(57)【要約】  本発明は、選択的細胞傷害活性を有する、α−ラクトアルブミンと脂肪酸又は脂質との活性複合体である、単量体α−ラクトアルブミン複合体、好ましくはＬＡＣを含む、薬学的組成物に関する。本発明の組成物は、オリゴマー／多量体α−ラクトアルブミン複合体、好ましくはＬＡＣを微量含む。α−ラクトアルブミン複合体、好ましくはＬＡＣ組成物の選択的細胞傷害性に基づいて、このような組成物は、療法における使用のための医薬の製造における使用に好適である。単量体ＬＡＣを含む医薬は、選択的細胞傷害活性に起因して、細菌及びウイルス感染症、並びに特に癌の治療において使用される。本願は、さらに、細胞傷害活性を有する、単量体α−ラクトアルブミン複合体、好ましくはＬＡＣを含む組成物の製造方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
α−ラクトアルブミンと脂肪酸又は脂質との単量体α−ラクトアルブミン複合体を含む薬学的組成物であって、該α−ラクトアルブミンがウシα−ラクトアルブミン又はその機能的均等物であり、該組成物が単量体α−ラクトアルブミンを少なくとも９５質量％含む、薬学的組成物。
【請求項２】
組成物が単量体α−ラクトアルブミンを少なくとも９８質量％含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
組成物中の多量体又はオリゴマーα−ラクトアルブミンの量が、ＰＡＧＥ及び免疫ブロット法などの方法による検出のレベル未満である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
ＬＤ５０として測定される細胞傷害活性が０．１ｍｇ／ｍｌ未満である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
ＬＤ５０として測定される細胞傷害活性が０．０４ｍｇ／ｍｌ未満である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
脂肪酸又は脂質が、Ｃ１６：１：６シス及びトランス、Ｃ１６：１：９シス及びトランス、Ｃ１６：１：１１シス及びトランス、Ｃ１８：１：６シス又はトランス、Ｃ１８：１：９シス及びトランス、Ｃ１８：１：１１シス又はトランス、Ｃ１８：１：１３シス又はトランス、Ｃ２０：１：９シス及びトランス、Ｃ２０：１：１１シス及びトランス、Ｃ２０：１：１３シス及びトランスの群より選択される一価飽和酸である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
機能的均等物がウシα−ラクトアルブミンと少なくとも７０％同一である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
機能的均等物が、ウシα−ラクトアルブミンの少なくとも４０個のアミノ酸の連続配列を少なくとも１つ含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
機能的均等物が、ウシα−ラクトアルブミンのアミノ酸４−８、３４−３８、４８−５８、７５−８８、９１−９７及びアミノ酸１０３−１２１の群より選択されるウシα−ラクトアルブミンのアミノ酸セグメント少なくとも２つの配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
α−ラクトアルブミンの前記機能的均等物が、ウマ、ヤギ、ウシ、ラクダ及びブタのα−ラクトアルブミンの群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
α−ラクトアルブミンがウシのものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
タンパク質濃度が５ｍｇ／ｍｌを超える、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
α−ラクトアルブミンと脂肪酸又は脂質との単量体α−ラクトアルブミン複合体を含む薬学的組成物の製造方法であって、該α−ラクトアルブミンがウシα−ラクトアルブミン又はその機能的均等物であり、該組成物が単量体α−ラクトアルブミンを少なくとも９５質量％含み、以下の工程：
ａ．単量体α−ラクトアルブミンを少なくとも９５質量％含むα−ラクトアルブミン組成物を得る工程、
ｂ．以下によって該α−ラクトアルブミンをα−ラクトアルブミン複合体へ変換する工程
ｉ．該α−ラクトアルブミンからのカルシウムの放出、及び
ｉｉ．該α−ラクトアルブミンへの脂肪酸又は脂質の結合、並びに
ｃ．該α−ラクトアルブミン複合体を精製する工程
を含む、方法。
【請求項１４】
医薬の製造のための、α−ラクトアルブミンと脂肪酸又は脂質との単量体α−ラクトアルブミン複合体を含む組成物の使用であって、該α−ラクトアルブミンがウシα−ラクトアルブミン又はその機能的均等物であり、該組成物が単量体α−ラクトアルブミンを少なくとも９５質量％含む、使用。
【請求項１５】
呼吸器感染症の治療のための請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
いぼの治療のための請求項１４に記載の使用。
【請求項１７】
乳頭腫の治療のための請求項１４に記載の使用。
【請求項１８】
癌の治療のための請求項１４に記載の使用。
【請求項１９】
膀胱癌の治療のための請求項１４に記載の使用。
【請求項２０】
血管新生の阻害のための請求項１４に記載の使用。
【請求項２１】
ｉ．α−ラクトアルブミンと脂肪酸又は脂質との単量体α−ラクトアルブミン複合体を含む組成物であって、該α−ラクトアルブミンがウシα−ラクトアルブミン又はその機能的均等物であり、該組成物が単量体α−ラクトアルブミンを少なくとも９５質量％含む、組成物、並びに
ｉｉ．薬学的賦形剤
を含む医薬を投与することを含む治療方法。
【請求項２２】
α−ラクトアルブミンと脂肪酸又は脂質との単量体α−ラクトアルブミン複合体を含む組成物であって、該α−ラクトアルブミンがウシα−ラクトアルブミン又はその機能的均等物であり、該組成物が単量体α−ラクトアルブミンを少なくとも９５質量％含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願、又は本出願において引用される全ての特許及び非特許参考文献もまた、それらの全体が、参照によって本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本発明は、選択的細胞傷害活性を有する、α−ラクトアルブミンと脂肪酸又は脂質との活性複合体である、単量体α−ラクトアルブミン複合体、好ましくはＬＡＣを含む、薬学的組成物に関する。本発明の組成物は、オリゴマー／多量体α−ラクトアルブミン複合体、好ましくはＬＡＣを微量含む。α−ラクトアルブミン複合体、好ましくはＬＡＣ組成物の選択的細胞傷害性に基づいて、このような組成物は、療法における使用のための医薬の製造における使用に好適である。単量体ＬＡＣを含む医薬は、選択的細胞傷害活性に起因して、細菌及びウイルス感染症、並びに特に癌の治療において使用される。
【０００３】
本願は、さらに、細胞傷害活性を有する、単量体α−ラクトアルブミン複合体、好ましくはＬＡＣを含む組成物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
単量体α−ラクトアルブミン（ＬＡ）は、ヒト乳清中において最も豊富なタンパク質である。成熟単量体α−ラクトアルブミンは、多くの哺乳動物種において１２３個のアミノ酸残基（１４．２ｋＤａ）からなる。ヒト、ウシ、ウマ、ヤギ、及びラクダ（camelide）α−ラクトアルブミンは全て１２３個のアミノ酸残基からなり、一方、ブタα−ラクトアルブミンは１２２個のアミノ酸からなる。ヒト、ウシ、ヤギ及びブタα−ラクトアルブミンはまた、１９個のアミノ酸のリーダー配列を含む。この１４ＫＤａタンパク質は広くキャラクタライズされており、結晶構造が解明されている。
【０００５】
α−ラクトアルブミンの結晶構造によって、タンパク質は４個のαヘリックスと、タンパク質のＣ末端で見られる１個の三本鎖βシートとからなることが示された。大きなαヘリックスドメインは、アミノ酸５−１１、２３−３４、８６−９８、及び短いαヘリックスセグメント；アミノ酸１８−２０、１１５−１１８を含む。βドメインは、アミノ酸４０−５０からなる三本鎖逆平行シート及び短い７６−８２ヘリックスを含む。
【０００６】
α−ラクトアルブミンは、金属タンパク質であり、高親和性Ｃａ2+結合部位及びいくつかの亜鉛結合部位を含む。高親和性Ｃａ2+結合部位は、アミノ酸残基７７−８９にわたる。特に、残基７９、８２、８４、８７及び８８が、Ｃａ2+結合に関与するようである（非特許文献１）。α−ラクトアルブミンは、高親和性結合部位についてＣａ2+と競合し得る、Ｍｇ2+、Ｍｎ2+、Ｎａ+及びＫ+などの他の生理学的に重要なカチオンに結合する。
【０００７】
ネイティブな単量体は、ラクトースシンターゼ複合体の調節サブユニットであり、ガラクトシルトランスフェラーゼの受容体特異性をＮ−アセチルグルコサミンからグルコースへ変化させ、引き続いてラクトースが合成される。
【０００８】
α−ラクトアルブミンと脂肪酸又は脂質との多量体複合体は殺細胞能を有し得ることが示された。オリゴマー複合体を含有する人乳由来のフラクションは、多量体α−ラクトアルブミン又はＭＡＬ又はＨＡＭＬＥＴ（腫瘍細胞に致死的なヒトａ−ラクトアルブミン）として記載され、単量体形態とは異なる生物学的特性を有すると報告された。それは、正常な分化細胞においてではなく、腫瘍細胞において選択的にインビトロアポトーシスを誘発する分子複合体である。
【０００９】
多量体ＬＡのアポトーシス活性は、セレンディピティーによって発見された。細菌付着に対する人乳の効果に関する研究の間、驚くべきことに、人乳は、形質転換及び非形質転換未熟細胞株においてアポトーシスを誘発することが発見された。人乳中のアポトーシス活性は、低いｐＨでの沈殿によって得られた人乳カゼインのフラクションから単離され、１Ｍ  ＮａＣｌ後に単一ピークとして溶離する、イオン交換クロマトグラフィーによって精製された。溶離液は、アポ様コンフォメーションの部分的に折り畳まれていないａ−ラクトアルブミンを含有することが分光法によって示され（非特許文献２）、ネイティブ様二次構造を有するが、側鎖の特定の三次パッキングを欠いている（非特許文献２）。アポトーシス誘発と折り畳み変化との関係は、ネイティブなα−ラクトアルブミンのアポトーシス誘発形態への故意の変換によって証明された（非特許文献３）。ＨＡＭＬＥＴは、腫瘍細胞の表面へ結合し、細胞質中へ移行し、細胞核中に蓄積し、ここで、それは、ＤＮＡフラグメント化を引き起こすことが示された（非特許文献３）。
【００１０】
オリゴマー複合体は、抗生物質（特許文献１）及び癌療法（非特許文献４）の分野の両方において治療用途を有すると報告されている。特に、オリゴマー形態は、正常な細胞においてではなく、癌細胞及び未熟細胞においてアポトーシス細胞死を誘発する。これらの観察によって、前記タンパク質がコンフォメーションのスイッチング後に新たな生物学的特性を獲得することが示唆された。
【００１１】
ａ−ラクトアルブミンは低いｐＨへ曝露されるとコンフォメーションのスイッチングを受けることが公知である。Ａ状態又はモルテングロビュール状態は、ネイティブな二次構造を有するが、ネイティブな状態よりもあまり十分に規定されていない三次構造を有する。ａ−ラクトアルブミンの同様の状態はまた、中性ｐＨでも、固く結合されたＣａ2+イオンの除去時、ジスルフィド結合の還元時、又は高温時に形成し得る。
【００１２】
他の試薬、具体的にはオレイン酸などの脂質が、ヒトａ−ラクトアルブミンのＨＡＭＬＥＴへの変換において有用であることも見出された。特に、オレイン酸（Ｃ１８：１：９シス）がＨＡＭＬＥＴ産生のために必要であることが以前報告された（非特許文献３）。
【００１３】
単一の非常に高親和性のＣａ2+結合部位へのＣａ2+の結合は、前記タンパク質がネイティブなコンフォメーションを維持するために重要である。高親和性Ｃａ2+結合部位は、ヒト、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギ及びラクダα−ラクトアルブミンを含む多くの哺乳動物種にわたって１００％保存されている。Ｃａ2+を連結する７つの酸素のうちの５つは、８２、８７及び８８位におけるＡｓｐ残基の側鎖カルボキシレートによって並びにＬｙｓ７９及びＡｓｐ８４のカルボニル酸素によって与えられ、２つの水分子が残りのリガンドを供給する。結合されたＣａ2+は、αヘリックス領域とシートとを接近させ、Ｃａ2+結合部位の側面に位置する２つのジスルフィド結合は、分子のこの部分をかなり剛直にする。他のカチオン、例えば、Ｍｇ2+、Ｍｎ2+、Ｎａ+及びＫ+の結合もまた、α−ラクトアルブミンにおいてコンフォメーション変化を引き起こすが、これらはＣａ2+の結合についてよりも小さい。
【００１４】
アポトーシス活性を有するＬＡＣへのヒトα−ラクトアルブミンの変換は、コンフォメーション又は折り畳み変化、脂肪酸又は脂質の存在及びオリゴマー化の両方を必要とすることが以前見出された。コンフォメーション又は折り畳み変化は、好都合なことに、カルシウムイオンの除去によって、又はカルシウムイオンを含まない変異体を使用することによって、行われる。しかし、いったん変化が行われると、カルシウム又は機能的カルシウム結合部位の存在は、活性のいかなる損失も生じさせない。オリゴマー複合体は、抗生物質（特許文献１）及び癌療法（非特許文献４）の分野の両方において治療用途を有すると報告されている。特に、ＬＡＣのオリゴマー形態は、癌細胞及び未熟細胞においてアポトーシス細胞死を誘発し得るが、成熟した正常な細胞においては誘発しない（又は低い程度でのみ誘発する）。これらの観察によって、前記タンパク質は、脂肪酸又は脂質と活性複合体を形成する際に新たな生物学的特性を獲得することが示唆された。従って、脂肪酸又は脂質、例えばオレイン酸などの試薬は、ＬＡのＬＡＣへの変換において有用であり得る。
【００１５】
以前、癌細胞及び未熟細胞に対する細胞傷害活性は、多量体ヒトＬＡＣのみの特徴であると考えられていた（非特許文献４、非特許文献２、非特許文献５）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＭＡＬＤＩ−ＭＳを使用して、Ｈａｋａｎｓｓｏｎら（２０００年）は、単量体ＬＡＣ及びオリゴマーＬＡＣの両方を含む組成物を分析した。活性細胞傷害性フラクションはＬＡＣのオリゴマー形態を含有し、ＬＡＣの殺細胞活性はオリゴマー形態のみに起因すると決定された（非特許文献５）。
【００１６】
Ｘｕら（２００５年）は、２つの別個の論文において、市販のウシα−ラクトアルブミン及び牛乳から精製したα−ラクトアルブミンを、細胞増殖の強力な阻害を示し細胞死を誘発し得る形態へ変換することができたことを示した（非特許文献６及び非特許文献７）。α−ラクトアルブミンの多量体形態のみが、これらの細胞傷害性生物学的活性を示し；単量体形態は、いかなる殺細胞活性をも示さなかった（非特許文献６及び非特許文献７）。
【００１７】
オリゴマー複合体は、抗生物質（特許文献１）及び癌療法（非特許文献４）の分野の両方において治療用途を有すると報告されている。特に、ＬＡＣのオリゴマー形態は、癌細胞及び未熟細胞においてアポトーシス細胞死を誘発し得るが、成熟した正常な細胞においては誘発しない（又は低い程度でのみ誘発する）。これらの観察によって、前記タンパク質は、脂肪酸又は脂質と活性複合体を形成する際に新たな生物学的特性を獲得することが示唆された。従って、脂肪酸又は脂質、例えばオレイン酸などの試薬は、ＬＡのＬＡＣへの変換において有用であり得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】W096/04929
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Permyakov et al., α-Lactalbumin: structure and function. FEBS Letters 473 (2000) 269-274.
