(57)【要約】  本発明は、少なくとも１つのアレルゲン由来の少なくとも一つのポリペプチドを示すために生成された造血（幹）細胞を移植することによって、少なくとも１つのアレルゲン由来の少なくとも１つのポリペプチドに対して、持続性があり頑強な特異的免疫寛容を誘引する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのアレルゲンに由来する少なくとも１つのポリペプチドをコードする核酸又はＤＮＡ分子を造血細胞に導入することによって、上記少なくとも１つのポリペプチドを細胞外に発現及び提示する造血細胞を生成する方法であって、
上記少なくとも１つのポリペプチドは、分泌シグナル配列、膜アンカー領域、及び／又は膜貫通領域に融合されている、方法。
【請求項２】
上記造血細胞は、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、造血幹細胞、好酸球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞及び樹状細胞からなる群より選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記少なくとも１つのポリペプチドをコードする上記ＤＮＡ分子は、ＤＮＡベクターに含まれていることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
上記ＤＮＡベクターは、ウイルスベクター、好ましくはレトロウイルスベクター、又はプラスミドベクターであることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
上記ベクターは、上記造血細胞に一過性に導入されていることを特徴とする請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
上記アレルゲンは、Ｐｈｌ  ｐ  １，Ｐｈｌ  ｐ  ２，Ｐｈｌ  ｐ  ５，Ｐｈｌ  ｐ  ６，Ｄｅｒ  ｐ  １，Ｄｅｒ  ｐ  ２，Ｄｅｒ  ｐ  ５，Ｄｅｒ  ｐ  ７，Ｄｅｒ  ｐ  ２１，Ｆｅｌ  ｄ  １，Ｂｅｔ  ｖ  １，Ｏｌｅ  ｅ  １，Ｐａｒ  ｊ  ２，Ｃａｎ  ｆ  １及びＣａｎ  ｆ  ２からなる群より選択されることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
上記アレルゲンの誘導体が、低アレルギー性であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに１項に記載の方法。
【請求項８】
上記ＤＮＡ分子は、化学的方法、好ましくはカチオン性脂質及びカチオン性ポリマーを用いた方法、物理的方法、好ましくは粒子衝突、マイクロインジェクション若しくはエレクトロポレーションを用いた方法、細胞表面受容体若しくは多量のリン脂質とのウイルス外被の相互作用によるウイルス法によって、造血細胞に導入されることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
アレルゲン由来のポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸分子を含み、
少なくとも１つの上記ポリペプチドは、分泌シグナル配列、膜アンカー領域、及び／又は膜貫通領域に融合されている、哺乳動物ウイルスベクターＤＮＡ。
【請求項１０】
上記アレルゲンは、Ｐｈｌ  ｐ  １，Ｐｈｌ  ｐ  ２，Ｐｈｌ  ｐ  ５，Ｐｈｌ  ｐ  ６，Ｄｅｒ  ｐ  １，Ｄｅｒ  ｐ  ２，Ｄｅｒ  ｐ  ５，Ｄｅｒ  ｐ  ７，Ｄｅｒ  ｐ  ２１，Ｆｅｌ  ｄ  １，Ｂｅｔ  ｖ  １，Ｏｌｅ  ｅ  １，Ｐａｒ  ｊ  ２，Ｃａｎ  ｆ  １及びＣａｎ  ｆ  ２からなる群より選択されることを特徴とする請求項９に記載のベクター。
【請求項１１】
上記アレルゲンの誘導体は、低アレルギー性であることを特徴とする請求項９又は１０に記載のベクター。
【請求項１２】
モロニーマウス白血病レトロウイルスの末端反復配列（ＬＴＲ）若しくは骨髄増殖性肉腫ウイルス（ＭＰＳＶ）の末端反復配列プロモーター−エンハンサーエレメント、プロモーター、好ましくはアルブミンプロモーター若しくはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、複製起点、好ましくはＥＢＶ若しくはＳＶ４０の複製起点、又はヒト染色体Ｓ／ＭＡＲを含んでいることを特徴とする請求項９〜１１のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法によって得られた、造血細胞。
【請求項１４】
上記少なくとも１つのポリペプチドが、膜アンカードメイン又は膜貫通ドメインに融合されていることを特徴とする請求項１３に記載の細胞。
【請求項１５】
上記少なくとも１つのポリペプチドが、細胞膜の細胞外側に結合されていることを特徴とする請求項１３又は１４に記載の細胞。
【請求項１６】
請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の哺乳類ウイルスベクターＤＮＡを含んでいる、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１７】
上記造血細胞は、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、造血幹細胞、好酸球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞及び樹状細胞からなる群より選択されることを特徴とする請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１８】
アレルギーの治療又は予防のための医薬を製造するための、請求項９〜１２のいずれか１項に記載のベクターＤＮＡの使用、又は請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の造血細胞の使用。
【請求項１９】
請求項９〜１２のいずれか１項に記載のベクターＤＮＡ、又は請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の造血細胞を含んでいる、薬剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、アレルゲン及びその誘導体を導入する方法に関し、アレルギー又は過敏症の予防及び治療手段に関する(Coombs RRA, Gell PGH, Clinical Aspects of Immunology, chapter 13. Oxford: Blackwell Science,1997;23-25)。
【０００２】
アレルギーは、通常は無害な外来性（すなわち、非自己）物質(「アレルゲン」)に対する反応能力が、遺伝的又は後天的に、特異的に入れ替わることである。アレルギーは、影響を受けた臓器系の炎症反応(皮膚、結膜、鼻、咽頭、気管支粘膜、胃腸管)、アレルギー性鼻炎、結膜炎、皮膚炎、アナフィラキシーショック及び喘息等の即時性病徴、並びに喘息及びアトピー性皮膚炎における後期反応等のような慢性的な疾患症状に関連している。
【０００３】
Ｉ型アレルギーは、産業化された世界の人口のおよそ２０％に影響を及ぼす、遺伝的過敏症疾患を意味している。Ｉ型アレルギーの病態生理学的な特徴は、通常無害な抗原（アレルゲン）に対して、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）抗体を産出することである。
【０００４】
現在、アレルギーに対する唯一の原因治療法は、アレルゲン特異的免疫療法である。この方法では、特異的アレルゲン無反応を誘発するために、アレルゲンの量を徐々に増やしながら患者に投与する。しかしながら、この方法は、立証されているとおり、例えば部分的にしか有効でなかったり、副作用が起こるリスクがかなり高かったりする等の制限がある。したがって、現在も治療及び予防のための改善された方法は見つかっていない。
【０００５】
アレルゲン特異的免疫療法の最大の弱点は、天然のアレルゲン抽出物の利用に依存している点である。これらを、少なくとも工業的に生産できる程度にまで水準を統一することは、たとえ不可能ではなかったとしてもかなり困難である。このような天然のアレルゲン抽出物は、様々なアレルギー性及び非アレルギー性の化合物からなる。したがって、投与された抽出物に特定のアレルゲンが存在していない可能性や、又は、さらにひどい場合には、治療の過程で患者が化合物に対して新たにＩｇＥ特異性を発現してしまう可能性がある。抽出物による治療での他の弱点は、生物学的に活性状態のアレルゲン製剤を投与することによって、アナフィラキシー性の副作用が起きる場合があることである。
【０００６】
アレルゲンを特徴付ける分野において、分子生物学的技術を応用することによって、全ての関連する環境アレルゲンをコードするｃＤＮＡを単離し、組換えアレルゲンを産出することが可能になった。このような組換えアレルゲンを用いることで、生体外で行う診断（すなわち、血清中のアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体の検出）又は生体内検査による、個々の患者の反応形態を決定することができるようになった。この技術をもとに、アレルギー、特にＩ型アレルギーに対する、患者の感作形態に適合した新しい成分に基づくワクチン接種方法が開発されるかのように思われた。しかし、組換えアレルゲンと天然のそれらの対応物との類似性により、組換えアレルゲンもまた著しいアレルギー活性を有する。組換えアレルゲンが、野生型アレルゲンのアレルギー活性を精確に模倣するため、天然のアレルゲンを用いる免疫療法において、アレルギー活性によって起きる障害が全て、組換えアレルゲンにおいても生じる。免疫療法を改善するためには、アナフィラキシー性の副作用のリスクを低く保ちながらも投与可能なアレルゲンの量を増やせるように、組換えアレルゲンのアレルギー活性を低減する必要がある。
【０００７】
別の提案は、遺伝子工学によって低アレルギー性のアレルゲンを産出することである。この提案は、アレルゲンが、わずかなアミノ酸残基のみが異なる、及び／又は低ＩｇＥ結合能を有する立体構造においてのみ異なるアイソフォームとして、天然に生じ得るという所見に基づいている。例えば、主要なシラカンバ花粉アレルゲンであるＢｅｔ  ｖ  １のオリゴマー形成によって、アレルギー活性が著しく低下した組換え三量体が遺伝子工学的に得られた。あるいは、アレルゲン構造の立体構造上の変化、及びこれによる非連続的なＩｇＥエピトープの分解を引き起こすか、ＩｇＥ結合能に直接影響を与えるかのいずれかのために、点変異導入することが提案されている(Valenta et al.,Biol.Chem.380(1999),815-824)。
【０００８】
アレルゲンをいくつかの部分（例えば、２つの部分）に断片化してアレルゲンの天然様折り畳み構造を失わせることによって、ＩｇＥ結合能及びアレルギー活性がほぼ完全に失われることも示されている。例えば、Ｂｅｔ  ｖ  １について、(Vrtala et al.(J.Clin.Invest.99(1997),1673-1681)、Ｂｅｔ  ｖ  ４について、Twardosz et al.(BBRC 239(1997),197-204)、Ａｌｎ  ｇ  ４について、Hayek et al.(J. Immunol.161(1998),7031-7039)、ウシ鱗屑アレルゲンについて、Zeiler et al.(J.Allergy Clin.Immunol.100(1997),721-727)、Ｌｅｐ  ｄ２について、Elfman(Int.Arch.Allergy Immunol.117 (1998),167-173)、Ｐｈｌｐ  ７について、Westritschnig (J.Immunol.172 (2004), 5684-5692)などが記載されている。主として非連続／立体構造ＩｇＥエピトープを含むタンパク質を断片化することは、アレルゲンのＩｇＥ結合能の実質的な低下を引き起こす。この知見に基づいて、先行技術では、このような低アレルギー性のアレルゲン断片が、ｉｎ  ｖｉｖｏで防御免疫反応を引き起こし得るか否かの研究が進められてきた(Westritschnig et al.(Curr. Opinion in Allergy and Clin. Immunol. 3(2003),495-500)。
【０００９】
現在の免疫療法は、基本的にＩｇＥ結合能を低下させたアレルゲンやその誘導体を、経口、粘膜、皮下、又は静脈を介して投与することで行われている。免疫療法は、ＩｇＧ反応を引き起こす、活性ワクチン接種治療である。このアプローチは、例えばアレルギー反応を完全には取り除く効果がないことや、その効果の持続期間が制限されていることなど、いくつかの欠点に起因した制限がある。
【００１０】
