(57)【要約】  本発明は、ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子及びその断片を含む胃癌診断用マーカー、それを使用した胃癌診断方法、及び前記マーカーを使用した胃癌誘発物質又は胃癌抑制物質のスクリーニング方法に関するもので、より詳細には、ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子が胃癌で特異的に発現が増加しており、前記遺伝子の過剰発現または抑制によって胃癌細胞株の細胞増殖と腫瘍形成能が活性または抑制され、ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子の発現が細胞増殖シグナル伝達系に作用して胃癌を誘発するので、前記遺伝子をマーカーにして胃癌の診断、胃癌誘発動物の製造、胃癌の予防及び治療、及び胃癌特異的抗癌剤の開発等に使用することができる。
2010523107.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表わされるＺＮＦ３１２ｂ遺伝子またはその断片の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドを増幅することができるプライマー対を含む胃癌診断用キット。
【請求項２】
前記断片が、配列番号１で表わされる塩基配列中にカルボキシ末端部位（配列番号２０）を含むことを特徴とする、請求項１に記載の胃癌診断用キット。
【請求項３】
配列番号２で表わされるＺＮＦ３１２ｂタンパク質またはその断片に特異的に結合する抗体を含む胃癌診断用キット。
【請求項４】
正常対照群と比較して、ＺＮＦ３１２ｂタンパク質またはその断片の量の増加で胃癌を診断することを特徴とする、請求項３に記載の胃癌診断用キット。
【請求項５】
配列番号１で表わされるＺＮＦ３１２ｂ遺伝子またはその断片の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、またはそれに相補的なオリゴヌクレオチドが組み込まれた胃癌診断用ＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項６】
配列番号２で表わされるＺＮＦ３１２ｂタンパク質またはその断片に特異的に結合する抗体を、胃組織、胃細胞、尿、血液、血清及び血漿からなる群から選択される生物学的試料と接触させる工程を含む胃癌マーカー検出方法。
【請求項７】
１）個体の試料から配列番号１で表わされるＺＮＦ３１２ｂ遺伝子またはその断片の発現レベルを測定する工程；及び
２）工程１）のマーカー遺伝子の発現レベルが正常対照群より有意に高い個体を選別する工程、を含む胃癌診断方法。
【請求項８】
工程１）の試料が、胃組織、胃細胞、尿、血液、血清及び血漿からなる群から選択されることを特徴とする、請求項７に記載の胃癌診断方法。
【請求項９】
１）実験群として胃由来細胞に被検組成物または被検化合物を処理する工程；
２）工程１）の実験群細胞と処理しない対照群細胞の配列番号１で表わされるＺＮＦ３１２ｂ遺伝子またはその断片の発現レベルを測定して比較する工程；及び
３）前記実験群の発現レベルを対照群と比較して有意に増加させる被検組成物または被検化合物を選別する工程、とを含む胃癌誘発物質スクリーニング方法。
【請求項１０】
工程２）の断片が、配列番号１で表わされる塩基配列中にカルボキシ末端部位（配列番号２０）を含むことを特徴とする、請求項９に記載の胃癌誘発物質スクリーニング方法。
【請求項１１】
１）実験群として胃由来細胞に被検組成物または被検化合物を処理する工程；
２）工程１）の実験群細胞と処理しない対照群細胞の配列番号１で表わされるＺＮＦ３１２ｂ遺伝子またはその断片の発現レベルを測定して比較する工程；及び
３）前記実験群の発現レベルを対照群と比較して有意に減少させる被検組成物または被検化合物を選別する工程、とを含む胃癌抑制物質スクリーニング方法。
【請求項１２】
工程２）の断片は配列番号１で表わされる塩基配列の中でカルボキシ末端部位（配列番号２０）を含むことを特徴とする、請求項９に記載の胃癌抑制物質スクリーニング方法。
【請求項１３】
１）配列番号９で表わされる塩基配列で構成されるＺＮＦ３１２ｂプロモーター及びその断片に作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含む遺伝子コンストラクトを製造する工程；
２）前記工程１）の遺伝子コンストラクトを発現ベクターに導入し、動物細胞に形質転換して形質転換体を製造する工程；
３）前記工程２）の形質転換体を被検組成物または被検化合物で処理した実験群と処理しない対照群を製造する工程；
４）前記工程３）の実験群及び対照群のレポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程；及び
５）前記工程４）の実験群の発現レベルを対照群と比較して有意に増加させる被検組成物または被検化合物を選別する工程、とを含む胃癌誘発物質スクリーニング方法。
【請求項１４】
工程１）の断片が、配列番号９で表わされる塩基配列中において、転写開始点を基準に−８５０ｂｐ〜＋１ｂｐ部位（配列番号１２）を含むことを特徴とする、請求項１３に記載の胃癌誘発物質スクリーニング方法。
【請求項１５】
工程１）のレポーター遺伝子が、ルシフェラーゼ遺伝子であることを特徴とする、請求項１３に記載の胃癌誘発物質スクリーニング方法。
【請求項１６】
１）配列番号９で表わされる塩基配列で構成されるＺＮＦ３１２ｂプロモーター及びその断片に作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含む遺伝子コンストラクトを製造する工程；
２）前記工程１）の遺伝子コンストラクトを発現ベクターに導入し、動物細胞に形質転換して形質転換体を製造する工程；
３）前記工程２）の形質転換体を被検組成物または被検化合物で処理した実験群と処理しない対照群を製造する工程；
４）前記工程３）の実験群及び対照群のレポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程；及び
５）前記工程４）の実験群の発現レベルを対照群と比較して有意に減少させる被検組成物または被検化合物を選別する工程、とを含む胃癌抑制物質スクリーニング方法。
【請求項１７】
工程１）の断片が、配列番号９で表わされる塩基配列の中で転写開始点を基準に−８５０ｂｐ〜＋１ｂｐ部位（配列番号１２）を含むことを特徴とする、請求項１６に記載の胃癌抑制物質スクリーニング方法。
【請求項１８】
工程１）のレポーター遺伝子が、ルシフェラーゼ遺伝子であることを特徴とする、請求項１３に記載の胃癌抑制物質スクリーニング方法。
【請求項１９】
１）配列番号１５で表わされる塩基配列で構成されるＫ−ｒａｓプロモーター及びその断片に作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含む遺伝子コンストラクトを製造する工程；
２）前記工程１）の遺伝子コンストラクトを発現ベクターに導入し、配列番号２で表わされるアミノ酸配列で構成されるＺＮＦ３１２ｂタンパク質またはその断片を発現する動物細胞に形質転換することにより形質転換体を製造する工程；
３）前記工程２）の形質転換体を被検組成物または被検化合物で処理した実験群と処理しない対照群を製造する工程；
４）前記工程３）の実験群及び対照群のレポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程；及び
５）前記工程４）の実験群の発現レベルを対照群と比較して有意に増加させる被検組成物または被検化合物を選別する工程、とを含む胃癌誘発物質スクリーニング方法。
【請求項２０】
工程１）の断片が、配列番号１９で表わされる塩基配列を含むことを特徴とする、請求項１９に記載の胃癌誘発物質スクリーニング方法。
【請求項２１】
１）配列番号１５で表わされる塩基配列で構成されるＫ−ｒａｓプロモーター及びその断片に作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含む遺伝子コンストラクトを製造する工程；
２）前記工程１）の遺伝子コンストラクトを発現ベクターに導入し、配列番号２で表わされるアミノ酸配列で構成されるＺＮＦ３１２ｂタンパク質またはその断片を発現する動物細胞を形質転換することにより形質転換体を製造する工程；
３）前記工程２）の形質転換体を被検組成物または被検化合物で処理した実験群と処理しない対照群を製造する工程；
４）前記工程３）の実験群及び対照群のレポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程；及び
５）前記工程４）の実験群の発現レベルを対照群と比較して有意に減少させる被検組成物または被検化合物を選別する工程、とを含む胃癌抑制物質スクリーニング方法。
【請求項２２】
工程１）の断片が、配列番号１９で表わされる塩基配列を含むことを特徴とする、請求項１９に記載の胃癌抑制物質スクリーニング方法。
【請求項２３】
１）配列番号１５で表わされる塩基配列で構成されるＫ−ｒａｓプロモーターまたはその断片を含むオリゴヌクレオチドと配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含むＺＮＦ３１２ｂタンパク質またはその断片とを、被検組成物または被検化合物と一緒に処理する工程；
２）工程１）の実験群と処理しない対照群でＫ−ｒａｓプロモーターまたはその断片に対するＺＮＦ３１２ｂタンパク質またはその断片の結合レベルを測定して比較する工程；及び
３）前記実験群の結合レベルを対照群と比較して有意に増加させる被検組成物または被検化合物を選別する工程、とを含む胃癌誘発物質スクリーニング方法。
【請求項２４】
工程１）のＫ−ｒａｓプロモーターの断片が、配列番号１９で表わされる塩基配列を含むことを特徴とする、請求項２３に記載の胃癌誘発物質スクリーニング方法。
【請求項２５】
工程１）のＺＮＦ３１２ｂタンパク質の断片が、配列番号２で表わされるアミノ酸配列の中でカルボキシ末端部分（配列番号２０）を含むことを特徴とする、請求項２３に記載の胃癌誘発物質スクリーニング方法。
【請求項２６】
１）配列番号１５で表わされる塩基配列で構成されるＫ−ｒａｓプロモーターまたはその断片を含むオリゴヌクレオチドと配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含むＺＮＦ３１２ｂタンパク質またはその断片とを、被検組成物または被検化合物と一緒に処理する工程；
２）工程１）の実験群と処理しない対照群で、Ｋ−ｒａｓプロモーターまたはその断片に対するＺＮＦ３１２ｂタンパク質またはその断片の結合レベルを測定して比較する工程；及び
３）前記実験群の結合レベルを対照群と比較して有意に減少させる被検組成物または被検化合物を選別する工程、とを含む胃癌抑制物質スクリーニング方法。
【請求項２７】
工程１）のＫ−ｒａｓプロモーターの断片が、配列番号１９で表わされる塩基配列を含むことを特徴とする、請求項２６に記載の胃癌抑制物質スクリーニング方法。
【請求項２８】
工程１）のＺＮＦ３１２ｂタンパク質の断片が、配列番号２で表わされるアミノ酸配列の中でカルボキシ末端部分（配列番号２０）を含むことを特徴とする、請求項２６に記載の胃癌抑制物質スクリーニング方法。
【請求項２９】
配列番号１で表わされるＺＮＦ３１２ｂ遺伝子またはその断片を含むベクターを、ヒトを除いた動物に形質転換することによって胃癌が誘発される胃癌診断及びスクリーニング用動物。
【請求項３０】
配列番号１で表わされるＺＮＦ３１２ｂ遺伝子またはその断片から転写されるｍＲＮＡの配列の全部または一部と相補的な配列を有し、前記ｍＲＮＡに結合して前記ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子またはその断片の発現を抑制するアンチセンス遺伝子。
【請求項３１】
配列番号１で表わされるＺＮＦ３１２ｂ遺伝子またはその断片から転写されるｍＲＮＡの配列の全部または一部と相補的な配列を有し、ダイサータンパク質によって認識されて前記ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子またはその断片の発現を阻害するｓｉＲＮＡ配列。
【請求項３２】
請求項１１、請求項１６、請求項２１または請求項２６に記載のいずれか一項の方法でスクリーニングされた胃癌抑制物質を有効成分として含む、胃癌予防及び治療用組成物。
【請求項３３】
請求項３２に記載の薬学的に有効な量の組成物を、胃癌にかかった個体に投与する工程を含む胃癌の治療方法。
【請求項３４】
請求項３２に記載の薬学的に有効な量の組成物を、個体に投与する工程を含む胃癌の予防方法。
【請求項３５】
胃癌予防及び治療用組成物の製造のための請求項３２に記載の胃癌抑制物質の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胃癌遺伝子であるＺＮＦ３１２ｂ又はその断片を含む胃癌診断用マーカー、それを使用する胃癌診断方法、及び該マーカーを使用する胃癌誘発物質又は胃癌抑制物質のスクリーニング方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒトを含む高等動物は、約３０，０００個の遺伝子を有しており、その中の約１５％だけがそれぞれの個体で発現される。したがって、どんな遺伝子が選択されて発現されるのかによって、生命のすべての現象、すなわち発生、分化、恒常性、刺激に対する反応、細胞分裂周期調節、老化及びアポトーシス（プログラム細胞死）等が決定される（Ｌｉａｎｇ，Ｐ．ａｎｄＡ．Ｂ．Ｐａｒｄｅｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９２年，第２５７巻，９６７−９７１頁）。
【０００３】
腫瘍発生のような病理学的現象は、遺伝子変異過程で誘発され、結局は遺伝子発現の変化を誘導するようになる。このような遺伝子変化は、細胞シグナル伝達の異常を招来する。したがって、相異している細胞間で現われる遺伝子発現の比較は、多くの生物学的現象を理解するのに基本的かつ効果的なアプローチ方法と言える。腫瘍発生に対する多くの研究結果を総合してみると、染色体ヘテロ接合性の消失、発癌遺伝子の活性化及びｐ５３遺伝子を含む他の腫瘍抑制遺伝子の不活性化等の様々な遺伝的変化が、腫瘍組織に蓄積されてヒトの腫瘍を起こすことが報告されている（Ｂｉｓｈｏｐ，Ｊ．Ｍ．，Ｃｅｌｌ，１９９１年，第６４巻，２３５−２４８頁、及びＨｕｎｔｅｒ，Ｔ．，Ｃｅｌｌ，１９９１年，第６４巻，２４９−２７０頁）。また、癌の１０〜３０％は、発癌遺伝子が増幅されることによって発癌遺伝子が活性化して起きると報告されている。発癌遺伝子の活性化は、多くの癌の病因学研究に重要な役割をし、それを明らかにすることが求められている。
【０００４】
胃癌は、韓国及び日本等のアジア地域で最も多く発生が見られる癌であり、死亡率１位を示す癌である（Ｐａｒｋｉｎら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１９９９年，第８０巻，８２７−８４１頁；Ｎｅｕｇｕｔら，Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１９９６年，第２３巻，２８１−２９１頁）。胃癌と関連した遺伝子は、あまり報告されていないが、最近分子的生物学的分析により、ｐ５３（Ｙｏｋｏｚａｋｉら，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．，２００１年，第２０４巻，４９−９５頁）、β−カテニン（朴ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１９９９年，第５９巻，４２５７−４２６０頁）、Ｅ−カデリン（Ｂｅｒｘら，Ｈｕｍ．  Ｍｕｔａｔ．，１９９８年，第１２巻，２２６−２３７頁）、トレホイル因子１（ｔｒｅｆｏｉｌ  ｆａｃｔｏｒ  １）（朴ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，２０００年，第１１９巻，６９１−６９８頁）、ｃ−ｍｅｔ（李ら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２０００年，第１９巻，４９４７−４９５３頁）のような遺伝子が、胃癌で多くの遺伝的変異があると報告されている。また、ＣＡ１１（Ｙｏｓｈｉｋａｗａら，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２０００年，第９１巻，４５９−４６３頁；Ｓｈｉｏｚａｋｉら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．，２００１年，第１９巻，７０１−７０７頁）と胃腸粘膜で合成されるトレホイル因子（ｔｒｅｆｏｉｌ  ｆａｃｔｏｒ）であるＴＦＦ１とＴＦＦ２（Ｓｈｉｏｚａｋｉら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．，２００１年，第１９巻，７０１−７０７頁；ＫｉｒｉｋｏｓｈｉとＫａｔｏｈＫｉｒｉｋｏｓｈｉ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．，２００２年，第２１巻，６５５−６５９頁）のような遺伝子が胃癌で低発現されるという報告もある。また、長谷川らは、腸タイプの胃癌で発現される２３，０４０個の遺伝子からなるｃＤＮＡマイクロアレイを使用して、ＲＰＬ１０、ＨＳＰＣＢ、ＬＯＣ５６２８７、ＩＧＨＭ、ＰＧＣ、ＲＥＧＩＡ、ＲＮＡＳＥ１、ＴＦＦ１及びＴＦＦ２遺伝子の発現が胃癌の転移と関連するという事実を報告したことがある（Ｈａｓｅｇａｗａら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２００２年，第６２巻，７０１２−７０１７頁）。しかし、このような遺伝子だけで胃癌を診断および治療するには、まだ不十分で現在まで臨床に使用される胃癌標的遺伝子は、存在しないのが実情である。
【０００５】
ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子は、Ｆｅｚｆ１（ｆｏｒｅｂｒａｉｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ−ｌｉｋｅ１  ｇｅｎｅ）とも呼ばれ、カエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）の前脳（ｆｏｒｅｂｒａｉｎ）と嗅覚神経（ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｓｅｎｓｏｒｙ  ｎｅｕｒｏｎ；ＯＳＮ）で初めて同定されたもので、亜鉛（Ｚｉｎｃ）イオンを有するタンパク質をコードする（Ｍａｔｓｕｏ−Ｔａｋａｓａｋｉら．，Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．，２０００年，第９３巻，２０１−２０４頁）。前記遺伝子は、嗅覚神経の適切な終了、嗅球（ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｂｕｌｂ）の形成と中間ニューロンプロジェニター（ｉｎｔｅｒｎｅｕｒｏｎ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）のロストラルストリーム転移（ｒｏｓｔｒａｌ  ｓｔｒｅａｍ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）等のために必要な遺伝子で、嗅覚神経軸索突起（ａｘｏｎａｌ  ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）の細胞自律的調節（ｃｅｌｌ−ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓｌｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ）と嗅球の膜形成の調節のための必須因子として知られている（Ｔｓｕｔｏｍｕ  Ｈｉｒａｔａら．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２００６年，第１３３巻，１４３３−１４４３頁）。また、ＺＮＦ３１２ｂの発現は、胚芽発生段階で現われ、その後、成体になった後、胃でその発現が微弱に起きて他の組織では発現しないことが報告されている。今までＺＮＦ３１２ｂ遺伝子の機能として報告されたものの中で、胃癌または癌発生等に関しては、いかなる報告もないのが実情である。
【０００６】
そこで、本発明者らは、ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子が胃癌組織で発現が増加していることに着眼し、癌発生と関連した前記遺伝子の機能を研究した結果、ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子が胃癌で特異的に発現が増加して、発癌関連機能を有し、細胞増殖シグナル伝達系の一因子として作用し、Ｋ−ｒａｓプロモーター部位に結合して、Ｋ−ｒａｓ発現を増加させることを解明して本発明を完成した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｌｉａｎｇ，Ｐ．ａｎｄＡ．Ｂ．Ｐａｒｄｅｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９２年，第２５７巻，９６７−９７１頁
【非特許文献２】Ｂｉｓｈｏｐ，Ｊ．Ｍ．，Ｃｅｌｌ，１９９１年，第６４巻，２３５−２４８頁
【非特許文献３】Ｈｕｎｔｅｒ，Ｔ．，Ｃｅｌｌ，１９９１年，第６４巻，２４９−２７０頁
【非特許文献４】Ｐａｒｋｉｎら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１９９９年，第８０巻，８２７−８４１頁
【非特許文献５】Ｎｅｕｇｕｔら，Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１９９６年，第２３巻，２８１−２９１頁
【非特許文献６】Ｙｏｋｏｚａｋｉら，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．，２００１年，第２０４巻，４９−９５頁
【非特許文献７】朴ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１９９９年，第５９巻，４２５７−４２６０頁
【非特許文献８】Ｂｅｒｘら，Ｈｕｍ．  Ｍｕｔａｔ．，１９９８年，第１２巻，２２６−２３７頁
【非特許文献９】朴ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，２０００年，第１１９巻，６９１−６９８頁
【非特許文献１０】李ら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２０００年，第１９巻，４９４７−４９５３頁
【非特許文献１１】Ｙｏｓｈｉｋａｗａら，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２０００年，第９１巻，４５９−４６３頁
【非特許文献１２】Ｓｈｉｏｚａｋｉら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．，２００１年，第１９巻，７０１−７０７頁
【非特許文献１３】ＫｉｒｉｋｏｓｈｉとＫａｔｏｈＫｉｒｉｋｏｓｈｉ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．，２００２年，第２１巻，６５５−６５９頁
【非特許文献１４】Ｈａｓｅｇａｗａら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２００２年，第６２巻，７０１２−７０１７頁
【非特許文献１５】Ｍａｔｓｕｏ−Ｔａｋａｓａｋｉら．，Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．，２０００年，第９３巻，２０１−２０４頁
【非特許文献１６】Ｔｓｕｔｏｍｕ  Ｈｉｒａｔａら．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２００６年，第１３３巻，１４３３−１４４３頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子またはその断片を含む胃癌診断及びスクリーニング用遺伝子マーカー、ならびにＺＮＦ３１２ｂタンパク質またはその断片を含む胃癌診断及びスクリーニング用タンパク質マーカーを提供して、前記マーカーを使用した胃癌診断方法、胃癌誘発物質スクリーニング方法、胃癌抑制物質スクリーニング方法、及び胃癌予防及び治療用組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記目的を達成するために、本発明は、配列番号１で表わされるＺＮＦ３１２ｂ遺伝子またはその断片を含むオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドを増幅することができるプライマー対を含む胃癌診断用キットを提供する。
【００１０】
また、本発明は、配列番号２で表わされるＺＮＦ３１２ｂタンパク質またはその断片に特異的に結合する抗体を含む胃癌診断用キットを提供する。
【００１１】
また、本発明は、配列番号１で表わされるＺＮＦ３１２ｂ遺伝子またはその断片を含むオリゴヌクレオチド、またはそれに相補的なオリゴヌクレオチドが組み込まれた胃癌診断用ＤＮＡマイクロアレイを提供する。
【００１２】
また、本発明は、配列番号２で表わされるＺＮＦ３１２ｂタンパク質またはその断片に特異的に結合する抗体を胃組織、胃細胞、尿、血液、血清及び血漿の中から選択される生物学的試料と接触させる工程を含む胃癌マーカー検出方法を提供する。
【００１３】
また、本発明は、
１）個体の試料から前記マーカー遺伝子の発現レベルを測定する工程；及び
２）工程１）のマーカー遺伝子の発現レベルが正常対照群より高い個体を選別する工程を含む胃癌診断方法を提供する。
【００１４】
また、本発明は、
１）実験群として胃由来細胞を被検組成物または被検化合物で処理する工程；
２）工程１）の実験群細胞と処理しない対照群細胞の前記マーカー遺伝子の発現レベルを測定して比較する工程；及び
３）前記実験群の発現レベルを対照群と比較して有意に増加または減少させる被検組成物または被検化合物を選別する工程とを含む、胃癌誘発物質または抑制物質をスクリーニングする方法を提供する。
【００１５】
また、本発明は、
１）配列番号９で表わされる塩基配列で構成されるＺＮＦ３１２ｂプロモーター及びその断片に作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含む遺伝子コンストラクトを製造する工程；
２）前記工程１）の遺伝子コンストラクトを発現ベクターに導入した後、動物細胞に形質転換して形質転換体を製造する工程；
３）前記工程２）の形質転換体を被検組成物または被検化合物で処理した実験群と処理しない対照群を製造する工程；
４）前記工程３）の実験群及び対照群のレポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程；及び
５）前記工程４）の実験群の発現レベルを対照群と比較して有意に増加または減少する被検組成物または被検化合物を選別する工程とを含む、胃癌誘発物質または抑制物質をスクリーニングする方法を提供する。
【００１６】
また、本発明は、
１）配列番号１５で表わされる塩基配列で構成されるＫ−ｒａｓプロモーター及びその断片に作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含む遺伝子コンストラクトを製造する工程；
２）前記工程１）の遺伝子コンストラクトを発現ベクターに導入し、配列番号２で表わされるアミノ酸配列で構成されるＺＮＦ３１２ｂタンパク質またはその断片を発現する動物細胞に形質転換することにより形質転換体を製造する工程；
３）前記工程２）の形質転換体を被検組成物または被検化合物で処理した実験群と処理しない対照群を製造する工程；
４）前記工程３）の実験群及び対照群のレポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程；及び
５）前記工程４）の実験群の発現レベルを対照群と比較して有意に増加または減少する被検組成物または被検化合物を選別する工程を含む、胃癌誘発物質または抑制物質をスクリーニングする方法を提供する。
【００１７】
また、本発明は、
１）実験群として配列番号１５で表わされる塩基配列で構成されるＫ−ｒａｓプロモーターまたはその断片を含むオリゴヌクレオチドと配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含むＺＮＦ３１２ｂタンパク質またはその断片とを、被検組成物または被検化合物と一緒に処理する工程；
２）工程１）の実験群と処理しない対照群で、Ｋ−ｒａｓプロモーターまたはその断片に対するＺＮＦ３１２ｂタンパク質またはその断片の結合レベルを測定して比較する工程；及び
３）前記実験群の結合レベルを対照群と比較して有意に増加または減少する被検組成物または被検化合物を選別する工程とを含む、胃癌誘発物質または抑制物質をスクリーニングする方法を提供する。
【００１８】
また、本発明は、配列番号１で表わされるＺＮＦ３１２ｂ遺伝子またはその断片を含むベクターをヒトを除いた動物に形質転換して、胃癌が誘発された胃癌診断及びスクリーニング用動物を提供する。
【００１９】
また、本発明は、配列番号１で表わされるＺＮＦ３１２ｂ遺伝子またはその断片から転写されるｍＲＮＡ配列の全部または一部と相補的な配列を有し、前記ｍＲＮＡに結合して前記ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子またはその断片の発現を抑制する、アンチセンス遺伝子を提供する。
【００２０】
また、本発明は、配列番号１で表わされるＺＮＦ３１２ｂ遺伝子またはその断片から転写されるｍＲＮＡの配列の全部または一部と相補的な配列を有し、ダイサータンパク質によって認識され、前記ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子またはその断片の発現を阻害するｓｉＲＮＡ配列を提供する。
【００２１】
また、本発明は、前記方法によってスクリーニングされた胃癌抑制物質を有効成分として含む胃癌予防及び治療用組成物を提供する。
【００２２】
また、本発明は、薬学的に有効な量の前記胃癌予防及び治療用組成物を個体に投与する工程を含む、胃癌の予防及び治療方法を提供する。
【００２３】
同時に、本発明は、前記方法によってスクリーニングされた胃癌抑制物質を胃癌予防及び治療用組成物の製造に使用する用途を提供する。
【００２４】
以下、本発明の用語を定義する。
【００２５】
本発明において、「マーカー」は、胃癌細胞を正常細胞と区分して診断することができる物質で、ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子に対する核酸マーカー及びＺＮＦ３１２ｂタンパク質に対するポリペプチドマーカーであり得る。これらマーカーは、正常細胞と比較して胃癌細胞で発現が増加する特徴を示すことを意味する。
【００２６】
本発明において、「診断」は、胃癌状態の存在または特徴を確認することを意味する。
【００２７】
本発明において、「遺伝子発現レベル」というのは、試料におけるＺＮＦ３１２ｂ胃癌マーカー遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを意味する。
【００２８】
本発明において、「プライマー」は、短い自由３’末端水酸化基を有する核酸配列で、相補的な鋳型と塩基対を形成することができ、鋳型鎖複写のための開始地点に機能する短い核酸配列を意味する。
【００２９】
本発明において、「タンパク質発現レベル」というのは、試料におけるＺＮＦ３１２ｂ胃癌マーカー遺伝子で発現されたタンパク質の発現レベルを意味する。
【００３０】
本発明において、「抗体」というのは、抗原性が決定される部位に特異的なタンパク質分子を意味する。
【００３１】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００３２】
本発明は、配列番号１で表わされるＺＮＦ３１２ｂ遺伝子（ＧｅｎｅＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＡＹ７２６５８８）またはその断片を含むオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドを増幅することができるプライマー対を含む胃癌診断用キットを提供する。
【００３３】
前記ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子の断片は、配列番号１で表わされる塩基配列の中でカルボキシ末端部位（配列番号２０）が含まれることが好ましいが、これに限定されない。
【００３４】
前記ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子は、転写調節因子として作用し、細胞増殖に係わる遺伝子を活性化する。配列番号１の塩基配列で、ヌクレオチド番号１０４部位に該当するオープンリーディングフレームは、全体タンパク質のコード領域で、それから誘導されるアミノ酸配列は、配列番号２に現われていて、４７５個のアミノ酸で成り立っている（「ＺＮＦ３１２ｂタンパク質」）。しかし、コドンの縮退（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）または前記発癌遺伝子を発現させるのに好適なコドンを考慮して、本発明の遺伝子は、コード領域から発現される発癌タンパク質のアミノ酸を変化させない範囲内で、コード領域の多様な変形が成立し得、コード領域を除外した部分でも遺伝子の発現に影響を及ぼさない範囲内で、多様な変形または修飾が成立し得るので、そのような変形遺伝子も本発明の範囲に含まれる。したがって、本発明は、前記配列番号１の発癌遺伝子と実質的に同一な塩基配列を有するポリヌクレオチド及び前記遺伝子の断片を含む。実質的に同一なポリヌクレオチドというのは、８０％以上、好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列相同性を有するものを含む。
【００３５】
本発明者らは、ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子が胃癌細胞で特異的に過剰発現するかどうか調べるため、ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子のｍＲＮＡ発現量を胃癌細胞株及び臨床組織で調査した。その結果、ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子は、胃癌細胞で特異的に過剰発現されることを確認した（図１及び図２参照）。
【００３６】
また、本発明者らは、ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子の発現レベルが胃癌細胞に及ぼす影響を調べるため、ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子を導入した発現ベクター、及びＺＮＦ３１２ｂ  ｓｈＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）発現ベクターをそれぞれ製造して胃癌細胞株に形質導入した後、前記胃癌細胞の細胞増殖及び細胞周期変化を調査した。その結果、ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子の過剰発現が対照群と比較して胃癌細胞株の細胞増殖を増加させ、細胞周期のＧ１期を減少させてＧ２＋Ｍ期を増加させ、細胞増殖率を増加させることが分かった。一方、ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子の発現抑制が、対照群と比較して胃癌細胞株の細胞増殖を減少させ、細胞周期のＧ１期を増加させてＧ２＋Ｍ期を減少させ、細胞増殖率を減少させることが分かった（図３〜図１１参照）。
【００３７】
また、本発明者らは、ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子の発癌遺伝子としての機能を確認するため、コロニー形成実験及びヌードマウスを使用した腫瘍形成実験を行なった。その結果、ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子の過剰発現がコロニー形成を増加させ、ヌードマウスで腫瘍の大きさを対照群と比較して顕著に増加させることを確認した（図１２〜図１７参照）。
【００３８】
したがって、本発明のＺＮＦ３１２ｂ遺伝子が、胃癌遺伝子として胃癌診断用マーカー遺伝子に使用できることが分かる。
【００３９】
前記胃癌診断用キットは、ＺＮＦ３１２ｂ  ｍＲＮＡを定量的に検出して診断及びスクリーニングすることが好ましいが、これに限定されない。
【００４０】
前記胃癌診断用キットは、ＺＮＦ３１２ｂ  ｍＲＮＡに特異的に結合する配列番号３または配列番号４のヌクレオチドを追加的に含むことが好ましいが、これに限定されない。
