(57)【要約】  本発明は、イン・ビトロおよび／またはイン・ビボにおいて腫瘍細胞の増殖を阻害可能な新規な単離された抗体（この抗体は機能的スクリーニングによって得られたものである）、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントに関する。より詳しくは、本発明は、ＪＡＭ−Ａタンパク質に特異的な６Ｆ４抗体、ならびに癌処置のためのその使用に関する。このような抗体からなる医薬組成物も含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも配列番号１、２、３、４、５もしくは６を含んでなる配列のＣＤＲ、またはその配列が最適なアライメントの後に配列番号１、２、３、４、５もしくは６の配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１つのＣＤＲの中から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる、イン・ビトロおよび／またはイン・ビボにおいて腫瘍細胞の増殖を阻害可能な単離された抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント。
【請求項２】
モノクローナル抗体からなる、請求項１に記載の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント。
【請求項３】
配列番号２、４および６の配列の３つのＣＤＲのうち少なくとも１つ、または最適なアライメントの後に配列番号２、４もしくは６の配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１つの配列を含んでなる重鎖を含んでなる、請求項１または請求項２に記載の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント。
【請求項４】
それぞれＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３である下記の３つのＣＤＲ：
ＣＤＲ−Ｈ１は、配列番号２、７もしくは９の配列、または最適なアライメントの後に配列番号２、７もしくは９の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなり、
ＣＤＲ−Ｈ２は、配列番号４もしくは１１の配列、または最適なアライメントの後に配列番号４もしくは１１の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなり；かつ
ＣＤＲ−Ｈ３は、配列番号６もしくは１２の配列、または最適なアライメントの後に配列番号６もしくは１２の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる
を含んでなる重鎖を含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント。
【請求項５】
配列番号７の配列のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４の配列のＣＤＲ−Ｈ２および配列番号１２の配列のＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖を含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント。
【請求項６】
配列番号９の配列のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１１の配列のＣＤＲ−Ｈ２および配列番号６の配列のＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖を含んでなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント。
【請求項７】
配列番号１、３および５の配列の３つのＣＤＲのうち少なくとも１つ、または最適なアライメントの後に配列番号１、３および５の配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１つの配列を含んでなる軽鎖を含んでなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント。
【請求項８】
それぞれＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３である下記の３つのＣＤＲ：
ＣＤＲ−Ｌ１は、配列番号１もしくは８の配列、または最適なアライメントの後に配列番号１もしくは８の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなり、
ＣＤＲ−Ｌ２は、配列番号３もしくは１０の配列、または最適なアライメントの後に配列番号３もしくは１０の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなり；かつ
ＣＤＲ−Ｌ３は、配列番号５の配列、または最適なアライメントの後に配列番号５の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる
を含んでなる軽鎖を含んでなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント。
【請求項９】
配列番号１の配列のＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３の配列のＣＤＲ−Ｌ２および配列番号５の配列のＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖を含んでなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント。
【請求項１０】
配列番号８の配列のＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１０の配列のＣＤＲ−Ｌ２および配列番号５の配列のＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖を含んでなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント。
【請求項１１】
下記の３つのＣＤＲ：
配列番号１の配列の、または最適なアライメントの後に配列番号１の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｌ１；
配列番号３の配列の、または最適なアライメントの後に配列番号３の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｌ２；および
配列番号５の配列の、または最適なアライメントの後に配列番号５の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｌ３
を含んでなる軽鎖と、
下記の３つのＣＤＲ：
配列番号７の配列の、または最適なアライメントの後に配列番号７の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｈ１；
配列番号４の配列の、または最適なアライメントの後に配列番号４の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｈ２；および
配列番号１２の配列の、または最適なアライメントの後に配列番号１２の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｈ３
を含んでなる重鎖と
を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント。
【請求項１２】
下記の３つのＣＤＲ：
配列番号８の配列の、または最適なアライメントの後に配列番号８の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｌ１；
配列番号１０の配列の、または最適なアライメントの後に配列番号１０の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｌ２；および
配列番号５の配列の、または最適なアライメントの後に配列番号５の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｌ３
を含んでなる軽鎖と、
下記の３つのＣＤＲ：
配列番号９の配列の、または最適なアライメントの後に配列番号９の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｈ１；
配列番号１１の配列の、または最適なアライメントの後に配列番号１１の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｈ２；および
配列番号６の配列の、または最適なアライメントの後に配列番号６の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｈ３
を含んでなる重鎖と
を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント。
【請求項１３】
配列番号１３のアミノ酸配列または最適なアライメントの後に配列番号１３の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる軽鎖配列を含んでなり、かつ、配列番号１４のアミノ酸配列または最適なアライメントの後に配列番号１４の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる重鎖配列を含んでなる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント。
【請求項１４】
配列番号１７のアミノ酸配列または最適なアライメントの後に配列番号１７の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる軽鎖配列を含んでなり、かつ、配列番号１８もしくは１９のアミノ酸配列または最適なアライメントの後に配列番号１８もしくは１９の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる重鎖配列を含んでなる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント。
【請求項１５】
誘導化合物が、初期抗体のパラトピック認識特性の総てまたは一部を保存するように少なくとも１つのＣＤＲがグラフトされているペプチドスキャフォールドを含んでなる結合タンパク質からなる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント。
【請求項１６】
ペプチドスキャフォールドが、ａ）系統発生的によく保存されており、ｂ）強固な構造であり、ｃ）周知の三次元分子構成を有し、ｄ）サイズが小さく、および／またはｅ）安定性を改変することなく欠失および／または挿入により改変可能な領域を含んでなるタンパク質の中から選択される、請求項１５に記載の抗体またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント。
【請求項１７】
前記ペプチドスキャフォールドが、ｉ）フィブロネクチン、優先的にはフィブロネクチン３型ドメイン１０に由来するスキャフォールド、リポカリン、アンチカリン、黄色ブドウ球菌のＡタンパク質のドメインＢに由来するＺタンパク質、チオレドキシンＡ、もしくは「アンキリンリピート」、「アルマジロリピート」、「ロイシンリッチリピート」および「テトラトリコペプチドリピート」などの繰り返しモチーフを有するタンパク質、またはｉｉｉ）ニューロンＮＯシンターゼのタンパク質阻害剤（ＰＩＮ）の中から選択される、請求項１５または請求項１６に記載の抗体またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント。
【請求項１８】
前記機能的フラグメントが、フラグメントＦｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃおよびダイアボディー、またはＰＥＧ化フラグメントなどの半減期が延長されているいずれかのフラグメントの中から選択される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント。
【請求項１９】
前記抗体がネズミ抗体であり、および配列番号１５のアミノ酸配列の、または最適なアライメントの後に配列番号１５の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列の軽鎖と、配列番号１６のアミノ酸配列の、または最適なアライメントの後に配列番号１６の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列の重鎖とを含んでなる、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント。
【請求項２０】
前記抗体が、マウスとは異種の抗体に由来する軽鎖および重鎖の定常領域も含んでなるキメラ抗体である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント。
【請求項２１】
前記の異種がヒトである、請求項２０に記載のキメラ抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント。
【請求項２２】
ヒト抗体に由来する軽鎖および重鎖の定常領域がそれぞれλまたはκ領域およびγ−１、γ−２またはγ−４領域である、請求項２１に記載のヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント
【請求項２３】
２００６年７月６日にＩ−３６４６番としてthe CNCM, Pasteur Institute, Parisに提出されたネズミハイブリドーマ。
【請求項２４】
請求項２３に記載のハイブリドーマにより分泌される抗体。
【請求項２５】
ＪＡＭ−Ａ（結合部接着分子−Ａ）タンパク質と特異的に結合できる、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント。
【請求項２６】
ＪＡＭ−Ａタンパク質に対するＫｄがおおよそ１ｎＭ〜１ｐＭの間、より優先的には１０ｐＭ〜４０ｐＭの間である、請求項２５に記載の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント。
【請求項２７】
下記の核酸：
ａ）請求項１〜２２および２４〜２６のいずれか一項に記載の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントをコードする核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡ；
ｂ）ａ）で定義された核酸と相補的な核酸；
ｃ）高ストリンジェント条件下で配列番号２０〜３１の核酸配列のＣＤＲの少なくとも１つとハイブリダイズし得る少なくとも１８ヌクレオチドの核酸；および
ｄ）高ストリンジェント条件下で少なくとも配列番号３２もしくは３６の核酸配列の軽鎖および／または配列番号３３、３７もしくは３８の核酸配列の重鎖とハイブリダイズし得る少なくとも１８ヌクレオチドの核酸
の中から選択される単離された核酸。
【請求項２８】
請求項２７に記載の核酸からなるベクター。
【請求項２９】
請求項２８に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項３０】
請求項２９に記載のベクターにより形質転換された細胞を含んでなる、ヒト以外のトランスジェニック動物。
【請求項３１】
請求項１〜２２および２４〜２６のいずれか一項に記載の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントを製造する方法であって、下記の工程：
ａ）請求項２９に記載の宿主細胞の培地で、請求項２９に記載の宿主細胞に好適な培養条件にて培養すること；および
ｂ）このようにして培養培地から、または培養細胞から生産された抗体またはその機能的フラグメントの１つを回収すること
を含む、方法。
【請求項３２】
二重特異性抗体からなり、受容体ＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＨＥＲ２ｎｅｕ、ＨＧＦ、ｃＭＥＴ、ＦＧＦ、ＣＸＣＲ４およびＣＸＣＲ２の中から選択される、腫瘍発達に関連する受容体と相互作用し得る第二のモチーフを含んでなる、請求項１〜２２および２４〜２６のいずれか一項に記載の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント。
【請求項３３】
薬剤として用いるための、請求項１〜２２、２４〜２６および３２のいずれか一項に記載の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント。
【請求項３４】
請求項１〜２２、２４〜２６、３２および３３のいずれか一項に記載の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントからなる化合物を有効成分として含んでなる、組成物。
【請求項３５】
同時、個別または継続形式で用いるための組合せ製品として、ＪＡＭ−Ａタンパク質に対する抗体以外の抗腫瘍抗体をさらに含んでなる、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
同時、個別または継続形式で用いるための組合せ製品として、細胞傷害性／細胞増殖抑制剤をさらに含んでなる、請求項３４または請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
前記細胞傷害性／細胞増殖抑制剤が同時使用のための前記組成物の少なくとも１つの要素と化学的に結合されている、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
少なくとも１つの前記抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントが、細胞毒および／または放射性同位元素にコンジュゲートされている、請求項３４〜３７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３９】
薬剤として用いるための、請求項３４〜３８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４０】
腫瘍細胞の増殖に関連する疾病の予防または治療のための薬剤の製造のための、請求項１〜２２、２４〜２６、３２および３４のいずれか一項に記載の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント、および／または請求項３３〜３８のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項４１】
癌の予防または治療のための薬剤の製造のための、請求項４０に記載の使用。
【請求項４２】
前記癌が前立腺癌、骨肉腫、肺癌、乳癌、子宮内膜癌、多発性骨髄腫、卵巣癌、膵臓癌および結腸癌の中から選択される癌である、請求項４１に記載の使用。
【請求項４３】
前記癌がエストロゲン関連乳癌、非小細胞肺癌、結腸癌および膵臓癌の中から選択される癌である、請求項４２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、腫瘍増殖を阻害可能な新規抗体、特にネズミモノクローナル抗体、キメラおよびヒト化抗体、ならびにこのような抗体をコードするアミノ酸配列および核酸配列に関する。一態様から、本発明は、腫瘍細胞の増殖を阻害可能な新規抗体、誘導化合物または機能的フラグメントに関する。本発明はまた、癌の予防的および／または治療的処置のための、ならびに癌診断に関連する手法またはキットにおける薬剤としてのこのような抗体の使用を含む。最後に、本発明はこのような抗体を他の抗体などの抗癌化合物と組み合わせて含む、または毒素とコンジュゲートされた組成物、特定の癌の予防および／または治療のためのその使用を含む。
【０００２】
一般に、モノクローナル抗体の製造のために選択される基準は、可能性のある治療標的として特定された免疫原の認識である。実際には、マウスを免疫原に相当する組換えタンパク質で免疫し、マウスによって産生されたモノクローナル抗体を回収した後、それらをまず、免疫原を特異的に認識するそれらの能力に関してスクリーニングする。第二の工程で、このようにして選択された抗体を、それらの活性ならびにそれらの特性および／または作用機序を決定するためにイン・ビボおよびイン・ビトロで試験する。
【０００３】
この「伝統的な」アプローチは、最初から機能する標的を知ることができるとしても、多くの場合、所与の標識を確かに特異的に認識し得るが、イン・ビボにおいて有意な生物活性を示さない多数の抗体を生じる。癌の分野では、抗体がイン・ビトロで良い結果を生じるとしても、このような抗体はその後、イン・ビボで本当の抗体活性を示すことを必ずしも意味するのではないということが実際に知られている。
【０００４】
本発明は「機能的」アプローチ、より詳しくは認識される抗原ではなく、抗体に求められる機能に基づく一次スクリーニングを基にしていることから、先行するこのようなものとは異なり、上述に背反さえする。
【０００５】
より詳しくは、本発明者らは、抗体選択パラメーターとして、ある機能、すなわち、細胞の基本増殖（誘導型のものではない）の阻害を選択した。
【０００６】
用いる生産法は以下の実施例でさらに詳しく記載する。
【０００７】
驚くべきことに、この機能的アプローチにより、発明者らはイン・ビトロおよび／またはイン・ビボにおいて腫瘍細胞の増殖を有意に阻害可能な抗体を作製および選択した。
【０００８】
第一の態様によれば、本発明はイン・ビトロおよび／またはイン・ビボにおいて腫瘍細胞の増殖を阻害可能な単離された抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントに関し、該抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、配列番号１、２、３、４、５もしくは６の配列の相補性決定領域（ＣＤＲ）の中から選択される少なくとも１つのＣＤＲ、またはその配列が最適なアライメントの後に配列番号１、２、３、４、５もしくは６の配列と少なくとも８０％、好ましくは、８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む。
【０００９】
抗体の「機能的フラグメント」とは、特に、フラグメントＦｖ、ｓｃＦｖ（ｓｃ＝単鎖）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ−Ｆｃもしくはダイアボディー、またはその半減期が延長されているいずれかのフラグメントなどの抗体フラグメントを意味する。このような機能的フラグメントは本明細書の後段で詳細に記載される。
【００１０】
抗体の「誘導化合物」はペプチドスキャフォールド（scaffold）と、その被認識力を保存するために元の抗体の少なくとも１つのＣＤＲとからなる結合タンパク質を意味する。当業者に公知のこのような誘導化合物は本明細書の後段で詳細に記載される。
【００１１】
より好ましくは、本発明は、本発明の抗体、それらの誘導化合物またはそれらの機能的フラグメント、特に、遺伝子組換えまたは化学合成によって得られたキメラまたはヒト化抗体を含む。
