(57)【要約】  （ａ）スプラタスト又はその製薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物；及び（ｂ）スタチン又はその製薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物を含む、併用製品を提供する。その様な併用製品は、アテローム性動脈硬化症及び関連疾患の治療に特に有用性を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）スプラタスト又はその製薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物；及び
（ｂ）スタチン又はその製薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物
を含む、併用製品。
【請求項２】
前記スタチンが、ピタバスタチン、フルバスタチン、シンバスタチン、ロバスタチン、ロスバスタチン、プラバスタチン、及びアトルバスタチンから選択される、請求項１に記載の併用製品。
【請求項３】
前記スタチンがロスバスタチン及びアトルバスタチンから選択される、請求項２に記載の併用製品。
【請求項４】
スプラタスト又はその製薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物；スタチン又はその製薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物；及び製薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤、又は担体を含む医薬製剤を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の併用製品。
【請求項５】
以下の成分：
（Ａ）スプラタスト又はその製薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物を、製薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤、又は担体とともに含む、医薬製剤；並びに
（ｂ）スタチン又はその製薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物を、製薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤、又は担体とともに含む、医薬製剤
を含むキットオブパーツを含み、成分（Ａ）及び（Ｂ）の各々が他方と併用して投与するために適切な形態で提供される、請求項１から３のいずれか一項に記載の併用製品。
【請求項６】
成分（Ａ）を成分（Ｂ）と関連させて、互いに併用して投与するために適切な２つの成分とする工程を含む、請求項５に規定のキットオブパーツの製造方法。
【請求項７】
（Ｉ）請求項５に規定の成分（Ａ）及び（Ｂ）の一方；並びに
（ＩＩ）当該成分を２つの前記成分の他方と併用するための説明書
を含む、キットオブパーツ。
【請求項８】
前記スタチンがスタチンラクトンの形態で使用されない、請求項１から５及び７のいずれか一項に記載の併用製品。
【請求項９】
使用される前記スタチンがロバスタチンラクトン又はシンバスタチンラクトンである、請求項１から５及び７のいずれか一項に記載の併用製品。
【請求項１０】
成分（Ａ）及び（Ｂ）が、炎症疾患の治療において連続的に、別々に、及び／又は同時に使用するために適切なものである、請求項５、７、８、及び９（請求項５又は７に従属する場合）のいずれか一項に記載のキットオブパーツ。
【請求項１１】
炎症疾患の治療のための医薬の製造のための、請求項１から５及び７から１０のいずれか一項に記載の併用製品の使用。
【請求項１２】
炎症疾患の治療を必要とする患者に、請求項１から５及び７から１０のいずれか一項に記載の併用製品を投与する工程を含む、炎症疾患の治療方法。
【請求項１３】
前記疾患が、喘息、慢性閉塞性肺疾患、偏頭痛、クローン病、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、又は潰瘍性大腸炎から選択される、請求項１０に記載のキットオブパーツ、請求項１１に記載の使用、又は請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記疾患がアテローム性動脈硬化症又は関連する心臓血管疾患である、請求項１０に記載のキットオブパーツ、請求項１１に記載の使用、又は請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記疾患がアテローム性動脈硬化症である、請求項１４に記載のキットオブパーツ、使用、又は方法。
【請求項１６】
アテローム性動脈硬化症に関連する前記心臓血管疾患が、大動脈瘤、動脈硬化、末梢動脈閉塞性疾患、冠動脈疾患、冠状動脈性心臓病、粥腫崩壊及び／又は不安定粥腫、粉瘤崩壊及び／又は不安定粉瘤、血管疾患、動脈疾患、虚血性疾患、虚血、及び脳卒中から選択される、請求項１４に記載のキットオブパーツ、使用、又は方法。
【請求項１７】
前記冠動脈疾患が、狭心症、心筋梗塞、及び心臓麻痺から選択される、請求項１６に記載のキットオブパーツ、使用、又は方法。
【請求項１８】
前記冠状動脈性心臓病が、心臓病及び心臓疾患から選択される、請求項１６に記載のキットオブパーツ、使用、又は方法。
【請求項１９】
前記脳卒中が、脳血管障害及び一過性脳虚血発作から選択される、請求項１６に記載のキットオブパーツ、使用、又は方法。
【請求項２０】
前記疾患が、粥腫崩壊及び／若しくは不安定粥腫又は粉瘤崩壊及び／若しくは不安定粉瘤である、請求項１６に記載のキットオブパーツ、使用、又は方法。
【請求項２１】
前記患者が急性冠不全症候群を有する、請求項１０から２０のいずれか一項に記載のキットオブパーツ、使用、又は方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な医薬の組み合わせに関する。
【背景技術】
【０００２】
冠状動脈性心臓病などの心臓血管疾患及び脳卒中は、特に先進国において、死亡、身体障害、及び医療負担の主要な原因である。その様な疾患は、多くの場合は、高血圧、糖尿病、高コレステロール血症、並びに血漿低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）及びトリグリセリドの増加などのリスクを有するか又は喫煙している対象において選択的に発症する多数の原因を有する疾患であるアテローム性動脈硬化症から続く後遺症である。
【０００３】
アテローム性動脈硬化症（斑）は、多くの場合には、数年及び時には数十年に亘って発症する。典型的には、動脈壁におけるコレステロールの蓄積、泡沫細胞の形成、炎症、及び細胞増殖などの病理過程を伴う。
【０００４】
高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、ＬＤＬ、総コレステロール、及びトリグリセリドのレベルは全て、アテローム性動脈硬化症及び関連する心臓血管疾患、例えば、冠動脈疾患（例えば、狭心症及び心筋梗塞など）、脳卒中（脳血管障害及び一過性脳虚血発作）、及び末梢動脈閉塞性疾患のリスクの測定における指標である。
【０００５】
高いコレステロール及び／又はトリグリセリド全体のレベルを有する患者は、好ましいＨＤＬレベルも有しているか否かにかかわらず、明らかにリスクを有する。正常なコレステロール全体のレベルを有するが低いＨＤＬレベルを有する患者も、リスクが大きい。最近では、高レベルのアポリポタンパク質Ｂ（ＡｐｏＢ；非常に低密度のリポタンパク質（ＶＬＤＬ）及びＬＤＬにおいて脂質を有する）及び／又は低レベルのアポリポタンパク質Ａ−ｌ（ＡｐｏＡ−ｌ；ＨＤＬにおいて脂質を有する）を伴う心臓血管疾患のリスクのレベルが非常に高いことにも注意すべきである。
【０００６】
血清中のＬＤＬレベルを低減させる薬剤は、アテローム斑の形成を低減させ、かつ、粥腫崩壊及び関連する血栓塞栓性の合併症のリスクを（長期において）低減させ得る。血中コレステロールレベルを低減させるために役立ち得る薬剤には幾つかのタイプが存在する。最も一般的に処方されているものは、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）レダクターゼインヒビター（以下においては、それらの一般名にかかわらず「スタチン」と称する）であり、シンバスタチン及びアトルバスタチンを含む。これらの薬剤は、肝臓に存在するコレステロールの形成を直接妨害し、かくして心臓血管疾患のリスクを低減させる。
【０００７】
他の処方される薬剤の種類は、レシン（例えば、コレスチラミン及びコレスチポール）を含み、胆汁酸に結合し、肝臓に後者を製造させ、そのプロセスにおいてコレステロールを使い果たさせることによって作用する。さらに、Ｂビタミンナイアシンは、高用量において、ＨＤＬレベルを増大させるのに加えてトリグリセリド及びＬＤＬのレベルを低減させることが報告されている。フィブラート（ゲムフィブロジル及びフェノフィブレート）は、トリグリセリドを低減させて、ＨＤＬレベルを増大させ得ることが知られている。
【０００８】
スタチンなどのコレステロール低下薬の導入によって、冠状動脈性心臓病及び脳卒中による死亡率を優位に低減させた。しかしながら、これらの薬剤は、全ての患者において等しく有効であるわけではなく、ある副作用（例えば、肝臓機能の変化、ミオパシー、及び黄紋筋融解症）を有することが知られている欠点に悩まされており、アテローム性動脈硬化症は依然として死亡及び身体障害の主要な原因である。事実、最近のレヴュー誌（Ｂｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ，ＪＡＭＡ，２９５，２０４６（２００６））は、スタチンが、急性冠不全症候群患者の治療の最初の４ヶ月の間において深刻な心血管系イベントを低減しないと示唆している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許出願第２００７／００１４７３３号
【特許文献２】米国特許出願第２００６／０１３５５７７号
【特許文献３】米国特許出願第２００６／０１４８８３０号
【特許文献４】米国特許出願第２００３／０１０４０８０号
【特許文献５】米国特許出願第２００６／００８４６９５号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｂｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ，ＪＡＭＡ，２９５，２０４６（２００６）
【非特許文献２】Ｔａｍｏａｋｉ，Ａｌｌｅｒｇｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，５３，５５（２００４）
【非特許文献３】Ｓｕｗａｋｉ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２１６３（２００１）
【非特許文献４】Ｕｍｅｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ，Ｈｅａｒｔ Ｖｅｓｓｅｌｓ，１８，１００（２００３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
かくして、アテローム性動脈硬化症及び関連する心臓血管疾患の、特に急性冠不全症候群患者における、より安全及び／又はより有効な治療方法が必要とされている。
【００１２】
スプラタストは、Ｔｈ２細胞からのＩＬ−４及びＩＬ−５の放出並びにマスト細胞からの化学伝達物質の放出を阻害するＴｈ２サイトカインインヒビターである。したがって、スプラタストは、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、間質性膀胱炎、及び慢性非細菌性前立腺炎などの疾患の治療において示される。例えば、Ｔａｍｏａｋｉ，Ａｌｌｅｒｇｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，５３，５５（２００４）及びＳｕｗａｋｉ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２１６３（２００１）を参照のこと。スプラタストは、急性好酸球性肺炎を治療する可能性が示されている（Ｕｍｅｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ，Ｈｅａｒｔ Ｖｅｓｓｅｌｓ，１８，１００（２００３））。
【００１３】
米国特許出願第２００７／００１４７３３号は、ネビボロールの代謝物を含む心臓血管疾患の治療のための医薬組成物を開示している。スプラタストは、その様な組成物中でその様な代謝物と組み合わされてよい多くの有効成分の中に記載されている。
【００１４】
米国特許出願第２００６／０１３５５７７号及び第２００６／０１４８８３０号は、とりわけ泌尿器系の疾患、例えば炎症などにおいて使用するためのＬＰＡ受容体（及び特にＥＤＧ−２受容体）の新規アンタゴニストを開示している。スプラタスト及びスタチンは、その様な新規化合物と併用してよい多数の異なる有効成分の中に別々に言及されている。
【００１５】
米国特許出願第２００３／０１０４０８０号は、シェルによってカプセル化された医薬有効成分を含む親水性界面活性剤含有フィラーを含む新規な医薬剤形を開示している。本明細書で挙げる化合物の幾つかを含む各種の化合物が、その様な剤形において使用する可能性がある多数の薬剤候補の中に記載されている。
【００１６】
最後に、米国特許出願第２００６／００８４６９５号は、アテローム性動脈硬化症などの心臓血管疾患の治療において使用するためのＭＡＰキナーゼ及び／又はＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼのインヒビターを開示している。
【００１７】
具体的にスプラタストとスタチンとを含む併用製品の使用は、上述の文献のいずれにおいても具体的に開示されていない。さらに、アテローム性動脈硬化症及び関連する心臓血管疾患の、特に急性冠障害症候群患者での、治療におけるその様な併用製品の使用は、それらの文献のいずれにおいても開示されていない。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明によれば、
（ａ）スプラタスト又はその製薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物；及び
（ｂ）スタチン又はその製薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物
