(57)【要約】  アクアポリンチャネルをアゴナイズまたはアンタゴナイズする、３−カルボキシアリールスルホンアミド化合物を含む化合物、および、それらを使用して、アクアポリンが介在する疾患または疾病を治療する方法。【選択図】図１
2010508300.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下式（Ｉ）−（ＩＶ）のいずれか１つの化合物またはその医薬的に許容可能な塩：
【化１】
2010508300.tif 000206
【化２】
2010508300.tif 000207
ここにおいて、
Ｂは、−ＯＨ、−ＯＲ、−ＯＣＨＲ１ＯＣＯＲ２またはＮＲ１Ｒ２であり；
Ｘ、ＹおよびＺは、独立に、水素、ハロゲン、−ＯＨ、−ＯＲ、−ＮＨＲ、−ＮＨＣＯＲ、−ＮＨＳＯ２Ｒ、−ＳＲ、−ＳＯＲまたは−ＳＯ２Ｒから成る群から選択され；
ここにおいて、Ｒは、
（ａ）直鎖または分枝鎖Ｃ１−Ｃ６アルキル；
（ｂ）ハロゲン、トリハロメタン、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、Ｎ−アルキルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノ、アルキルカルバモイル、アリールカルバモイル、アミノカルバモイル、Ｎ−アルキル−またはＮ，Ｎ−ジアルキルアミノカルバモイル、アルキルスルホニルアミノ、アリールスルホニルアミノ、カルボキシ、カルボキシアルキル、Ｎ−アルキルカルボキサミド、Ｎ，Ｎ−ジアルキルカルボキサミド、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、トリフルオロメチルスルホニルアミノ、アリールチオ、アリールスルフィニル、アリールスルホニル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アリールオキシアルキル、アミノアルキル、Ｎ−アルキルアミノアルキル、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノアルキル、アルキルカルバモイルアルキル、アリールカルバモイルアルキル、アミノカルバモイルアルキル、Ｎ−アルキルアミノカルバモイルアルキル、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノカルバモイルアルキル、アルキルスルホニルアミノアルキル、アリールスルホニルアミノアルキルから成る群の少なくとも１つのメンバーによって、置換されていない、または置換された、アリールまたはアリールＣ１−Ｃ６アルキル；
（ｃ）ハロゲン、トリハロメタン、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、Ｎ−アルキルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノ、アルキルカルバモイル、アリールカルバモイル、アミノカルバモイル、Ｎ−アルキル−またはＮ，Ｎ−ジアルキルアミノカルバモイル、アルキルスルホニルアミノ、アリールスルホニルアミノ、カルボキシ、カルボキシアルキル、Ｎ−アルキルカルボキサミド、Ｎ，Ｎ−ジアルキルカルボキサミド、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、トリフルオロメチルスルホニルアミノ、アリールチオ、アリールスルフィニル、アリールスルホニル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アリールオキシアルキル、アミノアルキル、Ｎ−アルキルアミノアルキル、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノアルキル、アルキルカルバモイルアルキル、アリールカルバモイルアルキル、アミノカルバモイルアルキル、Ｎ−アルキルアミノカルバモイルアルキル、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノカルバモイルアルキル、アルキルスルホニルアミノアルキル、アリールスルホニルアミノアルキル、アルキルカルボキシ、アルキルカルボキシアルキル、Ｎ−アルキルカルボキサミドアルキル、Ｎ，Ｎ−ジアルキルカルボキサミドアルキル、アルキルチオアルキル、アルキルスルフィニルアルキル、アルキルスルホニルアルキル、トリフルオロメチルスルホニルアミノアルキル、アリールチオアルキル、アリールスルフィニルアルキルおよびアリールスルホニルアルキルから成る群の少なくとも１つのメンバーによって、置換されていない、または置換された、ヘテロアリールまたはヘテロアリールＣ１またはＣ６アルキル
から成る群の１つのメンバーであり；および
Ｒ１およびＲ２は、以下である：
（ａ）独立に、水素または任意に置換された直鎖または分枝鎖Ｃ１−Ｃ６アルキル；
（ｂ）式−（ＣＨ２）ｎＣＨＲ−Ｑまたは−ＣＨＲ（ＣＨ２）ｎ−Ｑの群、ここにおいて、ｎ＝０−２であり、Ｑは、アリール、ヘテロアリール、−ＣＦ３、−ＣＨ２ＯＨ、−ＯＲ３、−ＣＨ２ＮＨＣＯＲ３、−ＣＨ２ＮＨＳ（Ｏ）２Ｒ３、−ＳＲ３、−Ｓ（Ｏ）Ｒ３、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ３から選択され；および、Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６直鎖または分枝鎖アルキル、アリールＣ０−Ｃ３アルキル−、ヘテロアリールＣ０−Ｃ３アルキル−のいずれかであってよい；
（ｃ）式−ＣＨ２ＣＨＲ−Ｑまたは−ＣＨＲＣＨ２−Ｑの群、ここにおいて、ｎ＝０−２であり、Ｑは−ＮＨＣＯＮＲ３Ｒ４または−ＮＲ３Ｒ４であり、ここにおいてＲ３およびＲ４は、独立に、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６直鎖または分枝鎖アルキル、アリール、ヘテロアリール、アリールＣ１−Ｃ３アルキル、ヘテロアリールＣ１−Ｃ３アルキルであり、または、ともに以下の環を形成する：
【化３】
2010508300.tif 000208
ここにおいて、
Ａは、−（ＣＨ２）ｎ−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−（ＣＨ２）ｎＣＯ−、−（ＣＨ２）ｎＯ−、−（ＣＨ２）ｎＳＯｍ−、または−（ＣＨ２）ｎＮＲ−および−ＮＲＣＯ−から成る群から選択され、ｎおよびｍは独立に０から２の間の整数であり、および、Ｒは前記の定義のとおりであり、
Ｄは−（ＣＨ２）ｎ−であり、ｎは０から２の間の整数であり、
ＥおよびＦは、独立に、ｎが０から２の間の整数である−（ＣＨ２）ｎ−であり；または、置換されたまたは置換されていない隣接して結合するアリール−またはヘテロアリール−環構造である；
（ｄ）それらが結合する窒素原子とともに、置換されたまたは置換されていない５−７員ヘテロシクロアルキルを形成し、前記ヘテロシクロアルキルは、環構造内部に、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−ＮＨ−、−ＮＲ−、−ＮＣＯＲ−、−ＮＳＯ２Ｒ−といった基を含むヘテロ原子を含んでよく、任意に置換されたまたは置換されていないアリールまたはヘテロアリール基に融合されており、および、Ｒは前記の定義のとおりであり；ここにおいて、式（ＩＶ）のＷはＳ、Ｏ、ＮＲであり、ここにおいて、ＲはＨ、アルキルまたはアリールアルキルである。
【請求項２】
式（Ｉ）を有し、Ｘが水素である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
式（Ｉ）を有し、Ｙが−ＮＨＲである、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
ＺがＯＲである、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ１およびＲ２が水素である、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
Ｂが−ＯＲであり、Ｒが、任意に、−ＣＨＲ１−Ｏ−ＣＯＲ２、または、−ＮＨ（ＣＨ２）２−モルフォリノである、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
Ｂが−ＮＲ１Ｒ２である、請求項５に記載の化合物。
【請求項８】
Ｘが−ＯＲである、請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
Ｙが水素である、請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｚがハロゲンである、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ１およびＲ２が水素である、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｂが−ＯＲである、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｂが−ＮＲ１Ｒ２である、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１４】
式（Ｉ）を有する請求項１に記載の化合物。
【請求項１５】
式（ＩＩ）を有する請求項１に記載の化合物。
【請求項１６】
式（ＩＩＩ）を有する請求項１に記載の化合物。
【請求項１７】
式（ＩＶ）を有する請求項１に記載の化合物。
【請求項１８】
請求項１に記載の化合物、および、医薬的に許容可能な希釈剤、担体または賦形剤を含む組成物。
【請求項１９】
アクアポリンによってまたはアクアポリンの異常な発現によって仲介される疾病または障害を患う患者を治療する方法であって、浮腫を減少させるためにまたは体液平衡異常を調節するために有効な量で、請求項１に記載の化合物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む方法。
【請求項２０】
前記疾病または障害が、浮腫、脳損傷、頭部外傷、眼障害、肺疾患、肺の疾病、脈管疾患、腎臓病、重金属毒性、アルツハイマー病、腫瘍および癌から成る群から選択される請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞膜におけるアクアポリンチャネルによる水の輸送を修飾する化合物、および、アクアポリン活性に関与する疾病および障害を治療するためのこれらの化合物の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本願は、合衆国法典第３５巻第１１９条（ｅ）および第１２０条の下、２００６年１０月２６日出願の米国仮出願第６０／８５４，６１８号の優先権を主張する。当該出願の全体は、本願に援用される。
【０００３】
本願は、国立衛生研究所により、契約番号Ｒ０１  ＧＭ０５９９８６およびＲ０１  ＮＲ００５２０８として認可された政府援助を受けている。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００４】
アクアポリン（ＡＱＰ）は、原核生物および真核生物にて見つかる多様な膜タンパク質のファミリーを意味する(Reizer et al., 1993; Hohmann et al., 2000; King et al., 2004)。アクアポリンチャネルは、水の膜内外の拡散(Agre et al., 1993)並びにイオン、ガスおよび小さな有機化合物を含むその他の分子の拡散(Yool and Stamer, 2002)の促進に周知の役割を有する。アクアポリンは、主要固有タンパク質（ｍａｊｏｒ  ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＭＩＰ）遺伝子ファミリーのメンバーによってコードされる。哺乳動物において、組織特異的な発現のパターンを示す、少なくとも１２のクラスのアクアポリン（ＡＱＰ０からＡＱＰ１１）が存在する(Nielsen et al., 2002)。アクアポリンチャネルは、様々な生理学的プロセスにおいて役割を果たし、水の平衡異常に関する病態生理学的症状に関連する。
【０００５】
ＡＱＰ１は、広範に発現する水チャネルであり、近位尿細管、ヘンレ係蹄の下行脚の基底外側および頂端側の細胞膜において、および、腎臓の直細血管の下行性の部分において見つかる。さらに、それは、赤血球、血管内皮、胃腸管、汗腺および肺に存在する。
【０００６】
ＡＱＰ４は、中枢神経系の全体にわたって多く発現され、そこでは、血管を囲み、脳血液関門の完全性を維持する星状膠細胞の血管周囲のエンドフィートに集中しており、このことは、脳水平衡（ｂｒａｉｎ  ｗａｔｅｒ  ｂａｌａｎｃｅ）の調節に重要な役割を有することを示唆している(Nagelhus et al., 1998; Rash et al., 1998)。アストログリアのエンドフィートにおいて、ＡＱＰ４は、Ｋｉｒ１．４（内部への整流）およびＫＣａ（Ｃａ＋２活性型）カリウムチャネルと共局在する。ＡＱＰ４は、塩および水浸入を制御するタンパク質の複雑な集合体の一部である可能性がある(Price et al., 2002)。プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性化は、ＡＱＰ４のセリン１８０におけるリン酸化を刺激し(Zelenina et al., 2002)、透水性の用量依存的抑制を引き起こす。ＡＱＰ４発現のレベルはまた、プロテインキナーゼＣ(Yamamoto et al., 2001; (Han et al., 1998))、ブラジキニン (Monti et al., 2001)、バソプレッシン(Niermann et al., 2001)および虚血関連遺伝子(Nicchia et al., 2003)に影響を受け、腫瘍関連反応性アストロサイトにおいて強くアップレギュレートされる(Saadoun et al., 2002)。
【０００７】
Ｖｅｒｋｍａｎらは、野生型（＋／＋）マウスおよびＡＱＰ４ノックアウト（−／−）マウスにおいて、水中毒および持続的脳卒中の効果を比較した(Manley et al., 2000) 。水中毒は、マウスに、体重の２０％と等しい蒸留水を腹腔内に注射することで行われた。結果は、死、観察される神経学的障害、および脳超微細構造の電子顕微鏡分析に着目された。１０の任意に選択された顕微鏡写真図におけるアストロサイトのエンドフィートの領域が、野生型およびＡＱＰ４欠損マウスにて測定された。ＡＱＰ４−／−マウスにおける脳組織のより低い含水量およびアストロサイトの膨潤の低下は、神経学的障害のスコアの改善およびＡＱＰ４＋／＋マウスと比較して実質的に良好な生存と一致した。
【０００８】
持続性の中大脳動脈（ＭＣＡ）閉塞もまた、ＡＱＰ＋／＋およびＡＱＰ４−／−マウスにて試験された（１群当たりｎ＝１０）。２４時間後における測定された結果は、半球サイズおよび神経学的障害だった（図１）。野生型において、脳浮腫から著しく大きな半球状拡大（ｈｅｍｉｓｐｈｅｒｉｃ  ｅｎｌａｒｇｅｍｅｎｔ）が生じた（図１Ａ）。ＡＱＰ４＋／＋マウスは、また、ＡＱＰ４−／−マウスと比較して、神経学的障害スコアが著しく高かった（より悪かった）（図１Ｂ）。Ｍａｎｌｅｙらは、ＡＱＰ４欠損マウスにおける脳浮腫の縮小は、「ＡＱＰ４水チャネルは創薬の潜在的なターゲットである」ことを示していると提唱した。
【０００９】
ＡＱＰ９はまた、脳浮腫に影響を及ぼすかもしれない。それは、水および小さな溶質（尿素、グリセリン）に対して透過性を示し、脳の膠細胞並びに肝臓、脾臓およびその他の器官にて発現する(Badaut et al., 2001; Badaut et al., 2002; Elkjaer et al., 2000; Nicchia et al., 2001)。ＡＱＰ９は、脳の血管および体液のコンパートメントに接するアストロサイトの細胞体および突起に存在する。ＡＱＰ４とは対照的に、ＡＱＰ９の染色はアストロサイトのエンドフィートにて極性を示さない(Badaut et al., 2004)。
【００１０】
浮腫は、いくつかの神経学的な症状または肺の症状を含む多くの臨床症状に起因する。主要な未解決の医学的必要性は、脳卒中に関連した浮腫の治療である。３番目の死の主要原因である脳卒中は、毎年アメリカにおいて７００，０００人を超える人々に影響する壊滅的な疾病である。脳浮腫の程度は、脳卒中の事象後における患者の生存にとって主要な決定要素である(Dirnagl et al., 1999; Taylor et al., 1996)。中大脳動脈閉塞による進行性浮腫では、死亡率は８０％に達する(Ayata and Ropper, 2002)。浮腫を発症する虚血性の脳組織の傾向は、大きな梗塞を（特に、全脳卒中の１５−２０％に関して、中大脳動脈領域および小脳の内部に）有した患者において、主要な死因となっている(Hacke et al., 1996)。先行技術において認識された重要な問題は、浮腫の経過における介在のための分子ターゲットの同定であった。しかしながら、虚血性の脳浮腫の処置にとって臨床的に許容できる戦略は達成できないままであり、利用可能な治療は、しばしば重い浮腫を有した患者にとって限られた価値しかなかった。
【００１１】
