(57)【要約】  本発明は、植物構造を改質し植物バイオマスおよび／またはスクロース収量を高める方法および構築物に関する。
2010507374.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イネ科(Poaceae)、ウリ科(Cucurbitaceae)、アブラナ科(Cruciferaceae)、ナス科(Solanaceae)、マメ科(Leguminosae)、およびキョウチクトウ科(Apocynaceae)の植物科からなる群から選択される科に属するトランスジェニック植物であって、
野生型コントロール植物と比較して発現が減少している内因性Ss2-ODD1 ＤＮＡ配列を含むことを特徴とする、トランスジェニック植物。
【請求項２】
イネ科に属する、請求項１に記載のトランスジェニック植物。
【請求項３】
サトウキビ、モロコシ、トウモロコシ、ススキである、請求項２に記載のトランスジェニック植物。
【請求項４】
上記の内因性Ss2-ODD1 ＤＮＡ配列が、アンチセンス抑制、センス共抑制、ＲＮＡ干渉、または酵素ＲＮＡによって減少する、請求項１に記載のトランスジェニック植物。
【請求項５】
(a)   Ss2-ODD1タンパク質レベルが抑制されたトランスジェニック植物を提供し、
(b)  前記植物からスクロースを得る
ことを含んでなる、スクロースの生産方法。
【請求項６】
植物が、サトウキビまたはモロコシである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
(a)  Ss2-ODD1タンパク質レベルが抑制されたトランスジェニック植物を提供し、
(b)  前記植物からバイオマスを得る
ことを含んでなる、バイオマスの生産方法。
【請求項８】
植物が、サトウキビまたはモロコシである、請求項８に記載の方法。
【請求項９】
植物のSs2-ODD1タンパク質レベルを抑制することを含んでなる、植物におけるスクロース収量を高める方法。
【請求項１０】
植物が、サトウキビまたはモロコシである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
植物のSs2-ODD1タンパク質レベルを抑制することを含んでなる、植物におけるバイオマスを高める方法。
【請求項１２】
植物が、サトウキビまたはモロコシである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
Ss2-ODD1配列を含んでなる、核酸構築物。
【請求項１４】
請求項１３に記載の核酸構築物を含んでなる、トランスジェニック植物または細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００６年１０月２７日出願の米国仮出願第６０／８６３，２５２号の優先権を主張するものであり、上記出願の開示内容は、その開示の一部として本明細書に引用されている。
【０００２】
発明の分野
本発明は、分子生物学の分野および異種遺伝子を植物細胞、好ましくはそのゲノムへ導入することによる植物特性の表現型変更に関する。更に詳細には、本発明は、同様な条件で成長した非トランスジェニック植物に関して植物構造を改質しかつバイオマスおよび／またはスクロース収量を高めたトランスジェニック植物を生産する方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
サトウキビは、最も光合成的に効率的に栽培される作物の１つである。世界の最大生産国であるブラジルにおけるサトウキビの平均年間収穫高は、８０〜１２０トン／ヘクタールの範囲である。更に、ヘクタール当たり３００トンのバイオマスの生産性の潜在能力が示唆されている。Alexander, 「エネルギーサトウキビ代替物 (THE ENERGY CANE ALTERNATIVE)」(Elsevier, 1985)。
【０００４】
バイオマスの利用は、特に樹木、イネ科植物および廃材のような非澱粉、非食物関連のバイオマスを用いて代替燃料を生産する方法を開発する努力に関して最近大きな関心の的となってきており、これは、砂糖の利用可能な供給源ベースを広げコストソースを引き下げることになる。ブラジルでは、サトウキビ工場では、燃料エタノールを生産するための大規模スクロース醗酵の技術が開発されている。２００６／２００７年の収穫高では、約１８０億リットルのサトウキビ由来のエタノールが生産された。燃料，サトウキビを原料とする燃料は、再生可能な燃料供給源を提供する他に、ＣＯ２放出を減少させる手段を提供する。
【０００５】
数世紀にわたり、サトウキビはほとんどスクロースの供給源としてのみ栽培され、スクロースは茎の節間に高濃度で蓄積される。次いで、スクロースが製粉工場で抽出されて精製され、食品産業における原材料として用いられる。
【０００６】
サトウキビは光合成上効率的であるが、世界中の商業的サトウキビ農園の平均生産性はサトウキビゲノムの高倍数体性によって限定されており、これによりサトウキビが二倍体種について開発された育種技術のほとんどには影響を受けにくくしている。伝統的育種プログラムでは高収穫高植物の生産の成功が限定的であったので、サトウキビの栽培品種はSaccharum officinarumとその類縁、最も頻繁にはS. spontaneumだけでなくS. sinenseまたはS. barberiであって、その子孫をS. officinarumに戻し交配したものとの種間交配に由来するクローンである。他方では、植物ゲノムを操作するための分子遺伝学の方法の出現は、植物に組換え核酸分子を導入して発現させることにより改良された特性または形質を有する収穫高を発展させる手段を研究者らに提供している。
【発明の概要】
【０００７】
一つの態様では、本発明は、イネ科(Poaceae)、ウリ科(Cucurbitaceae)、アブラナ科(Cruciferaceae)、ナス科(Solanaceae)、マメ科(Leguminosae)、およびキョウチクトウ科(Apocynaceae)の植物科からなる群から選択される科に属するトランスジェニック植物であって、野生型コントロール植物と比較して発現が減少している内因性Ss2-ODD1 ＤＮＡ配列を含むことを特徴とするトランスジェニック植物を提供する。もう一つの態様では、この植物はイネ科に属する。更に他の態様では、トランスジェニック植物はサトウキビ、モロコシ、トウモロコシおよびススキである。もう一つの態様では、Ss2-ODD1 ＤＮＡ配列の発現はアンチセンス抑制、センス共抑制、RNA干渉または酵素RNAによって減少する。
【０００８】
もう一つの態様では、本発明は、(a)   Ss2-ODD1タンパク質レベルが抑制されたトランスジェニック植物を提供し、(b)  前記植物からスクロースを得ることを含んでなる、スクロースの生産方法を提供する。一つの態様では、この植物はサトウキビまたはモロコシである。
【０００９】
もう一つの態様では、本発明は、(a)  抑制されたSs2-ODD1タンパク質レベルが抑制されたトランスジェニック植物を提供し、(b)  前記植物からバイオマスを得ることを含んでなる、バイオマスの生産方法を提供する。一つの態様では、この植物はサトウキビまたはモロコシである。
【００１０】
もう一つの態様では、本発明は、植物のSs2-ODD1タンパク質レベルを抑制することを含んでなる、上記植物のスクロース収量を高める方法を提供する。一つの態様では、この植物はサトウキビまたはモロコシである。
【００１１】
もう一つの態様では、本発明は、植物のSs2-ODD1タンパク質レベルを抑制することを含んでなる、上記植物収量でのバイオマスを高める方法を提供する。一つの態様では、この植物はサトウキビまたはモロコシである。
【００１２】
もう一つの態様では、本発明は、Ss2-ODD1配列を含んでなる核酸構築物を提供する。もう一つの態様では、本発明は、Ss2-ODD1配列を含んでなる核酸構築物を含んでなるトランスジェニック植物または細胞を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図は、Ss2-ODD1、Oryza sativa（イネ）、Sorghum bicolor（モロコシ）およびZea mays（トウモロコシ）由来のその緊密な同族体、および植物第一鉄依存性ジオキシゲナーゼにおける機能的アミノ酸残基の保存を示す。残基の番号は、Streptomyces jumonjinensis由来のイソペニシリンNシンターゼ（ＩＰＮＳ）タンパク質に基づいた。この配列は、非ヘムＦｅ（II）依存性ジオキシゲナーゼには共通の鉄結合モティーフＨｉｓ−Ｘ−Ａｓｐ（５３−５７）Ｘ−Ｈｉｓ（陰影部）を含む保存された残基（下線部）を示す（Kreisberg-Zakarin et al., Antonie Van Leeuwenhoek 75: 33-39, 1999)。これらの保存された残基は、活性部位における鉄結合に必要であると考えられる(Borovok et al, Biochemistry 35: 1981-1987, 1996)。Ss, Saccharum species（サトウキビ類）; Sb, Sorghum bicolor; Zm, Zea mays; ORYSA, Oryza sativa; ARATH, Arabidopsis thaliana（シロイヌナズナ）; CUCMA, Cucurbita maxima（セイヨウカボチャ）; STRJU, Streptomyces jumonjinensis; PETHY, Petuniahybrida（ペチュニア）; GARPE, garden petunia（ツクバネアサガオ）; ２−ＯＤＤ１，２−オキソ酸依存性ジオキシゲナーゼ； ＧＡ２，ジベレリン２β−ヒドロキシラーゼ； ＧＡ２０，ジベレリン２０−オキシダーゼ； ＧＡ３，ジベレリン３β−ヒドロキシラーゼ； ＧＡ７，ジベレリン７−オキシダーゼ； Ａ２，Ａ２遺伝子； ＬＤＯＸ，ロイコアントシアニジンジオキシゲナーゼ； ＦＬＳ，フラボノールシンターゼ； ＦＬ３Ｈ，フラバノン３β−ヒドロキシラーゼ； ２Ａ６，２Ａ６遺伝子。
【図２】図は、高等植物2-ODDsの系統発生分析を示す。主要な2-ODDs型の高等植物標本のアミノ酸配列を、BLOSUMマトリックスを用いてClustalアルゴリズムで整列した。系統発生の再構築は、ブートストラッピング（１，０００リサンプリング）によって評価した系統発生樹の節の頑健性を有するNeighbor-Joining法(NJ)によってMEGAバージョン3.1 (Kumar et al, Brief Bioinform. 5: 150-163, 2004) で得た。ブートストラップ値が５０より大きいものを示す。GenBank giまたはTIGR TC番号を配列名の後に付けている。Ss2-ODD1は、四角で囲われている。Arabidopsis thaliana (GA5, GA4)、Oryza sativa (Dl 8, SEMIDWARF 1)およびPisum sativum （エンドウ）(SLENDER)の対応する特性決定したジベレリン酸オキシダーゼ突然変異体を有するタンパク質が示唆されている。種およびタンパク質名は、次のように省略される: At, Arabidopsis thaliana; Cm, Cucurbita maxima; Cr, Capsella rubella（ルベラナズナ）; Cro, Catharanthus roseus（ニチニチソウ）; Hv, Hordeum vulgare（オオムギ）; Hn, Hyoscyamus niger（ヒヨス）; Le, Lycopersicum esculentum（トマト）; Mm, Marah macrocarpus（野生種キュウリ）; Ms, Medicago sativa（アルファルファ）; Mt, Medicago truncatula（タルウマゴヤシ）; Nt; Nicotiana tabacum（タバコ）; Os, Oryza sativa; Ps, Pisum sativum; Pt, Petunia x hybroda（ペチュニア）; St, Solanum tuberosum（ジャガイモ）; Sb, Sorghum bicolor; Ss, Saccharum species; Zm, Zea mays; A2, アントシアニン生合成に影響するＡ２座によってコードされたタンパク質； ＡＣＣＯ，１−アミノシクロプロパン−１−カルボキシレートオキシダーゼ； ＡＮＳ，アントシアニジンシンターゼ； ＣＦＩ，カルコン−フラバノンイソメラーゼ； ＤＶ４Ｈ，デスアセトキシビンドリン４−ヒドロキシラーゼ； Ｅ８，１−アミノシクロプロパン−１−カルボキシレートオキシダーゼ同族体（タンパク質Ｅ８）； Ｆ３Ｈ，フラバノン−３−ヒドロキシラーゼ； ＦＬＳ，フラボノールシンターゼ； ＧＡｏｘｉ，ジベレリン酸オキシダーゼ； Ｈ６Ｈ，ヒヨスチアミン６−ジオキシゲナーゼ； ＩＤＳ２，鉄欠乏性特異的−２ (iron deficiency specific-2)； ＬＤＯＸ，ロイコアントシアニジンジオキシゲナーゼ； Ｐ４Ｈ，プロリル４−ヒドロキシラーゼ； ＳＲＧ１，成長を阻止した Arabidopsis thaliana細胞で発現したコード化転写産物。
【図３】UBI-1::Ss2-ODD1as::NOSおよびUBI-1::Bar::NOSカセットの模式的表現。最初のクローニングベクターからカセットを放出するのに用いたエンドヌクレアーゼ(EarIおよびHindIII)を示す。
【図４】選択されたUBI-1::Ss2-ODD1as::NOS事象および非トランスジェニックコントロール栽培品種RB835486の高さ。2本の茎の高さは、茎の頂端部分を除いた後にそれぞれの試料 (n=12) について測定した。2個の星印は、99%の信頼度でダンネット法によって測定した栽培品種RB835486非トランスジェニックコントロール(C)とは有意に異なる事象を示す。誤差のバーは、平均値の標準偏差を示す。
【図５】選択されたUBI-1::Ss2-ODD1as::NOS事象および非トランスジェニックコントロール栽培品種RB835486の節間数。2本の茎の節間数は、頂端部分を除いた後にそれぞれの試料 (n=12) について測定した。2個の星印は、99%の信頼度でダンネット法によって測定した栽培品種RB835486非トランスジェニックコントロール(C)とは有意に異なる事象を示す。誤差のバーは、平均値の標準偏差を示す。
【図６】選択されたUBI-1::Ss2-ODD1as::NOS事象および非トランスジェニックコントロール栽培品種RB835486の平均節間長。2本の茎の総ての節間の長さは、頂端部を除いた後にそれぞれの試料(n=12)について測定した。2個の星印は、99%の信頼度でダンネット法によって測定した栽培品種RB835486非トランスジェニックコントロール(C)とは有意に異なる事象を示す。誤差のバーは、平均値の標準偏差を示す。
【図７】選択されたUBI-1::Ss2-ODD1as::NOS事象および非トランスジェニックコントロール栽培品種RB835486の平均節間径。2本の茎節間径は、頂端部分を除いた後にそれぞれの試料(n=12)について測定した。2個の星印は、99%の信頼度でダンネット法によって測定した栽培品種RB835486非トランスジェニックコントロール(C)とは有意に異なる事象を示す。誤差のバーは、平均値の標準偏差を示す。
【図８】選択されたUBI-1::Ss2-ODD1as::NOS事象および非トランスジェニックコントロール栽培品種RB835486の茎の新鮮重量。 Fresh重量 of2本の合わせた茎の新鮮重量は、頂端部分を除いた後にそれぞれの試料(n=12)について測定した。2個の星印は、99%の信頼度でダンネット法によって測定した栽培品種RB835486非トランスジェニックコントロール(C)とは有意に異なる事象を示す。誤差のバーは、平均値の標準偏差を示す。
【図９】選択されたUBI-1::Ss2-ODD1as::NOS事象および非トランスジェニックコントロール栽培品種RB835486のジュース容積。2本の合わせた茎から抽出したジュース容積は、頂端部分を除いた後に試料 (n=12)について測定した。2個の星印は、99%の信頼度でダンネット法によって測定した栽培品種RB835486非トランスジェニックコントロール(C)とは有意に異なる事象を示す。誤差のバーは、平均値の標準偏差を示す。
