(57)【要約】本発明は、哺乳動物においてポリペプチドの吸収および保持を増加させるのに有用である方法および組成物に関する。本発明は、肝臓取り込みが増加し、かつ血漿半減期が延長した脂質結合インターフェロンを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
パルミトイルシステインと可逆的に結合しているインターフェロン-αを含む、ポリペプチド。
【請求項２】
インターフェロン-αがヒトインターフェロン-αである、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項３】
インターフェロン-αが、1つまたは複数のシステイン残基を介して結合している、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項４】
インターフェロン-αが、少なくとも2分子のパルミトイルシステインと結合している、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項５】
インターフェロン-αが、4分子のパルミトイルシステインと結合している、請求項4記載のポリペプチド。
【請求項６】
請求項1記載のポリペプチドを含む、薬学的組成物。
【請求項７】
請求項1記載のポリペプチドを対象に投与する段階を含む、対象における肝疾患を治療する方法。
【請求項８】
肝疾患がウイルス性肝炎である、請求項7記載の方法。
【請求項９】
ポリペプチドをパルミトイルシステインと可逆的に結合させる段階を含む、対象への投与に際してインターフェロン-αの肝臓取り込みを増加させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は一般に、生物学および医学の分野に関する。本発明は、哺乳動物においてポリペプチドの吸収および保持を増加させるのに有用である方法および組成物に関する。より詳細には、本発明は、肝臓取り込みが増加し、かつ血漿半減期が延長した脂質結合インターフェロンに関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
インターフェロン-α(IFN-α)は、現在世界中で約8億人の人々が罹患している慢性ウイルス性肝炎に対する最も有効な抗ウイルス薬であると考えられている(Hoofnagle et al., N. Engl. J. Med. 336:347 (1997)（非特許文献1）)。しかし、半減期が短く、かつ肝臓特異的親和性が欠如しているために、IFN-α応答は制約を受ける。応答の持続は、慢性B型肝炎患者の3分の1および慢性C型肝炎患者の5分の1でしか得られない(Davis et al., N. Engl. J. Med. 321:1501 (1989)（非特許文献2）；Poynard et al., Hepatology 24:778 (1996)（非特許文献3）)。
【０００３】
IFN-αを修飾するには、ペグ化が最も一般的に用いられる。ペグ化IFN-α、例えばPEG-INTRONは、このようにしてその半減期が延長するように開発された。それにもかかわらず、ペグ化により不均一な種が生じる(Wang et al., Adv. Drug Delivery Rev. 54:547 (2002)（非特許文献4）)。PEG-INTRONに関しては、非選択的な炭酸スクシンイミジル化学が用いられ、結果としてペグ化型の混合物が生じた：平均分子量12,000ダルトンを有するポリエチレングリコール(PEG)が、共有結合によりIFN-αの少なくとも14個のアミノ酸残基のアミン基に付加される(Wang et al., Biochemistry 39:10634 (2000)（非特許文献5）)。ペグ化IFNでは、PEGの分子量の増加に伴って血清半減期が延長したが、インビトロ効力は75%を超えて顕著に低下した。親水性およびかさ高さが大きくなるのに応じて、肝臓に対するIFN-αの親和性が低下する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Hoofnagle et al., N. Engl. J. Med. 336:347 (1997)
【非特許文献２】Davis et al., N. Engl. J. Med. 321:1501 (1989)
【非特許文献３】Poynard et al., Hepatology 24:778 (1996)
【非特許文献４】Wang et al., Adv. Drug Delivery Rev. 54:547 (2002)
【非特許文献５】Wang et al., Biochemistry 39:10634 (2000)
【発明の概要】
【０００５】
発明の簡単な概要
本発明は、例えば治療ポリペプチドといった脂質結合ポリペプチドに関する。修飾ポリペプチドは血漿半減期の延長および肝臓取り込みの増加を示し、そのためポリペプチドの治療可能性が向上する。
