(57)【要約】本発明は、ＨＩＶ−１感染、ＡＩＤＳ、ＡＲＣ、多発性硬化症、慢性疲労症候群、関節リウマチ、アルツハイマー病、皮膚炎、１型糖尿病、大腸炎、炎症性腸疾患／過敏性腸症候群、クローン病、乾癬、慢性閉塞性肺疾患、全身性エリテマトーデス、移植による拒絶反応及び癌などの、ヘルパーＴ細胞減少に関連する疾患の治療及び診断器具で用いられる、シスタチンＡ及び少なくとも１種のヒストンを含む組成物について記載している。【選択図】  図１
2010510174.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）シスタチンＡタンパク質、及び、
（ｂ）少なくとも１種のヒストンタンパク質を含み、
他の胸腺タンパク質がなく、ヒトへの投与に適しており、薬理学的に許容される添加物又は担体が付加され得る組成物。
【請求項２】
前記少なくとも１種のヒストンタンパク質がヒストンＨ１である請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記少なくとも１種のヒストンタンパク質がヒストンＨ２Ａである請求項１記載の組成物。
【請求項４】
前記少なくとも１種のヒストンタンパク質がヒストンＨ２Ｂである請求項１記載の組成物。
【請求項５】
２種のヒストンタンパク質がある請求項１記載の組成物。
【請求項６】
前記２種のヒストンタンパク質がヒストンＨ１及びヒストンＨ２である請求項５記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物がｇｐ１２０への結合親和性を少なくとも５０００ＲＵ有する請求項１記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物がｇｐ４１への結合親和性を少なくとも５０００ＲＵ有する請求項１記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物がＣＤ４への結合親和性を少なくとも５０００ＲＵ有する請求項１記載の組成物。
【請求項１０】
前記添加物が水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウムである請求項１記載の組成物。
【請求項１１】
前記添加物がリン酸カルシウムである請求項１記載の組成物。
【請求項１２】
前記添加物が、モノホスホリルリピッドＡ、Ｑｕｉｌ−Ａ含有免疫刺激性複合体（ISCOMs）、及び、スレオニル誘導体又はムラミールジペプチドを含むＳｙｎｔｅｘ  ａｄｊｕｖａｎｔ製剤からなる群より選ばれた請求項１記載の組成物。
【請求項１３】
（ａ）シスタチンＡタンパク質、及び、
（ｂ）少なくとも１種のヒストンタンパク質を含み、
他の胸腺タンパク質がなく、ヒトへの投与に適しており、少なくとも１種の前記シスタチンＡタンパク質及び前記少なくとも１種のヒストンタンパク質がＣＤ４、ｇｐ１２０及びｐ４１からなる群より選ばれた少なくとも１種に複合化され、薬理学的に許容される添加物及び／又は担体が付加され得る組成物。
【請求項１４】
前記組成物がｇｐ１２０への結合親和性を少なくとも５０００ＲＵ有する請求項１記載の組成物。
【請求項１５】
前記組成物がｇｐ４１への結合親和性を少なくとも５０００ＲＵ有する請求項１記載の組成物。
【請求項１６】
前記組成物がＣＤ４への結合親和性を少なくとも５０００ＲＵ有する請求項１記載の組成物。
【請求項１７】
前記添加物が水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウムである請求項１記載の組成物。
【請求項１８】
前記添加物がリン酸カルシウムである請求項１記載の組成物。
【請求項１９】
前記添加物が、モノホスホリルリピッドＡ、Ｑｕｉｌ−Ａ含有免疫刺激性複合体（ISCOMs）、及び、スレオニル誘導体又はムラミールジペプチドを含むＳｙｎｔｅｘ  ａｄｊｕｖａｎｔ製剤からなる群より選ばれた請求項１記載の組成物。
【請求項２０】
（ａ）シスタチンＡタンパク質、及び、
（ｂ）少なくとも１種のヒストンタンパク質を含み、
他の胸腺タンパク質がなく、ヒトへの投与に適しており、薬理学的に許容される添加物又は担体が付加され得る組成物を必要としている被験者への投与を備え、ＡＩＤＳ（ＨＩＶ−１感染）又はＡＩＤＳになる危険性がある患者のための治療方法。
【請求項２１】
（ａ）シスタチンＡタンパク質、及び、
（ｂ）少なくとも１種のヒストンタンパク質を含み、
他の胸腺タンパク質がなく、ヒトへの投与に適しており、少なくとも１種の前記シスタチンＡタンパク質及び前記少なくとも１種のヒストンタンパク質がＣＤ４、ｇｐ１２０及びｐ４１からなる群より選ばれた少なくとも１種と複合化され、薬理学的に許容される添加物又は担体が付加され得る組成物を必要としている被験者への投与を備え、ＡＩＤＳ（ＨＩＶ−１感染）又はＡＩＤＳになる危険性がある患者のための治療方法。
【請求項２２】
前記投与を８週間以上にわたっておこなう請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記投与が週に２回である請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記週に２回の投与を連続した日におこなう請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記投与が経口、皮下、静脈内、筋肉内及び粘膜の投与のうちの少なくとも１つである請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記組成物がｇｐ１２０への結合親和性を少なくとも５０００ＲＵ有する請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記組成物がｇｐ４１への結合親和性を少なくとも５０００ＲＵ有する請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２８】
