(57)【要約】  核酸から、選択的な２価遷移金属イオン沈殿によって、対象のタンパク質、例えばマンノース結合レクチン（ＭＢＬ）を分離する方法が開示される。本方法によれば、対象のタンパク質から迅速かつ効率的に核酸を分離することを可能にする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロで培養された宿主細胞によって生産された対象のタンパク質から核酸を分離する方法であって、
ｉ）核酸およびタンパク質を含む組成物を備えること；および
ｉｉ）該組成物と２価遷移金属のカチオンとを接触させ、それによって核酸を沈殿させること；および
ｉｉｉ）上清から沈殿を分離すること、
の工程を含み、それによってタンパク質から核酸を分離する、上記方法。
【請求項２】
対象のタンパク質が、レクチンである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
レクチンが、マンノース結合レクチン（ＭＢＬ）である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＭＢＬが、配列番号１に記載のＭＢＬ、および配列番号１と少なくとも８０％同一な配列を含むその機能的な相同体からなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＭＢＬが、精製された天然のヒト血清ＭＢＬである、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
ＭＢＬが、組換え生産されている、請求項３または４に記載の方法。
【請求項７】
非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定して、ＭＢＬの５０％より多くが２００ｋＤａよりも大きい、請求項３〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
対象のタンパク質が、抗体またはその抗原結合フラグメントであり、ここにおいて該抗体は、Ｚｎ2+によって有意な含量で沈殿しない、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
核酸が、ＤＮＡおよびＲＮＡからなる群より選択される１つまたはそれ以上である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
核酸が、ＤＮＡである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＤＮＡが、ゲノムＤＮＡである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
組成物が、動物、その部分もしくは細胞から調製された抽出物、または、このような抽出物の単離された分画である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
動物、その部分または細胞が、前記タンパク質を生産する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
組成物が、全細胞培養物、すなわち細胞培養物および細胞培養上清、もしくは細胞培養上清、またはそれらの単離された分画である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
細胞が、対象のタンパク質を生産する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
細胞が、対象のタンパク質を生産し分泌する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
細胞が、該細胞中で発現を指示する第二の核酸配列に作動可能に会合された、対象のタンパク質をコードする第一の核酸を含み、ここで上記第二の核酸配列は、自然状態では第一の核酸配列と会合しない、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
細胞が、配列番号１のＭＢＬをコードする第一の核酸配列、またはそれと少なくとも８０％同一な配列を含む機能的な相同体を含むＨＥＫ細胞である、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
組成物が、ヒトの体液、またはその単離された分画である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
単離された分画が、クロマトグラフィーによって調製される、請求項１２〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
クロマトグラフィーが、アフィニティークロマトグラフィーである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
２価遷移金属のカチオンが、Ｚｎ2+、Ｍｎ2+、Ｎｉ2+、およびＣｏ2+からなる群より選択される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
２価遷移金属のカチオンが、Ｚｎ2+である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
Ｚｎ2+が、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、フッ化亜鉛、ヨウ化亜鉛、水酸化亜鉛、炭酸亜鉛、クロム酸亜鉛、および酢酸亜鉛からなる群より選択される１つまたはそれ以上である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
Ｚｎ2+が、ＺｎＣｌ2の形態である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
２価金属のカチオンを、１０〜１００ｍＭの範囲、好ましくは４０〜６０ｍＭの範囲の濃度で前記組成物に添加する、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
組成物に、ホスフェートを添加する、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
組成物に、ホスフェートを０．０１〜１０ｍＭの範囲の濃度で添加する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ホスフェートが、ＮａＰＯ4またはＮａＨ2ＰＯ4である、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
ホスフェートが、ＮａＨ2ＰＯ4である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
核酸を、５分〜４８時間の範囲、好ましくは１５分〜２４時間の範囲に亘って、例えば約１時間で２価金属のカチオンで沈殿させる、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
核酸を、１℃〜４０℃の範囲、好ましくは１℃〜３０℃の範囲、より好ましくは１℃〜２２℃の範囲の温度で、例えば約４℃で沈殿させる、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
核酸を、５〜８の範囲、好ましくは５．５〜６．５の範囲のｐＨで沈殿させる、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
組成物が、最大で５０ｍＭ、好ましくは最大で３０ｍＭのＥＤＴＡを含む、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
沈殿を、重力によって上清から分離する、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
沈殿を、遠心分離によって上清から分離する、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
組成物中の核酸の少なくとも５０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％を沈殿させる、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
対象のタンパク質の最大１０％、好ましくは最大６％で沈殿させる、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
インビトロで培養された宿主細胞によって生産された単離された対象のタンパク質を調製する方法であって、
ａ）場合により、１回またはそれ以上のタンパク質の単離工程を行うこと；および
ｂ）請求項１〜３８のいずれか一項に記載の方法を行うこと；および
ｃ）場合により、１回またはそれ以上のタンパク質の単離工程を行い、それによって単離された対象のタンパク質を得ること、
の工程を含む、上記方法。
【請求項４０】
少なくとも一つのタンパク質単離工程が、クロマトグラフィーである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
クロマトグラフィーが、アフィニティークロマトグラフィーである、請求項４０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、選択的２価遷移金属イオン沈殿によって核酸から対象のタンパク質を精製する方法に関する。特に、本発明は、例えばマンノース結合レクチン（ＭＢＬ）のような対象のタンパク質から核酸を分離する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
対象のタンパク質の精製は、核酸、その他のタンパク質、ファージまたはウイルスなどの不要な実体による汚染を伴うことが多い。汚染物質から対象のタンパク質を分離する方法として、クロマトグラフィーおよび／またはろ過方法が用いられることが多い。対象のタンパク質を精製する場合、特に該タンパク質を宿主細胞中で生産している場合、主要な汚染物質の１つは核酸、例えば宿主細胞のゲノムＤＮＡである。
【０００３】
本発明の好ましい実施態様において、対象のタンパク質は、マンノース結合レクチン（ＭＢＬ）である。ＭＢＬは、遺伝性または後天性ＭＢＬ欠損症に関連する機能的および／または臨床的症状を有する患者の補充または置換療法に使用できるタンパク質である。
【０００４】
ＭＢＬは、コレクチンファミリーのタンパク質であり、それぞれコラーゲン様ドメインに結合したカルシウム依存性のＣ型糖質ドメイン（ＣＲＤ）からなるサブユニットのオリゴマー構造を有することを特徴とする。ヒトの場合、ＭＢＬは、ＭＢＬ２遺伝子によってコードされている。ＭＢＬは、通常、ホモ三量体のＭＢＬからなるサブユニットで見出される。各サブユニットのポリペプチドは、Ｍ末端のジスルフィド架橋によって結合しており、３つのＭＢＬポリペプチドのコラーゲン様のドメインは、三重らせんのコラーゲン様のロッドを形成している。これらのサブユニットが組み立てられて２個を超えるサブユニットを含むより高次のオリゴマーになるが、ヒト血漿から精製されたＭＢＬの優勢な活性型は四量体である（非特許文献１）。
【０００５】
組換え生産されたＭＢＬから、血漿から誘導されたＭＢＬに類似したオリゴマーの変異が存在することがわかった（非特許文献２）。しかしながら、組換え生産されたＭＢＬは、血漿由来のＭＢＬで行なうよりも低質量の形態の含有量が高いことが多い。ＭＢＬの低質量の形態としては、例えば単一のポリペプチド鎖、単一のサブユニットおよび二量体のサブユニットが挙げられる。
【０００６】
ＭＢＬは、先天性免疫系において重要な役割を有する。ＭＢＬは、関連セリンプロテアーゼ（ＭＡＳＰ−マンノース結合レクチン関連セリンプロテアーゼ）を介して、すなわちＣ１ｑに類似したメカニズムによって補体経路を活性化する。
【０００７】
いくつかの異なるＭＢＬ精製の方法が説明されている。特許文献１には、ＭＢＬを精製する方法が記載されており、この方法は、例えばＣａ2+のような沈殿剤を用いてＭＢＬを沈殿させることを含む。
【０００８】
（組換え）ＭＢＬの精製に一般に使用される方法には、核酸からＭＢＬを分離するために、ＭＢＬ組成物にベンゾナーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ(R））エンドヌクレアーゼを添加することが含まれる（非特許文献２、３）。
【０００９】
非特許文献４および５には、金属カチオンそして特に亜鉛の添加によってＤＮＡの沈降を起こす方法が記載されている。これらの実験によれば、それらの制限フラグメントおよびλファージＤＮＡのフラグメントを含む２つのプラスミドからのＤＮＡ；スーパーコイルおよび線状ＤＮＡを、金属イオンと共にインキュベートすると、ＤＮＡの沈降が起こった。試験された金属イオンのなかで、亜鉛が最も有効であることが証明された。この方法は、長さが５６４〜２３，１３０ｂｐのＤＮＡフラグメントで試験された（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】ＷＯ０３／０１０１８８
