(57)【要約】  本発明は、酵母培養物から単離される新規の糖組成物に関する。本発明はまた、水溶性が向上した酵母細胞をベースとする組成物に関する。本発明で開示する糖組成物は、前記組成物が投与される動物又はヒト対象の健康を増進するために、栄養添加物若しくは医薬添加物又は栄養組成物若しくは医薬組成物の一部として使用することができる。本発明はまた、前記糖組成物の製造方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物又はヒトの胃障害、腸疾患の予防及び成長促進に使用するための糖含有産物の製造方法であって、
Ａ．酵母原材料、好ましくはビール酵母原材料の提供、
Ｂ．１％水溶液としての全体的溶解性が５５％を超える糖組成物を生成するための、酵素及び／又は最適化された酸加水分解による加水分解、
を含む、方法。
【請求項２】
Ａ．酵母原材料、好ましくはビール酵母原材料を提供する工程、
Ｂ．前記材料の物理的ホモジナイズ工程、
Ｃ．無機酸による加水分解工程、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
酸濃度約０．５〜約１．２５Ｍ、反応温度７０〜１００℃、反応時間２〜８時間、より好ましくは３〜５時間、最も好ましくは３．５〜４．５時間
と同等な条件下における、ＨＣｌ、リン酸、又は硫酸の群から選択される強酸による強加水分解
を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記加水分解が、酸濃度約０．５〜約１．２５Ｍ、反応温度７０〜１００℃、反応時間２〜８時間、より好ましくは３〜５時間、最も好ましくは３．５〜４．５時間と同等な条件下でリン酸によってビール酵母に実施される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のプロセスによって得られるＰｒｏｇｕｔタイプ可溶性糖組成物であって、１％水溶液としての全体的溶解性が５５％を超える、Ｐｒｏｇｕｔタイプ可溶性糖組成物。
【請求項６】
前記組成物の１％水溶液としての全体的溶解性が６０％〜８０％である、請求項５に記載のＰｒｏｇｕｔタイプ可溶性糖組成物。
【請求項７】
前記組成物が、総溶出体積１８ｍｌ及びカラム長３０ｃｍのスーパーデックスペプチド１０／３００ＧＬカラムから約６〜１６ｍｌ及び／又は６〜１４ｍｌに溶出する増加した量の糖を含む、請求項６に記載のＰｒｏｇｕｔタイプ可溶性糖組成物。
【請求項８】
前記６〜１４ｍｌに溶出する増加した量の糖が、２１４ｎＭにおいて６８０ｍＡＵの１．５倍のＵＶ吸収積分値に相当する、請求項７に記載のＰｒｏｇｕｔタイプ可溶性糖組成物。
【請求項９】
前記組成物が、増加した量のＭａｎα３Ｍａｎα２オリゴ糖を含む、請求項８に記載のＰｒｏｇｕｔタイプ可溶性糖組成物。
【請求項１０】
Ｍａｎα３Ｍａｎα２オリゴ糖中のマンノースの量が１５ｇ／ｋｇを超える、請求項９に記載のＰｒｏｇｕｔタイプ可溶性糖組成物。
【請求項１１】
前記可溶性糖画分を更なる工程で前記組成物から単離又は精製し、水溶性Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物又は半水溶性Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物を得る、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
以下の群から選択される方法又は／その任意の組合せにより前記可溶性糖画分を単離又は精製する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法：
ａ）
ｉ．帯電物質又は親油性物質（疎水性不純物）の吸収についてのクロマトグラフィー、
ｉｉ．サイズ排除クロマトグラフィー、特に低分子量不純物を除去するためのゲル濾過、
ｉｉｉ．糖又はその一部に結合するマトリックスを用いたアフィニティークロマトグラフィー、好ましくは活性炭を用いたクロマトグラフィー、
等のクロマトグラフィー法、
及び／又は
ｂ）溶媒抽出及び／又は不純物若しくは糖の沈殿等の相分離溶液法であって、好ましい実施形態では沈殿に有機溶媒、好ましくはメタノール、エタノール等のアルコール又はケトン、より好ましくはエタノールが用いられ、好ましいサイズの糖の沈殿にアセトンが用いられる、相分離溶液法、
及び／又は
ｃ）溶液及び沈殿剤の遠心分離、
及び／又は
ｄ）望ましくない成分の化学的又は酵素的分解方法であって、好ましくはアルカリに不安定な不純物を分解するための穏やかなアルカリ加水分解及び／又はＧｌｃα含有グリコーゲン／デンプン型糖の酵素的加水分解。
【請求項１３】
疎水性クロマトグラフィー及び／又はイオン交換クロマトグラフィー、並びに、サイズ排除クロマトグラフィーで前記糖画分を精製する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
１％水溶液としての全体的溶解性が９０％を超える、請求項１２〜１３のいずれか一項に記載のプロセスで得られるＰｒｏｇｕｔタイプ水溶性糖組成物。
【請求項１５】
１％水溶液としての全体的溶解性が９０〜１００％である、請求項１４に記載の糖組成物。
【請求項１６】
前記組成物が、総溶出体積１８ｍｌ及びカラム長３０ｃｍのスーパーデックスペプチド１０／３００ＧＬカラムから約６〜１６ｍｌ及び／又は６〜１４ｍｌに溶出する増加した量の糖を含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
前記６〜１４ｍｌに溶出する増加した量の可溶性材料が、２１４ｎＭにおいて６８０ｍＡＵの２．０倍のＵＶ吸収積分値に相当する、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記組成物が、増加した量のＭａｎα３Ｍａｎα２オリゴ糖を含む、請求項１７に記載の可溶性材料中の糖組成物。
【請求項１９】
６〜１６ｍｌに溶出するＭａｎα３Ｍａｎ２糖中のマンノースの量が２０ｇ／ｋｇを超える、請求項９に記載の糖組成物。
【請求項２０】
１２〜１６分に溶出するＭａｎα３Ｍａｎα２マンノースオリゴ糖がかなりの量、好ましくは全Ｍａｎα３Ｍａｎα２マンノース糖の少なくとも約１０％である、請求項１０又は１９に記載の糖組成物。
【請求項２１】
かなりの量のＧｌｃβ糖が存在し、そのため約４．５３ｐｐｍにおけるＧｌｃβのＨ１プロトンＮＭＲシグナルの積分値がＭａｎα３Ｍａｎα２−Ｈ１プロトンＮＭＲシグナルの少なくとも８０％である、請求項１０、１９又は２０のいずれか一項に記載の糖組成物。
【請求項２２】
濾過及び加水分解処理されたビール酵母原材料の可溶性成分をゲル浸透クロマトグラフィーにかけ、総溶出体積１８ｍｌ及びカラム長３０ｃｍのスーパーデックスペプチド１０／３００ＧＬカラムから約６〜１６ｍｌに溶出する画分中の中間サイズ糖材料を単離することで得られる糖組成物。
【請求項２３】
動物の胃障害及び腸疾患の予防並びに成長促進に使用するための、請求項２２に記載の糖組成物。
【請求項２４】
ビール酵母原材料を濾過する工程、前記濾過されたビール酵母原材料を加水分解的に処理する工程、及びゲル浸透クロマトグラフィーで約６〜１６ｍｌに溶出され得る中間サイズ糖材料を単離する工程、を含む糖組成物の製造方法。
【請求項２５】
前記中間サイズ糖材料中の個々の糖物質を単離及び／又は同定する工程を更に含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
動物の胃障害、腸疾患の予防、又は成長促進における前記個々の糖物質の効果をスクリーニングする工程を更に含む、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母培養物から単離される新規の糖組成物に関する。本発明はまた、酵母細胞をベースとする水溶性が向上した糖組成物に関する。本発明が開示する糖組成物は、前記組成物が投与される動物又はヒト対象の健康を増進するために、栄養添加物若しくは医薬品添加物又は栄養組成物若しくは医薬組成物の一部として用いることができる。本発明はまた、前記糖組成物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｐｒｏｇｕｔ（商標）は、消化管の健康を良好に維持し、成長を促進し、動物の胃腸管のほとんどの問題で使用される抗生物質に取って代わる、全酵母（ｗｈｏｌｅ  ｙｅａｓｔ）をベースにした動物用飼料成分である（例えば特許文献１参照）。Ｐｒｏｇｕｔ（商標）は、全ビール酵母（ｗｈｏｌｅ  ｂｒｅｗｅｒｙ  ｙｅａｓｔ；サッカロマイセス・セレビシエ）から製造され、そのため、酵母細胞壁粒子（主にマンノプロテイン及びβ−グルカン）及び細胞内ヌクレオチドの両方を含む。これらの要素は全て、Ｐｒｏｇｕｔ（商標）の活性に重要であることが示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００２００６１３４５号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、最適化された強酸加水分解条件若しくは酵素的加水分解条件を用いるか又は生物活性を有する新規の高溶解性産物を得るための驚くほど効果的なそれらの組合せを用いて特に製造される新規のｐｒｏｇｕｔ型産物を明らかにする。溶解性の増加並びに生物活性の高い低分子量の多糖及びオリゴ糖を得るために、約０．５〜約１Ｍを含む非常に高い酸濃度及び／又は７５〜１００度の高い反応温度を含む驚くほど強力な酸処理条件が必要であることが観察された。この条件は強烈であり、酵母材料が加水分解に強い耐性を有することを示しているが、この条件には最適値があり、高温で酸を２Ｍに上げると細胞壁材料の可溶化効率が低下し且つ／又はほぼ完全に加水分解されることで遊離の単糖の量が増加する。
【０００５】
マンノースオリゴ糖含量が高いこと及びデンプンオリゴ糖含量が低いこと及びＧｌｃβ糖含量が高いこと等の特有の化学的特徴が、新規の糖画分の高い生物活性に関係している。これらは従来の産物及び競合産物とは明らかに異なる。有効なマンノースオリゴ糖及びＧｌｃβ糖を同じ標品中にかなりの量生成させるための最適な加水分解条件は、特にこの糖が、主要な加水分解処理又は抽出化学処理をされていない天然酵母等の酵母原材料、例えばビール製造工程に由来する酵母等の発酵に由来する酵母から同じ標品中に生成されるのであれば、新規且つ独創的である。
【０００６】
バックグラウンドでの酵母材料の酸処理は主に、中程度のｐＨ範囲及び反応温度にて低濃度の酸を用いる穏やかな処理であり、一般的に、グルカンと呼ばれる主に不溶性の細胞壁標品を得るためにアルカリ処理と共に用いられると理解される。グルカン標品の酸に由来するベータ６の証拠はない。
【０００７】
本発明では、一連の従来及び新規のＰｒｏｇｕｔ（商標）サンプル並びに精選した関連産物に由来するサンプルを分析する。分析は主にゲル浸透クロマトグラフィーで行うが、プロセスではここでゲル浸透クロマトグラフィーで単離された可溶性成分のＮＭＲ分析も用いられる。
【０００８】
本研究のもう１つの目的は、その活性を失うことなく溶解性が増加した新規のＰｒｏｇｕｔ（商標）を製造することである。これは、マンノプロテイン及び／又はβ−グルカンを酵素的又は機械的に分解するか酸加水分解によって分解することで達成され得る。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物（ＰＧ）及び関連サンプル中の可溶性成分の量を示す図である。ＰＧ１〜ＰＧ９：Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物サンプル。関連サンプル：Ｃ１、Ａｇｒｉｍｏｓ；Ｃ２、Ａｓｃｏｇｅｎ；Ｃ３、Ａｌｐｈａｍｕｎｅ  Ａｌｐｈａｒｍａ；Ｃ４、Ｂｉｏ−Ｍｏｓ。
【図２】０．２％溶液由来のＰＧ１とＰＧ２を比較した図である。０．２％溶液に由来するＰＧ１水溶性成分（Ａ）及びＰＧ２水溶性成分（Ｂ）の、スーパーデックスペプチドカラムを用いたゲル浸透クロマトグラム（等量のサンプル標品；Ａ２１４を測定）。
【図３】１％溶液由来のＰＧ１及びＰＧ２を比較した図である。１％溶液に由来するＰＧ１水溶性成分（Ａ）及びＰＧ２水溶性成分（Ｂ）の、スーパーデックスペプチドカラムを用いたゲル浸透クロマトグラム（等量のサンプル標品；Ａ２１４を測定）。
【図４】９個のＰＧサンプル及び関連サンプルを比較した図である。Ａ．ＰＧｌ、Ｂ．ＰＧ２、Ｃ．ＰＧ３、Ｄ．ＰＧ４、Ｅ．ＰＧ５、Ｆ．ＰＧ６、Ｇ．ＰＧ７、Ｈ．ＰＧ８、１．ＰＧ９、Ｊ．Ｃ１、Ｋ．Ｃ２、Ｌ．Ｃ３、Ｍ．Ｃ４の１％溶液に由来する水溶性成分の、スーパーデックスペプチドカラムを用いたゲル浸透クロマトグラム（等量サンプル標品；Ａ２３０を測定）。ＰＧ９の分析は約５０％少ない材料で行ったが、結果を同様に比較できるようにスケールを調節して補正している。
【図５】５個のＰＧサンプルを比較した図である。Ａ．ＰＧ１０、Ｂ．ＰＧ１１、Ｃ．ＰＧ１２、Ｄ．ＰＧ１３、Ｅ．ＰＧ１４の１％溶液に由来する水溶性成分の、スーパーデックスペプチドカラムを用いたゲル浸透クロマトグラム（等量サンプル標品；Ａ２３０を測定）。
【図６】ビール酵母溶液及びそのホモジナイズバージョンから作製したＰＧサンプルを比較した図である。酸加水分解されたビール酵母（Ａ）及びホモジナイズビール酵母（Ｂ）の１％溶液に由来する水溶性成分の、スーパーデックスペプチドカラムを用いたゲル浸透クロマトグラム（等量サンプル標品；Ａ２１４を測定）。
【図７】細菌接着試験用に酵素分解又は化学分解して作製したサンプルを比較した図である。Ａ．ビール酵母（ＢＹ）＋グルカネックス（Ｇ）、Ｂ．ホモジナイズＢＹ（ＨＢＹ）＋Ｇ、Ｃ．ＢＹ  Ｇ＋サビナーゼ（Ｓ）、Ｄ．ＨＢＹ  Ｇ＋Ｓ、Ｅ．ＢＹ  １Ｍ  Ｈ３ＰＯ４、Ｆ．ＨＢＹ  １Ｍ  Ｈ３ＰＯ４、Ｇ．ＢＹ  Ｇ＋ペクチナーゼ（ＰＥ）、Ｈ．ＨＢＹ  Ｇ＋ＰＥ、Ｉ．ＰＧ１  ＰＥ、Ｊ．ＰＧ１＋ＰＲの１％溶液に由来する水溶性成分の、スーパーデックスペプチドカラムを用いたゲル浸透クロマトグラム（等量サンプル標品）。Ａ、Ｂ、及びＩは、分取クロマトグラムであり、Ａ２３０を測定した（互いに比較可能）；その他は分析クロマトグラムであり、Ａ２１４を測定した（互いに比較可能）。
【図８】ＰＧ１、水溶性ＰＧ（ＰＧ  ＷＳ）、水溶性ＰＧと乳化剤（ＰＧ  ＷＳ＋Ｅ）、及び過剰に加水分解したＰＧを比較した図である。Ａ．ＰＧ１、Ｂ．ＰＧ  ＷＳ、Ｃ．ＰＧ  ＷＳ＋Ｅ、Ｄ．ＰＧ１５ｈの１％溶液に由来する水溶性成分の、スーパーデックスペプチドカラムを用いたゲル浸透クロマトグラム（等量サンプル標品；Ａ２１４を測定）。
【図９】Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物サンプルに対するプロナーゼの効果を示す図である。プロナーゼ消化なし（グレーの棒グラフ）及びあり（濃いグレーの棒グラフ）のＰｒｏｇｕｔタイプ産物サンプル１及び２（ＰＧ１及びＰＧ２）。
【図１０】Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物及びビール酵母溶液に対するプロナーゼの効果を示す図である。プロナーゼ消化なし（グレーの棒グラフ）及びあり（濃いグレーの棒グラフ）のＰｒｏｇｕｔタイプ産物サンプル１及び２（ＰＧ１及びＰＧ２）（２回目実験）。ビール酵母（ＢＹ）は、最初にプロナーゼで処理してから酸加水分解するか（ＢＹ１）、最初に酸加水分解してからプロナーゼ処理した（ＢＹ２）（濃いグレーの棒グラフ）。対照として、プロセスの手順通りにＢＹを酸で加水分解した（グレーの棒グラフ）。