前記組成物がＣＤ４への結合親和性を少なくとも５０００ＲＵ有する請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２９】
前記添加物が水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウムである請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項３０】
前記添加物がリン酸カルシウムである請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項３１】
前記添加物が、リン酸アルミニウム又は水酸化アルミニウムなどのアルミニウム塩添加物、リン酸カルシウムナノ粒子（BioSante Pharmaceuticals, Inc.）、ＺＡＤＡＸＩＮTM、ヌクレオチドｐｐＧｐｐ及びｐｐｐＧｐｐ、死滅されたBordetella pertussis又はその成分、Corenybacterium由来のＰ４０成分、死滅されたコレラの毒素又はその一部、死滅されたマイコバクテリア又はその一部からなる群より選ばれた請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項３２】
（ａ）被験者から血液、血清、又は血漿のサンプルを収集すること、
（ｂ）前記サンプルを（ｉ）シスタチンＡタンパク質及び（ｉｉ）少なくとも１種のヒストンタンパク質を含む組成物と混合すること、
（ｃ）ＨＩＶ−１感染の指標となる、ＣＤ４、ｇｐ１２０及びｇｐ４１のいずれか１つに結合した前記組成物の複合体を特定すること、
を有するＨＩＶ−１感染の診断方法。
【請求項３３】
前記複合体を電気泳動により特定する請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
前記複合体をクロマトグラフィーにより特定する請求項３２記載の方法。
【請求項３５】
前記複合体をＨＰＬＣにより特定する請求項３２記載の方法。
【請求項３６】
前記複合体を免疫学的反応により特定する請求項３２記載の方法。
【請求項３７】
（ａ）シスタチンＡタンパク質、
（ｂ）少なくとも１種のヒストンタンパク質、及び
（ｃ）前記シスタチンＡタンパク質及び前記少なくとも１種のヒストンタンパク質の複合体の少なくとも１種をＣＤ４、ｇｐ１２０、又はｇｐ４１で特定する装置、
を備えたＨＩＶ感染の検出のためのキット。
【請求項３８】
（ａ）シスタチンＡタンパク質、及び、
（ｂ）少なくとも１種のヒストンタンパク質を含み、
他の胸腺タンパク質がなく、ヒトへの投与に適しており、薬理学的に許容される添加物又は担体が付加され得る組成物を必要としている被験者への投与を有する、ＴＨ細胞数の減少に関連する疾患の治療方法。
【請求項３９】
前記疾患が、多発性硬化症、慢性疲労症候群、関節リウマチ、アルツハイマー病、皮膚炎、１型糖尿病、大腸炎、炎症性腸疾患／過敏性腸症候群、クローン病、乾癬、慢性閉塞性肺疾患、全身性エリテマトーデス、移植による拒絶反応、及び癌からなる群より選ばれたものである請求項３８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫学及びウイルス学の分野に関し、特に、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症のような感染症及び疾患、それに関連した後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）やエイズ関連症候群（ＡＲＣ）のような疾患、また、Ｔ細胞数の減少に関連する疾患の診断法及び治療法に有用なシスタチンＡ及びヒストンを含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨髄は、免疫細胞になる細胞を生み出す。これらの細胞は、リンパ球又は食細胞になる。リンパ球は、免疫系の活動を行うための大きな責務を担う小さな白血球である。リンパ球の２つの主な種類は、Ｂ細胞及びＴ細胞である。Ｂ細胞は、骨髄で成長する（これにより“Ｂ細胞”という）。Ｔ細胞は胸腺に移動し（これにより“Ｔ細胞”という）、そこで増殖して免疫反応が可能な細胞へと成長する。骨髄や胸腺から出たうえでＢ及びＴ細胞の両方は、体中を広く且つ継続的に移動する。
【０００３】
Ｔ細胞には、２種の主な方法において免疫防御に寄与する制御性Ｔ細胞と細胞傷害性Ｔ細胞という２つの型がある。Ｔ細胞における主細胞は、“ヘルパー／インデューサー”細胞である。Ｔ４細胞マーカーによって特定されるヘルパーＴ細胞は、ナチュラルキラー細胞やマクロファージだけでなくＢ細胞や他のＴ細胞の活性化にとって必須である。細胞傷害性Ｔ細胞は、例えば、ウイルスに感染又はガンによって形質転換した細胞体を直接攻撃して取り除くキラー細胞である。
【０００４】
重要な食細胞は、単球及びマクロファージである。単球は、血液を巡り組織に移動し、そこでマクロファージ（“大食漢”）へと発達する。マクロファージは、体中の組織で見受けられ多くの役割を担う万能細胞である。スカベンジャーとしてマクロファージは、損傷を受けた細胞体や他の残骸を取り除く。最初に消化をおこなって処理しＴ細胞に抗原を提示する細胞の第一線に立って、マクロファージは免疫反応を開始するうえでの重要な役割を担う。分泌細胞として、単球、及びマクロファージは、免疫反応の調整に不可欠である。これらは、病原菌や腫瘍細胞を追跡するためにそれ自身を“活性化”することを可能にするリンホカイン受容体をも持っている。
【０００５】
