(57)【要約】  標的微生物の存在について検査すべき試料をバクテリオファージへ曝露して、潜在的に交差反応性の非標的微生物へのファージの付着又はその中での複製を阻害する条件を提供する。試料をインキュベートしてアッセイして、バクテリオファージマーカーの存在又は非存在を検出して、標的微生物の存在又は非存在を決定する。阻害することは、阻害物質の添加、又は阻害工程の使用を含んでよい。それにはまた、標的細菌の増殖を許容する一方で、潜在的に交差反応性の細菌の増殖を阻害すること；選択的な結合剤を使用して、潜在的に交差反応性の細菌を選択的に除去又は阻止すること；又は潜在的に交差反応性の細菌を選択的に破壊することを含めてよい。
2010508044.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検査すべき試料中の標的微生物の存在又は非存在を決定する方法であって：
（ａ）前記標的微生物へ付着することが可能なバクテリオファージの量を前記試料と混合して、バクテリオファージ曝露試料を創出すること；
（ｂ）潜在的に交差反応性の非標的微生物におけるファージの付着又は複製を阻害する一方で、前記バクテリオファージが前記標的微生物へ付着することを可能にするのに十分な条件を前記バクテリオファージ曝露試料へ提供すること；並びに
（ｃ）バクテリオファージマーカーの存在又は非存在を検出するために前記バクテリオファージ曝露試料をアッセイして、前記標的微生物の存在又は非存在を決定することを含んでなる、前記方法。
【請求項２】
前記微生物が細菌であり、前記アッセイすることが、前記バクテリオファージマーカーを前記標的細菌の前記試料における存在の指標として検出することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記提供することが、前記バクテリオファージが前記標的微生物に感染して、前記標的微生物において複製することを許容する条件を提供することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記阻害することが、標的細菌の増殖を可能にする一方で、潜在的に交差反応性の細菌の増殖を阻害することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記阻害することが、前記試料へ阻害物質を加えることを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記阻害物質が、塩化ナトリウム、二価カチオン、鉄キレート剤、抗生物質、及び金属化合物からなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記阻害することが、基質へ付いた選択的結合剤を使用して、潜在的に交差反応性の微生物を前記試料より選択的に除去することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記選択的な除去が、非標的細菌に選択的な抗体又はバクテリオファージを使用することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記基質が微粒子を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記阻害することが、潜在的に交差反応性の微生物を選択的に破壊することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記破壊することが、選択的な抗生物質を前記試料と混合することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記破壊することが、１以上の潜在的に交差反応性の非標的微生物へ選択的に結合及び／又は感染するバクテリオファージを前記試料と混合することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記アッセイすることが免疫学的アッセイを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
検査すべき試料中の標的微生物の存在又は非存在を決定するための培地（２２０）であって、前記標的微生物へ特異的なバクテリオファージ（２２４）と、該バクテリオファージの潜在的に交差反応性の非標的微生物への付着又はその中での複製を阻害する阻害物質（２２８）を含んでなる、前記培地。
【請求項１５】
前記阻害物質が、前記交差反応性微生物へ特異的なバクテリオファージ、抗体、抗生物質、抗菌化合物、及び化学物質からなる群より選択される、請求項１４に記載の培地。
【請求項１６】
前記化学物質が、塩化ナトリウム及び金属化合物からなる群より選択される、請求項１５に記載の培地。
【請求項１７】