【図１１】Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物及びビール酵母溶液に対するサビナーゼの効果を示す図である。サビナーゼ消化なし（グレーの棒グラフ）及びあり（濃いグレーの棒グラフ）のＰｒｏｇｕｔタイプ産物サンプル１及び２（ＰＧ１及びＰＧ２）。ビール酵母（ＢＹ）は、最初にサビナーゼで処理してから酸加水分解するか（ＢＹ１）、最初に酸加水分解してからサビナーゼで処理した（ＢＹ２）（濃いグレーの棒グラフ）。対照として、プロセスの手順通りにＢＹ１及びＢＹ２を酸で加水分解した（グレーの棒グラフ）。
【図１２】Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物及びビール酵母溶液に対するペクチナーゼの効果を示す図である。ペクチナーゼ消化なし（グレーの棒グラフ）及びあり（濃いグレーの棒グラフ）のＰｒｏｇｕｔタイプ産物サンプル１及び２（ＰＧ１及びＰＧ２）。ビール酵母（ＢＹ）は、最初にペクチナーゼで処理してから酸加水分解するか（ＢＹ１）又は最初に酸加水分解してからペクチナーゼで処理した（ＢＹ２）（濃いグレーの棒グラフ）。対照として、プロセスの手順通りにＢＹ１及びＢＹ２を酸で加水分解した（グレーの棒グラフ）。
【図１３】ビール酵母溶液に対するグルカネックスの効果を示す図である。第１の実験は、ビール酵母を５、２０、１００ｍｇのグルカネックスを用いて３０℃で処理し（それぞれＧ５  ３０Ｃ、Ｇ２０  ３０Ｃ、Ｇ１００  ３０Ｃ）、その後プロセス酸処理を行った（濃いグレーの棒グラフ）。第２の実験では、ビール酵母を２０ｍｇのグルカネックスを用いて３７℃又は５０℃で処理し（それぞれＧ２０  ３７Ｃ、Ｇ２０  ５０Ｃ）、その後プロセス酸処理を行った（濃いグレーの棒グラフ）。対照として、両方の実験において、ビール酵母にプロセス酸処理のみを行った（グレーの棒グラフ）。
【図１４】ビール酵母溶液に対するグルカネックス及びサビナーゼの併用効果を示す図である。Ａ．ビール酵母を、最初に５、２０、１００ｍｇのグルカネックスを用いて３０℃で処理した後、サビナーゼ４μｌを用いて３７℃で処理し（それぞれＧ５＋Ｓ、Ｇ２０＋Ｓ、Ｇ１００＋Ｓ）、その後プロセス酸処理を行った（濃いグレーの棒グラフ）。Ｂ．ビール酵母溶液を、最初に２０ｍｇのグルカネックスを用いて３７℃で処理した後、４μｌ又は２０μｌのサビナーゼを用いて３７℃で処理するか（それぞれＧ３７＋Ｓ４、Ｇ３７＋Ｓ２０；濃いグレーの棒グラフ）、あるいは２０ｍｇのグルカネックスを用いて５０℃で処理した後、４μｌ又は２０μｌのサビナーゼを用いて３７℃で処理し（それぞれＧ５０＋Ｓ４、Ｇ５０＋Ｓ２０）、その後、プロセス酸処理を行った（濃いグレーの棒グラフ）。Ａ及びＢ両方の対照として、ビール酵母溶液を酵素なしでインキュベートし、プロセス酸処理のみを行った（グレーの棒グラフ）。
【図１５】ビール酵母溶液に対するグルカネックス及びエンドグルカナーゼ及び／又はサビナーゼの併用効果を示す図である。ビール酵母溶液をグルカネックス２０ｍｇとエンドグルカナーゼ２００μｇを用いて３７℃又は５０℃で処理するか（それぞれＧ３７＋ＥＧ、Ｇ５０＋ＥＧ）、最初にグルカネックス２０ｍｇとエンドグルカナーゼ２００μｇを用いて３７℃又は５０℃で処理した後、サビナーゼ４μｌを用いて３７℃で処理し（それぞれＧ３７＋ＥＧ＋Ｓ、Ｇ５０＋ＥＧ＋Ｓ）、その後プロセス酸処理を行った（濃いグレーの棒グラフ）。対照として、ビール酵母溶液を酵素なしでインキュベートし、プロセス酸処理のみを行った（グレーの棒グラフ）。
【図１６】サビナーゼ処理と組み合わせたより高い濃度のＨ３ＰＯ４のビール酵母溶液に対する効果を示す図である。０．３Ｍ、０．５Ｍ、１Ｍの各濃度のＨ３ＰＯ４を用いて１００℃でビール酵母溶液を酸加水分解した（それぞれ０．３Ｍ、０．５Ｍ、１Ｍ；濃いグレーの棒グラフ）。ビール酵母溶液をサビナーゼ（４μｌ）と一緒にインキュベートし、その後、０．３Ｍ、０．５Ｍ、１Ｍ、２Ｍの各濃度のＨ３ＰＯ４を用いて８０℃で酸加水分解した（それぞれ０．３Ｍ＋Ｓ、０．５Ｍ＋Ｓ、１Ｍ＋Ｓ；濃いグレーの棒グラフ）。対照として、ビール酵母溶液をプロセス酸処理した（グレーの棒グラフ）。
【図１７】ビール酵母溶液に対するＨＣｌの効果を示す図である。０．３Ｍ、０．５Ｍ、１Ｍ、２Ｍの各濃度のＨＣｌを用いて８０℃でビール酵母溶液を酸加水分解した（それぞれ０．３Ｍ、０．５Ｍ、１Ｍ、２Ｍ；濃いグレーの棒グラフ）。対照として、ビール酵母溶液をプロセス酸処理した（グレーの棒グラフ）。
【図１８】ビール酵母溶液に対するＨ２ＳＯ４の効果を示す図である。０．３Ｍ、０．５Ｍ、１Ｍ、２Ｍの各濃度のＨ２ＳＯ４を用いてビール酵母溶液を８０℃で酸加水分解した（それぞれ０．３Ｍ、０．５Ｍ、１Ｍ、２Ｍ；濃いグレーの棒グラフ）。対照として、ビール酵母溶液をプロセス酸処理した（グレーの棒グラフ）。
【図１９】ホモジナイズの効果を示す図である。８０℃で、ビール酵母溶液をプロセス酸加水分解又は１ＭのＨ３ＰＯ４で処理し、ホモジナイズビール酵母溶液を１ＭのＨ３ＰＯ４で処理した（それぞれＢＹ、ＢＹ  １Ｍ、ＨＢＹ  １Ｍ）。
【図２０】グルカネックス、サビナーゼ、及びペクチナーゼとホモジナイズの効果を示す図である。ビール酵母溶液（グレー）及びそのホモジナイズバージョン（濃いグレー）をグルカネックス、グルカネックスとサビナーゼ、グルカネックスとペクチナーゼで処理し（それぞれＢＹ  Ｇ、ＢＹ  Ｇ＋Ｓ、ＢＹ  Ｇ＋Ｐ）、その後、プロセス酸加水分解を行った。
【図２１】ＰＧ１、ＰＧ２、ＰＧ  ＷＳ、及びＰＧ  ＷＳ＋Ｅの溶解性を比較した図である。
【図２２】ＰＧ１、ＰＧ−ＷＳ、Ａｇｒｉｍｏｓ、Ａｓｃｏｇｅｎ、Ａｌｐｈａｍｕｎｅ  Ａｌｐｈａｒｍａ、及びＢｉｏ−Ｍｏｓのゲル浸透クロマトグラフィーによる比較を示す図である。１％溶液由来のサンプルをスーパーデックスペプチドカラムにかけた（Ａ２３０を測定）。
【図２３】１％溶液で測定した酵母産物の水への溶解性を示す図である。ＰＧ  Ａｖ：Ｐｒｏｇｕｔ（商標）の平均（ｎ＝９）；ＰＧ  Ｓ：可溶性Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物；Ａｇ、Ａｇｒｉｍｏｓ；Ａｌ、Ａｌｐｈａｍｕｎｅ（商標）；ＢＭ：Ｂｉｏ−Ｍｏｓ（登録商標）。
【図２４】５個のＰｒｏｇｕｔタイプサンプルの分析的ＧＰＣ分析を示す図である。この分析は、可溶性材料のＧＰＣプロフィールにほとんど変動がなく、したがって製造プロセスが十分に標準化されていることを示している。
【図２５】Ｐｒｏｇｕｔ（商標；ＰＧ）、可溶性Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物（ＰＧ  Ｓ）、及び水溶性Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物（ＰＧ  ＷＳ；Ｐｒｏｇｕｔ  Ｓを更に処理した完全に（水に）可溶性の産物）の分析的ＧＰＣ分析を示す図である。
【図２６】可溶性の多糖、オリゴ糖、及びペプチドの量を比較した図である。ゲル浸透クロマトグラムの溶出体積６〜１４ｍｌに基づき材料の相対量を面積として測定した（２１４ｎｍ）。ＰＧＡｖは５個の異なるＰＧバッチの平均面積であり、これを１とした。
【図２７】ＰＧ；ＰＧ  Ｓ；Ａｇｒｉｍｏｓ；Ａｌｐｈａｍｕｎｅ（商標）；及びＢｉｏ−Ｍｏｓ（登録商標）のＧＰＣ分析を示す図である。
【図２８】Ｐｒｏｇｕｔタイプ材料及び３つの競合産物中の多糖、オリゴ糖、及びペプチドの量を比較した図である。ＰＧ  Ａｖ、平均（５個の異なるＰＧバッチの平均面積を指し、これを１とした。）；ＰＧ  Ｓ；ＰＧ  ＷＳ；Ａｇ、Ａｇｒｉｍｏｓ；Ａｌ、Ａｌｐｈａｍｕｎｅ（商標）、ＢＭ、Ｂｉｏ−Ｍｏｓ（登録商標）。結果は、ゲル浸透クロマトグラム（６〜１４ｍｌ、２３０ｎｍ）から測定した相対量として示す。
【図２９】５個のＰｒｏｇｕｔタイプ産物バッチの可溶性中サイズ材料の量と細菌接着分析の結果の相関を示す図である。パネルＡ．ＧＰＣで測定した可溶性の多糖・オリゴ糖サイズの材料の相対量（１％ＰＧ溶液４００ｍｇに由来する部分精製された可溶性成分、すなわちアミノ酸／ペプチドをほとんど含まない可溶性成分の分取ＧＰＣ分析のデータ。６〜１４ｍｌにおける溶出を２３０ｎｍで測定。ここで５個のＰＧサンプルの平均面積は２７８００ｍＡｕであり、これを１とした）。パネルＢ．大腸菌接着分析の結果。
【図３０】Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物及び競合サンプルの可溶性材料の量と細菌接着分析の結果の相関を示す図である。パネルＡ．可溶性の多糖及びオリゴ糖サイズ材料の相対量（１％ＰＧ溶液４００ｍｇに由来する部分精製された可溶性成分、すなわちアミノ酸／ペプチドをほとんど含まない可溶性成分の１％サンプルの分析的ＧＰＣ分析のデータ。６〜１４ｍｌにおける溶出を２３０ｎｍで測定。５個のＰＧサンプルの平均面積は２０５ｍＡｕであり、これを１とした）。パネルＢ．大腸菌接着分析の結果。
【図３１】可溶性の多糖及びオリゴ糖サイズ材料（すなわち、１％ＰＧ溶液又は関連溶液からスーパーデックスペプチド１０／３０カラムを用いたＧＰＣで単離された、６〜１６ｍｌに溶出する可溶性成分）中のマンノース含量を示す図である。ＰＧ  Ａｖ、平均（ｎ＝５）；ＰＧ  ＷＳ；Ａｇ、Ａｇｒｉｍｏｓ；Ａｌ、Ａｌｐｈａｍｕｎｅ（商標）；ＢＭ、Ｂｉｏ−Ｍｏｓ（登録商標）。
【図３２】５個のＰｒｏｇｕｔタイプ産物バッチのマンノース含量と細菌接着分析の結果を比較した図である。パネルＡ．可溶性の多糖及びオリゴ糖サイズ材料（すなわち、１％ＰＧ溶液からスーパーデックスペプチド１０／３０カラムを用いたＧＰＣで単離された、６〜１６ｍｌに溶出する可溶性成分）中のマンノース含量。パネルＢ．大腸菌接着分析の結果。
【図３３】Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物の可溶性多糖及び可溶性オリゴ糖の１Ｈ  ＮＭＲを示す図である。ＮＭＲスペクトルにマンノーオリゴ糖のいくつかの構造的特徴が現れている。
【図３４】ＰＧと競合産物の１Ｈ  ＮＭＲを比較した図である
【発明を実施するための形態】
【００１０】
ビール酵母に由来する新規の可溶性産物の製造
本発明は、酵母、好ましくはビール酵母型の材料に由来する可溶性の治療薬又は栄養補助製品（食品若しくは飼料製品又はその添加物）の新規の製造方法を明らかにした。本発明は、以下の特定の加水分解法及び／又は分解法を含む、材料を製造するための複数の方法を明らかにした：
１）特定のグリコシダーゼ、特にエンドグリコシダーゼ、
２）プロナーゼ及びサビナーゼ等のタンパク質切断酵素、
３）改良された化学的加水分解、特に強酸加水分解、及び
４）原材料の物理的ホモジナイズ。
【００１１】
本発明は更に、可溶化活性を高めた、これらの方法の組合せにも関する。
【００１２】
新規の可溶性産物の製造に好ましい原材料
本発明は、好ましくは、好適な酵母材料の使用、特に酵母型発酵プロセス（ｙｅａｓｔ  ｆｏｒｍ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ）、最も好ましくは酵母が醸造プロセスに由来している場合の原材料としてのビール酵母の使用に関する。そのような酵母材料としては、植物に由来する不溶性材料が含まれ、特に、ヘミセルロース糖（ペクチナーゼによる切断により示される。）を初めとする植物多糖及び穀類のベータグルカン（穀類は醸造過程に使用されるものが好ましく、最も好ましくはオオムギである。）を初めとする植物由来のβ−グルカン材料を含む植物由来の不溶性材料が含まれると理解される。新規の酵素反応が、更なる量の穀類タイプの可溶性糖類を新規産物中に生成するのに有用であると理解される。
【００１３】
特定の酵素反応又は化学的方法によって製造された新規の糖は健康に有益な更なる効果を有すると理解される。
【００１４】
更に、
１）醸造に使用されない酵母及び
２）植物由来多糖、好ましくは植物多糖、例えばヘミセルロース多糖及び／又は植物グルカン、特に穀類由来の多糖、非常に好ましくはオオムギ由来の多糖、又は穀類グルカン、最も好ましくはオオムギグルカン
を原材料として混合することで、好ましい可溶性物の組合せを製造することができると理解される。
【００１５】
好ましいプロセス
好ましい最適化されたプロセスは、少なくとも以下の工程を含む：
１．ビール酵母原材料を提供する工程
２．酵素及び／又は最適化された酸加水分解による加水分解。
【００１６】
本発明は更に、
１．ビール酵母原材料を提供する工程
２．材料の物理的ホモジナイズ工程
３．酵素及び／又は酸による、好ましい実施形態では酸による、加水分解工程
を含むプロセスに関する。
【００１７】
本発明は更に、
１．ビール酵母原材料を提供する工程
２．材料の物理的ホモジナイズ工程
３．酵素及び酸による加水分解工程
を含むプロセスに関する。
【００１８】
新規のオリゴ糖及び低分子量多糖組成物
新規の分解的製造プロセスにより、溶解性が増加するか不溶性材料が減少した産物が得られた。この材料は、溶解性の増加に加えて、下痢を引き起こす感染に対するより高い生物学的活性及び動物の成長を促進する活性を有している。
【００１９】
新規産物からの可溶性成分の単離
本発明は特に、ビール酵母材料から製造される新規可溶性画分の分離に関する。
【００２０】
産物中の好ましいオリゴ糖組成物
本発明者らは、スーパーデックスペプチドクロマトグラム（１％水溶液）のプロフィールから、新規の可溶性産物の生物学的活性を分析した。吸収は、種々のサイズの可溶性成分の相対量を示している。
【００２１】
溶出部の面積を計算することで、生物学的モデルにおけるＰｒｏｇｕｔタイプ産物及び関連材料の相対的有効性を数値で表すことができる（例えば表１）。本発明は、「可溶性」及び「水溶性」材料と呼ばれる、下痢を引き起こす大腸菌活性を初めとする有害な細菌活性の抑制に有用な新規の可溶性糖標品を明らかにした。そのような標品は、ヒト及び動物の成長及び健康に有用であると理解される。
【００２２】
好ましい産物タイプ
新規の加水分解プロセスでは、酵母に由来する非分画組成物としてそれ自体用いることができる新規の可溶性の糖が製造されたと理解される。好ましい実施形態では、この標品は、好ましくは水酸化ナトリウム等の強アルカリによって中和又は一部中和される。好ましい実施形態では、標品は、例えば噴霧染色、ドラム乾燥、又はその他公知の乾燥方法によって乾燥される。
【００２３】
本発明は更に、部分的に分画及び精製された糖産物を含む、分画された産物に関する。好ましい部分精製法としては、主な非糖成分の一部の除去、例えば１）脱塩、好ましい実施形態ではカルシウム又はその他のイオンによるリン酸塩の沈殿等、塩の沈殿による脱塩、２）疎水性（ｈｙｄｒｏｐｈｏｐｈｉｃ）マトリックス又はイオン交換マトリックス等の特定の吸着剤によるイオン性分子又は疎水性分子の除去、及び／又は３）不溶性材料又はその一部の除去、が含まれる。部分精製により、標品中の新規な糖の含量は通常１０〜３０％、更には５０％も増加すると理解される。強リン酸加水分解後の脱塩は、標品中の糖の量を３０〜６０％も増加させ、したがって、好ましいＭａｎα３Ｍａｎ−マンノース糖の好ましい量を約１５、より好ましくは２０ｇ／Ｋｇから約２０ｇ／Ｋｅ、より好ましくは３０ｇ／Ｋｇに増加させる。
【００２４】
好ましい精製方法としては、糖画分又はその一部の単離が含まれる。精製画分中の糖含量は好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２５％、更により好ましくは少なくとも約５０％である。ゲル濾過画分のＮＭＲで測定した糖の純度は少なくとも６０％、更により好ましくは少なくとも７０％であると推定される。その他の標準的な精製方法及び分画方法でも同様な純度が達成できると理解される。
【００２５】
糖材料の好ましいサイズ
本発明は、可溶性産物の好ましい大きく２つのサイズ範囲を明らかにした。スーパーデックスペプチドカラムから６〜１２分に溶出する大サイズ産物及び約１２〜約１６分に溶出する中間サイズ産物である。
