(57)【要約】  【解決手段】  本発明は、ローズマリー抽出物を含有した紙巻きたばこ（たばこ）のフィルターと、たばこの煙に含まれる種々の有害物に起因したＤＮＡ損傷を低減する方法とに関する。より具体的には、本発明は、ヒトの肺内でベンゾ［ａ］ピレンジオールエポキシド−ｄＧ（ＢＰＤＥ−ｄＧ）付加体の還元により、ヒト細胞においてベンゾ［ａ］ピレンにより引き起こされるＤＮＡ損傷を、前記フィルターを使って低減することに関する。  【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィルターを有するたばこの喫煙により生じるたばこの煙からのヒト肺内ベンゾ［ａ］ピレンジオールエポキシド−ｄＧ（ＢＰＤＥ−ｄＧ）付加体を低減する方法であって、
ポリフェノール化合物またはその誘導体を含有するシソ科植物の抽出物を含浸させた前記フィルターに、前記たばこの煙を通過させる工程
を有する方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、前記植物はローズマリーである。
【請求項３】
請求項１記載の方法において、前記抽出物は、アルコール溶媒または水溶性アルコール溶媒での抽出により生成されるものである。
【請求項４】
フィルターを有するたばこの喫煙により生じるたばこの煙のヒト肺内ベンゾ［ａ］ピレンジオールエポキシド−ｄＧ（ＢＰＤＥ−ｄＧ）付加体を低減する方法であって、
少なくとも１つのポリフェノール化合物またはその誘導体を有する混合物を含浸させた前記フィルターに、前記たばこの煙を通過させる工程
を有する方法。
【請求項５】
請求項４記載の方法において、前記混合物は、カルノソール、ロスマノール、ロスマリン酸、およびカルノシン酸から成る群から選択される少なくとも１つのポリフェノール化合物またはその誘導体を有するものである。
【請求項６】
請求項５記載の方法において、前記混合物は、カルノソール、カルノシン酸、ロスマリン酸、およびロスマノールを含有するものである。
【請求項７】
請求項６記載の方法において、前記混合物は、カルノシン酸またはカルノソールを含有するものである。
【請求項８】
請求項７記載の方法において、前記フィルターは、少なくとも１つのポリフェノール化合物またはその誘導体を０．５ｇ〜０．１ｍｇ含有するものである。
【請求項９】
請求項７記載の方法において、前記フィルターは、少なくとも１つのポリフェノール化合物またはその誘導体を０．０１ｇ含有するものである。
【請求項１０】
請求項７記載の方法において、前記少なくとも１つのポリフェノールまたはその誘導体は、高分子担体（基剤）に結合し、マイクロカプセル基質中にあり、またはフィルターの繊維に加えられるものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ローズマリー抽出物を含有した紙巻きたばこ（以下「たばこ」）のフィルターと、たばこの煙に含まれる種々の有害物に起因したＤＮＡ損傷を低減する方法とに関する。より具体的には、本発明は、前記フィルターを用いることにより、ヒトの肺内におけるベンゾ［ａ］ピレンジオールエポキシド−ｄＧ（ＢＰＤＥ−ｄＧ）付加体を還元することにより、ヒト細胞におけるベンゾ［ａ］ピレンによるＤＮＡ損傷を低減することに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト肺内のベンゾ［ａ］ピレンジオールエポキシド−ｄＧ（ＢＰＤＥ−ｄＧ）付加体は、気管支細胞内に集中する。現在、この付加体は、ベンゾ［ａ］ピレンによる腫瘍形成について決定的な要因となる事象と認められている。たばこの煙は、ＢＰＤＥ−ｄＧ形成に対する有意な寄与因子である。たばこの使用は、公知の発癌性物質へのばく露と癌による死とをつなぐものとして群を抜いて一般的であり、そのため、癌誘発の機構を理解する上でのモデルとなっている。ベンゾ［ａ］ピレン（ＢＰ）は、排気ガス、焦げた食べ物、およびたばこの煙（少量）中に存在する高発癌性の多環芳香族炭化水素（ｐｏｌｙｃｙｃｌｉｃ  ａｒｏｍａｔｉｃ  ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ、略称ＰＡＨ）で、通常、たばこ１本あたり１０ｎｇ未満含まれている。ＢＰは、たばこの煙に含まれる６０を超える発癌性物質の１つで、肺癌の一因として疑われている。ＢＰは、代謝的に活性化されてベンゾ［ａ］ピレン−７，８−ジオール−９，１０−エポキシド（ＢＰＤＥ）になり、大多数グアニンのＮ２位でＤＮＡと反応して、ベンゾ［ａ］ピレン−７，８−ジオール−９，１０−エポキシド−Ｎ２−デオキシグアノシン（ＢＰＤＥ−ｄＧ）付加体などのＮ２−グアニン損傷を主に生成する。ＢＰＤＥ−ＤＮＡ付加体は、ヒト組織に存在することが結論付けられており、ＢＰＤＥ−ｄＧ付加体が気管支細胞だけに集中することから、これがヒト肺癌を発現することが示唆されている。
【０００３】
ローズマリー（Ｒｏｓｍａｒｉｎｕｓ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ  Ｌａｂｉａｔａｅ）の薬草および油、ローズマリー抽出物、カルノシン酸、およびカルノソールは、望ましい風味および高い抗酸化活性を有するため、食品加工においてスパイス（薬味）および香味料として一般に使用されている。
【０００４】
ただし、本発明以前には、たばこのフィルターにローズマリー抽出物を使うと、ベンゾ［ａ］ピレン、特にベンゾ［ａ］ピレンによる腫瘍形成について決定的要因となる事象と認められているヒト肺中のベンゾ［ａ］ピレンジオールエポキシド−ｄＧ（ＢＰＤＥ−ｄＧ）付加体によるヒト細胞のＤＮＡ損傷が減少するという認識はなかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＢＰは喫煙者の肺癌誘発に関与する重要な発癌性物質と見なされており、この研究で示すように、活性酸素種は、肺癌誘発について決定的な要因である肺発癌性付加体の形成に実質的に寄与する。たばこ依存症（中毒）を防ぐことも、禁煙および喫煙量低減用のプログラムの有効性を高めることも非常に重要であるが、それらのアプローチはこれまでほとんど効果を上げていない。ＢＰＤＥ−ｄＧ付加体形成の防止は、喫煙常習者の肺癌リスクの減少につながる可能性のあるアプローチの１つである。  
