(57)【要約】  本発明は、乳酸塩及び過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩を含むイメージング剤、前記イメージング剤の製造方法、前記イメージング剤の使用、並びに前記イメージング剤を使用する１３Ｃ−ＭＲイメージング法及び／又は１３Ｃ−ＭＲ分光法に関する。【選択図】    図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸塩及び過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩を含んでなるイメージング剤。
【請求項２】
ほぼ等しい濃度又は等しい濃度の乳酸塩及び過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩を含む、請求項１記載のイメージング剤。
【請求項３】
乳酸塩が乳酸、乳酸ナトリウム及び乳酸リチウムから選択される、請求項１又は請求項２記載のイメージング剤。
【請求項４】
当該イメージング剤がさらに水性キャリヤーを含む、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載のイメージング剤。
【請求項５】
当該イメージング剤がさらに通常の薬学的に許容されるキャリヤー及び／又は賦形剤及び／又は製剤化補助剤を含む、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載のイメージング剤。
【請求項６】
インビボ１３Ｃ−ＭＲイメージング及び／又は１３Ｃ−ＭＲ分光法で使用するための、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載のイメージング剤。
【請求項７】
当該イメージング剤がさらに１種以上の非水性溶媒、好ましくはＤＭＳＯ及び／又はメタノールを含む、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載のイメージング剤。
【請求項８】
インビトロ１３Ｃ−ＭＲイメージング及び／又は１３Ｃ−ＭＲ分光法で使用するための、請求項１乃至請求項４及び請求項７のいずれか１項記載のイメージング剤。
【請求項９】
１３Ｃ−ＭＲイメージング及び／又は１３Ｃ−ＭＲ分光法を用いてヒト又はヒト以外の動物の体内における代謝過程のインビボ研究を行うための、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載のイメージング剤の使用。
【請求項１０】
１３Ｃ−ＭＲイメージング及び／又は１３Ｃ−ＭＲ分光法を用いてヒト又はヒト以外の動物の体内における腫瘍組織のインビボ同定を行うための、請求項７又は請求項８記載のイメージング剤の使用。
【請求項１１】
１３Ｃ−ＭＲイメージング及び／又は１３Ｃ−ＭＲ分光法を用いてヒト又はヒト以外の動物の体内における心筋組織の生存度のインビボ評価を行うための、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載のイメージング剤の使用。
【請求項１２】
１３Ｃ−ＭＲイメージング及び／又は１３Ｃ−ＭＲ分光法を用いてヒト又はヒト以外の動物の体内における細胞死のインビボ検出を行うための、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載のイメージング剤の使用。
【請求項１３】
１３Ｃ−ＭＲイメージング及び／又は１３Ｃ−ＭＲ分光法を用いて細胞培養物、ヒト又はヒト以外の動物の身体から導かれる試料、或いはエクスビボ組織中における代謝過程のインビトロ研究を行うための、請求項７又は請求項８記載のイメージング剤の使用。
【請求項１４】
１３Ｃ−ＭＲイメージング及び／又は１３Ｃ−ＭＲ分光法を用いて細胞培養物、ヒト又はヒト以外の動物の身体から導かれる試料、或いはエクスビボ組織中における腫瘍細胞のインビトロ同定を行うための、請求項７又は請求項８記載のイメージング剤の使用。
【請求項１５】
１３Ｃ−ＭＲイメージング及び／又は１３Ｃ−ＭＲ分光法を用いて細胞培養物、ヒト又はヒト以外の動物の身体から導かれる試料、或いはエクスビボ組織中における細胞死のインビトロ検出を行うための、請求項７又は請求項８記載のイメージング剤の使用。
【請求項１６】
１３Ｃ−ピルビン酸又は１３Ｃ−ピルビン酸塩の動的核分極によって過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩を得、前記過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩の溶液に乳酸塩を添加することを含んでなる、請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載のイメージング剤の製造方法。
【請求項１７】
請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載のイメージング剤を用いる１３Ｃ−ＭＲイメージング法及び／又は１３Ｃ−ＭＲ分光法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸塩及び過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩を含むイメージング剤、前記イメージング剤の製造方法、前記イメージング剤の使用、並びに前記イメージング剤を使用する１３Ｃ−ＭＲイメージング法及び／又は１３Ｃ−ＭＲ分光法に関する。
【背景技術】
【０００２】
磁気共鳴（ＭＲ）イメージング（ＭＲＩ）は、非侵襲的に、かつ患者及び医療従事者を有害なおそれのある放射線（例えば、Ｘ線）に暴露することなく患者の身体又はその一部の画像を得ることができるため、医師にとって特に魅力的なイメージング技法になっている。高画質の画像並びに良好な空間的及び時間的解像度が得られるので、ＭＲＩは軟組織及び器官のイメージングのために好適なイメージング技法である。
【０００３】
ＭＲＩは、ＭＲ造影剤を使用しても使用しなくても実施できる。しかし、コントラスト増強ＭＲＩでは、通常ははるかに微小な組織変化の検出が可能となり、したがってそれは例えば微小な腫瘍や転移のような初期組織変化を検出するための強力なツールとなる。
【０００４】
ＭＲＩでは、数種類の造影剤が使用されてきた。水溶性の常磁性金属キレート剤（例えば、Ｏｍｎｉｓｃａｎ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）のようなガドリニウムキレート剤）は、広く使用されているＭＲ造影剤である。これらは、低分子量であるため、血管系に投与した場合に細胞外スペース（即ち、血液及び間質組織）中に急速に分布する。これらはまた、比較的速やかに体外に排出される。
【０００５】
他方、血液プールＭＲ造影剤（例えば、超常磁性酸化鉄粒子）は、長時間にわたって血管系内に保持される。これらは、肝臓内のコントラストを高めるばかりでなく、毛細血管の透過性異常（例えば、腫瘍血管形成の結果として生じる腫瘍内の「漏出性」毛細血管壁）を検出するためにも極めて有用であることが判明している。
【０００６】
上述の造影剤が優れた性質を有することは明白であるが、使用時に全く危険を伴わないわけではない。常磁性金属キレートは通常高い安定性定数を有するものの、投与後に体内で毒性金属イオンを放出するおそれがある。さらに、これらの種類の造影剤は低い特異性を示す。
【０００７】