を含む併用製品が提供される。当該併用製品を、以下においては「本発明に係る併用製品」と称する。
【００１９】
用語「スタチン」は、１つ又は複数のスタチンを含む。用語「スタチン」及び「ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼインヒビター」は、本発明においては同意語として使用され、フルバスタチン、シンバスタチン、ロバスタチン、ロスバスタチン、ピタバスタチン、グレンバスタチン、セリバスタチン、プラバスタチン、メバスタチン、ベルバスタチン、ダルバスタチン、及びアトルバスタチンを含む。
【００２０】
挙げられてよい他のスタチンは、アシテメート、ベンフルオレックス、クレスチン、コレストロン、ジヒドロメビノリン、メグルトール、ラウソノール、並びに以下のコードネーム：ATI-16000, BAY-10-2987, BAY-x-2678, BB-476, BIO-002, BIO-003, BIO-2, BMS-180431, CP-83101, DMP-565, FR-901512, GR-95030, HBS-107, KS-01-019, L-659699, L-669262, NR-300, P-882222, PTX-023595, RP 61969, S-2468, SC-32561, sc-45355, SDZ-265859, SQ-33600, U-20685を有する化合物、並びにＮＯ増加／放出スタチン、例えば、ＮＣＸ−６５６０（ニトロプラバスタチン）を含む。
【００２１】
より好ましいスタチンは、ピタバスタチン（例えば、Ｌｉｖａｌｏ（登録商標）、Ｐｉｔａｖａ（登録商標））、及びより好ましくは、フルバスタチン（例えば、Ｌｅｓｃｏｌ（登録商標）、シンバスタチン（Ｚｏｃｏｒ（登録商標）、Ｌｉｐｅｘ（登録商標））ロバスタチン（例えば、Ｍｅｖａｃｏｒ（登録商標））、Ａｌｔｏｃｏｒ（登録商標））、ロスバスタチン（例えば、Ｃｒｅｓｔｏｒ（登録商標））、プラバスタチン（例えば、Ｐｒａｖａｃｈｏｌ（登録商標）、Ｓｅｌｅｋｔｉｎｅ（登録商標）、Ｌｉｐｏｓｔａｔ（登録商標））、及びアトルバスタチン（例えば、Ｌｉｐｉｔｏｒ（登録商標）、Ｔｏｒｖａｓｔ（登録商標））を含む。特に好ましいスタチンは、シンバスタチン、とりわけアトルバスタチン、特にロスバスタチンである。
【００２２】
挙げられてよい製薬学的に許容される塩は、酸付加塩及び塩基付加塩を含む。その様な塩は、従来の手法、例えば、有効成分の遊離酸又は遊離塩基の形態の、１以上の当量の適当な酸又は塩基との、任意に溶媒中又は塩が不溶性の媒体中でその後に標準的な技術（例えば、真空条件、凍結乾燥、又は濾過）を用いて前記溶媒又は媒体を除去することによる反応によって形成されてよい。塩は、例えば適切なイオン交換樹脂を用いて、他の対イオンと塩の形態における有効成分の対イオンを交換することによって調製されてもよい。
【００２３】
スプラタストの好ましい塩の形態は、トシル酸塩である。
【００２４】
スタチンの好ましい塩は、ナトリウム塩、カリウム塩、及びカルシウム塩を含み、例えば、ピタバスタチンカルシウム、フルバスタチンナトリウム、プラバスタチンナトリウム、ロスバスタチンカルシウム、及びアトルバスタチンカルシウムを含む。
【００２５】
本発明に係る併用製品において使用される有効成分（特にスプラタスト）は、ジアステレオマー豊富化及び／又はエナンチオマー豊富化された形態であってよい。「ジアステレオマー豊富化」及び「エナンチオマー豊富化」の各々によって、一方の異性体が他方よりも大きな割合を占める、有効成分のジアステレオマー／エナンチオマーの任意の混合物を意味する。例えば、９０％超の光学純度（鏡像体過剰率）を有する（例えば、スプラタストの）エナンチオマーを使用してよい。
【００２６】
本発明に係る併用製品は、上述のスタチンと組み合わせた上述のスプラタストの投与のために提供され、かくして、少なくとも１つの製剤がスプラタストを含み、かつ、少なくとも１つの製剤がスタチンを含む別々の製剤として提供されてもよく、又は組み合わされた調製物（すなわち、スプラタストとスタチンとを含む単独の製剤）として提供（すなわち製剤化）されてよい。
【００２７】
かくして、
（１）スプラタスト又はその製薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物；スタチン又はその製薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物；及び製薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤、又は担体を含む医薬製剤（以下においては、当該製剤を「組み合わせた調製物」と称する）；並びに
（２）以下の成分：
（Ａ）スプラタスト又はその製薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物を製薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤、又は担体と共に含む医薬製剤；及び
（Ｂ）スタチン又はその製薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物を製薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤、又は担体と共に含む医薬製剤
を含み、成分（Ａ）及び（Ｂ）の各々が他方と併用して投与するために適切な形態で提供される、キットオブパーツ
が更に提供される。
【００２８】
本発明のさらなる態様によれば、上述の成分（Ａ）を上述の成分（Ｂ）と関連させて、その２つの成分を互いに併用して投与するために適切なものとすることを含む、上述のキットオブパーツの製造方法を提供する。
【００２９】
前記２つの成分を互いに「関連させる」ことによって、本発明者は、前記キットオブパーツの成分（Ａ）及び（Ｂ）には、
（ｉ）併用療法において互いに併用して使用するために実質的に一緒にされる別々の製剤（すなわち、互いに独立している）として提供されるか、又は
（ｉｉ）併用療法において互いに併用して使用するための「併用パック」の別々の成分として一緒に包装及び提供される
ことを含める。
【００３０】
かくして、
（Ｉ）上述の成分（Ａ）及び（Ｂ）の１つ；並びに
（ＩＩ）その２つの成分の他方と共に当該成分を使用するための説明書
を含むキットオブパーツを更に提供する。
【００３１】
本明細書に記載のキットオブパーツは、反復投与のために、スプラタスト／塩／溶媒和物の適当な量／用量を含む２つ以上の製剤、及び／又はスタチン／塩／溶媒和物の適当な量／用量を含む２つ以上の製剤を含んでよい。２以上の製剤（いずれかの活性化合物を含む）が存在する場合は、その様な製剤は、いずれかの化合物の用量、化学組成、及び／又は物理的形態について同一であるか又は異なるものであってよい。
【００３２】
本発明に係る併用製品において使用してよいスタチンは、好ましくは、いわゆる「スタチンラクトン」の形態であってよい。本発明に係る併用製品は、ピタバスタチンラクトン及びメバスタチンラクトン、好ましくはフルバスタチンラクトン、ロスバスタチンラクトン、プラバスタチンラクトン、及びアトルバスタチンラクトン、特にロバスタチンラクトン及びシンバスタチンラクトンを含んでよい。
【００３３】
本発明に係る併用製品は、炎症疾患の治療における有用性を示す。炎症疾患は、典型的には、ホストに対して有益というよりも有害な効果を生じる免疫防御機構の活性化によって特徴付けられる。その様な疾患は、一般的には、異なる程度の組織の赤み若しくは充血、腫脹、異常高温、痛み、かゆみ、細胞死及び細胞損傷、細胞増殖、及び／又は機能の損失と関連する。挙げられてよい炎症疾患は、アレルギー（アレルギー性結膜炎及びアレルギー性鼻炎を含む）、強直性脊椎炎、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患、接触性皮膚炎、膀胱炎、痛風性関節炎、炎症性腸疾患（例えば、クローン病及び潰瘍性大腸炎）、多発性硬化症、変形性関節症、膵炎、前立腺塩、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、腱炎、滑液包炎、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、ブドウ膜炎、蕁麻疹、脈管炎、糖尿病性血管合併症、偏頭痛、アテローム性動脈硬化症、及び関連する心臓血管疾患を含む。挙げられてよい疾患は、偏頭痛、及びより好ましくは喘息、慢性閉塞性肺疾患、クローン病、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、とりわけアテローム性動脈硬化症及び関連する心臓血管疾患を含む。
【００３４】
用語「アテローム性動脈硬化症」は、血管、特に動脈壁におけるコレステロール蓄積、泡沫細胞の形成、炎症、及び細胞増殖によって特徴付けられる任意の疾患を含むと当業者に理解されるであろう。アテローム性動脈硬化症と「関連する」心臓血管疾患は、大動脈瘤（腹部及び／又はアテローム硬化性動脈瘤を含む）、及びより好ましくは動脈硬化、末梢動脈閉塞性疾患、冠動脈疾患（例えば、狭心症、心筋梗塞、心臓麻痺など）、冠状動脈性心臓病（虚血心などの心臓病及び心臓疾患を含む）を含み、粥腫若しくは粉瘤の崩壊及び／又は不安定、血管又は動脈疾患、虚血性疾患／虚血、並びに脳卒中（脳血管障害及び一過性脳虚血発作）も含んでよい。
【００３５】
挙げられてよい患者群は、急性冠症候群患者を含む。用語「急性冠症候群」は、任意の異常心筋及び虚血状態を含むが、多くの場合は胸痛及び／又は心電図異常（ＥＣＧ）とのみ関連するものではないと当業者に理解されるであろう。その様な症候群は、心筋梗塞（心臓麻痺）の最も一般的な症状である。当業者は、「安定狭心症」（すなわち、運動中に発症し、かつ、休息時に消散する狭心症）の反対である用語「不安定狭心症」と同意義の用語であると解するであろう。同様に、悪化速度で発生する労作性狭心症（「漸増性狭心症」）は、「不安定」という定義の範囲内であると当業者に理解されるであろう。
【００３６】
本発明のさらなる態様によれば、炎症疾患、特にアテローム性動脈硬化症及び／又は関連する心臓血管疾患の治療方法であって、その様な治療を必要とする患者に対して本発明に係る併用製品を投与することを含む方法が提供される。
【００３７】
誤解を避けるために、本発明では、用語「治療」、「治療法」、及び「治療方法」は、必要がある患者の治療又は緩和処置並びにアテローム性動脈硬化症及び関連する心臓血管疾患などの炎症疾患の疑いがある患者の予防処置及び／又は診断を含む。
【００３８】
本明細書に記載のキットオブパーツに関しては、「と共に投与する」によって、本出願人は、スプラタスト（又はその塩／溶媒和物）及びスタチン（又はその塩／溶媒和物）を含む個々の製剤が、関連する疾患の治療の経過に亘って連続的に、別々に、及び／又は同時に投与されることを含める。
【００３９】
かくして、本発明に係る併用製品に関しては、用語「と共に投与」は、併用製品の２つの成分（スプラタスト及びスタチン）を、一緒に又は実質的に近い時間で（任意に反復して）投与して、関連する疾患の治療の経過に亘って、スプラタストを含む製剤又はスタチンを含む製剤のいずれかを同じ治療の経過において単独で他の成分の不在下において（任意に反復して）投与するより大きな、患者により有益な効果を可能にする。特定の疾患の治療に関して、治療の経過に亘ってより大きな有益な効果が併用によって提供されるか否かの測定は、治療又は予防する疾患に依存するであろうが、当業者によって日常的な作業によって達成されてよい。
【００４０】
さらに、本発明に係るキットオブパーツにおいては、用語「と共に」は、２つの製剤の一方が、他の成分の投与の前、後、及び／又は同時に投与（任意に反復投与）されてよいことを含む。この背景において使用される際には、用語「同時に投与」は、個々の用量のスプラタストとスタチンとが互いに４８時間以内（例えば２４時間以内）に投与されることを含む。
【００４１】
「患者」は、哺乳動物（ヒトを含む）患者を含む。
【００４２】
本発明にしたがって、スプラタスト及びスタチンが、局所的又は全身に、例えば、経口、静脈内若しくは動脈内（血管内ステント及び他の血管周囲の器具／剤形）、筋肉内、皮膚、皮下、経粘膜（例えば、舌下若しくは経頬）、直腸内、経皮、鼻内、肺（例えば、気管若しくは気管支）、局所、又は任意の他の非経口経路に、製薬学的に許容される剤形で化合物を含む医薬調製物の形態で好適に投与される。好ましい送達態様は、（特に）口腔、静脈内、皮膚若しくは皮下、鼻内、筋肉内、又は腹腔内送達を含む。
【００４３】
スプラタスト及びスタチンは、一般的に、意図する投与経路及び標準的な製薬慣習に関して選択されてよい製薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤、又は単体と混合した１つ又は複数の医薬製剤の形態において一緒又は別々に投与されるであろう。その様な製薬学的に許容される担体は、活性化合物に対して化学的に不活性であってよく、かつ、使用条件化において有害な副作用及び毒性を有しなくてよい。その様な製薬学的に許容される担体は、組み合わされた調製物又はキットオブパーツの形態で共に投与されるいずれかの活性化合物の迅速又は調節された放出を可能にする可能性もある。
【００４４】
適切な医薬製剤は、市販されているか又は文献、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，１９ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（１９９５）及びＭａｒｔｉｎｄａｌｅ−Ｔｈｅ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｄｒｕｇ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（３４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ）並びにそれらが引用している文献に説明されており、これらの文献は参照することによって本明細書に取り込む。そうでなくとも、適切な製剤、特にスプラタスト及びスタチンの双方を含む組み合わされた調製物の調製は、日常的に用いられる技術によって当業者に容易に達成されてよい。
【００４５】
前記製剤中の有効成分の量は、疾患の重度、治療しようとする患者、並びに使用する化合物に依存するであろうが、当業者によって容易に決定されてよい。
【００４６】
