(57)【要約】【課題】本発明は、ヒト及び動物の新生物、寄生虫症を治療する上記薬剤の使用、各種の疾患に対する適切な治療療法の決定、該化合物から２つ以上を組み合わせることによる相乗効果の決定、並びに活性化合物の作用様式、毒性、及び上記疾患、及び他の相関性のある疾患に対して現在治療に用いられている薬剤よりも好ましい結果が表れる上記化合物族に対する他の薬理学的要因の決定に関する。【解決手段】本発明は、ペンタ−１，４−ジエン−３−オンの新規の誘導体、及びその調製方法に関する。これらの化合物は、ラボラトリーアッセイ及び組織病理学研究によりほぼ無毒である強力な抗腫瘍作用及び有望な抗寄生虫作用を示す。本発明は、また、癌及び寄生虫性疾患を治療する上記化合物からなる医薬組成物、及び方法に関する。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造式ＩＩで表されるモノフェノラート又はジフェノラートを調製するためのプロセスであって、構造式Ｉで表される化合物を、前記構造式Ｉで表される化合物に対してモル比が１：１〜１：２である金属アルコキシドＲＯＭと溶媒としてのアルコールＲＯＨに接触させることを含むことを特徴とするプロセス：
【化１３】
2010501473.tif 000031
式中、Ｘは水素原子、マロニトリル基又はアルキルシアノアセテート基であり、Ｙは水素又はフェノキシドイオンの形態として安定化させる金属カチオンであり、Ｚはニトロ基、アミン基又は該位置に関しては無置換となる化合物を与える基（Ｚ＝Ｈ）、及びＭは前記化合物をフェノキシドイオンの形態として安定化させる金属カチオンを表す。
【請求項２】
１，５−ビス（４−ヒドロキシ−３−メトキシ−フェニル）ペンタ−１，４−ジエン−３−オンをナトリウムエトキシドのエタノール溶液と混合した後、固体が生成するまで溶媒を回転蒸発させる（ｒｏｔｏｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
水に易溶であって、後続の請求項に記載の生物学的試験に使用できる微粉末を得るために、得られたモノナトリウム塩及び／又はジナトリウム塩を篩過する請求項１又は２に記載のプロセス。
【請求項４】
一般式ＩＶで表されるアルキル化又はアシル化１，５−ビス−（アリール）−ペンタ−１，４−ジエン−３−オンを調製するためのプロセスであって、一般式ＩＩＩで表される対応する置換ペンタジエノンを、１，２−ジクロロエタン、ベンゾイルクロライド、モノクロロ酢酸又は酢酸無水物等のアルキル化剤又はアシル化剤と混合し、他のものと一緒に、構造式ＩＶで表される対応する置換ペンタジエノンを得ることを含むことを特徴とするプロセス：
【化１４】
2010501473.tif 000032
式中、Ｘは酸素又はマロニトリルを表し、Ｚはニトロ基又は水素原子を表し、Ｙはベンゾイル基、メチル基、クロロエチル基、アセチル基、カルボキシメチレン基又は無置換化合物を形成する窒素原子を表す。
【請求項５】
一般式ＩＶで表されるアシル化又はアルキル化ペンタジエノンを、一般式ＩＩＩで表される対応する置換アルキル化又はアシル化アルデヒドとアセトンから得るプロセスであって、前記アルデヒドとアセトンを酸性培地中、２５℃〜６０℃で２５ｋＨｚ〜４０ｋＨｚの超音波を照射し、１日〜７日間放置する請求項４に記載のプロセス：
【化１５】
2010501473.tif 000033
一般式ＩＶで表されるペンタジエノンにおいて、Ｘは酸素又はマロニトリルを表し、Ｚはニトロ基又は水素原子を表し、Ｙはベンゾイル基、メチル基、クロロエチル基、アセチル基、カルボキシメチレン基又は無置換化合物を形成する水素原子を表す。
【請求項６】
新規なペンタ−１，４−ジエン−３−オンを、シリカゲル充填クロマトグラフィーカラムと適切な溶離液を用いるか、又は再結晶することによって精製する請求項４又は５に記載のプロセス。
【請求項７】
一般式ＶＩで表される置換４−ニトロ−３，５−ジアリール−シクロヘキサノンを調製するためのプロセスであって、一般式Ｖで表される置換１，５−ビス（アリール）ペンタ−１，４−ジエン−３−オンと、ニトロメタン若しくはニトロエタン又はマロン酸誘導体とを、モル比約１：１でマイケル付加条件下、２０℃〜６０℃にて塩基存在下に２５ｋＨｚ〜４０ｋＨｚの超音波を照射した状態で１時間〜８時間接触させることを特徴とするプロセス：
【化１６】
2010501473.tif 000034
式中、Ａｒは３，４−ジメトキシフェニル、４−カルボキシメトキシ−３−メトキシ−フェニル、４−アセトキシ−３−メトキシ−フェニル、３−メトキシ−４−（３−メチル−ブタ−２−エニルオキシ）−フェニル、４−（２−クロロ−エトキシ）−３−メトキシ−フェニル、４−ベンゾイルオキシ−３−メトキシ−フェニル（即ちアリール）等の芳香族基、又はフラン、チオフェン等の複素環式芳香族を表し、Ｙはニトロ基又はシアノ基であり、Ｚは水素原子、メチル基、シアノ基等であり；試薬としてＲはアルキルでありＸはアルコキシカルボニル基又はシアノ基である。
【請求項８】
塩基が、ナトリウムメトキシドの無水メタノール溶液又は無水ジメチルホルムアミドの存在下にある炭酸ナトリウムである請求項７に記載のプロセス。
【請求項９】
等モル量のニトロメタン若しくはニトロエタン又はマロノニトリルと、炭酸カリウムと、対応する置換ペンタ−１，４−ジエン−３−オンとをジメチルホルムアミド存在下に含む反応混合物を、定速攪拌下約４０℃にて５時間〜１０時間還流する請求項７又は８に記載のプロセス。
【請求項１０】
使用する塩基がナトリウムメトキシドであり、置換ペンタ−１，４−ジエン−３−オンをメタノールに溶解させ、２５℃〜４０℃にて６時間〜１０時間激しく攪拌させる請求項７、８又は９に記載のプロセス。
【請求項１１】
反応混合物に２５ｋＨｚ〜４０ｋＨｚの超音波を照射する請求項７、８、９又は１０に記載のプロセス。
【請求項１２】
構造式ＶＩＩで表される置換２，６−ジベンジリデン−４−ニトロ−３，５−ジアリール−シクロヘキサノン（構造式ＶＩＩ中、Ｙ及びＺはそれぞれ水素、メチル基又はニトロ基であり、Ｘは酸素である）、又は式ＶＩＩで表される化合物であって３，５−ジベンジリデン−２，６−ビス−（４−ヒドロキシ−３−メトキシ−フェニル）−４−オキソ−シクロヘキサン−１，１−ジカルボニトリル(構造式ＶＩＩ中、Ｙ及びＺがシアノ基でありＸが酸素である)を調製するためのプロセスであって、構造式ＶＩで表される置換４−ニトロ−３，５−ジアリール−シクロヘキサノン又は２，６−ビス−（４−ヒドロキシ−３−メトキシ−フェニル）−４−オキソ−シクロヘキサノン−１，１−ジカルボニトリルと置換アルデヒドとを塩基性又は酸性媒質中においてアルドール縮合反応条件下で混合することを含むことを特徴とするプロセス。
【化１７】
2010501473.tif 000035
【請求項１３】
ナトリウムメタノレートのメタノール混合物を用いて、構造式ＶＩで表される置換シクロヘキサノンである４−オキソ−シクロヘキサン−１，１−ジカルボニトリルと置換アルデヒドとをモル比約１：４にて無水メタノール中で８時間〜１２時間の攪拌下に接触させることを含む請求項１２に記載のプロセス。
【請求項１４】
得られた化合物の精製が再結晶法により行われるか、又はシリカゲル充填クロマトグラフィーカラムと溶離液として適切な有機溶媒とを用いて行われる請求項１２又は１３に記載のプロセス。
【請求項１５】
インビトロ及び生体内での抗腫瘍及び抗寄生虫アッセイを行うための、ＨＢ−１（１，５−ビス（４−ヒドロキシ−３−メトキシ−フェニル）ペンタ−１，４−ジエン−３−オン）化合物とＨＢ−２（１，５−ビス（３−メトキシ−４−アセトキシ−フェニル）ペンタ−１，４−ジエン−３−オン）化合物のミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）８１０（登録商標）混合物を調製するためのプロセス。
【請求項１６】
ナトリウム４−［５−（４−ヒドロキシ−３−メトキシ−フェニル）−３−オキソ−ペンタ−１，４−ジエニル］−２−メトキシ−フェノラートであることを特徴とする化合物。
【請求項１７】
３−オキソ−ペンタ−１，４−ジエニル−ビス（ナトリウム２−メトキシ−フェノラート）であることを特徴とする化合物。
【請求項１８】
１，５−ビス−［４−（２−クロロ−エトキシ）−３−メトキシ−フェニルペンタ−１，４−ジエン−３−オンであることを特徴とする化合物。
【請求項１９】
｛４−［５−（４−カルボキシメトキシ−３−メトキシ−フェニル）−３−オキソ−ペンタ−１，４−ジエニル］−２−メトキシ−フェノキシ｝−酢酸であることを特徴とする化合物。
【請求項２０】
１，５−ビス−（４−ヒドロキシ−３−メトキシ−５−ニトロ−フェニル）ペンタ−１，４−ジエン−３−オンであることを特徴とする化合物。
【請求項２１】
１，５−ビス（４−ベンゾイルオキシ−３−メトキシ−フェニル）ペンタ−１，４−ジエン−３−オンであることを特徴とする化合物。
【請求項２２】
２−（３−［４−（２−クロロ−エトキシ）−３−メトキシ−フェニル］−１−｛２−［４−（２−クロロ−エトキシ）−３−メトキシ−フェニル］−ビニル｝−アリリデン）−マロノニトリルであることを特徴とする化合物。
【請求項２３】
３，５−ビス−［３−メトキシ−４−（３−メチル−ブタ−２−エニルオキシ）−フェニル］−４−ニトロ−シクロヘキサン−１−オンであることを特徴とする化合物。
【請求項２４】
３，５−ビス−（フル−２−イル）−４−ニトロ−シクロヘキサン−１−オンであることを特徴とする化合物。
【請求項２５】
３，５−ビス−（フル−２−イル）−４−メチル−４−ニトロ−シクロヘキサン−１−オンであることを特徴とする化合物。
【請求項２６】
３，５−ビス−（フェニル）−４−メチル−４−ニトロ−シクロヘキサン−１−オンであることを特徴とする化合物。
【請求項２７】
２，６−ビス［１−（フル−２−イル）メチリデン］−３，５−ビス（フル−２−イル）−４−メチル−４−ニトロ−シクロヘキサン−１−オンであることを特徴とする化合物。
【請求項２８】
３，５−ジフェニル−２，６−ビス−［１−（フル−２−イル）メチリデン］−４−メチル−４−ニトロ−シクロヘキサン−１−オンであることを特徴とする化合物。
【請求項２９】
２，６−ビス−［１−（５−ブロモ−フル−２−イル）メチリデン］−３，５−ジフェニル−４−メチル−４−ニトロ−シクロヘキサン−１−オンであることを特徴とする化合物。
【請求項３０】
２−（３，５−ジ−フラン−２−イル−４−ニトロ−シクロヘキシリデン）−マロノニトリルであることを特徴とする化合物。
【請求項３１】
２−（３，５−ジ−フラン−２−イル−４−メチル−４−ニトロ−シクロヘキシリデン）−マロノニトリルであることを特徴とする化合物。
【請求項３２】
請求項１〜１５のいずれかに記載のプロセスによって得られる化合物及び／又は請求項１６〜３１のいずれかに記載の化合物の使用であって、前記化合物が、ヒト及び動物における数種の腫瘍性疾患及び寄生虫性疾患を治療するための医薬組成物を調製するために使用されることを特徴とする使用。
【請求項３３】
肺癌、乳癌、多剤耐性乳癌、非メラノーマ皮膚癌、メラノーマ、リンパ性白血病、急性及び慢性の骨髄性白血病、赤白血病、脊髄異形成症、結腸癌、卵巣癌、頸癌、腎癌、脾臓癌、前立腺癌、軟部組織肉腫、肝癌、骨肉腫、中枢神経系腫瘍、神経芽腫、星状細胞腫、口腔咽頭部、甲状腺、胃及び男性生殖器の癌によって引き起こされる腫瘍性疾患の治療及び予防のための請求項３２に記載の化合物の使用。
【請求項３４】
治療有効量の請求項１〜１５のいずれかに記載のプロセスによって得られる化合物及び／又は請求項１６〜３１のいずれかに記載の化合物と、医薬的に許容される賦形剤とを含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項３５】
治療有効量の請求項１〜１５のいずれかに記載のプロセスによって得られる化合物及び／又は請求項１６〜３１のいずれかに記載の化合物を、腫瘍性疾患の治療を必要とする患者に投与することを特徴とする請求項３３に記載の腫瘍性疾患を治療するための治療方法。
【請求項３６】
投与が筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与、静脈内投与又は経口投与で行われる請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ヒト及び／又は動物の寄生虫性疾患が、リーシュマニア(Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）属、プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）属、トリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）属、トキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）属、ジアルジア（Ｇｉａｒｄｉａ）属及びエンタモエバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ）属を含む組織原虫、住血原虫又は腸内原虫によって引き起こされる寄生虫性疾患；及びタエニア（Ｔａｅｎｉａ）属、シストソーマ（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）属、アンシロストーマ（Ａｎｃｙｈｓｔｏｍａ）属、ネカトール（Ｎｅｃａｔｏｒ）属、アスカリス（Ａｓｃａｒｉｓ）属、エンテロビウス（Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ）属又はウケレリア（Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ）属によって引き起こされる寄生虫性感染症である請求項３２に記載の使用。
【請求項３８】
化合物がウォーレン（Ｗａｒｒｅｎ）培地中における前鞭毛型アマゾンリーシュマニア（Ｌ）（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ（Ｌ）ａｍａｚｏｎｅｎｓｉｓ）の増殖に対して活性を示す請求項３２に記載の使用。
【請求項３９】
化合物が、ＲＰＭＩ培地中における前鞭毛型アマゾンリーシュマニア（Ｌ）の増殖に対して活性を示す請求項３２に記載の使用。
【請求項４０】
化合物が、ＲＰＭＩ培地中におけるＨＢ−１で処理された前鞭毛型アマゾンリーシュマニア（Ｌ）の生存能力に対して作用する請求項３２に記載の使用。
【請求項４１】
化合物が、限局性皮膚リーシュマニア症（Ｌ．Ｃ．Ｌ．）及び汎発性皮膚リーシュマニア症（Ｄ．Ｃ．Ｌ．）の原因となるリーシュマニア分離株に対して、ＭＴＴ法によって評価される作用をする請求項３２に記載の使用。
【請求項４２】
化合物が無鞭毛型アマゾンリーシュマニア（Ｌ）に対して作用する請求項３２に記載の使用。
【請求項４３】
癌疾患及び寄生虫性疾患に対する適用において、研究対象とした正常器官のいずれにおいても重篤な変化を引き起こさず、且つネクローシス領域、色素沈着又は細胞変性を引き起こさない医薬組成物であって、請求項１〜１５のいずれかに記載するように製造された化合物及び／又は請求項１６〜３１のいずれかに記載の化合物を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項４４】
