(57)【要約】  ピリミジン誘導体は、特にＰＯＳＨポリペプチドのユビキチンリガーゼ活性を阻害するユビキチン化阻害剤であり、ウイルス感染及び神経学的障害の治療に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式Ｉの化合物、又はその鏡像異性体若しくは薬学的に許容される塩
【化１】
2010509205.tif 000022
［式中、
Ｒ１は、アルキル、アリール、ヘテロアリール、−ＣＯＲ６、−ＣＯＯＲ６、−ＮＲ７Ｒ８、−ＣＯＮＲ７Ｒ８又は−ＮＲ９ＣＯＲ１０であり、
Ｒ２はアリール又はヘテロアリールであり、
Ｒ３は、Ｈ、又は低級アルキル、低級アルコキシ、ハロゲン、−ＮＲ５Ｒ６、−ＣＯＯＲ４若しくは−ＣＯＮＲ５Ｒ６から選択される１〜３個の基を表し、
Ｒ４は、Ｈ、アルキル、アリール、カルボシクリル、アシル、→Ｏ又はヘテロシクリルであり、
Ｒ５は、Ｈ、ハロゲン、アルキル、アリール、ヘテロアリール、−ＯＲ６、−ＳＲ６、−ＣＯＲ６、−ＣＯＯＲ６、−ＮＲ７Ｒ８、−ＣＯＮＲ７Ｒ８又は−ＮＲ９ＣＯＲ１０であるか、或いは、Ｒ４、それが結合した窒素原子及びＲ５が、５〜６員のヘテロシクリル環を形成し、
Ｒ６は、Ｈ、ヒドロカルビル又はヘテロシクリルであり、
Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に、Ｈ、ヒドロカルビル又はヘテロシクリルであるか、或いはＲ７及びＲ８は、それらが結合した窒素原子と一緒になって、Ｎ、Ｓ及び／又はＯから選択される１又は２個のさらなるヘテロ原子を場合によって含有する５〜６飽和ヘテロシクリル環を形成し、前記さらなるＮ原子は、低級アルキル、アラルキル、ハロアルキル又はヒドロキシアルキルで場合によって置換されており、
Ｒ９は、Ｈ、低級アルキル又はフェニルであり、
Ｒ１０はアリール又はヘテロアリールであり、
前記ヒドロカルビル、ヘテロシクリル、アリール及びヘテロアリールは、低級アルキル、ハロゲン、アリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、ニトロ、エポキシ、エピチオ、−ＯＲ６、−ＳＲ６、−ＣＯＲ６、−ＣＯＯＲ６、−ＮＲ７Ｒ８、−ＣＯＮＲ７Ｒ８、ニトロ、−ＮＲ７−ＣＯＲ６、−ＳＯ３Ｒ６、−ＳＯ２Ｒ６、−ＳＯ２ＮＲ７Ｒ８及び−ＮＲ７ＳＯ２Ｒ６から選択される１個又は複数の基で場合によって置換され、ここで、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は上記で定義された通りである］。
【請求項２】
Ｒ１がＮＲ９ＣＯＲ１０であり、
Ｒ２が場合によって置換されているヘテロアリールであり、
Ｒ３がＨ又は１〜３個のアルキル基であり、
Ｒ４が、Ｈ、アルキル、カルボシクリル、アリール、アシル、→Ｏ又はヘテロシクリルであり、
Ｒ５が、Ｈ、ハロゲン、アルキル、アリール、ヘテロアリール、−ＯＲ６、−ＳＲ６、−ＣＯＲ６、−ＣＯＯＲ６、−ＮＲ７Ｒ８、−ＣＯＮＲ７Ｒ８又は−ＮＲ９ＣＯＲ１０であるか、或いは、Ｒ４、それが結合した窒素原子及びＲ５が、５〜６員のヘテロシクリル環を形成し、
Ｒ６が、Ｈ、アルキル、アリール又はヘテロシクリルであり、
Ｒ７及びＲ８が、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、アリール又はヘテロシクリルであるか、或いはＲ７及びＲ８が、それらが結合した窒素原子と一緒になって、Ｎ、Ｓ及び／又はＯから選択される１又は２個のさらなるヘテロ原子を場合によって含有する飽和５〜６ヘテロシクリル環を形成し、前記さらなるＮ原子が、フェニル、ハロゲン又はヒドロキシで場合によって置換されている低級アルキルで場合によって置換されており、
Ｒ９が、Ｈ、アルキル又はフェニルであり、
Ｒ１０がアリール又はヘテロアリールであり、
前記アルキル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、アリール及びヘテロアリールが、ハロゲン、ヒドロカルビル、ヘテロシクリル、ニトロ、エポキシ、エピチオ、ＯＲ、−ＳＲ、−ＣＯＲ、−ＣＯＯＲ’−ＮＲＲ’、−ＣＯＮＲＲ’、−ＮＲＣＯＲ’−ＳＯ３Ｒ、−ＳＯ２Ｒ、−ＳＯ２ＮＲＲ’及び−ＮＲＳＯ２Ｒから選択される１個又は複数の基で場合によって置換され、ここで、Ｒ及びＲ’は独立に、それぞれ、Ｈ、ヒドロカルビル又はヘテロシクリルであるか、或いはＲ及びＲ’は、それらが結合した窒素原子と一緒になって、Ｎ、Ｓ及び／又はＯから選択される１又は２個のさらなるヘテロ原子を場合によって含有する飽和ヘテロシクリル環を形成し、前記さらなるＮ原子はヒドロカルビルで場合によって置換されている、
請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記ヒドロカルビルが、アルキル、アルケニル、アルキニル、カルボシクリル、アリール又はアラルキル基から選択される、１〜２０個の炭素原子、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜６個、最も好ましくは２〜３個の炭素原子の、直鎖又は分岐鎖、非環式又は環式、飽和、不飽和又は芳香族のヒドロカルビル基である、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項４】
前記アルキルが、Ｏ、Ｓ及び／又はＮから選択される１個又は複数のヘテロ原子で場合によって遮断され、且つ／或いはハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、ニトロ、エポキシ、エピチオ、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＣＯＲ、−ＣＯＯＲ−ＮＲＲ’、−ＣＯＮＲＲ’、−ＮＲＣＯＲ’−ＳＯ３Ｒ、−ＳＯ２Ｒ、−ＳＯ２ＮＲＲ’及び−ＮＲＳＯ２Ｒから成る群より選択される１個又は複数の基により置換され、ここで、Ｒ及びＲ’は独立に、それぞれ、Ｈ、ヒドロカルビル又はヘテロシクリルであるか、或いはＲ及びＲ’は、それらが結合した窒素原子と一緒になって、Ｎ、Ｓ及び／又はＯから選択される１又は２個のさらなるヘテロ原子を場合によって含有する飽和５〜７員のヘテロシクリル環を形成し、前記さらなるＮ原子はヒドロカルビルで場合によって置換されている、直鎖又は分岐鎖の１〜１０個の炭素原子（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、好ましくは低級アルキル（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）である、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項５】
前記低級アルキルが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル又はｔｅｒｔ−ブチルから選択され、好ましくはメチルである、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
前記カルボシクリルが、ハロゲン、ヒドロカルビル、ヘテロシクリル、ニトロ、エポキシ、エピチオ、ＯＲ、−ＳＲ、−ＣＯＲ、−ＣＯＯＲ−ＮＲＲ’、−ＣＯＮＲＲ’、−ＮＲＣＯＲ’−ＳＯ３Ｒ、−ＳＯ２Ｒ、−ＳＯ２ＮＲＲ’及び−ＮＲＳＯ２Ｒから成る群より選択される１個又は複数の基で場合によって置換されている、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル及びシクロヘキセニルから選択される飽和Ｃ５〜Ｃ６シクロアルキル又は部分不飽和Ｃ５〜Ｃ６シクロアルケニル基であり、ここで、Ｒ及びＲ’は独立に、それぞれ、Ｈ、ヒドロカルビル又はヘテロシクリルであるか、或いはＲ及びＲ’は、それらが結合した窒素原子と一緒になって、Ｎ、Ｓ及び／又はＯから選択される１又は２個のさらなるヘテロ原子を場合によって含有する飽和ヘテロシクリル環を形成し、前記さらなるＮ原子はヒドロカルビルで場合によって置換されている、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項７】
前記アリールが、フェニル、ビフェニル、ナフチル又はアントラセニルから選択される、６〜１４個の炭素原子、好ましくは６〜１０個の炭素原子の、置換又は非置換の、単環式、二環式又は三環式芳香族炭素環基である、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項８】
前記ヘテロシクリルが、３〜１２個、好ましくは５〜１０個、より好ましくは５〜６個の環員であり、そのうちの１〜３個の原子が、Ｏ、Ｓ及び／又はＮから選択されるヘテロ原子である、飽和又は部分不飽和の、場合によって置換されている単環式、二環式又は三環式複素環である、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項９】
前記ヘテロシクリルが、ジヒドロフリル、テトラヒドロフリル、ジヒドロチエニル、ピロリジニル、ピロリニル、ジヒドロピリジル、ピペリジニル、ピペラジニル、モルホリノ又は１，３−ジオキサニルから選択される、請求項７に記載の化合物。
【請求項１０】
前記ヘテロアリールが、Ｏ、Ｓ及び／又はＮから選択される１〜３個のヘテロ原子を含有する置換又は非置換の単環式又は多環式芳香族複素環である、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項１１】
前記ヘテロアリールが、ピロリル、フリル、チエニル、ピラゾリル、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、ピリジル、キノリニル、イソキノリニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、１，３，４−トリアジニル、１，２，３−トリアジニル、１，３，５−トリアジニル、ベンゾフリル、イソベンゾフリル、インドリル、イミダゾ［１，２−ａ］ピリジル、ベンズイミダゾリル、ベンズチアゾリル及びベンゾオキサゾリル、ベンゾジアゼピニルから選択され、好ましくはチエニルである、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｒ７、Ｒ８及びそれらが結合したＮ原子から形成される、Ｎ、Ｓ及び／又はＯから選択される１又は２個のさらなるヘテロ原子を場合によって含有する前記５〜６飽和ヘテロシクリル環が、付加的なＮ原子で、低級アルキル、アラルキル、ハロアルキル又はヒドロキシアルキルにより場合によって置換されている、ピロリジノ、ピペリジノ、モルホリノ、チオモルホリノ、ピペラジノ、Ｎ−メチルピペラジノ及びジアゼピノから選択される、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項１３】
式Ｉａ又はＩｂの、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の化合物
【化２】
2010509205.tif 000023
［式中、
Ｘは、Ｏ、Ｓ又はＮＨであり、
Ｒ３はＨ又は１〜３個の（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルであり、
Ｒ４はＨ又は（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルであり、
Ｒ５はＨ又は場合によって置換されている（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであり、
Ｒ１１〜Ｒ１９は、それぞれ独立に、Ｈ、低級アルキル、ハロゲン、アリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、ニトロ、エポキシ、エピチオ、−ＯＲ６、−ＳＲ６、−ＣＯＲ６、−ＣＯＯＲ６、−ＮＲ７Ｒ８、−ＣＯＮＲ７Ｒ８、ニトロ、−ＮＲ７−ＣＯＲ６、−ＳＯ３Ｒ６、−ＳＯ２Ｒ６、−ＳＯ２ＮＲ７Ｒ８及び−ＮＲ７ＳＯ２Ｒ６から選択され、ここで、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、アリール若しくはヘテロシクリルであるか、又はＲ７及びＲ８は、それらが結合した窒素原子と一緒になって、Ｎ、Ｓ及び／又はＯから選択される１又は２個のさらなるヘテロ原子を場合によって含有する飽和ヘテロシクリル環を形成し、前記さらなるＮ原子は、フェニル、ハロゲン又はヒドロキシで場合によって置換されている低級アルキルで場合によって置換されており、
式Ｉｂ中の点線は、任意選択の二重結合を表す］。
【請求項１４】
ＸがＳであり、Ｒ３がＨ又は１〜３個のメチル基であり、Ｒ４がＨであり、Ｒ５がＨ又はメチルであり、Ｒ１１〜Ｒ１６がＨである、請求項１３に記載の式Ｉａの化合物。
【請求項１５】
本願において、式
【化３】
2010509205.tif 000024
の化合物１として特定される、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１６】
本願において、式
【化４】
2010509205.tif 000025
の化合物２として特定される、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１７】
本願において、式
【化５】
2010509205.tif 000026
の化合物３として特定される、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１８】
本願において、式
【化６】
2010509205.tif 000027
の化合物４として特定される、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１９】
ＸがＳであり、Ｒ３がＨ又は１〜３個のメチル基であり、Ｒ１１〜Ｒ１９がＨである、請求項１３に記載の式Ｉｂの化合物。
【請求項２０】
本願において、式
【化７】
2010509205.tif 000028
の化合物５として特定される、請求項１９に記載の化合物。
【請求項２１】
本願において、式
【化８】
2010509205.tif 000029
の化合物６として特定される、請求項１９に記載の化合物。
【請求項２２】
本願において、式
【化９】
2010509205.tif 000030
の化合物７として特定される、請求項１９に記載の化合物。
【請求項２３】
薬剤の調製のための、請求項１から２２までのいずれか一項に記載の一般式Ｉの化合物の使用。
【請求項２４】
本願において、請求項１５に記載の化合物１として特定される化合物の、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
本願において、請求項１６に記載の化合物２として特定される化合物の、請求項２３に記載の使用。
【請求項２６】
本願において、請求項１７に記載の化合物３として特定される化合物の、請求項２３に記載の使用。
【請求項２７】
本願において、請求項１８に記載の化合物４として特定される化合物の、請求項２３に記載の使用。
【請求項２８】
本願において、請求項２０に記載の化合物５として特定される化合物の、請求項２３に記載の使用。
【請求項２９】
本願において、請求項２１に記載の化合物６として特定される化合物の、請求項２３に記載の使用。
【請求項３０】
本願において、請求項２２に記載の化合物７として特定される化合物の、請求項２３に記載の使用。
【請求項３１】
好ましくはＲＩＮＧドメインを含有する、より好ましくは少なくとも１つのＳＨ３ドメインを含有するヒトポリペプチドのユビキチンリガーゼ活性の阻害のための、請求項２３から３０までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項３２】
前記ポリペプチドがヒトＰＯＳＨポリペプチドである、請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
ＰＯＳＨ関連タンパク質（ＰＯＳＨ−ＡＰ）、好ましくはＨＥＲＰＵＤ１のユビキチン化を阻害するための、請求項２３に記載の使用。
【請求項３４】
前記薬剤が、ウイルス感染、好ましくは、ＲＮＡウイルス、エンベロープウイルス又は霊長類レンチウイルス群を含むレンチウイルス等のレトロイドウイルスによって引き起こされるウイルス感染の治療のための薬剤である、請求項２３から３３までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項３５】
前記ウイルス感染が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）、ヒト免疫不全ウイルス２型（ＨＩＶ−２）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、エボラウイルス及びヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）から成る群より選択されるウイルスによって引き起こされる、請求項３４に記載の使用。
【請求項３６】
特に前記ウイルス感染がＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２によって引き起こされる場合における、本願において化合物１として示される化合物の、請求項３５に記載の使用。
【請求項３７】
特に前記ウイルス感染がＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２によって引き起こされる場合における、本願において化合物２として示される化合物の、請求項３５に記載の使用。
【請求項３８】
特に前記ウイルス感染がＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２によって引き起こされる場合における、本願において化合物５として示される化合物の、請求項３５に記載の使用。
【請求項３９】
前記薬剤が、神経学的状態、障害又は疾患の治療のための薬剤である、請求項２３から３３までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項４０】
前記神経学的障害又は疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ピック病、脳血管疾患、うつ病又は統合失調症である、請求項３８に記載の使用。
【請求項４１】
特にアルツハイマー病の治療のための、本願において、化合物１、化合物２及び化合物５として示される化合物の、請求項４０に記載の使用。
【請求項４２】
ヒトポリペプチドのユビキチンリガーゼ活性を阻害するための方法であって、請求項１から２２までのいずれか一項に記載の式Ｉの化合物を、前記ヒトポリペプチドのユビキチンリガーゼ活性を阻害するのに有効な量で、必要とする被験者に投与するステップを含む、上記方法。
【請求項４３】
前記ヒトポリペプチドがＲＩＮＧドメインを含有する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記ヒトポリペプチドが少なくとも１つのＳＨ３ドメインをさらに含有する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記ポリペプチドがヒトＰＯＳＨポリペプチドである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記被験者におけるウイルス感染の治療のための、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記ウイルス感染が、ＲＮＡウイルス、エンベロープウイルス又は霊長類レンチウイルス群を含むレンチウイルス等のレトロイドウイルスによって引き起こされる、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記ウイルス感染が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）、ヒト免疫不全ウイルス２型（ＨＩＶ−２）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、エボラウイルス及びヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）から成る群より選択されるウイルスによって引き起こされる、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
本願において、化合物１、２又は５として示される化合物から選択される化合物の抗ウイルス量の投与を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
被験者における、ＨＩＶ−１によって引き起こされるウイルス感染の治療のための方法であって、本願において、化合物、化合物２又は化合物５として示される化合物から選択される化合物の抗ＨＩＶ−１有効量を、前記被験者に投与するステップを含む、上記方法。
【請求項５１】
被験者における、ＨＩＶ−２によって引き起こされるウイルス感染の治療のための方法であって、本願において、化合物１、化合物２又は化合物５として示される化合物から選択される化合物の抗ＨＩＶ−２有効量を、前記被験者に投与するステップを含む、上記方法。
【請求項５２】
神経学的状態、障害又は疾患の治療のための、請求項４５に記載の方法。
【請求項５３】
前記神経学的障害又は疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ピック病、脳血管疾患、うつ病又は統合失調症である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記神経学的障害又は疾患がアルツハイマー病である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
アルツハイマー病に罹患している被験者の治療のための方法であって、本願において、化合物１、化合物２又は化合物５として示される化合物から選択される化合物の有効量を、前記被験者に投与するステップを含む、上記方法。
【請求項５６】
被験者における神経学的障害を治療するための方法であって、ヒトポリペプチドのユビキチンリガーゼ活性を阻害する小分子作用物質を前記被験者に投与するステップを含み、前記小分子化合物が、請求項１から２２までのいずれか一項に記載の式Ｉの化合物である、上記方法。