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）などいくつかの疾患は、ウイルス、ＡＩＤＳの場合、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）によって引き起こされる。このようなウイルスは、例として再びＡＩＤＳを挙げると、ヘルパーＴ細胞を破壊し、マクロファージ及び単球に潜伏する。ヘルパーＴ細胞へのＨＩＶ−１の侵入は、ＣＤ４一次レセプター、ＣＣＲ５及びＣＸＣＲ４コレセプターに作用するものである。細胞侵入の最初の段階は、ＨＩＶ−１糖タンパク質ｇｐ１２０が標的細胞のＣＤ４レセプターに結合したときに生じる。次の段階は、ＨＩＶ−１外膜タンパク質とＣＣＲ５コレセプターとの間の相互作用である。いったんｇｐ１２０がレセプター及びコレセプターに作用すると、ＨＩＶ−１外膜タンパク質ｇｐ４１は、構造変化を受け、まさにウイルス膜を細胞膜のごく近傍に接近させる。そして２つの脂質二重層の融合が生じ、ウイルス内容物の細胞内侵入が可能となる（例えば、Nature (1997) 387:426-430を参照）。
【０００６】
ＨＩＶがヒト患者に感染するとき、ＨＩＶはそれ自身を免疫細胞のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）へと組み込み、そして３ヶ月から何年という変動する期間、患者は免疫不全の兆候を示さず、ときには検出可能レベルの対ＡＩＤＳ抗原を産生しないこともある。最初のＨＩＶ感染は検出可能な臨床疾患症状又は抗体の検出可能レベルを直ちにもたらすものではないことから、本明細書における“ＨＩＶ感染”との用語は、感染、及びそれからもたらされる疾患の両方を包含し、後者は“ＨＩＶ関連疾患”という。ＨＩＶ関連疾患の例は、ＡＩＤＳ及びＡＲＣである。上記潜伏期間の後、ＨＩＶは感染された細胞内で増殖し、いずれ宿主細胞を破裂させて新しく作られたウイルスを放出する。宿主細胞は過程のなかで破壊されることから、患者の免疫機構は機能しなくなり、宿主は、正常な免疫機構を備えたヒトが影響を受けない日和見疾患の影響を受けやすくなる。ヒトにおいては、一般的にＡＩＤＳウイルスが増殖し、ヒトはいずれ重度の免疫不全で死亡する。興味深いことに、ヒトのみがＡＩＤＳにかかる。ウサギ、マウス、ラット又はウシのようなヒト以外の哺乳類がＨＩＶを注射されると、その動物は一時的にいくらかＴ細胞の破壊を受ける。しかしながら、感染後１４〜２１日でその動物は抗体攻撃を備え、ＡＩＤＳでは死亡しない。このように、ＡＩＤＳには、動物モデルがない。
【０００７】
これまでのところ、多大な努力にもかかわらず、ＡＩＤＳのための治療はなく、有効な治療法は限られており、ある場合には取るに足らない結果となる。
【０００８】
疾患のより早い段階でＡＩＤＳを正確に診断することは、研究活動における焦点である。これまでのところ、一般的に、商業的に有効な診断検査は、ＨＩＶに対する患者の抗体を検出することに向けられている。しかしながら、ウイルスに対する抗体産生は、一般的に、患者がＡＩＤＳに感染したときから約１４〜２１日後までは起こらない。それゆえ、仮に、抗体産生が始まり十分な量となる前に患者が検査されると、検査は、間違った陰性の結果を出し得る。一方で、これら検査のいくつかは、抗体の非特異的結合により誤った陽性の結果をも出し得る。ウイルス感染を検出する他の手段は、核酸ハイブリッド形成によるものである。
【０００９】
特に断りのない限り、次の記載は非特許文献１に基づく。
【００１０】
ＨＩＶ感染の段階に最も密接に関連している代理マーカーは、ＣＤ４+又はＴヘルパー細胞数である。ＨＩＶ−１外膜糖タンパク質ｇｐ１２０は、具体的には、リンパ球の一部には高濃度で、単球やマクロファージでは低量で発現されているＣＤ４レセプターに結合する。ＣＤ４レセプターを発現している細胞は、“ヘルパー／インデューサー”サブセットと称され、ヒト白血球抗原クラスIIレセプターを有する細胞で示される抗原に対するＢ細胞の反応のためのヘルパー細胞、及びＴ細胞の免疫反応を抑制させるインデューサー細胞の両方として役割をはたす。ＣＤ４+細胞の選択的な減少は、ＡＩＤＳの顕著な特徴である日和見性の感染への易感染性に関連する数々の免疫欠如をもたらす。
【００１１】
ＨＩＶコア抗原ｐ２４は、ＨＩＶ抗体の発現前に検知できる。酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）による検査によるＨＩＶ抗体の出現の後、ｐ２４抗原は、ときには存続し、しばしば疾患の末期に再発するが、ほとんどの場合、検出されなくなる。血漿及び末梢血単核細胞培養で発見されるＨＩＶ−１力価は、特異抗体が検出されると急速に低下し、少なくとも一時的に宿主免疫反応が効力を有することを示す。免疫刺激のマーカーは、β2−ミクログロブリンを含む。
【００１２】
患者においては、セロコンバージョンの時期に引き続き、ＣＤ４+細胞の減少がＡＩＤＳへの進行に関連している。β2−ミクログロブリンの血中濃度及び血中におけるｐ２４抗原の検出は、両者とも独立して進行速度に関連していた。ＣＤ4細胞数と相まって、β2−ミクログロブリン及びｐ２４抗原の使用が、ＣＤ４+細胞数のみと比べて、ＡＩＤＳへの進行の予後精度を増加した。
【００１３】
しかしながら、次の３年を経過してもセロコンバーターがＣＤ４+細胞の百分率において一貫した減少をするのはまれである。訪問しない間に、ＣＤ４+細胞の百分率の安定段階又は減少段階は、被験者の３８％で見受けられ、ＣＤ4細胞欠如速度における平坦化の後に、１２％減少する。概して、３年を超える追跡調査後、ＣＤ４+細胞百分率において６２％減少する。
【００１４】
セロコンバージョンの時期が不明で血清反応陽性の同性愛男性ＨＩＶ感染者３０６人の研究において、ＣＤ４+細胞数が５００／μｌ未満であること及びｐ２４抗原の検出されることの両方が、３０ヶ月以内にＡＩＤＳとなる予測となる。
【００１５】