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Teillet, F, Dublet B, Andrieu JP, Gaboriaud C, Arlaud GJ, Thielens NM: The two major oligomeric forms of human mannan-binding lectin: chemical characterization, carbohydrate-binding properties, and interaction with MBL-associated serine proteases, J Immunol 174 (2005) 2870-7
【非特許文献２】Vorup-Jensen T et al: Recombinant expression of human mannan-binding lectin, Int Immunopharm 1 (2001) 677-687
【非特許文献３】Jensen PH et al:Characterization of the oligomer structure of recombinant human mannan-binding lectin, J Biol Chem 280(2005)11043-11051
【非特許文献４】Kejnovsky, E and Kypr, J: Milimolar concentrations of zinc and other metal cations cause sedimentation of DNA, Nucleic Acids Res 26 (1998) 5295-5299
【非特許文献５】Kejnovsky, E and Kypr, J:DNA extraction by zinc, Nucleic Acids Res 25(1997)1870-1871
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
対象のタンパク質の精製は、一般的に、汚染する核酸、ファージおよび／またはウイルスの除去、またはそれらからの分離を含む。これらの汚染物質から対象のタンパク質を分離するための選択の方法は、クロマトグラフィーおよび／またはろ過方法による。また、酵素的な方法も場合により上述の方法と組み合わせていてもよい。しかしながら、対象のタンパク質の精製は、場合によっては、難しく、時間がかかり、および／または費用がかかる。上述したように、汚染ＤＮＡは、ヌクレアーゼ、例えばベンゾナーゼ(R)エンドヌクレアーゼの添加、続いてサイズ排除クロマトグラフィーによって除去することができるが、これらの方法はいずれも多大な費用を要するものであり、さらに、例えばＭＢＬをラージスケールで生産する場合にベンゾナーゼ（R）エンドヌクレアーゼの供給が不足する可能性があるため、これらの方法の代替法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明によれば、迅速かつ有効な対象のタンパク質の精製方法が開示される。特には、本発明によれば、その溶液に沈殿剤を添加することによって対象のタンパク質から核酸を分離する方法が開示され、該方法は：
−核酸およびタンパク質を含む組成物を備えること；および
−該組成物と２価遷移金属のカチオンとを接触させることによって、核酸を沈殿させること；および
−上清から沈殿を分離すること、
の工程を含み、それによって核酸をタンパク質から分離する。
【００１４】
対象のタンパク質は、どのような有用なタンパク質でもよい。好ましくは、対象のタンパク質は、前記２価遷移金属のカチオンによっていずれの有意な含量でも沈殿しないタンパク質である。
【００１５】
本発明のその他の好ましい実施態様において、前記タンパク質はレクチン、例えばＭＢＬまたはそれらの誘導体および／または変異体である。先行技術（ＷＯ０３／０１０１８８）において、ＭＢＬのようなレクチンは、沈殿剤（例えばＣａ2+）で沈殿され得ることが記載されている。驚くべきことに、本発明者等は、ＭＢＬは、２価遷移金属のカチオンでいずれの有意な含量でも沈殿しないことを実証した。従って、本発明に係る方法は、ＭＢＬのようなレクチンの精製に特に有用である。
【００１６】
本発明のその他の側面は、宿主細胞の培養によって生産された、単離された対象のタンパク質を調製する方法に関する。前記タンパク質の単離方法は、以下：
−場合により、１回またはそれ以上のタンパク質の単離工程を行うこと；および
−２価遷移金属のカチオンで核酸を沈殿させることによって対象のタンパク質から核酸を分離すること；および
−沈殿と上清とを分離し、上清を回収すること；および
−場合により、１回またはそれ以上のタンパク質単離工程を行うこと、
−それによって単離された対象のタンパク質を得ること
の工程を有する。
【００１７】
本発明に係る方法は、対象のタンパク質、例えばＭＢＬのようなレクチンのラージスケールでの製造を可能にする。従って、その他の形態において、本発明は、前記ＭＢＬを製造する際に前記方法を適用することを含む、任意の工業的またはラージスケールでのＭＢＬ製造方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１−１】左：前処理をせずにＺｎ2+またはＣａ2+を添加した後の沈殿のＡＩＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムである。右：前処理をせずにＺｎ2+またはＣａ2+を添加した後の沈殿のＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１−２】図１−１の続きである。
【図１−３】図１−２の続きである。
【図２−１】左：Ｚｎ2+またはＣａ2+トリス（１０ｍＭ）、ＮａＣｌ（１４０ｍＭ）（ｐＨ７．４）を添加した後の沈殿のＡＩＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムである。右：緩衝液をトリス（１０ｍＭ）、ＮａＣｌ（１４０ｍＭ）（ｐＨ７．４）に交換した後にＺｎ2+またはＣａ2+を添加した後の沈殿のＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２−２】図２−１の続きである。
【図２−３】図２−２の続きである。
【図３−１】左：Ｚｎ2+またはＣａ2+トリス（１０ｍＭ）、ＮａＣｌ（１４０ｍＭ）、Ｎａ2ＨＰＯ4（１ｍＭ）（ｐＨ７．４）を添加した後の沈殿のＡＩＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムである。右：緩衝液をトリス（１０ｍＭ）、ＮａＣｌ（１４０ｍＭ）、Ｎａ2ＨＰＯ4（１ｍＭ）（ｐＨ７．４）に交換した後にＺｎ2+またはＣａ2+を添加した後の沈殿のＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図３−２】図３−１の続きである。
【図４−１】Ｚｎ2+を添加した後の沈殿、および４℃または２２℃のいずれかで、１時間または２１時間のいずれかにおける沈殿のＡＩＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図４−２】図４−１の続きである。
【図４−３】図４−２の続きである。
【図４−４】図４−３の続きである。
【図５−１】Ｚｎ2+を様々な濃度；１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭおよび１００ｍＭで添加した後の沈殿のＡＩＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図５−２】図５−１の続きである。
【図５−３】図５−２の続きである。
【図５−４】図５−３の続きである。
【図５−５】図５−４の続きである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、２価遷移金属イオンを用いて核酸を選択的に沈殿させることによる、核酸からの対象のタンパク質の精製に関する。対象のタンパク質は、どのようなタンパク質であってもよい。好ましい一実施態様において、対象のタンパク質は、培養中で宿主細胞によって生産されたものである。好ましくは、対象のタンパク質は、Ｚｎ2+によっていずれの有意な含量でも沈殿しないものであり、より好ましくは対象のタンパク質は、２価遷移金属イオンによって沈殿しないものである。従って、好ましくは、対象のタンパク質はＢＳＡではない。また、対象のタンパク質は、好ましくは卵アルブミンではない。
【００２０】
好ましい一実施態様において、対象のタンパク質はレクチンであってもよく、すなわち１種またはそれ以上の糖質と会合することができるタンパク質であってもよい。本発明のその他の実施態様において、対象のタンパク質は、抗体またはそれらのフラグメントであってもよく、特に、Ｚｎ2+によっていずれの有意な含量でも沈殿しない抗体またはそれらのフラグメントであってもよい。
【００２１】
一形態において、本発明は、マンノース結合レクチンおよび核酸を含む組成物中で、マンノース結合レクチン（ＭＢＬ）のような対象のタンパク質から核酸を分離する方法に関し、ここにおいてＭＢＬは、配列番号１に記載のＭＢＬまたはそれらの相同体からなる群より選択されるポリペプチドを含み、前記相同体は、配列番号１と少なくとも８０％同一である。
【００２２】
レクチン
本発明に従って精製されるレクチンは、どのようなレクチンでもよい。例えばレクチンは、コレクチン、例えばヒトコレクチンであってもよい。例えばレクチンは、ＭＢＬ（マンノース結合レクチン）、例えばヒトＭＢＬ、またはＳＰ−Ａ（肺表面活性物質プロテインＡ）およびＳＰ−Ｄ（肺表面活性物質プロテインＤ）であってもよい。コレクチンは、Ｃａ2+依存性またはＣ型レクチンのグループであり、これらはいずれも、類似の全体構造：Ｎ末端領域、コラーゲン様の領域、αヘリカルコイルドコイル領域、および糖質認識ドメイン（ＣＲＤ）を共有する。αヘリカルコイルドコイル領域およびコラーゲン様の領域によって、三量体構造が与えられる。Ｎ末端領域は、比較的システイン豊富な領域であり、これは三量体を安定化して、それらをジスルフィド架橋の形成を介して一緒に連結してオリゴマーにする。
【００２３】
本発明のその他の好ましい実施態様において、レクチンは、ＭＢＬである。
【００２４】
ＭＢＬ
一実施態様において、本発明は、ＭＢＬの精製に関する。ＭＢＬは、ヒト由来のものでもよいし、またはこれに関して免疫系がヒトの免疫系と同様に作用するその他の動物種由来を起源とするものでもよい。本発明のその他の好ましい実施態様において、ＭＢＬは、ヒト起源のものである。
【００２５】
野生型ヒトＭＢＬ、すなわちこのタンパク質の天然の突然変異していない形態は、配列番号１として同定される。本発明はまた、配列番号１（本明細書において以下に記載される詳細を参照）と少なくとも８０％同一な配列を含むＭＢＬの変異体および機能的な相同体も包含する。
【００２６】
変異体は、同じ種の野生型ＭＢＬと配列が異なるが、それでもなお機能的に能力を有する、天然のＭＢＬと定義することができる。変異体は、同じ種の野生型ＭＢＬの突然変異した形態であってもよいし、または代替のスプライス変異体であってもよい。その他の形態において、ＭＢＬ変異体は、本明細書において以下で説明されているような機能的な相同体と定義される。機能的な相同体としては、これらに限定されないが、エキソビボで導入された１個またはそれ以上の突然変異、および／または１個またはそれ以上の配列の欠失および付加を有するＭＢＬの組換え型が挙げられる。
【００２７】
ＭＢＬおよびＭＢＬ変異体
本願におけるＭＢＬという用語は、野生型ＭＢＬ、およびＭＢＬ変異体を意味する。野生型ＭＢＬという用語は、所定の種における、そのタンパク質の天然の突然変異していない形態を意味する。ヒト野生型ＭＢＬは、配列番号１として同定される。好ましい本発明の一実施態様において、ＭＢＬは、ヒトＭＢＬであり、より好ましい実施態様において、ＭＢＬは、ヒト野生型ＭＢＬ（配列番号１で同定される）である。非常に好ましい実施態様において、ＭＢＬは、組換え野生型ヒトＭＢＬである。ＭＢＬ変異体は、当業者に知られたＭＢＬのあらゆる形態、およびあらゆるそれらの機能的な相同体を含む。例えば、ＭＢＬ変異体は、スプライス変異体、および対立遺伝子変異体、および一ヌクレオチド多型を含む。対立遺伝子変異体の例は、２４Ｔ→Ａ、５２Ｒ→Ｃ、５４Ｇ→Ｄ、５７Ｇ→Ｅであり、ここにおいてアミノ酸は、配列番号１に従って番号が付けられている。特に、ＭＢＬ変異体は、配列番号１と同定されたアミノ酸配列を含む少なくとも１種のポリペプチドを含むタンパク質、またはそれらの機能的な相同体であってもよい。ＭＢＬの機能的な相同体は、配列番号１と少なくともある程度の配列同一性を示し、ＭＢＬと例えば以下のような１つまたはそれ以上の機能を共有するあらゆるタンパク質であり得る：
ｉ．Ｃ４を活性化する能力、および／または
ｉｉ．ＭＡＳＰと会合する能力、および／または
ｉｉｉ．ＭＡＳＰを活性化する能力。
【００２８】
ＭＢＬのＣ４を活性化する能力は、ＷＯ０３／０７７９３７の実施例９で説明されているようにして測定することができる。ＷＯ０３／０７７９３７は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＭＢＬのＭＡＳＰと会合する能力は、当業者に知られたいくつかの技術によって測定することができる。タンパク質の会合を測定する当業者に知られた一般的な方法は、免疫共沈降（co-immunoprecipitation）または類似の手法による方法である。この技術は、タンパク質混合物（例えば全細胞溶解産物）から標的タンパク質を精製すること、および続いて溶出液サンプル中で、共精製された（co-purified）タンパク
