(57)【要約】  新規な抗菌性化合物の設計と同定のための方法が提供される。これらの抗菌性化合物を含む医薬品組成物も提供される。の抗菌性化合物は原核生物の一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質のポリペプチドへの結合を禁止する。いくつかの例では、原核生物の一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質は原核生物のエキソヌクレアーゼＩである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む抗菌活性候補化合物のスクリーニング方法：
ａ）原核生物のＳＳＢを含む第一のポリペプチド、原核生物のＳＳＢに結合する第二のポリペプチドおよび候補化合物を反応させること；および
候補化合物の存在しない場合と比較して、候補化合物が第二のポリペプチドへの第一のポリペプチドの結合を阻害するかどうかを決定し、候補化合物の存在しない場合と比較して結合が阻害された場合に、候補化合物を抗菌化合物であると同定する。
【請求項２】
第一のポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸配列を有するポリペプチドのカルボキシテールに少なくとも９０％同一のカルボキシテールを含む原核生物のＳＳＢを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
第一のポリペプチドは、１から４個の保存的アミノ酸置換を有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸配列を有するポリペプチドのカルボキシテールを含む原核生物のＳＳＢを含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
原核生物のＳＳＢ−結合蛋白質を含む第二のポリペプチドは、１から２個の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列Ａｓｐ−ｌｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）を含むカルボキシテールを含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
原核生物のＳＳＢを含むポリペプチドは、Ａｓｐ−ｌｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）のアミノ酸配列を含むカルボキシテールを含む、請求項１記載の方法。
【請求項６】
原核生物のＳＳＢに結合するポリペプチドは、原核生物のエキソヌクレアーゼ、原核生物のＤＮＡポリメラーゼサブユニット、原核生物のプライマーゼ、原核生物のヘリカーゼ、原核生物のトポイソメラーゼまたは原核生物のＤＮＡ修復酵素である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
原核生物のＳＳＢに結合するポリペプチドは原核生物のエキソヌクレアーゼである、請求項１記載の方法。
【請求項８】
原核生物のＳＳＢに結合するポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸配列に少なくとも９０％同一である、請求項１記載の方法。
【請求項９】
同定工程は蛍光偏光を測定することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
原核生物のＳＳＢのＣ末端テールへのＳＳＢ−結合蛋白質の結合を阻害する方法であって、請求項１記載の方法で同定された抗菌化合物と、ＳＳＢ−結合蛋白質、および原核生物のＳＳＢのＣ末端テールとを接触させ、該抗菌化合物はＳＳＢ−結合蛋白質への原核生物のＳＳＢの結合を阻害する方法。
【請求項１１】
ＳＳＢ−結合蛋白質が原核生物のエキソヌクレアーゼＩである、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
請求項１記載の方法で同定された抗菌化合物と微生物を接触させることを含み、それにより微生物の成長を阻害する、微生物の成長阻害方法。
【請求項１３】
微生物はバクテリアである、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
アクセションコード３Ｃ９４の下で蛋白質データバンクで指定された原子座標を本質的に表わす、原核生物のＳＳＢのＣ末端テールに結合した原核生物のエキソヌクレアーゼＩの結晶構造の３次元モデル。
【請求項１５】
ａ）アクセションコード３Ｃ９４の下で蛋白質データバンクで指定された原子座標に本質的に類似する原子座標を有する候補化合物を同定すること；
ｂ）候補化合物を、原核生物のＳＳＢを含む第一のポリペプチド、および原核生物のＳＳＢに結合する第二のポリペプチドと接触させること；および
ｃ）第二のポリペプチドへの第一のポリペプチドの結合を分析すること；を含み、
ここで、候補化合物の非存在下における第二のポリペプチドへの第一のポリペプチドの結合が減少した場合に、候補化合物を抗菌化合物として同定することを含む方法。
【請求項１６】
接触は溶液中で行なわれる、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
接触はインシリコでシミュレートされる、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
同定された抗菌化合物を対象に投与して、化合物が対象中の微生物の成長を低減するかどうかを決定する工程（ｄ）をさらに含む、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
表６中で指定された原子の座標を本質的に表わす、化合物９に結合した原核生物のエキソヌクレアーゼＩの結晶構造の３次元モデル。
【請求項２０】
ａ）表６中で指定された化合物９の原子座標に本質的に類似する原子座標を有する候補化合物を同定すること；
ｂ）候補化合物と、原核生物のＳＳＢを含むポリペプチド、および原核生物のＳＳＢに結合するポリペプチドとを接触させること；および
ｃ）原核生物のＳＳＢに結合するポリペプチドへの、原核生物のＳＳＢを含むポリペプチドの結合を分析すること；を含み、
ここで、候補化合物の非存在下における、原核生物のＳＳＢに結合するポリペプチドへの原核生物のＳＳＢを含むポリペプチドの結合が減少した場合に、候補化合物を抗菌化合物であると同定することを含む方法。
【請求項２１】
接触は溶液中で行なわれる、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
接触はインシリコでシミュレートされる、請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
同定された抗菌の化合物を対象に投与して、化合物が対象中の微生物の成長を低減するかどうかを決定する工程（ｄ）をさらに含む、請求項２０記載の方法。
【請求項２４】
表７中で指定された原子の座標を本質的に表わす、化合物１０に結合した原核生物のエキソヌクレアーゼＩの結晶構造の３次元モデル。
【請求項２５】
ａ）表７中で指定された化合物１０の原子座標に本質的に類似する原子座標を有する候補化合物を同定すること；  
ｂ）候補化合物と、原核生物のＳＳＢを含むポリペプチド、および原核生物のＳＳＢに結合するポリペプチドとを接触させること；および  
ｃ）原核生物のＳＳＢに結合するポリペプチドへの、原核生物のＳＳＢを含むポリペプチドの結合を分析すること；を含み、  
ここで、候補化合物の非存在下における、原核生物のＳＳＢに結合するポリペプチドへの原核生物のＳＳＢを含むポリペプチドの結合が減少した場合に、候補化合物を抗菌化合物であると同定することを含む方法。
【請求項２６】
接触は溶液中で行なわれる、  請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
接触はインシリコでシミュレートされる、請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
同定された抗菌の化合物を対象に投与して、化合物が対象中の微生物の成長を低減するかどうかを決定する工程（ｄ）をさらに含む、  請求項２５記載の方法。
【請求項２９】
以下を含む、原核生物のＳＳＢのＣ末端テールへの原核生物のエキソヌクレアーゼＩの結合を阻害する方法：
ａ）アクセションコード３Ｃ９４の下で蛋白質データバンクで指定された原子の座標に本質的に類似する原子座標を有する候補化合物をデザインすること；および
ｂ）候補化合物と、原核生物のエキソヌクレアーゼＩ、および原核生物のＳＳＢと接触させること；を含み、
ここで、候補化合物は、原核生物のＳＳＢへの原核生物のエキソヌクレアーゼＩの結合を阻害する。
【請求項３０】
接触は溶液中で行なわれる、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
接触はインシリコでシミュレートされる、請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
以下の式を有する合物と微生物とを接触させることを含む、微生物の成長を阻害する方法：
【化１】
2010528293.tif 000163
式中、ＹはＣＨ２、ＯおよびＮＨからなる群から選択される；
Ｒ１はＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩからなる群から選択される；
Ｒ２はＨ、およびＣＦ３からなる群から選択される；
Ｒ３はＨ、およびＣＯ２Ｈからなる群から選択される；
Ｒ４はＨ、およびＯＨからなる群から選択される；および
Ｒ５はＨ、およびアルコキシル基［ＯＣＨ３］およびＮＯ２からなる群から選択される。
【請求項３３】
以下の式を有する化合物と微生物と接触させることを含む、請求項３２記載の方法：
【化２】
2010528293.tif 000164
式中、ＹはＣＨ２、ＯおよびＮＨからなる群から選択される；  
Ｒ１はＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩからなる群から選択される；  
Ｒ２はＨ、およびＣＦ３からなる群から選択される；
Ｒ３はＨ、およびＣＯ２Ｈからなる群から選択される；
Ｒ４はＨ、およびＯＨからなる群から選択される；および
Ｒ５はＨ、およびアルコキシル基およびＮＯ２からなる群から選択される。
【請求項３４】
ＹがＮＨを表わし、Ｒ１はＣｌを表わし、Ｒ２はＣＦ３を表わし、Ｒ３はＣＯ２Ｈを表わし、Ｒ４はＨを表わし、Ｒ５はＯＣＨ３を表わす、請求項３２記載の方法。
【請求項３５】
ＹがＮＨを表わし、Ｒ１はＨを表わし、Ｒ２はＣＦ３を表わし、Ｒ３はＣＯ２Ｈを表わし、Ｒ４はＨを表わし、Ｒ５はＨを表わす、請求項３２記載の方法。
【請求項３６】
ＹがＯを表わし、Ｒ１はＣｌを表わし、Ｒ２はＣＦ３を表わし、Ｒ３はＨを表わし、Ｒ４はＯＨを表わし、Ｒ５はＮＯ２を表わす、請求項３２記載の方法。
【請求項３７】
以下の式を有する化合物と微生物と接触させることを含む、微生物の成長を阻害する方法：
【化３】
2010528293.tif 000165
式中、Ｒ１はＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩからなる群から選択される；  
Ｒ２はＨ、アルキル基、およびＣＦ３からなる群から選択される；  
Ｒ３はＨ、およびアルキル基からなる群から選択される；  
Ｒ４はＨ、Ｏ、およびＯＨからなる群から選択される；
ここでＲ４がＯの時には、Ｒ３は水素であり、Ｒ３とＲ４の間の一対の炭素の間には単結合が存在し、Ｒ４がＨまたはＯＨの時には、Ｒ３とＲ４の間の一対の炭素の間には二重結合が存在する。
【請求項３８】
以下の式を有する化合物と微生物と接触させることを含む、請求項３７記載の方法：  
【化４】
2010528293.tif 000166
式中、Ｒ１はＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩからなる群から選択される；
Ｒ２はＨ、アルキル基、およびＣＦ３からなる群から選択される；
Ｒ３はＨ、およびアルキル基からなる群から選択される；  
Ｒ４はＨ、Ｏ、およびＯＨからなる群から選択される；  
ここでＲ４がＯの時には、Ｒ３は水素であり、Ｒ３とＲ４の間の一対の炭素の間には単結合が存在し、Ｒ４がＨまたはＯＨの時には、Ｒ３とＲ４の間の一対の炭素の間には二重結合が存在する。
【請求項３９】
Ｒ１がＣｌを表わし、Ｒ２はアルキル基を表し、Ｒ３はＨを表わし、Ｒ４はＯを表わす、請求項３７記載の方法。
【請求項４０】
Ｒ１がＨを表わし、Ｒ２はアルキル基を表し、Ｒ３はアルキル基を表し、Ｒ４はＯＨを表わす、請求項３７記載の方法。
【請求項４１】
Ｒ１がＨを表わし、Ｒ２はアルキル基を表し、Ｒ３はＨを表わし、Ｒ４はＯを表わす、請求項３７記載の方法。
【請求項４２】
Ｒ１がＨを表わし、Ｒ２はアルキル基を表し、Ｒ３はＨを表わし、Ｒ４はＯＨを表わす、請求項３７記載の方法。
【請求項４３】
Ｒ１がＣｌを表わし、Ｒ２はアルキル基を表し、Ｒ３はＨを表わし、Ｒ４はＯを表わす、請求項３７記載の方法。
【請求項４４】
以下の式を有する合物と微生物とを接触させることを含む、微生物の成長を阻害する方法：  
【化５】
2010528293.tif 000167
式中、Ｒ１はＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩからなる群から選択される；
Ｒ２はＨ、アルキル基、およびＣＦ３からなる群から選択される；  
Ｒ３はＨ、アルキル基、およびＣＦ３からなる群から選択される。
【請求項４５】
以下の式を有する合物と微生物とを接触させることを含む、請求項４４記載の方法：
【化６】
2010528293.tif 000168
式中、Ｒ１はＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩからなる群から選択される；
Ｒ２はＨ、アルキル基、およびＣＦ３からなる群から選択される；  
Ｒ３はＨ、アルキル基、およびＣＦ３からなる群から選択される。
【請求項４６】
Ｒ１がＣｌを表わし、Ｒ２はアルキル基を表し、Ｒ３はアルキル基を表わす、請求項４４記載の方法。
【請求項４７】
以下の式を有する合物と微生物とを接触させることを含む、微生物の成長を阻害する方法：  
【化７】
2010528293.tif 000169
式中、Ｒ１はＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩからなる群から選択される；  
Ｒ２はＨ、アルキル基、およびＣＦ３からなる群から選択される；  
Ｒ３はフェニルおよびベンジルからなる群から選択される。
【請求項４８】
以下の式を有する合物と微生物とを接触させることを含む、請求項４７記載の方法：  
【化８】