【図１０】選択されたUBI-1::Ss2-ODD1as::NOS事象および非トランスジェニックコントロール栽培品種RB835486のPOL。2本の合わせた茎から抽出したジュースのPOLは、頂端部分を除いた後にそれぞれの試料(n=12)について測定した。2個の星印は、99%の信頼度でダンネット法によって測定した栽培品種RB835486非トランスジェニックコントロール(C)とは有意に異なる事象を示す。誤差のバーは、平均値の標準偏差を示す。
【図１１】選択されたUBI-1::Ss2-ODD1as::NOS事象および非トランスジェニックコントロール栽培品種RB835486のスクロース収量。スクロース収量は、頂端部分を除いた後にそれぞれの試料(n=12)について2本の合わせた茎からの総ジュース容積とそのスクロース濃度の積として計算した。2個の星印は、99%の信頼度でダンネット法によって測定した栽培品種RB835486非トランスジェニックコントロール(C)とは有意に異なる事象を示す。誤差のバーは、平均値の標準偏差を示す。
【図１２】選択されたUBI-1::Ss2-ODD1as::NOS事象および非トランスジェニックコントロール栽培品種RB835486のバガスの新鮮重量。2本の合わせた茎のバガス新鮮重量は、頂端部分を除いた後にそれぞれの試料(n=12)について測定した。2個の星印は、99%の信頼度でダンネット法によって測定した栽培品種RB835486非トランスジェニックコントロール(C)とは有意に異なる事象を示す。誤差のバーは、平均値の標準偏差を示す。
【図１３】定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (qRT-PCR)によって測定した野生型サトウキビ器官におけるSs2-ODD1転写産物の発現。定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (qRT-PCR)は、野生型サトウキビ植物 (栽培品種RB835486)の様々な器官から単離したRNAを用いて行った。ACTIN (ACT)に対するSs2-ODD1転写産物の存在量は、ΔCT値として表される。バーは、3回の独立した反復試験区からの平均値を示す。誤差バーは、平均値の標準偏差を示す。
【図１４】選択されたUBI-1::Ss2-ODD1as::NOS事象および野生型サトウキビ栽培品種RB835486コントロールの葉+4におけるSs2-ODD1タンパク質レベル。抽出物は、栽培品種RB835486の野生型植物(C)と事象09、14および21から収穫した葉＋４の葉身から調製した。組換えSs2-ODD1 (rSs2-ODD1) 0.5 ngを含む葉のタンパク質抽出物（５０μｇ）は、SDS-PAGEによって分離した。免疫ブロッティングは、Ss2-ODD1アフィニティー精製した抗体(上パネル)。矢じり型のものは、Ss2-ODD1タンパク質を示す。星印は、ローディングコントロールとして示された葉の抽出物における非特異的交差反応性ポリペプチドを示す。分子量はkDaで表した右側(MW)に示されている。移動後にクーマシーブルーで染色したゲルを、ローディングコントロールとして示す(下パネル)。
【発明の具体的な説明】
【００１４】
本発明は、若芽の(in planta)ジオキシゲナーゼ酵素を操作することによって植物構造を改質しかつ植物バイオマスおよび/またはスクロース収量を高める方法および構築物に関する。ペニシリン、セファロスポリン、セファマイシン、クラヴァム、カルニチンおよびコラーゲン生合成など多くの化合物の生合成に関与するジオキシゲナーゼは鉄を含む非ヘム酵素である(Prescott and Lloyd, Nat. Prod. Rep., 17: 367-383, 2000)。また、いくつかのジオキシゲナーゼは、様々なタンパク質ターゲットにおける数種類のアミノ酸残基を酸化してタンパク質の折り畳みを促進することが以前から報告されている。アミノ酸酸化の改質によって、調節的および構造的機構が可能になる(Ozer and Bruick, Nat. Chem. Biol, 3: 144-153, 2007)。特に植物では、様々なジオキシゲナーゼは、アブシジン酸、ジベレリンおよびエチレンのようなシグナル化合物、および二次代謝物、特にフラボノイドおよびアルカロイドの生合成に極めて重要な役割を果たしている。ジオキシゲナーゼによって触媒される反応の概説は、いくつかの論文やそこに見られる文献によって提供される(Prescott and John, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol, 47: 245-271, 1996; Prescott and Lloyd, Nat. Prod. Rep., 17: 367-383, 2000; Turnbull et al, J. Biol. Chem., 279: 1206-1216, 2004; Ozer and Bruick, Nat. Chem. Biol, 3: 144-153, 2007)。
【００１５】
植物ジオキシゲナーゼは、リポキシゲナーゼとヒドロキシル化、エポキシ化および脱飽和反応を触媒する2-オキソグルタレート依存性ジオキシゲナーゼ (2-oxoglutarate-dependent dioxygenases) (2-ODDs)との2つのクラスに分類される。後者の成員は、生合成経路の連続段階において2種類以上の反応をしばしば触媒する。2-ODDグループの酵素は、共基質としての2-オキソグルタレートの絶対的必要条件を示している。総ての2-ODDは、イン・ビトロでの最適基質転換にＦｅ２＋とアスコルビン酸塩を必要とする可溶性酵素である。いくつかの酵素はアスコルビン酸塩を絶対的必要条件しているが、多くのものはそうではない。アスコルビン酸塩の役割は不確定であることが多く、反応機構にとって間接的でありかつ関連がないと思われる。
【００１６】
2-ODDsの配列は、タンパク質のカルボキシ末端ハーフに主としてクラスター形成した保存残基を特徴としている。三次元構造は、細菌性2-ODDであるイソペニシリンＮシンターゼ (isopenicillin N synthase)(IPNS; Kreisberg-Zakarin et al, Antonie van Leeuwenhoek, 75: 33-39, 1999)。IPNSは植物2-ODDsに対する配列同一性が比較的低いが、多数の保存残基/モティーフおよび構造要素を共有しており、植物2-ODDsの構造のモデルとして提案されている。この構造は、INPSの触媒コアが、HX[DE]ダイアド(但し、Xは任意のアミノ酸である)と保存されたカルボキシ末端ヒスチジンであって、一緒に単一鉄原子をキレート化するものを含む二本鎖のβ−へリックス(DSBH)折り畳みからなることを示している(Kreisberg-Zakarin et al, Antonie van Leeuwenhoek, 75: 33-39, 1999)。2-ODDスーパーファミリータンパク質の保存された部分は、ウイルスキャプシドタンパク質でより普通に見られる酵素における比較的稀な構造であるゼリーロールトポロジーにおける２枚のシートに配置されているコアＤＳＢＨを含んでなる。
【００１７】
非ヘムＦｅ（II）依存性ジオキシゲナーゼの大きなグループであって、それらの総てが分子状酸素を活性化し、脂肪族ヒドロキシル化、脱飽和および環化のような多様な反応を行うものの一次アミノ酸配列を比較するための配列を分析 (Kreisberg-Zakarin et al, Antonie van Leeuwenhoek, 15: 33-39, 1999)。このクラスターの酵素のいくつかの５２個の成員の配列分析を行ったところ、全部で５個の残基、Ｇｌｙ４１、Ｈｉｓ２１２、Ａｓｐ２１４、Ｈｉｓ２６８およびＡｒｇ２７７（番号付けはS. jumonjinensis IPNSに従う)だけが保存されることが明らかになった(Borovok et al., Biochemistry, 35: 1981-1987, 1996）。生化学分析では、Ｈｉｓ２１２、Ａｓｐ２１４およびＨｉｓ２６８における突然変異体酵素はイン・ビトロでは全く活性がないことが明らかにされ（Tan and Sim, J Biol Chem., 271: 889-894, 1996; Loke et al, FEMS Microbiol. Lett., 157: 137-140, 1997）、２個の保存されたヒスチジンとアスパラギン酸がＩＰＮＳ活性にとって本質的であることを示唆していた。１３９個の重複しない非ヘムのＦｅ（II）依存性ジオキシゲナーゼを含んでなる更に広汎な分析では、２個のヒスチジンとアスパラギン酸およびグリシンが両方とも完全に保存されることが明らかになった(Kreisberg-Zakarin et al., Antonie van Leeuwenhoek, 75: 33-39, 1999)。この分析を用いて、総ての非ヘムＦｅ（II）依存性ジオキシゲナーゼに共通の配列モティーフＨｉｓ−Ｘ−Ａｓｐ（５３−５７）Ｘ−Ｈｉｓであって、活性部位における鉄の結合に必要と思われるものを定義した(Borovok et al, Biochemistry, 35: 1981-1987, 1996)。これまでは、如何なる役割もＧｌｙ４１によるものとはされていなかった。
【００１８】
この背景に対して、本発明では、ジオキシゲナーゼコード遺伝子のダウンレギュレーションにより植物構造を改質しかつ植物バイオマスおよび／またはスクロース収量を高める方法を記載する。
【００１９】
本明細書の記載に用いられる総ての技術用語は生化学、分子生物学、免疫学および農学の分野で一般に用いられており、従って、本発明が属する技術に熟練した者によって容易に理解される。これらの技術用語は、例えば「分子クローニング: 実験室便覧(MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL)」, 第3版, 第1-3巻, Sambrook and Russel監修, Cold Spring Harbor Laboratory Press, コールド・スプリング・ハーバー, ニューヨーク, 2001; 「分子生物学における最新の方法(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)」, Ausubel et al.監修, Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience, ニューヨーク, 1988 (定期的に改訂); 「分子生物学における簡単な方法: 分子生物学における最新のプロトコルからの方法の概説(SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY: A COMPENDIUM OF METHODS FROM CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)」, 第5版, 第1-2巻, Ausubel et al.監修, John Wiley & Sons, Inc., 2002; 「ゲノム解析: 実験室便覧(GENOME ANALYSIS: A LABORATORY MANUAL)」, 第1-2巻, Green et al.監修, Cold Spring Harbor Laboratory Press, コールド・スプリング・ハーバー, ニューヨーク, 1997; Harlow and Lane著「抗体: 実験室便覧(ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL)」, Cold Spring Harbor Laboratory Press, コールド・スプリング・ハーバー, ニューヨーク, 1988に見出すことができる。植物生物学の手法を包含する方法は本明細書に記載され、また「植物分子生物学の方法: 実験室コースマニュアル(METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY: A LABORATORY COURSE MANUAL)」, Maliga et al.監修, Cold Spring Harbor Laboratory Press, コールド・スプリング・ハーバー, ニューヨーク, 1995のような論文に詳細に記載されている。PCRを用いる様々な手法は、例えばInnis et al.著, 「PCRの方法: 方法および応用への手引(PCR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS)」, Academic Press, サン・ディエゴ, 1990およびDieffenbach and Dveksler著, 「PCRプライマー: 実験室便覧(PCR PRIMER: A LABORATORY MANUAL)」, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, コールド・スプリング・ハーバー, ニューヨーク, 2003に記載されている。PCR-プライマー対は、その目的でのコンピュータープログラム例えば、プライマー, バージョン0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, ケンブリッジ, マサチューセッツの使用などの既知の手法により既知の配列から誘導することができる。核酸の化学合成の方法は、例えばBeaucage & Caruthers, Tetra. Letts. 22: 1859-1862 (1981)およびMatteucci & Caruthers, J. Am. Chem. Soc. 103: 3185 (1981)に検討されている。
【００２０】
制限酵素消化、リン酸化,連結反応および形質転換は、特に断らない限りSambrook et al.著, 「分子クローニング: 実験室便覧(MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL)」, 第2版 (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載の方法で行った。細菌細胞の成長および維持に用いた総ての試薬および材料は、特に断らない限りAldrich Chemicals (ミルウォーキー, ウィスコンシン)、DIFCO Laboratories (デトロイト, ミシガン)、Invitrogen (ガイザースバーグ, メリーランド)またはSigma Chemical Company (セントルイス, ミズーリー)から入手した。
【００２１】
「コード化」および「コード」という用語は、ポリヌクレオチドが転写および翻訳の機構を介して上方を細胞に提供し、これから一連のアミノ酸を集合させて特定のポリペプチドとすることができる過程を表す。遺伝子コードが縮退しているため、ＤＮＡ配列である塩基が変化してもタンパク質のアミノ酸配列は変化しない。
【００２２】
「発現」という用語は、ポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドの産生を表す。あるいはまたは更に、「発現」は、構造遺伝子のようなコードＤＮＡ分子によって行われる転写および翻訳などポリペプチドを産生するための分子内過程の組合せを表す。「ダウンレギュレーション」および「抑制」は同義に用いられ、細胞または植物における特定の遺伝子配列の発現がコントロール細胞または植物に比較して減少していることを示す。
【００２３】
ポリヌクレオチドに関する「発現の変化」という用語は、例えばトランスジェニック植物または植物組織における発現のパターンが同じ種の野生型植物での発現パターンと異なることを示している。従って、目的とするポリヌクレオチドは、配列が野生型植物で発現する細胞または組織の種類以外の細胞または組織の種類で、または配列が野生型植物で発現する時間以外の時間の発現によって、またはホルモンまたは環境シグナルのような様々な誘導剤に応答することによって、または野生型植物に見られるのと比較して異なる発現レベルで発現する。生成する発現パターンは、一過性または安定、構成的または誘導的とすることができる。ポリペプチドに関して、「発現の変化」は、更にタンパク質レベルの変化またはポリペプチドと外来または内在モジュレーターとの相互作用から生じる、または因子同士の相互作用からまたはポリペプチドの化学修飾の結果として生じる活性レベルの変化にも関することがある。「外来核酸」(exogenous nucleic acid)および「異種核酸」(heterogenous nucleic acid)は相互交換可能に用いられ、ヒトの努力によって細胞中に導入されている核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡを表す。このような外来核酸は、それが導入される細胞に天然で存在する配列のコピーまたはその断片であることがある。
