(57)【要約】  水溶性のホウレンソウ抽出物を含む組成物、水溶性ホウレンソウ抽出物、リポソーム、カルジオリピン及び少なくとも1つの抗酸化剤を含む組成物、水溶性のホウレンソウ抽出物、シロイヌナズナ抽出物又はマスタード（アブラナ属）植物、リポソーム、カルジオリピン及び少なくとも1つの抗酸化剤を含む組成物、かかる組成物を得るための方法、及び核DNA、ミトコンドリアDNA又はその両方に対する損傷を修復し、例えば反応性酸素種又は8-ヒドロキシでオキシグアノシンからのこのようなDNAへの損傷を抑制又は減少させ、及び/又はミトコンドリア損傷及び膜流動性損失を修復又は抑制するための、かかる組成物を用いる方法が開示される。本発明の組成物は、局所的に投与され、経口的に投与され又は注射による投与のように非経口的に投与され得る。局所的に投与される場合に、浸透エンハンサー、芳香剤、保存料、湿潤剤及び化粧的助剤のような添加物は、本発明の組成物中に含まれ得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶性のホウレンソウ抽出物及び許容される担体を含む組成物を投与することを含む、DNAに対する酸化的損傷を修復する方法。
【請求項２】
前記酸化的損傷が、8-ヒドロキシデオキシグアノシンにおける少なくとも1つのグアニン残基を変換する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記8-ヒドロキシデオキシグアノシンが、少なくとも1つのDNA塩基対における塩基のペアリング修飾を起こす、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記DNAが、核DNA、ミトコンドリアDNA、又はその両方である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記水溶性のホウレンソウ抽出物が、以下のステップ：
ホウレンソウの水溶性スラリーを形成し；
該スラリーの固体成分から該スラリーの液状成分を分離し；
熱水又は蒸気を用いて、該スラリーの液状成分を活性炭と混合し；
該液状成分を活性炭から分離し；及び
該スラリーの液状成分をマイクロろ過して、実質的に無色の水溶性ホウレンソウ抽出物を回収すること、
によって得られる、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記の実質的に無色の水溶性のホウレンソウ抽出物を低温殺菌することを更に含む、請求項６記載の方法。
【請求項７】
実質的に無色の水溶性のホウレンソウ抽出物に対して少なくとも1つの保存料を添加することを更に含む、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記の水溶性のホウレンソウ抽出物を含む組成物が、局所的に又は経口的に投与される、請求項１記載の方法。
【請求項９】
水溶性のホウレンソウ抽出物を含む組成物を投与することを含む、DNAの酸化的損傷を抑制又は減少させる方法。
【請求項１０】
前記DNAが、核DNA、ミトコンドリアDNA、又はその両方である、請求項１１記載の方法。
【請求項１１】
前記水溶性のホウレンソウ抽出物が、以下のステップ：
ホウレンソウの水溶性スラリーを形成し；
該スラリーの固体成分から該スラリーの液状成分を分離し；
熱水又は蒸気を用いて、該スラリーの液状成分を活性炭と混合し；
該液状成分を活性炭から分離し；及び
該スラリーの液状成分をマイクロろ過して、実質的に無色の水溶性ホウレンソウ抽出物を回収すること、
によって得られる、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
前記の実質的に無色の水溶性ホウレンソウ抽出物を低温殺菌することを更に含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
実質的に無色の水溶性ホウレンソウ抽出物に対して少なくとも1つの保存料を添加することを更に含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記の水溶性のホウレンソウ抽出物を含む組成物が、局所的に又は経口的に投与される、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
水溶性ホウレンソウ抽出物を含む組成物を投与することを含む、細胞中のATP産生又は合成を増加させる方法。
【請求項１６】
前記水溶性のホウレンソウ抽出物が、以下のステップ：
ホウレンソウの水溶性スラリーを形成し；
該スラリーの固体成分から該スラリーの液状成分を分離し；
熱水又は蒸気を用いて、該スラリーの液状成分を活性炭と混合し；
該液状成分を活性炭から分離し；及び
該スラリーの液状成分をマイクロろ過して、実質的に無色の水溶性ホウレンソウ抽出物を回収すること、
によって得られる、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記の実質的に無色の水溶性のホウレンソウ抽出物を低温殺菌することを更に含む、請求項２０記載の方法。
【請求項１８】
前記の水溶性のホウレンソウ抽出物を含む組成物を投与する方法が、局所投与、経口投与及び非経口投与からなる群より選ばれる、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
水溶性のホウレンソウ抽出物、リポソーム、カルジオリピン及び少なくとも1つの抗酸化剤を含む、ミトコンドリア機能を改善、維持又は保存するための、あるいはDNAへの酸化的損傷を修復するための組成物であって、該カルジオリピンがリポソームのリン脂質二重層中に埋め込まれ、及び少なくとも1つの抗酸化剤がリポソームのリン脂質二重層に埋め込まれ、リポソームの水溶性中心に含まれ又はその両方に含まれる、前記組成物。
【請求項２０】
前記リポソームがホスファチジルコリンから主に成る、請求項１８記載の組成物。
【請求項２１】
前記カルジオリピンが、テトラオレオイル-カルジオリピンである、請求項２０記載の組成物。
【請求項２２】
前記少なくとも1つの抗酸化剤がメチルゲンチセートであり、更に該メチルゲンチセートがカルジオリピンと共にリポソームのリン脂質二重層中に埋め込まれる、請求項２１記載の組成物。
【請求項２３】
第二の抗酸化剤を更に含み、該第二の抗酸化剤がl-カルノシンであり、更に該l-カルノシンがリポソームの水溶性中心に含まれる、請求項２２記載の組成物。
【請求項２４】
マスタード（アブラナ属）種子の抽出物を更に含む、請求項２３記載の組成物。
【請求項２５】
シロイヌナズナの抽出物を更に含む、請求項２３記載の組成物。
【請求項２６】
前記のシロイヌナズナの抽出物が、8-オキソグアニンDNAグリコシラーゼである、請求項２５記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
背景
本願は、部分継続出願であり、参考として本明細書にその全体が援用される、2006年12月11日に出願された米国特許出願第11/636,889号の優先権を主張する。
【０００２】
ミトコンドリアは細胞内のエネルギー産生部位である。それらは、酸化的修復の副産物、すなわち反応性酸素種（ROS）からの過激なフリーラジカル活性の部位でもある。細胞及びミトコンドリアにおけるフリーラジカル活性は、エネルギー産物の結果的な損失、DNA機能不全又は破壊的酵素経路のアップレギュレーションを伴って、細胞性及び/又はミトコンドリア性損傷をもたらし得る。
【０００３】
ROS-介在DNA損傷のための最も重要なマーカーの1つは、8-ヒドロキシデオキシグアノシン（8-OHdG）である。具体的には、酸化剤は、グアニンを、シトシンの代わりにアデノシンと対にさせることによって、グアニンを、DNAにおける突然変異を誘導する8-OHdGに変換することができる。従って、DNAが複製される場合には、配列におけるグアノシン-シトシン対は、アデノシン-チミジン対によって置換される。従って、8-OHdGは、塩基のミスペアリング、ランダム変異及び核酸削除の知られている原因である。
【０００４】
DNAは生命維持に関わる細胞ペプチドをコードするので、抑制されないDNA損傷は細胞中で蓄積することができ、最終的に細胞機能不全又は細胞死を招くだろう。幸運なことに、細胞及びミトコンドリアは、例えば8-OHdG及び反応性酸素種によって起こるDNA損傷を扱う修復メカニズムを有する。しかしながら、修復メカニズムは、それ自体、特にミトコンドリア中では完全ではない。通常の修復メカニズムの場合でさえ、核DNA損傷に比べて、約10倍超のミトコンドリアDNA（「mtDNA」）損傷レベルである、ことが報告されている。ミトコンドリア中でのDNA修復のメカニズムは、ミトコンドリア性DNA突然変異として受け継がれる加齢及びある疾患のいくつかの局面が、個体生命に渡るミトコンドリア配列のエラーの蓄積によって悪化するという認識に因って、近年、多大な興味の対象となっている。
【０００５】
近年、細胞の対するDNA損傷についての問題を解決するための2つの主な方法が存在している。第１は、破壊分子がDNA又は他の細胞下構造を損傷する前に破壊細胞を除去するために抗酸化剤のレベルを増強することである。第２は、損傷DNA鎖の切除及び修復を起こすDNA修復酵素のファミリーのアップレギュレーションを直接的に加えるか、あるいは該アップレギュレーションを起こさせることのいずれかである。これらの種類の処理の例は以下である：Laboratories Serobiologiques由来のLS DNage、及びAGI Dermaticsから入手可能な修復酵素。Laboratories Serobiologiques由来のLS DNageは、gadd-45（成長停止及びDNA損傷）形成をアップレギュレートすると報告されている。Gadd-45は、あるDNA修復酵素の活性及び可触性を調節することが明らかになっている多機能性タンパク質である。AGI Dermaticsは、3種類の修復酵素を提供している。第１は、チミジンダイマーの切除を起こすエンドヌクレアーゼである。第２は、チミジンダイマー形成を直接的に逆転させるために働く光回復酵素である。第３は、シロイヌナズナから単離されたogg-1（8-オキソグアニンDNAグリコシラーゼ）であり、8-OHdGの切除修復を標的する。これらの方法は、特定の種類のDNA損傷を修復する点でいくらか効果的ではあるが、それらは完全ではない。具体的には、これらの解決策は、細胞に酸化的ストレスを受けさせ、次いで損傷を修復するために働かせるか、あるいは酸化的ストレスを抑制しようとするがそれが一旦起こると損傷を修復し損なうかのいずれかである。