脳浮腫は、血管原性（脳血液関門を通過する水および溶質の移動）、または細胞障害性（影響を受けた領域における細胞の浸透の膨潤）として分類される(Fishman, 1975; Klatzo, 1967)。細胞障害性浮腫は初期の梗塞サイズと関連し、血管原性浮腫は、脳腫脹の遅延型のリスク傾向の過程に寄与する（図２）。アストロサイトは両過程に役割を果たす。アブルミナル毛細管表面（abluminal capillary surface）をカバーするアストロサイトエンドフィートは、脳血液関門をつくる内皮細胞間の細胞間タイトジャンクションの保全を促進する(Huber et al., 2001)。虚血後の脳血液関門の破壊は、変更された輸送、傍細胞経路の開始およびアストロサイト−内皮細胞間のジャンクションの物理的な破壊に関与する(Sun and O'Donnell, 1996; Venero et al., 2001)。毛細血管周囲のアストロサイトエンドフィートは、脳虚血の際に膨張する最初の細胞要素であり(Dodson et al., 1977)、細胞外のＫ＋、Ｃｌ−およびＮａ＋の取り込みおよび水の浸透性の流出に起因すると考えられる過程であり(Su et al., 2002)、病理学の進行性のカスケードを促進する。
【００１２】
ＡＱＰ４を発現するマウスとＡＱＰ４を発現しないノックアウトマウスとの間における浮腫を比較する研究によると、アクアポリン発現は脳浮腫の形成に関係していた。半球状拡大の低下が、ノックアウトマウスで観察され（図１Ａ）、ノックアウトマウスの神経学的スコアは改善された（図１Ｂ）(Manley et al., 2004)。さらに、β−シントロフィン欠失による血管周囲のＡＱＰ４の選択的な除去が、内皮のＡＱＰ４の正常な補充の存在にもかかわらず、水中毒に続く脳浮腫の増強を遅らせることが示された（拡散強調ＭＲＩによって評価）(Amiry-Moghaddam et al., 2006)。
【００１３】
さらに、ラットの実験的脳内出血の後において、ＡＱＰ４ｍＲＮＡ発現と脳血液関門（ＢＢＢ）浸透性との間における有意な正相関が観察され、これらの変更は、大脳浮腫における観察された増加と一致している。その他の結果は、浮腫および血液脳浸透性にともなうＡＱＰ４の発現に関連する(Teng et al., 2006; Chen et al., 2006)。浮腫に関連する炎症もまた、ＡＱＰ４に関連する。システイニルロイコトリエン（ＬＴＣ４、ＬＴＤ４およびＬＴＥ４を含む）は、脳血液障壁（ＢＢＢ）の破壊および脳浮腫を誘導できる強力な炎症性媒介物質である。ＬＴＤ４は、２つの方法で脳浮腫に影響することが示された；ＣｙｓＬＴ１受容体は血管原性浮腫を仲介し、一方、ＣｙｓＬＴ２受容体はＡＱＰ４発現のアップレギュレートを介して細胞障害性浮腫を仲介する可能性がある(Wang et al., 2006)。
【００１４】
脳浮腫は、脳の様々な感染症に関係している。ある研究では、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が、野生型マウスおよびＡＱＰ４欠損マウスの脳脊髄液（ＣＳＦ）に注入された。ＡＱＰ４タンパク質は、髄膜炎の結果、強くアップレギュレートされ、脳血液関門を介した透水性（Ｐｆ）が非注入の野生型マウスと比較してほぼ５倍増大することが分かった(Papadopoulos, et al., Journal of Biological Chemistry (2005), 280(14), 13906-13912)。反対に、他者によって、細菌性の潰瘍における脳腫脹に対するＡＱＰ４の保護効果も実証され、このことは、ＡＱＰ４誘導は、大脳の感染症に関連した血管原性浮腫を縮小させる可能性を示唆している(Bloch, et al., Journal of Neurochemistry (2005), 95(1), 254-262)。
【００１５】
ＡＱＰ１およびＡＱＰ４のｍＲＮＡ発現が、ヒト単純性疱疹ウィルス脳炎（ＨＳＶＥ）によって引き起こされた脳炎を模倣する、十分確立されたマウスモデルにて分析された。この研究は、疾病の急性期におけるＡＱＰ４の有意なダウンレギュレーションおよび長期におけるＡＱＰ１およびＡＱＰ４のアップレギュレーションに一致している。ＡＱＰ４の調節は、ＨＳＶＥによるヘルペスの感染症に関連した脳浮腫の治療の潜在的なターゲットであることが示唆された(Torres et al., Journal of NeuroVirology (2007), 13(1), 38-46)。
【００１６】
アリール−スルホンアミド構造クラスの２つのメンバーが、ＡＱＰ４チャネルの阻害剤として報告された(Huber et al., Biorganic & Medicianal Chemistry Letters (2007), 17, 1270-1273)。これらの化合物のうちの１つであるアセタゾラミドは、近年、脳脊髄圧不安定症候群（ｕｎｓｔａｂｌｅ  ｃｅｒｅｂｒａｌｓｐｉｎａｌ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）の治療のための炭酸脱水酵素阻害剤であると主張された(Yoshida, Application: WO 2006-JP322065 20061030)。しかしながら、ＡＱＰ４機能を規制する化合物の構造に関する信頼できる情報は不足している(Dun et al., Neural Regeneration Research (2007), 2(4), 234-238.)。
【００１７】
浮腫および脳卒中関連病理学における臨床的処置のための潜在的な補助治療としての、ＡＱＰ４ブロッカーまたは活性化剤といった、アクアポリン修飾因子を同定し特徴づけることは、達成できていない目標である(Zador et al., Progress in brain research (2007), 161 185-94)。
【００１８】
従来、ＡＱＰチャネルの薬理学に関して知られていることはほとんどないものの、水銀および有機水銀剤といったいくつかの化合物は、ＡＱＰ１といった特定の種のＡＱＰを選択的にブロックするが、ＡＱＰ４はブロックしない。しかしながら、これらのブロッカーは、その潜在的な治療の価値を打ち消す、高い全身的毒性を示す。テトラエチルアンモニウムおよびフロレチンといったその他のアクアポリンブロッカーは、特異性および力価が不足する。ＡＱＰ４発現が浮腫のような事象に関係する一方、ＡＱＰ４活性の調節に適したまたは予期される臨床的使用に適した薬理学的化合物は利用可能となっていない。また、浮腫およびその他の疾病事象におけるアクアポリンの役割のさらなる研究のための新規のおよび／または選択的なＡＱＰ修飾因子の開発という重要な必要性が存在する。
【００１９】
これらの問題に取り組むために、本発明者らは、アクアポリン活性をアゴナイズし（ａｇｏｎｉｚｅ）またはアンタゴナイズし（ａｎｔａｇｏｎｉｚｅ）、且つ、先行する化合物における毒性、乏しい力価および低い特異性を欠いた、新規の化合物を同定した。
【発明の概要】
【００２０】
本発明は、ブメタニド、フロセミド、およびその他の置換された３−カルボキシ−アリール−スルホンアミド誘導体またはアナログが、卵母細胞発現系で機能するアクアポリンのブロッカーであり、ある場合には刺激剤（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｓ）であることを開示する。これらの基本的なコア構造を有する化合物が、細胞におけるＡＱＰ１およびＡＱＰ４の機能を選択的に調節することが実証された。ある種のアクアポリン調節薬理学的薬剤のこの重要な発見は、虚血性脳卒中および急性脳外傷の後における浮腫の形成を有意に減少させる新規の方法をもたらした。更に、このクラスのアクアポリン修飾因子は、アクアポリンと関連する又はアクアポリンが介在するその他の疾病、例えば、緑内障、黄斑変性、肺疾患およびある種の癌（例えば脳腫瘍）の治療を可能にする。
【００２１】
上記の発見の観点において、本発明の幾つかの非限定的な側面は以下の通りである：
下式（Ｉ）または下式（ＩＩ）−（ＩＶ）の付加的なアリールスルホンアミドによって定義される、３−カルボキシアリールスルホンアミド構造を有する化合物またはその医薬的に許容可能な塩：
【化１】
2010508300.tif 000003
【化２】
2010508300.tif 000004
【００２２】
ここにおいて、
Ｂは、−ＯＨ、−ＯＲ、ＯＣＨＲ１ＯＣＯＲ２またはＮＲ１Ｒ２であり；
Ｘ、ＹおよびＺは、独立に、水素、ハロゲン、−ＯＨ、−ＯＲ、−ＮＨＲ、−ＮＨＣＯＲ、−ＮＨＳＯ２Ｒ、−ＳＲ、−ＳＯＲまたは−ＳＯ２Ｒから成る群から選択され；
ここにおいて、Ｒは、
（ａ）直鎖または分枝鎖Ｃ１−Ｃ６アルキル；
（ｂ）ハロゲン、トリハロメタン、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、Ｎ−アルキルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノ、アルキルカルバモイル、アリールカルバモイル、アミノカルバモイル、Ｎ−アルキル−またはＮ，Ｎ−ジアルキルアミノカルバモイル、アルキルスルホニルアミノ、アリールスルホニルアミノ、カルボキシ、カルボキシアルキル、Ｎ−アルキルカルボキサミド、Ｎ，Ｎ−ジアルキルカルボキサミド、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、トリフルオロメチルスルホニルアミノ、アリールチオ、アリールスルフィニル、アリールスルホニル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アリールオキシアルキル、アミノアルキル、Ｎ−アルキルアミノアルキル、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノアルキル、アルキルカルバモイルアルキル、アリールカルバモイルアルキル、アミノカルバモイルアルキル、Ｎ−アルキルアミノカルバモイルアルキル、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノカルバモイルアルキル、アルキルスルホニルアミノアルキル、アリールスルホニルアミノアルキルから成る群の少なくとも１つのメンバーで置換されていないまたは置換された、アリールまたはアリールＣ１−Ｃ６アルキル；
（ｃ）ハロゲン、トリハロメタン、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、Ｎ−アルキルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノ、アルキルカルバモイル、アリールカルバモイル、アミノカルバモイル、Ｎ−アルキル−またはＮ，Ｎ−ジアルキルアミノカルバモイル、アルキルスルホニルアミノ、アリールスルホニルアミノ、カルボキシ、カルボキシアルキル、Ｎ−アルキルカルボキサミド、Ｎ，Ｎ−ジアルキルカルボキサミド、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、トリフルオロメチルスルホニルアミノ、アリールチオ、アリールスルフィニル、アリールスルホニル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アリールオキシアルキル、アミノアルキル、Ｎ−アルキルアミノアルキル、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノアルキル、アルキルカルバモイルアルキル、アリールカルバモイルアルキル、アミノカルバモイルアルキル、Ｎ−アルキルアミノカルバモイルアルキル、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノカルバモイルアルキル、アルキルスルホニルアミノアルキル、アリールスルホニルアミノアルキル、アルキルカルボキシ、アルキルカルボキシアルキル、Ｎ−アルキルカルボキサミドアルキル、Ｎ，Ｎ−ジアルキルカルボキサミドアルキル、アルキルチオアルキル、アルキルスルフィニルアルキル、アルキルスルホニルアルキル、トリフルオロメチルスルホニルアミノアルキル、アリールチオアルキル、アリールスルフィニルアルキルおよびアリールスルホニルアルキルから成る群の少なくとも１つのメンバーで置換されていないまたは置換された、ヘテロアリールまたはヘテロアリールＣ１またはＣ６アルキル
から成る群の１つのメンバーであり；および
Ｒ１およびＲ２は、以下である：
（ａ）独立に、水素または任意に置換された直鎖または分枝鎖Ｃ１−Ｃ６アルキル；
（ｂ）式−（ＣＨ２）ｎＣＨＲ−Ｑまたは−ＣＨＲ（ＣＨ２）ｎ−Ｑの群、ここにおいて、ｎ＝０−２であり、Ｑは、アリール、ヘテロアリール、−ＣＦ３、−ＣＨ２ＯＨ、−ＯＲ３、−ＣＨ２ＮＨＣＯＲ３、−ＣＨ２ＮＨＳ（Ｏ）２Ｒ３、−ＳＲ３、−Ｓ（Ｏ）Ｒ３、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ３から選択され；および、Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６直鎖または分枝鎖アルキル、アリールＣ０−Ｃ３アルキル−、ヘテロアリールＣ０−Ｃ３アルキル−のいずれかであってよい；
（ｃ）式−ＣＨ２ＣＨＲ−Ｑまたは−ＣＨＲＣＨ２−Ｑの群、ここにおいて、ｎ＝０−２であり、Ｑは−ＮＨＣＯＮＲ３Ｒ４または−ＮＲ３Ｒ４であり、ここにおいてＲ３およびＲ４は、独立に、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６直鎖または分枝鎖アルキル、アリール、ヘテロアリール、アリールＣ１−Ｃ３アルキル、ヘテロアリールＣ１−Ｃ３アルキルであり、または、ともに以下の環を形成する：
【化３】
2010508300.tif 000005
【００２３】
ここにおいて、
Ａは、−（ＣＨ２）ｎ−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−（ＣＨ２）ｎＣＯ−、−（ＣＨ２）ｎＯ−、−（ＣＨ２）ｎＳＯｍ−または−（ＣＨ２）ｎＮＲ−および−ＮＲＣＯ−から成る群から選択され、ｎおよびｍは独立に０から２の間の整数であり、および、Ｒは前記の定義のとおりであり、
Ｄは−（ＣＨ２）ｎ−であり、ｎは０から２の間の整数であり、
ＥおよびＦは、独立に、ｎが０から２の間の整数である−（ＣＨ２）ｎ−であり；または、置換されたまたは置換されていない隣接して結合するアリール−またはヘテロアリール−環構造である；
（ｄ）それらが結合する窒素原子とともに、置換されたまたは置換されていない５−７員ヘテロシクロアルキルを形成し、前記ヘテロシクロアルキルは、環構造内部に、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−ＮＨ−、−ＮＲ−、−ＮＣＯＲ−、ＮＳＯ２Ｒ−といった基を含むヘテロ原子を含んでよく、任意に置換されたまたは置換されていないアリールまたはヘテロアリール基に融合されており、および、Ｒは前記の定義のとおりである。ここにおいて、式（ＩＶ）のＷはＳ、Ｏ、ＮＲであり、ＲはＨ、アルキルまたはアリールアルキルである。
【００２４】
式（Ｉ）の化合物の好ましい置換基は以下を含む：Ｘが水素であり、Ｙが−ＮＨＲでありおよび／またはＺがＯＲである化合物。Ｘが水素であり、Ｙが−ＮＨＲでありおよびＺがＯＲであり、並びに、Ｒ１およびＲ２が水素である化合物。Ｘが水素であり、Ｙが−ＮＨＲであり、ＺがＯＲであり、Ｒ１およびＲ２は水素でありおよびＢがＯＲである化合物。Ｘが水素であり、Ｙが−ＮＨＲである、ＺがＯＲであり、Ｒ１およびＲ２は水素であり、およびＢが−ＯＲであり、または、Ｂが−ＮＲ１Ｒ２である化合物。Ｘが−ＯＲであり、Ｙが水素であり、および／またはＺがハロゲンであり、および、Ｒ１およびＲ２が水素であってよい化合物。Ｘが−ＯＲであり、Ｙが水素であり、および／またはＺがハロゲンであり、および、Ｒ１およびＲ２は水素であり、およびＢが−ＯＲであり、または、Ｂが−ＮＲ１Ｒ２である化合物。その他の好ましい化合物は、Ｂが−ＯＲであり、または、Ｂが−ＯＲであり、Ｒが、−ＣＨＲ１−Ｏ−ＣＯＲ２または−ＮＨ（ＣＨ２）２−モルフォリノ（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）の何れかである式（Ｉ）の化合物を含む。
【００２５】
ＡＱＰ１、ＡＱＰ４およびＡＱＰ９チャネルを含むアクアポリンチャネルに対して遮断または刺激の何れかを行う化合物を同定、評価および特徴づけするために使用される、アクアポリンを発現するアフリカツメガエル卵母細胞における水透過性アッセイに基づいてアクアポリン活性を調節する能力について化合物をスクリーニングする方法。
【００２６】
従来販売されていたループ系利尿剤（ｌｏｏｐ  ｄｉｕｒｅｔｉｃｓ）ブメタニドおよびフロセミドのための新規の使用。これらの使用は、浮腫または体液平衡（ｆｌｕｉｄ  ｂａｌａｎｃｅ）の調節が要求されるＡＱＰ４を発現する組織または臓器における、これらの古い薬剤（並びに新規のアナログおよび誘導体）を使用する治療方法を含む。ブメタニドおよびフロセミドを、これらの化合物がＡＱＰ４といったアクアポリンに対して有意な活性を有する標的細胞に導入する新規の方法が開示される。当該方法には、細胞に取り込まれた際にアクアポリンに対して細胞内で活性を示す分子を生産する、プロドラッグの形態のこれらの化合物設計が含まれる。以下に示されるフロセミドのアセトキシメチルプロドラッグ(Pandi, et al., Il Farmaco, 1992, 47, 249-263; Il Farmaco, 1992, 47, 1225-1230)は、ＡＱＰ４修飾因子およびアンタゴニストとして使用されてよい。
【化４】
2010508300.tif 000006
【００２７】
上記の化合物は、細胞の内部で既知の薬剤（フロセミド）に生物変換された場合にアクアポリン活性を調節する新規の用途を有する化合物の一例である。ブメタニドおよびフロセミドまたは標的細胞の内部で生物変換されるその他の既知のループ系利尿剤の何れかに基づく同様のプロドラッグが意図され、本願に開示されるとおりに作製されてよい。
【００２８】
式（Ｉ）に示されるようなコア構造に基づく新規の化合物が設計され、および、誘導体化、アナログ合成および再スキャフォールディングにより、修飾効率、インビボ安定性、可溶性および細胞へのこれらの化合物の輸送を増強するための方法。