【００２４】
対照的に、「内在核酸」(endogenous nucleic acid)という用語は、遺伝子工学処理を施される植物または生物に存在する核酸、遺伝子、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ分子を表す。内因性配列は、遺伝子工学処理を施される植物または生物に対して「本来的」(native)、すなわち固有のものである。
【００２５】
「相同配列」という用語は、共通の起源および配列保存により類似しているポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を表す。相同配列は、それらが種分化事象によって分離されている場合には「オルソロガス」であり、または遺伝子重複事象によって分離されている場合には「パラロガス」であることがある。
【００２６】
「機能的同族体」(functional homolog)という用語は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列共通の起源および配列保存により類似しておりかつ触媒、細胞または生体レベルで同一または類似機能を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を表す。
【００２７】
ジオキシゲナーゼ配列
ジオキシゲナーゼコード遺伝子はいくつかの植物の科で確認されており、サトウキビおよびモロコシのようなイネ科のものが例示される。本発明によれば、２−オキソグルタレート依存性ジオキシゲナーゼ(2-ODD)配列は、上記のように植物構造を改質しかつバイオマスおよび/またはスクロース収量を高めるのに用いることができる。
【００２８】
本発明においては、「Ss-2ODD1」は、タンパク質レベルおよび/または活性の減少によって構造を改質しバイオマスおよび/またはスクロース収量を高めた植物を生じる植物酵素を表す。本発明においては、「Ss-2ODD1」は、タンパク質レベルの減少および/または活性の抑制によって植物構造の改質およびスクロースおよび/またはバイオマスの増加を生じる植物酵素を表し、更に下記の反応:
(a)  分子状酸素の活性化および共基質としての２−オキソグルタレート必要条件を有するまたはなしでのヒドロキシル化、脱飽和、環化およびエポキシ化など基質の接触反応、
(b)  共同因子としてのアスコルビン酸塩の必要条件を有するまたはなしでの生体分子(代謝物および高分子)の酸化、
(c)  有機(代謝物および高分子)基質におけるＯ２から酸素の取込の接触反応、
(d)  アブシジン酸、ジベレリンおよびエチレンのような植物シグナル化合物の生合成または分解、および
(e)  二次代謝物、特にフラボノイドおよびアルカロイドの生合成または分解
の少なくとも1つを触媒する潜在能力を有するジオキシゲナーゼ活性を有する。
【００２９】
本発明のポリヌクレオチドは、２−オキソグルタレート依存性ジオキシゲナーゼ(2-ODD)ポリペプチドに対する高度の配列同一性を特徴とするポリペプチドをコードする。典型的な2-ODD配列はSacchanim spp. 2-ODD (Ss2-ODD1)のようなイネに由来するものであるが、他の植物の科由来の機能的同族体を用いて改質した植物構造および増加したバイオマスと増加したスクロース収量の少なくとも一方を有する植物を生産することができる。図２に示されるように、２−ＯＤＤ配列はいくつかの植物の科、とりわけイネ科（例えば、サトウキビおよびモロコシ）、ウリ科（例えば、カボチャおよび冬カボチャ）、アブラナ科（例えば、シロイヌナズナ）、ナス科（例えば、タバコおよびトマト）、マメ科（例えば、エンドウ）、およびキョウチクトウ科（例えば、ニチニチソウ）で確認されている。他の植物の科由来の植物2-ODD遺伝子が、実例としての配列番号１がコードするSs2-ODD1酵素(配列番号2)によって作用される同じ反応を触媒することが予想され、従って、このような遺伝子の発現が減少すると、上記しかつ下記の実施例に記載した植物によって例示される表現型を生じることになる。
【００３０】
更に、普通の遺伝学的機構が、イネ科中および双子葉植物および単子葉植物種にわたって植物構造を制御する。例えば、Doust, Ann. Bot. 100: 941-50, 2007およびそこに引用されている公表文献を参照されたい。従って、植物構造およびバイオマス蓄積を制御する様々な科から機能的同族体を同定して単離することによって、本発明により広汎な植物におけるこれらの特性を改質することができる。
【００３１】
追加の2-ODD配列は、配列比較によって同定し機能的に注釈を施すことができる。従って、熟練者であれば、公的に利用可能な配列分析プログラムとパラメーターを用いてＧｅｎＢａｎｋのような適当なデーターベースにおける機能的に関連したSs2-ODD1配列を容易に同定することができる。最初に2-ODDとして同定された配列を更に特性決定することによって、既知ジオキシゲナーゼのファミリーに含まれる配列モティーフに対応する特定の配列ストリングを含んでなる配列を同定することができる。あるいは、適当なハイブリダイゼーションプローブおよび条件を用いるｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって、機能的に関連したSs2-ODD1配列が同定される。フィールドワークでも同様に、同一性のレベルが減少した配列は(縮退した)オリゴヌクレオチドとＰＣＲに基づく方法によって単離することもできることが分かっている。
【００３２】
従って、上記の手法により、配列をSs2-ODD1ファミリーに属するものとして同定し機能的に注釈を施すことができる。同じ理由によって、本明細書の説明における「Ss2-ODD1 ＤＮＡ配列」は、ストリンジェントまたは高度のストリンジェントな条件下で配列番号1に記載の配列とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を有する任意の核酸分子を表し、上記のようなSs2-ODD1酵素をコードする。この用語によって表される範疇は、配列番号1に示されるSs2-ODD1ヌクレオチド配列と好ましくは少なくとも４０％、好ましくは少なくとも６０％、とりわけ好ましくは少なくとも８０％、および特に好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．９％の同一性を有する配列番号１と交配する配列も包含する。本発明のヌクレオチド配列は、配列番号２に記載の予測された遺伝子生成物に相同性のタンパク質をコードすることができる。
【００３３】
本明細書における「ストリンジェントな条件」という用語は、当該技術分野でよく知られているパラメーターを包含する。一本鎖ポリヌクレオチドは、水素結合、溶媒排除および塩基スタッキングのような様々な十分に特性決定された物理化学的力に基づいて会合するときに、それらはハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは関与した核酸の配列同一性の程度を反映しているので、ストリンジェンシーが高くなれば、２個のポリヌクレオチド鎖は一層類似する。ストリンジェンシーは、温度、塩濃度および組成、有機および非有機添加剤、溶媒などハイブリダイゼーションおよび洗浄溶液の両方に含まれるものおよびインキュベーション（および回数）を含む様々な因子によって影響される。
【００３４】
サザンブロットまたはノーザンブロットでのフィルター上の１００を上回る相補的残基を有する相補的核酸のハイブリダイゼーションについて、「ストリンジェント」ハイブリダイゼーション条件は、画定されたイオン強度およびｐＨで特異配列に対する熱融解温度（Ｔｍ）より約５℃〜２０℃低い温度によって示される。Ｔｍは、画定されたイオン強度およびｐＨにおいて、ターゲット配列の５０％が完全にマッチしたプローブにハイブリダイズする温度である。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子は、典型的には全ｃＤＮＡまたは選択された部分のいずれかに基づくプローブにハイブリダイズする。更に好ましくは、本明細書での「ストリンジェントな条件」は、３．５ｘＳＳＣ、１ｘデンハート溶液、２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤＳおよび２ｍＭＥＤＴＡ中６５℃で１８時間ハイブリダイゼーションした後、フィルターを６５℃で２０分間２ｘＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで４回洗浄し、最後に０．５ｘＳＳＣと０．１％ＳＤＳまたは０．３ｘＳＳＣと０．１％ＳＤＳとでストリンジェンシーを大きくし、また０．１ｘＳＳＣと０．１％ＳＤＳとでストリンジェンシーを更に大きくする目的で２０分間まで洗浄するような当該技術分野でよく知られているパラメーターを表す。ストリンジェンシーの程度が本明細書で提供されるのと同程度である限り、０．５ｘＳＳＣの最終洗浄を用いる他の条件に置き換えることができる。余り緊密に関連していない同族体の同定には、洗浄をより低温、例えば５０℃で行うことができる。一般に、ストリンジェンシーは、洗浄温度を上げおよび／またはＳＳＣの濃度を減少させることによって増加する。
【００３５】
本発明は、配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする配列番号１のヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子を提供する。本発明のタンパク質は、酵素の機能を変更しないアミノ酸置換、付加および欠失を包含することは言うまでもない。本発明の配列に導入される置換、欠失および挿入も、本発明に包含される。このような配列改質は、位置指定突然変異誘発によってまたは当該技術分野で知られている他の方法によって遺伝子工学処理を行って１つの配列とすることができる。アミノ酸置換は典型的には単一残基のものであり、挿入は通常は約１〜１０個程度のアミノ酸残基についてであり、欠失は約１〜３０個の残基にわたる。好ましい態様では、欠失または挿入は隣接対で作られ、例えば２残基の欠失または２残基の挿入である。置換、欠失、挿入またはそれらの任意の組合せを組み合わせて配列に到達することができる。Ss2-ODD1のようなODD1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで行われる突然変異は、リーディングフレームの外側の配列を配置すべきではなく、二次ｍＲＮＡ構造を生じることができる相補性領域を作成すべきではない。ＤＮＡによってコードされるポリペプチドは、所望な機能を行うのが好ましい。
【００３６】
記載された配列に対して相同性のジオキシゲナーゼ配列は、典型的には少なくとも約４０％のアミノ酸配列同一性を共有している。更に緊密に関連したジオキシゲナーゼアミノ酸配列は、記載された配列と少なくとも約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％または約８０％または約９０％または約９５％、９６％、９７％、９８％または９９．９％さえのアミノ酸配列同一性を共有する。ヌクレオチドレベルでは、配列は典型的には、記載された配列の１個以上に対して少なくとも約４０％ヌクレオチド配列同一性、好ましくは少なくとも約５０％、約６０％、約７０％または約８０％の配列同一性、更に好ましくは約８５％、約９０％、約９５％または約９７％以上の配列同一性を共有する。遺伝子コードの縮退によって、コードされたタンパク質のアミノ酸配列を保持したまま、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に大きく変化させることができる。
【００３７】
従って、本発明は、2-ODDポリペプチドをコードしかつ植物構造を改質しかつ植物バイオマスおよび／またはスクロース収量を増加させる植物から単離される任意の核酸、遺伝子、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ分子を包含する。ＤＮＡまたはＲＮＡは、二本鎖または一本鎖でよい。一本鎖ＤＮＡはセンス鎖としても知られるコード鎖であってもよく、またはアンチセンス鎖とも呼ばれる非コード鎖であってもよい。
【００３８】
様々なポリヌクレオチド配列のいずれも2-ODDポリペプチドをコードすることができることは、当業者であれば容易に理解されるであろう。遺伝子コードの縮退によって、多数の異なるポリヌクレオチドは、配列リストに示された配列の他に同一および/または実質的に類似のポリペプチドをコードすることができる。
【００３９】
「変異体」(variant)という用語は、特定の遺伝子またはタンパク質の標準的または所定のヌクレオチドまたはアミノ酸配列から外れるヌクレオチドまたはアミノ酸配列である。変異体は、置換アミノ酸が類似の構造的または化学的特性、例えばロイシンのイソロイシンによる置換を有する「保存的」変化を有することがある。変異体は、「非保存的」変化、例えばグリシンのトリプトファンによる置換を有することがある。類似の小さな変異としては、アミノ酸欠失または挿入、または両方を挙げることもできる。どのアミノ酸残基を置換し、挿入しまたは欠失することができるかの決定の手引は、Vector NTI Suite (InforMax, メリーランド)ソフトウェアのような当該技術分野で周知のコンピュータープログラムを用いて見出すことができる。「変異体」は、例えば米国特許第６，５０６，６０３号明細書、第６，１３２，９７０号明細書、第６，１６５，７９３号明細書および第６，１１７，６７９号明細書に記載の「シャッフルド遺伝子」(shuffled gene)をも表す。
【００４０】
また、本明細書でオリゴヌクレオチドと表され、少なくともストリンジェントまたは高ストリンジェントな条件下で上記のポリヌクレオチド配列にハイブリダイズする断片およびドメインも考えられる。オリゴヌクレオチドは、プライマー、プローブなどとして有用である。プローブ、プライマー、センスおよびアンチセンス剤としての使用に適当なオリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも約１５ヌクレオチドであり、更に多くの場合には長さが少なくとも約１８ヌクレオチド、多くの場合には少なくとも約２１ヌクレオチド、頻繁には少なくとも約３０ヌクレオチド、または約４０ヌクレオチド以上である。核酸プローブは、ハイブリダイゼーションプロトコル、例えばマイクロアレイ実験のプロトコルなど本発明の追加のポリペプチド同族体を同定するのに有用である。プライマーを核酸ハイブリダイゼーションによって相補的ターゲットＤＮＡ鎖に対してアニーリングさせ、プライマーとターゲットＤＮＡ鎖との間にハイブリッドを形成した後、ＤＮＡポリメラーゼ酵素によってターゲットＤＮＡ鎖に沿って伸張させることができる。プライマー対は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または他の核酸増幅法による核酸配列の増幅に用いることができる。
【００４１】
ポリペプチドに関する「断片」または「ドメイン」という用語は、ポリペプチドの部分配列を表す。幾つかの場合には、断片またはドメインは、完全なポリペプチドが行うのと実質的に同じ方法で、または同程度まで完全なポリペプチドの少なくとも１個の生物学的機能を行うポリペプチドの部分配列である。例えば、ポリペプチド断片は、ＤＮＡプロモーター領域に結合するＤＮＡ結合ドメイン、活性化ドメインまたはタンパク質−タンパク質相互作用のためのドメインのような認識可能な構造モティーフまたは機能ドメインを含んでなることができる。断片は６アミノ酸程度の少数から完全なポリペプチドの完全長まで大きさが変動することができるが、好ましくは長さが少なくとも約３０アミノ酸であり、更に好ましくは長さが少なくとも約６０アミノ酸である。
【００４２】