【請求項５７】
前記ヒトポリペプチドがＲＩＮＧドメインを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記ヒトポリペプチドが少なくとも１つのＳＨ３ドメインをさらに含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記ポリペプチドがヒトＰＯＳＨポリペプチドである、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記神経学的障害が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ピック病、脳血管疾患、うつ病及び統合失調症から成る群より選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
細胞中におけるアミロイドポリペプチド産生を阻害する方法であって、ヒトポリペプチド又はタンパク質のユビキチンリガーゼ活性を阻害する小分子作用物質を投与するステップを含み、前記小分子化合物が、請求項１から２２までのいずれか一項に記載の式Ｉの化合物である、上記方法。
【請求項６２】
ヒトポリペプチドがＲＩＮＧドメインを含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
ヒトポリペプチドが少なくとも１つのＳＨ３ドメインをさらに含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記ポリペプチドがヒトＰＯＳＨポリペプチドである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
細胞中におけるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の輸送を阻害する方法であって、小分子によってポリペプチドのユビキチンリガーゼ活性を阻害するステップを含み、前記小分子化合物が、請求項１から２２までのいずれか一項に記載の式Ｉの化合物である、上記方法。
【請求項６６】
ヒトポリペプチドがＲＩＮＧドメインを含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
ヒトポリペプチドが少なくとも１つのＳＨ３ドメインをさらに含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記ポリペプチドがヒトＰＯＳＨポリペプチドである、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
被験者におけるウイルス感染を治療する方法であって、ＰＯＳＨ関連タンパク質（ＰＯＳＨ−ＡＰ）を阻害する作用物質を、ウイルス感染を阻害するのに十分な量で投与するステップを含み、前記作用物質が、請求項１から２２までのいずれか一項に記載の式Ｉの化合物である、上記方法。
【請求項７０】
前記ＰＯＳＨ−ＡＰがＨＥＲＰＵＤ１である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記作用物質がＨＥＲＰＵＤ１のユビキチン化を阻害する、請求項７０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトポリペプチドのユビキチンリガーゼ活性の阻害剤、特にＰＯＳＨ阻害剤である小型ピリミジン誘導体、並びに、ウイルス感染及び神経学的状態、障害又は疾患の治療のための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
潜在的な薬物標的の検証では、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク分子が、疾患過程に関わり、したがって新たな治療薬物の開発に適した標的であるか否かを判断する。生物活性化合物を同定し特徴付ける過程である創薬は、ヒト疾患のための新たな治療の開発における重大なステップである。創薬の状況は、ゲノム革命によって劇的に変化した。ＤＮＡ及びタンパク質配列は、多数の新たな薬物標的及び膨大な量の関連情報を生み出している。
【０００３】
炎症及び免疫応答等、種々の病状又は主要な生物学的過程に関与する遺伝子及びタンパク質の同定は、薬物設計過程の不可欠な部分である。多くの疾患及び障害は、適切な分子標的を同定し、適切なアンタゴニストを発現させることができる場合、その状態の分子病因論に関与する１個又は複数の遺伝子の発現を減少させることによって、治療又は予防することができる。例えば、１個又は複数の細胞性癌遺伝子が活性化し、細胞周期過程の無制限の進行をもたらす癌は、適切な細胞周期制御遺伝子をアンタゴナイズすることによって治療できる。さらに、ハンチントン病等の多くのヒト遺伝子疾患、並びに、遺伝因子及びエピジェネティック因子両方の影響を受けるいくつかのプリオン状態は、その機能の完全喪失とは対照的な、ポリペプチドの不適切な活性に起因する。したがって、そのような突然変異遺伝子の異常機能をアンタゴナイズすることから、治療手段がもたらされる。加えて、ＨＩＶ等の感染症は、ＨＩＶプロテアーゼ又は逆転写酵素等の特異的な必須レトロウイルスタンパク質を標的とした分子アンタゴニストによって首尾よく治療されてきた。そのような疾患及び障害を治療するための薬物療法戦略では、疾病遺伝子（複数可）のポリペプチド産物を標的とする分子アンタゴニストを頻繁に用いてきた。しかしながら、関連遺伝子又はタンパク質標的の発見は、多くの場合、困難且つ時間のかかるものである。
【０００４】
特に関心の高い１つの分野は、ウイルスの生活サイクルの間にウイルスによって選出される宿主遺伝子及びタンパク質の同定である。多くのウイルス疾患の重篤性及び不治性は、多くのウイルスにおいて見られる高い突然変異率とあいまって、抗ウイルス剤の同定を世界の健康の向上にとって最優先のこととしている。ウイルスの生活サイクルに関与する遺伝子及びタンパク質は、一般に宿主細胞中における付加的な活性を有し、他の非ウイルス性の病状において役割を担い得るため、そのような遺伝子及びタンパク質は調査対象としても魅力がある。
【０００５】
ウイルス成熟には、Ｇａｇタンパク質のタンパク質分解処理及び種々の宿主タンパク質の活性が関与する。エキソ／エンドサイトーシス及びユビキチン抱合のための細胞機構は、成熟に関与し得ると考えられている。特に、種々のレトロウイルス、ラブドウイルス、レンチウイルス及びフィロウイルス等、レトロイドウイルス（ｒｅｔｒｏｉｄ  ｖｉｒｕｓ）、ＲＮＡウイルス及びエンベロープウイルスの会合、成熟、出芽及びそれに続く放出には、Ｇａｇポリタンパク質が関与する。その合成後、Ｇａｇは原形質膜を標的とし、そこで発生期のウイルス粒子の出芽を誘発する。
【０００６】
ウイルス会合におけるユビキチンの役割は、成熟ウイルス粒子が非抱合ユビキチン中で濃縮されることを観察したＤｕｎｉｇａｎら（１９８８、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６５、３１０；Ｍｅｙｅｒｓら、１９９１、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８０、６０２）によって示唆された。より最近では、プロテアソーム阻害剤が、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２並びにＳＩＶ及びＲＳＶ  Ｇａｇに由来するウイルス様粒子の放出を抑制することが示された。また、阻害剤は、Ｇａｇ処理及び感染粒子への成熟にも影響を及ぼす（Ｓｃｈｕｂｅｒｔら、２０００、ＰＮＡＳ  ９７、１３０５７；Ｈａｒｔｙら、２０００、ＰＮＡＳ  ９７、１３８７１；Ｓｔｒａｃｋら、２０００、ＰＮＡＳ  ９７、１３０６３；Ｐａｔｎａｉｋら、２０００、ＰＮＡＳ  ９７、１３０６９）。
【０００７】
当該技術分野においては、ユビキチン介在性タンパク質分解が、真核細胞中における細胞内タンパク質の選択的な制御分解のための主要経路であることがよく知られている。細胞内における多種多様なタンパク質標的のユビキチン修飾は、遺伝子発現の制御、細胞周期の制御、細胞表面受容体の修飾、リボソームの生合成及びＤＮＡ修復等、多数の基本的細胞機能において重要なようである。ユビキチン介在系の１つの主要な機能は、細胞タンパク質の半減期を制御することである。異なるタンパク質の半減期は、数分間から数日間までの範囲となり得、細胞型、栄養及び環境条件、並びに細胞周期の段階に応じて大幅に変動し得る。
【０００８】
おそらくユビキチン依存性プロテアソームの作用によって選択的分解を受けている標的タンパク質は、ユビキチンのＣ末端グリシル残基と基質タンパク質中の特異的なリシル残基との間におけるイソペプチド結合の形成を介して、共有結合によりユビキチンでタグ付けされる。この過程は、ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）及びユビキチン抱合酵素（Ｅ２）によって触媒され、一部の事例では、補助的な基質認識タンパク質（Ｅ３）を必要とする場合もある。第１のユビキチン鎖の結合に続いて、ユビキチンの付加的な分子を予め抱合した部分のリシン側鎖に結合し、分岐した多ユビキチン鎖を形成することができる。
【０００９】
ユビキチンのタンパク質基質との抱合は、多段階過程である。初期のＡＴＰ要求ステップでは、ユビキチンのＣ末端とＥ１酵素の内部システイン残基との間にチオエステルが形成される。その後、活性化ユビキチンは、数種のＥ２酵素のうちの１つの上で特異的システインへ移行することができる。最後に、これらのＥ２酵素は、一般にユビキチンリガーゼ酵素としても知られるＥ３タンパク質の援助によって、タンパク質基質にユビキチンを供与する。いくつかの事例において、基質はユビキチン抱合Ｅ２酵素によって直接認識される。ユビキチン（ｕｂ）タンパク質リガーゼ（Ｅ３）は、Ｅ１（ｕｂ−活性化酵素）及びＥ２（ｕｂ担体タンパク質）の存在下において、１個又は複数のユビキチン分子の基質タンパク質との共有結合（抱合）を容易にするタンパク質として機能的に定義される。タンパク質基質の不在下において、Ｅ３は、自己ユビキチン化、すなわち、Ｅ２由来の活性化ユビキチンの、Ｅ３ポリペプチド上のリシン残基受容体部位への移行であり、自己ユビキチン化と称される反応を触媒することができる。トランスユビキチン化と同様に、自己ユビキチン化は、Ｅ１、Ｅ２及び完全なＥ３機能モジュール、すなわちＲＩＮＧフィンガー又はＨＥＣＴドメインの存在に依存する（Ｌｏｒｉｃｋ  ＫＬら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１９９９、９６、１１３６４〜９；Ｋａｏ  ＷＨら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．、２０００、７４、６４０８〜６４１７）。
【００１０】
ユビキチン系は、細胞内輸送、細胞周期進行、アポトーシス及び多くの膜受容体の代謝回転を含む広範な細胞過程において役割を担っていることも知られている。ウイルス感染において、ユビキチン系は、会合、出芽及び放出だけでなく、ウイルス誘発性の新生物につながり得るｐ５３等の宿主タンパク質の抑制にも関与している。ＨＩＶ  Ｖｐｕタンパク質は、ＩκＢ分解を制御するＥ３タンパク質と相互作用しており、ＮＦ−κＢ活性を間接的に阻害することによって感染細胞のアポトーシスを促進すると考えられている（Ｂｏｕｒら（２００１）、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９４、１２９９〜３１１；米国特許第５，９３２，４２５号）。ユビキチン系は、モノユビキチン化及びポリユビキチン化の両方によってタンパク質機能を制御する。ポリユビキチン化は、主としてタンパク質分解に関連する。
【００１１】
ＰＯＳＨ（Ｐｌｅｎｔｙ  ｏｆ  ＳＨ３  ｄｏｍａｉｎｓ；多数のＳＨ３ドメイン）タンパク質は、タンパク質分解、細胞内輸送、細胞周期進行、アポトーシス及び多くの膜受容体の代謝回転を含む広範な細胞過程において役割を担っている。ウイルス感染におけるＰＯＳＨ、ユビキチンリガーゼ及び「ＰＯＳＨタンパク質」（そのアミノ酸配列中にＲＩＮＧドメイン及び少なくとも１つのＳＨ３ドメインを本質的に含むタンパク質）の必須機能、並びに、ウイルス感染、特にＨＩＶ感染を阻害するためのＰＯＳＨ阻害の使用については、２００２年１１月１２日出願の米国特許出願第１０／２９３，９６５号；ＷＯ０３／０９５９７２として公開された２００２年１１月１２日出願のＰＣＴ／ＵＳ０２／３６３６６；２００２年７月３１日出願のＰＣＴ／ＵＳ０２／２４５８９；２００２年１１月１１日出願のＷＯ０３／０７８６０１、ＷＯ０３／０６００６７、ＥＰ１３１０５５２及びＥＰ０２２５７７９６において広く記述された。これらの出願はすべて、参照により、本明細書において完全に開示されているかの如く、その全体が本明細書に組み込まれる。
【００１２】
ＰＯＳＨ等のユビキチンリガーゼは、例えば、細胞へのウイルス侵入、ウイルスタンパク質の産生、ウイルスタンパク質の会合及び細胞からのウイルス粒子の放出等、ウイルスの生活サイクルの種々の段階のうちの１つ又は複数を含む生物学的過程に関係し得る。上記の特許出願には、いくつかのＰＯＳＨポリペプチドが、ウイルス粒子中におけるタンパク質の生成、翻訳後プロセシング、会合及び／又は放出を含むウイルス成熟に関与していることが記述されている。したがって、ウイルス感染は、ＰＯＳＨの活性（例えば、ユビキチンリガーゼ活性又は標的タンパク質相互作用）を阻害することによって寛解することができる。
【００１３】
加えて、２００４年４月５日出願の、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／１０５８２号において記述されている通り、数種のタンパク質がＰＯＳＨと相互作用し、これを使用して候補治療薬を同定することができる。これらのＰＯＳＨ関連タンパク質（ＰＯＳＨ−ＡＰ）の１つがＨＥＲＰＵＤ１であり、神経学的障害、特にアルツハイマー病に関連することが知られている。
【００１４】
ＰＯＳＨタンパク質を結合し、ＰＯＳＨタンパク質活性を阻害する小分子としての化合物、より具体的には、ＰＯＳＨタンパク質介在性ユビキチン化を阻害する化合物を同定することが有益であろう。
【００１５】
本明細書全体を通して、種々の科学刊行物及び特許又は公開特許出願が参照される。これらすべての刊行物の開示は、本発明が属する技術分野の状況をより完全に記述するために、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。この節又は本明細書の他の任意の部分における任意の参照文献の引用又は特定を、そのような参照文献が本発明の先行技術として利用可能であることの承認として解釈してはならない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
一態様において、本発明は、以下に示される式Ｉのピリミジン誘導体である小分子を提供する。好ましい実施形態において、式Ｉの化合物は、本明細書において化合物１、２、３、４、５、６及び７として示される化合物である。
【００１７】
一態様において、本発明は、薬剤の調製のための、一般式Ｉの化合物の使用に関する。好ましい実施形態において、使用される化合物は、本明細書において化合物１、２、３、４、５、６及び７として示される化合物である。
【００１８】
好ましい実施形態において、式Ｉの化合物は、ヒトポリペプチドのユビキチンリガーゼ活性の阻害のために、本発明に従って使用される。
【００１９】
別の態様において、本発明は、ヒトポリペプチドのユビキチンリガーゼ活性を阻害するための方法であって、式Ｉの化合物を、該ヒトポリペプチドのユビキチンリガーゼ活性を阻害するのに有効な量で、必要とする被験者に投与するステップを含む上記方法に関する。
【００２０】
好ましい実施形態において、該ヒトポリペプチドは、ＲＩＮＧドメイン、より好ましくは、少なくとも１つのＳＨ３ドメインを含有する。最も好ましい実施形態において、該ポリペプチドはヒトＰＯＳＨポリペプチドである。
【００２１】
一般式Ｉの化合物は、ＰＯＳＨタンパク質介在性ユビキチン化を阻害することがわかり、本明細書においては「ＰＯＳＨ阻害剤」と命名する。
【００２２】
ＰＯＳＨポリペプチドは、ウイルス成熟を含むウイルスの生活サイクルの種々の段階において、及び神経学的障害においても役割を担うものとして同定されている。したがって、ＰＯＳＨポリペプチド活性、特にＰＯＳＨタンパク質介在性ユビキチン化の阻害は、そのような活性を消失させ、ウイルス感染の治療及び最終的にはウイルス死滅又は神経学的状態、障害若しくは疾患の治療につながることになる。
【００２３】
一実施形態において、式Ｉの化合物を使用し、本発明に従って調製される薬剤は、ウイルス感染の治療のための薬剤である。
【００２４】
別の実施形態において、薬剤は、神経学的状態、障害又は疾患の治療のための薬剤である。
【００２５】
さらなる態様において、本発明は、ウイルス感染、特に、ＨＩＶ、エボラ、ＨＢＶ、ＨＣＶ及びＨＴＬＶを含む、レトロイドウイルス、ＲＮＡウイルス及びエンベロープウイルスによって引き起こされるウイルス感染に罹患している患者の治療のための方法であって、以下の一般式Ｉの少なくとも１種の化合物の有効量を該患者に投与するステップを含む上記方法に関する。
【００２６】
別の態様において、本発明は、化合物１及び２の合成の方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ＨＩＶ−１ＩＩＩＢウイルスに感染したＣＥＭ−ＳＳ細胞に対する化合物１の抗ウイルス効果及び非感染ＣＥＭ−ＳＳ細胞に対する化合物１の細胞毒性効果を示すグラフである。
【図２】ＨＩＶ−１ＩＩＩＢウイルスに感染したＣＥＭ−ＳＳ細胞に対する化合物５の抗ウイルス効果及び非感染ＣＥＭ−ＳＳ細胞に対する化合物５の細胞毒性効果を示すグラフである。
【図３】ＨＩＶ−２ＲＯＤウイルスに感染したＣＥＭ−ＳＳ細胞に対する化合物１の抗ウイルス効果及び非感染ＣＥＭ−ＳＳ細胞に対するその細胞毒性効果を示すグラフである。
【図４】ＨＩＶ−２ＲＯＤウイルスに感染したＣＥＭ−ＳＳ細胞に対する化合物２の抗ウイルス効果及び非感染ＣＥＭ−ＳＳ細胞に対する化合物２の細胞毒性効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明によれば、いくつかのピリミジン誘導体はユビキチン化阻害剤として作用し、ＰＯＳＨタンパク質介在性ユビキチン化を阻害できることがわかった。
【００２９】
したがって、一態様によれば、本発明は、一般式Ｉの化合物、又はその鏡像異性体若しくは薬学的に許容される塩を提供し、
【化１】
2010509205.tif 000002
式中、
Ｒ１は、アルキル、アリール、ヘテロアリール、−ＣＯＲ６、−ＣＯＯＲ６、−ＮＲ７Ｒ８、−ＣＯＮＲ７Ｒ８又は−ＮＲ９ＣＯＲ１０であり、
Ｒ２はアリール又はヘテロアリールであり、
Ｒ３は、Ｈ、又は低級アルキル、低級アルコキシ、ハロゲン、−ＮＲ５Ｒ６、−ＣＯＯＲ４若しくは−ＣＯＮＲ５Ｒ６から選択される１〜３個の基を表し、
Ｒ４は、Ｈ、アルキル、アリール、カルボシクリル、アシル、→Ｏ又はヘテロシクリルであり、
Ｒ５は、Ｈ、ハロゲン、アルキル、アリール、ヘテロアリール、−ＯＲ６、−ＳＲ６、−ＣＯＲ６、−ＣＯＯＲ６、−ＮＲ７Ｒ８、−ＣＯＮＲ７Ｒ８又は−ＮＲ９ＣＯＲ１０であるか、或いはＲ４、それが結合した窒素原子及びＲ５が５〜６員のヘテロシクリル環を形成し、
Ｒ６は、Ｈ、ヒドロカルビル又はヘテロシクリルであり、
Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に、Ｈ、ヒドロカルビル又はヘテロシクリルであるか、或いはＲ７及びＲ８は、それらが結合した窒素原子と一緒になって、Ｎ、Ｓ及び／又はＯから選択される１又は２個のさらなるヘテロ原子を場合によって含有する５〜６飽和ヘテロシクリル環を形成し、該さらなるＮ原子は、低級アルキル、アラルキル、ハロアルキル又はヒドロキシアルキルで場合によって置換されており、
Ｒ９は、Ｈ、低級アルキル又はフェニルであり、
Ｒ１０はアリール又はヘテロアリールであり、
該ヒドロカルビル、ヘテロシクリル、アリール及びヘテロアリールは、低級アルキル、ハロゲン、アリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、ニトロ、エポキシ、エピチオ、−ＯＲ６、−ＳＲ６、−ＣＯＲ６、−ＣＯＯＲ６、−ＮＲ７Ｒ８、−ＣＯＮＲ７Ｒ８、ニトロ、−ＮＲ７−ＣＯＲ６、−ＳＯ３Ｒ６、−ＳＯ２Ｒ６、−ＳＯ２ＮＲ７Ｒ８及び−ＮＲ７ＳＯ２Ｒ６（ここで、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は上記で定義された通りである）から選択される１個又は複数の基で場合によって置換されている。
【００３０】
１つの好ましい実施形態において、式Ｉの化合物中、Ｒ１はＮＲ９ＣＯＲ１０であり、Ｒ２は場合によって置換されているヘテロアリールであり、Ｒ３はＨ又は１〜３個のアルキル基であり、Ｒ４〜Ｒ１０は上記で定義された通りである。
【００３１】
さらなる可能な定義に範囲を限定することなく、本明細書において使用する場合、以下の用語は次の通りに定義される。
【００３２】
「ヒドロカルビル」という用語は、１〜２０個の炭素原子、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜６個、最も好ましくは２〜３個の炭素原子の、非環式又は環式、飽和、不飽和又は芳香族のヒドロカルビル基であってよい炭化水素に由来する基を意味し、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アラルキル及びアリールを含む。
【００３３】