請求項１６〜３１のいずれかに記載の（１，５−ビス（４−ヒドロキシ−３−メトキシ−フェニル）ペンタ−１，４−ジエン−３−オン）（ＨＢ−１）及び（１，５−ビス（３−メトキシ−４−アセトキシ−フェニル）ペンタ−１，４−ジエン−３−オン）（ＨＢ−２）と、医薬的に許容される賦形剤とを含むことを特徴とする相乗組成物。
【請求項４５】
請求項１に記載のプロセスによって得られる生成物である、ナトリウム４−［５−（４−ヒドロキシ−３−メトキシ−フェニル）−３−オキソ−ペンタ−１，４−ジエニル］−２−メトキシ−フェノラート、３−オキソ−ペンタ−１，４−ジエニル−ビス（ナトリウム２−メトキシ−フェノラート）及びそれらの誘導体の使用であって、前記化合物がヒト及び動物の腫瘍性及び寄生虫性疾患の治療に使用されることを特徴とする使用。
【請求項４６】
請求項１５に記載するように調製される、腫瘍の増殖を阻害すると共に前記腫瘍に対して特異的な免疫応答を誘導するための組成物の使用であって、前記組成物がＨＢ−１（１，５−ビス（４−ヒドロキシ−３−メトキシ−フェニル）ペンタ−１，４−ジエン−３−オン）化合物とＨＢ−２（１，５−ビス（３−メトキシ−４−アセトキシ−フェニル）ペンタ−１，４−ジエン−３−オン）化合物との、ＨＢ−１の比率がＨＢ−２に対して２０％〜８０％で併用されているミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）８１０（登録商標）中での混合物を含むことを特徴とする使用。
【請求項４７】
請求項１〜１５のいずれかに記載するように製造された化合物及び／又は請求項１６〜３１のいずれかに記載の化合物が線維芽細胞、リンパ球及びマクロファージ等のヒト及び動物の正常細胞に対して重篤な細胞毒性を示さないことを特徴とする使用。
【請求項４８】
請求項１〜１５のいずれかに記載するように製造された化合物及び／又は請求項１６〜３１のいずれかに記載の化合物が免疫細胞の特異的なインビトロ増殖活性を誘導しないことを特徴とする使用。
【請求項４９】
請求項１〜１５のいずれかに記載するように製造された化合物及び／又は請求項１６〜３１のいずれかに記載の化合物が、腫瘍細胞の内臓器官への播種及び遊走を防ぐと共に、二次性腫瘍或いは転移の発生を防ぐことを特徴とする使用。
【請求項５０】
請求項１〜１５のいずれかに記載するように製造された化合物及び／又は請求項１６〜３１のいずれかに記載の化合物が、ヒト及び動物の原発性腫瘍において特異的な炎症応答を生体内で誘導し、前記腫瘍の増殖及び播種を防ぐことを特徴とする使用。
【請求項５１】
請求項１〜１５のいずれかに記載するように製造された化合物及び／又は請求項１６〜３１のいずれかに記載の化合物が、ヒト及び動物の免疫抑制病態、免疫不全病態及び退行性病態に対して特異的な免疫刺激剤として機能することを特徴とする使用。
【請求項５２】
ＤＭ−１化合物及びＤＭ−２化合物の使用であって、ＤＭ−１化合物及びＤＭ−２化合物が、ヒト及び動物の数種の腫瘍細胞株に対し生体内においてより高く、且つ、特異的な効果を発揮し、且つ他の被験化合物よりも低い５０％阻害濃度（ＩＣ５０値）を示すことを特徴とする使用。
【請求項５３】
請求項１〜１５のいずれかに記載するように製造された化合物及び／又は請求項１６〜３１のいずれかに記載の化合物が、生体内での処置後、内臓器官に肉眼的又は組織病理学的変化を示さず、急性又は慢性炎症変化、血管不全、腎不全、肝不全及び肺不全のいずれもが観察されないことを特徴とする使用。
【請求項５４】
請求項１〜１５のいずれかに記載するように製造された化合物及び／又は請求項１６〜３１のいずれかに記載の化合物が、プログラムされた細胞死（アポトーシス）により、ヒト及び動物の腫瘍の増殖を阻害すると共にその遊走を防ぐことを特徴とする使用。
【請求項５５】
請求項１〜１５のいずれかに記載するように製造された化合物及び／又は請求項１６〜３１のいずれかに記載の化合物が、ヒト及び動物の増殖性疾患のためにプログラムされた細胞死（アポトーシス）を誘導することを特徴とする使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗腫瘍剤として生体内生物学的用途、及び抗寄生虫薬としてインビトロ用途等に用いるための調製及び精製を含む合成方法を含む１，５‐ビス（アリール）ペンタ‐１，４‐ジエン‐３‐オン誘導体の調製方法に関する。
また、本発明は癌及び寄生虫感染症を治療する上記化合物を含む薬剤適用性を示す化学組成に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｈ．ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｇｏｏｔ等（非特許文献１）は、抗酸化特性を示す１，５‐ジアリール‐１，４‐ペンタジエン‐３‐オン及びその環式類似体を得た。環式化合物は、塩酸の存在下でシクロヘキサノン及び／又はシクロペンタノンによる置換アルデヒドの反応により合成された。
【０００３】
Ｍ．Ａｒｔｉｃｏ等は、非特許文献２に刊行された論文で、ＭＴ‐４細胞で行う研究において抗ＨＩＶ‐１特性がある２，６‐ビス（３，４‐ジヒドロキシ‐ベンジリデン）シクロヘキサノン、３，５‐ビス（３，４‐ジヒドロキシ‐ベンジリデン）ピペリジン‐４‐オン、及び３，５‐ビス（３，４‐ジヒドロキシ‐ベンジリデン）テトラヒドロ‐ピラン‐４‐オンの調製を報告している。
【０００４】
その後、Ｂｕｏｌｏｍｗｉｎｉ及びＡｓｓｅｆａは非特許文献３に刊行された論文で、２，５‐ビス（３，４−ジヒドロキシ‐ベンジリデン）シクロペンタノン及び３，５‐ビス（３，４‐ジヒドロキシ‐ベンジリデン）テトラヒドロ−チオピラン‐４‐オンの抗ＨＩＶ作用を証明した。
【０００５】
２００４年及び２００５年に、Ｙｏｕｓｓｅｆ等は（非特許文献４及び非特許文献５）対応する置換アルデヒド及びシクロヘプタノン、又は酸性媒体における４‐ピペリジドン（ｐｉｐｅｒｉｄｉｄｏｎｅ）の反応から置換２，７‐ビス（ベンジリデン）シクロヘプタノン、及び３，５−ビス（ベンジリデン）‐Ｎ‐アルキル‐４‐ピペリドンの合成を開発し、これらの化合物は抗酸化特性及び化学抗癌剤作用を示した。
【０００６】
２００４年に非特許文献６に刊行された論文には、２，６‐ビス（（４‐ヒドロキシ‐３‐メトキシ‐フェニル）‐メチリデン）‐シクロヘキサノン由来の抗腫瘍・抗血管新生特性が評価された製品リストを含む。３，５‐ビス（２‐フルオロ‐ベンジリデン）‐４‐オキソ‐ピペリジンアセテート化合物が最も活性の高い化合物として際立つ。
【０００７】
最近、超音波技術による１，５‐ビス（４‐ヒドロキシ‐３‐メトキシ‐フェニル）ペンタ‐１，４‐ジエン‐３‐オン及びその誘導体、及びそれらのインビトロでの抗腫瘍性を得る新規な方法（非特許文献７）が刊行された。本発明の請求項で保護される抗腫瘍性を有する１，５‐ビス（４‐ヒドロキシ‐３‐メトキシ‐フェニル）ペンタ‐１，４‐ジエン‐３‐オンの合成誘導体を下記の化学式に示す。
【化１】
2010501473.tif 000002
更に、本発明の請求項において、そのような化合物の生体内毒物学的な結果、例えばＬＤ５０（５０％致死量）の値が保護された。
【０００８】
また、フェノール性ヒドロキシル基の存在により、該化合物が単塩及び複塩として扱われてもよいと考えるべきである。これらの誘導体は、これまで合成的又は生物学的に文献に記載されなかった。
【０００９】
前記の類似体のＯ‐アルキル化由来の生成物の合成又は生物学的特性評価は、これまで文献で報告されなかった。
【００１０】
２００２年に、Ｔｈａｙｕｍａｎａｖａｎと共同研究者によって、α，β−不飽和ケトンとニトロジエノフィル（ｎｉｔｒｏｄｉｅｎｏｐｈｉｌｅｓ）とのアミノ触媒によるディールス・アルダー反応により置換４‐ニトロ‐３，５‐ジアリール‐シクロヘキサノンが得られた（非特許文献８）。この研究によって、該化合物は高収率で生成された（最大収率８７％）が、エナンチオ選択性は低い。しかしながら、用いた方法は中間体である２‐アミノ‐１，３‐ブタジエンの分離を必要としない利点があり、ｉｎ  ｓｉｔｕで生成できるため、置換４‐ニトロ‐３，５‐ジアリール‐シクロヘキサノンが一工程で調製される。
【００１１】
Ｃｒａｗｓｈａｗと共同研究者（非特許文献９）は、４−ニトロ−３，５−ジアリール−シクロヘキサノンが固相で行われるマレイミドとニトロスチレンとの反応により得られることを示す。この方法により、適度な収率（３７〜８７％）だが、高純度（〜９０％）な生成物が得られる。
【００１２】
この１０年間で、Ｐａｄｍａｖａｔｈｉと共同研究者が二重結合に対するマイケル付加により、環状付加物、例えば、１，１‐ジシアノ‐３‐メチル‐６‐アリール‐４‐オキソシクロヘキサン誘導体等を得る研究に励んでいる（非特許文献１０）。Ｖ．Ｐａｄｍａｖａｔｈｉ等は、非特許文献１１に刊行された論文で、トリトンＢの存在下でマロノニトリルを１，５‐ジアリール‐２‐メチル‐１，４‐ペンタ‐ジエン‐３‐オンにマイケル付加することで１，１‐ジシアノ‐３‐メチル‐２‐フェニル‐６‐アリール‐４‐オキソシクロヘキサンを合成し、スピロヘテロ環を得るプロセスにおいてこれらの化合物は中間体として使用されることを報告した。
【００１３】
１９９８年に、Ｒｏｗｌａｎｄ等は、ジアリール置換シクロヘキサノンに対するＣ−１及びＣ−２位置の立体化学を研究し、塩基性条件下でトランス異性体からシス異性体への相互変換能力を示した。（非特許文献１２）。
【００１４】
上記化合物の生物学的用途及び本願に関する生物学的用途は、抗腫瘍及び抗寄生虫用途を含む。
【００１５】
癌又は新生物は、体のほぼすべての組織に影響を及ぼす異常細胞の制御されない増殖により特徴づけられる１００を超える疾患の総称である。毎年、１千百万人を超える人々に影響を及ぼし、毎年７百万人が死に至り、統計的には世界中の死者の１２．５％を占める（非特許文献１３から入手可能）。
【００１６】
メラノーマは、皮膚に生じる新生物である。しかし、粘膜表面から、又は神経堤細胞が移動する他の部位からも発生し、目（眼内メラノーマ）、髄膜、胃腸管、リンパ節等の他の場所にも発生しうる。腫瘍は、半数を超える場合が成人に生じ、通常の肌、及び太陽光に曝される肌の位置に明らかに生じる。男性は、体幹、頭、又は首に生じることが多い。女性は、下肢の遠位側三分の一により多く現れる。暗色皮膚の人々は、一般的にメラノーマが爪下領域、手のひら又は足底等にある。最も一般的な症状は、かゆみ、表面組織の変化、局所出血、均一な痛みである。メラノーマは、深刻な皮膚腫瘍である。悪性癌の進行は、一連のイベントによる。これらのイベントは、腫瘍細胞の継続的な成長、アポトーシスを避ける、及び増殖阻害シグナルを克服する、更に反応を発達させる、血管形成反応を維持する、隣接する組織へ浸潤する、遠隔臓器へ移動（転移）する能力である。浸潤及び転移は、腫瘍進行の重要な態様である。両プロセスとも、細胞外基質及び調節分子を退化させる接着分子、細胞骨格要素、プロテアーゼ間の連携によるレギュレーターとエフェクターとの局所的平衡から生じるようである。
【００１７】
最も使用されている治療薬はドキソルビシン、パクリタキセル、及びエトポシドである。下記表は、最も使用されている抗腫瘍剤の中の数種の薬量、５０％致死量、及びいくつかの副作用の値を示す。
【００１８】
下記表で分かるように、これらの薬剤は、患者の状態を損なう、又は患者の生活の質を非常に低下させる入院を必要とする不快で起こりがちな悪影響に加えて、有効量が比較的多く、治療指数が低い等の欠点がある。
【００１９】
寄生虫症に関しては、例えば、リーシュマニア症は、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）属の原生動物感染によって起こる病状であり、今日まで社会的経済的に重要な疾患であり、原生動物による寄生虫感染症では二番目にランクし、おそらくマラリアの次に重要である。世界保健機関  国連開発計画／世界銀行／ＷＨＯ−非特許文献１４の報告（インターネットで入手可能）によると、１９９６年には、８８カ国で患者が該疾患に冒され、１千２百万人が感染し、約３億５千万人が発症する恐れがあった。
【表１】
2010501473.tif 000003
【００２０】
該疾患を治療するために最も用いられている薬剤は、Ｎ−メチルグルカミンアンチモン酸塩、及びスチボグルコン酸ナトリウム等の五価アンチモン剤である。概して、両薬剤は、皮膚と内臓と両方のリーシュマニア症に対して良好な治療指数を示す。しかし、非経口投与経路により、該薬剤を用いる治療における主な問題として、寄生抵抗性及び薬物毒性が挙げられる（非特許文献１５）。
【００２１】
他の薬剤、例えば、アムホテリシンＢ、ペンタミジン、メフロキン、及びミルテホシンもまた、これらの寄生虫症の治療に用いられるが、アンチモン剤よりも薬効が低く、実際には、寄生抵抗性、又は不耐性患者の場合に用いられる（非特許文献１６）。
【００２２】
下記表は、リーシュマニア症の治療に用いられるいくつかの薬剤、その薬量、副作用、及び使用制限に関するコメントを示す。
【表２】
2010501473.tif 000004
【００２３】
上記表に示すように、リーシュマニア症の治療に有効な薬剤の使用制限は高毒性に関連し、いくつかの重度の副作用、及び広範囲な強度及び重症度の有害反応を生じるため、ときには治療を中止することになる。クラシック・ドラッグの利用が困難、又は実用的でない要因としては、投与経路が常に非経口である不便性によって、患者のコミットメントが妨げられる、あるいは入院が避けられない、治療に対する抵抗性、ある種又は寄生虫分離株により発展した薬剤耐性、患者により頻繁に中止される長期の治療期間が挙げられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２４】
【非特許文献１】Ｈ．ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｇｏｏｔ等  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３２，６２５−６３０，１９９７
【非特許文献２】Ｍ．Ａｒｔｉｃｏ等  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（ｖ．４１，３９４８−３９６０，１９９８）
【非特許文献３】Ｂｕｏｌｏｍｗｉｎｉ及びＡｓｓｅｆａ  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（４５，８４１−８５２，２００２）
【非特許文献４】Ｙｏｕｓｓｅｆ等  Ａｒｃｈ．Ｐｈａｒｍ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３３７，４２−５４，２００４
【非特許文献５】Ｙｏｕｓｓｅｆ等  Ａｒｃｈ．Ｐｈａｒｍ．Ｃｈｅｍ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．３３８，１８１−１８９，２００５
【非特許文献６】ｊｏｕｒｎａｌ  Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （１２，  ３８７１−３８８３，  ２００５）
【非特許文献７】Ｊ．  Ｑｕｉｎｃｏｃｅｓ等“Ｎｅｗ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  １，５−ｂｉｓ（４−Hｙｄｒｏｘｙ−３−ｍｅｔｈｏｘｙ−ｐｈｅｎｙｌ）ｐｅｎｔａ−１，４−ｄｉｅｎ−３−ｏｎｅ  ａｎｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ”：ＰＩ  ０２０７１４１−０；ＰＣＴ：０５．２８．２００５）
