(57)【要約】  本発明は、マイクロアレイを用いて１又は複数の遺伝子の発現から１又は複数の発現ベクトルを計算することにより、転移性メラノーマ及び／又は免疫抑制の早期検出及び整合的判定をするための組成物、システム及び方法を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
メラノーマを有する対象を同定する方法であって、
１又は複数のメラノーマ発現ベクトルの発現量を含むデータセットを確定するステップ、及び
メラノーマ発現ベクトルの各々を個別の識別子で表示するステップ
を含む方法。
【請求項２】
１又は複数のメラノーマ発現ベクトルが、表２、表８、表９、表１２又はそれらの組合せから選択される３種以上の遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
以下から選択される６種以上の遺伝子がマイクロアレイ上に配置される、請求項１に記載の方法：
ＲＮＡ結合領域（ＲＮＰ１、ＲＲＭ）含有１；網膜芽細胞腫結合タンパク質６；ＧｒｐＥ様１（ミトコンドリア（大腸菌））；ｐｅｌｌｉｎｏホモログ１（ショウジョウバエ）；リングフィンガータンパク質１０；仮想タンパク質ＬＯＣ９０６３７；ポリコームホモログ１（ショウジョウバエ）のエンハンサー；全長インサートｃＤＮＡクローンＺＢ８１Ｂ１２；ＰＴＫ９プロテインチロシンキナーゼ９；細胞分裂周期関連４；ピリオドホモログ１（ショウジョウバエ）；ジンクフィンガータンパク質２３７；ＴＣＤＤ誘導性ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ；サイクリンＬ１；ＴＳＰＹ様２；グルタミン酸受容体（イオンチャンネル共役型、Ｎ−メチルＤ−アスパラギン酸様１Ａ型）；ＫＩＡＡ０８６３タンパク質；ｖ−ｍａｆ筋腱膜性線維肉腫癌遺伝子のホモログＦ（鳥類）；ＰＲＯ０１４９タンパク質；タンパク質チロシンホスファターゼＩＶＡ型、メンバー１；セリン／トレオニンキナーゼ受容体関連タンパク質；多プリン要素結合タンパク質Ｂ；ホスホジエステラーゼ４Ｂ、ｃＡＭＰ特異的（ホスホジエステラーゼＥ４ｄｕｎｃｅホモログ、ショウジョウバエ）；エストロゲン受容体結合タンパク質；ストレス７０タンパク質シャペロン、ミクロソーム関連、６０ｋＤａ；ＢＴＧファミリーのメンバー３；トランスフェリン受容体（ｐ９０、ＣＤ７１）；仮想タンパク質ＦＬＪ２０４３６；ホスホジエステラーゼ４Ｄ、ｃＡＭＰ特異的（ホスホジエステラーゼＥ３ｄｕｎｃｅホモログ、ショウジョウバエ）；ＫＩＡＡ００６３遺伝子産物；ｔ−ＳＮＡＲＥとの相互作用による小胞輸送ホモログ１Ａ（酵母）；ＬＯＣ４４０３０９；ＳＮＦ１様キナーゼ；二重特異性ホスファターゼ８；ＲＮＡ結合領域（ＲＮＰ１、ＲＲＭ）含有２；ダイニン軽鎖２；膜結合性ＤＮＡ結合タンパク質；セリン／トレオニンキナーゼ１７ｂ（アポトーシス誘発性）；腫瘍壊死因子α誘導タンパク質３；不均一核内リボ核タンパク質Ｃ（Ｃ１／Ｃ２）；ホスホジエステラーゼ４Ｄ、ｃＡＭＰ特異的（ホスホジエステラーゼＥ３ｄｕｎｃｅホモログ、ショウジョウバエ）；ｋｅｌｃｈ様１５（ショウジョウバエ）；ＫＩＡＡ０８６３タンパク質；活性化転写因子４（ｔａｘ応答性エンハンサー要素Ｂ６７）；ビリン２（エズリン）；核内小リボ核タンパク質のポリペプチドＡ’；ジンクフィンガータンパク質１９８；ｃＡＭＰ応答性要素モジュレーター；スプライシング因子３ａ、サブユニット１、１２０ｋＤａ；ＣＤ８３抗原（活性化Ｂリンパ球、免疫グロブリンスーパーファミリー）；ＤｎａＪ（Ｈｓｐ４０）ホモログ、サブファミリーＢ、メンバー６；染色体２０のオープンリーディングフレーム１１１；エタノールアミンキナーゼ１；染色体４のオープンリーディングフレーム１５；リングフィンガータンパク質１３９；リボヌクレアーゼＨ１；ｊｕｎ  Ｄ癌原遺伝子；Ｓ期キナーゼ関連タンパク質１Ａ（ｐ１９Ａ）；メチルＣｐＧ結合タンパク質２（レット症候群）；不均一核内リボ核タンパク質Ｈ３（２Ｈ９）；仮想タンパク質ＤＫＦＺｐ５８６Ｉ１４２０；ヌクレオソームアセンブリータンパク質１様５；Ｒａｓ−ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質ＳＨ３ドメイン結合性タンパク質２；ジンクフィンガータンパク質３３１；カリン��；シュバッハマンボディアンダイアモンド症候群；ステロールＣ５デサチュラーゼ（ＥＲＧ３δ−５−デサチュラーゼホモログ、真菌）様；ホスファチジルイノシトールグリカン、クラスＡ（発作性夜間血色素尿症）；イソペンテニル二リン酸δイソメラーゼ；染色体２０のオープンリーディングフレーム６７；ｖ−ｍａｆ筋腱膜性線維肉腫癌遺伝子のホモログＫ（鳥類）；ウィスコットアルドリッチ症候群タンパク質相互作用性タンパク質；ｋｅｌｃｈ様７（ショウジョウバエ）；腫瘍壊死因子α誘導タンパク質３；仮想ＬＯＣ３８８７９６；アルマジロリピート含有８；膜結合性ＤＮＡ結合タンパク質；ジンクフィンガータンパク質３３１；ｃＡＭＰ応答性要素モジュレーター；推定翻訳開始因子；ＤｎａＪ（Ｈｓｐ４０）ホモログ、サブファミリーＢ、メンバー６；核内受容体サブファミリー４、グループＡ、メンバー２；円柱腫（ターバン頭布腫症候群）；核内受容体サブファミリー４、グループＡ、メンバー２；６−ピルボイルテトラヒドロプテリンシンターゼ；Ｓ期キナーゼアクチベーター；活性化ＲＮＡポリメラーゼIIの転写補因子４（活性化ＲＮＡポリメラーゼIIの転写コアクチベーターｐ１５に関連（正の補因子４）（ＰＣ４）（ｐ１４））；仮想ＬＯＣ３８８７９６；接合媒介／調節タンパク質；仮想遺伝子ＣＧ０１８；推定翻訳開始因子；二重特異性ホスファターゼ５；スプリット１のトランスデューシン様エンハンサー（ショウジョウバエのＥ（ｓｐ１）ホモログ）；ミトコンドリア運搬体タンパク質；タンパク質チロシンホスファターゼＩＶＡ型、メンバー１；ジンクフィンガータンパク質３３１；ＣＤＮＡクローンＩＭＡＧＥ：３０３３２３１６の部分ｃｄｓ；インターロイキンエンハンサー結合因子３、９０ｋＤａ；ホモサピエンス、クローンＩＭＡＧＥ：４７５３７１４、ｍＲＮＡ；ＳＯＮ  ＤＮＡ結合タンパク質；ＡＰ１γサブユニット結合タンパク質１；ジンクフィンガータンパク質３９４；真核性翻訳開始因子５；活性化転写因子７相互作用性タンパク質２；仮想タンパク質ＬＯＣ２８５８３１；アクチン関連タンパク質２／３複合体のサブユニット５様；仮想タンパク質ＬＯＣ１４４４３８；推定翻訳開始因子；Ｈ３ヒストン、ファミリー３Ｂ（Ｈ３．３Ｂ）；ｋｅｌｃｈリピート及びＢＴＢ（ＰＯＺ）ドメイン含有２；ＣＤＮＡ  ＦＬＪ４０７２５  ｆｉｓのクローンＴＫＩＤＮ１０００００１（ミトコンドリア内膜２３のトランスロカーゼに酷似）；円柱腫（ターバン頭布腫症候群）；ホスホジエステラーゼ４Ｄ、ｃＡＭＰ特異的（ホスホジエステラーゼＥ３ｄｕｎｃｅホモログ、ショウジョウバエ）；熱ショック７０ｋＤａタンパク質１４；ＨＳＰＣ１２８タンパク質；ＲＮＡ（グアニン−７−）メチルトランスフェラーゼ；イズロン酸２−スルファターゼ（ハンター症候群）；仮想タンパク質ＭＧＣ２９８１４；カゼインキナーゼ１（ε）；プロテインホスファターゼ１の調節（阻害）サブユニット１６Ｂ；イソペンテニル二リン酸δイソメラーゼ；ＲＡＤ２３ホモログＢ（Ｓ．セレビシエ）；ホスホジエステラーゼ４Ｄ、ｃＡＭＰ特異的（ホスホジエステラーゼＥ３ｄｕｎｃｅホモログ、ショウジョウバエ）；ジンクフィンガータンパク質２９５；仮想タンパク質ＦＬＪ１３１４９；及���ＢＴＧファミリー、メンバー３、並びにそれらの組合せ。
【請求項４】
以下から選択される６種以上の遺伝子がマイクロアレイ上に配置される、請求項１に記載の方法：
ＷＡＲＳ、ＩＦＩ５３、ＩＦＰ５３、ＧＡＭＭＡ−２、ＦＡＭ４６Ｃ、ＦＬＪ２０２０２、Ｈ３Ｆ３Ｂ、Ｈ３．３Ｂ、ＦＯＸＫ２、ＩＬＦ、ＩＬＦ１、ＩＬＦ−１、ＤＵＳＰ５、ＨＶＨ３、ＡＲＦ６、ＤＫＦＺｐ７６２Ｃ１８６、ＢＲＤ２、ＮＡＴ、ＲＮＦ３、ＦＳＲＧ１、ＲＩＮＧ３、ＤＳ６１１３Ｅ、ＫＩＡＡ９００１、ＲＯＲＡ、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＲＯＲ３、ＲＺＲＡ、ＮＲ１Ｆ１、ＤＫＦＺｐ７６２Ｃ１８６、ＤＮＡＪＢ１、ＳＵＩ１、ＣＸＣＲ４、ＨＭ８９、ＬＡＰ３、ＮＰＹＲ、ＷＨＩＭ、ＬＥＳＴＥＲ、ＮＰＹ３Ｒ、ＨＳＹ３ＲＲ、ＮＰＹＹ３Ｒ、Ｄ２Ｓ２０１Ｅ、ＧＲＩＮＬ１Ａ、ＣＴＳＢ、ＴＲＩＰ−Ｂｒ２、ＰＤＥ４Ｂ、ＤＰＤＥ４、ＰＤＥＩＶＢ、ＰＭＡＩＰ１、ＡＰＲ、ＮＯＸＡ、ＢＴＧ２、ＰＣ３、ＴＩＳ２１、ＡＳＡＨＬ、ＳＯＮ、ＳＵＩ１、Ａ１２１、ＩＳＯ１、ＨＥＲＰＵＤ１、ＳＵＰ、Ｍｉｆ１、ＫＩＡＡ００２５、ＤＵＳＰ２、ＰＡＣ１、ＰＡＣ−１、ＲＮＦ１３９、ＲＣＡ１、ＴＲＣ８、ＨＲＣＡ１、ＭＧＣ３１９６１、ＴＮＦＡＩＰ３、Ａ２０、ＴＮＦＡＩＰ２、ＡＲＳ２、ＨＮＲＰＬ、ｈｎＲＮＰ−Ｌ、Ｐ／ＯＫｃ１．１４、Ｃ２０ｏｒｆ６７、Ｃ２０ｏｒｆ１１１、ＨＳＰＣ２０７、ｄＪ１１８３Ｉ２１．１、ＺＮＦ３３１、ＲＩＴＡ、ＺＮＦ３６１、ＺＮＦ４６３、Ｃ２０ｏｒｆ６７、ＩＥＲ５、ＳＢＢＩ４８、ＳＵＩ１、ＪＵＮ、ＡＰ１、ＣＤ６９、ＴＯＢ１、Ｈ３Ｆ３Ｂ、Ｈ３．３Ｂ、ＦＯＬＲ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＣＦ８、ＢＺＰ、ＺＥＢ、ＺＥＢ１、ＡＲＥＢ６、ＺＦＨＥＰ、ＮＩＬ−２Ａ、ＺＦＨＸ１Ａ、ＮＩＬ−２−Ａ、ＤＵＳＰ１０、ＭＫＰ５、ＭＫＰ−５、ＧＧＴＬＡ４、ＭＧＣ５０５５０、ｄＪ８３１Ｃ２１．２、ＰＭＡＩＰ１、ＺＣ３ＨＡＶ１、ＺＡＰ、ＦＬＢ６４２１、ＺＣ３ＨＤＣ２、ＦＬＪ１３２８８、ＭＧＣ４８８９８、ＤＳＩＰＩ、ＤＩＰ、ＧＩＬＺ、ｈＤＩＰ、ＴＳＣ−２２Ｒ、ＭＣＬ１、ＴＭ、ＥＡＴ、ＭＣＬ１Ｌ、ＭＣＬ１Ｓ、ＭＧＣ１８３９、ＳＨ３ＴＣ１、ＦＬＪ２０３５６、ＣＩＡＳ１、ＦＣＵ、ＭＷＳ、ＦＣＡＳ、ＮＡＬＰ３、Ｃ１ｏｒｆ７、ＰＹＰＡＦ１、ＡＩＩ／ＡＶＰ、ＡＧＴＡＶＰＲＬ、ＳＬＣ１５Ａ３、ＰＨＴ２、ＰＴＲ３、ｈＰＴＲ３、ＰＴＤＳＲ、ＰＳＲ、ＰＴＤＳＲ１、ＫＩＡＡ０５８５、ＢＨＬＨＢ２、ＤＥＣ１、ＳＴＲＡ１３、Ｓｔｒａ１４、ＨＭＧＥ、ＫＩＡＡ００６３、ＮＲ４Ａ２、ＮＯＴ、ＰＮＲ１、ＨＺＦ−３、ＴＩＮＵＲ、ＮＲ４Ａ２、ＮＯＴ、ＰＮＲ１、ＨＺＦ−３、ＮＵＲＲ１、ＴＩＮＵＲ、ＰＴＳ、ＰＴＰＳ、ＨＥＡＢ、ＣＬＰ１、ｈＣｌｐ１、ＡＲＥＧ、ＳＤＧＦ、ＣＲＤＧＦ、ＭＧＣ１３６４７、ＥＤＧ４、ＬＰＡ２、ＥＤＧ−４、ＬＰＡＲ２、ＣＲＥＭ、ＩＣＥＲ、ＭＧＣ１７８８１、ＭＧＣ４１８９３、ＣＤ８３、ＢＬ１１、ＨＢ１５、ＺＮＦ３９４、ＦＬＪ１２２９８、及びそれらの組合せから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
１又は複数のメラノーマ発現ベクトルが、表１２から選択される過剰発現若しくは過少発現した６種以上の遺伝子、又はそれらの組合せを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
メラノーマ発現ベクトルが、血小板、血小板糖タンパク質、血小板由来免疫メディエーター、ＭＨＣ／リボソームタンパク質、ＭＨＣクラスＩ分子、β２ミクログロブリン、リボソームタンパク質に関連する遺伝子、ヘモグロブリン遺伝子、又はそれらの組合せを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
メラノーマ発現ベクトルが、インターフェロン誘導性遺伝子、シグナル伝達分子、キナーゼ、ＲＡＳファミリーメンバー、又はそれらの組合せを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
１又は複数のメラノーマ発現ベクトルの発現量が、ｍＲＮＡの発現量、タンパク質の発現量、又はｍＲＮＡの発現量、タンパク質の発現量双方を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
発現量が、ｍＲＮＡの発現量を含み、ポリメラーゼ連鎖反応、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、ハイブリダイゼーション、プローブハイブリダイゼーション及び遺伝子発現アレイからなる群から選択される方法により定量化される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
１又は複数のメラノーマ発現ベクトル中の１又は複数の多形を検出するステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ポリメラーゼ連鎖反応、ヘテロデュプレックス分析、一本鎖構造多形分析、リガーゼ連鎖反応、比較ゲノムハイブリダイゼーション、サザンブロット、ノーザンブロット、ウェスタンブロット、酵素免疫吸着アッセイ、蛍光共鳴エネルギー移動、及び配列決定からなる群から選択される少なくとも１種の技法を用いて発現量を決定する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
試料の表現型を決定するためのコンピュータにより実行される方法であって、
複数の試料プローブ強度を得るステップ、
複数の試料プローブ強度に基づいてメラノーマを診断するステップ、及び
複数の試料プローブ強度と基準プローブ強度との間の線形相関係数を計算するステップ、及び
線形相関係数が閾値より大きい場合、試料の表現型として暫定的な表現型を受け入れるステップ
を含むコンピュータにより実行される方法。
【請求項１３】
試料の表現型を決定する方法を実施するためのコンピュータ実行可能な指令を含む、コンピュータ可読性媒体であって、前記方法が、
複数の試料プローブ強度を得るステップ、
表９〜１４に列挙した１又は複数の遺伝子から選択される２種以上の転移性メラノーマ発現ベクトルについて、複数の試料プローブ強度に基づいてメラノーマを診断するステップ、及び
複数の試料プローブ強度と基準プローブ強度との間の線形相関係数を計算するステップ、及び
線形相関係数が閾値より大きい場合、試料の表現型として暫定的な表現型を受け入れるステップ
を含む、コンピュータ可読性媒体。
【請求項１４】
移植に関連した免疫抑制の対象を同定する方法であって、
１又は複数の免疫抑制発現ベクトルの発現量を決定するステップ、及び
免疫抑制発現ベクトルの各々を個別の識別子で表示するステップ
を含む方法。
【請求項１５】
１又は複数の免疫抑制発現ベクトルが、表１０、表１１、表１３又はそれらの組合せから選択される３種以上の遺伝子を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
１又は複数の免疫抑制関連発現ベクトルの発現量が、ｍＲＮＡの発現量、タンパク質の発現量、又はｍＲＮＡの発現量、タンパク質の発現量双方を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
発現量が、ｍＲＮＡの発現量を含み、ポリメラーゼ連鎖反応、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、ハイブリダイゼーション、プローブハイブリダイゼーション及び遺伝子発現アレイからなる群から選択される方法により定量化される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
１又は複数の免疫抑制関連発現ベクトル中の１又は複数の多形を検出するステップを更に含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
ポリメラーゼ連鎖反応、ヘテロデュプレックス分析、一本鎖構造多形分析、リガーゼ連鎖反応、比較ゲノムハイブリダイゼーション、サザンブロット、ノーザンブロット、ウェスタンブロット、酵素免疫吸着アッセイ、蛍光共鳴エネルギー移動、及び配列決定からなる群から選択される少なくとも１種の技法を用いて発現量を決定する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
１又は複数の免疫抑制関連発現ベクトルが白血球に由来している、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
試料の免疫抑制性向を決定するためのコンピュータにより実行される方法であって、
複数の試料プローブ強度を得るステップ、
試料プローブ強度に基づいて免疫抑制を診断するステップ、及び
試料プローブ強度と基準プローブ強度との間の線形相関係数を計算するステップ、及び
線形相関係数が閾値より大きい場合、試料の表現型として暫定的な表現型を受け入れるステップ
を含むコンピュータにより実行される方法。
【請求項２２】
表２、表８、表９、表１２又はそれらの組合せから選択される６種以上の遺伝子からなる群から選択される４種以上の遺伝子を基材上に配置してメラノーマのヒト対象を同定するためのマイクロアレイ。
【請求項２３】
表１０、表１１、表１３又はそれらの組合せから選択される６種以上の遺伝子からなる群から選択される４種以上の遺伝子を基材上に配置して免疫抑制の素因があるヒト対象を同定するためのマイクロアレイ。
【請求項２４】
トランスクリプトームベクトルデータを表示する方法であって、
モジュール各々に対して遺伝子発現ベクトル総計値を画像表示するために、１又は複数の遺伝子を１又は複数のモジュールに分離するステップ、及び
各モジュールにおける遺伝子発現ベクトル総計値の過剰発現、過少発現又は等価発現について、遺伝子発現ベクトル総計値を表示するステップ
を含む方法。
【請求項２５】
過剰発現が第１の識別子で特定され、過少発現が第２の識別子で特定される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
過剰発現が第１の識別子で特定され、過少発現が第２の識別子で特定されており、第１の識別子が第１の色であり、第２の識別子が第２の色であって、第１及び第２の識別子を重ね合わせて混合色を得る、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、転移性メラノーマ及び／又は免疫抑制のインディケーターをモニターする診断分野に関し、より特定すれば、転移性メラノーマの診断、予後及び追跡、並びに被移植者（例えば、肝臓）に関する免疫抑制インディケーターのモニタリングをするシステム、方法及び装置に関する。
【０００２】
長大な表
本特許出願は長大な表セクションを含んでいる。この表のコピーは、ＵＳＰＴＯのウェブサイト（http://seqdata.uspto.gov/）から電子文書形態で入手できる。この表の電子コピーは、請求し、37 CFR 1.19(b)(3)に提示された料金を支払うことでも、ＵＳＰＴＯから入手することができよう。
【背景技術】
【０００３】
本出願は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれている、２００５年１２月９日出願の米国仮特許出願第６０／７４８８８４号明細書に対する優先権を主張するものである。本発明の範囲を制限することなく、診断法に関してその背景技術を説明する。
【０００４】
薬理的免疫抑制は、移植においてこれまで役立っており、最後の手段である実験的手技をいつも成功する手技に変えてきた。サイクロスポリン及びタクロリムス／ＦＫ５０６は、被移植者にとって現在主軸となっている。活性化Ｔ細胞は、免疫抑制治療の主要な細胞標的と見なされてきたが、最近の報告では、こうした薬物の抗原提示細胞に対する顕著な効果も認められており、この効果は、一般化された免疫不応答状態の確立に更に寄与する可能性が高い（Lee, Y. R., Yang, I. H., Lee, Y. H., Im, S. A., Song, S., Li, H., Han, K., Kim, K., Eo, S. K., and Lee, C. K. (2005b). Cyclosporin A and tacrolimus, but not rapamycin, inhibit MHC-restricted antigen presentation pathways in dendritic cells. Blood.; Woltman, A. M., van der Kooij, S. W., Coffer, P. J., Offringa, R., Daha, M. R., and van Kooten, C. (2003). Rapamycin specifically interferes with GM-CSF signaling in human dendritic cells, leading to apoptosis via increased p27KIP 1 expression. Blood 101, 1439-1445）。薬理治療で生じる激しい免疫抑制は、移植片の生存及び機能の維持にとって必要ではあるが、そのために被移植者は、生命に危険な感染症及び悪性疾患に曝されることにもなる。皮膚癌は、臓器被移植者における十分に確立された合併症である（Gerlini, G., Romagnoli, P., and Pimpinelli, N. (2005). Skin cancer and immunosuppression. Crit Rev Oncol Hematol 56, 127-136）。最近の疫学的調査によれば、欧州では腎臓被移植患者１１１５名のほぼ２０％が皮膚の悪性疾患を発現し（Bordea, C., Wojnarowska, F., Millard, P. R., Doll, H., Welsh, K., and Morris, P. J. (2004). Skin cancers in renal transplant recipients occur more frequently than previously recognized in a temperate climate. Transplantation 77, 574-579）、より厳しい気候では発生率がはるかに高く、例えばオーストラリアでは２８％もの発生率が認められることが示された（Carroll, R. P., Ramsay, H. M., Fryer, A. A., Hawley, C. M., Nicol, D. L., and Harden, P. N. (2003). Incidence and prediction of nonmelanoma skin cancer post-renal transplantation: a prespective study in Queensland, Australia. Am J Kidney Dis 41, 676-683）。発生頻度の増加に加え、被移植患者では、皮膚の悪性疾患が、悪性度のより高い臨床経過を辿り、遠位へ転移し、致命的な結果に至る性向を高める（Barrett, W. L., First, M. R., Aron, B. S., and Penn, I. (1993). Clinical course of malignancies in renal transplant recipients. Cancer 72, 2186-2189）。
【０００５】
腫瘍は、免疫系を弱めることにより生存を維持する。サイトカイン（例えば、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β）、ホルモン（例えば、プロスタグランジンＥ２）、及び他の因子（例えば、ＭＩＡ：メラノーマ阻害活性（Melanoma inhibitory activity）、テナシンＣ）などの免疫抑制因子の分泌を含め、様々な機構が特定されている（Jachimczak, P., Apfel, R., Bosserhoff, A. K., Fabel, K., Hau, P., Tschertner, I., Wise, P., Schlingensiepen, K. H., Schuler-Thurner, B., and Bogdahn, U. (2005). Inhibition of immunosuppressive effects of melanoma-inhibiting activity (MIA) by antisense techniques. Int J Cancer 113, 88-92.; Puente Navazo, M. D., Valmori, D., and Ruegg, C. (2001). The alternatively spliced domain TnFnIII A1A2 of the extracellular matrix protein tenascin-C suppresses activation-induced T lymphocyte proliferaton and cytokine production. J Immunol 167, 6431-6440）。更に、腫瘍は、サプレッサ−Ｔ細胞の発現を促進する可能性もある（Liyanage, U. K., Moore, T. T., Joo, H. G., Tanaka, Y., Herrmann, V., Doherty, G., Drebin, J. A., Strasberg, S. M., Eberlein, T. J., Goedegebuure, P. S., and Linehan, D. C. (2002). Prevalence of regulatory T cells is increased in peripheral blood and tumor microenvironment of patients with pancreas or breast adenocarcinoma. J Immunol 169, 2756-2761.; Viguier, M., Lemaitre, F., Verola, O., Cho, M. S., Gorochov, G., Dubertret, L., Bachelez, H., Kourilsky, P., and Ferradini, L. (2004). Foxp3-expressing CD4+CD25(high) regulatory T cells are overrepresented in human metastatic melanoma lymph nodes and inhibit the function of infiltrating T cells. J Immunol 173, 1444-1453）が、これは、樹状細胞の調節を介して起こることも考えられる（Gabrilovich, D. (2004). Mechanisms and functional significance of tumour-induced dendritic-cell defects. Nat Rev Immunol 4, 941-952.; Lee, J. H., Torisu-Itakara, H., Cochran, A. J., Kadison, A., Huynh, Y., Morton, D. L., and Essner, R. (2005a). Quantitative analysis of melanoma-induced cytokine-mediated immunosuppression in melanoma sentinel nodes. Clin Cancer Res 11, 107-112.; Monti, P., Leone, B. E., Zerbi, A., Balzano, G., Cainarca, S., Sordi, V., Pontillo, M., Mercalli, A., Di Carlo, V., Allavena, P., and Piemonti, L. (2004). Tumor-derived MUC1 mucins interact with differentiating monocytes and induce IL-10highIL-12low regulatory dendritic cell. J Immunol 172, 7341-7349）。
【０００６】
このように免疫抑制は、腫瘍又は薬理治療に由来するかを問わず、癌の進行と関連付けられてきた。したがって、転移性メラノーマ、肝臓同種移植片のいずれかを有する免疫抑制患者から得られる末梢血単核細胞（peripheral blood mononuclear cell、「ＰＢＭＣ」）の試料における全ゲノム転写活性のプロファイルを作成することにより、共通の分子シグニチャーを特定することができよう。本研究に関して生成した白血球転写活性のプロファイルの分析により、この概念が支持され、免疫抑制の血液シグニチャーが特定される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Lee, Y. R., Yang, I. H., Lee, Y. H., Im, S. A., Song, S., Li, H., Han, K., Kim, K., Eo, S. K., and Lee, C. K. (2005b). Cyclosporin A and tacrolimus, but not rapamycin, inhibit MHC-restricted antigen presentation pathways in dendritic cells. Blood.