本明細書で用いられる「Ss2-ODD1 ＤＮＡ配列」は、Ss2-ODD1遺伝子が配列番号１に記載の配列、並びに１個以上の塩基が欠失し、置換し、挿入しまたは付加された配列番号１の変異体であって、少なくとも４０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする変異体から構成される核酸分子を包含することを意味するものと理解される。従って、「１個以上の塩基が欠失し、置換し、挿入しまたは付加した塩基配列」を有する配列は、コード化アミノ酸配列が１個以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されているときであっても、生理活性を保持する。更に、Ss2-ODD1酵素の多型が存在することがあり、これはポリペプチドの翻訳後修飾またはSs2-ODD1遺伝子の多型によることがある。このような修飾を有しかつジオキシゲナーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列は、本発明の範囲内に包含される。
【００４３】
例えば、ポリＡ尾または５’−または３’−末端の非翻訳領域が欠失されることがあり、塩基はアミノ酸が欠失される程度まで欠失されることがある。塩基は、フレームシフトが生じない限り置換されることもある。塩基は、アミノ酸が付加される程度まで「付加」されることもある。しかしながら、如何なる上記修飾もジオキシゲナーゼ酵素活性を喪失しないことが最も重要である。これに関して改質ＤＮＡは、特定部位のアミノ酸が、例えば、Zoller & Smith, Nucleic Acid Res. 10: 6487-500, 1982に記載の部位特異的突然変異誘発によって置換、欠失、挿入または付加されるように本発明のＤＮＡ塩基配列を改質することによって得ることができる。
【００４４】
特に断らない限り、本明細書でＤＮＡ分子をシークエンシングすることによって決定される総てのヌクレオチド配列は、Applied Biosystems, Inc.製のModel 373のような自動ＤＮＡシークエンサーを用いて決定される。従って、この自動化法によって決定される任意のＤＮＡ配列について当該技術分野で知られているように、本明細書で決定される任意のヌクレオチド配列はいくらかの過誤を含むことがある。自動的に決定されるヌクレオチド配列は、配列決定されたＤＮＡ配列の実際のヌクレオチド配列に対して典型的には少なくとも約９５％同一であり、更に典型的には少なくとも約９６％〜少なくとも約９９．９％同一である。実際の配列は、当該技術分野で周知の手動によるＤＮＡシークエンシング法によってより精確に決定することができる。また、当該技術分野で知られているように、実際の配列に比較して決定されたヌクレオチド配列における単一の挿入または欠失がヌクレオチド配列の翻訳にフレームシフトを引き起こし、決定されたヌクレオチド配列によってコードされた予想アミノ酸配列は、このような挿入または欠失の点から始まる配列決定したＤＮＡ分子によって実際にコードされるアミノ酸配列とは全く異なることがある。
【００４５】
核酸構築物
本発明は、１個以上の本明細書に記載の核酸配列を含んでなる組換え構築物(construct)を包含する。この構築物は、典型的にはプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス（例えば、植物ウイルス）、細菌性の人工染色体（ＢＡＣ）、酵母の人工染色体（ＹＡＣ）などのベクターであって、これに核酸配列が前進または復帰配向で挿入されている。好ましい態様では、構築物は更に、例えば、配列に操作可能に連結したプロモーターなどの調節配列を含んでなる。多数の適当なベクターおよびプロモーターが知られており、市販されている。
【００４６】
組換え核酸構築物は、標準的手法を用いて作製することができる。例えば、転写についてのヌクレオチド配列は、上記配列を含むベクターを制限酵素で処理して適当なセグメントを切出すことによって得ることができる。転写についてのヌクレオチド配列は、合成オリゴヌクレオチドをアニーリングして連結し、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で合成オリゴヌクレオチドを用いて、それぞれの末端に適当な制限部位を付与することによって生成させることもできる。次に、ヌクレオチド配列を、上流プロモーターおよび下流ターミネーター配列のような適当な調節要素を含むベクターにクローニングする。
【００４７】
典型的には、植物形質転換ベクターは、５’および３’調節配列および選択可能マーカーの転写制御下で１個以上のクローニングした植物のコード配列（ゲノムまたはｃＤＮＡ）を含む。このような植物形質転換ベクターは、典型的にはプロモーター（例えば、誘導的または構成的な環境的または発生的に調節されたまたは細胞または組織特異的発現を制御する調節領域）、転写開始部位、ＲＮＡプロセシングシグナル（イントロンスプライス部位など）、転写終結部位および／またはポリアデニル化シグナルもふくむ。
【００４８】
本発明のODD1配列の発現に用いることができる適当な構成的植物プロモーターとしては、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターおよびトウモロコシポリユビキチンプロモーターであって、構成的で高レベルの発現をほとんどの植物組織に付与するもの(例えば、米国特許第5,510,474号明細書; Odell et al, Nature 313: 810-812, 1985を参照)、ノパリンシンターゼプロモーター (An et al, Plant Physiol. 88: 547-552, 1988)、およびオクトピンシンターゼプロモーター(Fromm et al., Plant Cell 1: 977-984, 1989)、並びに組織特異的で組織に好ましい、細胞型特異的および誘導的プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、サトウキビでは、葉に生成したスクロースは「節間」に蓄積し、これは２つの節の間のシュート軸(shoot axis)の部分を表し、節間特異的プロモーターを用いるのが有利であることがある。
【００４９】
ベクターは、本発明の核酸分子の下流に位置して、ｍＲＮＡの転写を終結しポリＡ配列を付加するようになっている終結配列を含むこともある。典型的なターミネーターは、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓターミネーターおよびノパリンシンターゼ遺伝子（ＮＯＳ）ターミネーターである。
【００５０】
発現ベクターは、形質転換細胞を培養中に同定することができる選択マーカーを含むこともある。このマーカーは、異種核酸分子、すなわちプロモーターに操作可能に連結した遺伝子と関連していることがある。本明細書で用いられる「マーカー」という用語は、マーカーを含む植物または細胞を選択またはスクリーニングすることができる形質または表現型をコードする遺伝子を表す。植物では、例えば、マーカー遺伝子は抗生物質または除草剤耐性をコードする。これによって、形質転換またはトランスフェクションしていない細胞から形質転換細胞を選択することができる。
【００５１】
適当な選択可能マーカーの例としては、アデノシンデアミナーゼ、ジヒドロホレートレダクターゼ、ハイグロマイシン-B-ホスホトランスフェラーゼ、チミジンキナーゼ、キサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、グリホセートおよびグルホシネート耐性、およびアミノ−グリコリド３’−Ｏ−ホスホトランスフェラーゼ（カナマイシン、ネオマイシンおよびＧ４１８耐性）が挙げられる。これらのマーカーは、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシンおよびゲンタマイシンに対する耐性を含むことがある。この構築物は、グルホシン酸アンモニウムのような除草剤のホスフィノトリシン類似体に耐性を付与する選択可能マーカー遺伝子Ｂａｒを含むこともある。Thompson et al, EMBO J. 6: 2519-23 (1987)。他の適当な選択マーカーも知られている。
【００５２】
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のような可視マーカーを用いてもよい。細胞分割の制御に基づいて形質転換植物を同定または選択する方法も、報告されている。John and Van Mellaert，ＷＯ２０００／０５２１６８号、およびFabijansk et al，ＷＯ２００１／０５９０８６号を参照されたい。
【００５３】
細菌またはウイルス起源の複製配列も、細菌またはファージ宿主でベクターをクローニングする目的で含まれていることもある。好ましくは、複製の原核生物起源の広汎な宿主範囲が用いられる。細菌についての選択可能マーカーを、所望な構築物を有する細菌細胞を選択する目的で包含することができる。適当な原核生物の選択可能マーカーは、カナマイシンまたはテトラサイクリンのような抗生物質に対する耐性を含むこともある。
【００５４】
追加の機能をコードする他の核酸配列も、当該技術分野で知られているように、ベクターに含まれていることもある。例えば、アグロバクテリウム（Agrobacterium）が宿主であるときには、T-DNA配列が含まれ、続いて植物染色体への移動および組込みを促進することがある。
【００５５】
ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列の発現を変更する方法
本発明の態様では、植物バイオマスおよび/またはスクロース収量は、本発明のポリヌクレオチド配列の発現をダウンレギュレーションすることによって高くなる。転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）の様々な方法は当該技術分野で周知であり、本発明で用いられることがある。
【００５６】
例えば、植物形質を改質するためのトランスジェニック植物における本発明の配列の発現の減少または除去（すなわち、「ノックアウト」）は、ｃＤＮＡとして目的のポリペプチドに対応するアンチセンス構築物を導入することによって得ることができる。アンチセンス抑制には、ポリヌクレオチド配列または相同性ｃＤＮＡを、発現ベクターにおけるプロモーター配列に対して逆配向で（コード配列に関して）配置する。導入された配列は完全長のｃＤＮＡまたは遺伝子である必要はなく、また形質転換される植物の種類に見られるｃＤＮＡまたは遺伝子と同一である必要はない。典型的には、アンチセンス配列は天然のメッセンジャーＲＮＡの任意の隣接配列に対して相補的であることがあり、すなわち、５’−末端またはキャップ形成部位に近位の、キャップ形成部位の下流、キャップ形成部位と開始コドンの間の内在性ｍＲＮＡ配列に相補的であることがあり、非コード領域の全部または一部のみをカバーし、非コードおよびコード領域を架橋し、コード領域の全部または一部に相補的であり、コード領域の３’−末端に相補的であり、またはｍＲＮＡの３’−未翻訳領域に相補的であることがある。
【００５７】
特定のアンチセンス配列およびアンチセンス配列の長さは、例えば、所望な阻害の程度およびアンチセンス配列の安定性によって変化する。従って、導入される配列の長さが短めである場合には、効果的なアンチセンス抑制には一層高度の内在性Ss2-ODD1配列に対する同一性が必要となる。様々な長さのアンチセンス配列を用いることができるが、好ましくは、ベクターにおける導入されるアンチセンス配列の長さは、ダウンレギュレーションされる配列の少なくとも１３〜約１５ヌクレオチドであり、少なくとも１６〜約２１ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約７５ヌクレオチド、少なくとも約１００ヌクレオチド、少なくとも約１２５ヌクレオチド、少なくとも約１５０ヌクレオチド、少なくとも約２００ヌクレオチド、または全長である。更に、配列は、その３’または５’末端で伸張したりまたは短縮することができる。本明細書で提供される一般に利用可能な手法および情報により、適当なコードアンチセンス配列を選択することができる。本明細書における配列番号１に関しては、本発明のオリゴヌクレオチドは、宿主植物細胞に形質転換するときには、所望な効果を得るのに十分な任意の長さのアンチセンス配向でのSs2-ODD1 ｃＤＮＡ配列の連続断片であることがある。
【００５８】
本発明は、Ss2-ODD1コード配列のセンス共抑制について説明する。本発明の実施に用いられるポリヌクレオチドは、植物細胞で発現するときには、植物Ss2-ODD1タンパク質の本来の発現を抑制するのに十分な長さである。このようなセンスポリヌクレオチドは本質的にはSs2-ODD1酵素をコードする全ゲノムまたは相補的核酸またはその断片であり、これらの断片は長さが典型的には少なくとも１５ヌクレオチドである。細胞における本来の遺伝子の発現を抑制するセンスＤＮＡの長さを確かめる目的で、様々な手法が一般に利用可能である。
【００５９】
本発明の別態様では、植物細胞は、酵素性ＲＮＡ分子（「リボザイム」）をコードするポリヌクレオチドセグメントを含む核酸構築物により形質転換され、この酵素性ＲＮＡ分子は上記のようにSs2-ODD1をコードするＤＮＡのｍＲＮＡ転写産物に向けられる（開裂する）。リボザイムは、ターゲットｍＲＮＡの接近可能な領域に結合する基質結合ドメインとＲＮＡの開裂を触媒して翻訳およびタンパク質産生を妨げるドメインを含む。結合ドメインは、ターゲットｍＲＮＡ配列に相補的なアンチセンス配列を含んでなることがあり、触媒モティーフはハンマーヘッドモティーフまたは他のモティーフ、例えばヘアピンモティーフであることがある。
【００６０】
ＲＮＡターゲット中のリボザイム開裂部位は、最初にリボザイム開裂部位（例えば、ＧＵＡ、ＧＵＵまたはＧＵＣ配列）についてターゲット分子を走査することによって同定することができる。同定を行ったならば、開裂部位を含むターゲット遺伝子の領域に対応する１５、２０、３０以上のリボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列を予想された構造上の特徴について評価することができる。
【００６１】
候補ターゲットの適合性を、当該技術分野で知られているリボヌクレアーゼ保護分析法を用いて、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの実施可能性を試験することによって評価することもできる。酵素性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡは、既知の手法にしたがって産生させることができる。例えば、米国特許第４，９８７，０７１号明細書、第５，５５９，０２１号明細書、第５，５８９，３６７号明細書、第５，５８３，０３２号明細書、第５，５８０，９６７号明細書、第５，５９５，８７７号明細書、第５，５９１，６０１号明細書、および第５，６２２，８５４号明細書を参照されたい。
【００６２】
植物細胞でのこのような酵素性ＲＮＡ分子の産生およびSs2-ODD1タンパク質産生の崩壊は、アンチセンスＲＮＡ分子の産生と本質的に同様に、すなわち、酵素を産生する細胞におけるｍＲＮＡの翻訳を崩壊させることによって植物細胞におけるタンパク質活性を減少させる。「リボザイム」という用語は、エンドリボヌクレアーゼのような酵素として機能し、「酵素性ＲＮＡ分子」と互換的に用いることができるＲＮＡを含む核酸を表す。
【００６３】
本発明は、リボザイムをコードする核酸であって、リボザイムをコードしかつ発現ベクターに挿入されている核酸、上記のようなベクターを含む宿主細胞、および植物でのSs2-ODD1活性を減少させる目的でリボザイムを用いる方法も包含する。
【００６４】
もう一つの態様では、本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）遺伝子サイレンシングを伝達する二本鎖核酸分子を提供する。一つの態様では、本発明のｓｉＮＡ分子は、約１５〜約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０）個のヌクレオチド含んでなるオリゴヌクレオチドの間に約１５〜約３０個の塩基対を含む二本鎖核酸分子からなっている。もう一つの態様では、本発明のｓｉＮＡ分子は、約１〜約３２（例えば約１、２または３）個のヌクレオチドの突出末端を有する二本鎖核酸分子、例えば、約１９塩基対と３’−末端モノヌクレオチド、ジヌクレオチドまたはトリヌクレオチド突出を有する約２１ヌクレオチド二本鎖を含んでなる。更にもう一つの態様では、本発明のｓｉＮＡ分子は、平滑末端を有する二本鎖核酸分子であって、両末端が平滑であるか、あるいは末端の一方が平滑であるものを含んでなる。
