(57)【要約】【課題】  本発明は、増殖性疾患、例えば腫瘍および癌の治療のための方法、試薬、医薬製剤、およびキットを提供する。本発明はNa+、K+−ATPアーゼの選択したサブユニット、特にNa+、K+−ATPアーゼのアルファ-１サブユニットおよび／またはアルファ-3サブユニットを標的することを教示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬品として使用するための、好ましくは増殖性疾患の治療に使用するための、（ａ） Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-１サブユニットの発現を減少可能な、もしくは（ｂ）Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-１サブユニットに結合可能な、および／または（ｃ）Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-３サブユニットの発現を減少可能な、もしくは（ｄ）Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-３サブユニットに結合可能な薬剤。
【請求項２】
増殖性疾患の治療用の医薬品を調製するための、（ａ）Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-１サブユニットの発現を減少可能な、もしくは（ｂ）Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-１サブユニットに結合可能な、および／または（ｃ）Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-３サブユニットの発現を減少可能な、もしくは（ｄ）Na+、K++−ATPアーゼのアルファ-３サブユニットに結合可能な薬剤の使用。
【請求項３】
増殖性疾患の治療用の医薬品を調製するための、（ａ） Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-１サブユニットの発現を減少可能な、または（ｂ）Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-１サブユニットに結合可能な薬剤の使用、および（ｃ）Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-３サブユニットの発現を減少可能な、または（ｄ）Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-３サブユニットに結合可能な薬剤の使用。
【請求項４】
（１）（ａ） Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-１サブユニットの発現を減少可能な、もしくは（ｂ）Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-１サブユニットに結合可能な第一の薬剤を同定または生成する工程、および／または（ｃ）Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-３サブユニットの発現を減少可能な、もしくは（ｄ）Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-３サブユニットに結合可能な第一の薬剤を同定または生成する工程、ならびに（２）第一の薬剤および／または第二の薬剤を増殖性疾患の治療用の医薬品を調製するために使用する工程、を含む方法。
【請求項５】
NKAのアルファ-１および／またはアルファ-３サブユニットに結合可能な薬剤がNKAの１つ以上の態様の生物学的活性を変更、好ましくは阻害または活性化することを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の薬剤、使用、または方法。
【請求項６】
NKAのアルファ-１および／またはアルファ-３サブユニットに結合可能な薬剤が、化学物質、好ましくは有機分子、更に好ましくは小さな有機分子；ペプチド；ペプチド模倣薬；ポリペプチドまたはタンパク質；抗体の断片および誘導体を含む抗体；アプタマー；脂質；炭水化物；またはオリゴヌクレオチドを含む核酸からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の薬剤、使用、または方法。
【請求項７】
薬剤が、式Ｉ：
【化１】
2010509251.tif 000008
式中、R1はフォルミル、ヒドロキシC１−４アルキル、C１−４アルキルカルボニルオキシC１−４アルキル、C５−１２アリールカルボニルオキシC１−４アルキルから選択され、 R2はオキソ、C１−４アルキルカルボニル C１−４アルキル、 C５−１２アリールカルボニルC１−４アルキルから選択され、または R2はR2を有する炭素原子と複素環の窒素原子との間の二重結合であり； 好ましくは、 R1は フォルミル、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、メチルカルボニルオキシメチル、エチルカルボニルオキシメチル、プロピルカルボニルオキシメチル、フェニルカルボニルオキシメチルから選択され、R2はオキソ、 メチルカルボニルオキシメチル、エチルカルボニルオキシメチル、プロピルカルボニルオキシメチル、フェニルカルボニルオキシメチルから選択され、または R2はR2を有する炭素原子と複素環の窒素原子との間の二重結合である、
式Iの化合物を含む、または式Iの化合物からなる群から選択される有機分子である、請求項６に記載の薬剤、使用、または方法。
【請求項８】
薬剤が、次式：
【化２】
2010509251.tif 000009
の有機分子である、請求項７に記載の薬剤、使用、または方法。
【請求項９】
薬剤がNKAのアルファ-１サブユニットおよび／またはアルファ-３サブユニットに特異的な抗体、抗体の断片または誘導体であることを特徴とする、請求項６に記載の薬剤、使用、または方法。
【請求項１０】
Na+／K+−ATPアーゼのアルファ-１サブユニットおよび／またはアルファ-３サブユニットの発現を減少可能な薬剤が、化学物質、好ましくは有機分子、更に好ましくは小さな有機分子；、アンチセンス薬剤、好ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、またはRNA干渉を引き起こすことができる薬剤からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の薬剤、使用、または方法。
【請求項１１】
薬剤が、アンチセンス薬剤、好ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、請求項１０に記載の薬剤、使用、または方法。
【請求項１２】
薬剤がRNA干渉を引き起こすことができることを特徴とする、請求項１０に記載の薬剤、使用、または方法。
【請求項１３】
増殖性疾患が腫瘍、悪性疾患、または癌を含むことを特徴とする、請求項１〜１２のいずれかに記載の薬剤、使用、または方法。
【請求項１４】
増殖性疾患が、NKAのアルファ-１サブユニットおよび／またはアルファ-３サブユニットを過剰発現する増殖性疾患であることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれかに記載の薬剤、使用、または方法。
【請求項１５】
増殖性疾患が、神経膠腫、好ましくは神経膠芽細胞腫、前立腺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、または結腸癌から選択されることを特徴とする、請求項１３または１４に記載の薬剤、使用、または方法。
【請求項１６】
増殖性疾患が非小細胞肺癌(NSCLC)であることを特徴とする、請求項１５に記載の薬剤、使用、または方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれかに記載の治療有効量の１以上の薬剤、またはその薬学的に許容される塩を含み、および１以上の薬学的に許容される緩衝剤、担体、賦形剤、安定化剤を更に含む医薬組成物。
【請求項１８】
テスト薬剤が（ａ）Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-１サブユニットの発現を減少することが可能か否か、もしくは（ｂ）Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-１サブユニットに結合することが可能か否か、および／またはテスト薬剤が（ｃ）Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-３サブユニットの発現を減少することが可能か否か、もしくは（ｄ）Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-３サブユニットに結合することが可能か否か、を決定すること含む、一群のテスト薬剤の中から増殖性疾患の治療における治療剤として潜在的に有用な候補薬剤を選択するアッセイ。
【請求項１９】
増殖性疾患の非ヒト動物モデル、好ましくは非ヒト哺乳類モデルに投与する組成物を調製するために選択された候補薬剤を使用すること、およびそのモデルにおける候補薬剤の治療効果をモニターすることを更に含む、請求項１８に記載のアッセイ。
【請求項２０】
請求項１８または１９に記載のアッセイによって選択された候補薬剤の、増殖性疾患の治療用医薬品の製造への使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、増殖性疾患、例えば腫瘍および癌の治療のための方法、試薬、医薬製剤およびキットを提供する。本発明はNa+、K+−ATPアーゼの選択したサブユニットを標的とすることを教示する。
【背景技術】
【０００２】
増殖性疾患、例えば種々の腫瘍および癌と闘う新規で、および／または改良された方式を考案する重要性は自明である。したがって、増殖性疾患に関連する細胞性標的を同定し、ならびにそれら標的に影響する治療用の試薬を構築することに多くの研究は最大の注意を向けている。
【０００３】
Na+、K+−ATPアーゼ（NKAまたはナトリウムポンプ）は、高等な全ての真核細胞に存在する内在性膜タンパク質であって、ATPを加水分解してNa+およびK+イオンを原形質膜透過させる（Horisberger 2004. Physiology (Bethesda) 19： 377-87（非特許文献１）、 Lingrel and Kuntzweiler 1994. J Biol Chem 269：19659-62（非特許文献２））。ナトリウムポンプは、実質的に等モル比で、２つのサブユニット、すなわちアルファ（α）およびベータ（β）から構成される。アルファサブユニットは触媒性と考えられており、Na+およびK+イオンに対する結合部位を有している。ベータサブユニットは制御性で、酵素複合体の生合成と活性を支援すると見なされている。現在までに、アルファサブユニットには４つのアイソフォームが（α１、α２、α３およびα４）、またベータサブユニットには３つのアイソフォーム（β１、β２、β３）が哺乳類の細胞で同定されており、これらは各種組織で選択的に発現されている（Blanco 2005. Semin Nephrol 25： 292-303（非特許文献３））。Pestov et al.は1999年に四番目のベータサブユニット（β-m）が筋肉に特異的に存在すると報告したが（FEBS Lett 456： 243-248, 1999（非特許文献４））、しかしこのアイソフォームがNa+、K+−ATPアーゼの一部を構成するのか、または他の何かX、K+−ATPアーゼの成分であるのかは未だ判っていない。
【０００４】
ナトリウムポンプは、イオンを移送するほかに、他の細胞タンパク質、例えば近隣の膜タンパク質と相互作用したり、細胞質のシグナル伝達系に関与したりしているようである。強心配糖体、例えばウアバインがナトリウムポンプと相互作用すると、細胞内のNa+およびK+の濃度変化とは無関係に活性化または誘起化されるシグナル伝達経路がいくつか報告されており、例えばSrcキナーゼの活性化、上皮成長因子受容体のSrcによる相互活性化、p42/p44マイトージェンで活性化されるタンパク質キナーゼとRasの活性化、およびミトコンドリアによる活性酸素種の生成増加等が含まれる（Xie and Askari 2002. Eur J Biochem 269： 2434-2439（非特許文献５）、 Wang et al. 2004. J Biol Chem 279： 17250-17259（非特許文献６））。細胞の原形質膜の内部には、実質的に異なるナトリウムポンプの「プール」が存在しているらしく、それぞれ異なる機能を有しており、１つのプールは（主に）イオン輸送に関連し、他のプールは(主に)シグナル伝達経路に関与している（Xie and Askari 2002）。
【０００５】
強心性ステロイド(CS)には、ナトリウムポンプの細胞外表面に結合する能力を持った一群の化合物が包含されており、それらの結合部位を構成する官能基はアルファサブユニットでは多数存在し、ベータサブユニットでは少程度である。このグループの化合物には、例えば、植物由来の医薬品、例えばジギタリスのステロイド配糖体（ジギトキシン、ジゴキシン等）、または極性の多い植物性のモノ配糖体であるウアバイン、さらに脊椎動物由来のアグリコンCS、例えばブファリン、マリノブファゲニンが含まれる。CSの典型的な作用は、CSがナトリウムポンプを阻害することによって細胞内のナトリウム濃度を増大することができるということである。したがって強心配糖体、例えばジギトキシン、ウアバインはうっ血性の心不全の治療に普通に使用される。しかし、新しい証拠によれば、CSの活性は、膜貫通ナトリウムの濃度勾配が実質的に減退していない状況下で生じ、細胞内のセカンドメッセンジャーを介してシグナル伝達経路を操作し、最終的には遺伝子発現、細胞の成長と分裂に効果を及ぼすことも示唆されている（Xie and Askari 2002）。
【０００６】
いくつかの強心配糖体（とりわけジギトキシン、ジゴキシン、ウアバイン、オレアンドリン）はヒトの癌細胞株に対しインビトロで抗増殖効果を発揮することが示されている（Xie and Cai 2003. MoI Interv 3: 157-68（非特許文献７））。例えば、ウアバインまたはジギタリスの強心配糖体は神経膠芽細胞種（Haux 1999. Med Hypo 53: 543-548（非特許文献８））、前立腺癌(McConkey et al.2000. Cancer Res 60: 3807-3812（非特許文献９）)または乳癌（Kometiani et al. 2005. MoIPharmacol 67: 929-36（非特許文献１０））においてアポトーシスを誘導するものと報告された。
ジギタリス治療による乳癌患者由来の腫瘍細胞群は、ジギタリス治療を行わない患者由来の腫瘍細胞に比較してより低下した増殖能を持ったことをを強く示す、多数の細胞数計算上の特徴によって特徴付けられる。
【０００７】
更に、乳癌患者をジギタリス治療すると有益な効果が得られることが疫学的な研究により示唆されている。Stenkvistが2001年に報告（(Anticancer Drugs 12: 635-636（非特許文献１１））したところによると、(心臓性障害のために) ジギタリス治療を行った乳癌患者由来の腫瘍細胞群は、ジギタリス治療を行わない患者由来の腫瘍細胞に比較してより低下した増殖能を持ったことをを強く示す、多数の細胞数計算上の特徴によって特徴付けられる。また、Stenkvist et al.が５年にわたる追跡研究で1982年に見出した（N Engl J Med 306: 484（非特許文献１２））ところによると、ジギタリス療法を受けていない患者での再発率はジギタリス療法を受けている患者に比べて９．６倍高く、また２０年の追跡で見出した（Stenkvist et al. 1999. Oncol Rep 6: 493-6（非特許文献１３））ところによると、乳癌による死亡率はジギタリス療法を受けていない患者（34%）に比べてジギタリス療法を受けている患者（6%）では有意に低かった。
【０００８】
以上の証拠から、ナトリウムポンプは増殖性疾患を予防し治療するのに関連する分子標的であることが示唆される。しかし、現在この分子に影響を与える有用な物質についての情報の蓄積はやや乏しい。
【０００９】
したがって、ナトリウムポンプを標的とする別の試薬、特にそのような試薬であってかつ有利な特性を有するもの、例えば有効性が高まりおよび／または望ましくない副作用を減少し、および／または癌細胞に対する選択性が更に大きく、および／または健常な細胞に対する侵食性が更に少なく、および／または特別な癌のタイプに対し比較的に特異的であり、および／または毒性が更に少ない、等の試薬の必要性が存在する。一例として、そのような試薬の上記の優れたまたは更に改良された特性もしくは諸特性を証明するには、ナトリウムポンプを標的とする当技術分野で公知の１つ以上の物質、例えば１つ以上の強心配糖体、例えば限定されないがウアバイン、ジギトキシンまたはジゴキシンの１つ以上を対照にすればよい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Horisberger 2004. Physiology (Bethesda) 19： 377-87
【非特許文献２】Lingrel and Kuntzweiler 1994. J Biol Chem 269：19659-62
【非特許文献３】Blanco 2005. Semin Nephrol 25： 292-303
【非特許文献４】Pestov et al., FEBS Lett 456： 243-248, 1999
【非特許文献５】Xie and Askari 2002. Eur J Biochem 269： 2434-2439
【非特許文献６】Wang et al. 2004. J Biol Chem 279： 17250-17259
【非特許文献７】Xie and Cai 2003. MoI Interv 3: 157-68
【非特許文献８】Haux 1999. Med Hypo 53: 543-548
【非特許文献９】McConkey et al. 2000. Cancer Res 60: 3807-3812
【非特許文献１０】Kometiani et al. 2005. MoI Pharmacol 67: 929-36
【非特許文献１１】Stenkvist, 2001, Anticancer Drugs 12: 635-636
【非特許文献１２】Stenkvist et al., 1982, N Engl JMed 306: 484
【非特許文献１３】Stenkvist et al. 1999. Oncol Rep6: 493-6
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の態様において、上記の当技術分野のニーズの少なくともいくつか、例えば１つ以上に応える使用、方法、測定、試薬、組成物、およびキットを本発明は提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
より具体的には、Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-１（α１）サブユニットおよび／またはアルファ-３（α３）サブユニットを、（ａ）前記α１および／またはα３サブユニットの発現を減少させるか、（ｂ）前記α１および／またはα３サブユニットに結合する薬剤が標的とする場合に、そのような標的行為によって上記の利点の1つ以上が増殖性疾患の治療体系の中で発揮されることを、驚くべきことに本発明は実現した。
【００１３】
非限定的な一例として、例えばナトリウムポンプのα１および／またはα３サブユニットを特異的に標的とすることによって、効果の増大、および／または副作用の減少、および／または健常細胞に比較して癌性細胞に対する選択性の増大等がもたらされる。
【００１４】
文献記載によりアルファサブユニットには少なくとも4個のアイソマーが、ベータサブユニットには３個のアイソマーが存在し、したがってナトリウムポンプの(アルファ-N)2(ベータ-N)2には少なくとも１２個の異なるアイソマーがあると仮定すると、アルファ-１および／またはアルファ-３のみを特異的に標的とすれば格別な効果が示されるというのは非常に驚くべきことである。なお、ここでN＝１〜４である。
【００１５】
本発明は、上記関連の具体化を発明の多様な態様に統合する。
【００１６】
したがって、一態様において、本発明は特に増殖性疾患の治療において医薬品として使用するための、（ａ）Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-１サブユニットの発現を減少可能な、または（ｂ）Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-１サブユニットに結合可能な薬剤に関する。
【００１７】
別の態様では、本発明は特に増殖性疾患の治療において医薬品として使用するための、（ａ）Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-３サブユニットの発現を減少可能な、または（ｂ）Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-３サブユニットに結合可能な薬剤に関する。
【００１８】
更に他の態様では、本発明は増殖性疾患の治療用医薬品の調製のための、（ａ）Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-１サブユニットの発現を減少可能な、または（ｂ）Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-１サブユニットに結合可能な薬剤の使用に関する。
【００１９】
更に他の態様では、本発明は増殖性疾患の治療用医薬品の調製のための、（ａ）Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-３サブユニットの発現を減少可能な、または（ｂ）Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-３サブユニットに結合可能な薬剤の使用に関する。
【００２０】
更に他の態様では、本発明は増殖性疾患の治療用医薬品の調製のための、（ａ）Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-１サブユニットの発現を減少可能な、または（ｂ）Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-１サブユニットに結合可能な薬剤、および（ｃ）Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-３サブユニットの発現を減少可能な、または（ｄ）Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-３サブユニットに結合可能な薬剤の使用に関する。
【００２１】
一態様において、本発明は増殖性疾患の治療を必要としている被験体に対する増殖性疾患の治療方法であって、（ａ）Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-１サブユニットの発現を減少可能な、または（ｂ）Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-１サブユニットに結合可能な薬剤の治療有効量を前記被験体に投与する工程を含む、方法を提供する。
【００２２】
別の態様では、本発明は増殖性疾患の治療を必要としている被験体に対する増殖性疾患の治療方法であって、（ａ）Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-３サブユニットの発現を減少可能な、または（ｂ）Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-３サブユニットに結合可能な薬剤の治療有効量を前記被験体に投与する工程を含む、方法に関する。
【００２３】
更に別の態様では、本発明は増殖性疾患の治療を必要としている被験体に対する増殖性疾患の治療方法であって、（ａ）Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-１サブユニットの発現を減少可能な、または（ｂ）Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-１サブユニットに結合可能な薬剤、および（ｃ）Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-３サブユニットの発現を減少可能な、または（ｄ）Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-３サブユニットに結合可能な薬剤の治療有効量を前記被験体に投与する工程を含む、方法に関する。
【００２４】