ＷＯ００／６６７１５は、共同刺激因子受容体が抑制された抗原提示細胞に関する。ここでの抗原提示細胞は、例えば、樹状細胞であり得る。これらの抗原提示細胞は、目的の抗原をコードする遺伝子を運ぶウイルスベクター、微生物ベクター、プラスミド等のような核酸分子を導入することによって処理することができる。これにより、他において通常、ＩｇＥ反応を引き起こす原因となるアレルゲンとなり得る、抗原を抗原提示細胞に発現させる。これらの細胞中のアレルゲン抗原は、ＭＣＨ分子において提示される。ＷＯ０１／５１６３１は、ポリペプチド及びペプチドを組み替え的に発現するように改変した樹状細胞に関する。これらのポリペプチド及びペプチドは抗原性を有し、対応する抗体の形成を引き起こす。このような樹状細胞は、ポリペプチド又はペプチドが関連する疾患を治療するために用いられる。このポリペプチドは、ＭＣＨ分子において提示される。
【００１１】
Sudoweらの文献(Journal of Allergy and Clinical Immunology 117(2006):196-203)では、アレルゲンβ−ガラクトシダーゼで操作的に色づけしたｆａｓｃｉｎプロモーターを含むベクターを用いた、皮膚由来の樹状細胞のトランスフェクションが記載されている。
【００１２】
Amineva S Pらの文献(Official Journal of the Virology Division of the International Union of Microbiological Societies 115(2006):1933-3416)は、アレルギー誘発性タンパク質（オボムコイド）をコードする核酸分子を運ぶピコルナウイルスベクターに関する。このベクターは、アレルギー誘発性タンパク質の細胞間提示に有用な手段であり、アレルギー性感作の予防のために生体内に用いることができるとして記載されている。Forman Daronら(Journal of Immunology 176(2006):3410-3416)、Tian Chaoruiら(Journal of Immunology 173 (2004):7217-7222)及びBagley Jessamynら(Transplantation(Hagerstown)84(2007):38-41)の文献には、臓器移植における許容誘導に関する。ＩｇＥ媒介アレルギーは、アロ免疫及び自己免疫疾患から根本的に区別される。
【００１３】
Nagato Toshihiroら(Journal of Immunology 178(2007):1189-1198)、Akdisら(Journal of Allergy and Clinical Immunology 119(2007):780-789)、及びHochreiter Romanaら(European Journal of Immunology 33(2003):1667-1676)の文献には、許容ストラテジーに関連する免疫機構（特に、制御性Ｔ細胞）について、検討している。ＨＳＣに基づいたアプローチが、排他的又は優勢に、末梢機構（すなわち、制御性Ｔ細胞）ではなく、中央許容機構（すなわち、胸腺内）に依存していることで特徴づけられていることは、ごく一般的に知られている。
【００１４】
本発明の目的は、従来のアレルゲン免疫療法とは全く異なる方針に基づいた、アレルギーの予防及び治療に用いられる、改善された方針の手段及び方法を提供することにある。本発明の別の目的は、アレルギー反応の進行をほぼ生涯を通じて予防することが可能な手段を提供することである。
【００１５】
そのため、本発明は、少なくとも１つのポリペプチドを、細胞外で発現して提示することによって、造血細胞を生成する方法であって、上記少なくとも１つのアレルゲンに由来する少なくとも１つのポリペプチドをコードするＤＮＡ分子又は核酸分子を上記細胞に導入することによって造血細胞を生成し、上記少なくとも１つのポリペプチドは、分泌シグナル配列、膜結合領域及び／又は膜貫通領域に融合している、方法である。
【００１６】
本発明の方法によって得られる造血細胞を移植することによって、アレルゲンに対して許容する結果をもたらし、そのアレルゲンに対して生涯にわたって特異的に許容するように誘引される。実施例では、この造血細胞が得られたマウスと、遺伝的に同一のマウスに、当該細胞を移植した。この同系マウスモデルは、ヒトにおいて、ｅｘ  ｖｉｖｏで自身の細胞を改変し、同一固体に再度移植する（すなわち、自家移植）臨床状況と同等である。
【００１７】
本発明は、高度に選択及び標的設定された方法である。導入されたアレルゲンに対して免疫反応が、完全に、特異的に、かつ永久的に発生しないことで特徴づけられる、最も高度な免疫寛容を引き起こすことが、本発明に固有のものである。他の抗原／アレルゲンに対する免疫反応は影響を受けない。文献に記載されている他の方法は、一般に、アレルゲンに対して逸脱した免疫反応を引き起こし、ＩｇＥが介在する抗アレルゲン免疫反応を無効にする（臨床的に使用されている免疫療法等）。これと明確に対照的に、実施例では、関連のないアレルゲンに対する免疫反応が影響を受けない状態で、導入した特異的アレルゲンに対する免疫反応が免疫系のいかなるレベルにおいてもない（ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ３、ＩｇＡ、Ｔ細胞応答、エフェクター細胞応答のいずれもない）ことが実証されている。導入されたアレルゲンは自己抗原と同様に被提供者の免疫系によって処理されているため、被提供者に導入されたアレルゲンが繰り返し体外から導入されたとしても、それに対して有害な免疫反応が発生するのを防ぐことができる。
【００１８】
造血細胞は、アレルゲンに由来するポリペプチドを生成するように改変された場合に、アレルギーの予防及び治療に有利に用いることができる。本発明に係る造血細胞はポリペプチドを生成及び分泌することが可能であり、免疫システムに曝露されて、Ｔ細胞、Ｂ細胞、及びエフェクター細胞レベルにおいて、当該ポリペプチドに対して特異的に免疫寛容を誘発する。さらなる有利な点は、造血細胞は、改変された後（自家移植造血細胞）に、個体に移植又は再移植することができる。
【００１９】
造血（幹）細胞は特有の特徴を有する（他の細胞種にはない）独特の細胞集団である。すなわち、自己回復能力があり、全ての造血系統（例えば、リンパ球、樹状細胞）に分化することができる。
【００２０】
成熟した又は未成熟の造血細胞は、公知の方法で個体から単離することができる。特に、骨髄、臍帯血、又はＧ−ＣＳＦ（顆粒球刺激因子）分離末梢血から造血幹細胞又は造血前駆細胞が得ることが好ましい(Shizuru, Negrin and Weissman,Annu Rev Med 56(2005):509-38;Copelan E.A.,N Engl J Med 354(17):1813-1826)。
【００２１】
臓器移植の分野では、アロ抗原に対する寛容を誘発する方法として、造血キメラ化の誘発が研究されている(Wekerle and Sykes,Annu Rev Med 2001;52:353-70)。この計画では、ドナーの造血細胞（例えば、骨髄の形態のもの）は、適切に準備された被提供者に移植される。この被提供者は、同一のドナーから臓器移植片の提供も受ける。造血ドナー細胞は、長期的に持続し、被提供者をキメラ化し、特に同種異系のドナーに対して寛容となる。あるいは、被提供者自身の造血細胞が、ドナーＭＨＣアロ抗原を発現するように、ｉｎ  ｖｉｔｏｒｏで改変される(Madsen et al.,Nature 1988,332:161-164;Iacomini et al.Blood 99:4394-4399,2002;Sonntag KC et al.J Clin Invest 107:65-71,2001)。続いて、改変された細胞は元の個体に移植し戻され、いわゆる分子キメラ化及び単一ドナーアロ抗原に対する寛容を誘引する。この方法は、Ｉ型糖尿病又は多発性硬化症のマウスモデルにおいて、自己免疫疾患の治療法としても応用されている(Steptoe et al. J Clin Invest 111:1357-1363,2003;Xu et al. Mol Ther 13:42-48,2006)。
【００２２】
Ｉ型アレルギー反応はアロ免疫及び自己免疫疾患から区別される。これらの区別されたもののそれぞれは、例えば原因及び誘因の相違、並びにエフェクター細胞の種類及びエフェクター機構の相違等、数多くの免疫特性において異なる。その上、アレルギーは全く異なる別の臨床疾患であり、異なる療法を用いて治療される。本発明が得られる以前は、アレルゲンを提示するように改変された自家造血幹細胞の移植は、アレルギーと関連付けて研究も使用もされていない。
【００２３】
本発明によれば、上記少なくとも１つのポリペプチドは、分泌シグナル配列、膜アンカー領域、及び／又は膜貫通領域に融合されている。
【００２４】
分泌シグナル配列単体、又は分泌シグナル配列と膜アンカー領域もしくは膜貫通領域との組み合わせのいずれかに融合した本発明のポリペプチドは、本発明の少なくとも１つのポリペプチドを細胞外マトリックスに分泌する、又は細胞膜の細胞外側に結合されている本発明の少なくとも１つのポリペプチドを有する、造血細胞の生成を可能にする。このような細胞は、アレルゲンに由来する本発明のポリペプチドを個体の免疫系に提示するのに適している。本発明のポリペプチドは、ポリペプチドが細胞表面に固定されるように、分泌シグナル配列と膜結合領域又は膜貫通領域に融合されているので、が特に有利である。こうすることで、ポリペプチドを細胞から放出することなく、ポリペプチドを免疫系に曝露することができる。その結果、従来の方法に比べて、アレルゲンに対する免疫を確立する細胞をより効率的に得ることができる。
【００２５】
分泌シグナル配列、膜アンカー領域、及び膜貫通領域は、当業者に周知のものを用いることが好ましい。(Coloma et al., J Imm Methods 152(1992):89-104;Gronwald et al., Proc Natl Acad Sci USA 85(1988):3435-3439)
本発明において、「少なくとも１つのアレルゲンに由来するポリペプチド」（「アレルゲン誘導体」）とは、アレルゲン又はその断片もしくは誘導体である少なくとも１つのポリペプチドを、ＤＮＡベクターのＤＮＡ領域がコードしていることを意味する。アレルゲン誘導体は、野生型アレルゲンの誘導体の中で、特にアレルギー誘発性が著しく低下した野生型アレルゲンの誘導体を含んでいる。アレルギー誘発性は、いくつかの手段によって低下させることができ、その手段の全てにおいて、分子内の二硫化ブリッジを分裂させることによってタンパク質の形態を不安定にし、それによって三次元構造を不安定化させることを目的としている。これらの誘導体はＴ細胞反応性を保持しながらもアレルギー誘発性を低下させることができ、野生型アレルゲンとの結合性においてＩｇＥと競合するアレルゲン特異的ＩｇＧを特に誘発する免疫原を、高用量全身投与するのにより適している。したがって、低アレルギー性の誘導体は、療養及び予防目的に適している。
【００２６】
アレルゲン誘導体、特に低アレルゲン性ポリペプチドの生成は、ネイティブな配列に変異を導入することにより行われてもよい。これは、以下の方法によって得ることができる。タンパク質の三次元構造に置換、欠失、又は付加を導入する、又はタンパク質が三次元の構成を失うように三次元構造を変性することによって得ることができる。これは、他と同様に、タンパク質を断片的に発現させるか、二硫化ブリッジ形成に関与するシステイン残基を欠失させるか、タンパク質の三次構造が実質的に変性するように残基を付加することにより、得ることができる。
【００２７】
低アレルギー性のアレルゲンは、Ｔ細胞反応性及び／又は野生型アレルゲンに対する免疫反応を刺激する能力を残しつつ、ＩｇＥ結合反応性及び／又はそのヒスタミン放出活動を低減又は消滅させるように、変質させることが好ましい。変異アレルゲンのアレルギー誘発性、及び結果としてそのアレルギー誘発性の低下は、ヒスタミン放出活性、又はＩｇＥ結合反応性によるいずれかの方法で、野生型と比較されてもよい。。「実質的に低下したアレルギー誘発性」とは、残基ＩｇＥ結合活性によって計測されたアレルギー誘発性が、ネイティブな無改変又は無変質のタンパク質の活性に比べて最大５０％、好ましくは最大２０％、より好ましくは最大１０％、さらに好ましくは最大５％、さらにより好ましくは５％未満、低下していることを意味する。あるいは,「実質的に」はまた、変異体のヒスタミン放出活性が天然のタンパク質と比べて、少なくとも１００倍因子、好ましくは１０００倍因子、さらに好ましくは１００００倍因子、減少していることを意味する。
【００２８】
本発明に係るアレルゲン誘導体は、少なくとも１つのアレルゲン、好ましくは野生型アレルゲンの断片同士をネイティブ配列とは異なる配列で融合させることによって得られる、改造又はモザイクポリペプチドであってもよい（例えば、ＷＯ２００４／０６５４１４参照）。
【００２９】
本明細書で用いられる「ポリペプチド」とは、ペプチド結合を介して共有結合された、少なくとも５個（好ましくは少なくとも７個、８個、又は１０個）の、アミノ酸残基を有する分子のことである。
【００３０】
