(57)【要約】本発明は、被検体から得た体液サンプル中のワイルドタイプまたは変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子を検出する方法を開示している。さらに、癌を検出するバイオマーカーとしてＢ−ＲＡＦを用い、癌の結果を予測し、癌の治療または癌の状態をモニタリングする方法が開示されている。また、本発明は、ワイルドタイプ遺伝子にハイブリダイゼーション可能なペプチド核酸クランプと、前記遺伝子の変異体にハイブリダイゼーション可能なロックされた核酸プローブを用いて変異体を検出する方法および組成物に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体中のワイルドタイプまたは変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子を検出する方法において、
被検体からＤＮＡを含む体液サンプルを得るステップと、
前記サンプル中のワイルドタイプまたは変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子を検出するステップと、を具えることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記体液サンプルが、血液、血漿、血清または脳髄液サンプルであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子が、Ｂ−ＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異体を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
被検体中の癌を検出する方法において、
ＤＮＡを含む体液サンプルを被検体から得るステップと、
前記サンプル中の変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子を検出するステップと、を具え、
前記変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子の存在が、前記被検体が癌に罹患していることを示唆することを特徴とする方法。
【請求項５】
前記体液サンプルが、血液、血漿、血清または脳髄液サンプルであることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子がＢ−ＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異体を含むことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記癌が、黒色腫、甲状腺癌、直腸結腸癌、肺癌または神経系の癌であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項８】
癌の結果を予測する方法において、
癌に罹患しているテスト被検体からＤＮＡを含む組織または体液サンプルを得るステップと、
前記サンプル中の変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子を検出するステップとを具え、
前記変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子の存在が示唆することが、癌に罹患しているが変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子を有しないコントロール被検体よりも、前記テスト被検体が、生き残る、または、癌療法に対するレスポンダーである可能性が低いことを特徴とする方法。
【請求項９】
前記組織サンプルは、パラフィン包埋組織サンプルであり、前記体液サンプルが、血液、血漿、血清または脳髄液サンプルであることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記癌が、黒色腫、甲状腺癌、直腸結腸癌、肺癌または神経系の癌であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子がＢ−ＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異体を含むことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記癌療法が、生化学的療法であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記サンプルが、前記療法の前または後で前記テスト被検体から得られることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
癌治療をモニタリングする方法において、
癌療法を用いて癌に罹患している被検体を治療するステップと、
前記被検体からＤＮＡを含む組織または体液サンプルを得るステップと、
前記サンプル中の変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子を検出するステップと、を具え、
前記治療後の前記変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子の量が、前記治療前の前記変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子の量よりも少ない場合、前記被検体が前記療法に対するレスポンダーである可能性があることを示唆することを特徴とする方法。
【請求項１５】
前記組織サンプルがパラフィン包埋組織サンプルであり、前記体液サンプルが、血液、血漿、血清または脳髄液サンプルであることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記癌が、黒色腫、甲状腺癌、直腸結腸癌、肺癌または神経系の癌であることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子が、Ｂ−ＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異体を含むことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記癌療法が、生化学的療法であることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
被検体中の癌の状態をモニタリングする方法において、
第１の時間ポイントで、癌に罹患している被検体からＤＮＡを含む第１の体液サンプルを得るステップと、
前記第１の時間ポイントに続く第２の時間ポイントで、前記被検体からＤＮＡを含む第２の体液サンプルを得るステップと、
前記第１および第２のサンプル中の変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子の量を検出するステップと、を具え、
前記第２のサンプル中の前記変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子の量が、前記第１のサンプル中の前記変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子の量よりも多い場合、前記癌が、前記被検体中で進行している可能性があることを示唆し、前記第２のサンプル中の前記変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子の量が、前記第１のサンプル中の前記変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子の量よりも少ない場合、前記癌が前記被検体中で減退している可能性があることを示唆することを特徴とする方法。
【請求項２０】
前記変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子は、Ｂ−ＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異体を含むことを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子を検出する方法において、
ＤＮＡを含むサンプルと、ワイルドタイプＢ−ＲＡＦ遺伝子にハイブリダイゼーション可能なペプチド核酸クランプとを提供するステップと、
前記サンプル中の変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子を検出するステップと、を具えることを特徴とする方法。
【請求項２２】
前記変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子が、前記変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子にハイブリダイゼーション可能なロックされた核酸プローブで検出されることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子が、ポリメラーゼ鎖反応によって検出されることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記サンプルが、被検体から得られる組織または体液サンプルであることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子が、Ｂ−ＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異体を含むことを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