関連する態様では、本発明は（１）（ａ）Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-１サブユニットの発現を減少可能な、もしくは（ｂ）Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-１サブユニットに結合可能な第一薬剤を同定または生成する工程、および／または（ｃ）Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-３サブユニットの発現を減少可能な、もしくは（ｄ）Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-３サブユニットに結合可能な第二薬剤を同定または生成する工程、ならびに（２）増殖性疾患の治療用医薬品の調製のために第一薬剤および／もしくは第二薬剤を使用する工程を含む、方法を提供する。
【００２５】
更に関連する態様では、本発明は増殖性疾患の治療を必要としている被験体に対する増殖性疾患の治療方法であって、（１）（ａ）Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-１サブユニットの発現を減少可能な、もしくは（ｂ）Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-１サブユニットに結合可能な第一薬剤を同定または生成する工程、および／または（ｃ）Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-３サブユニットの発現を減少可能な、もしくは（ｄ）Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-３サブユニットに結合可能な第二薬剤を同定または生成する工程、ならびに（２）第一薬剤および／もしくは第二薬剤の治療有効量を前記被験体に投与する工程を含む、方法を開示する。
【００２６】
別の態様では、本発明は（ａ）Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-１サブユニットの発現を減少可能な、もしくは（ｂ）Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-１サブユニットに結合可能な薬剤、および／または（ｃ）Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-３サブユニットの発現を減少可能な、もしくは（ｄ）Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-３サブユニットに結合可能な薬剤、またはそれらの薬剤の薬学的に許容される塩、それらの治療有効量を含む医薬組成物を提供する。また前記医薬組成物は薬学的に許容される緩衝剤、担体、賦形剤、安定化剤等の1つ以上を一般に含んでもよい。
【００２７】
別の態様では、本発明は増殖性疾患の治療において一般的に有用な、他の試薬、組成物または 装置のほかに上記抗体性薬剤または 医薬組成物を含むキットを提供する。
【００２８】
別の態様では、本発明は増殖性疾患の治療での療法剤として潜在的に有用な候補薬剤をテスト薬剤の群から選択するための測定法を提供し、前記測定法は、テスト薬剤が（ａ）Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-１サブユニットの発現を減少可能な、もしくは（ｂ）Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-１サブユニットに結合可能な、および／または（ｃ）Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-３サブユニットの発現を減少可能な、もしくは（ｄ）Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-３サブユニットに結合可能であるかを決定する工程を含む。
【００２９】
前記測定法は、そのように選択した候補薬剤を増殖性疾患のインビトロまたはインビボのモデル、例えば細胞、組織、または臓器のモデル、例えば非ヒト動物モデル、好ましくは非ヒト哺乳類モデルに投与したときの、その効果、例えば治療効果をモニターする工程を更に含んでよい。そうでなければ、前記測定法は、そのように選択した候補薬剤を投与のため組成物の調製用に使用し、これを増殖性疾患の非ヒト動物モデル、好ましくは非ヒト哺乳類モデルに投与し、その効果、例えば治療効果をモニターする工程を含んでよい。
【００３０】
また本発明は、上記諸態様の、続いて起こる特に好ましいが、典型的で非限定的な実施態様に関する。
【００３１】
一実施態様では、Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-１サブユニットおよび／またはアルファ-３サブユニットの発現を減少可能な薬剤はアンチセンス薬剤、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはリボザイム、またはRNA干渉を引き起こすことができる薬剤である。
【００３２】
別の実施態様では、Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-１サブユニットおよび／またはアルファ-３サブユニットに結合可能な薬剤はポリペプチドまたはタンパク質、抗体、ペプチド、ペプチド模倣薬、アプタマー、化学物質（好ましくは有機分子、更に好ましくは小さな有機分子）、脂質、炭水化物、核酸等である。
【００３３】
他の実施態様では、Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-１サブユニットおよび／またはアルファ-３サブユニットに特異的に結合可能な薬剤はNa+、K+−ATPアーゼの生物学的活性の１つ以上の態様を変更する、例えば阻害するまたは活性化することもできる。
【００３４】
別の実施態様では、増殖性疾患はNKAのアルファ-１サブユニットおよび／またはアルファ-３サブユニットを過剰発現する疾患である。
【００３５】
好ましい実施態様では、増殖性疾患、例えばNKAのアルファ-１および／またはアルファ-３サブユニットを過剰発現する疾患は神経膠腫、好ましくは神経膠芽細胞腫、前立腺癌、非小細胞肺癌（NSCLC）；または結腸癌から選択される。
【００３６】
特に好ましい実施態様では、増殖性疾患、特にNKAのアルファ-１サブユニットを過剰発現する疾患はNSCLCである。NSCLCにおけるNKAのアルファ-１サブユニットの過剰発現は、前記サブユニットが癌においてはダウンレギュレートされると報告（Sakai et al. 2004. FEBS Lett563(1-3): 151-4）されているから驚くべきことである。
【００３７】
これらの態様および追加態様、ならびに好ましい実施態様を以下の諸章節におよび添付の特許請求の範囲に記述する。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】NKAのアルファ-１サブユニットの典型的な配列を示す。
【図２】NKAのアルファ-３サブユニットの典型的な配列を示す。
【図３】NSCLC-ADCおよびNSCLC-SCCに対して正常な肺実質組織および気管支組織における、Na+／K+−ATPアーゼα１、α２、およびα３サブユニットの典型的な発現パターンを示す。
【図４】正常な肺の実質組織および気管支組織、NSCLC-ADC、NSCLC-SCC、および諸細胞株における、Na+／K+−ATPアーゼα１、α２、およびα３サブユニットの更に詳細な量的関係を示す。
【図５】siRNAによるNa+／K+−ATPアーゼα１減少の効果を示す。
【図６】ウアバイン、ジギトキシン、ジゴキシンとの対比による化合物２のインビトロの抗腫瘍効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本明細書で使用する単数形「a」、「an」、および「the」には、文脈上、別段明確な指示のある場合を除き、単数指示と複数指示の両方が含まれる。例えば、「an antibody」は１つまたは２つ以上の抗体をいい、「an antigen」は１つまたは２つ以上の抗原をいう。
【００４０】
本明細書で使用する用語「comprising」、「comprises」、および「comprised of」は、「including」、「includes」または「containing」、「contains」と同義であって、包括的または制約がなく、列記していない追加的な構成部材、要素または方法ステップを排除しない。
【００４１】
本明細書で使用する用語「約」は、それが実測可能な値、例えばパラメータ、量、時間的期間等を言っている場合には、特定値から＋／−２０％以下、好ましくは＋／−１０％以下、更に好ましくは＋／−５％以下、一層好ましくは＋／−１％以下、およびなお更に好ましくは＋／−０．１％以下の偏差を包含する意味合いがある。ただしそのような偏差が開示した発明で実施に適切である限りである。
【００４２】
本明細書に引用の文献は全てそれらの全体が参照によって本明細書に援用される。特に、本明細書で具体的に言及された全文献の教示は参照によって援用される。
【００４３】
したがって、本発明の態様は、Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-１サブユニットおよび／またはアルファ-３サブユニットの発現を減少可能な薬剤、ならびにNa+、K+−ATPアーゼのアルファ-１サブユニットおよび／またはアルファ-３サブユニットに結合可能な薬剤、ならびにそのような薬剤を治療、特に増殖性疾患の治療において使用することに関係しており、これらは要約の章に記載される。
【００４４】
本明細書で使用する用語「薬剤」は、広範に任意の化学的（例えば無機または有機）、生化学的または生物学的な物質、分子またはマクロ分子（例えば、生物学的マクロ分子）、それらを組み合わせたものまたは混合物、組成未測定の試料、または生物学的材料、例えばバクテリア、植物、黴、または動物の細胞または組織からの抽出物を言う。好ましいが非限定的な「薬剤」には、例えば核酸、オリゴヌクレオチド、リボザイム、ポリペプチドまたはタンパク質、ペプチド、ペプチド模倣薬、抗体およびこれらの断片および誘導体、アプタマー、化学物質、好ましくは有機分子、更に好ましくは小さな有機分子、脂質、炭水化物、ポリサッカライド等、ならびにこれらの任意の組合せが含まれる。
【００４５】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、本明細書では互換的に使用され、一般にはペプチド結合により連結しているアミノ酸残基のポリマーを言い、最小長に限定されない。したがって、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、二量体（ヘテロ体およびホモ体）、多量体（ヘテロ体およびホモ体）等は、この定義に含まれる。全長のタンパク質とその断片は両方共に定義に包含される。またこの用語には、ポリペプチドの発現後の修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化等が包含される。さらに、本発明の目的のために言えば、天然のタンパク質またはポリペプチドの配列に修飾、例えば削除、付加および置換 (例えば、性質は保存して)も含まれる場合に、これら用語は以上のような物を言う。
【００４６】
本明細書で使用する用語「ペプチド」は、好ましくは、本明細書で使用するポリペプチドであって、実質的に含有するアミノ酸の数が≦５０、例えば≦４５、好ましくは≦４０、例えば≦３５、更に好ましくは連続して≦３０、例えば≦２５、≦２０、≦１５、≦１０、または≦５のものを言う。
【００４７】
本明細書で使用する用語「核酸」は、実質的にヌクレオチドのみからなる任意の長さのポリマー、例えばデオキシリボヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドを意味する。核酸は、プリン塩基および／もしくはピリミジン塩基、ならびに／または他の天然の、化学的または生化学的に修飾（例えばメチル化）した、非天然のもしくは誘導した、ヌクレオチド諸塩基を含むことができる。核酸の骨格は、一般にはRNAまたはDNAに見られるように糖とリン酸基、および／または１つ以上の修飾もしくは置換した（例えば、２’-Ｏ-アルキル化、例えば、２’-Ｏ-メチル化もしくは２’-Ｏ-エチル化；または２’-Ｏ,４’-C-アルキン化、例えば２’-Ｏ,４’-C-エチル化）糖、または１つ以上の修飾もしくは置換したリン酸基を含むことができる。例えば、核酸の類似骨格には、例えばフォスフォジエステル、フォスフォロチオエート、フォスフォロジチオエート、メチルフォスフォネート、フォスフォラミデート、アルキルフォスフォトリエステル、スルファメート、３’−チオアセタール、メチレン（メチルイミノ）、３’−N−カルバメート、モルフォリノカルバメート、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）を含んでよい。
【００４８】
用語「核酸」は、更に具体的にはDNA、RNAおよびDNA／RNAハイブリッド分子を包含し、例えば具体的にはhnRNA、pre-mRNA、mRNA、ｃDNA、ゲノムDNA、遺伝子、増幅体、オリゴヌクレオチド、および合成（例えば、化学的合成）DNA、RNAまたはDNA／RNAハイブリッドが含まれる。本明細書で使用する用語「リボ核酸」および「RNA」は、リボヌクレオチドからなる任意の長さのポリマーを意味する。本明細書で使用する用語「デオキシリボ核酸」および「DNA」は、デオキシリボヌクレオチドからなる任意の長さのポリマーを意味する。本明細書で使用する用語「DNA／RNAハイブリッド」は、１つ以上のデオキシリボヌクレオチドおよび１つ以上のリボヌクレオチドからなる任意の長さのポリマーを意味する。
【００４９】
核酸は、天然素材であり得るし、例えば天然に存在しもしくは天然から単離可能であり、組み換えが可能、すなわち組換えDNA技術によって製造可能であり、および／または部分的にまたは全体的に、化学的にまたは生化学的に合成可能である。核酸は二本鎖、部分的二本鎖、または一本鎖であり得る。一本鎖の場合にはセンス鎖またはアンチセンス鎖であり得る。更に核酸は環状または直鎖状であり得る。
【００５０】
本明細書で使用する用語「オリゴヌクレオチド」は、一本鎖核酸（ヌクレオチドマルチマー）を言い、その長さはヌクレオチド数で２より大きく好ましくは２００まで、更に好ましくは約１０から約１００まで、一層好ましくは約１２から約５０までである。オリゴヌクレオチドは、当技術分野で公知の方法によって、例えば化学的または生化学的合成によって、例えば固相フォスフォラミド化学合成、または組換え核酸分子、例えばバクテリアベクターもしくはレトロウイルスベクターからインビボもしくはインビトロの発現によって、合成することができる。
【００５１】
「発現を減少可能」または「特異的に結合可能」における「可能（can）」は、「ができる(capable of)」と同義であり、ある存在物、例えばある薬剤が、例えば患者にまたは関連するインビトロまたはインビボのモデル系に投与された場合に、その詳述した効果または作用を詳述した正確な時点で達成することとは対照的に(達成を必要としなくてよい)、詳述した効果または作用を達成する能力がその薬剤にあるということを意味する。
【００５２】
本明細書では、用語「Na+、K+−ATPアーゼ」、「NKA」、「ナトリウムポンプ」およびこれらの変異体は、当技術分野でこれらの名称のもとに一般に公知である内在性膜タンパク質を言い、これらタンパク質は高等な真核生物に存在し、ATPの加水分解を利用して、原形質膜を横断してNa+またはK+イオンを運ぶ（総説には、Horisberger 2004； Lingreland Kuntzweiler 1994；前記文献を参照）。NKAもEC3.6.3.9として公知である。これらの用語は、存在する任意の生物、特に動物、好ましくは脊椎動物、更に好ましくは哺乳類、例えばヒトおよび非ヒト哺乳類由来の上記タンパク質を包含する。本明細書で使用するこれらの用語がNa+、K+−ATPアーゼを言っているのは、それが生物、器官、組織、および／または細胞の部分を形成し、ならびにこれらから少なくとも部分的に単離され、再構成される等の場合である。またこれら用語がNa+、K+−ATPアーゼを包含するのは、その部分の１つ以上または全ては組換えDNA技術を用いて発現されている場合である。
【００５３】
NKAの原型の構造組織には２つのアルファ（α）サブユニットと２つのベータ（β）サブユニットからなるヘテロ四量体が含まれる。本発明は、特にアルファサブユニットの特定のアイソフォーム、すなわちアルファ-１（α１）およびアルファ-３（α３）に関する。
【００５４】
本明細書で使用する用語「アルファ-１」または「α１」サブユニット、および「アルファ-３」または「α３」サブユニットとは当技術分野でそのような名称で一般に公知のNa+、K+−ATPアーゼのそれぞれのサブユニットを言う。この用語には、存在する任意の生物由来の、特に動物、好ましくは脊椎動物、更に好ましくは哺乳類、例えばヒトおよび非ヒト哺乳類由来の上記サブユニットが包含される。
【００５５】
本明細書で使用する「アルファ-１」／「α１」サブユニットまたは「アルファ-３」／「α３」サブユニットとは、「天然の」配列を有するポリペプチド、すなわち１次配列が天然からそれぞれ誘導したNKAのアルファ-１またはアルファ-３サブユニットの配列と同じのポリペプチドを言う。α１サブユニットの天然の配列、またはα３サブユニットの天然の配列は、種が異なれば該種間での遺伝的多様性により、異なる可能性があることを当業者は了解している。更に、α１サブユニットの天然の配列またはα３サブユニットの天然の配列は、一定の種の中での通常の遺伝的多様性（変異）により、種は同じでも異なる個体間でまたは個体内でさえも、異なる可能性がある。また、α１サブユニットの天然の配列またはα３サブユニットの天然の配列は、転写後の修飾、例えば差別的なスプライシング、RNAの編集等により、種は同じでも異なる個体間でまたは個体内でさえも、異なる可能性がある。したがって、天然に存在するアルファ-１またはアルファ-３の配列、および好ましくは生物学的な機能を有する分子を規定する配列は天然のものと考えられる。
【００５６】
本明細書で使用する「アルファ-１」／「α１」サブユニットもしくは「アルファ-３」／「α３」サブユニットは生物、器官、組織、および／もしくは細胞の部分を形成していてよく、またはこれらから（少なくとも部分的に）単離され、再構成されてよい。これらの用語は組換えまたは合成の手段によって生産されたそれぞれサブユニットをも包含する。
【００５７】
典型的なNKAのアルファ-１サブユニットには、例えば、Uniprot/Swissprot (http://www.expasy.org/) アクセッション番号 P05023（図１にSEQ ID NO: 1としても示してある）によって注釈されている１次配列を有するヒトα１サブユニット、ならびに、他の動物由来で同じデータベースに注釈されている１次配列を有するヒトα１サブユニット、例えばイヌ（アクセッション番号P50997）、ブタ（P05024）、ヒツジ（P04074）、ウマ（P18907）、ニワトリ（P09572）、マウス（Q8VDN2）、またはラット（P06685）由来が含まれるが、これらに限定されない。上記配列には成熟タンパク質に（少なくとも部分的に）存在しない可能性のある前駆体プロペプチドを含有するものがあることを当業者は了解する。例えば、ヒトα１サブユニット（P05023）に対してUniprot/Swissprotに登録されているものはSEQ ID NO: 1に示すアミノ酸１〜５からなるプロペプチドを特定している。同様なプロペプチドが他のα１サブユニット前駆体にも存在する可能性がある。留意すべきこととして、同一種内変異または転写後修飾等によっても上に列記の配列とは多少異なる天然アルファ-１サブユニットの配列が生産される可能性がある。
【００５８】
典型的なNKAのアルファ-３サブユニットには、例えば、Uniprot/Swissprot (http://www.expasy.org/) アクセッション番号 P13637（図２にSEQ ID NO: ２としても示してある）によって注釈されている１次配列を有するヒトα３サブユニット、ならびに、同じデータベースに注釈されている１次配列を有する他の動物由来、例えばニワトリ（P24798）、マウス（Q6PIC6）、またはラット（P06687）由来のα３サブユニットが含まれるが、これらに限定されない。上記配列または他のα3配列には成熟タンパク質に存在しない可能性のある前駆体プロペプチドを含有する可能性があることを当業者であれば了解する。留意すべきこととして、同一種内変異または転写後修飾等によっても上に列記の配列とはある程度異なる他の天然アルファ-３サブユニットの配列が生産され得る。
【００５９】
用語「単離された」は、自然環境の成分から同定、分離されおよび／または回収された分子を言う。例えば、単離されたタンパク質は細胞材料または誘導元の細胞または組織由来の他のタンパク質から実質的に分離することができる。同様に、単離された核酸は細胞材料または誘導元の細胞もしくは組織由来の他の核酸から実質的に分離することができる。
【００６０】
また、用語「単離された」は、上記単離された分子、例えばポリペプチドもしくはタンパク質、または核酸が実質的に純度がよい、例えば少なくとも７０〜８０%重量純度、更に好ましくは少なくとも８０〜９０%重量純度、一層好ましくは少なくとも９０〜９５%重量純度、最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００%重量純度である調製物を言う。例えば、ポリペプチドまたはタンパク質の純度はLowry法によって測定してよい。また単離されたポリペプチドまたはタンパク質は均質性に精製してよく、均質性はクマシーブルーまたは好ましくは銀汚染を使用して還元性または非還元性条件下でSDS-PAGEにより決定される。しかし、別の方法として、単離されたポリペプチドまたはタンパク質を十分に精製してスピンニングカップ配列決定装置によりN末端または内側のアミノ酸配列を少なくとも１５残基取得してもよい。例えば、核酸の純度は吸光度A２６０／A２８０を測定して決定してよい。また、単離された核酸は均質性に精製してよく、均質性はアガロースまたはポリアクリルアミドゲルの電気泳動およびエチジウムブロマイドまたは同じような染色により決定してよい。
【００６１】
Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-１サブユニットおよび／またはアルファ-３サブユニットに結合する薬剤
以上より、本発明の一態様として、薬剤はNa+、K+−ATPアーゼのアルファ-１サブユニットおよび／またはアルファ-３サブユニットに結合することができる。
【００６２】
本明細書で使用する用語「結合」は、一般に分子体の間、例えば「リガンド」（一般に任意の薬剤、例えば物質または分子を言う）と「レセプター」（一般に任意の分子を言う）の間の物理的会合、好ましくは非共有結合的な物理的会合を言う。好ましくは、「レセプター」はポリペプチドもしくはタンパク質、例えばNKAのアルファ-１サブユニットもしくはアルファ-３サブユニット、またはそれらの変異体もしくは断片、または以上をコードする核酸であってよい。好ましくは、「リガンド」は、例えばポリペプチドまたはタンパク質、抗体、ペプチド、ペプチド模倣薬、アプタマー、化学物質（好ましくは有機分子、さらに好ましくは小さな有機分子）、脂質、炭水化物、核酸等であってよい。
【００６３】
好ましい実施態様では、薬剤はNKAのアルファ-１サブユニットおよび／またはアルファ-３サブユニットの天然の立体配座に結合することができる。
【００６４】
用語「天然の立体配座」は、タンパク質の天然状態の二次構造および三次構造を実質的に保持している立体配座を言うのに使用する。一例として、NKAのアルファ-１サブユニットまたはアルファ-３サブユニットが天然の立体配座を有すると言われるのは、それらがそれぞれの天然のサブユニットの二次構造および三次構造を実質的に保持し、好ましくは天然のNKA、例えば好ましい酵素活性NKAの一部をなす場合である。
【００６５】
有利なことには、それぞれの標的タンパク質、例えば特定のNKAアルファ-サブユニットは天然の、または実質的に天然の立体配座で主に存在することが期待される場合には、標的ポリペプチドの天然の立体配座に結合する薬剤は、インビボで特に有効であることが待ち望まれている。
【００６６】
実施態様において、薬剤は、NKAのアルファ-１サブユニットもしくはNKAのアルファ-３サブユニット、の（１）細胞外部分もしくは（２）細胞内部分もしくは（３）膜貫通部分に結合できる、または（同時に）サブユニットそれぞれの前記位置の２つ以上に結合できる。
【００６７】
本明細書で使用する用語、NKAのアルファ-１サブユニットまたはアルファ-３サブユニットの「細胞外部分」とは、各サブユニットの部分であって、各サブユニットが天然の立体配座にある場合、例えば各サブユニットが天然のNKA，例えば好ましくは酵素的に活性なNKAの一部をなす場合に、細胞の外部空間に向かってまたは細胞内の膜結合オルガネラの内腔に向かって露出されている部分を言う。これを補足する用語「細胞内部分」とは、NKAのアルファ-１サブユニットまたはアルファ-３サブユニットの部分であって、細胞の細胞質に面している部分を言う。したがって、用語「膜貫通部分」とは、NKAのアルファ-１サブユニットまたはアルファ-３サブユニットの部分であって、細胞膜の内部に埋め込まれている部分を言う。
【００６８】
