する。
【００５９】
ある特定の実施形態において、本抗体は、約１×１０−１２〜約１×１０−１１Ｍ、約１×１０−１１〜約１×１０−１０Ｍ、約１×１０−１０〜約１×１０−９Ｍ、約１×１０−９〜約１×１０−８Ｍ、約１×１０−８〜約１×１０−７Ｍの解離定数でヒトＯＸ４０に結合する。
【００６０】
本発明は、哺乳動物において喘息の重症度を低下させるための方法を包含し、この方法は、哺乳動物に有効量の抗体を投与する工程を包含し、ここで、その抗体は、以下の特性：（ａ）ヒトＯＸ４０に、約１×１０−１２〜約１×１０−８ＭのＫＤで結合する；（ｂ）ＯＸ４０に対する結合に関連する１つ以上の機能を阻害する；および（ｃ）ＯＸ４０に対するＯＸ４０Ｌの結合を阻害する、のうちの少なくとも１つを備えている。
【００６１】
本発明の抗体は、以下のものに限定されないが、アレルギー、喘息、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、炎症性腸疾患、移植片対宿主病、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、自己免疫性神経障害（例えば、ギラン・バレー）、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、重症筋無力症、コラーゲン誘発関節炎、大腸炎（例えば、潰瘍性大腸炎）、接触過敏症反応、糖尿病、クローン病およびバセドウ病の処置にも有用であり得る。
【００６２】
本発明の抗体はまた、サルコイドーシス、実験的リーシュマニア症、悪性貧血、側頭動脈炎、抗リン脂質症候群、血管炎（例えば、ウェゲナー肉芽腫症）、ベーチェット病、疱疹状皮膚炎、尋常性天疱瘡、白斑、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性肝炎、橋本甲状腺炎、自己免疫性の卵巣炎および睾丸炎、副腎の自己免疫疾患、全身性エリテマトーデス、強皮症、皮膚筋炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、脊椎関節症（例えば、強直性脊椎炎）、ライター症候群、シェーグレン症候群およびその他のものの処置にも有用であり得る。
【００６３】
本発明は、薬物調製の際の本発明の抗体の使用を包含する。
【００６４】
本発明は、ＯＸ４０に関連する疾患または障害を処置するための、本発明の抗体の使用を包含する。
【００６５】
本発明は、ＯＸ４０を検出するための、本発明の抗体の使用を包含する。
【００６６】
本発明は、容器に入った所定量の本発明の抗体および別個の容器に入った緩衝液を備えるキットを包含する。
【００６７】
本発明は、容器に入った所定量の本発明の組成物および別個の容器に入った緩衝液を備えるキットを包含する。
【００６８】
本発明は、本発明の抗体を備える医療デバイスを包含する。
【００６９】
本発明は、本発明の組成物を備える医療デバイスを包含する。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１Ａ】ヒトＯＸ４０ｃＤＮＡに対する核酸配列（アクセッション番号  ＮＭ＿００４２９５を示している。
【図１Ｂ】ヒトＯＸ４０タンパク質に対するアミノ酸配列（アクセッション番号ＮＭ＿００３３１８を示している。
【図２】インビトロにおいて活性化されたナイーブヒトＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ−２（２Ａ）およびＩＬ−１３（２Ｂ）の産生に対するマウス抗ＯＸ４０ｍＡｂであるＢ６６の阻害作用を示している。
【図３】インビトロにおいて活性化されたナイーブヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖に対するマウス抗ＯＸ４０ｍＡｂであるＢ６６の阻害作用を示している。
【図４】インビトロにおいてプライミングされたヒトＴｈ２細胞に対するキメラ抗ＯＸ４０ｍＡｂであるＡ１０およびＢ６６のアポトーシス作用を示している。
【図５】インビトロにおいてプライミングされたヒトＴｈ２細胞の増殖に対するキメラ抗ＯＸ４０ｍＡｂであるＡ１０およびＢ６６の阻害作用を示している。白四角は、ナイーブＣＤ４を表し；白三角は、コントロールＬ細胞を用いたときのナイーブＣＤ４＋を表し；黒三角は、ナイーブＣＤ４＋およびＯＸ４０Ｌ  Ｌ細胞を用いたときのＢ６６を表し；黒四角は、ナイーブＣＤ４＋およびＯＸ４０Ｌ  Ｌ細胞を用いたときの２Ｃ４（ＩＣ）を表し；そして黒丸は、ナイーブＣＤ４＋およびＯＸ４０Ｌ−Ｌ細胞を用いたときのＡ１０を表す。
【図６】インビトロにおいてプライミングされたヒトＴｈ２細胞によるＩＬ２（６Ａ）およびＩＬ−１３（６Ｂ）の産生に対するキメラ抗ＯＸ４０ｍＡｂであるＡ１０およびＢ６６の阻害作用を示している。白四角は、ナイーブＣＤ４を表し；白三角は、コントロールＬ細胞を用いたときのナイーブＣＤ４＋を表し；黒三角は、ナイーブＣＤ４＋およびＯＸ４０Ｌ  Ｌ細胞を用いたときのＢ６６を表し；黒四角は、ナイーブＣＤ４＋およびＯＸ４０Ｌ  Ｌ細胞を用いたときの２Ｃ４（ＩＣ）を表し；そして黒丸は、ナイーブＣＤ４＋およびＯＸ４０Ｌ−Ｌ細胞を用いたときのＡ１０を表す。
【図７】インビトロにおいて活性化されたナイーブヒトＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ−２およびＩＬ−１３の産生に対する、キメラ抗ＯＸ４０ｍＡｂであるＢ６６と市販の抗ＯＸ４０ｍＡｂであるＬ１０６との阻害作用の比較を示している表。
【図８】インビトロにおいて活性化されたナイーブヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖、ならびにそれらのＩＬ−２、ＩＬ−５およびＩＬ−１３の産生に対する、ヒト化、キメラおよびマウス抗ＯＸ４０ｍＡｂ  Ａ１０の阻害作用を示している表。
【図９】インビトロにおいてプライミングされたヒトＴｈ１細胞の増殖、ならびにそれらのＩＬ−２、ＩＬ−５およびＩＬ−１３の産生に対する、ヒト化、キメラおよびマウス抗ＯＸ４０ｍＡｂ  Ａ１０の阻害作用を示している表。
【図１０】インビトロにおいてプライミングされたヒトＴｈ２細胞の増殖、ならびにそれらのＩＬ−２、ＩＬ−５およびＩＬ−１３の産生に対する、ヒト化、キメラおよびマウス抗ＯＸ４０ｍＡｂ  Ａ１０の阻害作用を示している表。
【図１１】同種異系ＴＳＬＰ活性化ミエロイド樹状細胞を用いたときの、インビトロにおいてプライミングされたヒトＴｈ２細胞の増殖、ならびにそれらのＩＬ−２、ＩＬ−５およびＩＬ−１３の産生に対する、ヒト化、キメラおよびマウス抗ＯＸ４０ｍＡｂ  Ａ１０の阻害作用を示している表。
【図１２Ａ】ヒト鋳型ＩＧＫＶ４−１／ＩＧＫＪ１と比較しながら、マウス抗体Ａ１０およびＢ６６に対する可変軽鎖アミノ酸配列、ならびにＡ１０（ＴＨ）ｈｕ３３６Ｆの得られたヒト化配列を示している。上に付いている番号は、Ｋａｂａｔに従ったアミノ酸位置を示している。
【図１２Ｂ】ヒト鋳型ＩＧＨＶ１−４６／ＩＧＨＪ４と比較しながら、マウス抗体Ａ１０に対する可変重鎖アミノ酸配列、およびＡ１０（ＴＨ）ｈｕ３３６Ｆの得られたヒト化配列を示している。上に付いている番号は、Ｋａｂａｔに従ったアミノ酸位置を示している。
【図１３】親マウス抗体Ａ１０（黒塗りの円）およびそのキメラ型（黒塗りの三角形）よりも、ヒト化クローンＡ１０（ＴＨ）ｈｕ３３６Ｆ（黒塗りの四角形）の結合活性が高いことを示している。
【図１４−１】抗ＯＸ４０のマウス可変領域およびヒト化可変領域の核酸配列を示している：Ａ）軽鎖カッパー可変２５２−Ａ１０；Ｂ）軽鎖カッパー可変２５２−Ｂ６６；Ｃ）ヒト化軽鎖可変Ａ１０（ＳＮ）、全抗体ＢおよびＥ；Ｄ）ヒト化軽鎖可変Ａ１０（ＳＨ）、全抗体ＡおよびＤ；Ｅ）ヒト化軽鎖可変Ａ１０（ＴＨ）ｈｕ３３６、全抗体ＣおよびＦ；Ｆ）重鎖可変２５２−Ａ１０；Ｇ）重鎖可変Ａ１０（ＴＨ）ｈｕ３３６、全抗体Ｄ−Ｆ；Ｈ）重鎖可変Ａ１０Ｌ７０、全抗体Ａ−Ｃ。
【図１４−２】抗ＯＸ４０のマウス可変領域およびヒト化可変領域の核酸配列を示している：Ａ）軽鎖カッパー可変２５２−Ａ１０；Ｂ）軽鎖カッパー可変２５２−Ｂ６６；Ｃ）ヒト化軽鎖可変Ａ１０（ＳＮ）、全抗体ＢおよびＥ；Ｄ）ヒト化軽鎖可変Ａ１０（ＳＨ）、全抗体ＡおよびＤ；Ｅ）ヒト化軽鎖可変Ａ１０（ＴＨ）ｈｕ３３６、全抗体ＣおよびＦ；Ｆ）重鎖可変２５２−Ａ１０；Ｇ）重鎖可変Ａ１０（ＴＨ）ｈｕ３３６、全抗体Ｄ−Ｆ；Ｈ）重鎖可変Ａ１０Ｌ７０、全抗体Ａ−Ｃ。
【図１５】ヒト化クローンＡ１０（ＴＨ）ｈｕ３３６Ｆ（黒塗りの四角形）、マウスＡ１０（黒塗りの円）およびそのキメラ型（黒塗りの三角形）が、ＯＸ４０に対して等しく十分に競合することを示している。
【図１６Ａ】以下のとおりの、本発明を実施する際に使用するための例示的なアクセプターヒトコンセンサスフレームワーク配列を配列識別名とともに示している：可変重鎖（ＶＨ）コンセンサスフレームワーク（図１６Ａ、１６Ｂ）ヒトＶＨサブグループＩコンセンサスフレームワーク−ＫａｂａｔＣＤＲ（配列番号３０；ヒトＶＨサブグループＩコンセンサスフレームワーク−延長された超可変領域（配列番号３１〜３３）；ヒトＶＨサブグループＩＩコンセンサスフレームワーク−ＫａｂａｔＣＤＲ（配列番号３４）；ヒトＶＨサブグループＩＩコンセンサスフレームワーク−延長された超可変領域（配列番号３５〜３７）；ヒトＶＨサブグループＩＩコンセンサスフレームワーク−延長されたヒトＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク−ＫａｂａｔＣＤＲ（配列番号３８）；ヒトＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク−延長された超可変領域（配列番号３９〜４１）；ヒトＶＨアクセプターフレームワーク−ＫａｂａｔＣＤＲ（配列番号４２）；ヒトＶＨアクセプターフレームワーク−延長された超可変領域（配列番号４３〜４４）；ヒトＶＨアクセプター２フレームワーク−ＫａｂａｔＣＤＲ（配列番号４５）；ヒトＶＨアクセプター２フレームワーク−延長された超可変領域（配列番号４６〜４８）。
【図１６Ｂ】以下のとおりの、本発明を実施する際に使用するための例示的なアクセプターヒトコンセンサスフレームワーク配列を配列識別名とともに示している：可変重鎖（ＶＨ）コンセンサスフレームワーク（図１６Ａ、１６Ｂ）ヒトＶＨサブグループＩコンセンサスフレームワーク−ＫａｂａｔＣＤＲ（配列番号３０；ヒトＶＨサブグループＩコンセンサスフレームワーク−延長された超可変領域（配列番号３１〜３３）；ヒトＶＨサブグループＩＩコンセンサスフレームワーク−ＫａｂａｔＣＤＲ（配列番号３４）；ヒトＶＨサブグループＩＩコンセンサスフレームワーク−延長された超可変領域（配列番号３５〜３７）；ヒトＶＨサブグループＩＩコンセンサスフレームワーク−延長されたヒトＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク−ＫａｂａｔＣＤＲ（配列番号３８）；ヒトＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク−延長された超可変領域（配列番号３９〜４１）；ヒトＶＨアクセプターフレームワーク−ＫａｂａｔＣＤＲ（配列番号４２）；ヒトＶＨアクセプターフレームワーク−延長された超可変領域（配列番号４３〜４４）；ヒトＶＨアクセプター２フレームワーク−ＫａｂａｔＣＤＲ（配列番号４５）；ヒトＶＨアクセプター２フレームワーク−延長された超可変領域（配列番号４６〜４８）。
【図１７Ａ】以下のとおりの、本発明を実施する際に使用するための例示的なアクセプターヒトコンセンサスフレームワーク配列を配列識別名とともに示している：可変軽鎖（ＶＬ）コンセンサスフレームワーク（図１７Ａ、１７Ｂ）；ヒトＶＬカッパーサブグループＩコンセンサスフレームワーク（配列番号４９）；ヒトＶＬカッパーサブグループＩＩコンセンサスフレームワーク（配列番号５０）；ヒトＶＬカッパーサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク（配列番号５１）；ヒトＶＬカッパーサブグループＩＶコンセンサスフレームワーク（配列番号５２）。
【図１７Ｂ】以下のとおりの、本発明を実施する際に使用するための例示的なアクセプターヒトコンセンサスフレームワーク配列を配列識別名とともに示している：可変軽鎖（ＶＬ）コンセンサスフレームワーク（図１７Ａ、１７Ｂ）；ヒトＶＬカッパーサブグループＩコンセンサスフレームワーク（配列番号４９）；ヒトＶＬカッパーサブグループＩＩコンセンサスフレームワーク（配列番号５０）；ヒトＶＬカッパーサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク（配列番号５１）；ヒトＶＬカッパーサブグループＩＶコンセンサスフレームワーク（配列番号５２）。
【図１８】ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８軽鎖および重鎖のフレームワーク領域配列を示している。上付き／太字の番号は、Ｋａｂａｔに従ったアミノ酸位置を示している。
【図１９】ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８軽鎖および重鎖の改変／バリアントフレームワーク領域配列を示している。上付き／太字の番号は、Ｋａｂａｔに従ったアミノ酸位置を示している。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
５．詳細な説明
本明細書中に記載される特定の方法、プロトコル、細胞株、ベクターまたは試薬は、変化し得るので、本発明は、これらに限定されない。さらに、本明細書中で使用される用語は、特定の実施形態を説明するだけの目的であり、本発明の範囲を限定すると意図されない。本明細書中、および添付の請求項において使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに別のことを示さない限り、複数の言及物を包含し、例えば、「宿主細胞（ａ  ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ）」という言及は、複数のそのような宿主細胞を包含する。別段定義されない限り、本明細書中で用いられるすべての専門用語および科学用語ならびに任意の頭字語は、本発明の分野の当業者が通常理解している意味と同じ意味を有する。本発明を実施する際に、本明細書中に記載される方法および材料と類似または等価な任意の方法および材料を用いることができるが、例示的な方法、デバイスおよび材料を本明細書中で説明する。
【００７２】
本明細書中で述べられるすべての特許および刊行物は、それらの特許および刊行物に報告されている、本発明とともに用いられ得るタンパク質、酵素、ベクター、宿主細胞および方法を説明および開示する目的で、法が認める程度に参考として本明細書中に組み込まれる。しかしながら、先行発明という理由で本発明がそのような開示に先行する権利を与えられないという承認として解釈されるべきものは、本明細書中には何も無い。
【００７３】
５．１  定義
本願を通して用いられる用語は、当業者にとって通常かつ典型的な意味を用いて解釈されるべきである。しかしながら、本出願人は、下記で定義されるような特定の定義を以下の用語に与えることを要求する。
【００７４】
抗体鎖ポリペプチド配列に関する句「実質的に同一」は、参照ポリペプチド配列に対して少なくとも７０％または８０％または９０％または９５％の配列同一性を示す抗体鎖と解釈され得る。核酸配列に関してこの用語は、参照核酸配列に対して少なくとも約８５％または９０％または９５％または９７％の配列同一性を示すヌクレオチドの配列と解釈され得る。
【００７５】
用語「同一性」または「相同性」は、配列をアラインメントし、ギャップを導入することにより、必要であれば、配列全体に対して最大の同一性パーントを達成させた後の（配列同一性の一部として、いかなる保存的置換も考慮しない）、比較される対応配列の残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージのことを意味すると解釈されなければならない。Ｎ末端またはＣ末端の伸長も挿入も、同一性または相同性を低下させると解釈されるべきではない。アラインメントするための方法およびコンピュータプログラムは、当該分野で周知である。配列同一性は、配列解析ソフトウェアを用いて測定され得る。
【００７６】
用語「抗体」は、最も広い意味で用いられ、この用語には、免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子が含まれ、具体的には、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体および多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）を網羅する。抗体（Ａｂ）および免疫グロブリン（Ｉｇ）は、同じ構造上の特性を有する糖タンパク質である。抗体が、特定の標的に対して結合特異性を示すのに対し、免疫グロブリンは、抗体と、標的特異性を欠く他の抗体様分子との両方を包含する。天然の抗体および免疫グロブリンは、通常、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、２本の同一の軽（Ｌ）鎖および２本の同一の重（Ｈ）鎖から構成される。各重鎖は、片端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、続いていくつかの定常ドメインを有する。各軽鎖は、片端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、もう片端に定常ドメインを有する。さらに、用語「抗体」（Ａｂ）または「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）は、タンパク質に特異的に結合することができるインタクトな分子と、抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント）との両方を包含すると意味される。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、インタクトな抗体のＦｃフラグメントを欠き、動物または植物の循環から、より迅速にクリアランスされ、そしてインタクトな抗体よりも低い非特異的な組織結合性を有し得る（Ｗａｈｌら、Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ２４：３１６（１９８３））。
【００７７】
本明細書中で使用されるとき、「抗ＯＸ４０抗体」は、そのようなＯＸ４０とそのリガンドであるＯＸ４０リガンドとの結合を阻害するか、または実質的に低下させるような様式でヒトＯＸ４０に結合する抗体のことを意味する。
【００７８】
本明細書中で使用されるとき、用語「ＯＸ４０媒介性障害」には、アレルギー、喘息、ならびに自己免疫および炎症に関連する疾患（例えば、多発性硬化症、関節リウマチ、炎症性腸疾患、移植片対宿主病、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、実験的リーシュマニア症、コラーゲン誘発関節炎、大腸炎（例えば、潰瘍性大腸炎）、接触過敏症反応、糖尿病、クローン病およびバセドウ病が挙げられる）に関連する状態が含まれる。他の状態（例えば、サルコイドーシス、自己免疫性の眼球の疾患、自己免疫性ブドウ膜炎、アトピー性皮膚炎、重症筋無力症、自己免疫性神経障害（例えば、ギラン・バレー）、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性溶血性貧血、悪性貧血、自己免疫性血小板減少症、側頭動脈炎、抗リン脂質症候群、血管炎（例えば、ウェゲナー肉芽腫症）、ベーチェット病、乾癬、疱疹状皮膚炎、尋常性天疱瘡、白斑、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性肝炎、橋本甲状腺炎、自己免疫性の卵巣炎および睾丸炎、副腎の自己免疫疾患、全身性エリテマトーデス、強皮症、皮膚筋炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、脊椎関節症（例えば、強直性脊椎炎）、ライター症候群およびシェーグレン症候群）もまた、この用語の範囲に包含される。
【００７９】
抗体の可変ドメインとの関連において用語「可変」とは、可変ドメインのある特定の一部が、抗体間でその配列に広く相違があり、特定の抗体の各々の特定の標的に対する結合性および特異性において用いられるという事実のことを指す。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメイン全体にわたって均等に分布していない。可変性は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの両方において、超可変領域としても知られる相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインの高度に保存された部分は、フレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。当該分野で公知であるように、抗体の超可変領域を線引きするアミノ酸位置／境界は、状況および当該分野で公知の様々な定義に応じて変化し得る。可変ドメイン内のいくつかの位置が、１つの基準セットの下では超可変領域内であるとみなされ得る一方で、異なる基準セットの下では超可変領域の外側であるとみなされるという点で、これらの位置が、ハイブリッド超可変位置とみなされることがある。これらの位置のうちの１つ以上は、延長された超可変領域においても見られることがある。本発明は、これらのハイブリッド超可変位置において改変を含む抗体を提供する。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインは、各々、３つのＣＤＲに接続された、主としてβシート配置をとる４つのＦＲ領域を含み、それらは、そのβシート構造を接続するループを形成し、いくつかの場合においては、そのβシート構造の一部を形成する。各鎖内のＣＤＲは、ＦＲ領域と近接して一緒に保持され、他方の鎖のＣＤＲは、抗体の標的結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７）参照）。本明細書中で使用されるとき、免疫グロブリンアミノ酸残基の付番は、別段示されない限り、Ｋａｂａｔらの免疫グロブリンアミノ酸残基の付番方式に従って行われる。
【００８０】
用語「抗体フラグメント」とは、完全長抗体の一部、通常、標的結合領域または可変領域のことを指す。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメントが挙げられる。抗体の「抗原結合フラグメント」という句は、完全長抗体と共通する質的な生物学的活性を有する化合物である。例えば、抗ＯＸ４０抗体の抗原結合フラグメントは、そのような分子がＯＸ４０リガンドに結合する能力を有することを妨害するか、または実質的に減少させるような様式で、ＯＸ４０レセプターに結合することができるものである。本明細書中で使用されるとき、抗体に関して「機能的フラグメント」とは、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ）およびＦ（ａｂ’）２フラグメントのことを指す。「Ｆｖ」フラグメントは、完全な標的認識部位および標的結合部位を含む最小の抗体フラグメントである。この領域は、堅固な非共有結合性の会合での、１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる（ＶＨ−ＶＬ二量体）。この配置で、各可変ドメインの３つのＣＤＲは、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の標的結合部位を定義するように相互作用する。６つのＣＤＲは、集団で、その抗体に対して標的結合特異性を付与する。しかしながら、結合部位全体よりも低い親和性ではあるが、単一可変ドメイン（または、標的に特異的な３つのＣＤＲだけを含むＦｖの半分）でさえも、標的を認識し、結合する能力を有する。「一本鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、ここで、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する。一般に、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に、ｓＦｖが標的に結合するための所望の構造を形成させるポリペプチドリンカーをさらに含む。
【００８１】
Ｆａｂフラグメントは、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端においていくつかの残基が付加されているという点でＦａｂフラグメントと異なる。Ｆ（ａｂ’）フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２ペプシン消化産物のヒンジシステインにおけるジスルフィド結合を切断することによって生成される。抗体フラグメントのさらなる化学的結合は、当業者に公知である。
【００８２】
用語「モノクローナル抗体」とは、本明細書中で使用されるとき、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体のことを指し、すなわち、その集団を構成する個別の抗体は、微量で存在し得かつ天然に存在し得る変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、非常に特異的であり、単一の標的部位に対するものである。さらに、代表的には様々な決定基（エピトープ）に対する様々な抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体の各々は、標的上の単一の決定基に対するものである。モノクローナル抗体は、それらの特異性に加えて、他の免疫グロブリンによって汚染されていないハイブリドーマ培養物によって合成され得るという点において有利である。修飾語「モノクローナル」とは、実質的に均一な抗体集団から得られるという抗体の性質のことを示し、その抗体の作製に任意の特定の方法が必要であると解釈されるべきでない。例えば、本発明とともに使用するためのモノクローナル抗体は、周知の手法を用いて、ファージ抗体ライブラリーから単離され得る。本発明に従って用いられる親モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）によって初めて報告されたハイブリドーマ法によって作製されてもよいし、組換え法によって作製されてもよい。
【００８３】
用語「キメラ」抗体とは、本明細書中で使用されるとき、非ヒト免疫グロブリン（例えば、ラットまたはマウス抗体）由来の可変配列、および代表的にはヒト免疫グロブリン鋳型から選択されるヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体のことを指す。
【００８４】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含む、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそれらのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体の他の標的結合部分列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅｓ））である。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、および代表的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、ここで、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、代表的には、選択されるヒト免疫グロブリン鋳型の一部も含み得る。
【００８５】
本明細書中で使用されるとき、「ヒト抗体」は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を包含し、そしてヒト免疫グロブリンライブラリーから単離された抗体、または下記および例えばＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらによる米国特許第５，９３９，５９８号に記載されているような、１つ以上のヒト免疫グロブリンについて遺伝子導入されていて、かつ内因性の免疫グロブリンを発現しない動物から単離された抗体を包含する。
【００８６】
用語「細胞」、「細胞株」および「細胞培養物」には、子孫が包含される。すべての子孫が、故意または偶然の変異に起因して、ＤＮＡ含有量が正確には同一ではないことがあることも理解される。初めに形質転換された細胞においてスクリーニングされるとき、同じ機能または生物学的特性を有する変異体の子孫が包含される。本発明において用いられる「宿主細胞」は、通常、原核生物または真核生物の宿主である。
【００８７】
ＤＮＡによる細胞性生物の「形質転換」とは、ＤＮＡが染色体外のエレメントとして、または染色体への組み込みによって、複製可能になるように、ＤＮＡを生物に導入することを意味する。ＤＮＡによる細胞性生物の「トランスフェクション」とは、任意のコード配列が実際に発現されるか否かに関係なく、その細胞または生物によるＤＮＡ（例えば、発現ベクター）の取り込みのことを指す。用語「トランスフェクトされた宿主細胞」および「形質転換された」とは、ＤＮＡが導入された細胞のことを指す。その細胞は、「宿主細胞」と呼ばれ、原核生物の細胞であってもよいし、真核生物の細胞であってもよい。代表的な原核生物の宿主細胞としては、様々な株のＥ．ｃｏｌｉが挙げられる。代表的な真核生物の宿主細胞は、哺乳動物の細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞）またはヒト起源の細胞である。導入されるＤＮＡ配列は、宿主細胞と異なる種の宿主細胞と同じ種由来であり得るか、またはいくつかの外来性ＤＮＡおよびいくつかの相同ＤＮＡを含むハイブリッドＤＮＡ配列であり得る。
【００８８】
用語「ベクター」とは、適当な宿主においてＤＮＡの発現に影響することができる適当な調節配列に作動可能に連結されたＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物のことを意味する。そのような調節配列としては、転写に影響するプロモーター、そのような転写を調節する任意のオペレーター配列、適当なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終結を調節する配列が挙げられる。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子または単にゲノムの挿入物になり得るものであり得る。ベクターは、適当な宿主に形質転換されると、宿主ゲノムとは独立して複製および機能し得るか、またはいくつかの場合ではそのゲノム自体に組み込まれ得る。プラスミドが、最もよく用いられるベクターの形態であるので、本明細書では「プラスミド」と「ベクター」は、時折、交換可能に用いられる。しかしながら、本発明は、等価な機能を果たし、当該分野で公知であるかまたは公知になる、そのような他の形態のベクターを包含すると意図される。
【００８９】
処置の目的での「哺乳動物」とは、哺乳動物として分類される任意の動物のことを指し、それには、ヒト、家畜および農場の動物、非ヒト霊長類、ならびに動物園の動物、競技用の動物または愛玩動物（例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなど）が包含される。
【００９０】
単語「標識」とは、本明細書中で使用されるとき、分子またはタンパク質、例えば、抗体に直接的または間接的に結合体化され得る検出可能な化合物または組成物のことを指す。その標識自体が、検出可能であってもよいし（例えば、放射性同位体標識または蛍光標識）、酵素的な標識の場合は、検出可能な基質化合物または基質組成物の化学変化を触媒するものであってもよい。
【００９１】
本明細書中で使用されるとき、「固相」とは、本発明の抗体が付着することができる非水性マトリックスのことを意味する。本明細書中で包含される固相の例としては、ガラス（例えば、コントロールドポアガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ））、多糖（例えば、アガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコールおよびシリコーンで部分的または全体的に形成されているものが挙げられる。ある特定の実施形態において、固相は、状況に応じて、アッセイプレートのウェルを含み得る；他の状況では、固相は、精製カラム（例えば、アフィニティークロマトグラフィカラム）である。
【００９２】
５．２  免疫原
２つの形態のＯＸ４０レセプターを、本発明の抗ＯＸ４０抗体を作製するための免疫原として用いた：（１）１つは、ヌクレオチド残基１０５〜６２７によってコードされるヒトＦｃγ１および細胞外ドメインを含む融合タンパク質として発現されるヒトＯＸ４０レセプターの可溶型だった；そして（２）２つ目は、安定的にトランスフェクトされたマウス線維芽細胞Ｌ細胞の表面上に発現される完全長ＯＸ４０を含む細胞ベースの免疫原だった。可溶性ＯＸ４０レセプターまたはそのフラグメントを、本発明の抗体を作製するために免疫原として用いてもよい。得られるアンタゴニスト抗体は、ＯＸ４０に対するものであり、ＯＸ４０ＬがＯＸ４０と相互作用するのを阻害することにより、レセプター活性を中和することができる。免疫原は、好ましくは、ポリペプチドであり、膜貫通型分子であり得る。免疫原は、組換え的に作製されてもよいし、合成方法を用いて生成されてもよい。また、免疫原は、天然の起源から単離されてもよい。
【００９３】
免疫原は、ＯＸ４０の細胞外ドメインを含み得る。あるいは、その細胞外ドメインを含む膜貫通タンパク質を発現する細胞を、免疫原として使用してもよい。そのような細胞は、天然の起源（例えば、Ｔ細胞株）に由来するものであってもよいし、それらの表面上にレセプターを発現させるために組換え手法によって形質転換された細胞であってもよい。抗体を作製するために有用な他の免疫原およびその形態は、当業者に明らかであろう。全細胞の免疫原を用いた、げっ歯類などの宿主動物の免疫は、当該分野で周知である。
【００９４】
あるいは、ＯＸ４０をコードする遺伝子またはｃＤＮＡは、プラスミドまたは他の発現ベクターにクローニングされ、そして当業者に周知の方法に従って、いくつかの発現系のいずれかにおいて発現し得る。ＯＸ４０およびＯＸ４０に対する核酸配列の、クローニングおよび発現の方法は、周知である（例えば、米国特許第５，８２１，３３２号および同第５，７５９，５４６号参照）。遺伝暗号の縮重が原因で、ＯＸ４０ポリペプチドをコードする多数のヌクレオチド配列が生成され得る。可能性のあるコドンの選択に基づいて組み合わせを選択することにより、ヌクレオチド配列を変化させてもよい。これらの組み合わせは、天然に存在するＯＸ４０ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に適用されるような標準的なトリプレット遺伝暗号に従って作製され、そのようなすべてのバリエーションが、考慮されるべきである。これらのポリペプチドのうちのいずれか１つを、ＯＸ４０に結合する抗体を作製するための動物の免疫に用いることができる。
【００９５】