疾患、治療しようとする患者、並びに投与経路に依存して、有効成分が、必要とする患者に対して異なる治療上有効量で投与されてよい。
【００４７】
しかしながら、本発明において、哺乳動物、特にヒトに投与する用量は、適当な時間枠に亘って哺乳動物において治療反応をもたらすために十分であるべきである。当業者は、正確な用量及び組成並びに最も適当な送達計画は、とりわけ製剤の薬理学的性質、治療する疾患の性質及び重度、患者の体調及び精神力、特定の化合物の有効性、治療しようとする患者の年齢、状態、体重、性別、及び応答、疾患の段階／重度、並びに患者の間の遺伝的差異にも影響を受けるであろう。
【００４８】
有効成分の投与は、連続的又は断続的（例えば、静脈内ボーラスによって）であってよい。用量は、投与時間及び頻度によって決定されてもよい。
【００４９】
有効成分の適切な用量は、参照することによって本明細書に取り込むＭａｒｔｉｎｄａｌｅ−Ｔｈｅ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｄｒｕｇ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ （３４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ）及びそこに引用されている文献などの医学文献において記載されているものを含む。したがって、有効成分の適切な用量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ（体重）から約１，０００ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲である。より好ましい範囲は、経口投与される際には、一日に約０．１ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇである。
【００５０】
しかしながら、スプラタストの適切な用量は当業者に既知である。したがって、経口用量は、使用する製剤が上述の組み合わせた調製物であるかまたはキットオブパーツであるかにかかわらず、一日に約０．５ｍｇから約１０００ｍｇの範囲、例えば、約２ｍｇから約８００ｍｇ、好ましくは約２０ｍｇから約６００ｍｇ、例えば、約２００ｍｇ（例えば、３００ｍｇ）から約４５０ｍｇの範囲である。
【００５１】
同様に、スタチンの適切な用量は当業者に既知である。したがって、経口用量は、使用する製剤が上述の組み合わせた調製物であるか又はキットオブパーツであるかにかかわらず、典型的には、一日に約２ｍｇから約１５０ｍｇ、例えば、５ｍｇから約１００ｍｇ、好ましくは約８ｍｇから約９０ｍｇ、例えば、約１０ｍｇから約８０ｍｇの範囲である。ピタバスタチンの適切な用量は、使用する製剤が上述の組み合わされた調製物であるか又はキットオブパーツであるかにかかわらず、約０．５から約１０ｍｇの範囲、例えば、約０．７５ｍｇから約５ｍｇ、好ましくは約１ｍｇから約４ｍｇ、例えば約２ｍｇである。
【００５２】
いずれの場合においても、当業者又は医療従事者は、個々の患者に最も適切な実際の用量を日常的な作業によって決定することが可能であろう。上述の用量は、平均的な場合の例であって、言うまでもなくより高い又は低い用量が好ましい個々の場合があってよく、そのような場合も本発明の範囲内である。
【００５３】
用語「約」が本明細書において、例えば、有効成分の用量との関連で使用される際は常に、その様な変動値は、近似値であり、±１０％、例えば、±５％、好ましくは±２％（例えば、±１％）で特定の値から変動してよいと解されるであろう。
【００５４】
本明細書に記載する併用製品／方法は、上述の疾患の治療において、炎症疾患など（例えば、アテローム性動脈硬化症及び関連する心臓血管疾患）の治療において使用するための従来技術における同様の方法（治療）よりも、医療従事者及び／又は患者にとって簡便であり、より有効であり、より毒性が少なく、より広い範囲の活性を有し、より強力であり、より少ない副作用を示し、又は他の有用な薬理学的特性を有する可能性があるという利点を有する。
【００５５】
本発明を以下の実施例によって説明する。
【実施例】
【００５６】
（実施例１）
ＭｏｎｏＭａｃ−６細胞炎症性メディエータ放出アッセイ
ＭｏｎｏＭａｃ−６（ＭＭ６）細胞（Ｘｉｅｇｌｅｒ−Ｈｅｉｔｂｒｏｃｋ ｅｔ ａｌ、Ｉｎｔ，Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，４１，４５６（１９８８））を、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１×非必須アミノ酸、１から１００μｇ／ｍＬインスリン、１ｍＭオキサル酢酸、１００単位／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、及び１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地で培養した（３７℃／５％ ＣＯ２）。分化させるために、ＴＧＦβ（２ｎｇ／ｍｌ）及び１．２５（ＯＨ）２Ｄ３（５０ｎＭ）を一般的には約２から４日間に亘って添加した。
【００５７】
炎症性メディエータであるロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）の放出を刺激するために、分化又は未分化のＭＭ６細胞（１から１５×１０６／ｍＬ；０．５から１ｍＬ）を、２５から５０μＭのアラキドン酸及び２から１０μＭのカルシウムイオノフォアＡ２３１８７（Ａ２３１８７はアラキドン酸無しで使用されてもよい）とともに、５から３０分間に亘ってインキュベートした（カルシウムを含むＰＢＳ中で３７℃）。ＭＭ６細胞は、文献に記載の生物学的に有効な濃度のアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）及び／又はトロンボキサンアナログＵ−４６６１９を、上述のＡ２３１８７及び／又はアラキドン酸と共に又はなしで用いて刺激してもよい。上述のＭＭ６のインキュベート／刺激は、１：１０から１：１００００のＭＭ６：血小板の比率でヒト血小板（健康な提供者に由来する）の存在下で実施してよい。前記インキュベート／刺激は、内部標準として添加した冷メタノール及びプロスタグランジンＢ２（ＰＧＢ２）の２容量を用いて停止させる。サンプルを遠心分離して、上清を水で希釈して、最終的なメタノール濃度を３０％とし、ｐＨを３から４に調節する。上清中のアラキドン酸代謝物を、事前に調整した（１ｍＬメタノールの後に１ｍＬ Ｈ２Ｏ）Ｃ１８固相カラム（Ｓｏｒｂｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｕ．Ｋ．）で抽出した。代謝物をメタノールで溶出して、１容量の水を溶出物に添加する。逆相ＨＰＬＣのために、各サンプルの７６μＬを３９μＬ Ｈ２Ｏ（他の容量比が使用されてもよい）と混合する。Ｗａｔｅｒｓ ＲＣＭ ８×１０カラムをメタノール／アセトニトリル／Ｈ２Ｏ／酢酸（３０：３５：３５：０．０１ｖ／ｖ）を用いて１．２ｍＬ／分で溶出する。ＰＧＢ２及びＬＴＢ４の検出及び定量のために、溶出物の吸光度を２７０ｎｍでモニターする。ＬＴＢ４を測定するための市販の酵素イムノアッセイキット（ＥＩＡ／ＥＬＩＳＡキット）が、キット製造業者の指示に従って使用されてもよい。製造業者からの指示に従って市販の酵素イムノアッセイキット（ＥＩＡ／ＥＬＩＳＡ）を使用して、ＭＭ６をインキュベート／刺激したものの上清を、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）及び／又はトロンボキサンＢ２（ＴＸＢ２）の含有量に関して分析してもよい。
【００５８】
スプラタスト及びスタチン（ピタバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、好ましくは、シンバスタチン、ロスバスタチン、又はアトルバスタチン）のストック溶液をエタノール、ＤＭＳＯ、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、ＰＥＧ４００、プロピレングリコール、及び／又は脱イオン水若しくは生理食塩水中で、必要であれば超音波処理、加熱、及びｐＨの調節を用いて調製する（他の媒体が使用されてもよい）。細胞を試験薬（スタチンと組み合わせたスプラタスト、スプラタスト単独、及びスタチン単独）と、炎症性メディエータ放出のためのＭＭ６刺激の前（ＭＭ６刺激と同時に試験薬を添加してもよい）に１分から２４時間に亘ってインキュベートする（添加物を含むか又は含まない、カルシウムを含まないＰＢＳ又は１から１０％のウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ−１６４０中で３７℃／５％ ＣＯ２）。
【００５９】
ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＭＣＰ−１などの炎症性サイトカイン及びケモカインの放出を刺激するために、分化又は未分化のＭＭ６細胞（１から１０×１０６／ｍＬ）を、リポポリサッカリド（ＬＰＳ，１から１００ｎｇ／ｍＬの終濃度）、ホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ，１から１００ｎｇ／ｍＬの終濃度）、又はＬＰＳ／ＰＭＡ混合物を用いて４から２４時間に亘って（添加物を含むか又は含まない、１から１０％のウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ−１６４０中で）インキュベートする（３７℃／５％ ＣＯ２）。ＭＭ６細胞は、上述のＰＭＡ及び／又はＬＰＳとともに又はそれらなしで、文献に記載の生物学的に有効な濃度のアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アラキドン酸、カルシウムイオノフォア Ａ２３１８７、及び／又はトロンボキサンアナログ Ｕ−４６６１９を用いて刺激してもよい。ＭＭ６細胞インキュベート／刺激は、１：１０から１：１００００のＭＭ６：血小板の比率で（健康な提供者の血液に由来する）ヒト血小板の存在下で実施してもよい。細胞を試験薬（スタチンと組み合わせたスプラタスト、スプラタスト単独、及びスタチン単独；上述のストック溶液及び濃度として）と共に、ＭＭ６刺激の前に１分から２４時間に亘って（比較のために、幾つかの実験は試験薬無しで実施され；試験薬がＭＭ６刺激と同時に添加されてもよい）インキュベートする（添加物を含むか又は含まない、１から１０％のウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ−１９４０中で３７℃／５％ ＣＯ２）。インキュベート／刺激後に細胞を遠心分離した後に、上清中のヒトサイトカイン及びケモカイン濃度をＣｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）を製造業者の指示に従って用いて定量する。サイトカイン及びケモカインを測定するための市販の酵素イムノアッセイキット（ＥＩＡ／ＥＬＩＳＡキット）を製造業者の指示に従って使用してもよい。細胞沈殿物をＲＬＴ緩衝液（ＱＩＡＧＥＮ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）中でマイクロアレイ実験のために更に処理するまで凍結補存する（−８０℃）（下記実施例１２参照）。
【００６０】
（実施例２）
ヒト末梢血細胞炎症メディエータ放出アッセイ
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）又は多型核細胞（ＰＭＮ）を、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ又はＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ分離（Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｐｒｅｐ分離及び／又はＤｅｘｔｒａｎ沈殿と共に又はそれら無しで）によって、確立されたプロトコルを用いて健康な提供者の血液から単離する。
【００６１】
炎症性メディエータであるロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）の放出を刺激するために、ＰＢＭＣ又はＰＭＮ（１から１５×１０６／ｍＬ；０．５から１ｍＬ）を、２５から５０μＭアラキドン酸及び２からら１０μＭカルシウムイオノフォアＡ２３１８７（Ａ２３１８７はアラキドン酸なしで使用してもよい）と共に５から３０分間に亘ってインキュベートした（カルシウムを含むＰＢＳ中で３７℃）。ＰＢＭＣ及びＰＭＮは、上述のＡ２３１８７及び／又はアラキドン酸と共に又はそれらなしで、文献で説明されている生物学的に有効な濃度のアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）及び／又はトロンボキサンアナログＵ−４６６１９で刺激してもよい。上述のＰＢＭＣ／ＰＭＮインキュベート／刺激は、（健康な提供者の血液に由来する）ヒト血小板の存在下で、１：１０から１：１００００のＰＢＭＣ／ＰＭＮ：血小板の比率で実施されてもよい。前記インキュベート／刺激は、内部標準として添加した冷メタノール及びプロスタグランジンＢ２の２容量を用いて停止されてよい。サンプルを遠心分離して、上清を水で希釈して、３０％の最終的なメタノール濃度とし、ｐＨを３から４に調節する。上清中のアラキドン酸代謝物を事前に調整した（１ｍＬメタノールの後に１ｍＬ Ｈ２Ｏ）Ｃ１８固相カラム（Ｓｏｒｂｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｕ．Ｋ．）で抽出する。代謝物をメタノールで抽出した後に、１容量の水を溶出物に添加する。逆相ＨＰＬＣのために、７６μｌの各サンプルを３９μＬ Ｈ２Ｏと混合する（他の容量比が用いられてもよい）。Ｗａｔｅｒｓ ＲＣＭ８×１０カラムをメタノール／アセトニトリル／Ｈ２Ｏ／酢酸（３０：３５：３５：０．０１ ｖ／ｖ）を用いて１．２ｍＬ／分で溶出する。ＰＧＢ２及びＬＴＢ４の検出及び定量のために、溶出物の吸光度を２７０ｎｍでモニターする。ＬＴＢ４を測定するために市販の酵素イムノアッセイキット（ＥＩＡ／ＥＬＩＳＡ）を製造業者の指示に従って使用してもよい。製造業者からの指示に従って市販の酵素イムノアッセイキット（ＥＩＡ／ＥＬＩＳＡ）を使用して、ＰＢＭＣ／ＰＭＮインキュベート／刺激したものに由来する上清を、炎症性メディエータであるプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）及び／又はトロンボキサンＢ２（ＴＸＢ２）の含有量について分析してもよい。細胞を試験薬（スタチン（ピタバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、好ましくは、シンバスタチン、ロスバスタチン、又はアトルバスタチン）と組み合わせたスプラタスト、スプラタスト単独、及びスタチン単独）と共に、炎症メディエータ放出のためのＰＢＭＣ／ＰＭＮ刺激の前に１から２４時間に亘ってインキュベート（カルシウムを含まないＰＢＳ又は０から１０％のウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ−１９４０中で３７℃）する（薬剤ストック溶液及び濃度については実施例１参照。試験薬はＰＢＭＣ／ＰＭＮ刺激と同時に添加してもよい）。比較のために、幾つかの実験は薬剤なしで実施する。