国際公開第９９／３５５０８号には、高Ｔ１剤の過分極溶液をＭＲＩ造影剤として使用する患者のＭＲ検査方法が開示されている。「過分極」という用語は、高Ｔ１剤中に存在するＮＭＲ活性核（即ち、非ゼロ核スピンを有する核、好ましくは１３Ｃ又は１５Ｎ核）の核分極を増強させることを意味する。ＮＭＲ活性核の核分極を増強させると、これらの核の励起核スピン状態と基底核スピン状態との母集団差は顕著に増加し、それによりＭＲ信号強度は１００倍以上に増幅される。１３Ｃ及び／又は１５Ｎが濃縮された過分極高Ｔ１剤を使用する場合、１３Ｃ及び／又は１５Ｎの天然存在度は無視できるほどに低いのでバックグラウンド信号からの干渉はほとんど存在せず、したがって画像コントラストは有利に高くなる。通常のＭＲＩ造影剤とこれらの過分極高Ｔ１剤との主な相違点は、前者ではコントラストの変化が体内の水プロトンの緩和時間に影響を及ぼすことで誘起されるのに対し、後者の種類の薬剤は得られる信号がもっぱら薬剤に由来しているので非放射性トレーサーと見なし得ることである。
【０００８】
国際公開第９９／３５５０８号には、ＭＲイメージング剤として使用可能な各種の高Ｔ１剤が開示されている。かかる高Ｔ１剤としては、酢酸塩、ピルビン酸塩、シュウ酸塩又はグルコン酸塩、グルコースやフルクトースのような糖、尿素、アミド、グルタミン酸やグリシンやシステインやアスパラギン酸のようなアミノ酸、ヌクレオチド、アスコルビン酸のようなビタミン、ペニシリン誘導体及びスルホンアミドのような非内因性及び内因性化合物が挙げられる。さらに、クエン酸回路のような代謝サイクル中の中間体は代謝活性のＭＲイメージング用の好ましいイメージング剤であることが述べられている。
【０００９】
ヒト及びヒト以外の動物の体内における代謝過程で役割を果たす過分極ＭＲイメージング剤は、インビボＭＲ検査で組織の代謝状態に関する情報を得るために使用できるので（即ち、代謝活性のインビボイメージングのために有用であるので）大いに興味がある。組織の代謝状態に関する情報は、例えば、健常組織と罹患組織とを識別するために使用できよう。
【００１０】
ピルビン酸塩はクエン酸回路中で役割を果たす化合物であり、過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩からその代謝産物である過分極１３Ｃ−乳酸塩、過分極１３Ｃ−重炭酸塩及び過分極１３Ｃ−アラニンへの転化は人体内における代謝過程のインビボＭＲ研究のために使用できる。過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩は、例えば、国際公開第２００６／０１１８１０号に詳述されているようなインビボ腫瘍イメージングのため、及び国際公開第２００６／０５４９０３号に詳述されているようなＭＲイメージングによって心筋組織の生存度を評価するためのＭＲイメージング剤として使用できる。
【００１１】
ピルビン酸塩は、たとえ高濃度でも、人体によって非常によく容認される内因性化合物である。クエン酸回路中の前駆体として、ピルビン酸塩は人体内において重要な代謝的役割を果たす。ピルビン酸塩は様々な化合物に転化される。即ち、それのアミノ基転移はアラニンを生じ、酸化的脱炭酸反応によってピルビン酸塩はアセチルＣｏＡ及び二酸化炭素（これはさらに重炭酸塩に転化される）に転化され、ピルビン酸塩の還元は乳酸塩を生じ、それのカルボキシル化はオキサロ酢酸塩を生じる。
【００１２】
さらに、過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩からその代謝産物である過分極１３Ｃ−乳酸塩、過分極１３Ｃ−重炭酸塩（１３Ｃ１−ピルビン酸塩、１３Ｃ１，２−ピルビン酸塩又は１３Ｃ１，２，３−ピルビン酸塩の場合のみ）及び過分極１３Ｃ−アラニンへの代謝転化は人体内における代謝過程のインビボＭＲ研究のために使用できる。１３Ｃ１−ピルビン酸塩は、３７℃のヒト全血中で約４２秒のＴ１緩和を有している。しかし、過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩から過分極１３Ｃ−乳酸塩、過分極１３Ｃ−重炭酸塩及び過分極１３Ｃ−アラニンへの転化は、１３Ｃ−ピルビン酸塩出発化合物及びその代謝産物からの信号検出を可能にするのに十分速いことが判明している。アラニン、重炭酸塩及び乳酸塩の量は、研究対象である組織の代謝状態に依存する。過分極１３Ｃ−乳酸塩、過分極１３Ｃ−重炭酸塩及び過分極１３Ｃ−アラニンのＭＲ信号強度は、これらの化合物の量及び検出時における分極の残存率に関係しているので、過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩から過分極１３Ｃ−乳酸塩、過分極１３Ｃ−重炭酸塩及び過分極１３Ｃ−アラニンへの転化をモニターすることにより、非侵襲的なＭＲイメージング又はＭＲ分光法を用いることでヒト又はヒト以外の動物の体内における代謝過程をインビボで調べることが可能である。
【００１３】
様々なピルビン酸塩代謝産物に由来するＭＲ信号振幅は、組織の種類に応じて変化する。アラニン、乳酸塩、重炭酸塩及びピルビン酸塩によって形成される特有の代謝ピークパターンは、検査対象である組織の代謝状態に関するフィンガープリントとして使用できる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】国際公開第９９／３５５０８号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００６／０１１８１０号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００６／０５４９０３号パンフレット
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
今回、非過分極乳酸塩及び過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩を含むＭＲイメージング剤は単独の過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩に比べて優れた性質を有するという知見を得た。かかるイメージング剤の使用は、観測可能な１３Ｃ−乳酸塩の量の増加及び１３Ｃ−乳酸塩からのＭＲ信号の増加をもたらす。１３Ｃ−乳酸塩からの信号は、国際公開第２００６／０１１８１０号に記載されているように腫瘍組織が高い１３Ｃ−乳酸塩信号で表される場合、ＭＲ腫瘍イメージングのためにモニターされる信号である。１３Ｃ−乳酸塩からの増加した信号を用いれば、非常に初期の段階で微小な腫瘍又は腫瘍組織を検出することが可能となり得る。１３Ｃ−乳酸塩からの信号はまた、国際公開第２００６／０５４９０３号に記載されているように危険な状態の心筋組織（即ち、虚血状態の心筋組織）が最低の１３Ｃ−重炭酸塩信号及び／又は最高の１３Ｃ−乳酸塩信号によって同定される場合、ＭＲ心臓イメージングのためにモニターされる信号でもある。さらに、１３Ｃ−乳酸塩からの信号は、瀕死の細胞が１３Ｃ−乳酸塩信号の低下又は欠如によって表される場合、細胞死のＭＲイメージングのためにモニターされる信号である。
【００１６】
かくして、第１の態様で本発明は、乳酸塩及び過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩を含むイメージング剤を用いる１３Ｃ−ＭＲイメージング法又は１３Ｃ−ＭＲ分光法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】エトポシドで処理したＥＬ４細胞懸濁液及び未処理ＥＬ４細胞懸濁液中における１３Ｃ１−ピルビン酸塩及び１３Ｃ１−乳酸塩のピーク強度を時間に対して示している。
【図２】ＥＬ４細胞に対するエトポシド処理及びエトポシド／ニコチンアミド処理の効果を細胞死誘発薬物エトポシドに対して示している。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
「過分極」及び「分極」という用語は以後は互換的に使用され、０．１％を超え、さらに好ましくは１％を超え、最も好ましくは１０％を超える核分極レベルを意味する。
【００１９】