免疫原であるＯＸ４０ポリペプチドは、それが有益であるとき、別のポリペプチド（例えば、免疫グロブリンＦｃ領域）に融合されたＯＸ４０ポリペプチドを有する融合タンパク質として発現されてもよい。その融合ポリペプチドは、しばしば、例えば、融合タンパク質が単離されて、アフィニティークロマトグラフィによって精製されるのを可能にすることによって、タンパク質精製を助ける。融合タンパク質は、そのタンパク質のカルボキシル末端および／またはアミノ末端に結合された融合セグメントを含むタンパク質をコードする融合核酸配列で形質転換された組換え細胞を培養することによって作製され得る。融合セグメントとしては、免疫グロブリンＦｃ領域、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、二価の金属イオンに結合することができるポリヒスチジンセグメント、およびマルトース結合タンパク質が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００９６】
本発明では、組換えＯＸ４０を用いてマウスを免疫することにより、アンタゴニスト抗体を作製した。組換えＯＸ４０は、いくつかの供給源から市販されている（例えば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ．，ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｉｎｃ．，ＮＪおよびＳａｎｏｆｉ  Ｂｉｏ−Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｅｒｖｏｓｅ，ＰＡ．参照）。例示的なポリペプチドは、配列番号１およびそのバリアントのすべてまたは一部を含む。
【００９７】
５．３  抗体の作製
本発明の抗体は、当該分野で公知の任意の適当な方法によって作製され得る。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体を含み得る。ポリクローナル抗体の調製方法は、当業者に公知である（Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．（１９８８））この全体が、本明細書中で参考として組み込まれる）。
【００９８】
例えば、上に記載したような免疫原は、様々な宿主動物（例えば、ウサギ、マウス、ラットなどが挙げられるがこれらに限定されない）に投与されて、その抗原に特異的なポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導し得る。免疫原の投与は、免疫剤、および所望であればアジュバントの１回以上の注射を必要とし得る。宿主種に応じて、様々なアジュバントを用いることにより、免疫応答を増強することができ、そのようなアジュバントとしては、フロイント（完全および不完全）、無機物ゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、表面活性物質（例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン）、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノールおよび潜在的に有用なヒトアジュバント（例えば、ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）が挙げられるがこれらに限定されない。用いられ得るアジュバントのさらなる例としては、ＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコレート）が挙げられる。免疫プロトコルは、当該分野で周知であり、選択される動物宿主において免疫応答を誘発する任意の方法によって行われ得る。アジュバントも当該分野で周知である。
【００９９】
代表的には、免疫原（アジュバント有りまたは無し）は、複数回の皮下注射もしくは腹腔内注射によって、または筋肉内もしくはＩＶを介して、哺乳動物に注射される。免疫原には、ＯＸ４０ポリペプチド、融合タンパク質またはそのバリアントが包含され得る。ポリペプチドの性質（すなわち、疎水性のパーセント、親水性のパーセント、安定性、正味電荷、等電点など）に応じて、免疫原と、免疫される哺乳動物において免疫原性であることが知られているタンパク質との結合体化が、有用であることがある。そのような結合体化には、免疫原と免疫原性タンパク質との両方に対する化学官能基の活性な誘導体化による化学的な結合体化（共有結合が形成されるように結合体化される）、もしくは融合タンパク質ベースの方法を介した化学的な結合体化のいずれか、または当業者に公知の他の方法が包含される。そのような免疫原性タンパク質の例としては、キーホールリンペットヘモシアニン、オバルブミン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、ダイズトリプシンインヒビターおよび混交Ｔヘルパーペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。様々なアジュバントを用いることにより、上に記載したような免疫応答を増強することができる。
【０１００】
本発明の抗体は、モノクローナル抗体を含み得る。モノクローナル抗体は、単一の抗原部位を認識する抗体である。それらの均一な特異性のおかげで、モノクローナル抗体は、通常種々の異なる抗原部位を認識する抗体を含むポリクローナル抗体よりも一層有用になる。モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）；米国特許第４，３７６，１１０号；Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．（１９８８）およびＨａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９８１）によって報告されているようなハイブリドーマ技術、組換えＤＮＡ法、または当業者に公知の他の方法を用いて調製され得る。モノクローナル抗体を作製するために用いられ得る方法の他の例としては、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２（１９８３）；Ｃｏｌｅら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８０：２０２６（１９８３））、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ｐｐ．７７−９６，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ（１９８５））が挙げられるが、これらに限定されない。そのような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびそれらの任意のサブクラスをはじめとした任意の免疫グロブリンクラスであり得る。本発明のｍＡｂを産生するハイブリドーマは、インビトロにおいて培養されてもよいし、インビボにおいて培養されてもよい。
【０１０１】
ハイブリドーマモデルでは、宿主（例えば、マウス、ヒト化マウス、ヒト免疫系を有するマウス、ハムスター、ウサギ、ラクダまたは他の任意の適切な宿主動物）を免疫することにより、免疫に用いられたタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するか、または産生することができるリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球をインビトロにおいて免疫してもよい。次いで、ポリエチレングリコールなどの適当な融合剤を用いて、リンパ球をミエローマ細胞に融合して、ハイブリドーマ細胞を形成させる（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．５９−１０３（１９８６））。
【０１０２】
一般に、抗体産生ハイブリドーマを作製する際に、ヒト起源の細胞が望ましい場合は、末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）を用いるか、または非ヒト哺乳動物起源が望ましい場合は、脾臓細胞もしくはリンパ節細胞を用いる。次いで、ポリエチレングリコールなどの適当な融合剤を用いて、そのリンパ球を不死化細胞株と融合して、ハイブリドーマ細胞を形成させる（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．５９−１０３（１９８６））。不死化細胞株は、通常、形質転換された哺乳動物細胞、特に、げっ歯類、ウシまたはヒト起源のミエローマ細胞である。代表的には、ラットまたはマウスのミエローマ細胞株が用いられる。好ましくは、未融合の不死化細胞の成長または生存を阻害する１つ以上の物質を含む適当な培養液中で、そのハイブリドーマ細胞を培養してもよい。例えば、親細胞が、酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠いている場合、ハイブリドーマに対する培養液は、代表的には、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を妨害する物質である、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含むものである（「ＨＡＴ培地」）。
【０１０３】
好ましい不死化細胞株は、効率的に融合し、選択される抗体産生細胞によって安定な高レベルの抗体産生を助け、そしてＨＡＴ培地などの培地に感受性である、細胞株である。これらのミエローマ細胞株としては、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．Ｕ．Ｓ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．から入手可能なＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍、ならびにＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．ＵＳＡから入手可能なＳＰ２／０またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞に由来するものなどのマウスのミエローマ株である。ヒトミエローマ細胞株およびマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株もまた、ヒトモノクローナル抗体の産生について報告されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ，ｐｐ．５１−６３（１９８７））。マウスミエローマ細胞株ＮＳＯを用いてもよい（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｓｈｉｒｅ，ＵＫ）。
【０１０４】
ハイブリドーマ細胞を生育する培養液を、ＯＸ４０に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降またはインビトロ結合アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素免疫結合吸着測定法（ＥＬＩＳＡ））によって測定され得る。そのような手法は、当該分野で公知であり、当業者の技術の範囲内である。ＯＸ４０に対するモノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、スキャッチャード解析によって測定され得る（Ｍｕｎｓｏｎら、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １０７：２２０（１９８０））。
【０１０５】
所望の特異性、親和性および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定されたら、そのクローンを、限界希釈手順によってサブクローン化し、標準的な方法によって生育する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．５９−１０３（１９８６））。この目的に適した培養液としては、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）またはＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。さらに、ハイブリドーマ細胞は、動物内の腹水腫瘍としてインビボにおいて生育してもよい。
【０１０６】
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順（例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、ゲル排除クロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティークロマトグラフィ）によって、培養液、腹水または血清から適切に分離または単離される。
【０１０７】
モノクローナル抗体を作製するための種々の方法が当該分野に存在するので、本発明は、ハイブリドーマ作製方法だけに限定されない。例えば、モノクローナル抗体は、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されているような組換えＤＮＡ法によって作製されてもよい。ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの起源として機能する。そのＤＮＡは、いったん単離されると、発現ベクターに入れられ、そして、別途免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、ＮＳ０細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはミエローマ細胞）にトランスフェクトされて、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成がもたらされ得る。そのＤＮＡを、例えば、相同なマウス配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖の定常ドメインに対するコード配列で置換することによって（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８１：６８５１（１９８４））、または非免疫グロブリンポリペプチドに対するコード配列のすべてまたは一部を、免疫グロブリンコード配列に共有結合的に連結することによって、改変してもよい。そのような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインで置換され得るか、またはキメラ二価抗体を作製するために本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインで置換され得る。
【０１０８】
本抗体は、一価の抗体であり得る。一価の抗体を作製するための方法は、当該分野で周知である。例えば、１つの方法は、免疫グロブリン軽鎖および改変された重鎖の組換え発現を含む。その重鎖は、重鎖の架橋を妨害するように、一般にＦｃ領域内の任意の点において切断されている。あるいは、関連するシステイン残基が、架橋を妨害するように、別のアミノ酸残基で置換されているか、または欠失している。
【０１０９】
特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは、公知の手法によって作製され得る。従来、これらのフラグメントは、インタクトな抗体のタンパク分解性消化によって得られていた（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：１０７（１９９２）；Ｂｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１（１９８５）参照）。例えば、本発明のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、パパイン（Ｆａｂフラグメントを生成する）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを生成する）などの酵素を用いる、免疫グロブリン分子のタンパク分解性切断によって作製され得る。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、可変領域、軽鎖定常領域および重鎖のＣＨ１ドメインを含む。しかしながら、これらのフラグメントは、現在、組換え宿主細胞によって直接産生され得る。例えば、抗体フラグメントは、抗体ファージライブラリーから単離され得る。あるいは、Ｆ（ａｂ’）２−ＳＨフラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉから直接回収され、化学的に結合されることによって、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントが形成され得る（Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３（１９９２）。別のアプローチによれば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、組換え宿主細胞培養物から直接単離され得る。抗体フラグメントを作製するための他の手法は、当業者に明らかであろう。他の実施形態において、最適な抗体は、一本鎖Ｆｖフラグメント（Ｆｖ）（ＰＣＴ特許出願ＷＯ９３／１６１８５）である。
【０１１０】
ヒトにおける抗体のインビボにおける用途およびインビトロ検出アッセイをはじめとしたいくつかの用途のために、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体を使用することが好ましいことがある。キメラ抗体は、抗体の様々な部分が、異なる動物種から得られている分子、例えば、マウスモノクローナル抗体由来の可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体である。キメラ抗体を作製するための方法は、当該分野で公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１（１９８９）；米国特許第５，８０７，７１５号；同第４，８１６，５６７号；および同第４，８１６３９７号（これらの全体が、本明細書中で参考として組み込まれる）参照。
【０１１１】
ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリンに対して、動物由来のモノクローナル抗体よりも高い相同性を有するように設計されている。ヒト化は、実質的にはインタクトではないヒト可変ドメインが非ヒト種由来の対応配列で置換されている、キメラ抗体を作製するための手法である。ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク（ＦＲ）領域を有し、所望の抗原に結合する、非ヒト種において産生される抗体分子である。しばしば、ヒトフレームワーク領域内のフレームワーク残基は、抗原結合性を変化させる、好ましくは、改善する、ＣＤＲドナー抗体由来の対応残基で置換される。これらのフレームワーク置換は、当該分野で周知の方法、例えば、ＣＤＲ残基とフレームワーク残基との相互作用をモデル化して抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定すること、および特定の位置における稀なフレームワーク残基を同定する配列比較によって同定される。例えば、米国特許第５，５８５，０８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３（１９８８）（これらの全体が、本明細書中で参考として組み込まれる）参照。例えば、ＣＤＲ移植（ＥＰ２３９，４００；ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；同第５，５３０，１０１号；および同第５，５８５，０８９号）、ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサーフェシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（ＥＰ５９２，１０６；ＥＰ５１９，５９６；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２８：４８９（１９９１）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７：８０５（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１：９６９（１９９４））およびチェインシャフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）をはじめとした当該分野で公知の種々の手法を用いて、抗体をヒト化することができる。
【０１１２】
一般に、ヒト化抗体には、非ヒトである起源から１つ以上のアミノ酸残基が導入されている。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「移入（ｉｍｐｏｒｔ）」残基と呼ばれ、これらは、代表的には、「移入」可変ドメインから得られる。ヒト化は、本質的には、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者らの方法（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４（１９８８））に従って、非ヒトＣＤＲまたはＣＤＲ配列を、ヒト抗体の対応配列で置換することによって行われ得る。したがって、そのような「ヒト化」抗体は、実質的にはインタクトではないヒト可変ドメインが非ヒト種由来の対応配列によって置換されているキメラ抗体である（米国特許第４，８１６，５６７号）。実際、ヒト化抗体は、代表的には、いくつかのＣＤＲ残基および可能性のあるいくつかのＦＲ残基が、げっ歯類抗体における類似の部位で置換されている、ヒト抗体である。
【０１１３】
ヒト化抗体が、抗原に対してより高い親和性および他の好ましい生物学的特性を保持することは、さらに重要である。この目標を達成するために、好ましい方法によれば、ヒト化抗体は、親配列およびヒト化配列の３次元モデルを用いて、親配列および様々な概念的なヒト化産物の解析のプロセスによって調製される。３次元免疫グロブリンモデルは、商業的に入手可能であり、当業者に知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の有望な３次元立体配座構造を図示および表示するコンピュータプログラムが入手可能である。これらの表示を調べることにより、候補免疫グロブリン配列が機能する際の、ある特定の残基の果たし得る役割の解析、すなわち、候補免疫グロブリン配列の能力に影響を及ぼす残基の解析、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の解析が可能になる。このように、所望の抗体特性（例えば、標的抗原に対する親和性の増大）が最大になるように、ＦＲ残基をレシピエント配列および移入配列から選択し、組み合わせることができるが、抗原結合性に直接かつ最も実質的に影響を及ぼすのは、ＣＤＲ残基である。
【０１１４】
ヒト化抗体を作製する際に用いられる軽鎖と重鎖の両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低下させるために重要である。いわゆる「ベストフィット（ｂｅｓｔ−ｆｉｔ）」法によれば、非ヒト抗体の可変ドメインの配列を、公知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。次いで、非ヒト親抗体の配列に最も近いヒト配列をヒト化抗体用のヒトＦＲとして採用する（Ｓｉｍｓら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９６：９０１（１９８７））。
【０１１５】
別の方法では、軽鎖または重鎖の特定のサブグループのヒト抗体すべてのコンセンサス配列由来の特定のフレームワークを使用する。いくつかの異なるヒト化抗体に対して、同じフレームワークを用いてもよい（Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５１：２６２３（１９９３））。本発明の抗体は、任意の適当なヒト軽鎖もしくは重鎖フレームワーク配列またはヒトコンセンサス軽鎖もしくは重鎖フレームワーク配列を含み得るが、ただし、本抗体は、所望の生物学的特性（例えば、所望の結合親和性）を示す。いくつかの実施形態では、ヒトおよび／またはヒトコンセンサス非超可変領域配列内に、１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９またはそれ以上）のさらなる改変が存在する。１つの実施形態において、本発明の抗体は、ヒト軽鎖のフレームワーク配列の少なくとも一部（またはすべて）を含む。１つの実施形態において、本発明の抗体は、ヒト重鎖のフレームワーク配列の少なくとも一部（またはすべて）を含む。１つの実施形態において、本発明の抗体は、ヒトサブグループＩフレームワークコンセンサス配列の少なくとも一部（またはすべて）を含む。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、ヒトサブグループＩＩＩ重鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。１つの実施形態において、本発明の抗体のフレームワークコンセンサス配列は、７１位、７３位および／または７８位に置換を含む。これらの抗体のいくつかの実施形態において、７１位は、Ａであり、７３位は、Ｔであり、そして／または７８位は、Ａである。
【０１１６】
完全ヒト抗体は、ヒト患者の治療上の処置にとって特に望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列由来の抗体ライブラリーを用いる、上に記載したファージディスプレイ法をはじめとした当該分野で公知の種々の方法によって作製することができる。米国特許第４，４４４，８８７号および同第４，７１６，１１１号；およびＰＣＴ公開ＷＯ９８／４６６４５、ＷＯ９８／５０４３３、ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ９８／１６６５４、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９６／３３７３５およびＷＯ９１／１０７４１もまた参照のこと；これらの各々の全体が本明細書中で参考として組み込まれる。ＣｏｌｅらおよびＢｏｅｒｎｅｒらの手法もまた、ヒトモノクローナル抗体を調製するために利用可能である（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｒｉｓｓ（１９８５）；およびＢｏｅｒｎｅｒら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４７：８６（１９９１））。
【０１１７】
ヒト抗体は、機能的な内因性の免疫グロブリンを発現することができないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することができる、トランスジェニックマウスを用いても作製することができる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖の免疫グロブリン遺伝子複合体をランダムに、または相同組換えによって、マウス胚性幹細胞に導入することができる。あるいは、ヒト重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子に加えて、ヒトの可変領域、定常領域および多様性領域をマウス胚性幹細胞に導入してもよい。マウスの重鎖および軽鎖の免疫グロブリン遺伝子を、相同組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入とは別で機能しないようにさせてもよいし、同時に機能しないようにさせてもよい。特に、ＪＨ領域のホモ欠失によって、内因性の抗体産生が妨害される。改変された胚性幹細胞を増殖させ、胚盤胞にマイクロインジェクションすることにより、キメラマウスを作出する。次いで、そのキメラマウスを成育することにより、ヒト抗体を発現するホモ接合性の子孫を作出する。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｉｓら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｉｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ７：３３（１９９３）；Ｄｕｃｈｏｓａｌら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５５：２５８（１９９２））参照。
【０１１８】
そのトランスジェニックマウスを、選択された抗原、例えば、本発明のポリペプチドのすべてまたは一部を用いて、通常の様式で免疫する。その抗原に対するモノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ技術を用いて、免疫されたトランスジェニックマウスから得ることができる。このトランスジェニックマウスが内部に有するヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細胞分化中に再配列され、続いて、クラススイッチおよび体細胞変異を起こす。このような手法を用いることにより、治療的に有用なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥ抗体を作製することができる。ヒト抗体を作製するためのこの技術に関する概要については、Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３：６５−９３（１９９５）参照。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を作製するためのこの技術、ならびにそのような抗体を作製するためのプロトコルに関する詳細な議論については、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９６／３４０９６；ＷＯ９６／３３７３５；欧州特許番号０５９８８７７；米国特許第５，４１３，９２３号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６６１，０１６号；同第５，５４５，８０６号；同第５，８１４，３１８号；同第５，８８５，７９３号；同第５，９１６，７７１号；および同第５，９３９，５９８号（これらの全体が本明細書中で参考として組み込まれる）参照。さらに、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｇｅｎｐｈａｒｍ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆ．）およびＭｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）などの会社は、上に記載した技術と同様の技術を用いることによる、選択された抗原に対するヒト抗体の提供に関与している。
【０１１９】
また、ヒトｍＡｂは、ヒト末梢血白血球、脾細胞または骨髄が移植されたマウスを免疫することによって、作製することができる（例えば、ＸＴＬのトリオーマ技術）。選択されたエピトープを認識する完全ヒト抗体は、「誘導選択（ｇｕｉｄｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」と呼ばれる技術を用いて作製することができる。このアプローチでは、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えば、マウス抗体を用いることにより、同じエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択が誘導される（Ｊｅｓｐｅｒｓら、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：８９９（１９８８））。
【０１２０】
さらに、本発明のポリペプチドに対する抗体は、当業者に周知の手法を用いて、本発明のポリペプチドを「模倣する」抗イディオタイプ抗体を作製するために用いることができる（例えば、Ｇｒｅｅｎｓｐａｎら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ７：４３７（１９８９）；Ｎｉｓｓｉｎｏｆｆ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４７：２４２９（１９９１）参照）。例えば、ポリペプチドに結合し、かつ、そのポリペプチドの多量体化および／またはリガンドに対する本発明のポリペプチドの結合を競合的に阻害する抗体を用いることにより、そのポリペプチドの多量体化および／または結合ドメインを「模倣」し、結果として、ポリペプチドおよび／またはそのリガンドに結合し、それらを中和する抗イディオタイプを作製することができる。そのような中和抗イディオタイプまたはそのような抗イディオタイプのＦａｂフラグメントは、治療レジメンでは、ポリペプチドリガンドを中和するために用いることができる。例えば、そのような抗イディオタイプ抗体を用いることにより、本発明のポリペプチドに結合し、そして／またはそのリガンド／レセプターに結合し、それにより、その生物学的活性を阻止することができる。
【０１２１】
本発明の抗体は、二重特異性抗体であり得る。二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有する、モノクローナルの、好ましくは、ヒト抗体またはヒト化抗体である。本発明において、結合特異性のうちの１つは、ＯＸ４０に対するものであり得、その他の結合特異性は、他の任意の抗原、および好ましくは細胞表面タンパク質、レセプター、レセプターサブユニット、組織特異的抗原、ウイルス由来タンパク質、ウイルスにコードされるエンベロープタンパク質、細菌由来タンパク質、または細菌表面タンパク質などに対するものであり得る。
【０１２２】
二重特異性抗体を作製するための方法は、周知である。従来から、二重特異性抗体の組換え作製は、２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対（ここで、その２つの重鎖は、異なる特異性を有する）の同時発現に基づくものである（Ｍｉｌｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７（１９８３））。免疫グロブリン重鎖と軽鎖とがランダムに組み合わされるので、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０個の異なる抗体分子（それらのうちの１つだけが正しい二重特異性構造を有する）の潜在的な混合物を産生する。その正しい分子の精製は、通常、アフィニティークロマトグラフィ工程によって行われる。同様の手順が、ＷＯ９３／０８８２９およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ  １０：３６５５（１９９１）に開示されている。
【０１２３】