「アルキル」、「アルケニル」又は「アルキニル」基は、それぞれ、直鎖又は分岐鎖であってよく、Ｏ、Ｓ及び／又はＮから選択される１個又は複数のヘテロ原子で遮断されていてよい、且つ／或いはハロゲン、アリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、ニトロ、エポキシ、エピチオ、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＣＯＲ、−ＣＯＯＲ−ＮＲＲ’、−ＣＯＮＲＲ’、−ＮＲＣＯＲ’−ＳＯ３Ｒ、−ＳＯ２Ｒ、−ＳＯ２ＮＲＲ’及び−ＮＲＳＯ２Ｒ（ここで、Ｒ及びＲ’は独立に、それぞれ、Ｈ、ヒドロカルビル又はヘテロシクリルであるか、或いはＲ及びＲ’は、それらが結合した窒素原子と一緒になって、Ｎ、Ｓ及び／又はＯから選択される１又は２個のさらなるヘテロ原子を場合によって含有する飽和５〜７員のヘテロシクリル環を形成し、該さらなるＮ原子はヒドロカルビルで場合によって置換されている）から成る群より選択される１個又は複数の基により置換されていてよい、「Ｃ１〜Ｃ１０アルキル」、好ましくは「Ｃ１〜Ｃ４アルキル」、「Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル」、好ましくは「Ｃ２〜Ｃ４アルケニル」又は「Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル」、好ましくは「Ｃ２〜Ｃ４アルキニル」である。
【００３４】
「低級アルキル」という用語は、１〜４個の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖アルキル基であってよく、Ｏ、Ｓ及び／又はＮから選択される１個又は複数のヘテロ原子で遮断され、且つ／或いは上記で定義された通り置換されていてよい、「Ｃ１〜Ｃ４アルキル」を指す。低級アルキルは、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチルを含む。１つの好ましい実施形態において、低級アルキルはメチルである。
【００３５】
あらゆる「Ｃ２〜Ｃ４アルケニル」は、２〜４個の炭素原子及び１若しくは２個の二重結合を有する直鎖又は分岐鎖の不飽和基、例えばアルカジエニル基であり、該アルケニル基は、好ましくは末端二重結合を有し、例えば、ビニル、プロプ−２−エン−１−イル、ブト−３−エン−１−イルを含む。あらゆる「Ｃ２〜Ｃ４アルキニル」は、２〜４個の炭素原子及び１個又は複数の三重結合を有する直鎖又は分岐鎖の不飽和基であり、例えば、エチニル、プロピニル、ブチニルを含む。すべてのアルキル、アルケニル及びアルキニル基は、上記で定義された通り置換されていてよい。
【００３６】
本明細書における「カルボシクリル」という用語は、「Ｃ５〜Ｃ６シクロアルキル」又は「Ｃ５〜Ｃ６シクロアルケニル」、すなわち、５〜６個の完全飽和又は部分不飽和の炭素環基をそれぞれ指す「シクロアルキル」及び「シクロアルケニル」という用語を含み、ハロゲン、ヒドロカルビル、ヘテロシクリル、ニトロ、エポキシ、エピチオ、ＯＲ、−ＳＲ、−ＣＯＲ、−ＣＯＯＲ−ＮＲＲ’、−ＣＯＮＲＲ’、−ＮＲＣＯＲ’−ＳＯ３Ｒ、−ＳＯ２Ｒ、−ＳＯ２ＮＲＲ’及び−ＮＲＳＯ２Ｒ（ここで、Ｒ及びＲ’は独立に、それぞれ、Ｈ、ヒドロカルビル又はヘテロシクリルであるか、或いはＲ’及びＲ”は、それらが結合した窒素原子と一緒になって、Ｎ、Ｓ及び／又はＯから選択される１又は２個のさらなるヘテロ原子を場合によって含有する飽和ヘテロシクリル環を形成し、該さらなるＮ原子はヒドロカルビルで場合によって置換されている）から成る群より選択される１個又は複数の基により置換されていてよい、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロペンテニル及びシクロヘキセニルを含む。
【００３７】
「アリール」という用語は、上記で定義された通りの１個又は複数の基により置換されていてよい、フェニル、ナフチル及びアントラセニル等、単環、二環又は三環から成る、６〜１４個の炭素原子、好ましくは６〜１０個の炭素原子を有する「Ｃ６〜Ｃ１４」芳香族炭素環基を指す。
【００３８】
「ヘテロシクリル」という用語は、環員の１〜３個が、Ｏ、Ｓ及び／又はＮから選択されるヘテロ原子である、３〜１２個、好ましくは５〜１０個、より好ましくは５〜６個の環員の、飽和又は部分不飽和（非芳香族）の単環式、二環式又は三環式複素環に由来する基を意味する。非芳香族ヘテロシクリルの非限定的例は、ジヒドロフリル、テトラヒドロフリル、ジヒドロチエニル、ピロリジニル、ピロリニル、ジヒドロピリジル、ピペリジニル、ピペラジニル、モルホリノ、１，３−ジオキサニル等を含む。ヘテロシクリル基は、上記で定義された通りの１個又は複数の基により置換されていてよい。多環式ヘテロシクリル環が置換されている場合、置換は炭素環及び／又はヘテロシクリル環のいずれの中であってもよいことを理解されたい。
【００３９】
「ヘテロアリール」という用語は、本明細書において使用する場合、Ｏ、Ｓ及びＮから成る群より選択される１〜３個のヘテロ原子を含有する単環式又は多環式芳香族複素環に由来する基を意味する。特定の例は、ピロリル、フリル、チエニル、ピラゾリル、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、ピリジル、キノリニル、イソキノリニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、１，３，４−トリアジニル、１，２，３−トリアジニル、１，３，５−トリアジニル、ベンゾフリル、イソベンゾフリル、インドリル、イミダゾ［１，２−ａ］ピリジル、ベンズイミダゾリル、ベンズチアゾリル及びベンゾオキサゾリル、ベンゾジアゼピニル、並びにさらなる多環式芳香族複素環由来の他の基である。ヘテロアリール基は、上記で定義された通りの１個又は複数の基により置換されていてよい。多環式ヘテロアリール環が置換されている場合、置換は、炭素環及び／又はヘテロシクリル環のいずれの中であってもよいことを理解されたい。１つの好ましい実施形態において、ヘテロアリールはチエニルである。
【００４０】
「ハロゲン」という用語は、フルオロ、クロロ、ブロモ又はヨードを指す。好ましい実施形態において、ハロゲンはクロロである。
【００４１】
基−ＮＲ７Ｒ８又は−ＮＲＲ’は、Ｒ７（又はＲ）及びＲ８（又はＲ’）がいずれも水素である場合、−ＮＨ２であってよく、或いはＲ７（又はＲ）がＨであり及びＲ８（又はＲ’）がＣ１〜Ｃ４アルキルである場合、第二級アミノであってよく、或いはＲ７（又はＲ）及びＲ８（又はＲ’）がそれぞれＣ１〜Ｃ４アルキルであるか、又はＲ７若しくはＲ８（それぞれＲ及びＲ’）が、それらが結合した窒素原子と一緒になって、窒素、酸素及び／又は硫黄から選択される１又は２個のさらなるヘテロ原子を場合によって含有する飽和、好ましくは５又は６員のヘテロシクリル環を形成し得る場合、第三級アミノであってよい。そのような環は、好ましくはさらなるＮ原子で、低級アルキル、アラルキル、ハロアルキル又はヒドロキシアルキルにより置換されていてよい。そのような環の例は、ピロリジノ、ピペリジノ、モルホリノ、チオモルホリノ、ピペラジノ、Ｎ−アルキルピペラジノ、例えばＮ−メチルピペラジノ、及びジアゼピノを含むがこれらに限定されない。
【００４２】
Ｒ６（又はＲ）がアルキルである場合、基ＯＲ６（又はＯＲ）、ＳＲ６（又はＳＲ）、ＣＯＲ６（又はＣＯＲ）によって形成される任意のアルコキシ、アルキルチオ又はアルカノイル基は、それぞれＣ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４アルキルチオ及びＣ２〜Ｃ４アルカノイル基である。アルコキシの例は、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシ、ブトキシ等であり、アルキルチオの例は、−Ｏ−を−Ｓ−で置き換えることを除いて同じであり、アルカノイルの例は、アセチル、プロパノイル、ブタノイル等である。すべてのアルコキシ、チオアルキル及びアルカノイル基は、上記で定義された通り置換されていてよい。１つの好ましい実施形態において、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシはメトキシである。
【００４３】
好ましい実施形態によれば、本発明は、式Ｉａ又はＩｂの化合物を提供し、
【化２】
2010509205.tif 000003
式中、
Ｘは、Ｏ、Ｓ又はＮＨであり、
Ｒ３はＨ又は１〜３個の（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルであり、
Ｒ４はＨ又は（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルであり、
Ｒ５はＨ又は場合によって置換されている（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであり、
Ｒ１１〜Ｒ１９は、それぞれ独立に、Ｈ、低級アルキル、ハロゲン、アリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、ニトロ、エポキシ、エピチオ、−ＯＲ６、−ＳＲ６、−ＣＯＲ６、−ＣＯＯＲ６、−ＮＲ７Ｒ８、−ＣＯＮＲ７Ｒ８、ニトロ、−ＮＲ７−ＣＯＲ６、−ＳＯ３Ｒ６、−ＳＯ２Ｒ６、−ＳＯ２ＮＲ７Ｒ８及び−ＮＲ７ＳＯ２Ｒ６（ここで、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、アリール若しくはヘテロシクリルであるか、又はＲ７及びＲ８は、それらが結合した窒素原子と一緒になって、Ｎ、Ｓ及び／又はＯから選択される１又は２個のさらなるヘテロ原子を場合によって含有する飽和ヘテロシクリル環を形成し、該さらなるＮ原子は、フェニル、ハロゲン又はヒドロキシで場合によって置換されている低級アルキルで場合によって置換されている）から選択され、式Ｉｂ中の点線は、任意選択の二重結合を表す。
【００４４】
より好ましい実施形態において、ＸがＳであり、Ｒ３がＨ又は１〜３個のメチル基であり、Ｒ４がＨであり、Ｒ５がＨ又はメチルであり、Ｒ１１〜Ｒ１６がＨである、式Ｉａの化合物である。
【００４５】
本発明によって提供される式Ｉａの１つの最も好ましい化合物は、本明細書において、化合物１、２、３及び４として特定される化合物であり、化合物１は
【化３】
2010509205.tif 000004
であり、化合物２は
【化４】
2010509205.tif 000005
であり、化合物３は
【化５】
2010509205.tif 000006
であり、化合物４は
【化６】
2010509205.tif 000007
である。
【００４６】
別のより好ましい実施形態によれば、本発明は、ＸがＳであり、Ｒ３がＨ又は１〜３個のメチル基であり、Ｒ１１〜Ｒ１９がＨである、式Ｉｂの化合物を提供する。最も好ましい実施形態において、化合物は、本明細書において、化合物５、６及び７として特定され、化合物５は
【化７】
2010509205.tif 000008
であり、化合物６は
【化８】
2010509205.tif 000009
であり、化合物７は
【化９】
2010509205.tif 000010
である。
【００４７】
式Ｉの化合物の塩も本発明によって企図されており、いずれの塩も、酸添加及び／又は塩基塩と同様に、分子中に存在する任意のカルボキシ又はスルホ基及び塩基によって形成される。
【００４８】
薬学的に許容される塩は、アルカリ及びアルカリ土類金属又は有機アミン等、金属又はアミンと形成される。カチオンとして使用される金属の例は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等である。適切なアミンの例は、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン及びプロカインである（例えば、Ｂｅｒｇｅ  Ｓ．Ｍ．ら、「薬学的塩（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ）」（１９７７）、Ｊ．ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、６６、１〜１９を参照）。塩は、式−ＮＲＲ’Ｒ”＋Ｚ’の第四級塩等、薬学的に許容される第四級塩であってもよく、ここで、Ｒ、Ｒ’及びＲ”は、それぞれ独立に、水素、アルキル又はベンジルであり、Ｚは、塩化物、臭化物、ヨウ化物、Ｏ−アルキル、トルエンスルホン酸塩、メチルスルホン酸塩、スルホン酸塩、リン酸塩、カルボン酸塩、酢酸塩又はトリフルオロ酢酸塩を含む対イオンである。
【００４９】
薬学的に許容される化合物の酸付加塩は、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸等の無機酸に由来する塩、並びに、脂肪族モノ−及びジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、アルカン二酸、芳香族酸、脂肪族及び芳香族スルホン酸等の有機酸に由来する塩を含む。したがって、そのような塩は、硫酸塩、ピロ硫酸塩、重硫酸塩、亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、硝酸塩、リン酸塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸塩、プロピオン酸塩、カプリル酸塩、イソ酪酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、フタル酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、フェニル酢酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩等を含む。アルギネート等のアミノ酸及びグルコン酸塩又はガラクツロン酸塩の塩も企図されている（例えば、Ｂｅｒｇｅ  Ｓ．Ｍ．ら、「薬学的塩（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ）」（１９７７）、Ｊ．ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、６６、１〜１９を参照）。
【００５０】
該塩基性化合物の酸付加塩は、従来の方式で、遊離塩基形態を十分な量の所望の酸と接触させ、塩を生成することによって調製される。遊離塩基形態は、従来の方式で、塩形態を塩基と接触させ、遊離塩基を単離することによって再生できる。遊離塩基形態は、極性溶媒中での溶解度等、いくつかの物理的性質がその各塩形態とは若干異なるが、それ以外の点では、塩は、本発明の目的のために、その各遊離塩基と同等である。
【００５１】
該酸性化合物の塩基付加塩は、従来の方式で、遊離酸形態を十分な量の所望の塩基と接触させ、塩を生成することによって調製される。遊離酸形態は、従来の方式で、塩形態を酸と接触させ、遊離酸を単離することによって再生できる。遊離酸形態は、極性溶媒中での溶解度等、いくつかの物理的性質がその各塩形態とは若干異なるが、それ以外の点では、塩は、本発明の目的のために、その各遊離酸と同等である。
【００５２】
化合物１及び２は、本発明に従って、本明細書において実施例７及び８並びにスキーム１及び２に記述されている通り、３ステップ反応手順を使用して調製した。最初の２ステップは既知であるが、第３のステップは新しいものであり、２−（２−チエニル）−４−（２−チエニルメチレン）オキサゾール−５（４Ｈ）−オン（アザラクトン、スキーム１における中間体２）を４−アミノ−Ｎ−（４，６−ジメチルピリミジン−２−イル）ベンゼンスルホンアミド又は氷酢酸中の４−アミノ−Ｎ１−（２−ピリミジニル）−１−ベンゼンスルホンアミドと混合し、還流しながら撹拌することを伴う。
【００５３】
本明細書において使用する場合、「ＰＯＳＨ」、「ＰＯＳＨタンパク質（複数可）」又は「ＰＯＳＨポリペプチド（複数可）」という用語は同義で使用され、そのアミノ酸配列中にＲＩＮＧドメイン及び少なくとも１つのＳＨ３ドメインを含むポリペプチドを指す。一部の事例において、ＰＯＳＨタンパク質は、３つ又は４つのＳＨ３ドメインを有し得る。
【００５４】
「ＰＯＳＨ介在性ユビキチン化」又は「ＰＯＳＨタンパク質介在性ユビキチン化」という用語は同義で使用され、ＰＯＳＨタンパク質の介入を必要とする任意のユビキチン化過程を指す。
【００５５】
「ユビキチン化阻害剤」、「ＰＯＳＨ阻害剤」又は「ＰＯＳＨタンパク質阻害剤」という用語は同義で使用され、ＰＯＳＨタンパク質介在性ユビキチン化を含む、本明細書において完全に開示されているかの如く、その全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ０２／３６３６６（ＷＯ０３／０９５９７２）において定義されている通りのＰＯＳＨ活性を阻害する、本明細書における式Ｉのピリミジン誘導体を指す。
【００５６】
ＰＯＳＨポリペプチドは、ウイルス成熟を含むウイルスの生活サイクルの種々の段階において、及び神経学的障害においても役割を担っていることが知られている。したがって、本発明によって提供されるＰＯＳＨ阻害剤による、ＰＯＳＨポリペプチド活性、特にＰＯＳＨタンパク質介在性ユビキチン化の阻害は、そのような活性を消失させることができ、ウイルス感染の治療及び最終的にはウイルス死滅又は神経学的状態、障害若しくは疾患の治療につながることになる。
【００５７】
したがって、別の態様において、本発明は、薬剤の調製のためのユビキチン化阻害剤の使用に関し、該ユビキチン化阻害剤は、上記一般式Ｉのピリミジン誘導体である。
【００５８】
好ましい実施形態において、一般式ＩのＰＯＳＨポリペプチド阻害剤は、ＰＯＳＨポリペプチド、好ましくはヒトＰＯＳＨポリペプチドのユビキチンリガーゼ活性を阻害する。別の好ましい実施形態において、ＰＯＳＨ阻害剤は、ＰＯＳＨ自己ユビキチン化、特にヒトＰＯＳＨポリペプチドのＲＩＮＧフィンガー依存性ユビキチン化を阻害する。より好ましい実施形態において、ＰＯＳＨ阻害剤は、ＰＯＳＨを選択的に阻害し、ＳＨ３ドメインを有さないＭｄｍ２及びｃ−Ｃｂｌ等の他のユビキチンＥ３リガーゼのフィンガー依存性ユビキチン化は阻害しない。
【００５９】
好ましい実施形態において、薬剤の調製のために使用されるユビキチン化阻害剤中、Ｒ１はＮＲ９ＣＯＲ１０であり、Ｒ２は場合によって置換されているヘテロアリールであり、Ｒ３はＨ又は１〜３個のアルキル基である。より好ましくは、阻害剤は式Ｉａ又はＩｂのものであり、最も好ましくは、使用される化合物は化合物１、２、３、４、５、６及び７である。
【００６０】
最も好ましい実施形態において、本発明は、ウイルス感染、好ましくは、ＲＮＡウイルス、エンベロープウイルス又は霊長類レンチウイルス群を含むレンチウイルス等のレトロイドウイルスによって引き起こされるウイルス感染、最も好ましくは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）、ヒト免疫不全ウイルス２型（ＨＩＶ−２）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、エボラウイルス及びヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）から成る群より選択されるウイルスによって引き起こされる感染によって引き起こされるウイルス感染の治療用の、抗ウイルス活性を呈する薬剤の調製のための、一般式Ｉのユビキチン化阻害剤の使用を提供する。好ましい実施形態において、化合物は、式Ｉの化合物の使用の好ましい実施形態において上記で定義された通りであり、最も好ましくは、化合物１、２及び５である。
【００６１】
さらに別の態様において、本発明は、ウイルス感染に罹患している患者の治療のための方法であって、上記一般式Ｉの少なくとも１種のピリミジン誘導体の有効量を、該患者に投与するステップを含む上記方法に関する。
【００６２】
本発明によれば、ＰＯＳＨタンパク質阻害剤は、任意のウイルス感染の治療に有用となることが予想される。
【００６３】
本明細書の教示に照らして、当業者は、本発明の方法及び組成物が、例えば、レトロイドウイルス、ＲＮＡウイルス及びエンベロープウイルス等の広範なウイルスに適用可能であることを理解するであろう。
【００６４】
「エンベロープウイルス」という用語は、本明細書において使用する場合、ウイルス放出過程において細胞膜及び／又は任意のオルガネラ膜を使用する任意のウイルスを指す。
【００６５】
好ましい実施形態において、本発明は、レトロイドウイルスに適用可能である。より好ましい実施形態において、本発明は、レトロウイルス（レトロウイルス科）にさらに適用可能である。別のより好ましい実施形態において、本発明は、霊長類レンチウイルス群を含むレンチウイルスに適用可能である。最も好ましい実施形態において、本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）、ヒト免疫不全ウイルス２型（ＨＩＶ−２）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）及びヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）に適用可能である。
【００６６】
限定を意図するものではないが、関連レトロウイルスは、カワカマスにおいてリンパ肉腫を引き起こすＣ型レトロウイルス、ミンクに感染するＣ型レトロウイルス、ヒツジに感染するヤギレンチウイルス、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ブタに感染するＣ型レトロウイルス、トリ白血病肉腫ウイルス（ＡＬＳＶ）、猫白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、猫エイズウイルス、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）、サル白血病ウイルス（ＳＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩＩ型（ＨＴＬＶ−ＩＩ）、ヒト免疫不全ウイルス２型（ＨＩＶ−２）及びヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）を含む。
【００６７】
本発明の方法及び組成物は、ｓｓＲＮＡマイナス鎖ウイルス及びｓｓＲＮＡプラス鎖ウイルスを含むＲＮＡウイルスにさらに適用可能である。ｓｓＲＮＡプラス鎖ウイルスはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）を含む。好ましい実施形態において、本発明は、フィロウイルスを含むモノネガウイルス目に適用可能である。フィロウイルスは、エボラウイルス及びマールブルグウイルスをさらに含む。
【００６８】