【００４１】
前記胃癌診断用キットは、ＺＮＦ３１２ｂ  ｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡ製造用プライマー、逆転写酵素、Ｔａｑポリメラーゼ、ＰＣＲ用プライマー及びｄＮＴＰからなる群から選択されたいずれか一つ以上を追加的に含むことが好ましいが、これに限定されない。
【００４２】
前記胃癌診断用キットは、前記マーカー遺伝子を増幅することができるプライマー対を含むことが好ましいが、これに限定されない。
【００４３】
前記プライマーは、マーカー遺伝子の塩基配列に特異的な配列を有するヌクレオチドとして、好ましくは約７〜５０ｂｐの塩基配列、より好ましくは１０〜３０ｂｐの塩基配列で構成されるが、これに限定されるのではない。
【００４４】
前記プライマーは、適切な緩衝溶液及び温度で重合反応のための試薬、及び相異した四種類ヌクレオチド三リン酸の存在下でＤＮＡ合成を開始することができる。プライマーは、ＤＮＡ合成の開始点で作用するプライマーの基本性質を変化させない、追加の特徴を混入することができる。
【００４５】
前記プライマーは、ホスホロアミダイト固体支持体方法またはその他広く公知された方法を使用して変形または化学的に合成することができる。
【００４６】
前記胃癌診断用キットは、テストチューブ、適切なコンテナ、反応緩衝液、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰｓ）、Ｔａｑポリメラーゼ、逆転写酵素、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ抑制剤、ＤＥＰＣ水及び滅菌水からなる群から選択されるいずれか一つ以上を追加的に含むことが好ましいが、これに限定されるのではない。
【００４７】
また、本発明は、配列番号２で表わされるＺＮＦ３１２ｂタンパク質またはその断片に特異的に結合する抗体を含む胃癌診断用キットを提供する。
【００４８】
前記ＺＮＦ３１２ｂタンパク質の断片は、配列番号２で表わされるアミノ酸配列の中でカルボキシ末端部位が含まれることが好ましいが、これに限定されない。
【００４９】
本発明者らは、ＺＮＦ３１２ｂタンパク質またはその断片の転写因子としての機能及び作用部位を調べるため、前記タンパク質又はその断片を発現する組換えベクターを胃癌細胞株に導入した後、核分画及び免疫細胞染色法を使用して細胞内位置を確認した。その結果、ＺＮＦ３１２ｂタンパク質または前記タンパク質の中でカルボキシ末端部位（配列番号２０）を含有した断片が、核に移行したことが分かった（図１８〜図２０参照）。
【００５０】
また、本発明者らは、ＺＮＦ３１２ｂタンパク質またはその断片が胃癌細胞株の細胞増殖及びコロニー形成に及ぼす影響を調べるため、前記タンパク質及びその断片を過剰発現する組換えベクターを胃癌細胞株に導入した後、細胞増殖程度及びコロニー形成程度を測定した。その結果、ＺＮＦ３１２ｂタンパク質または前記タンパク質の中でカルボキシ末端を含有した断片が過剰発現された場合、細胞増殖が増加し、コロニー形成が増加した（図２１〜図２３参照）。
【００５１】
また、本発明者らは、ＺＮＦ３１２ｂタンパク質またはその断片の胃癌細胞株の細胞増殖シグナル伝達系を確認するために、前記タンパク質又はその断片の発現を過剰発現または抑制する組換えベクターをそれぞれ胃癌細胞株に導入した後、多様な抗体を使用したウエスタンブロット分析をした。その結果、ＺＮＦ３１２ｂまたはその断片による抑制は、Ｋ−ｒａｓの発現を減少させ、これは、ＥＲＫシグナル伝達の不活性化を誘導する一方、ＺＮＦ３１２ｂ及びその断片の過剰発現は、Ｋ−ｒａｓの発現の活性を誘導してそれを通じてＥＲＫシグナル伝達が活性化することが分かった（図２４〜図２５参照）。
【００５２】
したがって、本発明のＺＮＦ３１２ｂタンパク質及び前記タンパク質の中でカルボキシ末端部位（配列番号２０）を含有した断片は、胃癌を診断及びスクリーニングするタンパク質マーカーとして使用することができることが分かる。
【００５３】
前記キットは、好ましくは前記ＺＮＦ３１２ｂタンパク質またはその断片を追加的に含むが、これに限定されない。
【００５４】
前記キットに含まれる抗体は、好ましくはポリクローナル抗体、モノクローナル抗体または組換え抗体であるが、これに限定されない。
【００５５】
前記抗体を生成することは、当業者に広く知られた技術を使用して容易に製造することができる。当業者に公知の方法によって、ポリクローナル抗体は、ＺＮＦ３１２ｂタンパク質抗原を動物に注射して、動物から採血して抗体を含む血清を得ることができる。動物としては、ヤギ、ウサギ、ブタ等、任意の動物宿主を使用して製造することができる。モノクローナル抗体は、本発明が属する技術分野において公知である、ハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ  ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９７６年，第６巻，５１１−５１９頁）またはファージ抗体ライブラリ（Ｃｌａｃｋｓｏｎ等．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９１年，第３５２巻，６２４−６２８頁；Ｍａｒｋｓ等，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９１年，第２２２巻，５８，１−５９７頁）技術を使用して製造することができる。
【００５６】
前記ハイブリドーマ法は、ＺＮＦ３１２ｂタンパク質抗原を注射したマウスのような免疫学的に相応しい宿主動物の細胞を使用して、もう一つは、癌または骨髄腫細胞株を使用することができる。このような二つの種類の細胞をポリエチレングリコールのような当業界に広く公知された方法で融合させた後、抗体生産細胞を標準的な組織培養方法で増殖させることができる。限界希釈法によるサブクローニングによって均一な細胞集団を得た後、ＺＮＦ３１２ｂタンパク質に対して特異的な抗体を生産することができるハイブリドーマを、標準技術にしたがって試験管内または生体内で大量培養することができる。
【００５７】
前記ファージ抗体ライブラリ方法は、ＺＮＦ３１２ｂタンパク質に対する抗体遺伝子を獲得して、それをファージの表面に融合タンパク質形態で発現して抗体ライブラリを試験管内で作製し、前記ライブラリからＺＮＦ３１２ｂタンパク質と結合するモノクローナル抗体を分離して作製することができる。
【００５８】
前記方法によって製造された抗体は、電気泳動、透析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の方法で分離することができる。
【００５９】
前記キットに含まれる抗体は、２個の全長軽鎖及び２個の全長重鎖を有する完全な形態だけではなく、抗体分子の機能的な断片を含む。抗体分子の機能的断片というのは、少なくとも抗原結合機能を保有している断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２及びＦｖ等がある。
【００６０】
前記キットは、好ましくは、ＥＬＩＳＡ用診断キットとし、対照群タンパク質に特異的な抗体を含むことができ、その他にも、抗原抗体複合体を検出することができる試薬、例えば、標識された２次抗体、発色団、抗体とコンジュケートされた酵素もしくはその基質又は抗体と結合することができる他の物質等を含むことができる。
【００６１】
また、本発明は、前記マーカー遺伝子塩基配列の全部または一部を含むオリゴヌクレオチド、またはそれに相補的なオリゴヌクレオチドが組み込まれた胃癌診断用マイクロアレイを提供する。
【００６２】
また、本発明は、配列番号２で表わされるＺＮＦ３１２ｂタンパク質またはその断片に特異的に結合する抗体を胃組織、胃細胞、尿、血液、血清及び血漿の中から選択される生物学的試料と接触させる工程を含む、胃癌マーカー検出方法を提供する。
【００６３】
前記胃癌マーカー検出方法は、具体的に、
１）分析する生物学的試料とＺＮＦ３１２ｂタンパク質、またはその断片に特異的に結合する抗体を接触させる工程；
２）前記工程１）の接触で形成された抗原抗体複合体を定量検出する工程；及び
３）前記工程２）の検出レベルを対照群と比較して選別する工程を含む。
【００６４】
前記方法において、工程２）の抗原抗体複合体を定量検出する方法では、好ましくはウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、放射免疫拡散法、オークタロニー免疫拡散法、ロケット免疫電気泳動、組織免疫染色、免疫沈降、補体固定アッセイ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｆｉｘａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）、ＦＡＣＳ及びタンパク質チップからなる群から選択されるが、これに限定されない。
【００６５】
前記方法において、工程２）の抗原抗体複合体の形成量は、検出レベルのシグナルの大きさを通じて定量的に測定することができる。検出レベルは、好ましくは酵素、蛍光物質、リガンド、発光物質、微少粒子（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ）、レドックス分子及び放射線同位元素からなる群から選択されるいずれか一つであるが、これに限定されるのではない。
【００６６】
前記検出レベルの測定において、酵素は、β−グルクロニダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコースオキシダーゼ及びヘキソキナーゼからなる群から選択されたいずれか一つであることが好ましいが、これに限定されない。前記蛍光物質は、フルオレシン、ピコシアニンまたはフルオレスカミンが好ましいが、これに限定されない。前記リガンドは、ビオチン誘導体が好ましいが、これに限定されない。前記発光物質は、ルシフェリンが好ましいがこれに限定されない。前記微少粒子では、金コロイドが好ましいが、これに限定されない。前記レドックス分子は、キノン、１，４−ベンゾキノンまたはヒドロキノンが好ましいが、これに限定されない。前記放射線同位元素は、３Ｈまたは１４Ｃが好ましいが、これに限定されない。
【００６７】
また、本発明は、
１）個体の試料からＺＮＦ３１２ｂマーカー遺伝子及びその断片の発現レベルを測定する工程；及び
２）工程１）のマーカー遺伝子の発現レベルが正常対照群より高い個体を選別する工程を含む胃癌診断方法を提供する。
【００６８】
前記方法において、工程１）の試料は、胃組織、胃細胞、尿、血液、血清及び血漿から選択されるいずれか一つであることが好ましいが、これに限定されない。
【００６９】
前記方法において、工程１）の発現レベルは、ｍＲＮＡレベル及びタンパク質レベルですべて測定することができる。
【００７０】
前記ｍＲＮＡレベルで測定する方法では、ＲＴ−ＰＣＲ、競合的ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮａｓｅ保護分析法（ＲＮａｓｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）、ノ−ザンブロッティング（Ｎｏｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）及びＤＮＡチップからなる群から選択されるいずれが一つを使用することが好ましいが、これに限定されない。前記方法を通じて、正常対照群でのｍＲＮＡ発現量と胃癌の疑いがある患者でのｍＲＮＡ発現量を比較することができ、ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子マーカーでｍＲＮＡへの有意な発現量の増加有無を判断して、胃癌の疑いがある患者が実際に胃癌患者であるかどうかを診断することができる。
【００７１】
前記タンパク質レベルで測定する方法は、２次元電気泳動、タンパク質チップ、ＥＬＩＳＡまたは前記マーカータンパク質に特異的に結合することができる抗体を使用することが好ましいが、これに限定されない。
【００７２】
前記タンパク質発現レベルは、固体支持体に付着した抗体と抗原の複合体で抗原を認識する標識された他の抗体を使用する直接的サンドイッチＥＬＩＳＡ、固体支持体に付着した抗体と抗原の複合体で抗原を認識する他の抗体と反応させた後、前記抗体を認識する標識された２次抗体を使用する間接的サンドイッチＥＬＩＳＡ等、多様なＥＬＩＳＡ方法を使用して検出することができる。さらに好ましくは、固体支持体に抗体を付着させて試料を反応させた後、抗原抗体複合体の抗原を認識する標識された抗体を付着させて酵素的に発色させるか、抗原抗体複合体の抗原を認識する抗体に対して標識された２次抗体を付着させて酵素的に発色させる、サンドイッチＥＬＩＳＡ方法によって検出することができる。
【００７３】
前記タンパク質発現レベルは、ＺＮＦ３１２ｂタンパク質マーカーに対する一つ以上の抗体が基板上の決められた位置に配列され、高密度に固定化されているタンパク質チップを使用して検出することができる。タンパク質チップを使用して試料を分析する方法は、試料からタンパク質を分離して、分離したタンパク質をタンパク質チップと混成化させて抗原抗体複合体を形成させ、それを判読してタンパク質の存在または発現レベルを確認して、胃癌発病の有無を確認することができる。
【００７４】
前記タンパク質発現レベルは、ＺＮＦ３１２ｂに対する抗体を使用してウエスタンブロットを遂行して検出することができる。試料から全体タンパク質を分離して、それを電気泳動してタンパク質を大きさによって分離した後、ニトロセルロース膜に移動させて抗体と反応させる。生成された抗原抗体複合体の量を標識された抗体を使用して確認することで、胃癌発病の有無を確認することができる。
【００７５】
本発明は、
１）実験群として胃由来細胞に被検組成物または被検化合物を処理する工程；
２）工程１）の実験群細胞と処理しない対照群細胞の配列番号１で表わされる塩基配列またはその断片を含む胃癌診断用ＺＮＦ３１２ｂマーカー遺伝子の発現レベルを測定して比較する工程；及び
３）前記実験群の発現レベルを対照群と比較して、有意に増加する被検組成物または被検化合物を選別する工程を含む、胃癌誘発物質スクリーニング方法を提供する。
【００７６】
前記方法において、工程２）のＺＮＦ３１２ｂ遺伝子は、配列番号１で表わされる塩基配列またはその断片を含むことが好ましく、前記断片は、配列番号１で表わされる塩基配列中でカルボキシ末端部位が含まれることが好ましいが、これに限定されない。
【００７７】
前記方法において、工程２）の遺伝子発現レベルを測定する方法は、ＲＴ−ＰＣＲ、競合的ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮａｓｅ保護分析法、ノ−ザンブロットティング及びＤＮＡチップからなる群から選択されるいずれか一つを使用することが好ましいが、これに限定されない。前記検出方法を通じて、正常対照群でのｍＲＮＡ発現量と実験群でのｍＲＮＡ発現量を比較することができ、ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子マーカーでｍＲＮＡへの有意な発現量の減少有無を判断して、胃癌抑制物質をスクリーニングすることができる。
【００７８】
また、本発明は、
１）実験群として胃由来細胞に被検組成物または被検化合物を処理する工程；
２）工程１）の実験群細胞と処理しない対照群細胞の配列番号１で表わされる塩基配列またはその断片を含む胃癌診断用ＺＮＦ３１２ｂマーカー遺伝子の発現レベルを測定して比較する工程；及び
３）前記実験群の発現レベルを対照群と比較して、有意に減少させる被検組成物または被検化合物を選別する工程を含む、胃癌抑制物質スクリーニング方法を提供する。
【００７９】
前記方法において、工程２）のＺＮＦ３１２ｂ遺伝子は、配列番号１で表わされる塩基配列またはその断片を含むことが好ましく、前記断片は、配列番号１で表わされる塩基配列中でカルボキシ末端部位を含むことが好ましいが、これに限定されない。
【００８０】
前記方法において、工程２）の遺伝子発現レベルを測定する方法は、ＲＴ−ＰＣＲ、競合的ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮａｓｅ保護分析法、ノ−ザンブロットティング及びＤＮＡチップからなる群から選択されるいずれか一つを使用することが好ましいが、これに限定されない。前記検出方法たちを通じて正常対照群でのｍＲＮＡ発現量と実験群でのｍＲＮＡ発現量を比較することができ、ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子マーカーでｍＲＮＡへの有意な発現量の減少有無を判断して、胃癌抑制物質をスクリーニングすることができる。
【００８１】
また、本発明は、
１）配列番号９で表わされる塩基配列で構成されるＺＮＦ３１２ｂプロモーター又はその断片に作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含む遺伝子コンストラクトを製造する工程；
２）前記工程１）の遺伝子コンストラクトを発現ベクターに導入した後、動物細胞に形質転換して形質転換体を製造する工程；
３）前記工程２）の形質転換体に被検組成物または被検化合物を処理した実験群と処理しない対照群を製造する工程；
４）前記工程３）の実験群及び対照群のレポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程；及び
５）前記工程４）の実験群の発現レベルを対照群と比較して有意に増加する被検組成物または被検化合物を選別する工程を含む、胃癌誘発物質スクリーニング方法を提供する。
【００８２】
前記方法において、工程１）の断片は、配列番号９で表わされる塩基配列の中で転写開始点を基準に−８５０ｂｐ〜＋１ｂｐ部位（配列番号１２）を含むことが好ましいが、これに限定されない。
【００８３】
前記方法において、工程１）のレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ遺伝子を使用することが好ましいが、これに限定されない。
【００８４】
本発明者らは、転写活性能が高いＺＮＦ３１２ｂプロモーター部位の選択及び細胞株を樹立するために、前記プロモーターの多様な断片をルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードすることができるベクターに導入し、胃癌細胞株に形質転換させ、ルシフェラーゼの活性を分析した。その結果、ＺＮＦ３１２ｂプロモーターの転写活性能は、前記プロモーター部位の中で転写開始点を基準に−８５０ｂｐ〜＋１ｂｐ部位（配列番号１２）を含むものが最も高く、転写活性能を持続的に有するベクターが、一時的に有するベクターと比較して高いことが分かる。
