(57)【要約】  液体のサンプル（１０２，８０４）中の多細胞生物の蛍光測定装置及びその蛍光測定方法は、ポンプ機構と、フローセル（１０４）と、測定値を解析する（１００，３００，５０８）方法と、任意選択で仕分け機構（５０２）とを含んでいる。ポンプ機構は、生じさせる身体的損傷及び／又はストレスを最小にしながら、容器からフローセル（１０４）を通過させて大型多細胞生物を移動させる（４０２，８３６）。サンプル容器／貯蔵器から測定装置を通過させるように生物を駆動する圧力差は、重力（８００）、空気圧（４１２）又は液体圧、あるいはこの３つのある組み合わせから得ることができる。蛍光は、光検出器又は撮像器（１０６）を使用してサイトメータで測定することができる。一般に、検出要素は、蛍光発光波長を分離するフィルタ（１１４）を含むことになる。照明は、多波長による同時照明を可能にするために、ダイクロイックミラーの使用と組み合わされたレーザ（１１２）又はＬＥＤ（３０２）によって行ってもよい。さらに、ＬＥＤは、散乱／反射ＬＥＤ光（しかし蛍光ではない）を検出要素から遮断しながら最適励起波長を分離するためのフィルタと共に、通常使用されることになる。
2010509610.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポンプを介して多細胞生物を通過させることなく、フローセル（１０４）を介して前記多細胞生物を含む液体サンプル（１０２，８０４）をサンプル容器（４０２，８２６）から廃棄物容器（８０６，４２２）に送るための蛍光測定装置であって、
前記サンプル（１０２，８０４）を含むサンプル容器（４０２，８２６）と、
該サンプル容器（４０２，８２６）と前記廃棄物容器（８０６，４２２）の間に圧力差を選択的に加える供給手段と、
前記サンプル容器を前記フローセル（１０４）に結合するための第１の流出口（４０６，４１６，８２０）と、
廃棄物容器（８０６，４２２）と、
前記フローセルを前記廃棄物容器に結合するための第２の流出口（４２０，８１８，８１４）とを備え、
前記供給手段により圧力差が加えられたとき、前記サンプルの部分が、前記サンプル容器から前記第１の流出口と前記フローセルと前記第２の流出口を通って前記廃棄物容器に流れ、
前記サンプルの部分が、前記ポンプを介して通過しないことを特徴とする蛍光測定装置。
【請求項２】
前記多細胞生物は、長さが０．１ｍｍから３ｃｍであることを特徴とする請求項１に記載の蛍光測定装置。
【請求項３】
前記多細胞生物は、アフリカツメガエルのオタマジャクシであることを特徴とする請求項２に記載の蛍光測定装置。
【請求項４】
前記圧力差を選択的に加える供給手段は、前記サンプル容器に結合された、前記サンプル容器中の圧力を上昇させるための空気ポンプ（４１２）であることを特徴とする請求項１に記載の蛍光測定装置。
【請求項５】
前記圧力差を選択的に加える供給手段は、重力を使用することを特徴とする請求項１に記載の蛍光測定装置。
【請求項６】
前記圧力差を選択的に加える供給手段は、前記サンプル容器中の液体レベルを第１のレベル（８３６）まで上昇させるための手段（８２８，８３２，８１４）を備え、
前記第１のレベルは、前記廃棄物容器中の液体レベルより高いことを特徴とする請求項５に記載の蛍光測定装置。
【請求項７】
前記廃棄物容器から前記サンプル容器に前記サンプルの部分を送り戻すための手段をさらに備え、
前記サンプル容器中の液体レベルを前記廃棄物容器中の液体レベルより低く第２のレベル（８３８）まで低下させる手段（８３２）と、前記サンプルの部分が前記廃棄物容器から前記サンプル容器に流れることを可能にするためのバルブ（８３４）とを備えていることを特徴とする請求項６に記載の蛍光測定装置。
【請求項８】
前記サンプル容器中に、前記第２のレベルの下に（８４０）前記多細胞生物を収容するように構成された間仕切り（８４２）をさらに備えていることを特徴とする請求項７に記載の蛍光測定装置。
【請求項９】
前記サンプル容器は、前記多細胞生物がその中に沈むことができる、前記サンプル容器の横断面より狭い下側領域を有するように構成されていることを特徴とする請求項１に記載の蛍光測定装置。
【請求項１０】
前記第１の流出口は、前記多細胞生物を吸い出すための前記下側領域中に延在したパイプ（４０６，７０８）を備えていることを特徴とする請求項９に記載の蛍光測定装置。
【請求項１１】
前記パイプは、前記下側領域中に延在するように湾曲した端部（４０８，７０８）を備えていることを特徴とする請求項１０に記載の蛍光測定装置。
【請求項１２】
前記圧力差は、約１４０ｍｌ／分のサンプル流量を達成するのに十分であることを特徴とする請求項１に記載の蛍光測定装置。
【請求項１３】
前記サンプル内の光度を測定するための検出要素（１００，３００，５０８）を備え、前記多細胞生物が流出した後に、測定された光度に従って前記多細胞生物を仕分けするための機構（５０８，５０２）をさらに備えていることを特徴とする請求項１に記載の蛍光測定装置。
【請求項１４】
多細胞生物の蛍光測定方法であって、
サンプル容器（４０２、８２６）内に前記多細胞生物を含む液体サンプル（１０２，８０４）を配置するステップと、
廃棄物容器（８０６，４２２）を提供するステップと、
前記サンプル容器と前記廃棄物容器の間の流れの結合中に蛍光測定装置（１０４）を配置するステップと、
