(57)【要約】  本発明は、構造(I)の化合物を提供し、式中、Xは、S、O又はNRNであり、RNは、H又はアルキルであり、Lは、リンカー基であり、Qは、2本鎖DNAと結合することができる基であり、G及びG'は、独立に、存在しないか、又は1個から20個までの主鎖原子を有し、FGは、少なくとも1つのO原子若しくはN原子又は遷移金属錯体を含む官能部分であり、Rは、H、アルキル、アルコキシ又は6員環を形成するようにLにおける原子に結合したOCRaRbからなる群から選択され、Ra及びRbは、独立にHであるか、又は場合によって置換されたアルキルである。2010509322.tif 000029
2010509322.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造(I)
【化１】
2010509322.tif 000024
の化合物
[式中、
Xは、S、O又はNRNであり、RNは、H又はアルキルであり、
Lは、リンカー基であり、
Qは、2本鎖DNAと結合することができる種であり、
G及びG'は、独立に、存在しないか、又は1個から30個までの主鎖原子を有し、
FGは、少なくとも1つのO原子若しくはN原子又は遷移金属錯体を含む官能部分であり、
Rは、H、アルキル、アルコキシ又は6員環を形成するようにLにおける原子に結合したOCRaRbからなる群から選択され、Ra及びRbは、独立にHであるか、又は置換されていてもよいアルキルである]。
【請求項２】
XがSである、請求項1に記載の化合物。
【請求項３】
QがdsDNAに挿入することができる、請求項1又は2に記載の化合物。
【請求項４】
Qがナフタレンジイミド基である、請求項3に記載の化合物。
【請求項５】
Lが構造OCH2を有する、請求項1から4のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
化合物が構造(II):
【化２】
2010509322.tif 000025
を有する、請求項1から4のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
G及びG'がCH2、(CH2)3、CH2O(CH2)6、CH2OCH2(CH2OCH2)2CH2、CH2OCH2(CH2OCH2)4CH2及びCH2OCH2(CH2OCH2)3CH2からなる群から独立に選択される、請求項1から6のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
FGがOH、NH2、イミダゾリル、ピリジニル又は金属錯体である、請求項1から7のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
FGが構造(III)
【化３】
2010509322.tif 000026
を有し、ただし、L'がリンカー基であり、X'がS、O又はNRNであり、RNがH又はアルキルであり、R'がH、アルキル、アルコキシ又は6員環を形成するようにL'における原子に結合したOCRcRdからなる群から選択され、Rc及びRdは、独立にHであるか、又は置換されていてもよいアルキルである、請求項1から7のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
X'がSである、請求項9に記載の化合物。
【請求項１１】
L'が構造OCH2を有する、請求項9又は10に記載の化合物。
【請求項１２】
化合物が構造(IV):
【化４】
2010509322.tif 000027
を有する、請求項9から11のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１３】
GとG'が同じであり、XとX'が同じである、請求項12に記載の化合物。
【請求項１４】
請求項1から13のいずれか一項に記載の化合物に由来するモノマー単位を含む、導電性ポリマー。
【請求項１５】
前記ポリマーがコポリマーであり、第2のモノマー由来のモノマー単位をさらに含み、前記第2のモノマーが、置換されていてもよいチオフェン、置換されていてもよいピロール若しくは置換されていてもよいフランであるか、又はこれらの2つ以上の混合物であり、前記置換されていてもよいチオフェン、置換されていてもよいピロール若しくは置換されていてもよいフランが2位及び5位において非置換である、請求項14に記載のポリマー。
【請求項１６】
前記第2のモノマーが3,4-エチレンジオキシチオフェンである、請求項15に記載のコポリマー。
【請求項１７】
請求項1に記載の構造(I)の化合物を製造する方法であって、構造(V)
【化５】
2010509322.tif 000028
の化合物及び構造FG-G'-NH2の化合物を構造A-Q-Aの化合物と反応させることを含み、ただし、Aがアミン基とカップリングすることができる官能基であり、QがdsDNAと結合することができる基である、方法。
【請求項１８】
構造A-Q-Aの化合物がナフタレン二酸無水物である、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
構造FG-G'-NH2の化合物が構造(V)を有する、請求項17又は18に記載の方法。
【請求項２０】
請求項17から19のいずれか一項に記載の方法により製造される、請求項1に記載の構造(I)の化合物。
【請求項２１】
請求項1に記載の構造(I)のモノマーを電解重合することを含む、請求項14に記載のポリマーを製造する方法。
【請求項２２】
構造(I)のモノマーを第2のモノマーと混合し、前記第2のモノマーが置換されていてもよいチオフェン、置換されていてもよいピロール若しくは置換されていてもよいフランであり、前記置換されていてもよいチオフェン、置換されていてもよいピロール若しくは置換されていてもよいフランが2位及び3位において非置換である、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
請求項21又は22に記載の方法により製造される、請求項14に記載のポリマー。
【請求項２４】
試料中のdsDNAの存在又は非存在を判定する方法であって、
・請求項1から13若しくは20のいずれか一項に記載の化合物に、又は請求項14から16若しくは23のいずれか一項に記載のポリマーに試料を曝露させる段階と、
・前記曝露の前の化合物又はポリマーからのシグナルを前記曝露の後の化合物又はポリマーの対応するシグナルと比較する段階と、
・前記比較により試料中のdsDNAの存在又は非存在を判定する段階と
を含む、方法。
【請求項２５】
前記シグナルがUV/可視光の吸光度、UV/可視光の吸収極大、電気インピーダンス、電気抵抗、電気伝導率及び電気伝導率に関するオンセット電位からなる群から選択される、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
請求項14から16又は23のいずれか一項に記載の導電性ポリマーを含む、試料中のdsDNAの存在又は非存在を検出するためのセンサー。
【請求項２７】
試料中の特定のポリヌクレオチド配列の存在又は非存在を判定する方法であって、
・前記特定のヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列を表面に結合させた電極を準備する段階と、
・試料及び請求項1から13又は20のいずれか一項に記載の化合物に電極を曝露させる段階と、
・前記化合物を電解重合して導電性ポリマーを生成させるように、サイクリックボルテージを電極に印加する段階と、
・電極上の導電性ポリマーのサイクリックボルタモグラムを測定する段階と、
・前記ボルタモグラムを対照電極のボルタモグラムと比較する段階と、
・前記比較により試料中の特定のポリヌクレオチド配列の存在又は非存在を判定する段階と
を含む、方法。
【請求項２８】
試料中の特定のポリヌクレオチド配列の存在又は非存在を判定する方法であって、
・前記特定のヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列を表面に結合させた電極を準備する段階と、
・試料に電極を曝露させる段階と、
・請求項1から13又は20のいずれか一項に記載の化合物を電解重合して導電性ポリマーを生成させるように、前記化合物の存在下で電極にサイクリックボルテージを印加する段階と、
・電極上の導電性ポリマーのサイクリックボルタモグラムを測定する段階と、
・前記ボルタモグラムを対照電極のボルタモグラムと比較する段階と、
・前記比較により試料中の特定のポリヌクレオチド配列の存在又は非存在を判定する段階と
を含む、方法。
【請求項２９】
前記方法が前記特定のポリヌクレオチド配列の濃度を測定する方法であり、比較する段階が前記ボルタモグラムにおける電流の大きさを、既知の濃度の前記特定のヌクレオチド配列を用いて測定したボルタモグラムにおける電流の大きさと比較することを含み、判定する段階が比較により試料中の特定のポリヌクレオチド配列の濃度を測定することを含む、請求項27又は28に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、2本鎖DNAと複合体化できる化合物及びそのポリマーに関し、またポリヌクレオチドを検出するためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
DNAバイオセンサーは、分子診断の最も有望な手段の1つである。配列特異的DNA検出に関する大多数のプロトコールは標的DNAの事前の標識を必要とするが、有効なDNA標識法は、限られており、非特異的標識を防ぐために徹底的な洗浄プロトコールを必要とする。挿入剤は、非標識標的DNAと捕捉プローブが、ハイブリダイゼーションした2本鎖DNA(dsDNA)と選択的に結合するため、核酸検出に一般的に用いられている。これらの挿入剤は、一般的に挿入ユニットが、電気又は光学シグナルを発生することができる小さな分子又は生体分子と結合している。電気化学的検出は費用対効果がより高く、迅速、直接的かつ光吸収耐性検出ができるため、電気化学的挿入剤は、特に興味深い。さらに、検出装置は、携帯型で、頑健、安価かつ取扱い容易な電気部品により組み立てられ、したがって、電気化学的検出は、実地試験及び処置が必要な現場での使用に適している。電気化学的挿入剤を電極触媒反応と組み合せることにより、電流測定出力が増幅され、DNA検出限界が低くなることが示された。2本鎖DNA(dsDNA)に選択的かつ可逆的に結合する挿入有機/無機化合物は、抗腫瘍薬、DNAプローブ及び遺伝子送達ベクターとしての適用を示した。蛍光性及び酸化還元活性(redox-active)挿入剤は、標的DNAの標識を避けるためのDNAハイブリダイゼーションのインジケータとして用いられている。相補的DNA標的は、これらの挿入剤からの光学的/電気化学的出力を測定することにより検出される。しかし、これらの方法の大部分は、シグナル強度が低く、シグナル/ノイズ比が不十分であることによって制限される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Taton T. A.、Mirkin C. A.、Letsinger R. L.、Science 2000、289、1757頁
【非特許文献２】Park S.-J.、Taton T. A.、Mirkin C. A.、Science 2002、295、1503頁
【非特許文献３】Gao Z. Q.、Rafea S.、Lim、L. H.、Adv. Mat.、2007、19、602頁
【非特許文献４】Fan Y.、Chen X. T.、Trigg A. D.、Tung C. H.、Kong J. M.、J. Am. Chem. Soc.、2007、129、5437頁
【非特許文献５】A. Lima、P. Schottland、S. Sadki、C. Chevrot、Synthetic Metals 1998、93、33頁
【非特許文献６】S. Akoudad、J. Roncali、Electrochemistry Communications 2000、2、72頁
【非特許文献７】S. J. Meunier、Q. Wu、S.-N. Wang R. Roy、Can. J. Chem. 1997、75、1472
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、当技術分野において、DNA結合のための挿入ユニットと結合した、エチレンジオキシチオフェン(EDOT)モノマーに基づくものなどの導電性ポリマーを用いることによるシグナル出力の改善及び検出限界の低下に関する継続的な必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の第1の態様において、構造(I)
【０００６】
【化１】
2010509322.tif 000003
【０００７】
の化合物を提供し、
式中、
Xは、S、O又はNRNであり、RNは、H又はアルキルであり、
Lは、リンカー基であり、
Qは、2本鎖DNAと結合することができる基であり、
G及びG'は、独立に、存在しないか、又は1個から30個までの主鎖原子を有し、存在する場合、場合によって置換されており、
FGは、少なくとも1つのO原子若しくはN原子又は遷移金属錯体を含む官能部分であり、
Rは、H、アルキル、アルコキシ又は6員環を形成するようにLにおける原子に結合したOCRaRbからなる群から選択され、Ra及びRbは、独立にHであるか、又は場合によって置換されたアルキルである。
【０００８】
以下の選択肢は、第1の態様とともに、個別に又は適切な任意の組合せで用いることができる。
【０００９】
構造(I)の化合物は、対称化合物であってよい。それは、非対称化合物であってよい。
【００１０】
Xは、Sであってよい。
【００１１】
Qは、dsDNAと選択的に結合することが可能であってよい。それは、dsDNAに挿入することが可能であってよい。それは、スレッディング(threading)挿入モードによりdsDNAに結合することが可能であってよい。Qは、ナフタレンジイミド基であってよい。
【００１２】
Lは、構造OCH2を有していてよい。
【００１３】
構造(I)の化合物は、構造(II)を有していてよい。
【００１４】
【化２】
2010509322.tif 000004
【００１５】
それは、G-O-G'-FGに結合した3,4-エチレンジオキシチオフェン基を含んでいてよく、ここで、G、G'、Q及びFGは、以前に定義した通りである。
【００１６】
G及びG'は、CH2、(CH2)3、CH2O(CH2)6、CH2OCH2(CH2OCH2)2CH2、CH2OCH2(CH2OCH2)4CH2及びCH2OCH2(CH2OCH2)3CH2からなる群から独立に選択することができる。
【００１７】
FGは、OH、NH2、イミダゾリル、ピリジニル又は遷移金属錯体、例えば、オスミウム錯体若しくはルテニウム錯体若しくは鉄錯体であってよい。それは、酸化還元錯体(redox complex)を含んでいてよい。
【００１８】
FGは、構造(III)を有していてよく、ただし、L'は、リンカー基であり、X'は、S、O又はNRNであり、RNは、H又はアルキルであり、R'は、H、アルキル、アルコキシ又は6員環を形成するようにL'における原子に結合したOCRcRdからなる群から選択され、Rc及びRdは、独立にHであるか、又は場合によって置換されているアルキルである。構造(III)において、X'は、Sであってよい。構造(III)において、L'は、構造OCH2を有していてよい。
【００１９】
【化３】
2010509322.tif 000005
【００２０】
構造(I)の化合物は、構造(IV)を有していてよい。
【００２１】
【化４】
2010509322.tif 000006
【００２２】
構造(IV)において、GとG'は同じであってよく、XとX'は同じであってよい。
【００２３】
本発明の1つの実施形態において、以下の一般式
【００２４】
【化５】
2010509322.tif 000007
【００２５】
を有する化合物を提供し、
式中、
G及びG'のそれぞれは、場合によって置換されている、0個から20個までの主鎖原子を含む独立に選択される結合部分であり、
FGは、少なくとも1つの酸素若しくは窒素原子又は遷移金属錯体を含む官能部分であり、
Rは、水素、アルキル、アルコキシ又は縮合6員環を形成するように*で印を付けた炭素と縮合した-O-CH2-から選択される。
【００２６】
上の実施形態の少なくとも1つの化合物のモノマーを含むポリマーも提供する。ポリマーは、電解重合により生成させることができる。