【００１２】
好ましい実施形態によれば、本発明の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントはモノクローナル抗体からなることを特徴とする。
【００１３】
「モノクローナル抗体」は、ほぼ均質な抗体集団から得られる抗体を意味するものと理解される。より詳しくは、集団の個々の抗体は、最小の比率で見られる可能性のある少数の天然突然変異以外は同一である。言い換えれば、モノクローナル抗体は単細胞クローン（例えば、ハイブリドーマ、均質な抗体をコードするＤＮＡ分子でトランスフェクトされた真核生物宿主細胞、均質な抗体をコードするＤＮＡ分子でトランスフェクトされた原核生物宿主細胞など）の増殖から生じる均質な抗体からなり、一般に、１つ、および１つのクラス、またサブクラスのみの重鎖と一種のみの軽鎖を特徴とする。モノクローナル抗体は極めて特異的であり、単一の抗原に向けられる。さらに、一般に、種々の決定基またはエピトープに対する種々の抗体を含むポリクローナル抗体の調製とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原の単一のエピトープに向けられる。
【００１４】
ここで、本発明は天然型の抗体に関するのではなく、すなわち、それらは天然環境から採取されたものではないが、天然源からの精製により単離または取得されたか、あるいは遺伝子組み換えまたは化学合成によって取得され、従って、それらは後述されるように非天然アミノ酸を有し得ると理解すべきである。
【００１５】
より詳しくは、本発明の好ましい実施形態によれば、該抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、配列番号１、３もしくは５のアミノ酸配列のＣＤＲの中から選択される少なくとも１つのＣＤＲ、またはその配列が最適なアライメントの後に配列番号１、３もしくは５の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる軽鎖を含むか、あるいは配列番号２、４もしくは６のアミノ酸配列のＣＤＲの中から選択される少なくとも１つのＣＤＲ、またはその配列が最適なアライメントの後に配列番号２、４もしくは６の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる重鎖を含んでなることを特徴とする。
【００１６】
より詳しくは、本発明の抗体、またはそれらの誘導化合物もしくは機能的フラグメントの１つは、配列番号２、４および６の配列の３つのＣＤＲのうち少なくとも１つ、または最適なアライメントの後に配列番号２、４もしくは６の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する少なくとも１つの配列を含んでなる重鎖を含んでなることを特徴とする。
【００１７】
さらにより好ましくは、本発明の抗体、またはそれらの誘導化合物もしくは機能的フラグメントの１つは、それぞれＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３の下記の３つのＣＤＲ：
ＣＤＲ−Ｈ１は、配列番号２、７もしくは９の配列、または最適なアライメントの後に配列番号２、７もしくは９の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなり、
ＣＤＲ−Ｈ２は、配列番号４もしくは１１の配列、または最適なアライメントの後に配列番号４もしくは１１の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなり；かつ
ＣＤＲ−Ｈ３は、配列番号６もしくは１２の配列、または最適なアライメントの後に配列番号６もしくは１２の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる
を含んでなる重鎖を含んでなることを特徴とする。
【００１８】
特定の実施形態によれば、抗体、またはそれらの誘導化合物もしくは機能的フラグメントの１つは、配列番号７の配列のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４の配列のＣＤＲ−Ｈ２および配列番号１２の配列のＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖を含んでなることを特徴とする。
【００１９】
別の特定の実施形態によれば、抗体、またはそれらの誘導化合物もしくは機能的フラグメントの１つは、配列番号９の配列のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１１の配列のＣＤＲ−Ｈ２および配列番号６の配列のＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖を含んでなることを特徴とする。
【００２０】
別の実施形態によれば、本発明の抗体、またはそれらの誘導化合物もしくは機能的フラグメントの１つは、配列番号１、３および５の３つのＣＤＲのうち少なくとも１つ、または最適なアライメントの後に配列番号１、３もしくは５の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する少なくとも１つの配列を含んでなる軽鎖を含んでなることを特徴とする。
【００２１】
好ましい様式では、本発明の抗体、またはそれらの誘導化合物もしくは機能的フラグメントの１つは、それぞれＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３の下記の３つのＣＤＲ：
ＣＤＲ−Ｌ１は、配列番号１もしくは８の配列、または最適なアライメントの後に配列番号１もしくは８の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなり；
ＣＤＲ−Ｌ２は、配列番号３もしくは１０の配列、または最適なアライメントの後に配列番号３もしくは１０の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなり；かつ
ＣＤＲ−Ｌ３は、配列番号５の配列、または最適なアライメントの後に配列番号５の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる
を含んでなる軽鎖を含んでなることを特徴とする。
【００２２】
特定の実施形態によれば、抗体、またはそれらの誘導化合物もしくは機能的フラグメントの１つは、配列番号１の配列のＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３の配列のＣＤＲ−Ｌ２および配列番号５の配列のＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖を含んでなることを特徴とする。
【００２３】
別の特定の実施形態によれば、抗体、またはそれらの誘導化合物もしくは機能的フラグメントの１つは、配列番号８の配列のＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１０の配列のＣＤＲ−Ｌ２および配列番号５の配列のＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖を含んでなることを特徴とする。
【００２４】
本明細書において「ポリペプチド」、「ポリペプチド配列」、「ペプチド」および「抗体化合物またはそれらの配列と結合しているタンパク質」は互換的なものである。
【００２５】
ここで、本発明は天然型の抗体に関するのではなく、すなわち、それらは天然環境から採取されたものではないが、天然源からの精製により単離または取得されたか、あるいは遺伝子組み換えまたは化学合成によって取得され、従って、それらは後述されるように非天然アミノ酸を有し得ると理解すべきである。
【００２６】
第一の実施形態において、相補性決定領域、またはＣＤＲは、Kabat et al. (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991およびその後続版)により定義されているような免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の超可変領域を意味する。３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲがある。ここで、「ＣＤＲ」とは、抗原または抗体が認識するエピトープに対する抗体の結合親和性を担うアミノ酸残基の大部分を含む領域の、場合によって１以上またはさらには総てを示すために用いる。
【００２７】
第二の実施形態において、ＣＤＲ領域またはＣＤＲとは、ＩＭＧＴによって定義されているような免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の超可変領域を示すものとする。
【００２８】
ＩＭＧＴユニークナンバリングは、抗原受容体、鎖のタイプまたは種が何であれ、可変ドメインに匹敵すると定義されている[Lefranc M. -P., Immunology Today 18, 509 (1997) / Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999) / Lefranc, M.-P., Pommie, C, Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V.およびLefranc, Dev. Comp. Immunol, 27, 55-77 (2003)]。ＩＭＧＴユニークナンバリングでは、例えば、システイン２３（１ｓｔ−ＣＹＳ）、トリプトファン４１（ＣＯＮＳＥＲＶＥＤ−ＴＲＰ）、疎水性アミノ酸８９、システイン１０４（２ｎｄ−ＣＹＳ）、フェニルアラニンまたはトリプトファン１１８（Ｊ−ＰＨＥまたはＪ−ＴＲＰ）など、保存されているアミノ酸は常に同じ位置を有する。ＩＭＧＴユニークナンバリングは、フレームワーク領域（ＦＲ１−ＩＭＧＴ：１〜２６番、ＦＲ２−ＩＭＧＴ：３９〜５５番、ＦＲ３−ＩＭＧＴ：６６〜１０４番、ＦＲ４−ＩＭＧＴ：１１８〜１２８番）および相補性決定領域：ＣＤＲ１−ＩＭＧＴ：２７〜３８番、ＣＤＲ２−ＩＭＧＴ：５６〜６５番、ＣＤＲ３−ＩＭＧＴ：１０５〜１１７番の標準化された範囲をもたらす。ギャップは占有されていない位置を表すので、ＣＤＲ−ＩＭＧＴ長（例えば［８．８．１３］など、括弧で示され、ドットで区切られたもの）は重要な情報となる。ＩＭＧＴユニークナンバリングは、IMGT Colliers de Perles [Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002) / Kaas, Q. and Lefranc, M.-P., Current Bioinformaticws, 2, 21-30 (2007)]として示される２Ｄグラフ表示およびIMGT/3Dstructure-DB [Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)]における３Ｄ構造で用いられる。
【００２９】
３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲが存在する。ＣＤＲとは、ここでは、抗原または抗体が認識するエピトープに対する抗体の親和性によって結合を担うアミノ酸残基の大部分を含むこれらの領域の、場合によって、１つまたはこれらの領域のいくつかもしくはさらには総てを示すために用いられる。
【００３０】
より明解にするため、以下の記載において、より詳しくは、表２および３において、ＣＤＲはＩＭＧＴナンバリング、ｋａｂａｔナンバリングおよび共通ナンバリングにより定義される。
【００３１】
共通ナンバリングは、ＩＭＧＴナンバリングシステムおよびＫａｂａｔナンバリングシステムにより定義されるようなＣＤＲに共通の各ＣＤＲの残基部分を再編成する。
【００３２】
ＩＭＧＴナンバリングシステムは、上記で定義されたようなＩＭＧＴシステムに従ってＣＤＲを定義し、ｋａｂａｔナンバリングシステムは、上記で定義されたようなｋａｂａｔシステムに従ってＣＤＲを定義する。
【００３３】
より詳しくは、ＣＤＲ−Ｌ１は、共通ナンバリングシステムとＩＭＧＴナンバリングシステムでは配列番号１（ＱＤＩＮＮＹ）であり、ｋａｂａｔナンバリングシステムでは配列番号８（ＫＡＳＱＤＩＮＮＹＩＡ）である。
【００３４】
ＣＤＲ−Ｌ２に関しては、共通ナンバリングシステムとＩＭＧＴナンバリングシステムでは配列番号３（ＹＴＳ）であり、ｋａｂａｔナンバリングシステムでは配列番号１０（ＹＴＳＴＬＱＡ）である。
【００３５】
ＣＤＲ−Ｌ３は、３つの各ナンバリングシステムで配列番号５（ＬＱＹＤＮＬＷＴ）である。
重鎖に関しては、ＣＤＲ−Ｈ１は、共通ナンバリングシステムでは配列番号２（ＴＤＹＳ）であり、ＩＭＧＴナンバリングシステムでは配列番号７（ＧＹＳＦＴＤＹＳ）であり、ｋａｂａｔナンバリングシステムでは配列番号９（ＴＤＹＳＭＹ）である。
【００３６】
ＣＤＲ−Ｈ２は、共通ナンバリングシステムとＩＭＧＴナンバリングシステムでは配列番号４（ＩＤＰＹＮＧＧＴ）であり、ｋａｂａｔナンバリングシステムでは配列番号１１（ＹＩＤＰＹＮＧＧＴＲＹＮＱＫＦＫＧ）である。
【００３７】
最後に、ＣＤＲ−Ｈ３は、共通ナンバリングシステムとｋａｂａｔナンバリングシステムでは配列番号６（ＱＴＤＹＦＤＹ）であり、ＩＭＧＴナンバリングシステムでは配列番号１２（ＡＲＱＴＤＹＦＤＹ）である。
【００３８】
本発明の意味において、２配列の核酸またはアミノ酸間の「同一性％」は、最適なアライメントの後に得られる、比較する２配列間で同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基のパーセンテージを意味し、このパーセンテージは単に統計的なものであり、２配列間の違いはそれらの長さに添ってランダムに分布している。２つの核酸またはアミノ酸配列の比較は従来、それらを最適にアラインした後にそれらの配列を比較することにより行われ、この比較はセグメントで行うこともできるし、あるいは「アライメントウインドウ」を用いて行うこともできる。比較のための配列の最適なアライメントは、手による比較の他、Smith and Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2:482]のローカルホモロジーアルゴリズムの手段、Neddleman and Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48:443]のローカルホモロジーアルゴリズムの手段、Pearson and Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444]の類似性検索法の手段、またはこれらのアルゴリズムを用いたコンピューターソフトウエア（the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡまたは匹敵するソフトウエアＢＬＡＳＴ  ＮＲもしくはＢＬＡＳＴ  Ｐによる）の手段によって行うことができる。
【００３９】
２つの核酸またはアミノ酸配列間の同一性％は２つの最適にアラインされた配列を比較することによって求められ、比較する核酸またはアミノ酸配列はその２配列間の最適なアライメントのための参照配列と比較して付加または欠失を有する可能性がある。同一性％は、その２配列間でアミノ酸、ヌクレオチドまたは残基が同じである位置の数を求め、そのアライメントウインドウにおいて、同一の位置の数を位置の総数で割り、その結果に１００を掛けて２配列間の同一性％を得ることで算出される。
【００４０】
例えば、サイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.htmlで入手可能なＢＬＡＳＴプログラム「BLAST 2 sequences」(Tatusova et al, "Blast 2 sequences- a new tool for comparing protein and nuclotide sequences", FEMS Microbiol, 1999, Lett. 174:247-250)を、デフォルトパラメーター（特にパラメーターとしては、「オープンギャップペナルティー」：５および「エクステンションギャップペナルティー」：２；選択マトリックスは、例えばプログラムにより提案された「ＢＬＯＳＵＭ  ６２」マトリックスである）とともに用いることができ、比較する２配列間の同一性％はそのプログラムによって直接算出される。
【００４１】
参照アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示すアミノ酸配列では、好ましい例は、参照配列、特定の修飾、特に、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、付加または置換、末端切断または延長を含むものが挙げられる。１以上の保存的または非保存的アミノ酸の置換の場合、置換は置換されるアミノ酸が「等価な」アミノ酸に置き換えられることが好ましい。ここで、「等価なアミノ酸」とは、対応する抗体の生物活性を改変することなく構造アミノ酸の、また、以下に定義される特定の例の１つに置換され得るいずれのアミノ酸も示すものとする。
【００４２】
等価なアミノ酸は、それらが置換されるアミノ酸との構造的相同性か、または生成され得る種々の抗体間の生物活性の比較試験の結果のいずれかに基づいて決定することができる。
【００４３】
限定されない例としては、下表１は、対応する修飾抗体の生物活性の有意な改変をもたらさずに実施可能な可能性のある置換をまとめたものであり、逆の置換も同じ条件で本来可能である。
【表１】
2010509931.tif 000002
【００４４】
当業者ならば、当技術分野の現状で、６つのＣＤＲ間で最も大きな変動（長さおよび組成）は３つの重鎖ＣＤＲ、より詳しくは、この重鎖のＣＤＲ−Ｈ３に見られることが分かるであろう。結果として、本発明の抗体またはそれらの誘導化合物もしくは機能的フラグメントの１つの、好ましい特徴的なＣＤＲは重鎖の３つのＣＤＲ、すなわち、それぞれ配列番号２、４および６の配列によりコードされているＣＤＲ、さらにより優先的には、配列番号６の配列によりコードされているＣＤＲ−Ｈ３に相当するＣＤＲである。
【００４５】
特定の実施形態において、本発明は、ネズミ抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントに関する。
【００４６】
本発明の別の実施形態は、下記の３つのＣＤＲ：
配列番号１の配列の、または最適なアライメントの後に配列番号１の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｌ１；
配列番号３の配列の、または最適なアライメントの後に配列番号３の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｌ２；および
配列番号５の配列の、または最適なアライメントの後に配列番号５の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｌ３
を含んでなる軽鎖と、下記の３つのＣＤＲ：
配列番号７の配列の、または最適なアライメントの後に配列番号７の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｈ１；
配列番号４の配列の、または最適なアライメントの後に配列番号４の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｈ２；および
配列番号１２の配列の、または最適なアライメントの後に配列番号１２の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｈ３
を含んでなる重鎖とを含んでなる、抗体またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントを開示する。
【００４７】
本発明のさらに別の実施形態は、下記の３つのＣＤＲ：
配列番号８の配列の、または最適なアライメントの後に配列番号８の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｌ１；
配列番号１０の配列の、または最適なアライメントの後に配列番号１０の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｌ２；および
配列番号５の配列の、または最適なアライメントの後に配列番号５の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｌ３
を含んでなる軽鎖と、下記の３つのＣＤＲ：
配列番号９の配列の、または最適なアライメントの後に配列番号９の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｈ１；
配列番号１１の配列の、または最適なアライメントの後に配列番号１１の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｈ２：および
配列番号６の配列の、または最適なアライメントの後に配列番号６の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｈ３
を含んでなる重鎖とを含んでなる、抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントを開示する。
【００４８】
さらに別の実施形態によれば、本発明の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、配列番号１３のアミノ酸配列、または最適なアライメントの後に配列番号１３の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列を含んでなる軽鎖配列を含んでなること；かつ、配列番号１４の配列、または最適なアライメントの後に配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列を含んでなる重鎖配列を含んでなることを特徴とする。
【００４９】
また、配列番号１７のアミノ酸配列、または最適なアライメントの後に配列番号１７の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる軽鎖配列を含んでなり、かつ、配列番号１８もしくは１９のアミノ酸配列、または最適なアライメントの後に配列番号１８もしくは１９の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる重鎖配列を含んでなることを特徴とする、ヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントも開示される。
【００５０】
すぐ上に示したように、本発明はまた、本発明に記載されるような抗体から誘導された化合物に関する。より詳しくは、本発明の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、該誘導化合物が初期抗体のパラトープ認識特性の総てまたは一部が保存されるように少なくとも１つのＣＤＲがグラフトされたペプチドスキャフォールドを含んでなる結合タンパク質であることを特徴とする。
【００５１】
本明細書に記載されている６つのＣＤＲ配列のうち１以上の配列は、種々の免疫グロブリンタンパク質スキャフォールド上にも存在し得る。この場合、このタンパク質配列はグラフトされるＣＤＲの折りたたみに都合のよいペプチド骨格を再生することができ、それらのパラトープ抗原認識特性を保存することが可能である。