検査すべき試料中の標的微生物の存在又は非存在を決定するためのキット（３５４）であって、前記標的微生物へ付着するか又は感染することが可能な特異的なバクテリオファージ（３６８）；及び、潜在的に交差反応性の非標的微生物へのファージ付着又はその中での複製を阻害することが可能な阻害物質（３５８）を含んでなる、前記キット。
【請求項１８】
前記バクテリオファージが第一容器（３６０）にあり、前記阻害物質が第二容器（３５６）にある、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
前記のバクテリオファージ及び阻害物質が単一の容器にある、請求項１７に記載のキット。
【請求項２０】
免疫アッセイ試験デバイスがさらに含まれる、請求項１７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全般的には、微視的生物体の同定の分野に、そしてより特別には、バクテリオファージを使用する微生物の同定に関する。
【背景技術】
【０００２】
バクテリオファージは、自ら複製する手段として細菌を使用するように自然界で進化してきたウイルスである。バクテリオファージ（又はファージ）は、それ自身を細菌へ付着させてその遺伝物質をその細菌へ注入して、ファージ複製を誘導することによってそれを行う。溶原性バクテリオファージと呼ばれるバクテリオファージは、宿主細菌を破裂させ、その子孫ファージを環境へ放出して、他の細菌を捜し出す。親ファージによる細菌の感染、細菌において子孫ファージを産生するファージ増殖（増幅）、及び溶菌後の子孫ファージの放出の合計インキュベーション時間は、ファージ、宿主細菌、及び試料の環境条件に依っては、１時間ほどしか要さない場合もある。
【０００３】
微生物同定を迅速化する方法として、バクテリオファージベースの方法が示唆されてきた。例えば、いずれも Stuart Mark Wilson への米国特許第５，９８５，５９６号（1999年11月16日発行）及び６，４６１，８３３Ｂ１号（10月8日発行）；米国特許第４，８６１，７０９号（Ulitzur et al. へ1989年8月29日発行）；米国特許第５，８２４，４６８号（Scherer et al. へ1998年10月20日発行）；米国特許第５，６５６，４２４号（Jurgensen et al. へ1997年8月12日発行）；米国特許第６，３００，０６１Ｂ１号（Jacobs, Jr. et al. へ2001年10月9日発行）；米国特許第６，５５５，３１２Ｂ１号（Hiroshi Nakayama へ2003年4月29日発行）；米国特許第６，５４４，７２９Ｂ２号（Sayler et al. へ2003年4月8日発行）；米国特許第５，８８８，７２５号（Michael F. Sanders へ1999年3月30日発行）；米国特許第６，４３６，６５２Ｂ１号（Cherwonogrodzky et al. へ2002年8月20日発行）；米国特許第６，４３６，６６１Ｂ１号（Adams et al. へ2002年8月20日発行）；米国特許第５，４９８，５２５号（Rees et al. へ1996年3月12日発行）；Angelo J. Madonna, Sheila VanCuyk and Kent J. Voorhees,「Detection Of Esherichia CoIi Using lmmunomagnetic Separation And Bacteriophage Amplification Coupled With Matrix-Assisted Laser Desorption/lonization Time-Of-Flight Mass Spectrometry（マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析法と共役した免疫磁気分離及びバクテリオファージ増殖を使用する大腸菌の検出）」ウィリー・インターサイエンス、DOI:10.1002/rem.900, 2002年12月24日；及び、米国特許出願公開公報番号２００４／０２２４３５９（2004年11月11日公開）を参照のこと。
【０００４】
これらの方法のいずれでも、標的細菌を潜在的に含有する試料をその細菌に特異的なバクテリオファージとともにインキュベートする。その細菌の存在時に、バクテリオファージは、その細菌に感染してその中で増殖して、標的細菌の存在を示す、入力ファージレベルより高い測定可能なシグナルの産生をもたらす。いくつかの方法は、検出及び同定の手段として、被感染標的細菌より放出される子孫ファージの検出を利用する。この場合、親ファージが標的細菌へ成功裡に感染しなければ、子孫ファージは、産生されない。なお他の方法は、子孫ファージ全体ではなく、ファージ複製産物の検出に依拠する。例えば、ルシフェラーゼレポーターバクテリオファージは、それらが標的細菌へ成功裡に感染するとき、ルシフェラーゼを産生する。次いで、ルシフェラーゼは光を産生し、それは、検出されるならば、標的細菌の試料中の存在を示す。