【００２７】
本発明の他の実施形態において、以下の一般式
【００２８】
【化６】
2010509322.tif 000008
【００２９】
を有する化合物を提供し、
式中、
G及びG'のそれぞれは、場合によって置換されている、0個から20個までの主鎖原子を含む独立に選択される結合部分であり、
R及びR'のそれぞれは、水素、アルキル、アルコキシ又は縮合6員環を形成するように*で印を付けた炭素と縮合した-O-CH2-から選択される。
【００３０】
第1の態様の少なくとも1つの化合物由来のモノマー群を含むポリマーも提供する。ポリマーは、電解重合により生成させることができる。
【００３１】
本発明の他の実施形態において、構造(IIa)の化合物を提供し、式中、G、G'及びFGは、上述の通りである。
【００３２】
【化７】
2010509322.tif 000009
【００３３】
本発明の他の実施形態において、構造(IVa)の化合物を提供し、式中、G及びG'は、上述の通りである。
【００３４】
【化８】
2010509322.tif 000010
【００３５】
本発明はまた、第1の態様の化合物及び少なくとも1つの溶媒、希釈剤又は賦形剤を含む組成物を提供する。組成物は、溶液であってよく、又は懸濁液であってよく、又は乳濁液であってよく、又はマイクロエマルジョンであってよく、又は分散系であってよい。
【００３６】
本発明の第2の態様において、本発明の第1の態様による化合物由来のモノマー単位を含む導電性ポリマーを提供する。
【００３７】
該ポリマーは、コポリマーであってよく、第2のモノマー由来のモノマー単位をさらに含んでいてよく、前記第2のモノマーは、場合によって置換されているチオフェン、場合によって置換されているピロール若しくは場合によって置換されているフランであるか、又はこれらの任意の2つ以上の混合物であり、前記場合によって置換されているチオフェン、場合によって置換されているピロール若しくは場合によって置換されているフランは、2位及び5位において非置換である。第2のモノマーは、3,4-エチレンジオキシチオフェンであってよい。第2のモノマーは、第1の態様の化合物とともに電解重合することができるべきである。第2のモノマーは、それとともに電解重合して、導電性ポリマーを形成することができる。該ポリマーは、第1の態様の化合物由来のもの以外のモノマー単位を有さなくてよく、又は第1の態様の化合物及び第2のモノマー由来のもの以外のモノマー単位を有さなくてよく、或いは該ポリマーが導電性であるならば、さらなるモノマー単位を有していてよい。
【００３８】
本発明の第3の態様において、上で定義した構造(I)の化合物を製造する方法を提供し、前記方法は、構造(V)の化合物及び構造FG-G'-NH2の化合物を構造A-Q-Aの化合物と反応させることを含み、ただし、Aは、アミン基とカップリングすることができる官能基であり、Qは、dsDNAと結合することができる基である。
【００３９】
【化９】
2010509322.tif 000011
【００４０】
以下の選択肢は、第3の態様とともに、個別に又は適切な任意の組合せで用いることができる。
【００４１】
Aは、酸無水物基であってよい。
【００４２】
Qは、ナフタレン基であってよい。
【００４３】
構造A-Q-Aの化合物は、ナフタレン二酸無水物(naphthalene dianhydride)であってよい。
【００４４】
構造FG-G'-NH2の化合物は、構造(V)を有していてよい。この場合、該方法は、構造(V)の化合物をナフタレン二酸無水物と反応させることを含む。
【００４５】
本発明はまた、第3の態様の方法により製造される上で定義した構造(I)の化合物を提供する。
【００４６】
本発明の第4の態様において、第2の態様によりポリマーを製造する方法を提供し、前記方法は、上述の構造(I)のモノマーを電解重合することを含む。
【００４７】
1つの実施形態において、構造(I)のモノマーを第2のモノマーと混合し、前記第2のモノマーは、場合によって置換されているチオフェン、場合によって置換されているピロール若しくは場合によって置換されているフランであり、ただし、前記場合によって置換されているチオフェン、場合によって置換されているピロール若しくは場合によって置換されているフランは、2位及び5位において非置換である。この実施形態において、該方法は、構造(I)のモノマーを第2のモノマーとともに電解重合することを含む。
【００４８】
他の実施形態において、第2の態様によりポリマーを製造する方法を提供し、前記方法は、本発明の第3の態様の方法を用いて構造(I)のモノマーを製造し、前記モノマーを電解重合することを含む。
【００４９】
他の実施形態において、第2の態様によりポリマーを製造する方法を提供し、前記方法は、本発明の第3の態様の方法を用いて構造(I)のモノマーを製造する段階と、前記モノマーを第2のモノマーとともに電解重合する段階とを含み、前記第2のモノマーは、場合によって置換されているチオフェン、場合によって置換されているピロール若しくは場合によって置換されているフランであり、ただし、前記場合によって置換されているチオフェン、場合によって置換されているピロール若しくは場合によって置換されているフランは、2位及び5位において非置換である。
【００５０】
本発明はまた、第4の態様の方法により製造されるポリマーを提供する。
【００５１】
本発明の第5の態様において、試料中のdsDNAの存在又は非存在を判定する方法であって、
第1の態様による、若しくは第3の態様により製造された化合物に、又は第2の態様による、若しくは第4の態様により製造されたポリマーに試料を曝露させる段階と、
前記曝露の前の化合物又はポリマーからのシグナルを前記曝露の後の化合物又はポリマーの対応するシグナルと比較する段階と、
前記比較により試料中のdsDNAの存在又は非存在を判定する段階と
を含む、方法を提供する。
【００５２】
シグナルは、UV/可視光の吸光度(例えば、最大吸光度)、電気インピーダンス、電気抵抗、電気伝導率及び電気伝導率に関するオンセット電位を含む群から選択することができる。
【００５３】
該方法は、試料中のdsDNAの濃度を測定する方法であってよい。
【００５４】
1つの実施形態において、該方法は、
(i)化合物又はポリマーからのシグナルを測定する段階と、
(ii)化合物又はポリマーとdsDNAとの結合を促進する条件下で、試料を化合物又はポリマーと混合して混合物を形成させる段階と、
(iii)前記混合物のシグナルを測定する段階と、
(iv)(i)と(iii)との間のシグナルの差を求める段階であって、前記シグナルの差が前記dsDNAの存在を示す段階とを含む。
【００５５】
本発明の第6の態様において、試料中のdsDNAの存在又は非存在を検出するためのセンサーを提供し、前記センサーは、第2の態様による、又は第4の態様により製造された導電性ポリマーを含む。
【００５６】
本発明の第7の態様において、試料中の特定のポリヌクレオチド配列の存在又は非存在を判定する方法であって、
前記特定のヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列をその表面に結合させた電極を準備する段階と、
試料及び第1の態様による、又は第3の態様により製造された化合物に電極を曝露させる段階と、
前記化合物を電解重合して導電性ポリマーを生成させるように、サイクリックボルテージ(cyclic voltage)を電極に印加する段階と、
電極上の導電性ポリマーのサイクリックボルタモグラムを測定する段階と、
前記ボルタモグラムを対照電極のボルタモグラムと比較する段階と、
前記比較により試料中の特定のポリヌクレオチド配列の存在又は非存在を判定する段階と
を含む、方法を提供する。
【００５７】
本発明の第8の態様において、試料中の特定のポリヌクレオチド配列の存在又は非存在を判定する方法であって、
前記特定のヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列をその表面に結合させた電極を準備する段階と、
試料に電極を曝露させる段階と、
化合物を電解重合して導電性ポリマーを生成させるように、第1の態様による、又は第3の態様により製造された化合物の存在下で電極にサイクリックボルテージを印加する段階と、
電極上の導電性ポリマーのサイクリックボルタモグラムを測定する段階と、
前記ボルタモグラムを対照電極のボルタモグラムと比較する段階と、
前記比較により試料中の特定のポリヌクレオチド配列の存在又は非存在を判定する段階と
を含む、方法を提供する。
【００５８】
第7又は第8の態様の方法は、前記特定のポリヌクレオチド配列の濃度を測定する方法であってよい。この場合には、比較する段階は、前記ボルタモグラムにおける電流の大きさを既知の濃度の前記特定のヌクレオチド配列を用いて測定したボルタモグラムにおける電流の大きさと比較することを含み、判定する段階は、比較により試料中の特定のポリヌクレオチド配列の濃度を測定することを含む。
【００５９】
第7又は第8の態様において、サイクリックボルテージを印加する段階は、導電性ポリマーを生成させ、それにより前記ポリマー上の基が電極上の、存在する場合、2本鎖ポリヌクレオチドにより挿入されるように、実施することができる。
【００６０】
本発明の第9の態様において、第1の態様による、又は第3の態様の方法により製造される構造(I)の化合物、或いは第2の態様による、又は第4の態様の方法により製造されるポリマーを提供し、それにより、前記化合物又はポリマー上の基QがdsDNA又は2本鎖ポリヌクレオチドにより挿入される。1つの実施形態において、dsDNA又は2本鎖ポリヌクレオチドを電極に連結、場合によって結合させる。電極は、金電極又は白金電極又はパラジウム電極であってよい。dsDNA又は2本鎖ポリヌクレオチドは、硫黄-金属(例えば、硫黄-金、硫黄-白金又は硫黄-パラジウム)結合により電極に連結させることができる。
【００６１】
本発明の第10の態様において、第2の態様による、又は第4の態様の方法により製造されるポリマーを製造する方法であって、それにより前記ポリマーの基QがdsDNA又は2本鎖ポリヌクレオチドにより挿入され、dsDNA又は2本鎖ポリヌクレオチドの存在下で、第1の態様による、又は第3の態様の方法により製造された構造(I)の化合物を電解重合することを含む方法を提供する。1つの実施形態において、前記電解重合中に構造(I)の化合物がdsDNA又は2本鎖ポリヌクレオチドにより挿入される。いくつかの実施形態において、dsDNA又は2本鎖ポリヌクレオチドを電極に連結、場合によって結合させる。電極は、金電極又は白金電極又はパラジウム電極であってよい。dsDNA又は2本鎖ポリヌクレオチドは、硫黄-金属(例えば、硫黄-金、硫黄-白金又は硫黄-パラジウム)結合により電極に連結させることができる。
【００６２】
本発明の好ましい実施形態は、添付図面に関連して例としてのみ記述することとする。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】100mV/秒のスキャン速度での(A)ビス-EDOT-ND 4a及び(B)ビス-EDOT-ND 4bの電解重合のプロットを示す図である。電解重合は、10mMの各モノマーを含む0.1MのnBu4NPF6/CH2Cl2溶液中で実施した。
【図２】100mV/秒のスキャン速度でのビス-EDOT-ND 4b及びEDOTのモノマー混合物の電解重合のプロットを示す図である。モノマー混合物は、(A)50%及び(B)10%の4bを含む。電解重合は、10mMのモノマー混合物を含む0.1MのnBu4NPF6/CH2Cl2溶液中で実施した。
【図３】ITO電極上のポリ4b-コ-ポリEDOT膜のUV-可視スペクトルを示す図である。膜は、0.1MのnBu4NPF6/CH2Cl2溶液中(A)50%及び(B)10%の4bを含むモノマー混合物から電解重合した。スペクトルは、ポリEDOTの吸収極大(λmax=600nm)に基づいて標準化した。
【図４】(1)0、(2)50、(3)100、(4)150及び(5)200μMの2本鎖サケ精子DNA(塩基対)の存在下でのPBS緩衝液中の25μMのビスEDOT-ND (A)4a、(B)4b及び(C)4cのUV-可視吸収スペクトルを示す図である。挿入図:挿入剤結合範囲の拡大UV-可視吸収スペクトル。
【図５】EDOT-ND-Os(-)、EDOT-ND-EDOT(---)及びOs(bpy)2Cl2(・・・)の(A)UV-可視吸収スペクトル及び(B)サイクリックボルタモグラムを示す図。UV-可視吸収スペクトルは、エタノール溶液中で測定した。サイクリックボルタモグラムは、0.1M nBu4NPF6/CH3CN(EDOT-ND-Os及びEDOT-ND-EDOT)及びPBS(Os(bpy)2Cl2)中で100mV/秒のスキャン速度で測定した。0、25、50及び75μM(上から下へ)のサケ精子DNAを含むPBS緩衝液中25μMの(C) EDOT-ND-Os及び(D) EDOT-ND-EDOTのUV-可視吸収スペクトルを示す図である。DNAの濃度は、塩基対に基づいている。
【図６】(A)20pM相補的標的(-)、100pM非相補的標的(---)及び無標的(・・・)とハイブリダイゼーションさせたDNA捕捉プローブに結合したEDOT-ND-Osの矩形波ボルタモグラム、(B)ブランク実験(無標的)のシグナルサブトラクション後の0.14Vにおける(A)からの(中空)100pM相補的標的、(灰色)20pM相補的標的及び(黒色) 100pM非相補的標的をハイブリダイゼーションさせたバイオセンサー電極からのアンペロメトリーシグナル、(C)5mM EDOT-OHの種媒介電解重合後に(A)に記載の組立て済みバイオセンサー電極上に形成されたPEDOTsのサイクリックボルタモグラム、(D)ブランク実験(無標的)のシグナルサブトラクション後の0.3V（酸化）における(C)からの(中空)100pM相補的標的、(灰色)20pM相補的標的及び(黒色) 100pM非相補的標的をハイブリダイゼーションさせたバイオセンサー電極からのアンペロメトリーシグナルを示す図である。ボルタモグラムは、支持電解質として0.1M LiClO4を含む水溶液中で測定した。
【図７Ａ】実施例からの選択した化合物のNMRスペクトルを示す図である。
【図７Ｂ】図7A参照。
【図７Ｃ】図7A参照。
【図７Ｄ】図7A参照。
【図７Ｅ】図7A参照。
【図８】EDOTグラフト挿入剤を用いた電気化学的DNA検出を示すスキームを示す図である。
【００６４】
定義
本明細書で用いるように「挿入」という用語は、ある物体が、2つ以上の他の物体の間に可逆的又は非可逆的に含まれる過程を意味する。この物体は、分子全体、その一部または官能基であってよい。
【００６５】
本明細書で用いるように「バイオセンシング」という用語は、物理化学的手段による生物学的成分と結合している分析物の検出を意味する。
【００６６】
本明細書で用いるように「アルキル」という用語は、一価、飽和、直及び枝分れ鎖並びに環状炭化水素遊離基をその意味の範囲内に含む。
本明細書で用いるように「アルコキシ」という用語は、酸素に結合したあらゆるアルキル基をその意味の範囲内に含む。
【発明を実施するための形態】
【００６７】
本発明は、構造(I)の化合物を提供する。これらの化合物は、2本鎖ポリヌクレオドに挿入することができる。それらは、2本鎖ポリヌクレオドに選択的に結合することができる。
【００６８】
【化１０】
2010509322.tif 000012
【００６９】
構造(I)並びに構造(II)、(IIa)、(III)、(IV)、(IVa)及び(V)において、様々な部分(存在する場合)の以下の説明が当てはまる。
【００７０】
X及びX'は、独立にS、O又はNRNであってよく、ここで、RNは、H又はアルキルである。いくつかの実施形態において、X及びX'の少なくとも1つはSである。さらなる実施形態において、X及びX'の両方がSである。
【００７１】
L及びL'は、リンカー基である。それらは同じであってよく、又はそれらは異なっていてもよい。それらは、独立にOCH2、OCRxRy(Rx及びRyはH及びアルキル基からなる群から独立に選択される)又はOCH(炭素原子はR又はR'に結合している:下を参照)であってよい。
【００７２】