所望の結合特異性（抗体抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインを、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合することができる。その融合は、好ましくは、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合である。その免疫グロブリン重鎖定常ドメインは、その融合物のうちの少なくとも１つに存在する、軽鎖結合に必要な部位を含む第１重鎖定常領域（ＣＨ１）を有し得る。免疫グロブリン重鎖融合物、および所望であれば免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを別個の発現ベクターに挿入し、そして適当な宿主生物に同時に形質転換する。二重特異性抗体の作製に関するさらなる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈら、Ｍｅｔｈ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍ  １２１：２１０（１９８６）参照。
【０１２４】
ヘテロ結合体（Ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）抗体もまた、本発明によって企図される。ヘテロ結合体抗体は、２つの共有結合された抗体から構成される。そのような抗体は、例えば、不必要な細胞に免疫系細胞を標的化するために提案されている（米国特許第４，６７６，９８０号）。その抗体は、架橋剤が関与する方法をはじめとした合成タンパク質化学における公知の方法を用いて、インビトロにおいて調製され得ることが企図される。例えば、ジスルフィド交換反応を用いて、またはチオエステル結合を形成することによって、免疫毒素を構築してもよい。この目的に適した試薬の例としては、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデートおよび例えば、米国特許第４，６７６，９８０号に開示されたものが挙げられる。
【０１２５】
さらに、ＯＸ４０に対する単一ドメイン抗体を作製することができる。この技術の例は、Ｃａｍｅｌｉｄａｅ重鎖Ｉｇ由来の抗体についてのＷＯ９４２５５９１に記載されており、また、ファージライブラリーからの単一ドメイン完全ヒト抗体の単離を説明しているＵＳ２００３０１３０４９６にも記載されている。
【０１２６】
重鎖Ｆｖ領域と軽鎖Ｆｖ領域とが接続されている単一ペプチド鎖結合分子を作製することもできる。一本鎖抗体（「ｓｃＦｖ」）およびそれらを構築する方法は、米国特許第４，９４６，７７８号に記載されている。あるいは、Ｆａｂは、同様の手段によって構築することができ、発現させることができる。完全ヒト抗体および部分的なヒト抗体のすべてが、完全なマウスｍＡｂよりも免疫原性が低く、また、そのフラグメントおよび一本鎖抗体も、免疫原性が低い。
【０１２７】
抗体または抗体フラグメントは、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２（１９９０）に記載されている手法を用いて作製される抗体ファージライブラリーから単離することができる。Ｃｌａｒｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４（１９９１）およびＭａｒｋｓら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２２：５８１（１９９１）には、ファージライブラリーを用いた、それぞれマウス抗体およびヒト抗体の単離が記載されている。その後の刊行物には、チェインシャフリングによる高親和性（ｎＭ範囲）のヒト抗体の作製（Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９（１９９２））、ならびに非常に大きなファージライブラリーを構築するためのストラテジーとしてのコンビナトリアル感染およびインビボ組換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２１：２２６５（１９９３））が記載されている。このように、これらの手法は、モノクローナル抗体を単離するための従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ手法に対する実行可能な代替物である。
【０１２８】
例えば、相同なマウス配列の代わりに、ヒト重鎖および軽鎖の定常ドメインに対するコード配列で置換することによって、そのＤＮＡを改変することもできる（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８１：６８５１（１９８４））。
【０１２９】
別の代替物は、ハイブリドーマを形成するために、化学的な融合ではなく、電気的な融合を用いることである。この手法は、十分に確立されている。融合の代わりに、例えば、エプスタイン・バーウイルス、またはトランスフォーミング遺伝子を用いて、Ｂ細胞を形質転換して不死にすることもできる。例えば、“Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｌｙ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｏｆ  Ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ”，Ｚｕｒａｗａｋｉら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｋｅｎｎｅｔｔら編，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１９−３３．（１９８０））参照。げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスターおよびモルモット）を、真核生物系または原核生物系によって発現されるＯＸ４０タンパク質、融合タンパク質、またはそれらのフラグメントで免疫することによって、抗ＯＸ４０ｍＡｂを産生させることができる。免疫のために、他の動物、例えば、非ヒト霊長類、トランスジェニックマウス発現免疫グロブリン、およびヒトＢリンパ球が移植された重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスも用いることができる。ハイブリドーマは、先に記載されているように（Ｋｏｅｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５））、免疫された動物由来のＢリンパ球を、ミエローマ細胞（例えば、Ｓｐ２／０およびＮＳＯ）と融合することによって、従来の手順によって作製することができる。さらに、抗ＯＸ４０抗体は、ファージディスプレイシステムにおいて、ヒトＢリンパ球からの組換え一本鎖ＦｖまたはＦａｂライブラリーのスクリーニングによって作製することができる。そのｍＡｂのＯＸ４０に対する特異性は、ＥＬＩＳＡ、ウエスタン免疫ブロット法または他の免疫化学的手法によって試験することができる。ＣＤ４＋Ｔ細胞活性化に対するその抗体の阻害活性は、増殖アッセイ、サイトカイン放出アッセイおよびアポトーシスアッセイによって評価することができる。陽性ウェル内に存在するハイブリドーマを、限界希釈によってクローン化する。ヒトＯＸ４０に対する特異性について、上に記載したアッセイによって特徴付けするために、その抗体を精製する。
【０１３０】
５．４  アンタゴニスト抗ＯＸ４０抗体の同定
本発明は、ＯＸ４０の作用を阻害および中和するアンタゴニストモノクローナル抗体を提供する。特に、本発明の抗体は、ＯＸ４０に結合し、ＯＸ４０の活性化を阻害する。本発明の抗体は、Ａ１０およびＢ６６と命名された抗体を包含し、これらのマウス抗体のヒト化抗体を開示する。本発明はまた、これらの抗体のエピトープ、例えば、モノクローナル抗体Ａ１０（ＴＨ）ｈｕ３３６Ｆのエピトープと同じエピトープに結合する抗体も包含する。
【０１３１】
候補抗ＯＸ４０抗体を：（１）蛍光微量（ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｍｉｃｒｏ−ｖｏｌｕｍｅ）アッセイ技術（ＦＭＡＴ）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，ＣＡ）、（２）酵素免疫結合吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、および（３）フローサイトメトリーイムノアッセイ、を用いてスクリーニングした。選択された抗体を特徴付けるために行われるアッセイとしては：（１）Ｈｕｔ−７８アッセイ；（２）ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞アッセイ；（３）ＴＨ１、ＴＨ２およびＴＨ１７条件；（４）ＴＣＲ−活性化ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞プロトコル；（５）アポトーシスアッセイ、および（６）交差反応性試験が挙げられた。実験の詳細は、実施例で説明する。
【０１３２】
本発明の抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、一価抗体、二重特異性抗体、ヘテロ結合体抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生されるフラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）、および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３３】
本発明の免疫グロブリン分子は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）または任意のサブクラスの免疫グロブリン分子であり得る。本抗体は、本発明の抗原結合抗体フラグメントであり得、それらとしては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）およびＶＬドメインまたはＶＨドメインのいずれかを含む単一ドメイン抗体が挙げられるが、これらに限定されない。一本鎖抗体をはじめとした抗原結合抗体フラグメントは、可変領域を単独で、または以下：ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの全体または一部と組み合わせて、含み得る。可変領域と、ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインとの任意の組み合わせを含む抗原結合フラグメントもまた、本発明に包含される。本発明の抗体は、鳥類および哺乳動物をはじめとした任意の動物起源に由来し得る。好ましくは、本抗体は、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類（例えば、マウスおよびラット）、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマまたはニワトリに由来する。
【０１３４】
本発明の抗体は、単一特異性、二重特異性、三重特異性、またはそれ以上の多重特異性であり得る。多重特異性抗体は、ＯＸ４０の異なるエピトープに対して特異的であってもよいし、ＯＸ４０と、非相同のエピトープ（例えば、非相同のポリペプチドまたは固体支持体材料）との両方に対して特異的であってもよい。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９３／１７７１５；ＷＯ９２／０８８０２；ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／０５７９３；Ｔｕｔｔら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４７：６０（１９９１）；米国特許第４，４７４，８９３号；同第４，７１４，６８１号；同第４，９２５，６４８号；同第５，５７３，９２０号；同第５，６０１，８１９号；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４８：１５４７（１９９２）参照。
【０１３５】
本発明の抗体は、それらが認識するかまたは特異的に結合するＯＸ４０のエピトープまたは部分に関して記載され得るか、または特定され得る。そのエピトープまたはポリペプチド部分は、本明細書中に記載されるように、例えば、Ｎ末端およびＣ末端の位置、連続するアミノ酸残基のサイズによって特定され得るか、または表および図に列挙され得る。
【０１３６】
本発明の抗体はまた、交差反応性に関して記載され得るか、または特定され得る。ＯＸ４０に対して少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％および少なくとも５０％の同一性（当該分野において公知で、本明細書中に記載される方法を用いて計算される）を有するＯＸ４０ポリペプチドに結合する抗体もまた、本発明に包含される。抗ＯＸ４０抗体は、約１０−７Ｍ未満の、約１０−６Ｍ未満または約１０−５Ｍ未満のＫＤで、他のタンパク質（例えば、その抗ＯＸ４０抗体が対象としている種以外の種由来の抗ＯＸ４０抗体）にも結合し得る。
【０１３７】
特定の実施形態において、本発明の抗体は、ヒトＯＸ４０およびその対応エピトープの他の哺乳動物ホモログと交差反応し得る。特定の実施形態において、上記の交差反応性は、任意の単一の特定の抗原性ポリペプチドもしくは免疫原性ポリペプチド、または本明細書中に開示される特定の抗原性ポリペプチドおよび／もしくは免疫原性ポリペプチドの組み合わせに関するものである。
【０１３８】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＯＸ４０をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに結合する抗体も、さらに本発明に包含される。本発明の抗体は、本発明のポリペプチドに対する結合親和性に関しても記載され得るか、または特定され得る。好ましい結合親和性としては、１０−８〜１０−１５Ｍ、１０−８〜１０−１２Ｍ、１０−８〜１０−１０Ｍまたは１０−１０〜１０−１２Ｍの平衡解離定数すなわちＫＤを有するものが挙げられる。本発明はまた、競合的結合を測定するための当該分野で公知の任意の方法（例えば、本明細書中に記載されるイムノアッセイ）によって測定されるような、本発明のエピトープへの抗体の結合を競合的に阻害する抗体を提供する。好ましい実施形態において、本抗体は、エピトープへの結合を、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％または少なくとも５０％、競合的に阻害する。
【０１３９】
５．５  ベクターおよび宿主細胞
別の局面において、本発明は、本明細書中に開示されるような抗体をコードする、単離された核酸配列、本発明の抗体をコードするヌクレオチド配列を含むベクター構築物、そのようなベクターを含む宿主細胞、および本抗体を作製するための組換え手法を提供する。
【０１４０】
本抗体の組換え作製のために、本抗体をコードする核酸を単離し、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現に向けて、複製可能なベクターに挿入する。本抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて（例えば、本抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）、容易に単離および配列決定される。クローニングおよび形質転換のための標準的な手法は、本発明の抗体を発現する細胞株の調製において用いられ得る。
【０１４１】
５．５．１  ベクター
多くのベクターが利用可能である。そのベクターの成分としては、一般に、以下：シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーターおよび転写終結配列、のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の抗体をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターは、周知の手法を用いて調製することができる。発現ベクターは、適当な転写制御ヌクレオチド配列または翻訳制御ヌクレオチド配列（例えば、哺乳動物、微生物、ウイルスまたは昆虫の遺伝子に由来するもの）に作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み得る。制御配列の例としては、転写プロモーター、オペレーター、エンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、ならびに／または転写および翻訳の開始および終結を調節する他の適切な配列が挙げられる。ヌクレオチド配列は、制御配列が、適切なポリペプチドに対してそのヌクレオチド配列に機能的に関連するとき、「作動可能に連結」されている。したがって、プロモーターヌクレオチド配列は、そのプロモーターヌクレオチド配列が、適切なヌクレオチド配列の転写を調節する場合、例えば抗体重鎖配列に作動可能に連結されている。本発明の抗体の発現に有用な発現ベクターの例は、出願ＷＯ０４／０７００１１（これは、本明細書中で参考として組み込まれる）に見られる。
【０１４２】
さらに、抗体の重鎖配列および／または軽鎖配列と天然には関連しない適切なシグナルペプチドをコードする配列が、発現ベクターに組み込まれ得る。例えば、シグナルペプチド（分泌リーダー）に対するヌクレオチド配列は、その抗体が細胞周辺腔または培地中に分泌されるように、ポリペプチド配列にインフレームで融合され得る。意図される宿主細胞において機能性であるシグナルペプチドは、適切な抗体の細胞外分泌を増大させる。そのシグナルペプチドは、細胞から抗体が分泌されるとき、ポリペプチドから切断され得る。そのような分泌シグナルの例は、周知であり、それらとしては、例えば、米国特許第５，６９８，４３５号；同第５，６９８，４１７号；および同第６，２０４，０２３号に記載されているものが挙げられる。
【０１４３】
５．５．２  宿主細胞
本発明において有用な宿主細胞は、原核生物細胞、酵母細胞または高等真核細胞であり、それらとしては、抗体コード配列を含む、組換えバクテリオファージＤＮＡ発現ベクター、プラスミドＤＮＡ発現ベクターまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などの微生物；抗体コード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）；抗体コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染させた昆虫細胞系；抗体コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス，ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス，ＴＭＶ）で感染させたか、または抗体コード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された、植物細胞系；または哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）もしくは哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現構築物を有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３細胞）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１４４】
本発明において宿主細胞として有用な原核生物としては、グラム陰性生物またはグラム陽性生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、ＳｅｒｒａｔｉａおよびＳｈｉｇｅｌｌａ、ならびにＢａｃｉｌｌｉ、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）が挙げられる。１つの好ましいＥ．ｃｏｌｉクローニング宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）であるが、他の株（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）およびＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５））も適当である。これらの例は、限定するものでなく、例示である。
【０１４５】
原核生物宿主細胞において使用するための発現ベクターは、一般に、１つ以上の表現型選択マーカー遺伝子を含む。表現型選択マーカー遺伝子は、例えば、抗生物質耐性を付与するか、または独立栄養要求性を与えるタンパク質をコードする遺伝子である。原核生物宿主細胞に有用な発現ベクターの例としては、市販のプラスミド（例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、ｐＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ．，ＵＳＡ）およびｐＥＴ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）およびｐＲＳＥＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ））の一連のベクター（Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１９：３７（１９９１）；Ｓｃｈｏｅｐｆｅｒ，Ｇｅｎｅ  １２４：８３（１９９３））から得られるものが挙げられる。組換え原核生物宿主細胞発現ベクターに通常用いられるプロモーター配列としては、Ｔ７（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｇｅｎｅ  ５６：１２５（１９８７））、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ２７５：６１５（１９７８）；Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ  ２８１：５４４（１９７９））、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ８：４０５７（１９８０））およびｔａｃプロモーター（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９９０））が挙げられる。
【０１４６】
本発明において有用な酵母または糸状菌としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ属由来のものおよび糸状菌（例えば、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、ＴｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）が挙げられる。酵母ベクターは、しばしば、２μ酵母プラスミド由来の複製起点配列、自律複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終結のための配列、および選択マーカー遺伝子を含む。酵母ベクターにとって適当なプロモーター配列としては、とりわけ、メタロチオネイン、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２５５：２０７３（１９８０））または他の糖分解酵素（Ｈｏｌｌａｎｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  １７：４９００（１９７８））（例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼおよびグルコキナーゼ）に対するプロモーターが挙げられる。酵母での発現において用いるための他の適当なベクターおよびプロモーターは、さらに、Ｆｌｅｅｒら、Ｇｅｎｅ  １０７：２８５（１９９１）に記載されている。酵母にとって他の適当なプロモーターおよびベクターならびに酵母形質転換プロトコルは、当該分野で周知である。酵母形質転換プロトコルは、周知である。１つのそのようなプロトコルは、Ｈｉｎｎｅｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ７５：１９２９（１９７８）によって報告されている。このＨｉｎｎｅｎプロトコルは、選択培地中でＴｒｐ＋形質転換体を選択するものである。
【０１４７】
哺乳動物または昆虫の宿主細胞培養系を、組換え抗体を発現させるために用いてもよい。原則として、脊椎動物の培養物由来であるか、無脊椎動物の培養物由来であるかに関係なく、いずれの高等真核細胞培養物も用いることができる。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞および昆虫細胞が挙げられる（Ｌｕｃｋｏｗら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：４７（１９８８）；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｅｔｌｏｗら編、Ｖｏｌ．８，ｐｐ．２７７−９，Ｐｌｅｎａｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（１９８６）；Ｍｓｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：５９２（１９８５））。例えば、異種タンパク質の生成のために、バキュロウイルス系を用いてもよい。昆虫系では、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が、外来遺伝子を発現させるベクターとして用いられ得る。そのウイルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞において生育する。抗体コード配列を、そのウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）に個別にクローニングし、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の支配下に置いてもよい。同定されている他の宿主としては、Ａｅｄｅｓ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒおよびＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉが挙げられる。トランスフェクション用の種々のウイルス株（例えば、ＡｃＮＰＶのＬ−１バリアントおよびＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ＮＰＶのＢｍ−５株）が、公的に入手可能であり、そのようなウイルスは、特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために本発明に従って本明細書中でウイルスとして用いられ得る。さらに、ワタ、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマトおよびタバコの植物細胞培養物もまた、宿主として用いられる。
【０１４８】
培養（組織培養）における、脊椎動物細胞、および脊椎動物細胞の増殖は、通例の手順になっている。Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｋｒｕｓｅら編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９７３）参照。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、サル腎臓；ヒト胎児腎株；ベビーハムスター腎臓細胞；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞；ヒト肺細胞；ヒト肝臓細胞；マウス乳腺腫瘍；およびＮＳ０細胞である。
【０１４９】
宿主細胞は、抗体産生のために、上記ベクターで形質転換され、そして、適切な場合に、プロモーター、転写調節配列および翻訳調節配列を誘導するため、形質転換体を選択するため、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために、改変された従来の栄養培地中で培養される。通常用いられるプロモーター配列およびエンハンサー配列は、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、サルウイルス４０（ＳＶ４０）およびヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来である。ＳＶ４０ウイルスゲノム由来のＤＮＡ配列は、哺乳動物宿主細胞内の構造遺伝子配列、例えば、ＳＶ４０起源、初期および後期プロモーター、エンハンサー、スプライシング部位およびポリアデニル化部位を発現させるための他の遺伝因子を提供するために用いられ得る。ウイルスの初期プロモーターと後期プロモーターの両方が、ウイルス複製起点も含み得るフラグメントとしてウイルスゲノムから容易に得られるので、それらが特に有用である。哺乳動物宿主細胞において用いるための例示的な発現ベクターは、市販されている。
【０１５０】
本発明の抗体を作製するために用いられる宿主細胞は、種々の培地中で培養され得る。市販の培地（例えば、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、基礎培地（ＭＥＭ，Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）およびダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ，Ｓｉｇｍａ））が、宿主細胞の培養に適している。さらに、Ｈａｍら、Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓら、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １０２：２５５（１９８０）および米国特許第４，７６７，７０４号；同第４，６５７，８６６号；同第４，５６０，６５５号；同第５，１２２，４６９号；同第５，７１２，１６３号；または同第６，０４８，７２８号に記載されている任意の培地を、宿主細胞用の培養液として用いてもよい。これらの培地のうちのいずれかには、必要に応じて、ホルモンおよび／または他の成長因子（例えば、インスリン、トランスフェリンまたは上皮成長因子）、塩（例えば、塩化Ｘ（ここで、Ｘは、ナトリウム、カルシウム、マグネシウムである）；およびリン酸塩）、緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えば、アデノシンおよびチミジン）、抗生物質（例えば、ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬）、微量元素（マイクロモルの範囲の最終濃度で通常存在する無機化合物として定義される）、およびグルコースまたは等価なエネルギー源が補充されていてもよい。他の任意の必要な補充物もまた、当業者に公知の適切な濃度で含まれていてもよい。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現について選択される宿主細胞とともにそれまで用いられていたものであり、当業者には明らかであろう。
【０１５１】
５．６  抗体をコードするポリヌクレオチド
本発明は、本発明の抗体およびそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドまたは核酸、例えば、ＤＮＡをさらに提供する。例示的なポリヌクレオチドとしては、本明細書中に記載されるアミノ酸配列のうちの１つ以上を含む抗体鎖をコードするものが挙げられる。本発明はまた、ストリンジェントな、またはそれより低いストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドも包含する。
【０１５２】
本ポリヌクレオチドは、当該分野で公知の任意の方法によって、入手され、そしてそのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が決定され得る。例えば、本抗体のヌクレオチド配列が既知である場合、本抗体をコードするポリヌクレオチドは、化学的に合成されたオリゴヌクレオチド（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １７：２４２（１９９４））に記載されているように）から構築され得、その構築は、簡潔には、本抗体をコードする配列の一部を含む重複オリゴヌクレオチドの合成、それらのオリゴヌクレオチドのアニーリングおよび連結、次いで、その連結されたオリゴヌクレオチドのＰＣＲによる増幅が含まれる。
【０１５３】
あるいは、抗体をコードするポリヌクレオチドは、適当な起源由来の核酸から作製され得る。特定の抗体をコードする核酸を含むクローンが入手できないが、その抗体分子の配列が既知である場合、その免疫グロブリンをコードする核酸は、その配列の３’および５’末端にハイブリダイズすることができる合成プライマーを用いたＰＣＲ増幅、または特定の遺伝子配列（例えば、本抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡクローンを同定するための配列）に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いるクローニングによって、適当な起源（例えば、本抗体を発現する任意の組織または細胞（例えば、本発明の抗体を発現させるために選択されたハイブリドーマ細胞）から作製された抗体ｃＤＮＡライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラリー、またはそのような組織もしくは細胞から単離された核酸、好ましくは、ポリＡ＋ＲＮＡ）から化学的に合成され得るか、または入手され得る。次いで、ＰＣＲによって生成された増幅核酸を、当該分野で周知の任意の方法を用いて、複製可能なクローニングベクターにクローニングすることができる。
【０１５４】
いったん、本抗体のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列が決定されると、その抗体のヌクレオチド配列を、ヌクレオチド配列の操作にむけて、当該分野で周知の方法、例えば、組換えＤＮＡ技術、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲなど（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９９０）；Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９８）（この両方の全体が、本明細書中で参考として組み込まれる）に記載されている技術参照）を用いて、操作することにより、異なるアミノ酸配列を有する抗体を作製してもよく、例えば、アミノ酸の置換、欠失および／または挿入をもたらしてもよい。
【０１５５】