【００６２】
ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＭＣＰ−１、ＰＢＭＣ／ＰＭＮなどの炎症性サイトカイン及びケモカインの放出を刺激するために、ＰＢＭＣ／ＰＭＮ（１から１０×１０６／ｍＬ）を、リポポリサッカリド（ＬＰＳ、１から１００μｇ／ｍＬの終濃度）、ホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ，終濃度１から１００ｎｇ／ｍＬ）、又はＬＰＳ／ＰＭＡ混合物を用いて４から２４時間に亘って（１から１０％のウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ−１６４０中で）インキュベート（３７℃／５％ ＣＯ２）する。ＰＢＭＣ／ＰＭＮ細胞は、文献に記載された生物学的に有効な濃度のアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アラキドン酸、カルシウムイオノフォアＡ２３８７、及び／又はトロンボキサンアナログＵ−４６６１９と共に、上述のＰＭＡ及び／又はＬＰＳとともに及び／又はなしで刺激してもよい。ＰＢＭＣ／ＰＭＮインキュベート／刺激は、１：１０から１：１００００のＰＢＭＣ／ＰＭＮ：血小板の比率で（健康な提供者の血液に由来する）ヒト血小板の存在下で実施されてもよい。細胞は、サイトカイン／ケモカイン放出のためのＰＢＭＣ／ＰＭＮ刺激の前に１分から２４時間に亘って試験薬（スタチンと組み合わせたスプラタスト、スプラタスト単独、及びスタチン単独）と共にインキュベート（１から１０％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ−１６４０中で３７℃／５％ ＣＯ２）される（比較のために、幾つかの実験は薬剤無しで実施される；試験薬はＰＢＭＣ／ＰＭＮ刺激と同時に添加されてもよい）。インキュベート／刺激後に細胞を遠心分離した後に、上清中のヒトサイトカイン及びケモカイン濃度を製造業者の指示に従ってＣｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）を用いて定量する。サイトカイン及びケモカインを測定するための市販の酵素イムノアッセイキット（ＥＩＡ／ＥＬＩＳＡ）を製造業者の指示に従って使用してもよい。マイクロアレイ実験のために更に処理する（実施例１２参照）まで、細胞沈殿物をＲＬＴ干渉液（ＱＩＡＧＥＮ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）中で凍結保存（−８０℃）する。
【００６３】
（実施例３）
マウスマスト細胞炎症メディエータ放出アッセイ
骨髄由来の培養マウスマスト細胞（ｍＭＣ）を、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の骨髄細胞を培養することによって得る。前記骨髄細胞（ＰＢＳで洗浄したマウス大腿骨由来）を、１０％熱非導化ウシ胎仔血清、４ｍＭ Ｌ−グルタミン、５０μＭ ２−メルカプトエタノール、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、及び１００μｇ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシンを添加した、１０％ＷＥＨＩ−３又はＸ−６３豊富化調整ＲＰＭＩ−１６４０中で培養（３７℃／５％ ＣＯ２）する。（懸濁物中で増殖させた）マスト細胞の発生を、（一般的には培養の少なくとも３から５週間後の）トルイジンブルー染色により及び／又は細胞表面上のＫｉｔの発現によって（フローサイトメトリーによって）確認する。
【００６４】
結合組織型（ＣＴ型）の骨髄由来培養マウスマスト細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の骨髄細胞を培養することによって得る。５０ｎｇ／ｍＬ組換えマウス幹細胞因子及び１ｎｇ／ｍＬマウス組換えＩＬ−４を添加した、１０％の濾過したＦＣＳ、４ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１００ＩＵ／ｍＬペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、０．１ｍＭ ＭＥＭ非必須アミノ酸、及び５０μＭ ２−ＭＥを含有するＲＰＭＩ−１６４０中で骨髄細胞を培養（３７℃／５％ ＣＯ２）する。マスト細胞の発生を、（一般的には培養の少なくとも３から５週間後の）トルイジンブルー染色により及び／又は細胞表面上のＫｉｔの発現によって（フローサイトメトリーによって）確認する。
【００６５】
マウスマスト細胞株ＭＣ／９（ＡＴＣＣから得られる、製品Ｎｏ ＣＲＬ−８３０６）及びＣ．１ＭＣ／Ｃ５７．１（Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，９１７５（１９８７））を使用してもよい。ＭＣ／９細胞は、ＡＴＣＣ（http://www.atcc.org）からの指示に従って培養し、Ｃ１．ＭＣ／Ｃ５７．１細胞はＲｕｍｓａｅｎｇ ｅｔ ａｌ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８，１３５３（１９９７））に記載のように培養する。
【００６６】
ＩｇＥ受容体の架橋によって活性化／刺激するために、１５％ハイブリドーマ上清として使用されるマウス抗ＴＮＰ ＩｇＥ抗体（ＩｇＥ１−ｂ４，ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）を用いて、培養マスト細胞を最初に９０分間に亘って３７℃（５％ ＣＯ２）で感作させる。Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ヘキソサミニダーゼ（若しくはヒスタミン）又はサイトカイン／ケモカイン放出アッセイ（下記参照）において使用する細胞を、次いで、ＰＢＳで二回洗浄し、０．２％ウシ胎仔血清（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ）を添加したＲＰＭＩ−１６４０中で再懸濁し、その後に前記細胞（０．５から１０×１０６／ｍＬ）を９／１のカップリング比率を有する１００ｎｇ／ｍＬ ＴＮＰ−ＢＳＡ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）の添加によって活性化させる。ＴＮＰ−ＢＳＡを用いたインキュベート（３７℃／５％ ＣＯ２）は、β−へキソサミニダーゼ（又はヒスタミン）の分析については３０分間であり、サイトカイン及びケモカイン放出の分析のためには６から２４時間である。細胞は、試験薬（スタチン（ピタバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、好ましくはシンバスタチン、ロスバスタチン、又はアトルバスタチン）と組み合わせたスプラタスト、スプラタスト単独、及びスタチン単独）を用いてＴＮＰ−ＢＳＡの添加の前の１分から２４時間に亘ってインキュベート（３７℃／５％ ＣＯ２）する（薬剤ストック溶液及び濃度の詳細については上記の実施例１を参照）。比較のために、幾つかの実験は薬剤無しで実施する。インキュベート／刺激後に、サンプルを遠心分離して、下記のβ−へキソサミニダーゼ（ヒスタミン）及び／又はサイトカイン／ケモカインの含有量に関して上清を分析する。マイクロアレイ実験のために更に処理する（実施例１２参照）まで、細胞沈殿物をＲＬＴ緩衝液（ＱＩＡＧＥＮ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）中で凍結保存（−８０℃）する。
【００６７】
顆粒マスト細胞酵素β−へキソサミニダーゼのＩｇＥ依存放出を検出するために、酵素比色分析を使用する。各ウェルの上清６０μＬを９６ウェルプレートに移し、同量の基質溶液（８０ｍＭクエン酸に溶解した７．５ｍＭ ｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−ｂ−Ｄ−グルコサミニド，ｐＨ ４．５）と混合する。その混合物をロッカープラットホーム上で２時間に亘って３７℃でインキュベートする。１２０μＬのグリシン（０．２Ｍ，ｐＨ １０．７）を各ウェルに添加して、４０５及び４９０ｎｍの吸収をＥｍａｘ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて測定する。β−ヘキソサミニダーゼの放出は、細胞溶解後に測定した総β−ヘキソサミニダーゼの割合として表わす。顆粒マスト細胞ヒスタミンのＩｇＥ依存放出を検出するために、ヒスタミンを測定するための市販の酵素イムノアッセイキット（ＥＩＡ／ＥＬＩＳＡ）を製造業者の指示に従って使用する。
【００６８】
ＩＬ−６、ＩＬ−４、ＴＮＦ、ＩＬ−１β、ＫＣ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＦＮγなどのマウスマスト細胞サイトカイン及びケモカインのＩｇＥ依存放出を検出するために、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）を製造業者の指示に従って用いる。サイトカイン及びケモカインを測定するための市販の酵素イムノアッセイキット（ＥＩＡ／ＥＬＩＳＡ）を、製造業者の指示に従って使用してもよい。
【００６９】
上記のマスト細胞実験に加えて、（上述の）試験薬のマスト細胞阻害効果を、新たに単離した腹膜ラット又はマウスマスト細胞からのヒスタミン、β−ヘキソサミニダーゼ、又はトリプターゼの（ＩｇＥ（ラット又はマウスＩｇＥで細胞の事前処理をして又はそれ無しで）、コンカナバリンＡ、Ｌタンパク質、化合物４８／８０、イオノフォアＡ２３１８７、ＰＭＡを用いて）誘導された放出の分析するための、よく確立されて文献に記載されている実験手法及びアッセイを用いて試験してもよい。
【００７０】
（実施例４）
ＲＡＷ２６４．７細胞炎症メディエータ放出アッセイ
ＲＡＷ２６４．７細胞を、１００単位／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、及び１０％ウシ胎仔血清を添加したＤＭＥＭ中で培養（３７℃／５％ ＣＯ２）する。
【００７１】
ＩＬ−６、ＴＮＦ、ＩＬ−１β、ＫＣ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＦＮγなどの炎症性サイトカイン及びケモカインの放出を刺激するために、ＲＡＷ２６４．７細胞（１から１０×１０６／ｍＬ）と、リポポリサッカリド（ＬＰＳ，終濃度１から１００ｎｇ／ｍＬ）、ホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ，終濃度１から１００ｎｇ／ｍＬ）、又はＬＰＳ／ＰＭＡ混合物を用いて、４から４時間に亘ってインキュベート（３７℃／５％ ＣＯ２）する。ＲＡＷ２６４．７細胞は、文献に記載の生物学的に有効な濃度のアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アラキドン酸、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７、及び／又はトロンボキサンアナログＵ−４６６１９を、上述のＰＭＡ及び／又はＬＰＳと共に又はそれら無しで用いて刺激してもよい。ＲＡＷ２６４．７インキュベート／刺激を、１：１０から１：１００００のＲＡＷ２６４．７：血小板の比率で、マウス又はヒト（健康な提供者の血液に由来する）血小板の存在下で実施してもよい。サイトカイン／ケモカイン放出のためのＲＡＷ２６４．７刺激の前に１分から２４時間に亘って、試験薬（スタチン（ピタバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、好ましくは、シンバスタチン、ロスバスタチン、又はアトルバスタチン）と組み合わせたスプラタスト、スプラタスト単独、及びスタチン単独）と共に細胞をインキュベート（添加物を含むか又は含まない、１から１０％ウシ胎仔血清を添加したＤＭＥＭ中で３７℃／５％ ＣＯ２）してよい（薬剤のストック溶液及び濃度の詳細に関しては実施例１を参照；試験薬はＲＡＷ２６４．７刺激と同時に添加されてもよい）。比較のために、幾つかの試験は薬剤無しで実施する。インキュベート／刺激後に細胞を遠心分離した後に、上清中のマウスサイトカイン及びケモカイン濃度を、製造業者の指示に従ってＣｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）を用いて定量する。サイトカイン及びケモカインを測定するための市販の酵素イムノアッセイキット（ＥＩＡ／ＥＬＩＳＡ）を、製造業者の指示に従って使用してもよい。細胞沈殿物は、マイクロアレイ実験のために更に処理する（実施例１２参照）までＲＬＴ緩衝液（ＱＩＡＧＥＮ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）中で凍結保存（−８０℃）する。
【００７２】
（実施例５）
カラギーナンによって誘導されるラット後肢炎症