質、すなわち標的タンパク質と相互作用するタンパク質の存在に関して分析することを含む。共精製されたタンパク質を検出および同定するために適用された共通の技術は、マススペクトロメトリーおよびウェスタンブロッティングであり、これらはいずれも当業者に知られている。好ましくは、ＭＡＳＰ−２とＭＢＬとの共精製を可視化するために、ウェスタンブロッティングが用いられる。タンパク質の会合を測定するアプローチは、表面プラズモン共鳴分析であり、これによってさらに結合親和性に関する見識も得られる可能性があり、このような分析は当業者には知られている。最終的に、ＭＡＳＰ活性を測定する方法は当分野で説明されている。
【００２９】
機能的な相同体のさらなる詳細に関しては本明細書に記載の以下の章を参照されたい。
【００３０】
本発明に係るＭＢＬは、１種またはそれ以上のサブユニットを含んでもよい。ＭＢＬサブユニットは通常、３個の別個のポリペプチドからなり；好ましくはそれぞれ個々のポリペプチドは、配列番号１で同定されるアミノ酸配列、またはそれらの機能的な相同体を含む。例えばＭＢＬは、サブユニットの単量体、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体、十量体、１１−ｍｅｒ、１２−ｍｅｒであってもよいし、またはＭＢＬは、１２個よりもさらに多いサブユニットを含んでさえいてもよい。好ましくは、ＭＢＬは、２個より多いサブユニットを含む。さらに、３個よりも少ないまたは多いポリペプチドのサブユニット中に、ＭＢＬまたはＭＢＬ分画が存在していてもよく、これも本発明の範囲内である。
【００３１】
本発明で使用可能なＭＢＬは、あらゆる適切な源から誘導することができ、例えばＭＢＬは、天然のＭＢＬでもよいし、またはＭＢＬは組換え生産されたＭＢＬでもよい。その他の好ましい実施態様において、ＭＢＬは、組換えヒトＭＢＬである。より好ましい実施態様において、ＭＢＬは、組換えヒト野生型ＭＢＬである。組換え生産されたＭＢＬが本発明と共に用いられる場合、該組換え生産されたＭＢＬが、天然のＭＢＬに類似した粒度分布プロファイルを有することが好ましい。従って、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定した場合、少なくとも５０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％のＭＢＬが、２００ｋＤａより大きい見かけの分子量を有することが好ましい。
【００３２】
機能的な相同体
ＭＢＬサブユニットの各ポリペプチド鎖は、コラーゲン様ドメインに結合したＣ末端糖質認識ドメイン（ＣＲＤ）を含む。これらの２つのドメインはよく特徴付けられており、Ｘ線結晶学および／またはＮＭＲにより得られた３次元構造が公開されている。コラーゲンドメインに関して数種の３次元構造が公開されており（例えば、Kramer, R.Z. et al. 1999）、さらにヒトＭＢＬのＣＲＤも研究されている（Sheriff, S. et al. 1994）。コラーゲン／コラーゲン様ドメインは、３つの相互作用するポリペプチド鎖によって作出された三重らせんコンフォメーションを特徴とする。現在のところ、４５０種を超えるコラーゲン／コラーゲン様ドメインが哺乳動物タンパク質に注釈付けされている。これらのドメインは、Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａの３回の反復からなり、ここにおいて位置１のグリシンは、不変の残基である。位置２および３はどのようなアミノ酸を含んでいてもよいが、イミノ基のへリックスを安定化する作用のために、プロリンおよびヒドロキシ−プロリン残基の傾向がある。Ｋｒａｍｅｒ等は、Ｘ線結晶学によって、３回の反復の位置２および３は、プロリンおよびヒドロキシプロリン以外のアミノ酸を含んでもよいことを示し、ＢｈａｔｔａｃｈａｒｊｅｅおよびＢａｎｓａｌ（２００５）は、コラーゲンの３回の反復配列中の位置２および３において、所定の好ましいアミノ酸をまとめている。
【００３３】
当業者であれば、例えば上述のコラーゲン様ドメインのような他のタンパク質の保存されたドメインに関して公開された３次元構造および置換の研究に基づいて、機能的なＭＢＬ変異体をストレートに推測することができる。好ましくは、例えば配列アライメントによって評価した場合に密接に関連しているが異なる種のＭＢＬ間の進化的な保存を用いて、個々の残基に関して進化圧の程度を特定することができる。好ましくは、ＭＢＬ配列は、ＭＢＬの機能は保存されている種間で比較され、例えば、これらに限定されないが、齧歯類、サルおよび類人猿などの哺乳動物間で比較される。残基は、高い選択圧力下で、種間で変化する残基に比べて容易に置換することができない必須アミノ酸を示す可能性が高い。例えば、このようなアライメントは、ＢＬＡＳＴでアカゲザル（ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔｏ）のＭＢＬとヒトＭＢＬとを比較することによって行ってもよい。
【００３４】
ＭＢＬの機能の保存を確かめるために、当業者によく知られている機能分析を用いることができる。例えば、ＭＢＬのＣＲＤドメインの公開された３次元構造の検査、それに続いて、選択された突然変異体を比較するための競合糖結合分析に基づいて、Iobst et al.(1994)は、ラットＭＢＬにおいて突然変異（例えば、Ｉｌｅ（２０７）→Ｖａｌ）を同定したが、この変異によってマンノース結合定数が有意に変更されることはない。この方策は、難なくヒトＭＢＬに用いることができる。当業者によく知られたＭＢＬの機能を評価するための他の機能分析としては、これらに限定されないが、本明細書において上記で述べられた分析が挙げられ、例えばＣ４活性化分析（ＷＯ０３／０７７９３７で記載されている）である。
【００３５】
さらに当業者であれば、あるアミノ酸が１つまたはそれ以上の共通の化学および／または物理特性を有するその他のアミノ酸で置換される「保存的」アミノ酸置換の作製方法および評価方法について知っている。保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能性に影響を与える可能性が低い。アミノ酸は、共通の特徴に従って分類することができる。保存的アミノ酸置換は、予め決められたアミノ酸グループ内のあるアミノ酸を、同じグループ内のその他のアミノ酸で置換することであり、ここにおいて予め決められたグループ内のアミノ酸は、類似した、または実質的に類似した特徴を示す。本明細書において適用される用語「保存的アミノ酸置換」の意味の範囲内において、以下を有することを特徴とするアミノ酸グループ内で、あるアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい：
ｉ）極性側鎖（Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、および、Ｃｙｓ）
ｉｉ）非極性側鎖（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、および、Ｍｅｔ）
ｉｉｉ）脂肪族側鎖（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ）
ｉｖ）環状側鎖（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ）
ｖ）芳香族側鎖（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）
ｖｉ）酸性側鎖（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）
ｖｉｉ）塩基性側鎖（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）
ｖｉｉｉ）アミド側鎖（Ａｓｎ、Ｇｌｎ）
ｉｘ）ヒドロキシ側鎖（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）
ｘ）硫黄含有側鎖（Ｃｙｓ、Ｍｅｔ）、および
ｘｉ）モノアミノ−ジカルボン酸、またはモノアミノ−モノカルボン酸−モノアミドカルボン酸であるアミノ酸（Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ）。
【００３６】
本発明の範囲内の機能的な相同体は、配列番号１として同定されるヒトＭＢＬとある程度の配列同一性を示すポリペプチドであり、この相同体は、配列番号１と、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７５％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、その上さらにより好ましくは少なくとも９５％、および、最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する。
【００３７】
配列同一性は、多数のよく知られたアルゴリズムを用いて、および多数の異なるギャップペナルティーを適用することによって計算することができる。配列同一性は、全長の配列番号１と比較することによって計算することもできる。代替法として、配列同一性は、配列番号１と比較して計算することもでき、この場合、シグナルペプチドをコードする配列は含まれない。理論に束縛されるものではないが、シグナルペプチドは、配列番号１のアミノ酸１〜２０を含むと予想される。あらゆる配列アライメントツール（例えば、これらに限定されないが、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＬＡＬＩＧＮ）を用いて、相同体を検索して、配列同一性を計算することができる。さらに、一般的によく知られているあらゆる置換マトリックス（例えば、これらに限定されないがＰＡＭ、ＢＬＯＳＳＵＭまたはＰＳＳＭマトリックス）が、検索アルゴリズムと共に適宜用いることができる。例えばＰＳＳＭ（位置特異的スコア行列）を、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴプログラムを介して適用してもよい。さらに配列アライメントは、ギャップオープニングおよび伸長に関する各種のペナルティーを用いて行ってもよい。例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、５〜１２の範囲のギャップオープニングペナルティー、および１〜２の範囲のギャップ伸長ペナルティーと共に用いてもよい。
【００３８】
組換え生産
本発明は、対象のタンパク質の精製に関する。対象のタンパク質は、様々な方法で生産することができ、例えばヒト、動物、血清、血漿、乳汁、体液、組織、植物からの単離によって、または原核細胞、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞のような細胞中での発現、もしくは無細胞系での発現によって生産することができる。例えば抗体は、ハイブリドーマ細胞またはその他の宿主細胞で生産させることが可能であり、または抗体は血清から精製することもできる（詳細な説明については、以下の抗体に関する章を参照）。
【００３９】
本発明のその他の好ましい実施態様において、対象のタンパク質は、宿主細胞によって組換え生産されたものである。
【００４０】
従って、本発明の一形態において、対象のタンパク質は宿主細胞中で発現を指示することができる第二の核酸と作動可能に会合している、対象のタンパク質をコードする第一の核酸配列を含む宿主細胞によって生産される。従って、第二の核酸配列は、前記細胞において対象のタンパク質の発現を指示すると予想されるプロモーターを含むものが可能であり、またはこのようなプロモーターからなるものでもよい。当業者であれば、所定の宿主細胞に使用するのに有用な第二の核酸配列を容易に同定できると予想される。
【００４１】
対象の組換えタンパク質の生産方法は、一般的に、以下：
−宿主細胞を備えること、
−対象のタンパク質をコードする第一の核酸を含む遺伝子発現コンストラクトを調製すること（ここで第一の核酸は、宿主細胞中で上記対象のタンパク質の発現を指示することができる第二の核酸に作動可能に会合している）、
−宿主細胞を上記コンストラクトで形質転換すること、
−宿主細胞を培養して、それによって対象のタンパク質を発現させること、
の工程を含む。
【００４２】
従って、対象のタンパク質および核酸を含む組成物は、前記宿主細胞の抽出物でもよいし、または前記宿主細胞の抽出物から精製された組成物でもよい。本発明の一実施態様において、対象のタンパク質および核酸を含む組成物は、宿主細胞および培地を含む組成物であり、ここにおいて前記宿主細胞は培養されたものである。
【００４３】
従って、生産された組換えタンパク質は任意の従来の方法によって単離することができ、例えば本明細書において以下で説明されるタンパク質単離方法のいずれかによって単離することができる。当業者であれば、任意の対象のタンパク質を精製するための適切なタンパク質を単離する工程を特定することは可能である。