【０００６】
本発明の1つの態様は、ポリペプチドを脂質と結合させる段階を含む、対象への投与に際してポリペプチドの肝臓取り込みを増加させる方法に関する。
【０００７】
本発明の別の態様は、ポリペプチドを脂質と結合させる段階を含む、対象への投与に際してポリペプチドの血漿半減期を延長させる方法に関する。
【０００８】
本発明はさらに、脂質結合治療ポリペプチドを対象に投与する段階を含む、対象における肝疾患を治療する方法に関する。
【０００９】
さらなる態様において、本発明は、ポリペプチドが治療ポリペプチドである、脂質結合ポリペプチドに関する。
【００１０】
さらなる態様において、本発明は、脂質結合ポリペプチドを含む薬学的組成物に関する。
【００１１】
1つの態様において、タンパク質は、例えば肝炎といった肝疾患に対して治療的である。1つの態様において、ポリペプチドはインターフェロン、例えばインターフェロン-αである。さらなる態様において、脂質はパルミトイルシステインである。
【００１２】
1つの態様においては、脂質を、可逆的結合により、例えばポリペプチド内のジスルフィド結合の修飾により、ポリペプチドに結合させる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
本発明は、添付の図面を参照することで、よりよく理解されると考えられる。
【図１】図1A〜1Cは、パルミトイルシステインが、Cys 1、Cys 29、およびCys 138(SEQ ID NO:1〜3)の位置でのジスルフィド結合によりIFNに結合していることを示すLC-MSスペクトルのグラフである。
【図２】CF-1マウスに静脈内投与した際の、PAL-IFNおよびIFNの血漿濃度 対 時間プロファイルを示すグラフである。
【図３】図3Aおよび3Bはそれぞれ、CF-1マウスへのiv注射後15分、60分、および240分の時点での、PAL-IFN、IFN、およびPEG-INTRONの血漿レベルおよび肝臓保持を示すグラフおよび棒グラフである。
【図４】図4Aおよび4Bはそれぞれ、Sg-PC2細胞株および初代培養マウス肝細胞におけるPAL-IFN、IFN、およびPEG-INTRONの取り込みを示すグラフおよび棒グラフである。
【図５】マウスにPAL-IFNまたはIFNを静脈内注射した後の血清中のIFN活性の回収（recovery）を示す棒グラフである。
【図６】図6Aおよび6Bはそれぞれ、マウスにPAL-IFNまたはIFNを静脈内注射した際の肝臓におけるOAS1の発現を示すウェスタンブロッティング写真および棒グラフである。
【図７】PAL-IFNおよびIFNの類似の構造を示す円二色性プロットである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
発明の詳細な説明
本発明は、血漿半減期が延長し、かつ肝臓取り込みが増加した脂質結合ポリペプチド、および例えば肝疾患といった疾患を治療するための修飾ポリペプチドの使用に関する。
【００１５】
本発明は、任意のポリペプチド、例えば治療ポリペプチドを用いて実行することができる。本発明の目的のためには、「ポリペプチド」という用語は、3個またはそれ以上のアミノ酸を含むアミノ酸鎖を指す。ポリペプチドは天然供給源から単離してもよいし、組換えDNA技術または固体合成など、当技術分野で周知の手段によって調製してもよい。本発明に従って使用するポリペプチドは、天然のL-アミノ酸のみ、L-アミノ酸と他のアミノ酸(D-アミノ酸および修飾アミノ酸を含む)との組み合わせ、またはL-アミノ酸以外のアミノ酸のみを含み得ることが意図される。本発明の1つの態様において、脂質複合体は、ポリペプチド上の少なくとも1つの反応性チオール基を介して形成される。多くの場合、ポリペプチドはシステイン残基(チオール基を含むアミノ酸)を含む。チオール基を含まないポリペプチドは、当業者に周知である手順によって修飾することができる；特に、この目的には、周知のチオール化剤(例えば、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオン酸(SPDP)および2-イミノチオラン(トラウト(Traut)試薬))が日常的に使用され得る。
【００１６】
治療ポリペプチドの例には、これらに限定されないが、免疫グロブリン、エリスロポエチン、インターフェロン(インターフェロン-α、インターフェロン-β、インターフェロン-γなど)、α-1プロテイナーゼ阻害剤、アンジオゲニン、アンチトロンビンIII、β酸デカルボキシラーゼ、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、ブタ成長ホルモン、ヒト血清アルブミン、仔ウシ腸アルカリホスファターゼ、嚢胞性線維症膜貫通調節因子、第VIII因子、第IX因子、第X因子、インスリン、ラクトフェリン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ミエリン塩基性タンパク質、インスリン、プロインスリン、プロラクチン、B型肝炎抗原、免疫グロブリン断片(例えば、FAB)、モノクローナル抗体CTLA4 