【非特許文献２】Woltman, A. M., van der Kooij, S. W., Coffer, P. J., Offringa, R., Daha, M. R., and van Kooten, C. (2003). Rapamycin specifically interferes with GM-CSF signaling in human dendritic cells, leading to apoptosis via increased p27KIP 1 expression. Blood 101, 1439-1445
【非特許文献３】Gerlini, G., Romagnoli, P., and Pimpinelli, N. (2005). Skin cancer and immunosuppression. Crit Rev Oncol Hematol 56, 127-136
【非特許文献４】Bordea, C., Wojnarowska, F., Millard, P. R., Doll, H., Welsh, K., and Morris, P. J. (2004). Skin cancers in renal transplant recipients occur more frequently than previously recognized in a temperate climate. Transplantation 77, 574-579
【非特許文献５】Carroll, R. P., Ramsay, H. M., Fryer, A. A., Hawley, C. M., Nicol, D. L., and Harden, P. N. (2003). Incidence and prediction of nonmelanoma skin cancer post-renal transplantation: a prespective study in Queensland, Australia. Am J Kidney Dis 41, 676-683
【非特許文献６】Barrett, W. L., First, M. R., Aron, B. S., and Penn, I. (1993). Clinical course of malignancies in renal transplant recipients. Cancer 72, 2186-2189
【非特許文献７】Jachimczak, P., Apfel, R., Bosserhoff, A. K., Fabel, K., Hau, P., Tschertner, I., Wise, P., Schlingensiepen, K. H., Schuler-Thurner, B., and Bogdahn, U. (2005). Inhibition of immunosuppressive effects of melanoma-inhibiting activity (MIA) by antisense techniques. Int J Cancer 113, 88-92
【非特許文献８】Puente Navazo, M. D., Valmori, D., and Ruegg, C. (2001). The alternatively spliced domain TnFnIII A1A2 of the extracellular matrix protein tenascin-C suppresses activation-induced T lymphocyte proliferaton and cytokine production. J Immunol 167, 6431-6440
【非特許文献９】Liyanage, U. K., Moore, T. T., Joo, H. G., Tanaka, Y., Herrmann, V., Doherty, G., Drebin, J. A., Strasberg, S. M., Eberlein, T. J., Goedegebuure, P. S., and Linehan, D. C. (2002). Prevalence of regulatory T cells is increased in peripheral blood and tumor microenvironment of patients with pancreas or breast adenocarcinoma. J Immunol 169, 2756-2761
【非特許文献１０】Viguier, M., Lemaitre, F., Verola, O., Cho, M. S., Gorochov, G., Dubertret, L., Bachelez, H., Kourilsky, P., and Ferradini, L. (2004). Foxp3-expressing CD4+CD25(high) regulatory T cells are overrepresented in human metastatic melanoma lymph nodes and inhibit the function of infiltrating T cells. J Immunol 173, 1444-1453
【非特許文献１１】Gabrilovich, D. (2004). Mechanisms and functional significance of tumour-induced dendritic-cell defects. Nat Rev Immunol 4, 941-952
【非特許文献１２】Lee, J. H., Torisu-Itakara, H., Cochran, A. J., Kadison, A., Huynh, Y., Morton, D. L., and Essner, R. (2005a). Quantitative analysis of melanoma-induced cytokine-mediated immunosuppression in melanoma sentinel nodes. Clin Cancer Res 11, 107-112
【非特許文献１３】Monti, P., Leone, B. E., Zerbi, A., Balzano, G., Cainarca, S., Sordi, V., Pontillo, M., Mercalli, A., Di Carlo, V., Allavena, P., and Piemonti, L. (2004). Tumor-derived MUC1 mucins interact with differentiating monocytes and induce IL-10highIL-12low regulatory dendritic cell. J Immunol 172, 7341-7349
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ゲノム研究は、不評なほどノイズが多く、解釈が困難であり、研究室間及びプラットフォーム間で十分に対応が取れない転写データの分析について、多大な難題に直面している。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、マイクロアレイプラットフォーム間の不整合を克服する分析モジュールに統合される、生物学的に関連する遺伝子の分析の早期段階における選択を強調した分析戦略を開発した。開発したこの転写モジュールは、大量の遺伝子発現データセットの分析に使用し得る。この分析から導かれる結果は、容易に解釈可能であり、市販マイクロアレイプラットフォーム間に認められる高度の再現性によって示されるように、格別に頑健である。
【００１０】
この分析法の応用は、ＰＢＭＣ転写プロファイルの大型セットのマイニングにより例示される。４，７４２個の遺伝子を再編した転写モジュール２８個を特定した。本発明を用いて、モジュールレベルで測定した、例えば血中白血球の転写性変化の組合せによって、疾患が、特異に特徴付けられることを示すことが可能である。実際、血中白血球の転写レベルにおけるモジュールレベルの変化は、疾患又は試料の分子的指紋を構成する。
【００１１】
本発明は、広範な用途を有している。本発明は、任意の生物系（例えば、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、血液細胞、糞便（fecal）細胞、腹膜細胞、固形臓器生検試料、切除腫瘍、一次細胞、細胞系、細胞クローンなど）の転写モジュール成分を特徴付けるために、使用することができる。この手法により生成したＰＢＭＣ転写モジュールデータは、疾患重症度、薬物治療に対する応答、薬物毒性などの分子的な診断、予後、評価のために使用することができる。この手法を用いて処理した他のデータは、例えば、機構の研究又は薬物化合物のスクリーニングに用いることができる。実際のところ、このデータ分析戦略及びマイニングアルゴリズムは、遺伝子発現データの汎用分析ソフトウェアにおいて実施することができ、疾患又は病態特異的な新規モジュールを発見、開発及び試験するためにさえ、使用し得る。本発明は、薬理ゲノミクス、分子診断、バイオインフォマティクスなどとも、一緒に使用し得るが、その場合、臨床試験中に入手し得る結果を改善するために（例えば、試料母集団の改善又はその中からの補助的選択により）、詳細な発現データを使用し得る。
【００１２】
より特定すれば、本発明は、患者のトランスクリプトームを入手し；疾患又は病態を指示する１又は複数の転写モジュールに基づいてトランスクリプトームを分析し；その１又は複数の転写モジュールにおけるトランスクリプトーム内の遺伝子の有無又は発現量に基づいて、患者の疾患又は病態を判定することにより、疾患又は病態を診断するためのアレイ、装置、システム及び方法を包含する。転写モジュールは、１又は複数の転写モジュールのために遺伝子発現値を繰返し選択し；疾患又は病態毎に一致する、各クラスター由来の遺伝子を該モジュールのために選択し；選択した遺伝子を分析から取り出し；該疾患又は病態の部分分画に集合する遺伝子を求めて、遺伝子発現値選択の過程を反復し；すべての遺伝子クラスターが無くなるまで、各クラスターに対してモジュールの生成を繰返し反復することにより、取得し得る。
【００１３】
本発明に使用するために選択されるクラスターの例には、それだけに限らないが、発現値クラスター、キーワードクラスター、代謝クラスター、疾患クラスター、感染クラスター、移植クラスター、シグナル伝達クラスター、転写クラスター、複製クラスター、細胞周期クラスター、ｓｉＲＮＡクラスター、ｍｉＲＮＡクラスター、ミトコンドリアクラスター、Ｔ細胞クラスター、Ｂ細胞クラスター、サイトカインクラスター、リンホカインクラスター、熱ショッククラスター、及びそれらの組合せが挙げられる。本発明を用いて分析する疾患又は病態の例には、例えば、自己免疫疾患、ウィルス感染症、細菌感染症、癌、及び移植片拒絶反応が挙げられる。より特定すれば、分析対象の疾患は、以下の病態：全身若年性特発性関節炎、全身性エリテマトーデス、Ｉ型糖尿病、肝臓被移植者、メラノーマ患者、及び大腸菌（Escherichia coli）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）などの細菌感染症、インフルエンザＡ型などのウィルス感染症の患者、並びにそれらの組合せの１又は複数から選択し得る。生物兵器に関連する特定の疾患又は病態を検出する、特定のアレイさえ作製し得る。
【００１４】
本発明を用いて分析し得る細胞には、例えば、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、血液細胞、胎児細胞、腹膜細胞、固形臓器生検試料、切除腫瘍、一次細胞、細胞系、細胞クローン、及びそれらの組合せが挙げられる。該細胞は、単独細胞、細胞集合体、組織、細胞培養物、体液例えば血液中の細胞でもよい。細胞は、組織生検試料、選別した１又は複数の細胞集団、細胞培養物、細胞クローン、形質転換細胞、生検試料、又は単独細胞から得てもよい。細胞型は、例えば、脳、肝臓、心臓、腎臓、肺、脾臓、網膜、骨、神経、リンパ節、内分泌腺、生殖器官、血液、神経、血管組織及び嗅覚上皮の各細胞でもよい。細胞を分離した後、こうした細胞由来のこうしたｍＲＮＡを取得し、例えば、プローブアレイ、ＰＣＲ、定量ＰＣＲ、ビーズ系アッセイ、及びそれらの組合せを用いて、遺伝子発現量の個々の分析を行う。遺伝子発現量の個々のこの分析は、逆転写酵素用鋳型として細胞から採集したｍＲＮＡから作製したｃＤＮＡを用いる、固体支持体上での核酸のハイブリダイゼーションを用いてさえ行い得る。
【００１５】
薬理的免疫抑制は、被移植者における移植片の生存を促進する。内因性免疫抑制は、担癌患者における癌の生存を促進する。転移性メラノーマ患者からの白血球は、薬理的免疫抑制を受けている肝臓被移植者と共通する、内因性免疫抑制のシグニチャーを表現する。血液のマイクロアレイ分析を、健常志願者２５名、転移性メラノーマ患者３５名及び肝臓被移植者３９名において実施した。疾患シグニチャーを特定し、健常対照と比較して、独立のデータセットにおいて確認した。他の６種の疾患と比較して、メラノーマ群及び移植群に選択的に過剰発現された転写物６９種のセットを分析することにより、インターロイキン−２転写の数種のリプレッサー、ＮＦ−κＢ及びＭＡＰＫ経路の強力な阻害剤、並びに抗増殖性分子を含め、顕著な機能的収斂が明らかとなった。したがって、転移性メラノーマ患者は、免疫抑制の内因性転写シグニチャーを表現する。このシグニチャーは、転移性メラノーマの進行する危険性が高い患者を特定するために、今や使用し得る。
【００１６】
本発明は、遺伝子発現の多変数分析を用いて、転移性メラノーマの予後及び診断、並びに／或いは被移植者（例えば、肝臓）に関する免疫抑制インディケーターのモニタリングをするために、試料を分析するシステム及び方法を包含する。後に残る遺伝子発現の差異は、高い信頼度で不一致な変化に帰することができる。こうして特定した遺伝子発現の差異は、例えば、疾患の診断、生理状態の特定、ドラッグデザイン、及び治療薬のモニターに使用することができる。
【００１７】
該試料は、発現ベクトルのｍＲＮＡ、タンパク質、又はｍＲＮＡ、タンパク質双方を定量することにより、スクリーニングし得る。スクリーニングがｍＲＮＡ量を対象とする場合、その量は、ポリメラーゼ連鎖反応、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、ハイブリダイゼーション、プローブハイブリダイゼーション及び遺伝子発現アレイから選択される方法により、定量し得る。このスクリーニング法は、バイオマーカーにおける多形の検出も含み得る。或いは、このスクリーニングステップは、ポリメラーゼ連鎖反応、ヘテロデュプレックス分析、一本鎖構造多形分析、リガーゼ連鎖反応、比較ゲノムハイブリダイゼーション、サザンブロット、ノーザンブロット、ウェスタンブロット、酵素免疫吸着アッセイ、蛍光共鳴エネルギー移動、及び配列決定からなる群から選択される少なくとも１種の技法を用いて実現し得る。本発明で使用するために、試料は、多種の免疫細胞、例えば白血球、又はそれらの準構成要素のいずれでもよい。
【００１８】
一実施形態では、本発明は、表２、８、９、１２及びそれらの組合せから選択される６種、７種、８種、１０種、１５種、２０種、２５種又はそれより多種の遺伝子の組合せについて、試料の表現型を調べることにより、メラノーマ患者を同定する方法を含む。
【００１９】
一実施形態では、本発明は、表１０、１１、１３及びそれらの組合せから選択される６種、７種、８種、１０種、１５種、２０種、２５種又はそれより多種の遺伝子の組合せについて、試料の表現型を調べることにより、被移植者において薬理的免疫抑制に対する遺伝子発現応答を同定する方法を含む。
【００２０】
該試料は、発現ベクトルのｍＲＮＡ、タンパク質、又はｍＲＮＡ、タンパク質双方を定量することにより、スクリーニングし得る。ｍＲＮＡ量を調べる場合、その量は、ポリメラーゼ連鎖反応、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、ハイブリダイゼーション、プローブハイブリダイゼーション及び遺伝子発現アレイから選択される方法により、定量し得る。このスクリーニング法は、バイオマーカーにおける多形の検出も含み得る。或いは、このスクリーニングステップは、ポリメラーゼ連鎖反応、ヘテロデュプレックス分析、一本鎖構造多形分析、リガーゼ連鎖反応、比較ゲノムハイブリダイゼーション、サザンブロット、ノーザンブロット、ウェスタンブロット、酵素免疫吸着アッセイ、蛍光共鳴エネルギー移動、及び配列決定からなる群から選択される少なくとも１種の技法を用いて実現し得る。本発明で使用するために、試料は、多種の免疫細胞、例えば白血球、又はそれらの準構成要素のいずれでもよい。
【００２１】
発現ベクトルは、発現ベクトルのｍＲＮＡ、タンパク質、又はｍＲＮＡ、タンパク質双方を定量することにより、スクリーニングし得る。発現ベクトルがｍＲＮＡ量である場合、その量は、ポリメラーゼ連鎖反応、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、ハイブリダイゼーション、プローブハイブリダイゼーション及び遺伝子発現アレイから選択される方法により、定量し得る。このスクリーニング法は、バイオマーカーにおける多形の検出も含み得る。或いは、このスクリーニングステップは、ポリメラーゼ連鎖反応、ヘテロデュプレックス分析、一本鎖構造多形分析、リガーゼ連鎖反応、比較ゲノムハイブリダイゼーション、サザンブロット、ノーザンブロット、ウェスタンブロット、酵素免疫吸着アッセイ、蛍光共鳴エネルギー移動、及び配列決定からなる群から選択される少なくとも１種の技法を用いて実現し得る。本発明で使用するために、試料は、多種の免疫細胞、例えば白血球、又はそれらの準構成要素のいずれでもよい。
【００２２】
例えば、１又は複数の転移性メラノーマ発現ベクトルの発現量を含むデータベースの決定による、メラノーマを有する対象を同定する方法。本発明の別の実施形態は、複数の試料プローブ強度を得ることにより、試料の遺伝子型を決定するコンピュータプログラムを含む。転移性メラノーマの診断は、試料プローブ強度、及び試料プローブ強度と基準プローブ強度との間の線形相関係数の計算に基づく。
【００２３】
本発明は、試料の遺伝子型を決定する方法を実施するためのコンピュータ実行可能な指令を含んだ、コンピュータ可読性媒体も含む。表現型を決定する方法は、複数の試料プローブ強度を得るステップ、表２、３、８、９、１２及びそれらの組合せに列挙したものからデータセット中に選択される２種以上の転移性メラノーマ発現ベクトルについて、試料プローブ強度に基づいてメラノーマを診断するステップ、及び試料プローブ強度と基準プローブ強度との間の線形相関係数を計算するステップを含む。線形相関係数が閾値より大きい場合、試料の表現型として暫定的な表現型が容認される。それに加え、本発明は、メラノーマのヒト対象を特定するためのマイクロアレイも含む。このマイクロアレイは、表２、８、９、１２及びそれらの組合せに列挙した２種以上の転移性メラノーマ遺伝子の発現のデータセット中への検出を含む。本発明は、１又は複数の遺伝子の発現量を決定し、１又は複数の遺伝子発現ベクトルを計算することにより、転移性メラノーマと移植片に伴う免疫抑制とを識別する方法を提供する。メラノーマ特異的なトランスクリプトーム発現ベクトルは、表２、３、８、９、１２及びそれらの組合せに列挙した６種以上の遺伝子を上方調節又は下方調節するための数値を含み得る。本発明は、１又は複数の免疫抑制関連発現ベクトルの発現量を決定することにより、移植片に伴う免疫抑制の対象を特定する方法を提供する。免疫抑制特異的なトランスクリプトーム発現ベクトルは、表１０、１１及び１３、並びにそれらの組合せに列挙した６種以上の遺伝子を上方調節又は下方調節するための数値を含み得る。
【００２４】
本発明は、複数の試料プローブ強度を得るステップ、及び試料プローブ強度に基づいて免疫抑制を診断するステップを含む、試料の免疫抑制の素因を決定するコンピュータプログラムも含む。線形相関係数は、複数の試料プローブ強度と基準プローブ強度との間の計算である。次いで、線形相関係数が閾値より大きい場合、暫定的な遺伝子型を試料の遺伝子型として容認する。メラノーマ特異的なトランスクリプトーム発現ベクトルは、表２、８、９、１２及びそれらの組合せに列挙した６種以上の遺伝子を上方調節又は下方調節するための数値を含み得る。免疫抑制特異的なトランスクリプトーム発現ベクトルは、表１０、１１及び１３、並びにそれらの組合せに列挙した６種以上の遺伝子を上方調節又は下方調節するための数値を含み得る。
【００２５】
試料の表現型を決定する方法を実施するためのコンピュータ実行可能な命令を有する、コンピュータ可読性媒体も含まれる。試料の表現型を決定する方法は、複数の試料プローブ強度を得るステップ、及び２種以上の免疫抑制関連発現ベクトルについて、試料プローブ強度に基づいて免疫抑制を診断するステップを含む。試料プローブ強度と基準プローブ強度との間で、線形相関係数を計算し、線形相関係数が閾値より大きい場合、暫定的な表現型を試料の表現型として容認する。本発明は、１種、２種、３種、４種、５種、６種、８種、１０種、１５種、２０種、２５種又はそれより多種の遺伝子から選択される２種以上の免疫抑制発現ベクトルの発現量を決定する発現量検出器を含んだ、免疫抑制を診断するシステムも含む。データセット中にその後保存される発現データを各遺伝子について生成するために使用される、メラノーマ特異的なトランスクリプトーム発現ベクトルは、表２、８、９、１２及びそれらの組合せに列挙した６種以上の遺伝子を上方調節又は下方調節するための数値を含み得る。免疫抑制特異的なトランスクリプトーム発現ベクトルは、表１０、１１及び１３、並びにそれらの組合せに列挙した６種以上の遺伝子の上方調節又は下方調節を含んだ数値をデータセット中に含み得る。
【００２６】
本発明のアレイ、方法及びシステムは、見込み患者のトランスクリプトームを得るステップ、臨床試験で治療する予定の疾患又は病態を指示する１又は複数の転写モジュールと、そのトランスクリプトームを比較するステップ、及び患者のトランスクリプトーム中に発現される１又は複数の遺伝子の、臨床試験での好結果と相関する１又は複数の転写モジュール内における有無又は量に基づいて、その患者が臨床試験の適正な候補である可能性を判定するステップによって、臨床試験に向けて患者を選定するためにさえも使用し得る。一般に、各モジュールに対して、試料中の転写物の比率全体と相関するベクトルを使用し得る、例えば、各モジュールがベクトルを含み、１又は複数の疾患又は病態が１又は複数のベクトルに関連する場合である。したがって、各モジュールは、各モジュール内の１又は複数の遺伝子の発現量と相関するベクトルを含み得る。
【００２７】
本発明は、１又は複数の疾患の識別に十分な比率の差次的発現遺伝子をもたらす、１又は複数の発現ベクトル由来のプローブを十分に含んだ固体支持体上に、固定化された核酸プローブをアレイ、例えばカスタムマイクロアレイも含む。例えば、固体支持体上に固定化された核酸プローブのアレイであって、該アレイは少なくとも２セットのプローブモジュールを含み、第１のプローブセットにあるプローブは、１又は複数の疾患にそれぞれ対応する１又は複数の取調べ位置を有する。該アレイは、１００〜１００，０００プローブを有することができ、各プローブは、例えばヌクレオチド９〜２１個の長さになり得る。組織化したプローブセットに分けた際、こうしたプローブは別々に取調べを受けることができる。
【００２８】
本発明は、各群が表１に規定する１又は複数のプローブを有する、第１及び第２のプローブ群を少なくとも一対含んだモジュールアレイを形成するために、固体支持体上に固定化された１又は複数の核酸プローブも含む。該プローブ群は、マイクロアレイプラットフォームを通して整合する複合転写マーカーベクトルを与えるように選択される。実際に、該プローブ群は、マイクロアレイプラットフォームを通して整合し、規制認可のために一括表示される複合転写マーカーベクトルを与えるためにさえ、使用し得る。本発明のモジュールを用いて、様々な疾患及び／又は病態を速やかに診断し、又はそれらを識別するために使用し得る、１又は複数の疾患特異的アレイを速やかに開発することが可能であることは、当業者であれば理解されよう。
【００２９】
本発明は、モジュール各々に対して遺伝子発現ベクトル総計値を画像表示するために、１又は複数の遺伝子を１又は複数のモジュールに分離するステップ、及び各モジュールにおける遺伝子発現ベクトル総計値の過剰発現、過少発現又は等価発現について、遺伝子発現ベクトル総計値を表示するステップによって、トランスクリプトームベクトルデータを表示する方法も含む。一例では、過剰発現は第１の識別子で特定され、過少発現は第２の識別子で特定される。識別子の例には、色、形、パターン、明暗、オンオフ、記号、及びそれらの組合せが挙げられる。例えば、過剰発現は第１の識別子で特定され、過少発現は第２の識別子で特定されており、第１の識別子が第１の色であり、第２の識別子が第２の色であって、第１及び第２の識別子を重ね合わせて混合色を得る。
【００３０】
本発明の特徴及び利点をより完全に理解するために、添付した図と共に、本発明の詳細な説明を以下に言及する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１Ａ】容認した遺伝子レベルマイクロアレイデータの分析に関わる基本的なマイクロアレイデータマイニング戦略の各ステップを示す図である。
【図１Ｂ】本発明のモジュールマイニング戦略を示す図である。
【図１Ｃ】発現ベクトルの創製に使用される１又は複数のデータセットを生成するためのモジュール抽出アルゴリズムの原寸表示を示す図である。
【図２】独立の試料群にわたるモジュール遺伝子発現プロファイルのレベルを示す転写プロファイルを表すグラフである。
【図３】協調発現された遺伝子４セットについて得られた、文献中でのキーワード出現率の分布を示す図である。
【図４】転写系の特性決定をするためのモジュールマイクロアレイの分析戦略を示す図である。
【図５】患者血中白血球の転写プロファイルの分析を示す図である。
【図６】疾患が起こす転写変化のモジュールマップを示す図である。
【図７】転移性メラノーマ患者における血中白血球の転写シグニチャーの特定を示す図である。
【図８】独立の試料セットにおけるマイクロアレイ結果の検証を示す図である。
【図９】免疫抑制薬物療法を受けた被移植者における血中白血球の転写シグニチャーの特定を示す図である。
【図１０】モジュールレベル分析の詳細結果を示す図である。
【図１１】モジュールレベル分析の詳細結果を示す図である。
【図１２】モジュールレベル分析の詳細結果を示す図である。
【図１３】モジュールレベル分析の詳細結果を示す図である。
【図１４】転移性メラノーマ患者及び肝臓被移植者の血液中の特徴的転写シグニチャーに対するモジュールレベル分析を示す図である。
【図１５】モジュールレベルにおける患者血中白血球の転写変化のマッピングを示す図である。
【図１６】転移性メラノーマ患者及び肝臓被移植者の血液中の共通的転写シグニチャーに対するモジュールレベル分析を示す図である。
【図１７】健常志願者と比較してメラノーマ、肝臓移植両患者に高度に発現する遺伝子を用いた有意パターンの分析を示す図である。
【図１８】メラノーマ群及び移植群に共通する普遍的及び特異的な遺伝子シグニチャーのモジュール分布を示す図である。
【図１９】免疫抑制の転写シグニチャーを示す図である。
【図２０】患者及び各対照の統計的な群間比較を示す図である。
【図２１】ＳＬＥ患者では過剰発現するが、急性インフルエンザＡ型感染症患者では過剰発現しない遺伝子に対する、有意パターンの分析を示す図である。
【図２２】インフルエンザＡ型及びＳＬＥに共通する遺伝子に対する、有意パターンを示す図である。
【図２３】インフルエンザ感染症及び狼瘡の患者が共有し、有意パターンに従って区分した遺伝子の機能分析を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明の各種実施形態の実施及び使用を以下で詳細に考察するが、本発明は、多種多様な特定の関係において具体化できる、適用可能で進歩性のある多くの概念を提供することを理解されたい。本明細書で考察する特定の実施形態は、本発明を実施し、使用する特定の方法を単に例示しているだけであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【００３３】
本発明の理解を容易にするために、多数の用語を以下に定義する。本明細書で定義する用語は、本発明に関わる分野の技術者が通常理解している意味を有する。「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」などの用語は、単一の構成要素だけを指すのではなく、例示のためにその具体例を使用し得る部類全体を包含することを意図している。本明細書における専門用語は、本発明の特定の実施形態を述べるために使用するが、その使用法は、特許請求の範囲中で概説されない限り、本発明を限定するものではない。別途定義しない限り、本明細書で使用する技術及び科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の技術者が通常理解している意味を有する。以下の参考文献は、本発明で使用する用語の多数に関する一般的定義を技術者に与えてくれる：Singleton, et. al., Dictionary Of Microbiology And Molecular Biology (2d ed. 1994); The Cambridge Dictionary Of Science And Technology (Walker ed., 1988); The Glossary Of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991);及びHale & Marham, The Harper Collins Dictionary Of Biology (1991).