【００２９】
脳卒中、脳損傷、緑内障、黄斑変性、脳腫瘍および大脳感染症といった症状の治療に有用である、アクアポリン発現組織または臓器、特にＡＱＰ４を発現するそれらにおける、浮腫の治療、大脳の圧力の緩和および体液平衡の保全のための、ブメタニドおよびフロセミドといった先行技術にかかる化合物並びに式（Ｉ）の化合物といった新規のアナログおよび誘導体を使用する新規の方法。
【００３０】
医薬品、および、脳卒中、外傷、緑内障、黄斑変性、脳腫瘍および大脳感染症を含む症状に関する浮腫を患う対象において浮腫を縮小する方法における本発明の化合物を投与する様々な様式。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】脳卒中モデルにおける持続性の閉塞後の脳腫脹の神経学的な障害および程度。（Ａ）ＭＣＡ閉塞の２４ｈの後における、ＡＱＰ４＋／＋およびＡＱＰ４−／−マウスの脳の組織学的分析。ＡＱＰ４−／−マウス（各々ｎ＝７）にて、半球状拡大が有意に低かった。（Ｂ）ＡＱＰ４＋／＋およびＡＱＰ４−／−マウスにおける、２４時間のときのＭＣＡ閉塞に続く神経学的な結果。平均値：記号およびエラーバー。Manley et al., 2000由来の改訂された図。
【図２】虚血性脳卒中の後の損傷およびそれらの関連する影響の時間スケールの概略図。(Dirnagl et al., 1999) 由来の修正した図表。
【図３】卵母細胞で発現される野生型および部位特異的変異型のＡＱＰ１チャネルの水透過性（Ｐｆ）値に対するテトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）の効果。Brooks et al., 2000からの図。
【図４】ＡＱＰ１結晶構造。（ａ）ＡＱＰ１四量体チャネルの細胞外側から見た図。水孔はそれぞれのサブユニットの中心に位置する。（ｂ）単一のサブユニットの側面図であり、砂時計型の孔の中心に特徴的なＮＰＡ（ａｒｇ−ｐｒｏ−ａｌａ）領域が示される。Ｎ末端およびＣ末端は、タンパク質の細胞質側に存在する。De Groot and Grubmuller (2001)に基づいて修正。
【図５】ＡＱＰ４を発現する卵母細胞薬剤が破裂する時間に対する薬剤の効果。我々の予備実験にてスクリーニングされた３０を超える化合物のうち、１００μＭブメタニドは、ＡＱＰ４を発現する卵母細胞において、破裂時間を有意に遅らせた４つの化合物のうちの１つてあった。ＡＱＰ４（「水銀非感受性水チャネル」としても知られている）は、ＨｇＣｌ２の効果を示さなかった。
【図６】ブメタニドおよび関連するループ系利尿剤化合物によるＡＱＰ４発現卵母細胞における遮断の定量分析。（ａ）細胞外ブメタニドによる用量依存的な遮断、および１００μＭのフロセミドによる同様の遮断。（ｂ）１ｍＭまでの濃度のトラセミド（ｔｏｒｓｅｍｉｄｅ）による遮断の欠如。（ｃ）ｎ値（Ｘ軸の下）および統計的有意性を示す、対応する概略的ヒストグラム。（ｄ）ループ系利尿剤化合物の構造；差異は、ＡＱＰ４遮断に関連する特徴に対する見識を提供する。（ｅ）卵母細胞へのブロッカーの内部注射の効果の増強、内部作用点と一致する；（ｆ）ブメタニドおよびフロセミドの「ｉ」細胞内、「ｅ」の細胞外の適用のためのデータの概略的ヒストグラム。（ｅ）。記号：ｏは、未処理の野生型と異ならない；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１．独立スチューデント−ｔテスト。
【図７】時間０における、５０％低張食塩水にさらした後の、主要な海馬の培養物（インビトロで１４−１５日）におけるアストログリアの膨潤に対するブメタニドの保護効果。プロット（左）：位相差顕微鏡法により視覚化した細胞領域。Ｓｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅ（ＮＩＨ）ソフトウェアにて定量した初期量に対して標準化した。イメージ（右）：低張食塩水（上）の前に、および、５０％低張食塩水から１５秒（下）における、ブメタニドで処理したグリア細胞（矢印）。
【図８】図８は、オスのコントロールマウスにおける中大脳動脈閉塞による虚血性脳卒中の負荷の前、間および後における、血液の流速のドップラーレーザー測定を示す。
【図９】図９は、インビボ実験プロトコールにおける基準のためのスケジュールを示す模式図。
【図１０】図１０は、再灌流の１０分前に１回の大量投与で静脈内に投与するブメタニド（６０ｍｇ／ｋｇ）を受けたおよび受けない、１時間の虚血および２４時間の再灌流にさらされたマウスにおける大脳浮腫および梗塞サイズを示す。２％ＴＴＣで染色すると、梗塞した領域は白色である；領域は、治療群を知らされていない研究者によって、形態測定ソフトウェアを使用して分析される。統計的有意性（ｐ＜０．０６）は基準を満たさないが、見込みを示し、ｎ値の増大につれて確証されてよい。
【発明の詳細な説明】
【００３２】
本発明に開示される方法および化合物は、アクアポリン水チャネル、特にアクアポリン１（ＡＱＰ１）およびアクアポリン４（ＡＱＰ４）を調節し、それゆえ、浮腫、病理学的な水の再分布、分布または流出が介在する様々な症状および炎症に苦しむ患者を治療するために使用されてよい。ＡＱＰ４が豊富に発現される場合、治療は、脳またはその他の組織における浮腫のレベルを下げるだろう。本発明により治療可能なそのような症状は、虚血性脳卒中および出血性脳卒中、頭部の外傷に起因する浮腫、脳腫瘍からの浮腫、脳炎または髄膜炎を含むがこれらに限定されない特定の感染症からの大脳／肺浮腫を含む。
【００３３】
本発明の化合物は、様々な形態で患者に対して投与されてよい。これらは、静脈注射（大量瞬時投与または注入）、筋肉内（ＩＭ）、経口送達（ピル、錠剤またはカプセルによる）、吸入（アエロゾル化液体または乾燥粉末の鼻腔内または肺による吸入）、直腸、頬、またはその他の粘膜組織、または「パッチ」技術による皮膚を介した投与を含む。これらの送達方法を達成するための処方は、既知の緩衝剤、糖、塩、浸透物質、賦形剤、結合剤、生理学的に許容可能な溶剤等を使用して、当該分野において周知である。投与量は、当該分野において周知の標準的な薬理学的方法によって決定されてよい。
【００３４】
アクアポリン組成物および投与の経路
「アクアポリン修飾因子」という用語は、アクアポリンアゴニスト（例えば、アクアポリン機能を増強または促進する化合物）、およびアンタゴニスト（例えば、アクアポリンによる水輸送を遮断する化合物）の両方を含む。
【００３５】
「プロドラッグ」という用語は、投与または摂取によって（例えば、循環系の中への摂食または輸送の後に）活性型アクアポリン修飾因子に代謝されるアクアポリン修飾因子、並びに、細胞内部で一度輸送されると活性型アクアポリン修飾因子へ代謝される化合物の両方を含む。
【００３６】
「投与する」という用語は、本発明のアクアポリン修飾因子を対象に誘導する任意の方法、または、これらの組成物に対象をさらす任意の方法を含む。これは、対象に投与されると本発明の化合物へ変換されるプロドラッグ、または、それとは違って、投与の前に活性型を放出するよう処理されるプロドラッグの投与を含む。
【００３７】
「医薬的に許容可能な担体」という用語は、本発明のアクアポリン修飾因子と互換性を有し、医薬の投与に適している任意のおよび全ての担体および賦形剤、例えば、希釈剤、溶剤、分散剤、乳剤、脂質二分子膜、リポソーム、コーティング剤、抗菌性または抗真菌性物質を含む防腐剤、等張剤、ｐＨ緩衝剤、および吸収調節剤等を含む。そのような担体、崩壊剤、賦形剤および薬剤の医薬的活性物質の投与のための使用は、当該分野において周知である（the Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, Am. Pharm. Assoc. (2000)参照、当該文献は本願に援用される）。
【００３８】
本発明の医薬組成物は、一般に、非経口投与、経口投与または局所的投与といった、意図された投与経路との適合性のために処方される。投与の経路はまた、静脈内（ｉ．ｖ．）、皮内、皮下（ｓ．ｃ．）、大脳内、口腔粘膜、経皮的、吸入（例えば、気管内、肺内または気管支内）、鼻腔内、経口、サブブッカル（ｓｕｂｕｃｃａｌ）、経皮的および直腸の投与を含む。本発明の医薬組成物は、単位用量（ｕｎｉｔ  ｄｏｓｅｓ）として処方されてよく、または、単位用量を含む個々の容器（例えば、注射器、アンプル、バイアル、カプセルまたは錠剤）に収められてよい。さらに、それらは、一旦摂取または投与されると、予定された速度でアクアポリン修飾因子を放出する、または、分解または未熟な代謝（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｚａｔｉｏｎ）からアクアポリン介在物質を保護する、徐放性製剤として処方されてよい。
【００３９】
経口投与される組成物は、固体の担体または賦形剤を含むことができ、または、液体またはゲルの製剤として処方されてよい。経口投与のための組成物は、食用に適すまたは不活性な担体を含んでよく、および、カプセルに封入され、錠剤に圧縮され、またはトローチとして処方されてよい。経口投与される組成物は、胃における分解を予防し、アクアポリン修飾因子またはプロドラッグ（細胞内でアクアポリン修飾因子へと代謝される）の取り込みを最適化するために、徐放性またはカプセル化された形態で処方されてよい。
【００４０】
注射可能な組成物は、当該分野で周知の方法で処方されてよく、アクアポリン修飾因子の無菌の溶液または分散液を包含してよい。そのようなものは、通常、水、生理食塩液または本発明のアクアポリン修飾因子に適合するその他の緩衝剤といった無菌の希釈剤を含むだろう。従来の緩衝剤および等張剤を使用してもよく、または、ｐＨは、ＨＣｌまたはＮａＯＨまたは緩衝剤といった周知の薬剤を使用して調整してよい。抗菌剤または静菌剤、ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡといったキレート試薬、および酸化防止剤および防腐剤を含んでよい。
【００４１】
本発明のアクアポリン修飾因子は、吸入によって（例えば、噴霧、微粒化）、またはエアゾールスプレーの形態の送達によって投与されてよい。これらは、噴霧剤および製薬の使用に適した任意の担体を含む加圧容器またはディスペンサーに収められてよい。
【００４２】
アクアポリン修飾因子の用量は、治療される症状、解剖学的位置、疾患の根本的な生理学およびアクアポリン修飾因子の薬理学的特性に依存して変化するだろう。一般に、０．０１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇに及ぶ用量、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇから５ｍｇ／ｋｇの間の用量で投与されるだろう。
【００４３】
アクアポリンの選択的標的化による疾病および疾患の治療
アクアポリン（ＡＱＰｓ）は、浮腫および体液平衡異常（ｆｌｕｉｄ  ｉｍｂａｌａｎｃｅ）が主要な関心事である、生理学的に必須の組織および器官にて発現する関連タンパク質のファミリーである。一般式（Ｉ）といったアクアポリン活性を調節する化合物は、アクアポリンが介在するまたはアクアポリンの異常な発現によって特徴付けられる疾病または障害の予防または治療に有用である。そのような疾病および障害は、脳水ホメオスタシスの調節および浮腫、血管形成、細胞移動、発生、神経病理学の疾病、および癌に関するものを含む。
【００４４】
アクアポリン修飾因子を使用する脳浮腫の治療
一般式（Ｉ）の化合物といった本発明のアクアポリン修飾因子は、液体の蓄積による膨潤（浮腫）といった浮腫を仲介するために使用してよく、アクアポリンに関する体液平衡異常は、目および脳における主要な関心事である(Amiry-Moghaddam and Ottersen, 2003; King et al., 2004; Venero et al., 2004)。ＡＱＰのための現在知られる遮断薬は、水銀および有機水銀剤であり、それらの毒性により治療薬としての使用は明白に実現可能でない。カリウムホメオスタシスは、ニューロンの興奮性の調節に必須であり、液体の体積の調節のためのメカニズムと緊密に関係がある。ＣＮＳの星状膠細胞の主要な水チャネルであるＡＱＰ４は、アストロサイトの特殊化したエンドフィート領域における内向き整流器Ｋｉｒ４．１と共局在する。Ｋｉｒ４．１チャネルを経由するＫ＋の輸出と平行するＣｌ−の流出は、電気的中性な輸送によるＫＣｌ塩の輸出を促進し、従って、血管周囲のエンドフィートにおける関連するＡＱＰ４チャネルを通る水流のための合理的な原動力を提供する。
【００４５】
ＣＮＳにおけるＡＱＰ４チャネルは、生理的条件下での脳からの水の輸出の仲介において特に重要な役割を有して、水ホメオスタシスを可能とするが、病理学的な条件の下浮腫に対する脆弱性（血漿が薄すぎる場合に血液から脳へと水が望まれない「逆流」を起こす（低ナトリウム血症または「水毒性」として知られている症状））をもたらす。
【００４６】
マウス遺伝モデルにおける神経膠のエンドフィートゾーンからのＡＱＰ４の消失は、誘導される脳浮腫の発病を遅らせることにおける有益な効果を提供し、薬理学的にこれらの水チャネルを遮断する臨床治療は、浮腫に対する防護効果を提供することができる。アンタゴニストによって、水の急性の吸収は、初期の浮腫形成の際にＡＱＰ４ブロッカーにより予防されるかもしれない。アゴニストによって、脳からの水の輸出による水ホメオスタシスの回復におけるＡＱＰ４の正常でより長期的なメカニズムを増強することができるかもしれない。水の過負荷に直面した時の、ＡＱＰ４をアップレギュレートする脳神経膠の自然な反応は、神経膠のエンドフィートは水の追い出しのために重要なメカニズムを提供するという概念を支持するだろう。最初の数時間中のアンタゴニストおよび続くアゴニストの連続した適用は、脳卒中に誘導されたおよび損傷に誘導された脳浮腫の臨床治療を最適化するために使用することができる。
【００４７】
浮腫は、いくつかの神経学的な症状または肺の症状を含む多くの臨床症状に起因する。主要な未解決の医学のニーズのうちの１つは脳卒中にある。脳卒中は、死の３番目の主要原因として、毎年アメリカにおいて７００，０００人を超える人々が患う壊滅的な疾病である。脳浮腫の程度は、脳卒中の事象の後の患者の生存の主要な決定要素である(Dirnagl et al., 1999; Taylor et al., 1996)。中大脳動脈閉塞による進行性の浮腫では、死亡率は８０％近い値となる(Ayata and Ropper, 2002)。浮腫を発症する虚血性の脳組織の傾向は、特に、全脳卒中の１５−２０％が関連する中大脳動脈領域および小脳内に大きな梗塞を有した患者における主要な死因として残っている(Hacke et al., 1996)。したがって、浮腫の経過における介在のための分子ターゲットの同定は、説得力のある研究目標である。現在、虚血性の脳浮腫の処置のための最適な戦略は捉えがたいままであり、利用可能な治療は、しばしば、重篤な浮腫を有した患者にとって限定的な価値しかない。
【００４８】
脳浮腫は、血管原性（脳血液関門を介した水および溶質の移動）または細胞障害性（影響を受けた領域における細胞の浸透性の膨潤）として分類される(Fishman, 1975; Klatzo, 1967)。細胞障害性浮腫は初期の梗塞サイズと関連し、血管原性浮腫は脳腫脹の遅延するリスクの傾向のある過程に寄与する（図２）。アストロサイトは両方の過程に役割を果たす。アブルミナル毛細管表面を覆うアストロサイトエンドフィートは、脳血液関門を作る内皮細胞間の細胞間タイトジャンクションの維持を促進する(Huber et al., 2001)。虚血後の脳血液関門の破壊は、変更された輸送、傍細胞経路の開始およびアストロサイト−内皮ジャンクションの物理的な破壊に関与する(Sun and O'Donnell, 1996; Venero et al., 2001)。毛細血管周囲のアストロサイトエンドフィートは、脳虚血の際に膨張する最初の細胞の要素(Dodson et al., 1977)、細胞外のＫ＋、Ｃｌ−およびＮａ＋の取り込みおよび水の浸透性の流出に起因すると考えられる過程(Su et al., 2002)であり、病理学の進行性のカスケードを促進する。
【００４９】
上述したとおり、脳浮腫の形成は、マウスにおけるＡＱＰ４チャネルのノックアウトに続いて遅れ、したがって、本発明のアクアポリン修飾因子、特にＡＱＰ４機能の修飾因子は、脳浮腫に関する症状に苦しむ患者に対して著しい臨床的利点を提示する。
【００５０】
脳損傷の治療
一般式（Ｉ）の化合物のような本発明のアクアポリン修飾因子は、浮腫または頭蓋内圧を減少または調整するために、脳損傷を有する対象に対して投与されてよい。アクアポリンアンタゴニスト、例えばＡＱＰ４アンタゴニストは、脳卒中または頭部の外傷に関連した浮腫に起因するＡＱＰ４の増大した表現の効果を弱めるために投与されてよい。スルフォラファン（ＳＵＬ）（ブロッコリといったアブラナ科の野菜に豊富に存在するイソチオシアン酸塩）の損傷後投与にて観察される、ＡＱＰ４消失によって誘導された、減じられた頭部の外傷は、損傷後３日における脳浮腫の有意な減少（パーセンテージ含水量にて評価）を伴う(Zhao et al., Journal of Neuroscience Research (2005), 82(4), 499-506)。
【００５１】
アクアポリンアゴニストは、ＡＱＰ４といったアクアポリンの発現の減少に関連した頭蓋内圧を下げるために、頭部外傷を有する対象に対して与えられてよい(Hoshi et al., Sei Marianna Ika Daigaku Zasshi (2005), 33(5), 373-381)。