特定の実施形態において、重鎖および／または軽鎖の可変ドメインのアミノ酸配列を、周知の方法（例えば、配列の超可変性の領域を決定するための、他の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の既知のアミノ酸配列との比較）によって調べることより、ＣＤＲの配列を同定してもよい。通例の組換えＤＮＡ技術を用いて、そのＣＤＲのうちの１つ以上をフレームワーク領域内、例えば、ヒトフレームワーク領域内に挿入することにより、前に記載したように非ヒト抗体をヒト化してもよい。そのフレームワーク領域は、天然に存在するフレームワーク領域またはコンセンサスフレームワーク領域であり得、好ましくは、ヒトフレームワーク領域であり得る（例えば、ヒトフレームワーク領域の列挙についてＣｈｏｔｈｉａら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２７８：４５７（１９９８）参照）。好ましくは、フレームワーク領域とＣＤＲとを組み合わせることによって作製されるポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体をコードする。好ましくは、前で述べられたように、１つ以上のアミノ酸が、フレームワーク領域内で置換されてもよく、好ましくは、そのアミノ酸置換は、抗原に対するその抗体の結合を高めるものである。さらに、そのような方法を用いることにより、鎖内ジスルフィド結合に関与する１つ以上の可変領域システイン残基のアミノ酸を置換または欠失させることにより、１つ以上の鎖内ジスルフィド結合を欠く抗体分子を作製してもよい。本ポリヌクレオチドに対する他の変更も、本発明によって包含され、それは、当該分野の技術範囲内である。
【０１５６】
さらに、適切な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子とともに、適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子をスプライシングすることによる、「キメラ抗体」を作製するために開発された手法（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８１：８５１（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４（１９８４）；Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２（１９８５））を用いることができる。前に記載されたように、キメラ抗体は、様々な部分が様々な動物種由来の分子（例えば、マウスｍＡｂ由来の可変領域、およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する分子、例えば、ヒト化抗体）である。
【０１５７】
あるいは、一本鎖抗体の作製について報告されている手法（米国特許第４，９４６，７７８号；Ｂｉｒｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５：５８７９（１９８８）；およびＷａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５４４（１９８９））を、一本鎖抗体を作製するために適合させることができる。一本鎖抗体は、アミノ酸の架橋を介して、Ｆｖ領域の重鎖フラグメントと軽鎖フラグメントとを連結することによって形成され、その結果、一本鎖ポリペプチドがもたらされる。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて機能的なＦｖフラグメントを構築するための手法を用いてもよい（Ｓｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：１０３８（１９８８））。
【０１５８】
５．７  抗ＯＸ４０抗体の作製方法
本発明の抗体は、抗体を合成するための当該分野で公知の任意の方法、特に化学合成、または好ましくは組換え発現技術によって、作製され得る。
【０１５９】
本発明の抗体またはそのフラグメント、誘導体もしくはアナログ（例えば、本発明の抗体の重鎖もしくは軽鎖または本発明の一本鎖抗体）の組換え発現には、本抗体または本抗体のフラグメントをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの構築が必要である。いったん、抗体分子をコードするポリヌクレオチドが得られると、本抗体の作製用のベクターは、組換えＤＮＡ技術によって作製され得る。抗体コード配列、ならびに適切な転写制御シグナルおよび翻訳制御シグナルを含む発現ベクターが構築される。これらの方法としては、例えば、インビトロにおける組換えＤＮＡ技術、合成技術およびインビボにおける遺伝的組換えが挙げられる。
【０１６０】
その発現ベクターは、従来の手法によって宿主細胞に移入され、次いで、トランスフェクトされた細胞は、従来の手法によって培養されて、本発明の抗体が産生される。本発明の１つの局面において、重鎖と軽鎖の両方をコードするベクターは、以下で詳述されるように免疫グロブリン分子全体の発現のために、宿主細胞において同時発現され得る。
【０１６１】
種々の宿主発現ベクターシステムを用いることにより、上に記載したように本発明の抗体分子が発現され得る。そのような宿主発現系は、目的のコード配列を作製し、続いて精製し得るビヒクルであるが、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトされたときに、本発明の抗体分子をインサイチュで発現し得る細胞でもある。Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞および真核細胞は、通常、組換え抗体分子の発現のために、特に、組換え抗体分子全体の発現のために、用いられる。例えば、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要中間初期（ｍａｊｏｒ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）遺伝子プロモーターエレメントなどのベクターとともに用いられるＣＨＯなどの哺乳動物細胞は、抗体に対して有効な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら、Ｇｅｎｅ  ４５：１０１（１９８６）；Ｃｏｃｋｅｔｔら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：２（１９９０））。
【０１６２】
さらに、挿入された配列の発現を調節するか、または遺伝子産物を所望の特定の様式で改変およびプロセシングする宿主細胞株が選択され得る。タンパク質産物のそのような改変（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切断）は、そのタンパク質が機能するのに重要であり得る。様々な宿主細胞が、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後のプロセシングおよび改変に対して特徴的かつ特定のメカニズムを有している。適切な細胞株または宿主系を選択することにより、発現する外来タンパク質の適正な改変およびプロセシングを確実に行うことができる。この目的のために、一次転写物の適正なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化およびリン酸化に対する細胞機構を有する真核生物宿主細胞を用いることができる。そのような哺乳動物宿主細胞としては、ＣＨＯ、ＣＯＳ、２９３、３Ｔ３またはミエローマ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６３】
長期間にわたり高収率で組換えタンパク質を産生するためには、安定な発現が好ましい。例えば、抗体分子を安定して発現する細胞株を作り出してもよい。ウイルス複製開始点を含む発現ベクターを用いるのではなく、宿主細胞を、適切な発現調節領域（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）によって制御されるＤＮＡおよび選択マーカーで形質転換することができる。外来ＤＮＡを導入した後、作り出された細胞を強化培地中で１〜２日間生育し、次いで選択培地に切り替える。その組換えプラスミド内の選択マーカーは、その選択に対する抵抗性を付与するものであり、その選択マーカーによって、その細胞の染色体にプラスミドを安定的に組み込むことができるようになり、そしてその細胞が生育されることにより遺伝子座が形成され、そしてその細胞は、クローン化されて、細胞株に増幅され得る。この方法は、抗体分子を発現する細胞株を作り出すために都合よく用いられ得る。そのような作り出された細胞株は、抗体分子と直接的または間接的に相互作用する化合物のスクリーニングおよび評価において特に有用であり得る。
【０１６４】
いくつかの選択システムを用いてもよく、それらとしては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ  １１：２２３（１９７７））、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ４８：２０２（１９９２））およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら、Ｃｅｌｌ  ２２：８１７（１９８０））遺伝子が挙げられるがこれらに限定されず、それらは、それぞれｔｋ細胞、ｈｇｐｒｔ細胞またはａｐｒｔ細胞において用いられ得る。また、以下の遺伝子：ｄｈｆｒ（メトトレキサートに対する抵抗性を付与する）（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７７：３５７（１９８０）；Ｏ’Ｈａｒｅら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７８：１５２７（１９８１））；ｇｐｔ（ミコフェノール酸に対する抵抗性を付与する）（Ｍｕｌｌｉｇａｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７８：２０７２（１９８１））；ｎｅｏ（アミノグリコシドＧ−４１８に対する抵抗性を付与する）（Ｗｕら、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７（１９９１））；およびｈｙｇｒｏ（ハイグロマイシンに対する抵抗性を付与する）（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、Ｇｅｎｅ  ３０：１４７（１９８４））に対する選択の根拠として、代謝拮抗物質抵抗性を用いることができる。組換えＤＮＡ技術の分野で通常知られている方法を日常的に適用することにより、所望の組換えクローンを選択してもよく、そのような方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９３）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）；およびＤｒａｃｏｐｏｌｉら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９４）の第１２および１３章；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １５０：１（１９８１）（これらの全体が本明細書中で参考として組み込まれる）に記載されている。
【０１６５】
抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅によって高めることができる（総説として、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら、“Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｇｅｎｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ”ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌ．３．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７）参照）。抗体を発現するベクターシステム内のマーカーが増幅可能であるとき、宿主細胞の培養物中に存在するインヒビターのレベルを上昇させることにより、マーカー遺伝子のコピー数を増加させる。その増幅された領域は、抗体遺伝子に関連するので、その抗体の産生も増加することになる（Ｃｒｏｕｓｅら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ３：２５７（１９８３））。
【０１６６】
本発明の２つの発現ベクターを用いて、宿主細胞を同時にトランスフェクトしてもよく、ここで、第１のベクターは、重鎖由来のポリペプチドをコードし、第２のベクターは、軽鎖由来のポリペプチドをコードする。その２つのベクターは、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの発現を等しくする同一の選択マーカーを含み得る。あるいは、重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドの両方をコードし、発現することができる単一ベクターを用いてもよい。そのような状況では、有毒な遊離重鎖が過剰にならないようにするために、軽鎖を重鎖の前に配置するべきである（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：５２（１９８６）；Ｋｏｈｌｅｒ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７７：２１９７（１９８０））。重鎖および軽鎖に対するコード配列には、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡが含まれ得る。
【０１６７】
いったん、本発明の抗体分子が、動物によって産生されるか、化学的に合成されるか、または組換え的に発現されたら、その抗体分子を、免疫グロブリン分子を精製するための当該分野で公知の任意の方法によって、例えば、クロマトグラフィ（例えば、イオン交換、親和性（特に、プロテインＡの後の特定の抗原に対する親和性）およびサイズ排除クロマトグラフィ）、遠心分離、差次的な溶解性、またはタンパク質を精製するための他の任意の標準的な手法によって精製してもよい。さらに、本発明の抗体またはそのフラグメントを、本明細書中に記載されるかまたは別途当該分野で公知の異種ポリペプチド配列に融合して、精製を容易にすることができる。
【０１６８】
本発明は、ポリペプチドに組換え的に融合されているか、または化学的に結合体化されている（共有結合的な結合体化と非共有結合的な結合体化の両方を含む）抗体を包含する。融合または結合体化された本発明の抗体は、精製を容易にするために用いられ得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９３／２１２３２；ＥＰ４３９，０９５；Ｎａｒａｍｕｒａら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ３９：９１（１９９４）；米国特許第５，４７４，９８１号；Ｇｉｌｌｉｅｓら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：１４２８（１９９２）；Ｆｅｌｌら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４６：２４４６（１９９１）（これらの全体が本明細書中で参考として組み込まれる）参照。
【０１６９】
さらに、本発明の抗体またはそのフラグメントを、マーカー配列（例えば、精製を容易にするペプチド）に融合することができる。好ましい実施形態において、そのマーカーアミノ酸配列は、ヘキサ−ヒスチジンペプチド（例えば、とりわけ、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９  Ｅｔｏｎ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，Ｃａｌｉｆ，９１３１１）内に提供されるタグであり、これらの多くが市販されている。Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：８２１（１９８９）に記載されているように、例えば、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の便利な精製を提供する。精製に有用な他のペプチドタグとしては、「ＨＡ」タグ（インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに相当するタグ）（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ  ３７：７６７（１９８４））および「ｆｌａｇ」タグが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７０】
５．８  抗体の精製
組換え手法を用いるとき、本抗体は、細胞内で、もしくは細胞周辺腔内に産生され得るか、または直接、培地に分泌され得る。本抗体が、細胞内で産生される場合、第１工程として、粒状の破片、すなわち、宿主細胞または溶解フラグメントを、例えば、遠心分離または限外濾過によって除去してもよい。Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３（１９９２）には、Ｅ．ｃｏｌｉの細胞周辺腔に分泌された抗体を単離するための手順が記載されている。簡潔には、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡおよびフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）の存在下において、約３０分間にわたって細胞ペーストを溶かす。細胞残屑を遠心分離によって除去する。その抗体が培地中に分泌される場合、一般に、まず、そのような発現系からの上清を、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを用いて、濃縮する。タンパク質分解を阻害するために、ＰＭＳＦなどのプロテアーゼインヒビターを前述の工程のいずれかに含めてもよく、外因性の夾雑物の増殖を防ぐために、抗生物質を含めてもよい。
【０１７１】
細胞から調製される抗体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析およびアフィニティークロマトグラフィを用いて精製され得、アフィニティークロマトグラフィが、好ましい精製手法である。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適合性は、その抗体に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種およびアイソタイプに左右される。プロテインＡを用いることにより、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４重鎖に基づいて抗体を精製することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ  ６２：１（１９８３））。プロテインＧは、すべてのマウスアイソタイプおよびヒトＩｇＧ３に対して推奨される（Ｇｕｓｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ  ５：１５６７（１９８６））。親和性リガンドを付着させるマトリックスは、アガロースであることが最も多いが、他のマトリックスも利用可能である。力学的に安定なマトリックス（例えば、コントロールドポアガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼン）では、アガロースよりも速い流速かつ短いプロセス時間が達成され得る。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸＴＭ樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ；Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）が精製に有用である。タンパク質を精製するための他の手法（例えば、イオン交換カラムにおける分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカにおけるクロマトグラフィ、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）におけるクロマトグラフィ、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂におけるクロマトグラフィ（例えば、ポリアスパラギン酸カラム）、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび硫安塩析）も、回収される抗体に応じて利用可能である。任意の予備的な精製工程の後、目的の抗体および夾雑物を含む混合物を、約２．５〜４．５のｐＨの溶出緩衝液を用いて低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィに供してもよく、好ましくは、低塩濃度（例えば、約０〜０．２５Ｍの塩）において行われ得る。
【０１７２】
５．９  薬学的処方物
本ポリペプチドまたは本抗体の治療的な処方物は、所望の純度を有する本ポリペプチドと、当該分野において代表的に用いられる、任意の「薬学的に許容可能な」キャリア、賦形剤または安定剤（これらのすべてが、「賦形剤」と呼ばれる）、すなわち、緩衝剤、安定化剤、保存剤、等張化剤（ｉｓｏｔｏｎｉｆｉｅｒ）、非イオン性洗浄剤、酸化防止剤および他の種々雑多な添加剤とを混合することによって、凍結乾燥された処方物または水溶液として貯蔵用に調製され得る。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ編（１９８０）参照。そのような添加剤は、用いられる投薬量および濃度においてレシピエントに対して無毒性でなければならない。
【０１７３】
緩衝剤は、生理学的条件に近似の範囲内にｐＨを維持するのを助ける。緩衝剤は、好ましくは、約２ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲の濃度で存在する。本発明とともに使用するのに適した緩衝剤としては、有機酸と無機酸の両方、およびそれらの塩（例えば、クエン酸緩衝液（例えば、クエン酸一ナトリウム−クエン酸二ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸三ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸一ナトリウム混合物など）、コハク酸緩衝液（例えば、コハク酸−コハク酸一ナトリウム混合物、コハク酸−水酸化ナトリウム混合物、コハク酸−コハク酸二ナトリウム混合物など）、酒石酸緩衝液（例えば、酒石酸−酒石酸ナトリウム混合物、酒石酸−酒石酸カリウム混合物、酒石酸−水酸化ナトリウム混合物など）、フマル酸緩衝液（例えば、フマル酸−フマル酸一ナトリウム混合物など）、フマル酸緩衝液（例えば、フマル酸−フマル酸一ナトリウム混合物、フマル酸−フマル酸二ナトリウム混合物、フマル酸一ナトリウム−フマル酸二ナトリウム混合物など）、グルコン酸緩衝液（例えば、グルコン酸−グルコン酸ナトリウム混合物、グルコン酸−水酸化ナトリウム混合物、グルコン酸−グルコン酸カリウム混合物など）、シュウ酸緩衝液（例えば、シュウ酸−シュウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸−水酸化ナトリウム混合物、シュウ酸−シュウ酸カリウム混合物など）、乳酸緩衝液（例えば、乳酸−乳酸ナトリウム混合物、乳酸−水酸化ナトリウム混合物、乳酸−乳酸カリウム混合物など）および酢酸緩衝液（例えば、酢酸−酢酸ナトリウム混合物、酢酸−水酸化ナトリウム混合物など））が挙げられる。さらに、リン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液およびＴｒｉｓなどのトリメチルアミン塩も挙げられ得る。
【０１７４】
微生物の成長を遅延させるために保存剤を加えてもよく、それは、０．２％〜１％（ｗ／ｖ）の範囲の量で加えてもよい。本発明とともに用いるのに適した保存剤としては、フェノール、ベンジルアルコール、メタ−クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、ベンザルコニウムハロゲン化物（例えば、塩化物、臭化物およびヨウ化物）、塩化ヘキサメトニウムおよびアルキルパラベン（例えば、メチルパラベンまたはプロピルパラベン）、カテコール、レソルシノール、シクロヘキサノールおよび３−ペンタノールが挙げられる。時折「安定剤」として知られる等張剤（Ｉｓｏｔｏｎｉｃｉｆｉｅｒｓ）は、本発明の液体組成物の等張性を確実にするために加えられることがあり、それらとしては、多価糖アルコール、好ましくは、三価またはそれ以上の糖アルコール（例えば、グリセリン、エリトリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトール）が挙げられる。
【０１７５】
安定剤とは、増量剤から、治療薬を可溶化するかまたは変性の妨害もしくは容器の壁への接着の妨害を助ける添加剤までの範囲の機能を有し得る、広いカテゴリーの賦形剤のことを指す。代表的な安定剤は、多価糖アルコール（上に列挙したもの）；アミノ酸（例えば、アルギニン、リシン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、Ｌ−ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸、トレオニンなど）、有機糖または有機糖アルコール（例えば、ラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイニシトール（ｍｙｏｉｎｉｓｉｔｏｌ）、ガラクチトール、グリセロールなど（イノシトールなどのシクリトールを含む））；ポリエチレングリコール；アミノ酸ポリマー；硫黄含有還元剤（例えば、尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、アルファ−モノチオグリセロールおよびチオ硫酸ナトリウム）；低分子量ポリペプチド（すなわち＜１０残基）；タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）単糖類（例えば、キシロース、マンノース、フルクトース、グルコース）；二糖類（例えば、ラクトース、マルトース、スクロース）および三糖類（例えば、ラフィノース）；および多糖類（例えば、デキストラン）であり得る。安定剤は、活性なタンパク質の１重量部あたり０．１〜１０，０００重量の範囲で存在し得る。
【０１７６】
非イオン性の界面活性物質または洗浄剤（「湿潤剤」としても知られる）は、治療薬の可溶化を助けるため、ならびに振動に誘導される凝集から治療タンパク質を保護するために加えられてもよい（それらによって、タンパク質を変性させることなく、その処方物が、圧力がかけられた剪断面に曝露される）。適当な非イオン性界面活性物質としては、ポリソルベート（２０、８０など）、ポリオキサマー（ｐｏｌｙｏｘａｍｅｒｓ）（１８４、１８８など）、プルロニックポリオール、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（ＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０など）が挙げられる。非イオン性界面活性物質は、約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約１．０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．０７ｍｇ／ｍｌ〜約０．２ｍｇ／ｍｌの範囲で存在し得る。
【０１７７】
さらなる種々雑多な賦形剤としては、増量剤（例えば、デンプン）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ）および共溶媒が挙げられる。本明細書中の処方物はまた、処置される特定の徴候に対して必要に応じて、２つ以上の活性な化合物を含んでもよく、それらは、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない補完的な活性を有するものである。例えば、免疫抑制剤をさらに提供することが望ましいことがある。そのような分子は、意図される目的に有効な量で組み合わされて適当に存在する。その活性成分はまた、例えば、コアセルベーション手法もしくは界面重合（例えば、ヒドロキシメチルセルロース）によって調製されるマイクロカプセル内、またはゼラチン−マイクロカプセル内、およびポリ−（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル内に、それぞれ、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）またはマクロエマルジョンにおいて、封入され得る。そのような手法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓａｌ編（１９８０）に開示されている。
【０１７８】
インビボ投与に使用する処方物は、滅菌されていなければならない。
これは、例えば、滅菌濾過膜での濾過によって、容易に達成される。徐放調製物を調製してもよい。徐放調製物の適当な例としては、本抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、成形された物、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態である。徐放マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、ポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とエチル−Ｌ−グルタメートとの共重合体、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸共重合体（例えば、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸共重合体および酢酸ロイプロリドから構成される注射可能なミクロスフェア））およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸などのポリマーが、１００日を越えて分子を放出することができるのに対し、ある特定のヒドロゲルは、それよりも短い時間にわたってタンパク質を放出する。カプセルに入れられた抗体が、体内に長時間にわたって存在するとき、３７℃での水分への曝露の結果として、それらの抗体は、変性または凝集し、生物学的活性を喪失し得、免疫原性の変化が生じ得る。
【０１７９】
関与するメカニズムに応じて、安定性のために、合理的なストラテジーを工夫することができる。例えば、凝集メカニズムが、チオ−ジスルフィド交換を介した分子間Ｓ−Ｓ結合の形成であると発見される場合、スルフヒドリル残基の改変、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加物の使用、および特定のポリマーマトリックス組成物の開発によって、安定性が達成されることがある。
【０１８０】
特定の障害または状態の処置に有効な、治療的なポリペプチド、抗体またはそのフラグメントの量は、その障害または状態の性質に左右され、標準的な臨床上の手法によって決定され得る。可能である場合、まずはインビトロにおいて、次いで、ヒトでの試験の前に有用な動物モデル系において、用量反応曲線および本発明の薬学的組成物を決定することが望ましい。
【０１８１】
好ましい実施形態において、治療的なポリペプチド、抗体またはそのフラグメントの水溶液は、皮下注射によって投与される。各用量は、約０．５μｇ〜約５０μｇ／キログラム体重、またはより好ましくは、約３μｇ〜約３０μｇ／キログラム体重の範囲であり得る。
【０１８２】
皮下投与用の投薬スケジュールは、疾患のタイプ、疾患の重症度およびその治療薬に対する被験体の感度をはじめとしたいくつかの臨床学的因子に応じて、１ヶ月に１回から１日に１回まで様々であり得る。
【０１８３】
５．１０  抗ＯＸ４０抗体の診断での使用
本発明の抗体は、改変された誘導体、すなわち、本抗体に対する、任意のタイプの分子の共有結合（ＯＸ４０への結合を干渉しないような共有結合）によって改変された誘導体を包含する。例えば、その抗体誘導体としては、例えば、ビオチン化、ＨＲＰまたは他の任意の検出可能な部分によって改変されている抗体が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１８４】
本発明の抗体は、例えば、ＯＸ４０を精製または検出（インビトロとインビボの両方における診断方法を含む）するために用いられ得るが、これらに限定されない。例えば、本抗体は、生物学的サンプル中のＯＸ４０のレベルを定性的および定量的に測定するためのイムノアッセイにおける用途を有する。例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．（１９８８）（この全体が本明細書中で参考として組み込まれる）参照。
【０１８５】
以下で詳細に述べられるように、本発明の抗体は、単独で用いてもよいし、他の組成物と組み合わせて用いてもよい。本抗体は、さらに、Ｎ末端またはＣ末端において異種ポリペプチドに組換え的に融合されてもよいし、ポリペプチドまたは他の組成物に化学的に結合体化されてもよい（共有結合的および非共有結合的な結合体化を含む）。例えば、本発明の抗体は、検出アッセイにおける標識として有用な分子に、組換え的に融合されてもよいし、結合体化されてもよい。
【０１８６】
本発明は、診断用薬剤に結合体化された抗体またはそのフラグメントをさらに包含する。その抗体は、診断的に、例えば、特定の細胞、組織または血清において目的の標的の発現を検出するために；または例えば、所与の処置レジメンの有効性を判定するための臨床試験手順の一部として免疫学的応答の発生もしくは進行をモニターするために、用いることができる。検出は、その抗体と検出可能な物質とを結合させることによって容易になり得る。検出可能な物質の例としては、様々な酵素、補欠分子族、蛍光性材料、発光性材料、生物発光性材料、放射性材料、様々なポジトロン放出断層撮影を用いる陽電子放出金属、および非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。その検出可能な物質は、当該分野で公知の手法を用いて、抗体（またはそのフラグメント）に直接、または中間体（例えば、当該分野で公知のリンカー）を介して間接的に、結合または結合体化され得る。酵素標識の例としては、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ；米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ））、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖類酸化酵素（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼおよびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環オキシダーゼ（例えば、ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ）、ラクトペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼなどが挙げられる。