Qは、dsDNAと結合することができる基である。それは、dsDNAに挿入することができる。それは、スレッディング挿入モードによりdsDNAに結合することができる。それは、dsDNAと複合体を形成することが可能であってよい。それは、dsDNAと選択的に結合又は複合体形成することが可能であってよい。それは、ナフタレンジイミド基であってよい。ナフタレンジイミド基は、非置換であってよい。それは、置換されていてよい。それは、1つ又は複数(例えば、2、3又は4つ)のアルキル又はアリール基で置換されていてよい。挿入は、分子又は分子上の基の他の2つの分子又は基の間への可逆的な包含又は挿入とみなすことができる。
【００７３】
G及びG'は、独立に、存在しないか、又は1〜30個の主鎖原子を有し、存在する場合、場合によって置換されている。G及びG'は、同じであってよい。それらは異なっていてよい。それらは、両方とも非存在であってよく、或いは1つ又は両方が存在してよい。Gが存在しない場合には、基-L-G-Q-は-L-Q-である。同様に、G'が存在しない場合には、基-Q-G'-FGは-G-FGである。G及びG'は、存在する場合、独立に、1〜30個の主鎖原子を有していてよく、或いは1〜20個、1〜12個、1〜6個、1〜4個、6〜30個、12〜30個、20〜30個、6〜20個、12〜20個又は6〜12個の主鎖原子、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29又は30個の主鎖原子を有していてよい。主鎖原子は、すべてが炭素であってよく、或いは一部が炭素であってよく、また一部が酸素であってよい。いくつかの実施形態において、G及びG'における主鎖原子の一部は、窒素である。G及びG'の適切な例としては、CH2、(CH2)2、(CH2)3、CH2O(CH2)6、CH2OCH2(CH2OCH2)2CH2、CH2OCH2(CH2OCH2)4CH2及びCH2OCH2(CH2OCH2)3CH2などがある。G及びG'は、独立に、1つ又は複数(例えば、1、2、3、4、5又は6つ)のポリエーテル基を含んでいてよい。
【００７４】
FGは、少なくとも1つのO原子若しくはN原子又は遷移金属錯体を含む官能部分である。FGは、構造(I)の化合物又はそのポリマー若しくはコポリマーの2本鎖ポリヌクレオチドとの結合を強化することが可能であってよい。それは、電気的に中性の基であってよい。それは、正に荷電した基であってよい。FGの例としては、OH、NH2、イミダゾリル、ピリジニル又は金属錯体、例えば、酸化還元対に基づく無機錯体などがある。適切な酸化還元対及び錯体としては、Fe2+/Fe3+、Os2+/Os3+、Ru2+/Ru3+、Os(ビピリジン)2Cl(イミダゾール)、Os(ビピリジン)2Cl(ピリジン)、Ru(ビピリジン)2Cl(イミダゾール)、Ru(ビピリジン)2Cl(ピリジン)、フェロセンなどがある。FGは、もう1つの選択肢として、構造(III)を有していてよい。この後者の場合、構造(I)の化合物は、2つの電解重合性基を有する。これらは同じであってよく、或いはそれらは異なっていてよい。FGは、dsDNAに静電的に結合することが可能であってよい。それは、基QのdsDNAとの結合(又は挿入)を強化することが可能であってよい。強化は、静電結合に起因するものであってよい。したがって、いくつかの実施形態において、-Q-G'-FGがdsDNAに結合している場合、Qは、dsDNAに(特にdsDNAの疎水性内部領域に)挿入し、FGは、dsDNAの疎水性領域に静電的に結合する。FGが(III)である化合物の例は、(IV)、特に(IVa)である。
【００７５】
【化１１】
2010509322.tif 000013
【００７６】
多くの場合において、構造(I)の化合物は、非対称性である。例を下に示す。
【００７７】
【化１２】
2010509322.tif 000014
【００７８】
R及びR'は、独立に、H、アルキル、アルコキシ又は6員環を形成するようにそれぞれL及びL'における原子に結合したOCRaRbからなる群から選択され、Ra及びRbは、独立にHであるか、又は場合によって置換されたアルキルである。したがって、いくつかの実施形態において、Rは、6員環を形成するようにLにおける原子に結合したOCH2であり、かつ/又はR'は、6員環を形成するようにL'における原子に結合したOCH2である。特に、環の1つ又は両方が3,4-エチレンジオキシチオフェン縮合環系の一部を形成していてよい。
【００７９】
本明細書において、アルキル基(例えば、上のRN、Ra、Rb、Rc、Rd、Rx及びRy)に言及する。各場合において、独立に、アルキル基は、以下からなる群から選択することができる。
【００８０】
線状アルキル基  -  これらは、1〜20個の炭素原子、又は1〜12個、1〜6個、1〜4個、6〜20個、12〜20個若しくは6〜12個の炭素原子、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18若しくは20個の炭素原子を有していてよい。例としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ヘキシル、デシル、ドデシル、オクタデシルなどがある。
【００８１】
分枝アルキル基  -  これらは、3〜20個の炭素原子、又は3〜12個、3〜6個、6〜12個若しくは12〜20個の炭素原子、例えば、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18若しくは20個の炭素原子を有していてよい。それらは、1、2、3、4つ又は4つを超える分枝を有していてよい。例としては、イソプロピル、イソブチル、tert-ブチル、ネオペンチル、イソペンチル、イソオクチルなどがある。
【００８２】
環状アルキル基  -  これらは、3〜20個の炭素原子、又は3〜12個、3〜6個、6〜12個若しくは12〜20個の炭素原子、例えば、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18若しくは20個の炭素原子を有していてよい。それらは、単環、二環であってよく、或いは3つ又はそれ以上の環を有していてよい。これらは、縮合又は結合又はスピロ結合していてよい。例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロオクチル、ボルニル、アダマンチルなどがある。
【００８３】
組合せ  -  アルキル基は、上の構造の複数のものを含んでいてよい。例えば、それは、アルキル置換シクロアルキル基又はシクロアルキル置換アルキル基を含んでいてよい。
【００８４】
本明細書において、アリール基に言及する。それらは、単環、二環又は多環であってよい。それらは、縮合芳香族化合物であってよい。それらは、共役芳香族化合物であってよい。それらは、6〜20個の炭素原子、又は6〜12個、6〜8個、8〜20個、12〜20個若しくは8〜12個の炭素原子、例えば、6、8、10、12、14、16、18若しくは20個の炭素原子を有していてよい。例としては、フェニル、ナフチル、アントラシル、フェニルフェニルなどがある。アリール基は、アルキル基で置換されていてよい。例としては、トリル、エチルベンジル、エチルアントラシルなどがある。
【００８５】
上の例のいずれか又はすべてにおいて、アルキル又はアリール基は、場合によって置換されていてよい。置換基は、アリール基、ハロゲン(例えば、F、Cl若しくはBr)又は他のある種の基であってよい。或いは、アルキル又はアリール基は、非置換であってよい。
【００８６】
本発明はまた、第1の態様の化合物を少なくとも1つの溶媒、希釈剤又は賦形剤とともに含む組成物を提供する。組成物は、液剤又は懸濁剤又は乳剤又はマイクロエマルジョン又は分散系であってよい。溶媒又は希釈剤又は賦形剤は、水性溶媒であってよい。それは、水であってよく、或いは水を含んでいてよい。それは、有機溶媒であってよく、或いは有機溶媒を含んでいてよい。それは、アルコール性溶媒であってよく、或いはアルコール性溶媒を含んでいてよい。
【００８７】
本発明はまた、本発明の第1の態様による化合物由来のモノマー単位を含む導電性ポリマーを提供する。この状況において、「由来の」は、ポリマーを製造する方法が第1の態様による化合物の使用を含むことを必ずしも示す必要はない。したがって、「(I)由来の」モノマー単位を含むポリマーは、それがどのようにして形成されたかに無関係に、構造(VI)のモノマー単位を有していてよい。
【００８８】
【化１３】
2010509322.tif 000015
【００８９】
FGが電解重合性基(例えば、構造(VI)における)を含む場合には、FGはポリマー主鎖に取り込まれる可能性があることが理解されよう。
【００９０】
ポリマーは、コポリマーであってよい。それは、ブロックコポリマー、交互コポリマー、ランダムコポリマー又は他のある種のコポリマーであってよい。それは、ポリマー主鎖が2種の異なるモノマー由来のモノマー単位を含む構造を有していてよい。ポリマーは、第2のモノマー由来のモノマー単位をさらに含んでいてよい。第2のモノマーは、場合によって置換されているチオフェン、場合によって置換されているピロール又は場合によって置換されているフラン、或いはこれらのいずれか2つ又はそれ以上の混合物であってよい。場合によって置換されているチオフェン、場合によって置換されているピロール又は場合によって置換されているフランは、2位及び5位において非置換であってよい。第2のモノマーは、3,4-エチレンジオキシチオフェンであってよい。上のモノマー単位の重合は、前記モノマー単位における5員複素環の2位及び5位を介するものであってよい。ポリマーは、第3、場合によって第4、場合によって第5のモノマー由来のモノマー単位をさらに含んでいてよい。第3、第4及び第5のモノマーのそれぞれは、それぞれ独立に、第2のモノマー単位について述べたのと同様であってよい。ポリマーは、線状ポリマーであってよい。それは、架橋コポリマーであってよい。それは、それを伝導性にするために、ドーピングすることができる。それは、ドーピングされていなくてよい。
【００９１】
ポリマー(又はコポリマー)は、dsDNAに結合することが可能であってよい。それは、dsDNAに挿入可能であってよい。それは、スレッディング挿入モードによりdsDNAに結合することが可能であってよい。それは、dsDNAと複合体を形成することが可能であってよい。それは、dsDNAと選択的に結合又は複合体形成することが可能であってよい。それは、ナフタレンジイミド基であってよい。
【００９２】
ポリマーは、約2,000から約2,000,000までの分子量(Mn又はMw)、或いは約2000から1000000まで、2000から500000まで、2000から100000まで、2000から50000まで、2000から10000まで、2000から5000まで、10000から2000000まで、100000から2000000まで、1000000から2000000まで、10000から1000000まで、10000から100000まで若しくは100000から1000000まで、例えば、約2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000、500000、600000、700000、800000、900000、1000000、1500000若しくは2000000又は他のある適切な分子量を有していてよい。それは、約10から約10000まで、或いは約10から1000まで、10から500まで、10から200まで、10から100まで、10から50まで、10から20まで、20から10000まで、50から10000まで、100から10000まで、1000から10000まで、5000から10000まで、50から5000まで、50から1000まで、50から500まで、50から100まで、100から1000まで、100から500まで又は500から1000まで、例えば、約10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000又は10000の重合の程度を有していてよい。それは、狭い分子量分布を有していてよく、或いは、それは、広い分子量分布を有していてよい。それは、約1から約10まで、或いは約1から5まで、1から2まで、2から10まで、50から10まで、1.5から5まで又は2から5まで、例えば、約1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5若しくは10又は10を超えてもよい多分散性を有していてよい。
【００９３】
ポリマー(又はコポリマー)は、少なくとも約10-3Sm-1、或いは少なくとも約5*10-3、10-2、5*10-2、0.1、0.5、1、5、10、50、100、200、500若しくは1000Sm-1、又は約0.001〜1000、0.001〜100、0.001〜10、0.001〜1、0.001〜0.01、0.01〜1000、1〜1000、100〜1000、0.1〜100、0.1〜10、0.1〜1若しくは1〜100Sm-1、例えば、約0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500若しくは1000 Sm-1の伝導率を有していてよい。
【００９４】
構造(I)の化合物は、構造(V)の化合物及び構造FG-G'-NH2を構造A-Q-Aの化合物と反応させることによって製造することができ、ここで、Aはアミン基と結合することができる官能基であり、QはdsDNAと結合することができる基である。
【００９５】
【化１４】
2010509322.tif 000016
【００９６】
Aは、酸無水物基、例えば、環状酸無水物であってよい。この場合、アミンは、Aと反応して、アミド(非環状酸無水物の場合)又はイミド(環状酸無水物の場合)を生成することができる。アミンと反応することができる他の基としては、酸塩化物(アミドを生成する)、N-ヒドロキシコハク酸イミドエステル(アミドを生成する)、カルボニル基(イミンを生成する)、ハロゲン化アルキル(アミンを生成する)、アルキルトシラート(アミンを生成する)などがある。Qは、以前に述べた通りであってよい。
【００９７】
構造A-Q-Aの化合物は、ナフタレン二酸無水物であってよく、その場合、アミンとの反応により、置換ナフタレンジイミドが得られる。
【００９８】
本発明のいくつかの実施形態において、構造FG-G'-NH2の化合物は、構造(V)を有する。この場合、対称に置換されたナフタレンジイミドを得るために、方法は、構造(V)の化合物をナフタレン二酸無水物と反応させることを含む。(V)とFG-G'-NH2が同じでない場合、複数の2付加体が生成する。この場合、方法は、該反応で生成した他の化合物から所望の2付加体を分離するための分離段階を含んでもよい。
【００９９】
A-Q-Aと(V)及びFG-G'-NH2との反応は、塩基の存在下で行わせることができる。適切には、それを、塩基として、かつ溶媒として機能し得るピリジン中で行わせることができる。酢酸亜鉛などの触媒も加えることができる。一般的な条件は、生成物への満足のいく変換を得るために十分な時間(例えば、一夜)にわたり溶媒中で試薬を、場合によって必要な場合に添加塩基とともに加熱することを必要とする。アミン試薬(V)を得るための適切な手順は、対応するアルコールから出発するものである。変換スキームは、(V)の複素環に影響を及ぼさないようなものであるべきである。適切なスキーム(スキーム1に例示する)は、アルコールから出発する。これをトリアルキルアミンのような塩基の存在下で塩化メシルでエステル化して、メシラートエステルを生成させることができる。次いで、これをアジ化ナトリウムと反応させて、対応するアジド置換種を生成させることができる。この反応は、メシラートエステル及びアジ化ナトリウムを少なくとも部分的に溶解するように、一般的に極性溶媒(水及び/又はアルコールを含んでいてよい)中で行わせる。アジドを生成させるためにアジドと反応させることができる活性化アルコール誘導体をもたらす他の反応は、アルコールと水素化ナトリウムとの反応と、次いでトシラートエステル(例えば、テトラエチレングリコールジトシラート)による処理によるトシラートの生成と、それに続く得られたトシラートとヨウ化ナトリウムとの反応による対応するヨウ化物の生成を含む。次いで、これをアジ化ナトリウムと反応させて、対応するアジドを生成させることができる。アジドとトリフェニルホスフィン及び塩基(例えば、水酸化物)との反応により、対応するアミンが得られる。
【０１００】
構造(I)の化合物を重合させて、第2の態様によるポリマーを生成させることができる。重合を実施する適切な方法は、構造(I)のモノマーを電解重合することを含む。これは、(I)の複素環の2位及び5位を介しての重合につながる。重合は、酸化的重合であってよい。それは、酸化的電解重合であってよい。