【非特許文献８】Ｔｈａｙｕｍａｎａｖａｎと共同研究者  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４３，３８１７−３８２０，２００２
【非特許文献９】Ｃｒａｗｓｈａｗと共同研究者  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，３８，７１１５−７１１８，１９９７
【非特許文献１０】Ｐａｄｍａｖａｔｈｉと共同研究者  Ｉｎｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ３  ＩＢ，１，４０７−４１０，１９９２
【非特許文献１１】Ｖ．Ｐａｄｍａｖａｔｈｉ等  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｈｅｍ．，４２，７９７−８０２，２００５，
【非特許文献１２】Ｒｏｗｌａｎｄ等  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６３，４３５９−４３６５，１９９８
【非特許文献１３】世界保健機関、癌、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｃａｎｃｅｒ／ｅｎ，アクセス日２２／０９／２００５
【非特許文献１４】Ｓｐｅｃｉａｌ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  ｔｒａｉｎｉｎｇ  ｉｎ  ｔｒｏｐｉｃａｌ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  （ｈｔｔｐ：／／ｗｈｏ．ｃｈ／ｐｒｏｇｒａｍｍｅｓ／ｔｄｒ／ｗｏｒｋｐｌａｎ／ｌｅｉｓｈｍａｎ．ｈｔｍ，アクセス日０９／２２／２００５
【非特許文献１５】Ｒｅｖ．Ｓｏｃ．Ｂｒａｓ．Ｍｅｄ．Ｔｒｏｐ．３３（６），５３５−５４３，２０００
【非特許文献１６】Ｔｒｏｐ．Ｄｉｓ．Ｈｙｇ．８，３１９−３４２，２００２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
本発明は、ヒト及び動物の新生物、寄生虫症を治療する上記薬剤の使用、各種の疾患に対する適切な治療療法の決定、該化合物から２つ以上を組み合わせることによる相乗効果の決定、並びに活性化合物の作用様式、毒性、及び上記疾患、及び他の相関性のある疾患に対して現在治療に用いられている薬剤よりも好ましい結果が表れる上記化合物族に対する他の薬理学的要因の決定に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、ＨＢ−１で処置した後のＢ１６Ｆ１０マウスメラノーマ成長（体積）の評価を示す。
【図２】図２は、ＨＢ−１で処置した後のＢ１６Ｆ１０マウスメラノーマ成長（面積）の評価を示す。
【図３】図３は、対照群：ミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）８１０（登録商標）を示す。Ａは色素沈着した背部結節性腫瘍を示す。
【図４】図４は、対照群：ミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）８１０（登録商標）を示す。Ａは色素沈着した背部結節性腫瘍を示す。
【図５】図５は、対照群：ミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）８１０（登録商標）を示す。Ａは背部腫瘍を示す。広範囲で周辺への浸潤が観察される。
【図６】図６は、ミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）８１０（登録商標）で希釈したＨＢ−１化合物を用いる処置群の背部腫瘍を示す。Ａは、ＨＢ−１化合物で処置した背部腫瘍を示す。Ｂは、ネクローシスを示す。
【図７】図７は、ミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）８１０（登録商標）で希釈したＨＢ−１化合物を用いる処置群の背部腫瘍を示す。
【図８】図８は、ミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）８１０（登録商標）で希釈したＨＢ−１化合物を用いる処置群の背部腫瘍を示す。Ａは、背部腫瘍を示す。腫瘍周辺に滲出液が観察される。
【図９】図９は、ミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）８１０（登録商標）で希釈したＨＢ−１化合物を用いる処置群の背部腫瘍を示す。広範囲で周辺の潅注が観察される。Ａは、腫瘍周辺の滲出液を示す。Ｂは、血管系及びネクローシスを示す。
【図１０】図１０は、ＨＢ−１  １５ｍｇ／ｋｇで処理したＢｌ６Ｆ１０メラノーマの細胞周期の分析を示す。
【図１１】図１１は、Ｂｌ６Ｆ１０マウスメラノーマ細胞における毒性アッセイ（ＨＢ−１）を示す。
【図１２】図１２は、Ｂｌ６Ｆ１０マウスメラノーマ細胞に対するミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）８１０（登録商標）で希釈したＨＢ−１化合物の細胞毒性増殖抑制効果を示す。
【図１３】図１３は、正常な腹膜マクロファージに対するミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）８１０（登録商標）で希釈したＨＢ−１化合物の細胞毒性増殖抑制効果を示す。
【図１４】図１４は、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ腫瘍を有する動物の悪液質指数の評価を示す。
【図１５】図１５は、メラノーマＢｌ６Ｆ１０を注入したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに対するＨＢ−２化合物、ＨＢ−１＋ＨＢ−２（併用）、及びミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）（対照）の評価を示す。
【図１６】図１６は、メラノーマＢｌ６Ｆ１０を注入したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに対するＨＢ−２化合物、ＨＢ−１＋ＨＢ２（併用）の評価（面積）を示す。
【図１７】図１７は、Ｂｌ６Ｆ１０メラノーマ細胞に対するミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）８１０（登録商標）で希釈したＨＢ−１化合物の細胞毒性増殖抑制効果を示す。
【図１８】図１８は、正常ヒト皮膚線維芽細胞に対するミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）８１０（登録商標）で希釈したＨＢ−２化合物、及びミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）８１０（登録商標）（対照）の増殖抑制及び細胞毒性効果のＭＴＴ方法による評価を示す。
【図１９】図１９は、Ｂｌ６Ｆ１０メラノーマ細胞に対する一ナトリウム化合物の増殖抑制及び細胞毒性効果の評価を示す。
【図２０】図２０は、Ｂｌ６Ｆ１０メラノーマ細胞に対する二ナトリウム化合物の増殖抑制及び細胞毒性効果の評価を示す。
【図２１】図２１は、Ｔリンパ球に対するＤＭ−２化合物の増殖抑制及び細胞毒性効果の評価を示す。
【図２２】図２２は、静脈内注射によりＢａｌｂ−ｃマウスに投与された一ナトリウム化合物の毒性を示す。
【図２３】図２３は、背部メラノーマ腫瘍の顕微鏡写真を示す。Ａは、色素沈着した背部結節性腫瘍の存在を示す。Ｃは、炎症性白血球浸潤がない、色素沈着した背部結節性腫瘍の存在を示す。
【図２４】図２４は、背部メラノーマ腫瘍の顕微鏡写真を示す。Ｂは、広範囲にネクローシスがある色素沈着した背部結節性腫瘍の存在を示す。Ｃは、炎症性白血球浸潤がない、色素沈着した背部結節性腫瘍の存在を示す。
【図２５】図２５は、ミメラノーマ背部腫瘍を注入したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）８１０（登録商標）で希釈したＨＢ−１化合物を腹腔内投与により処置した１４日間後の顕微鏡写真である。Ａは、腫瘍内及び腫瘍周辺部分の炎症性白血球浸潤が集中的に存在することを示す。
【図２６】図２６は、メラノーマ背部腫瘍を注入したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）８１０（登録商標）で希釈したＨＢ−１化合物を腹腔内投与により処置した１４日後の顕微鏡写真である。Ｂは、広範囲のネクローシス領域を伴う浸潤した結節性腫瘍塊を示す。
【図２７】図２７は、メラノーマ背部腫瘍を注入したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）８１０（登録商標）を腹腔内投与した１４日後の顕微鏡写真である。Ａは、色素沈着した背部結節性腫瘍を示し、Ｂは広範囲のネクローシスを伴う色素沈着した背部結節性腫瘍血管新生（＊）を示す。
【図２８】図２８は、メラノーマ背部腫瘍を注入したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）８１０（登録商標）希釈剤を腹腔内投与した１４日後の顕微鏡写真である。Ａは、色素沈着した背部結節性腫瘍を示し、Ｃは、腫瘍内及び腫瘍周辺部分の炎症性浸潤白血球がない色素沈着した背部結節性腫瘍を示す。Ｄは、広範囲のネクローシスを伴う色素沈着した背部結節性腫瘍血管新生（＊）を示す。
【図２９】図２９は、ミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）８１０（登録商標）で希釈したＨＢ−１化合物処置群の背部メラノーマ腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの肺実質の顕微鏡写真である。
【図３０】図３０は、ミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）８１０（登録商標）処置群の背部メラノーマ腫瘍を有する５７ＢＬ／６Ｊマウスの肺実質の顕微鏡写真である。
【図３１】図３１は、保存状態の良い肝実質細胞、良好に確定された小葉、及び放射状の小柱を示す肝実質切片の顕微鏡写真である。
【図３２】図３２は、一般的な良好に保存された腎小体、良好に保存された遠位及び近位尿細管を示す構造的変化のない腎実質の顕微鏡写真である。
【図３３】図３３は、ウォーレン（Ｗａｒｒｅｎ）培地で培養した前鞭毛型アマゾンリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ａｍａｚｏｎｅｎｓｉｓ）に対するＨＢ−１化合物の効果を示す。
【図３４】図３４は、ＲＰＭＩ培地で培養した前鞭毛型アマゾンリーシュマニアに対するＨＢ−１化合物の効果を示す。
【図３５】図３５は、ＲＰＭＩ培地においてＨＢ−１で処理した前鞭毛型アマゾンリーシュマニア（Ｌ）の生存能力を示す。
【図３６】図３６は、ＨＢ−１の存在下ウォーレン培地で培養された前鞭毛型リーシュマニア（Ｌ．Ｃ．Ｌ．分離株）に対するＨＢ−１化合物の効果を示す。
【図３７】図３７は、ＨＢ−１の存在下ウォーレン培地で培養された前鞭毛型リーシュマニア（Ｄ．Ｃ．Ｄ．分離株）に対するＨＢ−１化合物の効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
パート１：誘導体の合成、分離、及び特性解析
本発明は、１，５−ビス（４−ヒドロキシ−３−メトキシ−フェニル）ペンタ−１，４−ジエン−３−オンから、１：１及び１：２（モル比）の金属アルコキシドの存在下でそれぞれ、４−［５−（４−ヒドロキシ−３−メトキシ−フェニル）−３−オキソ−ペンタ−１，４−ジエニル］−２−メトキシ−フェノラート及び３−オキソ−ペンタ−１，４−ジエニル−ビス（２−メトキシ−フェノラート）を調製することに関する。好ましくは、１，５−ビス（４−ヒドロキシ−３−メトキシ−フェニル）ペンタ−１，４−ジエン−３−オンを各アルコキシドのアルコール溶液と接触させ、その後、固体になるまで溶液を回転蒸発（ｒｏｔｏｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）させる。構造中に２つのフェノール基が存在するため単塩及び複塩誘導体が得られ、その割合は試薬のモル比によって調整される。得られたフェノラートは、水により容易に溶解する微細な粉末を得るためにふるいにかけられ、本明細書に後に記載する生物学的試験に使用される。抗寄生虫及び抗腫瘍性を有する１，５−ビス（４−ヒドロキシ−３−メトキシ−フェニル）ペンタ−1，４−ジエン−３−オンの他の単塩及び複塩誘導体を下記式で表す。
【化２】
2010501473.tif 000005
式中、Ｘは、酸素原子、マロノニトリル基、又はアルキルシアノアセテートでもよい；Ｙは、水素、又はフェノキシドイオンの形態として化合物を安定させる金属カチオンである；Ｚは、ニトロ及びアミノ基、又は該位置に関しては無置換となる化合物を与える基（Ｚ＝Ｈ）；Ｍは、化合物をフェノキシドイオンの形態として安定化する金属カチオンを表す。
【００２８】
また、本発明は、抗寄生虫及び抗腫瘍性を有する他の１，５−ビス（４−ヒドロキシ−３−メトキシ−フェニル）ペンタ−１，４−ジエン−３−オン誘導体を調製する新規の方法に関する。
【００２９】
下記式は、抗寄生虫及び抗腫瘍性を有する１，５−ビス（４−ヒドロキシ−３−メトキシ−フェニル）ペンタ−１，４−ジエン−３−オンの新規に合成された誘導体を表す。
【化３】
2010501473.tif 000006
式中、Ｘは、酸素及びマロノニトリルから変わり；Ｚはニトロ基または水素基からなり；Ｙはベンゾイル、メチル、クロロエチル、アセチル、カルボキシメチレン等の基、及び非置換化合物を構成する水素原子からなる。
【００３０】
同じアシル化又はアルキル化ペンタジエノンは、下記式に示すように、対応する置換アシル化又はアルキル化アルデヒド、及びケトンを酸性培地で、温度を２５〜６０℃に変化させ、２５〜４０ＫＨｚの範囲で超音波照射して１〜７日間放置することで得られる。
【化４】
2010501473.tif 000007
式中、Ｘは、酸素及びマロノニトリルを表し、Ｚは、ニトロ基又は水素原子を表し、Ｙは、ベンゾイル、メチル、クロロエチル、アセチル、カルボキシメチレン基、及び無置換化合物を形成する水素原子を表し、前記そのコードにより同定された１，５−ビス（４−ヒドロキシ−３−メトキシ−フェニル）ペンタ−１，４−ジエン−３−オンから合成されるのと同じ誘導体化合物となる。
【００３１】
本発明は、また、マイケル付加反応条件化で、それぞれ置換１，５−ビス（アリール）ペンタ−１，４−ジエン−３−オン、及びニトロアルカン、又はマロン酸誘導体を混合してなる置換４−ニトロ−３，５−ジアリール−シクロヘキサノン、又は置換２，６−ジアリール−シクロヘキサノンを調製するための新規の方法に関する。好ましくは、置換１，５−ビス（アリール）ペンタ−１，４−ジエン−３−オン及びニトロアルカン、又はマロン酸誘導体を、モル比１：１で、温度２０〜６０℃、１〜８時間、２５〜４０ＫＨｚの範囲で超音波照射して反応させる。
