(57)【要約】  本発明は、アミロイドベータペプチド(Aベータ)に対する抗体、抗体分子、抗体の混合物および／または抗体分子の混合物の安定な非経口医薬製剤、ならびに製造方法に関する。さらに、対応する使用が記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
約1〜約250mg/mL Aベータ抗体、
約0.001〜約1%の少なくとも1つの界面活性剤、
約1〜約100mMのバッファ、
任意に約10〜約500mMの安定剤および/または約5〜約500mMの等張化剤を、
約4.0〜約7.0のpHで含む、安定な非経口Aベータ抗体医薬製剤。
【請求項２】
液体製剤である、請求項１記載の製剤。
【請求項３】
凍結乾燥製剤である、請求項１記載の製剤。
【請求項４】
凍結乾燥製剤から還元される液体製剤である、請求項１記載の製剤。
【請求項５】
Aベータ抗体濃度が約1〜約200mg/mLである、請求項１〜４いずれかに記載の製剤。
【請求項６】
Aベータ抗体濃度が約50mg/mL〜約200mg/mLである、請求項５記載の製剤。
【請求項７】
Aベータ抗体濃度が約150mg/mL〜約200mg/mLである、請求項６記載の製剤。
【請求項８】
安定剤が製剤中に約10〜約300mMの量で存在する、請求項１〜７いずれかに記載の製剤。
【請求項９】
安定剤が製剤中に約100〜約300mMの量で存在する、請求項１〜７いずれかに記載の製剤。
【請求項１０】
安定剤が、糖、アミノ酸、ポリオール、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤、シクロデキストリン、特にヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン、スルホブチルエチル-β-シクロデキストリンおよびβ-シクロデキストリン、ポリエチレングリコール、特にPEG3000、PEG3350、PEG4000およびPEG6000、アルブミン、ヒト血清アルブミン(HSA)、ウシ血清アルブミン(BSA)、塩、特に塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、ならびにキレート剤、特にEDTAからなる群より選択される、請求項１〜９いずれかに記載の製剤。
【請求項１１】
安定剤が凍結乾燥保護剤である、請求項１〜１０いずれかに記載の製剤。
【請求項１２】
凍結乾燥保護剤が、糖、アミノ酸、ポリオールおよび糖アルコールからなる群より選択される、請求項１１記載の製剤。
【請求項１３】
凍結乾燥保護剤が、トレハロース、スクロース、マンニトール、ラクトース、グルコース、マンノース、マルトース、ガラクトース、フルクトース、ソルボース、ラフィノース、グルコサミン、N-メチルグルコサミン(「メグルミン」)、ガラクトサミン、ノイラミン酸およびアルギニンからなる群より選択される、請求項１２記載の製剤。
【請求項１４】
界面活性剤が製剤中に約0.005〜約0.1%w/vの量で存在する、請求項１〜１３いずれかに記載の製剤。
【請求項１５】
界面活性剤が製剤中に約0.01%〜約0.04%w/vの量で存在する、請求項１４記載の製剤。
【請求項１６】
界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、アルキルフェニルポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレンコポリマーおよびドデシル硫酸ナトリウムからなる群より選択される、請求項１〜１５いずれかに記載の製剤。
【請求項１７】
界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートおよびポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポロキサマー124、ポロキサマー188、ポロキサマー237、ポロキサマー338およびポロキサマー407、ポリオキシエチレン(23)ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン(20)セチルエーテル、ポリオキシエチレン(10)オレイルエーテルおよびポリオキシエチレン(20)オレイルエーテル、ならびにオクチルフェノールエトキシレート(7.5)、オクチルフェノールエトキシレート(9.5)、およびオクチルフェノールエトキシレート(102)の群より選択される、請求項１６記載の製剤。
【請求項１８】
界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートおよびポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートを含む群より選択される、請求項１７記載の製剤。
【請求項１９】
バッファが製剤中に約1mM〜約100mMの量で存在する、請求項１〜１８いずれかに記載の製剤。
【請求項２０】
バッファが製剤中に約5mM〜約50mMの量で存在する、請求項１５記載の製剤。
【請求項２１】
バッファが製剤中に約10〜約20mMの量で存在する、請求項２０記載の製剤。
【請求項２２】
バッファが、ヒスチジンバッファ、クエン酸バッファ、コハク酸バッファ、酢酸バッファおよびリン酸バッファからなる群より選択される、請求項１〜２１いずれかに記載の製剤。
【請求項２３】
バッファが、L-ヒスチジン、またはL-ヒスチジンと塩酸L-ヒスチジンの混合物を含む、請求項２２記載の製剤。
【請求項２４】
pHが約4.0〜約7.0である、請求項１〜２３いずれかに記載の製剤。
【請求項２５】
pHが約5.0〜約6.0である、請求項２４記載の製剤。
【請求項２６】
pHが約5.5である、請求項２５記載の製剤。
【請求項２７】
１つ以上の等張化剤を含む、請求項１〜２６いずれかに記載の製剤。
【請求項２８】
等張化剤が製剤中に約5mM〜約500mMの量で存在する、請求項１〜２７いずれかに記載の製剤。
【請求項２９】
等張化剤が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、アミノ酸、糖、およびその組み合わせからなる群より選択される、請求項１〜２８いずれかに記載の製剤。
【請求項３０】
静脈(i.v.)または皮下(s.c.)または任意の他の非経口投与によって投与され得る、請求項１〜２９いずれかに記載の製剤。
【請求項３１】
約1〜約200mg/mL Aベータ抗体、
0.04% Tween 20 w/v、
20mM L-ヒスチジン、
250mM スクロースを、
pH 5.5で
または
37.5mg/mL Aベータ抗体、
0.02% Tween 20 w/v、
10mM L-ヒスチジン、
125mM スクロースを、
pH 5.5で
または
37.5mg/mL Aベータ抗体、
0.01% Tween 20 w/v、
10mM L-ヒスチジン、
125mM スクロースを、
pH 5.5で
または
7.5mg/mL Aベータ抗体、
0.04% Tween 20 w/v、
20mM L-ヒスチジン、
250mM スクロースを、
pH 5.5で
または
7.5mg/mL Aベータ抗体、
0.02% Tween 20 w/v、
10mM L-ヒスチジン、
125mM スクロースを、
pH 5.5で
または
37.5mg/mL Aベータ抗体、
0.02% Tween 20 w/v、
10mM L-ヒスチジン、
125mM トレハロースを、
pH 5.5で
または
37.5mg/mL Aベータ抗体、
0.01% Tween 20 w/v、
10mM L-ヒスチジン、
125mM トレハロースを、
pH 5.5で
または
75mg/mL Aベータ抗体、
0.02% Tween 20 w/v、
20mM L-ヒスチジン、
250mM トレハロースを、
pH 5.5で
または
75mg/mL Aベータ抗体、
0.02% Tween 20 w/v、
20mM L-ヒスチジン、
250mM マンニト−ルを、
pH 5.5で
または
75mg/mL Aベータ抗体、
0.02% Tween 20 w/v、
20mM L-ヒスチジン、
140mM 塩化ナトリウムを、
pH 5.5で
または
150mg/mL Aベータ抗体、
0.02% Tween 20 w/v、
20mM L-ヒスチジン、
250mM トレハロースを、
pH 5.5で
または
150mg/mL Aベータ抗体、
0.02% Tween 20 w/v、
20mM L-ヒスチジン、
250mM マンニトールを、
pH 5.5で
または
150mg/mL Aベータ抗体、
0.02% Tween 20 w/v、
20mM L-ヒスチジン、
140mM 塩化ナトリウムを、
pH 5.5で
または
10mg/mL Aベータ抗体、
0.01% Tween 20 w/v、
20mM L-ヒスチジン、
140mM 塩化ナトリウムを、
pH 5.5で
含む、請求項２記載の液体製剤。
【請求項３２】
約1〜約200mg/mL Aベータ抗体、