【００５２】
一般に、当業者ならば、元の抗体に由来する少なくとも１つのＣＤＲをグラフトするためのタンパク質スキャフォールドの種類をどのようにして決定すればよいかを知っている。
【００５３】
より詳しくは、このようなスキャフォールドを選択するには、次のような判定基準の最大数を見たさなければならないことが知られている(Skerra A., J. Mol. Recogn., 2000, 13:167-187)。
・系統発生的保存が良好なこと
・三次元構造が既知であること（例えば、結晶学、ＮＭＲ分光法または当業者に公知の他のいずれかの技術による）
・サイズが小さいこと
・転写後修飾が少ないか無いこと、および／または
・産生、発現および精製が容易なこと
【００５４】
このようなタンパク質スキャフォールドの起源は、限定されるものではないが、フィブロネクチンおよび優先的にはフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン１０、リポカリン、アンチカリン(Skerra A., J. Biotechnol., 2001, 74(4):257-75)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)のＡタンパク質のドメインＢに由来するＺタンパク質、チオレドキシンＡ、または「アンキリンリピート」(Kohl et al, PNAS, 2003, vol. 100, No. 4, 1700-1705)、「アルマジロリピート」、「ロイシンリッチリピート」および「テトラトリコペプチドリピート」などの繰り返しモチーフを有するタンパク質の中から選択される構造であり得る。
【００５５】
例えば、サソリ、昆虫、植物、軟体動物などに由来する毒素のような毒素に由来するスキャフォールド、およびニューロンＮＯシンターゼのタンパク質阻害剤（ＰＩＮ）も挙げるべきである。
【００５６】
限定されるものではないが、このようなハイブリッド構築の例としては、ＰＩＮのループの１つにおける抗ＣＤ４抗体、すなわち、１３Ｂ８．２のＣＤＲ−Ｈ１（重鎖）の挿入があり、このようにして得られた新たな結合タンパク質は元の抗体と同じ結合特性を保存している(Bes et al, Biochem. Biophys. Res. Commun., 2006, 343(1), 334-344)。単に例として、ネオカルジノスタチンのループの１つに抗リゾチームＶＨＨ抗体のＣＤＲ−Ｈ３（重鎖）をグラフトすることも挙げられる(Nicaise et al, Protein Science, 2004, 13(7):1882-1891)。
【００５７】
最後に、上記のように、このようなペプチドスキャフォールドは元の抗体に由来する１〜６つのＣＤＲを含み得る。好ましくは、必ずしも必要ではないが、当業者は重鎖由来の少なくとも１つのＣＤＲを選択し、それは抗体の特異性を主として担うことが知られている。１以上の適切なＣＤＲの選択は当業者には自明であり、次に、好適な既知の技術を選択することができる(Bes et al, FEBS letters 508, 2001, 67-74)。
【００５８】
本発明の特定の態様は、本発明の抗体から誘導された化合物を選択するための方法に関し、該誘導化合物はイン・ビトロおよび／またはイン・ビボで腫瘍細胞の増殖を阻害することができ、また、該誘導化合物は、少なくとも１つの抗体ＣＤＲがグラフトされるペプチドスキャフォールドを含んでなり、その方法は下記の工程：
ａ）イン・ビトロにおいて、少なくとも１つの抗体ＣＤＲがグラフトされたペプチドスキャフォールドからなる化合物を、増殖可能な腫瘍細胞を含む生体サンプルと接触させて、これらの細胞が増殖可能な条件下に置くこと；および
ｂ）その化合物がこれらの腫瘍細胞の増殖を阻害することができれば、その化合物を選択することを特徴とし、また、該少なくとも１つのグラフトされたＣＤＲが下記のＣＤＲ：
配列番号１、８の配列の、または最適なアライメントの後に配列番号１、８の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ；
配列番号３、１０の配列の、または最適なアライメントの後に配列番号３、１０の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ；
配列番号５の配列の、または最適なアライメントの後に配列番号５の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ；
配列番号２、７、９の配列の、または最適なアライメントの後に配列番号２、７、９の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ；
配列番号４、１１の配列の、または最適なアライメントの後に配列番号４、１１の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ；および
配列番号６、１２の配列の、または最適なアライメントの後に配列番号６、１２の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ
の中から選択されることを特徴とする。
【００５９】
好ましい様式によれば、その方法は、工程ａ）において、イン・ビトロにおいて少なくとも２つまたは３つの抗体ＣＤＲがグラフトされているペプチドスキャフォールドを含んでなる化合物を接触させることを含み得る。
【００６０】
この方法のさらにより好ましい様式によれば、ペプチドスキャフォールドは、その構造が上述されたスキャフォールドまたは結合タンパク質の中から選択される。
【００６１】
明らかにこれらの例は何ら限定されるものではなく、当業者に既知または自明の他のいずれの構造も本特許出願により付与される保護に包含されるものとみなされるべきである。
【００６２】
よって、本発明は、ペプチドスキャフォールドが、ａ）系統発生的によく保存されており、ｂ）強固な構造であり、ｃ）周知の三次元分子構成を有し、ｄ）サイズが小さく、および／またはｅ）安定性を改変することなく欠失および／または挿入により改変可能な領域を含んでなるタンパク質の中から選択されることを特徴とする抗体またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントに関する。
【００６３】
好ましい実施形態によれば、本発明の抗体またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、該ペプチドスキャフォールドが、ｉ）フィブロネクチン、優先的にはフィブロネクチン３型ドメイン１０、リポカリン、アンチカリン、黄色ブドウ球菌のＡタンパク質のドメインＢに由来すＺタンパク質、チオレドキシンＡ、または「アンキリンリピート」(Kohl et al, PNAS, 2003, vol. 100, No. 4, 1700-1705)、「アルマジロリピート」、「ロイシンリッチリピート」および「テトラトリコペプチドリピート」などの繰り返しモチーフを有するタンパク質、またはｉｉｉ）ニューロンＮＯシンターゼのタンパク質阻害剤（ＰＩＮ）の中から選択されることを特徴とする。
【００６４】
本発明の別の態様は上記の抗体の機能的フラグメントに関する。
【００６５】
より詳しくは、本発明は、該機能的フラグメントがフラグメントＦｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃおよびダイアボディー、またはＰＥＧ化フラグメントなどの半減期が延長されているいずれかのフラグメントの中から選択されることを特徴とする抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントを対象とする。
【００６６】
本発明の抗体のこのような機能的フラグメントは、例えば、フラグメントＦｖ、ｓｃＦｖ（ｓｃ＝単鎖）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ−Ｆｃもしくはダイアボディー、またはポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコールの付加（ペグ化）（ＰＥＧ化フラグメントはＦｖ−ＰＥＧ、ｓｃＦｖ−ＰＥＧ、Ｆａｂ−ＰＥＧ、Ｆ（ａｂ’）２−ＰＥＧおよびＦａｂ’−ＰＥＧと呼ばれる）などの化学修飾により、あるいはリポソーム、マイクロスフェアまたはＰＬＧＡの組み込みによりその半減期が延長されているいずれかフラグメントであり、該フラグメントは、一般的な様式で、それが由来する抗体の活性（部分的なものであっても）を著しく示し得る本発明の特徴的なＣＤＲの少なくとも１つを有する。
【００６７】
好ましくは、該機能的フラグメントは、それらが由来する抗体の可変重鎖または軽鎖の部分配列を含んでなる、または含み、該部分配列は、それが由来する抗体と同じ結合特異性、および十分な親和性、好ましくは、それが由来する抗体の親和性の少なくとも１／１００相当、より好ましくは少なくとも１／１０を保持するに十分なものである。
【００６８】
このような機能的フラグメントは、それが由来する抗体の配列の少なくとも５つのアミノ酸、好ましくは６、７、８、１０、１５、２５、５０または１００の連続するアミノ酸を含む。
【００６９】
好ましくは、これらの機能的フラグメントは、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）、ｓｃＦｖ−Ｆｃまたはダイアボディータイプのものであり、これらは一般に、それらが由来する抗体と同じ結合親和性を有する。本発明によれば、本発明の抗体のフラグメントは上記の抗体から、ペプシンまたはパパインを含む酵素消化などの方法により、および／または化学的還元によるジスルフィド橋の切断により得ることができる。これらの抗体フラグメントはまた、これもまた当業者に公知の組換え遺伝学技術により、または例えばApplied BioSystemsなどによって販売されているものなどの自動ペプチド合成装置の手段によるペプチド合成によって得ることもできる。
【００７０】
本発明はまた、該抗体がネズミ抗体であること、および配列番号１５のアミノ酸配列の、または最適なアライメントの後に配列番号１５の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列の軽鎖と、配列番号１６のアミノ酸配列の、または最適なアライメントの後に配列番号１６の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列の重鎖とを含んでなることを特徴とする、始原ネズミ抗体、すなわち、本発明の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントを対象とする。
【００７１】
より明確にするため、下表２は本発明の抗体に相当する種々のアミノ酸配列をまとめたものである。
【表２】
2010509931.tif 000003
【００７２】
本発明の別の特定の態様は、抗体がまた、マウスとは異種、すなわちヒトの抗体に由来する軽鎖および重鎖定常領域も含むことを特徴とする、キメラ抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントに関する。
【００７３】
本発明のさらに別の特定の態様は、ヒト抗体に由来する軽鎖および重鎖の定常領域がそれぞれλまたはκ領域およびγ−１、γ−２またはγ−４領域であることを特徴とする、ヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントに関する。
【００７４】
別の態様によれば、本発明は、本発明のモノクローナル抗体を分泌し得るネズミハイブリドーマ、特に、２００６年７月６日にＩ−３６４６番としてフランスの微生物培養に関するセンター(CNCM, Pasteur Institute, Paris）に提出されたネズミ起源のハイブリドーマに関する。該ハイブリドーマはＢａｌｂ／Ｃ免疫マウス脾細胞と骨髄腫Ｓｐ  ２／Ｏ−Ａｇ  １４系統の細胞との融合によって得られたものである。
【００７５】
抗体が２００６年７月４日にＩ−３６４６番としてＣＮＣＭに提出されたハイブリドーマにより分泌されることを特徴とするモノクローナル抗体（ここでは６Ｆ４と呼ぶ）、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは明らかに本発明の一部をなす。
【００７６】
本発明の抗体はまた、キメラまたはヒト化抗体も含む。
【００７７】
キメラ抗体は、ある種の抗体に由来する天然可変領域（軽鎖および重鎖）をその種とは異種の抗体の軽鎖および重鎖の定常領域と組み合わせて含むものである。
【００７８】
抗体またはそのキメラフラグメントは組換え遺伝学の技術を用いて作製することができる。例えば、キメラ抗体は、プロモーターと、本発明の非ヒト、特にネズミのモノクローナル抗体の可変領域をコードする配列とヒト抗体定常領域をコードする配列を含む組換えＤＮＡをクローニングすることにより作製することができた。このようなある組換え遺伝子によりコードされている本発明のキメラ抗体は例えばマウス−ヒトキメラであってよく、この抗体の特異性はネズミＤＮＡに由来する可変領域により決定され、そのイソ型はヒトＤＮＡに由来する定常領域により決定される。キメラ抗体の作製方法については、Verhoeyn et al. (BioEssays, 8:74, 1988)を参照。
【００７９】
「ヒト化抗体」とは、非ヒト起源の抗体に由来するＣＤＲ領域を含むが、その抗体分子の他の部分は１つの（またはいくつかの）ヒト抗体に由来している抗体を意味する。さらに、その骨格セグメント残基（ＦＲと呼ばれる）のいくつかは結合親和性を保持するために改変可能である(Jones et al. , Nature, 321 :522-525, 1986; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988; Riechmann et al., Nature, 332:323-327, 1988)。
【００８０】
本発明のヒト化抗体またはそのフラグメントは、当業者に公知の技術によって作製することができる（例えば、文献Singer et al., J. Immun., 150:2844-2857, 1992; Mountain et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10:1-142, 1992;およびBebbington et al, Bio/Technology, 10:169-175, 1992に記載されているものなど）。このようなヒト化抗体はin vitroにおける診断またはin vivoにおける予防処置および／もしくは治療処置を含む方法におけるそれらの使用に好ましい。例えば、ＰＤＬにより特許ＥＰ０４５１２６１、ＥＰ０６８２０４０、ＥＰ０９３９１２７、ＥＰ０５６６６４７またはＵＳ５，５３０，１０１、ＵＳ６，１８０，３７０、ＵＳ５，５８５，０８９およびＵＳ５，６９３，７６１に記載されている「ＣＤＲグラフト」技術などの他のヒト化技術も当業者に知られている。米国特許第５，６３９，６４１号または同第６，０５４，２９７号、同第５，８８６，１５２号および同第５，８７７，２９３号も挙げられる。
【００８１】
さらに、本発明はまた、上記のネズミ抗体に由来するヒト化抗体に関する。
【００８２】
より詳しくは、６Ｆ４抗体のためのヒト化法は、軽鎖および重鎖に関してそれぞれ実施例２および３に詳細に記載されている。
【００８３】
好ましい様式では、ヒト抗体に由来する軽鎖および重鎖の定常領域はそれぞれλまたはκおよびγ−１、γ−２またはγ−４領域である。
【００８４】
ＩｇＧ１イソ型ＩｇＧ１に相当する実施形態では、その抗体のさらなる特徴は、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）などのエフェクター機能を示すことである。
【００８５】
本発明の別の態様では、出願者らはまた、本発明の抗体によって認識される抗原を同定した。
【００８６】
これを果たすために用いられる方法は下表４に詳細に記載されている。
【００８７】
ＪＡＭ−Ａは免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）に属す膜タンパク質であり、それは結合部接着分子（ＪＡＭ）ファミリーに属する。ヒトでは、このＪＡＭファミリーは、ＪＡＭ−Ａ、ＪＡＭ−Ｂ、ＪＡＭ−Ｃ、Ａ３３およびＡ３４タンパク質をはじめとするいくつかのメンバーを含んでなる。ＪＡＭファミリーのメンバーのうち、ＪＡＭ−ＡはＪＡＭ−ＢおよびＪＡＭ−Ｃと最も高い相同性を有し、アミノ酸ではおよそ３５％の配列同一性、そしてこれら２つのタンパク質と４５％の類似性を有する。ＪＡＭ−Ａタンパク質はまた、ＪＡＭ  Ａ、Ｆ１１Ｒ、Ｆ１１受容体、ＪＡＭ−１、ＪＡＭ  １、ＰＡＭ−１またはＣＤ３２１とも呼ばれる。
【００８８】
細胞外領域の長さで異なるＪＡＭ−Ａ前駆体の２つのイソ型は、
イソ型ａ：２９９アミノ酸（配列番号６１）
イソ型ｂ：２５９アミノ酸（配列番号６３）
と確認されている。
【００８９】
これら２つのイソ型のヌクレオチド配列は、イソ型ａについては配列番号６２で、イソ型ｂについては配列番号６４で表される。
【００９０】
ヒト細胞の表面で発現されるタンパク質は、細胞内Ｃ末端ドメイン、１回膜貫通ドメイン（２１アミノ酸）および２つの「Ｉｇ様」ドメインを含むＮ末端細胞外領域を有する単一のポリペプチド鎖を有する。
【００９１】
ＪＡＭ−Ａは、Ｎ−グリコシル化部位、イソ型ａでは１８５番に、そしてイソ型ｂでは１４５番にＡｓｎ残基、および１つはＩｇＮ末端ドメインの５０番と１０９番のＣｙｓ残基の間、もう１つは第二のＩｇドメインの１５３番と２１２番のＣｙｓ残基の間に２つのジスルフィド橋を有する。
【００９２】
２つの細胞外Ｉｇ様ドメインの存在は結晶学によって確認された(Kostrewa et al, 2001, EMBO J. 16:4391-4398; Prota et al, 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:5366-5371)。これら２つのドメインはトリペプチドリンカー（配列ＶＬＶ［１２７〜１２９］、イソ型Ａ）により接続されている。これらの構造研究ではまた、細胞外領域を含む細胞表面上での同種親和性相互作用におけるＪＡＭ−Ａの関連が確認され、組換え型において産生され、溶液中でホモ二量体を形成し得る(Bazzoni et al, 2000, J. Biol. Chem. 275:30970-30976)この領域も、これらの相互作用に関与するアミノ酸：Ａｒｇ  ５９、Ｇｌｕ  ６１、Ｌｙｓ  ６３、Ｌｅｕ  ７２、Ｔｙｒ  ７５、Ｍｅｔ  １１０、Ｇｌｕ  １１４、Ｔｙｒ  １１９およびＧｌｕ  １２１の同定を可能とする。トリペプチドＲＶＥ［５９〜６１］はＪＡＭファミリー内で比較的保存されており（ＪＡＭ−ＢではＲＬＥ、ＪＡＭ−ＣではＲＩＥ）、ホモ二量体形成の最小モチーフとなる(Kostrewa et al, 2001, EMBO J. 16:4391-4398)。
【００９３】
上皮細胞および内皮細胞では、ＪＡＭ−Ａは主として密着結合部で見られる(Liu et al, 2000, J. Cell Sci., 113:2363-2374)。この細胞質領域はＣ末端位にＩＩ型ＰＤＺドメイン（配列ＦＬＶ［２９８〜３００］、イソ型ａ、ＪＡＭ−Ａと、密着結合に関連する種々のサイトゾルタンパク質との相互作用を担う）を含み、また、ＺＯ−１、ＡＦ−６、ＭＵＰＰ−１およびＰＡＲ−３などのＰＤＺドメインも含む(Ebnet et al, 2000, J. Biol. Chem., 275:27979-27988; Itoh et al, 2001, J. Cell Biol, 154:491-498; Hamazaki et al, 2002, J. Biol. Chem., 277:455-461)。二量体形成に関与する領域［１１１〜１２３］に対するネズミ抗体、いわゆるＪ３Ｆ．１およびＪ１０．４抗体はイン・ビトロにおいてＪＡＭ−Ａのホモ二量体形成および上皮バリアの再構築を阻害し得る(Mandell et al, 2004, J. Biol. Chem., 279:16254-16262)。
【００９４】
ＪＡＭ−Ａはインテグリンαｖβ３と相互作用し、インテグリンαｖβ３のリガンドであるビトロネクチンへの内皮細胞の移動に関与する(Naik and Naik, 2005, J. Cell Sci. 119:490-499)。抗ＪＡＭ−Ａ抗体Ｊ３Ｆ．１は、抗αｖβ３抗体と同様に、in vitroにおいて内皮細胞の移動およびｂＦＧＦにより誘発される脈管形成を阻害する(Naik et al, 2003, Blood, 102:2108-2114)。内皮細胞において、種々のシグナル伝達経路が証明されている：ＭＡＰキナーゼ、ＰＩ３−キナーゼおよびＰＫＣ(Naik et Naik, 2005, J. Cell Sci., 119:490-499; Naik et al., 2003, Blood, 102:2108-2114; Naik et al., 2003, Artherioscler. Thromb. Vase. Biol, 23:2165-2171)。
【００９５】
ＪＡＭ−Ａはまた、単球、リンパ球、好中球および血小板でも発現される(Williams et al., 1999, Mol. Immunol, 36:1175-1188)。しかしながら、ＪＡＭ−Ａタンパク質は、当初は、血小板を活性することができ、それらの凝集を誘発することができる抗体であるＦ１１抗体の受容体として同定されていた(Naik et al., 1995, Biochem. J., 310:155-162; Sobocka et al., 2000, Blood, 95:2600-2609)。ペプチド［２８〜６０］および［９７〜１０９］はＦ１１抗体エピトープに属し、血小板の活性化と凝集現象ならびにホモ二量体形成に関与している(Babinska et al., 2002, Thromb. Haemost., 87:712-721)。
【００９６】
ネズミ型のＪＡＭ−Ａに対するラット抗体ＢＶ１１は、in vitroおよびin vivoで単球の経内皮移動を阻害する(Del Maschio et al., 1999, J. Exp. Med., 190:1351-1356)。Ostermannおよび共同研究者(2002, Nature Immunol., 3:151-158)は、ＪＡＭ−Ａが、抗炎症性応答の発達中にある種のケモカインに応答して過剰発現され、白血球の血管外遊出または炎症部位への移動に必要とされるαＬβ２またはＬＦＡ−１（リンパ球機能関連抗原１）インテグリンのリガンドであることを示した。ＪＡＭ−Ａは、第二のＩｇ様ドメインを介してＴリンパ球および好中球の接着および経内皮移動に寄与し(Ostermann et al., 2002, Nature Immunol, 3:151-158)、従って、炎症部位への白血球の補充に重要な役割を果たす。
【００９７】
ＪＡＭ−Ａタンパク質はまた、ウイルス感染現象にも関連付けられる。ＪＡＭ−Ａはまさに、付着タンパク質σ１と相互作用する手段によってある種の脳炎を担うウイルス、レオウイルスの受容体である(Barton et al., 2001, Cell 104:441-451)。抗ＪＡＭ−Ａ抗体Ｊ１０．４は、レオウイルスのＪＡＭ−Ａとの結合を阻害する(Forrest et al, 2003, J. Biol. Chem., 278:48434-48444)。