非限定的に実例で示すと、ヒトのアルファ-１サブユニットに対してUniprot/Swissprot に登録されているP05023の指摘によれば、SEQ ID NO:1に示すアルファ-１配列のアミノ酸１０９〜１３１、３０９〜３２０、７９３〜８０２、８６７〜９１８および９７１〜９８５はこのサブユニットの内腔／細胞外部分を構成し、またはその部分に寄与するものと特に予想され；SEQ ID NO: 1に示すアルファ-１配列のアミノ酸６〜８７、１５３〜２８８、３３９〜７７２、８２４〜８４３，９３９〜９５１および１００７〜１０２３はこのサブユニットの細胞質部分を構成し、またはその部分に寄与するものと特に予想され；およびSEQ ID NO: 1に示すアルファ-１配列のアミノ酸８８〜１０８、１３２〜１５２、２８９〜３０８、３２１〜３３８、７７３〜７９２、８０３〜８２３、８４４〜８６６、９１９〜９３８、９５２〜９７０および９８６〜１００６はこのサブユニットの膜貫通部分を構成し、またはその部分に寄与するものと特に予想される。
【００６９】
非限定的に実例で示すと、ヒトのアルファ-３サブユニットに対してUniprot/Swissprot に登録されているP13637の指摘によれば、SEQ ID NO: ２に示すアルファ-３配列のアミノ酸９９〜１２１、２９９〜３１０、７８３〜７９２、８５７〜９０８および９６１〜９７５はこのサブユニットの内腔／細胞外部分を構成し、またはその部分に寄与するものと特に予想され；SEQ ID NO: ２に示すアルファ-３配列のアミノ酸１〜７７、１４３〜２７８、３２９〜７６２、８１４〜８３３，９２９〜９４１および９９７〜１０１３はこのサブユニットの細胞質部分を構成し、またはその部分に寄与するものと特に予想され；およびSEQ ID NO:２に示すアルファ-３配列のアミノ酸７８〜９８、１２２〜１４２、２７９〜２９８、３１１〜３２８、７６３〜７８２、７９３〜８１３、８３４〜８５６、９０９〜９２８、９４２〜９６０および９７６〜９９６はこのサブユニットの膜貫通部分を構成し、またはその部分に寄与するものと特に予想される。
【００７０】
当業者は、ポリペプチドまたはタンパク質の膜トポロジーを予測するアルゴリズム、ならびにそのように予測したトポロジーを証明する実験方法を承知しており、その方法を適用すればNKAのアルファ-１サブユニットまたはアルファ-３サブユニットの内腔／細胞外領域、膜貫通領域および細胞内／細胞質領域を予測することができる。例えば、この目的のための適切な予測アルゴリズムはBernsel and Von Heijne 2005 (Protein Science 14: 1723-1728)に記載している。
【００７１】
好ましい実施態様において、薬剤はアルファ-１サブユニットおよび／またはアルファ-３サブユニットの細胞外部分に結合することができる。例えば、そのような結合により、結合を誘発する目的で薬剤が細胞膜を通過することは必要とされず、それゆえに薬物の送達が潜在的に容易になる。
【００７２】
好ましい実施態様において、薬剤は生理学的な条件下でNKAのアルファ-１サブユニットおよび／またはアルファ-３サブユニットに結合することができる。「生理学的な条件」とは生物の（例えば治療される被験体、例えば動物またはヒト被験体の）健康または正常な機能動作に特徴的な条件である。
【００７３】
本発明態様の好ましい実施態様において、本発明の薬剤はNKAのアルファ-１サブユニットおよび／またはアルファ-３サブユニットに高い親和性で結合する。
【００７４】
本明細書で使用するように、結合が「高い親和性」と考えることができるのは、そのような結合の親和性定数（KA）が、KA ≧1×104 M−1、好ましくは KA ≧ 1×105 M−1、 更に好ましくは KA ≧ 1×106 M−1 、例えば、 KA ≧1×107 M−1、そのうえ更に好ましくは KA≧ 1×108 M−1、一層好ましくは KA ≧ 1×109 M−1、例えば KA≧ 1×1010 M−1、最も好ましくは KA ≧ 1×1011 M−1、例えば KA ≧1×1012 M−1、 KA ≧ 1×1013 M−1、 KA ≧ 1×1014 M−1、 KA ≧ 1×1015 M−1 、あるいはそれ以上の場合である。ここで、KA＝（リガンド−レセプター）／（リガンド）（レセプター）である。KAの決定は当技術分野で公知の方法により、例えば平衡透析およびスキャッチャードプロット解析を使用して実施することができる。
【００７５】
有利なことには、高い親和性結合により、その薬剤と分子標的との間の比較的に高い相互作用力のために、患者での治療効果を達成するのに必要とする薬剤の量を減らすことができる。
【００７６】
本発明の態様の更に好ましい実施態様において、NKAのアルファ-１サブユニットおよび／またはアルファ-３サブユニットに対する本発明の薬剤の結合は特異的であり得る。
【００７７】
用語「特異的に結合する」または「特異的な結合」は、リガンドが無作為で関連のないレセプターに結合するよりも、もっと容易にリガンドが所与のレセプターに結合する場合の状況を示す。例えば、ポリペプチドまたはタンパク質（１）に特異的に結合するリガンド（薬剤）は、前記ポリペプチドまたはタンパク質（１）に特異的に結合する条件下では、他のポリペプチドに、好ましくは前記ポリペプチドまたはタンパク質（１）の同族体もしくは相同体に、ほとんど結合しないか、または全く結合しないことが好ましい。ほとんど結合しないか、または全く結合しなければ、その意味は、KA ≦ 1×104 M−1、 好ましくは KA ≦ 1×103 M−1、 更に好ましくは KA ≦ 1×102 M−1、 そのうえ更に好ましくは KA≦ 1×101M−1、 例えば KA ≦ 1 M−1、 最も好ましくは KA << 1 M−1、例えば KA ≦ 1×10−1 M−1、 KA ≦1×10−２ M−1、 KA ≦ 1×10−３ M−1、 KA ≦ 1×10−４ M−1、 KA ≦ 1×10−５ M−1、 KA ≦ 1×10−６ M−1、またはそれ以下である。
【００７８】
非限定的な一例として、NKAのアルファ-１サブユニットに特異的に結合する薬剤は、他の任意のNKAアルファサブユニットアイソフォーム、例えばアルファ-２、アルファ-３およびアルファ-４にほとんど結合しないか、または全く結合しないことが好ましい。NKAのアルファ-３サブユニットに特異的に結合する薬剤は、他の任意のNKAアルファサブユニットアイソフォーム、例えばアルファ-１、アルファ-２およびアルファ-４にほとんど結合しないか、または全く結合しないことが好ましい。NKAのアルファ-１およびアルファ-３のサブユニットに特異的に結合する薬剤は、他の任意のNKAアルファサブユニットアイソフォーム、例えばアルファ-２およびアルファ-４にほとんど結合しないか、または全く結合しないことが好ましい。
【００７９】
有利なことには、薬剤にこのように特異的な結合により、特異的に標的とするアルファサブユニットを含む分子以外のNKA分子に対する効果を含め、特異的標的以外のレセプターに対するその薬剤の潜在的な効果が減少し、それにより治療の選択性が向上し、望ましくない副作用が起こる機会が減少する。
【００８０】
好ましくは高い親和性で、かつ特異的に、NKAのアルファ-１および／またはアルファ-3サブユニットに結合する薬剤は、好ましい実施態様においてNKAの生物活性をも変更、例えば阻害または活性化する可能性があり、すなわちNKAの「阻害剤」または「活性化剤」である可能性がある。
【００８１】
そのような薬剤がNKAの「阻害剤」または「活性化剤」であると言われる場合には、NKAのアルファサブユニットの１つまたは両方への前記薬剤の結合は、前記薬剤が結合しなかった場合に比べて、前記NKAの生物活性の１つ以上の態様をそれぞれ減少または増大させることを一般には意味する。また、これらの用語が言っている可能性のあることとして、NKAの生物活性を含んでいるインビトロ系、細胞、組織または生体に、好ましくは患者にこれらの薬剤を投与することによって、前記NKAの生物活性の１つ以上の態様が、前記薬剤を投与しなかった場合に比べて、それぞれ減少または増大する。
【００８２】
NKAの生物活性の一態様はその酵素活性であり、すなわちATPの加水分解によってNa+とK+イオンの膜横断交換に対する能力である。したがって、NKA「阻害剤」はNKAの酵素活性を阻害する可能性があり、NKA「活性化剤」はNKAの酵素活性を活性化する可能性がある。例えば、そのレベルを測定／試験する典型的な方法、すなわち問題の薬剤によるNKAの酵素活性の阻害または活性化を実施例３に示す。
【００８３】
NKAの生物活性の一態様はシグナル伝達経路、例えばSrcキナーゼ、上皮成長因子受容体、Ras、p42／p44マイトージェン活性化タンパク質キナーゼ、および活性酸素種産生増加を含むシグナル伝達経路の制御である（Xie and Askari2002; Wang et al. 2004； 上記）。したがって、NKA「阻害剤」はNKAによって制御されるシグナル伝達経路の１つ以上を阻害する可能性があり、NKA「活性化剤」はNKAによって制御されるシグナル伝達経路の１つ以上を活性化する可能性がある。当業者が認めるところとして、所与のリガンドはNKAの生物活性の１つ以上の態様に、例えば上記２つの態様に影響を与える可能性がある。非限定的な一例として、所与のリガンドがNKAの酵素活性を阻害し、しかしNKAが制御するシグナル伝達経路の１つ以上を活性化する可能性がある。したがって、例えばNKAの酵素活性に影響を与えるNKA「阻害剤」と言われる薬剤は、NKAが制御するシグナル伝達経路の１つ以上を実際に活性化する可能性がある。さもなければ、所与の薬剤はNKAが制御するシグナル伝達経路の１つ以上を阻害し、しかし他のNKAが制御するシグナル伝達経路等の１つ以上を活性化する可能性がある。
【００８４】
用語「阻害する」および「活性化する」は、それぞれ阻害または活性化の任意の程度を包含する。例えば、NKA生物活性、例えば酵素活性および／またはシグナル伝達活性の１つ以上の(各独立の)態様に対する阻害率は、薬剤がNKAのアルファサブユニットの一または両方に結合する場合には、少なくとも約１０％、例えば少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約３０％、例えば少なくとも約４０％、更に好ましくは少なくとも約５０％、例えば少なくとも約６０％、更に一層好ましくは少なくとも約７０％、例えば少なくとも約８０％、および最も好ましくは少なくとも約９０％、例えば少なくとも約９５％、例えば少なくとも約９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の可能性がある。
【００８５】
例えば、NKA生物活性、例えば酵素活性および／またはシグナル伝達活性の１つ以上の(各独立の)態様に対する活性化率は、薬剤がNKAのアルファサブユニットの１つまたは両方に結合する場合には、少なくとも約１０％、例えば少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約３０％、例えば少なくとも約４０％、更に好ましくは少なくとも約５０％、例えば少なくとも約７５％、更に一層好ましくは少なくとも約１００％、例えば少なくとも約１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％、または少なくとも約５００％の可能性がある。
【００８６】
好ましい実施態様において、NKAのアルファ-１および／またはアルファ-３サブユニットに結合する薬剤は以下の効果、すなわち（１）NKAの酵素活性を阻害、（２）カベオリン１の細胞発現を減少（例えば、Glenney et al. 1992. FEBS Lett 314: 45-48 and Swissprot Q03135 for description ofhuman caveolin-1を参照）、（３）細胞アクチン細胞骨格の崩壊を惹起、（４）細胞ATPの消耗を惹起、（５）NKA アルファサブユニットと細胞アクチン細胞骨格との間の相互作用の解離を惹起、の１つ、２つ以上または全部を誘導する可能性がある。本発明者らは、上記効果の１つ以上が本発明による増殖性疾患の治療に特に関連している可能性があることを実感した。薬剤の上記効果は、適当なモデル系、例えば細胞性または非ヒト動物モデル系、例えば実施例３もしくは４に示す系、または当技術分野で公知の方法、例えば免疫細胞化学、共焦点顕微鏡および／もしくは免疫沈降を使用して検査することができる。
【００８７】
更に好ましい実施態様において、NKAのアルファ-１サブユニットおよび／またはアルファ-３サブユニットに結合可能な薬剤は細胞培地および／または関連する増殖性疾患の非ヒト動物モデルにおいて、抗増殖効果および／または抗転移効果を誘起する可能性があり、実施例６に示す。
【００８８】
好ましい実施態様において、NKAのアルファ-１サブユニットおよび／もしくはアルファ-３サブユニットに結合することができる薬剤またはリガンドは、化学物質、好ましくは有機分子、更に好ましくは小さい有機分子、ペプチド、ペプチド模倣薬、ポリペプチドもしくはタンパク質、抗体、例えばその断片および誘導体、アプタマー、脂質、炭水化物、もしくは核酸、例えばオリゴヌクレオチド、からなる群から選択することができる。このような薬剤は本明細書で定義した単離または実質的に単離されてよい。
【００８９】
上で挙げた型の薬剤、例えば化学物質、ペプチド、アプタマー、炭水化物、または核酸の多くは合成物、コンビナトリアル製品、および天然物のライブラリーで入手可能であり、本発明スクリーニングアッセイを使用しNKAのアルファ-１および／またはアルファ-３サブユニットへのテスト薬剤の結合性を決定することにより、ライブラリーから選択することができる。
【００９０】
好ましい一実施態様において、NKAのアルファ-１サブユニットおよび／またはアルファ-３サブユニットに結合することができる薬剤またはリガンドは、化学物質、好ましくは有機分子、更に好ましくは小さい有機分子である。
【００９１】
本明細書で使用する用語「化学物質」または「化合物」は当技術分野でのそれらの意味合いを言う。これらの用語には、化学結合した２つ以上の異なる化学元素からなり、その組成を決定する比率が一定である物質が包含される。その用語には有機化合物および無機化合物が共に包含される。
【００９２】
本明細書で使用する用語「有機化合物」または「有機分子」は当技術分野でのそれらの広い意味合いを言う。これらの用語には、天然物である有機分子、ならびに半合成または全合成した有機分子が包含される。
【００９３】
本明細書で使用する用語「小さな有機分子」は、医薬品で一般に使用するそれら有機分子に匹敵する大きさを有する有機化合物を言う。この用語には生化学的なマクロ分子（例えば、タンパク質、核酸等）は除外される。好ましい小さな有機分子の大きさは、約５０００Daまで、例えば約４０００Daまで、好ましくは約３０００Daまで、更に好ましくは約２０００Daまで、一層好ましくは約１０００Daまで、例えば約９００、８００、７００、６００Daまで、または約５００Daまでの範囲である。
【００９４】
実施態様において、有機分子は化学式１の化合物を含む、またはそれからなる群から選択される。
【化１】
2010509251.tif 000002
式中、R1はフォルミル、ヒドロキシC１−４アルキル、C１−４アルキルカルボニルオキシC１−４アルキル、C５−１２アリールカルボニルオキシC１−４アルキルから選択され、R2はオキソ、C１−４アルキルカルボニルC１−４アルキル、C５−１２アリールカルボニルC１−４アルキルから選択され、またはR2はR2を担持する炭素原子と複素環の窒素原子との間の二重結合である。好ましくは、R1はフォルミル、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、メチルカルボニルオキシメチル、エチルカルボニルオキシメチル、プロピルカルボニルオキシメチル、フェニルカルボニルオキシメチルから選択され、R2はオキソ、メチルカルボニルオキシメチル、エチルカルボニルオキシメチル、プロピルカルボニルオキシメチル、フェニルカルボニルオキシメチルから選択され、またはR2はR2を担持する炭素原子と複素環の窒素原子との間の二重結合である。
【００９５】
本実施例の典型的な化合物には、表１の化合物が含まれるが、これらに限定されない。
【００９６】
【表１】
2010509251.tif 000003
*は、化学式１のN含有複素環のN原子とC原子との間の二重結合を意味する。
【００９７】
更に好ましい一実施態様において、有機分子は次の化学式の化合物２である。
【化２】
2010509251.tif 000004
【００９８】
上記化合物は、例えばVan Quaquebeke et al.2005 (J Med Chem 48: 849-856)に詳記の方法、またはそれらの改良法を使用して(半)合成することができる。
【００９９】
更に好ましい実施態様において、NKAのアルファ-１サブユニットおよび／またはアルファ-３サブユニットに結合することができる薬剤またはリガンドはペプチド模倣薬、特に各サブユニットに結合するペプチドのペプチド模倣薬である。
【０１００】
本明細書で使用する用語「ペプチド模倣薬」は、対応するペプチドの位相類似体である非ペプチド性の薬剤を言う。ペプチドのペプチド模倣薬を合理的にデザインする方法は当技術分野で公知である。例えば、硫酸化した８量体ペプチドCCK26-33に基づく３つのペプチド模倣薬および１１量体ペプチドSubstance Pに基づく２つのペプチド模倣薬の合理的なデザイン、および関連するペプチド模倣薬のデザイン原理は、Horwell 1995 (Trends Biotechnol13: 132-134)に記載している。
【０１０１】
ペプチド模倣薬は向上した特性をしばしば示し、例えば対応するペプチドよりも安定性が向上し、加水分解への抵抗が増大し、送達が容易である。
【０１０２】
更に好ましい実施態様において、NKAのアルファ-１サブユニットおよび／またはアルファ-３サブユニットに結合することができる薬剤またはリガンドがアプタマーである。
【０１０３】
本明細書で使用する用語「アプタマー」は、単鎖もしくは二重鎖のオリゴDNA、オリゴRNAもしくはオリゴDNA／RNAまたはこれらの類似体であって、標的分子に、好ましくはポリペプチドまたはタンパク質、例えばNKAのアルファ-１サブユニットまたはアルファ-３サブユニットに特異的に結合し、その生物活性を変更するものを言う。アプタマーは生理的条件下でそれらのそれぞれの標的に結合することができる。アプタマーをインビトロで選定すると、特定のタンパク質に対する特異性および親和性が高い極めて希少なオリゴ体を急速に単離することができる。典型的なRNAアプタマーは、本明細書に参照によって援用されるUS 5,270,163、 Ellington and Szostak1990 (Nature 346: 818-822)、 Tuerk and Gold1990 (Science 249: 505-510)に記載されている。RNAアプタマーはタンパク質の個々の機能部位をしばしば細かく識別することができ、Gold et al. 1995 (AnnuRev Biochem 64: 763-797)を参照。
【０１０４】
好ましい実施態様において、NKAのアルファ-１サブユニットおよび／またはアルファ-３サブユニットに結合することができる薬剤またはリガンドは抗体であり、その断片および誘導体を含む。
【０１０５】
本明細書で使用する用語「抗体」は、その最も広い意味で使用され、一般には任意の免疫結合剤を言う。この用語には、無傷のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの無傷の抗体から形成された多価（例えば２、３以上の価）および／または多特異的抗体（例えば２つ以上に特異的な抗体）、および所望の生物活性（特に関連する抗原に特異的に結合する可能性）を発揮する限りの抗体断片、ならびにこのような断片の多価および／または多特異的複合体、が包含される。用語「抗体」には、免疫化を含む方法によって生成した抗体ばかりでなく、任意のポリペプチド、例えば組換え技術で発現されたポリペプチドであって、関連する抗原上のエピトープに特異的に結合することができる少なくとも１つの相補性決定領域（CDR）を包むように作製されたもの、が包含される。したがって、この用語が以上のような分子に適用される場合には、それらの生産がインビトロであるかインビボであるかは関係ない。
【０１０６】
好ましくは、本発明の方法で用いる抗体は単離されていてよい。「単離された」抗体はその自然環境の成分から同定され、分離されおよび／または回収されたものである。抗体の自然環境の混入物質は抗体の治療的使用を妨害する材料であり、酵素、ホルモン、他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質等が含まれる可能性がある。好ましくは、単離された抗体は、（１）Lowry法で測定した抗体重量が８０％を超えるまで、更に好ましくは９０％を超えるまで、なお一層好ましくは９５％を超えるまで、最も好ましくは９９％を超えるまで、および／または（２）還元もしくは非還元条件下でクマシーブルーもしくは好ましくは銀染色を使用して、SDS-PAGEによって均質性になるまで、および／または（３）アミノ酸配列のN末端もしくは内部の少なくとも１５残基がスピンニングカップ配列決定装置を使用して取得されるのに十分な程度にまで、精製される。単離された抗体には例えば組換え細胞内のin situ抗体が含まれる。その理由はその抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないからである。しかし、通常は、単離された抗体は精製の少なくとも一工程により調製されるだろう。
【０１０７】
したがって、本抗体は好ましくはNKAのアルファ-１サブユニットおよび／またはアルファ-３サブユニット（したがってその抗体の抗原である）「に特異的に結合することができ」または「に特異的」であり、この意味は、該抗体がサブユニットのそれぞれのエピトープに自分の相補性決定領域（CDR）を介して結合することができるということ、およびこの結合にはCDRとエピトープとの間に多少の相補性が必要であるということである。抗体と抗原の間の特異的結合は通常は非共有結合であり可逆的である。したがって、抗体が自分のCDRを介してサブユニットのエピトープに結合する方が無作為で関連のないエピトープに結合するよりも容易である場合に、その抗体はサブユニットそれぞれに「特異的に結合する」または「特異的」である。
【０１０８】
特異的な結合は、通常は親和性が高く容量性が低〜中程度であることによって表現され、反対に非特異的な結合は多くの場合に親和性が低く容量性が中〜高程度である。抗体の抗原に対する、本明細書で使用する用語「親和性」は、個々のエピトープが抗体分子のCDRに結合する強さの尺度を言う。例えば、Harlow et al. 1988. Antibodies: A LaboratoryManual, Cold Spring HarbourLaboratory Press, 2nd ed., p. 27-28を参照。ここで用語「結合力」とは一群の免疫グロブリンと抗原との複合体の全安定性、すなわち免疫グロブリンと抗原の混合物の機能的な結合力を言う。例えば、Harlow at p. 29-34を参照。
【０１０９】
本明細書で使用するように、抗体の抗原に対する結合が特異的であると考えられる場合には、親和性定数はKA ≧ 1×104 M−1、 好ましくは KA ≧ 1×105 M−1、 更に好ましくは KA ≧ 1×106 M−1 、例えば, KA ≧ 1×107 M−1、 一層好ましくは KA ≧ 1×108 M−1、例えば, KA ≧ 1×109 M−1、 KA ≧ 1×1010 M−1、 最も好ましくは KA ≧ 1×1011 M−1、例えば KA ≧ 1×1012 M−1、 KA ≧ 1 ×1013 M−1、KA ≧ 1×1014 M−1、KA ≧ 1×1015 M−1であり以上であり、ここで KA= [AgAb]／[Ag][Ab]である。抗体の結合親和性は、例えば、Munson et al. 1980 (Anal Biochem107: 220)のスキャッチャードプロット解析によって、BIAcore system (BiacoreAB, Uppsala, Sweden)におけるように、決定することができる。
【０１１０】
また抗体はそれらの交差反応性によって記述してもよい。本明細書で使用する用語「交差反応性」とは第一の抗原に特異的な抗体が第二の抗原と反応する可能性、すなわち２つの異なる抗原物質の間の近縁性の尺度を言う。したがって、ある抗体が交差反応性である場合には、その抗体は自分の形成を誘導したエピトープ以外のエピトープにも結合する。
【０１１１】
ある抗体が、その誘導（すなわち特異的）エピトープと特異的に結合する条件下で、他のエピトープ、例えば自分との特異的なエピトープとの配列同一性が99.5%未満、 99%未満、 98%未満、 97%未満、 96%未満、 95%未満、 94%未満、93%未満、 92%未満、 91%未満、90%未満、 85%未満、 80%未満、 75%未満、 70%未満、65%未満、 60%未満、 55%未満、および／または 50%未満であるエピトープとは実質的に結合しない場合(例えば、KA ≦ 1×104 M−1、 好ましくは KA ≦ 1×103 M−1、 更に好ましくは KA ≦ 1 ×102 M−1、 そのうえ一層好ましくはKA ≦ 1×101 M−1、例えば KA ≦ 1 M−1、最も好ましくは KA << 1 M−1、例えば KA ≦ 1×10−1M−1、KA ≦ 1 ×10−2M−1、KA ≦ 1×10−3M−1、KA ≦1 ×10−4M−1、KA ≦ 1×10−5M−1、KA ≦ 1×10−6M−1、または未満)には、その抗体は「交差反応性」が微小または皆無であると言ってよい。