【００３２】
下記式は、抗腫瘍及び抗寄生虫性を示す合成された新規なシクロヘキサノン誘導体（置換４−ニトロ−３，５−ジアリール−シクロヘキサノン、及び置換２，６−ジアリール−シクロヘキサノン）を表す。
【化５】
2010501473.tif 000008
Ｃ１７：Ａｒ＝３，５−ジ（フル−２−イル）；Ｙ＝ＮＯ２；Ｚ＝Ｈ
Ｃ１８：Ａｒ＝３，５−ジ（フル−２−イル）；Ｙ＝ＮＯ２；Ｚ＝Ｍｅ
Ｃ１９：Ａｒ＝３，５−ジフェニル；Ｙ＝ＮＯ２；Ｚ＝Ｍｅ
Ｃ２０：Ａｒ＝３，５−ビス［４−（２クロロ−エトキシ）−３−メトキシ−フェニル］；Ｙ＝ＮＯ２；Ｚ＝Ｈ
Ｃ２１：Ａｒ＝３，５−ビス［３，４−ジメトキシ−フェニル］；Ｙ＝ＮＯ２；Ｚ＝Ｈ
Ｃ２２：Ａｒ＝３，５−ビス［４−カルボキシメトキシ−３−メトキシ−フェニル］；Ｙ＝ＮＯ２；Ｚ＝Ｈ
Ｃ２３：Ａｒ＝３，５−ビス［４−アセトキシ−３−メトキシ−フェニル］；Ｙ＝ＮＯ２；Ｚ＝Ｈ
Ｃ２４：Ａｒ＝３，５−ビス［４−ベンゾイルオキシ−３−メトキシ−フェニル］；Ｙ＝ＮＯ２；Ｚ＝Ｈ
Ｃ２５：Ａｒ＝３，５−ビス［３−メトキシ−４−（３−メチル−ブタ−２−エニルオキシ）−フェニル］；Ｙ＝ＮＯ２；Ｚ＝Ｈ
Ｃ２６：Ａｒ＝３，５−ビス［３−メトキシ−４−（３−メチル−ブタ−２−エニルオキシ）−フェニル］；Ｙ＝ＣＮ；Ｚ＝ＣＮ
塩基＝金属アルコキシド又はトリトンＢ
Ｒ＝アルキル基；Ｘ＝ＣＮ又はＣＯＯＲ
式中、Ａｒは、３，４−ジメトキシフェニル；４−カルボキシメトキシ−３−メトキシ−フェニル；４−アセトキシ−３−メトキシ−フェニル；３−メトキシ−４−（３−メチル−ブタ−２−エニルオキシ）−フェニル；４−（２−クロロ−エトキシ）−３−メトキシ−フェニル；４−ベンゾイルオキシ−３−メトキシ−フェニル、（即ちアリール）等の芳香族基、又はフラン及びチオフェン等の複素環式芳香族を含み、Ｙは、ニトロ基又はシアノ基であり、Ｚは水素原子、及びメチル基及びシアノ基を含む。試薬としては、Ｒはアルキルであり、Ｘはアルコキシカルボニル基又はシアノ基である。
【００３３】
置換４−ニトロ−３，５−ジアリール−シクロヘキサノン、又は置換２，６−ジアリール−シクロヘキサノンは、置換アルデヒド触媒の存在下、酸性又は塩基性媒質中において、それぞれ、置換２，６−ジベンジリデン−４−ニトロ−３，５−ジアリール−シクロヘキサノン、又は置換３，５−ジベンジリデン−２，６−ジアリール−シクロヘキサノンに変換される。
【化６】
2010501473.tif 000009
上記式は抗腫瘍及び抗寄生虫性を示す置換２，６−ジベンジリデン−４−ニトロ−３，５−ジアリール−シクロヘキサノン、及び置換３，５−ジベンジリデン−２，６−ジアリール−シクロヘキサノンの新規に合成された誘導体を示す。
Ｃ２７：Ｘ＝Ｏ；Ｙ＝ＮＯ２；Ｚ＝Ｍｅ；Ｒ＝２，６−ビス−フラン−２−イル−メチレン；Ａｒ＝３，５−ビス（フル−２−イル）
Ｃ２８：Ｘ＝Ｏ；Ｙ＝ＮＯ２；Ｚ＝Ｍｅ；Ｒ＝２，６−ビス−フラン−２−イル−メチレン；Ａｒ＝３，５−ジフェニル
Ｃ２９：Ｘ＝Ｏ；Ｙ＝ＮＯ２；Ｚ＝Ｍｅ；Ｒ＝２，６−ビス（５−ブロモ（ｂｒｏｍｕｍ）−フル−２−イル）メチレン］Ａｒ＝３，５−ジフェニル
Ｃ３０：Ｘ＝Ｏ；Ｙ＝ＮＯ２；Ｚ＝Ｈ；Ｒ＝２，６−ビス−フラン−２−イル−メチレン；Ａｒ＝３，５−ビス（３，４−ジメトキシ−フェニル）
Ｃ３１：Ｘ＝Ｏ；Ｙ＝ＮＯ２；Ｚ＝Ｈ；Ｒ＝２，６−ビス（３，４−ジメトキシ−フェニル）；Ａｒ＝３，５−ビス（３，４−ジメトキシ−フェニル）
Ｃ３２：Ｘ＝Ｏ；Ｙ＝ＮＯ２；Ｚ＝Ｈ；Ｒ＝２，６−ビス−フラン−２−イル）メチレン；Ａｒ＝３，５−ビス−［３−メトキシ−４−（３−メチル−ブタ−エニルオキシ）−フェニル］
Ｃ３３：Ｘ＝Ｏ；Ｚ＝Ｈ；Ｙ＝ＮＯ２；Ｒ＝２，６−ビス（３，４−ジメトキシ−フェニル）；Ａｒ＝３，５−ビス−［３−メトキシ−４−（３−メトキシ−ブタ−２−エニルオキシ）−フェニル］
Ｃ３４：Ｘ＝Ｃ（ＣＮ）２；Ｚ＝Ｈ；Ｙ＝ＮＯ２；Ｒ＝２，６−ビス（３，４−ジメトキシ−フェニル）；Ａｒ＝３，５−ビス−［３−メトキシ−４−（３−メチル−ブタ−２−エニルオキシ−フェニル］
Ｃ３５：Ｘ＝Ｃ（ＣＮ）２；Ｚ＝Ｈ；Ｙ＝ＮＯ２；Ｒ＝２，６−ビス−フラン−２−イル−メチレン；Ａｒ＝３，５−ビス−［３−メトキシ−４−（３−メチル−ブタ−２−エニルオキシ）−フェニル］
式中、Ｘは、酸素原子又はＣ（ＣＮ）２若しくはＣ（ＣＮ）ＣＯＯＲ基であり、Ｚは、メチル、水素、又はシアノ基であり、Ｙは、ニトロ基又はシアノ基等一定であり、Ｒは、３，４−ジメトキシフェニル；４−カルボキシメトキシ−３−メトキシ−フェニル；４−アセトキシ−３−メトキシ−フェニル；３−メトキシ−４−（３−メチル−ブタ−２−エニルオキシ）−フェニル；４−（２−クロロ−エトキシ）−３−メトキシ−フェニル；４−ベンゾイルオキシ−３−メトキシ−フェニル、（即ちアリール）、並びにフラン及びチオフェン等の複素環式芳香族である。
【００３４】
これらの発明は、下記実施例の実施により説明される。
実施例１：ナトリウム４−［５−（４−ヒドロキシ−３−メトキシ−フェニル）−３−オキソ−ペンタ−１，４−ジエニル］−２−メトキシ−フェノレートの調製（ＤＭ２）
【化７】
2010501473.tif 000010
モル比１：１の金属アルコキシド存在下、１，５−ビス（４−ヒドロキシ−３−メトキシ−フェニル）ペンタ−１，４−ジエン−３−オンから調製する。好ましくは、１，５−ビス（４−ヒドロキシ−３−メトキシ−フェニル）ペンタ−１，４−ジエン−３−オンを、各アルコキシドのアルコール溶液と混合し、次に、固体が生成するまで溶液を回転蒸発（ｒｏｔｏｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）させる。単塩を高収率で得ても良い。得られたフェノラートは、水により容易に溶解する微粉末を得るために篩過され、本明細書に後に記載する生物学的試験に使用される。
生成物は黒赤色を示す。
一般式：Ｃ１９Ｈ１７Ｏ５Ｎａ  分子量：３４８
収率：９０％
構造的特徴の結果：
ＵＶ‐ＶＩＳ：水中での最大吸収３８８ｎｍ
【００３５】
塩酸による酸性化により、単塩が対応する１，５−ビス（４−ヒドロキシ−３−メトキシ−フェニル）ペンタ−１，４−ジエン−３−オンに変換され、エチルエーテル、又はクロロホルム、又はエチルアセテートで抽出される。分離された化合物の構造的特徴の結果は以下の通りである。
１，５−ビス−（４−ヒドロキシ−３−メトキシ−フェニル）−ペンタ−１，４−ジエン−３−オン。これは、またＨＢ−１と表される。
【化８】
2010501473.tif 000011
一般式：Ｃ１９Ｈ１８Ｏ５  分子量＝３２６
融点：１４０℃  収率：９２％
定量元素分析の結果
計算値              実測値
Ｃ  ６９．９４％  Ｃ  ６９．９１％
Ｈ  ５．５２％    Ｈ  ５．４９％
分光分析
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：７．７（ｄ，２Ｈ，Ｈ−１’，Ｈ−５’）；７．１９（ｍ，Ｈ−２，Ｈ−５，Ｈ−６）；４．０（ｓ，６Ｈ，ＭｅＯ）ｐｐｍ．
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：１８８（Ｃ−３’）；１４８（Ｃ−１’，Ｃ−５’）；１４６（Ｃ−３）；１４３（Ｃ−４）；１２８（Ｃ−２’，Ｃ−４’）；１２２．９（Ｃ−１）；１１６．５（Ｃ−６）；１１０（Ｃ−２，Ｃ−５）；５６（メトキシ基の炭素）ｐｐｍ．
ＩＶ(ｆｉｌｍ)：３３９６(ＯＨ  ｂａｎｄ）；２９６２（Ｃｓｐ２Ｈ）；２８４１（Ｃｓｐ３Ｈ）；１５８７（Ｃ＝Ｏ結合体）ｃｍ−１．
ＭＳ（７０ｅＶ）：３２７（Ｍ＋＋＋Ｈ）；ＣＯ基に対応する２８（３２７．３−２９９．３）、メトキシ基に対応する３２（Ｍ＋−２９５）、メチル基に対応する１５（２０３−１８８）。
【００３６】
実施例２：二ナトリウム３−オキソ−ペンタ−1，４−ジエニル−ビス（２−メトキシ−フェノラート）の調製（ＤＭ１）
【化９】
2010501473.tif 000012
モル比１：２の金属アルコキシド存在下、１，５−ビス（４−ヒドロキシ−３−メトキシ−フェニル）ペンタ−１，４−ジエン−３−オンから調製する。好ましくは、１，５−ビス（４−ヒドロキシ−３−メトキシ−フェニル）ペンタ−１，４−ジエン−３−オンを、各アルコキシドのアルコール溶液と混合し、次に、固体になるまで溶液を回転蒸発（ｒｏｔｏｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）させる。複塩を高収率で得ることができる。得られたフェノラートは、水により容易に溶解する微細な粉末を得るためにふるいにかけられ、本明細書に後に記載する生物学的試験に使用される。
生成物は黒赤色を示す。
一般式：Ｃ１９Ｈ１６Ｏ５Ｎａ２  分子量：３７０
収率：９５％
構造的特徴の結果
ＵＶ‐ＶＩＳ：水中での最大吸収３７０ｎｍ
【００３７】
塩酸酸性化により、対応する複塩が対応する１，５−ビス（４−ヒドロキシ−３−メトキシ−フェニル）ペンタ−１，４−ジエン−３−オンに変換され、エチルエーテル、又はクロロホルム、又はエチルアセテートにより抽出される。化合物の特徴は上記と同じ結果である。
【００３８】
実施例３：３，５−ビス−［３−メトキシ−４−（３−メチル−ブタ−２−エニルオキシ）−フェニル］−４−ニトロ−シクロヘキサノン（Ｃ−２５）の調製
【化１０】
2010501473.tif 000013
調製手順Ａ
事前に、ジメチルホルムアミド５〜２０ｍＬ、無水炭酸カリウム１．３８ｇ（０．０１ｍｏｌ）、及びニトロメタン０．０１ｍｏｌ（０．５４ｍＬ）を含む混合物を調製し、還流下、２０〜７０℃で３０〜６０分間撹拌しながら加熱する。その後、適量のジメチルホルムアミドに溶解した１，５−ビス［３−メトキシ−４−（３−メチル−ブタ−２−エニルオキシ）−フェニル］ペンタ−1，４−ジエン−３−オン化合物０．００１ｍｏｌ（５４０ｍｇ）を加え、撹拌しながら５〜１５時間加熱する。その後、混合物を水及び氷に滴下し、酸化して、必要に応じてエチルアセテートで抽出し、有機相を蒸留水で洗う。無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を回転蒸発（ｒｏｔｏｅｖａｐｏｒａｔｅ）させて反応生成物を得る。
【００３９】
調製手順Ｂ
この調製手順では、超音波技術が使用され、１，５−ビス［３−メトキシ−４−（３−メチル−ブタ−２−エニルオキシ）−フェニル］ペンタ−１，４−ジエン−３−オン０．００１ｍｏｌ（５４０ｍｇ）をジメチルホルムアミド５〜２０ｍＬ、無水炭酸カリウム０．０１ｍｏｌ（１．３８ｇ）、及びニトロメタン０．０１ｍｏｌ（０．５４ｍＬ）と混合し、３０〜７０℃で３〜１０時間反応させる。反応の終了後、前記調製手順１と同様にプロセスを進める。
生成物は茶色がかっている。
一般式：Ｃ３０Ｈ３７ＮＯ７  分子量：５２３
収率：９５％
定量分析の結果
計算値                実測値
Ｃ  ６８．８３％    Ｃ  ６８．７９％
Ｈ  ７．０７％      Ｈ  ７．１０％
Ｎ  ２．６８％      Ｎ  ２．６５％
分光分析
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：６．９〜６．６（ｍ，３Ｈ，Ｈ−２，Ｈ−５，Ｈ−６）；５．５（ｍ，２Ｈ，Ｈ−２’）；５．２（ｔ，１Ｈ，Ｈ−４”）；４．５９（ｄ，４Ｈ，Ｈ−１’）；３．８０及び３．８８（ｓ，６Ｈ，２ＭｅＯ基）；３．０〜２．８（ｍ，６Ｈ，Ｈ−６”，Ｈ−２”，Ｈ−３”，Ｈ−５”）；１．７８（ｓ，６Ｈ，Ｍｅ），１．７３（ｓ，６Ｈ，Ｍｅ）ｐｐｍ．
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：２０８．０（ＣＯ）；１４９，０（Ｃ−３）；１４８．０（Ｃ−４）；１３８．０（Ｃ−３’）；１３２．７（Ｃ−１）；１２９．１（Ｃ−６）；１２０．７（Ｃ−２’）；１１３，１（Ｃ−２）；１１１．２（Ｃ−５）；９２．２（Ｃ−４”）；６６．８（Ｃ−１’）；５６．１（ＭｅＯ）；４３．０（Ｃ−２”，Ｃ−６”）；４２．０（Ｃ−３”，Ｃ−５”）；２６．０（Ｃ−４’）；１９．３（Ｃ−４’）ｐｐｍ．
ＩＶ（ｆｉｌｍ）：２９７０（Ｃｓｐ２−Ｈ）；２９３３，２９１６（Ｃｓｐ３−Ｈ）；１７１２（Ｃ＝Ｏ非共役），１５１４ｅ１３８１（ＮＯ２）ｃｍ−１．
【００４０】
実施例４：３，５−ビス−（フル−２−イル）−４−ニトロ−１−シクロヘキサノンの調製
ジビニルケトンに対するニトロアルカンのマイケル付加による置換環式γ−ニトロケトンの合成
【化１１】
2010501473.tif 000014
調製手順Ａ
無水ＭｅＯＨ  ５〜２０ｍＬ中のナトリウム溶液３０ｍｍｏｌ（０．６９ｇ）に対してニトロアルカン４０ｍｍｏｌを加えて得たニトロアルカンナトリウム塩のペースト状溶液を、無水ＭｅＯＨ  ２０〜４０ｍＬ中の対応するジビニルケトン混合物２０ｍｍｏｌに加える。混合物を４〜８時間激しく撹拌し、氷で外部冷却して激しくゆっくりと撹拌し、氷酢酸で酸性化する。生成物が結晶化するまで、混合物を５〜１２時間冷却し、濾過してＭｅＯＨで洗浄する。残留水相は、ジエチルエーテルで抽出し、水洗して無水硫酸ナトリウムで乾燥する。エーテル抽出物は、回転蒸発器（ｒｏｔｏｅｖａｐｏｒａｔｏｒ）で濃縮され、得られたオイルは熱いＭｅＯＨで結晶化する。
【００４１】
調製手順Ｂ
ジビニルケトン１ｍｍｏｌ、ニトロアルカン５ｍｍｏｌ、無水炭酸カリウム１．４ｍｍｏｌ（０．２ｇ）をＥｔＯＨ  ５〜２０ｍＬに混ぜる。混合物を５〜１０時間還流する。反応の最後に、試薬混合物に水２０〜４０ｍＬを加え、クロロホルムで抽出する（３×１０ｍＬ）。クロロホルム抽出物は、十分な量の蒸留水で洗浄され、無水硫酸ナトリウムで乾燥され、オイル構造体になるまで溶媒を回転蒸発（ｒｏｔｏｅｖａｐｏｒａｔｅ）させる。このオイルは、熱いＥｔＯＨ及び活性木炭で処理され、減圧下で濾過することで分離する固体を生成する。
【００４２】
調製手順Ｃ
この合成変異体を得るために手順Ａと同様に反応が行われるが、エネルギー源として超音波照射３０〜７０ｋＨｚを１〜４時間間隔で使用する。生成物は、手順Ａと同様に分離され、精製される。
【００４３】
３ＲＳ−（３α，４β，５β）−３，５−ジ（フル−２−イル）−４−ニトロ−１−シクロヘキサノン
白色結晶  収率：手順Ａ：６０％；手順Ｂ：４７％；手順Ｃ：７５％
融解温度：９２℃
分子式Ｃ１４Ｈ１３ＮＯ５（Ｍ＝２７５．２６）
【表３】
2010501473.tif 000015
ＥＭ：ＩＥ（７０ｅＶ），［Ｍ］＋＝２７５（１２），２４５（Ｈ），２２８（７６），２００（５３），１６１（４０），１０７（１００），９４（４１），６５（３０）．
ＩＲ：（ＫＢｒ）１７２０ｃｍ−１（ＣＯ），１５５０，１３７２．５ｃｍ−１（ＮＯ２）．
１Ｈ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３），δ（ｐｐｍ）：７．３４（２Ｈ，ｍ，Ｈ−５Ｆｕｒ），６．２９（２Ｈ，ｄｄ，Ｈ−４Ｆｕｒ），６．１４（２Ｈ，ｄ，Ｈ−３Ｆｕｒ），５．４４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ４−３ａ＝１３．２３Ｈｚ，Ｊ４−５ｅ＝６．６Ｈｚ，Ｈ−４），４．０７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ３ａ−４＝１３．２Ｈｚ，Ｊ３−２＝６．６Ｈｚ，Ｈ−３ａｘ），３．８（１Ｈ，ｍ，Ｊ５−６ｅ＝３．９Ｈｚ，Ｊ５−４＝５．５３Ｈｚ，Ｊ５−６ａ＝９．３Ｈｚ，Ｈ−５ｅｃ），３．０５（２Ｈ，ｍ，Ｈ−２ａｘ，Ｈ−６ａｘ），２．８（２Ｈ，ｍ，Ｈ−２ｅｃ，Ｈ−６ｅｃ）．