【００５２】
アクアポリン修飾因子を使用する重金属中毒の治療
鉛に曝された対象は、水透過性に対する鉛中毒の効果を減少させるために、アクアポリン修飾因子の投与により治療されてよい。対象の鉛に対する暴露は、ＡＱＰ４を発現するアストロサイトの水透過性（Ｐｆ）において、有意に４０％の増加を誘導するが、ＡＱＰ４を発現しないアストロサイトのＰｆでは効果を有さない(Gunnarson, et al., Neuroscience (Oxford, United Kingdom) (2005), 136(1), 105-114)。更に、水透過性における増加は、鉛の洗い出し後に続いたが、鉛キレート化剤（ｍｅｓｏ−２，３−ジメルカプトコハク酸）による治療は、Ｐｆにおける鉛に誘導された増加をなくした。これらのデータは、小分子ＡＱＰ４ブロッカーによる治療は有益である可能性のある鉛曝露に関連した病理学および神経毒性における、ＡＱＰ４の役割を指す。
【００５３】
水銀および有機水銀剤といった重金属は、ＡＱＰ１のようないくつかのタイプのＡＱＰを選択的に遮断するが、ＡＱＰ４を遮断しないことが知られている。したがって、水銀剤への接触によって引き起こされたアクアポリン機能における異常は、本発明の選択的なアクアポリン修飾因子の投与によって覆されまたは補われてよい。
【００５４】
アクアポリン活性に影響するその他の重金属の毒作用は、本発明のアクアポリン修飾因子を使用して、同様に治療されてよい。
【００５５】
アクアポリン修飾因子を使用した緑内障、黄斑変性および網膜剥離を含む視覚の障害の治療
一般式（Ｉ）の化合物を含む本発明のアクアポリン修飾因子は、液体の体積、組織の水和、および緑内障および黄斑変性に関連した圧力の調節のために、対象に投与されてよい。
【００５６】
ＡＱＰは、目において液体の分泌および吸収を促進し、それゆえ、圧力、体積および組織水和の調節に関与する。例えば、ＡＱＰ４は、繊毛の皮膜組織および網膜のミュラー細胞にて選択的に発現され、ＡＱＰ４を欠くマウスでは、網膜電図検査によると、光によって誘起される電位が縮小された(Verkman, et al., Experimental eye research (2003), 76(2), 137-43)。それゆえ、ＡＱＰ機能の薬理学的変化は、緑内障、角膜の浮腫、黄斑変性およびＩＯＰまたは組織水和における異常に関する目のその他の疾病における、新規の治療を提供する。
【００５７】
ＡＱＰ１は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）（目の後部を覆い、はぐれた光（ｓｔｒａｙ  ｌｉｇｈｔ）を吸収し、光受容体の隣接した層の機能を助ける着色された組織）にて発現される水チャネルである。塩イオンチャネルおよびトランスポーターと平行して働くことで、ＡＱＰ１は、ＲＰＥを介した目から血漿への水の輸出を可能にする。ＲＰＥを介した目からの塩および水の引抜きは、目の後部に対する網膜の付着の維持において重要であると提唱されている。ＡＱＰ１のアゴニストは、網膜剥離により失明のリスクを遅らせまたは減らすために投与されてよい。好ましくは、ＡＱＰ１の選択的なブロッカーが使用される。それは、主要な視覚情報処理が生じる隣接した網膜の層における膠細胞のＡＱＰ４機能に影響しないためである。
【００５８】
アクアポリン修飾因子を使用する発作および嘔吐の治療
一般式（Ｉ）の化合物のような本発明のアクアポリン修飾因子は、発作および嘔吐を生じやすい対象に対して投与されてよい。
【００５９】
ＡＱＰ４は、神経膠と間質液との間および脳脊髄液と血管との間における液体の調節および輸送の最も重要な構造的な基礎である。神経膠の水チャネルアクアポリン−４（ＡＱＰ４）を欠くマウスが、大脳浮腫を減少させ、水中毒または虚血性の負荷に続く神経学的な結果を改善したことが報告されている(Binder, et al., Neuroreport (2004), 15(2), 259-62)。ＡＱＰ４は、損傷、脳卒中、脳腫瘍等の様々な原因に起因する、水頭症の形成および発作の発生に関与する(Liu et al., Guoji Jianyan Yixue Zazhi (2006), 27(11), 999-1000, 1003)。さらに、医学的に難治性癲癇を有した患者の脳におけるＡＱＰ４の発現は、癲癇の発病の後の２次的な大脳浮腫と関連する、ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの両方における統計的に著しい増加（Ｐ＜０．０１）を示すことがわかった(Chen et al., Neuroscience Bulletin (2005), 21(6), 413-417)。まとめると、これらは、神経膠の水チャネルは、脳の興奮性および発作活性の開始および汎化を調節することを示す。本発明のアクアポリンアンタゴニストを使用するＡＱＰ４の遮断は、発作の重症度および持続を低下させるために使用してよい。
【００６０】
アクアポリン修飾因子を使用した浸透度調節を提供するための能力の改善
一般式（Ｉ）の化合物を含む本発明のアクアポリン修飾因子は、浸透性の調節に役立つ。
【００６１】
例えば、ＡＱＰ４アゴニストおよびアンタゴニストは、全身的な血漿の変化による刺激に応じて視床下部／脳下垂体軸によるバソプレッシン分泌の反応性を調節するために使用できる。バソプレッシンは、シグナリングの源および標的の両方で発現されるＡＱＰチャネルと共に、体液ホメオスタシスを調節するホルモンである。バソプレッシンの源は、脳、特に視床下部の神経下垂体系であり、そこでは、ホルモンであるバソプレッシンおよびオキシトシン（出産および乳汁分泌といった性機能に関係する）を合成する巨大細胞の神経分泌細胞が、脳室傍および視索上核に位置する(Young and Gainer 2003)。脳のこれらの浸透感受性領域は、高いレベルのＡＱＰ４を示す(Jung and others 1994; Nielsen and others 1997)。巨大細胞のニューロンからの単一の軸索は、神経下垂体に対して突出し、血流中にホルモンシグナルを直接放出する。バソプレッシンの標的は腎臓の集合管であり、そこでは、結合するＶ２受容体が、水再吸収を増加させるために、ＡＱＰ２チャンルの原形質膜への移行を誘導し、それにより、脱水症に逆らう抗利尿性効果をもたらす(Brown 2003)。ＡＱＰ４の存在は、浸透圧感覚系の感度を調節する；したがって、ＡＱＰ４のアンタゴニストは、ホルモン分泌の反応性を鈍らせるために使用でき、一方、アゴニストは、液体の消失、水の貯蓄または高血圧の治療のための自然なバソプレッシン調節系を促進するために使用できる。
【００６２】
アクアポリン修飾因子を使用する水頭症の調節
水頭症は脳の心室における脳脊髄液の異常な蓄積に関与する障害であり、本発明のアクアポリン修飾因子を使用して改善されてよい。脳および脊髄を浸す脳脊髄液（ＣＳＦ）は、高濃度のＡＱＰ１チャネルを発現する脈絡叢によってつくられる。ＡＱＰ１チャネルは、Ｎａ＋およびＣｌ−のためのトランスポーターと平行して、脳への水の輸入のための経路を供給する。蜘蛛膜顆粒を介したＣＳＦの流出の閉塞は、水頭症を引き起こし、圧力の内部増加のために幼児における頭の拡大および年配患者における神経病理学をもたらす。水頭症の現在の有効な治療法は、過剰の液体を放出するシャント（ｓｈｕｎｔ）の外科的挿入であるが、この方法は詰まりおよび感染症といった欠点が存在する。ＡＱＰ１アンタゴニストといった本発明のアクアポリンアンタゴニストの使用は、液体ホメオスタシスの調節−ＣＳＦ産生と脳からのその除去との平衡を保つことにより、外科的な介入なくこの症状を改善する方法を提供する。
【００６３】
アクアポリン修飾因子を使用するアルツハイマー病の改善
本発明のアクアポリンアゴニストは、ＣＳＦ生成および代謝回転の増大並びにアルツハイマー病に関与する神経毒および有毒代謝物質の排出により、アルツハイマー病を改善することができる。脈絡叢の損なわれた機能および脳脊髄液（ＣＳＦ）の減少した生産は、遅発症性の形態のアルツハイマー病に寄与してよい。ＣＳＦは、脳の物理的防護を提供するクッション、塩および栄養素の貯蔵庫、および廃棄物および代謝物質の除去のための廃水系と伝統的に考えられてきた。より新たな見解によれば、脈絡叢およびＣＳＦの役割は、ＣＮＳの成長、ホメオスタシスおよび修復まで拡大される(Redzic and others 2005)。Ｒｅｄｚｉｃらが概説するように、膜状の組織は、栄養性および脈管原性因子を合成し、栄養素およびペプチドホルモンの侵入を制御し、および、毒素および薬剤のクリアランスに貢献する。脈絡膜に由来する成長因子は、発生の際のパターンに影響を及ぼす；成人のＣＮＳでは、脈絡叢は、外傷性および虚血性の脳外傷からのニューロンの修復および回復に関係するように思われる。年齢とともに、ＣＳＦ分泌は減少し、アルツハイマー病といった遅発性の疾病を発病するリスクを増大させ得る(Redzic and others 2005)。ＡＱＰ１のアゴニストはＣＳＦ生産を増大することができ、ＣＳＦの代謝回転速度および対応する細胞外空間の排出を増大させ、アルツハイマー病の進行に寄与すると予想される代謝物質、毒素および廃棄物の提案された神経毒性の蓄積を相殺する。
【００６４】
アクアポリン修飾因子を使用した、より正常な肺機能の維持または回復
一般式（Ｉ）といった本発明のアクアポリン修飾因子は、アクアポリンに関する肺の疾患または疾病を治療するために使用してよい。肺組織の水和の程度は、肺の正規曲線を維持することに役立つ。膨潤、液体の蓄積およびガス交換障害（肺の浮腫）を含む水和の障害が生じうる。例えば、ＡＱＰ４は肺組織で発現され、本発明の化合物は、ＡＱＰ４に対するそれらの効果により、肺における水の輸送および水和を調節することができる。本発明の修飾因子は、肺における水の不制御によって引き起こされた疾患を治療するために、単独またはその他の薬剤と共に使用してよい。
【００６５】
アクアポリン修飾因子を使用する腎臓疾患および疾病の治療
本発明のアクアポリン修飾因子、特にアンタゴニストは、腎臓における水の再吸収を制御するために使用してよい。例えば、ＡＱＰ１は、近位尿細管およびヘンレ係蹄の下行脚の細い部（ｔｈｅ  ｄｅｓｃｅｎｄｉｎｇ  ｔｈｉｎ  ｌｉｍｂｓ  ｏｆ  Ｈｅｎｌｅ）における腎臓の内腔から体内への水の再吸収の主要なメカニズムである。したがって、ＡＱＰ１のアンタゴニストは、水の再吸収を減少させ、利尿薬として尿量を増加させるために使用してよい。ＡＱＰ４は、その他のＡＱＰと共に末端の腎臓に存在し、そのため、腎臓における可能性のあるアゴニストまたはアンタゴニストの効果は、ＡＱＰ１およびＡＱＰ４に関与する少なくとも部分的に重複した機構の存在により抑えられる可能性がある。したがって、これらのアクアポリンのいずれかまたは両方の薬理学の調節は、腎臓における水の輸送の制御に使用されてよい。
【００６６】
アクアポリン発現に関連した血管性の疾病および疾患の治療
アクアポリンアンタゴニストは、これらの疾病におけるアクアポリンの効果を調節するために、血管障害または疾病を有する対象に対して投与してよい。例えば、ＡＱＰ１は、周辺の脈管系の内皮細胞にて発現するが、中枢神経系の毛細管床では発現しない。ＡＱＰ１は、周辺循環の傍細胞の浸透性の制御に関係する内皮細胞表面対体積の比率における変化を仲介し、従って、血管形成に関連する細胞形態変化は治療学上制御できる。そのような場合、血管形成、癌治療における補助治療として特定の関心対象の機能を減少させるために、ＡＱＰ１のアンタゴニストを使用することができるかもしれない。
【００６７】
アクアポリンを過剰発現する、またはアクアポリンが病因または病的状態に寄与する、癌または腫瘍の治療
本発明のアクアポリン修飾因子は、アクアポリンがアップレギュレートされる癌を治療するために使用してよい。本発明のアクアポリンアンタゴニストの投与は、そのような癌におけるアクアポリンのアップレギュレーションによって引き起こされた有害な効果を減少することができる。例えば、ＡＱＰ１は、脳の膠芽腫および乳癌細胞にてアップレギュレートされ、細胞の縮小、伸長および癌の拡散を促す移動を促進することに関係する。これらの有害な効果を予防または改善するために、ＡＱＰ１のアンタゴニストが投与される。したがって、アクアポリン修飾因子（アンタゴニスト）は、癌、特に高度に侵襲性であるため、外科的な削除が非常に困難な多形膠芽腫の治療の補助治療として癌患者に対して提供してよい。
【００６８】
近年示された証拠から、膜の水チャネルタンパク質アクアポリン−４（ＡＱＰ４）は脳腫瘍の浮腫に役割を果たすことが示唆される。ＡＱＰ４欠損マウスは、脳腫瘍注入を含む様々な損傷の後に著しく変更された脳水平衡を示す(Papdopoulos et al., Neuroscience (Oxford, United Kingdom) (2004), 129(4), 1011-1020)。ヒト脳におけるＡＱＰ４発現は、外傷性脳損傷の後、脳由来の腫瘍内でおよび脳腫瘍のまわりで増大する(Hu et al., Journal of Zhejiang University, Science, B (2005), 6B(1), 33-37)。ＡＱＰ４およびＫｉｒ４．１の再配送は、低級および高級の神経膠腫において異なるため、神経膠エンドフィート膜ドメインにおけるＡＱＰ４およびＫｉｒ４．１のクラスター形成メカニズムは、また同様に異なり、原因として、脳浮腫の形成に関与するかもしれない(Warth et al., Acta Neuropathologica (2005), 109(4), 418-426)。実際、ＡＱＰ４の再分布による高級な神経膠腫にて生じた脳内の圧力は、現在の化学療法に対する脳のいくつかの癌の流出応答（ｐｏｕｒ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）の部分的な原因かもしれない。それ故、補助治療における小分子ＡＱＰ４遮断薬の使用には、現在および将来の脳腫瘍化学療法が取り組む気圧勾配を減少するという利点が期待される。
【００６９】
ＡＱＰ１の無いマウスにおいて、皮下または頭蓋内の腫瘍細胞注入後、腫瘍血管分布の減少および広範囲な壊死とともに、腫瘍増殖の著しい減少が観察された。しかしながら、ＡＱＰ１、または構造上異なる水選択的なトランスポーター（ＡＱＰ４）を有する非内皮細胞の安定したトランスフェクションは、インビトロで細胞移動および創傷治癒を加速した。これらの知見は、血管形成、創傷治癒、腫瘍拡散および臓器再生を含む、多様な生物学の事象にとって主要な細胞移動における水チャネルの基本的役割を示す(Saadoun et al., Nature (2005), 434(7034), 786-92)。
【００７０】
アクアポリン修飾因子の機能的な特徴づけ
一般式（Ｉ）の構造を有するものを含む、本発明のアクアポリン修飾因子は、特定の機能的特徴によってさらに特徴づけられてよい。これらの特徴は以下のことを含む。
【００７１】
同じ投与経路にて等価の用量で対象に投与されるブメタニドまたはフロセミドと比較した、アクアポリン修飾因子の細胞へ入り込む能力の増大。この増大した能力は、修飾された化合物（アクアポリン修飾因子）を、細胞膜を介して細胞内部のアクアポリン活性を修飾する部位へより容易に移動または拡散させる、ブメタニドまたはフロセミドのコア構造の修飾によって、および／または、アクアポリン修飾因子のインビボの安定性の増大によって、付与されてよい。
【００７２】
分子量、ＣｌｏｇＰ、ｔＰＳＡによって、または、修飾因子の疎水性と極性の特性との比率によって特徴付けられるような、特定のアクアポリン修飾因子の機能的な特徴。本発明のアクアポリン修飾因子は、２５０−５５０の間、好ましくは３００−４７０の間の分子量を有してよく；０から５、好ましくは１から４のＣｌｏｇＰを有してよく；および、７０から１７０Å２の、好ましくは１００から１５０Å２のｔＰＳＡを有してよい。
【００７３】
上述されるような卵母細胞膨潤アッセイにおける水輸送に対する効果によって特徴づけられる、本発明のアクアポリン修飾因子。細胞外で適用された場合、本発明のアクアポリン修飾因子は、このアッセイによって測定されるように、ブメタニドまたはフロセミドと比較して、少なくとも１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、９０または１００％の作動作用（ａｇｏｎｉｓｍ）または拮抗作用（ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ）またはアクアポリン（例えばＡＱＰ１またはＡＱＰ４）の増大を示してよい。上記の範囲は、中間の部分範囲および値をすべて含む。
【００７４】
アクアポリン修飾因子、特にアンタゴニストは、選択的に、１つのタイプのアクアポリンチャネル（例えば、ＡＱＰ１またはＡＱＰ４）を調節してよく、その他のアクアポリンチャネルをアゴナイズする（ａｇｏｎｉｚｅ）またはアンタゴナイズする（ａｎｔａｇｏｎｉｚｅ）能力をもたない、または、実質的にそのような能力を減少している。例えば、選択的なアクアポリンアンタゴニストは、ＡＱＰ４のアクアポリン活性を、その正常値の５、１０、２０、５０、７０または９０％に減少させることができるが、その他のアクアポリンチャネルの活性を全くアンタゴナイズすることなく、または、ＡＱＰ４に対するよりも有意に少なくアンタゴナイズする。選択的なアクアポリンアンタゴニストは、その他のものと比較して、１つの種のアクアポリンチャネルをアンタゴナイズする能力が、５、１０、２０、５０、７５％または１００％高い。そのような修飾因子の例は、ＡＱＰ４チャネルを介してで水の流れを遮断するが、実質的にＡＱＰ１またはＡＱＰ９チャネルを遮断しない化合物、またはＡＱＰ１を遮断するが、ＡＱＰ４チャネルに対して実質的に活性を持たない修飾因子であるだろう。
【００７５】