0.04% Tween 20 w/v、
20mM L-ヒスチジン、
250mM スクロースを、
pH 5.5で
または
75mg/mL Aベータ抗体、
0.04% Tween 20 w/v、
20mM L-ヒスチジン、
250mM スクロースを、
pH 5.5で
または
75mg/mL Aベータ抗体、
0.02% Tween 20 w/v、
20mM L-ヒスチジン、
250mM スクロースを、
pH 5.5で
または
15mg/mL Aベータ抗体、
0.04% Tween 20 w/v、
20mM L-ヒスチジン、
250mM スクロースを、
pH 5.5で
または
75mg/mL Aベータ抗体、
0.04% Tween 20 w/v、
20mM L-ヒスチジン、
250mM トレハロースを、
pH 5.5で
または
75mg/mL Aベータ抗体、
0.02% Tween 20 w/v、
20mM L-ヒスチジン、
250mM トレハロースを、
pH 5.5で
または
20mg/mL Aベータ抗体、
0.011% Tween 20 w/v、
5.3mM L-ヒスチジン、
66.7mM スクロースを、
pH 5.5で
含む、請求項３記載の凍結乾燥製剤。
【請求項３３】
10mg/mL Aベータ抗体、
0.01% Tween 20 w/v、
20mM L-ヒスチジン、
140mM 塩化ナトリウムを、
pH 5.5で
含む、請求項２または３１記載の液体製剤。
【請求項３４】
75mg/mL Aベータ抗体、
0.04% Tween 20 w/v、
20mM L-ヒスチジン、
250mM スクロースを、
pH 5.5で
含む、請求項３または３２記載の凍結乾燥製剤。
【請求項３５】
20mg/mL Aベータ抗体、
0.011% Tween 20 w/v、
5.3mM L-ヒスチジン、
66.7mM スクロースを、
pH 5.5で
含む、請求項３または３２記載の凍結乾燥製剤。
【請求項３６】
Aベータ抗体が、重鎖(VH)の可変領域中にグリコシル化アスパラギン(Asn)を含む少なくとも１つの抗原結合部位を含む、請求項１〜３５いずれかに記載の製剤。
【請求項３７】
Aベータ抗体が、
(a)抗原結合部位の1つが重鎖(VH)の可変領域中にグリコシル化アスパラギン(Asn)を含む、Aベータ抗体、および
(b)抗原結合部位の両方が重鎖(VH)の可変領域中にグリコシル化アスパラギン(Asn)を含む、Aベータ抗体
の定義される混合物であり、
抗原結合部位のいずれもが重鎖(VH)の可変領域中にグリコシル化アスパラギン(Asn)を含まないAベータ抗体を、含まないまたは非常に低い程度で含む、請求項１〜３６いずれかに記載の製剤。
【請求項３８】
重鎖(VH)の可変領域中のグリコシル化アスパラギン(Asn)が重鎖(VH)のCDR2領域中のグリコシル化アスパラギン(Asn)である、請求項３６または３７記載の製剤。
【請求項３９】
Aベータ抗体が、配列番号：1に定義される重鎖および配列番号：2に定義される軽鎖を含む、請求項１〜３８いずれかに記載の製剤。
【請求項４０】
アルツハイマー病の治療に有用な医薬の製造のための請求項１〜３９いずれかに記載の製剤の使用。
【請求項４１】
明細書に記載される発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミロイドベータペプチド(Aベータ)に対する抗体、抗体分子、抗体の混合物および／または抗体分子の混合物の安定な非経口医薬製剤、ならびにその製造方法に関する。さらに、対応する使用が記載される。
【０００２】
第一局面において、本発明は、
約1〜約250mg/mL Aベータ抗体、
約0.001〜約1%の少なくとも１つの界面活性剤、
約1〜約100mMのバッファ、
任意に約10〜約500mMの安定剤および/または約5〜約500mMの等張化剤（tonicity agent）を、
約4.0〜約7.0のpHで
含む、安定な医薬非経口Aベータ抗体医薬製剤に関する。
【０００３】
特に、本発明は、含まれるAベータ抗体(またはその混合物)が、アミロイドベータペプチドに特異的に結合することができるAベータ抗体製剤に関する。Aベータに特異的に結合する抗体は、当該技術分野で公知である。本発明による製剤に使用され得るAベータ抗体の具体例が、公開PCT特許出願WO 03/070760、特に請求の範囲に記載されており、その内容は参照によって本明細書に援用される。
【０００４】
アミロイドベータペプチドは、「アミロイドβ」、「Aβ」、「Aβ4」、または「β-A4」、特に本発明の状況で「Aベータ」とも呼ばれるが、アルツハイマー病のようなアミロイド形成性疾患と関連する細胞外神経炎性局面の主要成分である：Selkoe (1994), Ann. Rev. Cell Biol. 10, 373-403, Koo (1999), PNAS Vol. 96, pp. 9989-9990, 米国特許第4,666,829号またはGlenner(1984), BBRC 12, 1131を参照。このアミロイドβは、「アルツハイマー前駆タンパク質／β-アミロイド前駆タンパク質」(APP)に由来する。APPは、統合された膜糖タンパク質であり(Sisodia(1992), PNAS Vol. 89, pp. 6075参照)、細胞膜プロテアーゼα-セクレターゼによってAベータ配列内でエンドプロテアーゼ分解切断される(Sisodia(1992)、一部引用、参照)。さらに、さらなるセクレターゼ活性、特にβ-セクレターゼおよびγ-セクレターゼ活性によって39アミノ酸(Aβ39)、40アミノ酸(Aβ40)、42アミノ酸(Aβ42)または43アミノ酸(Aβ43)のいずれかを含むアミロイド-β(Aβ)の細胞外放出がもたらされる; Sinha(1999), PNAS 96, 11094-1053; Price (1998), Science 282, 1078〜1083; WO 00/72880またはHardy(1997), TINS 20, 154を参照。
【０００５】
Aβはいくつかの天然形態を有し、ヒト形態は上記Aβ39、Aβ40、Aβ41、Aβ42およびAβ43と呼ばれる。最も顕著な形態Aβ42は、アミノ酸配列(N-末端から開始): DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(配列番号3)を有する。Aβ41、Aβ40、Aβ39では、C末端アミノ酸A、IAおよびVIAが、それぞれ欠失している。Aβ43形態では、さらなるトレオニン残基が上記配列(配列番号3)のC末端に含まれる。
【０００６】
タンパク質医薬の群の一部として、抗体分子は、変性および凝集、脱アミド化、酸化および加水分解のような物理的および化学的分解を非常に受けやすい。タンパク質安定性は、タンパク質自体の特徴、例えばアミノ酸配列、および外部影響、例えば温度、溶媒pH、賦形剤、相互作用の手段、または分解速度によって影響を受ける。そこで、製造、保存および投与中の分解反応に対してタンパク質を保護するための最適製剤化条件を定義することが重要である。(Manning, M. C., K. Patel, et al. (1989). "Stability of protein pharmaceuticals." Pharm Res 6(11): 903-18., Zheng, J. Y. and L. J. Janis (2005). "Influence of pH, buffer species, and storage temperature on physicochemical stability of a humanized monoclonal antibody LA298." IntJ Pharm.)
【０００７】
皮下または筋肉内経路による抗体の投与には、高用量をしばしば必要とするためおよび投与容量が制限されるために最終製剤中の高いタンパク質濃度を要する。(Shire, S. J., Z. Shahrokh, et al. (2004). "Challenges in the development of high protein concentration formulations." J Pharm Sci 93(6): 1390-402., Roskos, L. K., C. G. Davis, et al. (2004). "The clinical pharmacology of therapeutic monoclonal antibodies." Drug Development Research 61(3): 108-120.)  高濃度タンパク質の大規模製造は、限外濾過プロセス、乾燥プロセス、例えば、凍結乾燥または噴霧乾燥、および沈殿プロセスによって達成され得る。(Shire, S. J., Z. Shahrokh, et al. (2004). "Challenges in the development of high protein concentration formulations." J Pharm Sci 93(6): 1390-402.)