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ローズマリー抽出物を含有した紙巻きたばこ（たばこ）のフィルターと、たばこの煙に含まれる有害物に起因したＤＮＡ損傷を低減する方法とに関する。より具体的には、本発明は、前記フィルターを用いることにより、ヒト肺内でベンゾ［ａ］ピレンジオールエポキシド−ｄＧ（ＢＰＤＥ−ｄＧ）付加体を還元することにより、ベンゾ［ａ］ピレンがヒト細胞に入り込むことに起因したＤＮＡ損傷を低減するものである。
【０００７】
（−）−ａｎｔｉ−ＢＰＤＥ−ｄＧ付加体の量は、（＋）−ＢＰ−７，８−ジオールの存在下におけるたばこ煙の濃度とともに直線的に増加することがわかっている。カタラーゼおよびスーパーオキシドジスムターゼは、（−）−ａｎｔｉ−ＢＰＤＥ−ｄＧ付加体形成を８０％を超えて阻害する。ＭＣＦ−７細胞を（＋）−ＢＰ−７，８−ジオールで２時間処理した場合、たばこの煙の用量に依存して、（−）−ａｎｔｉ−ＢＰＤＥ−ｄＧの形成が増加し、（＋）−ｓｙｎ−ＢＰＤＥ付加体のＣＹＰ依存形成が減少する。
【０００８】
ベンゾ［ａ］ピレンにより最高１日にわたり細胞を処理したのち、これをたばこの煙に２時間ばく露した。この２時間の間に、たばこの煙で処理した細胞内の前記付加体の形成が、ＣＹＰ活性により、未処理細胞でのレベルと比べて２倍増加したことを発見した。このように、たばこの煙に含まれる活性酸素種により、ＢＰＤＥ−ｄＧ付加体の形成につながる第２の段階であるベンゾ［ａ］ピレン代謝経路が活性化されることを発見した。
【０００９】
上記のように、たばこの煙は、肺癌誘発について決定的な要因である発癌性付加体の形成につながる。  
【発明の効果】
【００１０】
最終的に、ローズマリー抽出物を含有するよう修正を加えたたばこのフィルターがＭＣＦ−７細胞でのたばこ煙によるＢＰＤＥ−ｄＧ付加体レベルを、７０％を超えて低下させることを発見した。この発見は、喫煙常習者の肺癌リスクを低減する上での著しい進展であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、発癌性物質ベンゾ［ａ］ピレンの主な代謝経路およびＤＮＡ結合を示した図である。ベンゾ［ａ］ピレンは、酵素的に、または活性酸素種により、ｉｎ  ｖｉｖｏで変換されて、ＤＮＡ反応性ジヒドロジオールエポキシドを生成するたばこ発癌性物質である。（−）−ＢＰ−７，８−ジヒドロジオールからの変異原性（＋）−ｒ−７，ｔ−８−ジヒドロキシ−ｔ−９，１０−オキシ−７，８，９，１０−テトラヒドロ−ＢＰ［（＋）−ａｎｔｉ−ＢＰＤＥ］の立体選択的生成は、シトクロムＰ４５０依存モノオキシゲナーゼ（Ｐ４５０）または活性酸素種の触媒作用による。それに続くこの求電子性中間体およびゲノムＤＮＡの反応により、ジヒドロジオールエポキシドとグアノシンの環外アミノ基との間に安定した付加体が生成される。この種のＤＮＡ損傷は、この付加体が修復されない限り、以下の複製サイクル内での突然変異に変換される可能性がある。
【図２】図２は、無細胞系を使い、同時にＤＮＡ付加を行って得られた結果を示した図である。６ｍｇの仔ウシ胸腺ＤＮＡを２ｍｌの水に混合したものを５ｍｌのＣＳＳに加え、異なる希釈液を使用して、（＋）−ＢＰ−７，８−ジオール（最終濃度３．６μＭ）と室温で２時間反応させた。ＤＮＡを加水分解し、放出されたＢＰ−テトラオールＩを、「材料および方法」で概略説明したように測定した。
【図３】図３は、（ａ）ＢＰ−７，８−ジオールの、ペルオキシルラジカルおよびシトクロムＰ４５０による、ＤＮＡに結合可能な反応種（ａｎｔｉ−ＢＰＤＥおよびｓｙｎ−ＢＰＤＥ）へのエポキシ化の立体化学および（ｂ）この研究で測定された、ＤＮＡのＢＰ−テトラオールへの酸加水分解を示した図である。（−）−ａｎｔｉ−ＢＰＤＥ−ｄＧおよび（−）−ｓｙｎ−ＢＰＤＥの加水分解により、ＢＰ−テトラオールＩ−２およびＢＰ−テトラオールＩＩ−１が形成されるが、これらは不安定で、ＢＰ−テトラオールＩ−１およびＢＰ−テトラオールＩＩ−２に変換される。
【図４】図４は、ＭＣＦ−７を用いて得られた結果を示した図である。総容積２０ｍｌの１０×１０６細胞／１５０ｃｍ２のフラスコを、（＋）−ＢＰ−７，８−ジオール（０．２μＭ）単独、またはＣＳＳの異なる希釈液の存在下で２時間処理した。ＤＮＡを単離して加水分解し、放出されたＢＰ−テトラオールを、「材料および方法」で概略説明したように測定し、結合レベルを決定した。（−）−ａｎｔｉ−ＢＰＤＥ−ｄＧおよび（＋）−ｓｙｎ−ＢＰＤＥ−ｄＧからそれぞれ得られたＢＰ−テトラオールＩおよびＢＰ−テトラオールＩＩに対応したクロマトグラムには、明確に区別できる２つのピークが観測された（参照文献３２〜３４）。示した値は、３〜４回ＨＰＬＣを行った２つの独立した実験についての平均＋標準偏差を表している。図４ａ（上図）は、ＣＳＳ希釈に伴う（−）−ａｎｔｉ−ＢＰＤＥ−ｄＧ付加体の増加を示している。図４ｂ（下図）は、ＣＳＳ希釈に伴う１／（＋）−ｓｙｎ−ＢＰＤＥ−ｄＧ付加体の減少を示している。
【図５】図５は、ＢＰ２．５μＭまたはＢＰ２．５μＭ＋ＣＳ溶液（希釈２０倍）に、示した時間だけばく露した後のＭＣＦ−７細胞におけるＢＰＤＥ−ｄＧ結合を示した図である。このＢＰばく露中、最後の２時間は、たばこ煙溶液を加えた（スキーム１）。「材料および方法」に記載のとおり、ＢＰＤＥ−ｄＧの分析を行った。示した値は、４〜６回のＨＰＬＣおよび標準実験を行った２つの独立実験についての平均＋標準偏差を表している。ＢＰＤＥ−ｄＧ値は、培養１２時間後に１１．７±０．５（平均±標準偏差）μｇ付加体／ｍｇ  ＤＮＡ、１８時間後および２４時間後にそれぞれ１７．６±０．４付加体／ｍｇ  ＤＮＡ、、２６．１±０．９付加体／ｍｇ  ＤＮＡであった。ＣＹＰの自然代謝は、これらの値を基準時間である１２時間、１８時間、および２４時間それぞれの２時間後、１７．２±０．５、２７．８±０．８、および４２．２±１．０に増加させた。たばこ煙溶液（ＣＳＳ）を加えたところ、この２時間の間に、はるかに大きな劇的変化が誘発され、１２時間、１８時間、および２４時間経過後に、最終的なＢＰＤＥ−ｄＧ値３６．９±１．２、５６．７±０．９、および８０．２±１．２（平均±標準偏差）μｇ付加体／ｍｇ）が得られた。