【００２６】
本発明は特に、新規の有用な糖類を含み且つ産物の増加・向上された生物学的活性に関連する記載した糖画分に関する。
【００２７】
好ましい可溶性多糖のサイズ及び画分
産物は、ゲル濾過サイズ約２０〜約３０ヘキソース（Ｈｅｘ）単位のサイズの糖及び可能なより大きな可溶性多糖に対応するボイドピークを含む。より好ましくは、約７．７分のボイドは約２５ヘキソース単位以上の糖である可溶性多糖に対応する。本発明は、可溶性多糖材料を多く含む新規の産物に関し、これは新規産物の特徴である。好ましい多糖画分は、約２０ヘキソース単位以上の糖に対応するスーパーデックスペプチドカラムから６〜９分及び６〜１２分に溶出する画分を含む。
【００２８】
１２分の溶出時点が、オリゴ糖（ＤＰ１０）と１０以上の単糖残基を含む多糖とのほぼ境界であると理解される。
【００２９】
したがって、本発明は、
ａ）１０〜３０マー又はゲル濾過サイズが１０〜少なくとも約３０Ｈｅｘ単位以上の可溶性多糖からの多糖画分
ｂ）本発明に係るプロセスによって製造される、２０〜３０マー又はゲル濾過サイズが２０〜少なくとも約３０Ｈｅｘ単位の多糖画分
に関する。
【００３０】
好ましい中間サイズ産物
本発明は更に、約１２〜約１６分に溶出する好ましい中間サイズ産物に関する。この範囲は、約二／三糖〜約十糖類のオリゴ糖又はゲル濾過サイズ３〜少なくとも約１０Ｈｅｘ単位の糖に対応する。
【００３１】
好ましいより大きなオリゴ糖及び多糖画分
本発明は更に、約６〜１４分に溶出する、より大きなオリゴ糖及び多糖を組み合わせた画分に関する。この好ましい画分は、約４〜６マー、より好ましくは約５〜６マーのオリゴ糖から少なくとも約２０〜３０マーの多糖又はゲル濾過サイズ５〜少なくとも約３０Ｈｅｘ単位以上の可溶性多糖を含む。
【００３２】
ゲル濾過では、２ヘキソース（例えばグルコース、マンノース、又はガラクトース）単位は通常、オリゴ糖又は多糖中の１つのＨｅｘＮＡｃ（例えばＧｌｃＮＡｃ又はＧａｌＮＡｃ）に相当し、糖の予想溶出サイズは、通常Ｈｅｘ単位の量から計算することができる。
【００３３】
原材料のホモジナイズ及び加水分解との組合せ
プロセス酸加水分解前にビール酵母溶液をホモジナイズするとＰｒｏｇｕｔタイプ産物タイプ産物の溶解性が１５％増加し、ビール酵母原材料及び更なる酸を用いると更に増加することが明らかになった。
【００３４】
本発明は特に、好ましい実施形態では酸加水分解である加水分解の前にホモジナイズを含むプロセスに関する。
【００３５】
酵素処理による酸加水分解産物（ＰＧ）の溶解性の増加
本発明は、酸で加水分解した産物をプロテアーゼ又は多糖切断酵素で酵素処理することで更に溶解性が増すことを明らかにした。好ましい酵素処理としては、プロナーゼ（Ｐｒｏｎａｓｅ）、サビナーゼ（Ｓａｖｉｎａｓｅ）、ペクチナーゼ（Ｐｅｃｔｉｎａｓｅ）、グルカネックス（Ｇｌｕｃａｎｅｘ）、及びサビナーゼと組み合せたグルカネックス、又は同じ種類のタンパク質若しくは多糖に特異性を有する酵素が含まれる。
【００３６】
酸加水分解前の酵素処理
本発明は、酸で加水分解された産物を酸加水分解の前にプロテアーゼ又は多糖類切断酵素で酵素処理すると溶解性がより高くなることを明らかにした。好ましい酵素処理としては、プロナーゼ、サビナーゼ、ペクチナーゼ、グルカネックス及びサビナーゼと組み合せたグルカネックス、並びに必要に応じてサビナーゼと組み合わせたエングルカナーゼ、又は同じ種類のタンパク質又は多糖に特異性を有する酵素が含まれる。
【００３７】
最適化された酸加水分解条件
本発明は、新規の可溶性産物を製造するための、最適化された酸加水分解条件に関する。
【００３８】
本発明は、酸の量を増やして酸処理するとビール酵母への溶解性が増加することを明らかにした。
【００３９】
本発明は特に、乾燥重量で計算した酵母原材料の量が総反応体積の５〜３５重量／体積（ｗ／ｖ）％、より好ましくは１０〜３０％（ｗ／ｖ）、更により好ましくは１５〜２５％（ｗ／ｖ）、最も好ましくは総反応体積の約２０％（ｗ／ｖ）である、最適化された加水分解プロセスに関する。
【００４０】
本発明は、時間、温度、酸濃度（／サンプル量当たりの酸の量）、及び酸の種類に関して最適化された加水分解条件に関する。好ましい酸としては、無機酸、リン酸（Ｈ３ＰＯ４）、塩酸、及び硫酸が含まれる。最も好ましい酸はリン酸（Ｈ３ＰＯ４）である。
【００４１】
本発明は、生物活性を有する新規の可溶性産物を得るための最適化された強酸加水分解条件又は酵素的加水分解条件又はその驚くほど効果的な組合せにより特に製造された新規のＰｒｏｇｕｔタイプ産物を明らかにする。溶解性を増加させるため及び生物活性の高い低分子量の多糖及びオリゴ糖を得るためには、約０．５Ｍ〜約１Ｍ酸といった非常に高い酸濃度及び／又は７５〜１００℃の高い反応温度を含む驚くほど強い酸処理条件が必要であることが観察された。この条件は強烈であり、加水分解に対して酵母材料が高い耐性を有することを示しているが、条件には最適値があり、そのため、高温で酸を２Ｍに上げると、細胞壁材料の可溶化効率が低下し且つ／又はほぼ完全に加水分解されることで遊離の単糖類の量が増える。
【００４２】
Ｈ３ＰＯ４による最適化された加水分解
本発明は好ましくは、濃度が０．５Ｍ超、より好ましくは０．７５Ｍ超、更により好ましくは１Ｍ超、最も好ましくは約１Ｍのリン酸（Ｈ３ＰＯ４）の使用に関する。
【００４３】
２Ｍリン酸を用いた場合、可溶化の効果は０．５Ｍリン酸を用いた場合よりも低くなった。驚くべきことに、極端な酸濃度は加水分解を促進せずに材料を沈殿させた。このことは、効果的な可溶化に最適な酸濃度が約０．５〜約１Ｍであることを示している。
【００４４】
好ましい実施形態では、約１ＭのＨ３ＰＯ４を最適濃度として用い、好ましい範囲は、反応が約８０℃（好ましくは７０〜１００℃、更により好ましくは７０〜９５℃、更により好ましくは７５〜８５℃で行われる場合、約０．７５〜約１．２５Ｍ、更により好ましくは約０．８〜約１．２Ｍ、最も好ましくは約０．９〜約１．１Ｍである。好ましい反応時間は約４時間、好ましくは２〜８時間、より好ましくは３〜５時間、最も好ましくは３．５〜４．５時間である。
【００４５】
本発明は特に、可溶性が高く生物活性を有する本発明に係る糖をより多く得るための強加水分解条件又は強酸加水分解条件と酵素的加水分解との組合せに関し、好ましい実施形態では本発明と同等の加水分解条件が用いられる。
【００４６】
好ましい実施形態では、この条件は、１ＭのＨ３ＰＯ４で４時間、約７５〜９０℃で約４時間に相当する。温度を上げれば酸の量及び／又は反応時間を下げることができ、逆も同様であると理解される。別の好ましい実施形態では、温度を約９０〜約１００℃に上げ、酸の量を約０．５〜約１Ｍ、反応時間を約４時間にする。図１６は、１００℃、０．５Ｍ及び１Ｍの酸による高い溶解性を示している。
【００４７】
更に、図１６にサビナーゼで示すように、本発明に従って酵素を用いるか酸加水分解と組み合わせて酵素を用いることで、高い溶解性及び生物活性を有する産物を得ることができると理解される。酵素を使用すると可溶化プロセスが促進され、必要な酸濃度、反応温度、反応時間が低くなる。好ましい実施形態では、本発明は、０．３〜１Ｍの酸と組み合わせた本発明に係る酵素の使用に関する。
【００４８】
塩酸ＨＣｌによる最適化された加水分解
本発明は好ましくは、濃度が０．５Ｍ超、より好ましくは約０．７５Ｍ超、更により好ましくは約１Ｍ以上のＨＣｌの使用に関する。２Ｍの酸を用いると溶解性はより大きくなるが、非常に強力な鉱酸を用いた酸加水分解条件は完全な加水分解条件に近く、単糖の量も増加した。
【００４９】
好ましい実施形態では、約ＨＣｌを最適濃度として用い、好ましい範囲は、反応が約８０℃（好ましくは７０〜９０℃、更により好ましくは７５〜８５℃）で行われる場合、約０．７５〜約１．２５Ｍ、更により好ましくは約０．８〜約１．２Ｍ、最も好ましくは約０．９〜約１．１Ｍである。好ましい反応時間は約４時間、好ましくは２〜８時間、より好ましくは３〜５時間、最も好ましくは３．５〜４．５時間である。
【００５０】
本発明は更に、別の酸処理で既に述べたように約０．５Ｍ超及び約１Ｍの高濃度のＨ２ＳＯ４の使用に関する。データは、２Ｍの酸は溶解性を増加させず沈殿を増やす可能性があることを示している。更に
【００５１】
可溶化方法の組合せ
本発明は更に、実験セクションに記載するように、方法の複数の有用な組合せを明らかにした。好ましい組合せとしては、酵素的又は化学的な加水分解とホモジナイズが含まれる。
【００５２】
好ましい実施形態では、本発明は、ホモジナイズ及び改良された化学的加水分解等の方法の組合せに関する。この方法は、産物の可溶化効率が高く、方法及び試薬のコストが低いため好ましい。
【００５３】
本発明は更に、グリコシダーゼ及び／タンパク質切断酵素による酵素的加水分解とホモジナイズの組合せに関する。
【００５４】
本発明は更に、高収量で材料を製造する、タンパク質の酵素切断及びグリコシダーゼ切断の好ましい組合せを明らかにした。この方法はホモジナイズと組み合わせることが好ましい。
【００５５】
本発明は更に、高収量で材料を製造する、タンパク質の酵素切断及び／又はグリコシダーゼ切断と化学的切断方法の好ましい組合せを明らかにした。この方法はホモジナイズと組み合わせることが好ましい。
【００５６】
製造される可溶性炭水化物の向上された活性
本発明は、好ましい可溶化方法で、有用な生物学的活性を有する可溶性分子材料がより多く製造されることを明らかにした。本発明は特に、下痢を引き起こす微生物、特に大腸菌を初めとする細菌等の病原微生物に対する向上された活性に関する。
【００５７】
好ましい酵素処理
好ましいエンドグリコシダーゼ
グルコース多糖の切断
本発明は、グルコース多糖切断酵素が新規の可溶性産物の製造に有用であることを明らかにした。
【００５８】
好ましい実施形態では、セルラーゼ活性を有するエンド−グルコシダーゼ及びグルカネックス等の、β−結合グルコース多糖を切断するエンド−β−グルコシダーゼ酵素は、新規の製造プロセス中で不溶性材料を低下させる有用な活性を有する。本発明は特に、セルロースタイプの多糖及びβグルカン多糖の切断に関する。切断される好ましいβ−グルカンは、セルロース、グルコース残基間にβ４−β３結合を有する穀類ｂ−グルカン等のβ−グルカンを含むＧｌｃβ４Ｇｌｃ構造である。好ましいエンド−β−グルコシダーゼはエンド−グルコシダーゼ及びセルラーゼである。
【００５９】
本発明は特に、好ましい実施形態では高い溶解性を得るため且つ／又は可溶性の生物活性グルカンオリゴ糖を得るための、ビール酵母材料中の酵母細胞壁グルカン、穀類グルカン、及び／又は、セルロース材料等の残存不溶性β−グルカンの切断に関する。
【００６０】
本発明は特に、式
［Ｇｌｃβ４］ｎＧｌｃ構造
（式中、ｎは２〜２０、より好ましくは２〜１０の整数である。）の構造を含むセルロース及び／又は穀類β−グルカンオリゴ糖の製造に関する。
【００６１】
本発明は、より好ましくは、産物になる穀類タイプのグルカンオリゴ糖の製造に関する。好ましくは産物は、式
［Ｇｌｃβ４］ｎ１［Ｇｌｃβ３］ｎ２［Ｇｌｃβ４］ｎ３Ｇｌｃβ３［Ｇｌｃβ４］ｎ４Ｇｌｃ構造
（式中、ｎ１、ｎ３、及びｎ４は独立して０〜約５、好ましくは１〜４、更により好ましくは１〜３の整数であり、ｎ２は０又は１である。）で表されるグルコース残基間にβ４及びβ３結合を含む。
【００６２】
本発明は特に、エンド−β−グルコシダーゼが触媒するグルカンオリゴ糖の製造に関する。
【００６３】
本発明は、本発明に係る好ましい画分中にα結合したグルコース材料が存在することを明らかにした。本発明は更に、新規の可溶性産物の製造におけるエンド−α−グルコシダーゼの使用に関する。α−グルコース多糖切断酵素は、新規産物組成の調整及び最適化に特に好ましく、エンド−α−グルコシダーゼ活性、特にエンド−α４−グルコシダーゼ活性を有する更なる酵素、好ましくはデンプン又はアミロースを切断する酵素として好ましい。
【００６４】
ペクチン及び関連ヘミセルロース材料の切断
本発明は更に、ペクチナーゼ酵素標品によるビール酵母材料の処理に関する。ペクチナーゼは複数の活性を有することが報告されていると理解される。本発明は、ペクチン及び／又はその他のヘミセルロースタイプの材料の切断、例えばペクチナーゼ酵素含有標品によるペクチン含有ヘミセルロース材料の切断に関する。
【００６５】
好ましい実施形態では本発明は、ペクチン及び若しくはヘミセルロースに由来する、産物になるオリゴ糖又は低分子量可溶性多糖の製造に関する。
【００６６】
好ましいプロテアーゼ処理
本発明は、原材料又は酸加水分解された材料に由来するタンパク質材料を切断するためのプロテアーゼの使用に関する。好ましいプロテアーゼはサビナーゼ又はプロナーゼである。
【００６７】
溶解性の向上した新規のグリカン含有材料、
可溶性Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物及び水溶性Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物
本発明は、本発明に係る最適化された方法により、酸加水分解された、水溶性の増加した酵母標品の製造が可能であることを明らかにした。可溶性の高い材料は、飼料及び食品のより効果的な配合に有用であると理解される。液体飼料及び液状の食品又は食品添加物、特に飲料には、可溶性画分が特に好ましい。可溶性材料が５０％よりはるかに低い材料は、例えば製造における液体材料の瓶詰め及び輸送といった実用的な理由から、液状の食品又は飲料に有用でなく、実用的な材料は好ましくは５０％を優に超える可溶性材料を有するべきであると理解される。いくつかの応用では、材料は部分的に不溶性であってもよく、好ましい実施形態では不溶性材料のごく一部が栄養及び健康を支援するために食品組成物中で繊維として用いられると理解される。動物用飼料に用いられているいくつかの参照用産物と比較したＰｒｏｇｕｔタイプ産物及び可溶性Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物の全体的溶解性を図２３に示す。
【００６８】
新規可溶性産物は、更に多くの生物学的活性の向上した可溶性糖材料（オリゴ糖及び多糖）を含む。可溶性の多糖材料及びオリゴ糖材料（図２５に示されるように、スーパーデックスペプチドカラムで６〜１４分に溶出）の量を図２６及び２８に示す。可溶性Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物及び水溶性Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物中のオリゴ糖の量は、それほど最適化していないＰｒｏｇｕｔタイプ産物と比べてそれぞれ約２倍又は３倍以上多かった。
【００６９】
新規可溶性材料の好ましい溶解性範囲
本発明は特に、１％水溶液としての全体的溶解性が５５％超、より好ましくは６０％超、更により好ましくは６５％超、更により好ましくは６３％超、更により好ましくは６６％超、更により好ましくは６７％超、最も好ましくは６８％超である、新規の可溶性Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物に関する。好ましい実施形態では、水への溶解性は約７０％、好ましくは５５〜８５％、より好ましくは６０〜８０％、より好ましくは６３〜７７％、より好ましくは６５〜７５％、更により好ましくは６６〜７４％、更により好ましくは６７〜７３％である。
【００７０】
本発明は更に、実質的に完全に水溶性の糖含有産物に関し、この水溶性産物は、室温（好ましくは２０〜２５℃）で１％（重量／体積）水溶液として実質的に完全に水溶性である。好ましい水溶性画分は、Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物、好ましくは可溶性Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物から分離される。