【００４４】
本発明の一実施態様において、組換え生産された対象のタンパク質は、宿主細胞によって分泌される。これは、対象のタンパク質がＭＢＬであるようなケース、または対象のタンパク質が抗体であるようなケースであり得る。
【００４５】
対象のタンパク質が分泌される場合、対象の組換えタンパク質の生産方法は、以下：
−宿主細胞を備えること、
−対象のタンパク質をコードする第一の核酸を含む遺伝子発現コンストラクトを調製すること（ここで第一の核酸は、上記宿主細胞中で上記対象のタンパク質の発現を指示することができる第二の核酸に作動可能に連結している）、
−該コンストラクトで宿主細胞を形質転換すること、
−宿主細胞を培養し、それにより対象のタンパク質の発現、および培地へのタンパク質の分泌を得ること、
−それによって対象のタンパク質を含む培地を得ること、
の工程を含んでいてもよい。
【００４６】
従って、本発明のこの実施態様において、対象のタンパク質および核酸を含む組成物は、培地であってもよいし、または培地から調製された組成物であってもよい。一実施態様において、対象のタンパク質および核酸を含む組成物は、宿主細胞を含む培地であり得る。
【００４７】
本発明のその他の実施態様において、前記組成物は、動物、それらの部分もしくは細胞から調製された抽出物、またはこのような抽出物の単離された分画である。
【００４８】
本発明のその他の好ましい実施態様において、対象のタンパク質は、インビトロで宿主細胞中で組換え生産されたものであり、細胞溶解産物、細胞抽出物、または組織培養上清から単離される。より好ましい実施態様において、対象のタンパク質は、対象のタンパク質を発現するように改変された宿主細胞によって生産される。さらにより本発明の好ましい実施態様において、前記宿主細胞は、対象のタンパク質を生産して分泌するように形質転換されたものである。
【００４９】
従って、その他の好ましい実施態様において、ＭＢＬ調製は、好ましくは組換えによる調製であり、ここにおいてＭＢＬ調製は、以下：
宿主細胞中で発現を指示することができる第二の核酸に作動可能に連結したヒトＭＢＬペプチドまたはそれらの機能的な等価体をコードする第一の核酸を含む遺伝子発現コンストラクトを調製すること、
該コンストラクトで宿主細胞培養を形質転換すること、
培地中で宿主細胞培養を培養し、それによりポリペプチドの発現、および培地へのポリペプチドの分泌を得ること、
様々なＭＢＬ分子および核酸を含む組成物を得ること、
により得られる。
【００５０】
前記組成物は、例えば培地、培地から精製した組成物、または宿主細胞を含む培地であり得る。
【００５１】
好ましい本発明の一実施態様において、前記核酸およびタンパク質を含む組成物が培地である場合、好ましくは該培地の採取後できる限り早く、培地（場合により、宿主細胞を含んでいてもよい）を、前記２価遷移金属のカチオンと接触させ、ここにおいて、好ましくは採取後２４時間以内、より好ましくは１２時間以内、さらにより好ましくは３時間以内、さらにより好ましくは１時間以内、例えば３０分以内、例えば採取後１５分以内に接触させる。非常に好ましい実施態様において、前記２価遷移金属のカチオンは、細胞が培養されている容器中直接培地に添加される。
【００５２】
本発明によれば、ＭＢＬ遺伝子由来の配列は、ヒトＭＢＬ遺伝子由来のものでもよいし、またはこれに関して免疫系がヒトの免疫系と同様に作用するその他の動物種のＭＢＬ遺伝子由来のものでもよい。
【００５３】
対象のタンパク質の合成は、インビトロまたはインビボでの培養を使用してもよい。宿主細胞培養は、好ましくは真核宿主細胞培養であり、例えば哺乳動物細胞培養である。好ましい宿主細胞培養は、ヒト腎細胞の培養であり、より好ましい形態において、宿主細胞培養は、ヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ細胞）の培養である。本発明は、対象の組換えタンパク質を生産するためにＨＥＫ２９３細胞系の使用を特徴とする場合がある。「ＨＥＫ２９３細胞系」は、ヒト胎児腎臓組織から誘導されたあらゆる細胞系を意味し、例えばこれらに限定されないが、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託された番号ＣＲＬ−１５７３およびＣＲＬ−１０８５２の細胞系が挙げられる。
【００５４】
好ましい本発明の実施態様において、前記ＨＥＫ細胞は、配列番号１のＭＢＬをコードする核酸配列、または少なくとも８０％の配列同一性を有する変異体もしくは機能的な相同体を含む。
【００５５】
本発明のその他の実施態様において、対象のタンパク質は、天然のヒト血清ＭＢＬである。
【００５６】
対象のタンパク質の組換え発現の好ましい実施態様の例が、ＰＣＴ出願ＷＯ００／０７００４３の実施例２に記載されており、これは参考文献として本明細書に組み込まれる。この実施例において、組換えＭＢＬは、ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞で発現される。
【００５７】
その他の好ましい実施態様において、宿主細胞培養は、ハイブリドーマ細胞培養である。これは、対象のタンパク質が抗体である場合に特に適している。
【００５８】
抗体
本発明の一実施態様において、対象のタンパク質は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。好ましくは、上記抗体は、Ｚｎ2+によっていずれの有意な含量でも沈殿しない抗体である。抗体またはそれらの機能的な等価体は、任意のタイプの当分野で既知の抗体であってよく、例えば哺乳動物から誘導されたポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、または合成抗体、例えば単鎖抗体もしくは抗体フラグメントを含むハイブリッドが挙げられる。加えて、抗体の機能的な等価体は、抗体フラグメント、特にエピトープ結合フラグメントであってよい。さらに上記抗体またはそれらの機能的な等価体は、抗体を模倣する低分子物質であってもよい。天然の抗体は、重鎖および軽鎖からなる免疫グロブリン分子である。
【００５９】
モノクローナル抗体（Ｍａｂ）は、全ての抗体分子が類似しているため同じエピトープを認識する抗体である。モノクローナル抗体は、一般的に、ハイブリドーマ細胞系によって生産される。モノクローナル抗体、および抗体を合成するハイブリドーマ細胞の作成方法は当業者によく知られている。抗体を生産するハイブリドーマは、例えば抗体を生産するＢリンパ球と、不死化したＢリンパ球系とを融合させることによって調製できる。本発明に係るモノクローナル抗体は、例えばＥｄ  ＨａｒｌｏｗおよびＤａｖｉｄ  ＬａｎｅによるＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ），１９８８）に記載されているようにして調製してもよい。前記モノクローナル抗体はあらゆる適切な哺乳動物種から誘導することができるが、モノクローナル抗体は、げっ歯類の抗体、例えばマウスまたはラットのモノクローナル抗体であることが多くなる。
【００６０】
ポリクローナル抗体は、特異的な所定の抗原を認識する抗体分子の混合物であるため、ポリクローナル抗体は、前記抗原内の種々のエピトープを認識する可能性がある。一般に、ポリクローナル抗体は、予め抗原で免疫化した哺乳動物の血清から精製される。ポリクローナル抗体は、例えばEd HarlowおよびDavid LaneによるAntibodies:A Laboratory Manual（コールドスプリングハーバーラボラトリープレス，１９８８）に記載されている方法のいずれかによって製造することができる。ポリクローナル抗体は、例えばマウス、ラット、ウサギ、ロバ、ヤギ、ヒツジなどのあらゆる適切な哺乳動物種から誘導することができる。抗体は非哺乳動物の種から誘導されたものではないことが好ましく、すなわち上記抗体は、例えばニワトリ抗体ではないことが好ましい。
【００６１】
本発明の一実施態様において、上記抗体はヒト抗体であり、例えばヒトモノクローナル抗体である。あるいは上記抗体は、ヒト化抗体であってもよい。ヒト化抗体は、一般に、ヒト抗体から誘導された領域と、ヒト以外の抗体（例えばげっ歯類の抗体）から誘導された領域とを含むキメラ抗体である。ヒト化（または、いわゆる再形成（Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ）、またはＣＤＲグラフティング）は、異種の源（一般的にはげっ歯類）由来のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の免疫原性を減少させるために、およびそれらのヒトの免疫系の活性化、げっ歯類のＣＤＲをグラフト化したフレームワークを改善するために十分に確立された技術である。用語「ヒト化抗体分子」（ＨＡＭ）は、本明細書において、ヒト以外の種由来の免疫グロブリンから誘導された抗原結合部位を有する分子を説明するものとして用いられ、ここにおいて、この分子の残存する免疫グロブリンから誘導された部分の一部または全部は、ヒト免疫グロブリンから誘導される。抗原結合部位は、１種またはそれ以上のヒト定常ドメインに融合した非ヒト免疫グロブリン由来の完全な可変ドメイン；または可変ドメイン中の適切なヒトフレームワーク領域にグラフト化された１つまたはそれ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）のいずれかを含んでもよい。ＭＡｂをヒト化する方法の１つは、１つの抗体の完全な可変ドメインを含む抗原結合部位が、第二の抗体、好ましくはヒト抗体から誘導された定常ドメインに融合しているキメラ抗体の生産に関する。
【００６２】
抗体の機能的な等価体は、抗体のフラグメントでもよいし、好ましくは抗原結合フラグメント、または可変領域でもよい。本発明で使用するのに有用な抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、およびＦｖフラグメントが挙げられる。パパインで抗体を消化すると、Ｆａｂ  フラグメントと呼ばれる２つの同一な抗原結合フラグメントが生産され、これらはそれぞれ、単一の抗原結合部位、および残留した「Ｆｃ」フラグメント（その容易に結晶化する能力にちなんで「Ｆｃ」フラグメントと称される）を有する。ペプシン処理により、抗原を架橋できる２つの抗原結合フラグメントを有するＦ（ａｂ’）2フラグメント、および残りのその他のフラグメント（これはｐＦｃ’と呼ばれる）が得られる。更なるフラグメントとしては、二重特異性抗体、線状抗体、単鎖抗体分子、および抗体フラグメントから形成された多重特異性を有する抗体が挙げられる。抗体に関して本明細書で用いられる「機能的なフラグメント」は、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ）、および、Ｆ（ａｂ’）2フラグメントのことである。
【００６３】
Ｆａｂは、抗体分子の１価の抗原結合フラグメントを含むフラグメントである。Ｆａｂフラグメントは、酵素パパインで全抗体を消化して無傷の軽鎖と１つの重鎖の一部を得ることによって生産できる。
【００６４】
Ｆａｂ’は、抗体分子のフラグメントであり、これは、全抗体をペプシンで処理し、続いて還元し、無傷の軽鎖と重鎖の一部を生じさせることにより得ることができる。抗体分子１つあたり、２つのＦａｂ’フラグメントが得られる。Ｆａｂ’フラグメントは、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に、抗体のヒンジ領域からの１個またはそれ以上のシステインなどの数個の残基が付加されている点で、Ｆａｂフラグメントとは異なる。
【００６５】
（Ｆａｂ’）2は、酵素ペプシン全抗体をその後の還元を行わずに処理することにより得ることができる抗体のフラグメントである。Ｆ（ａｂ’）2は、２つのジスルフィド結合によって一つに保持された２つのＦａｂ’フラグメントの二量体である。
【００６６】
Ｆｖは、完全な抗原認識および結合部位を含む最小限の抗体フラグメントである。この領域は、強い非共有結合で会合した１つの重鎖と１つの軽鎖可変ドメインとの二量体からなる（ＶH−ＶL二量体）。この立体配置において、各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用して、ＶH−ＶL二量体の表面上の抗原結合部位が規定される。６個のＣＤＲが集合的に、抗体に抗原結合の特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメインでも（または抗原に特異的なＣＤＲを３つしか含まないＦｖの半分）、結合部位全体よりも低い親和性であるが、抗原を認識して結合する能力を有する。
【００６７】
また抗体は、単鎖抗体（「ＳＣＡ」）であってもよく、これは、遺伝子学的操作により融合した単一鎖分子として適切なポリペプチドリンカーによって連結された軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域を含む遺伝子操作された分子と定義される。またこのような単鎖抗体は、「単鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体フラグメントとも呼ばれる。一般に、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、それにより、ｓＦｖが抗原結合にとって望ましい構造を形成することができる。