前記サンプルの部分が前記サンプル容器から前記蛍光測定装置を介して通過して前記廃棄物容器中に流れるように、前記サンプル容器と前記廃棄物容器の間に圧力差を選択的に加えるステップとを有し、
ポンプを介して前記サンプルの部分を通過させるステップを含まないことを特徴とする蛍光測定方法。
【請求項１５】
前記圧力差を加えるステップは、前記サンプル容器中に空気を送り込む（４１２）ステップを有することを特徴とする請求項１４に記載の蛍光測定方法。
【請求項１６】
前記圧力差を加えるステップは、前記廃棄物容器中の液体レベルより高く前記サンプル容器中の液体レベル（８３６）を上昇させる（８２８，８３２，８１４）ステップを有することを特徴とする請求項１４に記載の蛍光測定方法。
【請求項１７】
前記廃棄物容器内の液体レベルより下に（８３８）前記サンプル容器内の液体レベルを低下させることによって（８３２）、前記サンプル容器に前記サンプルを移動させて戻すステップをさらに有することを特徴とする請求項１６に記載の蛍光測定方法。
【請求項１８】
前記多細胞生物は、アフリカツメガエルのオタマジャクシであることを特徴とする請求項１４に記載の蛍光測定方法。
【請求項１９】
前記蛍光測定装置中の前記サンプル内の光を検出する（１００，３００，５０８）ステップと、検出された光に従って前記多細胞生物を仕分けする（５０８，５０２）ステップとをさらに有することを特徴とする請求項１４に記載の蛍光測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多細胞生物の蛍光測定装置及びその蛍光測定方法に関し、より詳細には、流動液体中の大型多細胞生物（ｌａｒｇｅ  ｍｕｌｔｉ−ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｏｒｇａｎｉｓｍ）の蛍光測定を実施して仕分けするための蛍光測定装置及びその蛍光測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＷａｔｃｈＦｒｏｇ（仏国パリ）は、環境中の汚染物質を敏感に試験し、そして製剤試験するための技術を開発してきた。アフリカツメガエルのオタマジャクシ（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｔａｄｐｏｌｅ）は、汚染物質（又は薬物）に反応して「光を発し」（蛍光を示す）、そして同時にいくつかの化学種の存在を表示することができる。これは、遺伝子組み換えのアフリカツメガエルに関する公開されて利用できる文献（例えば、非特許文献１参照）及び特許文献１に記載されており、以下に要約する。
【０００３】
基本原理には、顧客が興味を示すことがある分子のどのようなタイプの生理作用にも反応して、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ：緑色蛍光タンパク質）を発現させることができる遺伝子構造を生成することが含まれる。次いで、この「分子線量計（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｏｓｉｍｅｔｅｒ）」をアフリカツメガエルの幼虫中に組み込み、これによって、生体内で被験サンプルに反応することができる生化学的調節をすべて勘定に入れる。
【０００４】
例えば、外因性内分泌かく乱化学物質（ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｄｉｓｒｕｐｔｅｒ）が存在する場合、それは、エストロゲン（ｅｓｔｒｏｇｅｎ）や甲状腺ホルモン（ｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ）など様々なホルモンの反応要素を活性化して、蛍光タンパク質の合成を始動させることになる。蛍光は、多細胞生物の透明性によって現れ、したがって、動物を犠牲にすることなく、検出し定量化することができる。幼虫は、試験を実施するために液体サンプル中に置く必要があるだけである。遺伝子構造は、様々な破壊的な、又は薬理的な作用に反応するために試験範囲を注文通りにするように必要に応じて変更することができる。
【０００５】
この試験方法は、生体内におけるという利点と生体外でのフレキシビリティを兼ね備える。それは、低コストで材料の経済的な使用及び自動化の可能性と共に、高い感度及び特異性で正確な情報を迅速かつ簡単に提供する。
【０００６】
アフリカツメガエル（種の選択）は、完全な免疫系を有し、それに加えてより複雑な心臓及び循環系を有する。さらに、内分泌生理学の観点では、アフリカツメガエルと人間の間の生化学的機構（ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）の不変性が実証され証明されている。アフリカツメガエルは、研究世界では調査され認められたモデルである。
【０００７】
さらに、アフリカツメガエルは、多くの薬理学上の用途をもたらす。例えば、アフリカツメガエルは、その成長過程中に血管系及び複雑な中枢神経系を極めて迅速に発現させることに、やはり関連性がある。したがって、目標モデルを開発して、血管形成又は神経学的な興味がある新しい分子を試験することができる。
【０００８】