他の方法は、特異的なバクテリオファージによる標的細菌の成功した溶菌感染に続いて放出される細菌残滓の検出に依拠する。標的細菌を正確に同定するために、これらのファージベースの診断方法のいずれでも、そのバクテリオファージが、標的細菌への高い感度と、非標的細菌の系統又は種における複製を回避する高い特異性をともに有することが要求される。こういった特徴のあるバクテリオファージを発見又は開発することは、きわめて困難なことであり得る。高いレベルの感度があるバクテリオファージは、しばしば十分な特異性を欠いている。即ち、それらは、非標的細菌と交差反応するのである。従って、高レベル感度を保持する一方でより高いレベルの特異性を達成するバクテリオファージを使用する、微生物検出法へのニーズが依然としてある。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、潜在的に交差反応性の非標的細菌におけるファージ付着又は複製をあるやり方で阻害する一方で、標的細菌における付着又は複製にはほとんど影響しない条件を同定することによって、先行技術の上記の問題、並びに他の問題を解決する。この阻害は、少なくとも３つのやり方で達成することができる：１）標的細菌の増殖を可能にする一方で、潜在的に交差反応性の細菌の増殖を阻害すること；２）選択的な結合剤を使用して、潜在的に交差反応性の細菌を選択的に除去又は阻止すること；及び３）潜在的に交差反応性の細菌を選択的に破壊すること。当業者は、同じ結果をもたらす他の方法も考慮することができる。
【０００６】
本発明は、検査すべき試料中の標的微生物の存在又は非存在を決定する方法を提供し、該方法は：（ａ）標的微生物へ付着することが可能なバクテリオファージの量を該試料と混合して、バクテリオファージ曝露試料を創出すること；（ｂ）潜在的に交差反応性の非標的微生物におけるファージの付着又は複製を阻害する一方で、該バクテリオファージが標的微生物へ付着することを可能にするのに十分な条件を該バクテリオファージ曝露試料へ提供すること；並びに（ｃ）バクテリオファージマーカーの存在又は非存在を検出するために該バクテリオファージ曝露試料をアッセイして、標的微生物の存在又は非存在を決定することを含んでなる。好ましくは、該方法は、潜在的に交差反応性の微生物におけるファージ複製を一掃するか又は阻害する一方で、バクテリオファージが標的微生物に感染して、標的微生物において増殖することを許容する条件を含む。好ましくは、該方法は、検出可能なタグの付いたバクテリオファージマーカーをさらに含み、そしてここで、アッセイすることは、標的分離工程、つまりバクテリオファージ曝露試料を、試料に存在する標的微生物を含有する標的微生物部分と、標的微生物へ結合していないタグ付きバクテリオファージを含有する非結合タグ付きバクテリオファージ部分へ分離することが可能な分離工程を実施することを含む。好ましくは、阻害することは、標的細菌の増殖を許容する一方で、潜在的に交差反応性の細菌の増殖を阻害することを含む。好ましくは、阻害することは、阻害物質を試料へ加えることを含む。好ましくは、阻害物質は、二価カチオン、抗生物質、キレート剤、及び金属化合物からなる群より選択される。好ましくは、阻害することは、基質へ付いた選択的な結合剤を使用して、潜在的に交差反応性の微生物を試料から選択的に除去することを含む。好ましくは、選択的な除去は、非標的細菌に選択的な抗体又はバクテリオファージを使用することを含む。好ましくは、基質は、微粒子を含む。好ましくは、阻害することは、潜在的に交差反応性の微生物を選択的に破壊するか又はその増殖を有意に遅らせることを含む。好ましくは、破壊することは、試料と抗生物質を選択的に混合することを含む。好ましくは、破壊することは、１以上の潜在的に交差反応性の非標的微生物へ選択的に結合及び／又は感染するバクテリオファージを試料と混合することを含む。好ましくは、アッセイすることは、免疫学的アッセイを含む。
【０００７】
本発明はまた、検査すべき試料中の標的微生物の存在又は非存在を決定するための選択的な増殖培地を提供し、該培地は、標的微生物に特異的な１以上のバクテリオファージ、栄養増殖培地、及び潜在的に交差反応性の非標的微生物へのファージ付着又はその中での複製を阻害する阻害物質（複数）を混合することを含んでなる。好ましくは、阻害物質（複数）は、交差反応性微生物に特異的なバクテリオファージ、抗体、抗生物質、抗菌化合物、二価カチオン、キレート剤、及び金属化合物からなる群より選択される。
【０００８】
さらに、本発明は、検査すべき試料中の標的微生物の存在又は非存在を決定するためのキットを提供し、該キットは、標的微生物に特異的な１以上のバクテリオファージ、栄養増殖培地、及び阻害物質を含有する選択的な増殖培地を含んでなる。好ましくは、バクテリオファージと阻害物質は、単一の容器中で混合することができる。あるいは、バクテリオファージと栄養増殖培地が一方の容器にあって、阻害物質が他方の容器にあってよい。好ましくは、キットには、側方流動ストリップのような迅速診断ツールがさらに含まれる。