【００３４】
各種の生化学的及び分子生物学的方法が、当技術分野で周知である。例えば、核酸を単離及び精製する方法は、国際公開第９７／１０３６５号パンフレット、国際公開第９７／２７３１７号パンフレット、Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, (P. Tijssen, ed.) Elsevier, N.Y. (1993)の第３章、Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part 1. Theory and Nucleic Acid Preparation, (P. Tijssen, ed.) Elsevier, N.Y. (1993)の第３章、及びSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., (1989)、並びにCurrent Protocols in Molecular Biology, (Ausubel, F. M. et al., eds.) John Wiley & Sons, Inc., New   York (1987-1999)と、その補遺であるsupplement 46 (April 1999)などに詳細に記載されている。
【００３５】
バイオインフォマティクスの定義
本明細書で使用する場合、「目的物（object）」とは、所望の任意の項目又は情報を指す（名詞、動詞、形容詞、副詞、句、文、記号、数字などを含む、一般にテキスト通りのもの）。したがって、目的物は、関係を形成できる任意の事項、並びにソースから入手、特定及び／又は検索できる任意の事項である。「目的物」には、それだけに限らないが、遺伝子、タンパク質、疾患、表現型、機構、薬物などの所望の構成要素が含まれる。いくつかの態様では、目的物は、以下に更に記載するようにデータでもよい。
【００３６】
本明細書で使用する場合、「関係」とは、同じユニット（例えば、句、文、テキストの２行以上、段落、ウェブページの項、ページ、雑誌、書類、本など）内におけるオブジェクトの同時出現を指す。それは、テキスト、記号、数値及びそれらの組合せでもよい。
【００３７】
本明細書で使用する場合、「メタデータコンテンツ」とは、データソースにおけるテキストの編成に関する情報を指す。メタデータは、Dublin Coreメタデータなどの標準的メタデータを含むことができ、又は収集内容に独特なものでもよい。メタデータフォーマットの形式例には、それだけに限らないが、図書目録に使用されるMachine Readable Catalog （ＭＡＲＣ）記録、Resource Description Format （ＲＤＦ）及びExtensible Markup Language （ＸＭＬ）が挙げられる。メタオブジェクトは、手操作又は自動情報抽出アルゴリズムにより生成し得る。
【００３８】
本明細書で使用する場合、「エンジン」とは、他のプログラムのために中枢又は必須機能を行うプログラムを指す。例えば、エンジンには、他のプログラムの全般的な作動を調整するオペレーティングシステム又はアプリケーションプログラムの中心プログラムがなり得る。「エンジン」という用語は、変更できるアルゴリズムを含んだプログラムを指すこともある。例えば、知識発見用エンジンは、関係を特定し、順位付けする新規な規則を反映させるために、関係を特定する手法を変更できるように設計し得る。
【００３９】
本明細書で使用する場合、「意味解析（semantic analysis）」とは、類似概念を表現する単語間の関係を、例えば、接尾辞の除去若しくは語幹の設定、又はシソーラスの使用により特定することを指す。「統計分析」とは、各用語（単語、語根、語幹、ｎ−ｇｒａｍ、句など）の出現を計数することに基づいた技法を指す。主題に関して制限のない収集内容では、異なる文脈に使用される同じ句は異なる概念を表すこともある。句の同時出現に関する統計分析は、語意のあいまいさを解消するために役立てることができる。「構文解析」は、品詞解析によりあいまいさを更に減らすために使用することができる。本明細書で使用する場合、このような解析の１又は複数は、より一般的には「字句解析」と呼称される。「人工知能（ＡＩ）」とは、人間にとって注目に値する、又は「知的」と思われる作業を、コンピュータなどの非人的装置が行う方法を指す。その例には、画像の特定、話し言葉又は文書の理解、及び問題の解決が挙げられる。
【００４０】
本明細書で使用する場合、「データベース」又は「データセット」という用語は、多様な情報ファセットをデータフィールド内に見出すことができる場合でも、生データ又は編集データの宝庫を指す。データベースは、内容にアクセスし、それを管理し、更新する（例えば、データベースは動的である）ことができるように通常整理されている。「データベース」及び「ソース」という用語は、データ及び情報の主たるソースがデータベースであるので、本発明では互換的にも使用される。しかし、「ソースデータベース」又は「ソースデータ」とは、データ、例えば、非構造化テキスト、及び／又はオブジェクトを特定し、関係を決定するためにシステム中に入力される、構造化データを一般に指す。ソースデータベースは、リレーショナルデータベースの場合も、そうでない場合もある。しかし、システムデータベースには、オブジェクト間の関係に関する保存数値を保存又は包含する、リレーショナルデータベース、又は何らかの等価型のデータベース若しくはデータセットが普通、含まれている。
【００４１】
本明細書で使用する場合、「システムデータベース」及び「リレーショナルデータベース」は、互換的に使用され、所定のカテゴリーに適合したデータを含む１組の表に整理した１又は複数のデータ集合体を指す。例えば、データベース表は、縦列で規定される１又は複数のカテゴリー（例えば、属性）を含み得るのに対し、データベースの横列は、縦列で規定されるカテゴリーに対する独特のオブジェクトを含み得る。したがって、遺伝子の同一性などのオブジェクトは、その遺伝子の有無及び／又は発現量に対する縦列を有することもある。リレーショナルデータベースの横列は、「セット」とも呼称されることがあり、その縦列の各数値で一般に規定される。リレーショナルデータベースに関する「ドメイン」とは、縦列などのフィールドが含み得る一連の有効な数値である。
【００４２】
本明細書で使用する場合、「知識領域」とは、システムが作動する研究分野、例えば、すべての生物医学データを指す。いくつかの領域のデータ、例えば、生物医学データ及びエンジニアリングデータを組み合わせることには利点があることを指摘すべきである。何故なら、この多様なデータは、１つの分野又は調査／研究（１つの領域）だけしか精通していない普通の人には集められない事項を時には繋ぎ合わせることができる。「分散型データベース」とは、ネットワーク中の異なるポイント間で分散又は複製し得るデータベースを指す。
【００４３】
「データ」、「情報」などの用語は、「情報」及び「知識」同様に、しばしば互換的に使用される。本明細書で使用する場合、「データ」とは、実験的な１測定値又は１組の測定値である最も基本的なユニットである。データは、情報に寄与するように編集されるが、前者は基本的には後者から独立している。対照的に、情報は関心から導き出される、例えば、心血管疾患の危険性と相関する変数を見出すために、民族性、性別、身長、体重及び食事に関するデータ（ユニット）を集めることもある。しかし、その同じデータは、調理法の開発、又は、食事の好みに関する「情報」、即ち、スーパーマーケットのある種の製品がより高い販売確率を有するという確率の創出に使用することができよう。
【００４４】
本明細書で使用する場合、「情報」とは、数字、文字、数字のセット、文字のセットを含み得るデータセット、又は、データ１セットから得られる若しくは引き出される結論を指す。次に「データ」は、測定値又は統計値であり、情報の基本ユニットである。「情報」は、単語、記号、非構造化フリーテキストなどのテキスト、コードなどの他種のデータも含み得る。「知識」とは、原因と結果をモデル化するシステムを十分に理解できるようにする、情報１セットと大まかに定義される。先の例を拡張すると、人口統計、性別及びこれまでの購入歴に関する情報は、食品販売の地域販売戦略を開発するために使用し得る一方、国籍に関する情報は、製品輸入の指針としてバイヤーが使用することができよう。データ、情報及び知識の間に厳密な境界はなく、この３つの用語は時々同等と見なされることに留意することが重要である。一般に、データは調査に由来し、情報は相互の関連付けに由来し、知識はモデル化に由来する。
【００４５】
本明細書で使用する場合、「プログラム」又は「コンピュータプログラム」とは、特定のプログラム言語の規則に従っており、ある種の機能、タスク又は問題の解決又は実行に必要な「コードセグメント」に分割可能である宣言及び命令文、又は命令からなる構文ユニットを一般に指している。プログラム言語とは、一般に、プログラムを表現する人工言語である。
【００４６】
本明細書で使用する場合、「システム」又は「コンピュータシステム」とは、データ処理を行う、１又は複数のコンピュータ、周辺機器及びソフトウェアを一般に指している。「ユーザ」又は「システムオペレーター」には、データ処理及び情報交換のために、「ユーザ装置」（例えば、コンピュータ、無線装置など）を介してアクセスされるコンピュータネットワークを使用する個人が一般に含まれる。「コンピュータ」とは、人間を介在せずに多数の算術演算及び論理演算を含め、多量の計算を行うことのできる機能ユニットである。
【００４７】
本明細書で使用する場合、「アプリケーションソフトウェア」又は「アプリケーションプログラム」とは、アプリケーション問題の解決に特有のソフトウェア又はプログラムを一般に指している。「アプリケーション問題」とは、一般に、エンドユーザにより提示され、その解決のために情報処理を要する問題である。
【００４８】
本明細書で使用する場合、「自然言語」とは、特別な指示をせずに現在の使用法に基づく規則を有する言語、例えば、英語、スペイン語又は中国語を指す。本明細書で使用する場合、「人工言語」とは、使用前に明確に確立した規則を有する言語、例えば、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｊａｖａ（登録商標）、ＢＡＳＩＣ、ＦＯＲＴＲＡＮ又はＣＯＢＯＬなどのコンピュータプログラミング言語を指す。
【００４９】
本明細書で使用する場合、「統計的関連性」とは、ある関係が、無作為確率で期待されるより有意に高い頻度で発生する場合、その関係が統計的に関連性ありと判定される、順位付け体系（Ｏ／Ｅ比、強度など）の１又は複数の使用を指す。
【００５０】
本明細書で使用する場合、「協調調節される遺伝子」又は「転写モジュール」は、特定遺伝子のグループ別遺伝子発現プロファイル（例えば、特定の遺伝子配列に関わるシグナル値）を指すために、互換的に使用される。各転写モジュールは、２種のキーデータ、即ち、文献検索部分と、遺伝子マイクロアレイから得られる実際の遺伝子発現実験値データとを相関させる。転写モジュール中に選択される遺伝子のセットは、遺伝子発現データの分析（上記のモジュール抽出アルゴリズムを用いて）に基づく。追加の各ステップは、Chaussabel, D. & Sher, A. Mining microarray expression data by literature profiling. Genome Biol 3, RESEARCH0055 (2002), (http://genomebiology.com/2002/3/10/research/0055)により教示され、関連部分は、参照により本明細書に組み込まれており、発現データは、所望の疾患又は病態、例えば、全身性エリテマトーデス、関節炎、リンパ腫、癌腫、メラノーマ、急性感染症、自己免疫疾患、自己炎症性障害など）から得られる。
【００５１】
下記の表は、文献検索部分の開発、又は転写モジュールへの寄与のために使用したキーワードの例を列挙している。他の病態、例えば、特定の癌、特定の感染症、移植などのために他の用語を容易に選択し得ることは、当業者であれば認識されよう。例えば、Ｔ細胞活性化に関わる遺伝子、及びそうした遺伝子に対するシグナルは、モジュールＩＤ「Ｍ２．８」として下記されており、そこではある種のキーワード（例えば、リンパ腫、Ｔ細胞、ＣＤ４、ＣＤ８、ＴＣＲ、胸腺、リンパ球、ＩＬ２）を用いて、キーとなるＴ細胞付随遺伝子、例えば、Ｔ細胞表面マーカー（ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ２６、ＣＤ２８、ＣＤ９６）；リンパ球系細胞が発現する分子（リンホトキシンβ、ＩＬ２誘導Ｔ細胞キナーゼ、ＴＣＦ７；及びＴ細胞分化タンパク質ｍａｌ、ＧＡＴＡ３、ＳＴＡＴ５Ｂ）を特定した。次に、こうした遺伝子（プラットフォーム、有無、及び／又は上方若しくは下方調節に関係なく）に対する患者のデータを相関させて、転写モジュールを生成することにより、完全なモジュールが開発される。いくつかの事例では、当該遺伝子プロファイルが、これらの病態及びデータについて特定の遺伝子クラスタリングに（現時点では）一致しないが、ある種の生理学的経路（例えば、ｃＡＭＰシグナル伝達、ジンクフィンガータンパク質、細胞表面マーカーなど）が「不確定」モジュール内に見出される。実際に、遺伝子発現データを用いて、キーワード検索と一致させる前に、協調発現する遺伝子を抽出し得る、即ち、いずれのデータセットも、第２のデータセットと交差参照する前に相関させ得る。
【００５２】
【表１】
2010508826.tif 000002
2010508826.tif 000003
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【００５３】
本明細書で使用する場合、用語「アレイ」とは、１又は複数のペプチド又は核酸プローブを支持体に結合した、固体の支持体又は基材を指す。アレイは、基材表面の既知の異なる箇所にカップリングした、１又は複数の異なる核酸又はペプチドプローブを通常有している。「マイクロアレイ」、「遺伝子チップ」又はＤＮＡチップとも表現されるこうしたアレイは、既知のゲノム、例えばヒトゲノムに基づいた１０，０００個、２０，０００個、３０，０００個又は４０，０００個の異なる同定可能な遺伝子を有し得る。こうしたパンアレイは、試料中に発現される、又は見出される遺伝子の「トランスクリプトーム」又は転写プールの全体、例えば、ＲＴ及び／又はＲＴ−ＰＣＲを受けることによりＤＮＡレプリコンの相補セットを作製し得る、ＲＮＡ、ｍＲＮＡなどとして発現される核酸を検出するために、使用される。アレイは、機械的合成法、非リトグラフィー法及び／又はフォトリトグラフィー法の組合せを取り込んだ光誘導合成法、並びに固相合成法を用いて製造し得る。３μｍビーズに結合した５０量体のオリゴヌクレオチドプローブを含んだビーズアレイを使用し得るが、例えば、スライドガラス表面のマイクロウェル中に留置して、又は、液相中のデジタルビーズアレイであり、検出及び同定に「バーコード付き」ガラス棒を使用する液相懸濁アレイ（例えば、Luminex又はIllumina）の一部として、使用し得る。
【００５４】
こうした核酸アレイを合成する様々な技法が、これまで記載されており、例えば、ほぼ任意形状の表面又は多数の表面にさえ作製されてきた。アレイは、ビーズ、ゲル、ポリマー表面、光ファイバーなどの繊維、ガラス、又は適当な任意の基材上のペプチド又は核酸でもよい。アレイは、診断、又は包括的器具の他の操作を可能とするようにまとめてもよい。例えば、その関連部分を参照により本明細書に組み込んである米国特許第６９５５７８８号明細書を参照されたい。
【００５５】
生物学的定義
本明細書で使用する場合、用語「疾患」とは、細胞が何らかの異常な生物学的状態にある生物の生理状態を指す。疾患には、それだけに限らないが、固有であり、遺伝しており、感染が原因となり、異常な細胞機能、異常な細胞分裂などが原因となり得る、細胞、組織、体内機能、全身又は器官の妨害、停止又は障害が挙げられる。「疾患状態」を起こす疾患は、生物系、即ち疾患の宿主にとって一般に有害である。本発明に関しては、感染（例えば、ウィルス、細菌、真菌、寄生虫などによる）、炎症、自己炎症、自己免疫、アナフィラキシー、アレルギー、前癌状態、悪性腫瘍、手術、移植、疾患又は障害に関わる生理状態などの任意の生物学的状態が、疾患状態であると見なされる。病的状態は、疾患状態と一般に同等である。
【００５６】
疾患状態は、異なる程度の疾患状態にも区分し得る。本明細書で使用する場合、疾患又は疾患状態の程度は、疾患又は疾患状態の進行、並びに治療時、治療中及び治療後の生理的応答を反映する任意の尺度である。疾患又は疾患状態は、一般に、疾患の影響が益々重大となるレベル又は段階を経て進行することになろう。疾患状態の程度には、試料中の細胞の生理状態が影響し得る。
【００５７】
本明細書で使用する場合、「療法」又は「治療計画」という用語は、疾患状態を緩和又は変化させるために採られる医療措置、例えば、薬理、外科、食事及び／又は他の技法を用いて疾患の影響又は症状を低減又は除去することを意図した治療の過程を指す。治療計画は、１又は複数の薬物の処方による投薬、又は手術を含み得る。療法は、大概は有益であり、疾患状態を低減させようが、多くの例では、療法の作用は、望ましくない又は副次的な作用を示すことになろう。療法の作用は、宿主の生理状態、例えば、年齢、性別、遺伝、体重、他の疾患状態などにも影響されよう。
【００５８】
本明細書で使用する場合、「薬理状態」又は「薬理状況」という用語は、例えば、薬理介入の結果、新たに転写され、安定化され、及び／又は不安定化される、試料中の１又は複数の核酸の薬理状態に影響し得る１又は複数の薬物、手術などで、治療を今後する、現在している、及び／又は過去にした試料に言及している。試料の薬理状態は、薬物治療の前、間及び／又は後における生物学的状態の変化に関しており、本明細書で教示するように、診断機能又は予後機能として役立ち得る。薬物治療又は手術後のいくつかの変化は、疾患状態に関わることもあり、及び／又はその療法の無関係な副作用であることもある。薬理状態の変化は、治療期間、処方薬の種類及び用量、所与の治療過程に対する順守度、及び／又は摂取した非処方薬から予想される結果である。
【００５９】
本明細書で使用する場合、用語「生物学的状態」とは、発現の変化を分析するために分離し、精製した細胞試料のトランスクリプトーム（即ち、ＲＮＡ転写物の全集合体）の状態を指す。生物学的状態は、形態的表現型又は転写物検知法の組合せに従って特徴付けられる、細胞成分の存在量及び／又は活性の測定により、試料中の細胞の生理状態を反映する。
【００６０】
本明細書で使用する場合、用語「発現プロファイル」とは、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はタンパク質の存在量又は活性量の相対的存在量を指す。発現プロファイルには、例えば、転写状態又は翻訳状態の測定値がなり得るが、その測定は、任意数の方法により、及び多数の遺伝子チップ、遺伝子アレイ、ビーズ、マルチプレックスＰＣＲ、定量ＰＣＲ、ランオンアッセイ、ノーザンブロット分析、ウェスタンブロット分析、タンパク質発現、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）、酵素免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、化学発光試験、酵素アッセイ、増殖試験のいずれか、或いは遺伝子発現の決定及び／又は分析用で、商業的に容易に入手できる他の任意の方法、装置及びシステムを用いてなされる。
【００６１】
本明細書で使用する場合、試料の「転写状態」という用語は、試料中に存在するＲＮＡ種、特にｍＲＮＡの同一性及び相対存在量を包含する。試料の全転写状態、即ちＲＮＡの同一性及び存在量の組合せは、本明細書ではトランスクリプトームとも呼称される。一般に、試料中のＲＮＡ種のセット全体について、すべての相対的成分の実質的分率が測定される。
【００６２】
本明細書で使用する場合、「転写ベクトル」、「発現ベクトル」、「ゲノムベクトル」（互換的に使用される）という用語は、「差次的発現遺伝子の比率」を反映した転写発現データを指す。例えば、各モジュールについて、少なくとも２群（例えば、健常対象対患者）間に差次的に発現される転写物の比率。このベクトルは、２群の試料の比較により導き出される。第１の分析ステップは、各モジュール内の疾患特異的な転写物セットを選択するために使用される。次に「発現量」がある。所与の疾患に対する群間比較によって、各モジュールに対する差次的発現遺伝子のリストが得られる。異なる疾患からモジュール内転写物の異なるサブセットが得られることが判明した。次いで、この発現量を用いて、差次的に発現されると確認された疾患特異的な遺伝子サブセットの発現値を平均することにより、単一試料の各モジュール（複数も）に対するベクトルを計算することが可能になる。この手法によって、単一試料のモジュール内発現ベクトル、例えば、本明細書に開示されているモジュールマップ中に表現されているものに関するマップ作成が可能となる。こうしたベクトルモジュールマップは、各試料について導き出すことのできる、各モジュールに対する平均発現量（差次的発現遺伝子の比率の代わりに）を表す。これらの複合「発現ベクトル」は、連続回の選択、即ち１）試験群間で有意に変化したモジュールの選択、及び２）試験群間で有意に変化するこれらのモジュール内での遺伝子の選択を経て形成される（図２、ステップII）。続いて、発現量が、各ベクトルを形成する転写物のサブセットについて得られた数値を平均することにより、導き出される（図２、ステップIII）。次いで、これらのベクトル各々について得られた発現量をグラフ上に（例えば、レーダープロット上に）プロットすることにより、患者プロファイルを表すことができる。したがって、ベクトル１セットが、２回の選択、まずモジュールレベル、次いで遺伝子レベルでの選択から生じる。ベクトル発現値は、そのベクトルを形成する転写物の平均発現値から導き出されるので、構成上複合的である。
【００６３】
本発明を用いて、モジュールレベルだけでなく遺伝子レベルでも疾患を特定し、識別することが可能である。即ち、２種の疾患は同じベクトルを有することができる（差次的に発現される転写物の同一比率、つまり同一「極性」）が、発現ベクトルの遺伝子組成は、依然として疾患特異性を保ち得る。この疾患特異的カスタム化によって、ユーザが、所与のマーカーセットの特異性を高めることにより、その性能を最適化することが可能になる。
【００６４】