その他のＲＮＡウイルスは、エンテロウイルス、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス及びＡ型肝炎ウイルス等のピコルナウイルス、ノーウォーク様ウイルスを含むカリチウイルス属、狂犬病ウイルスを含むラブドウイルス、アルファウイルス、セムリキ森林熱ウイルス、デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス及び風疹ウイルスを含むトガウイルス、Ａ、Ｂ及びＣ型インフルエンザウイルスを含むオルトミクソウイルス、リフトバレー熱ウイルス及びハンタウイルスを含むブンヤウイルス属、エボラウイルス及びマールブルグウイルス等のフィロウイルス、並びにムンプスウイルス及び麻疹ウイルスを含むパラミクソウイルスを含む。治療できる付加的なウイルスは、ヘルペスウイルスを含む。
【００６９】
本発明の好ましい実施形態に従う好ましい局面において、ウイルス感染はレトロイドウイルスによって引き起こされる。
【００７０】
本発明の好ましい実施形態に従う別の好ましい局面において、ウイルス感染はＲＮＡウイルスによって引き起こされる。
【００７１】
本発明の好ましい実施形態に従うさらなる好ましい局面において、ウイルス感染はエンベロープウイルスによって引き起こされる。
【００７２】
本発明の好ましい実施形態に従うまた別の好ましい局面において、ウイルス感染は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、特にＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２によって引き起こされる。
【００７３】
本発明の好ましい実施形態に従うまたさらなる好ましい局面において、ウイルス感染はエボラウイルスによって引き起こされる。
【００７４】
本発明の好ましい実施形態に従うまた別の好ましい局面において、ウイルス感染はＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）によって引き起こされる。
【００７５】
本発明の好ましい実施形態に従うまた別の好ましい局面において、ウイルス感染はＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）によって引き起こされる。
【００７６】
本発明の好ましい実施形態に従うまた別の好ましい局面において、ウイルス感染は、ＨＴＬＶ１型（ＨＴＬＶ−１）等のヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）によって引き起こされる。
【００７７】
本発明の最も好ましい実施形態において、ウイルス感染、好ましくはＨＩＶウイルスによって引き起こされるウイルス感染の治療のために使用される化合物は、本明細書において、化合物１、２及び５として特定される化合物である。
【００７８】
別の最も好ましい実施形態において、本発明は、薬学的に許容される担体と一般式Ｉのピリミジン誘導体とを含む、神経学的状態、障害又は疾患の治療のための医薬組成物を提供する。好ましい実施形態において、化合物は、医薬組成物の好ましい実施形態において上記で定義された通りである。
【００７９】
さらに別の態様において、本発明は、神経学的状態、障害又は疾患に罹患している患者の治療のための方法であって、上記一般式Ｉの少なくとも１種のピリミジン誘導体の有効量を、該患者に投与するステップを含む上記方法に関する。
【００８０】
本発明によれば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ピック病、脳血管疾患、うつ病又は統合失調症を含むがこれらに限定されない、任意の神経学的状態、障害又は疾患を、式Ｉの化合物によって治療することができる。
【００８１】
本発明の好ましい実施形態に従う好ましい局面において、神経疾患はアルツハイマー病である。この局面によれば、本発明は、細胞中におけるアミロイドポリペプチド産生を阻害する方法であって、ヒトポリペプチド又はタンパク質のユビキチンリガーゼ活性を阻害する小分子作用物質を投与するステップを含み、該小分子化合物が、上記式Ｉのピリミジン誘導体である、上記方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、細胞中におけるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の輸送を阻害する方法であって、小分子によってポリペプチドのユビキチンリガーゼ活性を阻害するステップを含み、該小分子化合物が、式Ｉのピリミジン誘導体である、上記方法を提供する。
【００８２】
本発明に従って使用するための医薬組成物は、１種又は複数の生理学的に許容される担体又は賦形剤を使用して、従来の方式で配合することができる。したがって、化合物並びにその生理学的に許容される塩及び溶媒和物は、全身及び局所又は限局投与を含む多種多様な投与経路による投与のために、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｅａｄｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ペンシルバニア州において記述されている通りの従来の方法によって配合することができる。
【００８３】
全身投与には、筋肉内、静脈内、腹腔内及び皮下を含む注射が好ましい。注射のために、本発明の化合物を、溶液中、好ましくは、ハンクス液又はリンゲル液等の生理学的に適合する緩衝液中に配合することができる。加えて、化合物を固体形態で配合し、使用直前に再溶解又は懸濁してもよい。凍結乾燥形態も含まれる。
【００８４】
経口投与のために、医薬組成物は、例えば、結合剤、増量剤（例えば、ラクトース、微結晶セルロース又はリン酸水素カルシウム）、滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク又はシリカ）、崩壊剤（例えば、バレイショデンプン又はデンプングリコール酸ナトリウム）又は湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）等の薬学的に許容される賦形剤とともに従来の手段によって調製された錠剤又はカプセルの形態をとり得る。錠剤は、当該技術分野において既知の方法によってコーティングすることができる。経口投与用の液体製剤は、例えば、溶液、シロップ又は懸濁液の形態をとってもよく、又は使用前の水若しくは他の適切なビヒクルによる構築のために乾燥生成物として提示してもよい。そのような液体製剤は、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体又は水素化可食性油脂）、乳化剤（例えば、レシチン又はアカシア）、非水性ビヒクル（例えば、アチオンド（ａｔｉｏｎｄ）油、油性エステル、エチルアルコール又は分画した植物油）、及び保存料（例えば、メチル若しくはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエート又はソルビン酸）等の薬学的に許容される添加物とともに従来の手段によって調製することができる。製剤は、必要に応じて、緩衝塩、香味剤、着色剤及び甘味剤を含有してもよい。
【００８５】
経口投与用の製剤は、活性化合物の制御放出を行うよう、適切に配合することができる。口腔投与のために、組成物は、従来の方式で配合された錠剤又は舐剤の形態をとり得る。吸入による投与のために、本発明に従って使用するための化合物は、適切な推進剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の適切なガスを使用することにより、加圧パック又はネブライザーからのエアゾールスプレー提示の形態で好都合に送達される。加圧エアゾールの場合、用量単位は、計測量を送達するための弁を設けることによって決定することができる。吸入器又は注入器において使用するための、例えばゼラチンのカプセル及び薬包は、化合物とラクトース又はデンプン等の適切な粉末基剤との混合粉体を含有させて配合することができる。
【００８６】
化合物を、注射、例えばボーラス注射又は持続注入による非経口投与用に配合することができる。注射用の配合物は、保存料を添加した単位剤形、例えば、アンプル又は複数用量容器で提示してよい。組成物は、油性又は水性ビヒクル中の懸濁液、溶液又はエマルション等の形態をとってよく、懸濁化剤、安定化剤及び／又は分散剤等の製剤化剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔｓ）を含有し得る。代替として、有効成分は、使用前の適切なビヒクル、例えば無菌パイロジェンフリー水による構築のための粉末形態であってよい。
【００８７】
化合物を、例えばココアバター又は他のグリセリド類等の従来の坐薬基剤を含有する、坐薬又は停留浣腸等の直腸組成物中に配合してもよい。
【００８８】
前述の配合物に加えて、化合物をデボー製剤として配合してもよい。そのような長時間作用型配合物は、移植（例えば、皮下又は筋肉内に）又は筋肉内注射によって投与することができる。したがって、例えば、化合物を、適切なポリマー若しくは疎水性材料（例えば、許容される油中のエマルションとして）又はイオン交換樹脂とともに、或いは難溶性誘導体として、例えば難溶性塩として配合することができる。
【００８９】
全身投与は、経粘膜的又は経皮的手段によるものであってもよい。経粘膜又は経皮投与には、障壁に浸透するのに適した浸透剤が配合物中に使用される。そのような浸透剤は、当該技術分野において概して既知であり、例えば、経粘膜投与のために胆汁塩及びフシジン酸誘導体を含む。加えて、浸透を容易にするために界面活性剤を使用してもよい。経粘膜投与は、鼻腔用スプレーによるものであっても坐薬を使用するものであってもよい。局所投与のために、本発明の化合物は、当該技術分野において概して既知であるように、軟膏、塗擦剤、ゲル又はクリーム中に配合される。外傷又は炎症を治療して治癒を加速させるために、洗浄液を局所的に使用してよい。
【００９０】
組成物は、必要に応じて、有効成分を含有する１種又は複数の単位剤形を収容し得るパック又はディスペンサー装置に入れて提示してよい。パックは、例えば、ブリスターパック等、金属又はプラスチック箔を含み得る。パック又はディスペンサー装置には、投与の指示書が添付されている場合がある。
【００９１】
ＰＯＳＨは、ＰＯＳＨポリペプチド又はＰＯＳＨ−ＡＰポリペプチドのレベル及び／又は活性に影響を及ぼすことによって操作することができる広範な主要細胞機能と交わり、それらを制御する。ＰＯＳＨ、特にヒトＰＯＳＨの多くの特徴は、ＰＣＴ特許公報ＷＯ０３／０９５９７１Ａ２及びＷＯ０３／０７８６０１Ａ２において記述されており、その教示は参照により本明細書に組み込まれる。
【００９２】
上記で参照した刊行物に記述されている通り、天然ヒトＰＯＳＨは、ＲＩＮＧドメイン及び４つのＳＨ３ドメインを含有する大きなポリペプチドである。ＰＯＳＨはユビキチンリガーゼ（「Ｅ３」酵素とも称される）であり、ＲＩＮＧドメインは、例えばＰＯＳＨポリペプチド自体のユビキチン化を媒介する。ＰＯＳＨは、多数のタンパク質と相互作用し、多数の異なる生物学的過程に関係する。本開示において実証されているように、ＰＯＳＨは、細胞中の多数の異なるタンパク質に関連している。ＰＯＳＨは、トランスゴルジ網内に位置することが知られているタンパク質と共局在化し、ＰＯＳＨが分泌系におけるタンパク質の輸送に関係していることを暗示している。「分泌系」という用語は、膜区画及び関連タンパク質、並びに、翻訳部位から、液胞内の位置、分泌経路自体、リソソーム若しくはエンドソーム内の区画、又は原形質膜若しくは細胞外の位置への、タンパク質の移動に関与する他の分子を指すものとして理解すべきである。分泌系における区画の通例引用される例は、小胞体、ゴルジ体並びにシス及びトランスゴルジ網を含む。
【００９３】
加えて、出願人らは、ホスホリパーゼＤ、ＨＩＶ  Ｇａｇ、ＨＩＶ  Ｎｅｆ、Ｒａｐｓｙｎ及びＳｒｃを含む多種多様なタンパク質の正常な分泌、局在化又は処理に、ＰＯＳＨが必要であることを実証した。これらのタンパク質の多くはミリストイル化されており、これは、ミリストイル化タンパク質の処理及び正常な局在化において、ＰＯＳＨが一般的役割を担っていることを示している。したがって、いくつかの態様において、ＰＯＳＨは、ミリストイル化タンパク質の処理及び正常な局在化において役割を担い得る。Ｎ−ミリストイル化は、ミリスチン酸塩、炭素数１４の炭素飽和脂肪酸の、タンパク質のＮ−末端グリシンとの共有結合をもたらすアシル化過程である（Ｆａｒａｚｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６、３９５０１〜０４（２００１））。Ｎ−ミリストイル化は共翻訳的に発生し、弱く可逆的なタンパク質−膜相互作用を促進する。ミリストイル化タンパク質は、細胞質中及び膜と関連付けられている状態の両方で見られる。膜結合性はタンパク質の立体配置に依存する、すなわち、ミリストイル基の表面接触性は、リン酸化、ユビキチン化等のタンパク質修飾によって制御することができる。本出願におけるミリストイル化タンパク質の細胞内輸送の調節は、これらの修飾タンパク質の輸送及び局在化に対する効果を含む。
【００９４】
「Ｅ１」はユビキチン活性化酵素である。好ましい実施形態において、Ｅ１は、ユビキチンをＥ２へ移行することができる。好ましい実施形態において、Ｅ１はユビキチンと高エネルギーチオールエステル結合を形成し、それによってユビキチンを「活性化する」。「Ｅ２」はユビキチン担体酵素（ユビキチン抱合酵素としても知られる）である。好ましい実施形態において、ユビキチンはＥ１からＥ２へ移行される。好ましい実施形態において、移行は、Ｅ２とユビキチンとの間に形成されるチオールエステル結合をもたらす。好ましい実施形態において、Ｅ２は、ユビキチンをＰＯＳＨポリペプチドへ移行することができる。
【００９５】
いくつかの実施形態において、同定される本発明の作用物質は、ウイルス成熟に場合によって干渉する抗ウイルス剤であり、ここで、好ましくは、ウイルスはレトロイドウイルス、ＲＮＡウイルス及びエンベロープウイルスである。
【００９６】
いくつかの好ましい実施形態において、抗ウイルス剤は、ＰＯＳＨのユビキチンリガーゼ（触媒）活性（例えば、ＰＯＳＨ自己ユビキチン化又は標的タンパク質への移行）に干渉する。
【００９７】
付加的ないくつかの好ましい実施形態において、抗ウイルス剤は、ＰＯＳＨとＰＯＳＨ−ＡＰ（アダプター）ポリペプチドとの間の相互作用に干渉し、例えば、抗ウイルス剤は、ＰＯＳＨポリペプチドと、別のＰＯＳＨポリペプチド（ＰＯＳＨ二量体の場合と同様に、２種の異なるＰＯＳＨポリペプチドのヘテロ二量体、ホモ多量体及びヘテロ多量体）；ＧＴＰアーゼ（例えば、Ｒａｃ、Ｒａｃ１、Ｒｈｏ、Ｒａｓ）；Ｅ２酵素及びユビキチン、又は場合によって、カリン；クラスリン；ＡＰ−１；ＡＰ−２；ＨＳＰ７０；ＨＳＰ９０、Ｂｒｃａ１、Ｂａｒｄ１、Ｎｅｆ、ＰＡＫ１、ＰＡＫ２、ＰＡＫファミリー、Ｖａｖ、Ｃｄｃ４２、ＰＩ３Ｋ（例えば、ｐ８５又はｐ１１０）、Ｎｅｄｄ４、ｓｒｃ（ｓｒｃファミリー）、Ｇａｇ、特にＨＩＶ  Ｇａｇ（例えば、ｐ１６０）、Ｔｓｇ１０１、ＶＡＳＰ、ＲＮＢ６、ＷＡＳＰ、Ｎ−ＷＡＳＰ及びＳｐｒｅｄ−２と同様のＫＩＡＡ０６７４、並びに、いくつかの実施形態において、クラスリン被覆小胞に関連していることが知られているタンパク質、及び／又はタンパク質選別経路（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｏｒｔｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ）に関与するタンパク質等、ＰＯＳＨ−ＡＰポリペプチドとの間の相互作用を妨害又は不可逆にすることができる。
【００９８】
さらに付加的な実施形態において、本発明の作用物質は、ＰＯＳＨポリペプチドとＲａｃタンパク質との間の相互作用を場合によって妨害する、Ｒａｃ又はＲａｓ等のＧＴＰアーゼのシグナル伝達に干渉する。
【００９９】
いくつかの実施形態において、本発明の作用物質は、ＰＯＳＨのユビキチンリガーゼ活性を調節し、これを使用して、ユビキチンリガーゼ活性に関連するいくつかの疾患を治療することができる。
【０１００】
その他いくつかの実施形態において、本発明は、ＰＯＳＨポリペプチドのユビキチン関連活性を減少させる作用物質を、同定、最適化又は評価するためのアッセイを開示する。ＰＯＳＨポリペプチドのユビキチン関連活性は、概してＥ２酵素からＰＯＳＨポリペプチドへのユビキチンの移行を伴うＰＯＳＨポリペプチドの自己ユビキチン化活性と、概してＰＯＳＨポリペプチドから標的タンパク質へのユビキチンの移行を伴う標的タンパク質（例えば、ＨＥＲＰＵＤ１）のユビキチン化とを含み得る。いくつかの実施形態において、ＰＯＳＨ活性は、少なくとも部分的に、ＰＯＳＨ  ＲＩＮＧドメインによって媒介される。
【０１０１】
さらに他のいくつかの実施形態において、アッセイは、ＰＯＳＨポリペプチド、Ｅ２ポリペプチド及びユビキチン源（ユビキチンと予め複合体を形成したＥ２ポリペプチドであってよい）を含む混合物を形成することを含む。場合によって、混合物はＥ１ポリペプチドを含み、場合によって、混合物は、例えばＨＥＲＰＵＤ１等の標的ポリペプチドを含む。混合物の付加的な構成要素は、ＰＯＳＨポリペプチドのユビキチン化と一致する条件を提供するように選択してよい。ＰＯＳＨ−ユビキチン抱合体、Ｅ２−ユビキチンチオエステル、遊離ユビキチン及び標的ポリペプチド−ユビキチン複合体等、多種多様なパラメータのうちの１つ又は複数を検出することができる。
【０１０２】
「検出する」という用語は、本明細書において、検出対象（例えば、ＰＯＳＨ−ユビキチン、Ｅ２−ユビキチン等）の有無の判断、検出対象の量の定量的計測、又は、他のパラメータの検出に基づく、検出対象の有無若しくは量の数値計算を含むように使用される。「検出する」という用語は、検出対象が不在又は感度レベル未満であると判断される事態を含む。検出は、標識（例えば、蛍光標識、放射性同位元素標識及びその他後述のもの）の検出、サイズによる分解能及び同定（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、質量分析）、精製及び検出、並びに、本明細書に照らして当業者に利用可能な他の方法を含み得る。例えば、放射性同位元素標識化は、シンチレーション計数、又は写真乳剤に対する暴露後の密度測定、又はホスフォイメージャー等の装置を使用することによって計測することができる。同様に、密度測定を使用して、酵素標識が使用される場合に不透明な生成物を生成する酵素標識基質との反応後、結合したユビキチンを計測することができる。好ましい実施形態において、アッセイは、ＰＯＳＨ−ユビキチン抱合体を検出することを含む。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、アッセイは、ＰＯＳＨポリペプチド、標的ポリペプチド及びユビキチン源（ユビキチンと予め複合体を形成したＰＯＳＨポリペプチドであってよい）を含む混合物を形成することを含む。場合によって、混合物はＥ１及び／又はＥ２ポリペプチドを含み、場合によって、混合物はＥ２−ユビキチンチオエステルを含む。混合物の付加的な構成要素は、標的ポリペプチドのユビキチン化と一致する条件を提供するように選択してよい。ＰＯＳＨ−ユビキチン抱合体及び標的ポリペプチド−ユビキチン抱合体等、多種多様なパラメータのうちの１つ又は複数を検出することができる。好ましい実施形態において、アッセイは、例えばユビキチン化ＨＥＲＰＵＤ１を検出すること等、標的ポリペプチド−ユビキチン抱合体を検出することを含む。別の好ましい実施形態において、アッセイは、ＰＯＳＨ−ユビキチン抱合体を検出することを含む。
【０１０４】
上述のアッセイは、ＰＯＳＨポリペプチドのユビキチン関連活性を調節する作用物質を同定するためのスクリーニングアッセイにおいて使用することができる。スクリーニングアッセイは、概して、上記アッセイのうちの１つ、又はＰＯＳＨポリペプチドのユビキチン関連活性を評価するように設計されたその他任意のアッセイに、試験作用物質を添加することを伴う。スクリーニングアッセイにおいて検出されたパラメータ（複数可）を、適切な基準と比較することができる。適切な基準は、試験作用物質を省略し、前に、並行して又は後に行ったアッセイであってよい。適切な基準は、試験作用物質の不在下における先行計測の平均であってもよい。概して、スクリーニングアッセイ混合物の構成要素は、評価される全体の活性と一致する任意の順序で添加してよいが、いくつかの変形形態が好ましい場合がある。例えば、いくつかの実施形態において、試験作用物質及びＥ３（例えば、ＰＯＳＨポリペプチド）をプレインキュベートした後、試験作用物質を除去し、他の構成要素を添加してアッセイを完了することが望ましい場合がある。このようにして、作用物質単独でのＰＯＳＨポリペプチドに対する効果を評価することができる。いくつかの好ましい実施形態において、抗ウイルス剤のスクリーニングアッセイでは、Ｌドメイン、好ましくはＨＩＶ  Ｌドメインを含む標的ポリペプチドを用いる。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、アッセイはハイスループットフォーマットで実施される。例えば、混合物の構成要素のうちの１つを固体基質に付着させてよく、他の構成要素のうちの１つ又は複数を標識化する。例えば、ＰＯＳＨポリペプチドを９６ウェルプレート等の表面に付着させてよく、ユビキチンを溶液中に入れて標識化する。Ｅ２及びＥ１も溶液中に入れ、固体表面を洗浄して複合体を形成していない標識ユビキチンを除去し、結合したままのユビキチンを検出することにより、ＰＯＳＨ−ユビキチン抱合体形成を計測することができる。他の変形形態を使用してもよい。例えば、溶液中のユビキチンの量を検出することができる。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、ユビキチン複合体の形成は、ＦＲＥＴ等の相互作用技術によって計測することができ、この技術においては、ユビキチンを第１の標識で標識化し、所望の複合体パートナー（例えば、ＰＯＳＨポリペプチド又は標的ポリペプチド）を第２の標識で標識化し、ここで、第１及び第２の標識は、両者が近接した際に相互作用して変性シグナルを生成する。ＦＲＥＴにおいて、第１及び第２の標識は蛍光色素分子である。ＦＲＥＴについては以下でさらに詳細に記述する。ポリユビキチン複合体の形成は、ポリユビキチンの形成時に相互作用する別個に標識化されたユビキチンの２つ以上のプールを混合することによって実施することができる（例えば、米国特許出願公開第２００２／００４２０８３号を参照）。ハイスループットスクリーニングは、同じく溶液中で、ＦＲＥＴ等の相互作用アッセイを実施することによって実現できる。加えて、ＰＯＳＨポリペプチド又は標的ポリペプチド等、混合物中のポリペプチドが容易に精製可能である（例えば、特異抗体、又はビオチン、ＦＬＡＧ、ポリヒスチジン等のタグによって）場合、反応を溶液中で実施し、タグ付きポリペプチドを、そのタグ付きポリペプチドに関連するユビキチン等の任意のポリペプチドとともに、迅速に単離することができる。検出のためにＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質を分解することもできる。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、ユビキチンは、直接又は間接的に標識化される。これは、一般に、連結したユビキチンの簡単且つ迅速な検出及び計測を可能にし、アッセイをハイスループットスクリーニング用途のために有用なものとしている。上述の通り、いくつかの実施形態では、１種又は複数のタグ付き又は標識タンパク質を用い得る。「タグ」は、タグ付きポリペプチドの迅速な単離を容易にする部分を含むことが意図されている。タグを使用して、ポリペプチドの、表面への結合を容易にすることができる。「標識」は、標識ポリペプチドの迅速な検出を容易にする部分を含むことが意図されている。いくつかの部分は、標識及びタグの両方として使用することができる（例えば、十分に特徴付けされた抗体によって容易に精製及び検出されるエピトープタグ）。ポリペプチドのビオチン化はよく知られており、例えば、タンパク質、核酸、炭水化物、カルボン酸のビオチン化のためのアミン反応剤及びチオール反応剤を含む多数のビオチン化剤が知られている（参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｃａｔａｌｏｇ、Ｈａｕｇｌａｎｄ、第６版、１９９６の第４章を参照）。ビオチン化基質は、アビジン又はストレプトアビジンを介してビオチン化された構成要素と結合することができる。同様に、多数のハプテン化試薬も既知である。