【図６】図６は、標準的フィルターと、ローズマリー抽出物を含んだフィルターとを使って得られた、ＢＰ２．５μＭまたはＢＰ２．５μＭ＋ＣＳ溶液にばく露した後のＭＣＦ−７細胞中のＢＰＤＥ−ｄＧ結合を示した図である。示した時間だけＢＰにばく露している間、最後の２時間は、たばこ煙溶液を加えた（スキーム１）。「材料および方法」に記載のとおり、ＢＰＤＥ−ｄＧの分析を行った。ＨＰＬＣ実験では、（＋）−ａｎｔｉ−ＢＰＤＥ−ｄＧ由来のＢＰ−テトラオールＩに対応するクロマトグラムのピークは１つだけであることが示された。示した値は、４〜６回ＨＰＬＣを行った２つの独立した実験についての平均＋標準偏差を表している。
【図７】図７は、ＭＣＦ−７細胞を１２時間および１８時間、ＢＰで処理したのち、さらに２時間、たばこの煙およびＢＰで処理した図である（それぞれ実験ＡおよびＢ）。この実験の目標は、ＢＰを異なる時間で活性化させてＢＰ−７，８−ジオールを生成したのち、たばこの煙で細胞を処理し、その効果を最後の２時間の間、調べることであった。その対照試料は、ＢＰだけで処理した細胞である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
【表１】
2010509913.tif 000002
【００１３】
標準ＣＳＳ系には、２ｍｌの仔ウシ胸腺ＤＮＡ（３ｍｇ／ｍｌ）、６００μｌの３０μＭ（＋）ＢａＰ−７，８−ジオール、およびｐＨ７．４、５ｍｌのＣＳＳのＰＢＳでの希釈液（１：１９）が含まれ、これを室温で２時間培養した。各値は、重複して行った３つの独立した実験から得られたものである。その平均誤差は、各重複実験において約１２％であった。標準実験のＢＰＤＥ−ｄＧ値は、５６±６．３（平均±標準偏差）付加体／ｍｇ  ＤＮＡであった。
【００１４】
喫煙は、多数のヒト癌と因果関係がある。たばこの使用は、公知の発癌性物質へのばく露と癌による死とをつなぐものとして群を抜いて一般的であり、そのため、癌誘発の機構を理解する上でのモデルとなっている。
【００１５】
ベンゾ［ａ］ピレン（ＢＰ）は、排気ガス、焦げた食べ物、およびたばこの煙（少量）中に存在する高発癌性の多環芳香族炭化水素（ｐｏｌｙｃｙｃｌｉｃ  ａｒｏｍａｔｉｃ  ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ、略称ＰＡＨ）で、通常、たばこ１本あたり１０ｎｇ未満含まれている。ＢＰは、たばこの煙に含まれる６０を超える発癌性物質の１つで、肺癌の一因として疑われている。ＢＰは、代謝的に活性化されてベンゾ［ａ］ピレン−７，８−ジオール−９，１０−エポキシド（ＢＰＤＥ）になり、大多数グアニンのＮ２位でＤＮＡと反応して、ベンゾ［ａ］ピレン−７，８−ジオール−９，１０−エポキシド−Ｎ２−デオキシグアノシン（ＢＰＤＥ−ｄＧ）付加体などのＮ２−グアニン損傷を主に生成する。
【００１６】
ＢＰＤＥ−ＤＮＡ付加体は、ヒト組織に存在することが結論付けられており、ＢＰＤＥ−ｄＧ付加体が気管支細胞だけに集中することから、これがヒト肺癌を発現することが示唆されている。
【００１７】
この発癌性物質は、第１相酵素により代謝され、フェノール、アレーンオキシド、キノン、ジヒドロジオール、およびジオールエポキシドを含む多数の代謝産物が生成される。（＋）−ａｎｔｉ−ＢＰＤＥ−ｄＧ付加体の形成につながるＢＰ代謝経路の概要を図１に示す。
【００１８】
より詳しく説明すると、ＢＰから、シトクロムＰ４５０（チトクロームＰ４５０）を介した酸化を２回経た後、究極発癌性物質（＋）−ａｎｔｉ−ＢＰＤＥが形成される。この酸化の第１段階により、（−）−７，８−ジヒドロ−７，８−ジヒドロベンゾ（ａ）ピレン［（−）ＢＰ  −７，８−ジオール］が優先的に生成される。そのジオールがさらに酸化され、主に変異原性の強い（＋）−ｒ−７，ｔ−８−ジヒドロキシ−ｔ−９，１０−オキシ−７，８，９，１０−テトラヒドロ−ＢＰ［（＋）−ａｎｔｉ−ＢＰＤＥ］が生成される。多くの研究によると、［（＋）−ａｎｔｉ−ＢＰＤＥ］はＢＰの主な発癌性代謝産物であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（生体外）およびｉｎ  ｖｉｖｏ（生体内）でＢＰより強力な変異原活性を呈することが明らかに認められている。肺発癌性物質の代謝における遺伝的変異について、これまでの研究の大半は、種々のシトクロムＰ４５０による代謝活性化に主眼を置いてきた（これらの酵素が肺内で発現する可能性は一般に低いが）。肺上皮細胞によるＢＰ−７，８−ジオールの活性化は、典型的なＣＹＰ／ＧＳＴ依存生体内変換の過程だけで生じるものではなく、ＣＹＰ以外の代謝経路もいくつか関与する。これらには、リポキシゲナーゼ、脂質過酸化生成物、ペルオキシダーゼ、ＣＯＸ−１、およびＣＯＸ−２に依存する経路などがある。
【００１９】
喫煙者における肺癌誘発については、現在、たばこフリーラジカルの有意な因果性を示唆する証拠が増えている。たばこを１回吸うたび、１０兆を超えるフリーラジカルが煙中に形成され、細胞巨大分子に繰り返されるＲＯＳの攻撃が腫瘍発現および各種形態のヒト癌の進行の双方の一因となるおそれがある。主要なフリーラジカル種は、セミキノン、ハイドロキノン、およびキノンの平衡混合物であると仮定される。このフリーラジカル複合体は、酸化還元サイクルを生じ、これにより酸素分子からスーパーオキシドアニオンが生成して過酸化水素およびヒドロキシルラジカルの形成につながることが示唆されている。これらの反応種は、げっ歯類およびヒトの培養細胞においてＤＮＡ切断およびＤＮＡの１本鎖切断を生じる。これらの作用には、キノンに伴う酸化還元サイクルが関与している可能性があり、ハイドロキノンおよびカテコールが大きな役割を果たすと考えられている。
【００２０】
たばこの煙が、酸素により生じるラジカルのため、ＢＰ代謝経路の第２段階が活性化され、おそらく細胞内での（−）−ＢＰ−７，８−ジオールから（＋）−ｒ−７，ｔ−８−ジヒドロキシ−ｔ−９，１０−オキシ−７，８，９，１０−テトラヒドロ−ＢＰ［（＋）−ａｎｔｉ−ＢＰＤＥ］への代謝により、ＢＰＤＥ−ｄＧ付加体が形成される可能性があることを発見した（図１）。
【００２１】
この活性化がＣＹＰ機構の場合より少なくとも２倍高いことも発見した。
【００２２】
さらに、たばこの煙からのＲＯＳがＢＰＤＥ−ｄＧ付加体形成増加の一因となっている可能性があることを発見した。
【００２３】