【００６５】
本発明のｓｉＮＡ分子は、ＲＮＡｉを伝達する能力を保持したまま改質ヌクレオチドを含んでなることがある。改質ヌクレオチドは、イン・ビトロまたはイン・ビボでの安定性、活性および／またはバイオアベイラビリティーのような特性を向上させるのに用いることができる。例えば、本発明のｓｉＮＡ分子は、ｓｉＮＡ分子に含まれるヌクレオチドの総数の一部として改質ヌクレオチドを含んでなることができる。その意味において、本発明のｓｉＮＡ分子は、一般的には約５％〜約１００％改質ヌクレオチド（例えば、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％改質ヌクレオチド）を含んでなることができる。所定のｓｉＮＡ分子に含まれる改質ヌクレオチドの実際の割合は、ｓｉＮＡに含まれるヌクレオチドの総数によって変化する。ｓｉＮＡ分子が一本鎖であるときには、改質割合は一本鎖ｓｉＮＡ分子に含まれるヌクレオチドの総数によって変化することができる。同様に、ｓｉＮＡ分子が二本鎖であるときには、改質割合はセンス鎖、アンチセンス鎖、またはセンスおよびアンチセンス鎖の両方に含まれるヌクレオチドの総数によって変化することができる。
【００６６】
遺伝子工学処理のための植物
本発明は、植物構造を改質しバイオマスおよび／またはスクロース収量を高めるための植物の遺伝子操作を包含する。
【００６７】
「植物」という用語は、遺伝子操作を行うことができる任意のセルロースを含む植物材料を表し、分化または未分化植物細胞、プロトプラスト、完全な植物、植物組織または植物器官、または葉、茎、根、芽、塊茎、果実、根茎のような植物の任意の構成要素が挙げられるが、これらに限定されない。「珠芽」という用語は、新たな植物を生じる能力を有する構造体、例えば種子、胚種、または親から引き離されたときに独立して成長することができる植物体の一部が挙げられる。
【００６８】
「トランスジェニック植物」とは、遺伝子工学処理を行った植物細胞またはプロトプラスト由来の植物またはその子孫を表し、その植物ＤＮＡは導入外来ＤＮＡ分子を含む。更に、「トランスジェニック植物」の範疇には、例えば、標準的遺伝子移入または従来の育種のような別の育種法としてのその系統の形質転換体が挙げられる。対照的に、遺伝子操作を行わない植物はコントロール植物であり、「非トランスジェニック」植物と表される。非トランスジェニック植物は、ポリヌクレオチド配列を含んでなる構築物を導入することによって予備修飾なしに培養細胞または組織から再生させることができる。更に、「野生型植物」は、ゲノムが本発明のポリヌクレオチド配列またはその断片を含んでなる構築物の導入によって改質されず、また培養細胞または組織から再生されない非トランスジェニック植物を表す。
【００６９】
本発明による遺伝子工学処理を施すことができる植物としては、裸子植物、単子葉および双子葉植物などの任意の高等植物が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の植物としては、大豆、小麦、トウモロコシ、ジャガイモ、綿、米、ナタネ(カノーラを包含する)、マメ、ヒマワリ、アルファルファ、サトウキビ、ターフ、大麦、ライ麦、キビ、モロコシ、ビート、甜菜、キャッサバ、ヤムイモ、および甘藷などの作物が挙げられるが、これらに限定されない。この植物は、マツ、ポプラ、ハコヤナギ、ヤナギ、およびユーカリのような木質種であってもよい。また、この植物は、サトウキビ、エリアンサス、ススキ、ナレンガ、スクレロスタチア(Sclerostachya)、モロコシ、トウモロコシ、ブタモロコシ、トリプサクム、キビ、テフ、スイッチグラス、アフリカチカラシバ、米、マコモ、燕麦、大麦、ライ麦、ヤマカモジ、ライグラス、ウシノケグサ、ターフグラス(turf grass)、またはタケ種などの禾本が挙げられるが、これらに限定されない。更に具体的には、本発明に準じて遺伝子工学処理を施すことができる植物としては、木本樹、サトウキビおよびモロコシが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
「サトウキビ植物」とは、サトウキビ属、好ましくはSaccharum officinarum種、更に好ましくはSaccharum officinarumをSaccharum spontaneumと交配させることによって産生される種間ハイブリッドの植物を意味するものと理解される。「モロコシ」とは、モロコシ属の一員である任意の植物を表し、糖分含量が高い「サトウモロコシ」品種が挙げられる。
【００７１】
遺伝子工学処理の方法
本発明のポリヌクレオチドは、改質した構造と植物バイオマスおよび/またはスクロース収量を高めたトランスジェニック植物の生産に用いることができる。
【００７２】
ポリヌクレオチドを組込みおよび/または本発明のポリペプチドを発現させるトランスジェニック植物(植物細胞、植物外植片、または植物組織など)は、後掲の様々な十分に確認されている手法によって生産することができ、最も適当な形質転換法の選択は実施者が決定することができる。ベクター、最も典型的にはポリヌクレオチド、例えばSs2-ODD1配列を包含する発現カセットの構築の後に、当該技術分野で知られている標準的手法を用いてポリヌクレオチドを目的とする植物、植物細胞、植物外植片または植物組織に導入して、安定に組込むことができる。場合によっては、植物細胞、外植片または組織を、トランスジェニック植物を生産する目的で再生することができる。
【００７３】
単子葉および双子葉の被子植物または裸子植物の植物細胞は、いずれも形質転換することができる。例えば、Klein and Fitzpatrick-McElligott., Current Opinion in Biotechnology 4: 583-590, 1993; Bechtold et al, C. R. Acad. ScL Paris 316: 1194-1199, 1993; Koncz and Schell, Mol. Gen. Genet. 204: 383-396, 1986; Paszkowski et al, EMBO J. 3: 2717-2722, 1984; Sagi et al, Plant Cell Rep. 13: 262-266, 1994を参照されたい。A. tumefaciensおよびA. rhizogenesのようなアグロバクテリウム種を、例えば、Nagel et al., FEMS Microbiol Lett 61: 325-328, 1990に準じて用いることができる。更に、植物をRhizobium、SinorhizobiumまたはMesorhizobium形質転換によって形質転換することができる。Broothaerts et al, Nature 433: 629-633, 2005。
【００７４】
植物または細胞の遺伝子工学処理の追加的方法としては、電気穿孔、パーティクル・ガン衝撃 (Klein et al, Nature 327: 70-73, 1987)、リン酸カルシウム沈澱、およびポリエチレングリコール融合、発芽花粉粒への導入、直接的形質転換(Lorz et al, Mol Gen. Genet. 199: 179-82, 1985)、および当該技術分野で知られている他の方法が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７５】
適当なプロトコルは、イネ (トウモロコシ、サトウキビ、モロコシなど)、マメ (アルファルファ、大豆、クローバーなど)、セリ (ニンジン、セロリ、アメリカボウフウ)、アブラナ(キャベツ、ダイコン、ナタネ、ブロッコリーなど)、ウリ (メロンおよびキュウリ)、イネ (小麦、トウモロコシ、米、大麦、キビなど)、ナス (ジャガイモ、トマト、タバコ、コショウなど)、および様々な他の作物について利用可能である。Ammirato et al, 「植物細胞培養ハンドブック-作物種(Handbook of Plant Cell Culture - Crop Species)」. Macmillan Publ. Co., ニューヨーク, 1984; Shimamoto et al, Nature 338: 274-276, 1989; Fromm et al, Bio/Technology 8: 833-39, 1990; and Vasil et al, Bio/Technology 8: 429-34, 1990に記載のプロトコルを参照されたい。サトウキビの形質転換についてのプロトコルは、本発明にとって特に興味深いものである。サトウキビはパーティクル・ガン衝撃によって形質転換することができ、Bower & Birch, Plant Journal 2: 409-416, 1992; Franks & Birch, Aust. J. Plant Physiol. 18: 471-80, 1991; Gallo-Meagher & Irvine, Crop Science 36: 1367-1374, 1996; Bower et al, Molecular Breeding 2: 239-249, 1996; Snyman et al, S. Afr. J. Bot. 62: 151-154, 1996を参照されたい。またはアグロバクテリウム依存性の遺伝子導入によって形質転換することができる。例えば、Arencibia et al., Transgenic Res. 7: 213-22, 1998を参照されたい。
【００７６】
形質転換細胞または培養物からトランスジェニック植物を再生する方法は植物種によって変化するが、既知の方法に基づいている。例えば、トランスジェニックサトウキビ植物を再生する方法は周知である。例えば、Weng et al, Pest Manag. ScI 62: 178-87, 2006; Santosa et al, Molecular Biotechnology 28: 113-19, 2004; Bower and Birch, Plant Journal 2: 409-416, 1992; and Falco et al, Plant Cell Reports 19: 1188-194, 2000を参照されたい。
【００７７】
カナマイシン耐性のような選択マーカーを用いると、どの細胞が良好に形質転換されているかを決定することが容易になる。マーカー遺伝子をｃｒｅまたはｆｌｐのような特異的リコンビナーゼによって認識される組換え部位の対に包含させ、選択後にこのマーカーの除去を促進することができる。米国公表出願第２００４／０１４３８７４号明細書を参照されたい。
【００７８】
内因性2-ODD1遺伝子の発現が減少した形質転換植物を選択する。例えば、本発明のトランスジェニックサトウキビ植物または細胞は、トランスジェニック植物または細胞が、天然ではサトウキビ野生型植物／植物細胞に存在するような分子のコピーの他にゲノムに安定に組込まれた配列番号1に記載の核酸分子の少なくとも1コピーを含んでなるという事実によって、野生型サトウキビと区別することができる。この場合には、例えば、トランスジェニックサトウキビ植物/細胞をサトウキビ野生型植物/細胞と区別することができ、追加のコピーまたは複数コピーは野生型植物/細胞には見られないゲノムの位置に配置されているからである。
【００７９】
本発明に関して、上記方法によって生産されるトランスジェニック植物は、従来の育種プログラムにおけるトランスジーンの供給源として用いることができる。一般に、トランスジェニック植物からの花粉を用いて非トランスジェニック植物を受粉させる。母植物の種子を用いて、上記方法によって生産した最初のトランスジェニック植物とは異なる新たなトランスジェニック植物を生産することができる。
【００８０】
増加したバイオマスおよびスクロース収量の定量方法
本発明のトランスジェニック植物および細胞は、変化した植物構造および増加したバイオマスおよび/または増加したスクロース収量を特徴とする。これは、2-ODD発現を減少させまたは抑制することによって達成される。
【００８１】
「形質」という用語は、植物または特定の植物材料または細胞の生理学、形態学、生化学または物理特性を表す。いくつかの例では、この特性は種子または植物の大きさのようにヒトの眼に見え、または植物部分のタンパク質またはスクロース含量のような利用可能な生化学的手法によって、または例えば、ノーザンブロット分析、ＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイ遺伝子発現分析またはレポーター遺伝子発現系を用いることによって、または収量または改質した構造測定のような農業観察によって測定することができる。
【００８２】
この説明では、「高めたバイオマス」とは、対応する非トランスジェニック植物の対応する部分のバイオマスに対する植物の1以上の部分、特に地上(収穫可能な)部分におけるバイオマスの増加、根のバイオマスの増加または任意の他の収穫可能な部分のバイオマスの増加を意味する。「繊維収量」とは、植物によって生産される固形の水に不溶性の材料の総量を意味すると理解される。本発明の目的に対して、繊維はバイオマスの一構成要素と考えられ、サトウキビの茎を圧搾してそのジュースを抽出した後に残るバガスを表す。「高めた繊維収量」とは、非トランスジェニック植物に対してトランスジェニック植物における総繊維収量の増加を表す。
【００８３】
「スクロース収量」とは、植物によって生産されるスクロースの総量を意味するものと理解される。スクロース収量は、茎の圧搾によって得られるジュース容積にそのジュースのスクロース濃度を掛けた積として定義される見かけの総スクロースを計算することによって定量される。更に好ましくは、本発明に関して、スクロース収量は、トランスジェニックプランテーション1ヘクタール当たりの生産されるスクロースの総量を意味する。「高めたスクロース収量」という用語は、非トランスジェニック植物と比較したトランスジェニック植物におけるスクロース含量の増加を表す。
【００８４】
本明細書で定義される「改質構造」(modified architecture)は、葉、苗条、茎、若木、花序(単子葉および双子葉植物について)、穂、花粉、胚珠、種子、胚、内乳、種皮および糊粉の任意の1個以上の外観または数における任意の変化を包含する。更にまたはあるいは、「改質構造」は、植物の高さおよび/または重量の増加、茎の節間数の増加、茎の節間径の増加および/または茎の節間長の増加、およびトランスジェニック植物の最下部から頂部までの一層均質な節間径の少なくとも1つによって表される。
【００８５】
植物バイオマスの定量
バイオマスの増加は、植物重量およびサイズ、茎重量およびサイズ、葉重量およびサイズ、根重量およびサイズ、および種子数および重量などこれらに限定されない一層容易に識別できる特性を測定することによって決定することができる。
【００８６】
「バイオマスを高めた」植物とは、非トランスジェニック植物と比較してトランスジェニック植物における乾燥および／または新鮮重量が２〜１００％、好ましくは５〜９０％、更に好ましくは１０〜８０％だけ増加することを表す。
【００８７】
本発明の目的には、繊維はバイオマスに包含される。サトウキビの場合には、繊維含量は、通常は新鮮重量の８〜１４％の範囲である。本明細書で用いられる「繊維」とは、サトウキビの茎を圧搾してそのジュースを抽出した後に残るバガスまたはバイオマスを表す。従って、繊維収量は、バガスの新鮮重量を高容量精度天秤(high capacity precision balance)で測定することによって定量される。サトウキビミルでは、その総圧搾量から３０％近くのバガスが生産される。発電およびバイオベースの材料の生産するための再生可能な供給原料としてバガスを用いる目的で、多くの研究努力が試みられてきた。更に、バガスは、多量に燃焼させると十分な熱エネルギーを生成するので、主要な燃料源として用いることができる。
【００８８】
「繊維収量を高めた」植物は、同じ種または品種のコントロール植物と比較して、総繊維収量が２〜７０％だけ、好ましくは５〜５０％だけ、更に好ましくは１０〜４０％だけ増加することを表す。
【００８９】
スクロース収量の定量