【００７１】
好ましい完全な水溶性は、少なくとも９０％又は９０％超、より好ましくは９３％超、更により好ましくは９５％超、更により好ましくは９６％超、更により好ましくは９７％超、最も好ましくは９８％超である。
【００７２】
本発明は更に、不溶性材料が一部除去された半水溶性Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物に関する。一部除去される量が少ないと可溶性産物と同様な材料が得られ、一部除去される量が多いと水溶性産物と同様な材料が得られると理解される。好ましい実施形態では、半水溶性産物を得るために、不溶性成分は約１０〜約８０％、より好ましくは約２０％〜約７５％、より好ましくは約２５〜約６６％、更により好ましくは約３３〜約６６％の種々の程度で除去され得る。半水溶性産物の全体的溶解性は、好ましくは、約７３〜約９４％、より好ましくは約７６〜約９２．５％、更により好ましくは約８０〜約９０％、更により好ましくは約８１〜約８９％の範囲内である。好ましい実施形態では、溶解性は約８０％に近く、好ましくは約７５〜約８５％、又は約９０％に近く、約８５〜約９５％である。半水溶性画分の全体的溶解性は、可溶性画分／材料と水溶性画分／材料との間の溶解性を網羅することが好ましい。
【００７３】
約という語は好ましくは、好ましい実施形態では、その値の２％単位以内であり、より好ましくは１％以内、より好ましくは正確な値の０．５％単位以内を指し、別の実施形態では正確にその値を指す。
【００７４】
生物学的に活性な炭水化物成分
本発明は更に、溶解性の向上した新規の材料が下痢を引き起こす細菌に対して向上した生物学的活性を有することを明らかにした。このことを、図３０のパネルＢの関連材料との比較で図２９に示す。この生物学的活性は、ＵＶ吸収材料の存在に関連している。材料は除タンパクされ、疎水性不純物が除去されており、オリゴ糖領域にＮＭＲで観察可能な大きな不純物は含まれていなかった。したがって、吸収は、炭水化物材料の水溶性オリゴ糖及び多糖を含む糖に相当すると思われ、一部はプロセス中に形成される還元末端アルデヒドの吸収及び還元末端誘導体並びに糖に結合した少量のＧｌｃＮＡｃ残基による。図の説明に記載されているように、少量のペプチド材料も含まれやすいが、ＮＭＲによれば、その量的重要性は限定的である。
【００７５】
活性炭水化物成分
マンノース糖類
図３１に示す分析結果は、新規で活性の高い可溶性Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物がより多くのマンノースオリゴ糖を含むことを示している。図３２は、画分の生物学的活性がマンノース含量に一部相関することを示している。本発明者らは、Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物中に、新規の活性の高いマンノースオリゴ糖及び多糖をＮＭＲ分析で確認することができた。この種類のオリゴ糖の増加は新規の栄養補助食品用分子（ｎｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）に特に有用である。新規の可溶性産物中のマンノース含量は約５０％増加していた。
【００７６】
好ましい末端Ｍａｎα３構造
本発明は更に、マンノース含量の他に、（例えば図３０に示されるように）Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物の高い活性がマンノースオリゴ糖の特別な構造により説明されることを明らかにした。本発明は特に、図３３及び３４に示されるように、増加した量の末端Ｍａｎα３構造を含むオリゴ糖配列に関する。本発明は更に、顕著な量の非還元末端及び３置換Ｍａｎα２エピトープ並びに酵母に由来するマンノース糖の主要部分である直鎖Ｍａｎα２構造中の中鎖（ｍｉｄｃｈａｉｎ）Ｍａｎα２エピトープが存在することを明らかにした。
【００７７】
本発明は、好ましくは、本発明に係るプロセスによって製造された、好ましい実施形態ではビール酵母から製造された、多くの末端Ｍａｎα３構造、より好ましくは非還元末端Ｍａｎα３Ｍａｎα２を含むオリゴ糖に関する。好ましい実施形態では、図３３及び３４に示されるように、この量の末端Ｍａｎα３構造はＮＭＲシグナルを生じ、これは非還元末端及び３置換Ｍａｎα２エピトープのＮＭＲシグナルより大きいか、直鎖Ｍａｎα２構造中の中鎖Ｍａｎα２エピトープのＮＭＲシグナルより大きい。好ましい実施形態では、図３３及び３４に示されるように、Ｍａｎα３シグナルは図３３にプロトンＮＭＲ分光法で記録されたＭａｎα２エピトープシグナルのどれよりも大きい。本発明は特に、図３３に示す比較となるＭａｎα２シグナルと比較してＭａｎα３の位置のプロトンＮＭＲシグナルが少なくとも５％大きい、より好ましくは少なくとも７％大きい、更により好ましくは９、最も好ましくは少なくとも１０％大きいＭａｎα３グリカンに関する。
【００７８】
末端の非還元末端Ｍａｎα３Ｍａｎα２構造は、病原体、特に大腸菌等の下痢を引き起こす細菌の抑制を担う新規の活性成分であると理解される。還元末端Ｍａｎα２構造はグリカンに新規の立体構造を付与する。このグリカンの活性は、Ｍａｎα３Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃ構造等の他のグリカン又は還元性の二糖エピトープに基づいて理解することができない。
【００７９】
本発明は更に、少なくとも約１０グラム、更により好ましくは少なくとも１５グラム／ｋｇ、更により好ましくは少なくとも１６グラム、更により好ましくは少なくとも１７グラム、更により好ましくは少なくとも１８グラム、更により好ましくは少なくとも１９グラム、更により好ましくは少なくとも２０グラム、更により好ましくは少なくとも２１グラム、更により好ましくは少なくとも２２グラム、最も好ましくは少なくとも２３又は２４グラム毎ｋｇの好ましいマンノースオリゴ糖を含む、末端Ｍａｎα３が豊富な糖画分に関する。好ましいマンノースオリゴ糖としては、マンノースを含むオリゴ糖、好ましくは、主にマンノースを含むオリゴ糖が含まれるが、これは更に他の単糖残基、好ましくはＧｌｃ又はＧｌｃＮＡｃ若しくはＧｌｃＮを、好ましくは少量成分として、含んでいてもよい。
【００８０】
その他の炭水化物成分、特異なβ−グルコ糖シグナル
本発明者は、プロトンＮＭＲスペクトル中の約４．５１〜４．５３ｐｐｍの領域に特異なβ−グルコースオリゴ糖シグナルを観察した。このシグナルは、新規の独特な低分子量グルコースオリゴ糖及び多糖のシグナルに関連付けられている。本発明は特に、その領域に特徴的なシグナルを有するβ６結合したグルコース糖の豊富なオリゴ糖（Ｇｌｃβ６のゲンチオビオースＨ１は約４．５１ｐｐｍ、中鎖Ｇｌｃβ６残基のシグナルは約４，５１９；４，５２９；及び４．５２３ｐｐｍである。Ｌｏ  Ｖ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ  Ｒｅｓ．（１９９３）２４５、３３３−３４５）に関する。
【００８１】
本発明は更に、少量のＧｌｃＮ／ＧｌｃＮＡｃを更に含む本発明に係る糖材料に関し、好ましくは、材料は酵母に由来するＧｌｃβ材料であり、より好ましくはＧｌｃβ６残基を含むものである。
【００８２】
本発明は更に、別の実施形態では、β４結合したグルコースオリゴ糖に関し、酵母原材料が（穀類）β３／４グルカン又はセルロースを含む材料中で培養された場合、好ましいβ（３／）４グルコース糖シグナルが好ましい領域に存在する（例えばβ３／４グルカンオリゴ糖は、約４．５３ｐｐｍにβ４結合したＧｌｃ  Ｈ１シグナルを有する）。
【００８３】
グルコース材料の量は、単糖の分析によれば、サンプル中のマンノース材料の量に匹敵し、Ｇｌｃ材料の構成要素としてはＧｌｃα材料が含まれるが、アルファシグナル及びベータシグナルのどちらもかなりの量の糖に相当する。
【００８４】
本発明に係る好ましい濃縮オリゴ糖
本発明は、Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物のＮＭＲシグナルが尖鋭であるためにシグナルが特にオリゴ糖由来のものである、本発明に係る好ましい糖に関する。本発明に係るオリゴ糖のオリゴマー形成の程度は２〜１０である。バックグラウンドのほとんどは、グルカン等の多糖材料及び不溶性の巨大多糖によるものであると理解される。
【００８５】
糖の総含量及びより大きな糖の含量
ＵＶ吸収によるより大きなオリゴ糖及び多糖の定量
本発明は、より大きな（ｌａｒｇｅｒ）オリゴ糖及び多糖を特定量含有する新規のＰｒｏｇｕｔタイプ産物に関する。
【００８６】
乾燥Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物又は関連産物０．４グラムのサンプルを水に希釈して１％溶液（重量／体積）を作製した。サンプルを遠心し、水溶性画分を乾燥させ、更なる分析に供した。１．４ｍｌのＤｏｗｅｘ  Ｈ＋樹脂及びｂｏｎｄ  ｅｌｕｔカラムを用いてインキュベートすることによりタンパク質及びペプチド及び脂溶性不純物を除去することで、更にオリゴ糖及び多糖の画分を精製した（分析、実験セクション）。精製したサンプルを真空遠心機中で乾燥させ、１０００マイクロリットルの水に溶かした。この１０００マイクロリットルのサンプルから１５マイクロリットルをスーパーデックスペプチドカラムにかけ、６〜１４分の２１４ｎｍに吸収を示す領域を回収した。標準化されたＰｒｏｇｕｔタイプ産物は、６〜１４分の間にカラムから溶出するより大きな糖（より大きなオリゴ糖及び多糖を含む。）の範囲に６８０ｍＡＵ（吸収単位）の吸収を示した。
【００８７】
本発明は特に新規のＰｒｏｇｕｔタイプ産物に関し、特に、糖画分から混入ペプチド及びタンパク質を除いて本質的に精製した糖画分を流速１．０ｍｌ／ｍｉｎでスーパーデックスペプチドカラム（アマシャムファルマシア社製、分析実験）にかけたときに、６〜１４分の間の吸収積分値が元の乾燥サンプル６ｍｇ当たり６８０ｍＡＵ（Ａｂｓ単位、吸収単位）を超える可溶性及び水溶性の産物に関する。本発明はまた、ゲル濾過で同様な材料サイズ範囲にあり、本発明に係るプロセスによって製造される材料を含む、同等のオリゴ糖画分に関する。吸収積分値の好ましい値は、６８０ｍＡＵの１．３倍、より好ましくは１．５倍、更により好ましくは１．７倍、更により好ましくは１．８倍、更により好ましくは２．０倍、更により好ましくは２．３倍、更により好ましくは２．５倍、更により好ましくは２．７倍、更により好ましくは２．８倍、最も好ましくは好ましくは２．９倍、３．０倍、又は３．２倍である。
【００８８】
マンノース質量によるオリゴ糖及び多糖の定量
本発明は、特定の総オリゴ糖・多糖含量を有する新規のＰｒｏｇｕｔタイプ産物に関する。この定量は、スーパーデックスペプチドカラムで６〜１６分に溶出するオリゴ糖及び／又は多糖の画分中の総マンノース含量を分析することで行われる。
【００８９】
可溶性糖材料の精製又は単離
本発明は特に、本発明に係る好ましい種類の糖を１又は複数含む精製又は濃縮された画分に関する。濃縮又は精製された画分は、栄養補助機能食品若しくは栄養補助機能飼料又は栄養補助（食品又は飼料）用添加物としての比活性が特に高いと理解される。
【００９０】
好ましい精製方法としては、以下及びその組合せが含まれる：
ａ）
ｉ．帯電物質及び又は親油性物質（疎水性不純物）の吸収についてのクロマトグラフィー
ｉｉ．サイズ排除クロマトグラフィー、特に低分子量不純物を除去するためのゲル濾過
ｉｉｉ．糖又はその一部に結合するマトリックスを用いたアフィニティークロマトグラフィー、好ましくは活性炭を用いたクロマトグラフィー等のクロマトグラフィー法
及び／又は
ｂ）溶媒抽出及び／又は不純物若しくは糖の沈殿等の相分離溶液法。好ましい実施形態では、沈殿に有機溶媒、好ましくはメタノールやエタノール等のアルコール又はケトン、より好ましくはエタノールが用いられ、又は好ましいサイズの糖を沈殿させるためにアセトンが用いられる。
及び／又は
ｃ）溶液及び沈殿剤の遠心分離
及び／又は
ｄ）望ましくない成分の化学的又は酵素的な分解方法、好ましくは、アルカリに不安定な不純物を分解するための穏やかなアルカリ加水分解及び／又はＧｌｃα含有グリコーゲン／デンプン型の糖の酵素的加水分解。
【００９１】
更に本発明は特に、不純物を除去するためのイオン交換クロマトグラフィー及び／若しくは疎水性クロマトグラフィー並びに／又は新規の糖画分を精製するためのサイズ排斥クロマトグラフィーに関する。イオン交換、好ましい実施形態では陽イオン交換の樹脂材料が親油性化合物を吸収してもよく、又は同じカラムに両方のマトリックスが含まれてもよいと理解される。
【００９２】
溶解性実験
図９〜２１は、酸処理及び／又は酵素処理後の産物画分の溶解性を示している。０．２％水溶液中に残存する不溶性材料を測定した。示されている量は、５０ｍｌ中に最初に存在する乾燥産物１００ｍｇに対するものである。したがって、記載されているｍｇ量は、不溶性材料の％に相当する。図２３は可溶性材料の量を％で示している。
【００９３】
実験セクション
略語
ＢＹ：    ビール酵母
ＨＢＹ：  ホモジナイズビール酵母
Ｇ：      グルカネックス
ＰＧ：    Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物
ＰＧ  Ｓ：  可溶性Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物
ＰＧ  ＷＳ：  水溶性Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物
ＰＧ  ＷＳ＋Ｅ：  水溶性Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物と乳化剤
ＰＥ：    ペクチナーゼ
ＰＲ：    プロナーゼ
Ｓ：      サビナーゼ
【実施例１】
【００９４】
材料及び方法
材料
スオメン・レフ社（Ｓｕｏｍｅｎ  Ｒｅｈｕ）製Ｐｒｏｇｕｔ（商標；ＰＧ）サンプル
異なる製造バッチ由来の１４個のＰｒｏｇｕｔ（商標）タイプ産物サンプル：ＰＧ１〜ＰＧ１４。異なる製造プロセス由来の３つのＰｒｏｇｕｔタイプ産物サンプル：１５時間加水分解（ＰＧ  １５ｈ）；水溶性ＰＧ（ＰＧ  ＷＳ）；水溶性ＰＧと乳化剤（ＰＧ  ＷＳ  Ｅ＋）。
【００９５】
ＰＧ１は良好な作用が示されたが、ＰＧ２は細菌接着アッセイで示されたほど効果的ではなかった。ＰＧ４は、ヤギを用いた実地試験で良好な結果を示した。
【００９６】
他のメーカーから市販されているサンプル
Ａｇｒｉｍｏｓ（Ｃ１）及びＡｓｃｏｇｅｎ（Ｃ２）、Ａｌｐｈａｍｕｎｅ  ａｌｐｈａｒｍａ（Ｃ３）、並びにＢｉｏ−Ｍｏｓ（Ｃ４）。
【００９７】
全ビール酵母試料
ビール酵母（ＢＹ）及びホモジナイズしたビール酵母（ＨＢＹ）。
【００９８】
分析手順
サンプルの調製
Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物及び関連サンプルから０．２％水溶液又は１％水溶液を調製した。これらを穏やかに混合しながら２〜５時間室温でインキュベートした。次いでこの混合物を遠心（４０００ｒｐｍで２０分間）し、上清を凍結乾燥し、乾燥重量を測定した。
【００９９】
可溶性成分の分析
