(57)【要約】  本発明は、ＩＧＦ−１Ｒ、具体的にはｈＩＧＦ−１Ｒと特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。また、本発明の抗体または抗原結合フラグメントを含む抗体調製物を開示する。かかる抗体または抗原結合フラグメントの製造方法、およびそれらの使用もまた本発明の範囲内である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のＣＤＲ Ｈ３、またはＣＤＲ Ｈ３中に１もしくは２個のアミノ酸置換を含有するその変異体を含み、ＩＧＦ−１Ｒと特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
配列番号１のアミノ酸残基が位置７および９から選択される１もしくは複数の位置における置換で相違している、請求項１記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項３】
配列番号１のアミノ酸残基が、位置７におけるＲからＳへの置換、および位置９におけるＫからＲへの置換から選択される１もしくは複数の置換で相違している、請求項２記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項４】
抗体または抗原結合フラグメントが、次の配列：ＣＤＲ Ｈ２（配列番号２）またはＣＤＲ Ｈ１（配列番号３）、ＣＤＲ Ｌ１（配列番号４）、ＣＤＲ Ｌ２（配列番号７）およびＣＤＲ Ｌ３（配列番号６）の１もしくは複数をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項５】
１もしくは複数のＣＤＲがその変異体で置き換えられてもよく、変異体ＣＤＲはそれぞれ１もしくは２個のアミノ酸置換を含有する、請求項４記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項６】
配列番号３のＣＤＲ Ｈ１をさらに含む、請求項４または５記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項７】
配列番号７のＣＤＲ Ｌ２をさらに含む、請求項４または５記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項８】
以下のＣＤＲ：
ＣＤＲ Ｈ１：配列番号３
ＣＤＲ Ｈ２：配列番号２
ＣＤＲ Ｈ３：配列番号１
ＣＤＲ Ｌ１：配列番号４
ＣＤＲ Ｌ２：配列番号７
ＣＤＲ Ｌ３：配列番号６
をさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項９】
配列番号８の重鎖可変領域および配列番号９の軽鎖可変領域を含み、ＩＧＦ−１Ｒと特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
配列番号１０の重鎖可変領域および配列番号１１の軽鎖可変領域を含み、ＩＧＦ−１Ｒと特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１１】
配列番号１２の重鎖可変領域および配列番号１３の軽鎖可変領域を含み、ＩＧＦ−１Ｒと特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１２】
配列番号１４の重鎖可変領域ドメインおよび配列番号１６の軽鎖可変領域ドメインを含み、ＩＧＦ−１Ｒと特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１３】
配列番号１５の重鎖可変領域および配列番号１６の軽鎖可変領域を含み、ＩＧＦ−１Ｒと特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１４】
抗体または抗原結合フラグメントが、ラット、マウス、霊長類（例えばカニクイザル、旧世界ザルもしくは類人猿）、またはヒトのものである、請求項１〜８のいずれか１項に記載のＣＤＲ、または請求項９〜１３のいずれか１項に記載の重鎖もしくは軽鎖可変領域を含む抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項１５】
抗体がヒト化抗体またはキメラ抗体である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項１６】
抗体または抗原結合フラグメントが霊長類ＩＧＦ−１Ｒとさらに結合する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項１７】
抗体が定常領域を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項１８】
抗体がＩｇＧアイソタイプの定常領域を含む、請求項１７記載の抗体。
【請求項１９】
抗体がＩｇＧ１である、請求項１８記載の抗体。
【請求項２０】
抗体のＡＤＣＣおよび／もしくは補体活性化、またはエフェクター機能が低減されるように定常ドメイン領域を含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２１】
抗体のエフェクター機能／ＡＤＣＣおよび／もしくは補体活性化が増強されるように変異型定常ドメインまたは改変された糖鎖付加プロフィールを有する定常ドメインを含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２２】
フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニ抗体、ミニボディ、単離されたＶＨまたは単離されたＶＬである、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗原結合フラグメント。
【請求項２３】
抗体またはその抗原結合フラグメントが、少なくともある程度のエフェクター機能が可能なものである、例えばある程度のＡＤＣＣまたはＣＤＣ機能が可能なものである、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の抗体または請求項１〜２２のいずれか１項に記載の抗原結合フラグメント。
【請求項２４】
少なくとも１個の発現カセットを含む、組換え形質転換、トランスフェクトまたは形質導入した宿主細胞であって、該発現カセットは、本明細書に記載した本発明に係る抗体または抗原結合フラグメントの重鎖をコードするポリヌクレオチドを含み、さらに本明細書に記載した本発明に係る抗体または抗原結合フラグメントの軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む、上記宿主細胞。
【請求項２５】
少なくとも１個の発現カセットを含む、組換え形質転換、トランスフェクトまたは形質導入した宿主細胞であって、第１の発現カセットは本明細書に記載した本発明に係る抗体または抗原結合フラグメントの重鎖をコードするポリヌクレオチドを含み、さらに本明細書に記載した本発明に係る抗体または抗原結合フラグメントの軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む第２の発現カセットを含む、上記宿主細胞。
【請求項２６】
真核生物のものである、請求項２４または２５記載の宿主細胞。
【請求項２７】
哺乳動物のものである、請求項２６記載の宿主細胞。
【請求項２８】
ＣＨＯまたはＮＳＯである、請求項２７記載の宿主細胞。
【請求項２９】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の抗体または請求項１〜２２のいずれか１項に記載のその抗原結合フラグメントを作製する方法であって、無血清培養培地において請求項２４〜２８のいずれか１項に記載の宿主細胞を培養するステップを含む方法。
【請求項３０】
抗体が、前記宿主細胞により培養培地中に分泌される、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
抗体が、該抗体を含有する培養培地に対して、少なくとも９５％以上（例えば９８％以上）までさらに精製される、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記請求項のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメントと、製薬上許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項３３】
請求項３２記載の組成物と共に使用説明書を含む部材キット。
【請求項３４】
前記請求項のいずれかに記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または請求項３２記載の組成物の治療有効量を投与するステップを含む、癌に罹患したヒト患者の治療方法。
【請求項３５】
患者が乳癌に罹患している、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
患者が前立腺癌に罹患している、請求項３４記載の方法。
【請求項３７】
関節リウマチ、乳癌、前立腺癌、肺癌または骨髄腫からなる群より選択される疾患または障害を治療するための医薬の製造における、前記請求項のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメントの使用。
【請求項３８】
抗体がＩＧＦ−１Ｒの活性を中和する、前記請求項のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトインスリン様成長因子受容体（ｈＩＧＦ−１Ｒ）に特異的に結合する、抗体およびその抗原結合フラグメントに関する。本発明はまた、前記抗体およびその抗原結合フラグメントによる疾患または障害の治療方法、前記抗体およびその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物、ならびに製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトインスリン様成長因子受容体（ＩＧＦ−１Ｒ、ＣＤ２２１、またはＥＣ２．７．１１２としても知られる）は、インスリン受容体と７０％の相同性を有するチロシンキナーゼ受容体である。この受容体と高い親和性で結合する２個のリガンドＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩによって、この受容体は活性化される。この受容体は、ジスルフィド結合したαβ二量体であり、（αβ）２と表示される。α鎖は完全に細胞外にあるが、β鎖は膜貫通し、細胞外ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインを有する。リガンドが媒介する受容体の活性化によって、ＭＡＰＫおよびＰＩ３Ｋ−プロテインキナーゼＢ経路の活性化を含む細胞内事象が誘発される。正常胎児および出生後産児の成長と発育に、ＩＧＦ−１Ｒが重要な役割を有することが知られているが、ＩＧＦ−１Ｒは癌生物学においても重要な役割を担い、有糸分裂誘発、形質転換、およびアポトーシスからの防御など、いくつかの生物学的経路に関与するとされてきた（Basergaら，(1997) Endocrine, 7(1):99-102、Baserga (2003) Int J Cancer, 107(6):873-7、Larssonら，(2005) Br J Cancer, 92(12):2097-101、Romano (2003) Drug News Perspect, 16(8):525-31に詳細な概説）。さらに、受容体発現レベルは、様々な腫瘍型で上方調節されることが知られており（Khandwalaら，(2000) Endocr Rev., 21(3):215-44が概説）、リガンドＩＧＦ−Ｉレベルの上昇は、前立腺癌発生の危険性の増大に関連する（Chanら，(1998) Science, 279(5350):563-6）。
【０００３】
ＩＧＦ−１Ｒシグナル伝達経路のアンタゴニストは、インビトロおよびインビボにおけるその抗腫瘍効果で知られている（Hofmannら，(2005) Drug Discov Today, 10(15):1041-7およびZhangら，(2004) Expert Opin Investig Drugs, 13(12):1569-77に概説）。手法には、中和抗体（Kullら，(1983) J Biol Chem., 258(10):6561-6およびLiら, (1993) Cancer Immunol Immunother., 49(4-5):243-52、Xiongら，(1992) Proc Natl Acad Sci U S A., 89(12):5356-60、Burtrumら，(2003) Cancer Res., 63(24):8912-21、Cohenら，(2005) Clin Cancer Res., 11(5):2063-73、Maloneyら，(2003) Cancer Res., 63(16):5073-83、Jackson-Boothら，(2003) Horm Metab Res., 35(11-12):850-6を参照）、アンチセンス（Resnicoffら，(1994) Cancer Res., 54(18):4848-50、Leeら，(1996) Cancer Res., 56(13):3038-41、Mullerら，(1998) Int J Cancer., 77(4):567-71、Trojanら，(1993) Science, 259(5091):94-7、Shapiroら，(1994) J Clin Invest., 94(3):1235-42を参照）、ドミナントネガティブ突然変異体（Pragerら，(1994) Proc Natl Acad Sci U S A., 91(6):2181-5）、および小分子チロシンキナーゼ阻害薬（Hopfnerら，(2006) Biochem Pharmacol. 2006,71(10):1435-48を参照）、およびＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ−Nickersonら，(1997) Biochem Biophys Res Commun., 237(3):690-3を参照）が含まれる。公知のモノクローナル抗体には、ＷＯ９９／６００２３号、ＷＯ０３／１００００８号、ＷＯ０２／０５３５９６号、ＷＯ０４／０７１５２９号、欧州特許第０６２９２４０号、ＷＯ０３／０５９９５１号、ＷＯ０３／１０６６２１号、ＷＯ０４／０８３２４８号、ＷＯ０４／０８７７５６号、ＵＳ２００６４５２１６７Ａに記載されたものなどがある。しかし、エフェクター機能が改善された抗体、例えばＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ機能が改善された抗体が必要とされている。
【０００４】
抗体の構造は、当技術分野でよく知られており、特に重鎖定常領域がグリコシル化された糖鎖を有することが知られており、この糖鎖はＮ−グリコシド結合糖鎖、例えばＮ−アセチルグルコサミン（acetlyglucosamine）であることができ、かつ糖鎖はフコシル化されていても、またはそうでなくてもよい。
【０００５】
フコシル化レベルを測定する方法は、当技術分野でよく知られており、例えば、抗体集団については、酸加水分解を利用して、抗体から、グリコシル化された糖鎖の単糖類を除去することができ、２−アミノ安息香酸（２−ＡＡ）などの色素を用いてこれらを標識することができる。そして、蛍光検出を用いる逆相高速液体クロマトグラフィーを実施し、試料を定量するために検量線を作成することができる。次いで、抗体集団当たりのフコース対マンノースの比を算出することができる。
【発明の概要】
【０００６】
一実施形態では、本発明によって、配列番号１のＣＤＲ Ｈ３、またはＣＤＲ Ｈ３中に１もしくは２個のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【０００７】
一実施形態では、本発明によって、ＩＧＦ−１Ｒ、特にｈＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合し、かつｈＩＧＦ−１Ｒの活性を中和する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、配列番号１のＣＤＲ Ｈ３、またはＣＤＲ Ｈ３中の１もしくは２個のアミノ酸残基が、配列番号１のその対応する位置のアミノ酸残基と異なるその変異体を含む重鎖可変ドメインを含む抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【０００８】
本明細書に記載した抗体を作製する方法であって、細胞系中で抗体またはその抗原結合フラグメントを発現させるステップを含む方法も提供される。
【０００９】
別の実施形態では、本明細書に記載した組成物と共に使用説明書を含む部材キットが提供される。
【００１０】
また、癌に罹患しているヒト患者の治療方法であって、本明細書に記載した抗体調製物の治療有効量を投与するステップを含む治療方法も提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＥＬＩＳＡによって測定した、精製マウスモノクローナル抗体とヒトＩＧＦ−１Ｒとの結合を示す図である。
【図２Ａ】ＥＬＩＳＡによって測定した、精製６Ｅ１１キメラ抗体および６Ｅ１１ヒト化抗体と、ヒトＩＧＦ−１Ｒとの結合を示す図である。図２Ａでは、抗体の濃度が非常に低く正確に定量できなかったために、Ｈ０Ｌ０の結合曲線は右へシフトした。一方、図２Ｄでは、全体的傾向は類似しているが、他のアッセイと比べてシグナルは減少した。
【図２Ｂ】ＥＬＩＳＡによって測定した、精製６Ｅ１１キメラ抗体および６Ｅ１１ヒト化抗体と、ヒトＩＧＦ−１Ｒとの結合を示す図である。
【図２Ｃ】ＥＬＩＳＡによって測定した、精製６Ｅ１１キメラ抗体および６Ｅ１１ヒト化抗体と、ヒトＩＧＦ−１Ｒとの結合を示す図である。
【図２Ｄ】ＥＬＩＳＡによって測定した、精製６Ｅ１１キメラ抗体および６Ｅ１１ヒト化抗体と、ヒトＩＧＦ−１Ｒとの結合を示す図である。
【図２Ｅ】ＥＬＩＳＡによって測定した、精製６Ｅ１１キメラ抗体および６Ｅ１１ヒト化抗体と、ヒトＩＧＦ−１Ｒとの結合を示す図である。
【図３】３Ｔ３／ＬＩＳＮ ｃ４細胞を、ヒトＩＧＦ−１Ｒに対する精製６Ｅ１１マウスモノクローナル抗体と共に２４時間インキュベーション後、ＩＧＦ−１Ｒ受容体が下方調節されることを示す図である。
【図４】ＮＣＩ−Ｈ８３８細胞を、ヒトＩＧＦ−１Ｒに対するヒト化Ｈ０Ｌ０抗体と共に最長２４時間インキュベーション後、ＩＧＦ−１Ｒ受容体が下方調節されることを示す図である。
【図５】ＮＣＩ−Ｈ８３８細胞を、Ｈ０Ｌ０、Ｈ０Ｌ０ ＩｇＧ１ｍ（ＡＡ）、または非標的化ヒトＩｇＧと共に２４時間インキュベーション後、ＩＧＦ−１Ｒ受容体およびインスリン受容体が下方調節されることを示す図である。
【図６】４℃および３７℃でＨ０Ｌ０とインキュベーションした後の顆粒球およびリンパ球集団のＩＧＦ−１Ｒレベルの蛍光強度を示すヒストグラムである。
【図７】４℃および３７℃でＨ０Ｌｏとインキュベーションした後の顆粒球およびリンパ球集団のＩＧＦ−１Ｒレベルをアイソタイプ対照と比較して示す蛍光強度のヒストグラムである。
【図８】精製マウスモノクローナル抗体６Ｅ１１、５Ｇ４、および１５Ｄ９によって媒介される受容体リン酸化阻害を示す図である。
【図９】６Ｅ１１ｃと比較して、Ｈ１Ｌ０によって媒介される受容体リン酸化阻害の例を示す図である。
【図１０】Ｈ０Ｌ０とＨ０Ｌ０ ＩｇＧ１ｍ（ＡＡ）、およびＨ１Ｌ０とＨ１０Ｌ０ ＩｇＧ１ｍ（ＡＡ）によって媒介される受容体リン酸化阻害の例を示す図である。
【図１１】図１１Ａ：競合ＥＬＩＳＡにおける様々な精製マウスモノクローナル抗体の活性の例を示す図である。図１１Ｂ：６Ｅ１１ｃと比較した、競合ＥＬＩＳＡにおけるＨ１Ｌ０の活性の例を示す図である。
【図１２Ａ】精製６Ｅ１１マウスモノクローナル抗体または６Ｅ１１キメラ抗体または６Ｅ１１ヒト化抗体が、ＩＧＦ−１Ｒ受容体と第２中和抗体との結合を阻害する能力を実証するための競合ＥＬＩＳＡである。
【図１２Ｂ】精製６Ｅ１１マウスモノクローナル抗体または６Ｅ１１キメラ抗体または６Ｅ１１ヒト化抗体が、ＩＧＦ−１Ｒ受容体と第２中和抗体との結合を阻害する能力を実証するための競合ＥＬＩＳＡである。
【図１２Ｃ】精製６Ｅ１１マウスモノクローナル抗体または６Ｅ１１キメラ抗体または６Ｅ１１ヒト化抗体が、ＩＧＦ−１Ｒ受容体と第２中和抗体との結合を阻害する能力を実証するための競合ＥＬＩＳＡである。
【図１３】図１３Ａ：ＥＬＩＳＡによって定量した、精製マウスモノクローナル抗体と組換えカニクイザルＩＧＦ−１Ｒとの結合を示す図である。図１３Ｂ：６Ｅ１１キメラ（６Ｅ１１ｃ）と比較した、精製ヒト化モノクローナル抗体と組換えカニクイザルＩＧＦ−１Ｒとの結合を示す図である。
【図１４】精製マウスモノクローナル抗体を使用するインスリン受容体結合ＥＬＩＳＡを示す図である。
【図１５】精製ヒト化抗体を使用するインスリン受容体結合ＥＬＩＳＡを示す図である。
【図１６】本抗体が、Ｃｏｌｏ２０５腫瘍細胞系を認識することを実証するＦＡＣＳアッセイである。
【図１７】本抗体が、ＮＣＩ−Ｈ８３８肺癌腫瘍細胞系を認識することを実証するＦＡＣＳアッセイである。
【図１８】本抗体が、ＭＣＦ７癌腫およびＡ５４９肺（lunch）癌腫細胞系を認識することを実証するＦＡＣＳアッセイである。
【図１９】精製マウスモノクローナル抗体を使用する、腫瘍および正常前立腺試料の凍結組織試料の免疫組織化学を示す図である。
【図２０】精製マウスモノクローナル抗体を使用する、腫瘍乳房試料の凍結組織試料の免疫組織化学を示す図である。
【図２１】精製Ｈ１Ｌ０ヒト化および６Ｅ１１キメラモノクローナル抗体を使用する、腫瘍乳房試料の凍結組織試料の免疫組織化学を示す図である。
【図２２】ビオチン標識Ｈ０Ｌ０抗体を使用する、腫瘍乳房試料の凍結腫瘍組織試料の免疫組織化学を示す図である。
【図２３】精製マウスモノクローナル抗体により阻害された、３Ｔ３／ＬＩＳＮ ｃ４細胞のＩＧＦ−Ｉ媒介増殖の阻害を示す図である。
【図２４】精製Ｈ１Ｌ０ヒト化または６Ｅ１１キメラモノクローナル抗体により阻害された、３Ｔ３／ＬＩＳＮ ｃ４細胞のＩＧＦ−Ｉ媒介増殖の阻害を示す図である。
【図２５Ａ】精製ヒト化または精製マウス６Ｅ１１モノクローナル抗体により阻害された、３Ｔ３／ＬＩＳＮ ｃ４細胞のＩＧＦ−Ｉ媒介増殖の阻害を示す図である。
【図２５Ｂ】精製ヒト化または精製マウス６Ｅ１１モノクローナル抗体により阻害された、３Ｔ３／ＬＩＳＮ ｃ４細胞のＩＧＦ−Ｉ媒介増殖の阻害を示す図である。
【図２５Ｃ】精製ヒト化または精製マウス６Ｅ１１モノクローナル抗体により阻害された、３Ｔ３／ＬＩＳＮ ｃ４細胞のＩＧＦ−Ｉ媒介増殖の阻害を示す図である。
【図２５Ｄ】精製ヒト化または精製マウス６Ｅ１１モノクローナル抗体により阻害された、３Ｔ３／ＬＩＳＮ ｃ４細胞のＩＧＦ−Ｉ媒介増殖の阻害を示す図である。
【図２５Ｅ】精製ヒト化または精製マウス６Ｅ１１モノクローナル抗体により阻害された、３Ｔ３／ＬＩＳＮ ｃ４細胞のＩＧＦ−Ｉ媒介増殖の阻害を示す図である。
【図２６】ヨウ化プロピジウム染色およびフローサイトメトリーによって定量した、精製マウスモノクローナル抗体によるＩＧＦ−Ｉ媒介細胞周期の阻害を示す図である。
【図２７】マウス６Ｅ１１モノクローナル抗体による、ＮＣＩ−Ｈ８３８細胞でのカンプトテシン誘導アポトーシスからのＩＧＦ−１媒介防御の逆転を示す図である。
【図２８】選択した抗体による、Ａ５４９細胞でのカンプトテシン誘導アポトーシスからのＩＧＦ−１媒介防御の逆転を示す図である。
【図２９】架橋抗体の存在下で、精製マウスモノクローナル抗体のアゴニスト活性が存在しないことを示す図である。
【図３０】陰性対照抗体と比較した、Ｈ０Ｌ０抗体が、分化した前脂肪細胞で基礎レベルのホスホ−ＡＫＴに及ぼす活性を示す図である。
【図３１】Ｈ０Ｌ０抗体が、Ａ５４９細胞でホスホ（phosphor）−ＡＫＴの基礎レベルに及ぼす活性を示す図である。
【図３２】ヒト化抗体が、３Ｔ３／ＬＩＳＮ ｃ４細胞で基礎ＩＧＦ−１Ｒ受容体リン酸化レベルに及ぼす活性を示す図である。
【図３３】架橋ヒト化抗体が、３Ｔ３／ＬＩＳＮ ｃ４細胞で基礎ＩＧＦ−１Ｒ受容体リン酸化レベルに及ぼす活性を示す図である。
【図３４】リガンド刺激の非存在下で、ヒト化抗体が、ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞の増殖に及ぼす活性を示す図である。
【図３５】ヌードマウスにおける、６Ｅ１１モノクローナル抗体処置後の、３Ｔ３／ＬＩＳＮ ｃ４腫瘍増殖の阻害を示す図である。
【図３６】ヌードマウスにおける、６Ｅ１１モノクローナル抗体処置後の、３Ｔ３／ＬＩＳＮ ｃ４腫瘍増殖の阻害を示す図である。
【図３７】ヌードマウスにおける、６Ｅ１１およびヒト化モノクローナル抗体処置後の、３Ｔ３／ＬＩＳＮ ｃ４腫瘍増殖の阻害を示す図である。
【図３８】ヌードマウスにおける、６Ｅ１１モノクローナル抗体処置後の、Ｃｏｌｏ２０５腫瘍増殖の阻害を示す図である。
【図３９】Ｈ０Ｌ０と共にインキュベートしたＮＣＩ−Ｈ８３８細胞を使用する、受容体結合動力学を示す図である。
【図４０】６Ｅ１１、６Ｅ１１ｃ、およびＨ０Ｌ０ ｍＩｇＧ（ＡＡ）抗体に対して、Ｃｏｌｏ−２０５細胞および組換えＮＩＨ−３Ｔ３細胞を使用するＩＧＦ−１Ｒ／ＩＲヘテロ二量体結合アッセイである。
【図４１】６Ｅ１１およびＨ０Ｌ０の存在下でのＮＣＩ−Ｈ９２９細胞の増殖を示す図である。
【図４２】血清中でのＨ０Ｌ０の安定性の測定を示す図である。
【図４３】Ｈ０Ｌ０または６Ｅ１１処置後の、ＬＩＳＮ／３Ｔ３ ｃ４細胞におけるインビボでのＩＧＲ−１Ｒの下方調節を示す図である。
【発明の詳細な説明】
【００１２】
表の簡単な説明
表１：ハイブリドーマの可変重鎖および軽鎖の配列番号。  
表２：リン酸化アッセイにおける選択した抗体のＩＣ５０値。  
表２ａ：リン酸化アッセイにおける選択した抗体のＩＣ５０値。  
表３：マウスモノクローナル抗体の動力学的データ。  
表４：ヒト化モノクローナル抗体の動力学的データ。  
表５：野生型Ｆｃおよび無効化Ｆｃのヒト化モノクローナル抗体の動力学的データ。  
表６：ヒト化モノクローナル抗体の動力学的データ。  
表７：ヒト化モノクローナル抗体の動力学的データ。  
表８：抗ＩＧＦ−１Ｒと、ヒトおよびカニクイザルのＩＧＦ−１Ｒとを対比させた動力学的データ。  
表９：２００ＲＵのＩＧＦ−１表面の阻害値。  
表１０：４０００ＲＵのＩＧＦ−１表面の阻害値。  
表１１：受容体とリガンドの結合の中和。  
表１２：腫瘍組織マイクロアレイの免疫組織化学分析のまとめ。  
表１３：ＡＫＴリン酸化アッセイでの様々な抗体の活性。  
表１４：ＡＫＴリン酸化アッセイでの様々な抗体の活性。
【００１３】
本発明は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する、例えばｈＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００１４】
本発明の一実施形態では、ｈＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合し、かつｈＩＧＦ−１Ｒの活性を中和する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、配列番号１のＣＤＲ Ｈ３、またはＣＤＲ Ｈ３中の１もしくは２個のアミノ酸残基が配列番号１のその対応する位置のアミノ酸残基と異なるその変異体を含む重鎖可変ドメインを含む、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【００１５】
本発明の一実施形態では、アミノ酸残基におけるこれらの相違は保存的置換である。
【００１６】
本発明の別の実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合し、かつ配列番号１に示される配列の変異体であるＣＤＲ Ｈ３を含み、該変異体のＣＤＲ Ｈ３中の１もしくは２個の残基が配列番号１の位置７および／または位置９の対応する位置の残基（その場合、第一残基が位置１のＷであり、最後の残基Ｖは位置１４にある）と異なる、抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【００１７】
本発明の別の実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合し、配列番号１に示される配列の変異体であるＣＤＲ Ｈ３を含み、該変異体のＣＤＲ Ｈ３中の１もしくは２個の残基が、位置７のＲをＳにする置換によって、または位置９のＫをＲにする置換によって、または位置７のＲをＳにし、位置９のＫをＲにする置換によって、配列番号１のその対応する位置の残基と異なる、抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【００１８】
本発明の別の実施形態では、さらに、以下の配列：配列番号２に示されるＣＤＲ Ｈ２、配列番号３に示されるＣＤＲ Ｈ１、配列番号４に示されるＣＤＲ Ｌ１、配列番号５に示されるＣＤＲ Ｌ２、および配列番号６に示されるＣＤＲ Ｌ３の１もしくは複数を含む抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【００１９】
本発明の一実施形態では、ＣＤＲ Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３、ならびにＣＤＲ Ｌ１およびＬ３が６Ｅ１１に由来し、ＣＤＲ Ｌ２が９Ｃ７に由来する抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【００２０】
本発明の一実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントのＣＤＲの１もしくは複数は、上記配列に示されるＣＤＲの変異体を含みうる。各変異体ＣＤＲは、上記配列中の対応する位置のアミノ酸残基と異なる１もしくは２個のアミノ酸残基を含むであろう。そのようなアミノ酸残基の置換は、例えば、一つの疎水性アミノ酸を別の疎水性アミノ酸に置換、例えば、ロイシンをバリンまたはイソロイシンに置換するような保存的置換でありうる。
【００２１】
本発明の別の実施形態では、ＣＤＲ Ｈ３を含み、さらに以下の配列：ＣＤＲ Ｈ２（配列番号２）、ＣＤＲ Ｈ１（配列番号３）、ＣＤＲ Ｌ１（配列番号４）、ＣＤＲ Ｌ２（配列番号７）、およびＣＤＲ Ｌ３（配列番号６）の１もしくは複数を含む抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【００２２】
本発明のさらに別の実施形態では、ＣＤＲ Ｈ３を含み、さらに以下の配列：ＣＤＲ Ｈ２（配列番号２）、ＣＤＲ Ｈ１（配列番号３）、ＣＤＲ Ｌ１（配列番号４）、ＣＤＲ Ｌ２（配列番号７）、およびＣＤＲ Ｌ３（配列番号６）の１もしくは複数を含む抗体またはその抗原結合フラグメントが提供され、その場合、そのＣＤＲの１もしくは複数は、各変異体ＣＤＲが１または２個のアミノ酸置換を含む変異体に置き換えられていてよい。
【００２３】
一実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１のＣＤＲ Ｈ３および配列番号３のＣＤＲ Ｈ１を含む。別の実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１のＣＤＲ Ｈ３および配列番号７のＣＤＲ Ｌ２を含む。さらに別の実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１のＣＤＲ Ｈ３、配列番号３のＣＤＲ Ｈ１、および配列番号７のＣＤＲ Ｌ２を含む。
【００２４】
本発明の別の実施形態では、本明細書に記載した本発明に係る抗体またはその抗原結合フラグメントであって、さらに以下のＣＤＲを含む抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される：
ＣＤＲ Ｈ１（配列番号３）
ＣＤＲ Ｈ２（配列番号２）
ＣＤＲ Ｈ３（配列番号１）
ＣＤＲ Ｌ１（配列番号４）
ＣＤＲ Ｌ２（配列番号７）
ＣＤＲ Ｌ３（配列番号６）。
【００２５】
本発明の別の実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合し、かつ上記配列の変異体であるＣＤＲを含む抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【００２６】
本発明の別の実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合し、かつ配列番号８の重鎖可変ドメインと配列番号９の軽鎖可変ドメイン、または配列番号１０の重鎖可変ドメインと配列番号１１の軽鎖可変ドメイン、または配列番号１２の重鎖可変ドメインと配列番号１３の軽鎖可変ドメイン、または配列番号１４の重鎖可変ドメインと配列番号１６の軽鎖可変ドメイン、または配列番号１５の重鎖可変ドメインと配列番号１６の軽鎖可変ドメインを含む、抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【００２７】
本発明の別の実施形態では、配列番号１２、配列番号１４または配列番号１５、例えば配列番号１２を含む抗体の単離された重鎖可変ドメインが提供される。
【００２８】
本発明の別の実施形態では、本明細書に記載した本発明に係るＣＤＲ、または本明細書に記載した本発明に係る重鎖もしくは軽鎖可変ドメインを含む抗体またはその抗原結合フラグメントであって、ラット、マウス、霊長類（例えばカニクイザル、旧世界ザル、もしくは類人猿）またはヒトの抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【００２９】
本発明の別の実施形態では、本明細書に記載した抗体またはその抗原結合フラグメントは、さらに霊長類ＩＧＦ−１Ｒ、例えばカニクイザル（Cynomolgus macaque）ＩＧＦ−１Ｒに結合する。
【００３０】
本発明の別の実施形態では、ヒトフレームワークの状況において、例えばヒト化またはキメラ抗体として以下のＣＤＲ：配列番号１に示されるＣＤＲ Ｈ３、配列番号２に示されるＣＤＲ Ｈ２、配列番号３に示されるＣＤＲ Ｈ１、配列番号４に示されるＣＤＲ Ｌ１、配列番号５に示されるＣＤＲ Ｌ２、および配列番号６に示されるＣＤＲ Ｌ３の１もしくは複数を含む抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【００３１】
本発明の一実施形態では、ヒト化重鎖可変ドメインは、アクセプター抗体フレームワーク内に配列番号１〜３に示されるＣＤＲを含み、該アクセプター抗体フレームワークは、配列番号５９のヒトアクセプター配列に対して、フレームワーク領域において８０％超の同一性、または８５％超、または９０％超、または９５％超、または９８％超、またはフレームワーク領域において９９％超の同一性を有する。
【００３２】
本発明の一実施形態では、ヒト化軽鎖可変ドメインは、アクセプター抗体フレームワーク内に配列番号４〜６に示されるＣＤＲを含み、該アクセプター抗体フレームワークは、配列番号６０のヒトアクセプター配列に対して、フレームワーク領域において８０％超の同一性、または８５％超、または９０％超、または９５％超、または９８％超、またはフレームワーク領域において９９％超の同一性を有する。
【００３３】
配列番号５９および配列番号６０では、そのＣＤＲ配列の位置はＸａａによって表示される。
【００３４】
本発明の一実施形態では、本明細書に記載した本発明に係るＣＤＲ、または本明細書に記載した本発明に係る重鎖もしくは軽鎖可変ドメインを含む抗体またはその抗原結合フラグメントであって、該抗体の半減期は、マウス動物モデルで少なくとも５日間、または少なくとも７日間または少なくとも９日間である、抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【００３５】
本発明の別の実施形態では、本明細書に記載した本発明に係るＣＤＲ、または本明細書に記載した本発明に係る重鎖もしくは軽鎖可変ドメインを含む抗体またはその抗原結合フラグメントであって、該抗体がさらに、任意のアイソタイプまたはサブクラスのものでありうる定常領域を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。一実施形態では、重鎖定常領域は、ＩｇＧアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはその変異体のものである。一実施形態では、抗体はＩｇＧ１である。
【００３６】
本発明の一実施形態では、本明細書に記載した本発明に係る抗体であって、該抗体のＡＤＣＣおよび／もしくは補体の活性化またはエフェクターの機能性が低減するように定常領域を含む抗体が提供される。そのような実施形態では、重鎖定常領域は、ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４アイソタイプの自然に無効化された定常領域、または変異型ＩｇＧ１定常領域を含みうる。適切な改変例は、欧州特許第０３０７４３４号に記載されている。一例として、位置２３５および２３７（ＥＵ索引番号）におけるアラニン残基の置換がある。
【００３７】
本発明の別の実施形態では、少なくともある程度のエフェクター機能を有することができ、例えば、ある程度のＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ機能を有することができる、本明細書に記載した本発明に係る抗体が提供される。本発明の一実施形態では、定常領域を含む抗体または定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントであって、ＩＧＦ−１Ｒ、例えばヒトＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合し、配列番号１のＣＤＲ Ｈ３、またはＣＤＲ Ｈ３中に１もしくは２個のアミノ酸置換を含むその変異体を含む抗体またはその抗原結合フラグメント、例えば、定常領域を含む抗体または定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントであって、ＣＤＲ Ｈ１（配列番号３）、ＣＤＲ Ｈ２（配列番号２）、ＣＤＲ Ｈ３（配列番号１）、ＣＤＲ Ｌ１（配列番号４）、ＣＤＲ Ｌ２（配列番号７）、およびＣＤＲ Ｌ３（配列番号６）から選択されるＣＤＲを含み、かつさらにＩｇＧ１野生型、ＩｇＧ２野生型、ＩｇＧ３野生型、ＩｇＧ４野生型、またはその増強された形態の定常領域を含む抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【００３８】