2010528293.tif 000170
式中、Ｒ１はＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩからなる群から選択される；  
Ｒ２はＨ、アルキル基、およびＣＦ３からなる群から選択される；  
Ｒ３はフェニルおよびベンジルからなる群から選択される。
【請求項４９】
Ｒ１がＢｒを表わし、Ｒ２はＨを表わし、Ｒ３はフェニル基を表わす、請求項４７記載の方法。
【請求項５０】
Ｒ１がＨを表わし、Ｒ２はアルキル基を表し、Ｒ３はフェニル基を表わす、請求項４７記載の方法。
【請求項５１】
以下の式を有する化合物を活性成分として含む抗菌性医薬品の組成物：
【化９】
2010528293.tif 000171
式中、ＹはＣＨ２、ＯおよびＮＨからなる群から選択される；  
Ｒ１はＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩからなる群から選択される；
Ｒ２はＨ、およびＣＦ３からなる群から選択される；  
Ｒ３はＨ、およびＣＯ２Ｈからなる群から選択される；  
Ｒ４はＨ、およびＯＨからなる群から選択される；および  
Ｒ５はＨ、およびアルコキシル基［ＯＣＨ３］およびＮＯ２からなる群から選択される。  
【請求項５２】
ＹがＮＨを表わし、Ｒ１はＣｌを表わし、Ｒ２はＣＦ３を表わし、Ｒ３はＣＯ２Ｈを表わし、Ｒ４はＨを表わし、Ｒ５はＯＣＨ３を表わす、請求項５１記載の組成物。  
【請求項５３】
ＹがＮＨを表わし、Ｒ１はＨを表わし、Ｒ２はＣＦ３を表わし、Ｒ３はＣＯ２Ｈを表わし、Ｒ４はＨを表わし、Ｒ５はＨを表わす、請求項５１記載の組成物。  
【請求項５４】
ＹがＯを表わし、Ｒ１はＣｌを表わし、Ｒ２はＣＦ３を表わし、Ｒ３はＨを表わし、Ｒ４はＯＨを表わし、Ｒ５はＮＯ２を表わす、請求項５１記載の組成物。
【請求項５５】
請求項５１記載の医薬品組成物を治療上有効な量で対象に投与する工程を含む、微生物に感染された対象を処理する方法。
【請求項５６】
以下の式を有する化合物を活性成分として含む抗菌性医薬品の組成物：
【化１０】
2010528293.tif 000172
式中、Ｒ１はＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩからなる群から選択される；  
Ｒ２はＨ、アルキル基、およびＣＦ３からなる群から選択される；  
Ｒ３はＨ、およびアルキル基からなる群から選択される；  
Ｒ４はＨ、Ｏ、およびＯＨからなる群から選択される；  
ここでＲ４がＯの時には、Ｒ３は水素であり、Ｒ３とＲ４の間の一対の炭素の間には単結合が存在し、Ｒ４がＨまたはＯＨの時には、Ｒ３とＲ４の間の一対の炭素の間には二重結合が存在する。
【請求項５７】
Ｒ１がＣｌを表わし、Ｒ２はアルキル基を表し、Ｒ３はＨを表わし、Ｒ４はＯを表わす、請求項５６記載の組成物。
【請求項５８】
Ｒ１がＨを表わし、Ｒ２はアルキル基を表し、Ｒ３はアルキル基を表し、Ｒ４はＯＨを表わす、請求項５６記載の組成物。
【請求項５９】
Ｒ１がＨを表わし、Ｒ２はアルキル基を表し、Ｒ３はＨを表わし、Ｒ４はＯを表わす、請求項５６記載の組成物。
【請求項６０】
Ｒ１がＨを表わし、Ｒ２はアルキル基を表し、Ｒ３はＨを表わし、Ｒ４はＯＨを表わす、請求項５６記載の組成物。
【請求項６１】
Ｒ１がＣｌを表わし、Ｒ２はアルキル基を表し、Ｒ３はＨを表わし、Ｒ４はＯを表わす、請求項５６記載の組成物。
【請求項６２】
請求項５６記載の医薬品組成物を治療上有効な量で対象に投与する工程を含む、微生物に感染された対象を処理する方法。
【請求項６３】
以下の式を有する化合物を活性成分として含む抗菌性医薬品組成物：  
【化１１】
2010528293.tif 000173
式中、Ｒ１はＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩからなる群から選択される；  
Ｒ２はＨ、アルキル基、およびＣＦ３からなる群から選択される；  
Ｒ３はＨ、アルキル基、およびＣＦ３からなる群から選択される。  
【請求項６４】
Ｒ１がＣｌを表わし、Ｒ２はアルキル基を表し、Ｒ３はアルキル基を表わす、請求項６３記載の組成物。
【請求項６５】
請求項６３記載の医薬品組成物を治療上有効な量で対象に投与する工程を含む、微生物に感染された対象を処理する組成物。
【請求項６６】
以下の式を有する化合物を活性成分として含む抗菌性医薬品組成物：
【化１２】
2010528293.tif 000174
式中、Ｒ１はＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩからなる群から選択される；  
Ｒ２はＨ、アルキル基、およびＣＦ３からなる群から選択される；  
Ｒ３はフェニル基およびベンジル基からなる群から選択される。  
【請求項６７】
Ｒ１がＢｒを表わし、Ｒ２はＨを表わし、Ｒ３はフェニル基を表わす、請求項６６記載の組成物。
【請求項６８】
Ｒ１がＨを表わし、Ｒ２はアルキル基を表わし、Ｒ３はフェニル基を表わす、請求項６６記載の組成物。
【請求項６９】
請求項６６記載の医薬品組成物を治療上有効な量で対象に投与する工程を含む、微生物に感染された対象を処理する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照される関連出願
本発明は、参照されここに組込まれる、２００７年５月２２日に出願された米国仮特許出願番号６０／９３１，４１１への優先権を主張する。
政府の権利
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所によって与えられた米国国庫補助番号ＧＭ０６８０６１により行われた。米国政府は本発明について一定の権利を有している。
本発明の分野
【０００３】
本発明は、新規な抗菌化合物をスクリーニングするための技術分野に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
新たなバクテリアの病原体と同様にバクテリアの抗生物質耐性株も、世界の健康に対して高まる脅威を生み出す。また、これらの脅威に対抗するために必要な抗生物質の開発は先の数十年間の間に劇的に遅くなり、人類をこれらの危険に対して弱いまま放置している（Ｋａｔｚら、２００６，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：１５２９−１５３１；Ｐａｙｎｅら、２００７，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ６：２９−４０）。最も新しく開発された抗生物質は、単に既に開発された前の世代の抗生物質について示された脆弱な経路のうちの１つを目標としている。これらの医薬品は有効であるが、それらに対する抵抗性は驚くべき速度で上昇しており、追加のバクテリアの分子または細胞の作用をターゲットとする、抗生物質の必要を示唆する。
【０００５】
バクテリア中の一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質（ＳＳＢ）は、少なくとも１ダースの他のＤＮＡ複製、ＤＮＡ組換えおよびＤＮＡ修復タンパク質と本質的に分子間錯体を形成する（Ｍｏｌｉｎｅｕｘ  ａｎｄ  Ｇｅｆｔｅｒ，１９７５，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．９８：８１１−８２５；Ｂｕｔｌａｎｄら、２００５，Ｎａｔｕｒｅ  ４３３：５３１−５３７）。さらに、ＳＳＢタンパク質は、様々なゲノム・メンテナンス・タンパク質との相互作用によって重要な生命上の役割を果たす。すべてではないにしてもこれらの相互作用のいくつかのものは、ＳＳＢからのほぼ８−１０のカルボキシ末端残基によって取り次がれることが知られている。それは、バクテリアのＳＳＢの中に高度に保存されるが、真核生物のＳＳＢでは見つからないペプチド・シーケンスを形成する（Ｓａｎｄｉｇｕｒｓｋｙら、１９９６，Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｒｅｓ．１４５：６１９−６２３；Ｃｕｒｔｈら、１９９６，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：２７０６−２７１１；Ｇｅｎｓｃｈｅｌら、２０００，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８１：１８３−１９２）。従来の研究は、ＳＳＢからのこの相互作用シーケンス内での突然変異あるいは欠失が、バクテリアの生存度に劇的な効果があることを示した、この部位との適切なタンパク質相互作用の形成が細菌増殖には重要であることを示した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ＭｏｌｉｎｅｕｘおよびＧｅｆｔｅｒ，１９７５，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．９８：８１１−８２５；
【非特許文献２】Ｂｕｔｌａｎｄら、２００５，Ｎａｔｕｒｅ  ４３３：５３１−５３７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＳＳＢはすべての生物体について見出される重要なタンパク質ファミリーであり、ＤＮＡ代謝のほぼすべての面において様々な本質的な役割を果たす。ＳＳＢは、ＤＮＡ複製、組換えおよび修復の際に生じるセンシティブな一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）中間体と結合して保護する。ＳＳＢは、ｓｓＤＮＡへのゲノム・メンテナンス・タンパク質を補充し、ｓｓＤＮＡ分解、複製開始、相同遺伝子組換えの開始、超コイルＤＮＡの弛緩および多数の他のゲノム・メンテナンス・プロセスに助けになる役割を果たす。ＳＳＢの欠失は、致死に至ることが示されている。既知のすべてのＳＳＢが細胞において同様の役割を果たすので、バクテリアのＳＳＢを禁じる化合物が見いだされれば、真核細胞に同様の効果がありえる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
概略
新しいクラスの抗菌化合物の発生が期待できる目標として、ＳＳＢを含むインタフェースが使用されてもよいことが見出された。本発明の方法は原核生物の一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質を含むポリペプチド、原核生物の一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質に結合するポリペプチドおよび候補化合物を反応させ、原核生物の一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質に結合するポリペプチドへの、原核生物の一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質を含むポリペプチドの結合について分析し、候補化合物の非存在下での、原核生物の一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質に結合するポリペプチドの、原核生物の一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質を含むポリペプチドの結合の減少は、候補化合物が抗菌化合物であると同定することを含むものとして提供される。方法を実施する際には、原核生物の一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質を含むポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸配列を有するポリペプチドのカルボキシテール（ｃａｒｂｏｘｙ−ｔａｉｌ）、または１から４の保存的アミノ酸置換を有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸配列を備えたポリペプチドのカルボキシテールに、少なくとも９０％同一のカルボキシテールを有する。原核生物の一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質ポリペプチドを含むポリペプチドは、アミノ酸配列Ａｓｐ−ｌｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、または１から２つの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列Ａｓｐ−ｌｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）を含むカルボキシテールを含むことができる。
【０００９】
方法の実施の際には、原核生物の一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質に結合するポリペプチドは、エキソヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼサブユニット、プライマーゼ、ヘリカーゼ、トポイソメラーゼ、ＤＮＡ修復酵素などを含むことができる。１例において、原核生物の一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質に結合するポリペプチドは、エキソヌクレアーゼＩを含んでいる。原核生物の一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質に結合するポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸配列に少なくとも９０％同一であることができる。本発明方法は、蛍光偏光測定法を含むアッセイを含むことができる。
【００１０】
原核生物のＳＳＢのＣ末端テール（Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｔａｉｌ）へのＳＳＢ結合蛋白質の結合を禁止する方法が提供される。本発明の方法は上記で同定された抗菌化合物、ＳＳＢ結合蛋白質、および原核生物のＳＳＢのＣ末端テールとを反応させることを含み、抗菌化合物が原核生物のＳＳＢの、ＳＳＢ−結合蛋白質への結合を禁止する。ＳＳＢ結合蛋白質はエキソヌクレアーゼであることができる。また、いくつかの実施態様では、ＳＳＢ結合蛋白質は原核生物のエキソヌクレアーゼＩであることができる。
【００１１】
微生物の成長を禁止する方法が提供される。この方法は上記で同定された抗菌化合物を微生物と接触させ、それにより微生物の成長を禁止することを含む。
【００１２】
原核生物のＳＳＢのＣ末端テールに結合された原核生物のエキソヌクレアーゼＩの結晶構造の三次元モデルが提供される。１つの実施態様では、モデルは本質的に、アクセションコード３Ｃ９４の下で蛋白質データバンクで指定された原子座標を表わす。
以下を含む方法が提供される：