１３Ｃ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３），δ（ｐｐｍ）：２０４．６１（ＣＯ），１５１．３２，１５０．４８，１４２．９１，１４２．７５，１１０．７０，１１０．５５，１０８．２６，１０８．１２，（２  Ｃ−２，２  Ｃ−５，２  Ｃ−４，２  Ｃ−３，Ｃ４Ｈ３Ｏ），８６．０６（Ｃ−４），４０．９６，４０．８９（Ｃ−２，Ｃ−６），３７．３０，３７．１８（Ｃ−３，Ｃ−５）．
【００４４】
３ＲＳ−（３α，4β，５α）］−３，５−ジ（フル−２−イル）−４−メチル−４−ニトロ−１−シクロヘキサノン
白色スケール収率：手順Ａ：２８％；手順Ｃ：４０％
融解温度１３０〜１３１℃
分子式：Ｃ１５Ｈ１５ＮＯ５（Ｍ＝２８９．２９）
【表４】
2010501473.tif 000016
ＥＭ：ＩＥ（７０ｅＶ），［Ｍ］＋＝２８９（２．５），２４２（８０），２２７（５０），１９９（３０），１２１（１００），９４（８０），８１（７５），６５（４８），３９（６３）．
ＩＲ：（ＫＢｒ）１７２８ｃｍ−１（ＣＯ），１５５２，１３５２ｃｍ−１（ＮＯ２）．
１Ｈ−ＮＭＲ：（ＤＭＳＯ−ｄ６），δ（ｐｐｍ）：７．６（２Ｈ，ｍ，Ｊ５−４＝１．８Ｈｚ，Ｈ−５Ｆｕｒ），６．４（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ４−３＝３．２Ｈｚ，Ｊ４−５＝１．８７Ｈｚ，Ｈ−４Ｆｕｒ），６．２（２Ｈ，ｄ，Ｈ−３Ｆｕｒ），４．３５（２Ｈ，ｃ，Ｊ３−２ｅ＝４．５Ｈｚ，Ｊ３−２ａ＝１４．１７Ｈｚ，Ｈ−３，Ｈ−５），３．０２（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ２ａ−３＝１４．１Ｈｚ，Ｊ２ａ−２ｅ＝１６．４Ｈｚ，Ｈ−２ａｘ，Ｈ−６ａｘ），２．６（２Ｈ，ｍ，Ｊ２ｅ−３＝４．５８Ｈｚ，Ｈ−２ｅｃ，Ｈ−６ｅｃ），１．４（３Ｈ，ｓ，Ｍｅ）．
１３Ｃ−ＮＭＲ：（ＤＭＳＯ−ｄ６），δ（ｐｐｍ）：２０３．７３（ＣＯ），１５０．８３，１４３．１０，１１０．４２，１０８．２７（２  Ｃ−２，２  Ｃ−５，２  Ｃ−４，２  Ｃ−３，Ｃ４Ｈ３Ｏ），９４．２１（Ｃ−４），４２．７５（Ｃ−３，Ｃ−５），４０．６２（Ｃ−２，Ｃ−６），１１．８６（Ｍｅ）．
【００４５】
３ＲＳ−（３α，４β，５α）］−３，５−ジフェニル−４−メチル，４−ニトロ−１−シクロヘキサノン
白色針状結晶  収率：手順Ｃ８５％（Ｌｉｔ．４０％）
融解温度１８７〜１８８℃（Ｌｉｔ．１８８℃）
分子式：Ｃ１９Ｈ１９ＮＯ３（Ｍ＝３０９．３６）
【表５】
2010501473.tif 000017
ＥＭ：ＩＥ（７０ｅＶ），［Ｍ］＋＝３０９（１．５），［Ｍ＋１］＋＝３１０（１），２８０（２），２６０（６５），２４７（８），２１９（８），２０５（１２），１７５（１７），１５９（３８），１３１（１００），１０４（７７），９１（７３），７７（２３）．
ＩＲ：（ＫＢｒ）１７２５ｃｍ−１（ＣＯ），１５３８，１３４１ｃｍ−１（ＮＯ２）．
１Ｈ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３），δ（ｐｐｍ）：７．３０−７．２６（６Ｈ，ｍ，Ｃ６Ｈ５），７．２０−７．０５（４Ｈ，ｍ，Ｃ６Ｈ５），４．４３（１Ｈ，ｄｄ，Ｈ−５），３．６５（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｈ−３），２．９５（２Ｈ，ｄｄ，Ｈ−２ａｘ，Ｈ−６ａｘ），２．７（２Ｈ，ｄｄ，Ｈ−２ｅｃ，Ｈ−ｅｃ），１．４（３Ｈ，ｓ，Ｍｅ）．
１３Ｃ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３），δ（ｐｐｍ）：２０８．５６（ＣＯ），１３７．６８，１３６．２９（２  Ｃ−１，Ｃ６Ｈ５），１２９．１０，１２８．９２，１２８．８１，１２８．６５，１２８．５６，１２８．４４，１２８．３５，１２８．２０，１２８．１１（１０ＣＨ，Ｃ６Ｈ５），９３．８９，（Ｃ−４），４８．５５，４６．４５（Ｃ−３，Ｃ−５），４２．１６，４１．８０（Ｃ−２，Ｃ−６），２１．４４（Ｍｅ）．
【００４６】
実施例５：２，６−ジ−（アリールアルキリデン）−３，５−ジ−（フル−２−イル）−４−メチル−４−ニトロ−１−シクロヘキサノンの調製
無水ＭｅＯＨ  ５ｍＬ内で、対応するシクロヘキサノンＡ  １ｍｍｏｌをアルデヒド４ｍｍｏｌと反応させ、撹拌しながらゆっくりとソジウムメタノラート４ｍｍｏｌの混合物を無水ＭｅＯＨ  １０ｍＬに滴下する。１２時間撹拌し続け、固体沈殿物を濾過し、生成物をクロマトグラフィーカラムで分離し、再結晶化する。
【００４７】
３ＲＳ−（３α，４β，５α）］−２，６−ジ［１−（フル−２−イル）メチリデン］−３，５−ジ（フル−２−イル）−４−メチル−４−ニトロ−１−シクロヘキサノン
黄色固体  Ｒｆ：０．３（ｎ−へプタン／エチルアセテート  ３：１）  収率：５１％
融解温度：１９５〜１９６℃（ＭｅＯＨ−水）  分子式：Ｃ２５Ｈ１９ＮＯ７（Ｍ＝４４５．４３）
【表６】
2010501473.tif 000018
ＥＭ：ＩＥ（７０ｅＶ），［Ｍ］＋＝４４５（３），３９９（２９），３９８（８０），３８３（２４），３１５（１８），１７１（１８），１４３（２３），１２８（７０），１１５（１００），８１（５２），５５（４５），３９（５５）．
ＩＲ：（ＫＢｒ）１６６４ｃｍ−１（ＣＯ），１６０４（Ｃ＝Ｃ），１５３６，１３４４ｃｍ−１（ＮＯ２）．
１Ｈ−ＮＭＲ：（ＤＭＳＯ−ｄ６），δ（ｐｐｍ）：７．８７（２Ｈ，ｄ，Ｊ５−４＝１．５Ｈｚ，２Ｈ−５Ｆｕｒ  ｉｎ  Ｒ１），７．７１（２Ｈ，ｓ，Ｈ−７，Ｈ−８），７．４０（２Ｈ，ｄ，Ｊ５−４＝１．４Ｈｚ，２Ｈ−５Ｆｕｒ  ｅｍ  Ｒ），６．８８（２Ｈ，ｄ，Ｊ４−３＝３．４Ｈｚ，２Ｈ−３Ｆｕｒ  ｅｍ  Ｒ１），６．６４（２Ｈ，ｍ，２Ｈ−４Ｆｕｒ  ｅｍ  Ｒ１），６．１４（２Ｈ，ｍ，Ｊ４−３＝３．２５Ｈｚ，２Ｈ−４Ｆｕｒ  ｅｍ  Ｒ），５．８６（２Ｈ，ｄ，２Ｈ−３Ｆｕｒ  ｅｍ  Ｒ），５．６０（２Ｈ，ｓ，Ｈ−３，Ｈ−５），２．０（３Ｈ，ｓ，Ｍｅ）．
１３Ｃ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３），δ（ｐｐｍ）：１８３．６８（ＣＯ），１５０．４５，１４９．３７（２  Ｃ−２，Ｃ４Ｈ３Ｏ），１４７．２７，１４２．０６（２  Ｃ−５，Ｃ４Ｈ３Ｏ），１２７．２７（Ｃ−２，Ｃ−６），１２６．５０（２ＣＨｏｌｅｆ．），１１９．６３，１１３．１１（２  Ｃ−３，Ｃ４Ｈ３Ｏ），１１０．５７，１０９．８０（２  Ｃ−４，Ｃ４Ｈ３Ｏ），９２．８７（Ｃ−４），４８．５５，４３．２７（Ｃ−３，Ｃ−５），２５．２２（Ｍｅ）．
【００４８】
３ＲＳ−（３α，４β，５α）］−３，５−ジフェニル−２，６−ジ−［１−（フル−２−イル）メチリデン］−４−メチル−４−ニトロ−１−シクロヘキサノン
黄色結晶  Ｒｆ：０．３４（ｎ−へプタン／エチルアセテート  ３：１）  収率：６０％  融解温度：２１６〜２１８℃（ＤＭＦ−水）  分子式：Ｃ２９Ｈ２３ＮＯ５（Ｍ＝４６５．５１）
【表７】
2010501473.tif 000019
ＥＭ：ＩＥ（７０ｅＶ），［Ｍ］＋＝４６５．１（１００），４１９（３７），４１８（４１），４０３（１３），３３５（１４），２０８（１１），１９４（１２），１６５（３９），１５３（２６），１０５（２２），８１（１４），７７（１３）．
ＩＲ：（ＫＢｒ）１６６５．８ｃｍ−１（ＣＯ），１６００（Ｃ＝Ｃ），１５４０，１３５１ｃｍ−１（ＮＯ２）．
１Ｈ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３），δ（ｐｐｍ）：７．９１（１Ｈ，ｓ，Ｈ−７），７．８（１Ｈ，ｓ，Ｈ−８），７．５８−７．４７（２Ｈ，ｄ，Ｈ−５Ｆｕｒ），７．４−７．２６（１０Ｈ，ｍ，Ｃ６Ｈ５），６．７−６．６（２Ｈ，ｄ，Ｈ−３Ｆｕｒ），６．５−６．４（２Ｈ，ｄｄ，Ｈ−４Ｆｕｒ），５．６（１Ｈ，ｓ，Ｈ−３），５．１３（１Ｈ，ｓ，Ｈ−５），１．６７（３Ｈ，ｓ，Ｍｅ）．
１３Ｃ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３），δ（ｐｐｍ）：１８９．１９（ＣＯ），１５１．３３，１５１．１７，１４６．１０，１４５．８２（２  Ｃ−２，２  Ｃ−５，Ｃ４Ｈ３Ｏ），１３９．４９，１３７．８２（２  Ｃ−１，Ｃ６Ｈ５），１３２．８４，１３０．３７（Ｃ−２，Ｃ−６），１３０．１８，１２９．６０，１２８．７７，１２８．２６，１２７．７６（１０  ＣＨ，Ｃ６Ｈ５），１２７．０４，１２６．４８（２ＣＨｏｌｅｆ．），９３．９９（Ｃ−４），５３．６７，４８．３３（Ｃ−３，Ｃ−５），２５．２１（Ｍｅ）．
【００４９】
３ＲＳ−（３α，４β，５α）］−２，６−ジ−［１−（５−ブロモ−フル−２−イル）メチリデン］−３，５−ジフェニル−４−メチル−４−ニトロ−１−シクロヘキサノン
黄色固体  Ｒｆ：０．３（ｎ−へプタン／エチルアセテート  ３：１）  収率：６５％
融解温度：２２６〜２２７℃（ＭｅＯＨ−水）  分子式：Ｃ２９Ｈ２１Ｂｒ２ＮＯ５（Ｍ＝５４３．３９）
【表８】
2010501473.tif 000020
ＩＲ：（ＫＢｒ）１６６８．３ｃｍ−１（ＣＯ），１６１１．４（Ｃ＝Ｃ），１５４２，１３６１ｃｍ−１（ＮＯ２）．
１Ｈ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３），δ（ｐｐｍ）：７．６（１Ｈ，ｓ，Ｈ−８），７．５２（１Ｈ，ｓ，Ｈ−７），７．２５−７．１（１０Ｈ，ｍ，Ｃ６Ｈ５），６．４２（２Ｈ，ｍ，Ｈ−３Ｆｕｒ），６．１９（２Ｈ，ｍ，Ｈ−４Ｆｕｒ），５．２６（１Ｈ，ｓ，Ｈ−３），４．７８（１Ｈ，ｓ，Ｈ−５），１．５（３Ｈ，ｓ，Ｍｅ）．
１３Ｃ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３），δ（ｐｐｍ）１８７．１２（ＣＯ），１５１．５９，１５１．５４，１３７．３８，１３６．０４，１３１．３６，１３０．０４，１２９．２２，１２８．８１（２  Ｃ−２，Ｃ４Ｈ３Ｏ，２  Ｃ−１，Ｃ６Ｈ５，２  Ｃ−５，Ｃ４Ｈ３Ｏ，Ｃ−２，Ｃ−６），１２７．４０，１２７．３５，１２６．８６，１２６．５３，１２５．７３，１２５．５７，１２３．９８，１２３．７８（１０  ＣＨ，Ｃ６Ｈ５，２  ＣＨｏｌｅｆ．），９２．０３（Ｃ−４），５１．７５，４７．９９（Ｃ−２，Ｃ−５），２３．５４（Ｍｅ）．
【００５０】
実施例６：２−（３，５−ジアリール−４−ニトロシクロヘキシリデン）マロノニトリルの調製
【化１２】
2010501473.tif 000021
乾燥トルエン６０ｍＬ中で、対応する４−ニトロシクロヘキサノンＣ  １０ｍｍｏｌを、マロノニトリル２０ｍｍｏｌ、酢酸アンモニウム１２．９ｍｍｏｌ（１ｇ）、氷酢酸１ｍＬと反応させる。ディーン・スターク装置を使用して混合物を３〜１０時間還流する。その後、反応物を炭酸ナトリウム（１０％）水溶液、続いて蒸留水で冷却する。有機物分画を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、熱いメタノールでオイル構造体が結晶化するまで真空回転蒸発（ｒｏｔｏｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）により濃縮する。
【００５１】
３ＲＳ−（３α，４β，５β）］−［３，５−ジ（フル−２−イル）−４−ニトロシクロヘキシリデン］マロノニトリル
薄緑結晶
収率：８０％
融解温度：１４１〜１４２℃（ＭｅＯＨ）  分子式：Ｃ１７Ｈ１３Ｎ３Ｏ４（Ｍ＝３２３．３０）
【表９】
2010501473.tif 000022
ＥＭ：ＩＥ，（７０ｅＶ），［Ｍ］＋＝３２３（７），２９３（２８），２７６（１００），２４７（２６），２０９（９６），１７３（１５），１１５（１４），９４（１９），８３（６５）．
ＩＲ：（ＫＢｒ）２２３２ｃｍ−１（２  ＣＮ），１６００，１５００（Ｃ＝Ｃ），１５４８，１３５６ｃｍ−１（ＮＯ２）．
１Ｈ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３），δ（ｐｐｍ）：７．４０（２Ｈ，ｄｄ，Ｈ−５Ｆｕｒ），６．３８（２Ｈ，ｍ，Ｈ−４Ｆｕｒ），６．２８（ＩＨ，ｄ，Ｈ−３Ｆｕｒ），６．２０（ＩＨ，ｄ，Ｈ−３’Ｆｕｒ），５．３５（ＩＨ，ｄｄ，Ｊ４．３＝１２．８Ｈｚ，Ｊ４−５＝５．８Ｈｚ，Ｈ−４），４．０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ３−２＝１１．１Ｈｚ，Ｊ３−２ｅ＝６．３Ｈｚ，Ｈ−３ａｘ），３．８（１Ｈ，ｍ，Ｊ５−６＝３．１Ｈｚ，Ｈ−５ｅｃ），３．４４（２Ｈ，ｍ，Ｈ−２ａｘ，Ｈ−ａｘ），３．１６（２Ｈ，ｍ，Ｈ−２ｅ，Ｈ−６ｅ）．
１３Ｃ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３），δ（ｐｐｍ）：１７５．７１（Ｃ＝Ｃ），１５０．０９，１４９．３４，１４３．４，１４３．０１，１１０．９４，１１０．７２，１０８．７４，１０８．４４（２  Ｃ−２，２  Ｃ−５，２  Ｃ−３，２  Ｃ−４，Ｃ４Ｈ３Ｏ），１１１．１２（２ＣＮ），８６．６６（＝Ｃ（ＣＮ）２），８５．９３（Ｃ−４），３７．１７，３７．１１（Ｃ−３，Ｃ−５），３４．１７，３３．９６（Ｃ−２，Ｃ−６）．
【００５２】
３ＲＳ−（３α，４β，５β）］−［３，５−ジ（フル−２−イル）−４−メチル−４−ニトロシクロヘキシリデン］マロノニトリル
ライトグレー結晶
収率：８５％
融解温度：１９２℃（ＭｅＯＨ）
分子式：Ｃ１８Ｈ１５Ｎ３Ｏ４Ｍ＝３３７．３３）
【表１０】
2010501473.tif 000023
ＥＭ：ＩＥ（７０ｅＶ），［Ｍ−４７］＋＝２９０（２０），［Ｍ−４６］＋＝２９１（６０），２７５（１００），２２２（２０），１４７（１８），１２８（２０），１１５（２７），９５（５２），８１（９８），６５（４１），５３（５４），３９（８８）．
ＩＲ：（ＫＢｒ）２２４０ｃｍ−１（２ＣＮ），１６０８，１５０４（Ｃ＝Ｃ），１５４８，１３５２ｃｍ１（ＮＯ２）．
１Ｈ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３），δ（ｐｐｍ）：７．６２（２Ｈ，ｄ，Ｈ−５Ｆｕｒ），６．４４（２Ｈ，ｄｄ，Ｈ−４Ｆｕｒ），６．３２（２Ｈ，ｄ，Ｈ−３Ｆｕｒ），４．１８（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ３−ｅ＝５．０Ｈｚ，Ｊ３−ａ＝１４．４Ｈｚ，Ｈ−３ａｘ，Ｈ−５ａｘ），３．２８（２Ｈ，ｍ，Ｊａ−３＝１４．２Ｈｚ，Ｈ−２ａｘ，Ｈ−６ａｘ），３．１０（２Ｈ，ｍ，Ｊｅ−３＝５．１Ｈｚ，Ｈ−２ｅｃ，Ｈ−６ｅｃ），１．３（３Ｈ，ｓ，Ｍｅ）．
１３Ｃ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３），δ（ｐｐｍ）：１７７．３５（Ｃ＝Ｃ），１５０．１７，１４３．３２，１１０．４９，１０８．５９（２  Ｃ−２，２  Ｃ−５，２  Ｃ−４，２  Ｃ−３，Ｃ４Ｈ３Ｏ），１１１．７３（２  ＣＮ），９３．９１（Ｃ−４），８４．０１（＝Ｃ（ＣＮ）２），４３．１２（Ｃ−３，Ｃ−５），３３．３８（Ｃ−２，Ｃ−６），１１．９３（Ｍｅ）．