分極レベルは、例えば、固体過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩（例えば、１３Ｃ−ピルビン酸塩の動的核分極（ＤＮＰ）によって得られる固体過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩）における固体状態１３Ｃ−ＮＭＲ測定によって決定できる。固体状態１３Ｃ−ＮＭＲ測定は、好ましくは小さいフリップ角を用いる単パルス獲得ＮＭＲシーケンスからなる。ＮＭＲスペクトル中の過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩の信号強度を分極プロセス前に得られたＮＭＲスペクトル中の１３Ｃ−ピルビン酸塩の信号強度と比較する。次いで、分極前後における信号強度の比から分極レベルを計算する。
【００２０】
同様に、溶解した過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩に関する分極レベルは、液体状態ＮＭＲ測定によって決定できる。この場合にも、溶解過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩の信号強度を分極前の溶解１３Ｃ−ピルビン酸塩の信号強度と比較する。次いで、分極前後における１３Ｃ−ピルビン酸塩の信号強度の比から分極レベルを計算する。
【００２１】
「イメージング剤」という用語は、ＭＲ活性剤（即ち、イメージング成分）としての過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩及び過分極していない乳酸塩を含む液体組成物を意味する。本発明に係るイメージング剤は、ＭＲイメージングにおけるイメージング剤として、或いはＭＲ分光法におけるＭＲ分光剤として使用できる。
【００２２】
本発明の方法で使用するイメージング剤は、インビボ（即ち、ヒト又はヒト以外の動物の生体内）での１３Ｃ−ＭＲイメージング又は分光法のためのイメージング剤として使用できる。さらに、本発明の方法で使用するイメージング剤は、例えば細胞培養物、ヒト又はヒト以外の動物の身体から導かれる試料（例えば、尿、唾液又は血液）、或いはエクスビボ組織（例えば、生検で得られるエクスビボ組織）中において、インビトロ１３Ｃ−ＭＲイメージング又は分光法のためのイメージング剤として使用できる。
【００２３】
本発明の方法で使用する過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩の同位体濃縮度は、好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上であり、９０％以上の同位体濃縮度が最も好ましい。理想的には、濃縮度は１００％である。本発明の方法で使用する１３Ｃ−ピルビン酸塩は、Ｃ１位置（以後は１３Ｃ１−ピルビン酸塩という）、Ｃ２位置（以後は１３Ｃ２−ピルビン酸塩という）、Ｃ３位置（以後は１３Ｃ３−ピルビン酸塩という）、Ｃ１及びＣ２位置（以後は１３Ｃ１，２−ピルビン酸塩という）、Ｃ１及びＣ３位置（以後は１３Ｃ１，３−ピルビン酸塩という）、Ｃ２及びＣ３位置（以後は１３Ｃ２，３−ピルビン酸塩という）又はＣ１、Ｃ２及びＣ３位置（以後は１３Ｃ１，２，３−ピルビン酸塩という）で同位体濃縮できる。１３Ｃ１−ピルビン酸塩は、３７℃のヒト全血中において、他のＣ位置で同位体濃縮された１３Ｃ−ピルビン酸塩より高いＴ１緩和（約４２秒）を有するので、Ｃ１位置での同位体濃縮が好ましい。
【００２４】
ＮＭＲ活性１３Ｃ核の過分極は、例えば国際公開第９８／３０９１８号、同第９９／２４０８０号及び同第９９／３５５０８号（これらの開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす）に記載されている様々な方法によって達成でき、過分極方法には、希ガスからの分極移動、「ブルートフォース（ｂｒｕｔｅ ｆｏｒｃｅ）」、スピン冷凍、パラ水素法及び動的核分極（ＤＮＰ）がある。
【００２５】
過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩を得るためには、１３Ｃ−ピルビン酸塩を直接に分極させるか、或いは１３Ｃ−ピルビン酸を分極させ、分極１３Ｃ−ピルビン酸を（例えば、塩基での中和により）分極１３Ｃ−ピルビン酸塩に転化させることが好ましい。
【００２６】
過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩を得るための１つの好適な方法は、国際公開第９８／３０９１８号に記載されているような過分極希ガスからの分極移動である。非ゼロ核スピンを有する希ガスは、円偏光の使用によって過分極させることができる。過分極希ガス（好ましくはＨｅ又はＸｅ或いはかかるガスの混合物）を用いて１３Ｃ核の過分極を達成することができる。過分極ガスは気相中にあってもよく、液体／溶媒中に溶解されてもよく、或いは過分極ガス自体を溶媒として使用してもよい。別法として、ガスを冷却固体表面上に凝縮させ、この形態で使用してもよいし、或いは昇華させてもよい。過分極ガスと１３Ｃ−ピルビン酸塩又は１３Ｃ−ピルビン酸とを緊密に混合することが好ましい。したがって、室温で液体である１３Ｃ−ピルビン酸を分極させるならば、過分極ガスを液体／溶媒中に溶解するか、或いは溶媒として使用することが好ましい。１３Ｃ−ピルビン酸塩を分極させるならば、ピルビン酸塩を溶解した液体／溶媒中に過分極ガスを溶解することが好ましい。
【００２７】
過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩を得るための別の好適な方法は、非常に低い温度及び高い磁場での熱力学的平衡化によって１３Ｃ核に分極を付与するものである。過分極は、ＮＭＲ分光計の動作磁場及び温度に比べ、非常に高い磁場及び非常に低い温度（ブルートフォース）の使用によって達成される。使用する磁場強度はできるだけ高くすべきであり、好適には１Ｔより高く、好ましくは５Ｔより高く、さらに好ましくは１５Ｔ以上であり、特に好ましくは２０Ｔ以上である。温度は非常に低くすべきであり、例えば４．２Ｋ以下、好ましくは１．５Ｋ以下、さらに好ましくは１．０Ｋ以下、特に好ましくは１００ｍＫ以下である。
【００２８】
過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩を得るための別の好適な方法は、スピン冷凍法である。この方法は、スピン冷凍分極によって固体の化合物又は系のスピン分極をカバーする。かかる系には、三次若しくはそれ以上の対称軸をもつ好適な結晶質常磁性物質（例えば、Ｎｉ２＋、ランタニド又はアクチニドイオン）がドープされるか、或いは緊密に混合される。共鳴励起磁場を全く加えないので均一な磁場は必要とされず、その計装はＤＮＰのために必要なものより簡単である。このプロセスは、磁場の方向に直角な軸の周りで試料を物理的に回転させることによって実施される。この方法についての前提条件は、常磁性種が高度に異方性のｇ因子をもつことである。試料回転の結果として、電子常磁性共鳴が核スピンと接触して、核スピン温度の低下をもたらす。試料回転は、核スピン分極が新しい平衡に達するまで実施される。
【００２９】
好ましい実施形態では、過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩を得るためにＤＮＰ（動的核分極）が使用される。ＤＮＰでは、分極させるべき化合物中のＭＲ活性核の分極は、不対電子を含む化合物である分極剤又はいわゆるＤＮＰ剤によって達成される。ＤＮＰプロセス中には、通常はマイクロ波放射の形態でエネルギーが供給され、これがまずＤＮＰ剤を励起する。基底状態への崩壊に際して、ＤＮＰ剤の不対電子から分極させるべき化合物のＮＭＲ活性核（例えば、１３Ｃ−ピルビン酸塩中の１３Ｃ核）への分極の移動が起こる。一般に、ＤＮＰプロセスでは中程度の又は高い磁場及び非常に低い温度が使用されており、例えば、液体ヘリウム及び約１Ｔ以上の磁場中でＤＮＰプロセスが実施される。別法として、中程度の磁場及び十分な分極増強が達成される任意の温度を使用することもできる。ＤＮＰ技法は、例えば、国際公開第９８／５８２７２号及び同第０１／９６８９５号に一層詳しく記載されており、これらの開示内容はいずれも援用によって本明細書の内容の一部をなしている。