本発明の一実施形態では、定常領域を含む本明細書に記載した抗体または定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ−２、またはＨＥＲ−３から選択される成長因子受容体に特異的に結合する。例えば、ＨＥＲ−２またはＨＥＲ−３に特異的に結合する抗体、あるいは例えば、ＩＧＦ−１ＲまたはＥＧＲＦ、例としてヒトＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体である。
【００３９】
一実施形態では、本発明の抗体は、ＶＥＧＦもしくはＥＧＦＲに特異性を有する１もしくは複数のドメイン抗体に連結される。
【００４０】
本発明の一実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントが増強されたエフェクター機能を有するように、その重鎖定常領域中に１もしくは複数の変異を含む、本明細書に記載した本発明に係る抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。例えば、それは増強されたＡＤＣＣまたは増強されたＣＤＣを有し、あるいは、それは増強されたＡＤＣＣとＣＤＣエフェクター機能を有している。適切な改変例は、Shieldsら，J. Biol. Chem (2001) 276: 6591-6604、Lazarら，PNAS (2006) 103: 4005-4010、および米国特許第６７３７０５６号、ＷＯ２００４０６３３５１号およびＷＯ２００４０２９２０７号に記載されている。
【００４１】
本発明の一実施形態では、重鎖定常領域を含む抗体または重鎖定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントであって、ＩＧＦ−１Ｒ、例えばヒトＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１のＣＤＲ Ｈ３、またはＣＤＲ Ｈ３中の１もしくは２個のアミノ酸残基が、配列番号１のその対応する位置のアミノ酸残基と異なるその変異体を含んでよく、かつ野生型と比較して、抗体またはその抗原結合フラグメントが増強されたエフェクター機能を有するように変異した重鎖定常領域を含む。例えば、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合し、配列番号１のＣＤＲ Ｈ３を含む抗体またはその抗原結合フラグメント、例えば、ＣＤＲ Ｈ１（配列番号３）、ＣＤＲ Ｈ２（配列番号２）、ＣＤＲ Ｈ３（配列番号１）、ＣＤＲ Ｌ１（配列番号４）、ＣＤＲ Ｌ２（配列番号７）、およびＣＤＲ Ｌ３（配列番号６）から選択されるＣＤＲを含み、かつ野生型と比較して、抗体またはその抗原結合フラグメントが増強されたエフェクター機能を有するように変異した重鎖定常領域を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント。
【００４２】
本発明の一実施形態では、そのような変異は２３９、３３２、および３３０（ＩｇＧ１）から選択される位置の１もしくは複数、あるいは他のＩｇＧアイソタイプの同等位置にある。適切な変異の例としては、Ｓ２３９ＤおよびＩ３３２ＥおよびＡ３３０Ｌがある。一実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、位置２３９および３３２で、例えばＳ２３９ＤおよびＩ３３２Ｅで変異し、例えば２３９および３３２および３３０、例としてＳ２３９ＤおよびＩ３３２ＥおよびＡ３３０Ｌから選択される３またはそれ以上の位置で変異している。
【００４３】
本発明の別の実施形態では、本明細書に記載した本発明に係る重鎖定常領域を含む抗体または重鎖定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントであって、配列番号６４および配列番号６６に示される定常領域から選択される定常領域を含む抗体またはその抗原結合フラグメント、例えば、配列番号１４と配列番号１５の可変ドメインと共に、配列番号６４または配列番号６６に示される重鎖定常領域を含む抗体または抗原結合フラグメント、例えば、重鎖定常領域を含む抗体または重鎖定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントであって、配列番号１４、配列番号１５、および配列番号６４を含む抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載した本発明に係る重鎖定常領域を含む抗体または重鎖定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントであって、配列番号６４および配列番号６６に示される重鎖定常領域から選択される重鎖定常領域を含む抗体またはその抗原結合フラグメント、例えば、配列番号１４と配列番号１６の可変ドメインと共に、配列番号６４または配列番号６６に示される重鎖定常領域を含む抗体またはその抗原結合フラグメント、例えば、配列番号１４、配列番号１６、および配列番号６４を含む抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【００４４】
本発明の一実施形態では、本明細書に記載した本発明に係る重鎖定常領域を含む抗体または重鎖定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントであって、抗体またはその抗原結合フラグメントが増強されたエフェクター機能を有するように糖鎖付加プロフィールが改変された重鎖定常領域を含む抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。例えば、抗体または抗原結合フラグメントは、増強されたＡＤＣＣまたは増強されたＣＤＣを有し、あるいは増強されたＡＤＣＣとＣＤＣエフェクター機能を有する。糖鎖付加プロフィールが改変されている抗体を作製する適切な方法の例は、ＷＯ２００３０１１８７８号、ＷＯ２００６０１４６７９号および欧州特許第１２２９１２５号に記載されている。
【００４５】
本発明の一実施形態では、本明細書に記載した本発明に係る重鎖定常領域を含む抗体または重鎖定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントであって、ＩＧＦ−１Ｒ、例えばヒトＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１のＣＤＲ Ｈ３、またはＣＤＲ Ｈ３中の１もしくは２個のアミノ酸残基が配列番号１のその対応する位置のアミノ酸残基と異なるその変異体を含んでよく、かつ野生型と比較して、抗体または抗原結合フラグメントが増強されたエフェクター機能を有するように糖鎖付加プロフィールが改変されている重鎖定常領域を含む。
【００４６】
例えば、ＩＧＦ−１Ｒ、例えばヒトＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合し、配列番号１のＣＤＲ Ｈ３を含む抗体またはその抗原結合フラグメント、例えば、ＣＤＲ Ｈ１（配列番号３）、ＣＤＲ Ｈ２（配列番号２）、ＣＤＲ Ｈ３（配列番号１）、ＣＤＲ Ｌ１（配列番号４）、ＣＤＲ Ｌ２（配列番号７）、およびＣＤＲ Ｌ３（配列番号６）から選択されるＣＤＲを含み、かつ野生型と比較して、抗体または抗原結合フラグメントが増強されたエフェクター機能を有するように糖鎖付加プロフィールが改変されている重鎖定常領域を含む抗体またはその抗原結合フラグメント。
【００４７】
一実施形態では、本発明は、抗体調製物中のフコース対マンノースの比が、０．８：３以下、例えば、０．７：３以下、または０．６：３以下、または０．５：３以下、または０．４：３以下、または０．３：３以下、または０．２：３以下、または０．１：３以下である抗体調製物を提供する。一実施形態では、抗体調製物は結合フコースを全くまたは無視しうる程度でしか含まない。
【００４８】
本発明の別の実施形態では、配列番号１４と配列番号１５または配列番号１４と配列番号１６の可変ドメインを含む抗体またはその抗原結合フラグメントを含む抗体調製物であって、該抗体調製物中のフコース対マンノースの比は０．８：３以下、例えば０．７：３以下、または０．６：３以下、または０．５：３以下、または０．４：３以下、または０．３：３以下、または０．２：３以下、または０．１：３以下である、抗体調製物が提供される。一実施形態では、抗体調製物は結合フコースを全くまたは無視しうる程度でしか含まない。
【００４９】
本発明の一実施形態では、本明細書に記載した本発明に係る重鎖定常領域を含む抗体または重鎖定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントであって、抗体または抗原結合フラグメントが増強されたエフェクター機能を有するように変異した重鎖定常領域および改変されている糖鎖付加プロフィールを含む抗体またはその抗原結合フラグメント、例えば、以下の機能：増強されたＡＤＣＣのまたは増強されたＣＤＣの１もしくは複数を有する、例えば、増強されたＡＤＣＣ機能を有する、抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【００５０】
本発明の一実施形態では、本明細書に記載した免疫グロブリン重鎖定常領域を含む抗体または免疫グロブリン重鎖定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントを含む抗体調製物であって、該免疫グロブリン重鎖定常領域が、その抗体または抗原結合フラグメントにエフェクター機能を付与し、かつ該抗体または抗原結合フラグメントが、成長因子受容体に特異的に結合し、該免疫グロブリン重鎖定常領域が少なくとも２つの位置で変異され、かつ糖鎖付加プロフィールが改変されており、その結果、フコース対マンノースの比が０．８：３以下であり、その結果、前記抗体または抗原結合フラグメントが、前記変異がなく、かつ糖鎖付加プロフィールが改変されていない免疫グロブリン重鎖定常領域を有する同等の抗体または抗原結合フラグメントと比較して増強されたエフェクター機能を有する、抗体調製物が提供される。前記抗体調製物の改変された糖鎖付加プロフィールは、前記免疫グロブリン重鎖変異の結果ではない。
【００５１】
例えば、そのような抗体または抗原結合フラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒ、例えばヒトＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合し、かつ配列番号１のＣＤＲ Ｈ３を含み、例えば、抗体または抗原結合フラグメントは、ＣＤＲ Ｈ１（配列番号３）、ＣＤＲ Ｈ２（配列番号２）、ＣＤＲ Ｈ３（配列番号１）、ＣＤＲ Ｌ１（配列番号４）、ＣＤＲ Ｌ２（配列番号７）、およびＣＤＲ Ｌ３（配列番号６）から選択されるＣＤＲを含み、かつその抗体または抗原結合フラグメントが増強されたエフェクター機能を有するように、変異した重鎖定常領域を含み、改変された糖鎖付加プロフィールを有する。例えば、そのような抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号１４と配列番号１５または配列番号１４と配列番号１６の可変ドメインを含みうる。
【００５２】
そのような実施形態では、変異は、２３９、３３２および３３０（ＩｇＧ１）から選択される１もしくは複数の位置、または他のＩｇＧアイソタイプの同等位置にある。適切な変異の例は、Ｓ２３９ＤおよびＩ３３２ＥおよびＡ３３０Ｌである。一実施形態では、定常領域を含む抗体または定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントは、２３９および３３２に、例えば、Ｓ２３９ＤおよびＩ３３２Ｅに変異を有し、あるいはさらに２３９、３３２、および３３０、例えば、Ｓ２３９ＤおよびＩ３３２ＥおよびＡ３３０Ｌから選択される３またはそれ以上の位置に変異を含みうる。
【００５３】
一実施形態では、前記抗体調製物中のフコース対マンノースの比は、０．８：３以下、例えば、０．７：３以下、または０．６：３以下、または０．５：３以下、または０．４：３以下、または０．３：３以下、または０．２：３以下、または０．１：３以下である。一実施形態では、抗体調製物は、結合フコースを全くまたは無視しうる程度でしか含まない。
【００５４】
本発明の一実施形態では、本明細書に記載した本発明に係る重鎖定常領域を含む抗体または重鎖定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントであって、キメラ重鎖定常領域を含み、例えば、抗体または抗原結合フラグメントが増強されたエフェクター機能を有するようにＩｇＧ３からの少なくとも１個のＣＨ２ドメインを含み、例えば、以下の機能：増強されたＡＤＣＣまたは増強されたＣＤＣの１もしくは複数を有する、例えば、増強されたＣＤＣＣを有する、抗体または抗原結合フラグメントが提供される。例えば、抗体または抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ３からの１個のＣＨ２ドメインまたはＩｇＧ３からの両ＣＨ２ドメインを含みうる。
【００５５】
本発明の別の実施形態では、本明細書に記載した本発明に係る重鎖定常領域を含む抗体または重鎖定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントであって、変異型およびキメラ重鎖定常領域を含み、例えば、ＩｇＧ３からの少なくとも１個のＣＨ２ドメインと、ＩｇＧ１からの１個のＣＨ２ドメインとを含み、そのＩｇＧ１のＣＨ２ドメインは、２３９、３３２、および３３０から選択される位置に１もしくは複数の変異を有し、例えば、その抗体が増強されたエフェクター機能を有するようにその変異はＳ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、およびＡ３３０Ｌから選択され、例えば、以下の機能：増強されたＡＤＣＣまたは増強されたＣＤＣの１もしくは複数を有する、例えば、増強されたＡＤＣＣおよび増強されたＣＤＣＣを有する、抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。一実施形態では、ＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインは変異Ｓ２３９ＤおよびＩ３３２Ｅを有する。
【００５６】
本発明の一実施形態では、本明細書に記載した本発明に係る重鎖定常領域を含む抗体または重鎖定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントであって、重鎖定常領域がＩｇＧ３からの少なくとも１個のＣＨ２ドメインと、ＩｇＧ１からの１個のＣＨ２ドメインとを含むようにキメラ重鎖定常領域および改変された糖鎖付加プロフィールを含み、かつフコース対マンノースの比が０．８：３以下であるように糖鎖付加プロフィールが改変され、その結果、抗体または抗原結合フラグメントが増強されたエフェクター機能を有するように、前記変異および改変された糖鎖付加プロフィールを有していない免疫グロブリン重鎖定常領域を有する同等の抗体または抗原結合フラグメントと比較して、前記抗体または抗原結合フラグメントが増強されたエフェクター機能を有する、例えば、以下の機能：増強されたＡＤＣＣまたは増強されたＣＤＣの１もしくは複数を有する、例えば、増強されたＡＤＣＣおよび増強されたＣＤＣＣを有する、抗体または抗原結合フラグメントが提供される。
【００５７】
別の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、少なくとも１個のＩｇＧ３ ＣＨ２ドメインと、ＩｇＧ１から少なくとも１個の重鎖定常ドメインを有し、本明細書に記載した制限に従って、両ＩｇＧ ＣＨ２ドメインは変異されている。
【００５８】
本発明の一実施形態では、変異型およびキメラ重鎖定常領域を含む、重鎖定常領域を含む抗体または重鎖定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントを含む抗体調製物であって、抗体または抗原結合フラグメントが増強されたエフェクター機能を有するように、前記抗体調製物の糖鎖付加プロフィールは改変されており、例えば、以下の機能：増強されたＡＤＣＣまたは増強されたＣＤＣの１つもしくは複数を有する、抗体調製物が提供される。一実施形態では、変異は位置２３９および３３２および３３０から選択され、例として、変異はＳ２３９ＤおよびＩ３３２ＥおよびＡ３３０Ｌから選択される。別の実施形態では、重鎖定常領域は、ＩｇＧ３からの少なくとも１個のＣＨ２ドメインと、ＩｇＧ１からの１個のＣＨ２ドメインとを含む。一実施形態では、フコース対マンノースの比が０．８：３以下であるように、重鎖定常領域の糖鎖付加プロフィールは改変されており、その結果、前記変異がなく、かつ糖鎖付加プロフィールが改変されていない免疫グロブリン重鎖定常領域を有する同等の非キメラの抗体またはその抗原結合フラグメントと比較して、前記抗体または抗原結合フラグメントが増強されたエフェクター機能を有する。
【００５９】
本発明の一実施形態では、少なくとも１個の発現カセットを含む組換え形質転換、トランスフェクト、または形質導入した宿主細胞が提供され、例えば、発現カセットは、本明細書に記載した本発明に係る抗体またはその抗原結合フラグメントの重鎖をコードするポリヌクレオチドを含み、さらに本明細書に記載した本発明に係る抗体またはその抗原結合フラグメントの軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含み、あるいは、２個の発現カセットがあり、その第１の発現カセットは軽鎖をコードし、その第２の発現カセットは重鎖をコードする。例えば、一実施形態では、第１の発現カセットは、本明細書に記載した本発明に係る定常領域を含む抗体または定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントの重鎖をコードするポリヌクレオチドを含み、さらに本明細書に記載した本発明に係る定常領域を含む抗体または定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントの軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む第２のカセットを含み、例えば、第１の発現カセットは、配列番号４０、配列番号４１または配列番号６７、または配列番号７０から選択される重鎖をコードするポリヌクレオチドを含み、第２の発現カセットは配列番号４２または配列番号６９から選択される軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む。
【００６０】
本発明の別の実施形態では、本明細書に記載した定常領域を含む抗体または定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントの重鎖および／または軽鎖をコードする１もしくは複数の発現カセットを含むベクターを含む安定に形質転換された宿主細胞が提供される。例えば、そのような宿主細胞は、軽鎖をコードする第１のベクターおよび重鎖をコードする第２のベクターを含んでよく、例えば、第１のベクターは、配列番号３７、配列番号３８または配列番号６８から選択される重鎖をコードし、第２のベクターは軽鎖、例えば配列番号３９の軽鎖をコードする。
【００６１】
本発明の別の実施形態では、細胞が真核生物、例えば細胞が哺乳動物である、本明細書に記載した本発明に係る宿主細胞が提供される。そのような細胞系の例にはＣＨＯまたはＮＳ０が含まれる。
【００６２】
本発明の別の実施形態では、本明細書に記載した本発明に係る定常領域を含む抗体または定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントを作製する方法であって、培地において、例えば血清不含培養培地において宿主細胞を培養するステップを含む方法が提供される。
【００６３】
また、細胞系において抗体またはその抗原結合フラグメントを発現させるステップを含む、本明細書に記載した抗体を作製する方法であって、フコースと、その免疫学的機能を有する分子に結合するＮ−グリコシド結合糖鎖との結合の存在または不在を調節するように適合させた方法も提供される。
【００６４】
本発明の別の実施形態では、抗体含有血清不含培養培地に関して、抗体が少なくとも９５％以上（例えば９８％以上）にさらに精製される、本明細書に記載した本発明に係る方法が提供される。
【００６５】
本発明の別の実施形態では、本明細書に記載した本発明に係る定常領域を含む抗体または定常領域に連結されたその抗原結合フラグメント、および製薬上許容される担体を含む医薬組成物が提供される。
【００６６】
本発明の別の実施形態では、本明細書に記載した本発明に係る組成物と共に、使用説明書を含む部材キットが提供される。
【００６７】
本発明の別の実施形態では、関節リウマチに罹患しているヒト患者の治療方法であって、本明細書に記載した本発明に係る定常領域を含む抗体または定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントの治療有効量を投与するステップを含む方法が提供される。定常領域を含む抗体または定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントは、製薬上許容される担体と組み合わせることができる。
【００６８】
本発明の別の実施形態では、癌に罹患しているヒト患者の治療方法であって、本明細書に記載した本発明に係る定常領域を含む抗体または定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントの治療有効量を投与するステップを含む方法が提供される。定常領域を含む抗体または定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントは、製薬上許容される担体と組み合わせることができる。
【００６９】
本発明の別の実施形態では、糖尿病性網膜症に罹患しているヒト患者の治療方法であって、本明細書に記載した本発明に係る定常領域を含む抗体または定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントの治療有効量を投与するステップを含む方法が提供される。定常領域を含む抗体または定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントは、製薬上許容される担体と組み合わせることができる。
【００７０】
本発明の別の実施形態では、黄斑変性症に罹患しているヒト患者の治療方法であって、本明細書に記載した本発明に係る定常領域を含む抗体または定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントの治療有効量を投与するステップを含む方法が提供される。定常領域を含む抗体または定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントは、製薬上許容される担体と組み合わせることができる。
【００７１】
本発明の別の実施形態では、癌に罹患しているヒト患者の治療方法であって、本明細書に記載した本発明に係る定常領域を含む抗体または定常領域に連結されたその抗原結合フラグメント、および製薬上許容される担体を含む医薬組成物の治療有効量を投与するステップを含む方法が提供される。
【００７２】
本発明の別の実施形態では、新血管新生疾患、例えば、増殖性糖尿病性網膜症、血管新生緑内障および加齢黄斑変性（ＡＭＤ）からなる群から選択される疾患もしくは障害、また以下からなる群から選択される疾患もしくは障害を治療するための医薬の製造における、本明細書に記載した本発明に係る定常領域を含む抗体または定常領域に連結されたその抗原結合フラグメントの使用が提供される：関節リウマチ、乾癬、または癌、例えば急性リンパ芽球性白血病、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連癌、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門癌、小児小脳星細胞腫、小児大脳星細胞腫、直腸結腸癌、基底細胞癌、肝外胆管癌、膀胱癌、骨肉腫／悪性線維性組織球腫骨癌、脳腫瘍（例えば、脳幹部神経膠腫、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫／悪性神経膠腫、上衣細胞腫、髄芽細胞腫、テント上未分化神経外胚葉性腫瘍、視覚路および視床下部神経膠腫）、乳癌、気管支腺腫／カルチノイド、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、胃腸カルチノイド腫瘍、原発不明癌、原発性中枢神経系、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫／悪性神経膠腫、子宮頚癌、小児癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、大腸癌、直腸結腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、子宮内膜癌、上衣細胞腫、食道癌、ユーイングファミリー肉腫、頭蓋外胚細胞性腫瘍、性腺外胚細胞性腫瘍、肝外胆管癌、眼内黒色腫眼癌、網膜芽細胞腫眼癌、胆嚢癌、胃（Gastric）（胃（Stomach））癌、胃腸カルチノイド腫瘍、胚細胞性腫瘍（例えば、頭蓋外、性腺外、および卵巣）、妊娠性栄養膜腫瘍、神経膠腫（例えば、成人、小児脳幹、小児大脳星細胞腫、小児視覚路、および視床下部）、有毛細胞白血病、頭頚部癌、肝細胞性（肝臓）癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、視床下部および視覚路神経膠腫、眼内黒色腫、膵島細胞癌（膵内分泌部）、カポジ肉腫、腎臓（腎細胞）癌、喉頭癌、白血病（例えば、急性リンパ芽球性、急性骨髄性、慢性リンパ球性、慢性骨髄性、および有毛細胞）、唇および口腔癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、リンパ腫（例えば、ＡＩＤＳ関連、バーキット、皮膚Ｔ細胞、ホジキン、非ホジキン、および原発性中枢神経系）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、骨悪性線維性組織球腫／骨肉腫、髄芽細胞腫、黒色腫、眼内（眼）黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、原発不明の転移性扁平上皮頚部癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、慢性骨髄増殖性疾患、鼻腔および副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、口腔癌、口咽頭癌、骨肉腫／骨悪性線維性組織球腫、卵巣癌、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞性腫瘍、卵巣低悪性潜在的腫瘍、膵癌、膵島細胞膵癌、副鼻腔および鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、クロム親和細胞腫、松果体芽腫、下垂体腫瘍、形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞（腎臓）癌、腎盂および輸尿管移行性細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、軟部組織肉腫、子宮肉腫、セザリー症候群、非黒色腫皮膚癌、メルケル細胞皮膚癌腫、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、胸腺腫、胸���癌、甲状腺癌、妊娠性栄養膜腫瘍、原発部位不明癌腫、原発部位不明癌、尿道癌、子宮内膜子宮癌、子宮肉腫、膣癌、視覚路および視床下部神経膠腫、外陰部癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、およびウィルムス腫瘍。
【００７３】
本発明の別の実施形態では、患者が、増殖性糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、血管新生緑内障、関節リウマチ、乾癬、直腸結腸癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、または骨髄腫の１もしくは複数に罹患している、本明細書に記載した本発明に係る方法が提供される。
【００７４】
定義
用語「抗体」は、本明細書において広い意味で使用され、具体的には、所望の生物学的活性を示すものであれば、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体など）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、および抗体フラグメントを包含する。これらについては以下により詳細に説明する。
【００７５】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団、すなわち該集団に含まれる個々の抗体は、わずかな程度で存在する可能性のある天然変異を除いて同一である、集団から得られる抗体を指す。モノクローナル抗体は、単一の抗原結合部位に対して高度に特異的である。さらに、典型的に種々の決定基（エピトープ）に対する種々の抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体はそれぞれ抗原上の単一の決定基に対するものである。
【００７６】
ポリヌクレオチドおよびポリペプチドに関して、「同一性」は、場合に応じて以下の（１）および（２）に示されるアルゴリズムを用いて計算される比較を意味する：
（１）ポリヌクレオチドの同一性は、所定の配列におけるヌクレオチドの総数に、１００で除した％同一性を規定する整数を乗じ、続いて、その配列におけるヌクレオチド総数からその解を減ずることによって計算される。すなわち、
ｎｎ≦ｘｎ−（ｘｎ・ｙ）
〔式中、ｎｎはヌクレオチド変化の数であり、ｘｎは所定の配列におけるヌクレオチドの総数であり、ｙは、９５％については０．９５、９７％については０．９７または１００％については１．００であり、・は乗算演算子の記号であり、ｘｎおよびｙの整数ではない解は、ｘｎから減ずる前に最も近い整数に切り捨てる〕。ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の変化は、このコード配列においてナンセンス、ミスセンスまたはフレームシフト変異をもたらす可能性があり、それによりその変化後のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが変化する。
【００７７】
（２）ポリペプチドの同一性は、アミノ酸の総数に、１００で除した％同一性を規定する整数を乗じ、続いて、そのアミノ酸総数からその解を減ずることによって計算される。すなわち、
ｎａ≦ｘａ−（ｘａ・ｙ）
〔式中、ｎａはアミノ酸変化の数であり、ｘａは配列におけるアミノ酸の総数であり、ｙは、９５％については０．９５、９７％については０．９７または１００％については１．００であり、・は乗算演算子の記号であり、ｘａおよびｙの整数ではない解は、ｘａから減ずる前に最も近い整数に切り捨てる〕。
【００７８】
本明細書で使用される用語「変異体（複数可）」は、それぞれ基準ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるが、本質的な性質を保持しているポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。ポリヌクレオチドの典型的な変異体は、別の基準ポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列が相違している。その変異体のヌクレオチド配列の変化は、基準ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を改変するものであってもよいし、またはしないものであってもよい。ヌクレオチドの変化は、以下で説明するように、基準配列によってコードされるポリペプチドにおけるアミノ酸置換、付加、欠失、融合タンパク質および末端切断をもたらしうる。ポリペプチドの典型的な変異体は、別の基準ポリペプチドとはアミノ酸配列が相違している。一般的に、相違は、基準ポリペプチドと変異体の配列が全体にわたって非常に類似しており、多くの領域において同一であるように制限される。変異体および基準ポリペプチドは、アミノ酸配列において１もしくは複数の置換、付加、欠失の任意の組み合わせで相違することができる。置換または挿入されたアミノ酸残基は、遺伝暗号によってコードされるものであってもよいし、またはそうではなくてもよい。当業者には当然のことであるが、ある種のアミノ酸置換は、「保存的」であると見なされる。アミノ酸は、共通する側鎖の性質に基づいてグループに分けられており、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントの結合親和性をすべて維持する、または実質的にすべて維持する、グループ内の置換は保存的置換と見なされる。以下の表を参照されたい。
【００７９】
側鎖                      メンバー
疎水性                    Met, Ala, Val, Leu, Ile
中性親水性                Cys, Ser, Thr
酸性                      Asp, Glu
塩基性                    Asn, Gln, His, Lys, Arg
鎖の配向に影響する残基    Gly, Pro
芳香族                    Trp, Tyr, Phe
【００８０】
本発明のいくつかの態様において、いくつかの、例えば５〜１０個、１〜５個、１〜３個、１〜２個のアミノ酸残基、または１個のアミノ酸残基が、任意の組み合わせで置換、欠失または付加された変異体が含まれる。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異体は、対立遺伝子変異体などの天然のものであってもよいし、または天然に存在することが知られていない変異体であってもよい。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの非天然変異体は、突然変異誘発法により、直接合成により、および当技術分野で公知の他の組換え法によって作製することができる。
【００８１】
「単離された」とは、その天然状態から「人の手によって」改変されている、その元の環境から変化もしくは取り出されている、またはその両方を意味する。例えば、生存生物に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離された」ものではないが、その天然状態の共存物質から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離された」ものである。例えば限定されるものではないが、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが分離されたのと同じ種または型の細胞であっても、そのポリヌクレオチドまたはポリペプチドを細胞に導入し戻すような場合がある。
【００８２】
本明細書および添付の特許請求の範囲において、用語「含んでいる」および「含む」は、「からなっている」および「からなる」を包含する。すなわち、これらの単語は、その状況が許す場合には、具体的に記載していない他の要素または数字の可能な包含を指していることを意図している。
【００８３】
本明細書で使用される用語「糖鎖付加プロフィール」とは、抗体集団における糖鎖付加のレベルを指す。
【００８４】
本発明の抗体およびその抗原結合フラグメントに関連して、本明細書を通じて使用される「特異的に結合する」という用語は、抗体がヒトＩＧＦ−１Ｒ（ｈＩＧＦ−１Ｒ）とは結合するが、他のヒトタンパク質とは、結合しないまたは有意な結合はしないことを意味する。しかしながら、この用語は、本発明の抗体が他の形態のＩＧＦ−１Ｒ、例えば霊長類ＩＧＦ−１Ｒとも交差反応する可能性があることを排除するものではない。
【００８５】
本発明の抗体およびその抗原結合フラグメントに関連して、本明細書を通じて使用される「中和する」という用語は、本発明の抗体およびその抗原結合フラグメントの存在下で、ＩＧＦ−１Ｒの生物活性が、そうした抗体およびその抗原結合フラグメントの非存在下でのＩＧＦ−１Ｒ活性と比べて低下することを意味する。中和は、限定されるものではないが、リガンド結合のブロッキング、リガンドの受容体活性化の阻止、ＩＧＦ−１Ｒの下方調節、またはエフェクター機能への影響の１以上に起因しうる。中和のレベルは、いくつかの方法で、たとえば、以下の実施例に記載のアッセイを用いて、たとえば、例として実施例２３に記載のように実施することができるＬＩＳＮ細胞増殖アッセイで、測定することができる。このアッセイにおいてＩＧＦ−１Ｒの中和は、中和抗体の存在下での腫瘍細胞増殖の減少を評価することによって測定される。
【００８６】
中和のレベルはまた、たとえば、例として実施例１３に記載のように実施することができる受容体リン酸化アッセイで、測定することができる。このアッセイにおいてＩＧＦ−１Ｒの中和は、中和抗体の存在下での受容体リン酸化の阻害を評価することによって測定される。
【００８７】
抗体またはその抗原結合フラグメントが中和能力を有する場合、このことは、ヒトＩＧＦ−１Ｒ結合タンパク質（例えばｈＩＧＦ−ＩまたはｈＩＧＦ−ＩＩ）とその受容体の間の相互作用の阻害を示す。ヒトＩＧＦ−１Ｒに対する中和活性を有するとみなされる抗体は、実施例２３および実施例１３にそれぞれ記載されるＬＩＳＮ細胞増殖アッセイまたは受容体リン酸化アッセイにおいて１０μｇ／ｍｌ未満、もしくは５μｇ／ｍｌ未満、もしくは２μｇ／ｍｌ未満、もしくは１μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０を有すると思われる。
【００８８】
本発明のもう１つの態様において、本明細書で例示される抗体、たとえば、実施例２３および実施例１３にそれぞれ記載されるＬＩＳＮ細胞増殖アッセイまたは受容体リン酸化アッセイにおいてＨ０Ｌ０およびＨ０Ｌ０ ＩｇＧ１ｍ（ＡＡ）、ならびにＨ１Ｌ０およびＨ１０Ｌ０ ＩｇＧ１ｍ（ＡＡ）の中和活性を保持する抗体と同等の中和活性を有する、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００８９】