【０１１２】
所与のポリペプチドまたはタンパク質に特異的なある抗体が、前記ポリペプチドまたはタンパク質と特異的に結合する条件下で、前記ポリペプチドまたはタンパク質の同族体もしくは相同体と実質的に結合しない場合(例えば、KA ≦ 1×104 M−1、好ましくはKA ≦ 1×103 M−1、更に好ましくはKA≦ 1×102 M−1、一層好ましくはKA ≦ 1×101 M−1、例えばKA ≦ 1 M−1、最も好ましくはKA << 1 M−1、例えば KA ≦ 1×10−1M−1、KA ≦1 ×10−2M−1、KA ≦ 1×10−3M−1、KA ≦1×10−4M−1、KA ≦ 1×10−5M−1、KA≦ 1×10−6M−1、または未満)には、その抗体はその同族体または相同体と「交差反応性」が微小または皆無であると言ってよい。
【０１１３】
例えば、所与のポリペプチドまたはタンパク質（１）に特異的なある抗体が他のポリペプチドまたはタンパク質（２）との、例えば前記ポリペプチドまたはタンパク質（１）の同族体もしくは相同体との「交差反応性」が微小または皆無であると言ってよい場合には、このようなポリペプチドまたはタンパク質（２）に対する前記抗体の結合の程度は、例えば蛍光活性化細胞選別(FACS)分析または（放射線）免疫沈降法（RIA)によって測定すると、ポリペプチドまたはタンパク質（１）および（２）に対する前記抗体の全結合の10％未満、好ましくは5%未満、更に好ましくは1%未満、一層更に好ましくは0.1%未満、最も好ましくは0.01%未満、または0.001%未満である。典型的にこれは上記したNKAアルファサブユニットにも適用することができる。
【０１１４】
好ましい実施態様において、NKAのアルファ-１サブユニットに特異的な抗体が示す、他のNKAアルファサブユニットの任意のアイソフォーム、例えばアルファ-２、アルファ-３およびアルファ-４との交差反応性は好ましくは微小または皆無である。NKAのアルファ-３サブユニットに特異的な抗体が示す、他のＮＫＡアルファサブユニットの任意のアイソフォーム、例えばアルファ-１、アルファ-２およびアルファ-４との交差反応性は好ましくは微小または皆無である。NKAのアルファ-１およびアルファ-３サブユニットに特異的な抗体が示す、他のNKAアルファサブユニットの任意のアイソフォーム、例えばアルファ-２およびアルファ-４との交差反応性は好ましくは微小または皆無である。
【０１１５】
一実施態様において、抗体は無傷の抗体であってよい。
【０１１６】
「無傷の」抗体とは、抗原結合性可変領域ならびに軽鎖定常領域（CL）および重鎖定常領域、CH1、CH2およびCH3を含む抗体である。定常領域は天然配列の定常領域（例えばヒト天然配列の定常領域）またはこのアミノ酸配列変異体であってよい。
【０１１７】
重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、無傷の抗体は本発明で意図される別々の「クラス」に割当てることができる。無傷抗体には五個の主要なクラス、IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMがあり、これらの中のいくつかは更に「サブクラス」（アイソタイプ）、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、およびIgA2に分割されてよい。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常領域は、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる。脊椎動物種由来の抗体の「軽鎖」は、それらの定常領域のアミノ酸配列に基いて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つの明瞭に異なるタイプの１つに割当てることができる。イムノグロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元立体配座は公知である。
【０１１８】
一実施態様において、抗体は上のIgクラスのいずれか、好ましくはIgGクラス抗体であってよい。
【０１１９】
哺乳類を含む脊椎動物の大部分の天然抗体は、通常は約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、２つの同じ軽（L）鎖と２つの同じ重（H）鎖からなる。各軽鎖は1個の共有ジスルフィド結合によって重鎖に連結しており、ただしジスルフィド連結の個数はイムノグロブリンの異なるアイソタイプの重鎖間でいろいろに異なる。各重鎖および軽鎖にも実質的に規則正しい間隔をおいて鎖間ジスルフィド橋がある。各重鎖には一端に可変領域（VH）があり、それに続いて多数の定常領域がある。各軽鎖には一端に可変領域（VL）、他端に定常領域がある。軽鎖の定常領域は重鎖の第一定常領域と連携し、軽鎖の可変領域は重鎖の可変領域に連携している。特別なアミノ酸残基が軽鎖と重鎖の可変領域の間に界面を形成すると信じられている。
【０１２０】
用語「可変」とは、可変領域の或る部分の配列が抗体ごとに広範囲に異なり、その部分が各特定抗体のその特定抗原に対する結合の特異性において使用するという事実を言う。しかし、その可変性は抗体の可変領域全体に一様に分布しているわけではない。軽鎖と重鎖の両方の可変領域において超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに可変性が濃縮されている。可変領域のより高度に保持される部分を枠組み構造領域（ＦＲ）と呼ばれる。一般に天然の重鎖と軽鎖の可変領域にはそれぞれ４つのＦＲが含まれており、それらは３つの超可変領域によって連結されている。各鎖の超可変領域（複数）はＦＲによって一体に保持されて相互に接近し、他の鎖に由来する超可変領域と共に抗体の「抗原結合部位」の形成に寄与している（Kabat et al. 1991. Sequences of Proteins ofImmunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes ofHealth, Bethesda,Mdを参照）。定常領域は抗体を抗原に結合するのに直接には関与しないが、各種のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞毒性（ADCC）における抗体の関与、を発揮する。
【０１２１】
例えばある種の免疫グロブリン分子がラクダ種から誘導され、またはラクダ免疫グロブリンに基づいて組立てられた場合には、完全免疫グロブリン分子が重鎖のみからなり軽鎖がないことがある（例えば、Hamers-Casterman et al. 1993. Nature 363: 446-448を参照）。したがって、これらの免疫グロブリンではVHHと言われる重鎖可変領域が全体のCDRを形成する。これらの分子およびこれらの機能的断片および／または誘導体も本明細書で使用する用語「抗体」に包含される。したがって、一実施態様において、抗体が上記のラクダ抗体であってよい。
【０１２２】
好ましい実施態様において、抗体がモノクローナル抗体またはモノクローナル抗体混合物である。モノクローナル抗体によって提供される利点は、例えば、とりわけ当業者に明白な、特定の抗原および前記抗原内の特定のエピトープさえも選択的にかつ再現性よく標的とすること、ならびに再現性のよい生産と力価である。
【０１２３】
本明細書で使用する用語「モノクローナル抗体」とは実質的に同質の抗体の集団から得た抗体を言い、すなわち量的に少ない突然変異が自然に起きている可能性があるものを除けばその集団を含む個々の抗体は同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、1個の抗原部位に対向する。更に、ポリクローナル抗体がいろいろな抗原決定基（エピトープ）に対向するいろいろな抗体を含んでいるのとは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の1個の抗原決定基に対向している。モノクローナル抗体は、特異性があることに加えて、他の抗体に混在されずに合成される点で有利である。「モノクローナル」という修飾語によって、その抗体の特徴は実質的に同質の抗体集団から得られたことが指称され、しかし何か特別な方法によってその抗体を生産する必要があるという意味には解釈されない。
【０１２４】
非限定的な一例として、本発明に従って使用するモノクローナル抗体は、Kohler et al. 1975 (Nature 256: 495)によって記載のハイブリドーマ法によって作製してよいし、または組換えDNA法（例えば、US 4,816,567におけるように）によって作製してもよい。モノクローナル抗体は、ファージの抗体ライブラリーから例えばClackson et al. 1991 (Nature 352: 624-628) および Marks et al. 1991 (J MoI Biol222: 581-597)によって記載の技術を使用して単離してもよい。
【０１２５】
また本明細書で定義のモノクローナル抗体は特別に「キメラ」抗体を包含する。この抗体は、所望の生物活性を発揮する限りにおいて、この抗体の重鎖および／または軽鎖の一部はある特別な種に由来するまたは特別な抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一もしくは相同であり、他方、鎖（複数）の残部は他の種に由来するまたは他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体ならびにその抗体の断片の対応する配列と同一もしくは相同である（例えば、US 4,816,567; Morrison et al.1984. PNAS 81: 6851-6855を参照）。したがって、ある実施態様において抗体はキメラ抗体であってよい。
【０１２６】
本明細書で関心のある模範的なキメラ抗体は、例えば「霊長動物化（ｐｒｉｍａｔｉｓｅｄ）」した抗体であり、それは非ヒト霊長動物（例えば、旧世界サル、尾なしサル等）由来の可変領域抗原結合性配列とヒト定常領域配列を含有している。
【０１２７】
非ヒト（例えば、齧歯類動物）の抗体の「ヒト化」型は非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含有するキメラ抗体である。ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン（受容側抗体）であり、その抗体では受容側の超可変領域由来の残基が所望の特異性、親和性および能力を有する非ヒト種（供与側抗体）、例えばマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長動物の超可変領域由来の残基によって置換されている。場合によっては、ヒト免疫グロブリンの枠組み構造領域(FR)残基が対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は受容側抗体または供与側抗体に存在しない残基を含んでいてよい。これら修飾体を処理して抗体特性を更に純化する。一般に、ヒト化抗体には少なくとも１つ、一般には２つの可変領域の実質的に全部が含まれており、その領域では超可変ループの全部または実質的に全部が非ヒト免疫グロブリンのループであり、FRの全部または実質的に全部がヒト免疫グロブリン配列のFRである。またヒト化抗体は任意に免疫グロブリン、定常領域(Fc)、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。ヒト化抗体の実施についての更なる詳細は、例えばJones et al. 1986 (Nature 321 : 522-525), Riechmann et al. 1988 (Nature 332: 323-329) および Presta 1992 (Curr Op Struct Biol 2: 593-596)が参照される。したがって、一実施態様において、抗体がヒト化抗体であってよく、それによって例えば元の抗体の非ヒト部分に対する免疫反応が最小限になるので有利である。
【０１２８】
本明細書で使用する用語「超可変領域」は、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を言う。一般に超可変領域には「相補性決定領域」すなわち「CDR」由来のアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変領域で残基24〜34 (L1 )、 50〜56 (L2) および 89〜97 (L3)および重鎖可変領域で31〜35 (H1 )、 50〜65 (H2) および 95〜102 (H3)；Kabat et al. 1991.Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service,National Institutes of Health, Bethesda, Md.)および／または「超可変領域」由来のアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変領域で残基26〜32 (L1 )、 50〜52 (L2) および 91〜96 (L3)および重鎖可変領域で26〜32 (H1 )、 53〜55 (H2) および 96〜101 (H3)；Chothia and Lesk 1987. J MoI Biol 196: 901-917）が含まれる。「枠組み構造領域」すなわち「FR」残基は、超可変領域残基以外の可変領域残基である。
【０１２９】
別の実施態様において、抗体薬剤が以下に記載するように抗体断片であってよい。そのような断片の利点は、例えばサイズが小さくなる、送達が容易に成る、エフェクター領域がない等が含まれる。
【０１３０】
「抗体断片」には元の抗体の一部が含まれ、それには抗原結合領域またはその可変領域が含まれる。抗体断片の例には、Fab、Fab’、F（ab’）2、FvおよびscFｖ断片、デイボディース、線状抗体、単鎖抗体分子、および抗体断片、例えばデイボディース、トリボディース、およびマルチボディースから形成された多価ならびに／または多特異的抗体が含まれる。上の表記Fab、Fab’、F（ab’）2、Fv、scFｖ等は当技術分野で確立されているそれぞれの意味を有する。
【０１３１】
更に説明すると、抗体をパパインで消化すると、「Fab」断片と呼ばれ、それぞれ1個の抗原結合部位を有する2つの同じ抗原結合性断片、および残余の「Fc」断片が産生する。ペプシン処理をすると2つの抗原結合部位を有するF（ab’）2断片が得られる。典型的なFc断片にはジスルフィドで結合した2つのH鎖のC末端部位が含まれる。抗体のエフェクター機能はFc領域の配列によって決定され、この領域は或るタイプの細胞上に存在するFc受容体（FcR)によって認識される部分でもある。
【０１３２】
Fvは抗体断片であり、完全な抗原認識性で抗原結合性の部位を含む。この領域は本質的には１個の重鎖可変領域と１個の軽鎖可変領域とが緊密に非共有結合で会合した二量体からなる。この立体配座において各可変領域の３つの超可変領域は相互に作用し、それによりVH−VL二量体の表面上に抗原結合性部位が規定される。合わせると、６つの超可変領域によって抗体は抗原結合の特異性を付与される。しかし、VHまたはVLの可変領域単独でも、すなわちFcの半分であっても抗原特異的な超可変領域を３つだけ含めば、抗原を認識して結合することができる。しかしその結合の親和性は完全な結合部位に比べ低い（単独領域抗体）。
【０１３３】
「単鎖Fv」すなわち「scFv」の抗体断片には抗体のVHおよびVL領域が含まれるが、この断片においてこれらの領域は単独のポリペプチド鎖の形で存在している。FvポリペプチドにはVHとVL領域の間にポリペプチドリンカーが含まれるのが好ましく、このリンカーによってscFvは抗原結合に望ましい構造を形成することができる。scFvを実施するための調査には、Plueckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)を参照。
【０１３４】
加えて、また用語「Fv」には更に機能的な（すなわち特異的に抗原結合する）その断片が包含される。そのような断片の例には、Fvの重鎖断片のみを含む「ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）」、抗体重鎖可変領域の小さな分画単位を含む「ミクロボディ（ｍｉｃｒｏｂｏｄｙ）」（PCT/IL99/00581参照）、軽鎖の断片を有する類似体、および軽鎖可変領域の機能的断片を有する類似体が含まれるが、これらに限定されない。当然のことながら、Fv分子の断片は実質的に環状またはループ状のポリペプチドの可能性がある。
【０１３５】
また典型的なFab断片は軽鎖定常領域および重鎖の第一定常領域（CH1）を含有する。Fab’断片とFab断片の相違は重鎖CH1領域のC末端に数個の残基が付加されていることであり、その残基には例えば抗体のヒンジ領域由来の１つ以上のCys残基が含まれる。本明細書でFab’−SHの表記は、Fab’であって、その定常領域のシステイン残基（複数）が少なくとも１個の遊離チオール基を担持しているFab’を示す。
【０１３６】
「F（ab’）2」抗体断片は、元々は対をなすFab’断片であってそれらの間にヒンジCys残基を有しているものとして産生された。抗体断片の他の化学結合物も公知であり、それらは本用語の中に包含される。
【０１３７】
用語「ダイアボディ」とは、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を言い、この断片には同一のポリペプチド鎖（VH−VL）の中で軽鎖可変領域（VL）に連結している重鎖可変領域が含まれる。非常に短いリンカーを使用することによって同一鎖上の２つの領域の間に対が形成されないようにすれば、それらの領域は他の鎖の相補的な領域とやむなく対を形成し、２つの抗原結合部位が創出される。ダイアボディは、例えばEP 404,097, WO 93/11161、および Hollinger et al. 1993 (PNAS 90: 6444-6448)にさらに詳しく記述している。
【０１３８】
別の実施態様において、抗体は以下に定義するポリクローナル抗体であってよい。
【０１３９】
用語「ポリクローナル抗体」とは、異なるエピトープ、例えば同一の抗原の異なるエピトープに特異的な抗原結合機能を有する抗体分子の不均質な集団である抗体を言う。一般的に、ポリクローナル抗体は抗原で免疫した動物の血清由来であってよい。更に具体的には、この用語には全抗血清、全抗血清を代表する抗体集団、ならびに全抗血清由来の抗体の下位集団、例えばクラスに特異的な下位集団または抗原に特異的な下位集団（例えば、アフィニティー精製による）が包括される。
【０１４０】
好ましくは、ポリクローナル抗体は血清成分から単離すればよいし、ならびに／またはIgクラスにまで精製し、および／もしくはアフィニティー精製し、特異性がより大きくかつ非特異的反応の危険がより低くなればよい。
【０１４１】
抗原結合機能とは異なり、いくつかの抗体、例えば特に天然抗体は「エフェクター機能」を伴い、「エフェクター機能」とは抗体のFc領域(天然配列でのFc領域またはアミノ酸配列の機能的な変異体のFc領域)に起因する生物活性を言う。抗体のエフェクター機能の例には、C1qへの結合性、補体依存性の細胞障害性、Fc受容体への結合性、抗体依存性細胞介在型細胞傷害性（ADCC）、ファゴサイトーシス、細胞表面受容体(例えばB細胞受容体；BCR)のダウンレギュレーション等が含まれる。
【０１４２】
当業者が理解していることとして、抗体のエフェクター機能は低下または排除されてもよく、それによって抗体のそれぞれの抗原への結合能が実質的に減少することはない。非限定的な一例として、排除すべき１つ以上のエフェクター機能の原因であるFc部分またはその一部を、抗体から除去することができる。また、抗体のFc部分を１つ以上のアミノ酸位置において変異させてもよく、それによってエフェクター機能は低下または排除する。更には、抗体のエフェクター領域が、ある動物種では有効であっても他の種では有効性が少ないか、または無症状である可能性もある。
【０１４３】
したがって、好ましい実施態様において、抗体はエフェクター機能を含んでおらず、例えばそのエフェクター機能の原因となる領域を欠き、またはそのようなエフェクター機能などを減少または排除する変異部分を含有する。好ましくは、本発明の治療方法において抗体を投与すべき生物のエフェクター機能を伴うことができる領域をその抗体が欠損（例えば、削除、変異、修飾等）する。有利なことには、そのような抗体はNKAのそれぞれのアルファサブユニットに特異的に結合するが、前記抗体が結合する細胞に対する補体系または免疫系（例えば、細胞性または体液性）の反応を誘起しない。これによって、望ましくない治療効果の危険性が減ることになる。
【０１４４】
抗体の用語には、任意の動物種、好ましくは脊椎動物、例えば鳥類および哺乳類に由来する１つ以上の部分を起源とする、またはそれを含む抗体が包含される。抗体はチキン、七面鳥、ガチョウ、アヒル、ホロホロ鳥、鶉または雉であってよいが、限定されない。また、抗体はヒト、ネズミ（例えばマウス、ラット等）、ロバ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、テンジクネズミ、ラクダ（例えば、Camelus bactrianus および Camelus dromaderius）、ラマ（例えば、Lama paccos、 Lama glama または Lama vicugna）、またはウマであってよいが、限定されない。更に、可変領域は起源がコンドリクトイド（ｃｏｎｄｒｉｃｔｈｏｉｄ）（例えばサメ由来）であってよいが、限定されない。
【０１４５】
本明細書で使用する「ヒト」抗体には、ヒトの免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体が含まれ、およびヒト免疫グロブリンのライブラリーから、または１つ以上のヒト免疫グロブリン用に形質転換され内来性の免疫グロブリンを発現しない動物から単離した抗体が含まれ、これは下記に例えばUS 5,939,598に記載されている。
【０１４６】
当業者が理解していることとして、抗体は１つ以上のアミノ酸の削除、付加および／または置換（例えば保存的置換）を含むことができる。ただしそのような変更があってもそれぞれの抗原への結合性は維持される限りにおいてである。抗体は、その構成アミノ酸残基の天然のまたは人工の修飾（例えばグリコシル化）を含んでもよい。
【０１４７】
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、ならびにそれらの断片の生産方法は当技術分野で公知である（例えば、Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, New York, 1988を参照、参照によって本明細書に援用される）。ならびに組換え抗体またはその断片の生産方法。モノクローナル抗体の製造方法と使用の実例には、US 5,688,681、 US 5,688,657、 US 5,683,693、 US 5,667,781、 US 5,665,356、 US 5,591,628、 US 5,510,241、 US 5,503,987、 US 5,501,988、 US 5,500,345および US 5,496,705、 Skerra et al.1993 (Curr Opinion in Immunol5： 256-262)、 Plueckthun 1992 (Immunol Revs 130：151-188)、 McCafferty et al. 1990 (Nature 348：552-554)、 Clackson et al. 1991(Nature 352：624-628)、 Marks et al. 1991 (J MoI Biol 222: 581-597)、 Marks et al. 1992 (BioTechnology 10：779-783)、 Waterhouse et al. 1993 (NuCAcids Res 21：2265-2266)、 US 4,816,567、 Morrison et al. 1984 (PNAS 81： 6851)が参照され、全体が参照により援用される。ポリクローナル抗体の製造方法と使用の実例は、US 5,512,282、US 4,828,985、US 5,225,331 および US 5,124,147に開示されており、全体が参照により援用される。抗体断片の製造方法の実例には、例えばMorimoto et al. 1992 (J BiochemBiophys Methods 24：107- 117)、 Brennan et al. 1985 (Science 229： 81 ); Carter et al.1992 (BioTechnology 10：163-167)、 WO 93/16185、 US 5,571 ,894、 US 5,587,458、 US 5,641 ,870が参照され、全体が参照により援用される。EP 0 656 946にはラクダの免疫グロブリンの単離と使用が記述されており、参照により本明細書に援用される。