本発明の技術分野でやはり知られていることは、粒子を検出する様々な方法である。例えば、本発明者に与えられた特許（例えば、特許文献２参照）には、噴水流サイトメータ（ｆｏｕｎｔａｉｎ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）が開示されており、蛍光標識された細胞のサンプルが、デジタルＣＣＤ又はＣＭＯＳカメラ及び前置光学系に対してチューブに流れる。このことは図１（従来技術）に示されている。細胞が、透明端部要素を通るレーザによって焦点面上で照明される。細胞（１つ又は複数）がデジタルカメラの焦点面を通過するとき、それは、透明窓及び蛍光発光波長を分離するフィルタを通して、カメラ及びレンズアセンブリによって撮像される。次いで、細胞を浮遊させる液体は、窓を通り過ぎドレインチューブから流出する。
【０００９】
図１は、従来の落射蛍光噴水流サイトメータ（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｆｏｕｎｔａｉｎ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）の概略図である。符号１００は、落射蛍光噴水流サイトメータを示している。蛍光生物のサンプル１０２は、デジタルカメラ１０６及び前置光学系１０８に対してフローセル（ｆｌｏｗ  ｃｅｌｌ）１０４を通過する。細胞は、レーザ１１２によって焦点面１１０上で照明される。次いで、細胞（１つ又は複数）は、ＣＣＤカメラの焦点面を通過し、それは、透明なフローセル１０４の窓を通し、蛍光発光波長を分離するフィルタ１１４を使用して、ＣＣＤカメラ及びレンズアセンブリによって撮像される。次いで、細胞を浮遊させる液体は、窓１１８を通り過ぎ、廃液１２０は、フローセル１０４のドレインチューブ１１６から流出する（矢印で表された経路中で）。
【００１０】
フローブロックは、フローセル１０４として使用することができ、図２に示されているように、サンプル１０２が、入力配管２０８を介して流入チューブ２０２を通ってフローブロックに流入し、押し上げられ、そして撮像窓１１８の下方を押し流され、下方に流れて戻り、ドレインチューブ１１６を通り、そして廃液流出配管２０６から流出する。
【００１１】
図２は、図１に示したサイトメータとともに使用されるアルミニウムのフローブロックのチューブを示す図である。このサイトメータ（フローセル１０４）において、サンプル１０２は、ステンレス鋼の流入チューブ２０２に結合された入力配管２０８のフレキシブル配管（Ｔｙｇｏｎ（商標）など）を通ってフローセル（フローブロック）１０４に流入し、そしてステンレス鋼のドレインチューブ１１６を通って廃液流出配管２０６に流出する。２つの垂直な８ｍｍの穴が、アルミニウムのフローブロック中にあけられており、それらは、流入穴２１０及び流出穴２１４である。サンプルが内部の流入穴２１０を上方に流れるので、サンプルは、デジタル（例えば、ＣＣＤ又はＣＭＯＳ）のカメラ１０６の焦点面１１０を通過する。この穴２１０は、散乱光を減少させるために、一般的に黒く塗られている。テフロン（登録商標）テープのガスケット２１６が、アルミニウムのフローブロックと円形ＢＫ７窓１１８の間に介装され、ねじ式の黄銅キャップ２１８よってしっかりと固定される。ガスケットは、窓１１８を通してサンプルを観察することができるように切断される。次いで、サンプル１０２は、流出穴２１４を下方に通ってドレインチューブ１１６に進む。図３に示すように、ＬＥＤによる照明を使用してもよい。
【００１２】
図３は、ＬＥＤによって照明される従来の落射蛍光噴水流サイトメータを示す図である。符号３００は落射蛍光噴水流サイトメータを示している。蛍光標識された細胞のサンプルが、デジタルカメラ１０６及び前置光学系１０８に対してフローセル１０４を通って流れる。細胞は、焦点面上でＬＥＤ３０２によって照明される。細胞（１つ又は複数）がＣＭＯＳカメラの焦点面１１０を通過するとき、それは、透明なフローセルの窓１１８及び蛍光発光波長を分離するフィルタ（図示せず）を通してカメラ及びレンズアセンブリ１０８によって撮像される。次いで、細胞を浮遊させる液体は、窓１１８を通り過ぎ、フローセル１０４のドレインチューブ１１６から流出する。（注：現在の実施形態では、蠕動ポンプは、使用されない。）
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００６／０１０１５２８号明細書
【特許文献２】米国特許第６７６５６５６号明細書
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Turque他、２００５
【非特許文献２】Demeneix, B and Turque, N.  Transgenic clawed frog embryos and use thereof as detectors of endocrine disrupters in the environment. （US Patent Application 2006/0101528）
【非特許文献３】Johnson PE, Votaw AS, Deromedi, AJ.  Biodetection with flow cytometry: better, faster, cheaper.  In Biodetection Technologies, vol. 1., Brookline, Massachusetts: Knowledge Press; 2002; p 71-83.