【非特許文献２】M. Svensson, et al, (1999) J Biol Chem, 274, 6388-96
【非特許文献３】M. Svensson, et al., (2000) Proc Natl Acad Sci USA, 97, 4221-6
【非特許文献４】A. Hakansson et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, (1995) 92, 8064-8068
【非特許文献５】A. Hakansson et al. Molecular Microbiology (2000) 35, 589-600
【非特許文献６】Xu et al., Biosci.Biotechnol. Biochem. (2005) 69, 1082-1089
【非特許文献７】Xu et al., Biosci.Biotechnol. Biochem. (2005) 69, 1189-1192
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、単量体ＬＡＣが、選択的細胞傷害活性、例えば、癌細胞及び未熟細胞に対する細胞傷害活性を含む、多量体ＬＡＣと同様の生物学的活性を含み得るという知見に関する。
【００２１】
本発明のある局面は、α−ラクトアルブミンと脂肪酸又は脂質との複合体である単量体ＬＡＣを含む薬学的組成物であって、該α−ラクトアルブミンがヒトα−ラクトアルブミン若しくはウシα−ラクトアルブミン又はその機能的均等物であり、該組成物が単量体ＬＡＣを少なくとも５０質量％含む、薬学的組成物に関する。
【００２２】
好ましくは、単量体ＬＡＣ組成物は選択的細胞傷害活性を有し、ここで、ＬＤ５０として測定される効力は、０．１ｍｇ／ｍｌ未満である。
【００２３】
好ましい態様において、α−ラクトアルブミンは、配列番号１によって同定されるウシα−ラクトアルブミンである。別の態様において、α−ラクトアルブミンは、配列番号２によって同定されるヒトα−ラクトアルブミンである。
【００２４】
さらなる局面において、本発明は、α−ラクトアルブミンと脂肪酸又は脂質との複合体である単量体ＬＡＣを含む組成物の製造方法であって、該α−ラクトアルブミンが配列番号１若しくは配列番号２のα−ラクトアルブミン又はそれに少なくとも７０％同一の配列を含むその機能的均等物であり、該組成物が単量体ＬＡＣを少なくとも５０質量％含み、以下の工程：
ａ．単量体α−ラクトアルブミンを少なくとも９５質量％含むα−ラクトアルブミン組成物を得る工程、
ｂ．以下によって該α−ラクトアルブミンをＬＡＣへ変換する工程
ｉ．該α−ラクトアルブミンからのカルシウムの放出、及び
ｉｉ．該α−ラクトアルブミンへの脂肪酸又は脂質の結合、並びに
ｃ．ＬＡＣを精製する工程
を含む方法に関する。
【００２５】
他の同様に好ましい態様において、ＬＡＣは、デンマーク特許出願PA 2007 0693の実施例３及び４に記載の方法に従って製造され得る。
【００２６】
なおさらなる局面において、本発明は、医薬の製造のための、α−ラクトアルブミンと脂肪酸又は脂質との複合体である単量体ＬＡＣを含む組成物の使用であって、該α−ラクトアルブミンが配列番号１若しくは配列番号２のα−ラクトアルブミン又はそれに少なくとも７０％同一の配列を含むその機能的均等物であり、該組成物が単量体ＬＡＣを少なくとも５０質量％含む、使用に関する。
【００２７】
本発明の次の局面は、
ｉ．α−ラクトアルブミンＬＡと脂肪酸又は脂質との複合体である単量体ＬＡＣを含む薬学的組成物であって、該α−ラクトアルブミンが配列番号１若しくは配列番号２のもの又はそれに少なくとも７０％同一の配列を含むその機能的均等物であり、該組成物が単量体ＬＡＣを少なくとも５０質量％含む、薬学的組成物、並びに
ｉｉ．薬学的賦形剤
を含む医薬を投与することを含む治療方法に関する。
【００２８】
本明細書において使用される場合：
用語「α−ラクトアルブミン」は、本明細書において使用される場合、ポリペプチドの三次構造とは無関係のα−ラクトアルブミンポリペプチドの意味を有する。ウシ及びヒトα−ラクトアルブミンの配列は、それぞれ、配列番号１及び配列番号２によって定義される。１Ａは、ヒト及びウシα−ラクトアルブミンの配列アラインメントを示す。従って、ヒトα−ラクトアルブミンは、任意の三次元構造を有する配列番号２の任意のポリペプチドである。同様に、ウシα−ラクトアルブミンは、任意の三次元構造を有する配列番号１の任意のポリペプチドである。
【００２９】
用語「ＬＡ」は、本明細書において使用される場合、好ましくはネイティブな三次元構造であり、かつ、好ましくは高親和性カルシウム結合部位へ結合されたカルシウムを有する、α−ラクトアルブミンポリペプチドの意味を有する。ＬＡは、脂肪酸又は脂質と複合体化されておらず、好ましくは、殺細胞能を有さない。用語「ｈＬＡ」及び「ｂＬＡ」は、本明細書において使用される場合、それぞれ、ヒトＬＡ及びウシＬＡの意味を有する。
【００３０】
α−ラクトアルブミンのＡ状態は、例えば低ｐＨで溶解される場合に採用されるα−ラクトアルブミンの部分的に折り畳まれた状態の意味を有し、一方、アポ状態は、例えば中性ｐＨ及び低塩濃度でのタンパク質結合カルシウムの除去時に採用されるα−ラクトアルブミンの部分的に折り畳まれた状態である。
【００３１】
用語「ＬＡＣ」は、本明細書において使用される場合、α−ラクトアルブミンと脂肪酸又は脂質との活性複合体の意味を有する。「活性な」によって、複合体がアポトーシス誘発能を有することが意味される（より詳しくは本明細書下記のセクション「α−ラクトアルブミン」を参照のこと）。用語ｈＬＡＣ及びｂＬＡＣは、本明細書において使用される場合、それぞれ、ヒトＬＡＣ及びウシＬＡＣの意味を有する。好ましくは、ＬＡＣは、１５μｇ未満／７０μｌ中１００．０００細胞である殺細胞活性を有する。好ましい態様において、ＬＤ５０は、１０μｇ未満／７０μｌ中１００．０００細胞である。本発明に従うα−ラクトアルブミン組成物は、より好ましくは、５μｇ未満／１００．０００細胞の、ＬＤ５０として測定される細胞傷害活性を有する。最も好ましいのは、ＬＤ５０として測定される細胞傷害活性が、１〜５μｇ／７０μｌ中１００．０００細胞である組成物である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本出願人は、本明細書において、α−ラクトアルブミン複合体を含む組成物、好ましくは、多量体又はオリゴマーＬＡＣの含有量と比較して優勢な含有量の単量体ＬＡＣを含有するＬＡＣを含む組成物を記載する。
【００３３】
単量体α−ラクトアルブミンは、約１４ｋＤａの分子量を有する。α−ラクトアルブミンの単量体は、例えば、該単量体がイオン交換カラムを通過すると、多量体化又はオリゴマー化し、より高い分子量の分子を形成し得る（療法（A.Hakansson et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, (1995) 92, 8064-8068）。これらの多量体形態は、選択的細胞傷害活性を有することがわかった（A.Hakansson et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, (1995) 92, 8064-8068）。
【００３４】
同様に、本発明に従う単量体α−ラクトアルブミン複合体は、好ましくは、単量体α−ラクトアルブミンと脂質又は脂肪酸とからなる。
【００３５】
一般的に、本発明に従う単量体α−ラクトアルブミン分子は、たった１個のα−ラクトアルブミンポリペプチド、例えば、本明細書以下に記載の任意のα−ラクトアルブミンポリペプチドを含有する。好ましくは、本発明に従う単量体α−ラクトアルブミン分子は、１４〜１５ｋＤａの範囲の分子量を有する。一般的に、α−ラクトアルブミンの二量体は、厳密に２つのα−ラクトアルブミンポリペプチド、例えば、本明細書以下に記載の任意のα−ラクトアルブミンポリペプチドを含有する。好ましくは、α−ラクトアルブミンの二量体は、２８〜３０ｋＤａの範囲の分子量を有する。一般的に、α−ラクトアルブミンの三量体は、厳密に３つのα−ラクトアルブミンポリペプチド、例えば、本明細書以下に記載の任意のα−ラクトアルブミンポリペプチドを含有する。好ましくは、三量体は、４２〜４５ｋＤａの範囲の分子量を有する。同様のことがより高次のオリゴマーについて当てはまる。
【００３６】
ＬＡＣ単量体及びオリゴマーの含有量は、重量、即ち、タンパク質複合体の質量によって算出される。α−ラクトアルブミン分子の相対含有量が以下の通りである例において［６個の単量体α−ラクトアルブミン、１個の二量体α−ラクトアルブミン及び１個の三量体α−ラクトアルブミンを含む組成物］、単量体α−ラクトアルブミンの含有量は、６×１４／（６×１４＋２×１４＋３×１４）×１００％＝８４／１５４×１００％＝５４．５％である。
【００３７】
本発明に従うα−ラクトアルブミン組成物、好ましくはＬＡＣは、５０％（質量％）を超える単量体ＬＡＣ、例えば６０質量％を超える、例えば７０質量％を超える、好ましくは８０質量％を超える、又は９０質量％を超える単量体ＬＡＣ、好ましくは、９５質量％を超える単量体ＬＡＣを含む。
【００３８】
特に好ましい態様において、本組成物は、９６％（質量％）を超える単量体α−ラクトアルブミン、好ましくはＬＡＣ、より好ましくは９７％を超える、又は９８％を超える、最も好ましくは９９％を超える単量体α−ラクトアルブミン、好ましくはＬＡＣを含み、従って、本組成物は、好ましくは、多量体又はオリゴマーα−ラクトアルブミン、好ましくはＬＡＣを微量含む、本質的に純粋な単量体α−ラクトアルブミン、好ましくはＬＡＣ組成物である。実施例１に記載され、図４Ｂ及び４によってキャラクタライズされるα−ラクトアルブミン複合体組成物は、多量体又はオリゴマーα−ラクトアルブミン、好ましくはＬＡＣの含有量が、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）又はウエスタンブロット法のいずれかによって検出可能でない組成物を示す。
【００３９】
組成物中の多量体又はオリゴマーα−ラクトアルブミン、好ましくはＬＡＣの量は、ＰＡＧＥ又は免疫ブロット法などの方法による検出のレベル未満であることが好ましい。
【００４０】
本発明の局面は、α−ラクトアルブミンと脂肪酸又は脂質との複合体である、単量体α−ラクトアルブミン、好ましくはＬＡＣを含む組成物であって、該α−ラクトアルブミンがウシ若しくはヒトα−ラクトアルブミン又はその機能的均等物であり、該組成物が単量体ＬＡＣを少なくとも９５質量％含む組成物に関する。好ましい態様において、α−ラクトアルブミンは、ウシα−ラクトアルブミンである。
【００４１】
野生型ウシα−ラクトアルブミン、即ち、該タンパク質の天然の非突然変異型は、配列番号１として同定され、野生型ヒトα−ラクトアルブミン、即ち、該タンパク質の天然の非突然変異型は、配列番号２として同定される。本発明はまた、配列番号１に対して少なくとも７０％の配列同一性を含むか又は配列番号２に対して少なくとも７０％の配列同一性を含むα−ラクトアルブミンの機能的相同体並びにα−ラクトアルブミンの機能的相同体と脂肪酸又は脂質との活性複合体を包含する。リーダー配列を含む野生型ウシα−ラクトアルブミン、即ち、１９個のアミノ酸のリーダー配列を含む該タンパク質の天然の非突然変異型は、配列番号３として同定され、リーダー配列を含む野生型ヒトα−ラクトアルブミン、即ち、１９個のアミノ酸のリーダー配列を含む該タンパク質の天然の非突然変異型は、配列番号４として同定される。
【００４２】
機能的相同体は、野生型α−ラクトアルブミン、例えば、野生型ヒトα−ラクトアルブミン又は野生型ウシラクトアルブミンとは配列が異なるが、依然として機能的に能力のある、α−ラクトアルブミンとして定義され得る。機能的相同体は、野生型α−ラクトアルブミンの突然変異型又は代替のスプライス変異体であり得る。別の局面において、α−ラクトアルブミンの機能的相同体は、本明細書以下において記載されるように定義される。機能的相同体は、エクスビボで導入された、１つ又はそれ以上の突然変異及び／又は１つ又はそれ以上の配列欠失及び／又は付加を有するα−ラクトアルブミンの組換え型であり得るが、これに限定されない。
【００４３】
本発明の好ましい態様において、α−ラクトアルブミンは、ヒト又はウシα−ラクトアルブミンであり得、ここで、該α−ラクトアルブミンは、天然のミルクα−ラクトアルブミン又は組換えで作製されたα−ラクトアルブミンのいずれかである。
【００４４】
α−ラクトアルブミン
α−ラクトアルブミンは、背景セクションにおいて記載したように、ミルク中において非常に豊富である。異なる哺乳動物種由来のα−ラクトアルブミンの配列は、十分に保存されている。齧歯動物（マウス、ラット、ウサギ、モルモット）、霊長類、ネコ及びイヌ由来の配列は、高度の同一性を示す。ウマ、ヤギ、ウシ、ブタ及びヒト由来のアミノ酸配列は、約７５〜９５％同一性を示す（Pettersson, Jenny, BBRC 345 (2006) 260-270）。
【００４５】
任意の種、好ましくは任意の哺乳動物種由来のα−ラクトアルブミンが、単量体α−ラクトアルブミン、好ましくはＬＡＣの製造のために、本発明に従って使用され得る。本発明について、ウシ又はヒト種とは異なる任意の種由来のα−ラクトアルブミンは、ウシ又はヒトα−ラクトアルブミンの機能的均等物（下記参照）と考えられる。α−ラクトアルブミンは、リゾチームＣと進化的に関連し、リゾチームＣと約３５〜４０％の配列相同性及び４個のジスルフィド結合の位置を共有する。
【００４６】
本発明のある態様において、ウシ又はヒトα−ラクトアルブミンの機能的均等物は、ウマ、ヤギ、ウシ、ラクダ及びブタからなる群より選択される。最も好ましい態様において、α−ラクトアルブミンはウシのものである。図１Ｂは、ウシ及びヒトα−ラクトアルブミンのタンパク質配列のアラインメントを示す。
【００４７】
ヒト野生型α−ラクトアルブミンは、配列番号２として同定され、ウシ野生型α−ラクトアルブミンは、配列番号１として同定される。本発明の１つの好ましい態様において、α−ラクトアルブミンは、ウシα−ラクトアルブミンであり、本発明の別の態様において、α−ラクトアルブミンは、ヒトα−ラクトアルブミンである。より好ましい態様において、α−ラクトアルブミンは、配列番号１によって同定されるウシ野生型α−ラクトアルブミンであり、本発明の別の好ましい態様において、α−ラクトアルブミンは、配列番号２によって同定されるヒトα−ラクトアルブミンである。
【００４８】
別の好ましい態様において、α−ラクトアルブミンは、組換え野生型ヒトα−ラクトアルブミンであり、本発明の同様に好ましい態様において、α−ラクトアルブミンは、組換え野生型ウシα−ラクトアルブミンである。α−ラクトアルブミン変異体としては、当業者に公知の任意の形態のα−ラクトアルブミン及びその任意の機能的相同体が挙げられる。例えば、α−ラクトアルブミン変異体としては、スプライス変異体、及び対立遺伝子変異体、及び一塩基変異多型が挙げられる。
【００４９】
α−ラクトアルブミンの機能的相同体は、配列番号１又は配列番号２との少なくともいくらかの配列同一性を示し、かつ、脂肪酸又は脂質で複合体化されると、ＬＡＣと１つ又はそれ以上の機能、例えば、アポトーシス誘発能を共有する、任意のタンパク質であり得る（より詳しくは本明細書下記を参照のこと）。
【００５０】
アポトーシス誘発のＬＡＣの能力は、例えば、デンマーク特許出願PA 2007 0693に記載されるように、又は実施例：単量体α−ラクトアルブミン組成物の細胞傷害性におけるように、測定され得る。ＤＮＡフラグメント化のα−ラクトアルブミンの能力は、例えば、３０５ｎｍ  ＵＶ光源を使用して臭化エチジウムを用いて、（Pettersson, Jenny, BBRC 345 (2006) 260-270）に記載されるように、視覚化され得る。野生型ＬＡＣの機能である、α−ラクトアルブミンのヒストン結合活性は、デンマーク特許出願PA 2007 0693に記載されるように測定され得る。
【００５１】
本発明で使用されるα−ラクトアルブミンは、任意の好適な供給源から誘導され得、例えば、α−ラクトアルブミンは、天然のα−ラクトアルブミンであり得、又はα−ラクトアルブミンは、本明細書以下において詳細に記載される、組換えで作製されたα−ラクトアルブミンであり得る。好ましい態様において、α−ラクトアルブミンは、人乳から精製されたヒトα−ラクトアルブミンであり、別の同様に好ましい態様において、α−ラクトアルブミンは、牛乳から精製されたウシα−ラクトアルブミンである。好ましい態様において、α−ラクトアルブミンは、組換えウシα−ラクトアルブミンである。より好ましい態様において、α−ラクトアルブミンは、組換えウシ野生型α−ラクトアルブミンである。
【００５２】
α−ラクトアルブミンの機能的均等物
本発明の１つの好ましい態様において、α−ラクトアルブミンは、ウシα−ラクトアルブミンであり、より好ましい態様において、α−ラクトアルブミンは、配列番号１によって同定されるウシ野生型α−ラクトアルブミンである。非常に好ましい態様において、α−ラクトアルブミンは、組換え野生型ヒトα−ラクトアルブミンである。本発明の別の好ましい態様において、α−ラクトアルブミンは、ヒトα−ラクトアルブミンであり、より好ましい態様において、α−ラクトアルブミンは、配列番号２によって同定されるヒト野生型α−ラクトアルブミンである。非常に好ましい態様において、α−ラクトアルブミンは、組換え野生型ウシα−ラクトアルブミンである。
【００５３】
ウシ又はヒトα−ラクトアルブミン配列の合理的な数の修飾又は変更は、本発明に従うα−ラクトアルブミン分子の活性を妨げないことが、上記から明らかである。このようなα−ラクトアルブミン分子は、本明細書において、ウシ又はヒトα−ラクトアルブミンの機能的均等物と呼ばれ、例えば、本明細書以下に記載されるネイティブなウシ又はヒトα−ラクトアルブミンの変異体及びフラグメントであり得る。
【００５４】
α−ラクトアルブミンの機能的相同体は、配列番号１又は配列番号２との少なくともいくらかの配列同一性を示し、かつ、α−ラクトアルブミンと以下のような機能を１つ又はそれ以上共有する、任意のタンパク質であり得る：
・ラクトースの合成において補因子として作用すること
・ＬＡＣへ変換されると殺細胞活性を示すこと
・ＬＡＣへ変換されるとアポトーシスを誘発する能力
・ＬＡＣへ変換される場合のヒストン結合活性
【００５５】
ＬＡＣが殺細胞活性を有するかどうか測定するために、いくつかの方法が使用され得る。
【００５６】
ＬＡＣがヒストン結合活性を有するかどうか測定するために、いくつかの方法が使用され得る。
【００５７】
好ましくは、機能的相同体は、配列番号１又は配列番号２との少なくともいくらかの配列同一性を示し、かつ、殺細胞能を有する。
【００５８】
好ましくは、例えば配列アラインメントによって評価される、異なるが密接に関連する種のα−ラクトアルブミン間の進化的保存は、個々の残基に対する進化的圧力の程度を示すために使用され得る。好ましくは、α−ラクトアルブミン配列は、α−ラクトアルブミン機能が保存されている種間で、例えば、しかしこれらに限定されないが、齧歯動物、サル及び類人猿を含む哺乳動物間で、比較される。高い選択圧下での残基は、種間で変化する残基ではなく、容易には置換され得ない必須のアミノ酸を示す可能性が高い。例えば、このようなアラインメントは、ＥＢＭＬ−ＥＢＩ製のＣｌｕｓｔａｌＷを使用し、ブタα−ラクトアルブミン及びヒトα−ラクトアルブミンを比較して、行われ得る（図１Ａ）。ウシ又はヒトα−ラクトアルブミン配列の合理的な数の修飾又は変更は、本発明に従うα−ラクトアルブミン分子の活性を妨げないことが、上記から明らかである。このようなα−ラクトアルブミン分子は、本明細書において、ウシ又はヒトα−ラクトアルブミンの機能的均等物と呼ばれ、例えば、本明細書以下に記載されるネイティブなウシ又はヒトα−ラクトアルブミンの変異体及びフラグメントであり得る。
【００５９】
機能アッセイは、例えば、α−ラクトアルブミン機能が保存されているかどうかを測定するために使用され得る。当業者に公知の機能アッセイが、複合体化されていないα−ラクトアルブミンの機能的保存を確認するために使用され得る。このような機能アッセイは、ラクトースの産生におけるラクトースシンターゼ複合体の調節サブユニットとして作用するα−ラクトアルブミンの能力を測定する。
【００６０】
当業者に公知の機能アッセイが、脂肪酸又は脂質と複合体化したα−ラクトアルブミンの機能的保存を確認するために使用され得る。当業者に公知のα−ラクトアルブミン機能を評価するための機能アッセイとしては、本明細書上記及びデンマーク特許出願PA 2007 0693において記載されるアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
本明細書において使用される場合、表現「変異体」は、基本のタンパク質（これは、好適には、ウシ又はヒトα−ラクトアルブミンである）に相同であるが、配列内の１つ又はそれ以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されている点で、それらが誘導される基本配列とは相違する、ポリペプチド又はタンパク質を指す。アミノ酸が大まかに類似した特性を有する異なるアミノ酸で置換される場合、アミノ酸置換は「保存的」と見なされ得る。非保存的置換は、アミノ酸が異なるタイプのアミノ酸で置換される場合である。大まかに述べると、より少ない非保存的置換が、ポリペプチドの生物学的活性を変更することなく可能である。図１Ａは、ウシ、ヒト、ウマ、ヤギ、ウシ、ラクダ及びブタα−ラクトアルブミンのタンパク質配列のアラインメントを示し、ここで、同一残基（「*」）並びに保存的置換を有する残基（「：」）及び半保存的置換を有する残基（「．」）がマークされている。