モジュールを基盤として使用することにより、発現ベクトルは、含んだノイズ量が最小限の、一貫した機能／転写ユニットへ。更に、本発明は複合転写マーカーを利用している。本明細書で使用する場合、用語「複合転写マーカー」とは、マーカーとして個々の遺伝子を使用することと比較した場合の、多重遺伝子（モジュールのサブセット）の平均発現値を指す（また、これらのマーカーの組成は疾患特異的になり得る）。複合転写マーカーという手法は、ユーザが、例えばＳＬＥの患者の疾患重度を評価するため、又は本明細書に開示の発現ベクトルを導き出すために、多変量マイクロアレイスコアを開発できるので、独特である。発現ベクトルが複合的である（即ち、転写物の組合せで形成される）という事実は、これらのマーカーの安定性に更に寄与する。最も重要なことには、本発明のモジュール内複合転写マーカーを用いると、本明細書に見出される結果がマイクロアレイプラットフォームを通して再現性を示し、そのため規制当局の認可のために信頼性が高まることが判明した。事実、マイクロアレイプラットフォーム間で得られる優れた再現性、並びに小児狼瘡患者の独立した１セットにおいて得られた検証結果により示されるように、ベクトル発現値は著しくロバストであることが分かった。マイクロアレイデータの信頼性向上が、臨床実務におけるこの技術の広範な使用の前提条件であるので、これらの結果は重要である。
【００６５】
本発明で使用する遺伝子発現モニタリングシステムは、１又は複数の標的疾患に特異的であり、及び／又はカスタム化されている限定数及び／又は基本数の遺伝子を用いる、カスタム化遺伝子アレイを含み得る。慣例的に使用されている一般的なパンゲノムアレイと異なり、本発明は、特定のプラットフォームを使用する必要なしに、遺伝子及びゲノムのレトロスペクティブ分析のためにこうした一般的アレイの使用を提供するだけでなく、より重要なことには、他の数千もの無関係な遺伝子を必要とせずに、最適な分析用遺伝子セットをもたらすカスタム化アレイの開発を提供する。本発明の最適化アレイ及びモジュールの現行技術に対する際立った一利点は、財務費用（例えば、アッセイ当たりの費用、材料、装置、時間、人材、訓練など）の低下であり、より重要なことには、厖大なデータが無関係であるパンアレイを製造する際の環境コストの低下である。本発明のモジュールは、最少数のプローブで最適なデータを得る一方、シグナル対ノイズ比を最大限にする単純なカスタムアレイの設計を初めて可能にする。分析用遺伝子の総数を削除することにより、例えば、厖大な量の無関係データを生む汎用遺伝子チップの製造中に、数千もの高価なフォトリトグラフィー用白金マスクを製造する必要を除くことが可能となる。本発明を使用して、本発明の限られたプローブセット（複数も）を、例えば、デジタル光学式化学アレイ、ボールビーズアレイ、ビーズ（例えば、Luminex）、マルチプレックスＰＣＲ、定量ＰＣＲ、ランオンアッセイ、ノーザンブロット分析、又はタンパク質分析に対してさえ、例えば、ウェスタンブロット分析、２Ｄ及び３Ｄゲルタンパク質発現、ＭＡＬＤＩ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）（細胞表面若しくは細胞内）、酵素免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、化学発光試験、酵素アッセイ、増殖試験、或いは遺伝子発現の決定及び／又は分析用で、商業的に容易に入手できる他の任意の方法、装置及びシステムと共に使用するならば、マイクロアレイの必要性を完全に回避することが可能である。
【００６６】
本発明の「分子指紋方式」は、異なる細胞若しくは組織、同じ細胞若しくは組織の異なる亜集団、同じ細胞若しくは組織の異なる生理状態、同じ細胞若しくは組織の異なる発生段階、又は同じ組織の異なる細胞集団における発現を、他の疾患及び／又は正常細胞の対照に対して比較分析することを促進し、実施するために使用し得る。いくつかの事例では、正常若しくは野生型発現データが、同時若しくはほぼ同時に分析される試料から得られる場合もあり、又はそのデータが、現存の遺伝子アレイ発現データベース、例えば、ＮＣＢＩ Gene Expression Omnibusデータベースなどの公的データベースから入手若しくは抜粋された発現データである場合もある。
【００６７】
本明細書で使用する場合、用語「差次的発現」とは、２つ以上の試料、例えば、疾患試料と正常試料との間で変化する細胞成分（例えば、核酸、タンパク質、酵素活性など）の測定値を示す。細胞成分は、オンのこともオフのこともあり（存在している、又は欠如している）、基準値に対して上方調節されていることも、基準値に対して下方調節されていることもある。遺伝子チップ又は遺伝子アレイでの使用では、核酸、例えば、ｍＲＮＡ又は他のＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ等）の差次的遺伝子発現は、細胞型又は核酸の識別をするために使用し得る。細胞の転写状態の測定は、最も普通には、定量的逆転写酵素（ＲＴ）及び／又は定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ゲノム発現分析、翻訳後分析、ゲノムＤＮＡに対する修飾、転座、インシトゥ（in situ）ハイブリダイゼーションなどにより実現される。
【００６８】
いくつかの疾患状態については、特に疾患状態の早期段階で、細胞上又は形態上の差を特定することが可能である。本発明では、細胞自体の遺伝子のモジュールを調べることにより、又はより重要なことには、通常の生理的範囲内で、即ち、免疫活性化中、免疫寛容中、又は免疫アネルギー中にさえ作用している、免疫エフェクター細胞由来の遺伝子の細胞内ＲＮＡ発現を調べることにより、そうした特異的変異又は１若しくは複数の遺伝子を同定する必要性が回避される。遺伝子変異は一群の遺伝子の発現量を激変させ得るが、生物系は、他の遺伝子の発現を変化させることにより、その変化を補償することがしばしばある。こうした内部補償応答の結果、多くの摂動は、その系の認め得る表現型に最小限の作用しか及ぼさないが、細胞成分の組成には甚大な作用を及ぼし得る。同様に、遺伝子転写物の実際のコピーは、増加しないことも減少しないこともあるが、転写物の寿命又は半減期は、タンパク質産生を大幅に増加させるような影響を受け得る。本発明は、一実施形態では、単一のメッセージ及び／又は変異ではなく、エフェクター細胞（例えば、白血球、リンパ球、及び／又はそれらの亜集団）を調べることにより、実際のメッセージを検出する必要性を排除する。
【００６９】
当業者であれば、試料は、例えば、単一細胞、細胞集合体、組織、細胞培養物などを含む多様な供給源から取得し得ることは、容易に理解されよう。ある種の事例では、例えば、尿、血液、唾液、組織又は生検試料中に見出される細胞から、十分なＲＮＡを単離することが可能なことさえもある。ある種の状況では、十分な細胞及び／又はＲＮＡは、粘膜分泌物、糞便、涙液、血漿、腹水、間質液、硬膜内液、脳脊髄液、汗又は他の体液から取得し得る。核酸源、例えば組織源又は細胞源には、組織生検試料、１若しくは複数の分取細胞集団、細胞培養物、細胞クローン、形質転換細胞、生検体、又は単一細胞を含み得る。組織源には、例えば、脳、肝臓、心臓、腎臓、肺、脾臓、網膜、骨、神経、リンパ節、内分泌線、生殖器官、血液、神経、血管組織及び嗅覚上皮を含み得る。
【００７０】
本発明は、単独又は組み合わせて使用し得る以下の基本構成要素、即ち、１若しくは複数のデータマイニングアルゴリズム；１若しくは複数のモジュールレベル分析プロセス；血中白血球転写モジュールの特性決定；ヒト疾患に分子的診断／予後を下すための多変量分析における集計モジュールデータの使用；及び／又はモジュールレベルのデータと結果の視覚化を包含する。本発明を使用すれば、複合転写マーカーを開発し、分析することも可能であり、そのマーカーは、単一の多変量スコアに更に統合し得る。
【００７１】
本発明者等は、現在のマイクロアレイベースの研究が、「ノイズが多い」という悪評のデータ、即ち、解釈が困難で、研究室間及びプラットフォーム間で対応が十分に取れないデータの分析で、大きな難題に直面していることを認識している。マイクロアレイデータの広く受け入れられている分析手法は、試験群間で差次的に発現する遺伝子サブセットの特定から始まる。次に、ユーザは、パターン発見アルゴリズム及び現在の科学知識を用いて、生成した遺伝子リストの「意味を理解する」ことをその後に試みる。
【００７２】
プラットフォーム間の大きな変動性に対処するのではなく、本発明者等は、分析の初期段階で生物学的に関連ある遺伝子の選択を重視する戦略を開発した。手短に言えば、この方法には、所与の生物系を特徴付ける転写成分の同定が含まれ、その系に対して、大きなデータ集合体から協調発現する遺伝子の群又は転写モジュールを分析し、抽出するために、改良されたデータマイニングアルゴリズムを開発した。
【００７３】
本明細書に記載のバイオマーカー発見戦略は、全体的規模で収集したマイクロアレイデータの利用に特に良く適合していた。転写物約４４，０００個から始めて、転写物ほぼ５０００個からなる２８モジュール１セットを確定した。次いで、疾患特異的な複合発現ベクトルの各セットを導き出した。ベクトル発現値（発現ベクトル）は、マイクロアレイプラットフォーム間で得られた優れた再現性に示されるように、著しくロバストであることが分かった。マイクロアレイデータの信頼性向上は、臨床実務におけるこの技術の広範な使用の前提条件であるので、この知見は注目すべきである。最終的に、発現ベクトルを順に組み合わせることにより、特異な多変量スコアを取得し、したがって主流の臨床実務に適合可能な形態で結果を伝えることができる。注目すべきことに、多変量スコアは、個々のマーカーの変化ではなく、変化の全体的パターンを再現する。このような「全体的バイオマーカー」の開発は、診断、薬理ゲノミクスの両分野のために使用することができる。
【００７４】
一例では、４７４２プローブセットを再編した２８転写モジュールが、血中白血球の２３９転写プロファイルから得られた。これらのモジュールを形成する遺伝子間の機能的収斂は、文献プロファイルの作成を通じて示された。第２のステップは、モジュール基準での転写系の摂動試験からなっていた。この概念を例示するために、健常志願者及び患者から得られる白血球転写プロファイルを取得し、比較し、分析した。この遺伝子指紋戦略の更なる検証は、公表されているマイクロアレイデータセットの分析を通じて得られた。
【００７５】
目覚しいことには、既存のデータを用いた本発明の転写モジュールの装置、システム及び方法は、市販の２つのマイクロアレイプラットフォーム間で高度な再現性を示した。
【００７６】
本発明は、転写系のモジュール分析用に設計した、適用広範な２段階マイクロアレイデータマイニング戦略の実施を包含する。この新規な手法を用いて、臨床関連の最も入手し易い情報源を構成する、血中白血球の転写シグニチャーの特性決定を行った。
【００７７】
本明細書に示すように、当該ベクトルが２種の疾患に対して同一（＋／＋）、例えば、ＳＬＥ、ＦＬＵの双方に対してＭ１．３＝５３％減であるとしても、両疾患を区別するために各ベクトルの組成をなお使用できるので、２つのベクトルに基づいて２種の疾患を判定、区別及び／又は識別することが可能である。例えば、差次的発現転写物の比率及び極性が、Ｍ１．３に対し２種の疾患の間で同一であっても、遺伝子組成は、依然として疾患特異性を保つことができる。遺伝子レベル及びモジュールレベルの分析を併用すると、分解能は相当に増加する。更に、疾患を区別するために、モジュールを２個、３個、４個、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、２８個、又はそれより多数個、使用することが可能である。
【００７８】
用語「遺伝子」とは、ポリペプチド（例えば）、前駆体、又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の産生に必要なコード配列を含む核酸（例えば、ＤＮＡ）配列を指す。ポリペプチドは、全長コード配列、又は、全長若しくは断片の所望の活性若しくは機能性（例えば、酵素活性、リガンド結合、シグナル伝達、免疫原性など）が保持される限り、そのコード配列の任意の部分によって、コードされ得る。この用語は、構造遺伝子のコード領域と、そのコード領域に隣接し、５’、３’両末端上に、両末端上の約２ｋｂ以上の距離に対して、該遺伝子が全長ｍＲＮＡと該遺伝子の転写性に影響する５’調節配列との長さに対応するように、配置された各配列とを包含もする。コード領域の５’側に配置され、ｍＲＮＡ上に存在する配列は、５’−非翻訳配列と呼称される。５’−非翻訳配列は、普通、調節配列を含有する。コード領域の３’側又はその下流に配置され、ｍＲＮＡ上に存在する配列は、３’−非翻訳配列と呼称される。用語「遺伝子」は、遺伝子のｃＤＮＡ形及びゲノム形を共に包含する。遺伝子のゲノム形又はクローンは、「イントロン」又は「介在領域」又は「介在配列」と称する非コード配列で割り込まれたコード領域を含有する。イントロンは、核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）中に転写される遺伝子セグメントであり、イントロンは、エンハンサーなどの調節要素を含有し得る。イントロンは、核転写物又は一次転写物から除外され、又は「スプライシングで除かれ」、そのため、イントロンは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写物中には存在しない。ｍＲＮＡは、発生しつつあるポリペプチド中のアミノ酸の配列又は順序を指定するために、翻訳中に機能する。
【００７９】
本明細書で使用する場合、用語「核酸」とは、それだけに限らないが、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びＲＮＡを含む、任意の核酸含有分子を指す。特に、「表Ｘ中の遺伝子」という用語は、以下に見出されるように、特定の表中に列挙した少なくとも一部分又は全長配列を指す。その遺伝子は、ゲノム形でさえも見出される、又は検出されることもあり、即ち、それには１又は複数のイントロンが含まれる。遺伝子のゲノム形は、コード配列の５’及び３’末端上に配置され、そのＲＮＡ転写物上に存在する配列も含み得る。これらの配列は、「フランキング」配列又は領域と呼称される。５’フランキング領域は、プロモーター、エンハンサーなどの遺伝子の転写を制御し、又はそれに影響する調節配列を含有し得る。３’フランキング領域は、転写終結、転写後切断、ｍＲＮＡの安定性、及びポリアデニル化に影響する調節配列を含有し得る。
【００８０】
本明細書で使用する場合、用語「野生型」とは、天然源から単離された遺伝子又は遺伝子産物を指す。野生型遺伝子は、集団中に最も頻繁に認められる遺伝子であり、したがって、その遺伝子の「正常」又は「野生型」形態と任意に呼称される。対照的に、「改変された」又は「変異体」という用語は、野生型遺伝子又は遺伝子産物と比較したとき、配列及び／又は機能特性に改変（即ち、変化した特性）を示す遺伝子又は遺伝子産物を指している。天然の変異体を単離できることが認められるが、これらの変異体は、野生型遺伝子又は遺伝子産物と比較したとき、変化した特性（変化した核酸配列を含めて）を有するという事実により特定される。
【００８１】
本明細書で使用する場合、用語「多形」とは、単一の異種交配集団における、ある遺伝子に関する２種以上の対立遺伝子の正規な同時発生を指し、希少な方の対立遺伝子の頻度は、反復突然変異だけで説明できる頻度より大きい（通常１％超）。
【００８２】
本明細書で使用する場合、「をコードする核酸分子」、「をコードするＤＮＡ配列」及び「をコードするＤＮＡ」という用語は、デオキシリボ核酸のストランドに沿ったデオキシリボヌクレオチドの順序又は配列に言及する。こうしたデオキシリボヌクレオチドの順序が、ポリペプチド（タンパク質）鎖に沿ったアミノ酸の順序を決定する。したがって、ＤＮＡ配列はアミノ酸配列をコードする。
【００８３】
本明細書で使用する場合、「相補的」又は「相補性」という用語は、塩基対形成規則により関係付けられるポリヌクレオチド（即ち、ヌクレオチドの配列）に関して使用される。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」は、配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」に相補的である。相補性は「部分的」である場合もあり、その場合、核酸塩基の一部だけが、塩基対形成規則に従って適合している。或いは、核酸の間で「完全な」又は「全体的な」相補性が存在することもある。核酸鎖の間の相補性の程度は、核酸鎖の間でのハイブリダイゼーションの効率及び強度に大きな効果を及ぼす。この程度は、増幅反応、並びに核酸間の結合に依存する検出法において特に重要である。
【００８４】
本明細書で使用する場合、用語「ハイブリダイゼーション」は、相補的な核酸の対形成に関して使用される。ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの強度（即ち、核酸間の結合強度）は、核酸間の相補性の程度、使用する条件のストリンジェンシー（stringency）、形成されるハイブリッドのＴｍ、核酸内のＧ対Ｃ比などの要因に影響される。構造内に相補的核酸の対形成を含有する単一分子は、「自己ハイブリッド化」されていると言う。
【００８５】
本明細書で使用する場合、用語「ストリンジェント」は、核酸のハイブリダイゼーションを行う、温度、イオン強度、及び有機溶媒などの他の化合物の存在からなる条件に関して使用される。「低ストリンジェント条件」下では、所望の核酸配列は、正確な相補体、１塩基ミスマッチを有する配列、関連密接な配列（例えば、相同性が９０％以上の配列）、及び相同性が一部にすぎない配列（例えば、相同性が５０〜９０％の配列）とハイブリッドを形成することになろう。「中ストリンジェント条件」下では、所望の核酸配列は、正確な相補体、１塩基ミスマッチを有する配列、及び関連密接な配列（例えば、相同性が９０％以上の配列）とハイブリッドを形成するにすぎないことになろう。「高ストリンジェント条件」下では、所望の核酸配列は、正確な相補体、及び（温度などの条件に応じて）１塩基ミスマッチを有する配列とハイブリッドを形成するにすぎないことになろう。言い換えれば、高ストリンジェントの条件下では、１塩基ミスマッチを有する配列とのハイブリッド形成を除外するように、温度を上げることができる。
【００８６】
本明細書で使用する場合、用語「プローブ」とは、精製した制限酵素消化物のように自然に発生しようが、合成、組換え又はＰＣＲ増幅で産生しようが、所望の別のオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成できるオリゴヌクレオチド（即ち、ヌクレオチドの配列）を指す。プローブは、一本鎖の場合も２本鎖の場合もある。プローブは、特定の遺伝子配列の検出、同定及び単離に有用である。本発明に使用する任意のプローブは、それだけに限らないが、酵素系（例えば、ＥＬＩＳＡ並びに酵素法組織化学アッセイ）、蛍光系、放射活性系、発光系などを含む、任意の検出系で検出できるように、任意の「レポーター分子」で標識してもよい。本発明を任意の特定の検出系又は標識に限定することは、意図していない。
【００８７】
本明細書で使用する場合、用語「標的」とは、プライマーが結合する核酸の領域を指す。したがって、「標的」は、他の核酸配列から選別しようとされる。「セグメント」は、標的配列内にある核酸の領域と定義される。
【００８８】
本明細書で使用する場合、用語「サザンブロット」とは、アガロース又はアクリルアミドのゲル上でＤＮＡを分析し、サイズに従ってＤＮＡを分画した後、ＤＮＡをゲルから、ニトロセルロースやナイロン膜などの固体支持体上に移すことを指す。次いで、固定化ＤＮＡを標識プローブで探知することにより、使用したプローブに相補的なＤＮＡ種を検出する。ＤＮＡは、電気泳動の前に制限酵素で切断してもよい。電気泳動の後、ＤＮＡは、固体支持体上に移す前又はその間に、部分的に脱プリンし、変性させてもよい。サザンブロットは、分子生物学者の標準的ツールである（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY, pp 9.31-9.58, 1989）。
【００８９】
本明細書で使用する場合、用語「ノーザンブロット」とは、アガロースゲル上でのＲＮＡの電気泳動によりＲＮＡを分析し、サイズに従ってＲＮＡを分画した後、ＲＮＡをゲルから、ニトロセルロースやナイロン膜などの固体支持体上に移すことを指す。次いで、固定化ＲＮＡを標識プローブで探知することにより、使用したプローブに相補的なＲＮＡ種を検出する。ノーザンブロットは、分子生物学者の標準的ツールである（Sambrook et al., supra, pp 7.39-7.52, 1989）。
【００９０】
本明細書で使用する場合、用語「ウェスタンブロット」とは、ニトロセルロースや膜などの支持体上に固定化されたタンパク質（複数も）（又はポリペプチド）の分析を指す。タンパク質をアクリルアミドゲル上で移動させることにより、タンパク質を分離した後、タンパク質をゲルから、ニトロセルロースやナイロン膜などの固体支持体上に移す。次いで、固定化タンパク質を、所望の抗原に対して反応性を有する抗体に曝す。抗体の結合は、放射標識抗体の使用を含む、多様な方法により検出し得る。
【００９１】
本明細書で使用する場合、用語「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）とは、クローニングや精製をせずに、ゲノムＤＮＡの混合物中にある標的配列のセグメントの濃度を増加させる方法を記載した、K. B. Mullisの方法（参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４６８３１９５号、第４６８３２０２号及び第４９６５１８８号各明細書）を指す。標的配列を増幅するこのプロセスは、所望の標的配列を含有するＤＮＡ混合物に大過剰のオリゴヌクレオチドプライマー２種を導入した後、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で厳密な一連の熱サイクルを行うことからなる。この２種のプライマーは、２本鎖標的配列の各鎖に相補的である。増幅するには、混合物を変性した後、標的分子内の相補配列にプライマーをアニーリングする。アニーリングの後、プライマーをポリメラーゼで伸長させて、新たな一対の相補鎖を形成する。変性、プライマーアニーリング及びポリメラーゼ伸長の各ステップを多数回繰り返す（即ち、変性、アニーリング及び伸長で１「サイクル」が構成され、多数回の「サイクル」を行い得る）ことにより、所望の標的配列の増幅セグメントを高濃度で得ることができる。所望の標的配列の増幅セグメント長は、プライマー相互の相対位置で決定され、したがってこの長さは制御可能なパラメーターである。このプロセスの反復性態様によって、この方法は「ポリメラーゼ連鎖反応」（以後は「ＰＣＲ」）と呼称される。標的配列の所望の増幅セグメントは、混合物中で主要な配列となる（濃度に関して）ので、「ＰＣＲ増幅された」と言われる。
【００９２】
本明細書で使用する場合、「ＰＣＲ産物」、「ＰＣＲ断片」及び「増幅産物」という用語は、変性、アニーリング及び伸長のＰＣＲステップを２サイクル以上完了した後の生成した化合物混合物を指す。これらの用語は、１又は複数の標的配列の１又は複数のセグメントを増幅した場合も包含する。
【００９３】
本明細書で使用する場合、本明細書で使用する場合の用語「リアルタイムＰＣＲ」とは、反応完了後とは対照的に、その間に増幅を測定するＰＣＲの各種適用を指す。本発明のリアルタイムＰＣＲの実施形態での使用に適した試薬には、それだけに限らないが、TaqManプローブ、分子ビーコン、Scorpionsプライマー又は２本鎖ＤＮＡ結合色素が挙げられる。