【００３０】
ＤＮＰ法によって化合物を分極させるためには、分極させるべき化合物とＤＮＰ剤との混合物（「試料」）を調製し、次いでこれを凍結して分極用のＤＮＰ分極装置内に挿入する。分極後、凍結した固体過分極試料は、融解又は適当な溶解媒質中への溶解によって急速に液体状態に移行される。溶解が好ましく、凍結過分極試料の溶解プロセス及びそのための好適な装置は国際公開第０２／３７１３２号に詳述されている。融解プロセス及び融解用の好適な装置は、例えば国際公開第０２／３６００５号に記載されている。
【００３１】
分極させるべき化合物中に高い分極レベルを得るためには、ＤＮＰプロセス中に前記化合物とＤＮＰ剤とが緊密に接触している必要がある。凍結又は冷却時に試料が結晶化するならば、それに該当しない。結晶化を避けるためには、試料中にガラス形成剤を存在させる必要があり、或いは凍結時に結晶化せずにガラスを形成する化合物を分極用に選択する必要がある。
【００３２】
前述の通り、１３Ｃ−ピルビン酸又は１３Ｃ−ピルビン酸塩が過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩を得るための好適な出発原料である。
【００３３】
同位体濃縮された１３Ｃ−ピルビン酸塩は、例えば１３Ｃ−ピルビン酸ナトリウムとして商業的に入手できる。別法として、Ｓ．Ａｎｋｅｒ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１７６，１９４８，１３３−１３３５）によって記載されたようにしてそれを合成することもできる。
【００３４】
１３Ｃ１−ピルビン酸の合成のためには、いくつかの方法が当技術分野で公知である。簡単に述べれば、Ｓｅｅｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４０（２），１９７５，２３１−２３７には、カルボニル含有出発原料をＳ，Ｓ−アセタール（例えば、１，３−ジチアン又は２−メチル−１，３−ジチアン）として保護及び活性化することに基づく合成経路が記載されている。かかるジチアンをメタレート化し、メチル含有化合物及び／又は１３ＣＯ２と反応させる。この参考文献中に略述されているような適当な同位体濃縮１３Ｃ−成分を使用することで、１３Ｃ１−ピルビン酸塩、１３Ｃ２−ピルビン酸塩又は１３Ｃ１，２−ピルビン酸塩を得ることが可能である。次いで、文献中に記載されている通常の方法を用いてカルボニル官能基を遊離させる。異なる合成経路は酢酸から開始するが、酢酸をまず臭化アセチルに転化させ、次いでＣｕ１３ＣＮと反応させる。得られたニトリルはアミドを介してピルビン酸に転化される（例えば、Ｓ．Ｈ．Ａｎｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１７６（１９４８），１３３３又はＪ．Ｅ．Ｔｈｉｒｋｅｔｔｌｅ，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９９７），１０２５を参照されたい）。さらに１３Ｃ−ピルビン酸は、例えば米国特許第６，２３２，４９７号に記載された方法又は国際公開第２００６／０３８８１１号に記載された方法により、商業的に入手できる１３Ｃ−ピルビン酸ナトリウムへのプロトン付加によって得ることができる。
【００３５】
ＤＮＰによる１３Ｃ−ピルビン酸の過分極は、国際公開第２００６／０１１８０９号（その開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす）に詳述されている。簡単に述べれば、１３Ｃ−ピルビン酸は凍結時にガラスを形成するので、それはＤＮＰのためにそのまま使用できる。ＤＮＰ後、凍結過分極１３Ｃ−ピルビン酸を溶解して中和すること（即ち、１３Ｃ−ピルビン酸塩に転化させること）が必要である。転化のためには、強塩基が必要である。さらに、１３Ｃ−ピルビン酸は強酸であるので、この強酸中で安定なＤＮＰ剤を選択する必要がある。好ましい塩基は水酸化ナトリウムであり、水酸化ナトリウムによる過分極１３Ｃ−ピルビン酸の転化は過分極１３Ｃ−ピルビン酸ナトリウムを生じる。これは、インビボＭＲイメージング及び／又は分光法（即ち、ヒト又はヒト以外の動物の生体に関して実施されるＭＲイメージング及び／又は分光法）のために使用されるイメージング剤にとって好ましい１３Ｃ−ピルビン酸塩である。
【００３６】
別法として、１３Ｃ−ピルビン酸塩（即ち、１３Ｃ−ピルビン酸の塩）をＤＮＰのために使用できる。好ましい塩は、ＰＣＴ出願第０７／００１０９号（その開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす）に詳述されているように、ＮＨ４＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋、Ｃｓ＋、Ｃａ２＋、Ｓｒ２＋及びＢａ２＋、好ましくはＮＨ４＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋及びＣｓ＋、さらに好ましくはＫ＋、Ｒｂ＋及びＣｓ＋、最も好ましくはＣｓ＋からなる群からの無機陽イオンを含む１３Ｃ−ピルビン酸塩である。これらの好ましい１３Ｃ−ピルビン酸塩の合成法もまた、ＰＣＴ出願第０７／００１０９号に開示されている。過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩をインビボＭＲイメージング及び／又は分光法用のイメージング剤中に使用するならば、ＮＨ４＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋、Ｃｓ＋、Ｃａ２＋、Ｓｒ２＋及びＢａ２＋からなる群からの無機陽イオンを生理学的に非常によく容認される陽イオン（例えば、Ｎａ＋又はメグルミン）と交換することが好ましい。これは、陽イオン交換カラムの使用のような当技術分野で公知の方法で行うことができる。
【００３７】
さらに他の好ましい塩は、国際公開第２００７／０６９９０９号（その開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす）に詳述されているように、有機アミン又はアミノ化合物の１３Ｃ−ピルビン酸塩（好ましくは、ＴＲＩＳ−１３Ｃ−ピルベート又はメグルミン−１３Ｃ−ピルベート）である。これらの好ましい１３Ｃ−ピルビン酸塩の合成法もまた、国際公開第２００７／０６９９０９号に開示されている。
【００３８】
本発明の方法で使用する過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩がＤＮＰによって得られるならば、１３Ｃ−ピルビン酸又は１３Ｃ−ピルビン酸塩及びＤＮＰ剤を含む分極させるべき試料は、さらに常磁性金属イオンを含み得る。ＤＮＰによって分極させるべき組成物中に常磁性金属イオンが存在することは、国際公開第２００７／０６４２２６号（その開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす）に記載されているように、分極レベルの向上をもたらすことが判明している。
【００３９】