本発明のアクアポリン修飾因子は、ブメタニドまたはフロセミドよりも、Ｎａ−Ｋ−Ｃｌコトランスポーターに対する活性が小さい。これらのアクアポリン修飾因子の相対的に減少したＮａ−Ｋ−Ｃｌトランスポーター機能活性は、トラセミド感受性のＮａの細胞への取り込みの測定によって特徴付けられてよい。コトランスポーター機能は、ループ系利尿剤の古典的な標的である。ループ系利尿剤ファミリーのうち、トラセミドは、上述の卵母細胞膨潤アッセイのデータから明らかな通り、アクアポリンに影響しないが、なおコトランスポーターの強力なブロッカーであるため、それは、ブメタニドまたはフロセミドといったコントロール化合物との比較による、Ｎａ−Ｋ−Ｃｌトランスポーター経路に対するアクアポリン修飾因子の活性の特徴づけのために使用できる。
【００７６】
一般式（Ｉ）の化合物のような本発明のアクアポリン修飾因子は、ブメタニドまたはフロセミドのようなループ系利尿剤と比較して、Ｎａ−Ｋ−Ｃｌトランスポーターに対して活性を示さず、または、Ｎａ−Ｋ−Ｃｌトランスポーターに対して、少なくとも１、５、１０、２０または５０％減少した活性であってよい。アクアポリン修飾因子のループ系利尿剤の効果は、ループ系利尿剤薬物作用に要求されるカルボン酸基を修飾することができる。
【００７７】
上記の範囲は、中間の部分範囲および値をすべて含む。アクアポリンおよびＮａ−Ｋ−Ｃｌトランスポーターに対する本発明のアクアポリン修飾因子の特異的な活性は、特異的に制御されるべき各々の治療の利点がことを可能にする。補足的および選択的なブロッカーのセットは、治療摂生法の個別化された調節を可能にする。例えば、脳浮腫の治療のために、ＡＱＰ４を遮断し且つループ系利尿剤作用をさらに示すアクアポリン修飾因子を選択することが好ましい場合がある。
【実施例】
【００７８】
例１
選択原理および方法論。アクアポリンチャネルを遮断する化合物、アナログおよび／または薬剤の能力は、定義された浸透勾配における時間の関数としてのＡＱＰ発現卵母細胞の横断面積のビデオ顕微鏡的分析により分析した。これは、水透過性因子（Ｐｆ）の計算、水侵入の割合における有意な差の統計評価、およびＩＣ５０値（最大半減の遮断に必要な濃度）による用量作用曲線の定義を可能とする。
【００７９】
この化合物の評価方法は、ＡＱＰ１、−４、−５および−９チャネルで使用された。チャネル刺激の観察を、同様のアッセイ方法を使用して行ったが、その結果は、所定の濃度におけるコントロールに対する％刺激として報告された。Ｙｏｏｌらによる以前の研究(Brooks et al., 2000; Yool et al., 2002) は、テトラエチルアンモニウムを、ＡＱＰ１チャネルを介した水流出を遮断する最初の非水銀薬剤として同定した（図３）。ＴＥＡは、Ｋ＋チャネルサブタイプおよびニコチン性アセチルコリン受容体のブロッカーとして知られている。ＡＱＰ１のＴＥＡ感受性は、水孔の外側の前庭における、チロシン１８６をフェニルアラニンとする（Ｙ１８６Ｆ）部位特異的突然変異によって除去され、このことから、ＴＥＡの抑制作用は、内因性のチャネルに対する非特異的効果によらないことが確認された(Brooks et al., 2000)。
【００８０】
腎臓における天然のＡＱＰ１チャネルおよびメイディン・ダービー・イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）細胞株における組み換えＡＱＰ１チャネルもまた、ＴＥＡによる水透過性の遮断を示し(Yool et al., 2002)、このことは、この効果が卵母細胞発現系に限定されないことを示す。ＴＥＡによる水透過性の阻害は、ラットの腎臓のヘンレ係蹄の下行脚の細い部（天然ＡＱＰ１を豊富に発現する）にて見られたが、上行脚の細い部（ａｓｃｅｎｄｉｎｇ  ｔｈｉｎ  ｌｉｍｂｓ）（それらは発現しない）では見られなかった。この働きは独立して確認および拡張され (Detmers et al., 2006; Tyagi and Namboodri, 2005)、このことは、卵母細胞発現系におけるアクアポリンチャネルのブロッカーのスクリーニングの実現可能性を提供する。図３は、卵母細胞で発現される野生型および部位特異的変異型のＡＱＰ１チャネルの水透過性（Ｐｆ）値に対するテトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）の効果を示す。ＡＱＰ遮断薬のメカニズムの理解に対する構造的な見通しは、蓄積されたウシＡＱＰ１のＸ線構造（１Ｊ４Ｎ）の研究から得られた（図４参照）。ＡＱＰ１を通した水流出の遮断は、システイン１８９における水銀（ＨｇＣｌ２）の共有結合に関与することが報告された(Preston et al., 1993)。Ｃｙｓ−１８９が外側の水孔前庭にあるため、水銀化合物によるＡＱＰ１の遮断は、直接の閉塞の結果であると考えられる。しかしながら、分子モデリング研究は、ＡＱＰ４における対応する残基が水銀非感受性アラニンであることを明らかにする。反対に、ＡＱＰ４チャネルの阻害は、ＰＫＣによるセリン１８０のリン酸化に起因する一方で、ＡＱＰ１における等価な残基がアルギニンであることが報告された (Zelenina et al., 2002) 。更に、Ｓｅｒ−１８０が水孔から離れて位置するため、チャネル阻害は構造変化に仲介されるようであり、このことは、従って、ＡＱＰ４機能のアロステリックな調節のための能力を示唆する。これらの理由のために、本発明者は、まず、潜在的なＡＱＰ４チャネルブロッカーとしてのバイアスをかけた化合物のライブラリーを評価することを選択した。
【００８１】
最初のＡＱＰチャネルスクリーニングのためのライブラリーの組成物は、直観および水を輸送する組織に関わる臨床的な副作用に関する手掛かりに基づいて、様々なチャネル、トランスポーターおよび受容体遮断化合物を含んでいた。単純なスクリーニグでは（図５）、コントロールおよびＡＱＰ４を発現する卵母細胞を、試験化合物を含む等張食塩水  （１００ｍＭ  ＮａＣｌ；５ｍＭ  ＭｇＣｌ２；５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．３；〜２００ｍＯｓｍ）の中で、それぞれの実験の前に１０−１５分間前培養し；その後、１００ｍＯｓｍ食塩水に移した後、卵母細胞の破裂（物理的な爆発）までの時間を視覚的にモニターした。ブロッキング化合物がない状態で、浸透圧的に生じる水浸入は、迅速な膨潤および破裂をもたらした。遮断は、低張食塩水における破裂に要する時間の増大から明らかであった。真水の環境に適用されＡＱＰを欠くコントロール卵母細胞は、１０分以上において検出可能な膨張は示さなかった。
【００８２】
図５は、ＡＱＰ４を発現する卵母細胞における、破裂までの時間に対する薬剤の効果を示す。本発明者によってスクリーニングされた３０を超える化合物のうち、１００μＭのブメタニドは、ＡＱＰ４発現卵母細胞において、破裂時間を有意に遅らせた４つの化合物のうちの１つだった。ＡＱＰ４（「水銀非感受性水チャネル」としても知られる）は、ＨｇＣｌ２の効果を示さなかった。これらのデータは、有意なＡＰＱ４遮断が１００μＭブメタニドによる処理に起因したことを示す。しかしながら、このアッセイの細胞の性質およびブメタニドの既知のＮａ−Ｋ−Ｃｌチャネル遮断特性により、卵母細胞膨潤に対するブメタニドの遮断効果はＡＱＰ４チャンルとの直接の相互作用に起因することを実証する必要があった。ＡＱＰ４に対するブメタニドの直接の作用は、ＡＱＰ４変異体を遮断するブメタニドの能力を減じるが、水流出の割合は変更しないような部位特異的突然変異によって、明白に実証された。これらの突然変異部位において注目すべきことは、ＡＱＰ４の細胞内表面のまたはその表面近くのそれらの位置である。
【００８３】
ブメタニドに加えて、フロセミドおよびトラセミドのようなその他の古典的ループ系利尿剤薬剤が試験され、ＡＱＰ４を遮断する能力が有意に異なることがわかった。ＡＱＰ４発現卵母細胞（図６ａ−ｄ）において、フロセミドは、正常な細胞外の様式で投与された場合、膨潤速度の遮断は、ブメタニドほど有効ではなかった。部位特異的突然変異の結果に基づき、これらの薬剤の提案される細胞内結合部位を試験するよう実験が設計された。ブメタニド、特にフロセミドは、より低い濃度で遮断の改善を示すという観察結果（図６ｅおよびｆ）は、これらの薬剤の推定上の結合部位は、ＡＱＰ４チャネルの細胞内またはその付近にあるという我々の仮説を支持している。さらに、この結果は、ＡＱＰ４遮断薬のための重要なファルマコフォア要素として、フロセミドおよびブメタニドの両方に共通する３−（スルファモイル）安息香酸スキャフォールドの重要性を明らかにした。
【００８４】
この発見は、ブメタニドおよびフロセミドに類似していないトラセミドが、１ｍＭまでの濃度におけるＡＱＰ４発現卵母細胞における膨潤に遮断効果を示さないという発見に一致する。さらに、細胞におけるＮａ−Ｋ−Ｃｌコトランスポーター（ＮＫＣＣ１）に対するこれらのループ系利尿剤の報告されたＩＣ５０値は、これらのＡＱＰ４実験にて観察された値および傾向と異なっている。例えば、フロセミドは、２３μＭの最大半減のブロッキング濃度（ＩＣ５０）を示し、ブメタニドのＩＣ５０は、マウス腎臓集合管細胞株にて０．３３μＭと測定され(Glanville et al., 2001)、一方、潅流された腎臓ヘンレ上行脚（ｋｉｄｎｅｙ  ａｓｃｅｎｄｉｎｇ  ｌｏｏｐｓ  ｏｆ  Ｈｅｎｌｅ）で測定されたトラセミドのＩＣ５０は０．３μＭである(Greger, 1988)。したがって、本発明者はまた、内因性の体積調節応答の寄与は、異種性に豊富なＡＱＰ４を発現する卵母細胞において小さいという結論を出した。
【００８５】
図６は、ブメタニドおよび関連するループ系利尿剤化合物による、ＡＱＰ４発現卵母細胞における遮断の定量分析を示す。（ａ）細胞外のブメタニドによる用量依存的な遮断、およびフロセミドによる１００μＭの同様の遮断。（ｂ）１ｍＭまでの濃度のトラセミドによる遮断の欠如。（ｃ）ｎ値（Ｘ軸の下）および統計的有意性を示す、対応する概略的ヒストグラム。（ｄ）ループ系利尿剤化合物の構造；差異は、ＡＱＰ４遮断に関連する特徴に対する見通しを提供する。（ｅ）卵母細胞へのブロッカーの内部注射の増強された効果、内部作用部位と一致する；（ｆ）ブメタニドおよびフロセミドの「ｉ」細胞内、「ｅ」細胞外の適用のデータの概略的ヒストグラム。（ｅ）。記号：ｏは、未処理の野生型と差がない；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１．独立スチューデント試験。
【００８６】
例２
ＡＱＰ４遮断のインビボの効果
ブメタニドによる遮断の標的としての本来のＡＱＰ４の役割を、星状膠細胞（Ｆｉｇ．８）の初代培養にて試験した。我々は、薬剤を含むまたは含まない１５分のプレインキュベーション後に、初代の海馬カルチャーにおけるラット星状膠細胞の膨張応答を比較した。膨潤は、プレインキュベーションの条件と一致する細胞外ブメタニド（１００μＭ）と共に、またはブメタニドなしで、５０％の低張食塩水で培養プレートの迅速な潅流によって誘導した。膠細胞は、神経膠特異的マーカー（ＧＦＡＰ）に陽性の細胞との形態的比較によって同定した。低張負荷の前およびその間に、タイムラプス画像を１５秒おきに撮影した。応答は、逆位相差顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）を使用してタイムラプスデジタル画像（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＭａｇｎａＦｉｒｅ  ｃａｍｅｒａ  ａｎｄ  ｉｍａｇｅ  ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅ）によって視覚化し、時間の関数として細胞体領域における変化によって決定した；データは、Ｓｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅ（ＮＩＨ）ソフトウェアによって分析した。それぞれのカルチャーは、１度のみの膨潤試験に使用した。コントロールカルチャーは、プレインキュベーションおよび低張食塩水中での等価用量のベヒクル（ＤＭＳＯ）にて、並行に処理した。ＤＭＳＯの用量は、膠細胞応答に大きな効果はなかった（データは示さず）。神経膠の最初の膨潤および続く調節性の体積減少（ＲＶＤ）の両方は、コントロールと比較してブメタニド処理によって減少した。ＲＶＤの効果は、イオン輸送系の遮断から予測されるかもしれないが、最初の膨潤過程の遮断はＡＱＰ４水チャネルに対する直接の効果と一致する。したがって、ＡＱＰ４は、脳浮腫形成の緩和における、ブメタニド（およびより強力な誘導体）の使用の候補となる標的である。
【００８７】
本発明者らは、ＡＱＰ４の遮断は、膨張から星状膠細胞を保護し（図７）、従って、発作後の初期段階におけるそのような膨潤によって引き起こされる脳血液関門の物理的な破壊を減少し、および、続く損傷の拡散を緩和することができることを示した。
【００８８】
図７は、初代の海馬のカルチャー（インビトロで１４−１５日）における、０時における５０％低張食塩水への接触後の星状膠細胞の膨潤に対するブメタニドの保護効果を示す。プロット（左）：Ｓｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅ（ＮＩＨ）ソフトウェアによって定量された最初の体積で標準化した、位相差顕微鏡法によって視覚化された細胞領域。画像（右）：低張食塩水の前（上）および５０％低張食塩水で１５秒（下）における、ブメタニド処理を行った膠細胞（矢印）。
【００８９】
脳浮腫におけるブメタニドの保護効果は以前に文献で報告されたものの(Lam et al., 2005)、この効果は、腎臓機能の変化によってではなく、おそらく脳血液関門における移送機構に作用することによって、Ｎａ−Ｋ−Ｃｌコトランスポーターを遮断すると解釈された。これらの研究において、試験した未処理のラットおよび腎摘出を受けたラットは、中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）のモデルにおいて脳浮腫が縮小したこと、および、使用したブメタニドの３０ｍｇ／ｋｇの用量は、利尿薬としての使用のための正常な薬理用量より高かったことに留意される。それにもかかわらず、ブメタニドのこの用量は、中大脳動脈閉塞を受けたラットにおいて、虚血に誘導された大脳浮腫を有効に縮小した。Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌら(O'Donnell et al., 2004) は、また、核磁気共鳴拡散強調法（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ−ｗｅｉｇｈｔｅｄ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｔｕｄｉｅｓ）を使用し、静脈内のブメタニドが、ＭＣＡＯに誘導された脳虚血の最初の３時間以内に浮腫形成を縮小したことを示した。保護効果は、腎摘出を受けたラットで観察され、従って、腎臓の利尿が間接的に原因ではなかった。ブメタニドは、７．６ｍｇ／ｋｇと同程度に低い用量で有効であった。
【００９０】
梗塞サイズ、脳体積の解剖学的測定、神経学的評価および死亡率は、中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）モデルマウスの結果を評価するために使用できる。げっ歯動物ＭＣＡＯモデル、脳虚血および再灌流の容認されたモデル(Clark et al., 1997)は、大脳動脈閉塞を促進するためにシリコンコートしたフィラメントを使用する(Migliati et al., 2001)。リアルタイムで有効な閉塞を測定する革新的な方法は、血流速度のレーザードップラーモニタリングによる。
【００９１】
図８は、オスのコントロールマウスにおける中大脳動脈閉塞による虚血性脳卒中の負荷の前、間および後における血流速度のドップラーレーザー測定を示す。
【００９２】
マウスにおけるＭＣＡＯモデルのための典型的な手順方法：９−１１週齢の野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊのオスのマウスに麻酔し、脳の血流を、レーザードップラーを使用してベースラインとして記録する。モノフィラメントは内部の共通する頚動脈に設置し、中大脳動脈の心門に向かって進む。フィラメント設置は、脳血流の≧７５％減少によって成功とみなす。図１８によるドップラーの流れの調査は、脳血流における＞８０％の減少は、虚血に十分な期間（〜６０分）維持されたことを示す。虚血の１時間後、フィラメントの収縮によって再灌流を開始すると、血流はベースラインに向けて戻る。２４時間後、動物を、神経学的な障害、行動の障害および一般的な障害の評価に供し、その後、屠殺し、梗塞および反対のコントロール半球の解剖学的な分析に供した。標準的手順は、図９に要約される。この中では、インビボの実験プロトコールにおける標準のためのスケジュールの概要的例が示される。
【００９３】
図１０は、再灌流の１０分前に１回の大量投与で静脈内にブメタニド（６０ｍｇ／ｋｇ）を投与するおよびしない、１時間の虚血および２４時間の再灌流にさらされたマウスにおける、大脳浮腫および梗塞サイズを示す。２％ＴＴＣで染色すると、梗塞した領域は白色となる；領域は、治療群を知らされない研究者により形態測定ソフトウェアを使用して分析される。統計的有意性（ｐ＜０．０６）は基準を満たさないが、見込みを示し、ｎ値が増大によって確証されてよい。
【００９４】
インビボで実証されたＡＱＰ４遮断薬（ブメタニド）の保護効果は、ＡＳＰ４ノックアウトマウスにて観察された浮腫の縮小に一致する。
【００９５】