【００５３】
パート２：抗腫瘍活性、及び関連する前臨床アッセイ
本発明は、また、上記誘導体とその前駆体１，５−ビス（４−ヒドロキシ−３−メトキシ−フェニル）ペンタ−１，４−ジエン−３−オンに対する生体内抗腫瘍活性に関する。
【００５４】
本発明は、また、１，５−ビス（４−ヒドロキシ−３−メトキシ−フェニル）ペンタ−１，４−ジエン−３−オン（ＨＢ−１）及び４−［５−（４−アセトキシ−３−メトキシ−フェニル）−３−オキソ−ペンタ−１，４−ジエニル］−２−メトキシ−フェニルアセテート（ＨＢ−２）を適切なモル比、適切な溶剤で調製される複合物の生体内抗腫瘍活性に関する。
【００５５】
本明細書中の化合物は、生体内で行われる実験において細胞増殖抑制作用及び細胞毒性作用を含む有効な増殖抑制作用を示し、また、ほぼ無毒として示され、後者の特性が非常に有利である。
【００５６】
観察された作用を下記実施例により説明する。
実施例７：阻害能力分析（５７ＢＬ／６Ｊマウスに移植したメラノーマ腫瘍における腹腔内投与された（１，１５μｇ／ｋｇ日）ＨＢ−１化合物に対しての体積及び腫瘍面積）。図１及び図２にこの分析を示す。
腫瘍細胞（２×１０５腫瘍細胞／ｍＬ）を移植して４日後、動物を２つの群に分けた。ミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）８１０（登録商標）で希釈したＨＢ−１化合物で処置した試験群と、試験群と同量の希釈剤（ミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）８１０（登録商標））のみを投与した対照群とに分けた。動物は、毎日腹腔内投与により処置された。同時に、動物の重量及び腫瘍の大きさ（２つの測度：長さ×幅）が測定され、腫瘍の状況を写真撮影して登録した。
【００５７】
１４日後、動物は頚椎脱臼により屠殺され、腫瘍が取り除かれ、解剖して全ての内臓器官及び肉眼的病変を取り除き、病理組織学的分析を行った。
【００５８】
腫瘍パラメータとしては、下記式で計算して平均腫瘍面積（Ａ）及び体積（Ｖ）を得た。
Ａ＝πＲ２、及びＶ＝４／３πＲ３
（Ｒ＝平均腫瘍半径）
【００５９】
ミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）８１０（登録商標）で希釈したＨＢ−１化合物で処置した結果、腫瘍パラメータ（体積及び面積）が非常に著しく低減した。処置の間、ミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）８１０（登録商標）で希釈したＨＢ−１化合物を投与した動物は、背部腫瘍の指数増殖を全く示さず、ミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）８１０（登録商標）だけを投与した対照群には背部腫瘍の指数増殖が観察された。Ｂｌ６Ｆ１０メラノーマに対する抑制処理の割合は、９８％よりも高く、腫瘍増殖を低減及び阻止する効果が明らかに示される。
【００６０】
実施例８：肉眼所見
・対照群−背部腫瘍の肉眼所見→メラノーマ
対照群の色素沈着した背部結節性腫瘍は、動物の体の体積の３／４を占める（図３及び図４）。図５は、同じ対照群の腫瘍解剖後の肉眼所見を示す。図５において、背部腫瘍（メラノーマ）周辺の潅流系（血管形成）が観察できる。
・処置群−背部腫瘍の肉眼所見→メラノーマ
処置群の色素沈着した背部腫瘍を図６及び図７に示す。色素沈着した小さな背部腫瘍が観察でき、小結節又は潰瘍がない。ネクローシス領域は腫瘍成長がないと観察される。
処置群の血管系、及び背部腫瘍（メラノーマ）の腫瘍周辺滲出液の肉眼所見を図８及び図９に示す。）腫瘍潅流系及び細胞の発達及び／又は腫瘍の周りの浸潤の低減が観察される。
【００６１】
・ＨＢ−１化合物を腹腔内投与で１４日間処置したメラノーマ背部腫瘍のフローサイトメトリーによる細胞周期相の測定
ＨＢ−１  １５ｍｇ／ｋｇで処理したＢｌ６Ｆ１０メラノーマの細胞周期の分析を図１０に示す。ミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）８１０（登録商標）賦形剤を投与した対照群に対する腫瘍細胞懸濁液（１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）のアリコート、及びＨＢ−１化合物を腹腔内投与で１４日間処置した動物のアリコートを、直ぐにクエン酸塩（２ｍＭ）、スクロース（２５ｍＭ）、０．０５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）緩衝液で氷冷し、使用時まで液体窒素中に保存した。試料を氷浴で溶かした後、細胞を１０分間、室温で、３７５μＬトリプシン０．０３ｇ／Ｌ（シグマ社）で培養し、トリプシン阻害剤（シグマ社）０．５ｇ／Ｌ、リボヌクレアーゼＡ（シグマ社）０．１ｇ／Ｌ、スペルミン１．２ｇ／Ｌ（シグマ社）で中和した。試料は、フローサイトメーター（ベクトン・ディッキンソンアンドカンパニー社）で分析され、細胞周期の異相、細胞消滅レベル（Ｓｕｂ−Ｇ１）、Ｓ相におけるＤＮＡ含有率、静止細胞（Ｇ０／Ｇ１）、及び前有糸分裂細胞（Ｇ２／Ｍ）に対して細胞の割合が評価された。
【００６２】
ミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）８１０（登録商標）で希釈したＨＢ−１化合物は、細胞周期のＧ０／Ｇ１段階における腫瘍細胞個体数を著しく減らす結果を示す（図１１）。この結果は、ドキソルビシン、メトトレキサートナトリウム、又は、パクリタキセル及びエトポシドの誘導体である前世代の薬剤等のヒト悪性新生物の治療に対して日常使用される化学療法薬と同じ特性でＨＢ−１化合物が腫瘍細胞の増殖を妨げることが可能であることを示す。
【００６３】
・ＨＢ−１化合物及び対照として用いたミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）８１０（登録商標）のＢｌ６Ｆ１０メラノーマ細胞に対する細胞毒性及び増殖抑制効果のＭＴＴ比色法による分析
損傷細胞、及び正常細胞に対する細胞毒性及び増殖抑制効果を、ミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）８１０（登録商標）で希釈した異なる濃度のＨＢ−１化合物、および対照として希釈液のみにて検討した。なお、ミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）８１０は、全ての希釈溶液に使用される希釈剤であり、市販の化学療法薬（パクリタキセル，エトポシド）の希釈にも用いられる。ＭＯＳＭＡＮＮ（１９８３）によって記されたＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）によるミトコンドリアの呼吸経路の比色定量法を使用した。この方法は、生体細胞によるＭＴＴからホルマザンへの還元に基づいている。正常細胞及び腫瘍細胞を充満するまで増殖させた後、ミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）８１０（登録商標）で希釈した異なる濃度のＨＢ−１化合物及び対照である希釈剤ミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）８１０（登録商標）が接着細胞に加えられ、２４時間培養された。その後、ＭＴＴ（５ｍｇ／ｍＬ）１０μｌが加えられ、培養器内にて３７℃、５％ＣＯ２で３時間培養された。次に、培養プレートの内容物が２分間、１８００ｒｐｍ、４℃で遠心分離され、上清を取り除き、形成及び析出したホルマザン結晶を溶解するためにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）１００μＬを加えた。ＥＬＩＳＡリーダー（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＴｉｔｅｒＴｅｋ社）により波長５４０ｎｍで、図１２に示す吸光度を得た。
【００６４】
・一次方程式によって得たＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞のＩＣ５０の評価
ＩＣ５０＝ミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）８１０（登録商標）で希釈したＨＢ−１化合物７．０μｇ／ｍＬ
・ＭＴＴ方法により評価した正常腹腔マクロファージに対するＨＢ−１化合物の細胞毒性効果
腹腔マクロファージを以下の手順により正常Ｂａｌｂ−Ｃマウスから得た。動物の腹腔は、無菌状態、層流下で開かれ、露出された。粉末状ヘパリン（Ｌｉｑｕｅｍｉｎｅ  ロシュ社）５０００Ｕを含む食塩水２ｍＬが腹腔に注入され、マッサージし、腹腔洗浄液を採取して、２０００ｒｐｍ、４℃で、１０分間遠心分離した。
懸濁液が１０％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地で再懸濁され、ノイバウアー血球計算板（Ｎｅｕｂａｕｅｒ  ｃｈａｍｂｅｒ）で細胞数を１０６／ｍＬに調整した。マクロファージを９６ウエル平底プレートに分注し、ミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）８１０（登録商標）で希釈したＨＢ−１化合物の存在下及び不在下で培養した。２４時間後、プレートをＭＴＴ比色法で細胞毒性及び増殖抑制効果を評価した。結果を図１３に示す。
ＩＣ５０＝ミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）８１０（登録商標）で希釈したＨＢ−１化合物に対して１６．８９μｇ／ｍＬ
【００６５】
・背部メラノーマを有する動物に対し、ＨＢ−２及び（ＨＢ−１＋ＨＢ−２）複合物を、１４日間腹腔内投与した場合の、悪液質（体重減少合計）指数による毒性作用評価
背部メラノーマ腫瘍を有する対照群の動物は、同量の（ミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）８１０（登録商標）１００μｌ）希釈剤を同じ経路で投与された。
ＨＢ−２及びＨＢ−１＋ＨＢ−２複合物を投与する前に、動物は、毎日重量測定され、肉眼的変化（抜け毛−脱毛）又は行動の変化（運動、興奮性、陶酔感）を明らかに示さなかった。結果として（図１４）、ミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）８１０（登録商標）で希釈したＨＢ−２化合物で処置した動物、及び対照群は、重量減少に関して同様の反応を示したが、これは、腫瘍を有する動物に予測されたことであった。一方で、ＨＢ−１＋ＨＢ−２複合物を投与した動物群は、投与期間中には顕著な重量減少を示さず、ＨＢ−２処置群及び対照群と比較して、重量減少は観察されなかった。結果的に、ＨＢ−１＋ＨＢ−２複合物は、腫瘍体積又は面積の制御に効果的でないにもかかわらず、生体内低毒性を示す。
【００６６】
・ＨＢ−２化合物及びＨＢ−１＋ＨＢ−２複合物でのＢ１６Ｆ１０メラノーマ処置に対する生体内抗腫瘍パラメータ（体積）の分析
ＨＢ−２化合物及びＨＢ−１＋ＨＢ−２併複合物でのＢ１６Ｆ１０メラノーマ処置に対する生体内抗腫瘍パラメータ（体積）の分析を図１５に示す。
【００６７】
・ＨＢ−２化合物及びＨＢ−１＋ＨＢ−２複合物でのＢ１６Ｆ１０メラノーマ処置に対する生体内抗腫瘍パラメータ（面積及び体積）の分析
腫瘍細胞を注入後、ミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）８１０（登録商標）で希釈したＨＢ−２化合物、及びＨＢ−１＋ＨＢ−２複合物で動物を処置し、対照群には同量の希釈剤を同じ投与経路（腹腔内−１００μｌ）で投与した。毎日、動物に化合物（１００μｌ）を投与し、対照群にはミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）８１０（登録商標）を投与し、動物を重量測定し、腫瘍を測定し（長さ×幅）、写真撮影した。１４日後、動物を頚椎脱臼により屠殺し、腫瘍を切除し、死後解析を行い、内臓器官及び肉眼的病変を切除し、病理組織学的分析を行った。
【００６８】
腫瘍のパラメータは、下記式で計算して平均腫瘍面積（Ａ）及び体積（Ｖ）を得た。
Ａ＝πＲ２、及びＶ＝４／３πＲ３
結果を表１６に示す。
【００６９】
Ｂｌ６Ｆ１０背部メラノーマの処置による抗腫瘍効果に関して、ＨＢ−２化合物及び（ＨＢ−２＋ＨＢ−１）複合物は重要な抗増殖因子であることを示し、腫瘍面積及び体積に関して、腫瘍負荷を著しく減らし、それぞれ、ＨＢ−２化合物による処置では６０％、（ＨＢ−２＋ＨＢ−１）複合物による処置では８０％減少した。
【００７０】
・Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞に対して、ミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）８１０（登録商標）で希釈したＨＢ−２化合物及び対照としてミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）８１０（登録商標）を処理したときの、細胞毒性及び増殖抑制効果のＭＴＴ比色法による分析
ＩＣ５０＝ミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）８１０（登録商標）で希釈したＨＢ−２化合物９０．２８μｇ／ｍＬ
ミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）８１０（登録商標）で希釈したＨＢ−２化合物でＢ１６Ｆ１０メラノーマのインビトロ処理は、図１７に示すように、他の化合物と比較して、低い細胞毒性効果を示し、一次方程式によりＩＣ５０約９０．３μｇ／ｍＬであった。しかしながら、ＨＢ−１化合物と複合物として用いる場合は、腫瘍面積及び体積が８０％低減する生体内抗腫瘍処理効果を示した。
【００７１】
・正常ヒト皮膚線維芽細胞に対するミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）８１０（登録商標）（対照）、及びミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）８１０（登録商標）で希釈したＨＢ−２化合物の増殖抑制及び細胞毒性効果のＭＴＴ方法による分析
皮膚片は、美容手術の組織剥離処置中に無菌的に採取され、２０％ウシ胎仔血清を含むＨＡＭ  Ｆ−１２培地（ギブコ社）を含む無菌バイアル５０ｍＬ中に迅速に移された。皮膚片は断辺化され、きれいにしたあとに、小さめの断片を１０％ウシ胎仔血清を含むＨａｍ−Ｆ１２培地でペトリ皿にて培養し、加湿培養器内で３７℃、５％ＣＯ２に保持した。
【００７２】
ほぼいっぱいに細胞が増えた後に、細胞は、５分間トリプシン処理され、１０％ウシ胎仔血清で不活性化し、１０分間、２０００ｒｐｍ、４℃で遠心分離され、９６ウエル平底プレートに移され、ＣＯ２５％培養器中で２４時間培養された。線維芽細胞を、ミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）８１０（登録商標）で希釈した異なる濃度のＨＢ−２化合物、及び同量のミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）８１０（登録商標）だけを投与した対照群で２４時間処理した。細胞毒性及び増殖抑制効果をＭＴＴ比色法で評価した。