【０１８７】
酵素を抗体に結合体化するための手法は、Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎら、“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｌａｎｇｏｎｅら編、ｐｐ．１４７−６６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８１）に記載されている。例えば、本発明に従って診断薬として使用するために、抗体に結合体化することができる金属イオンについての、米国特許第４，７４１，９００号参照。適当な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適当な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ；適当な蛍光性材料の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンが挙げられ；発光性材料の例としては、ルミノールが挙げられ；生物発光性材料の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられ；そして適当な放射性材料の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎまたは９９Ｔｃが挙げられる。
【０１８８】
時折、標識は、抗体に間接的に結合体化される。当業者は、これを達成するための様々な手法を知っている。例えば、抗体をビオチンと結合体化し、そして上で述べた３つの広いカテゴリーの標識のうちのいずれかをアビジンと結合体化するか、またはその逆でもよい。ビオチンは、アビジンに選択的に結合するので、この間接的な様式で、標識を抗体と結合体化することができる。あるいは、標識と抗体との間接的な結合体化を達成するために、抗体を小型ハプテン（例えば、ジグロキシン）で結合体化し、そして上で述べた標識のうちの異なるタイプの１つを抗ハプテン抗体（例えば、抗ジグロキシン抗体）で結合体化する。このように、抗体と標識との間接的な結合体化を達成することができる。
【０１８９】
本発明の別の実施形態では、本抗体は、標識される必要はなく、その存在は、その抗体に結合する標識された抗体を用いて検出することができる。
【０１９０】
本発明の抗体は、任意の公知のアッセイ方法（例えば、競合結合アッセイ、直接および間接サンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイ）において用いられ得る。Ｚｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７−１５８，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７）参照。
【０１９１】
競合結合アッセイは、標識された標準物質が、限られた量の抗体との結合について被験サンプルと競合する能力に依存している。被験サンプル中の標的の量は、その抗体に結合するようになる標準物質の量に反比例する。結合するようになる標準物質の量の測定を容易にするために、その抗体は、一般に競合の前または後で不溶化される。結果として、抗体に結合している標準サンプルおよび被験サンプルは、未結合のままの標準サンプルおよび被験サンプルから都合よく分離され得る。
【０１９２】
サンドイッチアッセイは、２つの抗体の使用を含み、その各々は、異なる免疫原性部分すなわちエピトープまたは検出されるべきタンパク質に結合することができる。サンドイッチアッセイでは、解析される被験サンプルが、固体支持体上に固定化されている１次抗体に結合し、その後、２次抗体がその被験サンプルに結合し、そして不溶性の３つの部分の複合体が形成される。例えば、米国特許第４，３７６，１１０号参照。２次抗体は、それ自体が検出可能な部分で標識されているものであってもよいし（直接サンドイッチアッセイ）、検出可能な部分で標識された抗免疫グロブリン抗体を用いて測定されるものであってもよい（間接サンドイッチアッセイ）。例えば、サンドイッチアッセイの１つのタイプは、ＥＬＩＳＡアッセイであり、この場合、検出可能な部分は、酵素である。
【０１９３】
抗体を固体支持体に付着させてもよく、これは、イムノアッセイまたは標的抗原の精製に特に有用である。そのような固体支持体としては、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンが挙げられるが、これらに限定されない。このプロセスにおいて、抗体は、当該分野で周知の方法を用いて、固体支持体（例えば、ＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）樹脂または濾紙）上に固定化される。その固定化された抗体を、精製される標的を含んでいるサンプルと接触させ、その後、その支持体を、固定化された抗体に結合している精製される標的以外のサンプル中の実質的にすべての材料を除去する適当な溶媒で洗浄する。最後に、その支持体を、その抗体から標的を放出させる別の適当な溶媒（例えば、グリシン緩衝液）で洗浄する。
【０１９４】
ＯＸ４０に特異的に結合する、標識抗体、ならびにその誘導体およびアナログは、ＯＸ４０の異常な発現および／または活性に関連する疾患、障害および／または状態を検出、診断またはモニターするために、診断目的で用いられる。本発明は、ＯＸ４０の異常な発現の検出を提供し、その検出は、（ａ）ＯＸ４０に特異的な本発明の１つ以上の抗体を用いて、ある個体の細胞または体液中のＯＸ４０の発現をアッセイする工程、および（ｂ）その遺伝子発現のレベルを、標準的な遺伝子発現レベルと比較することにより、標準的な発現レベルと比べて、アッセイされたＯＸ４０発現レベルが高いかまたは低いことが、異常な発現を示す工程、を包含する。
【０１９５】
抗体は、サンプル中の、例えば、体液サンプル中または組織サンプル中の、ＯＸ４０の存在および／またはレベルを検出するために用いられ得る。この検出方法は、サンプルをＯＸ４０抗体と接触させる工程、およびそのサンプルに結合した抗体の量を測定する工程を包含し得る。免疫組織化学のために、サンプルは、新鮮なものであってもよいし、凍結されたものであってもよいし、パラフィン内に包埋され、例えば、ホルマリンなどの保存剤で固定されたものであってもよい。
【０１９６】
本発明は、障害を診断するための診断アッセイを提供し、そのアッセイは、（ａ）本発明の１つ以上の抗体を用いて、ある個体の細胞または体液中のＯＸ４０の発現をアッセイする工程、および（ｂ）その遺伝子発現のレベルを、標準的な遺伝子発現レベルと比較することにより、標準的な発現レベルと比べて、アッセイされた遺伝子発現レベルが高いかまたは低いことが、特定の障害を示す工程、を包含する。
【０１９７】
本発明の抗体を用いることにより、当業者に公知の従来の免疫組織学的な方法を用いて、生物学的サンプル中のタンパク質レベルをアッセイすることができる（例えば、Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １０１：９７６（１９８５）；Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １０５：３０８７（１９８７）参照）。タンパク質遺伝子発現の検出に有用な他の抗体ベースの方法としては、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）などのイムノアッセイが挙げられる。適当な抗体アッセイ標識は、当該分野で公知であり、それらとしては、グルコースオキシダーゼなどの酵素標識；放射性同位体（例えば、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）およびテクネチウム（９９Ｔｃ））；ルミノールなどの発光性標識；および蛍光標識（例えば、フルオレセイン、ローダミンおよびビオチン）が挙げられる。放射性同位体結合型の同位体は、免疫シンチグラフィを用いて局在化され得る。
【０１９８】
本発明の１つの局面は、動物、好ましくは、哺乳動物、最も好ましくは、ヒトにおけるＯＸ４０の異常な発現に関連する疾患または障害の検出および診断である。１つの実施形態において、診断は：ａ）ＯＸ４０に特異的に結合する有効量の標識分子を被験体に投与する工程（例えば、非経口的、皮下または腹腔内に）；ｂ）投与後に、その標識分子が、そのポリペプチドが発現する被験体内の部位に優先的に集中すること（および未結合の標識分子がバックグラウンドレベルにクリアランスされること）が可能となる時間だけ待つ工程；ｃ）バックグラウンドレベルを決定する工程；およびｄ）被験体内の標識分子を検出し、バックグラウンドレベルより高い標識分子が検出されることによって、その被験体がＯＸ４０の異常な発現に関連する特定の疾患または障害を有することが示唆される工程、を包含する。バックグラウンドレベルは、特定の系に対して、予め測定しておいた標準的な値と検出される標識分子の量との比較をはじめとした、様々な方法によって決定され得る。
【０１９９】
被験体のサイズおよび用いられるイメージングシステムが、診断画像を生成するのに必要なイメージング部分の質を決定することは、当該分野において理解されるだろう。放射性同位体部分の場合、ヒト被験体に対しては、注射される放射能の量は、９９Ｔｃに関して、通常、約５〜２０ミリキュリーの範囲である。次いで、標識された抗体または抗体フラグメントは、特定のタンパク質を含む細胞の位置に優先的に蓄積する。インビボイメージングは、Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、“Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．”Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｔｈｅ  Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｂｕｒｃｈｉｅｌら編，Ｍａｓｓｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（１９８２）の第１３章に記載されている。
【０２００】
用いられる標識のタイプおよび投与様式をはじめとしたいくつかの可変要素に応じて、標識分子が被験体内の部位に優先的に集中すること、および未結合の標識分子がバックグラウンドレベルにクリアランスされることを可能にするための投与後の時間は、６〜４８時間、６〜２４時間または６〜１２時間である。別の実施形態において、投与後のその時間は、５〜２０日間または５〜１０日間である。
【０２０１】
ある実施形態において、上記疾患または障害のモニタリングは、その疾患または疾患を診断するための方法を繰り返すことによって行われる（例えば、最初の診断の１ヶ月後、最初の診断の６ヶ月後、最初の診断の１年後など）。
【０２０２】
標識分子の存在は、インビボにおけるスキャニングのための当該分野で公知の方法を用いて、患者において検出され得る。これらの方法は、用いる標識のタイプに依存する。当業者は、特定の標識を検出するために適切な方法を判断することができる。本発明の診断方法において用いられ得る方法およびデバイスとしては、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、全身スキャン（例えば、陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）および超音波検査）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０３】
特定の実施形態において、上記分子は、放射性同位体で標識され、患者において放射線応答性手術装置（米国特許第５，４４１，０５０号）を用いて検出される。別の実施形態では、上記分子は、蛍光性化合物で標識され、患者において蛍光応答性走査装置を用いて検出される。別の実施形態では、上記分子は、陽電子放出金属で標識され、患者において陽電子放出断層撮影法を用いて検出される。なおも別の実施形態では、上記分子は、常磁性標識で標識され、患者において磁気共鳴画像（ＭＲＩ）を用いて検出される。
【０２０４】
別の局面において、本発明は、サイトカインの制御されていない発現が原因の疾患を発症する患者の素因を診断するための方法を提供する。ある特定の患者の細胞、組織または体液中のＯＸ４０の量が多いことは、その患者が、ある特定の疾患に罹患しやすいことを示唆し得る。１つの実施形態において、本方法は、低レベルまたは正常なレベルのＯＸ４０を有することが知られている被験体から細胞、組織または体液サンプルを回収する工程、その組織中のＯＸ４０の存在についてその組織または体液を解析する工程、およびその組織または体液中のＯＸ４０の発現レベルに基づいて、ある特定の疾患に対するその患者の素因を予測する工程を包含する。別の実施形態では、本方法は、規定のレベルのＯＸ４０を含むことが知られている細胞、組織または体液サンプルを患者から回収する工程、その組織または体液をＯＸ４０の量について解析する工程、および正常な細胞、組織または体液に対して確立された規定レベルまたは被験レベルに対するＯＸ４０の量の変化に基づいて、ある特定の疾患に対するその患者の素因を予測する工程を包含する。上記のＯＸ４０の規定レベルは、文献値に基づいた既知の量であってもよいし、正常な細胞、組織または体液中の量を測定することによって前もって決定されたものであってもよい。具体的には、ある特定の組織または体液中のＯＸ４０レベルの測定は、好ましくは疾患が発生する前に、その患者における疾患の特異的かつ早期の検出を可能にする。本方法を用いて診断することができる疾患としては、本明細書中に記載される疾患が挙げられるが、それらに限定されない。好ましい実施形態において、上記組織または体液は、末梢血、末梢血白血球、バイオプシー組織（例えば、肺または皮膚のバイオプシー）および組織である。
【０２０５】
本発明の抗体は、キット、すなわち、診断アッセイを行うための指示を含む、所定量の試薬のパッケージ化された組み合わせとして提供され得る。本抗体が酵素で標識される場合、そのキットは、その酵素が必要とする基質および補因子（例えば、検出可能な発色団またはフルオロフォアをもたらす基質前駆体）を備えていてもよい。さらに、他の添加剤（例えば、安定剤、緩衝液（例えば、ブロッキング緩衝液または溶解緩衝液）など）も備えていてもよい。様々な試薬の相対量は、アッセイの感度を実質的に最適化する試薬溶液における濃度を提供するために、広く変化し得る。特に、それらの試薬は、溶解時に適切な濃度を有する試薬溶液をもたらす賦形剤を含む、乾燥粉末、通常は凍結乾燥されたものとして提供され得る。
【０２０６】
５．１１  抗ＯＸ４０抗体の治療上の使用
本発明の抗体は、哺乳動物を処置するために用いられ得ることが企図される。１つの実施形態において、本抗体は、例えば前臨床データを得る目的で、非ヒト哺乳動物に投与される。処置される例示的な非ヒト哺乳動物としては、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、げっ歯類および前臨床試験が行われる他の哺乳動物が挙げられる。そのような哺乳動物は、本抗体を用いて処置される疾患に対して確立された動物モデルであり得るか、または目的の抗体の毒性を研究するために用いられ得る。これらの実施形態の各々において、用量漸増研究が、その哺乳動物に対して行われ得る。
【０２０７】
単独で投与されるかまたは細胞傷害性因子とともに投与される抗体（結合体化される治療的な部分有りまたは無し）を治療薬として用いることができる。本発明は、抗体ベースの治療に関し、その治療は、ＯＸ４０媒介性の疾患、障害または状態を処置するために、本発明の抗体を動物、哺乳動物、またはヒトに投与する工程を包含する。その動物または被験体は、特定の処置を必要とする動物（例えば、特定の障害、例えば、ＯＸ４０に関連する障害を有すると診断された動物）であり得る。ＯＸ４０に対する抗体は、動物（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌ、非ヒト霊長類などが挙げられるがこれらに限定されない）ならびにヒトにおいて、アレルギー、喘息、自己免疫性疾患および炎症性疾患に有用である。例えば、治療的に許容可能な用量の本発明の抗体もしくは本抗体のカクテルを投与するによって、またはそれらを様々な起源の他の抗体とともに投与することによって、自己免疫性疾患または炎症性疾患の症状が、処置される哺乳動物において低減され得るか、または取り除かれ得る。
【０２０８】
本発明の治療化合物としては、本発明の抗体（本明細書中に記載されるような、そのフラグメント、アナログおよび誘導体を含む）および以下に記載されるような本発明の抗体をコードする核酸（本明細書中に記載されるようなそのフラグメント、アナログおよび誘導体、ならびに抗イディオタイプ抗体を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の抗体を用いることにより、ＯＸ４０の異常な発現および／または活性に関連する疾患、障害または状態（例えば、本明細書中に記載される疾患、障害または状態のうちのいずれか１つ以上が挙げられるがそれらに限定されない）を処置、阻害または予防することができる。ＯＸ４０の異常な発現および／または活性に関連する疾患、障害または状態の処置および／または予防としては、それらの疾患、障害または状態に関連する少なくとも１つの症状の軽減が挙げられるがこれに限定されない。本発明の抗体は、当該分野で公知かまたは本明細書中に記載されるような、薬学的に許容可能な組成物として提供され得る。
【０２０９】
本発明の抗ＯＸ４０抗体は、種々の疾患において治療的に用いられ得る。本発明は、哺乳動物においてＯＸ４０媒介性疾患を予防または処置するための方法を提供する。その方法は、疾患を予防または処置する量の抗ＯＸ４０抗体を哺乳動物に投与する工程を包含する。抗ＯＸ４０抗体は、ＯＸ４０に結合し、かつ、サイトカインおよび細胞レセプター発現を制御し、それにより、非疾患状態に特有のサイトカインレベルをもたらすものである。ＯＸ４０シグナル伝達は、様々な疾患（例えば、アレルギー、喘息、ならびに自己免疫および炎症に関連する疾患（例えば、多発性硬化症、関節リウマチ、炎症性腸疾患、移植片対宿主病、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、実験的リーシュマニア症、コラーゲン誘発関節炎、大腸炎（例えば、潰瘍性大腸炎）、接触過敏症反応、糖尿病、クローン病およびバセドウ病が挙げられる））に結びつけられている。
【０２１０】
本発明の抗体はまた、他の疾患（例えば、サルコイドーシス、自己免疫性の眼球の疾患、自己免疫性ブドウ膜炎、アトピー性皮膚炎、重症筋無力症、自己免疫性神経障害（例えば、ギラン・バレー）、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性溶血性貧血、悪性貧血、自己免疫性血小板減少症、側頭動脈炎、抗リン脂質症候群、血管炎（例えば、ウェゲナー肉芽腫症）、ベーチェット病、乾癬、疱疹状皮膚炎、尋常性天疱瘡、白斑、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性肝炎、橋本甲状腺炎、自己免疫性の卵巣炎および睾丸炎、副腎の自己免疫疾患、全身性エリテマトーデス、強皮症、皮膚筋炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、脊椎関節症（例えば、強直性脊椎炎）、ライター症候群、シェーグレン症候群およびその他の疾患が挙げられる）を予防および処置するために有用であり得る。
【０２１１】
宿主被験体において用いるための治療薬は、好ましくは、前記被験体においてその薬剤に対する免疫原性応答をほとんどから全く誘発しない。１つの実施形態において、本発明は、そのような薬剤を提供する。例えば、１つの実施形態において、本発明は、宿主被験体において、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む抗体と比べて実質的に低レベルでヒト抗マウス抗体応答（ＨＡＭＡ）を誘発する、および／または誘発すると予想される、ヒト化抗体を提供する。別の例では、本発明は、最小のヒト抗マウス抗体応答（ＨＡＭＡ）を誘発する、および／もしくは誘発すると予想されるか、または全く誘発しない、および／もしくは誘発しないと予想される、ヒト化抗体を提供する。１つの例において、本発明の抗体は、臨床的に許容可能なレベル、またはそれ未満のレベルで抗マウス抗体応答を誘発する。
【０２１２】
ＯＸ４０の異常な発現および／または活性に関連する疾患または障害の処置、阻害および予防において有効な本抗体の量は、標準的な臨床手法によって決定することができる。投薬量は、処置される疾患のタイプ、疾患の重症度および経過（本抗体が予防的な目的で投与されるのか、治療的な目的で投与されるのかに関係なく）、これまでの治療、患者の病歴および本抗体に対する反応性、ならびに主治医の裁量に依存する。本抗体は、その疾患にふさわしい処置レジメンで投与され得る（例えば、疾患状態を寛解させるために１日〜数日間にわたる１回もしくは数回の投薬、またはアレルギーもしくは喘息を予防するために、長期間にわたる周期的な投薬）。さらに、インビトロアッセイを必要に応じて用いることにより、最適な投薬量の範囲の特定が助けられることがある。処方物において用いられるべき正確な用量もまた、投与経路および疾患または障害の重症度に依存し、従事者の判断および各患者の状況に従って決定されるべきである。有効量は、インビトロまたは動物モデル試験システムから得られた用量反応曲線からの外挿により決定されてもよい。
【０２１３】
抗体について、患者に投与される投薬量は、代表的には、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１５０ｍｇ／ｋｇ患者体重である。好ましくは、患者に投与される投薬量は、０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ患者体重、より好ましくは、１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ患者体重である。一般に、ヒト抗体の半減期は、外来ポリペプチドに対する免疫応答に起因して、他の種由来の抗体よりもヒトの体内において長い。したがって、ヒト抗体では、低投薬量および低頻度の投与が可能になることが多い。さらに、例えば脂質化などの改変によって、抗体の取り込みおよび組織（例えば、脳）への透過を高めることにより、本発明の抗体の投薬量および投与の頻度は、低くなり得る。状態に応じて数日間またはそれ以上にわたる反復投与については、その処置は、疾患症状の所望の抑制が生じるまで持続される。しかしながら、他の投与レジメンも有用であり得る。この治療の進捗は、従来の手法およびアッセイによって容易にモニターされる。抗ＬＦＡ−１抗体または抗ＩＣＡＭ−１抗体に対する例示的な投薬レジメンは、ＷＯ９４／０４１８８に開示されている。
【０２１４】
組成物の形態であり得る本発明の抗体は、良好な医療行為にふさわしい様式で製剤化、投薬および投与されるべきである。この文脈において考慮する因子としては、処置される特定の障害、処置される特定の哺乳動物、個別の患者の臨床状態、その障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、および医師に公知の他の因子が挙げられる。投与される抗体組成物の「治療有効量」は、上記のような考慮される因子に左右され、その治療有効量は、疾患または障害の予防、寛解または処置に必要な最小量である。本抗体は、対象の障害を予防または処置するために現在用いられている１つ以上の薬剤とともに製剤化される必要はないが、必要に応じてそれらとともに製剤化される。そのような他の薬剤の有効量は、処方物中に存在する抗体の量、障害または処置のタイプ、および上で述べた他の因子に依存する。これらは、通常、同じ投薬量、および本明細書の前で用いられたような投与経路、またはこれまでに用いられた投薬量の約１〜９９％で、使用される。
【０２１５】
本発明の抗体は、他のモノクローナル抗体またはキメラ抗体、あるいは例えば、本抗体と相互作用するエフェクター細胞の数もしくは活性を増加させるように働くリンフォカインまたは造血性成長因子（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−７およびＩＦＮ−γ）と組み合わせて都合よく用いられ得る。
【０２１６】
本発明の抗体は、単独で投与されてもよいし、他のタイプの処置（例えば、抗炎症性治療、免疫抑制性の薬物、免疫療法、化学療法、気管支拡張薬、抗ＩｇＥ分子、抗ヒスタミンまたは抗ロイコトリエン）と組み合わせて投与されてもよい。
【０２１７】
好ましい局面において、本抗体は、実質的に精製される（例えば、その作用を限定するかまたは望まれない副作用をもたらす物質を実質的に含まない）。様々な送達系が知られており、本発明の抗体を投与するためにそれらを用いることができ、そのような送達系としては、注射、例えば、リポソーム、微小粒子、マイクロカプセル、本化合物を発現することができる組換え細胞内への封入、レセプター媒介性のエンドサイトーシス（例えば、Ｗｕら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６２：４４２９（１９８７）参照）、レトロウイルスベクターまたは他のベクターの一部としての核酸の構築物などが挙げられる。
【０２１８】
抗ＯＸ４０抗体は、任意の許容可能な様式で哺乳動物に投与され得る。導入方法としては、非経口、皮下、腹腔内、肺内、鼻腔内、硬膜外、吸入および経口経路、ならびに所望であれば、免疫抑制性の処置のための病巣内投与が挙げられるがこれらに限定されない。非経口注入としては、筋肉内、皮内、静脈内、動脈内または腹腔内の投与が挙げられる。本抗体または本組成物は、任意の通例の経路によって、例えば、注入またはボーラス注射、上皮もしくは粘膜皮膚の裏打ち（例えば、口内の粘膜、直腸および腸管の粘膜など）を通過する吸収、によって投与され得、そして他の生物学的に活性な薬剤とともに投与され得る。投与は、全身性または局所性であり得る。さらに、脳室内注射および髄腔内注射をはじめとした任意の適当な経路によって、本発明の治療用抗体または治療用組成物を中枢神経系に導入することが望ましいことがある；脳室内注射は、脳室内カテーテル、例えば、レザバー（例えば、オマヤレザバー）に取り付けられたものによって容易になり得る。さらに、本抗体は、パルス注入によって適切に、特に本抗体の用量を減少させながら、投与される。投与が、短時間であるか長期間であるかに部分的に応じて、好ましくは注射によって、最も好ましくは静脈内注射または皮下注射によって、投薬される。
【０２１９】
例えば、吸入器または噴霧器、およびエアロゾル化剤を含む処方物を使用することによって、経肺投与もまた用いることができる。また、本抗体は、乾燥粉末組成物の形態で患者の肺に投与され得る（例えば、米国特許第６，５１４，４９６号参照）。
【０２２０】
特定の実施形態では、本発明の治療用抗体または治療用組成物を、処置の必要な領域に局所的に投与することが望ましいことがある；これは、例えば、局所的注入、局所的適用、カテーテルを用いる注射によって、坐剤を用いて、または埋没物を用いて、達成され得るが、これらに限定されず、前記埋没物は、多孔性、非多孔性またはゼラチン状の材料（シラスチック膜などの膜または繊維を含む）である。好ましくは、本発明の抗体を投与するときは、タンパク質を吸収しない材料を使用するように注意を払わなければならない。
【０２２１】
別の実施形態において、本抗体は、小胞、特にリポソームとして送達され得る（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７（１９９０）；Ｔｒｅａｔら、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎら編、ｐｐ．３５３−３６５（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，同書，ｐｐ．３１７−２７参照；広く同書参照）。
【０２２２】
なおも別の実施形態では、本抗体は、放出制御システムで送達され得る。１つの実施形態において、ポンプが使用され得る（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７（１９９０）；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｆ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｅｎｇ  １４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら、Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３２１：５７４（１９８９）参照）。別の実施形態では、ポリマー性材料が使用され得る（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒら編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ｓｍｏｌｅｎら編、Ｗｉｌｅｙ（１９８４）；Ｒａｎｇｅｒら、Ｊ  Ｍａｃｒｏｍｏｌ  Ｓｃｉ  Ｒｅｖ  Ｍａｃｒｏｍｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２３：６１（１９８３）参照；Ｌｅｖｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０（１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇら、Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ  ２５：３５１（１９８９）；Ｈｏｗａｒｄら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  ７１：１０５（１９８９）もまた参照）。なおも別の実施形態では、放出制御システムが、治療標的の近位に設置され得る。
【０２２３】
本発明は、薬学的組成物も提供する。そのような組成物は、治療有効量の抗体および生理的に許容可能なキャリアを含む。特定の実施形態において、用語「生理的に許容可能な」とは、連邦政府もしくは州政府の規制当局によって承認されていること、または米国薬局方、もしくは、動物、より詳細にはヒトにおいて使用するための他の一般に認識されている薬局方に列挙されていることを意味する。用語「キャリア」とは、その治療薬とともに投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルのことを指す。そのような生理学的キャリアは、滅菌された液体（例えば、水および油（例えば、石油、動物、野菜または合成起源のもの（例えば、落花生油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油など）が挙げられる））であり得る。その薬学的組成物が静脈内投与されるとき、水が好ましいキャリアである。食塩水溶液および水性のデキストロース溶液およびグリセロール溶液もまた、液体キャリアとして、特に注射可能な溶液において、用いられ得る。適当な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、イネ、穀粉、胡粉、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。また、本組成物は、所望であれば、少量の湿潤剤もしくは乳化剤またはｐＨ緩衝剤を含んでもよい。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル、散剤、徐放処方物などの形態をとり得る。本組成物は、従来の結合剤およびキャリア（例えば、トリグリセリド）とともに、坐剤として製剤化され得る。経口処方物は、標準的なキャリア（例えば、薬学的グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなど）を含み得る。適当なキャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”に記載されている。そのような組成物は、患者への適正な投与のための形態を提供するために、有効量の抗体、好ましくは精製された形態の抗体を、適当量のキャリアとともに含む。本処方物は、投与様式に適しているべきである。
【０２２４】
１つの実施形態において、本組成物は、人間への静脈内投与に適合させた薬学的組成物として、通例の手順に従って製剤化される。代表的には、静脈内投与用の組成物は、滅菌された等張性水性緩衝液における溶液である。必要であれば、本組成物は、可溶化剤、および注射部位における疼痛を和らげるリグノカインなどの局所麻酔剤も含んでもよい。通常、それらの成分は、別々に供給されるか、または密閉された容器（例えば、活性な薬剤の量を示しているアンプルまたは小袋）内に、単位剤形で、例えば、凍結乾燥された粉末もしくは水を含まない濃縮物として、一緒に混合される。本組成物が、注入によって投与される場合、本組成物は、滅菌された薬学的グレードの水または食塩水が入った注入ボトルを用いて調剤されていてもよい。本組成物が、注射によって投与される場合、それらの成分が投与前に混合され得るように注射用の滅菌水または食塩水のアンプルが、提供され得る。
【０２２５】
本発明はまた、本発明の薬学的組成物の成分のうちの１つ以上で満たされた１つ以上の容器を備えた薬学的なパッケージまたはキットも提供する。医薬品または生物製品の製造、使用または販売を取り締まっている行政機関によって規定された形態の注意書きは、そのような容器に必要に応じて関連づけられ得、その注意書きは、ヒトへの投与についての製造、使用または販売に関する機関による承認を表したものである。
【０２２６】
さらに、本発明の抗体は、様々なエフェクター分子（例えば、異種ポリペプチド、薬物、放射性ヌクレオチドまたはトキシン）に結合体化され得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０８４９５；ＷＯ９１／１４４３８；ＷＯ８９／１２６２４；米国特許第５，３１４，９９５号；およびＥＰ３９６，３８７参照。抗体またはそのフラグメントは、治療的な部分（例えば、細胞毒（例えば、細胞分裂抑制剤または細胞破壊剤））、治療薬または放射性金属イオン（例えば、アルファ放射体、例えば、２１３Ｂｉ）に結合体化され得る。細胞毒または細胞傷害性薬剤には、細胞にとって有害な任意の薬剤が含まれる。例としては、パクリタキセル、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラセンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピューロマイシン、ならびにそれらのアナログまたはホモログが挙げられる。治療薬としては、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシル、ダカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣおよびｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前のダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシン（ＡＭＣ））および有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２７】