【００９４】
本明細書で使用する場合、本明細書で使用する場合の用語「転写上方調節」とは、ＤＮＡ鋳型を用いたＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ合成の増加を指す。例えば、本発明の方法に関して使用する場合、用語「転写上方調節」とは、ＳＬＥの素因がない個人由来の試料中の検出量と比較したとき、ＳＬＥの素因がある個人由来の試料中に検出される、所望遺伝子に対応するｍＲＮＡ量が、少なくとも１〜２倍、２〜３倍、３〜１０倍、及び１０倍超ですら増加することを指す。しかし、このシステム及び評価は、検出しようとする発現が２倍未満の変化で済むに十分な特異性を有する。更に、この発現の変化は、細胞レベル（単一細胞内若しくは細胞集団内の発現変化）でもよく、又は遺伝子を発現している細胞数の変化が起こる組織レベルで評価してさえもよい。特に有用な差は、統計的に有意な差である。
【００９５】
逆に用語「転写下方調節」とは、ＤＮＡ鋳型を用いたＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ合成の減少を指す。例えば、本発明の方法に関して使用する場合、用語「転写下方調節」とは、ＳＬＥの素因がある個人由来の試料中に検出される、所望遺伝子に対応するｍＲＮＡ量が、そのような病態の素因がない個人由来の試料中の検出量、或いは野生型及び／又は正常対照、例えば線維筋痛の情報データベースと比較したとき、少なくとも２倍、２〜３倍、３〜１０倍、及び１０倍超ですら減少することを指す。やはり、このシステム及び評価も、検出しようとする発現が２倍未満の変化で済むに十分な特異性を有する。特に有用な差は、統計的に有意な差である。
【００９６】
転写「上方調節」／過剰発現及び転写「下方調節」／過少発現も共に、所望の遺伝子に対応する翻訳産物量又はタンパク質量の測定により間接的にモニターし得る。本発明は、転写の上方調節又は下方調節に関連する所与のいずれの機構にも限定されない。
【００９７】
本明細書で使用する場合の用語「真核細胞」とは、膜結合し、構造的に個別の核と、十分に発達した他の細胞内区画とを有する細胞又は生物を指す。真核生物には、ウィルス、細菌及び藍藻を除いたすべての生物が含まれる。
【００９８】
本明細書で使用する場合、用語「インビトロ転写」とは、プロモーターを含有する精製ＤＮＡ鋳型、リボヌクレオチド三リン酸、還元剤と陽イオン、例えばＤＴＴ及びマグネシウムイオンとを含む緩衝系、並びに適当なＲＮＡポリメラーゼを含み、生細胞又は生物の外部で行われる転写反応を指す。
【００９９】
本明細書で使用する場合、用語「増幅試薬」とは、プライマー、核酸鋳型及び増幅酵素は別として、増幅に必要な試薬（デオキシリボヌクレオチド三リン酸、緩衝剤など）を指す。通常、増幅試薬は、他の反応成分と共に反応容器（試験管、マイクロウェルなど）中に投入し、収容される。
【０１００】
本明細書で使用する場合、用語「診断」とは、疾患症例の本質の判定を指す。本発明のいくつかの実施形態では、ＳＬＥの判定を可能とする診断方法が提供される。
【０１０１】
本発明は、疾患の進行及び／又は患者の管理をモニターするために、単独で又は疾患療法と組み合わせて使用し得る。例えば、患者は、最良の治療過程を決定し、治療が意図した医療効果を有しているか否か、その患者が特定のその療法にとって候補者でないかどうか、及びその双方を判定するために、１回又は複数回の試験を受けることがある。当業者であれば、発現ベクトルの１又は複数が、１又は複数の疾患を指示し得るものであり、急性、慢性のいずれかに関わらず他の病態の影響を受け得ることを認識されよう。
【０１０２】
本明細書で使用する場合、用語「薬理遺伝試験」とは、例えば、薬物の吸収及び処置（薬物動態）又は薬物作用（薬力学）に関連したＤＮＡ配列の個体間変動を調べることを意図したアッセイを指し、その変動は、例えば、輸送体、代謝酵素、受容体及び他のタンパク質の機能をコードする１又は複数の遺伝子の多形変動を含み得る。
【０１０３】
本明細書で使用する場合、用語「薬理ゲノム試験」とは、薬理機能及び治療応答と相関し得る、全ゲノム又は候補遺伝子の個体間変動、例えば、一塩基変異多型（ＳＮＰ）マップ若しくはハプロタイプマーカー、及び遺伝子発現若しくは不活性化の変化を調べるために用いるアッセイを指す。
【０１０４】
本明細書で使用する場合、「発現プロファイル」とは、複数の細胞成分の相対的存在量に関する測定値を指す。このような測定値には、例えば、ＲＮＡ又はタンパク質の存在量又は活性量を含み得る。発現プロファイルには、例えば、転写状態又は翻訳状態の測定値がなり得る。関連部分が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６０４０１３８号、第５８００９９２号、第６０２０１３５号、第６０３３８６０号の各明細書を参照されたい。遺伝子発現モニタリングシステムには、核酸プローブアレイ、膜ブロット（ノーザン、サザン、ドットなどのハイブリダイゼーション分析に使用するようなブロット）、又はマイクロウェル、試料管、ゲル、ビーズ若しくはファイバー（或いは、結合した核酸を含む任意の固体支持体）が含まれる。関連部分が参照により本明細書に組み込まれる、例えば、米国特許第５７７０７２２号、第５８７４２１９号、第５７４４３０５号、第５６７７１９５号及び第５４４５９３４号の各明細書を参照されたい。遺伝子発現モニタリングシステムは、溶液中の核酸プローブも含み得る。
【０１０５】
本発明による遺伝子発現モニタリングシステムは、異なる細胞若しくは組織、同じ細胞若しくは組織の異なる亜集団、同じ細胞若しくは組織の異なる生理状態、同じ細胞若しくは組織の異なる発生段階、又は同じ組織の異なる細胞集団における発現の比較分析を促進するために使用し得る。
【０１０６】
本明細書で使用する場合、用語「差次的発現」とは、２つ以上の試料で変化する細胞成分の測定値を示す。細胞成分は、試験試料中で基準値に対して上方調節されていることも、試験試料中で１又は複数の基準値に対して下方調節されていることもある。差次的遺伝子発現は、細胞型又は核酸の識別をするために使用することもできる。関連部分が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５８００９９２号明細書を参照されたい。
【０１０７】
療法又は治療計画：疾患状態を緩和又は変化させるために、療法又は治療計画がしばしば企てられる。本明細書で使用する場合、療法又は治療計画は、疾患の影響又は症状を低減又は除去することを意図した治療の過程を指す。治療計画は、それだけに限らないが、１若しくは複数の薬物の処方による投薬、又は手術を通常、含むことになろう。療法は、理想的には、有益であり、疾患状態を低減させようが、多くの例では、療法の作用は、望ましくない作用も示すことになろう。療法の作用は、試料の生理状態にも影響されよう。
【０１０８】
モジュールは特有の「転写挙動」を示す。同時発現する遺伝子は、機能的に繋がっていると広く想定されている。「連座制」というこの概念は、遺伝子が多くの試料間で複雑な発現パターンを示す場合に特に頼らざるを得ない。本発明者等は、転写モジュールが一貫した生物学的ユニットを形成することを発見し、したがって、初期のデータセット中に特定された同時発現性が、独立した試料セット中に保存されると予測した。データは、健常志願者２１名の血液から分離したＰＢＭＣから得た。これらの試料は、上記のモジュール選択プロセスでは使用しなかった。
【０１０９】
本発明は、単独又は組み合わせて使用し得る以下の基本構成要素、即ち、１若しくは複数のデータマイニングアルゴリズム；１若しくは複数のモジュールレベル分析プロセス；血中白血球転写モジュールの特性決定；ヒト疾患に分子的診断／予後を下すための多変量分析における集計モジュールデータの使用；及び／又はモジュールレベルのデータと結果の視覚化を包含する。本発明を使用すれば、複合転写マーカーを開発し、分析することも可能であり、そのマーカーは、単一の多変量スコアに更に統合し得る。
【０１１０】
本発明者等は、現在のマイクロアレイベースの研究が、「ノイズが多い」という悪評のデータ、即ち、解釈が困難で、研究室間及びプラットフォーム間で対応が十分に取れないデータの分析で、大きな難題に直面していることを認識している。マイクロアレイデータの広く受け入れられている分析手法は、試験群間で差次的に発現する遺伝子サブセットの特定から始まる。次に、ユーザは、パターン発見アルゴリズム及び現在の科学知識を用いて、生成した遺伝子リストの「意味を理解する」ことをその後に試みる。
【０１１１】
プラットフォーム間の大きな変動性に対処するのではなく、本発明者等は、分析の初期段階で生物学的に関連ある遺伝子の選択を重視する戦略を開発した。手短に言えば、この方法には、所与の生物系を特徴付ける転写成分の同定が含まれ、その系に対して、大きなデータ集合体から協調発現する遺伝子の群又は転写モジュールを分析し、抽出するために、改良されたデータマイニングアルゴリズムを開発した。
【０１１２】
本発明者等が開発したバイオマーカー発見戦略は、全体的規模で収集したマイクロアレイデータの利用に特に良く適合している。転写物約４４０００個から始めて、転写物ほぼ５０００個からなる２８モジュールを確定した。次いで、疾患特異的な複合発現ベクトルの各セットを導き出した。ベクトル発現値は、マイクロアレイプラットフォーム間で得られた優れた再現性に示されるように、著しくロバストであることが分かった。マイクロアレイデータの信頼性向上は、臨床実務におけるこの技術の広範な使用の前提条件であるので、この知見は注目すべきである。最終的に、発現ベクトルを順に組み合わせることにより、特異な多変量スコアを取得し、したがって主流の臨床実務に適合可能な形態で結果を伝えることができる。注目すべきことに、多変量スコアは、個々のマーカーの変化ではなく、変化の全体的パターンを再現する。したがって、このような「全体的バイオマーカー」の開発は、診断、薬理ゲノミクスの両分野にとって有望な展望となる。
【０１１３】
一例では、４７４２プローブセットを再編した２８転写モジュールが、血中白血球の２３９転写プロファイルから得られた。これらのモジュールを形成する遺伝子間の機能的収斂は、文献プロファイルの作成を通じて示された。第２のステップは、モジュール基準での転写系の摂動試験からなっていた。この概念を例示するために、健常志願者及び患者から得られる白血球転写プロファイルを取得し、比較し、分析した。この遺伝子指紋戦略の更なる検証は、公表されているマイクロアレイデータセットの分析を通じて得られた。目覚しいことには、既存のデータを用いた本発明の転写モジュールの装置、システム及び方法は、市販の２つのマイクロアレイプラットフォーム間で高度な再現性を示した。
【０１１４】
本発明は、転写系のモジュール分析用に設計した、適用広範な２段階マイクロアレイデータマイニング戦略の実施を包含する。この新規な手法を用いて、臨床関連の最も入手し易い情報源を構成する、血中白血球の転写シグニチャーの特性決定を行った。
【０１１５】
本明細書に示すように、当該ベクトルが２種の疾患に対して同一（＋／＋）、例えば、ＳＬＥ、ＦＬＵの双方に対してＭ１．３＝５３％減であるとしても、両疾患を区別するために各ベクトルの組成をなお使用できるので、２つのベクトルに基づいて２種の疾患を判定、区別及び／又は識別することが可能である。例えば、差次的発現転写物の比率及び極性が、Ｍ１．３に対し２種の疾患の間で同一であっても、遺伝子組成は、依然として疾患特異性を保つことができる。遺伝子レベル及びモジュールレベルの分析を併用すると、分解能は相当に増加する。更に、疾患を区別するために、モジュールを２個、３個、４個、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、２８個、又はそれより多数個、使用することが可能である。
【０１１６】
材料及び方法。血液試料の処理。すべての血液試料は、酸性クエン酸デキストロースチューブ（BD Vacutainer）中に採取し、処理のためにBaylor Institute for Immunology Research, Dallas, ＴＸへ室温で直ちに発送した。血液３〜４ｍｌからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ficoll勾配を介して分離し、β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）と共にＲＬＴ試薬（Qiagen, Valencia, ＣＡ）中で直ちに溶解し、ＲＮＡ抽出ステップまで−８０℃で保存した。
【０１１７】
マイクロアレイ分析。RNeasyキット（Qiagen）を用い、製造業者の使用説明に従って総ＲＮＡを分離し、Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent, Palo Alto, ＣＡ）を用いてＲＮＡ全体を評価した。
【０１１８】
Affymetrix GeneChip：これらのマイクロアレイは、石英ウェーハ上その場で合成した短鎖オリゴヌクレオチドプローブセットを含む。標的の標識は、製造業者の標準的手順（Affymetrix Inc., Santa Clara, ＣＡ）に従って行った。ビオチニル化ｃＲＮＡ標的を精製し、その後AffymetrixのHG-U133A及びU133B GeneChip（＞４４０００プローブセット）とハイブリッド形成した。アレイは、Affymetrix共焦点レーザースキャナーを用いて掃引した。Microarray Suite, Version 5.0（MAS 5.0, Affymetrix）のソフトウェアを用いて、ハイブリダイゼーション蛍光シグナルを評価し、シグナルを規格化し、シグナル検出コールを評価した。チップ当たりシグナル値の規格化は、GeneChip当たり標的強度値を５００へスケーリングするMAS 5.0大域法を用いて実現した。遺伝子発現分析のソフトウェアプログラムGeneSpring, Version 7.1（Agilent）を用いて、統計分析及び階層的クラスター化を行った。
【０１１９】
Illumina BeadChip：これらのマイクロアレイは、スライドガラスの表面のマイクロウェル中に留置してある、３μｍビーズに結合した５０量体のオリゴヌクレオチドプローブを含む。試料は、サービス契約に基づいてIllumina Inc.（San Diego, ＣＡ）が処理し、収得した。標的は、IlluminaＲＮＡ増幅キット（Ambion, Austin, ＴＸ）を用いて調製した。ｃＲＮＡ標的は、Sentrix HumanRef8 BeadChip（＞２５０００プローブ）とハイブリッド形成し、Illumina BeadStation 500上で掃引した。IlluminaのBeadstudioソフトウェアを用いて、ハイブリダイゼーション蛍光シグナルを評価した。
【０１２０】
文献プロファイル作成。この試験に使用された文献プロファイル作成アルゴリズムは、以前に詳細に記載されている（関連部分が参照により本明細書に組み込まれる、Chaussabel, D. & Sher, A. Mining microarray expression data by literature profiling. Genome Biol 3, RESEARCH0055 (2002)）。この手法は、類似のキーワードを共有する遺伝子を関連付ける。該手法では、文献アブストラクトにおける用語出現のパターンを分析するために、好評な監視なしパターン発見アルゴリズムである階層的クラスター化が使用される。ステップ１：各遺伝子の関連刊行物を特定する遺伝子文献指数を創出する。ステップ２：用語出現頻度をテキストプロセッサーで計算した。ステップ３：厳密なフィルター規準を用いて、関連キーワードを選択する（即ち、全遺伝子に及ぶ高頻度又は低頻度の用語を削除し、少数だけの遺伝子に高頻度のパターンを特徴とする少数の識別性用語を保持する）。ステップ４：遺伝子と出現パターンに基づく関連キーワードとの階層的クラスター化双方向群であって、一群の遺伝子間に存在する機能的関係を視覚的に表示する双方向群。
【０１２１】
モジュールデータマイニングアルゴリズム。まず、単一遺伝子のレベルを超えた生物系の特性決定を可能とする、１又は複数の転写成分を同定する。新規なマイニングアルゴリズムを用いて協調調節される遺伝子のセット、又は転写モジュールを抽出し、これを血中白血球のマイクロアレイプロファイルの大きなセットに適用した（図１）。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の合計２３９試料からの遺伝子発現プロファイルを、Affymetrix U133A&B GeneChip（＞４４０００プローブセット）を用いて生成した。転写データは、８実験群について取得した（全身若年性特発性関節炎、全身性エリテマトーデス、Ｉ型糖尿病、肝臓被移植者、メラノーマ患者、並びに大腸菌、黄色ブドウ球菌及びインフルエンザＡ型の急性感染症患者）。各群について、全病態を通してフラグコールが存在しない転写物をフィルターに掛けて除外した。残りの遺伝子を階層的クラスター化（クラスターＣ１〜Ｃ３０）により３０セットの間に分配した。各遺伝子に対するクラスターの割当てを表に記録し、分配パターンを全遺伝子の間で比較した。モジュールは、全試験群中の同じクラスターに属する遺伝子の最大セット（即ち、８実験群の８群中の同じクラスターに見出された遺伝子）から始める反復プロセスを用いて選択した。次いで、この基準コアパターンから７／８、６／８及び５／８が一致する遺伝子を含めるように、その選択を拡張した。生成した遺伝子セットは、転写モジュールを形成し、選択プールから抜き取った。次いで、２番目に大きい遺伝子セットから始めてそのプロセスを反復し、次第にストリンジェンシーを低下させていった。この分析により、モジュール２８個の間に分配された転写物５３４８個が特定された（完全なリストは補足資料として提供されている）。各モジュールには、選択の回及び順を示す特有の識別子が割り当てられている（即ち、Ｍ３．１は３回目の選択で特定された第１モジュールであった）。
【０１２２】
「有意パターン」の分析は、同じAffymetrixシステム上で標準操作手順を用いて操作したAffymetrix HG-U133A GeneChipを用いて生成した、患者及び健常志願者から得たＰＢＭＣの遺伝子発現データに関して行った。Ｐ値は、７患者群を各健常対照群と比較することにより得た（Mann-Whitney順位検定）。当該各群は、１）全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ、１６試料）、２）インフルエンザＡ型（１６試料）、３）黄色ブドウ球菌（１６試料）、４）大腸菌（１６試料）、及び５）肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）（１４試料）の小児患者、並びに６）免疫抑制療法下で移植片を受け入れた肝臓移植患者（１６試料）、及び７）移植片対宿主病に罹っている骨髄被移植者（ＧＶＨＤ、１２試料）の成人被移植者から構成されていた。対照群も、年齢、性別及びプロジェクトを考慮して形成した（各群１０試料）。「試験群」（インフルエンザＡ型及び／又はＳＬＥ）で有意に変化した遺伝子（ｐ＜０．０１）は、対照に対して過剰発現及び対照に対して過少発現の２セットに分割した。過剰発現セットを形成した遺伝子のＰ値は、「基準群」（大腸菌、黄色ブドウ球菌、肺炎連鎖球菌の感染症、肝臓被移植者、及び移植片対宿主病）について得た。基準群のＰ値は、遺伝子が過少発現したとき１に設定した。試験群において過少発現した遺伝子のセットに同じ手順を用いたが、今度は基準群のＰ値を、遺伝子が過剰発現したとき１に設定した。Ｐ値データは、遺伝子発現分析のソフトウェアプログラム、GeneSpring, Version 7.1（Agilent）で処理し、これを用いて、階層的クラスター化を行い、有意パターンに基づいて遺伝子をグループ分けした。
【０１２３】
モジュールは特有の「転写挙動」を示す。同時発現する遺伝子は、機能的に繋がっていると広く想定されている。「連座制」というこの概念は、遺伝子が多くの試料間で複雑な発現パターンを示す場合に特に頼らざるを得ない。本発明者等は、転写モジュールが一貫した生物学的ユニットを形成することを発見し、したがって、初期のデータセット中に特定された同時発現性が、独立した試料セット中に保存されると予測した。データは、健常志願者２１名の血液から分離したＰＢＭＣから得た。これらの試料は、上記のモジュール選択プロセスでは使用しなかった。
【０１２４】
図２は、異なる４モジュールの遺伝子発現プロファイルが示されていることを示す（図２：Ｍ１．２、Ｍ１．７、Ｍ２．１１及びＭ２．１）。図２のグラフでは、各線は、多数の試料（ｘ軸上の２１試料）にまたがった単一遺伝子の発現量（ｙ軸）を表す。この例における遺伝子発現の差は、「健常」個人間の個体間変動を表す。各モジュール内で、遺伝子は一貫した「転写挙動」を示すことが判明した。実際、遺伝子発現の変動は、全試料にわたって整合しているように見えた（一部の試料では、全遺伝子の発現が上昇し、ピークを形成したが、他の試料では、発現量が全遺伝子に対して低く、窪みを形成した）。重要なことには、ピーク及び窪みが、Ｍ１．２、Ｍ２．１１及びＭ２．１の異なる試料に対して形成されたので、個体間変動はモジュール特異的であるように見えた。更に、変動幅も各モジュールに特徴的であり、Ｍ１．２及びＭ２．１１の発現量は、Ｍ２．１及び特にＭ１．７より変動性が大きかった。したがって、転写モジュールは独立の生物学的変数を構成することが分かる。
【０１２５】
転写モジュールの機能特性決定。次に、モジュールの特性を機能レベルで決定した。各遺伝子のために収集した生物医学文献からキーワードを抽出するために、テキストマイニング手法を採用した（非特許文献１８に記載）。分析した４モジュールに関するキーワードの分布は、明らかに異なっている（図３）。以下は、ある種のモジュールに関連し得るキーワードのリストである。
【０１２６】
・  Ｍ１．２に非常に特異的なキーワードは、血小板、凝集又は血栓症を含み、ＩＴＧＡ２Ｂ（インテグリンα２ｂ、血小板糖タンパク質IIｂ）、ＰＦ４（血小板第４因子）、ＳＥＬＰ（セクレチンＰ）及びＧＰ６（血小板糖タンパク質６）などの遺伝子に関連していた。
・  Ｍ１．３に非常に特異的なキーワードは、Ｂ細胞、免疫グロブリン又はＩｇＧを含み、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ７２Ａ、ＢＬＮＫ（Ｂ細胞リンカータンパク質）、ＢＬＫ（Ｂリンパ球チロシンキナーゼ）及びＰＡＸ５（ペアードボックス遺伝子５、Ｂ細胞系列特異的アクチベーター）などの遺伝子に関連していた。
・  Ｍ１．５に非常に特異的なキーワードは、単球、樹状、ＣＤ１４又はＴｏｌｌ様を含み、ＭＹＤ８８（骨髄分化一次応答遺伝子８８）、ＣＤ８６、ＴＬＲ２（Ｔｏｌｌ様受容体２）、ＬＩＬＲＢ２（白血球免疫グロブリン様受容体２）及びＣＤ１６３などの遺伝子に関連していた。