ＣＤ８+細胞の増加は、続いて起こるＡＩＤＳの進行の若干なりとも予測となった。
【００１６】
ＡＩＤＳへ進行すること及びＡＩＤＳながら生存することなどの臨床評価項目を、抗ウイルス療法の効果の代理マーカーとより相関させるために、ネオプテリン及びβ2−ミクログロブリンなどの付加マーカーの分析が、ＣＤ４細胞数及びｐ２４抗原と組み合わせられつつある。
【００１７】
抗エイズ薬であるジドブジンを許容し１２週間生存しているＡＩＤＳ及びＡＲＣ患者の限定された研究（非特許文献２）では、下記の事項が見出された。
【００１８】
３つの要因（年齢、開始時のＡＩＤＳ診断、血清ネオプテリン濃度の基準の記録）を制御した後、経時的な変化ではなく、８〜１２週におけるＣＤ４+の記録が生存継続を最も予測できた。８〜１２週におけるβ2−ミクログロブリン濃度の減少が生存を有意に予測し、ＣＤ４+細胞数の記録と相関し、最良の予測モデルを示した。ｐ２４抗原、血清ネオプテリン濃度、及びカルホフスキー一般状態（日常活動の機能測定）の減少は、臨床における生存と有意な相関を示さなかった。
【００１９】
ステインら（非特許文献１）は、ＣＤ４+細胞数及び代理マーカーの変化が抗レトロウイルス活動の調査用、薬剤や臨床、ＨＩＶ感染初期の患者における唯一の評価項目として使われることが多くなってくると推論している。
【００２０】
１型糖尿病、大腸炎及びクローン病などの他の疾患は、ウイルス感染により引き起こされるとは、現在のところ知られていない。しかしながら、これら疾患もヘルパーＴ細胞（ＴH）の数の減少と関連している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】Stein et al.（1992）Infect. Diseases 165:352
【非特許文献２】Jacobson（1991）BNJ, 302:73
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
それゆえ本発明は、ヘルパーＴ細胞数の減少に関わるＨＩＶ−１感染、ＡＩＤＳ、ＡＲＣ及び他の疾患のための診断及び治療をおこなう、シスタチンＡと少なくとも１種のヒストンとを含む組成物を提供するものである。
【００２３】
本発明は、さらに、シスタチンＡ及び少なくとも１種のヒストンを含みヒトへの投与に適した組成物を投与することによる、ＨＩＶ−１感染、ＡＩＤＳ、ＡＲＣ、そして他のＴ細胞の激減に関連する疾患にかかった又はかかる危険性がある被験者の治療法を具体化している。
【００２４】
本発明の他の実施形態においては、ＨＩＶ−１感染を特定するために用いられる診断法に、シスタチンＡ及び少なくとも１種のヒストンが含まれている。
【００２５】
本発明のさらなる実施形態は、シスタチンＡ及び少なくとも１種のヒストンを用いた、ＨＩＶ感染の特定を可能にするキットを含んでいる。
【００２６】
本発明の他の実施形態は、シスタチンＡ及び少なくとも１種のヒストンを含みヒトへの投与に適した組成物を投与することによる治療の方法であって、多発性硬化症（Nakajimaら. (2004) European Neurology 52:162-168）、慢性疲労症候群、関節リウマチ（Leader (1998) Ann Rheum Dis 57:328- 330）、アルツハイマー病、皮膚炎、(Feizy 及び Ghobadi, Dermatology Online Journal 12(3):3）、１型糖尿病（Feizy 及び Ghobadi, Dermatology Online Journal 12(3):3）、大腸炎（Fort ら. (2001) J Immunol 166:2793-2800）、炎症性腸疾患／過敏性腸症候群（Weinstock及び Summers (2001) Currents VoI 2, Number 1; Fichtner-Feigl ら. (2005) J Clin Invest doi: 10.1172/JCI24792）、クローン病（Sato ら. (2005) Gut 54:1254-1262）、乾癬（Simpson ら. (2002) Clin Exp Allergy 32:37-42）、慢性閉塞性肺疾患（Bottini ら. (2005) Intl Arch Allergy Immunol 138:328-333）、全身性エリテマトーデス、移植による拒絶反応、及び癌（Wu ら. (2005) Leukemia 19:268-274; Vujanovic ら. (2006) Cancer Gene Therapy 13:798-805）など、ＴＨ細胞の数の減少に関わる疾患（Simpsonら. (2002) Clin Exp Allergy 32:37-42; Bottini ら. (2005) Intl Arch Allergy Immunol 138:328-333）の治療の方法を含んでいる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ＨＩＶ−１外膜糖タンパク質及びヒトＣＤ４分子に結合したＴＮＰを示す。（Ａ）：クマシー染色の後のＴＮＰの１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（レーン１−分子量基準；レーン２−ＴＮＰ  ８０μｇ／ｍＬ）。（Ｂ）：Biacoreセンサーチップに固定された糖タンパク質  ヒトＣＤ４分子とＴＮＰとの代表的な結合センサー図（８μｇ／ｍＬ；、１．６μｇ／ｍＬ、０．４μｇ／ｍＬ）。（Ｃ）：Biacoreセンサーチップに固定された糖タンパク質  ＨＩＶ−１全長ｇｐ４１とＴＮＰとの結合センサーグラムの代表的な図（８μｇ／ｍＬ；、１．６μｇ／ｍＬ、０．４μｇ／ｍＬ）。（Ｄ）：Biacoreセンサーチップに固定された糖タンパク質  ＨＩＶ−１全長ｇｐ１２０とＴＮＰとの結合センサーグラムの代表的な図（８μｇ／ｍＬ；、１．６μｇ／ｍＬ、０．４μｇ／ｍＬ）。