図１８に示すように、ミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）８１０（登録商標）で希釈したＨＢ−２化合物で処理した後の正常ヒト線維芽細胞に細胞毒性効果は観察されなかった。
【００７３】
・Ｂ１６Ｆ１０マウスメラノーマに対する一ナトリウムＨＢ−１化合物、及び対照の増殖抑制効果、並びに細胞毒性効果のＭＴＴ法による分析
ＩＣ５０＝ＤＭ−２化合物  １．９μｇ／ｍＬ
結果として、（図１９）ＨＢ−１化合物の一ナトリウム薬剤組成は、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞に対する細胞毒性反応を著しく増加させ、ＣＩ５０％＝１．９μｇ／ｍＬを示した。インビトロ効果は、細胞毒性効果を７．０倍増加させた。
【００７４】
・Ｂ１６Ｆ１０マウスメラノーマ細胞に対するＤＭ−１化合物、及び対照の増殖抑制効果、並びに細胞毒性効果のＭＴＴ法による分析
ＩＣ５０＝ＤＭ−１化合物  ７．９５μｇ／ｍＬ
結果として、（図２０）ＤＭ−１化合物の薬剤組成は、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞における細胞毒性反応を著しく増加させ、ＩＣ５０＝７．９５μｇ／ｍＬを示した。インビトロ効果は、一ナトリウムＤＭ−２化合物に対して約６．０倍小さい。
従って、一ナトリウム誘導体は、二ナトリウム誘導体よりも優れる。
ＩＣ５０％＝ＤＭ−１化合物  ７．９５μｇ／ｍＬ
【００７５】
・Ｔリンパ球に対するＤＭ−２化合物の評価
実施例９：Ｔリンパ球の調製
生後２ヶ月の５  Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス群を頚椎脱臼により屠殺し、腋窩、膝窩、腸間膜領域のリンパ節鎖を無菌状態で切除した。リンパ節は、５６℃で不活性化したウシ胎仔血清１０％を含むＲＰＭＩ−１６４０培地で抗生物質の存在下に維持され、柳葉刀で細切された。得られた細胞懸濁液を３０μｍ透析膜を介して濾過され、１０分間、１８００ｒｐｍ、４℃で遠心分離を行った。沈殿した細胞がＲＰＭＩ完全培地に再懸濁され、その後、ウシ胎仔血清１０ｍＬを含むペトリ皿で３７℃、５％ＣＯ２培養器内で１時間培養した。その後、非接着細胞、Ｔリンパ球、が採取され、５０ｍＬ円錐チューブに移され、遠心分離され、ＲＰＭＩ−１６４０完全培地に再懸濁された。細胞濃度は、マラッセチャンバ（Ｍａｌｌａｓｓｅｚ  ｃｈａｍｂｅｒ）内で計算した後に、５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ濃度に調整され、トリパンブルー除去法で細胞の生存率が決定された。
細胞毒性及び増殖活性がフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）のマイトジェン活性と比較して９６ウエルプレートで決定され、ＭＴＴ比色法で評価された。得られた値は、パーセンテージで表された。
各実験データは、分散分析試験で、統計的に分析され、危険率ｐ＜０．０５で有意であった。
結果は（図２１）、異なる濃度のＤＭ−２化合物でリンパ球を処理すると、陽性対照として用いた最適濃度が２．５及び５．０μｇであるフィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）と比較して、これらの細胞の増殖活性が誘導されなかったことを示す。これらの結果は、正常細胞に毒性作用を示さない化合物であることを示し、免疫複合体産生、アレルギー、過敏症、又は自己免疫反応等の副作用を起こしうる特異的な免疫応答としての増殖活性を誘導することができないことを示す。
【００７６】
・Ｂａｌｂ−ｃマウスにおけるＤＭ−２の静脈内接種による急性及び亜慢性毒性
ＬＤ５０＝１４ｍｇ／Ｋｇ／動物〜７００ｍｇ／体重
Ｂａｌｂ−ｃマウスを計量し、動物実験室に収容し、かご毎に５匹をいれグループ化し、２週間後、異なる濃度のＤＭ−２化合物を静脈経路で投与した。全ての濃度に対して化合物０．２ｍＬ（容積）をマイクロシリンジで、眼窩静脈叢を介して投与した。投与後、運動性の減少、疲労、呼吸頻度低下、低容量性ショック等の行動の変化は見られなかった。
２４時間後、最大耐量（ＭＴＤ）を決めるため、処置した動物の致死率及び体重減少合計を観察した。この群の動物を６０日間観察した。
結果として、（図２２）、１４ｍｇ／Ｋｇの量が、５０％致死量（ＤＬ５０）に相当し、これが同じ投与経路での、最大耐量に相当する。３０日目に解剖後、内臓器官に顕著な肉眼的及び組織病理学的変化は見られなかった。
データ分析後、上記生体内抗腫瘍活性及び毒性に関して、ペンタ−１，４−ジエン−３−オン及びその誘導体の作用と、ドキソルビシン、タキソール、及びエトポシド等の治療で現在使用される薬剤の作用との間で簡単な比較ができる。下記表はこれらの比較を示す。
【表１１】
2010501473.tif 000024
＊異なる単位は、治療薬が示すヒトから得た標準用量計算ではなく前臨床実験モデルで得たデータである。
ＤＭ−１化合物はタキソール及びドキソルビシンと比べてＬＤ５０値が劣り、タキソールでは、１．７５倍少なく、ドキソルビシンでは３５倍少ない。
前臨床実験の間、ＤＭ−１は、急性呼吸器病、及び心毒性に対していかなる効果も示さない。このことは、抗腫瘍副作用がより小さい可能性のある抗腫瘍薬として一連の化合物を調べる利点を示唆する。
【００７７】
上記の化合物は、また、肺癌、乳癌、多剤耐性乳癌、非メラノーマ皮膚癌、リンパ性白血病、急性及び慢性骨髄性白血病、赤白血病、脊髄異形成症、結腸癌、卵巣癌、頸癌、腎癌、膵癌、前立腺癌、軟部組織肉腫、肝癌、骨肉腫、中枢神経系腫瘍、神経芽腫、星状細胞腫、口腔咽頭部，甲状腺、胃、男性生殖器の癌によって引き起こされる腫瘍性疾患の治療及び予防にも使用してもよいことを重視すべきである。
【００７８】
実施例１０：組織学的説明
動物は、頚椎脱臼により屠殺され、腫瘍領域に隣接する領域から器官片が採取され、１０％ホルムアルデヒドを含むバイアルに保存され、所定の組織学的処理を施すために固定された（ＰＡＲＤＩ，ＰＣ；ＳＩＭＯＥＳ，ＭＪ，ＢＩＮＩＶＩＧＮＡＴ，Ｇ．Ｏ−Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｔｒｏｍａ  ｏｆ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ−ｅｓｔｒｏｕｓ  ｒａｔｓ−Ｒｅｖ．Ｃｈｉｌ．Ｃｉｅｎｃ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ  ３（２）：６１−６５，１９９３）。
メラノーマＢ１６Ｆ１０細胞株が、動物あたり５×１０４細胞、接種された。この量は、選択した種類の動物に対して既に示した所望の結果を得るための理想的な容量である。
全ての動物が腫瘍注入後１４日後に処置され、結果として、１５日目に解剖が始まる。
ＨＢ−１投与の結果を視覚化するために、動物を下記群に割り当てる。
１  対照群：動物は、１〜６に同定され、ミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）８１０（登録商標）で処置し、不断給餌及び不断給水される。
２  ＨＢ−１群：ミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）８１０（登録商標）で希釈したＨＢ−１化合物で処置し、不断給餌及び不断給水される。
両群とも、標準投与用量１．１５μｇ／ｋｇが、誘導投与経路として腹腔内投与される。
【００７９】
動物は頚椎脱臼により屠殺され、解剖を行い、材料を迅速に採取して１０％ホルムアルデヒドを含むバイアルに写して、１〜２日後、所定の組織学的技術、組織学的技術マニュアル（Ｍａｎｕａｌ  Ｄｅ  Ｔｅｃｎｉｃａｓ  Ｐａｒａ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉａ−Ｎｏｒｍａｌ  Ｅ  Ｐａｔｏｌｏｇｉｃａ：  Ｃａｓｔｒｏ  Ｄｅ  Ｔｏｌｏｓａ，  Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ，  Ｂｅｈｍｅｒ  Ｅ  Ｆｒｅｉｔａｓ  Ｎｅｔｏ，  Ｅｄｉｔｏｒａ  Ｍａｎｏｌｅ  ２００３）で処理された。
【００８０】
この技術は、アルコール濃度を増やすことにより、試験片を脱水させ、ついでキシロールで組織片を透徹し、５７℃恒温槽中で液状パラフィンを注入し、最後に、室温でパラフィンにブロックを埋め込む。
ブロック切片は、半自動ライカミクロトームで最大厚さ７μｍの標本にされる。
切断後、切片が水浴で維持され、事前にアルブミンで覆ったガラスの薄板に移され、材料が固定される。
【００８１】
薄板に固定後、ヘマトキシリン／エオシン染色方法−組織学的技術マニュアル（Ｍａｎｕａｌ（Ｍａｎｕａｌ  Ｄｅ  Ｔｅｃｎｉｃａｓ  Ｐａｒａ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉａ  −  Ｎｏｒｍａｌ  Ｅ  Ｐａｔｏｌｏｇｉｃａ：  Ｃａｓｔｒｏ  Ｄｅ  Ｔｏｌｏｓａ，  Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ，  Ｂｅｈｍｅｒ  Ｅ  Ｆｒｅｉｔａｓ  Ｎｅｔｏ，  Ｅｄｉｔｏｒａ  Ｍａｎｏｌｅ  ２００３）が各ブロックにおける成分に対して主に用いられ、組織及び細胞の形態評価に良い結果を示す。
【００８２】
染色は、以下の通りに行われる：
薄板を、恒温器で５７℃、約２０分間乾燥する。
２つのキシロール浴内で組織片を透徹する。
アルコール量を減らして（１００％，９６％，７０％，５０％）水和する。
蒸留水で３０分間洗浄する。
３０秒間ヘマトキシリン染色を行い、水道水を流しながら洗浄し、過剰な染料を取り除く。
１分間エオシン染色。
アルコール量を増やして（９６％，１００％）脱水する。
キシロール内で組織片を透徹する。（２つの浴）。
染色後、薄板を載せ、ＡＸＩＯＣＡＭ−ＭＲＣ３（商標）デジタルカメラを使用してツァイス顕微鏡で分析する。得られた写真をＡＸＩＯＶＩＳＯＮ  ＲＥＬ  ４．２（カールツァイス社）ソフトウエアで処理し、コンピュータに保存する。
組織学的観察及び結果は以下の通りである。
【００８３】
結果Ａ：対照群−ミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）８１０（登録商標）投与
図２３及び図２４は、対照群の腫瘍組織片を示す。背部腫瘍を注入したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスがミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）８１０（登録商標）で腹腔内投与により処置され、処置１４日目に屠殺された。
図２３及び図２４の顕微鏡写真から、色素沈着した背部結節性腫瘍（Ａ）、及び広範囲の壊死（Ｂ）が存在するが、炎症性白血球浸潤（Ｃ）がないことが観察できる。
【００８４】
結果Ｂ：ＨＢ−１群  ミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）８１０（登録商標）で希釈
ミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）８１０（登録商標）で希釈したＨＢ−１化合物で処置されたメラノーマを有する動物の背部腫瘍の組織病理分析を図２５及び図２６に示す。
腫瘍内及び腫瘍周辺部分に高度の炎症性白血球浸潤（Ａ）、広範囲のネクローシスを伴う浸潤した結節性腫瘍塊（Ｂ）が観察できる。
腫瘍内及び腫瘍周辺部分の白血球浸潤は、ＨＢ−１化合物で１４日間の処置することで、化合物と腫瘍細胞との間の相互作用により、又は間接的に他の種類の細胞との相互作用により特異的な免疫応答を誘導できることを示す。ＨＢ−１化合物で処置したメラノーマ腫瘍に存在する炎症細胞浸潤は、同じ実験条件及び同じ投与経路で化合物の賦形剤ミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）８１０（登録商標）を投与した対照群には見られなかった。一方で、これらの知見は、腫瘍細胞成長及び播種を阻止するＨＢ−１化合物の抗腫瘍効果を確証する：処置動物群には転移病巣が見られず、一方、対照群には肺及びリンパ神経節にいくつか病巣、又は結節性腫瘍が見られた。
【００８５】
結果Ｃ：対照群−ミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）８１０（登録商標）で希釈
ミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）８１０（登録商標）で処置したメラノーマを有する動物の背部腫瘍の病理組織学的分析を図２７及び図２８に示す。
色素沈着した背部結節性腫瘍（Ａ）には血管新生（＊）や広範囲のネクローシス（Ｂ及びＤ）が存在するが、腫瘍内及び腫瘍周辺部分には炎症性白血球浸潤（Ｃ）が観察されない。
【００８６】
結果Ｄ：肺実質転移
肺実質転移の病理組織学的分析を図２９及び図３０に示す。
対照群（図３０）と比較して、ＨＢ−１化合物で処置した動物（図２９）には気管支上皮の厚さの変化や剥離脱落、うっ血性変化、フィブリン沈着、及び色素沈着がなく、炎症性細胞などにおいて、変化はなかった。転移塊又は小結節の存在が観察されなかった（図２９）。一方で、対照群の動物は、肺の被膜に接して、いくつかの転移病巣を示し、この細胞にはメラニン色素が認められる。炎症性浸潤は観察されない（Ａ）。
【００８７】
結果Ｅ：内臓器官の病理組織学的分析
肝臓、及び腎臓等の内臓器官の病理組織学的結果をそれぞれ図３１及び図３２に示す。
結果は、顕著な病変あるいは炎症所見がない保存された正常な実質組織を示す。図３１において、良好に保存された肝実質細胞、及び良好に確定された放射状の小葉、及び小柱が観察できる。中心静脈は標準的な類洞と共に良好に保存されることも観察できる。図３２は、構造的変化のない一般的な良好に保存された腎小体、良好に保存された遠位及び近位尿細管を明らかに示す。
背部メラノーマを有しミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）８１０（登録商標）希釈剤で処置した動物の内臓器官は、全ての切断面で正常であり、隣接領域もしくは潰瘍塊の炎症過程もしくは浸潤、又は毒性作用もしくは希釈剤沈着に関係しうる他の変化がない。
【００８８】
パート３：抗寄生虫活性
本発明は、また、この項目のパート１の式に示した上記誘導体の抗寄生虫作用にも関する。
ここで示す化合物は、アメリカ外皮リーシュマニアの原因となるリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｓｐｐ）から分離する異なる分離株である前鞭毛型の増殖及び／又は生存度、及び無鞭毛型アマゾンリーシュマニアの増殖及び／又は生存度に対するインビトロ効果として評価されている。
【００８９】