変異体遺伝子を検出する方法において、
ＤＮＡを含むサンプルと、ワイルドタイプ遺伝子にハイブリダイゼーション可能なペプチド核酸クランプを提供するステップと、
前記変異体遺伝子にハイブリダイゼーション可能なロックされた核酸プローブで、前記サンプル中の前記遺伝子の変異体を検出するステップと、を具えることを特徴とする方法。
【請求項２７】
前記変異体遺伝子が、ポリメラーゼ鎖反応によって検出されることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記サンプルが、被検体から得た組織または体液サンプルであることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記遺伝子が、Ｋ−Ｒａｓ、Ｎ−ＲＡＳ、ｐ５３、レセプタチロシンキナーゼ、ＥＧＦＲまたはＲＥＴ遺伝子であることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
ワイルドタイプ遺伝子にハイブリダイゼーション可能なペプチド核酸クランプと、
前記遺伝子の変異体にハイブリダイゼーション可能なロックされた核酸プローブとを具える組成物。
【請求項３１】
前記遺伝子が、Ｂ−ＲＡＦ、Ｋ−Ｒａｓ、Ｎ−ＲＡＳ、ｐ５３、レセプタチロシンキナーゼ、ＥＧＦＲまたはＲＥＴ遺伝子であることを特徴とする請求項３０に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００７年２月２６日に出願された米国仮出願番号６０／８９１，５８９、及び、２００７年３月６日に出願された米国仮出願番号６０／８９３，２４３の優先権を主張し、その両方の内容は、参照することで本明細書にその全体を組み込むものとする。
【０００２】
本発明は、ＮＩＨ（ＰＯＣＡ０２９６０５、ＰＯＣＡ０１２５８２、及び、Ｒ３３−ＣＡ１００３１４）からの許諾による部分的支援がなされていた。従って、米国政府は所定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、一般的な癌の管理に関する。より具体的には、本発明は、検出、予測およびモニタリング療法についての癌患者の評価におけるバイオマーカーとして、Ｂ−ＲＡＦ遺伝子（ワイルドタイプおよび変異体）の使用方法を提供する。
【背景技術】
【０００４】
皮膚黒色腫の管理は、重大課題に困惑している状態が続いている。医療予後因子は、疾患の再発や転移性疾患の患者の全体的な生存を予測することが示されていない。メラノーマに対するアジュバント治療は、重い副作用がでる可能性があり、深刻な病的状態と関連している可能性がある。さらに、どの患者が利用可能ないくつかの処置オプションに応答するか判定し、疾患の再発や進行を予測することは、困難である。
【０００５】
最近の十年間に亘って、メラノーマ翻訳リサーチの進歩は、この疾患の進行に影響を与える、分子の重要な組成と遺伝的改変を識別することを試みてきた（１）。高処理量遺伝的アプローチは、ＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ−ＭＡＰキナーゼシグナル経路における遺伝子異常（ａｂｅｒｒａｔｉｏｎ）の同定に焦点を当てており、それは、細胞分化、増殖およびアポトーシスを調節することを示していたからである（２−４）。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、循環するＢ−ＲＡＦ変異（Ｂ−ＲＡＦｍｕｔ）が、Ｂ−ＲＡＦ変異を担持する癌の診断と、治療に対する癌患者の反応のモニタリングに使用可能であるという予期せぬ発見に少なくとも部分的に基づいている。従って、本発明は、癌患者中の循環するＢ−ＲＡＦ変異（Ｖ６００Ｅ）またはワイルドタイプＤＮＡの検出、および、その臨床的有用性の評価を提供する。
【０００７】
より具体的には、一態様においては、本発明は、被検体のワイルドタイプまたは変異Ｂ−ＲＡＦ遺伝子の検出方法を提供する。この方法は、被検体からＤＮＡを含む体液サンプルを得るステップと、サンプル中のワイルドタイプまたは変異Ｂ−ＲＡＦ遺伝子を検出するステップとを具える。
【０００８】
別の態様においては、本発明は、被検体の癌を検出する方法を提供する。本発明の方法は、被検体からＤＮＡを含む体液サンプルを得るステップと、サンプル中の変異Ｂ−ＲＡＦ遺伝子を検出するステップとを具える。変異Ｂ−ＲＡＦ遺伝子の存在は、被検体が癌に罹患していることを示唆する。
【０００９】
さらに別の態様において、癌の結果を予測する方法を提供する。この方法は、癌に罹患しているテスト被検体からＤＮＡを含む組織または体液サンプルを得るステップと、サンプル中の変異Ｂ−ＲＡＦ遺伝子を検出するステップと、を具える。変異Ｂ−ＲＡＦ遺伝子の存在は、テスト被検体が、癌に罹患しているが変異Ｂ−ＲＡＦ遺伝子を有しないコントロール被検体よりも、生き残るか、あるいは、癌治療に対するレスポンダー（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）となる可能性が低いことを示唆する。いくつかの実施例においては、癌治療の前に、サンプルはテスト被検体から得られ；他の実施例においては、癌治療後に、サンプルはテスト被検体から得られた。
【００１０】
さらなる別の態様において、本発明は、癌治療をモニタリングする方法を提供する。この方法は、癌セラピで、癌に罹患している被検体を治療するステップと、被検体からＤＮＡを含む組織または体液サンプルを得るステップと、サンプル中に変異Ｂ−ＲＡＦ遺伝子を検出するステップとを具える。治療後の変異Ｂ−ＲＡＦ遺伝子の量は、治療前の変異Ｂ−ＲＡＦ遺伝子の量よりも少ない場合、被検体が治療のレスポンダーである可能性があることを示唆する。
【００１１】
本発明は、被検体の癌の状態をモニタリングする方法をさらに提供する。この方法は、第１の時間ポイントで癌に罹患している被検体からＤＮＡを含む第１の体液サンプルを得るステップと、第１の時間ポイントに続く第２の時間ポイントで被検体からＤＮＡを含む第２の体液サンプルを得るステップと、第１および第２のサンプルにおける変異Ｂ−ＲＡＦ遺伝子の量を検出するステップと、を具える。第２のサンプル中の変異Ｂ−ＲＡＦ遺伝子の量が、第１のサンプル中の変異Ｂ−ＲＡＦ遺伝子の量よりも多い場合、癌は、被検体で進行している可能性がある。他方、第２のサンプル中の変異Ｂ−ＲＡＦ遺伝子の量が、第１のサンプル中の変異Ｂ−ＲＡＦ遺伝子の量よりも少ない場合、癌は、被検体で減退している可能性がある。
【００１２】
さらに、本発明は、変異Ｂ−ＲＡＦ遺伝子を検出する方法を提供する。この方法は、ＤＮＡと、ワイルドタイプのＢ−ＲＡＦ遺伝子にハイブリダイゼーション可能なペプチド核酸クランプとを含むサンプル（例えば、被検体から得られる組織または体液サンプル）を提供するステップと、サンプル中に変異Ｂ−ＲＡＦ遺伝子を検出するステップと、を具える。いくつかの実施例においては、変異Ｂ−ＲＡＦ遺伝子は、変異Ｂ−ＲＡＦ遺伝子にハイブリダイゼーション可能なロックされた核酸プローブで検出される。いくつかの実施例においては、変異Ｂ−ＲＡＦ遺伝子が、ポリメラーゼ鎖反応によって検出される。
【００１３】
さらに、本発明は、変異遺伝子を検出する方法を提供する。この方法は、ＤＮＡと、ワイルドタイプ（例えば、Ｋ−Ｒａｓ、Ｎ−ＲＡＳ、ｐ５３、レセプタチロシンキナーゼ、ＥＧＦＲまたはＲＥＴ遺伝子）の遺伝子にハイブリダイゼーション可能なペプチド核酸クランプを含むサンプル（例えば、被検体から得られる組織または体液サンプル）を提供するステップと、変異遺伝子にハイブリダイゼーション可能なロックされた核酸プローブで、サンプル中の遺伝子の変異を検出するステップと、を具える。いくつかの実施例においては、変異遺伝子は、ポリメラーゼ鎖反応によって検出される。
【００１４】
本発明の方法において、体液サンプルは、血液、血漿、血清または大脳脊髄液サンプルでもよく；組織サンプルは、パラフィン包埋組織サンプルでもよく；癌は、メラノーマ、甲状腺癌、直腸結腸癌、肺癌または神経系の癌でもよく；変異Ｂ−ＲＡＦ遺伝子は、Ｂ−ＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異を含んでいてもよく；および、癌療法は、生化学的療法でもよい。
【００１５】
本発明は、ワイルドタイプ遺伝子（例えば、Ｂ−ＲＡＦ、Ｋ−Ｒａｓ、Ｎ−ＲＡＳ、ｐ５３、レセプタチロシンキナーゼ、ＥＧＦＲまたはＲＥＴ遺伝子）にハイブリダイゼーション可能であるペプチド核酸クランプを具える組成物と、遺伝子の変異にハイブリダイゼーション可能なロックされた核酸プローブを具える。
【００１６】
本発明の上述したその他の特徴、および、これらを取得して使用する方法は、添付の図面と併せて以下の説明を参照することによって、より明らかになり、完全に理解されるであろう。図面は、本発明の典型的な実施例のみを示しており、従って、本発明の範囲を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、ＰＣＲによって行われるＰＮＡ／ＬＮＡクランプの概略図である。図の上方は、増幅されていないＰＮＡ／ｗｔ  ＤＮＡ複合体を示している。図の下方は、Ｖ６００Ｅを認識しハイブリダイゼーションする二重ラベルＬＮＡプローブを用いてＢ−ＲＡＦｍｔを含むＤＮＡテンプレートの増幅を示す。
【図２】図２は、ＢＣ患者のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線を示す。全生存でのＢＣ後の血清Ｂ−ＲＡＦ状態、Ｂ−ＲＡＦｓｍｔおよびＢ−ＲＡＦｓｗｔの相互関係（ログランクテスト、Ｐ＝０．０３９）。