【０００８】
Andyaら(米国特許第6,267,958号、米国特許第6,85,940号)は、抗体の安定な凍結乾燥製剤を記載しており、該製剤は必要な濃度を達成するための適切な希釈容量で還元される。製剤は、凍結乾燥保護剤、バッファおよび界面活性剤を含む。
【０００９】
Liuら(Liu, J., M. D. Nguyen, et al. (2005). "Reversible self-association increases the viscosity of a concentrated monoclonal antibody in aqueous solution." J Pharm Sci 94(9): 1928-40.)は、高濃度の抗体製剤の粘度挙動を調べた。同じIgG1フレームワークから構築された3つのモノクローナル抗体が、高いタンパク質濃度での自己会合について調べられた。3つの抗体は一定した粘度プロフィールを示さず、自己会合挙動の有意さを示した。
【００１０】
本発明の1つの目的は、Aベータ抗体または該抗体の混合物の製剤を提供することであり、該抗体は適切な容量を用いた凍結乾燥製剤の還元(reconstitution)または限外濾過プロセスによる溶媒の除去によって必要な濃度に濃縮される。製剤は、製造、保存および投与中に十分な安定性を示す。Liuらが示したように、抗体は、予期し得ない粘度-濃度プロフィールを示す。(Liu, J., M. D. Nguyen, et al. (2005). "Reversible self-association increases the viscosity of a concentrated monoclonal antibody in aqueous solution." J Pharm Sci 94(9): 1928-40.)  米国特許第6,267,958号および第6,685,940号と比較して、提示された製剤は、保存中に同等もしくは良好なAベータヒト抗体の安定性を提供し、皮下または筋肉内投与経路に適切な粘度を有する。
【００１１】
本発明に有用なAベータ抗体の例は、免疫グロブリン分子、例えば、IgG分子である。IgGは、2つの重鎖および2つの軽鎖を含むことを特徴とし(例えば、図1に例示される)、これらの分子は2つの抗原結合部位を含む。該抗原結合部位は、重鎖(VH)の一部および軽鎖(VL)の一部からなる「可変領域」を含む。抗原結合部位は、VH領域およびVL領域の並置によって形成される。抗体分子または免疫グロブリン分子についての一般的な情報について、一般的な教科書、例えば Abbas “Cellular and Molecular Immunology”, W.B. Sounders Company (2003)も参照。
【００１２】
一態様において、本発明の非経口製剤は、Aベータ抗体の重鎖中の可変領域の少なくとも1つにN−グリコシル化を含むAベータ抗体(またはかかる抗体の混合物)を含む。重鎖(VH)の可変領域中のグリコシル化アスパラギン(Asn)は相補性決定領域2(CDR2領域)中に存在し得、該グリコシル化アスパラギン(Asn)は配列番号１に示される重鎖(VH)の可変領域中の52位に存在し得る。
【００１３】
用語「モノグリコシル化抗体」は、個々の抗体分子の１つの(VH)領域中にN-グリコシル化を含む抗体分子に関するものである；図1も参照。用語「二重グリコシル化抗体」は、重鎖の両方の可変領域上でN-グリコシル化された抗体分子を定義する(図1)。両方の重鎖(VH)領域上でN-グリコシル化を欠く抗体分子は、「非グリコシル化抗体」と称される(図1)。モノグリコシル化抗体、二重グリコシル化抗体および非グリコシル化抗体は、同じアミノ酸配列または異なるアミノ酸配列を含み得る。
【００１４】
モノグリコシル化抗体および二重グリコシル化抗体は、本明細書で、「グリコシル化抗体アイソフォーム」と呼ばれる。少なくとも1つの抗原結合部位が重鎖(VH)の可変領域中にグリコシル化を含むことを特徴とする精製抗体分子は、二重グリコシル化抗体および非グリコシル化抗体から選択されるアイソフォームを含まないまたは非常に低い程度で該アイソフォームと関連するモノグリコシル化抗体、即ち、「精製モノグリコシル化抗体」である。本発明の状況において、二重グリコシル化抗体は、モノグリコシル化抗体および非グリコシル化抗体から選択されるアイソフォームを含まないまたは非常に低い程度で該アイソフォームと関連し、即ち、「精製二重グリコシル化抗体」である。
【００１５】
本発明による製剤は、モノグリコシル化抗体もしくは二重グリコシル化抗体もしくは非グリコシル化抗体、または具体的に定義されたそれらの混合物を含み得る。本明細書に提供される抗体混合物または抗体プールは、本明細書に定義されるように、50％モノグリコシル化抗体および50％二重グリコシル化抗体を含み得る。しかし、30/70〜70/30の比率も考えられる。さらに、当業者は、他の比率も本発明の抗体混合物で考えられることを知っている。例えば、10/90または90/10、20/80または80/20および40/60または60/40も本発明の状況で使用され得る。本発明の製剤に含まれ、本明細書で上述に定義する二重グリコシル化抗体およびモノグリコシル化抗体を含む抗体混合物における特に有用な比率は、40/60〜45/55の比率である。
【００１６】
用語「含まないまたは非常に低い程度で」は、他の(グリコシル化)アイソフォームそれぞれが完全に存在しないこと、または最大10%、例えば最大5%、例えば最大4%、例えば最大3%、例えば最大2%、例えば最大1%、例えば最大0.5%、例えば最大0.3%、例えば最大0.2%の濃度で別の(グリコシル化)アイソフォームが存在することを示す。
【００１７】
用語「（1つまたは複数の）抗体」は、本明細書で、用語「（1つまたは複数の）抗体分子」と同義的に使用され、本発明の状況で、完全免疫グロブリン分子、例えば、IgM、IgD、IgE、IgAもしくはIgG、例えばIgG1、IgG2、IgG2b、IgG3もしくはIgG4およびかかる免疫グロブリン分子の一部、例えばFab断片、Fab’断片、F(ab)2断片、キメラF(ab)2断片もしくはキメラFab’断片、キメラFab断片または単離VH領域もしくはCDR領域(前記単離VH領域もしくはCDR領域は、例えば対応する「（1つまたは複数の）フレームワーク」に統合され、または対応する「（1つまたは複数の）フレームワーク」に設計される)などの、（１つまたは複数の）抗体分子を含む。従って、用語「抗体」は、免疫グロブリンの公知のアイソフォームおよび改変物、例えば、単鎖抗体または単鎖Fv断片(scAB/scFv)または二特異的抗体構築物も含み、該アイソフォームおよび改変物は、本明細書で定義される少なくとも1つのグリコシル化VH領域を含むことを特徴とする。かかるアイソフォームまたは改変物の具体例は、VH-VLまたはVL-VH形式のsc(単鎖)抗体であり得、該VHは、本明細書に記載されるグリコシル化を含む。VH-VL-VH-VL、VL-VH-VH-VL、VH-VL-VL-VH形式などの二特異的scFvも考えられる。用語「抗体」には、ダイアボディ(diabody)、および少なくとも１つの抗原結合部分/ペプチドに結合するビヒクルとしての抗体Fc領域を含む分子、例えばWO 00/24782に記載されるペプチボディ(peptibody)も含まれる。上記より、本発明は抗体／抗体分子の「混合物」を含むAベータ抗体の非経口製剤にも関することが明らかである。該抗体の特定の「混合物」は、上記され、即ちAベータに対して指向された「モノ」および「二重」グリコシル化抗体の混合物である。
【００１８】
「抗体断片」は、本質的に、エフェクター機能(ADCC/CDC)を提供し得ないが、（1つまたは複数の）適切な抗体定常領域と合わされた後で本発明による方法でこの機能も提供するような断片も含む。
【００１９】
（1つまたは複数の）本発明の製剤に含まれ得る（1つまたは複数の）Aベータ抗体は、とりわけ、（1つまたは複数の）組み換え生成Aベータ抗体である。これらは哺乳動物細胞培養系、例えばCHO細胞で生成され得る。かかる哺乳動物細胞培養系は、可変領域中にN-グリコシル化を含む本明細書で具体的に例示されるAベータ抗体のようにグリコシル化されるAベータ抗体またはAベータ抗体／抗体分子の調製に特に有用である。抗体分子は、例えば、以下の本明細書に記載される特定のグリコシル化抗体アイソフォームを精製するために、クロマトグラフィー工程および濾過工程の順によってさらに精製され得る。
【００２０】
用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、本明細書で使用される場合、単一のアミノ酸組成の抗体分子の調製物のことをいう。従って、用語「ヒトモノクローナル抗体」とは、ヒト生殖系免疫グロブリン配列由来の可変領域および定常領域を有する単一の結合特異性を示す抗体のことをいう。一態様において、ヒトモノクローナル抗体は、ヒト重鎖トランス遺伝子およびヒト軽鎖トランス遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えば、トランスジェニックマウスから得られたB細胞が不死化細胞に融合されるような、ハイブリドーマによって産生される。