本アッセイは、本質的には、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ（Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，１１１，５４４（１９６２））の説明に従うものである。０．０３から５０ｍｇ／ｋｇの容量の試験薬（スタチン（ピタバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、好ましくは、シンバスタチン、ロスバスタチン、又はアトルバスタチン）と組み合わせたスプラタスト、スプラタスト単独、又はアトルバスタチン単独）を皮下、静脈内、腹腔内、又は経口に２から２４時間毎に、約１５０から４００ｇの体重のオスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ又はＷｉｓｔａｒラットに投与する（比較のために、幾つかの実験は薬剤無しで実施する）。投与前に、薬剤のストック溶液（上記の実施例１参照）を必要に応じて、例えば、生理食塩水（非経口投与用）又は水（経口治療用）中の０．５％から１％メチルセルロースに希釈する。他の媒体を使用してもよい。最初の薬剤投与の１分から２４時間後に、０．５、１．０、又は２．０％のカラギーナン（タイプＩＶ λ，Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）の０．９％生理食塩水溶液を、麻酔したラットの後肢の足底下の領域に注射する。カラギーナン注射の前及び３から２４時間の所定の間隔で、デジタルインジケーターと共に圧力トランスデューサーと接続したｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｐｌｅｔｈｙｓｍｏｍｅｔｅｒを用いて、注射した後肢の容積を測定する。腫脹の程度が炎症浮腫の程度を示す。カラギーナン注射の３から２４時間後、ラットを屠殺して、生理食塩水又はＰＢＳ（他のかん流媒体を用いてもよい）でかん流させる。炎症を起こした後肢に由来する足裏軟組織生検を回収して、秤量し、凍結乾燥して（マイクロアレイ分析のためのサンプルを−８０℃でＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で凍結させる）、その後に下記（実施例１０及び１２）のように、１）炎症性好中球蓄積を反映するミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）蓄積；及び／又は２）マイクロアレイ技術を用いて組織遺伝子発現に関して分析する。未処理のラットに由来する炎症を起こしていない後肢の組織は、ＭＰＯ及び遺伝子発現のベースラインを提供する。組織炎症は、従来の組織学的及び免疫組織学的技術を用いて試験してもよい。後肢の炎症は、（カラギーナンの代わりに）化合物４８／８０（４８／８０，５０から１００μｌ ＰＢＳ又は生理食塩水中で１から５μｇ）の足裏下注射によって誘導し、４８／８０注射の３０分から８時間後に炎症を起こした後肢の腫脹の測定並びにマイクロアレイ及び／又はＭＰＯ分析のための組織生検の回収を実施してよい。
【００７３】
（実施例６）
クロトン油によって誘導されるマウスの耳の炎症
このアッセイは、本質的には、Ｔｏｎｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ７７，６２５（１９６５））に記載されているアッセイに従うものである（他のマウスの種を使用してもよい）。０．０３から５０ｍｇ／ｋｇの用量の試験薬（スタチン（ピタバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、好ましくは、シンバスタチン、ロスバスタチン、又はアトルバスタチン）と組み合わせたスプラタスト、スプラタスト単独、又はアトルバスタチン単独）を皮下、静脈内、腹膜内、又は経口に２から２４時間毎に投与する（比較のために、幾つかの実験は薬剤無しで実施する）。投与前に、薬剤のストック溶液（実施例１参照）を必要に応じて、例えば、生理食塩水（非経口投与用）又は水（経口治療用）中の０．５％から１％メチルセルロースで希釈する。他の媒体を使用してもよい。最初の薬剤投与の１分から２４時間後に。１０から３０μＬの２．０又は４．０％ クロトン油のアセトン又はエタノール溶液を、一方又は双方の耳に局所的に適用する。クロトン油と適用した後の４から１２時間の所定の間隔で、動物を屠殺して、耳のパンチ生検を秤量して、耳の炎症性腫脹を測定する（耳の厚みも測定して腫脹を測定する）。炎症を起こした耳に由来する生検を回収して、凍結保存（マイクロアレイ分析のためのサンプルを−８０℃でＴＲＩｚｏｌ中において凍結する）し、その後に下記（実施例１０及び１２）のように、１）炎症性好中球蓄積を反映するミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）蓄積；及び／又は２）マイクロアレイ技術を用いて組織遺伝子発現について分析する。未処理のマウスに由来する炎症を起こしていない耳の生検は、腫脹、ＭＰＯ、及び遺伝子発現のベースラインを提供する。組織炎症は、従来の組織学及び免疫組織学的技術を用いて試験されてもよい。
【００７４】
（実施例７）
ホルボールエステル又はアラキドン酸によって誘導されるマウス耳の炎症
これらのアッセイは、本質的には、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１４２，１９７（１９８７））に記載されているアッセイに従うものである（しかしながら、他のマウスの種を使用してもよい）。０．０３から５００ｍｇ／ｋｇの用量の試験薬（スタチン（ピタバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、好ましくは、シンバスタチン、ロスバスタチン、又はアトルバスタチン）と組み合わせたスプラタスト、スプラタスト単独、及びスタチン単独）を、皮下、静脈内、腹膜内、又は経口で２から２４時間毎にオス又はメスのマウスに投与する（比較のために、幾つかの実験は薬剤無しで実施する）。投与前に、薬剤のストック溶液（上記の実施例１参照）を、必要に応じて、例えば、生理食塩水（非経口投与容）又は水（経口治療用）中の０．５％又は１％のメチルセルロースで希釈する。他の媒体が使用されてもよい。１０から３０μｌのアセトン又はエタノール中の１から１０μｇのホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ）、テトラデカノイルホルボールアセテート（ＴＰＡ）、又は１から５ｍｇのアラキドン酸を一方又は両方の耳に局所的に適用する。ＰＡＭ又はＴＰＡ適用の４から１２時間後及びアラキドン酸適用の３０分から６時間後に、動物を屠殺して、耳のパンチ生検を秤量して、耳の炎症性腫脹を測定する（耳の厚みも測定して腫脹を測定してよい）。炎症を起こした耳に由来する生検を回収して、凍結保存し（マイクロアレイのためのサンプルをＴＲＩｚｏｌ中で−８０℃において凍結する）、その後に下記（実施例１０及び１２）のように、１）炎症性好中球蓄積を反映するミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）蓄積；及び／又は２）マイクロアレイ技術を用いて組織遺伝子発現に関して分析する。未処理のマウスに由来する炎症を起こしていない耳の生検は、腫脹、ＭＰＯ、及び遺伝子発現のベースラインを提供する。組織炎症は、従来の組織学及び免疫組織学的技術を用いて試験してもよい。
【００７５】
（実施例８）
マウス及びラットにおける損傷に対する急性組織反応及び炎症
約１５から３０ｇの体重のオスのＣＢＡ及びＮＭＲＩマウス又は約１５０から４５０ｇの体重のＳｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを使用する（他のマウス及びラットの種を使用してもよい）。急性の組織損傷及び急性の炎症が、無菌状態で外科用メスを用いて、尻尾の末端部分又は耳の一方において得られる。１、２、又は３つの平行した約５から１５ｍｍの長さの縦方向の切片を皮膚の全ての層から作製した。０．０３から５０ｍｇ／ｋｇの用量の試験薬（スタチン（ピ多スタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、好ましくは、シンバスタチン、ロスバスタチン、又はアトルバスタチン）と組み合わせたスプラタスト、スプラタスト単独、スタチン単独）を、皮下、静脈内、腹膜内、又は経口に、２から２４時間毎に投与し、最初の投与は組織損傷の１分から２４時間前に与える（比較のために、幾つかの実験は薬剤無しで実施する）。投与前に、薬剤のストック溶液（実施例１参照）を必要に応じて、例えば、水（経口治療用）又は生理食塩水（非経口投与用）中の０．５％から１％のメチルセルロースで希釈する。他の媒体を使用してもよい。損傷の２から４８時間後に、前記動物を屠殺して、組織の損傷した部位を取り出して、秤量し、凍結保存して（マイクロアレイ分析のためのサンプルを−８０℃で凍結する）、その後に下記（実施例１０及び１２）のように、１）炎症性好中球蓄積を反映するミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）蓄積；及び／又は２）マイクロアレイ技術を用いて組織遺伝子発現に関して分析する。未処理の動物に由来する対応する非損傷／非炎症組織は、ＭＰＯ及び遺伝子発現のベースラインのレベルを提供する。損傷に対する組織反応及び炎症は、従来の組織学及び免疫組織学的技術を用いて試験してもよい。
【００７６】
（実施例９）
ラットにおける損傷に対する急性組織反応及び炎症
３５０から５００ｇの体重のオスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを使用する（他のラットの種を使用してもよい）。動物を酸素中のイソフルレンを用いて麻酔をして、急性組織損傷及び急性炎症を、以下のように左総頚動脈において達成した：左総外及び内頚動脈の外科的露出及び一時的な結紮糸による局部血流量の一時的停止後に、バルーン付きカテーテル（２つのフレンチ・フォガティ）を外頚動脈から大動脈内に入れる。次に、バルーンを十分な水で膨らませて、総頚動脈を膨張させ、次いで外頚動脈へと引き戻した。この手順を三回繰返し、次いで、カテーテルを除去して、外頚動脈を結紮し、傷を閉じた。０．０３から５０ｍｇ／ｋｇの用量の試験薬（スタチン（ピタバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、好ましくは、シンバスタチン、ロスバスタチン、又はアトルバスタチン）と組み合わせたスプラタスト、スプラタスト単独、及びスタチン単独）を、皮下、静脈内、腹膜内、又は経口に２から２４時間毎に投与し、最初の投与を組織損傷の１分から２４時間前に与えた（比較のために、幾つかの実験は薬剤無しで実施する）。投与の前に、薬剤のストック溶液（実施例１参照）を必要に応じて、例えば、生理食塩水（非経口投与用）又は水（経口治療用）中の０．５％又は１％のメチルセルロースで希釈する。他の媒体を使用してもよい。損傷の２から４８時間後に、動物を酸素中のイソフルレンで麻酔して、それらの左頚動脈を露出する。クランプを総及び内頚動脈の各々の非常に近接した部位に置き、次いで、クランプの間の血管を滅菌生理食塩水及び／又はＴＲＩｚｏｌでやさしく洗い流し、取り出して、秤量し、凍結保存し（マイクロアレイのためのサンプルをＴＲＩｚｏｌ中で−８０℃において凍結する）、その後に下記のように、１）炎症性好中球蓄積を反映するミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）蓄積；及び／又は２）マイクロアレイ技術を用いて組織遺伝子発現に関して分析する。未処理のラットに由来する対応する非損傷／炎症血管は、ＭＰＯ及び遺伝子発現のベースラインのレベルを提供する。損傷に対する組織反応及び炎症は、従来の組織学及び免疫組織学的技術を用いて試験されてもよい。
【００７７】
（実施例１０）
組織ミエロペルオキシダーゼの炎症による蓄積
酵素ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）が好中球において豊富であり、多くの場合に、炎症組織における好中球の蓄積の検出のためのマーカーとして使用される。炎症マウス及びラット組織において炎症性ミエロペルオキシダーゼ蓄積を測定するために（実施例５から９に記載のように）、０．５％ヘキサデシルトリメチル−アンモニウムブロミド中で組織をホモジナイズして、凍結融解する。上清のＭＰＯ活性を、ＭＰＯに触媒されるＨ２Ｏ２−テトラメチルベンジジンの酸化還元反応において生じる６５０ｎｍ（２５℃）の吸光度における変化として分光学的に測定する。
【００７８】
（実施例１１）
平滑筋細胞アッセイ
ラット大動脈平滑筋細胞（ＲＡＳＭＣ）を、過去に文献（Ｈｅｄｉｎ ｅｔ ａｌ，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．，１７，１９７７（１９９７））に説明されているように単離する。１０％ウシ胎仔血清、５０μｇ／ｍＬ Ｌ−アスコルビン酸、５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン、５０ＩＵ／ｍＬペニシリン（Ｆ−１２／１０％ウシ胎仔血清）を添加したＨａｍ’ｓ培地Ｆ−１２中で細胞を培養（３７℃／５％ ＣＯ２）して、コンフルエントになるまで増殖させ、トリプシン処理をして連続的に継代し、２から６回継代したところで実験に使用する。ＲＡＳＭＣを２４ウェルプレートｗに約４×１０４細胞／ウェルの密度でＦ−１２／１０％ウシ胎仔血清中で播種する（１つのプレートにより多くのウェルを有するプレート及びより少ないウェル毎の細胞数を用いてもよい）。２４時間後に、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、５０μｇ／ｍＬ Ｌ−アスコルビン酸、５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン、及び５０ＩＵ／ｍＬペニシリン（Ｆ−１２／０．１ ＢＳＡ）を添加したＨａｍ’ｓ培地Ｆ−１２中で２４から４８時間に亘って飢餓状態にすることによって、細胞をＧ０／Ｇ１期に同期させる。ＤＮＡ合成を推定するために、飢餓状態のＲＡＳＭＣを１０ｎｇ／ｍＬ ＩＧＦ−１又は１０％ウシ胎仔血清のいずれかを用いて１２から４８時間に亘って刺激する（他のよく確立されたマイトジェン、例えば、ＰＤＧＦを用いてよい）。試験薬（スタチン（ピタバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、好ましくは、シンバスタチン、ロスバスタチン、又はアトルバスタチン）と組み合わせたスプラタスト、スプラタスト単独、及びスタチン単独）を、刺激前の１分から２４時間に添加する（薬剤ストック溶液及び濃度に関しては上記実施例１参照；試験薬は刺激と同時に投与されてもよい）。比較のために、幾つかの実験は薬剤無しで実施する。刺激期間の最後の８時間に、細胞を１μＣｉ［３Ｈ］−チミジンで標識する。次いで、プレートを氷冷ＰＢＳで洗浄し、氷冷１０％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸を用いて一晩インキュベートし、０．２Ｍ水酸化ナトリウム中で可溶化し、放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定する。刺激したＲＡＳＭＣ増殖は、市販のブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）細胞増殖アッセイ（例えば、細胞増殖ＥＬＩＳＡ、ＢｒｄＵ、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）、細胞増殖試薬ＷＳＴ−１（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａ ＡＢ，Ｂｒｏｍｍａ，Ｓｗｅｄｅｎ）（どちらも製造業者の指示に従って）、或いは細胞計数によって分析されてもよい。（遺伝子発現を試験するための）別の実験で、より多くの数の飢餓ＲＡＳＭＣ（１から５×１０５細胞／ウェル）を、上述のように１０ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ−１又は１０％ウシ胎仔血清（若しくはＰＤＧＦ）或いは１から１０％のウシ胎仔血清と共にＬＰＳ（１から１００ｎｇ／ｍＬ）で４から４８時間に亘って刺激してよい（全ての刺激は上述のように試験薬とともに又は無しで実施する）。次いで、細胞を回収して、マイクロアレイ実験のために更に処理する（実施例１２参照）までＲＬＴ緩衝液（ＱＩＡＧＥＮ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）中で凍結保存する。