【発明の概要】
【０００６】
簡単な概要
1つの例では、本発明は、水溶性のホウレンソウ抽出物を含む組成物であって、該水溶性ホウレンソウ抽出物が核DNA、ミトコンドリアDNA又はその両方の酸化的損傷を抑制又は減少させ；核DNA、ミトコンドリアDNA又はその両方の損傷を修復し；及び/又はATPの産生もしくは合成を促進又は増加させる、前記組成物である。
【０００７】
別の例では、本発明は、水溶性ホウレンソウ抽出物を含む組成物を投与することを含む、核DNA、ミトコンドリアDNA又はその両方の酸化的損傷を抑制又は減少させる方法であって、該水溶性ホウレンソウ抽出物が核DNA、ミコトンドリアDNA又はその両方の酸化的損傷を抑制又は減少させる、前記方法である。
【０００８】
更なる例では、本発明は、水溶性ホウレンソウ抽出物を含む組成物を投与することを含む、核DNA、ミトコンドリアDNA又はその両方の酸化的損傷を修復する方法であって、該水溶性ホウレンソウ抽出物が核DNA、ミコトンドリアDNA又はその両方の酸化的損傷を修復する、前記方法である。
【０００９】
別の例では、本発明は、水溶性ホウレンソウ抽出物を含む組成物を投与することを含む、細胞中のATP産生又は合成を増加させる方法であって、水溶性ホウレンソウ抽出物が細胞中のATP産生又は合成を増加させる、前記方法である。
【００１０】
更なる例では、本発明は、ホウレンソウのマイクロろ過によって得られる水溶性ホウレンソウ抽出物を含む組成物である。
【００１１】
なお更なる例では、本発明は、水溶性ホウレンソウ抽出物を含む組成物であって、該水溶性ホウレンソウ抽出物が、以下：
新鮮な、凍結した、脱水した又は乾燥したホウレンソウ及び水を粉砕して、スラリーを形成し；
該スラリーの固体成分及び液状成分を分離し；
該スラリーの液状成分を回収し；
スチームケトルに該スラリーの液状成分を置き；
該スチームケトルに活性炭（すなわち、活性化された炭素、活性炭（activate carbon））を加え；
蒸気及び場合により攪拌器を用いて、該スチームケトル中でスラリーの液状成分と活性炭とを混合し；並びに
該液状成分を活性炭から分離し、及びマイクロろ過し、例えばナノろ過して水溶性ホウレンソウ抽出物を得ること、によって得られ；
更にここで、水溶性ホウレンソウ抽出物は、核DNA、ミトコンドリアDNA又はその両方の酸化的損傷を抑制又は減少させ、核DNA、ミトコンドリアDNA又はその両方の酸化的損傷を修復し、及び/又はATPの産生もしくは合成を促進又は増加させる、前記組成物である。
【００１２】
なお更なる例では、本発明は、先の段落に記載された方法を用いて得られた水溶性ホウレンソウ抽出物を含む組成物であって、該方法は、低温殺菌ステップ、及び/又は担体、例えばブチレングリコール（1,3-ブタンジオール; 1,3-ブチレングリコール）及び/又は保存料を加えるステップを更に含む、前記組成物である。本発明の組成物におい使用され得る保存料のいくつかの例は、2-フェノキシエタノール、例えばフェノニップ（Phenonip）（登録商標）（Clariant Corp. Charlotte, N.C.）及びクロルフェネシン、例えばゲルマジド（Germazide）（登録商標）M（Engelhard Corp., Iselin, N.J.）を含む。
【００１３】
別の例では、本発明は、水溶性ホウレンソウ抽出物、リポソーム、カルジオリピン及び少なくとも1つの抗酸化剤を含む組成物であって、カルジオリピンがリポソームのリン脂質二重層中に埋め込まれ、更に該少なくとも1つの抗酸化剤がカルジオリピンと共にリポソームの脂質二重層中に埋め込まれ、リポソームの水溶性中心に含まれ、あるいはその両方に含まれる、前記組成物である。1つの例では、カルジオリピンは、テトラオレオイル-カルジオリピン、テトラパルミトレオイル-カルジオリピン、テトラミリストイル-カルジオリピン、又は種子油由来のカルジオリピンでよい；リポソームは、ホスファチジルコリンから主に成ってもよい；カルジオリピンと共にリン脂質二重層中に埋め込まれる少なくとも1つの抗酸化剤は、メチルゲンチセート（又はメチル ゲンチセート又はメチル デヒドロキシベンゾエート）でもよい；そして、リポソームの水溶性中心に含まれる少なくとも1つの抗酸化剤は、l-カルノシンでよい。
【００１４】
更なる例では、本発明は、ミトコンドリア機能を改良し、維持し又は回復させ、及びDNAに対する酸化的損傷を修復する方法であって、水溶性ホウレンソウ抽出物、リポソーム、カルジオリピン及び少なくとも1つの抗酸化剤を含む組成物を投与することを含み、該カルジオリオピンはリポソームのリン脂質二重層中に埋め込まれ、及び該少なくとも1つの抗酸化剤はリポソームのリン脂質二重層中に埋め込まれ、リポソームの水溶性中心に含まれ、又はその両方に含まれる、前記方法である。更なる例では、カルジオリピンは、テトラオレオイル-カルジオリピン、テトラパルミトレオイル-カルジオリピン、テトラミリストイル-カルジオリピン、又は種子油由来のカルジオリピンでよい；リポソームは、ホスファチジルコリンから主に成ってもよい；カルジオリピンと共にリン脂質二重層中に埋め込まれる少なくとも1つの抗酸化剤は、メチルゲンチセート（又はメチル ゲンチセート又はメチル デヒドロキシベンゾエート）でもよい；そして、リポソームの水溶性中心に含まれる少なくとも1つの抗酸化剤は、l-カルノシンでよい。
【００１５】
別の例では、本発明は、水溶性ホウレンソウ抽出物、シロイヌナズナの抽出物、例えば8-オキソグアニンDNAグリコシラーゼ（8-OHdGの切除修復を標的するDNA修復酵素）、リポソーム、カルジオリピン、及び少なくとも1つの抗酸化剤を含む組成物であって、該カルジオリオピンはリポソームのリン脂質二重層中に埋め込まれ、及び更に該少なくとも1つの抗酸化剤はカルジオリオピンと共にリポソームのリン脂質二重層中に埋め込まれ、リポソームの水溶性中心に含まれ、又はその両方に含まれる、前記組成物である。1つの例では、カルジオリピンは、テトラオレオイル-カルジオリピン、テトラパルミトレオイル-カルジオリピン、テトラミリストイル-カルジオリピン、又は種子油由来のカルジオリピンでよい；リポソームは、ホスファチジルコリンから主に成ってもよい；カルジオリピンと共にリン脂質二重層中に埋め込まれる少なくとも1つの抗酸化剤は、メチルゲンチセート（又はメチル ゲンチセート又はメチル デヒドロキシベンゾエート）でもよい；そして、リポソームの水溶性中心に含まれる少なくとも1つの抗酸化剤は、l-カルノシンでよい。本発明の別の例は、例えば、ミコトンドリア機能を改善し、維持し又は回復させ、及び/又は細胞DNAD及び/又はミトコンドリアDNAに対する酸化的損傷を修復するために、本段落に記載された組成物を用いる方法である。
【００１６】
更なる例では、本発明は、水溶性ホウレンソウ抽出物、マスタード（アブラナ属）植物、リポソーム、カルジオリピン及び少なくとも1つの抗酸化剤を含む組成物であって、該カルジオリオピンはリポソームのリン脂質二重層中に埋め込まれ、及び更に該少なくとも1つの抗酸化剤はカルジオリピンと共にリポソームのリン脂質二重層中に埋め込まれ、リポソームの水溶性中心に含まれ、又はその両方に含まれる、前記組成物である。1つの例では、カルジオリピンは、テトラオレオイル-カルジオリピン、テトラパルミトレオイル-カルジオリピン、テトラミリストイル-カルジオリピン、又は種子油由来のカルジオリピンでよい；リポソームは、ホスファチジルコリンから主に成ってもよい；カルジオリピンと共にリン脂質二重層中に埋め込まれる少なくとも1つの抗酸化剤は、メチルゲンチセート（又はメチル ゲンチセート又はメチル デヒドロキシベンゾエート）でもよい；そして、リポソームの水溶性中心に含まれる少なくとも1つの抗酸化剤は、l-カルノシンでよい。本発明の別の例は、例えば、ミコトンドリア機能を改善し、維持し又は回復させ、及び/又は細胞DNA及び/又はミトコンドリアDNAに対する酸化的損傷を修復するために、本パラグラフに記載された組成物を用いる方法である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、本発明の組成物において用いられる水溶性抽出物を得るため使用され得る方法を説明するフローチャートである。
【図２】図２は、水溶性抽出物を得るために使用され得る方法についての変形を説明するフローチャートであり、凍結されたホウレンソウは出発物質である。
【図３】図３は、水溶性抽出物を得るために使用され得る別の方法についての変形を説明するフローチャートであり、ホウレンソウ脱水物は出発物質である。
【図４】図４は、約50%のホウレンソウ抽出物、約49%のブチレングリコール、及び約1%の保存料、例えばフェノニップ（登録商標）又はゲルマジド（登録商標）M、を含む、ホウレンソウ脱水物の水溶性抽出物を用いて達成されたATP産生を説明するグラフである。結果は、非処理の対照細胞と比べて、水溶性のホウレンソウ脱水物の抽出物は、細胞ATPレベルの用量依存的増加を誘導することを示す。図４では、データを、非処理の対照細胞におけるATPレベルに対する、%対照ATPとして示す。従って、ATPの増加は、試験されたサンプル（複数）の陽性効果と考えられる。