前述した通り、本発明の方法に係るイメージング剤は、インビボＭＲイメージング及び／又は分光法（即ち、ヒト又はヒト以外の動物の生体に関して実施されるＭＲイメージング及び／又は分光法）のためのイメージング剤として使用できる。かかるイメージング剤は、ＭＲ活性剤である１３Ｃ−ピルビン酸塩に加えて、水性キャリヤー、好ましくは生理学的に容認されかつ薬学的に許容される水性キャリヤー（例えば、水、緩衝液又は食塩水）を含むことが好ましい。かかるイメージング剤はさらに、通常の薬学的又は獣医学的キャリヤー又は賦形剤（例えば、ヒト医学又は獣医学における診断用組成物に関して常用されているような製剤化補助剤）を含むことができる。
【００４０】
さらに、本発明の方法に係るイメージング剤は、インビトロＭＲイメージング及び／又は分光法（例えば、細胞培養物又はエクスビボ組織中における細胞死の検出）のためのイメージング剤として使用できる。かかるイメージング剤は、ＭＲ活性剤である１３Ｃ−ピルビン酸塩に加えて、インビトロ細胞又は組織アッセイに適合しかつそのために使用される溶媒（例えば、ＤＭＳＯ又はメタノール或いは水性キャリヤー及び非水性溶媒を含む溶媒混合物（例えば、ＤＭＳＯと水又は緩衝液との混合物或いはメタノールと水又は緩衝液との混合物））を含むことが好ましい。当業者には自明の通り、イメージング剤中には薬学的に許容されるキャリヤー、賦形剤及び製剤化補助剤が存在し得るが、かかる目的のために必要なわけではない。
【００４１】
本発明の方法で使用されるイメージング剤は、乳酸塩及び過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩を含んでいる。乳酸塩は過分極していない。乳酸塩は、好適には分極プロセス後に過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩に添加される。いくつかの乳酸塩添加方法が可能である。分極プロセスが過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩を含む液体組成物を生じる場合には、乳酸塩を前記液体組成物中に溶解するか、或いは適当な溶媒（好ましくは水性キャリヤー）中の乳酸塩溶液を液体組成物に添加すればよい。分極プロセスが過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩を含む固体組成物を生じるならば、固体組成物を溶解するために使用する溶媒媒質中に乳酸塩を溶解すればよい。例えば、ＤＮＰ法によって分極させた１３Ｃ−ピルビン酸塩は、乳酸塩を含む水又は緩衝液のような水性キャリヤー中に溶解できる。過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩が動的核分極によって得られているならば、最終液体組成物（即ち、溶解／融解後の液体組成物或いはＤＮＰ剤及び／又は任意の常磁性金属イオンの除去後の液体組成物）に乳酸塩を添加することが好ましい。この場合にも、乳酸塩は固体として液体組成物中に添加でき、或いは適当な溶媒（例えば、水又は緩衝液のような水性キャリヤー）中に溶解できる。乳酸塩の溶解を促進するため、当技術分野で公知のいくつかの手段（例えば、撹拌、渦動又は音波処理）を使用できる。しかし、迅速であると共に、混合装置を必要とせずに液体組成物との接触を助ける方法が好ましい。したがって、渦動又は音波処理のような方法が好ましい。
【００４２】
好適には、乳酸塩は乳酸又は乳酸の塩（好ましくは乳酸リチウム又は乳酸ナトリウム、最も好ましくは乳酸ナトリウム）の形態で添加される。本発明の方法で使用するイメージング剤中における過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩及び乳酸塩の濃度はほぼ等しいか又は等しく、或いは乳酸塩が１３Ｃ−ピルビン酸塩より低い濃度又は高い濃度で存在する。例えば、イメージング剤がｘＭの１３Ｃ−ピルビン酸塩を含むならば、それはｘＭ又はほぼｘＭの乳酸塩、或いはそれより少ないが好ましくはｘＭの１／１０以上の乳酸塩、或いはそれより多いが好ましくはｘＭの３倍以下の乳酸塩を含む。好ましい実施形態では、本発明の方法で使用するイメージング剤中における乳酸塩の濃度は過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩の濃度にほぼ等しいか又は等しい。「ほぼ等しい濃度」という用語は、１３Ｃ−ピルビン酸塩濃度の±３０％、好ましくは±２０％、さらに好ましくは±１０％である乳酸塩濃度を意味する。
【００４３】
本発明の方法においてインビボ１３Ｃ−ＭＲイメージング又は１３Ｃ−ＭＲ分光法のためのイメージング剤として使用するためには、乳酸塩及び過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩を含むイメージング剤は、ヒト又はヒト以外の動物の生体に投与するのに適した組成物として供給される。イメージング剤は、好ましくは上述したような水性キャリヤー（例えば、緩衝液又は緩衝液混合物）を含む。イメージング剤はさらに、通常の薬学的に許容されるキャリヤー、賦形剤及び製剤化補助剤を含み得る。したがって、イメージング剤は例えば安定剤、重量オスモル濃度調整剤、可溶化剤などを含み得る。
【００４４】
本発明の方法で使用するイメージング剤が、例えばヒト又はヒト以外の動物の生体におけるインビボＭＲイメージング又は分光法のために使用されるならば、前記イメージング剤は好ましくは前記生体に非経口的に（好ましくは静脈内に）投与される。一般に、検査すべき生体はＭＲ磁石内に配置される。専用の１３Ｃ−ＭＲ ＲＦコイルが、検査対象領域をカバーするように配置される。イメージング剤の用量及び濃度は、毒性及び投与経路のような一連の因子に依存する。好適には、イメージング剤は、体重１ｋｇ当たり１ｍｍｏｌ以下、好ましくは０．０１〜０．５ｍｍｏｌ／ｋｇ、さらに好ましくは０．１〜０．３ｍｍｏｌ／ｋｇの１３Ｃ−ピルビン酸塩濃度で投与される。投与速度は、好ましくは１０ｍｌ／秒未満、さらに好ましくは６ｍｌ／分未満、最も好ましくは５ｍｌ／秒〜０．１ｍｌ／秒である。投与後４００秒未満、好ましくは１２０秒未満、さらに好ましくは投与後６０秒未満、特に好ましくは２０〜５０秒に、検査対象体積をエンコードするＭＲイメージングシーケンスを複合した周波数及び空間選択的な方法で印加する。これによって、１３Ｃ−ピルビン酸塩及び１３Ｃ−乳酸塩の代謝画像が得られる。ＭＲシーケンスの正確な印加時間は、検査対象体積に大きく依存する。
【００４５】
本発明の方法においてインビトロ１３Ｃ−ＭＲイメージング又は１３Ｃ−ＭＲ分光法のためのイメージング剤として使用するためには、乳酸塩及び過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩を含むイメージング剤は、例えば細胞培養物、ヒト又はヒト以外の動物の身体から導かれる試料、或いは生検組織のようなエクスビボ組織に添加するのに適した組成物として供給される。当業者には自明の通り、イメージング剤中には薬学的に許容されるキャリヤー、賦形剤及び製剤化補助剤が存在し得るが、かかる目的のために必要なわけではない。したがってイメージング剤は、上述したような水性キャリヤー（例えば、緩衝液又は緩衝液混合物）及び／又は細胞培養物又は組織に適合した１種以上の非水性溶媒（例えば、ＤＭＳＯ又はメタノール）を含むことが好ましい。細胞培養物、ヒト又はヒト以外の動物の身体から導かれる試料、或いは生検組織のようなエクスビボ組織中において使用するためのイメージング剤は、１３Ｃ−ピルビン酸塩濃度が好ましくは１０〜１００ｍＭ、さらに好ましくは２０〜９０ｍＭ、最も好ましくは４０〜８０ｍＭである。
【００４６】
さらに別の態様から見れば、本発明は、乳酸塩及び過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩を含んでなるイメージング剤を提供する。
【００４７】