【００７９】
ヒト気管支平滑筋（ＨＢＳＭＣ，Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、１０％ＦＢＳ、１００単位／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、０．１２ＩＵ／ｍＬインスリンを添加し、２μｇ／ｍＬアンホテリシンＢを添加しているか又はしていないＤＭＥＭ中で培養する。実験前に、低ＦＢＳ（０．３から５％）のインスリンを含まない培地中で、細胞増殖を２４時間に亘って停止させてよい。ＩＬ−８及びエオタキシンなどの炎症性サイトカイン及びケモカインの形成及び放出を刺激するために、ＨＢＳＭＣ（８０％コンフルエント、約８×１０５／２５ｃｍ２フラスコ）を、２４から４８時間に亘って（添加物を含むか又は含まない、１から１０％のウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ中で）、ＩＬ−１β及びＴＮＦ−α（双方１から５０ｎｇ／ｍＬ）の異なる組み合わせと共にインキュベート（３７℃／５％ ＣＯ２）する。試験薬（上述のスタチンと組み合わせたスプラタスト、スプラタスト単独、及びスタチン単独）とともに、ＨＢＳＭＣ刺激の前の１分から２４時間に亘って細胞をインキュベート（添加物を含むか又は含まない、０．３から１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ中で３７℃／５％ ＣＯ２）する（薬剤ストック溶液及び濃度の詳細に関しては実施例１参照；試験薬はＨＢＳＭＣ刺激と同時に添加してもよい）。比較のために、幾つかの実験は薬剤無しで実施する。インキュベート／刺激後に、上清中のヒトサイトカイン及びケモカイン濃度を、製造業者の指示に従って市販の酵素イムノアッセイキット（ＥＩＡ／ＥＬＩＳＡ）を用いて定量する。次いで、細胞を回収し、マイクロアレイ実験のために更に処理する（下記の実施例１２参照）まで、ＲＬＴ緩衝液（ＱＩＡＧＥＮ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）中で凍結（−８０℃）保存する。
【００８０】
（実施例１２）
遺伝子発現の分析
マウス及びラット組織（実施例５から９、１５、及び１６参照）由来の総ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、その後に製造業者の指示に従ってＲＮｅａｓｙ ｃｌｅａｎｕｐ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて単離する。上記及び下記の実施例に記載の細胞インキュベート物及び刺激物（マウスマスト細胞、ＭｏｎｏＭａｃ−６、ＰＢＭＣ、ＰＭＮ、ＲＡＷ ２６４．７、ＲＡＳＭＣ、ＨＢＳＭＣ、ＮＢ４、ＨＬ−６０）に由来する総ＲＮＡを、製造業者のプロトコルに従ってＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）をＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ ｓｅｔ（ＱＩＡＧＥＮ）とともに又はそれなしで単離する。異なる組織及び細胞の起源である種に依存して、マイクロアレイ分析を製造業者の指示に従ってＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標） Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０ Ａｒｒａｙ、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標） Ｍｏｕｓｅ Ｇｅｎｏｍｅ ４３０ ２．０ Ａｒｒａｙ、又はＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標） Ｒａｔ Ｇｅｎｏｍｅ ２３０ ２．０ Ａｒｒａｙ、或いはこれらのチップの対応するより新しいバージョン（全てのアレイはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ社製）を用いて実施する。マイクロアレイ発現データは、例えば、ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）及びＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ／Ｒ（www.bioconductor.org）を用いて分析する。他の関連するソフトウェアも使用してよい。
【００８１】
各種の種からの遺伝子発現は、製造業者であるＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）からのプロトコルに従ってＨｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｕｒｖｅｙ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｖ２．０，Ｍｏｕｓｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｕｒｖｅｙ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｖ２．０又はＲａｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｕｒｖｅｙ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ（或いはこれらのアレイの対応するより新しいバージョン）を用いて分析してもよい。これらのマイクロアレイ発現データは、例えば、Ｏｒａｃｌｅ（登録商標）アノテーションデータベース、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ７．２（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）、及びＭｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｕｉｔｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ５．０ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＭＡＳ ５．０，Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を備えた１７００ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して分析する。他の関連するソフトウェアを使用してもよい。
【００８２】
遺伝子発現（ｍＲＮＡレベル）は、定量又は半定量ＰＣＲを用いて分析してもよい。タンパク質レベルの遺伝子発現の分析は、（製造業者の指示に従って）市販の酵素イムノアッセイキット（ＥＩＡ／ＥＬＩＳＡ）又は従来のウエスタンブロット及び／若しくは免疫組織学的手法を用いて分析してもよい。
【００８３】
（実施例１３）
細胞増殖アッセイ
上記及び下記の実施例に記載の刺激及び未刺激のマウスマスト細胞、ＭｏｎｏＭａｃ−６細胞、ＲＡＷ ２６４．７細胞、ＮＢ４細胞、ＨＬ−６０細胞、及びＨＢＳＭＣの増殖（２４から７２時間に亘る個々の試験薬の添加並びに／又は上記及び下記の実施例に記載の刺激の前に、０．１から５％のウシ胎仔血清中で２４から４８時間に亘る増殖停止を実施するか又はしないで）は、製造業者の指示に従って細胞増殖試薬であるＷＳＴ−１（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａ ＡＢ，Ｂｒｏｍｍａ，Ｓｗｅｄｅｎ）又は市販のブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）細胞増殖アッセイ（例えば、細胞増殖ＥＬＩＳＡ、ＢｒｄＵ、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて測定する。他の従来の細胞増殖試験を使用してもよい。
【００８４】
（実施例１４）
血小板凝集試験
アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アラキドン酸、コラーゲン、又はトロンボキサンアナログＵ−４６６１９によって誘導されるウサギ又はヒト血小板の凝集（血小板の豊富な血漿又は全血）を、例えばＢｅｒｔｅｌｅ ｅｔ ａｌ（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．８５，３３１（１９８２））に記載のような凝集測定を用いて分析する。（上述のように）誘導された血小板凝集は、洗浄したヒト又はウサギ血小板を用いて、及び／又は他の確立された凝集測定若しくは他の対応する血小板凝集測定方法を用いて分析してもよい。試験薬（スタチン（ピタバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、好ましくは、シンバスタチン、ロスバスタチン、又はアトルバスタチン）と組み合わせたスプラタスト、スプラタスト単独、及びスタチン単独）を、血小板凝集の１から１２０分前に添加する（薬剤ストック溶液及び濃度に関する詳細は上記の実施例１参照；試験薬は血小板凝集誘導と同時に添加してもよい）。比較のために、幾つかの実験は薬剤なしで実施する。
【００８５】
（実施例１５）
ザイモサン及び他の刺激によって誘導されるマウス腹膜炎
このアッセイは、本質的には、Ｒａｏ ｅｔ ａｌ（Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２６９，９１７（１９９４））に従うアッセイである（他のマウスの種を使用してもよい）。０．０３から５０ｍｇ／ｋｇの用量の試験薬（スタチン（ピタバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、好ましくは、シンバスタチン、ロスバスタチン、又はアトルバスタチン）と組み合わせたスプラタスト、スプラタスト単独、及びスタチン単独）を、皮下、静脈内、腹膜内、又は経口に２から２４時間毎に動物に投与する（比較のために、幾つかの実験は薬剤無しで実施する）。投与の前に、薬剤のストック溶液（上記の実施例１参照）を、必要に応じて、例えば、生理食塩水（非経口投与用）又は水（経口治療用）中の０．５％又は１％メチルセルロースで希釈する。他の媒体を使用してもよい。最初の薬剤投与の１分から２４時間後に、０．５から１ｍＬ 滅菌ＰＢＳ（超音波処理及びよく混合）中の０．５から２ｍｇのザイモサン Ａ（Ｓｉｇｍａ，ｃａｔ．ｎｏ．Ｚ４２５０）を腹膜に注射する（ザイモサンＡを使用する代わりに、腹膜炎は、炎症性濃度の他のよく確立された炎症性刺激、例えば、抗マウスＩｇＥ（１から３日間に亘るマウスＩｇＥを用いて腹膜内の事前処理あり又はなしで）、コンカナバリンＡ、カラギーナン、プロテオースペプトン、ＬＰＳ、ＰＭＡ、チオグリコレート、アラキドン酸、ｆＭＬＰ、ＴＮＦ、ＩＬ−１βの腹膜内注射によって誘導されてもよい。試験薬はザイモサンの腹膜内注射又は他の炎症性刺激と同時に投与されてもよい。）。ザイモサン注射（又は１つ若しくは複数の他の炎症性刺激）の２から２４時間後に、動物を屠殺する。次いで、腹膜腔を１から３ｍＬの洗浄緩衝液（３から５ｍＭ ＥＤＴＡ又は５から１０単位／ｍＬのヘパリンを含むか又は含まない氷冷ＰＢＳ）で洗浄する。洗浄液中の全体又は分化した白血球数を、チュルク液で染色下のあとに染色血球計を用いて計測し、及び／又はｃｙｔｏｓｐｉｎ調製物のＭａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ Ｇｉｅｍｓａによる染色若しくは修飾Ｗｒｉｇｈｔ’ｓ（Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｋ）の各々を、標準形態学的基準を用いて光学顕微鏡によって計数する。全体又は分化した白血球の計数のための他の確立された方法を使用してもよい。残部の洗浄液を遠心分離（３００から３０００×ｇ、４℃、３から１０分）して、細胞を含まない洗浄液上清を、炎症メディエータであるＬＴＢ４、ＰＧＥ２、ＴＸＢ２の含有量、及び／又は上記の実施例１に記載のマウスサイトカイン／ケモカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＴＮＦ、ＩＬ−１β、ＫＣ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＦＮγ）の含有量について分析するまで凍結保存（−２０℃から−８０℃）する。洗浄液上清中のヒスタミンの含有量は、製造業者の指示に従って市販のヒスタミン酵素イムノアッセイキット（ＥＩＡ／ＥＬＩＳＡ）を用いて測定する。炎症性腹膜細胞活性化は、実施例３に記載のβ−ヘキソサミニダーゼアッセイを用いる洗浄液中のβ−ヘキソサミニダーゼ活性を測定することによって試験してもよい。洗浄液の細胞沈殿物は、０．５％ ＨＴＡＢを含む０．１から１．０ｍＬの０．０５Ｍ ＫＨＰＯ４ ｐＨ ６．０中に再懸濁し、Ｒ��ｏ ｅｔ ａｌ（Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２６９，９１７−２５（１９９４））に記載のミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）含有量の分析まで凍結保存（−２０℃から−８０℃）する。別々の動物に由来する同一の細胞沈殿物をＲＬＴ緩衝液（ＱＩＡＧＥＮ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）中でマイクロアレイのために更に処理する（実施例１２参照）まで凍結保存（−８０℃）する。洗浄緩衝液で腹膜腔を洗浄するのと同時に、炎症を起こした腹膜腔に由来する組織（腹膜壁、小腸、及び／又は他の腹膜内若しくは腹膜後の器官／組織）生検を回収し、秤量し、凍結保存（ＴＲＩｚｏｌ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ中でマイクロアレイ分析のためのサンプルを−８０℃で凍結する）し、実施例１２に記載のように、その後にマイクロアレイ技術を用いて組織の遺伝子発現に関して分析する。未処理の動物に由来する非炎症腹膜腔は、ＭＰＯ、炎症性メディエータ、サイトカイン／ケモカイン、及び遺伝子発現のベースラインのレベルを提供する。組織炎症は、従来の組織学及び免疫組織学的技術を用いて試験してもよい。