【非特許文献４】Johnson PE.  Apparatus and methods for high throughput analysis of samples in a translucent flowing liquid. （US Patent 6,765,656; 2004）
【非特許文献５】Johnson, PE, Deromedi, AJ, Lebaron, P, Catala, P., and Cash, J.  Rapid detection and enumeration of Escherichia coli in aqueous samples using Fountain Flow Cytometry, in press, Cytometry Part A, 69A, 1212-1221, 2006.
【非特許文献６】Johnson, PE, Deromedi, AJ, Lebaron, P, Catala, P, Havens, C, and Pougnard, C.  High throughput, real-time detection of Naegleria lovaniensis in natural river water using LED-illuminated Fountain Flow Cytometry, 103(3), 700-720 J Appl Microbiol, 2007.
【非特許文献７】Johnson PE.  Method and system for counting particles in a laminar flow with an imaging device. （US Patent Application 1 1/328,033; 2006）
【非特許文献８】www.watchfrog.fr.  Accessed November 11, 2006.
【非特許文献９】Turque, N., Palmier, K., Le Mevel, S., Alliot, C. and Demeneix, B.A.  A Rapid, Physiologic Protocol for Testing Transcriptional Effects of Thyroid-Disrupting Agents in Premetamorphic Xenopus Tadpoles.  Environmental Health Perspectives, 113, Number 11, November 2005.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、このような問題に鑑みてなされたもので、その目的とするところは、流動液体中の大型多細胞生物の蛍光測定を実施して仕分けするための蛍光測定装置及びその蛍光測定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
大型（幅がほぼ１〜５ｍｍ）の多細胞生物を含む水性サンプルのリアルタイム蛍光測定を可能にする発明を説明する。本システムは、ポンプサブシステムと、蛍光測定サブシステムと、測定値を処理するためのユニットとを少なくとも含んでいる。さらに、本システムは、さらなる解析のために、多細胞生物をその蛍光に従って容器中に仕分けする仕分けユニットを含むことができる。ポンプユニットに対する１つの制約は、それがサンプル中の多細胞生物に対して非破壊的でなければならないということである。本発明におけるポンプ方法は、空気圧及び／又は重力に基づき、送られる多細胞生物に対して比較的ストレスがない。多細胞生物の蛍光を測定するための好ましい技術がここに提示され、それは、上述した特許文献２に詳細に記載された、ＬＥＤによる照明及びデジタル撮像器と結合された噴水流細胞数測定技術（ｆｏｕｎｔａｉｎ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）である。
【００１７】
多細胞生物にポンプを通過させることなく、サンプル容器からフローセルを通過させて廃棄物容器へ多細胞生物を含む液体サンプルを送るための蛍光測定装置は、サンプルを含むサンプル容器と、サンプル容器と廃棄物容器の間に圧力差を選択的に加えるための供給手段と、サンプル容器をフローセルに結合するための第１の流出口と、廃棄物容器と、フローセルを廃棄物容器に結合するための第２の流出口とを含んでおり、圧力差が加えられたとき、サンプルの部分が、サンプル容器から流れて、第１の流出口を通り、フローセルを通り、そして第２の流出口を通って廃棄物容器に進み、そしてサンプルの部分は、決してポンプを通過しない。
【００１８】
多細胞生物は、長さが０．１ｍｍから３ｃｍとなることがあり、例えば、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）のオタマジャクシ（ｔａｄｐｏｌｅ）としてもよい。
【００１９】
圧力差を選択的に加えるための供給手段は、サンプル容器に結合された、サンプル容器中の圧力を上昇させるための空気ポンプとすることができる。
【００２０】