さらに別の好ましい実施形態では、本発明に係るイメージング剤は、ほぼ等しい濃度又は等しい濃度の過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩及び乳酸塩を含むか、或いは１３Ｃ−ピルビン酸塩より低い濃度又は高い濃度で乳酸塩を含む。例えば、イメージング剤がｘＭの１３Ｃ−ピルビン酸塩を含むならば、それはｘＭ又はほぼｘＭの乳酸塩、或いは好ましくはｘＭの１／１０以上の乳酸塩、或いは好ましくはｘＭの３倍以下の乳酸塩を含む。好ましい実施形態では、本発明の方法に係るイメージング剤中における乳酸塩の濃度は過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩の濃度にほぼ等しいか又は等しい。「ほぼ等しい濃度」という用語は、１３Ｃ−ピルビン酸塩濃度の±３０％、好ましくは±２０％、さらに好ましくは±１０％である乳酸塩濃度を意味する。
【００４８】
別の好ましい実施形態では、乳酸塩は乳酸、乳酸リチウム及び乳酸ナトリウムからなる群から選択される。
【００４９】
イメージング剤は、好ましくは１３Ｃ−ＭＲイメージング又は１３Ｃ−ＭＲ分光法で使用される。
【００５０】
本発明に係るイメージング剤がインビボイメージング剤として使用されるならば（即ち、ヒト又はヒト以外の動物の生体に投与されるならば）、前記イメージング剤は、好ましくはさらに上述したような水性キャリヤー（例えば、緩衝液又は緩衝液混合物）を含む。イメージング剤はさらに、通常の薬学的に許容されるキャリヤー、賦形剤及び製剤化補助剤を含み得る。したがって、イメージング剤は例えば安定剤、重量オスモル濃度調整剤、可溶化剤などを含み得る。
【００５１】
本発明に係るイメージング剤がインビトロ１３Ｃ−ＭＲイメージング又は１３Ｃ−ＭＲ分光法のために使用されるならば、以前の段落に述べた通り、それはさらに薬学的に許容されるキャリヤー、賦形剤及び製剤化補助剤を含み得る。しかし、当業者には自明の通り、かかる薬学的に許容されるキャリヤー、賦形剤及び製剤化補助剤はかかる目的のために存在する必要はない。したがってイメージング剤はさらに、上述したような水性キャリヤー（例えば、緩衝液又は緩衝液混合物）及び／又は細胞培養物又は組織に適合した１種以上の非水性溶媒（例えば、ＤＭＳＯ又はメタノール）を含むことが好ましい。
【００５２】
本発明のさらに別の態様は、乳酸塩及び過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩を含むイメージング剤の製造方法であって、１３Ｃ−ピルビン酸又は１３Ｃ−ピルビン酸塩の動的核分極によって過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩を得、前記過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩の溶液に乳酸塩を添加することを含んでなる方法である。
【００５３】
本発明のさらに別の態様は、１３Ｃ−ＭＲイメージング及び／又は１３Ｃ−ＭＲ分光法を用いてヒト又はヒト以外の動物の体内における代謝過程のインビボ研究を行うための、本発明に係るイメージング剤の使用である。
【００５４】
本発明のさらに別の態様は、１３Ｃ−ＭＲイメージング及び／又は１３Ｃ−ＭＲ分光法を用いて細胞培養物、ヒト又はヒト以外の動物の身体から導かれる試料、或いはエクスビボ組織中における代謝過程のインビトロ研究を行うための、本発明に係るイメージング剤の使用である。
【００５５】
本発明のさらに別の態様は、１３Ｃ−ＭＲイメージング及び／又は１３Ｃ−ＭＲ分光法を用いてヒト又はヒト以外の動物の体内における腫瘍組織のインビボ同定を行うための、本発明に係るイメージング剤の使用である。
【００５６】
本発明のさらに別の態様は、１３Ｃ−ＭＲイメージング及び／又は１３Ｃ−ＭＲ分光法を用いて細胞培養物、ヒト又はヒト以外の動物の身体から導かれる試料、或いはエクスビボ組織中における腫瘍細胞のインビトロ同定を行うための、本発明に係るイメージング剤の使用である。
【００５７】
腫瘍組織のインビボ同定及び腫瘍細胞のインビトロ同定のための好適な１３Ｃ−ＭＲイメージング及び／又は１３Ｃ−ＭＲ分光法プロトコルは、国際公開第２００６／０１１８１０号に記載されている。
【００５８】
本発明のさらに別の態様は、１３Ｃ−ＭＲイメージング及び／又は１３Ｃ−ＭＲ分光法を用いてヒト又はヒト以外の動物の体内における心筋組織の生存度のインビボ評価を行うための、本発明に係るイメージング剤の使用である。
【００５９】
ヒト又はヒト以外の動物の体内における心筋組織の生存度のインビボ評価のための好適な１３Ｃ−ＭＲイメージング及び／又は１３Ｃ−ＭＲ分光法プロトコルは、国際公開第２００６／０５４９０３号に記載されている。
【００６０】
本発明のさらに別の態様は、１３Ｃ−ＭＲイメージング及び／又は１３Ｃ−ＭＲ分光法を用いてヒト又はヒト以外の動物の体内における細胞死のインビボ検出を行うための、本発明に係るイメージング剤の使用である。
【００６１】
本発明のさらに別の態様は、１３Ｃ−ＭＲイメージング及び／又は１３Ｃ−ＭＲ分光法を用いて細胞培養物、ヒト又はヒト以外の動物の身体から導かれる試料、或いはエクスビボ組織中における細胞死のインビトロ検出を行うための、本発明に係るイメージング剤の使用である。
【００６２】
細胞死（例えば、アポトーシス及び壊死）は、本発明の方法により、１３Ｃ−ピルビン酸塩信号及びその代謝産物である１３Ｃ−乳酸塩の信号を経時的に追跡することで検出できる。生細胞では、１３Ｃ−ピルビン酸塩信号は経時的に減衰する。１３Ｃ−乳酸塩信号は、１３Ｃ−ピルビン酸塩から１３Ｃ−乳酸塩への代謝転化のために増加し、次いで主として緩和のためにゆっくりと減少する。瀕死細胞では、１３Ｃ−ピルビン酸塩から１３Ｃ−乳酸塩への代謝転化は大幅に減少する。１３Ｃ−ピルビン酸塩信号は経時的に減衰するものの、１３Ｃ−乳酸塩信号は細胞死の程度及び瀕死細胞／死細胞の量に応じてわずかに増加するか、或いは全く検出されないことがある。理論によって束縛されることは望まないが、これはＮＡＤＨ及びＮＡＤ＋の相互転化を伴いながらピルビン酸塩及び乳酸塩の相互転化を触媒する酵素乳酸デヒドロゲナーゼの活性の喪失に原因し、及び／又は補因子ＮＡＤＨ及びＮＡＤ＋の喪失に原因し、及び／又は細胞内乳酸塩濃度の減少に原因すると考えられる。
【００６３】
エトポシド処理によって細胞死を受けるように誘発されたＥＬ４マウスリンパ腫細胞の酸抽出物に関する３１Ｐ−ＮＭＲ測定は、未処理対照細胞と比較した場合、ＮＡＤ(Ｈ)からの共鳴強度の減少を示した。ＮＡＤ(Ｈ)の喪失は、各種のタンパク質をポリアデニル化しかつＮＡＤ＋を基質として使用する酵素ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の活性化がＤＮＡの損傷で誘発されることによって説明できる。また、解糖中間体フルクトース−１，６−二リン酸（ＦＢＰ）からの共鳴の増加も存在していたが、これは補酵素ＮＡＤ(Ｈ)の喪失による解糖酵素グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の阻害によって説明できる。競合阻害剤（２０ｍＭニコチンアミド）又は３−アミノベンズアミド（１０ｍＭ）によるＰＡＲＰ活性の阻害は、アポトーシス細胞で認められるＮＡＤ(Ｈ)の喪失及びＦＢＰ濃度の増加を抑制した。
【００６４】
ＰＡＲＰ活性化に原因するこのようなＮＡＤ(Ｈ)の喪失はまた、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性、したがってピルビン酸塩と乳酸塩との間で測定される１３Ｃ−標識の流れも抑制するはずである。この仮説に合致して、ニコチンアミド及びエトポシドの両方或いは３−アミノベンズアミド及びエトポシドの両方で処理された細胞は、蛍光顕微鏡法を用いて検出されるように瀕死細胞の通常の形態学的特徴を示しながらも、ピルビン酸塩及び乳酸塩プールの間で過分極１３Ｃ−標識を移動させる能力を維持することが認められた。