【０１０１】
適切な電解重合法において、モノマーを非プロトン性有機溶媒中支持電解質の溶液に溶解する。適切な支持電解質としては、テトラブチルアンモニウムヘキサフルオロリン酸塩などのテトラブチルアンモニウム塩などがある。適切な有機溶媒としては、クロロホルム、塩化メチレン、アセトニトリルなどがある。溶媒は、電解重合反応に必要な濃度のモノマー又は複数のモノマーを溶解することができるべきである。溶媒中の電解質の濃度は、約0.02〜約0.2M、或いは0.02〜0.1、0.02〜0.05、0.05〜0.2、0.1〜0.2又は0.05〜0.15M、例えば、約0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19又は0.2Mであってよい。溶液は、モノマー又は複数のモノマー(共重合の場合)をさらに含む。各モノマー又は全モノマーの濃度は、独立に、約0.1〜10mM、或いは、約0.5〜10、1〜10、2〜10、5〜10、0.1〜5、0.1〜2、0.1〜1、0.1〜0.5、0.5〜5、1〜5又は0.5〜2mM、例えば、約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9又は10mMであってよい。2つの電極を溶液中に少なくとも部分的に浸し、電極の電位を高及び低電位間で掃引する。掃引のスキャン速度は、約50〜約500mV/秒、或いは、約50〜200、50〜100、100〜500、200〜500又は100〜200mV/秒、例えば、約50、100、150、200、250、300、350、400、450又は500mV/秒であってよい。高及び低電位間の差は、約1〜約2V、或いは、約1〜1.5、1.5〜2、1.3〜1.8、1.5〜1.7又は1.5〜1.6V、例えば、約1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9又は2Vであってよい。高電位は、Ag/Ag+に対して約+1〜約+1.5V、或いは、Ag/Ag+に対して約+1〜+1.3、+1.2〜+1.5又は+1.2〜+1.4V、例えば、Ag/Ag+に対して約+1、1.1、1.2、1.3、1.4又は1.5Vであってよい。低電位は、Ag/Ag+に対して約-0.1〜約-0.5V、或いは、Ag/Ag+に対して約-0.1〜-0.3、-0.2〜-0.5又は-0.2〜-0.3V、例えば、Ag/Ag+に対して約-0.1、-0.2、-0.3、-0.4又は-0.5Vであってよい。
【０１０２】
構造(I)のモノマーは、コポリマーを生成させるように、電解重合の前に第2のモノマー及び場合によって第3、第4及び/又は第5のモノマーと混合することができる。追加のモノマーは、構造(I)のモノマーと共重合することができる適切なモノマーであってよい。これは、場合によって置換されているチオフェン、場合によって置換されているピロール又は場合によって置換されているフランであってよい。場合によって置換されているチオフェン、場合によって置換されているピロール又は場合によって置換されているフランは、重合を促進するように、2位及び5位において非置換であってよい。したがって、適切なコモノマーは、フラン、ピロール、N-メチルピロール、チオフェン、3,4-エチレンジオキシチオフェン、これらの置換形(好ましくは2位及び5位において非置換)及び上のいずれか2つ又はそれ以上の混合物などである。
【０１０３】
上述のポリマー又は構造(I)の化合物は、試料中のdsDNAの存在又は非存在を判定するのに用いることができる。該方法は、試料を化合物又はポリマーに曝露させる段階、及び前記曝露前の化合物又はポリマーからのシグナルを前記曝露後の化合物又はポリマーからの対応するシグナルと比較する段階を含む。用いることができる適切なシグナルは、UV/可視光の吸光度(例えば、最大吸光度)、電気インピーダンス、電気抵抗、電気伝導率及び電気伝導率に関するオンセット電位などである。該方法は、試料中のdsDNAの濃度を測定する方法であってよい。この場合、該方法は、
(i)化合物又はポリマーからのシグナルを測定する段階と、
(ii)化合物又はポリマーとdsDNAとの結合を促進する条件下で、試料を化合物又はポリマーと混合して混合物を生成させる段階と、
(iii)前記混合物のシグナルを測定する段階と、
(iv)(i)と(iii)との間のシグナルの差を求める段階であって、前記シグナルの差が試料中の前記dsDNAの濃度を示す段階とを含んでいてよい。
【０１０４】
本発明はまた、試料中のdsDNAの存在又は非存在を検出するためのセンサーを提供する。センサーは、本明細書で述べる通り、導電性ポリマーを含む。センサーは、試料中のdsDNAの存在又は非存在を検出するための検出器に組み込むことができる。センサーは、例えば、電極であってよく、それにより、dsDNAを含む試料中のセンサーの少なくとも一部の浸漬がセンサーの電気的特性(例えば、伝導率、抵抗、伝導率のオンセット電位)の変化を引き起こし、これを試料中のdsDNAの存在を検出するための検出器により検出することができる。センサー(及び検出器)は、試料中のdsDNAの濃度を測定することができ、或いは試料中のdsDNAの濃度に依存する出力シグナルを出すことができる。したがって、センサーの電気的特性の変化の大きさを用いて試料中のdsDNAの濃度を測定することができる。これは、該変化の大きさをdsDNAの既知の濃度の変化の大きさと比較することによって達成することができる。
【０１０５】
本明細書で述べるモノマー(第1の態様で述べた、又は第3の態様により製造される)は、試料中の特定のポリヌクレオチド配列の存在又は非存在を判定するのに用いることができる。この方法において、前記特定のヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列をその表面に結合させた電極を試料及び第1の態様による化合物又は第3の態様により製造された化合物に曝露させる。相補的ヌクレオチド配列が特定のポリヌクレオチド配列(存在する場合)とハイブリダイゼーションして、2本鎖ポリヌクレオチドを形成するように、適切な条件(温度、溶媒等)を整えるべきである。化合物はこの2本鎖ポリヌクレオチド(存在する場合)に挿入することができる。化合物は、電解ポリ可能基(例えば、EDOT)を有し、また、ポリヌクレオチドとの結合を促進する酸化還元基(redox group)及び/又は正に荷電した基のような基を含んでいてよい。非相補的配列などの望ましくない化合物の非特異的結合を低減するために、電極を場合によって洗浄してよい。次いで、化合物を電解重合して導電性ポリマーを生成させるように、サイクリックボルテージを電極に印加する。次いで、導電性ポリマーの存在又は非存在を測定する。これは、電極上の導電性ポリマーのサイクリックボルタモグラムを測定し、そのボルタモグラムを導電性ポリマーを有さない対照電極のボルタモグラムと比較することによって達成される。特に、電流又は電流変動を測定することができる。ポリマーの測定は、酵素又は電極触媒シグナル増幅、或いは非増幅電気化学的シグナルと比べてポリヌクレオチド配列を検出する大きい感度を有する。
【０１０６】
試料中の特定のポリヌクレオチド配列の存在又は非存在を判定する同様な方法において、前記特定のヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列をその表面に結合させた電極を試料に曝露させる。試料が特定のヌクレオチド配列を含んでいる場合、それは相補的なポリヌクレオチド配列とハイブリダイゼーションする。非相補的配列などの望ましくない化合物の非特異的結合を低減するために、電極を場合によって洗浄してよい。化合物を電解重合して導電性ポリマーを生成させるように、第1の態様による、又は第3の態様により製造された化合物の存在下でサイクリックボルテージを電極に印加する。上の前の方法と同様に、サイクリックボルタモグラムを測定し、対照ボルタモグラムと比較する。
【０１０７】
上述の2つの方法の両方は、前記特定のポリヌクレオチド配列の濃度を測定するのに用いることができる。この場合、ボルタモグラムにおける電流又は電流変動の大きさを既知の濃度の前記特定のヌクレオチド配列を用いて測定したボルタモグラムにおける電流又は電流変動の大きさと比較する。未知濃度の試料中の濃度を測定するのに用いるための校正曲線を作製するために、既知のポリヌクレオチド濃度を用いて一連のボルタモグラムを測定することができる。
【０１０８】
上の方法では、本発明の第1の態様による、又は第3の態様により製造された化合物を用いることによる特定のポリヌクレオチド配列の検出を述べた。他の関連化合物がこの方法における使用に適している可能性があり、これらが本発明者らにより予想されることは明らかであろう。したがって、該化合物の代わりに1)電解重合性基を有する、2)2本鎖ポリヌクレオチドに挿入することができる基を有する、かつ3)電解重合したとき、導電性ポリマーを形成する、化合物を用いることができる。そのような化合物はそれら自体、本発明の態様としても構想される。第1の態様に含まれ、第3の態様により製造される特定の化合物は、単にこの一般的クラスの例である。
【０１０９】
本発明の好ましい実施形態を下で述べる。本明細書に示す図及び実施例は、本発明及びその様々な実施形態を例示するものであって、限定するものではないことを理解すべきである。
【０１１０】
本発明の実施形態は、DNA結合のための挿入単位を連結したエチレンジオキシチオフェン(EDOT)モノマーに関する。EDOTは、その高い伝導率、低いオンセット電位及び重合後の水溶液中の優れた安定性のため、導電性ポリマーの構築ブロックとして選択される。EDOTを挿入単位と連結するアプローチの利点は、増幅リポーターとしての導電性ポリマーの使用であり、この検出スキームを適切な装置設計と組み合わせることにより、検出されるアンペロメトリーシグナルはμA〜mAレベルとすることができるのに対して、ボルタンメトリー検出方法によりnAレベルが達成される。したがって、検出限界は著しく低くなる。得られる結果は、2本鎖DNAとの有意な結合及び電解重合によるホモポリマー又はコポリマーの生成を示す。
【０１１１】
DNA結合のための挿入単位を連結したエチレンジオキシチオフェン(EDOT)モノマーに基づく導電性ポリマーを用いることによる検出限界の低下及びシグナル出力の改善のための組成物及び方法を本明細書に記載する。このアプローチの利点は増幅リポーターとしての導電性ポリマーの使用であることは、当業者により理解されよう。当業者は、この検出スキームを適切な装置設計と組み合わせることにより、ボルタンメトリー検出方法により達成されるnAレベルと異なり、検出されるアンペロメトリーシグナルをμA〜mAレベルとすることができることを認識するであろう。したがって、DNAの検出限界は著しく低くなる。
【０１１２】
本明細書にスレッディング挿入性EDOTモノマーを得るための合成戦略を開示する。EDOTモノマーは、dsDNAとの著しい結合を示し、電解重合によりホモポリマー又はコポリマーを形成することができる。これらのモノマー及びポリマーは、核酸バイオセンシングにおける適用に適している。
【０１１３】
本発明によれば、DNA結合のための挿入単位を連結したエチレンジオキシチオフェン(EDOT)モノマーに基づく導電性ポリマーの製造及び使用のための組成物、方法及びキットを提供する。方法は、核酸を検出するためのEDOTポリマーの組成物を一般的に含む。
【０１１４】
本発明の1つの形態において、本明細書に開示するEDOTモノマーは、以下の一般式
【０１１５】
【化１５】
2010509322.tif 000017
【０１１６】
のものであってよく、
式中、Rは、少なくとも1つの酸素若しくは窒素原子を含む官能性部分又は遷移金属錯体である。
【０１１７】
リンカーは、場合によって置換されている、0〜20個の主鎖原子を含む独立に選択される部分である。ナフタレンジイミド(NDs)と結合した無機錯体は、スレッディング挿入剤として以前に合成され、dsDNAに対するより良好な選択的結合を示した。無機錯体は、Fe2+/Fe3+、Os2+/Os3+及びRu2+/Ru3+の酸化還元対に基づいていてよい。
【０１１８】
アミノ官能基化EDOT誘導体3a〜cは、スキーム1〜3に示すように種々のリンカーを用いて得られた。EDOTは、その高い伝導率、低いオンセット電位及び重合後の水溶液中の優れた安定性のため、導電性ポリマーの構築ブロックとして選択した。合成は、ヒドロキシメチル官能基化EDOT(EDOT-OH)を用いて開始させた。3b及び3cの合成において、ウィリアムソンエーテル合成により疎水性及び親水性リンカーを最初にEDOT-OH上に導入した後、求核置換によりアジド官能基化EDOT(EDOT-N3)、2a〜cを生成させた。その後、アジド官能基化EDOT誘導体2a〜cを還元して、対応するアミノ官能基化EDOT(EDOT-NH2)、3a〜cを生成させた。
【０１１９】
【化１６】
2010509322.tif 000018
【０１２０】
3a〜cと1,4,5,8-ナフタレンテトラカルボン酸二無水物との縮合により、2つのEDOT部分にNDsが結合したもの(ビス-EDOT-ND、4a〜c)が40〜80%の収率で得られた(スキーム4)。3つのビス-EDOT-ND誘導体のすべてがCH2Cl2及びジメチルスルホキシド(DMSO)への良好な溶解性を示した。化合物4a及び4bは、CH3CN及び水に不溶性であったが、より親水性の4cは、これらの溶媒への高い溶解性を示した。電解重合は、10mMのビス-EDOT-NDモノマー及び支持電解質としての0.1Mのテトラブチルアンモニウムヘキサフルオロリン酸(nBu4NPF6)を含むCH2Cl2溶液中で100mV/秒のスキャン速度で-0.2から1.3Vまでの反復サイクリング(Ag/Ag+参照電極と呼ぶ)により実施して成功を収めた。最初のスキャンの後の酸化電流オンセットのマイナス側への移動とその後のスキャンにおける新たな広い酸化還元波(redox wave)の成長から、電極表面でのポリマーの成長が示唆された(図1)。これらの新しいモノマーと他のEDOTモノマーとの種々の比率でのコポリマーも同様な条件下で電解重合した(図2)。ポリEDOT主鎖のUV-可視吸収強度(λmax=600nm)を標準化した後、50%の4bを含むモノマー混合物から調製したコポリマーにおける10%の4bのみを含む同様な系と比較してNDによる強い吸収(λmax=326nm)が認められた(図3)。これは、コポリマーの組成がモノマー混合物の組成に直接関連していたことを示すものであった。共重合実験が成功したことから、ポリEDOTを核酸バイオセンシングの増幅リポーターとして適用することが実現可能であることがわかった。
【０１２１】
【化１７】
2010509322.tif 000019
【０１２２】
ビス-EDOT-NDとdsDNAとの結合を試験するために、漸増量の2本鎖サケ精子DNAの存在下でのビス-EDOT-ND 4a〜cのUV-可視スペクトルを最初に検討した。スレッディング挿入剤の縮合平面芳香環系がdsDNAの塩基対の間に挿入されている挿入結合は、淡色効果及びNDによる吸収の低下をもたらす。8.0のDNA塩基対/ビス-EDOT-NDの比率で4a及び4bにDNAを加えたところ、363及び387nmでのND吸収帯の約7%及び約10%の低下がもたらされた(図4)。この限られた淡色効果は、4a及び4bの疎水性に起因している可能性がある。以前に報告したNDベースの挿入剤は、通常NDに結合した荷電又は金属中心官能基を含み、負に荷電したdsDNAへのNDの挿入のより良好な速度論的経路を可能にした。この仮説は、同様な実験を4cについて実施したときにはるかに大きい42%の吸収の低下によって立証された。ビス-EDOT-ND 4cは、親水性テトラエチレングリコールリンカーを含んでいた。したがって、それがより良好な挿入結合を生じさせた。
【０１２３】
同様な合成戦略を用いて、非対称性モノ-EDOT-ND複合体5を合成した(スキーム5)。1,4,5,8-ナフタレンテトラカルボン酸二無水物と1当量のEDOT-NH2 3a〜c及び1当量の他の官能基化アミンとの縮合により、カラムクロマトグラフィー精製の後に所望の生成物が得られた。これらのモノ-EDOT-ND誘導体は、我々が荷電官能基(アンモニウム、ピリジニウム、イミダゾリウム)又は金属中心酸化還元対(Fe2+/Fe3+、Os2+/Os3+、Ru2+/Ru3+)を導入することを可能にした。結果として、EDOTベースの挿入剤の挿入結合特性が増強された。