本明細書を通じて、抗体配列中のアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔの方式にしたがって番号が付けられている。同様に、「ＣＤＲ」、「ＣＤＲ Ｌ１」、「ＣＤＲ Ｌ２」、「ＣＤＲ Ｌ３」、「ＣＤＲ Ｈ１」、「ＣＤＲ Ｈ２」、「ＣＤＲ Ｈ３」という用語は、Kabat et al; Sequences of proteins of Immunological Interest NIH, 1987に記載のＫａｂａｔの番号付け方式に従う。当業者には明らかであるが、ＣＤＲ配列の別の定義、例えばChothia et al. (1989)に記載されているような定義がある。
【００９０】
当業者には明らかであるが、「由来する」という用語は、それが物質の物理的起源であるという意味で、起源を明らかにするのみならず、その物質と（一次アミノ酸配列に関して）構造的に同一であるがその基準起源から生じたのではない物質も明示することを意図するものである。したがって、「ＣＤＲ Ｈ３の由来するドナー抗体に存在する残基」は、必ずしもドナー抗体から精製されたものである必要はない。
【００９１】
本明細書を通じて本発明の抗体およびその抗原結合フラグメントに関して使用される用語「安定性」とは、直接結合ＥＬＩＳＡにより測定した場合の抗体または抗原結合フラグメントの活性が、ＥＣ−５０の開始時の値と、−２０℃、４℃または３７℃での血清中インキュベーションの１２日後に同等であることを意味する。
【００９２】
「キメラ抗体」とは、ドナー抗体由来の天然の可変ドメイン（軽鎖および重鎖）と、それと結合した、アクセプター抗体由来の軽鎖および重鎖定常領域とを含む、ある種の操作された抗体を指す。
【００９３】
「ヒト化抗体」とは、非ヒトドナー免疫グロブリンに由来するＣＤＲを有し、分子の残りの免疫グロブリン由来部分は１種（もしくは複数）のヒト免疫グロブリンに由来する、ある種の操作された抗体を指す。さらに、フレームワークサポート残基を改変して結合親和性を保存することができる（例えば、Queen et al., Proc. Natl Acad Sci USA, 86:10029-10032 (1989)；Hodgson et al., Bio/Technology, 9:421 (1991)を参照されたい）。好適なヒトアクセプター抗体は、慣用のデータベース、例えばＫＡＢＡＴ（登録商標）データベース、Ｌｏｓ ＡｌａｍｏｓデータベースおよびＳｗｉｓｓ Ｐｒｏｔｅｉｎデータベースから、ドナー抗体のヌクレオチドおよびアミノ酸配列との相同性によって選択されたものとすることができる。ドナー抗体のフレームワーク領域との（アミノ酸基準での）相同性を特徴とするヒト抗体は、ドナーＣＤＲの挿入のための重鎖定常領域および／または重鎖可変フレームワーク領域を提供するために好適である。軽鎖定常または可変フレームワーク領域を提供することができる好適なアクセプター抗体も同様にして選択することができる。アクセプター抗体の重鎖および軽鎖は、同じアクセプター抗体を起源とする必要がないことに留意されたい。先行技術は、そのようなヒト化抗体を作製するためのいくつかの方法を記載している。例えばＥＰ−Ａ−０２３９４００およびＥＰ−Ａ−０５４９５１を参照されたい。
【００９４】
用語「ドナー抗体」とは、改変された免疫グロブリンコード領域を得、ドナー抗体に特徴的な抗原特異性および中和活性を有する改変された抗体の発現が生じるように、第１の免疫グロブリンパートナーに、その可変ドメイン、ＣＤＲ、またはその機能的フラグメントもしくは類似体のアミノ酸配列を提供する抗体（モノクローナルおよび／または組換え）を指す。
【００９５】
用語「アクセプター抗体」とは、第１の免疫グロブリンパートナーに、その重鎖および／または軽鎖フレームワーク領域、ならびに／あるいはその重鎖および／または軽鎖定常領域をコードするアミノ酸配列のすべて（または任意の部分であるが、好ましくはすべて）を提供する、ドナー抗体とは異種の抗体（モノクローナルおよび／または組換え）を指す。ヒト抗体はアクセプター抗体である。
【００９６】
「ＣＤＲ」は、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の超可変ドメインである抗体の相補性決定領域アミノ酸配列と定義されている。例えば、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第4版、U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)を参照されたい。免疫グロブリンの可変部分には、３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわちＣＤＲ領域）がある。したがって、本明細書で使用される「ＣＤＲ］とは、３つの重鎖ＣＤＲのすべて、または３つの軽鎖ＣＤＲのすべて（あるいは必要に応じて、すべての重鎖ＣＤＲおよびすべての軽鎖ＣＤＲ）を指す。抗体の構造およびタンパク質折りたたみは、他の残基が抗原結合領域と考えられる部分であることを意味し、これは当業者によってそのように理解されている。例えばChothia et al., (1989) Conformations of immunoglobulin hypervariable domains; Nature 342, p877-883を参照されたい。
【００９７】
ＣＤＲは、抗原またはエピトープへの抗体の結合のための接触残基の大部分を提供する。本発明の対象のＣＤＲは、ドナー抗体可変重鎖および軽鎖配列に由来するものであり、天然ＣＤＲの類似体を含むが、この類似体もまたそれが由来するドナー抗体と同じ抗原結合特異性および／または中和能力を有するまたは保持する。
【００９８】
用語「ＶＨ」および「ＶＬ」は、それぞれ抗体の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを指すために本明細書において用いられる。
【００９９】
本明細書で使用される用語「エフェクター機能」は、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ）が媒介する応答、Ｆｃが媒介する食作用、およびＦｃＲｎ受容体による抗体の再生利用の１もしくは複数を指すことを意味している。抗体の定常領域と種々のＦｃ受容体（ＦｃＲ）との相互作用は、抗体のエフェクター機能を媒介すると考えられている。有意な生物学的効果は、エフェクター機能、特に抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）、補体の固化（補体依存性細胞傷害活性、すなわちＣＤＣ）、食作用（抗体依存性細胞媒介食作用、すなわちＡＤＣＰ）、および抗体の半減期／クリアランスの結果である可能性がある。通常、エフェクター機能媒介能には抗原への抗体の結合が必要であり、全ての抗体がそれぞれのエフェクター機能を媒介するものではない。
【０１００】
エフェクター機能は、いくつかの方法で測定することができ、例えばナチュラルキラー細胞へのＦｃγＲＩＩＩの結合によって、または単球／マクロファージへのＦｃγＲＩの結合によって、ＡＤＣＣエフェクター機能について測定する。例えば、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、ナチュラルキラー細胞アッセイにおいて同等の野生型抗体またはその抗原結合フラグメントに対して測定した場合より増大したＡＤＣＣエフェクター機能を有する。そのようなアッセイの例は、Shields et al, 2001 The Journal of Biological Chemistry, Vol. 276, p6591-6604；Chappel et al, 1993 The Journal of Biological Chemistry, Vol 268, p25124-25131；Lazar et al, 2006 PNAS, 103; 4005-4010に見出すことができる。
【０１０１】
ＣＤＣ機能を測定するためのアッセイの例としては、1995 J Imm Meth 184:29-38に記載されているものが挙げられる。
【０１０２】
抗体の重鎖定常領域への様々な改変（修飾）が、所望のエフェクター性質に応じて行われている。ａ）古典的経路による補体の活性化、およびｂ）抗体依存性細胞傷害活性の媒介、という機能を本質的に欠損するヒト定常領域には、ＩｇＧ４定常領域およびＩｇＧ２定常領域がある。特定の変異を含有するＩｇＧ１定常領域は、Ｆｃ受容体への結合を低減し、それゆえＡＤＣＣおよびＣＤＣを低下させることが別々に記載されている（Duncan et al. Nature 1988, 332; 563-564；Lund et al. J. Immunol. 1991, 147; 2657-2662；Chappel et al. PNAS 1991, 88; 9036-9040；Burton and Woof, Adv. Immunol. 1992, 51;1-84；Morgan et al., Immunology 1995, 86; 319-324；Hezareh et al., J. Virol. 2001, 75 (24); 12161-12168）。残基Ａｓｎ２９７に特定の変異または改変された糖鎖付加を含有するヒトＩｇＧ１定常領域もまた、Ｆｃ受容体への結合を増強すると記載されている。これらはまた、いくつかの事例においてＡＤＣＣおよびＣＤＣを増強することが示されている（Lazar et al. PNAS 2006, 103; 4005-4010；Shields et al. J Biol Chem 2001, 276; 6591-6604；Nechansky et al. Mol Immunol, 2007, 44; 1815-1817）。
【０１０３】
ＩｇＧ抗体に関して、ＡＤＣＣおよびＡＤＣＰなどのエフェクター機能は、重鎖定常領域と、免疫細胞の表面上に存在するＦｃγ受容体ファミリーとの相互作用によって媒介される。ヒトにおいては、これらには、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）が含まれる。抗原に結合した抗体と、Ｆｃ／Ｆｃγ複合体の形成との相互作用によって、ある範囲の効果、例えば細胞傷害活性、免疫細胞活性化、食作用、炎症性サイトカインの放出が誘導される。定常領域における特定の置換（Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅを含む）は、ある種のＦｃ受容体に対する重鎖定常領域の親和性を増大させ、それゆえ抗体のエフェクター機能を増強することが知られている（Lazar et al. PNAS 2006）。
【０１０４】
１．抗体の構造
１．１  インタクトな抗体
インタクトな抗体としては、少なくとも２つの重鎖および２つの軽鎖を含むヘテロ多量体糖タンパク質がある。ＩｇＭを除いて、インタクトな抗体は通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖、および２つの同一の重（Ｈ）鎖から構成される、約１５０ｋＤａのヘテロ四量体糖タンパク質である。典型的には、それぞれの軽鎖は、１つのジスルフィド共有結合によって重鎖に連結されているが、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間のジスルフィド結合の数はさまざまである。それぞれの重鎖および軽鎖は、鎖内ジスルフィド橋も有している。それぞれの重鎖は、一端に１つの可変ドメイン（ＶＨ）を有し、続いていくつかの定常領域がある（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）。それぞれの軽鎖は１つの可変領域（Ｌ）およびその他端に１つの定常領域を有する；軽鎖の重鎖定常領域は重鎖の最初の定常領域と並んでおり、軽鎖可変ドメインは重鎖可変ドメインと並んでいる。ほとんどの脊椎動物種由来の抗体の軽鎖は、定常領域のアミノ酸配列に基づいて、κおよびλと呼ばれる２タイプのうち１つに帰属することができる。それらの重鎖の重鎖定常領域のアミノ酸配列に応じて、ヒト抗体は５つの異なるクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭに帰属することができる。ＩｇＧおよびＩｇＡは、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４；ならびにＩｇＡ１およびＩｇＡ２に、さらに細かく分類することができる。動物種による変異体が存在し、マウスおよびラットは、少なくともＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂを有する。抗体の可変ドメインは、抗体に結合特異性を付与し、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる特別な可変性を示す特定の領域を有する。可変ドメインのうち比較的保存される部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。インタクトな重鎖および軽鎖のそれぞれの可変領域は、３つのＣＤＲによって結合された４つのＦＲを含む。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域によってきわめて近接してまとまった状態で保持され、他方の鎖のＣＤＲとともに、抗体の抗原結合部位の形成をもたらす。定常領域は、直接的には、抗体の抗原との結合に関与しないが、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）への関与、Ｆｃγ受容体への結合を介した食作用への関与、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）による半減期／クリアランス速度への関与、ならびに補体カスケードのＣ１ｑ成分を介した補体依存性細胞傷害への関与といった、さまざまなエフェクター機能を示す。
【０１０５】
１．１．２  ヒト抗体
ヒト抗体は、当業者に知られているいくつかの方法によって作製することができる。ヒト抗体は、ヒト骨髄腫もしくはマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞系を用いて、ハイブリドーマ法によって作製することができる。Kozbor、 J.Immunol 133, 3001, (1984)、およびBrodeur, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 51-63ページ (Marcel Dekker Inc, 1987)を参照されたい。別法としては、ファージライブラリもしくはトランスジェニックマウスの使用が挙げられるが、これらはいずれもヒト可変ドメインレパートリーを利用する（Winter G, (1994), Annu.Rev.Immunol 12,433-455, Green LL (1999), J.Immunol.methods 231, 11-23を参照されたい）。
【０１０６】
マウスの免疫グロブリン遺伝子座がヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントで置き換えられた、いくつかのトランスジェニックマウス系統が現在利用可能である（Tomizuka K, (2000) PNAS 97,722-727; Fishwild D.M (1996) Nature Biotechnol. 14,845-851, Mendez MJ, 1997, Nature Genetics, 15,146-156を参照されたい）。抗原によるチャレンジ後に、上記のマウスはヒト抗体のレパートリー（そこから目的の抗体を選択することができる）を産生することができる。特に注目すべきは、放射線照射したマウスにヒトリンパ球を移植するＴｒｉｍｅｒａＴＭ系（Eren Rら、(1998) Immunology 93:154-161を参照されたい）、ヒト（もしくは他種）のリンパ球に、大量プールｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗体産生手順を効果的に受けさせた後、デコンボリュート、限界希釈および選択手順を行うSelected Lymphocyte Antibody System（SLAM、Babcookら、PNAS (1996) 93:7843-7848を参照されたい）、ならびにＸｅｎｏｍｏｕｓｅＩＩＴＭ（Abgenix Inc）である。別の手法は、Morphotek Ink.から入手可能であるＭｏｒｐｈｏｄｏｍａＴＭ技術を用いる。
【０１０７】
ファージディスプレイ技術を用いて、ヒト抗体（およびそのフラグメント）を作製することができる。McCafferty、Nature, 348, 552-553 (1990) およびGriffiths ADら、 (1994) EMBO 13:3245-3260を参照されたい。この技術によって、抗体可変ドメイン遺伝子は、Ｍ１３もしくはｆｄといった繊維状バクテリオファージの主要なもしくはマイナーなコートタンパク質遺伝子内にインフレームでクローニングされ、ファージ粒子の表面にその機能的抗原結合フラグメントとしてディスプレイされる（通常、ヘルパーファージの助けを要する）。抗体の機能上の特性に基づく選択の結果、そうした特性を示す抗体をコードする遺伝子が選択される。ファージディスプレイ法を用いて、疾患もしくは障害に罹患した個体、または免疫化されていないヒトドナーから採取された、ヒトＢ細胞より作製されたライブラリから、抗原特異的抗体を選択することができる（Marks; J.Mol.Bio. 222,581-597, 1991を参照されたい）。定常ドメインを含むインタクトなヒト抗体が求められる場合には、望ましい定常領域を含む哺乳動物発現ベクター中に、ファージディスプレイに由来するフラグメントを再クローニングして、安定した発現細胞株を確立する必要がある。
【０１０８】
親和性成熟（Marks; Bio/technol 10,779-783 (1992)）の技術を用いて、結合親和性を向上させることができるが、この場合、Ｈ鎖およびＬ鎖可変ドメインを天然に存在する変異体で順次置き換えて、結合親和性の向上に基づいて選択することによって、ヒト一次抗体の親和性は向上する。「エピトープインプリンティング」といった上記技法の変法も、現在では利用することができる。ＷＯ９３／０６２１３号を参照されたい。また、Waterhouse; Nucl.Acids Res 21, 2265-2266 (1993)も参照されたい。
【０１０９】
１．２  キメラおよびヒト化抗体
インタクトな非ヒト抗体をヒトの疾患もしくは障害の治療に使用することは、現在十分に立証されている免疫原性の問題を引き起こす可能性を伴い、すなわち、患者の免疫系はインタクトな非ヒト抗体を非自己と認識して、中和応答を開始する可能性がある。これは、ヒト患者への非ヒト抗体の複数回投与で特にはっきりと認められる。こうした問題を克服するために、長年にわたってさまざまな技法が開発されてきたが、こうした技法は、一般に、免疫した動物、たとえばマウス、ラットもしくはウサギから非ヒト抗体を得ることの相対的な容易さを維持する一方で、インタクトな抗体における非ヒトアミノ酸配列の構成割合を減らすことを必要とする。概して、これを達成するために２つの手法が用いられてきた。第１はキメラ抗体であって、これは一般に、ヒト定常領域に融合された非ヒト（たとえば、マウスなどの齧歯類）可変ドメインを含む。抗体の抗原結合部位は可変ドメイン内に局在するので、キメラ抗体は、抗原に対するその結合親和性を維持するが、ヒト定常領域のエフェクター機能を獲得しているため、上記のようなエフェクター機能を果たすことができる。キメラ抗体は、典型的には、組換えＤＮＡ法を用いて作製される。従来の方法を用いて（たとえば、本発明の抗体のＨおよびＬ鎖をコードする遺伝子と特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、抗体をコードするＤＮＡ（たとえばｃＤＮＡ）を単離し、配列を決定する。ハイブリドーマ細胞は、こうしたＤＮＡの典型的な供給源となる。単離後、ＤＮＡを発現ベクターに入れ、その発現ベクターを次に、本来免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞もしくは骨髄腫細胞といった宿主細胞にトランスフェクトして、抗体を合成させる。ＤＮＡは、ヒトＬおよびＨ鎖のコード配列に、対応する非ヒト（たとえばマウス）ＨおよびＬ定常領域を置き換えることによって、改変することができる。たとえば、Morrison; PNAS 81, 6851 (1984)を参照されたい。
【０１１０】
第２の手法は、可変ドメインをヒト化することによって抗体の非ヒト含量を減少させる、ヒト化抗体の作製に関する。ヒト化について２つの技術が広く支持されている。第１は、ＣＤＲグラフティング（移植）によるヒト化である。ＣＤＲは抗体のＮ末端近くにループを作り、そこで、フレームワーク領域によってもたらされるスキャフォールドに嵌め込まれた表面を形成する。抗体の抗原結合特異性は、主として、その抗体のＣＤＲ表面のトポグラフィーおよび化学的性質によって決まる。次いで、これらの特徴は、個別のＣＤＲのコンフォメーションによって、ＣＤＲの相対的配置によって、ならびにＣＤＲを構成する残基の側鎖の性質および配置によって決定される。免疫原性の大幅な低下は、非ヒト（たとえばマウス）抗体（「ドナー」抗体）のＣＤＲのみを、ヒトのフレームワーク（「アクセプターフレームワーク」）および定常領域上に移植（グラフティング）することによって達成することができる（Jonesら、 (1986) Nature 321,522-525、ならびにVerhoeyen Mら、(1988) Science 239, 1534-1536を参照されたい）。しかしながら、ＣＤＲ移植は本質的に、抗原結合特性の完全な保持をもたらさない可能性があり、有意な抗原結合親和性を回復させようとする場合には、ドナー抗体のフレームワーク残基（「復帰突然変異」と呼ばれることもある）の一部をヒト化分子内に保存する必要があることが、多くの場合、明らかになっている（Queen C ら、(1989) PNAS 86, 10,029-10,033, Co, Mら、(1991) Nature 351, 501-502を参照されたい）。この場合、ヒトフレームワーク（ＦＲ）を用意するために、非ヒトドナー抗体に対して最大の配列相同性を示すヒト可変ドメインをデータベースから選択する。ヒトＦＲは、ヒトコンセンサスもしくは個別のヒト抗体のどちらからも選択することができる。必要ならば、ドナー抗体由来の重要残基を、ヒトアクセプターフレームワーク内に置換して入れて、ＣＤＲコンフォメーションを保存する。抗体のコンピューターモデリングを用いることができるが、それは、このような構造的に重要な残基を同定するのに役立つ。ＷＯ９９／４８５２３号を参照されたい。
【０１１１】
別法として、ヒト化は、「ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ」のプロセスによって行うことができる。特異なヒトおよびマウス免疫グロブリンの重鎖および軽鎖可変ドメインの統計分析によって、露出した残基の正確なパターンがヒトとマウスの抗体で異なること、ならびにほとんどの個々の表面位置は、少数の異なる残基を強く優先して選ぶことが明らかになった（Padlan E.A.ら、(1991) Mol.Immunol.28, 489-498、およびPedersen J.T.ら、(1994) J.Mol.Biol. 235; 959-973を参照されたい）。したがって、そのフレームワーク領域内の、ヒト抗体に通常存在するものとは異なる、露出した残基を取り替えることによって、非ヒトＦｖの免疫原性を低下させることができる。タンパク質の抗原性は、表面への接近可能性と相関しうるので、表面残基を置き換えることは、マウス可変ドメインをヒトの免疫系に「見えない」ようにするのに十分であると考えられる（Mark G.E.ら、(1994)、実験薬理学ハンドブック（Handbook of Experimental Pharmacology）第113号より：モノクローナル抗体の薬理学（The pharmacology of monoclonal Antibodies）、Springer-Verlag、105-134ページも参照されたい）。こうしたヒト化の手順は、抗体の表面だけを変更し、支持する残基はそのままになっているので、「ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ」と呼ばれる。
【０１１２】
１．３  二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。こうした抗体を作製する方法は当技術分野で知られている。従来、二重特異性抗体の組換え生産は、２つの免疫グロブリンＨ鎖−Ｌ鎖対の同時発現を基本とし、その２つのＨ鎖が異なる結合特異性を有する。Millsteinら、Nature 305 537-539 (1983)、ＷＯ９３／０８８２９号およびTrauneckerら、EMBO, 10, 1991, 3655-3659を参照されたい。Ｈ鎖とＬ鎖のランダムな組み合わせのため、１０種の異なる抗体構造の混合物が生じる可能性があり、そのうち１つだけが求める結合特異性を有するものである。別の手法は、ヒンジ領域の少なくとも一部、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含む重鎖定常領域に、望ましい結合特異性を有する可変ドメインを融合することを行う。一実施形態において、軽鎖との結合に必要な部位を含有するＣＨ１領域は、融合物の少なくとも１つに存在する。これらの融合物、および、必要ならば、Ｌ鎖をコードするＤＮＡを、別々の発現ベクターに挿入した後、適当な宿主生物に共トランスフェクトする。２つの鎖、もしくは３つすべての鎖のコード配列を１つの発現ベクターに挿入することも可能である。ある手法において、二重特異性抗体は、一方のアームに第１の結合特異性を有するＨ鎖と、他方のアームに第２の結合特異性を与えるＨ−Ｌ鎖対とから構成される。ＷＯ９４／０４６９０号を参照されたい。また、Sureshら、Methods in Enzymology 121, 210, 1986も参照されたい。
【０１１３】
本発明のある実施形態において、二重特異性抗体が提供されるが、その抗体の少なくとも一方の結合特異性はｈＩＧＦ−１Ｒに対するものであって、前記抗体は、ｈＩＧＦ−１Ｒの活性を中和する。こうした抗体は、ＩｇＧアイソタイプ、たとえばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のヒト定常領域をさらに含むことができる。本発明の抗体はまた、多重特異性、例えばいくつかの抗原結合フラグメントの集合によって形成される多重特異性抗体であってもよい。
【０１１４】
１．４  抗原結合フラグメント
かかる抗原結合フラグメントは、そのフラグメントが由来する抗体と同じ抗原結合特異性、および同じまたは類似の中和活性を保持する、部分的な重鎖または軽鎖可変配列（例えば、免疫グロブリン可変ドメインのアミノまたはカルボキシ末端におけるわずかな欠失）を含む。
【０１１５】
本発明のある実施形態において、ｈＩＧＦ−１Ｒの活性を中和する抗原結合フラグメントが提供される。こうしたフラグメントは、インタクトな、および／またはヒト化された、および／またはキメラ抗体の機能的抗原結合フラグメント、たとえば、上記抗体のＦａｂ、Ｆａｂ‘、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ＳｃＦｖフラグメントとすることができる。従来、こうしたフラグメントは、インタクトな抗体のタンパク質分解によって、たとえばパパイン分解によって（たとえば、ＷＯ９４／２９３４８号を参照されたい）作製されるが、遺伝子組換えによる形質転換宿主細胞から直接産生させることもできる。ＳｃＦｖの作製については、Birdら、(1988) Science, 242, 423-426を参照されたい。それに加えて、抗原結合フラグメントは、下記のさまざまな遺伝子工学技術を用いて作製することができる。
【０１１６】
Ｆｖフラグメントは、その２つの鎖の相互作用エネルギーがＦａｂフラグメントより低いと思われる。ＶＨおよびＶＬドメインの結合を安定化するために、これらのドメインは、ペプチド（Birdら、(1988) Science 242, 423-426、Hustonら、PNAS, 85, 5879-5883）、ジスルフィド橋（Glockshuberら、(1990) Biochemistry, 29, 1362-1367）、および「knob in hole」変異（Zhuら、(1997), Protein Sci., 6, 781-788）によって連結されている。ＳｃＦｖフラグメントは、当業者に周知の方法によって作製することができる。Whitlowら、(1991) Methods companion Methods Enzymol, 2, 97-105 およびHustonら、(1993) Int.Rev.Immunol 10, 195-217を参照されたい。ＳｃＦｖは、大腸菌（E. coli）などの細菌細胞内で産生させることができるが、真核細胞内で産生させる方が好ましい。ＳｃＦｖの不利な点は、産物が一価であること、そのために多価結合による結合力の増加が不可能になること、ならびに半減期が短いことである。こうした問題を克服するための試みには、二価（ＳｃＦｖ’）２があるが、これは、追加のＣ末端システインを含有するＳｃＦｖから、化学的カップリングによって（Adamsら、(1993) Can.Res 53, 4026-4034、およびMcCartneyら、(1995) Protein Eng. 8, 301-314）、または不対Ｃ末端システイン残基を含有するＳｃＦｖの自然発生的部位特異的二量体化によって（Kipriyanovら、(1995) Cell. Biophys 26, 187-204を参照されたい）作製される。
【０１１７】
あるいはまた、ペプチドリンカーを３〜１２残基に短縮して「ダイアボディ（diabody）」を形成することによって、ＳｃＦｖに多量体を形成させることができる。Holligerら、PNAS (1993), 90, 6444-6448を参照されたい。リンカーをさらに小さくすることで、ＳｃＦｖ三量体（「トリアボディ」、Korttら、(1997) Protein Eng, 10, 423-433を参照されたい）および四量体（「テトラボディ」、Le Gallら、(1999) FEBS Lett, 453, 164-168を参照されたい）をもたらすことができる。二価ＳｃＦｖ分子の構築は、「ミニ抗体（miniantibody）」（Packら、(1992) Biochemistry 31, 1579-1584を参照されたい）および「ミニボディ」（Huら、(1996), Cancer Res. 56, 3055-3061を参照されたい）を形成することができるタンパク質二量体化モチーフとの遺伝子融合によっても、達成することができる。ＳｃＦｖ−ＳｃＦｖタンデム（（ＳｃＦｖ）２）は、第３のペプチドリンカーによって２つのＳｃＦｖ単位を連結することによって作製することもできる。Kuruczら、(1995) J.Immol.154, 4576-4582を参照されたい。二重特異性ダイアボディは、ある抗体のＶＬドメインに短いリンカーで連結された、別の抗体由来のＶＨドメインからなる、２つの一本鎖融合産物の非共有結合によって作製することができる。Kipriyanovら、(1998), Int. J. Can 77, 763-772を参照されたい。このような二重特異性ダイアボディの安定性は、ジスルフィド橋、もしくは上記の「knob in hole」変異を導入することによって、または２つのハイブリッドＳｃＦｖフラグメントがペプチドリンカーを介して連結される、一本鎖ダイアボディ（ＳｃＤｂ）を形成することによって、高めることができる。Kontermannら、(1999) J. Immunol. Methods 226 179-188を参照されたい。四価の二重特異性分子は、たとえば、ＳｃＦｖフラグメントを、ＩｇＧ分子のＣＨ３ドメインに、またはヒンジ領域を介してＦａｂフラグメントに、融合することによって得られる。Co
lomaら、(1997) Nature Biotechnol. 15, 159-163を参照されたい。あるいはまた、四価の二重特異性分子は、二重特異性一本鎖ダイアボディの融合によって作製されている（Altら、(1999) FEBS Lett 454, 90-94を参照されたい）。より小さい四価の二重特異性分子は、ヘリックス−ループ−ヘリックスモチーフ含有リンカーによるＳｃＦｖ−ＳｃＦｖタンデムの二量体化（ＤｉＢｉミニ抗体、Mullerら、(1998) FEBS Lett 432, 45-49を参照されたい）、または分子内対合を妨げる配向で４つの抗体可変ドメイン（ＶＨおよびＶＬ）を含む一本鎖分子の二量体化（タンデムダイアボディ、Kipriyanovら、(1999) J.Mol.Biol. 293, 41-56を参照されたい）のいずれかによって、作製することもできる。二重特異性Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、Ｆａｂ’フラグメントの化学的カップリングによって、またはロイシンジッパーによるヘテロ二量体化によって作製することができる（Shalabyら、(1992) J.Exp.Med. 175, 217-225、およびKostelnyら、(1992), J.Immunol. 148, 1547-1553を参照されたい）。
【０１１８】
「免疫グロブリン単一可変ドメイン」という表現は、異なるＶ領域またはドメインとは独立して抗原またはエピトープと特異的に結合する抗体可変ドメイン（ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ）を意味する。免疫グロブリン単一可変ドメインは、単一免疫グロブリン可変ドメインが抗原結合のために他の異なる可変領域または可変ドメインが必要とされない（すなわち免疫グロブリン単一可変ドメインが別の可変ドメインとは独立して抗原と結合する）場合、他の異なる可変領域または可変ドメインとの形態（例えばホモまたはヘテロ多量体）で存在することができる。
【０１１９】
また、単離されたＶＨおよびＶＬドメイン（Domantis plc）も利用できる。米国特許第６，２４８，５１６号；同第６，２９１，１５８号；同第６，１７２，１９７号を参照されたい。これらはドメイン抗体として知られる。「ドメイン抗体」または「ｄＡｂ」は、抗原と結合可能な「免疫グロブリン単一可変ドメイン」（この用語は本明細書で使用される）と同じである。免疫グロブリン単一可変ドメインは、ヒト抗体可変ドメインであってもよいが、他の種、例えばげっ歯類などに由来する単一抗体可変ドメイン（例えばＷＯ００／２９００４号に開示、テンジクザメおよびラクダ科（Camelid）ＶＨＨ ｄＡｂなど）を含んでもよい。ラクダ科ＶＨＨは、天然に軽鎖を欠損する重鎖抗体を産生するラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダおよびグアナコなどの種に由来する免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドである。このようなＶＨＨドメインは、当技術分野で利用可能な標準技術によりヒト化することができ、このようなドメインもまた本発明において「ドメイン抗体」とみなされる。本明細書において使用される「ＶＨ」にはラクダ科ＶＨＨドメインが含まれる。
【０１２０】
ある実施形態において、ｈＩＧＦ−１Ｒと特異的に結合して、ｈＩＧＦ−１Ｒの活性を中和する抗原結合フラグメント（たとえば、ＳｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２）、または上記のように遺伝子工学的に作製された抗原結合フラグメントが提供される。抗原結合フラグメントは、配列番号１に示されるＣＤＲ Ｈ３、配列番号２に示されるＣＤＲ Ｈ２、配列番号３に示されるＣＤＲ Ｈ１、配列番号４に示されるＣＤＲ Ｌ１、配列番号５に示されるＣＤＲ Ｌ２、および配列番号６に示されるＣＤＲ Ｌ３の配列のうち１もしくは複数を含むことができる。
【０１２１】
１．５  ヘテロコンジュゲート抗体
ヘテロコンジュゲート抗体も本発明の実施形態をなすものである。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の好都合な架橋結合法を用いて形成される、共有結合で結ばれた２つの抗体からなる。たとえば、米国特許第４，６７６，９８０号を参照されたい。
【０１２２】
さらに、本発明には、抗体および抗原結合フラグメントの組み合わせ、例えば１以上のドメイン抗体および／またはモノクローナル抗体と結合したＳｃＦｖの組み合わせが含まれる。
【０１２３】
１．６  他の改変
抗体の定常領域と、さまざまなＦｃ受容体（ＦｃγＲ）との相互作用は、抗体のエフェクター機能を仲介すると考えられるが、このエフェクター機能には、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）、補体結合、食作用、および抗体の半減期／クリアランスが含まれる。所望の特性に応じて、本発明の抗体の定常領域のさまざまな改変を行うことができる。たとえば、本来なら溶解性の抗体を非溶解性にする定常領域内の特異的変異が、ＥＰ０６２９  ２４０Ｂ１およびＥＰ０３０７  ４３４Ｂ２に詳述されており、あるいは抗体にサルベージ（salvage）受容体結合エピトープを組み込んで、血中半減期を延ばすことができる。米国特許第５，７３９，２７７号を参照されたい。現在知られているヒトＦｃγ受容体には５つあり、ＦｃγＲ（Ｉ）、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａおよび新生児ＦｃＲｎである。Shieldsら、(2001) J. Biol. Chem 276, 6591-6604は、共通のＩｇＧ１残基のセットがすべてのＦｃγＲとの結合に関与しているが、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩは、この共通のセットの外側にある別個の部位を利用することを明らかにした。一群のＩｇＧ１残基は、Ｐｒｏ−２３８、Ａｓｐ−２６５、Ａｓｐ−２７０、Ａｓｎ−２９７およびＰｒｏ−２３９をアラニンに変えると、すべてのＦｃγＲへの結合を低下させた。いずれもＩｇＧ  ＣＨ２ドメインに存在し、ＣＨ１およびＣＨ２をつなぐヒンジ部の近くでクラスターを形成している。ＦｃγＲＩは、結合のためにＩｇＧ１残基の共通セットのみを用いるが、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩは、共通セットに加えて、別個の残基とも相互作用する。一部の残基の変更は、ＦｃγＲＩＩとの結合のみを低下させ（たとえば、Ａｒｇ−２９２）、またはＦｃγＲＩＩＩとの結合のみを低下させた（たとえば、Ｇｌｕ−２９３）。ある変異体は、ＦｃγＲＩＩもしくはＦｃγＲＩＩＩに対する結合の強化を示したが、もう一方の受容体との結合には影響を与えなかった（たとえば、Ｓｅｒ−２６７Ａｌａは、ＦｃγＲＩＩに対する結合は強化したが、ＦｃγＲＩＩＩとの結合には影響しなかった）。また他の変異体は、ＦｃγＲＩＩもしくはＦｃγＲＩＩＩに対する結合の強化を示したが、もう一方の受容体との結合は低下した（たとえば、Ｓｅｒ−２９８ＡｌａはＦｃγＲＩＩＩに対する結合を強化したが、ＦｃγＲＩＩとの結合は低下した）。ＦｃγＲＩＩＩａに関して、もっともよく結合するＩｇＧ１変異体は、Ｓｅｒ−２９８、Ｇｌｕ−３３３およびＬｙｓ−３３４でのアラニン置換の組み合わせを有していた。新生児ＦｃＲｎ受容体は、抗体クリアランスおよび組織にわたるトランスサイトーシスのどちらにも関与していると考えられる（Junghans R. P (1997) Immunol. Res 16. 29-57 およびGhetieら、(2000) Annu. Rev. Immunol. 18, 739-766を参照されたい）。ヒトＦｃＲｎと直接相互作用すると確定されたヒトＩｇＧ１残基には、Ｉｌｅ２５３、Ｓｅｒ２５４、Ｌｙｓ２８８、Ｔｈｒ３０７、Ｇｌｎ３１１、Ａｓｎ４３４およびＨｉｓ４３５がある。本項に記載のこれらの位置のうち任意箇所での切り替えは、血清半減期の増加、および／または本発明の抗体のエフェクター特性の改変を可能にすることができる。