【００６２】
従って、本発明の１態様において、α−ラクトアルブミンの機能的相同体は、配列番号１又は配列番号２に対して高い配列同一性を有する配列を含むことが好ましく、ここで、図１Ａにおいて「*」でマークされた保存された残基はいずれも置換されていない。この態様においてさらに好ましいのは、図１Ａにおいて「：」でマークされた残基が、置換されていないか、又は保存的置換によって、より好ましくは本明細書以下において定義される高いレベルの類似性を有するアミノ酸での置換によって、置換されているのみであることである。
【００６３】
従って、１態様において、ウシα−ラクトアルブミンの機能的相同体は、配列番号１に対して高い配列同一性を有する配列を有することが好ましく、ここで、残基Ｅ１、Ｌ３、Ｅ７、Ｖ８、Ｌ１５、Ｙ１８、Ｖ２１、Ｓ２２、Ｖ２７、Ｑ３９、Ａ４０、Ｉ４１、Ｎ４４、Ｉ５９、Ｋ６２、Ｑ６５、Ｉ８５、Ｍ９０、Ｎ１０２、Ｓ１１２、Ｄ１１６、Ｋ１２２は、置換されていないか、又は保存的置換のみによって置換されており、より好ましくは本明細書以下において定義される高いレベルの類似性を有するアミノ酸のみによって置換されている。
【００６４】
α−ラクトアルブミンの機能的相同体が配列番号１又は配列番号２に対して高い配列同一性を有する配列を有することが、本発明において、なおさらに好ましく、ここで、図１Ａにおいて「．」でマークされた残基は、置換されていないか、又は保存的置換によって、例えば、本明細書以下において定義されるより低いレベル又は高いレベルの類似性を有するアミノ酸で、置換されているのみである。従って、ウシα−ラクトアルブミンの機能的相同体は、配列番号１に対して高い配列同一性を有する配列を有することが好ましく、ここで、残基Ｄ１４、Ｋ１６、Ｇ１７、Ｇ２０、Ｐ２４、Ｓ４７、Ｎ５６、Ｄ６３、Ｄ６４、Ｎ７４、Ｖ９２、及びＡ１０９は、置換されていないか、又は保存的置換によって、例えば、本明細書以下において定義されるより低いレベル又は高いレベルの類似性を有するアミノ酸で、置換されているのみである。
【００６５】
α−ラクトアルブミンの機能的相同体が、図１Ａにおいてマークされていない残基が任意の他のアミノ酸で置換され得る、配列番号１又は配列番号２に対して高い配列同一性を有する配列を有し得ることも、本発明内に含まれる。従って、ヒトα−ラクトアルブミンの機能的相同体は、配列番号１に対して高い配列同一性を有する配列を有し得、ここで、残基Ｆ９、Ｒ１０、Ｅ１１、Ｇ１９、Ｗ２５、Ｔ２９、Ｔ３０、Ｔ３３、Ｑ４３、Ｄ４６、Ｔ４８、Ｎ６６、Ｐ６７、Ｈ６８、Ｓ７０、Ｉ８９、Ｋ９８、Ｖ９９、Ｌ１１８、及びＬ１２３は、置換されていないか、又は任意の他のアミノ酸で置換されている。
【００６６】
当業者は、１つのアミノ酸が１つ又はそれ以上の共通の化学的及び／又は物理的特徴を有する別のもので置換される、「保存的」アミノ酸置換の作製及び評価方法を知っている。保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能に影響を与える可能性が低い。アミノ酸は、共通の特徴に従って分類され得る。保存的アミノ酸置換は、所定のグループのアミノ酸内の１つのアミノ酸の、同一のグループ内の別のアミノ酸での置換であり、ここで、所定のグループ内のアミノ酸は、類似する又は実質的に類似する特徴を示す。
【００６７】
保存的アミノ酸置換は、類似する側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸のグループは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンであり；脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸のグループは、セリン及びスレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸のグループは、アスパラギン及びグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸のグループは、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸のグループは、リジン、アルギニン及びヒスチジンであり；硫黄含有側鎖を有するアミノ酸のグループは、システイン及びメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換グループは、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、及びアスパラギン−グルタミンである。
【００６８】
本明細書において適用される場合の用語「保存的アミノ酸置換」の意味において、１つのアミノ酸は、本明細書以下に記載のアミノ酸のグループ内の別のもので置換され得る：
【００６９】
より低いレベルの類似性：
極性：
ｉ）極性側鎖を有するアミノ酸（Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、及びＣｙｓ）
ｉｉ）非極性側鎖を有するアミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、及びＭｅｔ）
親水性又は疎水性：
ｉｉｉ）疎水性アミノ酸（Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ）
ｉｖ）親水性アミノ酸（Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ）
電荷：
ｖ）中性アミノ酸（Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ）
ｖｉ）塩基性アミノ酸（Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ）
ｖｉｉ）酸性アミノ酸（ａｓｐ、Ｇｌｕ）
高いレベルの類似性：
ｖｉｉｉ）酸性アミノ酸及びそれらのアミド（Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ）
ｉｘ）脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ）
ｘ）芳香族側鎖を有するアミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）
ｘｉ）塩基性側鎖を有するアミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）
ｘｉｉ）ヒドロキシ側鎖を有するアミノ酸（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）
ｘｉｉｉ）硫黄含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃｙｓ、Ｍｅｔ）
【００７０】
好ましい保存的アミノ酸置換グループは、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、及びアスパラギン−グルタミンである。
【００７１】
従って、本発明に従う変異体又はそのフラグメントは、前記配列又はそのフラグメントの同一の変異体内で、又は、前記配列又はそのフラグメントの異なる変異体間で、少なくとも１つの置換、例えば、互いに独立して導入された複数の置換を含み得る。
【００７２】
同一の変異体又はそのフラグメントは、本明細書上記に定義される保存的アミノ酸の１を超えるグループ由来の１を超える保存的アミノ酸置換を含み得ることが、上記の概要から明らかである。
【００７３】
２０個の標準アミノ酸並びに２個の特別なアミノ酸、セレノシステイン及びピロリシンに加えて、インビボでタンパク質へ組み込まれない莫大な数の「非標準アミノ酸」が存在する。非標準アミノ酸の例としては、硫黄含有タウリン並びに神経伝達物質であるＧＡＢＡ及びドーパミンが挙げられる。他の例は、ランチオニン、２−アミノイソ酪酸、及びデヒドロアラニンである。さらなる非標準アミノは、オルニチン及びシトルリンである。
【００７４】
非標準アミノ酸は、通常、標準アミノ酸への修飾によって形成される。例えば、タウリンは、システインの脱炭酸によって形成され得、一方、ドーパミンは、チロシンから合成され、ヒドロキシプロリンは、プロリンの翻訳後修飾によって作製される（コラーゲン中において一般的）。非天然アミノ酸の例は、例えば３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．セクション１．８２２（ｂ）（４）に列挙されるものであり、これらの全ては、参照によって本明細書に組み入れられる。
【００７５】
本明細書に記載される標準及び非標準アミノ酸残基は両方とも、「Ｄ」又は「Ｌ」異性体形態であり得る。
【００７６】
本発明に従う機能的均等物は、非標準アミノ酸を含む任意のアミノ酸を含み得ることが考えられる。好ましい態様において、機能的均等物は、標準アミノ酸のみを含む。
【００７７】
標準及び／又は非標準アミノ酸は、ペプチド結合又は非ペプチド結合によって連結され得る。用語ペプチドはまた、当該技術分野において公知であるように、化学又は酵素触媒反応によって導入される翻訳後修飾を包含する。このような翻訳後修飾は、必要に応じて、分配の前に導入され得る。本明細書に明記されるアミノ酸は、優先的にＬ−立体異性体形態にある。アミノ酸アナログが、２０個の天然アミノ酸の代わりに使用され得る。フルオロフェニルアラニン、ノルロイシン、アゼチジン−２−カルボン酸、Ｓ−アミノエチルシステイン、４−メチルトリプトファンなどを含む、いくつかのこのようなアナログが公知である。
【００７８】
好適には、変異体は、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％同一であり、従って、変異体は、好ましくは、ウシα−ラクトアルブミンの所定の配列との少なくとも７５％配列同一性、例えば少なくとも８０％配列同一性、例えば少なくとも８５％配列同一性、例えば少なくとも９０％配列同一性、例えば少なくとも９１％配列同一性、例えば少なくとも９１％配列同一性、例えば少なくとも９２％配列同一性、例えば少なくとも９３％配列同一性、例えば少なくとも９４％配列同一性、例えば少なくとも９５％配列同一性、例えば少なくとも９６％配列同一性、例えば少なくとも９７％配列同一性、例えば少なくとも９８％配列同一性、例えば９９％配列同一性を有する。
【００７９】
配列同一性は、多数の周知のアルゴリズムを使用し、多数の異なるギャップペナルティーを適用して算出され得る。配列同一性は、全長配列番号１又は配列番号２と比べて算出される。代替案において、それは、シグナルペプチドをコードする配列が含まれていない配列番号１又は配列番号２と比べて算出される。理論に拘束されないが、シグナルペプチドは、配列番号１及び配列番号２のアミノ酸１〜２４を含むと予想される。これらに限定されないがＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、又はＬＡＬＩＧＮなどの、任意の配列アラインメントツールが、相同体を検索し配列同一性を算出するために使用され得る。さらに、適切な場合、これらに限定されないがＰＡＭ、ＢＬＯＳＳＵＭ又はＰＳＳＭ行列などの、任意の周知の置換行列が、検索アルゴリズムと共に適用され得る。例えば、ＰＳＳＭ（位置特異的スコア行列）が、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴプログラムを介して適用され得る。さらに、配列アラインメントが、ギャップオープニング及びエクステンションについて一連のペナルティーを使用して行われ得る。例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、５〜１２の範囲のギャップオープニングペナルティー、及び１〜２の範囲のギャップエクステンションペナルティーを用いて使用され得る。
【００８０】
本発明の範囲内の機能的相同体は、配列番号１又は配列番号２によって同定されるウシα−ラクトアルブミン又はヒトα−ラクトアルブミンとのいくらかの配列同一性を示すポリペプチドであり、好ましくは、それらは、配列番号１又は配列番号２との高い配列同一性を有し、例えば、機能的相同体は、少なくとも７０％配列同一性を共有する配列を有し得、好ましくは、機能的相同体は、配列番号１又は配列番号２との少なくとも７５％配列同一性、例えば少なくとも８０％配列同一性、例えば少なくとも８５％配列同一性、例えば少なくとも９０％配列同一性、例えば少なくとも９１％配列同一性、例えば少なくとも９１％配列同一性、例えば少なくとも９２％配列同一性、例えば少なくとも９３％配列同一性、例えば少なくとも９４％配列同一性、例えば少なくとも９５％配列同一性、例えば少なくとも９６％配列同一性、例えば少なくとも９７％配列同一性、例えば少なくとも９８％配列同一性、例えば９９％配列同一性を有する。
【００８１】
機能的均等物は、さらに、ヒトタンパク質中に通常存在しない、化学的修飾、例えば、ユビキチン化、標識化（例えば、放射性核種、種々の酵素などを用いる）、ペグ化（ポリエチレングリコールを用いての誘導体化）、又はオルニチンなどのアミノ酸（アミノ酸）の挿入（又は化学合成による置換）を含み得る。
【００８２】
本明細書に記載のペプチジル化合物に加えて、立体的に類似する化合物が、ペプチド構造の重要な部分を模倣するように作製され得、そのような化合物もまた、本発明のペプチドと同一の様式で使用され得る。これは、当業者に公知のモデリング及び化学的デザイニングの技術によって達成され得る。例えば、エステル化及び他のアルキル化が、テトラペプチド構造を模倣するように、例えば、ジアルギニンペプチド骨格の、アミノ末端を修飾するために使用され得る。全てのこのような立体的に類似する構築物は本発明の範囲内にあることが理解される。
【００８３】
Ｎ末端アルキル化及びＣ末端エステル化を有するペプチドもまた、本発明内に包含される。機能的均等物はまた、無関係の化学的部分又は二量体を含む、同一の分子を用いて形成された、グリコシル化及び共有結合性又は集合性複合体を含む。このような機能的均等物は、当該技術分野において公知の手段によって、Ｎ及びＣ末端のいずれか一方又は両方を含む、フラグメント中において見られる基への官能基の連結によって作製される。
【００８４】
用語「そのフラグメント」は、所定のアミノ酸配列の任意の部分を指し得る。フラグメントは、一緒に連結された、全長タンパク質内からの１を超える部分を含み得る。好適なフラグメントは、欠失又は付加突然変異体であり得る。少なくとも１つのアミノ酸の付加は、好ましくは２〜２５０個のアミノ酸、例えば１０〜２０個のアミノ酸、例えば２０〜３０個のアミノ酸、例えば４０〜５０個のアミノ酸の付加であり得る。フラグメントは、タンパク質由来の小さな領域又はこれらの組み合わせを含み得る。
【００８５】
好適なフラグメントは、欠失又は付加突然変異体であり得る。少なくとも１つのアミノ酸の付加又は欠失は、好ましくは２〜２５０個のアミノ酸、例えば１０〜２０個のアミノ酸、例えば２０〜３０個のアミノ酸、例えば４０〜５０個のアミノ酸の付加又は欠失であり得る。欠失及び／又は付加は、互いに独立して、配列内での及び／又は配列の末端での欠失及び／又は付加であり得る。
【００８６】
機能的相同体は、少なくとも７０％を共有する、配列番号１又は配列番号２によって同定されるα−ラクトアルブミンの欠失突然変異体であり得、従って、機能的相同体は、好ましくは、少なくとも７５％配列同一性、例えば少なくとも８０％配列同一性、例えば少なくとも８５％配列同一性、例えば少なくとも９０％配列同一性、例えば少なくとも９１％配列同一性、例えば少なくとも９１％配列同一性、例えば少なくとも９２％配列同一性、例えば少なくとも９３％配列同一性、例えば少なくとも９４％配列同一性、例えば少なくとも９５％配列同一性、例えば少なくとも９６％配列同一性、例えば少なくとも９７％配列同一性、例えば少なくとも９８％配列同一性、例えば９９％配列同一性を有する。
【００８７】
欠失突然変異体は、好適には、長さが少なくとも２０又は４０連続アミノ酸、より好ましくは少なくとも８０又は１００連続アミノ酸のものを含む。従って、このようなフラグメントは、少なくとも２０連続アミノ酸、例えば少なくとも３０連続アミノ酸、例えば少なくとも４０連続アミノ酸、例えば少なくとも５０連続アミノ酸、例えば少なくとも６０連続アミノ酸、例えば少なくとも７０連続アミノ酸、例えば少なくとも８０連続アミノ酸、例えば少なくとも９０連続アミノ酸、例えば少なくとも９５連続アミノ酸、例えば少なくとも１００連続アミノ酸、例えば少なくとも１０５アミノ酸、例えば少なくとも１１０連続アミノ酸、例えば少なくとも１１５連続アミノ酸、例えば少なくとも１２０連続アミノ酸を含む、配列番号１又は配列番号２によって同定される配列のより短い配列であり得、ここで、該欠失突然変異体は、好ましくは、配列番号１又は配列番号２と少なくとも７５％配列同一性、例えば少なくとも８０％配列同一性、例えば少なくとも８５％配列同一性、例えば少なくとも９０％配列同一性、例えば少なくとも９１％配列同一性、例えば少なくとも９１％配列同一性、例えば少なくとも９２％配列同一性、例えば少なくとも９３％配列同一性、例えば少なくとも９４％配列同一性、例えば少なくとも９５％配列同一性、例えば少なくとも９６％配列同一性、例えば少なくとも９７％配列同一性、例えば少なくとも９８％配列同一性、例えば９９％配列同一性を共有する。
【００８８】
α−ラクトアルブミンの機能的相同体は、多くても５００個、より好ましくは多くても４００個、なおより好ましくは多くても３００個、さらにより好ましくは多くても２００個、例えば多くても１７５個、例えば多くても１６０個、例えば多くても１５０個のアミノ酸、例えば多くても１４２個のアミノ酸を含むことが好ましい。
【００８９】
用語「そのフラグメント」は、所定のアミノ酸配列の任意の部分を指し得る。フラグメントは、一緒に連結された、全長タンパク質内からの１を超える部分を含み得る。部分は、好適には、基本の配列由来の少なくとも５個、好ましくは少なくとも１０個の連続アミノ酸を含む。それらは、タンパク質由来の小さな領域又はこれらの組み合わせを含み得る。
【００９０】
本発明のある態様において、α−ラクトアルブミンフラグメントは、１つ又はそれ以上のアミノ酸セグメントを含む。セグメントは、以下より選択され得る：アミノ酸５−１１、２３−３４、８６−９８を含む大きなαヘリックスドメイン、及び短いαヘリックスセグメント；アミノ酸１８−２０、１１５−１１８、又は三本鎖逆平行シート：アミノ酸４０−５０、及び短い７６−８２ヘリックスを含むβドメイン、又はカルシウム結合ドメイン７６−８９、又はこれらのドメイン間の任意のセグメント：アミノ酸１−４、１２−１７、２１−２２、３５−３９、５１−７６、８２−８４、９９−１１４若しくは１１９−１２３。好ましくは、α−ラクトアルブミンフラグメントは、上述のセグメントを少なくとも２個、より好ましくは記載のセグメントを少なくとも３個、より好ましくは４個又は最も好ましくは５個又は６個全ての上述のセグメントを含む。
【００９１】
αドメインとβドメインとの界面を形成する領域は、ヒトａ−ラクトアルブミンにおいては、構造中においてアミノ酸３５−３９及び８３−８７によって定義される。従って、それらと平行によって（by parallel thereto）、ウシα−ラクトアルブミンの好適なフラグメントは、これらの領域、好ましくは、ネイティブなタンパク質のアミノ酸３５−８７、例えばネイティブなタンパク質のアミノ酸２０−１００、例えばネイティブなタンパク質のアミノ酸１０−１１０、例えばネイティブなタンパク質のアミノ酸５−１１５、例えばアミノ酸１−１２３由来の全領域を含む。前記分子のこの領域は、３つの塩基性アミノ酸の１つ（Ｒ７０）がウシα−ラクトアルブミンにおいてＳ７０へ変化されており、従って１つの可能性のある配位性側鎖が排除されている点で、ウシタンパク質とヒトタンパク質とで相違する。
【００９２】
欠失及び／又は付加は、互いに独立して、配列内での及び／又は配列の末端での欠失及び／又は付加であり得る。
【００９３】
高親和性Ｃａ2+結合部位は、異なる種由来のα−ラクトアルブミンにおいて１００％保存され（Acharya K. R., et al., (1991) J Mol Bio3 221,5il-581）、該タンパク質についてのこの機能の重要性を示している。それは、背景セクションにおいて記載したように、５個の異なるアミノ酸及び２個の水分子によって配位結合される。
【００９４】
特定の態様において、本発明に従う変異体は、カルシウム結合部位が、カルシウムについての親和性が低下されるように、又はそれがもはや機能的ではないように修飾されているものである。α−ラクトアルブミン中のカルシウム結合部位は、残基Ｋ７９、Ｄ８２、Ｄ８４、Ｄ８７及びＤ８８によって配位されている。従って、例えば酸性残基の１つ又はそれ以上を除去することによる、これらの残基の修飾は、カルシウムについての前記部位の親和性を低下させるか又は機能を完全に排除し得、このタイプの突然変異体は、本発明の１態様である。特定の態様において、前記タンパク質配列内のアミノ酸８７位のアスパラギン酸残基は、非酸性残基、特に非極性又は非荷電極性側鎖へ突然変異される。突然変異体タンパク質における構造的歪みを最小化するために、Ｄ８７はまたアスパラギン（Ｎ）によっても置換され得る。従って、本発明の複合体における使用についての変異体は、ａ−ラクトアルブミンのＤ８７Ａ及びＤ８７Ｎ変異体、又はこの突然変異を含むフラグメントであり得る。