【００６８】
１価の抗体とは、抗原の単一分子と結合することができる抗体分子を意味し、従って１価の抗体は、抗原架橋の能力はない。１価の抗体の場合、免疫グロブリンの定常ドメインのアミノ酸残基配列は、当分野既知の抗体分子の構造的な部分、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４を含む。その上、定常ドメインが、重鎖または軽鎖定常ドメイン（それぞれＣHまたはＣL）のいずれかの可能性がある限り、軽鎖定常ドメインは、他方の軽鎖定常ドメイン、または重鎖定常ドメインのいずれかにジスルフィド架橋が可能である。それに対して、重鎖定常ドメインは、２つの独立したジスルフィド架橋を形成することができ、それにより、他方の重鎖および軽鎖の両方への架橋形成、または重鎖のポリマーの形成が可能になる。
【００６９】
多価の抗体は、少なくとも２つの結合ドメインを有する。これらの結合ドメインは、同じリガンドに対して特異性を有していてもよいし、または異なるリガンドに対して特異性を有していてもよい。
【００７０】
二重特異性分子は、単一鎖の二重特異性分子、例えば単一鎖の二重特異性抗体、１つの単鎖抗体と結合ドメインとを含む単一鎖の二重特異性分子、または２つの結合ドメインを含む単一鎖の二重特異性分子であり得る。また多重特異性を有する分子は、単一鎖の分子であってもよいし、または少なくとも２つの単一鎖の分子を含んでもよい。
【００７１】
ＤＮＡ
本発明は、宿主細胞の培養によって生産された核酸をタンパク質から分離する方法に関する。核酸は、ヌクレオチドのポリマーである。ポリヌクレオチド鎖は、ホスフェート、糖、および４種の核酸塩基（ＤＮＡの場合は：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびチミン（Ｔ）であり、またはＲＮＡの場合はチミンの代わりにウラシル（Ｕ））の１つからなるヌクレオチドサブユニットで構成され、この核酸塩基が交互になった糖−ホスフェートと共有結合で連結され、ＤＮＡ主鎖を形成する。ＤＮＡの２つのポリヌクレオチド鎖が絡み合って二重らせん構造を形成する。本発明のその他の好ましい実施態様において、前記核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。
【００７２】
数種のタイプの核酸が、宿主細胞から単離されたタンパク質サンプルを汚染する可能性がある。ウイルスは、ＲＮＡまたはＤＮＡウイルスのいずれかの可能性があり、従って一本鎖（ｓｓＲＮＡまたはｓｓＤＮＡ）、または二本鎖（ｄｓＲＮＡまたはｄｓＤＮＡ）核酸ウイルスのいずれかの可能性がある。タンパク質を単離する場合、ウイルス核酸が汚染源となることが多く、または例えば血清、血漿または細胞抽出物から単離する場合、内因性核酸が汚染源となることが多い。
【００７３】
本発明の一実施態様において、ウイルス核酸も、本明細書において説明される方法によって対象のタンパク質から分離することができる。従って、本発明に係る方法はまた、ウイルスを減少させることにも使用できる。
【００７４】
プラスミドは、典型的には環状の二本鎖ＤＮＡ分子であり、典型的には自律増殖できる細菌由来である。
【００７５】
また核酸は、バクテリオファージであってもよい。
【００７６】
ゲノムＤＮＡ
本発明の一実施態様において、前記核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡ、例えばＤＮＡ、ＲＨＡ、ファージまたはウイルスからなる群より選択される１種またはそれ以上である。好ましい実施態様において、前記核酸は、ＤＮＡである。さらにより好ましい実施態様において、本発明は、対象のタンパク質から、宿主細胞由来の残留したゲノムＤＮＡを分離することに関する。
【００７７】
生物のゲノムは、該生物が保持するあらゆる遺伝性物質と定義され、一般的にはＤＮＡであるが、ある種のウイルスはＲＮＡである。より正確な定義は、真核生物において染色体の一倍体の一組；細菌において単一の染色体；または、ウイルスのＤＮＡまたはＲＮＡに含まれる全ての遺伝学的な物体である。脊椎動物において、ゲノムＤＮＡとは、一般的に生物の核のＤＮＡを説明しており、それら自身のＤＮＡを含むミトコンドリアのような細胞小器官のＤＮＡは含まれない。
【００７８】
例えば組換えタンパク質生産のような分子生物学的な方法に、動物、それらの部分もしくは細胞が用いられる場合、残留したゲノムＤＮＡはしばしば汚染の原因となる。残留したゲノムＤＮＡは、ベンゾナーゼ（R）またはＤＮアーゼＩのようなヌクレアーゼの添加によって除去することができる。ヌクレアーゼは、ＤＮＡのヌクレオチドサブユニット間のホスホジエステル結合を切断することができる酵素である。しかしながらこの方法は極めて多大な費用を要し、ｒｈＭＢＬを大規模生産する際にベンゾナーゼ（R）供給の不足に伴う問題が生じる可能性がある。
【００７９】
２価遷移金属イオン
本発明のその他の形態は、核酸およびタンパク質を含む組成物と、２価遷移金属のカチオンとを接触させることに関する。好ましくは、２価遷移金属のカチオンは、Ｚｎ2+、Ｍｎ2+、Ｎｉ2+、およびＣｏ2+からなる群より選択され、より好ましくはＺｎ2+である。
【００８０】
日常の生物学的プロセスにおける金属イオン、特に２価金属イオンの役割は重要である。このような金属イオンは、以下の少なくとも３つの役割において機能する可能性がある：
１：タンパク質の離れた（一次構造に関して）残基またはドメインを架橋すること、
２：タンパク質とリガンドとの相互作用を媒介すること、および
３：活性部位において、求核性触媒または電子輸送体のいずれかとしての役割を果たすこと。
【００８１】
この問題をより興味深くすることは、ほとんど全ての金属イオンはこれらの役割それぞれを満たすことができるが、２価遷移金属イオンが他の２価カチオンと比較して異なる生物活性を示すように生物学的プロセスが金属イオン特異的であることが多いことである。例えば凝固カスケードは、Ｃａ（ＩＩ）イオン特異的であり、タンパク質生合成は、主としてＭｇ（ＩＩ）イオン特異的であり、一連の酵素は、Ｚｎ（ＩＩ）イオン特異的であり、酸化性プロセスは、鉄特異的であることが多い。
【００８２】
興味深いことに、ＭＢＬのようなある種のレクチンは、２価カチオン、すなわちＣａ2+によって沈殿する可能性があると説明されているが、本発明は、ＭＢＬは、Ｚｎ2+によっていずれの有意な含量でも沈殿しないことを、これまでに開示している。
【００８３】
一般に、２価遷移金属のカチオンは、塩の形態となる。それに対応するアニオンは、あらゆる有用なアニオンが可能である。
【００８４】
２価遷移金属イオンに対応するアニオンは、あらゆる適切なアニオンが可能である。本発明の一実施態様において、２価遷移金属イオンに対応するアニオンは、サルフェート、クロライド、フルオライド、ヨーダイド、ヒドロキサイド、Ｍｅ2+カーボネート、クロメートおよびアセテートからなる群より選択される１種またはそれ以上であり得る。
【００８５】
組成物に１種より多くの異なる２価遷移金属のカチオンが添加されることも本発明の範囲内に含まれ、例えば２種、例えば３種、例えば４種の異なる２価遷移金属のカチオンが添加される。また、１種より多くの異なる塩が添加されることも本発明に含まれる。従って、上述のあらゆる２価遷移金属のカチオン、および、それらに対応するアニオンのあらゆる混合物が本発明で使用できる。
【００８６】
本発明のその他の好ましい実施態様において、２価遷移金属のカチオンは、Ｚｎ2+である。
【００８７】
２価遷移金属のカチオン、好ましくはＺｎ2+、例えばＺｎＣｌ2の形態のＺｎ2+は、好ましくは１ｍＭ〜４００ｍＭ、好ましくは５ｍＭ〜３００ｍＭ、例えば１０ｍＭ〜２００ｍＭ、好ましくは２０ｍＭ〜１００ｍＭ、例えば２５ｍＭ〜９０ｍＭ、好ましくは３０ｍＭ〜８０ｍＭ、例えば３５ｍＭ〜７０ｍＭ、好ましくは４０ｍＭ〜６０ｍＭの範囲の濃度で、例えば約５０ｍＭの濃度で組成物に添加される。
【００８８】
従って、本発明の一実施態様において、Ｚｎ2+は、組成物中のＺｎ2+の濃度が、１ｍＭ〜４００ｍＭ、好ましくは５ｍＭ〜３００ｍＭ、例えば１０ｍＭ〜２００ｍＭ、好ましくは１５ｍＭ〜１００ｍＭ、例えば２０ｍＭ〜８０ｍＭ、好ましくは２０ｍＭ〜８０ｍＭ、より好ましくは２０ｍＭ〜４０ｍＭ、例えば３０ｍＭ〜７０ｍＭ、好ましくは３５ｍＭ〜５０ｍＭ、より好ましくは２０ｍＭ〜８０ｍＭ、さらにより好ましくは３０ｍＭ〜７０ｍＭ、さらにより好ましくは４０ｍＭ〜６０ｍＭ、例えば３５ｍＭ〜４５ｍＭの範囲、例えば約４０ｍＭ、例えば４０ｍＭになるような量で組成物に添加される。
【００８９】
特に、本発明の実施態様において、沈殿が３７℃で行われる場合、組成物中のＺｎ2+の濃度は、好ましくは２０ｍＭ〜８０ｍＭの範囲であり、好ましくは２０ｍＭ〜６０ｍＭ、より好ましくは２０ｍＭ〜４０ｍＭの範囲である。
【００９０】
本発明の実施態様において、沈殿が４℃で行われる場合、組成物中のＺｎ2+の濃度は、好ましくは２０ｍＭ〜８０ｍＭの範囲、より好ましくは３０ｍＭ〜７０ｍＭの範囲、より好ましくは３０〜５０ｍＭの範囲、さらにより好ましくは４０〜６０ｍＭの範囲である。
【００９１】
亜鉛カチオンは、ＤＮＡにおいてコンフォメーション変化の誘導物質である。亜鉛カチオンはＤＮＡ二重鎖を安定化することによって、ＤＮＡの変性および復元に影響を与える。また亜鉛は、「ジンクフィンガー」ドメインを含むタンパク質と、ＤＮＡ、例えば多くの転写因子との相互作用においてもジンクフィンガードメインを安定化することによって重要な役割を果たす。
【００９２】
本発明の範囲内のＺｎ2+は、あらゆるＺｎ2+塩または複合体の形態であってもよく、例えばこれらに限定されないが、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、硝酸亜鉛、リン酸亜鉛、アルミン酸亜鉛、フッ化亜鉛、ヨウ化亜鉛、水酸化亜鉛、炭酸亜鉛、クロム酸亜鉛、安息香酸亜鉛、酢酸亜鉛、ｐ−アミノ安息香酸亜鉛、ｐ−ジメチルアミノ安息香酸亜鉛、ｐ−フェノールスルホン酸亜鉛、ｐ−メトキシケイ皮酸亜鉛、乳酸亜鉛、グルコン酸亜鉛、クエン酸亜鉛、サリチル酸亜鉛、ステアリン酸亜鉛、ラウリン酸亜鉛、ミリスチン酸亜鉛、オレイン酸亜鉛、２，５−ピリジンジカルボン酸亜鉛、２，６−ピリジンジカルボン酸亜鉛、４−ピリジンジカルボン酸亜鉛、２，４−ジカルボキシピリジン亜鉛、３−ヒドロキシ−２−カルボキシピリジン亜鉛、３−ｎ−プロポキシ−２−カルボキシピリジン亜鉛、３−ｎ−ヘキシルオキシ−２−カルボキシピリジン亜鉛、５−ｎ−プロポキシ−２−カルボキシピリジン亜鉛、５−ｎ−ブトキシ−２−カルボキシピリジン亜鉛、５−（２−エチル−ヘキシルオキシ）−２−カルボキシピリジン亜鉛、６−ｎ−ブトキシ−２−カルボキシピリジン亜鉛、３−メトキシ−２−カルボキシピリジン亜鉛、５−メトキシ−２−カルボキシピリジン亜鉛、６−メトキシ−２−カルボキシピリジン亜鉛、６−ｎ−ヘキシルオキシ−２−カルボキシピリジン亜鉛、３−メチル−２−カルボキシピリジン亜鉛、４−メチル−２−カルボキシピリジン亜鉛、４−ｔｅｒｔ−ブチル−２−カルボキシピリジン亜鉛、５−メチル−２−カルボキシピリジン亜鉛、５−ｎ−ヘキシル−２−カルボキシピリジン亜鉛、３−ｎ−ウンデシル−２−カルボキシピリジン亜鉛、４−ｎ−ウンデシル−２−カルボキシピリジン亜鉛、５−ｎ−ブチル−２−カルボキシピリジン亜鉛、６−ｎ−ウンデシル−２−カルボキシピリジン亜鉛、４−ニトログリセリン−２−カルボキシピリジン亜鉛、５−ヒドロキシ−２−カルボキシピリジン亜鉛、４−フルオロ−２−カルボキシピリジン亜鉛、２−カルボキシピリジンＮ−酸化物亜鉛、ピコリン酸亜鉛、ニコチン酸亜鉛、ニコチンアミド亜鉛、３，４−ジヒドロキシ安息香酸亜鉛、らせん状のヒスチジン亜鉛、ヒノキチオール亜鉛、プロトポルフィリン亜鉛、ポルフィリン亜鉛、または、ピコリン酸アミド亜鉛が挙げられる。
【００９３】
数種の異なるＺｎ2+塩が使用できることも本発明に含まれ、例えば上述の亜鉛塩および／または亜鉛複合体の組み合わせが使用可能である。このような組み合わせは、２種またはそれ以上の種類を含む組み合わせであってもよい。
【００９４】
精製
一実施態様において、本発明は、核酸およびタンパク質を含む組成物から対象のタンパク質を精製することに関し、ここにおいて１つの工程は、２価遷移金属イオンを用いて核酸を選択的に沈殿させることである。
【００９５】
本発明の一実施態様において、２価遷移金属イオンを用いた核酸の沈殿は、細胞培養と上清との両方を含む細胞培養中で直接的に行ってもよいし、または１つまたはそれ以上の任意のタンパク質単離工程の前に、またはその後に、もしくはその間に行ってもよい。
【００９６】
本発明に係る方法は、１つまたはそれ以上のタンパク質単離工程を含んでもよい。任意の適切なタンパク質単離工程を本発明で使用可能である。このような必要性がある場合、当業者であれば、一般的に、対象のタンパク質にとって有用なタンパク質単離工程を容易に認識できる。
【００９７】