「スクロース収量」とは、植物によって生産されるスクロースの総量を意味するものと理解される。「スクロース収量」とは、植物によって生産されるスクロースの総量を意味するものと理解される。スクロース収量は、茎の圧搾によって得られるジュース容積にそのジュースのスクロース濃度を掛けた積として定義される見かけの総スクロースを計算することによって定量される。更に好ましくは、本発明に関して、スクロース収量は、トランスジェニックプランテーション1ヘクタール当たりの生産されるスクロースの総量を意味する。
【００９０】
「スクロース収量を高めた」植物は、同じ種または品種のコントロール植物と比較して、総スクロース収量が２〜１００％だけ、好ましくは５〜９０％だけ、更に好ましくは１０〜８０％だけ増加することを表す。
【００９１】
植物構造改質の評価
本発明の植物の説明において、「変更した植物構造」を有する植物は、例えば、植物の高さ、重量および直径、分蘖数、節間数、長さおよび均質性、葉数、長さ、幅および角度分布、根の長さ、長さおよび重量の変更を表す。
【００９２】
本発明を下記の実施例に関して更に説明するが、これは単に実例としてのものであり、本発明を制限するものではない。
【実施例】
【００９３】
実施例１：  Saccharum spp. 2-オキソグルタレート−依存性ジオキシゲナーゼ (Ss2-ODD1)の同定および特性決定
コメ由来の2-ODD同族体を用いる検索を、ＧｅｎＢａｎｋで入手可能なサトウキビで発現した配列ｔａｇ（ＥＳＴ）においてＢＬＡＳＴアルゴリズムで行った（Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990)。特定のコメ2-ODD同族体(gi 27311281)を用いる検討により、Saccharum spp. 推定2-ODD同族体をコードする２つのクラスターを同定した。これらのクラスターの一方は、ＧｅｎＢａｎｋ（gi 35984354）で見出された３’末端が不完全な2-ODD ｃＤＮＡクローンにほぼ同一であった。これらのクラスターは単一ｃＤＮＡクローンに相当することが見出され、以後Ss2-ODD1 (配列番号１)と命名した。Ss2-ODD1は、極めて類似の植物同族体による配列アライメントによって決定したところ、蓋然的完全長(probable full-length)のSs2-ODD1ポリペプチド(配列番号２）をコードするオープンリーディングフレーム（５０−９８２位）を含む。Ss2-ODD1は３１０アミノ酸残基および理論分子質量が３４，４５２のポリペプチドをコードする。ザ・ナショナル・センター・フォー・バイオテクノロジー・インフォメーション・コンサーブド・ドメイン・データーベース・コレクション(the National Center for Biotechnology Information Conserved Domain Database collection)における検索により、Ss2-ODD1ポリペプチドのカルボキシ末端ハーフ（１７０−２７１位の残基）に含まれる２−オキソグルタレート依存性ジオキシゲナーゼドメイン（ｐｆａｍ０３１７１）が明らかになった。図１は、非ヘムＦｅ（II）依存性ジオキシゲナーゼに共通している鉄結合モティーフ  Ｈｉｓ−Ｘ−Ａｓｐ（５３−５７）Ｘ−Ｈｉｓなどのこのドメインにおける保存残基の存在を示している(Kreisberg-Zakarin et al., Antonie Van Leeuwenhoek 75: 33-39, 1999)。これらの保存残基は、活性部位における鉄結合に必要であると思われる(Borovok et al, Biochemistry 35: 1981-1987, 1996)。
【００９４】
実施例２：  系統発生分析
Ss2-ODD1配列によるザ・ナショナル・センター・フォー・バイオテクノロジー・インフォメーション・ジンバンク・プロテイン・データーベース(the National Center for Biotechnology Information GenBank protein databases)と対照したＢＬＡＳＴ検索では、いくつかの機能的に特性決定された2-ODDタンパク質と様々な高等植物種由来の未知機能の数種類の2-ODD様タンパク質を得た。主要な2-ODDタイプの典型的な成員の完全長アミノ酸配列を、BLOSUMマトリックスを用いてClustalアルゴリズムで整列させた(Sugawara et al, Nucleic Acids Res. 31: 3497-3500, 2003)。系統発生分析は、ブートストラッピング（１，０００リサンプリング）によって評価した統発生樹の節の頑健性を有するＭＥＧＡバージョン３．１（Kumar et al, Brief Bioinform. 5: 150-163, 2004)を用いるNeighbor-Joining (NJ)法によって行った。このようにして得られた系統発生樹（図２）では、主要な機能が異なる2-ODDグループを確認することができる。主として１−アミノシクロプロパン−１−カルボキシレートオキシダーゼによって表されるグループ、および主としてジベレリン酸−２、−３および−２０オキシダーゼを含んでなる他のグループが注目される。後者では、Arabidopsis thaliana、Oryza sativaおよびPisum sativumにおけるジベレリン代謝に影響する遺伝子によってコードされたタンパク質である。Ss2-ODD1は、Arabidopsis thaliana、Catharanthus roseus、Medicago truncatula、Oryza sativa、Sorghum bicolorおよびZea mays由来のいくつかの同族体と一緒に機能が特性決定されていない2-ODDsの別個のグループに属する。この種の範囲中のSs2-ODD1関連配列の同定は、単子葉植物および双子葉植物クレードにおいてこのグループが広義で保存されることを示唆している。
【００９５】
実施例３：  ベクター構築
Ss2-ODD1 ｃＤＮＡ（配列番号１）のヌクレオチド５８〜６７６に及ぶ６１９ｂｐ断片は、Saccharum雑種栽培品種ＳＰ８０ １８４２の未成熟葉から単離された総ＲＮＡを用いるＲＴ−ＰＣＲによって得た。オリゴヌクレオチドSs2-ODD1as Fwd (配列番号3, CGCGGATCCGAACCTGCACCTCCCCGT)およびSs2-ODD1as Rev (配列番号4, CGGACTAGTCAGGCCAGGAGTGCCATC)は、Ss2-ODD1 EST (GenBank gi 35984354)の配列に基づいてデザインした。ＢａｍＨＩおよびＳｐｅＩ部位（下線部）を、それぞれプライマーSs2-ODD1as FwdおよびSs2-ODD1as Revにデザインした。増幅断片をpGEM-T Easy (Promega)にクローニングし、シークエンシングによって検証し、ＳｐｅＩおよびＢａｍＨＩを用いる消化によって摘出した。消化生成物をアガロースゲル電気泳動によって分離し、精製し、ｐＵＢＩのＡｖｒIIおよびＢａｍＨＩ部位でクローニングし(Christensen and Quail, Transgenic Res. 5: 213-218, 1996)、Ss2-ODD1断片をアンチセンス配向でトウモロコシ由来のポリユビキチン遺伝子ＵＢＩ−１プロモーターとAgrobacterium tumefaciens由来のノパリンシンターゼ遺伝子ＮＯＳ転写ターミネーターの間に配置した。生成する構築物を、シークエンシングによって検証した。この構築物をＨｉｎｄIIIで消化し、UBI-1::Ss2-ODD1as::NOSカセット（図３）を放出した。pBLUESCRIPT SK-でクローニングしたカセットUBI-1::Bar::NOS (Christensen and Quail, Transgenic Res. 5: 213-218, 1996)を、ＥａｒＩで消化することによって放出した（図３）。消化生成物をアガロースゲル電気泳動によって分離し、UBI-1::Ss2-ODD1as::NOSおよびUBI-1::Bar::NOSカセットに対応する断片を精製し、胚発生性のサトウキビ・カルス(sugarcane calli)形質転換に用いた。
【００９６】
実施例４：  サトウキビ形質転換
胚発生性カルス培養物を、Saccharum雑種栽培品種RB835486の頂端分裂組織および葉原基(primordial leaves)から定着させた。8週齢のカルスを、等モル濃度のUBI-1::Bar::NOSおよびUBI-1::Ss2-ODD1as::NOS発現カセット(10 μgDNA/3 mgパーティクル)を用いて上記のパーティクル衝撃によって形質転換した(Klein et al, Plant Physiol. 91: 440-444, 1989)。衝撃の後、カルスをホスフィノトリシン（ＰＰＴ）および１ｍｇ／Ｌベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）を含むＭＳ培地(Murashige and Skoog, Physiol Plant 15: 473-479, 1962)に導入し、非トランスジェニック組織の発生を阻止し、苗条再生を促進した。２週間後、カルスを、苗条伸張および根形成のための１ｍｇ／Ｌ ＰＰＴおよび１ｍｇ／Ｌインドール−３−酪酸（ＩＡＢ）を含むＭＳ培地に移した。２週間後、苗木をマゼンタボックス(magenta boxes)に入れて順化させ、２週間後、十分に発育した根を有する苗条（高さ１０〜１５ｃｍ）を鉢植え土壌に移し、温室に入れた。再生したトランスジェニック植物を、選択可能マーカー遺伝子（Ｂａｒ）およびUBI::Ss2-ODD1as::NOSトランスジーンの存在についてPCR分析により遺伝子型を分類した。組織培養した非トランスジェニックコントロールは、発現カセットによるパーティクル衝撃およびホスフィノトリシン選択を省いた以外は上記と同様にSaccharum雑種栽培品種RB835486の胚発生性カルスから植物を再生することによって得た。植物は、茎切断によって増やした。
【００９７】
実施例５：  UBI-1::Ss2-ODD1as::NOS植物における植物構造の変更
トランスジェニックサトウキビ植物におけるSs2-ODD1発現の減少効果を評価するため、UBI-1::Ss2-ODD1as::NOSとは独立したトランスジェニック事象およびサトウキビ品種RB835486の非トランスジェニック野生型植物を温室で評価した。植物（事象当たり１２反復試験区）を、５０Ｌポット中ココヤシ殻繊維基質で生育させた。植物を、栄養溶液で１日３回灌水した（総量１．５Ｌ）。植物当たり４個までの若木を発育させ、過剰の株は手で除去した。実生出現の７ヶ月後、灌水型を水道水による１日当たり３回（総量２５０ｍＬ）１４日間の灌水に変更し、成熟させた。それぞれの反復試験区からの２本の最も均質な若木を分析に選択し、その茎を最も古い節の下で切断した。最初の目に見える胸垂（dewlap）の下の８個の節間を同定し、茎を７番目と８番目の節間で切断し、茎の頂端部分を総ての葉と共に捨てた。茎の高さおよび重量、および節間数、幅および長さを測定した。総ての測定値に対する平均比較のための変動分析（ＡＮＯＶＡ）およびダンネット試験は、MINITAB Release 14で行った。
【００９８】
植物の完全な特性決定前の植物成長の段階中に、様々なUBI-1::Ss2-ODD1as::NOS事象は、非トランスジェニックコントロール栽培品種RB835486と比較してその大きさがかなり変った。実生出現の７ヶ月後に測定したところ、事象０６、０９、１２、１３、１４、１５、１８および２１は、非トランスジェニックコントロールと比較して高さが有意に増加した（図４）ことが明らかになった。事象０９、１３、１４および１５では、これは節間数が有意に増加したことによるものと思われ（図５）、一方、事象１２、１８および２１では、これは平均節間長さが有意に増加した結果と思われる（図６）。測定では、節間径が事象０６および２１で有意に増加していることも明らかになった（図７）。全般的な大きさが増加した結果、事象０６、０９および２１では、茎新鮮重量によって示されるようにバイオマスが有意に増加した（図８）。全体的に見て、Ss2-ODD1発現の減少は、大きさを増加させる植物構造における様々な程度の変化を引き起こすと思われる。
【００９９】
実施例６：  UBI-1::Ss2-ODD1as::NOS植物におけるスクロース収量の増加
トランスジェニックサトウキビ植物におけるSs2-ODD1発現減少の効果を評価するため、UBI-1::Ss2-ODD1as::NOSから独立したトランスジェニック事象およびサトウキビ品種RB835486の非トランスジェニック野生型植物を温室で評価した。植物（事象当たり１２反復試験区）を５０−Ｌポット中ココヤシ殻繊維基質で生育させた。植物を、栄養溶液で１日３回灌水した（総量１．５Ｌ）。植物当たり４個までの若木を発育させ、過剰の株は手で除去した。実生出現の７ヶ月後、灌水型を水道水による１日当たり３回（総量２５０ｍＬ）１４日間の灌水に変更し、成熟させた。それぞれの反復試験区からの２本の最も均質な若木を分析に選択し、その茎を最も古い節の下で切断した。最初の目に見える胸垂（dewlap）の下の８個の節間を同定し、茎を７番目と８番目の節間で切断し、茎の頂端部分を総ての葉と共に捨てた。適当な成熟誘導の評価のため、全可溶性固形物を携帯型Reichert Brix Scale Refractometerで測定し、８つの節間および終わりから３番目の節間について得られた値の比を計算した。比はいずれの場合にも８０％を上回っており、これは成熟の正の表示である。３ローラーの電動圧搾機を用いて、茎からジュースを抽出した。ジュースは、直ちにステンレススチール製篩で濾過した。ジュースの容積を測定し、これを再度１２０メッシュの篩で濾過した。ジュース中の総可溶性固形物およびスクロース濃度を、直ちに評価した。ジュースの総可溶性固形物は、Bellingham + Stanley RFM840 Digital Refractometerを用いる屈折率測定法によって測定した。水酸化カルシウム、塩化アルミニウム六水和物およびCeliteの混合物で透明にした後、ジュースのスクロース濃度をZeiss Polomat A偏光計により円複屈折を測定することによって評価した。ジュース中のスクロース濃度を、溶液１００ｍＬ当たりのスクロースのグラム数を示す％ＰＯＬとして表した。見かけの総スクロースは、ジュース容積にジュース中のスクロース濃度を掛けた積として計算した（ＰＯＬ）。平均比較のための変動分析（ＡＮＯＶＡ）およびダンネット試験は、MINITAB Release 14で行った。
【０１００】
事象０６および０９では、非トランスジェニックコントロール栽培品種RB835486に比較してジュース容積が有意に増加し（図９）、一方、事象１３、１４および２１では、ジュース中のスクロース濃度が有意に増加した（図１０）。スクロース収量に対する推計値として、見かけの総スクロースを計算した。この分析により、事象０９、１３、１４、２０および２１では、スクロース収量が有意に増加することが明らかになった（図１１）。従って、Ss2-ODD１発現の減少は、ジュース容積とスクロース濃度を変化させ、スクロース収量を増加させると思われる。
【０１０１】
実施例７：  UBI-1::Ss2-ODD1as::N0S植物におけるバイオマス収量の増加
トランスジェニックサトウキビ植物におけるSs2-ODD1発現の減少効果を評価するため、UBI-1::Ss2-ODD1as::NOSとは独立したトランスジェニック事象およびサトウキビ品種RB835486の非トランスジェニック野生型植物を温室で評価した。植物（事象当たり１２反復試験区）を、５０Ｌポット中ココヤシ殻繊維基質で生育させた。植物を、栄養溶液で１日３回灌水した（総量１．５Ｌ）。植物当たり４個までの若木を発育させ、過剰の株は手で除去した。実生出現の７ヶ月後、灌水型を水道水による１日当たり３回（総量２５０ｍＬ）１４日間の灌水に変更し、成熟させた。それぞれの反復試験区からの２本の最も均質な若木を分析に選択し、その茎を最も古い節の下で切断した。最初の目に見える胸垂（dewlap）の下の８個の節間を同定し、茎を７番目と８番目の節間で切断し、茎の頂端部分を総ての葉と共に捨てた。３ローラーの電動圧搾機を用いて、茎からジュースを抽出した。茎を圧搾してジュースを抽出した後、バガスの新鮮重量を高容量精度天秤で測定した。平均比較のための変動分析（ＡＮＯＶＡ）およびダンネット試験は、MINITAB Release 14で行った。
【０１０２】