【００２１】
用語「キメラ抗体」とは、1つの供給源または種由来の可変領域、即ち、結合領域、および異なる供給源または種由来の定常領域の少なくとも一部を含むモノクローナル抗体のことをいい、通常組み換えDNA技術によって調製される。マウス可変領域およびヒト定常領域を含むキメラ抗体が、特に好ましい。かかるマウス／ヒトキメラ抗体は、マウス免疫グロブリン可変領域をコードするDNAセグメントおよびヒト免疫グロブリン定常領域をコードするDNAセグメントを含む免疫グロブリン遺伝子の発現産物である。本発明に含まれる他の形態の「キメラ抗体」は、クラスまたはサブクラスがもともとの抗体のクラスまたはサブクラスから改変または変更されたものである。かかる「キメラ」抗体は、「クラススイッチ抗体」とも呼ばれる。キメラ抗体の製造方法は、現在当該技術分野で周知の従来の組み換えDNA技術および遺伝子トランスフェクション技術を伴う。例えば、Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; 米国特許第5,202,238号および第5,204,244号を参照。
【００２２】
用語「ヒト化抗体」とは、フレームワークまたは「相補性決定領域」(CDR)が親の免疫グロブリンのものと比較して異なる特異性を有する免疫グロブリンのCDRを含むように改変された抗体のことをいう。好ましい態様において、マウスCDRがヒト抗体のフレームワーク領域に融合され、「ヒト化抗体」が調製される。例えば、Riechmann, L., et al., Nature 332(1988)323-327; およびNeuberger, M.S., et al., Nature 314(1985)268-270を参照。特に好ましいCDRは、キメラ抗体および二官能性抗体について上記した抗原を認識する提示配列に対応する。
【００２３】
用語「ヒト抗体」は、本明細書で使用される場合、ヒト生殖系免疫グロブリン配列由来の可変領域および定常領域を有する抗体を含むことを意図する。可変重鎖は、好ましくは生殖系配列DP-50(GenBank LO6618)に由来し、可変軽鎖は、好ましくは生殖系配列L6(GenBank X01668)に由来する。抗体の定常領域は、ヒトIgG1型の定常領域である。かかる領域は、アロタイプであり得、例えば、Johnson, G., and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28(2000)214-218およびそこに引用されるデータベースに記載されており、本発明によるADCCおよび好ましくはCDCの誘導の特性が保持される限り有用である。
【００２４】
用語「組み換えヒト抗体」は、本明細書で使用される場合、組み換え手段によって調製、発現、作製または単離される全てのヒト抗体、例えばSP2-0、NS0もしくはCHO細胞(CHO K1等)などの宿主細胞またはヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物(例えば、マウス)から単離された抗体、あるいは宿主細胞にトランスフェクトされる組み換え発現ベクターを用いて発現される抗体を含むことを意図する。かかる組み換えヒト抗体は、再配列形式のヒト生殖系免疫グロブリン配列由来の可変領域および定常領域を有する。本発明による組み換えヒト抗体は、インビボ体性過剰変異に供される。従って、組み換え抗体のVH領域およびVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系VH配列およびVL配列に由来し、かつ関連するが、インビボでヒト抗体生殖系レパートリー内に天然には存在し得ない配列である。
【００２５】
本明細書で使用されるように、「結合」とは、約10-13〜10-8M(KD)、好ましくは約10-13〜10-9Mの親和性で、Aベータに対する抗体が結合することをいう。
【００２６】
「定常領域」は、抗体の抗原に対する結合に直接関与しないが、エフェクター機能(ADCC、補体結合、およびCDC)に関与する。本発明による抗体の定常領域はIgG1型である。これらの特徴を有するヒト定常領域は、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)、およびBrueggemann, M., et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361; Love, T.W., et al., Methods Enzymol. 178 (1989) 515-527に詳細に記載されている。例は、WO 2005/005635の配列番号5〜8に示される。他の有用で好ましい定常領域は、DSMZまたはATCCなどの寄託機関に寄託されたハイブリドーマ細胞株から得ることができる抗体の定常領域である。定常領域は、補体結合を提供し得る。ADCCおよび任意にCDCは、可変領域および定常領域の組み合わせによって提供される。
【００２７】
「可変領域」(軽鎖(VL)の可変領域、重鎖(VH)の可変領域)は、本明細書で使用される場合、抗体の抗原への結合に直接関与する軽鎖および重鎖の対のそれぞれを示す。ヒトの軽鎖および重鎖の可変領域は、同じ一般的構造を有し、それぞれの領域は、配列が広く保存され、3つの「超可変領域」（または相補性決定領域、CDR）によって結合される4つのフレームワーク(FR)領域を含む。フレームワーク領域はβ-シート構造を取り、CDRはβ-シート構造を連結するループを形成し得る。各鎖のCDRは、フレームワーク領域によって3次元構造に保たれ、他の鎖由来のCDRと共に抗原結合部位を形成する。抗体重鎖および軽鎖CDR3領域は、本発明による抗体の結合特異性／親和性において特に重要な役割を果たし、従って、本発明のさらなる目的を提供する。
【００２８】
用語「超可変領域」または「抗体の抗原結合部分」とは、本明細書で使用される場合、抗原結合に重要である、抗体のアミノ酸残基のことをいう。超可変領域は、「相補性決定領域」または「CDR」のアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」または「FR」領域は、本明細書に定義される超可変領域残基以外の可変領域である。従って、抗体の軽鎖および重鎖は、N-末端からC-末端に、領域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、およびFR4を含む。特に、重鎖のCDR3は、抗原結合に最も寄与する領域である。CDR領域およびFR領域は、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))の標準定義および／または「超可変ループ」の残基により決定される。
【００２９】
本発明の製剤は、とりわけ、「安定剤」、「凍結乾燥保護剤(lyoprotectant)」、「糖」、「アミノ酸」、「ポリオール」、「抗酸化剤」、「保存剤」、「界面活性剤」、「バッファ」および／または「等張化剤」を含み得る。
【００３０】
用語「安定剤」は、製造、保存および使用中の化学的および／または物理的分解から活性医薬成分および／または製剤を保護する薬学的に許容され得る賦形剤を示す。タンパク質医薬の化学的および物理的分解経路は、Cleland, J. L., M. F. Powell, et al. (1993). "The development of stable protein formulations: a close look at protein aggregation, deamidation, and oxidation." Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 10(4): 307-77、Wang, W. (1999). "Instability, stabilization, and formulation of liquid protein pharmaceuticals." Int J Pharm 185(2): 129-88、Wang, W. (2000). "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals." Int J Pharm 203(1-2): 1-60、およびChi, E. Y., S. Krishnan, et al. (2003). "Physical stability of proteins in aqueous solution: mechanism and driving forces in nonnative protein aggregation." Pharm Res 20(9): 1325-36に概説されている。安定剤としては、限定されないが、後で定義される糖、アミノ酸、ポリオール、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤、シクロデキストリン、例えば、ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン、スルホブチルエチル-β-シクロデキストリン、β-シクロデキストリン、ポリエチレングリコール、例えば、PEG3000、PEG3350、PEG4000、PEG6000、アルブミン、例えばヒト血清アルブミン(HSA)、ウシ血清アルブミン(BSA)、塩、例えば塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、キレート剤、例えば、EDTAが挙げられる。上記のように、安定剤が製剤中に約10〜約500mMの量、好ましくは約10〜約300mMの量、より好ましくは約100mM〜約300mMの量で存在し得る。