ａ）原核生物の一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質のＣ末端テールに結合されているエキソヌクレアーゼＩの結晶構造の三次元モデルを使用して、候補化合物を同定すること、ここで該モデルはアクセションコード３Ｃ９４の下で蛋白質データバンクで指定された原子の座標を本質的に表わす；
ｂ）  候補化合物を、原核生物の一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質を含むポリペプチド、および原核生物の一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質に結合するポリペプチドと接触させること；および
ｃ）原核生物の一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質に結合するポリペプチドへの、原核生物の一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質を含むポリペプチドの結合をアッセイすること；
ここで候補化合物の非存在下での、原核生物の一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質に結合するポリペプチドへの、原核生物の一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質を含むポリペプチドの結合の減少は、候補化合物を抗菌化合物であると同定する。接触は溶液中で行なわれることができる。
あるいは、接触はインシリコ（ｉｎ−ｓｉｌｉｃｏ）でシミュレートされることができる。本発明の方法は、さらに化合物が対象中で微生物の成長を低減するかどうかを決めるために、対象への同定された抗菌化合物を投与する工程（ｄ）を含むことができる。これらの方法によって同定された化合物が提供される。活性成分としてこれらの方法によって同定された化合物を含む抗菌医薬品組成物も提供される。
【００１３】
原核生物のＳＳＢのＣ末端テールへの原核生物のエキソヌクレアーゼ  Ｉの結合を禁止する方法が提供される。この方法は次のものを含む：
ａ）原核生物のＳＳＢのＣ末端テールに結合されている原核生物のエキソヌクレアーゼＩの結晶構造の三次元モデルを使用して、候補化合物を設計すること、ここで該モデルはアクセションコード３Ｃ９４の下で蛋白質データバンクで指定された原子の座標を本質的に表わす；および
ｂ）  候補化合物とエキソヌクレアーゼ  Ｉ、および原核生物のＳＳＢとを接触させる、ここで候補化合物は原核生物のＳＳＢへの原核生物のエキソヌクレアーゼ  Ｉの結合を禁止する。
接触は溶液で行なわれることができる。あるいは、接触はインシリコでシミュレートされることができる。
【００１４】
本発明によって同定された化合物へ結合した原核生物のエキソヌクレアーゼＩの結晶構造の三次元モデルが提供される。例えば、化合物９に結合した原核生物のエキソヌクレアーゼＩの結晶構造の３次元モデルが提供される。そこではモデルは、表６の中で指定された原子座標を本質的に表わす。同様に、化合物１０に結合した原核生物のエキソヌクレアーゼＩの結晶構造の３次元モデルが提供される。そこではモデルは、表７の中で指定された原子座標を本質的に表わす。
以下を含む方法が提供される：
ａ）化合物９または１０に結合したエキソヌクレアーゼＩの結晶構造の３次元モデルを使用して、候補化合物をそれぞれ同定すること、ここでモデルはそれぞれ表７および８の中で指定された原子座標を本質的に表わす；
ｂ）候補化合物と、原核生物の一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質を含むポリペプチド、および原核生物の一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質に結合したポリペプチドを接触させる；および
ｃ）原核生物の一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質に結合するポリペプチドへの、原核生物の一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質を含むポリペプチドの結合をアッセイすること；ここで候補化合物の非存在下での、原核生物の一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質に結合するポリペプチドへの、原核生物の一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質を含むポリペプチドの結合の減少は、候補化合物を抗菌化合物であると確認する
接触は溶液で行なわれることができる。あるいは、接触はインシリコでシミュレートされることができる。本発明の方法は、さらに化合物が対象中で微生物の成長を低減するかどうかを決めるために、対象への同定された抗菌化合物を投与する工程（ｄ）を含むことができる。これらの方法によって同定された化合物が提供される。活性成分としてこれらの方法によって同定された化合物を含む抗菌医薬品組成物も提供される。
【００１５】
上記のように同定された抗菌化合物と微生物を接触させ、それにより微生物の成長を禁止することを含む微生物の成長を禁止する方法が提供される。
【００１６】
上記のように同定された抗菌化合物活性成分として含む抗菌医薬品組成物が提供される。さらに治療上有効な量で、新規な医薬品組成物を投与する工程を含む、微生物に感染された対象を処理する方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は阻害剤３によるペプチド結合の阻害を示すグラフである。
【図２】図２は阻害剤９によるペプチド結合の阻害を示すグラフである。
【図３】図３は阻害剤１０によるペプチド結合の阻害を示すグラフである。
【図４】図４は阻害剤３２によるペプチド結合の阻害を示すグラフである。
【図５】図５は阻害剤３７によるペプチド結合の阻害を示すグラフである。
【図６】図６は、阻害剤４６によるペプチド結合の阻害と、阻害剤３１よるペプチド結合の阻害を示すグラフである。
【図７】図７はＷＴペプチドによるペプチド結合の阻害を示すグラフである。
【図８】図８は、阻害剤３による大腸菌４２１３（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ４２１３）の成長の阻害を示すグラフである。
【図９】図９は、阻害剤８による大腸菌４２１３の成長の阻害を示すグラフである。
【図１０】図１０は、阻害剤９による大腸菌４２１３の成長の阻害を示すグラフである。
【図１１】図１１は、阻害剤１０による大腸菌４２１３の成長の阻害を示すグラフである。
【図１２】図１２は、阻害剤２８による大腸菌４２１３の成長の阻害を示すグラフである。
【図１３】図１３は、阻害剤２９による大腸菌４２１３の成長の阻害を示すグラフである。
【図１４】図１４は、阻害剤３１による大腸菌４２１３の成長の阻害を示すグラフである。
【図１５】図１５は、阻害剤３２による大腸菌４２１３の成長の阻害を示すグラフである。
【図１６】図１６は、阻害剤３７による大腸菌４２１３の成長の阻害を示すグラフである。
【図１７】図１７は、阻害剤３による黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の成長の阻害を示すグラフである。
【図１８】図１８は、阻害剤８による黄色ブドウ球菌の成長の阻害を示すグラフである。
【図１９】図１９は、阻害剤９による黄色ブドウ球菌の成長の阻害を示すグラフである。
【図２０】図２０は、阻害剤１０による黄色ブドウ球菌の成長の阻害を示すグラフである。
【図２１】図２１は、阻害剤３２による黄色ブドウ球菌の成長の阻害を示すグラフである。
【図２２】図２２は、阻害剤３７による黄色ブドウ球菌の成長の阻害を示すグラフである。
【図２３】図２３は、阻害剤４２による黄色ブドウ球菌の成長の阻害を示すグラフである。
【図２４】図２４は様々の阻害剤の存在下および非存在下での、トポイソメラーゼＩＩＩペプチド結合を示すグラフである。
【図２５Ａ】図２５Ａは、大腸菌Ｅｘｏｌ／ＳＳＢ−Ｃｔ錯体の構造を示す。
【図２５Ｂ】図２５Ｂは、大腸菌Ｅｘｏｌ／ＳＳＢ−Ｃｔ錯体の構造を示す。
【図２５Ｃ】図２５Ｃは、大腸菌Ｅｘｏｌ／ＳＳＢ−Ｃｔ錯体の構造を示す。
【図２５Ｄ】図２５Ｄは、大腸菌Ｅｘｏｌ／ＳＳＢ−Ｃｔ錯体の構造を示す。
【図２５Ｅ】図２５Ｅは、大腸菌Ｅｘｏｌ／ＳＳＢ−Ｃｔ錯体の構造を示す。
【図２５Ｆ】図２５Ｆは、大腸菌Ｅｘｏｌ／ＳＳＢ−Ｃｔ錯体の構造を示す。
【図２６Ａ】図２６Ａは、平衡結合がＳＳＢ−Ｃｔ結合中のペプチド−Ａ結合部位およびベーシック  リッジ（ｂａｓｉｃ  ｒｉｄｇｅ）の役割を強調することを例証する。
【図２６Ｂ】図２６Ｂは、平衡結合がＳＳＢ−Ｃｔ結合中のペプチド−Ａ結合部位およびベーシック  リッジ（ｂａｓｉｃ  ｒｉｄｇｅ）の役割を強調することを例証する。
【図２６Ｃ】図２６Ｃは、平衡結合がＳＳＢ−Ｃｔ結合中のペプチド−Ａ結合部位およびベーシック  リッジ（ｂａｓｉｃ  ｒｉｄｇｅ）の役割を強調することを例証する。
【図２６Ｄ】図２６Ｄは、平衡結合がＳＳＢ−Ｃｔ結合中のペプチド−Ａ結合部位およびベーシック  リッジ（ｂａｓｉｃ  ｒｉｄｇｅ）の役割を強調することを例証する。
【図２６Ｅ】図２６Ｅは、平衡結合がＳＳＢ−Ｃｔ結合中のペプチド−Ａ結合部位およびベーシック  リッジ（ｂａｓｉｃ  ｒｉｄｇｅ）の役割を強調することを例証する。
【図２７Ａ】図２７Ａは、Ｅｘｏｌ／ＳＳＢの物理的な相互作用が、Ｅｘｏｌ活性のＳＳＢシミュレーションにとって不可欠であるかを例証する。
【図２７Ｂ】図２７Ｂは、Ｅｘｏｌ／ＳＳＢの物理的な相互作用が、Ｅｘｏｌ活性のＳＳＢシミュレーションにとって不可欠であるかを例証する。
【図２７Ｃ】図２７Ｃは、Ｅｘｏｌ／ＳＳＢの物理的な相互作用が、Ｅｘｏｌ活性のＳＳＢシミュレーションにとって不可欠であるかを例証する。
【図２７Ｄ】図２７Ｄは、Ｅｘｏｌ／ＳＳＢの物理的な相互作用が、Ｅｘｏｌ活性のＳＳＢシミュレーションにとって不可欠であるかを例証する。
【図２７Ｅ】図２７Ｅは、Ｅｘｏｌ／ＳＳＢの物理的な相互作用が、Ｅｘｏｌ活性のＳＳＢシミュレーションにとって不可欠であるかを例証する。
【図２８】図２８はＳＳＢ−ＣｔペプチドＡおよびＢについての、Ｆｏ−Ｆｃを省略した電子密度地図を示す。
【図２９Ａ】図２９Ａは、ＳＳＢ−ＣｔペプチドＡと会合するＥｘｏｌヘリカルドメインからの２つのグルタミン残基の結晶学的な会合を示す。
【図２９Ｂ】図２９Ｂは、ＳＳＢ−ＣｔペプチドＡと会合するＥｘｏｌヘリカルドメインからの２つのグルタミン残基の結晶学的な会合を示す。
【図２９Ｃ】図２９Ｃは、ＳＳＢ−ＣｔペプチドＡと会合するＥｘｏｌヘリカルドメインからの２つのグルタミン残基の結晶学的な会合を示す。
【図２９Ｄ】図２９Ｄは、ＳＳＢ−ＣｔペプチドＡと会合するＥｘｏｌヘリカルドメインからの２つのグルタミン残基の結晶学的な会合を示す。
【図３０】図３０は、Ｅｘｏｌ  ＳＳＢ−Ｃｔ結合部位（Ａ）と、大腸菌ＲｅｃＱウイグド−ヘリックスドメインの表面上部位（Ｂ）との類似性を示す。本発明の好ましい実施態様の詳細な説明
【００１８】
抗生物質開発用の新規で選択的な目標が提供される。本発明の化合物およびアッセイは、ＳＳＢとその目標蛋白質の間の相互作用を選択的に抑制する分子の同定に使用できる。そのような分子は新規であり、広汎なスペクトルを有する抗生物質として使用されることができる。あるいは、そのような分子は化学的に変成されることができる。すなわち、それらは広汎なスペクトルを有する抗生物質の開発のための出発物質に使用されることができる。本発明の組成物は、微生物の成長を抑制する方法において使用されることができる。それらは消毒剤として使用されることができる。それらは、医薬品組成物の中で活性成分として使用されることができる。また、さらに、それらは微生物が感染した対象を処理する方法に使用されることができる。用語「対象」は、患者、正常なボランティア、霊長類のような非人間の哺乳動物およびさらに他の動物を含むように意図される。
【００１９】
１つの態様では、本発明は、新規な抗菌化合物およびそれを同定する方法に関する。「抗菌物質」は、バクテリア（抗バクテリア活性）、菌類（抗真菌活性）、ウィルス（抗ウィルス活性）または寄生生物（駆虫活性）のような微生物を殺すかまたはその成長を抑制する物質である。「抗生物質」は一般に細菌感染を治療するために使用される抗菌物質である。
【００２０】
本発明は、バクテリアの成長を抑制できる小さな分子の形をしている抗菌化合物の同定に特に適合する。いくつかの例において、その成長が本発明の化合物を使用して抑制されるバクテリアは、グラム陰性細菌、例えば大腸菌である。他の例において、その成長が本発明の化合物を使用して抑制されるバクテリアは、グラム陽性細菌、例えば黄色ブドウ球菌である。本発明は、グラム陽性細菌またはグラム陰性細菌として必ずしも分類されないバクテリア、例えばデイノコッカス−ラジオデュランス、および結核菌のようなマイコバクテリア、およびさらにここに記載されるようなＣ末端残基を保存した他のバクテリアに使用できる。
【００２１】
１つの実施態様では、本発明は、一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質の高度に保存されたＣ末端テールによってメディエートされた蛋白質錯体形成を阻害する化合物の同定を提供する。それは化学療法の新規なクラスに結びつくことがある。用語「ＳＳＢ」は一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質をいう。本発明のいくつかの実施態様では、大腸菌ＳＳＢは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド配列を有し、またＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸配列を有している．
【００２２】
本発明の原核生物のＳＳＢは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の多形性の変形、突然変異体および異種間の同族体であるポリペプチドを含む。本発明の原核生物のＳＳＢは、さらにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の機能的な等価物またはフラグメントを含む。本発明のポリペプチドの「機能的なフラグメント」または「機能的な等価物」または「機能的な同族体」は、特定のポリペプチドの同族であるが、特定のポリペプチドと１つ以上のアミノ酸の相違を有しているポリペプチドをいう。ポリペプチドの機能的なフラグメントまたは等価物は、全部でなくても、少なくとも幾分かの特定のポリペプチドの活性を保持する。
【００２３】