【図３】図３は、ＢＣ治療後、レスポンダーおよび非レスポンダーの血清中の縦貫するＢ−ＲＡＦｓｍｔのＤＮＡ濃度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、いくつかある中で、血液中、すなわち、血清または血漿、およびパラフィン包埋組織中で、Ｂ−ＲＡＦｍｕｔの検出に関する感度の良いアッセイを提供する。血液中を循環するＢ−ＲＡＦｍｕｔの検出によって、治療の前、治療中、その後に患者をモニタリングするサロゲート（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ）として使用可能である、Ｂ−ＲＡＦｍｕｔを評価するための腫瘍の生検採取または試験片を用いずに、Ｂ−ＲＡＦｍｕｔを取得することができる。循環するＢ−ＲＡＦｍｕｔの検出は、腫瘍破壊、癌の早期検出、癌の再発、および、癌の進行の評価に使用可能である。重大なＢ−ＲＡＦ変異を有する、主な適用可能な癌は、限定するものではないが、メラノーマ、甲状腺癌、大腸直腸癌、肺癌および神経系の癌を含む。
【００１９】
従って、本発明の１つの方法は、ＤＮＡを含む体液サンプルを被検体から得るステップと、サンプル中のワイルドタイプまたは変異Ｂ−ＲＡＦ遺伝子を検出するステップとを含む。
【００２０】
本明細書で使用されるように、「被検体」はヒトまたは動物を意味し、霊長類（特に高等霊長類）、羊、犬、齧歯類（例えば、マウスまたはラット）、モルモット、ヤギ、ブタ、ネコ、ウサギおよび牛などの全ての哺乳類を含む。好適な実施例においては、被検体はヒトである。別の実施例においては、被検体は、実験動物または疾患モデルとして適当な動物である。
【００２１】
用語「体液」は、限定するものではないが、血液、血清、血漿、骨髄、脳髄液、腹膜液／胸膜液、リンパ液、腹水、漿液、痰、涙、大便および尿を含む。「細胞性ＤＮＡ」は、細胞なに存在するＤＮＡか、このようなＤＮＡの単離された形態を意味する；「無細胞性ＤＮＡ」は、被検体の細胞外に存在するＤＮＡまたはこのようなＤＮＡの単離された形態を意味する。
【００２２】
体液サンプルは、当分野で周知な方法のいずれかを使用して被検体から得ることができる。体液サンプルから細胞性ＤＮＡを抽出する方法は、当分野で周知である。通常、細胞は、データジェントとともに溶解される。溶解後、各種プロテアーゼを用いて、タンパク質をＤＮＡから除去する。次いで、ＤＮＡをフェノールで抽出し、アルコールに析出させ、水溶液に溶解する。体液サンプルから無細胞生ＤＮＡを抽出する方法は、当分野で周知である。一般に、体液サンプルの無細胞ＤＮＡは細胞から分離され、アルコールに析出され、水溶液に溶解される。
【００２３】
「ワイルドタイプ」遺伝子は、自然に生じるとき、遺伝子の一般的な形態である；「変異」遺伝子は、遺伝子のＤＮＡ内の構造的な変化である、変異のインスタンスから生じるまたは由来し、ワイルドタイプ遺伝子とは異なる新しい遺伝子の形成となる。
【００２４】
Ｂ−ＲＡＦ遺伝子は、ＭＡＰＫを介してＲＡＳからの調節シグナルを伝達するＭＡＰキナーゼ経路におけるＲＡＳについてのセリンスレオニンキナーゼの下流をコードしている（８−１１）。Ｂ−ＲＡＦ遺伝子の変異は、複数の部位に存在していることが周知であり（５−８）、キナーゼドメイン中の遺伝子のエクソン１１および１５周辺のクラスタリングは、極めて頻度が高い（５，６，１２）。例えば、エクソン１５中の１７９６Ｔ→Ａ塩基変換によるＶ６００Ｅ（かつてはＶ５９９Ｅ）アミノ酸ミスセンス変異は、メラノーマでの優性変異である（１３）。
【００２５】
ワイルドタイプおよび変異Ｂ−ＲＡＦ遺伝子は、本願に記載された方法のいずれか、または、当分野で十分に周知なものを使用して、検出および定量化可能である。例えば、以下に詳述するように、Ｂ−ＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ遺伝子を含む変異Ｂ−ＲＡＦ遺伝子は、ワイルドタイプＢ−ＲＡＦ遺伝子にハイブリダイゼーション可能なペプチド核酸クランプと、変異Ｂ−ＲＡＦ遺伝子にハイブリダイゼーション可能なロックされた核酸プローブとを用いて、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲによって検出および定量化可能である。代替としては、ワイルドタイプおよび変異Ｂ−ＲＡＦ遺伝子は、配列（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）によって検出および定量化されてもよい。
【００２６】
本発明の別の方法は、被検体の癌を検出することに関する。ＤＮＡを含む体液サンプルは、被検体から得られ、サンプル中の変異Ｂ−ＲＡＦ遺伝子は、上述したように検出される。変異Ｂ−ＲＡＦ遺伝子がサンプル中に存在している場合、被検体は癌に罹患している。
【００２７】
本明細書で使用されるように、「癌」は、制御されてない細胞分裂やこれらの細胞の拡散する能力によって、侵襲を介した隣接する組織への直接的な成長によって、あるいは、転移により離れた部位への移植（ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）によって、特徴付けられる疾患または疾病を意味する。例示的な癌は、限定するものではないが、原発癌、転移性の癌、ＡＪＣＣステージＩ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶの癌、癌腫、リンパ腫、白血病、肉腫、中皮腫、神経膠腫（ｇｌｉｏｍａ）、胚細胞種、絨毛癌（ｃｈｏｒｉｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、前立腺癌、肺癌、乳癌、直腸結腸癌、胃腸癌、膀胱癌、膵癌、子宮体（ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ）癌、卵巣癌、黒色腫、脳腫瘍、精巣癌、腎臓癌、皮膚癌、甲状腺癌、頭頸部癌、肝臓癌、食道癌、胃癌、腸癌、大腸癌、直腸癌、骨髄腫および網膜芽腫を含む。好適には、癌は、黒色腫、甲状腺癌、直腸結腸癌、肺癌または神経系の癌である。
【００２８】
さらに、本発明は、癌に罹患しているテスト被検体からＤＮＡを含む組織または体液サンプルを得るステップと、サンプル中の変異Ｂ−ＲＡＦ遺伝子を検出するステップとによって、癌の結果を予測する方法を提供する。このサンプルは、上記療法の前または後に被検体から得てもよい。変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子がサンプル中に存在する場合、テスト被検体は、癌に罹患しているが変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子を持たないコントロール被検体と比較して、生き残る、または、癌療法に対するレスポンダーになる可能性が低い。
【００２９】
被検体からの「組織」サンプルは、バイオプシー試料サンプル、通常または良性組織サンプル、癌または腫瘍組織サンプル、新しく調製した組織サンプル、凍結組織サンプル、パラフィン包埋組織サンプル、原発癌または腫瘍サンプル、あるいは、転移性サンプルであってもよい。例示的な組織は、限定するものではないが、上皮性、結合性、筋肉、神経、心臓、肺、脳、目、腹部（ｓｔｏｍａｃｈ）、脾臓、骨、膵臓、腎臓、胃腸、皮膚、子宮、胸腺、リンパ節、結腸、胸部、前立腺、卵巣、食堂、頭部、首、直腸、精巣、喉、甲状腺、腸、メラニン細胞、直腸結腸、肝臓、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）および膀胱組織を含む。
【００３０】
被検体から組織サンプルを得る方法は、当分野において十分に周知である。細胞性および無細胞生ＤＮＡは、例えば、上述したものと同様な方法など、当分野で周知なあらゆる方法を用いてサンプルから抽出できる。
【００３１】
「癌療法」は、癌、癌の徴候、癌の二次的な疾患状態または癌に対する素因を、回復、緩和、軽減、治療、予防または改善する目的で、癌に罹患している被検体への物質の投与、または、癌に罹患している被検体における手術を意味する。
【００３２】
例えば、化学療法は、癌を治療するために一般的に使用される。それは、癌細胞の成長を止める化学薬剤の使用を含む。癌の治療に手術を行う場合、癌および癌周辺のいくつかの組織は、通常、取り除かれる。さらなる癌治療は、放射線療法、生物学的療法（すなわち、免疫学的療法、免疫療法、バイオセラピー）およびホルモン療法を含む。生物学的療法は、癌細胞を殺すのを助けるために体の免疫システムを使用する。生物学的療法の種類は、インターフェロン、インターロイキン、モノクローナル抗体、コロニー刺激因子、サイトカインおよびワクチンを含む。ホルモンは、胸腺または前立腺などホルモン感受性組織の成長を刺激する、体内の物質を自然に生じさせる。癌が、胸部または前立腺組織に形成されるとき、その成長および核酸は体自身のホルモンによって生じる場合がある。従って、ホルモン療法は、ホルモン産生をブロックするか、または、ホルモンの作用する方法を変化させる薬剤、および、卵巣または精巣などホルモンを分泌する組織の除去に関する。生化学的療法は、化学的療法と併せた免疫療法の使用である。
【００３３】
癌療法に対する「レスポンダー」は、被検体の腫瘍の大きさが治療後に減少するような被検体である。治療に対する応答は、部分的応答（ＰＲ）または完全応答（ＣＲ）でもよい。癌治療に対する「非レスポンダー」は、治療後、進行性の疾患（ＰＤ）を発展させる被検体である。
【００３４】