【００３１】
用語「凍結乾燥保護剤」は、凍結乾燥プロセス、次の保存および還元中の不安定な条件に対して不安定な活性成分(例えばタンパク質)を保護する薬学的に許容され得る賦形剤を示す。凍結乾燥保護剤は、糖、ポリオール(例えば、糖アルコールなど)およびアミノ酸からなる群を含むが、これに限定されない。好ましい凍結乾燥保護剤は、糖、例えばスクロース、トレハロース、ラクトース、グルコース、マンノース、マルトース、ガラクトース、フルクトース、ソルボース、およびラフィノース、ノイラミン酸およびガラクトサミン、アミノ糖、例えばグルコサミン、N-メチルグルコサミン(「メグルミン」)、ポリオール、例えばマンニトール、ならびにアミノ酸、例えばアルギニンからなる群より選択され得る。凍結乾燥保護剤は、一般的に約10〜500mMの量、好ましくは約10〜約300mMの量、より好ましくは約100〜約300mMの量で使用される。
【００３２】
用語「糖」は、本明細書で使用される場合、一般的に約10mM〜約500mMの量、好ましくは約10〜約300mMの量、より好ましくは約100〜約300mMの量で使用される薬学的に許容され得る糖を示す。適切な糖は、トレハロース、スクロース、ラクトース、グルコース、マンノース、マルトース、ガラクトース、フルクトース、ソルボース、ラフィノース、グルコサミン、N-メチルグルコサミン(いわゆる「メグルミン」)、ガラクトサミンおよびノイラミン酸を含むが、これに限定されない。好ましい糖は、スクロースおよびトレハロース、より好ましくはスクロースである。
【００３３】
用語「アミノ酸」は、非経口医薬製剤の状況において、本明細書で使用される場合、カルボキシル基に対してα位置に位置するアミノ部分を有する薬学的に許容され得る有機分子を示す。アミノ酸は、アルギニン、グリシン、オルニチン、リジン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、イソロイシン、ロイシン、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、セリン、プロリンおよびその組み合わせを含むが、これに限定されない。アミノ酸は、一般的に約10〜500mMの量、好ましくは約10〜約300mMの量、より好ましくは約100〜約300mMの量で使用される。
【００３４】
用語「ポリオール」は、本明細書で使用される場合、１つより多いヒドロキシ基を有する薬学的に許容され得るアルコールを示す。ポリオールは、約10mM〜約500mMの量、好ましくは約10〜約300の量、より好ましくは約100〜約300mMの量で使用され得る。適切なポリオールは、マンニトール、ソルビトール、グリセリン、デキストラン、グリセロール、アラビトール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールおよびその組み合わせを含むが、これに限定されない。
【００３５】
用語「抗酸化剤」は、活性医薬成分の酸化を妨げる薬学的に許容され得る賦形剤を示す。抗酸化剤は、約1〜約100mMの量、好ましくは約5〜約50mMの量、より好ましくは約5〜約20mMの量で使用され得る。抗酸化剤は、アスコルビン酸、グルタチオン、システイン、メチオニン、クエン酸、EDTAおよびその組み合わせを含むが、これに限定されない。
【００３６】
用語「保存剤」は、製剤中の微生物の増殖を妨げる薬学的に許容され得る賦形剤を示す。例えば、保存剤の複数用量製剤への添加によって、微生物汚染に対して製剤が保護される。保存剤は、一般的に約0.001〜約2%(w/v)の量で使用される。保存剤は、エタノール、ベンジルアルコール、フェノール、m-クレゾール、p-クロル-m-クレゾール、メチルまたはプロピルパラベン、塩化ベンズアルコニウムおよびその組み合わせを含むが、これに限定されない。
【００３７】
用語「界面活性剤」は、本明細書で使用される場合、薬学的に許容され得る界面活性剤を示す。本発明の製剤において、界面活性剤の量は、重量/体積パーセント(w/v%)で表されるパーセンテージで記載される。適切な薬学的に許容され得る界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル(Tween)、ポリオキシエチレンアルキルエーテル(Brij)、アルキルフェニルポリオキシエチレンエーテル(Triton-X)、ポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレンコポリマー(ポロキサマー、プルロニック)、およびドデシル硫酸ナトリウム(SDS)の群を含むが、これに限定されない。好ましいポリオキシエチレンソルビタン-脂肪酸エステルは、ポリソルベート20、(商標Tween 20TMで販売)およびポリソルベート80(商標Tween 80TMで販売)である。好ましいポリエチレン-ポリプロピレンコポリマーは、名称プルロニック（登録商標）F68またはポロキサマー188TMで販売されているものである。好ましいポリオキシエチレンアルキルエーテルは、商標BrijTMで販売されているものである。好ましいアルキルフェノールポリオキシエチレンエーテルは、商標名Triton-Xで販売されている。ポリソルベート20(Tween 20TM)およびポリソルベート80(Tween 80TM)を使用する場合、これらは、一般的に約0.001〜約1%w/v、好ましくは約0.005〜約0.1%w/v、より好ましくは約0.01%〜約0.04%w/vの濃度範囲で使用される。
【００３８】
用語「バッファ」は、本明細書で使用される場合、医薬製剤のpHを安定にする薬学的に許容され得る賦形剤を示す。適切なバッファは、当該技術分野で周知であり、文献に見ることができる。好ましい薬学的に許容され得るバッファは、ヒスチジンバッファ、クエン酸バッファ、コハク酸バッファおよびリン酸バッファを含むが、これに限定されない。より好ましいバッファは、当該技術分野で公知の酸または塩基と共にpH調整に用いるL-ヒスチジン、またはL-ヒスチジンと塩酸L-ヒスチジンの混合物を含む。上記ヒスチジンバッファは、一般的に約1mM〜約100mMの量、好ましくは約5mM〜約50mMの量、より好ましくは約10〜20mMの量で使用される。使用されるバッファとは独立して、pHは、当該技術分野で公知の酸または塩基、例えば、塩酸、酢酸、リン酸、硫酸およびクエン酸、水酸化ナトリウムならびに水酸化カリウムを用いて、約4.0〜約7.0、好ましくは約5.0〜約6.0、より好ましくは約5.5などの値に調整され得る。
【００３９】
用語「等張化剤」は、本明細書で使用される場合、薬学的に許容され得る等張化剤を示す。等張化剤は、製剤の張度を調節するために使用される。製剤は、低張、等張、または高張であり得る。等張性は、一般的に、通常ヒト血清の浸透圧に対する溶液の相対的浸透圧に関するものである。本発明による製剤は、低張、等張または高張であり得るが、好ましくは等張であり得る。明瞭さに関して、等張製剤は、液体または固体形態、例えば凍結乾燥形態から還元される液体であり、比較されるいくつかの他の溶液例えば生理学的塩溶液および血清と同じ張度を有する溶液を意味することがまた強調される。適切な等張化剤は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリンおよび本明細書で定義されるアミノ酸、糖、特にグルコースの群からの任意の成分ならびにその組み合わせを含むが、これに限定されない。等張化剤は、約5mM〜約500mMの量で使用される。
【００４０】
用語「液体」は、本発明による製剤に関して本明細書で使用される場合、標準圧力下で少なくとも約2〜約8℃の温度で液体である製剤を示す。
【００４１】
用語「凍結乾燥物」は、本発明による製剤に関して本明細書で使用される場合、本質的に当該技術分野で公知の凍結乾燥法によって製造される製剤を示す。溶媒(例えば、水)は、真空下での昇華後の凍結および高温度での残余水の脱離によって除去される。医薬の分野において、凍結乾燥物は、通常約0.1〜5%(w/w)の残余水分を有し、粉末または物理的に安定な固形として存在する。凍結乾燥物は、還元媒体の添加後の速い溶解を特徴とする。