本明細書において用いる場合、「少なくとも１つのアレルゲンに由来する少なくとも１つのポリペプチド」は、ポリペプチドが、アレルゲンのアミノ酸配列全体又はその断片を有していることを示している。
【００３１】
アレルゲンの断片は、その少なくとも１つのアレルゲンの、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個の連続するアミノ酸を有している。さらに、その少なくとも１つのアレルゲンに由来する少なくとも１つのポリペプチドは、アレルゲンに関連する配列又は配列断片と、少なくとも８０％（好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、特に１００％）の同一性を示す。
【００３２】
もちろん、ポリペプチドは、１より多くのアレルゲン又はその断片を融合して有していてもよく、ポリペプチドがＩｇＥと結合しない、又は実質的に結合しない、１以上のＴ細胞エピトープを有することが好ましい。
【００３３】
本発明によれば、「同一性」（「同一」）は、比較時間を通して、２つの最適に位置あわせした配列を比較することによって決定される。比較時間の間、アミノ酸配列の断片は、２つの配列を最適に位置あわせするために、（付加又は失欠を有さない）参考配列と比べて、付加又は失欠（例えば、間隙やはみ出し）を有していてもよい。一般的には、最高次一致が得られるように、配列は位置あわせされている（例えば、Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York,1988;Biocomputing:Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993;Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds.,Humana Press,New Jersey,1994;Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G. , Academic Press,1987;及びSequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York,1991;Carillo et al.(1988) SIAM J Applied Math 48:1073を参照）。
【００３４】
いかなる２つのアミノ酸分子においても、例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％「同一」のアミノ配列を有するかどうかは、「ＦＡＳＴ  Ａ」プログラムのような公知のコンピュータアルゴリズムを用いて、例えば、PearsonらのPNAS USA 85:2444(1988)（他のプログラムは、ＧＣＧプログラムパッケージ(Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research (1984) Nucleic Acids Res., 12, 387-395)、BLASTP、BLASTN、FASTA(Altschul, S.F., et al., J Molec Biol 215: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, and Carilloet al, (1988)SIAM J Applied Math 48 : 1073を有する)に記載のデフォルトパラメータを用いて判断される。例えば、ＮＣＢＩデータベースのＢＬＡＳＴツールを同一性判断に用いることができる。他の商業的又は公然に提供されているプログラムとして、ＤＮＡＳｔａｒの「ＭｅｇＡｌｉｇｎ」プログラム（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）及びウィスコンシン大学遺伝子コンピュータグループ（ＵＷＧ）の「Ｇａｐ」プログラム（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｕ））が挙げられる。タンパク質及び／又はペプチドの同一性割合は、例えば、ＧＡＰコンピュータプログラム（例えばSmith and Waterman(1981)によって改訂された（Adv. Appl. Math.2:482）、Needleman et al.,(1970) J. Mol. Biol. 48:443）を用いて配列情報を比較することで決定することができる。簡単に言えば、ＧＡＰプログラムは類似性を、類似する配列記号（すなわち、ヌクレオチド又はアミノ酸）の数を、２つの配列のうちの短い配列にある記号の合計数で割った数として定義している。ＧＡＰプログラムのデフォルトパラメーターは、次を含むことができる：（１）単一比較マトリックス（同一性及び非同一性を示す１の値を有する）、及びSchwartz and Dayhoff, eds., ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358(1979)に記載のGribskov et al. 14:6745の荷重比較マトリックス；（２）各間隙に３．０のペナルティと、各間隙内の各記号につき、追加で０．１０ペナルティ；及び（３）末端間隙にはペナルティ無し。
【００３５】
本明細書で用いられているように、「少なくとも８０％同一」という表現は、参考アレルゲンに関連して、８０から９９．９９の同一性割合に関する。したがって、本発明のポリペプチドは、また、１以上のアミノ酸修飾（すなわち、置換、欠失、挿入）を含んでいてもよい。
【００３６】
８０％以上のレベルでの同一性は、１００のアミノ酸の試験的ポリペプチドと参考ポリペプチドとにおいて、例示を目的として長さを比較した場合、試験的ポリペプチドのアミノ酸残基の２０％（すなわち、１００のうちの２０）以下が参考ポリペプチドと異なることを示している。このような相違は、アミノ酸配列の全体の長さにわたってランダムに分布された点変異として示すことができる。又は、点変異は、様々な長さの１以上の場所に、可能な最大値、例えば２０／１００アミノ酸相違（およそ８０％同一性）まで集中していてもよい。相違はアミノ酸置換、挿入、又は欠失として定義される。８５から９０％程度以上の相同又は同一レベルにおいて、結果は、プログラム及び設定された間隙パラメータセットから独立しているべきである。このような高いレベルでの同一性は、しばしばソフトウェアに頼ることなく、容易に評価することができる。
【００３７】
造血細胞に導入される核酸又はＤＮＡ分子は、少なくとも１つのポリペプチドをコードする一続きの核酸又はＤＮＡを、収容するもしくは含むＤＮＡベクター又は他の核酸運搬媒体であることが好ましい。本発明の方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行うことが好ましい。
【００３８】
本明細書で用いられている「ＤＮＡベクター」は、例えば細菌性といったウイルス性、又は非ウイルス性種の、外来性又は異種核酸配列をコードするように設計されたＤＮＡ媒体を表している。そのため、この表現には従来の細菌性プラスミドが含まれている。このようなプラスミド又はベクターは、ウイルス又はファージからのプラスミド配列を含むことができる。このようなベクターとして、例えば細菌性プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、イースト染色体成分、及びウイルス（レトロウイルス等）に由来するベクターといった、染色体、エピソーム、及びウイルス由来のベクターが挙げられる。ベクターは、また、例えばプラスミド、ウイルス性及びバクテリオファージの真核性又は原核性遺伝因子、コスミド、並びにファージミドといった、ものを組み合わせたものに由来していてもよい。この表現はまた、１つの細胞から別の細胞へと遺伝子を運搬する非複製ウイルスをも含む。また、例えばポリリシン化合物といった、細胞内の核酸運搬を容易にする非プラスミド化合物及び非ウイルス性化合物も含むように解釈すべきである。そのため、本明細書で用いられる「ＤＮＡベクター」という表現は、「ＤＮＡ媒体」、「ウイルス」、「レトロウイルス」等の表現と交換可能に用いられる。
【００３９】
ＤＮＡベクターは転写調節因子（又はＤＮＡ調節因子）を含んでいてもよい。この転写調節因子は、目的の遺伝子に作動可能に連結されている場合に、その因子に特徴的な方法で目的の遺伝子の転写を変化させることができる。転写調節因子としては、プロモーター、エンハンサー、サプレッサー、転写開始部位、転写終了部位、ポリアデニル化部位等が挙げられる。
【００４０】
本発明に係るＤＮＡベクター又はＤＮＡ分子を用いて造血細胞を形質転換させるには、異種タンパク質ＤＮＡコンストラクトを、宿主細胞染色体ＤＮＡに挿入する、または染色体外形態で存在させるかのいずれかに依存したいくつかのシステムを用いることができる。
【００４１】
異種タンパク質のＤＮＡ配列に作動可能に連結されたプロモーターが、直鎖分子、又はより好ましくは自己複製ができない、閉じられた共有結合環状分子の非複製ＤＮＡ（又はＲＮＡ）分子として造血細胞に導入された場合、導入された配列の一過性発現を通して異種タンパク質が発現する可能性がある。
【００４２】
遺伝的に安定した形質転換体は、ベクターシステム又は形質転換システムを含んで構成されていてもよい。このことにより、異種タンパク質のＤＮＡが宿主染色体に統合される。このような統合は細胞内において新たに発生してもよく、又は宿主染色体に機能的に挿入されるベクターを用いた形質転換により補助されて発生してもよい。染色体挿入が可能なベクターは、例えば、レトロウイルスベクター、トランスポゾン、又は染色体におけるＤＮＡ配列、特に目的の染色体の挿入部位に異種同型のＤＮＡ配列の組込みを促進する他のＤＮＡエレメントが挙げられる。
【００４３】
導入されたＤＮＡを染色体に安定して組み込んだ細胞は、所望の配列を有する宿主細胞を選択可能とする１以上のマーカーを導入することによっても、選択される。例えば、マーカーは、例えば抗生物質又は銅等の重金属に対する寛容といったバイオサイドの寛容を提供してもよい。選択可能なマーカー遺伝子は、発現されるようにＤＮＡ遺伝子配列に直接結合していてもよく、又は同時トランスフェクションで同じ細胞に導入されてもよい。
【００４４】
他の好ましい実施の形態では、導入された配列は被提供者ホストの自己複製可能なプラスミド又はウイルス性ベクターに組み込まれる。以下に説明するように、この目的のために幅広い種類のいかなるベクターを採用することができる。
【００４５】
特定のプラスミド又はウイルス性ベクターを選択する際の重要なファクターとして、ベクターを含まない被提供者の細胞中から、ベクターを含む被提供者の細胞を認識及び選択できる容易さ、特定の宿主内におけるベクターの目的の複製数、並びに異なる種類の宿主細胞同士でベクターを入れ替えられることが望ましいかどうか、等が挙げられる。
【００４６】
好ましい真核プラスミドは、ウシパピローマウイルス、ワクシニアウイルス、及びＳＶ４０に由来するものが含まれる。このようなプラスミドは公知であり、一般に又は市販で入手可能である。プラスミドのコピー数を増幅させ、宿主細胞の染色体にプラスミドを融合させるために、ヘルパーウイルスを用いて同時形質移入することができる哺乳類発現ベクター系がその一例である。（Perkins, A. S. et al., Mol. Cell Biol. 3:1123(1983);クロンテック、米国）。
【００４７】
コンストラクトを含むベクター又はＤＮＡ配列を発現のために用意した後、トランスフェクション、エレクトロポレーション、又はリポソームを介した運搬等の様々な適した手段によって、ＤＮＡコンストラクトを造血細胞に導入する。トランスフェクション実験においては、ＤＥＡＥ−デキストラン又はリン酸カルシウムが好適に用いられる。
【００４８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでベクターを導入した後、被提供者の細胞を選択培地、すなわち、ベクター含有細胞の培養用に選択された培地で培養される。クローン遺伝子配列が発現することにより、異種タンパク質が生成される。
【００４９】
本発明の好ましい実施の形態によれば、造血細胞は単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、造血幹細胞、好酸球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞及び樹状細胞からなる群より選択される。
【００５０】
アレルゲン又はその断片、もしくは誘導体をコードする核酸分子を有するＤＮＡベクターは、上記の列挙された造血細胞の全ての種類に導入され得る。これら全ての細胞は、アレルゲンに由来するポリペプチドを発現及び分泌することができる。
【００５１】
ＤＮＡベクターは、好ましくはウイルスベクター、好ましくはレトロウイルスベクター、又はプラスミドベクターである（Papapetrou EP et al., Gene Therapy 12 (2005):118-130）。
【００５２】