【００９８】
これまでに、ヒト型のＪＡＭ−Ａに対する上記の抗体でイン・ビボ活性を示したものはなく、抗腫瘍活性はずっと低い。このような抗体は研究手段としてのみ用いられている。よって、前者の技術分野では、イン・ビトロおよびイン・ビボで活性のある抗腫瘍抗体は本当に無いのである。
【００９９】
特定の態様によれば、本発明の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、ＪＡＭ−Ａタンパク質と特異的に結合できることを特徴とする（英名では「結合部接着分子」）。
【０１００】
さらに別の態様によれば、本発明の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、ＪＡＭ−Ａに対しておおよそ１ｎＭ〜おおよそ１ｐＭの間のＫＤを示すことを特徴とする。より好ましくは、このＪＡＭ−Ａに対するＫＤはおおよそ１０ｐＭ〜おおよそ４０ｐＭの間である。
【０１０１】
「ＫＤ」とは、ある抗体−抗原複合体の解離定数を示す。ＫＤ＝Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎ（Ｋｏｆｆは抗体−抗原複合体からの抗体が解離する「解離速度」定数であり、Ｋｏｎは抗体が抗原と結合するレベルである）(Chen Y. et al, 1999, J.Mol.Biol, 293:865-881)。
【０１０２】
本発明の新規な態様は、下記の核酸（いずれの縮重遺伝コードも含む）：
ａ）本発明の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントの１つをコードする核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡ；
ｂ）ａ）で定義された核酸と相補的な核酸；
ｃ）高ストリンジェント条件下で配列番号２０〜３１の核酸配列のＣＤＲの少なくとも１つと、または最適なアライメントの後に配列番号２０〜３１の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列とハイブリダイズし得る少なくとも１８ヌクレオチドの核酸；および
ｄ）高ストリンジェント条件下で少なくとも配列番号３２もしくは３６の核酸配列の軽鎖および／または配列番号３３、３７もしくは３８の核酸配列の重鎖と、あるいは最適なアライメントの後に配列番号３２もしくは３６および／または３３、３７もしくは３８の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列とハイブリダイズし得る少なくとも１８ヌクレオチドの核酸
の中から選択されることを特徴とする単離された核酸に関する。
【０１０３】
下表３は本発明の抗体に関する種々のヌクレオチド配列をまとめたものである。
【表３】
2010509931.tif 000004
【０１０４】
本明細書で互換的に用いられる「核酸」、「核配列」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」および「ヌクレオチド配列」とは、改変型であれ非改変型であれ、核酸のあるフラグメントまたは領域を定義し、非天然ヌクレオチドを含むまたは含まない、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡまたは該ＤＮＡの転写産物のいずれかである厳密なヌクレオチド配列を意味する。
【０１０５】
ここで、本発明はそれらの天然染色体環境、すなわち天然状態のヌクレオチド配列に関するものではないことにも触れておかなければならない。本発明の配列は単離および／または精製されたものであり、すなわち、それらは例えば複製により直接的または間接的にサンプリングされ、それらの環境は少なくとも部分的に改変されている。組換え遺伝学により、例えば宿主細胞の手段により得られた、または化学合成により得られた単離された核酸もここに挙げておくべきであろう。
【０１０６】
「最適なアライメントの後に好ましい配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性％を示す核配列」とは、参照核配列に対して、特に、欠失、末端切断、延長、キメラ融合および／または置換（特に、点によるもの）などのある種の改変を示す核配列を意味する。好ましくは、これらは参照配列と同じアミノ酸配列をコードする配列であり、これは遺伝コードの縮重、または参照配列と、好ましくは高ストリンジェント条件下（特に、以下に定義されるもの）で特異的にハイブリダイズし得る相補的配列に関連する。
【０１０７】
高ストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーションとは、温度およびイオン強度に関する条件が、２つの相補的ＤＮＡフラグメントの間でハイブリダイゼーションを維持させるように選択されることを意味する。単に例として、上記のポリヌクレオチドフラグメントを定義する目的でのハイブリダイゼーション工程の高ストリンジェント条件は有利には次の通りである。
【０１０８】
ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションは、２段階で行う：（１）４２℃で３時間、５Ｘ  ＳＳＣ（１Ｘ  ＳＳＣは０．１５Ｍ  ＮａＣｌ＋０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムの溶液に相当する）、５０％ホルムアミド、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１０Ｘデンハート溶液、５％デキストラン硫酸および１％サケ精子ＤＮＡを含有するリン酸バッファー（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）中でのプレハイブリダイゼーション；（２）プローブの長さに応じた温度（すなわち、プローブ＞１００ヌクレオチド長の場合は４２℃）で２０時間の予備ハイブリダイゼーションの後、２０℃で２０分、２Ｘ  ＳＳＣ＋２％ＳＤＳ中での洗浄２回、２０℃で２０分、０．１Ｘ  ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ中での洗浄１回。最後の洗浄は、０．１Ｘ  ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ中、プローブ＞１００ヌクレオチド長の場合は６０℃で３０分行う。定義された大きさのポリヌクレオチドに対する上記の高ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、当業者ならば、Sambrook, et al. (Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory; 3rd edition, 2001)に記載の手順に従って、より長いまたはより短いオリゴヌクレオチドのために適合させることができる。
【０１０９】
本発明はまた、本発明に記載されているような核酸を含んでなるベクターに関する。
【０１１０】
本発明は特に、このようなヌクレオチド配列を含むクローニングベクターおよび／または発現ベクターを対象とする。
【０１１１】
本発明のベクターは、好ましくは、ある宿主細胞においてヌクレオチド配列の発現および／または分泌を可能とするエレメントを含む。このように、ベクターはプロモーター、翻訳開始および終結シグナル、ならびに好適な転写調節領域を含まなければならない。それは宿主細胞において安定に維持され得るものでなければならず、所望により、翻訳されたタンパク質の分泌を指定する特異的シグナルを有してもよい。これら種々のエレメントは、当業者により、用いる宿主細胞に応じて選択および至適化される。この目的で、これらのヌクレオチド配列は選択された宿主内に自己複製ベクターにて挿入することもできるし、あるいは選択された宿主の組込型ベクターであってもよい。
【０１１２】
このようなベクターは、当業者により一般に用いられている方法によって作製され、得られたクローンは、リポフェクション、エレクトロポレーション、熱ショックまたは化学法などの標準的な方法によって好適な宿主へ導入することができる。
【０１１３】
これらのベクターは例えばプラスミドまたはウイルス起源のベクターである。それらは本発明のヌクレオチド配列をクローニングまたは発現させるために宿主細胞を形質転換するのに用いられる。
【０１１４】
本発明はまた、本発明に記載されているようなベクターにより形質転換された、または本発明に記載されているようなベクターを含んでなる宿主細胞を含む。
【０１１５】
宿主細胞は細菌細胞、例えば、限定されるものではないが酵母作用、または動物細胞、特に哺乳類細胞などの原核生物系または真核生物系の中から選択することができる。また、昆虫細胞または植物細胞も使用可能である。
【０１１６】
本発明はまた、本発明の形質転換細胞を有するヒト以外の動物に関する。
【０１１７】
本発明の別の態様は、本発明の抗体またはその機能的フラグメントの１つの製造方法に関し、その方法は下記の工程：
ａ）本発明の宿主細胞の培地で、本発明の宿主細胞に好適な培養条件にて培養すること；および
ｂ）このようにして培養培地から、または培養細胞から生産された抗体またはその機能的フラグメントの１つを回収すること
を含むことを特徴とする。
【０１１８】
本発明の形質転換細胞は本発明の組換えポリペプチドの製造方法に用いられるものである。本発明のベクターおよび／またはベクターにより形質転換された細胞を用いることを特徴とする、本発明のポリペプチドを組換え型で製造する方法もまた本発明に含まれる。好ましくは、本発明のベクターにより形質転換された細胞は、前記ポリペプチドの発現および前記組換えペプチドの回収を可能とする条件下で培養される。
【０１１９】
すでに述べたように、宿主細胞は原核生物系または真核生物系の中から選択することができる。このような原核生物系または真核生物系において分泌を促進する本発明のヌクレオチド配列を同定することができる。従って、このような配列を有する本発明のベクターは分泌させる組換えタンパク質の産生に有利に使用することができる。実際、着目するこれらの組換えタンパク質の精製は、宿主細胞内よりもむしろ細胞培養の上清中に存在するということで容易となる。
【０１２０】
本発明のポリペプチドはまた、化学合成によっても製造することができる。このような製造方法の１つも本発明の目的である。当業者ならば、固相技術（特に、Steward et al, 1984, Solid phase peptides synthesis, Pierce Chem. Company, Rockford, 111, 2nd ed.参照）または溶液中でのフラグメントの縮合もしくは慣例の合成による部分的固相技術などの化学合成法を知っている。化学合成法によって得られ、対応する非天然アミノ酸を含み得るポリペプチドも本発明に含まれる。
【０１２１】
本発明の方法によって取得され得る抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントも本発明に含まれる。
【０１２２】
さらに別の態様によれば、本発明は、さらにヒトチロシンキナーゼファミリー受容体と特異的に結合することができ、かつ／またはこのような受容体のチロシンキナーゼ活性を特異的に阻害することができることを、上記のような抗体に関する。
【０１２３】
新規な実施形態によれば、本発明は、例えば、ＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＨＥＲ２ｎｅｕ、ＨＧＦ、ｃＭＥＴ、ＦＧＦ、テトラスパニン、インテグリン、ＣＸＣＲ４またはＣＸＣＲ２など、腫瘍の発達に関連づけられている受容と相互作用し得る第二のモチーフを含むという意味で特異的である抗体からなる、抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントに関する。
【０１２４】
第一の実施形態によれば、このようなある抗体は二重特異性抗体からなり、ＥＧＦとヒト上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）との結合を特異的に阻害し、かつ／または該ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を特異的に阻害する第二のモチーフを含む。本発明のさらにより好ましい態様によれば、該第二の抗ＥＧＦＲモチーフはモノクローナル抗体セツキシマブ(cetuximab)（Ｃ２２５またはエルビタックス(erbitux)）、マツズマブ(matuzumab)、ｈｕＲ３、ＨｕＭａｘ−ＥＧＦＲまたはパニツマブ(panitumab)に由来する。
【０１２５】
第二の実施形態によれば、本発明の抗体は二重特異性抗体からなり、ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体により調節される活性を特異的に阻害し、かつ／または該ＥＲ２／ｎｅｕ受容体のチロシンキナーゼ活性を特異的に阻害する第二のモチーフを含む。より詳しくは、該第二の抗ＨＥＲ２／ｎｅｕモチーフは、マウスモノクローナル抗体４Ｄ５もしくは２Ｃ４またはヒト化抗体トラスツズマブ(trastuzumab)もしくはペルツズマブ(pertuzumab)に由来する。
【０１２６】
第三の実施形態によれば、本発明の抗体は二重特異性抗体からなり、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）とｃＭＥＴ受容体との結合を特異的に阻害し、かつ／または該ｃＭＥＴ受容体のチロシンキナーゼ活性を特異的に阻害する第二のモチーフを含む。
【０１２７】
第四の実施形態によれば、本発明の抗体は二重特異性抗体からなり、ＩＧＦ−１Ｒ受容体により調節される活性を特異的に阻害し、かつ／または該ＩＧＦ−１Ｒ受容体のチロシンキナーゼ活性を特異的に阻害する第二のモチーフを含む。より詳しくは、該第二の抗ＩＧＦ−１Ｒモチーフはマウスモノクローナル抗体７Ｃ１０、対応するヒト化抗体ｈ７Ｃ１０（Goetsch et al, 国際特許出願ＷＯ０３／０５９９５１）、ｈＥＭ１６４抗体(Maloney et al, Cancer Res., 2003, 63 (16):5073-5083)、Ａｂｇｅｎｉｘにより開発された抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体（米国特許出願第２００５／２８１８１２号参照）またはＭａｂ  ３９、１Ｈ７(Li et al, Cancer Immunol. Immunother., 2000, 49(4-5):243-252)または４Ｇ１１(Jackson-Booth et al, Horm. Metab. Res., 2003, 35(11-12):850-856)に由来する。
【０１２８】
最後に、第五の実施形態によれば、本発明の抗体は二重特異性抗体からなり、限定されない例として、ＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ（繊維芽細胞増殖因子）などの腫瘍発達に関連づけられているいずれかの受容体種、あるいはＣＸＣＲ２またはＣＸＣＲ４などのＣＸＣＲ（ケモカイン受容体）ファミリーのいずれかのメンバーと相互作用し得る第二のモチーフを含む。
【０１２９】
また、リツキシマブ、イブリツモマブ(ibritumomab)またはトシツモマブ(tositumomab)などの抗ＣＤ２０抗体；ゲムツズマブ(gemtuzumab)またはリンツズマブ(lintuzumab)などの抗ＣＤ３３抗体；エプラツズマブ(epratuzumab)などの抗ＣＤ２２抗体；アレムスズマブ(alemtuzumab)などの抗ＣＤ５２抗体；エドレコロマブ(edrecolomav)、Ｃｈ  １７−１ＡまたはＩＧＮ−１０１などの抗ＥｐＣＡＭ抗体；キサクチン(Xactin)などの抗ＣＴＰ２１または１６抗体；１３１Ｉ−Ｃｏｔａｒａ  ＴＮＴ−１などの抗ＤＮＡ−Ａｇ抗体；ペムツモマブ(pemtumomab)またはＲ１１５０などの抗ＭＵＣ１抗体；ＡＢＸ−ＭＡ１などの抗ＭＵＣ１８抗体；ミツモマブ(mitumomab)などの抗ＧＤ３抗体；ＣｅａＶａｃまたはラベツズマブ(labetuzumab)などの抗ＥＣＡ抗体；ＯｖａＲｅｘなどの抗ＣＡ１２５抗体；アポリズマブ(apolizumab)などの抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体；ＭＤＸ−０１０などの抗ＣＴＬＡ４抗体；ＭＤＸ−０７０、１１１Ｉｎ  ＆  ９０Ｙ−Ｊ５９１、１７７Ｌｕ  Ｊ５９１、Ｊ５９１−ＤＭ１などの抗ＰＳＭＡ抗体；ＩＧＮ３１１などの抗Ｌｅｗｉｓ  Ｙ抗体；ＡＳ１４０５および９０ＹｍｕＢＣ１などの抗脈管形成抗体；ＴＲＡＩＬ  Ｒ１ｍＡｂまたはＴＲＡＩＬ  Ｒ２ｍＡｂなどの抗Ｔｒａｉｌ−Ｒ１抗体なども挙げるのに適している。
【０１３０】
二重特異性または二機能性抗体は、２つの異なる可変領域が同じ分子内で組み合わされている第二世代のモノクローナル抗体である(Hollinger and Bohlen, 1999, Cancer and metastasis, rev. 18:411-419)。それらの有用性は診断および治療の両領域で、新たなエフェクター機能を動員する、または腫瘍細胞の表面にいくつかの分子を標的化するそれらの能力に関して実証されており、このような抗体は化学的手法(Glennie MJ et al, 1987, J. Immunol. 139, 2367-2375; Repp R. et al, 1995, J. Hemat., 377-382)または体細胞法(Staerz U.D. and Bevan M.J., 1986, PNAS 83, 1453-1457; Suresh M.R. et al, 1986, Method Enzymol, 121:210-228)だけでなく、優先的には、ヘテロ二量体形成を促し、従って、求める抗体の精製を容易にすることができる遺伝子工学技術によっても得ることができる(Merchand et al., 1998, Nature Biotech., 16:677-681)。
【０１３１】
これらの二重特異性抗体は、完全なＩｇＧ、二重特異性Ｆａｂ’２、Ｆａｂ’ＰＥＧ、ダイアボディーまたは二重特異性ｓｃＦｖとしてだけではなく、標的化される各抗原に対して２つの結合部位が存在する四価二重特異性抗体(Park et al, 2000, Mol. Immunol, 37(18):1123-30)または上記のようにそのフラグメントとしても構築することができる。
【０１３２】
二重特異性抗体の生産および投与が２つの特異性抗体を生産するよりも安価であるという経済的利点に加え、このような二重特異性抗体の使用は処置の毒性を軽減するという利点も有する。実際、二重特異性抗体を用いると、循環抗体の全体量を低くし、結果的に潜在的毒性を小さくすることができる。
【０１３３】
本発明の好ましい実施形態では、二重特異性抗体は二価または四価の抗体である。
【０１３４】
最後に、本発明は、薬剤として用いるための上記の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントに関する。
【０１３５】
本発明はまた、本発明の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントの１つからなる化合物を有効成分として含んでなる医薬組成物に関する。好ましくは、該抗体には賦形剤および／または薬学上許容される担体が添加される。
【０１３６】
さらに別の実施形態によれば、本発明はまた、ＩＧＦ−１Ｒ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃＭＥＴ、ＶＥＧＦＲもしくはＶＥＧＦなどの受容体のチロシンキナーゼ活性を特異的に阻害することができる化合物、または当業者に公知の他のいずれかの抗腫瘍化合物の中から選択される第二の抗腫瘍化合物を少なくとも含んでなる上記のような医薬組成物に関する。本発明の第二の好ましい態様では、該第二の化合物は、または該受容体によって誘導される増殖活性および／または抗アポトーシ活性および／または脈管形成活性および／または内転移誘発活性を阻害し得る、単離された抗ＥＧＦＲ、抗ＩＧＦ−１Ｒ、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ、抗ｃＭＥＴ、ＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦなどの抗体、またはそれらの機能的フラグメントおよび誘導化合物の中から選択することができる。
【０１３７】
本発明のさらに別の実施形態によれば、該組成物はさらに、同時、個別または延長形式で用いるための組合せ製品として、ＩＧＦ−１Ｒ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃＭＥＴおよびＶＥＧＦＲなどの受容体のチロシンキナーゼ活性の少なくとも１つの阻害剤を含んでなる。
【０１３８】
別の好ましい実施形態では、これらの受容体のチロシンキナーゼ活性の阻害剤は、誘導型天然因子、ジアニリノフタルイミド、ピラゾロ−もしくはピロール−ピリドピリミジンまたはキナゾリンを含む群から選択される。このような阻害剤は当業者によく知られ、文献に記載されている(Ciardiello F., Drugs 2000, Suppl. 1, 25-32)。
【０１３９】
本発明を補足する別の実施形態は、同時、個別または継続使用のための組合せ製品としてさらに細胞傷害性／細胞増殖抑制剤を含んでなる上記の組成物からなる。
【０１４０】
「同時使用」とは、単一の投与形に含まれる組成物の両化合物の投与を意味する。
【０１４１】
「個別使用」とは、異なる投与形に含まれる組成物の両化合物の同時投与を意味する。
【０１４２】
「継続使用」とは、異なる投与形に各々含まれる組成物の両化合物の逐次投与を意味する。
【０１４３】
一般に、本発明の組成物は癌処置の有効性を著しく高める。言い換えれば、本発明の抗体の治療効果は細胞傷害性薬剤の投与によって、予期されないように増強される。本発明の組成物によってもたらされる別の主要な次の利点は、有効成分のより低い有効用量を使用できる可能性に関し、従って、副作用、特に細胞傷害性薬剤の作用の出現のリスクを回避または軽減することを可能とする。さらに、この組成物は期待される治療効果をより早急に達成することを可能とする。
【０１４４】
「治療的抗癌薬」または「細胞傷害性薬剤」とは、患者に投与した際に、患者の癌の発達を治療または予防する物質を意味する。このような薬剤の限定されない例としては、「アルキル化」剤、代謝拮抗物質、抗腫瘍抗生物質、有糸分裂阻害剤、クロマチン機能阻害剤、抗脈管形成薬、抗エストロゲン作用薬、抗アンドロゲン作用薬および免疫調節剤が挙げられる。
【０１４５】
このような薬剤は、例えば、ＶＩＤＡＬの、標題「細胞傷害性」として腫瘍学および血液学に関する化合物に当てられた頁に引用され、この文献に引用されている細胞傷害性化合物は本明細書において好ましい細胞傷害性薬剤として引用される。
【０１４６】
「アルキル化剤」とは、細胞内で任意の分子、優先的には核酸（例えばＤＮＡ）と共有結合することができる、またはアルキル化することができる任意の物質を指す。このようなアルキル化剤の例としては、メクロレタミン、クロラムブシル、メルファラン、クロルヒドレート、ピポブロマン、プレドニムスチン、リン酸二ナトリウムもしくはエストラムスチンなどのナイトロジェンマスタード；シクロホスファミド、アルトレタミン、トロフォスファミド、スルホホスファミドもしくはイフォスファミドなどのオキサザホスホリン；チオテパ、トリエチレンアミンもしくはアルテトラミンなどのアジリジンもしくはエチレン−イミン；カルムスチン、ストレプトゾシン、フォテムスチンもしくはロムスチンなどのニトロソ尿素；ブスルファン、トレオスルファンもしくはインプロスルファンなどのスルホン酸アルキル；ダカルバジンなどのトリアゼン；またはシスプラチン、オキサリプラチンもしくはカルボプラチンなどの白金複合体が挙げられる。