【０００９】
本発明は、標的微生物への感度をさほど改変させずにファージベースの微生物検出法の特異性を高めるという課題を解決する。本発明の数多くの他の特徴、目的、及び利点は、付帯の図面と関連付けて読むときに、以下の詳細な説明より明らかになろう。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、ファージ増幅プロセスを図解する；
【図２】図２は、本発明により微生物の存在又は非存在を決定するための方法及び装置のいくつかの例示の態様を図解する；及び
【図３】図３は、本発明による検出キットを図解する。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、バクテリオファージを使用して微生物の検出を高めるための方法及び装置を提供する。当該技術分野で知られているように、バクテリオファージは、特別な微生物に対して概して特異的であるが、それらは、しばしば、近縁である生物に対してやや低レベルの交差反応性を明示する。一般に、バクテリオファージは、標的微生物へ特異的なバクテリオファージを混合することによって、試料中の標的微生物の存在を検出するために使用される。次いで、バクテリオファージが前記標的微生物へ付着するか又はその中で複製することを可能にするのに十分な条件を提供することによって、バクテリオファージ曝露試料をインキュベートする。インキュベーション後、バクテリオファージマーカーの存在又は非存在を検出するためにバクテリオファージ曝露試料をアッセイして、前記標的微生物の存在又は非存在を決定する。試料におけるファージの付着又は複製の成功は、標的微生物のその試料中の存在を示す。本発明は、バクテリオファージが特定の微生物に対して完全には特異的でない場合もあるという事実に対処する。バクテリオファージが相互作用する関連の非標的微生物は、一般に、「交差反応性」生物と呼ばれる。
【００１２】
当該技術分野では、バクテリオファージが微生物へ付着したか又はその内部で複製したかどうかを決定するために種々の方法が開発されてきた。一般に、これらには、バクテリオファージへ付着したフラッグの検出、バクテリオファージそれ自体の検出、主要カプシドタンパク質のようなバクテリオファージの部分の検出、ファージ複製の酵素又は他の副産物の検出（特に、ルシフェラーゼレポーターファージのような修飾されたバクテリオファージを用いる）、又は、成功したファージ複製及び微生物溶菌の後で放出される細菌残滓の検出が関与する。本発明の目的では、これらのファージ関連シグナルのいずれもの検出は、ファージマーカーの検出を含む。
【００１３】
本発明は、バクテリオファージ複製の詳細のいくらかを理解することで、より容易に把握することができる。この複製プロセスを図１に図解する。典型的なバクテリオファージ（７０）（この例では、ＭＳ２−Ｅ．Ｃｏｌｉ）が図の右側で細菌（１５２）より出現していることが示されている。構造的には、バクテリオファージ（７０）は、時々頭部と呼ばれる、ウイルス核酸（７４）、即ちＤＮＡ及び／又はＲＮＡを被包するタンパク質の外殻又はカプシド（７２）を含む。バクテリオファージには、カプシド又はＤＮＡ／ＲＮＡを構成するタンパク質、ネック（７６）、尾鞘（７７）、尾繊維（７８）、端盤（７９）、及びピン（８０）が含まれる場合もある。カプシド（７２）は、１以上のタンパク質の反復コピーより構築される。図面の左側に注目すると、ファージ（１５０）が細菌（１５２）（この例では、交差反応性細菌である）に感染するとき、それは、細菌の壁又は膜（１５１）の特定部位へそれ自身を付着させて、その核酸（１５４）をその細菌へ注入し、それがファージを数十のコピーから数千のコピーへ複製するように誘導する。このプロセスを図１において概略的に示す。このＤＮＡは、初期のｍＲＮＡ（１５５）と初期のタンパク質（１５６）へ進展し、その中には、ライン（１５７）に沿って膜成分になるものもあれば、宿主染色体（１５９）からの細菌ヌクレアーゼを利用して、ライン（１６４）に沿ってＤＮＡ前駆体になるものもある。他のものは、方向（１７０）に沿って移動して、ライン（１６６）に沿ってＤＮＡを取り込む頭部前駆体になる。膜成分は、経路（１６０）に沿って進展して、尾鞘、基盤、及びピンを生成する。他のタンパク質は、経路（１７２）に沿って進展して、尾繊維を生成する。生成すると、頭部は膜（１５１）より遊離して、経路（１７４）に沿って尾鞘と合体してから、この尾鞘と頭部が（１７６）で尾繊維と合体して、バクテリオファージ（７０）を生成する。溶原性バクテリオファージと呼ばれるある種のバクテリオファージは、（１８０）で示すように、宿主細菌を破裂させて、子孫をファージ環境へ放出して、環境中の他の細菌を捜し求める。交差反応性細菌（１５２）におけるこの付着又は複製プロセスに選択的に干渉するどの工程又は物質も、本発明の一部を形成するものと考慮される。これには、ファージの付着又は複製を直接阻害するあらゆる工程又は物質だけでなく、細菌（１５２）そのものに影響を及ぼして、それによりファージの付着又は複製を間接的に阻害するあらゆる工程又は物質も含まれる。