他の実施形態として、圧力差を選択的に加えるための供給手段は、重力を使用する。圧力差を選択的に加えるための供給手段は、サンプル容器中の液体レベルを第１のレベルまで上昇させることを含み、その第１のレベルは、廃棄物容器中の液体レベルより高い。特徴として、この実施形態は、再測定のために、サンプルの部分を廃棄物容器からサンプル容器に送り戻す能力も含んでもよい。これは、サンプル容器中の液体レベルを第２のレベルまで低下させることによって達成され、その第２のレベルは、廃棄物容器中の液体レベルより低い。バルブによって、再循環されるサンプルの部分が、廃棄物容器からサンプル容器に流れることが可能になる。
【００２１】
一般に、第２の実施形態は、サンプル容器中に、第２のレベルより低く多細胞生物を収納するように構成された間仕切りを含んでいる。
【００２２】
いくつかの実施形態では、サンプル容器は、多細胞生物が沈むことができる、サンプル容器の横断面より狭い下側領域を含むように構成される。したがって、第１の流出口は、多細胞生物を吸い出すために、下側領域中に延在するパイプを含んでもよい。パイプは、この下側領域に到達するための湾曲端部を有することができる。
【００２３】
圧力差は、サンプル流量が約１４０ｍｌ／分を達成するのに十分であることが好ましい。一般に、蛍光測定装置は、サンプル内の光度を測定するための検出要素を含んでいる。特徴は、多細胞生物が蛍光測定装置を流出した後、測定された光度に従って多細胞生物を仕分けするための機構である。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】従来の落射蛍光噴水流サイトメータ（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｆｏｕｎｔａｉｎ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）の概略図である。
【図２】図１に示したサイトメータとともに使用されるアルミニウムのフローブロックのチューブを示す図である。
【図３】ＬＥＤによって照明される従来の落射蛍光噴水流サイトメータを示す図である。
【図４】本発明のポンプシステムの第１の好ましい実施形態を示す概略図である。
【図５】本発明によって実施されるプロセスを明らかにするブロック図である。
【図６Ａ】噴出流構成（ｆｏｕｎｔａｉｎ  ｆｌｏｗ  ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）で使用される本発明のポンプシステムを明らかにする概略図である。
【図６Ｂ】サンプル導入ユニットと共にサンプル容器を示す本発明の実施形態の概略図である。
【図７Ａ】本発明において使用することが可能な容器構成を明らかにする図である。
【図７Ｂ】本発明において使用することが可能な容器構成を明らかにする図である。
【図７Ｃ】本発明において使用することが可能な容器構成を明らかにする図である。
【図８】本発明のポンプシステムの第２の好ましい実施形態を明らかにする概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態について説明する。  
本発明は、液体のサンプル中の大型多細胞生物の蛍光測定装置及びその蛍光測定方法を含んでいる。蛍光測定装置は、２つのポンプ機構を含んでいる。第１のポンプ機構は、図４に示し、空気圧及び重力を使用しており、第２のポンプ機構は、図８に示し、重力だけを使用している。蛍光測定装置が図６Ａに示してあり、サンプルを導入するための機構が図６Ｂに示してある。測定値を解析する方法は、任意選択の仕分け機構を含み、図５に示されている。図７Ａ乃至図７Ｃに、本発明に適切な貯蔵容器の例を示している。
【００２６】
ポンプ機構の実施形態は、生じさせる身体的な損傷及び／又はストレスを最小にしながら、容器からフローセルを通過させて多細胞生物を移動させる。サンプル容器／貯蔵器から測定装置を通過させる、それらの多細胞生物を駆動する圧力差が、重力、空気圧、液体圧、又はその３つのある組み合わせから得ることができる。蛍光は、噴水流サイトメータ中で、ＣＭＯＳ検出器、電荷結合素子、又はすべての他の撮像又は光検出ユニットを含む光検出器又は撮像器を使用して、測定することができる。一般に、検出要素は、蛍光発光波長を分離するフィルタを含むことになる。照明は、多波長による同時照明を可能にするために、ダイクロイックミラーの使用と組み合わされたレーザ又はＬＥＤによって行ってもよい。さらに、ＬＥＤは、散乱／反射ＬＥＤ光（しかし蛍光発光ではない）を検出要素から遮断しながら最適励起波長を分離するためのフィルタと共に、通常使用されることになる。
【００２７】
好ましい（そして実施するのに簡単化された）実施形態では、被試験生物は、野生型又は遺伝子組み換えが行われているアフリカツメガエルである。本発明の具体的な実施形態は、以下に詳細に述べる。
【００２８】
１．＜ポンプ＞