【０１４８】
本発明による抗体の生産には、宿主動物、好ましくは脊椎動物、更に好ましくは哺乳類を適切な抗原で免疫化する工程が含まれてよい。
【０１４９】
本明細書で使用する用語「抗原」は、宿主の免疫反応を引き起こすことが可能な、特に前記抗原に特異的な抗体の生産に関わる体液性応答を引き起こすことが可能な、任意の物質を意味する。抗原には１つ以上の抗原決定基またはエピトープが含まれ、それらは同一でも異なってもよい。用語「抗原決定基」または「エピトープ」は、対応する抗体の抗原結合部位に相補的であり、それゆえ抗体と特異的に相互作用することが可能な、抗原の部位を言う。
【０１５０】
本発明の特定目的からすると、「抗原」は、ナトリウムポンプのアルファ-１サブユニットまたはアルファ-３サブユニット、それらの断片（例えば連続するアミノ酸個数が≧4、 ≧5、 ≧6、 ≧8、 ≧10、 好ましくは ≧15、 更に好ましくは ≧20、 いっそう更に好ましくは ≧25、 ≧30、 ≧40、 ≧50、 ≧100 または ≧500を含む、または例えばポリペプチド配列の≧10%、 ≧20%、 ≧30%、 ≧40%、 ≧50%、 ≧60%、 ≧70%、 ≧80% または ≧90%を含む）、それらの変異体（例えばアミノ酸の１つ以上の削除、付加、および／または置換、好ましくは同類置換を含み、天然タンパク質またはその断片との配列同一性は、例えばNCBI BLAST配列比較アルゴリズムによって測定すると、≧50%、 ≧60%、 好ましくは ≧70%、 更に好ましくは ≧80%、 いっそう更に好ましくは≧90%、 ≧95%、 ≧99%が可能であり）、それらの誘導体（例えばグリコシル化、リン酸化、ジスルフィド橋等による例えば１つ以上のアミノ酸残基の誘導化を含む、ただし修飾したアミノ酸の画分は、その天然タンパク質もしくはその断片またはその変異体に対し≦50%、 ≦40%、 ≦30%、 好ましくは ≦20%、 更に好ましくは ≦10%、 いっそう好ましくは ≦5%、 例えば≦4%、 ≦3%、 ≦2% または ≦1 %）、または以上の任意のものおよび異質な担体、例えばGST、ＨＢc、スカシ貝ヘモシアニン、血清アルブミン、ウシのサイログロブリン、もしくは大豆トリプシンインヒビター等の遺伝子的または化学的な融合体、を含む、本質的にそれらのみからなる、またはそれらのみからなる。ただし上記によって天然のアルファ-1サブユニッまたはアルファ-３サブユニットの（１つ以上のエピトープ）に特異的な抗体の産生が誘導される限りにおいてである。これらの修飾は部位指向的な変異を介するように意図的であってもよいし、または抗原産生宿主の変異を介するように偶然であってもよい。
【０１５１】
また、アルファ-１サブユニットおよび／またはアルファ-３サブユニットを細胞表面で発現する細胞を使用して抗体を作製することができる。抗体作製に有用なアルファ-１および／またはアルファ-３サブユニットの他の形態は当業者には明瞭であろう。
【０１５２】
タンパク質、特にNKAのアルファ-１サブユニットおよび／またはアルファ-３サブユニットの抗原性領域は、標準的な抗原特異性とヒドロパシープロットを使用して、例えば抗原性プロファイルのためのHopp／Woods法（Hopp et at. 1981.PNAS 78： 3824-3828）およびヒドロパシープロットのためのKyte-Doolittle技法（Kyte et al. 1982. J MoI Biol 157： 105-132）を使用して同定することができる。またこのような予測プログラムは標準配列解析ソフトウェア、例えばAccelrysからのGCG（商標）のバージョン１１．１．２パッケージに含まれている。
【０１５３】
ポリペプチドまたはタンパク質分子内の予測されるエピトープは「直線」であり、すなわちポリペプチドまたはタンパク質分子の数個の連続するアミノ酸、例えば約５〜１２個の隣接アミノ酸、または約６〜１０個の隣接アミノ酸であり得る。またポリペプチドまたはタンパク質分子内の予測されるエピトープは、「立体配座」であり、すなわちポリペプチドまたはタンパク質分子の一次アミノ酸配列において直線的に配列しておらず、または全部が直線的に配列しておらず、天然のポリペプチドもしくはタンパク質の三次元折畳み構造内で抗体によって認識されるように並列しているアミノ酸によって形成される。またエピトープは天然のポリペプチドまたはタンパク質の別の特性、例えばグリコシル化、リン酸化等を限定なく含んでいてよい。
【０１５４】
好ましい実施態様において、本発明の抗体によって認識されるエピトープはNKAのアルファ-１サブユニットまたはNKAのアルファ-３サブユニットの細胞外部分にある。このために、投与された抗体がそれぞれのサブユニットに接近し結合することは容易である。したがって、一実施態様において、免疫化抗原は、遊離状態の、もしくは提示担体に結合している、NKAのアルファ-1サブユニットもしくはアルファ-３サブユニット、それらの変異体もしくは誘導体の少なくとも細胞外部分の一部、を含む、本質的にそれらのみからなる、またはそれらのみからなることができる。
【０１５５】
抗原を誘起するNKAのアルファ-１サブユニットおよび／またはアルファ-３サブユニットに対向して生成した抗体をそれぞれのサブユニットへの結合性について試験して、例えば上記特性を有しかつ本発明方法において有用な抗体を選択するために、当技術分野で公知の方法、例えば免疫沈降法、親和性クロマトグラフィー、ELISA、RIA、変性または非変性免疫ブロッティング法、免疫細胞化学法、免疫組織化学法等を使用することができる。モノクローナル抗体の結合親和性を測定するためには、例えばMunson et al. 1980 (Anal Biochem 107: 220)のスキャッチャード分析によることができる。同様に、抗体の単離と精製の方法、例えばアフィニティー精製、プロテインAセファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、塩析等は当技術分野で公知である。
【０１５６】
NKAのアルファ-１サブユニットおよび／またはアルファ-３サブユニットの発現を減少する薬剤
本発明の別の態様において、薬剤はNa+、K+−ATPアーゼのアルファ-１サブユニットおよび／またはアルファ-３サブユニットの発現を減少することができる。
【０１５７】
薬剤、例えば物質または分子がNKAのアルファ-１サブユニットまたはアルファ-３サブユニットの「発現を減少」すると言うときには、一般にこの意味は、前記物質を細胞、組織、または生物に投与することによって各サブユニットの発現濃度が前記物質を投与しなかった場合と比較的して低くなるということである。発現のこのような減少は、例えば不均質な核RNA（hnRNA）、前駆体mＲＮＡ(pre-mＲＮＡ)、mＲＮＡ、cＤＮＡ、および／または各サブユニットのタンパク質の濃度で観察し定量できる。発現を探知し定量する適切な方法は当技術分野で公知であり、例えばノーザンブロッティング、定量的RT-PCR、ウエスタンブロッティング、ELISA、RIA、免疫沈降等が含まれるが、限定されない。この用語に含まれる発現減少の程度は任意であり、例えば一例として、発現減少は少なくとも約 10%, 例えば少なくとも約20%, 好ましくは少なくとも約30%, 例えば 少なくとも約40%、 更に好ましくは少なくとも約50%、 例えば少なくとも約 60%、 更にいっそう好ましくは約70%、例えば少なくとも約80%、最も好ましくは少なくとも約90%、 またはそれ以上、 例えば少なくとも 95%、少なくとも約 96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または更に (約) 100%であり、例えば総質量でおよび／または個々の細胞での濃度で測定される。
【０１５８】
好ましい実施態様において、NKAのアルファ-１サブユニットおよび／もしくはアルファ-３サブユニットの発現を減少させることができる薬剤またはリガンドは、化学物質、好ましくは有機分子、更に好ましくは小さな有機分子；アンチセンス薬剤、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、またはRNA干渉を引き起こすことができる薬剤からなる群から選択することができる。そのような薬剤は本明細書で定義したように単離または実質的に単離してよい。
【０１５９】
好ましい実施態様において、そのような薬剤は標的とするNKAのアルファ-１サブユニットおよび／またはアルファ-３サブユニットの発現を特異的に減少する。用語「特異的に減少する」とは、薬剤が標的の発現を減少し、他のランダムで無関係な分子の発現は減少しないときの状態を反映する。
【０１６０】
好ましい実施態様において、NKAのアルファ-１サブユニットおよび／またはアルファ-３サブユニットの発現を減少させることができる薬剤はアンチセンス試薬、特にアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【０１６１】
本明細書で使用する用語「アンチセンス」とは、遺伝子発現を妨害するようにデザインされ、所望の標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合することができる分子を言う。
【０１６２】
アンチセンス分子は、一般には（しかし必ずしもではないが）標的分子に特異的にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体が、含まれる。したがって用語「アンチセンス」オリゴヌクレオチドとは、問題のタンパク質をコードするゲノムDNA、hnRNA、mＲＮＡもしくはcＤＮＡ、好ましくはmＲＮＡもしくはcＤＮＡの内部、例えばNKAのアルファ-１サブユニットもしくはアルファ-３サブユニットのゲノムDNA、hnRNA、mＲＮＡもしくはcＤＮＡ、好ましくはmＲＮＡもしくはcＤＮＡの内部の配列に相補的または実質的に相補的(すなわち全体的にではないが大部分が相補的)な核酸配列を、含む、本質的にそれらのみからなる、またはそれらのみからなるオリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド類似体を言う。「実質的に相補的」とは、少なくとも85% 相補的、例えば好ましくは少なくとも90%相補的、例えば 少なくとも 91%相補的、92%相補的、更に好ましくは少なくとも 93%相補的、例えば94%相補的、いっそう好ましくは 少なくとも95%相補的、例えば少なくとも 96%相補的、更にいっそう好ましくは少なくとも 97%相補的、例えば少なくとも98%相補的、最も好ましくは少なくとも99%相補的であることを言う。アンチセンスオリゴヌクレオチドはmRＮＡもしくはcＤＮＡの５’非翻訳領域、コード領域、および／または３’非翻訳領域のいずれかに相補的または実質的に相補的であってよいと考えられる。
【０１６３】
理論やメカニズムに限定されずに一般に信じられていることとして、アンチセンスオリゴヌクレオチドの活性は、そのオリゴヌクレオチドが標的核酸に結合するか否かによって定まり、結合した場合にはハイブリダイゼーション捕捉（例えばポリメラーゼのRNA処理活性を防止）または標的RNAのRNaseHによる分解（RNAにハイブリダイズしたときにRNaseHを活性化することができる）のいずれかによってその標的の機能は崩壊し、結果的には発現が阻止される。
【０１６４】
これらを参照すると、本明細書で使用する用語「ハイブリダイゼーション」または「ハイブリダイズする」とは、塩基対、好ましくは水素結合を含んで、更に好ましくはワトソンクリックの塩基対相互作用を介して核酸の鎖が相補的な配列を含む鎖と結合する任意のプロセスを言う。ハイブリダイゼーションは異なる鎖の間で、または同一の鎖の中で起こり得る。
【０１６５】
ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強度（すなわち、核酸鎖の間の会合強度）に影響する因子は、例えば核酸間の相補の程度、関係する条件のストリンジェンシー、形成されたハイブリッドの溶融温度、および核酸中のＧ：Ｃ（ＲＮＡではＵ：Ｃ）の比率である。配列情報に加えて、核酸の同一性／相補性が≧85、≧90、≧95または更に≧100%であるかどうかを決定することは高いストリンジェンシーでハイブリダイゼーションすることにより可能である。「高いストリンジェンシー」の条件には、例えば結合またはハイブリダイゼーションのための以下の模範的な条件に均等な条件が含まれる。すなわち、65℃ にて 5×SSPE (43.8 g/l NaCl、 6.9 g/l NaH2PO4-H2O および 1.85 g/l EDTA、 pH7.4、NaOH で調整)、 0.1% SDS、 5×デンハルト試薬 (50×デンハルト試薬 の500 ml当たりが含有； 5 g Ficoll （Type 400, Pharmacia)、 5 g BSA (Fraction V； Sigma)および 100μg/ml 変性サケ精液 DNA）からなる溶液中で結合またはハイブリダイゼーションを行い、次に5×SSPE、 0.1% SDSを含む溶液中で65 ℃ にて洗浄するが、この場合に使用するプローブの長さは約５００ヌクレオチドである。長さが約５０〜１００ヌクレオチドを超える核酸配列に対して「高いストリンジェンシー」でハイブリダイゼーションさせる他の模範的な条件には、例えば6×SSC中45℃ でハイブリダイゼーションを行い、次に0.2×SSC、0.1% SDS中 65℃ で１回以上洗浄する条件に均等な条件が含まれる。多数の均等条件を採用してストリンジェンシーの条件を変えてもよい。因子には、例えばプローブの長さと性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成）、標的の性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成、溶解または固定化された状態で存在）および塩濃度や他の成分（例えば、フォルムアミド、硫酸デキストラン、ポリエチレングリコールの存在または不存在）が考えられ、かつハイブリダイゼーション溶液を変更し、上記した条件とは異なるが、それらに均等な低いまたは高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を作製してもよい。更に、高いストリンジェンシーの条件下でハイブリダイゼーションを促進する条件(例えば、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄のステップでの温度を上げる、ハイブリダイゼーション溶液中にフォルムアミドを使用する、等)は当技術分野で公知である。ハイブリダイゼーション反応を実施するためのガイドラインは例えばCurrent Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons, N. Y., 6.3.1-6.3.6, 1989, および最新の編集版に見ることができ、それらの全部が参照により援用される。
【０１６６】
本発明に適切なアンチセンス薬剤は、高いストリンジェンシーの条件でそれぞれの標的にハイブリダイズする能力があってもよい。そのような薬剤は生理学的な条件下で標的に特異的にハイブリダイズしてよい。
【０１６７】
核酸に関して本明細書で使用する用語「相補的」または「相補性」とは、塩（イオン強度）および温度の寛容性のある条件下で塩基対により、好ましくはワトソンクリックの塩基対によりポリヌクレオチドが正常に結合することを言う。一例として、相補的なワトソンクリックの塩基対は塩基ＡとＴ、ＡとＵ、またはＧとＣの間で起こる。例えば、配列A-G-T（すなわち５’-A-G-T-３’）はT-C-A（すなわち５’-T- C -A-３’）の相補配列である。
【０１６８】
２つの単鎖核酸分子の間の相補性は「部分的」であってもよく、したがって鎖がハイブリダイズした際にその核酸の或るヌクレオチドだけが結合していてもよく、または「全体的」であってもよく、したがって単鎖分子の間に全相補性が存在してもよい。一例として、比較的に短い核酸鎖が比較的に長い核酸鎖に対し全相補性を示すのは、後者の鎖が前者の鎖の配列に十分に相補的な配列を含有する場合である。
【０１６９】
核酸分子（１）の核酸分子（２）に対する「相補性の程度」は、核酸分子（１）のヌクレオチドの中で核酸分子（２）のヌクレオチドにマッチする、すなわちワトソンクリックの塩基対を形成すると期待される部分（百分率）として表示することができ、ただしそれは前記核酸分子（１）および（２）が好ましくは高いストリンジェンシー条件でハイブリダイズした場合である。
【０１７０】
「コードする」という意味は、核酸配列またはその部分が、（問題の生物、好ましくは哺乳類、例えばヒトの）遺伝子コードのおかげで、特定のアミノ酸配列、例えば特定のポリペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列に対応することである。一例として、特定のポリペプチドもしくはタンパク質を「コードする」核酸配列が、前記ポリペプチドもしくはタンパク質に対する天然由来のゲノム、hnRNA、プリmＲＮＡ、mＲＮＡ(もしくはこれらから得たcＤＮＡ)を含有してよく、または天然の核酸配列の組替え型対応物もしくは変異体を含有してよい。
【０１７１】
NKAのアルファ-１サブユニットおよび／もしくはアルファ-３サブユニット、またはそれらの任意の（好ましくは機能的な）変異体もしくは断片をコードする核酸配列が意味するものは、（問題の生物、好ましくは哺乳類、例えばヒトの）遺伝子コードのおかげで、前記サブユニット、それらの変異体もしくは断片のアミノ酸配列に対応する核酸配列である。非限定的な一例として、NKAのアルファ-１サブユニットおよび／またはアルファ-３サブユニットをコードする核酸配列は、前記サブユニットに対するそれぞれ天然のゲノム、hnRNA、プリmＲＮＡ、mＲＮＡ(またはこれらから得たcＤＮＡ)配列を含有してよく、または天然の核酸配列の組替え型対応物もしくは変異体を含有してよい。
【０１７２】
当業者が理解していることとして、NKAα１サブユニットまたはNKAα３サブユニットをコードする核酸配列は、遺伝子の動物種間の分枝のために動物種が異なれば異なる可能性がある。更に、NKAα１サブユニットまたはNKAα３サブユニットをコードする天然の核酸配列は、動物種間または同一種であっても個体間で異なる可能性がある。それは種内でも遺伝子は正常に分枝し、または翻訳後に修飾されるからである。したがって天然に存在するアルファ-１サブユニットまたはアルファ-３サブユニットをコードするすべての核酸配列、および生物学的に機能するポリペプチド分子をコードする核酸配列は天然と考えられる。
【０１７３】
NKAアルファ-１サブユニットに対する模範的なcＤＮＡ配列には、例えばNCBI GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) のアクセッション番号 NM_000701でアノテーションされているヒトα１サブユニットcＤＮＡが含まれるが、これに限定されない。NKAアルファ-３サブユニットに対する模範的なcＤＮＡ配列には、例えばNCBI GenBankにアクセッション番号 NM_152296でアノテーションされているヒトα３サブユニットcＤＮＡが含まれるが、これに限定されない。
【０１７４】
別の好ましい実施態様において、NKAのアルファ-１サブユニットおよび／またはアルファ-３サブユニットの発現を減少することができる薬剤はリボザイムである。
【０１７５】
本明細書で使用する用語「リボザイム」とは、ポリヌクレオチドを触媒的に切断することができる核酸分子、好ましくはオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体である。「リボザイム」は、所与のポリペプチドまたはタンパク質のmＲＮＡ、例えば好ましくはNKAのアルファ-１サブユニットおよび／またはアルファ-３サブユニットのmＲＮＡを切断し、それによってその翻訳を減少することができるのが好ましい。本明細書で考えている模範的なリボザイムには、ハンマーヘッド型のリボザイム、ヘアピン型リボザイム、デルタ型リボザイム等が含まれるが、これらに限定されない。リボザイムとそのデザインについての教示には、例えばUS 5,354,855、 US 5,591 ,610、 Pierce et al. 1998 (Nucleic Acids Res 26： 5093-5101 )、 Lieber et al. 1995 (Mol Cell Biol 15： 540-551 )、 および Benseler et al. 1993 (J Am Chem Soc 115： 8483-8484)が参照され、それらの全部が参照により本明細書に援用される。
【０１７６】
そのうえ更に好ましい実施態様において、NKAのアルファ-１サブユニットおよび／またはアルファ-３サブユニットの発現を減少することができる薬剤は、それぞれの転写産物、好ましくはmＲＮＡに対してRNA干渉を引き起こすことができる。
【０１７７】
「RNA干渉」すなわち「RNAi」は、最初は植物および昆虫で観察された現象に与えられた用語であり、それらにおいて二本鎖RNA（dsRNA）が特異的にかつ転写後に遺伝子の発現を妨害する。したがって、RNAiとは、一般に動物において短鎖干渉核酸（siNA）、好ましくは短鎖干渉RNA（siRNA）が介入する配列特異的な、転写後遺伝子サイレンシングの過程を言う。RNAiによってインビトロまたはインビボで遺伝子発現を阻害する有用な方法が提供される。
【０１７８】
RNA干渉薬剤には、NKAのアルファ-１サブユニットおよび／またはアルファ-３サブユニットの発現に対するRNA干渉（RNAi）に介入することができる、例えば短鎖干渉核酸（siNA）、短鎖干渉RNA（siRNA）、二本鎖RNA（dsRNA）、マイクロRNA（miRNA）、および短鎖ヘアピンRNA(shRNA)分子のいずれも含まれ得る。
【０１７９】
この趣旨において、「dsRNA」という表現はRNA干渉を引き起こすことができる二本鎖RNAに関する。標的遺伝子へのRNAiまたはRNAが介入する遺伝子サイレンシングを指導することができる任意の適切な二本鎖RNA断片を本発明に従って使用することができる。本明細書で使用する「二本鎖リボ核酸分子（dsRNA）」とは、RNA二倍体を形成する二本鎖を含有する任意のRNA分子、断片またはセグメントを言い、それは対にならずに突出した単鎖ヌクレオチドが存在するか否かには係わらない。二本鎖RNAにアニーリングした相補的な鎖（複数）が含まれ、その中の一本の鎖が有するヌクレオチド配列はダウンレギュレートすべき標的遺伝子の標的ヌクレオチド配列に（すなわちmＲＮＡ転写体の少なくとも一部に）対応する。二本鎖RNAの他の鎖はこの標的ヌクレオチド配列に相補する。
【０１８０】
二本鎖RNAは、ダウンレギュレートすべき標的遺伝子のmＲＮＡ配列に十分に類似することだけが必要であり、それによりRNAiに介入することができる。したがって、本発明の有利な点は、遺伝子の突然変異、株の多型、または進化上の多様性が原因で予測される配列変異に寛容可能であることである。標的配列とdsRNA配列のヌクレオチド配列との間でのミスマッチで寛容可能なヌクレオチド数は、僅か５塩基対の中の１、または１０塩基対の中の１、または２０塩基対の中の１、または５０塩基対の中の１である。
【０１８１】
本発明による「dsRNA」すなわち「二本鎖RNA」は、この表現が妨害を引き起こすことができるRNAに関する場合には常に、アニーリングして一体となった二本の別々の（センスおよびアンチセンス）RNA鎖から形成されてよい。また、dsRNAは折り畳みステムループ構造またはヘアピン構造を有し、dsRNAの二本のアニーリング鎖が共有結合で連結していてもよい。この実施態様においてdsRNAのセンスおよびアンチセンス鎖は部分的に自己相補的な単一のRNA配列の異なる領域から形成される。
【０１８２】
本明細書で使用する用語「RNAi分子」は二本鎖RNA分子を言う遺伝子用語であり、これには例えば短鎖干渉RNA (siRNA）、短鎖ヘアピンRNA(shRNA）、およびインビボで切断してsiRNAを形成することができる他のRNA分子が含まれる。RNAi分子には、標的核酸配列に同一もしくは実質的に同一の長いdsRNA、または標的核酸配列のある領域のみに同一もしくは実質的に同一の短鎖dsRNAのいずれかが含まれ得る。
【０１８３】
対象のRNAi分子は「短鎖干渉RNA」すなわち「siRNA」であり得る。siRNA分子は通常は二本鎖分子として合成され、各鎖の長さは約１９〜３０ヌクレオチド、更に好ましくは２１〜２３ヌクレオチドである。このsiRNAはヌクレアーゼ複合体を動員し、この複合体を特定の配列に対にさせて標的ｍＲＮＡに誘導すると理解されている。結果的にはこのタンパク質複合体のヌクレアーゼによって標的ｍＲＮＡは分解される。特定の実施態様において、このsiRNA分子には３’ヒドロキシル基が含有される。ある実施態様において、このsiRNA分子は、例えば酵素二倍体の存在下に長い二本鎖RNAの処理により作製することができる。
【０１８４】
また、このRNAi分子は、ヘアピンRNAまたはshRNAと呼ばれるヘアピン構造の形態をしている。このヘアピンRNAは外来的に合成することができ、またはRNAポリメラーゼIIIプロモータからインビボでの転写により形成することができる。このようなヘアピンＲＮＡは細胞内でまたは動物内で生産されて確実に所望の遺伝子を連続的かつ安定的に抑制することが好ましい。細胞内でヘアピンRNAが処理されてsiRNAが産生することは当技術分野で公知である。