【０１２４】
他の改変には、本発明の抗体の糖鎖付加（グリコシル化）変異体がある。抗体の定常領域内の保存された位置での糖鎖付加（グリコシル化）は、抗体機能、特に上記のようなエフェクター機能に重大な影響を及ぼすことが知られている。たとえば、Boydら、(1996), Mol. Immunol. 32, 1311-1318を参照されたい。１もしくは複数の糖鎖を付加、置換、欠失もしくは修飾した、本発明の抗体もしくはその抗原結合フラグメントの糖鎖付加変異体が想定される。アスパラギン−Ｘ−セリン、もしくはアスパラギン−Ｘ−スレオニンモチーフの導入は、糖鎖を酵素的に連結することができる部位を作り出すので、それを用いて、抗体の糖鎖付加を操作することができる。Rajuら、(2001) Biochemistry 40, 8868-8876において、ＴＮＦＲ−ＩｇＧイムノアドヘシンの末端シアリル化は、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼおよび／またはα−２，３−シアリルトランスフェラーゼによる再ガラクトシル化および／または再シアリル化により増加した。末端シアリル化の増加は、免疫グロブリンの半減期を増加させると考えられる。抗体は、ほとんどの糖タンパク質と同様に、典型的にはグライコフォームの混合物として産生される。こうした混合物は、抗体を真核生物、とりわけ哺乳動物細胞内で産生させたとき、特に明らかである。特定したグライコフォームを製造するために、さまざまな方法が開発されている。Zhangら、Science (2004), 303, 371、 Searsら、Science, (2001) 291, 2344、 Wackerら、(2002) Science, 298 1790、Davisら、(2002) Chem. Rev. 102, 579、Hangら、(2001) Acc. Chem. Res 34, 727を参照されたい。したがって、本発明は、前記抗体もしくはその抗原結合フラグメントの特定された数（たとえば７個以下、例として５個以下、たとえば２または１個）のグライコフォームを含む、本明細書に記載の複数の（モノクローナル）抗体（ＩｇＧ１アイソタイプ、たとえばＩｇＧ１とすることができる）を想定する。
【０１２５】
本発明のさらに他の実施形態には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコールもしくはポリオキシアルキレンといった、非タンパク質性ポリマーと結合した本発明の抗体もしくはその抗原結合フラグメントが含まれる。タンパク質のＰＥＧとの結合は、タンパク質の半減期を長くするのと同時に、タンパク質の抗原性および免疫原性を低下させるための確立された技術である。分子量および形状（直鎖もしくは分枝）の異なる分子によるＰＥＧ化の使用は、インタクトな抗体、ならびにＦａｂ’フラグメントで検討されている。Koumenis I.L.ら、(2000) Int. J. Pharmaceut. 198:83-95を参照されたい。
【０１２６】
２．作製方法
本発明の抗体は、ポリクローナル集団として作製することができるが、モノクローナル集団として（すなわち、特定の抗原結合部位に対する同一抗体からなる実質的に均一な集団として）作製することがより好ましい。集団が２つ以上の抗体種を意味することは、当然、当業者には明らかである。本発明の抗体は、ヤギ（Pollockら、(1999), J. Immunol. Methods 231:147-157を参照されたい）、ニワトリ（Morrow KJJ (2000) Genet. Eng. News 20:1-55を参照されたい）、マウス（Pollockら）、または植物（Doran PM, (2000) Curr. Opinion Biotechnol. 11, 199-204、Ma JK-C (1998), Nat. Med. 4; 601-606、Baez Jら、BioPharm (2000) 13: 50-54、Stoger Eら、(2000) Plant Mol. Biol. 42:583-590を参照されたい）といったトランスジェニック生物内で産生することができる。抗体はまた、化学合成によっても作製することができる。しかしながら、本発明の抗体は、典型的には、当業者に周知の組換え細胞培養技術を用いて作製される。抗体をコードするポリヌクレオチドを単離し、その後のクローニング（増幅）もしくは発現のために、複製可能なベクターに挿入する。特に宿主細胞がＣＨＯもしくはＮＳ０である場合（下記を参照されたい）、１つの有用な発現系は、グルタミン酸シンテターゼ系（Lonza Biologicsが販売しているものなど）である。抗体をコードするポリヌクレオチドは、従来の方法（たとえば、オリゴヌクレオチドプローブ）によって、容易に単離され、配列決定される。使用可能なベクターには、プラスミド、ウイルス、ファージ、トランスポゾン、ミニ染色体（プラスミドがその典型的な具体例である）がある。一般にこうしたベクターは、発現を促進するために、軽鎖および／または重鎖ポリヌクレオチドに機能的に連結された、シグナル配列、複製起点、１もしくは複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列をさらに含有する。軽鎖および重鎖をコードするポリヌクレオチドは、別々のベクター内に挿入し、同一の宿主細胞にトランスフェクトすることができ、あるいは必要に応じて、重鎖および軽鎖をともに同一ベクター内に挿入して、宿主細胞にトランスフェクトすることができる。このように、本発明の一態様に従って、本発明の抗体もしくはその抗原結合フラグメントの軽鎖および／または重鎖をコードするベクターを構築する方法が提供されるが、その方法は、本発明の抗体の軽鎖および／または重鎖をコードするポリヌクレオチドをベクター内に挿入することを含む。
【０１２７】
当業者には、天然または野生型遺伝子と同じタンパク質をコードする合成遺伝子を、その遺伝子に用いられているコドンを変更することによって設計することができることが知られている。
【０１２８】
これらの設計手法は、遺伝子における、哺乳動物の遺伝子では稀にしか使用されないコドンを、哺乳動物の遺伝子においてそのアミノ酸についてより高頻度で使用されるコドンで置き換えるプロセスを含む。このプロセス、いわゆるコドン最適化は、宿主細胞によって生成される総タンパク質レベルが、野生型配列でトランスフェクトした場合のレベルと比べて、コドン最適化遺伝子でトランスフェクトした場合に高くなることを意図して用いられる。複数の方法が公表されている（Nakamura et. al., Nucleic Acids Research 1996,24 : 214-215；ＷＯ９８／３４６４０号；ＷＯ９７／１１０８６号）。
【０１２９】
コドン頻度は、多くの種の高発現される遺伝子に関する文献情報源から導くことができる（例えばNakamura et al. Nucleic Acids Research 1996,24 : 214-215参照）。ヒトについてのコドン用法表もまた公開されている（ＷＯ２００５０２５６１４号）。
【０１３０】
遺伝子コードの縮重（redundancy）のため、本発明のポリペプチドをコードする本明細書に記載のポリヌクレオチドの代わりとなるポリヌクレオチド（特に所定の宿主細胞における発現についてそのコドンが最適化されている）も利用可能であることは、当業者には容易に理解することができる。
【０１３１】
３．１  シグナル配列
本発明の抗体は、成熟タンパク質のＮ末端に特異的な切断部位を有する、異種シグナル配列を含む融合タンパク質として作製することができる。シグナル配列は、宿主細胞によって認識されて、プロセシングされるべきである。原核生物の宿主細胞については、シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、または耐熱性エンテロトキシンＩＩリーダーとすることができる。酵母分泌のためには、シグナル配列は、例えば酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー、または酸ホスファターゼリーダーとすることができる。ＷＯ９０／１３６４６号を参照されたい。哺乳動物細胞系では、ウイルス分泌リーダー、たとえば単純ヘルペスｇＤシグナル、ならびに天然免疫グロブリンシグナル配列が好適である。典型的には、シグナル配列は、本発明の抗体をコードするＤＮＡに、リーディングフレーム内で連結される。
【０１３２】
３．２  複製起点
複製起点は当技術分野で周知であり、ｐＢＲ３２２がほとんどのグラム陰性細菌に適合し、２μプラスミドがほとんどの酵母に適合し、さらに、さまざまなウイルス由来のもの、たとえば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶもしくはＢＰＶはほとんどの哺乳動物細胞に適している。一般に、複製起点の要素は、哺乳動物発現ベクターには必要でないが、ＳＶ４０は、初期プロモーターを含有しているので使用することができる。
【０１３３】
３．３  選択マーカー
典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質もしくは他の毒素（たとえば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートもしくはテトラサイクリン）に対する耐性を付与するタンパク質をコードするか、または（ｂ）栄養要求性の欠乏を補完する、もしくは複合培地で利用できない栄養素を補充するタンパク質をコードする。選択方式は、宿主細胞の増殖の停止を伴ってもよい。本発明の抗体をコードする遺伝子による形質転換が成功した細胞は、たとえば選択マーカーによって付与された薬剤耐性のために、生き残る。もう一つの例はいわゆるＤＨＦＲ選択マーカーであるが、この場合、形質転換体はメトトレキサート存在下で培養される。典型的な実施形態では、メトトレキサートの量を増加させて細胞を培養し、目的の外来遺伝子のコピー数を増幅させる。ＣＨＯ細胞は、ＤＨＦＲ選択に特に有用な細胞系である。さらにもう一つの例は、グルタミン酸シンテターゼ発現系（Lonza Biologics）である。酵母での使用に適した選択遺伝子はｔｒｐ１遺伝子である。Stinchcombら、Nature 282, 38, 1979を参照されたい。
【０１３４】
３．４  プロモーター
本発明の抗体の発現に適したプロモーターは、抗体をコードするＤＮＡ／ポリヌクレオチドに、機能的に連結される。原核生物宿主のためのプロモーターには、ｐｒｏＡプロモーター、βラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファンおよびハイブリッドプロモーター、たとえばＴａｃがある。酵母細胞での発現に適したプロモーターには、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖系酵素、たとえばエノラーゼ、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース６リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼおよびグルコキナーゼがある。誘導性酵母プロモーターには、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸ホスファターゼ、メタロチオネイン、および窒素代謝またはマルトース／ガラクトース利用を担う酵素が含まれる。哺乳動物細胞系における発現のためのプロモーターには、ウイルスプロモーター、たとえば、ポリオーマ、鶏痘およびアデノウイルス（たとえばアデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス（具体的には前初期遺伝子プロモーター）、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、アクチン、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ならびに初期もしくは後期シミアンウイルス４０がある。当然、プロモーターの選択は、発現に使用される宿主細胞との適切な適合性に基づく。したがって、ある実施形態において、ＲＳＶおよび／またはＳＶ４０および／またはＣＭＶプロモーター、本発明の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）をコードするＤＮＡ、κＣ領域を、ネオマイシンおよびアンピシリン耐性選択マーカーとともに含有する第１のプラスミド、ならびにＲＳＶまたはＳＶ４０プロモーター、本発明の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）をコードするＤＮＡ、γ１定常領域をコードするＤＮＡ、ＤＨＦＲおよびアンピシリン耐性マーカーを含有する第２のプラスミドが提供される。
【０１３５】
３．５  エンハンサーエレメント
必要に応じて、たとえば、高等真核生物での発現のために、ベクター内でプロモーターエレメントに機能的に連結されたエンハンサーエレメントを使用することができる。適当な哺乳動物エンハンサー配列には、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、フェトプロテインおよびインスリン由来のエンハンサー要素が含まれる。あるいはまた、ＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００−２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリーマエンハンサー、バキュロウイルスエンハンサー、またはマウスＩｇＧ２ａ遺伝子座といった、真核細胞ウイルス起源のエンハンサーエレメントを使用してもよい（ＷＯ０４／００９８２３号を参照されたい）。エンハンサーは、ベクター上で、プロモーターの上流の部位に位置することができる。
【０１３６】
３．５．５  ポリアデニル化シグナル
真核細胞系では、ポリアデニル化シグナルが、本発明の抗体をコードするＤＮＡ／ポリヌクレオチドに、機能的に連結される。こうしたシグナルは典型的には、オープンリーシングフレームの３’側に置かれる。哺乳動物の系で、限定的でない例としては、成長ホルモン、伸長因子１αおよびウイルス（たとえば、ＳＶ４０）遺伝子、またはレトロウイルスのロング・ターミナル・リピート由来のシグナルが挙げられる。酵母系では、ポリアデニル化／終結シグナルの限定的でない例として、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）およびアルコールデヒドロゲナーゼ１（ＡＤＨ）遺伝子由来のシグナルが挙げられる。原核細胞系では、ポリアデニル化シグナルは一般的には必要とされず、その代わりにもっと短く明確なターミネーター配列を用いるのが通例である。当然、ポリアデニル化／終結配列の選択は、発現に使用される宿主との適切な適合性に基づいて行われる。
【０１３７】
３．６  宿主細胞
本発明の抗体をコードするベクターをクローニングし、または発現させるのに適した宿主細胞は、原核細胞、酵母、もしくは高等真核細胞である。適当な原核細胞には、真正細菌、例を挙げると、腸内細菌科、エシェリキア属（Escherichia）たとえば大腸菌（E. coli）（たとえば、ATCC 31,446; 31,537; 27,325）、エンテロバクター属（Enterobacter）、エルウィニア属（Erwinia）、クレブシエラ属（Klebsiella）、プロテウス属（Proteus）、サルモネラ属（Salmonella）たとえばネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、セラチア属（Serratia）たとえばセラチア・マルセスセンス（Serratia marcescens）、およびシゲラ属（Shigella）など、ならびにバシラス属（Bacilli）の枯草菌（B. subtilis）およびＢ．リケニホルミス（B. licheniformis）（DD 266 710を参照されたい）など、シュードモナス属（Pseudomonas）の緑膿菌（P. aeruginosa）など、さらにストレプトミセス属（Streptomyces）がある。酵母宿主細胞のうち、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（schizosaccharomyces pombe）、クルイベロミセス属（Kluyveromyces）（たとえば、ATCC 16,045; 12,424; 24178; 56,500）、ヤロウィア属（yarrowia）（ＥＰ４０２２２６）、ピキア・パストリス（Pichia Pastoris）（ＥＰ１８３０７０、Pengら、J.Biotechnol. 108 (2004) 185-192も参照されたい)、カンジダ属（Candida）、トリコデルマ・リーシア（Trichoderma reesia）（ＥＰ２４４２３４）、ペニシリン属（Penicillin）、トリポクラジウム属（Tolypocladium）ならびにアスペルギルス属（Aspergillus）宿主、たとえばアスペルギルス・ニデュランス（A. nidulans）およびクロコウジカビ（A. niger）も想定される。
【０１３８】
原核生物および酵母宿主細胞は具体的に本発明で想定はされるが、本発明の宿主細胞は、高等真核細胞である。適当な高等真核生物宿主細胞には、哺乳動物細胞、たとえば、ＣＯＳ−１（ATCC番号 CRL 1650）、ＣＯＳ−７（ATCC CRL 1651）、ヒト胚性腎細胞系２９３、仔ハムスター腎細胞（ＢＨＫ）（ATCC CRL.1632）、ＢＨＫ５７０（ATCC番号: CRL 10314）、２９３（ATCC番号CRL 1573）、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ（たとえば、ＣＨＯ−Ｋ１、ATCC番号: CCL 61、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞系、たとえばＤＧ４４など（Urlaubら、(1986) Somatic Cell Mol.Genet.12, 555-556を参照されたい））、特に懸濁培養に適したＣＨＯ細胞系、マウスセルトリ細胞、サル腎細胞、アフリカミドリザル腎細胞（ATCC CRL-1587）、ＨＥＬＡ細胞、イヌ腎細胞（ATCC CCL 34）、ヒト肺細胞（ATCC CCL 75）、ＨｅｐＧ２および骨髄腫もしくはリンパ腫細胞、たとえばＮＳ０（米国特許第５，８０７，７１５号を参照されたい）、Ｓｐ２／０、Ｙ０が含まれる。
【０１３９】
したがって、本発明のある実施形態において、本明細書に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメントの重鎖および／または軽鎖をコードするベクターを含む、安定して形質転換された宿主細胞が提供される。こうした宿主細胞は、軽鎖をコードする第１のベクター、および前記重鎖をコードする第２のベクターを含む。
【０１４０】
細菌発酵
細菌系は、抗原結合フラグメントの発現に特に適している。こうしたフラグメントは、細胞内、もしくはペリプラズム内に局在する。当業者に知られている方法にしたがって、不溶性ペリプラズムタンパク質を抽出し、リフォールディングして活性タンパク質を形成することができる。Sanchezら、(1999) J. Biotechnol. 72, 13-20およびCupit PMら、(1999) Lett Appl Microbiol, 29, 273-277を参照されたい。
【０１４１】
３．７  細胞培養法
本発明の抗体もしくはその抗原結合フラグメントをコードするベクターで形質転換された宿主細胞は、当業者に公知の方法によって培養することができる。宿主細胞は、スピナーフラスコ、ローラーボトル、または中空糸の系で培養することができるが、大規模生産のためには、特に懸濁培養用に撹拌槽型リアクターを使用する。撹拌槽は、たとえば、スパージャー、バッフルもしくは低剪断インペラを用いて、通気に適合させることが好ましい。気泡塔およびエアリフトリアクターには、空気もしくは酸素気泡による直接通気を用いることができる。宿主細胞を無血清培地中で培養する場合、通気プロセスの結果として細胞が損傷するのを防ぐのに役立つ、プルロニックＦ−６８のような細胞保護物質を添加する。宿主細胞の特性に応じて、マイクロキャリアを、足場依存性細胞系の増殖基質として使用することができ、あるいは細胞を懸濁培養に適応させることもできる（こちらが一般的である）。宿主細胞、特に無脊椎動物宿主細胞の培養は、流加培養、反復バッチ処理（Drapeauら、(1994) cytotechnology 15: 103-109を参照されたい）、延長バッチ法もしくは潅流培養といった、さまざまな運転モードを利用することができる。組換えによって形質転換された哺乳動物宿主細胞は、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）のような血清含有培地で培養することができるが、こうした宿主細胞は、例えば、Keenら、(1995) Cytotechnology 17:153-163に記載の合成無血清培地、またはＰｒｏＣＨＯ−ＣＤＭもしくはＵｌｔｒａＣＨＯＴＭ（Cambrex NJ, USA）といった市販の培地中で、必要ならば、グルコースなどのエネルギー源および組換えインスリンのような合成増殖因子を添加して、培養する。宿主細胞の無血清培養は、その細胞が無血清条件での増殖に適応していることを必要とすると考えられる。１つの適応法は、こうした宿主細胞を血清含有培地で培養し、宿主が無血清条件に適応するようになるように、培地の８０％を無血清培地に繰り返し交換することである（たとえば、Scharfenberg Kら、(1995)「動物細胞工学」（Animal Cell technology）より: 21世紀に向けた開発（Developments towards the 21st century）（Beuvery E.C.ら、編）、619-623ページ, Kluwer Academic publishersを参照されたい）。
【０１４２】
培地中に分泌された本発明の抗体は、さまざまな技法を用いて回収および精製され、目的の用途に適した精製度を与えることができる。たとえば、本発明の抗体をヒト患者の治療に使用するには、一般に少なくとも９５％の純度、より典型的には９８％、もしくは９９％以上の純度が要求される（粗製の培地と対比して）。第１の例では、細胞片を培地から、一般には、遠心によって除去し、次に、たとえば、精密濾過、限外濾過および／またはデプス濾過を用いて、清澄化ステップを行う。さまざまな他の技法、たとえば、透析およびゲル電気泳動、ならびにクロマトグラフィー法、例としてヒドロキシアパタイト（ＨＡ）、アフィニティクロマトグラフィー（状況に応じて、ポリヒスチジンのようなアフィニティタグ標識システムを含む）および／または疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ、米国特許第５，４２９，７４６号を参照されたい）が利用できる。ある実施形態において、本発明の抗体は、さまざまな清澄化ステップの後、プロテインＡもしくはＧアフィニティクロマトグラフィーを用いて捕捉し、次いでさらに、イオン交換および／またはＨＡクロマトグラフィー、陰イオンもしくは陽イオン交換、サイズ排除クロマトグラフィーといったクロマトグラフィーステップ、ならびに硫安沈澱を行う。一般に、さまざまなウイルス除去ステップも行われる（たとえば、ＤＶ−２０フィルターなどを用いたナノ濾過）。こうしたさまざまなステップの後、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ以上、たとえば１００ｍｇ／ｍｌ以上の本発明の抗体もしくはその抗原結合フラグメントを含む精製（好ましくはモノクローナル）調製物が得られ、したがってその調製物が本発明の実施形態を構成する。適切なことに、この調製物は本発明の抗体の凝集体を実質的に含まない。
【０１４３】
４．医薬組成物
上記の本発明の抗体の精製調製物（特にモノクローナル調製物）を、以下のようなヒトの疾患および障害の治療に使用するための医薬組成物に組み入れることができる。すなわち、関節リウマチ、乾癬、または癌、例えば急性リンパ芽球性白血病、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連癌、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門癌、小児小脳星細胞腫、小児大脳星細胞腫、直腸結腸癌、基底細胞癌、肝外胆管癌、膀胱癌、骨肉腫／悪性線維性組織球腫骨癌、脳腫瘍（例えば、脳幹部神経膠腫、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫／悪性神経膠腫、上衣細胞腫、髄芽細胞腫、テント上未分化神経外胚葉性腫瘍、視覚路および視床下部神経膠腫）、乳癌、気管支腺腫／カルチノイド、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、胃腸カルチノイド腫瘍、原発不明癌、原発性中枢神経系、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫／悪性神経膠腫、子宮頚癌、小児癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、大腸癌、直腸結腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、子宮内膜癌、上衣細胞腫、食道癌、ユーイングファミリー肉腫、頭蓋外胚細胞性腫瘍、性腺外胚細胞性腫瘍、肝外胆管癌、眼内黒色腫眼癌、網膜芽細胞腫眼癌、胆嚢癌、胃（Gastric）（胃（Stomach））癌、胃腸カルチノイド腫瘍、胚細胞性腫瘍（例えば、頭蓋外、性腺外、および卵巣）、妊娠性栄養膜腫瘍、神経膠腫（例えば、成人、小児脳幹、小児大脳星細胞腫、小児視覚路、および視床下部）、有毛細胞白血病、頭頚部癌、肝細胞性（肝臓）癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、視床下部および視覚路神経膠腫、眼内黒色腫、膵島細胞癌（膵内分泌部）、カポジ肉腫、腎臓（腎細胞）癌、喉頭癌、白血病（例えば、急性リンパ芽球性、急性骨髄性、慢性リンパ球性、慢性骨髄性、および有毛細胞）、唇および口腔癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、リンパ腫（例えば、ＡＩＤＳ関連、バーキット、皮膚Ｔ細胞、ホジキン、非ホジキン、および原発性中枢神経系）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、骨悪性線維性組織球腫／骨肉腫、髄芽細胞腫、黒色腫、眼内（眼）黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、原発不明の転移性扁平上皮頚部癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、慢性骨髄増殖性疾患、鼻腔および副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、口腔癌、口咽頭癌、骨肉腫／骨悪性線維性組織球腫、卵巣癌、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞性腫瘍、卵巣低悪性潜在的腫瘍、膵癌、膵島細胞膵癌、副鼻腔および鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、クロム親和細胞腫、松果体芽腫、下垂体腫瘍、形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞（腎臓）癌、腎盂および輸尿管移行性細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、軟部組織肉腫、子宮肉腫、セザリー症候群、非黒色腫皮膚癌、メルケル細胞皮膚癌腫、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、胸腺腫、胸腺癌、甲状腺癌、妊娠性栄養膜腫瘍、原発部位不明癌腫、原発部位不明癌、尿道癌、子宮内膜子宮癌、子宮肉腫、膣癌、視覚路および視床下部神経膠腫、外陰部癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、および���ィルムス腫瘍。
【０１４４】
典型的には、こうした組成物は、許容される医薬慣習で知られ、必要とされる、製薬上許容される担体を含む。たとえば、Remingtons Pharmaceutical Sciences, 第16版、(1980), Mack Publishing Coを参照されたい。このような担体の例としては、適当なバッファーでｐＨ５〜８の範囲内に緩衝化された、生理食塩水、リンガー溶液もしくはブドウ糖溶液のような滅菌担体がある。注射用（たとえば、静脈内、腹腔内、皮内、皮下、筋肉内もしくは門脈内投与による）または持続点滴用の医薬組成物は、目に見える粒子状物質のない適切な状態で、０．１ｎｇ〜１００ｍｇの抗体、例えば５ｍｇ〜２５ｍｇの抗体を含有することができる。このような医薬組成物を調製する方法は、当業者に周知である。ある実施形態において、医薬組成物は、０．１ｎｇ〜１００ｍｇの本発明の抗体を、状況に応じて使用説明書と共に、単位投与剤形中に含む。本発明の医薬組成物は、当業者に周知の、もしくは明白な方法にしたがって投与前に再調製されるように、凍結乾燥されていてもよい。本発明の実施形態がＩｇＧ１アイソタイプを有する本発明の抗体を含む場合、クエン酸塩（たとえば、クエン酸ナトリウム）またはＥＤＴＡまたはヒスチジンといった銅のキレート剤を医薬組成物に添加して、このアイソタイプの抗体の、銅を介した分解の度合いを低下させることができる。ＥＰ０６１２２５１を参照されたい。
【０１４５】
本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントを投与するための有効投与量および治療計画は、一般に、経験的に決定され、患者の年齢、体重および健康状態、ならびに治療すべき疾患もしくは障害といった要因に左右される。こうした要因は主治医の裁量の範囲内にある。適当な投与量を選択する際の指針は、たとえばSmithら、(1977)「ヒトの診断および治療における抗体」（Antibodies in human diagnosis and therapy）、Raven Press, New Yorkに見出すことができるが、概して１ｍｇ〜１０００ｍｇである。
【０１４６】
好都合にも、使用説明書を含み、別の薬剤と共に本発明の抗体もしくはその抗原結合フラグメントの部材キット（キット・オブ・パーツ）を含む医薬組成物も、本発明で想定される。
【０１４７】
本発明はさらに、ＩＧＦ−ＩとＩＧＦ−１Ｒとの相互作用またはＩＧＦ−ＩＩとＩＧＦ−１Ｒとの相互作用の中和に応答する疾患の治療に使用するために、治療上有効な量の、本明細書に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を想定する。
【０１４８】
本発明において、治療上有効な量のモノクローナルヒト化抗体を含む医薬組成物が提供されるが、この抗体は、配列番号１４からなる群から選択されるＶＨドメイン、および配列番号１６からなる群から選択されるＶＬドメインを含む。
【０１４９】
本発明において、治療上有効な量のモノクローナルヒト化抗体を含む医薬組成物が提供されるが、この抗体は、配列番号１５からなる群から選択されるＶＨドメイン、および配列番号１６からなる群から選択されるＶＬドメインを含む。
【０１５０】
好都合にも、状況に応じて使用説明書を含み、このような別の薬剤と共に本発明の抗体もしくはその抗原結合フラグメントの部材キット（キット・オブ・パーツ）を含む医薬組成物も、本発明で想定される。
【０１５１】
本発明はさらに、ＩＧＦ−１Ｒの活性の中和に応答する疾患の治療に使用するために、治療上有効な量の、本明細書に記載のモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を想定する。
【０１５２】
本発明の別の実施形態において、医薬組成物は、ヒトの疾患および障害、例えば：関節リウマチ、乾癬、または癌、例えば急性リンパ芽球性白血病、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連癌、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門癌、小児小脳星細胞腫、小児大脳星細胞腫、直腸結腸癌、基底細胞癌、肝外胆管癌、膀胱癌、骨肉腫／悪性線維性組織球腫骨癌、脳腫瘍（例えば、脳幹部神経膠腫、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫／悪性神経膠腫、上衣細胞腫、髄芽細胞腫、テント上未分化神経外胚葉性腫瘍、視覚路および視床下部神経膠腫）、乳癌、気管支腺腫／カルチノイド、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、胃腸カルチノイド腫瘍、原発不明癌、原発性中枢神経系、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫／悪性神経膠腫、子宮頚癌、小児癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、大腸癌、直腸結腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、子宮内膜癌、上衣細胞腫、食道癌、ユーイングファミリー肉腫、頭蓋外胚細胞性腫瘍、性腺外胚細胞性腫瘍、肝外胆管癌、眼内黒色腫眼癌、網膜芽細胞腫眼癌、胆嚢癌、胃（Gastric）（胃（Stomach））癌、胃腸カルチノイド腫瘍、胚細胞性腫瘍（例えば、頭蓋外、性腺外、および卵巣）、妊娠性栄養膜腫瘍、神経膠腫（例えば、成人、小児脳幹、小児大脳星細胞腫、小児視覚路、および視床下部）、有毛細胞白血病、頭頚部癌、肝細胞性（肝臓）癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、視床下部および視覚路神経膠腫、眼内黒色腫、膵島細胞癌（膵内分泌部）、カポジ肉腫、腎臓（腎細胞）癌、喉頭癌、白血病（例えば、急性リンパ芽球性、急性骨髄性、慢性リンパ球性、慢性骨髄性、および有毛細胞）、唇および口腔癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、リンパ腫（例えば、ＡＩＤＳ関連、バーキット、皮膚Ｔ細胞、ホジキン、非ホジキン、および原発性中枢神経系）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、骨悪性線維性組織球腫／骨肉腫、髄芽細胞腫、黒色腫、眼内（眼）黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、原発不明の転移性扁平上皮頚部癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、慢性骨髄増殖性疾患、鼻腔および副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、口腔癌、口咽頭癌、骨肉腫／骨悪性線維性組織球腫、卵巣癌、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞性腫瘍、卵巣低悪性潜在的腫瘍、膵癌、膵島細胞膵癌、副鼻腔および鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、クロム親和細胞腫、松果体芽腫、下垂体腫瘍、形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞（腎臓）癌、腎盂および輸尿管移行性細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、軟部組織肉腫、子宮肉腫、セザリー症候群、非黒色腫皮膚癌、メルケル細胞皮膚癌腫、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、胸腺腫、胸腺癌、甲状腺癌、妊娠性栄養膜腫瘍、原発部位不明癌腫、原発部位不明癌、尿道癌、子宮内膜子宮癌、子宮肉腫、膣癌、視覚路および視床下部神経膠腫、外陰部癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、およびウィルムス腫瘍の治療に使用される、他の治療薬または放射線療法と組み合わせて、例えば以下に���まれる他のクラスの薬物：分裂抑制剤、アルキル化剤、抗代謝物質、挿入剤抗生物質、成長因子阻害剤、細胞周期阻害剤、酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、抗生存因子、生物応答改変剤、抗ホルモン、抗血管新生剤、例えば抗成長因子受容体アンタゴニスト、例えばトラスツズマブ（ハーセプチン）、Ｅｒｂｉｔｕｘ（セツキシマブ）、抗成長因子抗体、例えばベバシズマブ（アバスチン）、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、神経成長因子（ＮＧＦＲ）、線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）のアンタゴニスト、小分子チロシンキナーゼ阻害剤、例えばラパチニブ、ゲフィチニブなど、化学療法剤、例えばゲムシタビン、イリノテカン、パクリタキセル、シスプラチン、ドキソルビシン、トポテカン、シクロホスファミド、メルファラン、ダカルバジン、ダウノルビシン、アミノカンプトテシン、エトポシド、テニポシド、アドリアマイシン、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）、チオテパ、タキソテール、ブスルファン、サイトキシン、タキソール、メトトレキセート、ビンブラスチン、ブレオマイシン、イフォスファミド、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシンと組み合わせて、抗体を含む。