【００４２】
用語「還元される製剤」は、本発明による製剤に関して本明細書で使用される場合、凍結乾燥され、還元媒体の添加によって再溶解される製剤を示す。還元媒体は、注射用水(WFI)、注射用静菌水(BWFI)、塩化ナトリウム溶液(例えば0.9%(w/v) NaCl)、グルコース溶液(例えば、5%グルコース)、界面活性剤含有溶液(例えば、0.01% ポリソルベート20)、pH緩衝溶液(例えば、リン酸緩衝溶液)およびその組み合わせを含むが、これに限定されない。
【００４３】
用語「安定な製剤」は、本発明による製剤に関して本明細書で使用される場合、製造、保存および使用中に物理的および化学的完全性を保存する製剤を示す。タンパク質安定性を評価する様々な分析技術が利用可能であり、Reubsaet, J. L., J. H. Beijnen, et al. (1998). “Analytical techniques used to study the degradation of proteins and peptides: chemical instability”. J Pharm Biomed Anal 17(6-7): 955-78およびWang, W. (1999). "Instability, stabilization, and formulation of liquid protein pharmaceuticals." Int J Pharm 185(2): 129-88に概説されている。安定性は、選択期間中の選択環境条件での保存、選択期間中の選択振とう頻度での振とうなどの機械的ストレスをかけること、選択期間中の選択光強度を用いた照射、または選択温度での繰り返し凍結および解凍によって評価され得る。
【００４４】
用語「薬学的に許容され得る」は、本発明による製剤に関して本明細書で使用される場合、現在の医薬の国際管理要件に従う製剤を示す。薬学的に許容され得る製剤は、予測される使用の経路および安全な濃度範囲について一般的に認められる賦形剤を含む。また、製造、保存および使用中に十分な安定性を提供すべきである。特に、非経口経路に使用する製剤は、ヒト血液の組成と比べて、等張性および体水分正常(euhydric)pHの要件を満たすべきである。
【００４５】
上記のように、一局面において、本発明は、
約1〜約250mg/mL Aベータ抗体、
約0.001〜約1%の少なくとも１つの界面活性剤、
約1〜約100mMのバッファ、
任意に約10〜約500mMの安定剤および／または約5〜約500mMの等張化剤を、
約4.0〜約7.0のpHで
含む、安定な非経口Aベータ抗体医薬製剤に関する。
【００４６】
Aベータ抗体濃度は、約1〜約250mg/mL、好ましくは約50mg/mL〜約200mg/mL、より好ましくは約150mg/mL〜約200mg/mLの範囲である。明瞭さの理由のために、本明細書に示される濃度が、液体または固体から正確に還元される液体の濃度と関係することが強調される。従って、得られた還元製剤が本明細書に記載の濃度におけるそれぞれの成分を含むように、本明細書に記載の凍結乾燥製剤を凍結乾燥物から還元することができる。
【００４７】
しかし、得られた還元製剤がさらに濃縮されるかまたはあまり濃縮されないような量の還元媒体を用いて、本明細書に記載される安定な凍結乾燥物を還元し得ることも当業者には明らかである。例えば、得られた還元製剤がさらに希釈されて、例えば20mg/mL Aベータ抗体、5.3mM L-ヒスチジン、66.7mM スクロースおよび0.011％ ポリソルベート20を含むように、本明細書の表2に記載される「製剤A」の凍結乾燥物を還元し得る；表2の製剤Rを参照。
【００４８】
本発明の製剤は、液体形態、凍結乾燥形態または凍結乾燥形態から還元される液体形態であり得る。
【００４９】
本発明の製剤が凍結乾燥形態であるかまたは凍結乾燥形態から還元された液体形態である場合、該製剤は安定剤として少なくとも1つの凍結乾燥保護剤を含み得る。
【００５０】
本発明の製剤は、静脈（i.v.）、皮下（s.c.）または製薬分野に公知のものなどの任意の他の非経口投与手段によって投与され得る。本発明の製剤は、好ましくは皮下経路で投与される。
【００５１】
本発明の製剤は、限外ろ過-ダイアフィルトレーション、透析、添加および混合、凍結乾燥、還元ならびにそれらの組合せなどの当該技術分野に公知の方法によって調製し得る。本発明の製剤の調製の例は以下に見ることができる。
【００５２】
好ましい態様において、本発明の非経口医薬製剤に含まれるAベータ抗体は、配列番号：1：
2010512356.tif 000002
に定義される種々の領域を含み得るかまたは有し得る。
【００５３】
この配列はまた、本明細書において以下：
2010512356.tif 000003
に示され、CDR、CH領域、重領域および2つのN-グリコシル化部位（Asn 52およびAsn 306）が示される。
【００５４】
本明細書に記載される配列番号：1を含む例示されたAベータ抗体はまた、軽鎖を含み、該軽鎖は以下のアミノ酸配列：
2010512356.tif 000004
を含み得るかまたは有し得る。
【００５５】
用語「Aベータ抗体A」は、本明細書で使用される場合、配列番号：1に定義される重鎖および配列番号：2に定義される軽鎖を含む例示されたAベータ抗体に関する。
【００５６】
用語「（1つまたは複数の）モノグリコシル化抗体」は、本明細書で使用される場合、個々の抗体分子、例えば免疫グロブリン、例えばIgG、例えばIgG1中の1つの(VH)領域中にN-グリコシル化を含む抗体分子に関する。例えば、該「モノグリコシル化形態」は、重鎖の1つの可変領域上、例えば本明細書に記載の「Aベータ抗体A」のアスパラギン位「Asn 52」にグリコシル化を含む。この「モノグリコシル化IgG1形態またはモノグリコシル化アイソフォーム」はまた、本明細書に示されるように、Fc部の良好に保存されたグリコシル化部位、例えば本明細書に例示される「Aベータ抗体A」の非可変Fc部のアスパラギンAsn 306にグリコシル化を含み得る。
【００５７】
本発明の意味における用語「（1つまたは複数の）二重グリコシル化抗体」は、両方の重鎖（VH）領域の可変領域上に、本明細書に定義されるグリコシル化を含む。また、この「二重グリコシル化形態」は、両方の重鎖の可変領域上、例えば本明細書に例示される「Aベータ抗体A」のアスパラギン位Asn 52にグリコシル化を含む。この「二重グリコシル化IgG1形態または二重グリコシル化アイソフォーム」はまた、本明細書に示されるように、非可変/定常Fc部の良好に保存されたグリコシル化部位、特に、例示される「Aベータ抗体A」の306位上にグリコシル化を含み得る。添付の図1は、対応する抗体分子を図示する。
【００５８】
可変領域中、例えば両方の重鎖の可変領域（両（VH）領域）中でかかる翻訳後修飾を欠いた抗体は、本発明の文脈において、「非グリコシル化形態」と見なされ、重鎖の可変領域中にグリコシル化を含まない。しかし、この「非グリコシル化形態」は、抗体の定常領域（C領域）、例えば最も一般的にはFc部の良好に保存されたグリコシル化部位、特に本明細書に定義される非可変/定常Fc部のアスパラギン（Asn）306中に（1つまたは複数の）グリコシル化を含み得る；配列番号：1も参照。
【００５９】
本発明の非経口医薬製剤は、本明細書で上述され、付随の実施例に示される典型的な「Aベータ抗体A」を含み得る。従って、Aベータ抗体Aを含む前記非経口医薬製剤は、モノグリコシル化Aベータ抗体Aもしくは二重グリコシル化Aベータ抗体Aもしくは非グリコシル化Aベータ抗体Aまたは上述のそれらの混合物を含み得る。
【００６０】
組換え発現されるAベータ抗体分子のグリコシル化アイソフォームの精製は、
(1) プロテインAカラム精製；
(2) イオン交換カラム精製、例えば陽イオン交換クロマトグラフィー；および任意に、
(3) サイズ排除カラム精製
の工程を含み得る。
【００６１】
精製プロトコルは、さらに、濃縮工程、例えばダイアフィルトレーション、または分析工程、例えば分析カラムなどのさらなる工程を含み得る。特定の工程を繰り返すこと（例えば、2回のイオン交換クロマトグラフィー工程を行ってもよい）または特定の工程（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー）を省略し得ることも想定され、かつ実行可能である。
【００６２】
プロテインAは、ほとんどのIgG1アイソタイプのFc領域に結合する、官能基特異的リガンドである。プロテインAは数種の系統の黄色ブドウ球菌によって合成され、そこから単離してクロマトグラフィービーズに結合させることができる。数種類のゲル調製物が市販されている。使用され得るプロテインAカラムの例は、MabSelect(登録商標)カラムである。典型的に、カラムを25mM Tris/HCl、25mM NaCl、5mM EDTAで平衡化し、細胞培養上清をカラムに負荷し、カラムを1M Tris/HCl pH 7.2で洗浄し、100mM酢酸を使用してpH 3.2で抗体を溶出する。