【図５】図５は、様々な水溶性ホウレンソウ抽出物を用いて達成されたATP産生を説明する棒グラフである。結果は、水溶性ホウレンソウ抽出物が、非処理の対照細胞と比べて細胞ATPレベルの用量依存的増加を誘導することを示す。図５では、データを、非処理の対照細胞におけるATPレベルに対する、%対照ATPとして示す。従って、ATPの増加は、試験されたサンプル（複数）の陽性効果と考えられる。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
詳細な説明
本発明は、本明細書に記載の特定の組成物、方法論又はプロトコールに限定されないことを理解されたい。更に他に特定しなければ、本明細書に記載のすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する当業者に通常理解されるものと同一の意味を有する。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施例のみを説明するための目的であり、特許請求の範囲によってのみ限定されることになる本発明の範囲を限定する意図ではない、ことも理解されたい。
【００１９】
本発明は、酸化的ストレスから細胞を保護し、及び酸化的に損傷されたDNA例えば8-OHdGによって損傷されたDNAを修復するために使用することにより、細胞機能を保持するためのより包括的な方法を提供することによって、核及び/又はミトコンドリアDNA修復を解決するための現存の技術の不利益を解消する。具体的には、本発明は、酸化的ストレスに対する細胞抵抗性及びDNAに対する酸化的損傷の修復を増強することによって、細胞機能、特にDNAに対する損傷を抑制することによるミトコンドリア機能、核及びミトコンドリア機能の両方を改善することを目的とする。より具体的には、本発明は、独特の水溶性ホウレンソウ抽出物を含む組成物であって、該水溶性ホウレンソウ抽出物が酸化的DNA損傷、具体的には8-OHdG損傷、の修復を促進する、前記組成物である。1つの例では、本発明は、ミトコンドリア（「糸状複合体（mitocomplex）」又は「ミトコム（mitocom）」）を標的し、及び/又は細胞膜及び構造（すなわち、細胞防御（cellufortification)））を補強するようにデザインされている、複合体である。かかる複合体は、水溶性ホウレンソウ抽出物、マスタード（アブラナ属）種子の抽出物又はシロイヌナズナの抽出物、例えばロキシソーム（登録商標）（AGI Dermatics, Inc., Freeport, NY）又は8-オキソグアニンDNAグリコシラーゼ（8-OHdGの切除修復を標的するDNA修復酵素）及びリポソームから成ってもよく、リポソームのリン脂質二重層に埋め込まれたカルジオリピン及びメチルデヒドロキシベンゾエート（メチルゲンチセート）、及びリポソームの水溶性中心に埋め込まれたl-カルノシンを有するホスファチジルコリンから主に成ってもよい。
【００２０】
「水溶性抽出物」は、該抽出物を得るために使用される方法に関係なく、水溶性又は水に溶解することができるホウレンソウの任意の抽出物である。従って、水溶性ホウレンソウ抽出物は、例えば、蒸気蒸留法、ナノろ過法、冷水抽出法、熱水抽出法、有機溶媒による抽出などによって得られる。当業者は、本発明の範囲内で水溶性抽出物を得るために使用され得る多くの他の方法又は抽出法が存在することを理解されたい。
【００２１】
ホウレンソウ（ピナシア・オレラセア）は、一般的に、最も重要な抗酸化野菜の1つと考えられている。カットされたばかりのホウレンソウの葉は、約1000 mgの総フラボノイド/kgを含むと見積もられる。多くの異なったフラボノイドは、例えばパツレチン（3,5,7,3',4'-ペンタヒドロキシ-6-メトキシフラボン）、スピナセチン、フラボノールグリコシド、グルクロニド、6-酸化添加フラボノールのメチル化及びメチレンジオキシド誘導体のアシル化ジ-及びトリグリセリド、を含むホウレンソウに存在する。かかるフラボノイドに加えて、「NAO」として知られている強力で、水溶性の、天然抗酸化物混合物は、ホウレンソウに見出される。NAOはリポキシゲナーゼ酵素を特異的に阻害し、NAOの抗酸化活性は他の公知の抗酸化剤の抗酸化活性に匹敵し、緑茶、N-アセチルシステイン、ブチル化ヒドロキシトルエン及びビタミンEの抗酸化活性よりもin vitro及びin vivoにおいて優れていることが分かっている。Lomnitski他, "Composition, Efficacy, and Safety of Spinach Extracts," Nutrition and Cancer, 2003; 46(2): 222-231。
【００２２】
ホウレンソウの抗酸化性は、細胞に対する酸化的損傷のために重要であり、DNAは年齢と共に増加し、加齢プロセス及び癌を含む数種類の疾患の重要な原因であると考えられている。DNAに対する酸化的損傷は、放射線によって生成され、好気的代謝の副産物である、励起された酸素種によって起こり得る。酸化された塩基8-OHdGは、DNAの両方の種類に見出されるが、約20個の公知の放射線損傷産物の内の1つであり、核DNAよりもミトコンドリアDNAにおいてより多く存在していることが分かっている。Richter他, "Normal oxidative damage to mitochondrial and nuclear DNA is extensive," Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988; 85: 6465-6467。mtDNAにおける8-OHdGの高レベルは、mtDNAのかなり非効率的修復である、ミトコンドリアで起こる膨大な酸素代謝によって起こり得、それは、mtDNAについて観察された高い変異率の原因であろう。従って、8-OHdGによって起こる変異を抑制する組成物、及び/又は8-OHdGによって損傷されるDNA、例えばミトコンドリアDNA、を修復する組成物についての要求が存在する。
【００２３】
上で説明したように、ROSのような酸化剤は、DNAにおけるグアニン残基を8-OHdGに変換することができる。DNAにおける新規な8-OHdG残基は、具体的には（通常グアニンと対を形成する）シトシンの代わりにアデノシンでペアリングすることによって、塩基対修飾を起こすことによって該DNAにおいて変異を誘導する。従って、DNAが複製される時には、配列中のグアニン-シトシンのペアリングは、アデノシン-チミンのペアリングによって置換される。重要なことには、本発明の水溶性ホウレンソウ抽出物は、グアニン修飾部位での効果を奏するその能力の点で独特である。特に、本発明の水溶性ホウレンソウ抽出物は、グアニンの8-OHdGへの変換を抑制し、グアニンが8-OHdGに変換される回数を減らし、及び/又は8-OHdGに既に変換されたグアニン残基を修復することができる。このことは、ホウレンソウが抗酸化性を有することが知られ、DNA損傷のいくつかの種類を修復する能力を有することが先に示されているが、水溶性ホウレンソウ抽出物がグアニン残基での損傷及び/又は8-OHdGによって起こる損傷を抑制又は修復するために使用され得る、ので重要である。
【００２４】
例えば、1988年にDoetsch他は、ホウレンソウからの新規なDNA修復酵素の単離を報告した。該酵素はヌクレアーゼSPと称され、アデニン変異に対するその効果を優先的に有する。Doetsch他, "ヌクレアーゼSP: アデニン部位で損傷された二重鎖DNAを優先的に切断する、ホウレンソウ由来の新規酵素" Nucleic Acids Res. 1988; 16(14): 6935-6952。加えて、Oleykowski他は、1988年にDoetschによって最初に記載されたヌクレアーゼSPは、グアニン残基を除くすべてのDNAミスマッチを切断する、ことを示した。Oleykowski他, "ホウレンソウのSPヌクレアーゼによるヌクレオチド挿入/削除及び塩基対ミスマッチの切断" Biochem. 1999; 38(7): 2200-5。反対に、本発明の水溶性のホウレンソウ抽出物は、8-OhdGによって起こるDNA損傷の修復を議論している実施例4に示されるように、グアニン修飾部位においてその効果を発揮する。
【００２５】
DNAの完全な状態は正常細胞の操作には重要である。ヒトミトコンドリアは5〜10個の同一のDNAの環状分子を含む。各々は、2個の異なったリボゾームRNA（rRNA）分子；22個の異なった転移RNA（tRNA）分子をコードする37遺伝子（各アミノ酸について少なくとも1つ）；及び13個のポリヌクレオチドについての情報を有する16,569塩基対から成る。13個のポリヌクレオチドは、NADHデヒドロゲナーゼ、チトクロームcオキシダーゼ及びATPシンターゼのサブユニットを含む内側ミトコンドリア膜におけるタンパク質複合体のサブユニットである。これらの重要な補助因子の原因となるmtDNAの損傷及び不完全な修復、及び加齢をもたらす酵素は、エネルギー生成の重要な損失を導くことができ、これは、細胞の正常な機能のために必要とされる生のタンパク質、脂質及び糖類を産生する細胞の能力を無能にする。従って、DNA、例えばミトコンドリアDNAの損傷を抑制し、及び/又はDNA損傷を修復し得る組成物について、当該分野での要求が存在する。
【００２６】
本発明は、水溶性のホウレンソウ抽出物であるホウレンソウの水溶性分画が核DNA及びミトコンドリアDNA、特に細胞中のDNAを含む細胞を酸化的ストレスから保護し及びROS例えば過酸化水素ラジカルによって起こる損傷を修復する能力を有する、驚くべく発見に基いている。具体的には、実施例3に記載するように、フローサイトメトリーがスーパーオキサイドの酸化を測定するために使用され、それによって、水溶性のホウレンソウ抽出物がDNA（核、ミトコンドリア又はその両方）を酸化的ストレスから保護することを証明する。実施例4に記載するように、同一の抽出物がDNA修復を助けることが示されている。加えて、実施例2で議論するように、本発明は、正常の電子的プロセスで起こる酸化的損傷から細胞を保護する直接的結果であるかもしれない、水溶性のホウレンソウ抽出物がATPの産生の増加に効果的であるという驚くべき発見に基いている。