【００９５】
ＬＡＣは、カルシウムが存在する場合も存在しない場合も活性であるようである。これについて２つの説明が妥当と思われる。第１の最も可能性の高いシナリオにおいて、ＬＡＣは、αヘリックスドメインの妨害をほぼ伴わずに、展開及び脂肪酸の結合（下記参照）によって形成される。次いで、Ｃａ2+結合部位は、脂肪酸が存在しない場合と同様のコンフォメーションを保持し得、Ｃａ2+がそこへ結合され得る。第２の可能性は、Ｃａ2+部位が破壊され、観察されるＣａ2+結合は、ＬＡＣにおける新たなＣａ2+部位の形成によって説明されるということである。脂肪酸の頭部基は、アミノ酸残基と共に潜在的にカルシウムに配位し得る。
【００９６】
従って、Ｃａ2+結合部位は、アポトーシス関連コンフォメーションへのａ−ラクトアルブミンの変換に関与しておらず、ＬＡＣへのＣａ2+結合に関連する構造変化は、生物学的機能を妨げないようである。従って、代替の態様において、Ｃａ2+結合部位は、上述のアミノ酸セグメント７６−８９を含めることによって保存される。
【００９７】
α−ラクトアルブミン複合体
本発明に従うα−ラクトアルブミン組成物は、配列番号１又は配列番号２のウシ若しくはヒトα−ラクトアルブミン又はその機能的均等物と脂質又は脂肪酸とを含むα−ラクトアルブミン複合体（ＬＡＣ）を含む。
【００９８】
本発明の好ましい態様において、α−ラクトアルブミンは、脂肪酸と複合体化されている。脂肪酸は、しばしば長い非分枝の脂肪族鎖を有するカルボン酸である。脂肪酸の生合成はアセチル−ＣｏＡを必要とし、ここで、酢酸単位は２つのＣ原子を含有するので、大抵の天然脂肪酸は、４〜８０Ｃ原子の範囲の偶数のＣ原子を有する。脂肪酸の脂肪族鎖は、飽和又は不飽和のいずれかであり得る。飽和脂肪酸は、水素で飽和されており、従って二重結合を有さない。不飽和脂肪酸は、１個の二重結合を有する一価不飽和（又はＭＵＦＡ）又は２個若しくはそれ以上の二重結合を有する多価不飽和（ＰＵＦＡ）のいずれかであり得る。本発明の脂肪酸は、飽和脂肪酸又は不飽和脂肪酸であり得る。
【００９９】
本発明の好ましい態様において、脂肪酸は、Ｃ４〜Ｃ３０の群、例えばＣ６〜Ｃ２８、例えばＣ８〜Ｃ２６、例えばＣ１０〜Ｃ２４、例えばＣ１２〜Ｃ２２、例えばＣ１４〜Ｃ２０、例えばＣ１６〜Ｃ２０、例えばＣ１６、Ｃ１７、Ｃ１８及びＣ２０の群、例えばＣ１６、Ｃ１８及びＣ２０の群より選択される。
【０１００】
脂肪酸は、しばしば、鎖のＣ原子の数、並びに二重結合の数、位置及びコンフォメーションを使用して記載される。例えば、ステアリン酸は、１８個のＣ原子を有し、そして二重結合を有さない鎖を有し、Ｃ１８：０と記載され得、オレイン酸は、１８個のＣ原子及び１個の二重結合の鎖を有し、Ｃ１８：１と記載され得、リノール酸は、１８個のＣ原子及び２個の二重結合の鎖を有し、Ｃ１８：２と記載され得るなどである。
【０１０１】
二重結合は、カルボキシル末端から数えて、第ｘ番目の炭素−炭素結合上に配置される。ラテン語の接頭語シス（同じ側）又はトランス（反対側）は、二重結合に関する水素原子の方向を記載することによって二重結合のコンフォメーションを記載する。シスコンフォメーションの二重結合が好ましい。二重結合の位置は、しばしば、二重結合の数を示す整数の後に、最後の数として記載される。従って、例えば、炭素９と１０の間に１個の二重結合を有する１８炭素鎖を有するオレイン酸は、Ｃ１８：１：９シスと記載され得、それぞれ、炭素９と１０、１２と１３、１５と１６の間に３個の二重結合を有する１８炭素鎖を有するα−リノレン酸は、Ｃ１８：３：９，１２，１５と記載され得る。シス又はトランスは、二重結合の位置の後に記載され得る。１を超える二重結合が存在し、かつ、それらが全て同一のコンフォメーションである場合、用語シス又はトランスは、全ての二重結合の位置の記載の後に記載され得、従って全ての二重結合のコンフォメーションに関する。従って、例えば、それぞれ炭素９と１０、１２と１３の間の両方ともシス二重結合である２個の二重結合を有する１８炭素鎖を有するリノール酸は、Ｃ１８：２：９，１２シスと記載され得る。
【０１０２】
本発明の好ましい態様において、脂肪酸は、０〜６個の範囲の二重結合、例えば１〜５個の範囲の二重結合を有し、例えば、二重結合の数は、１、２、３又は４個の二重結合の群より選択される。本発明のより好ましい態様において、脂肪酸は、１又は３個の二重結合を有する。本発明の最も好ましい態様において、脂肪酸は、１個の二重結合を有する。
【０１０３】
飽和脂肪酸の例は以下である：
酪酸（ブタン酸）：ＣＨ３（ＣＨ２）２ＣＯＯＨ、又はＣ４：０
カプロン酸（ヘキサン酸）：ＣＨ３（ＣＨ２）４ＣＯＯＨ、又はＣ６：０
カプリル酸（オクタン酸）：ＣＨ３（ＣＨ２）６ＣＯＯＨ、又はＣ８：０
カプリン酸（デカン酸）：ＣＨ３（ＣＨ２）８ＣＯＯＨ、又はＣ１０：０
ラウリン酸（ドデカン酸）：ＣＨ３（ＣＨ２）１０ＣＯＯＨ、又はＣ１２：０
ミリスチン酸（テトラデカン酸）：ＣＨ３（ＣＨ２）１２ＣＯＯＨ、又はＣ１４：０
パルミチン酸（ヘキサデカン酸）：ＣＨ３（ＣＨ２）１４ＣＯＯＨ、又はＣ１６：０
ステアリン酸（オクタデカン酸）：ＣＨ３（ＣＨ２）１６ＣＯＯＨ、又はＣ１８：０
アラキジン酸（エイコサン酸）：ＣＨ３（ＣＨ２）１８ＣＯＯＨ、又はＣ２０：０
ベヘン酸（ドコサン酸）：ＣＨ３（ＣＨ２）２０ＣＯＯＨ、又はＣ２２：０
【０１０４】
不飽和脂肪酸が、本発明について好ましい。
【０１０５】
本発明において使用され得る不飽和脂肪酸の例としては、例えば以下が挙げられる：
オレイン酸：ＣＨ３（ＣＨ２）７ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＯＯＨ、又はＣ１８：１：９シス
リノール酸：ＣＨ３（ＣＨ２）４ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＯＯＨ、又はＣ１８：２：９，１２シス
α−リノレン酸：
ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＯＯＨ、又はＣ１８：３：９，１２，１５シス
アラキドン酸：
ＣＨ３（ＣＨ２）４ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）３ＣＯＯＨ、又はＣ２０：４
エイコサペンタエン酸、又はＣ２０：５
ドコサヘキサエン酸、又はＣ２２：６
エルカ酸：ＣＨ３（ＣＨ２）７ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）１１ＣＯＯＨ、又はＣ２２：１
バクセン酸：Ｃ１８：１：１１シス
パルミトレイン酸：１６：１：９シス
ペトロセリン酸：Ｃ１８：１：６シス
ステアリドン酸：Ｃ１８：４：６，９，１２，１５シス
ヘプタデセン酸  １７：１：１０シス
ステアリドン酸  １８：４：６，９，１２，１５シス
エイコセン酸  ２０：１：１１シス
【０１０６】
ある態様において、一価飽和酸は、α−ラクトアルブミンと複合体化されている。より好ましいのは、Ｃ１６：１：６シス及びトランス、Ｃ１６：１：９シス及びトランス、Ｃ１６：１：１１シス及びトランス、Ｃ１８：１：６シス又はトランス、Ｃ１８：１：９シス及びトランス、Ｃ１８：１：１１シス又はトランス、Ｃ１８：１：１３シス又はトランス、Ｃ２０：１：９シス及びトランス、Ｃ２０：１：１１シス及びトランス、Ｃ２０：１：１３シス及びトランスの群より選択される一価飽和酸である。
【０１０７】
好ましい態様において、α−ラクトアルブミンと複合体化された一価飽和酸は、Ｃ１６：１：６シス、Ｃ１６：１：９シス、Ｃ１６：１：１１シス、Ｃ１８：１：６シス、Ｃ１８：１：９シス、Ｃ１８：１：１１シス、Ｃ１８：１：１３シス、Ｃ２０：１：９シス、Ｃ２０：１：１１シス、Ｃ２０：１：１３シスの群より選択される脂肪酸のようにシスコンフォメーションにある。
【０１０８】
別の好ましい態様において、α−ラクトアルブミンと複合体化された脂肪酸は、好ましくはＣ１８：１：９シス、Ｃ１８：１：１１シス、Ｃ１８：１：６シス、Ｃ１６：１：９シス、Ｃ１８：３：６，９，１２シス、Ｃ１８：３：９，１２，１５シス、Ｃ１８：２：９，１２シスからなる群より選択される、シスコンフォメーションの不飽和脂肪酸である。
【０１０９】
別の好ましい態様において、α−ラクトアルブミンと複合体化された脂肪酸は、１〜５個の範囲のシス二重結合を含むＣ１６〜Ｃ２０脂肪酸からなる群より選択される。従って、脂肪酸は、例えば、バクセン酸Ｃ１８：１：１１シス、リノール酸Ｃ１８：２：９，１２シス、αリノレン酸Ｃ１８：３：９，１２，１５、パルミトレイン酸Ｃ１６：１：９シス、ヘプタデセン酸Ｃ１７：１：１０シス、γリノレン酸Ｃ１８：３：６，９，１２シス、ステアリドン酸Ｃ１８：４：６，９，１２，１５シス、エイコセン酸Ｃ２０：１：１１シス及びエイコサペンタエン酸Ｃ２０：５：５，８，１１，１４，１７シスからなる群より、例えば、バクセン酸Ｃ１８：１：１１シス、リノール酸Ｃ１８：２：９，１２シス、αリノレン酸Ｃ１８：３：９，１２，１５からなる群より選択され得る。
【０１１０】
本発明の非常に好ましい態様において、α−ラクトアルブミンと複合体化された脂肪酸は、不飽和Ｃ１６又はＣ１８脂肪酸、好ましくはＣ１８脂肪酸であり、ここで、全ての二重結合はシス二重結合である。この態様において、脂肪酸は、好ましくは、１個、例えば２個、例えば３個、例えば４個の二重結合を含み得、ここで、全ての二重結合はシス二重結合である。従って、脂肪酸は、例えば、Ｃ１８：１：９シス、Ｃ１８：１：１１シス、Ｃ１８：１：６シス、Ｃ１６：１：９シス、Ｃ１８：３：６，９，１２シス、Ｃ１８：３：９，１２，１５シス、Ｃ１８：２：９，１２シス及びＣ１８：４：６，９，１２，１５シスからなる群より選択され得、好ましくはＣ１８：１：９シス、Ｃ１８：１：１１シス、Ｃ１８：１：６シス、Ｃ１８：３：６，９，１２シス、Ｃ１８：３：９，１２，１５シス、Ｃ１８：２：９，１２シス及びＣ１８：４：６，９，１２，１５シスからなる群より選択され得、例えばＣ１８：１：９シス、Ｃ１８：１：１１シス、Ｃ１８：３：６，９，１２シス、Ｃ１８：３：９，１２，１５シス及びＣ１８：２：９，１２シスからなる群より選択され得る。
【０１１１】
最も好ましい脂肪酸は、本発明によれば、Ｃ１８：１：９シス及びＣ１８：１：１１シスである。Ｃ１８：１：９シスは、本発明の複合体について非常に好ましい。
【０１１２】
代替の態様において、多価不飽和酸（polysatued acid）がα−ラクトアルブミンと複合体化されている。好ましくは、多価不飽和酸（polysatuated acid）は、Ｃ１８：２：９，１２シス、Ｃ１８：３：９，１２，１５シス、Ｃ１８：３：６，９，１２シス、及びＣ２０：４：５，８，１１，１５シスの群より選択される。
【０１１３】
１態様において、脂肪酸は人工脂肪酸である。
【０１１４】
α−ラクトアルブミン中の脂肪酸又は脂質結合部位は、αヘリックスドメインとβシートドメインとの間の溝中に配置され得、これは、アポタンパク質において露出されるようになる。本出願人は、オレイン酸などの補因子が、αドメインとβドメインとの間の界面において結合し、結合された補因子酸が、αドメインがネイティブ様コンフォメーションを維持することを可能にさせながら、該分子のこの領域をロックすると考える。
【０１１５】
前記分子のこの領域は、３つの塩基性アミノ酸の１つ（Ｒ７０）がウシα−ラクトアルブミンにおいてＳ７０へ変化されており、従って１つの可能性のある配位性側鎖が排除されている点で、ウシタンパク質とヒトタンパク質とで相違する。
【０１１６】
活性複合体は、好ましくは、変更されたタンパク質折り畳みを好み、かつ、脂肪酸又は脂質補因子は利用可能である、ローカルな環境において作製される。
【０１１７】
α−ラクトアルブミン、好ましくはＬＡＣ、複合体組成物の製造
α−ラクトアルブミン組成物は、本発明によれば、任意の好適な方法によって製造され得る。α−ラクトアルブミンの天然供給源は、好ましくはウマ、ヤギ、ウシ及びブタの群、最も好ましくはウシより選択される、種々の哺乳動物種由来の乳である。又は、α−ラクトアルブミンは、組換えで作製され得（より詳しくは本明細書下記のセクション「組換え作製」を参照のこと）、又はいくつかの会社から商品として得ることができる。
【０１１８】
精製
タンパク質の精製は、一般的に、コンタミしている核酸、ファージ及び／又はウイルス、他のタンパク質及び／又は他の生体高分子の除去又は分離の１つ又はそれ以上の工程を含む。ＬＡを含む組成物、例えば乳又は宿主細胞の抽出物又は培養培地（本明細書以下のセクション「組換え作製」を参照のこと）からＬＡを得ることは、１つ又はそれ以上のタンパク質単離工程を含み得る。任意の好適なタンパク質単離工程が本発明で使用され得る。当業者は、一般的に、そのようなものが必要であれば、ＬＡについて有用なタンパク質単離工程を容易に同定することができる。
【０１１９】
本発明で有用なタンパク質単離工程は、例えば、クロマトグラフ法、例えば、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及び／又はアフィニティークロマトグラフィー；濾過法、例えば、ゲル濾過及び限外濾過；沈殿、例えば、硫安沈殿及び／又は勾配分離、例えば、ショ糖勾配分離を含む、タンパク質精製のために一般的に使用される方法であり得る。ＬＡの精製は、任意の組み合わせで上述の方法の１つ又はそれ以上を含み得る。
【０１２０】
上述の方法は当業者に周知であり、例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって作成されＧＥから入手可能である、表題“Antibody Purification”、“The Recombinant Protein Handbook”、“Protein Purification”、“Ion Exchange Chromatography”、“Affinity Chromatography”、“Hydrophobic Interaction Chromatography”、“Gel Filtration”、“Reversed Phase Chromatography”、“Expanded Bed Adsorption”及び“Chromatofocusing”を含む“Protein Separation Handbook Collection”に記載されるように行われ得る。
【０１２１】
特に、ＬＡの精製は、例えば、１つ又はそれ以上の遠心分離工程を含み得る。前記遠心分離は、例えば、脱脂目的のため及び／又は細胞／細胞残屑などを除去するため及び／又は沈殿物から上澄みを分離するために使用され得る。
【０１２２】
特に、ＬＡの精製は、例えば、１つ又はそれ以上の沈殿工程、例えば、硫酸アンモニウムを、例えば１０〜７５％、好ましくは３０〜６０％の範囲、例えば４０〜４５％の範囲の濃度で使用する沈殿を含み得る。沈殿が４０〜４５％の範囲の硫酸アンモニウム濃度を使用して行われる場合、ＬＡは、一般的に、上澄み中に存在する。
【０１２３】
ＬＡの精製は、１つ又はそれ以上の濾過工程、例えば、濾紙による濾過及び／又は０．１μｍ〜１００μｍの範囲、例えば０．５〜５０μｍの範囲、例えば０．５〜２０μｍの範囲、例えば０．５〜１μｍの範囲の細孔径を有する別のフィルターを使用する濾過を含み得る。
【０１２４】
ＬＡの精製は、１つ又はそれ以上のクロマトグラフィー工程、例えば、任意の上述のクロマトグラフ法を含み得る。１つの好ましい態様において、本方法は、疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む。
【０１２５】
組換え作製
ＬＡの機能的均等物は、好ましくは、組換えで作製される。野生型ＬＡもまた、１つの好ましい態様において、組換えで作製され得る。有用な組換え作製法としては、当該技術分野において公知の従来の方法、例えば、組換えタンパク質の作製に好適な大腸菌（E. coli）、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）又はＳ．ポンベ（S. pombe）又は昆虫又は哺乳動物細胞などの好適な宿主細胞における異種ＬＡ又はその機能的相同体の発現による方法が挙げられる（下記を参照のこと）。当業者は、一般的に、一般的には組換えタンパク質、具体的にはＬＡの作製のための有用な組換え技術を容易に同定することができる。
【０１２６】
１態様において、ＬＡは、トランスジーン植物又は動物において産生される。この文脈において、トランスジェニック植物又は動物は、ヒト若しくはウシＬＡ又はこの機能的相同体をコードする核酸を含有し発現するように遺伝子操作された植物又は動物を意味する。
【０１２７】
本発明の好ましい態様において、ＬＡ又はその機能的相同体は、宿主細胞によって組換えで作製される。
【０１２８】
従って、本発明の１局面において、ＬＡは、宿主細胞において発現を指示することができる第２核酸と作動可能に結合されたα−ラクトアルブミン又はその機能的相同体をコードする第１核酸配列を含む宿主細胞によって産生される。従って、第２核酸配列は、前記細胞において問題のタンパク質の発現を指示するプロモーターを含み得るか、又はこれからなってよい。当業者は、所定の宿主細胞における使用について有用な第２核酸配列を容易に同定することができる。
【０１２９】
組換えＬＡ又はその機能的相同体の製造方法は、一般的に、以下の工程を含む：
−  宿主細胞を提供する工程
−  宿主細胞において問題の前記タンパク質の発現を指示することができる第２核酸へ作動可能に連結されたＬＡ又はその機能的相同体をコードする第１核酸を含む遺伝子発現構築物を作製する工程
−  前記構築物で前記宿主細胞を形質転換する工程
−  前記宿主細胞を培養し、それによってＬＡ又はその機能的相同体を発現させる工程。
【０１３０】
従って、ＬＡを含む組成物は、前記宿主細胞の抽出物、又は前記宿主細胞の抽出物から及び／又は培養培地から精製された組成物であり得る。
【０１３１】
このようにして作製された組換えＬＡは、任意の従来の方法によって、例えば、本明細書において上述した任意のタンパク質精製方法によって単離され得る。当業者は、問題のタンパク質を精製するための好適なタンパク質単離工程を同定することができる。
【０１３２】
本発明の１態様において、組換えで作製されたＬＡ又はその機能的相同体は、宿主細胞によって分泌される。
【０１３３】
ＬＡ又はその機能的相同体が分泌される場合、問題の組換えタンパク質の製造方法は、以下の工程を含み得る：
−  宿主細胞を提供する工程
−  前記宿主細胞においてＬＡ又はその機能的相同体の発現を指示することができる第２核酸へ作動可能に連結されたＬＡ又はその機能的相同体をコードする第１核酸を含む遺伝子発現構築物を作製する工程
−  前記構築物で前記宿主細胞を形質転換する工程
−  培養培地において前記宿主細胞を培養し、それによって、ＬＡ又はその機能的相同体を発現させ、該培養培地中へ該タンパク質を分泌させる工程
−  それによってＬＡ又はその機能的相同体を含む培養培地を得る工程。
【０１３４】
従って、ＬＡ又はその機能的相同体を含む組成物は、本発明のこの態様において、前記培養培地又は前記培養培地から作製された組成物であり得る。
【０１３５】
本発明の別の態様において、前記組成物は、動物、その部分若しくは細胞から作製された抽出物、又はこのような抽出物の単離されたフラクションである。
【０１３６】
本発明の好ましい態様において、ＬＡは、宿主細胞においてインビトロで組換えによって作製され、細胞溶解物、細胞抽出物から、又は組織培養上澄みから単離される。より好ましい態様において、ＬＡは、それらが問題のタンパク質を発現するように修飾されている宿主細胞によって産生される。本発明のなおより好ましい態様において、前記宿主細胞は、ＬＡを産生し分泌するように形質転換される。
【０１３７】
従って、好ましい態様において、ＬＡ作製は、好ましくは組換え作製であり、ここで、ＬＡ産生は以下によって得られる：
−  宿主細胞において発現を指示することができる第２核酸へ作動可能に連結された、ヒト若しくはウシα−ラクトアルブミンペプチド又はその機能的相同体をコードする第１核酸を含む遺伝子発現構築物を作製すること
−  前記構築物で宿主細胞培養物を形質転換すること
−  培養培地において前記宿主細胞培養物を培養し、それによって、前記ポリペプチドを発現させ該培養培地中へ分泌させること
−  種々のα−ラクトアルブミン分子及び核酸を含む組成物を得ること。
【０１３８】
１態様において、ＬＡ作製は、好ましくは組換え作製であり、ここで、ＬＡ作製は以下によって得られる：
−  宿主細胞において発現を指示することができる第２核酸へ作動可能に連結された、ヒト若しくはウシα−ラクトアルブミンペプチド又はその機能的相同体をコードする第１核酸を含む遺伝子発現構築物を作製すること、
−  前記構築物で宿主細胞培養物を形質転換すること、
−  前記宿主細胞培養物をインビトロで又はトランスジェニック植物又は動物の形態で培養し、それによってＬＡを発現させること、
−  複数のＬＡ分子及び核酸を含む組成物を得ること。
【０１３９】
本発明に従って、α−ラクトアルブミンをコードする核酸は、ヒト又はウシα−ラクトアルブミン遺伝子から、又は本明細書上記に定義される他の動物種のα−ラクトアルブミン遺伝子から誘導され得る。
【０１４０】
好ましい態様において、遺伝子発現構築物は、哺乳動物細胞株又はトランスジェニック植物若しくは動物における発現に好適である。１態様において、宿主細胞培養物は、トランスジーン動物中において培養される。この文脈において、トランスジェニック植物又は動物は、本明細書上記に定義されるヒト若しくはウシα−ラクトアルブミン又はその機能的相同体をコードする核酸を含有し発現するように遺伝子操作された植物又は動物を意味する。