本発明に有用なその他のタンパク質を単離する工程は、タンパク質精製に一般的に使用される方法でもよく、このような方法としては、例えばクロマトグラフィー方法、例えばガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、および／またはアフィニティークロマトグラフィー；ろ過方法、例えばゲルろ過、および限外ろ過；沈殿、例えば硫酸アンモニウム沈殿、および勾配による分離、例えばスクロース勾配による分離が挙げられる。
【００９８】
具体的な対象のタンパク質に応じて、上述のタンパク質単離工程のうち１つまたはそれ以上を本発明で用いてもよい。
【００９９】
上述の方法は当業者にはよく知られており、例えば「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ」（本書は、以下の題名「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、「Ｔｈｅ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、「Ｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ」、「Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ」、「Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ」、「Ｇｅｌ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ」、「Ｒｅｖｅｒｓｅｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ」、「Ｅｘｐａｎｄｅｄ  Ｂｅｄ  Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ」、および、「Ｃｈｒｏｍａｔｏｆｏｃｕｓｉｎｇ」を含み、アマシャム・バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって作製され、ＧＥより入手可能である）に記載されているように行ってもよい。
【０１００】
本発明の一実施態様において、核酸およびタンパク質を含む組成物からの対象のタンパク質の精製（ここにおいて、１つの工程は、２価遷移金属イオンを用いて核酸を選択的に沈殿させることである）は、それ以上のタンパク質単離工程を行わずに行われる。その他の実施態様において、２価遷移金属イオンを用いた核酸の沈殿は、２価遷移金属イオンを用いた核酸の沈殿の前に、またはその後に、１つの更なるタンパク質単離工程と共に行われる。本発明の第三の実施態様において、２価遷移金属イオンを用いた核酸の沈殿は、２価遷移金属イオンを用いた核酸の沈殿の前に、またはその後に、２つの更なるタンパク質単離工程と共に行われる。本発明の第四の実施態様において、２価遷移金属イオンを用いた核酸の沈殿は、２価遷移金属イオンを用いた核酸の沈殿の前に、または、その後に３つまたはそれより多くの更なるタンパク質単離工程と共に行われる。本発明の実施態様のいずれかにおいて、前記任意のタンパク質を単離する工程としては、これらに限定されないが、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、および／またはアフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過、限外ろ過、硫酸アンモニウム沈殿、またはスクロース勾配による分離が挙げられる。
【０１０１】
本発明の具体的な一実施態様において、対象のタンパク質および核酸を含む組成物は、対象のタンパク質を発現する宿主細胞を含む培地である。前記培地は、例えば、本明細書の上記の「組換え生産」の章で説明されているようにして調製してもよい。前記宿主細胞を含む培地と、前記２価カチオンとの接触は、好ましくは、前記培地を採取してすぐに、またはその直後であり、好ましくは採取後２４時間以内、より好ましくは１２時間以内、さらにより好ましくは３時間以内、さらにより好ましくは１時間以内、例えば３０分以内、例えば採取後１５分以内であり、例えば２価カチオンは、細胞を培養した容器に直接添加してもよい。この具体的な実施態様において、核酸を選択的に沈殿させる工程は、前記細胞を含む培地中で直接行ってもよい。該工程は、本明細書において以下の「沈殿」の章で説明されているようにして行ってもよい。従って、本方法は、
ｉ）核酸およびタンパク質を含む組成物を備えること、ここにおいて該組成物は、上記タンパク質を発現する宿主細胞を含む培地であり；および
ｉｉ）上記組成物と２価遷移金属のカチオンとを接触させ、それによって核酸を沈殿させること；および
ｉｉｉ）上清から沈殿を分離し、それによって上記タンパク質から核酸が分離すること、
の工程を含んでもよい。
【０１０２】
この具体的な実施態様の方法の１つの利点は、核酸を選択的に沈殿させる工程中に製造された沈殿からの上清の分離は、同じ工程で培地からの細胞の分離として行うことができることである。従って、この工程が遠心分離によって行われる場合、二段階の遠心分離に比べて、必要な工程は１つのみである。従って、上述の工程ｉｉｉ）は、好ましくは、以下を含む：
ｉｉｉ）遠心分離および／またはろ過により（好ましくは遠心分離により）上清から沈殿を分離し、それにより培地から宿主細胞も分離すること。
【０１０３】
従って本方法によれば、好ましくは概ね核酸を含まない上清、および概ね宿主細胞を含まない上清が得られ、
ここにおいて、概ね核酸を含まないとは、含まれる核酸の量が、前記タンパク質を発現する宿主細胞を含む培地中に含まれる核酸の好ましくは最大で１０％、より好ましくは最大で５％であることを意味し、
ここにおいて、概ね宿主細胞を含まないとは、含まれる宿主細胞の量が、前記タンパク質を発現する宿主細胞を含む培地に含まれる宿主細胞の好ましくは最大で１０％、より好ましくは最大で５％、例えば最大で２％、例えば最大で１％、例えば最大で０．１％であることを意味する。
【０１０４】
本発明の一形態において、前記組成物は、ヒトの体液、またはその単離された分画である。本発明のその他の形態において、前記組成物は、動物、それらの部分もしくは細胞から調製された抽出物、またはこのような抽出物の単離された分画である。本発明のその他の好ましい実施態様において、前記分画は、クロマトグラフィーによって調製される。さらにより好ましい本発明の実施態様において、クロマトグラフィーは、アフィニティークロマトグラフィーである。
【０１０５】
アフィニティークロマトグラフィーは、タンパク質を精製するためのよく知られた方法であり、これは、タンパク質と結合パートナーとの間の高度に特異的な相互作用に基づいており、例えば抗原とその抗体との相互作用、または受容体とそのリガンドとの相互作用、またはレクチンと糖との相互作用に基づく。
【０１０６】
本発明の一実施態様において、対象のタンパク質は、ＭＢＬである。血漿からＭＢＬを精製する方法の例は、当業者によく知られている。例えば、精製方法は、ＰＣＴ出願公開ＷＯ９９／６４４５３の例えば第９頁（第２４行）〜第１４頁（第２行）、および、ＷＯ０３／０３３５２２の実施例１〜７に記載されている。ＷＯ９９／６４４５３、およびＷＯ０３／０３３５２２は、本明細書にそれらの全体が組み込まれる。好ましくは本発明のＭＢＬは、組換えＭＢＬである。組換えＭＢＬを精製する方法は、例えばＷＯ００／７００４３の実施例３、およびＷＯ０３／０３３５２２の実施例１に記載されている。ＷＯ００／７００４３、およびＷＯ０３／０３３５２２は、この参照によ本明細書に組み込まれる。ＷＯ９９／６４４５３、ＷＯ０３／０３３５２２、およびＷＯ００／７００４３で概説されているＭＢＬの精製方法は、精製プロセスにおいて、多糖類および／または糖誘導体に対するＭＢＬの親和性を利用している。また、組換えＭＢＬを生産する方法の例も、ＰＣＴ出願公開ＷＯ００／７００４３で説明されている。特に、本発明で用いようとする組換えＭＢＬは、ＰＣＴ出願公開ＷＯ００／７００４３の実施例１に記載されているようにして調製してもよい。この実施例において、組換えＭＢＬは、ヒトＭＢＬ２遺伝子由来の配列を含む発現ベクターの使用によって調製される。
【０１０７】
本方法は、低質量および高質量ＭＢＬの両方を含むあらゆるＭＢＬ出発原料に適用してもよい。しかしながら、本発明のその他の好ましい実施態様において、高質量ＭＢＬがより望ましいため、５０％より多いＭＢＬが２００ｋＤａより大きく、ＭＢＬは、組換え生産される。
【０１０８】
対象のタンパク質および核酸を含む組成物の精製の好ましい実施態様の例が、ＰＣＴ出願公開ＷＯ０３／０３３５５２の実施例１〜５に記載されており、これは、本明細書に参考文献として組み込まれる。この実施例において、組換えＭＢＬは、アフィニティークロマトグラフィーの使用によって精製され、より正確には、固定化されたアミノ糖を用いることによって精製される。
【０１０９】
その他の本発明の実施態様は、前記金属イオンを前記細胞培養に添加する前またはその後のいずれかに、更なるタンパク質を単離する工程をまったく行うことなく、２価遷移金属イオンを細胞培養に直接添加することによって核酸を沈殿させ、および対象のタンパク質はいずれの有意な含量でも沈殿させないことを含む。本発明の一実施態様において、前記細胞培養は、対象のタンパク質を生産する細胞培養である。本発明のその他の実施態様において、前記細胞培養によって生産された対象のタンパク質は、ＭＢＬである。
【０１１０】
好ましくは、対象のタンパク質は、精製中にいずれの有意な含量でも変性しない。従って、好ましくは、精製中に変性した対象のタンパク質は、最大で２０％、例えば最大で１０％、例えば最大で５％、例えば最大で２％、例えば最大で１％であり、例えば実質的になしである。このような状況において、実質的になし、とは、検出限界を下回っていることを意味する。従って、例えば、精製法に、６５℃より高い温度に加熱する工程が含まれないことが好ましい。
【０１１１】
沈殿
２価遷移金属のカチオンを用いた核酸の沈殿は、好ましくは１分〜７２時間、例えば５分〜４８時間、例えば１０分〜２４時間、好ましくは１５分〜１２時間、例えば２０分〜６時間、例えば２５分〜３時間、好ましくは３０分〜２時間、例えば約１時間、例えば１時間〜２４時間、例えば６時間〜２０時間、例えば８時間〜１６時間の範囲で、例えば一晩行われる。
【０１１２】
２価遷移金属のカチオンを用いた核酸の沈殿はさらに、１℃〜４０℃の範囲、好ましくは１℃〜３０℃の範囲、より好ましくは１℃〜２２℃の範囲、例えば１℃〜１０℃の範囲、好ましくは２℃〜６℃の範囲、より好ましくは３℃〜５℃の範囲、例えば約４℃、例えば４℃の温度で行われる。その他の実施態様において、沈殿は、３０〜４０℃の範囲の温度で、例えば３６〜３８℃の範囲、例えば約３７℃、例えば３７℃で行ってもよい。
【０１１３】
このような実施態様において、沈殿はより低い温度で行われることが好ましい。従って、この実施態様において、例えば、沈殿は、好ましくは５０℃よりも低い、より好ましくは４０℃よりも低い、さらにより好ましくは３０℃よりも低い、さらにより好ましくは２０℃よりも低い、さらにより好ましくは１０℃よりも低い、例えば５℃よりも低い温度で行われる。加えて、前記核酸およびタンパク質を含む組成物と前記２価遷移金属のカチオンとを接触させてから、上清から沈殿を分離するまでの間のどのような時でも、温度は、好ましくは４０℃を超えて、好ましくは５０℃を超えて、例えば６０℃を超えて、例えば６５℃を超えて上昇させず、例えば６５〜１００℃の範囲の温度に、例えば８４℃に、例えば１００℃に上昇させない。
【０１１４】
２価遷移金属のカチオンを用いた核酸の沈殿はさらに、２〜１４の範囲のｐＨで、例えば３〜１０、好ましくは４〜８、例えば５〜７、好ましくは５．５〜６．５の範囲のｐＨで、例えば５．８５のｐＨで行われる。沈殿は、好ましくは酸性から中性ｐＨで、好ましくはｐＨ７．５またはそれより低いｐＨで、例えばｐＨ７またはそれより低いｐＨで行われる。具体的には、沈殿はアルカリ性のｐＨで行わないことが好ましく、例えば８を超えるｐＨで、例えばｐＨ８で、例えば約９のｐＨで行わない。
【０１１５】
その他の実施態様において、リン酸塩は、好ましくは０．０１〜１００ｍＭの範囲、例えば０．０５ｍＭ〜５０ｍＭの範囲、好ましくは０．１ｍＭ〜１０ｍＭの範囲、例えば０．１ｍＭ〜１ｍＭの範囲、例えば約１ｍＭで前記組成物に添加される。本発明のその他の好ましい実施態様において、本組成物に添加されるリン酸塩は、ＮａＰＯ4またはＮａ2ＰＯ4であり、さらにより好ましい実施態様において、リン酸塩は、Ｎａ2ＰＯ4である。
【０１１６】
ＥＤＴＡは添加されないことが多いが、一実施態様において、ＥＤＴＡが前記組成物に添加される。従って、本組成物は、最大で５０ｍＭ、例えば最大で４０ｍＭ、好ましくは最大で３０ｍＭ、例えば最大で２０ｍＭ、例えば少なくとも１０ｍＭのＥＤＴＡを含んでいてもよい。
【０１１７】
本発明のその他の側面は、対象のタンパク質を含む上清から沈殿を分離すること、それによって対象のタンパク質、例えばＭＢＬから核酸を分離することに関する。本発明のその他の好ましい実施態様において、上清の沈殿の分離は、重力によって行われ、例えば遠心分離によって行われる。
【０１１８】
本発明の側面は、２価遷移金属イオンを用いた選択的な沈殿による核酸からの対象のタンパク質の精製効率である。本発明のその他の好ましい実施態様において、本組成物中、少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％の核酸が、前記２価遷移金属のカチオンによって、好ましくは４０ｍＭの前記２価遷移金属のカチオンによって、より好ましくは４０ｍＭのＺｎ2+によって沈殿する。