【００２７】
本発明の水溶性のホウレンソウ抽出物は、例えば、熱水及びマイクロろ過ステップを用いる抽出方法によって得られる。本発明の水溶性のホウレンソウ抽出物は、蒸気蒸留によっても得られる。当業者は、本発明の範囲内にある水溶性のホウレンソウ抽出物を得るために使用され得る多数の他の方法があることを理解するだろう。水溶性のホウレンソウ抽出物を得るために使用され得る抽出方法の1つの例は、実施例1に記載され、図1に図示されている。一般的に、この方法は、新鮮な、乾燥した、脱水された又は凍結されたホウレンソウを得、そしてそのホウレンソウを水で粉砕してスラリーにする、ことを含む。該スラリー液及び固体は、次いで分離され、スラリーの液状部分は回収される。スラリーの液状部分は、活性炭と共にスチームケトルに加えられる。蒸気を入れ、又は熱水を加え、スラリーの液状部分及び活性炭を蒸気（又は熱水）と混合して、スラリーの緑色液状部分を脱色して、無色の液状ホウレンソウ抽出物を得る。液状ホウレンソウ抽出物及び活性炭は次いで分離する。液状ホウレンソウ抽出物中の任意の浸透物は、更なる抽出のために、マイクロろ過（例えば、ナノろ過又は限界ろ過（「UF」））によって洗浄水と混合され得る。透明な液状ホウレンソウ抽出物は次いでスチームケトル中で低温殺菌される。保存料、例えば2-フェノキシエタノール例えばフェノニップ（登録商標）（Clariant Corp. Charlotte, N. C.）又はクロルフェネシン例えばゲルマジド（登録商標）M（Engelhard Corp. Iselin, N.J.）、担体、例えばブチレングリコール（1,3-ブタンジオール; 1,3-ブチレングリコール）、及び/又は他の化粧品補助剤、添加剤、賦形剤等を、透明な液状ホウレンソウ抽出物に加えてもよい。
【００２８】
上記の抽出方法のある局面は変更することができ、それは本発明の範囲内に依然としてあることを理解されたい。例えば、スチームケトルの種類は変更してもよく、スチームケトル中の蒸気温度は変更することができ及び/又は熱水は蒸気の代わりに使用することができ、使用される保存料は変更してもよく、ろ過のために使用される篩又は膜は変更することができ、スラリーの調製に使用される水の量は変更することができ、ホウレンソウの起源は変更することができ、ホウレンソウは乾燥しても、脱水しても、新鮮でも又は凍結されたものなどでもよい。
【００２９】
水溶性のホウレンソウ抽出物を含む本発明の組成物は、許容される担体、添加剤、保存料、賦形剤及び/又は化粧品助剤と共に投与され得る。更に、水溶性のホウレンソウ抽出物を含む本発明の組成物は、ゲル、ローション、クリーム、トニック、エマルション、ペースト等の形態で許容される担体と共に外部から投与され得る。別の例として、水溶性のホウレンソウ抽出物を含む本発明の組成物は、ピル剤、錠剤、粉剤、棒状剤、飲料等の形態で許容される担体と共に内部から投与され得る。従って、本明細書に記載の組成物は、化粧品、医薬品、食品及び飲料組成物を含む非常に様々な最終製品において有用である。本発明の組成物が有用である最終製品は、核DNA、ミトコンドリアDNA又はその両方の損傷を修復するために、及び/又は例えばROS又は8-OHdG由来の、核、ミトコンドリア又はその両方のDNAに対する損傷を抑制するために使用され得る。
【００３０】
従って、本発明の1例では、本発明の組成物は、溶液、ゲル、ローション、クリーム、軟膏、水中油型エマルション、油中水型エマルション、スティック、スプレイ、ペースト、ムース、トニック又は他の化粧品的及び局所的に好適な形態で、局所的に投与される。
【００３１】
例えば、本発明の組成物は、局所製剤として投与され、ミトコンドリア機能を改善し、回復し及び/又は維持するために有用であるリポソームと共に、本明細書に記載の水溶性のホウレンソウ抽出物を含んでもよい。リポソームは、化粧及び皮膚用製品としての局所的適用のための効率的な薬物送達システムとして知られている。特に、リポソームは、リン脂質二重層から成る膜を有する球状小胞である。リポソームの脂質二重層は、他の二重層、例えば細胞及び/又はミトコンドリア膜と融合することができ、それによってリポソーム内容物を送達する。
【００３２】
リポソームは、混合された脂質鎖例えば卵ホスファチジルエタノールアミンを有する天然由来のリン脂質を含む様々なリン脂質、又はDOPE（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）のような純粋な成分から成り得る。リポソームは典型的には、約25〜1000 nmの範囲にある小サイズである。リポソームは、リン脂質二重層から成る閉鎖構造であり、そして、その水溶性コア内の水溶性の親水性分子、及び二重層の疎水性部位内の油溶性の疎水性分子をカプセル化することができる。一般的に、リポソームは、中性、陰性又は陽性でもよい。例えば、陽性リポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、カルジオリピン及びホスファチジルセリンを含む溶液から形成され得る。リポソームは、多層小胞と単層小胞との混合物でもよい。
【００３３】
上で説明したように、リポソームは、リン脂質から成る。リン脂質分子は、それ自体親水性である「頭グループ」及び2つのアシル鎖からなる疎水性の「尾」を有する。リン脂質の水溶性は、疎水性の尾の長さ及び頭グループの水への親和性に依拠する。例えば、飽和C-Cを有する直鎖（非分岐）の形態での14以上の炭素原子を含む各アシル鎖を有する純粋な脂質は、水不溶性である。一般的に、脂質のアシル鎖長が増加すると、限界ミセル濃度は急激に減少する。
【００３４】
本発明の組成物で使用されるリポソームは、リン脂質、セラミド、スフィンゴ脂質、コレステロール及びトリグリセリド、又は植物由来のフィトステロールのような他の脂質を含む、細胞膜に存在する脂質から主に成ってもよい。1つの例では、本発明の組成物で使用されるリポソームは、ホスファチジルコリン（又はホスファチジル コリン）から主になってもよい。ホスファチジルコリンは、細胞膜の主な構成成分であるリン脂質である。ホスファチジルコリンは、1,2-ジヘキサデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、PtdCho及びレクチンとしても知られている。不飽和ホスファチジルコリンは、コリン、ω-6不飽和脂肪酸（例えば、リノール酸）、ω-3脂肪酸（例えば、γ-リノール酸）を含み、残りのグリセリドを低レベルで含む（又はまったく含まない）。
【００３５】
リポソーム研究の進歩は、リポソームに、体内の免疫システム具体的には網内系（RES）の細胞による検出を避けさせることができた。かかるリポソームは、「スレルスリポソーム」として知られ、コーティングとしてのPEG（ポリエチレングリコール）で構築されている。体内で不活性であるPEGコーティングは、薬物送達メカニズムのためのより長い循環寿命を可能にする。従って、本発明の組成物は水溶性のホウレンソウ抽出物、及びリポソームはカルジオリピンと共に埋め込まれたホスファチジルコリン、例えばテトラオレオイル-カルジオリピン、及び少なくとも1つの抗酸化剤、例えばメチルゲンチセート及び/又はl-カルノシンから主に成ってもよく、PEG「スレルス」コーティングを更に含んでもよい。PEGコーティングに加えて、本発明の組成物で使用されるステルスリポソームは、送達の標的部位に対する結合を可能にする、結合されたリガンドを有してもよい。
【００３６】
皮膚ケア又は化粧品では、リポソームは、血清、ローション、ゲル又はクリームのような好適なマトリックス（例えば、許容される担体）中に調合され得る。より具体的には、局所投与用の本発明の組成物は、クリーム、ローション、ゲル、ペースト又は他の化粧的及び局所的に好適な形成でよく、水溶性のホウレンソウ抽出物、及びカルジオリピン及び抗酸化剤が埋め込まれたリポソームから成ることがある。1つの例では、局所投与用の本発明の組成物は、水溶性のホウレンソウ抽出物、ホスファチジルコリンから主に成りカルジオリピンが埋め込まれたリポソーム、例えばテトラオレオイルカルジオリピン、及び少なくとも1つの抗酸化剤を含む。少なくとも1つの抗酸化剤は、l-カルノシン、メチルゲンチセート又はその両方でよい。リポソーム内に埋め込まれたカルジオリピンは、1以上のテトラパルミトレオイル-カルジオリピン及びテトラミリストイル-カルジオリピンでもよい。カルジオリピンは、リポソームのリン脂質二重層内に埋め込まれている。少なくとも1つの抗酸化剤は、リポソームのリン脂質二重層、リポソームの水溶性中心又はその両方に埋め込まれてもよい。1つの例では、少なくとも1つの抗酸化剤は、水溶性抗酸化剤でよい。別の例では、少なくとも1つの抗酸化剤は、脂溶性抗酸化剤でよい。更なる例では、少なくとも1つの抗酸化剤は、1重項酸素スカベンジャーでよい。更なる例では、本発明の組成物に含まれる抗酸化剤は、水溶性かつ1重項酸素スカベンジャー、又は脂溶性かつ1重項酸素スカベンジャーのいずれかでよい。
【００３７】
少なくとも1つの抗酸化剤は、例えばカルジオリピン及び少なくとも1つの抗酸化剤を含むリポソームを含む組成物の局所的投与によってカルジオリピンが細胞に送達されるまで、カルジオリピンを安定化すると考えられる。1つの例では、カルジオリピンを安定化する少なくとも1つの抗酸化剤は、カルジオリピンを酸化から保護する強力な抗酸化剤である、メチルゲンチセートである。更に、リポソーム送達技術の本質上、リポソームは水内部を含む。カルジオリピンの酸化をリポソーム内で避けるために、第2の抗酸化剤、例えば水溶性抗酸化剤に基づく強力なペプチドであるl-カルノシンがリポソームに含まれてもよい。