さらに、本発明は、癌治療をモニタリングする方法を提供する。癌に罹患している被検体は、癌療法で治療される。ＤＮＡを含む組織または体液サンプルは、被検体から得られる。次いで、サンプル中の変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子が検出され、定量化される。治療後の変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子遺伝子の量が、治療前の変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子の量よりも少ない場合、被検体は、治療に対するレスポンダーである可能性がある。
【００３５】
本発明は、被検体中の癌の状態をモニタリングする方法をさらに提供する。ＤＮＡを含む第１の体液サンプルは、癌に罹患している被検体から、第１の時間ポイントで得られる。ＤＮＡを含む第２の体液サンプルは、第１の時間ポイントに続く第２の時間ポイントで、被検体から得られる。次いで、変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子の量は、第１および第２のサンプルにおいて検出される。第２のサンプル中の変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子の量が第１のサンプル中の変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子の量よりも多い場合、癌は、被検体で進行している可能性がある；第２のサンプル中の変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子の量が第１のサンプル中の変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子の量よりも少ない場合、癌は被検体で減退している可能性がある。
【００３６】
本発明の他の目的は、ＤＮＡを含むサンプルと、ワイルドタイプＢ−ＲＡＦ遺伝子にハイブリダイゼーション可能なペプチド核酸クランプを提供するステップと、サンプル中に変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子を検出するステップによって、変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子を検出する方法を提供する。
【００３７】
本発明のサンプルは、上述したように、被検体から得られる組織または体液サンプルでもよい。
【００３８】
ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、相補的なＤＮＡとハイブリダイゼーションする親和性の高いＤＮＡ合成アナログである（２０）。ＰＮＡは、骨格としてＮ−（２−アミノエチル）−グリシンユニットを有する。ＰＮＡ−ＤＮＡハイブリッドは、ｃＤＮＡ−ＤＮＡに関するものよりも安定であり、１つの塩基対のミスマッチを区別するほどの高い感度と特異性がある。さらに、ＰＮＡオリゴマーは、ＰＣＲ反応のプライマとして機能できないとき、それらは、ワイルドタイプＤＮＡテンプレートの増幅を阻止するブロッカーとして使用可能である（２１）。ＰＮＡクランプは、当分野の当業者に周知である。例えば、米国特許第６，００４，７５０号参照。
【００３９】
いくつかの実施例においては、変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子は、変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子にハイブリダイゼーション可能なロックされた核酸（ＬＮＡ）で検出される。アクセスの難しい（ｉｎａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ）ＲＮＡと呼ばれているＬＮＡは、修飾されたＲＮＡヌクレオチドである。ＬＮＡヌクレオチドのリボース部分は、２’および４’炭素に結合する特別な架橋（ｅｘｔｒａ  ｂｒｉｄｇｅ）で修飾される。この架橋は、ＤＮＡまたはＲＮＡのＡフォームにおいてしばしばみつかる、３’−末端構造形態のリボースを「ロック」する。ＬＮＡヌクレオチドは、所望であれば、オリゴヌクレオチドにおいて、ＤＮＡまたはＲＮＡ塩基と混合可能である。このようなオリゴマは、市販されている。ロックされたリボース構成は、塩基スタッキングおよび骨格プレ組織を促進する。これは、オリゴヌクレオチドの熱安定性（融点）を大幅に増大させる。例えば、Ｋａｕｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）、Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ，Ｄｏｕｎｔｅｒｉｏｎ，ａｎｄ  Ｈｙｄｒａｔｉｏｎ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒｔａｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｉｎｔｏ  ＤＮＡ  Ｄｕｐｌｅｘｅｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４５（２３）：７３４７−５５参照。さらに、ＬＮＡは、ｃＤＮＡよりもＤＮＡにより高い親和力を有し、１つの塩基対ミスマッチを区別するのに、より高い感度および特異性を有する。
【００４０】
量的リアルタイムＰＣＲアッセイに基づいたＰＮＡクランプおよびＬＮＡプローブ技術は、サンプル中の変異体遺伝子を検出するために使用可能である。標的ＤＮＡの量がサンプル中に少ないので、高い感受性を必要とするサンプル中の１つの塩基対変異体を検出するのに特に有用である。
【００４１】
変異体遺伝子を検出する本発明の方法は、ワイルドタイプ遺伝子にハイブリダイゼーション可能なＤＮＡおよびＰＮＡクランプを含むサンプルを提供するステップと、変異体遺伝子にハイブリダイゼーション可能なＬＮＡプローブを用いてサンプル中の遺伝子の変異体を検出するステップと、を具える。この方法は、変異体Ｂ−ＲＡＦ、Ｋ−Ｒａｓ、Ｎ−ＲＡＳ、ｐ５３、レセプタチロシンキナーゼ、ＥＧＦＲまたはＲＥＴ遺伝子など、変異体遺伝子を検出するのに有用である。
【００４２】
さらに、本発明は、ワイルドタイプ遺伝子にハイブリダイゼーション可能なＰＮＡクランプと、遺伝子の変異体にハイブリダイゼーション可能なＬＮＡプローブとを具える組成物である。この組成物は、サンプル中の変異体遺伝子を検出するのに使用可能である。この組成物は、ＰＣＲ反応用の試薬をさらに含んでもよいキットにパッケージングされてもよい。
【００４３】
以下の実験例では、限定するものではないが、本発明の範囲を例示することを意図している。このような実施例は、使用可能な一般的なものではあるが、当分野の当業者に周知な他のプロセスを代替として利用可能である。実際に、当分野の当業者であれば、余計な実験を行わずに、本明細書の教示に基づいて、さらなる実施例を容易に発想し、作成することができるであろう。
【００４４】
実験例
要約
目的：体（ｓｏｍａｔｉｃ）のＢ−ＲＡＦ遺伝子変異体は、多くの悪性腫瘍で同定されており、皮膚の悪性黒色腫で高頻度に検出される。しかしながら、治療応答または疾患結果についての予見能力および予測能力の点でのＢ−ＲＡＦ変異体（Ｂ−ＲＡＦｍｔ）の重要性は、未知である。血清で検出されるＶ６００Ｅでの循環血清Ｂ−ＲＡＦｍｔ（Ｂ−ＲＡＦｓｍｔ）は、同時発生的な生化学的療法（ＢＣ）を受ける黒色腫患者で応答することを予測すると仮定した。
【００４５】
実験設計：リアルタイムクランプ定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ）アッセイを設計し、ＰＮＡクランピングおよびＬＮＡハイブリッドプローブによってＢ−ＲＡＦｓｍｔを評価した。通常（ｎ＝１８）およびＡＪＣＣステージＩ−ＩＶ黒色腫患者（ｎ＝１０３）を評価した。これらは、ＢＣ前後で抜き取った血液を有するステージＩＶ患者（ｎ＝４８）を含んだ。患者をＢＣレスポンダーまたは非レスポンダーに分類した。レスポンダー（ｎ＝２４）は、ＢＣ後、完全または部分的応答があった；非レスポンダー（ｎ＝２４）は、進行性の疾患が展開した。
【００４６】
結果：１０３人の黒色腫患者のうち、３８人（３７％）はＢ−ＲＡＦｓｍｔＤＮＡを有し、３４人中１１人（３２％）がステージＩ／ＩＩであり、６９人中２７人（３９％）がステージＩＩＩ／ＩＶだった。４８人のＢＣ患者のうち、２４人中１０人（４２％）の患者が、治療前のレスポンダーおよび非レスポンダーグループのそれぞれにおいて、Ｂ−ＲＡＦｓｍｔについて陽性だった。ＢＣ後、Ｂ−ＲＡＦｓｍｔは、レスポンダーグループにおいて１０人中１人（１０％）のみで検出され、非レスポンダーグループにおいて１０人中７人（７０％）で検出された。Ｂ−ＲＡＦｓｍｔはＢＣを受ける患者において、大幅に悪い（ｐ＝０．０３９）全生存と関連している。
【００４７】
結論：これらの研究は、黒色腫患者の循環Ｂ−ＲＡＦｓｍｔＤＮＡの存在および有用性を示している。
【００４８】
イントロダクション