【０１５３】
本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、１または複数の他の治療活性薬または放射線と組み合わせて、例えば以下に含まれる他のクラスの薬物と組み合わせて用いることができる：分裂抑制剤、アルキル化剤、抗代謝物質、挿入剤抗生物質、成長因子阻害剤、細胞周期阻害剤、酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、抗生存因子、生物応答改変剤、抗ホルモン、抗血管新生剤、例えば抗成長因子受容体アンタゴニスト、例えばトラスツズマブ（ハーセプチン）、Ｅｒｂｉｔｕｘ（セツキシマブ）、抗成長因子抗体、例えばベバシズマブ（アバスチン）、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、神経成長因子（ＮＧＦＲ）、線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）のアンタゴニスト、小分子抗ＩＧＦ−１Ｒ剤、小分子チロシンキナーゼ阻害剤、例えばラパチニブ、ゲフィチニブなど、化学療法剤、例えばゲムシタビン、イリノテカン、パクリタキセル、シスプラチン、ドキソルビシン、トポテカン、シクロホスファミド、メルファラン、ダカルバジン、ダウノルビシン、アミノカンプトテシン、エトポシド、テニポシド、アドリアマイシン、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）、チオテパ、タキソテール、ブスルファン、サイトキシン、タキソール、メトトレキセート、ビンブラスチン、ブレオマイシン、イフォスファミド、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン。
【０１５４】
したがってさらなる実施形態において、本発明は、ＩＧＦ−１受容体シグナル伝達がその疾患に寄与しているまたは受容体活性の中和が有益である疾患の治療におけるかかる組み合わせの使用、ならびに以下のような障害の組み合わせ療法（併用療法）のための医薬の製造における抗体またはその抗原結合フラグメントの使用を提供する：関節リウマチ、乾癬、または癌、例えば急性リンパ芽球性白血病、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連癌、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門癌、小児小脳星細胞腫、小児大脳星細胞腫、直腸結腸癌、基底細胞癌、肝外胆管癌、膀胱癌、骨肉腫／悪性線維性組織球腫骨癌、脳腫瘍（例えば、脳幹部神経膠腫、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫／悪性神経膠腫、上衣細胞腫、髄芽細胞腫、テント上未分化神経外胚葉性腫瘍、視覚路および視床下部神経膠腫）、乳癌、気管支腺腫／カルチノイド、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、胃腸カルチノイド腫瘍、原発不明癌、原発性中枢神経系、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫／悪性神経膠腫、子宮頚癌、小児癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、大腸癌、直腸結腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、子宮内膜癌、上衣細胞腫、食道癌、ユーイングファミリー肉腫、頭蓋外胚細胞性腫瘍、性腺外胚細胞性腫瘍、肝外胆管癌、眼内黒色腫眼癌、網膜芽細胞腫眼癌、胆嚢癌、胃（Gastric）（胃（Stomach））癌、胃腸カルチノイド腫瘍、胚細胞性腫瘍（例えば、頭蓋外、性腺外、および卵巣）、妊娠性栄養膜腫瘍、神経膠腫（例えば、成人、小児脳幹、小児大脳星細胞腫、小児視覚路、および視床下部）、有毛細胞白血病、頭頚部癌、肝細胞性（肝臓）癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、視床下部および視覚路神経膠腫、眼内黒色腫、膵島細胞癌（膵内分泌部）、カポジ肉腫、腎臓（腎細胞）癌、喉頭癌、白血病（例えば、急性リンパ芽球性、急性骨髄性、慢性リンパ球性、慢性骨髄性、および有毛細胞）、唇および口腔癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、リンパ腫（例えば、ＡＩＤＳ関連、バーキット、皮膚Ｔ細胞、ホジキン、非ホジキン、および原発性中枢神経系）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、骨悪性線維性組織球腫／骨肉腫、髄芽細胞腫、黒色腫、眼内（眼）黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、原発不明の転移性扁平上皮頚部癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、慢性骨髄増殖性疾患、鼻腔および副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、口腔癌、口咽頭癌、骨肉腫／骨悪性線維性組織球腫、卵巣癌、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞性腫瘍、卵巣低悪性潜在的腫瘍、膵癌、膵島細胞膵癌、副鼻腔および鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、クロム親和細胞腫、松果体芽腫、下垂体腫瘍、形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞（腎臓）癌、腎盂および輸尿管移行性細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、軟部組織肉腫、子宮肉腫、セザリー症候群、非黒色腫皮膚癌、メルケル細胞皮膚癌腫、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、胸腺腫、胸腺癌、甲状腺癌、妊娠性栄養膜腫瘍、原発部位不明癌腫、原���部位不明癌、尿道癌、子宮内膜子宮癌、子宮肉腫、膣癌、視覚路および視床下部神経膠腫、外陰部癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、およびウィルムス腫瘍。
【０１５５】
本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントを他の治療活性薬と組み合わせて使用する場合、それらの成分は、一緒にまたは別々に、連続してまたは同時に、任意の好都合な経路によって投与することができる。
【０１５６】
上述した組み合わせは、医薬製剤の形態で使用のために提示されることが好都合であり、それゆえ上述した組み合わせと場合により製薬上許容される担体もしくは賦形剤とを含む医薬製剤は、本発明の別の実施形態を構成する。そのような組み合わせの個々の成分は、一緒にまたは別々に、連続してまたは同時に、別個のまたは合わせた医薬製剤として投与することができる。
【０１５７】
２つの成分を同じ製剤において組み合わせる場合、２つの成分は安定であり、かつ互いにそして製剤の他の成分と適合性である必要があり、投与のために製剤化されることが理解されよう。それらを別々に製剤化する場合には、抗体およびその抗原結合フラグメントについて当技術分野で公知の方法で好都合に、任意の好都合な製剤としてそれらを提供することができる。
【０１５８】
同じ疾患に対して活性を有する第２の治療薬と組み合わせる場合、各成分の用量は、抗体またはその抗原結合フラグメントを単独で使用する場合とは異なるだろう。適当な用量は当業者であれば容易に理解することができる。
【０１５９】
したがってさらなる実施形態において、本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントと別の治療活性薬とを含む組み合わせを提供する。
【０１６０】
上述した組み合わせは、医薬製剤の形態で使用のために提示されることが好都合であり、それゆえ上述した組み合わせと場合によりその製薬上許容される担体とを含む医薬製剤は、本発明の別の実施形態を構成する。
【０１６１】
以下の実施例は、本発明の様々な態様を説明する。これらの実施例は、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【０１６２】
モノクローナル抗体の作製
概ね、E HarlowおよびD Lane, Antibodies a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988に記載される方法に従って、ハイブリドーマ細胞によってモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を産生させた。組換えヒトＩＧＦ−１Ｒ（R&D Systems，#305-GR）を添加したＲＩＢＩアジュバントの腹腔内注射によって、ＳＪＬマウスを予備刺激（primed）し追加免疫（boosted）した。応答動物の脾臓を採取し、X63Ag8653GFP1L5骨髄腫細胞に融合してハイブリドーマを作製した。ＦＭＡＴ（AB18200）およびＢＩＡｃｏｒｅ  Ａ１００を使用し、ＩＧＦ−１Ｒと結合するハイブリドーマ上清材料をスクリーニングした。ＡＢ１８２００を使用して、組換えＩＧＦ−１Ｒ（R&D Systems，305-GR-050と391-GR-050）、およびＨＥＫ２９３Ｔで発現したヒトＩＧＦ−１Ｒ、ＨＥＫ２９３Ｔで発現したカニクイザルＩＧＦ−１Ｒとの結合を確認し、かつＨＥＫ２９３Ｔで発現したヒトインスリン受容体とは結合しないことを確認した。ＢＩＡｃｏｒｅ  Ａ１００を使用して、ハイブリドーマにより産生された抗体と、組換えＩＧＦ−１Ｒ（R&D Systems，#305-GR）との結合動力学を評価した。ウサギ抗マウスＩｇＧ（BR-1005-14，Biacore AB）を使用し、抗体をチップ上に捕捉した。半固形培地（メチルセルロース溶液）、Ｏｍｎｉｔｒａｙ、およびＣｌｏｎｅＰｉｘ  ＦＬ装置を使用し、当該ハイブリドーマをモノクローン化した。
【実施例２】
【０１６３】
ハイブリドーマ材料とモノクローナル抗体のスケールアップおよび精製
スケールアップするハイブリドーマは、組織培養中で増殖し、コンフルエント２２５ｃｍ２のフラスコ４個のスケールにした。この時点で、４００ｇで５分間遠心分離することによって細胞を採取した。ペレットを１００ｍｌの血清不含培地（JRH610）に再懸濁して細胞を洗った。次いで、細胞を４００ｇで５分間遠心分離した。上清を吸引し廃棄した。１５０ｍｌの新鮮な血清不含培地を使用して、細胞ペレットを再懸濁した。次いで、細胞懸濁液を新たな２２５ｃｍ２のフラスコに移し、５日間インキュベーター中に置いた。次いで、上清を採取し、４００ｇで２０分間遠心分離した。上清を採取し、精製の準備として０．２μＭフィルターで滅菌ろ過した。プロテインＡ樹脂カラムを使用し、抗体を精製した。精製抗体をｐＨ７．４のＰＢＳで透析した。
【実施例３】
【０１６４】
ＩＧＦ−１Ｒ発現ベクターの構築
完全長ヒトＩＧＦ−１Ｒ用発現カセットの作製
ヒトＩＧＦ−１Ｒ ｃＤＮＡ発現カセットは、ヌクレオチド３５１０が変化していることを除きＧｅｎｂａｎｋ Ｘ０４４３４と同一であった。これにより、グリシン１１７０のコドン「ＧＧＴ」が「ＧＧＧ」へとサイレントに変化する。ヒトＩＧＦ−１Ｒ ｃＤＮＡは、ｐｃＤＮＡ３．１（−）ベクター（Invitrogen）から発現させた。ヒトＩＧＦ−１Ｒの配列を配列番号４４に記載する。
【０１６５】
完全長マウスＩＧＦ−１Ｒの発現カセットの作製
マウスＩＧＦ−１Ｒ ｃＤＮＡ発現カセットは、ヌクレオチド３５２２が変化していることを除きＧｅｎｂａｎｋ ＡＦ０５６１８７と同一であった。これにより、グリシン１１７４のコドン「ＧＧＣ」が「ＧＧＧ」へとサイレントに変化する。マウスＩＧＦ−１Ｒ ｃＤＮＡは、ｐｃＤＮＡ３．１Ｄ−Ｖ５−Ｈｉｓ ＴＯＰＯベクター（Invitrogen）から発現させた。マウスＩＧＦ−１Ｒの配列を配列番号４６に記載する。
【０１６６】
完全長マカクザル属カニクイザル（Macaca fascicularis）ＩＧＦ−１Ｒの発現カセット作製
ＰＣＲによって、カニクイザルの腎臓ｃＤＮＡライブラリーから、カニクイザルＩＧＦ−１Ｒの新たな配列をクローン化した。プライマーは、ヒトＩＧＦ−１ＲデータベースエントリーＮＭ＿０００８７５に基づいていた。ＰＣＲプライマーは、５’末端にコザックモチーフと、フランキングＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ制限部位を用いて設計した。ｐＣＤＮＡ３．１Ｄ中に、ＩＧＦ−１Ｒコード配列の５’末端近位にベクターＴ７配列を用いて、ＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ ＰＣＲ生成物をクローン化した。得られたｃＤＮＡは、タンパク質レベルでヒト配列と９９．６％同一（ヒトとの差異４ａａ）である。カニクイザルＩＧＦ−１Ｒの配列を配列番号４５に記載する。
【０１６７】
完全長ヒトインスリン受容体（Ｂ型）の発現カセットの作製
ヒトインスリン受容体Ｂ型（配列番号５３）をコードするＤＮＡカセットをｐｃＤＮＡ３．１（Invitrogen）にクローン化した。比較として、以下の変化を除き、配列番号５３のコード配列は、Ｇｅｎｂａｎｋエントリー：Ｍ１００５１に示された配列と同一である。
【０１６８】
ヌクレオチドの番号付けは、開始メチオニン「Ａ」に基づいてヌクレオチド１にする（それは、Ｍ１００５１のヌクレオチド配列の位置１３９に相当する）。
【０１６９】
ヌクレオチド      アミノ酸        配列番号５３          Ｍ１００５１
511          171            TAC (Tyr)              CAC (His)
783          261            GAT (Asp)              GAC (Asp)
909          303            CAG (Gln)              CAA (Gln)
1343          448            ATC (Ile)              ACC (Thr)
1474          492            CAG (Gln)              AAG (Lys)
1638          546            GAC (Asp)              GAT (Asp)
1650          550            GCA (Ala)              GCG (Ala)
3834         1278            AAC (Asn)              AAG (Lys)
【０１７０】
標準プロトコルとリポフェクトアミン試薬（Invitrogen）を使用し、ヒト、マウス、およびカニクイザルのＩＧＦ−１Ｒ、ならびにヒトインスリン受容体Ｂ型のベクターを２９３ＨＥＫ−Ｔ細胞中で一過性発現させた。
【実施例４】
【０１７１】
ＢａｃＭａｍを使用する組換えタンパク質の発現および生成
ｐＦａｓｔＢａｃＭａｍベクター本体の構築
ｐＦａｓｔＢａｃ １（Invitrogen）をＳｎａＢＩおよびＨｐａ１により消化して、そのポリヘドリンプロモーターを取り除いた。これをｐｃＤＮＡ３（Invitrogen）の３．１ｋｂのＮｒｕＩ−Ｂｓｔ１１０７Ｉフラグメントと連結したが、このフラグメントは、ポリリンカーとＢＧＨポリＡ部位を有するサイトメガロウイルス前初期（ＣＭＶ ＩＥ）プロモーター、およびＧ４１８耐性遺伝子の発現を駆動するＳＶ４０プロモーターを含む。このベクターによって、哺乳動物細胞においてＣＭＶプロモーターの制御下に遺伝子を発現するバキュロウイルスを産生できるようになる。Ｇ４１８の選択下に細胞を置くことによって、安定した誘導体を選択することもできる。
【０１７２】
ヒトＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ融合タンパク質
Ｘａ因子切断部位とＩｇＧ１のヒトＦｃ配列に融合したヒトＩＧＦ−１Ｒ細胞外ドメイン配列を発現するように設計したプラスミドを構築した。ヒトＩＧＦ−１Ｒ ｃＤＮＡの細胞外ドメイン（アミノ酸１〜９３５）をコードする配列をＰＣＲによって増幅し、Ｘａ因子切断部位とヒトＩｇＧ１のＦｃ配列に融合した。次いで、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとして、挿入物全体をｐＦａｓｔＢａｃＭａｍ発現ベクター中にサブクローン化した。ヒトＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ融合タンパク質配列を配列番号４７に記載する。
【０１７３】
マカクザル属カニクイザル（Macaca fascicularis）ＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ融合タンパク質
Ｘａ因子切断部位とＩｇＧ１のヒトＦｃ配列に融合したカニクイザルＩＧＦ−１Ｒ細胞外ドメイン配列を発現するように設計したプラスミドを構築した。Ｘｂａｌで切断し再連結することによって、ベクター骨格の８２ｂｐのＸｂａｌフラグメントを除去し、ヒトＩＧＦ−１Ｒ発現プラスミドを改変した。これにより第２のＮｏｔＩ部位が除去される。カニクイザルＩＧＦ−１Ｒの細胞外ドメインのコード配列（アミノ酸１〜９３５）をＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩフラグメントとしてＰＣＲによって増幅し、そして改変ヒトＩＧＦ−１Ｒ発現プラスミド中に連結したが、このプラスミドはヒト配列を除去するためにＨｉｎｄＩＩＩとＮｏｔＩを用いて切断されている。マカク属カニクイザルＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ融合タンパク質の配列を配列番号４８に記載する。
【０１７４】
ＢａｃＭａｍを使用する組換えタンパク質の発現
Ｘａ因子切断部位とヒトＩｇＧ１のＦｃ配列に融合した、ヒトおよびマカクザル属カニクイザルＩＧＦ−１Ｒ細胞外ドメイン配列をコードするプラスミドベクターを使用して、ＢａｃＭａｍ系を使用するタンパク質の発現を行った。Invitrogen社製Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ系を使用し、バキュロウイルスを作製した。標準手順を使用して、初期ＰＯストックを計って１リットルＰ１ストックにした。ＨＥＫ２９３−Ｆ細胞を含む懸濁培養液１〜５リットルに、必要なＢａｃＭａｍウイルスを感染させることによって、タンパク質の産生を開始した（典型的には感染多重度（ＭＯＩ）１０対１００対１で行ったが、これは通常、タンパク質の産生を最大にするために最適化されている）。２〜３日培養後、細胞培養上清を採取し、遠心分離によって細胞を除去し、次いで清澄化した上清から発現したタンパク質を精製した。
【実施例５】
【０１７５】
ＩＧＦ−１Ｒリガンド発現プラスミドの構築
ＩＧＦ−Ｉ（アミノ酸４９〜１１８，Swiss-prot P01343）およびＩＧＦ−ＩＩ（アミノ酸２５〜９１，Swiss-prot P01344）のプロセシング形態の遺伝子配列は、大腸菌発現用に最適化したコドンであった。それら遺伝子は、重複するオリゴヌクレオチドの組み立て（build up）によって新たに調製し、pET-21b（Novagen）のNdeI−BamHI部位中にクローン化した。ビオチン標識ＩＧＦ−１Ｒリガンドを産生するために、Ｃ末端１５アミノ酸ビオチン標識タグ配列（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ，参照：Schatz (1993) Biotechnology (NY), 11(10):1138-43）配列番号１７を遺伝子の組み立てに加えた。
【０１７６】
ヒトＩＧＦ−ＩリガンドおよびＩＧＦ−ＩＩリガンド配列を、それぞれ配列番号４９および配列番号５１に記載する。
【実施例６】
【０１７７】
ＩＧＦ−１Ｒリガンドの発現および精製
プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞中で形質転換し、次いで１ｍＭ ＩＰＴＧにより３７℃で１６時間誘導した後、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地を使用し発現を行った。遠心分離によって細胞ペレットを採取した。細胞ペレットを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＤＴＴ中に再懸濁し、超音波処理によって溶解し、遠心分離によって封入体画分を回収することによって、ＩＧＦ−１Ｒリガンドを不溶性封入体として単離した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、６Ｍ塩酸グアニジンに封入体を可溶化し、次いで速やかに１００倍過剰容量の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１ｍＭの酸化グルタチオン、１ｍＭ還元グルタチオン中に希釈し、続いて４℃で１６時間混合することによって、可溶性ＩＧＦ−１Ｒリガンドを生成した。可溶性タンパク質を濃縮し、遠心分離して可溶性材料を除去し、次いでアセトニトリル勾配を用いるＳｐｈｅｒｉｓｏｒｂ Ｃ６カラム（Waters）を使用し、逆相ＨＰＬＣによって生物的に活性なＩＧＦ−１Ｒリガンドを精製した。
【０１７８】
ビオチン標識タグ付きＩＧＦ−１Ｒリガンド用に、精製タンパク質に、５ｍＭ ＡＴＰ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ｄ−ビオチン、および１μＭビオチンリガーゼを加えることによってビオチン標識を実施した。混合物を室温で３時間インキュベートした。Superdex７５カラム（GE Healthcare）を使用し、ビオチン標識ＩＧＦ−１Ｒリガンドをサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。精製ＩＧＦ−１ＲリガンドをＰＢＳに対して透析し、ＢＳＡ標準およびＢｉｏＲａｄクーマシーに基づくタンパク質アッセイを使用して定量し、次いでアリコートを−８０℃で保存した。精製タンパク質の分子量を質量分光法により検証した。ヒトタグ付きＩＧＦ−Ｉリガンドおよびタグ付きＩＧＦ−ＩＩリガンドの配列を、それぞれ配列番号５０および配列番号５２に記載する。
【実施例７】
【０１７９】
ハイブリドーマ可変ドメインのシーケンシング
QIAGEN社製ＲＮｅａｓｙキット（#74106）を使用し、各ハイブリドーマクローン用に、約１０６細胞のペレットから全ＲＮＡを抽出した。Ｐｒｏｍｅｇａ ＡｃｃｅｓｓＱｕｉｃｋ ＲＴ−ＰＣＲ系（A1702）を使用して、マウスリーダー配列およびマウスＩｇＧ１／ＫもしくはＩｇＧ２ｂ／Ｋ定常領域に特異的な縮重プライマーを用いて可変重鎖および軽鎖領域のｃＤＮＡを生成した。ＴＡクローニングキット（Invitrogen（K2030-40））を使用して、精製したＲＴ−ＰＣＲフラグメントをクローン化し、そして配列アラインメント、データベース探索、およびKABAT（Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)）に収載された公知の免疫グロブリン可変配列とのアラインメントにより、各ハイブリドーマ用にコンセンサス配列を得た。ハイブリドーマ６Ｅ１１、９Ｃ７、２Ｂ９、１５Ｄ９、および５Ｇ４の可変ドメインの配列表の番号を表１に示す。
【表１】
2010518140.tif 000002
【実施例８】
【０１８０】
キメラ抗体の構築
ヒトＩｇＧ１／κ野生型定常領域上に移植した親マウス可変ドメインを含むキメラ抗体をＰＣＲクローニングによって構築した。コンセンサス配列をベースとして、哺乳動物発現ベクター中へのクローニングを促進するのに必要な制限部位を組み込んで、マウス可変ドメインを増幅するためのプライマーを設計した。６Ｅ１１キメラ抗体（６Ｅ１１ｃ）の完全長重鎖および軽鎖を配列番号２４および配列番号２５に示す。
【実施例９】
【０１８１】
ヒト化方法
マウス６Ｅ１１抗体から得たＣＤＲ Ｈ１、ＣＤＲ Ｈ２、ＣＤＲ Ｈ３、ＣＤＲ Ｌ１、およびＣＤＲ Ｌ３、ならびにマウス９Ｃ７抗体から得たＣＤＲ Ｌ２を適切なヒトフレームワーク配列上に移植するプロセスによってヒト化抗体を作製した。
【０１８２】
Ｌ０のヒト化可変軽鎖ドメイン配列を（配列番号１６）に示す。
【０１８３】
Ｈ０およびＨ１のヒト化可変重鎖ドメイン配列を（それぞれ、配列番号１４および配列番号１５）に示す。これらの配列をコードする最適化ヌクレオチド配列を配列番号３４（Ｈ０）、３５（Ｈ１）、および３６（Ｌ０）に示す。別のＬ０およびＨ０可変ドメイン配列を、それぞれ配列番号６１および６２に示し、別のＬ０軽鎖およびＨ０重鎖配列を配列番号６９および７０に示す。
【０１８４】
ヒト化抗体ベクターの構築
ＰＣＲをベースとした方法と重複オリゴヌクレオチドを使用し、新たに、ヒト化可変重鎖および可変軽鎖領域をコードするＤＮＡフラグメントを構築した。それぞれ、ヒトγ１定常領域とヒトκ定常領域を含む哺乳動物発現ベクター中に、ＰＣＲ産物をクローン化した。これは、野生型Ｆｃ領域である。
【０１８５】
類似の方法を使用し、２個のアラニン置換Ｌ２３５ＡおよびＧ２３７Ａ（ＥＵインデックス番号付け）を含むヒトγ１定常領域の変異体上に、可変重鎖領域もクローン化した。本明細書では、これらの構築体をＩｇＧ１ｍ（ＡＡ）と称する。ＩｇＧ１ｍ（ＡＡ）変異体を含む２個のヒト化構築体をＨ０Ｌ０ ＩｇＧ１ｍ（ＡＡ）（配列番号５４および配列番号３９）、そしてＨ１Ｌ０ ＩｇＧ１ｍ（ＡＡ）（配列番号５６および配列番号３９）として記載する。
【０１８６】
特に明記しない限り、本明細書の実施例で使用した全てのヒト化構築体には、野生型ヒトγ１定常領域が含まれる。
【実施例１０】
【０１８７】
ＣＨＯ細胞での組換え抗体の発現
キメラまたはヒト化抗体の、それぞれ重鎖および軽鎖をコードする発現プラスミドを一過性にＣＨＯ−Ｋ１細胞中に共トランスフェクトした。ある場合には、結合および活性アッセイの試験対象として、その上清材料を使用した。別の場合には、その上清材料を滅菌ろ過し、プロテインＡを使用するアフィニティクロマトグラフィーによってその抗体を回収した。安定したポリクローナルＣＨＯ細胞系でも抗体を発現させた。重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡベクターをＣＨＯ細胞懸濁液に同時にエレクトロポレーションした。振盪フラスコでＭＲ１基礎選択培地中、３７℃、５％ＣＯ２、１３０〜１５０ｒｐｍで、細胞生存率および細胞数が向上するまで細胞を継代培養した。次いで、ＭＲ１基礎×２選択培地にＣＨＯ細胞を接種し、１０〜１４日間、３４℃、５％ＣＯ２、１３０〜１５０ｒｐｍでインキュベートした。遠心分離によって細胞をペレット化し、上清を滅菌ろ過した。プロテインＡ精製によって抗体を回収した。
【０１８８】
ハイブリドーマおよび／またはキメラｍＡｂおよび／またはヒト化Ｍａｂ間の比較データ
【実施例１１】
【０１８９】
受容体結合ＥＬＩＳＡ
６×Ｈｉｓ（Abcam，#ab9108）に対するウサギポリクローナル抗体を０．５〜１μｇ／ｍｌでコートしたＥＬＩＳＡプレート上に、０．４μｇ／ｍＬヒスチジンタグ付き組換えヒトＩＧＦ−１Ｒ（R&D Systems，#305-GR-050）を捕捉した。試験上清または精製材料からの抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体をプレートの全体に滴定した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートさせたヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Dako，P0260）もしくはヤギ抗ヒトκ軽鎖ペルオキシダーゼコンジュゲート（Sigma，A7164）によって処理することによって、受容体結合レベルを検出した。Ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）ペルオキシダーゼ基質（Sigma，P9187）を使用し、ＥＬＩＳＡを発色させた。
【０１９０】
図１は、マウス抗体６Ｅ１１、５Ｇ４、および１５Ｄ９の結合曲線を示す。図２は、Ｈ０Ｌ０およびＨ１Ｌ０、ならびにＨ０Ｌ０ ＩｇＧ１ｍ（ＡＡ）およびＨ１Ｌ０ ＩｇＧ１ｍ（ＡＡ）の結合曲線を示し、６Ｅ１１キメラと比較したとき、それらが類似の結合活性を有することが確認される。他のモノクローナル抗体を試験した（データ非掲示）。
【実施例１２】
【０１９１】
受容体下方調節
３Ｔ３／ＬＩＳＮ ｃ４細胞（ヒトＩＧＦ−１Ｒを発現するマウスＮＩＨ ３Ｔ３細胞系、Kalekoら，(1990) Molecular and Cellular Biology, 10 (2):464-473を参照）を５μｇ／ｍＬ抗体と共に３７℃で２４時間インキュベートした後、細胞を採取した。これらの細胞ペレットの溶解物をＳＤＳ ＰＡＧＥゲルで泳動し、ＰＶＤＦ膜に転写した（ウエスタンブロット）。ウサギ抗ＩＧＦ−１Ｒβ Ｃ−２０抗体（Santa Cruz Biotechnology, sc-713）で処理し、続いて抗ウサギＨＲＰとコンジュゲートさせた２次抗体（P0217）で処理し、増感化学発光（ＥＣＬ）試薬（GE Healthcare）を使用して検出することにより、ＩＧＦ−１Ｒを検出した。
【０１９２】
図３は、３Ｔ３／ＬＩＳＮ ｃ４細胞をモノクローナル抗体６Ｅ１１と共にインキュベーションすることによって、ＩＧＦ−１Ｒβ鎖が下方調節されることを示す。
【０１９３】
類似実験では、Ｈ０Ｌ０で処理した後、受容体レベルをＮＣＩ−Ｈ８３８細胞でアッセイした。ヒトＩＧＦ−１Ｒを発現するＮＣＩ−Ｈ８３８細胞（１×１０６／ウェル）を５μｇ／ウェルのＨ０Ｌ０と共に２４時間までの様々な時間でインキュベートした。次いで細胞を採取し、細胞ペレットを溶解し、ＳＩＤＳ ＰＡＧＥゲルで泳動し、ＰＶＤＦ膜に転写し、ウサギ抗ＩＧＦ−１Ｒβｃ−２０抗体（Santa Cruz，sc713）を使用してＩＧＦ−１Ｒでブロットした。結合を抗ウサギＨＲＰ抗体（Dako，PO217）により検出した。ウエスタンブロットのレーンは左から右へ、無抗体対照（２４時間目に採取）、次いで０、０．２、０．５、１、１．５、３、６、および２４時間目採取物である。図４は、Ｈ０Ｌ０が曝露から３０分（０．５時間）ほどの早い時期に分解を誘発するが、ＩＧＦ−１Ｒレベルが基礎レベルに達するためには３時間持続する曝露が必要であることを示す。別の実験では、ＩＧＦ−１Ｒ β鎖でウエスタンブロットすることにより測定したように、Ｃｏｌｏ２０５細胞と、６Ｅ１１親、６Ｅ１１キメラ、Ｈ０Ｌ０を含む様々な抗体との２４時間インキュベーションによって、受容体レベルがかなり低下した（データ非掲示）。
【０１９４】
追跡実験では、ＮＣＩ−Ｈ８３８肺癌細胞を治療ヒト化用抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体で処理した。ＮＣＩ−Ｈ８３８細胞を２４時間血清不足にし、そして未処理（対照）、または２４時間１２０ｎＭ Ｈ０Ｌ０、Ｈ０Ｌ０ ＩｇＧ１ｍ（ＡＡ）または非標的化ヒトＩｇＧ（対照）で処理した。細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、氷上で１０分間かけて１％ＮＰ４０溶解緩衝液により溶解し、４℃で１６４００ｒｐｍ、２０分間遠心分離することによって清澄にし、５０μｇの可溶性細胞タンパク質を４から１２％ポリアクリルアミドゲルでのＳＤＳ ＰＡＧＥ還元に供した。電気泳動後、タンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、ＩＧＦ−１Ｒまたはインスリン受容体でイムノブロットした。各レーンにおける添加量を評価するために、α−チューブリンでも膜をイムノブロットした。蛍光標識付き２次抗体を使用し、LI COR Odysseyイメージング装置を用いて、ＩＧＦ−１Ｒ、インスリン受容体、およびα−チューブリンの量を定量した。使用した１次および２次抗体は、Ａｌｅｘａ６８０、ヤギ抗ウサギ、分子プローブ＃Ａ−２１０７６から選択した。使用１／２００００＝０．５ｍｌ／１０ｍｌ（２５℃で４５分間）、ＩＲＤｙｅ８００、ロバ抗マウス、Ｒｏｃｋｌａｎｄ＃６１０−７３２−１２４。使用１／１００００＝１ｍｌ／１０ｍｌ（２５℃で４５分間）およびＩＲＤｙｅ８００、ロバ抗ウサギ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ＃６１１−７３２−１２７。使用１／１００００＝０．５ｍｌ／５ｍｌ（２５℃で４５分間）。
【０１９５】
ＩＧＦ−１Ｒの９７ｋＤａのβサブユニット、および２００ｋＤａの完全長ＩＧＦ−１Ｒ、インスリン受容体の９５ｋＤａのβサブユニット、および２００ｋＤａ完全長インスリン受容体、ならびに５０ｋＤａのα−チューブリンを図５に示す。ヒト化抗体とのインキュベーションの結果、ＩＧＦ−１Ｒレベルが著しく低下した。対照抗体で処理した試料に比べて約８０％低下した（図５）。これには、インスリン受容体レベルの低下も同時に生じたが、これはおそらくＩＧＦ−１Ｒ／インスリン受容体ヘテロ二量体の分解のためである可能性が高い。
【０１９６】
ＬＩＳＮ／３Ｔ３ ｃ４細胞での受容体下方調節もまた、全血（赤血球枯渇）についてＦＡＣＳベースのアッセイを使用し実証した。Ｈ０Ｌ０を１ドナー（ドナー９０２６３）からの全血試料に、４℃または３７℃で２４時間加えた。図６は、顆粒球およびリンパ球集団（前方および側方散乱プロフィールを使用してゲート）の４℃（実線）および３７℃（点線）での蛍光強度を重ね合せたヒストグラムを示す。インキュベーション後、ＰＥ標識した抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体１Ｈ７（BD Pharmingen，#555999）を使用し、受容体レベルを評価した。別の実験では、別のドナー（ドナー９０６９１）からの全血試料に、Ｈ０Ｌ０または対照ＩｇＧを４℃または３７℃で２４時間加えた。図７は、アイソタイプ対照と比較して、顆粒球集団の４℃および３７℃での蛍光強度を重ね合せたヒストグラムを示す。両ドナーにおいて、３７℃で２４時間インキュベーションすると、同じ細胞系の４℃でのインキュベーションと比較して、平均蛍光強度の顕著な減少が引き起こされた。数体の他のドナーの全血試料でアッセイを繰り返して類似の全体的効果が得られたが、受容体発現および下方調節の大きさはドナーごとに異なった。少数のドナーは、受容体の発現が非常に低く、抗体とのインキュベーションに影響を受けなかった。
【実施例１３】
【０１９７】
ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−ＩＩ刺激受容体リン酸化の阻害
９６ウェルプレートに３Ｔ３／ＬＩＳＮ ｃ４細胞を１００００細胞／ウェルの密度で播種し、完全ＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ−Ｈｅｐｅｓ改変＋１０％ＦＣＳ）中で１〜２日間増殖させた。抗ｈＩＧＦ−１Ｒ抗体（ハイブリドーマ上清または精製抗体）を細胞に加え、１時間インキュベートした。３０〜５０ｎｇのｒｈＩＧＦ−１（R&D Systems 291-G1）、または５０ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＧＦ−Ｉ（実施例５および６を参照）、または１００ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＧＦ−２（R&D Systems 292-G2）（実施例５および６を参照）を処理細胞に加え、受容体のリン酸化を刺激するために、さらに２０〜３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで一度洗浄し、次いでＲＩＰＡ溶解緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ、６ｍＭ デオキシコール酸Ｎａ、１％Ｔｗｅｅｎ２０）＋プロテアーゼインヒビターカクテル（Roche 11 697 498 001）を加えることによって溶解した。プレートを３０分間または終夜凍結させた。解凍後、抗ＩＧＦ−１Ｒ捕捉抗体（R&D Systems，MAB391）を２μｇ／ｍｌで予めコートした９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに、各ウェルの溶解物を移し、４％ＢＳＡ／ＴＢＳでブロッキングした。いくつかの実験では、別の捕捉抗体を使用した（２Ｂ９ 配列番号１０および１１を１μｇ／ｍｌでコート）。プレートを４℃で終夜インキュベートした。プレートをＴＢＳＴ（ＴＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄し、４％ＢＳＡ／ＴＢＳで１／２５００に希釈したユーロピウム標識抗ホスホチロシン抗体（PerkinElmer DELFIA Eu-N1 PT66）を各ウェルに加えた。１時間のインキュベーション後、プレートを洗浄し、ＤＥＬＦＩＡ増強（PerkinElmer 1244-105）液を加えた。１０分間のインキュベーション後、ユーロピウム時間分解蛍光（ＴＲＦ）を測定するために、プレートリーダー設定を使用して受容体リン酸化レベルを測定した。
【０１９８】
図８は、精製マウスモノクローナル抗体６Ｅ１１、５Ｇ４、および１５Ｄ９によって媒介される受容体リン酸化阻害の例を示し、異なるプレートについての同時に実施した実験についてデータを並置した。
【０１９９】
図９は、キメラ６Ｅ１１抗体（６Ｅ１１ｃ）と比較して、Ｈ１Ｌ０によって媒介される受容体リン酸化阻害の例を示す。
【０２００】
図１０は、野生型ＩｇＧ１ Ｆｃ領域および置換ＩｇＧ１ Ｆｃ領域（ＩｇＧ１ｍ（ＡＡ））と関連して、Ｈ０Ｌ０およびＨ１Ｌ０によって媒介される受容体リン酸化阻害の例を示す。
【０２０１】
類似の方法を使用する別の実験セットでは、受容体リン酸化阻害のＩＣ５０値を取得し、ヒト化および６Ｅ１１マウス親抗体が、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩによって媒介される受容体リン酸化阻害について同等のプロフィールを示すことを確認している（表２）。
【表２】
2010518140.tif 000003
【０２０２】