図１０は、再灌流の開始前１０分にブメタニド（６０ｍｇ／ｋｇ）を適用しおよび適用しない（コントロール）場合の、１時間の閉塞および２４時間の再灌流の後のＭＣＡＯマウスの脳における脳梗塞を示す。（Ａ）梗塞領域の概略的ヒストグラム。（Ｂ）色素（ＴＴＣ）染色の不足により視覚化される、梗塞領域の４つのスライスされた脳の画像。
【００９６】
ブメタニド、フロセミドおよび関連する化合物のアナログの処理。
【００９７】
ＡＱＰ修飾因子としてのブメタニドのエステル、アミドおよびスルホンアミド誘導体：ブメタニドのエステルは２つの方法で作製することができる。第１の方法は、ジアゾメタン、ジアゾエタン等といったジアゾアルカンによりブメタニドの処理である（スキーム１）。例えば、１当量のジアゾメタンによるブメタニドの滴定により、メチルエステル１が生じる。しかしながら、過剰のジアゾメタン（Ｒ１Ｒ２Ｃ＝ＣＨ２）またはその他のジアゾアルカン（経路ａ）による長期の処理は、スルホンアミド基の、Ｎ−置換−およびＮ，Ｎ−二置換−ブメタニドメチルエステル誘導体（それぞれ２および２ｂ）への転換をもたらす。別の方法（経路ｂ）では、メチルエステル１を、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）といった適切な溶剤中で、カリウムｔ−ブトキシドまたは水素化ナトリウムといった非求核性塩基の存在下で、一般式Ｒ１Ｒ２ＣＨ−Ｘのハロゲン化アルキルまたは等価物で処理することで、一般式２のスルホンアミドエステルが得られる。その後のＬｉＯＨによる２のけん化は、アルキルスルホンアミドブメタニドアナログ３をもたらす。スキーム２で概説されるように、酸３のエステルおよびアミド誘導体の形成は、構造４の追加的エステル、アミドおよびプロドラッグの作製のために使用される。
【化５】
2010508300.tif 000007
【００９８】
あるいは、ブメタニドは、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）で処理することができ、得られるイミダゾリド（ｉｍｉｄａｚｏｌｉｄｅ）４はアルコールと反応させ、純度良くエステル５を形成することができる（スキーム２−経路ａ）。
【化６】
2010508300.tif 000008
【００９９】
反対に、イミダゾリド中間体４と一級または二級アミンとの反応により、対応するカルボキサミド誘導体６が得られる（スキーム２−経路ｂ）。
【０１００】
ＡＱＰ修飾因子としてのブメタニドの環置換誘導体の作製：
ブメタニドの環置換誘導体の作製は、文献(Feit, J. Med. Chem. 1970, 13(6) 1071-1075, J. Med. Chem. 1971, 14(2) 432-439) ならびに密接に関連する３，４−二置換５−スルファモイル安息香酸についての文献(Nielsen, J. Med. Chem. 1973, 16(10) 1170-1177, J. Med. Chem. 1974, 18(1) 41-50; Feit, J. Med. Chem. 1974, 17(6) 572-578)に十分開示されている。これらの誘導体への一般的アプローチはスキーム３に概説される。この単純な手順では、市販の４−クロロ−３−ニトロ−５−スルファモイル安息香酸１を、非求核性塩基を添加しまたは添加せず、窒素、酸素または硫黄求核分子（Ｒ１ＸＨ）で処理し、芳香族求核置換生成物２を作製する。ニトロ基の還元は、当該分野において周知の様々な標準条件（接触水素化、Ｎａ２Ｓ２Ｏ４の作用および塩化スズの作用を含む）の使用により行うことが出来る。その後、得られたアニリン誘導体３は、ＮａＢＨ３ＣＮ、ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３といった還元剤の存在下でのアルデヒド（Ｒ２ＣＨＯ）によるアルキル化、または接触水素化を行って、所望の４−Ｒ１Ｘ−３−Ｒ２ＮＨ−５−スルファモイル安息香酸４ａを得てよい（経路ａ）。あるいは、アニリン中間体３は、塩基の存在下または非存在下で、適したハロゲン化アルキルにてアルキル化し、酸性の生成物４ｂもしくは対応するエステル５、またはその両方の混合物を得てよい（経路ｂ）。構造５のエステルは、ＬｉＯＨによるけん化または水性ＨＣｌによる酸性の加水分解によって、対応する酸４ｂに変換してよい。一般構造３のアニリンはまた、それぞれカルボン酸ハロゲン化物（経路ｃ）またはスルホニル基ハロゲン化物（経路ｄ）による処理により、カルボキサミド４ｃまたはスルホンアミド４ｄに変換してよい。
【０１０１】
スキーム３に概説されたブメタニド誘導体は、さらに、スキーム１および２で概説されるように、エステル、プロドラッグ、カルボキサミド、およびスキーム３の一般構造６のスルホンアミド誘導体に修飾してよい。
【化７】
2010508300.tif 000009
【０１０２】
ＡＱＰ修飾因子としてのフロセミドのエステルおよびプロドラッグ誘導体の作製：
フロセミドのエステルは２つの方法で作製することができる。第１の方法は、ジアゾメタン、ジアゾエタン、ジアゾジフェニルメタン、ジアゾ酢酸エチル等といったジアゾアルカンでフロセミドを処理する（スキーム４、経路ａ）。例えば、ジアゾアルカンの１つの相当物によるフロセミドの滴定は、エステル１を産出する。あるいは、フロセミドは、カルボニル化合物ジイミダゾール（ＣＤＩ）で処理することができ、得られるイミダゾリド２は、アルコールと反応させて純度良くエステル１を形成することができる（スキーム４−経路ｂ）。
【化８】
2010508300.tif 000010
【０１０３】
ＡＱＰ修飾因子としてのフロセミドのアミド誘導体の作製：
反対に、一級または二級アミンによるイミダゾリド中間体２の処理は、対応するカルボキサミド誘導体４をもたらす（スキーム４−経路ｃ）。
【０１０４】
ＡＱＰ修飾因子としてのフロセミドのスルホンアミド誘導体の作製：
フロセミドのスルホンアミド誘導体は２つの方法で作製することができる。第１の方法では、過剰のジアゾアルカン試薬によるフロセミドメチルエステル１の延長した処理は、少量のＮ，Ｎ−アルキル−スルホンアミド生成物とともに一級スルホンアミド基のＮ−アルキル−スルホンアミド２への転換がもたらされる（スキーム５−経路ａ）。ＬｉＯＨにより続くけん化は、アルキルスルホンアミドフロセミドアナログ３をもたらした。あるいは、メチルエステル１は、ハロゲン化アルキルおよび非求核性塩基で処理し、Ｎ−アルキル−フロセミド誘導体２を形成することができる（スキーム５−経路ｂ）。
【０１０５】
スキーム２で概説されるように、酸３のエステルおよびアミドの誘導体の形成は、構造４の付加的なエステル、アミドおよびプロドラッグの作製のために使用される。
【化９】
2010508300.tif 000011
【０１０６】
ＡＱＰ修飾因子としてのフロセミドの環置換誘導体の作製：
フロセミド、その他の２，４二置換５−スルファモイル安息香酸の環置換誘導体の作製のための方法は、文献(Sturm, Chemische Berichte 1966, 99(1), 328-344; Feit, J. Med. Chem. 1972, 15(1), 79-83, J. Med. Chem. 1973, 16(2), 127-130)に十分記載される。所望の置換パターンに依存して、適切な市販される２，４−ジハロ−５−スルファモイル安息香酸は、単一またはタンデムの芳香族求核置換反応の際に、付加的選択の所望の順序を達成するために使用できる（スキーム６）。２，４−ジクロロ−５−スルファモイル安息香酸１は、２位における置換の選択性を提供し（経路ａ）、最初の生成物４は、高温および延長した反応時間の条件下で、二置換生成物５とされてよく（経路ｄ）、一方、２−付加生成物６（経路ｂ）または二置換およびタンデムの付加生成物７（経路ｅ）は、出発原料として２，４−ジフルオロ−５−スルファモイル安息香酸２を使用して、より容易に達成することができる（経路ｂ）。あるいは、四置換生成物８は、出発原料として２−クロロ−４−フルオロ−５−スルファモイル安息香酸３を使用して、選択的に達成することができる（経路ｃ）。第２の求核分子は、続いて、中間体８に添加され、この２，４−二置換パターンにバリエーション９を付与する（経路ｆ）。
【０１０７】
スキーム２に概説されるように、カルボン酸のエステルおよびアミドの誘導体の形成は、構造４の付加的なエステル、カルボキサミドおよびプロドラッグの作製に使用される。
【化１０】
2010508300.tif 000012
【０１０８】
１つの再スキャフォールディング戦略では、２，４−二置換−５−スルファモイル安息香酸スキャフォールドは、２−二置換−５−スルファモイル−ピリジン−３−カルボキシル酸スキャフォールドと取り替えられる。２−ヒドロキシニコチン酸１スキャフォールドからの、多目的な中間体エチル２−クロロ−５−クロロスルホニル−ニコチネート４の作製は以前に記述されている(Dunn, 2001)。この手順方法（スキーム７）では、２−ヒドロキシニコチン酸は、発煙硝酸で処理し、スルホン酸２が得られ、これは、エチルアルコールでの還流により、エチルエステル３をもたらす。塩化スルフリル（ＳＯＣｌ２）による３の処理は、５−クロロスルホニル中間体４をもたらす。アンモニア、第一級アミンまたは二級アミンによるスルフォニルクロリド４の処理は、対応するスルホンアミド５を与える。第２の求核分子によるスルホンアミド５の処理は、２−クロロピリジン基での求核置換反応によって６を与える。２−クロロピリジンの反応は、酸素、窒素および硫黄求核分子（Ｚ＝Ｏ、ＮＲまたはＳ）とともに生じることが周知である。
【０１０９】
スキーム２に概説されるように、酸７のエステルおよびアミド誘導体の形成は、付加的なエステル、アミドおよびプロドラッグの作製のために使用される。
【化１１】
2010508300.tif 000013
【０１１０】
ピラゾロピリミジノンの作製の手順（Dunn PJ, Dunn C, WO-01982）
第２の再スキャフォールディング戦略において、ブメタニドまたはフロセミドの中央の６員環は、スキーム8に概説されるように、５員複素環系によって置換される。ルートＡにおいて、市販の４−チアゾールカルボキシル酸１は、サイクリックカルバミック（ｃｙｃｌｉｃ  ｃａｒｍｂａｍｉｃ）無水物中間体を介して、そのエチルエステル２に変換される。適切なアリールまたはアルキルアルデヒドによるアミノ基の還元的アミノ化により、中間体３が得られる。３のスルフォニルクロリドへの酸化は、次亜塩素酸ナトリウムといった当該分野で既知の方法によって行なわれ、この材料は、その後、アミンと反応され、スルホンアミド４が作られる。必要な場合は、４のエチルエステル基は、酸性またはアルカリ性条件の下で加水分解酸し、５が作られる。
【０１１１】
関連する手順（スキーム８ルートＢ）では、市販の５−アミノ−２−メチルスルファニル−１，３−チアゾール−４カルボン酸塩６は、当該分野において周知の方法により、適切なアリールまたはアルキルアルデヒドで還元的にアルキル化され、中間体７が得られる。７のメタ−クロロ−ペルオキシ安息香酸（ＭＣＰＢＡ）による酸化によって、スルホンエステル８が得られ、これは任意に、けん化されてスルホン酸９とされる。
【０１１２】
以前に記述されるように、スキーム２に概説されるように、酸５および９のエステルおよびカルボキサミドの形成は、付加的なエステル、アミド誘導体およびプロドラッグの作製のために使用される。
【化１２】
2010508300.tif 000014
【０１１３】
ヘテロアリールチオールからのヘテロアリールスルホンアミドおよびスルホニル基フルオライドの好都合な作製（Wright, SW.; Hallstrom, KN. Journal of Organic Chemistry 2006, 71(3), 1080-1084.）
同様の再スキャフォールディングアプローチを、その他の５員複素環スキャフォールドの入手のために使用できる（スキーム９）。この場合、市販の２−スルファモイル−イミダゾール−４−カルボン酸１はそのエステル２に変換され、その生成物は、２当量の強塩基の存在下で、適切なアルキルまたはアリールアルキルハロゲン化物とともに反応され、Ｎ−アルキル化生成物３および４が得られる。エステル加水分解３および４を、酸性またはアルカリ性条件のいずれかの下で、任意に行い、それぞれ酸５および６を得ることができる。
【０１１４】
以前に記述されるように、スキーム２に概説されるように、酸５および６のエステルおよびカルボキサミドの形成は、付加的なエステル、アミド誘導体およびプロドラッグの形成のために使用される。
【化１３】
2010508300.tif 000015
【０１１５】
その他の再スキャフォールディングアプローチは、その他の５員複素環スキャフォールドの入手に使用することができる（スキーム１０）。この場合、市販の２−クロロ−５−ニトロ−ベンゼンスルホンアミドは、適切なアルコール、アミンまたはチオールによる芳香族求核置換を行い、２が得られる。ニトロ基の還元は、従来記述された方法によって行うことができ、生成されるアニリンは、カルボン酸誘導体、イソシアン酸塩、イソチオシアン酸塩、塩化カルバモイルまたはスルフォニルクロリドに任意に結合され、それぞれカルボキサミド４、尿素５、チオ尿素６、カルバメート７またはスルホンアミド８が得られる。
【化１４】
2010508300.tif 000016
【０１１６】
フロセミドは、試薬と反応させて、関心ある二環式スキャフォールドを形成することもできる（スキーム１１）。例えば、フロセミドは、亜リンオキシ塩化物の存在下またはマイクロ波による補助の下、ホルムアミドと反応し(Alexandre 2002)（経路ａ）、キナオリン（ｑｕｉｎａｏｌｉｎ）−４−１誘導体１が得られる。あるいは、フロセミドは、酸の存在下で、脱水条件下でアルデヒド２、アセタールまたはケタール３、およびエノールエーテル４、またはエノールエステル５と反応し、一般構造６および７の複素環式化合物を得ることができる（経路ｂ）。これらの後者の薬剤は、アクアポリンチャネルにて直接作用してよく、または、標的結合部位により効率的にフロセミドを送達するプロドラッグとして作用してよい。
【化１５】
2010508300.tif 000017
【０１１７】
２．ＡＱＰ−０００１（構造−Ａ）、ＡＱＰ−０００２（構造−Ｂ）、ＡＱＰ−０００５（構造Ｃ）の作製
反応
【化１６】
2010508300.tif 000018
【表１】
2010508300.tif 000019
【表２】
2010508300.tif 000020
【表３】
2010508300.tif 000021
【表４】
2010508300.tif 000022
【０１１８】
作製：
８ｇｍのＫＯＨを含む６ｍｌの水および６ｍｌのＥｔＯＨを含む１００ｍｌのＲＢＦの溶液に、テフロン（登録商標）連結蒸留ヘッドを装備し、氷水バス中の受け入れフラスコおよび添加漏斗を有した冷蔵冷却器にて、１０ｍｌのＤＣＭを添加し、２相システムを８５℃に加熱した。蒸留が始まると、１０ｍｌのＤＣＭおよび５ｍｌのＥｔＯＨに２．１４ｇ（１０ｍｍｏｌ）のジアザルド（Ｄｉａｚａｌｄ）を含む溶液を１５分にわたって添加した。蒸留溶液が黄色でなくなると、得られた黄色の蒸留物に栓をし、使用するまでアイスバスに貯蔵した。
【０１１９】
２つの実験のために、２つの５０ｍｌのエルレンマイヤーフラスコに１８４ｍｇのブメタニド（０．５ｍｍｏｌ）を用意した。弱い黄色の色が続くまで、第１のフラスコをＣＨ２Ｎ２溶液で処理し、ガス発生が観察された。第２のフラスコは残るＣＨ２Ｎ２溶液で処理し、ガス発生が観察され、栓を緩く付け、週末にわたって静置した。
【０１２０】
７２時間後、第１の溶液は蒸発し、固体が残った。第２の溶液には弱い黄色の色調をなお有していた。ＴＬＣは、第１のフラスコがほぼ純粋な生成物を含み、一方、第２のフラスコが大部分の極性のより小さい生成物および微量の第３のさらに極性の低い生成物を含んだことを示した。主にブメタニドメチルエステルを含むと予想される、第１のフラスコの固形分は、穏やかに加熱して１．５ｍｌのＣＨＣｌ３に溶解し、〜６ｍｌのヘキサンで希釈した。形成された結晶をろ過によって回収し、１４４ｍｇの白色のフレーク状物質が得られた。
【０１２１】
母液を第２のフラスコの生成物と混合し、１ｃｍ  Ｂｉｏｔａｇｅ  ｓａｍｐｌｅｔ ｇｕａｒｄカラムでによるロマトグラフィにかけ、および、Ｓｉ−１２＋Ｍ（１６０ｍｍ）カートリッジを使用してクロマトグラフィにかけた。クロマトグラムは以下のようになった：画分１５−１７は生成物Ｃ（２０ｍｇ）を与え、１８−２２は主生成物Ｂ（１１０ｍｇ）を与え、および２４＋２５は生成物Ａ（２０ｍｇ）を与えた。  
生成物の収量は、(140+20)=160 mg (A), 110 mg (B), and 20 mg (C)であり；それぞれ、AQP-0001, AQP-0002, AQP-0005。  
(A) NMR AQP-0001
'HNMR (300MHz, CDCl3) 0.80ppm (t, J=10Hz, 3H), 1.19ppm (m, 2H), 1.45ppm (m,2H), 2.68ppm (bs, 1H), 3.14ppm (q, J= 6.6, 2H), 3.91ppm (t, J=6.6Hz, 1H), 4.1ppm (s, 3H), 4.98ppm (s, 1H), 6.92ppm (d, J=7.8Hz, 2H), 7.03ppm (t, 7.2Hz, 1H), 7.34ppm (d, J=7.8Hz, 1H), 7.43ppm (t, 7.2Hz, 1H), 7.55ppm (s, 1H), 7.98ppm (s, 1H)
13CNMR (75MHz, CDCl3) 14.02, 20.16, 31.32, 43.05, 52.89, 55.23, 115.72, 116.76, 117.07, 124.20, 128.40, 130.51, 136.45, 140.19, 142,59, 156.07, 166.35.