【図２】ＨＩＶ−１ｇｐ１２０及びＣＤ４との結合によって精製されたＴＮＰタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図３Ａ】ヒストン画分Ｈ１、全ヒストン画分の異種混合物、非分画全ヒストン、並びに、ＢＳＡのヒトＣＤ４及びＨＩＶ−１  ｇｐ１２０との結合活性の代表例を示す。
【図３Ｂ】ヒストン画分Ｈ１、全ヒストン画分の異種混合物、非分画全ヒストン、並びに、ＢＳＡのヒトＣＤ４及びＨＩＶ−１  ｇｐ１２０との結合活性の代表例を示す。
【図３Ｃ】ヒストン画分Ｈ１、全ヒストン画分の異種混合物、非分画全ヒストン、並びに、ＢＳＡのヒトＣＤ４及びＨＩＶ−１  ｇｐ１２０との結合活性の代表例を示す。
【図３Ｄ】ヒストン画分Ｈ１、全ヒストン画分の異種混合物、非分画全ヒストン、並びに、ＢＳＡのヒトＣＤ４及びＨＩＶ−１  ｇｐ１２０との結合活性の代表例を示す。
【図３Ｅ】ヒストン画分Ｈ１、全ヒストン画分の異種混合物、非分画全ヒストン、並びに、ＢＳＡのヒトＣＤ４及びＨＩＶ−１  ｇｐ１２０との結合活性の代表例を示す。
【図３Ｆ】ヒストン画分Ｈ１、全ヒストン画分の異種混合物、非分画全ヒストン、並びに、ＢＳＡのヒトＣＤ４及びＨＩＶ−１  ｇｐ１２０との結合活性の代表例を示す。
【図３Ｇ】ヒストン画分Ｈ１、全ヒストン画分の異種混合物、非分画全ヒストン、並びに、ＢＳＡのヒトＣＤ４及びＨＩＶ−１  ｇｐ１２０との結合活性の代表例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
１．定義
次の定義は、本明細書において用いられる。
【００２９】
添加物（アジュバント）：この用語は、特異的又は非特異的に免疫反応を高める抗原に、取り込まれ、関連し又はその抗原と同時に投与される物質をあらわすために用いられる。
【００３０】
ヒストン：他に断りのない限り、この用語は、Ｈ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、Ｈ４、及びＨ５を含む全てのヒストンタンパク質を包含する。
【００３１】
ヒトへの投与に適する：この用語は、化合物又は組成物のさらなる操作をヒトへの投与前に必要としないように、毒性がなく十分に純度を高められた化合物又は組成物であることを求めている。
【００３２】
胸腺タンパク質：この用語は、もっぱら胸腺で産生され見つけられるタンパク質を表す。この用語は、構造に組み込まれる、又は全ての細胞型で起こる生理的過程に加わるタンパク質を包含する。例として、ヒストン及びユビキチンは、胸腺タンパク質と考えられる一方で、アルブミン及びインシュリンは、胸腺タンパク質ではない。
【００３３】
２．本発明
本発明は、シスタチンＡ及び少なくとも１種のヒストンを含みヒトへの投与に適した組成物を提供する。これらタンパク質は、胸腺から得られる抽出物の副画分であり、子牛胸腺から単離されたときはしばしば“胸腺核タンパク質（ＴＮＰ）”として表現される（例えば、ＵＳ２００４００１８６３９参照）。
【００３４】
より詳しくは、シスタチンＡ及び少なくとも１種のヒストンは、それぞれ１２ｋＤ、１５及び／又は１６ｋＤの分子量を有する。これらのタンパク質は、子牛、羊、山羊、豚などの哺乳類の胸腺から標準的な操作によってサイズ排除法をおこなうことにより単離され得る。例えば、胸腺抽出物は、Hand ら. (1967) Biochem. BioPhys. Res. Commun. 26:18-23、Hand ら. (1970) Experientia 26:653-655、又は、Moudjou ら (2001) J Gen Virol 82:2017-2024の操作法を採用することにより得られる。サイズ排除クロマトグラフィーは、例えば、Folta-Stogniew 及び Williams (1999) J. Biomolec. Tech. 10:51-63 、並びに、Brooks ら. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. 97:7064-7067に記載されている。
【００３５】
シスタチンＡ及びヒストンは、ＣＤ４、ｇｐ１２０、ｇｐ４０の少なくとも１つへの連続的な結合によって、サイズの選択された結果として生じたタンパク質溶液から精製される。精製は、Moritz ら. (1990) FEBS Lett. 275:146-50、Hecker ら. (1997) Virus Res. 49:215-223、Mclnerney ら. (1998) J. Virol. 72:1523-1533、及び、Poumbourios ら. (1992) AIDS Res. Hum. Retroviruses 8:2055-2062に記載されているように例えば親和性クロマトグラフィーによって実行され得る。
【００３６】
必要であれば、ヒトへの投与に適した組成物を得るためにさらなる精製が実施される。付加的な精製方法の例を挙げるとすれば、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、質量分析、等電点電気泳動法、親和性クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、逆相クロマトグラフィー、電気泳動法である。これらの技術は標準的でよく知られたものであり、また、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel ら (eds), John Wiley and Sons, New York.；Protein Purification: Principles, High Resolution Methods, and Applications, 2nd ed., 1998, Janson and Ryden (eds.) Wiley-VCH；並びに、Protein Purification Protocols, 2nd ed., 2003, Cutler (ed.) Humana Pressのような研究マニュアルで参照される。