【０１４１】
好ましい態様において、本発明の遺伝子発現構築物は、ウイルス系ベクター、例えばＤＮＡウイルス系ベクター、ＲＮＡウイルス系ベクター、又はキメラウイルス系ベクターを含む。ＤＮＡウイルスの例は、サイトメガロウイルス、単純ヘルペス（Herpex Simplex）、エプスタイン・バーウイルス、シミアンウイルス４０、ウシパピローマウイルス、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウィルス、及びバキュロウィルスである。しかし、遺伝子発現構築物は、例えば、プラスミド系ベクターを含むだけであり得る。
【０１４２】
１局面において、本発明は、この機能的誘導体を含むヒト又はウシα−ラクトアルブミン遺伝子由来のイントロン配列を１つ又はそれ以上含むことを特徴とする、ヒト若しくはウシα−ラクトアルブミン又はその機能的相同体をコードする発現構築物を提供する。さらに、それは、ウイルス遺伝子又は哺乳動物及び昆虫遺伝子を含む真核生物遺伝子由来のプロモーター領域を含有し得る。
【０１４３】
プロモーター領域は、好ましくは、ネイティブなヒト又はウシα−ラクトアルブミンプロモーターとは異なるように選択され、好ましくはヒト又はウシα−ラクトアルブミンの収率を最適化するために、プロモーター領域は、問題のベクター及び宿主細胞で最適に機能するように選択される。
【０１４４】
好ましい態様において、プロモーター領域は、ラウス肉腫ウイルスの長い末端反復プロモーター、及びサイトメガロウイルス前初期プロモーター、及び延長因子１αプロモーターを含む群より選択される。
【０１４５】
別の態様において、プロモーター領域は、微生物、例えば他のウイルス、酵母及び細菌の遺伝子から誘導される。
【０１４６】
組換えＬＡ又はその機能的相同体のより高い収率を得るために、プロモーター領域は、エンハンサーエレメント、例えば、マウス血管内皮成長因子遺伝子の５’末端非翻訳領域のＱＢＩ  ＳＰ１６３エレメントを含み得る。
【０１４７】
本発明に従う組換えＬＡの１つの製造方法は、宿主細胞培養物が、真核生物のもの、例えば、哺乳動物細胞培養物又は酵母細胞培養物であり得ることを特徴とする。
【０１４８】
有用な哺乳動物細胞は、例えば、ヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ細胞）、例えば、番号ＣＲＬ−１５７３及びＣＲＬ−１０８５２でAmerican Type Culture Collectionに寄託された細胞株、トリ胚線維芽細胞、ハムスター卵巣細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ヒト子宮頸癌細胞、ヒトメラノーマ細胞、ヒト腎臓細胞、ヒト臍血管内皮細胞、ヒト脳内皮細胞、ヒト口腔腫瘍細胞、サル腎臓細胞、マウス線維芽細胞、マウス腎臓細胞、マウス結合組織細胞、マウスオリゴ樹状（oligodendritic）細胞、マウスマクロファージ、マウス線維芽細胞、マウス神経芽細胞腫細胞、マウスプレＢ細胞、マウスＢリンパ腫細胞、マウス形質細胞腫細胞、マウス奇形癌細胞、ラット星状細胞腫細胞、ラット乳腺上皮細胞、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、及びＮＩＨ  ３Ｔ３細胞であり得る。
【０１４９】
しかし、宿主細胞は、原核生物細胞又は酵母細胞のいずれかであることが好ましい。原核生物細胞は、例えば、大腸菌であり得る。酵母細胞は、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces）、ピキア（Pichia）又はハンセヌラ（Hansenula）であり得る。
【０１５０】
組換えで作製されたα−ラクトアルブミンが本発明で使用される場合、組換えで作製されたα−ラクトアルブミンは、天然のα−ラクトアルブミンと同様のサイズ分布プロフィールを有することが好ましい。
【０１５１】
上述の方法は当業者に周知であり、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, 2001, John Wiley and Sons, Inc., Frederick M. Ausubel et al.編に記載されるように行われ得る。
【０１５２】
組換えで作製されたＬＡは、例えば、本明細書上記のセクション“α−ラクトアルブミンの精製”に記載されるように精製され得、組換えで作製されたＬＡは、例えば本明細書以下に記載されるように、ＬＡＣを作製するために使用され得る。
【０１５３】
α−ラクトアルブミン複合体の製造方法
本発明に従うＬＡＣは、α−ラクトアルブミンと脂肪酸又は脂質との活性複合体である。当業者に公知の機能アッセイは、脂肪酸又は脂質と複合体化したα−ラクトアルブミンの機能的活性を確認するために使用され得る。当業者に公知のα−ラクトアルブミン機能を評価するための機能アッセイとしては、本明細書上記並びに実施例６及び７に記載のアッセイ、例えば、殺細胞アッセイ又はヒストンアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５４】
牛乳から出発する、α−ラクトアルブミン複合体、好ましくはＬＡＣ、組成物の好ましい製造方法は、遠心分離、沈殿、濾過及び疎水性相互作用クロマトグラフィーの工程を含み得る。乳からのα−ラクトアルブミンの好ましい製造方法を、実施例１に記載する。α−ラクトアルブミンの精製に続いて、α−ラクトアルブミンはα−ラクトアルブミン複合体、好ましくはＬＡＣへ変換される。この変換は、α−ラクトアルブミンからのＣａ2+イオンの放出を含む一連の工程によって行われ得る。次いで、α−ラクトアルブミンは、例えばイオン交換マトリックス上の、脂質補因子に結合される。第３に、活性複合体は、例えば、高塩濃度を使用する溶離によって、単離され得る（実施例１を参照のこと）。
【０１５５】
カルシウムの放出
カルシウムの放出は、当業者に公知の任意の好適な方法によって得られ得る。
【０１５６】
１態様において、カルシウムの放出は、ＬＡをカルシウムキレート剤と接触させることによって達成され得る。カルシウムキレート剤は、１，２−ビス（２−アミノフェノキシ）−エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＢＡＰＴＡ）又はエチレングリコール−ビス（アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）又はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含むがこれらに限定されないカルシウムキレート剤の群より選択され得る。本発明の非常に好ましい態様において、カルシウムキレート剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である。
【０１５７】
１つの好ましい態様において、カルシウムキレート剤は、エチレンジアミン四酢酸である。
【０１５８】
本発明の特定の態様において、カルシウムの放出は、α−ラクトアルブミンの機能的相同体を使用することによって得られ、ここで、カルシウム結合部位が、α−ラクトアルブミンの機能的相同体がカルシウムに結合する能力を低下させる様式で修飾されている。特に、カルシウム結合部位のアミノ酸（Ｋ７９、Ｄ８２、Ｄ８４、Ｄ８７及びＤ８８）は、カルシウムについての親和性が低下されるように、又はそれがもはや機能的ではなくなるように、修飾され得る。この特定の態様において、ＬＡからのカルシウムの放出を含む工程は、もはや用いられず、ＬＡＣへのＬＡの変換は、アニオン交換媒体への同時の又は後の曝露を伴う、ＬＡへの脂肪酸又は脂質の結合から構成される。
【０１５９】
α−ラクトアルブミン組成物は、ポリアクリルゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、免疫ブロット法（ウエスタンブロット法）及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、又はα−ラクトアルブミン組成物の内容物が分析され得る任意の他の方法を使用して、さらに分析され得る。ポリアクリルゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、免疫ブロット法（ウエスタンブロット法）及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用するα−ラクトアルブミン組成物の分析を、図３及び４に示す。
【０１６０】
続いて、精製されたα−ラクトアルブミン複合体は、高濃度のα−ラクトアルブミン複合体の安定な溶液を得るために、濾過、濃縮及び緩衝剤交換され得る。
【０１６１】
好ましい態様において、組成物は、０．０１〜９０％の食塩水組成物、例えば０．１〜８０％ＮａＣｌ、例えば０．２〜７０％ＮａＣｌ、例えば０．３〜６０％ＮａＣｌ、例えば０．４〜５０％ＮａＣｌ、例えば０．５〜４０％ＮａＣｌ、例えば０．６〜３０％ＮａＣｌ、例えば０．７〜２０％ＮａＣｌ、例えば０．８〜１０％ＮａＣｌ、例えば０．８５〜５％ＮａＣｌ、例えば約０．９％ＮａＣｌである。好ましい態様において、組成物は０．９％ＮａＣｌ溶液である。
【０１６２】
本発明に従うα−ラクトアルブミン複合体、好ましくはＬＡＣ、組成物は、好ましくは、１ｍｇ／ｍｌを超える、例えば２ｍｇ／ｍｌを超える、好ましくは５ｍｇ／ｍｌを超える、例えば６ｍｇ／ｍｌ又は７ｍｇ／ｍｌを超える、例えば８ｍｇ／ｍｌを超える、より好ましくは約９ｍｇ／ｍｌの濃度を有する。別の態様において、本発明に従うα−ラクトアルブミン複合体、好ましくはＬＡＣ、組成物は、好ましくは、約７ｍｇ／ｍｌの濃度を有する。
【０１６３】
本出願人は、理論によって拘束されないが、α−ラクトアルブミン複合体、好ましくはＬＡＣ、組成物中の単量体／多量体α−ラクトアルブミンの比率は、変換手順に供される単量体／多量体α−ラクトアルブミンの比率によって制御されることを見出した。従って、α−ラクトアルブミンの最初の精製手順から得られる単量体／多量体α−ラクトアルブミンの比率が重要である。実施例１において、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）のアウトプットは、図３Ａにおいて見られるように、主に単量体であり、単量体α−ラクトアルブミン複合体組成物へ至り（図３Ｂ）、一方、混合された単量体／多量体α−ラクトアルブミン組成物を与える精製手順は、混合された単量体／多量体α−ラクトアルブミン複合体組成物を生じさせる（データを示さず）。実施例１において適用される方法において、α−ラクトアルブミンは、６ｍｇ／ｍｌゲル（９０ｍｇ／ｃｍ2）のロードでのＨＩＣに続いて得られ、一方、混合された単量体／多量体α−ラクトアルブミン組成物は、２ｍｇ／ｍｌゲル（３２ｍｇ／ｃｍ2）のロードでのＨＩＣに続いて得られた。単量体α−ラクトアルブミン複合体の製造は、高濃度の出発生成物によって好まれ得、それによって、中間のＨＩＣ精製されるα−ラクトアルブミンは、単量体形態のα−ラクトアルブミン複合体を生じさせる変換に好適な単量体形態で得られる。
【０１６４】
従って、本発明のある局面は、多量体又はオリゴマーＬＡＣの含有量と比較して、９５％（質量％）を超える単量体α−ラクトアルブミン複合体、好ましくはＬＡＣを含む本発明に従う組成物の製造方法に関する。
【０１６５】
ある態様は、α−ラクトアルブミンと脂肪酸又は脂質との単量体複合体である単量体ＬＡＣを含む組成物の製造方法であって、該α−ラクトアルブミンが配列番号１若しくは配列番号２のウシ若しくはヒトα−ラクトアルブミン又はその機能的均等物であり、該組成物が単量体α−ラクトアルブミンを少なくとも５０質量％含み、以下の工程：
ｂ．単量体α−ラクトアルブミンを少なくとも９５質量％含むα−ラクトアルブミン組成物を得る工程、
ｃ．以下によって該α−ラクトアルブミンをＬＡＣへ変換する工程
ｉ．該α−ラクトアルブミンからのカルシウムの放出、及び
ｉｉ．該α−ラクトアルブミンへの脂肪酸又は脂質の結合、並びに
ｄ．ＬＡＣを精製する工程
を含む方法に関する。
【０１６６】
工程ｃｉ及びｃｉｉは、任意の順序で連続して、又は同時に、行われ得る。
【０１６７】
単量体α−ラクトアルブミンを少なくとも９５質量％含むα−ラクトアルブミン組成物は、好ましくは、疎水性相互作用クロマトグラフィーによって得られ得、ここで、カラムに２ｍｇ／ｍｌ超、好ましくは４ｍｇ／ｍｌ超、例えば少なくとも６ｍｇ／ｍｌがロードされる。ロードは、代わりにｍｇ／ｃｍ2で測定され得、それによって、好ましいロードは、４０ｍｇ／ｃｍ2超、例えば５０ｍｇ／ｃｍ2超又は好ましくは６０ｍｇ／ｃｍ2超である。なおさらに好ましいのは、７０ｍｇ／ｃｍ2超又は８０ｍｇ／ｃｍ2超のロードである。
【０１６８】
ある態様において、α−ラクトアルブミン複合体、好ましくはＬＡＣの製造のために本発明で使用される方法は、例えばデンマーク特許出願PA 2007 00693の実施例３及び４に記載されるような、クロマトグラフィーによるα−ラクトアルブミン複合体へのα−ラクトアルブミンの変換を含む。これらの態様において、より高いロードのα−ラクトアルブミン及び高い収率のα−ラクトアルブミン複合体、好ましくはＬＡＣが達成され得る。
【０１６９】
従って、ＬＡＣの作製のために、変換用のカラムに、２０ｍｇを超えるα−ラクトアルブミン／ｃｍ2イオン交換媒体、例えば少なくとも３０ｍｇ／ｃｍ2、例えば４０ｍｇ／ｃｍ2を超える、例えば少なくとも５０ｍｇ／ｃｍ2、例えば６０ｍｇ／ｃｍ2を超える、例えば少なくとも７０ｍｇ／ｃｍ2、例えば８０ｍｇ／ｃｍ2を超える、例えば少なくとも９０ｍｇのα−ラクトアルブミン／ｃｍ2イオン交換媒体がロードされ得る。本発明のある態様において、上述のロードでのラクトアルブミン複合体の収率は、少なくとも５０％、例えば少なくとも５５％、例えば６０％超、例えば少なくとも６５％、例えば７０％超、例えば少なくとも７５％、例えば８０％超である。従って、１つの好ましい態様において、ロードが３０ｍｇ  α−ラクトアルブミン／ｃｍ2イオン交換媒体である場合、収率は、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、例えば少なくとも７５、例えば少なくとも８０％である。ロードが４２ｍｇ  α−ラクトアルブミン／ｃｍ2イオン交換媒体である場合、収率は、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、例えば少なくとも７５、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％であることも好ましい。別の態様において、ロードが９０ｍｇ  α−ラクトアルブミン／ｃｍ2イオン交換媒体である場合、収率は、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、例えば少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、例えば少なくとも７５、例えば少なくとも８０％であることが好ましい。
【０１７０】
さらに好ましいのは、組成物が、もしあれば、ほんの僅かしかコンタミしているタンパク質などの生体高分子を含まないことである。従って、組成物のタンパク質の少なくとも５０質量％、例えば少なくとも６０質量％、例えば少なくとも７０質量％、例えば少なくとも８０質量％、例えば少なくとも９０質量％がＬＡＣであることが好ましい。
【０１７１】
細胞傷害性
背景セクションにおいて記載したように、多量体α−ラクトアルブミン（ＭＡＬ）又はＨＡＭＬＥＴは、細菌及びウイルス感染に対するその効果に加えて、癌細胞及び未熟細胞に対して選択的細胞傷害活性を有することが実証された。活性複合体の形成は、補因子オレイン酸に依存し、環境からのｃａ2+の減少によって刺激されることが示された。
【０１７２】
本出願人は、ここで、癌細胞に対して同様の細胞傷害活性を有する単量体α−ラクトアルブミン複合体、好ましくはＬＡＣの製造を記載する。単量体α−ラクトアルブミン複合体、好ましくはＬＡＣ組成物の細胞傷害性は、当該技術分野において周知である、任意の好適な細胞傷害性アッセイを使用して評価され得る。このようなアッセイのある例、即ち、ＶｉａＬｉｇｈｔアッセイを実施例２に記載する。手順の概観を図５に概説する。
【０１７３】
所定の細胞集団の５０％を殺すことができるα−ラクトアルブミンの用量は、測定されるルミネセンスデータに基づいて算出される。α−ラクトアルブミン組成物の効力は、ＬＤ５０用量によって反映され、ここで、低いＬＤ５０用量が、高い効力を有する組成物、即ち、癌細胞を殺すことにおいて非常に有効な組成物についての特徴である。この状況において、癌細胞株Ｌ１２１０が使用されるが、いくつかの異なる細胞株が前記目的について好適であることは明らかである。このような分析からの結果を、図６及び７に並びに実施例２、表１において表形式で表す。
【０１７４】
ある態様において、α−ラクトアルブミン複合体、好ましくはＬＡＣ組成物のＬＤ５０として測定される細胞傷害活性は、１５μｇ未満／７０μｌ中１００．０００細胞である。好ましい態様において、ＬＤ５０は、１０μｇ未満／７０μｌ中１００．０００細胞である。本発明に従うα−ラクトアルブミン複合体、好ましくはＬＡＣ組成物は、より好ましくは、５μｇ未満／１００．０００細胞のＬＤ５０として測定される細胞傷害活性を有する。最も好ましいのは、ＬＤ５０として測定される細胞傷害活性が１〜５μｇ／７０μｌ中１００．０００細胞である組成物である。
【０１７５】
ＬＤ５０は、所定の容積中の細胞集団の５０％を殺すために必要とされるα−ラクトアルブミン複合体、好ましくはＬＡＣ組成物の量などの、化合物の濃度として算出され得る。実施例２表１に示される結果は、本発明に従う組成物は、好ましくは、７０μｌ中１００，０００細胞の細胞集団について測定した場合に０．１ｍｇ／ｍｌ未満のＬＤ５０濃度、例えば、７０μｌ中１００，０００細胞の細胞集団について測定した場合に０．９ｍｇ／ｍｌ未満のＬＤ５０を有することを示している。特に好ましい態様において、７０μｌ中１００，０００細胞の細胞集団について測定した場合に０．０８未満のＬＤ５０濃度、より好ましくは０．０６未満、最も好ましくは７０μｌ中１００，０００細胞の細胞集団について測定した場合に０．０４ｍｇ／ｍｌ未満である。
【０１７６】
薬学的製剤
本発明の組成物を含有する薬学的組成物は、従来の技術によって、例えば、Remington:
The Science and Practice of Pharmacy 1995, E. W. Martin編, Mack Publishing Company, 19th edition, Easton, Pa.に記載されるように作製され得る。組成物は、従来の形態、例えば、カプセル剤、錠剤、エアロゾル、液剤、懸濁剤又は局所適用であり得る。
【０１７７】
用語「医薬」及び「薬学的組成物」は、本明細書において交換可能に使用される。
【０１７８】
本発明は、α−ラクトアルブミン複合体、好ましくはＬＡＣを含む薬学的組成物を提供する。
【０１７９】
１局面において、本発明は、薬学的組成物に関する。薬学的組成物は、特定の薬学的組成物についての目的に応じて、多数の異なる様式で製剤化され得る。
【０１８０】
例えば、薬学的組成物は、それが特定の投与形態について有用となる様式で製剤化され得る。好ましい投与形態は、本明細書以下に記載される。
【０１８１】
１態様において、薬学的組成物は、それが液体となるように製剤化される。例えば、組成物はタンパク質溶液であり得、又は組成物はタンパク質懸濁液であり得る。前記液体は、非経口投与について、例えば注射又は注入について好適であり得る。
【０１８２】
液体は任意の有用な液体であり得るが、しばしば、液体は水性液体であることが好ましい。多くの目的について、特に液体が非経口投与について使用される場合、液体は無菌であることがさらに好ましい。無菌は、任意の従来の方法、例えば濾過、照射又は加熱によって与えられ得る。さらに、特に液体が非経口投与について製剤化される場合、液体はウイルス低減工程へ供されていることが好ましい。
【０１８３】
ウイルス低減は、例えば、ナノ濾過、又は、好適なフィルター、例えばいくつかの層からなるＰｌａｎｏｖａフィルターでのウイルス濾過によって行われ得る。Ｐｌａｎｏｖａフィルターは、任意の好適なサイズ、例えば、７５Ｎ、３５Ｎ、２０Ｎ又は１５Ｎであり得、又は、異なるサイズのフィルター、例えばＰｌａｎｏｖａ２０Ｎが使用され得る。ウイルス低減はまた、別のフィルターを用いての、例えば０．０１〜１μｍの範囲、例えば０．０５〜０．５μｍの範囲、例えば約０．１μｍの細孔径を有するフィルターを使用しての、プレ濾過工程を含み得る。ウイルス低減はまた、酸処理工程を含み得る。
【０１８４】
薬学的組成物は、使用者により便利であり得る、単回投薬単位に包装され得る。従って、ボーラス注射用の薬学的組成物は、例えば多くても１０ｍｌ、好ましくは多くても８ｍｌ、より好ましくは多くても６ｍｌ、例えば多くても５ｍｌ、例えば多くても４ｍｌ、例えば多くても３ｍｌ、例えば約２．２ｍｌの投薬単位で包装され得る。
【０１８５】
薬学的組成物は、任意の好適な容器に包装され得る。１例において、薬学的組成物の単回投薬量が、注射器又は注入に有用な容器に包装され得る。
【０１８６】
本発明の別の態様において、薬学的組成物は、乾燥組成物である。乾燥組成物は、そのまま使用され得るが、大抵の目的について、該組成物は、貯蔵のみについての乾燥組成物である。使用前に、乾燥組成物は、好適な液体組成物、例えば滅菌水に溶解又は懸濁され得る。