【０１０８】
代替的な実施形態において、ＰＯＳＨポリペプチド、Ｅ２又は標的ポリペプチドは、場合によってタグの援助により、ビーズと結合される。連結後、ビーズは結合していないユビキチンから分離され、結合したユビキチンを計測することができる。好ましい実施形態において、ＰＯＳＨポリペプチドはビーズと結合し、使用される組成物は標識ユビキチンを含む。この実施形態において、結合したユビキチンを持つビーズは、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）マシンを使用して分離することができる。そのような使用のための方法は、米国特許出願第０９／０４７，１１９号において記述されており、該出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。その後、結合したユビキチンの量を計測することができる。
【０１０９】
スクリーニングアッセイにおいて、試験作用物質の効果は、例えば、反応の動態、定常状態及び／又は終点における試験作用物質の効果を評価することにより、評価できる。
【０１１０】
本明細書において提供される種々のアッセイ混合物の構成要素は、種々の量で組み合わせてよい。好ましい実施形態において、ユビキチン（又はＥ２複合体形成ユビキチン）は、反応溶液１００マイクロリットル当たり５〜２００ｎｇの最終濃度で使用される。場合によって、Ｅ１は、反応溶液１００マイクロリットル当たり１〜５０ｎｇの最終濃度で使用される。場合によって、Ｅ２は、反応溶液１００マイクロリットル当たり１０〜１００ｎｇ、より好ましくは、反応溶液１００マイクロリットル当たり１０〜５０ｎｇの最終濃度で使用される。好ましい実施形態において、ＰＯＳＨポリペプチドは、反応溶液１００マイクロリットル当たり１ｎｇ〜５００ｎｇの最終濃度で使用される。
【０１１１】
概して、アッセイ混合物は、ユビキチンリガーゼ活性及び／又はユビキチン化活性を支持するように調製される。概して、これは、５０〜２００ｍＭの塩（例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ）、５乃至９、好ましくは６乃至８のｐＨ等、生理的条件となる。そのような条件は、試行錯誤によって最適化することができる。インキュベーションは、最適活性を容易にする任意の温度、一般に４乃至４０℃で実施することができる。インキュベーション期間は、最適活性のために選択されるが、ハイスループットスクリーニングを容易にするために最適化することもできる。一般に、０．５乃至１．５時間で十分であろう。
【０１１２】
多種多様な他の試薬を組成物中に含んでよい。これらは、最適ユビキチン化酵素活性を容易にし、且つ／又は非特異的若しくはバックグラウンド相互作用を低減するために使用することができる、塩、溶媒、緩衝液、中性タンパク質、例えばアルブミン、界面活性剤等のような試薬を含む。
【０１１３】
プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤等、アッセイの効率を別の手法で向上させる試薬を使用してもよい。組成物は、好ましくは、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）も含む。
【０１１４】
構成要素の混合物は、ユビキチンリガーゼ活性を促進する、又は候補調節物質の効果の同定を最適化する任意の順序で添加してよい。好ましい実施形態において、ユビキチンが反応緩衝液中に提供された後、ユビキチン化酵素を添加する。代替的な好ましい実施形態において、ユビキチンが反応緩衝液中に提供され、その後、候補調節物質を添加した後、ユビキチン化酵素活性を添加する。
【０１１５】
概して、ＰＯＳＨユビキチン関連活性を減少させる試験作用物質を使用して、ＰＯＳＨ機能をインビボで阻害することができる。試験作用物質は、例えばエステル等の疎水性部分の添加により、インビボでの使用のために修飾してよい。
【０１１６】
本発明のいくつかの実施形態は、ＰＯＳＨポリペプチド若しくはＨＥＲＰＵＤ１等のＰＯＳＨ−ＡＰ、又は場合によって、ＳＨ３若しくはＲＩＮＧドメイン等のＰＯＳＨの特定のドメインと結合する作用物質を同定するためのアッセイに関する。好ましい実施形態において、ＰＯＳＨポリペプチドは、ｈＰＯＳＨの第４のＳＨ３ドメイン（記述されている通り、配列番号３０）を含むポリペプチドである。この目的のために、標識インビトロタンパク質−タンパク質結合アッセイ、電気泳動移動度シフトアッセイ、タンパク質結合の免疫測定等を含む幅広い種類のアッセイを使用することができる。精製タンパク質は、分子間相互作用及び試験作用物質の設計をモデル化するために使用され得る、三次元結晶構造の測定のために使用してもよい。一実施形態において、アッセイは、１個又は複数の対象ＰＯＳＨポリペプチドの、ＰＯＳＨ−ＡＰとの相互作用を阻害する作用物質を検出する。別の実施形態において、アッセイは、酵素活性、他の細胞構成要素との結合、細胞区画化等、ＰＯＳＨポリペプチド又はＰＯＳＨ複合体の内因性生物活性を調節する作用物質を検出する。
【０１１７】
一態様において、本発明は、ＰＯＳＨポリペプチド又はＨＥＲＰＵＤ１等のＰＯＳＨ−ＡＰの機能に干渉する組成物の同定のための方法及び組成物を提供する。ウイルス生成におけるＰＯＳＨポリペプチドの役割を考慮すると、ＰＯＳＨポリペプチドと、ＰＯＳＨ−ＡＰ、特にウイルスタンパク質を含むＰＯＳＨ複合体等、相互作用するタンパク質との間のタンパク質−タンパク質相互作用の形成又は安定性を混乱させる組成物は、ウイルス感染の治療のための候補医薬品である。
【０１１８】
機序に拘束されることは望まないが、ＰＯＳＨポリペプチドは、ビリオンの放出及び他の生物学的過程において重要なタンパク質複合体の会合を促進すると仮定される。本発明の複合体は、ＰＯＳＨポリペプチドと、下記ＰＯＳＨ−ＡＰのうちの１種又は複数との組合せを含み得る：ＰＯＳＨ−ＡＰ；ＰＯＳＨポリペプチド（ＰＯＳＨ二量体の場合と同様に、２種の異なるＰＯＳＨのヘテロ二量体、ホモ多量体及びヘテロ多量体）；Ｖｐｕ；Ｃｂｌ−ｂ；ＰＫＡ；ＵＮＣ８４；ＭＳＴＰ０２８；ＨＥＲＰＵＤ１；ＧＯＣＡＰ１；ＰＴＰＮ１２；ＥＩＦ３Ｓ３；ＳＡＲ１；ＧＯＳＲ２；ＲＡＬＡ；ＳＩＡＨ；ＳＭＩＮ１；ＳＭＮ２；ＳＹＮＥ１；ＴＴＣ３；ＶＣＹ２ＩＰ１；ＳＡＭ６８；ｇａｇ−ｐｏｌ；ＧＴＰアーゼ；Ｅ２酵素；ユビキチン、又は場合によって、カリン；クラスリン；ＡＰ−１；ＡＰ−２；ＨＳＰ７０；ＨＳＰ９０、Ｂｒｃａ１、Ｂａｒｄ１、Ｎｅｆ、ＰＡＫ１、ＰＡＫ２、ＰＡＫファミリー、Ｖａｖ、Ｃｄｃ４２、ＰＩ３Ｋ（例えば、ｐ８５又はｐ１１０）、Ｎｅｄｄ４、ｓｒｃ（ｓｒｃファミリー）、Ｔｓｇ１０１、ＶＡＳＰ、ＲＮＢ６、ＷＡＳＰ、Ｎ−ＷＡＳＰ、Ｇａｇ、特にＨＩＶ  Ｇａｇ（例えば、ｐ１６０）；及びＳｐｒｅｄ−２と同様のＫＩＡＡ０６７４、並びに、いくつかの実施形態において、クラスリン被覆小胞に関連していることが知られているタンパク質、及び／又はタンパク質選別経路に関与するタンパク質。
【０１１９】
ＰＯＳＨポリペプチドによって形成される複合体の種類は、タンパク質中に存在するドメインに依存することになる。限定を意図するものではないが、潜在的な相互作用タンパク質の例示的なドメインを以下に提供する。ＲＩＮＧドメインは、カリン、Ｅ２酵素、ＡＰ−１、ＡＰ−２及び／又はユビキチン化のための基質（例えば、一部の事例では、ＨＩＶ  ｐ１６０等、Ｇａｇ  Ｌドメイン又はＧａｇ−Ｐｏｌ等のＧａｇポリペプチドを含むタンパク質）と相互作用することが期待される。ＳＨ３ドメインは、Ｇａｇ  Ｌドメイン及びＷＯ０３／０９５９７１において開示されている通りの配列モチーフを有する他のタンパク質と相互作用することができ、その教示は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２０】
抗ウイルス剤のための好ましいアッセイにおいて、試験作用物質は、ＰＯＳＨポリペプチドと、Ｒａｃポリペプチド、特にＲａｃ１等のヒトＲａｃポリペプチドとの複合体の形成を妨害又は阻害するためのその能力について評価される。
【０１２１】
多種多様なアッセイフォーマットが十分なものとなるが、当業者であれば、本開示を踏まえて、本明細書には明示的に記述されていないものも理解するであろう。タンパク質複合体の形成、酵素活性、及びさらにはＰＯＳＨポリペプチド介在性膜再組織化若しくは小胞形成活性等の条件に近似するアッセイフォーマットは、多くの異なる形態で生み出すことができ、無細胞系、例えば精製タンパク質又は細胞溶解物に基づくアッセイ、並びに完全な細胞を利用する細胞ベースのアッセイを含む。単純な結合アッセイを使用して、ＰＯＳＨと結合する作用物質を検出することもできる。そのような結合アッセイは、ＰＯＳＨポリペプチドとＰＯＳＨ相互作用タンパク質との間の相互作用、又はＰＯＳＨポリペプチド若しくは複合体の基質との結合を妨害することによって作用する作用物質を同定することもできる。試験される作用物質は、例えば、細菌、酵母菌又は他の有機体によって生成（例えば、天然物）、化学的に生成（例えば、ペプチド模倣薬を含む小分子）又は組み換えによって生成することができる。好ましい実施形態において、試験作用物質は、約２，０００ダルトン未満の分子量を有する、例えばペプチド又はオリゴヌクレオチド以外の有機小分子である。
【０１２２】
化合物及び天然抽出物のライブラリーを試験する多くの薬物スクリーニングプログラムにおいて、一定期間中に調査される化合物の数を最大化するために、ハイスループットアッセイが望ましい。精製若しくは半精製タンパク質又は溶解物によって開発し得るもの等、無細胞系中で実施される本発明のアッセイは、多くの場合、試験化合物によって媒介される分子標的中における変性の迅速な発展及び比較的簡単な検出を可能にするために作成することができる「一次」スクリーニングとして好ましい。さらに、試験化合物の細胞毒性及び／又はバイオアベイラビリティの効果は、インビトロ系においては概して無視することができ、アッセイは、代わりに、他のタンパク質との結合親和性の変性又は分子標的の酵素的性質の変化において明らかになり得るような、分子標的に対する薬物の効果に主として焦点を合わせている。
【０１２３】
本アッセイの好ましい実施形態において、再構築ＰＯＳＨ複合体は、少なくとも半精製されたタンパク質の再構築混合物を含む。半精製とは、再構築混合物中で利用されるタンパク質が、他の細胞タンパク質又はウイルスタンパク質から予め分離されていることを意味する。例えば、細胞溶解物とは対照的に、ＰＯＳＨ複合体形成に関与するタンパク質は、混合物中のその他すべてのタンパク質に対して少なくとも５０％の純度まで混合物中に存在し、より好ましくは、９０〜９５％の純度で存在する。主題の方法のいくつかの実施形態において、再構築タンパク質混合物は、再構築混合物が実質的に他のタンパク質を欠いているような高度に精製されたタンパク質（細胞又はウイルス起源のもの等）を混合することによって導出され、これが、ＰＯＳＨ複合体会合及び／又は分解を計測するための能力に干渉又はそれを変性させる。
【０１２４】
候補阻害剤の存在下及び不在下におけるＰＯＳＨ複合体のアッセイは、反応物質を収容するのに適した任意の容器中で遂行することができる。例として、マイクロタイタープレート、試験管及びマイクロ遠心管がある。
【０１２５】
本発明の一実施形態において、ＰＯＳＨ複合体の会合又は安定性に干渉するその能力に基づいて、阻害剤を検出する薬物スクリーニングアッセイを作成することができる。例示的な結合アッセイにおいて、対象とする化合物を、ＰＯＳＨポリペプチド及び少なくとも１種の相互作用ポリペプチドを含む混合物と接触させる。ＰＯＳＨ複合体の検出及び定量化は、２種のポリペプチド間の相互作用を阻害する際の化合物の効能を測定するための手段を提供する。化合物の効能は、種々の濃度の試験化合物を使用して得られたデータから用量反応曲線を作成することによって評価できる。さらに、比較のためのベースラインを提供するために、対照アッセイを実施してもよい。対照アッセイにおいては、試験化合物の不在下で複合体の形成を定量化する。
【０１２６】
ＰＯＳＨポリペプチドと基質ポリペプチドとの間における複合体形成は、多種多様な技術によって検出することができ、事実上、その多くについて上述した。例えば、複合体の形成の調節は、検出可能に標識化されたタンパク質（例えば、放射性標識、蛍光標識又は酵素標識されたもの）を使用して、免疫測定又はクロマトグラフ検出によって定量化することができる。Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢ（Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）から入手可能なもの等の表面プラズモン共鳴システムを使用して、タンパク質−タンパク質相互作用を検出することもできる。
【０１２７】
多くの場合、複合体を形成していない形態の１個のタンパク質からの複合体の分離を容易にするために、ポリペプチドのうちの１個を固定化すること、並びにアッセイの自動化を適応させることが望ましいであろう。例示的な実施形態において、タンパク質が不溶性マトリックスと結合することを可能にするドメインを添加する、融合タンパク質を提供することができる。例えば、ＧＳＴ−ＰＯＳＨ融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）又はグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレートに吸着することができ、その後、これを、潜在的な相互作用タンパク質、例えば３５Ｓ−標識ポリペプチド及び試験化合物と組み合わせ、複合体形成を促す条件下でインキュベートする。インキュベーションに続いて、ビーズを洗浄して結合していない相互作用タンパク質をすべて除去し、マトリックスビーズ結合した放射性標識を直接（例えば、シンチラント（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）中にビーズを入れて）、又は複合体が解離した後、例えばマイクロタイタープレートを使用する場合は、上清中で測定する。代替として、結合していないタンパク質を洗い流した後、複合体をマトリックスから解離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって分離し、標準的な電気泳動技術を使用して、マトリックス結合した画分中に見られる相互作用ポリペプチドのレベルをゲルから定量化することができる。
【０１２８】
別の実施形態において、ＰＯＳＨポリペプチド及び潜在的な相互作用ポリペプチドを使用して、タンパク質の互いの結合を妨害する作用物質をその後に検出するための相互作用捕捉アッセイを生み出すことができる（米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓら（１９９３）、Ｃｅｌｌ、７２、２２３〜２３２；Ｍａｄｕｒａら（１９９３）、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２６８、１２０４６〜１２０５４；Ｂａｒｔｅｌら（１９９３）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１４、９２０〜９２４；及びＩｗａｂｕｃｈｉら（１９９３）、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、８、１６９３〜１６９６も参照）。
【０１２９】
本アッセイのまたさらなる実施形態において、ＰＯＳＨ複合体は、対象アッセイを支援するための細胞培養技術を活用して、全細胞中に生み出される。例えば、後述のように、ＰＯＳＨ複合体は、哺乳動物及び酵母細胞を含む真核細胞培養系中で構築することができる。多くの場合、そのような細胞中において、対象のＰＯＳＨポリペプチドとともに１個又は複数のウイルスタンパク質（例えば、Ｇａｇ又はＥｎｖ）を発現することが望ましいであろう。細胞を対象とするウイルスに感染させることが望ましい場合もある。完全な細胞中で対象アッセイを生み出すことの利点には、細胞内に侵入する作用物質の能力を含む、阻害剤の治療的使用が必要とし得る環境とより密接に近似した環境において機能的な阻害剤を検出する能力を含む。さらに、以下に挙げる例等、アッセイのインビボ実施形態のいくつかは、候補作用物質のハイスループット分析に適している。
【０１３０】
ＰＯＳＨ複合体の構成要素は、アッセイを支援するために選択される細胞に内在し得る。代替として、構成要素の一部又はすべては、外部源に由来するものであってよい。例えば、組み換え技術（発現ベクターの使用によるもの等）、並びに融合タンパク質自体を微量注入すること又は融合タンパク質をｍＲＮＡコードすることによって、融合タンパク質を細胞内に導入してよい。
【０１３１】
多くの実施形態において、細胞は、インキュベーション後に候補作用物質によって操作され、ＰＯＳＨ活性についてアッセイされる。いくつかの実施形態において、ＰＯＳＨ活性は、ウイルス様粒子の生成によって表される。本明細書において実証されている通り、ＰＯＳＨ活性を妨害する作用物質は、ウイルス様粒子の生成の減少を引き起こすことができる。いくつかの実施形態において、ＰＯＳＨ活性は、複合体形成、ユビキチン化及び膜融合イベント（例えば、ウイルス出芽の放出又は小胞の融合）を含むがこれらに限定されない。ＰＯＳＨ複合体形成は、共免疫沈降タンパク質の免疫沈降及び分析又は共精製タンパク質の親和性精製及び分析によって評価することができる。蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）ベースのアッセイを使用して、複合体形成を測定することもできる。互いに近接する正常な発光及び励起スペクトルを有する蛍光分子は、ＦＲＥＴを呈し得る。蛍光分子は、一方の分子（ドナー分子）の発光スペクトルが、他方の分子（アクセプタ分子）の励起スペクトルと重複するように選定される。ドナー分子は、ドナーの励起スペクトル内の適切な強度の光によって励起される。その後、ドナーは、吸収エネルギーを蛍光として放射する。それが生成する蛍光エネルギーを、アクセプタ分子によってクエンチする。ＦＲＥＴは、ドナーからの蛍光シグナルの強度の低減、その励起状態の寿命の低減及び／又はより長い波長（より低いエネルギー）特性のアクセプタにおける蛍光の再発光として現れる場合がある。蛍光タンパク質が物理的に分離すると、ＦＲＥＴ効果は漸減又は排除される（米国特許第５，９８１，２００号）。
【０１３２】
例えば、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）は、約４２５〜４５０ｎｍ波長の光によって励起され、４５０〜５００ｎｍの範囲の光を放射する。黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）は、約５００〜５２５ｎｍの光によって励起され、５２５〜５００ｎｍで光を放射する。これらの２種のタンパク質を溶液中に入れると、シアン及び黄色蛍光を別個に視覚化することができる。しかしながら、これらの２種のタンパク質を互いに近接させると、蛍光特性はＦＲＥＴによって変性される。ＣＦＰによって放射された青みを帯びた光は、ＹＦＰによって吸収され、黄色光として再放射される。これは、タンパク質が波長４５０ｎｍの光によって刺激されると、シアン放射光が大幅に低減し、通常この波長では刺激されない黄色光が大幅に増大することを意味する。ＦＲＥＴは、一般に、ドナーの励起範囲内の光による刺激に対応する放射光のスペクトルを計測し、ドナー放射光とアクセプタ放射光との比率を計算することによって、監視される。ドナー：アクセプタ発光比率が高い場合、ＦＲＥＴは発生しておらず、２種の蛍光タンパク質は近接していない。ドナー：アクセプタ発光比率が低い場合、ＦＲＥＴが発生しており、２種の蛍光タンパク質は近接している。このようにして、第１及び第２のポリペプチドの間の相互作用を計測することができる。
【０１３３】