【００８６】
（実施例１６）
ザイモサン及び他の刺激によって誘導されるラット腹膜炎
約１５０から４５０ｇの体重のオスのＷｉｓｔａｒ又はＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットを使用する。０．０３から５０ｍｇ／ｋｇの用量の試験薬（スタチン（ピタバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、好ましくは、シンバスタチン、ロスバスタチン、又はアトルバスタチン）と組み合わせたスプラタスト、スプラタスト単独、及びスタチン単独）を、皮下、静脈内、腹膜内、又は経口に２から２４時間毎に動物に投与する（比較のために、幾つかの実験は薬剤無しで実施する）。投与の前に、薬剤のストック溶液（上記の実施例１参照）を、必要に応じて、例えば、生理食塩水（非経口投与用）又は水（経口治療用）中の０．５又は１％のメチルセルロースで希釈する。他の媒体を使用してもよい。最初の薬剤投与の１分から２４時間後に、１から１０ｍＬのＰＢＳ中の１から１００ｍｇのザイモサン（Ｓｉｇｍａ，ｃａｔ．ｎｏ．Ｚ４２５０）（超音波処理及びよく混合）を腹腔内に注射する（ザイモサンＡを使用する代わりに、腹膜炎は、炎症性濃度の他のよく確立された炎症性刺激、例えば抗ラットＩｇＥ（１から３日間に亘るラットＩｇＥを用いた腹膜内事前処理あり又はなしで）、コンカナバリンＡ、タンパク質Ｌ、化合物４８／８０、カラギーナン、プロテオースペプトン、ＬＰＳ、ＰＭＡ、チオグリコレート、アラキドン酸、ｆＭＬＰ、ＴＮＦ、ＩＬ−１βの腹膜内注射によって誘導されてもよい。試験薬は、ザイモサンの腹膜内注射又は他の炎症性刺激と同時に投与されてもよい。）。ザイモサン注射（又は１つ若しくは複数の他の刺激）の２から２４時間後に、動物を屠殺する。次いで、腹膜腔を１０から２０ｍｌの洗浄緩衝液（例えば、３から５ｍＭのＥＤＴＡ又は５から１０単位／ｍＬのヘパリンを含むか又は含まない氷冷ＰＢＳ）を用いて洗浄する。洗浄液中の全体及び分化した白血球数の計測を、チュルク液で染色下のあとに染色血球計を用いて計測し、及び／又はｃｙｔｏｓｐｉｎ調製物のＭａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ Ｇｉｅｍｓａによる染色若しくは修飾Ｗｒｉｇｈｔ’ｓ（Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｋ）染色の各々を、標準形態学的基準を用いて光学顕微鏡によって計数する。全体又は分化した白血球の計数のための他の確立された方法を使用してもよい。残部の洗浄液を遠心分離（３００から３０００×ｇ、４℃、３から１０分）して、細胞を含まない洗浄液上清を、炎症メディエータであるＬＴＢ４、ＰＧＥ２、ＴＸＢ２の含有量、及び／又は上記の実施例１及び４に記載のマウスサイトカイン／ケモカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＴＮＦ、ＩＬ−１β、ＫＣ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＦＮγ）の含有量について分析するまで凍結保存（−２０℃から−８０℃）する。洗浄液上清中のヒスタミンの含有量は、製造業者の指示に従って市販のヒスタミン酵素イムノアッセイキット（ＥＩＡ／ＥＬＩＳＡ）を用いて測定する。炎症性腹膜細胞活性化は、実施例３に記載のβ−ヘキソサミニダーゼアッセイを用いる洗浄液中のβ−ヘキソサミニダーゼ活性を測定することによって試験してもよい。洗浄液の細胞沈殿物は、０．５％ ＨＴＡＢを含む０．１から１．０ｍＬの０．０５Ｍ ＫＨＰＯ４ ｐＨ ６．０中に再懸濁し、Ｒａｏ ｅｔ ａｌ（Ｊ．Ｐｈ���ｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２６９，９１７−２５（１９９４））に記載のミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）含有量の分析まで凍結保存（−２０℃から−８０℃）する。別々の動物に由来する同一の細胞沈殿物をＲＬＴ緩衝液（ＱＩＡＧＥＮ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）中でマイクロアレイのために更に処理する（実施例１２参照）まで凍結保存（−８０℃）する。洗浄緩衝液で腹膜腔を洗浄するのと同時に、炎症を起こした腹膜腔に由来する組織（腹膜壁、小腸、及び／又は他の腹膜内若しくは腹膜後の器官／組織）生検を回収し、秤量し、凍結保存（ＴＲＩｚｏｌ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ中でマイクロアレイ分析のためのサンプルを−８０℃で凍結する）し、実施例１２に記載のように、その後にマイクロアレイ技術を用いて組織の遺伝子発現に関して分析する。未処理の動物に由来する非炎症腹膜腔は、ＭＰＯ、炎症性メディエータ、サイトカイン／ケモカイン、及び遺伝子発現のベースラインのレベルを提供する。組織炎症は、従来の組織学及び免疫組織学的技術を用いて試験してもよい。
【００８７】
（実施例１７）
ＮＢ４及びＨＬ−６０細胞炎症性メディエータ放出アッセイ
ヒトＮＢ４細胞（Ｌａｎｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ，７７，１０８０（１９９１））を、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、および１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清を添加したＲＰＭＩ−１６４０中で培養（３７℃／５％ ＣＯ２）する。分化のために、１から５μＭのオールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）を一般的には３日毎に添加する。
【００８８】
ヒトＨＬ−６０細胞（Ｓｔｅｉｎｈｉｌｂｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１７８，１（１９９３））を、１００単位／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、及び１０から２０％（ｖ／ｖ）のウシ胎仔血清を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地に培養（３７℃／５％ ＣＯ２）する。分化のために、ＡＴＲＡ（１から５μＭ）、ＤＭＳＯ（１から２％）、ＰＭＡ（１００から５００ｎｇ／ｍＬ）、又はビタミンＤ３（１から１５μＭ）を５日間に亘って添加した。
【００８９】
炎症性メディエータであるロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）の形成及び放出を刺激するために、分化又は未分化ＮＢ４又はＨＬ−６０細胞（１から１５×１０６／ｍＬ）を、１０から４０μＭアラキドン酸及び／又は２から１０μＭカルシウムイオノフォアＡ２３１８７と共に５から３０分間に亘ってインキュベート（カルシウムを含むＰＢＳ中で３７℃）する。ＮＢ４及びＨＬ−６０細胞は、文献に記載の生物学的に有効な濃度のアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、ｆＭＬＰ、及び／又はトロンボキサンアナログＵ−４６６１９と共に、上記のＡ２３１８７及び／又はアラキドン酸有り又は無しで刺激してもよい。上記のＮＢ４及びＨＬ−６０インキュベート／刺激は、１：１０から１：１００００のＮＢ４／ＨＬ−６０：血小板の比率で（健康な提供者の血液に由来する）ヒト血小板の存在下で実施してもよい。前記インキュベート／刺激は、内部標準として添加する１ｍＬの冷メタノール及びプロスタグランジンＢ２（ＰＧＢ２）を用いて停止する。サンプルを遠心分離して、上清を水で希釈して、メタノールの終濃度を３０％とし、かつ、ｐＨを３から４に調節する。上清中のアラキドン酸代謝物を、事前に調整（１ｍＬメタノールの後に１ｍＬ Ｈ２Ｏ）したＣ１８固相カラム（Ｓｏｒｂｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｕ．Ｋ．）で抽出する。代謝物をメタノールで溶出し、１容量の水を溶出物に添加する。逆相ＨＰＬＣのために、７６μＬの各サンプルを３９μＬのＨ２Ｏと混合する（他の容量比を使用してもよい）。Ｗａｔｅｒｓ ＲＣＭ ８×１０カラムを、メタノール／アセトニトリル／Ｈ２Ｏ／酢酸（３０：３５：３５：０．０１ ｖ／ｖ）を用いて１．２ｍＬ／分で溶出する。溶出物の吸光度を、ＰＧＢ２及びＬＴＢ４の検出及び低量のために２７０ｎｍでモニターする。ＬＴＢ４を測定するための市販の酵素イムノアッセイキット（ＥＩＡ／ＥＬＩＳＡ）を、キットの製造業者の指示に従って使用してもよい。製造業者の指示に従って市販の酵素イムノアッセイキット（ＥＩＡ／ＥＬＩＳＡ）を使用して、上記のＮＢ４／ＨＬ−６０インキュベート物／刺激物に由来する上清を、炎症性メディエータであるプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）及び／又はトロンボキサンＢ２（ＴＸＢ２）の含有量に関して分析してもよい。細胞は、試験薬（スタチン（ピタバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、好ましくは、シンバスタチン、ロスバスタチン、又はアトルバスタチン）と組み合わせたスプラタスト、スプラタスト単独、及びスタチン単独）と共に、炎症性メディエータ放出のためのＮＢ４又はＨＬ−６０刺激の前に１分から２４時間に亘ってインキュベート（添加物を含むか又は含まない、カルシウムを含まないＰＢＳ中又は１から２０％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ−１６４０中で３７℃）する（薬剤ストック溶液及び濃度に関しての詳細は上記の実施例１参照；試験薬はＮＢ４／ＨＬ−６０刺激と同時に添加してよい）。比較のために、幾つかの実験は薬剤無しで実施する。
【００９０】
ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＭＣＰ−１、ＰＡＦ、Ｃ５ａなどの炎症性サイトカイン、ケモカイン、及びメディエータの形成及び放出を刺激するために、分化又は未分化のＮＢ４又はＨＬ−６０（１から１０×１０６／ｍＬ）を、リポポリサッカリド（ＬＰＳ １から１００ｎｇ／ｍＬ）、ホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ １から１００ｎｇ／ｍＬ）、又はカルシウムイオノフォアＡ２３１８７（１から１０μＭ）、或いはそれらの刺激の組み合わせと共に、４から２４時間に亘って（添加物を含むか又は含まない、１から１０％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ−１６４０中で）インキュベート（３７℃／５％ ＣＯ２）する。ＮＢ４及びＨＬ−６０細胞は、文献に記載の生物学的に有効な濃度のアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）及び／又はトロンボキサンアナログＵ−４６６１９とともに、上記のＬＰＳ、ＰＭＡ、及び／又はＡ２３１８７あり又はなしで刺激してもよい。ＮＢ４及びＨＬ−６０インキュベート／刺激は、１：１０から１：１００００のＮＢ４／ＨＬ−６０：血小板の比率でヒト血小板（健康な提供者の血液由来）の存在下で実施してもよい。細胞は、サイトカイン／ケモカイン／メディエータ放出のためのＮＢ４又はＨＬ−６０刺激の前の１分から２４時間に亘って、試験薬（上記のスタチンと組み合わせたスプラタスト、スプラタスト単独、及びスタチン単独）と共に、インキュベート（添加物を含むか又は含まない、１から１０％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ−１６４０中で３７℃／５％ ＣＯ２）する（比較のために、幾つかの実験は薬剤無しで実施する；試験薬はＮＢ４／ＨＬ−６０刺激と同時に添加してもよい）。細胞を遠心分離した後に、上清中のヒトサイトカイン／ケモカイン及びメディエータの濃度を、製造業者の指示に従ってＣｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）を用いて定量する。サイトカイン／ケモカイン及びメディエータを測定するための市販の酵素イムノアッセイキット（ＥＩＡ／ＥＬＩＳＡキット）を、製造業者による指示に従って使用してもよい。細胞沈殿物は、マイクロアレイ実験のために更に処理するまで（上記実施例１２参照）、ＲＬＴ緩衝液（ＱＩＡＧＥＮ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）中で凍結保存（−８０℃）する。
【００９１】