【００６５】
本発明に係るイメージング剤がインビトロでの細胞死の検出（例えば、細胞培養物、ヒト又はヒト以外の動物の身体から導かれる試料、或いはエクスビボ組織中における細胞死の検出）のために使用されるならば、イメージング剤は１３Ｃ−ピルビン酸塩濃度が１０〜５０ｍＭ、好ましくは２０〜４０ｍＭである。
【００６６】
本発明に係るイメージング剤が、インビボでの細胞死の検出（即ち、ヒト又はヒト以外の動物の生体における細胞死の検出）のために使用されるならば、本発明に係るイメージング剤は好ましくは前記生体に非経口的に（好ましくは静脈内に）投与される。一般に、検査すべき生体はＭＲ磁石内に配置される。専用の１３Ｃ−ＭＲ ＲＦコイルが、検査対象領域をカバーするように配置される。イメージング剤の用量及び濃度は、毒性及び投与経路のような一連の因子に依存する。好適には、イメージング剤は、体重１ｋｇ当たり１ｍｍｏｌ以下、好ましくは０．０１〜０．５ｍｍｏｌ／ｋｇ、さらに好ましくは０．１〜０．３ｍｍｏｌ／ｋｇの１３Ｃ−ピルビン酸塩濃度で投与される。投与速度は、好ましくは１０ｍｌ／秒未満、さらに好ましくは６ｍｌ／分未満、最も好ましくは５ｍｌ／秒〜０．１ｍｌ／秒である。投与後４００秒未満、好ましくは１２０秒未満、さらに好ましくは投与後６０秒未満、特に好ましくは２０〜５０秒に、検査対象体積をエンコードするＭＲイメージングシーケンスを複合した周波数及び空間選択的な方法で印加する。これによって、１３Ｃ−ピルビン酸塩及び１３Ｃ−乳酸塩の代謝画像／スペクトルが得られる。ＭＲシーケンスの正確な印加時間は、アポトーシスを検出するための検査対象体積に大きく依存する。
【００６７】
検査対象体積をエンコードするＭＲイメージングシーケンスを複合した周波数及び空間選択的な方法で印加し、イメージング剤の添加（ｔ＝０）から約１０分、好ましくは６分、さらに好ましくは５分までの期間にわたって１３Ｃ−ピルビン酸塩の１３Ｃ−ＭＲ信号をＭＲイメージング又は分光法で追跡する。同じ期間内において、１３Ｃ−乳酸塩信号の外観、増加及びそれに続く減少をモニターする。定量的な評価を得るためには、健常細胞又は組織のＭＲイメージング又は分光法を実施し、結果（即ち、所定期間にわたって生成される乳酸塩の量）を比較すればよい。
【００６８】
検査対象体積のエンコーディングは、例えば、Ｔ．Ｒ．Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９，３５２３−３５２６（１９８２）及びＡ．Ａ．Ｍａｕｄｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓ．５１，１４７−１５２（１９８３）に記載されているようないわゆる分光イメージングシーケンスを用いて達成できる。分光画像データは多数の体積要素を含んでおり、各要素は完全な１３Ｃ−ＭＲスペクトルを含んでいる。１３Ｃ−ピルビン酸塩及びその代謝産物である１３Ｃ−乳酸塩は１３Ｃ−ＭＲスペクトル中で固有の位置を有しており、これらの共鳴周波数を用いて各々を同定することができる。共鳴周波数でのピークの積分値は、それぞれ１３Ｃ−ピルビン酸塩及び１３Ｃ−乳酸塩の量に直接関係している。１３Ｃ−ピルビン酸塩及び１３Ｃ−乳酸塩の量を、例えばＬ．Ｖａｎｈａｍｍｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍａｇｎ Ｒｅｓｏｎ １２９，３５−４３（１９９７）に記載されているように時間領域当てはめルーチンを用いて推定する場合には、１３Ｃ−ピルビン酸塩及び１３Ｃ−乳酸塩について画像を生成することができ、画像中ではカラーコード又はグレイコードで１３Ｃ−ピルビン酸及び１３Ｃ−乳酸塩の測定量が表される。
【００６９】
分光イメージング法はあらゆる種類のＭＲ核（例えば、１Ｈ、３１Ｐ、２３Ｎａ）を用いて代謝画像を生成する際に有用であることが判明しているが、分光画像を完全にエンコードするのに要する反復量のため、この方法は過分極１３Ｃにはあまり適さない。全ＭＲデータが取得されるまでの間、過分極１３Ｃ信号が確実に入手できるよう注意を払わなければならない。これは、信号対雑音比の低下を代償として、すべての位相エンコードステップで適用されるＲＦパルス角を低下させることによって達成できる。マトリックスサイズを高めるには、位相エンコードステップを追加し、スキャン時間を延ばす必要がある。
【００７０】
データ取得時にリードアウト勾配を適用する、Ｐ．Ｃ．Ｌａｕｔｅｒｂｕｒ （Ｎａｔｕｒｅ，２４２，１９０−１９１（１９７３））及びＰ．Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ （Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃ．６，Ｌ４２２−Ｌ４２６（１９７３））の先駆的研究に基づくイメージング法では、信号対雑音比の高い画像或いはＳＮ比は同等で空間分解能の高い画像を得ることができる。しかし、これらのイメージング法はその基本形では、１３Ｃ−ピルビン酸塩及び１３Ｃ−乳酸塩に関する画像を別々に生成することはできない。即ち、特定の代謝産物の識別は不可能である。
【００７１】
好ましい実施形態では、周波数情報をコードするためにマルチエコーを用いるイメージングシーケンスが使用される。水及び脂肪の１Ｈ−画像を別々に生成できるシーケンスは、例えば、Ｇ．Ｇｌｏｖｅｒ，Ｊ Ｍａｇｎ Ｒｅｓｏｎ Ｉｍａｇｉｎｇ １９９１；１：５２１−５３０及びＳ．Ｂ．Ｒｅｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＭＲＭ ５１ ３５−４５（２００４）に記載されている。検出すべき代謝産物、したがってそのＭＲ周波数は知られているので、上記の文献に記載されたアプローチを適用すれば、１３Ｃ−ピルビン酸塩及び１３Ｃ−乳酸塩の直接画像を取得することができる。この方法では、過分極１３Ｃ−ＭＲ信号を効率的に利用でき、分光イメージングに比べて良質な信号品質、高い空間分解能及び速い取得時間が得られる。
【００７２】
好ましい実施形態では、細胞死の検出は、本発明に係るイメージング剤を予め投与したヒト又はヒト以外の動物の身体から、或いは本発明に係るイメージング剤を添加した細胞培養物、ヒト又はヒト以外の動物の身体から導かれる試料、或いはエクスビボ組織から、１３Ｃ−ピルビン酸塩及び１３Ｃ−乳酸塩の直接１３Ｃ−ＭＲ画像又はスペクトルを取得することを含んでいる。細胞死は、１３Ｃ−乳酸塩からの１３Ｃ信号強度の低下又は１３Ｃ−乳酸塩からの信号の欠如或いは１３Ｃ−乳酸塩の生成速度の減少によって確認されかつ検出される。
【００７３】
ピルビン酸塩信号を補正するため、乳酸塩画像及びピルビン酸画像の両方を各画像中の最大値に対して正規化する。次に、正規化した乳酸塩画像に、反転ピルビン酸塩画像（例えば、画像中の最大ピルビン酸信号から各ピクセルについてのピルビン酸レベルを差し引いたもの）を乗じる。最後の段階として、上記の操作で得た中間結果に元の乳酸塩画像を乗じる。別法として、それぞれの画像の各ピクセルにおけるピルビン酸塩及び乳酸塩ピーク強度をピルビン酸塩と乳酸塩との間における１３Ｃ標識の流れの動力学的モデルに当てはめることで、標識の流れに関する速度定数及びスピン格子緩和時間を得ることができる。分極の損失に対する多重ＲＦパルスの効果についても補正が必要となる場合がある。
【００７４】