【０１８７】
本発明に従う薬学的組成物はまた、ＬＡＣ、例えば本明細書上記に記載の任意のＬＡＣをコードする第１核酸配列を含み得る。第１核酸配列は、薬学的組成物で治療される個体において、より好ましくは罹患している該個体の細胞において、第１核酸配列の発現を指示する第２核酸配列と好ましくは作動可能に結合されている。従って、第２核酸配列はヒトにおいて第１核酸配列の発現を指示し得ることが好ましい。臨床状態が癌である本発明の態様において、第２核酸配列は、悪性細胞などの癌細胞において第１核酸配列の発現を指示し得ることが好ましい。第１及び第２核酸配列は好適なベクター中に含まれることがさらに好ましい。
【０１８８】
薬学的組成物が、例えばローション、クリーム、軟膏剤、スプレー、例えばエアロゾルスプレー又は鼻腔用スプレー、直腸坐剤又は膣坐剤、点滴剤、例えば点眼剤又は点鼻剤、パッチ、密封包帯などの形態で、部位の部位へ局所的に適用され得ることも本発明に含まれる。
【０１８９】
薬学的に許容される添加剤
α−ラクトアルブミン複合体、好ましくはＬＡＣを含有する薬学的組成物は、任意の従来の技術によって、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy 1995, E. W. Martin編, Mack Publishing Company, 19th edition, Easton, Paに記載されるように、製造され得る。
【０１９０】
用語「医薬」及び「薬学的組成物」は、本明細書において交換可能に使用される。
【０１９１】
薬学的に許容される添加剤は、任意の通常使用される薬学的に許容される添加剤であり得、これらは、特定の製剤、意図される投与経路などに応じて選択される。例えば、薬学的に許容される添加剤は、Nemaら，1997年に記載される任意の添加剤であり得る。さらに、薬学的に許容される添加剤は、例えばインターネットアドレスhttp://www.fda.gov/cder/drug/iig/default.htmにおいて入手可能である、ＦＤＡの“inactive ingredients list”からの任意の承認された添加剤であり得る。
【０１９２】
本発明のある態様において、薬学的組成物は等張剤を含むことが望ましい。特に、薬学的組成物が注射又は注入による投与について作製される場合、等張剤が添加されることがしばしば望ましい。
【０１９３】
従って、組成物は、等張剤である薬学的に許容される添加剤を少なくとも１つ含み得る。
【０１９４】
薬学的組成物は、等張、低張、又は高張であり得る。しかし、注入又は注射用の薬学的組成物は、それが投与される際に、本質的に等張であることがしばしば好ましい。従って、貯蔵について、薬学的組成物は、好ましくは、等張又は高張であり得る。薬学的組成物が貯蔵について高張である場合、それは、投与前に、等張溶液となるように希釈され得る。
【０１９５】
等張剤は、塩などのイオン性等張剤、又は炭水化物などの非イオン性等張剤であり得る。
【０１９６】
イオン性等張剤の例としては、ＮａＣｌ、ＣａＣｌ2、ＫＣｌ及びＭｇＣｌ2が挙げられるが、これらに限定されない。非イオン性等張剤の例としては、マンニトール及びグリセロールが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９７】
しかし、本発明の他の態様において、薬学的組成物は、緩衝剤を全く含まないか、又は緩衝剤をマイクロモル量だけ含む場合がある。
【０１９８】
好ましい態様において、緩衝剤はＴＲＩＳである。ＴＲＩＳ緩衝剤は、種々の他の名称、例えば、トロメタミンＵＳＰを含むトロメタミン、ＴＨＡＭ、トリズマ、トリスアミン、トリスアミノ及びトロメタモールで公知である。名称ＴＲＩＳは、上述の名称全てを含む。
【０１９９】
特に薬学的製剤が非経口用途用である場合、緩衝剤は、さらに例えば、非経口用途についてのＵＳＰ適合緩衝剤より選択され得る。例えば、緩衝剤は、一塩基酸、例えば、酢酸、安息香酸、グルコン酸、グリセリン酸及び乳酸、二塩基酸、例えば、アコニット酸、アジピン酸、アスコルビン酸、炭酸、グルタミン酸、リンゴ酸、コハク酸及び酒石酸、多塩基酸、例えば、クエン酸及びリン酸、並びに塩基、例えば、アンモニア、ジエタノールアミン、グリシン、トリエタノールアミン、及びＴＲＩＳからなる群より選択され得る。
【０２００】
薬学的組成物は、安定剤である薬学的に許容される添加剤を少なくとも１つ含み得る。
【０２０１】
例えば、安定剤は、ポロキサマー、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｔｗｅｅｎ−４０、Ｔｗｅｅｎ−６０、Ｔｗｅｅｎ−８０、Ｂｒｉｊ、金属イオン、アミノ酸、ポリエチレングリコール、Ｔｒｉｔｏｎ、ＥＤＴＡ、アスコルビン酸、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ＮＰ４０又はＣＨＡＰＳからなる群より選択され得る。
【０２０２】
本発明に従う薬学的組成物はまた、凍結保護剤を１つ又はそれ以上含み得る。特に、組成物が凍結乾燥タンパク質を含むか又は組成物が凍結状態で保存される場合、薬学的組成物へ凍結保護剤を添加することが望ましい場合がある。
【０２０３】
凍結保護剤は、任意の有用な凍結保護剤であり得、例えば、凍結保護剤は、デキストラン、グリセリン、ポリエチレングリコール、スクロース、トレハロース及びマンニトールからなる群より選択され得る。
【０２０４】
従って、薬学的に許容される添加剤は、等張塩、高張塩、緩衝剤及び安定剤からなる群より選択される１つ又はそれ以上を含み得る。さらに、薬学的に許容される添加剤は、等張剤、緩衝剤、安定剤及び凍結保護剤からなる群より選択される１つ又はそれ以上を含み得る。例えば、薬学的に許容される添加剤は、グルコース一水和物、グリシン、ＮａＣｌ及びポリエチレングリコール３３５０を含む。
【０２０５】
製剤
本発明の組成物が未加工の組成物として投与されることが可能である一方、薬学的製剤の形態でそれを提示することが好ましい。従って、本発明は、さらに、本明細書に定義される、本発明の組成物又はその薬学的に許容される塩、並びにそれについての薬学的に許容される担体を含む、医薬適用のための、薬学的製剤を提供する。
【０２０６】
経口投与
本発明の組成物は、多種多様の経口投与投薬形態で製剤化され得る。薬学的組成物及び投薬形態は、活性成分として本発明の組成物又はその薬学的に許容される塩若しくはその結晶形態を含み得る。薬学的に許容される担体は、固体又は液体のいずれかであり得る。固体形態調製物としては、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、カシェ剤、坐剤、及び分散性顆粒剤が挙げられる。固体担体は、希釈剤、矯味矯臭剤、可溶化剤、滑沢剤、懸濁化剤、結合剤、防腐剤、湿潤剤、錠剤崩壊剤、又はカプセル化材料としても機能し得る１つ又はそれ以上の物質であり得る。
【０２０７】
好ましくは、組成物は、約０．５質量％〜７５質量％が本発明の組成物であり、残りは、好適な薬学的賦形剤からなる。経口投与について、このような賦形剤としては、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石、セルロース、グルコース、ゼラチン、スクロース、炭酸マグネシウムなどが挙げられる。
【０２０８】
散剤中において、担体は、細かく分割された固体であり、これは、細かく分割された活性成分との混合物である。錠剤中において、活性成分は、必要な結合能を有する担体と好適な割合で混合されており、所望の形状及びサイズに圧縮されている。散剤及び錠剤は、好ましくは、活性組成物を１〜約７０％含有する。好適な担体は、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、砂糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、デンプン、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロールナトリウム、低融点ワックス、ココアバターなどである。用語「作製」は、活性成分が、担体有り又は無しで、それと結合されている担体によって囲まれているカプセル剤を提供する、担体としてのカプセル化材料を用いての活性組成物の製剤化を含むように意図される。同様に、カシェ剤及びロゼンジも含まれる。錠剤、散剤、カプセル剤、丸剤、カシェ剤、及びロゼンジが、経口投与に好適な固体形態であり得る。複数単位投薬量顆粒剤（multiple-unit-dosage granule）も同様に作製され得る。上記コアの錠剤及び顆粒剤は、砂糖の濃縮溶液などでコーティングされ得る。コアはまた、胃腸管における溶解速度を変化させるポリマー、例えば、５．５を超えるｐｋａを有するアニオン性ポリマーでコーティングされ得る。このようなポリマーは、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、セルロースアセテートフタレート、並びに商標Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｓ１００及びＬ１００で販売されているポリマーである。ゼラチンカプセル剤の作製において、これらは軟質又は硬質であり得る。前者の場合、活性化合物はオイルと混合され、後者の場合は、複数単位投薬量顆粒剤がその中に充填される。
【０２０９】
本発明に従う点滴剤は、滅菌又は非滅菌水性又は油性溶液又は懸濁液を含み得、場合により殺菌剤及び／又は殺真菌剤及び／又は任意の他の好適な防腐剤を含み、場合により界面活性剤を含む、好適な水性溶液に有効成分を溶解することによって作製され得る。得られた溶液は、次いで、濾過によって浄化され得、好適な容器へ移され、これは次いで密封され、半時間９８〜１００℃でオートクレーブ処理するか又は維持することによって滅菌される。又は、前記溶液は、濾過によって滅菌され、無菌的に容器へ移され得る。点滴剤に含めるために好適である殺菌剤及び殺真菌剤の例は、硝酸フェニル水銀又は酢酸フェニル水銀（０．００２％）、塩化ベンザルコニウム（０．０１％）及び酢酸クロルヘキシジン（０．０１％）である。任意の油性溶液の作製についての好適な溶媒としては、グリセロール、希釈アルコール及びプロピレングリコールが挙げられる。
【０２１０】
使用直前に経口投与用の液体形態調製物へ変換されることが意図される固体形態調製物もまた含まれる。このような液体形態としては、溶液、懸濁液、及びエマルジョンが挙げられる。これらの調製物は、活性成分に加えて、着色剤、フレーバー、安定剤、緩衝剤、人工及び天然甘味料、分散剤、増粘剤、可溶化剤などを含有し得る。
【０２１１】
経口投与について好適な他の形態としては、エマルジョン、シロップ剤、エリキシル剤、水溶液、水性懸濁剤、練り歯磨き、ゲル歯磨き、チューインガムを含む液体形態調製物、又は使用直前に液体形態調製物へ変換されるように意図される固体形態調製物が挙げられる。エマルジョンは、プロピレングリコール水溶液中の溶液で作製され得、又は、レシチン、ソルビタンモノオレエート、又はアカシアなどの乳化剤を含有し得る。水溶液は、水に活性成分を溶解し、好適な着色剤、フレーバー、安定剤及び増粘剤を添加することによって、作製され得る。水性懸濁剤は、天然又は合成ゴム、樹脂、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、及び他の周知の懸濁化剤などの粘性材料と共に、水に、細かく分割された活性成分を分散させることによって、作製され得る。固体形態調製物としては、液剤、懸濁剤、及びエマルジョンが挙げられ、活性成分に加えて、着色剤、フレーバー、安定剤、緩衝剤、人工及び天然甘味料、分散剤、増粘剤、可溶化剤などを含有し得る。
【０２１２】
非経口投与
本発明の組成物は、（例えば、注射、例えばボーラス注射又は持続注入による）非経口投与について製剤化され得、添加された防腐剤を含む、アンプル、予め充填された注射器、少容量注入、又は複数用量容器での、単位用量形態で提示され得る。組成物は、油性又は水性ビヒクル中の、懸濁液、溶液、又はエマルジョン、例えば、水性ポリエチレングリコール中の溶液などの形態をとり得る。油性又は非水性担体、希釈剤、溶媒若しくはビヒクルの例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油）、及び注射可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）が挙げられ、製剤化剤（formulatory agent）、例えば、保存剤、湿潤剤、乳化剤若しくは懸濁化剤、安定剤及び／又は分散剤を含有し得る。又は、有効成分は、好適なビヒクル、例えば発熱物質を含まない滅菌水を用いての使用前の構築のための、溶液からの凍結乾燥によって又は滅菌固体の無菌単離によって得られる、粉末形態であり得る。
【０２１３】
非経口製剤において有用なオイルとしては、石油、動物油、植物油、又は合成油が挙げられる。このような製剤において有用なオイルの具体例としては、落花生油、大豆油、ゴマ油、綿実油、トウモロコシ油、オリーブ油、ペトロラタム、及び鉱油が挙げられる。非経口製剤における使用のための好適な脂肪酸としては、オレイン酸、ステアリン酸、及びイソステアリン酸が挙げられる。オレイン酸エチル及びミリスチン酸イソプロピルは、好適な脂肪酸エステルの例である。
【０２１４】
非経口製剤における使用について好適な石鹸としては、脂肪アルカリ金属、アンモニウム及びトリエタノールアミン塩が挙げられ、好適な洗剤としては、（ａ）陽イオン洗剤、例えば、ジメチルジアルキルアンモニウムハライド、及びアルキルピリジニウムハライド；（ｂ）陰イオン洗剤、例えば、アルキル、アリール、及びオレフィンスルホネート、アルキル、オレフィン、エーテル、及びモノグリセリドスルフェート、及びスルホスクシーネート、（ｃ）非イオン洗剤、例えば、脂肪アミンオキシド、脂肪酸アルカノールアミド、及びポリオキシエチレンポリプロピレンコポリマー、（ｄ）両性洗剤、例えば、アルキル−β−アミノプロピオネート、及び２−アルキル−イミダゾリン第四級アンモニウム塩、並びに（ｅ）それらの混合物が挙げられる。
【０２１５】
非経口製剤は、典型的に、溶液中において有効成分を約０．５〜約２５質量％含有する。防腐剤及び緩衝剤が使用され得る。注射部位での炎症を最小化又は排除するために、このような組成物は、約１２〜約１７の親水性・親油性バランス（ＨＬＢ）を有する非イオン性界面活性剤を１つ又はそれ以上含有し得る。このような製剤中の界面活性剤の量は、典型的に約５〜約１５質量％の範囲にある。好適な界面活性剤としては、ポリエチレンソルビタン脂肪酸エステル、例えばソルビタンモノオレエート、及び、プロピレンオキシドとプロピレングリコールとの縮合によって形成される、疎水性塩基を有するエチレンオキシドの高分子量付加物が挙げられる。非経口製剤は、単位用量又は複数用量の密封容器、例えば、アンプル及びバイアルに提示され得、使用の直前に、注射用の滅菌液体賦形剤、例えば水の添加のみを必要とする、フリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存され得る。即席の注射溶液及び懸濁液は、以前に記載された種類の滅菌散剤、顆粒剤、及び錠剤から調製され得る。
【０２１６】
局所投与
本発明の組成物はまた、局所的に送達され得る。局所投与についての領域としては、皮膚表面、並びにまた膣、直腸、鼻、口及び喉の粘膜組織が挙げられる。皮膚及び粘膜を介しての局所投与のための組成物は、炎症の徴候、例えば、腫脹又は赤みを引き起こさないべきである。
【０２１７】
局所組成物は、局所投与に適合された薬学的に許容される担体を含み得る。従って、組成物は、例えば、懸濁剤、液剤、軟膏剤、ローション、性的潤滑剤、クリーム、フォーム、エアロゾル、スプレー、坐剤、インプラント、吸入剤、錠剤、カプセル剤、乾燥粉末、シロップ剤、香膏又はロゼンジの形態をとり得る。このような組成物を作製するための方法は、製薬産業において周知である。
【０２１８】
本発明の組成物は、軟膏剤、クリーム又はローションとして、又は経皮パッチとして、表皮への局所投与用に製剤化され得る。軟膏剤及びクリームは、例えば、好適な増粘剤及び／又はゲル化剤の添加を伴って水性又は油性基剤を用いて製剤化され得る。ローションは、水性又は油性基剤を用いて製剤化され得、一般的に、乳化剤、安定剤、分散剤、懸濁化剤、増粘剤、又は着色剤も１つ又はそれ以上含有する。口腔における局所投与について好適な製剤としては、風味付けされた基剤、通常はスクロース及びアカシア又はトラガカント中に活性薬剤を含むロゼンジ；不活性基剤、例えば、ゼラチン及びグリセリン又はスクロース及びアカシア中に有効成分を含む香錠；並びに好適な液体担体中に有効成分を含むうがい薬が挙げられる。
【０２１９】
本発明に従うクリーム、軟膏剤又はペーストは、外用の有効成分の半固体製剤である。それらは、好適な機械類の助けを借りて、脂肪性又は非脂肪性基剤と、細かく分割された又は粉末化された形態の有効成分を、単独で又は水性若しくは非水性流体中の溶液若しくは懸濁液で、混合することによって作製され得る。基剤は、炭化水素、例えば、固形、軟質又は流動パラフィン、グリセロール、蜜蝋、金属石鹸；粘液；天然起源の油、例えば、アーモンド油、トウモロコシ油、ラカッセイ油、ヒマシ油又はオリーブ油；羊毛脂又はその誘導体、又は脂肪酸、例えば、ステアリン酸又はオレイン酸、並びにアルコール、例えば、プロピレングリコール又はマクロゲルを含み得る。製剤は、任意の好適な界面活性剤、例えば、アニオン性、カチオン性又は非イオン性界面活性剤、例えば、ソルビタンエステル又はそのポリオキシエチレン誘導体を含み得る。懸濁化剤、例えば、天然ガム、セルロース誘導体、又は無機材料、例えば、珪質シリカ、及び他の成分、例えば、ラノリンも含まれ得る。
【０２２０】
本発明に従うローションとしては、皮膚又は眼への適用に好適であるものが挙げられる。アイローションは、殺菌剤を場合により含有する滅菌水溶液含み得、点滴剤の作製についてのものと同様の方法によって作製され得る。皮膚への適用のためのローション又はリニメント剤はまた、乾燥を促進し皮膚を冷却する薬剤、例えば、アルコール又はアセトン、及び／又は保湿剤、例えば、グリセロール、又は油、例えば、ヒマシ油又はラッカセイ油を含み得る。
【０２２１】
経皮送達
本明細書に記載される医薬品−化学修飾剤複合体は、経皮的に投与され得る。経皮投与は、典型的に、患者の体循環中への薬物の経皮的通過のための医薬品の送達を含む。皮膚部位は、薬物を経皮的に投与するための解剖学的領域を含み、前腕部、腹部、胸部、背部、殿部、乳様突起部などを含む。
【０２２２】
経皮送達は、長期間、患者の皮膚へ前記複合体の供給源をさらすことによって達成される。経皮パッチは、身体へ医薬品−化学修飾剤複合体の制御送達を提供するという追加の利点を有する。Transdermal Drug Delivery: Developmental Issues and Research Initiatives, Hadgraft and Guy (eds.), Marcel Dekker, Inc., (1989)；Controlled Drug Delivery: Fundamentals and Applications, Robinson and Lee (eds.), Marcel Dekker Inc., (1987)；及びTransdermal Delivery of Drugs, Vols. 1-3, Kydonieus and Berner (eds.), CRC Press, (1987)を参照のこと。このような投薬形態は、適切な媒体、例えば、エラストマーマトリクス材料中に医薬品−化学修飾剤複合体を溶解するか、分散するか、又はそうでなければ組み込むことによって作製され得る。吸収促進剤もまた、皮膚を通っての前記化合物の流動を増加させるために使用され得る。このような流動の速度は、速度制御膜を提供するか、又は前記化合物をポリマーマトリクス又はゲルに分散させることによって、制御され得る。
【０２２３】
受動的経皮薬物送達
種々のタイプの経皮パッチが、本明細書に記載の方法において使用され得る。例えば、簡単な接着性パッチは、基材及びアクリレート接着剤から作製され得る。医薬品−化学修飾剤複合体及び任意の促進剤が、接着性キャスト溶液へ配合され、徹底的に混合される。溶液は、基材上へ直接キャストされ、キャスト溶媒はオーブンにおいて蒸発され、接着性フィルムが残る。剥離ライナーが、システムを完成するために付けられ得る。
【０２２４】
又は、ポリウレタンマトリクスパッチが、医薬品−化学修飾剤複合体を送達するために使用され得る。このパッチの層は、基材、ポリウレタン薬物／促進剤マトリクス、膜、接着剤、及び剥離ライナーを含む。ポリウレタンマトリクスは、室温硬化性ポリウレタンプレポリマーを使用して作製される。前記プレポリマーへの水、アルコール、及び複合体の添加によって、基材のみに直接キャストされ得る粘着性フィルムエラストマーが形成される。
【０２２５】
本発明のさらなる態様は、ヒドロゲルマトリクスパッチを使用する。典型的に、ヒドロゲルマトリクスは、アルコール、水、薬物、及びいくつかの親水性ポリマーを含む。このヒドロゲルマトリクスは、基材と接着層との間の経皮パッチ中へ組み込まれ得る。
【０２２６】
液体リザーバパッチもまた、本明細書に記載の方法において使用され得る。このパッチは、不透過性又は半透性の、ヒートシール可能な基材、ヒートシール可能な膜、アクリレート系感圧皮膚接着剤、及びシリコン処理剥離ライナーを含む。基材が膜へヒートシールされ、リザーバが形成され、次いでこれに複合体、促進剤、ゲル化剤、及び他の賦形剤の溶液が充填される。