【００８５】
また、本発明は、
１）配列番号９で表わされる塩基配列で構成されるＺＮＦ３１２ｂプロモーター及びその断片に作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含む遺伝子コンストラクトを製造する工程；
２）前記工程１）の遺伝子コンストラクトを発現ベクターに導入した後、動物細胞に形質転換して形質転換体を製造する工程；
３）前記工程２）の形質転換体に被検組成物または被検化合物を処理した実験群と処理しない対照群を製造する工程；
４）前記工程３）の実験群及び対照群のレポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程；及び
５）前記工程４）の実験群の発現レベルを対照群と比較して有意に減少させる被検組成物または被検化合物を選別する工程とを含む、胃癌抑制物質スクリーニング方法を提供する。
【００８６】
前記方法において、工程１）の断片は、配列番号９で表わされる塩基配列の中で転写開始点を基準に−８５０ｂｐ〜＋１ｂｐ部位（配列番号１２）を含むことが好ましいが、これに限定されない。
【００８７】
前記方法において、工程１）のレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ遺伝子を使用することが好ましいが、これに限定されない。
【００８８】
本発明者らは、ＺＮＦ３１２ｂプロモーター転写活性能を阻害する化合物をスクリーニングするため、ＺＮＦ３１２ｂプロモーター及び転写開始点を基準に−８５０ｂｐ〜＋１ｂｐ部位（配列番号１２）を含む断片を、ルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードする持続的に転写活性能を有するベクターに導入した後、胃癌細胞株に形質転換させた後、多様な化合物を処理して、ルシフェラーゼレポーター活性の阻害程度を測定した。その結果、実験に使用された化合物の中で、約５０％がルシフェラーゼレポーター活性を４０％以上阻害し、これら阻害化合物の中で約６０％が、１０％未満の細胞毒性を有することが分かった（表１及び表２参照）。
【００８９】
したがって、ＺＮＦ３１２ｂプロモーター転写活性能を使用して、ＺＮＦ３１２ｂ発現レベルを阻害する化合物をスクリーニングすることができることが分かる。
【００９０】
また、本発明は、
１）配列番号１５で表わされる塩基配列で構成されるＫ−ｒａｓプロモーター及びその断片に作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含む遺伝子コンストラクトを製造する工程；
２）前記工程１）の遺伝子コンストラクトを発現ベクターに導入し、配列番号２で表わされるアミノ酸配列で構成されるＺＮＦ３１２ｂタンパク質またはその断片を発現する動物細胞に形質転換することにより形質転換体を製造する工程；
３）前記工程２）の形質転換体に被検組成物または被検化合物を処理した実験群と処理しない対照群を製造する工程；
４）前記工程３）の実験群及び対照群のレポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程；及び
５）前記工程４）の実験群の発現レベルを対照群と比較して有意に増加させる被検組成物または被検化合物を選別する工程とを含む、胃癌誘発物質スクリーニング方法を提供する。
【００９１】
前記方法において、工程１）のＫ−ｒａｓプロモーターの断片は、配列番号１９で表わされる塩基配列を含むことが好ましいが、これに限定されない。
【００９２】
前記方法において、工程１）のレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ遺伝子を使用することが好ましいが、これに限定されない。
【００９３】
前記方法において、好ましくはＺＮＦ３１２ｂの断片は、配列番号２で表わされるアミノ酸配列の中で配列番号２０で表わされるアミノ酸配列であるカルボキシ末端部位を含むことが好ましいが、これに限定されない。
前記方法において、工程２）のＺＮＦ３１２ｂの断片は、配列番号２で表わされるアミノ酸配列の中で配列番号１９で表わされるアミノ酸配列であるカルボキシ末端部位を含むことが好ましいが、これに限定されない。
【００９４】
また、本発明は、
１）配列番号１５で表わされる塩基配列で構成されるＫ−ｒａｓプロモーター及びその断片に作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含む遺伝子コンストラクトを製造する工程；
２）前記工程１）の遺伝子コンストラクトを発現ベクターに導入し、配列番号２で表わされるアミノ酸配列で構成されるＺＮＦ３１２ｂタンパク質またはその断片を発現する動物細胞に形質転換することにより形質転換体を製造する工程；
３）前記工程２）の形質転換体に被検組成物または被検化合物を処理した実験群と処理しない対照群を製造する工程；
４）前記工程３）の実験群及び対照群のレポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程；及び
５）前記工程４）の実験群の発現レベルを対照群と比較して有意に減少させる被検組成物または被検化合物を選別する工程とを含む、胃癌抑制物質スクリーニング方法を提供する。
【００９５】
前記方法において、工程１）のＫ−ｒａｓプロモーターの断片は、配列番号１９で表わされる塩基配列を含むことが好ましいが、これに限定されない。
【００９６】
前記方法において、工程１）のレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ遺伝子を使用することが好ましいが、これに限定されない。
【００９７】
前記方法において、工程２）のＺＮＦ３１２ｂの断片は、配列番号２で表わされるアミノ酸配列の中で配列番号２０で表わされるアミノ酸配列であるカルボキシ末端部位を含むことが好ましいが、これに限定されない。
【００９８】
本発明者らは、ＺＮＦ３１２ｂタンパク質またはその断片によるＫ−ｒａｓの発現レベルの調節機序を解明するため、Ｋ−ｒａｓプロモーターをルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードするベクターに導入した後、胃癌細胞株にＺＮＦ３１２ｂタンパク質またはその断片とともに形質転換させ、ルシフェラーゼレポーター活性を測定した。その結果、ＺＮＦ３１２ｂタンパク質またはその断片の発現によって、Ｋ−ｒａｓプロモーターが活性化することが分かった。
【００９９】
また、本発明者らは、ＺＮＦ３１２ｂタンパク質またはその断片によるＫ−ｒａｓプロモーター活性の作用部位を確立するため、多様な断片のＫ−ｒａｓプロモーターをルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードするベクターに導入した後、胃癌細胞株にＺＮＦ３１２ｂタンパク質またはその断片とともに形質転換させた後、ルシフェラーゼレポーター活性を測定した。その結果、ＺＮＦ３１２ｂタンパク質またはその断片のＫ−ｒａｓプロモーター活性の作用部位は、配列番号１６で表わされる５７ｂｐ部位であることが分かった。
【０１００】
したがって、Ｋ−ｒａｓプロモーターの中で配列番号１９で表わされる５７ｂｐ部位の転写活性能を測定して、ＺＮＦ３１２ｂタンパク質またはその断片の作用活性を分析することで、胃癌誘発物質または抑制物質をスクリーニングすることができる。
【０１０１】
また、本発明は、
１）配列番号１５で表わされる塩基配列で構成されるＫ−ｒａｓプロモーターまたはその断片を含むオリゴヌクレオチドと配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含むＺＮＦ３１２ｂタンパク質またはその断片とを、被検組成物または被検化合物と一緒に処理する工程；
２）工程１）の実験群と処理しない対照群で、Ｋ−ｒａｓプロモーターまたはその断片に対するＺＮＦ３１２ｂタンパク質またはその断片の結合レベルを測定して比較する工程；及び
３）前記実験群の結合レベルを対照群と比較して有意に増加させる被検組成物または被検化合物を選別する工程とを含む、胃癌誘発物質スクリーニング方法を提供する。
【０１０２】
前記方法において、工程１）のＫ−ｒａｓプロモーターの断片は、配列番号１６で表わされる塩基配列を含むことが好ましいが、これに限定されない。
【０１０３】
前記方法において、工程１）のＺＮＦ３１２ｂの断片は、配列番号２で表わされるアミノ酸配列の配列番号２０で表わされるアミノ酸配列であるカルボキシ末端部位を含むことが好ましいが、これに限定されない。
【０１０４】
前記方法において、工程２）の測定は、２次元電気泳動、タンパク質チップ、ＥＬＩＳＡまたは前記マーカータンパク質に特異的に結合することができる抗体を使用して測定することが好ましいが、これに限定されない。
【０１０５】
また、本発明は、
１）配列番号１５で表わされる塩基配列で構成されるＫ−ｒａｓプロモーターまたはその断片を含むオリゴヌクレオチドと配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含むＺＮＦ３１２ｂタンパク質またはその断片とを、被検組成物または被検化合物と一緒に処理する工程；
２）工程１）の実験群と処理しない対照群で、Ｋ−ｒａｓプロモーターまたはその断片に対するＺＮＦ３１２ｂタンパク質またはその断片の結合レベルを測定して比較する工程；及び
３）前記実験群の結合レベルを対照群と比較して有意に減少させる被検組成物または被検化合物を選別する工程とを含む、胃癌抑制物質スクリーニング方法を提供する。
【０１０６】
前記方法において、好ましくは工程１）のＺＮＦ３１２ｂの断片は、配列番号２で表わされるアミノ酸配列の配列番号２０で表わされるアミノ酸配列であるカルボキシ末端部位を含むことが好ましいが、これに限定されない。
【０１０７】
前記方法において、工程２）の測定は、２次元電気泳動、タンパク質チップ、ＥＬＩＳＡまたは前記マーカータンパク質に特異的に結合することができる抗体を使用して測定することが好ましいが、これに限定されない。
【０１０８】
本発明者らは、ＺＮＦ３１２ｂタンパク質またはその断片のＫ−ｒａｓプロモーター活性の作用部位を確認するため、ＤＮＡ結合部位分析キットを使用して分析した結果、ＺＮＦ３１２ｂタンパク質及びその断片が、Ｋ−ｒａｓプロモーター内配列番号１９で表わされる５７ｂｐ部位に結合することが分かった。
【０１０９】
したがって、Ｋ−ｒａｓプロモーターの配列番号１９で表わされる５７ｂｐ部位に対するＺＮＦ３１２ｂタンパク質またはその断片の結合レベルを測定して、ＺＮＦ３１２ｂタンパク質またはその断片の作用活性を分析することにより、胃癌誘発物質または抑制物質をスクリーニングすることができる。
【０１１０】
また、本発明は、配列番号１で表わされるＺＮＦ３１２ｂ遺伝子またはその断片を含むベクターを、ヒトを除いた動物に形質転換して、胃癌が誘発された胃癌診断及びスクリーニング用動物を提供する。
【０１１１】
前記形質転換動物は、本発明のＺＮＦ３１２ｂ遺伝子またはその断片を哺乳動物、例えば、マウス等のげっ歯類動物に導入することで製造することができ、その遺伝子を少なくとも８細胞期以前の受精卵工程で導入することが好ましい。このように製造された形質転換動物は、発癌性物質、または前記遺伝子阻害物質及び抗癌物質の探索等に有用に使用することができる。
【０１１２】
また、本発明は、前記胃癌抑制物質スクリーニング方法によってスクリーニングされた胃癌抑制物質を有効成分として含む、胃癌予防及び治療用組成物を提供する。
【０１１３】
前記胃癌抑制物質は、配列番号１の塩基配列で表わされるＺＮＦ３１２ｂ遺伝子またはその断片から転写されるｍＲＮＡの配列の全部または一部と相補的な配列を有し、前記ｍＲＮＡに結合してＺＮＦ３１２ｂ遺伝子またはその断片の発現を抑制するアンチセンス遺伝子を含むことが好ましいが、これに限定されない。前記アンチセンス遺伝子は、ｍＲＮＡと結合してリボソームによる翻訳過程を阻害することができる配列を有するＤＮＡ配列を患者の体内に導入することで、前記ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子の発現による胃癌を治療することができる。
【０１１４】
前記胃癌抑制物質は、ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子またはその断片から転写されるｍＲＮＡの配列の全部または一部と相補的な配列を有して、ダイサータンパク質によって認識され、ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子またはその断片の発現を阻害するｓｉＲＮＡを含むことが好ましいが、これに限定されない。前記ｓｉＲＮＡは、２１〜３０ヌクレオチドのＲＮＡ断片で細胞内に導入されるとダイサーによって認識され、これは細胞内に存在する前記遺伝子のｍＲＮＡを分解するようになって遺伝子の発現を阻害するようになる。
【０１１５】
本発明の胃癌予防及び治療用組成物は、胃癌抑制物質の中で１種の有効成分以外に、薬学的に許容可能な担体、すなわち食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エチルアルコール、リポゾーム及びこれら成分の中で１種以上を混合して使用することができ、必要によって抗酸化剤、緩衝液等他の通常の添加剤を加えることができる。また希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び滑剤を付加的に添加して、水溶液、懸濁液、乳濁液等のような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができ、標的器官に特異的に作用するように標的器官特異的抗体または、その他リガンドを前記担体と結合させて使用することができる。さらに、当該技術分野の適正な方法で、またはレミントンの文献（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（最新版）、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ）に開示されている方法を使用して、各成分によって好ましく製剤化することができる。
【０１１６】
また、本発明は、薬学的に有効な量の前記胃癌予防及び治療用組成物を、胃癌にかかった個体に投与する工程を含む胃癌治療方法を提供する。
【０１１７】
また、本発明は、薬学的に有効な量の前記胃癌予防及び治療用組成物を、個体に投与する工程を含む胃癌の予防方法を提供する。
【０１１８】
本発明の組成物の投与方法は、特別に制限されるものではないが、目的と方法によって、静脈内、皮下、腹腔内または局所適用のように非経口投与するか、経口投与することができる。投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率及び疾患の重症度等によってその範囲が多様である。一日投与量は、化合物の場合、約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇであり、好ましくは０．５〜１０ｍｇ／ｋｇであり、一日に１回〜数回に分けて投与することが好ましい。
【０１１９】
本発明の組成物を使用した治療方法中、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスを使用した遺伝子治療は、通常的な方法で患者に投与して発癌遺伝子の発現を阻害することができる。例えば、文献（Ｊ．Ｓ．Ｋｉｍ等，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１９９８年，第５３巻，１７５−１８２頁）の方法によって、アンチセンスオリゴジオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）をポリ−Ｌ−リジン誘導体と静電気的引力によって混合させて、その混合体を患者に静脈投与することができる。
【発明の効果】
【０１２０】
本発明の新規な胃癌の診断及び治療用マーカーであるＺＮＦ３１２ｂは、胃癌患者試料で過剰発現し、前記遺伝子の過剰発現または抑制によって胃癌細胞株の細胞増殖と腫瘍形成能が活性または抑制されることにより  、胃癌の診断、胃癌誘発動物の製造、胃癌の予防及び治療、及び胃癌特異的抗癌剤の開発等に効果的に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】ヒト胃癌患者から得た総ＲＮＡを使用して、ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子に対するリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行なった結果を示した図である。
【図２】ヒト胃癌患者から得た総ＲＮＡを使用して、ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子に対するリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行なった結果を示した図である。
【図３】ＺＮＦ３１２ｂのｓｉＲＮＡでの前記遺伝子の発現を示した図である。
【図４】前記ｓｉＲＮＡの中でｓｉ−ＺＮＦ３１２ｂ−１配列を使用して作製されたベクターであるｓｈＺＮＦ３１２ｂを導入して樹立された胃癌細胞株であるＳＮＵ６６８−ｓｈＺＮＦ３１２ｂでの前記遺伝子の発現を示した図である。
【図５】ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子の細胞増殖実験結果を示した図で、ＺＮＦ３１２ｂのｓｉ−ＺＮＦ３１２ｂ−１オリゴマーを胃癌細胞株であるＳＮＵ６６８に導入した後の細胞増殖結果を示した図である。
【図６】ＺＮＦ３１２ｂの抑制細胞株であるＳＮＵ６６８−ｓｈＺＮＦ３１２ｂの細胞増殖結果を示した図である。
【図７】ＺＮＦ３１２ｂの過剰発現細胞株であるＳＮＵ６３８−ＺＮＦ３１２ｂ及びＳＮＵ６６８−ＺＮＦ３１２ｂの細胞増殖実験結果を示した図である。実験結果は、有意性検定を通じて結果の信頼性を確認した。＊は、Ｐ値０．０５以下で９５％の信頼度を有するもの、＊＊は、０．０１以下で９９％の信頼性を有するもの、＊＊＊は、０．００１以下は９９．９％で信頼性を有するものである。
【図８】ＺＮＦ３１２ｂの過剰発現細胞株であるＳＮＵ６３８−ＺＮＦ３１２ｂ及びＳＮＵ６６８−ＺＮＦ３１２ｂの細胞増殖実験結果を示した図である。実験結果は、有意性検定を通じて結果の信頼性を確認した。＊は、Ｐ値０．０５以下で９５％の信頼度を有するもの、＊＊は、０．０１以下で９９％の信頼性を有するもの、＊＊＊は、０．００１以下は９９．９％で信頼性を有するものである。