本発明の好ましい実施の形態によれば、ベクターは、造血細胞に一過性に導入される。
【００５３】
ベクターを細胞に一過性に導入することによって、造血細胞からアレルゲン誘導体をコードするＤＮＡを経時的に欠失させることができる。これは、限られた時間しかアレルゲン誘導体の発現が必要でない場合に、特に有利である。例えば、トランスフェクトした造血細胞においてキメラ化を起こしてその個体の生涯にわたってアレルゲン誘導体を生成することになるリスクを負うことなく、個人に投与又は移植することができる。
【００５４】
本発明に係る方法は、いかなる種のアレルゲンに由来するポリペプチドを用いて行ってもよい。アレルゲンは、以下からなる群より選択されることが好ましい：Ａｍｂ  ａ  １，Ａｍｂ  ａ  ２，Ａｍｂ  ａ  ３，Ａｍｂ  ａ  ５，Ａｍｂ  ａ  ６，Ａｍｂ  ａ  ７，Ａｍｂ  ａ  ８，Ａｍｂ  ａ  ９，Ａｍｂ  ａ  １０，Ａｍｂ  ｔ  ５，Ａｒｔ  ｖ  １，Ａｒｔ  ｖ  ２，Ａｒｔ  ｖ  ３，Ａｒｔ  ｖ  ４，Ａｒｔ  ｖ  ５，Ａｒｔ  ｖ  ６，Ｈｅｌ  ａ  １，Ｈｅｌ  ａ  ２，Ｈｅｌ  ａ  ３，Ｍｅｒ  ａ  １，Ｃｈｅ  ａ  １，Ｃｈｅ  ａ  ２，Ｃｈｅ  ａ  ３，  Ｓａｌ  ｋ  １，Ｃａｔ  ｒ  １，Ｐｌａ  ｌ  １，Ｈｕｍ  ｊ  １，Ｐａｒ  ｊ  １，Ｐａｒ  ｊ  ２，Ｐａｒ  ｊ  ３，Ｐａｒ  ｏ  １，Ｃｙｎ  ｄ  １，Ｃｙｎ  ｄ  ７，Ｃｙｎ  ｄ  １２，Ｃｙｎ  ｄ  １５，Ｃｙｎ  ｄ  ２２ｗ，Ｃｙｎ  ｄ  ２３，Ｃｙｎ  ｄ  ２４，Ｄａｃ  ｇ  １，Ｄａｃ  ｇ  ２，Ｄａｃ  ｇ  ３，Ｄａｃ  ｇ  ５，Ｆｅｓ  ｐ  ４ｗ，Ｈｏｌ  ｌ  １，Ｌｏｌ  ｐ  １，Ｌｏｌ  ｐ  ２，Ｌｏｌ  ｐ  ３，Ｌｏｌ  ｐ  ５，Ｌｏｌ  ｐ  １１，Ｐｈａ  ａ  １，Ｐｈｌ  ｐ  １，Ｐｈｌ  ｐ  ２，Ｐｈｌ  ｐ  ４，Ｐｈｌ  ｐ  ５，Ｐｈｌ  ｐ  ６，Ｐｈｌ  ｐ  １１，Ｐｈｌ  ｐ  １２，Ｐｈｌ  ｐ  １３，Ｐｏａ  ｐ  １，Ｐｏａ  ｐ  ５，Ｓｏｒ  ｈ  １，Ｐｈｏ  ｄ  ２，Ａｌｎ  ｇ  １，Ｂｅｔ  ｖ  １，Ｂｅｔ  ｖ  ２，Ｂｅｔ  ｖ  ３，Ｂｅｔ  ｖ  ４，Ｂｅｔ  ｖ  ６，Ｂｅｔ  ｖ  ７，Ｃａｒ  ｂ  １，Ｃａｓ  ｓ  １，Ｃａｓ  ｓ  ５，Ｃａｓ  ｓ  ８，Ｃｏｒ  ａ  １，Ｃｏｒ  ａ  ２，Ｃｏｒ  ａ  ８，Ｃｏｒ  ａ  ９，Ｃｏｒ  ａ  １０，Ｃｏｒ  ａ  １１，Ｑｕｅ  ａ  １，Ｆｒａ  ｅ  １，Ｌｉｇ  ｖ  １，Ｏｌｅ  ｅ  １，Ｏｌｅ  ｅ  ２，Ｏｌｅ  ｅ  ３，Ｏｌｅ  ｅ  ４，Ｏｌｅ  ｅ  ５，Ｏｌｅ  ｅ  ６，Ｏｌｅ  ｅ  ７，Ｏｌｅ  ｅ  ８，Ｏｌｅ  ｅ  ９，Ｏｌｅ  ｅ  １０，Ｓｙｒ  ｖ  １，Ｃｒｙ  ｊ  １，Ｃｒｙ  ｊ  ２，Ｃｕｐ  ａ  １，Ｃｕｐ  ｓ  １，Ｃｕｐ  ｓ  ３ｗ，Ｊｕｎ  ａ  １，Ｊｕｎ  ａ  ２，Ｊｕｎ  ａ  ３，Ｊｕｎ  ｏ  ４，Ｊｕｎ  ｓ  １，Ｊｕｎ  ｖ  １，Ｐｌａ  ａ  １，Ｐｌａ  ａ  ２，Ｐｌａ  ａ  ３，Ａｃａ  ｓ  １３，Ｂｌｏ  ｔ  １，Ｂｌｏ  ｔ  ３，Ｂｌｏ  ｔ  ４，Ｂｌｏ  ｔ  ５，Ｂｌｏ  ｔ  ６，Ｂｌｏ  ｔ  １０，Ｂｌｏ  ｔ  １１，Ｂｌｏ  ｔ  １２，Ｂｌｏ  ｔ  １３，Ｂｌｏ  ｔ  １９，Ｄｅｒ  ｆ  １，Ｄｅｒ  ｆ  ２，Ｄｅｒ  ｆ  ３，Ｄｅｒ  ｆ  ７，Ｄｅｒ  ｆ  １０，Ｄｅｒ  ｆ  １１，Ｄｅｒ  ｆ  １４，Ｄｅｒ  ｆ  １５，Ｄｅｒ  ｆ  １６，Ｄｅｒ  ｆ  １７，Ｄｅｒ  ｆ  １８ｗ，Ｄｅｒ  ｍ  １，Ｄｅｒ  ｐ  １，Ｄｅｒ  ｐ  ２，Ｄｅｒ  ｐ  ３，Ｄｅｒ  ｐ  ４，Ｄｅｒ  ｐ  ５，Ｄｅｒ  ｐ  ６，Ｄｅｒ  ｐ  ７，Ｄｅｒ  ｐ  ８，Ｄｅｒ  ｐ  ９，Ｄｅｒ  ｐ  １０，Ｄｅｒ  ｐ  １１，Ｄｅｒ  ｐ  １４，Ｄｅｒ  ｐ  ２０，Ｄｅｒ  ｐ  ２１，Ｅｕｒ  ｍ  ２，Ｅｕｒ  ｍ  １４，Ｇｌｙ  ｄ  ２，Ｌｅｐ  ｄ  １，Ｌｅｐ  ｄ  ２，Ｌｅｐ  ｄ  ５，Ｌｅｐ  ｄ  ７，Ｌｅｐ  ｄ  １０，Ｌｅｐ  ｄ  １３，  Ｔｙｒ  ｐ  ２，Ｔｙｒ  ｐ  １３，Ｂｏｓ  ｄ  ２，Ｂｏｓ  ｄ  ３，Ｂｏｓ  ｄ  ４，Ｂｏｓ  ｄ  ５，Ｂｏｓ  ｄ  ６，Ｂｏｓ  ｄ  ７，Ｂｏｓ  ｄ  ８，Ｃａｎ  ｆ  １，Ｃａｎ  ｆ  ２，Ｃａｎ  ｆ  ３，Ｃａｎ  ｆ  ４，Ｅｑｕ  ｃ  １，Ｅｑｕ  ｃ  ２，  Ｅｑｕ  ｃ  ３，Ｅｑｕ  ｃ  ４，Ｅｑｕ  ｃ  ５，Ｆｅｌ  ｄ  １，Ｆｅｌ  ｄ  ２，Ｆｅｌ  ｄ  ３，Ｆｅｌ  ｄ  ４，Ｆｅｌ  ｄ  ５ｗ，Ｆｅｌ  ｄ  ６ｗ，Ｆｅｌ  ｄ  ７ｗ，Ｃａｖ  ｐ  １，Ｃａｖ  ｐ  ２，Ｍｕｓ  ｍ  １，Ｒａｔ  ｎ  １，Ａｌｔ  ａ  １，Ａｌｔ  ａ  ３，Ａｌｔ  ａ  ４，Ａｌｔ  ａ  ５，Ａｌｔ  ａ  ６，Ａｌｔ  ａ  ７，Ａｌｔ  ａ  ８，Ａｌｔ  ａ  １０，Ａｌｔ  ａ  １２，Ａｌｔ  ａ  １３，Ｃｌａ  ｈ  ２，Ｃｌａ  ｈ  ５，Ｃｌａ  ｈ  ６，Ｃｌａ  ｈ  ７，Ｃｌａ  ｈ  ８，Ｃｌａ  ｈ  ９，Ｃｌａ  ｈ  １０，Ｃｌａ  ｈ  １２，Ａｓｐ  ｆｌ  １３，Ａｓｐ  ｆ  １，Ａｓｐ  ｆ  ２，Ａｓｐ  ｆ  ３，Ａｓｐ  ｆ  ４，Ａｓｐ  ｆ  ５，Ａｓｐ  ｆ  ６，Ａｓｐ  ｆ  ７，Ａｓｐ  ｆ  ８，Ａｓｐ  ｆ  ９，Ａｓｐ  ｆ  １０，Ａｓｐ  ｆ  １１，Ａｓｐ  ｆ  １２，Ａｓｐ  ｆ  １３，Ａｓｐ  ｆ  １５，Ａｓｐ  ｆ  １６，Ａｓｐ  ｆ  １７，Ａｓｐ  ｆ  １８，Ａｓｐ  ｆ  ２２ｗ，Ａｓｐ  ｆ  ２３，Ａｓｐ  ｆ  ２７，Ａｓｐ  ｆ  ２８，Ａｓｐ  ｆ  ２９，Ａｓｐ  ｎ  １４，Ａｓｐ  ｎ  １８，Ａｓｐ  ｎ  ２５，Ａｓｐ  ｏ  １３，Ａｓｐ  ｏ  ２１，Ｐｅｎ  ｂ  １３，Ｐｅｎ  ｂ  ２６，Ｐｅｎ  ｃｈ  １３，Ｐｅｎ  ｃｈ  １８，Ｐｅｎ  ｃｈ  ２０，Ｐｅｎ  ｃ  ３，Ｐｅｎ  ｃ  １３，Ｐｅｎ  ｃ  １９，Ｐｅｎ  ｃ  ２２ｗ，Ｐｅｎ  ｃ  ２４，Ｐｅｎ  ｏ  １８，Ｆｕｓ  ｃ  １，Ｆｕｓ  ｃ  ２，Ｔｒｉ  ｒ  ２，Ｔｒｉ  ｒ  ４，Ｔｒｉ  ｔ  １，Ｔｒｉ  ｔ  ４，Ｃａｎｄ  ａ  １，Ｃａｎｄ  ａ  ３，Ｃａｎｄ  ｂ  ２，Ｐｓｉ  ｃ  １，Ｐｓｉ  ｃ  ２，Ｃｏｐ  ｃ  １，Ｃｏｐ  ｃ  ２，Ｃｏｐ  ｃ  ３，Ｃｏｐ  ｃ  ５，Ｃｏｐ  ｃ  ７，Ｒｈｏ  ｍ  １，Ｒｈｏ  ｍ  ２，Ｍａｌａ  ｆ  ２，Ｍａｌａ  ｆ  ３，Ｍａｌａ  ｆ  ４，Ｍａｌａ  ｓ  １，Ｍａｌａ  ｓ  ５，Ｍａｌａ  ｓ  ６，Ｍａｌａ  ｓ  ７，Ｍａｌａ  ｓ  ８，Ｍａｌａ  ｓ  ９，Ｍａｌａ  ｓ  １０，Ｍａｌａ  ｓ  １１，Ｍａｌａ  ｓ  １２，Ｍａｌａ  ｓ  １３，Ｅｐｉ  ｐ  １，Ａｅｄ  ａ  １，Ａｅｄ  ａ  ２，Ａｐｉ  ｍ  １，Ａｐｉ  ｍ  ２，Ａｐｉ  ｍ  ４，Ａｐｉ  ｍ  ６，Ａｐｉ  ｍ  ７，Ｂｏｍ  ｐ  １，Ｂｏｍ  ｐ  ４，Ｂｌａ  ｇ  １，Ｂｌａ  ｇ  ２，Ｂｌａ  ｇ  ４，Ｂｌａ  ｇ  ５，Ｂｌａ  ｇ  ６，Ｂｌａ  ｇ  ７，Ｂｌａ  ｇ  ８，Ｐｅｒ  ａ  １，Ｐｅｒ  ａ  ３，Ｐｅｒ  ａ  ６，Ｐｅｒ  ａ  ７，Ｃｈｉ  ｋ  １０，Ｃｈｉ  ｔ  １−９，Ｃｈｉ  ｔ  １．０１，Ｃｈｉ  ｔ  １．０２，Ｃｈｉ  ｔ  ２．０１０１，Ｃｈｉ  ｔ  ２．０１０２，Ｃｈｉ  ｔ  ３，Ｃｈｉ  ｔ  ４，Ｃｈｉ  ｔ  ５，Ｃｈｉ  ｔ  ６．０１，Ｃｈｉ  ｔ  ６．０２，Ｃｈｉ  ｔ  ７，Ｃｈｉ  ｔ  ８，Ｃｈｉ  ｔ  ９，Ｃｔｅ  ｆ  １，Ｃｔｅ  ｆ  ２，Ｃｔｅ  ｆ  ３，Ｔｈａ  ｐ  １，Ｌｅｐ  ｓ  １，Ｄｏｌ  ｍ  １，Ｄｏｌ  ｍ  ２，Ｄｏｌ  ｍ  ５，Ｄｏｌ  ａ  ５，Ｐｏｌ  ａ  １，Ｐｏｌ  ａ  ２，Ｐｏｌ  ａ  ５，Ｐｏｌ  ｄ  １，Ｐｏｌ  ｄ  ４，Ｐｏｌ  ｄ  ５，Ｐｏｌ  ｅ  １，Ｐｏｌ  ｅ  ５，Ｐｏｌ  ｆ  ５，Ｐｏｌ  ｇ  ５，Ｐｏｌ  ｍ  ５，Ｖｅｓｐ  ｃ  １，Ｖｅｓｐ  ｃ  ５，Ｖｅｓｐ  ｍ  １，Ｖｅｓｐ  ｍ  ５，Ｖｅｓ  ｆ  ５，Ｖｅｓ  ｇ  ５，Ｖｅｓ  ｍ  １，Ｖｅｓ  ｍ  ２，Ｖｅｓ  ｍ  ５，Ｖｅｓ  ｐ  ５，Ｖｅｓ  ｓ  ５，Ｖｅｓ  ｖｉ  ５，Ｖｅｓ  ｖ  １，Ｖｅｓ  ｖ  ２，Ｖｅｓ  ｖ  ５，Ｍｙｒ  ｐ  １，Ｍｙｒ  ｐ  ２，Ｓｏｌ  ｇ  ２，Ｓｏｌ  ｇ  ４，Ｓ���ｌ  ｉ  ２，Ｓｏｌ  ｉ  ３，Ｓｏｌ  ｉ  ４，Ｓｏｌ  ｓ  ２，Ｔｒｉａ  ｐ  １，Ｇａｄ  ｃ  １，Ｓａｌ  ｓ  １，Ｂｏｓ  ｄ  ４，Ｂｏｓ  ｄ  ５，Ｂｏｓ  ｄ  ６，Ｂｏｓ  ｄ  ７，Ｂｏｓ  ｄ  ８，Ｇａｌ  ｄ  １，Ｇａｌ  ｄ  ２，Ｇａｌ  ｄ  ３，Ｇａｌ  ｄ  ４，Ｇａｌ  ｄ  ５，Ｍｅｔ  ｅ  １，Ｐｅｎ  ａ  １，Ｐｅｎ  ｉ  １，Ｐｅｎ  ｍ  １，Ｐｅｎ  ｍ  ２，Ｔｏｄ  ｐ  １，Ｈｅｌ  ａｓ  １，Ｈａｌ  ｍ  １，Ｒａｎ  ｅ  １，Ｒａｎ  ｅ  ２，Ｂｒａ  ｊ  １，Ｂｒａ  ｎ  １，Ｂｒａ  ｏ  ３，Ｂｒａ  ｒ  １，Ｂｒａ  ｒ  ２，Ｈｏｒ  ｖ  １５，Ｈｏｒ  ｖ  １６，Ｈｏｒ  ｖ  １７，Ｈｏｒ  ｖ  ２１，Ｓｅｃ  ｃ  ２０，Ｔｒｉ  ａ  １８，Ｔｒｉ  ａ  １９，Ｔｒｉ  ａ  ２５，Ｔｒｉ  ａ  ２６，Ｚｅａ  ｍ  １４，Ｚｅａ  ｍ  ２５，Ｏｒｙ  ｓ  １，Ａｐｉ  ｇ  １，Ａｐｉ  ｇ  ４，Ａｐｉ  ｇ  ５，Ｄａｕ  ｃ  １，Ｄａｕ  ｃ  ４，Ｃｏｒ  ａ  １．０４，Ｃｏｒ  ａ  ２，Ｃｏｒ  ａ  ８，Ｆｒａ  ａ  ３，Ｆｒａ  ａ  ４，Ｍａｌ  ｄ  １，Ｍａｌ  ｄ  ２，Ｍａｌ  ｄ  ３，Ｍａｌ  ｄ  ４，Ｐｙｒ  ｃ  １，Ｐｙｒ  ｃ  ４，Ｐｙｒ  ｃ  ５，Ｐｅｒｓ  ａ  １，Ｐｒｕ  ａｒ  １，Ｐｒｕ  ａｒ  ３，Ｐｒｕ  ａｖ  １，Ｐｒｕ  ａｖ  ２，Ｐｒｕ  ａｖ  ３，Ｐｒｕ  ａｖ  ４，Ｐｒｕ  ｄ  ３，Ｐｒｕ  ｄｕ  ４，Ｐｒｕ  ｐ  ３，Ｐｒｕ  ｐ  ４，Ａｓｐａ  ｏ  １，Ｃｒｏ  ｓ  １，Ｃｒｏ  ｓ  ２，Ｌａｃ  ｓ  １，Ｖｉｔ  ｖ  １，Ｍｕｓ  ｘｐ  １，Ａｎａ  ｃ  １，Ａｎａ  ｃ  ２，Ｃｉｔ  ｌ  ３，Ｃｉｔ  ｓ  １，Ｃｉｔ  ｓ  ２，Ｃｉｔ  ｓ  ３，Ｌｉｔ  ｃ  １，Ｓｉｎ  ａ  １，Ｇｌｙ  ｍ  １，Ｇｌｙ  ｍ  ２，Ｇｌｙ  ｍ  ３，Ｇｌｙ  ｍ  ４，Ｖｉｇ  ｒ  １，Ａｒａ  ｈ  １，Ａｒａ  ｈ  ２，Ａｒａ  ｈ  ３，Ａｒａ  ｈ  ４，Ａｒａ  ｈ  ５，Ａｒａ  ｈ  ６，Ａｒａ  ｈ  ７，Ａｒａ  ｈ  ８，Ｌｅｎ  ｃ  １，Ｌｅｎ  ｃ  ２，Ｐｉｓ  ｓ  １，Ｐｉｓ  ｓ  ２，Ａｃｔ  ｃ  １，Ａｃｔ  ｃ  ２，Ｃａｐ  ａ  １ｗ，Ｃａｐ  ａ  ２，Ｌｙｃ  ｅ  １，Ｌｙｃ  ｅ  ２，Ｌｙｃ  ｅ  ３，Ｓｏｌａ  ｔ  １，Ｓｏｌａ  ｔ  ２，Ｓｏｌａ  ｔ  ３，Ｓｏｌａ  ｔ  ４，Ｂｅｒ  ｅ  １，Ｂｅｒ  ｅ  ２，Ｊｕｇ  ｎ  １，Ｊｕｇ  ｎ  ２，Ｊｕｇ  ｒ  １，Ｊｕｇ  ｒ  ２，Ｊｕｇ  ｒ  ３，Ａｎａ  ｏ  １，Ａｎａ  ｏ  ２，Ａｎａ  ｏ  ３，Ｒｉｃ  ｃ  １，Ｓｅｓ  ｉ  １，Ｓｅｓ  ｉ  ２，Ｓｅｓ  ｉ  ３，Ｓｅｓ  ｉ  ４，Ｓｅｓ  ｉ  ５，Ｓｅｓ  ｉ  ６，Ｃｕｃ  ｍ  １，Ｃｕｃ  ｍ  ２，Ｃｕｃ  ｍ  ３，Ｚｉｚ  ｍ  １，Ａｎｉ  ｓ  １，Ａｎｉ  ｓ  ２，Ａｎｉ  ｓ  ３，Ａｎｉ  ｓ  ４，Ａｒｇ  ｒ，Ａｓｃ  ｓ  １，Ｃａｒ  ｐ  １，Ｄｅｎ  ｎ  １，Ｈｅｖ  ｂ  １，Ｈｅｖ  ｂ  ２，Ｈｅｖ  ｂ  ３，Ｈｅｖ  ｂ  ４，Ｈｅｖ  ｂ  ５，Ｈｅｖ  ｂ  ６．０１，Ｈｅｖ  ｂ  ６．０２，Ｈｅｖ  ｂ  ６．０３，Ｈｅｖ  ｂ  ７．０１，Ｈｅｖ  ｂ  ７．０２，Ｈｅｖ  ｂ  ８，Ｈｅｖ  ｂ  ９，Ｈｅｖ  ｂ  １０，Ｈｅｖ  ｂ  １１，Ｈｅｖ  ｂ  １２，Ｈｅｖ  ｂ  １３，Ｈｏｍ  ｓ  １，Ｈｏｍ  ｓ  ２，Ｈｏｍ  ｓ  ３，Ｈｏｍ  ｓ  ４，Ｈｏｍ  ｓ  ５及びＴｒｉｐ  ｓ  １。
【００５５】
特に、Ｐｈｌ  ｐ  １，Ｐｈｌ  ｐ  ２，Ｐｈｌ  ｐ  ５，Ｐｈｌ  ｐ  ６，Ｄｅｒ  ｐ  １，Ｄｅｒ  ｐ  ２，Ｄｅｒ  ｐ  ５，Ｄｅｒ  ｐ  ７，Ｄｅｒ  ｐ  ２１，Ｆｅｌ  ｄ  １，Ｂｅｔ  ｖ  １，Ｏｌｅ  ｅ  １，Ｐａｒ  ｊ  ２，Ｃａｎ  ｆ  １及びＣａｎ  ｆ  ２のアレルゲンが好ましく用いられる。