類似の方法を使用する別の実験セットでは、受容体リン酸化阻害のＩＣ５０値を取得し、ヒト化抗体Ｈ０Ｌ０およびマウス親抗体６Ｅ１１が同等の活性を示すことを確認している。並行して、ヒトインスリン受容体を発現するように設計した３Ｔ３細胞系を使用し、インスリン受容体に対する抗体活性を試験した。この実験では、その抗体のいずれも、インスリンが誘発する受容体のリン酸化を阻害しなかった。
【０２０３】
2010518140.tif 000004
【実施例１４】
【０２０４】
競合ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡプレートに、抗ヒトＩＧＦ−１Ｒアンタゴニスト抗体（MAB391，R&D Systems）を２μｇ／ｍｌでコートし、４％ＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキングした。精製モノクローナル抗体の存在下、ポリＨｉｓタグ付き組換えヒトＩＧＦ−１Ｒ（R&D Systems #305-GR）を４００ｎｇ／ｍｌで加え、室温で１時間インキュベートした。プレートをＴＢＳＴ（ＴＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄した後、ＨＲＰ標識抗ポリｈｉｓ抗体（Sigma A7058-1 VC）を１２〜３０μｇ／ｍｌで添加した。プレートを１時間インキュベートした後、さらに洗浄し、ＯＰＤ基質（Sigma P9187）で発色させた。２Ｍ硫酸を加えることによって反応を停止し、吸光度を４９０ｎｍで測定した。
【０２０５】
図１１Ａは、競合ＥＬＩＳＡでの様々な精製マウスモノクローナル抗体の活性の例を示す。同時に行った実験についてデータを並置した。
【０２０６】
図１１Ｂは、６Ｅ１１キメラ（６Ｅ１１ｃ）と比較して、競合ＥＬＩＳＡでのＨ１Ｌ０の活性の例を示す。同時に行った実験についてデータを並置した。
【０２０７】
図１２Ａは、マウス親抗体（６Ｅ１１）およびキメラ（６Ｅ１１ｃ）と比較して、競合ＥＬＩＳＡでの様々な精製ヒト化抗体の活性の例を示す。図１２Ａでは、図１２Ｂおよび１２Ｃに示す反復アッセイと比較して、Ｈ０Ｌ０およびＨ０Ｌ０ ＩｇＧ１ｍ（ＡＡ）のシグナルの増大が示された。
【０２０８】
図１２Ｂ、Ｃは、競合ＥＬＩＳＡでの様々な精製ヒト化抗体の活性の例を示す。
【実施例１５】
【０２０９】
カニクイザルＩＧＦ−１Ｒ結合ＥＬＩＳＡ
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに組換えカニクイザルＩＧＦ−１Ｒ（実施例４を参照）を１〜２μｇ／ｍｌで終夜コートし、４％ＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキングした。精製抗ｈＩＧＦ−１Ｒ抗体を加え、室温で１時間インキュベートした。プレートをＴＢＳＴで洗浄し、ＨＲＰとコンジュゲートさせた抗マウスＩｇ（DAKO #P0260）を０．６〜１．０μｇ／ｍｌで各ウェルに加えた。プレートを室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳＴで洗浄し、ＯＰＤ基質（Sigma P9187）もしくはＴＭＢ基質（Sigma T8665）で発色させた。反応を２Ｍ硫酸で停止し、（ＯＰＤには）４９０ｎｍで、（ＴＭＢには）４５０ｎＭで吸光度を測定することによって結合レベルを測定した。ヒトＩｇＧ１／Ｃκ定常領域を含む抗体については、ＨＲＰとコンジュゲートさせた抗マウスＩｇ検出抗体をヤギ抗ヒトκ軽鎖ペルオキシダーゼコンジュゲート（Sigma，A7164）に置き替えた。
【０２１０】
図１３Ａは、組換えカニクイザルＩＧＦ−１Ｒに対する精製マウスモノクローナル抗体の結合の例を示す。同時に行った実験についてデータを並置した。
【０２１１】
図１３Ｂは、６Ｅ１１キメラ（６Ｅ１１ｃ）と比較した、組換えカニクイザルＩＧＦ−１Ｒに対する精製ヒト化モノクローナル抗体の結合の例を示す。
【実施例１６】
【０２１２】
インスリン受容体結合ＥＬＩＳＡ
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを組換えヒトインスリン受容体（R&D Systems 1544-IRを０．５μｇ／ｍｌで終夜コートし、４％ＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキングした。精製抗ｈＩＧＦ−１Ｒ抗体またはマウス抗ヒトインスリン受容体抗体（R&D Systems MAB15441）をプレートに加え、室温で１時間インキュベートした後、ＴＢＳＴで洗った。ＨＲＰとコンジュゲートさせた抗マウスＩｇ（DAKO #P0260）を４％ＢＳＡ／ＰＢＳで１／５００または１／２０００にしたものを各ウェルに加え、プレートを１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ＴＭＢ基質（Sigma T8665）またはＯＰＤ（Sigma P9187）を加えることによって発色させた。反応を２Ｍ硫酸で停止し、４５０ｎｍまたは４９０ｎｍで吸光度を測定することによって結合を検出した。ヒトＩｇＧ１／Ｃκ定常領域を含む抗体を検出するために、上掲の検出抗体（ＨＲＰとコンジュゲートさせた抗マウスＩｇ）をヤギ抗ヒトκ軽鎖ペルオキシダーゼコンジュゲート（Sigma，A7164）に置き替えた。
【０２１３】
図１４は、精製マウスモノクローナル抗体を使用するインスリン受容体結合ＥＬＩＳＡの例を示す。陽性対照抗体（R&D Systems，MAB15441）とは対照的に、精製抗体６Ｅ１１、５Ｇ４、および１５Ｄ９は、１０μｇ／ｍｌまでの濃度ではインスリン受容体との結合が見られなかった。実験のデータを並置した。
【０２１４】
別の実験では、類似の方法を使用し、様々なヒト化抗体のインスリン受容体結合プロフィールを試験した。陽性対照抗体（R&D Systems，AF1544）は良好な結合を示したが、５０μｇ／ｍｌまでの濃度では、ヒト化抗体と組換えインスリン受容体との結合は検出できなかった（図１５）。
【実施例１７】
【０２１５】
結合動力学の測定
ヒトＩＧＦ−１Ｒに対する抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合動力学は、ＢｉａｃｏｒｅＴＭシステムを使用して評価した。抗体捕捉法を使用し、動力学的分析を実施した。簡単に説明すると、マウス親抗体の分析に抗マウスＩｇＧ抗体（Biacore，カタログ番号BR-1005-14）を使用し、ヒト化抗体にはプロテインＡを使用した。ＢｉａｃｏｒｅＴＭ標準プロトコルに従い、機器ソフトウェアに付随する固定化Ｗｉｚａｒｄ設備を使用し、一級アミンのカップリングによって、ＣＭ５ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒチップ上に、抗マウス抗体またはプロテインＡを固定した（通常固定した場合、３０００〜４０００共鳴単位（ＲＵ）のレベル）。次いで、ハイブリドーマ上清から直接、または精製材料から抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体を捕捉した。上清の捕捉レベルは、ハイブリドーマの開始濃度に依存し、これらは約２０ＲＵ〜６５０ＲＵの間で変動した。精製材料には、試験抗体の捕捉レベルは一般的に２０〜６００ＲＵであった。捕捉後、組換えＩＧＦ−１Ｒ前に基線を安定させ、次いでR&D Systems社製ヒスチジンタグ付き材料（カタログ番号305-GR）を所定の濃度（通常０〜２５６ｎＭの範囲）で表面に流した。相互作用の親和性が高いので、最長１時間までの解離時間を使用した。１００ｍＭ リン酸または１０ｍＭ グリシン（ｐＨ１．５）を使用する酸溶出によって再生を行った。再生は、別の分析ステップで抗体を捕捉するための表面能力にあまり影響を与えなかった。実施は２５℃および３７℃で実施した。実験は、Ｔ１００ ＢｉａｃｏｒｅＴＭシステムでＴ１００対照および分析ソフトウェアを使用し実施した。実験データは、その機器分析ソフトウェアに付随する１：１結合モデルに適合させた。
【０２１６】
表３〜７は、上清および精製材料で実施した一連の実験を示す。
【表３】
2010518140.tif 000005
【０２１７】
【表４】
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【０２１８】
【表５】
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【０２１９】
【表６】
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【０２２０】
【表７】
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【０２２１】
別の実験では以下の手法を使用した。製造業者の標準プロトコルに従って、一級アミンカップリングにより、プロテインＡをＣＭ５表面上に固定した。ＩＧＦ−１Ｒに対する抗体をこの表面に捕捉し、ある時間安定化させた後、組換えヒトもしくはカニクイザルＩＧＦ−１Ｒをこの捕捉した表面に注入した。一般的に、使用したＩＧＦ−１Ｒの濃度は２５６〜１６ｎＭであったが、Ｂｉａｃｏｒｅ動力学的分析を最良で実施するために、二重基準用に０ｎＭ注入（緩衝液のみ）も使用した。データは、Ｂｉａｃｏｒｅ機器に付随する１：１モデルを使用して分析し、Ｔ１００においてＨＢＳ−ＥＰランニング緩衝液を使用して３７℃で作業を実施した。ヒト化変異体Ｈ０Ｌ０およびＨ０Ｌ０ ＩｇＧ１ｍ（ＡＡ）は、組換えヒトおよびカニクイザルＩＧＦ−１Ｒに対して高親和性結合（約３００〜６００ｐＭ）を示し、６Ｅ１１キメラと同等の動力学を示すという結果が確認されている。
【表８】
2010518140.tif 000010
【０２２２】
Ｈ０Ｌ０、Ｈ０Ｌ０ ＩｇＧ１ｍ（ＡＡ）および６Ｅ１１キメラが、同等の結合動力学を示すことを確認する類似の実験を実施した。しかし、全体的親和性は、前の全ての実験（それぞれ１．８８、１．８４、および１．５２ｎＭ）のものよりも低かった。明白な差異の理由は不明である。
【実施例１８】
【０２２３】
Ｂｉａｃｏｒｅを使用して定量したリガンド結合の阻害
２種の異なる密度の捕捉ビオチン標識ＩＧＦ−Ｉの使用して実験を実施した。簡単に説明すると、ストレプトアビジンセンサーチップ上に、２００または４０００ＲＵを安定して捕捉した。抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の中和能力を試験するために、異なる濃度の抗体を固定濃度の組換えＩＧＦ−１Ｒと予め混合した。対照として、ビオチン標識していないＩＧＦ−１も同じ濃度のＩＧＦ−１Ｒと混合した。次いで、この混合物をＩＧＦ−Ｉ表面に流し、最大の会合点を測定した。次いで、この読取り値を、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の非存在下における同じ濃度のｈｉｓタグ付きＩＧＦ−１Ｒを含む試料と比較した。中和抗体の存在によって、ＩＧＦ−１ＲとＩＧＦ−Ｉの結合がブロックされ、観察される最大の会合が減少した。値を比較することによって阻害率（％）を算出した。４Ｍ塩化マグネシウム添加を２回使用し、再生を実施した。Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００装置で実験を実施した。
【０２２４】
表９および１０に、得られた阻害率と、さらにこれらの結果を得るために使用した抗体ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−１Ｒの濃度の詳細を示す。
【表９】
2010518140.tif 000011
【０２２５】
【表１０】
2010518140.tif 000012
【０２２６】
別の実験では、捕捉したビオチン標識リガンド（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−２）を使用し、リガンド結合を直接ブロックするヒト化抗体の能力をＢｉａｃｏｒｅに基づく方法を使用して評価した。ストレプトアビジン（strepavidin）バイオセンサーチップ上に、ビオチン標識ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２を、それぞれ、約３００ＲＵおよび３５０ＲＵで固定した。ＩＧＦ−１Ｒを５０ｎＭ単独で、または２５０ｎＭの抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体（ＩＧＦ−Ｉ実験用）もしくは５００ｎＭの抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体（ＩＧＦ−２実験用）を含む５０ｎＭ事前混合液でその表面に流した。天然リガンドＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２（どちらもビオチン非標識）の存在下で、ＩＧＦ−１Ｒ結合も実施した。１００ｍＭリン酸を使用して表面を再生した。Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００で、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液を使用して２５℃で実験を実施した。注意：ＩＧＦ−２アッセイデータの分析は、その抗体のいくつかが、ＩＧＦ−２表面単独と非特異的結合を示したことによって複雑になった。固定化された（immobolised）ＩＧＦ−Ｉについて、最も効率的な受容体結合阻害薬は、非標識ＩＧＦ−Ｉであり、ＩＧＦ−２およびＨ０Ｌ０は約６０％の阻害を示した（表１１）。固定したＩＧＦ−２については、最も効率的な受容体結合阻害薬は非標識ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−２であった。このアッセイでは、Ｈ０Ｌ０を含む中和抗体によって、ＩＧＦ−２結合の部分的阻害が示された（表１１）。
【表１１】
2010518140.tif 000013
【実施例１９】
【０２２７】
蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）分析
ＦＡＣｓ緩衝液（４％ ＦＣＳ／ＰＢＳ）中１０μｇ／ｍｌの抗ｈＩＧＦ−１Ｒ精製抗体で１時間かけてＣｏｌｏ２０５細胞（２×１０７細胞／ｍｌ）を染色した。好適な陰性対照マウス抗体（Sigma #15154）でも細胞を染色した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、次いで抗マウスＩｇＧ ＰＥ２次抗体を１：１００（Sigma P8547）で用いて染色した。ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、Ｃｅｌｌ Ｆｉｘ（Becton Dickinson）で固定した後、細胞をフローサイトメトリーにより分析した。
【０２２８】
図１６は、抗体６Ｅ１１が、ヒト腫瘍細胞系の表面に自然に発現したＩＧＦ−１Ｒを認識できることを実証している。
【０２２９】
別の実験では、ＩＧＦ−１Ｒを過剰発現することが知られている様々なヒト腫瘍細胞系を染色する能力について、ヒト化抗体を試験した。ＮＣＩ−Ｈ８３８肺癌細胞を、選択した抗体１００μｇ／ｍｌにより４℃で４５分間で染色した。ＰＥとコンジュゲートさせた抗ヒトＩｇＧ抗体（Sigma P8047）で結合を検出した。Becton Dickinson FACscanサイトメーターを使用し、試料をフローサイトメトリーにより分析した。図１７に示す結果から、ヒト化変異体がＮＣＩ−Ｈ８３８に結合できることが確認される。同様の結果は、ＭＣＦ７乳癌細胞およびＡ５４９肺癌細胞でも得られている（図１８）。
【実施例２０】
【０２３０】
凍結組織切片での免疫組織化学
スライドガラスに組織切片をのせ、アセトンで２分間固定し、次いで自動スライド染色機（Dako Cytomation S3400）に装填した。次いで、スライドをブロッキングし、標準的免疫化学染色法を使用し、マウス抗体（１次抗体）および抗マウスＩｇ−ＨＲＰ２次抗体（DakoCytomation Envision Kit）で染色した。この２次インキュベーション後、スライドを洗浄し、DakoCytomation Envision DAB溶液を使用して発色させ、すすぎ、脱水し、観察するためにカバーガラスを載せた。非関連対照抗体（ＭＯＰＣ２１ハイブリドーマから精製したマウスＩｇＧ１）を陰性対照として使用した。
【０２３１】
同様に、ヒト化およびキメラ抗体を分析したが、検出を促進するためにこれらの抗体をビオチン標識したことを除く。しかし、ビオチンタグの存在は、ＥＬＩＳＡによって測定されるこれらの抗体の活性を減少させることが判明し（データ非掲示）、従って使用した１次抗体の濃度を１００μｇ／ｍｌまで増やした。上掲の２次抗体（DakoCytomation Envision Kit−抗マウスＩｇ−ＨＲＰコンジュゲート）をストレプトアビジン−ＨＲＰ（DakoCytomationカタログ番号1016）に置き替えた。別の非関連抗体もビオチン標識し、陰性対照として使用した（Sigma #15154）。
【０２３２】
以下のように試料を分析した。較正キャリア（#69935000、05041103097）を使用して機器を較正した後、スライドをＣｈｒｏｍａＶｉｓｏｎ自動細胞イメージング装置に装填し、１０倍でスキャンした。データ分析を実施して組織染色率（％）を算出した（茶褐色／茶褐色＋青色＊１００として定義）。
【０２３３】
図１９および２０は、６Ｅ１１がヒト腫瘍組織試料を染色することを示している。基準として陽性対照抗体を含めた（Abcam、#4065）。
【０２３４】
図２１は、６Ｅ１１キメラ（６Ｅ１１ｃ）およびＨ１Ｌ０が、ヒト腫瘍組織試料を染色することを示している。
【０２３５】
別個の実験では、Cytomyxxから入手した凍結組織マイクロアレイ（アレイＩＤ：ＭＢ−１００２）を使用し、ヒト腫瘍組織試料上のヒトＩＧＦ−１Ｒを認識するヒト化Ｈ０Ｌ０の能力について試験した。このアレイには、１０の肺腫瘍コア、１０の乳房腫瘍コア、１０の結腸腫瘍コア、および１０の前立腺腫瘍コアが含まれている。Ｈ０Ｌ０をビオチン標識して検出を促進した。凍結マイクロアレイスライド（Ｃｙｔｏｍｙｘｘ ＭＢ−１００２）をアセトン／エタノール（５０：５０）の４℃溶液により５分間かけて固定し、洗浄し、次いで３％過酸化水素により５分間処理して、いかなる内在性ペルオキシダーゼも除去した。スライドを７．０μｇ／ｍｌのビオチン標識抗ＩＧＦ−１Ｒ Ｈ０Ｌ０で室温で１時間かけて染色した。洗浄後、ストレプトアビジンペルオキシダーゼを２０分間適用し、ＤＡＢ（ジアミノベンジジン）で２分間かけて可視化した。最後に、切片を洗浄し、Ｍａｙｅｒヘマトキシリンで対比染色し、水道水ですすぎ、脱水し、清澄にし乗せた。腫瘍試料は次の通りである：肺（右図：扁平細胞腫瘍、左図：腺癌）；乳房（右図：腺癌、導管上皮、左図：腺癌、浸潤性）；結腸（右図：高分化腺癌、左図：高分化腺癌）；前立腺（右図：腺癌、左図：腺癌）。
【０２３６】
結果から、表１２にまとめるように、Ｈ０Ｌ０は、生存切片を中程度／高度に染色したことが確認される。肺、乳房、結腸、および前立腺腫瘍の代表的な高倍率像（２００倍）を図２２に示すが、ビオチン標識Ｈ０Ｌ０抗体が上皮細胞を広く染色することが確認される。
【表１２】
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【実施例２１】
【０２３７】
ＡＫＴシグナル伝達の阻害
Costar社製９６ウェルプレート（#3598）をゼラチン２％を含むＰＢＳ溶液５０μｌでコートし、３７℃のインキュベーターで少なくとも一時間インキュベートした。使用前に、プレートをＰＢＳで一度すすいだ。一次ヒト前脂肪細胞をトリプシン処理し、遠心分離し、培地をサイホンで吸い上げ除去した。１０ｍｌの暖めた前駆脂肪細胞増殖培地（ZenBio、#PM-1）に細胞を再懸濁した。細胞密度は、前駆脂肪細胞増殖培地（ZenBio）１ｍｌ当たり１５０，０００細胞に調整した。培地５０ｍｌを含むT225 Costarフラスコ２個それぞれに、１００万細胞を播種した。Multidrop 384または類似の機器を利用し、残りの細胞を使用して、ゼラチンをコートした９６ウェルプレートに播種した（１００μｌ＝１５，０００細胞／ウェル）。細胞を３７℃、５％ＣＯ２雰囲気、９０％湿度中で終夜インキュベートした。翌日、培地を除去し、誘導培地２００μｌを加え、プレートをBreath-Easy気体透過性フィルム（Sigma #Z380059）で覆った。プレートを３７℃、５％ＣＯ２雰囲気、９０％湿度中で６日間インキュベートした。６日後、培地を吸引し分化培地２００μｌを加えた。プレートをBreath-Easy気体透過性フィルムで覆い、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気、９０％湿度中で７日間インキュベートした。細胞分化後、培地を吸引し、細胞を２００μＬのＰＢＳで一度漱いだ。脂肪細胞飢餓培地７５μｌを加え、プレートを被覆し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気、９０％湿度中で終夜インキュベートした。試験試料を終濃度の４倍の脂肪細胞飢餓培地で希釈した。２５μＬの希釈試験化合物を各ウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。ＩＧＦ−Ｉリガンド（R&D Systems，#291-G1）を脂肪細胞飢餓培地で３０ｎＭに希釈し、２０μＬの３０ｎＭ ＩＧＦ−Ｉを各ウェルに加えた（終濃度５ｎＭ）。シンク中に培地を垂らし落とす（flicking）ことによって上清を除去した時間の後、プレートを３７℃で正確に５分間インキュベートした。プレートをペーパータオル上で乾燥した。
【０２３８】
完全溶解緩衝液（ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害薬を含むＭＳＤ溶解緩衝液）６５μｌを各ウェルに加え、加熱式プレートシーラーでプレートを密封した。プレートを−８０℃で貯蔵（後の分析用）するか、または室温で１５分間シェーカー（約５００ｒｐｍ）上に置いた後、ＭＳＤアッセイを実施した。
【０２３９】
リン酸化ＡＫＴ（ｐＳｅｒ４７３）のレベルは、ＭＳＤリン酸化アッセイキット（#K111 CAD）を使用し評価した。簡単に説明すると、１５０μＬ／ウェルのブロッキング液（ＭＳＤ Ｔｒｉｓ洗浄緩衝液に溶解したＭＳＤブロッカーＡ）をＭＳＤアッセイプレートの各ウェルに加えた。プレートを密封し、ベンチトッププレートシェーカーを使用してシェーカー上に３００ｒｐｍで室温で１時間置いた。ブロッキング液をＭＳＤプレートから除去し、プレートを１×ＭＳＤ Ｔｒｉｓ洗浄緩衝液２００μＬ／ウェルで４回洗浄した。細胞プレートから５０μＬ／ウェルの細胞溶解物をＭＳＤプレートの対応するウェルに移し密封した。ベンチトッププレートシェーカーを使用し、プレートを３００ｒｐｍで室温で１時間振盪した。１×ＭＳＤ Ｔｒｉｓ洗浄緩衝液（ELx405）を使用し、ＭＳＤプレートを２００μＬ／ウェルで４回洗浄した。
【０２４０】
希釈した検出抗体混合物（終濃度１０ｎＭ）２５μＬをＭＳＤプレートの各ウェルに加えた。ベンチトッププレートシェーカーを使用し、プレートを３００ｒｐｍで室温で１時間振盪し、次いで１×ＭＳＤ Ｔｒｉｓ洗浄緩衝液（ELx405）を使用し２００μＬ／ウェルで４回洗浄した。界面活性剤を含む読み取り緩衝液Ｔ（Read Buffer T）１５０μＬを各ウェルに加え、MSD 6000 SECTORリーダーでプレートを読み取った。シグナル強度は時間と共に読み取り緩衝液で減少したが、シグナルウインドウ（signal window）は典型的には約２０〜３０分間安定したままだった。
【０２４１】
表１３は、３個の独立したプレートのデータのまとめを示し、精製マウス親、キメラ、およびヒト化ＭａｂがＡＫＴリン酸化のＩＧＦ−Ｉ媒介誘導を阻害することを示す。プレート１および２は並行して実施した。別の日にプレート３を実施した。値は、ｐＩＣ５０（＝−ｌｏｇ１０（ＩＣ５０）（ｇ／ｍｌ））で表す。
【表１３】
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【０２４２】
２回の別の実験では、ＩＧＦ−Ｉまたはインスリン刺激に応答してのＡＫＴリン酸化の阻害について、様々なヒト化抗体を試験した。表１４に示すＩＧＦ−Ｉの結果について、値は平均ｐＩＣ５０［ｇ／ｍｌ；ｐＩＣ５０＝−ｌｏｇ１０（ＩＣ５０）］として表す。Ｖｍａｘ＝リガンド非存在下でのシグナルの割合（％）として表す最大阻害。実験１は４回の実施の平均である。実験２は３回の実施の平均である。実験１および２は、約６ヵ月の間を空けて実施した。いくつかの抗体（＊＊Ｈ０Ｌ０）に、異なるバッチの材料を並行して試験した。陰性対照抗体と比較。全ての抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、ヒト化抗体Ｈ０Ｌ０によるＡＫＴリン酸化の用量依存性阻害を示し、６Ｅ１１マウス親抗体または６Ｅ１１キメラ抗体と同等の活性が示された（表１４）。
【表１４】
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【０２４３】
本アッセイ系は、（インスリン受容体を介する）インスリンが媒介するＡＫＴのリン酸化に対しても感受性であったので、インスリンシグナル伝達に与えるヒト化抗体の影響を上記ＩＧＦ−Ｉ実験と平行して評価した。ＩＧＦ−Ｉ刺激による結果とは対照的に、ヒト化抗体では、陰性対照抗体で観察された非特異的影響（データ非掲示）を超えて上回る、インスリン受容体シグナル伝達の阻害は示されなかった。これらの結果は、２回の独立した実験で観察された（全部で７回実施）。
【実施例２２】
【０２４４】
ＭＣＦ７細胞を用いた増殖アッセイ
ＭＣＦ−７細胞（ATCC HBT-22）を９６ウェルプレートに１００００細胞／ウェルの密度で播種し、完全培地（ＭＥＭ＋Earles塩＋１０％ＦＣＳ＋０．１ｍｇ／ｍｌウシインスリン（Sigma 10516））中で２日間増殖させた。細胞を洗浄し、血清不含ＭＥＭ（無血清、無インスリン）で４時間インキュベートした。培地を除去し、血清不含培地（１００μｌ／ウェル）で希釈したある範囲の濃度の精製抗体（０．０１４〜１０μｇ／ｍｌ）に置き換えた。細胞を１時間インキュベートした後、ＩＧＦ−Ｉ（R&D Systems #291-G1）をさらに添加して終濃度５０ｎｇ／ｍｌにした。全ての処理を三連で実施した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で５日間インキュベートした。インキュベーション後、ＭＴＴ色素溶液（Promega #G402A）１５μｌを各ウェルに加え、プレートをさらに４時間インキュベートした。停止／可溶化（Solublisation）溶液（Promega #G401A）１００μｌを各ウェルに加え、プレートを室温で終夜静かに振盪した。翌日、プレートリーダーを使用し、５７０ｎｍで吸光度を測定することによって増殖レベルを測定した。
【０２４５】
図２３に、腫瘍細胞の増殖を阻害する様々な精製マウスモノクローナル抗体の活性を示す。実験についてデータを並置した。
【実施例２３】
【０２４６】
増殖アッセイ−ＬＩＳＮ細胞
ＬＩＳＮ細胞（３Ｔ３ ｈＩＧＦ−１Ｒ）を白色壁９６ウェルプレート（Corning 3610）中に１００００細胞／ウェルの密度で播種し、完全培地（改変ＤＭＥＭ−Ｈｅｐｅｓ＋１０％ＦＣＳ）で１日間増殖させた。培地を除去し、細胞を血清不含ＤＭＥＭで４時間インキュベートした。培地を除去し、血清不含培地（５０μｌ／ウェル）で希釈したある範囲の濃度（０．００４１〜３μｇ／ｍｌ終濃度）の精製抗体に置き換えた。細胞を１時間インキュベートした後、さらに５０μｌ／ウェルのＩＧＦ−１（R&D Systems 291-GlまたはＩＧＦ−Ｉ；実施例５および６参照）を加えて、終濃度５０〜６０ｎｇ／ｍｌにした。全ての処理を三連で実施した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で０〜３日間インキュベートした。インキュベーション後、１００μｌの新たに調製したPromega社製CellTitre-Glo試薬（Promega G7571）を各ウェルに加え、プレートを２分間振盪した。プレートをさらに室温で１０分間インキュベートしてシグナルを安定させた後、発光シグナルをWallac Victorプレートリーダーで測定した。
【０２４７】
図２４および図２５Ａ〜Ｅは、精製６Ｅ１１マウスモノクローナル抗体、６Ｅ１１ｃ Ｈ０Ｌ０、およびＨ０Ｌ０ ＩｇＧ１ｍ（ＡＡ）、ならびにＨ１Ｌ０、およびＨ１Ｌ０ ＩｇＧ１ｍ（ＡＡ）の活性を示す。データから、Ｈ０Ｌ０およびＨ１Ｌ０が、腫瘍細胞増殖をインビトロで阻害できることが確認される。実験についてデータを並置した。
【実施例２４】
【０２４８】
細胞周期の阻害
ＮＣＩ−Ｈ８３８（ATCC CRL-5844）細胞を２４ウェルマイクロプレートに２×１０５細胞／ウェルの密度で播種し、１ｍｌの完全ＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ）中で終夜増殖させた。翌日、細胞をＳＦＭ（血清不含ＲＰＭＩ培地）で洗浄し、同培地１ｍｌ中で４時間インキュベートした。細胞から培地を吸引し、２０μｇ／ｍｌの精製抗体を含むＳＦＭを５００μｌ加えた（１０μｇ／ｍｌ終濃度）。細胞を１時間インキュベートした。数個のウェルに、ＩＧＦ−Ｉ（R&D Systems 291-G1）を含むＳＦＭを加えて終濃度５０ｎｇ／ｍｌにした。処理した細胞を終夜インキュベートした。翌日、細胞をＰＢＳで静かに洗浄し、次いでヴェルセン溶液（Invitrogen #15040）２００μｌを加えることによって採取した。細胞懸濁液を９６ウェルのＶ底プレートに移した。遠心分離によって細胞をペレット化した後、冷却した８０％エタノールを添加することによって細胞を固定し、氷上で３０分間インキュベーションした。細胞をペレット化し、２００μｌの５０μｇ／ｍｌヨウ化プロピジウム、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．０５ｍｇ／ｍｌ  ＲＮＡｓｅＡに再懸濁した。フローサイトメトリーにより分析するまで、細胞は暗所氷上でインキュベートした。
【０２４９】
図２６に、ＩＧＦ−Ｉの存在下での様々な処理群の細胞周期状態を示すが、細胞を周期が循環するように誘導している。６Ｅ１１抗体の存在下では、細胞周期は、ＩＧＦ−Ｉの非存在下でインキュベートした細胞の細胞周期と同等のレベルで阻害された。
【実施例２５】
【０２５０】
アポトーシスからの防御
９６ウェルマイクロプレートに、ＮＣＩ−Ｈ８３８細胞（ATCC CRL-5844）を１００μｌの完全ＲＰＭＩ培地中１００００細胞／ウェルの密度で播種し、２日間増殖させた。次いで、細胞をＳＦＭ（ＲＰＭＩ無血清）で洗浄し、１００μｌのＳＦＭで４〜５時間インキュベートした。培地を除去した後、無抗体、陰性対照抗体、または２０μｇ／ｍｌの精製抗ｈＩＧＦ−１Ｒ抗体（６Ｅ１１）で処理した。細胞を、さらに、ＳＦＭ単独、ＳＦＭ＋２０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１、ＳＦＭ＋５μＭのカンプトテシン、または５μＭのＳＦＭ＋カンプトテシン＋２０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１で処理した。全ての処理を最終容量１００μｌで三連で試験した。次いで、プレートを２０時間インキュベートした。ウェルから培地を吸引し、０．５％ＮＰ−４０を含むＰＢＳを２００μｌ加えることによって細胞を溶解し、続いて室温で振盪しながら５分間インキュベーションした。Roche細胞死ＥＬＩＳＡキットの準備されたマイクロプレートに、溶解物２０μｌを移し、インキュベーション緩衝液８０μｌを加えた。キット挿入物（Rocheカタログ番号1 544 675）に記載されているプロトコルに従い、マイクロプレートリーダーを使用し４０５ｎｍの吸光度を測定した。
【０２５１】
図２７は、ＩＧＦ−Ｉの存在により、ＮＣＩ−Ｈ８３８細胞が、カンプトテシン誘導アポトーシスからある程度防御されることを示す。６Ｅ１１を添加すると、アポトーシスからのＩＧＦ−１媒介防御が逆転した。
【０２５２】
別の実験では、Ａ５４９細胞においてカンプトテシン誘導アポトーシスからのＩＧＦ−１レスキューを防止する能力について、選択した抗体を試験した。Ａ５４９細胞を１×１０４で播種し、９６ウェルプレートで増殖し、血清不含条件で２０μｇ／ｍｌの選択した抗体により１時間処理した。１５ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１および５μｇ／ｍｌのカンプトテシンを一緒に加え、細胞を終夜インキュベートした。ＤＮＡ断片化の相対レベルを評価するRoche細胞死検出ＥＬＩＳＡキット（Roche 11774425001）を使用し、アポトーシスレベルを測定した。図２８に示すように、全てのヒト化抗体は、ＩＧＦ−１が誘発するアポトーシスからのレスキューを防止した。
【実施例２６】
【０２５３】
架橋抗体の存在下または非存在下でのアゴニスト活性（agonism）の非存在
９６ウェルマイクロプレートで、完全ＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ Ｈｅｐｅｓ改変＋１０％ＦＣＳ）中、３Ｔ３／ＬＩＳＮ ｃ４細胞を１０，０００細胞／ウェルの密度で播種し２日間増殖させた。精製抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体を完全ＤＭＥＭ中の細胞に滴定したが、各希釈は三連で試験した。アゴニスト活性を有すると報告されている抗体（#556000，BD Biosciences）および／または５０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−Ｉ（２０〜３０分間インキュベート）を陽性対照としていくつかの実験に含めた。非関連抗体および培地単独の陰性対照を含めた。別の実験では、抗マウス架橋抗体（Sigma M8144）または抗ヒト架橋結合抗体（Sigma 13382）を、２：１［抗ＩＧＦ−ＩＡｂ］：［架橋結合Ａｂ］の割合で抗体滴定を含めた。プレートを３０分間インキュベートした。培地を吸引し、細胞をＰＢＳで静かに一回洗浄した後、ＲＩＰＡ溶解緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ、６ｍＭデオキシコール酸Ｎａ、１％Ｔｗｅｅｎ２０）＋プロテアーゼインヒビターカクテル（Roche 11 697 498 001）を用いて溶解した。プレートを−２０℃で終夜静置した。解凍後、抗ＩＧＦ−１Ｒ捕捉抗体（２Ｂ９）を２μｇ／ｍｌで予めコートし４％ＢＳＡ／ＴＢＳでブロッキングした９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに、溶解物試料１００μｌを移した。プレートを４℃で終夜インキュベートした。プレートをＴＢＳＴ（ＴＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で４回洗浄し、４％ＢＳＡ／ＴＢＳで１／２５００に希釈したユーロピウム標識抗ホスホチロシン抗体（DELFIA Eu-N1 PT66，PerkinElmer）を各ウェルに加えた。１時間インキュベーション後、プレートを先と同様に洗浄し、１００μｌ ＤＥＬＦＩＡ増強溶液（PerkinElmer 1244-105）を加えた。１０分間インキュベーション後、ユーロピウム時間分解蛍光（ＴＲＦ）を測定するように設定したプレートリーダーを使用し、受容体リン酸化レベルを測定した。
【０２５４】
図２９は、架橋抗体の存在下、６Ｅ１１が、１０μｇ／ｍｌまでの濃度ではアゴニスト活性を有しないことを示す。実験についてデータを並置した。
【０２５５】
別の実験では、前脂肪細胞アッセイ系を使用して、ヒト化抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の６Ｅ１１シリーズが、アゴニスト特性を示すと考えられるホスホ−ＡＫＴ基礎レベルを調節するかどうかを判定した。この実験では、前脂肪細胞を実施例２１に記載したように分化させ、処理した。しかし、ヒト化抗体の存在下でのＡＫＴリン酸化の基礎レベルを評価するために、刺激ステップは省いた。結果は、２０μｇ／ｍｌまでの濃度のヒト化抗体では、基礎ＡＫＴリン酸化は上昇しなかったことを示す（図３０）。
【０２５６】
肺癌細胞系Ａ５４９を使用する平行の実験セットでは、０〜２０μｇ／ｍｌ抗体の存在下およびリガンドの非存在下で、基礎ＡＫＴリン酸化レベルを評価した。２個の異なるＨ０Ｌ０バッチ、陰性対照試料、および１１Ｃ１１（受容体リン酸化の中程度の活性化を示す抗体、図３１参照）。ｙ軸は、任意単位のＡＫＴリン酸化レベルを示す。実施例２１に示したデータに一致して、Ｈ０Ｌ０は、用量依存的にＩＧＦ−Ｉ媒介Ａｋｔリン酸化を阻害した（ＩＣ５０は２００〜５００ｎｇ／ｍｌ範囲、データ非掲示）。しかし、リガンド非存在下で抗体濃度を上げると、ホスホ−Ａｋｔの基礎レベルが若干上がるように見える。しかし、シグナルはプラトーであり、２つの異なる材料バッチによる休止レベルの３倍ほどにしか達しないようである。シグナルが多少増大する理由は不明であり、このデータは他のいかなる実験データによっても支持されない。
【０２５７】
ＬＩＳＮ−ｃ４ ３Ｔ３細胞を使用する平行の実験セットでは、リガンド刺激の非存在下で、ヒト化抗体が受容体リン酸化の基礎レベルに与える影響を評価した。ある範囲の濃度（２７ｎｇ／ｍｌ〜２０μｇ／ｍｌ）の選択した抗体の存在下で、ＬＩＳＮ細胞を３０分間インキュベートした。既知のアゴニスト抗体１１Ｃ１１およびＢＤ５５６０００（Becton Dickinson）の滴定も含めた。１００ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−２により刺激した対照ウェルを含めることができる。先に記載したＤＥＬＦＩＡアッセイを使用し、ＩＧＦ−１Ｒのリン酸化を測定した。受容体リン酸化で用量依存的上昇を誘発した２つの陽性対照抗体１１Ｃ１１およびＢＤ５５６０００とは対照的に、ヒト化抗体ではリン酸化受容体の基礎レベルの上昇は見られなかった（図３２）。表面結合抗体の架橋は、受容体のシグナル伝達を誘発する可能性があるので、架橋抗体の存在下で実験を繰り返した。選択した抗体を好適な架橋結合抗体と２：１の割合で混合したものをある範囲の濃度で、ＬＩＳＮ細胞と３０分間インキュベートした（ヒト化抗体にはSigma 13382、そしてマウス抗体にはSigma M8144）。先に記載したＤＥＬＦＩＡアッセイを使用し、ＩＧＦ−１Ｒのリン酸化を測定した。結果は、リン酸化受容体レベルを上げた１１Ｃ１１とは対照的に、ヒト化抗体は、リン酸化受容体の基礎レベルを上げなかったことを示している（図３３）。
【０２５８】