・  Ｍ３．１に非常に特異的なキーワードは、インターフェロン、ＩＦＮ−α、抗ウィルス又はＩＳＲＥを含み、ＳＴＡＴ１（signal transducer and activator of transcription 1）、ＣＸＣＬ１０（ＣＸＣケモカインリガンド１０、ＩＰ−１０）、ＯＡＳ２（オリゴアデニル酸シンセターゼ）、及びＭＸ２（ミクソウィルス抵抗性２）などの遺伝子に関連していた。
【０１２７】
用語出現のこの対照的パターンは、各モジュールの顕著な機能的一貫性を示している。特定されたすべてのモジュールについて文献から抽出した情報は、転写レベルにおけるＰＢＭＣ系の包括的な機能特性の決定を可能とする。表２は、例えば、メラノーマ及び肝臓移植に対する免疫応答の識別に使用し得る遺伝子の例を示す。
【０１２８】
【表２】
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【０１２９】
単独で、又は図１７に示し、Ｐ２と表示したデータを含む、補足の表に列挙した遺伝子と組み合わせて使用し得る更に別の群であって、過剰発現する以下の遺伝子を１又は複数含み得る群において、該遺伝子は、例えば、ＷＡＲＳ、ＩＦＩ５３、ＩＦＰ５３、ＧＡＭＭＡ−２、ＦＡＭ４６Ｃ、ＦＬＪ２０２０２、Ｈ３Ｆ３Ｂ、Ｈ３．３Ｂ、ＦＯＸＫ２、ＩＬＦ、ＩＬＦ１、ＩＬＦ−１、ＤＵＳＰ５、ＨＶＨ３、ＡＲＦ６、ＤＫＦＺｐ７６２Ｃ１８６、ＢＲＤ２、ＮＡＴ、ＲＮＦ３、ＦＳＲＧ１、ＲＩＮＧ３、ＤＳ６１１３Ｅ、ＫＩＡＡ９００１、ＲＯＲＡ、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＲＯＲ３、ＲＺＲＡ、ＮＲ１Ｆ１、ＤＫＦＺｐ７６２Ｃ１８６、ＤＮＡＪＢ１、ＳＵＩ１、ＣＸＣＲ４、ＨＭ８９、ＬＡＰ３、ＮＰＹＲ、ＷＨＩＭ、ＬＥＳＴＥＲ、ＮＰＹ３Ｒ、ＨＳＹ３ＲＲ、ＮＰＹＹ３Ｒ、Ｄ２Ｓ２０１Ｅ、ＧＲＩＮＬ１Ａ、ＣＴＳＢ、ＴＲＩＰ−Ｂｒ２、ＰＤＥ４Ｂ、ＤＰＤＥ４、ＰＤＥＩＶＢ、ＰＭＡＩＰ１、ＡＰＲ、ＮＯＸＡ、ＢＴＧ２、ＰＣ３、ＴＩＳ２１、ＡＳＡＨＬ、ＳＯＮ、ＳＵＩ１、Ａ１２１、ＩＳＯ１、ＨＥＲＰＵＤ１、ＳＵＰ、Ｍｉｆ１、ＫＩＡＡ００２５、ＤＵＳＰ２、ＰＡＣ１、ＰＡＣ−１、ＲＮＦ１３９、ＲＣＡ１、ＴＲＣ８、ＨＲＣＡ１、ＭＧＣ３１９６１、ＴＮＦＡＩＰ３、Ａ２０、ＴＮＦＡＩＰ２、ＡＲＳ２、ＨＮＲＰＬ、ｈｎＲＮＰ−Ｌ、Ｐ／ＯＫｃ１．１４、Ｃ２０ｏｒｆ６７、Ｃ２０ｏｒｆ１１１、ＨＳＰＣ２０７、ｄＪ１１８３Ｉ２１．１、ＺＮＦ３３１、ＲＩＴＡ、ＺＮＦ３６１、ＺＮＦ４６３、Ｃ２０ｏｒｆ６７、ＩＥＲ５、ＳＢＢＩ４８、ＳＵＩ１、ＪＵＮ、ＡＰ１、ＣＤ６９、ＴＯＢ１、Ｈ３Ｆ３Ｂ、Ｈ３．３Ｂ、ＦＯＬＲ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＣＦ８、ＢＺＰ、ＺＥＢ、ＺＥＢ１、ＡＲＥＢ６、ＺＦＨＥＰ、ＮＩＬ−２Ａ、ＺＦＨＸ１Ａ、ＮＩＬ−２−Ａ、ＤＵＳＰ１０、ＭＫＰ５、ＭＫＰ−５、ＧＧＴＬＡ４、ＭＧＣ５０５５０、ｄＪ８３１Ｃ２１．２、ＰＭＡＩＰ１、ＺＣ３ＨＡＶ１、ＺＡＰ、ＦＬＢ６４２１、ＺＣ３ＨＤＣ２、ＦＬＪ１３２８８、ＭＧＣ４８８９８、ＤＳＩＰＩ、ＤＩＰ、ＧＩＬＺ、ｈＤＩＰ、ＴＳＣ−２２Ｒ、ＭＣＬ１、ＴＭ、ＥＡＴ、ＭＣＬ１Ｌ、ＭＣＬ１Ｓ、ＭＧＣ１８３９、ＳＨ３ＴＣ１、ＦＬＪ２０３５６、ＣＩＡＳ１、ＦＣＵ、ＭＷＳ、ＦＣＡＳ、ＮＡＬＰ３、Ｃ１ｏｒｆ７、ＰＹＰＡＦ１、ＡＩＩ／ＡＶＰ、ＡＧＴＡＶＰＲＬ、ＳＬＣ１５Ａ３、ＰＨＴ２、ＰＴＲ３、ｈＰＴＲ３、ＰＴＤＳＲ、ＰＳＲ、ＰＴＤＳＲ１、ＫＩＡＡ０５８５、ＢＨＬＨＢ２、ＤＥＣ１、ＳＴＲＡ１３、Ｓｔｒａ１４、ＨＭＧＥ、ＫＩＡＡ００６３、ＮＲ４Ａ２、ＮＯＴ、ＰＮＲ１、ＨＺＦ−３、ＴＩＮＵＲ、ＮＲ４Ａ２、ＮＯＴ、ＰＮＲ１、ＨＺＦ−３、ＮＵＲＲ１、ＴＩＮＵＲ、ＰＴＳ、ＰＴＰＳ、ＨＥＡＢ、ＣＬＰ１、ｈＣｌｐ１、ＡＲＥＧ、ＳＤＧＦ、ＣＲＤＧＦ、ＭＧＣ１３６４７、ＥＤＧ４、ＬＰＡ２、ＥＤＧ−４、ＬＰＡＲ２、ＣＲＥＭ、ＩＣＥＲ、ＭＧＣ１７８８１、ＭＧＣ４１８９３、ＣＤ８３、ＢＬ１１、ＨＢ１５、ＺＮＦ３９４、ＦＬＪ１２２９８、及びそれらの組合せ。
【０１３０】
モジュール基準マイクロアレイデータマイニング戦略。「従来の」マイクロアレイ分析の結果は、ノイズが多いと悪評であり、解釈するのが困難である。マイクロアレイデータの広く受け入れられている分析手法は、１）試験群間で差次的に発現する遺伝子を選択するための統計検定の使用、２）生成した遺伝子リストの中でシグニチャーを特定するためのパターン発見アルゴリズムの適用、及び３）文献又はオントロジーのデータベースから導き出される知識を用いたデータの解釈の基本的３ステップを含む。
【０１３１】
本発明は、分析の初期段階で生物学的に関連ある遺伝子の選択を重視する、新規なマイクロアレイデータマイニング戦略を使用する。この第１ステップは、例えば上記のモジュールマイニングアルゴリズムを、各転写モジュールの詳細な特性決定に使用される機能マイニングツールと併用して実施することができる（図４のステップ１上段パネル）。この分析では、遺伝子発現量の群間差を考慮していない。むしろ、本発明は、生物学的変動（例えば、患者集団内の個体間変動）により生じる複雑な遺伝子発現パターンに、代わりに注目している。所与の生物系に関連する転写成分を確定した後、分析の第２ステップは、異なる試験群の比較による遺伝子発現の変化の分析を含む（図４のステップ２下段パネル）。群間比較分析は、各モジュールについて独自に実施される。モジュールレベルでの変化は、有意規準を満たす遺伝子の比率として表現される（図５における円グラフ又は図６におけるスポットによって表示されている）。顕著なことには、モジュールレベルでの比較実施により、遺伝子の「無作為」集合体について数千もの検定を行った際に発生するノイズを回避することが可能になる。
【０１３２】
ヒト疾患におけるＰＢＭＣモジュール転写プロファイルの摂動。上記のマイクロアレイデータマイニング戦略（図４）の第２ステップを例示するために、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の子供１８人及び急性インフルエンザＡ型感染症の子供１６人で構成される、小児患者２集団から得たＰＢＭＣ試料の遺伝子発現データを取得し、比較し、分析した。各患者コホートは、それぞれの対照群と対応させた（健常志願者：ドナー１１人及び１０人をＳＬＥ群及びインフルエンザ群にそれぞれ対応させた）。図４に描写した分析概要に従って、個々の各モジュールに対する患者群と健常者群との統計的な群間比較、及び各モジュールにおいて有意に変化した遺伝子の比率測定（図５）を行った。統計的な群間比較手法によって、ノイズを最小限量しか含まず、特定可能な生物学的意味を保持する良く確定した遺伝子群に、ユーザが分析の焦点を合わせることが可能になる。こうした結果のグラフ表示の手掛りが図４に示されている。
【０１３３】
以下の知見が得られた。（１）Ｍ３．１（「インターフェロン関連」）における高い遺伝子比率は、Ｆｌｕ、ＳＬＥ両群において有意水準を満たした（各々８４％及び９４％）。この観察により、ＳＬＥ患者に関する以前の研究（非特許文献１９）が確証され、急性インフルエンザ感染症の患者におけるインターフェロンシグニチャーの存在が確認される。（２）Ｍ１．３（「Ｂ細胞関連」）における相等しい遺伝子比率は、両群において有意に変化し（５３％）、５０％強がその２つのリスト間で重複した。今回では、遺伝子が、健常者群に比較して患者において一貫して過少発現した。（３）この２種の疾患を識別するモジュールも見出された。モジュール１．１において有意に変化した遺伝子比率は、ＳＬＥ患者では３９％に達し、Ｆｌｕ患者ではほんの７％にすぎないが、この７％は、０．０５の有意水準で、偶然にしか差次的に発現されないと予想される遺伝子比率に非常に近い。注目すべきことには、このモジュールは、免疫グロブリン鎖をコードする遺伝子で殆ど専ら構成されており、形質細胞に関連していた。しかし、このモジュールは、遺伝子発現の量、パターンの双方（示されていない）から見て、Ｂ細胞関連モジュール（Ｍ１．３）とは明らかに異なる。（４）モジュール１．５が示すように、個々のモジュールの遺伝子レベル分析を用いることにより、この２種の疾患を更に識別することができる。それはＭ１．３にも当てはまり、モジュールレベルでの差がない（図４：５３％の過少発現転写物）にもかかわらず、Ｆｌｕ群とＳＬＥ群との差は、遺伝子レベルで確認することができた（Ｍ１．３における過少発現転写物の５１％だけが、２疾患群に共通していた）。これらの例は、マイクロアレイ結果の分析及び解釈を能率化するためのモジュールフレームワークの使用を示している。
【０１３４】
モジュールレベルでの遺伝子発現のマッピング変化。データの視覚化は、複雑なデータセットの解釈にとって最重要であり、本発明は、モジュールレベルで起こる変化の包括的なグラフ表示を包含する。異なる疾患が起こす遺伝子発現量の変化を、ＰＢＭＣの２８転写モジュールについて表示した（図６）。各疾患群を、年齢及び性別を合わせた健常ドナーから構成されるそれぞれの対照群と比較する（ＳＬＥ患者１８人、急性インフルエンザ感染症１６人、転移性メラノーマ１６人、及び免疫抑制薬物治療を受けている肝臓被移植者１６人を、健常対象１０〜１１人からなる各対照群と比較した）。モジュールレベルデータを、格子上に整列させたスポットによりグラフ表示し、各位置を異なるモジュールに対応させた（モジュール各々の機能アノテーションについては表１を参照されたい）。
【０１３５】
スポット強度は、各モジュールについて有意に変化した遺伝子の比率を示す。スポットの色は、その変化の極性を示す（赤色：過剰発現遺伝子の比率、青色：過少発現遺伝子の比率；過剰発現、過少発現双方の遺伝子を有意に含有するモジュールであれば、紫色となろう。だが、まったく観察されなかった）。この表示によって、ＰＢＭＣ転写系の摂動を迅速に評価することが可能になる。このような「モジュールマップ」を各疾患について作成した。４つのマップを比較して、疾患は、モジュールの特異な組合せを特徴とすることが見出された。事実、Ｍ１．１及びＭ１．２の結果だけで、全４疾患の識別をするのに十分であった（Ｍ１．１／Ｍ１．２：ＳＬＥ＝＋／＋；ＦＬＵ＝０／０；メラノーマ＝−／＋；移植＝−／−）。Ｍ３．２（「炎症」）における多数の遺伝子が、全疾患で過剰発現した（特に移植群に当てはまる）が、Ｍ３．１（インターフェロン）における遺伝子は、ＳＬＥ、インフルエンザ感染症の患者で過剰発現し、被移植者ではある程度そうなった。「リボソームタンパク質」モジュールの遺伝子（Ｍ１．７及びＭ２．４）は、ＳＬＥ、ＦＬＵ両群において過少発現した。これらの遺伝子の発現量は、ＳＬＥ患者における疾患活性に逆相関していることが、最近判明した（Bennett et al.、提出済み）。Ｍ２．８は、リンパ球減少ＳＬＥ患者及びＴ細胞を標的とする免疫抑制薬物で処置した被移植者において過少発現する、Ｔ細胞転写物を包含する。
【０１３６】
注目すべきことに、各モジュールにおける差次的発現遺伝子は、主に過少発現している、又は過剰発現しているのいずれかであった（図５及び図６）。とは言え、モジュールは、遺伝子発現プロファイルの類似性に基づいて純粋に選択したものであり、各群間の発現量の変化に基づいて選択したものではない。遺伝子発現の変化が各モジュール内で高度に分極して見えるという事実は、モジュールデータの機能的関連性を表している。したがって、本発明は、患者の血中白血球の転写プロファイルをモジュール分析することにより、疾患の指紋鑑識を可能にする。
【０１３７】
公表データセットにおけるＰＢＭＣモジュールの検証。次に、「第三者」のデータセットにおける上記のＰＢＭＣ転写モジュールの妥当性を検定した。ヒトＰＢＭＣにおける遺伝子発現に対する運動の効果を調べたConnolly, et al.（非特許文献２０）の研究を検定した。
【０１３８】
血液は、下表に見られるように、樹状細胞治療ワクチンの効力を試験するように設計した、３種の第１／２相臨床試験に登録した転移性メラノーマ患者３５人から得られた。遺伝子発現シグニチャーは、ワクチン療法の開始前、及び患者が最後の全身療法を受けた場合にはその療法から少なくとも４週後に収集した血液試料から生成された。
【０１３９】
【表３】
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【０１４０】
表は、転移性メラノーマ患者３５人の臨床的及び人口統計的特性を示す。
【０１４１】
第２の患者群には、薬理免疫抑制療法下で移植片を維持している肝臓被移植者３９人が含まれ、移植からの期間は、中央値７２９日、３３８〜１９０５日の間の範囲を示した。日常的検査のために訪れる外来患者が、この試験のために採用された。すべての患者が、カルシニューリン阻害剤を用いる標準的な治療計画を受けていた（例えば、タクロリムス：ｎ＝２５；サイクロスポリンＡ：ｎ＝１３）。肝臓移植のための主要な適応疾患は、Ｃ型肝炎（ｎ＝１９）及びラエネック肝硬変（ｎ＝７）であった。下記の表は、肝臓被移植者３９人の臨床的特性、人口統計的特性の双方を示す。
【０１４２】
【表４】
2010508826.tif 000013
【０１４３】
血液試料は、対照群を構成する健常ドナー２５人からも得られた。下記の表は、健常ドナー２５人の人口統計的特性を示す。
【０１４４】
【表５】
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【０１４５】
疾患関連血中白血球転写シグニチャーの特定。血中白血球の遺伝子発現シグニチャーを、転移性メラノーマ患者及び肝臓被移植者において特定した。各々の患者セットを健常志願者の対照群と比較した。患者試料は、訓練セット及び独立の試験セットに分割し、訓練セットは、疾患関連で予測的な発現シグニチャーの特定に使用した。この段階的分析によって、疾患シグニチャーの確定に使用しなかった試料における結果の検証が可能になった。分析の生物学的及び／又は技術的要因との混同を避けるために、訓練セットを形成する試料の選択には、厳密な規準を採用した。下記の表は、転移性メラノーマに関する発現シグニチャーの特定（訓練）及び検証（試験）に使用した、年齢、性別及び試料処理法を考慮に入れた各試料セットの構成を示している。
【０１４６】
【表６】
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【０１４７】
同様に、下記の表は、免疫抑制薬物療法を受けている肝臓被移植者に関する発現シグニチャーの特定（訓練）及び検証（試験）をするための、年齢、性別及び試料処理法を考慮に入れた各試料セットの構成を示している。
【０１４８】
【表７】
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【０１４９】
表８は、健常志願者と比較して、転移性メラノーマ患者に差次的に発現した遺伝子を列挙している。健常志願者２３人の訓練セットに対する転移性メラノーマ患者２２人の１群の統計的比較によって、差次的発現遺伝子８９９種を同定した（ｐ＜０．０１、ノンパラメトリックMann-Whitney順位検定で変化倍率＞１．２５；過剰発現遺伝子が２１８種及び過少発現遺伝子が６８１種）。表８から１４までは、コンピュータ可読フォーム（ＣＲＦ）中に長大な表の一部として示され、参照により本明細書に組み込まれる。これらの表は、その中で同定のなされたモジュール、発現量、個々の同定に対する各種命名との相関性を示している。
【０１５０】
図７Ａ〜７Ｄは、遺伝子の階層的クラスター化の画像である。図７Ａは、反転発現パターンを生じる遺伝子の階層的クラスター化を示し、これは、図７Ｂに示す独立の試験セットにおいて確証された。図７Ｂは、健常志願者１３人対患者１６人の結果を示す。次に、クラス予測アルゴリズムを最初の訓練セットに適用した。こうしたアルゴリズムによって、図７Ｃ及び表９）に示すように、差次的発現に基づく健常志願者と患者とのクラス分け能が最良の遺伝子８１種が生み出された。表９は、メラノーマ患者を健常志願者と識別する転写物１セットの発現量を示す。８１種のこうした遺伝子を用いて、精度９０％で独立の試験セットをクラス分けした。わずか３人のクラスは、図７Ｄに示すように不確定であった。
【０１５１】
図８Ａ及び８Ｂは、訓練セット及び試験セットについて得られた発現量を相関させることにより、マイクロアレイ結果の信頼性を確認するために、独立の試料セットにおいてその結果をプロットしたものである。患者と健常志願者とを識別する能力が最良の遺伝子を、クラス予測アルゴリズム（ｋ最近隣法）を用いた訓練セットにおいて同定した。健常志願者、患者間の倍率変化発現量を、その訓練セット及び試験セットにおける識別性遺伝子について測定した。訓練セット及び試験セットにおいて得られた倍率変化数値を相関させた。図８Ａは、転移性メラノーマの結果を示し、ｒ２＝０．８３のPearson相関及びｐ＜０．０００１を有する遺伝子８１種を生み出し、図８Ｂは、肝臓被移植者の結果を示し、ｒ２＝０．９４のPearson相関及びｐ＜０．０００１を有する遺伝子６５種を生み出した。
【０１５２】
図９Ａ〜９Ｄは、免疫抑制薬物療法下にある被移植者において、血中白血球転写シグニチャーを特定するための階層的遺伝子クラスター化の画像である。試料を訓練セット（健常者２７人、患者２２人）に分割し、そのセットは、図９Ａ及び図９Ｃにそれぞれ見られるように、肝臓被移植者対健常志願者における差次的発現遺伝子を同定するために用いた。健常者９人及び患者２１人の試験セットを用いて、図９Ｂ及び図９Ｄに見られるように、このシグニチャーを別途検証した。クラス間比較によって、差次的発現遺伝子２５８９種を同定した（Mann-Whitney検定ｐ＜０．０１、倍率変化＞１．２５）。図９Ａは試験セットにおける類似のシグニチャーを示し、図９Ｂは遺伝子８１種を同定したクラス予測を示す。図９Ｃは、精度９０％での独立の試験セットの識別を示す。図９Ｄは、３０試料中２試料のクラスが特定できなかったことを示す。１試料の予測は誤りであった（即ち、被移植者が健常とクラス分けされた）。
【０１５３】
同じ分析戦略を肝臓被移植者に適用した。被移植者２２人対健常志願者２７人の１群の統計的比較によって、差次的発現遺伝子２５８９種を同定した（ｐ＜０．０１、ノンパラメトリックMann-Whitney順位検定で変化倍率＞１．２５；過剰発現遺伝子が９３８種及び過少発現遺伝子が１６５１種；表１０）。表１０は、健常志願者と比較して、免疫抑制薬で処置されている肝臓被移植者において差次的に発現する遺伝子を示す。遺伝子の階層的クラスター化によって、図９Ａに見られるような訓練セット、及び図９Ｂに見られるような独立の試験セットの両方で観察される反転発現パターンが生じた。６５種のクラス分類子遺伝子が、訓練セットにおいて確定されており、図９Ｃ及び表１１に示してある。表１１は、免疫抑制薬で処置されている肝臓被移植者を健常志願者から識別する転写物１セットの発現量を示す。そのクラス分類子遺伝子６５種を、健常ドナー９人及び患者２１人の独立の試験セットに適用した。その時の試料は、９０％適正にクラス分けされた。２例では、クラスを決定することができず、図９Ｄに見られるように、１試料は誤ってクラス分けされた。これらのセット双方について得られた結果は、高度に相関しており、例えば、図８Ｂに見られるようにピアソン相関がｒ２＝０．９４、ｐ＜０．０００１であった。したがって、転移性メラノーマ患者及び肝臓被移植者に関わる血中白血球転写シグニチャーは、特定され、検証された。
【０１５４】
患者ＰＢＭＣの転写プロファイルのモジュールレベル分析を行った。カイタムマイクロアレイのデータマイニング戦略を用いて、疾患関連の遺伝子発現パターンを更に特徴付けた。血中白血球の転写シグニチャー２３９種１セットの分析により、４７４２プローブを再編する２８転写モジュールを特定した。これらの「転写モジュール」は、同時発現メタ分析により、多重試験において多数の試料にわたって類似の発現パターンに従う遺伝子セットである。各モジュールは、選択の回数及び順序を示す特異な識別子を伴う（例えば、Ｍ２．８は、第２回選択の第８モジュールを指定する）。抽出した際、各転写モジュールは、文献プロファイル作成の補助を得て機能的に特徴付けられる（Chaussabel, D. & Sher, A. (2002). Mining microarray expression data by literature profiling. Genome Biol 3, RESEARCH0055）。
【０１５５】
図１０〜１３は、モジュールレベル分析に関する健常群と疾患群との詳細な統計的比較を示す。例えば、協調発現遺伝子又は転写モジュールの２８セットを、ＰＢＭＣマイクロアレイの２３９プロファイルを分析することにより特定した。こうしたモジュール各々について、健常志願者群と転移性メラノーマ患者群、被移植者群いずれかとの間の発現量の変化を検定した。円グラフは、各モジュールにおいて有意に変化した遺伝子の比率を示し、赤色は過剰発現遺伝子を示し、青色は過少発現遺伝子を示し、Mann-Whitney検定でｐ＜０．０５である。各モジュールについて、文献から抽出したキーワードを、遺伝子間に存在する関係の機能評価と共に、緑色で列挙している。
【０１５６】
図１４は、少数の代表的モジュールで観察され、転写プロファイルで表示された変化のプロットである。各々の差次的発現遺伝子は、健常志願者及び患者の試料にわたる相対的発現量を示す線で表示されている。ピーク及び窪みは、所与の患者における相対的に高い、及び低い遺伝子発現をそれぞれ表す。有意差のなかった遺伝子は、表示されていない。血小板シグニチャーに関わる遺伝子の発現量は、反対方向に変化した、即ち、このシグニチャー（Ｍ１．２）を形成する遺伝子の２８％が、メラノーマ患者で過剰発現し、２７％が被移植者で過少発現した。更に、モジュールＭ２．１（細胞傷害性細胞シグニチャー）に属する遺伝子の半数が、被移植者で過少発現した。この傾向は、メラノーマ患者では観察されなかった（７％がｐ＜０．０５で過剰発現したが、５％の変化は偶然にすぎないと予想される）。同様に、Ｔ細胞に関わる遺伝子の大規模な下方調節が、被移植者で観察された（Ｍ２．８における遺伝子の７４％）。この知見が薬理的免疫抑制を反映していることは、ほぼ間違いない。メラノーマ患者では、これらのＴ細胞関連遺伝子の２９％が下方調節された。それに加え、モジュールＭ３．１を形成するインターフェロン誘導性遺伝子の４４％が、被移植者で過剰発現したのに対し、メラノーマ患者では２６％が過少発現した。各モジュールにおける差次的発現遺伝子のリストは、表１２及び１３中で入手できる。
【０１５７】
転移性メラノーマ患者及び被移植者は、モジュールレベルで共通の転写プロファイルを示す。この分析により、転移性メラノーマ患者及び肝臓被移植者の血中白血球転写シグニチャーの類似性並びに差異が確認された。
【０１５８】
図１５は、それぞれの健常対照群に対して両群の患者に認められたモジュール変化の画像である。各モジュールの差次的発現遺伝子の比率は、強度が可変のスポットで示されている。例えば、オーバーレイでは、移植における変化は黄色で表示され、一方、メラノーマにおける変化は青色で示され、両方での変化は緑色で示されている。過少発現及び過剰発現した転写物の比率は、異なる格子上に表示されている。両患者群間に共通であったモジュールには、Ｍ１．４（ｃＡＭＰ及びＮＦ−ｋＢシグナル伝達経路の調節因子）、Ｍ２．６（骨髄系細胞で発現される遺伝子を含む）、Ｍ３．２及びＭ３．３（Ｍ３．２及び３．３共、図１０〜１３に見られるように、炎症に関与する因子を含む）が含まれる。