【０１２４】
【化１８】
2010509322.tif 000020
【実施例】
【０１２５】
(実施例1)
一般的方法: 核磁気共鳴(NMR)スペクトルは、Bruker Avance 400分光計で記録した。化学シフトは、残留溶媒に基づいて求める。高分解能質量スペクトル(HR-MS)は、Finnigan MAT 95XL-T分光計で記録した。UV-可視スペクトルは、Agilent 8453ダイオードアレイ分光光度計で記録した。カラムクロマトグラフィーは、Teledyne Isco製のCombiFlash Companionを用いて実施した。空気及び水感受性反応は、Innovative Technologiesグローブボックス中で行わせた。
【０１２６】
材料: 無水テトラヒドロフラン(THF)は、Sigma-Aldrichから密閉(sure-seal)びん入りで購入した。無水水素化ナトリウム(95%)は、Sigma-Aldrichから購入し、グローブボックス内に保管し、使用した。EDOT-OHは、既知の方法に従って調製した。1b-Cl、1b-I、1c-OTS及び1c-Iの合成は、以前に報告した。他のすべての化学物質は、試薬用であり、受け取ったままのものを使用した。
【０１２７】
(実施例2)
EDOT-OMs(1a-OMs): EDOT-OH(924mg、5.4mモル)を撹拌棒を含む100mL丸底フラスコに入れ、アルゴンで3回置換した。乾燥CH2Cl2(15mL)及びトリエチルアミン(0.94mL、0.68g、6.7mモル)を導入し、反応混合物を氷浴中で冷却した。塩化メタンスルホニル(0.50mL、0.79g、6.5mモル)を1滴ずつ加えた。氷浴を除去し、反応混合物を18時間撹拌した。水を混合物に加え、層を分離し、水層をCH2Cl2で2回抽出した。合わせた有機層を5%H2SO4水溶液、飽和NaHCO3溶液及び食塩水で洗浄し、MgSO4で乾燥し、蒸発させた。粗生成物を黄色油状物として得、次の段階に直接用いた。
【０１２８】
(実施例3)
EDOT-N3(2a): 前の段階からの粗生成物1a-OMs(5.4mモル)を100mL丸底フラスコ中でTHF(5mL)及びEtOH(10mL)に溶解し、新たに調製したNaN3水溶液(2.80g、10mLのH2O中43.2mモルのNaN3)を加えた。混合物を還流冷却器下で80℃で48時間撹拌した。有機溶媒の大部分をロータリーエバポレータにより除去し、次いで、水層を酢酸エチルで3回抽出した。合わせた有機層をMgSO4で乾燥し、蒸発させた。生成物をシリカゲルフラッシュカラム上(ヘキサン/酢酸エチル=20:1)で精製した。生成物2a(985mg、93%)を粘稠な無色油状物として得た。1H NMR (400MHz, CDCl3): δ 6.38 (dd, 2H, J=11.2, 3.6Hz)、4.33 (ddd, 1H, J=12.0, 6.8, 2.4Hz)、4.21 (dd, 1H, J=12.0, 2.4Hz)、4.07 (dd, 1H, J=12.0, 6.8Hz)、3.59 (dd, 1H, J=13.2, 6.0Hz)、3.50 (dd, 1H, J=13.2, 6.0Hz)。
【０１２９】
(実施例4)
EDOT-NH2(3a): アジド2a(1.43g、7.2mモル)を撹拌棒を含む100mL丸底フラスコ中でTHF(25mL)に溶解し、トリフェニルホスフィン(PPh3;2.08g、7.9mモル)を固体として加えた。窒素の激しい発生が認められた。反応物を50℃で1時間加熱し、その後、新たに調製したNaOH溶液(2M、25mL)を加え、混合物を激しく撹拌しながらさらに2時間加熱した。濃HClによる酸性化(pH<3)の後にTHFの大部分をロータリーエバポレータにより除去した。水層をCH2Cl2で3回抽出し、合わせた有機層を捨てた。次いで、NaOHを水層に加え、得られた溶液(pH>8)をCH2Cl2で3回抽出した。合わせた有機層をNa2SO4で乾燥し、蒸発させた。生成物3a(1.23g、100%)を無色の粘稠な液体として得た。1H NMR (400MHz, CDCl3): δ 6.33 (dd, 2H, J=8.8, 4.8Hz)、4.21 (dd, 1H, J=11.2, 2.0Hz)、4.13 (ddd, 1H, J=11.2, 7.6, 2.0Hz)、4.07 (dd, 1H, J=12.0, 7.6Hz)、2.97 (m, 2H)、1.43 (広幅 s, 2H)。13C NMR (100MHz, CDCl3): δ 141.7、141.6、100.0、99.6、75.2、66.6、42.3。
【０１３０】
(実施例5)
EDOT-Cl(1b-Cl): 無水THF(10mL)中EDOT-OH(688mg、4.00mモル)及び18-クラウン-6(52.8mg、0.200mモル)の溶液を、無水THF(60mL)中水素化ナトリウム(95%、505mg、20.0mモル)の懸濁液を含む他の空気を含まないフラスコに0℃で1滴ずつ加えた。次いで、混合物をブロモクロロヘキサン(1.60g、8.00mモル)に導入し、N2中で一夜還流した。水で過剰な水素化ナトリウムを失活させた後、THFを真空中で除去した。次いで、反応混合物を食塩水で洗浄し、酢酸エチルで3回抽出した。合わせた有機層をMgSO4で乾燥し、フラッシュクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル=9:1)により精製して、1b-Cl(680mg、2.34mモル、59%)を無色結晶として得た。1H NMR (400MHz, CDCl3): δ 6.34 (d, 1H, J=4Hz)、6.32 (d, 1H, J=3.6Hz)、4.33〜4.27 (m, 1H)、4.24 (dd, 1H, J=11.6, 2.4Hz)、4.06 (dd, 1H, J=11.6, 7.6Hz)、3.68 (dd, 1H, J=10.4, 5.2Hz)、3.60 (dd, 1H, J=10.4, 5.6Hz)、3.53 (t, 2H, 6.8Hz)、3.50 (t, 2H, J=6.8Hz)、1.82〜1.73 (m, 2H)、1.64〜1.55 (m, 2H)、1.50〜1.31 (m, 4H)。
【０１３１】
(実施例6)
EDOT-I(1b-I): 1b-Cl(680mg、2.34mモル)及びヨウ化ナトリウム(1.72g、11.5mモル)の溶液をアセトン(20mL)中で18時間還流した。次いで、反応混合物をろ過して沈殿を除去し、アセトンを真空中で除去した。次いで、それを酢酸エチルに溶解し、飽和Na2S2O3(水性)で洗浄した。フラッシュクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル=9:1)による精製の後に、生成物を粘稠な淡黄色液体(647mg、1.69mモル、74%)として得た。1H NMR (400MHz, CDCl3): δ 6.34 (d, 1H, J=3.6Hz)、6.32 (d, 1H, J=4Hz)、4.34〜4.27 (m, 1H)、4.24 (dd, 1H, J=11.6, 2Hz)、4.06 (dd, 1H, J=11.6, 7.6Hz)、3.68 (dd, 1H, J=10.4, 5.2Hz)、3.60 (dd, 1H, J=10.4, 5.6Hz)、3.50 (t, 2H, 6.4Hz)、3.20 (t, 2H, J=7.2Hz)、1.80〜1.75 (m, 2H)、1.65〜1.50 (m, 2H)、1.50〜1.31 (m, 4H)。
【０１３２】
(実施例7)
EDOT-N3(2b): アジ化ナトリウム(439mg、6.76mモル)の水溶液(4mL)をDMF(4mL)中1b-I(647mg、1.69mモル)の溶液に加えた。18時間の還流後、飽和NH4Cl(水性)で洗浄することによってDMFを除去した。反応混合物を酢酸エチルで抽出し、有機層を水で洗浄し、MgSO4で乾燥し、溶媒をロータリーエバポレータにより除去した。フラッシュクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル=19:1)による精製後に、2bを粘稠な淡黄色液体(420mg、1.41mモル、84%)として得た。1H NMR (400MHz, CDCl3): δ 6.34 (d, 1H, J=3.6Hz)、6.32 (d, 1H, J=4Hz)、4.33〜4.26 (m, 1H)、4.23 (dd, 1H, J=11.6, 2.4Hz)、4.05 (dd, 1H, J=11.6, 7.2Hz)、3.68 (dd, 1H, J=10.4, 4.8Hz)、3.59 (dd, 1H, J=10.4, 6.4Hz)、3.49 (t, 2H, 6.4Hz)、3.26 (t, 2H, J=7.2Hz)、1.67〜1.50 (m, 4H)、1.45〜1.30 (m, 4H)。13C NMR (100MHz, CDCl3): δ 141.6、141.5、99.7、99.6、77.3、72.6、71.8、69.1、66.2、51.4、29.4、28.8、26.5、25.7。HR-MS (FAB): C13H19N3O3S+H+の計算値 298.1225 [M+H+]; 実測値 298.1209。
【０１３３】
(実施例8)
EDOT-NH2(3b): THF(5mL)中2b(297mg、1.00mモル)の溶液をトリフェニルホスフィン(PPh3、288mg、1.10mモル)と混合し、50℃で1時間加熱した。その後、5mLのNaOH溶液(2M)を加え、反応をさらに2時間継続させた。THFをロータリーエバポレータにより除去し、水性反応混合物をpH<3に酸性化した。水相をCH2Cl2で洗浄した。次いで、NaOHを加え、得られた溶液(pH>10)をCH2Cl2で抽出した。有機層をNa2SO4で乾燥し、溶媒を真空中で除去した。Kugelrohr装置(20mトールで170℃)を用いて精製された生成物を粘稠な黄色液体(149mg、0.549mモル、55%)として留出させた。1H NMR (400MHz, CDCl3): δ 6.34 (d, 1H J=3.6Hz)、6.32 (d, 1H, J=4.0Hz)、4.33〜4.26 (m, 1H)、4.24 (dd, 1H, J=11.6, 2.0Hz)、4.05 (dd, 1H, J=11.6, 7.6Hz)、3.67 (dd, 1H, J=10.4, 4.8Hz)、3.59 (dd, 1H, J=10.4, 6.0Hz)、3.49 (t, 2H, 6.4Hz)、2.85 (t, 2H, J=7.2Hz)、1.67〜1.50 (m, 4H)、1.49〜1.30 (m, 4H)。13C NMR (100MHz, CDCl3): δ 151.6、151.5、99.7、99.6、77.2、72.6、71.9、69.1、66.2、53.5、41.6、40.5、32.4、32.3、30.1、29.4、26.6、25.8、25.7。HR-MS (FAB): C13H21NO3S+H+の計算値 272.1320 [M+H+]; 実測値 272.1321。
【０１３４】
(実施例9)
EDOT-OTs(1c-OTs): 無水THF(10mL)中EDOT-OH(1.72g、10.0mモル)及び18-クラウン-6(132mg、0.500mモル)の溶液を、無水THF(150mL)中水素化ナトリウム(95%、1.26g、50.0mモル)の懸濁液を含む他の空気を含まないフラスコに0℃で1滴ずつ加えた。次いで、混合物をテトラエチレングリコールジトシラート(1.01g、20.0mモル)に加え、N2中で一夜還流した。水で過剰な水素化ナトリウムを失活させた後、THFを真空中で除去した。次いで、反応混合物を飽和NaCl(水性)で洗浄し、CH2Cl2で3回抽出した。合わせた有機相をMgSO4で乾燥し、フラッシュクロマトグラフィー(ジクロロメタン/酢酸エチル=9:1)により精製した。生成物を真空中で乾燥して、淡黄色液体(1.00g、20%)を得た。1H NMR (400MHz, CDCl3): δ 7.80 (d, 1H, J=1.6Hz)、7.78 (d, 1H, J=1.2Hz)、6.32 (d, 1H, J=3.6Hz)、6.31 (d, 1H, J=3.6Hz)、4.35〜4.29 (m, 1H)、4.24 (dd, 1H, J=11.6, 2.0Hz)、4.15 (t, 2H, J=4.8Hz)、4.11 (dd, 1H, J=14.4, 7.2Hz)、4.05 (dd, 1H, J=11.6, 7.6Hz)、3.76 (dd, 1H, J=10.4, 4.8Hz)、3.71〜3.53 (m, 14H)、2.44 (s, 3H)。
【０１３５】
(実施例10)
EDOT-I(1c-I): 1c-OTs(1.00g、1.99mモル)及びヨウ化ナトリウム(1.49g、9.95mモル)の溶液をアセトン(20mL)中で18時間還流した。次いで、反応混合物をろ過し、アセトンを真空中で除去した。次いで、それをCH2Cl2に溶解し、飽和Na2S2O5(水性)で洗浄した。フラッシュクロマトグラフィー(ジクロロメタン/酢酸エチル=19:1)による精製の後に、1c-I(400mg、43.6%)を得た。1H NMR (400MHz, CDCl3): δ 6.33 (d, 1H, J=3.6Hz)、6.32 (d, 1H, J=3.6Hz)、4.36〜4.29 (m, 1H)、4.25 (dd, 1H, J=11.6, 2.8Hz)、4.06 (dd, 1H, J=11.6, 7.2Hz)、3.77 (dd, 1H. J=9.6, 4.8Hz)、3.75 (t, 2H, J=5.2Hz)、3.71〜3.63 (m, 13H)、3.26 (t, 2H, J=7.2Hz)。
【０１３６】
(実施例11)
EDOT-N3(2c): DMF(5mL)中1c-I(400mg、0.873mモル)の溶液とアジ化ナトリウム(227mg、3.49mモル)の水溶液(5mL)とを混合し、18時間還流した。飽和NH4Cl(水性)で洗浄することによってDMFを除去した。反応混合物をCH2Cl2に溶解し、水で洗浄し、MgSO4で乾燥した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー(ジクロロメタン/酢酸エチル=19:1)により精製して、粘稠な無色液体(212mg、0.568mモル、65%)を得た。1H NMR (400MHz, CDCl3): δ 6.33 (d, 1H, J=4Hz)、6.32 (d, 1H, J=3.6Hz)、4.35〜4.29 (m, 1H)、4.25 (dd, 1H, J=11.6, 2.4Hz)、4.06 (dd, 1H, J=11.6, 7.2Hz)、3.76 (dd, 2H, J=10.8, 5.2Hz)、3.71〜3.52 (m, 15H)、3.39 (t, 2H, J=5.2Hz)。13C NMR (100MHz, CDCl3): δ 141.6、141.5、99.7、99.6、77.3、72.6、71.2、70.7、70.7、70.6、70.5、70.1、69.6、66.1、50.7。HR-MS (FAB): C15H23N3O6S+H+の計算値 374.1386 [M+H+]; 実測値 374.1379。
【０１３７】
EDOT-N2(3c): THF(3mL)中2c(100mg、0.268mモル)の溶液をトリフェニルホスフィン(77.3mg、0.295mモル)と混合し、50℃で1時間加熱した。その後、3mLのNaOH(水性)(2M)を加え、反応物をさらに2時間撹拌した。THFをロータリーエバポレータにより除去し、水性反応混合物をpH<3に酸性化した。水相をCH2Cl2で洗浄した。次いで、NaOHを加え、得られた溶液(pH>10)をCH2Cl2で抽出した。有機層をNa2SO4で乾燥し、溶媒を真空中で除去して、粘稠な黄色液体(80.0mg、86%)を得た。1H NMR (400MHz, CDCl3): δ 6.29 (d, 1H, J=3.6Hz)、6.28 (d, 1H, J=3.2Hz)、4.32〜4.25 (m, 1H)、4.21 (dd, 1H, J=11.6, 2Hz)、4.02 (dd, 1H, J=11.6, 7.6Hz)、3.72 (dd, 2H, J=10.4, 4.8Hz)、3.67〜3.57 (m, 15H)、3.47 (t, 2H, J=5.2Hz)。13C NMR (100MHz, CDCl3): δ 141.5、141.4、99.7、99.6、72.9、72.6、71.1、70.6、70.5、70.5、70.2、69.6、66.1、53.5、41.5。HR-MS (FAB): C15H25NO6S+H+の計算値 348.1481 [M+H+]; 実測値 348.1478。