サンプルの可溶性成分をゲル濾過クロマトグラフィーの前に２段階の精製工程で精製した。最初の工程で、乾燥材料を希釈してＨ＋ビーズ（ＡＧ  ５０Ｗ−Ｘ８樹脂、バイオラッド社製、サンプル０．４ｇに対して１．４ｍｌ）のスラリーにし、穏やかに混合しながら室温で２時間インキュベートした。第２の工程で、Ｈ＋ビーズ溶液の上清を、ＢｏｎｄＥｌｕｔ  Ｃ−１８カラム（５００ｍｇ／６ｍｌ、バリアン社（Ｖａｒｉａｎ）製）を通して溶出させる。濃縮後、サンプルを、５０ｍＭの炭酸水素アンモニウムを用いて流速１ｍｌ／ｍｉｎでスーパーデックスペプチド１０／３００ＧＬカラム（アマシャムバイオサイエンス社製）によるゲル浸透クロマトグラフィーにかけ、２１４ｎｍ又は２３０ｎｍの吸収をＡｋｔａ  Ｐｕｒｉｆｉｅｒ  １０（ポンプＰ−９０３、ＵＶ−９００、アマシャムバイオサイエンス社製）で測定した。スーパーデックスペプチドカラム：ボイド容量６．７ｍｌ；総溶出体積１８．０ｍｌ。多糖／オリゴ糖／単糖の溶出：ボイド容量では３０Ｈｅｘ単位、７．７ｍｌでは２５Ｈｅｘ単位、１４．４ｍｌでは５Ｈｅｘ単位、１６．７ｍｌでは２Ｈｅｘ単位、１７．３ｍｌでは１Ｈｅｘ単位。
【０１００】
核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）
ＮＭＲ分析用に、スーパーデックスペプチドクロマトグラフィーから以下のようにサンプルを回収した：大サイズ成分（６〜１２ｍｌで溶出）及び中間サイズ成分（１２〜１６ｍｌで溶出）。１次元１Ｈ  ＮＭＲ実験の前に、サンプルを最初に凍結乾燥し、その後Ｄ２Ｏ（９９．９％）に溶かした。２３℃でＶａｒｉａｎ  Ｕｎｉｔｙ５００分光計（バリアン社製）を用いてＮＭＲスペクトルを記録した。
【０１０１】
ビール酵母の酸加水分解
Ｈ３ＰＯ４を用いた全ビール酵母溶液の酸加水分解は、Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物製造プロセスで用いる加水分解と同様である：Ｈ３ＰＯ４（濃縮、８７％）を用いてｐＨを２．４に調整し８０℃で４時間インキュベートする。以降の本文内では、この酸加水分解を「プロセス酸加水分解」と呼ぶ。
【０１０２】
結果
可溶性成分の量の比較
９個のＰｒｏｇｕｔタイプ産物サンプル及び４個の関連サンプルの１％溶液を調製し、水溶性成分の乾燥重量を測定した（図１）。図１に示す結果から、Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物材料は、バッチにより溶解性は異なるものの、約５０％が水溶性であると結論することができる。Ａｌｐｈａｍｕｎｅ  ａｌｐｈａｒｍａ（Ｃ３）、Ｂｉｏ−Ｍｏｓ（Ｃ４）、及びＡｇｒｉｍｏｓ（Ｃ１）の可溶性成分はＰｒｏｇｕｔタイプ産物より少ない。一方、Ａｓｃｏｇｅｎ（Ｃ２）は良好な溶解性を有するようである。
【０１０３】
しかし、これらの凍結乾燥サンプルに種々の量の水が残っている可能性に留意すべきである。したがって、乾燥重量で表した誤差は平均的な誤差よりも大きい可能性がある。
【０１０４】
ゲル浸透クロマトグラフィーによる可溶性材料の比較
０．２％溶液のクロマトグラム
ＰＧ１及び２の比較
材料及び方法に記載したようにＰＧ１及びＰＧ２の０．２％溶液を調製した。可溶性材料のクロマトグラムを図２に示す。ＰＧ１及びＰＧ２の可溶性材料を比較すると、ＰＧ１はＰＧ２よりも比較的多くの中間サイズ材料（１２〜１６分の溶出）を含み、一方、ＰＧ２はＰＧ１よりも多くの大サイズ材料（６〜１２分の溶出）を含むことが分かる。可溶性材料の全体量は、ＰＧ１の吸収度（ａｂｓｏｒｂｔｉｖｉｔｙ）が大きいことから示されるように、ＰＧ２よりもＰＧ１で多いようである。同じ現象は図１からも指摘することができる。
【０１０５】
これらの溶解性及びクロマトグラフィーの挙動の差は、ＰＧ１とＰＧ２の有効性を示唆している。ＰＧ１及びＰＧ２は細菌接着試験による実験が行われており、ＰＧ１は有効であるがＰＧ２は有効でないことが示されている。
【０１０６】
１％溶液のクロマトグラム
ＰＧ１及びＰＧ２の比較
可溶性成分のＮＭＲ分析にはかなりの量の材料が必要である。そこで、半分取ゲル浸透クロマトグラム用に１％の溶液を調製した。０．２％溶液のクロマトグラムとの比較として、ＰＧ１及びＰＧ２の１％溶液に由来する可溶性材料のクロマトグラムを図３に示す。検出器への負荷が幾分過剰になっているが、ＰＧ２には中間サイズの可溶性成分がＰＧ１ほど含まれていないことが更により明確に分かるであろう。
【０１０７】
９個のＰｒｏｇｕｔタイプ産物及び４個の関連サンプルの比較
９個のＰｒｏｇｕｔタイプ産物（ＰＧ１〜９）及び４個の関連サンプル（Ｃ１〜Ｃ４）を同時に調製し、同様に分析した。したがって、これらのゲル浸透クロマトグラムは比較可能である。ここで、サンプルはＡ２３０で検出し、適切な比較として、ＰＧ１及びＰＧ２を分析した。サンプルの比較を容易するために、吸収軸の目盛りを全てのクロマトグラムで同じになるように調整している。
【０１０８】
ＰＧ１、３、４、及び６（図４Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｆ）は形状及び材料の量の両方の点で似通っている。ＰＧ１（細菌接着アッセイ）及びＰＧ４（ヤギを用いた実地実験）はどちらも有効であることが示されている。一方、ＰＧ２、５、７、及び８に含まれる材料は、他のＰＧサンプルよりも材料が少ない（図４Ｂ、Ｅ、Ｇ、Ｈ）。これらのうち、ＰＧ２は細胞接着アッセイで有効でないことが知られている。このデータは、好ましい実施形態において、クロマトグラムの形状及び特に中間サイズ可溶性材料の量から有効なＰｒｏｇｕｔタイプ産物の予測が可能であることを示している。中間サイズ材料（１２〜１６ｍｌに溶出）の相対量はクロマトグラムの面積から算出することができ（ｍＡｂ単位にｍｌをかける）、その値（表１）を比較することでＰｒｏｇｕｔタイプ産物間の差の推定が確認される。
【０１０９】
大サイズ材料（６〜１２ｍｌで溶出）及び中間サイズ材料（１２〜１６分で溶出）をＮＭＲ分析用に回収した。
【０１１０】
関連サンプルでは、中間サイズ材料の量だけでなく大サイズ材料の量さえ、Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物よりずっと少ない（図４Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍ）。Ａｌｐｈａｍｕｎｅ  Ａｌｐｈａｒｍａ（Ｃ３）及びＢｉｏ−Ｍｏｓ（Ｃ４）（それぞれ図４Ｌ及びＭ）中の可溶性材料の総量は、Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物と比較して少ないようであり（ｍｉｎｏｒ）、このことは図１でも見られる。Ａｇｒｉｍｏｓ（Ｃ１）及び特にＡｓｃｏｇｅｎ（Ｃ２）中の可溶性材料の総量はＰｒｏｇｕｔタイプ産物に匹敵するが、そのほとんどは低分子量サイズの材料である（図４Ｊ及びＫ）。低分子量サイズ材料は、他の有益な特性を有し得るものの、細菌接着の抑制には適していない。
【０１１１】
【表１】
2010529980.tif 000002
【０１１２】
５個のＰｒｏｇｕｔタイプ産物サンプルの比較
図４のサンプルと同様に、ゲル浸透クロマトグラフィー用にＰｒｏｇｕｔタイプ産物サンプルＰＧ１０〜１４を調製した。したがって、図４及び５のクロマトグラムは比較可能である。ＰＧ１０〜１４の生物活性についての情報はないが、このクロマトグラムで全てのサンプル中に主に中〜高分子量の化合物からなるかなりの量の可溶性材料が存在することから、これら（ＰＧ１０〜１４）のＰｒｏｇｕｔタイプ産物バッチが良好に作用することが示唆される。大サイズ（６〜１２ｍｌに溶出）及び中間サイズ（１２〜１６ｍｌに溶出）の材料をＮＭＲ用に回収した。
【０１１３】
酸加水分解されたビール酵母及びそのホモジナイズバージョン
工業用高圧ホモジナイザーでビール酵母溶液をホモジナイズし、ビール酵母溶液及びそのホモジナイズバージョンの両方のサンプルを、材料及び方法で記載したようにＰｒｏｇｕｔタイプ産物のプロセス酸加水分解によって加水分解した。半分取ゲル浸透クロマトグラフィーでＮＭＲ用のサンプルを単離するために検出器へのロードを過剰にしたため、図４及び５と比較可能なクロマトグラムは利用できない。しかし、分析的ゲル浸透クロマトグラムにかけた（図６）ところ、クロマトグラムの特徴はＰＧ１のもの（図２Ａ）とよく似ていた。図６Ａ及び６Ｂのクロマトグラムの面積の比較から、ホモジナイズにより溶解性が１５％増加することが示される。
【０１１４】
細菌接着試験用に調製したサンプル
Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物を液体サンプル、最も好ましくは飲料水中に配合するために、Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物により高い溶解性が必要である。新規の水溶性Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物を得るために、１０個のサンプル候補を選択した。これらのサンプルは、細菌接着試験に十分な量で調製した。そのゲル浸透クロマトグラムを図７に示す（実験プロセスは実施例２の材料及び方法に示す）。サンプルは、
１．グルカネックス及びプロセス酸加水分解で処理したビール酵母：ＢＹ  Ｇ（図７Ａ）
２．グルカネックス及びプロセス酸加水分解で処理したホモジナイズビール酵母：ＨＢＹ  Ｇ（図７Ｂ）
３．グルカネックス及びサビナーゼで処理した後、プロセス酸加水分解したビール酵母：ＢＹ  Ｇ＋Ｓ（図７Ｃ）
４．グルカネックス及びサビナーゼで処理した後、プロセス酸加水分解したホモジナイズビール酵母：ＨＢＹ  Ｇ＋Ｓ（図７Ｄ）
５．１ＭのＨ３ＰＯ４で処理したビール酵母：ＢＹ  １Ｍ（図７Ｅ）
６．１ＭのＨ３ＰＯ４で処理したホモジナイズビール酵母：ＨＢＹ  １Ｍ（図７Ｆ）
７．グルカネックス及びペクチナーゼで処理した後、プロセス酸加水分解したビール酵母：ＢＹ  Ｇ＋ＰＥ（図７Ｇ）
８．グルカネックス及びペクチナーゼで処理した後、プロセス酸加水分解したホモジナイズビール酵母：ＨＢＹ  Ｇ＋ＰＥ（図７Ｈ）
９．ペクチナーゼで処理したＰＧ１、ＰＧ１  ＰＥ（図７Ｉ）
１０．プロナーゼで処理したＰＧ１、ＰＧ１  ＰＲ（図７Ｊ）
となる。
【０１１５】
最終的に、新規の水溶性Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物の候補として５個を細菌接着試験に選択した（サンプル１、２、５、６、及び９）。ビール酵母をグルカネックス及び１Ｍ  Ｈ３ＰＯ４で処理することで、従来のＰｒｏｇｕｔタイプ産物試験プロセスと同様に実施した細菌接着アッセイにおいて最大の活性を有する材料が得られた。
【０１１６】
興味深いことに、酵素処理後のビール酵母及びそのホモジナイズバージョンのクロマトグラムはかなり似ていた。一方、１Ｍ  Ｈ３ＰＯ４で処理したホモジナイズビール酵母には、非ホモジナイズサンプルより多くの可溶性中間サイズ材料が見られた（図７、Ｆ対Ｅ）。
【０１１７】
水溶性Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物
１Ｍ  Ｈ３ＰＯ４処理されたビール酵母を、実地（ｏｎ  ｆｉｅｌｄ）での有効性を調べるため、産業規模で調製し、この産物を水溶性Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物（ＰＧ  ＷＳ）と名付けた。乳化剤を導入した別のバージョンのＰＧ  ＷＳも調製し、これをＰＧ  ＷＳ＋Ｅと名付けた。これらの溶解性をゲル浸透クロマトグラフィーで分析し、比較し易いように、ＰＧ１を同じ一連の実験手順で分析した（図８）。ＰＧ（図８Ａ）とＰＧ  ＷＳ（図８Ｂ）のクロマトグラム及びそれから算出される材料の相対量（表２）を比較すると、ＰＧ  ＷＳ中に３０％超多くの可溶性材料が存在すると結論することができる。特に非常に大きなサイズの材料（６〜９ｍｌで溶出）の相対量が大幅に（６０％）増加していた。しかし、中間サイズ材料（１２〜１６ｍｌ）の相対量はほぼ等しい。したがって、ＰＧ  ＷＳ製造中のより高い濃度のＨ３ＰＯ４は、水に可溶性となるのにちょうど十分なだけ不溶性部分を分解するようである。産物は完全に可溶性ではないが、この変化は、ＰＧ  ＷＳを飲料水中の液体飼料として搬送する（ｄｅｌｉｖｅｒ）のに十分な変化である。
【０１１８】
別のサンプルを、加水分解をより長く行った（１５時間）以外は通常のプロセスで調製した（ＰＧ  １５ｈ）。ＰＧ  １５ｈのゲル浸透クロマトグラム（図８Ｄ）は、この産物がＰＧ１と似ていることを示唆している。ＮＭＲ分析を行えば、成分の構造に変化があるかどうかが明らかになるであろう。
【０１１９】
【表２】
2010529980.tif 000003
【０１２０】
Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物サンプル中の中間サイズ成分のＮＭＲ分析
中間サイズ画分のＮＭＲ分析で最も顕著なシグナルは、α−グリコシド炭水化物鎖のＨ−１に帰属することができる。分析した材料の生物学的起源を考慮すると、このシグナルの起源はα−グルカン鎖及びα−マンノース鎖であると予想される。
【０１２１】
スペクトルは、β−グリコシド単位のＨ−１に由来するシグナルも示している。これらのシグナルは、種々のβ−グルコース残基に由来すると予想される。かかる単位を含む炭水化物オリゴマーは、本発明のプロセス中に、例えば酵母及びオオムギのベータ−グルカンから生成すると予想される。
【０１２２】
結論
主要なメーカーのＰｒｏｇｕｔタイプ産物サンプル及び関連サンプルの溶解性を分析しゲル浸透クロマトグラフィーのプロフィールを作製した。その結果から、同じプロセスを行ったサンプルの可溶性材料の相対量から、問題のＰｒｏｇｕｔタイプ産物の動物用飼料としての有効性が示されるようである。大サイズ及び中間サイズの材料の両方の量が特に重要と考えられる。全ての関連サンプルが、Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物サンプルよりも大サイズ及び中間サイズの材料の量が明らかに少ない。関連サンプルのいくつかでは、可溶性材料のほとんどが低分子量サイズであり、細菌接着の抑制に有効でない可能性が高い。
【０１２３】
本発明は、これらのゲル浸透クロマトグラムに示される可溶性成分の単離並びに任意で材料の更なる分画並びにより詳細な化学的分析、例えば単離及び／分画された材料のＮＭＲによる化学的分析に関する。本発明は特に、中間サイズ材料及び活性に重要な成分としてのその相対量に関する。本発明は更に、大サイズ材料及び活性に重要な成分としてのその相対量に関する。
【実施例２】
【０１２４】
材料及び方法
材料
スオメン・レフ社製Ｐｒｏｇｕｔ（商標）（ＰＧ）タイプ産物サンプル
ＰＧ１；ＰＧ２；１５時間加水分解したＰＧ（ＰＧ  １５ｈ）；水溶性ＰＧ（ＰＧ  ＷＳ）；水溶性ＰＧと乳化剤（ＰＧ  ＷＳ  Ｅ＋）。
【０１２５】
細菌接着アッセイにおいて、ＰＧ１は良好に作用することが示されているが、一方、ＰＧ２はそれほど有効ではなかった。
【０１２６】
全ビール酵母サンプル
本実験に使用したビール酵母サンプルは、平均２０％の乾燥物質を含んでいた。
【０１２７】
酸を用いた加水分解
リン酸
Ｈ３ＰＯ４を用いた全ビール酵母溶液の主な酸加水分解は、Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物製造プロセス中で用いられる加水分解と同様である、すなわち、Ｈ３ＰＯ４（濃縮、８７％）でｐＨを２．４に調整し、８０℃で４時間インキュベートする。以降の本文中では、この酸加水分解を「プロセス酸加水分解」と呼ぶ。
【０１２８】
より高濃度のＨ３ＰＯ４を用いた酸加水分解を、０．３Ｍ、０．５Ｍ、１Ｍ、及び２ＭのＨ３ＰＯ４を用いて８０℃又は１００℃で４時間行った。
【０１２９】
塩酸
ＨＣｌを用いた酸加水分解を、０．３Ｍ、０．５Ｍ、１Ｍ、及び２ＭのＨＣｌを用いて８０℃で４時間行った。
【０１３０】
硫酸
Ｈ２ＳＯ４を用いた酸加水分解を、０．３Ｍ、０．５Ｍ、１Ｍ、及び２ＭのＨ２ＳＯ４を用いて８０℃で４時間行った。