【００５６】
本発明に係る方法において用いられるアレルゲンの誘導体は、低アレルギー性であることが好ましい。アレルギー反応又は他の副作用が発生するリスクを低減した安全なワクチン接種が保障できるのは、低アレルギー性の分子を用いたときのみである。
【００５７】
本発明に係る方法によって得られる造血細胞は、免疫系にポリペプチドが曝露されるように、細胞外にアレルゲンの誘導体を分泌することができる。しかしながら、少なくとも１つの膜貫通領域を有するようにアレルゲンの誘導体を設けることも、造血細胞自体が、免疫系に面する表面にアレルゲンの誘導体を提示ことができるため、有利である。そのため、少なくとも１つのポリペプチドは、分泌シグナル配列、膜アンカー領域及び／又は膜貫通領域に融合されている。
【００５８】
しかしながら、もちろんのこと、アレルゲンの誘導体を別のペプチド又はポリペプチドに融合させることも可能である。このことによって、免疫刺激効果又は治療効果を得ることができる。
【００５９】
ＤＮＡベクター、ＤＮＡ媒体，ポリペプチドアンカー媒体又はウイルスは、化学的方法、好ましくはカチオン性脂質及びカチオン性ポリマーを用いた方法、物理的方法、好ましくは粒子衝突、マイクロインジェクション及びエレクトロポレーションによる方法、細胞表面受容体若しくは多量のリン脂質とのウイルス外被の相互作用によるウイルス法によって、造血細胞に導入されることが好ましい。
【００６０】
本発明の別の様態は、アレルゲンに由来するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸分子を有する哺乳類ウイルスベクターＤＮＡに関する。アレルゲンに由来するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸分子を有する哺乳類ウイルスベクターＤＮＡにおいて、少なくとも１つのポリペプチドは、分泌シグナル配列、膜アンカー領域、及び／又は膜貫通領域に融合されている。
【００６１】
ウイルスベクター及び媒体は、哺乳類細胞を感染させたり、アレルゲンの誘導体をコードするＤＮＡ分子を形質導入したりするために、通常用いられている。これらのベクターには、コードＤＮＡ分子を細胞にうまく形質導入するために必要なベクター因子を付加的に含んでいてもよい。モロニーマウス白血病系レトロウイルスベクター又はＨＩＶ−１系レンチウイルスベクターが、哺乳類細胞感染に一般的に用いられている（Sinn,PL et al., Gene Therapy 12 (2005):1089-1098）。
【００６２】
ベクターは、モロニーマウス白血病レトロウイルスの末端反復配列（ＬＴＲ）若しくは骨髄増殖性肉腫ウイルス（ＭＰＳＶ）の末端反復配列プロモーターエンハンサーエレメントを有していることが好ましい。あるいは、アルブミンプロモーター又はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター等のプロモーターを選択することによって、組織又は細胞特異的長期発現を容易にすることができる。あるいは、エピソームベクターが、例えばＥＢＶもしくはＳＶ４０の複製の起点又はヒト染色体Ｓ／ＭＡＲを有している。
【００６３】
本発明の好ましい実施の形態によれば、アレルゲンは、Ｐｈｌ  ｐ  １，Ｐｈｌ  ｐ  ２，Ｐｈｌ  ｐ  ５，Ｐｈｌ  ｐ  ６，Ｄｅｒ  ｐ  １，Ｄｅｒ  ｐ  ２，Ｄｅｒ  ｐ  ５，Ｄｅｒ  ｐ  ７，Ｄｅｒ  ｐ  ２１，Ｆｅｌ  ｄ  １，Ｂｅｔ  ｖ  １，Ｏｌｅ  ｅ  １，Ｐａｒ  ｊ  ２，Ｃａｎ  ｆ  １  及びＣａｎ  ｆ  ２からなる群より選択される。
【００６４】
ベクターは、いかなる公知のアレルゲンの誘導体を有していてもよい。
【００６５】
アレルゲンの誘導体は、低アレルギー性であることが好ましい。
【００６６】
本発明のさらに別の様態は、本発明に係る方法によって得られる造血細胞に関する。
【００６７】
膜アンカー領域又は膜貫通領域は、このような細胞膜に融合していることが好ましい。
【００６８】
本発明の好ましい実施の形態によれば、上記少なくとも１つのポリペプチドは、細胞膜の細胞外側に結合している。
【００６９】
本発明の他の好ましい実施の形態によれば、造血細胞は、本発明に係る哺乳類ウイルスベクターＤＮＡを含んでいる。
【００７０】
造血細胞は、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、造血幹細胞、好酸球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞及び樹状細胞からなる群より選択されることが好ましい。
【００７１】
本発明の他の形態は、アレルギーの治療又は予防のための医薬の製造に、本発明に係るベクターＤＮＡ又は宿主細胞を使用することに関する。
【００７２】
本発明の医薬は、アレルギーを患う又は患うリスクのある個体に対して投与することができる。本発明の医薬は、自家造血細胞を含んでいることが好ましい。したがって、治療のはじめに、個体から造血細胞を単離し、本発明のＤＮＡベクターをトランスフェクトし、細胞を取り出した同じ個体に投与することを意味する。
【００７３】
本発明の他の形態は、本発明に係るベクターＤＮＡ又は宿主細胞を有する製剤ソ生物に関する。
【００７４】
本発明は、アレルギーの予防及び治療のための方法を提供し、次の工程を含んでいることを特徴としている：
−１つ以上のアレルゲン／外来抗原、アレルゲン／外来抗原の誘導体、アレルゲン／外来抗原由来のエピトープ／断片を用意し、
−上記アレルゲン／外来抗原、アレルゲン／外来抗原の誘導体、アレルゲン／外来抗原由来のエピトープ／断片を、自家構造（造血細胞等）に提示するために、アレルゲン／外来抗原、アレルゲン／外来抗原の誘導体、アレルゲン／外来抗原由来のエピトープ／断片を、自家構造に直接取り付ける、又は自家構造に発現させることによって、アレルゲン／外来抗原、アレルゲン／外来抗原の誘導体、アレルゲン／外来抗原由来のエピトープ／断片を処理し、
−アレルゲン／外来抗原、アレルゲン／外来抗原の誘導体、アレルゲン／外来抗原由来のエピトープ／断片、を含む自家構造を個体へ移植し、そのアレルゲン／外来抗原、アレルゲン／外来抗原の誘導体、アレルゲン／外来抗原由来のエピトープ／断片に対する特異的な非応答性を誘引する。
【００７５】
本方法は、被提供者内にアレルゲンを保持した多数の自家構造(造血細胞等)を存在させることにつながる。被提供者に、改変した自家構造を長期にわたって存在させることは、この方法を成功させる上で必要不可欠であると考えられる。
【００７６】
本方法は、個体において、他の全ての生理的免疫機能を不安定にすることなく、１つ以上のアレルゲンに対して特異的な免疫非応答性を得るための方法を提供する。このいわゆる「寛容状態」は、数々の実験結果によって立証されているとおり、特に強固である。これによって、いかなる個体において発生し得る生理的因子（感染等）によっても、本方法によって得られた寛容は、容易に破壊されることはないという利点が得られる。別の主な利点は、寛容が非常に長期的、おそらく生涯続くという点である。この方法は、単一の野生型アレルゲン、ハイブリッド分子（２つ以上のアレルゲン又はアレルゲンの誘導体）、Ｔ細胞エピトープを保持する低アレルギー性の誘導体、ペプチドを含有するＴ細胞エピトープ、又はＢ細胞エピトープ由来のペプチド（Linhart and Valenta. Curr Opin Immunol 17: 646-655, 2005に観察される）に対する寛容を得るのに用いることができる。
【００７７】
本方法は、予防方法及び治療方法の２つの方法において用いることができる。両方の方法において、本発明の方法は、生涯的にアレルゲン特異的寛容を誘引するために用いられる。
【００７８】
−予防方法：産業化された国におけるアレルギーの罹患率は２５％を超えており、そこからさらに上昇している。さらに、深刻なアレルギーを発症するリスクが特に高い新生児を識別する精度の向上が可能となってきている。そのため、高いリスクを負った新生児、又はゆくゆくは通常のリスクを負った一般集団が、アレルギーの進行を予防する方法の恩恵を受ける個体の見込み群であるといえる。アレルゲンに対する感作は、通常であれば出生後数年以内に発生する。そのため、予防的処置の理想的な時期は、出生後まもなくとなる。一つの可能性として、未成熟造血細胞（造血幹細胞等）を個体から得ること（例えば、他の目的で現在頻繁に行われている、出生時に臍帯血を採取し、保存すること）が挙げられる。これらの細胞又はそのサブセットは、目的のアレルゲン／外来抗原、アレルゲン／外来抗原の誘導体、アレルゲン／外来抗原由来のエピトープ／断片を、挿入又は連結させることによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（ＧＭＰ条件下）において処理される。これらの改変された細胞は、次に、個体が適切に準備された後、その同一個体に再導入される（静脈注入等を介して）。あるいは、成熟細胞又は自家構造を、アレルゲン／外来抗原、アレルゲン／外来抗原の誘導体、アレルゲン／外来抗原由来のエピトープ／断片として改変するか、これらの媒体として用いて、その後上記と同様に同一個体に再導入されてもよい。
【００７９】
−治療アプローチ：Ｉ型アレルギーのいかなる年齢の患者、特に深刻又は生命を脅かすようなＩ型アレルギーの亜型の患者が、治療方法として本発明の方法を用いる候補者である。この個体からは、造血細胞又はその他の種類の細胞が得られる（例えば、日常的に他の目的で臨床的に用いられる技術を用いて、骨髄又は移動性末梢血白血球を採取する）。これらの細胞又はその亜型は、遺伝子組み換えによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで処理され、目的のアレルゲン／外来抗原、アレルゲン／外来抗原の誘導体、アレルゲン／外来抗原由来のエピトープ／断片が挿入される。あるいは、成熟細胞又は自家構造（抗体等）を、アレルゲン又はペプチドと組み換え又は連結してもよい。これらの組み換えられた細胞又は自家構造は、次に同一個体に、その個体が適切に準備された後に、再導入される（例えば、静脈注入又は皮下もしくは経口を介して投与される）。
【００８０】
本発明において、アレルゲン／外来抗原、アレルゲン／外来抗原の誘導体、アレルゲン／外来抗原由来のエピトープ／断片が形質導入された造血細胞を移植することによって、分子キメラ化(すなわち、組換え自家構造を存在させること)を誘引し、その結果として形質導入されたアレルゲンに対する永久的で強固な寛容が得られる。
【００８１】
本発明の好ましい実施の形態によれば、アレルゲン特異的抗体（ＩｇＥ亜型を含む）の進行の予防、アレルギー媒介物質の放出予防、アレルゲン特異的Ｔ細胞反応性の予防、及びアレルギー皮膚反応の予防を、動物モデルにおける生体内実験で確立することができた。
【００８２】
アレルゲンに対する寛容は、遺伝子組み換え後に組換えアレルゲンを発現する、遺伝子的に同質な（臨床環境における自家状況に対応して遺伝子的に同一な）造血幹細胞の移植を通した分子キメラ化によって得られる。このマウスモデルでは、寛容が結果として生じ、Ｉ型アレルギーの進行を防止する。
【００８３】
本技術は、治療方法だけでなく、予防方法としても使用できる。
【００８４】
深刻なアレルギーに進展するリスクを負っていると認識されている個体は、Ｉ型アレルギーを防止するべく、本技術を用いて予防的に処置を受けてもよい。例えば、保存された臍帯血細胞から得られた血球を精製し、前駆細胞を得てもよい（ＣＤ３４ポジティブ細胞を選別する等）。骨髄細胞の単離及びＣＤ３４ポジティブ前駆細胞の精製は、選択肢の１つとなり得る。単離された自家細胞又は遺伝子的に同一な個体からの細胞を、サイトカインの存在下で培養し、アレルゲン導入媒体で数回処理してもよい。これらの媒体は、レトロウイルス導入遺伝子融合組換え粒子又は他のアレルゲン導入媒体であってもよい。遺伝子的に組み換えられて培養された細胞は、少なくとも一時的に、表面にアレルゲン／外来抗原、アレルゲン／外来抗原の誘導体、アレルゲン／外来抗原由来のエピトープ／断片を含むか、発現するか、又はこれらのアレルゲンを分泌する。
【００８５】
遺伝子的に組み換えられた細胞は、適切に事前処置された個体に静脈から注入される。アレルゲンが発現することで、アレルゲンを自家タンパク質のように認識し、その結果として寛容が引き起こされる。個体は、導入されたアレルゲンを造血細胞の表面に発現するか、導入されたアレルゲンを分泌する。導入されたアレルゲンを発現する細胞の存在は、分子キメラ化として知られている。分子キメラ化によって、導入されたアレルゲンに対して長期的に寛容となるように誘引される。そのため、上記アレルゲンに対して寛容な個体がアレルゲンと繰り返し接触したとしても、Ｉ型アレルギーは進行しない。下記の実施例部分では、好ましい方法が示されている。
【００８６】