図４は、本発明のポンプシステムの第１の好ましい実施形態を示す概略図である。具体的な装置は以下に述べる。図４に示されているアフリカツメガエルのポンプサブシステムは、（左側から右側に）バリアック（Ｖａｒｉａｃ）（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｖｏｌｔａｇｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ：可変電圧変圧器）４１０と、水槽空気ポンプ４１２と、サンプル容器４０２のための環状スタンド支持器と、サンプル容器４０２と、フローセル１０４及び廃棄物容器４２２を含んでいる。サンプル容器４０２は、オタマジャクシを容器の底隅部に集めるために、約３０°傾けられている。空気ポンプ４１２は、短いステンレス鋼の空気パイプ４０４中に空気配管４１４を介して空気を送り込むものである。サンプル１０２は、容器４０２中の最下位点から長いステンレス鋼のサンプルパイプ４０６／Ｔｙｇｏｎ（商標）サンプル配管４１６の組み合わせを通してフローセル１０４に送られる。フローセル１０４からサンプルは、サンプル配管４２０を介して廃棄物容器４２２中に流入する。
【００２９】
一実施形態では、アフリカツメガエルのオタマジャクシを含んだ容器４０２は、２つの穴があけられたゴム栓を有した５００ｍｌのガラス瓶であり、２つの直径８ｍｍのステンレス鋼のチューブが栓を貫通して挿入されている。パイプ４０４の一方は、短く、栓を貫通して延在するのにちょうど十分な長さである（図４、図６Ａ及び図６Ｂ）。長いパイプ４０６は、ガラス瓶の底の近くにまで延在する。その下側端部に、オタマジャクシにより良好に到達するために、湾曲端部片４０８が配置されることが好ましい。１２０ボルトの交流で動作する安価な水槽空気ポンプ４１２を用い、空気配管４１４を介して短いパイプ４０４中に、空気が送り込まれる。容器４０２は、オタマジャクシが最下位点に定着することを好むので、傾けられている。ポンプ４１２からの空気圧によって、オタマジャクシが容器から送り出され、フローセル１０４を通り、ガラスの「廃棄物」容器４２２中に進む。
【００３０】
流量が、可変変圧器４１０（「バリアック」）によって制御されるが、何かより基本的なことを開発することができる。（直流電源によって動作する空気ポンプは、良好に働くはずである）。約１４０ｍｌ／分の流量を達成するための電圧は、交流の約２５ボルトである。この流量より遅く送ると、オタマジャクシは、配管中に移動しないことになる。
【００３１】
フローセル１０４は、図４に示された、流入チューブ２０２とドレインチューブ１１６及び観察領域４１８とを有したフローブロックとすることができる。測定装置の残された部分は、明確にするために省略されているが、図６Ａ及び図６Ｂに示している。
【００３２】
本システムは、ポンプがインペラーポンプ、ダイヤフラムポンプ、ピストンポンプ、シリンジポンプ、蠕動ポンプ、歯車ポンプ、又はすべての他の種類の機械的ポンプであろうとも、オタマジャクシがポンプを通り抜けるどのようなシステムよりも優れている。一般に、機械的ポンプは、オタマジャクシなどの大型の軟質粒子にとって、その中を流れることは優しくない。具体的に、研究者は、遠心分離式／インペラーポンプを試みてきたが、オタマジャクシを殺すことなくそれらを働かせる方法を見つけることができない。図４に示された空気ポンプシステムは、オタマジャクシに大変優しく、同じセットのオタマジャクシは、それらを殺すことなく何回か測定装置を通過させることができる。
【００３３】
２．＜生物の解析及び仕分け＞
図５は、本発明によって実施されるプロセスに関する変化を明らかにするブロック図である。空気ポンプ４１２及びサンプル容器４０２は、図４に示されている。測定装置５０８の一例が図６Ａ及び図６Ｂに示されている。
【００３４】
測定ステップからの結果は、蛍光測定からバルブ５０２を始動させることによって、蛍光に従ってオタマジャクシを仕分けするために使用することができ、これによってオタマジャクシは、蛍光強度に従って２つ以上の瓶５０４、５０６に仕分けられる。
【００３５】
図６Ａは、噴出流構成（ｆｏｕｎｔａｉｎ  ｆｌｏｗ  ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）で使用される本発明のポンプシステムを明らかにする概略図で、図４からのサンプル容器４０２及びＦＦＣ（Ｆｏｕｎｔａｉｎ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ；噴水流サイトメータ）測定装置５０８をフローセル１０４と共に示す本発明の実施形態の概略図である。
【００３６】
ＬＥＤ３０２によって励起されたオタマジャクシからの発光強度を測定する噴水流サイトメータ（ＦＦＣ：特許文献２参照）中に、オタマジャクシが送り込まれる。オタマジャクシが、ＧＦＰ発現について測定されている場合、ＦＦＣは、ＧＦＰを測定するために励起フィルタ（図示せず）と共に青色ＬＥＤを使用し、そしてデジタルカメラ１０６は、ＧＦＰを測定するために発光フィルタ（図示せず）を使用する。ＣＭＯＳカメラは、フローセル１０４からの発光を、通常２〜１０フレーム／秒の割合で連続的に測定するために使用される。光度測定は、ＣＭＯＳフレーム中の画素のすべての強度を合計することによって行われる。（他の実施形態では、光電子増倍管又はソリッドステート光検出器が強度をモニタするために使用することができる）。データは、強度測定値の時系列として記録される（ストリップチャート記録器からの出力と同様）。オタマジャクシ事象は、データ中にピークとして出現する。サンプルは、通常、２００ｍｌのサンプル中で１０〜３０のオタマジャクシからなる。解析によって平均強度及び標準誤差が得られ、それらは、遺伝子組み換えのアフリカツメガエルの場合、サンプル中の汚染物質のレベルを表す。