本方法がインビトロでの細胞死の検出のために使用されるならば、解剖学的及び／又は灌流情報を細胞死の検出に含めてもよい。解剖学的情報は、例えば、適当な造影剤を使用し又は使用せずにプロトン又は１３Ｃ−ＭＲ画像を取得することによって得ることができる。相対的灌流は、例えばＯｍｎｉｓｃａｎ（商標）のようなＭＲ造影剤を用いることによって決定できる。同様に、造影剤を投与せずに灌流を測定するＭＲイメージング技法も当技術分野で公知である。好ましい実施形態では、非代謝過分極１３Ｃ−造影剤を用いて定量的灌流が求められる。好適な技法及び造影剤は、例えば国際公開第０２／２３２０９号に記載されている。さらに好ましい実施形態では、過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩を用いて定量的灌流が求められる。
【００７５】
別の好ましい実施形態では、本発明に係るイメージング剤を繰り返し投与することで動的研究が可能になる。ピルビン酸塩の低毒性及びそれの好適な安全性プロフィルのため、この化合物の反復投与は患者によって十分に容認される。
【００７６】
こうして得られた結果から、医師は検査中の患者にとって適切な治療を選択でき、或いは医師は治療の成否を判定できる。
【００７７】
図面の簡単な説明
図１は、エトポシドで処理したＥＬ４細胞懸濁液及び未処理ＥＬ４細胞懸濁液中における１３Ｃ１−ピルビン酸塩及び１３Ｃ１−乳酸塩のピーク強度を時間に対して示している。
【００７８】
図１中の曲線の番号は下記のものを意味する。
１：未処理対照細胞懸濁液及びエトポシド処理細胞懸濁液における１３Ｃ１−ピルビン酸塩強度（１００で割った値）。
２：対照細胞懸濁液における１３Ｃ１−乳酸塩強度。
３：エトポシド処理細胞懸濁液における１３Ｃ１−乳酸塩強度。
【００７９】
図２は、ＥＬ４細胞に対するエトポシド処理及びエトポシド／ニコチンアミド処理の効果を細胞死誘発薬物エトポシドに対して示している。図２中の棒グラフは、３回の実験±標準偏差を表している。
【００８０】
図２中の棒の番号は下記のものを意味する。
１：未処理ＥＬ４細胞懸濁液。
２：エトポシド処理ＥＬ４細胞懸濁液。
３：エトポシド／ニコチナミド処理ＥＬ４細胞懸濁液。
【実施例】
【００８１】
以下、ピルビン酸塩、１３Ｃ−ピルビン酸塩及び１３Ｃ１−ピルビン酸塩という用語は互換的に使用され、すべてが１３Ｃ１−ピルビン酸塩を意味する。同様に、ピルビン酸、１３Ｃ−ピルビン酸及び１３Ｃ１−ピルビン酸という用語は互換的に使用され、すべてが１３Ｃ１−ピルビン酸を意味する。
【００８２】
実施例１：ＤＮＰ剤であるトリス（８−カルボキシ−２，２，６，６−テトラ（メトキシエチル）ベンゾ［１，２−４，５’］ビス−（１，３）ジチオール−４−イル）メチルナトリウム塩の合成
国際公開第９８／３９２７７号の実施例７に従って合成したトリス（８−カルボキシ−２，２，６，６−テトラ（ヒドロキシエチル）ベンゾ［１，２−４，５’］ビス−（１，３）ジチオール−４−イル）メチルナトリウム塩１０ｇ（７０ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下で２８０ｍｌのジメチルアセトアミド中に懸濁した。水素化ナトリウム（２．７５ｇ）、次いでヨウ化メチル（５．２ｍｌ）を添加し、わずかに発熱性の反応を３４℃の水浴中で１時間（６０分間）進行させた。水素化ナトリウム及びヨウ化メチルの添加は、それぞれ同量の化合物を用いて２回繰り返した。最後の添加後、混合物を室温で６８時間撹拌し、次いで５００ｍｌの水中に注ぎ込んだ。４０ｍｌの１Ｍ ＮａＯＨ（水溶液）を用いてｐＨをｐＨ＞１３に調整し、混合物を周囲温度で１５時間撹拌することで生成したメチルエステルを加水分解した。次に、５０ｍｌの２Ｍ ＨＣｌ（水溶液）を用いて混合物を約２のｐＨに酸性化し、酢酸エチル（５００ｍｌ及び２×２００ｍｌ）で３回抽出した。合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、次いで蒸発乾固させた。アセトニトリル／水を溶離剤として用いる分取ＨＰＬＣによって粗生成物（２４ｇ）を精製した。集めた画分を蒸発させてアセトニトリルを除去した。残った水相を酢酸エチルで抽出し、有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、次いで蒸発乾固させた。水（２００ｍｌ）を残留物に添加し、０．１Ｍ ＮａＯＨ（水溶液）を用いてｐＨを注意深く７に調整したが、この過程中に残留物は徐々に溶解した。中和後、水溶液を凍結乾燥した。
【００８３】
実施例２：乳酸塩及び過分極１３Ｃ１−ピルビン酸塩を含むイメージング剤の調製
実施例１のラジカルを１３Ｃ１−ピルビン酸（４４ｍｇ、９１％）に溶解することで１５ｍＭ溶液を調製した。試料を均質になるまで混合し、溶液を試料カップに入れ、ＤＮＰ分極装置内に挿入した。
【００８４】
ＤＮＰ条件下、３．３５Ｔの磁場中において１．２Ｋでマイクロ波（９４ＧＨｚ及び１００ｍＷ）を照射して試料を分極させた。分極に続いて固体状態ＮＭＲを実施した。９０分の過分極後、９４ｍＭ ＮａＯＨ、３０ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ及び５０ｍｇ／ｌ ＥＤＴＡの水溶液６ｍｌに試料を溶解した。溶解試料のｐＨは７．４であり、最終１３Ｃ１−ピルビン酸塩濃度は７５ｍＭであった。
【００８５】
得られた溶液２ｍｌを、１８ｍｇの乳酸リチウムを含む水５００μｌと混合することで、６０ｍＭの過分極１３Ｃ１−ピルビン酸塩及び７５ｍＭの乳酸塩を含むイメージング剤を得た。
【００８６】
実施例３：細胞培養物中における細胞死の検出
３．１  ＥＬ４細胞の前処理
ＥＬ４マウスリンパ腫細胞（１０８細胞）を、１６時間の暴露後に細胞死を誘発することが知られている化合物である１５μＭのエトポシド（ＰＣＨ Ｐｈａｒｍａｃｈｅｍｉｅ ＢＶ、ハルレエム）で処理した。別の細胞集合を、１５μＭのエトポシド及び２０ｍＭのニコチンアミド（公知のＰＡＲＰ阻害剤）で１６時間処理した。細胞死（アポトーシス及び壊死）はアクリジンオレンジ及びヨウ化プロピジウム染色によって確認した。１０％ＦＣＳを含む３７℃のＲＰＭＩ１６４０増殖培地で細胞を３回洗浄し、エトポシド処理及びエトポシド／ニコチンアミド処理ＥＬ４細胞懸濁液２ｍｌに、実施例２に係るイメージング剤２ｍｌを添加した。かくして、最終細胞懸濁液は３０ｍＭの過分極１３Ｃ１−ピルビン酸塩及び３７．５ｍＭの乳酸塩を含んでいた。
【００８７】
３．２  ＥＬ４細胞の１３Ｃ−ＭＲ分光法
３．１に記載したようなエトポシド処理ＥＬ４細胞懸濁液中の１３Ｃ−ピルビン酸塩及び１３Ｃ−乳酸塩からの１３Ｃ−信号強度を、イメージング剤の添加時刻から２４０秒の期間にわたって追跡した。９．４Ｔでの低フリップ角パルスを用いて毎秒１つの１３Ｃスペクトルを獲得し、全部で２４０のスペクトルを得た。エトポシドで処理しない（未処理）ＥＬ４リンパ腫細胞の対照品も上記に概説したようにして検査し、未処理及びエトポシド処理ＥＬ４細胞からの１３Ｃ−ピルビン酸塩及び１３Ｃ−乳酸塩のピーク強度をグラフ上にプロットした（図１）。
【００８８】
３．３  ＥＬ４細胞の１３Ｃ−ＭＲ分光法
３．１に記載したようなエトポシド処理及びエトポシド／ニコチンアミド処理ＥＬ４細胞懸濁液中の１３Ｃ−ピルビン酸塩及び１３Ｃ−乳酸塩からの１３Ｃ−信号強度を、イメージング剤の添加時刻から２４０秒の期間にわたって追跡した。９．４Ｔでの低フリップ角パルスを用いて毎秒１つの１３Ｃスペクトルを獲得し、全部で２４０のスペクトルを得た。エトポシドで処理しない（未処理）ＥＬ４リンパ腫細胞の対照品も上記に概説したようにして検査し、未処理、エトポシド処理及びエトポシド／ニコチンアミド処理ＥＬ４細胞からの１３Ｃ−ピルビン酸塩及び１３Ｃ−乳酸塩のピーク強度を比較した。修正ブロッホ式に基づく二部位交換モデルにデータを当てはめ、順方向及び逆方向交換１３Ｃの流れに関する速度定数を求めた。図２中の棒グラフは、３回の実験±標準偏差を表している。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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