【００１４】
本発明は、潜在的に交差反応性の非標的細菌におけるファージの付着及び／又は複製が何らかのやり方で阻害される条件を同定して、ファージベースの診断法の特異性を高めるためにこの阻害を使用する。この阻害は、阻害物質の添加、又は阻害工程の使用を含んでよい。この阻害法の３つの態様：１）標的細菌の増殖を許容する一方で、潜在的に交差反応性の細菌の増殖を阻害すること；２）選択的な結合剤を使用して、潜在的に交差反応性の細菌を選択的に除去又は阻止すること；及び３）潜在的に交差反応性の細菌を選択的に破壊することについて、本明細書に記載する。これらの態様は、例示であると企図されるが、本発明は、これらの態様に限定されない。同じ結果を伴う他の方法も、当業者によって考慮され得る。
【００１５】
潜在的に交差反応性の細菌の阻害は、微生物の検出に一般的な方法を使用して達成することができる。例えば、塩化ナトリウム（高濃度の）のような塩、二価カチオン、ポリミキシンＢ又はＥのような抗生物質、アクリフラビンのような防腐薬、亜テルル酸カリウムのような金属化合物、及びデフェロキサミンのような鉄キレート剤は、黄色ブドウ球菌の増殖を許容する一方で、一部のコアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ＣＮＳ）の増殖を阻害する。これらの化合物はまた、バクテリオファージのＣＮＳ中での複製を有意に阻害するか又は遅延させることができる一方で、黄色ブドウ球菌中での複製にはほとんど影響を及ぼさない。ファージ複製の効率及び時機に示差的に影響を及ぼす選択培地の使用は、バクテリオファージベースの細菌診断法の特異性を改善するための新規な方法である。
【００１６】
非標的細菌の除去又は阻止は、抗体、非標的細菌に選択的なバクテリオファージ、非標的細菌へ選択的に結合する他の化合物を使用して達成してよい。黄色ブドウ球菌同定検査では、ＣＮＳ種の除去が有益であり得る。これら化合物の非標的細菌への結合は、標的細菌に対して不十分に特異的であるバクテリオファージによる上記細菌への後続の結合を阻止するのに十分であり得るので、非標的細菌における非特異的な感染及び複製を妨げる。あるいは、これらの化合物を、微粒子、磁気ビーズ、又は固体基質のような他の基質へ付けてよい。試料とともにインキュベートされるとき、潜在的な非標的細菌は、その基質へ選択的に結合する。次いで、この基質は、試料より物理的に除去することができる。分離の方法には、微粒子の遠心分離、磁気ビーズを単離するための磁場の適用、又は他の分離法が含まれる。
【００１７】
非標的細菌の選択的な破壊は、標的細菌はほとんど無事でファージ感染を受け易いままにする一方で、ファージ感染を受けられないように非標的細菌を選択的に破壊する抗菌化合物を使用して達成することができる。そのような化合物には、ａ）選択的な抗生物質、及びｂ）潜在的に交差反応性の非標的細菌へ選択的に結合及び／又は感染するバクテリオファージが含まれる。後者は、試料中の標的細菌へ選択的に感染させるために使用する一次バクテリオファージに対して相補的なバクテリオファージである。相補的バクテリオファージは、非標的細菌に成功裡に感染して溶菌することによって非標的細菌を破壊することができるので、一次バクテリオファージによるファージ感染が消失されるか又は有意に抑制される。相補的バクテリオファージはまた、外からの溶菌として知られるプロセスによって非標的細菌を破壊するために使用することができる。「外からの溶菌」は、数百又は数千のファージ粒子が細菌の細胞壁へ結合するときのその破壊を意味する。このプロセスは、本発明において、多数の相補的ファージが潜在的に交差反応性の細菌へ迅速かつ選択的に結合するように、高濃度の相補的ファージを試料へ加えることによって利用することができる。多重的なファージ結合の圧力の下で、交差反応性細菌は、破裂するように強いられて、最重要なバクテリオファージによるファージ感染の焦点としては除外される。
【００１８】
図２は、本発明による例示の工程、並びに例示のバクテリオファージ−阻害剤の混合物を図解する。試料（２００）は、標的細菌（２０４）と交差反応性細菌（２０８）をともに含有する。添加混合物（２２０）は、バクテリオファージ（２２４）と、「Ｉ」によって特定する阻害成分（２２８）を含む。好ましくは、成分（２２４）及び（２２８）は、液体培地や他の培養基のような、バクテリオファージ（２２４）と阻害剤（２２８）に適した培地に提供する。バクテリオファージ（２２４）は、標的細菌（２０４）に特異的であるが、交差反応性細菌（２０８）へ付着することもできて、それに感染する場合もある。阻害剤（２２８）は、別のバクテリオファージ、抗体、化学物質、抗生物質、抗菌化合物でもよく、バクテリオファージマーカーへのアッセイに対する交差反応性の寄与を阻害するように作用し得る他のどの物質でもよい。