【００３７】
測定装置５０８は、ＦＦＣに限定されず、例えば、水性サンプル中の大型粒子の蛍光を測定する任意のシステムとすることができる。
【００３８】
図６Ｂは、サンプル導入ユニットと共にサンプル容器を示す本発明の実施形態の概略図で、オタマジャクシを含むサンプルをサンプル容器中に導入するために、「サンプル導入ユニット」（この場合じょうご６０６として示す）が取り付けられたサンプル容器４０２を含む図６Ａに示した実施形態の概略図である。
【００３９】
このユニットは、サンプル導入バルブ６０４を有し、これは、一方向に開くとオタマジャクシをサンプル容器４０２中に導入し、他方向に開くと空気がサンプル導入ユニット／チャンバを通って漏れないように保ちながら空気６０２をサンプル容器４０２中に送り込むことを可能にする。
【００４０】
図７Ａ乃至図７Ｃは、本発明において使用することが可能な容器構成を明らかにする図である。これらのサンプル容器は、容器中の最下位点に定着した生物を収容する。図７Ａは、その最下位の隅部に到達するために湾曲パイプ７０８を含む傾けられた容器７０２を示す図である。図７Ｂは、くぼみのある容器７０４を示す図である。図７Ｃは、先細の容器７０６を示す図である。
【００４１】
多くのアフリカツメガエルのオタマジャクシは、サンプル容器中の最下位点に定着することを好む。オタマジャクシが容器中の底に定着したとき、それらが長いチューブの入力端部の近くに定着するように、サンプル容器の底部を狭める、又は先細にすることは、速くて能率的である。これによって、オタマジャクシが流れ中に飲み込まれることになって長いチューブ中に流されることが容易になる。長いチューブの端部で速度を増加させることも、その直径を端部において先細に狭めることによって可能である（図示せず）。
【００４２】
図８は、本発明によるポンプ装置の第２の実施形態を明らかにする概略図である。図８の実施形態は、再循環オタマジャクシポンプ（ＲＴＰ（Ｒｅｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｔａｄｐｏｌｅ  Ｐｕｍｐ）８００といわれ、オタマジャクシを送るために重力だけを使用し、同じサンプル１０２を何回か測定するための方法を含んでいる。
【００４３】
ＲＴＰ８００は、オタマジャクシのそれぞれについてオタマジャクシの蛍光を測定するために、フローセル１０４を通過させて一定サンプル１０２（通常、幅が約４ｍｍの、ほぼ４０のオタマジャクシを含む０．５から１．０リットル）を送るように設計された、重力によって搬送するポンプシステム（ｐｕｍｐｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）である。測定中、オタマジャクシは、第２のシリンダ８２６中のより高いレベル８３６と第１のシリンダ８０６中の液体高さの間の液体の高度差を使用して、第２のシリンダ８２６からフローセルを介して注ぎ込まれる（ｐｕｍｐ）。
【００４４】
オタマジャクシは、第１のシリンダ８０６中の液体高さと第２のシリンダ８２６中の下側液体の高さレベル８３８の間の水の高度差を使用して、ドレイン８１２を介して経路８１６に従って第１のシリンダ８０６から第２のシリンダ８２６に送り戻される（最初の導入後、又は各測定後）。
【００４５】
第１及び第２のシリンダ８０６，８２６の底部は、先細にされて、オタマジャクシがそれぞれの基部中の流出口中に流入するように、促進される。さらに、シリンダの壁に留まろうとするオタマジャクシの自然な性癖に打ち勝つために、洗浄／攪拌水がバルブ８１０，８２８中にパイプで送り込まれてシリンダ中に循環が導入されて、オタマジャクシがそこから流されることになる。洗浄水は、シリンダが空になった後、シリンダ中に残ったいずれのオタマジャクシも洗い流すことにも使用することができる。ポンプの速度は、流れに逆らって泳ごうとするオタマジャクシの自然な性癖に打ち勝つために、約１５０ｍｌ／分より高く維持されることが好ましい。
【００４６】
「レベラ（ｌｅｖｅｌｅｒ）」８０８，８３０，８３２は、シリンダ中の開口部であり、「開口時」、それらそれぞれのシリンダ中の液体レベルに上限値を与える。レベラ８３０及び８０８は、レベル維持のための流出であり、水レベルが、決してそれらの高さを超えるはずがないので、バルブは必要でない。レベラ８０８の口にある間仕切り８４６が、その点でシステムから出ないようにオタマジャクシを引き留める。レベラ８３２は、レベルを維持するためのバルブであり、サンプルを第２のシリンダ８２６に戻すとき、第２のシリンダ８２６中の液体レベルをレベル８３８まで低下させるために使用される。間仕切り８４２が第２のシリンダ８２６を横切って延在し、その下に、したがってレベラ８３２から離してオタマジャクシを引き留めておくので、間仕切りは必要でない。さらに、間仕切り８４２は、オタマジャクシを含むサンプル容積８４０を小さく保つために使用され、したがって、オタマジャクシは、ドレイン８２０近くにあり、流れによってフローセル１０４中に容易に押し流される。