アレルギー患者の治療では、例えばＧ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）で刺激を与えられた自家移動性末梢血白血球が単離され、収集される。自家骨髄細胞を収集してもよい。例えばＣＤ３４ポジティブ前駆細胞のような細胞を精製してもよい。これらの細胞を、生体外においてサイトカイン存在下で培養し、幾度かにわたってアレルゲン導入媒体で処置してもよい。アレルゲンの発現は、例えばフローサイトメトリーによって判断され、アレルゲン保持細胞は静脈注入によって前処理された患者に導入される。分子キメラ化は、白血球におけるアレルゲンの発現により観察することができる。
【００８７】
本発明は以下の実施例や図面によってさらに説明されるが、本発明はこれらの実施例や図面に特に制限されない。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】図１は、分泌タンパク質（Ａ）のためのシグナル配列、及び膜アンカータンパク質（Ｂ）のための付加的な膜貫通領域（ＴＭ）に誘導したＰｈｌ  ｐ  ５及びｅＧＦＰをコードするＭＭＰ系レトロウイルスベクターを示す図である。ＬＴＲは末端反復配列を示し、ＳＤはスプライシングドナーを示し、ＳＡはスプライシング受容体を示している。開始コドンはＮｃｏＩ部位に挿入されており、停止コドンはＢａｍＨＩ又はＢｇｌＩＩ部位の直前に挿入されている。
【図２】図２は、生体内におけるアレルゲン特異的寛容を誘引するための実験的なプロトコルを示す図である。Ｂａｌｂ／ｃ被提供者に、８  Ｇｙ  ＴＢＩ（全身放射線照射）及びＴ細胞枯渇抗体（抗ＣＤ４及び抗ＣＤ８モノクローナル抗体）で前処理し、アレルゲンが形質導入されたＢＭ細胞（ｉｖ）を、静脈を介して移植した。アレルゲンが形質導入されたＢＭの移植後、マウスに抗ＣＤ４０Ｌ  ｍＡｂを与えた。ＢＭ移植（ＢＭＴ）から６，９，１２及び２２週間後、組換えＰｈｌ  ｐ  ５を５μｇ、及び水酸化アルミニウムを含む組換えＢｅｔ  ｖ  １を５μｇ、マウスの皮下に注入した（ｓ．ｃ．）。それぞれの免疫処理の前に、分析用の血清を得るために、マウスから採血した。ＢＭ移植から３０〜４０週間後に、マウスを処分した。
【図３】図３は、レトロウイルスの形質導入及び培養後の、骨髄細胞におけるＰｈｌ  ｐ  ５（Ａ）及びｅＧＦＰ（Ｂ）の発現率を示す図である。骨髄細胞を、ＶＳＶ−Ｐｈｌ  ｐ  ５−ＴＭ、又はＶＳＶ−ｅＧＦＰ−ＴＭで形質導入するか、偽形質導入した。形質導入後、偽形質導入した骨髄細胞及びＰｈｌ  ｐ  ５−ＴＭを形質導入した細胞を、Ｐｈｌ  ｐ  ５特異的ビオチン化抗体及びフィコエリトリン標識ストレプトアビジン（Ａ）で染色し、フローサイトメトリーで分析した。ＶＳＶ−ｅＧＦＰ−ＴＭを形質導入した骨髄細胞は、染色せずに分析し、形質導入していない骨髄細胞（Ｂ）と比較した。
【図４】図４は、様々な白血球系統の中で、長期的に安定してＰｈｌ  ｐ  ５のキメラ化のレベルの高さを示す図である。末梢白血球（ＷＢＣ）のサブセットのうちのＰｈｌ  ｐ  ５ポジティブ細胞の割合を、ＢＭ移植後の複数の時点において、２色フローサイトメトリーで判断した。キメラ化の割合を、平均（ｎ＝３）で示した。末梢血白血球を、系統特異的フルオレセインイソシアネート接合抗体及びＰｈｌ  ｐ  ５特異的抗体で染色した。複数の系統における分子キメラ化の実質的なレベルの長期的な持続性は、もともとの造血幹細胞に生体外でうまくＰｈｌ  ｐ  ５を形質導入したことを示している。□はＣＤ４を示し、●はＣＤ８を示し、○はＢを示し、黒四角は単球及び顆粒球を示している。Ｐｈｌ  ｐ  ５ポジティブ細胞の割合を、２色フローサイトメトリーで判断した。
【図５Ａ】図５は、Ｐｈｌ  ｐ  ５キメラの血清における、検出可能なＰｈｌ  ｐ  ５特異的抗体レベルの不在を示す図である。血清内のアレルゲン特異的（Ｐｈｌ  ｐ  ５及びＢｅｔ  ｖ  １）ＩｇＧ１（Ａ）及びアレルゲン特異的ＩｇＥ（Ｂ）レベルを、ＥＬＩＳＡを用いて、ＢＭ移植後の複数時点に測定した。免疫前レベル（ｐｉ）を、１回目の感作の前に測定した。２つの異なる実験サンプルをプールした。１つ目の実験を４０週で終了し、２つめの実験を２９週で終了した。Ｐｈｌ  ｐ  ５を形質導入したＢＭを移植したマウス群（ｎ＝１０）、偽形質導入した（ｎ＝３）ＢＭを移植したマウス群、及び感作した形質導入していないマウス群（ｎ＝１０）を分析した。Ｐｈｌ  ｐ  ５を形質導入したＢＭを移植したマウスでは、分析中のいかなる時点においても、Ｐｈｌ  ｐ  ５特異的ＩｇＧ１及びＩｇＥが検出されなかった。アレルゲンＢｅｔ  ｖ  １を制御する抗体の発達は、影響を受けずに発生した。このことにより、寛容の誘引状態の特異性が示された。
【図５Ｂ】図５は、Ｐｈｌ  ｐ  ５キメラの血清における、検出可能なＰｈｌ  ｐ  ５特異的抗体レベルの不在を示す図である。血清内のアレルゲン特異的（Ｐｈｌ  ｐ  ５及びＢｅｔ  ｖ  １）ＩｇＧ１（Ａ）及びアレルゲン特異的ＩｇＥ（Ｂ）レベルを、ＥＬＩＳＡを用いて、ＢＭ移植後の複数時点に測定した。免疫前レベル（ｐｉ）を、１回目の感作の前に測定した。２つの異なる実験サンプルをプールした。１つ目の実験を４０週で終了し、２つめの実験を２９週で終了した。Ｐｈｌ  ｐ  ５を形質導入したＢＭを移植したマウス群（ｎ＝１０）、偽形質導入した（ｎ＝３）ＢＭを移植したマウス群、及び感作した形質導入していないマウス群（ｎ＝１０）を分析した。Ｐｈｌ  ｐ  ５を形質導入したＢＭを移植したマウスでは、分析中のいかなる時点においても、Ｐｈｌ  ｐ  ５特異的ＩｇＧ１及びＩｇＥが検出されなかった。アレルゲンＢｅｔ  ｖ  １を制御する抗体の発達は、影響を受けずに発生した。このことにより、寛容の誘引状態の特異性が示された。
【図６】図６は、Ｐｈｌ  ｐ  ５キメラにおける、好塩基球脱顆粒実験を示している。アレルゲン特異的β−ヘキソサミニダーゼ放出を測定する、ラット好塩基球白血病（ＲＢＬ）実験を、ＢＭ移植から数週間後に、図５において説明した群に対して行った。Ｐｈｌ  ｐ  ５キメラ（ｎ＝３）において、特異的な好塩基球脱顆粒は検出できなかった。一方で、Ｂｅｔ  ｖ  １特異的β−ヘキソサミニダーゼ放出はコントロール群（偽形質導入した群：ｎ＝３；形質導入しなかった群：ｎ＝５）と同様であった。
【図７】図７は、Ｐｈｌ  ｐ  ５キメラにおける、皮膚プリックテストでのＰｈｌ  ｐ  ５に対する寛容を示す図である。Ｐｈｌ  ｐ  ５及びＢｅｔ  ｖ  １に対して免疫した、形質導入していないマウスの代表的な皮膚薄片（Ａ）と、Ｐｈｌ  ｐ  ５及びＢｅｔ  ｖ  １に対して免疫したＰｈｌ  ｐ  ５  キメラマウスの代表的な皮膚薄片（Ｂ）とを示した。ネガティブコントロールとして、未処理Ｂａｌｂ／ｃマウスにＰＢＳのみを皮下に注射した（Ｃ）。ｒＰｈｌ  ｐ  ５、ｒＢｅｔ  ｖ  １、肥満細胞脱顆粒化合物４８／８０、及びＰＢＳに対する皮膚反応を、皮下注射から２０分後に、腹部皮膚の内部で測定した。Ｄは、皮下注射の一覧表を示している。
【図８】図８は、Ｐｈｌ  ｐ  ５キメラにおける、Ｐｈｌ  ｐ  ５特異的Ｔ細胞感作の予防について示す図である。様々な群のマウスに由来する脾臓細胞における、生体外でのリンパ球増殖を、移植後２９週又は４０週において測定した（培地との反応性に関して、ＳＩ＝刺激指数として示している）。（Ａ）の図では、脾臓細胞を２μｇ／ｍｌのｒＰｈｌ  ｐ  ５で刺激し、（Ｂ）の図において、悲壮細胞を２μｇ／ｍｌのｒＢｅｔ  ｖ  １で刺激した。Ｐｈｌ  ｐ５を形質導入したキメラは、免疫されたＢａｌｂ／ｃマウスと比べて、Ｐｈｌ  ｐ  ５の刺激に対する応答で増殖に著しい減少が見られたが、Ｂｅｔ  ｖ  １の刺激に対する応答では共に強い増殖が見られた。
【図９】図９は、シグナルペプチド（Ｓ）及び膜貫通領域（ＴＭＤ）に融合したＢｅｔ  ｖ  １をコードするＭＭＰ系レトロウイルスベクターであるＭＭＰ−Ｂｅｔ  ｖ  １−ＴＭ及びＩＲＥＳｅＧＦＰに融合した導入遺伝子の構成（Ａ）、ＭＭＰ−Ｂｅｔ  ｖ  １−ＴＭ−ＩＲＥＳｅＧＦＰ（Ｂ）、さらには空のコントロールベクターであるＭＭＰ−ＩＲＥＳｅＧＦＰ（Ｃ）を示す図である。ＬＴＲは末端反復配列を示し、ＳＤはスプライシングドナーを示し、ＳＡはスプライシング受容体を示している。開始コドン及び停止コドンは、制限部位ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩと共に挿入した。Ｂｅｔ  ｖ  １は、臨床的に関連性の高い主要なシラカンバ花粉アレルゲンである。Ｂｅｔ  ｖ  １は、Ｐｈｌ  ｐ  ５と関連性を有さない。
【図１０】図１０は、フローサイトメトリーで測定したＧＦＰポジティブＮＩＨ  ３Ｔ３細胞又はＢｅｔ  ｖ  １ポジティブＮＩＨ  ３Ｔ３細胞の割合を示す図である。グレーの線は、レトロウイルスベクターＶＳＶ−Ｂｅｔ  ｖ  １−ＴＭ−ＧＦＰで形質導入した細胞を示している。黒線は、コントロールとして未処理のＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を用いたものを示している。形質導入した細胞の９４．５％がＧＦＰポジティブであり（Ａ）、５５．６％がＢｅｔ  ｖ  １特異的抗体によって検出されるＢｅｔ  ｖ  １を発現した（Ｂ）。
【図１１】図１１は、Ｂｅｔ  ｖ  １を形質導入した骨髄細胞を移植する生体内実験の、実験計画を示す図である。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、抗ＣＤ４  ｍＡｂ、抗ＣＤ８  ｍＡｂで処理し、放射線に曝露した（実験開始前日（第−１日目）に８Ｇｙ）。実験開始日（第０日目）に、形質導入した骨髄細胞を尾静脈内に移植し、さらに抗ＣＤ４０Ｌを腹腔内に注入した。末梢白血球（ＷＢＣ）のうちのＢｅｔ  ｖ  １＋細胞のキメラ化の後、続けてフローサイトメトリーを行った。被提供者は、組換えＰｈｌ  ｐ  ５及びｒＢｅｔ  ｖ  １の免疫の有効性を、定められた時間に皮下でテストした。
【図１２】図１２は、フローサイトメトリー（グレー線）によって測定した、ＧＦＰポジティブ細胞の形質導入効率を示す図である。骨髄細胞を、ＶＳＶ−Ｂｅｔ  ｖ  １−ＴＭ−ＧＦＰ（Ａ）又はＶＳＶ−ＧＦＰ（Ｂ）を用いて形質導入した。ネガティブコントロール（黒線）は、形質導入していない、培養された骨髄細胞を示している。
【図１３】図１３は、Ｂ細胞及び骨髄造血系統（それぞれＢ２２０＋及びＭａｃ１＋）のＢｅｔ  ｖ  １＋キメラ化の割合を示す図である。ＶＳＶ−Ｂｅｔ  ｖ  １−ＴＭ−ＧＦＰで形質導入した骨髄（ｎ＝４）の被提供者を、図１１で説明したプロトコルにしたがって処置した。骨髄細胞を、ＶＳＶ−Ｂｅｔ  ｖ  １−ＴＭ−ＧＦＰで形質導入した。末梢白血球を、ビオチン化した系統特異的抗体で培養し、ストレプトアビジン−ＰＥ−Ｃｙ５で染色した。Ｍａｃ１＋系統の５％がＧＦＰポジティブであり、Ｂ２２０＋ポジティブ細胞のおよそ３．５％が、フローサイトメトリーにおいてＧＦＰ発現を示した。
【実施例１】
【００８９】
膜結合型アレルゲン又は分泌アレルゲンのための融合遺伝子を、哺乳類初期骨髄細胞に組み込むための組換えレトロウイルスの生成
ａ）膜アンカー型及び分泌型のＰｈｌ  ｐ  ５及びＧＦＰを運ぶ組換えレトロウイルスをコードする、レトロウイルスベクターの構築
分泌型Ｐｈｌ  ｐ  ５分子を有するレトロウイルスベクターを生成するために、オリジナルのＰｈｌ  ｐ  ５シグナル配列を、ネズミ免疫グロブリン（ｐＤｉｓｐｌａｙ，インビトロジェン）のｋ短鎖のシグナル配列（Ｓ）に置き換え、重複ＰＣＲ法(Ho et al. Gene 77:51-59, 1989)を用いて完全長Ｐｈｌ  ｐ  ５及びｅＧＦＰ（ベクター  ｐＥＧＦＰ−Ｃ１，クロンテック）に融合した(Vrtala et al. J Immunol 151(9):4773-4781,1993)（図１Ａ）。膜アンカー型Ｐｈｌ  ｐ  ５を生成するために、ヒト血小板由来成長因子（ｐＤｉｓｐｌａｙ，インビトロジェン）の膜貫通領域（ＴＭＤ）を、シグナル配列及びＰｈｌ  ｐ  ５又はｅＧＦＰにさらに融合した（図１Ｂ）。Ｐｈｌ  ｐ  ５融合遺伝子の５’末端における制限部位ＮｃｏＩ及び３’末端における制限部位ＢａｍＨＩを、以下のプライマーによって挿入し、またｅＧＦＰ融合遺伝子の５’末端における制限部位ＮｃｏＩ及び３’末端における制限部位ＢｇｌＩＩ部位を、以下のプライマーによって挿入した（括弧内は配列番号を示す）。
【００９０】
【表１】
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【００９１】
融合した断片を、受容体ベクターｐＳＴ−Ｂｌｕｅ  １（Ｎｏｖａｇｅｎ社）にクローンした。ポジティブ導入を、レトロウイルスベクターｐＭＭＰ(John Iacomini、ボストンより提供)にサブクローンし、その結果、ｐＭＭＰ−Ｐｈｌ  ｐ  ５及びｐＭＭＰ−ｅＧＦＰ（図１Ａ）、並びにｐＭＭＰ−Ｐｈｌ  ｐ  ５−ＴＭ、及びｐＭＭＰ−ｅＧＦＰ−ＴＭ（図１Ｂ）を得た。ポジティブクローンを、二本鎖配列で確認した。
【００９２】
ｂ）膜アンカー型Ｐｈｌ  ｐ  ５及びＧＦＰを有する組換え偽型レトロウイルスの産出