【０１４７】
「代謝拮抗物質」とは、ある種の活性、一般にはＤＮＡ合成を妨げることによって増殖および／または細胞代謝を遮断する物質を指す。代謝拮抗物質の例としては、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、５−フルオロデオキシウリジン、カペシタビン、シタラビン、フルダラビン、シトシンアラビノシド、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）、６−チオグアニン（６−ＴＧ）、クロロデスオキシアデノシン、５−アザシチジン、ゲムシタビン、クラドリビン、デオキシコフォルミシンおよびペントスタチンが挙げられる。
【０１４８】
「抗腫瘍抗生物質」とは、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質の合成を妨害または阻害し得る化合物を指す。このような抗腫瘍抗生物質の例としては、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、バルルビシン、ミトキサントロン、ダクチノマイシン、ミトラマイシン、プリカマイシン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシンおよびプロカルバジンが挙げられる。
【０１４９】
「有糸分裂阻害剤」は、細胞周期および有糸分裂の正常な進行を妨害する。一般に、パクリタキセルおよびドセタキセルなどの微小管阻害剤または「タキソイド」は有糸分裂を阻害し得る。ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビノレルビンなどのビンカアルカロイドも有糸分裂を阻害し得る。
【０１５０】
「クロマチン阻害剤」または「トポイソメラーゼ阻害剤」は、トポイソメラーゼＩおよびＩＩなどの、クロマチンを形成するタンパク質の正常な機能を阻害する物質である。このような阻害剤の例としては、トポイソメラーゼＩとしては、カンプトテシンおよびその誘導体（イリノテカンまたはトポテカンなど）；トポイソメラーゼＩＩとしては、エトポシド、リン酸エチポシドおよびテニポシドが挙げられる。
【０１５１】
「抗脈管形成薬」は、血管の成長を阻害する薬剤、化合物、物質または因子である。抗脈管形成薬の例としては、限定されるものではないが、ラゾキシン、マリマスタット、バチマスタット、プリノマスタット、タノマスタット、イロマスタット、ＣＧＳ−２７０２３Ａ、ハロフギロン、ＣＯＬ−３、ネオバスタット、ＢＭＳ−２７５２９１、サリドマイド、ＣＤＣ  ５０１、ＤＭＸＡＡ、Ｌ−６５１５８２、スクアラミン、エンドスタチン、ＳＵ５４１６、ＳＵ６６６８、インターフェロン−α、ＥＭＤ１２１９７４、インターロイキン−１２、ＩＭ８６２、アンギオスタチンおよびビタキシンが挙げられる。
【０１５２】
「抗エストロゲン作用薬」または「エストロゲン拮抗薬」とは、エストロゲン作用を低下、拮抗または阻害する物質を指す。このような薬剤の例としては、タモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、ヨードキシフェン、アナストロゾール、レトロゾールおよびエキセメスタンが挙げられる。
【０１５３】
「抗アンドロゲン作用薬」または「アンドロゲン拮抗薬」とは、アンドロゲン作用を低下、拮抗または阻害する物質を指す。抗アンドロゲン作用薬の例としては、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、スピロノラクトン、酢酸シプロテロン、フィナステリドおよびシミチジンが挙げられる。
【０１５４】
免疫調節剤は、免疫系を刺激する物質である。免疫調節剤の例としては、インターフェロン、インターロイキン（アルデスロイキン、ＯＣＴ−４３、デニロイキンディフチトクスもしくはインターロイキン−２など）、腫瘍壊死因子（タソネルミンなど）、またはレンチナン、シゾフィラン、ロキニメックス、ピドチモド、ペガデマーゼ、チモフェチン、ポリＩ：Ｃまたはレバミゾールと５−フルオロウラシルの組合せなどの他種の免疫調節剤が挙げられる。
【０１５５】
さらに詳細なことについては、当業者ならば、「Therapeutic chemistry, vol. 6, Antitumor drugs and perspectives in the treatment of cancer, TEC and DOC edition, 2003 [仏語]と題されたthe French Association of Therapeutic Chemistry Teachersが刊行しているマニュアルを参照することができる。
【０１５６】
特に好ましい実施形態では、組合せ製品としての本発明の組成物は、同時使用のために前記細胞傷害性薬剤が前記抗体と化学的に結合されることを特徴とする。
【０１５７】
特に好ましい実施形態では、前記組成物は、前記細胞傷害性／細胞増殖抑制剤が紡錘体阻害剤または安定剤、好ましくは、ビノレルビンおよび／またはビンフルニンおよび／またはビンクリスチンの中から選択されることを特徴とする。
【０１５８】
該細胞傷害性薬剤と本発明の抗体の間の結合を容易にするために、結合される２つの化合物の間に、ポリ（アルキレン）グリコール、ポリエチレングリコールまたはアミノ酸などのスペーサー分子を導入することもできるし、あるいは別の実施形態では、その抗体と反応し得る官能基が導入された該細胞傷害性薬剤の活性な誘導体を使用することもできる。これらの結合技術は当業者によく知られ、本明細書ではこれ以上詳しく述べない。
【０１５９】
他のＥＧＦＲ阻害剤としては、限定されるものではないが、モノクローナル抗体Ｃ２２５および抗ＥＧＦＲ  ２２Ｍａｂ(ImClone Systems Incorporated)、ＡＢＸ−ＥＧＦ  (Abgenix/Cell Genesys)、ＥＭＤ−７２００(Merck KgaA)または化合物ＺＤ−１８３４、ＺＤ−１８３８およびＺＤ−１８３９(AstraZeneca)、ＰＫＩ−１６６(Novartis)、ＰＫＩ−１６６／ＣＧＰ−７５１６６(Novartis)、ＰＴＫ  ７８７(Novartis)、ＣＰ  ７０１  (Cephalon)、フルノミド(Pharmacia/Sugen)、ＣＩ−１０３３(Warner Lambert Parke Davis)、ＣＩ−１０３３／ＰＤ  １８３、８０５(Warner Lambert Parke Davis)、ＣＬ−３８７、７８５(Wyeth-Ayerst)、ＢＢＲ−１６１１(Boehringer Mannheim GMBH/Roche)、ＮａアミジンＡ(Bristol-board Myers Squibb)、ＲＣ−３９４０−ＩＩ(Pharmacia)、ＢＩＢＸ−１３８２(Boehringer Ingelheim)、ＯＬＸ−１０３(Merck & Co)、ＶＲＣＴＣ−３１０(Ventech Research)、ＥＧＦ融合毒素(Seragen Inc.)、ＤＡＢ−３８９(Seragen/Lilgand)、ＺＭ−２５２８０８(Imperial Cancer Research Fund)、ＲＧ−５０８６４(INSERM)、ＬＦＭ−Ａ１２(Parker Hughes Center Cancer)、ＷＨＩ−Ｐ９７(Parker Hughes Center Cancer)、ＧＷ−２８２９７４(Glaxo)、ＫＴ−８３９１(Kyowa Hakko)または「ＥＧＦＲワクチン」(York Medical/Centro of Immunologia Molecular)が挙げられる。
【０１６０】
本発明の別の態様は、前記抗体またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントの少なくとも１つが細胞毒素および／または放射性同位元素とコンジュゲートされていることを特徴とする組成物に関する。
【０１６１】
好ましくは、前記毒素または前記放射性同位元素は、腫瘍細胞の成長または増殖を妨害し得る、特に腫瘍細胞を完全に不活性化し得る。
【０１６２】
また好ましくは、前記毒素は細菌内毒素、特に、シュードモナス外毒素Ａである。
【０１６３】
優先的に治療抗体と組み合わされる放射性同位元素は、γ線を放出する放射性同位元素であり、優先的には、ヨウ素１３１、イットリウム９０、金１９９、パラジウム１００、銅６７、ビスマス２１７およびアンチモン２１１である。α線およびβ線を放出する放射性同位元素も治療に使用可能である。「本発明の抗体またはその機能的フラグメントの少なくとも１つと組み合わされた毒素または放射性同位元素」とは、特に、結合分子を導入して、または導入せずに、２つの化合物間を共有結合させることにより、該毒素または放射性同位元素を少なくとも１つの抗体と結合可能にするいずれの手段も指す。
【０１６４】
コンジュゲートの要素の総てまたは一部の化学結合（共有結合）、静電気的結合、または非共有結合を可能にする薬剤の例としては、特に、ベンゾキノン、カルボジイミド、より詳しくは、ＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチル−アミノプロピル］−カルボジイミド−ヒドロクロリド）、ジマレイミド、ジチオビス−ニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ）、Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）、紫外線と反応する１以上のフェニルアシ(phenylaside)基を有する１以上基を有する架橋剤、最も優先的には、Ｎ−［４−（アジドサリチルアミノ）ブチル］−３’−（２’−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド（ＡＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミド−イル３（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）および６−ヒドラジノ−ニコチンアミド（ＨＹＮＩＣ）が挙げられる。
【０１６５】
特に放射性同位元素に対する結合の別の形態は、二官能性イオンキレート剤の使用からなり得る。
【０１６６】
このようなキレート剤の例としては、金属、特に放射性金属と免疫グロブリンの結合を生じさせるＥＤＴＡ（エチレンジアミ四酢酸）またはＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）由来のキレート剤が挙げられる。よって、ＤＴＰＡおよびその誘導体は炭素鎖において種々の基で置換可能であり、このようにして配位子−金属錯体の安定性および堅牢性を高めることができる(Krejcarek et al., 1977; Brechbiel et al., 1991; Gansow, 1991;米国特許第４，８３１，１７５号)。
【０１６７】
例えば、遊離形態または金属イオンとの錯体として薬剤および生物学で広く使用されて久しいＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）およびその誘導体は、癌治療の放射能−免疫コンジュゲートの開発のため、抗体などの治療的または診断的の着目されるタンパク質と結合することができる金属イオンと安定なキレートを形成する著しい特徴を示す(Meases et al., 1984; Gansow et al., 1990)。
【０１６８】
また、好ましくは、該コンジュゲートを形成する本発明の少なくとも１つの抗体は、その機能的フラグメント、特に、ｓｃＦｖフラグメントなど、それらのＦｃ成分を失ったフラグメントの中から選択される。
【０１６９】
本発明はまた、癌の予防または治療を意図した薬剤の製造のための該組成物の使用も含む。
【０１７０】
本発明はまた、腫瘍細胞の増殖を阻害することを目的とする薬剤の製造のための本発明の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント、好ましくは、ヒト化抗体、および／または組成物の使用に関する。一般に、本発明は、癌の予防または治療を目的とする薬剤の製造のための本発明の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント、好ましくは、ヒト化抗体、および／または組成物の使用に関する。
【０１７１】
予防および／または治療可能な好ましい癌としては、前立腺癌、骨肉腫、肺癌、乳癌、子宮内膜癌、結腸癌、多発性骨髄腫、卵巣癌、膵臓癌または他のいずれかの癌が挙げられる。
【０１７２】
好ましい様式では、前記癌はエストロゲン関連乳癌、非小細胞肺癌、結腸癌および／または膵臓癌の中から選択される癌である。
【０１７３】
本発明の別の態様は、ＪＡＭ−Ａ発現レベルに関連する疾病の、好ましくはイン・ビトロにおける診断方法に記載されているような抗体の使用に関する。好ましくは、該診断方法における該ＪＡＭ−Ａタンパク質関連疾患は癌である。
【０１７４】
よって、本発明の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、特に、癌など、このタンパク質による異常な発現に関連する疾病の診断のための、イン・ビトロにおける生体サンプル中のＪＡＭ−Ａタンパク質の検出および／または定量のための方法に使用可能であり、その方法は下記の工程：
ａ）生体サンプルを本発明の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントと接触させること；
ｂ）形成され得る抗原−抗体複合体を実証すること
を含む。
【０１７５】
よって、本発明はまた、記載のような（レジオネラ・ニューモフィラ・パリス(Legionella pneumophila Paris)菌もしくは関連微生物由来の遺伝子の発現を検出するため、またはレジオネラ・ニューモフィラ・パリス菌もしくは関連微生物を検出および／または同定するための）方法の実行のための、下記の要素：
ａ）本発明のポリクローナルまたはモノクローナル抗体；
ｂ）所望により、免疫反応に好適な媒体を構成するための試薬；
ｃ）所望により、免疫反応によって産生される抗原−抗体複合体試薬を解明するための試薬
を含んでなるキットまたは補助品を含む。
【０１７６】
有利には、これらの抗体またはその機能的フラグメントは支持体、特にタンパク質チップに固定することができる。このようなタンパク質チップの１つは、本発明の目的である。
【０１７７】
有利には、これらのタンパク質チップは、生体サンプル中でＪＡＭ−Ａタンパク質を検出および／または定量するのに必要なキットまたは補助品に使用可能である。
【０１７８】
本明細書において「生体サンプル」とは、生きている生物体から採取されたサンプル（哺乳類、特にヒトから採取された、特に、血液、組織、器官またはその他のサンプル）またはこのようなあるＪＡＭ−Ａタンパク質を含む可能性のあるいずれかのサンプル（必要に応じて形質転換された細胞のサンプルなど）に関するということを述べておくべきであろう。
【０１７９】
該抗体またはその機能的フラグメントは、検出可能かつ／または定量可能なシグナルを得るために免疫複合体または標識抗体の形態であり得る。
【０１８０】
本発明の標識抗体またはその機能的もしくはフラグメントとしては、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコースアミラーゼ、炭酸脱水酵素、アセチルコリンエステラーゼ、リゾチーム、リンゴ酸デヒドロゲナーゼもしくはグルコース６リン酸デヒドロゲナーゼなどの酵素、またはビオチン、ジゴキシゲニンもしくは５−ブロモ−デスオキシウリジンなどの分子と組み合わせることができる抗体コンジュゲート（免疫複合体）が挙げられる。特にフルオレセインおよびその誘導体、フルオロクロム、ローダミンおよびその誘導体、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ダンシル、ウンベリフェロンなどをはじめとする蛍光標識もまた、本発明の抗体またはその機能的フラグメントと組み合わせることができる。このようなコンジュゲートでは、本発明の抗体またはその機能的フラグメントは当業者に公知の方法によって作製することができる。それらは、酵素もしくは蛍光標識と直接；あるいはスペーサー基または架橋基（ポリアルデヒド、グルタルアルデヒド、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）またはジエチレントリアミン五酢酸（ＤＰＴＡ）など）を介して；あるいは治療コンジュゲートに関して上記したものなどの結合剤の存在下で結合させることができる。フルオレセイン標識を有するコンジュゲートはイソチオシアネートとの反応によって作製することができる。
【０１８１】
他のコンジュゲートはまた、ルミノールおよびジオキセタンなどの化学発光標識、ルシフェラーゼおよびルシフェリンなどの生物発光標識、またはヨウ素１２３、ヨウ素１２５、ヨウ素１２６、ヨウ素１３３、臭素７７、テクネチウム９９ｍ、インジウム１１１、インジウム１１３ｍ、ガリウム６７、ガリウム６８、ルテニウム９５、ルテニウム９７、ルテニウム１０３、ルテニウム１０５、水銀１０７、水銀２０３、レニウム９９ｍ、レニウム１０１、レニウム１０５、スカンジウム４７、テルル１２１ｍ、テルル１２２ｍ、テルル１２５ｍ、ツリウム１６５、ツリウム１６７、ツリウム１６８、フッ素１８、イットリウム１９９およびヨウ素１３１放射性標識を含み得る。放射性同位元素と抗体を直接または上記のＥＤＴＡもしくはＤＴＰＡなどのキレート剤を介して結合させるための当業者に公知の既存の方法は診断用放射性同位元素についても使用可能である。よって、クロラミン−Ｔ技術による［Ｉ１２５］Ｎａでの標識[Hunter W.M. and Greenwood F.C. (1962) Nature 194:495]；Crockford et al.（米国特許第４，４２４，２００号）が記載しているようなテクネチウム９９ｍでの標識またはHnatowich（米国特許第４，４７９，９３０号）が記載しているようなＤＴＰＡを介した結合を挙げるべきであろう。
【０１８２】
本発明はまた、ＪＡＭ−Ａタンパク質を発現または過剰発現する細胞に対して生物学的に活性な化合物の特異的標的化のための薬剤の製造を目的とした本発明の抗体の使用に関する。
【０１８３】
本明細書の意味において、「生物学的に活性な化合物」とは、細胞の活性、特に成長、増殖、転写および遺伝子翻訳を調節、特に阻害し得る化合物である。
【０１８４】
本発明はまた、好ましくは標識された、特に放射性標識された本発明の抗体またはその機能的フラグメントからなるイン・ビボ診断試薬およびＪＡＭ−Ａタンパク質の細胞内発現または過剰発現に関連する癌の医学的画像化、特に検出におけるその使用に関する。
【０１８５】
本発明はまた、薬剤として用いる本発明の組合せ製品としての組成物、または抗ＪＡＭ−Ａ／毒素コンジュゲートまたは放射性同位元素に関する。
【０１８６】
好ましくは、前記の組合せ製品としての組成物またはコンジュゲートには、賦形剤および／または医薬ビヒクルが添加される。
【０１８７】
本明細書において「医薬ビヒクル」とは、二次反応を引き起こさず、例えば、有効化合物の投与を容易にするか、生物体内でのその寿命および／または有効性を増強するか、その溶液中での溶解度を高めるか、またはその保存性を改良する医薬組成物に入っている化合物、または化合物の組合せを意味する。このような医薬担体は周知のものであり、選択される有効化合物の性質および投与経路によって当業者によって適合される。
【０１８８】
好ましくは、このような化合物は全身経路、特に、静脈経路、筋肉経路、皮内経路、腹腔内経路、皮下経路または経口経路によって投与される。より好ましくは、本発明の抗体からなる組成物は経時的に等間隔の数回に分けて投与される。
【０１８９】
それらの投与経路、投与計画および最適な剤形は、例えば、患者の年齢または体重、患者の健康状態の重篤度、処置に対する患者の耐性、および受ける副作用など、患者に適した処置を確立する際に一般に考慮される基準に従って決定することができる。
【０１９０】
よって、本発明は、ＪＡＭ−Ａを発現または過剰発現する細胞に対して生物学的に活性な化合物の特異的標的化のための薬剤の製造を目的とした抗体またはその機能的フラグメントの１つの使用に関する。
【０１９１】
本発明の他の特徴および利点は本明細書の実施例および図面（範例を以下に示す）でさらに明らかになる。
【実施例】
【０１９２】
実施例１：６Ｆ４抗体の作製
ネズミモノクローナル抗体（Ｍａｂ）を作製するために、ＢＡＬＢ／ＣマウスをＡＴＣＣからのＭＣＦ−７細胞５×１０６個を用いて免疫した。１０７個のＭＣＦ−７細胞の最終追加免疫注射後、マウスのリンパ節(lymph nods)由来の細胞を、Kohler and Milsteinによって記載されている古典的な技術を用いてＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４骨髄腫細胞と融合する。次に、融合から生じるハイブリドーマの上清を機能活性、すなわちイン・ビトロでのＭＣＦ−７細胞の増殖阻害についてスクリーニングした。
【０１９３】
このスクリーニングでは、ＭＣＦ−７細胞を９６ウェル培養皿において１００μｌのウシ胎児血清不含ハイブリドーマ培地中５×１０３細胞／ウェルで培養する。これらのプレートを５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で２４時間インキュベートする。２４時間後、スクリーニングするハイブリドーマの上清５０μｌを各ウェルに入れる。プレートの最下段は対照用に確保する：
３つのウェルには、目的の活性に関して無関係であり、かつ融合細胞に用いた同じ培養培地中で培養されるハイブリドーマ上清５０μｌを添加する。これらのウェルは、不活性上清のトリチウム化チミジン取り込みに対する影響を較正するために用いられる；
３つのウェルにはハイブリドーマ培養培地５０μｌを入れる。
【０１９４】
培養からおおよそ５２時間後、各ウェルに０．２５μＣｉの［３Ｈ］チミジンを添加し、再度３７℃で２０時間インキュベートする。ＤＮＡ中への［３Ｈ］チミジンの取り込み（細胞増殖を示す）は、液体シンチレーションを測定することによって定量される。各プレートについてバックグラウンドノイズおよび閾値は、培地だけを入れた対照ウェルおよび無関係なハイブリドーマ上清の関数として測定される。
【０１９５】
この方法によって、第一回目のスクリーニング後にＭＣＦ−７細胞の増殖を阻害する抗体を分泌する４３のハイブリドーマが選択された。これらの４３ハイブリドーマのうち１１ハイブリドーマは増殖が弱いかまたは存在せず、廃棄した。ハイブリドーマの増加およびクローニング後に実施した増殖試験中に、その上清がＭＣＦ−７細胞の増殖に対して≧２０％の阻害活性を有していたハイブリドーマだけを選択した。クローニング／選択プロセスの終わりに、１つのクローンだけが必要な特性を有することが分かった、６Ｆ４クローン。
【０１９６】
実施例２：６Ｆ４抗体軽鎖可変領域（６Ｆ４  ＶＬ）のＣＤＲグラフトによるヒト化プロセス
ａ）６Ｆ４  ＶＬヌクレオチド配列と総ての既知ネズミ細胞系統配列との比較
ＣＤＲグラフトによるヒト化における予備段階として、初めに、６Ｆ４  ＶＬヌクレオチド配列をＩＭＧＴデータバンク（インターネットアドレス：http://imgt.cines.fr）に存在する総てのネズミ細胞系統配列と比較した。