また、ローズマリー粉末製剤を含んだフィルターにより、たばこの煙から来る酸素により生じるラジカルに起因したＢＰＤＥ−ｄＧレベルを有意に低下させることができ、上記の発見をたばこのフィルターに応用すると、気管支上皮細胞における発癌性ＢＰＤＥ−ｄＧ付加体の形成を低減できることも発見した。
【００２４】
この発明では、（ｉ）シトクロムＰ４５０との比較による、たばこの煙中のＲＯＳのＢＰ−７，８−ジオール活性化への相対寄与を決定する手段と、（ｉｉ）たばこの煙のＲＯＳが、ＢＰ−７，８−ジオールの代謝に寄与して決定的な要因である肺内ＢＰＤＥ−ｄＧの形成を高めることにより、発癌過程を促進するかどうかを決定する手段と、（ｉｉｉ）ＢＰＤＥ−ｄＧの形成を有意に減少させるたばこフリーラジカルのスカベンジャー（消去剤または捕捉剤）を含有したフィルターと、（ｉｖ）ＢＰＤＥ−ｄＧ付加体の作用を有意に減少させるための前記フィルターの使用とを提供する。
【実施例】
【００２５】
化学物質（化学品）。プロテイナーゼＫ（ＥＣ  ３．４．２１．６４、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ  ｆｒｏｍ  Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ  ａｌｂｕｍ）をＳｉｇｍａ（米国ミズーリ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）から、ＲＮａｓｅ  Ｔ１（ＥＣ  ３．１．２１．３、ＲＮａｓｅ  Ｔ１  ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）およびＲＮａｓｅ（ＤＮａｓｅなし、ウシ膵臓からのＲＮａｓｅの不均一混合物）をＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ（ドイツＭａｎｎｈｅｉｍ）から、それぞれ購入した。リン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、略称ＰＢＳ）は、Ｅ．Ｍｅｒｃｋ（ドイツＤａｒｍｓｔａｄｔ）製の分光測定用のもので、３．０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＫＨ２ＨＰＯ４、１４０ｍＭのＮａＣｌ、８．０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．４）、ＨＰＬＣグレード水、ＭｅＯＨ、エーテル、およびエタノールを含むものであった。他の化学物質は、別段の断りがない限り、Ｓｉｇｍａ（フランスＬ'Ｉｓｌｅ  ｄ'Ａｂｅａｕ  Ｃｈｅｓｎｅｓ）、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ（ドイツＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）、およびＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ（ドイツＭａｎｎｈｅｉｍ）から購入した。すべてのＢＰ代謝産物基準は、米国国立癌研究所の発癌性化学物質参照基準リポジトリミッドウェスト研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ  Ｍｉｄｗｅｓｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、米国ミズーリ州Ｋａｎｓａｓ  Ｃｉｔｙ）から取得した。
【００２６】
装置。島津製作所ＲＦ−１０ＡＸＬ蛍光検出器を備えたＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄの高圧アイソクラティックおよびグラジエントシステムをＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ（ドイツＷａｌｄｂｏｒｎ）インテグレーターに連結して、高速液体クロマトグラフィー（ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、略称ＨＰＬＣ）を行った。
【００２７】
たばこ煙／ＰＢＳ溶液（ＣＳＳ）の調製。Ｐｒｙｏｒらの方法に従って「ケンブリッジ」フィルターなしで喫煙が行われた。煙収集方法としては、原則としてＮａｋａｙａｍａらと同じ方法が使用された。長さ８ｃｍの燃焼中の紙巻きたばこ（Ｍａｒｌｂｏｒｏ（マルボロ））から出る煙を、ウォーターポンプでの常時減圧により３．８分間収集し、その気泡が１０ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液を通過して、たばこ煙に含まれる気相化学物質およびタール化学物質の双方が当該溶液に取り込まれるようにした。洗浄瓶壁には不水溶性タール化合物が不在だったことから、１本のたばこの煙からの水溶性化合物の大部分は、１０ｍｌのＰＢＳ溶液に含有された。たばこ煙溶液（ｃｉｇａｒｅｔｔｅ  ｓｍｏｋｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ、略称ＣＳＳ）と呼ばれるこの水溶液を、ベンゾ［ａ］ピレンまたはそれに最も近い代謝産物（＋）−ＢａＰ−７，８−ジオールの存在下で、外来ＤＮＡとただちに反応させ、または培養物中のＭＣＦ−７細胞に加えた。ＣＳＳの種々の希釈液が使用された（下記参照）。
【００２８】
たばこフィルターへのローズマリー粉末抽出物の導入。
【００２９】
従来のたばこのフィルターを取り外し、フィルターがあった位置に、たばこ自体に近接させて、４０ｍｇのローズマリー粉末抽出物を導入した。この作業を行った後、前記フィルターを再設置した。このフィルターの効果を、質量分析法により評価した。簡潔に説明すると、スピントラップ付加体である３，３，５，５−テトラメチル−１−ピロリン−Ｎ−オキシド（３，３，５，５−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｙｒｒｏｌｉｎｅ−Ｎ−ｏｘｉｄｅ：ＴＭＰＯ）を含んだ有機溶液を前記たばこ煙の気泡が通過するようにした。次に、液体クロマトグラフィーおよび質量分析により、ヒドロキシルラジカル付加体の量を定量化した。使用した喫煙条件では、ヒドロキシルラジカルに３０％の減少が見られた。
【００３０】