本明細書で使用される用語「ゲノム・メンテナンス」は、ゲノムの構造およびインテグリティの維持をいう。一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質（ＳＳＢ）のような蛋白質はゲノム・メンテナンスに関係することがある。
【００２４】
蛋白質またはポリペプチドの「カルボキシテール」（カルボキシテール、カルボキシル末端（ｃａｒｂｏｘｙ  ｔｅｒｍｉｎｕｓ）、カルボキシ終点、Ｃ−末端エンド（Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｅｎｄ）、Ｃ末端（Ｃ−ｔｅｒｍｉｎｕｓ）またはＣＯＯＨ終点（ＣＯＯＨ−ｔｅｒｍｉｎｕｓ）としても知られている）は、遊離カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）で終了したアミノ酸鎖の末端である。本発明の目的のためには、蛋白質のＣ−末端は、蛋白質のＣ末端のおよそ１０−２０のアミノ酸を包含する。ＳＳＢのＣ末端は本明細書においてＳＳＢ−Ｃｔとも呼ばれる。
【００２５】
規範の原核生物のＳＳＢは４つの同一のサブユニットからなるホモ四量体であり、それぞれの単量体単位はオリゴヌクレオチド／オリゴサッカライド結合（ＯＢ）−ｆｏｌｄから成り、無秩序Ｃ末端テールが続く。Ｃ末端テールの最終１０アミノ酸は、バクテリア中に非常に高度に保存され、大腸菌中の生存度にとって不可欠である。しかし、それらは真核生物・ミトコンドリアのＳＳＢには顕著に非存在である。大腸菌ＳＳＢのＣ末端テールは、ＳＳＢと、トポイソメラーゼＩＩＩ、ＰｒｉＡ  ＤＮＡヘリカーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩのカイ・サブユニット、ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼおよびエキソヌクレアーゼＩを含むＳＳＢの機能的なパートナーの多く（すべてではないにしても）との間の一次相互反応サイトである。ＳＳＢのＣ末端テールの除去は、ＳＳＢのＤＮＡ結合能力に効果がほとんどない。しかし、それにもかかわらずそれは大腸菌に致死である。
【００２６】
方法は、ＳＳＢのＣ末端テールによって仲介された蛋白質間相互作用を抑制する化合物の同定のために提供される。本発明はさらに、これらの方法を使用して同定される化合物を提供する。それらの化合物はＳＳＢのＣ−末端テールにより仲介された蛋白質間相互作用を抑制できる。これらの化合物は、原核生物中の、特にはバクテリア中のゲノム・メンテナンス蛋白質錯体の形成を途絶させることにより、広いスペクトルを有する抗生物質として役立つことができる。真核生物のＲＰＡ（複製プロテインＡ）が同様のＣ末端領域を含んでいないので、恐らく結合パートナーを募る別個の方法を使用するので、これらの化合物は真核生物のゲノム・メンテナンス錯体に有害ではない。
異なる原核生物からのＳＳＢテールのアラインメント
【００２７】
およそ２８０の原核生物のＳＳＢのカルボキシテールのアラインメントは表１に示される。それは、原核生物のＳＳＢのカルボキシテールを含むおよそ１０のアミノ酸残基の保存を示す。およそ２８０の原核生物のＳＳＢのＣ末端２０残基のアラインメントは、４つの一番端のＣ末端残留物（ＤＩＰＦ、つまりＡｓｐ−ｌｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示される）が、これらの原核生物のＳＳＢのカルボキシテール中で最も高度に保存された残基であることを示す（表１）。原核生物のＳＳＢのカルボキシテールからのこれらの最終Ｃ末端残基は、蛋白質の結合にとって最も重要なものであるように見える。
【００２８】
本発明は、表１中に示されるようなカルボキシテールを備えたポリペプチドの使用を企図する。本発明は、表１中で示されるカルボキシテールの同族のカルボキシテールを備えたポリペプチドの使用を企図する。例えば、他の有用なポリペプチドは、１つ以上の保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を備えた表１の中で示されるようなカルボキシテールを有することができる。
【表１】
2010528293.tif 000002
2010528293.tif 000003
2010528293.tif 000004
2010528293.tif 000005
2010528293.tif 000006
2010528293.tif 000007
【００２９】
１つの態様では、本発明は、目標蛋白質（大腸菌からのエキソヌクレアーゼＩ（Ｅｘｏ  Ｉ））に結合した大腸菌ＳＳＢの、以前に公開されていない高解像度構造の決定に関する。大腸菌エキソヌクレアーゼＩはＬｅｈｍａｎ、１９６０年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３５：１４７９−１４８７によって記載された。エキソヌクレアーゼ（それらは、個別の酵素として、またはより大きな酵素錯体の部分として見い出すことができる）は、ポリヌクレオチド鎖の端から一度にヌクレオチド１を開裂する酵素である。大腸菌エキソヌクレアーゼＩは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のヌクレオチド配列を有している：また、それは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸配列を有している。大腸菌エキソヌクレアーゼＩの結晶構造の原子の座標は、アクセションコード３Ｃ９５の下で蛋白質データバンクに堆積された。本発明は、他の原核生物のエキソヌクレアーゼの使用を企図する。特には大腸菌エキソヌクレアーゼＩの他の原核生物の同族体の使用を企図する。
【００３０】
本発明の原核生物のエキソヌクレアーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の多様な変形、突然変異体および異種間の同族体であるポリペプチドを含む。本発明の原核生物のエキソヌクレアーゼは、さらにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の機能的な等価物またはフラグメントを含んでいる。
【００３１】
方法は、「ＳＳＢ−結合蛋白質」（さらに本明細書では「目標蛋白質」とも呼ばれる）への原核生物のＳＳＢの結合をアッセイするために提供される。ＳＳＢ−結合蛋白質はＳＳＢに結合する蛋白質である。例えば、ＳＳＢは原核生物のＳＳＢであることができ、たとえばＳＳＢは大腸菌ＳＳＢであることができる。ＳＳＢ−結合蛋白質は、原核生物のＳＳＢ−結合蛋白質であることができ、たとえばＳＳＢ−結合蛋白質はエキソヌクレアーゼであることができる。エキソヌクレアーゼは原核生物のエキソヌクレアーゼであることができる。また、それは特にエキソヌクレアーゼＩであることができる。エキソヌクレアーゼＩは大腸菌エキソヌクレアーゼＩであることができる。
【００３２】
さらに、溶液中でエキソヌクレアーゼＩへのＳＳＢの結合を測定するために高速蛍光偏光法方法が提供される。蛍光偏光法（ＦＰ）は、偏光と蛍光性トレーサを使用する、標的分子への標識分子の結合を測定する技術である。偏光で励起された時、分子に結合されたトレーサは多量の偏向した蛍光を放射する。より小さな分子に付けられたトレーサと比較して、より大きな分子に付けられたトレーサは回転がより遅い。例えば、蛍光でラベルされたペプチドが、様々な分子へのペプチドの特異的結合を検知するために使用できる。なぜなら、蛍光でラベルされたペプチドは目標分子と結合した時に、その自由なタンブリング速度と比較してゆっくりとタンブリングするようになるので、よりゆっくりと非偏光となるからである。化学的には蛍光異方性アッセイは、蛍光、すなわち励起状態と放射された（蛍光）プロトンの間の偏光の非相関性から分子の回転拡散を分析する。
回転拡散定数から、高分子の形を評価し、薬剤の候補となる他の分子を設計するためにその情報を使用できる。
【００３３】
（１）ＳＳＢと蛋白質との相互作用の重要性、（２）バクテリアの種にわたるＳＳＢタンパク結合シーケンスの広い保存、および（３）真核生物の（人間）システムからのＳＳＢタンパク結合シーケンスの明白な不在を与え、これらのアッセイは、選択的に原核生物の成長を抑制する化合物の同定に特効を有することがある。ＳＳＢとその目標蛋白質の間の相互作用を選択的に阻害する、小さな分子は、このように魅力的で、新規な広いスペクトルを有する抗生物質である。本発明は、この相互作用の小さな分子の阻害剤のための高生産性スクリーン用に本明細書に記載された方法を使用することを企図する。そのような阻害剤は、将来の生化学・抗微生物の研究のための先駆的な化合物として役立つことができる。
【００３４】
本発明の方法は溶液中（すなわちｉｎ  ｖｉｔｒｏで）実行されることができる。したがって、生体外でのアッセイを行うことによって、本発明によって新規な抗菌化合物を同定することが可能である。別の例において、本発明の方法はインシリコ、すなわちコンピュータ・プログラムを使用するシミュレーションによって実施することができる。したがって、本発明の結晶構造についての情報を使用して、新規な抗菌化合物の構造を同定および／または設計し、その後当技術分野において公知の方法を使用して、化学的に合成することが可能である。
【００３５】
この発明の実施の際に使用される、スクリーニングされることのできる化合物のライブラリの例としては、メイブリッジ（Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ）（例えば１４，４００の化合物のＨｉｔＦｉｎｄｅｒコレクション）；ケンブリッジの１６，０００の化合物のＤＩＶＥＲＳｅｔライブラリ；ケムダイバーシティライブラリ、ケミカル・ディバーシティ・ラブズ社などがあげられる。他の候補化合物も、本発明によるアッセイの中で使用できる。スクリーンされるためにはライブラリから候補化合物を得なければならないわけではない。候補化合物は当技術の中で既知の方法を使用して合成し、次に本発明のアッセイで使用できる。例えば、候補化合物は、相互作用蛋白質（例えばＳＳＢとエキソヌクレアーゼ）の結晶構造上のデータを使用して、インシリコで設計できる。一旦候補化合物がインシリコで設計されれば、これらの候補化合物は合成化学の既知の方法を使用して合成でき、次に、相互作用蛋白質（例えばＳＳＢとエキソヌクレアーゼ）間の相互作用を阻害するかまたは影響を及ぼすかのそれらの効能に関してテストできる。
【００３６】
１例において、ＳＳＢ  Ｃ末端テールを媒介とした蛋白質／蛋白質相互作用を阻害する化合物の同定が、ハイスループット蛍光偏光法（ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ：ＦＰ）に基づいたスクリーンを使用して行われる。発明者は、大腸菌ＳＳＢのＣ末端テールにＥｘｏｌの結合することを阻害する化合物を同定するためにＦＰスクリーンを使用した。ハイスループット・スクリーンのためのリポーターとして結合するＥｘｏｌ−ＳＳＢ  Ｃ末端テールを使用することは、いくつかの長所を有している。最初に、ＥｘｏｌとＳＳＢのＣ末端テールの間の結合は、他の公知の結合と比較してかなり強く、ＦＰを使用した正確なＫｄの決定を許容し、錯体形成が飽和するので、Ｅｘｏｌ−ＳＳＢ−Ｃｔ錯体の著しい集団のスクリーニングを許容する。次に、ＦＰはハイスループット・プラットフォームで処理することができ、それにより多くの化合物を速くスクリーンすることを許容する。第３に、発明者のＳＳＢのＣ末端テールへのエキソヌクレアーゼＩ結合の結晶構造の最近の発見は、機能的なパートナーに結合したＳＳＢ  Ｃ末端テールの最初の高解像度の画像を提供した。結晶構造は、Ｃ末端テールの最終アミノ酸が結合に重大な役割を果たすことを示唆する。これらの発見は、ＳｅｒへのＳＳＢの最後から二番目のＰｒｏ残基の突然変異が、ＥｘｏｌがＳＳＢのＣ末端テールに結合する能力を失わせることを示すＦＰデータによって支持される。理論によって拘束されるものではないが、異種のバクテリアのＳＳＢ同族体中のＳＳＢの最終４アミノ酸間の非常に高度な保存が与えられて、タンパク結合のこのモードは、ゲノム・メンテナンスのための蛋白質のための補充のための保存機構であるかもしれない。
【００３７】
この結合を阻害する小さな分子を見つけることによって、ＳＳＢエキソヌクレアーゼＩ相互作用を分裂させ、それにより細菌増殖を遅くするか、またはバクテリアを殺すことが可能である。更に、結合を阻害する小さな分子は、さらにＳＳＢ  Ｃ末端テールと他の結合パートナーとの間の結合を阻害することがある。
【００３８】
１例において、ハイスループット・スクリーンは、ＳＳＢのＣ末端テールと他の既知のＳＳＢ結合パートナーとの間の相互作用を分裂させる分子を捜ために行うことができる。例えば、１ダース以上のＳＳＢと相互に作用する蛋白質は、大腸菌において既に同定されている（Ｂｕｔｌａｎｄら、２００５年、ネイチャー４３３：５３１−５３７）。これらの相互作用の多くはＳＳＢのＣ末端テールとその異型の結合パートナーの間の接触により媒介される。例えばＥｘｏｌ（Ｓａｎｄｉｇｕｒｓｋｙら、１９９６年、Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １４５：）６１９−６２３；Ｇｅｎｓｃｈｅｌら、２０００、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８１：１８３−１９２）、ＤＮＡ  ポリメラーゼ  ＩＩＩのχφサブユニット（Ｙｕｚｈａｋｏｖら、１９９９，Ｃｅｌｌ  ９６：１５３−１６３；Ｗｉｔｔｅら、２００３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：４４３４−４４４０）、ウラシル  ＤＮＡ  グリコシラーゼ（Ｈａｎａｄａら、２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：１６９９２−１６９９７）、ＰｒｉＡ  ＤＮＡヘリカーゼ（Ｃａｄｍａｎ  および  ＭｃＧｌｙｎｎ，２００４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２：６３７８−６３８７），およびＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼ（Ｓｈｅｒｅｄａら、２００７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２：１９２４７−１９２５８）を参照。バクテリアのＳＳＢ蛋白質が主にホモ四量体（タンパク結合サイトの役割をすることができる４つのＣ末端を有する）で、複数のＳＳＢ四量体は１つの伸張されたｓｓＤＮＡ領域に結合することができ（Ｌｏｈｍａｎ  ａｎｄ  Ｆｅｒｒａｒｉ，１９９４，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６６：５２７−５７０）、多くのゲノム・メンテナンス酵素の共通の目標としてのＳＳＢの利用は、いくつかのＤＮＡ代謝活性の効率的にターゲットとすることおよびコーディネーションを促進する。