【００３８】
改良された細胞機能は、水溶性ホウレンソウ抽出物、及びカルジオリピン例えばテトラオレオイルカルジオリピンを含むリポソーム、例えばホスファチジルコリンリポソーム、及び少なくとも1つの抗酸化剤、含む本発明の組成物によって達成される。なぜならば、そのような組成物は、核及びミトコンドリアDNAを修復し及び回復するための水溶性ホウレンソウ抽出物、細胞を酸化的損傷から保護するための抗酸化剤、例えばl-カルノシン、及びミトコンドリア機能を維持又は回復するための及び/又はミトコンドリア膜を修復するためのカルジオリピン、例えばテトラオレオイルカルジオリピンを含むからである。従って、本発明のかかる組成物は、ミトコンドリア機能を改善、維持又は回復するために、及びDNAに対する酸化的損傷を修復するために有用である。
【００３９】
カルジオリピンは、異例の構造のリン脂質であり、特に不飽和脂肪酸が豊富である。典型的には、リノール酸は、カルジオリピンに存在する不飽和脂肪酸の少なくとも85%を示す。従って、約85のリノール酸から成るカルジオリピンは、リポソーム例えばリポソームのリン脂質二重層に埋め込まれている。別の例では、テトラオレオイル-カルジオリピンは、リポソーム中に埋め込まれている。テトラオレオイル-カルジオリピンは、リノール酸カルジオリピンよりも酸化的損傷をほとんど受けず及び分解している、4つのオレイン酸構成物（C18：1、テトラオレオイル-カルジオリピン）から成る。他の例では、カルジオリピンは、種子油由来のカルジオリピンでもよい。使用されるカルジオリピンの他の例は、例えばAvanti（登録商標）Polar Lipids, Inc. (Alabaster, AL) から入手可能である。Avanti（登録商標）Polar Lipids, Inc.から入手できるカルジオリピンの例は、以下：1,1',2,2'-テトラミルストイルカルジオリピン（アンモニウム塩）(製造番号770332); 1,1',2,2'-テトラミルストイルカルジオリピン（ナトリウム塩）(製造番号750332又は710335); 1,1'-オレオイル-2,2'-(12-ビオチニル(アミノドデカノイル)）カルジオリピン（アンモニウム塩）（製造番号860564); カルジオリピン（E. Coli、ジナトリウム塩）(製造番号841199); カルジオリピン（Heart, Bovine-Disodium Salt) (製造番号770012); カルジオリピン（ウシ心臓ジナトリウム塩）(製造番号840012); 水素化カルジオリピン（ウシ心臓ジナトリウム塩）(製造番号830057); ジリソカルジオリピン（ウシ心臓ジナトリウム塩）(製造番号850082); ジリソカルジオリピン（ウシ心臓ジナトリウム塩）；心臓水素化カルジオリピン; リソカルジオリピン; モノリソカルジオリピン（ウシ心臓ジナトリウム塩）(製造番号850081); 及びモノリソカルジオリピン（ウシ心臓ジナトリウム塩）を含む。更なる例では、リポソーム中に埋め込まれたカルジオリピンは、ジホスファチジルグリセロール、又はより正確には1,3-ビズ(sn-3'-ホスファチジル)-sn-グリセロールでよい。
【００４０】
本発明の組成物に取り込まれ得る多くの抗酸化剤が存在する。例えば、本発明のリポソームに取り込まれる抗酸化剤は、水溶性でよく、よってリポソームの水溶性中心に埋め込まれる。別の例では、リポソームに埋め込まれる抗酸化剤は、脂溶性でよく、よってリポソームの脂質二重層に取り込まれる。更なる例では、本発明のリポソーム中に埋め込まれる抗酸化剤は、1重項酸素スカベンジャーでよい。別の例では、抗酸化剤は、水溶性かつ1重項酸素スカベンジャーでも、又は脂溶性かつ1重項酸素スカベンジャーでもよい。更なる例では、1超の抗酸化剤は、本発明のリポソーム中に埋め込まれている。例えば、1以上の以下の抗酸化剤は、本発明のリポソーム中に埋め込まれている：メチルゲンチセート、l-カルノシン、ブチル化ヒドロキシトルエン（BHT）、tert-ブチルヒドロキノン（TBHQ）又はそれらの組合せ。
【００４１】
1つの例では、メチルゲンチセートは、脂溶性であり、カルジオリピンを安定化する能力を有するので、抗酸化剤として使用される。メチルゲンチセートは、高い酸素ラジカル吸収性（「ORAC」）（25,605 μmol Teq/g）を有する、これは強い抗酸化剤であることを示す。次いで、そのORAC値に基づいて例えば高いORAC値を有する抗酸化剤を選択することによって、本発明での使用のための抗酸化剤を選択することができる。別の例では、l-カルノシンは、本発明において抗酸化剤として使用される。水溶性であり、リポソームの水溶性中心に因ってカルジオリピンを酸化的損傷から保護する能力を有するからである。従って、1つの例では、リポソームの水溶性中心は、l-カルノシンを含む。更なる例では、リポソームのリン脂質二重層はカルジオリピン及びメチルゲンチセートと共に埋め込まれ、リポソームの水溶性中心はl-カルノシンを含む。
【００４２】
別の実施例では、本発明のリポソーム中に埋め込まれた抗酸化剤は、ミトコンドリアにおいて見出される抗酸化剤、例えばグルタチオンでもよい。グルタチオンが細胞から人工的に削除される時に、酸化的損傷が増加することが、明らかになっている。ミトコンドリア中のグルタチオンのレベルは、細胞の残りの部分におけるグルタチオンのレベルよりも非常に重要である。ミトコンドリアのグルタチオンレベルは、細胞の残りの部分におけるレベルよりも、年齢と共に減少する。
【００４３】
アスコルビン酸（すなわち、ビタミンＣ）及びビタミンＥ（すなわち、トコフェロール）は、リポソーム及び水溶性ホウレンソウ抽出物の両方を含む本発明の組成物で投与される、リポソーム中に埋め込まれていることがある抗酸化剤の他の例である。本発明の組成物で投与されるリポソーム中に埋め込まれていることがある多数の他の抗酸化剤が存在することを理解されたい。カルジオリピン及び少なくとも1つの抗酸化剤例えばメチルゲンチセート、l-カルノシン又はその含むリポソームである、本発明で使用されるリポソームは、約10℃〜約60℃、好ましくは約20℃〜約55℃、好ましくは約30℃〜約50℃の範囲の温度で保存される時に、安定であり及び実質的な酸化的損傷を受けにくいという利益を有する、ことも理解されたい。
【００４４】
局所投与に好適である本発明の組成物は、許容される担体と混合され得る。許容される担体は、溶媒、担体、希釈剤又は組成物の構成成分のための分散剤として広く働くことができ、好適な濃度での該構成分の皮膚表面への均一な適用を可能にする。許容される担体は、組成物の皮膚への浸透を促進することもできる。
【００４５】
本発明の水溶性ホウレンソウ抽出物を含む局所的投与用製剤の1つの例では、許容される担体は、局所的組成物の約80重量%〜約100重量%を形成し得る。他の例では、許容される担体は、総組成物の約85重量%〜約95重量%を形成し得る。従って、1例では、本発明の組成物は、約0.01%〜約5%の水溶性ホウレンソウ抽出物、カルジオリピンを含む約0.01%〜約5%のリポソーム、及び少なくとも1つの抗酸化剤；並びに約90%〜約99.99%の担体を含み得る。別の例では、本発明の組成物は、約0.01%〜約5%の水溶性ホウレンソウ抽出物、及び総組成物の約90%〜約99.99%の許容される担体を含み得る。別の例では、本発明の組成物は、総組成物の約90%〜約99.99%の、例えば任意の添加剤及び/又は賦形剤、例えば2-フェノキシエタノール又はフェノニップ（登録商標）、又はクロルフェネシン又はゲルマジド（登録商標）Mのような保存料を含む許容される担体、例えばブチレングリコールを含み、総組成物の約0.01重量%〜約5重量%、及び総組成物の約0.01重量%〜約5重量%の水溶性ホウレンソウ抽出物を形成し得る。当業者は、保存料が本発明の組成物に含まれる場合に、含まれる保存料の種類は保存料の濃度を決定するだろう、ことを理解するだろう。例えば、フェノニップ（登録商標）は、総組成物の約0.25重量%〜約1重量%の範囲の濃度で組み込まれる時に化粧品及び洗浄用品を維持する商業的に入手可能な保存料である。使用され得る別の商業的に入手可能な保存料は、米国特許第6,447,793号明細書により充分に記載されているゲルマジド（登録商標）Mである。ゲルマジド（登録商標）Mは、典型的には、総組成物の約0.5重量%〜約2重量%の範囲で有用である。
【００４６】
他の例、又は少なくとも水溶性ホウレンソウ抽出物を含み、カルジオリピンと共にリポソームをも含むことがあり、そして少なくとも1つの抗酸化剤を含む本発明の組成物の局所的適用剤において、許容される担体は、総組成物の約90重量%〜約99.99重量%を形成し；総組成物の約97重量%〜約99重量%を形成し；総組成物の約91重量%〜約98重量%を形成し；総組成物の約92重量%〜約97重量%を形成し；総組成物の約93重量%〜約96重量%を形成し；又は、総組成物の約94重量%〜約95重量%を形成する。他の化粧品添加物又は添加物の非存在下で、許容される担体は組成物のバランスを形成する。
【００４７】
水溶性ホウレンソウ抽出物及び本発明を実施するにおいて使用される他の成分は、許容される担体に溶解性でも又は不溶性でもよい。組成物のすべての成分が許容される担体に溶解性である場合には、担体は溶媒として働く。しかし、組成物のすべての又はいくつかの成分が許容される担体中で溶解性である場合には、それらの成分は例えば懸濁液、エマルジョン、ゲル又はペースト等の方法によって担体中に分散される。
【００４８】
従って、可能な許容される担体の範囲が非常に広いことは当業者には明らかであろう。例えば、許容される担体は、エマルジョン、ローション、クリーム又はトニックでよい。許容される担体は、水、エタノール、ブチレングリコール、又は皮膚の浸透を助ける他の様々な溶媒を含み得る。好適な担体のいくつかの例は、米国特許第6,184,247号明細書及び同第6,579,516号明細書に記載され、その内容全体は参照により本明細書に援用される。