ＦＲＥＴの発生は、ドナー蛍光部分の蛍光寿命減少も引き起こす。この蛍光寿命の変化は、蛍光寿命イメージング技術（ＦＬＩＭ）と称される技術を使用して計測することができる（Ｖｅｒｖｅｅｒら（２０００）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９０、１５６７〜１５７０；Ｓｑｕｉｒｅら（１９９９）、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｓｃ．、１９３、３６；Ｖｅｒｖｅｅｒら（２０００）、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．、７８、２１２７）。ＦＬＩＭデータを分析するためのグローバル分析技術が開発されている。これらのアルゴリズムは、ドナー蛍光部分が、それぞれ異なる蛍光寿命を持つ限定数の状態でのみ存在するという理解を使用する。各状態の定量マップを、ピクセル単位で生み出すことができる。
【０１３４】
ＦＲＥＴベースのアッセイを実施するために、ＰＯＳＨポリペプチド及び対象とする相互作用タンパク質をいずれも蛍光標識化する。適切な蛍光標識は、本明細書に照らして、当該技術分野において既知である。以下に例を提供するが、具体的に論じられていない適切な蛍光標識も当業者には利用可能である。蛍光標識化は、蛍光タンパク質、例えば、クラゲ、サンゴ及び他の腔腸動物から単離された蛍光タンパク質との融合タンパク質としてポリペプチドを発現させることによって遂行できる。例示的な蛍光タンパク質は、オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｉａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の多くの変異体を含む。変異体は、より明るくてもより薄暗くてもよく、又は異なる励起及び／若しくは発光スペクトルを有してもよい。いくつかの変異体は、もはや緑色には見えないように変性され、青色、シアン、黄色又は赤色に見える場合がある（それぞれ、ＢＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ及びＲＦＰと称される）。蛍光タンパク質は、例えば、ペプチド結合（例えば、融合タンパク質として発現）、化学的架橋及びビオチン−ストレプトアビジンカップリングを含む多種多様な共有及び非共有結合を介して、ポリペプチドと安定に結合することができる。蛍光タンパク質の例については、米国特許第５，６２５，０４８号；第５，７７７，０７９号；第６，０６６，４７６号；第６，１２４，１２８号；Ｐｒａｓｈｅｒら（１９９２）、Ｇｅｎｅ、１１１、２２９〜２３３；Ｈｅｉｍら（１９９４）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、９１、１２５０１〜０４；Ｗａｒｄら（１９８２）、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．、３５、８０３〜８０８；Ｌｅｖｉｎｅら（１９８２）、Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、７２Ｂ、７７〜８５；Ｔｅｒｓｉｋｈら（２０００）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９０、１５８５〜８８を参照されたい。
【０１３５】
当該技術分野において既知である他の例示的な蛍光部分は、フルオレセイン、ベンゾオキサジアゾール、クマリン、エオシン、ルシファーイエロー、ピリジルオキサゾール及びローダミンの誘導体を含む。これら及び他多くの例示的な蛍光部分は、そのような部分によってポリペプチドを修飾するための方法論とともに、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（２０００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）において見ることができる。蛍光部分と組み合わせた際に蛍光を発する例示的なタンパク質は、ビブリオ・フィシェリ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）由来の黄色蛍光タンパク質（Ｂａｌｄｗｉｎら（１９９０）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９、５５０９〜１５）、渦鞭毛藻シンビオジニウム種（Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．）由来のペリジニン−クロロフィルａ結合タンパク質（Ｍｏｒｒｉｓら（１９９４）、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２４、６７３、７７）、並びにシネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）等の海洋シアノバクテリア由来のフィコビリンタンパク質、例えばフィコエリスリン及びフィコシアニン（Ｗｉｌｂａｎｋｓら（１９９３）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８、１２２６〜３５）を含む。これらのタンパク質は、蛍光補助因子として、それぞれフラビン、ペリジニン−クロロフィルａ及び種々のフィコビリンを必要とする。
【０１３６】
ＦＲＥＴベースのアッセイは、細胞ベースのアッセイ及び無細胞アッセイにおいて使用することができる。ＦＲＥＴベースのアッセイは、蛍光活性化細胞選別及びマイクロタイターアレイの蛍光スキャニングを含むハイスループットスクリーニング法に適している。
【０１３７】
概して、スクリーニングアッセイが結合アッセイである場合（タンパク質−タンパク質結合、作用物質−タンパク質結合等であるか否かを問わず）、分子のうちの１個又は複数は標識に連結することができ、ここで、標識は、直接的又は間接的に検出可能なシグナルを提供することができる。種々の標識は、放射性同位元素、蛍光体（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｒ）、化学発光体（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒ）、酵素、特異的結合分子、粒子、例えば磁性粒子等を含む。特異的結合分子は、ビオチン及びストレプトアビジン、ジゴキシン及び抗ジゴキシン等の対を含む。特異的結合メンバーに関して、相補的メンバーは、通常、既知の手順に従って、検出を提供する分子によって標識化することができる。
【０１３８】
さらなる実施形態において、本発明は、治療的介入の標的を同定するための方法を提供する。ＰＯＳＨと相互作用する、又はＰＯＳＨ介在性過程（ウイルス成熟等）に関係するポリペプチドを使用して、候補治療薬を同定することができる。そのような標的は、例えば、抗ＰＯＳＨ抗体による免疫沈降、ハイスループット結合データのインシリコ分析、ツーハイブリッドスクリーニング、及び本明細書に記述されている又は本開示に照らして当該技術分野において既知である他のタンパク質−タンパク質相互作用アッセイにより、ＰＯＳＨ（ＰＯＳＨ−ＡＰ）と関連するタンパク質を同定することによって同定できる。そのような標的と結合する、又はそのタンパク質−タンパク質相互作用を妨害する、又はその生化学的活性を阻害する作用物質を、そのようなアッセイにおいて使用してよい。
【０１３９】
特に、酵母ツーハイブリッドスクリーニングは、ハイブリッドタンパク質を発現するキメラ遺伝子を利用する。例証するために、第１のハイブリッド遺伝子は、「ベイト」タンパク質、例えば、潜在的な相互作用タンパク質と結合するのに十分な長さのＰＯＳＨポリペプチドを表すコード配列とインフレームで融合することができる転写活性化因子のＤＮＡ結合ドメインのコード配列を含む。第２のハイブリッドタンパク質は、「フィッシュ」タンパク質、例えば、ベイト融合タンパク質のＰＯＳＨポリペプチド部分と相互作用するのに十分な長さの潜在的な相互作用タンパク質をコードする遺伝子とインフレームで融合した転写活性化ドメインをコードする。ベイト及びフィッシュタンパク質が相互作用し得る場合、例えば、ＰＯＳＨ複合体を形成することができる場合、これらのタンパク質は、転写活性化因子の２つのドメインに近接する。この近接は、レポーター遺伝子の転写を引き起こし、これが転写活性化因子に反応する転写制御部位に動作可能に結合しており、レポーター遺伝子の発現を検出し、これを使用してベイト及びフィッシュタンパク質の相互作用を評点することができる。
【０１４０】
そのようなアプローチによって同定された標的は、ＨＥＲＰＵＤ１を含む。そのようなアプローチによって同定することができる他の標的は、Ｖｐｕ；Ｃｂｌ−ｂ；ＰＫＡ；ＵＮＣ８４；ＭＳＴＰ０２８；ＧＯＣＡＰ１；ＰＴＰＮ１２；ＥＩＦ３Ｓ３；ＳＡＲ１；ＧＯＳＲ２；ＲＡＬＡ；ＳＩＡＨ；ＳＭＩＮ１；ＳＭＮ２；ＳＹＮＥ１；ＴＴＣ３；ＶＣＹ２ＩＰ１；ＳＡＭ６８；Ｇａｇ−Ｐｏｌ；ＧＴＰアーゼ（例えば、Ｒａｃ、Ｒａｃ１、Ｒｈｏ、Ｒａｓ）；Ｅ２酵素、カリン；クラスリン；ＡＰ−１；ＡＰ−２；ＨＳＰ７０；ＨＳＰ９０、Ｂｒｃａ１、Ｂａｒｄ１、Ｎｅｆ、ＰＡＫ１、ＰＡＫ２、ＰＡＫファミリー、Ｖａｖ、Ｃｄｃ４２、ＰＩ３Ｋ（例えば、ｐ８５又はｐ１１０）、Ｎｅｄｄ４、ｓｒｃ（ｓｒｃファミリー）、Ｔｓｇ１０１、ＶＡＳＰ、ＲＮＢ６、ＷＡＳＰ、Ｎ−ＷＡＳＰ、Ｇａｇ、特にＨＩＶ  Ｇａｇ（例えば、ｐ１６０）；及びＳｐｒｅｄ−２と同様のＫＩＡＡ０６７４、並びに、いくつかの実施形態において、クラスリン被覆小胞に関連していることが知られているタンパク質、タンパク質選別経路に関与するタンパク質及びＲａｃシグナル伝達経路に関与するタンパク質を含む。
【０１４１】
多種多様な他の試薬をスクリーニングアッセイに含んでよい。これらは、最適タンパク質−タンパク質結合を容易にし、且つ／又は非特異的若しくはバックグラウンド相互作用を低減するために使用される、塩、中性タンパク質、例えばアルブミン、界面活性剤等のような試薬を含む。プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤等、アッセイの効率を向上させる試薬を使用してよい。構成要素の混合物は、必須結合を提供する任意の順序で添加される。インキュベーションは、任意の適切な温度、一般に４°〜４０℃で実施される。インキュベーション期間は、最適活性のために選択されるが、迅速なハイスループットスクリーニングを容易にするために最適化することもできる。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、試験作用物質を、ＰＯＳＨポリペプチドの局在化を混乱させるその能力、例えば、核及び／又はゴルジ網へのＰＯＳＨ局在化を防止することについて評価することができる。
【０１４３】
参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２００４年４月５日に出願された出願人の先願ＰＣＴ／ＵＳ２００４／１０５８２において、ＰＯＳＨタンパク質とＨＥＲＰＵＤ１タンパク質との間の新規関連性の発見、並びに関連の方法及び組成物が記述された。該出願において、いくつかの病状間における、ＰＯＳＨ核酸とタンパク質、及びＨＥＲＰＵＤ１核酸とタンパク質の新規関連性も開示された。
【０１４４】
ＰＯＳＨ、特にヒトＰＯＳＨと関連するタンパク質を同定することにより、本出願は、ＰＯＳＨ−ＡＰ並びにＰＯＳＨ−ＡＰに関連する細胞過程及び障害とＰＯＳＨ自体との間の概念的結合を提供する。したがって、本開示のいくつかの実施形態において、ＨＥＲＰＵＤ１等のＰＯＳＨ−ＡＰを調節する作用物質は、現在、ＰＯＳＨ機能及び神経学的障害等のＰＯＳＨ機能に関連する障害を調節するために使用することができる。同様に、本開示のいくつかの実施形態において、ＰＯＳＨを調節する作用物質は、現在、ＨＥＲＰＵＤ１等のＰＯＳＨ−ＡＰ、ＨＥＲＰＵＤ１関連神経学的障害を含むＨＥＲＰＵＤ１機能に関連する障害等、ＰＯＳＨ−ＡＰ機能に関連する機能及び障害を調節するために使用することができる。加えて、試験作用物質を、ＨＥＲＰＵＤ１に対する効果についてスクリーニングし、その後、ＰＯＳＨ−ＡＰ機能又はＰＯＳＨ−ＡＰ機能に関連する障害に対する効果についてさらに試験することができる。上記のＰＣＴ出願において、ＰＯＳＨポリペプチドは１種又は複数のＨＥＲＰＵＤ１ポリペプチドと相互作用することが開示された。
【０１４５】
「アミロイドポリペプチド」という用語は、アミロイド斑の有意な構成要素である種々のポリペプチド並びにその前駆体のいずれかを指すのに使用される。アミロイドベータＡ４前駆体タンパク質（「ＡＰＰ」）は、アルツハイマー病、ダウン症（高齢患者におけるもの）及びいくつかの遺伝性脳出血アミロイドーシスに関連するアミロイド斑の主要構成要素を形成する約４０個のアミノ酸ベータアミロイドタンパク質等のより小さいタンパク質を生じさせる。ＡＰＰは、１９個のエクソン遺伝子：エクソン１〜１３、１３ａ及び１４〜１８の選択的スプライシングによって生み出されるいくつかのアイソフォームを有する（Ｙｏｓｈｉｋａｉら、１９９０）。優勢な転写産物は、ＡＰＰ６９５（エクソン１〜６、９〜１８、１３ａを除く）、ＡＰＰ７５１（エクソン１〜７、９〜１８、１３ａを除く）及びＡＰＰ７７０（エクソン１〜１８、１３ａを除く）である。これらはすべて、単一の膜貫通ドメインを持つ多ドメインタンパク質をコードする。それらは、ＡＰＰ７５１及びＡＰＰ７７０が、セリンプロテアーゼ阻害剤ドメインをコードするエクソン７を含有する点で異なる。ＡＰＰ６９５は神経組織中の優勢な形態であり、一方、ＡＰＰ７５１は別の場所において優勢な変異体である。ベータアミロイドは、エクソン１６及び１７の一部によってコードされるタンパク質の部分に由来する。ＡＰＰのアイソフォーム及びそれに由来するより小さいタンパク質のすべて、並びに、その種々の自然発生的な変形形態のいずれか、及び自然発生タンパク質の１つ若しくは複数の機能的特性を保持するか、又はＡＰＰ若しくはそれに由来するタンパク質の生成を監視するためのプロキシとして有用である任意の人工的に生成された変異体は、「アミロイドポリペプチド」という用語に含まれる。ＡＰＰであるか又はそれに由来するアミロイドポリペプチドのサブセットを、特に「ＡＰＰアミロイドポリペプチド」と称する場合がある。Ｙｏｓｈｉｋａｉら、Ｇｅｎｅ、８７、２５７〜２６３、１９９０。
【０１４６】
「ＰＯＳＨ関連タンパク質」又は「ＰＯＳＨ−ＡＰ」は、ＰＯＳＨポリペプチドに干渉し、且つ／又はそれと結合することができるタンパク質を指す。概して、ＰＯＳＨ−ＡＰは、ＰＯＳＨポリペプチドと直接的又は間接的に相互作用することができる。本出願の好ましいＰＯＳＨ−ＡＰは、ＨＥＲＰＵＤ１である。ＨＥＲＰＵＤ１ポリペプチドの例は、至るところで提供されている。
【０１４７】
記述されているように、ＰＯＳＨポリペプチドは、ＰＯＳＨ−ＡＰ  ＨＥＲＰＵＤ１「ホモシステイン誘導性、小胞体ストレス誘導性、ユビキチン様ドメインメンバー１」タンパク質と相互作用する。この相互作用は、本明細書において以下に記述する通り、出願人らによって、酵母ツーハイブリッドアッセイで同定された。ＨＥＲＰＵＤ１はＨｅｒｐ又はＨＥＲＰと同意語であり、これらの用語は本明細書において同義で使用される。ＨＥＲＰＵＤ１は、ＨＩＶ等のエンベロープウイルスの成熟に関与する。
【０１４８】
いくつかのＨＥＲＰＵＤ１ポリペプチドは、特に、高レベルのホモシステインに暴露されている細胞を含む血管内皮細胞におけるＪＮＫ介在性アポトーシスに関与する。いくつかのＨＥＲＰＵＤ１ポリペプチドは、小胞体ストレス応答、つまり小胞体中の変性タンパク質の存在に対する細胞応答に関与する。いくつかのＨＥＲＰＵＤ１ポリペプチドは、ステロール生合成の制御に関与する。したがって、いくつかのＰＯＳＨポリペプチドは、小胞体ストレス応答及びステロール生合成に関与する。
【０１４９】
他の態様において、いくつかのＨＥＲＰＵＤ１ポリペプチドは、プレセニリン介在性アミロイドベータタンパク質産生を増強する。例えば、ＨＥＲＰＵＤ１ポリペプチドは、細胞中で過剰発現すると、アミロイドベータ産生のレベルを増大させ、ＨＥＲＰＵＤ１ポリペプチドが、プレセニリンタンパク質、プレセニリン−１（ＰＳ−１）及びプレセニリン−２（ＰＳ−２）と相互作用することが観察された（Ｓａｉ，Ｘ．ら（２００２）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７７、１２９１５〜１２９２０を参照）。したがって、いくつかの態様において、ＰＯＳＨポリペプチドは、アミロイドベータ産生のレベルを調節することができる。加えて、ＰＯＳＨポリペプチドは、プレセニリン１及びプレセニリン２と相互作用することができる。したがって、いくつかのＰＯＳＨポリペプチドは、プレセニリン介在性アミロイドベータ産生を調節すると考えられている。アミロイドベータの蓄積は、アルツハイマー病の１つの特質である。したがって、これらのＰＯＳＨポリペプチドは、アルツハイマー病の病因に関与し得る。トランスゴルジ網を含む後期細胞内区画部位（ｌａｔｅ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ  ｓｉｔｅ）等の部位において、いくつかの変異プレセニリン−２ポリペプチドは、４２位で終端するアミロイドベータペプチド（Ａβ４２）の生成を上方制御する（Ｉｗａｔａ，Ｈ．ら（２００１）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６、２１６７８〜２１６８５を参照）。したがって、ＰＯＳＨポリペプチドは、トランスゴルジ網を含む後期細胞内区画部位において、変異プレセニリン−２によってＡβ４２の生成を制御することができる。さらに、ホモシステインレベルの上昇は、アルツハイマー病及び脳血管疾患に関連する危険因子であることがわかっている。血漿ホモシステインレベルの上昇等のいくつかの危険因子は、いくつかの中枢神経系（ＣＮＳ）障害の重症度を加速又は増大させ得る。血漿ホモシステインのレベルの上昇は、統合失調症に罹患している若い男性患者において見られ、このことは、ホモシステインレベルの上昇が統合失調症の態様の病態生理学に関連し得ることを示唆していた（Ｌｅｖｉｎｅ，Ｊ．ら（２００２）、Ａｍ．Ｊ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ、１５９、１７９０〜２）。疫学的及び実験的研究は、アルツハイマー病、パーキンソン病、うつ病及び脳卒中を含む神経変性状態とホモシステインレベルの増大を関連付けた（Ｍａｔｔｓｏｎ，ＭＰ及びＳｈｅａ，ＴＢ（２００３）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２６、１３７〜４６に掲載）。
【０１５０】
したがって、いくつかのＰＯＳＨポリペプチドは、神経学的障害に関与する。神経学的障害は、血漿ホモシステインのレベルの増大、アミロイドベータ生成のレベルの増大又は異常なプレセニリン活性に関連する障害を含む。神経学的障害は、アルツハイマー病、脳血管疾患及び統合失調症等のＣＮＳ障害を含む。
【０１５１】
いくつかのＰＯＳＨポリペプチドは、血栓塞栓性血管疾患、特に高ホモシステイン血症に関連する疾患特性等の循環器疾患に関与し得る。例えば、Ｋｏｋａｍｅら、２０００、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７５、３２８４６〜５３；Ｚｈａｎｇら、２００１、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ、２８９、７１８〜２４を参照されたい。
【０１５２】
本明細書に記述されているように、ＰＯＳＨ及びＨＥＲＰＵＤ１は、ウイルス粒子中におけるタンパク質の生成、翻訳後プロセシング、会合及び／又は放出を含むウイルス成熟に関与している。したがって、ウイルス感染は、ＨＥＲＰＵＤ１又はＰＯＳＨの活性を阻害すること（例えば、ユビキチンリガーゼ活性の阻害）によって寛解することができる。好ましい実施形態において、ウイルスは、ＨＩＶ、エボラ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＴＬＶ、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）又はモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭｕＬＶ）を含む、レトロイドウイルス、ＲＮＡウイルス又はエンベロープウイルスである。付加的なウイルス種については、以下でさらに詳細に記述する。いくつかの事例において、ＰＯＳＨ機能の減少は、ウイルス粒子の放出においてＰＯＳＨを用いるウイルスに感染した細胞にとって致命的である。
【０１５３】
いくつかの態様において、本出願は、Ｒａｃ、小型ＧＴＰアーゼ並びにＰＯＳＨ関連キナーゼＭＬＫ、ＭＫＫ及びＪＮＫとのｈＰＯＳＨ相互作用について記述している。Ｒｈｏ、Ｒａｃ及びＣｄｃ４２は、一緒になって、アクチン細胞骨格の組織化及びＭＬＫ−ＭＫＫ−ＪＮＫ  ＭＡＰキナーゼ経路を制御するために動作する（本明細書においては、「ＪＮＫ経路」又は「Ｒａｃ−ＪＮＫ経路」と称される）（Ｘｕら、２００３、ＥＭＢＯ  Ｊ．、２、２５２〜６１）。マウスＰＯＳＨ（「ｍＰＯＳＨ」）の異所性発現は、ＪＮＫ経路を活性化し、ＮＦ−κＢの核局在化を引き起こす。線維芽細胞中におけるｍＰＯＳＨの過剰発現は、アポトーシスを刺激する（Ｔａｐｏｎら（１９９８）、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１７、１３９５〜４０４）。ショウジョウバエにおいて、ＰＯＳＨは、別のＧＴＰアーゼ、Ｒａｓと相互作用するか、又はそのシグナル伝達に影響を与えることができる（Ｓｃｈｎｏｒｒら（２００１）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１５９、６０９〜２２）。ＪＮＫ経路及びＮＦ−κＢは、例えば、免疫応答、炎症、細胞増殖及びアポトーシスに関与する多種多様な鍵遺伝子を制御する。例えば、ＮＦ−κＢは、インターロイキン１、インターロイキン８、腫瘍壊死因子及び多くの細胞接着分子の生成を制御する。ＮＦ−κＢは、細胞中におけるプロアポトーシス及び抗アポトーシスの役割の両方を有する（例えば、それぞれＦＡＳ誘発性細胞死及びＴＮＦ−アルファシグナル伝達において）。ＮＦ−κＢは、阻害タンパク質ＩκＢα及びＩκＢβ（「ＩκＢ」と総称される）により、部分的に負に制御される。ＩκＢのリン酸化は、ＮＦ−κＢの活性化及び核局在化を可能にする。ＩκＢのリン酸化は、ユビキチン系によるその分解の誘因となる。