Ig、Tag 72モノクローナル抗体、Tag 72一本鎖抗原結合タンパク質、プロテインC、サイトカインおよびその受容体(例えば、腫瘍壊死因子αおよびβ、それらの受容体ならびにそれらの誘導体を含む)；レニン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；α-1-アンチトリプシン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；フォンウィルブラント因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺サーファクタント；ウロキナーゼ；ボンベシン；トロンビン；造血系増殖因子；エンケファリナーゼ；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質(MIP-1-α)；血清アルブミン、例えばミュラー管抑制因子など；リラキシンA鎖；リラキシンB鎖；プロリラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；β-ラクタマーゼ、DNアーゼ；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子(VEGF)；ホルモンまたは増殖因子の受容体；インテグリン；プロテインAまたはD；リウマトイド因子；神経栄養因子、例えば、骨由来神経栄養因子(BDNF)、ニューロトロフィン-3、-4、-5、もしくは-6(NT-3、NT-4、NT-5、またはNT-6)、またはNGF-βなどの神経成長因子など；血小板由来増殖因子(PDGF)；線維芽細胞増殖因子、例えばaFGFおよびbFGFなど；上皮増殖因子(EGF)；トランスフォーミング増殖因子(TGF)、例えばTGF-αおよびTGF-β(TGF-1、TGF-2、TGF-3、TGF-4、またはTGF-5を含む)など；インスリン様増殖因子-Iおよび-II(IGF-IおよびIGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脳IGF-I)、インスリン様増殖因子結合タンパク質；CDタンパク質、例えばCD-3、CD-4、CD-8、およびCD-19など；骨誘導因子；免疫毒素；骨形成タンパク質(BMP)；コロニー刺激因子(CSF)、例えばM-CSF、GM-CSF、およびG-CSF；インターロイキン(IL)、例えばIL-1〜IL-12；スーパーオキシドジスムターゼ；T細胞受容体；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；ウイルス抗原、例えばAIDSエンベロープの一部など；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；抗体；キメラタンパク質、例えばイムノアドヘシンなど、ならびに上記ポリペプチドのいずれかの断片または融合物が含まれる。これらのタンパク質の核酸およびタンパク質配列は、GenBankなどの公的データベースで入手可能である。
【００１７】
1つの態様において、治療ポリペプチドは肝疾患に対して治療的であり、したがって複合化ポリペプチドの肝臓取り込みの向上を利用する。肝疾患の例には、非限定的に、肝炎(例えば、ウイルス性肝炎)、肝硬変、肝癌、脂肪症、およびアルコール性肝疾患が含まれる。肝疾患に対して治療的であるポリペプチドには、これに限定されないが、インターフェロン-α、インターフェロン-β、またはインターフェロン-γなどのインターフェロンが含まれる。
【００１８】
本発明の目的のために、「脂質」という用語は、脂質基それ自体または脂質基を含む炭化水素ベースの基(特に、1つまたは複数のアミノ酸)のいずれかを指す。「脂質基」という用語は、4〜26個の炭素原子、好ましくは5〜19個の炭素原子からなる疎水性置換基を意味する。適切な脂質基には、これらに限定されないが以下のものが含まれる：パルミチル(C15H31)；オレイル(C15H29)；ステアリル(C17H35)；コール酸；およびデオキシコール酸。
【００１９】
脂質は、当技術分野で公知の任意の結合手段により、ポリペプチドに結合させることができる。(例えば、米国特許第5,907,030号；第6,590,071号を参照されたい)。本発明の1つの態様においては、脂質を可逆的結合を介してポリペプチドに結合させる。可逆的結合の機構には、非限定的に、ジスルフィド結合の還元、加水分解、および光分解結合開裂が含まれる。(例えば、米国特許第5,505,931号およびその中で引用されている参考文献を参照されたい)。公開されたWO 96/22773およびWO 98/13007は、スルフヒドリル含有ペプチドおよびタンパク質の経細胞送達および放出を開示している。スルフヒドリル含有ポリペプチドの細胞吸収は、ジスルフィド結合を介した脂質との結合によって増加させることができる。不安定なジスルフィド結合は容易に還元されて、一旦体内に入ると、脂質からポリペプチドが放出される機構が提供される。特定の細胞を標的化するためのモノクローナル抗体または他の基質を組み込みながらポリペプチドを有機酸と結合させる、加水分解ベースの送達系も公知である。(例えば、米国特許第4,764,368号、第4,618,492号、第5,505,931号、および第5,563,250号を参照されたい)。標的細胞に特異的に結合した後、これらの複合体は細胞内にポリペプチドを送達するが、この場合加水分解によって細胞内に遊離ポリペプチドが放出される。