【０１８５】
本RNAiにはリン酸−糖の骨格またはヌクレオサイドのいずれかへの修飾が含まれてよく、それによって例えば細胞ヌクレアーゼへの感受性を減らし、生体内利用率を高め、製剤化特性を高め、および／または他の薬物動態特性を変更する。
【０１８６】
RNAi分子の少なくとも１本の鎖において長さ約１〜約６個分のヌクレオチド、例えば長さ２〜４個分のヌクレオチドが３’に突き出ている場合がある。３’突出は長さ１〜３個分のヌクレオチドであるのが更に好ましい。ある実施態様において、１本の鎖に３’突出があり、他の鎖は末端が平滑であるか、またはこれにも突出がある。突出の長さは各鎖に対し同じでも異なってもよい。RNAi分子の安定性を更に強化するために３’突出を分解に対して安定化することができる。一実施態様において、RNAを安定化するためにプリンヌクレオチド、例えばアデノシンまたはグアノシンヌクレオチドを含有させる。また、ピリミジンヌクレオチドを修飾した類似体に置換する、例えば３’突出があるウリジンヌクレオチドを２’デオキシチミジンに置換すると、RNAiの効果には影響を与えずに耐久化される。
【０１８７】
siRNA薬剤のデザインについての更なる詳細については、例えばElbashir et al. 2001 (Nature 411；494-501)を参照のこと。
【０１８８】
好ましい実施態様において、本発明はRNA配列を使用して本明細書で定義のRNAi分子、好ましくはsiRNA分子を調製することに関する。前記siRNA分子の特徴は以下の指標の１つ以上、好ましくは全てである：
−  標的ｍRNA、例えばNKAのアルファ-１サブユニットまたはアルファ-３サブユニットに対するｍＲＮＡとの配列同一性が少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、更に好ましくは８０％、更にいっそう好ましくは９０％であること；
−  標的遺伝子のエクソン領域を標的とする配列を有すること；
−  標的遺伝子の５’末端を標的とするよりもむしろ標的遺伝子の３’末端を優先的に標的とすること。
【０１８９】
更に好ましい実施態様において、siRNA分子は以下の指標の１つ以上を更に特徴としてよい：
−  核酸の長さが１５〜２５ヌクレオチドの間、好ましくは１８〜２２ヌクレオチドの間、好ましくは１９ヌクレオチドであること；
−  含まれるGCの含有率は３０〜５０％の間であること；
−  ３’末端にTT（T）配列を呈すること；
−  二倍体の形態を採る場合には二次構造を呈さないこと；
−  Tm（溶融温度）が２０℃未満であること；
−  ヌクレオチドの配列において表２に示すヌクレオチドを有すること、表においてｈはａ、ｃ、ｔもしくはｕであるがｇではなく、ｄはａ、ｇ、ｔもしくはｕであるがｃではなく、およびｗはａまたはｔもしくはｕであるがｇもしくはｃではない。
【０１９０】
【表２】
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【０１９１】
上記の核酸試薬、例えばアンチセンス試薬、リボザイムおよびRNAi分子の生産は、化学合成法によって、または組換え核酸技術によって実施可能であり、例えば細胞中のベクター、例えばウイルスベクター、真核性発現ベクター、遺伝子治療用発現ベクター（すなわちインビボ）等から発現可能であり、または酵素的に、例えばT7もしくはSP6 RNAポリメラーゼを使用してDNA鋳型からインビトロの転写により合成可能である。核酸分子は酵素によって、または部分的／全体的な有機合成によって生産してよい。任意の修飾リボヌクレオチドを誘導するにはインビトロの酵素的合成、または有機合成によって可能である。
【０１９２】
上記の核酸試薬、例えばアンチセンス試薬、リボザイムおよびRNAi分子を精製するためには、当業者に公知の多数の技術を使用して可能である。例えば、ゲル電気泳動を使用すれば核酸試薬を精製することができる。また、非変性的な方法、例えば非変性的なカラムクロマトグラフィーを使用すればそれらの分子を精製することができる。更に、クロマトグラフィー（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー）、グリセロール濃度勾配遠心分離、抗体とのアフィニティー精製を使用すればそれら分子を精製することができる。
【０１９３】
（リボ）核酸（例えば、アンチセンス、リボザイムまたはRNAi）を動物細胞に導入する公知の方法が数種あり、本発明ではそれらのどれを使用してもよく、それらは宿主次第である。最も簡単には、その核酸を標的細胞／標的組織に直接に注入することができる。他の方法には、例えば核酸を含有するバクテリア原形質と受容細胞の融合、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、塩化リチウム、リン酸カルシウム、DEAEデキストラン、陽イオン性脂質もしくはリポゾームのような組成分の使用、または受容体介入のエンドサイトーシスのような方法、微粒子銃（「遺伝子銃」法）、ウイルスベクターを感染、電気窄針等が含まれる。（リボ）核酸分子を標的細胞に送達するのに適切な他の技術もしくは方法には、例えば、ポリ（乳酸−グリコール酸）共重合体の微小球から本明細書で定義の分子を連続的に送達する、または防護（安定化）した分子を微小ポンプに直接注入し、手術部位に依然として存在する腫瘍細胞に向け手術切除した孔に、例えば脳実質に依然として存在する腫瘍細胞に向け神経外科的に切除した孔にその分子を送達する、等が挙げられ、他の抗転移化合物に使用については前に詳述した（Lefranc et al. 2003. Neurosurgery 52:881-891）。Kawakami et al. 2004 (J Neurosurg 101 : 1004-1011)によって詳述されているように、安定化したRNAi分子の送達を対流によって増大するのも使用することができる。他の可能性は移植可能で薬物放出性があり生体内で分解可能な微小球の使用であり、最近それらはMenei and Benoit 2003 (Acta Neurochir 88:51-55)によって概説されている。上記した異なる送達のモードまたは方法の組合せも使用可能であることは明瞭である。
【０１９４】
好ましいアプローチは、オマヤレザバー（ｏｍｍａｙａ  ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）（微小ポンプ）によって本RNAiを送達する、または核酸をカプセル化する、例えばRNAi分子を生体内分解性の微小球体中にカプセル化する、のどちらかを使用することであるが、両方のアプローチを同時にもある。
【０１９５】
核酸、例えばアンチセンス、リボザイムまたはRNAi技術によってインビボでの遺伝子サイレンシングで達成すべき主な障害は送達である。熱安定性およびヌクレアーゼ消化への抵抗性を増大し、上記ツールの細胞取得を増大するために、各種のアプローチが適用可能であり、当業者には公知である。このアプローチには、例えば以下が含まれる。
−  化学修飾様にロックされた核酸（LNA）、フォスフォン酸置換、フォスフォロチオ酸置換、フォスフォロジチオ酸置換、モルフォリノオリゴマー、２’−フルオロ置換、２’−O−メチル置換、安定化ステルス（商標）RNAi（Invitrogen）、等
−  各型のリポソーム（免疫リポソーム、PEG化（免疫）リポソーム）にカプセル化、陽イオン性脂質およびポリマー、ナノ粒子または樹枝状体、ポリ（乳酸−グリコール酸）共重合体微小球、移植可能で薬物放出性があり生体内で分解可能な微小球、等
−  ヌクレアーゼ阻害剤アウリントリカルボン酸のような防護剤と共に注入。
【０１９６】
増殖性疾患
本発明は、増殖性疾患の治療に有用な方法と薬剤に関する。
【０１９７】
「増殖性疾患または疾病」の意味は全ての腫瘍性の細胞成長および増殖であり、悪性であるか良性であるかには関係なく、形質転換した細胞および組織の全てならびに癌性細胞および組織の全てが含まれる。増殖性疾患または疾病には、例えば前癌性または前癌状態の病巣、異常な細胞成長、良性腫瘍、悪性腫瘍、および「癌」が含まれるが、これらに限定されない。
【０１９８】
増殖性疾患および／または疾病の他の例には、例えば、悪性であるか良性であるかには関係なく、前立腺、大腸、腹部、骨、乳房、消化系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、上皮小体、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭および首、神経（中枢および末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、柔組織、脾臓、胸郭、および泌尿生殖管に局在する新生物が含まれるが、これらに限定されない。
【０１９９】
好ましい実施態様において、増殖性疾患が腫瘍を含む。
【０２００】
本明細書で使用する「腫瘍」または「腫瘍組織」とは、過剰な細胞分裂の結果生ずる異常な組織塊を言う。腫瘍または腫瘍組織には、異常な成長特性を有し有用な生体機能がない新生物細胞である「腫瘍細胞」が含有される。腫瘍、腫瘍組織および腫瘍細胞は良性でも悪性でもよい。また腫瘍または腫瘍組織には、「腫瘍関連の非腫瘍細胞」、例えば血管を形成しながら腫瘍または腫瘍組織を供給する血管細胞が含有されている。非腫瘍細胞の複製と成長は腫瘍細胞によって誘導され、例えば腫瘍または腫瘍組織の中に血管形成が誘導される。
【０２０１】
他の好ましい実施態様において、増殖性疾患が悪性疾患または癌に関する。
【０２０２】
本明細書で使用する用語「悪性疾患」とは、非良性の腫瘍または癌を言う。本明細書で使用する用語「癌」は増殖性疾患の１つの型を言い、この型には例えば無秩序で制御不能な細胞成長を特徴とする悪性疾患が含まれる。癌の例には、例えば上皮癌、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病またはリンパ系悪性疾患が含まれるが、これらに限定されない。このような癌の更に特別な例を以下に示すが、例えば：鱗屑状細胞癌（例えば上皮鱗屑状細胞癌）、肺癌、例えば小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜の癌、肝臓細胞癌、胃または胃部の癌、例えば消化器癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝（細胞）癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓または腎部の癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝上皮癌、肛門上皮癌、陰茎上皮癌、ならびに頭頸癌である。用語「癌」には、例えば、原発性の悪性細胞または腫瘍（例えば、被検者の体内においてその腫瘍細胞が最初の悪性疾患または腫瘍の部位以外の部位へ転移していない腫瘍）、および二次的な悪性細胞または腫瘍（例えば、転移から生じた腫瘍であって、悪性細胞または腫瘍細胞が最初の腫瘍部位とは異なる二次部位に転移）が含まれる。
【０２０３】
悪性疾患または癌の他の例には、例えば以下が含まれるが、これらに限定されない： 急性小児期リンパ芽球白血病、急性リンパ芽球白血病、急性リンパ球白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質上皮癌、成人（原発性）肝細胞癌、成人（原発性）肝癌、成人急性リンパ球白血病、成人急性骨髄性白血病、成人ホジキンス疾患、成人ホジキンスリンパ腫、成人リンパ球白血病、成人非ホジキンスリンパ腫、成人原発性肝癌、成人柔組織肉腫、エイズ関連リンパ腫、エイズ関連悪性疾患、肛門癌、星状細胞腫、胆汁管癌、膀胱癌、骨癌、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、乳癌、腎盂および尿道の癌、中枢神経系（原発性）リンパ腫、中枢神経系リンパ腫、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫、頸部癌、小児期（原発性）肝細胞癌、小児期(原発性）肝癌、小児期急性リンパ芽球白血病、小児期急性骨髄性白血病、小児期脳幹神経膠腫、神経膠芽細胞腫、 小児期小脳星状細胞腫、小児期大脳星状細胞腫、小児期頭蓋外胚芽細胞腫瘍、小児期ホジキンス疾患、小児期ホジキンスリンパ腫、視床下部および視覚経路の小児期神経膠腫、小児期リンパ芽球白血病、小児期髄芽細胞腫、小児期非ホジキンスリンパ腫、小児期松果体およびテント上の原始神経外胚葉性腫瘍、小児期原発性肝臓癌、小児期横紋筋肉腫、小児期柔組織肉腫、 小児期視覚経路および視床下部神経膠腫、 慢性リンパ球白血病、 慢性骨髄性白血病、結腸癌、皮膚T-細胞リンパ腫、内分泌ランゲルハンス島細胞癌、子宮内膜癌、脳室上衣細胞腫、上皮癌、食道癌、エウィング肉腫および関連腫瘍、外分泌膵臓癌、頭蓋外胚芽細胞腫瘍、生殖腺外胚芽細胞腫瘍、 肝臓外胆汁管癌、眼癌、女性乳癌、ゴーシェ疾患、胆嚢癌、胃癌、胃腸カルチノイド腫瘍、胃腸腫瘍、胚芽細胞腫瘍、妊娠栄養膜腫瘍、毛様細胞白血病、頭および頸癌、肝細胞癌、ホジキンス疾患、ホジキンスリンパ腫、高ガンマグロブリン血症、咽頭下垂体癌、腸癌、眼内黒色腫、島細胞癌、ランゲルハンス島細胞癌、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、口唇および口腔癌、肝臓癌、肺臓癌、リンパ増殖性疾患、大グロブリン血症、男性乳癌、悪性中皮腫、悪性胸腺腫、髄芽細胞腫、黒色腫、中皮腫、転移不顕性原発性鱗屑状頸癌、転移性原発性鱗屑状頸癌、転移性鱗屑状頸癌、多発性黒色腫、多発性黒色腫／形質細胞新生物、脊髄形成異常症候群、骨髄性白血病、骨髄球性白血病、骨髄増殖性疾患、鼻腔および副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、妊娠中の非ホジキンスリンパ腫、非黒色腫皮膚癌、 非小細胞肺臓癌、不顕性原発性転移鱗屑状頸癌、口腔咽頭癌、骨繊維／悪性繊維肉腫、骨肉腫／悪性繊維組織球腫、骨肉腫／骨の悪性繊維組織球腫、卵巣上皮癌、卵巣芽細胞腫瘍、卵巣低悪性潜在腫瘍、膵臓癌、パラプロテイン血症、紫斑病、甲状腺近傍癌、陰茎癌、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、形質細胞新生物／多発性黒色腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性肝臓癌、前立腺癌、直腸癌、腎臓細胞癌、腎盂および尿道癌、網膜芽細胞癌、横紋筋肉腫、唾液腺癌、類肉腫症、セザリー症候群、皮膚癌、小細胞肺臓癌、小腸癌、柔組織肉腫、鱗屑状頸癌、胃癌、テント上の原始神経外胚葉性腫瘍および松果体腫瘍、T-細胞リンパ腫、精巣癌、胸腺腫、甲状腺癌、腎盂および尿道の遷移性細胞癌、腎盂および尿道の遷移性癌、栄養膜腫瘍、尿道および腎盂の細胞癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、視覚経路および視床下部の神経膠腫、外陰部癌、ワルデンストローム大グロブリン血症、ウィルムス腫瘍、および上記の臓器系に局在する、新生物以外の、任意の増殖性疾患である。
【０２０４】
別の好ましい実施態様において、増殖性疾患は前癌状態である。過形成、化生、または最も具体的には形成異常のみからなる非腫瘍性の細胞成長が起こった場合、前癌状態は腫瘍形成または特に、癌化に先立って進行しているのではないかと察知され、または疑われる（このような異常増殖条件についての概説には、Robbins and Angell 1976 (Basic Pathology,2d Ed., W. B. Saunders Co., Philadelphia,pp. 68- 79）が参照される。
【０２０５】
「過形成」は制御された細胞増殖の１つの形態であり、組織または臓器において細胞数は増大するが、構造または機能には有意な変化がない。本発明方法によって治療可能な過形成疾患には、例えば、管小胞縦隔リンパ節過形成、好酸球増加症を伴うリンパ球過形成、非定型黒色腫細胞過形成、基底細胞過形成、良性巨大リンパ節過形成、セメント質過形成、先天性副腎過形成、先天性皮脂過形成、嚢胞性過形成、乳房の嚢胞性過形成、義歯過形成、管過形成、子宮内膜過形成、繊維筋肉過形成、病巣上皮過形成、歯肉過形成、炎症性繊維過形成、炎症性乳頭過形成、血管内乳頭内皮過形成、前立腺の結節過形成、結節再生過形成、偽内皮腫性過形成、老人性皮脂過形成、およびいぼ過形成が含まれるが、これらに限定されない。
【０２０６】
「化生」は制御された細胞増殖の１つの形態であり、その形態では成熟または十分に分化した細胞の１つの型が他の成熟細胞の型に取って代わる。本発明方法で治療可能な化生疾患には、例えば、原因不明の骨髄化生、アポクリン化生、非定型化生、自己実質化生、結合組織化生、上皮化生、腸化生、化生性貧血、変形骨化、異形成性ポリープ、骨髄化生、原発性骨髄化生、二次骨髄化生、鱗屑性化生、羊膜の鱗屑性化生、および症候性骨髄化生が含まれるが、これらに限定されない。
【０２０７】
「形成異常」は、しばしば癌の前兆であり、主に上皮に存在する。これは新生物形成ではないが、細胞成長の最も疾病的な形態であり、個々の細胞の均質性および細胞の構造的な方向性が欠如している。異形成細胞は、しばしば異常に大きく、濃く着色した核を有し、かつ多形態性を示す。形成異常は、慢性的な刺戟または炎症が存在する場合に起こる特徴がある。本発明方法で治療可能な形成異常疾患には、例えば、無汗性外胚葉形成異常、前後形成異常、窒息性胸郭形成異常、心房指形成異常、気管支肺形成異常、大脳形成異常、頸部形成異常、軟骨外胚葉形成異常、鎖骨頭蓋形成異常、先天性外胚葉形成異常、頭蓋骨骨幹形成異常、頭蓋軟骨形成異常、頭蓋骨端形成異常、象牙質形成異常、骨幹形成異常、外胚葉形成異常、エナメル質形成異常、脳−眼形成異常、形成異常骨による先天的発生異常、形成異常骨多発、形成異常骨斑点、上皮形成異常、顔指生殖器形成異常、家族性顎線維形成異常、家族性白色スポンジ母斑形成異常、線維筋肉形成異常、骨の線維形成異常、鮮紅色骨様形成異常、遺伝性腎−網膜形成異常、多汗性外胚葉形成異常、発汗減少性外胚葉形成異常、リンパ球減少性胸腺形成異常、乳腺形成異常、下顎骨顔形成異常、骨幹端形成異常、モンディニ形成異常、単骨性線維形成異常、粘膜上皮形成異常、多発性骨端形成異常、眼耳脊椎形成異常、眼歯指形成異常、眼脊椎形成異常、歯芽形成異常、眼下顎骨形成異常、歯根尖端周囲セメント形成異常、多骨性線維形成異常、偽軟骨無形成症様脊椎骨端形成異常、網膜形成異常、中隔−眼形成異常、脊椎骨端形成異常、および 室橈骨形成異常、が含まれるが、これらに限定されない。
【０２０８】
更に前新生物形成疾患には、例えば、良性異常増殖性疾患（例えば、良性腫瘍、線維嚢胞性条件、組織肥大、腸管ポリープ、結腸ポリープ、および食道形成異常）、白斑症、角化症、ボーエン病、農夫皮膚症、日光口唇炎、および日光角化症が含まれるが、これらに限定されない。
【０２０９】
好ましい実施態様において、増殖性疾患は、神経膠腫、好ましくは神経膠芽細胞腫、前立腺癌、非小細胞肺癌（NSCLC）、または結腸癌から選択される。本発明者らは、上の癌タイプが本発明の方法と薬剤によって恩恵を受けることができることに気づいた。
【０２１０】
本明細書で使用する用語「神経膠腫」とは、当技術分野において承認されている意味合いを言う。非限定的に更に説明すると、用語「神経膠腫」とは、脳または脊髄索に起源のある腫瘍を言う。神経膠腫は膠細胞、例えば星状細胞および希突起細胞から誘導され得るので、神経膠腫には、例えば星状細胞腫、希突起細胞腫、ならびに異型性神経膠腫、神経膠芽細胞腫、および脳室上衣細胞腫が含まれる。星状細胞腫および脳室上衣細胞腫は小児および成人の両方の脳および脊髄索の全ての領域で生起可能である。希突起細胞腫は典型的には成人の大脳半球に生起する。悪性の星状細胞腫は、正常な脳実質の中に拡散的に浸潤することができるので、最悪な予後を伴い、世界健康機構（WHO）の評価段階II、IIIおよびIVの腫瘍が含まれる。
【０２１１】
本明細書で使用する用語「神経膠芽細胞腫」とは、当技術分野において承認されている意味合いを言う。非限定的に更に説明すると、神経膠芽細胞腫は「神経膠芽細胞腫多形」（GBM）として、または「評価段階４の星状神経膠細胞腫」としても知られており、おそらく悪性原発性脳腫瘍の最も普通にある攻撃的な型を代表する。
【０２１２】
本明細書で使用する用語「前立腺癌」（CaP）とは、当技術分野において承認されている意味合いを言う。非限定的に更に説明すると、用語「前立腺癌」とは、前立腺の触知可能な腫瘍の出現を言うが、顕微鏡で検知できる程度の腫瘍性または形質転換した前立腺細胞をも言う。後者の場合には、前記組織学的に検知できる前立腺癌は無症状の可能性があり、患者も医術担当者も癌細胞の存在を検知しない。一般に、７０歳台または８０歳台まで生きてきた男性の前立腺には癌細胞が存在するが、これらの男性の全てにおいて前立腺癌が進展するわけではない。前立腺癌が前立腺より遠位の別の部位に転移した場合に、その状態を転移性癌（MC）として表記し、この状態を臓器が特定された前立腺癌とは識別する。CaPでの死亡は一般には前立腺癌細胞が遠位部、通常は体軸骨格に拡散した結果である。
【０２１３】
用語「非小細胞肺癌」（NSCLC）とは、当技術分野において承認されている意味合いを言う。非限定的に更に説明すると、この用語には、そのサブタイプ、すなわち肺腺癌、肺扁平上皮癌、および肺大細胞癌が包含される。
【０２１４】
用語「結腸癌」とは、当技術分野で承認されている意味合いを言う。非限定的に更に説明すると、用語「結腸癌」とは、大腸（結腸および直腸の両方を含む）に生ずる任意の組織学的タイプの癌を言い、悪性の上皮腫瘍が含まれるが、これに限定されない。したがって本明細書で使用するこの用語結腸癌には結腸直腸癌が含まれる。大腸の悪性上皮腫瘍は５つの主要な組織学的タイプ、すなわち腺癌、粘液腺癌（コロイド性腺癌とも言う）、印環細胞腺癌、スキルス癌、および単純癌に分割してよい。結腸癌は当技術分野で公知のいくつかの分類系を使用して病期分類される。デューク系は最も頻繁に使用する病期分類系の１つである。Dukes and Bussey 1958 (Br J Cancer 12:309)を参照。
【０２１５】
別の好ましい実施態様において、増殖性疾患はNKAのアルファ-１サブユニットおよび／またはアルファ-３サブユニットを過剰発現する疾患である。
【０２１６】
増殖性疾患、例えばNKAのアルファ-１サブユニットおよび／またはアルファ-３サブユニットを「過剰発現」する癌または上記疾患のいずれかにおいては前記サブユニットの産生濃度は、同じ組織タイプの健常な例えば非癌性の細胞に比べると、全体量当たりおよび／または個々の細胞レベルで有意に高い。患者由来の試料、例えば腫瘍バイオプシー中にあるこのサブユニットポリペプチドおよび／またはそれをコードする核酸の濃度を評価して、前記サブユニットの過剰発現を診断的に決定すればよい。このような決定において一般に採用可能な技術は当技術分野で公知であり、例えばIHC、FISH、サザンブロッティング、PCR、ウエスタンブロッティング、ELISA、RIA、免疫沈降等が含まれるが、これらに限定されない。この用語に含まれる過剰発現の程度は任意であり、一例として、過剰発現率は、例えば全体量当たりおよび／または個々の細胞濃度で測定した場合に、少なくとも約10%、例えば少なくとも約20%、好ましくは少なくとも約30%、例えば少なくとも約40%、 更に好ましくは少なくとも約50%、例えば少なくとも約60%、更にいっそう好ましくは少なくとも約70%、例えば少なくとも約80%、 その上好ましくは少なくとも約90%、例えば少なくとも約100%、またはそれ以上、例えば少なくとも約150%、少なくとも約200%、少なくとも約250%、少なくとも約300%、少なくとも約400%、またはさらに少なくとも約500%である。
【０２１７】
更に好ましい実施態様において、NKAのアルファ-１サブユニットおよび／またはアルファ-３サブユニットを過剰発現する増殖性疾患は、神経膠腫、好ましくは神経膠芽細胞腫、前立腺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、または結腸癌から選択される。本発明者らは、これらの癌タイプがNKAのアルファ-１サブユニットおよび／またはアルファ-３サブユニットを頻繁に過剰発現することに気づいた。
【０２１８】
更に好ましい実施態様において、NKAのアルファ-１サブユニットを過剰発現する増殖性疾患は非小細胞肺癌である。本発明者らはこの癌タイプがNKAのアルファ-１サブユニットを特に頻繁に過剰発現することに気づいた。
【０２１９】
治療
本発明はまた、本発明の１つ以上の上記薬剤の治療有効量を投与することを含む、治療を必要とする被験体の増殖性疾患を治療することに関係する。
【０２２０】
注記しない限り、「被験体」または「患者」は互換的に使用され、動物、好ましくは脊椎動物、更に好ましくは哺乳類を言い、特にヒト患者および非ヒト哺乳類を含む。「哺乳類」被験体には、例えばヒト、家畜、農場の動物、動物園の動物、スポーツ用動物、ペットおよび実験動物、例えばイヌ、ネコ、テンジクネズミ、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、畜牛、ウシ；霊長類、例えばサル、オランウータン、およびチンパンジー；イヌ科、例えばイヌ、オオカミ、ネコ科、例えばネコ、ライオン、およびトラ；ウマ科、例えばウマ、ロバ、およびシマウマ；食用動物、例えばウシ、ブタ、およびヒツジ；有蹄動物、例えばシカ、およびキリン；齧歯動物、例えばマウス、ラット、ハムスターおよびテンジクネズミ、等が含まれるが、これらに限定されない。したがって、本明細書で使用する「被験体」または「患者」は、本発明組成物を投与することができる任意の哺乳類の患者または被験体を意味する。