【０１３８】
(実施例13)
ビス-EDOT-ND(4a): ナフタレン二酸無水物(35.6mg、0.133mモル)、EDOT-NH2 3a(50.0mg、0.292mモル)及び酢酸亜鉛(20.4mg、0.093mモル)をピリジン(10mL)中で混合し、一夜還流した。反応混合物を、CH2Cl2を溶出液として用いてシリカゲルの短いカラムを通してろ過した。次いで、有機溶液をHCl(1N)及び脱イオン水で洗浄し、MgSO4で乾燥し、溶媒をロータリーエバポレータにより除去した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル=5:1)によりさらに精製して、4aをオレンジ色固体(64.0mg、0.111mモル、78%)として得た。1H NMR (400MHz, CDCl3): δ 8.81 (t, 4H, J=6.4)、6.35 (d, 2H, J=3.6Hz)、6.29 (d, 2H, J=3.6Hz)、4.75 (dd, 2H, J=13.6, 7.6Hz)、4.35 (dd, 2H, J=13.6, 4.8Hz)、4.26 (dd, 2H, J=12.4, 2.4Hz)、4.12 (dd, 2H, J=11.6, 6.4Hz)。13C NMR (100MHz, CDCl3): δ 162.8、141.2、140.9、131.4、126.9、126.5、100.2、100.0、99.9、71.2、66.5。HR-MS (FAB): C28H18N2O8S2+H+の計算値 575.0583 [M+H+]; 実測値 574.0575。
【０１３９】
(実施例14)
ビス-EDOT-ND(4b): 4aの場合と同様な合成手順に従って、4bを3bからフラッシュクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル=3:1)の後にオレンジ色固体(52.0mg、80%)として得た。1H NMR (400MHz, CDCl3): δ 8.75 (s, 4H)、6.33 (d, 2H, J=3.6Hz)、6.32 (d, 2H, J=3.6Hz)、4.32〜4.26 (m, 2H)、4.23 (dd, 2H, J=11.6, 2.4Hz)、4.19 (t, 4H, J=7.6Hz)、4.05 (dd, 2H, J=11.6, 7.6Hz)、3.64 (dd, 2H, J=10.4, 4.8Hz)、6.59 (dd, 2H, J=10.4, 6Hz)、3.50 (t, 4H, J=3.2Hz)、1.77〜1.64 (m, 4H)、1.61〜1.50 (m, 8H)、1.50〜1.38 (m, 4H)。13C NMR (100MHz, CDCl3): δ 162.9、141.6、141.5、131.0、126.7、126.6、99.7、99.6、72.6、71.9、69.1、66.2、40.9、29.7、29.4、28.0、26.8、25.8。HR-MS (FAB): C40H42N2O10S2+H+の計算値 775.2359 [M+H+]; 実測値 775.2344。
【０１４０】
(実施例15)
ビス-EDOT-ND(4c): 4aの場合と同様な合成手順に従って、4cを3cからフラッシュクロマトグラフィー(ジクロロメタン/酢酸エチル=2:1)の後にオレンジ色固体(11.0mg、30%)として得た。1H NMR (400MHz, CDCl3): δ 8.75 (s, 4H)、6.31 (d, 2H, J=3.6Hz)、6.29 (d, 2H, J=3.6Hz)、4.46 (t, 4H, J=6Hz)、4.34〜4.27 (m, 2H)、4.23 (dd, 2H, J=11.6, 2.4Hz)、4.04 (dd, 2H, J=11.6, 4.8Hz)、3.84 (t, 4H, J=5.6Hz)、3.75 (dd, 2H, J=10.4, 4.8Hz)、3.72〜3.64 (m, 10H)、3.64〜3.56 (m, 16H)。13C NMR (100MHz, CDCl3): δ 162.9、141.5、141.5、131.0、126.7、126.6、100.0、99.7 99.6、77.9、72.6、71.2、70.6、70.6、70.5、70.1、69.6、67.8、66.1、39.6。HR-MS (FAB): C44H50N2O16S2+H+の計算値 927.2680 [M+H+]; 実測値 927.2698。
【０１４１】
(実施例16)
モノ- EDOT-ND(5b): ピリジン(6mL)中3b(25.0mg、0.092mモル)、ナフタレン二酸無水物(26.0mg、0.092mモル)、アミノプロパノール(6.91mg、0.092mモル)及び酢酸亜鉛(14.1mg、0.064mモル)の溶液を一夜還流した。ピリジンの除去後に、有機溶液をCH2Cl2に溶解し、HCl(1N)及び脱イオン水で洗浄し、MgSO4で乾燥した。溶媒をロータリーエバポレータにより除去した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル=19:1)により精製して、黄色固体(12mg、22%)を得た。1H NMR (400MHz, CDCl3): δ 7.78 (t, 4H, J=8Hz)、6.32 (d, 1H, J=3.6Hz)、6.31 (d, 1H, J=3.6Hz)、4.38 (t, 2H, J=6Hz)、4.32〜4.25 (m, 1H)、4.23 (dd, 1H, J=11.6, 2Hz)、4.20 (t, 2H, J=7.6Hz)、4.05 (dd, 1H, J=11.6, 7.2Hz)、3.67 (dd, 1H, J=10.4, 6Hz)、3.64 (t, 2H, J=5.6Hz)、3.59 (10.4, 6Hz)、3.50 (t, 2H, J=6.8Hz)、2.02 (q, 2H, J=5.6Hz)、1.77〜1.45 (m, 8H)。13C NMR (400MHz, CDCl3): δ 163.5、162.8、141.6、141.5、131.3、131.0、126.9、126.8、126.7、126.2、100.0、99.7、99.6、77.9、72.6、71.9、69.1、66.2、59.1、40.9、37.5、30.9、29.4、28.0、26.8、25.8。HR-MS (FAB): C30H30N2O8S+H+の計算値 579.1801 [M+H+]; 実測値 579.1792。
【０１４２】
(実施例17)
電気化学: すべての電気化学的測定は、Autolab PGSTAT 32ポテンシオスタット(Metrohm)又はCHI830ポテンシオスタット(CH Instruments, Inc.)を用いて実施した。サイクリックボルタンメトリーは、無水CH3CN中0.01MのAgNO3/0.1Mの(nBu)4NPF6中に入れたquasi-internal Ag wire reference electrode(CH Instruments, Inc.)対1チャンバー及び3電極セルで実施した。一般的サイクリックボルタモグラム(CV)は、作用電極としての白金ボタン電極又はインジウムスズ酸化物(ITO)被覆ガラス電極及び白金コイル対電極を用いて測定した。
【０１４３】
(実施例18)
電気化学的重合及び共重合: 単独重合については、電極電位を100mV/秒のスキャン速度でAg/Ag+に対して-0.2及び+1.3Vの間で掃引したとき、0.1Mの(nBu)4NPF6/CH2Cl2溶液中10mMのモノマー4a〜bが酸化的に重合した。共重合については、0.1Mの(nBu)4NPF6/CH2Cl2中異なるモノマー比を有する2つの混合物を調製した。第1の混合物は1mMの4a〜b及び9mMのEDOTを含み、他の混合物は5mMの4a〜b及び5mMのEDOTを含んでいた。100mV/秒のスキャン速度でAg/Ag+に対して-0.3及び+1.3Vの間でのサイクリックボルタンメトリーにより、酸化的重合を行った。
【０１４４】
いくつかの最近の報告で、ナノ粒子媒介性((a)Taton T. A.、Mirkin C. A.、Letsinger R. L.、Science 2000、289、1757頁、(b)Park S.-J.、Taton T. A.、Mirkin C. A.、Science 2002、295、1503頁)又は酵素触媒作用による((a)Gao Z. Q.、Rafea S.、Lim. L. H.、Adv. Mat.、2007、19、602頁、(b)Fan Y.、Chen X. T.、Trigg A. D.、Tung C. H.、Kong J. M.、J. Am. Chem. Soc.、2007、129、5437頁)物質の成長によるサンドイッチDNAアッセイ(捕捉プローブ/標的DNA/検出プローブ)によって発生した著しく増幅したシグナルが示された。このシグナル増幅法を非標識DNA検出のための挿入剤の有利な使用と組み合わせることにより、発明者らは、シグナル増幅のためのハイブリダイゼーションしたDNA上の導電性ポリマーの成長を電気化学的に媒介し、促進するためのエチレンジオキシチオフェン(EDOT)グラフト挿入剤に基づく、感度の高いDNA検出を達成するための挿入剤媒介ポリマー成長の新規な分子的アプローチを発見した。
【０１４５】
酸化還元活性部分(redox active moiety)に結合させたナフタレンジイミド(ND)挿入剤は、電気化学的DNA検出に適用可能である。他方で、EDOT由来の導電性ポリマーは、高い伝導性、長期安定性及び構造汎用性のため有望な伝導性材料である。発明者らは、水溶性の改善のためのオリゴエチレングリコールリンカーを介して対称(EDOT-ND-EDOT)又は非対称(EDOT-ND-Os)にグラフトさせたEDOTを含む2つのND誘導体化分子を設計した。
【０１４６】
【化１９】
2010509322.tif 000021
【０１４７】
1H及び13C NMR並びにHR-MSに加えて、標的化合物をUV-可視吸収スペクトル(図5A)及びサイクリックボルタモグラム(図5B)により特徴づけした。EDOT-ND-OsのUV-可視スペクトルは、Os(bpy)22+(λmax=296nm)及びND(λmax=359及び379nm)による吸収帯を示し、一方、EDOT-ND-EDOTの吸収スペクトルは、NDから生じた吸収帯のみを示した。同様に、EDOT-ND-Osは、酸化時にOs2+/Os3+(E1/2=-0.08V)による酸化還元波(redox wave)、還元時にNDのπ共役系(E1/2=-1.3V及び-0.88V)による酸化還元波を示した。
【０１４８】
挿入において、dsDNA塩基対間への平面芳香環の挿入は、淡色効果及びUV-可視吸収スペクトルの赤色移動をもたらす。図5Cに示すように、3.0のDNA塩基対/EDOT-ND-Os比でのEDOT-ND-Os溶液へのサケ精子DNAの添加により、362及び383nmにおけるND吸収帯の40%の低下がもたらされた。これらの吸収帯は、脂肪族第三級アミン側鎖又は対称Os(bpy)22+錯体を有するNDに関する以前の報告と同様に、約3nmの赤色移動も示した。これと異なり、EDOT-ND-EDOTについては限られた淡色効果及び赤色移動が認められた。これは、おそらく正電荷の欠如によって生ずる限られた結合能力によると思われる。従来のDNA検出については、標的DNAハイブリダイズの濃度は非常に低いので、挿入は純粋な拡散によって起りがたい。正に荷電したEDOT-ND-Osについては、さらなる静電相互作用により多価陰イオン性DNAと陽イオン性挿入剤との間に好ましい結合が生じ、より強い挿入挙動につながった。EDOT-ND-Osの挿入特性を競合的置換アッセイによりさらに試験した。EDOT-ND-Osの水溶液を一般的な蛍光性挿入剤であるチアゾールオレンジ(TO)であらかじめ飽和したdsDNA溶液に加えた場合、EDOT-ND-Os/TOの比が4/1に達したとき、蛍光の50%の低下が認められた。この実験により、EDOT-ND-Osの挿入性が確認されただけでなく、EDOT-ND-Osの結合定数も8×104と推定することもできた。
【０１４９】
DNAの検出のために、チオール官能基化ペプチド核酸(PNA)捕捉プローブ(5'-TTTGAGTCTGTTGCTTGG)とメルカプトウンデカノールを金電極表面上で自己集合させた。PNAは、ペプチド主鎖を有し、示した構造の記号は、塩基を示し、主鎖を示すものではない。PNAプローブは、陽イオン性EDOT-ND-Osの非特異的結合を減少させ、DNA標的がDNAプローブとハイブリダイゼーションするときに存在する陰イオン反発を減少させることにより、ハイブリダイゼーションの効率を増大させるために用いた。鳥類インフルエンザウイルスのN1遺伝子を標的とするプローブ配列を設計した。相補的標的(5'-CCAAGCAACAGACTCA-AA)とのハイブリダイゼーション、EDOT-ND-Os挿入及び洗浄の後に、Os2+/Os3+の酸化還元活性を電気化学的に観測した(図6A)。矩形波ボルタンメトリー法を用いて、100pM非相補的標的(5'-GGTTCGTTGTCTGAGTTT)の対照及び標的を用いないブランク実験と比較して大きいアンペロメトリーシグナルが20pM相補的標的で得られた。しかし、バックグラウンド補正の後でさえも、シグナルの差は限られていた。相補的標的の最大アンペロメトリー出力は、非相補的標的からのシグナルの約4倍にすぎなかった(図6B)。
【０１５０】
次いで、バイオセンサー電極を電解質水溶液(0.1M LiClO4)中に入れ、-0.2から1.0Vまでのサイクリックポテンシャル(cyclic potential)を印加した。相補的標的とハイブリダイゼーションさせた電極において、表面に結合したEDOT-ND-Osからのオリゴマー/ポリマーの形成により、最初のサイクルとその後のサイクルとの間のより大きいアンペロメトリーの差が得られた。シグナルの差をさらに増大させるために、電極を5mM EDOT-OHを含む電解質水溶液中に入れた。導電性ポリマーの電気化学的成長に関する以前の報告で、ポリマーの最初の層が析出した後にはるかに低い電位でポリマーが生成したことが示された(Lima A.、Schottland P.、Sadki S.、Chevrot C.、Synth. Met. 1998、93、33頁)。これは、最初のラジカル-ラジカルカップリングに加えて、電子輸送及び交互逐次ポリマー成長段階の改善により必要な過電位がより低いことによる可能性がある。電気化学的ポリマー成長条件の微調整の後に、0.9Vで120秒間のアンペロメトリーポリマー成長が最適であることが発見された。図6Cに示すように、ポリ(EDOT-OH)フィルムの形成はサイクリックボルタモグラムにおけるより大きいアンペロメトリー出力(サブμAレベル)がもたらした。対照実験(非相補的標的DNA)及びブランク実験(無標的)のボルタモグラムはほぼ同じであり、Os2+/Os3+から以前に観測された電気化学的シグナルと比較して、相補的標的と非相補的標的との間の大きいシグナルの差が認められた。より高い電位の印加又は重合時間の延長は、対照実験でのポリマーの成長の有意な増加をもたらし、コントラストを効果的に減少させた。バックグラウンドシグナル(無標的)のサブトラクションの後に、感度がより低いサイクリックボルタンメトリー法(図6Aで適用した矩形波法と比較して)からの相補的及び非相補的DNA標的の間のアンペロメトリー出力のコントラストは、>100倍であった。
【０１５１】
結論として、導電性ポリマーのモノマー単位EDOTをグラフトした有効なdsDNA挿入剤を設計し、合成して、好結果が得られた。新たな分子は、感度の高いDNA検出用のdsDNA固定化電極上の電気化学的導電性ポリマー成長を促進する新規なアプローチを提供する。
【０１５２】
実施例19〜21に関する一般的実験