希釈たばこ煙溶液（ＣＳＳ）の存在下における外来ＤＮＡの（＋）−ＢＰ−７，８−ジオールとの反応。２０倍に希釈した５ｍｌのＣＳＳに２ｍｌの仔ウシ胸腺ＤＮＡ（３ｍｇ／ｍｌ）を加え、室温で２時間、次の反応に従い（＋）−ＢＰ−７，８−ジオール（最終濃度３．６μＭ）と反応させた。
【００３１】
【数１】
2010509913.tif 000003
【００３２】
結果的に得られた（−）−ａｎｔｉ−ＢＰＤＥ−ｄＧ付加体のレベルを測定した（下記参照）。対照実験として、ＣＳＳなしのものを行った。
【００３３】
細胞の培養条件および処理。１５０ｃｍ２の細胞培養フラスコを使い、総体積２０ｍｌの最小必須培地Ｅ−ＭＥＭに１０％のＦＣＳと１５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液と抗生物質（２００ユニット／ｍｌのペニシリン、２００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、および２５μｇ／ｍｌのアンピシリン）とを補足したもので、ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ−７を成長させた。細胞は、３７℃で、５％ＣＯ２／９５％空気の雰囲気下で維持および処理した。ＭＣＦ−７細胞が前記フラスコ表面積の９０％を覆った後（密集した（コンフルエントな）培養物の分割から２〜３日後に）、当該培地を、１０％の血清を含んだ２０ｍｌの新鮮培地で置き換えた。２４時間後、略密集した細胞、例えばＧ０／Ｇ１相の細胞の９０％超をＤＭＳＯ単独で、またはＤＭＳＯおよびたばこ煙／ＰＢＳ（上記ＣＳＳ参照）に発癌性物質（下記参照）を溶解したもので処理した。ＤＭＳＯの最終濃度は、総培養体積の０．１％を超えなかった。各培養セットに含まれた対照試料は、ＤＭＳＯ単独で処理した。
【００３４】
ａ）（＋）−ＢＰ−７，８−ジオールおよびたばこ煙によるＭＣＦ−７細胞の処理（＋）−ＢＰ−７，８−ジオール（０．２μＭ）だけで、または異なるＣＳＳ希釈液の存在下で細胞を２時間処理した。ＣＳから生成したＲＯＯ°および細胞ＣＹＰで（＋）−ＢａＰ−７，  ８−ジオールを活性化させて、（−）−ａｎｔｉ−ＢＰＤＥ−ｄＧおよび（＋）−ｓｙｎ−ＢＰＤＥ−ｄＧをそれぞれ形成した。それらのレベルを、ＢＰ−テトラオールＩ−１およびＢＰ−テトラオールＩＩ−２の形成により測定した（下記および図３を参照）。
【００３５】
ｂ）ＢＰでの時間／用量ばく露実験。ＢＰおよびＢＰＤＥ−ｄＧレベルに対する時間／用量ばく露を特徴付けるため、細胞（１０×１０６細胞／１５０ｃｍ２フラスコ、総体積２０ｍｌ）を、最終濃度１．２５、２．５、および５．０μＭの培地で、それぞれ６、１２、１８、および２４時間処理した（２フラスコ／用量／時間ポイント）。細胞内に形成されたＢＰＤＥ−ｄＧ付加体は、他の研究で示されたように（３０）、用量および時間に依存した態様で線形的に増加した。得られた結果を踏まえ、ＢＰ用の作業用濃度として２．５μＭを選択した。
【００３６】
ｃ）ＢＰおよびたばこ煙によるＭＣＦ−７細胞の処理ＣＳ濃度の効果を見るため、異なるＣＳＳ希釈液（体積／体積比１：７９、１：３９、１：１９、１：９）でスキーム１の経験Ａを行った。この経験から得られた結果を踏まえ、１：１９（体積／体積比）の希釈液を作業用ＣＳ濃度として選択した。このように、スキーム１（図６−スキーム１を参照）に従い、細胞（上記「細胞の培養条件および処理」参照）をＢＰ（２．５μＭ）およびＣＳＳ（１：１９体積／体積比で希釈）で処理した。
【００３７】
すべての培養セットを、複製試料で２〜３回繰り返した。処理終了時には、細胞の形態的な変化を微視的に調べたのち、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ（０．０５％のトリプシン、０．１４ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＫＣｌ、０．１ＭのＮａ２ＨＰＯ４、１．５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、０．５ｍＭのＥＤＴＡ）でのトリプシン処理により集菌した。１０％ＦＣＳを含んだ培地を等しい体積だけ加えた後、その細胞を１０００ｇで遠心分離し、ＰＢＳで３回洗浄したのち、その細胞沈殿物を−２０℃で冷凍保管した。ＢＰおよびたばこ煙で処理し、または（＋）−ＢＰ−７，８−ジオールおよびたばこ煙で処理した前記細胞の生存率は、集菌時にトリパンブルー色素排除試験法で決定したところ、約９０％であった。使用した用量については、乳酸脱水素酵素の活性測定（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ製ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ、ドイツＭａｎｎｈｅｉｍ）による測定で、細胞毒性は示されなかった。
【００３８】
ＤＮＡの調製および加水分解。ＭＣＦ−７細胞沈殿物からのＤＮＡの単離は、ＲＮａｓｅ、プロテイナーゼＫ、塩析手順（３１）、およびクロロホルムでの処理により行った。前記細胞沈殿物を短時間、ＥＤＴＡ−ドデシル硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ、略称ＳＤＳ）緩衝液［１０ｍＭのトリス緩衝液、１ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ、１％のＳＤＳ（重量／体積）、ｐＨ８］で再懸濁し、１時間３７℃でＲＮａｓｅ  Ｔ１（２０００Ｕ／ｍｌ）およびＲＮａｓｅ  Ａ（ＤＮａｓなし、１００μｇ／ｍｌ）によりシェーカー（１００ｒｐｍ）で培養した。次に、プロテイナーゼＫ（３００μｇ／ｍｌ）を加え、３７℃で一晩培養を続けた。その分解後、６ＭのＮａＣｌを加え、１００００ｇでの遠心分離の後、最終濃度１Ｍを得た。上清中のＤＮＡをその体積の２倍のエタノールで沈殿させ、７０％エタノールおよび１００％エーテルで洗浄し、乾燥させて、１０ｍＭのトリス緩衝液に溶解した。再びＲＮａｓｅ  Ａ（１００μｇ／ｍｌ）およびＲＮａｓｅ  Ｔ１（２０００Ｕ／ｍｌ）を加え、その溶液を３７℃で１時間培養したのち、プロテイナーゼＫ（１００μｇ／ｍｌ）を加えてさらに３７℃で２時間培養した。その溶液を、一度クロロホルムで抽出して遠心分離し、１ＭのＮａＣｌ溶液とした。その２倍体積の冷却エタノールでＤＮＡを沈殿させた。