抗菌化合物用のスクリーンを行なう場合のアッセイ成分の添加順序
【００３９】
本発明は、本明細書に記載された種々の抗菌化合物用のスクリーンを企図する。以下に示されるように、候補抗菌化合物として多くのものを同定するために、化合物のライブラリをスクリーンすることは可能である。これらの候補化合物は、ＳＳＢ−結合蛋白質（例えばＥｘｏｌ）に結合したＳＳＢのＣ末端を表わす結晶構造中のペプチド結合サイトへマップすることができる。１例において、Ｅｘｏｌへあらかじめ結合された、蛍光ラベルが付けられたＣ末端ＳＳＢペプチドの溶液を使用し、化合物を滴定することによりスクリーニングすることが可能である。あるいは、エキソヌクレアーゼＩ（例えば３８４ウエルプレートへ）を加えて、次に、各々のウエルに１つの（例えば、異なる）候補化合物を加えることにより、スクリーンを行うことは可能である。これは、化合物がＥｘｏｌの１つまたは複数の結合ポケットに結合することを可能にするだろう。その後、本発明の蛍光ラベルが付けられたペプチドを加えることができる。この蛍光ラベルが付けられたペプチドは、１つまたは複数のポケットに結合されたすべての化合物と競争するだろう。以下の理論によって拘束されるものではないが、目標がＳＳＢ末端領域と会う前に、生体内の薬はその目標と会うので、後者はより生理学的に適切なスクリーンになりえる。下記の例において、Ｅｘｏｌおよびペプチドテールを使用してスクリーンが行われたが、潜在的に有用になりうるこの主題について多くの変化がある。スクリーンも大腸菌以外の他の目標、例えばトポイソメラーゼＩＩＩ、ＤＮＡポリメラーゼのカイ・サブユニット、ギラーゼ、これらの混合物または他の目標などを使用して行なうことができる。更に、これらに限定されないが、ブドウ球菌、かん菌、腸球菌などを含む別のバクテリアからの蛋白質を使用して、このスクリーンを行うことができる。これらのアッセイは、テストされている種からの全蛋白質またはＣ末端テールを使用して行うことができる。
化合物の改善された結合および同定のためのドッキングコンピュータ・プログラムの使用
【００４０】
コンピュータモデリングおよびドッキング手続きが、結合ポケット中の既知の小さな分子のドッキングモードの分析により、小さな分子のスクリーニングライブラリィからのヒットを検査し改善するために使用できる。ドッキングはリセプターポケット中の、小さな分子の結晶構造で始まる。データベースからの最初のヒットは薬のための最適の構造ではないことがある。これは、活性部位中のヒットをモデル化し、その後、他の分子をドッキングすることによりテストできる。結合エネルギーは計算され、既知のヒットと比較される。コンフォーマルな適合はドッキングの結果の重要な部分で、モデリングにより通常検査される。
【００４１】
結合された小さな分子について最初の結晶構造が決定された後、コンピュータによるスクリーニングとドッキングプログラム、たとえばＡｕｔｏ  Ｄｏｃｋ（Ｓｃｒｉｐｐｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｌａ  ＪｏＩＩａ，ＣＡ），ＦｌｅｘＸ（ＢｉｏＳｏｌｖｅｌＴ  ＧｍｂＨ，Ｓａｎｋｔ  Ａｕｇｕｓｔｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ），およびＳＬＩＤＥ（Ｍｉｃｈｉｇａｎ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｅａｓｔ  Ｌａｎｓｉｎｇ，Ｍｌ）が、既知のデータベースから何千もの化合物をスクリーニングするために使用できる。この例において、分子はそれぞれレセプタ部位に適合するコンフォーマルな柔軟性が許容され、結合能力が評価される。ほとんどの場合、レセプタも柔軟性を与えられる。データベースからの最初の化合物は点数を付けられ、格付けされる。また、結合モードおよび結合エネルギーは、小さな分子のアッセイからの実際のヒットと比較される。これは、化学アッセイおよびドッキングモードの両方の信頼度を格付けする。この手続きは、原子デノボによって、または同様な薬剤結合コンピュータ・プログラムによって、原子と結合ポケットを最適化するために出発分子として役立つことができる一群の分子に導く。
【００４２】
本明細書に記載された方法は、この種の手続きで処理することができる。
確かに、本発明の発明者は、阻害剤が結合ポケットに結合された多くの結晶構造を解決した。これらのツールを使用して、既に同定されたものと同等又は恐らくさらによく結合する分子を、インシリコで（つまり、コンピュータ・プログラムを使用して）探索することが可能である。本質的には、適切なコンピュータ・ソフトウェアを、最良にペプチド結合を阻害する化合物の構造を同定するのを支援するために使用することができる。インシリコ技術を使用する利点は、潜在的な候補化合物をスクリーンできる迅速さである。なぜなら、何千もの結合アッセイを溶液中、すなわちｉｎ  ｖｉｔｒｏで分析するよりはるかに速い方法だからである。
同定された化合物を含む医薬品組成物
【００４３】
活性成分として本発明によって同定された抗菌化合物を含む医薬品組成物も提供される。医薬品組成物は液体または固体であることができる。液体組成物は、たとえば１つ以上の抗菌化合物を含む水溶液であることができる。固体の組成物は上記の水溶液を、たとえば凍結乾燥または噴霧乾燥することにより入手可能な固形剤であることができる。１つの実施態様では、固形剤は凍結乾燥物である。上に言及された水性物の調剤は、そのような固形剤の水溶液を含んでいる。上記の固体組成物は、固形剤と注入剤が別個に調剤薬に配合されるキットの形であることができる。
【００４４】
この発明の医薬品の組成物を生産するための技術の例は、以下に記載される。水溶液は選択した溶剤中に、従来の方法で抗菌化合物を溶かすことにより生産できる。この水溶液はアルカリ性、中性、または塩基性であることができる；抗菌化合物が水溶液に溶解されることで十分である。そのような水溶液中の抗菌化合物の濃度は、例えば測定された最小阻止濃度（表３）と一致する濃度である。いくつかの実施態様では、それが後の手続きでの成功する凍結乾燥を許容するような濃度が選ばれる。固体の医薬品組成物の製造については、たとえば凍結乾燥物は、本発明の１つ以上の抗菌化合物を含む水溶液の凍結乾燥により生産できる。例示的な手順は、約−２５℃で、約０．１トル以下の内部を減圧にした凍結乾燥機で水溶液を凍らせ、プレート温度を５℃から２０℃／時の速度で約２５から４０℃の最終温度にあげることを含む。凍結乾燥が実行される場合、形態調整剤が、凍結乾燥物の形態を改善する目的で、抗菌化合物の水溶液に加えられることができる。形態調整剤としては、糖類（例えばマンニトール、キシリトール、イノシトール、ソルビトールなどのような糖アルコール、マルトース、蔗糖、ラクトーゼなどのようなヘキソースに基づいた二糖類、およびグルコースのような単糖類）、中性アミノ酸（例えばグリシン、アラニン、プロリン、バリン、メチオニンなど）およびコハク酸のアルカリ金属塩（例えば琥珀酸ナトリウムなど）があげられる。スプレー乾燥が所望の生成物である場合、上に記載された水溶液は公知の技術によりスプレー乾燥される。例示的な手続きはスプレー乾燥機ノズル（たとえばツインノズル、圧力ノズルなど）から霧状の水溶液を射出するか、またはロータリーディスクの乾燥室内に、約５−２０ｍｌ／分（例えば乾燥室入り口、出口温度がそれぞれ約８０から１２０℃と約３０℃から５０℃；送気量約７０−１００ｋｇ／時間）の流量で供給する。
【００４５】
薬物吸収の一層の増加の保証のために、界面活性剤は、本発明の医薬品組成物において付随的に使用できる。好適な界面活性剤の例としてはソルビタン脂肪酸エステル（例えばソルビタンモノパルミチン酸塩、ソルビタンセスクイステアレート（ｓｅｓｑｕｉｓｔｅａｒａｔｅ）など）、グリセリン脂肪酸エステル（たとえばモノステアリン酸グリセリンなど）、プロピレングリコール脂肪酸エステル（例えばモノステアリン酸プロピレングリコール）、ポリオキシエチレン・グリセリン脂肪酸エステル（たとえばポリオキシエチレン・モノステアリン酸グリセリンなど）、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル（例えばモノステアリン酸ポリオキシエチレン、ＰＥＧジステアレートなど）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（例えばポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテルなど）、ポリオキシエチレン水素化ヒマシ油、ポリオキシエチレンソルビトールみつろう誘導体、ポリオキシエチレン・ラノリン・アルコール、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル、プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）シリーズ界面活性剤のような非イオン性界面活性剤；アルカリ金属ドデシル硫酸塩、アルカリ金属ステアリン酸塩、アルカリ金属パルミチン酸塩、およびトゥイーン２０およびトウィーン８０のような液体の界面活性剤のような陰イオン界面活性剤があげられる。これらの界面活性剤は、好適な比率で単独でまたは複数で使用できる。
【００４６】
抗菌化合物の可溶性または安定性の改善のために、様々な塩（例えばクエン酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム、安息香酸ナトリウムなどのような有機酸の塩）および／または安定剤（例えば炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム、炭酸水素マグネシウム、炭酸水素カルシウムなどのような無機塩基の塩類）が組込まれるか、または本発明の組成物に加えられることができる。必要ならば、浸透圧調節のための等張化剤（例えば塩化ナトリウム）および／または無痛化薬または局所麻酔薬（例えばグルコース、ソルビトール、マンニトール、ベンジルアルコール、塩酸メピバカイン、キシロカイン塩酸塩など）も使用できる。
【００４７】
保存料およびｐＨ制御因子は必要に応じ少量加えることができる。保存料としては、メチルｐ−ヒドロキシベンゼン、プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエートなどのパラベン類、クロロブタノールのようなアルコール、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、セトリミドなどのような第四級アンモニウム塩、ソルビン酸、クロルヘキシジン、チメロサールなどがあげられる。ｐＨ制御因子としては、様々な酸、例えば塩酸、ホウ酸、リン酸、炭酸、炭酸水素などのような無機酸、モノまたはポリカルボン酸、アミノ酸などの有機酸、および様々な塩基、たとえば水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのようなアルカリ金属水酸化物、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウムなどのようなアルカリ金属水素化炭酸塩があげられる。好ましくは、これらの添加物は、単独でまたは組み合わせて使用でき、抗菌化合物の１ミリグラム当たり、約０．００１−１０ｍｇで、好ましくは約０．０１−５ｍｇで加えることができる。
【００４８】
本発明の医薬品組成物は、薬理学的に受理可能なキャリアまたは賦形薬を含む有効成分の配合により製造された剤形で、一般に経口的にまたは非経口的に投与できる。本発明の医薬品組成物は次の方法で使用することができる。例として固体の組成物を挙げると、それは滅菌蒸留水または注入液（例えば生理食塩類、グルコース注射剤など）に溶かし、例えば静脈注射、皮下注射、筋肉注射、点滴静注注入または眼科用液剤として使用できる。そのような注入の準備は、既知の無菌の手続きによって好ましくは行なわれる。
【００４９】
本発明の医薬品の組成物の量は、剤形、最適投薬方式、活性体の種および他の要因に依存する。いくつかの実施態様では、医薬品組成物は１日当たり１回か、または２〜３回に分割して投与されることができる。
実施例
【００５０】
本発明は、特別の方法論、治験実施計画、対象または記載された反応物に制限されるものではなく、変更されることができる。本明細書に使用される用語は、特別の実施態様だけを記載されるためにあり、本発明の範囲を制限するようには意図されない。本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ制限されている。次の例は例示のために提示され、特許請求の範囲に記載される発明を制限するものではない。
化合物の構造
【００５１】
本発明によりＳＳＢエキソヌクレアーゼＩ結合を阻害する化合物のスクリーンの中で同定された化合物の例が以下に示される。化合物の各々については、化合物の名前、化合物の化学式、化合物の分子量（ＭＷ）および化合物の化学構造が示される。さらに、化合物が同定されたライブラリを提供した会社の名前およびライブラリ中の特定の化合物の製品コードが示される。Ｋｉ値は解離定数であり、配位子（たとえば薬剤、本発明の場合には試験される阻害化合物）とペプチド又は蛋白質との間の親和性、すなわち配位子（つまり試験される阻害化合物）が、どれくらいしっかりと特定のペプチドまたは蛋白質に結合するかを表す。ＩＣ５０値は半数阻害濃度、すなわち生体外で、目標の５０％の阻害に必要な化合物の濃度をいう。それは、ある生物学的プロセス（例えばＬＢの中の細菌増殖）を阻害するためにどれだけの特定の物質／分子が必要かを測定する。
化合物３
【００５２】
名前：２−［５−（３−ブロモベンジリデン）−４−オキソ−２−チオキソ−１，３−チアゾリジン−３−イル］―３−フェニルプロパン酸
式：Ｃ１９Ｈ１４ＢｒＮＯ３Ｓ２
ＭＷ：４４８．３６
会社：ケンブリッジ
製品コード：６０４４４４８
Ｋｉ＝約２．５μＭ
ＩＣ５０大腸菌４２１３＝５．５μＭ
ＩＣ５０黄色ブドウ球菌＝１０μＭ
【化１】
2010528293.tif 000008
化合物８
【００５３】
名前：［５−（２−メチル−３−フェニル−２−プロペン−１−イリデン）−４−オキソ−２−チオキソ−１，３−チアゾリジン−３−イル］（フェニル）酢酸
式：Ｃ２１Ｈ１７ＮＯ３Ｓ２
ＭＷ：３９５．５
会社：ケンブリッジ
製品コード：５７６７７２０
Ｋｉ＝約４μＭ
ＩＣ５０大腸菌４２１３＝１１μＭ
ＩＣ５０黄色ブドウ球菌＝２９μＭ
【化２】
2010528293.tif 000009
化合物９
【００５４】
名前：３−（ｔｅｒｔ−ブチル）−１−（６−クロロ−１，３−ベンゾチアゾール−２−イル）−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−５−オン
式：Ｃ１４Ｈ１４ＣｌＮ３ＯＳ
ＭＷ：３０７．７９７６６
会社：メイブリッジ
製品コード：ＳＥＷ０１２９７
Ｋｉ＝約７７３ｎＭ
ＩＣ５０大腸菌４２１３＝６μＭ
ＩＣ５０黄色ブドウ球菌＝５．５μＭ