【００２０】
本発明の1つの態様において、脂質結合ポリペプチドはインターフェロン-αである。さらなる態様では、インターフェロン-αをパルミトイルシステイン、例えば少なくとも2分子、例えば3分子または4分子のパルミトイルシステインと結合させる。1つの態様では、例えばインターフェロン-αの1つまたは複数のシステイン残基とパルミトイルシステインのシステイン部分との間のジスルフィド結合の形成により、インターフェロン-αをパルミトイルシステインと可逆的に結合させる。
【００２１】
本発明はさらに、本発明の脂質結合ポリペプチドを対象に投与することにより、対象における疾患または状態を治療する方法に関する。「治療する」という用語は、疾患または状態の予防、改善、または治癒を含み得る目的のために、脂質結合ポリペプチドを対象に投与することを指す。ポリペプチドの送達により疾患または状態を治療するための当技術分野で公知の任意の技法を用いて、修飾ポリペプチドを対象に投与することができる。1つの態様において、脂質結合ポリペプチドは薬学的組成物の一部として存在するか、または薬学的組成物の一部として投与する。
【００２２】
本発明による投与用の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体と任意で組み合わせた、薬学的に許容される形態の、本発明による少なくとも1つの脂質結合ポリペプチドを含み得る。これらの組成物は、それらの意図される目的を達成する任意の手段によって投与することができる。例えば、投与は、経口、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮、髄腔内、頭蓋内、または鼻腔内経路によるものであってよい。投与する投与量は、レシピエントの年齢、健康状態、および体重、もしあれば同時の治療の種類、治療頻度、および所望する効果の性質に依存する。本発明による投与のための量および計画は、臨床治療の当業者によって容易に決定され得る。
【００２３】
投与形態には、乳剤、ナノ粒子(例えば、固体脂質ナノ粒子)、リポソーム、マイクロスフェア、マイクロカプセル、エアロゾル、吸入、および経皮剤形が含まれ得る。
【００２４】
非経口投与に適した製剤には、水溶性形態の化合物の水溶液が含まれる。加えて、適切に油性の注射懸濁液として、化合物の懸濁液を投与することもできる。適切な親油性溶媒または媒体としては、脂肪油(例えば、ゴマ油)または合成脂肪酸エステル(例えば、オレイン酸エチルまたはトリグリセリド)が挙げられる。水性注射懸濁液は、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および/またはデキストランをはじめとする、懸濁液の粘性を高める物質を含み得る。任意で、水溶液および/または懸濁液は、安定剤、および/またはホウ酸緩衝液等の緩衝液も含み得る。
【００２５】
本発明の薬学的調製物は、例えば、慣例的な混合工程、顆粒化工程、糖衣錠作製工程、溶解工程、または凍結乾燥工程の手段によるなど、それ自体公知の様式で製造する。したがって、経口使用するための薬学的調製物は、活性化合物を固体賦形剤と混合し、得られた混合物を任意で粉砕し、錠剤または糖衣錠コアを得るために、所望によりまたは必要に応じて適切な補助剤を添加した後に、顆粒の混合物を加工することによって得ることができる。
【００２６】
適切な賦形剤は、例えば、増量剤、例えば糖類、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールなど；セルロース調製物および/またはリン酸カルシウム、例えばリン酸三カルシウムまたはリン酸水素カルシウムなど；ならびに結合剤、例えば、例えばトウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプンを用いたデンプンのり、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および/またはポリビニルピロリドンなどである。必要に応じて、上記のデンプン、およびまたカルボキシメチルデンプン、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはアルギン酸ナトリウムのようなその塩などの崩壊剤を添加することができる。