Ｂ−ＲＡＦ変異体（Ｂ−ＲＡＦｍｔ）は、黒色腫、甲状腺癌および肺癌において、高頻度に報告されている（５−８）。Ｂ−ＲＡＦは、ＭＡＰＫを介したＲＡＳからの調節信号を伝達するＭＡＰキナーゼ経路において、ＲＡＳについてのセリンスレオニンキナーゼの下流をコードしている（８−１１）。Ｂ−ＲＡＦｍｔは複数部位でみられ、これにより、キナーゼドメインにおいて、遺伝子のエキソン１１および１５の周囲のクラスタリングがよくおこる（５，６，１２）。黒色腫の進行において、Ｂ−ＲＡＦｍｔの頻度を評価する最近の研究において、発明者らは、Ｂ−ＲＡＦのエキソン１５における１７９６Ｔ→Ａ塩基転換に由来するＶ６００Ｅ（以前はＶ５９９Ｅ）アミノ酸ミスセンス変異体が、評価した腫瘍における優勢な変異体であり、この変異が原発黒色腫の３１％、転移性黒色腫の５７％でみつかったことを明らかにした（１３）。この変異体がキナーゼ活性を大幅に上昇させ、Ｎ−ＲＡＳ、ｐ１６ＩＮＫ４ａ、および、ｐ５３など、黒色腫で見つかった他の遺伝子変異体よりも大幅に高い頻度で生じることが示されているので（５，１４，１５）、黒色腫患者の血清中のＶ６００ＥでＢ−ＲＡＦｍｔを有する循環ＤＮＡの存在が、臨床的に意味のあることと仮定した。発明者らは、すでに、黒色腫患者の血清の循環ＤＮＡが、疾患の進行、潜在的再発の識別、手術およびアジェバント療法に対する応答の予測を示すマーカーとして臨床的に有用であることを明らかにしていた（１６−１８）。Ｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌは、血清中の循環メチル化ＤＮＡと、疾患の進行との相関関係を示し、循環メチル化ＤＮＡと生化学的療法（ＢＣ）に対する応答との間の関連を示した（１６，１９）。
【００４９】
この研究において、発明者らは、黒色腫患者の血清循環Ｂ−ＲＡＦｓｍｔＤＮＡを検出する定量的リアルタイムＰＣＲアッセイに基づいて、ペプチド核酸（ＰＮＡ）クランプおよびロックされた核酸（ＬＮＡ）プローブ技術を開発した。循環Ｂ−ＲＡＦｓｍｔＤＮＡの頻度が低いので、循環ＤＮＡ中の１つの塩基対変異体の検出は、極めて感度の高いアッセイを必要とする。ＰＮＡおよびＬＮＡは、相補的ＤＮＡとハイブリダイズする高親和性ＤＮＡ合成類似体である（２０）。ＰＮＡは、骨格として、Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシンユニットを有する。ＰＮＡ−ＤＮＡハイブリッドは、ｃＤＮＡ−ＤＮＡに関するものよりも安定性が高く、一塩基対ミスマッチを区別するのに高い感度と特異性がある。さらに、ＰＮＡオリゴマはＰＣＲ反応においてプライマとして機能できないとき、それらは、ワイルドタイプＤＮＡテンプレートの増幅を阻害するブロッカとして使用される（２１）。さらにＬＮＡはｃＤＮＡよりも高いＤＮＡに対する親和力を有し、１つの塩基対のミスマッチを認識するための特異性に関する我々のアッセイに組み込まれた。ＬＮＡ−ＤＮＡキメラは、プライマまたはプローブとして使用されるように構成可能である。特異的なＰＮＡクランピングおよびＬＮＡハイブリダイゼーションプローブを用いて、Ｂ−ＲＡＦｓｍｔのより高い特異的検出がなされた。
【００５０】
本研究の目的は、黒色腫患者の血清中に循環ＤＮＡとしてエキソン１５上のＢ−ＲＡＦ  Ｖ６００Ｅを同定できるか否か判定し、Ｂ−ＲＡＦｍｔの定量的検出が、非侵襲性疾患進行または治療的技法（ｍａｎｅｕｖｅｒ）を評価する際の潜在的臨床適用可能性を有しているか否か判定することである。現在に至るまで、転移性黒色腫のＢ−ＲＡＦｍｔは５５％以上の患者で頻繁に検出されたが、黒色腫組織のＢ−ＲＡＦｍｔ（Ｖ６００Ｅ）の検出は、疾患の結果についての重大な相関関係を示していなかった。この研究において、我々は、高い感度と特異性を有する循環変異体ＤＮＡの量を検出した。Ｂ−ＲＡＦｓｍｔＤＮＡの存在についての可能な臨床的関連性をさらに試験するために、我々は、ＢＣでの治療前後に、患者から血清を収集した。我々は、治療後にＢ−ＲＡＦｓｍｔの存在が治療に対する応答性がないことを示唆しているであろうと仮定した。
【００５１】
材料および方法
患者および細胞株：黒色腫の様々なＡＪＣＣステージにある５５人の患者をＢ−ＲＡＦｓｍｔについて評価した。さらに、ＢＣを受けた５０人の黒色腫ステージＩＶ患者が、治療応答研究に含まれた。血液をＢＣの開始前１週間以内、最後のサイクルの後４週間以内に採取した。ＢＣの完全なサイクルの平均は、レスポンダーグループについて６であり、非レスポンダーグループについて３だった。既に開示されているように（２２，２３）、受けたサイクルの最大値は６サイクルだった。さらに、これらの患者をＢＣに対する応答に基づいて２つのグループに分けた（レスポンダーおよび非レスポンダー）。腫瘍の大きさが治療後に減少した患者は（ＰＲ、部分的応答；ＣＲ、完全応答）、レスポンダー（ｎ＝２４）にグループ分けされ、進行性疾患（ＰＤ，進行性疾患）を有するものは、非レスポンダーとしてグループ分けされる（ｎ＝２４）。２患者は、安定疾患（ＳＤ、安定疾患）であり、最終的な統計分析から除去された。ＢＣ療法を２１日間のインターバルで５日間周期で行い、生物学的応答修飾剤ＩＬ−２およびインターフェロンａ−２ｂの添加を伴うダカーバジン、シスプラチン、ビンブラスチンおよびタモキシフェンからなる複数薬剤化学療法の投与を含んだ。患者は、Ｊｏｈｎ  Ｗａｙｎｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＪＷＣＩ）およびＴｈｅ  Ａｎｇｅｌｓ  Ｃｌｉｎｉｃ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの双方を介して増えた。ヒト被検体Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｒｏａｄ（ＩＲＢ）の許可を、参加している研究機関でこの研究の目的のために取得した。サイン付きのインフォームドコンセントを全ての患者から取得した。コントロールとして使用した１８人の健康なドナーからの血清サンプルも分析した。
【００５２】
既に開示されているように、ＪＷＣＩで確立し特性化された１４の黒色腫細胞株をＢ−ＲＡＦｍｔ（Ｖ６００Ｅ）について評価した（２４−２６）。細胞株を１０％熱不活性化ウシ胎児血清（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｃａｌａｂａｓａｓ、ＣＡ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを加えたＲＰＭＩ１６４０で成長させ、既に開示されているように、初期の継代（ｅａｒｌｙ  ｐａｓｓａｇｅ）で評価した（２４）。培養が７０−８０％コンフルエントのときにＤＮＡを細胞から抽出した。
【００５３】
ＤＮＡ抽出：クエン酸ナトリウム含有チューブ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｎｅｓ、ＮＪ）中に患者から血液を回収した。血漿を１０００×ｇ、１５分間、分画遠心法によって血液細胞から速やかに分離し、１３ｍｍ血清フィルタ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ  ＰＡ）を介してフィルタし、−８０℃で冷凍保存した。修飾剤とともにＱｉａｇｅｎミニカラム（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用い、製造者の指示に従って、ＤＮＡを血清から単離した。１μｌのＰｅｌｌｅｔ  Ｐａｉｎｔ（登録商標）ＮＦ共−析出剤（ｃｏ−ｐｒｅｃｉｐｉｔａｎｔ）（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）で血清を析出させた。既に開示されているように、細胞株からのＤＮＡを、ＤＮＡｚｏｌ（登録商標）を用いて抽出した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ、ＯＨ）（２７）。全ての血清試料をＤＮＡを得るために試した。
【００５４】
オリゴ設計：簡潔に説明すると、変異ホットスポット（Ｖ６００Ｅ）を含む、プライマをＢ−ＲＡＦ遺伝子のエキソン１５を増幅するように設計した。ワイルドタイプ（ｗｔ）テンプレート上のホットスポットをクランプし、ワイルドタイプのテンプレートがＰＣＲによって増幅されるのを防ぐように、ＰＮＡ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を設計した。特にＴからＡへの変異など、Ｖ６００Ｅでの認識してハイブリダイゼーションするように、蛍光共鳴エネルギ移動（ＦＲＥＴ）デュアルラベルＬＮＡプローブを設計して合成する。すなわち、このような変異は、上記ホットスポットでのＢ−ＲＡＦについての変異に最も頻繁にみられる（５）。第２のＦＲＥＴ  ＤＮＡプローブをＢｉｏｓｏｕｒｃｅ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、ＣＡ）から購入し、ホットスポットを避けるように上記ＬＮＡプローブの隣接シークエンスを用いて合成し、ＰＣＲ反応において、増幅して、ＤＮＡテンプレート、すなわちワイルドタイプ（ｗｔ）（Ｖ６００Ｅ）および変異体（ｍｔ）（Ｖ６００Ｅ）の両方、の総数を推定した。ＦＲＥＴ  ＤＮＡプローブを用いたテンプレートの総数についてのｑＰＣＲからの個別の反応において、ＰＮＡクランプおよびＦＲＥＴ  ＬＮＡプローブの両方を用いて、リアルタイム量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を行った。
【００５５】