【０１１９】
本発明のその他の実施態様において、前記２価遷移金属のカチオンによって、好ましくは４０ｍＭの前記２価遷移金属のカチオンによって、より好ましくは４０ｍＭのＺｎ2+によって、対象のタンパク質の最大で２０％が核酸と共に沈殿し、好ましくは最大で１５％、より好ましくは最大で１０％、例えば最大で８％、例えば最大で６％の対象のタンパク質が沈殿する。
【０１２０】
対象のタンパク質は、好ましくは、２価遷移金属のカチオンによっていずれの有意な含量でも沈殿しない。このような状況において、用語「いずれの有意な含量でも」は、最大で２０％、好ましくは最大で１５％、より好ましくは最大で１０％、さらにより好ましくは最大で８％、さらにより好ましくは最大で７％、さらにより好ましくは最大で６％の対象のタンパク質が、前記２価遷移金属のカチオンによって、好ましくは４０ｍＭの前記２価遷移金属のカチオンによって、より好ましくは４０ｍＭのＺｎ2+によって沈殿することを意味する。
【０１２１】
図面の詳細な説明
図１：左：前処理をせずにＺｎ2+またはＣａ2+を添加した後の沈殿のＡＩＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムである。右：前処理をせずにＺｎ2+またはＣａ2+を添加した後の沈殿のＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムである。
【０１２２】
図２：左：Ｚｎ2+またはＣａ2+トリス（１０ｍＭ）、ＮａＣｌ（１４０ｍＭ）（ｐＨ７．４）を添加した後の沈殿のＡＩＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムである。右：緩衝液をトリス（１０ｍＭ）、ＮａＣｌ（１４０ｍＭ）（ｐＨ７．４）に交換した後にＺｎ2+またはＣａ2+を添加した後の沈殿のＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムである。
【０１２３】
図３：左：Ｚｎ2+またはＣａ2+トリス（１０ｍＭ）、ＮａＣｌ（１４０ｍＭ）、Ｎａ2ＨＰＯ4（１ｍＭ）（ｐＨ７．４）を添加した後の沈殿のＡＩＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムである。右：緩衝液をトリス（１０ｍＭ）、ＮａＣｌ（１４０ｍＭ）、Ｎａ2ＨＰＯ4（１ｍＭ）（ｐＨ７．４）に交換した後にＺｎ2+またはＣａ2+を添加した後の沈殿のＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムである。
【０１２４】
図４：Ｚｎ2+を添加した後の沈殿、および４℃または２２℃のいずれかで、１時間または２１時間のいずれかにおける沈殿のＡＩＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムである。
【０１２５】
図５：Ｚｎ2+を様々な濃度；１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭおよび１００ｍＭで添加した後の沈殿のＡＩＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムである。
【実施例】
【０１２６】
実施例１：サンプル材料
以下の全ての実施例１〜６におけるサンプル材料は、１０ｍＭトリス、１４０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＥＤＴＡ中に１．０９ｍｇ／ｍＬの組換えヒトＭＢＬ（ｒｈＭＢＬ）を含む、ｒｈＭＢＬ含有アフィニティークロマトグラフィー（ＡｆｆＣ）材料であった。ｐＨを測定したところ５．８５であった。
【０１２７】
実施例２：アフィニティークロマトグラフィー回収材料へのＺｎＣｌ2またはＣａＣｌ2の添加（何の前処理も行わずに）
ＡｆｆＣ回収材料は、約２０ｍＭのＥＤＴＡを含む。ＺｎまたはＣａを過剰に含ませるために、培地に４０ｍＭのＺｎＣｌ2またはＣａＣｌ2を直接添加した。ネガティブコントロールとして、同様の量の１０ｍＭトリス、１４０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４）を用いた。
【０１２８】
ＺｎＣｌ2またはＣａＣｌ2またはトリス緩衝液を添加した後、サンプルを４℃で１時間インキュベートした。続いてサンプルを２５００ｇで５分間遠心分離し、上清をＡＩＥＣ−およびＳＥＣ  ＨＰＬＣ、ならびにＰｉｃｏＧｒｅｅｎを用いて分析した。
【０１２９】
【表１】
2010510770.tif 000002
【０１３０】
ＡｆｆＣ回収材料に過剰のＺｎＣｌ2を直接添加すると（何の前処理も行わずに）、ｒｈＭＢＬ濃度に何の影響を与えることなくＤＮＡの選択的な沈殿が起こった。それに対して、ＣａＣｌ2を添加すると、ＤＮＡの沈殿だけでなくｒｈＭＢＬの沈殿も起こった（図１）。
【０１３１】
実施例３：トリス（１０ｍＭ）、ＮａＣｌ（１４０ｍＭ）（ｐＨ７．４）への緩衝液交換後の、アフィニティークロマトグラフィー回収材料へのＺｎＣｌ2またはＣａＣｌ2の添加
ＥＤＴＡを除去するために、ＺｎＣｌ2またはＣａＣｌ2を添加する前に、ＡｆｆＣ回収材料の緩衝液を１０ｍＭトリス、１４０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４）に交換した。ＡｆｆＣ回収材料からＥＤＴＡを除去したことにより、ＤＮＡの沈殿を引き起こすのに必要なＺｎまたはＣａの量が減少し、１０ｍＭの濃度が用いられた。
【０１３２】
１０ｍＭのＺｎＣｌ2またはＣａＣｌ2を培地に添加し、ネガティブコントロールとして、同様の体積の１０ｍＭトリス、１４０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４）を添加した。
【０１３３】
ＺｎＣｌ2またはＣａＣｌ2またはトリス緩衝液を添加した後、サンプルを４℃で１時間インキュベートした。続いてサンプルを２５００ｇで５分間遠心分離し、上清をＡＩＥＣ−およびＳＥＣＨＰＬＣ、ならびにＰｉｃｏＧｒｅｅｎを用いて分析した。
【０１３４】
【表２】
2010510770.tif 000003
【０１３５】
出発原料のより低い濃度で示されるように、緩衝液交換によって、ＡｆｆＣ回収材料の希釈が生じた。ＺｎＣｌ2またはＣａＣｌ2の添加によってＤＮＡの沈殿が起こったが、緩衝液の交換をしない場合よりも透明になる作用は低かった（図２）。この低い作用から、ＡｆｆＣ回収材料中で可能な限り効率的にＤＮＡを沈殿させるには１０ｍＭよりも高い濃度が好ましいことが示された。さらに、ＣａＣｌ2の添加後もｒｈＭＢＬ濃度の減少は観察されず、得られたＤＮＡ濃度の減少はわずか２倍であった。
【０１３６】
実施例４：トリス（１０ｍＭ）、ＮａＣｌ（１４０ｍＭ）、ＮａＨ2ＰＯ4（１ｍＭ）（ｐＨ７．４）への緩衝液交換後のアフィニティークロマトグラフィー回収材料へのＺｎＣｌ2またはＣａＣｌ2の添加
ＡｆｆＣ回収材料の緩衝液をトリス（１０ｍＭ）、ＮａＣｌ（１４０ｍＭ）、ＮａＨ2ＰＯ4（１ｍＭ）（ｐＨ７．４）に交換した。ＥＤＴＡを除去するために、ＺｎＣｌ2またはＣａＣｌ2を添加する前に、ＡｆｆＣ回収材料の緩衝液を１０ｍＭトリス、１４０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４）に交換した。ＡｆｆＣ回収材料からＥＤＴＡを除去したことにより、ＤＮＡの沈殿を引き起こすのに必要なＺｎまたはＣａの量が減少し、１０ｍＭの濃度が用いられた。
【０１３７】
１０ｍＭのＺｎＣｌ2またはＣａＣｌ2を培地に添加し、同様の体積の１０ｍＭトリス、１４０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．４）をネガティブコントロールとして用いた。
【０１３８】
ＺｎＣｌ2またはＣａＣｌ2もしくはトリス緩衝液を添加した後、サンプルを４℃で１時間インキュベートした。続いてサンプルを２５００ｇで５分間遠心分離し、上清をＡＩＥＣ−およびＳＥＣ  ＨＰＬＣ、ならびにＰｉｃｏＧｒｅｅｎを用いて分析した。
【０１３９】
【表３】
2010510770.tif 000004
【０１４０】
緩衝液をホスフェートを含むトリス緩衝液に交換したところ、ＺｎＣｌ2を添加した後のｒｈＭＢＬの損失が生じた。
【０１４１】
実施例５：４０ｍＭのＺｎＣｌ2を用いてＤＮＡ沈殿の時間および温度依存性
ＥＤＴＡを除去するために、ＺｎＣｌ2を添加する前に、ＡｆｆＣ回収材料の緩衝液を１０ｍＭトリス、１４０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４）に交換した。ＡｆｆＣ回収材料からＥＤＴＡを除去したことにより、ＤＮＡの沈殿を引き起こすのに必要なＺｎの量が減少し、１０ｍＭの濃度が用いられた。
【０１４２】
１０ｍＭのＺｎＣｌ2を培地に添加し、ネガティブコントロールとして、同様の体積の１０ｍＭトリス、１４０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４）を添加した。
【０１４３】
ＺｎＣｌ2またはトリス緩衝液を添加した後、１時間または一晩のいずれかの沈殿時間、および４℃または室温のいずれかの沈殿温度でサンプルを作製した。続いてサンプルを２５００ｇで５分間遠心分離し、−２０℃で一晩保管し、一晩沈殿させたサンプルを分析した。ＡＩＥＣ  ＨＰＬＣで、およびＰｉｃｏＧｒｅｅｎを用いてサンプルを分析した。
【０１４４】
【表４】
2010510770.tif 000005
【０１４５】
時間および温度の実験から、ＡｆｆＣ回収材料に４０ｍＭのＺｎＣｌ2を直接添加することによって、ｒｈＭＢＬの損失をまったく起こすことなくＤＮＡが選択的に沈殿したことが確認された（図４）。
【０１４６】
１時間後に沈殿したＤＮＡの量において、ＤＮＡ濃度にほんのわずかな差しか観察されなかったために温度非依存性であるように見える。沈殿時間を２１時間（一晩）まで長くしたところ、温度を４℃に維持した場合、ＤＮＡ濃度は減少したが、室温では増加が観察された（図４）。
【０１４７】
実施例６：ＤＮＡ沈殿の濃度依存性
１ｍＬのＡｆｆＣ回収材料を含む全てのバイアルに、様々な濃度；１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭおよび１００ｍＭの１００μＬのＺｎＣｌ2を添加した。これらのサンプルを室温で１時間沈殿させ、２５００ｇで５分間遠心分離し、続いて−２０℃で一晩保管した。これらのサンプルを、ＡＩＥＣ  ＨＰＬＣで、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎを用いて分析した。
【０１４８】
【表５】
2010510770.tif 000006
【０１４９】
濃度依存性実験によれば、ＤＮＡを沈殿させる最適な濃度は、ＡｆｆＣ回収材料に約５０〜６０ｍＭのＺｎＣｌ2を添加することであったことがわかる。さらに、ｒｈＭＢＬの沈殿が確認された（図５）。
【０１５０】
実施例７
流加採取（fed−batch harvest）におけるＺｎＣｌ2を用いた核酸の沈殿
実験１：
組換えＭＢＬ（配列番号１）を発現するＨＥＫ２９３細胞の流加培養から、細胞を含む培地２×２００ｍＬを採取した。培地のｐＨは７であった。
【０１５１】
第一の２００ｍＬに、ＺｎＣｌ2を最終濃度４０ｍＭになるまで添加した（１Ｍの滅菌ストック溶液から）。これを混合して４℃で一晩インキュベートした（Ｎ２０１−６５Ｂ）。
【０１５２】
もう一方の２００ｍＬを遠心分離し、上清にＺｎＣｌ2を最終濃度４０ｍＭになるまで添加した。これを混合し、４℃で一晩インキュベートした（Ｎ２０１−６５Ｃ）。
【０１５３】
次の日、両方のサンプルを遠心分離し、滅菌ろ過した。
【０１５４】
さらに、流加培養から細胞を含む２００ｍＬの培地を採取した。このサンプルを遠心分離し、滅菌ろ過した。続いてＺｎＣｌ2を最終濃度４０ｍＭになるまで添加した（１Ｍの滅菌ストック溶液から）。これを混合し、４℃で一晩インキュベートした（Ｎ２０１−６５Ｇ）。
【０１５５】
ＺｎＣｌ2沈殿の後、サンプルを遠心分離し、上清のＤＮＡおよびＭＢＬ含量を測定した。
【０１５６】
以下の表に結果を示す。
【表６】
2010510770.tif 000007
【０１５７】
実験１によれば、ＤＮＡは、細胞（Ｎ２０１−６５Ｂ）を含む培地から、細胞培養上清（Ｎ２０３−６５Ｃ）と同様に効率的に沈殿させ得ることが示される。また、沈殿後に上清中に保持されたＭＢＬ含量も、沈殿の前に上清から細胞を除去したかかどうかに関係なく同様のレベルであった。
【０１５８】
実験２：
組換えＭＢＬ（配列番号１）を発現するＨＥＫ２９３細胞の流加培養から、細胞を含む培地を採取し、４℃で１０日間維持した。培地のｐＨは７であった。
【０１５９】
冷却した細胞懸濁液から８つの同質のサンプル（それぞれ１０ｍＬ）を採取し、以下の表に示した最終濃度になるまで１Ｍの滅菌ストック溶液からＺｎＣｌ2（ｍＭ）を添加した。ＺｎＣｌ2を含むサンプルを指定された温度で１時間インキュベートした。サンプルを遠心分離し、上清のＤＮＡおよびＭＢＬ含量を測定した。
【０１６０】
【表７】