この分析により、非トランスジェニックコントロールと比較して、事象９および２１ではバガスの新鮮重量の量が有意に増加し（図１２）、これらの事象はバイオマス収量を増加させたことが明らかになった。
【０１０３】
実施例８：  サトウキビ器官におけるSs2-ODD1転写産物の発現
Ss2-ODD1転写産物の空間的および時間的存在量を決定するため、野生型サトウキビ植物(栽培品種RB835486)の様々な器官から単離したＲＮＡを用いて定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を行った。最も若い葉の葉身、苗条頂部、葉＋４の葉身、葉＋４の葉鞘、節間＋４、最も古い緑葉の葉身、最も古い緑葉の葉鞘、最も古い緑葉に結合した節間、終わりから３番目の節間（頂部から基部まで）、および根を、８月齢の温室で生育させた植物から収穫した。葉＋４は、葉身接合部に明らかに目に見える胸垂（dewlap）を有する４番目に若い葉と定義される。総ての葉および根を、同じ栽培品種の３０ｃｍ丈の実生から収穫した。３種類の独立した８月齢植物、およびそれぞれ３種類の実生を含んでなる３種類のプールを、この分析に用いた。液体窒素で凍結した組織を乳鉢と乳棒で粉末状に粉砕し、総ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Invitrogen）を用いて製造業者の指示に従って単離した。総ＲＮＡをＤＮアーゼＩ（Promega）で処理し、ｃＤＮＡ第一鎖を総ＲＮＡ ２μｇを用いてSuperscript II Reverse Transcriptase (Invitrogen)で合成した。ｃＤＮＡの１０分の１を、５００ｎＭ濃度の遺伝子特異的プライマーとSYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)と組み合わせて用いた。ＰＣＲは、ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems)上で行った。Ss2-ODD1転写産物を増幅するため、オリゴヌクレオチドプライマーSs2-ODD1 Fwd (配列番号5, CAGTTGGTAAAGAGCGGTATTCGGTGGC)およびSs2-ODD1 Rev (配列番号6, CTTGATAGGTGGAAACCTTGGTGGACATGC)であって、Ss 2-ODD1コード配列（塩基対７７０−８８０）の３’末端でアニーリングするものを用いた。参照遺伝子として用いられるアクチン(SsACT; GenBank gi 53759188)を、オリゴヌクレオチドプライマーSsACT Fwd (配列番号7, AAGCAGCATGAAGATCAAGGTCGTTGCAC)およびSsACT Rev (配列番号8, CTGTGAACAATTGCCGGGCCAGACTC)であって、SsACT コード配列（塩基対９７２−１１２１）の３’末端でアニーリングするもので増幅した。増幅は、５０℃で２分間、９５℃で１０分間、および９５℃、１５秒間および６０℃、１分間で４５サイクル行った。増幅反応の特異性は、解離曲線の解析によって評価した。Ss2-ODD1およびSsACT増幅産物の量の比は、２−ΔΛＣｔ法を用いて計算した(Livak and Schmittgen, Methods 25: 402-408, 2001)。それぞれの反復試験区についての規格化発現レベルは、Ｌ＝２−ΔＣｔおよびΔＣＴ＝ＣＴ，Ｓｓ２−ＯＤＤ１−ＣＴ，ＳｓＡＣＴとして計算した。 SsACTの転写産物レベルに対するSs2-ODD1転写産物レベルは、それぞれの器官についての生物学的反復試験区として用いた３つの独立した試料から得た値の平均値として計算した。この解析の結果を、図１３に示す。
【０１０４】
Ss2-ODD1転写産物は分析を行った総ての器官で検出され、ＥＳＴｓライブラリーにおけるその低頻度に従ってＳｓＡＣＴ転写産物より遙かに少ない存在量であると思われ、低発現レベルを示唆した。Ss2-ODD1転写産物は、８月齢の植物の葉身で最も豊富であった。最高発現レベルは、最も古い緑葉の葉身に続いて葉＋４および最も若い葉の葉身で見られた。実生全葉は、中間的発現レベルを示した。より低い転写産物レベルは、８月齢植物の葉鞘、根、節間および苗条頂部に見られ、発現は実生根で最低となった。全般的発現パターンはSs2-ODD1がやや遍在発現を示すことを示唆しているが、積極的に光合成する葉におけるSs2-ODD1に対する機能を示唆している。
【０１０５】
実施例９：  Ss2-ODD1組換えタンパク質の精製およびポリクローナルSs2-ODD1の生成
UBI-1::Ss2-ODD1as::NOSトランスジーン由来のアンチセンス転写産物の発現は、Ss2-ODD1タンパク質存在量の減少を目的とするものであった。本発明者らは、UBI-1::Ss2-ODD1as::NOS事象および非トランスジェニックコントロールにおける免疫検出のための組換えSs2-ODD1タンパク質に対するポリクローナル抗体の産生について検討を行い、トランスジーン由来のアンチセンス転写産物がSs2-ODD1タンパク質の存在量を減少させるかどうかを実証した。
【０１０６】
完全長のSs2-ODD1 コード配列を、Ss2-ODD1 CDS Fwdプライマー(配列番号9, AGCATGGCAGGCAACCTGCACCTCCCCGTG)とSs2-ODD1 CDS Revプライマー(配列番号10, CTTATTTGTATGTCGAATTTATTCGCCCAACTACGTATTCCCCAC)を有するHiFi TaqDNAポリメラーゼ(Invitrogen)でサトウキビ(Saccharum雑種栽培品種RB835486)の葉から調製したｃＤＮＡから増幅した。生成する９３６ｂｐの増幅断片をpET SUMO (Invitrogen)中に製造業者の指示に従ってクローニングし、そのヌクレオチド配列をシークエンシングによって立証した。生成する構築物であるpET SUMO-Ss2-ODD1は、Ss2-ODD1のアミノ末端で融合したヘキサヒスチジンで標識した小ユビキチンモディファイアー(SUMO)ポリペプチドからなる融合タンパク質(SUMO-Ss2-ODD1)をコードする。セリンコドンを、Ss2-ODD1翻訳開始メチオニンコドンの前に前進オリゴヌクレオチドプライマーを介して付加し、SUMOプロテアーゼ(Invitrogen)で消化することによってSUMOの除去を促進した。pET SUMO-Ss2-ODD1をEscherichia coli CY(DE3) pLysS株で形質転換させ(Farah and Reinach, Biochemistry 38: 10543- 10551, 1999)、SUMO-Ss2-ODD1融合タンパク質の発現を、１ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを用いるO.D.６００〜０．５、３７℃で３時間の細胞培養物の誘導によって達成した。細胞を遠心分離によって集め、０．２ｍｇ／ｍＬリゾチームを補足したＰＢＳ ｐＨ７．２で氷上にてリーシスした後、音波処理した。溶解物を、１５，０００ｇで１５分間遠心分離して透明にした。１０ ｍＭイミダゾールを上清に加え、SUMO-Ss2-ODD1融合タンパク質を、１ｍＬ ＨｉＴｒａｐ ＨＰカラム(Amersham)上でＮｉ＋２に結合させた。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．２上で１０ｍＭイミダゾールで十分に洗浄した後、SUMO-Ss2-ODD1融合タンパク質をＰＢＳ ｐＨ７．２上で１０〜５００ｍＭイミダゾールグラディエントにて溶出した。本来のSs2-ODD1タンパク質を、SUMOプロテアーゼ(Invitrogen)にてアフィニティー精製したSUMO-Ss2-ODD1を開裂させることによって得て、２５℃で４時間SUMOプロテアーゼによる消化を行うこと以外は製造業者の指示に従って更に精製した。
【０１０７】
「本来のSs2-ODD1」（１５０μｇ）を、フロイントの完全アジュバントと共にウサギに投与した。Ｓs2-ODD1 １５０μｇとフロイントの不完全アジュバントを用いて、３回のブースト注射を行った。抗体は、Harlow and Laneによって報告された方法で粗製血清からアフィニティー精製した（「抗体: 実験室便覧(ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL)」, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, ニューヨーク, 1988）。ＩｇＧ濃縮画分は、５０％硫酸アンモニウムで飽和して沈澱させることによって粗製抗血清から得た。生成するペレットをＰＢＳ ｐＨ７．２に可溶化し、透析した。この画分を、構築物ｐＥＴ ＳＵＭＯ−ＣＡＴ（Invitrogen）から発現した結合したヘキサヒスチジンで標識したＳＵＭＯ−ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）融合タンパク質と共に１ｍＬ ＨｉＴｒａｐ ＨＰカラム（Amersham)上を４℃で一晩連続循環させることによって非Ss2-ODD1抗体を涸渇した。次いで、フロースルー画分を、共有結合したSUMO-Ss2-ODD1融合タンパク質と共に１ｍＬ ＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ活性化ＨＰカラム（GE Healthcare Bio-Sciences AB)上を４℃で一晩連続循環させた。抗体が吸着したカラムをＰＢＳ  ｐＨ７．２で十分に洗浄し、抗体を１００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭグリシン，ｐＨ２．４で溶出した。集めた画分を０．１容の２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０で直ちに中和し、多量のＩｇＧを含む画分をプールし、Centricon-10スピン・カートリッジ (Millipore)で濃縮した後、ＰＢＳ ｐＨ７．２による十分な緩衝液交換を行った。
【０１０８】
実施例１０：  UBI-1::Ss2-ODD1as::NOS事象および非トランスジェニックコントロールにおけるSs2-ODD1タンパク質レベル
組換えを行った本来のSs2-ODD1に対して生じたアフィニティー精製したポリクローナル抗体を用いて、UBI-1::Ss2-ODD1as::NOS事象および非トランスジェニックコントロール植物の器官におけるSs2-ODD1の免疫ブロット分析を行い、トランスジーン由来のアンチセンス転写産物がSs2-ODD1タンパク質存在量を減少させるかどうかを立証した。それぞれのトランスジェニック事象または野生型コントロールについて、葉＋４の葉身を８月齢の温室で生育させた植物から収穫した。葉＋４は、葉身接合部に明らかに目に見える胸垂（dewlap）を有する４番目に若い葉と定義される。
【０１０９】
収穫した植物材料を直ちに液体窒素で凍結させ、後で処理するために-80℃で保管し、液体窒素中で微細粉末状にホモジナイズし、円錐状の微小遠心分離管に移した。Complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail (Roche Diagnostics GmbH)を補足した氷冷抽出緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ６．８，５ｍＭ ＥＤＴＡ，０．１％ＳＤＳ，１７５ｍＭ β−メルカプトエタノール，１０％グリセロール）３容を粉砕した組織に加え、４℃にて２０分間一定攪拌下に保持した。ホモジェネートを１５，０００ｇで４℃にて１５分間遠心分離することによって透明にした。タンパク質濃度を、ＢＳＡを標準として用いるブラッドフォード分析法（Protein Assayキット, Bio-Rad）によって測定した。可溶性タンパク質抽出物（５０μｇ）を１２．５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＴＧＭ緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ，１９２ｍＭグリシン，２０％メタノール）中１５０ボルトｘ時でタンク・トランスファー・システム（tank transfer system; Mini Trans-Blot Cell, Bio-Rad)中ポリビニリデンジフルオリド膜(Hybond-P PVDF, Amersham)上にブロットした。膜を９％無脂肪乳固形物／ＴＢＳＴ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０）でブロックし、ＴＢＳＴ中１：１，０００の希釈倍率のアフィニティー精製した抗体と共に室温で一晩インキュベーションした。膜をＴＢＳＴで１０分間３回洗浄し、ＴＢＳＴ中西洋ワサビペルオキシダーゼ（GE Healthcare Bio-Sciences AB）に接合したロバ抗ウサギＩｇＧの１：１０，０００の希釈液で室温にて１．５時間インキュベーションした。次に、膜をＴＢＳＴで３回洗浄し、ECL Plus (GE Healthcare Bio-Sciences AB)で展開した後、ラジオグラフィーフィルム(Hyperfilm ECL; GE Healthcare Bio- Sciences AB)に様々な時間間隔で暴露した。
【０１１０】
アフィニティー精製した抗体を用いて、Ss2-ODD1を、組換えした本来のSs2-ODD1タンパク質に大きさが相当する葉＋４の葉身から調製した抽出物中で約３４ｋＤのポリペプチドとして検出した（図１４）。事象９、１４および２１由来の葉＋４の葉身では、野生型コントロールと比較してSs2-ODD1タンパク質の量が様々な程度で減少した（図１４）。観察された差は、Ss2-ODD1タンパク質発現の部分的減少からほぼ完全な停止にまで及んだ。Ss2-ODD1タンパク質は事象１４ではほとんど検出されず、Ss2-ODD1アンチセンス転写産物の発現によりSs2-ODD1タンパク質発現が劇的に減少したことを示していた。事象９および２１では、Ss2-ODD1タンパク質レベルは事象１４と野生型コントロールで観察されたものの中間であった。事象９は、明らかに分析を行った事象中ではSs2-ODD1タンパク質レベルの減少が最も少なかった。
【０１１１】
葉＋４の葉身におけるSs2-ODD1タンパク質レベルの減少は、分析を行ったUBI-1::Ss2-ODD1as::NOSで観察された明示された表現型とは余り相関していなかった。事象依存性であること以外にも、Ss2-ODD1タンパク質レベルの減少範囲は様々な器官で変化する可能性があり、表現型は葉＋４の葉身以外の器官におけるSs2-ODD1の存在量の変化と最もよく相関する。また、Ss2-ODD1タンパク質レベルの変化を最適に調節して、最も良好な表現型効果が得られるようにしなければならないことも起こり得る。
【図１】
2010507374.tif 000003
【図２】
2010507374.tif 000004
【図３】
2010507374.tif 000005
【図４】
2010507374.tif 000006
【図５】
2010507374.tif 000007
【図６】
2010507374.tif 000008
【図７】
2010507374.tif 000009
【図８】
2010507374.tif 000010
【図９】
2010507374.tif 000011
【図１０】
2010507374.tif 000012
【図１１】
2010507374.tif 000013
【図１２】
2010507374.tif 000014
【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年7月3日(2009.7.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