ヒドロキシメチルEDOTは、以前に記載された手順((a)A. Lima、P. Schottland、S. Sadki、C. Chevrot、Synthetic Metals 1998、93、33頁、(b)S. Akoudad、J. Roncali、Electrochemistry Communications 2000、2、72頁)に従って合成した。すべての化学物質は、試薬用であり、受け取ったままのものを使用した。無水溶媒は、Sigma-Aldrichから密閉(sure-seal)びん入りで購入し、標準的真空/不活性ガスマニホールド技術を用いてAr中で反応フラスコ中に導入した。他のすべての溶媒は、J.T. Baker(Phillipsburg、NJ)から購入した。すべての試薬は、商業的供給元から購入し、特に示さない限り、さらに精製せずに用いた。重水素化溶媒は、Sigma-Aldrich又はCambridge Isotope Laboratories, Inc.から購入した。1H及び13C NMRデータは、Bruker AV 400分光計で25℃で得た。選択した化合物のNMRスペクトルを図7に示す。フラッシュクロマトグラフィーは、CombiFlash Companion又は順相シリカゲルカートリッジ上Rx16で実施した。MSは、ESIプローブを取付けたFinnigan/MAT LCQ質量分光計(ThermoFinnigan、San Jose、CA)で実施した。UV-Vis分光光度法は、Agilent 8453ダイオードアレイ分光光度計で記録した。ペプチド核酸(PNA)捕捉プローブは、Applied Biosystems(Foster City、CA)により受注合成されたが、DNAオリゴヌクレオチドは、1st Base Pte Ltd(Singapore)により受注製造された。塩基配列は、N-TTTGAGTCTGTTGCTTGG(リンカー)-Cys(PNA捕捉プローブ)、5'-CCAAGCAACAGACTCAAA(相補的DNA標的)及び5'-GGTTCGTTGTCTGAGTTT(非相補的DNA標的)であった。EDOT挿入剤の電気化学的試験は、Innovative Technologies(Newburyport、MA)製のグローブボックス中でAutolab PGSTAT 32ポテンシオスタット(Metrohm)を用いて実施した。1チャンバー3電極セルは、無水CH3CN中0.01MのAgNO3/0.1Mの(nBu)4NPF6中に入れたquasi-internal Ag wire reference electrode(CH Instruments、Inc.)、白金ボタン作用電極及び白金コイル対電極からなっていた。電気化学的DNA検出は、CH Instrumentsモデル760C電気化学ワークステーション(CH Instruments、Austin、TX)を用いて行った。直径3.0mmの金作用電極(CH Instruments)、非漏洩小型Ag/AgCl参照電極(Cypress Systems、Lawrence、KS)及び白金線対電極からなる従来の3電極システムをすべての電気化学的測定に用いた。PBS緩衝液(15M NaCl、20mMリン酸緩衝液;pH7.4)は、PNA捕捉プローブの固定化のために用いたが、TE緩衝液(Tris-HCl、1.0mM EDTA;pH8.0、0.1M NaCl及び0.01%トリトンXを含む)は、ハイブリダイゼーション緩衝液及びハイブリダイゼーション後洗浄に用いた。挿入剤のインキュベーションは、TE緩衝液中で行ったが、10%エタノールを含むNaCl飽和TE緩衝液は、分析の前の最終洗浄溶液として用いた。LiClO4水溶液(0.1M)は、電気化学的検出手順における電解質として用いた。
【０１５３】
(実施例19)
EDOT-ND-EDOTの合成
【０１５４】
【化２０】
2010509322.tif 000022
【０１５５】
11-(2,3-ジヒドロチエノ[3,4-b][1,4]ダイオキシン-3-イル)メチル)-3,6,9-トリオキサウンデシルトシラート(EDOT-EG4-OTs、7): 無水THF(10mL)中EDOT-OH(6;1.72g、10.0mモル)及び18-クラウン-6(132mg、0.500mモル)の溶液を0℃の無水THF(150mL)中に懸濁させたNaH(95%、1.26g、50.0mモル)に1滴ずつ加えた。次いで、混合物をテトラエチレングリコールジトシラート(1.01g、20.0mモル)に加え、N2中で一夜還流した。水で反応を停止させた後、THFを真空中で除去し、CH2Cl2で3回抽出した。合わせた有機相をMgSO4で乾燥し、フラッシュクロマトグラフィー(ジクロロメタン/酢酸エチル=9:1)により精製した。真空中で乾燥した後にEDOT-EG4-OTs(7;1.00g、20%)を淡黄色液体として得た。1H NMR (400MHz, CDCl3): δ 7.80 (d, 1H, J=1.6Hz)、7.78 (d, 1H, J=1.2Hz)、6.32 (d, 1H, J=3.6Hz)、6.31 (d, 1H, J=3.6Hz)、4.35〜4.29 (m, 1H)、4.24 (dd, 1H, J=11.6, 2.0Hz)、4.15 (t, 2H, J=4.8Hz)、4.11 (dd, 1H, J=14.4, 7.2Hz)、4.05 (dd, 1H, J=11.6, 7.6Hz)、3.76 (dd, 1H, J=10.4, 4.8Hz)、3.71〜3.53 (m, 14H)、2.44 (s, 3H)。
【０１５６】
2-((11-ヨード-3,6,9-トリオキサウンデシルオキシ)メチル)-2,3-ジヒドロチエノ[3,4-b][1,4]ダイオキシン(EDOT-EG4-I、8): 7(1.00g、1.99mモル)及びヨウ化ナトリウム(1.49g、9.95mモル)の溶液をアセトン(20mL)中で18時間還流した。次いで、反応混合物をろ過し、揮発物質を真空中で除去し、CH2Cl2に溶解し、飽和Na2S2O5(飽和)で洗浄した。フラッシュクロマトグラフィー(ジクロロメタン/酢酸エチル=19:1)により精製した後、真空中で乾燥した後にEDOT-EG4-I(8;400mg、44%)を淡黄色液体として得た。1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 6.33 (d, 1H, J=3.6Hz)、6.32 (d, 1H, J=3.6Hz)、4.36〜4.29 (m, 1H)、4.25 (dd, 1H, J=11.6, 2.8Hz)、4.06 (dd, 1H, J=11.6, 7.2Hz)、3.77 (dd, 1H, J=9.6, 4.8Hz)、3.75 (t, 2H, J=5.2Hz)、3.71〜3.63 (m, 13H)、3.26 (t, 2H, J=7.2Hz)。
【０１５７】
2((11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデシルオキシ)メチル)-2,3-ジヒドロチエノ[3,4-b][1,4]ダイオキシン(EDOT-EG4-N3、9): DMF(5mL)中8(400mg、0.873mモル)の溶液と水(5mL)中アジ化ナトリウム(227mg、3.49mモル)の溶液とを混合し、18時間還流した。飽和NH4Cl(水性)で洗浄することにより、DMFを除去した。反応混合物をCH2Cl2に溶解し、水で洗浄し、MgSO4で乾燥した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー(ジクロロメタン/酢酸エチル=19:1)により精製して、粘稠な無色液体(212mg、0.568mモル、65%)が生じた。1H NMR (400MHz, CDCl3): δ 6.33 (d, 1H, J=4Hz)、6.32 (d, 1H, J=3.6Hz)、4.35〜4.29 (m, 1H)、4.25 (dd, 1H, J=11.6, 2.4Hz)、4.06 (dd, 1H, J=11.6, 7.2Hz)、3.76 (dd, 2H, J=10.8, 5.2Hz)、3.71〜3.52 (m, 15H)、3.39 (t, 2H, J=5.2Hz)。13C NMR (100MHz, CDCl3): δ 141.6、141.5、99.7、99.6、77.3、72.6、71.2、70.7、70.7、70.6、70.5、70.1、69.6、66.1、50.7。HR-MS (FAB): C15H23N3O6S+H+の計算値 374.1386 [M+H+]; 実測値 374.1379。
【０１５８】
2-((11-アミノ-3,6,9-トリオキサウンデシルオキシ)メチル)-2,3-ジヒドロチエノ[3,4-b][1,4]ダイオキシンEDOT-EG4-NH2: THF(3mL)中9(100mg、0.268mモル)の溶液をトリフェニルホスフィン(77.3mg、0.295mモル)と混合し、50℃で1時間加熱した。その後、3mLのNaOH(水性)(2M)を加え、反応物をさらに2時間撹拌した。ロータリーエバポレータによりTHFを除去し、水性反応混合物をpH<3に酸性化した。水相をCH2Cl2で洗浄した。次いで、NaOHを加え、得られた溶液(pH>10)をCH2Cl2で抽出した。有機層をNa2SO4で乾燥し、溶媒を真空中で除去して、粘稠黄色液体(80.0mg、86%)を得た。1H NMR (400MHz, CDCl3): δ 6.29 (d, 1H, J=3.6Hz)、6.28 (d, 1H, J=3.2Hz)、4.32〜4.25 (m, 1H)、4.21 (dd, 1H, J=11.6, 2Hz)、4.02 (dd, 1H, J=11.6, 7.6Hz)、3.72 (dd, 2H, J=10.4, 4.8Hz)、3.67〜3.57 (m, 15H)、3.47 (t, 2H, J=5.2Hz)。13C NMR (100MHz, CDCl3): δ 141.5、141.4、99.7、99.6、72.9、72.6、71.1、70.6、70.5、70.5、70.2、69.6、66.1、53.5、41.5。HR-MS (FAB): C15H25NO6S+H+の計算値 348.1481 [M+H+]; 実測値 348.1478。
【０１５９】
N,N'-ビス[11-(2,3-ジヒドロチエノ[3,4-b][1,4]ダイオキシン-3-イル)メチル)-3,6,9-トリオキサウンデシル]-1,4,5,8-ナフタレンテトラカルボキシジイミド(Bis-EDOT-ND、12): 酸二無水物11(35.1mg、0.131mモル)、アミン10(100.0mg、0.288mモル)及び酢酸亜鉛(20.2mg、0.092mモル)をピリジン(10mL)中で18時間還流した。反応混合物をCH2Cl2を溶出液として用いてシリカゲルの短いカラムを通してろ過した。次いで、有機溶液をHCl(1N)及び脱イオン水で洗浄し、MgSO4で乾燥し、溶媒をロータリーエバポレータにより除去した。フラッシュクロマトグラフィー(ジクロロメタン/酢酸エチル=2:1)の後に、ジイミド12をオレンジ色固体(11.0mg、30%)として得た。1H NMR (400MHz, CDCl3): δ 8.75 (s, 4H)、6.31 (d, 2H, J=3.6Hz)、6.29 (d, 2H, J=3.6Hz)、4.46 (t, 4H, J=6Hz)、4.34〜4.27 (m, 2H)、4.23 (dd, 2H, J=11.6, 2.4Hz)、4.04 (dd, 2H, J=11.6, 4.8Hz)、3.84 (t, 4H, J=5.6Hz)、3.75 (dd, 2H, J=10.4, 4.8Hz)、3.72〜3.64 (m, 10H)、3.64〜3.56 (m, 16H)。13C NMR (100MHz, CDCl3): δ 162.9、141.5、141.5、131.0、126.7、126.6、100.0、99.7 99.6、77.9、72.6、71.2、70.6、70.6、70.5、70.1、69.6、67.8、66.1、39.6。HR-MS (FAB): C44H50N2O16S2+H+の計算値 927.2680 [M+H+]; 実測値 927.2698。
【０１６０】
(実施例20)
EDOT-ND-Osの合成
【０１６１】
【化２１】
2010509322.tif 000023
【０１６２】
8-アジド-3,6-ジオキサオクチルトシラート(TsO-EG3-N3、14): NaN3(3.25g、50mモル)及びNaI(0.30g、2mモル)の溶液に塩化物13(1.46mL、1.69g、10mモル)を加え、混合物を80℃で18時間加熱した。溶液を分液漏斗に移し、CH2Cl2 (5×)で抽出した。合わせた有機層を乾燥し(MgSO4)、溶液の容積を約20〜30mLに減少させた。塩化トシル(2.10g、11mモル)及び4-ジメチルアミノピリジン(DMAP;122mg、1mモル)を加え、続いてEt3N(1.6mL、1.21g、12mモル)を1滴ずつ加えた。18時間後に、溶液を10%H2SO4(水性)、飽和NaHCO3(水性)で洗浄し、乾燥し(MgSO4)、揮発物を真空中で除去した。カラムクロマトグラフィー(CombiFlash 40gカートリッジ、20分にわたるヘキサン中酢酸エチルの0〜60%勾配)の後に、アジド14(3.10g、94%)を無色液体として得た。1H及び13C NMRデータは、以前に報告されたもの(S. J. Meunier、Q. Wu、S.-N. Wang R. Roy、Can. J. Chem. 1997、75、1472頁)と一致していた。
【０１６３】
2-((8-アジド-3,6-トリオキサオクチルオキシ)メチル)-2,3-ジヒドロチエノ[3,4-b][1,4]ダイオキシン(EDOT-EG3-N3、15): EDOT-OH(6;1.72g、10mモル)及びNaI(0.375g、2.5mモル)及び乾燥DMF(10mL)の溶液に、NaH(鉱油中60%;600mg、15mモル)をArの弱い逆流に対して加え、混合物を20分間撹拌した。DMF(10mL)中14(3.29g)の溶液を1滴ずつ加え、混合物を18時間撹拌した。混合物をH2O(300mL)とジエチルエーテル(100mL)とに分配し、有機層をさらにH2O(5×)で洗浄した。乾燥(MgSO4)し、真空中で揮発物質を除去した後、カラムクロマトグラフィー(CombiFlash 40gカートリッジ、20分にわたるヘキサン中酢酸エチルの30〜70%勾配)の後に、15(2.94g、89%)を得た。1H NMR (400MHz, CDCl3): δ 6.35 (d, 1H, J=3.6Hz)、6.34 (d, 1H, J=3.2Hz)、4.36〜4.31 (m, 1H)、4.26 (dd, 1H, J=10.8, 1.6Hz)、4.07 (dd, 1H, J=10.8, 7.6Hz)、3.77 (dd, 2H, J=10.8, 5.2Hz)、3.70〜3.67 (m, 10H)、3.39 (t, 2H, J=4.8Hz)。13C NMR (100MHz, CDCl3): δ 141.6、141.5、99.7、99.6、72.6、71.2、70.7、70.6、70.1、69.6、66.1、60.4、50.1。
【０１６４】
2-((8-アミノ-3,6-ジオキサオクチルオキシ)メチル)-2,3-ジヒドロチエノ[3,4-b][1,4]ダイオキシン(EDOT-EG3-NH2、16): THF(10mL)中15(660mg、2.0mモル)の溶液及びトリフェニルホスフィン(577mg、2.2mモル)を50℃で1時間加熱した。NaOH(水性)(2M;10mL)を加え、反応混合物をさらに2時間撹拌した。ロータリーエバポレータによりTHFを除去し、水性反応混合物をpH<3に酸性化した。水相をCH2Cl2 (3×)で抽出し、有機層を捨てた。水層に、NaOHを加え、溶液(pH>10)をCH2Cl2 (3×)で抽出した。有機層をNa2SO4で乾燥し、溶媒を真空中で除去して、粘稠な黄色液体(388mg、86%)を得た。1H NMR (400MHz, CDCl3): δ 6.29 (d, 1H, J=3.6Hz)、6.28 (d, 1H, J=3.2Hz)、4.32〜4.25 (m, 1H)、4.21 (dd, 1H, J=11.6, 2Hz)、4.02 (dd, 1H, J=11.6, 7.6Hz)、3.72 (dd, 2H, J=10.4, 4.8Hz)、3.67〜3.57 (m, 15H)、3.47 (t, 2H, J=5.2Hz)。13C NMR (100MHz, CDCl3): δ 141.5、141.4、99.7、99.6、72.9、72.6、71.1、70.6、70.5、70.5、70.2、69.6、66.1、53.5、41.5。
【０１６５】