【０１５９】
図１６は、本発明のモジュールレベル分析を例示する画像である。転移性メラノーマ患者及び肝臓被移植者からの血液中に共通の転写シグニチャー。血中白血球転写モジュールＭ１．１、Ｍ１．３、Ｍ１．４及びＭ３．２に属する遺伝子の発現プロファイル。プローブ総数が、簡単な機能解釈と共に各モジュールについて示されている（Ｕ１３３Ａ）。文献プロファイルの作成により抽出されたキーワードが、緑色で示されている。各モジュールにおける総数から、適当な健常対照群と比較して患者で有意に変化した遺伝子の比率（Mann-Whitney検定、ｐ＜０．０５）が、円グラフで示され、過剰発現した遺伝子は赤色で表現され、過少発現した遺伝子は青色で表現されている。グラフは、有意に変化した遺伝子の転写プロファイルを表し、各線は、多数の状態（試料、ｘ軸）にわたる単一転写物のｙ軸上の発現量を示す。
【０１６０】
転移性メラノーマ、肝臓移植間の表現型上の関連性は、図１６に見られるようにＭ１．４及びＭ３．２について最も強かった。注目すべきことに、大多数の過少発現モジュールは、メラノーマ群及び移植群に共通であり、最も顕著な類似性は、Ｍ１．１（形質細胞付随遺伝子を含む）、Ｍ１．３（Ｂ細胞付随遺伝子を含む）、並びにＭ１．８（代謝酵素及びＤＮＡ複製に関与する因子をコードする遺伝子を含む）の場合に認められた。
【０１６１】
転移性メラノーマ及び肝臓移植の患者に特異な共通転写シグニチャーの特定。転移性メラノーマ患者及び肝臓被移植者の間における、これら両群の患者に特異的な類似性の程度を調べた。統計的な群間比較を、患者及び健常対象の間で全試料にわたり実施した（例えば、メラノーマ３８個、移植４３個、健常３６個）。手短に言うと、肝臓被移植者、転移性メラノーマ患者の双方で、有意に過剰発現した転写物を３２３種同定し、有意に過少発現した転写物を９１８種同定した（Mann-Whitney検定、ｐ＜０．０１、倍率変化＞１．２５を選別）。次に、これらの転写物の群間比較を、全身性エリテマトーデス（「ＳＬＥ」）、急性感染症（肺炎連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、大腸菌、及びインフルエンザＡ型）、並びに移植片対宿主病（「ＧＶＨＤ」）の患者からの試料を用い、適切な健常対照と比較して実施した。この分析によって、それらの階層的クラスター化で、メラノーマ群及び移植群に共通した転写物間の異なる有意パターンを特定した各ｐ値が得られた。この分析によって、図１７に見られるように、全疾患にわたって変化した遺伝子セットが確認され、Ｐ１は普遍的に過剰発現し、Ｐ３は普遍的に過少発現していたのに対し、他の遺伝子セットは、図１８に見られるように、メラノーマ群及び移植群に、より特異的に関連しており、Ｐ２は過剰発現し、Ｐ４は過少発現していた。表１４は、パターンＰ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４を形成する遺伝子の８疾患にわたる有意水準を示す。
【０１６２】
図１７は、有意パターンの分析画像である。健常志願者と比較して、４期メラノーマ又は肝臓移植の患者双方で多量に発現した遺伝子を選択した。Ｐ値は、他の疾患モデル：全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、又はインフルエンザウィルス（Influenza A）、大腸菌（E. coli）、肺炎連鎖球菌（Strep. Pneumo.）若しくは黄色ブドウ球菌（Staph. aureus）の急性感染症に罹っている、患者から得たＰＢＭＣで作成した遺伝子発現プロファイルからも同様にして得た。これらのコホート各々を、これらの試験に関して獲得した健常志願者の適当な対照群と比較した。メラノーマ患者、肝臓被移植者双方から得たＰＢＭＣ中で、有意により多量又はより少量発現した遺伝子（各々OVER-XP及びUNDER-XP）を、上掲の全病態について生成した各ｐ値の階層的クラスター化により順位付けた。Ｐ値は、カラースケールに従って表示され、緑色が低いｐ値（有意性あり）を示すのに対し、白色が高いｐ値（有意性なし）を示す。異なる有意パターンが特定されており、Ｐ１及びＰ３は普遍的であり、Ｐ２及びＰ４は、メラノーマ群及び肝臓移植群により特異的である。
【０１６３】
図１８は、メラノーマ群及び移植群に共通した、普遍的な及び特異的な遺伝子シグニチャーのモジュール分布チャートである。ＰＢＭＣの２８転写モジュール間の分布を、メラノーマ群及び移植群に共通した、普遍的（Ｐ１）及び特異的（Ｐ２）な転写シグニチャーを形成する遺伝子について決定した。次に、モジュール各々の遺伝子リストを、Ｐ１及びＰ２を形成する１０９及び６９転写物と比較した。各モジュールに対して、Ｐ１、Ｐ２のいずれかと共有される遺伝子の比率を記録した。これらの結果は、図１８の棒グラフで表示されている。
【０１６４】
したがって、メラノーマ群及び移植群に共通の遺伝子シグニチャーを形成する遺伝子は、２つの性質：（１）図１３の転写モジュールに見られるような協調発現、及び（２）図１７の有意パターンに見られるような各疾患にわたる発現の変化、に基づいて異なるセットに分配することができる。こうした２つのマイニング戦略からの結果は、普遍的（Ｐ１）及び特異的（Ｐ２）なＰＢＭＣ転写シグニチャーのモジュール分布の調査によって回復された。図１８は、ＰＢＭＣの現在までに特定した２８転写モジュールにわたるＰ１及びＰ２の分布が、無作為ではないことを明確に示している。実際、Ｐ１転写物が、Ｍ３．２（炎症関連の転写物を特徴とする）中で選択的に見出されるのに対し、Ｍ１．４転写物は、メラノーマ患者及び肝臓被移植者においてより特異的に過剰発現する遺伝子を含むＰ２に、ほぼ専ら属していた。
【０１６５】
図１９は、免疫抑制の転写シグニチャーの図である。メラノーマ患者及び肝臓被移植者において最も特異的に過剰発現する転写物（Ｐ１）には、免疫応答のリプレッサーが含まれ、その免疫応答には、１）ＮＦ−ｋＢ転位、２）インターロイキン２の産生及びシグナル伝達、３）ＭＡＰＫ経路、並びに４）細胞増殖：を阻害することが含まれる。こうした因子の一部は、特性が十分に決定された抗炎症性分子であり、他の因子はアネルギーＴ細胞中に発現される。
【０１６６】
免疫抑制の分子シグニチャー。メラノーマ群及び移植群において最も特異的に過剰発現した遺伝子（Ｐ１）を調べた。６９プローブセットから、特異な５５遺伝子識別子を同定した。遺伝子の索引を付けた文献データベースに対するクエリーを、マイクロアレイ遺伝子発現データの解釈を補助するために開発し、４７遺伝子に関連する６５２７件の刊行物を特定し、該遺伝子中３０種は１０件超の刊行物に関連していた。図１９は、このシグニチャーを形成する遺伝子間での顕著な機能的収斂を示し、免疫調節機能を有する分子をコードする遺伝子（例えば、抗増殖性遺伝子：ＢＴＧ２、ＴＯＢ１、ＡＲＥＧ、ＳＵＩ１又はＲＮＦ１３９；抗炎症性遺伝子：ＴＮＦＡＩＰ３）；転写阻害剤：（ＳＯＮ、ＺＣ３ＨＡＶ１、ＺＮＦ３９４）；ストレス誘導分子（ＨＥＲＰＵＤ１）を含むのに対し、他のものは、十分に確定された免疫抑制的性質を有する。例えば、二重特異性ホスファターゼ２、５及び１０（ＤＵＳＰ２、５、１０）は、タクロリムス／ＦＫ５０６などのカルシニューリン阻害剤の既知の標的であるＭＡＰキナーゼＥＲＫ１／２を妨害する。ＤＵＳＰ１０は、ストレス活性化キナーゼを選択的に脱リン酸化する（Theodosiou, A., Smith, A., Gillieron, C., Arkinstall, S., and Ashworth, A. (1999). MKP5, a new member of the MAP kinase phosphatase family, which selectively dephosphorylates stress-activated kinases. Oncogene 18, 6981-6988）。注目すべきことに、ＤＵＳＰ５は、Ｔ細胞におけるＩＬ２シグナル伝達で負のフィードバックの役割を有することが判明した（Kovanen, P. E., Rosenwald, A., Fu, J., Hurt, E. M., Lam, L. T., Giltnane, J. M., Wright, G., Staudt, L. M., and Leonard, W. J. (2003). Analysis of gamma c-family cytokine target genes. Identification of dual-specificity phosphatase 5 (DUSP5) as a regulator of mitogen-activated protein kinase activity in interleukin-2 signaling. J Biol Chem 278, 5205-5213）。ＣＲＥＭ、ＦＯＸＫ２及びＴＣＦ８は、ＩＬ２プロモーターに直接結合し、Ｔ細胞アネルギーにおいてＩＬ−２産生の抑制に寄与することができる（Powell, J. D., Lerner, C. G., Ewoldt, G. R., and Schwartz, R. H. (1999). The -180 site of the IL-2 promoter is the target of CREB/CREM binding in T cell anergy. J Immunol 163, 6631-6639）。ＢＨＬＨＢ２（Ｓｔｒａ１３）は、リンパ球の発生及び機能をインビボで負に調節する（Seimiya, M., Wada, A., Kawamura, K., Sakamoto, A., Ohkubo, Y., Okada, S., Hatano, M., Tokuhisa, T., Watanabe, T., Saisho, H., et al. (2004). Impaired lymphocyte development and function in Clast5/Stra13/DEC1-transgenic mice. Eur J Immunol 34, 1322-1332）。ＣＩＡＳ１は、ＮＦ−κＢの活性化及び炎症性サイトカインの産生を調節するタンパク質、クリオピリンをコードする。この遺伝子の変異は、数種の炎症性疾患において特定された（Agostini, L., Martinon, F., Burns, K., McDermott, M. F., Hawkins, P. N., and Tschopp, J. (2004). NALP3 forms an IL-1beta-processing inflammasome with increased activity in Muckle-Wells autoinflammatory disorder. Immunity 20, 319-325）。ロイシンジッパータンパク質のＤＳＩＰＩは、広範囲のシグナル伝達経路（ＮＦ−κＢ、ＮＦＡＴ／ＡＰ−１、ＭＥＫ、ＥＲＫ１／２）の妨害により、糖質コルチコイド及びＩＬ１０の免疫抑制作用を媒介し、マクロファージにおける炎症応答の全般的阻害、及びＴ細胞におけるＩＬ２受容体の下方調節を起こすことが知られている。注目すべきことに、免疫細胞におけるＤＳＩＰＩの発現は、薬物処理（デキサメタゾ��）（D'Adamio, F., Zollo, O., Moraca, R., Ayroldi, E., Bruscoli, S., Bartoli, A., Cannarile, L., Migliorati, G., and Riccardi, C. (1997). A new dexamethasone-induced gene of the leucine zipper family protects T lymphocytes from TCR/CD3-activated cell death. Immunity 7, 803-812）又は腫瘍細胞に対する長期曝露（バーキットリンパ腫）（Berrebi, D., Bruscoli, S., Cohen, N., Foussat, A., Migliorati, G., Bouchet-Delbos, L., Maillot, M. C., Portier, A., Couderc, J., Galanaud, P., et al. (2003). Synthesis of glucocorticoid-induced leucine zipper (GILZ) by macrophages: an anti-inflammatory and immunosuppressive mechanism shared by glucocorticoids and IL-10. Blood 101, 725-738）の後、増強されることが判明した。
【０１６７】
Ｐ１に属していない他の免疫抑制分子も、メラノーマ群及び移植群で過剰発現することが分かった。注目すべきことに、ラパマイシンの哺乳類標的であるｍＴＯＲを阻害することが、最近判明した別のデキサメタゾン誘導遺伝子であるＤＤＩＴ４（Corradetti, M. N., Inoki, K., and Guan, K. L. (2005). The stress-inducted proteins RTP801 and RTP80IL are negative regulators of the mammalian target of rapamycin pathway. J Biol Chem 280, 9769-9772）。したがって、この内因性因子は、効力ある免疫抑制薬の作用を再現できるようである。抗炎症性も示す細胞保護分子であるＨＭＯＸ１。つい最近、ＨＭＯＸ１の発現は、ＦＯＸＰ３により誘発され、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節Ｔ細胞の免疫抑制作用を媒介することが判明した（Choi, B. M., Pae, H. 0., Jeong, Y. R., Kim, Y. M., and Chung, H. T. (2005). Critical role of heme oxygenase-1 in Foxp3-mediated immune suppression. Biochem Biophys Res Commun 327, 1066-1071）。したがって、ＨＭＯＸ１の転写活性の増加は、実験的移植モデルにおける好ましい結果と相関している（Soares, M. P., Lin, Y., Anrather, J., Csizmadia, E., Takigami, K., Sato, K., Grey, S. T., Colvin, R. B., Choi, A. M., Poss, K. D., and Bach, F. H. (1998). Expression of heme oxygenase-1 can determine cardiac xenograft survival. Nat Med 4, 1073-1077）。ＤＤＩＴ４、ＨＭＯＸ１の両遺伝子は、大腸菌又は黄色ブドウ球菌の急性感染症患者でも過剰発現した。ＦＫ５０６結合タンパク質ファミリーの一員であるイムノフィリンＦＫＢＰ１Ａ（ＦＫＢＰ１２）は、薬物のＦＫ５０６（タクロリムス）及びラパマイシンによるＴ細胞免疫抑制の重要なメディエーターである（Xu, X., Su, B., Barndt, R. J., Chen, H., Xin, H., Yan, G., Chen, L., Cheng, D., Heitman, J., Zhuang, Y., et al. (2002). FKBP12 is the only FK506 binding protein mediating T-cell inhibition by the immunosuppressant FK506. Transplantation 73, 1835-1838）。
【０１６８】
血液は、入手可能な組織であり、多数の疾患にわたる比較分析が可能である。薬理的及び腫瘍媒介的な免疫抑制は、血中白血球において共通の転写シグニチャーを産生すると思われる。転移性メラノーマ及び被移植者の疾患関連転写シグニチャーが、患者血液において特定された。これらのシグニチャーは、数種の分析手法により特定され、確認された。転写モジュールの分析によって、細胞型（例えば、形質細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、細胞傷害性細胞）及び免疫反応（例えば、炎症、インターフェロン）に関連する血中白血球転写成分の変化を特定した。更に、転写モジュール、遺伝子発現量の両方を用いて、転移性メラノーマ患者及び肝臓被移植者における血液転写シグニチャー間の類似性を確認した。しかし、共通のこの転写シグニチャーの原因を、すべて免疫抑制とすることはできなかった。例えば、Ｂ細胞関連遺伝子（Ｍ１．３）の発現量は、メラノーマ群及び移植群で減少しただけでなく、急性インフルエンザ感染症及び全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の患者でも減少した（遺伝子の５３％が健常対照と比較して過少発現した；Chaussabel et al.）。反対に、形質細胞に関連する遺伝子（Ｍ１．１）のほぼ４０％が、ＳＬＥ患者で過剰発現し、急性インフルエンザ感染症の患者では変化がなかった（遺伝子の７％がｐ＜０．０５で過剰発現した）が、メラノーマ患者、被移植者の双方で発現量が有意に減少した（Ｍ１．１における遺伝子の各々６１％及び６２％）。メラノーマ及び移植のシグニチャー間で共通の最も特異的な転写物を選択するために、総計８群の患者にわたって遺伝子レベル分析を実施した。この結果、免疫抑制患者で最も特異的に発現する転写物１セットが同定された。同定された遺伝子セットは、顕著な機能的収斂を示し、インターロイキン−２転写のリプレッサー、ＮＦ−ｋＢ又はＭＡＰＫ経路の阻害剤、及び抗増殖性分子をコードする遺伝子を含んでいた。注目すべきことに、これらのシグニチャーは、薬理的免疫抑制のために使用される薬物であって、Ｔ細胞の活性化時にＮＦ−ＡＴ及びＮＦ−κＢの核転位を担う、カルシウム依存性セリントレオニンプロテインホスファターゼであるカルシニューリンの活性を阻害する薬物の作用機構と整合している。進行メラノーマ患者及び薬理処置被移植者において作動する免疫抑制機構間の機能的収斂を示すこと。免疫抑制患者においてより特異的に誘導される転写物には、糖質コルチコイド誘導性遺伝子（例えば、ＤＳＩＰＩ、ＣＸＣＲ４、ＪＵＮ）、並びにホルモン核内受容体（ＮＲ４Ａ２及びＲＯＲＡ）が含まれるという事実（Winoto, A., and Littman, D. R. (2002). Nuclear hormone receptors in T lymphocytes. Cell 109 Suppl, S57-66）は、腫瘍媒介免疫抑制におけるステロイドホルモンの考え得る役割を示唆している。
【０１６９】
転移性メラノーマ患者は、肝臓移植を受けた患者における薬理的処置で誘導されるものと類似した、内因性の免疫抑制転写シグニチャーを示す。本発明は、メラノーマ進行の高い危険性にある患者を特定する方法及び装置を提供する。それに加え、本発明は、肝臓被移植者のために免疫抑制薬の投与量を調節し、拒絶の危険性と副作用を均衡させるのに役立ち得る、免疫抑制インディケーターをモニターする方法及び装置も提供する。
【０１７０】
患者情報及び血液試料の処理の実施例には、以下のものが含まれる。血液は、施設内ＩＲＢにより承認された（肝臓被移植者：００２−１５７０１９９−０１７；メラノーマ患者；０００−０４８、００２−０９４；００３−１８７）際、インフォームドコンセントの後に取得した。血液試料は、テキサス州ダラスにあるBaylor University Medical Centerにて酸性クエン酸デキストロースの黄色栓チューブ（BD Vaccutainer）中に取得した。試料は、処理のために室温で直ちにBaylor Institute for Immunology Research, Dallas, ＴＸへ配送した。Ficoll勾配を介して分離した新鮮なＰＢＭＣは、液体窒素中に保存し（例えば、生存適正凍結）、又はβ−メルカプトエタノール（Qiagen, Valencia, ＣＡ）を含有するＲＬＴ緩衝液中で直ちに溶解した。総ＲＮＡを、液体窒素中で予め凍結した細胞（「凍結」）から、又は分離後、直ちに溶解した細胞（「新鮮」）から、製造業者の推奨手順（Qiagen, Valencia, ＣＡ）に従って、RNEASY（登録商標）Mini Kitを用いて抽出した。このパラメーターは、実験計画において考慮に入れたが、その計画では、年齢、性別、並びに転移性メラノーマ及び免疫抑制療法を受けている肝臓被移植者に関わる、発現シグニチャーの特定（訓練）及び検証（試験）に用いた試料処理法も考慮に入れた。
【０１７１】
マイクロアレイアッセイ。総ＲＮＡを、製造業者の使用説明に従ってRNEASY（登録商標）キット（Qiagen, Valencia, ＣＡ）を用いて分離し、その一体的ＲＮＡを、Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent, Palo Alto, ＣＡ）を用いて評価した。しかし、当業者であれば、他の分離法も使用し得ることは認識されよう。総ＲＮＡ２〜５μｇから、Ｔ７−ｄＴ（２４）プロモーター配列（Operon Biotechnologies, Huntsville, AL）を含有する２本鎖ｃＤＮＡを生成した。次いで、このｃＤＮＡを、ビオチン標識（Affymetrix Inc, Santa Clara, ＣＡ製のEnzo BioArray HighYield RNA Transcript Labeling Kit）を用いたインビトロ転写用単回増幅のための鋳型として用いた。ビオチニル化ｃＲＮＡ標的は、試料浄化モジュールを用いて精製した後、製造業者の標準手順に従ってヒト用U133A GeneChip（Affymetrix Inc, Santa Clara, ＣＡ）とハイブリッド形成した。Affymetrix U133A GeneChipは、１０〜２０対の特異なプローブ対（完全マッチ及び対応するそのミスマッチ）に代表される２２２８３プローブセットを含有し、１４５００個の異なる遺伝子及び発現した配列タグ（ＥＳＴ）の検出を可能にする。アレイは、レーザー共焦点スキャナー（Agilent）を用いて掃引した。試料は、同じチームにより、同じ中核施設で処理し、アレイの各操作回間で無作為化した。生データはＧＥＯ（www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）に寄託してある。
【０１７２】