リガンド非存在下で、ヒト化抗体の添加が、ＬＩＳＮ−ｃ４およびＮＣＩ−Ｈ９２９（ヒト多発性骨髄腫細胞系）の増殖に与える影響も試験した。ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞を９６ウェルプレートの血清不含培地に４×１０４細胞／ウェルで播種した。選択した抗体の希釈物を２０〜０．０１９μｇ／ｍｌの範囲で加えた。細胞を３７℃で４日間インキュベートした後、Promega Cell Titre Blueアッセイキット（Promega G8081）を使用し増殖を測定した。図３４は、Ｈ０Ｌ０が、血清不含培地においてＮＣＩ−Ｈ９２９細胞の増殖を刺激しないことを示す。同様の結果は、ＬＩＳＮ−ｃ４細胞でも観察された（データ非掲示）。
【実施例２７】
【０２５９】
同種移植モデル−３Ｔ３／ＬＩＳＮ ｃ４
３Ｔ３／ＬＩＳＮ ｃ４細胞を使用するインビボ腫瘍モデルを用いて、胸腺欠損ヌードマウスで予め樹立した腫瘍の増殖を阻害する６Ｅ１１マウスモノクローナル抗体の能力を確立した。Cohenら, Clinical Cancer Research 11: 2063-2073 (2005)に公開されている方法と類似の方法によって腫瘍を誘発した。簡単に説明すると、マトリゲルＴＭ０．１ｍｌに懸濁した２．５×１０６個のＬＩＳＮ細胞を４〜６週齢の胸腺欠損ＣＤ１ ｎｕ／ｎｕマウスに皮下接種した。腫瘍のサイズが約１５０ｍｍ３に達したなら、マウスに３週間にわたり週２回ずつ抗体２５０μｇを含むＰＢＳ０．２ｍｌを腹腔内注射する処置を行った。ノギスにより一週間に３回、２つの直径で腫瘍を計測し、式（長さ×［幅］２）／２を使用し容積を算出した。次のようにデータを分析した：Ｌｏｇ１０形質転換腫瘍の容積は、ランダム係数回帰分析を使用し分析した。これにより、各群の切片（基線）および勾配（腫瘍増殖速度）を見積もる。ＰＢＳ処置群と比較して、６Ｅ１１群で増殖速度が３１％減少した（図３５、ｐ＝０．０００７）。
【０２６０】
類似実験では、ヌードマウスに２．５×１０６細胞を含むマトリゲルを皮下移植した。移植後１８日目、腫瘍容積が１００〜２００ｍｍ３のマウスを無作為に処置群あたり８頭の動物の群に分けた。抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体６Ｅ１１を３週間にわたり週２回、２５０μｇ／マウスおよび１００μｇ／マウス用量で腹腔内注射によって投与した。同じスケジュールで対照動物に生理食塩水を与えた。腫瘍サイズおよびマウス体重を週２回測定した。生理食塩水処置群と比較して、３５日目に測定した腫瘍容積で、５６％および７０％の減少が、それぞれ１００μｇ／マウスおよび２５０μｇ／マウス群に見られた（図３６）。
【０２６１】
別の研究では、様々な抗体活性をＰＢＳ陰性対照群と比較して試験した。ＣＤ１ ｎｕ／ｎｕ胸腺欠損マウスそれぞれに、マトリゲルに懸濁した２．５×１０６のＬＩＳＮ／３Ｔ３−ｃ４細胞を皮下移植し、腫瘍サイズをノギスによって測定し、容積を等式：腫瘍容積＝長さ×（幅）２×０．５によって計算した。腫瘍が平均容積約１５０ｍｍ３に達したなら、動物を無作為に同等の腫瘍サイズを有する群に分け、各動物に３週間にわたり週２回、２５０μｇの好適なモノクローナル抗体を含むＰＢＳを腹腔内に与えた。処置群は、６Ｅ１１（マウス親ｍＡｂ）、Ｈ０Ｌ０ ＩｇＧ１ｍ（ＡＡ）およびＨ０Ｌ０の２つの異なるバッチであった。ＰＢＳのみの処置をこれらの研究用のビヒクル対照として使用した。この研究の群の大きさは最少１４頭であった。データは、抗体処置後日数に対する平均腫瘍容積±標準誤差のデータとして表した。両６Ｅ１１およびＨ０Ｌ０は、腫瘍増殖速度が、それぞれ、５２％（Ｐ＜０．０００１）および６０％（Ｐ＜０．０００１）であり、統計上有意な減少が示された（図３７）。以前の研究（データ非掲示）に一致して、ＰＢＳ対照群と比較して、Ｈ０Ｌ０ ＩｇＧ１ｍ（ＡＡ）抗体のどちらのバッチも、腫瘍増殖速度を有意には変化させなかった。
【０２６２】
腫瘍増殖速度の減少に加えて、ＰＢＳ対照と比較して、６Ｅ１１およびＨ０Ｌ０で処置したマウスの除外時間（time-to-cull）生存率が改善した（データ非掲示）。腫瘍増殖データに一致して、Ｈ０Ｌ０ ＩｇＧｍ（ＡＡ）では、除外時間の遅延で利益は見られなかった（データ非掲示）。
【０２６３】
この研究を６Ｅ１１およびＨ０Ｌ０抗体を使用して反復したが、マトリゲルを使用しなかった。この研究の結果は、前の研究の結果を反映し、ＰＢＳ対照と比較して、６Ｅ１１およびＨ０Ｌ０は、腫瘍増殖速度がそれぞれ２０％（ｐ＝０．０４６４）および２９．７％（ｐ＝０．００３７）であり、有意な減少を示した。ＰＢＳ対照と比較して、６Ｅ１１およびＨ０Ｌ０で処置したマウス群の除外時間生存率も改善した。この実験では、非関連抗体が対照として使用され、ＰＢＳ群に類似するプロフィールが示された（データ非掲示）。
【実施例２８】
【０２６４】
６Ｅ１１マウス親抗体によるＣｏｌｏ２０５細胞腫瘍の増殖阻害
Ｃｏｌｏ２０５細胞を使用するインビボ腫瘍モデルを用いて、ＨＲＬＮ雌ｎｕ／ｎｕマウスで予め樹立した腫瘍の増殖を阻害する６Ｅ１１マウスモノクローナル抗体の能力を確立した。１×１０６個のＣｏｌｏ２０５細胞を５０％マトリゲルに懸濁し、ヌードマウスの側腹部に皮下移植した。腫瘍の大きさが約８０〜１２０ｍｍ３に達したなら（図３８の１日目に等しい）、マウスに腹腔内注射によって１０ｍｇ／ｋｇの抗体を３日毎に処置し、延べ１０回注射した。腫瘍をノギスによって測定し、式（長さ×［幅］２）／２を用いて容積を計算した。データを次のように分析した：Ｌｏｇ１０形質転換した腫瘍容積は、ランダム係数回帰分析を使用し分析した。これにより、各群の切片（基線）および勾配（腫瘍増殖速度）を評価する。ビヒクル対照（ＰＢＳ）と比較して、６Ｅ１１抗体で増殖速度は５８％減少した（図３８、ｐ＝０．００１９）。
【０２６５】
上記の実験と類似の実験を別の機会に実施した。しかし、Ｃｏｌｏ２０５細胞を使用するこの２回目の実験では、腫瘍増殖の阻害は６Ｅ１１を処置した動物では観察されなかった。６Ｅ１１で阻害が見られなかった理由は不明である（データ非掲示）。
【０２６６】
また、上記の実験と類似する実験を１×１０７個のＡ５４９細胞を移植したマウスを使用し実施した。しかし、この実験では、腫瘍増殖の阻害は６Ｅ１１を処置した動物では観察されなかった。６Ｅ１１で阻害が見られなかった理由は不明である（データ非掲示）。
【０２６７】
これらの最後の２回の実験データからは、本発明の抗体はこれらのモデルで腫瘍増殖を阻害しないように見えるが、最初の２頭の腫瘍モデル（同種移植モデルおよび最初のｃｏｌｏ２０５モデル）は、より頑健であると考えられる。これらの最初の２頭のモデルで陽性シグナルをもたらした（すなわち腫瘍増殖の阻害を示した）対照抗体は、２つ目のＣｏｌｏ２０５腫瘍モデル研究またはＡ５４９腫瘍モデル研究では阻害を示さなかった。従って本発明者らは、最初の２頭の腫瘍モデルのデータは、２番目の２頭のモデルのデータよりも、試験抗体の活性をより示していることに、より自信を持っている。
【０２６８】
３回の追加の異種移植研究を６Ｅ１１またはそのヒト化変異体で実施した。第一の研究では、Ｃｏｌｏ２０５モデルで、６Ｅ１１の活性をＨ０Ｌ０ ＩｇＧ１ｍ（ＡＡ）と比較した。図３８に示した結果とは対照的に、ＰＢＳ対照群と比較して、６Ｅ１１またはＨ０Ｌ０ ＩｇＧ１ｍ（ＡＡ）による処置後、腫瘍増殖の阻害の兆候はなかった。処置群が、ＰＢＳ、６Ｅ１１、Ｈ０Ｌ０、陽性対照抗体、および非関連抗体対照である反復研究では、いずれの群でも、腫瘍増殖を阻害するいかなる兆候も見られなかったが、ＰＢＳに比べて腫瘍増殖速度で２３％の減少を示した陽性対照を除く（ｐ＝０．００３）。しかし、非関連抗体対照では、ＰＢＳと比較して１５％の腫瘍増殖阻害が示された（ｐ＝０．０５３）。非関連抗体対照に比べて、どの抗体でも腫瘍増殖阻害は見られなかった。
【０２６９】
別の異種移植モデル（ＭＣＦ−７乳房腫瘍モデル）では、動物をＰＢＳ、６Ｅ１１、Ｈ０Ｌ０、陽性対照抗体、および非関連抗体対照で処置した。この研究では、いずれの処置群も、ＰＢＳまたは非関連抗体対照と分けなかった。両研究では、パクリタキセルによる処置によって、腫瘍増殖は著しく阻害された（データ非掲示）。
【０２７０】
研究後分析では、全３つの研究の最後で採取した腫瘍試料を受容体発現について免疫組織化学により評価した。ビオチン標識Ｈ０Ｌ０プローブを使用しても、ＩＧＦ−１Ｒ受容体の発現の兆候は観察されなかったが、同じ標識抗体によって、ＬＩＳＮ／３Ｔ３ ｃ４腫瘍試料および患者腫瘍試料は陽性染色された。
【０２７１】
図３８に示した最初のＣｏｌｏ２０５研究、ＬＩＳＮモデル（ＩＧＦ−１Ｒ−１１およびＩＧＦ−１Ｒ−１２研究）から得られた組織内結果、ならびに抗体が媒介する腫瘍増殖阻害が見られなかった３種の追加研究から得られた結果の間の抗体活性の明白な差異の理由は不明である。しかし、Ｃｏｌｏ２０５およびＭＣＦ−７細胞系の少なくともいくつかに由来する腫瘍が、研究の最後で受容体陰性（ＰＢＳ対照群を含む）であるという事実から、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体のインビボ効力を評価するこれらの特定の実験の妥当性については懸念が生じる。
【実施例２９】
【０２７２】
受容体再生利用の動力学
抗体中止後の受容体の再出現を検討するために、図３９に示した１．６７μｇ／ｍｌのＨ０Ｌ０（Ｈ０Ｌ０）抗体の存在下、ＮＣＩ−Ｈ８３８細胞を増殖培地中でインキュベートした。抗体添加から０．５時間後に第一細胞試料を採取した。抗体添加から３時間後、増殖培地に戻す前に他の全ての試料をＰＢＳで徹底的に洗浄した。次いで、抗体添加から３、４、５、６、７および２４時間後に細胞を採取し、ウサギ抗ＩＧＦ−１Ｒβ ｃ２０抗体（Santa Cruz，sc713）を使用してウエスタンブロットによりＩＧＦ−１Ｒの発現を評価した。ＨＲＰ抗体を使用して結合を検出し、ＩｇＧ１κを陰性対照抗体として使用した。レーン１〜７は、０．５、３、４、５、６、７、２４時間での採取物である。レーン８および９は、それぞれ、無抗体対照および陰性対照抗体（Sigma 15154）であり、３時間において採取した。Magic Mark（Sigma，LC5602）をレーン１０に示す。抗体の除去後（ｔ＝３時間）、ウエスタンブロットにより、ｔ＝７時間（レーン６）にＩＧＦ−１Ｒの発現の兆候がないことが示されている。一方、ｔ＝２４時間（レーン７、抗体除去後２１時間）にはＩＧＦ−１Ｒβ鎖に一致する強力なバンドが現れている。
【０２７３】
２回目の実験（データ非掲示）により、受容体の再出現が４８、７２および９６時間に維持されることが確認された。これらのデータは、大半の受容体の再出現が、抗体の除去後最初の４〜２１時間以内に生じることを示唆するものである。
【実施例３０】
【０２７４】
ＩＧＦ−１Ｒ／ＩＲヘテロ二量体結合アッセイ
両ＩＧＦ−１Ｒおよびインスリン受容体（複数、単数）を発現する細胞において、ハイブリッド受容体ＩＧＦ−１Ｒ：インスリン受容体（ＩｎｓＲ）が存在することが示されている（Pandiniら，(1999) Clin Cancer Res., 5(7):1935-44）。近年、インスリン受容体に対して交差反応しない抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体が、おそらく高い可能性でハイブリッド受容体を内部移行させ分解することによって、インスリン受容体レベルを低下させることが示されている（Sachdevら，(2006) Cancer Res., 66(4):2391-402）。
【０２７５】
免疫共沈降アッセイを使用し、ハイブリッド受容体に対する活性についてヒト化抗体を評価した。図４０Ａに示す最初の実験では、ＣＯＬＯ−２０５結腸癌細胞、およびヒトインスリン受容体を発現する組換えＮＩＨ−３Ｔ３細胞を氷上で１０分間、１％ＮＰ４０溶解緩衝液により溶解し、４℃で１６４００ｒｐｍで２０分間の遠心分離によって清澄にした。ＩＧＦ−１Ｒに対する抗体（６Ｅ１１、６Ｅ１１キメラ、Ｈ０Ｌ０ ＩｇＧ１ｍ（ＡＡ）、ＩＧＦ−１Ｒβ、インスリン受容体（β）、または非標的化ヒトＩｇＧ（対照）５μｇを用いて、可溶性細胞タンパク質（５００μｇ）を免疫沈降させた。免疫沈降したタンパク質を４〜１２％ポリアクリルアミドゲル上で還元ＳＤＳ ＰＡＧＥにかけ、ＰＶＤＦ膜に転写し、そしてＩＧＦ−１Ｒまたはインスリン受容体でイムノブロットした。蛍光標識付き２次抗体を使用し、ＬＩ ＣＯＲ Ｏｄｙｓｓｅｙシステムを用いてＩＧＦ−１Ｒ／インスリン受容体イムノブロットをイメージングした。上記の類似の方法を使用する別の実験では（図４０Ｂ）、Ｈ０Ｌ０およびＨ０Ｌ０ ＩｇＧ１ｍ（ＡＡ）を比較した。未結合画分は、免疫沈降後の上清中の材料に関することに留意されたい。ＩＧＦ−１Ｒの９７ｋＤａのβサブユニット、および２００ｋＤａの完全長ＩＧＦ−１Ｒ、ならびにインスリン受容体の９５ｋＤａのβサブユニット、および２００ｋＤａの完全長インスリン受容体を図に示す。図４０Ａおよび４０Ｂに示すように、ヒト化抗体は、６Ｅ１１キメラと同等のレベルで、Ｃｏｌｏ２０５ヒト癌腫細胞系から、インスリン受容体およびＩＧＦ−１Ｒを免疫共沈降させることができた。同抗体は、ＩＧＦ−１Ｒの非存在下ではインスリン受容体を免疫沈降せず（図４０Ａ参照、４つ目の図、レーン１〜５）、その抗体が、インスリン受容体に対して反応性ではないことを示している。抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体を用いて免疫沈降させた後、細胞溶解物から大半のＩＧＦ−１Ｒが除去されて、ヒト化抗体が、ヘテロ二量体ＩＧＦ−１Ｒ：インスリン受容体およびホモ二量体ＩＧＦ−１Ｒ受容体と結合できることがさらに示されたが（図４０Ｂ、上図レーン３〜５）、ＩＰ後の細胞溶解物中には、かなりの割合のインスリン受容体（ほとんどホモ二量体部分であろう）が依然として残存した（図４０Ｂ、下図レーン３〜５）。
【実施例３１】
【０２７６】
ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞の増殖
血清不含培地に様々な濃度の選択した抗体が存在する中で、ヒト骨髄腫細胞系ＮＣＩ−Ｈ９２９をＩＧＦ−１で刺激した。ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞を無血清培地で洗浄し、９６ウェルプレートに４×１０４細胞／ウェルで播種した。選択した抗体の希釈物を２０〜０．０１９μｇ／ｍｌの範囲で３７℃で１時間加えた後、固定濃度（２５ｎｇ／ｍｌ）のＩＧＦ−１を加えた。細胞を３７℃で４日間インキュベートした後、Promega Cell Titre Blueアッセイキット（Promega G8081）を使用し増殖を測定した。図４１は、Ｈ０Ｌ０および親６Ｅ１１による、ＩＧＦ−１が誘導するＮＣＩ−Ｈ９２９細胞のインビトロ増殖の用量依存性阻害を示す。
【実施例３２】
【０２７７】
血清中での安定性
ヒト血清中でのＨ０Ｌ０の安定性を検討するために、１００μｇ／ｍＬの抗体の５００ｍｌのアリコートを１２日間までの期間でヒト１００％血清中、−２０℃、４℃、および３７℃でインキュベートした。１２日後の活性を直接結合ＥＬＩＳＡによって測定した。ＥＣ５０値を算出し、いくつかの先の結合ＥＬＩＳＡのこれまでのＥＣ５０値と比較した。下図４２に示した結果から、血清中１２日間までの期間で−２０℃、４℃、または３７℃でインキュベートしたときにはＨ０Ｌ０の活性は低下しないことが確認される。
【実施例３３】
【０２７８】
異種移植モデルでの受容体下方調節の薬動力学
Ｈ０Ｌ０がインビボでＩＧＦ−１Ｒ受容体を下方調節できることを確認するために、ＬＩＳＮ／３Ｔ３ ｃ４細胞系に基づくインビボアッセイが、現在、他の知見を基にして開発中である（Cohenら，(2005) Clin Cancer Res., 11(5):2063-73）。第一の研究では、胸腺欠損ＣＤ１ ｎｕ／ｎｕマウスに、マトリゲル（Becton Dickinson）中２．５×１０６個の３Ｔ３／ＬＩＳＮ細胞を移植した。腫瘍が大きさ４００〜５００ｍｍ３に達したときに、マウスに１２５μｇの対照抗体またはＨ０Ｌ０を投与した。投与からＴ＝１６、２４、４８、７２または１２０時間後にマウスを屠殺した。腫瘍を切除し、直ちに液体窒素で凍結した。秤量した腫瘍試料をＲＩＰＡ緩衝液＋プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害薬中で均質化し、タンパク質アッセイを遠心分離後の溶解物で実施した。ＤＥＬＦＩＡアッセイ（実施例３４を参照）を実施して、腫瘍試料の全ＩＧＦ−１Ｒの相対レベルを評価した。図４３Ａに示すように、Ｈ０Ｌ０処置は、２４〜７２時間の時間枠で全受容体に対してある程度の影響を与えるように思われるが、その影響の大きさは以前に報告されているものよりもかなり小さい（Cohen，2005）。
【０２７９】
第二の研究では、上記のようにマウス群（ｎ＝６）に移植した。腫瘍が４００〜５００ｍｍ３の大きさに達したとき、７２時間空けて２度マウスに対照抗体またはＨ０Ｌ０を２５０μｇ投与した。最終投与から２４時間後、１０μｇのヒト組換えＩＧＦ−１を静脈内投与した。１０分後、腫瘍を切除し液体窒素で凍結した。実施例３４に記載したように、全ＩＧＦ−１Ｒ ＤＥＬＦＩＡアッセイを実施した。動物をＩＧＦ−Ｉで処置したが、未処置対照群と比較して、リン酸化受容体レベルで一貫した変化は観察されなかった。しかし、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体（６Ｅ１１、Ｈ０Ｌ０）で処置した群は、全受容体レベルで減少が見られた（図４３Ｂ）。類似の影響は、有効性研究の最後の腫瘍試料で見られた（データ非掲示）。受容体リン酸化および全受容体レベルに及ぼす経時的影響を調査する組み合わせ研究は、決定的でないことが証明された（データ非掲示）。
【実施例３４】
【０２８０】
全ＩＧＦ−１Ｒ ＤＥＬＦＩＡアッセイ
タンパク質１０または２５μｇを含む腫瘍溶解物の１００μｌを抗ＩＧＦ−１Ｒ捕捉抗体２Ｂ９で予めコートしたＥＬＩＳＡプレートにロードした（実施例１３を参照）。次いで、プレートを終夜４℃インキュベートしＴＢＳＴで洗浄した。４％ＢＳＡ／ＴＢＳ中４００ｎｇ／ｍｌのポリクローナル抗ＩＧＦ−１Ｒビオチン標識抗体（R&D Systems BAF391）１００μｌを各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。プレートをＴＢＳＴで洗浄し、１／１０００希釈のＥｕ標識したストレプトアビジン（Perkin Elmer，1244-360）１００μｌを各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。プレートをＴＢＳＴで洗浄し、ＤＥＬＦＩＡ増強溶液（Perkin Elmer 1244-105）１００μｌを各ウェルに加え、１０分間インキュベートした。Wallac Victorマルチラベルプレートリーダーを使用し、時間分解蛍光シグナルを測定した。
【０２８１】
2010518140.tif 000017
2010518140.tif 000018
2010518140.tif 000019
【０２８２】
配列表
配列番号1:
WILYYGRSKWYFDV
配列番号2:
NINPNNGGTNYNQKFKD
配列番号3:
DYYMN
配列番号4:
RSSQSIVQSNGDTYLE
配列番号5:
RISNRFS
配列番号6:
FQGSHVPYT
配列番号7:
RVSNRFS
配列番号8:
EVQLQQSGPELVKPGASVRISCKASGYAFTDYYMNWVKQSHGKSLEWVANINPNNGGTNYNQKFKDKATLTVDKSSNTAYMELRSLTSEDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGTGTTVTVSS
配列番号9:
DVLMTQTPLSLPVSLGDHASISCRSSQSIVQSNGDTYLEWYLQKPGQSPKLLIYRISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIKRA
配列番号10:
QVQLKQSGPGLVQSSQSLSITCTISGFSLTSHGIYWLRQSPGKGLEWLGVIWSGGSADYNAAFISRLSISKDNSKSQVFFKMNSLQADDTAIYYCARSPYYYRSSLYAMDYWGQGTSVTVSS
配列番号11:
NIVLTQSPKSMSMSIGERVTLSCKASENVGTYVSWYQQKAEQSPKLLIYGASNRHTGVPDRFTGSGSSTDFTLTISSVQAEDLADYHCGQSYSDPLTFGAGTKLELKRA 
配列番号12:
EVQLQQSGPELVKPGASVRISCKASGYAFTDYYMNWVKQSHGKSLEWVANINPNNGGTNYNQKFKDKATLTVDKSSNTAYMELRSLTSEDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGTGTLVTVSS
配列番号13:
DVLMTQTPLSLPVSLGDHASISCRSSQSIVQSNGDTYLEWYLQKPGQSPKLLIYRISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIKRT
配列番号14:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGNINPNNGGTNYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGRGTLVTVSS
配列番号15:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYAFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGNINPNNGGTNYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGRGTLVTVSS
配列番号16:
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVQSNGDTYLEWYLQKPGQSPQLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGQGTKLEIKRT
配列番号17:
GLNDIFEAQKIEWHE
配列番号18:
EVQLQQSGPELVKPGASVRISCKASGYAFTDYYMNWVKQSHGKSLEWMANINPNNGGTNYNQKFKDKATLTVDKSSNTAYMELRSLTSEDSAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGPGTTVTVSS
配列番号19:
DVLMTQSPLSLPVSLGDHASISCRSSQSIVQSNGDTYLEWYLQKPGQSPKLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIKRA
配列番号20:
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYAFTDYYMNWVKQTHGRSLEWMANINPNTGGTNYNQKFRGKATLTVDKSSTTAYMELRSLTSEDSAVYYCARWILYYGSSRWYFDVWGTGTTVTVSS
配列番号21:
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIKRA
配列番号22:
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYAFTDYYMNWVKQSHGKSLEWMANINPNTGGTNYNQKFTGKATLTVDKSSTTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRWILYYGSSKWYFDVWGTGTTVTVSS
配列番号23:
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYRVSYRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDLGIYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIKRA
配列番号24:
MGWSWIFFFLLSETAGVLSEVQLQQSGPELVKPGASVRISCKASGYAFTDYYMNWVKQSHGKSLEWVANINPNNGGTNYNQKFKDKATLTVDKSSNTAYMELRSLTSEDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGTGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号25:
MKLPVRLVVLMFWIPASSSDVLMTQTPLSLPVSLGDHASISCRSSQSIVQSNGDTYLEWYLQKPGQSPKLLIYRISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号26:
GAGGTCCAGCTGCAACAATCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAGGATATCCTGTAAGGCTTCTGGATACGCGTTCACTGACTACTACATGAACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGGTGGCAAATATTAATCCCAACAATGGTGGTACTAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCCAACACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGTCTGACATCTGAGGACACTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATGGATTCTTTACTACGGTCGTAGCAAATGGTACTTCGATGTCTGGGGCACAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCG
配列番号27:
GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCACGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGTATTGTTCAAAGTAATGGAGACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAGAATTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAGGGTTCACATGTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGGGCT
配列番号28:
GAGGTCCAGCTGCAACAATCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAGGATATCCTGTAAGGCTTCTGGATACGCGTTCACTGACTACTACATGAACTGGGTGAAACAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATGGCAAATATTAATCCCAACAATGGTGGTACTAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCCAACACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGTCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATGGATTCTTTACTACGGTCGTAGCAAGTGGTACTTCGATGTCTGGGGCCCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCG
配列番号29:
GATGTTTTGATGACCCAAAGTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCACGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTTCAAAGTAATGGAGACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTATAGAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAGGGTTCACATGTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGGGCT
配列番号30:
GAGGTCCAGCTGCAACAATCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAGGATATCCTGTAAGGCTTCTGGATACGCGTTCACTGACTACTACATGAACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGGTGGCAAATATTAATCCCAACAATGGTGGTACTAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCCAACACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGTCTGACATCTGAGGACACTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATGGATTCTTTACTACGGTCGTAGCAAATGGTACTTCGATGTCTGGGGCACAGGGACACTAGTCACAGTCTCCTCA
配列番号31:
GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCACGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGTATTGTTCAAAGTAATGGAGACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAGAATTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAGGGTTCACATGTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGTACG
配列番号32:
ATGGGATGGAGCTGGATCTTTTTCTTCCTCCTGTCAGAAACTGCAGGTGTCCTCTCTGAGGTCCAGCTGCAACAATCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAGGATATCCTGTAAGGCTTCTGGATACGCGTTCACTGACTACTACATGAACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGGTGGCAAATATTAATCCCAACAATGGTGGTACTAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCCAACACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGTCTGACATCTGAGGACACTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATGGATTCTTTACTACGGTCGTAGCAAATGGTACTTCGATGTCTGGGGCACAGGGACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
配列番号33:
ATGAAGTTGCCTGTTCGGCTCGTGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTGCTTCCAGCAGTGATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCACGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGTATTGTTCAAAGTAATGGAGACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAGAATTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAGGGTTCACATGTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
配列番号34:
CAGGTCCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGAGCTAGCGTCAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCAGGCTACACATTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGAGACAGGCTCCAGGACAGGGCCTCGAGTGGATGGGCAACATCAACCCCAACAATGGCGGGACAAACTACAACCAGAAGTTCAAGGATCGCGTGACCATGACCACCGACACTAGCACCTCAACAGCCTACATGGAGCTGAGGTCTCTGCGGAGCGATGACACTGCCGTGTACTACTGTGCCAGGTGGATTCTGTACTACGGGAGGAGCAAGTGGTACTTCGACGTCTGGGGAAGAGGGACACTAGTGACCGTGAGCAGC
配列番号35:
CAGGTCCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGAGCTAGCGTCAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCAGGCTACGCCTTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGAGACAGGCTCCAGGACAGGGCCTCGAGTGGATGGGCAACATCAACCCCAACAATGGCGGGACAAACTACAACCAGAAGTTCAAGGATCGCGTGACCATGACCACCGACACTAGCACCTCAACAGCCTACATGGAGCTGAGGTCTCTGCGGAGCGATGACACTGCCGTGTACTACTGTGCCAGGTGGATTCTGTACTACGGGAGGAGCAAGTGGTACTTCGACGTCTGGGGAAGAGGGACACTAGTGACCGTGAGCAGC
配列番号36:
GACATCGTCATGACCCAGAGCCCACTGTCACTCCCCGTGACACCCGGAGAGCCCGCTAGCATCAGCTGTAGAAGCTCCCAGAGCATCGTGCAGTCTAACGGCGATACCTACCTCGAGTGGTACCTGCAGAAGCCCGGACAGTCTCCTCAGCTCCTGATTTACCGCGTCAGCAATCGCTTTTCCGGGGTGCCTGATCGGTTTAGCGGCTCAGGAAGCGGAACCGACTTCACCCTGAAGATCTCAAGGGTGGAGGCTGAGGATGTGGGCGTGTACTACTGCTTCCAGGGATCTCACGTGCCTTACACCTTCGGACAGGGCACAAAGCTCGAGATTAAGCGTACG
配列番号37:
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGNINPNNGGTNYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号38:
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYAFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGNINPNNGGTNYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号39:
MGWSCIILFLVATATGVHSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVQSNGDTYLEWYLQKPGQSPQLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号40:
ATGGGATGGTCCTGTATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACAGCAACTGGCGTGCACTCTCAGGTCCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGAGCTAGCGTCAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCAGGCTACACATTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGAGACAGGCTCCAGGACAGGGCCTCGAGTGGATGGGCAACATCAACCCCAACAATGGCGGGACAAACTACAACCAGAAGTTCAAGGATCGCGTGACCATGACCACCGACACTAGCACCTCAACAGCCTACATGGAGCTGAGGTCTCTGCGGAGCGATGACACTGCCGTGTACTACTGTGCCAGGTGGATTCTGTACTACGGGAGGAGCAAGTGGTACTTCGACGTCTGGGGAAGAGGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGTGA
配列番号41:
ATGGGATGGTCCTGTATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACAGCAACTGGCGTGCACTCTCAGGTCCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGAGCTAGCGTCAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCAGGCTACGCCTTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGAGACAGGCTCCAGGACAGGGCCTCGAGTGGATGGGCAACATCAACCCCAACAATGGCGGGACAAACTACAACCAGAAGTTCAAGGATCGCGTGACCATGACCACCGACACTAGCACCTCAACAGCCTACATGGAGCTGAGGTCTCTGCGGAGCGATGACACTGCCGTGTACTACTGTGCCAGGTGGATTCTGTACTACGGGAGGAGCAAGTGGTACTTCGACGTCTGGGGAAGAGGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGTGA
配列番号42:
ATGGGATGGTCCTGCATCATCCTGTTCCTGGTGGCAACTGCCACTGGAGTCCACTCCGACATCGTCATGACCCAGAGCCCACTGTCACTCCCCGTGACACCCGGAGAGCCCGCTAGCATCAGCTGTAGAAGCTCCCAGAGCATCGTGCAGTCTAACGGCGATACCTACCTCGAGTGGTACCTGCAGAAGCCCGGACAGTCTCCTCAGCTCCTGATTTACCGCGTCAGCAATCGCTTTTCCGGGGTGCCTGATCGGTTTAGCGGCTCAGGAAGCGGAACCGACTTCACCCTGAAGATCTCAAGGGTGGAGGCTGAGGATGTGGGCGTGTACTACTGCTTCCAGGGATCTCACGTGCCTTACACCTTCGGACAGGGCACAAAGCTCGAGATTAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGA
配列番号43:
MGWSCIILFLVATATGVHS
配列番号44:
MKSGSGGGSPTSLWGLLFLSAALSLWPTSGEICGPGIDIRNDYQQLKRLENCTVIEGYLHILLISKAEDYRSYRFPKLTVITEYLLLFRVAGLESLGDLFPNLTVIRGWKLFYNYALVIFEMTNLKDIGLYNLRNITRGAIRIEKNADLCYLSTVDWSLILDAVSNNYIVGNKPPKECGDLCPGTMEEKPMCEKTTINNEYNYRCWTTNRCQKMCPSTCGKRACTENNECCHPECLGSCSAPDNDTACVACRHYYYAGVCVPACPPNTYRFEGWRCVDRDFCANILSAESSDSEGFVIHDGECMQECPSGFIRNGSQSMYCIPCEGPCPKVCEEEKKTKTIDSVTSAQMLQGCTIFKGNLLINIRRGNNIASELENFMGLIEVVTGYVKIRHSHALVSLSFLKNLRLILGEEQLEGNYSFYVLDNQNLQQLWDWDHRNLTIKAGKMYFAFNPKLCVSEIYRMEEVTGTKGRQSKGDINTRNNGERASCESDVLHFTSTTTSKNRIIITWHRYRPPDYRDLISFTVYYKEAPFKNVTEYDGQDACGSNSWNMVDVDLPPNKDVEPGILLHGLKPWTQYAVYVKAVTLTMVENDHIRGAKSEILYIRTNASVPSIPLDVLSASNSSSQLIVKWNPPSLPNGNLSYYIVRWQRQPQDGYLYRHNYCSKDKIPIRKYADGTIDIEEVTENPKTEVCGGEKGPCCACPKTEAEKQAEKEEAEYRKVFENFLHNSIFVPRPERKRRDVMQVANTTMSSRSRNTTAADTYNITDPEELETEYPFFESRVDNKERTVISNLRPFTLYRIDIHSCNHEAEKLGCSASNFVFARTMPAEGADDIPGPVTWEPRPENSIFLKWPEPENPNGLILMYEIKYGSQVEDQRECVSRQEYRKYGGAKLNRLNPGNYTARIQATSLSGNGSWTDPVFFYVQAKTGYENFIHLIIALPVAVLLIVGGLVIMLYVFHRKRNNSRLGNGVLYASVNPEYFSAADVYVPDEWEVAREKITMSRELGQGSFGMVYEGVAKGVVKDEPETRVAIKTVNEAASMRERIEFLNEASVMKEFNCHHVVRLLGVVSQGQPTLVIMELMTRGDLKSYLRSLRPEMENNPVLAPPSLSKMIQMAGEIADGMAYLNANKFVHRDLAARNCMVAEDFTVKIGDFGMTRDIYETDYYRKGGKGLLPVRWMSPESLKDGVFTTYSDVWSFGVVLWEIATLAEQPYQGLSNEQVLRFVMEGGLLDKPDNCPDMLFELMRMCWQYNPKMRPSFLEIISSIKEEMEPGFREVSFYYSEENKLPEPEELDLEPENMESVPLDPSASSSSLPLPDRHSGHKAENGPGPGVLVLRASFDERQPYAHMNGGRKNERALPLPQSSTC
配列番号45:
MKSGSGGGSPTSLWGLLFLSAALSLWPTSGEICGPGIDIRNDYQQLKRLENCTVIEGYLHILLISKAEDYRSYRFPKLTVITEYLLLFRVAGLESLGDLFPNLTVIRGWKLFYNYALVIFEMTNLKDIGLYNLRNITRGAIRIEKNADLCYLSTVDWSLILDAVSNNYIVGNKPPKECGDLCPGTMEEKPMCEKTTINNEYNYRCWTTNRCQKMCPSACGKRACTENNECCHPECLGSCSAPDNDTACVACRHYYYAGVCVPACPPNTYRFEGWRCVDRDFCANILSAESSDSEGFVIHDGECMQECPSGFIRNGSQSMYCIPCEGPCPKVCEEEKKTKTIDSVTSAQMLQGCTIFKGNLLINIRRGNNIASELENFMGLIEVVTGYVKIRHSHALVSLSFLKNLRLILGEEQLEGNYSFYVLDNQNLQQLWDWDHRNLTIKAGKMYFAFNPKLCVSEIYRMEEVTGTKGRQSKGDINTRNNGERASCESDVLHFTSTTTWKNRIIITWHRYRPPDYRDLISFTVYYKEAPFKNVTEYDGQDACGSNSWNMVDVDLPPNKDVEPGILLHGLKPWTQYAVYVKAVTLTMVENDHIRGAKSEILYIRTNASVPSIPLDVLSASNSSSQLIVKWNPPSLPNGNLSYYIVRWQRQPQDGYLYRHNYCSKDKIPIRKYADGTIDIEEVTENPKTEVCGGEKGPCCACPKTEAEKQAEKEEAEYRKVFENFLHNSIFVPRPERKRRDVMQVANTTMSSRSRNTTAADTYNITDLEELETEYPFFESRVDNKERTVISNLRPFTLYRIDIHSCNHEAEKLGCSASNFVFARTMPAEGADDIPGPVTWEPRPENSIFLKWPEPENPNGLILMYEIKYGSQVEDQRECVSRQEYRKYGGAKLNRLNPGNYTARIQATSLSGNGSWTDPVFFYVQAKTGYENFIHLIIALPVAVLLIVGGLVIMLYVFHRKRNNSRLGNGVLYASVNPEYFSAADVYVPDEWEVAREKITMSRELGQGSFGMVYEGVAKGVVKDEPETRVAIKTVNEAASMRERIEFLNEASVMKEFNCHHVVRLLGVVSQGQPTLVIMELMTRGDLKSYLRSLRPEMENNPVLAPPSLSKMIQMAGEIADGMAYLNANKFVHRDLAARNCMVAEDFTVKIGDFGMTRDIYETDYYRKGGKGLLPVRWMSPESLKDGVFTTYSDVWSFGVVLWEIATLAEQPYQGLSNEQVLRFVMEGGLLDKPDNCPDMLFELMRMCWQYNPKMRPSFLEIISSIKDEMEPGFREVSFYYSEENKLPEPEELDLEPENMESVPLDPSASSSSLPLPDRHSGHKAENGPGPGVLVLRASFDERQPYAHMNGGRKNERALPLPQSSTC
配列番号46:
MKSGSGGGSPTSLWGLVFLSAALSLWPTSGEICGPGIDIRNDYQQLKRLENCTVIEGFLHILLISKAEDYRSYRFPKLTVITEYLLLFRVAGLESLGDLFPNLTVIRGWKLFYNYALVIFEMTNLKDIGLYNLRNITRGAIRIEKNADLCYLSTIDWSLILDAVSNNYIVGNKPPKECGDLCPGTLEEKPMCEKTTINNEYNYRCWTTNRCQKMCPSVCGKRACTENNECCHPECLGSCHTPDDNTTCVACRHYYYKGVCVPACPPGTYRFEGWRCVDRDFCANIPNAESSDSDGFVIHDDECMQECPSGFIRNSTQSMYCIPCEGPCPKVCGDEEKKTKTIDSVTSAQMLQGCTILKGNLLINIRRGNNIASELENFMGLIEVVTGYVKIRHSHALVSLSFLKNLRLILGEEQLEGNYSFYVLDNQNLQQLWDWNHRNLTVRSGKMYFAFNPKLCVSEIYRMEEVTGTKGRQSKGDINTRNNGERASCESDVLRFTSTTTWKNRIIITWHRYRPPDYRDLISFTVYYKEAPFKNVTEYDGQDACGSNSWNMVDVDLPPNKEGEPGILLHGLKPWTQYAVYVKAVTLTMVENDHIRGAKSEILYIRTNASVPSIPLDVLSASNSSSQLIVKWNPPTLPNGNLSYYIVRWQRQPQDGYLYRHNYCSKDKIPIRKYADGTIDVEEVTENPKTEVCGGDKGPCCACPKTEAEKQAEKEEAEYRKVFENFLHNSIFVPRPERRRRDVMQVANTTMSSRSRNTTVADTYNITDPEEFETEYPFFESRVDNKERTVISNLRPFTLYRIDIHSCNHEAEKLGCSASNFVFARTMPAEGADDIPGPVTWEPRPENSIFLKWPEPENPNGLILMYEIKYGSQVEDQRECVSRQEYRKYGGAKLNRLNPGNYTARIQATSLSGNGSWTDPVFFYVPAKTTYENFMHLIIALPVAILLIVGGLVIMLYVFHRKRNNSRLGNGVLYASVNPEYFSAADVYVPDEWEVAREKITMNRELGQGSFGMVYEGVAKGVVKDEPETRVAIKTVNEAASMRERIEFLNEASVMKEFNCHHVVRLLGVVSQGQPTLVIMELMTRGDLKSYLRSLRPEVEQNNLVLIPPSLSKMIQMAGEIADGMAYLNANKFVHRDLAARNCMVAEDFTVKIGDFGMTRDIYETDYYRKGGKGLLPVRWMSPESLKDGVFTTHSDVWSFGVVLWEIATLAEQPYQGLSNEQVLRFVMEGGLLDKPDNCPDMLFELMRMCWQYNPKMRPSFLEIIGSIKDEMEPSFQEVSFYYSEENKPPEPEELEMELEMEPENMESVPLDPSASSASLPLPERHSGHKAENGPGPGVLVLRASFDERQPYAHMNGGRANERALPLPQSSTC
配列番号47:
MKSGSGGGSPTSLWGLLFLSAALSLWPTSGEICGPGIDIRNDYQQLKRLENCTVIEGYLHILLISKAEDYRSYRFPKLTVITEYLLLFRVAGLESLGDLFPNLTVIRGWKLFYNYALVIFEMTNLKDIGLYNLRNITRGAIRIEKNADLCYLSTVDWSLILDAVSNNYIVGNKPPKECGDLCPGTMEEKPMCEKTTINNEYNYRCWTTNRCQKMCPSTCGKRACTENNECCHPECLGSCSAPDNDTACVACRHYYYAGVCVPACPPNTYRFEGWRCVDRDFCANILSAESSDSEGFVIHDGECMQECPSGFIRNGSQSMYCIPCEGPCPKVCEEEKKTKTIDSVTSAQMLQGCTIFKGNLLINIRRGNNIASELENFMGLIEVVTGYVKIRHSHALVSLSFLKNLRLILGEEQLEGNYSFYVLDNQNLQQLWDWDHRNLTIKAGKMYFAFNPKLCVSEIYRMEEVTGTKGRQSKGDINTRNNGERASCESDVLHFTSTTTSKNRIIITWHRYRPPDYRDLISFTVYYKEAPFKNVTEYDGQDACGSNSWNMVDVDLPPNKDVEPGILLHGLKPWTQYAVYVKAVTLTMVENDHIRGAKSEILYIRTNASVPSIPLDVLSASNSSSQLIVKWNPPSLPNGNLSYYIVRWQRQPQDGYLYRHNYCSKDKIPIRKYADGTIDIEEVTENPKTEVCGGEKGPCCACPKTEAEKQAEKEEAEYRKVFENFLHNSIFVPRPERKRRDVMQVANTTMSSRSRNTTAADTYNITDPEELETEYPFFESRVDNKERTVISNLRPFTLYRIDIHSCNHEAEKLGCSASNFVFARTMPAEGADDIPGPVTWEPRPENSIFLKWPEPENPNGLILMYEIKYGSQVEDQRECVSRQEYRKYGGAKLNRLNPGNYTARIQATSLSGNGSWTDPVFFYVQAKTGYENFIHAAAIEGRSGSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKLRRASLG
配列番号48:
MKSGSGGGSPTSLWGLLFLSAALSLWPTSGEICGPGIDIRNDYQQLKRLENCTVIEGYLHILLISKAEDYRSYRFPKLTVITEYLLLFRVAGLESLGDLFPNLTVIRGWKLFYNYALVIFEMTNLKDIGLYNLRNITRGAIRIEKNADLCYLSTVDWSLILDAVSNNYIVGNKPPKECGDLCPGTMEEKPMCEKTTINNEYNYRCWTTNRCQKMCPSACGKRACTENNECCHPECLGSCSAPDNDTACVACRHYYYAGVCVPACPPNTYRFEGWRCVDRDFCANILSAESSDSEGFVIHDGECMQECPSGFIRNGSQSMYCIPCEGPCPKVCEEEKKTKTIDSVTSAQMLQGCTIFKGNLLINIRRGNNIASELENFMGLIEVVTGYVKIRHSHALVSLSFLKNLRLILGEEQLEGNYSFYVLDNQNLQQLWDWDHRNLTIKAGKMYFAFNPKLCVSEIYRMEEVTGTKGRQSKGDINTRNNGERASCESDVLHFTSTTTWKNRIIITWHRYRPPDYRDLISFTVYYKEAPFKNVTEYDGQDACGSNSWNMVDVDLPPNKDVEPGILLHGLKPWTQYAVYVKAVTLTMVENDHIRGAKSEILYIRTNASVPSIPLDVLSASNSSSQLIVKWNPPSLPNGNLSYYIVRWQRQPQDGYLYRHNYCSKDKIPIRKYADGTIDIEEVTENPKTEVCGGEKGPCCACPKTEAEKQAEKEEAEYRKVFENFLHNSIFVPRPERKRRDVMQVANTTMSSRSRNTTAADTYNITDLEELETEYPFFESRVDNKERTVISNLRPFTLYRIDIHSCNHEAEKLGCSASNFVFARTMPAEGADDIPGPVTWEPRPENSIFLKWPEPENPNGLILMYEIKYGSQVEDQRECVSRQEYRKYGGAKLNRLNPGNYTARIQATSLSGNGSWTDPVFFYVQAKTGYENFIHAAAIEGRSGSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKLRRASLG
配列番号49: 
MGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSA
配列番号50:
MGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSAGLNDIFEAQKIEWHE
配列番号51:
MAYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRPASRVSRRSRGIVEECCFRSCDLALLETYCATPAKSE
配列番号52: 
MAYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRPASRVSRRSRGIVEECCFRSCDLALLETYCATPAKSEGLNDIFEAQKIEWHE
配列番号53:
MGTGGRRGAAAAPLLVAVAALLLGAAGHLYPGEVCPGMDIRNNLTRLHELENCSVIEGHLQILLMFKTRPEDFRDLSFPKLIMITDYLLLFRVYGLESLKDLFPNLTVIRGSRLFFNYALVIFEMVHLKELGLYNLMNITRGSVRIEKNNELCYLATIDWSRILDSVEDNYIVLNKDDNEECGDICPGTAKGKTNCPATVINGQFVERCWTHSHCQKVCPTICKSHGCTAEGLCCHSECLGNCSQPDDPTKCVACRNFYLDGRCVETCPPPYYHFQDWRCVNFSFCQDLHHKCKNSRRQGCHQYVIHNNKCIPECPSGYTMNSSNLLCTPCLGPCPKVCHLLEGEKTIDSVTSAQELRGCTVINGSLIINIRGGNNLAAELEANLGLIEEISGYLKIRRSYALVSLSFFRKLRLIRGETLEIGNYSFYALDNQNLRQLWDWSKHNLTITQGKLFFHYNPKLCLSEIHKMEEVSGTKGRQERNDIALKTNGDQASCENELLKFSYIRTSFDKILLRWEPYWPPDFRDLLGFMLFYKEAPYQNVTEFDGQDACGSNSWTVVDIDPPLRSNDPKSQNHPGWLMRGLKPWTQYAIFVKTLVTFSDERRTYGAKSDIIYVQTDATNPSVPLDPISVSNSSSQIILKWKPPSDPNGNITHYLVFWERQAEDSELFELDYCLKGLKLPSRTWSPPFESEDSQKHNQSEYEDSAGECCSCPKTDSQILKELEESSFRKTFEDYLHNVVFVPRKTSSGTGAEDPRPSRKRRSLGDVGNVTVAVPTVAAFPNTSSTSVPTSPEEHRPFEKVVNKESLVISGLRHFTGYRIELQACNQDTPEERCSVAAYVSARTMPEAKADDIVGPVTHEIFENNVVHLMWQEPKEPNGLIVLYEVSYRRYGDEELHLCVSRKHFALERGCRLRGLSPGNYSVRIRATSLAGNGSWTEPTYFYVTDYLDVPSNIAKIIIGPLIFVFLFSVVIGSIYLFLRKRQPDGPLGPLYASSNPEYLSASDVFPCSVYVPDEWEVSREKITLLRELGQGSFGMVYEGNARDIIKGEAETRVAVKTVNESASLRERIEFLNEASVMKGFTCHHVVRLLGVVSKGQPTLVVMELMAHGDLKSYLRSLRPEAENNPGRPPPTLQEMIQMAAEIADGMAYLNAKKFVHRDLAARNCMVAHDFTVKIGDFGMTRDIYETDYYRKGGKGLLPVRWMAPESLKDGVFTTSSDMWSFGVVLWEITSLAEQPYQGLSNEQVLKFVMDGGYLDQPDNCPERVTDLMRMCWQFNPNMRPTFLEIVNLLKDDLHPSFPEVSFFHSEENKAPESEELEMEFEDMENVPLDRSSHCQREEAGGRDGGSSLGFKRSYEEHIPYTHMNGGKKNGRILTLPRSNPS
配列番号54:
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGNINPNNGGTNYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号55:
ATGGGATGGTCCTGTATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACAGCAACTGGCGTGCACTCTCAGGTCCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGAGCTAGCGTCAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCAGGCTACACATTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGAGACAGGCTCCAGGACAGGGCCTCGAGTGGATGGGCAACATCAACCCCAACAATGGCGGGACAAACTACAACCAGAAGTTCAAGGATCGCGTGACCATGACCACCGACACTAGCACCTCAACAGCCTACATGGAGCTGAGGTCTCTGCGGAGCGATGACACTGCCGTGTACTACTGTGCCAGGTGGATTCTGTACTACGGGAGGAGCAAGTGGTACTTCGACGTCTGGGGAAGAGGGACACTAGTGACCGTGAGCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACAAGCGGGGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACAGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCTGAACTGGCCGGAGCCCCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAACAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAACCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCTCCCGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCCGGCAAGTGA 
配列番号56:
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYAFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGNINPNNGGTNYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.
配列番号57:
ATGGGATGGTCCTGTATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACAGCAACTGGCGTGCACTCTCAGGTCCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGAGCTAGCGTCAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCAGGCTACGCCTTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGAGACAGGCTCCAGGACAGGGCCTCGAGTGGATGGGCAACATCAACCCCAACAATGGCGGGACAAACTACAACCAGAAGTTCAAGGATCGCGTGACCATGACCACCGACACTAGCACCTCAACAGCCTACATGGAGCTGAGGTCTCTGCGGAGCGATGACACTGCCGTGTACTACTGTGCCAGGTGGATTCTGTACTACGGGAGGAGCAAGTGGTACTTCGACGTCTGGGGAAGAGGGACACTAGTGACCGTGAGCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACAAGCGGGGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACAGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCTGAACTGGCCGGAGCCCCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAACAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAACCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCTCCCGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCCGGCAAGTGA
配列番号58:
ATGGGATGGTCCTGCATCATCCTGTTCCTGGTGGCAACTGCCACTGGAGTCCACTCCGACATCGTCATGACCCAGAGCCCACTGTCACTCCCCGTGACACCCGGAGAGCCCGCTAGCATCAGCTGTAGAAGCTCCCAGAGCATCGTGCAGTCTAACGGCGATACCTACCTCGAGTGGTACCTGCAGAAGCCCGGACAGTCTCCTCAGCTCCTGATTTACCGCGTCAGCAATCGCTTTTCCGGGGTGCCTGATCGGTTTAGCGGCTCAGGAAGCGGAACCGACTTCACCCTGAAGATCTCAAGGGTGGAGGCTGAGGATGTGGGCGTGTACTACTGCTTCCAGGGATCTCACGTGCCTTACACCTTCGGACAGGGCACAAAGCTCGAGATTAAGCGTACGGTGGCCGCTCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAAAGCGTCACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACACTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCTAG
配列番号59:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTXaaXaaXaaXaaXaaWVRQAPGQGLEWMGXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaWGRGTLVTVSS
配列番号60:
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaWYLQKPGQSPQLLIYXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaFGQGTKLEIKRT
配列番号61: 
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCCAGCGTCAAGGTGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGCGGCAGGCCCCAGGCCAGGGACTGGAATGGATGGGCAACATCAACCCCAACAACGGCGGCACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACCGGGTCACCATGACCACCGACACCAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGCGGAGCCTGAGAAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGTGGATCCTGTACTACGGCCGGTCCAAGTGGTACTTCGACGTGTGGGGCAGGGGCACACTAGT
配列番号62:
GACATCGTGATGACCCAGAGCCCCCTGAGCCTGCCCGTGACCCCTGGCGAGCCCGCCAGCATCAGCTGCAGAAGCAGCCAGAGCATCGTCCAGAGCAACGGCGACACCTACCTGGAATGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAGTCCCCCCAGCTGCTGATCTACAGAGTGAGCAACCGGTTCAGCGGCGTGCCCGACAGATTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCCGGGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGCTTTCAAGGCAGCCACGTGCCCTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGTACG
配列番号63
ACTAGTCACCGTGAGCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGAGCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCTGAGCTGCTGGGCGGACCCGACGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAACAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCCGAGGAAAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAACCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCTCCCGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCCGGCAAGTGA
配列番号64
LVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号65 
ACTAGTCACCGTGAGCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGAGCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCTGAGCTGCTGGGCGGACCCGACGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAACAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTCTGCCCGAGGAAAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAACCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCTCCCGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCCGGCAAGTGA
配列番号66 
LVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPLPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号67
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCCAGCGTCAAGGTGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGCGGCAGGCCCCAGGCCAGGGACTGGAATGGATGGGCAACATCAACCCCAACAACGGCGGCACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACCGGGTCACCATGACCACCGACACCAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGCGGAGCCTGAGAAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGTGGATCCTGTACTACGGCCGGTCCAAGTGGTACTTCGACGTGTGGGGCAGGGGCACACTAGTCACCGTGAGCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGAGCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCTGAGCTGCTGGGCGGACCCGACGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAACAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCCGAGGAAAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAACCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCTCCCGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCCGGCAAGTGA
配列番号68
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGNINPNNGGTNYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号69
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCGACATCGTGATGACCCAGAGCCCCCTGAGCCTGCCCGTGACCCCTGGCGAGCCCGCCAGCATCAGCTGCAGAAGCAGCCAGAGCATCGTCCAGAGCAACGGCGACACCTACCTGGAATGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAGTCCCCCCAGCTGCTGATCTACAGAGTGAGCAACCGGTTCAGCGGCGTGCCCGACAGATTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCCGGGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGCTTTCAAGGCAGCCACGTGCCCTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGA
配列番号70
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCCAGCGTCAAGGTGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGCGGCAGGCCCCAGGCCAGGGACTGGAATGGATGGGCAACATCAACCCCAACAACGGCGGCACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACCGGGTCACCATGACCACCGACACCAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGCGGAGCCTGAGAAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGTGGATCCTGTACTACGGCCGGTCCAAGTGGTACTTCGACGTGTGGGGCAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGTGATGA
【図１】
2010518140.tif 000020
【図２Ａ】
2010518140.tif 000021
【図２Ｂ】
2010518140.tif 000022
【図２Ｃ】
2010518140.tif 000023
【図２Ｄ】
2010518140.tif 000024
【図２Ｅ】
2010518140.tif 000025
【図３】
2010518140.tif 000026
【図４】
2010518140.tif 000027
【図５】
2010518140.tif 000028
【図６】
2010518140.tif 000029
【図７】
2010518140.tif 000030
【図８】
2010518140.tif 000031
【図９】
2010518140.tif 000032
【図１０】
2010518140.tif 000033
【図１１】
2010518140.tif 000034
【図１２Ａ】
2010518140.tif 000035
【図１２Ｂ】
2010518140.tif 000036
【図１２Ｃ】
2010518140.tif 000037
【図１３】
2010518140.tif 000038
【図１４】
2010518140.tif 000039
【図１５】
2010518140.tif 000040
【図１６】
2010518140.tif 000041
【図１７】
2010518140.tif 000042
【図１８】
2010518140.tif 000043
【図１９】
2010518140.tif 000044
【図２０】
2010518140.tif 000045
【図２１】
2010518140.tif 000046
【図２２】
2010518140.tif 000047
【図２３】
2010518140.tif 000048
【図２４】
2010518140.tif 000049
【図２５Ａ】
2010518140.tif 000050
【図２５Ｂ】
2010518140.tif 000051
【図２５Ｃ】
2010518140.tif 000052
【図２５Ｄ】
2010518140.tif 000053
【図２５Ｅ】
2010518140.tif 000054
【図２６】
2010518140.tif 000055
【図２７】
2010518140.tif 000056
【図２８】
2010518140.tif 000057
【図２９】
2010518140.tif 000058
【図３０】
2010518140.tif 000059
【図３１】
2010518140.tif 000060
【図３２】
2010518140.tif 000061
【図３３】
2010518140.tif 000062
【図３４】
2010518140.tif 000063
【図３５】
2010518140.tif 000064
【図３６】
2010518140.tif 000065
【図３７】
2010518140.tif 000066
【図３８】
2010518140.tif 000067
【図３９】
2010518140.tif 000068
【図４０】
2010518140.tif 000069
【図４１】
2010518140.tif 000070
【図４２】
2010518140.tif 000071
【図４３】
2010518140.tif 000072
【配列表】
2010518140000001.xml
【国際調査報告】
2010518140.tif 000098
2010518140.tif 000099
2010518140.tif 000100
2010518140.tif 000101