【０１９７】
Ｖ領域については９８．５６％の配列同一性を有するマウス細胞系統領域Ｖ、そしてＪ領域については１００％の配列同一性を有するマウス細胞系統領域Ｊそれぞれ、ＩＧＫＶ１９−９３＊０１（配列番号３９、ＥＭＢＬ命名法：ＡＪ２３５９３５）およびＩＧＫＪ１＊０１（配列番号４０、ＥＭＢＬ命名法：Ｖ００７７７）を同定した。
【０１９８】
これらの同一性％を踏まえて、６Ｆ４  ＶＬ配列をそのまま用いることにした。
【０１９９】
これらのアライメントはＶ領域については図２Ａに、そしてＪ領域については図２Ｂに示している。
【０２００】
ｂ）６Ｆ４  ＶＬヌクレオチド配列と総ての既知ヒト細胞系統配列との比較
ＣＤＲグラフトに最良のヒト候補を同定するために、６Ｆ４  ＶＬと最大限の同一性を有するヒト由来生殖細胞系を探した。このために、マウス６Ｆ４  ＶＬヌクレオチド配列をＩＭＧＴデータベースに存在する総てのヒト細胞系統配列と比較した。
【０２０１】
Ｖ領域については８１．３６％の配列同一性を有するヒト由来細胞系統領域Ｖ、すなわちＩＧＫＶ１−３３＊０１（配列番号４１、ＥＭＢＬ命名法：Ｍ６４８５６）を、そしてＪ領域については８６．８４％の配列同一性を有するヒト由来細胞系統領域Ｊ、すなわちＩＧＫＪ１＊０１（配列番号４２、ＥＭＢＬ命名法：Ｊ００２４２）を同定した。
【０２０２】
このようにして、マウス６Ｆ４  ＶＬ  ＣＤＲのヒト受容体配列としてＶ領域については細胞系統ＩＧＫＶ  １−３３＊０１、そしてＪ領域についてはＩＧＫＪ１＊０１を選択した。
【０２０３】
これらのアライメントはＶ領域については図３Ａに、そしてＪ領域については図３Ｂに示している。
【０２０４】
ｃ）ヒト化型６Ｆ４  ＶＬ
ヒト化プロセスにおける下記の工程は、ＩＧＫＶ１−３３＊０１細胞系統配列とＩＧＫＪ１＊０１細胞系統配列を結合すること、その後これらの同じ生殖細胞系のスキャフォールド領域にマウス６Ｆ４  ＶＬ  ＣＤＲを結合することからなる。
【０２０５】
該プロセスのこの段階のマウス６Ｆ４  Ｆｖ領域分子モデルは、分子の三次元構造（ＣＤＲのカノニカル構造、ＶＨ／ＶＬ界面など）の維持または抗原の結合のいずれかに関与し得ることから、保存するマウス残基の選択において特に有用となるであろう。スキャフォールド領域において、マウス（６Ｆ４  ＶＬ）ヌクレオチドとヒト（ＩＧＫＶ１−３３＊０１／ＩＧＫＪ１＊０１）ヌクレオチドとの間でのそれぞれの相違を非常に慎重に検討する。
【０２０６】
以下のことをより明確にするために、図４では、ＫＡＢＡＴ分類およびＩＭＧＴ分類に準拠して６Ｆ４  ＶＬ配列を示している。保存されるはずの３つのネズミ残基を同定した。
【０２０７】
残基３３（Ｉｌｅ）は、ＩＭＧＴによればＣＤＲ１アンカリングに関与し、ＫａｂａｔによればＣＤＲ１の一部である。
【０２０８】
残基４９（Ｈｉｓ）は、ＩＭＧＴによればＣＤＲ２アンカリングに関与し、ＶＨ／ＶＬ界面に関与し、バーニアゾーンに属する。
【０２０９】
残基５３（Ｔｈｒ）は、ＩＭＧＴによればＣＤＲ２アンカリングに関与し、ＫａｂａｔによればＣＤＲ２の一部である。
【０２１０】
最初に、ＩＧＫＶ１−３３＊０１およびＩＧＫＪ１＊０１のスキャフォールド領域における３つの変化を研究する。これらの変化は残基２４、６９および７１（ＩＭＧＴ命名法）に関係する。当然のことながら、これらの３つの変化は互いに独立に検討され、さらに様々な組合せにおいても検討されると理解すべきである。考えられるあらゆる変異株を用意して、それらを試験し、かつ最良の結合特性を保存した変異株を選択することがこの目的である。例えば各変異株に対してＥＬＩＳＡ／Ｂｉａｃｏｒｅ結合試験を実施する。
【０２１１】
残基２４（Ｌｙｓ／Ｇｌｎ）は、ＣＤＲ１付近に存在し、結果として、正確なＣＤＲ１提示を可能にするコンフォーメーションの維持に重要である可能性が考えられる。より詳しくは、この残基はバーニアゾーン内の残基６９−７０と相互作用する可能性がある。ＬｙｓはヒトＶＬにおいてわずかしか表示されないが、ＫａｂａｔによればＣＤＲ１の一部である。
【０２１２】
残基６９（Ａｒｇ／Ｔｈｒ）は、バーニアゾーンに存在するためＣＤＲ１のカノニカル構造に直接関与するが、この残基はヒトＶＬにおいて常にＴｈｒである。
【０２１３】
残基７１（Ｔｙｒ／Ｐｈｅ）は、ＣＤＲ１のカノニカル構造に直接関与するが、ヒトＶＬにおいて規則的にＰｈｅである。
【０２１４】
次に、残基５６（Ａｌａ）のＴｈｒへの改変を考えることができる。この残基は、ＩＭＧＴによればＣＤＲ外にあるが、ＫａｂａｔによればＣＤＲ２に属する。
【０２１５】
第三そして最後に、２つのさらなる変化が残基３４および５５（ＩＭＧＴ命名法）においてもたらされる可能性が考えられる。ＩＭＧＴによって定義されたＣＤＲの外にあるこれらの２つの残基は、Ｋａｂａｔによって定義されたＣＤＲ中に含まれる。
【０２１６】
残基３４（Ａｌａ／Ａｓｎ）は、ＫａｂａｔによればＣＤＲ１に属し、ＶＨ／ＶＬ界面に参加する。ヒトにおいてＡｌａが強く表示されるにもかかわらず、このような突然変異は関連性を保ち続ける。
【０２１７】
残基５５（Ｇｌｎ／Ｇｌｕ）は、ＫａｂａｔによればＣＤＲ２の一部であり、ＶＨ／ＶＬ界面にも参加する。ヒトにおいてＧｌｎが強く表示されるにもかかわらず、このような突然変異もまた関連性を保ち続ける。
【０２１８】
上記したように、これらの３つの突然変異は独立に試験することができ、または様々な組合せにおいて試験することができた。
【０２１９】
実施例３：６Ｆ４抗体重鎖可変領域（６Ｆ４  ＶＨ）のＣＤＲグラフティングによるヒト化プロセス
ａ）６Ｆ４  ＶＨヌクレオチド配列と総ての既知ネズミ細胞系統配列との比較
ＣＤＲグラフトによるヒト化における予備段階として、初めに、６Ｆ４  ＶＨヌクレオチド配列をＩＭＧＴデータバンク（インターネットアドレス：http://imgt.cines.fr）に存在する総てのネズミ細胞系統配列と比較した。
【０２２０】
Ｖ領域については９９．３０％の配列同一性を有するネズミ細胞系統領域Ｖ（ＩＧＨＶ１Ｓ１３５＊０１；配列番号４３；ＥＭＢＬ命名法：ＡＦ３０４５５６）、Ｄ領域については８０％の配列同一性を有するネズミ細胞系統領域Ｄ（ＩｇＨＤ−ＳＴ４＊０１；配列番号４４；ＥＭＢＬ命名法：Ｍ２３２４３）、そしてＪ領域については１００％の配列同一性を有するネズミ細胞系統領域Ｊ（ＩｇＨＪ２＊０１；配列番号４５；ＥＭＢＬ命名法：Ｖ００７７０）。
【０２２１】
これらのアライメントはＶ領域については図５Ａに、Ｄ領域については図５Ｂに、そしてＪ領域については図５Ｃに示している。
【０２２２】
これらの同一性％を踏まえて、６Ｆ４  ＶＬの場合と同様に、６Ｆ４  ＶＨ配列をそのまま用いることにした。
【０２２３】
ｂ）６Ｆ４  ＶＨヌクレオチド配列と総ての既知ヒト細胞系統配列との比較
ＣＤＲグラフトに最良のヒト候補を同定するために、６Ｆ４  ＶＨの３つの領域Ｖ、ＤおよびＪそれぞれと最大限の同一性を有するヒト由来生殖細胞系を探した。このために、マウス６Ｆ４  ＶＨヌクレオチド配列をＩＭＧＴデータベースに存在する総てのヒト細胞系統配列と比較した。
【０２２４】
Ｖ領域については７５．３４％の配列同一性を有するヒト由来生殖細胞系（ＩＧＨＶ１−ｆ＊０１；配列番号４６；ＥＭＢＬ命名法：Ｚ１２３０５）を、Ｄ領域については７１．４２％の配列同一性を有するヒト由来生殖細胞系（ＩＧＨＤ１−１＊０１；配列番号４７；ＥＭＢＬ命名法：Ｘ９７０５１）を、そしてＪ領域については８７．５１％の配列同一性を有するヒト由来生殖細胞系（ＩＧＨＪ４＊０１；配列番号４８、ＥＭＢＬ命名法：Ｊ００２５６）を同定した。
【０２２５】
領域Ｖ、ＤおよびＪそれぞれに対して、上記生殖系統を選択し、それらで再配列した。
【０２２６】
これらのアライメントはＶ領域については図６Ａに、Ｄ領域については図６Ｂに、そしてＪ領域については図６Ｃに示している。
【０２２７】
ｃ）ヒト化型６Ｆ４  ＶＨ
ヒト化プロセスにおける下記の工程は、ＩＧＨＶ１−ｆ＊０１細胞系統配列、ＩＧＨＤ１−１＊０１細胞系統配列およびＩＧＨＪ４＊０１細胞系統配列を結合すること、その後これらの同じ生殖細胞系のスキャフォールド領域にマウス６Ｆ４  ＶＨ  ＣＤＲを結合することからなる。
【０２２８】
該プロセスのこの段階のマウス６Ｆ４  Ｆｖ領域分子モデルは、分子の三次元構造（ＣＤＲのカノニカル構造、ＶＨ／ＶＬ界面など）の維持または抗原の結合のいずれかに関与し得ることから、保存するマウス残基の選択において特に有用となるであろう。スキャフォールド領域において、マウス（６Ｆ４  ＶＨ）ヌクレオチドとヒト（ＩＧＨＶ１−ｆ＊０１、ＩＧＨＤ１−１＊０１およびＩＧＨＪ４＊０１）ヌクレオチドとの間でのそれぞれの相違を非常に慎重に検討する。
【０２２９】
以下のことをより明確にするために、図７では、ＫＡＢＡＴ分類およびＩＭＧＴ分類に準拠して６Ｆ４  ＶＨ配列を示している。
【０２３０】
軽鎖の場合と同様に、変化しないはずの４つの残基を同定した。
【０２３１】
残基２（Ｉｌｅ）は、バーニアゾーンの一部であり、およびＣＤＲ３構造化に関与する。
【０２３２】
残基３５（Ｔｙｒ）は、ＩＭＧＴによればＣＤＲ１アンカリングに関与し、ＫａｂａｔによればＣＤＲ１の一部であり、ＶＨ／ＶＬ界面にも参加し、ＣＤＲ３と相互作用する。
【０２３３】
残基５０（Ｔｙｒ）は、ＩＭＧＴによればＣＤＲ２アンカリングに関与し、ＫａｂａｔによればＣＤＲ２の一部であり、バーニアゾーンの一部でもあり、ＶＨ／ＶＬ界面にも参加する。
【０２３４】
残基５９（Ａｒｇ）は、ＩＭＧＴによればＣＤＲ２アンカリングに関与し、ＫａｂａｔによればＣＤＲ２の一部であり、ＶＨ／ＶＬ界面に参加する。
【０２３５】
第一のヒト化型には、残基６１、６２および６５それぞれに３つの突然変異を含めることができるであろう（ＩＭＧＴ分類）。
【０２３６】
これらの３つの残基は、ＫａｂａｔによればＣＤＲ２中に存在し、ＶＨ／ＶＬ界面に参加する。
【０２３７】
残基６１（Ａｓｎ／Ａｌａ）は抗原認識に直接関係しない。そのため、その突然変異を考えることができる。
【０２３８】
残基６２（Ｇｌｎ／Ｇｌｕ）および残基６５（Ｌｙｓ／Ｇｌｎ）。
【０２３９】
次に、２つのさらなる変化を評価する。これらの２つの変化は残基４８および７４（ＩＭＧＴ命名法）に関係する。
【０２４０】
スキャフォールド領域に属する残基４８（Ｉｌｅ／Ｍｅｔ）は、ＶＨ／ＶＬ界面に参加する。
【０２４１】
残基７４（Ｌｙｓ／Ｔｈｒ）は、バーニアゾーンの一部であり、ＣＤＲ２構造化に関係している可能性がある。
【０２４２】
第三そして最後に、第三の突然変異系列すなわち残基９（Ｐｒｏ／Ａｌａ）および４１（Ｈｉｓ／Ｐｒｏ）の変化を考えることができた。こうして、６Ｆ４  ＶＬに対して計画した突然変異と同じ方法で、ＣＤＲアンカリングを改変することなく可能な限り厳密にヒト生殖細胞系に近づけることがこの目的である。
【０２４３】
要約する目的でのみ、以下の表４および５に、用いた細胞系統と、それぞれの、それらのアミノ酸およびヌクレオチド配列番号を記載している。
表４
【表４】
2010509931.tif 000005
表５
【表５】
2010509931.tif 000006
【０２４４】
実施例４：６Ｆ４抗体の抗原標的の精製および同定
免疫親和性による精製
６Ｆ４抗体の抗原標的をＨＴ−２９細胞高密度膜画分から精製する。１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００およびＩＧＥＰＡＬを含有する５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌバッファー、ｐＨ７．４に可溶化した後、膜タンパク質を、セファロースビーズ上に固定化されている６Ｆ４抗体の存在下、＋４℃でゆっくりと混合しながら一晩インキュベートする。次に、非特異的に吸着したタンパク質を除去するために、ビーズ上に形成された６Ｆ４−Ａｇ複合体を様々な洗浄剤含有溶液で洗浄する。０．１Ｍ  Ｇｌｙ／ＨＣｌバッファー、ｐＨ２．７を用いて６Ｆ４−セファロース支持体から６Ｆ４抗原標的を溶出する。目的の抗原の高密度画分を選択するために、集めた画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動（１０％ゲル、非還元性条件）およびニトロセルロース膜への転写後のウエスタンブロット（一次６Ｆ４抗体を０．５μｇ／ｍｌで使用、化学発光により検出）により解析する（図８Ａおよび８Ｂ）。ウエスタンブロットによる解析により、非選択画分および洗液中に目的のタンパク質が存在しないこと、そして酸性ｐＨにおいて後者が特異的に溶出されることが確認される。
【０２４５】
次に、２回の精製から生じる高密度画分を、上記の条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動（１０％ゲル）およびウエスタンブロットにより解析した。ウエスタンブロットにおいて６Ｆ４抗体によって認識された抗原は、還元性条件での解析後の見かけの分子量は３５ｋＤａであった（図９Ａおよび９Ｂ）。電気泳動を非還元性条件で実施したときに見かけの分子量が異なることが分かる：これらの条件下では、見かけの分子量は還元性条件で認められるものより実際には少し低い。
【０２４６】
抗原標的の同定
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動（１０％ゲル）後、質量分析による解析と適合する方法を用いて目的タンパク質をコロイダルブルーで染色する（図１０）。ウエスタンブロットによって検出された目的タンパク質に対応する特定のバンドを、外科用メスを用いて切り取り、その後２５ｍＭ重炭酸アンモニウム溶液中でのインキュベーションにより脱染する。還元（ＤＴＴ）／アルキル化（ヨードアセトアミド）およびトリプシン(Promega)（リジンおよびアルギニン残基でタンパク質を加水分解し、その結果、Ｃ末端位置にリジンまたはアルギニン残基を有するペプチドを放出するタンパク質分解酵素）による目的タンパク質の「ゲル内」加水分解（３７℃で一晩）後、生成したペプチドをギ酸の存在下でアセトニトリル／水混合物（７０／３０、ｖ／ｖ）を用いて抽出する。次いで、これらを、マトリックス（α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸, Bruker Daltonics）との混合物としてＡＴＦＡの存在下でＭＡＬＤＩターゲット上に付着させた後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析(Auto flex, Bruker Daltonics)により解析する。得られた質量スペクトルを図１０に示す。この解析から推定されるペプチドのリストを用いて、Mascot search engine(Matrix Sciences)を用いたデータバンク検索により目的タンパク質を同定する。
【０２４７】
ＮＣＢＩｎｒデータバンク検索結果から、ヒト由来タンパク質に限り、３つのタンパク質が大きなスコア（スコア＞６４）をとることが分かる：
１．ヒト結合部接着分子タイプ１の結晶構造
スコア＝１１６
このタンパク質は構造研究に用いたＦ１１Ｒ／ＪＡＭ−Ａ  タンパク質の細胞外ドメインに相当する。
２．Ｆ１１受容体（ホモ・サピエンス(Homo sapiens)）
スコア＝１１６
このタンパク質は、タンパク質Ｆ１１Ｒ／イソ型ａの前駆体に相当する。
３．Ｆ１１受容体イソ型ｂ（ホモ・サピエンス）
スコア＝６５
【０２４８】
これはタンパク質Ｆ１１Ｒイソ型ｂの前駆体であり、イソ型ａに対して２０アミノ酸の２欠失が存在する。
【０２４９】
よって、このアプローチにより同定されたタンパク質は、Ｆ１１ＲまたはＦ１１受容体と呼ばれる。これは実際に、該タンパク質がいわゆるＦ１１抗体の受容体として最初に記載されたときに採用された該タンパク質の正式呼称である(Naik et al., 1995, Biochem. J., 310, 155-162)。このタンパク質は今日ＪＡＭ−Ａまたは「結合部接着分子Ａ」という名前でよく知られており、ＪＡＭ１、ＰＡＭ−１、ＣＤ３２１または抗原１０６とも呼ばれる。
【０２５０】
トリプシン加水分解によって放出され、質量分析によって解析したペプチドのうち９つのペプチドは、ヒト型ＪＡＭ−Ａ／イソ型ａの理論加水分解から生じるペプチドのものに相当する、０．１Ｄａを超えない実験分子量を有する。これらの９つのペプチドは該タンパク質の一次配列の３７％に及ぶ。さらに、ＪＡＭ−Ａ前駆体の理論分子量（〜３２．９ｋＤａ）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって実験的に決定された見かけの分子量と一致する。
【０２５１】
ウエスタンブロットによって同定された標的の確認
次に、プロテオミクス手法によるＪＡＭ−Ａの同定をウエスタンブロット（非還元性条件で１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル、６Ｆ４抗体を０．５μｇ／ｍｌで使用、化学発光により検出）により確認した。
【０２５２】
図１１Ａに示されるように、６Ｆ４抗体は、ＨＴ−２９膜抽出物中および免疫精製によって濃縮された画分中の天然ＪＡＭ−Ａタンパク質（見かけのＭＷ＝３５ｋＤａ）だけでなく、二量体組換えタンパク質ＪＡＭ−Ａ／Ｆｃ（R&D Systems  ｒｅｆ．１１０３−ＪＭ、見かけのＭＷ  〜１２０ｋＤａ）も認識する。この認識は１／１０００に希釈した市販の抗ヒトＪＡＭ−Ａヤギポリクローナル抗体（R&D Systems、ｒｅｆ．ＡＦ１１０３）のものに等しい（図１１Ｂ）。
【０２５３】
実施例５：ヒトＪＡＭ−Ａに対する６Ｆ４抗体の特異性
６Ｆ４抗体の特異性を上記の条件下でウエスタンブロットにより確認した。
図１２では、６Ｆ４抗体が組換えタンパク質ｈＪＡＭ−Ａ／Ｆｃ（R&D Systems  ｒｅｆ．１１０３−ＪＭ）を認識するが、ヒト型ＪＡＭ−ＢおよびＪＡＭ−Ｃ（組換えタンパク質ｈＪＡＭ−Ｂ／ＦｃおよびｈＪＡＭ−Ｃ／Ｆｃ、R&D Systems  ｒｅｆ．１０７４−ＶＪおよび１１８９−Ｊ３）もネズミ型ＪＡＭ−Ａ（組換えタンパク質ｍＪＡＭ−Ａ／Ｆｃ、R&D Systems  ｒｅｆ．１０７７−ＪＭ）も認識しないことから、６Ｆ４抗体がヒト型ＪＡＭ−Ａに対して特異的であることが分かる。
【０２５４】
実施例６：ＢＩＡｃｏｒｅ（表面プラズモン共鳴）による６Ｆ４抗体の親和性の測定
原理
ＢＩＡｃｏｒｅを用い、可溶性タンパク質ＪＡＭ−１−Ｆｃ（抗体のＦｃフラグメントと融合され、ＮＳ０細胞内で組換え型として産生される細胞外ドメイン）に対する６Ｆ４抗体の親和性定数ＫＤ（Ｍ）は、結合速度（ｋａ）（１／ｍ．ｓ）および解離速度（ｋｄ）（１／ｓ）の決定から、式ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ(Rich and Myszka, J. Mol. Recog., 2005, 18, 431)に従って算出することができる。
【０２５５】
材料および方法
使用機器：ＢＩＡｃｏｒｅ  ＸおよびＢＩＡevaluation  ３．１Ｘソフトウエア(Uppsala、SW)
試薬：
ネズミモノクローナル６Ｆ４抗体：１．３ｍｇ／ｍｌ
ヒトＪＡＭ−１−Ｆｃ（ｒｅｆ．  １１０３−ＪＭ  R&D Systems）：５０μｇ担体不含
マウスＪＡＭ−１−Ｆｃ（ｒｅｆ．  １０７７−ＪＭ  R&D Systems）：５０μｇ担体不含
ランニングバッファー  ：ＨＢＳ−ＥＰ(BIAcore)
結合キット：「アミン」(BIAcore)
結合バッファー：酢酸ｐＨ５．０(BIAcore)
補足抗体：ヤギＩｇＧ  Ｆｃ抗ヒト（＝ＧＡＨ、ヤギ抗ヒト）(Bioscience）
再生バッファー：グリシン、ＨＣｌ  ｐＨ１．５  ３０秒(BIAcore)
【０２５６】
考察および結論
図１３のデータは、ネズミ６Ｆ４抗体がヒトＪＡＭ−１タンパク質の細胞外部分と結合するが、ネズミＪＡＭ−１タンパク質の細胞外部分とは結合しないことを示す。
【０２５７】
図１４のデータにより、これらの実験条件下でヒトＪＡＭ−１タンパク質に対する６Ｆ４抗体のＫＤは２２ｐＭと算出できる。解離速度が遅いことは、この抗原に対する抗体アビジティーの現象の関与を示す（二価分析モデル）。
【０２５８】
実施例７：ＭＣＦ−７異種移植モデルにおける６Ｆ４抗体のイン・ビボ活性
未精製の、２５０μｇ／マウスの用量でＩＰ経路により注射された６Ｆ４抗体の試験は、この抗体が、ＰＢＳを注射したマウスの５６％に達する阻害率％でイン・ビボにおいてＭＣＦ−７細胞の増殖を有意に阻害することを示す（図１５）。ＩｇＧ１対照イソ型として無関連の９Ｇ４抗体は予測されたように抗腫瘍活性を持たない。
【０２５９】
実施例８：腫瘍細胞パネルに対して６Ｆ４により認識される抗原の分布の検討
６Ｆ４抗体に対する可能性のある適応を決定するため、４種類の腫瘍を膜発現特性に関してフローサイトメトリーで検討した。選択した細胞系統はＭＣＦ−７（エストロゲン関連乳癌）、Ａ５４９（非小細胞肺癌）、ＨＴ２９およびＣｏｌｏ  ２０５（結腸癌）およびＢｘＰＣ３（膵臓癌）である。細胞の標識については、一定範囲の用量（１０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．２５μｇ／ｍｌおよび０．１２５μｇ／ｍｌ）を試験した。
【０２６０】
図１６に示される結果は、６Ｆ４抗体が試験した総ての細胞の表面で有意に発現される抗原を認識することを示す。得られた標識は可飽和であり、その特異性を証明する。この部位の飽和は抗体濃度１μｇ／ｍｌから得られ、これはＪＡＭ−Ａ抗原に対する６Ｆ４抗体の親和性が高いという証拠である。
【０２６１】
実施例９：６Ｆ４抗体の軽鎖可変領域（６Ｆ４  ＶＬ）のＣＤＲグラフトによるヒト化
免疫分析の概要
【表６】
2010509931.tif 000007
【０２６２】
最も近いヒトＶ遺伝子の同定に関する詳細なデータ
最も近いＶ領域（Ｖ領域の最初のヌクレオチドから２番目のＣＹＳコドンおよび１５ｎｔのＣＤＲ３−ＩＭＧＴまでを評価）
スコア      同一性
M64856 IGKV1-33*01        922        81.36% (227/279nt)
M64855 IGKV1D-33*01       922        81.36% (227/279nt)
X63398 IGKV1-27*01        868        79.21% (221/279nt)
Y14865 IGKV1-NL1*01       841        78.14% (218/279nt)
X72817 IGKV1D-43*01       841        78.14% (218/279nt)
【０２６３】
最も近いヒトＪ遺伝子の同定に関する詳細なデータ
最も近いＪ領域：
スコア      同一性
J00242 IGKJ1*01           140        86.49% (32/37nt)
AF103571 IGKJ4*02         122        81.08% (30/37nt)
J00242 IGKJ4*01           113        78.38% (29/37nt)
Z70260 IGKJ2*02           104        75.68% (28/37nt)
Z46620 IGKJ2*04           95         72.97% (27/37nt)
【０２６４】
重要残基の同定
いくつかの基準はＣＤＲの外側の重要残基の定義およびランク付けに関与したものである。これらには少なくとも、ＶＨ／ＶＬ境界、抗原結合またはＣＤＲ構造における残基の既知の関与、ネズミ残基とヒト残基の間のアミノ酸クラスの変化、可変ドメインの三次元構造における残基の局在が含まれる。
【０２６５】