補助剤は、とりわけ、流動調節剤および潤滑剤、例えばシリカ、タルク、ステアリン酸もしくはその塩(ステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸カルシウムなど)、および/またはポリエチレングリコールである。必要に応じて胃液抵抗性の適切なコーティング剤を用いて、糖衣錠コアが提供される。この目的のために、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、および/または二酸化チタン、ラッカー溶液、ならびに適切な有機溶媒または溶媒混合物を任意で含み得る濃縮糖類溶液を使用することができる。胃液抵抗性のコーティング剤を生成するためには、フタル酸アセチルセルロースまたはフタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどの適切なセルロース調製物の溶液を使用する。コーティング剤は、酸性環境への早期曝露から本発明の脂質結合ポリペプチドを保護するために提供してもよい。胃酸から保護されるコアを有する投与単位を調製する方法に関しては、米国特許第4,786,505号および第4,853,230号を参照されたい。好ましくは、コアは中性または塩基性である。
【００２７】
塩基性コアは、米国特許第4,786,505号および第4,853,230号に記載される化合物のような1つまたは複数のアルカリ反応化合物を含む。例えば、活性化合物の用量の組み合わせを特徴づけるための同定用に、染料または色素を錠剤または糖衣錠コーティング剤に添加することができる。
【００２８】
使用できる他の薬学的調製物には、これらに限定されないが、ゼラチン製の経口押し込み型カプセル、直腸坐剤、経口および/または経鼻投与用の吸入製剤、薬学的に許容される担体、浸透促進剤、賦形剤、および/または増量剤と任意に組み合わせた経鼻または直腸のクリームまたは軟膏が含まれ得る。使用に適した浸透促進剤としては、陽イオン性、陰イオン性、両性、および中性の浸透促進剤、例えば塩化ベンザルコニウム、クロルブタノール、AZONE、および当技術分野で公知のその他のものなどが挙げられる。
【００２９】
以下の実施例は、本発明の方法を説明するものであって、限定するものではない。医学的治療および薬学で一般的に直面し、かつ当業者に明らかな種々の条件およびパラメータの他の適切な改変および適合化は、本発明の精神および範囲の範囲内である。
【００３０】
実施例1
パルミトイル化ヒトインターフェロンα(PAL-IFN)の合成
パルミトイルシステインをジスルフィド結合によってIFN-αのシステイン残基に特異的に結合させることにより、ヒトIFN-αを可逆的に脂質化した。この合成戦略を通して、均一な単一種の複合体、PAL-IFNが生成された。より重要なことには、PAL-IFNにおけるジスルフィドリンカーにより、体内のおそらくは肝臓内での還元に際して、非修飾IFN-αの放出が確実になる(Shen et al., Peptide and Protein Drug Delivery, S. Frokjer, L. Christrup, P. Krogsgaard-Larsen, Eds. (Munksgaard, Copenhagen, 1998) pp. 397-408)。結果として、放出されたIFN-αは長期にわたって肝臓内で局所的に循環し、それによってウイルス性肝炎の治療可能性が高まる。PAL-IFN、ならびにペグ化IFN-α、および非修飾IFN-αの間で薬物動態、体内分布、およびインビボ生物活性を比較したところ、送達および肝臓標的化特性が改善された新規修飾IFNとして、PAL-IFNの可能性が判明した。
【００３１】
ヒトインターフェロン-α(hIFN-α)は、BioVision(カリフォルニア州、マウンテンビュー)から入手した。以下の記載および図面では、IFNはhIFN-αのみを表す。50マイクログラム(μg) IFNを、0.5% Chapsを含むPBS 200μLに溶解した。IFNのジスルフィド結合を還元するため、新たに調製したジチオスレイトール(DTT)(8μL、1 mg/ml)を溶液に添加した。37℃で1時間インキュベートした後、N-パルミトイルシステイニル2-ピリジルジスルフィド(Pal-CPD) 24μLを反応混合物に添加し、室温でさらに1時間インキュベーションを継続した。
【００３２】
HPLC解析を用いて、全反応をモニターした。HPLCは、250×4.6 mm Phenomenex Jupiter C4カラム(カリフォルニア州、トランス)を使用して、Hewlett-Packard 1050 HPLCシステム(ペンシルバニア州、エイボンデール)で行った。移動相は、0.1%トリフルオロ酢酸中の5%アセトニトリル(A)および0.1%トリフルオロ酢酸中の95%アセトニトリル(B)であった。勾配溶出をプログラムし、10% Bから開始して、15分間で100% Bまで漸増し、100% Bでさらに5分間継続した。検出は214 nmで行った。HPLC解析によると、IFNは10.98分で溶出され、PAL-IFN複合体は13.112分で単一ピークとして溶出された。