【００４９】
一般的に、本発明に従う許容される担体は、限定されるものではないが、以下の例のいずれかを含み得る：水；ブチレングリコール；ヒマシ油；エチレングリコールモノブチルエーテル；ジエチレングリコールモノエチルエーテル；コーン油；ジメチルスルホキシド；エチレングリコール；イソプロパノール；大豆油；グリセリン；溶解性コラーゲン；酸化亜鉛；酸化チタン；又はカオリン。
【００５０】
1つの局面では、本発明を実行するにおいて使用される許容される担体は、水及びエタノールを含む。場合により、許容される担体は、ブチレングリコール及び/又はフレスコレートMGAをも含む。例えば、許容される担体は、組成物の重量で40〜60%の水及び5〜10%のブチレングリコールを含み得る。本発明の実施において、許容される担体は、総組成物の重量で約0.01%〜約5%；より具体的には総組成物の重量で約1%〜約5%；より具体的には総組成物の重量で約2%〜約4%；より具体的には総組成物の重量で約3%を含む水溶性ホウレンソウ抽出物と混合される。
【００５１】
更に、本発明で使用される許容される担体は、場合により、ジブチルフタレート；溶解性コラーゲン；ソルビトール；又は2-ピリドン-5-カルボキシレートナトリウムを含むがこれらに限定されない1以上の湿潤剤を含んでもよい。本発明を実施するにおいて使用され得る湿潤剤の他の例は、関連する部分が参照として援用されている、CTFA (Cosmetic Toiletry and Fragrance Association) 化粧品成分ハンドブックに見出される。
【００５２】
更に、本発明で使用される許容される担体は、場合により、ブタン-1,3-ジオール；パルミチン酸セシル；ジメシルポリシロキサン；グリセリルモノリシノール酸；モノステアリン酸グリセリル；パルミチン酸イソブチル；ステアリン酸イソセチル；パルミチン酸イソプロピル；ステアリン酸イソプロピル；ステアリン酸ブチル；ラウリン酸イソプロピル；ラウリン酸ヘキシル；オレイン酸デシル；ミリスチン酸イソプロピル；ラウリル乳酸；オクタデカン-2-オール；カプリル酸トリグリセリド；カプロン酸トリグリセリド；ポリエチレングリコール；プロパン-1,2-ジオール；トリエチレングリコール；ゴマ油；ココナッツ油；ヒマワリ油；ラウリン酸イソアミル；ノンオキシノール-9；パンテノール；水素化植物油；酢酸トコフェリル：リノール酸トコフェリル；プロピレングリコール；落花生油；ヒマシ油；イソステアリン酸；パルミチン酸；リノール酸イソプロピル；ラウリン乳酸；ミリスチル乳酸；デシルオレイン酸又はミリスチルミリスチン酸を含むがこれらに限定されない1以上の皮膚軟化薬を含んでもよい。本発明を実施するにおいて使用され得る皮膚軟化薬の他の例は、関連する部分が参照として援用されている、CTFA (Cosmetic Toiletry and Fragrance Association) 化粧品成分ハンドブックに見出される。
【００５３】
更に、本発明で使用される許容される担体は、場合により、ピロリドン、例えば2-ピロリドン；アルコール、例えばエタノール；アルカノール、例えばデカノール；グリコール、例えばプロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ブチレングリコール；界面活性剤；又はテルペンを含むがこれらに限定されない1以上の浸透エンハンサーを含む。
【００５４】
本発明を実施するにおいて使用され得る他の許容される担体は、当業者には明らかであり、本発明の範囲内に含まれる。
【００５５】
別の例では、本発明の組成物は、液体又は固体の形態で経口的に投与される。液体は、水-型、ミルク-型、紅茶-型、果汁-型、又はそれらの組合せでよい。本発明に従う内部投与のための固体及び液体組成物は、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、微結晶性セルロース、デンプン、デキストリン、発酵ホエイ、豆腐、マルトデキストリン、糖アルコール（例えば、ソルビトール及びマンニトール）を含むポリオール、糖類（例えば、ラクトース）、プロピレングリコールアルギン酸、ゲランガム、グアール、ペクチン、トランガカントガム、アカシアガム、ローカストビーンガム、アラビアガム、ゼラチン、及びそれらの増粘剤の混合物を含む増粘剤を更に含んでもよい。これらの増粘剤は、関連する特定の増粘剤及び所望の粘性効果によって、典型的には、約0.1%までのレベルで本発明の組成物に含まれる。
【００５６】
本発明の固体及び液体の組成物（食品、飲料、サプリメント又は医薬）は、糖類甘味料及び天然及び/又は人工の無/低カロリー甘味料を含む1以上の甘味料の有効量を含むことができ、典型的には含むだろう。本発明の組成物で使用される甘味料の量は、使用される甘味料の種類及び所望の甘味強度によって典型的には変動するだろう。
【００５７】
本発明の組成物は、核DNA、ミトコンドリアDNA又はその両方に対する損傷の所望の修復、及び/又は例えば反応性酸素種又は8-OHdGからの例えばDNAへの損傷の抑制に決定的に影響を与えない限り、投与形式に関わらず、様々な公知の及び慣用的な化粧的助剤を含んでもよい。例えば、本発明の組成物は、フィラー（例えば、固体、半固体、液体等）；担体；希釈剤；増粘剤；ゲル化剤；ビタミン、レチノイド、及びレチノール（例えば、ビタミンB3、ビタミンA等）：顔料；芳香剤；紫外線防止剤及び紫外線遮断剤；抗酸化剤及びラジカルスカベンジャー；有機ヒドロキシ酸；湿潤剤（exfoliant）；皮膚調整剤；湿潤剤；セラミド、偽セラミド、リン脂質、スフィンゴ脂質、コレステロール、グルコサミン、薬学的に許容される浸透剤（例えば、n-デシルメチルスルホキシド、レシチン有機ゲル、チロシン、リジン等）；抗菌剤；アミノ酸、例えばプロリン、ピロリジンカルボン酸、その誘導体及び塩、糖類異性体、パンテノール、トリエタノールアミン又は水酸化ナトリウムのような塩基を含む緩衝剤；ワックス、例えば蜜蝋、地蝋、パラフィンワックス；アロエベラ、コーンフラワー、マンサク、ニワトコの花又はキュウリを含むがこれらに限定されない植物抽出物；乳白剤；懸濁化剤；結合剤；保存料；及びそれらの組合せを含むがこれらに限定されない、1以上の添加剤又は当業者に周知の他の任意の成分を更に含むことができる。含まれ得る保存料の1例は、フェノニップ（登録商標）（Clariant, Charlotte, N. C）、2-フェノキシエタノール及びグリコールエーテルを含む植物抽出物の抗菌性混合物である。他の好適な添加剤及び/又は助剤は、その内容全体が参照として本明細書に援用されている、米国特許第6,184,247号明細書に記載されている。
【００５８】
上記組成物は、界面活性剤、共-溶剤及び賦形剤を含むがこれらに限定されない更なる不活性成分を含み得る。親水性及び疎水性の界面活性剤のような界面活性剤は、組成物において含まれ得る。具体的な界面活性剤は、全体的組成及び組成物の意図した送達に基いて使用され得る。有用な界面活性剤は、ポリエトキシル化（PEG）脂肪酸、PEG-脂肪酸ジエステル、PEG-脂肪酸モノ-及びジ-エステル混合物、ポリエチレングリコールグリセロールエステル、アルコール-油エステル交換生成物、ポリグリセリド化脂肪酸、プロピレングリコール脂肪酸エステル、プロピレングリコールエステル-グリセロールエステルの混合物、モノ-及びジグリセリド、ステロール及びステロール誘導体、ポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル、ポリエシレングリコールアルキルエーテル、多糖エステル、ポリエチレングリコールアルキルフェノール、ポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレンブロックコポリマー、ソルビタン脂肪酸エステル、低級アルコール脂肪酸エステル、イオン性界面活性剤、及びそれらの混合物を含む。
【００５９】
本発明の組成物に含まれ得る他の添加剤は、当業者に明らかであり、本発明の範囲内に含まれるだろう。
【００６０】
投与形式に関らず、一般的に、本発明の組成物は、日基準で少なくとも投与され得る。本発明の組成物の投与は、任意の好適な時間継続され得る。核DNA、ミトコンドリアDNA又はその両方への損傷の修復の程度、及び/又は例えば反応性酸素種又は8-OHdGからの例えばDNAへの損傷の抑制の程度は、使用される組成物の総量及び頻度で直接的に変化するだろう、ことを理解されたい。
【００６１】
1つの例では、本発明の組成物は、少なくとも1日に1回投与される。別の例では、本発明の組成物は1日に2回投与され得る。更なる例では、本発明の組成物は1日に3〜5回投与され得る。別の例では、毎日投与される本発明の組成物の量に制限はない。最大の効果のためには、本発明の組成物は、少なくとも1週〜数週間の間、少なくとも毎日投与される。本発明の組成物は、数週間〜1月〜数ケ月〜1年〜数年の間、少なくとも毎日基準で投与してもよい。本発明の組成物がどの程度頻繁に又はどのくらい長く投与されるかについて限定がないことを理解されたい。
【００６２】
先の詳細な説明は限定であるよりもむしろ説明として解釈される意図である。本発明は、限定するものと解釈してはならない以下の実験的試験及び実施例によって更に説明される。本特許の全体に渡って引用された参考文献、特許及び公表された出願は、本明細書に文献として援用される。
【実施例】
【００６３】
実施例 1: 水溶性ホウレンソウ抽出物を得るためにホウレンソウを抽出する方法
例えば有機的条件下で成長したホウレンソウを採取し、ホウレンソウの葉を穏やかな条件下で洗浄した。洗浄した葉を次いで乾燥した。乾燥した時、Rietz Disintegrator (Hosokawa) を1/2の開口で、水対新鮮ホウレンソウを4:1の割合で用いて、ホウレンソウを水と共に粉砕してスラリーにした
【００６４】