【００３９】
加水分解するＤＮＡの一部を１００％エタノールで洗って、結合していないＢＰ−テトラオールを取り除いた。これにより得られた非結合ＢＰ−テトラオールを含まないＤＮＡを水に溶解し、そのＤＮＡ濃度をＡ２６０ｎｍにより決定した。その純度を、Ａ２６０／Ａ２８０およびＡ２６０／Ａ２３０での比により確定した。分析用の量のＤＮＡを、最終濃度０．１ＮのＨＣｌで、９０℃で４時間培養して、これまで説明したとおり加水分解した。これにより、テトラオールが放出され（図３）、ＢＰＤＥ−ＤＮＡ付加体が９０％を超える回収率で得られる。前記加水分解物の注入用体積は７００μｌとし、これに５〜１０μｇのＤＮＡが含まれていた。
【００４０】
ＢＰＤＥ−Ｎ２−ｄＧ付加体レベルの決定。付加体レベルは、ｒ−７，ｃ−９，ｔ−８，ｔ−１０−テトラヒドロキシ−７，８，９，１０−テトラヒドロベンゾ（ａ）ピレン（ＢＰ−テトラオールＩＩ−１）を内部標準として使って［３４］、これまで説明されているように［３２，３３］、ＨＰＬＣ−ＦＤにより決定した。１０％のＭｅＯＨで平衡化した５μｍのＣ１８逆相物質（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ  １００）を含むラテックスプレカラムモジュール（ＨＤ−ドイツ）に、前記加水分解物を充填し、２０分間１２ｍｌの１０％ＭｅＯＨで洗浄した。次いで前記プレカラムをＶａｌｃｏ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓの切り替えバルブで、４．６ｍｍ×２５ｃｍ  ５μｍ  Ｃ１８の逆相（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ  １００）分析カラム（Ａｌｌｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ、ドイツＵｎｔｅｒｈａｃｈｉｎｇ）へ流れを切り替えた。加水分解により得られた生成物を、５０％  ０〜１７分間、５０〜６０％  １７〜３２分間、６０％  ３２〜４２分間、６０〜１００％  ４２〜５７分間のＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ勾配で溶出させた。前記ＢＰ−テトラオールの保持時間は、ＢＰ−テトラオールＩ−１（ｔｒａｎｓ−ａｎｔｉ−ＢＰ−テトラオール）（３５．２分間）、ＢＰ−テトラオールＩＩ−１（ｔｒａｎｓ−ｓｙｎ−ＢＰ−テトラオール）内部標準（３６．９分間）、ＢＰ−テトラオールＩＩ−２（ｃｉｓ−ｓｙｒｃ−ＢＰ−テトラオール）（４２．３分間）であった。励起波長３４４ｎｍおよび発光波長３９８ｎｍで蛍光を評価した。別個のＭＣＦ−７試料分析でＢＰ−テトラオールＩＩ−１の形成が検出されなかったことから、これを内部標準（各ＨＰＬＣ実験で２ｐｇを加えた）として相対保持時間の確認用に使用した。検出限界値は、ＢＰ−テトラオールＩ−１およびＢＰ−テトラオールＩＩ−１について０．５ｐｇであった。各ＢＰ−テトラオールのレベルは、ＭＣＦ−７試料分析の直前に分析した信頼できるＢＰ−テトラオール基準の蛍光ピーク領域から生成された標準曲線を使って決定した。検出されたＢＰ−テトラオールＩ−１は、（＋）−ａｎｔｉ−ＢＰＤＥ−ＤＮＡ付加体の加水分解後に導出された。（−）−ａｎｔｉ−ＢＰＤＥ−ｄＧの加水分解により、ＢＰ−テトラオールＩ−２が形成されるが、これは不安定で、ＢＰ−テトラオールＩ−１に変換される（図３）（３８）。このため、ＨＰＬＣ実験で見られたＢＰ−テトラオールＩ−１の量により、形成された（−）−ａｎｔｉ−ＢＰＤＥ−ｄＧのレベルを測定した。ＤＮＡと反応したＢＰＤＥが主にＢＰＤＥ−Ｎ２−ｄＧ（７）を生成するという結果に基づき、私は、ＢＰ−テトラオールＩ−１のレベルがＢＰＤＥ−Ｎ２−ｄＧのレベルに対応すると仮定した。ＭＣＦ−７ＤＮＡに結合したＢＰＤＥのレベルを重複測定で定量化した。その付加体レベルを、式１ｐｍｏｌ／ｍｇ  ＤＮＡ／３．１２５＝１付加体／１０６ヌクレオチドから計算した。前記ＨＰＬＣの実験結果は定量的に再現可能であり、２つのアッセイ間の変動性は５％より低かった。
【００４１】
ＢＰによる変異原性の機構は詳しく定義されているため、これを「分子署名」として使い、腫瘍の進行および癌を誘発するばく露における特定の遺伝的事象間の因果関係（の決定的証拠）を確立する。「ＢＰの分子署名」には、たばこの煙がヒト肺癌の原因であることを正確に指摘し、たばこ喫煙を最小限に抑え若しくはその予防措置を導入する具体的な戦略を策定する上で大きな意味合いがある。癌の化学予防に使用される具体的な薬剤は、発癌性物質がＤＮＡに及ぼす損傷、突然変異誘発、腫瘍促進、および／または腫瘍進行を抑制することにより、作用するように見られる。
【００４２】
私は、ヒト細胞で安定したＤＮＡ付加体形成を可能とするＢＰ−７，８−ジオールからＢＰＤＥへの生体内変換におけるＣＳの相対的役割を詳しく調べた。多数の研究では、安定したＰＡＨ−ＤＮＡ付加体がヌクレオチドの誤取り込みまたは欠失を介した突然変異につながりうることが実証されている。ＣＳは、有機化合物および無機化合物の双方をこれまで特定されただけでも４８００含む複雑な化学組成のエアロゾルである。煙の気相も粒子相もフリーラジカルを含有することが知られている。気相中のラジカルは全般的に短寿命であるが、粒子相中のラジカルは比較的安定でハイドロキノン、セミキノン、キノン複合体から成り、この複合体は、酸素分子を還元してスーパーオキシド、最終的には過酸化水素およびヒドロキシルラジカルを生成できる活性酸化還元系である。また、少なくとも６０の異なるＣＳ発癌性物質が腫瘍の発現および促進の原因として示唆されてきており、ＣＳに含まれる強力な発癌性物質は、その大半がＢＰおよびＮＮＫ（４−（メチルニトロソアミノ）−１−（３−ピリジル）−１−ブタノン）である。
【００４３】