(B) NMR AQP-0002
'HNMR (300MHz, CDCl3) 0.80ppm (t, J=10Hz, 3H), 1.19ppm (m, 2H), 1.45ppm (m,2H), 2.55ppm (d, J= 5Hz, 3H), 3.14ppm (q, J= 6.6, 2H), 3.91ppm (t, J=6.6Hz, 1H), 4.1ppm (s, 3H), 4.98ppm (s, 1H), 6.92ppm (d, J=7.8Hz, 2H), 7.03ppm (t, 7.2Hz, 1H), 7.34ppm (d, J=7.8Hz, 1H), 7.43ppm (t, 7.2Hz, 1H), 7.55ppm (s, 1H), 7.98ppm (s, 1H)
13CNMR (75MHz, CDCl3) 14.02, 20.16, 29.98, 31.32, 43.05, 52.89, 55.23, 115.72, 116.76, 117.07, 124.20, 128.40, 130.51, 136.45, 140.19, 142,59, 156.07, 166.35.
(C) NMR AQP-0005
'HNMR (300MHz, CDCl3) 0.80ppm (t, J=10Hz, 3H), 1.19ppm (m, 2H), 1.45ppm (m,2H), 2.78ppm (s, 6H), 3.14ppm (q, J= 6.6, 2H), 3.91ppm (t, J=6.6Hz, 1H), 4.1ppm (s, 3H), 4.98ppm (s, 1H), 6.92ppm (d, J=7.8Hz, 2H), 7.03ppm (t, 7.2Hz, 1H), 7.34ppm (d, J=7.8Hz, 1H), 7.43ppm (t, 7.2Hz, 1H), 7.55ppm (s, 1H), 7.98ppm (s, 1H)
13CNMR (75MHz, CDCl3) 14.04, 20.19, 31.35, 37.83, 43.45, 52.85, 55.23, 115.72, 116.76, 117.07, 124.20, 128.40, 130.51, 136.45, 140.19, 142,59, 156.07, 166.35.
３．ＡＱＰ−０００３の作製
反応
【化１７】
2010508300.tif 000023
【表５】
2010508300.tif 000024
【表６】
2010508300.tif 000025
【表７】
2010508300.tif 000026
【表８】
2010508300.tif 000027
【０１２２】
作製：
２ｍｌの３：１のＭｅＯＨ／水に７０ｍｇ（０．１８ｍｍｏｌ）のエステルおよび４２ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ）のＬｉＯＨ．Ｈ２Ｏを含んだ混合物を、室温で２４時間撹拌した。１．０ｍｌの１ＮのＨＣｌを添加し、白い沈殿物をろ過し、吸収乾燥させて７０ｍｇの生成物を得た。1H NMR gaf_2005_36_1および13C NMR gaf_2005_36_2は、所望する生成物と一致していた。収量は本質的に定量的であった。化合物はＢＩＯ５＿ＡＱＰ＿ＧＡＦ＿００３＿０１として登録した。
【０１２３】
NMR AQP-0003
'HNMR (300MHz, CDCl3) 0.80ppm (t, J=10Hz, 3H), 1.19ppm (m, 2H), 1.45ppm (m,2H), 2.55ppm (d, J= 5Hz, 3H), 3.14ppm (q, J= 6.6, 2H), 3.91ppm (t, J=6.6Hz, 1H), 4.98ppm (s, 1H), 6.92ppm (d, J=7.8Hz, 2H), 7.03ppm (t, 7.2Hz, 1H), 7.34ppm (d, J=7.8Hz, 1H), 7.43ppm (t, 7.2Hz, 1H), 7.55ppm (s, 1H), 7.98ppm (s, 1H)
13CNMR (75MHz, CDCl3, DMSO-d6)13.90, 19.98, 29.56, 31.13, 43.17, 115.56, 116.87, 117.07, 118.70, 123.48, 128.26, 130.24, 133.08, 140.16, 142,50, 156.34, 167/60。
【０１２４】
４．ＡＱＰ−０００４の作製
反応
【化１８】
2010508300.tif 000028
【表９】
2010508300.tif 000029
【表１０】
2010508300.tif 000030
【表１１】
2010508300.tif 000031
【表１２】
2010508300.tif 000032
【０１２５】
作製：
磁気撹拌子を含む１０ｍｌのＲＢＦに、ブメタニド（１６２ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）および３．０ｍｌのＥｔＯＡｃを添加した。混合物は、２５度で、アルゴン下で撹拌し、９７ｍｇ（０．６０ｍｍｏｌ）のカルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）を添加した。混合物は、均質になるまでホットエアーガン（ｈｏｔ  ａｉｒ  ｇｕｎ）で加熱し、その後冷却させた。冷却の際、新たな沈殿が形成し、ＴＬＣによって、新たな、極性のより低い、明るい青色の蛍光性スポットが示された。１０分間の静置後、３ｍｌのＥｔＯＡｃに８６ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ）のピペラジンを含む溶液を添加した。混合物は撹拌子で撹拌し、一晩撹拌した。反応物の小量のアリコットを、２ドラムバイアル中のＥｔＯＡｃ（１ｍｌ）に注ぎ、２ｘ１ｍｌの水で洗浄し、１ｍｌの塩水で振盪し、有機層をＴＬＣで分析した。ＴＬＣによれば、出発材料は残っておらず、主要なより極性のスポットがみられた。
【０１２６】
溶液は水に注入し、２５ｍｌのＥｔＯＡｃに抽出し、水（２ｘ２０ｍｌ）および塩水（２０ｍｌ）で洗浄し、その後ＭｇＳＯ４で乾燥し、濃縮した。
【０１２７】
粗製生成物は、１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭを使用する５０ｍｌのシリカゲルによるフラッシュ・クロマトグラフィーによって精製し、淡黄色の泡状の１５０ｍｇのきれいな分離が得られた。
【０１２８】
ＮＭＲは所望の生成物と一致していた。サンプルはＡＱＰ−０００４と名付けた。
【０１２９】
NMR AQP-0004
'HNMR (300MHz, CDCl3) 0.80ppm (t, J=10Hz, 3H), 1.19ppm (m, 2H), 1.45ppm (m,2H), 3.0ppm (bs, 4H), 3.14ppm (q, J= 6.6, 2H), 3.50 (bs, 2H), 3.80 (bs, 2H), 3.91ppm (t, J=6.6Hz, 1H), 6.92ppm (d, J=7.8Hz, 2H), 7.03ppm (t, 7.2Hz, 1H), 7.34ppm (s, 2H), 7.45ppm (t, 7.2Hz, 1H), 7.55ppm (s, 1H)
13CNMR (75MHz, CDCl3) 14.02, 20.16, 29.98, 31.32, 43.05, 52.89, 55.23, 115.72, 116.76, 117.07, 124.20, 128.40, 130.51, 136.45, 140.19, 142,59, 156.07, 166.35.
FABMS 434 (M+H)+ ; HRMS calcd for C21H29N4O4S+ 433.19 ; found 433.40
参照、Ford, R.A., et. al., J. Med. Chem. 1986, 29, 538-549 (page 548 prep of 9b); Schoenfield, R.C. and Ganem, B., Tet. Lett., 1998, 39, 414704150。
【０１３０】
５．ＡＱＰ−０００６の作製
【化１９】
2010508300.tif 000033
【表１３】
2010508300.tif 000034
【表１４】
2010508300.tif 000035
【表１５】
2010508300.tif 000036
【表１６】
2010508300.tif 000037
【０１３１】
作製：
磁気撹拌子を含む１０ｍｌのＲＢＦに、ブメタニド（１８２ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）を含むＥｔＡＯｃ（３ｍｌ）を添加した。この溶液をアルゴン下で撹拌した。１，１’−カルボニルジイミダゾール（１０９ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）を上記溶液に添加し、均質になるまで加熱した。混合物を室温まで冷却させた。冷却により、白色の沈殿物が形成された。ブメタニドに対する１００％のＥｔＡＯｃにおけるＳｉＯ２のＴＬＣは、より極性の低いスポットを示した。
【０１３２】
モルホリン（９７ｍｇ、１ｍｍｏｌ）を、ピペットを使用して、室温で上記溶液に添加した。溶液は再び均質になった。一晩撹拌した。１００％のＥｔＯＡｃにおけるＳｉＯ２のＴＬＣは、より極性の低い生成物を示した。
【０１３３】
２５ｍｌのＥｔＯＡｃに反応混合物を抽出した。２ｘ２０ｍｌ蒸留水および２０ｍｌの塩水で洗浄した。所望の画分を組み合わせて、無水ＭｇＳＯ４で乾燥させた。ろ過および濃縮した。最小量のＥｔＯＡｃで溶解し、ヘキサンから再度沈殿させた。沈殿物をろ過し、減圧乾燥させた。
【０１３４】
２滴のＭｅＯＤをともなうＣＤＣｌ３におけるＨおよび１３ＣのＮＭＲ。高解像度質量スペックを適用した。限定試薬、ブメタニドに基づいて８８％の収率を得た。サンプルはＮＴＦ−２００６−１−００４Ａと名付けた。
【０１３５】
'HNMR (300 MHz, CDCl3) 0.81(t, J= 7.5Hz, 3H), 1.18 (m, J= 7.5 Hz, 2H), 1.41 (m, J=7.2 Hz, 2H), 3.05 (t, J= 6.9 Hz, 2H), 3.75 (br m, 8H), 5.11(s, 1H), 6.92 (br t, 1H), 6.95 (br d, J= 1.5 Hz, 2H), 7.10 (t, J= 7.5 Hz, 2H), 7.32 (td, J= 9Hz, 2H) 13C 
NMR (75 MHz, CDCl3) 14.00, 20.17, 31.26, 43.27, 49.94, 67.22, 113.44, 114.74, 115.65, 124.14, 130.48, 133.68, 136.33, 156.16, 169.56   
FABMS 434 (M+H)+ ; HRMS calcd for C21H28N3O5S+ 434.1750 ; found 434.1757。
【０１３６】
６．イミダゾリド中間体の作製
【化２０】
2010508300.tif 000038
【表１７】
2010508300.tif 000039
【表１８】
2010508300.tif 000040
【表１９】
2010508300.tif 000041
【表２０】
2010508300.tif 000042
【０１３７】
作製：
清潔な撹拌子を含む１０ｍｌのＲＢＦに、ボトルから直接ブメタニド（９１０ｍｇ、２．４９ｍｍｏｌ）を添加した。ＥｔＯＡｃ（１５ｍｌ）にブメタニドを溶解した。アルゴン下で撹拌した。１，１−カルボニルジイミダゾール（４８５ｍｇ、２．９５ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を、均一になるまで加熱し、アルゴン下で撹拌した。反応混合物を冷やすことで、白い沈殿が形成された。１００％のＥｔＯＡｃにおけるＳｉＯ２のＴＬＣは、より極性の低い青緑色の蛍光性スポットを示した。
【０１３８】
沈殿物を減圧しながらろ過した。ＥｔＯＡｃで徹底的に洗浄した。アルゴン下で乾燥させ、出発材料に対して９９％の収率で白色粉末を得た。ＣＤＣｌ３における‘Ｈおよび１３ＣのＮＭＲは、生成物と一致していた。
【０１３９】
'H NMR (300 MHz, CDCl3) 0.82 (t, J=7.5 Hz, 3H), 1.14 (m, J= 7.5 Hz, 2H), 1.43 (m, J= 6.6 Hz, 2H), 3.08 (t, J= 6 Hz, 2H), 6.97 (d, J= 7.2 Hz, 2H), 7.18 (m, 2H), 7.34 (m, J= 6.9 Hz, 2H), 7.58 (s, 1H), 7.64 (m, 1H), 8.14 (s, 1H) 
13C NMR (75 MHz, CDCl3) 13.94, 20.11, 31.13, 43.25, 50.0, 50.05, 77.63, 115.75, 116.34, 118.46, 130.64, 138.55。
【０１４０】
７．ＡＱＰ−０００７の作製
【化２１】
2010508300.tif 000043
【表２１】
2010508300.tif 000044
【表２２】
2010508300.tif 000045
【表２３】
2010508300.tif 000046
【表２４】
2010508300.tif 000047
【０１４１】
作製：
磁気撹拌子を含む１０ｍｌのＲＢＦに、２−（４−メチルピペラジン−１−イル）エタンアミン（１４３ｍｇ、１ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（１ｍｌ）を添加した。アルゴン下、室温で撹拌させた。１，１’−カルボニルジイミダゾール（２０７ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）を、スパチュラを使用して、上記溶液に添加した。白い沈殿の形成が開始した。イミダゾリドに対する１００％のＭｅＯＨにおけるＳｉＯ２のＴＬＣは、非常に極性のある生成物を示した。
【０１４２】
溶液をアルゴン下で一晩撹拌させた。ＴＬＣは、反応の完了を示した。２５ｍｌのＥｔＯＡｃに混合物を抽出した。２ｘ２０ｍｌの蒸留水および２０ｍｌの塩水で洗浄した。所望の画分を組み合わせて、無水ＭｇＳＯ４で乾燥させた。減圧下でろ過および濃縮した。最少量のＥｔＯＡｃで溶解し、ヘキサンから再度沈殿させた。無色の固体として生成物をろ過し、減圧乾燥させて、６９％の収率を得た。
【０１４３】
'H and 13C NMR in CDCl3 with 2 drops of MeOD. Sample was designated NTF-2006-1-006A 
'HNMR (300 MHz, CDCl3) 0.78 (t, J= 7.5 Hz, 3H), 1.08 (m, J= 7.5 Hz, 2H), 1.38 (m, J= 7.5 Hz,4H), 1.47 (br s, 4H), 2.27 (s, 3H), 2.47 (br t,4H),2.54 (br t, 4H), 2.60 (t, J=6 Hz, 3H), 3.08 (m, J= 9.0 Hz, 2H), 3.52 (m, J= 5.7 Hz, 2H), 6.89 (d, J= 9.0 Hz, 2H), 7.07 (t, J= 6.9 Hz, 1H), 7.28 (t, J= 8.4 Hz, 2H), 7.45 ( br d,J=1.8 Hz, 1H), 7.55 (br d, 1H) 
13C NMR (75 MHz, CDCl3) 14.00, 20.16, 31.32, 36.84, 43.26, 43.36, 46.23, 53.07, 55.21, 56.99, 112.96, 115.64, 124.05, 130.44, 132.81, 136.18, 142.79, 142.84, 156.20   
FABMS 490 (M+H)+ ;HRMS  calcd for C24H36N5O4S+ 489.2410 ; found 490.2510。
【０１４４】
８．ＡＱＰ−０００８の作製
【化２２】
2010508300.tif 000048
【表２５】
2010508300.tif 000049
【表２６】
2010508300.tif 000050
【表２７】
2010508300.tif 000051
【表２８】
2010508300.tif 000052
【０１４５】
作製：
磁気撹拌子を含む１０ｍｌのＲＢＦに、１−メチルピペラジン（１００ｍｇ、１ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（１ｍｌ）を添加した。アルゴン下、室温で撹拌した。スパチュラを使用して、１，１’−カルボニルジイミダゾール（２０７ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を撹拌して、均質にした。イミダゾリドに対するＥｔＯＡｃにおける１０％のＭｅＯＨにおけるＳｉＯ２のＴＬＣは、非常に極性のある生成物のスポットを示した。
【０１４６】
アルゴン下、室温で溶液を一晩撹拌した。出発物質であるイミダゾリドに対するＴＬＣは、反応の完了を示した。２５ｍｌのＥｔＯＡｃに反応混合物を抽出した。２ｘ２０ｍｌの蒸留水および２０ｍｌの塩水で洗浄した。所望の画分を組み合わせて、無水ＭｇＳＯ４で乾燥させた。ろ過し、減圧下で濃縮した。最少量のＥｔＯＡｃに溶解し、ヘキサンから再度沈殿した。無色の生成物をろ過し、真空の下で乾燥させ、ＮＴＦ−２００６−１−００７と名付けた固体を得た。２滴のＭｅＯＤを伴うＣＤＣｌ３における‘Ｈおよび１３ＣのＮＭＲ。高解像度質量スペックに供した。
【０１４７】
'HNMR (300 MHz, CDCl3) 0.81 (t, J=7.5 Hz, 3H), 1.15 (m, J=7.5 Hz, 2H), 1.40 (m, J=7.5 Hz, 2H), 2.32(s, 3H), 2.45 (br d, 4H) , 3.05 (m, J=6 Hz, 2H), 3.64 (br 6, 4H), 3.93 (t, J=5.4 Hz, 1H), 5.29 (br s, 2H), 6.94 (br m,  3H),  7.09 (t, J=9 Hz, 1H), 7.24(s, 1H), 7.31 (t, J=9Hz, 2H) 