【００４７】
実験の終わりに、サンプル１０２は、フローセル１０４中に流入する代わりに、ドレインバルブ８２４を使用して第２のシリンダ８２６から下方にドレインチューブ８２２でサンプルを迂回させることによって、システム８００から除去することができる。第２のシリンダ８２６中の液体レベルをレベル８３６まで上昇させて重力圧を生成し、それによってサンプルにフローセル１０４を通過させ、そして洗浄／攪拌／補充の両方のために、水槽ポンプ（図示せず）を使用して水をシステム中に送り込んでもよい。
【００４８】
以下に測定サイクルについて詳細に説明する。  
１．例えば、手動によって導入じょうご８０２を通して第１のシリンダ８０６中に、サンプル８０４を導入する。
【００４９】
２．バルブ８３４を開き、第２のシリンダ８２６中で間仕切り８４２の下に、サンプルを導入する。レベラバルブ８３２によって水レベルが下側レベル８３８に、すなわち、第１のシリンダ８０６中の水レベルより下に保持されて、第１のシリンダ８０６から第２のシリンダ８２６への流れが維持されている。レベラバルブ８３２は、このステップ中開けたままにしておいて、第２のシリンダ８２６中の液体レベルを十分低く保ってもよい。オタマジャクシは、間仕切り８４２によって第２のシリンダ８２６中に保たれる。第１のシリンダ８０６中に残されたすべてのサンプルを洗い流すために、バルブ８１０を介して少量の洗浄水を加える。
【００５０】
３．バルブ８３２及び８３４を閉じる。
【００５１】
４．洗浄／攪拌／補充水バルブ８２８を開き、水を第２のシリンダ８２６中に送り込むことによって（ポンプは図示せず）、第２のシリンダ８２６に水を補充する。第２のシリンダ８２６中の液体レベルがレベル８３６に一度達すると、測定を開始するためにバルブ８１４を開き、そうするとサンプルがフローセル１０４を貫流して、フローセル１０４７から第１のシリンダ８０６へ経路８１８をたどって進む。上側レベルを維持するための流出８３０が水頭を一定レベル８３６に維持して、フローセル１０４を通る流速を一定に保つ。
【００５２】
５．オタマジャクシのすべてが容器を出てしまうまで搬送が継続される。
【００５３】
６．ここで、オタマジャクシは第１のシリンダ８０６にあり、ステップ１に戻ってシリンダＡへ再導入できる状態になる。
【００５４】
バルブのすべては、現在手動で操作されているが、容易にコンピュータによって操作することができる。
【符号の説明】
【００５５】
１００  サイトメータ
１０２  サンプル
１０４  フローセル
１０６  デジタルカメラ
１０８  光学系
１１０  焦点面
１１２  レーザ
１１４  フィルタ
１１６  ドレインチューブ
１１８  窓
１２０  廃液
２０２  流入チューブ
２０６  廃液流出配管
２０８  ポンプからの配管
２１０  流入穴
２１４  流出穴
２１６  ガスケット
２１８  ねじ式キャップ
３００  ＬＥＤサイトメータ
３０２  ＬＥＤ
４０２  サンプル容器
４０４  空気パイプ
４０６  サンプルパイプ
４０８  湾曲端部
４１０  バリアック（可変変圧器）
４１２  空気ポンプ
４１４  サンプル容器への配管
４１６  フローセルへの配管
４１８  観察領域
４２０  廃棄物容器への配管
４２２  廃棄物容器
５０２  バルブ
５０４、５０６  瓶
５０８  測定装置
６０２  送り込まれる空気
６０４  サンプル導入バルブ
６０６  サンプル導入じょうご
７０２、７０４、７０６  容器構成
７０８  湾曲パイプ
８００  重力による実施形態
８０２  サンプル導入じょうご
８０４  サンプル
８０６  第１のシリンダ
８０８  第１のシリンダレベルを維持するための流出
８１０  第１のシリンダ水の補充バルブ
８１２  第１のシリンダから第２のシリンダへのドレイン
８１４  フローセルから第１のシリンダへのバルブ
８１６  第１のシリンダから第２のシリンダへのサンプル経路
８１８  フローセルから第１のシリンダへのサンプル経路
８２０  第２のシリンダからフローセルへのドレイン
８２２  ドレインチューブ
８２４  ドレインバルブ
８２６  第２のシリンダ
８２８  第２のシリンダ水の補充バルブ
８３０  第２のシリンダレベルを維持するための流出
８３２  第２のシリンダレベルを維持するためのバルブ
８３４  第２のシリンダのサンプル入力バルブ
８３６、８３８  第２のシリンダの補充レベル
８４０  第２のシリンダのサンプル容積
８４２  第２のシリンダの間仕切り
８４６  第１のシリンダの間仕切り
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【国際調査報告】
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