無細胞系を使用し同時にＤＮＡ付加を行った場合の（＋）−ａｎｔｉ−ＢＰＤＥ−ｄＧに対するたばこ煙の効果たばこの煙から生じた活性酸素に依存するＢＰＤＥ−ｄＧ形成の機構を解明するため、この付加体について、無細胞ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系で同時にＤＮＡ付加を行って調べた。たばこ煙の気相およびタールのラジカルを含んだＣＳＳ溶液を、（＋）−ＢＰ−７，８−ジオールの存在下でＤＮＡとただちに反応させた（上記プロトコルを参照）。この実験で得られた結果により、ＣＳが（＋）−ＢＰ−７，８−ジオールを酸化して（−）−ａｎｔｉ−ＢＰＤＥを生成し、これから（−）−ａｎｔｉ−ＢＰＤＥ−ｄＧ付加体が形成されうることが示された。（−）−ａｎｔｉ−ＢＰＤＥ−ｄＧの量は、用量に依存して線形的に増加した（図２を参照）。
【００４４】
ＰＢＳに捕獲したたばこの煙からは、Ｈ２Ｏ２やＯ２−などの活性酸素が大量に生成されることがこれまでにわかっている。たばこの煙から生成されるこの活性酸素は、これまで観測されている（−）−ａｎｔｉ−ＢＰＤＥ−ｄＧ形成をもたらす可能性がある。これを確認するため、（−）−ａｎｔｉ−ＢＰＤＥ−ｄＧ生成に対するカタラーゼおよびスーパーオキシドジスムターゼ（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ、略称ＳＯＤ）の効果を調べたところ、どちらの酵素も当該付加体の形成を阻害することがわかった。不活性化したカタラーゼは、何の効果も示さなかった（表１）。これらの結果から、たばこの煙は（＋）−ＢＰ−７，８−ジオールを酸化し、これにより（−）−ａｎｔｉ−ＢＰＤＥ−ｄＧを形成できると結論し、またそのような能力は、主にたばこ煙からの酸素生成作用により説明できると結論した。
【００４５】
（＋）−ＢＰ−７，８−ジオールで処理したＭＣＦ−７細胞内で形成される（−）−ａｎｔｉ−ＢＰＤＥ−ｄＧ付加体に対するたばこ煙の効果。ＢＰ−７，８−ジオールからＢＰＤＥへの代謝に参与する経路としては、独立に２つのものが示されている（図３）。（＋）−鏡像異性体のシトクロムＰ４５０依存代謝では（＋）−ｓｙｎ−ＢＰＤＥが優先的に生成される一方、過酸化物（過酸化脂質など）とヘム含有タンパク質が関与する経路では、（−）−ａｎｔｉ−ＢＰＤＥが優先的に生成される。他方、（−）−ＢＰ−７，８−ジオールはどちらの経路でも代謝され、結果的にＢＰおよび（−）−ｓｙｎ−ＢＰＤＥの最終形態である（＋）−ａｎｔｉ−ＢＰＤＥが形成される。ａｎｔｉ−ＢＰＤＥおよびｓｙｎ−ＢＰＤＥ由来のテトラオールは本明細書の条件でそれぞれ明確に分離されるため、上記の異なる経路は、ＨＰＬＣ分析で区別することができる。
【００４６】
（−）−ａｎｔｉ−ＢＰＤＥ、さらにＤＮＡ  （−）−ａｎｔｉ−ＢＰＤＥ−ｄＧ付加体の形成につながる（＋）−ＢＰ−７，８−ジオールのたばこ煙依存エポキシ化の役割についてさらに調べるため、ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ−７を使用した。（＋）−ＢＰ−７，８−ジオールの活性化に関するたばこ煙ＲＯＳの効果を調べるためＭＣＦ−７細胞を使用した理由は、この細胞にペルオキシダーゼ活性がほとんどないためである。ＲＯＳ依存経路およびＣＹＰ依存経路で形成された付加体を区別できる立体化学的プローブ、（＋）−ＢＰ−７，８−ジオールで、前記細胞を処理した（図３）。（−）−ａｎｔｉ−ＢＰＤＥ−ｄＧおよび（＋）−ｓｙｎ−ＢＰＤＥ−ｄＧからそれぞれ得られたＢＰ−テトラオールＩおよびＢＰ−テトラオールＩＩに対応したクロマトグラムには、明確に区別できる２つのピークが観測された（参照文献３２〜３４）。たばこの煙が線形的に増加すると、その用量に依存して（−）−ａｎｔｉ−ＢＰＤＥ−ｄＧのＲＯＳ依存形成が高まり（図４ａ）、ＢＰ−テトラオールＩＩの形成により測定した（＋）−ｓｙｎ−ＢＰＤＥ−ｄＧ付加体のＣＹＰ依存形成は減少した。この減少は用量にも依存し、ＤＮＡ付加体の逆数は、たばこ煙の濃度とともに線形的に増加した（図４ｂ）。（＋）−ｓｙｎ−ＢＰＤＥ−ｄＧのＣＹＰ依存形成に対するＣＳの阻害作用と、（−）−ａｎｔｉ−ＢＰＤＥ−ｄＧ付加体の形成増加とにより、たばこの煙から生じた酸素の（−）−ａｎｔｉ−ＢＰＤＥ−ｄＧ付加体形成における役割が確認された。
【００４７】
他の研究では、誘発されたＣＹＰ活性が、酸化的攻撃により損なわれたことが示されている。そのような現象の基にある機構は、シトクロムＰ４５０１Ａ１遺伝子のダウンレギュレーション（下方制御）である。ペルオキシダーゼ活性がほとんど場合、ＭＣＦ細胞は「ストレス」条件下に置かれ、ＤＮＡ損傷が高まり、修復能力が低下する。その結果、ＢＰＤＥ−ＤＮＡ付加体がＢＰ−７，８−ジオール活性化とは独立に増加する。
【００４８】
ＢＰ処理した細胞内で形成されるＢＰＤＥ−ｄＧ付加体に対するたばこ煙の効果。ＭＣＦ−７細胞培養に関するこれまでの研究では、それらの細胞がＰ４５０１Ｂ１およびＰ４５０１Ａ１の誘導活性を有することが明らかにされている。Ｐ４５０を触媒としたＢＰ代謝回転の存在と、ＭＣＦ−７細胞における検出可能なペルオキシダーゼ活性の不在とにより、ヒト細胞培養物でのＢＰ活性化におけるたばこ煙の酸素ラジカルの役割を評価することが可能になった。ＭＣＦ−７細胞はＢＰの代謝活性化に対し高いＣＹＰ１Ａ１酵素活性を有するため、（−）−ＢＰ−７，８−ジオールが形成され、これにより（＋）−ａｎｔｉ−ＢＰＤＥ−ｄＧが形成される（図１）。ばく露６時間後の付加体形成レベルは、同１２時間後および２４時間後に観測された値より有意に低かった。２．５μＭのＢＰで６時間処理した後には、約２０００ｐｇ付加体／ｍｇ  ＤＮＡが形成され、１２時間後および２４時間後には、それぞれ１１０００ｐｇ付加体／ｍｇ  ＤＮＡを超え、２００００ｐｇ付加体／ｍｇ  ＤＮＡを超える付加体が形成された（ウイルコクソンの順位和検定ではｐ＝０．００２２）。
【００４９】