【００１９】
（２２９）で示すように、添加混合物（２２０）を試料（２００）へ加える。曝露された試料（２３６）において、バクテリオファージ（２２４）は、標的細菌（２０４）と交差反応性細菌（２０８）をともに見出してそれへ付着する。簡単にするために、各細菌に対してバクテリオファージが１つだけ付着するように示すが、多くの、しばしば数百個のバクテリオファージが付着するものである。さらに、（２３４）で示すように、阻害剤成分（２２８）はまた、その阻害剤がバクテリオファージ又は抗体であれば、それへ付着することによって、又は他の何らかの相互作用によって、交差反応性細菌に影響を及ぼすものである。その相互作用がどんなものであれ、それは、交差反応性細菌に対して悪影響を及ぼすものである。例えば、阻害成分（２２８）が、標的細菌に対してではなく、交差反応性細菌に対して特異的であるバクテリオファージであれば、その交差反応性細菌には千個以上のバクテリオファージが付着することになり得るので、それによりその細菌が破壊されて、バクテリオファージ（２２４）は複製されず、このアッセイに寄与するバクテリオファージマーカーを創出しない。あるいは、阻害剤が抗体又はバクテリオファージであれば、この抗体又はバクテリオファージを使用して、交差反応性細菌を基質（２５４）へ付着させて基質／阻害剤／交差反応性細菌複合体（２５６）を創出することができて、これを経路（１４８）より試料より除去して、（２５０）で交差反応性細菌を単離することができる。この事例において、標的細菌プロセスは、経路（２４６）を介して（２４０）へ進行して、ここでは、本質的に、標的細菌／バクテリオファージ複合体（２３８）だけが試料に残り、バクテリオファージが（２６４）のようなバクテリオファージマーカーを試料（２６０）において創出し、交差反応性細菌がこのマーカーアッセイに寄与しないので、アッセイの特異性が大いに高められる。また、阻害剤が、交差反応性細菌に特異的である抗生物質又は化学物質であるならば、交差反応性細菌が死滅するので、交差反応性細菌へ付着したバクテリオファージ（２２４）は、複製することができない。従って、やや異なる経路（２５７）を介しても、結果は同じである：試料（２６０）は、標的細菌からのマーカー（２６４）だけを本質的に含有して、これだけがマーカーアッセイに寄与するのである。（２６０）において、マーカーは、子孫バクテリオファージとして示されているが、他の多くの種類のファージマーカーもあり得る。検出アッセイは、抗体結合事象を利用して検出可能なシグナルを産生する、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、側方流動イムノクロマトグラフィー（ＬＦＩ）、及びフロースルーアッセイ技術のようなイムノアッセイ方法を使用してよい。検出アッセイは、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット、アプタマーベースのアッセイ、免疫蛍光、本明細書においてＭＡＬＤＩとして引用する飛行時間質量分析法を伴うマトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）、及び他の検出方法も使用してよい。
【００２０】
図３は、微視的生物体を検出するための例示の検査キット（３５４）を示す。検査キット（３５４）には、好ましくは、交差反応性微生物の阻害剤溶液（３５８）、反応容器（３６０）、保護ケース（３６３）に包まれた１以上の検出エレメント（３６６）、キットを使用するための手引書（３７０）、及び上述の検査キット部品を保持するための保存容器（receptacle）（３７２）が含まれる。保護ケース（３６３）には、細菌が存在していない場合に予測結果（３６７）を示す、標準検出エレメント（３７６）も含めてよい。例えば、検出エレメントが、側方流動ストリップ又はフロースルーデバイスのようなイムノアッセイ検査デバイスであれば、標準検出エレメントは、細菌が存在していなかったバクテリオファージの標準試料を適用した、同一のイムノアッセイデバイスであってよい。反応容器（３６０）には、容器本体（３６７）と容器栓（３６４）が含まれる。好ましくは、反応容器本体は、ボトル（３６７）であり、反応容器栓は、ボトルキャップ（３６４）である。反応容器（３６０）は、ファージ（３６８）と任意選択の増殖培地（３６９）を含有する。ファージ（３６８）は、好ましくは、反応容器本体（３６７）の内壁（３６９）へ付着している所定量のファージを含む。キャップ（３６４）は、好ましくは、ボトル（３６７）の最上部のねじ山と合致する内側ネジ（３６２）を有するネジ式キャップである。キャップ（３６４）には、好ましくは、ディスペンサー（３６５）が含まれ、これは、好ましくは、所定サイズの液滴を放出するように設計されたスポイトヘッドである。この態様において、検出エレメント（３６６）は、抗体を含み、そしてより具体的には、側方流動ストリップ（３６６）であるが、それはまた、フロースルーデバイスであっても、他のどんな検出装置であってもよい。好ましくは、保存容器（３７２）は、プラスチックバッグ（３７２）を含み、これは、検査キット部品を保持することと、検査が完了した後で簡便な使い捨て保存容器を提供することの二重の目的に役立つ。検査キット（３５４）は、交差反応性微生物の阻害剤溶液（３５８）を反応容器（３６０）へ加えることにより容器（３５６）を不要にすることによって簡略化してもよい。