【００３３】
実施例2
PAL-IFNの特徴づけ
PAL-IFNの修飾を特徴づけるため、液体クロマトグラフィー-イオントラップ質量分析(LC-MS)を適用した。新たに調製した1%トリプシンでPAL-IFN 10μgを37℃で2時間消化し、新鮮な1%トリプシンを補充することにより消化をさらに2時間、次いで一晩繰り返した。5%酢酸を添加して、トリプシン消化を停止した。C18スピンカラムを使用して、試料を脱塩した。
【００３４】
Micro-Tech Scientific製の150 mm×75μm C-18逆相(RP)カラム(5μm 300Å粒子)を使用してUltra Plus II LCシステム(Micro-Tech Scientific、オンタリオ州、ブロックビル)で実施するRP-LCと共に、Thermo Finnigan LCQ Deca XPPlus質量分析計を使用して、PAL-IFNの質量分析解析を実施した。95%溶媒A(2%アセトニトリル、0.1%ギ酸)および5%溶媒B(95%アセトニトリル、0.1%ギ酸)でMichrom Bioresourcesペプチドキャップトラップにペプチドを負荷し、次いで5〜60%溶媒Bの直線勾配を用いて65分間、および60〜90%溶媒Bの直線勾配を用いて10分間溶出した。Xcalibur 1.2ソフトウェアを用いて、タンデムMS/MSスペクトルを取得した。フルMSスキャンの後に、先行するフルスキャンによる上位3つのイオンピークのMS/MSスキャンを3回連続して行った。
【００３５】
1分以内にあるイオンが3回出現すると、そのイオンが3分間の排除リストに置かれるように、動的排除を可能にした。その他の質量分析データ作成パラメータは以下の通りであった：衝突エネルギー35%、フルスキャンMS質量範囲400〜1800 m/z、最小MSシグナル5×104カウント、最小MS/MSシグナル5×103カウント。質量分析計は、コーティングされていない10μm-ID SilicaTip(商標) PicoTip(商標)ナノスプレーエミッター(New Objective、マサチューセッツ州、ウォバーン)を使用するナノスプレーイオン源(Thermo Electron)を備えていた。質量分析計のスプレー電圧は1.9 kvであり、加熱キャピラリー温度は180℃であった。
【００３６】
得られたMSスペクトルを以下の通りに解析した。取得したスペクトルとヒトインターフェロンαタンパク質データベースとの間の相互相関スコアを決定するため、SEQUESTアルゴリズムを利用する、Thermo Electron製の9ノード(2 cpu/ノード)クラスターコンピュータでのBioworks(Bioworks 3.1)のβテスト版を使用した。Cys結合PALペプチドを同定するには、+358.559(PALの分子量)の差次的修飾を使用した。その他のSEQUESTパラメータには、閾値：1000；モノアイソトピック；酵素：トリプシン；荷電状態：自動が含まれた。ペプチド同定に関しては、相関 対 荷電状態の閾値(+1イオンについては1.5、+2イオンについては2.0、+3イオンについては2.5)を通過するスペクトルを次に調べて、主要なイオンがすべて同定されたことを確認した。MS/MSスペクトルも手動で確認した。
【００３７】
IFN-αには4つのシステイン残基が存在して、2つのジスルフィド結合(Cys1-Cys98；Cys29-Cys138)を形成している。LC-MSにより、Cys1、Cys29、およびCys138に対するパルミトイルシステインの結合が同定された。図1は、Cys1(A)、Cys29(B)、およびCys138(C)修飾の質量スペクトルを示す。Cys98を含むトリプシン断片は大きすぎるために、LC-MSにおいてC-18 RPカラムから溶出され得なかった。しかし、還元されたシステイニル残基はタンパク質内で不安定であるため、Cys1の修飾(図1A)から、Cys98も同様に脂質化されていると推測される。
【００３８】
実施例3
インビボでのPAL-IFNの血漿レベル 対 時間プロファイル
実験前に食料および水を自由に利用できるようにした、それぞれ体重27〜30 gの雄CF-1マウスを動物実験に使用した。尾静脈より、125I-PAL-IFNおよび125I-IFNをマウスに投与した。注射後5分、15分、30分、1、2、4、および8時間の時点で、各実験群による動物3匹を屠殺し、心臓から血液を採取した。血液を6,000 rpmで10分間遠心分離することにより、血漿200μLを回収した。20%氷冷トリクロロ酢酸で無傷のタンパク質を沈殿させ、沈殿中の放射能をγカウンターで測定した。
【００３９】