【図９】ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子の細胞周期実験結果を示したもので、ＰＩ染色法を使用してＤＮＡを染色した後、細胞分析機を使用して測定した結果を示した図であり、ＺＮＦ３１２ｂのｓｉ−ＺＮＦ３１２ｂ−１を胃癌細胞株であるＳＮＵ６６８に導入した後の細胞周期結果を示した図で、細胞分析機を通じて分析された細胞周期を示していて、分析された細胞周期は、細胞増殖率（Ｇ２＋Ｍ＋Ｓ期の細胞数／全体細胞数×１００）で計算して図１０のグラフに示した。
【図１０】ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子の細胞周期実験結果を示したもので、ＰＩ染色法を使用してＤＮＡを染色した後、細胞分析機を使用して測定した結果を示した図が図９であり、ＺＮＦ３１２ｂのｓｉ−ＺＮＦ３１２ｂ−１を胃癌細胞株であるＳＮＵ６６８に導入した後の細胞周期結果を示し、細胞分析機を通じて分析された細胞周期を示していて、分析された細胞周期は、細胞増殖率（Ｇ２＋Ｍ＋Ｓ期の細胞数／全体細胞数×１００）で計算してグラフに示した。
【図１１】ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子の細胞周期実験結果を示したもので、ＰＩ染色法を使用してＤＮＡを染色した後、細胞分析機を使用して測定した結果を示した図であり、ＺＮＦ３１２ｂの過剰発現細胞株であるＳＮＵ６３８−ＺＮＦ３１２ｂ及びＳＮＵ６６８−ＺＮＦ３１２ｂの細胞周期実験結果を示した図である。
【図１２】ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子の腫瘍形成能を調べるために実施した実験でコロニー形成実験結果を示した図で、ＺＮＦ３１２ｂの抑制細胞株であるＳＮＵ６６８−ｓｈＺＮＦ３１２ｂのコロニー形成結果を示した図である。
【図１３】ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子の腫瘍形成能を調べるために実施した実験でコロニー形成実験結果を示した図で、ＺＮＦ３１２ｂの抑制細胞株であるＳＮＵ６６８−ｓｈＺＮＦ３１２ｂのコロニー形成結果を示した図である。
【図１４】ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子の腫瘍形成能を調べるために実施した実験でコロニー形成実験結果を示した図で、ＺＮＦ３１２ｂの過剰発現細胞株であるＳＮＵ６３８−ＺＮＦ３１２ｂ及びＳＮＵ６６８−ＺＮＦ３１２ｂのコロニー形成実験結果を示した図である。
【図１５】ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子の腫瘍形成能を調べるために実施した実験でコロニー形成実験結果を示した図で、ＺＮＦ３１２ｂの過剰発現細胞株であるＳＮＵ６３８−ＺＮＦ３１２ｂ及びＳＮＵ６６８−ＺＮＦ３１２ｂのコロニー形成実験結果を示した図である。
【図１６】ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子の過剰発現細胞株であるＳＮＵ６６８−ＺＮＦ３１２ｂをヌードマウスに移植して腫瘍形成能実験を行なった結果を示した図である。
【図１７】ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子の過剰発現細胞株であるＳＮＵ６６８−ＺＮＦ３１２ｂをヌードマウスに移植して腫瘍形成能実験を行なった結果を示した図である。
【図１８】ＺＮＦ３１２ｂの腫瘍関連作用部位を解明するために、ＺＮＦ３１２ｂのドメイン分析と細胞内存在位置を実験した結果を示した図で、ＺＮＦ３１２ｂタンパク質の欠失突然変異を示した模式図である。
【図１９】ＺＮＦ３１２ｂの腫瘍関連作用部位を解明するために、ＺＮＦ３１２ｂのドメイン分析と細胞内存在位置を実験した結果を示した図で、各ＺＮＦ３１２ｂ断片に対する核での移動程度を確認するために核分画を通じて細胞質と核を区分した後、それぞれのタンパク質をウエスタンブロットで確認した図である。
【図２０】ＺＮＦ３１２ｂの腫瘍関連作用部位を解明するために、ＺＮＦ３１２ｂのドメイン分析と細胞内存在位置を実験した結果を示した図で、核分画を通じて得たＺＮＦ３１２ｂの位置を確認するために免疫染色法を通じて、ＺＮＦ３１２ｂの細胞内存在位置を示した図である。
【図２１】全長ＺＮＦ３１２ｂとカルボキシ基末端を含有した断片ＺＮＦ３１２ｂの過剰発現によって、細胞増殖と腫瘍形成能が活性化になることを示した図であり、対照群（ｐＨＡ）、全長ＺＮＦ３１２ｂ（ＦＬ）、アミノ末端部分を含有した断片ＺＮＦ３１２ｂ（Ｎ１）、及びカルボキシ末端を含有した断片ＺＮＦ３１２ｂ（Ｃ１）を細胞内に形質導入して一時的に過剰発現させた後、細胞増殖をＣＣＫ−８試薬を使用して測定した結果を示した図である。
【図２２】全長ＺＮＦ３１２ｂとカルボキシ基末端を含有した断片ＺＮＦ３１２ｂの過剰発現によって、細胞増殖と腫瘍形成能が活性化になることを示した図であり、前記ＤＮＡを使用して細胞内にこれらを恒常的に発現する細胞株を作った後、図２１と同じ実験を行なって得た結果を示した図である。
【図２３】全長ＺＮＦ３１２ｂとカルボキシ基末端を含有した断片ＺＮＦ３１２ｂの過剰発現によって、細胞増殖と腫瘍形成能が活性化になることを示した図であり、図８ｂで使用した細胞株を使用して実施した実験でコロニー形成実験結果を示したもので、ｓｏｆｔ−ａｇａｒを使用してコロニー形成効率を測定した実験の結果を示した図である。
【図２４】ＺＮＦ３１２ｂの腫瘍形成能の作用メカニズムを確認するための実験として、ＺＮＦ３１２ｂはＫ−ｒａｓの転写活性を調節し、ＲＡＳ−ＥＲＫ−ｐａｔｈｗａｙを活性化して細胞増殖を誘導することを示した図であり、ＺＮＦ３１２ｂのｓｉＲＮＡを使用して細胞内のＺＮＦ３１２ｂの発現量を減少させた後、ＲＡＳタンパク質量とＲＡＳ−ＥＲＫ経路の活性化程度をウエスタンブロットで確認した図である。
【図２５】ＺＮＦ３１２ｂの腫瘍形成能の作用メカニズムを確認するための実験として、ＺＮＦ３１２ｂはＫ−ｒａｓの転写活性を調節し、ＲＡＳ−ＥＲＫ−ｐａｔｈｗａｙを活性化して細胞増殖を誘導することを示した図であり、ＲＡＳタンパク質の量とＥＲＫ経路活性化が一時的に増加されたＺＮＦ３１２ｂによって増加するのか、また、Ｃ−末端部位含有断片ＺＮＦ３１２ｂによっても同じ結果を得ることができるかどうかを確認した図である。
【図２６】多様なＺＮＦ３１２ｂプロモーター部位を導入したｐＧＬ３ｂ−ＺＮＦ３１２ｂベクターマップを示した図である。
【図２７】それぞれのｐＧＬ３ｂ−ＺＮＦ３１２ｂベクターを胃癌細胞株に形質導入させた後、ルシフェラーゼレポーター活性を測定した結果を示した図である。
【図２８】ＺＮＦ３１２ｂプロモーター中、＋１ｂｐ〜−８５０ｂｐ部位を導入したｐＧＬ４．１４−ＺＮＦ３１２ｂ−０．８５ベクターマップを示した図である。
【図２９】ｐＧＬ４．１４−ＺＮＦ３１２ｂ−０．８５ベクターを胃癌細胞株に形質導入させた後、ルシフェラーゼレポーター活性を測定した結果を示した図である。
【図３０】Ｋ−ｒａｓプロモーターを含む多様なレポーターベクターを示した図である。
【図３１】ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子及び前記遺伝子の中でカルボキシ末端を含む断片ＺＮＦ３１２ｂの発現によって、Ｋ−ｒａｓレポーターの活性化有無を確認した図である。
【図３２】ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子及び前記遺伝子の中でカルボキシ末端を含む断片ＺＮＦ３１２ｂによって活性化するＫ−ｒａｓプロモーター部分を同定するための実験を行なった結果を示した図である。
【図３３】Ｋ−ｒａｓプロモーターのＺＮＦ結合予想部位とＺＮＦ３１２ｂタンパク質を直接結合させて、Ｋ−ｒａｓプロモーター中の−６５０ｂｐ〜−５００ｂｐ部位に存在するＺＮＦ結合予想部位である５７ｂｐに、ＺＮＦ３１２ｂの結合有無を確認した結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【０１２２】
以下、本発明を実施例及び実験例によって詳しく説明する。
但し、下記の実施例及び実験例は、本発明を例示するだけのものであって、本発明の内容が、下記の実施例及び実験例に限定されるものではない。
【実施例】
【０１２３】
＜実施例１＞腫瘍細胞培養及び総ＲＮＡの分離
＜１−１＞腫瘍細胞培養
本発明者らは、１９８２年韓国胃癌患者から樹立されたもので、韓国細胞株銀行から分譲受けたＳＮＵ−６３８及びＳＮＵ−６６８細胞株を培養した。前記細胞株は、１０％牛胎児血清、１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、そして１００ＩＵ／ｍｌアンピシリンが含まれたＲＰＭＩ−１６４０（Ｈｙｃｌｏｎｅ，米国）培地で培養した。
【０１２４】
＜１−２＞総ＲＮＡ分離
本発明者らは、商業的に販売されているシステムであるＲＮｅａｓｙ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，ドイツ）を使用して胃癌患者から得た組織から総ＲＮＡを抽出した。ＤＮＡ汚染源を除去するためにＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ，米国）を使用し、フェノールクロロホルム法によって総ＲＮＡのみを精製した。
【０１２５】
＜実施例２＞ＲＴ−ＰＣＲ
本発明者らは、前記実施例＜１−２＞で得た総ＲＮＡ  １ｍｇにオリゴｄＴをプライマーとして逆転写反応を行なった。続いて、生成されたｃＤＮＡを１／２０に希釈した後、希釈されたｃＤＮＡ  ２μｌを鋳型にして、ＺＮＦ３１２ｂのプライマー［正方向：５’−ＣＧＡＡＧＴＧＴＧＴＧＧＡＡＡＧＧＴ−３’（配列番号３）、逆方向：５’−ＡＡＴＡＣＡＣＧＣＧＧＧＣＴＡＣＡＡＡＣ−３’（配列番号４）］でＰＣＲを行なった。前記ＰＣＲ反応の条件は、９４℃で４５秒、５８℃で４５秒、及び７２℃で４５秒反応させながら、それを３５回繰り返した後、最終伸長時間として７分反応させた。増幅された産物は、１．２％アガロースゲルに電気泳動した後、ＥｔＢｒで染色して紫外線を照射してイメージ分析装置で確認した。その結果を映像分析装置で分析して定量化した。対照群にＢ２Ｍを使用して試料間の差異を補正した。図２は、胃癌患者等の組織からＺＮＦ３１２ｂの発現レベルを確認した結果を示したものであり、それを図１に定量化して示した。図１から分かるように、ＺＮＦ３１２ｂは胃癌組織で過量に過剰発現されることが確認された（図１及び図２）。
【０１２６】
＜実施例３＞ＺＮＦ３１２ｂ発現または抑制ベクターの製造
＜３−１＞ＺＮＦ３１２ｂ発現ベクターの製造
本発明者らは、ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子をｐｃＤＮＡベクターにクローニングした。まず、総ｃＤＮＡを鋳型にして、ＫｐｎＩとＢａｍＨＩ制限酵素認識部位を含有したＺＮＦ３１２ｂプライマーを使用してＰＣＲを行なった。生成されたＰＣＲ産物を精製した後、ＫｐｎＩとＢａｍＨＩ制限酵素で切断後、ｐｃＤＮＡベクターに挿入してｐｃＤＮＡ−ＺＮＦ３１２ｂ発現ベクターを製造した。
【０１２７】
＜３−２＞ＺＮＦ３１２ｂ抑制ベクターの製造
本発明者らは、ＺＮＦ３１２ｂ  ｓｈＲＮＡを発現するベクターを製造するために、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ４．１−ＣＭＶｎｅｏ（Ａｍｂｉｏｎ，米国）ベクターにＺＮＦ３１２ｂ  ｓｈＲＮＡ配列を含有したｓｉ−ＺＮＦ３１２ｂ−１オリゴマー［５’−ＧＣＡ  ＣＴＣ  ＴＣＴ  ＧＣＡ  ＴＣＴ  ＣＡＡ  Ｃ−３’（配列番号５）］を挿入して、ｐＳｉｌｅｎｔ−ＺＮＦ３１２ｂベクターを製造した。
【０１２８】
＜実施例４＞形質転換胃癌細胞株の樹立
＜４−１＞ＺＮＦ３１２ｂ過剰発現胃癌細胞株の樹立
本発明者らは、前記実施例＜３−１＞で製造したｐｃＤＮＡ−ＺＮＦ３１２ｂベクターを胃癌細胞株であるＳＮＵ−６３８及びＳＮＵ−６６８に形質導入し、ＺＮＦ３１２ｂ過剰発現細胞株であるＳＮＵ６３８−ＺＮＦ３１２ｂとＳＮＵ６６８−ＺＮＦ３１２ｂをそれぞれ樹立した。
【０１２９】
まず、過剰発現細胞株を樹立するためにＳＮＵ−６３８及びＳＮＵ−６６８細胞に、Ｆｕｇｅｎｅ−６（Ｒｏｃｈｅ、ドイツ）を使用してそれぞれｐｃＤＮＡ−ＺＮＦ３１２ｂを形質導入させた。前記遺伝子が発現される細胞株のみを選択するために選別マーカーであるＧ４１８を６００μｇ／ｍｌになるように培養液に入れた。また、単一クローンを有した細胞株を得るために、コロニーを選別した。そのために、Ｇ４１８培地を３日間隔で交換した。形成されたコロニーを選別して細胞数を増やし、凍結保管して一部は前記遺伝子の発現確認のためにＲＮＡ抽出またはタンパク質抽出のために使用した。
【０１３０】
＜４−２＞ＺＮＦ３１２ｂ抑制胃癌細胞株の樹立
本発明者らは、前記実施例＜３−２＞で製造されたベクターｐＳｉｌｅｎｔ−ＺＮＦ３１２ｂを、ＳＮＵ−６６８に形質導入させてＺＮＦ３１２ｂ抑制細胞株であるＳＮＵ６６８−ｓｈＺＮＦ３１２ｂを樹立した。
【０１３１】
まず、抑制細胞株を樹立するためにＳＮＵ−６６８細胞にＦｕｇｅｎｅ−６（Ｒｏｃｈｅ，ドイツ）を使用して、それぞれｐＳｉｌｅｎｔ−ＺＮＦ３１２ｂを形質導入させた。前記遺伝子が発現される細胞株のみを選択するために、選別マーカーであるＧ４１８を６００μｇ／ｍｌになるように培養液に入れた。また、単一クローンを有した細胞株を得るために、コロニーを選別した。そのためにＧ４１８培地を３日間隔で交換した。形成されたコロニーを選別して細胞数を増やして凍結保管し、一部は前記遺伝子の発現確認のためにＲＮＡ抽出またはタンパク質抽出用に使用した。前記遺伝子の抑制が確認された細胞株は、多量で培養して凍結保管用と機能解明用に使用した。
【０１３２】
＜実施例５＞ウエスタンブロット実験
本発明者らは、前記＜実施例４＞で製造されたベクターのタンパク質の発現レベルを評価するために、ウエスタンブロット実験を行なった。
【０１３３】
まず、細胞に溶解緩衝溶液Ａ［２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，２ｍＭ  ＥＧＴＡ，１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，１０％グリセロール、プロテアーゼカクテルＩ、ＩＩ（Ｓｉｇｍａ、米国）］を添加した後、４℃で２０分間放置した。細胞溶解物を新しいチューブに移した後、４℃、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離してタンパク質を得た。前記細胞溶解物を５×試料緩衝溶液を添加して、９５℃で１０分間沸してゲルローディング試料に作ってＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに電気泳動した。前記電気泳動で分子量によって分離したタンパク質バンドは、ニトロセルロース膜でｔｒａｎｓｆｅｒ  ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、米国）を使用して移動させた後、５％脱脂乳で１時間ブロッキングした。次に、各々の抗体［ＨＡ−ＺＮＦ３１２ｂを検出するためのＨＡ抗体、及び対照群であるチューブリンを検出するためのチューブリン抗体］を４℃で１２時間処理した。ＴＢＳＴ（０．２％Ｔｗｅｅｎ２０）緩衝溶液を使用して膜を洗浄した後、２次抗体を１時間処理した後、ＴＢＳＴで洗浄した後、ＨＲＰ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＡＢ  ｆｒｏｎｔｉｅｒ，韓国）を使用してフィルムに現像した。
【０１３４】
＜実施例６＞細胞増殖実験
＜６−１＞ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子の発現抑制による細胞増殖
本発明者らは、ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子の発現抑制による胃癌細胞株の細胞増殖能を調査するために、ＺＮＦ３１２ｂの塩基配列（配列番号１）中で１９個のヌクレオチドからなる三つの種類のｓｉＲＮＡ［ｓｉ−ＺＮＦ３１２ｂ−１：５’−ＧＣＡ  ＣＴＣ  ＴＣＴ  ＧＣＡ  ＴＣＴ  ＣＡＡ  Ｃ−３’（配列番号６）、ｓｉ−ＺＮＦ３１２ｂ−２：５’−ＧＴＧ  ＴＧＴ  ＧＧＡ  ＡＡＧ  ＧＴＣ  ＴＴＴ  Ａ−３’（配列番号７）、及びｓｉ−ＺＮＦ３１２ｂ−３’：５’−ＧＣＡ  ＧＴＴ  ＣＡＡ  ＧＴＧ  ＣＡＡ  ＴＡＴ  Ｃ−３’（配列番号８）］を作製し、それによって、ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子の発現阻害能を測定した。その結果、図３のように、ｓｉ−ＺＮＦ３１２ｂ−１の阻害能が最も高いことが調査され、それをＺＮＦ３１２ｂ遺伝子の一時的な発現阻害実験に使用した（図３）。
【０１３５】
また、恒常的な前記遺伝子の発現抑制を誘導するために、前記実施例＜３−２＞で製造したＳＮＵ６６８−ｓｈＺＮＦ３１２ｂ細胞株から総ＲＮＡを抽出して発現阻害程度を確認した結果、ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子が抑制されることが確認され、それをＺＮＦ３１２ｂ遺伝子の恒常的な抑制実験に使用した。細胞増殖実験は、ＣＣＫ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ，日本）試薬を使用して行なった。これは、テトラゾリウム塩を使用する方法で、細胞内に存在する脱水素酵素によって親水性のホルマザンに転換されることを測定して細胞増殖有無を判断した。図５は、一時的に前記ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子の発現を阻害した時、細胞増殖が減少することを示していて、グラフ中の図は、ＺＮＦ３１２ｂの抑制程度をＲＴ−ＰＣＲで確認したものを示したものである。図６は、恒常的に前記遺伝子を阻害する細胞株を使用して細胞増殖実験を行なったもので、細胞増殖が対照群と比較して減少することが分かった（図５及び図６）。
【０１３６】
＜６−２＞ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子の過剰発現による細胞増殖