抗体に対してそのような治療的な部分を結合体化するための手法は、周知であり、例えば、Ａｒｎｏｎら、“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編）、ｐｐ．２４３−５６  Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ（１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｒｏｂｉｎｓｏｎら編、ｐｐ．６２３−５３，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ（１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａら編、ｐｐ．４７５−５０６（１９８５）；“Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎら編、ｐｐ．３０３−１６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８５）；およびＴｈｏｒｐｅら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  ６２：１１９（１９８２）参照。あるいは、抗体は、２次抗体に結合体化されて、ヘテロ結合体抗体を形成し得る。例えば、米国特許第４，６７６，９８０号参照。
【０２２８】
本発明の結合体は、所与の生物学的応答を改変するために用いられ得、治療薬部分または薬物部分は、従来の化学的な治療薬に限定されると解釈されるべきでない。例えば、薬物部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリペプチドであり得る。そのようなタンパク質としては、例えば、トキシン（例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素またはジフテリアトキシン）；タンパク質（例えば、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノゲンアクチベーター、アポトーシス剤、例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＡＩＭ  Ｉ（国際公開番号ＷＯ９７／３３８９９参照）、ＡＩＭ  ＩＩ（国際公開番号ＷＯ９７／３４９１１参照）、Ｆａｓリガンド（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，６：１５６７（１９９４））、ＶＥＧＩ（国際公開番号ＷＯ９９／２３１０５参照））；血栓剤（ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）；抗血管新生剤、例えば、アンジオスタチンまたはエンドスタチン；または生物学的応答改変物質（ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ）（例えば、リンフォカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）または他の成長因子）が挙げられ得る。
【０２２９】
５．１２  抗体ベースの遺伝子治療
本発明の別の局面において、抗体またはその機能的な誘導体をコードする配列を含む核酸が、遺伝子治療によって、ＯＸ４０の異常な発現および／または活性に関連する疾患または障害を処置、阻害または予防するために投与される。遺伝子治療とは、発現された核酸または発現可能な核酸を被験体に投与することによって行われる治療のことを指す。本発明のこの実施形態において、その核酸は、治療効果を媒介するそれらのコードされるタンパク質を生成する。利用可能な遺伝子治療のための方法のいずれかが、本発明に従って用いることができる。例示的な方法を下記に記載する。
【０２３０】
遺伝子治療の方法に関する一般的な総説としては、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２：４８８（１９９３）；Ｗｕら、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ３２：５７３（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６（１９９３）；Ｍｏｒｇａｎら、Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ６２：１９１（１９９３）；Ｍａｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：１５５（１９９３）参照。
【０２３１】
１つの局面において、本化合物は、抗体をコードする核酸配列を含み、前記核酸配列は、適当な宿主において、抗体、あるいはそのフラグメントもしくはキメラタンパク質または重鎖もしくは軽鎖を発現する発現ベクターの一部である。特に、そのような核酸配列は、抗体コード領域に作動可能に連結されたプロモーターを有し、前記プロモーターは、誘導性または構成性であり、必要に応じて、組織特異的である。
【０２３２】
別の特定の実施形態において、抗体コード配列および他の任意の所望の配列が、ゲノム内の所望の部位における相同組換えを促進する領域と隣接しているがゆえに、抗体をコードする核酸の染色体内発現をもたらす核酸分子が用いられる（Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：８９３２（１９８９）；Ｚｉｊｌｓｔｒａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：４３５（１９８９））。特定の実施形態において、発現される抗体分子は、一本鎖抗体である；あるいは、核酸配列は、抗体の重鎖と軽鎖の両方をコードする配列、またはそのフラグメントを含む。
【０２３３】
患者への上記核酸の送達は、直接的（患者が核酸または核酸を有するベクターに直接曝露される場合）であってもよいし、間接的（細胞をまずインビトロにおいて核酸で形質転換し、次いで、患者に移植される場合）であってもよい。これらの２つのアプローチは、それぞれ、インビボ遺伝子治療またはエキソビボ遺伝子治療として知られている。
【０２３４】
特定の実施形態において、上記核酸配列は、その核酸配列が、コードされる生成物をもたらすように発現される場合、インビボにおいて直接投与される。これは、当該分野で公知の数多くの方法のいずれかによって、例えば、適切な核酸発現ベクターの一部として核酸配列を構築し、それが細胞内のものになるようにそのベクターを投与することによって（例えば、欠損レトロウイルスベクターもしくは弱毒性レトロウイルスベクターまたは他のウイルスベクターを用いる感染によって（米国特許第４，９８０，２８６号参照）、あるいは裸のＤＮＡの直接的な注射によって、あるいは微小粒子銃（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ）を使用することによって）、あるいは、リポソーム内、微小粒子内またはマイクロカプセル内に封入したものを脂質または細胞表面レセプターまたはトランスフェクト剤で被覆することによって、あるいは、それらを、核に入ることが知られているペプチドに連結した状態で投与することによって（それを、レセプター媒介性のエンドサイトーシスを起こしやすいリガンドに連結された状態で投与することによって）（例えば、Ｗｕら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６２：４４２９（１９８７）参照）（これは、レセプターを特異的に発現する細胞型を標的化するために用いることができる）などによって、達成することができる。別の実施形態では、核酸−リガンド複合体を形成することができ、ここで、そのリガンドは、エンドソームを破壊する融合性のウイルスペプチドを含むことにより、その核酸がリソソームの分解を回避することができるようになる。なおも別の実施形態では、特定のレセプターを標的化することによって、インビボにおいて細胞特異的な取り込みおよび発現に核酸を標的化することができる（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０６１８０；ＷＯ９２／２２６３５；ＷＯ９２／２０３１６；ＷＯ９３／１４１８８、ＷＯ９３／２０２２１参照）。あるいは、上記核酸は、細胞内に導入され得、相同組換えによって発現用の宿主細胞ＤＮＡ内に組み込まれ得る（Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：８９３２（１９８９）；Ｚｉｊｌｓｔｒａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：４３５（１９８９））。
【０２３５】
特定の実施形態では、本発明の抗体をコードする核酸配列を含むウイルスベクターを用いる。例えば、レトロウイルスベクターを用いることができる（Ｍｉｌｌｅｒら、Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２１７：５８１（１９９３）参照）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムの正確なパッケージングおよび宿主細胞ＤＮＡへの組み込みに必要な成分を含む。遺伝子治療において用いられる抗体をコードする核酸配列は、１つ以上のベクターにクローニングされ、それにより、患者への遺伝子の送達が容易になる。レトロウイルスベクターについての詳細は、Ｂｏｅｓｅｎら、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ６：２９１（１９９４）に見られ、そこには、化学療法に対してより抵抗性の幹細胞を作製するために、ｍｄｒｌ遺伝子を造血性幹細胞に送達するためのレトロウイルスベクターの使用が記載されている。遺伝子治療におけるレトロウイルスベクターの使用を説明している他の参考文献は：Ｃｌｏｗｅｓら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９３：６４４（１９９４）；Ｋｉｅｍら、Ｂｌｏｏｄ  ８３：１４６７（１９９４）；Ｓａｌｍｏｎｓら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：１２９（１９９３）；およびＧｒｏｓｓｍａｎら、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｇｅｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖ  ３：１１０（１９９３）である。
【０２３６】
アデノウイルスを本発明において用いてもよい。アデノウイルスは、抗体を呼吸上皮に送達するための、本発明において特に魅力的なビヒクルである。アデノウイルスは、呼吸上皮に天然に感染する。アデノウイルスベースの送達系に対する他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞および筋肉である。アデノウイルスは、非分裂細胞に感染することができるという利点を有する。Ｋｏｚａｒｓｋｙら、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｇｅｎ  Ｄｅｖ  ３：４９９（１９９３）には、アデノウイルスベースの遺伝子治療に関する総説が提供されている。Ｂｏｕｔら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：３（１９９４）では、遺伝子をアカゲザルサルの呼吸上皮に移入するアデノウイルスベクターの使用が実証されている。遺伝子治療におけるアデノウイルスの使用に関する他の例は、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１（１９９１）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｃｅｌｌ  ６８：１４３（１９９２）；Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９１：２２５（１９９３）；ＰＣＴ公開ＷＯ９４／１２６４９；Ｗａｎｇら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２：７７５（１９９５）に見られる。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）もまた、遺伝子治療において使用するために提案されている（Ｗａｌｓｈら、Ｐｒｏｃ  Ｓｏｃ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ  ２０４：２８９（１９９３）；米国特許第５，４３６，１４６号；同第６，６３２，６７０号；および同第６，６４２，０５１号）。
【０２３７】
遺伝子治療に対する別のアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介性のトランスフェクションまたはウイルス感染などの方法によって、組織培養物内の細胞への遺伝子の移入を含む。通常、この移入方法は、細胞への選択マーカーの移入を含む。次いで、その細胞を選択下に置くことにより、遺伝子を取り込み、その移入された遺伝子を発現している細胞が単離される。そして、それらの細胞が、患者に送達される。
【０２３８】
この実施形態において、その核酸が細胞に導入された後、得られた組換え細胞がインビボにおいて投与される。そのような導入は、当該分野で公知の任意の方法によって行われ得、そのような方法としては、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、核酸配列を含むウイルスベクターまたはバクテリオファージベクターによる感染、細胞融合、染色体媒介性の遺伝子導入、微小核体（ｍｉｃｒｏｃｅｌｌ）媒介性の遺伝子導入、スフェロプラスト融合などが挙げられるがこれらに限定されない。外来遺伝子を細胞に導入するための数多くの手法が、当該分野で公知であり（例えば、Ｌｏｅｆｆｌｅｒら、Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２１７：５９９（１９９３）；Ｃｏｈｅｎら、Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２１７：６１８（１９９３）；Ｃｌｉｎｅ，Ｐｈａｒｍａｃ  Ｔｈｅｒ  ２９：６９（１９８５）参照）、それらの方法は、本発明に従って用いられ得るが、ただし、レシピエント細胞の必要な発生的および生理学的な機能は、破壊されない。この手法は、その核酸が、その細胞によって発現可能であり、好ましくは遺伝性であり、かつその子孫細胞によって発現可能であるように、核酸が安定して細胞に移入させるものであるべきである。
【０２３９】
得られた組換え細胞は、当該分野で公知の様々な方法によって患者に送達され得る。組換え血液細胞（例えば、造血性幹細胞または造血性前駆細胞）は、好ましくは、静脈内に投与される。使用が想定される細胞の量は、所望の作用、患者の状態などに依存し、当業者が決定することができる。
【０２４０】
遺伝子治療の目的で核酸を導入することができる細胞には、任意の所望の入手可能な細胞型が包含され、それらとしては、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋細胞、肝細胞；血液細胞（例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球）；様々な幹細胞または前駆細胞、特に、造血性幹細胞または造血性前駆細胞、例えば、骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝から得られるようなものなどが挙げられるがこれらに限定されない。
【０２４１】
１つの実施形態において、遺伝子治療のために用いられる細胞は、患者にとって自己由来のものである。本発明の抗体をコードする核酸配列は、それらが細胞またはその子孫によって発現可能であるように細胞に導入され、次いで、その組換え細胞を、治療効果のためにインビボにおいて投与する。特定の実施形態では、幹細胞または前駆細胞が用いられる。インビトロにおいて単離および維持することができる任意の幹細胞および／または前駆細胞は、潜在的には、本発明のこの実施形態に従って用いることができる（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９４／０８５９８；Ｓｔｅｍｐｌｅら、Ｃｅｌｌ  ７１：９７３（１９９２）；Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ，Ｍｅｔｈ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ  ２１Ａ：２２９（１９８０）；Ｐｉｔｔｅｌｋｏｗら、Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｐｒｏｃ  ６１：７７１（１９８６）参照）。
【実施例】
【０２４２】
６．実施例
本発明は、以下の本発明の好ましい実施形態の例によってさらに例示され得るが、これらの実施例は、単なる例示の目的で含められるものであり、別段具体的に示されない限り、本発明の範囲を限定する意図はないことが理解されるだろう。
【０２４３】
実施例１：ヒトＯＸ４０／ＦＣ免疫原の調製
２つの型のＯＸ４０レセプターを免疫原として用いることにより、本発明のアンタゴニスト抗ＯＸ４０抗体を作製した。その１つ目は、配列番号１のヌクレオチド残基１０５〜６２７によってコードされるヒトＦｃγ１および細胞外ドメインを含む融合タンパク質として発現される、可溶型のヒトＯＸ４０レセプターであった。２つ目の型は、安定的にトランスフェクトされたマウス線維芽細胞のＬ細胞の表面上に発現される完全長ＯＸ４０を含む細胞ベースの免疫原であった。
【０２４４】
可溶型のＯＸ４０を、ＴＣＲ活性化ヒトＣＤ４Ｔ細胞から単離されたＯＸ４０ｃＤＮＡクローンからクローニングした。ＯＸ４０ｃＤＮＡクローンを作製するために用いた２つのプライマーは：（１）ＨｉｎｄＩＩＩ部位を含むヌクレオチド配列ｃｃｃａａｇｃｔｔｔａｃｃｃｃａｇｃａａｃｇａｃｃｇｇｔｇｃｔｇｃ（配列番号３）を有するセンスプライマー、および（２）ヒトＦｃγ１とインフレームでＸｈｏＩ部位を含むヌクレオチド配列ｃｇｃｃｔｃｇａｇｇａｃｃｔｃｃａｃｇｇｇｃｃｇｇｇｔｇｇ（配列番号４）を有するアンチセンスプライマーであった。得られた５４０ｂｐのＰＣＲフラグメントを、５’末端に分泌シグナルペプチド配列および３’末端にヒトＦｃγ１配列（ヒンジならびに定常領域ＣＨ２およびＣＨ３）を含む市販のベクターにサブクローニングした。配列決定することにより、その構築物の構成内容を確かめた。
【０２４５】
一過性の発現のために、ＯＸ４０／Ｆｃγ１ＤＮＡを、製造者のプロトコルに従い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によって、２９３Ｔ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後に、トランスフェクトされた細胞の培養上清を、精製するために回収した。ＯＸ４０／Ｆｃγ１の安定な発現もまた、２９３Ｔ細胞株において確立した。発現を確かめるために、培養上清を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって解析した。分離されたタンパク質を、ニトロセルロース膜に転写し、そしてＨＲＰ−ロバ抗ヤギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）で検出される西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合体化された、マウス抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）モノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）またはポリクローナルヤギ抗ＯＸ４０抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）で検出した。高感度の化学発光検出（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて、免疫反応性のタンパク質をフィルム上で同定した。ＯＸ４０／Ｆｃγ１を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で平衡させたプロテインＡアフィニティーカラム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で精製した。上記細胞培養上清をそのカラムにアプライした後、樹脂を約２０カラム容積のＰＢＳで洗浄し、続いてＳＣＣ緩衝洗浄液（０．０５Ｍクエン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム，ｐＨ６．０）で洗浄することにより、未結合タンパク質を除去した。０．０５Ｍクエン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ３．０）を用いて、ＯＸ４０融合タンパク質を溶出した後、ＰＢＳ（ｐＨ７．０）中で透析した。ＯＸ４０／Ｆｃγ１を含むアフィニティーカラムからの画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。そのタンパク質の純度を、クマシーブルー染色、ならびに上に記載したようなヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）およびヤギ抗ヒトＯＸ４０抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いるウエスタン免疫ブロット法によるタンパク質の同一性によって解析した。
【０２４６】
２つ目の型の免疫原は、ＴＣＲ活性化ヒトＣＤ４Ｔ細胞からクローニングされた完全長ヒトＯＸ４０ｃＤＮＡを用いて構築した。用いた２つのプライマーは、ヌクレオチド配列ｃａｃｃａｔｇｔｇｃｇｔｇｇｇｇｇｃｔｃｇｇｃｇｇｃｔｇｇｇ（配列番号５）およびｇａｔｃｔｔｇｇｃｃａｇｇｇｔｇｇａｇｔｇｇｇｃｇｔｃｇｇｃｃ（配列番号６）を有するＯＸ４０特異的プライマーであった。得られたＰＣＲ産物を、市販のベクターに直接クローニングし、高レベルでＯＸ４０を発現させるためにマウスＬ線維芽細胞に安定的にトランスフェクトした。投与の前に、ＧａｍｍａＣｅｌｌ  １０００  ＥｌｉｔｅモデルＡ（ＭＤＳ  Ｎｏｒｄｉｏｎ，Ｏｔｔａｗａ  Ｃａｎａｄａ）を用いて、その細胞ベースの免疫原のＬ細胞に６８００Ｇｒａｙで照射することにより、その免疫原の増殖を阻害した。
【０２４７】
実施例２：抗ＯＸ４０ＭＡＢの作製
約２０μｇの可溶性ＯＸ４０／Ｆｃγ１免疫原をフロイントアジュバントと混合し（１：１）、２匹の６週齢Ａ／Ｊマウス（Ｈａｒｌａｎ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔｅｘ．）の皮下に３回注射して投与し、７日後に１回、腹腔内注射した（アジュバント無し）。最後の注射の３日後に、免疫されたマウスの脾細胞を、以下に記載されるようなＧｒｏｔｈおよびＳｃｈｅｉｄｅｇｇｅｒ（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９８０）の方法に従ってマウスミエローマＳＰ２／０細胞と融合させた。
【０２４８】
細胞ベースの免疫原に対しては、ＯＸ４０で安定的にトランスフェクトされ、ガンマ線照射された３×１０６個のＬ細胞を、６週齢Ａ／Ｊマウス（Ｈａｒｌａｎ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔｅｘ．）の皮下にＰＢＳ中のものを３回注射して投与し、７日後に１回、腹腔内注射した。最後の注射の３日後に、免疫されたマウスの脾細胞を、以下に記載されるようにマウスミエローマＳＰ２／０細胞と融合させた。
【０２４９】
抗ＯＸ４０ｍＡｂの作製をもたらす融合では、免疫されたマウスの脾臓から単一細胞懸濁液を調製し、それを、適当な融合剤であるポリエチレングリコール（Ｍ．Ｗ．１４５０）（Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）および５％ジメチルスルホキシド（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いる不死化Ｓｐ２／０ミエローマ細胞との融合（１：１の比）に用いることにより、ハイブリドーマ細胞を形成させた（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．５９−１０３（１９８６）。１０日後、そのハイブリドーマ細胞株を、好ましくは、融合していない不死化細胞の成長または生存を阻害する物質であるヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）を含む、適当なＤＭＥＭ培養完全培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で培養した。２回の融合実験から、効率的に融合され、抗体を安定して高レベルで産生し、そしてＨＡＴ培地に感受性の、２４，０００個の好ましい不死化細胞株が得られた。
【０２５０】
実施例３：アンタゴニスト抗ＯＸ−４０抗体についてのスクリーニング
上記ハイブリドーマ細胞が生育している培養液を、ＯＸ４０に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の産生についてアッセイした。そのハイブリドーマ細胞によって産生されるｍＡｂの結合特異性を、３つの異なるアプローチ：ＦＭＡＴ、ＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーイムノアッセイによって測定した。
【０２５１】
Ａ．ＦＭＡＴスクリーニング
ＦＭＡＴアプローチを用いて、マウス抗ヒトＯＸ４０ｍＡｂを分泌する２２０個のハイブリドーマ細胞株を、ＯＸ４０で一過性にトランスフェクトされたＬ細胞に対しては強力な反応性を有するが、トランスフェクトされていないモック（ｍｏｃｋ）Ｌ細胞に対しては反応性を有しないことによって同定した。９６ウェルマイクロタイタープレート形式において細胞数と蛍光の両方を画像化および定量化する、大共焦点（ｍａｃｒｏｃｏｎｆｏｃａｌ）走査型プラットフォームを使用するＦＭＡＴを用いて、抗ＯＸ４０ハイブリドーマ上清をスクリーニングした。ＯＸ４０抗原を発現するＬ細胞を、５μｌの抗ＯＸ４０ハイブリドーマ上清とともにインキュベートし、そして、スクリーニング緩衝液中に０．１２５μｇ／ｍｌに希釈されたＣｙ−５結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｆｃγ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＰＡ）で蛍光標識した。インキュベートの２時間後に、ＦＭＡＴ  ８１００  ＨＴＳシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，ＣＡ）を用いて、そのプレートをスキャンした。下記の表１における結果は、クローンＢ２４およびＢ３９が、ポジティブコントロールに匹敵する活性を有することを示している。
【０２５２】
Ｂ．ＥＬＩＳＡスクリーニング
ポリ塩化ビニル９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を、４℃において一晩、ＯＸ４０／Ｆｃγ１（５ｎｇ／ウェル）またはスクリーニングコントロールとしてヒトＦｃγ１（２５ｎｇ／ウェル）でコーティングした後、ＰＢＳ中の２％ＢＳＡとともに１時間インキュベートすることにより、非特異的な結合をブロッキングした。約５０μｌのハイブリドーマ上清を加え、１時間インキュベートした。０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）−ＰＢＳで４回洗浄した後、約０．２μｇのＨＲＰ−ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃγ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＰＡ）をＲＴで１時間にわたって加えることにより、結合している抗ＯＸ４０抗体の存在を検出した。新しく作製した基質溶液である１００μｌの１ｍＭ  ＴＭＢ（Ｓｉｇｍａ）を各ウェルに３０分間加え、そして５０ｍｌの０．２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を加えることによって反応を停止させ、そのプレートを、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＣＡ）を用いて４５０ｎｍで読み出した。２４，０００ウェルのうち、２２０個が、ＦＭＡＴおよびＥＬＩＳＡによって陽性であると考えられた。代表的なデータを表１に報告する。
【０２５３】
【表１】
2010518873.tif 000002
Ｃ．フローサイトメトリースクリーニング
５μｌの抗ＯＸ４０ハイブリドーマ上清を用いて染色し、そしてＦＩＴＣ−結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｆｃγ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＰＡ）で蛍光標識した、ＯＸ４０で安定的にトランスフェクトされたＬ細胞を用いるフローサイトメトリーによってもまた、ＦＭＡＴおよびＥＬＩＳＡによって選択された２２０個の陽性ハイブリドーマを試験した。表２に示すデータは、抗ＯＸ４０ハイブリドーマ上清を用いて染色された、ＯＸ４０でトランスフェクトされた全Ｌ細胞のパーセンテージに対応する。
【０２５４】
【表２】
2010518873.tif 000003
表１および２において同定された２２０個の抗ＯＸ４０ｍＡｂのうち、抗ＯＸ４０ｍＡｂクローンＢ２、Ｂ２４、Ｂ３６、Ｂ３７およびＢ３９が、ＯＸ４０Ｌ  Ｌ細胞に対して陽性の結合性を示したが、トランスフェクトされていないＬ細胞に対しては陽性の結合性を示さなかった。Ｂ−１７は、ＯＸ４０Ｌ  Ｌ細胞に対する結合性を示さなかったので、却下された。
【０２５５】
実施例４：アンタゴニスト抗ＯＸ４０ＭＡＢの最初の特徴づけ
ヒトＯＸ４０に特異的な抗体を産生する２２０個のハイブリドーマを同定した後、それらのクローンを限界希釈手順によってサブクローン化し、標準的な方法（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．５９−１０３（１９８６））によって生育した。それらのサブクローンによって分泌される２２０個の抗ＯＸ４０ｍＡｂを、プロテインＡ−セファロースを用いる従来の精製手順によって、培養液から精製した。
【０２５６】
Ａ．細胞株の調製
ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の発達に対するＯＸ４０共刺激の影響を、特定の細胞株および新たに単離されたヒトナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を用いて調べることにより、２２０個の抗ＯＸ４０ｍＡｂ結合物を特徴付けた。これらの細胞株としては：（１）ＯＸ４０でトランスフェクトされたヒトＨｕｔ−７８白血病性ＣＤ４＋Ｔ細胞株、（２）ＯＸ４０ＬでトランスフェクトされたＬ線維芽細胞マウスＬ細胞およびそれらの親細胞株（Ｄｒ．Ｙｏｎｇ−Ｊｕｎ  Ｌｉｕ，Ｍ．Ｄ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸからの提供）、（３）ヒトナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、ならびに（４）ヒトＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦの存在下で培養され、単離されたＣＤ１４＋単球から分化した、ヒト樹状細胞（ＤＣ）が挙げられた。健常な成人個体から回収された血液のバフィーコート画分は、磁性枯渇（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）によって単離されたヒトナイーブＴ細胞（ＣＤ４＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ４５ＲＯ−およびＣＤ１４−表現型）の起源として；細胞選別によって単離されたＣＤ１１ｃ＋樹状細胞（ＤＣ）の起源として；または未熟ＤＣに分化した単離ＣＤ１４＋単球の起源として、役割を果たした。
【０２５７】
Ｂ．機能アッセイ
１．Ｈｕｔ−７８アッセイ
ＯＸ４０でトランスフェクトされたヒトＨｕｔ−７８白血病性ＣＤ４＋Ｔ細胞を、９６ウェルプレートにおいて、ＯＸ４０Ｌでトランスフェクトされ照射された（６８００ｃＧｒａｙ）Ｌ細胞またはトランスフェクトされていないＬ細胞の存在下（４：１の比（ＯＸ４０−Ｈｕｔ７８細胞／Ｌ細胞））において、５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３（ＯＫＴ３，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｅｎｃｅｓ，ＣＡ）および１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８ｍＡｂ（ＣＤ２８．２，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｅｎｃｅｓ，ＣＡ）で４８時間プライミングした。実施例３において同定された２２０個の抗ＯＸ４０ｍＡｂを、アッセイの始めに加えることにより、ＣＤ４＋Ｔ細胞のサイトカイン放出の阻害として定義されるアンタゴニスト活性についてスクリーニングした。このアッセイを、同じプロトコルを用いて３回繰り返した。表３にまとめた実験は、３つの代表的な抗ＯＸ４０ｍＡｂ（Ｂ６６、Ｂ７６およびＢ８６）の例であり、これは、ＯＸ４０Ｌでトランスフェクトされた細胞の存在下で活性化されたＴ細胞が、トランスフェクトされていないＬ細胞の存在下で活性化されたとき（ＩＬ−２産生に対しては２２ｐｇ／ｍｌおよびＩＬ−１３産生に対しては７０ｐｇ／ｍｌ）よりも、少なくとも１０倍多くＩＬ−２（１３８ｐｇ／ｍｌ）およびＩＬ−１３（６２０ｐｇ／ｍｌ）を産生したことを示した。精製された抗ＯＸ４０ｍＡｂのＢ６６およびＢ７６を細胞培養物に加えることにより、用量応答様式でＨｕｔ−７８ＣＤ４＋Ｔ細胞株のサイトカイン産生が抑制された。クローンＢ６６は、最高濃度において８８％のＩＬ−２および９２％のＩＬ−１３サイトカイン産生を阻害した（表３）。試験された２２０個の抗ＯＸ４０ｍＡｂのうち、ＩＬ−２およびＩＬ−１３のサイトカイン産生を６０％超阻害した１０個のクローンを選択した（データ示さず）。
【０２５８】
【表３】
2010518873.tif 000004
Ｃ．ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞アッセイ
Ｔ細胞増殖およびサイトカイン産生のＯＸ４０共刺激を抑制するために、２２０個の抗ＯＸ４０ｍＡｂを、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞における、サイトカイン産生の阻害、増殖の阻害およびアポトーシスの誘導の能力について機能的にスクリーニングした。健常な成人志願者（Ｇｕｌｆ  Ｃｏａｓｔ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）由来のヒト血液のバフィーコートから、市販のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を用いて、ナイーブヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を単離した。単離されたナイーブヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＯＸ４０Ｌでトランスフェクトされ照射されたＬ細胞または親Ｌ細胞の存在下（１：４の比（Ｌ細胞／ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞））において、５μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３（ＯＫＴ３，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ）および１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８ｍＡｂ（ＣＤ２８．２，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ）で活性化した。培養の７日後、ＯＸ４０Ｌトランスフェクタントの存在下で活性化されたナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｌ細胞の存在下でプライミングされたものよりも、少なくとも１０倍多くＩＬ−２およびＩＬ−１３を産生した（図２）。サイトカイン産生のレベルは、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）製のＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。それらの細胞は、図３に示されるようにＯＸ４０共刺激の存在下でより多く増殖した）。図２および３について：白四角は、ナイーブＣＤ４を表し；白三角は、コントロールＬ細胞を用いたときのナイーブＣＤ４＋を表し；黒三角は、ナイーブＣＤ４＋およびＯＸ４０Ｌ  Ｌ細胞を用いたときのＢ６６を表し；黒四角は、ナイーブＣＤ４＋およびＯＸ４０Ｌ  Ｌ細胞を用いたときの２Ｃ４（アイソタイプコントロール）を表し；そして黒丸は、ナイーブＣＤ４＋およびＯＸ４０Ｌ−Ｌ細胞を用いたときの無関係なＧ３−５１９ｍＡｂコントロールを表す。
【０２５９】
抗ＯＸ４０ｍＡｂのＢ６６を培養物に加えることにより、プライミングされたＣＤ４＋Ｔ細胞において、２Ｃ４またはＧ３−５１９コントロールと比べて用量依存的様式で、サイトカイン放出（図２）、細胞増殖（図３）が阻害され、アポトーシスが誘導された（表４）。
【０２６０】
【表４】
2010518873.tif 000005
実施例５：選択されたアンタゴニスト抗ＯＸ４０ＭＡＢのさらなる特徴付け
サイトカインは、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の分化を調節することができ、そのナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は、そのサイトカイン産生プロファイルによって定義されるＴ細胞サブセットをもたらす。ＩＬ−１２は、Ｔｈ１細胞（主にＩＦＮ−γおよびＩＬ−２を産生し、かつ細胞媒介性免疫および炎症促進性応答の調節に関与する細胞）を分化させる。ＩＬ−４は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞をＴｈ２細胞（主にＩＬ−４およびＩＬ−５を産生し、かつ体液性免疫および抗炎症性反応の調節に関与する細胞）に極性化する。最初の特徴づけから選択された２つの抗ＯＸ４０ｍＡｂのＡ１０およびＢ６６を、それらの生存増殖およびサイトカイン放出を抑制する能力について、Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞の両方において試験した。この試験を行うために、まず、それらを、マウス親抗体の可変領域およびヒト定常領域を含むキメラ型に変換した。すべての市販の抗体およびサイトカインは、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡから購入した。
【０２６１】
Ａ．Ｔｈ１アッセイ
上記の実施例４（Ｂ）（２）に記載したようなキットを用いて、ヒト血液のバフィーコートからヒトナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を単離した。５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１２サイトカインおよびが補充された培地中の、５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３（ＯＫＴ３、１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８（ＣＤ２８．２）および１０μｇ／ｍｌの抗ＩＬ−４中和抗体（ＭＰ４−２５Ｄ２）を用いて、Ｔｈ１−サイトカイン産生プロファイルを誘導するために、上記細胞を７日間プライミングした。それらの細胞を、ＯＸ４０Ｌでトランスフェクトされ照射されたＬ細胞または親Ｌ細胞の存在下（１：４の比（Ｌ細胞／ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞））において、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ｍＡｂとともに培養した。ＯＸ４０共刺激は、アネキシン染色陽性のＣＤ４＋細胞の数が減少することによって示されるようにＴｈ１エフェクター細胞の生存を増加させる（表５）。照射されたＬ細胞の共培養の開始時にキメラ抗ＯＸ４０ｍＡｂのＢ６６を加えることにより、この生存が阻害された。ＯＸ４０共刺激は、ＩＦＮ−γ産生も増加させるが、Ｂ６６の添加は、その産生を用量依存的様式で阻害した（表６）。
【０２６２】
【表５】
2010518873.tif 000006
【０２６３】
【表６】
2010518873.tif 000007
Ｂ．Ｔｈ２アッセイ
ヒトナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、上に記載したように単離した。５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４サイトカインが補充された培地中の、５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３、１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８および１０μｇ／ｍｌの抗ＩＦＮ−γ中和抗体を用いて、Ｔｈ２−サイトカイン産生プロファイルを誘導するために、上記細胞を７日間プライミングした。それらの細胞を、ＯＸ４０Ｌでトランスフェクトされ照射されたＬ細胞または親Ｌ細胞の存在下（１：４の比（Ｌ細胞／ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞））において、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ｍＡｂとともに培養した。ＯＸ４０共刺激は、アネキシン染色陽性のＣＤ４＋細胞の数が減少することによって示されるようにＴｈ２エフェクター細胞の生存を増加させる（図４）。照射されたＬ細胞の共培養の開始時に抗ＯＸ４０ｍＡｂのＡ１０およびＢ６６を加えることにより、用量依存的様式で、この生存（図４）ならびにＴｈ２細胞の増殖（図５）が阻害され、ＩＬ−２（図６ＡおよびＩＬ−１３（図６Ｂ）のサイトカイン産生が阻害された。
【０２６４】
Ｃ．Ｔｈ１７アッセイ
ＩＬ−２３の存在によってプライミングされたＴ細胞の独自のサブセットは、ＩＬ−１７の産生によって特徴づけられ、それらは、ある特定の慢性炎症性疾患の病原に決定的に関連するものである。最近データから、Ｔｈ１７細胞が、Ｔｈ１系列およびＴｈ２系列から初期に分岐するＣＤ４＋Ｔ細胞と完全に別個の系列であること、ならびにＴｈ１細胞およびＴｈ２細胞の発達を支配するサイトカインおよびシグナル伝達経路によって拮抗されること、が証明されている。ＯＸ４０共刺激の作用、および拮抗性の抗ＯＸ４０ｍＡｂがＴｈ１７分化を阻害する能力を研究するために、Ｔｈ１７Ｔ細胞をプライミングした。
【０２６５】
ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、実施例４（Ｂ）（２）に記載したようにバフィーコートから単離した。１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２３サイトカイン（Ｒ＆Ｄ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、それぞれ２０ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ−６およびｈＴＧＦβ１、５μｇ／ｍｌの事前にコーティングされた抗ＣＤ３（ＯＫＴ３，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ）、１μｇ／ｍｌの可溶性抗ＣＤ２８（ＣＤ２８．２）、それぞれ１０μｇ／ｍｌの抗ＩＬ４（ＭＰ４−２５Ｄ２）および抗ＩＦＮ−γ（Ｂ２７）の存在下で、上記細胞を７日間プライミングした。そのプライミングした細胞を洗浄し、ＯＸ４０Ｌでトランスフェクトされ照射されたＬ細胞または親Ｌ細胞の存在下（１：４の比（Ｌ細胞／ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞））において、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ｍＡｂとともにさらに３日間継代培養した。ＯＸ４０Ｌ−Ｌ細胞を介したＯＸ４０共刺激を誘導することによって、Ｔｈ１７細胞は、ＯＸ４０Ｌ共刺激なしにおいて培養された同じ細胞と比べて４倍増殖する。抗ＯＸ４０ｍＡｂのＡ１０およびＢ６６は、Ｔｈ１７増殖を用量依存的様式で阻害した（表７））。
【０２６６】
【表７】
2010518873.tif 000008
表８のデータから、ＯＸ４０Ｌが、Ｔｈ−１７の生存を有意に増加させたことが証明された（６８％  対  ８４％）。この生存の増加は、抗ＯＸ４０ｍＡｂのＡ１０およびＢ６６によって、用量依存的様式で抑制された（表８）。
【０２６７】
【表８】
2010518873.tif 000009
アポトーシスのインヒビターであり、かつＯＸ４０タンパク質の潜在的な標的であるサバイビンというタンパク質の細胞内発現を評価することによると、ＯＸ４０刺激によって、その発現が増加した。この発現の増加は、抗ＯＸ４０ｍＡｂのＡ１０およびＢ６６によって用量依存的様式で阻害された（表９）。
【０２６８】
【表９】
2010518873.tif 000010
プライミングされたＴｈ１細胞と比べて、ＴＨ１７細胞は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞のプライミングの７日後に、有意に高いレベルのＩＬ−１７を示した。Ｔｈ１７をＯＸ４０Ｌでトランスフェクトされ照射されたＬ細胞または親Ｌ細胞とさらに共培養した後、そのＴｈ１７細胞は、プライミングされたＴｈ１細胞と比べて、ＯＸ４０共刺激の存在下において有意水準のＩＬ−１７を産生した。このＩＬ１７産生は、アイソタイプコントロールＧ３−５１９（ＩＣ）と比べて、キメラ抗ＯＸ４０ｍＡｂのＡ１０およびＢ６６によって用量依存的様式で阻害された（表１０）。
【０２６９】
【表１０】
2010518873.tif 000011
Ｄ．Ｌ１０６との比較
ＯＸ４０共刺激の存在下において抗ＯＸ４０ｍＡｂのＡ１０およびＢ６６が活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞からのサイトカインＩＬ−２およびＩＬ−１３の放出を阻害する能力を、実施例４（Ｂ）（２）と同じプロトコルを用いて市販の抗ＯＸ４０抗体Ｌ１０６（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）と比較した。Ｌ１０６によるサイトカイン産生の阻害は、コントロール抗体との統計的な相違は見られなかった（図７参照）。したがって、この抗体は、非機能的である（すなわち、アゴニスト活性またはアンタゴニスト活性が無い）とみられた。
【０２７０】
実施例６：抗ＯＸ４０ＭＡＢのヒト化
マウスｍＡｂであるＡ１０およびＢ６６の重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）の核酸配列を図１４Ａ〜１４Ｄに示す。図１２には、選択されたヒト軽鎖鋳型と比較しながら、２５２−Ｂ６６および２５２−Ａ１０のマウス抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（ＤＮＡ配列から得られたもの）が提供されている。両方の抗体が、ＯＸ４０アンタゴニストとして機能し、互いに競合する。これらの配列を、公的データベースにおいて入手可能なヒト抗体生殖細胞系列配列と比較した。鋳型を決定する際に、全体の長さ、フレームワーク内の類似のＣＤＲの位置、全体的な相同性、ＣＤＲのサイズなどをはじめとしたいくつかの基準を用いた。これらの基準のすべてが一緒になって、図１２Ａおよび１２Ｂに示される、Ａ１０とＢ６６のｍＡｂの重鎖配列および軽鎖配列と、それぞれのヒト鋳型配列との配列アラインメントに示されるような最適なヒト鋳型を選択するための結果を提供した。マウスＡ１０の可変領域と、ヒトカッパー鎖の定常領域と、ヒトＩｇＧのＣＨ１部分とを組み合わせたコントロールとして、キメラＦａｂをファージベクター内に構築した。
【０２７１】
この場合、この抗体を設計するために２つ以上のヒトフレームワーク鋳型を用いた。ＶＨ鎖について選択されたヒト鋳型は、サブグループＶ１のＩＧＨＶ１−４６（ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号Ｘ９２３４３）と生殖系列ＩＧＨＪ４（ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号Ｊ００２５６）との組み合わせであった（図１２Ｂ参照）。ＶＬ鎖について選択されたヒト鋳型は、ＩＧＫＶ４−１（ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号Ｚ０００２３）と生殖系列Ｊ鋳型ＩＧＨＪ１（ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号Ｊ００２４２）との組み合わせであった（図１２Ａ参照）。図１２Ｂには、マウス抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列（ＤＮＡ配列から得られたもの）、選択されたヒト生殖系列鋳型とのそのアラインメント、およびＡ１０（ＴＨ）ｈｕ３３６Ｆのヒト化可変領域の配列が提供されている。Ｋａｂａｔの方法に従って、そのアミノ酸配列の付番を行った。Ａ１０のマウスＣＤＲをヒト可変フレームワークに移植した。この配列において、そのフレームワーク内のアミノ酸残基の総数は、８７であり；ヒトフレームワークとマウスフレームワークとで異なるアミノ酸残基の総数は、２１であり、マウスの残基は、ヒト化重鎖のフレームワーク内で保持されていない。
【０２７２】
配列比較によって、マウス抗体Ｂ６６は、Ａ１０と可変配列内の４アミノ酸だけ異なることが明らかになったが、上記の実施例４で述べた機能解析から、Ｂ６６のほうが、ＯＸ４０結合性およびアンタゴニスト活性が高いことが示された。Ｂ６６におけるアミノ酸変更のうちの２つは、第１ＣＤＲに存在し、マウス生殖系列配列からの変更である。これらの変更が、Ｂ６６の活性の増大に関与し得ると推論された。しかしながら、これらの抗体由来のＣＤＲが、ヒト可変フレームワークに移植されるとき、Ｂ６６の分泌は不十分だったので、さらなる発達に適していなかった。それゆえ、Ｂ６６のＣＤＲＬ１、ならびにＡ１０のＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３を選択して、ヒト可変鋳型に移植することにより、ヒト化抗ＯＸ４０アンタゴニストを作製した。この方法によって、ヒト化Ａ１０分子の結合親和性およびアンタゴニスト活性は、親マウス抗体と比べて、増加した。
【０２７３】
Ａ．ＢｉａＣｏｒｅによる抗ＯＸ４０Ｆａｂの動態解析
図１３は、もとのマウス分子との比較で、得られた分子のＯＸ４０結合活性を示している。ＣＤＲＬ１も変異させることにより、Ａ１０のもとのＣＤＲＬ１配列を反映させた。Ａ１０のＣＤＲＬ１をＢ６６のＣＤＲＬ１で置換することにより、「ヒト化」Ａ１０分子Ａ１０（ＴＨ）ｈｕ３３６Ｆの結合活性が増大した。図１５は、ヒト化クローンＡ１０（ＴＨ）ｈｕ３３６Ｆ、マウスＡ１０およびそのキメラ型が、ＯＸ４０に対して等しく十分に競合することを示している。
【０２７４】
実施例７：Ａ１０（ＴＨ）ＨＵ３３６Ｆのヒト化バリアントの特徴づけ
ヒト化Ａ１０候補であるＡ１０（ＴＨ）ｈｕ３３６Ｆの６つのバリアントを、結合ＥＬＩＳＡ、細胞ベースの結合アッセイ、およびそれらのアンタゴニスト活性を証明するさらなる機能アッセイを用いてスクリーニングした。６つのヒト化Ａ１０のうちの２つであるバリアントＡ１０−ＤおよびＦを６つの機能アッセイに供した。
【０２７５】
上に記載したヒト化可変領域が、発現したときにヒト定常領域とインフレームで融合されるように、そのヒト化可変領域を哺乳動物発現ベクターにクローニングした。試験用の全抗体を作製するために、さらなるヒト化候補も哺乳動物発現ベクターにクローニングした。これらの追加候補は、もとのＡ１０のＣＤＲＬ１を含むヒト化Ａ１０ＶＬ領域（ＡおよびＤ）、アスパラギン（Ｎ）からヒスチジン（Ｈ）に変更されたＫａｂａｔ番号３４を含むヒト化Ａ１０ＶＬ領域（ＢおよびＥ）（このバリアント中のＣＤＲ−Ｌ１は、アミノ酸配列ＫＡＳＱＴＶＤＹＤＧＤＳＹＭＨ（配列番号６１）を含む）、および配列の番号７０においてマウスロイシン（Ｌ）を含む代替のヒト化ＶＨ領域（Ａ１０Ｌ７０）（Ｋａｂａｔ番号６９）を含む。抗体を、表１１に示される組み合わせで哺乳動物細胞において発現させた。表１２は、対応するＢｉａｃｏｒｅデータを示している。これらのヒト化候補の可変領域ならびにマウス可変領域の核酸配列を図１４に示す。
【０２７６】
【表１１】
2010518873.tif 000012
【０２７７】
【表１２】
2010518873.tif 000013
Ａ．ＴＣＲ活性化ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞アッセイ
上記の実施例４（Ｂ）（２）に記載したプロトコルと同じプロトコルに従って、ナイーブヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化させた。ＯＸ４０Ｌの存在下で活性化されたナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は、培養の７日後に、Ｌ細胞の存在下でプライミングされたときよりもＩＬ−２、ＩＬ−５およびＩＬ−１３を少なくとも１０倍多く産生し、有意に多く増殖した（図８）。
【０２７８】
ヒト化バリアントであるＡ１０−ＤおよびＡ１０−Ｆは、アイソタイプコントロールと比べて、マウス親およびキメラ型のＡ１０と同じレベルにまでサイトカイン放出（ＩＬ−２／ＩＬ−５／ＩＬ−１３）を阻害し、ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を阻害した（図８）。
【０２７９】
Ｂ．プライミングされたＴ細胞のアッセイ
ヒト化バリアントであるＡ１０−ＤおよびＡ１０−Ｆを、そのアンタゴニスト活性；ＯＸ４０Ｌでトランスフェクトされ照射されたＬ細胞または親Ｌ細胞の存在下における、Ｔｈ１でプライミングされたＴ細胞、Ｔｈ２でプライミングされたＴ細胞およびＴｈ１７細胞の増殖およびサイトカイン放出の阻害について試験した（実施例５のプロトコル参照）。
【０２８０】
Ｔｈ１条件下において、ヒト化バリアントであるＡ１０−ＤおよびＡ１０−Ｆ）は、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＬ−１３サイトカインの産生および細胞増殖を、アイソタイプコントロールと比べて、キメラ（ＣＣ−Ａ１０）ｍＡｂおよび親マウス（Ｍ−Ａ１０）ｍＡｂと同じ程度にまで阻害した（図９）。
【０２８１】
Ｔｈ２条件下において、ヒト化バリアントであるＡ１０−ＤおよびＡ１０−Ｆは、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖およびサイトカイン放出（ＩＬ−２、ＩＬ−５およびＩＬ−１３）を阻害することによって、その細胞に対するアンタゴニスト作用を示した（図１０）。
【０２８２】
ヒト化バリアントであるＡ１０ＤおよびＡ１０−Ｆを、Ｔｈ１７細胞増殖、ＩＬ−１７サイトカイン産生および細胞アポトーシスに対するそれらのアンタゴニスト活性を比較するために、それらのキメラｍＡｂおよびマウス抗ＯＸ４０ｍＡｂと平行して試験した。結果を表１３に示す。
【０２８３】
【表１３】
2010518873.tif 000014
フローサイトメトリーおよびアネキシンＶ染色によってアポトーシス細胞を同定することにより、アイソタイプコントロールＧ３−５１９処理（ＩＣ）と比べて、ＯＸ４０Ｌが、Ｔｈ１７のアポトーシスを有意に減少させた一方で、ヒト化バリアントであるＡ１０−ＤおよびＡ１０−Ｆが、アポトーシスを用量依存的様式で増加させたことを、表１２に示されるデータは証明している（表１４）。
【０２８４】
【表１４】
2010518873.tif 000015
Ｃ．Ｔｈ２／ＴＳＬＰ−ＤＣ
ＣＤ１１ｃ＋樹状細胞（ＤＣ）を、健常な成人志願者由来のヒト血液のバフィーコートから単離した。系列マーカーＣＤ３（ＯＫＴ３）、ＣＤ１４（Ｍ５Ｅ２）、ＣＤ１５（ＨＢ７８）、ＣＤ２０（Ｌ２７）、ＣＤ５６（Ｂ１５９）およびＣＤ２３５α（１０Ｆ７ＭＮ）に対するｍＡｂの混合物を用いるネガティブ免疫選択によって、ＤＣが豊富な集団をＰＢＭＣから得た。その集団をヤギ抗マウスＩｇＧでコーティングされた磁気ビーズ（Ｍ−４５０；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ；ＣＡ）に通すことにより、結合した細胞を除去した。ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ（アロフィコシアニン（ＡＰＣ）で標識された抗ＣＤ１１ｃ（Ｂ−ｌｙ６）、ＦＩＴＣで標識されたｍＡｂのＣＤ１９（ＨＩＢ１９）とＣＤ５６（ＮＣＡＭ１６．２）との混合物、およびＡＰＣ−Ｃｙ７で標識されたＣＤ４（ＲＰＡ−Ｔ４）を用いる）によってＣＤ１１ｃ＋系列およびＣＤ４＋細胞を単離することにより、＞９９％の純度に達した。ＣＤ１１ｃ＋ＤＣを、２％ヒトＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｗｏｏｄｌａｎｄ，ＣＡ）を含むＹｓｓｅｌ培地中で培養した。細胞を、２×１０５細胞／２００ｍｌ培地の密度で平底９６ウェルプレートに、１５ｎｇ／ｍｌのＴＳＬＰ（Ｄｒ．Ｙｕｎ−Ｊｕｎ  Ｌｉｕ，Ｍ．Ｄ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒのご厚意により贈っていただいた組換えヒトＴＳＬＰ）の存在下において２４時間播種した。
【０２８５】
同種異系ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋ナイーブＴ細胞（純度＞９９％）を、ＣＤ４＋Ｔ細胞単離キットＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，ＣＡ）を用いて単離した後、細胞選別した（ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ２５−画分として）。その細胞を、丸底９６ウェル培養プレートにおいて７日間、ＴＳＬＰで刺激され洗浄されたミエロイド樹状細胞（ｍＤＣ）と共培養した（ＤＣ／Ｔ細胞比，１：５）。そのｍＤＣによる刺激の１サイクル（７日間）の後、プライミングされたＣＤ４＋Ｔ細胞を回収し、洗浄した。
【０２８６】
培養上清中のサイトカイン産生を検出するために、上記Ｔ細胞を１０６細胞／ｍｌの濃度で、プレートに結合された５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３および１μｇ／ｍｌの可溶性抗ＣＤ２８で再度、４８時間刺激した。ＩＬ−５、ＩＬ−１３およびＴＮＦ−αのレベルをＥＬＩＳＡで測定した。ＴＳＬＰ活性化ミエロイドＤＣでプライミングされたＴｈ２細胞における細胞増殖およびサイトカイン産生は、アイソタイプコントロール抗体と比べて、ヒト化バリアントＡ１０−Ｆの存在下において阻害された（表１５）。
【０２８７】
【表１５】
2010518873.tif 000016
細胞内サイトカイン産生のために、プライミングされたＣＤ４＋Ｔ細胞を、５０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ＋２μｇ／ｍｌのイオノマイシンで６時間刺激した。最後の２時間に、１０μｇ／ｍｌのブレフェルジンＡ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を加えた。その細胞を、Ｆｉｘａｔｉｏｎ緩衝液およびＰｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＣＡ）を用いて、ＩＬ−２およびＩＬ−１３に対するＰＥ標識ｍＡｂと、ＦＩＴＣ標識抗ＩＦＮ−γまたは抗ＴＮＦ−αとの組み合わせで染色した。ＴＳＬＰ活性化ミエロイドＤＣでプライミングされたＴｈ２細胞におけるＩＬ−２、ＩＬ−１３およびＴＮＦ−αサイトカイン産生は、アイソタイプコントロール抗体と比べて、ヒト化バリアントＡ１０−Ｆの存在下において阻害された（表１６）。
【０２８８】
【表１６】
2010518873.tif 000017
アネキシンで染色されたＣＤ４＋細胞の数の減少および細胞内でサバイビンタンパク質が発現しているＣＤ４＋細胞の数の増加によって示されるように、ＯＸ４０共刺激は、プライミングされたＴｈ２細胞の生存を増加させた。しかしながら、上記細胞培養物にヒト化バリアントＡ１０−Ｆを加えることによって、アポトーシスの有意な増加およびサバイビン発現の低下が誘導された（表１７）。
【０２８９】
【表１７−１】
2010518873.tif 000018
【０２９０】
【表１７−２】
2010518873.tif 000019
Ｄ．Ｔｈ１／ＬＰＳ−ＤＣプロトコル
Ｔｈ１プロファイルへのＴ細胞の極性化（ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）を解析するために、ナイーブＣＤ４Ｔ細胞を、ＬＰＳで刺激しておいた同種異系単球由来ＤＣとともに２４時間、共培養した。ＤＣは、当該分野で周知の標準的なプロトコルによってヒトＰＢＭＣから生成した。低密度ＰＢＭＣを回収し、ＣＤ１４−微小ビーズおよびＡｕｔｏＭａｃｓ装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を用いて、ＣＤ１４＋細胞をポジティブ選択した。ＤＣ分化を誘導するために、３７℃、５％ＣＯ２下、完全培地（ＲＰＭＩ−１０％ＦＢＳ）、５００ＩＵ／ｍｌヒトｒＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）および４００ＩＵ／ｍｌヒトｒＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）中で、１０６細胞／ｍｌのＣＤ１４＋単球を培養した。２または３日目に、ＤＣ培養物に、さらなる用量のＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を与えた。５日目に、静かにピペッティングすることによって非接着性ＤＣを回収し、１μｇ／ｍｌのＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）とともに再度培養した。ＬＰＳで活性化されたＤＣを回収し、洗浄し、そしてナイーブＣＤ４Ｔ細胞を、Ｔｈ−１極性化Ｔ細胞にプライミングするために用いた。その細胞を、１：４というＤＣ／Ｔ細胞の比で９６ウェルプレートにおいてインキュベートした。ヒト化バリアントのＡ１０−ＤおよびＡ１０−Ｆを、アンタゴニスト活性；ならびにＬＰＳで活性化されたＤＣの存在下においてＴｈ１でプライミングされたＴ細胞の増殖およびサイトカイン産生を阻害する能力について試験した。ヒト化バリアントのＡ１０−ＤおよびＦは、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αサイトカインの産生ならびに細胞増殖を、アイソタイプコントロールと比べて、キメラ（ＣＣ−Ａ１０）およびマウス（Ｍ−Ａ１０）バリアントｍＡｂと同じ程度にまで阻害した（図１１）。ＬＰＳで活性化されたＤＣは、ＯＸ４０以外の他の共刺激シグナルを提供することができるので、細胞増殖ならびにＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αサイトカイン産生の阻害は、完全ではなかった。
【０２９１】
Ｅ．交差反応性アッセイ
公開されている文献によれば、ヒトＯＸ４０タンパク質とマウスＯＸ４０タンパク質との間で共有される相同性は、低いと考えられている。これと一致して、キメラＡ１０およびＢ６６は、ＥＬＩＳＡプラットフォームにおいて、アイソタイプコントロール（ＩＣ：２Ｃ４）と比べてマウスＯＸ４０タンパク質に対していかなる交差反応性も示さなかった（表１８）。
【０２９２】
【表１８】
2010518873.tif 000020
ゆえに、フローサイトメトリー染色を用いることにより、抗ＯＸ４０ｍＡｂがサルＯＸ４０タンパク質と交差反応するか否かを判定するように設定した前臨床動物モデルにおいて、その抗ＯＸ４０ｍＡｂを試験した。ＣＤ４微小ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を用いて、全ＣＤ４＋Ｔ細胞をアカゲザルおよびカニクイザルの全血、ならびにヒトバフィーコートから単離した。その単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞を、５μｇ／ｍｌの事前にコーティングされた抗ＣＤ３ｍＡｂ（ＳＰ３４，ヒトおよびサル種のアカゲザルとカニクイザルの両方のＣＤ３タンパク質に交差反応することができるもの）および１μｇ／ｍｌの可溶性抗ＣＤ２８ｍＡｂ（ＣＤ２８．２，ヒトおよびサル種のアカゲザルとカニクイザルの両方のＣＤ２８タンパク質に交差反応することができるもの）を用いて２日間活性化させた。それらの細胞を、サルおよびヒトのＣＤ４（Ｌ２００）およびＣＤ２５（Ｍ−Ａ２５１）タンパク質に交差反応する抗体を用いる表面染色に供した。ＯＸ４０細胞表面発現に対して、ＰＥに結合体化されたヒト化Ａ１０−Ｆ  ＯＸ４０ｍＡｂを用いた。データ解析から、Ａ１０−Ｆが、ヒト、アカゲザルおよびカニクイザルの活性化ＣＤ４Ｔ細胞を容易に認識することが示された（表１９）。
【０２９３】
【表１９】
2010518873.tif 000021
実施例８：エピトープマッピング
エピトープマッピングに対する２つの標準的なアプローチである、酵母表面ディスプレイおよびキメラ分子の構築を用いて、Ａ１０（ＴＨ）ｈｕ３３６Ｆが結合するＯＸ４０エピトープをマッピングした。酵母表面ディスプレイでは、分泌されて酵母の表面上でディスプレイされることができるタンパク質融合物として、ＯＸ４０の細胞外ドメインをＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて発現させる。ＯＸ４０発現ベクターのランダム突然変異誘発により、ＯＸ４０変異タンパク質のライブラリーを酵母表面上で発現させる。ＯＸ４０に結合しないタンパク質を発現する変異体（Ｃ末端タグの存在によって判断される）を、蛍光性抗体を用いて染色し、ＦＡＣＳによって単離することができる。その変異体発現プラスミドを、レスキューされた酵母から単離し、そして配列決定することにより、どのアミノ酸残基がＡ１０（ＴＨ）ｈｕ３３６ＦとＯＸ４０との結合に必要であるかを決定する。
【０２９４】
２つ目のエピトープマッピングアプローチは、Ａ１０（ＴＨ）ｈｕ３３６Ｆが、ヒトＯＸ４０には結合するが、マウスＯＸ４０には結合しないという観察結果に依存している。マウスＯＸ４０の相同領域で置換されたヒトＯＸ４０の領域を有するキメラＯＸ４０分子を構築する。そのキメラ分子を、哺乳動物細胞の表面上で発現させ、蛍光標識されたＡ１０（ＴＨ）ｈｕ３３６Ｆへの結合をＦＡＣＳによってモニターする。ヒトＯＸ４０のどの領域がＡ１０（ＴＨ）ｈｕ３３６Ｆ結合に必要であるかを解析することによって、ＯＸ４０結合エピトープを決定する。
【０２９５】
当業者は、単なる通例の実験を用いることにより、本明細書中に記載した本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または確かめることができる。そのような等価物は、以下の請求項によって包含されると意図される。
【図４】
2010518873.tif 000022
【図７】
2010518873.tif 000023
【図８】
2010518873.tif 000024
【図９】
2010518873.tif 000025
【図１０】
2010518873.tif 000026
【図１１】
2010518873.tif 000027
【図１Ａ】
2010518873.tif 000028
【図１Ｂ】
2010518873.tif 000029
【図２】
2010518873.tif 000030
【図３】
2010518873.tif 000031
【図５】
2010518873.tif 000032
【図６】
2010518873.tif 000033
【図１２Ａ】
2010518873.tif 000034
【図１２Ｂ】
2010518873.tif 000035
【図１３】
2010518873.tif 000036
【図１４−１】
2010518873.tif 000037
【図１４−２】
2010518873.tif 000038
【図１５】
2010518873.tif 000039
【図１６Ａ】
2010518873.tif 000040
【図１６Ｂ】
2010518873.tif 000041
【図１７Ａ】
2010518873.tif 000042
【図１７Ｂ】
2010518873.tif 000043
【図１８】
2010518873.tif 000044
【図１９】
2010518873.tif 000045
【配列表】
2010518873000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年10月27日(2009.10.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