N-[3-(イミダゾール-1-イル)プロピル]-N'-[8-((2,3-ジヒドロチエノ[3,4-b][1,4]ダイオキシン-3-イル)メトキシ)-3,6-ジオキサオクチル]-1,4,5,8-ナフタレンテトラカルボキシジイミド(EDOT-ND-Im、18): 酢酸ジメチル(30mL)中11(804.6mg、3mモル)及び1-(3-アミノプロピル)イミダゾール(125.2mg、1mモル)の混合物を125℃で18時間加熱した。室温まで冷却後に、CHCl3(100mL)を加えた。沈殿をろ過し、揮発物質を真空中で除去した。水(150mL)を加え、生成した沈殿物をエタノール及びエーテルで洗浄した。粗生成物をDMF中でSOCl2(142.8mg、1.2mモル)とともに60℃で2時間加熱した。生成した沈殿物を収集し、エーテルで洗浄して、17(251.2mg、0.61mモル、61%)を得、これをさらに精製せずに次の段階に用いた。16(50mg、0.17mモル)、17(70mg、0.17mモル)及び酢酸亜鉛(2534mg、0.12mモル)の混合物をピリジン中で120℃で15時間加熱した。真空蒸留によるピリジンの除去後に、反応混合物をCH2Cl2とNaとに分配した。合わせた有機層をMgSO4で乾燥し、フラッシュクロマトグラフィー(ジクロロメタン/酢酸エチル=1/9)によるさらなる精製に供した。生成物は、黄色ゲル(18.5mg、0.03mモル、収率17.6%)として得られた。1H NMR (400MHz, CDCl3): δ 8.74 (t, 4H, J=8Hz)、7.56 (m, 1H)、7.02 (m, 2H)、6.32 (d, 1H, J=3.6Hz)、6.31 (d, 1H, J=3.6Hz)、4.48 (t, 2H, J=6Hz)、4.32〜4.25 (m, 1H)、4.23 (dd, 1H, J=11.6, 2Hz)、4.12 (t, 2H, J=7.6Hz)、4.05 (dd, 1H, J=11.6, 7.2Hz)、3.87 (dd, 1H, J=10.4, 6Hz)、3.71 (t, 2H, J=5.6Hz)、3.66〜3.60 (m, 8H)、2.32 (q, 2H, J=5.6Hz)、13C NMR (400MHz, CDCl3): δ 163.1、163.0、141.7、141.6、137.4、131.4、131.2、129.9、127.0、126.9、126.9、126.5、118.8、100.2、99.8、72.8、71.4、70.9、70.7、70.3、69.8、68.0、66.3、45.1、39.8、38.5、29.5。
【０１６６】
N-[3-(イミダゾール-1-イル)プロピル]-N'-[8-((2,3-ジヒドロチエノ[3,4-b][1,4]ダイオキシン-3-イル)メトキシ)-3,6-ジオキサオクチル]-1,4,5,8-ナフタレンテトラカルボキシジイミドのOs(bpy)2Cl2との錯体(EDOT-NTCDI-Os(19)): [Os(bpy)2Cl2]Cl.2H2O[3](18.9mg、0.029mモル)をエチレングリコール中18(18.5mg、0.030mモル)の溶液に加え、混合物を180℃で6時間撹拌した。サイクリックボルタンメトリーにより、反応の進行をモニターした。完結後に、エチレングリコールを除去し、固体をCHCl3(3×)で抽出した。合わせたCHCl3層を水で繰り返し洗浄した。生成物は、暗紫色のペースト(14.2mg、収率33%)として得られた。
【０１６７】
(実施例21)
電気化学的実験及びDNA検出
金電極上へのPNA捕捉プローブ(CP)の固定化:  金ボタン電極を最初に0.5μmアルミナスラリーで機械的に研磨した後、IPA(イソプロパノール)及び水で超音波処理した。その後、0.1M H2SO4溶液中-0.3〜1.5V(対Ag/AgCl)での反復電位スキャンにより電気化学的クリーニングを行った。水中での洗浄及び窒素気流による乾燥後に、電極は、使用の準備が整った。金電極をPBS(リン酸緩衝生理食塩水)中CPの1μM溶液中に12時間浸漬することにより、CPの単層が吸着された。吸着後、電極をPBSで十分に洗浄し、浸漬し、窒素気流で通気乾燥した。標的DNA及び挿入剤の非特異的取込みを最小限にし、CP単層の質及び安定性を改善するために、CP被覆金電極を1mM 11-メルカプトウンデカノール(MUD)のエタノール溶液中に3時間浸漬した。未反応MUDをエタノール、次に水で洗浄した。窒素通気乾燥した後、電極は、次の段階への準備が整った。
【０１６８】
ハイブリダイゼーション及び検出:  標的DNAのハイブリダイゼーションは、37℃に維持した水分飽和チャンバー中で行った。標的DNAを含むハイブリダイゼーション溶液の一部2.5μlをCP被覆電極上に均一に広げたままにし、4時間にわたりハイブリダイゼーションさせた。非特異的に結合したDNAを電極表面から除去するために、一連の高い及び低いストリンジェンシーでの洗浄を行った。電極を最初に撹拌ハイブリダイゼーション緩衝液(ブランク、0.01%トリトン-Xを含む)で37℃で5時間洗浄した後、ブランクTE緩衝液に室温で1分間浸漬し、最後に水で短時間洗浄した。TE緩衝液中100μM EDOT-ND-Osの一部3.0μlを電極表面に加え、室温で15分間インキュベートした。最終洗浄溶液で十分に洗浄した後に、電極は、電気化学的分析への準備が整った(図8)。最初に、Os+2/Os+3の酸化還元反応を、LiClO4の0.1M水溶液中での矩形波ボルタンメトリーにより観測した(結果は図6Aに示す)。次に、電極を-0.2〜1.0V(対Ag/AgCl)での5サイクルの電位スキャンにかけてオリゴEDOTsを形成させた。これらは、その後の重合の「種」としての機能を果たす。最終段階において、電極を5.0mMのEDOT-OHを含むLiClO4の0.1M水溶液に浸漬した。0.9V(対Ag/AgCl)の定電位を120秒間印加して、EDOT-OHモノマーを重合させた。短時間の水洗の後に、電極をブランク電解質溶液中で分析して、形成されたコポリマー膜を定量した(結果は図6Cに示す)。
【図１】
2010509322.tif 000030
【図２】
2010509322.tif 000031
【図３】
2010509322.tif 000032
【図４】
2010509322.tif 000033
【図５】
2010509322.tif 000034
【図７−２】
2010509322.tif 000035
【図７−３】
2010509322.tif 000036
【図７−４】
2010509322.tif 000037
【図７−５】
2010509322.tif 000038
【図６】
2010509322.tif 000039
【図７Ａ】
2010509322.tif 000040
【図８】
2010509322.tif 000041
【配列表】
2010509322000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成20年7月31日(2008.7.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０５】
本明細書で述べるモノマー(第1の態様で述べた、又は第3の態様により製造される)は、試料中の特定のポリヌクレオチド配列の存在又は非存在を判定するのに用いることができる。この方法において、前記特定のヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列をその表面に結合させた電極を試料及び第1の態様による化合物又は第3の態様により製造された化合物に曝露させる。相補的ヌクレオチド配列が特定のポリヌクレオチド配列(存在する場合)とハイブリダイゼーションして、2本鎖ポリヌクレオチドを形成するように、適切な条件(温度、溶媒等)を整えるべきである。化合物はこの2本鎖ポリヌクレオチド(存在する場合)に挿入することができる。化合物は、電解重合性基(例えば、EDOT)を有し、また、ポリヌクレオチドとの結合を促進する酸化還元基(redox group)及び/又は正に荷電した基のような基を含んでいてよい。非相補的配列などの望ましくない化合物の非特異的結合を低減するために、電極を場合によって洗浄してよい。次いで、化合物を電解重合して導電性ポリマーを生成させるように、サイクリックボルテージを電極に印加する。次いで、導電性ポリマーの存在又は非存在を測定する。これは、電極上の導電性ポリマーのサイクリックボルタモグラムを測定し、そのボルタモグラムを導電性ポリマーを有さない対照電極のボルタモグラムと比較することによって達成される。特に、電流又は電流変動を測定することができる。ポリマーの測定は、酵素又は電極触媒シグナル増幅、或いは非増幅電気化学的シグナルと比べてポリヌクレオチド配列を検出する大きい感度を有する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造(I)
【化１】
2010509322.tif 000042
の化合物
[式中、
Xは、Sであり、
Lは、リンカー基であり、
Qは、2本鎖DNAと結合することができる種であり、
G及びG'は、独立に、存在しないか、又は1個から30個までの主鎖原子を有し、
FGは、少なくとも1つのO原子若しくはN原子又は遷移金属錯体を含む官能部分であり、
Rは、H、アルキル、アルコキシ又は6員環を形成するようにLにおける原子に結合したOCRaRbからなる群から選択され、Ra及びRbは、独立にHであるか、又は置換されていてもよいアルキルである]。
【請求項２】
QがdsDNAに挿入することができる、請求項1に記載の化合物。
【請求項３】
Qがナフタレンジイミド基である、請求項2に記載の化合物。
【請求項４】
Lが構造OCH2を有する、請求項1から3のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
化合物が構造(II):
【化２】
2010509322.tif 000043
を有する、請求項1から3のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
G及びG'がCH2、(CH2)3、CH2O(CH2)6、CH2OCH2(CH2OCH2)2CH2、CH2OCH2(CH2OCH2)4CH2及びCH2OCH2(CH2OCH2)3CH2からなる群から独立に選択される、請求項1から5のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
FGがOH、NH2、イミダゾリル、ピリジニル又は金属錯体である、請求項1から6のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
FGが構造(III)
【化３】
2010509322.tif 000044
を有し、ただし、L'がリンカー基であり、X'がS、O又はNRNであり、RNがH又はアルキルであり、R'がH、アルキル、アルコキシ又は6員環を形成するようにL'における原子に結合したOCRcRdからなる群から選択され、Rc及びRdは、独立にHであるか、又は置換されていてもよいアルキルである、請求項1から6のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
X'がSである、請求項8に記載の化合物。
【請求項１０】
L'が構造OCH2を有する、請求項8又は9に記載の化合物。
【請求項１１】
化合物が構造(IV):
【化４】
2010509322.tif 000045
を有する、請求項8又は9に記載の化合物。
【請求項１２】
GとG'が同じであり、XとX'が同じである、請求項11に記載の化合物。
【請求項１３】
請求項1から12のいずれか一項に記載の化合物に由来するモノマー単位を含む、導電性ポリマー。
【請求項１４】
前記ポリマーがコポリマーであり、第2のモノマー由来のモノマー単位をさらに含み、前記第2のモノマーが、置換されていてもよいチオフェン、置換されていてもよいピロール若しくは置換されていてもよいフランであるか、又はこれらの2つ以上の混合物であり、前記置換されていてもよいチオフェン、置換されていてもよいピロール若しくは置換されていてもよいフランが2位及び5位において非置換である、請求項13に記載のポリマー。
【請求項１５】
前記第2のモノマーが3,4-エチレンジオキシチオフェンである、請求項14に記載のコポリマー。
【請求項１６】
請求項1に記載の構造(I)の化合物を製造する方法であって、構造(V)
【化５】
2010509322.tif 000046
の化合物及び構造FG-G'-NH2の化合物を構造A-Q-Aの化合物と反応させることを含み、ただし、Aがアミン基とカップリングすることができる官能基であり、QがdsDNAと結合することができる基である、方法。
【請求項１７】
構造A-Q-Aの化合物がナフタレン二酸無水物である、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
構造FG-G'-NH2の化合物が構造(V)を有する、請求項16又は17に記載の方法。
【請求項１９】
請求項16から18のいずれか一項に記載の方法により製造される、請求項1に記載の構造(I)の化合物。
【請求項２０】
請求項1に記載の構造(I)のモノマーを電解重合することを含む、請求項13に記載のポリマーを製造する方法。
【請求項２１】
構造(I)のモノマーを第2のモノマーと混合し、前記第2のモノマーが置換されていてもよいチオフェン、置換されていてもよいピロール若しくは置換されていてもよいフランであり、前記置換されていてもよいチオフェン、置換されていてもよいピロール若しくは置換されていてもよいフランが2位及び3位において非置換である、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
請求項20又は21に記載の方法により製造される、請求項13に記載のポリマー。
【請求項２３】
試料中のdsDNAの存在又は非存在を判定する方法であって、
・請求項1から12若しくは19のいずれか一項に記載の化合物に、又は請求項13から15若しくは22のいずれか一項に記載のポリマーに試料を曝露させる段階と、
・前記曝露の前の化合物又はポリマーからのシグナルを前記曝露の後の化合物又はポリマーの対応するシグナルと比較する段階と、
・前記比較により試料中のdsDNAの存在又は非存在を判定する段階と
を含む、方法。
【請求項２４】
前記シグナルがUV/可視光の吸光度、UV/可視光の吸収極大、電気インピーダンス、電気抵抗、電気伝導率及び電気伝導率に関するオンセット電位からなる群から選択される、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
請求項13から15又は22のいずれか一項に記載の導電性ポリマーを含む、試料中のdsDNAの存在又は非存在を検出するためのセンサー。
【請求項２６】
試料中の特定のポリヌクレオチド配列の存在又は非存在を判定する方法であって、
・前記特定のヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列を表面に結合させた電極を準備する段階と、
・試料及び請求項1から12又は19のいずれか一項に記載の化合物に電極を曝露させる段階と、
・前記化合物を電解重合して導電性ポリマーを生成させるように、サイクリックボルテージを電極に印加する段階と、
・電極上の導電性ポリマーのサイクリックボルタモグラムを測定する段階と、
・前記ボルタモグラムを対照電極のボルタモグラムと比較する段階と、
・前記比較により試料中の特定のポリヌクレオチド配列の存在又は非存在を判定する段階と
を含む、方法。
【請求項２７】
試料中の特定のポリヌクレオチド配列の存在又は非存在を判定する方法であって、
・前記特定のヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列を表面に結合させた電極を準備する段階と、
・試料に電極を曝露させる段階と、
・請求項1から12又は19のいずれか一項に記載の化合物を電解重合して導電性ポリマーを生成させるように、前記化合物の存在下で電極にサイクリックボルテージを印加する段階と、
・電極上の導電性ポリマーのサイクリックボルタモグラムを測定する段階と、
・前記ボルタモグラムを対照電極のボルタモグラムと比較する段階と、
・前記比較により試料中の特定のポリヌクレオチド配列の存在又は非存在を判定する段階と
を含む、方法。
【請求項２８】
前記方法が前記特定のポリヌクレオチド配列の濃度を測定する方法であり、比較する段階が前記ボルタモグラムにおける電流の大きさを、既知の濃度の前記特定のヌクレオチド配列を用いて測定したボルタモグラムにおける電流の大きさと比較することを含み、判定する段階が比較により試料中の特定のポリヌクレオチド配列の濃度を測定することを含む、請求項26又は27に記載の方法。
【国際調査報告】
2010509322.tif 000047
2010509322.tif 000048
2010509322.tif 000049
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