【０１３１】
溶解性実験
Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物サンプル又はビール酵母溶液のいずれかから、０．２％水溶液を調製した（すなわち、乾燥重量１００ｍｇの材料を含む反応混合物５００μｌをＨ２Ｏで５０ｍｌに希釈）。これを穏やかに混合しながら室温で２〜５時間インキュベートした。インキュベート時間は溶解性に関係しないことが示された。混合物を遠心（４０００ｒｐｍ、２０分間）し、沈殿の重量を凍結乾燥後に測定した。
【０１３２】
酵素処理
プロナーゼ
５ｍｌのビール酵母溶液／２０％Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物溶液、５ｍＭ  ＣａＣｌ２に対して２０ｍｇのプロナーゼ（ストレプトミセス・グリセウス、４８Ｕ／ｍｇ、シグマ社製）を添加し、３７℃で５時間インキュベートした。酵素処理の前又は後にプロセス酸加水分解を行った。溶解性実験によりプロナーゼの効果を分析した。
【０１３３】
サビナーゼ
ＮａＯＨでｐＨを１０に調整した５ｍｌのビール酵母溶液／２０％Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物溶液に対して４μｌ又は２０μｌのサビナーゼ（バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）由来のプロテアーゼ、１６ｍＵ／μｌシグマ社製）を添加し、３７℃で５時間インキュベートした。酵素処理の前又は後にプロセス酸加水分解を行った。溶解性実験によりサビナーゼの効果を示した。
【０１３４】
グルカネックス
反応においてグルカネックス（トリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）由来の溶解酵素、１．１８Ｕ／ｇ、シグマ社製）の量又は温度を変え、ビール酵母溶液の溶解性に対するグルカネックスの効果を調べた。５ｍｌのビール酵母溶液に対して５〜１００ｍｇのグルカネックスを添加し、３０、３７、又は５０℃で５時間インキュベートした。酵素処理後にプロセス酸加水分解を行った。溶解性実験によりグルカネックスの効果を示した。
【０１３５】
ペクチナーゼ
５ｍｌのビール酵母溶液又は２０％Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物溶液に対して２０ｍｇのペクチナーゼ（アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、１Ｕ／ｍｇ、カルバイオケム社（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）製）を添加し、３７℃で５時間インキュベートした。酵素処理の前又は後にプロセス酸加水分解を行った。溶解性実験によりペクチナーゼの効果を示した。
【０１３６】
エンドグルカナーゼ
５ｍｌのビール酵母溶液に対して２００μｇのエンドグルカナーゼ（トリコデルマ・リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）由来のエンドグルカナーゼＩ、ＶＴＴ社製）を添加し、３７又は５０℃で５時間インキュベートした。この反応は、グルカネックスと一緒に又はグルカネックス及びサビナーゼと一緒にした反応のみ行った（以下参照）。
【０１３７】
酵素処理の併用
グルカネックス及びサビナーゼの併用効果：最初に、記載したようにグルカネックスによる反応を行い、その後、記載したようにｐＨ１０でサビナーゼによる反応を行った。酵素処理後にプロセス酸加水分解を行い、その後、溶解性実験により酵素の効果を示した。
【０１３８】
グルカネックス及びエンドグルカナーゼの併用効果：記載したように、３７℃又は５０℃でのグルカネックス及びエンドグルカナーゼによる同時反応を行った。酵素処理後にプロセス酸加水分解を行い、その後、溶解性実験により酵素の効果を示した。
【０１３９】
グルカネックス、エンドグルカナーゼ、及びサビナーゼの併用効果：最初に、記載したようにグルカネックス及びエンドグルカナーゼによる３７℃又は５０℃での反応を行い、その後、記載したようにｐＨ１０でのサビナーゼによる反応を行った。酵素処理後にプロセス酸加水分解を行い、その後、溶解性実験により酵素の効果を示した。
【０１４０】
結果
各実験群には、本来のＰｒｏｇｕｔタイプ産物の製造プロセスを真似た対照反応、すなわち材料及び方法で記載したようなプロセス酸加水分解によるビール酵母溶液の処理が含まれる。
【０１４１】
酵素的及び／又は酸による加水分解実験後の成分の溶解性の増加を逆の方法で測定した。可溶性成分の乾燥重量は原則測定不可能であるため、代わりに不溶性成分の減少を測定した。
【０１４２】
プロナーゼの効果
材料及び方法に記載されているようにＰｒｏｇｕｔタイプ産物サンプルをプロナーゼで処理した。細菌接着抑制試験によれば、ＰＧ１は動物用飼料として有効であり、ＰＧ２より良い溶解性を有するようである。不溶性材料の量を表した図９に見られるように、プロナーゼ処理は、両方のＰｒｏｇｕｔタイプ産物サンプルの溶解性をかなり増加させる（これらのサンプル中の最初の乾燥重量材料は１００ｍｇであった）。
【０１４３】
次の一連の実験では、ＰＧ１及びＰＧ２のプロナーゼ消化を繰り返した。図１０に示すように、結果はかなり近似している。
【０１４４】
この一連の実験ではまた、ビール酵母を用いてプロナーゼ消化におけるｐＨの影響も調べた。消化はｐＨ５（インタクトな酵母溶液のｐＨ）及びｐＨ８で行い、その後、酸加水分解を行った。インキュベート中のｐＨ変化は溶解性に何ら大きな変化を生じなかった（データ示さず）。
【０１４５】
酸加水分解の前又は後にインキュベートしたプロナーゼの活性についても調べた。図１０の結果は、酸加水分解の前よりも後の方がプロナーゼの効果が高いことを示している。これはおそらく、酸加水分解後にはタンパク質が変性しており、プロテアーゼが接近しやすくなっていることを示唆している。
【０１４６】
したがって、プロナーゼは酸加水分解の前に使用された場合もＰｒｏｇｕｔタイプ産物の溶解性を増加させるであろう。Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物の製造プロセスを考慮すると、これは有益である。なぜなら、酸加水分解はプロナーゼを破壊し、動物用飼料として使用されたときに産物自体に酵素活性が残らないからである。
【０１４７】
Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物又はビール酵母の溶解性の結果（図１０）を比較すると、本来の産業用Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物製造プロセスは、（１）より可溶性の産物を製造するのにより効率的であり、（２）その産物は、インタクトのビール酵母用の研究室規模の酸加水分解プロセスよりもプロナーゼの作用を受けやすいようである。
【０１４８】
サビナーゼの効果
Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物と他のプロテアーゼの反応性を調べるために、工業生産用の塩基性プロテアーゼであるサビナーゼ（バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）由来のプロテアーゼ）を選んだ。サビナーゼでＰｒｏｇｕｔタイプ産物を試験したところ、不溶性材料はほぼ半減した（図１１）。しかし、プロナーゼの効果（図１０）の方がかなり高いようである。プロナーゼは不溶性材料の量を２２％まで減少させた（ＰＧ１）が、サビナーゼ処理されたＰＧ１では５３％の不溶性材料が残った。プロナーゼの作用とは対照的に、不溶性材料の量は、サビナーゼの使用がプロセス酸加水分解の前であるか後であるかに依存しない（図１０及び１１、ビール酵母での実験を参照）。
【０１４９】
サビナーゼは工業用酵素であるため、安価に使用することができる。しかし、サビナーゼの使用はプロナーゼの使用ほど実用的ではない。サビナーゼは塩基性プロテアーゼであるため、効果的な反応を得るためにはｐＨを１０に調整しなければならない。このことは、（サビナーゼの使用がプロセス酸加水分解の前であるか後であるかに関わらず）中和後の産物中にかなりの濃度のリン酸ナトリウムが存在することを意味する。
【０１５０】
ペクチナーゼの効果
ペクチンは巨大な、異種成分からなる（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）、負に帯電した細胞壁多糖である。工業用のペクチナーゼはペクチン溶解酵素であり、更に他にも複数の酵素活性を有する。そこで、ペクチナーゼ処理がＰｒｏｇｕｔタイプ産物溶液中で効果を有し得ると考えた。実際に、より水溶性の高いＰｒｏｇｕｔタイプ産物の製造において、ペクチナーゼはサビナーゼよりは効果的であるがプロナーゼほどは効果的ではないことが示された（図１０、１１、及び１２）。例えば、ＰＧ１中の不溶性材料の乾燥重量は、プロナーゼでは２２％まで、ペクチナーゼでは３４％に減少して、それぞれ８．５ｍｇ、１５ｍｇの不溶性材料が残った。プロナーゼ及びサビナーゼとは対照的に、ペクチナーゼ処理はビール酵母溶液においてプロセス酸加水分解（ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ａｃｉｄ  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ）後のみ効果的であった（図１２）。
【０１５１】
グルカネックスの効果
Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物の溶解性に対するβ−グルカンの影響を分析するためにβ−グルカナーゼ処理を行った。費用対効率の高い酵母細胞壁グルカン加水分解酵素であることが知られていることからグルカネックス（トリコデルマ・ハルジアナム由来の溶解酵素）が選ばれた。グルカネックスは、セルラーゼ活性、プロテアーゼ活性、及びキチナーゼ活性をも有することが知られている。まず、種々の量のグルカネックスの効果を３０℃において調べた。少量のグルカネックスではビール酵母の溶解性は実質的に増加しないことがはっきりと示された。しかし、図１３に示すように、１００ｍｇ／５ｍｌ酵母溶液では、不溶性材料の量は４６％まで減少した。第２の反応群では、温度の影響を調べた。実験は、＋４℃に１ヶ月置いて液性を少し高めたビール酵母を用いて行った。インキュベート温度を７℃上昇させる（３０℃から３７℃）と溶解性は明らかに増加した（不溶性材料は６４％から５４％になった）。一方で、温度を５０℃にまで上昇させると、不溶性材料の量は２６％しか減少しなかった。このことから、この酵素はこのような高温に耐えられないことが示唆される。３７℃では、グルカネックスによる不溶性材料の減少量は、プロナーゼ及びペクチナーゼとほぼ同じである（図１０、１２、及び１３参照）。
【０１５２】
酵素処理の組合せの効果
上記のように、タンパク質及び多糖を分解する酵素は、Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物又は酵母溶液中の不溶性材料の量を幾分効果的に減少させたが、これらの種類の酵素はいずれも単独で水溶性産物を製造することはできなかった。次に、プロテアーゼ及び例えばグルカナーゼの反応性が結合的（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｙ）、すなわちこれら酵素作用を組み合わせた作用によって可溶性産物を製造することが可能であるかを調べた。
【０１５３】
グルカネックス及びサビナーゼ
グルカネックス及びサビナーゼは共に費用効率が高い工業用酵素であるので、これらを組合せ反応性の試験に選んだ。グルカネックス単独（図１３）又はサビナーゼ単独（図１１）の効果とこれらを組み合わせた作用を比較すると、これらは一緒の方がより効果的に作用することが明確に分かる（図１４）。不溶性材料は、グルカネックス（２０ｍｇ、３７℃）処理単独では４７％、サビナーゼ単独（４μｌ、３７℃）では３２％減少したが、これらを組み合わせた反応では７７％減少した（すわなち、元の乾燥重量材料のうち、１２ｍｇだけが不溶性として残った）。しかし、実施した最も良い反応（３０℃でグルカネックス１００ｍｇ及び３７℃でサビナーゼ４μｌ）でも、最初にビール酵母溶液中に存在する乾燥重量材料１００ｍｇのうち８．５ｍｇが残っている。サビナーゼはプロナーゼ又はペクチナーゼより効果が低く、グルカネックスはプロナーゼ及びペクチナーゼとほぼ同じ効果を有することが示された（上記参照）。ビール酵母溶液でグルカネックス及びサビナーゼを組み合わせた作用は、プロナーゼ及びペクチナーゼよりはるかに良い結果を生じ、実際、Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物でプロナーゼ及びペクチナーゼを用いた場合の効果とほぼ同様である。
【０１５４】
グルカネックス及び／又はサビナーゼと組み合わせたエンドグルカナーゼ
多糖の分解を促進するために、グルカネックス及びサビナーゼと組み合わせたエンドグルカナーゼ（トリコデルマ・リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）由来のエンドグルカナーゼＩ）の有効性を調べた。グルカネックス及びエンドグルカナーゼでの処理（図１５）とグルカネックス単独処理（図１３）の実験は、付加的な効果がないことを示しており、対照と比べた不溶性材料の量は、それぞれ５４％及び５３％である。同様に、これらの実験においてグルカネックス及びサビナーゼと一緒に用いられてもエンドグルカナーゼは溶解性を向上させない（対照に対して不溶性材料の量は、ＥＧありで２２％、ＥＧなしで２３％）。
【０１５５】
酸の効果
他の酸と比べたＨ３ＰＯ４の可溶化効果の差を調べるために、２種類の強酸、ＨＣｌ及びＨ２ＳＯ４を酸加水分解実験に選んだ。ビール酵母溶液の溶解性に対するより高い酸濃度の効果も調べた。
【０１５６】
Ｈ３ＰＯ４−サビナーゼの有無と濃度上昇の効果
図１６にビール酵母溶液を用いた２つの実験群の結果を示す。明らかに、より高濃度のＨ３ＰＯ４（０．３Ｍ、０．５Ｍ、及び１Ｍ、１００℃）で産物の溶解性が増加している（図１６、最初の３組の棒グラフ）。より高濃度のＨ３ＰＯ４（０．３Ｍ、０．５Ｍ、１Ｍ、及び２Ｍ）中での８０℃の酸加水分解と組み合わせたビール酵母溶液のサビナーゼ処理でも、１００℃での酸加水分解と幾分同様な溶解性となった。
【０１５７】
ＨＣｌ
種々のＨＣｌ濃度でのビール酵母溶液の酸加水分解（図１７）は、Ｈ３ＰＯ４を用いた加水分解と幾分同様な効果を示している。
【０１５８】
Ｈ２ＳＯ４
Ｈ２ＳＯ４濃度を上昇させたビール酵母溶液の酸加水分解（図１８）をＨ３ＰＯ４による加水分解（図１６）と比べると、これらの酸で得られる溶解性がよく似ていることが示される。興味深いことに、２Ｍの酸では１Ｍの酸と比べて酸加水分解産物の溶解性が低下している。２ＭのＨ２ＳＯ４は非常に強い酸であるため、ビール酵母溶液の成分を沈殿させるのかも知れない。
【０１５９】
ホモジナイズの効果
ビール酵母溶液の機械的処理が酸加水分解の効果を改善させるかどうかを分析するために、ビール酵母サンプルを工業用ホモジナイザーでホモジナイズした。１Ｍ酸加水分解の結果を比較すると、ホモジナイズしたビール酵母は通常のビール酵母より溶解性が１０％増加している（図１９、プロセス加水分解に比べ、残存した不溶性材料は、ビール酵母では７５％、ホモジナイズしたビール酵母では６５％である）。一方、図２０に示されるように、グルカネックス、サビナーゼ、及びペクチナーゼ酵素の分解作用に対するホモジナイズの影響は軽微である。
【０１６０】