リアルタイム量的ＰＣＲおよびＢ−ＲＡＦｍｔの定量化：以下のプライマおよびプローブを用いてＰＣＲをおこなった。Ｂ−ＲＡＦ：５’−ＣＣＴＣＡＣＡＧＴＡＡＡＡＡＴＡＧＧＴＧ−３’（フォワード）；５’−ＡＴＡＧＣＣＴＣＡＡＴＴＣＴＴＡＣＣＡ−３’（リバース）；５’−ＣＴＡＣＡＧＡＧＡＡＡＴＣＴＣＧＡＴ−ＢＨＱ−１−３’（ＬＮＡ）；５’−ＡＴＣＧＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＧＴＡＧ−３’（ＰＮＡ）。ＰＣＲアッセイをｉＣｙｃｌｅｒｉＱリアルタイムＰＣＲ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で行った（図１）。パラフィン包埋腫瘍からのゲノムＤＮＡ（２０ｎｇ）を、ＰＣＲプライマ、ＬＮＡ、ＰＮＡ、デオキシヌクレオチドトリリン酸塩、ＭｇＣｌ２、ＰＣＲ緩衝液およびＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ，ＮＪ）を含む２０μｌの反応においてリアルタイムＰＣＲ（ｉＣｙｃｌｅｒ）を用いて増幅した。各ＰＣＲ反応を、９４℃で６０秒間、７２℃で５０秒間、５３℃で５０秒間、７２℃で６０秒間、５５サイクル行った。適宜なポジティブおよびネガティブ細胞株と試薬コントロールを用いて各サンプルを３回アッセイした。
【００５６】
Ｖ６００Ｅ  Ｂ−ＲＡＦｍｔターゲットＤＮＡ（ヘテロ接合体）のユニットを測定するための基準として、ＭＡ細胞株ＤＮＡを確立した；１μｇ／ｍＬのＭＡゲノムＤＮＡに含まれるターゲットの変異体ＤＮＡの量が、１ＵのＢ−ＲＡＦｍｔとなるように、任意に確立される。ｉＣｙｃｌｅｒによって生じるサンプルのｑＰＣＲ結果を、全てのサンプルのＢ−ＲＡＦｍｔの相対的ユニットを定量化するために、上記基準と比較した。変異配列分析について全てのＰＣＲアッセイを３回行い、その平均をデータ解析に使用した。
【００５７】
既に開示されているように、代表的なＢ−ＲＡＦｍｔ  Ｖ６００ＥおよびＢ−ＲＡＦｗｔ  Ｖ６００Ｅ腫瘍（ｎ＝４）を、ＰＣＲアッセイの精度を確かめるために、配列を決定した（５）。ＰＣＲ増幅を以下のＢ−ＲＡＦに対するプライマを用いて行った：５’−ＴＧＴＴＴＴＣＣＴＴＡＣＴＴＡＣＴＡＣＡＣＣＴＣＡ−３’（フォワード）；および５’−ＡＧＣＡＴＣＴＣＡＧＧＧＣＣＡＡＡＡＴ−３’（リバース）。このＰＣＲ生成物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、続いて、製造者の指示書に従って、Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ  ｋｉｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）を用いて５８℃で直接シークエンシングした。染料−末端生成物を、ＣＥＱ８０００ＸＬ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）についてのキャピラリアレイ電気泳動によって評価した。
【００５８】
ＢＣ応答：Ｂ−ＲＡＦｓｍｔの評価：データ分析については、報告された結果と同様に上記反応において、Ｂ−ＲＡＦｓｍｔＤＮＡコピー（ＭＡ  ＤＮＡのμｇ／ｍＬにおけるＶ６００Ｅ変異体コピーと等量のユニット）と、Ｂ−ＲＡＦｗｔＤＮＡテンプレート総量（１μｇ／ｍＬのＤＮＡにおけるＶ６００Ｅｗｔコピーと等量のユニット）との比を使用した。標準曲線に対するＭＡ  ＤＮＡの希釈系列を用いたＶ６００Ｅ変異−特異的ＦＲＥＴ  ＬＮＡプローブ使用し、ｑＰＣＲによって変異体ＤＮＡコピーを算出した；全Ｂ−ＲＡＦｗｔＤＮＡテンプレートコピーを、Ｖ６００Ｅ領域に対するＦＲＥＴ  ＤＮＡプローブを用いてｑＰＣＲによって測定した。ＢＣ前の血清サンプルと比べてＢＣ後の血清の比が１０分の１、またはそれ以上減少する場合、我々は、患者のＢ−ＲＡＦｓｍｔが「減少」したと判定した；１０倍またはそれ以上、比が上昇した場合、「上昇」とした。
【００５９】
生物統計学的分析：ｔ検定およびフィッシャーの直接確立検定によって全ての臨床病理的な因子およびＢ−ＲＡＦｓｍｔ頻度を比較した。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線分析を使用して、全体および疾患のない生存者を評価した。年齢、性別、ＥＣＯＧステータス、転移性部位の数、転移部位（他の組織に対する軟組織、リンパ節、肺）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）濃度および前治療（ｐｒｉｏｒ  ｐｒｅｖｉｏｕｓ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）（無治療に対するワクチン、化学療法および／またはインターフェロン）を含む、予後因子の一変量分析を評価した。さらに、Ｃｏｘ比例ハザード回帰モデルを用いた複数変量分析を、予後因子が調節されるときに、Ｂ−ＲＡＦｓｍｔの予後因子有意性（ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ）を評価するために行った。全ての分析をＳＡＳ（ＳＡＳ／ＳＴＡＴのユーザーガイド、バージョン８；ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．，Ｃａｒｙ，ＮＣ）を用いて行い、検定を０．０５未満の有意差レベルの２面について行った。
【００６０】
結果
Ｂ−ＲＡＦｍｔアッセイ感度：黒色腫細胞株ＭＡを用いて、Ｂ−ＲＡＦｍｔ  Ｖ６００Ｅを有することが示されるように、我々は、リアルタイムｑＰＣＲを用いたＬＮＡハイブリダイゼーションプローブアッセイで、ＰＮＡクランプの感度を決定するために、いくつかの一連の希釈実験を行った。μｇ／ｍＬのＭＡ  ＤＮＡを正常の固体から得たリンパ球ＤＮＡに希釈し、インビボモデルをシミュレーションした。Ｂ−ＲＡＦｍｔは、１０Ｕのリンパ球ＤＮＡに希釈された１×１０−４ユニットのＭＡ  ＤＮＡで検出可能であった。しかしながら、１×１０−５のＭＡ  ＤＮＡが１０Ｕのリンパ球ＤＮＡに希釈された場合、Ｂ−ＲＡＦｍｔ（Ｖ６００Ｅ）は検出されなかった。この一連の希釈実験では、ワイルドタイプＤＮＡの増幅をブロックする各反応において、ＰＮＡの量が限定されているとき、テンプレートとして１０ＵのＤＮＡよりも大きいところで、アッセイは、Ｂ−ＲＡＦワイルドタイプ（Ｂ−ＲＡＦｗｔ、Ｖ６００Ｅ）遺伝子の増幅を検出することを観察した。この観察を続け、我々は、非特異的コピー量を推定するために各サンプルを評価し、ＤＮＡテンプレートが、ＤＮＡの周知なユニットを用いたＭＡ  ＤＮＡ希釈の閾値サイクルに対する比較に基づいて、前記反応においてＰＮＡ消耗となる量を超えなかったことを確かめた。
【００６１】
続いて、ＰＮＡ／ＬＮＡ  ＰＣＲアッセイを黒色腫細胞株で最適化した。１４の黒色腫細胞株をＢ−ＲＡＦｍｔ（Ｖ６００Ｅ）について評価し、そのうちの８（５７％）がＢ−ＲＡＦｍｔを持っていることがわかった。Ｂ−ＲＡＦｍｔ（Ｖ６００Ｅ）の検出は、さらに、細胞株のゲノムＤＮＡのシークエンシングによって確認された。
【００６２】
黒色腫患者の血清中のＢ−ＲＡＦｓｍｔ：この実験において、ＢＣで治療した患者を含む１０３の黒色腫患者のうち、３８（３７％）の患者は、その血清中に検出されたＢ−ＲＡＦｓｍｔを持っていた。さらに患者を、初期および進行した疾患ステージに基づいて分けた場合、Ｂ−ＲＡＦｓｍｔを３４人中の１１人（３２％）の初期ステージ患者（ＡＪＣＣステージＩ／ＩＩ）で検出され、黒色疾患（ＡＪＣＣステージＩＩＩ／ＩＶ）を有する６９人中の２７人（３９％）で検出された。Ｂ−ＲＡＦｓｍｔは、１８人の健康な正常ドナー血清サンプルで検出された。
【００６３】
ステージＩＶ黒色腫患者のＢ−ＲＡＦｓｍｔ：ＢＣ前の５０人のステージＩＶ黒色腫患者のＢ−ＲＡＦｓｍｔの頻度を、黒色腫における周知の予後因子と比較した（表１）。これらの因子は、年齢、性別、ＥＣＯＧ状態、転移部位の数、黒色腫の部位（他の組織に対する軟組織、リンパ節および肺））、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）レベル、および、前治療（ｐｒｉｏｒ  ｐｒｅｖｉｏｕｓ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）（無治療に対するワクチン、化学療法および／またはインターフェロン）。Ｂ−ＲＡＦｓｍｔＤＮＡを２０人（４２％）の患者で検出した。Ｂ−ＲＡＦｍｔおよびＢ−ＲＡＦｗｔＤＮＡの頻度を、周知の予後因子と比較した。考えられ得る因子のうち、有意差は、他の組織に対して軟組織、リンパ節および肺に黒色腫がある患者（ｐ＜０．０２１）、および、ＬＤＨレベルのより高い患者（ｐ＜０．０２７）にみられた（表１）。
【００６４】
【表１】
2010528585.tif 000002
【００６５】
ＢＣ治療後の患者のＢ−ＲＡＦｓｍｔの予後因子有意性を決定するために、臨床病理的な変数を、一変量分析によって比較した（表２）。年齢および性別は、治療への応答についての有意な予測因子（ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ）ではなかった。しかしながら、ＥＣＯＧ状態（ｐ＝０．０４９）、転移部位（Ｐ＝０．０１９）およびＬＤＨレベル（ｐ＝０．０４１）は、治療応答を有意に予測した。ｐｒｅ−ＢＣのＢＲＡＦｓｍｔの存在は、治療への応答の有意な予測因子ではなかった。
【００６６】
【表２】
2010528585.tif 000003
【００６７】
一変量分析に基づいて、ＢＣ（ｐ＜０．０５）への応答に影響を与えることがわかっている変数を、Ｃｏｘ複数変数回帰分析によって分析した。これらの変数は、年齢、性別、ＥＣＯＧ状態、転移部位の数、転移部位（他の組織に対する軟組織、リンパ節および肺）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）レベル、および、前治療（ｐｒｉｏｒ  ｐｒｅｖｉｏｕｓ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）（無治療に対するワクチン、化学療法、および／または、インターフェロン）を含む。考えられ得る因子のうち、ＥＣＯＧ状態（ＨＲ０．２４、９５％  ＣＩ：０．０６、０．９８、ｐ＝０．０４７）のみ、転移部位（ＨＲ１１．５、９５％  ＣＩ：１．６２  −  ８２．５、ｐ＝０．０１５）、および、前治療（無治療に対する化学療法および／またはインターフェロン；ＨＲ０．１２、９５％  ＣＩ：０．０２、０．９２、ｐ＝０．０４１）は、ＢＣへの腫瘍応答に関する有意な予測因子だった。しかしながら、前ＢＣ  Ｂ−ＲＡＦｓｍｔ（ＨＲ  ２．２、９５％  ＣＩ：０．４９、９．８０、ｐ＝０．３０）は、ＢＣへの腫瘍応答に有意に相関しなかった。