６Ｆ４  ＶＬドメインと最も近いＩＧＫＶ１−３３＊０１ヒト生殖細胞系Ｖ遺伝子の間では２１アミノ酸の違いが見られ、それらの総てがＣＤＲ残基の外側にある。上記で挙げたパラメーターを分析すると、これら２１の残基のうち、９つの最も寄与する可能性の高い残基が同定される。これらのネズミ残基はＫ２４、Ｉ３９、Ａ４０、Ｈ５５、Ｔ６６、Ｑ６８、Ａ６９、Ｒ８５およびＹ８７である。これら９つの残基のうち、３つがより重要であると予想され、従って、それらはそれらのネズミ起源をヒト化型に保つ。これらはそれぞれＣＤＲ１およびＣＤＲ２アンカーに位置する残基Ｉ３９およびＨ５５およびＴ６６である。最後に、それらがヒト化可能かどうか、またはそれらがそれらのネズミ起源を維持しなければならないかどうかを調べるため、６つのアミノ酸は個々に、かつ／または組み合わせて分析する。抗原結合およびＶ領域の構造にＪ領域が無関連であることに着目し、天然ヒトＩＧＫＪ１＊０１生殖細胞系遺伝子を用いることにした。
【０２６６】
図１７に示されるヒト化６Ｆ４  ＶＬドメインのデザインされた配列において、
＊は、事実上それらのヒトカウンターパートへ変化したアミノ酸に相当し、
１は、それらのヒト化能に関して分析されたアミノ酸に相当し（そのヒト残基はサインの下に示されている）、
２は、ヒト化６Ｆ４  ＶＨドメイン中にネズミが残るアミノ酸に相当する。
【０２６７】
実施例１０：６Ｆ４抗体の重鎖の可変領域（６Ｆ４  ＶＨ）のＣＤＲグラフトによるヒト化の第一の形式
免疫分析の概要
【表７】
2010509931.tif 000008
【０２６８】
Ｄ遺伝子はＶＨドメイン内のＣＤＲ３領域に厳密に属している。このヒト化プロセスは「ＣＤＲグラフト」アプローチに基づく。この戦略において最も近いヒトＤ遺伝子の分析は有用ではない。
【０２６９】
最も近いヒトＶ遺伝子の同定に関する詳細なデータ
最も近いＶ領域（Ｖ領域の最初のヌクレオチドから２番目のＣＹＳコドンまでを評価）
スコア      同一性
Z12305 IGHV1-f*O1         796        75.35% (217/288nt)
X62106 IGHV1-2*O2         787        75.00% (216/288nt)
X92208 IGHV1-2*O3         782        74.65% (215/288nt)
Z12310 IGHV1-2*04         778        74.65% (215/288nt)
M99642 IGHV1-24*O1        760        73.96% (213/288 nt)
【０２７０】
最も近いヒトＪ遺伝子の同定に関する詳細なデータ
最も近いＪ領域：
スコア      同一性
J00256 IGHJ4*01          181        87.23% (41/47nt)
X86355 IGHJ4*02          172        85.11% (40/47nt)
M25625 IGHJ4*03          172        85.11% (40/47nt)
J00256 IGHJ1*01          138        74.51% (38/51nt)
J00256 IGHJ5*01          133        74.00% (37/50nt)
【０２７１】
重要残基の同定
いくつかの基準はＣＤＲの外側の重要残基の定義およびランク付けに関与したものである。これらには少なくとも、ＶＨ／ＶＬ境界、抗原結合またはＣＤＲ構造における残基の既知の関与、ネズミ残基とヒト残基の間のアミノ酸クラスの変化、可変ドメインの三次元構造における残基の局在が含まれる。
【０２７２】
６Ｆ４  ＶＨドメインと最も近いＩＧＫＨ１−ｆ＊０１ヒト生殖細胞系Ｖ遺伝子の間では３１アミノ酸の違いが見られ、それらの総てがＣＤＲ残基の外側にある。上記で挙げたパラメーターを分析すると、これら３１の残基のうち、９つの最も寄与する可能性の高い残基が同定される。これらのネズミ残基はＩ２、Ｙ４０、Ｉ５３、Ｙ５５、Ｒ６６、Ｎ６８、Ｑ６９、Ｋ７２およびＫ８２である。これら９つの残基のうち、２つがより重要であると予想され、従って、それらはそれらのネズミ起源をヒト化型に保つ。これらはＣＤＲ２アンカーに位置する残基Ｙ５５およびＲ６６である。最後に、それらがヒト化可能かどうか、またはそれらがそれらのネズミ起源を維持しなければならないかどうかを調べるため、７つのアミノ酸は個々に、かつ／または組み合わせて分析する。抗原結合およびＶ領域の構造にＪ領域が関与しないことに着目し、天然ヒトＩＧＫＪ４＊０１生殖細胞系遺伝子を用いることに決めた。
【０２７３】
図１８に示されるヒト化６Ｆ４  ＶＨドメインのデザインされた配列において、
＊は、事実上それらのヒトカウンターパートへ変化したアミノ酸に相当し、
１は、それらのヒト化能に関して分析されたアミノ酸に相当し（そのヒト残基はサインの下に示されている）、
２は、ヒト化６Ｆ４  ＶＨドメイン中にネズミが残るアミノ酸に相当する。
【０２７４】
実施例１１：６Ｆ４抗体（６Ｆ４  ＶＨ）の重鎖可変領域のＣＤＲグラフトによるヒト化の第二の形式
ＣＤＲグラフトのヒトＶ遺伝子候補を同定するための他の方法は、ＩＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎツールを用いて、アミノ酸レベルでヒトホモロジーを探すことである。
ＩＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎ免疫分析の結果を以下にまとめる。
対立遺伝子              IGHV-3*01
種                      ホモ・サピエンス
ドメイン                1
Smith-Watermanスコア    451
同一性％                64.3
重複                    98
【０２７５】
ＩＧＨＶ１−０３＊０１生殖細胞系遺伝子（配列番号４９、ＥＭＢＬ命名法：Ｘ６２１０９）における重要残基の同定
６Ｆ４  ＶＨドメインおよびＩＧＨＶ  １−３＊０１タンパク質配列のアライメントを図３１に示す。
【０２７６】
それらの残基の選択およびランク付けは、それらの構造的関連性、それらの既知の構造−機能関係、それが起こり、また、第一のヒト化プロセスの際に得られた結果を利用するならば、アミノ酸クラスの変異の関連性に従った単一の各位置の相対的重要性に基づいた示差的基準に基づく。
【０２７７】
最初の意図では、残基Ｙ５５およびＲ６６（双方ともＣＤＲ２アンカーに割り付けられた残基として結合に関与することが強く推測される）以外、種々の「ＣＤＲの外側」の総てのアミノ酸がそれらのヒト相対物に対して変異を持っていた。後に記載される他の総ての分析が行われる場合には、プロセスの終了時にこれらの２つの残基のヒト化能が検索される。実際、親抗体である６Ｆ４  Ｈｚ２再ヒト化ＶＨドメインの完全な活性の再生は、次のように改良しなければならない：「脱ヒト化」プロセスは、必要に応じて、それらのネズミ相対物におけるこれらのアミノ酸を戻し突然変異することである。
【０２７８】
第一群の残基、すなわち、Ｅ１Ｑ、Ｋ４３ＲおよびＫ７５Ｒは、基準の強い組合せを示し、利益を探す場合に「脱ヒト化」が評価される最初の位置に相当する。
【０２７９】
次に、第二群の残基、すなわち、Ｋ４８Ｑ、Ｓ４９Ｒ、Ｆ８８ＹおよびＨ９０Ｒは化学的に関連のある突然変異であるが、構造的には重要な残基とは思われず、２回目の実験で試験される。
【０２８０】
第三群の６つの残基はおそらく全体的および／または核配向(core-oriented)の残基に関与する可能性が高いので、結合に関与している可能性は低く、必要であれば３回目の改良で検討される。
【０２８１】
第四群の残基は構造的および／またはアミノ酸クラスの変異に関連するとは思えず、その「脱ヒト化」は後に検討される。
【０２８２】
最後に、次の６つの残基Ｉ２Ｖ、Ｙ４０Ｈ、Ｉ５３Ｍ、Ｎ６８Ｓ、Ｋ７２ＱおよびＫ８２Ｔは、ヒト化が最初にヒト化されるＶＨドメインの結合活性を、少なくともこの最初の組合せでは変化させなかったアミノ酸に相当する。これらの残基の「脱ヒト化」は最後の改良として行われる。
【０２８３】
Ｄ遺伝子は、ＶＨドメイン内のＣＤＲ３領域に厳密に属している。このヒト化プロセスは「ＣＤＲグラフト」アプローチに基づく。この戦略において最も近いヒトＤ遺伝子の分析は有用ではない。
【０２８４】
Ｊ領域はＶ領域の抗原結合および構造に無関連であることに着目し、天然ヒトＩＧＨＪ４＊０１生殖細胞系遺伝子を用いることにした。
【０２８５】
再ヒト化６Ｆ４抗体に関して得られた実験データ
以下の実験では、再ヒト化は、重鎖、実施例９に例示されたようなＱＴＹ／ＡＥＴヒト化６Ｆ４  ＶＬドメインに常に相当する軽鎖のみに関し、この最後に選択されたヒト化ＶＬドメインは組換えキメラ６Ｆ４抗体と同様の抗ＪＡＭ−ａ結合活性を示す。同様に、再ヒト化形式の改良アッセイを、ＥＬＩＳＡアッセイによって定義されたような組換えキメラ６Ｆ４抗体抗ＪＡＭ−結合活性を参照して行った（データは示されてない）。
【０２８６】
実施例１２：６Ｆ４  ＭＡｂによるＪＡＭ−Ａ発現のイン・ビトロダウンレギュレーション
ＪＡＭＡ発現に対する６Ｆ４  ＭＡｂの効果を調べるため、ＭＣＦ−７、ＨＴ２９およびＡ５４９細胞系統を選択した。要約すると、細胞を７５ｃｍ２フラスコに入れ、３７℃の５％ＣＯ２雰囲気下、２４時間、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加した培地中でインキュベートした。その後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、血清不含培地でさらに１日インキュベートした。この第二のインキュベーションの後、血清不含培地を除去し、新しい血清不含培地単独、または６Ｆ４、もしくは９Ｇ４と記載されるＩｇＧ１イソ型対照のいずれかを含有する新しい血清不含培地に置き換えた。インキュベーション５時間または１６時間後、冷溶解バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌバッファー  、ｐＨ７．５、１５％ＮａＣｌ  １Ｍ(Sigma Chemical Co.)、１０％洗剤混合物（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０％  Ｉｇｅｐａｌ溶解バッファー）(Sigma Chemical Co.)、５％デオキシコール酸ナトリウム(Sigma Chemical Co.)、１プロテアーゼ阻害剤カクテル完全ＴＭ錠剤(Roche)および１％ホスファターゼ阻害剤カクテルセットＩＩ(Calbiochem)、ｐＨ７．５）を加え、細胞を氷上で掻き取った。これらの溶解液を４℃での遠心分離によって明澄化した。タンパク質をＢＣＡタンパク質アッセイによって定量し、２５μｇのタンパク質をＢｉｏｒａｄ  ４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルの各レーンにのせた。サンプルは１００℃で５分間加熱し、−２０℃で維持するか、またはそのまま４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにのせ、ニトロセルロース膜に移した。ブロットをまず、総ての抗体に関して５％ＢＳＡでブロッキングした。特異的抗ＪＡＭＡ一次抗体のインキュベーションを室温で２時間行った。フィルターをＴＢＳＴで洗浄し、適当なＨＲＰ結合二次抗体とともに室温で１時間インキュベートした。膜をＴＢＳＴで洗浄した後、タンパク質をＥＣＬ(Amersham)で可視化した。
【０２８７】
図１９に示されるように、６Ｆ４  ＭＡｂで処理した３つの細胞系統で、有意なＪＡＭ−Ａのダウンレギュレーションが見られた。ＭＣＦ−７が最も感受性が高いと思われ、６Ｆ４インキュベーション５時間後という早期に完全かつ安定なダウンレギュレーションが見られた。ＨＴ２９細胞でも、部分的ではあるが、持続性のＪＡＭ−Ａダウンレギュレーションが見られた。６Ｆ４  ＭＡｂではインキュベーション１６時間後に完全な阻害が見られたのに対し、Ａ５４９細胞では、インキュベーション初期では有意な効果が見られなかったので、ダウンレギュレーションの速度論は異なっていた。予測されたように、非処理細胞と９Ｇ４イソ型対照とともにインキュベートした細胞の間には有意な差は見られなかった。
【０２８８】
実施例１３：イン・ビボ腫瘍増殖に対する６Ｆ４の単回注射の効果
６Ｆ４  ＭＡｂのイン・ビボ作用機序を調べるため、７週齢のエストロゲンペレット担持雌マウスにＭＣＦ−７細胞を注射した。腫瘍体積が８０〜１００ｍｍ３に達した際に、匹敵する腫瘍を有するマウス３群を構成した。非処理の腫瘍内の腫瘍細胞の基本増殖を確認するため、注射前にこれらの群のうちの１つから腫瘍を取り出した。他の２群のマウスに１ｍｇの６Ｆ４または同用量のＩｇＧ１イソ型対照（９Ｇ４と表記）のいずれかを注射した。
【０２８９】
注射６時間後に腫瘍を取り出し、ホルマリンで固定し、パラフィン包埋し、５μｍ切片とし、抗Ｋｉ６７抗体で染色し、処理腫瘍と対照腫瘍の増殖レベルを調べた。
【０２９０】
図２０に示されるように、注射前に取り出した腫瘍（０時点としてＴ０で表す）とイソ型対照９Ｇ４で処理した腫瘍の間に差は見られなかった。他方、６Ｆ４を１回注射した後では腫瘍細胞増殖の有意な阻害が見られた。
【０２９１】
実施例１４：イン・ビボＪＡＭ−Ａ発現に対する６Ｆ４の単回注射の効果
この研究でのイン・ビボプロトコールは、ウエスタンブロット解析のために、取り出した腫瘍を液体窒素中で急速冷凍したこと以外はイン・ビボ増殖実験で記載したものと同様である。ウエスタンブロットは上記実施例１３に記載されているように行った。
【０２９２】
図２１は、非処理マウス（０時点としてＴ０で表す）と９Ｇ４イソ型対照を１回注射したマウスの間でＪＡＭ−Ａ発現に差は見られなかった。マウスを６Ｆ４  ＭＡｂで処理した場合には有意なダウンレギュレーションが見られ、この抗体のイン・ビボ抗腫瘍活性に関与する潜在的作用機序が受容体のダウンレギュレーションであり得ることが示唆される。これらの結果はイン・ビトロで見られ、実施例１３に示されているものと一致していた。
【０２９３】
実施例１５：６Ｆ４およびそのＦ（ａｂ’）２フラグメントの抗腫瘍活性の比較
ＪＡＭ−ＡはＭＣＦ−７細胞によって高く発現され、６Ｆ４はＩｇＧ１（マウスでのエフェクター機能にあまり関与しないことが知られているイソ型）であるということにもかかわらず、イン・ビボ活性におけるエフェクター機能の関与の可能性を調べるため、６Ｆ４とそのＦ（ａｂ’）２フラグメントの間のイン・ビボ比較をＭＣＦ−７モデルで設定した。
【０２９４】
この目的で、５００万個のＭＣＦ７細胞を、エストロゲンペレットを担持する７週齢の雌マウスに移植した。細胞を移植して５日後、マウスを３００μｇの６Ｆ４または２００μｇの６Ｆ４  Ｆ（ａｂ’）２のいずれかで週に３回処理した。最初の注射では、６００μｇの抗体および４００μｇの６Ｆ４  Ｆ（ａｂ’）２を注射した。腫瘍体積を４週間、週に２回測定した。
【０２９５】
図２２は、６Ｆ４および６Ｆ４  Ｆ（ａｂ’）２で処理したマウスの腫瘍増殖は、Ｄ３〜Ｄ２７からの対照マウスの腫瘍増殖とは有意に異なっていた（６Ｆ４ではｐ≦０．０３、６Ｆ４  Ｆ（ａｂ’）２ではｐ≦０．０１５）。６Ｆ４および６Ｆ４  Ｆ（ａｂ’）２マウス群の間では差は見られず、エフェクター機能は６Ｆ４活性に関与しないことを示す。
【０２９６】
実施例１６：ヒト組織でのＪＡＭ−Ａ発現の評価
ＪＡＭＡを過剰発現する腫瘍種を選択するため、腫瘍組織と正常患者組織でＪＡＭ−Ａ発現の比較を行った。この検討のため、同じ患者から正常組織と腫瘍組織の対を選択した。これらの患者では、正常組織は腫瘍近傍から採取した。ＪＡＭ−Ａ発現は、Superships製の組織アレイを用い、免疫組織化学（ＩＨＣ）によって判定した。要約すると、スライドを脱脂し、Ｄａｋｏｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ溶液Ｓ１６９９を用い、９８℃で２０分間抗原賦活を行った。内在ペルオキシダーゼをクエンチ（０．３％  Ｈ２Ｏ２溶液、５分間）し、非特異的部位をブロッキング(Ultra-V-Block; Labvision, ref, TA-125-UB)した後、一次抗体（R&Dsytemからの抗−ｈＪＡＭ−Ａ、ＡＦ１１０３またはZymedからのヤギＩｇＧイソ型対照）を室温で１時間インキュベートした。ＴＢＳ−ｔｗｅｅｎ中で洗浄した後、dakocytomationからのＬＳＡＢ＋キットを用い、抗−ｈＪＡＭ−Ａの結合を現像した。一次抗体とＬＳＡＢ＋の複合体の可視化は、発色反応ＨＲＰ−ＤＡＢによって行った。その後、スライドをヘマトキシリンで対比染色を行った。
【０２９７】
甲状腺、肺および乳癌のサンプルを分析した。甲状腺サンプル（図２３）については、正常甲状腺組織では発現は見られなかったが、ＪＡＭ−Ａでは、同じ患者からの腫瘍切片（膜染色）で強く発現されたことが明らかであった。肺正常組織では、ＪＡＭ−Ａは胚細胞によって発現された。しかしながら、総ての腫瘍サンプルで強い膜発現が見られた（図２４）。乳癌では、正常乳房組織で小葉乳癌に位置する弱いＪＡＭ−Ａ発現が見られた。癌切片では、図２５に示される３例の癌腫（浸潤性乳管、非定型髄質および浸潤性乳頭状）は、ＪＡＭ−Ａが乳癌組織で過剰発現することを示す。
【０２９８】
これらのデータは、甲状腺癌、乳癌および肺癌がＪＡＭＡ療法の良好な標的となり得ることを示唆した。
【０２９９】
実施例１７：ヌードマウスにおけるＡ４３１類表皮癌異種移植片における６Ｆ４のイン・ビボ活性
Ａ−４３１細胞を、１０％熱不活化ウシ胎児血清(Sigma)を添加したＤＭＥＭ(Lonza)で通常に培養した。植え継ぎ２日前に細胞を二分したところ、それらは指数増殖期となった。１０００万個のＡ−４３１細胞を７週齢の無胸腺ヌードマウスに移植した。移植５日後（Ｄ５）、マウスを無作為化し、以下のスキームでｉ．ｐ．（腹腔）処置した：対照群には週に２回ＰＢＳ注射を施し、６Ｆ４処理群には負荷量２ｍｇ、次いで週に２回１ｍｇ用量の抗体をｉ．ｐ（腹腔）注射した。週に２回腫瘍を測定し、腫瘍体積を式：π／６長さ、幅、高さを用いて算出した。各時点でマン・ホイットニー検定およびＳｉｇｍａＳｔａｔソフトウエアを用いて統計分析を行った。図２６は、６Ｆ４  ＭＡｂがＡ４３１細胞系統のイン・ビボ増殖を有意に阻害し得ることを示した（３８日目から５６日目まででｐ＜０．００９）。
【０３００】
実施例１８：抗原提示細胞（ＡＰＣ）による抗原提示に対する６Ｆ４活性の評価
ＪＡＭタンパク質はヒト身体中の種々の組織ならびに血小板、白血球および赤血球の表面で発現される[Naik 1995; Malergue 1998; Korneki 1990; Williams 1999; Gupta 2000]。ＪＡＭ−Ａは血小板、好中球、単球、リンパ球および赤血球［総説としては、Mandell 2005参照］。
【０３０１】
６Ｆ４による処理が患者の抗原提示を損なう可能性があるかどうかを調べるため、マクロファージおよび樹状細胞を含む抗原提示細胞（ＡＰＣ）の妨害の可能性の評価を行った。提示過程で、ＡＰＣは抗原をインターナライズし、それらを消化して、細胞質内でＣＭＨクラスＩＩ分子と結合されるペプチドを生じる。次に、この複合体がＡＰＣ膜上で発現され、増殖による刺激に応答する特異的なＴリンパ球に提示される。
【０３０２】
以下に示す研究では、ヒトＰＢＭＣによる破傷風毒提示に対する６Ｆ４の潜在的効果を評価した。この目的で、血液からフィコール勾配遠心分離によりＰＢＭＣを単離した。細胞をＰＢＳで洗浄し、計数し、１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、グルタミンおよび抗生物質を添加したＲＰＭＩ  １６４０培地に０．２５．１０６細胞／ｍｌの濃度で懸濁させた。予め抗原および供試抗体（終濃度１０μｇ／ｍｌ）を満たした９６ウェルプレートの各ウェルに１００μｌのＰＢＭＣを播種した。ＩｇＧ１イソ型対照として９Ｇ４  Ｍａｂを用い、陽性対照としてリンパ球のポリクローナルアクチベーターであるフィトヘマグルチニンＰＨＡ（終濃度２．５μｇ／ｍｌ）を導入した。
【０３０３】
特異的な抗原アクチベーター破傷風毒（ＴＴ）を選択し、終濃度１００μｇ／ｍｌでＰＢＭＣに加えた。次に、プレートを３７℃、５％ＣＯ２を含む大気中で９６時間インキュベートした。その後、０．２５μＣｉの［３Ｈ］−チミジンをウェルに加え、２４時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を採取し、フィルター膜を乾燥させ、放射活性量をシンチレーションカウンターで計数した。
【０３０４】
２回の独立した実験の値を示す図２７Ａおよび２８Ａに関して、ＰＢＭＣ提示の陽性対照として用いたポリクローナルアクチベーターＰＨＡは、リンパ球増殖の有効なインデューサーであり、指数はドナーおよび実験によって３０〜７０の範囲である。これらの条件で、リンパ球増殖指数は抗体がインキュベートされた際は常に変化するとは限らず、６Ｆ４は有意なアゴニストまたはアンタゴニスト活性を示さなかった。２回の独立した実験の値を示す図２７Ｂおよび２８Ｂは、リンパ球増殖のＴＴ活性化に対してドナー間で有意な変動が生じ得ることを示した。これらの実験では、指数はドナーおよび実験によって２〜５の範囲であった。しかしながら、６Ｆ４が存在する場合には、抗原提示の妨げは見られなかった。
【０３０５】
結論として、ＡＰＣおよびリンパ球上でのＪＡＭ−Ａの有意な発現にもかかわらず、この標的に対する抗体を使用しても、リンパ球の非特異的増殖も抗原提示プロセスも損なわれない。
【０３０６】
実施例１９：６Ｆ４インキュベーション後の血小板凝集および活性化の評価
ヒト血小板と結合する６Ｆ４が生物学的機能を持ち得るかどうかを検討するため、血小板凝集とセロトニン放出の２つのパラメーターを測定した。
【０３０７】
この目的で、１０人の正常なドナーからのヒト血小板を数種の供試抗体５μｇ／ｍｌとともにインキュベートした。
【０３０８】
ＰＭ６／２４８（抗αＩＩｂβ３）は血小板凝集を誘発することが報告されている。陰性イソ型対照として９Ｇ４を用いた。
【０３０９】
予測されたように、ヒト血小板を用いて試験すると、トロンビンおよびＡＤＰは凝集を誘発した。ＰＭ６／２４８も血小板凝集を誘発した。
【０３１０】
６Ｆ４とともにインキュベートした後では、血小板凝集は測定されなかった。この作用は、陽性対照として用いた９Ｇ４の場合に見られたものに匹敵していた（図２９）。
【０３１１】
同様に、６Ｆ４はセロトニンの放出を誘発できなかったが（図３０）、トロンビンは予測されたように５−ＨＴの放出を誘発した。
【０３１２】
これらの結果は、総てを考え合わせると、６Ｆ４活性化後では、ＪＡＭ−Ａは発現されるが、ヒト血小板において生物学的機能は誘発されないことを示す。
【図面の簡単な説明】
【０３１３】
【図１】ネズミ６Ｆ４抗体の重鎖および軽鎖の各配列を示す。ＣＤＲは下線と太字で示されている（Ｋａｂａｔナンバリングによる）。
【図２Ａ】ネズミ６Ｆ４抗体と選択されたネズミ細胞系統（すなわち、Ｖ領域に関してはＩＧＫＶ１９−９３＊０１（配列番号３９）およびＪ領域に関してはＩＧＫＪ１＊０１（配列番号４０））のＶ領域（図２Ａ）およびＪ領域（図２Ｂ）の各アライメントを示す。
【図２Ｂ】ネズミ６Ｆ４抗体と選択されたネズミ細胞系統（すなわち、Ｖ領域に関してはＩＧＫＶ１９−９３＊０１（配列番号３９）およびＪ領域に関してはＩＧＫＪ１＊０１（配列番号４０））のＶ領域（図２Ａ）およびＪ領域（図２Ｂ）の各アライメントを示す。