好中球様ＮＢ４及びＨＬ−６０細胞由来のメディエータ及びケモカイン／サイトカインの放出に対する上記の薬剤の効果を試験することに加えて、自発的又は刺激による当該細胞の接着及び／又は移動に対する薬剤の効果を分析してもよい（標準的なプロトコルによって新しく単離したヒト血液多形核細胞（ＰＭＮ）を使用してもよい）。自発的又は刺激（ｆＭＬＰ、ＩＬ−８、ＰＡＦ、ＬＴＢ４、又は他の関連するＰＭＮ活性化因子）によるＰＭＮ又は好中球様細胞の、例えば、培養内皮細胞又はタンパク質被覆人工表面に対する接着は、よく確立され、かつ、文献に記載された実験手法及びアッセイを使用して試験する。ＰＭＮ又は好中球様細胞の移動（ｆＭＬＰ、ＩＬ−８、ＰＡＦ、ＬＴＢ４、又は他の関連するＰＭＮ活性化因子を用いた刺激による）は、よく確立され、かつ、文献に記載された実験手法及びアッセイ、例えば、その様な移動の試験のために設計された市販のタンパク質被覆膜を通過する移動を使用して試験する。
【００９２】
（実施例１８）
ヒト全血中の血小板及び白血球活性化
鬱血させずに、１／１０容量の１２９ｍＭクエン酸トリナトリウム（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｍｅｙｌａｎ，Ｆｒａｎｃｅ）を含有するシリコン処理バキュテナーチューブを用いて、静脈穿刺によって静脈血を回収する。全血血小板Ｐ−セレクチン発現（血小板活性を反映する）、白血球ＣＤ１１ｂ発現（白血球活性を反映する）単独血小板及び血小板−血小板微小凝集塊計数、並びに血小板−白血球凝集（ＰＬＡ）を、本質的には過去に文献（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １００，１３７４（１９９９））に記載されているように、フローサイトメトリーアッセイを用いて測定する。簡潔には、５μＬの一定分量の全血を、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、Ｕ−４６６１９、Ｕ−４４０６９、血小板活性化因子（ＰＡＦ）、アラキドン酸、コラーゲン、若しくはトロンビンなどの血小板活性化刺激及び／又はＮ−ホルミル−メチオニル−ロイシル−フェニルアラニン（ｆＭＬＰ）、アラキドン酸、ＰＡＦ、ＬＰＳ、Ａ２３１８７、又はＬＴＢ４などの白血球活性化刺激の存在下又は不在下において、適当に希釈した抗体（下記参照）を含有する４５μＬのＨｅｐｅｓ緩衝化生理食塩水（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４）に添加する。血液を血小板及び／又は白血球活性化刺激＋抗体に曝露する前に、血液サンプル（０．１から１ｍｌ）を試験薬（スタチン（ピタバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、好ましくは、シンバスタチン、ロスバスタチン、又はアトルバスタチン）と組み合わせたスプラタスト、スプラタスト単独、及びスタチン単独）と共に、１から６０分間に亘ってインキュベートする（試験薬は上記刺激と同時に添加されてもよい）。比較のために、幾つかの血液サンプルは薬剤への曝露無しで刺激する。血小板Ｐ−セレクチン発現は、Ｒ−フィコエチスリン（ＲＰＥ）−ＣＤ６２Ｐモノクローナル抗体（ＭＡｂ）ＡＣ１．２（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）によって測定する。白血球ＣＤ１１ｂ発現は、蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合ＭＡｂ ＢＥＡＲ１（Ｉｎｎｕｎｏｔｅｃｈ，Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）によって測定する。ＦＩＴＣ及びＲＰＥ結合同形ＭＡｂは、ネガティブコントロールとして使用する。血小板計数のために使用する蛍光ビーズ（ＳＰＨＥＲＯ（商標）Ｒａｉｎｂｏｗ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ，１．８から２．２μｍ）は、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）のものである。血小板はＦＩＴＣ結合抗ＣＤ４２ａ（ＧＰＩＸ）ＭＡｂ Ｂｅｄ１（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて同定し、白血球はＲＰＥ結合抗ＣＤ４５ＭＡｂ Ｊ３３（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）を用いて同定する。サンプル（上記の刺激あり又はなしの薬剤処理又は未処理の血液＋抗体）を、２０分間に亘って暗所で室温においてインキュベートする。その後、サンプルを希釈して、０．５％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒド生理食塩水を用いて穏やかに固定化し、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ ＥＰＩＣＳ ＸＬ−ＭＣＬ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｒｐ．，Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ）を用い���各種の血小板及び白血球パラメータについて分析する。血小板Ｐ−セレクチン発現データは、血小板集団におけるＰ−セレクチン陽性細胞の割合及びＰ−セレクチン陽性血小板数の絶対値として報告する。白血球ＣＤ１１ｂ発現は、白血球集団全体及び白血球亜集団の平均蛍光強度（ＭＦＩ）として報告する。血小板−白血球凝集（ＰＬＡ）は、絶対数並びに白血球集団全体及び白血球、単球、及び好中球の間の血小板結合白血球の割合の双方として表わす。ヒト全血中の対応する血小板及び白血球活性化を測定するための他の関連する試薬、実験条件／手法、装置、及び分析態様を使用してもよい。
【００９３】
（実施例１９）
マクロファージからの腫瘍壊死因子放出のスプラタスト及びロスバスタチンによる阻害
ヒトマクロファージ細胞株ＭｏｎｏＭａｃ−６（ＭＭ６）（Ｚｉｅｇｌｅｒ−Ｈｅｉｔｂｒｏｃｋ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，４１，４５６（１９８８））に由来する細胞を、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１×非必須アミノ酸、１０μｇ／ｍＬインスリン、１ｍＭオキサル酢酸、１００単位／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、及び５％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地中で培養（３７℃／５％ ＣＯ２）した。実験の始めに、ＭＭ６細胞を９６ウェルプレートに１×１０５細胞／ｍＬの密度で播種した（細胞生存率実験において１００μＬ／ウェル、及びＴＮＦ放出実験において１５０μＬ／ウェル  −下記参照）。
【００９４】
ＭＭ６細胞は、所定の終濃度の試験薬を用いて、細胞生存率／増殖の定量又はホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて刺激をする前に４８時間に亘って処理し、その後にＰＭＡ誘導ＴＮＦ−放出の測定を実施した（詳細は下記参照）。
【００９５】
主張壊死因子（ＴＮＦ）の形成及び放出を刺激するために、ＭＭ６細胞を、１０ｎｇ／ｍＬの終濃度のＰＭＡと共に、５時間に亘って（上記の添加物を含み５％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ−１６４０中で）インキュベート（３７℃／５％ ＣＯ２）した。
【００９６】
各種のＭＭ６インキュベート／刺激の後に細胞を遠心分離して（上記及び下記参照）、その後に上清中のＴＮＦの濃度を、製造業者の指示にしたがってＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）社製のヒトＴＮＦ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ ＩＩを用いて定量した。
【００９７】
ＭＭ６細胞増殖／生存率を、細胞増殖試薬ＷＳＴ−１（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｓｃ Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａ ＡＢ，Ｂｒｏｍｍａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して測定した。ＷＳＴ−１試薬は、例えば、細胞増殖及び生存率の分光光学的定量に使用するように設計されており、製造業者の指示にしたがって使用した。吸光度の測定のための波長は４５０ｎｍであり、ＷＳＴ−１試薬に曝露したＭＭ６細胞の入った全てのウェルの吸光度は０．９５超であった（各試験条件についてｎ＝３）。
【００９８】
スプラタスト（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｕｓｔｏｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡから購入されるトシレート塩）及びロスバスタチン（ナトリウム塩；ロスバスタチンは市販のＣｒｅｓｔｏｒ（登録商標）錠剤から抽出及び精製し、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．５，Ｎｏ．５，ｐｐ．４３７−４４４，１９９７に記載のようにナトリウム塩として単離した）のストック溶液を滅菌生理食塩水で作製した。
【００９９】
ＰＭＡに曝露していないＭＭ６細胞は、検出可能なレベルのＴＮＦを生産しなかった。しかしながら、ＰＭＡ刺激の五時間後に、未処理のＭＭ６細胞の上清中の平均ＴＮＦ濃度が４１．１．ｐｇ／ｍＬ（ｎ＝２）となった。
【０１００】
１０μＭ又は３０μＭの終濃度でロスバスタチン単独でＭＭ６細胞を処理した後に、ＰＭＡ刺激後の平均ＴＮＦ濃度が、７６．７ｐｇ／ｍＬ及び８４．０ｐｇ／ｍＬの各々に増大した（未処理の細胞と比較）（各濃度においてｎ＝２）。
【０１０１】
１０μＭ又は１０μＭの終濃度でスプラタスト単独でＭＭ６細胞を処理した後に、３９．６ｐｇ／ｍＬ（３．８％の低減）および３４．８ｐｇ／ｍＬ（１５．４％の低減）の各々への対応する平均ＴＮＦ濃度における小さな低減が存在した（未処理の細胞と比較）（各濃度においてｎ＝２）。
【０１０２】
１０μＭ又は３０μＭロスバスタチンの存在下において１μＭスプラタストでＭＭ６細胞を処理した際は、各々、１０μＭ又は３０μＭの各々のロスバスタチン単独で処理した際（上記参照）と比較して、相乗的に３６．１％及び３４．６％というＰＭＡ誘導ＴＮＦ放出の阻害が見られた（平均値、各組み合わせにおいてｎ＝２）。さらに、１０μＭ又は３０μＭロスバスタチンの存在下で１０μＭスプラタストを用いてＭＭ６を処理した際は、各々、１０μＭ又は３０μＭの各々のロスバスタチン単独で処理した際（上記参照）と比較して、相乗的に８８．５％及び７５．１％というＴＮＦ放出の阻害が見られた（平均値、各組み合わせにおいてｎ＝２）。
【０１０３】
未処理のＭＭ６細胞と比較して、１０μＭ又は３０μＭロスバスタチンを用いて４８時間に亘って処理したＭＭ６細胞の生存率（上記のＷＳＴ−１アッセイを用いてアッセイする）は、１０５％及び１０２％の各々であった。１μＭ又は１０μＭスプラタストについての対応する値は、９４％及び９２％の各々であり、上記の４つの異なるロスバスタチン−スプラタストの組み合わせについては、その値が１２４％（スプラタスト１μＭ＋ロスバスタチン１０μＭ）、１２５％（スプラタスト１μＭ＋ロスバスタチン３０μＭ）、１１４％（スプラタスト１０μＭ＋ロスバスタチン１０μＭ）、及び１２１％（スプラタスト１０μＭ＋ロスバスタチン３０μＭ）であった。かくして、ロスバスタチン−スプラタストの組み合わせによるＴＮＦ放出の相乗的な阻害は、細胞増殖又は生存率の低減によって引き起こされたものではなかった。
【０１０４】
（実施例２０）
マクロファージからの腫瘍壊死因子放出のスプラタスト及びアトルバスタチンによる阻害
上記の実施例１９の手法を、ロスバスタチンに代えてアトルバスタチン（ナトリウム塩；Ｂｉｏｃｏｎ，Ｌｔｄ．，Ｂａｎｇａｌｏｒｅ，Ｉｎｄｉａからの贈り物としてアトルバスタチンカルシウムを受け取り、塩酸水溶液の添加によってカルシウム塩を遊離酸に変換し、次いで、抽出によって単離した後に１当量のＮａＯＨ水溶液を添加することによってナトリウム塩に変換した）について繰り返した。
【０１０５】
１０μＭ又は３０μＭの終濃度でアトルバスタチン単独でＭＭ６を処理した後に、ＰＭＡ刺激後の平均ＴＮＦ濃度が、（未処理の細胞と比較して）１３３．６ｐｇ／ｍＬ及び５９．７ｐｇ／ｍＬの各々に増大した（各濃度においてｎ＝２）。
【０１０６】
１０μＭ又は３０μＭのアトルバスタチンの存在下において１μＭスプラタストでＭＭ６細胞を処理した際は、各々、１０μＭ又は３０μＭの各々のアトルバスタチン単独で処理した際（上記参照）と比較して、相乗的に３５．０％及び７６．９％というＰＭＡ誘導ＴＮＦ放出の阻害が見られた（平均値、各組み合わせにおいてｎ＝２）。さらに、１０μＭ又は３０μＭのアトルバスタチンの存在下で１０μＭスプラタストを用いてＭＭ６を処理した際は、各々、１０μＭ又は３０μＭの各々のアトルバスタチン単独で処理した際（上記）と比較して、相乗的に８４．０％及び９３．９％というＴＮＦ放出の阻害が見られた。
【０１０７】
未処理のＭＭ６細胞と比較して、１０μＭ又は３０μＭアトルバスタチンを用いて４８時間に亘って処理したＭＭ６細胞の生存率（上記のＷＳＴ−１アッセイを用いてアッセイした）は、９４％及び７９％の各々であった。上記の４つの異なるアトルバスタチン−スプラタストの組み合わせについての対応する値は、１１０％（スプラタスト１μＭ＋アトルバスタチン１０μＭ）、８５％（スプラタスト１μＭ＋アトルバスタチン３０μＭ）、９７％（スプラタスト１０μＭ＋アトルバスタチン１０μＭ）、及び９０％（スプラタスト１０μＭ＋アトルバスタチン３０μＭ）であった。かくして、また、アトルバスタチン−スプラタストの組み合わせによるＴＮＦ放出の相乗的な阻害は、細胞増殖又は生存率の低減によって引き起こされたものではなかった。
【０１０８】
上記の実施例の一つ又は複数が、スプラタストとスタチン（例えば、シンバスタチン、とりわけ、ロスバスタチン及び／又はアトルバスタチン）との組み合わせの明確な相乗的な効果を示している。
【国際調査報告】
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2010523486.tif 000003
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