【００６８】
循環Ｂ−ＲＡＦｓｍｔおよび生存率：Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線を展開し、全生存率と相関するか否か判定した（図２）。全生存率の有意差は、Ｂ−ＲＡＦｓｍｔを持たないものと比べて、ＢＣ前にＢ−ＲＡＦｓｍｔを有する２０人の患者間に存在していた（それぞれの平均値１３対３０．６  ｍｏｓ；ログランク、ｐ＝０．０３９）。
【００６９】
ＢＣへの応答におけるＢ−ＲＡＦｓｍｔ：ＢＣ（Ｎ＝４８）への応答において、循環Ｂ−ＲＡＦｓｍｔの検出における変化を評価する際、２４人中１０人（４２％）の患者からの血清は、レスポンダーグループにおけるＢ−ＲＡＦｓｍｔの存在に関して陽性であり、２４人中１０人（４２％）が非レスポンダグループにおいて陽性だった（図３）。しかしながら、ＢＣ治療後、循環Ｂ−ＲＡＦｓｍｔは、レスポンダーグループのＢＣ治療前における循環Ｂ−ＲＡＦｓｍｔを有することがわかっている患者のうち１０人中一人（１０％）にしか検出されなかった。対照的に、非レスポンダーグループについては、統計学的に有意な数の患者（１０人中７人、７０％；ｐ＝０．０２）が、ＢＣ治療後の血清に循環Ｂ−ＲＡＦｓｍｔを有し続けていた（表３）。３０人の患者に対して、我々は、黒色腫組織（原発、転移性）をそれぞれ評価することができた。これらの患者の１０人は、ＢＣ前のＢ−ＲＡＦｓｍｔポジティブであり、Ｂ−ＲＡＦｍｔ（Ｖ６００Ｅ）を持っていることと１００％一致した。
【００７０】
【表３】
2010528585.tif 000004
【００７１】
治療後血清ＤＮＡにみられる循環Ｂ−ＲＡＦｓｍｔを有するレスポンダーグループの一人の患者において、我々は、Ｂ−ＲＡＦｓｍｔのコピー数と、血清中の総血清Ｂ−ＲＡＦｗｔ（Ｂ−ＲＡＦｓｗｔ）のコピー数との比が、ＢＣ治療前の血清サンプルの比から強烈に減少したことを観察した；０．１１（治療前）から０．００２１（治療後）に。しかしながら、ＢＣ治療後の血清に循環Ｂ−ＲＡＦｓｍｔのない非レスポンダーグループの３人の患者は、ＢＣ治療前の血清におけるＢ−ＲＡＦｓｗｔ比に対する少量の変異体を持っていた。血清中の治療前Ｂ−ＲＡＦｓｍｔとＢ−ＲＡＦｓｗｔＤＮＡとの比は、３人の患者において、１．５×１０−３から９．０×１０−６の範囲であり、この比は、その他のＢＣ治療前血清サンプルにおいて実質的に高かった。
【００７２】
ＢＣ治療前の血清をＢＣ治療後の血清と比べるとき、Ｂ−ＲＡＦｓｍｔＤＮＡ比が、レスポンダーグループの２４人の患者全てと、非レスポンダーグループの２４人中２０人の患者において減少したことを我々は観察した。非レスポンダーグループにおける残りの患者のうち、一人の患者では、増大しており、３人は、Ｂ−ＲＡＦｓｍｔＤＮＡ比において「顕著な変化はなかった」。この観察結果は、ＤＮＡの量の不足によって、循環Ｂ−ＲＡＦｓｍｔが検出されなかった可能性と関連している場合がある。
【００７３】
ディスカッション
転移性黒色腫を有する患者のＢ−ＲＡＦｍｔ（Ｖ６００Ｅおよび他の部位）の頻度は、５５％より大きいことが報告されている（２８−３１）。Ｂ−ＲＡＦｍｔは、黒色腫の発達に機能すると提案されているが；しかしながら、このトピックは議論中である。異なるタイプの原発黒色腫は、Ｂ−ＲＡＦｍｔ頻度において異なる。実験したＢＣグループにおいて、５０人中４３人（９３％）の識別された原発（ｐｒｉｍａｒｉｅｓ）は、皮膚由来のものだった。異型母斑および黒色腫におけるＮ−ＲＡＳおよびＢ−ＲＡＦ遺伝子の両方の変異の重要性は、ＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路の調節解除が、黒色腫の進行に重要かもしれないという点で非常に興味深いものである（２，１４）。Ｂ−ＲＡＦｍｔ（Ｖ６００Ｅ）は、転移性黒色腫において頻繁に生じるので、Ｂ−ＲＡＦｍｔＶ６００Ｅが、転移性黒色腫を有する患者を検出するのに使用可能であるか否かを判定し、どの患者が潜在的に特異的なアジュバント治療に対してより応答性が高いのかを識別するのが重要である。
【００７４】
この研究において、我々は、Ｖ６００ＥでのＢ−ＲＡＦ変異を検出するのに、１つの塩基対ミスマッチを認識する特異性の高いアッセイを使用した。これは、黒色腫患者のＢ−ＲＡＦｓｍｔを検出能力と、ＢＣへの応答を予測するための潜在的な臨床有用性を示す最初の研究である。ＢＣを受けたステージＩＶの患者において、ＢＣに応答しない有意な数の患者（ｐ＝０．０２）は、治療終了後も、循環Ｂ−ＲＡＦｓｍｔを持っている状態が続いた。さらに、ＢＣに臨床的に応答する患者１人だけが、循環Ｂ−ＲＡＦｓｍｔを有することがわかった。これらの患者におけるＢ−ＲＡＦｓｍｔの存在は、臨床的応答の欠如を示唆した。応答患者におけるＢ−ＲＡＦｓｍｔの欠如についての説明としては、ＢＣに応答する腫瘍がアポトーシスし、これにより、ＤＮＡを小フラグメントに分解するように誘導し、小フラグメントは、体液中に移行すると、速やかに除去されるということである。非応答患者において、ＤＮＡは、腫瘍細胞ターンオーバ、循環腫瘍細胞の物理的破壊、および／または、腫瘍壊死から放出される可能性がある。これらのプロセスから放出されたＤＮＡは、アポトーシスプロセスを介して消えず、ＤＮＡ完全性を維持し、より長い寸法のフラグメントとして放出されるであろう。
【００７５】
Ｂ−ＲＡＦｓｍｔの存在は、転移の位置、ＬＤＨレベルおよび治療前など、他の周知の予後因子と比較すると、治療応答と有意な相関関係はないが、患者におけるＢＣ後のＢ−ＲＡＦｓｍｔの存在は、全生存率の低下など、より悪い結果に有意に相関している。
【００７６】
この試験的研究は、治療を受けている転移性黒色腫を有する患者をモニタリングするための潜在的な有用性を示している。これらの研究は、転移性黒色腫の組織におけるＢ−ＲＡＦｍｔ（Ｖ６００Ｅ）の頻度が原発腫瘍よりも高いことを示しているので、血清アッセイは、疾患の進行をモニタリングするために、患者の追跡調査にも有用である（１３，３２−３４）。Ｂ−ＲＡＦｍｔ（Ｖ６００Ｅ）は、疾患の進行に重要であり、予知有用性が潜在的にある（２９，３２，３４）。我々の今回の発見では、結果に影響を与えることが示されている周知の臨床パラメータと有意な相関がないこと示された。
【００７７】
結論としては、我々の発見によって、血清の循環ＤＮＡにおけるＢ−ＲＡＦｓｍｔの存在が、腫瘍応答および疾患結果の予測において、臨床的有用性を有する可能性があることが確認された。Ｂ−ＲＡＦｓｍｔは、疾患進行の他のマーカーと関連していないが、我々の研究は、変異体の存在が、全生存率の有意に低い悪い結果を招くことを示した。ＲＡＦ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路をターゲティングすることによって黒色腫および他の癌を阻害するｒａｆ−キナーゼインヒビタｓｏｒａｆｅｎｉｂ（ＢＡＹ  ４３−９００６）（３，３５，３６）は、腎細胞癌についてＦＤＡの許可がおりている。単独で使用されるＢＡＹ４３−９００６は、黒色腫患者に期待通りの結果を示さなかった。他の薬剤とＢＡＹ４３−９００６の組み合わせは、黒色腫患者に効果があるであろう。治療を開始する前に循環Ｂ−ＲＡＦｓｍｔの検出することは、ＲＡＦ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路ターゲット薬剤に応答する治療をモニタリングすることに非常に有用である。
【００７８】
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【００７９】
本明細書に引用される全ての文献のその内容は、参照することによってその全文を組み込むものとする。
【図１】
2010528585.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年2月5日(2009.2.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体中のワイルドタイプおよび変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子を検出する方法において、
被検体からＤＮＡを含む体液サンプルを得るステップと、
前記サンプル中のワイルドタイプおよび変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子を検出するステップとを具え、
前記ワイルドタイプ遺伝子が、ペプチド核酸クランプにハイブリダイズされ、前記変異体が、ロックされた核酸プローブにハイブリダイズされることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記体液サンプルが、血液、血漿、血清または脳髄液サンプルであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子が、Ｂ−ＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異体を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