前記細胞は、ＢＰで１２時間および１８時間処理されて、ＲＯＳの基質である（−）−ＢＰ−７，８−ジオールの形成を誘発した。優先的に形成された（−）−Ｂｐ−７，８−ジオールの間接的な確認は、（＋）−ＢＰ−７，８−ジオールを前駆体とするｓｙｎ−ＢＰＤＥ由来のＢＰ−テトラオールＩＩ不在をＨＰＬＣで確認することによる（図３）。次いで前記細胞を、たばこ煙のＣＳＳおよびＢＰに２時間ばく露する。ＨＰＬＣ実験では、（＋）−ａｎｔｉ−ＢＰＤＥ−ｄＧ由来のＢＰ−テトラオールＩに対応するクロマトグラムのピークは１つだけであることが示された。ＣＳＳで処理した細胞と未処理細胞（対照試料）との違いを図５に示す。上記のとおり、この研究に使った細胞株は、ＣＳからの酸化的攻撃後にＣＹＰ１Ａ１発現を減少させる能力を保った。シトクロムＰ４５０の抑制は、おそらくＢＰから（−）−ＢＰ−７，８−ジオールおよび（＋）−ａｎｔｉ−ＢＰＤＥへの活性化を低下させる。このように、ＣＳによる差の拡大は、ＣＳから生じたＲＯＳによる（−）−ＢａＰ−７，８−ジオールの代謝の高まりによるものである。ウイルコクソンの順位和検定では、上記１４時間後および２０時間後の各対照試料に対し、ＣＳ処理した細胞はｐ＝０．００２２であった。先般、ＢＰによるＤＮＡの劇的な損傷がヒト気管支上皮細胞に生じて、ヒト気管支上皮細胞での肺癌発現に「決定的な要因」と見なせるＢＰＤＥ−ｄＧ付加体を形成することがわかった。このように、たばこの煙に生じる活性酸素種は、気管支上皮細胞におけるこの「決定的な要因」である付加体の形成に重要な役割を果たす可能性がある（図１）。
【００５０】
ＢＰＤＥ−ｄＧ付加体形成に対する、ローズマリー抽出物を含有したフィルターの効果。ローズマリー（Ｒｏｓｍａｒｉｎｕｓ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ  Ｌａｂｉａｔａｅ）の薬草および油は、望ましい風味および高い抗酸化活性を有するため、食品加工においてスパイスおよび香味料として一般に使用されている。ローズマリー抽出物、カルノソール、またはウルソル酸をマウスの皮膚に局所適用すると、ベンゾ［ａ］ピレンおよび表皮ＤＮＡの共有結合、７，１２−ジメチルベンゾ［ａ］アントラセン（７，１２−ｄｉｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚ（ａ）ａｎｔｒａｃｅｎｅ、略称ＤＭＢＡ）による腫瘍発現、ＴＰＡにより誘発される腫瘍促進、オルニチンデカルボキシラーゼ活性、および炎症が阻害された。ローズマリー抽出物は、促進段階だけでなく発現段階にも有効であることが実証されている。ローズマリー抽出物、カルノシン酸、およびカルノソールは、第１相酵素であるＣＹＰ４５０の活性を強力に抑制し、第２相酵素であるグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の発現およびｃｊｕｉｎｏｎｅ還元酵素活性を誘発する。カルノソールは、活性化マクロファージにおける一酸化窒素（ＮＯ）生成を阻害する。この抗酸化特性は、ローズマリー抽出物、カルノソール、またはウルソル酸の防御効果の基本機構と呼ばれてきた。
【００５１】
たばこの煙に含まれるフリーラジカルおよび活性酸素種の除去を目的として、少量のローズマリー粉末を標準的フィルターに導入した（「材料」を参照）。ローズマリー抽出物を導入した前記フィルターにより誘発された凝縮物中のフリーラジカル減少については、ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳを使ったスピントラップ（ＴＭＰＯ）でのＣＳＳのヒドロキシルラジカル含有量の定量化により推定した。使用した喫煙条件では、ヒドロキシルラジカルに３０％の減少が見られた。たばこ煙中のフリーラジカルレベルを低下させる本発明のフィルターの効率を、上記添加剤を含まない同等な標準的マルボロフィルターと比較するため、ＭＣＦ−７細胞を使った場合のＢＰＤＥ−ｄＧの形成に関し、本発明のフィルターを通過するＣＳの効果を双方について比較した。
【００５２】
ＭＣＦ−７細胞をＢＰで処理した場合に得られた結果を図６に示す。２つの実験群（ＡおよびＢ）が実施された。細胞は、ＢＰで１２時間および１８時間それぞれ処理した後、さらに２時間、ＢＰと併せ２つのフィルターからのＣＳＳで処理した（スキーム１）。これら最後の２時間中のＣＹＰに依存した前記付加体の増加を評価するため、各群に２つの対照実験を行った。Ａ群については１２時間および１４時間、Ｂ群については１８時間および２０時間とした。標準的フィルターからのＣＳＳは、１４時間および２０時間について得られた結合レベルの２倍であった。
【００５３】
ただし、ローズマリーフィルターは、標準的フィルターにより得られた増加を、前記２群において７０％を超えて、強力に妨げている（図６）。前記修正フィルターはＲＯＳを除去し、その結果、（−）−ＢＰ−７，８−ジオールの活性化を低減した（図３）。このフリーラジカルの低減とは別に、ローズマリー粉末は、ＢＰＤＥ−ｄＧ形成を減少させる他の機構も有する可能性がある。
【００５４】
またローズマリー全体の抽出物（６μｇ／ｍｌ）を使っても、ヒト気管支上皮細胞における６時間の１．５μＭ  ＢＰとの共培養後、ＣＹＰ１Ａ１活性およびＤＮＡ付加体形成を８０％阻害できる（ＢＥＡＳ−２Ｂ）。このように、フリーラジカルの量を低減することにより、決定的な要因である発癌性付加体の形成を低下させるフィルターを使用すると、喫煙常習者に著しく有益である。
【００５５】
したがって、本発明の進歩性のあるローズマリーたばこフィルターは、気管支上皮細胞におけるＢＰＤＥ−ｄＧ低減を目的とした化学予防プログラムに使用するものの候補として有望である。
【００５６】
本発明に関する上記の説明は、種々の修正、変更、および適応を施すことが可能であり、それらは添付の請求項の均等物（等価物）の意味内および範囲内に包含されると理解すべきであることが理解されるであろう。最も明白な変更（修正）は、例えば電気応答性組成物として種々のゲル材料を使用することである。
【００５７】
そのため、以上の説明から明らかな上記の目的等は効率的に達成され、上記の方法（工程）を実施する際、本発明の要旨を逸脱しない範囲で特定の変更が可能であり、上記の説明に含まれる全内容は例示的かつ非限定的であると解釈しなければならないことが理解されるであろう。また言うまでもなく、以下の請求項は、本明細書に説明する本発明の総称的および具体的な特徴と、その双方の間に含まれるものとして言語的に表現されうる当該範囲の全記述とをすべて対象とすることを目的としている。
【図１】
2010509913.tif 000004
【図２】
2010509913.tif 000005
【図３】
2010509913.tif 000006
【図４】
2010509913.tif 000007
【図５】
2010509913.tif 000008
【図６】
2010509913.tif 000009
【図７】
2010509913.tif 000010
【国際調査報告】
2010509913.tif 000011