【００６３】
陽イオン交換クロマトグラフィーは、固定相中の正に荷電した官能基と移動相中の試料との相互作用を利用する。弱い陽イオン交換体（例えば、CM Toyopearl 650(登録商標)）を使用する場合、次にクロマトグラフィー工程を行う：100mM酢酸、pH 4で予備平衡化した後、プロテインA溶出液を負荷し、100mM酢酸、pH 4で洗浄して、250mM酢酸ナトリウム（pH 7.8〜8.5）および500mM酢酸ナトリウム（pH 7.8〜8.5）を加える工程によって抗体を溶出および分画する。第一の工程で、通常二重グリコシル化アイソフォーム画分およびモノグリコシル化アイソフォーム画分の混合物が溶出され、第二の工程で通常非グリコシル化アイソフォーム画分が溶出される。
【００６４】
強力な陽イオン交換体（例えば、SP Toyopearl 650）から、塩工程によって抗体を溶出することができる：カラムを50mM酢酸、pH 5.0で平衡化した後、pH 4のプロテインA溶出液を負荷し、50mM酢酸および210mM塩化ナトリウムを用いて第一の溶出工程を実施する。次いで、50mM酢酸および350mM塩化ナトリウムの第二の溶出工程を行う。第一の塩工程により、通常二重グリコシル化アイソフォーム画分およびモノグリコシル化アイソフォーム画分の混合物が溶出され、第二の塩工程により、通常非グリコシル化アイソフォームが溶出される。
【００６５】
また、塩勾配によって、強力な陽イオン交換体カラム（例えば、SP-Sepharose(登録商標)）から抗体を溶出してもよい：予備平衡化の後、カラムをpH 4.5で負荷および洗浄し、50mM MES、pH 5.8〜50mM MES/1M塩化ナトリウム、pH 5.8で塩勾配をかける。ここでは、通常二重グリコシル化アイソフォーム、モノグリコシル化アイソフォームおよび非グリコシル化アイソフォームの画分が別々に溶出される。その後、二重グリコシル化アイソフォーム画分およびモノグリコシル化アイソフォーム画分がプールされ得、生成物プールおよび/または所望の抗体混合物が得られる。
【００６６】
二重およびモノグリコシル化抗体分子、例えば免疫グロブリンの混合物のさらなる精製を、サイズ排除クロマトグラフィーにより行ってもよい。有用なカラムの例は、Superdex 200(登録商標)カラムである。ランニングバッファの例としては、ヒスチジン/塩化ナトリウム、例えば10mMヒスチジン/125mM塩化ナトリウム/pH 6、およびリン酸緩衝化食塩水（PBS）が挙げられる。
【００６７】
フロースルーモードの陰イオン交換クロマトグラフィー後の濃縮/ダイアフィルトレーションが代替的な精製工程である。Q Sepharose(登録商標)は陰イオン交換工程用の樹脂の例である。例えば、SPクロマトグラフィーからの溶出液を37.5mM Tris/HCl、pH 7.9で3倍希釈してもよく、25mM Tris/83mM酢酸ナトリウムで予備平衡化したQ-Sepharoseカラムに通してもよい。フロースルーを回収して、pH 5.5に調整し、例えばHydrosart 30 kD(登録商標)メンブレンを使用して限外ろ過により濃縮する。その後、濃縮液を、例えば10倍容量の20mMヒスチジン/HCl、pH 5.5でダイアフィルトレーションをしてもよい。
【００６８】
上述のように、抗体アイソフォームはまた、抗体分子の定常/非可変部、例えばIgGのFc部、例えばIgG1のFc部に（1つまたは複数の）さらなるグリコシル化を含み得る。該Fc部のグリコシル化は、例えば本明細書に定義される配列番号：1による重鎖のAsn 306位上に位置することを特徴とする良好に保存されたグリコシル化に関する。
【００６９】
本発明の製剤に含まれる抗体のIgG-Fc領域は、鎖間ジスルフィド結合されたヒンジ領域、CH2のアスパラギン306（Asn-306）にN結合オリゴ糖を有するグリコシル化CH2ドメインおよび非共有結合対CH3ドメインからなるホモダイマーであり得る。Asn-306でのグリコシル化のオリゴ糖は二分岐型の複合体であり、可変的な外部糖付加を有するコア七糖構造を含み得る。
【００７０】
該オリゴ糖は、Fc構造および機能に影響するかまたはそれを決定する（Jefferis (1998) Immunol Rev. 163, 50-76）。ある特異的IgG-Fc/エフェクターリガンド相互作用をナンバリングするエフェクター機能が記載されている（Jefferis (2002) Immunol Lett. 82(1-2), 57-65およびKrapp (2003) J Mol Biol. 325(5), 979-89）。この保存されたFc位置Asn-306は、カバットシステムの「Asn-297」に相当する（Kabat (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版、公衆衛生局、国立衛生研究所、Bethesda MD）。
【００７１】
特定の態様において、本発明の製剤は、
- 約1〜約200mg/mL Aベータ抗体、
- 0.04％ Tween 20 w/v、
- 20mM L-ヒスチジン、
- 250mM スクロースを、
- pH 5.5で
含む、液体製剤または凍結乾燥製剤である。
【００７２】
別の態様において、本発明の製剤はまた、
- 75mg/mL Aベータ抗体、
- 0.04％ Tween 20 w/v、
- 20mM L-ヒスチジン、
- 250mM スクロースを、
- pH5.5で
または
- 75mg/mL Aベータ抗体、
- 0.02％ Tween 20 w/v、
- 20mM L-ヒスチジン、
- 250mM スクロースを、
- pH5.5で
含む、凍結乾燥製剤を含む。
【００７３】
さらに別の態様において、本発明の製剤はまた、
- 37.5mg/mL Aベータ抗体、
- 0.02％ Tween 20 w/v、
- 10mM L-ヒスチジン、
- 125mM スクロースを、
- pH5.5で
または
- 37.5mg/mL Aベータ抗体、
- 0.01％ Tween 20 w/v、
- 10mM L-ヒスチジン、
- 125mM スクロースを、
- pH5.5で
含む、液体製剤を含む。
【００７４】
さらに別の態様において、本発明の製剤はまた、
- 15mg/mL Aベータ抗体、
- 0.04％ Tween 20 w/v、
- 20mM L-ヒスチジン、
- 250mM スクロースを、
- pH5.5で
含む、凍結乾燥製剤を含む。
【００７５】
さらに別の態様において、本発明の製剤はまた、
- 20mg/mL Aベータ抗体、
- 0.011％ Tween 20 w/v、
- 5.3mM L-ヒスチジン、
- 66.7mM スクロースを、
pH 5.5で
含む、凍結乾燥製剤を含む。
【００７６】
さらに別の態様において、本発明の製剤はまた、
- 7.5mg/mL Aベータ抗体、
- 0.04％ Tween 20 w/v、
- 20mM L-ヒスチジン、
- 25OmM スクロースを、
- pH 5.5で
または
- 7.5mg/mL Aベータ抗体、
- 0.02％ Tween 20 w/v、
- 10mM L-ヒスチジン、
- 125mM スクロースを、
pH 5.5で
含む、液体製剤を含む。
【００７７】
さらなる態様において、本発明の製剤はまた、
- 75mg/mL Aベータ抗体、
- 0.04％ Tween 20 w/v、
- 20mM L-ヒスチジン、
- 250mM トレハロースを、
- pH 5.5で
または
- 75mg/mL Aベータ抗体、
- 0.02％ Tween 20 w/v、
- 20mM L-ヒスチジン、
- 250mM トレハロースを、
- pH 5.5で
含む、凍結乾燥製剤を含む。
【００７８】
さらに別の態様において、本発明の製剤はまた、
- 37.5mg/mL Aベータ抗体、
- 0.02％ Tween 20 w/v、
- 10mM L-ヒスチジン、
- 125mM トレハロースを、
- pH 5.5で
または
- 37.5mg/mL Aベータ抗体、
- 0.01％ Tween 20 w/v、
- 10mM L-ヒスチジン、
- 125mM トレハロースを、
- pH 5.5で
含む、液体製剤を含む。
【００７９】
さらに別の態様において、本発明の製剤はまた、
- 75mg/mL Aベータ抗体、
- 0.02％ Tween 20 w/v、
- 20mM L-ヒスチジン、
- 250mM トレハロースを、
- pH 5.5で
または
- 75mg/mL Aベータ抗体、
- 0.02％ Tween 20 w/v、
- 20mM L-ヒスチジン、
- 250mM マンニトールを、
- pH5.5で
または
- 75mg/mL Aベータ抗体、
- 0.02％ Tween 20 w/v、
- 20mM L-ヒスチジン、
- 140mM 塩化ナトリウムを、
- pH5.5で
または
- 150mg/mL Aベータ抗体、
- 0.02％ Tween 20 w/v、
- 20mM L-ヒスチジン、