【０１５４】
付加的な実施形態において、ＰＯＳＨポリペプチドは、ＮＦ−κＢの核局在化を促進する。ＰＯＳＨを下方制御することにより、いくつかの細胞中でアポトーシスを漸減することができ、これは、心筋梗塞、脳卒中、筋肉及び神経の変性疾患（特にアルツハイマー病）等の過剰な細胞死を特徴とする状態においても、移植前の臓器保存のためにも、概して望ましいであろう。
【０１５５】
さらなる実施形態において、ＰＯＳＨポリペプチドは、クラスリン又はコートマー含有複合体等の小胞輸送複合体、特に、核及び／又はゴルジ体に局在化する輸送複合体に関連する。
【０１５６】
いずれも参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ０３／０９５９７１Ａ２及びＷＯ０３／０７８６０１Ａ２において記述されているように、ＰＯＳＨポリペプチドは、ユビキチン化系中においてＥ３酵素として機能する。したがって、ＰＯＳＨユビキチンリガーゼ活性の下方制御又は上方制御を使用して、タンパク質ユビキチン化によって影響される生物学的過程を操作することができる。ＰＯＳＨユビキチンリガーゼ活性の調節を使用して、ＰＯＳＨ及び関連の生物学的過程に影響を及ぼすことができ、同様に、ＰＯＳＨの調節を使用して、ＰＯＳＨユビキチンリガーゼ活性及び関連過程に影響を及ぼすこともできる。下方制御又は上方制御は、転写、翻訳又は翻訳後制御を含む、ＰＯＳＨ形成及び制御の任意の段階において実現することができる。例えば、ＰＯＳＨ転写レベルは、ＰＯＳＨ遺伝子配列を標的とするＲＮＡｉによって減少させることができる。別の例として、ＰＯＳＨユビキチンリガーゼ活性は、ＰＯＳＨ  ＲＩＮＧドメイン又は標的タンパク質（少なくとも部分的にＰＯＳＨ活性によってユビキチン化されるタンパク質）との相互作用を媒介するＰＯＳＨのドメインと結合し、それに干渉する抗体と、ＰＯＳＨを接触させることによって阻害することができる。
【０１５７】
さらなる例として、最も好ましい実施形態において、本明細書の一般式Ｉの化合物、より好ましくは式Ｉａの化合物から成るＰＯＳＨユビキチンリガーゼ活性の小分子阻害剤が本明細書において提供される。
【０１５８】
別の例として、ＰＯＳＨ活性は、ＰＯＳＨ又はその活性部分の発現増加を引き起こすことによって増大させることができる。ＰＯＳＨ及びＰＯＳＨユビキチンリガーゼ活性を調節するＰＯＳＨ−ＡＰは、例えば、細胞へのウイルス侵入、ウイルスタンパク質の生成、ウイルスタンパク質の会合及び細胞からのウイルス粒子の放出等、ウイルスの生活サイクルの種々の段階のうちの１つ又は複数を含む生物学的過程に関係し得る。ＰＯＳＨは、認知症（例えば、アルツハイマー及びピック）、封入体筋炎及び筋障害、ポリグルコサン小体筋障害、及び筋萎縮性側索硬化症のいくつかの形態等、ユビキチン化タンパク質の蓄積を特徴とする疾患に関係し得る。ＰＯＳＨは、過剰若しくは不適切なユビキチン化及び／又はタンパク質分解を特徴とする疾患に関係し得る。
【０１５９】
いくつかの態様において、本出願は、神経学的障害を含むＰＯＳＨ関連疾患（障害）の治療のための方法及び組成物を提供する。いくつかの態様において、本出願は、神経学的及びウイルス性障害を含むＨＥＲＰＵＤ１関連障害等のＰＯＳＨ−ＡＰ関連疾患（障害）、並びに、例えば、アルツハイマー病等の多種多様な神経変性障害を含む望ましくないアポトーシスに関連する神経学的障害の治療のための方法及び組成物を提供する。
【０１６０】
神経学的障害の治療のための本出願の好ましい治療薬は、神経学的障害に関連するＰＯＳＨポリペプチド又はＰＯＳＨ複合体の生物活性を妨害することによって機能し得る。本出願のいくつかの治療薬は、例えば、ＨＥＲＰＵＤ１のＰＯＳＨ介在性ユビキチン化を阻害する等、ＰＯＳＨポリペプチドのユビキチンリガーゼ活性を阻害することにより、ＰＯＳＨの活性を妨害することによって機能する。
【０１６１】
いくつかの実施形態において、本出願は、神経学的障害を治療又は予防する方法に関する。いくつかの態様において、本発明は、ＰＯＳＨ又はＨＥＲＰＵＤ１等のＰＯＳＨ−ＡＰの機能に干渉する組成物の同定のための方法及び組成物を提供し、ここで、その機能は、例えばアルツハイマー病に関連するアミロイドベータ前駆体タンパク質の処理等、神経変性障害に関連する異常なタンパク質の処理に関し得る。
【０１６２】
神経学的障害は、例えばアルツハイマー病等、アミロイドポリペプチドのレベル増大に関連する障害を含む。神経学的障害は、パーキンソン病、ハンチントン病、統合失調症、ピック病、ニーマンピック病、プリオン関連疾患（例えば、狂牛病）、うつ病及び統合失調症も含む。
【０１６３】
いくつかの態様において、本出願は、ＰＯＳＨ又はＰＯＳＨ−ＡＰ機能の干渉又は促進のいずれかを行う治療剤を同定するためのアッセイを提供する。いくつかの態様において、本出願は、ＰＯＳＨポリペプチドとＰＯＳＨ−ＡＰポリペプチドとの間における複合体形成の干渉又は促進のいずれかを行う治療剤を同定するためのアッセイも提供する。本出願の好ましい実施形態において、本出願は、ＰＯＳＨ又はＰＯＳＨ−ＡＰ（例えば、ＨＥＲＰＵＤ１）機能の干渉又は促進のいずれかを行う治療剤を同定するためのアッセイを提供する。いくつかの好ましい態様において、本出願は、ＰＯＳＨポリペプチドとＨＥＲＰＵＤ１ポリペプチドとの間における複合体形成の干渉又は促進のいずれかを行う治療剤を同定するためのアッセイも提供する。
【０１６４】
好ましい実施形態において、本出願は、神経学的障害の治療のための作用物質を提供する。いくつかの実施形態において、本出願は、ＰＯＳＨポリペプチドとＨＥＲＰＵＤ１ポリペプチドとの間の相互作用を妨害する作用物質を、同定、最適化又は評価するためのアッセイを提供する。
【０１６５】
いくつかの好ましい実施形態において、本発明の作用物質は、ＰＯＳＨ及びＨＥＲＰＵＤ１を含む複合体を妨害するものである。場合によって、作用物質は、ＰＯＳＨ自己ユビキチン化等のＰＯＳＨユビキチンリガーゼ活性を阻害することなく、ＰＯＳＨ及びＨＥＲＰＵＤ１を含む複合体を妨害するものである。いくつかの実施形態において、本出願の作用物質は、場合によってＰＯＳＨ自己ユビキチン化を阻害することなく、ＨＥＲＰＵＤ１のＰＯＳＨ介在性ユビキチン化を阻害するものである。
【０１６６】
いくつかの実施形態において、本出願の作用物質は、神経学的障害を治療又は予防するのに有用である。神経学的障害の治療又は予防は、神経学的障害の進行の阻害を含む。いくつかの実施形態において、神経学的障害の治療若しくは予防において有用な剤、又は神経学的障害の進行を阻害する作用物質は、ＰＯＳＨのユビキチンリガーゼ触媒活性（例えば、ＨＥＲＰＵＤ１等の標的タンパク質のＰＯＳＨユビキチン化）に干渉する。
【０１６７】
その他の実施形態において、本明細書において開示されている作用物質は、分泌経路におけるタンパク質の処理、例えばアミロイドポリペプチドの処理等、ＰＯＳＨ及びＨＥＲＰＵＤ１等のＰＯＳＨ−ＡＰ介在性細胞過程を阻害又は促進する。
【０１６８】
いくつかの実施形態において、本出願の作用物質は、ウイルス成熟に場合によって干渉する抗ウイルス剤であり、ここで、好ましくは、ウイルスはエンベロープウイルス、場合によってレトロイドウイルス又はＲＮＡウイルスである。いくつかの実施形態において、抗ウイルス剤は、ＰＯＳＨとＰＯＳＨ−ＡＰポリペプチドとの間の相互作用に干渉し、例えば、抗ウイルス剤は、ＰＯＳＨポリペプチドとＨＥＲＰＵＤ１ポリペプチドとの間の相互作用を妨害することができる。
【０１６９】
さらに付加的な実施形態において、本出願の作用物質は、ＰＯＳＨポリペプチドとＲａｃタンパク質との間の相互作用を場合によって妨害する、Ｒａｃ又はＲａｓ等のＧＴＰアーゼのシグナル伝達に干渉する。
【０１７０】
いくつかの実施形態において、本出願の作用物質は、分泌経路を通るタンパク質の輸送に干渉する。
【０１７１】
ＰＯＳＨ介在性ユビキチン化に対するＰＯＳＨ−ＡＰ（例えば、ＨＥＲＰＵＤ１）の効果を評価し、且つ／又はＰＯＳＨ−ＡＰ（例えば、ＨＥＲＰＵＤ１）がＰＯＳＨ介在性ユビキチン化の標的であるか否かを評価するためのＰＯＳＨユビキチン化アッセイに、付加的なＰＯＳＨ−ＡＰを添加してもよい。
【０１７２】
本出願は、ＰＯＳＨポリペプチド及び１種又は複数の相互作用ポリペプチドを含む、再構築タンパク質製剤を開示する。
【０１７３】
ＰＯＳＨ及びＰＯＳＨ−ＡＰ活性を評価するための付加的なバイオアッセイは、神経学的障害に関連するタンパク質の不正処理を検出するためのアッセイを含み得る。使用することができる１つのアッセイは、神経学的障害に関連するタンパク質の存在を、その量の増加又は減少を含み、検出するためのアッセイである。例えば、ＲＮＡｉの使用は、細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞又はＨｅＬａ細胞）中におけるＰＯＳＨ又はＨＥＲＰＵＤ１等のＰＯＳＨ−ＡＰポリペプチドの発現をノックダウンするために用いることができる。続いて、細胞培地中における、例えばアミロイドベータ等の分泌タンパク質の生成を評価し、対照細胞からの分泌タンパク質の生成と比較することができ、ここで対照細胞は、ＰＯＳＨ又はＰＯＳＨ−ＡＰ活性（例えば、ＨＥＲＰＵＤ１活性）が阻害されなかった細胞であってよい。一部の事例において、標識を分泌タンパク質中に組み込み、細胞培地中における標識された分泌タンパク質の存在を検出することができる。例えば神経細胞を含むあらゆる細胞型から分泌されたタンパク質を評価することができる。
【０１７４】
ＰＯＳＨ又はＰＯＳＨ−ＡＰ活性のバイオアッセイは、アルツハイマー病等の神経変性障害に関連するタンパク質の不正処理を検出するためのアッセイを含み得る。神経学的障害に関連するＰＯＳＨ又はＰＯＳＨ−ＡＰ活性を検出するために使用することができる１つのアッセイは、アミロイドポリペプチドの存在を、その量の増加又は減少を含めて検出するためのアッセイである。１つのそのようなアッセイは、アミロイドポリペプチドの産生に対するＰＯＳＨ又はＰＯＳＨ−ＡＰの調節の効果を評価することを含む。例えば、ＲＮＡｉの使用は、プレセニリン（例えば、プレセニリン１）等のガンマ−セクレターゼ活性に関連するタンパク質を発現し、その酵素活性がアミロイドベータペプチドを生み出すためのアミロイドベータ前駆体タンパク質（「ＡＰＰ」）のタンパク質分解的切断に関与する細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞）中における、ＰＯＳＨポリペプチド又はＰＯＳＨ−ＡＰ（例えば、ＨＥＲＰＵＤ１）の発現をノックダウンするために用いることができる。場合によって、例えば、ニカストリン、Ａｐｈ−１及びＰｅｎ−２等、ガンマ−セクレターゼに関連する他のタンパク質が発現し得る。続いて、例えば細胞培地中におけるアミロイドポリペプチドの産生を評価し、ＰＯＳＨ又はＰＯＳＨ−ＡＰ活性が調節されなかった細胞からのアミロイドポリペプチドの産生と比較することができる。いくつかの実施形態において、ＡＰＰのレベルを評価し、ＰＯＳＨ又はＰＯＳＨ−ＡＰ活性が調節されなかったＡＰＰのレベルと比較することができる。
【０１７５】
ＰＯＳＨ又はＰＯＳＨ−ＡＰ活性の付加的なアッセイは、インビトロガンマ−セクレターゼアッセイを含み、これを用いて、ガンマ−セクレターゼ活性に対するＰＯＳＨ又はＰＯＳＨ−ＡＰの調節（例えば、ＰＯＳＨ発現のノックダウン又はＲＮＡｉによるＨＥＲＰＵＤ１発現のノックダウン）の効果を、ＰＯＳＨ又はＰＯＳＨ−ＡＰ活性が調節されなかった細胞中におけるガンマ−セクレターゼ活性と比較して、評価することができる。例えば、ＰＯＳＨ又はＰＯＳＨ−ＡＰ活性が（例えば、ＲＮＡｉによって）調節された細胞中におけるガンマ−セクレターゼ活性は、タグ付き（例えば、ＦＬＡＧエピトープ）ＡＰＰベースの基質を持つ細胞由来の可溶化ガンマ−セクレターゼをインキュベートすること、及びその結果を免疫ブロットし、同じ方式で操作した対照細胞（ＰＯＳＨ又はＰＯＳＨ−ＡＰ活性が調節されなかった細胞）の結果と比較して、基質及び切断産物（例えば、アミロイドベータペプチド）を検出することによって監視できる。アミロイドポリペプチド産生に対するＰＯＳＨポリペプチド又はＰＯＳＨ−ＡＰの活性の調節の効果は、アミロイドポリペプチドを産生することができる任意の細胞中において評価することができる。
【０１７６】
ＰＯＳＨ又はＨＥＲＰＵＤ１等のＰＯＳＨ−ＡＰの活性を調節する作用物質の効果を、種々の神経学的障害のマウスモデルに対する効果について評定することができる。例えば、アルツハイマー病のマウスモデルについて記述されている。例えば、「スウェーデン変異を有するＡＰＰ対立遺伝子を内包するトランスジェニック動物（Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ａｎｉｍａｌｓ  Ｈａｒｂｏｒｉｎｇ  ＡＰＰ  Ａｌｌｅｌｅ  Ｈａｖｉｎｇ  Ｓｗｅｄｉｓｈ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ）」に関する米国特許第５，６１２，４８６号、「スウェーデン変異を有するＡＰＰ対立遺伝子を内包するトランスジェニックげっ歯動物（Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｏｄｅｎｔｓ  Ｈａｒｂｏｒｉｎｇ  ＡＰＰ  Ａｌｌｅｌｅ  Ｈａｖｉｎｇ  Ｓｗｅｄｉｓｈ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ）」に関する米国特許第５，８５０，００３号（’００３号特許）及び「アルツハイマー病を診断及びモデル化するための核酸（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｆｏｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ）」と題された米国特許第５，４５５，１６９号を参照されたい。アルツハイマー病のマウスモデルは、脳内においてレベルの上昇したベータアミロイドタンパク質を生成する傾向があり、試験作用物質による処理に対応するそのようなタンパク質の増加又は減少を検出することができる。一部の事例では、アルツハイマー病のマウスモデル並びに他の神経学的障害のマウスモデルの認知又は行動特性に対する試験作用物質の効果を評価することが望ましい場合もある。
【０１７７】
さらなる実施形態において、ＰＯＳＨ又はＰＯＳＨ−ＡＰによって制御される遺伝子を同定するために、ＨＥＲＰＵＤ１活性等、より高い又はより低いレベルのＰＯＳＨ又はＰＯＳＨ−ＡＰ活性を有する細胞中において、転写レベルを計測することができる。そのような遺伝子のプロモーター領域（又はそのような遺伝子のより大きい部分）を、レポーター遺伝子と動作可能に結合させ、ＰＯＳＨ又はＰＯＳＨ−ＡＰ制御遺伝子発現を増強又は漸減する作用物質を検出するためのレポーター遺伝子ベースのアッセイにおいて使用することができる。転写レベルは、例えば、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイ等、当該技術分野において既知の任意の手法で測定することができる。ＰＯＳＨ活性の増大は、例えば、強力なＰＯＳＨ発現ベクターを導入することによって実現できる。ＰＯＳＨ活性の減少は、例えば、ＲＮＡｉ、アンチセンス、リボザイム、遺伝子ノックアウト等によって実現できる。
【０１７８】
いくつかの実施形態において、試験作用物質は、例えばＰＯＳＨ等、ＰＯＳＨ−ＡＰの活性（機能）に対する効果を評価することにより、抗ウイルス活性を評価することができる。活性（機能）は、転写、翻訳又は翻訳後段階のうちの１つ又は複数において作用する作用物質によって影響される場合がある。例えば、ＰＯＳＨ−ＡＰコード遺伝子を対象とするｓｉＲＮＡは、ＰＯＳＨ−ＡＰの触媒活性に干渉する小分子のように、活性を減少させる。いくつかの実施形態において、作用物質は、１種又は複数のＰＯＳＨポリペプチドの活性を阻害する。
【０１７９】
ここまでは本発明について一般的に記述されているが、本発明のいくつかの態様及び実施形態の例証のみを目的として含まれ、本発明を限定することは意図していない以下の実施例を参照により、より容易に理解されるであろう。
【実施例】
【０１８０】
ＩＩ  生物学セクション
（実施例１）
ＨＴＳ  ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイによるＰＯＳＨ阻害剤の選択
Ｅ１及びＥ２の存在下、ＲＩＮＧフィンガー依存的な形でその自己ユビキチン化を媒介する、ＲＩＮＧドメインを含有するＰＯＳＨの阻害剤、ユビキチンタンパク質リガーゼ（Ｅ３）としての化合物を試験するために、ＨＴＳ（ハイスループットスクリーニング）均質ＴＲ−ＦＲＥＴ（時間分解蛍光共鳴エネルギー転移）アッセイを行ってＰＯＳＨ自己ユビキチン化を監視した。
【０１８１】
アッセイには、ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）及びユビキチン抱合酵素（Ｅ２）、ＰＯＳＨタンパク質の融合ＧＳＴ−ＲＩＮＧサブユニット、並びに２種の蛍光色素分子抱合検出試薬、すなわち抗ＧＳＴＸＬ６６５及びユーロピウムクリプテート標識ユビキチンを用いる。この均質アッセイは、Ｅｕ３＋クリプテートドナーと第２の蛍光標識（アクセプタ）であるアロフィコシアニンとの間のＦＲＥＴに基づくものである。アロフィコシアニン、つまり１０５ｋＤａフィコビリンタンパク質は、架橋してその安定性を確実なものとしている。ＸＬ６６５として知られるこの化学修飾蛍光色素分子は、Ｅｕ３＋クリプテートの光物理的性質と合致する光物理的性質のセットを表示する。
【０１８２】
ユビキチンクリプテートによるＰＯＳＨのユビキチン化及び抗ＧＳＴタグ付きＸＬ６６５の結合は、蛍光色素分子を近接させ、ＦＲＥＴ反応を発生させる。ＦＲＥＴ反応を発生させない化合物は、阻害剤とみなされる。
【０１８３】
均質時間分解蛍光共鳴エネルギー転移アッセイ（ＴＲ−ＦＲＥＴ）によって、ｈＰＯＳＨの自己ユビキチン化を測定した。ユビキチンクリプテートのＧＳＴタグ付きｈＰＯＳＨとの抱合及び抗ＧＳＴタグ付きＸＬ６６５の結合は、２個の蛍光色素分子を近接させ、これにより、ＦＲＥＴ反応を発生させる。ｈＰＯＳＨユビキチン化活性を計測するために、ＧＳＴタグ付きｈＰＯＳＨ（６０ｎＭ）を、反応緩衝液（４０ｍＭのＨｅｐｅｓ−ＮａＯＨ、ｐＨ７．５、１ｍＭのＤＴＴ、２ｍＭのＡＴＰ、５ｍＭのＭｇＣｌ２）中、組み換え型Ｅ１（８ｎＭ）、ＵｂｃＨ５ｃ（５００ｎＭ）及びユビキチンクリプテート（１５ｎＭ）（ＣＩＳ  Ｂｉｏ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）とともに、３７℃で３０分間インキュベートした。０．５ＭのＥＤＴＡで反応を停止させた。その後、室温でさらに４５分間インキュベーションするため、抗ＧＳＴ−ＸＬ６６５（ＣＩＳ  ｂｉｏ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）（５０ｎＭ）を反応混合物に添加した。蛍光リーダー（ＲＵＢＹｓｔａｒ、ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、３８０ｎｍでの励起後、６２０ｎｍ及び６６５ｎｍでの発光が得られた。その後、下記の式：
Ｆ＝［（Ｓ６６５／Ｓ６２０−Ｂ６６５／Ｂ６２０）／（Ｃ６６５／Ｃ６２０−Ｂ６６５／Ｂ６２０）］（ここで、Ｓ＝実際の蛍光、Ｂ＝ｃｂｌ−ｂのない並行インキュベーションで得られた蛍光、Ｃ＝添加化合物のない反応で得られた蛍光である）
を使用して、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ＝（Ｆ））を計算することにより、ｈＰＯＳＨ−ユビキチン−クリプテート付加体の産生を測定した。
【０１８４】
ＰＯＳＨ特異的阻害剤の評定及び同定のための第１ステップにおいて、候補化合物を種々の濃度でアッセイに添加した。１０μＭ（ＤＭＳＯ溶液中）の濃度のＰＯＳＨ自己ユビキチン化を９０％以上の阻害率で遮断した化合物を、良好な阻害剤と指定した。Ｅ１及びＥ２両方の存在下ではあるがＰＯＳＨの融合ＧＳＴ−ＲＩＮＧサブユニットの不在下、化合物（１μＭの濃度）を再度アッセイで試験し、Ｅ１＋Ｅ２ユビキチン化を７０％超阻害した化合物を除去した。ＰＯＳＨ自己ユビキチン化の良好な阻害剤として同定された化合物を、最適化に付した。
【０１８５】
化合物１は、このインビトロアッセイにおいて２μＭのＩＣ５０を提示した。
【０１８６】
（実施例２）
ウイルス放出のアッセイ−化合物１はＨＩＶ−１  ｐ２４の放出を阻害する
ＰＯＳＨ阻害剤である化合物１を、そのウイルス出芽及びＧＡＧ発現の効率、並びに処理済み及び未処理のＪｕｒｋａｔ細胞中における処理について試験した。細胞外ＧＡＧ  ｐ２４の濃度を、ウイルス出芽の指標として使用した。
【０１８７】
ＪＵＲＫＡＴ細胞を化合物１（５μＭ）とともに１日間又は３日間のいずれかインキュベートした。翌日、細胞にプラスミドｐＮＬｅｎｖ１（２μｇ／ｍｌ）を形質移入した。形質移入の１日後、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）放出を下記の通り測定した。ウイルス発現細胞の培地を収集し、５００×ｇで１０分間遠心分離した。結果として生じた上清を０．４５μｍ孔径フィルターに通し、ろ液を４℃において１４，０００×ｇで２時間遠心分離した。対応する細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、その後、下記の構成要素：５０ｍＭのＨｅｐｅｓ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５％ＮＰ−４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ及び１：２００希釈のプロテアーゼ阻害剤カクテル（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）を含有する溶解緩衝液中、氷上での１５分間のインキュベーションによって可溶化した。その後、細胞界面活性剤抽出物を４℃において１４，０００×ｇで１５分間遠心分離した。ＶＬＰ試料及び清澄化細胞抽出物の試料を１２．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離し、その後、ニトロセルロース紙上に移し、ウサギ抗ＣＡ抗体（Ｓｅｒａｍｕｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ，ＧｍｂＨ）、二次抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）抱合抗体及びＨＲＰ基質を用いる免疫ブロット分析に付した。その後、蛍光イメージング（Ｔｙｐｈｏｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｏｒｐ．）により、増強化学発光（ＥＣＬ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｏｒｐ．）を検出した。化合物１は、ウイルス放出アッセイにおいて４８μＭのＩＣ５０を提示した。