【化３】
2010528293.tif 000010
化合物１０
【００５５】
名前：２−［２−クロロ−５−（トリフルオロメチル）アニリノ］５−メトキシ安息香酸
ＡＣＤコード：ＭＦＣＤ００１７５８０７
式：Ｃ１５Ｈ１１ＣｌＦ３ＮＯ３
ＭＷ：３４５．７０５４４９
会社：メイブリッジ
製品コード：Ｓ０７１９７
Ｋｉ＝約１２４．７ｎＭ
ＩＣ５０大腸菌４２１３＝３０μＭ
ＩＣ５０黄色ブドウ球菌＝１８μＭ
【化４】
2010528293.tif 000011
化合物２８
【００５６】
名前：１−（１，３−ベンゾチアゾール−２−イル）−３，４−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール
式：Ｃ１２Ｈ１１Ｎ３ＯＳ
ＭＷ：２４５．３
会社：ケンブリッジ
製品コード：
９０４０９４４
【化５】
2010528293.tif 000012
化合物２９
【００５７】
名前：１−（１，３−ベンゾチアゾール−２−イル）−３−イソプロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール
式：Ｃ１３Ｈ１３Ｎ３ＯＳ
ＭＷ：２５９．３３
会社：ケンブリッジ
製品コード：９０３６３８９
【化６】
2010528293.tif 000013
化合物３１
【００５８】
名前：２−（１，３−ベンゾチアゾール−２−イル）−５−メチル−２，４−ジヒドロ−３Ｈ−ピラゾール−３−オン
式：Ｃ１１Ｈ９Ｎ３ＯＳ
ＭＷ：２３１．２７
会社：ケンブリッジ
製品コード：５１０８３０５
【化７】
2010528293.tif 000014
化合物３２
【００５９】
名前：２−［３−（トリフルオロメチル）アニリノ］安息香酸
式：Ｃ１４Ｈ１０Ｆ３ＮＯ２
ＭＷ：２８１．２３４１０９
会社：メイブリッジ
製品コード：ＲＪＣ０２１７９
【化８】
2010528293.tif 000015
化合物３７
【００６０】
名前：５−［２−クロロ−５−（トリフルオロメチル）フェノキシ］−２−ニトロフェノール
式：Ｃ１３Ｈ７ＣｌＦ３ＮＯ４
ＭＷ：３３３．６４
会社：ケンブリッジ
製品コード：５５２４８２７
【化９】
2010528293.tif 000016
化合物４２
【００６１】
名前：
Ｎ−（６−クロロ−１，３−ベンゾチアゾール−２−イル）−３，５−ジメチル−４−イソキサゾールカルボキシアミド
式：Ｃ１３Ｈ１０ＣｌＮ３ＯＳ
ＭＷ：３０７．７５４３
会社：メイブリッジ
製品コード：ＨＴＳ０８９０９
【化１０】
2010528293.tif 000017
化合物４６
【００６２】
名前：
１−（６−クロロ−１，３−ベンゾチアゾール−２−イル）−３−メチル−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−５−オン
式：Ｃ１１Ｈ８ＣｌＮ３ＯＳ
ＭＷ：２６５．７１７０２
会社：メイブリッジ
製品コード：ＳＥＷ０１２９６
【化１１】
2010528293.tif 000018
ＳＳＢのＣ末端テールに対応するペプチド
【００６３】
ＳＳＢまたはその変形のＣ末端テールに対応するペプチドは、ウィスコンシン−マジソン大学バイオテクノロジー・センターによって合成され精製された。「ＷＴ」ペプチドは、大腸菌ＳＳＢからの定量化のための加えられたＮ−末端  Ｔｒｐ  （Ｗ）と引き続く９つのＣ末端モースト（９Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ−ｍｏｓｔ）残基を含む：Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−ｌｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）。したがって、合成されたペプチドはフルオレセイン−ＷＭＤＦＤＤＤＩＰＦ（つまりフルオレセイン−ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）だった。Ｔｒｐ残基は２８０ｎｍを吸収する。したがってペプチド濃度の正確な定量化を許容する。あるいは、正確にペプチド濃度を測定するためにそれらを使用できる限り、本発明の実行のために他の残基またはタグを使用することができる。競争的結合の実験では、ペプチドＷＭＤＦＤＤＤＩＰＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）は蛍光部位なしで使用された。
【００６４】
使用された第二のペプチド「Ｆ−ＷＴ」は、同じシーケンスを含むが、Ｎ末端フルオレセイン部位が加えられた。Ｆ−ＷＴシーケンスを変更する追加の２つのペプチドも合成された：第一に、「Ｆ−Ｐ１７６Ｓ」はＷＴシーケンスの最後から二番目のＰｒｏの代わりにＳｅｒ残基を用いる。また第二に、「Ｆ−ｍｉｘｅｄ」は、Ｆ−ＷＴペプチド・シーケンスＴｒｐ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｌｌｅ−Ａｓｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）のＳＳＢ誘導部分のランダムに選択されたシーケンスである。下に記載された実験の中で使用された他のペプチドは、ＷＤＤＩＰＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）およびＷＭＤＦＤＤＤＩＰＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）だった。これらのペプチドのどちらも蛍光標識を付けられなかった。
ペプチド結合アッセイ
【００６５】
ペプチド結合アッセイは、様々な化合物の存在下、または非存在下で、上記のペプチドとエキソヌクレアーゼＩとを使用して溶液中で行なわれた。異なる量のエキソヌクレアーゼＩ（Ｅｘｏｌ）がペプチド結合アッセイで使用された。典型的には、０．１−１０，０００ｎＭ大腸菌Ｅｘｏｌ（または変種）が、１０ｎＭ  Ｆ−ＷＴ、Ｆ−Ｐ１７６ＳまたはＦ−ｍｉｘｅｄペプチドと、１０分間室温で、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣ中、ｐＨ  ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４％（ｖ／ｖ）グリセロール、１ｍＭ  ２−メルカプトエタノールおよび０．１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中でインキュベートされた。蛍光偏光法（ＦＰ）は２５℃で３回測定された；平均ＦＰ価値は、誤差として示された平均値の標準偏差とともにプロットされた。
【００６６】
表２の中のデータは、テストされたいくつかの候補化合物に対する解離定数（Ｋｉ）の値を要約する。個々の化合物（つまり阻害剤）のペプチド結合データを示すグラフが、図１−６に示される。ＷＴペプチド・コントロール用のデータは図７に示される。
【表２】
2010528293.tif 000019
2010528293.tif 000020
【００６７】
１例において、化合物（阻害剤）４６と３１の間のただ一つの差が、前者におけるＣｌ原子の存在だったことは注目すべきである。１つの原子置換の重要性を検討するために、阻害剤４６のペプチド結合阻害値は、阻害剤３１のペプチド結合阻害値に対して計画された（図６）。Ｃｌ原子の不在ははるかに弱い結合に帰着した（表３）。
【００６８】
図７は、Ｃ末端ペプチドのどの部分がエキソヌクレアーゼＩへの結合において重要かを示す。図７の中で示される実験の原理は、阻害剤について行なわれた実験（図１−６）に非常に似ているが、エキソヌクレアーゼＩに結合したＳＳＢ  Ｃ末端テールペプチドに蛍光タグを付けた溶液中の異なる阻害剤を滴定する代わりに、ラベルされていないペプチドまたはＮ末端のない３つのアミノ酸残基（ＭＤＦ）を有しているラベルされていないペプチドＤＤＤＩＰＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）が滴定された。Ｗは定量化の目的にのみ存在することは再び指摘されるべきである。失われた残基がペプチド結合において重要な役割を果たす場合、ペプチドの先を切られたバージョンは、短縮していないペプチドより貧弱な競争力を有するであろう。これはまさに図７で見られるものである；蛋白質に既に結合された蛍光性のペプチドを滴定するために、短縮していないペプチドより先を切られたペプチドは１０倍かかる。蛋白質を滴定することが可能であるという事実は、それらのＮ末端の３つの残基は結合に役割を果たしているが、重大ではないことを示す。なぜなら先を切られたペプチドも少量ではあるが競争しているからである。
【００６９】
化合物２８、２９および３１は結合を阻害しなかった（表３）。
ＳＳＢ／エキソヌクレアーゼＩ相互作用を阻害する分子を見つけるハイスループット・スクリーン
【００７０】
濃縮エキソヌクレアーゼＩは、２リットルの稀釈バッファ（ＤＢ）（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０  ＨＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１ｍＭベータメルカプトエタノール）へ一晩透析された。透析の後、エキソヌクレアーゼＩは、先にＤＢで希釈された蛍光ラベルが付けられたＳＳＢ  Ｃ末端ペプチド（アミノ酸配列（Ｎ末端）フルオレセイン）−ＷＭＤＦＤＤＤＩＰＦ、すなわちフルオレセイン−ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６（Ｃ末端）と混合された。ＤＢと調節した後のエキソヌクレアーゼＩ／ＳＳＢ  Ｃ末端ペプチド混合物の構成要素の最終濃度は、１μＭエキソヌクレアーゼＩ、１０ｎＭ  蛍光ラベルされたＳＳＢ  Ｃ末端ペプチド、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０  ＨＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１ｍＭベータメルカプトエタノールだった。５分間室温に置いた後に、液体取り扱いシステムが使用され、３８４ウエルプレート内に、３０マイクロリットル／ウエルで提供された。その後、１ｍＭ化合物の１マイクロリットルが加えられた。スクリーンされた化合物は、ケンブリッジ  ＤＩＶＥＲＳｅｔライブラリ（ケンブリッジ株式会社、サンディエゴ、ＣＡ）、メイブリッジ  ヒットファインダー  ライブラリ（サーモ  フィッシャー、サイエンティフィック、ウォルサム、ＭＡ）、ケムディブライブラリ（ケミカルディバーシティ  研究所、サンディエゴ、ＣＡ）、または既知のバイオアクティブライブラリィ−ＫＢＡ０１から得られた。
【００７１】
各ウエルに対するＦＰ（蛍光偏光値）は、プレート・リーダを使用して、化合物の添加後５分に測定された。ＦＰ値を低下させた化合物が同定された。これは典型的には３つの標準偏差を使用して行われた。蛍光性だったか、または過剰な沈殿を引き起こした化合物は考察から除外された。これらの基準を満たしたおよそ２０の化合物が分離され、ＰａｎＶｅｒａ  Ｂｅａｃｏｎ２０００  ＦＰ（ＰａｎＶｅｒａ社、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｌ）を使用して、より厳密にテストされた。これらの実験から、このように結合するペプチドの完全な阻害を示唆した程度にＦＰ値を低下させることができた５つの化合物が同定され、Ｋｉが決定される。
【００７２】
Ｋｉを決定するために、１μＭエキソヌクレアーゼＩ、蛍光ラベルされた１０ｎＭＳＳＢ  Ｃ末端ペプチド、２０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．０  ＨＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１ｍＭベータメルカプトエタノールを使用して、上記と同様にしてマスター・ミックスが調製された。ＦＰ値が、蛍光ラベルが付けられたペプチド単独からのみ得られる値に低下するまで、増加された化合物の量がペプチド蛋白質混合物へ滴定された。Ｋｉ値は、Ｐｒｏｆ．Ｓｈａｏｍｅｎｇ  Ｗａｎｇ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｈｉｇａｎ（Ｎｉｋｏｌｏｖｓｋａ−Ｃｏｌｅｓｋａら、２００４，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３３２：２６１−２７３）の、蛍光に基づく競合結合測定法を使用して測定された。
細菌増殖分析
【００７３】
図８−２３および表３に示されるように、候補化合物が細菌増殖を阻害するそれらの能力に関してテストされた。例えば、図８−１６では、大腸菌４２１３（易感染性細胞壁を有しているグラム陰性細菌）の成長曲線が示される。図８−１６は、それぞれの候補抑制化合物が大腸菌４２１３の成長をどのように阻害するかを示す。易感染性細胞壁は、化学薬品がそれをより容易に通り抜けることを可能にする。同様に、図１７−２３は、それぞれの候補抑制化合物が黄色ブドウ球菌１２５９８（グラム陽性細菌）の成長をどのように阻害するかを示す。
【００７４】
０．０５  ＯＤ  ６００の大腸菌１６５５、大腸菌４２１３または黄色ブドウ球菌を含んでいるＬＢの１００μＬが、９６ウエルプレート中でアリコートされた。ＤＭＳＯ中の化合物の１μＬが加えられ所定の最終濃度にされた。プレートは２５０ＲＰＭで振動させて、３７℃でインキュベートした。成長速度は、３時間から７時間の間（対数成長期）に起こったＯＤ／時間の平均変化を決定することにより計算された。本明細書に示されたグラフは、μＭでの阻害剤濃度に対する、この細菌増殖速度（ＯＤ／ｈの変化）のプロットである。
【００７５】
表３中のデータは、本発明による選択された化合物の、液体培地の中で細菌増殖を５０％低減するのに必要である濃度を要約する。
【表３】
2010528293.tif 000021
2010528293.tif 000022
2010528293.tif 000023
【００７６】
大腸菌阻害実験のデータは表４中に要約される。
【表４】
2010528293.tif 000024
【００７７】
黄色ブドウ球菌阻害実験のデータは表５に要約される。
【表５】
2010528293.tif 000025
【００７８】
多くの試験される候補化合物は、細菌増殖に対して充分な妨害作用を有していた。さらに、同定された薬化合物が多くの他のグラム陽性のバクテリアの種の成長を遅くすることができることが発見された。例えば、枯草菌とエンテロコッカス−フェカーリスの成長は、これらのバクテリアが化合物９または１０のどちらかの化合物を１００μＭ含んでいる寒天平板上で成長された時に、阻害された。同様のやり方でテストされた時、デイノコッカス−ラジオデュランスの成長も阻害された。
結晶構造
【００７９】