被検体中の癌を検出する方法において、
ＤＮＡを含む体液サンプルを被検体から得るステップと、
前記サンプル中の変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子を検出するステップと、を具え、
前記変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子の存在が、前記被検体が癌に罹患していることを示唆しており、前記遺伝子が、ペプチド核酸クランプにハイブリダイズされ、ロックされた核酸プローブで検出されることを特徴とする方法。
【請求項５】
前記体液サンプルが、血液、血漿、血清または脳髄液サンプルであることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子が、Ｂ−ＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異体を含むことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記癌が、黒色腫、甲状腺癌、直腸結腸癌、肺癌または神経系の癌であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項８】
癌の結果を予測する方法において、
癌に罹患しているテスト被検体からＤＮＡを含む組織または体液サンプルを得るステップと、
前記サンプル中の変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子を検出するステップと、を具え、
前記変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子の存在が示唆することが、癌に罹患しているが前記変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子を持たないコントロール被検体よりも、前記テスト被検体が、生き残る、または、癌療法に対するレスポンダーである可能性が低いことであり、
前記遺伝子がペプチド核酸クランプにハイブリダイズされ、ロックされた核酸プローブで検出されることを特徴とする方法。
【請求項９】
前記組織サンプルは、パラフィン包埋組織サンプルであり、前記体液サンプルは、血液、血漿、血清または脳髄液サンプルであることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記癌が、黒色腫、甲状腺癌、直腸結腸癌、肺癌または神経系の癌であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子が、Ｂ−ＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異体を含むことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記癌療法が生化学的療法であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記サンプルが、前記療法の前または後に前記テスト被検体から得られることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
癌治療をモニタリングする方法において、
癌療法を用いて、癌に罹患している被検体を治療するステップと、
前記被検体からＤＮＡを含む組織または体液サンプルを得るステップと、
前記サンプル中の変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子を検出するステップと、を具え、
前記治療後の前記変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子の量が、前記治療前の前記変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子の量よりも少ない場合に、前記被検体が、前記療法に対するレスポンダーである可能性があることを示唆し、
前記遺伝子が、ペプチド核酸クランプにハイブリダイズされ、ロックされた核酸プローブで検出されることを特徴とする方法。
【請求項１５】
前記組織サンプルが、パラフィン包埋組織サンプルであり、前記体液サンプルが、血液、血漿、血清または脳髄液サンプルであることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記癌が黒色腫、甲状腺癌、直腸結腸癌、肺癌または神経系の癌であることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子が、Ｂ−ＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異体を含むことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記癌療法が、生化学的療法であることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
被検体中の癌の状態をモニタリングする方法において、
第１の時間ポイントで、癌に罹患している被検体からＤＮＡを含む第１の体液サンプルを得るステップと、
前記第１の時間ポイントに続く第２の時間ポイントで、前記被検体からＤＮＡを含む第２の体液サンプルを得るステップと、
前記第１および第２のサンプル中の変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子の量を検出するステップとを具え、
前記第２のサンプル中の前記変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子の量が、前記第１のサンプル中の前記変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子の量よりも多い場合、前記癌が前記被検体中で進行している可能性があることを示唆し、前記第２のサンプル中の変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子の量が、前記第１のサンプル中の前記変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子の量よりも少ない場合、前記癌が前記被検体中で減退している可能性があることを示唆し、
前記遺伝子がペプチド核酸クランプにハイブリダイズされ、ロックされた核酸プローブで検出されることを特徴とする方法。
【請求項２０】
前記変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子はＢ−ＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異体を含むことを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子を検出する方法において、
ＤＮＡを含むサンプルと、ワイルドタイプＢ−ＲＡＦ遺伝子にハイブリダイゼーション可能なペプチド核酸クランプとを提供するステップと、
ロックされた核酸プローブで前記サンプル中の変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子を検出するステップと、
を具えることを特徴とする方法。
【請求項２２】
前記変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子が、ポリメラーゼ鎖反応によって検出されることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記サンプルが、被検体から得られる組織または体液サンプルであることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記変異体Ｂ−ＲＡＦ遺伝子が、Ｂ−ＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異体を含むことを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
変異体遺伝子を検出する方法において、
ＤＮＡを含むサンプルと、ワイルドタイプ遺伝子にハイブリダイゼーション可能なペプチド核酸クランプを提供するステップと、
前記変異体遺伝子にハイブリダイゼーション可能なロックされた核酸プローブで、前記サンプル中の前記遺伝子の変異体を検出するステップとを具えることを特徴とする方法。
【請求項２６】
前記変異体遺伝子が、ポリメラーゼ鎖反応によって検出されることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記サンプルが、被検体から得た組織または体液サンプルであることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記遺伝子が、Ｋ−Ｒａｓ、Ｎ−ＲＡＳ、ｐ５３、レセプタチロシンキナーゼ、ＥＧＦＲまたはＲＥＴ遺伝子であることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
ワイルドタイプ遺伝子にハイブリダイゼーション可能なペプチド核酸クランプと、前記遺伝子の変異体にハイブリダイゼーション可能なロックされた核酸プローブとを具える組成物。
【請求項３０】
前記遺伝子が、Ｂ−ＲＡＦ、Ｋ−Ｒａｓ、Ｎ−ＲＡＳ、ｐ５３、レセプタチロシンキナーゼ、ＥＧＦＲまたはＲＥＴ遺伝子であることを特徴とする請求項２９に記載の組成物。
【国際調査報告】
2010528585.tif 000008