図2から、各観察時点で、IFNの血漿濃度よりもPAL-IFNの血漿濃度が有意に高いことが示される。血漿PAL-IFNレベルは分布相および排出相の両方を示すのに対し、IFNは主に排出相を示す。曲線から算出したところ、PAL-IFNの排出半減期は3.28時間であり、これは非修飾IFNの半減期(0.73時間)と比較して有意に延長している。
【００４０】
実施例4
インビボでの血漿濃度および肝臓保持におけるIFN、PAL-IFN、およびPEG-INTRONの比較
PAL-IFNの血漿レベルおよびその肝臓保持を、IFNおよびPEG-INTRONのものとさらに比較した。125I-IFN、125I-PAL-IFN、および125I-PEG-INTRONを、CF-1マウスに静脈内注射した。注射後15分、60分、および240分の時点で、マウスを屠殺した。各マウスの血漿200μlおよび全肝臓内の放射能を測定した。
【００４１】
PAL-IFNの排出速度は、PEG-INTRONおよびIFNの排出速度よりも遅いようであった(図3A)。さらに、PAL-IFNは、有意により高い濃度で肝臓内に保持された(図3B)。注射後60分時を例に取ると、PAL-IFNの注射用量(ID)の18.89%が肝臓に吸収されたのに対し、同時点における肝臓内のIFNは3.66% IDであり、PEG-INTRONは5.92% IDであった。
【００４２】
実施例5
PAL-IFNの細胞取り込み
PAL-IFN、IFN、およびPEG-INTRONの細胞取り込みを、Sg-PC2細胞株および初代培養マウス肝細胞で測定した。
【００４３】
Sg-PC2は、HCV RNA自己レプリコンをトランフェクションしてあるヒトヘパトーマ細胞株、huh-7である。Sg-PC2を12ウェルプレートに2.5×105個/ウェルの密度で播種し、細胞がコンフルエンスに達するまで、加湿した5% CO2雰囲気中、DMEM/10% FBS中で37℃で培養した。細胞をPBSで一度洗浄した後、125I-IFN、125I-PAL-IFN、または125I-PEG-INTRONを含むDMEM/10% FBSを用いて37℃で2時間インキュベートした。次いで、細胞をトリプシン処理し回収して、放射能を測定した。結果を図4Aに示す。Sg-PC2細胞におけるPAL-IFNの取り込みは、PEG-INTRONの取り込みよりも17倍高く、IFNの取り込みよりも9倍高い。
【００４４】
PAL-IFNの肝細胞への細胞取り込みの増加を、初代培養マウス肝細胞でさらに確認した。コラゲナーゼ溶液をマウス肝臓に灌流することにより、初代マウス肝細胞を得た。肝細胞を12ウェルプレートに2.5×105個細胞/ウェルの密度で播種し、10% FBSを含むDMEM/F12中で24時間培養した。次いで、細胞を125I-IFN、125I-PAL-IFN、または125I-PEG-INTRONと共にインキュベートした。10分間、30分間、および2時間インキュベートした後、細胞を回収して、放射能を測定した。データは、取り込み(ng/ウェル)の平均値±SDとして表す。図4Bに示されるように、細胞へのPAL-IFNの取り込みは、インキュベーション時間が長くなるにつれて増加した。各観察時点で、PAL-IFNの取り込みは、PEG-INTRONまたはIFNの取り込みよりも有意に高かった。例えば、細胞内のPAL-IFNレベルは、インキュベーション後2時間の時点でIFNよりも2.5倍高く、PEG-INTRONよりも8.6倍高かった。
【００４５】
実施例6
PAL-IFNをマウスにiv注射した後の血清中のIFN活性の回収
0.1 mg/kg体重(BW)の用量で、PAL-IFNまたはIFNを尾静脈よりCF-1マウスに投与した。注射後10分、2、4、および8時間の時点で、各実験群よりマウス3匹を屠殺した。心臓から血液を採取し、4℃で一晩凝固させた後に血液を6,000 rpmで30分間遠心分離することにより、血清を得た。
【００４６】
Daudi細胞に対する抗増殖アッセイ法を用いて、血清中のIFN活性を定量した。Daudi細胞を96ウェルプレートに2×105個細胞/ウェルの密度で播種し、加湿した5% CO2雰囲気中、37℃で培養した。血清およびIFN標準物質の3倍段階希釈物を細胞に添加した。4日後、CellTiter 96 Aqueous One Solution Reagent(Promega、ウィスコンシン州、マディソン) 20μlを各ウェルにピペットで入れ、490 nmの吸光度を記録して、各ウェルにおける細胞増殖を解析した。各ウェルにおける血清IFN活性の量を、対応するIFN検量線のシミュレーションから作成した式より算出した。
【００４７】
図5から、IFN活性が、低レベルではあるものの8時間まで持続するレベルで、インビボにおいてPAL-IFNから再生されたことが示される。それに対して、天然IFNをマウスに投与した後では、注射後2時間の時点で、血清IFN活性は検出不可能なレベルにまで迅速に減少した。
【００４８】
実施例7
インビボでの肝臓2’,5’オリゴアデニル酸合成酵素1(OAS1)発現の誘導