エキソヌクレアーゼＩ結晶は、１２％のＰＥＧ  ４０００、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ８．０および５ｍＭの化合物を含んでいる浸透溶液に移された。５日間、時計皿中でこれらの溶液に浸漬された後、結晶は１２％のＰＥＧ  ４０００、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭトリス  ｐＨ  ８．０、５ｍＭの化合物および２５％のグリセロールを含んでいるクライオ溶液（ｃｒｙｏ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に結晶が移された。結晶はついで液体窒素中でフラッシュ凍結された。
【００８０】
細胞内での異種蛋白質とＳＳＢ相互作用の重要性にもかかわらず、ＳＳＢとそのパートナー蛋白質の間の相互作用についての構造およびその機構の理解は、不明瞭なままだった。１つの態様では、本発明は、その同系統のＳＳＢのＣ末端に結合した大腸菌Ｅｘｏｌの高解像度構造の解明を提供する。大腸菌ＥｘｏｌのａｐｏとＳＳＢのペプチドに結合された形式の結晶構造が、結晶構造内のＳＳＢのＣ末端ペプチドテールによって先に占められていた結合ポケットのうちの１つの中で結合する候補化合物として、決定された（Ｌｕ  ａｎｄ  Ｋｅｃｋ，２００８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｉｎ  ｐｒｅｓｓ）。
【００８１】
ＳＳＢ−Ｃｔ要素を含むペプチドに結合する大腸菌Ｅｘｏｌの結晶構造が決定された。
サーチのモデルとして、２．７−オングストロームの解像度でＥｘｏｌ／ＳＳＢ−Ｃｔ蛋白質が結晶回折され、ａｐｏ  Ｅｘｏｌ構造を使用して分子の置換によって決定された（Ｂｒｅｙｅｒ  ａｎｄ  Ｍａｔｔｈｅｗｓ，２０００，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：１１２５−１１２８）（表９）。さらにＳＳＢ−Ｃｔペプチドの非存在下で結晶化された大腸菌Ｅｘｏｌの１．７−オングストロームの解像度での構造が、比較の構造分析として決定された。結晶化はペプチドが結合されたものと同じ結晶化条件で行われた。
最初のａｐｏ−Ｅｘｏｌ構造のために記載されたように、両方の結晶形はエキソヌクレアーゼ（残基１−２０１）、ＳＨ３−ライク（残基２０２−３５２）、およびヘリカル（残基３６０−４７６）領域で形成される（図２５Ａおよび２５Ｂ）。
【００８２】
ＳＳＢ−Ｃｔ−結合されたＥｘｏｌ結晶からの異なる電子密度地図の検査は、図２５Ｃ、２５Ｄおよび図２８の中で示されるように、Ｅｘｏｌ表面に関連した、２つのＳＳＢ−ＣｔペプチドからのＣ末端に対応する特徴を明らかにした。両方のペプチドは、活性部位から２０オングストロームより離れた部位で結合する。第一のペプチド（「ペプチドＡ」）は、エキソヌクレアーゼとＥｘｏｌのＳＨ３−ライク領域の間に結合する（図２５Ｃおよび２５Ｅ）。電子密度は、ペプチドＡ（１７４−１７７）のＣ末端モースト（Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ−ｍｏｓｔ）のＳＳＢ残基では明白であるが、残基１６９−１７３（動的かディスオーダーなＮ末端と一致している）には見当たらない。ペプチド−Ａ結合部位は、Ｅｘｏｌからの進化的に保存された残基で構成されたディープポケットにＣ末端モーストのＳＳＢ−Ｃｔ残基（Ｐｈｅ１７７）をアンカーさせる。この相互作用では、疎水性のＰｈｅ側鎖は、ＥｘｏｌからのＬｅｕ１４７、Ｌｅｕ２０４およびＴｙｒ２０７側鎖に対してパックされる。そのα−カルボキシル酸素は、Ａｒｇ１４８側鎖と明白なイオン結合を形成する。ペプチドＡのより多くのＮ末端領域がＡｓｐ１７４を例外として、ＥｘｏｌからのＡｌａ３１０、Ｇｌｎ３１１およびＴｈｒ３１４に対してパックする。Ａｓｐ１７４は、結晶格子（図２９）内の隣接したＥｘｏｌ分子中のＥｘｏｌ残基Ｇｌｎ４４８およびＧｌｎ４５２と接触する。サイトＡに結合するＳＳＢ−Ｃｔは、ペプチドＡ（図２５Ｅ）のパスの方へ向く、Ｅｘｏｌ  Ａｒｇ３１６側鎖の再配列と一致する。このＡｒｇ３１６回転異性体位置は、Ｇｌｕ１５０、Ｇｌｕ３１８およびＡｓｐ３１９によって形成された酸性ポケットに非活性部位Ｍｇ２＋イオンが結合することを可能にする。これらの要素に加えて、Ａｒｇ３３８およびＬｙｓ２２７  Ｅｘｏｌ側鎖によって形成された「ベーシックリッジ（ｂａｓｉｃ  ｒｉｄｇｅ）」は、ペプチドＡ（図２５Ｄ）のＮ末端の近くに顕著な電気陽性のパッチ（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｐａｔｃｈ）を示す。
ＳＳＢ−Ｃｔの上の追加の未決着のＡｓｐ残基の存在を与えられて、このリッジは、構造中で説明されないＳＳＢ−Ｃｔ結合において役割を有する。この可能性もテストされた。
【００８３】
第二のペプチド「ペプチドＢ」用電子密度はＳＳＢ残基１７５−１７７を含んでいる。それは完全にＥｘｏｌのＳＨ３−ライク領域（図２５Ｆ）により結合されている。ペプチド−Ａサイトとともに、ペプチド−Ｂサイトは主としてＳＳＢ−ＣｔからのＰｈｅ１７７に結合し、その側鎖を疎水性ポケット（残基Ｔｒｐ２４５、Ｌｅｕ２６４およびＣｙｓ３３０で構成される）内にアンカーし、そのα−カルボキシルの酸素は、ＥｘｏｌのＡｒｇ３２７と明白なイオン結合を形成する。Ｅｘｏｌ残基Ｌｅｕ３３１、Ｌｅｕ３３４およびＰｒｏ３３８は、ペプチドＢのより多くのＮ末端領域と接触する。Ｅｘｏｌ／ＳＳＢ錯体が化学量論的であることを先の溶液研究（Ｇｅｎｓｃｈｅｌら、２０００，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８１：１８３−１９２）が示したので、単一のＥｘｏｌモノマーの表面へ２つのペプチドが結合するのを見つけることは予期されなかった。さらに、ペプチドＡが、結晶格子中の対称的に関連するＥｘｏｌ分子間に位置するので、結晶パッキングが錯体の構造に影響を及ぼす大きな可能性があった。したがって、ＳＳＢ結合および酵素の刺激のために各サイトでのＥｘｏｌ残基の役割を評価した実験を設計するために、この構造は出発点として使用された。
Ｅｘｏｌ／ＳＳＢ錯体の重要な特徴を画定する溶液ＳＳＢ−Ｃｔ結合の研究
【００８４】
溶液中でのＥｘｏｌ／ＳＳＢ−Ｃｔ錯体形成を検討するために、フルオレセインでラベルされたＳＳＢ−Ｃｔペプチド（Ｆ−ＳＳＢ−Ｃｔ）に結合するＥｘｏｌを測定する平衡蛍光異方性アッセイが開発された。このアッセイでは、Ｅｘｏｌは、Ｆ−ＳＳＢ−Ｃｔに１３６＋／−１１ｎＭの見掛平衡解離定数（Ｋｄ、ａｐｐ）で結合されている（図２６Ａ）。この結合は、それぞれ２および６μＭのＫｄ，ａｐｐ値で会合するＰｒｉＡとＲｅｃＱによるＳＳＢ−Ｃｔペプチド結合について観測されたものよりも高い親和性を有する。この相互作用が特異か否かをテストするために、２つのコントロール・ペプチドに結合するＥｘｏｌが検査された。第一に、「Ｆ−Ｐ１７６Ｓ」は、Ｆ−ＳＳＢ−Ｃｔシーケンスの最後から二番目のＰｒｏ残基をＳｅｒに変更する。これはよく研究されている細胞のＤＮＡ複製機構を備えたその相互作用の欠陥により害された細胞増殖を引き起こすｓｓｂ１１３突然変異を模倣した。第二のコントロール・ペプチド「Ｆ−ｍｉｘｅｄ」は、ランダムにＦ−ＳＳＢ−Ｃｔの中の残基のアレンジメントを混合する。両方のコントロール・ペプチドに結合するＥｘｏｌは、Ｆ−ＳＳＢ−Ｃｔペプチドに比べて最小だった（図２６Ａ）。相似性の特異性は、ＰｒｉＡとＲｅｃＱによって結合されたＳＳＢ−Ｃｔペプチドについて観察された。これらの結果は、Ｅｘｏｌが溶液中でＦ−ＳＳＢ−Ｃｔペプチドと特に相互に作用することを示す。これは、競争実験におけるＳＳＢから導かれたペプチドへのＥｘｏｌの結合を調べた従来の研究と一致している（Ｌｅｃｏｉｎｔｅら、２００７年、ＥＭＢＯ  Ｊ．２６：４２３９−４２５１）。
【００８５】
Ｅｘｏｌ変種のパネルは、ＳＳＢ−Ｃｔ結合への２つのサイトの寄与を評価するために、アラニンにペプチド−Ａ（Ａｒｇ１４８、Ｔｙｒ２０７、Ｇｌｎ３１１およびＡｒｇ３１６）またはペプチド−Ｂ（Ａｒｇ３２７とＬｅｕ３３１）結合部位を形成する表面に露出した残基が、個々に変化されて作成された。追加のＡｌａ変形は、Ｅｘｏｌ（Ｌｙｓ２２７とＡｒｇ３３８）上の顕著な「ベーシックリッジ」と、ＳＳＢ−Ｃｔペプチド（Ｇｌｕ１５０、Ｇｌｕ３１８およびＡｓｐ３１９）の存在下でＭｇ２＋と結合しているＥｘｏｌ残基がＦ−ＳＳＢ−Ｃｔ結合において役割を有しているか否かを調べるために試験が行われた。最後に、結晶構造中のペプチドＡとの蛋白質間接触を介するヘリカル領域（Ｇｌｎ４４８とＧｌｎ４５２）からのＡｌａ  変形残基も作成された。Ｅｘｏｌ変形はそれぞれ精製され、Ｆ−ＳＳＢ−Ｃｔペプチドへの結合についてテストされた。変種の遠ＵＶの円二色性分析は、野生型Ｅｘｏｌと区別可能であり、突然変異が変種の二次構造を著しく変更しなかったことを示した。
【００８６】
ペプチドＡ部位変種のうちの３つはＦ−ＳＳＢ−Ｃｔ結合の劇的な低減を示した（図２６Ｂおよび表１０）。Ａｒｇ１４８、Ｔｙｒ２０７およびＡｒｇ３１６Ａｌａ変種は、野生型のＥｘｏｌより約１０から１００倍弱くペプチドと結合する。Ａｒｇ１４８が最も弱い結合を示す。試験された最も高い酵素濃度（１０μＭ）においてペプチド結合が飽和されなかったので、Ｋｄ，ａｐｐ値は、これらの変種に対して導かれなかった。Ｇｌｎ３１１変種は、野生型のＥｘｏｌに対して約２倍弱く、より穏やかであった。ペプチドＡ部位変異体とは対照的に、ペプチド−Ｂ部位変異体のいずれも測定可能なＦ−ＳＳＢ−Ｃｔ結合の不足を示さなかった（図２６Ｃ）。これは、ペプチド−Ａ結合部位中の相似性の突然変異によって示された強い欠陥と、Ｐｈｅ１７７とペプチドＢの直接の接触を与えられることは驚くべき事である。
【００８７】
さらなる変異体が溶液中のＦ−ＳＳＢ−Ｃｔペプチド結合におけるベーシックリッジ、Ｍｇ２＋結合とヘリカル領域表面の役割をテストするために使用された（図２６Ｄ）。ベーシックリッジ変異体は、ペプチド結合の劇的な不足を示していた。Ｅｘｏｌ  Ｌｙｓ２２７およびＡｒｇ３３８変異体はそれぞれ７倍および３倍弱い結合を有していた。これらの結果は、ＳＳＢ−Ｃｔ結合中のＥｘｏｌのベーシックリッジの重要な役割を示す。Ｍｇ２＋を結合する変異体のうちの２つは、野生型のＥｘｏｌ（Ｇｌｕ１５０とＧｌｕ３１８）に比べて約２倍強い結合を有し、一方Ａｓｐ３１９変異体は２倍弱い結合を示した。理論によって拘束されるものではないが、これらの緩やかな効果は、結晶構造の中で観察されるＭｇ２＋結合が、ＳＳＢ／Ｅｘｏｌ錯体フォーメーション中のＭｇ２＋の主な役割の反映ではなく、結晶化状態での金属の高濃度の結果であることを示唆する。Ｇｌｎ４４８とＧｌｎ４５２の変異体によるＦ−ＳＳＢ−Ｃｔ結合は野生型のＥｘｏｌのそれと判別不能だった。これは結晶構造中のＳＳＢ−Ｃｔペプチドとの会合は結晶のパッキングを介するペプチドへのそれらの接近により、それらが溶液中ではＳＳＢ−Ｃｔ結合に役割を果たさないことを示唆する（図２９）。
Ｅｘｏｌ／ＳＳＢ錯体フォーメーションはＥｘｏｌ活性のＳＳＢ刺激に不可欠である。
【００８８】
初期の研究は、大腸菌ＳＳＢがＥｘｏｌヌクレアーゼ活性を刺激し、２つの蛋白質が物理的に相互に作用することを示した。しかしながら、Ｅｘｏｌ／ＳＳＢ錯体形成がこの刺激に必要かどうかはテストされていない。これを検査するために、ＳＳＢが追加され、４倍刺激できる反応において、放射性同位体でラベルされたｓｓＤＮＡ基質の加水分解がＥｘｏｌによって触媒されるヌクレアーゼ・アッセイが開発された（図２７Ａ）。ＳＳＢ刺激は２００ｎＭ  ＳＳＢで安定水準に達する。それはＳＳＢをｓｓＤＮＡで飽和するのに必要な濃度である。
【００８９】
ＳＳＢとの会合がＥｘｏｌ刺激に必要かどうか評価するために、２つのＳＳＢ変異体がアッセイにおいて代替えされた。第一はＳＳＢ１１３であり、これはＥｘｏｌ結合能を劇的に低減するが、野生型ｓｓＤＮＡ結合には寄与するよく特性づけられた大腸菌ＳＳＢである、第二はＳＳ−ｍｉｘｅｄであり、Ｆ−ｍｉｘｅｄ使用されたシーケンスと一致する混合Ｃ末端シーケンスを備えた変異体である。野生型ＳＳＢと比較し、ＳＳＢ１１３は非常に低い刺激（２フォールド未満）を与え、一方ＳＳ−ｍｉｘｅｄはＥｘｏｌ活性を全く刺激しなかった（図２７Ａ）。これらの結果は、Ｅｘｏｌ／ＳＳＢ相互作用がＳＳＢ刺激には重要であるというアイデアを支援する。ＳＳＢ−Ｃｔ要素だけに結合することがＥｘｏｌ活性を刺激するのに十分であるかどうかをテストするために、ＳＳＢ−ＣｔペプチドはＥｘｏｌアッセイへ滴定された。ペプチドは、酵素を結合するためのＫｄ，ａｐｐより十分に高い濃度においてさえも、Ｅｘｏｌヌクレアーゼ活性に明白な効果がなかった（図２７Ａ）。さらに、これらのデータはＳＳＢ−Ｃｔ／Ｅｘｏｌ錯体フォーメーションが必要であるが、Ｅｘｏｌ活性のＳＳＢ刺激のために十分ではないことと一致している。
【００９０】
ＳＳＢに刺激されたＥｘｏｌヌクレアーゼ活性に対するＡｌａ置換の影響もテストされた。ＳＳＢがその基質への酵素の補充によりＥｘｏｌを刺激すれば、ＳＳＢ−Ｃｔペプチドの結合を弱くするＥｘｏｌ変異体はＳＳＢ刺激活性も同様に弱くする。ペプチド−Ａ−およびペプチド−Ｂ部位変異体はこの予測と著しくよく一致した。ペプチドＡ部位変異体（Ａｒｇ１４８とＴｙｒ２０７）のうちの２つはＳＳＢの追加により影響されず、テストされたすべてのＳＳＢ濃度で野生型のレベルのヌクレアーゼ活性を維持する（図２７Ｂ）；これらの変異体は、さらにＥｘｏｌ突然変異蛋白質のパネルの中で、最も弱いＦ−ＳＳＢ−Ｃｔ結合を有していた（図２６Ｂ）。第三のペプチドＡ部位変異体、Ａｒｇ３１６は、野生型のＥｘｏｌに比較してＳＳＢ依存の活性を劇的に低減（ＳＳＢの２フォールド未満の増大）した。前の変異体より高い親和性で結合するように見えたが、Ａｒｇ１４８とＴｙｒ２０７の変異体でのようにＡｒｇ３１６変異体はさらにＦ−ＳＳＢ−Ｃｔ結合能を害した（図２６Ｂ）。最後に、Ｇｌｎ３１１変異体は、野生型のＥｘｏｌに対して温和に低減されたＳＳＢ刺激だけを有していた。それは、Ｆ−ＳＳＢ−Ｃｔペプチドへの親和性のその緩やかな減少と同様である。これらの発見から予言されるように、ペプチド−Ｂサイトおよびヘリカル領域変異体（それらは溶液中ではＦ−ＳＳＢ−Ｃ結合を変更しなかった）は、さらに野生型のＳＳＢ依存のヌクレアーゼ活性を有していた（図２７Ｃおよび図２９）。
【００９１】
ベーシックリッジおよびＭｇ２＋−結合Ｅｘｏｌ変異体も、ＳＳＢ依存のヌクレアーゼ活性に関してテストされた。ベーシックリッジ変異体（Ｌｙｓ２２７とＡｒｇ３３８）（それらはＦ−ＳＳＢ−Ｃｔ結合が弱い）は、同様にＳＳＢによって刺激を低減された（図２７Ｄ）。これらの結果は、ＳＳＢとの統合された活性のためのベーシックリッジの重要性を確認した。２つのＭｇ２＋−結合する変異体（Ｇｌｕ３１８とＡｓｐ３１９）は野生型のレベルのＳＳＢ刺激ヌクレアーゼ活性を有していた。しかし、３番目（Ｇｌｕ１５０）は、内因性（ＳＳＢ−独立性）およびＳＳＢ依存性の活性の両方のレベルを穏やかに上げた。Ｇｌｕ１５０の最大のＳＳＢ刺激活性は、野生型のＥｘｏｌのそれを超えたが、ＳＳＢによる刺激は野生型の酵素によるものと同じだった。したがって、Ｇｌｕ１５０とＧｌｕ３１８の変異体の約２倍のより高いＦ−ＳＳＢ−Ｃｔ結合能は、ヌクレアーゼ活性の向上されたＳＳＢ刺激に帰着しなかった。