次いで、液体及び固体を、バック圧縮及びリコテックスユニット (USSS 325メッシュシーブ、約44ミクロン開口を有する) のような好適な機器を用いて分離した。
【００６５】
ホウレンソウ抽出物液体及び7.5%の活性炭をスチームケトルに加えた。約140゜Fでの熱水又は蒸気の形態での熱を使用して、約30分間、ホウレンソウ抽出物液体及び7.5%の活性炭を混合した。混合のために攪拌器を使用してもよい。この加熱ステップは、緑色ホウレンソウ抽出物液体を脱色し、水溶性抽出物を局所的化粧品に添加する際に有用であり得る。
【００６６】
リコテックスユニット (USSS 325メッシュシーブ、約44ミクロン開口を有する) のような好適な機器を用いて抽出物液体及び活性炭を分離した。FP200番の膜のような好適なUFろ過機器を用いて、活性炭から更なる液体を分離し及び浄化し得る。
【００６７】
浸透物をUFろ過によって洗浄された水と混合した。得られた液体濃縮物中の総固体は、0.4〜1.0%の範囲にある。透明なホウレンソウ液体濃縮物を、180゜Fで攪拌器を用いてスチームケトル中で殺菌した。保存料、例えば2-フェノキシエタノール（例えばフェノニップ（登録商標）（Clariant Corp. Charlotte, N. C)）又はクロルフェネシン（例えば、ゲルマジド（登録商標）M）（Engelhard Corp. Iselin, NJ）を透明ホウレンソウ液体濃縮物に加えた。総組成は、% wt/wt/：約50%の透明ホウレンソウ液体濃縮物; 約49%の担体 (ブチレングリコール) 及び約1%の保存料 (例えば、フェノニップ（登録商標）（2-フェノキシエタノール）又はゲルマジド（登録商標）M (クロルフェネシン））である。
【００６８】
図2は、出発物質として凍ったホウレンソウを用いて水溶性ホウレンソウ抽出物を得るために使用され得る上記の方法の変形を説明する。図2はまた、抽出プロセルのどの時点において、以下の表IIで参照される水溶性抽出物1〜4が回収されるかを説明する。図3も、出発物質としてホウレンソウ脱水物を用いて水溶性ホウレンソウ抽出物を得るために使用され得る上記の方法の変形を説明する。図3はまた、抽出プロセルのどの時点において、以下の表IIで参照される水溶性抽出物5〜9が回収されるかを説明する。
【００６９】
実施例 2: ATPレベルの測定
細胞ATPのレベルは、細胞及びミトコンドリアの健康のマーカーである。この実施例で説明するように、ATPレベルは、ATPの存在下で光を発生するATP依存性ルシフェラーゼを用いて監視され得る。発生した光の量は、存在するATP量に直接比例する。
【００７０】
CHO-K1 (チャイニーズハムスター卵巣) 細胞は、ATCC (Manassas, VA) から購入した（細胞アクセッション番号ATCC CCL 61）。細胞培養は、1 x 104細胞/ウェルで96ウェルの不透明プレートで確立した。接着後、細胞を低グルコース培地（1 g/l）に供給し、終夜インキュベートした。低グルコース培地で培養した細胞は減少したATP量を有する。
【００７１】
終夜の培養後、細胞を2時間t-ブチル-過酸化物（1 mM）に曝露し、細胞ストレスを誘導した。過酸化物はグルコース単独よりも低くATPレベルを減少させ、損傷細胞状態を模倣する。過酸化物の曝露後に、新鮮な低グルコース培地を細胞にまた加えた。過酸化物でのチャレンジの直後に、典型的には1、10及び100 mg/mlの終濃度で細胞を試験試料に曝露した。37℃で4時間、細胞を試験試料でインキュベートした。この実施例で使用した試験試料は、凍ったホウレンソウスラリー及びホウレンソウ脱水物から得られた試料を含む。ホウレンソウ出発物質の2つの種類のための抽出プロセスから得られた試料は、粗ろ過ホウレンソウ抽出物、ナノ-ろ過抽出物、脱色抽出物、殺菌抽出物及び最終生成物を含む。結果を図4及び5に示す。図4及び5において、データは、非処理対照細胞のATPレベルと比べた、%対照ATPとして表わす。従って、ATPの増加は、試料（複数）の陽性効果と考えられる。図5で示されたデータは、ホウレンソウ脱水物から得られた試料が新鮮な凍ったホウレンソウから得られた試料よりも高い活性を有する傾向がある、ことを示している。
【００７２】
このアッセイは、損傷された細胞状態を模倣するストレス条件に従って、ATPレベルを回復する能力について化合物を選別する。従って、試験試料でチャレンジされた細胞をインキュベーションした後、製造者の仕様書に従ってPromega (Madison, WI) 由来のCell-Titer Glo試薬を用いて相対的細胞ATPレベルを測定した。すなわち、培地がウェルからはじき出た時に細胞を室温に平衡化した。希釈された試薬を添加し、プレートを室温で15分間インキュベートした。Wallachプレートリーダーで発光を読み取った。
【００７３】
各処理群の平均発光を計算し、各試験群からの平均を非処理対照の平均で除して%非処理対照を決定した。100%を超える任意の結果は細胞ATPレベルの正味の正の増加であると考えられるので、非処理対照は100%と考えられる。本実施例の結果を図4及び5に報告する。
【００７４】
実施例 3: 酸化的ストレスからの保護の測定
この実験で記載されたアッセイは、ミトコンドリア内で起こる酸化的ストレスを測定する。上で議論したように、エネルギー生成ATP分子を生じるためにミトコンドリアによって使用される生化学的反応はまた、副生成物のような高度に酸化されたスーパーオキシド・フリーラジカルを生成する。フローサイトメトリーを用いて、以下の実施例では、試験物質での処置後にミトコンドリア内でのスパーオキシドの状態を監視することによって、提供される様々な試験試料の、酸化的ストレスからの保護を測定した。
【００７５】
MitoSOX Redミトコンドリアスーパーオキシドインジケータ (Invitrogen cat番号36008) は、ミトコンドリアによって選択的に取られる蛍光色素である。ミトコンドリアにおいて一度、MitoSOXがスーパーオキシド・フリーラジカルと反応して蛍光産物（最大励起/最大発光 = 510/580 nm）を形成する。より高い蛍光読み値は、ミトコンドリア内に存在するスーパーオキシド・フリーラジカルのより高いレベルに相当する。
【００７６】
細胞培養: 試料につき16ウェルプレートを使用した。マルチプレートも同時に調製してもよい。プレートの説明については表I参照。THP単球（ATCC cat番号TIB-202）を6ウェルプレートに1.5 x 106細胞/ウェル（10% FBSで補充した2 ml/ウェル RMP1 1640培地を含む）で播き、処理前に1時間インキュベートした。
【００７７】
【表１】
2010512311.tif 000002
【００７８】
処理: グルタチオンモノエチルエステル (GMEE, 100 μM最終濃度) を陽性対照として使用した。より具体的には、陽性対照は、10 ml培地 (10% FBSで補充したRMPI 1640培地) に4 mgのグルタチオンモノエチルエステルを溶解することにより1.2 mMのストック溶液を作製することによって調製した。次いで、陽性対照ワーキング溶液 (300 μM) は、7.5 ml培地に2.5 mlストック溶液を加えることによって調製した。1 mlの陽性対照ワーキング溶液をプレートの1ウェルに加え、100 μMのグルタチオンモノエチルエステルの最終処理濃度を得た。
【００７９】
1 mlの培地 (10% FBSで補充したRMPI 1640培地) をプレートの所定のウェルに加えることによって（1ウェル/対照）、陰性対照及び正常対照を調製した。
【００８０】
試験試料は、100 mgの試験試料を秤量して15 mlの使い捨て遠心管に入れそして10 mlの脱イオン水を加えることにより、10 mg/mlの濃度の試料ストック溶液を作製することによって調製することができる。本実施例では、試験試料は、約50%のホウレンソウ抽出物、約49%のブチレングリコール及び約1%の保存料例えばフェノニップ（登録商標）又はゲルマジド（登録商標）Mを含む、ホウレンソウ脱水物の水溶性抽出物であった。次いで、試験試料ストック溶液を段階的に希釈して、300 μg/mlの試料ワークキング溶液を得た。次いで、試験試料ワーキング溶液の1 mlをプレートの3つの残りのウェルの各々に加え（3つ揃いウェル）、各試料ウェルについて100 μg/mlの最終試験試料濃度を得た。
【００８１】
次いで、試験試料及び対照ウェルを含むプレートを37℃、5% CO2で3時間インキュベートした。
【００８２】
チャレンジ: 3時間インキュベーション後、試験試料、陽性対照及び陰性対照を含むウェル中の細胞は、チャレンジ溶液を導入することによって酸化的ストレスに供した。チャレンジ溶液は以下のようにして調製した：
852 μl 8.8 M H2O2 + 4.15 ml培地 (=1.5 M H2O2) 
1 ml 1.5 M H2O2 + 9 ml培地 (= 150 mM H2O2) 
1 ml 150 mM + 30 ml培地 (=5 mM H2O2)。
正常対照を除いてプレートのすべてのウェルに1 mlの5 mM H2O2を加えた。1 mlの培地 (10% FBSで補充したRMPI 1640培地) を正常対照ウェルに加えた。次いでプレートを37℃、5% CO2で3時間インキュベートした。
【００８３】
染色: チャレンジでのインキュベーション後、すべてのウェルの中身をフローサイトメトリーチューブに移し、100 x gで5分間遠心した。細胞の上の培地を除き、次いで1 ml MitoSOX (5 μM) を各チューブに加えることによって細胞を染色した。MitoSOX染色液は、13 μL DMSO/バイアルを用いて2つのバイアルのMitoSOX (50 μg/バイアル, Invitrogen cat番号M36008) を溶解して、5 mM/バイアル (mw = 760 g/mole) の溶液を得ることによって、取得した。細胞を、暗中で、室温で15分間、染色液でインキュベートした。