【００３７】
また、シスタチンＡ及びヒストンは、上述したようにヒトへの投与に適した状態で混合、精製され、商業的に購入できる。シスタチンＡ及びヒストンの供給メーカーの例を挙げると、例えば、Sigma、ProSpec-Tany TechnoGene LTD、Lab Vision Corporation、Upstate Cell Signaling Solutions and Stressgen Bioreagentsである。シスタチンＡ及び少なくとも１種のヒストンの割合は、０．０１重量％：０．９９重量％から０．９９重量％：０．１重量％である。好ましい範囲は、ヒストンに対しシスタチンＡ１０重量％から９０重量％である。
【００３８】
３．本発明の組成物の重要な特徴
シスタチンＡ及び少なくとも１種のヒストンを含む本発明の組成物は、後述するようにさまざまな実験の結果によって証明されるように、組成物が患者個人に投与された場合、治療されなかった個人に比べて徐々に健康状態を向上させることから、興味深いものである。特に、本発明の組成物を受けた個人は、治療されなかった個人と比べてＴH細胞の数の増加を示した。例えば、本発明の組成物で治療された個人は、ＴH細胞の増加を少なくとも１０％、２５％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又はそれ以上示した。加えて、本発明の組成物で治療された個人は、体重の増加を０．１〜１ｋｇ、1〜２ｋｇ、２〜３ｋｇ、又は３ｋｇ以上示した。
【００３９】
ウイルス性又はレトロウイルス性の感染症を患う患者にとっては、本発明の組成物での治療は、ウイルス量の減少を少なくとも１０％、２５％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％もしくはそれ以上もたらし得る。
【００４０】
さらに、本発明の組成物にでの治療によって得られる効果は、治療の終了から少なくとも９０日、１５０日、１８０日、２４０日、３３０日、６６７日間もしくはそれ以上持続される。
【００４１】
本発明の組成物は、直接使用されるか又は適した添加物及び／又は担体と混合され得る。適した添加物としては、リン酸アルミニウム又は水酸化アルミニウムなどのアルミニウム塩添加物、リン酸カルシウムナノ粒子（BioSante Pharmaceuticals, Inc.）、ＺＡＤＡＸＩＮTM、ヌクレオチドｐｐＧｐｐ及びｐｐｐＧｐｐ、死滅されたBordetella pertussis又はその成分、Corenybacterium由来のＰ４０成分、コレラ毒素とマイコバクテリアの全部又は一部、及び免疫刺激性複合体ＩＳＣＯＭｓ（DeVries ら., 1988; Morein ら., 199&, Lovgren : al., 1991）を含む。当業者であれば、製薬学的用途にふさわしい、又は、ヒトにおける使用に適した担体に精通している。
【００４２】
４．本発明の組成物の使用
注射（筋肉内又は皮下）は、本発明の組成物の治療的投与にとって主要な経路になるであろう。しかしながら、静脈輸送、カテーテルを通した輸送、又は他の外科的なチューブも使用され得る。別の経路としては、錠剤もしくはその類似物、液状剤、凍結乾燥された吸入剤、又は噴霧性受容体が含まれる。液状剤は、粉状剤からの再構成後に使用され得る。
【００４３】
前記組成物は、ミクロスフェア、リポソーム、他の微粒子輸送システム、又は血液を含むある組織に留置された持続性放出剤によっても投与され得る。
【００４４】
投与される組成物の量は、用いられる剤型の特性次第であり、医師の技量の範囲内であるように、例えば、その結合活性、体内での血漿中濃度半減期、剤型内での組成物の濃度、投与経路、投与の場所及び速度、患者に関連する臨床的耐性、患者の病状などによって決まる。
【００４５】
異なる使用量が一連の連続的な予防接種で採用される；医師は、初回接種を投与し、次に比較的少ない組成物量で促進する。
【００４６】
次に示すのは、ＴＦ剤型、投与量、投与スケジュールの例である。各個人には、８ｍｇの組成物を含む筋肉内又は皮下注射が投与（好ましくは生理学的に許容される溶液中に組成物を４ｍｇ／ｍｌ含む２ｍｌの剤型）、又は、患者の体重１ｋｇあたり５７μｇのＴＦタンパク質が投与される。いずれの治療コースも１６回の投与からなり、８週間にわたって週あたり連続した日に２回の注射がある。患者の疾患状態は、以下に示す方法によって観察される。最終の注射から３ヶ月でもなお患者が疾患に苦しんでいる場合、投与計画は繰り返される。投与計画は、満足できる結果が得られるまで繰り返され、例えば、疾患の終了、疾患の進行の鈍化、疾患もしくは治療の緩和が得られるまで繰り返される。好ましくは、組成物は水酸化アルミニウム添加物で製剤化される。例えば、最終の組成物の剤型の１ｍｌは、４ｍｇの組成物を含み、０．０１６Ｍ  ＡｌＰＯ4（又は０．５ｍｇＡｌ3+）、０．１４Ｍ  ＮａＣｌ、０．００４Ｍ  ＣＨ3ＣＯＯＮａ、０．００４Ｍ  ＫＣｌ、ｐＨ６．２である。
【００４７】
また、各人は、５ヶ月後以降、好ましくは６ヶ月後以降から２年後、より好ましくは８ヶ月以降から１年後に患者の“免疫記憶”を高めるために接種され得る。Anderson ら., Infectious Diseases, 160 (6):960-969 (1989)を参照のこと。一般的に、比較的長い期間における組成物の不定期的な免疫投与は、最大免疫反応を導き出すために頻繁な免疫付与よりも好ましい。
【００４８】
本発明の組成物は、様々な方法で、異なる部類の受諾者に投与され得る。