【００９２】
大腸菌ＳＳＢからのＣ末端ペプチドへの大腸菌エキソヌクレアーゼＩ結合の結晶構造の原子座標は、アクセションコード３Ｃ９４の下で蛋白質データバンクに蓄積された。ＳＳＢに結合し、結合した時にそのモデルが、アクセションコード３Ｃ９４の下で蛋白質データバンクに蓄積されたモデルの中で指定された原子座標を本質的に表わす結晶構造を有する原核生物のエキソヌクレアーゼは、本発明の実施のために使用できる。同様に、原核生物のエキソヌクレアーゼに結合し、結合した時にそのモデルが、アクセションコード３Ｃ９４の下で蛋白質データバンクに蓄積されたモデルの中で指定された原子座標を本質的に表わす結晶構造を有しているＳＳＢは、本発明の実施のために使用できる。
【００９３】
図２５は、大腸菌Ｅｘｏｌ／ＳＳＢ−Ｃｔ錯体の構造を例証する。
図２５（Ａ）：大腸菌Ｅｘｏｌ、およびＳＳＢの構造の概要図（Ｅｘｏｌ：エキソヌクレアーゼ領域；ＳＨ３−ライク領域およびヘリカル領域；ＳＳＢ：約６０のディスオーダードＣ末端残基が続くオリゴヌクレオチド結合（ＯＢ）領域。棒グラフは、パーセントでの同一性として、２８４のバクテリアのＳＳＢ蛋白質中のＳＳＢ  Ｃ末端（ＳＳＢ−Ｃｔ）シーケンスの進化的保存を示す。
図２５（Ｂ）：２つのＳＳＢ−ＣｔペプチドへのＥｘｏｌ結合のリボンダイヤグラム。点線は、電子密度が観察されなかったセグメントを表わす。
図２５（Ｃ）：Ｅｘｏｌへ結合した２つのＳＳＢ−Ｃｔペプチド（ＡとＢ）のための結合部位を描く表面の表現。選択されたＥｘｏｌ残基がラベルされる。
図２５（Ｄ）：電気的陽性および電気的陰性でモデル化する（Ｃ）での表面の表現。
図２５（ＥおよびＦ）：
ペプチド−Ａおよびペプチド−Ｂ部位の詳細な図。
ａｐｏ  ＥｘｏｌからのＡｒｇ３１６側鎖が重ねられる。
【００９４】
図２６は、ＳＳＢ−Ｃｔ結合中のベーシックリッジおよびペプチド−Ａ結合部位の役割を強調した平衡結合を例証する。
図２６（Ａ−Ｄ）：蛍光異方性によってモニタされた、Ｅｘｏｌ（またはＡｌａ変異体）とＦ−ＳＳＢ−Ｃｔ（またはペプチド変異体）と会合した平衡等温線。データポイントはすべて３つの実験の平均である。エラーバーは平均値からの標準偏差である。
図２６（Ａ）：Ｆ−ＳＳＢ−Ｃｔ、Ｆ−Ｐ１７６ＳおよびＦ−ｍｉｘＥｘｏｌ結合等温線。
図２６（Ｂ）：ペプチドＡ部位Ｅｘｏｌ変異体（Ｒ１４８Ａ、Ｙ２０７Ａ、Ｑ３１１ＡおよびＲ３１６Ａ）によって結合されたＦ−ＳＳＢ−Ｃｔ。
図２６（Ｃ）：ペプチド−Ｂ部位Ｅｘｏｌ変異体（Ｌ３３１Ａ、Ｒ３２７Ａ）によって結合されたＦ−ＳＳＢ−Ｃｔ。
図２６（Ｄ）：ベーシックリッジ（Ｋ２２７Ａ、Ｒ３３８Ａ）およびＭｇ２＋結合部位（Ｅ１５０Ａ、Ｅ３１８Ａ、Ｄ３１９Ａ）Ｅｘｏｌ変異体によって結合されたＦ−ＳＳＢ−Ｃｔ。
（Ｅ）  Ｅｘｏｌ変異体Ｆ−ＳＳＢ−Ｃｔ結合の要約
野生型のＥｘｏｌに対してＦ−ＳＳＢ−Ｃｔで観察された結合能の倍率変化は次のとおりだった：１フォールド未満の結合変化（より高い親和性）、１−２フォールド、〉２−５フォールド、および〉５フォールド。
【００９５】
図２７は、物理的な相互作用がどんなにＥｘｏｌ／ＳＳＢがＥｘｏｌ活性のＳＳＢ刺激にとって不可欠であるかを例証する。
図２７（ＡＤ）：Ｅｘｏｌ比活性は、ＳＳＢ（またはＳＳＢ変異体）の関数としてプロットされている。データポイントは３つの実験の平均値である。エラーバーは平均値からの標準偏差である。トレンド線は明確性のために示される。
図２７（Ａ）：ｓｓＤＮＡの上のＥｘｏｌ活性はＳＳＢの追加により４倍刺激されたが、ＳＳＢ−Ｃｔペプチドだけではなかった。ＳＳＢ−Ｃｔペプチド変異体はＥｘｏｌ活性に対してより穏やかに刺激する（ＳＳＢ１１３）か、または影響しない（ＳＳＢ−ｍｉｘｅｄ）。
図２７（Ｂ）：ペプチドＡ部位Ｅｘｏｌ変異体ヌクレアーゼ（Ｒ１４８Ａ、Ｙ２０７Ａ、Ｑ３１１ＡおよびＲ３１６Ａ）活性のＳＳＢ依存。
図２７（Ｃ）：ペプチド−ＢサイトＥｘｏｌ異なるヌクレアーゼ（Ｌ３３１Ａ、Ｒ３２７Ａ）活性のＳＳＢ依存。
図２７（Ｄ）：ベーシックリッジ（Ｋ２２７Ａ、Ｒ３３８Ａ）およびＭｇ２＋結合部位（Ｅ１５０Ａ、Ｅ３１８Ａ、Ｄ３１９Ａ）Ｅｘｏｌ変異体ヌクレアーゼ活性のＳＳＢ依存。
図２７（Ｅ）：
Ｅｘｏｌ変異体ヌクレアーゼ活性のＳＳＢ依存性の要約。
【００９６】
図２８はＳＳＢ−ＣｔペプチドＡおよびＢについてのＦｏ−Ｆｃ  ｏｍｉｔ  ステレオ電子密度図（２．８σで輪郭をとった）である。
【００９７】
図２９は、ＳＳＢ−ＣｔペプチドＡと会合したＥｘｏｌヘリカル領域からの２つのグルタミン残基の結晶学的な会合を例証する。
図２９（Ａ）：ＳＳＢ−ＣｔペプチドＡは、Ｅｘｏｌヘリカル領域（Ｇｌｎ４４８とＧｌｎ４５２）からの２つのＧｌｎ残基を介して結晶格子の中における、対称的に関連するＥｘｏｌ分子（リボンの形で示される）と会合する。
図２９（Ｂ）：結晶格子中のＧｌｎを介した相互作用のクローズアップ・ステレオ図形。
図２９（Ｃ）：Ｇｌｎ４４８とＧｌｎ４５２  Ａｌａ変異体（Ｑ４４８Ａ、Ｑ４５２Ａ）は明白なＦ−ＳＳＢ−Ｃｔ結合欠陥を有していない。
図２９（Ｄ）：Ｇｌｎ４４８とＧｌｎ４５２  Ａｌａ変異体（Ｑ４４８Ａ、Ｑ４５２Ａ）は野生型のＳＳＢ依存のヌクレアーゼ活性を有している。
【００９８】
図３０は、大腸菌ＲｅｃＱ  ウイングドヘリックス領域（Ｂ）の表面上の部位と、Ｅｘｏｌ  ＳＳＢ−Ｃｔ結合部位（Ａ）の類似性を例証する。ＲｅｃＱウイングドヘリックス領域はＳＳＢ−Ｃｔ要素に結合されている。しかし、結合部位は記載されていない。Ｅｘｏｌ／ＳＳＢ−Ｃｔ結合に含まれるものと同様の静電気特徴を備えたＲｅｃＱ領域上の部位は、（Ｂ）に強調される。
【００９９】
表６は、本発明によるスクリーンの中で同定された化合物９と結合された大腸菌Ｅｘｏｌの結晶構造の座標を示す。原核生物のエキソヌクレアーゼと結合されて、そのモデルが表６の中で特定された原子座標を本質的に表わす結晶構造を有している化合物は、本発明の実施のために使用できる。
【表６】
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【０１００】
表７は、本発明によるスクリーンの中で同定された化合物１０と結合された大腸菌Ｅｘｏｌの結晶構造の座標を示す。原核生物のエキソヌクレアーゼと結合されて、そのモデルが表７の中で特定された原子座標を本質的に表わす結晶構造を有している化合物は、本発明の実施のために使用できる。
【表７】
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【０１０１】
表８は、いくつかの既知の同定された蛋白質とバクテリアのＳＳＢとの相互作用を例証する。
【表８】
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【０１０２】
表９は結晶学的なデータコレクションおよび精密な構造統計値を例証する。
【表９】
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＊  ＲＳｙｍ＝ΣΣ｜Ｉｊ―〈ｌ〉｜／ΣＩｊ、ここでＩｊは反射ｊの測定強度である。また、＜ｌ＞は多重記録反射の平均値である。
＊＊Ｒｗｏｒｋ、ｆｒｅｅ＝Σ｜｜ＦＯｂｓ｜―｜Ｆｃａｌｃ｜｜／｜ＦＯｂｓ｜、ここでｗｏｒとｆｒｅｅのＲは、それぞれｗｏｒｋｉｎｇとｆｒｅｅの反射セットを使用して計算された。
フリーのＲ反射（合計の５％）は、精製の全体にわたって別にされて保持された。
＊＊＊注：ａｐｏ−Ｅｘｏｌ構造については、いくつかの側鎖および１つのループ・シーケンスが複数の回転異性体／コンホメーションでモデル化された：原子が複数のコンホメーションでモデル化された時に、モデル化された位置はそれぞれ、蛋白質原子の数の中で数えられる。つまり、与えられた原子が２つの位置でモデル化される場合、それは、ＳＩ表９のうちの１ではなく２つの蛋白質原子として数えられる）
【０１０３】
表１０はＥｘｏｌおよび変異体によるＦ−ＳＳＢ−Ｃｔ結合に対するＫｄ，ａｐｐ値を示す。
【表１０】
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トポイソメラーゼＩＩＩペプチド結合
【０１０４】
トポイソメラーゼＩＩＩ結合アッセイが行われ、候補化合物が、既知のＳＳＢ結合パートナーである他の蛋白質への大腸菌ＳＳＢのＣ末端テールの結合を阻害することができるかどうか決定された（図２４）。そのような結合パートナーの１つは、トポイソメラーゼＩＩＩ（Ｔｏｐｏｌｌｌ）であり、ＳＳＢのＣ末端テールと相互作用する多くの蛋白質のうちの１つである（Ｓｈｅｒｅｄａ，Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，ａｎｄ  Ｋｅｃｋ，未刊行の観察）。Ｅｘｏｌの結合アッセイについて上記されたように、Ｔｏｐｏｌｌｌは１０ｎＭ蛍光性のペプチドへ滴定された。この結合アッセイのためのバッファ条件は次のとおりだった：３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ８．０、１０％グリセロール、１ｍＭ  ＢＭＥ（ベータメルカプトエタノール）および１％ＤＭＳＯ。使用されるＴｏｐｏｌｌｌの濃度は図２４のグラフに与えられる。結合したときの異方性の変化はＰａｎＶｅｒａ  Ｂｅａｃｏｎ  ２０００  ＦＰを使用して読まれた。
【０１０５】
データは、ペプチド結合がＴｏｐｏｌｌｌ／ペプチドの場合にははるかに弱いことを示し、正確に結合定数（Ｋｄ）を決定することを困難にしている。化合物が、ペプチドがＴｏｐｏｌｌｌに結合するために効果があるかどうかを決定するために、上記の実験と同様のセットが、緩衝液からのＤＭＳＯを除いた以外は同じにセットアップされた。その後、ラベルされていないペプチドまたは様々な化合物のいずれかが１００μＭの最終濃度まで加えられた。これらの化合物およびラベルされていないペプチドはＤＭＳＯに溶かされた。また、それらの追加は、ＤＭＳＯの最終濃度を１％にした。
【０１０６】
候補化合物のうちのいくつかは、観察された異方性値を低下させて、Ｔｏｐｏｌｌｌへのペプチドの結合を阻害することができた。図２４の中で示されるように、１００μＭのラベルのないペプチドの追加さえ、ベースライン（蛍光ラベルが付けられたペプチドの結合が無い場合に期待される値）まで異方性値を低下させなかった。これは結合を観察するために使用される必要のあるＴｏｐｏｌｌｌが非常に高濃度であるためである。したがって、１０のような化合物のうちのいくつかは、Ｅｘｏｌへの蛍光性のペプチドの結合を阻害するだけではなく、他の既知の結合パートナー、たとえばＴｏｐｏｌｌｌへの結合も阻害する。したがって、少なくとも同定された阻害剤のうちのいくつかは、それが結合パートナーの１つ以上に、Ｅｘｏｌだけでなく、ＳＳＢのＣ末端テールの結合を実際に阻害することができる。
哺乳動物細胞毒性
【０１０７】
同定された抗菌候補化合物の毒性は人間の結腸直腸腺癌細胞を生体外で使用してテストされた。試験された化合物は、ＨＴ−２９（人間の結腸直腸腺癌）に対して、グラム陽性細菌細胞または大腸菌感染された細胞壁に対するよりも著しく毒性が低かった。哺乳動物細胞はＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ＧＩｏ細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｌ）を使用してテストされた。
【０１０８】
このアッセイで得られたデータによれば、化合物３はＩＣ５０〉１００μＭ、化合物８はＩＣ５０〉１００μＭ、化合物９はＩＣ５０＝３８μＭ、化合物１０はＩＣ５０＝６０μＭ、化合物２８、２９、３２および３７はすべてＩＣ５０〉１００μＭ、化合物４２はＩＣ５０＝５１μＭ、化合物４６はＩＣ５０＝５５μＭを有していた。これらのデータを、細菌増殖カーブからのＩＣ５０と比較して、化合物は哺乳動物細胞よりバクテリアを殺すことにはるかにより有効であるという結論が得られた。
溶血反応
【０１０９】
生体外の溶血反応実験は、細胞溶解を引き起こすことにより同定された薬候補が細菌増殖を阻害したかどうかを決定するために実行された。同定された小さな分子が赤血球でインキュベートされ、細胞の何パーセンテージが１時間の後に溶解するか確かめられた。これらの実験からの結果は表１１中に示される。化合物がヘムと同じ波長を吸収する場合、または化合物が沈殿する場合には、評価された溶血反応データは吸収の読みについて問題がある。そのような実例では、吸光度の読みを定量化することは難しい；しかしながら、その後、何個の細胞が溶解したかの視覚的な決定を行なうことができる。それは溶菌の評価を提供する。
【表１１】
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【０１１０】
本発明は、記載された特定の装置、方法論、治験実施計画、対象または薬物に制限されるものではなく、変化することができる。さらに、ここに使用される用語は、具体的な実施態様を記載されるためだけにあり、本発明の範囲を制限するようには意図されない。それは特許請求の範囲によってのみ制限されている。生化学と薬化学の当業者にとって明白な他の好適な修正、および様々な条件およびパラメータの適応は、この発明の範囲内である。出版物、特許、およびここに引用された特許出願はすべてその全体が参照され、すべての目的のために本明細書に組み入れられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２５Ｅ】
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【図２５Ｆ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２６Ｄ】
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【図２６Ｅ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２７Ｄ】
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【図２７Ｅ】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
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【図２９Ｄ】
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【図３０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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