【０２２７】
フォームマトリクスパッチは、ゲル化された医薬品−化学修飾剤溶液が薄いフォーム層、典型的にポリウレタン中に束縛されていること以外、液体リザーバシステムと設計及び成分が類似する。このフォーム層は、パッチの周辺部でヒートシールされている膜と基材との間に位置する。
【０２２８】
受動送達系について、放出速度は、典型的に、リザーバと皮膚との間に配置された膜によって、モノリシックデバイスからの拡散によって、又は送達系中の速度制御バリアとして役立つ皮膚自体によって制御される。米国特許第4,816,258号；第4,927,408号；第4,904,475号；第4,588,580号；第4,788,062号などを参照のこと。薬物送達速度は、一部、膜の性質に依存する。例えば、体内の膜を通る薬物送達の速度は、一般的に、皮膚バリアを通るよりも速い。複合体がデバイスから膜へ送達される速度は、最も有利には、リザーバと皮膚との間に配置される律速膜の使用によって制御される。皮膚は複合体に対して十分に透過性である（即ち、皮膚を介しての吸収は、膜を介しての通過速度よりも高い）と考えると、膜は、患者によって経験される投薬速度を制御するために役立つ。
【０２２９】
好適な透過性膜材料は、所望の透過性度、複合体の性質、及びデバイスの構築と関係する機械的な考察に基づいて、選択され得る。例示的な透過性膜材料としては、多種多様の天然及び合成ポリマー、例えば、ポリジメチルシロキサン（シリコーンゴム）、エチレンビニルアセテートコポリマー（ＥＶＡ）、ポリウレタン、ポリウレタン−ポリエーテルコポリマー、ポリエチレン、ポリアミド、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、セルロース材料、例えば、三酢酸セルロース及び硝酸／酢酸セルロース、並びにヒドロゲル、例えば、２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）が挙げられる。
【０２３０】
所望のデバイス特徴に応じて、他のアイテム、例えば、治療薬の他の従来の成分がデバイス中に含有され得る。例えば、本発明に従う組成物はまた、防腐剤又は静菌剤、例えば、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、クロロクレゾール、塩化ベンザルコニウムなどを１つ又はそれ以上含み得る。これらの薬学的組成物はまた、他の有効成分、例えば、抗菌剤、特に抗生物質、麻酔薬、鎮痛薬、及び止痒剤を含有し得る。
【０２３１】
坐剤としての投与
本発明の組成物は、坐剤としての投与用に製剤化され得る。先ず、低融点ワックス、例えば、脂肪酸グリセリド又はココアバターの混合物が、溶融され、活性成分が、例えば撹拌によって、均一に分散される。次いで、溶融した均一混合物を好都合なサイズの型へ注ぎ、冷却し、固化させる。
【０２３２】
活性組成物は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）担体（例えば、ＰＥＧ１０００［９６％］及びＰＥＧ４０００［４％］）中に配置された、本発明の組成物を約０．５％〜約５０％含む坐剤へ製剤化され得る。
【０２３３】
本発明の組成物は、膣投与用に製剤化され得る。有効成分に加えて好適であることが当該技術分野において公知である担体を含有するペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム又はスプレー。
【０２３４】
呼吸器投与
本発明の組成物は、経鼻投与用に製剤化され得る。液剤又は懸濁剤は、従来の手段によって、例えばドロッパー、ピペット又はスプレーを用いて、鼻腔へ直接適用される。製剤は、単回又は複数用量形態で提供され得る。ドロッパー又はピペットの後者の場合において、これは、好適な、所定の量の液剤又は懸濁剤を患者へ投与することによって達成され得る。スプレーの場合において、これは、例えば、定量噴霧スプレーポンプによって達成され得る。
【０２３５】
本発明の組成物は、鼻腔内投与を含む特に呼吸器へのエアロゾル投与用に製剤化され得る。組成物は、一般的に、例えば５ミクロン以下の桁の小さな粒径を有する。このような粒径は、当該技術分野において公知の手段によって、例えばマイクロナイゼーションによって得られ得る。有効成分は、好適な噴射剤、例えばクロロフルオロカーボン（ＣＦＣ）、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、若しくはジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の好適なガスを含む加圧パックで提供される。エアロゾルはまた、好都合には、レシチンなどの界面活性剤を含有し得る。薬物の用量は、定量バルブによって制御され得る。又は、有効成分は、乾燥粉末の形態で、例えば、好適な粉末基剤、例えば、ラクトース、デンプン、デンプン誘導体、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）中の前記組成物の粉末ミックスの形態で提供され得る。粉末担体は、鼻腔内においてゲルを形成する。粉末組成物は、単位用量形態、例えば、粉末が吸入器によって投与され得る、例えばゼラチン又はブリスターパックのカプセル又はカートリッジで提示され得る。
【０２３６】
必要に応じて、製剤は、有効成分の持続又は制御放出投与に適合された腸溶コーティングを用いて作製され得る。
【０２３７】
薬学的調製物は、好ましくは、単位投薬形態である。このような形態において、調製物は、好適な量の活性成分を含有する単位用量へ細分化される。単位投薬形態は、パッケージが別個の量の調製物を含有する、パッケージされた調製物、例えば、バイアル又はアンプル中の、パッケージされた錠剤、カプセル剤、及び散剤であり得る。また、単位投薬形態は、カプセル剤、錠剤、カシェ剤、又はロゼンジ自体であり得、又はそれは、パッケージされた形態の好適な数の任意のこれらであり得る。
【０２３８】
薬学的に許容される塩
本発明の化合物の薬学的に許容される塩はまた、それらが作製され得る場合、本発明によって包含されるように意図される。これらの塩は、薬学的使用へのそれらの適用において許容されるものである。それによって、塩は親化合物の生物学的活性を保持し、かつ、塩は、疾患を治療することにおけるその適応及び使用において不都合な又は有害な効果を有さないことが意味される。
【０２３９】
薬学的に許容される塩は、標準的な様式で作製される。親化合物が塩基である場合、それは、好適な溶媒中において過剰量の有機又は無機酸で処理される。親化合物が酸である場合、それは、好適な溶媒中において無機又は有機塩基で処理される。
【０２４０】
本発明の化合物は、有効量で、経口、経直腸、又は非経口（皮下を含む）経路によって、そのアルカリ金属又はアルカリ土類金属塩の形態で、薬学的に許容される担体又は希釈剤と一斉に、同時に、又は共に、特に、好ましくはその薬学的組成物の形態で、投与され得る。
【０２４１】
本発明の薬学的組成物における使用のための薬学的に許容される酸付加塩の例としては、鉱酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、リン酸、メタリン酸、硝酸及び硫酸、並びに有機酸、例えば、酒石酸、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸、安息香酸、グリコール酸、グルコン酸、コハク酸、ｐ−トルエンスルホン酸、及びアリールスルホン酸から誘導されるものが挙げられる。
【０２４２】
投与形態
薬学的組成物は、それが１つ又はそれ以上の特定の投与方法について好適となるように、作製され得る。さらに、本明細書に記載の治療方法は、種々の投与方法を含み得る。
【０２４３】
一般的に、活性ＬＡＣが疾患部位に到達し得るような様式でＬＡＣが個体へ投与され得る任意の投与方法が、本発明で使用され得る。
【０２４４】
治療方法における、薬物送達の主な経路は、下記に記載されるように、静脈内、経口、及び局所である。薬物を標的部位へ送達するか又は薬物を血流中へ導入するに有効である、他の薬物投与方法、例えば、皮下注射又は吸入も考えられる。
【０２４５】
本発明の薬学的調製物が投与される粘膜は、例えば鼻、膣、眼、口、生殖管、肺、胃腸管、又は直腸における、生物学的に活性な物質が提供される哺乳動物の任意の粘膜、好ましくは鼻、口又は膣の粘膜であり得る。
【０２４６】
本発明の組成物は、非経口的に、即ち、静脈内、筋肉内、皮下、鼻腔内、直腸内、膣内又は腹腔内投与によって、投与され得る。非経口投与の皮下及び筋肉内形態が、一般的に好ましい。このような投与について好適な投薬形態は、従来の技術によって作製され得る。組成物はまた、吸入によって、即ち、鼻腔内及び経口吸入投与によって投与され得る。このような投与について好適な投薬形態、例えば、エアロゾル製剤又は定量吸入器は、従来の技術によって作製され得る。
【０２４７】
本発明に従う組成物は、少なくとも１つの他の化合物と共に投与され得る。前記化合物は、別個の製剤として又は単位投薬形態中に合わされて、同時に投与され得るか、又は連続して投与され得る。
【０２４８】
治療
本発明に従う組成物は、医薬の製造のために使用され得る。このような医薬は、選択的細胞傷害性が望ましい種々の疾患の治療について有用であり得る。明らかに、α−ラクトアルブミン複合体は、細菌の付着及びウイルスの広がりを防止することができる。ある態様において、前記医薬は、細菌及び／又はウイルス感染症の治療のために使用され得る。さらなる態様において、前記医薬は、癌の治療において使用される。
【０２４９】
細菌感染
明らかに、α−ラクトアルブミン複合体は、細胞表面、例えば上皮細胞への細菌の付着を防止することができ、又は代替手段によって、微生物に対する殺菌効果を発揮することができる。
【０２５０】
細菌感染によって引き起こされる疾患としては、炭疽、細菌性髄膜炎、ブルセラ症、カンピロバクター症、ネコひっかき病、コレラ、ジフテリア、流行性発疹チフス、淋病、膿痂疹、ジオネラ病、らい病（ハンセン病）、レプトスピラ症、リステリア症、ライム病、類鼻疽、ＭＲＳＡ感染症、ノカルジア症、百日咳（Pertussis）（百日咳（Whooping Cough））、ペスト、肺炎球菌性肺炎、オウム病、Ｑ熱、ロッキー山紅斑熱（ＲＭＳＦ）、サルモネラ症、猩紅熱、細菌性赤痢、梅毒、破傷風、トラコーマ、結核、野兎病、腸チフス、発疹チフス；尿路感染症が挙げられる。
【０２５１】
ある態様において、本発明に従う組成物は、細菌感染症の治療用である。
【０２５２】
特に、肺炎連鎖球菌及びインフルエンザ菌は、重篤な感染症の重要な原因である。好ましい態様において、本発明に従う組成物は、例えば肺炎連鎖球菌又はインフルエンザ菌によって引き起こされる感染症の治療用の医薬の製造用である。
【０２５３】
ウイルス感染
α−ラクトアルブミン複合体の選択的細胞傷害性は、ウイルス感染した細胞に対して向けられ得、それによって、ウイルスが増殖する前に細胞が破壊されるので、ウイルスの広がりが抑えられる。
【０２５４】
ウイルス感染によって引き起こされる疾患としては、ＡＩＤＳ、エイズ関連症候群、水痘（Chickenpox）（水痘（Varicella））、普通感冒、サイトメガロウイルス感染症、コロラドダニ熱、デング熱、エボラ出血熱、流行性耳下腺炎、エクスプロジシティス（Explodicitis）、手足口病、肝炎、単純ヘルペス、帯状ヘルペス、ＨＰＶ、インフルエンザ（フルー）、ラッサ熱、麻疹、マールブルグ出血熱、伝染性単核球症、おたふく風邪、灰白髄炎、進行性多巣性白質脳症、狂犬病、風疹、ＳＡＲＳ、天然痘(痘瘡）、ウイルス性脳炎、ウイルス性胃腸炎、ウイルス髄膜炎、ウイルス性肺炎、西ナイル病、黄熱が挙げられる。
【０２５５】
ある態様において、本発明に従う組成物は、ウイルス感染症の治療用である。
【０２５６】
種々のタイプのウイルス、例えば、呼吸器のウイルス、胃腸のウイルス、免疫不全ウイルス、例えば、ＨＩＶ、及び脳のウイルス、例えば、ウイルス髄膜炎、又は他の内部器官のウイルスが、本発明に従う組成物を使用して治療され得る。
【０２５７】
呼吸器の感染症
呼吸器の感染症、例えば、髄膜炎、耳炎及び副鼻腔炎は、鼻咽頭を介して進入する細菌によって引き起こされる。
【０２５８】
呼吸器のウイルス感染症は、例えば、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、呼吸器性シンシチウムウイルス（ＲＳＶ）、パラインフルエンザ、ライノウイルス（Phinovirus）及びコロナウイルスによって引き起こされ得る。
【０２５９】
ある態様において、本発明に従う組成物は、呼吸器の感染症の治療用である。本発明に従う医薬は、上気道中へミストの形態で吸入され得る。
【０２６０】
腫瘍の治療
１態様において、良性又は悪性の両タイプの腫瘍が、さらに、α−ラクトアルブミン複合体の選択的細胞傷害性に基づいて、本発明に従う組成物を使用して治療され得る。
【０２６１】
いぼ
いぼは、一般的に、カリフラワーに似ている、典型的に手及び足における、小さな粗い腫瘍である。いぼは、一般的であり、ウイルス感染によって、具体的にはヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）によって、引き起こされる。それらは、典型的に、数ヵ月後に消滅するが、何年も持続し得、再発し得る。
【０２６２】
形状及び冒された部位が異なる、広範囲の種々のタイプのいぼが同定され、これらとしては以下が挙げられる：
尋常性いぼ（尋常性疣贅）：手及び膝において最も一般的な、粗面を有する隆起したいぼ。
扁平いぼ（扁平疣贅）：数多く生じ得る、黄褐色又は肉色の、小さく、滑らかで扁平ないぼ；顔、首、手、手首及び膝において最も一般的。
糸状又は指状疣贅：顔に、特に眼瞼及び唇付近に最も一般的な、糸又は指様のいぼ。
足底いぼ（疣贅、足底疣贅）：中央に複数の黒い点をしばしば伴う、硬く時として痛みを伴うしこり；通常、足底における圧覚点においてのみ。
モザイク疣贅：一般的に手又は足底における、密集した足底型いぼの群。
陰部疣贅（性病いぼ、尖圭コンジローマ、尖圭疣贅（verruca acuminata））：陰部を冒すいぼ。
【０２６３】
好ましい態様において、本発明に従う組成物は、いぼの治療用であり、これは、好ましくは、本発明に従う医薬の局所適用によって治療される。
【０２６４】
乳頭腫
乳頭腫は、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされ得る又は引き起こされ得ない、良性上皮腫瘍を指す。代替の原因は、例えば、脈絡叢乳頭腫（ＣＰＰ）である。
【０２６５】
ＨＰＶにしばしば関連する２つのタイプの乳頭腫は、扁平上皮乳頭腫及び移行上皮乳頭腫（「膀胱乳頭腫」としても公知）である。
【０２６６】
好ましい態様において、本発明に従う単量体α−ラクトアルブミン複合体、好ましくはＬＡＣ組成物は、乳頭腫の治療用であり、これは、好ましくは、本発明に従う医薬の局所適用によって治療される。
【０２６７】
癌
癌性疾患は、新形成又は新生物と科学的に呼ばれ、良性又は悪性であり得る。癌は、腫瘍に似ている細胞のタイプ、及び従って、腫瘍の起源であると推定される組織によって分類される。以下の一般的なカテゴリーが適用される：
癌腫：上皮細胞由来の悪性腫瘍。この群は、乳癌、前立腺癌、肺癌及び結腸癌の一般的な形態を含む、最も一般的な癌を含む。
リンパ腫及び白血病：血液及び骨髄細胞由来の悪性腫瘍。
肉腫：結合組織、又は間葉細胞由来の悪性腫瘍。
中皮腫：腹膜及び胸膜を裏打ちする中皮細胞由来の腫瘍。
神経膠腫：脳細胞の最も一般的なタイプである神経膠由来の腫瘍。
胚細胞腫：通常精巣及び卵巣において見られる、生殖細胞由来の腫瘍。
絨毛癌：胎盤由来の悪性腫瘍。
【０２６８】
好ましい態様において、本発明に従う単量体α−ラクトアルブミン複合体、好ましくはＬＡＣ組成物は、癌の治療用である。
【０２６９】
癌の治療用の医薬は、本発明によれば、好ましくは、腫瘍へ直接適用される。
【０２７０】
粘膜腫瘍
粘膜表面で見られる条件は、ｐＨなどの特性の点で非常に独特であり得る。粘膜表面は、特に、鼻の通路、口、咽喉、食道、肺、胃、直腸、膣及び膀胱において見られる。
【０２７１】
本発明に従って治療され得る特定の粘膜表面としては、腫瘍である咽頭、肺、結腸及び膀胱表面が挙げられる。
【０２７２】
膀胱癌
膀胱癌は、膀胱のいくつかのタイプの悪性腫瘍の任意のものを指す。最も一般的なタイプの膀胱癌は、膀胱の内側を裏打ちする細胞において生じ、尿路上皮細胞癌又は移行上皮癌（ＵＣＣ又はＴＣＣ）と呼ばれる。
【０２７３】
より好ましい態様において、本発明に従う単量体α−ラクトアルブミン複合体、好ましくはＬＡＣ組成物は、膀胱癌の治療用である。
【０２７４】
神経膠芽腫
神経膠腫は、グリア細胞由来の原発性中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍のあるタイプである。神経膠腫の関与の最も一般的な部位は、脳であるが、それらはまた、脊髄、又はＣＮＳの任意の他の部分、例えば視神経にも影響を与え得る。
【０２７５】
より好ましい態様において、本発明に従う単量体α−ラクトアルブミン複合体、好ましくはＬＡＣ組成物は、神経膠腫／神経膠芽腫の治療用である。
【０２７６】
血管新生
腫瘍血管新生は、癌性腫瘍中へ浸透する血管の網目構造の増殖であり、栄養及び酸素を供給し、老廃物を除去する。血管新生のプロセスは、腫瘍細胞が正常なホスト組織へシグナル伝達する分子を放出し、新たな血管の増殖を促す遺伝子及びタンパク質を活性化すると、開始される。血管新生の一連の天然インヒビターが同定されており、癌細胞の増殖及び広がりを防止及び／又は阻害すると考えられている。
【０２７７】
α−ラクトアルブミン複合体は血管新生を阻害し得るという知見は、さらに、癌の治療及び／又は阻害にα−ラクトアルブミンの適用性を広げた。
【０２７８】
ある態様において、本発明に従う単量体α−ラクトアルブミン複合体、好ましくはＬＡＣ組成物は、血管新生の阻害用である。
【０２７９】
治療方法
本発明のある局面は、
以下を含む医薬を投与すること：
ｉ．α−ラクトアルブミンと脂肪酸又は脂質との複合体である単量体α−ラクトアルブミン複合体、好ましくはＬＡＣを含む組成物であって、該α−ラクトアルブミンが配列番号１若しくは配列番号２のウシ若しくはヒトα−ラクトアルブミン又はその機能的均等物であり、該組成物が単量体α−ラクトアルブミン複合体、好ましくはＬＡＣを少なくとも９５質量％含む、組成物、並びに
ｉｉ．薬学的賦形剤
を含む、治療の必要がある個体の治療方法に関する。
【０２８０】
本発明によれば、必要がある個体は、任意の上述の疾患に苦しむか又はこれに罹る危険性がある任意の個体である。従って、本発明に従う治療は、治癒的治療及び／又は予防的治療の両方であり得る。
【０２８１】
投与レジメン
投与される単量体α−ラクトアルブミン複合体、好ましくはＬＡＣの投薬要件は、使用される特定の薬物組成、投与経路、及び治療される特定の被験体に応じて変化する。理想的には、本方法によって治療される患者は、一般的に薬剤耐性が現れる前に必要とされる量以下の、最大許容量の、薬学的有効量の化合物を受容する。
【０２８２】
本化合物のために本明細書に開示される全ての使用方法について、一日経口投薬レジメンは、好ましくは、約０．０１〜約８０ｍｇ／ｋｇ総体重である。一日非経口投薬レジメンは、約０．００１〜約８０ｍｇ／ｋｇ総体重であり得る。一日局所投薬レジメンは、好ましくは、０．１ｍｇ〜１５０ｍであり、１日１〜４回、好ましくは２又は３回投与される。一日吸入投薬レジメンは、好ましくは、１日当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇである。化合物又はその薬学的に許容される塩の個々の投薬の最適量及び間隔は、治療される状態の性質及び程度、投与の形態、経路及び部位、並びに治療される特定の患者によって決定され、このような最適条件は従来の技術によって決定され得ることも当業者によって認識される。治療の最適なコース、即ち、所定の日数の間１日当たりに与えられる化合物又はその薬学的に許容される塩の投与数は、治療決定試験の従来のコースを使用して当業者によって確認され得ることも当業者によって認識される。
【０２８３】
活性化合物の日用量は多様であり、投与経路のタイプに依存するが、原則として、それは、個人投与で活性化合物１〜１００ｍｇ／用量、局所投与において２〜２００ｍｇ／用量である。２４時間当たりの適用数は、投与経路に依存するが、例えば、鼻における（in the no. se）局所適用の場合、２４時間当たり３回から８回へ変化し得、即ち、治療的使用において治療される身体によって産生される粘液の流れに依存する。
【０２８４】
用語「単位投薬形態」は、本明細書において使用される場合、ヒト及び動物被験体についての単位投薬として好適な物理的に別個の単位を指し、各々の単位は、薬学的に許容される希釈剤、担体、又はビヒクルと共に、所望の効果を生じるに十分な量の計算された、単独の又は他の薬剤と組み合わされた、所定量の化合物を含有する。本発明の単位投薬形態についての詳細は、使用される特定の化合物、及び達成される効果、並びにホストにおける各化合物と関連する薬力学に依存する。投与される用量は、「有効量」又は、個人の患者において「有効なレベル」を達成するために必要な量であるべきである。
【０２８５】
「有効なレベル」は、投与について好ましい終点として使用されるので、実際の用量及びスケジュールは、薬物動態、薬物分布、及び代謝における個人差に応じて、異なり得る。「有効なレベル」は、例えば、本発明に従う１つ又はそれ以上の化合物の濃度に対応する患者における所望の血液又は組織レベルとして定義され得る。