本発明者らは、前記＜実施例４＞で樹立された細胞株であるＳＮＵ６３８−ＺＮＦ３１２ｂ及びＳＮＵ６６８−ＺＮＦ３１２ｂを使用して、前記遺伝子の過剰発現を通じた胃癌細胞株の細胞増殖能を調査した。細胞増殖実験は、ＣＣＫ−８試薬を使用して行ない、細胞（５×１０３個）を９６ウェルプレートに入れて、２４時間培養した後、２４時間間隔で細胞増殖実験を行なった。図７はＳＮＵ６３８−ＺＮＦ３１２ｂを、図８はＳＮＵ６６８−ＺＮＦ３１２ｂを使用して細胞増殖実験を行なった結果を示したものであり、グラフ中の図は、ＨＡ−ＺＮＦ３１２ｂの過剰発現レベルをウエスタンブロットで示したもので、前記遺伝子の過剰発現が細胞増殖を増加させたことが分かった（図７及び図８）。
【０１３７】
＜実施例７＞細胞周期実験
本発明者らは、細胞周期を測定してＺＮＦ３１２ｂ遺伝子の細胞増殖関連性を調査した。細胞周期実験は、ＰＩ染色法を使用して行なった。ＰＩは、核を染色する方法で、各細胞を２４時間培養した後、７０％エチルアルコールで４℃、１２時間以上固定させた後、ＰＩで染色してＦＡＣＳ分析機を使用して測定した。その結果、図９〜図１１に見られるように、対照群と比較して前記ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子の発現が阻害された時、Ｇ１期が増加されて、Ｇ２＋Ｍ時期が減少して細胞増殖が減少したが、前記ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子を過剰発現した場合は、Ｇ１期が減少して、Ｇ２＋Ｍ時期が増加することによって細胞増殖率が増加することが分かった。細胞周期を使用した細胞増殖実験も、ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子の抑制または過剰発現によって細胞増殖の抑制または活性が確認され、本遺伝子が細胞増殖と関連があることが分かった（図９、図１０及び図１１）。
【０１３８】
＜実施例８＞コロニー形成実験
本発明者らは、ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子が発癌遺伝子として機能をするかどうかを確認するために、コロニー形成実験を行なった。まず、４５℃の２倍濃度のＲＰＭＩ１６４０培地と１．２％アガロース溶液を同量ずつ混ぜて０．６％の１×培地を作って、６ウェルプレートに入れて１時間固めた後、５０００個の細胞を０．５ｍｌ培地に希釈して同量の０．６％アガロースと混ぜて０．６％のアガロース平板上に入れた。常温で１時間固めた後、１×培地を入れて、３７℃の培養器で培養しながらコロニーの形成を観察した。形成されたコロニーは、１００倍率の顕微鏡で観察して計数して図式化した。図１２及び図１３は、ＺＮＦ３１２ｂ胃癌抑制細胞株であるＳＮＵ６６８−ｓｈＺＮＦ３１２ｂを使用して前記遺伝子を阻害した後、コロニー形成を観察したものであり、図１４及び図１５は、前記遺伝子を過剰発現胃癌細胞株であるＳＮＵ６３８−ＺＮＦ３１２ｂとＳＮＵ６６８−ＺＮＦ３１２ｂを使用してコロニー形成実験を行なったものである。その結果、図１２〜図１５に見られるように、ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子発現を阻害する胃癌抑制細胞株であるＳＮＵ６６８−ｓｈＺＮＦ３１２ｂを使用した場合、対照群と比較してコロニー形成が阻害され、ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子を過剰発現する胃癌細胞株であるＳＮＵ６３８−ＺＮＦ３１２ｂ及びＳＮＵ６６８−ＺＮＦ３１２ｂを使用した場合、対照群と比較してコロニー形成が増加したことが分かった（図１２、図１３、図１４及び図１５）。
【０１３９】
＜実施例９＞腫瘍形成実験
本発明者らは、ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子が発癌遺伝子として機能するかどうかを確認するために、ヌードマウスを使用した腫瘍形成実験を行なった。前記実施例＜４−１＞で樹立されたＳＮＵ６６８−ＺＮＦ３１２ｂ細胞株、及び対照群であるＳＮＵ６６８−Ｎｅｏ細胞株をヌードマウスにそれぞれ移植して腫瘍形成を観察した。実験群は、各３匹のヌードマウスに各細胞株５×１０５の細胞を接種した。接種４週後、それぞれの腫瘍の大きさを測定して数値化して比較した。腫瘍の大きさ（ｍｍ３）は、広さ×高さ／２の公式を使用して数値化した。その結果、図１６〜図１７にみられるように、ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子の過剰発現細胞株であるＳＮＵ６６８−ＺＮＦ３１２ｂを移植したヌードマウスの腫瘍大きさが顕著に大きくなっていることを確認することができた（図１６及び図１７）。
【０１４０】
＜実施例１０＞ＺＮＦ３１２ｂ断片過剰発現ベクター製造及びその胃癌細胞株樹立
＜１０−１＞ＺＮＦ３１２ｂ断片過剰発現ベクターの製造
本発明者らは、ｐｃＤＮＡ−ＺＮＦ３１２ｂベクターを鋳型にして、図７ａのような断片をＰＣＲ方法で増幅した後、ｐｃＤＮＡベクターにクローニングした。まず、ｐｃＤＮＡ−ＺＮＦ３１２ｂを鋳型にして、ＫｐｎＩとＢａｍＨＩ制限酵素認識部位を含有したＺＮＦ３１２ｂプライマーを使用してＰＣＲを行なった。生成された各ＰＣＲ産物を精製した後、ＫｐｎＩとＢａｍＨＩ制限酵素で切断後、ｐｃＤＮＡベクターに挿入してｐｃＤＮＡ−ＺＮＦ３１２ｂＮ１（Ｎ１で表記）、ｐｃＤＮＡ−ＺＮＦ３１２ｂＮ２（Ｎ２）、ｐｃＤＮＡ−ＺＮＦ３１２ｂＣ１（Ｃ１）及びｐｃＤＮＡ−ＺＮＦ３１２ｂＣ２（Ｃ２）発現ベクターを製造した（図１８）。
【０１４１】
＜１０−２＞ＺＮＦ３１２ｂ断片過剰発現胃癌細胞株の樹立
本発明者らは、前記実施例＜１０−１＞で製造したベクターｐｃＤＮＡ−ＺＮＦ３１２ｂ−Ｎ１と−Ｃ１を胃癌細胞株であるＳＮＵ−６３８に形質導入し、全長ＺＮＦ３１２ｂ及び断片ＺＮＦ３１２ｂ過剰発現細胞株であるＳＮＵ６３８−ＺＮＦ３１２ｂ（ＳＮＵ６３８−ＦＬ）、ＳＮＵ６３８−ＺＮＦ３１２ｂＮ１（ＳＮＵ６３８−Ｎ１）及びＳＮＵ６３８−ＺＮＦ３１２ｂＣ１（ＳＮＵ６３８−Ｃ１）をそれぞれ樹立した。
【０１４２】
まず、過剰発現細胞株を樹立するために、胃癌細胞株ＳＮＵ−６３８細胞にＦｕｇｅｎｅ−６（Ｒｏｃｈｅ，ドイツ）を使用して、ＦＬ、Ｎ１及びＣ１をそれぞれ形質導入した。前記遺伝子が発現される細胞株のみを選択するために、選別マーカーであるＧ４１８を６００μｇ／ｍｌになるように培養液に入れた。また、単一クローンを有した細胞株を得るためにコロニーを選別した。そのために、Ｇ４１８培地を３日間隔で交換した。形成されたコロニーを選択して細胞数を増やし、凍結保管して一部は前記遺伝子の発現確認のためにＲＮＡ抽出またはタンパク質抽出のために使用した。
【０１４３】
＜実施例１１＞ＺＮＦ３１２ｂ断片タンパク質の細胞内位置確認
＜１１−１＞核分画実験
本発明者らは、ＺＮＦ３１２ｂの細胞内位置と核に移動するのに必要なタンパク質部分を同定するために、核分画法を使用して細胞質と核を分離した。分離した試料を使用してウエスタンブロット法を行い、ＺＮＦ３１２ｂが核内に存在し、カルボキシ末端（配列番号２０）を通じて核に移動するということを確認した。
【０１４４】
まず、ＳＮＵ−６３８細胞にＺＮＦ３１２ｂ及びその断片を形質導入して発現させた。前記細胞を回収して、冷たいＰＢＳ緩衝溶液で二度洗浄した後、１ｍｌ  ＤＮＢ［１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５），２ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ  ＫＣｌ，０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．５ｍＭ  ＥＧＴＡ，プロテアーゼ阻害剤カクテルＩ，ＩＩ（Ｓｉｇｍａ，米国）、及び０．２％  ＮＰ−４０］で浮遊させた後、２２ゲージ針注射器を使用して、細胞を破裂させた。均質懸濁液を５００×ｇで１０分間遠心分離して細胞核を分離した。そこに、溶解緩衝溶液（ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）Ａ［２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  （ｐＨ７．５），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，２ｍＭ  ＥＧＴＡ，１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，１０％グリセロール，プロテアーゼカクテルＩ，ＩＩ（Ｓｉｇｍａ，米国）］を添加して溶解させた後、同一条件で遠心分離して核内のタンパク質を取得した。その結果、図１９に見られるように、カルボキシ末端を含有したＺＮＦ３１２ｂだけが、核に移動したことを確認した（図１９）。
【０１４５】
＜１１−２＞免疫細胞染色法による局在の確認
本発明者らは、ＺＮＦ３１２ｂ及びその断片を発現させた細胞をカバースリップガラス上において、２４時間後に前記細胞を４％パラホルムアルデヒドで２０分間処理して固定させた。前記固定された細胞等は、ＰＢＳを使用して３回洗浄した後、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で１０分間処理した後、１時間１％ＢＳＡで常温でブロッキングし、４℃でモノクローナル抗−ＨＡで１２時間反応させた。ＰＢＳで３回洗浄した後、Ａｌｅｘａ−５６８が付いている抗マウス２次抗体を１時間処理して、ＰＢＳで３回洗浄した。その後、３０分間ＤＰＡＩで反応させて、ＰＢＳで３回洗浄した。前記過程を経た細胞は、スライドの上に蓄積して、蛍光顕微鏡（ｏｌｙｍｐｕｓ，日本）を使用して分析した。その結果、図２０に見られるように、核分画実験と同様にカルボキシ末端を含有したＺＮＦ３１２ｂだけが、核に存在し、アミノ末端のみを含有した断片ＺＮＦ３１２ｂタンパク質は、細胞質に存在することが分かった（図２０）。
【０１４６】
＜実施例１２＞ＺＮＦ３１２ｂ断片過剰発現胃癌細胞株の細胞増殖及びコロニー形成実験
＜１２−１＞ＺＮＦ３１２ｂ断片過剰発現胃癌細胞株の細胞増殖
本発明者らは、前記実施例＜１０−２＞で樹立された細胞株であるＳＮＵ６３８−ＦＬ及びその断片ＺＮＦ３１２ｂを発現する細胞株ＳＮＵ６３８−Ｎ１及びＳＮＵ６３８−Ｃ１を使用して、胃癌細胞株の細胞増殖能を調査した。細胞増殖実験は、前記実施例＜６−１＞のようなＣＣＫ−８試薬を使用して行ない、全長ＺＮＦ３１２ｂ及びカルボキシ末端（配列番号２０）含有ＺＮＦ３１２ｂ断片を一時的に形質導入させて短期間発現させた後、細胞増殖実験を行なった。その結果、図２１にみられるように、一過性の過剰発現は、胃癌細胞株の細胞増殖を増加させることが分かり、図２２にみられるように前記遺伝子を恒常的に発現する細胞株を使用して細胞増殖実験を行なった結果、恒常的過剰発現も胃癌細胞株の細胞増殖を増加させることが分かった（図２１及び図２２）。
【０１４７】
＜１２−２＞ＺＮＦ３１２ｂ断片過剰発現胃癌細胞株のコロニー形成実験
本発明者らは、全長ＺＮＦ３１２ｂ及びカルボキシ末端含有ＺＮＦ３１２ｂ断片を恒常的に過剰発現する胃癌細胞株ＳＮＵ６３８−ＦＬ、ＳＮＵ６３８−Ｎ１及びＳＮＵ６３８−Ｃ１を使用して、前記＜実施例８＞と同じ方法でコロニー形成実験を行なった。その結果、図８ｃにみられるように全長ＺＮＦ３１２ｂ及びカルボキシ末端含有ＺＮＦ３１２断片を過剰発現させた時、コロニー形成が増加した。したがって、ＺＮＦ３１２ｂの胃癌腫瘍形成能は、ＺＮＦ３１２ｂタンパク質のカルボキシ末端部分に存在することが分かった（図２３）。
【０１４８】
＜実施例１３＞ＺＮＦ３１２ｂ及びその断片過剰発現による細胞増殖シグナル伝達系確認
＜１３−１＞ＺＮＦ３１２ｂ抑制による細胞増殖シグナル伝達
本発明者らは、ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子の発現抑制による胃癌細胞株の細胞増殖と係わるシグナル伝達系を調査するために、ｓｉ−ＺＮＦ３１２ｂ−１を胃癌細胞株に形質導入させてＺＮＦ３１２ｂの発現を減少させた後、前記＜実施例５＞の方法でウエスタンブロットを実施した。ここで、使用された抗体は、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＭＥＫ１／２、ＭＥＫ１／２、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫ１／２、ＥＲＫ１／２、Ｋ−ｒａｓ、及びチューブリンで、これらを通じてＺＮＦ３１２ｂのタンパク質がＫ−ｒａｓの発現を調節し、調節されたＫ−ｒａｓが細胞増殖シグナル伝達であるＥＲＫ経路に作用するかどうかを確認した。その結果、図２４に見られるように、ＺＮＦ３１２ｂの抑制は、Ｋ−ｒａｓの発現減少を誘導した。これは、ＥＲＫシグナル伝達であるＭＥＫ１／２及びＥＲＫ１／２のリン酸化減少、すなわちＥＲＫシグナル伝達の不活性化につながることを観察することができた（図２４）。
【０１４９】
＜１３−２＞ＺＮＦ３１２ｂ及びその断片過剰発現による細胞増殖シグナル伝達
本発明者らは、ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子及びその断片の過剰発現による胃癌細胞株の細胞増殖と係わるシグナル伝達を調査するために、ＳＮＵ−６３８細胞に各断片を形質導入させた後、それら細胞を溶解させて、前記実施例＜１３−１＞と同じ方法でシグナル伝達系を確認した。その結果、図２５にみられるように、図２４の結果とは反対に、全長ＺＮＦ３１２ｂ及びカルボキシ末端を含有した断片ＺＮＦ３１２ｂの過剰発現は、Ｋ−ｒａｓの発現活性を誘導してそれを通じてＥＲＫ経路が活性化することを確認した。したがって、ＺＮＦ３１２ｂは、細胞増殖シグナル伝達を調節し、前記調節は、ＺＮＦ３１２ｂのカルボキシ末端が核心的役割を果たして、それを通じて胃癌発生に関与していることが分かった（図２５）。
【０１５０】
＜実施例１４＞ＺＮＦ３１２ｂプロモーター発現ベクターの製造
＜１４−１＞ＺＮＦ３１２ｂプロモーター部位を含むｐＧＬ３ｂ−ＺＮＦ３１２ｂベクターの製造
本発明者らは、ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子のプロモーター部位をルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードすることができるベクターに導入するため、ＺＮＦ３１２ｂのプロモーター（配列番号９）及びその断片（配列番号１０〜配列番号１４）をＮｈｅＩとＢｇｌＩＩ制限酵素認識部位を含有したプライマーを使用してＰＣＲで増幅させた後、ｐＧＬ３  ｂａｓｉｃベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，米国）に挿入した。まず、ＳＮＵ６３８  ｃＤＮＡを鋳型にして増幅させたＰＣＲ産物を精製した後、ＮｈｅＩとＢｇｌＩＩ制限酵素で切断し、ｐＧＬ３  ｂａｓｉｃベクターに挿入して、ＺＮＦ３１２ｂのプロモーター部位を有する６種類のｐＧＬ３ｂ−ＺＮＦ３１２ｂベクターを製造した（図２６）。
【０１５１】
＜１４−２＞ＺＮＦ３１２ｂプロモーター転写活性能を一時的に有する細胞株の樹立
本発明者らは、ＺＮＦ３１２ｂのプロモーター（配列番号９）及びその断片（配列番号１０〜配列番号１４）中、活性を有する部位を解明するために、前記実施例＜１４−１＞で製造されたｐＧＬ３−ＺＮＦ３１２ｂベクターを胃癌細胞株であるＳＮＵ−６３８に形質導入させて、ＺＮＦ３１２ｂプロモーター活性を一時的に有する細胞株を樹立した。まず、胃癌細胞株ＳＮＵ−６３８の細胞（２×１０５個）にリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，米国）６μｌを使用して、それぞれのｐＧＬ３−ＺＮＦ３１２ｂベクター２μｇを形質導入した後、４８時間培養した。
【０１５２】
＜実施例１５＞ＺＮＦ３１２ｂプロモーターの転写活性能測定
本発明者らは、前記実施例＜１４−２＞で樹立した細胞株でのＺＮＦ３１２ｂのプロモーターの転写活性能を測定した。前記転写活性能の測定は、ルシフェラーゼレポーターの活性を評価した。測定には、ルシフェラーゼ分析システムキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，米国）を使用した。
【０１５３】
まず、６ウェルプレートに樹立した細胞株の密度が、２．５×１０５個になるようにして２４時間培養し、細胞が単層に均一に分布するようにした。細胞溶解液３００μｌを使用して、細胞を溶解させた。前記細胞溶解液を１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、上澄み液を新しい１．５ｍｌチューブに移して使用した。ブラッドフォード方法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ  ｍｅｔｈｏｄ）で対照群タンパク質にＢＳＡを０、１、２、３、４及び５μｇを使用して、標準曲線を描いてタンパク質を定量した後、細胞抽出物２μｌを使用して５９５ｎｍ波長で吸光度を測定した。タンパク質定量が終わった試料を使用して、ルシフェラーゼ活性を測定した。細胞抽出物２０μｌとルシフェラーゼレポーター基質５０μｌを混ぜた後、ルミネセンス測定機（Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，カナダ）を使用してルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現量を確認した。前記発現量を使用してルシフェラーゼの活性を測定した。計算法は、下記のとおりであり、ここで、ルシフェラーゼ分析試薬が入って測定された値がＲＬＵ（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｕｎｉｔ）である。
【０１５４】
【数１】
2010523107.tif 000003
【０１５５】
その結果、図２７に見られるように、ＺＮＦ３１２ｂのプロモーター中の＋１ｂｐ〜−８５０ｂｐ部位（配列番号１２）を含有したクローンが、対照群と比較してルシフェラーゼ活性が最も高いことが確認された（図２７）。
【０１５６】
＜実施例１６＞ＺＮＦ３１２ｂプロモーター中の＋１ｂｐ〜−８５０ｂｐ部位を含有したベクター及びその胃癌細胞株の樹立
＜１６−１＞ＺＮＦ３１２ｂプロモーター断片を含有したｐＧＬ４−ＺＮＦ３１２ｂベクターの製造
本発明者らは、プロモーター断片の転写活性能を恒常的に有する細胞株を樹立するため、ＺＮＦ３１２ｂのプロモーター中の＋１ｂｐ〜−８５０ｂｐ部位（配列番号１２）をＮｈｅＩとＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識部位を含有したプライマーを使用して、ｐＧＬ４．１４ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，米国）に挿入して、ｐＧＬ４．１４−ＺＮＦ３１２ｂ−０．８５ベクターを製造した（図２８）。