【００８４】
フローサイトメトリー: 染色後、試料は、488 nmの励起レーザー及びFL2 588 nmの発光フィルターを用いて、フローサイトメトリー (例えば、Becton-Dickinson FACS Caliber) によって分析した。データは、陰性及び正常対照の反応によって定義される曲線に線形化した（0% 保護 = 非処理された/チャレンジされた陰性対照, 100 % 保護 = 非処理された/非チャレンジされた正常対照）。これらの条件下で、陽性対照（100 μMのグルタチオンメチルエステル）は酸化的ストレスからの35%の保護を与えた。
【００８５】
結果: 
本実施例の結果は、ホウレンソウ脱水物の水溶性抽出物が、酸化的ストレスから顕著な保護、平均91.3±0.9%を与えたことを証明した。
【００８６】
実施例 4: 8-OHdG修復の測定
本実施例では、細胞は、過酸化物及びUV光でチェレンジし、酸化的DNA損傷のマーカーである8-OHdGのレベルを増加させた。チャレンジからの回復において細胞を助ける試験試料の能力、回復の時間の長さ及びDNA損傷の修復を測定した。
【００８７】
具体的には、HS27繊維芽細胞及びHEKO01ケラチノサイト由来のヒト真皮は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション (ATCC) (Manassas, VA) から購入した。HS27及びHEK001の同時培養は、4 x 104及び8 x 104/ウェルで12ウェルプレートにおいて確立した。細胞は終夜培養した。終夜培養後、培養培地は、0.5%ウシ胎児血清を含むリン酸緩衝生理食塩水で置換した。次いで、細胞培養物は、ソーラーからの全波長UV光シミュレーター（UVBメータで測定された25 mJ/cm2）及びH2O2に同時に曝露して、8-OHdG損傷を生成させた。UV及びH2O2への曝露後、細胞は緩やかに洗浄し、新鮮な完全培地を加えた。次いで、細胞は、（図1に概略したプロセスを用いて得た）9つの液状水溶性ホウレンソウ抽出物、ホウレンソウ抽出物（CEP Solabiaグループ (フランス) 及びAston Chemicals, Aylesbury, UKのような供給者から入手可能な蒸気蒸留の特定の方法を用いるホウレンソウの葉の水溶性抽出物）、及び50 mg/mlのストック溶液からの最終濃度1、10及び100 μg/mlの陽性対照を含む試験試料で処理した。処理後、細胞は、37℃のインキュベーターに戻し、1〜2時間インキュベートした。
【００８８】
インキュベーション時間後、細胞を洗浄し、（Trypl E解離試薬を用いる）トリプシン消化及び遠心によって回収した。シグマのGenElute哺乳動物ゲノムDNAミニプレップキットを用いて、細胞からDNAを単離、回収した。DNA単離及び回収後、各試料中のDNA量は、Molecular Probes (Invitrogen) 製のPicoGreen（登録商標）dsDNAキットを用いて測定することができる。
【００８９】
等量のDNAは、日本老化制御研究所（Japanese Institute for the Control of Aging）によって推奨されるヌクレアーゼP1及びアルカリホスファターゼを用いて消化した。消化した試料はEKISAキットを用いてアッセイした。具体的には、8-OHdGは、各試料由来の2 mg DNAを日本老化制御研究所（Nikken SEIL Corp., Haruoka, Fukuroi, Shizuoka, Japan）製の8-OHdG ELISAキットに加えることによってDNA試料において測定した。
【００９０】
本実施例の結果を以下の表IIに報告する。結果は、対照細胞中に存在するパーセンテージと比べた、試験試料に曝露された細胞中に存在する8-OHdGのパーセンテージとして報告される。従って、100%未満の任意の値は、陽性の結果と考えられ、DNA損傷の修復の指標である。ホウレンソウ抽出物、すなわち蒸気蒸留の特定の方法を用いるホウレンソウの葉の水溶性抽出物は、CEP Solabiaグループ (フランス) (又はSolabiaの供給者、例えばAston Chemicals (Aylesbury, UK)) から入手可能であり、63.9%のパーセント対照値でDNA損傷を修復する顕著な能力を証明した。水溶性ホウレンソウ抽出物1、6、7及び8も、それぞれ、85.7%、82.1%、82.0%及び80.9%のパーセント対照値でDNA損傷を修復する顕著な能力を証明した。
【００９１】
【表２】
2010512311.tif 000003
【００９２】
上の記載は、本発明の好ましい実施態様の記載である。均等の原理を含む特許法の原則に従って解釈される、添付の特許請求の範囲で特定され発明の趣旨及びより広い局面から逸脱することなく、様々な変更及び変化がなされる。例えば冠詞「a」、「an」、「the」又は「said」を用いる単数系の特許請求の範囲の要素への任意の言及は、単数形に該要素を限定するものと解釈してはならない。
【図１】
2010512311.tif 000004
【図２】
2010512311.tif 000005
【図３】
2010512311.tif 000006
【図４】
2010512311.tif 000007
【図５】
2010512311.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】平成21年11月13日(2009.11.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
DNAに対する酸化的損傷を修復、抑制又は減少させるための、水溶性のホウレンソウ抽出物及び許容される担体を含む組成物であって、投与される、前記組成物。
【請求項２】
前記酸化的損傷が、8-ヒドロキシデオキシグアノシンにおける少なくとも1つのグアニン残基を変換する、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記8-ヒドロキシデオキシグアノシンが、少なくとも1つのDNA塩基対における塩基のペアリング修飾を起こす、請求項２記載の組成物。
【請求項４】
前記DNAが、核DNA、ミトコンドリアDNA、又はその両方である、請求項３記載の組成物。
【請求項５】
前記水溶性のホウレンソウ抽出物が、以下のステップ：
ホウレンソウの水溶性スラリーを形成し；
該スラリーの固体成分から該スラリーの液状成分を分離し；
熱水又は蒸気を用いて、該スラリーの液状成分を活性炭と混合し；
該液状成分を活性炭から分離し；及び
該スラリーの液状成分をマイクロろ過して、実質的に無色の水溶性ホウレンソウ抽出物を回収すること、
を含む工程によって得られる、請求項１記載の組成物。
【請求項６】
前記工程が、前記の実質的に無色の水溶性のホウレンソウ抽出物を低温殺菌することを更に含む、請求項５記載の組成物。
【請求項７】
実質的に無色の水溶性のホウレンソウ抽出物に対して少なくとも1つの保存料を添加することを更に含む、請求項６記載の組成物。
【請求項８】
局所的に又は経口的に投与される、請求項１記載の組成物。
【請求項９】
細胞中のATP産生又は合成を増加させるための、水溶性ホウレンソウ抽出物を含む組成物であって、投与される、前記組成物。
【請求項１０】
前記水溶性のホウレンソウ抽出物が、以下のステップ：
ホウレンソウの水溶性スラリーを形成し；
該スラリーの固体成分から該スラリーの液状成分を分離し；
熱水又は蒸気を用いて、該スラリーの液状成分を活性炭と混合し；
該液状成分を活性炭から分離し；及び
該スラリーの液状成分をマイクロろ過して、実質的に無色の水溶性ホウレンソウ抽出物を回収すること、
を含む工程によって得られる、請求項９記載の組成物。
【請求項１１】
前記工程が、前記の実質的に無色の水溶性のホウレンソウ抽出物を低温殺菌することを更に含む、請求項９記載の組成物。
【請求項１２】
局所投与、経口投与及び非経口投与からなる群より選ばれる方法によって投与される、請求項１１記載の組成物。
【請求項１３】
ミトコンドリア機能を改善、維持又は保存するための、及びDNAへの酸化的損傷を修復するための請求項１記載の組成物であって、DNAへの酸化的損傷を改善、維持又は修復するための、水溶性のホウレンソウ抽出物、リポソーム、カルジオリピン及び少なくとも1つの抗酸化剤を更に含み、
該カルジオリピンがリポソームのリン脂質二重層中に埋め込まれ、及び少なくとも1つの抗酸化剤がリポソームのリン脂質二重層に埋め込まれ、リポソームの水溶性中心に含まれ又はその両方に含まれる、前記組成物。
【請求項１４】
前記リポソームがホスファチジルコリンから主に成る、請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】
前記カルジオリピンが、テトラオレオイル-カルジオリピンである、請求項１４記載の組成物。
【請求項１６】
前記少なくとも1つの抗酸化剤がメチルゲンチセートであり、更に該メチルゲンチセートがカルジオリピンと共にリポソームのリン脂質二重層中に埋め込まれる、請求項１５記載の組成物。
【請求項１７】
第二の抗酸化剤を更に含み、該第二の抗酸化剤がl-カルノシンであり、更に該l-カルノシンがリポソームの水溶性中心に含まれる、請求項１６記載の組成物。
【請求項１８】
マスタード（アブラナ属）種子の抽出物を更に含む、請求項１７記載の組成物。
【請求項１９】
シロイヌナズナの抽出物を更に含む、請求項１７記載の組成物。
【請求項２０】
前記のシロイヌナズナの抽出物が、8-オキソグアニンDNAグリコシラーゼである、請求項１７記載の組成物。
【請求項２１】
局所的化粧組成物を製造するために使用される、請求項１〜２０のいずれか１項記載の組成物。
【国際調査報告】
2010512311.tif 000009
2010512311.tif 000010
2010512311.tif 000011
2010512311.tif 000012