リン酸カルシウム沈殿法(Pear et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8392-8396, 1993)により、２９３Ｔ細胞(John Iacomini、ボストンより提供)を、ｐＭＭＰ−Ｐｈｌ  ｐ  ５  −ＴＭ（又はｐＭＭＰ−ｅＧＦＰ−ＴＭ），ｐＭＤ．Ｇ及びｐＭＬＶで、一過性トランスフェクトし、組換えレトロウイルスを生成した。ＭＭＰレトロウイルスベクターは、ＭＦＧの誘導体であり(Riviere et al. Proc Natl Acad Sci USA 92 (15):6733-6737,1995)、骨髄増殖性肉腫ウイルス（ＭＰＳＶ）末端反復配列プロモーター−エンハンサー因子を含んでいる。これらの転写因子は、造血細胞系統において発現を可能にすることが示されている(Bowtell et al. Mol Biol Med 4(4):229-50.,1987)。ベクターｐＭＤ．Ｇは、水疱性口内炎ウイルスＧ（ＶＳＶ−Ｇ）外被タンパク質をコードし、ＶＳＶ−Ｇ／レトロウイルス偽型を生成する(Ory et al.Proc Natl Acad Sci USA 93(21):11400-11406,1996)。トランスフェクトのために、１０ｃｍディッシュにおいて、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むダルベッコ最少必須培地（ＤＭＥＭ）（ＧＩＢＣＯ，インビトロジェン）で４．５×１０6の細胞を培養した。トランスフェクトの４時間前に、培地を、１０％ＦＣＳ及び２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ＭＰバイオメディカルズ、エッシュウェーゲ、ドイツ）を含むイスコフ改変ＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ，インビトロジェン）に、入れ替えた。一つのディッシュを、それぞれｐＭＭＰ−Ｐｈｌ  ｐ  ５−ＴＭ（又はｐＭＭＰ−ｅＧＦＰ−ＴＭ）（１０μｇ）、ｐＭＤ．Ｇ（５μｇ）及びｐＭＬＶ（７．５μｇ）でトランスフェクトした。トランスフェクトから１２〜１６時間後、培地を、１０％ＦＣＳ及び１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含むＤＭＥＭに入れ替えた。トランスフェクトから７２時間後にウイルス上清を回収し、超遠心分離機（製品名：Ｂｅｃｋｍａｎ  ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）を用いてろ過及び濃縮した。ウイルス粒子の用量設定濃度を、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞の感染により測定し、フローサイトメトリーによって分析した。Ｅｐｉｃｓ  ＸＬ−ＭＣＬ  フローサイトメトリー装置（製品名：Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、ＩＬ  Ａｌｌｉａｎｃｅ社、オーストリア）をデータ収集のために用い、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製ＥＸＰＯ３２  ＡＤＣ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（西シェフィールド、英国）を用いてフローサイトメトリーのデータを分析した。Ｐｈｌ  ｐ  ５の表面発現を同定するために、完全長組換えＰｈｌ  ｐ  ５に対するウサギポリクローナル抗血清（ｒＰｈｌ  ｐ  ５）を、製造者の指示に従って、タンパク質Ｇカラム（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて精製した。精製した抗体をビオチン化し、Ｐｈｌ  ｐ  ５発現２９３Ｔ細胞で用量設定した。
【実施例２】
【００９３】
アレルゲン特異的寛容の誘引
ａ）実験計画
本実施例の目的は、遺伝的に組み換えた同質遺伝子的造血細胞の移植を通して、Ｉ型アレルギーの寛容誘引の方法を確立することである。ＢＭ単離の７日前に、ドナーのＢａｌｂ／ｃマウスを、５−ＦＵを用いて処置した（Bodine et al.Exp.Hematol 19:206-212,1991）。ＢＭＣ（骨髄細胞）を以下に示すように単離して培養し、アレルゲン組み込みウイルス粒子で数回処理した。被提供者となるＢａｌｂ／ｃマウスに、致死量の放射線を照射し（８  Ｇｙ）、抗ＣＤ４及び抗ＣＤ８モノクローナル抗体で処置した。骨髄移植（ＢＭＴ）の直後、被提供者にＭＲ１（抗ＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体）を与えた。マウスには、組換えＰｈｌ  ｐ  ５及びＢｅｔ  ｖ  １  を繰り返し注入し、免疫後ＢＭ移植を行った。一連の生体内及び生体外実験によって、免疫寛容を測定した。アレルゲン形質導入白血球（すなわち、分子キメラ化）の存在を確認する上で、マウスから何度か採血し、フローサイトメトリーでキメラ化を決定した（図４）。
【００９４】
年齢の一致したメスＢａｌｂ／ｃマウスをチャールズ・リバー・ラボラトリーズ社（ドイツ）より得て、特定病原体のない環境で飼育し、８〜１２週齢の間、実験用として利用した。以下に示す表では、Ｐｈｌ  ｐ  ５を形質導入したＢａｌｂ／ｃマウスの群における典型的な実験方法を示している。
【００９５】
【表２】
2010528639.tif 000003
【００９６】
コントロールとして、第６週、第９週、第１２週及び第２２週の、ｒＰｈｌ  ｐ  ５及びｒＢｅｔ  ｖ  １で感作した形質導入していないＢａｌｂ／ｃマウス、さらに偽形質導入した（空のｐＭＭＰベクターで生成したレトロウイルス）マウス、又はＶＳＶ−ｅＧＦＰ−ＴＭで形質導入したＢＭを委嘱したマウスの群も、上記表に記載のＰｈｌ  ｐ  ５で形質導入したマウスと同様に処理した。
【００９７】
ｂ）初期骨髄細胞へのＶＳＶ−Ｐｈｌ  ｐ  ５−ＴＭの形質導入、及び前処理したＢａｌｂ／ｃマウスへの移植
７日前に５−フルオロウラシル（５−ＦＵ；１５０ｍｇ／ｋｇ）で処理したマウスのＢＭＣを採取し、単離したＢＭＣを、製造者の指示にしたがって、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）（タカラバイオ株式会社、滋賀県、日本）でコートした細胞培養プレートで培養した。１００ｎｇ／ｍｌ  ヒトインターロイキン−６（製品名：ＩＬ−６；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、米国）、１００ｎｇ／ｍｌ  組換えマウス幹細胞因子（製品名：ＳＣＦ；Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、米国）、５０ｎｇ／ｍｌ  組換えマウストロンボポエチン（製品名：ＴＰＯ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、５０ｎｇ／ｍｌ  組換えマウスＦｌｔ−３リガンド（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、及び０．１％ゲンタマイシン（ＭＰバイオメディカルズ、ドイツ）の終濃度になるように１５％ＦＣＳ及びサイトカインを含む、ＤＭＥＭ（製品名：ＧＩＢＣＯ、インビトロジェン）中でＭＮＣを培養した。形質導入を、３７℃で、５％ＣＯ2下において、９６時間行った。ＢＭＣを１ｍｌあたり４×１０6細胞の密度で培養し、感染多重度（ＭＯＩ）１〜５でウイルス粒子に感染させた。２４時間後、同じ数のウイルス粒子を用いて、細胞の形質導入を繰り返した。４８時間後に、細胞をプレートから回収し、遠心分離機にかけ（Ｈｅｒａｅｕｓ、１０００ｒｐｍ、ＲＴ、５分間）、ＢＭ培地、サイトカインカクテル中に再懸濁し、上記のようにウイルス粒子に感染させた。２４時間後、細胞をプレートから回収し、小球型にして、Ｍ１９９培地（Ｓｉｇｍａ）、ＤＮＡｓｅ（Ｓｉｇｍａ）０．０２Ｕ／ｍｌ、０．０８％ゲンタマイシン（ＭＰバイオメディカルズ社、エッシュウェーゲ、ドイツ）、及びＨＥＰＥＳ（ＭＰバイオメディカルズ社、ドイツ）１０ｍＭに再懸濁した。細胞を計数し、フローサイトメトリーによってＰｈｌ  ｐ  ５又はＧＦＰの表面発現を決定した（図３）。
【００９８】
ｃ）前処理したＢａｌｂ／ｃマウスへの、Ｐｈｌ  ｐ  ５を形質導入したＢＭ細胞の移植
形質導入の後、骨髄の機能を廃絶した（例えば、致死量の放射線が照射された）Ｂａｌｂ／ｃマウスに、２〜４×１０6のＢＭＣを静脈内に注入した。移植の１日前に、マウスの腹腔内に抗ＣＤ４抗体（ＧＫ１．５）及び抗ＣＤ８抗体（２．４３）を０．５ｍｇ注入した。移植の直後、マウスに抗ＣＤ４０Ｌ（ＭＲ１）（Ｂｉｏｅｘｐｒｅｓｓ、西レバノン、ＮＨ、米国より抗体を購入）を０．５ｍｇ注入した。
【実施例３】
【００９９】
生体内における、レトロウイルスによってコードされたアレルゲンの骨髄由来細胞内における安定した長期キメラ化
形質導入したＢＭの被提供者細胞におけるのＰｈｌ  ｐ  ５発現を、フローサイトメトリーを用いて調査した。実験された全ての白血球系統は、調査されている間（３８週間）、常に高いレベルでＰｈｌ  ｐ  ５を発現していた。キメラ化は約７５％まで到達し、典型的な範囲は２０〜４０％であった（図４）。白血球を、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｂ２２０、Ｍａｃ−１に対するフルオレセインイソシアネート（ＦＩＴＣ）結合抗体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、米国）及びフィコエリトリン−ストレプトアビジン（ＰＥＡ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、米国）で発達させたビオチン化Ｐｈｌ  ｐ  ５により染色した。Ｐｈｌ  ｐ  ５を形質導入した宿主細胞を区別するために、二色フローサイトメトリーを用い（ヨウ化プロピジウム染色した死細胞を除く）、Tomitaらの文献に記載されている、Ｐｈｌ  ｐ  ５ポジティブ細胞の比率として、キメラ化を算出した（Blood 83:939-948,1994）。
【実施例４】
【０１００】
分子キメラ化を通して確立したアレルゲンに対する寛容
ａ）Ｐｈｌ  ｐ  ５  分子キメラ化が、Ｐｈｌ  ｐ  ５特異的抗体の発達を特異的に妨げる
ＢＭ移植マウスを２種類のアレルゲンに感作した６、９、１２、及び２２週間後、ｒＰｈｌ  ｐ  ５及びｒＢｅｔ  ｖ  １（Ｂｉｏｍａｙ、オーストリア）の５μｇ／マウスを、Ａｌ（ＯＨ）3（Ａｌｕ−Ｇｅｌ−Ｓ、Ｓｅｒｖａ、ドイツ）に吸収させ、特異性をテストした。免疫化の１日前に、マウスから血液を採取し、血清を得た。血清を、分析されるまでの間、−２０°Ｃで保管した。そして、抗原特異的ＩｇＧ１及びＩｇＥ血清レベルを、ＥＬＩＳＡ(Vrtala et al., J Immunol 160 (12):6137-6144,1998)を用いて測定し（図５Ａ及び図５Ｂ）、Ｐｈｌ  ｐ  ５を形質導入したマウスが、Ｐｈｌ  ｐ  ５に対して寛容であるか否かを分析した。組換えＰｈｌ  ｐ  ５及びｒＢｅｔ  ｖ  １（５μｇ／ｍｌ）で、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、Ｍａｘｉｓｏｒｐ、デンマーク）をコートし、マウス血清をインキュベートした（ＩｇＧ１用に１：５００、ＩｇＥ  ＥＬＩＳＡ用に１：２０）。ＩｇＧ１結合又はＩｇＥ結合を、ラット抗マウスＩｇＧ１（１：１０００）又はラット抗マウスＩｇＥ（１：１０００）（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、サンディエゴ、カルフォルニア）、及びＨＲＰ標識化したロバ抗ラット抗血清（１：２０００）（アマシャム、バッキンガムシャー、英国）を用いて検出した。呈色反応を、ＥＬＩＳＡ−ｒｅａｄｅｒ（Ｗｌａｃ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌａｌｍｅｒ、オーストリア）を用いて、４０５ｎｍマイナス４９０ｎｍ波長において測定した。偽形質導入した（上述のように生成したウイルス上清と空のｐＭＭＰベクター）及び未処理の感作したＢａｌｂ／ｃマウスの血清は、Ｐｈｌ  ｐ  ５で形質導入したマウスと対照的に、高いＰｈｌ  ｐ  ５特異的ＩｇＧ１及びＩｇＥレベルを示した。Ｐｈｌ  ｐ  ５を形質導入したＢＭＣを移植した全てのマウスにおいて、Ｐｈｌ  ｐ  ５特異的ＩｇＧ１及びＩｇＥを検出可能レベルでは検出しなかったが、Ｂｅｔ  ｖ  １特異的ＩｇＧ１及びＩｇＥは高いレベルを示し、Ｐｈｌ  ｐ  ５に対して特異的に寛容であることを示した。別の２つの実験においても、同様のデータが得られた。
【０１０１】
ｂ）Ｐｈｌ  ｐ  ５寛容マウスにおけるアレルゲン特異的ＩｇＥ依存性好塩基球脱顆粒の防止