【０１５７】
＜１６−２＞ＺＮＦ３１２ｂプロモーター転写活性能を恒常的に有する細胞株の樹立
本発明者らは、ＺＮＦ３１２ｂプロモーター中の＋１ｂｐ〜−８５０ｂｐ部位（配列番号１２）の転写活性能を恒常的に有する細胞株を樹立するために、前記実施例＜１６−１＞で作製したｐＧＬ４．１４−ＺＮＦ３１２ｂ−０．８５をＳＮＵ−６３８細胞株にリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，米国）を使用して形質導入した。４８時間培養後、前記遺伝子が発現される細胞株のみを選択するために、選別マーカーであるハイグロマイシンを１００μｇ／ｍｌになるように培養液に入れた。また、単一クローンを有した細胞株を得るために、ハイグロマイシン培地を３日間隔で交換しながらコロニーを選別した。前記樹立された細胞株は、薬効がある化合物を選別するのに使用した。
【０１５８】
＜実施例１７＞ＺＮＦ３１２ｂプロモーターの転写活性能測定
本発明者らは、前記実施例＜１６−２＞で樹立した細胞株でのＺＮＦ３１２ｂプロモーター中の＋１ｂｐ〜−８５０ｂｐ部位（配列番号１２）の転写活性能を、前記＜実施例１０＞と同一な方法で測定した。ＺＮＦ３１２ｂプロモーター転写活性能を恒常的に有するｐＧＬ４．１４−ＺＮＦ３１２ｂ−０．８５含有細胞株を使用して実験した結果、図２９に見られるように、対照群と比較してルシフェラーゼ活性が約１５倍増加することが確認された（図２９）。
【０１５９】
＜実施例１８＞ＺＮＦ３１２ｂプロモーター転写活性能阻害化合物選別
本発明者らは、前記実施例＜１６−２＞で樹立したｐＧＬ４．１４−ＺＮＦ３１２ｂ−０．８５細胞株を９６ウェルプレートに密度が１×１０４個になるようにして２４時間培養し、細胞が単層に均一に分布するようにした。１００μｌ培地に化合物の最終濃度が１０μＭになるように処理した。ここで、化合物が溶解しているＤＭＳＯは、最終濃度０．３％になるようにした。２４時間をさらに培養した後、２５μｌの細胞溶解液で細胞を溶解させた。細胞抽出物２５μｌとルシフェラーゼレポーター基質２０μｌを混ぜた後、前記＜実施例１０＞と同一な方法でルシフェラーゼレポーター活性を測定して、薬効がある化合物を選別した。化合物を処理しないでＤＭＳＯだけ処理した細胞株を対照群にして、それぞれの化合物を処理した時、レポーター活性の阻害程度を示した。ルシフェラーゼレポーターの阻害活性は、下記の方法で計算した：
【０１６０】
【数２】
2010523107.tif 000004
【０１６１】
その結果、表１に見られるように、５４個中２７個の化合物（５０％）が、ルシフェラーゼレポーター活性を４０％以上阻害することが示された（表１）。
【０１６２】
【表１】
2010523107.tif 000005
【０１６３】
＜実施例１９＞転写活性能阻害化合物の細胞毒性測定
本発明者らは、ＺＮＦ３１２ｂの転写活性能を阻害するものとして選別された化合物の細胞毒性を測定するために、ＣＣＫ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ，日本）試薬で処理した。これは、テトラゾリウム塩を使用する方法で、細胞内に存在する脱水素酵素によって親水性のホルマザンに転換されることを測定して細胞毒性を確認した。まず、９６ウェルプレートに前記実施例＜１６−２＞で樹立した細胞株の密度が１．５×１０４個になるようにして２４時間培養し、細胞が単層に均一に分布するようにした。１００μｌ培地に化合物の最終濃度が１０μＭになるように処理した。ここで、化合物が溶解しているＤＭＳＯは、最終濃度０．３％になるようにした。２４時間さらに培養した後、ＣＣＫ−８試薬１０μｌを処理して細胞毒性を測定した。
【０１６４】
その結果、表２に見られるように、１６個化合物は、１０％未満の細胞毒性を有することが示された（表２）。
【０１６５】
【表２】
2010523107.tif 000006
【０１６６】
＜実施例２０＞Ｋ−ｒａｓプロモーター部位を含有したｐＧＬ３ｂ−Ｋ−ｒａｓベクターの製造及びその胃癌細胞株の樹立
＜２０−１＞Ｋ−ｒａｓプロモーター部位を含有したｐＧＬ３ｂ−Ｋ−ｒａｓベクターの製造
本発明者らは、ＺＮＦ３１２ｂによるＫ−ｒａｓ発現量増加と調節機序を解明するために、Ｋ−ｒａｓプロモーターレポーターを製造した。図３０に見られるように、Ｋ−ｒａｓのプロモーター部位の断片として、Ｒａｓ２．０（−２０００〜＋１ｂｐ；配列番号１５）、Ｒａｓ１．０（−１０００〜＋１ｂｐ；配列番号１６）、Ｒａｓ０．６５（−６５０〜＋１ｂｐ；配列番号１７）、及びＲａｓ０．５（−５００〜＋１ｂｐ；配列番号１８）を作製した（図３０）。プロモーターの作動有無を確認するためのレポーターシステムには、ルシフェラーゼ遺伝子を使用した。
【０１６７】
まず、ヒトゲノムＤＮＡを鋳型にして前記各プロモーター断片のオリゴマーを使用してＰＣＲで増幅した後、ルシフェラーゼ遺伝子が入っているｐＧＬ３  ｂａｓｉｃベクターにＮｈｅＩ／ＢｇｌＩＩでクローニングした。
【０１６８】
＜２０−２＞Ｋ−ｒａｓプロモーター転写活性能を一時的に有する胃癌細胞株の製造
本発明者らは、前記実施例＜２０−１＞のＫ−ｒａｓレポーター（Ｒａｓ２．０）を前記実施例＜１０−１＞のＺＮＦ３１２ｂ（ＦＬ）及びその断片（Ｎ１、Ｎ２、Ｃ１及びＣ２）と共にＳＮＵ−６３８細胞株に形質導入させた後、４８時間培養した。
【０１６９】
＜実施例２１＞Ｋ−ｒａｓプロモーターレポーター活性
＜２１−１＞ＺＮＦ３１２ｂ及びその断片によるＫ−ｒａｓプロモーター活性測定
本発明者らは、前記実施例＜２０−２＞で樹立した細胞株でのＫ−ｒａｓプロモーターの転写活性能を測定するため、ルシフェラーゼレポーターの活性を分析した。前記ルシフェラーゼ分析は、ルシフェラーゼ分析キット（Ｐｒｏｍｅｇａ，米国）を使用して、キットのプロトコルにしたがって行なった。すなわち、前記実施例＜２０−２＞の培養された細胞を溶解（ｌｙｓｉｓ）させて、４℃、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離してタンパク質を分離した後、タンパク質定量で試料間の総タンパク質を補正して、ルミノメーター（Ｖｉｃｔｏｒ  3  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ）を使用してルシフェラーゼ活性を測定した。ここで、使用された溶解物（ｌｙｓａｔｅ）は１０μｌで、前記溶解物内ルシフェラーゼの基質は、５０μｌを使用した。
【０１７０】
その結果、図３１に見られるように、ＺＮＦ３１２ｂの発現によってＫ−ｒａｓプロモーターが活性化してルシフェラーゼ活性が増加し、ＺＮＦ３１２ｂのカルボキシ末端を含有した断片でも、やはりルシフェラーゼ活性が増加した（図３１）。
【０１７１】
＜２１−２＞ＺＮＦ３１２ｂのＫ−ｒａｓプロモータートランス因子の確認
本発明者らは、ＳＮＵ−６３８細胞にそれぞれのＫ−ｒａｓレポーター（Ｒａｓ２．０，Ｒａｓ１．０，Ｒａｓ０．６５，及びＲａｓ０．５）とＺＮＦ３１２ｂ−Ｃ１を一緒に形質導入した。４８時間経過後、細胞を溶解してルシフェラーゼ分析及びＺＮＦ３１２ｂ−Ｃ１の発現量を調査するために、ウエスタンブロットを実施した。それを３回反覆して有意性のある結果を得た。
【０１７２】
その結果、図３２に見られるように、ＺＮＦ３１２ｂ−Ｃ１の発現によってＫ−ｒａｓレポーターであるルシフェラーゼの活性が増加し、Ｒａｓ０．５ではその活性が減少した。したがって、ＺＮＦ３１２ｂのＫ−ｒａｓプロモーター結合部位は、−６５０〜−５００ｂｐ間であることが分かる（図３２）。
【０１７３】
＜２１−３＞Ｋ−ｒａｓプロモーターの結合部位とＺＮＦ３１２ｂの結合確認
本発明者らは、ＺＮＦ３１２ｂによるＫ−ｒａｓ活性の作用部位が−６５０〜−５００ｂｐ部位であることをより正確に調べるため、ＴｒａｎｓＡＭ  ｆｌｅｘｉ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ａｃｔｉｖｅ  ｍｏｔｉｆ，米国）を使用して確認した。
【０１７４】
まず、ＳＮＵ６３８細胞にＺＮＦ３１２ｂの断片を形質導入させた後、４８時間後、前記細胞を核分画して核タンパク質を得た。その後、ＨＡ抗体を核タンパク質と１時間反応させた。一方、Ｋ−ｒａｓプロモーターの−６５０〜−５００ｂｐ部位で亜鉛フィンガータンパク質（Ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＺＮＦ）結合部位で予想される５７ｂｐ部位［５’−ｔｇｔ  ｔｔａ  ｔｔｔ  ａｃａ  ｔｇｃ  ａｇｔ  ｃａａ  ｔｇａ  ｔａｇ  ｔａａ  ａｔｇ  ｇａｔ  ｇｃｇ  ｃｇｃ  ｃａｇ  ｔａｔ  ａｇｇ  ｃｃｇ  ａｃｃ−３’（配列番号１９）］を５’にビオチンが添加されたオリゴで合成した。それをＴａｎｓＡＭ  Ｆｌｅｘｉ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔで提供される９６ウェルプレートのストレプトアビジンと反応させて結合させた後、前記の抗体と核タンパク質混合物を入れて１時間反応させた。その後、洗浄緩衝溶液を使用して２回洗浄して２次抗体を入れ、１時間反応させた後、基質を入れて色の反応程度を観察して１時間インキュベーションした後、ＥＬＩＳＡマイクロプレートを使用して測定した。ウエスタンブロットで核タンパク質内のＺＮＦ３１２ｂタンパク質量を定量した。
【０１７５】
その結果、図３３に見られるように、ＺＮＦ結合予想オリゴＤＮＡへの結合能が、ＺＮＦ３１２ｂ、及びそのカルボキシ末端を含有したＺＮＦ３１２ｂ断片で確認され、ＺＮＦ３１２ｂは、Ｋ−ｒａｓプロモーターの−６５０〜−５００ｂｐ部位に存在するＺＮＦ結合部位に結合することが分かった（図３３）。
【産業上の利用可能性】
【０１７６】
本発明の新規な胃癌の診断及び治療用マーカーであるＺＮＦ３１２ｂは、胃癌患者試料で過剰発現して、前記遺伝子の過剰発現または抑制によって胃癌細胞株の細胞増殖と腫瘍形成能が活性または抑制されるので、胃癌の診断、胃癌誘発動物の製造、胃癌の予防及び治療、及び胃癌特異的抗癌剤の開発等に効果的に使用することができる。
2010523107.tif 000007
2010523107.tif 000008
2010523107.tif 000009
2010523107.tif 000010
2010523107.tif 000011
2010523107.tif 000012
2010523107.tif 000013
2010523107.tif 000014
2010523107.tif 000015
2010523107.tif 000016
2010523107.tif 000017
2010523107.tif 000018
2010523107.tif 000019
2010523107.tif 000020
2010523107.tif 000021
2010523107.tif 000022
2010523107.tif 000023
2010523107.tif 000024
2010523107.tif 000025
2010523107.tif 000026
2010523107.tif 000027
2010523107.tif 000028
2010523107.tif 000029
2010523107.tif 000030
2010523107.tif 000031
2010523107.tif 000032
2010523107.tif 000033
2010523107.tif 000034
2010523107.tif 000035
2010523107.tif 000036
2010523107.tif 000037
2010523107.tif 000038
2010523107.tif 000039
【図１】
2010523107.tif 000040
【図２】
2010523107.tif 000041
【図３】
2010523107.tif 000042
【図４】
2010523107.tif 000043
【図５】
2010523107.tif 000044
【図６】
2010523107.tif 000045
【図７】
2010523107.tif 000046
【図８】
2010523107.tif 000047
【図９】
2010523107.tif 000048
【図１０】
2010523107.tif 000049
【図１１】
2010523107.tif 000050
【図１２】
2010523107.tif 000051
【図１３】
2010523107.tif 000052
【図１４】
2010523107.tif 000053
【図１５】
2010523107.tif 000054
【図１６】
2010523107.tif 000055
【図１７】
2010523107.tif 000056
【図１８】
2010523107.tif 000057
【図１９】
2010523107.tif 000058
【図２０】
2010523107.tif 000059
【図２１】
2010523107.tif 000060
【図２２】
2010523107.tif 000061
【図２３】
2010523107.tif 000062
【図２４】
2010523107.tif 000063
【図２５】
2010523107.tif 000064
【図２６】
2010523107.tif 000065
【図２７】
2010523107.tif 000066
【図２８】
2010523107.tif 000067
【図２９】
2010523107.tif 000068
【図３０】
2010523107.tif 000069
【図３１】
2010523107.tif 000070
【図３２】
2010523107.tif 000071
【図３３】
2010523107.tif 000072
【配列表】
2010523107000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年10月2日(2009.10.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表わされるＺＮＦ３１２ｂ遺伝子またはその断片の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドを増幅することができるプライマー対を含む胃癌診断用キット。
【請求項２】
前記断片が、配列番号２０のポリペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１に記載の胃癌診断用キット。
【請求項３】
配列番号２で表わされるＺＮＦ３１２ｂタンパク質またはその断片に特異的に結合する抗体を含む胃癌診断用キット。
【請求項４】
正常対照群と比較して、ＺＮＦ３１２ｂタンパク質またはその断片の量の増加で胃癌を診断することを特徴とする、請求項３に記載の胃癌診断用キット。
【請求項５】
配列番号１で表わされるＺＮＦ３１２ｂ遺伝子またはその断片の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、またはそれに相補的なオリゴヌクレオチドが組み込まれた胃癌診断用ＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項６】
配列番号２で表わされるＺＮＦ３１２ｂタンパク質またはその断片に特異的に結合する抗体を、胃組織、胃細胞、尿、血液、血清及び血漿からなる群から選択される生物学的試料と接触させる工程を含む胃癌マーカー検出方法。
【請求項７】
１）実験群として胃由来細胞に被検組成物または被検化合物を処理する工程；
２）工程１）の実験群細胞と処理しない対照群細胞の配列番号１で表わされるＺＮＦ３１２ｂ遺伝子またはその断片の発現レベルを測定して比較する工程；及び
３）前記実験群の発現レベルを対照群と比較して有意に増加させる被検組成物または被検化合物を選別する工程、とを含む胃癌誘発物質スクリーニング方法。
【請求項８】
工程２）の断片が、配列番号２０のポリペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項７に記載の胃癌誘発物質スクリーニング方法。
【請求項９】
１）実験群として胃由来細胞に被検組成物または被検化合物を処理する工程；
２）工程１）の実験群細胞と処理しない対照群細胞の配列番号１で表わされるＺＮＦ３１２ｂ遺伝子またはその断片の発現レベルを測定して比較する工程；及び
３）前記実験群の発現レベルを対照群と比較して有意に減少させる被検組成物または被検化合物を選別する工程、とを含む胃癌抑制物質スクリーニング方法。
【請求項１０】
工程２）の断片は配列番号２０のポリペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項９に記載の胃癌抑制物質スクリーニング方法。
【請求項１１】
１）配列番号９で表わされる塩基配列で構成されるＺＮＦ３１２ｂプロモーター及びその断片に作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含む遺伝子コンストラクトを製造する工程；
２）前記工程１）の遺伝子コンストラクトを発現ベクターに導入し、動物細胞に形質転換して形質転換体を製造する工程；
３）前記工程２）の形質転換体を被検組成物または被検化合物で処理した実験群と処理しない対照群を製造する工程；
４）前記工程３）の実験群及び対照群のレポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程；及び
５）前記工程４）の実験群の発現レベルを対照群と比較して有意に増加させる被検組成物または被検化合物を選別する工程、とを含む胃癌誘発物質スクリーニング方法。
【請求項１２】
工程１）の断片が、配列番号１２のオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１１に記載の胃癌誘発物質スクリーニング方法。
【請求項１３】
工程１）のレポーター遺伝子が、ルシフェラーゼ遺伝子であることを特徴とする、請求項１１に記載の胃癌誘発物質スクリーニング方法。
【請求項１４】
１）配列番号９で表わされる塩基配列で構成されるＺＮＦ３１２ｂプロモーター及びその断片に作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含む遺伝子コンストラクトを製造する工程；
２）前記工程１）の遺伝子コンストラクトを発現ベクターに導入し、動物細胞に形質転換して形質転換体を製造する工程；
３）前記工程２）の形質転換体を被検組成物または被検化合物で処理した実験群と処理しない対照群を製造する工程；