【００４９】
本発明の組成物は、一度の “カクテル”接種で他の抗原と組み合わせて投与され得る。該組成物は、長い時間をかけて投与される一連の予防接種として投与され得る。このような一連の予防接種は、抗原又は他のワクチンの同一又は異なる調合での接種を包含し得る。
【００５０】
例えば、投与量、スケジュール、添加物の選択など、選択された処置条件の妥当性は、患者からの血清の一定分量を取り、治療プログラムの経過の間における抗体及び／又はＴ細胞力価を測定することにより決定される。Ｔ細胞力価は、従来の方法で測定される。例えば、Bach, F., Contemporary Topics in Immunology, Vol. 2: Thymus Dependency, p. 189, Plenum Press, New York, 1973;、及び、Hoffmnan, T. & Kunkel, H. G., and Kaplan, M. E., ら.の両論文に記載されているように、Ｔリンパ球は、Ｅ−ロゼット形成により検出され得る。例えば、Ｔ細胞ロゼット形成の量は、治療後の３週間後であるが１０週間より以前に測定される。６５％を超えるロゼット形成は、患者における良好な細胞性免疫反応を示している。
【００５１】
加えて、患者の病体は、例えばＴ細胞数の増加及び／又は体重増加といった望ましい結果のために観察され得る。仮に不十分な効果となった場合、患者はさらなる治療で補完され、免疫反応を高めるために、例えば、本発明の組成物及び／又は添加物の量を増加させること、シスタチンＡ及び／又は少なくとも１種のヒストンを担体と複合化すること、又は免疫原生タンパク質に接合させること、又は投与経路を変更することなどにより、治療条件が変更され得る。
【００５２】
前記組成物は、付加的に、ＨＩＶ感染、ＡＩＤＳ及びＡＲＣなど、個人がかかった疾患を治療するために用いられる他の薬理作用のある物質とともに投与され得る。これら薬理作用のある物質の例は、ＡＺＴ、抗生物質、インターフェロンなどの免疫促進剤、抗炎症剤、及び抗腫瘍剤である。多発性硬化症、間接リウマチ、１型糖尿病及び炎症性腸症候群のような他の疾患は、他の薬理作用のある物質と関連している。適した薬理作用物質を特定することは、十分医師の技量の範囲にある。
【００５３】
感染及び／又は疾患を特定するための診断用装置
もう１つの側面として本発明は、感染及び／又は疾患をインビトロで特定するために有用な診断用装置を提供する。
【００５４】
本発明を記載したうえで、次の例は本発明を説明するために示され、そして本発明の範囲を限定するものとして解釈されるものではない。
【実施例】
【００５５】
５．本発明の組成物の有用性を裏付ける実験
（試験例１）
ＵＳ  ２００４００１８６３９に準じ、新鮮な子牛の胸腺から胸腺タンパク質を単離した。ウシ血清アルブミン（Sigma，cat.No  A-3912）を用いたブラッドフォード分析によって較正基準によりタンパク質の濃度を決定した。１０％及び／又は１５％のアクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によってサンプルの純度を分析した。製造者の手順書に従い、クマシーブリリアントブルーＲ２５０及び／又は銀染色（BioRad, Cat #161-0443）によって分離されたタンパク質を視覚化した。同じゲル上で測定し、分子量既知のマーカータンパク質の相対移動度と比較することにより、タンパク質帯の分子量を見積もった（図１Ａ）。
【００５６】
BIAcore 2000（Biacore, Sweden）で結合試験をおこなった。組み換えヒトＣＤ４（Progenies, Cat. # PRO 1008-1）、組み換えＨＩＶ−Ｉ  ｇｐ１２０（NIH AIDS Resea
rch & Reference Reagent Program, # 4961）及びｇｐ４１（546-682 aa）を、チップのデキストランマトリックスにおけるカルボキシル基へ該当タンパク質をアミン結合させることによって、バイセンサーチップ（ＣＭ５）の表面に固定させた。10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.05% surfactant P20を含みｐＨ７．４である流動緩衝液での粗試料の連続希釈液を、固定された各目的物に対して５μｌ／分で注入し、結合／解離の反応速度論をＳＰＲシグナル（resonance units−ＲＵ）の変化として測定した。各注入に続いて１Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＯＨでの３０秒間パルスの再生ステップをおこなった。実験データの数式による近似をＢＩＡ評価ソフトウェア３．０でおこなった。粗タンパク質は、ＣＤ４分子（図１Ｂ）、ＨＩＶ−１のｇｐ４１及びｇｐ１２０（図１Ｃ、図１Ｄ）に強く結合したが、ＢＳＡには結合しなかった。
【００５７】
製造者の取扱説明書に従い親和性クロマトグラフィーカラム（MicroLinkTM Protein Coupling Kit, Pierce, Cat. #20475）を用いて、単離された胸腺タンパク質サンプルからのタンパク質画分を精製した。即ち、組み換えヒトＣＤ４（Progenies, Cat. # PRO 1008-1）の０．２ｍｇ、又は組み換えＨＩＶ−Ｉ  ｇｐ１２０（NIH AIDS Research& Reference Reagent Program, #4961）、又は重要でない抗原（アミロイドベータペプチド）をアミノ架橋結合ゲルで固定させ、残存した活性結合部位を１Ｍ  Tris・HCl, 0.05% NaN3でブロックした。固定させたタンパク質で１ｍＬの粗胸腺タンパク質サンプルをインキュベートし免疫複合体を形成した。重要でない物質を取り除くべくゲル結合複合体を洗浄した。溶液（ｐＨ２．８）を含む１級アミンで、ＣＤ４又はｇｐ１２０に特に結合したタンパク質を溶離させ、中和した。溶離させた画分を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてクマシーブリリアントブルーＲ２５０及び／又は銀染色（それぞれ図２Ａ及び図２Ｂ）によって分析し、ブラッドフォードタンパク質分析によって濃度を決定した。これら帯の分子サイズは、約１４〜１７ｋＤａであった。