IFN誘導性抗ウイルス活性の代替マーカーとして、肝臓OAS1発現を使用した。体重27〜30 gのCF-1マウスを無作為にグループ化した。群当たり3匹のマウスに、PBS、0.2 mg/kg BWのIFN、および0.2 mg/kg BWのPAL-IFNをそれぞれ静脈内投与した。注射後24時間の時点で、マウスを屠殺し、肝臓を切除した。
【００４９】
一片の湿肝組織(0.5 g)を、改変溶解緩衝液(50 mM Tris-HCl、50 mM KCl、3 mM Mg(OAc)2、0.3 mM EDTA、10%グリセロール、0.01% NaN3、0.5% Triton-X 100、0.1 mMフッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF)、7 mM 2-メルカプトエタノール、pH 7.5) 5 ml中でホモジナイズした。肝臓ホモジネートを20,800×g、4℃で30分間遠心分離し、上清を等分して-80℃で保存した。上清中の総タンパク質濃度を、BCAタンパク質アッセイ法(Pierce Biotechnology、イリノイ州、ロックフォード)によって決定した。
【００５０】
一定分量の肝臓抽出物(湿組織300μg相当)を12%ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)に供し、次いで一定した200 mAでのウェットブロッティングにより、二フッ化ポリビニリデン(PVDF)膜に90分間転写した。膜を5%ノンファットドライミルク中で室温で1時間ブロッキングした後、1:500希釈したウサギ抗OAS1ポリクローナル抗体(Abgent、カリフォルニア州、サンディエゴ)と共に4℃で一晩インキュベートした。次いで膜を洗浄し、1:50,000希釈したペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギIgGと共に室温で1時間インキュベートした。膜をECLプラス試薬(Amersham Biosciences、ニュージャージー州、ピスカタウェイ)と共に1分間インキュベートし、膜をX線フィルムに2分間露光することにより、シグナルを検出した。各レーンの密度を、Quantity Oneソフトウェア(BioRad、カリフォルニア州、ハーキュリーズ)により定量した。各膜におけるタンパク質負荷を標準化するため、膜をストリッピングし、抗β-アクチンモノクローナル抗体と再ハイブリダイズさせてから、β-アクチンを測定した。
【００５１】
図6に示されるように、PAL-IFNで処理すると、24時間後には、肝臓におけるOAS1のタンパク質レベルが天然IFNによる処理と比較して2.5倍に有意に高まった。OAS1は、明確なインターフェロン誘導性タンパク質である。これは、ATPからの、2-5Aと称される2’,5’結合オリゴアデニル酸の合成を触媒する。2-5AはリボヌクレアーゼLに結合してこれを活性化するが、リボヌクレアーゼはmRNAを切断し、結果としてウイルス複製の阻害が起こる。OAS1誘導は、IFNの抗ウイルス効果と直接関連する。したがって、肝臓における局所的なOAS1の発現増加は、ウイルス性肝炎に対するPAL-IFNの治療効果を有意に向上させる。
【００５２】
実施例8
遠UV円二色性(CD)によるPAL-IFNの特徴づけ
PAL-IFNおよびIFNをHPLCから溶出し、回収した。遠UV CDスペクトルを得るため、50%アセトニトリル/0.1% TFA中の1 uM PAL-IFNを1.0 cm路長のキュベットに入れた。キュベットをJasco J810 Spectropolarimeter(Jasco Inc、メリーランド州、イーストン)中にセットした。190〜260 nmの波長範囲で100回スキャンすることにより、室温で完全なスペクトルを収集した。IFNおよび緩衝液(50%アセトニトリル/0.1% TFA)スペクトルも、同じ条件下で収集した。PAL-IFNおよびIFNスペクトルを緩衝液スペクトルから差し引いた。最終的なスペクトルデータを、Origin 7ソフトウェア(OriginLab Corporation、マサチューセッツ州、ノーサンプトン)を使用して解析した。
【００５３】
図7に示されるように、PAL-IFNのCDスペクトルはIFNのCDスペクトルと実質的に重複し、このことから、PAL-IFNが天然IFNに近い構造を維持していることが示される。222 nmにおける深いピークから、PAL-IFNおよびIFNがいずれも主にαヘリックスを含むことが示される。
【００５４】
本発明を十分に説明してきたが、本発明またはその任意の態様の範囲に影響を及ぼすことなく、条件、製剤、およびその他のパラメータの広範かつ同等の範囲内で同じことを実施できることが当業者に理解されよう。本明細書で言及した特許、特許出願、および出版物はすべて、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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