2010510770.tif 000008
【０１６１】
以下の表に結果を示す。
【表８】
2010510770.tif 000009
【０１６２】
この結果から、４℃で沈殿させた後の方が、３７℃で沈殿させた後よりも上清中のＭＢＬ濃度が高いことが示される。特に、より高いＺｎＣｌ2濃度を用いた場合、３７℃で沈殿させた後の上清中で低濃度のＭＢＬが得られた。
【０１６３】
実験３：
この実験は、実質的に実験２と同様にして行われたが、沈殿は採取直後に行われた。
【０１６４】
以下の表に結果を示す。
【表９】
2010510770.tif 000010
【０１６５】
この結果によれば、ＭＢＬは、採取直後に沈殿を行った場合、より効率的に上清中に保持されることが示される。
【０１６６】
配列表
配列番号１（スイスプロット登録番号：Ｐ１１２２６）： MSLFPSLPLLLLSMVAASYSETVTCEDAQKTCPAVIACSSPGINGFPGKDGRDGTKGEKGEPGQGLRGLQGPPGKLGPPGNPGPSGSPGPKGQKGDPGKSPDGDSSLAASERKALQTEMARIKKWLTFSLGKQVGNKFFLTNGEIMTFEKVKALCVKFQASVATPRNAAENGAIQNLIKEEAFLGITDEKTEGQFVDLTGNRLTYTNWNEGEPNNAGSDEDCVLLLKNGQWNDVPCSTSHLAVCEFPI。
【０１６７】
参考文献
Jensen PH et al:Characterization of the oligomer structure of recombinant human mannan-binding lectin, J Biol Chem 280(2005) 11043-11051).
Kejnovsky, E and Kypr, J:DNA extraction by zinc, Nucleic Acids Res 25(1997) 1870-1871.
Kejnovsky, E and Kypr, J:Milimolar concentrations of zinc and other metal cations cause sedimentation of DNA, Nucleic Acids Res 26(1998) 5295-5299.
Teillet, F, Dublet B, Andrieu JP, Gaboriaud C, Arlaud GJ, Thielens NM:The two major oligomeric forms of human mannan-binding lectin:chemical characterization, carbohydrate-binding properties, and interaction with MBL-associated serine proteases, J Immunol 174(2005) 2870-7.
Vorup-Jensen T et al:Recombinant expression of human mannan-binding lectin, Int
Immunopharm 1(2001) 677-687。
【図１−１】
2010510770.tif 000011
【図１−２】
2010510770.tif 000012
【図１−３】
2010510770.tif 000013
【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
2010510770.tif 000016
【図３−１】
2010510770.tif 000017
【図３−２】
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【図４−１】
2010510770.tif 000019
【図４−２】
2010510770.tif 000020
【図４−３】
2010510770.tif 000021
【図４−４】
2010510770.tif 000022
【図５−１】
2010510770.tif 000023
【図５−２】
2010510770.tif 000024
【図５−３】
2010510770.tif 000025
【図５−４】
2010510770.tif 000026
【図５−５】
2010510770.tif 000027
【配列表】
2010510770000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成20年9月29日(2008.9.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロで培養された宿主細胞によって生産されたレクチンから核酸を分離する方法であって、
ｉ）核酸およびレクチンを含む組成物を供給すること；および
ｉｉ）該組成物と２価遷移金属のカチオンとを接触させ、それによって核酸を沈殿させること；および
ｉｉｉ）上清から沈殿を分離すること、
の工程を含み、それによってレクチンから核酸を分離する、上記方法。
【請求項２】
レクチンが、マンノース結合レクチン（ＭＢＬ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＭＢＬが、配列番号１に記載のＭＢＬ、およびそれらと少なくとも８０％同一な配列を含むその機能的な相同体からなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＭＢＬが、精製された天然のヒト血清ＭＢＬである、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
ＭＢＬが、組換え生産されている、請求項２または３に記載の方法。
【請求項６】
非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定して、ＭＢＬの５０％より多くが２００ｋＤａよりも大きい、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
核酸が、ＤＮＡおよびＲＮＡからなる群より選択される１つまたはそれ以上である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
核酸が、ＤＮＡである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＤＮＡが、ゲノムＤＮＡである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
組成物が、動物、その部分もしくは細胞から調製された抽出物、またはこのような抽出物の単離された分画である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
動物、その部分または細胞が、タンパク質を生産する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
組成物が、全細胞培養物、すなわち細胞培養物および細胞培養上清、もしくは細胞培養上清、またはそれらの単離された分画である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
細胞が、対象のタンパク質を生産する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
細胞が、対象のタンパク質を生産し分泌する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
細胞が、該細胞中で発現を指示する第二の核酸配列に作動可能に会合された、レクチンをコードする第一の核酸を含み、ここで上記第二の核酸配列は、自然状態では第一の核酸配列と会合しない、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
細胞が、配列番号１のＭＢＬをコードする第一の核酸配列、またはそれと少なくとも８０％同一な配列を含む機能的な相同体を含むＨＥＫ細胞である、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
組成物が、ヒトの体液、またはその単離された分画である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
単離された分画が、クロマトグラフィーによって調製される、請求項１０〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
クロマトグラフィーが、アフィニティークロマトグラフィーである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
２価遷移金属のカチオンが、Ｚｎ2+、Ｍｎ2+、Ｎｉ2+、およびＣｏ2+からなる群より選択される、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
２価遷移金属のカチオンが、Ｚｎ2+である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
Ｚｎ2+が、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、フッ化亜鉛、ヨウ化亜鉛、水酸化亜鉛、炭酸亜鉛、クロム酸亜鉛、および酢酸亜鉛からなる群より選択される１つまたはそれ以上である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
Ｚｎ2+が、ＺｎＣｌ2の形態である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
２価金属のカチオンを、１０〜１００ｍＭの範囲、好ましくは４０〜６０ｍＭの範囲の濃度で組成物に添加する、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
組成物に、ホスフェートを添加する、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
組成物に、ホスフェートを０．０１〜１０ｍＭの範囲の濃度で添加する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ホスフェートが、ＮａＰＯ4またはＮａＨ2ＰＯ4である、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
ホスフェートが、ＮａＨ2ＰＯ4である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
核酸を、５分〜４８時間の範囲、好ましくは１５分〜２４時間の範囲に亘って、例えば約１時間で２価金属のカチオンで沈殿させる、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
核酸を、１℃〜４０℃の範囲、好ましくは１℃〜３０℃の範囲、より好ましくは１℃〜２２℃の範囲の温度で、例えば約４℃で沈殿させる、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
核酸を、５〜８の範囲、好ましくは５．５〜６．５の範囲のｐＨで沈殿させる、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
組成物が、最大で５０ｍＭ、好ましくは最大で３０ｍＭのＥＤＴＡを含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
沈殿を、重力によって上清から分離する、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
沈殿を、遠心分離によって上清から分離する、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
組成物中の核酸の少なくとも５０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％を沈殿させる、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
対象のタンパク質の最大１０％、好ましくは最大６％で沈殿させる、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
インビトロで培養された宿主細胞によって生産された単離されたレクチンを調製する方法であって、
ａ）場合により、１回またはそれ以上のタンパク質の単離工程を行うこと；および
ｂ）請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法を行うこと；および
ｃ）場合により、１回またはそれ以上のタンパク質の単離工程を行い、それによって単離されたレクチンを得ること、
の工程を含む、上記方法。
【請求項３８】
少なくとも一つのタンパク質単離工程が、クロマトグラフィーである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
クロマトグラフィーが、アフィニティークロマトグラフィーである、請求項３８に記載の方法。
【国際調査報告】
2010510770.tif 000028
2010510770.tif 000029
2010510770.tif 000030