データ分析。各Affymetrix U133A GENE CHIP（登録商標）について、生の強度データを、そのアレイ上の全測定値の平均強度に規格化し、Affymetrix Microarray Suite 5.0における５００の標的強度値（ＴＧＴ）にスケーリングした。GeneSpring ソフトウェア、バージョン７．２の補助を得て、患者試料アレイ毎の各遺伝子の測定値を、健常志願者コホートからの当該遺伝子の測定中央値で割った。Affymetrixフラグコールに基づいてフィルターを掛けた。即ち、プローブセットがいずれかの群（健常対照又は患者）における試料の少なくとも７５％中に「存在する」場合、該プローブセットを選択した。このステップによって、下流の分析で用いる遺伝子の強度測定値の信頼性向上が保証された。クラス間比較は、選択した遺伝子セットに適用したノンパラメトリック順位統計分析検定（Mann-Whitney）を用いて行った。垂直方向に、遺伝子の階層的クラスターを、Genespringの標準相関尺度であるほぼゼロのPearson相関を用いて作成した。規格化した遺伝子発現データをノンパラメトリック一変量分析（Fischerの厳密検定）で調べることにより、異なる２群を潜在的に識別する遺伝子を特定した。教師あり学習アルゴリズムのＫ最近隣法を適用して、３ステップ：１）識別すべきクラスと強い相関性のある遺伝子の特定（観察）、２）特定した遺伝子が所定のクラスを識別するという確認、及び３）「未知の試料」を用いた検証、で所定のクラスに試料を割り当てた。
【０１７３】
転写モジュールの特定。血中白血球の遺伝子発現プロファイル合計２３９点を、Affymetrix U133A&B GENECHIP（＞４４Ｋプローブセット）を用いて作成した。転写データは、８実験群について取得したが、その中には、全身若年性特発性関節炎、ＳＬＥ、肝臓被移植者、メラノーマ患者、並びに大腸菌、黄色ブドウ球菌及びインフルエンザＡ型の急性感染症患者が含まれていた。各群について、すべての病態の少なくとも５０％中に存在していた転写物を３０クラスターに分離した（ｋ平均法クラスター化：クラスターＣ１からＣ３０まで）。各遺伝子のクラスターの割当てを表に記録し、全遺伝子間で分布パターンを比較した。モジュールは、全試験群中の同じクラスターに属する遺伝子の最大セット（即ち、８実験群の８群中の同じクラスターに見出された遺伝子）から始める反復プロセスを用いて選択した。次いで、この基準コアパターンから７／８、６／８及び５／８が一致する遺伝子を含めるように、その選択を拡張した。生成した遺伝子セットは、転写モジュールを形成し、選択プールから抜き取った。次いで、２番目に大きい遺伝子セットから始めてそのプロセスを反復し、次第にストリンジェンシーを低下させていった。この分析により、モジュール２８個の間に分配された転写物４７４２個が特定された。各モジュールには、選択の回及び順を示す特有の識別子が割り当てられている（即ち、Ｍ３．１は３回目の選択で特定された第１モジュールであった）。
【０１７４】
有意パターンの分析。遺伝子発現データを、Affymetrix HG-U133A GENECHIPを用いて、患者及び健常志願者から得たＰＢＭＣについて作成した。Ｐ値は、患者群を各健常対照群と比較することにより、６基準データセットについて取得した（Mann-Whitney順位検定）。当該各群は、１）全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ、１６試料）、２）インフルエンザＡ型（１６試料）、３）大腸菌（１６試料）、４）黄色ブドウ球菌（１６試料）、及び５）肺炎連鎖球菌（１４試料）の患者、並びに７）移植片対宿主病に罹っている骨髄被移植者（ＧＶＨＤ、１２試料）から構成されていた。対照群も、年齢、性別及びプロジェクトを考慮して形成した（各群１０試料）。「試験群」（メラノーマ及び移植）で有意に変化した遺伝子（ｐ＜０．０１）は、対照に対して過剰発現及び対照に対して過少発現の２セットに分割した。過剰発現セットを形成した遺伝子のＰ値は、「基準群」（ＳＬＥ、ＧＶＨＤ、及びインフルエンザウィルス、大腸菌、黄色ブドウ球菌、肺炎連鎖球菌の感染症）に対して得た。Ｐ値データは、遺伝子発現分析のソフトウェアプログラム、GeneSpring, Version 7.2（Agilent）で処理し、これを用いて、階層的クラスター化を行い、有意パターンに基づいて遺伝子をグループ分けした。
［実施例２］
【０１７５】
有意パターンの決定及び分析が、患者末梢血白血球における普遍的な及び疾患特異的な遺伝子発現シグニチャーを特定するために使用される。
【０１７６】
患者基準の研究における遺伝子発現マイクロアレイの使用は、診断バイオマーカーの発見、及び発病に関連する遺伝子又は経路の特定をするための新たな展望を生み出す。遺伝子発現シグニチャーを、強い免疫系成分を提示する病態の百人余の患者（自己免疫性、移植片対宿主及び感染性疾患の患者、並びに免疫抑制された被移植者）から分離した、末梢血単核細胞から生成した。このデータセットによって、より広い関係の中で比較分析を実施し、疾患シグニチャーを確定する機会が実現された。遺伝子のリスト間におけるほぼ２０％の重複が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）及び急性インフルエンザ感染症の患者において、健常対照に対して有意に変化することが判明した。２２２８３プローブセットの転写変化を、各健常対照群に対する疾患７種について系統的に行った統計的群間比較によって、評価した。有意パターンは、ｐ値の階層的クラスター化により作成した。この「有意パターン」手法によって、他の６疾患では健常者と比較して変化しなかった遺伝子により形成される、ＳＬＥ特異的「診断シグニチャー」の特定に至った。逆に、全７疾患に共通する「前哨シグニチャー」の特性が決定された。こうした知見は、診断及び早期疾患検出のために、血中白血球発現シグニチャーの使用を可能とする。
【０１７７】
要約すれば、血液は、病原体、アレルゲン、腫瘍、移植片又は自己免疫反応に曝される免疫細胞にとって、貯蔵兼移動用区画である。患者の末梢血から分離した白血球は、臨床関連情報の入手源であり、こうした細胞の包括的な分子表現型は、マイクロアレイによって得ることができる。遺伝子発現マイクロアレイは、癌研究において広範に使用されてきており、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の患者から分離した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料を分析する原理証明試験によって、発症の機構及び処置に対する応答に関する理解が深まる。患者基準の研究に関しては、遺伝子発現マイクロアレイに対して２つの主たる用途：（１）バイオマーカーの発見及び診断／予後シグニチャーの確立（例えば、乳癌患者の生存予知）、（２）発病に関与する遺伝子／経路の特定と、その結果として、例えば、全身発症性の若年性特発性関節炎におけるインターロイキン−１の役割発見、が見出された。しかし、マイクロアレイデータの分析は、今なお相当な難関である。単一試験において数万もの特徴についてデータを同時に収集する能力は、マイクロアレイの最も魅力的な特性の１つであるが、それが大きな欠点ともなり得る（非特許文献７）。この「寸法の天罰」は、分析する試料数が普通少ないという事実によって悪化する。分析する遺伝子及び病態の件数間不均衡のために、データ解釈の能力が相当に弱まる。強い免疫性成分を保有する疾患の患者から得た試料を構成する、遺伝子発現マイクロアレイデータベースを創出した。本発明のメタ分析戦略により、普遍的な並びに疾患特異的なシグニチャーの特定が可能となる。
【０１７８】
血液試料の処理。血液試料は、静脈穿刺により収集し、処理のためにテキサス州ダラスにあるBaylor Institute for Immunology Researchへ室温で直ちに発送した。血液３〜４ｍｌからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ficoll勾配を介して分離し、β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）と共にＲＬＴ試薬（Qiagen, Valencia, ＣＡ）中で直ちに溶解し、ＲＮＡ抽出ステップまで−８０℃で保存した。
【０１７９】
マイクロアレイ分析。RNeasyキット（Qiagen, Valencia, ＣＡ）を用い、製造業者の使用説明に従って総ＲＮＡを分離し、Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent, Palo Alto, ＣＡ）を用いてＲＮＡ全体を評価した。標的の標識は、製造業者の標準的手順（Affymetrix Inc., Santa Clara, ＣＡ）に従って行った。ビオチニル化ｃＲＮＡ標的を精製し、その後Affymetrix HG-U133A GeneChip（２２２８３プローブセット）とハイブリッド形成した。アレイは、Affymetrix共焦点レーザースキャナーを用いて掃引した。Microarray Suite, Version 5.0（MAS 5.0; Affymetrix）のソフトウェアを用いて、ハイブリダイゼーション蛍光シグナルを評価し、シグナルを規格化し、シグナル検出コールを評価した。チップ当たりシグナル値の規格化は、GeneChip当たり標的強度値を５００へスケーリングするMAS 5.0大域法を用いて実現した。遺伝子発現分析のソフトウェアプログラムGeneSpring, Version 7.1（Agilent）を用いて、試料の統計分析、階層的クラスター化及びクラス分けを行った。
【０１８０】
有意パターンの発現及び分析。遺伝子発現データは、同じAffymetrixシステム上で標準操作手順を用いて操作したAffymetrix HG-U133A GeneChipを用いて、患者及び健常志願者から得たＰＢＭＣに関して生成した。Ｐ値は、７患者群を各健常対照群と比較することにより得た（Mann-Whitney順位検定）。当該各群は、１）全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ、１６試料）、２）インフルエンザＡ型（１６試料）、３）黄色ブドウ球菌（１６試料）、４）大腸菌（１６試料）、及び５）肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）（１４試料）の小児患者、並びに６）免疫抑制療法下で移植片を受け入れた肝臓移植患者（１６試料）、及び７）移植片対宿主病に罹っている骨髄被移植者（ＧＶＨＤ、１２試料）の成人被移植者から構成されていた。対照群も、年齢、性別及びプロジェクトを考慮して形成した（各群１０試料）。「試験群」（インフルエンザＡ型及び／又はＳＬＥ）で有意に変化した遺伝子（ｐ＜０．０１）は、対照に対して過剰発現及び対照に対して過少発現の２セットに分割した。過剰発現セットを形成した遺伝子のＰ値は、「基準群」（大腸菌、黄色ブドウ球菌、肺炎連鎖球菌の感染症、肝臓被移植者、及び移植片対宿主病）について得た。基準群のＰ値は、遺伝子が過少発現したとき１に設定した。試験群において過少発現した遺伝子のセットに同じ手順を用いたが、今度は基準群のＰ値を、遺伝子が過剰発現したとき１に設定した。Ｐ値データは、遺伝子発現分析のソフトウェアプログラム、GeneSpring, Version 7.1（Agilent）で処理し、これを用いて、階層的クラスター化を行い、有意パターンに基づいて遺伝子をグループ分けした。
【０１８１】
急性インフルエンザＡ型感染症及びＳＬＥに関わる血中白血球転写シグニチャーの特定。ＳＬＥ、急性インフルエンザＡ型感染症のいずれかの小児患者から得た遺伝子発現マイクロアレイデータを用いて、これらの２疾患に特徴的な転写シグニチャーを特定した（図２０）。類似数の患者（１８試料）の各対照群（１０試料）との統計的比較によって、（１）インフルエンザシグニチャーを形成する差次的発現遺伝子１８２６種（そのうち、７０３種は対照に比して過剰発現（赤色）し、１１２３種は過少発現（青色）した。図（２０Ａを参照）、２）ＳＬＥシグニチャーを形成する差次的発現遺伝子３３８２種（そのうち、１０１９種は対照に比して過剰発現し、２３６３種は過少発現した。図２０Ｂを参照）を同定した。
【０１８２】
図２０は、患者と各対照との統計的な群間比較を示す。図２０Ａ。急性インフルエンザＡ型感染症（ＦＬＵ）の児童１６人及び健常志願者（ＨＶ）１０人から分離したＰＢＭＣについて得た、マイクロアレイ発現を比較した（Mann-Whitney順位検定、ｐ＜０．０１）。差次的発現遺伝子１８２６種のうち、患者において７０３種は過剰発現し、１１２３種は過少発現した。図２０Ｂ。全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の同数の児童を、健常志願者（ＨＶ）１０人の各セットと比較した（Mann-Whitney順位検定、ｐ＜０．０１）。差次的発現遺伝子３３８２種のうち、患者において１０１９種は過剰発現し、２３６３種は過少発現した。図２０Ｃ。各対照群（健常志願者）に対する、ＳＬＥ及びＦＬＵ試料について得た過剰発現及び過少発現の遺伝子リストの比較。
【０１８３】
変換した発現量をカラースケールで示しており、全ドナーを通した各遺伝子の発現中央値と比較して、赤色は相対的に高い発現を表し、青色は相対的に低い発現を表す。
【０１８４】
有意パターンの分析。次に、各疾患についてのこれらのシグニチャーの特異性を判定した。相当な重複が、ＦＬＵ及びＳＬＥにおいて差次的に発現した遺伝子セット間に見出され（図２０Ｃ）、両疾患に共通に、２７９種が過剰発現し、４９０種が過少発現した（各々１９％及び１６％の類似性）。この観察を用いて、特定の疾患シグニチャーをより広い疾患セットに関して得ることができるか否かを判定した。
【０１８５】
この疑問に対処するために、細菌（大腸菌、黄色ブドウ球菌及び肺炎連鎖球菌）による急性感染症患者、並びに被移植者（薬理免疫抑制療法下で同種移植片を受け入れた肝臓受容者、及び移植片対宿主病の骨髄受容者）について得たＰＢＭＣ転写データセットに、分析を拡張した。インフルエンザに比較してＳＬＥにおいて特異的に過剰発現した遺伝子（図１、７４０遺伝子）について、有意パターンを分析した。この手法により、各対照群（年齢及び性別対応の健常志願者）と比較して、各疾患についての遺伝子発現量の変化の有意性を視覚化することが可能となった。遺伝子は、階層的クラスター化により有意パターンに従って配列した。
【０１８６】
特定した４パターンのうち、２パターンがＳＬＥに大いに特異的であった（図２１：Ｐ１が９８遺伝子及びＰ３が１９３遺伝子）。結論として、この方法を用いて、他の６疾患と比較して、ＳＬＥに対し高度な特異性を示す、特にＰ３中の遺伝子セットを特定した。
【０１８７】
図２１は、ＳＬＥ患者では過剰発現するが、急性インフルエンザＡ型感染症患者ではそうではない遺伝子の有意パターンの分析である。この分析に用い、各対照群と比較してＳＬＥ患者に有意に過剰発現し（Mann-WhitneyＰ＜０．０５）、急性インフルエンザＡ型感染症患者ではそうではなかった遺伝子が、この分析のために選択された（７４０遺伝子）。Ｐ値は、追加の５群の患者：大腸菌、黄色ブドウ球菌、肺炎連鎖球菌、肝臓被移植者及び移植片対宿主病患者について得た。それらの値をマイクロアレイデータ分析のソフトウェアパッケージにインポートした（詳細は方法を参照されたい）。４パターン：ＳＬＥ−１〜４を特定した。有意水準はカラースケールで示し、緑色が濃いほどＰ値が低いことを表し、白色はＰ値が１を示す。
【０１８８】
共通の疾患シグニチャーの特定。図２１からの有力な比率の遺伝子が、普遍的に誘導された（Ｐ２が２２２遺伝子及びＰ４が２２５遺伝子）。この知見は、異なるこれらの疾患が、「病気シグニチャー」を構成する共通の転写成分を血液中に共有し得ることを示唆している。この可能性を調べるために、インフルエンザ及びＳＬＥのシグニチャー間で共有される遺伝子セットを分析した（図２０：２７９遺伝子が過剰発現し、４９０遺伝子が過少発現した）。
【０１８９】
図２２は、インフルエンザＡ型及びＳＬＥに共通である遺伝子の有意パターンを示す。インフルエンザＡ型、ＳＬＥの患者双方で過剰発現（左側パネル、ＯＶＥＲ）及び過少発現（右側パネル、ＵＮＤＥＲ）した遺伝子を、他の疾患：大腸菌、黄色ブドウ球菌、肺炎連鎖球菌の急性感染症、肝臓被移植者（移植）及び移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の骨髄受容者に関して調べた。有意水準はカラースケールで示し、暗緑色がより低いＰ値を表し、白色はＰ値が１を示す。
【０１９０】
有意パターンは、上記のように全７疾患にわたるこれらの遺伝子について作成した。インフルエンザＡ型及びＳＬＥの患者に過剰発現した遺伝子中に、３サブセットを特定した。その１サブセットは大部分の疾患において変化し、別のサブセットは全疾患において有意差を示したが、第３のサブセットはインフルエンザ及びＳＬＥに、より特異的であった（図２２ＡのそれぞれＰ１、Ｐ２及びＰ３）。インフルエンザ及びＳＬＥに共通の過少発現遺伝子１セットを分析すると、同等のパターンを見出すことができる（図２２Ｂ、Ｐ４〜７）。注目すべきことに、インフルエンザ及びＳＬＥに最も類似した有意パターンを有する患者群は、移植片対宿主病に罹っていた。この対応性は、その過少発現遺伝子セットにとって特に顕著であった（図２２Ｂ）。
【０１９１】
有意パターンの機能分析。最後に、図２２で特定したパターンに関わる機能アノテーションを抜粋した。「防御応答」に関わる遺伝子は、２つのパターン中に選択的に見出された（図３及び４のＰ２〜３；この機能区分の過剰発現に対するFisher検定：ｐ＜０．０００５）。これらの遺伝子は、健常者と比較して多量に発現した。そのリストには、デフェンシンα３、アズロシジン１、スタビリン１（Ｐ２）；腫瘍壊死因子ファミリーメンバーのＴＲＡＩＬ、及びガレクチン３結合タンパク質（Ｐ３）が含まれる。反対に、パターンＰ４〜６に属する過少発現遺伝子は、「リボソーム構造成分」に選択的に関係していた（Ｐ４〜６における、この機能区分の過剰発現に対するFisher検定：ｐ＜０．０００１）。これらの遺伝子は複数のリボソームタンパク質ファミリーメンバー（例えば、ＲＰＳ１０、ＲＰＬ３７及びＲＰＬ１３）を含む。インフルエンザ及びＳＬＥ（Ｐ３）に最も特異的な過剰発現遺伝子セットに属する遺伝子は、「インターフェロン応答」（ｐ＜０．０００１、例えば、ミクソウィルス抵抗性１、インターフェロンα誘導性タンパク質１６、２本鎖ＲＮＡ誘導性プロテインキナーゼ）に選択的に関係していたが、Ｐ１における遺伝子は、「重金属結合」（ｐ＜０．０００１、メタロチオネインファミリーメンバーの過剰量を反映する）に特異に関係していた。
【０１９２】
図２３は、有意パターンに従ってグループ分けしたインフルエンザ感染症及び狼瘡の患者が共有する遺伝子の機能分析である。図２２に示した異なるパターンを形成する遺伝子セットに、機能分析を施した。棒グラフは、セット各々の所与の注釈に関連する遺伝子の比率（％）を示す。過剰発現遺伝子＝赤色、過少発現遺伝子＝青色。Ｐ１はｎ＝７１遺伝子、Ｐ２はｎ＝１１８、Ｐ３はｎ＝８５、Ｐ４はｎ＝１１７、Ｐ５はｎ＝１８４、Ｐ６はｎ＝１２０、Ｐ７はｎ＝４６。
【０１９３】
ＰＢＭＣ転写パターンの比較分析によって、疾患特異的な並びに普遍的な発現シグニチャーが特定された。インフルエンザ感染症及びＳＬＥの患者から得たＰＢＭＣの転写プロファイル間に共通することが判明した遺伝子中に、程度の異なる疾患特異性が認められた。有意パターンの差は、異なる機能的関連性に変換された。事実として、他の５疾患に比して、インフルエンザ及びＳＬＥに最も特異的な遺伝子が、「インターフェロン誘導」（過剰発現遺伝子；図２２及び２３のＰ３）又は「リボソームの構造成分」（過少発現遺伝子；図２２及び２４のＰ４）などの生物学的テーマに最も強く関連していた。これらの観察により、この手法の妥当性の検証が可能である。この分析は、疾患シグニチャーをはるかに広範に関連付けることにより、マイクロアレイデータの解釈を促進する。
【０１９４】
疾患過程の理解向上に寄与する以外に、ＰＢＭＣ転写データセットのメタ分析は、臨床診断に以下の点で重要な影響を及ぼす：（１）識別的な疾患特異的シグニチャーの特定、その理由は、数万もの潜在的マーカーをスクリーニングすれば、大抵の場合、疾患を特異に特徴付ける限定数の転写物を突き止めることが可能になると見込まれるからである；及び（２）前哨シグニチャーの特定、その理由は、広範な健康障害において発現の変化する遺伝子セットが、早期の疾患検知用スクリーニングアッセイに恐らく使用できると思われるからである。
【０１９５】
転移性メラノーマ患者は、肝臓移植を受けた患者の薬理的処置で誘導されるシグニチャーに類似した、免疫抑制に関する内因的転写シグニチャーを示す。本発明は、メラノーマ進行の高い危険性にある患者を特定する方法及び装置を提供する。それに加え、本発明は、肝臓被移植者のために免疫抑制薬の用量を調節し、拒絶の危険性と副作用とを均衡させるのに役立ち得る、免疫抑制インディケーターをモニターする方法及び装置も提供する。
【０１９６】
本明細書に記載の特定の実施形態は、例示のために示しているのであって、本発明を限定するものとして示しているのでないことは、理解されよう。本発明の主要な特徴は、本発明の範囲から逸脱せずに、多様な実施形態において使用することができる。当業者であれば、本明細書に記載の特定の手順に相当する多数の手順を認識され、又は単に常套的な実験を用いてそうした手順を確かめることができよう。このような相当手順は、本発明の範囲内に入ると見なされ、特許請求の範囲により包含される。
【０１９７】
本明細書に引用したすべての刊行物及び特許出願明細書は、本発明が関わる技術分野における技術者の技術水準を示している。すべての刊行物及び特許出願明細書は、参照により組み込むために、各個別の刊行物又は特許出願明細書が明確に個別に指示されている場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１９８】
本明細書に開示し、主張している組成物及び／又は方法はすべて、本開示内容に照らせば、過度の実験をせずに作製し、実行することができる。本発明の組成物及び方法は、好ましい実施形態に関して説明してきたが、該組成物、及び／又は該方法に、本明細書に記載の方法の各ステップ又は一連のステップにおいて、本発明の概念、趣旨及び範囲から逸脱せずに、変更を加え得ることは、当業者であれば明らかとなろう。より具体的には、化学的にも生理学的にも関係しているある種の作用剤を、本明細書に記載の作用剤の代用とし、同時に同一又は類似の結果を実現する見込みとなることは、明らかであろう。当業者に明白なこのようなすべての代用物及び改変は、添付の特許請求の範囲に規定する本発明の趣旨、範囲及び概念の中に入っていると見なされる。
【０１９９】
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【図１Ａ】
2010508826.tif 000017
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年6月24日(2009.6.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
本発明の範囲を制限することなく、診断法に関してその背景技術を説明する。
【国際調査報告】
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