【００５８】
１種はｇｐ１２０と結合しもう１種はヒトアミロイドベータペプチドに結合した２種のアミノ結合カラムを用いて、同じサンプルを精製し、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで溶離タンパク質の異なる画分を泳動することにより、これらタンパク質の特異性を確認した。３つの細い帯が検出され、ｇｐ１２０に特有の低分子量のタンパク質がｇｐ１２０のカラムから溶離された画分＃２、＃３、及び＃４に示された（図２Ｃ）一方で、アミロイドベータタンパク質のカラムから溶離したどの画分からもタンパク質は検出されなかった（図２Ｄ）。ｇｐ１２０のカラムから溶離された画分＃２〜＃４は、ＣＤ４と結合した他のアミノ結合カラムを通して出てきた。ｇｐ１２０に結合した３種全てのタンパク質は、ＣＤ４分子に特有でもあり、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでの検出で１４〜１７ｋＤａであった（図２Ｅ）。
【００５９】
（試験例２）
約１６，０００；１５，０００及び１２，０００ダルトンの分子量を備えた３つの帯の配列分析をカルフォルニア大学デービス校の分子構造施設でタンデム質量分析を用いて新たに配列分析することによりおこなった。ＬＣカラムへ直接結合したFinnigan LCQ Deca XP Plus（サンノゼ、カリフォルニア州）を用いてタンパク質分析をおこなった。配列分析ソフトウェア（Bioworks v. 3.1）を用いて、観察されたＭＳ／ＭＳスペクトルに最も適合するペプチド配列をヒト又はウシのタンパク質データベースにおいて特定した。
【００６０】
ウシのデータベースからの結果は、１６ｋＤａのタンパク質をヒストンＨ１．１又はＨ２Ｂと特定した。分析は、１５ｋＤａ及び１２ｋＤａのタンパク質がウシのＨ１．１配列（それぞれ５０．５％及び４８．６％配列包括度）であり得ることをも示した。これら分析に加えて、配列をヒトのデータベースと比較した。さらに、１６ｋＤａタンパク質は、ヒトのヒストンＨ２．Ｂ（４２．１％の包括度）を示すようであるが、このタンパク質の配列は、ヒトのシスタチンＡのアミノ酸配列に２４．５％の同一性をも有する。興味深いことに、１５ｋＤａタンパク質もシスタチンＡに４２．９％の同一性を示した一方で、１２ｋＤａのタンパク質は、６１．２％の同一性を示した。注目すべきは、これら分子も、Ｈ１ヒストンファミリーに約２４％のアミノ酸配列の同一性を有していた。
【００６１】
（試験例３）
ヒストン及びシスタチンＡの同一性を、これらタンパク質のＨＩＶ１ｇｐ１２０及びヒトＣＤ４分子への結合を直接的に実証することにより確認した。結合のための研究は、BIAcore 2000 （Biacore, Sweden）でおこなった。組み換えヒトＣＤ４（Progenies, Cat. # PRO 1008-1）、組み換えＨＩＶ−１  ｇｐ１２０（NIH AIDS Research & Reference Reagent Program, # 4961）、及びｇｐ４１（546-682 aa）を、チップのデキストランマトリックスにおけるカルボキシル基へ該当タンパク質をアミノ結合させることによって、バイオセンサーチップ（ＣＭ５）の表面へ固定した。10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.05% surfactant P20を含みｐＨ７．４である流動緩衝液における粗サンプルの連続的な希釈物を、固定された各目的物に対して５μｌ／分で注入し、結合／解離の反応速度論をＳＰＲシグナル（resonance units−ＲＵ）の変化として測定した。各注入に続いて１Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＯＨでの３０秒間パルスの再生ステップをおこなった。実験データの数式による近似をＢＩＡ評価ソフトウェア３．０でおこなった。
【００６２】
５種のヒストンのうち４種がｇｐ１２０及びＣＤ４分子によく結合した（図３Ａ及びＢ）。しかしながら、ｇｐ１２０への結合の親和性は、ＣＤ４のものと比べて顕著に高かった。
【００６３】
（試験例４）
組成物のシスタチンＡ及びヒストン成分の結合親和性は、等温滴定熱量法（参照することによりそのまま援用されるVelazquez-Campoy 及び Freire (2006) Nature Protocols 1: 186-19l；Sigurskjold (2000) Anal Biochem 277:260-266；Wiseman ら. (1989) Anal. Biochem 179:131-137のような標準手順を用いて決定される。あるいは、結合親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅ技術を用いることにより決定される。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
2010510174.tif 000008
【図３Ｅ】
2010510174.tif 000009
【図３Ｆ】
2010510174.tif 000010
【図３Ｇ】
2010510174.tif 000011
【国際調査報告】
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