【０２２１】
好ましい患者はヒト被験体である。
【０２２２】
本明細書で使用する用語「治療する」または「治療」とは、治癒的治療および予防または防止手段の両方を言い、望ましくない生理学的な変化もしくは不調、例えば増殖性疾患、例えば癌の進行もしくは拡大を防止または減速することを目的とする。有益なまたは望ましい臨床効果には、その効果が検知可能か否かに係わらず、例えば症状の緩和、疾患程度の減少、疾患状態の安定化（すなわち悪化させない）、疾患進行の遅延もしくは減速、疾患状態の改善もしくは軽減、または病気の小康（部分的か全体的かは関係ない）が含まれるが、これらに限定されない。また「治療」とは、治療を施さなかった場合に予想される生存に比べて生存を伸ばすことを意味する。
【０２２３】
本明細書で使用する語句、例えば「治療を必要とする被験体」には、例えば、所与の条件、好ましくは増殖性疾患、例えば癌を治療することによって上記のような利益を受ける哺乳類被験体が含まれる。このような被験体には、典型的には、例えばその疾患条件、好ましくは増殖性疾患、例えば癌があると診断された被験体、その疾患条件を有するまたは伸展させる傾向のある被験体、および／またはその疾患条件を防止すべき被験体が含まれる。
【０２２４】
用語「治療有効量」とは、被験体の疾患または不調を治療するのに、すなわち所望の局所的または全身的な効果および性能を取得するのに有効な、治療物質または組成物の量を言う。非限定的な一例として、増殖性疾患、例えば癌の場合に、治療的に有効な薬物量があれば、癌細胞の数は減少し、腫瘍の大きさは縮小し、癌細胞が周辺臓器に浸潤するのを阻止（すなわちある程度まで減速し好ましくは停止）し、腫瘍の成長をある程度まで阻止し、他の癌療法の有効性を増強し、および／または癌に伴う１つ以上の症候をある程度まで緩和する。薬物は、存在する癌細胞の成長を抑止し殺滅する限り、細胞増殖抑制的でありおよび／または細胞傷害的である。癌治療にあたって、例えばその有効性を決定するためには、疾患が進行するまでの時間（TTP）を評定しおよび／または反応率（RR）を測定すれば可能である。
【０２２５】
本発明薬剤は、単独で使用してよく、または化学療法、放射療法、免疫療法および／もしくは遺伝子療法を含む群から選択した任意の癌療法との組合せで使用してもよい。本明細書で使用する用語「癌治療」は、例えば放射療法、化学療法、免疫療法、遺伝子ベースの療法、手術、ならびにこれらの組合せを含む意図である。
【０２２６】
他の好ましい実施態様において、本発明薬剤は単独で使用してもよく、または癌、好ましくは神経膠腫、好ましくは神経膠芽細胞腫、前立腺癌、NSCLC、もしくは結腸癌の治療に好適な１つ以上の活性化合物との組合せで使用してもよい。用語「活性化合物」とは、本発明薬剤とは別の癌治療用化合物を言う。活性化合物は、好ましくは放射治療剤、化学療法剤、免疫療法剤、および／または遺伝子ベースの療法剤を含む群から選択してよく、ここで化学療法剤には、例えばテモゾロマイド、ビンクリスチン、ビノレルビン、プロカルバジン、カルムスチン、ロムスチン、タキソール、タキソテレ、タモキシフェン、レチン酸、５−フルオロウラシル、シクロフォスファミド、およびサリドマイドが含まれるがこれらに限定されない、また免疫療法剤には、例えば活性化T細胞、および振動を与えた樹状突起細胞が含まれるがこれらに限定されない。遺伝子ベースの療法剤は本発明薬剤の送達と共に神経膠腫の細胞にCD3、CD7およびCD45を遺伝子移送することに係るアプローチである。
【０２２７】
したがって、本発明の薬剤は、単独でもまたは１つ以上の活性化合物との組合せでも投与することができる。後者は、前記薬剤の投与の前、後または同時に投与することができる。
【０２２８】
医薬調製物
本発明の別の目的は医薬調製物であり、これには本発明の薬剤もしくは薬剤またはその薬学的に許容される塩の本明細書で定義の治療的な有効量、および薬学的に許容される担体、すなわち１つ以上の薬学的に許容される担体物質および／もしくは添加物、例えば緩衝剤、担体、賦形剤、安定化剤等が含まれる。
【０２２９】
本明細書で使用する用語「薬学的に許容される」は、当該技術および手段と矛盾せず、医薬組成物の他の成分と両立可能であり、服用者に有害ではないという意味である。
【０２３０】
本明細書で使用する用語「薬学的に許容される塩」は、無機酸付加塩、例えば塩酸塩、硫酸塩、およびリン酸塩、または有機酸付加塩、例えば酢酸塩、マレイン酸塩、フマール酸塩、酒石酸塩、およびクエン酸塩を意味する。薬学的に許容される金属塩の例は、アルカリ金属塩、例えばナトリウム塩およびカリウム塩、アルカリ土類金属塩、例えばマグネシウム塩、カルシウム塩、アルミニウム塩および亜鉛塩である。薬学的に許容されるアンモニウム塩の例は、アンモニウム塩およびテトラメチルアンモニウム塩である。薬学的に許容される有機アミン付加塩の例は、モルフォリンおよびピペリジンとの塩である。薬学的に許容されるアミノ酸付加塩の例は、リジン、グリシン、およびフェニルアラニンとの塩である。
【０２３１】
本発明の医薬組成物は、更に上で定義した活性化合物の少なくとも１つを含んでよい。
【０２３２】
本発明の医薬組成物は、経口で、例えば丸剤、錠剤、被覆錠剤、糖衣錠剤、顆粒、硬および軟ゼラチンカプセル、水溶性、アルコール性もしくは油溶性の溶液、シロップ、乳化もしくは懸濁の形態にて、または直腸経由で、例えば座剤の形態にて投与することができる。投与は、非経口的に、例えば皮下、筋肉内、または静脈内に注射または点滴用の溶液の形態にて実施することもできる。他の適切な投与形態は例えば経皮または局所の投与、例えば軟膏、チンキ剤、噴霧剤、もしくは経皮治療系の形態にて、または鼻スプレーもしくはエアゾール混合液の形態にて吸入投与、または例えばマイクロカプセル、インプラント、もしくはロッド（ｒｏｄ）である。
【０２３３】
医薬組成物の調製は自体公知の様式にて実施することができる。この目的のために、核酸および／または活性化合物は、１つ以上の固体もしくは液体の医薬用担体物質および／または添加剤(または補助物質)と共に、ならびに必要に応じて他の治療もしくは予防作用のある医薬活性化合物との組み合わせにて適切な投与形態または投薬形態にすれば、これを次にヒト用医薬品製剤として使用することができる。丸剤、錠剤、糖衣錠剤、および硬ゼラチンカプセルの製造には、例えば乳頭、澱粉、例えばトウモロコシ澱粉、または澱粉誘導体、タルク、ステアリン酸もしくはその塩、等を使用することができる。軟ゼラチンカプセルまたは座剤用の担体は例えば脂肪、ワックス、半固体または液体のポリオール、天然または硬化した油等である。溶液、例えば注射用溶液、または乳液もしくはシロップの適切な製造用担体は、例えば水、生理学的溶液の塩化物溶液、アルコール、例えばエタノール、グリセロール、ポリオール、糖、転化糖、グルコース、マンニトール、植物油等である。核酸および／または活性化合物を凍結乾燥し、得られた凍結乾燥体を使用して、例えば注射または点滴用の調製物を製造することも可能である。マイクロカプセル、インプラント、またはロッド（ｒｏｄ）用の適切な担体は例えばグリコール酸と乳酸の共重合体である。
【０２３４】
また医薬組成物は、添加剤、例えば充填剤、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、湿潤剤、安定化剤、乳化剤、分散剤、保存剤、甘味剤、着色剤、調味料、芳香剤、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、溶媒、可溶化剤、デポ効果を達成するための薬剤、浸透圧を変更するための塩、被覆剤、または抗酸化剤を含むことができる。
【０２３５】
好ましくは、本組成物はGLP／GMP溶媒にて投与され、シクロベータデキストリンおよび／または類似の化合物を含有し、または含有しない。
【０２３６】
本発明の薬剤は、１つ以上の投与すべき活性化合物と任意に組み合わせて使用し、その用法用量は個々のケースに依存し、通例通りに個々の状況に適合させて最適な効果を達成する。したがって、用法用量は、治療すべき疾病の性質と重症度に、および治療すべきヒトまたは動物の性別、年齢、体重、および個別の反応性に、使用する化合物の作用の有効性と持続性に、治療が急性的か慢性的か予防的かに、または本発明の薬剤に加えて他の活性化合物を投与するか否かに依存する。
【０２３７】
疾患のタイプと重症度に応じて、具体的な１日用量は約1μg／kg〜100 mg／kg以上であり、上記の因子に依存する。数日以上にわたって繰り返し投与する場合には、その状態に応じて、疾患症状の望ましい抑制が起こるまで治療を持続する。薬剤の好ましい用量は約0.05 mg／kg〜約10 mg／kgの範囲でよい。したがって、約0.5 mg／kg、 2.0 mg／kg、 4.0 mg／kg または 10 mg／kg (またはこれらの任意の組合せ) の１つ以上の用量を患者に投与すればよい。このような用量を間欠的に、例えば１週毎にまたは３週毎に投与すればよい。
【０２３８】
本発明が適用可能である場合、例えば薬剤がポリペプチド、ペプチド、抗体、アンチセンス薬剤、リボザイム、またはsiRNAである場合には、本発明はこれら薬剤を遺伝子療法により当技術分野で公知の有効な技術に従って投与することをも意図している。
【０２３９】
一例として、本発明の薬剤を腫瘍、例えば原発性腫瘍および／または転移癌の部位に送達すればよい。局所送達を達成するには他の箇所で記述したオマヤレザバーを利用する。
【０２４０】
別の実施態様において、本発明は、本発明による医薬組成物、および本明細書で定義した活性化合物とを含有し、これらを必要とする被験体にこれらを同時に、別々に、または連続して投与することを目的とする、キットを提供する。
【０２４１】
スクリーニングアッセイ
一態様において、本発明は、一群のテスト薬剤の中から増殖性疾患治療における治療剤として潜在的に有用な候補を選別する測定法を提供する。前記測定法は、テスト薬剤が（ａ）Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-１サブユニットの発現を減少することが可能か否か、または（ｂ）Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-１サブユニットに結合することが可能か否か、および／またはテスト薬剤が（ｃ）Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-３サブユニットの発現を減少することが可能か否か、または（ｄ）Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-３サブユニットに結合することが可能か否か、を決定する工程を含む。
【０２４２】
スクリーニングアッセイでの好ましいテスト薬剤のタイプは前の章で記載した通りであり、例えばアンチセンス薬剤、例えばアンチセンスのオリゴヌクレオチド、リボザイム、RNA干渉を潜在的に引き起こすことができる薬剤；ポリペプチドまたはタンパク質；抗体；ペプチド、ペプチド模倣薬、アプタマー、化学物質（好ましくは有機分子、更に好ましくは小型の有機分子）、脂質、炭水化物、核酸等が含まれる。前記テスト薬剤タイプの或るもの、例えば化学物質、ペプチド、炭水化物等は合成物、コンビナトリアル物質、または天然物のライブラリーから取得できる。他のテスト薬剤はそれらの標的についての知識を用いてデザインすればよい。
【０２４３】
一実施態様において、アッセイ（薬物スクリーニングアッセイまたはバイオアッセイ）には、NKAのアルファ-１サブユニットおよび／もしくはアルファ-３サブユニットに、またはこれらの変異体に、好ましくはこれらの機能的および／もしくは免疫学的に活性な変異体に、またはこれらの断片に、好ましくはこれらの機能的および／もしくは免疫学的に活性な断片に、またはこれらの機能的および／もしくは免疫学的に活性な誘導体に、テスト化合物が結合可能かについて評価するステップが含まれる。
【０２４４】
本明細書で使用する用語、NKAのアルファ-１サブユニットまたはアルファ-３サブユニットの「変異体」とは、アミノ酸配列がNKAのアルファ-１サブユニットまたはアルファ-３サブユニットの天然の配列に実質的に同一（すなわち全部が同一ではなく大部分が同一）であるポリペプチドを言う。「実質的に同一」とは、少なくとも 85%同一、例えば好ましくは少なくとも90% 同一、例えば少なくとも 91%同一、92%同一、更に好ましくは少なくとも93% 同一、例えば94%同一、 いっそう更に好ましくは少なくとも 95%同一、 例えば少なくとも 96%同一、そのうえ更に好ましくは少なくとも97%同一、例えば少なくとも98%同一、および最も好ましくは少なくとも99%同一を言う。
【０２４５】
２つのポリペプチドの間の配列同一性を決定可能にするためには、それらポリペプチドのアミノ酸配列を最適に整列し(２つのタンパク質配列を最適に整列するとは、ペアの総数を最大にし、導入したずれのペナルティーを除くように整列することであって、この最適整列を実行するためには、好ましくは、例えば、Needleman and Wunsch 1970 (J Mol Biol 48：443-453)のアルゴリズムを使用して「ずれ」のアルゴリズムを、またはSmith and Waterman 1981 (J Mol Biol 147：195-197) のアルゴリズム、これは Accelrys から例えば、the GCG（商標）v. 11.1.2 のパッケージにて入手可能である、を使用して「ベストフィット」のアルゴリズムをコンピュータによって遂行すればよい)、次に一方でそれらポリペプチドが含有するアミノ酸残基が同一である整列箇所の数を計測し、他方で２つのポリペプチドの配列が異なる整列箇所の数を計測する。２つのポリペプチドの配列が整列の所与の箇所で異なるとされるのは、その整列箇所でそれらポリペプチドが含有するアミノ酸残基が異なる（アミノ酸置換）場合であるか、またはその整列箇所に１つのポリペプチドが含有しているアミノ酸を他のポリペプチドは含有していない(アミノ酸の挿入または削除)、もしくはその逆になっている場合である。配列同一性は、それらポリペプチドが含有するアミノ酸残基が同一である整列箇所の数と整列箇所の総数との比（百分率）として計算される。配列の整列および配列同一性の決定を実行するための更に適切なアルゴリズムには、例えばAltschul et al. 1990 (J Mol Biol 215：403-10)によって最初に記載されたBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)、例えばTatusova and Madden 1999 (FEMS Microbiol Lett 174：247-250)によって記載されている「Blast 2 sequences」アルゴリズムをベースにしているアルゴリズムが含まれる。
【０２４６】
変異体のアミノ酸配列と、この変異体と実質的に同一である天然のアルファ-１またはアルファ-３サブユニットのアミノ酸配列との間の相違の少なくともいくつかはアミノ酸置換によることが可能である。好ましくは、この相違の少なくとも85%、例えば少なくとも90%、 更に好ましくは少なくとも95%、例えば100%はアミノ酸置換、好ましくは保存的アミノ酸置換が可能である。本明細書で使用する用語「保存的置換」とは、１つのアミノ酸残基が他の生物学的に類似のアミノ酸残基によって置換されたことを言う。保存的置換の非限定的な実例には、例えば１つの疎水性アミノ酸残基、例えばイソロイシン、バリン、ロイシン、もしくはメチオニンを他の疎水性アミノ酸残基に置換、または１つの極性アミノ酸残基を他の極性アミノ酸残基に置換、例えばアルギニンとリジンの間、グルタミン酸とアスパラギン酸の間、もしくはグルタミンとアスパラギンの間の置換が含まれる。
【０２４７】
本明細書で使用する用語、NKAのアルファ-１サブユニットまたはアルファ-３サブユニットの「変異体」には、NKAのそれぞれアルファ-１またはアルファ-３サブユニットにある程度の類似性を有するポリペプチドも具体的には含まれる。好ましくは、そのような変異体は少なくとも 90%類似、 例えば好ましくは 少なくとも91%類似、例えば少なくとも 92%類似、93%類似、更に好ましくは少なくとも94%類似、例えば95%類似、いっそう更に好ましくは 少なくとも96%類似、例えば少なくとも 97%類似、そのうえ更に好ましくは少なくとも98%類似、例えば少なくとも99%類似である。
【０２４８】
２つのポリペプチドの間の配列類似性を決定可能にするためには、それらポリペプチドのアミノ酸配列を最適に整列させ(上記参照)、次に一方でそれらポリペプチドが含有するアミノ酸残基が同一または類似（すなわち保存的置換）である整列箇所の数を計測し、他方で２つのポリペプチドの配列が異なる整列箇所の数を計測する。２つのポリペプチドの配列が整列の所与の箇所で異なるとされるのは、その整列箇所でそれらポリペプチドが非保存的アミノ酸残基を含有する場合であるか、またはその整列箇所でポリペプチドの１つがアミノ酸残基を含有しているが、他のポリペプチドは含有していない、もしくはその逆(アミノ酸の挿入または削除)になっている場合である。配列類似性は、それらポリペプチドが同一または類似のアミノ酸残基を含有する整列箇所の数と整列箇所の総数との比（百分率）として計算される。
【０２４９】
本明細書で使用する用語、NKAのアルファ-１サブユニットまたはアルファ-３サブユニットの「機能的変異体」とは、上で定義した変異体であって、Na+、K+−ATPアーゼの範囲内にある機能性を少なくとも部分的にも保持しているものを言う。例えば、このような変異体アルファ-１サブユニットまたはアルファ-３サブユニットの１つまたは２つを含有しているNa+、K+−ATPアーゼであれば、当技術分野の標準的な測定法で測定したNa+、K+−ATPアーゼの酵素活性の少なくとも20%、 例えば少なくとも30%、または少なくとも40%、 好ましくは少なくとも 50%、 例えば少なくとも60%、更に好ましくは少なくとも70%、 いっそう更に好ましくは少なくとも 80%、最も好ましくは少なくとも 90%、 例えば 少なくとも 95%を保持するであろう。
【０２５０】
本明細書で使用する用語、NKAのアルファ-１サブユニットの、またはアルファ-３サブユニットの「断片」とは、NKAアルファ-１サブユニットまたはNKAアルファ-3サブユニットと比較すると１つ以上のアミノ酸残基がN末端および／もしくはC末端で欠失しているポリペプチド、またはその変異体（好ましくは機能的変異体）を言うが、ただし断片の残りの一次配列が、それぞれNKAアルファ-１サブユニットの、もしくはNKAアルファ-３サブユニットの、またはその変異体（好ましくは機能的変異体）のアミノ酸配列の対応する場所のものと同一の場合である。
【０２５１】
例えば、アルファ-１サブユニットの、もしくはアルファ-３サブユニットの、またはその（好ましくは機能的）変異体の断片には、それぞれ前記アルファ-１サブユニットの、もしくはアルファ-３サブユニットの、またはその（好ましくは機能的）変異体の、≧5 個の連続するアミノ酸、好ましくは≧10個の連続するアミノ酸、更に好ましくは ≧20個の連続するアミノ酸、 いっそう好ましくは ≧30個の連続するアミノ酸、例えば ≧40個の連続するアミノ酸、および最も好ましくは ≧50個の連続するアミノ酸、例えば ≧60、 ≧70、≧80、≧90、≧100、≧200または≧500個の連続するアミノ酸の配列が含まれ得る。
【０２５２】
アルファ-１サブユニットの、もしくはアルファ-３サブユニットの、またはその(好ましくは機能的）変異体の断片は、それぞれ前記アルファ-１サブユニットの、もしくはアルファ-３サブユニットの、またはその（好ましくは機能的）変異体のアミノ酸配列の少なくとも 80%、例えば 少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、更に好ましくは少なくとも 95% または 99%をも提示することもできる。
【０２５３】
本明細書で使用する用語、NKAのアルファ-１サブユニットの、またはアルファ-３サブユニットの「機能的断片」とは、上で定義した断片であって、Na+、K+−ATPアーゼの範囲内にある機能性を少なくとも部分的にも保持しているものを言う。例えば、このようなアルファ-１サブユニット断片の、またはアルファ-３サブユニット断片の１つまたは２つを含有しているNa+、K+−ATPアーゼは、当技術分野の標準的な測定法で測定したNa+、K+−ATPアーゼの酵素活性の少なくとも20%、 例えば少なくとも30%、または少なくとも40%、 好ましくは少なくとも50%、 例えば少なくとも60%、更に好ましくは少なくとも70%、 いっそう更に好ましくは少なくとも80%、最も好ましくは少なくとも90%、 例えば 少なくとも95%を保持するであろう。
【０２５４】
具体的に示すと、一実施態様において、（ａ）（１）NKAのアルファ-１サブユニットもしくはアルファ-３サブユニットまたはその変異体、断片もしくは誘導体（好ましくは機能的および／または免疫的に活性な）と（２）テスト薬剤とを、例えばそのポリペプチド（１）とテスト薬剤（２）とが結合して複合体を形成することができる条件下で組合せ、次に複合体の形成を検出し、複合体中にテスト薬剤が存在していればテスト薬剤（２）はポリペプチド（１）と相互作用することができると指標される。複合体の形成は、例えば標準的な免疫測定法によって定量することができる。実施態様には更にテスト薬剤の単離および／または同定が含まれてよい。
【０２５５】
このような測定法で使用するNKAのアルファ-１サブユニットまたはアルファ-３サブユニット、その変異体、断片または誘導体（好ましくは機能的および／または免疫的に活性な）は、溶液中に遊離していても、固体担体に固定されていても、細胞表面上にあっても、または細胞内に局在していてもよい。この方法は真核または原核の宿主細胞を使用してよく、その細胞はアルファ-１サブユニットもしくはアルファ-３サブユニットを自然に発現するか、あるいは前記サブユニットまたはその変異体、断片もしくは誘導体を発現する組替え型核酸で一時的にもしくは安定的に形質転換される。
【０２５６】
また、本発明は、競合的なスクリーニングアッセイを意図しており、その方法ではNKAのアルファ-１サブユニットもしくはアルファ-３サブユニットまたはその変異体、断片もしくは誘導体（好ましくは機能的および／または免疫的に活性な）に結合することができる相殺性の抗体または化合物（例えばウアバイン、ジゴキシン）が前記サブユニットとの結合についてテスト薬剤と競合する。特に、本発明は競合的なスクリーニングアッセイに関するもので、その測定法には、（ａ）NKAのアルファ-１サブユニットもしくはアルファ-３サブユニットまたはその変異体、断片もしくは誘導体（好ましくは機能的および／または免疫的に活性な）に特異的な抗体または化合物を前記ポリペプチドとの結合についてテスト化合物と競合させること、および（ｂ） 前記テスト化合物と比較して前記抗体の競合量を決定すること、が含まれる。上記スクリーニングアッセイには、テスト化合物がアルファ-１またはアルファ-３サブユニットに結合する特異性を決定することが更に含まれてよく、そのためにはそのような結合力を他の細胞タンパク質への、特にNKAの他のアルファサブユニットへの前記薬剤の結合力と比較する。
【０２５７】
上記スクリーニングアッセイでは、テスト薬剤、好ましくはNKAのアルファ-１またはアルファ-３サブユニットに結合するテスト薬剤が前記NKAの生物学的活性、例えば酵素活性を変化する、例えば阻害するもしくは活性化するか否かを評定するステップが更に含まれてよい。具体的には、この方法では、NKAのアルファ-１サブユニットもしくはアルファ-３サブユニットまたは機能的なその変異体、断片もしくは誘導体を発現してNKA活性を有する細胞、組織、もしくは非ヒトのモデル生物にテスト化合物を接触させること、次にNKAの生物学的な活性の変化を評定することが含まれてよい。適切な評定方法は例えば実施例３、４および６に記載されている。
【０２５８】
一実施態様において、その測定法（薬物スクリーニングアッセイまたはバイオアッセイ）には、NKAのアルファ-１サブユニットおよび／またはアルファ-３サブユニットの発現を減少することができるか否かについてテスト薬剤を評価するステップが含まれる。一実施態様において、前記測定法には、（ａ）NKAのアルファ-１サブユニットおよび／もしくはアルファ-３サブユニット、または場合によってその変異体、誘導体もしくは断片を提供すること、（ｂ）前記細胞にテスト薬剤を導入すること、ならびに（ｃ）NKAのアルファ-１サブユニットおよび／もしくはアルファ-３サブユニット、または任意にその変異体、誘導体または断片の発現を測定し、それによってテスト薬剤が前記発現に介入するか否かを同定すること、が含まれる。発現は上記の各種レベルにて定量することができる。この実施態様には、前記テスト薬剤の単離および／または同定が更に含まれてよい。その細胞におけるアルファ-１サブユニットおよび／もしくはアルファ-３サブユニットの発現は、その細胞に固有なものであってもよいし、または組替え技術によって、例えば核酸、例えばアルファ-１サブユニットもしくはアルファ-３サブユニット、またはその適切な変異体、断片もしくは誘導体をコードするｃDNAで前記細胞を一時的にもしくは安定的に形質転換することによって促進されたものであってもよい。