ＰＧ、ＰＧ  ＷＳ、及びＰＧ  ＷＳ  Ｅ＋の比較
本明細書に示したこれらの溶解性の結果に従い、細菌接着抑制実験用に５個のサンプルを選んで調製する。サンプルは
１．グルカネックス処理及びプロセス酸加水分解を施したビール酵母溶液、
２．グルカネックス処理及びプロセス酸加水分解を施したホモジナイズビール酵母溶液、
３．ビール酵母溶液を１Ｍ  Ｈ３ＰＯ４酸加水分解、
４．ホモジナイズビール酵母溶液を１Ｍ  Ｈ３ＰＯ４酸加水分解、及び
５．ペクチナーゼ処理したＰＧ１
である。
【０１６１】
これらは全て細菌接着アッセイ（従来のＰｒｏｇｕｔタイプ産物試験プロセスと同様に実施）で良好な結果を示し、グルカネックス処理したサンプルが最も効果が高かった。しかし、１Ｍ  Ｈ３ＰＯ４酸加水分解産物もほとんど同じ効果があったので、これを実地実験に選び、調製した。
【０１６２】
この水溶性Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物（ＰＧ  ＷＳ）及び水溶性Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物と乳化剤（ＰＧ  ＷＳ＋Ｅ）を工業プロセスで作製し、そのサンプルの溶解性を調べた。図２１は、乳化剤を含む水溶性Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物及び乳化剤を含まない水溶性Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物の溶解性をＰＧ１及びＰＧ２と比較して示したものである。ＰＧ  ＷＳとＰＧ１とを比べると、不溶性材料の量が４０％減少している。一方、ＰＧ  ＷＳの溶解性に比較すると、乳化剤は溶解性を増加させないようである。
【０１６３】
更に、過剰に加水分解したＰｒｏｇｕｔタイプ産物サンプルを分析に用いた。この１５時間加水分解したＰｒｏｇｕｔタイプ産物の溶解性実験から、ＰＧ１と比べてほぼ等量の不溶性材料が残っていることが示された。例えば過度の分解が起こっているかどうかを検討するためには更なる分析が必要である。
【０１６４】
結論
製造プロセス中にビール酵母溶液を１ＭのＨ３ＰＯ４で加水分解することで、飲料水の成分として動物に搬送（ｄｅｌｉｖｅｒ）可能な産物が製造される。このことは、水溶性Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物中に残存する不溶性材料の量（２６％）が、動物への搬送過程に液体状態を維持するのに充分な程少ないことを意味する。ＰＧ−ＷＳを製造するこの手法は溶解性を顕著に増加させ、不溶性材料は現行のＰｒｏｇｕｔタイプ産物製品では４２％であるが、ＰＧ−ＷＳでは２６％である。
【０１６５】
Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物又はビール酵母溶液のプロセス酸加水分解と酵素処理を併用すると、前述の１Ｍ  Ｈ３ＰＯ４加水分解単独の場合よりも更に可溶性の高い産物を製造することができる。プロナーゼ又はグルカネックスとサビナーゼとの組合せで処理すると、不溶性材料の量は最大で１０％まで減少した。
【実施例３】
【０１６６】
Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物、新規可溶性産物、及び競合産物の水への溶解性
動物の飼育において自動給餌器中で搬送上の問題を生じない液状混合物として用いることができる可溶性のＰｒｏｇｕｔタイプ産物（可溶性Ｐｒｏｇｕｔタイプと呼ぶ）を製造するために加水分解プロセスの開発を更に進めた。Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物の溶解性が平均して約５０％（ｎ＝９）であるのに対し、可溶性Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物の溶解性は７０％を超えている。競合産物の溶解性は全て４０％未満であった（図２３）。
【０１６７】
可溶性Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物の特徴
動物の健康及び福祉に関して、Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物及びその他の酵母産物中の生物学的に関連のある材料は可溶性の多糖及びオリゴ糖であると思われる。ここで、１％又はそれ以上に希釈された溶液中ではオリゴ糖は全て可溶性である。不溶性部分は細胞壁成分、すなわち主に不溶性の多糖及びタンパク質からなる。ゲル浸透クロマトグラフィー（ＰＧＣ）において、可溶性の多糖及びオリゴ糖並びにペプチド（本明細書中では「中サイズ材料」とも呼ぶ。）は、６〜１４ｍｌで溶出し、その相対量は２１４ｎｍで測定される。
【０１６８】
可溶性Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物の変形加水分解プロセスは、中間サイズ材料を約２倍に増加させ、プロセスを更に進めた新規の可溶性Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物中に検出される中間サイズ材料の量はほぼ３倍である（図２５及び２６）。本発明はまた、単離された実質的に完全に可溶性の産物をも明らかにした。これを水溶性Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物と呼ぶ。
【０１６９】
多糖、オリゴ糖、及びペプチドの量は３つの競合産物ではかなり低くなっている（図２７及び２８）。
【０１７０】
可溶性材料と細菌接着分析の関係
Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物の生物学的活性は、中サイズ材料の量に比例する。図２９は、多糖、オリゴ糖、及びペプチドの量が高いと細菌接着活性が高くなることを示している。低量の中間サイズ材料を含む競合産物で大腸菌の接着が非常に少ないことも明らかになっている（図３０）。
【０１７１】
単糖分析−マンノース含量の比較
酵母産物中のマンナン及びマンノオリゴ糖は、生物活性成分であると考えられている。そこで、可溶性の多糖及びオリゴ糖画分のマンノース含量を測定した。図３１に示されるように、Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物製品は明らかに競合産物よりも多くの可溶性マンノオリゴ糖を含んでいる。
【０１７２】
マンノース含量と大腸菌接着活性との比較も行った。マンノース量と細菌接着活性の間に明確な関係はないことが分かった（図３２）。したがって、全てのマンノース多糖又はオリゴ糖が同様な細菌接着活性を示すのではなく、特定の構造がより高い生物活性を示すという仮説が立てられる。
【０１７３】
可溶性成分のＮＭＲ分析
１Ｈ  ＮＭＲ分析は、Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物及びその他の酵母産物中のマンノオリゴ糖の構造的特徴を明らかにすることができる。図３３にＰｒｏｇｕｔタイプ産物サンプルのＮＭＲ分析を示す。典型的な酵母マンナン糖の構造の詳細及びその特徴的ＮＭＲピークを挿入図に示す。
【０１７４】
Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物及び３つの競合産物のＮＭＲスペクトル（図３４）の比較から、末端Ｍａｎα１−３単位（図３３及び３４の青色の印）の相対量がＰｒｏｇｕｔタイプ産物で明らかに高いと結論づけられる。（消化管の健康を害する）いくつかの大腸菌株は哺乳類のＭａｎα１−３構造に優先的に結合することが示されている。末端Ｍａｎα１−３単位を有するオリゴ糖の増加はＰｒｏｇｕｔタイプ産物のプロセス加水分解工程によるものである。
【０１７５】
１Ｈ  ＮＭＲ分析の詳細
ＮＭＲサンプルを、その糖組成に従って２種類に分類した。
【０１７６】
低分子量マンノ多糖／マンノースオリゴ糖含有サンプル
糖シグナルの線形／幅は、糖がかなり大きいことを示唆している。高級マンナン（ｈｉｇｈｅｒ  ｍａｎｎａｎ）オリゴ糖についての公開データに基づいて、構成マンノース単位のアノマー１Ｈシグナルを帰属した。以下のマンノ−オリゴ糖断片が同定された。大文字に対応するマンノース単位を太字で示す。各サンプル中の各種マンノース残基の相対濃度を表１に示す。ピークの高さを用いて積分を行い、Ａに対するシグナルの値を１とした。積分値によると、末端α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１−３）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１−２）及びその他の一般的なマンノースエピトープ濃度がＰＧサンプルで競合産物サンプルよりも高く、更に内部α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１−２）エピトープＡに対するα−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１−３）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１−２）エピトープＢの相対比率も高い。表３に示す（＋）ように、これら全サンプルがデンプンも含んでいる。主要なマンノースシグナルの積分値は、デンプン含量がＰＧサンプル中の方が低いことを示している。
【０１７７】
マンノースＮＭＲシグナルＡ〜Ｅに対応する具体的な単糖構造のリスト
【０１７８】
【化１】
2010529980.tif 000004
【０１７９】
【表３】
2010529980.tif 000005
【０１８０】
デンプンオリゴ糖含有サンプル
以下のサンプルは、同定可能な唯一の糖成分としてデンプンオリゴ糖を含む：ＰＧ１中間体（ＧＰＣで１２〜１６ｍｌに溶出）、ＰＧ２中間体、ＰＧ３中間体、ＰＧ４中間体、ＰＧ６中間体、ＰＧ７中間体、ＰＧ８中間体、ＰＧ９中間体、ＰＧ１５ｈ中間体、ＰＧ１０中間体、ＰＧ１１中間体、ＰＧ１２中間体、ＰＧ１３中間体、ＰＧ１４中間体、Ａｇ中間体、Ａｓ中間体、Ａｌ中間体、及びＢＭ中間体。
【０１８１】
帰属は、それぞれ［α−（１−４）Ｇｌｃｐ］ｎ鎖、α−（１−６）Ｇｌｃｐ分岐点、並びに還元末端α−Ｄ−Ｇｌｃｐ及びβ−Ｄ−ＧｌｃｐのアノマーＨ１に対応する５．４０９ｐｐｍ、４．９７２ｐｐｍ、５．２３１ｐｐｍ及び４．６４５ｐｐｍのシグナルの存在に基づく。
【０１８２】
デンプンオリゴ糖主要成分に加えてマンノオリゴ糖断片と思われるものを含むサンプルも複数あった。これらの分子の同定には更なる実験が必要である。
【０１８３】
ＰＧ１中間体、ＰＧ  Ｓ中間体、ＰＧ  Ｓ＋Ｅ中間体、及びＰＧ  ＷＳ中間体サンプルのＮＭＲスペクトル中には、末端断片α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１−３）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１−２）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−及びα−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１−２）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１−２）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−に対応するグナルが存在した。
【０１８４】
低デンプン量
表４には、大きな糖画分に含まれるデンプンのＮＭＲによる定量が含まれる。好ましい実施形態では、本発明は、本発明に係る糖画分（６〜１２分、オリゴ糖も含んでよい）及び材料に関し、デンプンＧｌｃα４エピトープの量はＭａｎｐ−（１−３）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１−２）の量の３．５倍未満、より好ましくは３倍未満である。本発明は更に、本発明のサンプル中に、低分子量デンプン鎖を示すデンプン還元末端シグナルが存在することを明らかにした。更に、本発明に係る好ましいデンプンは、適度な量のＧｌｃα６分枝構造を含んでいる。本発明は、好ましいマンノースの量の多さを背景とした低量のデンプンに関する。このデンプン断片は、アミラーゼ型の酵素により分解できると理解される。好ましい実施形態では、残存デンプン材料は、より純粋なマンノース／グルコース糖を得るために、アミラーゼ等のデンプン分解酵素により分解される。中間体スーパーデックスペプチドゲル濾過画分の分析は、新規可溶性画分（ＰＧ  ＷＳ及びＰＧ  Ｓ）中にデンプンオリゴ糖の量が特に低いことを示している。
【０１８５】
新規可溶性標品中におけるより高量のマンノースオリゴ糖の存在
マンノースオリゴ糖のシグナルは可溶性（ＰＧ  Ｓ及びＰＧ  ＷＳ）の糖標品中でより顕著であった。デンプンオリゴ糖シグナルに対するα−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１−３）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１−２）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−シグナルを可溶性標品間で比較すると、これらのシグナルは、デンプンＧｌｃβ４シグナルの少なくとも約２０％、ある標品中ではデンプンシグナルの約３０〜６０％にもなり、帰属可能なオリゴ糖全体の量とほぼ同量であった。従来のプロセスによる標品では、非常に少量のα−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１−３）−α−Ｄ−Ｍａｎｐシグナルしか観察されず、これはデンプンシグナルのほんの数％、一般的に約５％未満であった。１２〜１６分に溶出するより大きなオリゴ糖を含む中間体画分は、単糖を除く最も小さなオリゴ糖（二糖及びおそらく一部又は三糖）以外のほとんどのオリゴ糖を含んでいる。より小さなマンノースオリゴ糖がサンプル中に存在する可能性は低いと理解される。中間体画分（スーパーデックスペプチド１２〜１６）の量は、ゲル濾過のプロフィールが示す通り、糖タイプ材料全体のかなりの部分を占めており、全糖類の約２０〜５０％であると推定される。したがって、サンプルは、全糖類の少なくとも約４〜３０％、より好ましくは少なくとも約５〜３０％、更により好ましくは少なくとも約１０〜３０％のマンノースオリゴ糖を含む。サンプルのマンノース及びグルコースの含量に基づけば、全マンノース含有糖類のマンノースオリゴ糖量は約１０〜６０％、より好ましくは２０〜６０％である。
【０１８６】
標品中のマンノースオリゴ糖には末端Ｍａｎα３エピトープが非常に豊富であり、これが標品中の主要なマンノースシグナルである。このことは、マンノース結合性病原体を抑制する新規の生物活性マンノース糖が豊富であることを意味している。
【０１８７】
このデータは、可溶性を得るための本発明の最適化された方法では、１２〜１６分に溶出する低分子量の実際の主要なマンノースオリゴ糖が効率的に製造されるが、以前のＰｒｏｇｕｔ製造方法等のその他の方法又は競合法ではそうでないことを明らかにしている。
【０１８８】
驚くべきことに、競合材料は、そのいくつかはマンノ−オリゴ糖として宣伝されているにも関わらず、マンノースオリゴ糖をあまり含んでいないようである。多くの企業の努力にも関わらず、酵母からのマンノースオリゴ糖の効率的な製造は簡単な課題ではないようである。
【０１８９】