【図面の簡単な説明】
【０２８６】
【図１】Ａ．ウマ、ブタ、ラクダ、ヒト、ウシ及びヤギα−ラクトアルブミンの配列アラインメント。Ｂ．ヒト及びウシα−ラクトアルブミンの配列アラインメント。
【図２】製造方法の概略図。
【図３】α−ラクトアルブミン複合体への変換前（Ａ）及び変換後（Ｂ）のα−ラクトアルブミン組成物のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）クロマトグラム。（Ａ）４０ｍｇ／ｃｍ2樹脂を超えるｂＬＡロードでの４連続ＨＩＣ実行から精製されたｂＬＡのＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムは、２４．６分の保持時間を伴う単一の単量体ｂＬＡピークを示す。Ｂ）Ａにおいて示される精製ｂＬＡのプールから製造されたｂＬＡＣのＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラム。
【図４】ｂＬＡ及びｂＬＡＣのウエスタンブロット。レーン１：Ｐｒｅｓｉｃｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｍｅｒｋｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）、レーン２：精製ｂＬＡ（Ｆｌｕｋａ  ６１２８９）、レーン３〜５  実施例１に記載されるように精製されたｂＬＡ、レーン６〜８  実施例３に示されるような２３分で溶離する二量体ピークを生じる３２ｍｇ／ｃｍ2のロードで精製されたｂＬＡ  −  レーン６  ２３分で溶離するピークフラクション、レーン７  中間フラクション、レーン８  ２４．６分で溶離するピークフラクション、レーン９  ４℃で保存されたｂＬＡＣ産物、レーン１０  −２０℃で保存されたｂＬＡＣ産物。単量体バンドは、僅か約１０ｋＤａの見かけの分子質量で移動し、二量体バンドは、１５ｋＤａとして移動する。単量体ｂＬＡサンプルは、標準プロトコルを使用して、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｍｉｃｒｏｆｌｅｘ装置においてＭＡＬＤＩ−ＭＳによって、単量体ｂＬＡについて予想されるように１４，１９６Ｄａの質量を有すると分析された。二量体バンドは、既知の分子質量の分子で実行されたＳＥＣマーカーを使用する直線性試験によって測定された２８ｋＤａの見かけの分子質量を有するように移動する。
【図５】細胞傷害性試験の概要。
【図６】Ａ．ルミネセンス（ＶｉａＬｉｇｈｔ）及びトリパンブルー排除によって測定された、ヒトα−ラクトアルブミン（ｈＬＡＣ）組成物Ｎ１７７−５８Ｂの細胞傷害性試験。Ｂ．ルミネセンス（ＶｉａＬｉｇｈｔ）によって測定されたウシα−ラクトアルブミン複合体（ｂＬＡＣ）組成物Ｎ２６２−３４Ｂの細胞傷害性試験。
【図７】Ａ．α−ラクトアルブミン複合体（ｈＬＡＣ）組成物Ｎ１７７−５８Ｂ、及びウシα−ラクトアルブミン複合体（ｂＬＡＣ）組成物Ｎ２６２−０１Ｅの細胞傷害性試験。Ｂ．ウシα−ラクトアルブミン（ｂＬＡＣ）組成物Ｎ２６２−３５Ｂ−０９３及びＮ２６２−３５Ｂ−０９４の細胞傷害性試験。
【図８】３２ｍｇ／ｃｍ2のロードで牛乳から精製されたｂＬＡ（Ａ）及び変換後に得られたｂＬＡＣ産物（Ｂ）のＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラム。ｂＬＡ及びｂＬＡＣ産物は両方とも、２３分で溶離する二量体ピークを示し、一方、単量体ｂＬＡ及びｂＬＡＣは２４．６±０．５分で溶離する。サンプルをウエスタンブロット法によって分析する（図４）。
【図９】ｂＬＡＣへのｂＬＡの変換の間、種々の塩濃度で溶離されたピークのキャラクタライゼーション。ｂＬＡ／ｂＬＡＣ二量体の保持時間＝２３分；ｂＬＡ／ｂＬＡＣ単量体の保持時間＝２５分。
【実施例】
【０２８７】
実施例１
ウシα−ラクトアルブミンの精製及びｂＬＡＣへの変換
ウシの全乳（２Ｌ）を、３０分間３５００×ｇでの遠心分離によって脱脂した。脱脂乳を、一晩、硫安沈殿させ（２６４ｇ／Ｌ＝４０−４５％飽和）、その後、沈殿物を３５００×ｇで３０分間遠心分離した。硫安沈殿上澄みを収穫し、先ず濾紙で濾過し、残存する沈殿物又は脂肪を除去し、続いてＰｏｌｙｓｅｐ  ＩＩメディアを含むＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｏｐｔｉｓｃａｌｅフィルター１．０／０．５μｍで濾過した。
【０２８８】
硫安沈殿上澄みを、硫安沈殿上澄み１００ｍＬ当たり３２．５５ｍＬ  ＥＤＴＡ（０．２５Ｍ）＋２４．９７ｍＬ  Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（Ｔｒｉｓ  ５０ｍＭ，ＥＤＴＡ  １ｍＭ，ｐＨ７．５）＋６７．４５ｍＬの添加によって、ＨＩＣクロマトグラフィーのために調整した。調整された媒体をｐＨ７．５へ調節した。
【０２８９】
１５ｃｍのベッド高さ及び１９．６ｃｍ2の面積を有するＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  ＦＦ  Ｈｉｇｈ  Ｓｕｂ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）樹脂３００ｍＬが充填されたＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＸＫ５０／３０カラムへ前記調整された媒体を適用することによって、疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用して、ウシα−ラクトアルブミンを精製した。全てのクロマトグラフィー実行を、４０ｃｍ／ｈｒの流速及び４０ｍｇ  ｂＬＡ／ｃｍ2のロードで行った。
【０２９０】
調整された媒体の適用前に、前記カラムを、平衡化溶液（Ｔｒｉｓ  ５０ｍＭ，ＥＤＴＡ  １ｍＭ，ｐＨ  ７．５）５カラム体積（ＣＶ）で平衡化した。
【０２９１】
カラム平衡化に続いて、前記調整された硫安沈殿上澄みを適用し、その後、カラムを３ＣＶの平衡化溶液（Ｔｒｉｓ  ５０ｍＭ，ＥＤＴＡ  １ｍＭ，ｐＨ  ７．５）で洗浄した。前記樹脂に結合されたｂＬＡを、２ＣＶの溶離溶液（Ｔｒｉｓ  ５０ｍＭ，ＣａＣｌ2  １ｍＭ，ｐＨ  ７．５）を使用して溶離した。溶離されたｂＬＡを、フラクションコレクターで回収し、メインピークサンプル容積は約１５０〜２００ｍＬのであった。ｂＬＡの回収は約６００ｍｇであった。
【０２９２】
クロマトグラフィー実行後、カラムを水で洗浄し、ＮａＯＨ（１Ｍ）で再生した。
【０２９３】
平衡から再生までのクロマトグラフィー実行は、約４１５分かかった。
【０２９４】
ＨＩＣ精製から回収されたｂＬＡを、変換前に、Ｍｉｎｉ  ｋｌｅｅｎｐａｋ  ２０フィルター（Ｐａｌｌ）で濾過した。
【０２９５】
１０ｃｍのベッド高さ及び１９．６ｃｍ2の面積を有するＤＥＡＥ  Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ  ｐｌｕｓ  Ｍ（Ｐａｌｌ  Ｂｉｏｓｅｐｒａ）樹脂２００ｍＬが充填されたＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＸＫ５０／２０カラムにおいて、α−ラクトアルブミンの変換を行った。全てのクロマトグラフィー実行を、４０ｃｍ／ｈｒの流速及び１５ｍｇ  ｂＬＡ／ｃｍ2のロードで行った。
【０２９６】
第１のＨＩＣ実行から回収されたｂＬＡの適用前に、カラムをオレイン酸でプレ調整した。先ず、３ＣＶの平衡化溶液（Ｔｒｉｓ  １０ｍＭ，ＮａＣｌ  ０．１Ｍ，ｐＨ  ８．５）を使用して、カラムを平衡化した。オレイン酸プレ調整を、エタノール２．５ｍＬ及び１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ８．５）２００ｍＬと共にオレイン酸２００μＬの溶液１６０ｍＬをカラム上に適用することによって行い、その後、カラムを２ＣＶの平衡化溶液（Ｔｒｉｓ  １０ｍＭ，ＮａＣｌ  ０．１Ｍ，ｐＨ  ８．５）、次いで３勾配ステップ溶離で洗浄した。ステップ１：１ＣＶについて０−１５％の溶離溶液（Ｔｒｉｓ  １０ｍＭ，ＮａＣｌ  １Ｍ，ｐＨ  ８．５）、ステップ２：２ＣＶについて１５％の溶離溶液（Ｔｒｉｓ  １０ｍＭ，ＮａＣｌ  １Ｍ，ｐＨ  ８．５）、次いで、２ＣＶの１００％溶離溶液（Ｔｒｉｓ  １０ｍＭ，ＮａＣｌ  １Ｍ，ｐＨ  ８．５）。前記ステップ溶離後、カラムを３ＣＶの平衡化溶液（Ｔｒｉｓ  １０ｍＭ，ＮａＣｌ  ０．１Ｍ，ｐＨ  ８．５）で平衡化した。
【０２９７】
オレイン酸でカラムをプレ調整した後、ＨＩＣによって得られたｂＬＡを、１００ｍＬ  ＨＩＣ回収当たり５０ｍＬ  Ｔｒｉｓ（１００ｍＭ）＋５０ｍＬ  ＥＤＴＡ（０．２５Ｍ）及び３００ｍＬ  Ｍｉｌｌｉ−Ｑ  Ｈ2Ｏの添加によって調整し、ｐＨ  ８．５及び導電率６．０±０．５ｍＳ／ｃｍ、その後、それをカラム上へ適用した。
【０２９８】
調整されたｂＬＡ含有ＨＩＣ回収の適用後、カラムを２ＣＶの平衡化溶液（Ｔｒｉｓ  １０ｍＭ，ＮａＣｌ  ０．１Ｍ，ｐＨ  ８．５）次いで３勾配ステップ溶離で洗浄した。ステップ１：１ＣＶについて０−１５％の溶離溶液（Ｔｒｉｓ  １０ｍＭ，ＮａＣｌ  １Ｍ，ｐＨ  ８．５）、ステップ２：２ＣＶについて１５％の溶離溶液（Ｔｒｉｓ  １０ｍＭ，ＮａＣｌ  １Ｍ，ｐＨ  ８．５）、次いで４ＣＶの１００％溶離溶液（Ｔｒｉｓ  １０ｍＭ，ＮａＣｌ  １Ｍ，ｐＨ  ８．５）。
【０２９９】
ｂＬＡＣを、フラクションコレクターで回収し、メインピークサンプル容積は約１５０−２００ｍＬであった。ｂＬＡＣの回収は約１６０ｍｇであった。
【０３００】
各バッチのｂＬＡ変換後、カラムを、２ＣＶの酢酸（１Ｍ）、２ＣＶの１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ８．５）、２ＣＶのＮａＯＨ（０．５Ｍ）、４ＣＶの１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ８．５）及び２〜３ＣＶの２０％エタノールで再生し、ここで、カラムを保存した。
【０３０１】
プレ調整平衡から再生までの変換クロマトグラフィー実行は、約５６０分かかった。
【０３０２】
緩衝剤交換及び濃縮の前に、ｂＬＡＣをＭｉｎｉ  Ｋｌｅｅｎｐａｋ  ２０フィルター（Ｐａｌｌ）で濾過した。
【０３０３】
変換されたウシα−ラクトアルブミンを、Ａｅｋｔａ  ＣｒｏｓｓＦｌｏｗ装置を使用して、緩衝剤交換し濃縮した。濾過を、ＫｖｉｃｋＳｔａｒｔ  ５ｋＤａ限外濾過膜を使用して行った。リテンテート（retentate）流量は、８０ｍＬ／分、ロード＜９．６ｍｇ／ｃｍ2及び４．０ｂａｒのＴＭＰリミットであった。変換されたウシα−ラクトアルブミンを約９ｍｇ／ｍＬへ濃縮し、緩衝剤を０．９％ＮａＣｌへ７回交換した。
【０３０４】
ウエスタンブロット法による単量体及び／又は多量体ｂＬＡＣの測定
オレイン酸と複合体化したウシα−ラクトアルブミンの単量体／多量体組成物（ｂＬＡＣ）を、ウエスタンブロット法によって視覚化することができた。ｂＬＡＣの単量体及び多量体形態を、供給業者（ＰＡＧＥｇｅｌ）によって推奨される標準プロトコルを使用して、１６％ＳＤＳゲル（ＰＡＧＥｇｅｌ）において分離することができ、引き続いてＰＶＤＦ膜へブロッティングした。単量体及び多量体形態を、１：６０００に希釈されたＨＲＰ標識ヤギ抗ウシ−ラクトアルブミン（Ｂｅｔｈｙｌ  Ａ１０−１２８Ｐ）を使用しての前記膜上での免疫検出によって視覚化し、化学発光基質（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ化学発光基質，Ｐｉｅｒｃｅ）で検出することができた（図３を参照のこと）。
【０３０５】
ＳＥＣ−ＨＰＬＣによる単量体及び／又は多量体ｂＬＡＣの測定
オレイン酸と複合体化されたウシα−ラクトアルブミンの単量体／多量体組成物（ｂＬＡＣ）を、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって視覚化することができた。ｂＬＡＣの単量体及び多量体形態を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５，Ｔｒｉｃｏｒｎ  １０／３００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ）上へｂＬＡＣ  ２５μＬを注入することによって分離することができた。安定なベースラインが得られるまで、カラムを溶離緩衝剤（Ｔｒｉｓ  １０ｍＭ，ＮａＣｌ  １４０ｍＭ，ＮａＮ3  ０．００１％，ｐＨ７．４）で平衡化した。ｂＬＡＣサンプルの適用後、サンプルを、１サンプル当たり８０分の実行時間を生じる３８ｃｍ／ｈｒの流量で溶離緩衝剤（Ｔｒｉｓ  １０ｍＭ，ＮａＣｌ  １４０ｍＭ，ＮａＮ3  ０．００１％，ｐＨ７．４）４０ｍＬで溶離した。ｂＬＡＣの単量体形態は２４．６±０．５分後に溶離し、一方、二量体は２３±０．５分後に溶離した（図２を参照のこと）。
【０３０６】
実施例２
単量体α−ラクトアルブミン組成物の細胞傷害性
α−ラクトアルブミン組成物の細胞傷害活性を、Ｃａｍｂｒｅｘ製のＶｉａＬｉｇｈｔ（登録商標）ＰＬＵＳ細胞増殖及び細胞傷害性バイオアッセイキットを使用して、下記および図４に示される概要に従い、生存能力アッセイで試験した。ＬＡＣ調製物の効力を、５％ウシ胎仔血清、１％非必須アミノ酸及び２ｍＭピルビン酸ナトリウムが補充されたＲＰＭＩ  １６４０培地（ＨＥＰＥＳ無し）中において培養されたマウスリンパ性白血病細胞株Ｌ１２１０（ＡＴＣＣ  ｃａｔ．ｎｏ  ＣＣＬ−２１９）を殺すそれらの能力から測定した。
【０３０７】
各々の試験したＬＡＣ調製物から、好適な希釈系列を０．９％  ＮａＣｌ溶液において作製した。各希釈物２０μＬを、三連で、９６ウエルホワイトウォール細胞培養プレート中において血清及びＨＥＰＥＳを含まないＲＰＭＩ  １６４０培地中にＰＢＳ洗浄されたＬ１２１０細胞１００，０００又は２００，０００個を含有する細胞懸濁液５０μＬと混合した。３７℃及び５％ＣＯ2で１時間インキュベーションした後、１ウエル当たりウシ胎仔血清５μＬを添加し、全ての細胞外ＬＡＣを不活性化した。３７℃及び５％ＣＯ2でさらに１時間インキュベーションすることによって、細胞にさらにアポトーシスを受けさせ、次いで、培養物の生存能力を測定した。
【０３０８】
培養物の生存能力を、ＬＡＣの代わりに０．９％ＮａＣｌ溶液２０μＬで処理したコントロール培養物に対する存在するＡＴＰの量を測定することによって、又は、トリパンブルー排除によって、測定することができた。ＡＴＰは、全ての代謝的に活性な細胞中に存在する。死細胞中において、ＡＴＰは急速に消滅し、従って、生存細胞のみがＡＴＰを含有すると考えられ得る。従って、ＡＴＰの相対レベルと生存細胞のパーセンテージとの間には直接的な相関関係が存在する。ＡＴＰの相対量を、Ｃａｍｂｒｅｘ製のＶｉａＬｉｇｈｔ  ＰＬＵＳキット及び照度計を使用して測定した。ＡＴＰを定量するために、以下の反応を使用した：
【数１】
2010510180.tif 000002
【０３０９】
発光は、照度計においてルミネセンスとして測定された。ルミネセンスは、ＡＴＰ濃度と線形的に関連した。本方法を使用した場合、前記プレートをインキュベーターから取り出し、室温で１０分間冷却した。１ウエル当たりＶｉａＬｉｇｈｔ  ＰＬＵＳキットからの溶解試薬５０μＬを添加し、プレートを室温で１０分間インキュベートした。次いで、ＶｉａＬｉｇｈｔ  ＰＬＵＳキットからのＡＭＲ  ＰＬＵＳ溶液１００μＬを各ウエルへ添加し、プレートを室温で５分間インキュベートした。プレートを、１秒の統合読み取り時間で照度計において読み取った。
【０３１０】
得られたデータから、生存能力又はルミネセンスに対するＬＡＣ用量のグラフ（１００，０００細胞当たりのμｇ、又は１細胞当たりのｐｇ）をプロットすることができ、ＬＤ５０（使用した条件及び特定の曝露時間でのＬ１２１０細胞の５０％に対して致死的であるＬＡＣの用量）を測定することができた。ルミネセンス測定法からの結果は、トリパンブルー排除によって得られた結果と同等であることがわかった。
【０３１１】
α−ラクトアルブミンのいくつかのバッチを試験して得られた結果を下記の表に示す。
【表１】
2010510180.tif 000003
【０３１２】
実施例３
α−ラクトアルブミン複合体の単量体／多量体ｂＬＡＣ比率についての決定因子としてのＨＩＣのロード
単量体／多量体ｂＬＡＣ比率を、実施例１に記載の疎水性相互作用クロマトグラフィーによって精製したｂＬＡの単量体／多量体組成物によって制御することができた。
【０３１３】
２ｍｇ／ｍＬゲル（３２ｍｇ／ｃｍ2）のロードによって二量体及び単量体形態の両方を有するｂＬＡが生じ（図８）、一方、６ｍｇ／ｍＬ樹脂（９０ｍｇ／ｃｍ2）のロードによって単量体ｂＬＡのみが得られた（実施例１、図３）。ｂＬＡの変換は実施例１に記載の通りに行った。
【０３１４】
実施例４
各サンプル調整の前に、新たに３．５ｍＭのオレイン酸溶液を調製した。オレイン酸（２０μＬ）を、エタノール９６％（０．２５ｍＬ）及びＴｒｉｓ−ＨＣｌ（１０ｍＭ）ｐＨ８．５、ＮａＣｌ（０．１Ｍ）（２０ｍＬ）と混合した。
【０３１５】
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によって精製されたｂＬＡを、ＥＤＴＡ、Ｔｒｉｓ（０．１Ｍ  ｐＨ８．５）及びオレイン酸溶液で調整した。種々のサンプル調整の説明を表４に示す。
【表２】
2010510180.tif 000004
【０３１６】
ＡＩＥＣカラムにおける適用の前に、調整されたサンプルを室温で約３０分間混合した。
【０３１７】
カラムに新たにＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬ樹脂（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を充填した。表２に示される種々のｂＬＡサンプルを、このカラム上に適用した。ＡＩＥＣ実行についてのクロマトグラフィーパラメータは、以下であった。
【表３】
2010510180.tif 000005
【０３１８】
いくつかの再生ストラテジーを試験した：
【表４】
2010510180.tif 000006
【０３１９】
７０％エタノールでの再生手順を、オレイン酸又はｂＬＡＣなどの疎水的に結合された物質を除去するために適用した。
【０３２０】
収率及び効力
変換実行の収率を、標準手順に従ってサイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）実行によって測定した。
【０３２１】
変換されたｂＬＡの効力を、殺細胞によって測定した。殺細胞アッセイを、本明細書以下の実施例５に記載されるように行った。殺細胞アッセイによって測定されたｂＬＡＣの効力を、１細胞当たりのｐｇ  ｂＬＡＣで示した（ＬＤ５０）。殺細胞アッセイにおける試験の前に、ｂＬＡＣ溶液を、ＮＡＰ−２５脱塩カラム（ＧＥ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ）を使用してＮａＣｌ（０．９％）に対して脱塩した。
【０３２２】
結果：変換実行の比較
Ｑ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬにおけるいくつかの変換実行のクロマトグラムが図９に見られる。全ての実行において、ＥＤＴＡの最終濃度は１ｍＭであった。
【０３２３】
変換実行の結果は、表３において要約した。収率計算及び殺細胞能を、７０％溶媒Ｂ（溶媒Ａ中）で溶離されたピークについて行った。
【０３２４】
【表５】
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【０３２５】
表３に示される結果から、変換の収率が８０％を超えることが理解され得る。
【０３２６】
２．９、４．１及び８．８ｍｇ／ｍＬ  Ｑ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬに対応する３つの異なるｂＬＡロード３０、４２及び９０ｍｇ／ｃｍ2を、ＬＡＣ−０４１、−０４２及び−０４７において試験した。変換の収率は、最も高いロード（ＬＡＣ−０４７）でも依然として８０％を超えるとわかった。
【０３２７】
ＳＥ−ＨＰＬＣ
ｂＬＡＣへのｂＬＡの異なる変換実行から溶離されたピークをＳＥ−ＨＰＬＣによって分析した。実行の収率を測定するために、これらの分析を変換の前及び後のｂＬＡ／ｂＬＡＣの定量化のために使用した（表３を参照のこと）。この分析によって、変換後のｂＬＡＣ、即ち、単量体、二量体、又は凝集体形態の純度も示された。これは、変換実行が異なるｂＬＡロードで行われた場合に、特に重要であった。
【０３２８】
ＳＥ−ＨＰＬＣクロマトグラム（図９）を見ると、７０％Ｂバッファーで回収されたｂＬＡＣは主に単量体形態であったことがわかる。より高いロードで、ｂＬＡＣ単量体のみが回収される傾向があった。次いで、ｂＬＡ二量体が、より少量のｂＬＡ単量体を伴って、４５％Ｂバッファーでの第１ステップ勾配において回収された。殺細胞活性は、４５％Ｂバッファー溶離において回収されなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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