【０２５９】
上記スクリーニングアッセイには、テスト薬剤、好ましくはNKAのアルファ-１サブユニットまたはアルファ-３サブユニットの発現を減少するテスト薬剤が前記NKAの生物学的活性、例えば酵素活性を変化するか否かを評定するステップが更に含まれてよい。具体的には、この方法では、NKAのアルファ-１サブユニットもしくはアルファ-３サブユニット、またはその機能的な変異体、断片もしくは誘導体を発現してNKA活性を有する細胞、組織、器官もしくは非ヒトのモデル生物にテスト薬剤を接触させること、次にNKAの生物学的な活性の変化を評定することが含まれてよい。適切な評定方法は例えば実施例３、４および６に記載している。
【０２６０】
実施態様において、その測定法は、神経膠腫、好ましくは神経膠芽細胞腫、前立腺癌、非小細胞肺癌（NSCLC）、または結腸癌から選択される増殖性疾患の治療における治療剤として潜在的に有用である候補薬剤をテスト薬剤の群の中から上記のように選定することである。
【０２６１】
一実施態様において、その測定法は、非小細胞肺癌（NSCLC）の治療における治療剤として潜在的に有用である候補薬剤をテスト薬剤の群の中から上記のように選定することである。
【０２６２】
別の実施態様において、その測定法は、NKAのアルファ-１サブユニットおよび／またはアルファ-３サブユニットを過剰発現する増殖性疾患の治療における治療剤として潜在的に有用である候補薬剤をテスト薬剤の群の中から選定することである。
【０２６３】
別の実施態様において、その測定法は、NKAのアルファ-１サブユニットおよび／またはアルファ-３サブユニットを過剰発現し、かつ神経膠腫、好ましくは神経膠芽細胞腫、前立腺癌、非小細胞肺癌（NSCLC）、または結腸癌から選択される、増殖性疾患の治療における治療剤として潜在的に有用である候補薬剤をテスト薬剤の群の中から選定することである。
【０２６４】
別の好ましい実施態様において、その測定法は、NKAのアルファ-１サブユニットを過剰発現し、かつ非小細胞肺癌（NSCLC）である、増殖性疾患の治療における治療剤として潜在的に有用である候補薬剤をテスト薬剤の群の中から選定することである。
【０２６５】
更にまた、本発明は本明細書に記載のスクリーニングアッセイのいずれかによって同定可能な薬剤に関する。また、本発明は組成物の製造方法であって、本明細書に記載の測定法によって同定可能な薬剤を薬学的に許容される担体と混合するステップを含む方法を意図している。明瞭なこととして、本発明は本明細書に記載の方法のいずれかにより同定可能な薬剤を含有する組成物を意図している。更に、本発明は本明細書に記載の方法のいずれかにより同定可能な薬剤を医薬品として使用することを意図している。このような薬剤は、本明細書に定義の増殖性疾患、特に癌、例えばNKAのアルファ-１もしくはアルファ-３サブユニットを過剰発現する癌、例えば神経膠腫、神経膠芽細胞腫、前立腺癌、NSCLC、または結腸癌の治療に特に適している。
本発明を実施例によって更に説明するが、これら実施例は限定的なものと考えてはならない。
【実施例】
【０２６６】
実施例１：アルファ-１NKAサブユニットの発現がNSCLCにおいて増大する
American Type Culture Collection (Manassas, VA)から取得し研究した細胞株には、２つのヒトNSCLC モデル、すなわち A549 (ATCC codeCCL-185) および A427 (ATCC code HTB-53)； ２つの正常なヒト肺線維芽細胞株、すなわちWI-38 (ATCC code CCL-75) および ccd25-Lu (ATCC code CCL-215)； マウス黒色腫細胞株 B16F10 (ATCCcode CRL- 6475)およびラット神経膠腫 C6 細胞株 (ATCC code CCL-107)を含めた。CAL-12T 細胞はDSMZ Animal Cell Line Database (code ACC-443;Brunswick, Germany)から取得した。NCI- H727 細胞は European Collectionof Cell Cultures (code ECACC 94060303; Sigma-Aldrich, Bornem, Belgium)から取得した。マウス MXT 乳腺癌細胞株は本発明者らの研究室で確立した(Kiss et al. Cancer Res 49:2945-2951 ,1989)。
【０２６７】
８４例の記録のある（フォルマリンで固定し、パラフィン中に埋蔵した）肺組織がDr. I. Salmon (Department of Pathology, ErasmeUniversity Hospital,Brussels, Belgium)により提供されたが、これらは一連の症例の一部であり、これらの臨床病理的データは全て記載済みであった(Mathieu et al. 2005. Mod Pathol 18：1264-1271)。25例の正常組織は外科切除したNSCLCの周縁から取得した。残りの５９例の試料は、NSCLC起源の３０例の腺癌 (NSCLC-ADC)およびNSCLC起源の２９例の鱗屑状細胞癌（NSCLC- SCC）を含んでいた。研究した６０例のNSCLCは、１９９５年から２００１年の間にErasmus University HospitalでNSCLCの外科切除を受けた５９人の患者由来である。入手された臨床データを表１に集約してある。腫瘍をTNM分類（UICC 2002；23）に従ってクラス分けし、段階付けを以下のように行った。ステージ I (T1-2 NO MO)、 ステージII(T1-2 N1 MO またはT3 NO MO)、ステージIII (T1-2 N2-3 MO、T3 N1-3 MOまたはT4 NO-3 MO)およびステージIV(全TおよびNおよび M1)。
【０２６８】
【表３】
2010509251.tif 000006
【０２６９】
８４例のヒト組織試料はフォルマリン固定パラフィン埋蔵の記録のある材料由来である。研究した６細胞株（２株は正常な線維芽細胞株、４株はNSCLC細胞株）の場合に、他の場所で詳記（Sunaga et al. 2004. Cancer Res 64： 4277-4285）した通りに６細胞株の各１０００万個の細胞を８００×ｇで10分間遠心分離して細胞ペレットを得た。次にこれらペレットを緩衝化したフォルマリン（４％）中で20分間固定し、脱水し、パラフィンワックスに埋蔵した。６細胞株の各々につて３つのペレットを得た。
【０２７０】
免疫組織化学検査を開始する前に、ワックスを除いた切片をDako細胞腫化緩衝液（DAKO、 Glostrup、 デンマーク）中で６００W、２×５分にて抗原回収に供した。次に切片を0.4%過酸化水素メタノール溶液と共に３０分間インキュベートして内在するパーオキシダーゼ活性を封止し、リン酸緩衝性生食液（PBS、0.04 M Na2HPO4、 0.01 M KH2PO4 および0.12 M NaCｌ、pH 7.4）で洗浄した。次に切片を室温で、i）特異的な１次抗体に１時間(下記参照)、ii）２次抗体（ウルトラセンスビオチニル化ヒツジ抗多価 RTU、 Immunologic、 Duiven、オランダ）に、iii）ウルトラセンス  ストレプトアビジン  パーオキシダーゼRTU（Immunologic、 Duiven、オランダ）に10分間、そしてiv）アビジン−ビオチン−パーオキシダーゼ複合体（ABC kit、 Glostrup、デンマーク）に連続して曝した。ジアミノベンチジンと過酸化水素を含有する色素物質ミックスと共にインキュベートすると、標識したパーオキシダーゼが抗原に依存して切片上に存在するのが視覚化された。慎重に洗浄した後に切片をマイヤーのヘマトキシリンで染色し、Entellan Neu （Merck, Amsterdam, オランダ）を載せた。抗原に依存しない染色を除去するためのコントロールとして、１次抗体を除外するか、または非免疫抗血清に置き換えた。全ての事例でこれらコントロールは陰性であった。
【０２７１】
Na+／K+−ATPアーゼα１、α２、およびα３サブユニットに対向して挙げられた１次抗体はUpstate (Bio-Connect BV； Huissen； オランダ； α１およびα２)から、およびSigma (Bornem、 ベルギー； α３)から取得した。
【０２７２】
免疫組織化学検査の後にNa+／K+−ATPアーゼα１、α２、およびα３サブユニットの発現レベルを定量的に測定するために、コンピュータ支援のKS 400 画像システム (Carl Zeissvision, Hallbergmoos, ドイツ)を使用した。このシステムは前に詳述した(Saussez et al. 2006. Ann Surg Oncol 13： 999-1009)。事例ごとに、60,000〜120,000μm2の範囲の表面に対応して２０領域を走査した。二人の独立した人が事例ごとに１０領域ずつを分析した。各マーカーの免疫組織化学的な発現パラメータをコンピュータによって形態的に分析するために、定量的に次の２つの変数を取り上げた。１）標識化インデックス（LI）、これは所与のマーカーに陽性に染色された細胞の百分率をいう、および２）平均光学濃度（MOD）、これは陽性細胞の染色強度に対応する（Saussezet al. 2006, 同上）。
【０２７３】
図３は、正常な肺実質気管支組織とNSCLC−ADCおよびNSCLC−SCCとにおいてNa+／K+−ATPアーゼα１、α２、およびα３サブユニットが発現する典型的なパターンを形態学的に示す。NSCLC−ADCｓにおいてα１の発現が増大していること、およびNSCLC−SCCにおいてそれ（α１）の発現が顕著に高いことが直ちに明瞭である。
【０２７４】
本研究のデータから強力に示唆されることとして、正常な肺組織に比べるとNSCLCの大部分ではNa+／K+−ATPアーゼα１サブユニットが増大している。したがって、このNa+／K+−ATPアーゼα１サブユニットは治療の標的にすることが可能であり、特に自分のNSCLCがこのサブユニットを過剰発現している患者では可能である。これとは著しく対照的に、Na+／K+−ATPアーゼα２サブユニットは正常な肺組織でより多く発現されているようである。Na+／K+−ATPアーゼα３サブユニットはNSCLCでも正常肺組織でもむしろ低いレベルで発現されているようにこの特別な実験では見える。
【０２７５】
図４は、２５例の正常肺組織の実質組織（白丸）と気管支組織（白四角）、３０例のNSCLC−ADC（黒丸）と２９例のNSCLC−SCC（黒四角）におけるNa+／K+−ATPアーゼα１、α２、およびα３サブユニットの免疫組織化学的な発現状況についての定量的測定（コンピュータ支援の顕微鏡により実施）を示す。数字１および２は２つのヒト正常肺線維芽細胞株（WI-38 および ccd25-Lu）を示し、これに対し数字３〜６はヒトNSCLC細胞株（A549、 Cal-12T、 NCI- H727、 A427）を示す。数字７〜９は３つの齧歯類の腫瘍細胞株、すなわちラットC6神経膠腫（数字７）、マウスB16黒色腫（数字８）、およびマウスMXT乳腺癌（数字９）の各モデルを示す。事例ごとに２０個の定量測定を実施し、LI（マーカーを発現した細胞の百分率）の平均とMOD（細胞当たりのマーカー濃度（光学濃度によって表現））の平均の値をこれら２０個の値から計算し、各事例のLI平均値をY軸にMOD値をX軸にとって各事例を２次元平面上に位置づけることができた。点線で示す楕円は正常な５０例（２５例の実質組織と２５例の気管支組織）全てについて計算した平均値＋１×標準偏差の値を含む領域を示し、これに対し、実線で示す楕円はこれら５０例の正常組織試料について計算した平均値＋２×標準偏差の値を含む領域を示す。
【０２７６】
図４Aは、Na+／K+−ATPアーゼα１の免疫組織化学的な発現状況に関して楕円（平均値＋２×標準偏差）により描かれた領域に含まれる正常事例は４５／５０（９０％）であり、これに対して同じ領域に含まれるNSCLCは３０／５９（５０．８５％）に過ぎないことを示す。これらのデータが意味するところとして、自分のNSCLSが呈するNa+／K+−ATPアーゼα１の免疫組織化学的な発現状況が正常な肺組織よりも有意に高い患者を同定するための限界値を定義することができる（およびその方法）。
【０２７７】
実施例２：アルファ-１サブユニットの発現をsiRNAにより阻害
アルファ-１サブユニットをsiRNAが標的とするためのいくつかのヌクレオチドをデザインし、次にEurogentec (Seraing, ベルギー)により合成し、それがNa+、K+−ATPアーゼアルファ-１サブユニットの発現を阻害することができるか否かをヒトA549 NSCLC細胞において評価した。抗−アルファ-１サブユニットsiRNAのセンスとして5’-GGGCAGUGUUUCAGGCUAA-3’を、アンチセンスとして5’-UUAGCCUGAAACACUGCCC-3’.を使用した場合に最良の結果が得られた。対応して組み合わせたsiRNA（センス：５’-UCUACGAGGCACGAGACUU-３’ および アンチセンス： ５’-AACUCUCGUGCCUCGUAGA-３’）をコントロールとして使用した。siRNAのアンチセンス鎖とセンス鎖とを50 mMTris, pH 7.5〜8.0、100 mM NaCI／DEPC処理水において製造者によりアニーリングした。siRNA二倍体の最終濃度は１００μMであった。組み合わせコントロールのアンチセンス鎖とセンス鎖も同じ方式でアニーリングした。
【０２７８】
本発明者らはNa+、K+−ATPアーゼα１サブユニットを標的とするsiRNAを使用したが、その有効性は図５Abで明らかである。このsiRNA（「α１siRNA」）によってNa+、K+−ATPアーゼα１サブユニットの発現レベルは削除されても、Na+、K+−ATPアーゼα2(図５Bb)およびα３（図５Cb）サブユニットの発現レベルは変化しなかった。組合せsiRNA (図５Aa、Ba、Ca)を使用した場合にも発現削除は観察されなかった。本発明者らがコンピュータ支援によるビデオ顕微鏡で観察したところによれば、このsiRNAを使用したためにNa+、K+−ATPアーゼα１サブユニットが6日間に８０％減少し、その結果A549NSCLC細胞は増殖も移動も著しく阻害された（図５Db）。この特徴は抗−α１組合せsiRNAでは観察されなかった(図５Da)。
【０２７９】
実施例３:昆虫細胞でのナトリウムポンプ阻害測定
Na+、K+−ATPアーゼの活性を、α１β１、α２β１、およびα３β１のアイソザイムを発現するSf-9細胞の均質液で測定した。γ[32P]-ATPから32Pi が遊離する最初の速度を測定した。
【０２８０】
３０〜４０μｇの全タンパク質試料のATPアーゼ活性の測定は、12OmM NaCl、3OmM KCl、3mM MgCl2、0.2mM EGTA、3OmM Tris- HCl(pH 7.4)± 特定濃度のテスト薬剤、例えば 本明細書での 化合物２を含有す溶媒での最終容積0.25mlにて測定した。
【０２８１】
試料を阻害剤と共に１０分間予めインキュベートした。0.2μCi γ[32P]-ATP （最終濃度2mM)と共にATPを加えて測定を開始した。３７℃で３０分インキュベートした後に氷の上にチューブを置き、２５μlの５５％トリクロロ酢酸を加えて反応を停止した。遊離してきた32Pi-Piをフォスフォモリブデン酸塩に変換し、イソブタノールで抽出した。１５０μlの有機相における放射活性を液体シンチレーションカウントして測定した。化合物２の０．０００１Mでの活性はウアバイン０．００１Mで得られた放射活性に匹敵した。したがって、この特異活性は０．０００１Mの化合物２が存在する場合と存在しない場合におけるATPの加水分解の差として決定した。
【０２８２】
実施例４：細胞内ATP([ATP]i)測定
細胞のATPレベルを、ATP測定キット（Molecular Probes、 Invitrogen、 Merelbeke、 ベルギー）に添付の使用説明書に従って生物発光法により測定した。概略すると、細胞をテスト薬剤、例えば仮にNa+、K+−ATPアーゼ阻害剤、例えば本明細書での化合物２（１０ｎM）の存在下にまたは不存在下に指示された期間培養し、その細胞を受動的な溶解緩衝液（Promega、 Leiden、オランダ）で溶解し、タンパク質濃度をBCA（Pierce、 Perbio Sciences、 Erembodegem、 ベルギー）タンパク質測定法により測定した。細胞溶解液（１μｇ）を１００μlのルシフェラーゼ試薬と混合し、発光度をルミノメーターＴＤ−20／20(Promega、 Leiden、オランダ）上で分析した。試料のATP濃度を、同時に作製したATPの既知濃度に対する検量曲線から計算した。処理によって細胞ATP濃度が減少したデータを百分率として表示するために、処理してないコントロールを１００％に設定した。
【０２８３】
実施例５：化合物２が呈するNa+／K+−ATPアーゼα１サブユニットに対する結合親和性は、対照としての他の強心配糖体よりも有意に高い
本発明者らは、対照としての他の強心配糖体、例えばウアバインおよびジゴキシンと比較した場合に化合物２はNa+／K+−ATPアーゼα１サブユニットに対し顕著な結合親和性を呈するのか否かを疑問に思っていた。本発明者らは最初の対照強心配糖体としてウアバインを選定したが、その理由はこの強心配糖体の生物学的効果およびナトリウムポンプ介在シグナル伝達の特徴が現在まで最もよく調べられているからである。本発明者らは第二の対照強心配糖体としてジゴキシンを選定したが、その理由は、たとえ新しい薬理学的薬剤、例えばアンギオテンシン変換性酵素（ACE）阻害剤、アンギオテンシンII受容体拮抗剤およびβブロッカーが開発されているとしても、この強心配糖体は心不全と心房細動に対して毎年アメリカで約１７０万人の患者の治療に使用するからである。
【０２８４】
Na+／K+−ATPアーゼおよびその各種アイソザイムα１β１、α２β１、およびα３β１の活性に対する化合物２の効果を測定するために、ナトリウムポンプ複合体をバキュロウイルスの発現系を利用して生産し、化合物に対する用量−応答曲線を作製した。異質タンパク質には昆虫細胞での発現(実施例３)が利用されているが、その理由は昆虫によって提供される真核細胞発現系では背景としての内在性Na＋／K+−ATPアーゼが極微小または皆無であるのに対し活性な組換え体Na＋／K+−ATPアーゼは大量に産生可能であるという利点があるからである（Blanco 2005. Front Biosci 10： 2397-2411）。化合物２にはα１β１、α２β１、およびα３β１の全てのNa＋、K+−ATPアーゼに阻害効果があった(表４A)。計算された阻害定数（Ki）が示すところによると、化合物２はウアバインよりも約１００倍大きな有効性をもってα１β１を阻害した。
【０２８５】
【表４】
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【０２８６】
実施例６：化合物２が呈する抗増殖活性は正常細胞よりも癌において有意に高く、かつ抗腫瘍効果はジゴキシンよりも有意に高い
実施例４のデータが強く示唆することとして、ナトリウムポンプのα１サブユニットは化合物２の標的であり、化合物２が呈するこのα１サブユニットに対する結合親和性はウアバインおよびジゴキシンよりも高い。この仮定を機能的にチェックするために、本発明者らはまず４つのヒトNSCLC細胞株を使用し、これらに対する化合物２、ウアバイン、ジギトキシンおよびジゴキシンの抗腫瘍効果(細胞集団全体の３日間における成長発生のレベルを低下する効果）をインビトロでテストした。また本発明者らは３つのマウス細胞株、すなわちC6ラット神経膠腫、MXTマウス乳腺癌、およびマウスB16F10黒色腫モデルを含む３つの癌細胞株を使用した。
【０２８７】
図６Aaのデータにより示されることとして、４つのヒトNSCLC細胞株の全体的成長に生じた障害はジゴキシン＜ジギトキシン＜ウアバイン＜化合物２の順序で増大し、したがってこれら４つの強心配糖体の中でジゴキシンは最も弱く、化合物２は最も強い抗腫瘍剤であることが示された。平均成長曲線（各腫瘍剤に対して得られた４つの成長曲線に基いて計算した）を考慮すると、図６Abから上記の順序が確認される。
【０２８８】
次に、本発明者らは３つの齧歯類の癌細胞株、すなわちC6ラット神経膠腫、MXTマウス乳腺癌、およびマウスB16F10黒色腫モデルを使用した。図６Bのデータから示されることとして、化合物２が実際に抗腫瘍効果を呈したのとは異なり、残りの３つの強心配糖体は高い用量（１０μM）でもいつまでも顕著な抗腫瘍効果を呈しなかった。ナトリウムポンプのα１サブユニットが強心配糖体に対して呈する感受性は動物種に応じて異なる。齧歯類では、α１の強心配糖体に対する感受性はヒト由来のα１サブユニットよりも１００〜１０００倍小さい（齧歯類のα１サブユニットが呈する変異体はヒトでは存在しないから）が、α２およびα３サブユニットでは事情が異なる。
【０２８９】
以上から、図６Aと図６Bのデータを対比すると以下の結論に至る。（i）腫瘍細胞の成長に主に関与しているのはナトリウムポンプのα１サブユニットである。および（ii）α１サブユニット活性の阻害において化合物２は他の公知の強心配糖体、例えばウアバイン、ジギトキシンまたはジゴキシンよりも強力である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年9月9日(2008.9.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非小細胞肺癌（NSCLC）、神経膠腫、黒色腫、リンパ腫、消化器癌、原始神経外胚葉性腫瘍、肉腫、頭頸癌、結腸癌、前立腺癌、肝臓癌、卵巣癌、子宮癌または乳癌の治療に使用される、Na+、K+−ATPアーゼ（NKA）のアルファ-１サブユニットの発現を減少可能なRNA干渉を引き起こすことができるアンチセンス薬剤または薬剤。
【請求項２】
非小細胞肺癌（NSCLC）、神経膠腫、黒色腫、リンパ腫、消化器癌、原始神経外胚葉性腫瘍、肉腫、頭頸癌、結腸癌、前立腺癌、肝臓癌、卵巣癌、子宮癌または乳癌の治療に使用するための、NKAのアルファ-１サブユニットに特異的な抗体、その断片または誘導体。
【請求項３】
非小細胞肺癌（NSCLC）、神経膠腫、黒色腫、リンパ腫、消化器癌、原始神経外胚葉性腫瘍、肉腫、頭頸癌、結腸癌、前立腺癌、肝臓癌、卵巣癌、子宮癌または乳癌の治療用医薬品の調製のための、NKAのアルファ-１サブユニット発現を減少可能なRNA干渉を引き起こすことができるアンチセンス薬剤または薬剤の使用。
【請求項４】
非小細胞肺癌（NSCLC）、神経膠腫、黒色腫、リンパ腫、消化器癌、原始神経外胚葉性腫瘍、肉腫、頭頸癌、結腸癌、前立腺癌、肝臓癌、卵巣癌、子宮癌または乳癌の治療用医薬品の調製のための、NKAのアルファ-１サブユニットに特異的な抗体、その断片または誘導体の使用。
【請求項５】
（１）NKAのアルファ-１サブユニット発現を減少可能なRNA干渉を引き起こすことができるアンチセンス薬剤もしくは薬剤またはNKAのアルファ-１サブユニットに特異的な抗体、その断片もしくは誘導体を、同定または生成する工程；および（２）非小細胞肺癌（NSCLC）、神経膠腫、黒色腫、リンパ腫、消化器癌、原始神経外胚葉性腫瘍、肉腫、頭頸癌、結腸癌、前立腺癌、肝臓癌、卵巣癌、子宮癌または乳癌の治療用医薬品の調製のために（１）の薬剤を使用する工程を含む方法。
【請求項６】
前記抗体、その断片または誘導体が、NKAの生物学的活性の１つ以上の態様を、好ましくは阻害または活性化するように変更させる、請求項２に記載される使用のための抗体、その断片もしくは誘導体、または請求項４もしくは５に記載の使用もしくは方法。
【請求項７】
該アンチセンス薬剤がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載される使用のためのアンチセンス薬剤、または請求項３もしくは５に記載される使用もしくは方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載される１以上の薬剤または抗体を治療有効量で含む医薬組成物、またはその薬学的に許容される塩、および１以上の薬学的に許容される緩衝剤、担体、賦形剤、安定化剤を更に含む医薬組成物。
【請求項９】
非小細胞肺癌（NSCLC）、神経膠腫、黒色腫、リンパ腫、消化器癌、原始神経外胚葉性腫瘍、肉腫、頭頸癌、結腸癌、前立腺癌、肝臓癌、卵巣癌、子宮癌または乳癌の治療において治療剤として潜在的に有用な候補薬剤を一群のテスト薬剤の中から選択するアッセイであって、前記アッセイは、（ａ）Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-１サブユニットの発現を減少することが可能か否か、または（ｂ）Na+、K+−ATPアーゼのアルファ-１サブユニットに結合することが可能か否か、を決定することを含むアッセイ。
【請求項１０】
非小細胞肺癌（NSCLC）、神経膠腫、黒色腫、リンパ腫、消化器癌、原始神経外胚葉性腫瘍、肉腫、頭頸癌、結腸癌、前立腺癌、肝臓癌、卵巣癌、子宮癌または乳癌の非ヒト動物モデルまたは非ヒト哺乳類モデルに投与する組成物を調製するために、選択された候補薬剤を使用し、およびそのモデルの治療効果をモニターすることを更に含む、請求項９に記載のアッセイ。
【国際調査報告】
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