実験に必要とされる培養物の量に応じて、異なる濃度の化合物１００．００〜３．１２μｇ／ｍＬ、及び培地１ミリリットル毎の寄生虫数１．０×１０６〜２．０×１０６を２〜２０ｍＬに培養することで増殖の抑制を測定するアッセイが行われる。化合物は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で溶かされてストック溶液とする。異なる濃度の試料を得るために、まず、第１の所望の濃度を得るために必要とされる十分な量の培地を加え、他の濃度は第１の濃度を倍々希釈することで得ることが出来る。培養物は、前鞭毛型及び無鞭毛型に対して、それぞれ２２℃又は２４℃で培養される。
【００９０】
寄生虫の生存能力評価に対する陽性対照として、他に何も加えずに培地及び寄生虫だけを使用した。化合物組成中の溶剤に対する毒性対照として、寄生虫をＤＭＳＯで希釈した培地で培養した。
【００９１】
前鞭毛型を定量化するためにはノイバウアー血球計算板を使用した。各実験において培養期間を通して、２４時間毎に前鞭毛型を定量した。試料は、培養物２０μＬの最初の希釈液を食塩水（ＰＢＳ＋２％ホルムアルデヒド）１８０μＬに配合して１／１０希釈溶液を得ることで調製される。必要であれば、連続希釈法が第１希釈から行われてもよい。全ての実験で、ＨＢ−１のいくつかの濃度、それらの各ＤＭＳＯ対照（最初のＨＢ−１原液がＤＭＳＯで調製され、寄生虫に関する毒性が評価されたことに留意すべきである）、及び規定の培養物で、培地に他の成分を加えずに寄生虫が培養されるべきである。集計は２人で二重に行い、最終結果が２つの集計から算術平均として表される。いくつかの手順を用いて無鞭毛型を定量化する。
【００９２】
最初の２４時間から、また、異なる培地においても、化合物は、前鞭毛型増殖に対して良好な抑制分布を示した。
化合物もまた、化合物に対して極めて感受性が高い無鞭毛型様の増殖能抑制に対して、非常に有望である。全ての評価した化合物濃度によって、培養の最初の４８時間で１００％の寄生虫が生存不可能な形態に変わり、既に最初の２４時間で濃度が１０μｇ／ｍＬ及び２０μｇ／ｍＬで１００％の無鞭毛型細胞活性を阻止する。
人の感染症の治療において、この細胞内形態が抗寄生虫薬の標的として確立しているので、この結果は、非常に重要である。
【００９３】
前鞭毛型及び無鞭毛型の生存度及び／又は細胞増殖評価は、Ｍｏｒｅｉｒａ等が示す（Ｍｏｒｅｉｒａ，Ｍ．Ｅ．Ｃ，  Ｄｅｌ  Ｐｏｒｔｉｌｌｏ，Ｈ．Ａ．，Ｍｉｌｄｅｒ，Ｒ．Ｖ．，Ｂａｌａｎｃｏ，Ｊ．Ｍ．Ｆ．ａｎｄ  Ｂａｒｃｉｎｓｋｉ，Ｍ．Ａ．Ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｐｒｏｍａｓｔｉｇｏｔｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｕｎｉｃｅｌｌｕｌａｒ  ｏｒｇａｎｉｓｍ  Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）ａｍａｚｏｎｅｎｓｉｓ，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １６７，３０５−３１３，１９９６）ＭＴＴ（ジフェニルテトラゾリウム３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］２，５−ブロミド）方法でも行われ、修正される。
【００９４】
寄生型を化合物で処理した後、上記に示すように、各実験に対して所定の時間（２４，４８，７２時間等）に、細胞懸濁液の１．０ｍＬが各培養管又はバイアルから採取され、微小遠心管に移され、１４．０００ｒｐｍ、３分間で遠心分離され、培地は吸引除去される。沈降細胞にＰＢＳ  ２００μＬを加える。その後、沈降細胞を含むＰＢＳを、９６ウエル培養プレート２つのウエルに分注する（各複製１００μＬ）。各々に対して、ＭＴＴ２０μＬ（５ｍｇ／ｍＬ原液、最終濃度１，０ｍｇ／ｍＬ）を加える。室温２２℃（前鞭毛型）又は３４℃（無鞭毛）で、１時間又は１時間３０分処理した後、各ウエルに１０％ＳＤＳ  １００μＬを加え、反応を中断し、細胞を溶解し、ホルマザン結晶を溶解し、均質な青い溶液を得る。試験波長として５９５ｎｍ、基準波長として６９０ｎｍを用いて培養マイクロプレート用分光光度計（モデル３５５０  バイオラッド社、カリフォルニア州リッチモンド）により吸光度を測定する。
【００９５】
光学濃度（Ｏ．Ｄ．）値は、代謝活性のある細胞によってＭＴＴが酵素還元されることに対応する。結果的に、Ｏ．Ｄ．は、細胞懸濁液中の生存可能な細胞の数に直接比例する。Ｏ．Ｄ．の漸進的増加は、細胞増殖を示す。結果は、光学濃度複製の算術平均として表される。
ブランク反応は、ＭＴＴ、及び異なるＨＢ−１濃度に加えて、各アッセイで用いられる特性の培地の培養により得られる。黄褐色のＨＢ−１は、培地及びＨＢ−１濃度により異なる規模の比色分析に特定の干渉を与える。概して、Ｏ．Ｄ．ブランクは、分析範囲中０．００２〜０．０２０である。
観察された活性及び結果を下記に示す。
【００９６】
実施例１１：ウォーレン培地におけるアマゾンリーシュマニア（Ｌ）(Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ（Ｌ）ａｍａｚｏｎｅｎｓｉｓ)の前鞭毛型増殖に対するＨＢ−１化合物の効果
前鞭毛型アマゾンリーシュマニア（Ｌ）（分離株ＬＶ７９、培地で８回継代、７日目の培養、静止期）が、１０６前鞭毛型／ｍＬの割合でウォーレン培地で培養される。最終体積は３．０ｍＬであり、ＨＢ−１の異なる濃度、及び増殖及び生存度に対する陽性対照としてその各対照を同量のＤＭＳＯ及び培地で用いる。ウォーレン培地で培養した前鞭毛型アマゾンリーシュマニアに対するＨＢ−１の効果を下記表及び図３３に示す。
ＥＶ：それぞれ、最終濃度の異なるＨＢ−１を得るために用いたＤＭＳＯと同量であるＤＭＳＯを含む培地で寄生虫を培養する場合の各ＨＢ−１濃度に対応する個々の対照を表す。
【００９７】
下記表及び図３３から分かるように、全てのＨＢ−１（１００μｇ／ｍＬ〜３．１２μｇ／ｍＬ）濃度が、程度差は異なるものの、最初の２４時間培養で前鞭毛型増殖を阻止する。７２時間培養後、濃度が２５μｇ／ｍＬ，５０μｇ／ｍＬ，及び１００μｇ／ｍＬの場合は、それぞれ、寄生虫増殖を８１％、９５．８％、及び１００％阻止し、１２０時間培養では１００％阻止する。
【表１２】
2010501473.tif 000025
従って、この期間内に寄生虫は１００％死滅する。結果的に、上記に示した実験条件で前鞭毛型増殖を１００％阻止する（＝死亡率１００％）ためのＨＢ−１の効果的な濃度は、培養時間に関連することを立証する。従って、死亡率１００％は、ＨＢ−１濃度が２５μｇ／ｍＬ，５０μｇ／ｍＬ，又は１００μｇ／ｍＬの場合、それぞれ１２０時間、９６時間又は７２時間培養で達成される。濃度が１２．５μｇ／ｍＬ〜３．１２μｇ／ｍＬの場合は、増殖阻止が最大７２時間培養のため亜致死である。
【００９８】
実施例１２：ＲＰＭＩ培地での前鞭毛型アマゾンリーシュマニア（Ｌ）に対するＨＢ−１化合物の効果
前鞭毛型アマゾンリーシュマニア（Ｌ）（分離株ＬＶ７９、培地で１回継代、７日目の培養、静止期）が、ＨＢ−１の異なる濃度、その各対照のＤＭＳＯを用いて１０６前鞭毛型／ｍＬの割合でＲＰＭＩ培地で培養される。最終体積は３．０ｍＬである。前鞭毛型アマゾンリーシュマニア（Ｌ）の増殖−ＲＰＭＩ培地に対するＨＢ−１化合物の影響を下記表及び図３４に示す。
【表１３】
2010501473.tif 000026
ＥＶ：それぞれ、最終濃度の異なるＨＢ−１を得るために用いたＤＭＳＯと同量であるＤＭＳＯを含む培地で寄生虫を培養する場合の各ＨＢ−１濃度に対応する個々の対照を表す。
ＲＰＭＩ培地を使用する場合、ＨＢ−１化合物は、全ての濃度（１００μｇ／ｍＬ〜３．１２μｇ／ｍＬ）が前鞭毛型リーシュマニアの増殖を阻止することが出来る。阻止効果は、これらの実験条件で特に明らかである。前記表及び図３４に示すように、最初の２４時間培養で、全ての実験濃度のＨＢ−１の重要な阻止効果が表れ、４８時間培養では、濃度１００μｇ／ｍＬ〜１２．５μｇ／ｍＬで１００％の阻止効果（＝致死量１００％）が観察できる。
【００９９】
実施例１３  ＲＰＭＩ培地におけるＨＢ−１で処理した前鞭毛型アマゾンリーシュマニア(Ｌ）の生存能力の測定
このアッセイでは、ＨＢ−１又はその対照のＤＭＳＯを用いて、ＲＰＭＩ培地で培養した場合の前鞭毛型リーシュマニアの生存能力を、ＭＴＴ法によって評価する。増殖曲線の静止期においてＨＢ−１の効果が検出できるかを確認することも可能である。
培養のために、前鞭毛型ＬＶ７９分離株の、初期接種濃度１．０×１０６／ｍＬから得られる１回継代の第７日目の培養を使用する。反応体の最終体積は３．０ｍＬである。ＲＰＭＩ培地においてＨＢ−１で処理した前鞭毛型アマゾンリーシュマニア(Ｌ）の生存能力測定の結果を、次の表及び図３５に示す。
【表１４】
2010501473.tif 000027
＊定量化誤差（技術的誤差）の可能性が大。
ＥＶ：それぞれ、最終濃度の異なるＨＢ−１を得るために用いたＤＭＳＯと同量であるＤＭＳＯを含む培地で寄生虫を培養する場合の各ＨＢ−１濃度に対応する個々の対照を表す。
前記表及び図３５に示す結果は、濃度が６．２５μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬのＨＢ−１処理が、最初の２４時間培養で、細胞の生存能力を不可逆的に損傷させていることを示す。それは、その後の培養時間において回復の兆候が見られないからである。
培養１４４時間でのＭＴＴ法によって測定されるミトコンドリア活動の観察によって、対照の反応（ＨＢ−１なしの場合）とその他の反応との比較から、ＨＢ−１は、増殖曲線の対数期と静止期の両方で細胞を生存不可能にする作用があることを明示できた。
これらの分析は、ノイバウアー血球計算板を用いた定量法によって得られる結果を裏付ける。ＨＢ−１の濃度が１２．５μｇ／ｍＬを超える場合は、増殖曲線の全体にわたって細胞が回復しないので、明らかな殺リーシュマニア効果を有することが観察できる。ＨＢ−１の濃度が６．２５μｇ／ｍＬの場合は、リーシュマニア増殖静止化効果があることが明らかにされているが、１００％の前鞭毛型を生存不可能にすることはできない。ＨＢ−１のミトコンドリア活性への効果は、寄生虫増殖の対数期及び静止期の両方において観察される。
【０１００】
実施例１４  限局性皮膚リーシュマニア症(Ｌ．Ｃ．Ｌ）及び汎発性皮膚リーシュマニア症（Ｄ．Ｃ．Ｌ．）の原因となるリーシュマニア分離株に対するＨＢ−１の効果のＭＴＴ法による評価
この実験は、分離株の初期接種濃度が２．０×１０６／ｍＬである培地を用いて、ウォーレン培地中で展開される。培養物は、７回継代であり最終対数期増殖（培養６日目）にあった。ウォーレン培地中、ＨＢ−１の存在下で培養した前鞭毛型リーシュマニア（Ｌ．Ｃ．Ｌ．からの分離株）の生存能力測定の結果を下記表及び図３６に示す。培養物の最終体積は５ｍＬで、ＭＴＴ反応は、培養物１．０ｍＬから開始して、１時間３０分の培養で処置された。
【表１５】
2010501473.tif 000028
＊Ｏ．Ｄ．＝波長５９５／６９０ｎｍでの光学濃度（２回の繰り返しの平均値）。
ＥＶ：同量のＤＭＳＯを含む培地で寄生虫を培養する場合の各ＨＢ−１濃度に対応する個々の対照を示す。
前記表及び図３６に示すように、このＬ．Ｃ．Ｌ．分離株は、ＨＢ−１作用に対して極めて感受性が高い。この化合物のこれらの細胞に対する効果には、明らかに用量依存性が見られ、濃度が５μｇ／ｍＬでは増殖を部分的に抑制するに留まり、濃度が１０μｇ／ｍＬではリーシュマニア増殖静止化効果を有し、そして濃度が２０μｇ／ｍＬでは殺リーシュマニア効果を有する。
【０１０１】
ウォーレン培地中、ＨＢ−１の存在下で培養した前鞭毛型のリーシュマニア（Ｄ．Ｃ．Ｌ．からの分離株）の生存能力測定の結果を下記表及び図３７に示す。
【表１６】
2010501473.tif 000029
＊Ｏ．Ｄ．＝波長５９５／６９０ｎｍでの光学濃度。
＊＊方法論的エラーにより分析から除外されたデータ点。
ＥＶ：異なる濃度を得るために用いたＤＭＳＯと同量であるＤＭＳＯを含む培地で寄生虫を培養する場合の各ＨＢ−１濃度に対応する個々の対照を表す。
Ｄ．Ｃ．Ｌ．分離株に関しては、結果（前記表及び図３７に示す）は同様で、前鞭毛型の生存能力に対する明白なＨＢ−１の効果を示している。しかしこの場合、Ｌ．Ｃ．Ｌ．分離株に対する濃度１０μｇ／ｍＬの化合物の効果がリーシュマニア増殖静止化効果のみであったのに対して、Ｄ．Ｃ．Ｌ．分離株に対するこの濃度の効果として殺リーシュマニア効果を観察することができるので、この寄生虫は該化合物に対してより高い感受性を有するようである。
【０１０２】
実施例１５  アマゾンリーシュマニア（Ｌ）の無鞭毛様型に対するＨＢ−１効果の評価
無鞭毛型が脊椎動物宿主の体内で増殖し、結果的にこの病気の原因となる型であることを考慮すると、無鞭毛型リーシュマニアをＨＢ−１存在下で培養する場合のその生存能力を評価することは必要不可欠である。
この評価は、前述の方法で、更に無菌培養から得られる無鞭毛型を利用することによって行われる。この結果を下記表に示す。
【表１７】
2010501473.tif 000030
＊Ｏ．Ｄ．＝光学濃度
ＥＶ：それぞれ、最終濃度の異なるＨＢ−１を得るために用いたＤＭＳＯと同量であるＤＭＳＯを含む培地で寄生虫を培養する場合の各ＨＢ−１濃度に対応する個々の対照を表す。
前記表に示すように、無鞭毛型は、ＨＢ−１に対して極めて感受性が高いことが分かった。最初の４８時間において、この寄生虫の１００％が全てのアッセイされた濃度のＨＢ−１によって生存不可能になり、そして最初の２４時間で、１０μｇ／ｍＬ及び２０μｇ／ｍＬの濃度のＨＢ−１が１００％の無鞭毛型の細胞活性を阻止する。
【０１０３】
記載された化合物が、リーシュマニア(Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）属、プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）属、トリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）属、トキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）属、ジアルジア（Ｇｉａｒｄｉａ）属、及びエンタモエバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ）属などの組織原虫、住血原虫又は腸内原虫によって引き起こされる寄生虫性疾患；並びにタエニア（Ｔａｅｎｉａ）属、シストソーマ（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）属、アンシロストーマ（Ａｎｃｙｈｓｔｏｍａ）属、ネカトール（Ｎｅｃａｔｏｒ）属、アスカリス（Ａｓｃａｒｉｓ）属、エンテロビウス（Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ）属、及びウケレリア（Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ）属などの他のぜん虫寄生虫類によって引き起こされる、それぞれ異なる臨床上の兆候有するヒト及び／又は動物の寄生虫症の治療にも使用してもよいことを重視すべきである。
【図１】
2010501473.tif 000036
【図２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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