４）前記工程３）の実験群及び対照群のレポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程；及び
５）前記工程４）の実験群の発現レベルを対照群と比較して有意に減少させる被検組成物または被検化合物を選別する工程、とを含む胃癌抑制物質スクリーニング方法。
【請求項１５】
工程１）の断片が、配列番号１２のオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１４に記載の胃癌抑制物質スクリーニング方法。
【請求項１６】
工程１）のレポーター遺伝子が、ルシフェラーゼ遺伝子であることを特徴とする、請求項１４に記載の胃癌抑制物質スクリーニング方法。
【請求項１７】
１）配列番号１５で表わされる塩基配列で構成されるＫ−ｒａｓプロモーター及びその断片に作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含む遺伝子コンストラクトを製造する工程；
２）前記工程１）の遺伝子コンストラクトを発現ベクターに導入し、配列番号２で表わされるアミノ酸配列で構成されるＺＮＦ３１２ｂタンパク質またはその断片を発現する動物細胞に形質転換することにより形質転換体を製造する工程；
３）前記工程２）の形質転換体を被検組成物または被検化合物で処理した実験群と処理しない対照群を製造する工程；
４）前記工程３）の実験群及び対照群のレポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程；及び
５）前記工程４）の実験群の発現レベルを対照群と比較して有意に増加させる被検組成物または被検化合物を選別する工程、とを含む胃癌誘発物質スクリーニング方法。
【請求項１８】
工程１）の断片が、配列番号１９で表わされる塩基配列を含むことを特徴とする、請求項１７に記載の胃癌誘発物質スクリーニング方法。
【請求項１９】
１）配列番号１５で表わされる塩基配列で構成されるＫ−ｒａｓプロモーター及びその断片に作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含む遺伝子コンストラクトを製造する工程；
２）前記工程１）の遺伝子コンストラクトを発現ベクターに導入し、配列番号２で表わされるアミノ酸配列で構成されるＺＮＦ３１２ｂタンパク質またはその断片を発現する動物細胞を形質転換することにより形質転換体を製造する工程；
３）前記工程２）の形質転換体を被検組成物または被検化合物で処理した実験群と処理しない対照群を製造する工程；
４）前記工程３）の実験群及び対照群のレポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程；及び
５）前記工程４）の実験群の発現レベルを対照群と比較して有意に減少させる被検組成物または被検化合物を選別する工程、とを含む胃癌抑制物質スクリーニング方法。
【請求項２０】
工程１）の断片が、配列番号１９で表わされる塩基配列を含むことを特徴とする、請求項１９に記載の胃癌抑制物質スクリーニング方法。
【請求項２１】
１）実験群として配列番号１５で表わされる塩基配列で構成されるＫ−ｒａｓプロモーターまたはその断片を含むオリゴヌクレオチドと配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含むＺＮＦ３１２ｂタンパク質またはその断片とを、被検組成物または被検化合物と一緒に処理する工程；
２）工程１）の実験群と処理しない対照群でＫ−ｒａｓプロモーターまたはその断片に対するＺＮＦ３１２ｂタンパク質またはその断片の結合レベルを測定して比較する工程；及び
３）前記実験群の結合レベルを対照群と比較して有意に増加させる被検組成物または被検化合物を選別する工程、とを含む胃癌誘発物質スクリーニング方法。
【請求項２２】
工程１）のＫ−ｒａｓプロモーターの断片が、配列番号１９で表わされる塩基配列を含むことを特徴とする、請求項２１に記載の胃癌誘発物質スクリーニング方法。
【請求項２３】
工程１）のＺＮＦ３１２ｂタンパク質の断片が、配列番号２０のポリペプチドを含むことを特徴とする、請求項２１に記載の胃癌誘発物質スクリーニング方法。
【請求項２４】
１）実験群として配列番号１５で表わされる塩基配列で構成されるＫ−ｒａｓプロモーターまたはその断片を含むオリゴヌクレオチドと配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含むＺＮＦ３１２ｂタンパク質またはその断片とを、被検組成物または被検化合物と一緒に処理する工程；
２）工程１）の実験群と処理しない対照群で、Ｋ−ｒａｓプロモーターまたはその断片に対するＺＮＦ３１２ｂタンパク質またはその断片の結合レベルを測定して比較する工程；及び
３）前記実験群の結合レベルを対照群と比較して有意に減少させる被検組成物または被検化合物を選別する工程、とを含む胃癌抑制物質スクリーニング方法。
【請求項２５】
工程１）のＫ−ｒａｓプロモーターの断片が、配列番号１９で表わされる塩基配列を含むことを特徴とする、請求項２４に記載の胃癌抑制物質スクリーニング方法。
【請求項２６】
工程１）のＺＮＦ３１２ｂタンパク質の断片が、配列番号２０のポリペプチドを含むことを特徴とする、請求項２４に記載の胃癌抑制物質スクリーニング方法。
【請求項２７】
配列番号１で表わされるＺＮＦ３１２ｂ遺伝子またはその断片を含むベクターを、ヒトを除いた動物に形質転換することによって胃癌が誘発される胃癌診断及びスクリーニング用動物。
【請求項２８】
請求項９、請求項１４、請求項１９または請求項２４に記載のいずれか一項の方法でスクリーニングされた胃癌抑制物質を有効成分として含む、胃癌予防及び治療用組成物。
【請求項２９】
前記胃癌抑制物質が、配列番号１のＺＮＦ３１２ｂ遺伝子またはその断片から転写されるｍＲＮＡの全部または一部と相補的な配列を含み、ｍＲＮＡに結合してＺＮＦ３１２ｂ遺伝子またはその断片の発現を阻害するアンチセンス遺伝子であることを特徴とする、請求項２８に記載の胃癌予防及び治療用組成物。
【請求項３０】
前記胃癌抑制物質が、配列番号１のＺＮＦ３１２ｂ遺伝子またはその断片から転写されるｍＲＮＡの全部または一部配列と相補的な配列を含み、ダイサータンパク質に認知されて、ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子またはその断片の発現を阻害することを特徴とするｓｉＲＮＡであることを特徴とする、請求項２８に記載の胃癌予防及び治療用組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２１】
【図１】ヒト胃癌患者から得た総ＲＮＡを使用して、ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子に対するリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行なった結果を示した図である。
【図２】ヒト胃癌患者から得た総ＲＮＡを使用して、ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子に対するリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行なった結果を示した図である。
【図３】ＺＮＦ３１２ｂのｓｉＲＮＡでの前記遺伝子の発現を示した図である。
【図４】前記ｓｉＲＮＡの中でｓｉ−ＺＮＦ３１２ｂ−１配列を使用して作製されたベクターであるｓｈＺＮＦ３１２ｂを導入して樹立された胃癌細胞株であるＳＮＵ６６８−ｓｈＺＮＦ３１２ｂでの前記遺伝子の発現を示した図である。
【図５】ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子の細胞増殖実験結果を示した図で、ＺＮＦ３１２ｂのｓｉ−ＺＮＦ３１２ｂ−１オリゴマーを胃癌細胞株であるＳＮＵ６６８に導入した後の細胞増殖結果を示した図である。
【図６】ＺＮＦ３１２ｂの抑制細胞株であるＳＮＵ６６８−ｓｈＺＮＦ３１２ｂの細胞増殖結果を示した図である。
【図７】ＺＮＦ３１２ｂの過剰発現細胞株であるＳＮＵ６３８−ＺＮＦ３１２ｂ及びＳＮＵ６６８−ＺＮＦ３１２ｂの細胞増殖実験結果を示した図である。実験結果は、有意性検定を通じて結果の信頼性を確認した。＊は、Ｐ値０．０５以下で９５％の信頼度を有するもの、＊＊は、０．０１以下で９９％の信頼性を有するもの、＊＊＊は、０．００１以下は９９．９％で信頼性を有するものである。
【図８】ＺＮＦ３１２ｂの過剰発現細胞株であるＳＮＵ６３８−ＺＮＦ３１２ｂ及びＳＮＵ６６８−ＺＮＦ３１２ｂの細胞増殖実験結果を示した図である。実験結果は、有意性検定を通じて結果の信頼性を確認した。＊は、Ｐ値０．０５以下で９５％の信頼度を有するもの、＊＊は、０．０１以下で９９％の信頼性を有するもの、＊＊＊は、０．００１以下は９９．９％で信頼性を有するものである。
【図９】ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子の細胞周期実験結果を示したもので、ＰＩ染色法を使用してＤＮＡを染色した後、細胞分析機を使用して測定した結果を示した図であり、ＺＮＦ３１２ｂのｓｉ−ＺＮＦ３１２ｂ−１を胃癌細胞株であるＳＮＵ６６８に導入した後の細胞周期結果を示した図で、細胞分析機を通じて分析された細胞周期を示していて、分析された細胞周期は、細胞増殖率（Ｇ２＋Ｍ＋Ｓ期の細胞数／全体細胞数×１００）で計算して図１０のグラフに示した。
【図１０】ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子の細胞周期実験結果を示したもので、ＰＩ染色法を使用してＤＮＡを染色した後、細胞分析機を使用して測定した結果を示した図が図９であり、ＺＮＦ３１２ｂのｓｉ−ＺＮＦ３１２ｂ−１を胃癌細胞株であるＳＮＵ６６８に導入した後の細胞周期結果を示し、細胞分析機を通じて分析された細胞周期を示していて、分析された細胞周期は、細胞増殖率（Ｇ２＋Ｍ＋Ｓ期の細胞数／全体細胞数×１００）で計算してグラフに示した。
【図１１】ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子の細胞周期実験結果を示したもので、ＰＩ染色法を使用してＤＮＡを染色した後、細胞分析機を使用して測定した結果を示した図であり、ＺＮＦ３１２ｂの過剰発現細胞株であるＳＮＵ６３８−ＺＮＦ３１２ｂ及びＳＮＵ６６８−ＺＮＦ３１２ｂの細胞周期実験結果を示した図である。
【図１２】ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子の腫瘍形成能を調べるために実施した実験でコロニー形成実験結果を示した図で、ＺＮＦ３１２ｂの抑制細胞株であるＳＮＵ６６８−ｓｈＺＮＦ３１２ｂのコロニー形成結果を示した図である。
【図１３】ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子の腫瘍形成能を調べるために実施した実験でコロニー形成実験結果を示した図で、ＺＮＦ３１２ｂの抑制細胞株であるＳＮＵ６６８−ｓｈＺＮＦ３１２ｂのコロニー形成結果を示した図である。
【図１４】ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子の腫瘍形成能を調べるために実施した実験でコロニー形成実験結果を示した図で、ＺＮＦ３１２ｂの過剰発現細胞株であるＳＮＵ６３８−ＺＮＦ３１２ｂ及びＳＮＵ６６８−ＺＮＦ３１２ｂのコロニー形成実験結果を示した図である。
【図１５】ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子の腫瘍形成能を調べるために実施した実験でコロニー形成実験結果を示した図で、ＺＮＦ３１２ｂの過剰発現細胞株であるＳＮＵ６３８−ＺＮＦ３１２ｂ及びＳＮＵ６６８−ＺＮＦ３１２ｂのコロニー形成実験結果を示した図である。
【図１６】ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子の過剰発現細胞株であるＳＮＵ６６８−ＺＮＦ３１２ｂをヌードマウスに移植して腫瘍形成能実験を行なった結果を示した図である。
【図１７】ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子の過剰発現細胞株であるＳＮＵ６６８−ＺＮＦ３１２ｂをヌードマウスに移植して腫瘍形成能実験を行なった結果を示した図である。
【図１８】ＺＮＦ３１２ｂの腫瘍関連作用部位を解明するために、ＺＮＦ３１２ｂのドメイン分析と細胞内存在位置を実験した結果を示した図で、ＺＮＦ３１２ｂタンパク質の欠失突然変異を示した模式図である。
【図１９】ＺＮＦ３１２ｂの腫瘍関連作用部位を解明するために、ＺＮＦ３１２ｂのドメイン分析と細胞内存在位置を実験した結果を示した図で、各ＺＮＦ３１２ｂ断片に対する核での移動程度を確認するために核分画を通じて細胞質と核を区分した後、それぞれのタンパク質をウエスタンブロットで確認した図である。
【図２０】ＺＮＦ３１２ｂの腫瘍関連作用部位を解明するために、ＺＮＦ３１２ｂのドメイン分析と細胞内存在位置を実験した結果を示した図で、核分画を通じて得たＺＮＦ３１２ｂの位置を確認するために免疫染色法を通じて、ＺＮＦ３１２ｂの細胞内存在位置を示した図である。
【図２１】全長ＺＮＦ３１２ｂとカルボキシ基末端を含有した断片ＺＮＦ３１２ｂの過剰発現によって、細胞増殖と腫瘍形成能が活性化になることを示した図であり、対照群（ｐＨＡ）、全長ＺＮＦ３１２ｂ（ＦＬ）、アミノ末端部分を含有した断片ＺＮＦ３１２ｂ（Ｎ１）、及びカルボキシ末端を含有した断片ＺＮＦ３１２ｂ（Ｃ１）を細胞内に形質導入して一時的に過剰発現させた後、細胞増殖をＣＣＫ−８試薬を使用して測定した結果を示した図である。
【図２２】全長ＺＮＦ３１２ｂとカルボキシ基末端を含有した断片ＺＮＦ３１２ｂの過剰発現によって、細胞増殖と腫瘍形成能が活性化になることを示した図であり、前記ＤＮＡを使用して細胞内にこれらを恒常的に発現する細胞株を作った後、図２１と同じ実験を行なって得た結果を示した図である。
【図２３】全長ＺＮＦ３１２ｂとカルボキシ基末端を含有した断片ＺＮＦ３１２ｂの過剰発現によって、細胞増殖と腫瘍形成能が活性化になることを示した図であり、実施例＜１０−２＞で樹立した細胞株を使用して実施した実験でコロニー形成実験結果を示したもので、ｓｏｆｔ−ａｇａｒを使用してコロニー形成効率を測定した実験の結果を示した図である。
【図２４】ＺＮＦ３１２ｂの腫瘍形成能の作用メカニズムを確認するための実験として、ＺＮＦ３１２ｂはＫ−ｒａｓの転写活性を調節し、ＲＡＳ−ＥＲＫ−ｐａｔｈｗａｙを活性化して細胞増殖を誘導することを示した図であり、ＺＮＦ３１２ｂのｓｉＲＮＡを使用して細胞内のＺＮＦ３１２ｂの発現量を減少させた後、ＲＡＳタンパク質量とＲＡＳ−ＥＲＫ経路の活性化程度をウエスタンブロットで確認した図である。
【図２５】ＺＮＦ３１２ｂの腫瘍形成能の作用メカニズムを確認するための実験として、ＺＮＦ３１２ｂはＫ−ｒａｓの転写活性を調節し、ＲＡＳ−ＥＲＫ−ｐａｔｈｗａｙを活性化して細胞増殖を誘導することを示した図であり、ＲＡＳタンパク質の量とＥＲＫ経路活性化が一時的に増加されたＺＮＦ３１２ｂによって増加するのか、また、Ｃ−末端部位含有断片ＺＮＦ３１２ｂによっても同じ結果を得ることができるかどうかを確認した図である。
【図２６】多様なＺＮＦ３１２ｂプロモーター部位を導入したｐＧＬ３ｂ−ＺＮＦ３１２ｂベクターマップを示した図である。
【図２７】それぞれのｐＧＬ３ｂ−ＺＮＦ３１２ｂベクターを胃癌細胞株に形質導入させた後、ルシフェラーゼレポーター活性を測定した結果を示した図である。
【図２８】ＺＮＦ３１２ｂプロモーター中、＋１ｂｐ〜−８５０ｂｐ部位を導入したｐＧＬ４．１４−ＺＮＦ３１２ｂ−０．８５ベクターマップを示した図である。
【図２９】ｐＧＬ４．１４−ＺＮＦ３１２ｂ−０．８５ベクターを胃癌細胞株に形質導入させた後、ルシフェラーゼレポーター活性を測定した結果を示した図である。
【図３０】Ｋ−ｒａｓプロモーターを含む多様なレポーターベクターを示した図である。
【図３１】ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子及び前記遺伝子の中でカルボキシ末端を含む断片ＺＮＦ３１２ｂの発現によって、Ｋ−ｒａｓレポーターの活性化有無を確認した図である。
【図３２】ＺＮＦ３１２ｂ遺伝子及び前記遺伝子の中でカルボキシ末端を含む断片ＺＮＦ３１２ｂによって活性化するＫ−ｒａｓプロモーター部分を同定するための実験を行なった結果を示した図である。
【図３３】Ｋ−ｒａｓプロモーターのＺＮＦ結合予想部位とＺＮＦ３１２ｂタンパク質を直接結合させて、Ｋ−ｒａｓプロモーター中の−６５０ｂｐ〜−５００ｂｐ部位に存在するＺＮＦ結合予想部位である５７ｂｐに、ＺＮＦ３１２ｂの結合有無を確認した結果を示した図である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４０】
＜実施例１０＞ＺＮＦ３１２ｂ断片過剰発現ベクター製造及びその胃癌細胞株樹立
＜１０−１＞ＺＮＦ３１２ｂ断片過剰発現ベクターの製造
本発明者らは、ｐｃＤＮＡ−ＺＮＦ３１２ｂベクターを鋳型にして、図１８のような断片をＰＣＲ方法で増幅した後、ｐｃＤＮＡベクターにクローニングした。まず、ｐｃＤＮＡ−ＺＮＦ３１２ｂを鋳型にして、ＫｐｎＩとＢａｍＨＩ制限酵素認識部位を含有したＺＮＦ３１２ｂプライマーを使用してＰＣＲを行なった。生成された各ＰＣＲ産物を精製した後、ＫｐｎＩとＢａｍＨＩ制限酵素で切断後、ｐｃＤＮＡベクターに挿入してｐｃＤＮＡ−ＺＮＦ３１２ｂＮ１（Ｎ１で表記）、ｐｃＤＮＡ−ＺＮＦ３１２ｂＮ２（Ｎ２）、ｐｃＤＮＡ−ＺＮＦ３１２ｂＣ１（Ｃ１）及びｐｃＤＮＡ−ＺＮＦ３１２ｂＣ２（Ｃ２）発現ベクターを製造した（図１８）。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４７】
＜１２−２＞ＺＮＦ３１２ｂ断片過剰発現胃癌細胞株のコロニー形成実験
本発明者らは、全長ＺＮＦ３１２ｂ及びカルボキシ末端含有ＺＮＦ３１２ｂ断片を恒常的に過剰発現する胃癌細胞株ＳＮＵ６３８−ＦＬ、ＳＮＵ６３８−Ｎ１及びＳＮＵ６３８−Ｃ１を使用して、前記＜実施例８＞と同じ方法でコロニー形成実験を行なった。その結果、図２３にみられるように全長ＺＮＦ３１２ｂ及びカルボキシ末端含有ＺＮＦ３１２断片を過剰発現させた時、コロニー形成が増加した。したがって、ＺＮＦ３１２ｂの胃癌腫瘍形成能は、ＺＮＦ３１２ｂタンパク質のカルボキシ末端部分に存在することが分かった（図２３）。
【国際調査報告】
2010523107.tif 000073
2010523107.tif 000074
2010523107.tif 000075
2010523107.tif 000076