【００２１】
本発明の方法は、細菌を同定するためのファージベースの方法において、高感度であるが最適未満の特異性を有するバクテリオファージを使用することを可能にするために開発された。それは、近縁の細菌株の標的株からの差別化を可能にする。それは、標的種に近縁である細菌種では達成することが困難である高い特異性の必要性を最小にする。
【００２２】
ある細菌種を阻害する選択的な化合物の使用については、１９５０年代より科学文献に公表されてきたが；この文献の中で、バクテリオファージの付着又は複製の反復を妨げる阻害の使用について考慮しているものは１つもない。当業者は、本開示が細菌の阻害に使用される先行技術の阻害の方法のいずれの使用も可能にして、バクテリオファージ複製を阻害するために潜在的に使用し得ることを理解されよう。
【００２３】
微生物を同定するために、及び／又は抗生物質抵抗性検査又は抗生物質感受性を判定するために使用される多くの他のファージベースの方法及び装置は、本発明の方法及び装置によって強化することができる。例えば、「Apparatus and Method For Detecting Microscopic Living Organisms Using Bacteriophage（バクテリオファージを使用して微視的生物体を検出するための装置及び方法）」と題する米国特許出願公開公報番号２００５／０００３３４６に記載される工程のようなファージ増幅工程は、本発明により強化され得る；あるいは、「Apparatus and Method For Detecting Microorganisms Using Flagged Bacteriophage（フラッグ融合バクテリオファージを使用して微生物を検出するための装置及び方法）」と題するＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０６／１２３７１に記載されるような、微生物へ付着させる工程も強化され得る。
【００２４】
他のどのファージベースの同定法も使用してよい。そのような方法の例が以下の公表文献に開示されている：
米国特許：
４，１０４，１２６号（David M. Young へ1978年8月1日発行）
４，７９７，３６３号（Teodorescu et al. へ1989年1月10日発行）
４，８６１，７０９号（Ulitzur et al. へ1989年8月29日発行）
５，０８５，９８２号（Douglas H. Keith へ1992年2月4日発行）
５，１６８，０３７号（Entis et al. へ1992年12月1日発行）
５，４９８，５２５号（Rees et al. へ1996年3月12日発行）
５，６５６，４２４号（Jurgensen et al. へ1997年8月12日発行）
５，６７９，５１０号（Ray et al. へ1997年10月21日発行）
５，７２３，３３０号（Rees et al. へ1998年3月3日発行）
５，８２４，４６８号（Scherer et al. へ1998年10月20日発行）
５，８８８，７２５号（Michael F. Sanders へ1999年3月30日発行）
５，９１４，２４０号（Michael F. Sanders へ1999年6月22日発行）
５，９５８，６７５号（Wicks et al. へ1999年9月28日発行）
５，９８５，５９６号（Stuart Mark Wilson へ1999年11月16日発行）
６，０９０，５４１号（Wicks et al. へ2000年7月18日発行）
６，２６５，１６９ Ｂ１号（Cortese et al. へ2001年7月24日発行）
６，３００，０６１ Ｂ１号（Jacobs, Jr. et al. へ2001年10月9日発行）
６，３５５，４４５ Ｂ２号（Cherwonogrodzky et al. へ2002年3月12日発行）
６，４２８，９７６ Ｂ１号（Chang et al. へ2002年8月6日発行）
６，４３６，６５２ Ｂ１号（Cherwonogrodzky et al. へ2002年8月20日発行）
６，４３６，６６１ Ｂ１号（Adams et al. へ2002年8月20日発行）
６，４６１，８３３ Ｂ１号（Stuart Mark Wilson へ2002年10月8日発行）