競合材料では残存マンノース材料が可溶性の低い高分子量材料として現れており、これは、本発明に係る材料のよりせまく滑らかなＮＭＲシグナルと比べて非常に広く弱いシグナルからも実証される。好ましい実施形態では、本発明は、本発明に係るマンノースシグナルＡ〜Ｅ及びＧｌｃベータシグナルに関して本質的に同様なＮＭＲスペクトルを生じる本発明に係る新規の糖材料に関し、そのようなＮＭＲスペクトルには、好ましくは同様なピーク幅、並びに／又は同様なピークの積分値及び高さ、並びに同様な低量のデンプンを表すシグナル、並びに／又は非炭水化物材料と思われるものを含む約４．７ｐｐｍにおける不純物シグナル等のその他の不純物が含まれる。
【０１９０】
ＮＭＲ分析のための参考文献：
Ｋａｔｈ，Ｆ．，ａｎｄ  Ｋｕｌｉｃｋｅ，Ｗ−Ｍ（１９９９）Ｄｉｅ  Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｍａｋｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  ２６８，６９−８０  Ｓｈｉｂａｔａ，Ｎ．，Ｋｏｊｉｍａ，Ｃ，Ｓａｔｏｈ，Ｙ．，Ｓａｔｏｈ，Ｒ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ａ．，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｓｕｚｕｋｉ，Ｓ．（１９９３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２１７，１−１２
Ｉｋｕｔａ，Ｋ．，Ｓｈｉｂａｔａ，Ｎ．，Ｂｌａｋｅ  Ｊ．Ｓ．，Ｄａｈｌ  Ｍ．Ｖ．，Ｎｅｌｓｏｎ，Ｒ．Ｄ．，Ｈｉｓａｍｉｃｈｉ，Ｋ．，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｈ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｏｋａｗａ  Ｙ．（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３２３，２９７−３０５
【０１９１】
結論として、Ｐｒｏｇｕｔタイプ産物は、１Ｈ  ＮＭＲ（図３３及び３４）に示されるようにより多くのＭａｎα１−３単位を含み、可溶性材料の単糖分析（図３１）に示されるようにマンノオリゴ糖含量が競合産物よりも高い。これらの結果から、活性マンノオリゴ糖の量が明らかに競合産物よりもＰｒｏｇｕｔタイプ産物で多いと結論づけることができる。
【０１９２】
α−Ｇｌｃ及びβ−Ｇｌｃ含有材料の帰属
表４は、Ｐｒｏｇｕｔタイプサンプル中に特異的なＧｌｃｂ材料が存在することを示している。約４．５３ｐｐｍにおけるＮＭＲシグナルで示されるＧｌｃｂ材料は可溶性産物から最も多量に見つかった。本発明は特に、４．５３ｐｐｍ付近のＧｌｃβＮＭＲシグナルが５．１４ｐｐｍ付近のＭａｎα３シグナルの少なくとも約８０％（表４の０．８倍）、より好ましくはＭａｎα３シグナルの９０％（表４の０．９倍）である、新規の可溶性産物に関する。本発明は、等モルの末端Ｇｌｃβ及びＭａｎα３材料にも関する。
【０１９３】
競合材料がいずれもＧｌｃβシグナルを有していないことも注目に値する。Ｇｌｃβシグナルの存在は、主要な量のＧｌｃβ６材料が含まれていることを意味すると考えられ、このことは、３．３１ｐｐｍのＧｌｃβ６−Ｈ２シグナルに帰属可能なシグナルが存在することからも支持される。Ｇｌｃβシグナルはまた、穀類グルカンシグナルと領域が重なっており、好ましい糖材料中に穀類グルカン由来の糖のＧｌｃβ４エピトープが一部存在することを示していると考えられるシグナル形状とも共通点がある。
【０１９４】
【表４】
2010529980.tif 000006
【実施例４】
【０１９５】
動物試験
Ｐｒｏｇｕｔの試験で用いられる標準的な方法（スオメン・レフ社から公開）を用いて、新規の糖標品であるＰＧ  ＷＳを飼料又は飲料水の０．３〜３％の量の栄養補助食品として試験動物に給餌する。通常のＰｒｏｇｕｔ標品又は競合産物を用いた場合よりも大きな体重増加及び／又は少ない下痢が観察される。
【図１】
2010529980.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年9月10日(2009.9.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物又はヒトの胃障害、腸疾患の予防及び成長促進に使用するための糖含有産物の製造方法であって、
ａ．酵母原材料、好ましくはビール酵母原材料の提供、
ｂ．１％水溶液としての全体的溶解性が５５％超である糖組成物を生成するための、少なくとも０．５Ｍの強酸中における最適化された酸加水分解による加水分解又は少なくとも０．５Ｍの強酸中における酵素及び最適化された酸加水分解による加水分解
を含む方法。
【請求項２】
動物又はヒトの胃障害、腸疾患の予防及び成長促進に使用するための糖含有産物の製造方法であって、
ａ．酵母原材料、好ましくはビール酵母原材料の提供、
ｂ．１％水溶液としての全体的溶解性が５５％超である糖組成物を生成するための、タンパク質切断酵素及び／又はグリコシダーゼを用いる酵素による加水分解
を含む方法。
【請求項３】
前記溶解性が６０％超である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記溶解性が７０％超である、請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記原材料がビール酵母である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
酵素的加水分解及び最適化された酸加水分解の両方を使用する、請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記強酸加水分解が、ＨＣｌ、リン酸、又は硫酸の群から選択される少なくとも０．５Ｍの強酸中で実施され、前記加水分解酵素がタンパク質切断酵素又はグリコシダーゼである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記強酸加水分解が少なくとも０．３Ｍのリン酸中で実施される、請求項１又は６に記載の方法。
【請求項９】
前記酵素処理が、プロナーゼ、サビナーゼ、ペクチナーゼ、エンドグルカナーゼ、グルカネックス、並びにサビナーゼ及び／又はエンドグルカナーゼと組み合わせたグルカネックスを含むか、同じ種類のタンパク質又は多糖に特異性を有する酵素を含む、請求項３〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記酵素処理が、プロナーゼ、サビナーゼ、ペクチナーゼ、グルカネックス、及びサビナーゼと組み合わせたグルカネックスを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
タンパク質切断酵素及びグリコシダーゼの組合せを含む酵素的加水分解のみを使用する、請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記酵素が、プロナーゼ、サビナーゼ、ペクチナーゼ、グルカネックス、及びサビナーゼと組み合わせたグルカネックスの群から選択される、請求項２〜５又は１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記酵素処理がペクチナーゼを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
ａ．酵母原材料、好ましくはビール酵母原材料を提供する工程、
ｂ．前記材料の物理的ホモジナイズ工程、
ｃ．無機酸による加水分解工程
を含む、請求項１又は３〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記強酸加水分解が少なくとも０．３Ｍのリン酸中で実施される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記強酸加水分解が少なくとも０．５Ｍのリン酸中で実施される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
酸濃度約０．５〜約１．２５Ｍ、反応温度７０〜１００℃、反応時間２〜８時間、より好ましくは３〜５時間、最も好ましくは３．５〜４．５時間
と同等な条件下における、ＨＣｌ、リン酸、又は硫酸の群から選択される強酸による強加水分解
を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記加水分解が、酸濃度約０．５〜約１．２５Ｍ、反応温度７０〜１００℃、反応時間２〜８時間、より好ましくは３〜５時間、最も好ましくは３．５〜４．５時間と同等な条件下でリン酸によりビール酵母に実施される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記酸濃度が０．７５〜１，２５Ｍである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項３〜１９のいずれか一項に記載のプロセスによって得られる、動物又はヒトの胃障害、腸疾患の予防及び成長促進に使用するための可溶性糖組成物であって、前記組成物の１％水溶液としての全体的溶解性が５５％超である、可溶性糖組成物。
【請求項２１】
前記糖組成物がビール酵母に由来する、請求項２０に記載の可溶性糖組成物。
【請求項２２】
１％水溶液としての全体的溶解性が６０〜８０％である、請求項２０に記載の可溶性糖組成物。
【請求項２３】
１％水溶液としての全体的溶解性が７０％超である、請求項２１に記載の可溶性糖組成物。
【請求項２４】
前記組成物が、総溶出体積１８ｍｌ及びカラム長３０ｃｍのスーパーデックスペプチド１０／３００ＧＬカラムから約６〜１６ｍｌ及び／又は６〜１４ｍｌに溶出する増加した量の糖を含む、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の可溶性糖組成物。
【請求項２５】
前記６〜１４ｍｌに溶出する増加した量の糖が、２１４ｎＭにおいて６８０ｍＡＵの１．５倍のＵＶ吸収積分値に相当する、請求項２４に記載の可溶性糖組成物。
【請求項２６】
前記組成物が、増加した量のＭａｎα３Ｍａｎα２オリゴ糖を含む、請求項２５に記載の可溶性糖組成物。
【請求項２７】
Ｍａｎα３Ｍａｎα２オリゴ糖中のマンノースの量が１５ｇ／ｋｇを超える、請求項２６に記載の可溶性糖組成物。
【請求項２８】
１％水溶液として少なくとも８５％の溶解性を有する前記可溶性糖画分を更なる工程で前記組成物から単離又は精製して、動物又はヒトの胃障害、腸疾患の予防及び成長促進に使用するための１％水溶液として少なくとも５５％の溶解性を有する産物を含む水溶性又は半水溶性の糖を得る、請求項３〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
以下の群から選択される方法又は／その任意の組合せにより前記可溶性糖画分を単離又は精製する、請求項３〜１９のいずれか一項に記載の方法：
ａ）
ｉ．帯電物質又は親油性物質（疎水性不純物）の吸収についてのクロマトグラフィー、
ｉｉ．サイズ排除クロマトグラフィー、特に低分子量不純物を除去するためのゲル濾過、
ｉｉｉ．糖又はその一部に結合するマトリックスを用いたアフィニティークロマトグラフィー、好ましくは活性炭を用いたクロマトグラフィー、
等のクロマトグラフィー法、
及び／又は
ｂ）溶媒抽出及び／又は不純物若しくは糖の沈殿等の相分離溶液法であって、好ましい実施形態では沈殿に有機溶媒、好ましくはメタノール、エタノール等のアルコール又はケトン、より好ましくはエタノールが用いられ、好ましいサイズの糖の沈殿にアセトンが用いられる、相分離溶液法、
及び／又は
ｃ）溶液及び沈殿剤の遠心分離、
及び／又は
ｄ）望ましくない成分の化学的又は酵素的分解方法であって、好ましくはアルカリに不安定な不純物を分解するための穏やかなアルカリ加水分解及び／又はＧｌｃα含有グリコーゲン／デンプン型糖の酵素的加水分解。
【請求項３０】
疎水性クロマトグラフィー及び／又はイオン交換クロマトグラフィー、並びに、サイズ排除クロマトグラフィーで前記糖画分を精製する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
請求項２９〜３０のいずれか一項に記載のプロセスによって得られる、動物又はヒトの胃障害、腸疾患の予防及び成長促進に使用するための、１％水溶液としての全体的溶解性が９０％超の水溶性糖組成物。
【請求項３２】
前記組成物の１％水溶液としての全体的溶解性が９０〜１００％である、請求項３１に記載の糖組成物。
【請求項３３】
前記組成物が、総溶出体積１８ｍｌ及びカラム長３０ｃｍのスーパーデックスペプチド１０／３００ＧＬカラムから約６〜１６ｍｌ及び／又は６〜１４ｍｌに溶出する増加した量の糖を含む、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３４】
前記６〜１４ｍｌに溶出する増加した量の可溶性材料が、２１４ｎＭにおいて６８０ｍＡＵの２．０倍のＵＶ吸収積分値に相当する、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３５】
前記組成物が、増加した量のＭａｎα３Ｍａｎα２オリゴ糖を含む、請求項３４に記載の可溶性材料中の糖組成物。
【請求項３６】
６〜１６ｍｌに溶出するＭａｎα３Ｍａｎ２糖中のマンノースの量が２０ｇ／ｋｇを超える、請求項２６に記載の糖組成物。
【請求項３７】
１２〜１６分に溶出するＭａｎα３Ｍａｎα２マンノースオリゴ糖がかなりの量で存在し、好ましくは全Ｍａｎα３Ｍａｎα２マンノース糖の少なくとも約１０％である、請求項２７又は３６に記載の糖組成物。
【請求項３８】
かなりの量のＧｌｃβ糖が存在し、そのため約ｐｐｍ４．５３におけるＧｌｃβのＨ１プロトンＮＭＲシグナルの積分値がＭａｎα３Ｍａｎα２−Ｈ１プロトンＮＭＲシグナルの少なくとも８０％である、請求項２７、３６、又は３７に記載の糖組成物。
【請求項３９】
請求項３〜５のいずれか一項に記載の加水分解処理をされたビール酵母原材料の可溶性成分をゲル浸透クロマトグラフィーにかけ、総溶出体積１８ｍｌ及びカラム長３０ｃｍのスーパーデックスペプチド１０／３００ＧＬカラムから約６〜１６ｍｌに溶出する画分中の中間サイズ糖材料を単離することで得られる糖組成物。
【請求項４０】
動物の胃障害、腸疾患の予防、及び成長促進に使用するための、請求項３９に記載の糖組成物。
【請求項４１】
ビール酵母原材料を濾過する工程、前記濾過されたビール酵母原材料を加水分解的に処理する工程、及びゲル浸透クロマトグラフィーで約６〜１６ｍｌに溶出され得る中間サイズ糖材料を単離する工程、を更に含む、請求項３〜５のいずれか一項に記載の糖組成物製造方法。
【請求項４２】
１２〜１６分に溶出する中間サイズ糖材料を単離する工程を更に含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
動物の胃障害、腸疾患の予防、又は成長促進における前記個々の糖物質の効果をスクリーニングする工程を更に含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
約４．５３ｐｐｍにおけるＧｌｃβＮＭＲシグナルが、約５．１４ｐｐｍのＭａｎα３シグナルの少なくとも約８０％、好ましくはＭａｎα３シグナルの９０％である、請求項２０に記載の組成物。
【国際調査報告】
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2010529980.tif 000045
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