【図１】図は、Ss2-ODD1、Oryza sativa（イネ）、Sorghum bicolor（モロコシ）およびZea mays（トウモロコシ）由来のその緊密な同族体、および植物第一鉄依存性ジオキシゲナーゼにおける機能的アミノ酸残基の保存を示す（記載の順にそれぞれ、配列番号１１〜６１）。残基の番号は、Streptomyces jumonjinensis由来のイソペニシリンNシンターゼ（ＩＰＮＳ）タンパク質に基づいた。この配列は、非ヘムＦｅ（II）依存性ジオキシゲナーゼには共通の鉄結合モティーフＨｉｓ−Ｘ−Ａｓｐ（５３−５７）Ｘ−Ｈｉｓ（陰影部）を含む保存された残基（下線部）を示す（Kreisberg-Zakarin et al., Antonie Van Leeuwenhoek 75: 33-39, 1999)。これらの保存された残基は、活性部位における鉄結合に必要であると考えられる(Borovok et al, Biochemistry 35: 1981-1987, 1996)。Ss, Saccharum species（サトウキビ類）; Sb, Sorghum bicolor; Zm, Zea mays; ORYSA, Oryza sativa; ARATH, Arabidopsis thaliana（シロイヌナズナ）; CUCMA, Cucurbita maxima（セイヨウカボチャ）; STRJU, Streptomyces jumonjinensis; PETHY, Petuniahybrida（ペチュニア）; GARPE, garden petunia（ツクバネアサガオ）; ２−ＯＤＤ１，２−オキソ酸依存性ジオキシゲナーゼ； ＧＡ２，ジベレリン２β−ヒドロキシラーゼ； ＧＡ２０，ジベレリン２０−オキシダーゼ； ＧＡ３，ジベレリン３β−ヒドロキシラーゼ； ＧＡ７，ジベレリン７−オキシダーゼ； Ａ２，Ａ２遺伝子； ＬＤＯＸ，ロイコアントシアニジンジオキシゲナーゼ； ＦＬＳ，フラボノールシンターゼ； ＦＬ３Ｈ，フラバノン３β−ヒドロキシラーゼ； ２Ａ６，２Ａ６遺伝子。
【図２】図は、高等植物2-ODDsの系統発生分析を示す。主要な2-ODDs型の高等植物標本のアミノ酸配列を、BLOSUMマトリックスを用いてClustalアルゴリズムで整列した。系統発生の再構築は、ブートストラッピング（１，０００リサンプリング）によって評価した系統発生樹の節の頑健性を有するNeighbor-Joining法(NJ)によってMEGAバージョン3.1 (Kumar et al, Brief Bioinform. 5: 150-163, 2004) で得た。ブートストラップ値が５０より大きいものを示す。GenBank giまたはTIGR TC番号を配列名の後に付けている。Ss2-ODD1は、四角で囲われている。Arabidopsis thaliana (GA5, GA4)、Oryza sativa (Dl 8, SEMIDWARF 1)およびPisum sativum （エンドウ）(SLENDER)の対応する特性決定したジベレリン酸オキシダーゼ突然変異体を有するタンパク質が示唆されている。種およびタンパク質名は、次のように省略される: At, Arabidopsis thaliana; Cm, Cucurbita maxima; Cr, Capsella rubella（ルベラナズナ）; Cro, Catharanthus roseus（ニチニチソウ）; Hv, Hordeum vulgare（オオムギ）; Hn, Hyoscyamus niger（ヒヨス）; Le, Lycopersicum esculentum（トマト）; Mm, Marah macrocarpus（野生種キュウリ）; Ms, Medicago sativa（アルファルファ）; Mt, Medicago truncatula（タルウマゴヤシ）; Nt; Nicotiana tabacum（タバコ）; Os, Oryza sativa; Ps, Pisum sativum; Pt, Petunia x hybroda（ペチュニア）; St, Solanum tuberosum（ジャガイモ）; Sb, Sorghum bicolor; Ss, Saccharum species; Zm, Zea mays; A2, アントシアニン生合成に影響するＡ２座によってコードされたタンパク質； ＡＣＣＯ，１−アミノシクロプロパン−１−カルボキシレートオキシダーゼ； ＡＮＳ，アントシアニジンシンターゼ； ＣＦＩ，カルコン−フラバノンイソメラーゼ； ＤＶ４Ｈ，デスアセトキシビンドリン４−ヒドロキシラーゼ； Ｅ８，１−アミノシクロプロパン−１−カルボキシレートオキシダーゼ同族体（タンパク質Ｅ８）； Ｆ３Ｈ，フラバノン−３−ヒドロキシラーゼ； ＦＬＳ，フラボノールシンターゼ； ＧＡｏｘｉ，ジベレリン酸オキシダーゼ； Ｈ６Ｈ，ヒヨスチアミン６−ジオキシゲナーゼ； ＩＤＳ２，鉄欠乏性特異的−２ (iron deficiency specific-2)； ＬＤＯＸ，ロイコアントシアニジンジオキシゲナーゼ； Ｐ４Ｈ，プロリル４−ヒドロキシラーゼ； ＳＲＧ１，成長を阻止した Arabidopsis thaliana細胞で発現したコード化転写産物。
【図３】UBI-1::Ss2-ODD1as::NOSおよびUBI-1::Bar::NOSカセットの模式的表現。最初のクローニングベクターからカセットを放出するのに用いたエンドヌクレアーゼ(EarIおよびHindIII)を示す。
【図４】選択されたUBI-1::Ss2-ODD1as::NOS事象および非トランスジェニックコントロール栽培品種RB835486の高さ。2本の茎の高さは、茎の頂端部分を除いた後にそれぞれの試料 (n=12) について測定した。2個の星印は、99%の信頼度でダンネット法によって測定した栽培品種RB835486非トランスジェニックコントロール(C)とは有意に異なる事象を示す。誤差のバーは、平均値の標準偏差を示す。
【図５】選択されたUBI-1::Ss2-ODD1as::NOS事象および非トランスジェニックコントロール栽培品種RB835486の節間数。2本の茎の節間数は、頂端部分を除いた後にそれぞれの試料 (n=12) について測定した。2個の星印は、99%の信頼度でダンネット法によって測定した栽培品種RB835486非トランスジェニックコントロール(C)とは有意に異なる事象を示す。誤差のバーは、平均値の標準偏差を示す。
【図６】選択されたUBI-1::Ss2-ODD1as::NOS事象および非トランスジェニックコントロール栽培品種RB835486の平均節間長。2本の茎の総ての節間の長さは、頂端部を除いた後にそれぞれの試料(n=12)について測定した。2個の星印は、99%の信頼度でダンネット法によって測定した栽培品種RB835486非トランスジェニックコントロール(C)とは有意に異なる事象を示す。誤差のバーは、平均値の標準偏差を示す。
【図７】選択されたUBI-1::Ss2-ODD1as::NOS事象および非トランスジェニックコントロール栽培品種RB835486の平均節間径。2本の茎節間径は、頂端部分を除いた後にそれぞれの試料(n=12)について測定した。2個の星印は、99%の信頼度でダンネット法によって測定した栽培品種RB835486非トランスジェニックコントロール(C)とは有意に異なる事象を示す。誤差のバーは、平均値の標準偏差を示す。
【図８】選択されたUBI-1::Ss2-ODD1as::NOS事象および非トランスジェニックコントロール栽培品種RB835486の茎の新鮮重量。 Fresh重量 of2本の合わせた茎の新鮮重量は、頂端部分を除いた後にそれぞれの試料(n=12)について測定した。2個の星印は、99%の信頼度でダンネット法によって測定した栽培品種RB835486非トランスジェニックコントロール(C)とは有意に異なる事象を示す。誤差のバーは、平均値の標準偏差を示す。
【図９】選択されたUBI-1::Ss2-ODD1as::NOS事象および非トランスジェニックコントロール栽培品種RB835486のジュース容積。2本の合わせた茎から抽出したジュース容積は、頂端部分を除いた後に試料 (n=12)について測定した。2個の星印は、99%の信頼度でダンネット法によって測定した栽培品種RB835486非トランスジェニックコントロール(C)とは有意に異なる事象を示す。誤差のバーは、平均値の標準偏差を示す。
【図１０】選択されたUBI-1::Ss2-ODD1as::NOS事象および非トランスジェニックコントロール栽培品種RB835486のPOL。2本の合わせた茎から抽出したジュースのPOLは、頂端部分を除いた後にそれぞれの試料(n=12)について測定した。2個の星印は、99%の信頼度でダンネット法によって測定した栽培品種RB835486非トランスジェニックコントロール(C)とは有意に異なる事象を示す。誤差のバーは、平均値の標準偏差を示す。
【図１１】選択されたUBI-1::Ss2-ODD1as::NOS事象および非トランスジェニックコントロール栽培品種RB835486のスクロース収量。スクロース収量は、頂端部分を除いた後にそれぞれの試料(n=12)について2本の合わせた茎からの総ジュース容積とそのスクロース濃度の積として計算した。2個の星印は、99%の信頼度でダンネット法によって測定した栽培品種RB835486非トランスジェニックコントロール(C)とは有意に異なる事象を示す。誤差のバーは、平均値の標準偏差を示す。
【図１２】選択されたUBI-1::Ss2-ODD1as::NOS事象および非トランスジェニックコントロール栽培品種RB835486のバガスの新鮮重量。2本の合わせた茎のバガス新鮮重量は、頂端部分を除いた後にそれぞれの試料(n=12)について測定した。2個の星印は、99%の信頼度でダンネット法によって測定した栽培品種RB835486非トランスジェニックコントロール(C)とは有意に異なる事象を示す。誤差のバーは、平均値の標準偏差を示す。
【図１３】定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (qRT-PCR)によって測定した野生型サトウキビ器官におけるSs2-ODD1転写産物の発現。定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (qRT-PCR)は、野生型サトウキビ植物 (栽培品種RB835486)の様々な器官から単離したRNAを用いて行った。ACTIN (ACT)に対するSs2-ODD1転写産物の存在量は、ΔCT値として表される。バーは、3回の独立した反復試験区からの平均値を示す。誤差バーは、平均値の標準偏差を示す。
【図１４】選択されたUBI-1::Ss2-ODD1as::NOS事象および野生型サトウキビ栽培品種RB835486コントロールの葉+4におけるSs2-ODD1タンパク質レベル。抽出物は、栽培品種RB835486の野生型植物(C)と事象09、14および21から収穫した葉＋４の葉身から調製した。組換えSs2-ODD1 (rSs2-ODD1) 0.5 ngを含む葉のタンパク質抽出物（５０μｇ）は、SDS-PAGEによって分離した。免疫ブロッティングは、Ss2-ODD1アフィニティー精製した抗体(上パネル)。矢じり型のものは、Ss2-ODD1タンパク質を示す。星印は、ローディングコントロールとして示された葉の抽出物における非特異的交差反応性ポリペプチドを示す。分子量はkDaで表した右側(MW)に示されている。移動後にクーマシーブルーで染色したゲルを、ローディングコントロールとして示す(下パネル)。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０６】
完全長のSs2-ODD1 コード配列を、Ss2-ODD1 CDS Fwdプライマー(配列番号9, AGCATGGCAGGCAACCTGCACCTCCCCGTG)とSs2-ODD1 CDS Revプライマー(配列番号10, CTTATTTGTATGTCGAATTTATTCGCCCAACTACGTATTCCCCAC)を有するHiFi TaqDNAポリメラーゼ(Invitrogen)でサトウキビ(Saccharum雑種栽培品種RB835486)の葉から調製したｃＤＮＡから増幅した。生成する９３６ｂｐの増幅断片をpET SUMO (Invitrogen)中に製造業者の指示に従ってクローニングし、そのヌクレオチド配列をシークエンシングによって立証した。生成する構築物であるpET SUMO-Ss2-ODD1は、Ss2-ODD1のアミノ末端で融合したヘキサヒスチジン（配列番号６２）で標識した小ユビキチンモディファイアー(SUMO)ポリペプチドからなる融合タンパク質(SUMO-Ss2-ODD1)をコードする。セリンコドンを、Ss2-ODD1翻訳開始メチオニンコドンの前に前進オリゴヌクレオチドプライマーを介して付加し、SUMOプロテアーゼ(Invitrogen)で消化することによってSUMOの除去を促進した。pET SUMO-Ss2-ODD1をEscherichia coli CY(DE3) pLysS株で形質転換させ(Farah and Reinach, Biochemistry 38: 10543- 10551, 1999)、SUMO-Ss2-ODD1融合タンパク質の発現を、１ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを用いるO.D.６００〜０．５、３７℃で３時間の細胞培養物の誘導によって達成した。細胞を遠心分離によって集め、０．２ｍｇ／ｍＬリゾチームを補足したＰＢＳ ｐＨ７．２で氷上にてリーシスした後、音波処理した。溶解物を、１５，０００ｇで１５分間遠心分離して透明にした。１０ ｍＭイミダゾールを上清に加え、SUMO-Ss2-ODD1融合タンパク質を、１ｍＬ ＨｉＴｒａｐ ＨＰカラム(Amersham)上でＮｉ＋２に結合させた。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．２上で１０ｍＭイミダゾールで十分に洗浄した後、SUMO-Ss2-ODD1融合タンパク質をＰＢＳ ｐＨ７．２上で１０〜５００ｍＭイミダゾールグラディエントにて溶出した。本来のSs2-ODD1タンパク質を、SUMOプロテアーゼ(Invitrogen)にてアフィニティー精製したSUMO-Ss2-ODD1を開裂させることによって得て、２５℃で４時間SUMOプロテアーゼによる消化を行うこと以外は製造業者の指示に従って更に精製した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０７】
「本来のSs2-ODD1」（１５０μｇ）を、フロイントの完全アジュバントと共にウサギに投与した。Ｓs2-ODD1 １５０μｇとフロイントの不完全アジュバントを用いて、３回のブースト注射を行った。抗体は、Harlow and Laneによって報告された方法で粗製血清からアフィニティー精製した（「抗体: 実験室便覧(ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL)」, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, ニューヨーク, 1988）。ＩｇＧ濃縮画分は、５０％硫酸アンモニウムで飽和して沈澱させることによって粗製抗血清から得た。生成するペレットをＰＢＳ ｐＨ７．２に可溶化し、透析した。この画分を、構築物ｐＥＴ ＳＵＭＯ−ＣＡＴ（Invitrogen）から発現した結合したヘキサヒスチジン（配列番号６２）で標識したＳＵＭＯ−ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）融合タンパク質と共に１ｍＬ ＨｉＴｒａｐ ＨＰカラム（Amersham)上を４℃で一晩連続循環させることによって非Ss2-ODD1抗体を涸渇した。次いで、フロースルー画分を、共有結合したSUMO-Ss2-ODD1融合タンパク質と共に１ｍＬ ＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ活性化ＨＰカラム（GE Healthcare Bio-Sciences AB)上を４℃で一晩連続循環させた。抗体が吸着したカラムをＰＢＳ  ｐＨ７．２で十分に洗浄し、抗体を１００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭグリシン，ｐＨ２．４で溶出した。集めた画分を０．１容の２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０で直ちに中和し、多量のＩｇＧを含む画分をプールし、Centricon-10スピン・カートリッジ (Millipore)で濃縮した後、ＰＢＳ ｐＨ７．２による十分な緩衝液交換を行った。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2010507374000001.app
【国際調査報告】
2010507374.tif 000017
2010507374.tif 000018