６，５２４，８０９ Ｂ１号（Stuart Mark Wilson へ2003年2月25日発行）
６，５４４，７２９ Ｂ２号（Sayler et al. へ2003年4月8日発行）
６，５５５，３１２ Ｂ１号（Hiroshi Nakayama へ2003年4月29日発行）
米国公開特許出願：
２００２／０１２７５４７ Ａ１号（Stefan Miller により2002年9月12日公開）
２００４／０１２１４０３ Ａ１号（Stefan Miller により2004年6月24日公開）
２００４／０１３７４３０ Ａ１号（Anderson et al. により2004年7月15日公開）
２００５／０００３３４６ Ａ１号（Voorhees et al. により2005年1月6日公開）
外国特許公開：
ＥＰＯ ０ ４３９ ３５４ Ａ３号（Bittner et al. により1991年7月31日公開）
ＷＯ９４／０６９３１号（Michael Frederick Sanders により1994年3月31日公開）
ＥＰＯ １ ３００ ０８２ Ａ２号（Michael John Gasson により2003年4月9日公開）
ＷＯ ０３／０８７７７２ Ａ２号（Madonna et al. により2003年10月23日公開）
他の公表文献：
Favrin et al.「Development and Optimization of a Novel Immunomagnetic Separation-Bacteriophage Assay for Detection of Salmonella enterica Serovar Enteritidis in Broth（サルモネラ腸炎菌のブロスにおける検出のための新規な免疫磁気分離−バクテリオファージアッセイの開発及び最適化）」Applied and Environmental Microbiology, January 2001, pp. 217-224, Volume 67, No. 1.
他のどのバクテリオファージベースの方法も同様に使用してよい。
【００２５】
選択される生物に特異的で、高感度、単純、迅速、及び／又は経済的であり、多数の新規の特徴を有する微生物検出方法について記載してきた。本明細書内で記載した特別な態様は、例示の目的のためであって、以下の特許請求項に記載される本発明を限定するものと解釈してはならないことを理解されたい。さらに、当業者には、本発明の概念より逸脱することなく、記載した具体的な態様の数多くの使用及び修飾をなし得ることが明らかである。記載した様々な構造及び方法の代わりに同等の構造及び方法を使用してよく、いくつかの事例では、本方法のサブ方法（subprocesses）を異なる順序で実施してよく、あるいは、多種多様な異なる材料及びエレメントを使用してよい。
【符号の説明】
【００２６】
７０  バクテリオファージ      ７２  カプシド      ７４  ウイルス核酸      ７６  ネック      ７７  尾鞘      ７８  尾繊維      ７９  端盤      ８０  ピン      １５０  ファージ      １５１  膜      １５２  細菌      １５４  核酸      １５５  初期のｍＲＮＡ      １５６  初期のタンパク質      １５７  ライン      １５９  宿主染色体      １６０  経路      １６４  ライン      １６６  ライン      １７０  方向      １７２    経路      １７４    経路      １７６  頭部      １８０  バクテリオファージ      ２００  試料      ２０４  標的細菌      ２０８  交差反応性細菌      ２２０  添加混合物      ２２４  バクテリオファージ      ２２８  阻害成分      ２３６  試料      ２３８  標的細菌／バクテリオファージ複合体      ２４６  経路      ２５４  基質      ２５６  基質／阻害剤／交差反応性細菌複合体      ２５７  経路      ２６０  試料      ２６４  マーカー      ３５４  検査キット      ３５６  容器      ３５８  阻害剤溶液      ３６０  反応容器    ３６２  内側ネジ      ３６３  保護ケース      ３６４  容器栓      ３６５  ディスペンサー      ３６６  検出エレメント      ３６７  容器本体      ３６８  ファージ      ３６９  内壁      ３７０  手引書      ３７２  保存容器      ３７６  標準検出エレメント
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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