ラット好塩基球白血病（ＲＢＬ）実験を行い、因子レベルにおける寛容が得られたか否かを調査した。ＲＢＬ−２Ｈ３細胞を９６ウェル細胞培養プレート（４×１０4細胞／ウェル）に入れ、２４時間、３７℃及び５％ＣＯ2下で培養した。そして、細胞を、Ｐｈｌ  ｐ  ５寛容マウス、偽形質導入したマウス、及び形質導入していない感作したＢａｌｂ／ｃマウスのマウス血清（１：５０希釈）で培養した。免疫前血清及び各アレルゲン注射後の血清を、ＲＢＬ細胞で２時間、３７°Ｃで培養した。上清を取り除き、細胞層を２×タイロード緩衝液（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、０．５ｍＭＭｇＣｌ2、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ2、０．４ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、５．６ｍＭ  Ｄ−グルコース、１２ｍＭ  ＮａＨＣＯ3、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、及び０．１％ｗ／ｖ  ＢＳＡ，ｐＨ  ７．２）で洗浄した。予め荷重した細胞を、３７°Ｃで３０分間、ｒＢｅｔ  ｖ  １のｒＰｈｌ  ｐ  ５（ウェル毎に０．０３μｇ）を用いて刺激した。そして、ポジティブコントロールのために、細胞を、１％トリトン  Ｘ−１００を用いて溶解した。この上清を、クエン酸塩緩衝剤（０．１Ｍ、ｐＨ４．５）内で８０μＭの４−メチルウンベリフェリル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミド(Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、オーストリア)と共に、３７°Ｃで１時間インキュベートし、β−ヘキソサミニダーゼ活性を分析した。グリシン緩衝剤（０．２Ｍグリシン、０．２ＭＮａＣｌ、ｐＨ１０．７）を１００μｌ加えることで反応を停止し、蛍光性マイクロプレートリーダー(Ｗａｌｌａｃ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、オーストリア)を用いて、λｅｘ：３６０／λｅｍ：４６５ｎｍで蛍光性を測定した。分析結果を、蛍光性単位及び１％トリトン  Ｘ−１００で細胞を溶解した後に放出された合計β−ヘキソサミニダーゼの割合で求めた。
【０１０２】
図６に示したように、ＲＢＬ細胞をｒＰｈｌ  ｐ  ５で刺激した後のＰｈｌ  ｐ  ５キメラマウスの血清には、好塩基球脱顆粒が見られなかった。偽形質導入したＢａｌｂ／ｃマウスは、形質導入していない、感作したＢａｌｂ／ｃマウスと同様に、β−ヘキソサミニダーゼの放出を示したが、Ｐｈｌ  ｐ  ５キメラマウスの血清は、Ｂｅｔ  ｖ  １で刺激した際に好塩基球脱顆粒を示し、Ｐｈｌ  ｐ  ５で形質導入したＢＭＣを移植することによって、アレルゲン特異的寛容が誘引されたことを示した。
【０１０３】
ｃ）皮膚プリックテストにおけるＰｈｌ  ｐ  ５に対する寛容
皮膚プリックテストを行い、皮膚Ｉ型過敏症反応の寛容を調べた。ＢＭ移植の３０〜４０週後、マウスの尾静脈に０．５％  Ｅｖａｎｓ  ｂｌｕｅ（Ｓｉｇｍａ、米国）を１００μｌ注射した。続いて、Ｐｈｌ  ｐ  ５及びＢｅｔ  ｖ  １（各０．５μｇ／ｍｌ、ＰＢＳで希釈）を３０μｌ、毛の剃られた腹部皮膚の皮内に注射した。ポジティブコントロールとして、肥満細胞脱顆粒化合物４８／８０（２０μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）を皮内に注射し、ポジティブコントロールとして、ＰＢＳを注射した。注射の２０分後、マウスを処分し、転化した皮膚において、反応の青色強度を、個々のポジティブコントロールと比較した。図７において、上述したような、形質導入していない免疫化した、典型的なＢａｌｂ／ｃマウスの転化腹部皮膚（Ａ）は、Ｂｅｔ  ｖ  １及びＰｈｌ  ｐ  ５の両方に対してポジティブ反応を示している。Ｐｈｌ  ｐ  ５キメラマウスは、Ｂｅｔ  ｖ  １に対してはポジティブ反応を示すものの、Ｐｈｌ  ｐ  ５に対してはポジティブ反応を示さなかった（Ｂ）。未処理のＢａｌｂ／ｃマウスは、アレルゲンに対して全くポジティブ反応を示さなかった（Ｃ）。図７Ｄは、組換えアレルゲン及びコントロールの注射一覧表を示している。
【０１０４】
ｄ）アレルゲン特異的Ｔ細胞増殖の著しい減少
Ｂ細胞寛容に加えてＴ細胞寛容をテストするべく、Ｔ細胞増殖実験を行った。マウスを処分したとき（ＢＭ移植後２９又は４０週目）に、年齢の一致した未処理Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝４）、Ｐｈｌ  ｐ  ５を形質導入した（ｎ＝６）、及び形質導入していない（ｎ＝７）感作したマウスの脾臓を単離した。脾臓細胞を、１ウェルあたり２×１０5細胞の濃度で９６丸底プレート（Ｎｕｎｃ、デンマーク）に播種し、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｂｉｏｃｈｒｏｍｅ  ＡＧ、ドイツ）において３７°Ｃ及び５％ＣＯ2下で培養し、コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ  Ａ；０．５μｇ／ウェル、Ｓｉｇｍａ）、ｒＰｈｌ  ｐ  ５（２μｇ／ウェル）、及びｒＢｅｔ  ｖ  １（２μｇ／ウェル）で刺激した。５日目の培地に、０．５μＣｉ／ウェルのトリチウム化したチミジン(アマシャム)を用いて、１６時間振動を与えて回収し、増殖反応をシンチレーションカウンターにより測定した。抗原（ｃｐｍ）と培地コントロール値（ｃｐｍ）との平均増殖の比率を求めた（刺激指数［ＳＩ］）。形質導入していない、感作したＢａｌｂ／ｃマウスと比較して、Ｐｈｌ  ｐ  ５  キメラマウスではほとんど増殖が検出されなかった。Ｂｅｔ  ｖ  １で刺激したリンパ球の増殖は、形質導入していない、感作したマウスと比較して、Ｐｈｌ  ｐ  ５キメラは同様であった（図８）。
【０１０５】
このモデルでは、同質遺伝子的に修飾した造血細胞を移植することにより、Ｉ型アレルギーにおける分子キメラ化及び持続性のある頑強な寛容を誘引できることが示された。このことは、リンパ球増殖実験に見られるＴ細胞寛容やＢ細胞寛容（キメラマウスにおいてアレルゲン特異的ＩｇＥ及びＩｇＧ１が生成されない）につながる。重要なことは、生体外及び生体内における好塩基球／肥満細胞の脱顆粒の不足によって判断できるように、エフェクター細胞レベルにおいて寛容が確立されたことである。
【実施例５】
【０１０６】
膜アンカー型花粉アレルゲンを骨髄細胞に組み込むための組換えレトロウイルスの生成
ａ）膜アンカー型Ｂｅｔ  ｖ  １を運ぶ組換えレトロウイルスをコードするレトロウイルスベクターの構成
以下の実施例は、アレルゲンＢｅｔ  ｖ  １を用いて行った。Ｂｅｔ  ｖ  １は主要なアレルゲンである、カンバの花粉である。Ｂｅｔ  ｖ  １は、病原性関連（ＰＲ）１０タンパク質に属し、アレルゲンＰｈｌ  ｐ  ５とは関連性を有さない。組換えレトロウイルスを生成するために、実施例１ａに示すように、Ｂｅｔ  ｖ  １の全長ｃＤＮＡを、シグナルペプチド及び膜貫通領域に融合した。そして、ＮｃｏＩ制限部位（３’末端）及びＸｈｏＩ制限部位（５’末端）を、以下のプライマーを用いて挿入した（括弧内は配列番号を表す）。
【０１０７】
【表３】
2010528639.tif 000004
【０１０８】
最初に、融合断片を受容体ベクターｐＳＴ−Ｂｌｕｅ  １（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローンした。ポジティブ挿入を、レトロウイルスベクターｐＭＭＰ−ｆ２（John Iacomini、ボストンより提供）にサブクローンし、結果としてＭＭＰ−Ｂｅｔ  ｖ  １−ＴＭを得た（図９Ａ）。また、ｐＭＭＰ−ＩＲＥＳｅＧＦＰベクターにも、レポーター遺伝子緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の共発現のためにサブクローンし、ＭＭＰ−Ｂｅｔ  ｖ  １−ＴＭ−ＩＲＥＳｅＧＦＰを得た（図９Ｂ）。導入遺伝子のないＭＭＰ−ＩＲＥＳｅＧＦＰベクターを、以下の実験においてコントロールとして用いた（図９Ｃ）。
【０１０９】
ｂ）ＧＦＰ混合膜結合型Ｂｅｔ  ｖ  １を有する組換え偽型レトロウイルスの産出
組換えレトロウイルスを、実施例１Ｂに記載のように生成した。２９３Ｔ細胞に、ｐＭＤ．Ｇ、ｐＭＬＶ、及びコントロールとしての、プラスミドＭＭＰ−Ｂｅｔ  ｖ  １−ＴＭ−ＩＲＥＳｅＧＦＰ又はＭＭＰ−ＩＲＥＳｅＧＦＰをコトランスフェクトし、ＶＳＶ−Ｂｅｔ  ｖ  １−ＴＭ−ＧＦＰ及びＶＳＶ−ＧＦＰ（コントロールウイルス）を得た。ウイルス上清を濃縮し、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を用いて用量設定した（実施例１Ｂに示すように）。Ｂｅｔ  ｖ  １をＢｅｔ  ｖ  １に対するウサギポリクローナル抗血清（全長アレルゲン）を用いて検出し、血清をタンパク質Ｇカラムで精製し、抗体をビオチン化し、ＶＳＶ−Ｂｅｔ  ｖ  １−ＴＭ−ＧＦＰ感染ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞によって用量設定した。Ｂｅｔ  ｖ  １及びＧＦＰ発現を、フローサイトメトリーで検出した。細胞表面におけるＢｅｔ  ｖ  １発現を、ビオチン化Ｂｅｔ  ｖ  １抗体で検出し、ストレプトアビジン−ＰＥ−Ｃｙ５で対比染色した（図１０Ｂ）。
【実施例６】
【０１１０】
Ｂｅｔ  ｖ  １を形質導入した骨髄細胞の移植
５−ＦＵ処置したＢＡＬＢ／ｃマウスの骨髄細胞を、実施例２Ｂに記載の方法にしたがって回収し、培養した。培養した骨髄細胞の形質導入を、ＶＳＶ−Ｂｅｔ  ｖ  １−ＴＭ−ＧＦＰ又はＶＳＶ−ＧＦＰを用いて、三度行った。Ｂｅｔ  ｖ  １−ＴＭコンストラクトの発現を、フローサイトメトリーでレポーター遺伝子ＧＦＰを検出することによって測定し（図１２Ａ及びＢ）、細胞を計数して、２×１０6の形質導入した細胞を、致死量の放射線を照射した被提供者の尾静脈に注射した。実験計画は図１１に示した。第−１日目に、マウスを抗ＣＤ４  ｍＡｂ及び抗ＣＤ８  ｍＡｂで処理し、放射線照射した（８Ｇｙ）。第０日目には、骨髄を尾静脈に移植し、ＭＲ１を注射した。骨髄移植から６、９、１５、及び２２週間後に、形質導入した被提供者の骨髄を、ｒＰｈｌ  ｐ  ５及びｒＢｅｔ  ｖ  １で感作した。観察期間を通して、Ｂｅｔ  ｖ  １のキメラ化を、フローサイトメトリーによって、白血球の異なる系統内において決定した。
【実施例７】
【０１１１】
生体内の骨髄由来細胞における、レトロウイルスにコードされたアレルゲンのキメラ化
被提供者におけるのキメラ化は、骨髄移植の３２日後に検出された。１グループのＢＡＬＢ／ｃマウスを、ＶＳＶ−Ｂｅｔ  ｖ  １−ＴＭ−ＧＦＰで形質導入したＢＭＣで再構築し、コントロールグループのマウスを、ＶＳＶ−ＧＦＰを形質導入したＢＭＣで再構築した。フローサイトメトリーに基づく決定によれば、全てのマウスがキメラであった。Ｂ細胞及び骨髄系統のキメラ化を検出するために、白血球を、ビオチン化Ｍａｃ１又はＢ２２０とともにインキュベートし、ストレプトアビジン−ＰＥ−Ｃｙ５で対比染色した。キメラ化を、レポーター遺伝子ＧＦＰの発現によって検出した。ＶＳＶ−Ｂｅｔ  ｖ  １−ＴＭ−ＧＦＰを形質導入した被提供者の骨髄において、およそ２％〜５．５％のＧＦＰポジティブ細胞が示された（図１３）。ＶＳＶ−ＧＦＰのが形質導入された被提供者においては、１９％〜３３．５％のキメラ化に到達した。
【図１Ａ】
2010528639.tif 000005
【図１Ｂ】
2010528639.tif 000006
【図２】
2010528639.tif 000007
【図３】
2010528639.tif 000008
【図４】
2010528639.tif 000009
【図５Ａ】
2010528639.tif 000010
【図５Ｂ】
2010528639.tif 000011
【図６】
2010528639.tif 000012
【図７Ａ】
2010528639.tif 000013
【図７Ｂ】
2010528639.tif 000014
【図７Ｃ】
2010528639.tif 000015
【図７Ｄ】
2010528639.tif 000016
【図８】
2010528639.tif 000017
【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
2010528639.tif 000019
【図９Ｃ】
2010528639.tif 000020
【図１０】
2010528639.tif 000021
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2010528639.tif 000026
2010528639.tif 000027
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