本発明は、本発明の組成物を備える医療デバイスを包含する。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
ヒトＯＸ４０エピトープに特異的に結合する、単離されたアンタゴニスト抗体であって、この抗体は：
ａ．
ｉ．配列番号１７のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１８のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２；および／または
ｉｉｉ．配列番号１９のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３；
を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／あるいは
ｂ．
ｉ．配列番号１２、１５または６１のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１３のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２；および／または
ｉｉｉ．（３）配列番号１４または１６のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む、抗体。
（項目２）
上記抗体が：
ａ．
ｉ．配列番号１７のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１８のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１９のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３；
を含む重鎖可変領域（ＶＨ）および／または
ｂ．
ｉ．配列番号１２のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１３のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．（３）配列番号１４のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む、項目１に記載の抗体。
（項目３）
上記抗体が：
ａ．
ｉ．配列番号１７のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１８のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１９のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３；
を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または
ｂ．
ｉ．配列番号１２のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１３のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１６のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む、項目１に記載の抗体。
（項目４）
上記抗体が：
ａ．
ｉ．配列番号１７のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１８のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．（３）配列番号１９のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３；
を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または
ｂ．
ｉ．配列番号１５のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１３のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．（３）配列番号１４のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む、項目１に記載の抗体。
（項目５）
上記抗体が：
ａ．
ｉ．配列番号１７のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１８のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１９のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３；
を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または
ｂ．
ｉ．配列番号１５のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１３のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２；および配列番号１６のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む、項目１に記載の抗体。
（項目６）
上記抗体が：
ａ．配列番号１０もしくは１１のいずれか１つに示されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＶＨ）、および／または
ｂ．配列番号７、８もしくは９のいずれか１つに示されているアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む、項目１に記載の抗体。
（項目７）
上記抗体が：
ａ．配列番号２５、２６もしくは２７の核酸配列のいずれか１つによってコードされる重鎖可変領域（ＶＨ）；および／または
ｂ．配列番号２０、２１、２２、２３もしくは２４の核酸配列のいずれか１つによってコードされる軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む、項目１に記載の抗体。
（項目８）
上記抗体が：
ａ．配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ、および配列番号７もしくは８のいずれか１つに示されているアミノ酸配列を有するＶＬ；または
ｂ．配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ、および配列番号９に示されているアミノ酸配列を有するＶＬ
を含む、項目６に記載の抗体。
（項目９）
上記抗体が：
ａ．配列番号２５の核酸配列によってコードされるＶＨ、および配列番号２０もしくは２１の核酸配列によってコードされるＶＬ；
ｂ．配列番号２６の核酸配列によってコードされるＶＨ、および配列番号２２、２３もしくは２４の核酸配列によってコードされるＶＬ；または
ｃ．配列番号２７の核酸配列によってコードされるＶＨ、および配列番号２２、２３もしくは２４の核酸配列によってコードされるＶＬ
を含む、項目７に記載の抗体。
（項目１０）
上記ＶＨが、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含み、上記ＶＬが、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含む、項目８に記載の抗体。
（項目１１）
上記ＶＨが、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含み、上記ＶＬが、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む、項目８に記載の抗体。
（項目１２）
上記ＶＨが、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含み、上記ＶＬが、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含む、項目８に記載の抗体。
（項目１３）
定常領域をさらに含む、項目１、２、３、４、５、６、７、８または９に記載の抗体。
（項目１４）
ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３ドメインを含む抗体定常領域をさらに含む、項目１３に記載の抗体。
（項目１５）
上記定常領域が、ＩｇＧ抗体由来である、項目１４に記載の抗体。
（項目１６）
上記ＩｇＧ抗体が、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体またはＩｇＧ４抗体である、項目１５に記載の抗体。
（項目１７）
上記抗体が、ヒト抗体である、項目１、２、３、４、５、６、７、８または９に記載の抗体。
（項目１８）
上記抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、モノクローナル抗体または組換え抗体である、項目１、２、３、４、５、６、７、８または９に記載の抗体。
（項目１９）
上記抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、一本鎖Ｆｖ、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ、単一ドメイン抗体、抗原結合フラグメント、ダイアボディ、トリアボディまたはミニボディである、項目１、２、３、４、５、６、７、８または９に記載の抗体。
（項目２０）
標識をさらに含む、項目１、２、３、４、５、６、７、８または９に記載の抗体。
（項目２１）
細胞毒または免疫毒素をさらに含む、項目１、２、３、４、５、６、７、８または９に記載の抗体。
（項目２２）
項目１に記載の抗体をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
（項目２３）
項目２２に記載の核酸分子を含むベクター。
（項目２４）
項目２３に記載のベクターを含む宿主細胞。
（項目２５）
項目１、２、３、４、５、６、７、８または９に記載の抗体と、生理的に許容可能なキャリア、希釈剤、賦形剤および安定剤のうちの少なくとも１つとを含む組成物。
（項目２６）
患者においてＯＸ−４０媒介性障害を処置する方法であって、この方法は、項目１、２、３、４、５、６、７、８または９のいずれか１項に記載の、有効量の抗体をこの患者に投与する工程を包含し、ここで、この抗体は、ＯＸ４０に対するＯＸ４０Ｌの結合を阻止し、そして／またはＯＸ４０に対するＯＸ４０Ｌの結合に関連する１つ以上の機能を阻害する、方法。
（項目２７）
上記ＯＸ４０媒介性障害が、炎症性疾患または自己免疫疾患である、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
上記疾患が、アレルギー、喘息、または自己免疫および炎症に関連する疾患、例えば、多発性硬化症、関節リウマチ、炎症性腸疾患、移植片対宿主病、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、自己免疫性神経障害、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、重症筋無力症、実験的リーシュマニア症、コラーゲン誘発関節炎、大腸炎（例えば、潰瘍性大腸炎）、接触過敏症反応、糖尿病、クローン病、バセドウ病、サルコイドーシス、悪性貧血、側頭動脈炎、抗リン脂質症候群、血管炎（例えば、ウェゲナー肉芽腫症）、ベーチェット病、疱疹状皮膚炎、尋常性天疱瘡、白斑、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性肝炎、橋本甲状腺炎、自己免疫性の卵巣炎および睾丸炎、副腎の自己免疫疾患、全身性エリテマトーデス、強皮症、皮膚筋炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、脊椎関節症（例えば、強直性脊椎炎）、ライター症候群、またはシェーグレン症候群である、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
上記疾患が、アレルギー、喘息、または自己免疫および炎症に関連する疾患、例えば、多発性硬化症、関節リウマチ、炎症性腸疾患、移植片対宿主病、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、実験的リーシュマニア症、コラーゲン誘発関節炎、大腸炎（例えば、潰瘍性大腸炎）、接触過敏症反応、糖尿病、クローン病またはバセドウ病である、項目２７に記載の方法。
（項目３０）
上記抗体が、静脈内、腹腔内、吸入、筋肉内、皮下および経口経路を含む経路のうちの１つ以上を介して上記患者に投与される、項目２６に記載の方法。
（項目３１）
患者においてＩｇＥ抗体産生を阻害することによって障害を処置するための方法であって、項目１、２、３、４、５、６、７、８または９のいずれか１項に記載の、有効量の抗体をこの患者に投与する工程を包含する、方法。
（項目３２）
上記障害が、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性皮膚炎、アナフィラキシー、じんま疹またはアトピー性皮膚炎である、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
哺乳動物において喘息の重症度を低下させるための方法であって、この方法は、項目１、２、３、４、５、６、７、８または９のいずれか１項に記載の、有効量の抗体をこの哺乳動物に投与する工程を包含し、ここで、この抗体は、以下の特性：（ａ）ヒトＯＸ４０に、約１×１０−１０乃至約１×１０−１２ＭのＫＤで結合する；（ｂ）ＯＸ４０への結合に関連する１つ以上の機能を阻害する；および（ｃ）ＯＸ４０に対するＯＸ４０Ｌの結合を阻害する、のうちの少なくとも１つを備えている、方法。
（項目３４）
上記抗体が、約１×１０−１２乃至約１×１０−１１Ｍ、約１×１０−１１乃至約１×１０−１０Ｍ、約１×１０−１０乃至約１×１０−９Ｍ、約１×１０−９乃至約１×１０−８Ｍ、または約１×１０−８乃至約１×１０−７ＭのＫＯでヒトＯＸ４０に結合する、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
項目２４に記載の細胞を、抗体の産生に適した条件下で培養する工程およびこの抗体を単離する工程を包含する、抗体の生成方法。
（項目３６）
項目１、２、３、４、５、６、７、８または９に記載されたような抗体を産生する、ハイブリドーマ。
（項目３７）
医薬の調製における、項目１、２、３、４、５、６、７、８または９のいずれか１項に記載の抗体の使用。
（項目３８）
ＯＸ４０に関連する疾患または障害を処置するための、項目１、２、３、４、５、６、７、８または９のいずれか１項に記載の抗体の使用。
（項目３９）
上記疾患が、アレルギー、喘息、または自己免疫および炎症に関連する疾患、例えば、多発性硬化症、関節リウマチ、炎症性腸疾患、移植片対宿主病、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、自己免疫性神経障害、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、重症筋無力症、実験的リーシュマニア症、コラーゲン誘発関節炎、大腸炎（例えば、潰瘍性大腸炎）、接触過敏症反応、糖尿病、クローン病、バセドウ病、サルコイドーシス、悪性貧血、側頭動脈炎、抗リン脂質症候群、血管炎（例えば、ウェゲナー肉芽腫症）、ベーチェット病、疱疹状皮膚炎、尋常性天疱瘡、白斑、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性肝炎、橋本甲状腺炎、自己免疫性の卵巣炎および睾丸炎、副腎の自己免疫疾患、全身性エリテマトーデス、強皮症、皮膚筋炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、脊椎関節症（例えば、強直性脊椎炎）、ライター症候群またはシェーグレン症候群である、項目３８に記載の使用。
（項目４０）
上記疾患が、アレルギー、喘息、または自己免疫および炎症に関連する疾患、例えば、多発性硬化症、関節リウマチ、炎症性腸疾患、移植片対宿主病、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、実験的リーシュマニア症、コラーゲン誘発関節炎、大腸炎（例えば、潰瘍性大腸炎）、接触過敏症反応、糖尿病またはクローン病である、項目３９に記載の使用。
（項目４１）
ＯＸ４０を検出するための、項目１、２、３、４、５、６、７、８または９に記載の抗体の使用。
（項目４２）
サンプル中のＯＸ４０を検出するための方法であって、このサンプルと、項目２０に記載の抗体とを接触させる工程を包含する、方法。
（項目４３）
容器に入った所定量の項目１、２、３、４、５、６、７、８または９に記載の抗体、および別個の容器に入った緩衝液を備えた、キット。
（項目４４）
容器に入った所定量の項目２５に記載の組成物、および別個の容器に入った緩衝液を備えた、キット。
（項目４５）
項目１、２、３、４、５、６、７、８または９に記載の抗体を備えた、医療デバイス。
（項目４６）
吸入デバイスである、項目４５に記載の医療デバイス。
（項目４７）
項目２５に記載の組成物を備えた、医療デバイス。
（項目４８）
吸入デバイスである、項目４７に記載の医療デバイス。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＯＸ４０エピトープに特異的に結合する、単離されたアンタゴニスト抗体であって、該抗体は：
ａ．
ｉ．配列番号１７のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１８のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２；および／または
ｉｉｉ．配列番号１９のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３；
を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／あるいは
ｂ．
ｉ．配列番号１２、１５または６１のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１３のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２；および／または
ｉｉｉ．（３）配列番号１４または１６のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む、抗体。
【請求項２】
前記抗体が：
ａ．
ｉ．配列番号１７のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１８のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１９のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３；
を含む重鎖可変領域（ＶＨ）および／または
ｂ．
ｉ．配列番号１２のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１３のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．（３）配列番号１４のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記抗体が：
ａ．
ｉ．配列番号１７のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１８のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１９のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３；
を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または
ｂ．
ｉ．配列番号１２のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１３のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１６のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体が：
ａ．
ｉ．配列番号１７のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１８のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．（３）配列番号１９のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３；
を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または
ｂ．
ｉ．配列番号１５のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１３のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．（３）配列番号１４のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体が：
ａ．
ｉ．配列番号１７のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１８のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１９のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３；
を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または
ｂ．
ｉ．配列番号１５のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１３のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２；および配列番号１６のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体が：
ａ．配列番号１０もしくは１１のいずれか１つに示されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＶＨ）、および／または
ｂ．配列番号７、８もしくは９のいずれか１つに示されているアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体が：
ａ．配列番号２５、２６もしくは２７の核酸配列のいずれか１つによってコードされる重鎖可変領域（ＶＨ）；および／または
ｂ．配列番号２０、２１、２２、２３もしくは２４の核酸配列のいずれか１つによってコードされる軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項８】
前記抗体が：
ａ．配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ、および配列番号７もしくは８のいずれか１つに示されているアミノ酸配列を有するＶＬ；または
ｂ．配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ、および配列番号９に示されているアミノ酸配列を有するＶＬ
を含む、請求項６に記載の抗体。
【請求項９】
前記抗体が：
ａ．配列番号２５の核酸配列によってコードされるＶＨ、および配列番号２０もしくは２１の核酸配列によってコードされるＶＬ；
ｂ．配列番号２６の核酸配列によってコードされるＶＨ、および配列番号２２、２３もしくは２４の核酸配列によってコードされるＶＬ；または
ｃ．配列番号２７の核酸配列によってコードされるＶＨ、および配列番号２２、２３もしくは２４の核酸配列によってコードされるＶＬ
を含む、請求項７に記載の抗体。
【請求項１０】
前記ＶＨが、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の抗体。
【請求項１１】
前記ＶＨが、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の抗体。
【請求項１２】
前記ＶＨが、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の抗体。
【請求項１３】
定常領域をさらに含む、請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９に記載の抗体。
【請求項１４】
ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３ドメインを含む抗体定常領域をさらに含む、請求項１３に記載の抗体。
【請求項１５】
前記定常領域が、ＩｇＧ抗体由来である、請求項１４に記載の抗体。
【請求項１６】
前記ＩｇＧ抗体が、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体またはＩｇＧ４抗体である、請求項１５に記載の抗体。
【請求項１７】
前記抗体が、ヒト抗体である、請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９に記載の抗体。
【請求項１８】
前記抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、モノクローナル抗体または組換え抗体である、請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９に記載の抗体。
【請求項１９】
前記抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、一本鎖Ｆｖ、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ、単一ドメイン抗体、抗原結合フラグメント、ダイアボディ、トリアボディまたはミニボディである、請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９に記載の抗体。
【請求項２０】
標識をさらに含む、請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９に記載の抗体。
【請求項２１】
細胞毒または免疫毒素をさらに含む、請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９に記載の抗体。
【請求項２２】
請求項１に記載の抗体をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項２３】
請求項２２に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項２４】
請求項２３に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２５】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９に記載の抗体と、生理的に許容可能なキャリア、希釈剤、賦形剤および安定剤のうちの少なくとも１つとを含む組成物。
【請求項２６】
患者においてＯＸ−４０媒介性障害を処置するための組成物であって、該組成物は、請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９のいずれか１項に記載の、有効量の抗体を含み、ここで、該抗体は、ＯＸ４０に対するＯＸ４０Ｌの結合を阻止し、そして／またはＯＸ４０に対するＯＸ４０Ｌの結合に関連する１つ以上の機能を阻害する、組成物。
【請求項２７】
前記ＯＸ４０媒介性障害が、炎症性疾患または自己免疫疾患である、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記疾患が、アレルギー、喘息、または自己免疫および炎症に関連する疾患、例えば、多発性硬化症、関節リウマチ、炎症性腸疾患、移植片対宿主病、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、自己免疫性神経障害、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、重症筋無力症、実験的リーシュマニア症、コラーゲン誘発関節炎、大腸炎（例えば、潰瘍性大腸炎）、接触過敏症反応、糖尿病、クローン病、バセドウ病、サルコイドーシス、悪性貧血、側頭動脈炎、抗リン脂質症候群、血管炎（例えば、ウェゲナー肉芽腫症）、ベーチェット病、疱疹状皮膚炎、尋常性天疱瘡、白斑、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性肝炎、橋本甲状腺炎、自己免疫性の卵巣炎および睾丸炎、副腎の自己免疫疾患、全身性エリテマトーデス、強皮症、皮膚筋炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、脊椎関節症（例えば、強直性脊椎炎）、ライター症候群、またはシェーグレン症候群である、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記疾患が、アレルギー、喘息、または自己免疫および炎症に関連する疾患、例えば、多発性硬化症、関節リウマチ、炎症性腸疾患、移植片対宿主病、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、実験的リーシュマニア症、コラーゲン誘発関節炎、大腸炎（例えば、潰瘍性大腸炎）、接触過敏症反応、糖尿病、クローン病またはバセドウ病である、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３０】
前記抗体が、静脈内、腹腔内、吸入、筋肉内、皮下および経口経路を含む経路のうちの１つ以上を介して前記患者に投与されることを特徴とする、請求項２６に記載の組成物。
【請求項３１】
患者においてＩｇＥ抗体産生を阻害することによって障害を処置するための組成物であって、請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９のいずれか１項に記載の、有効量の抗体を含む、組成物。
【請求項３２】
前記障害が、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性皮膚炎、アナフィラキシー、じんま疹またはアトピー性皮膚炎である、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
哺乳動物において喘息の重症度を低下させるための組成物であって、該組成物は、請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９のいずれか１項に記載の、有効量の抗体を含み、ここで、該抗体は、以下の特性：（ａ）ヒトＯＸ４０に、約１×１０−１０乃至約１×１０−１２ＭのＫＤで結合する；（ｂ）ＯＸ４０への結合に関連する１つ以上の機能を阻害する；および（ｃ）ＯＸ４０に対するＯＸ４０Ｌの結合を阻害する、のうちの少なくとも１つを備えている、組成物。
【請求項３４】
前記抗体が、約１×１０−１２乃至約１×１０−１１Ｍ、約１×１０−１１乃至約１×１０−１０Ｍ、約１×１０−１０乃至約１×１０−９Ｍ、約１×１０−９乃至約１×１０−８Ｍ、または約１×１０−８乃至約１×１０−７ＭのＫＯでヒトＯＸ４０に結合する、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
請求項２４に記載の細胞を、抗体の産生に適した条件下で培養する工程および該抗体を単離する工程を包含する、抗体の生成方法。
【請求項３６】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９に記載されたような抗体を産生する、ハイブリドーマ。
【請求項３７】
医薬の調製における、請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９のいずれか１項に記載の抗体の使用。
【請求項３８】
ＯＸ４０に関連する疾患または障害を処置するための医薬を調製することにおける、請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９のいずれか１項に記載の抗体の使用。
【請求項３９】
前記疾患が、アレルギー、喘息、または自己免疫および炎症に関連する疾患、例えば、多発性硬化症、関節リウマチ、炎症性腸疾患、移植片対宿主病、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、自己免疫性神経障害、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、重症筋無力症、実験的リーシュマニア症、コラーゲン誘発関節炎、大腸炎（例えば、潰瘍性大腸炎）、接触過敏症反応、糖尿病、クローン病、バセドウ病、サルコイドーシス、悪性貧血、側頭動脈炎、抗リン脂質症候群、血管炎（例えば、ウェゲナー肉芽腫症）、ベーチェット病、疱疹状皮膚炎、尋常性天疱瘡、白斑、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性肝炎、橋本甲状腺炎、自己免疫性の卵巣炎および睾丸炎、副腎の自己免疫疾患、全身性エリテマトーデス、強皮症、皮膚筋炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、脊椎関節症（例えば、強直性脊椎炎）、ライター症候群またはシェーグレン症候群である、請求項３８に記載の使用。
【請求項４０】
前記疾患が、アレルギー、喘息、または自己免疫および炎症に関連する疾患、例えば、多発性硬化症、関節リウマチ、炎症性腸疾患、移植片対宿主病、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、実験的リーシュマニア症、コラーゲン誘発関節炎、大腸炎（例えば、潰瘍性大腸炎）、接触過敏症反応、糖尿病またはクローン病である、請求項３９に記載の使用。
【請求項４１】
ＯＸ４０を検出するための、請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９に記載の抗体の使用。
【請求項４２】
サンプル中のＯＸ４０を検出するための方法であって、該サンプルと、請求項２０に記載の抗体とを接触させる工程を包含する、方法。
【請求項４３】
容器に入った所定量の請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９に記載の抗体、および別個の容器に入った緩衝液を備えた、キット。
【請求項４４】
容器に入った所定量の請求項２５に記載の組成物、および別個の容器に入った緩衝液を備えた、キット。
【請求項４５】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９に記載の抗体を備えた、医療デバイス。
【請求項４６】
吸入デバイスである、請求項４５に記載の医療デバイス。
【請求項４７】
請求項２５に記載の組成物を備えた、医療デバイス。
【請求項４８】
吸入デバイスである、請求項４７に記載の医療デバイス。
【国際調査報告】
2010518873.tif 000046
2010518873.tif 000047
2010518873.tif 000048
2010518873.tif 000049