【図３Ａ】ネズミ６Ｆ４抗体と選択されたヒト細胞系統（すなわち、Ｖ領域に関してはＩＧＫＶ１−３３＊０１（配列番号４１）およびＪ領域に関してはＩＧＫＪ１＊０１（配列番号４２））のＶ領域（図３Ａ）およびＪ領域（図３Ｂ）の各アライメントを示す。
【図３Ｂ】ネズミ６Ｆ４抗体と選択されたヒト細胞系統（すなわち、Ｖ領域に関してはＩＧＫＶ１−３３＊０１（配列番号４１）およびＪ領域に関してはＩＧＫＪ１＊０１（配列番号４２））のＶ領域（図３Ａ）およびＪ領域（図３Ｂ）の各アライメントを示す。
【図４】ＫＡＢＡＴナンバリングシステムおよびＩＭＧＴナンバリングシステムそれぞれに関する６Ｆ４抗体の軽鎖のタンパク質配列を示す。
【図５Ａ】ネズミ６Ｆ４抗体と選択されたネズミ細胞系統（すなわち、Ｖ領域に関してはＩＧＨＶ１Ｓ１３５＊０１（配列番号４３）、Ｄ領域に関してはＩｇＨＤ−ＳＴ４＊０１（配列番号４４）およびＪ領域に関してはＩｇＨＪ２＊０１（配列番号４５））のＶ領域（図５Ａ）、Ｄ領域（図５Ｂ）およびＪ領域（図５Ｃ）の各アライメントを示す。
【図５Ｂ】ネズミ６Ｆ４抗体と選択されたネズミ細胞系統（すなわち、Ｖ領域に関してはＩＧＨＶ１Ｓ１３５＊０１（配列番号４３）、Ｄ領域に関してはＩｇＨＤ−ＳＴ４＊０１（配列番号４４）およびＪ領域に関してはＩｇＨＪ２＊０１（配列番号４５））のＶ領域（図５Ａ）、Ｄ領域（図５Ｂ）およびＪ領域（図５Ｃ）の各アライメントを示す。
【図５Ｃ】ネズミ６Ｆ４抗体と選択されたネズミ細胞系統（すなわち、Ｖ領域に関してはＩＧＨＶ１Ｓ１３５＊０１（配列番号４３）、Ｄ領域に関してはＩｇＨＤ−ＳＴ４＊０１（配列番号４４）およびＪ領域に関してはＩｇＨＪ２＊０１（配列番号４５））のＶ領域（図５Ａ）、Ｄ領域（図５Ｂ）およびＪ領域（図５Ｃ）の各アライメントを示す。
【図６Ａ】ネズミ６Ｆ４抗体と選択されたヒト細胞系統（すなわち、Ｖ領域に関してはＩＧＨＶ１−ｆ＊０１（配列番号４６）、Ｄ領域に関してはＩＧＨＤ１−１＊０１（配列番号４７）およびＪ領域に関してはＩＧＨＪ４＊０１（配列番号４８））のＶ領域（図６Ａ）、Ｄ領域（図６Ｂ）およびＪ領域（図６Ｃ）の各アライメントを示す。
【図６Ｂ】ネズミ６Ｆ４抗体と選択されたヒト細胞系統（すなわち、Ｖ領域に関してはＩＧＨＶ１−ｆ＊０１（配列番号４６）、Ｄ領域に関してはＩＧＨＤ１−１＊０１（配列番号４７）およびＪ領域に関してはＩＧＨＪ４＊０１（配列番号４８））のＶ領域（図６Ａ）、Ｄ領域（図６Ｂ）およびＪ領域（図６Ｃ）の各アライメントを示す。
【図６Ｃ】ネズミ６Ｆ４抗体と選択されたヒト細胞系統（すなわち、Ｖ領域に関してはＩＧＨＶ１−ｆ＊０１（配列番号４６）、Ｄ領域に関してはＩＧＨＤ１−１＊０１（配列番号４７）およびＪ領域に関してはＩＧＨＪ４＊０１（配列番号４８））のＶ領域（図６Ａ）、Ｄ領域（図６Ｂ）およびＪ領域（図６Ｃ）の各アライメントを示す。
【図７】ＫＡＢＡＴナンバリングシステムおよびＩＭＧＴナンバリングシステムそれぞれに関する６Ｆ４抗体の重鎖のタンパク質配列を示す。
【図８Ａ】ＨＴ−２９細胞膜からの６Ｆ４抗原の６Ｆ４−セファロース免疫精製を示す。回収された画分の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動（図８Ａ）およびウエスタンブロット（図８Ｂ）による分析を同様に示す。
【図８Ｂ】ＨＴ−２９細胞膜からの６Ｆ４抗原の６Ｆ４−セファロース免疫精製を示す。回収された画分の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動（図８Ａ）およびウエスタンブロット（図８Ｂ）による分析を同様に示す。
【図９Ａ】免疫精製タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動（図９Ａ）およびウエスタンブロット（図９Ｂ）による分析を示す。２回の精製（＃１および＃２）を行い、還元条件および非還元条件下で分析した。
【図９Ｂ】免疫精製タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動（図９Ａ）およびウエスタンブロット（図９Ｂ）による分析を示す。２回の精製（＃１および＃２）を行い、還元条件および非還元条件下で分析した。
【図１０】トリプシン加水分解後に抽出されたペプチド混合物の、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析による分析を示す。
【図１１Ａ】ウエスタンブロット（非還元条件）により同定されたタンパク質の確定を示す（６Ｆ４抗体（図１１Ａ）および抗ヒトＪＡＭ−Ａポリクローナル抗体（図１１Ｂ）を用いて現像）。
【図１１Ｂ】ウエスタンブロット（非還元条件）により同定されたタンパク質の確定を示す（６Ｆ４抗体（図１１Ａ）および抗ヒトＪＡＭ−Ａポリクローナル抗体（図１１Ｂ）を用いて現像）。
【図１２】ヒトＪＡＭ−Ａタンパク質に対する６Ｆ４抗体の特異性を示す。各タンパク質の付着量は２５０ｎｇ、２５ｎｇおよび１０ｎｇである。
【図１３】ネズミＪＡＭ１  Ｆｃタンパク質（フローセル＃１、下のグラフ）およびネズミＪＡＭ１  Ｆｃタンパク質（フローセル＃２、上のグラフ）に対して、２０℃で解離時間５分および流速３０μｌ／分で、ＨＢＳ−ＥＰバッファー中１００ｎｍの６Ｆ４抗体を２分注射（両矢印）した後に得られたセンサーグラムを示す（ＣＭ４：ｍ−ＪＡＭ１−Ｆｃ  ５０１．６ＲＵ（Ｆｃ１）および５１１．５ＲＵ（Ｆｃ２））。
【図１４】二重参照（Ｆｃ２−Ｆｃ１）６Ｆ４（Ｆｃ２−Ｆｃ１）ＨＢＳ−ＥＰで得られたセンサーグラムを示す。Ｌａｎｇｍｕｉｒ  Ａ＋Ｂ結合モデルを用いてこの曲線の当てはめを行う。算出された動態パラメーター（黒い曲線）は次の通り：ｋａ＝（１．３８±０．００１）＊１０５  Ｍ１ｓ１；ｋｄ＝（０．２５±１．５８）＊１０６ｓ１；Ｒｍａｘ（グローバルフィッティング）＝３７１ＲＵ；Ｋ２＝０．８５３。
【図１５】スイスヌードマウスにおけるＭＣＦ−７細胞の異種移植モデルにおける６Ｆ４抗体の抗腫瘍活性を示す。６Ｆ４抗体は、１週間に２回、理論用量２５０μｇ／マウスで、未精製形態（腹腔液）にてＩＰ経路により試験した。９Ｇ４抗体は、測定する活性に関して無関連の、同じイソ型（ＩｇＧ１）の抗体である。
【図１６】種々の腫瘍系統の表面での、Ｍａｂ  ６Ｆ４により認識されるＪＡＭ−Ａタンパク質発現を示す。
【図１７】＊が事実上それらのヒトカウンターパートへ変化したアミノ酸に相当する、１がそれらのヒト化能に関して分析されたアミノ酸に相当する（そのヒト残基はサインの下に示されている）、および２がヒト化６Ｆ４  ＶＬドメイン中にネズミが残るアミノ酸に相当する、ヒト化６Ｆ４  ＶＬドメインの配列を示す。
【図１８】＊が事実上それらのヒトカウンターパートへ変化したアミノ酸に相当し、１がそれらのヒト化能に関して分析されたアミノ酸に相当し（そのヒト残基はサインの下に示されている）、および２がヒト化６Ｆ４  ＶＨドメイン中にネズミが残るアミノ酸に相当する、ヒト化６Ｆ４  ＶＨドメインの配列を示す。
【図１９】６Ｆ４  ＭＡｂによって誘発されたイン・ビトロＪＡＭ−Ａダウンレギュレーションを示す。
【図２０】６Ｆ４  ＭＡｂによって誘発された腫瘍細胞増殖のイン・ビボ阻害に示す。
【図２１】６Ｆ４  ＭａｂによってＪＡＭ−Ａのイン・ビボダウンレギュレーションを示す。
【図２２】ＭＣＦ−７イン・ビボモデルに対する６Ｆ４およびそのＦ（ａｂ’）２フラグメントの比較を示す。
【図２３】甲状腺組織でのＪＡＭ−Ａの正常発現と腫瘍性発現の比較を示す。
【図２４】肺組織でのＪＡＭ−Ａの正常発現と腫瘍性発現の比較を示す。
【図２５】乳房組織でのＪＡＭ−Ａの正常発現と腫瘍性発現の比較を示す。
【図２６】ヌードマウスにおけるＡ４３１類表皮癌異種移植片での６Ｆ４のイン・ビボ活性を示す曲線を示す。
【図２７】Ａ．ＰＨＡにより誘発される非特異的リンパ球増殖(lyphoproliferation)、およびＢ．抗原提示プロセスに対する６Ｆ４抗体の効果を示す。２つの独立したドナーを用いた第一の実験。
【図２８】Ａ．ＰＨＡにより誘発される非特異的リンパ球増殖(lyphoproliferation)、およびＢ．抗原提示プロセスに対する６Ｆ４抗体の効果を示す。２つの独立したドナーを用いた第二の実験。
【図２９】１０人のヒト正常ドナーでの血小板凝集を示す。結果は平均値＋／−標準誤差として表す。
【図３０】１０人のヒト正常ドナーでのセロトニン放出を示す。結果は平均値＋／−標準誤差として表す。
【図３１】６Ｆ４  ＶＨドメインおよびＩＧＨＶ  １−０３＊０１生殖細胞系遺伝子（配列番号４９）のアライメントを示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図１０】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２２】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年3月5日(2009.3.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも配列番号１、２、３、４、５もしくは６を含んでなる配列のＣＤＲの中から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる、イン・ビトロおよび／またはイン・ビボにおいて腫瘍細胞の増殖を阻害可能な単離された抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント。
【請求項２】
モノクローナル抗体からなる、請求項１に記載の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント。
【請求項３】
配列番号２、４および６の配列の３つのＣＤＲのうち少なくとも１つを含んでなる重鎖を含んでなる、請求項１または請求項２に記載の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント。
【請求項４】
それぞれＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３である下記の３つのＣＤＲ：
ＣＤＲ−Ｈ１は、配列番号２、７もしくは９の配列を含んでなり、
ＣＤＲ−Ｈ２は、配列番号４もしくは１１の配列を含んでなり；かつ
ＣＤＲ−Ｈ３は、配列番号６もしくは１２の配列を含んでなる
を含んでなる重鎖を含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント。
【請求項５】
配列番号７の配列のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４の配列のＣＤＲ−Ｈ２および配列番号１２の配列のＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖を含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント。
【請求項６】
配列番号９の配列のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１１の配列のＣＤＲ−Ｈ２および配列番号６の配列のＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖を含んでなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント。
【請求項７】
配列番号１、３および５の配列の３つのＣＤＲのうち少なくとも１つを含んでなる軽鎖を含んでなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント。
【請求項８】
それぞれＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３である下記の３つのＣＤＲ：
ＣＤＲ−Ｌ１は、配列番号１もしくは８の配列を含んでなり、
ＣＤＲ−Ｌ２は、配列番号３もしくは１０の配列を含んでなり；かつ
ＣＤＲ−Ｌ３は、配列番号５の配列を含んでなる
を含んでなる軽鎖を含んでなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント。
【請求項９】
配列番号１の配列のＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３の配列のＣＤＲ−Ｌ２および配列番号５の配列のＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖を含んでなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント。
【請求項１０】
配列番号８の配列のＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１０の配列のＣＤＲ−Ｌ２および配列番号５の配列のＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖を含んでなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント。
【請求項１１】
下記の３つのＣＤＲ：
配列番号１の配列のＣＤＲ−Ｌ１；
配列番号３の配列のＣＤＲ−Ｌ２；および
配列番号５の配列ＣＤＲ−Ｌ３
を含んでなる軽鎖と、
下記の３つのＣＤＲ：
配列番号７の配列のＣＤＲ−Ｈ１；
配列番号４の配列のＣＤＲ−Ｈ２；および
配列番号１２の配列のＣＤＲ−Ｈ３
を含んでなる重鎖と
を含んでなる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント。
【請求項１２】
下記の３つのＣＤＲ：
配列番号８の配列のＣＤＲ−Ｌ１；
配列番号１０の配列のＣＤＲ−Ｌ２；および
配列番号５の配列のＣＤＲ−Ｌ３
を含んでなる軽鎖と、
下記の３つのＣＤＲ：
配列番号９の配列のＣＤＲ−Ｈ１；
配列番号１１の配列のＣＤＲ−Ｈ２；および
配列番号６の配列のＣＤＲ−Ｈ３
を含んでなる重鎖と
を含んでなる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント。
【請求項１３】
配列番号１３のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖配列を含んでなり、かつ、配列番号１４のアミノ酸配列を含んでなる重鎖配列を含んでなる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント。
【請求項１４】
配列番号１７のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖配列を含んでなり、かつ、配列番号１８または１９のアミノ酸配列を含んでなる重鎖配列を含んでなる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント。
【請求項１５】
誘導化合物が、初期抗体のパラトピック認識特性の総てまたは一部を保存するように少なくとも１つのＣＤＲがグラフトされているペプチドスキャフォールドを含んでなる結合タンパク質からなる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント。
【請求項１６】
ペプチドスキャフォールドが、ａ）系統発生的によく保存されており、ｂ）強固な構造であり、ｃ）周知の三次元分子構成を有し、ｄ）サイズが小さく、および／またはｅ）安定性を改変することなく欠失および／または挿入により改変可能な領域を含んでなるタンパク質の中から選択される、請求項１５に記載の抗体またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント。
【請求項１７】
前記ペプチドスキャフォールドが、ｉ）フィブロネクチン、優先的にはフィブロネクチン３型ドメイン１０に由来するスキャフォールド、リポカリン、アンチカリン、黄色ブドウ球菌のＡタンパク質のドメインＢに由来するＺタンパク質、チオレドキシンＡ、または「アンキリンリピート」、「アルマジロリピート」、「ロイシンリッチリピート」および「テトラトリコペプチドリピート」などの繰り返しモチーフを有するタンパク質、またはｉｉｉ）ニューロンＮＯシンターゼのタンパク質阻害剤（ＰＩＮ）の中から選択される、請求項１５または請求項１６に記載の抗体またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント。
【請求項１８】
前記機能的フラグメントが、フラグメントＦｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃおよびダイアボディー、またはＰＥＧ化フラグメントなどの半減期が延長されているいずれかのフラグメントの中から選択される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント。
【請求項１９】
前記抗体がネズミ抗体であり、および配列番号１５のアミノ酸配列の軽鎖と、配列番号１６のアミノ酸配列の重鎖とを含んでなる、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント。
【請求項２０】
前記抗体がマウスとは異種の抗体に由来する軽鎖および重鎖の定常領域も含んでなるキメラ抗体である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント。
【請求項２１】
前記の異種がヒトである、請求項２０に記載のキメラ抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント。
【請求項２２】
ヒト抗体に由来する軽鎖および重鎖の定常領域が、それぞれλまたはκ領域およびγ−１、γ−２またはγ−４領域である、請求項２１に記載のヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント
【請求項２３】
２００６年７月６日にＩ−３６４６番としてthe CNCM, Pasteur Institute, Parisに提出されたネズミハイブリドーマ。
【請求項２４】
請求項２３に記載のハイブリドーマにより分泌される抗体。
【請求項２５】
ＪＡＭ−Ａ（結合部接着分子−Ａ）タンパク質と特異的に結合できる、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント。
【請求項２６】
ＪＡＭ−Ａタンパク質に対するＫｄがおおよそ１ｎＭ〜１ｐＭの間、より優先的には１０ｐＭ〜４０ｐＭの間である、請求項２５に記載の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント。
【請求項２７】
下記の核酸：
ａ）請求項１〜２２および２４〜２６のいずれか一項に記載の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントをコードする核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡ；
ｂ）ａ）で定義された核酸と相補的な核酸；
ｃ）高ストリンジェント条件下で配列番号２０〜３１の核酸配列のＣＤＲの少なくとも１つとハイブリダイズし得る少なくとも１８ヌクレオチドの核酸；および
ｄ）高ストリンジェント条件下で少なくとも配列番号３２もしくは３６の核酸配列の軽鎖および／または配列番号３３、３７もしくは３８の核酸配列の重鎖とハイブリダイズし得る少なくとも１８ヌクレオチドの核酸
の中から選択される単離された核酸。
【請求項２８】
請求項２７に記載の核酸からなるベクター。
【請求項２９】
請求項２８に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項３０】
請求項２９に記載のベクターにより形質転換された細胞を含んでなる、ヒト以外のトランスジェニック動物。
【請求項３１】
請求項１〜２２および２４〜２６のいずれか一項に記載の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントを製造する方法であって、下記の工程：
ａ）請求項２９に記載の宿主細胞の培地で、請求項２９に記載の宿主細胞に好適な培養条件にて培養すること；および
ｂ）このようにして培養培地から、または培養細胞から生産された抗体またはその機能的フラグメントの１つを回収すること
を含む、方法。
【請求項３２】
二重特異性抗体からなり、受容体ＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＨＥＲ２ｎｅｕ、ＨＧＦ、ｃＭＥＴ、ＦＧＦ、ＣＸＣＲ４およびＣＸＣＲ２の中から選択される、腫瘍発達に関連する受容体と相互作用し得る第二のモチーフを含んでなる、請求項１〜２２および２４〜２６のいずれか一項に記載の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント。
【請求項３３】
薬剤として用いるための、請求項１〜２２、２４〜２６および３２のいずれか一項に記載の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント。
【請求項３４】
請求項１〜２２、２４〜２６、３２および３３のいずれか一項に記載の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントからなる化合物を有効成分として含んでなる、組成物。
【請求項３５】
同時、個別または継続形式で用いるための組合せ製品として、ＪＡＭ−Ａタンパク質に対する抗体以外の抗腫瘍抗体をさらに含んでなる、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
同時、個別または継続形式で用いるための組合せ製品として、細胞傷害性／細胞増殖抑制剤をさらに含んでなる、請求項３４または請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
前記細胞傷害性／細胞増殖抑制剤が、同時使用のための前記組成物の少なくとも１つの要素と化学的に結合されている、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
少なくとも１つの前記抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントが、細胞毒および／または放射性同位元素にコンジュゲートされている、請求項３４〜３７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３９】
薬剤として用いるための、請求項３４〜３８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４０】
腫瘍細胞の増殖に関連する疾病の予防または治療のための薬剤の製造のための、請求項１〜２２、２４〜２６、３２および３４のいずれか一項に記載の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント、および／または請求項３３〜３８のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項４１】
癌の予防または治療のための薬剤の製造のための、請求項４０に記載の使用。
【請求項４２】
前記癌が前立腺癌、骨肉腫、肺癌、乳癌、子宮内膜癌、多発性骨髄腫、卵巣癌、膵臓癌および結腸癌の中から選択される癌である、請求項４１に記載の使用。
【請求項４３】
前記癌がエストロゲン関連乳癌、非小細胞肺癌、結腸癌および膵臓癌の中から選択される癌である、請求項４２に記載の使用。
【国際調査報告】
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