【０１８８】
（実施例３）
酵母ツーハイブリッドアッセイによるＰＯＳＨタンパク質−タンパク質相互作用
酵母ツーハイブリッドアッセイを使用することにより、ＰＯＳＨ関連タンパク質を同定した。
【０１８９】
手順
ベイトプラスミド（ＧＡＬ４−ＢＤ）を酵母株ＡＨ１０９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に形質転換し、既定のトリプトファン欠損培地上で形質転換体を選択した。予め形質転換したＨｅｌａ  ｃＤＮＡプレイ（ＧＡＬ４−ＡＤ）ライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を含有する酵母株Ｙ１８７を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈプロトコールに従って酵母を含有するベイトと交配し、トリプトファン、ロイシン、ヒスチジン欠損で２ｍＭ３のアミノトリアゾールを含有する規定の培地に平板培養した。選択培地上で成長したコロニーをベータ−ガラクトシダーゼ活性について試験し、陽性クローンをさらに特徴付けた。ｃＤＮＡ挿入断片を増幅し、ベクター由来のプライマーを使用して配列決定することにより、プレイクローンを同定した。
【０１９０】
ベイト
プラスミドベクター：ｐＧＢＫ−Ｔ７（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）
プラスミド名：ｐＰＬ２６９−ｐＧＢＫ−Ｔ７  ＧＡＬ４  ＰＯＳＨｄＲ
タンパク質配列：ＰＯＳＨのａａ５３−８８８（ＲＩＮＧドメイン欠失；配列番号１）に対応
スクリーニングするライブラリー：Ｈｅｌａの予め形質転換したライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）
【０１９１】
酵母ツーハイブリッドアッセイにより、ＰＯＳＨ−ＡＰ、ＨＥＲＰＵＤ１（Ｈｓ．１４６３９３）を同定した。
【０１９２】
ＨＥＲＰＵＤ１の核酸及びアミノ酸配列の例を以下に提供する。
【化１０】
2010509205.tif 000011
【０１９３】
（実施例４）
ｓｉＲＮＡによるＨＥＲＰＵＤ１減少はＨＩＶ成熟を低減する
ＨｅＬａ  ＳＳ６細胞に、ＨＥＲＰＵＤ１を対象とするｓｉＲＮＡ及びＨＩＶプロウイルスゲノム（ｐＮＬｅｎｖ−１）をコードするプラスミドを形質移入した。ＨＩＶ形質移入の２４時間後、培地中に分泌されたウイルス様粒子（ＶＬＰ）を単離し、逆転写酵素活性を測定した。活性ＲＴのＨＩＶ放出は、処理及び成熟ウイルスの放出の指標である。ＨＥＲＰＵＤ１のレベルを低減すると、ＲＴ活性が８０％阻害され、ＨＩＶ成熟におけるＨＥＲＰＵＤ１の重要性を実証した。
【０１９４】
実験概要
細胞培養及び形質移入
ＨｅＬａ  ＳＳ６は、Ｔｈｏｍａｓ  Ｔｕｓｃｈｌ博士（ｔｈｅ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  ＲＮＡ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）によって快く提供された。１０％熱非働化ウシ胎仔血清及び１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で細胞を増殖させた。形質移入のために、ＨｅＬａ  ＳＳ６細胞を、抗生物質なしで、１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中、５０％の集密度まで増殖させた。その後、リポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）を使用して、関連する二本鎖ｓｉＲＮＡ（５０〜１００ｎＭ）（ＨＥＲＰＵＤ１：５’−ＧＧＧＡＡＧＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＣＣＵｄＴｄＴ−３’（配列番号２０）及び５’−ｄＴｄＴＣＣＣＵＵＣＡＡＧＡＡＧＣＣＵＵＧＧＡ−５’（配列番号２１）を細胞に形質移入した。最初の形質移入の次の日、完全培地中で細胞を１：３に分割し、２４時間後、ＨＩＶ−１ＮＬｅｎｖ１（６ウェル当たり２μｇ）（Ｓｃｈｕｂｅｒｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７２、２２８０〜８８（１９９８））及び二本鎖ｓｉＲＮＡの第２の部分を同時形質移入した。
【０１９５】
ウイルス放出のアッセイ
前述の通り、プロウイルスＤＮＡによる形質移入の１日後に、ウイルス及びウイルス様粒子（ＶＬＰ）放出を測定した（Ａｄａｃｈｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、５９、２８４〜９１（１９８６）；Ｆｕｋｕｍｏｒｉら、Ｖｐｒ．Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ．、２、１０１１〜１７（２０００）；Ｌｅｎａｒｄｏら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７６、５０８２〜９３（２００２））。ウイルス発現細胞の培地を収集し、５００×ｇで１０分間遠心分離した。結果として生じた上清を０．４５μｍ孔径フィルターに通し、ろ液を４℃において１４，０００×ｇで２時間遠心分離した。結果として生じた上清を除去し、ウイルスペレットをＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液中に再懸濁した。対応する細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、その後、下記の構成要素：５０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５％ＮＰ−４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ及び１：２００希釈のプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を含有する溶解緩衝液中、氷上での１５分間のインキュベーションによって可溶化した。その後、細胞界面活性剤抽出物を４℃において１４，０００×ｇで１５分間遠心分離した。ＶＬＰ試料及び清澄化抽出物の試料（通常、初期試料の１：１０）を１２．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離し、その後、ニトロセルロース紙上に移し、ウサギ抗ＣＡ抗体を用いる免疫ブロット分析に付した。ＣＡの検出は、二次抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ抱合抗体を用いるインキュベーション後、増強化学発光（ＥＣＬ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によって検出するか、又はＣｙ５と抱合した二次抗ウサギ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）を用いるインキュベーション後、蛍光イメージング（Ｔｙｐｈｏｏｎ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）によって検出した。その後、Ｐｒ５５及びＣＡを密度測定によって定量化し、続いて、前述の通り、ＶＬＰ関連ＣＡと細胞内ＣＡ及びＰｒ５５との比率を計算することにより、放出されたＶＬＰの量を測定した（Ｓｃｈｕｂｅｒｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７２、２２８０〜８８（１９９８））。
【０１９６】
上清中における逆転写酵素活性の分析
ＲＴアッセイキット（Ｒｏｃｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ；カタログ番号１４６８１２０）を使用して、ペレット状のＶＬＰ（上記参照）中におけるＲＴ活性を測定した。手短に述べると、ＶＬＰペレットを４０μｌのＲＴアッセイ溶解緩衝液中に再懸濁し、室温で３０分間インキュベートした。インキュベーション終了時に、２０μｌのＲＴアッセイ反応混合物を各試料に添加し、３７℃で終夜インキュベーションを続けた。その後、試料（６０μｌ）をＭＴＰストリップウェルに移行し、３７℃で１時間インキュベートした。ウェルを洗浄緩衝液で５回洗浄し、３７℃での１時間のインキュベーションのためにＤＩＧ−ＰＯＤを添加した。インキュベーションの終了時に、ウェルを洗浄緩衝液で５回洗浄し、ＡＢＳＴ基質溶液を添加し、発色するまでインキュベートした。４０５ｎｍ（基準波長４９２ｎｍ）において、吸光度をＥＬＩＳＡリーダーで読み取った。結果として生じたシグナル強度はＲＴ活性と正比例しており、個々のウェルの反応物に含まれる既知の量のＲＴ酵素に対してプロットすることにより、ＲＴ濃度を測定した。
【０１９７】
（実施例５）
アミロイド前駆体タンパク質レベルはＰＯＳＨのレベルを低減した細胞中において低減される
低減したレベルのＰＯＳＨ（Ｈ１５３）を発現するＨｅＬａ  ＳＳ６細胞及びスクランブルＲＮＡｉ（Ｈ１８７）を発現している対照細胞に、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）を発現しているプラスミド及びプレセニリン１（ＰＳ１）を形質移入した。細胞を代謝標識し、抗アミロイドベータ特異抗体を用いてタンパク質抽出物を免疫沈降させ、これにより、ＡＰＰ、Ｃ１９９及びＡβポリペプチドに共通のエピトープを認識した。標識タンパク質は、Ｈ１８７形質移入細胞（図示せず）中の抗体によって特異的に沈殿した。しかしながら、このポリペプチドはＨ１５３細胞（図示せず）中においては認識されず、ＡＰＰ定常状態レベルがＨ１５３中では低減しており、これらの細胞中では迅速に分解し得ることを示している。
【０１９８】
方法
ｐＩＲＥＳ−ＡＰＰ−ＰＳ１のクローニング
クローニングは２ステップで実施した。まずプレセニリン１（ＰＳ１）をヒト脳ライブラリーからｐＩＲＥｓ（ｐＩＲＥｓ−ＰＳ１）にクローニングした。その後、２つのイメージクローン（３６３９５９９及び５５８２４０６）を増幅し、それらのＰＣＲ産物を付加的なＰＣＲ反応において混合し、完全長ＡＰＰ６９５を得て、これをさらにｐＩＲＥｓ−ＰＳ１に連結してｐＩＲＥｓ−ＡＰＰ−ＰＳ１を生み出すことにより、ＡＰＰ−６９５を得た。
【０１９９】
アミロイドベータ（Ａβ）の形質移入、代謝標識及び免疫隔離
ＰＯＳＨ特異的ＲＮＡｉ又はスクランブルＲＮＡｉ（それぞれＨ１５３及びＨ１８７）を発現しているＨｅｌａ  ＳＳ６細胞に、リポフェクトアミン２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＬＴＤ）を使用してｐＩＲＥｓ−ＡＰＰ−ＰＳ１（２４μｇ）を形質移入した。形質移入の２４時間後、３７℃でさらに２４時間、細胞を１ｍＣｉの３５Ｓ−メチオニンで代謝標識した。培地を細胞から収集し、３０００ｒｐｍで１０分間回転させて細胞残屑をペレット化した。プロテアーゼ阻害剤及び２ｍＭの１，１０−フェナントロリンを清澄化細胞培地に添加した。細胞を溶解緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％ＮＰ−４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム及びプロテアーゼ阻害剤）中に溶解した。細胞培地及び溶解物を、抗Ａβ（１〜１７）抗体（６Ｅ１０）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）又は非関連（ＮＲ）抗体によって免疫沈降させた。沈殿タンパク質を１６％トリス−トリシンゲル上で分離した。ゲルを乾燥し、ホスフォイメージャー（Ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ）（Ｔｙｐｈｏｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｏｒｐ．）によってバンドを検出した。
【０２００】
（実施例６）
細胞保護アッセイ：化合物１、２及び５によりＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２に感染した細胞に与えられる保護
ＨＩＶ細胞保護アッセイには、ＣＥＭ−ＳＳ細胞及びウイルスＨＩＶ−１ＩＩＩＢ、ＨＩＶ−１ＲＦ又はＨＩＶ−２ＲＯＤを使用した。
【０２０１】
手短に述べると、試験化合物の存在下、ウイルス及び細胞を混合し、６日間インキュベートした。対照ウェルがウイルス複製によって７０〜９５％の細胞生存の喪失を呈するように、ウイルスを予め滴定した。したがって、化合物がウイルス複製を防止した場合、抗ウイルス効果又は細胞保護が観察された。各アッセイプレートは、以下の対照：細胞対照ウェル（細胞のみ）、ウイルス対照ウェル（細胞プラスウイルス）、化合物毒性対照ウェル（細胞プラス化合物のみ）、化合物比色分析対照ウェル（化合物のみ）及び実験ウェル（化合物プラス細胞プラスウイルス）を含有していた。細胞保護及び化合物細胞毒性をＭＴＳ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ（登録商標）９６試薬、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）色素還元によって評価し、ＩＣ５０（ウイルス複製を５０％阻害する濃度）、ＴＣ５０（５０％の細胞死をもたらす濃度）及び計算されたＴＩ（治療指数ＴＣ５０／ＩＣ５０）が得られた。各アッセイは、陽性対照としてＨＩＶ逆転写酵素阻害剤ＡＺＴを含んでいた。
【０２０２】
ＨＩＶ−１ＩＩＩＢの感染に対する化合物１、２及び５による細胞保護について得られたＩＣ５０、ＴＣ５０及びＴＩデータを表１に示し、化合物１の抗ウイルス活性及び化合物細胞毒性を図１に示す。化合物５は、抗ＨＩＶ−１ＩＩＩＢ剤として、化合物１及び２と比較してはるかに有効であったことに留意されたい。
【０２０３】
ＨＩＶ−２ＲＯＤの感染に対する化合物１及び化合物２両方についての細胞保護アッセイデータを表２に示し、抗ウイルス活性及び化合物細胞毒性を図２及び３に提示する。
表１  ＣＥＭ−ＳＳ細胞中のＨＩＶ−１ＩＩＩＢに対する化合物１及び２による保護
【表１】
2010509205.tif 000012
表２  ＣＥＭ−ＳＳ細胞中のＨＩＶ−２ＲＯＤに対する化合物１及び２による保護
【表２】
2010509205.tif 000013
【０２０４】
ＩＩＩ  化学セクション
（実施例７）
化合物１の合成
スキーム１に示されている中間体１及び２の合成から始まる化合物１の合成は、以下の通りである。
【０２０５】
（ｉ）Ｎ−（チオフェン−２−カルボニル）グリシン（中間体１）の合成
水（１００ｍｌ）中のグリシン（７．０ｇ、９３ｍｍｏｌ）及び炭酸カリウム（１３．８ｇ、１００ｍｍｏｌ）の溶液に、チオフェン−２−カルボニルクロリド（７．３ｇ、５０ｍｍｏｌ）を撹拌しながら３０分間かけて添加した。結果として生じた溶液を１時間撹拌し、ジエチルエーテル（２×３０ｍｌ）で洗浄し、濃ＨＣｌで酸性化した。氷浴中で１時間冷却後、沈殿物をろ過除去し、氷水で洗浄し、風乾し、７．０ｇ（７６％）の酸中間体１を得た。
【０２０６】
（ｉｉ）２−（２−チエニル）−４−（２−チエニルメチレン）オキサゾール−５（４Ｈ）−オン（中間体２）の合成
酸中間体１（７．０ｇ、３８ｍｍｏｌ）、チオフェン−２−カルバルデヒド（５．１ｇ、４５ｍｍｏｌ）、酢酸ナトリウム（３．１ｇ、３８ｍｍｏｌ）及び無水酢酸（１１．６ｇ、１１４ｍｍｏｌ）の懸濁液を、撹拌しながら水蒸気浴で１時間加熱した。反応中に、混合物は橙色になり、凝固した。冷却された固体を水（５０ｍｌ）とともに１５分間撹拌し、結果として生じた沈殿物をろ過除去し、氷水及び若干の氷冷エタノールで洗浄し、風乾し、６．２ｇ（６３％）のアザラクトン中間体２を橙色固体として得た。
【０２０７】
（ｉｉｉ）化合物１の合成
氷酢酸（４０ｍｌ）中のアザラクトン２（２．８ｇ、１１ｍｍｏｌ）及び４−アミノ−Ｎ−（４，６−ジメチルピリミジン−２−イル）ベンゼンスルホンアミド（２．８ｇ、１０ｍｍｏｌ）の懸濁液を、還流しながら１時間撹拌した。固体がまず溶解され、その後、黄色沈殿物がもたらされた。冷却後、後者をろ過除去し、氷酢酸、エタノール、その後ジエチルエーテルで連続的に洗浄し、風乾し、３．７ｇ（６９％）の化合物１を淡黄色粉末として得た。
【化１１】
2010509205.tif 000014
【０２０８】
（実施例８）
化合物２の合成
化合物２の合成のために、まず中間体１及び２を上記実施例８に記述されている通りに合成した。化合物２の合成は、スキーム２に示されている。
【０２０９】
氷酢酸（７．３ｍｌ）中のアザラクトン（１）（５２２ｍｇ、２ｍｍｏｌ）及び４−アミノ−Ｎ１−（２−ピリミジニル）−１−ベンゼンスルホンアミド（５００ｍｇ、２ｍｍｏｌ）の懸濁液を、還流しながら１時間撹拌した。固体がまず溶解され、その後、黄色沈殿物が形成された。冷却後、後者をろ過除去し、氷酢酸、その後、エタノール及びジエチルエーテルで連続的に洗浄した後、１００℃で真空乾燥し、６８０ｍｇ（６７％）の所望の化合物２を得た。
【化１２】
2010509205.tif 000015
【０２１０】
（実施例９）
化合物４の合成
化合物４は、合成のステップ（ｉｉｉ）において、中間体２を４−アミノ−５−メチル−Ｎ−（４，６−ジメチルピリミジン−２−イル）ベンゼンスルホンアミド（２．８ｇ、１０ｍｍｏｌ）と反応させたことを除き、化合物１の合成と同様の方式で合成した。化合物４は、淡黄色粉末として７１％収率で得られた。
【０２１１】
（実施例１０）
化合物５の合成
スキーム３に記述されている通りの中間体３〜５の合成、続いて中間体２との反応から始まる化合物５の合成は、以下の通りである。
【０２１２】
（ｉ）１−アセチルインドリン−５−スルホニルクロリド（中間体３）の合成
１−アセチルインドリン（１６．１ｇ、１００ｍｍｏｌ）を、撹拌しながら、少量ずつ３０分間かけて、クロロスルホン酸（４０．４ｇ、３５０ｍｍｏｌ）に添加した。結果として生じた濃厚な溶液を６０℃で３０分間撹拌し、冷却し、クラッシュアイス（２００ｇ）で可能な限り急速に処理した。粗スルホニルクロリド（３）をろ過除去し、氷水で徹底的に洗浄し、クロロホルム（２００ｍｌ）中に溶解し、ＣａＣｌ２で短時間乾燥し、濃縮し、エーテル−ヘキサンから結晶化し、１９．５ｇ（７５％）の純中間体３を得た。
【０２１３】
（ｉｉ）１−アセチル−Ｎ−（４−メチルピリミジン−２−イル）インドリン−５−スルホンアミド（中間体４）の合成
３（５．２ｇ、２０ｍｍｏｌ）、２−アミノ−４−メチルピリミジン（２．１ｇ、１９ｍｍｏｌ）、ピリジン（１．７４ｇ、２２ｍｍｏｌ）及び１，２−ジクロロエタン（１５ｍｌ）の混合物を、４５〜５０℃で５時間撹拌した。揮発物を真空蒸留除去し、残留物を水（２０ｍｌ）中に懸濁した。粗中間体４をろ過除去し、水、その後、冷エタノールで洗浄し、３．６３ｇ（５２％）の帯黄色粉末を得た。この物質をさらに精製することなく次のステップにおいて使用した。
【０２１４】
（ｉｉｉ）Ｎ−（４−メチルピリミジン−２−イル）インドリン−５−スルホンアミド（中間体５）の合成
８％ＮａＯＨ（１５ｍｌ）中のスルホンアミド４（３．６３ｇ、１０ｍｍｏｌ）の溶液を９５〜１００℃で３時間撹拌し、冷却し、ろ過した。その後、ろ液を２５％ＨＣｌで中和した。形成された沈殿物をろ過除去し、水及びエタノールで洗浄した。５％ＮａＯＨ中に溶解し、続いて５％ＨＣｌで沈殿させることにより、これをさらに精製した。沈殿物を水及びエタノールで洗浄し、８０℃で風乾し、２．５７ｇ（８０％）の中間体５を得た。
【０２１５】
（ｉｖ）化合物の合成
氷酢酸（３０ｍｌ）中の、上記実施例７（ｉｉ）で得られた中間体２（１．４ｇ、５．５ｍｍｏｌ）及び中間体５（１．８ｇ、５．５ｍｍｏｌ）の懸濁液を、還流しながら１時間撹拌した。固体がまず溶解され、その後、黄色沈殿物が形成された。冷却後、後者をろ過除去し、氷酢酸、続いてエタノールで連続的に洗浄した。５％ＮａＯＨ中に溶解し、続いて５％ＨＣｌで沈殿させることにより、粗生成物をさらに精製し、１．４８ｇ（４５％）の純化合物５（Ｎ−（４−メチルピリミジン−２−イル）−１−［３−（２−チエニル）−２−（２−チエニルカルボニルアミノ）］プロペノイル］−インドリン−５−スルホンアミド）をほぼ無色の粉末（ｍ．ｐ．＞２５０℃、ｄｅｃ．）として得た。
【化１３】
2010509205.tif 000016
【０２１６】
（実施例１１）
化合物７の合成
化合物７は、合成のステップ（ｉ）において、出発材料として１−Ｈインドールを使用したことを除き、化合物５の合成と同様の方式で合成した。化合物７は、無色粉末として５０％収率で得られた。
【０２１７】
スキーム１
【化１４】
2010509205.tif 000017
スキーム２
【化１５】
2010509205.tif 000018
スキーム３
【化１６】
2010509205.tif 000019
付録Ａ
【表３−１】
2010509205.tif 000020
【表３−２】
2010509205.tif 000021
【図１】
2010509205.tif 000031
【図２】
2010509205.tif 000032
【図３】
2010509205.tif 000033
【図４】
2010509205.tif 000034
【配列表】
2010509205000001.app
【国際調査報告】
2010509205.tif 000035
2010509205.tif 000036