- 250mM トレハロースを、
- pH5.5で
または
- 150mg/mL Aベータ抗体、
- 0.02％ Tween 20 w/v、
- 20mM L-ヒスチジン、
- 250mM マンニトールを、
- pH5.5で
または
- 150mg/mL Aベータ抗体、
- 0.02％ Tween 20 w/v、
- 20mM L-ヒスチジン、
- 140mM 塩化ナトリウムを、
- pH5.5で
または
- 10mg/mL Aベータ抗体、
- 0.01％ Tween 20 w/v、
- 20mM L-ヒスチジン、
- 140mM 塩化ナトリウムを、
- pH 5.5で
含む、液体製剤を含む。
【００８０】
好ましい態様において、本発明の製剤はまた、
- 10mg/mL Aベータ抗体、
- 0.01％ Tween 20 w/v、
- 20mM L-ヒスチジン、
- 140mM 塩化ナトリウムを、
pH 5.5で
含む、液体製剤を含む。
【００８１】
別の好ましい態様において、本発明の製剤はまた、
- 75mg/mL Aベータ抗体、
- 0.04％ Tween 20 w/v、
- 20mM L-ヒスチジン、
- 250mM スクロースを、
pH 5.5で
含む、凍結乾燥製剤を含む。
【００８２】
別の好ましい態様において、本発明の製剤はまた、
- 20mg/mL Aベータ抗体、
- 0.011％ Tween 20 w/v、
- 5.3mM L-ヒスチジン、
- 66.7mM スクロースを、
pH 5.5で
含む、凍結乾燥製剤を含む。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】図1は、二重、モノおよび非グリコシル化抗体分子（免疫グロブリン）の模式図である。
【図２】図2は、開始後ならびに5℃、25℃/60％rhおよび40℃/75％rhで6ヶ月までインキュベートした後の、Aベータ抗体A製剤をサイズ排除クロマトグラフィーで測定したモノマーの含有量である。抗体調製物を凍結乾燥して、75mg/mLのみかけ上の濃度に還元する。
【図３】図3は、開始後ならびに5℃、25℃/60％rhおよび40℃/75％rhで3ヶ月間インキュベートした後の、Aベータ抗体A製剤をサイズ排除クロマトグラフィーで測定したモノマーの含有量である。抗体調製物K、LおよびNを75mg/mLで調製して、調製物O、PおよびQを150mg/mLで調製する。
【実施例】
【００８４】
本発明の皮下投与用の液体および凍結乾燥薬品製剤は以下のように開発した：
【００８５】
液体製剤の調製
配列番号：1に定義された重鎖および配列番号：2に定義された軽鎖を含むAベータ抗体（本発明の文脈中で「Aベータ抗体A」）は、WO 03/070760に記載のように調製して得られ、限外ろ過により20mMヒスチジンバッファ、pH約5.5中約40〜約200mg/mLの濃度に濃縮された。次いで、濃縮溶液を製剤バッファ（糖（それぞれ塩またはポリオール）、界面活性剤およびバッファ、約pH 5.5のpHを含む）で希釈して、最終バルク組成（例えば、10mM L-ヒスチジン、125mMスクロース、0.02％ Tween 20、pH 5.5）中に調製される約7.5mg/mL、37.5mg/mL、75mg/mLまたは150mg/mLの期待された抗体濃度を得た。
【００８６】
あるいは、Aベータ抗体Aを、期待されるバッファおよび糖組成物を含むダイアフィルトレーションバッファでバッファ交換して、約37.5mg/mLの終濃度以上の抗体濃度に濃縮した。100〜200倍ストック溶液として、限外ろ過操作を行った後に界面活性剤を抗体溶液に添加した。濃縮抗体溶液を、同じ賦形剤組成を含む製剤バッファで約37.5mg/mLの最終Aベータ抗体A濃度に調整した。
【００８７】
0.22μm低タンパク質結合フィルターで全ての製剤をろ過滅菌して、窒素大気下で、滅菌6mLガラスバイアルに無菌的に充填して、ETFE（エチレンおよびテトラフルオロエチレンのコポリマー）コートゴム製ストッパーおよびalucrimpキャップで密封した。充填容量は約2.4mLであった。これらの製剤を、異なる環境条件下で異なる時間間隔で保存して、振盪（5℃で200分-1の振盪回数で1週間）および凍結融解ストレス法によりストレスをかけた。ストレス試験にかける前後に試料を分析法、1）UV分光測光法、2）サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）および3）溶液の濁度を測定するための比濁法により分析した。
【００８８】
凍結乾燥製剤およびこの凍結乾燥製剤から還元される液体製剤の調製
約37.5mg/ml「Aベータ抗体A」の溶液を、液体製剤について上記のように調製した。当該技術分野に公知の任意の凍結乾燥法は、本発明の範囲内にあるものとする。例えば、この試験に使用された凍結乾燥法は、製剤を室温から約5℃に冷却する工程（予備冷却工程）および約1℃/分のプレート冷却速度で-40℃に凍結する工程、その後-40℃で約2時間維持する工程を含んだ。プレート温度約-25℃、チャンバー圧約80μバールで、約62時間、第一の乾燥工程を実施した。その後、0.2℃/分の温度傾斜で-25℃〜25℃で第二の乾燥工程を行い、25℃で少なくとも5時間、約80μバールのチャンバー圧で維持工程を続けた（用いた乾燥計画は表1に示す）。
【００８９】
Usifroid SMH-90 LN2凍結乾燥機（Usifroid, Maurepas, France）中で凍結乾燥を行った。この試験において凍結乾燥された全てのケーキは、カール-フィッシャー法で測定すると、約0.1〜1.0％の残存水分含量を有した。凍結乾燥された試料を、種々の温度、種々の時間間隔でインキュベートした。
【００９０】
凍結乾燥した製剤を、注射用水（WFI）で1.2mLの終容量に還元して、約75mg/mLの抗体濃度および3mPa・s未満の粘度を有する等張製剤を得た。凍結乾燥ケーキの還元時間は約2〜4分であった。還元した試料の分析は、還元直後、または還元した液体試料を25℃で24時間インキュベートした後のいずれかに行った。
【００９１】
1）UV分光測光法、2）還元時間の測定、3）サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）および4）溶液の濁度を測定するための比濁法により試料を分析した。
【００９２】
サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）を使用して、製剤中の可溶性高分子量種（凝集物）および低分子量加水分解生成物（LMW）を検出した。Tosohaas TSK G3000 SWXLカラムを備えたMerck Hitachi 7000 HPLC装置を使用して該方法を行った。移動相として0.2M K2HPO4/0.25M KCL、pH 7.0を使用して、定組成溶離プロフィールにより完全なモノマー、凝集物および加水分解生成物を分離して、280nmの波長で検出した。
【００９３】
タンパク質含有量の測定に使用したUV分光測光法は、Varian Cary Bio UV分光計を用いて、280nmで行った。正味のタンパク質試料を20mM L-ヒスチジン、pH 5.5で約0.5mg/mLに希釈した。タンパク質濃度は等式1に従って計算した。
【００９４】
2010512356.tif 000005
【００９５】
精度±10％でタンパク質濃度を測定した。280nmでのUV吸光を320nmの光散乱に対して補正し、正味の試料および希釈バッファの重量および密度から決定した希釈係数をかけた。その分子をキュベット通過長dおよび吸光係数εの積で割った。
【００９６】
透明度および乳光度を、比濁法によるFormazin Turbidity Units（FTU）として測定した。正味の試料を直径11mmの透明なガラス管に移し、HACH 2100 AN濁度計に入れた。
【００９７】
【表１】
2010512356.tif 000006
【００９８】
【表２】
2010512356.tif 000007
2010512356.tif 000008
2010512356.tif 000009
2010512356.tif 000010
2010512356.tif 000011
2010512356.tif 000012
2010512356.tif 000013
2010512356.tif 000014
2010512356.tif 000015
2010512356.tif 000016
2010512356.tif 000017
【図１】
2010512356.tif 000018
【図２】
2010512356.tif 000019
【図３】
2010512356.tif 000020
【配列表】
2010512356000001.app
【国際調査報告】
2010512356.tif 000021
2010512356.tif 000022
2010512356.tif 000023
2010512356.tif 000024
2010512356.tif 000025