13C NMR (75 MHz, CDCl3) 13.56, 19.78, 30.82, 42.81, 42.91,45.82, 112.97, 114.18, 115.24, 123.55, 129.97, 133.53, 135.95, 137.27, 142.49, 142.54, 155.80, 169.05  
FABMS 447 (M+H)+ ; HRMS  calcd for C22H31N4O4S+ 447.2066; found 447.2060。
【０１４８】
９．ＡＱＰ−０００９の作製
【化２３】
2010508300.tif 000053
【表２９】
2010508300.tif 000054
【表３０】
2010508300.tif 000055
【表３１】
2010508300.tif 000056
【表３２】
2010508300.tif 000057
【０１４９】
作製：
撹拌子を含む１０ｍｌのＲＢＦに、４−（２−アミノエチル）チオモルホリン１，１−ジオキシド（１７８ｍｇ、１ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（１ｍｌ）を添加した。溶液は、アルゴン下、室温で撹拌した。上記溶液に、スパチュラを使用して、１，１’−カルボニルジイミダゾール（２０７ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）を添加した。溶液は濁った。イミダゾリドに対する１００％のＭｅＯＨにおけるＳｉＯ２のＴＬＣ。
【０１５０】
アルゴン下、室温で反応物を一晩撹拌した。再び同じ条件溶媒系を使用したＴＬＣは、同一のスポットを示した。２５ｍｌのＥｔＯＡｃに抽出された。２ｘ２０ｍｌの蒸留水および２０ｍｌの塩水で洗浄した。所望の画分を組み合わせて、無水ＭｇＳＯ４で乾燥させた。ろ過し、減圧下で濃縮した。最小量のＥｔＯＡｃに溶解し、ヘキサンから再沈殿させた。生成物をろ過し、減圧下で乾燥させ、無色の固形生成物を得た。２滴のＭｅＯＤを伴うＣＤＣｌ３における‘Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲ。高解像度質量スペックに供した。サンプルはＮＴＦ−２００６−１−００８Ａと名付けた。
【０１５１】
'HNMR (300 MHz, CDCl3) 0.80 (t, J=6.3 Hz, 3H), 1.13 (m, J=7.5 Hz, 2H), 1.25 (br d, J= 7.2 Hz, 1H), 1.42 (m, J=7.2 Hz, 2H), 2.73 (t, J= 6 Hz, 2H), 3.04 (br, 8H), 3.08 (m, 2H), 3.49 (t, J=6 Hz, 2H),  5.60 (br s, 1H), 6.90 (d, J=9 Hz, 2H),  7.08 (t, J=6 Hz, 1H), 7.29 (t,J=  9 Hz, 2H), 7.43 (d, J= 1.5 Hz, 1H), 7.53 (d, J= 1.8 Hz, 1H)  
13C NMR (75 MHz, CDCl3) 8.0, 20.0, 31.0, 37.5, 43.0, 51.0, 52.0, 55.5, 61.0, 112.5, 115.7, 124.0, 130.5, 132.5, 136.0, 139.0, 142.5, 156.0, 167  
FABMS 525 (M+H)+ ;  HRMS calcd for C23H33N4O6S2+  525.1842 ; found 525.1819。
【０１５２】
１０．ＡＱＰ−００１０の作製
【化２４】
2010508300.tif 000058
【表３３】
2010508300.tif 000059
【表３４】
2010508300.tif 000060
【表３５】
2010508300.tif 000061
【表３６】
2010508300.tif 000062
【０１５３】
作製：
磁気撹拌子を含む１０ｍｌのＲＢＦに、Ｎ−エチルアミンモルホリン（１３０ｍｇ、１ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（１ｍｌ）を添加した。アルゴン下、室温で溶液を撹拌した。上記溶液に、スパチュラを使用して、１，１’−カルボニジイミダゾール（２０７ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）を添加した。ＥｔＯＡｃにおける１０％のＭｅＯＨにおけるＳｉＯ２のＴＬＣは、非常に極性のあるスポットを示した。
【０１５４】
アルゴン下、室温で一晩撹拌した。ＴＬＣは、反応の完了を示した。出発原料の跡は残されなかった。
【０１５５】
２５ｍｌのＥｔＯＡｃへ反応混合物を抽出させた。２ｘ２０ｍｌの蒸留水および２０ｍｌの塩水で有機層を洗浄した。所望の画分を組み合わせて、無水ＭｇＳＯ４で乾燥させた。ろ過し、減圧下で濃縮した。最少量のＥｔＯＡｃに再び溶解し、ヘキサンから再度沈殿させた。沈殿物をろ過し、ＮＴＦ−２００６−１−００９Ａと名付けた白い固体を得た。２滴のＭｅＯＤを伴うＣＤＣｌ３における‘Ｈおよび１３ＣのＮＭＲ。高解像度質量スペックに供した。
【０１５６】
'HNMR (300 MHz, CDCl3) 0.82 ( t, J=6 Hz, 3H), 1.11 ( m, J= 6 Hz, 2H), 1.37 ( m, J=6 Hz, 2H), 2.50 ( dd, 4H), 2.60 (t,J=3 Hz, 2H), 3.10 ( br dd,  2H), 3.55 (br dd, 2H), 3.70 (br dd, 4H), 3.89 (br t,  1H), 5.40 (br s, 1H), 6.87 (d, J=6 Hz, 2H), 7.05 (br t, 1H), 7.26 (br t, 1H), 7.39 (br d, 1H), 7.50 (br d, 1H)   
13CNMR (75MHz, CDCl3) 13.54, 19.69, 30.86, 36.33, 42.88, 53.28, 56.98, 66.71, 112.44, 115.08, 115.19, 123.56, 129.95, 132.29, 135.68, 138.53, 142.34, 155.72, 166.33   
FABMS  477 (M+H)+ ; HRMS calcd for C23H33N4O5S+ 477.2172 ; found 477.2175。
【０１５７】
ＡＱＰ−００１１の作製
【化２５】
2010508300.tif 000063
【表３７】
2010508300.tif 000064
【表３８】
2010508300.tif 000065
【表３９】
2010508300.tif 000066
【表４０】
2010508300.tif 000067
【０１５８】
作製：
磁気撹拌子を含む１０ｍｌのＲＢＦに、３−アミノメチルピリジン（１０８ｍｇ、１ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（１ｍｌ）を添加した。アルゴン下、室温で撹拌した。上記溶液に、１，１’−カルボニルジイミダゾール（２０７ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）を添加した。イミダゾリドに対する１０％のＭｅＯＨを含むＥｔＯＡｃにおけるＴＬＣを、得られた溶液について行った。
【０１５９】
アルゴン下一晩撹拌した。反応物を室温で維持した。１２時間後のＴＬＣは、反応の完了を示した。
【０１６０】
２５ｍｌのＥｔＯＡｃに抽出した。２ｘ２０ｍｌの蒸留水および２０ｍｌの塩水で有機層を洗浄した。所望の画分を組み合わせて、無水ＭｇＳＯ４で乾燥させた。ろ過し、減圧下で濃縮した。最少量のＥｔＯＡｃにて得られた粗製油を溶解し、ヘキサンから再度沈殿した。得られた沈殿をろ過し、減圧下で乾燥させ、ＮＴＦ−２００６−１−０１０Ａと名付けられる白い固体を得た。２滴のＭｅＯＤを伴うＣＤＣｌ３における‘Ｈおよび１３ＣのＮＭＲ。高解像度質量スペックに供した。
【０１６１】
'HNMR (300 MHz, CDCl3) 0.74 (t, J= 7.5 Hz, 3H), 1.07 (m, J= 7.5 Hz, 2H), 1.34 (m, J= 7.5 Hz, 2H), 2.59 (s, 4H), 3.03 (t, J= 6.6 Hz, 2H), 4.56 (d, J= 5.7 Hz), 6.85 (dt, J1= 7.5 Hz, J2= 2.1 Hz, 2H), 7.02 (tt, J1= 5.7 Hz, J2= 1.2 Hz, 1H), 7.26 (m, 1H), 7.43 (d, J= 2.1 Hz, 1H),  7.53 (d, J= 2.1 Hz, 1H), 7.20 (dt, J17.8 Hz, J2= 1.8 Hz, 1H), 8.01 (t, J= 4.5 Hz, 1H), 8.40 (dd, J1= 4.8 Hz, J2= 1.5 Hz, 1H), 8.50 ( br d, J= 4.2 Hz, 1H) 
13C NMR (75 MHz, CDCl3) 13.93, 20.09, 31.25, 41.69, 43.19, 113.03, 115.59, 115.76, 123.93, 124.15, 130.34, 132.11, 134.97, 136.12, 142.79, 148.42, 149.17, 156.19 
FABMS 455 (M+H)+ ; HRMS calcd for C23H27N4O4S+ 455.1753 ; found 455.1750。
【０１６２】
ＡＱＰ−００１２の作製
【化２６】
2010508300.tif 000068
【表４１】
2010508300.tif 000069
【表４２】
2010508300.tif 000070
【表４３】
2010508300.tif 000071
【表４４】
2010508300.tif 000072
【０１６３】
作製：
磁気撹拌子を含む２５ｍｌのＲＢＦに、２−アミノピリジン（０．０９４ｇ、０．９９９ｍｍｏｌ）を添加し、１ｍｌのＤＣＭに溶解した。上記溶液を、アルゴン下、室温で撹拌した。上記溶液に、ブメタニドのイミダゾリド（０．２０７ｇ、０．４９９ｍｍｏｌ）を添加し、撹拌した。
【０１６４】
ＥｔＯＡｃへ反応混合物を抽出し、２ｘ２０ｍｌの蒸留水および２ｘ２０ｍｌの塩水で洗浄した。ＭｇＳＯ４下で乾燥した。ろ過し、ロータリーエバポレーターで処理した。最少量のＥｔＯＡｃにとり、ヘキサンから再度沈殿させ、やや黄色の粉末を得た。
【０１６５】
'H NMR in (CDCl3, 300MHz) 1.80 ppm (t, J=10Hz, 3H), 1.13ppm (m, 2H), 1.37ppm (m, 2H) 1.90ppm (s, br, 1H), 3.04ppm (t, J= 7Hz, 2H), 6.92ppm (d, J= 7.8Hz, 1H), 7.09ppm (d, J=7.8Hz, 1H), 7.13ppm (dd, 1H), 7.23ppm (dd,1H), 7.57 (d, J=13.5ppm, 1H), 8.11ppm (s,1H)
13CNMR (75MHz, DMSO-d6) 9.25, 15.39, 26.51, 38.53, 38.63, 44.77, 45.06, 45.34, 45.62, 45.91, 110.93, 111.99, 112.18, 117.13, 119.40, 123.59, 125.72, 130.56, 131.76, 135.46, 137.79, 151.32, 161.73
FABMS 441(M+H)+ ; HRMS calcd for C22H25N4O4S+ 441.16 ; found 441.1600。
【０１６６】
ＡＱＰ−００１３の作製
【化２７】
2010508300.tif 000073
【表４５】
2010508300.tif 000074
【表４６】
2010508300.tif 000075
【表４７】
2010508300.tif 000076
【表４８】
2010508300.tif 000077
【０１６７】
作製：
磁気撹拌子を含む２５ｍｌのＲＢＦに、４−アミノピリジン（０．０９４ｇ、０．９９６ｍｍｏｌ）を添加し、１ｍｌのＤＣＭに溶解した。アルゴン下、室温で撹拌させた。上記溶液に、ブメタニドのイミダゾリド（０．２０７ｇ、０．４９８ｍｍｏｌ）を添加した。白い沈殿が形成された。上記溶液を、アルゴン下、室温で撹拌した。
【０１６８】
ＥｔＯＡｃに抽出した。水（２ｘ２０ｍｌ）および塩水（２ｘ２０ｍｌ）で洗浄した。有機層を組み合わせ、ＭｇＳＯ４の下乾燥し、ろ過した。減圧下で濃縮し、やや黄色の白い固体を得た。ＭｅＯＤにおけるＮＭＲ。
【０１６９】
'HNMR (300MHZ, MeOD) 0.75ppm (t, J= 5.4Hz, 3H), 1.10ppm (m, 2H), 1.30ppm (m, 2H), 2.85ppm (t, br, 2H), 6.76ppm (dd, 2H), 7.02ppm (t, br, J=6.9Hz, 1H), 8.00ppm (d, J=6.6Hz, 1H)
13CNMR (75MHz, DMSO-d6) 15.52, 22.26, 33.62, 45.27, 56.23, 111.56, 117.75, 131.89, 139.31, 142.72, 144.04, 159.54, 163.02。
【０１７０】
ＡＱＰ−００１４の作製
【化２８】
2010508300.tif 000078
【表４９】
2010508300.tif 000079
【表５０】
2010508300.tif 000080
【表５１】
2010508300.tif 000081
【表５２】
2010508300.tif 000082
【０１７１】
作製：
磁気撹拌子を含む２５ｍｌのＲＢＦに、イミダゾリド（０．２０７ｇ、０．４９９ｍｍｏｌ）を添加し、１ｍｌのＤＣＭに溶解した。アルゴン下、撹拌した。アミン（０．１０８ｇ、０．９９９ｍｍｏｌ）を添加し、一晩撹拌した。１００％のＥｔＯＡｃにおけるＴＬＣ。より極性のあるスポットが現われた。ＥｔＯＡｃへ抽出し、水（２ｘ２０ｍｌ）および塩水（２ｘ２０ｍｌ）で洗浄した。減圧下で濃縮した。最小量のＥｔＯＡｃに溶解し、ヘキサンから再沈殿させ、白い固体を得た。
【０１７２】
'HNMR (CDCl3, 300MHz) 0.82ppm (t, J=10Hz, 3H), 1.12ppm (m, 2H), 1.39ppm (m, 2H),  4.59ppm (s,br, 2H), 6.86ppm(d, J8Hz, 2H), 7.01ppm (t, J=7.8Hz, 1H), 7.26ppm (m, 2H), 7.33ppm (d, J=7.8Hz, 1H), 7.48ppm (s, 1H), 7.70ppm (s, 1H), 7.76ppm (t, 7.8Hz, 1H), 8.51ppm (t,J=1.8Hz, 1H)
13CNMR (75MHz, DMSO-d6) 14.38, 14.82, 20.16, 21.46, 31.14, 42.79, 45.51, 60.58, 114.06, 114.27, 116.39, 121.81, 122.94, 123.02, 129.91, 132.25, 137.56, 138.18, 139.19, 143.01, 149.67, 157.28, 159.55, 159.56, 166.24
FABMS 455(M+H)+; HRMS calcd for C23H27N4)4S+ 455.18 ; found 455.17。
【０１７３】
ＡＱＰ−００１５の作製
【化２９】
2010508300.tif 000083
【表５３】
2010508300.tif 000084
【表５４】
2010508300.tif 000085
【表５５】
2010508300.tif 000086
【表５６】
2010508300.tif 000087
【０１７４】
作製：
磁気撹拌子を含むＲＢＦに、イミダゾリド（０．２０７ｇ、０．４９９ｍｍｏｌ）を添加し、１ｍｌのＤＣＭに溶解した。アルゴン下で撹拌した。上記溶液に、アミン（０．１０８ｇ、０．９９９ｍｍｏｌ）を撹拌し、室温で一晩撹拌した。１００％のＥｔＯＡｃにおけるＴＬＣ。ＴＬＣのより極性のある生成物によって示されるとおり、反応は２、３時間で完了した。ＥｔＯＡｃ（２５ｍｌ）へ抽出し、水（２ｘ２０ｍｌ）および塩水（２ｘ２０ｍｌ）で洗浄した。有機層を組み合わせ、ＭｇＳＯ４で乾燥させた。ろ過し、濃縮した。最少量のＤＣＭに溶解し、ヘキサンから再度沈殿させ、無色の固体を得た。
【０１７５】
'HNMR (CDCl3, 300MHz) 0.82ppm (t, J=10Hz, 3H), 1.15ppm (m, 2H), 1.35ppm (m,2H), 4.51ppm (s,2H), 6.86ppm( d, J=7.8Hz, 2H),7.01ppm (d, J=12.9Hz, 1H), 7.24ppm (d, J=6.9Hz, 1H), 7.29ppm (t, J=6.9HzHz, 1H),7.30ppm (d, J=2.4Hz, 2H), 7.45ppm (s, 1H), 7.68ppm (t, J=2.1Hz, 1H), 8.51 (dd, 2H)
13CNMR (75MHz, DMSO-d6) 19.16, 19.59, 24.91, 26.25, 35.86, 47.34, 47.54, 65.33, 118.80, 118.93, 121.16, 127.72, 127.78, 134.67, 136.79, 142.96, 144.03, 147.79, 154.18, 155.12, 162.02, 171.10
FABMS 455(M+H)+ ; HRMS calcd for C23H27N4O4S+ 455.18; found 455.17。
【０１７６】
ＡＱＰ−００１６の作製
【化３０】
2010508300.tif 000088
【表５７】
2010508300.tif 000089
【表５８】
2010508300.tif 000090
【表５９】
2010508300.tif 000091
【表６０】
2010508300.tif 000092
【０１７７】
作製：
磁気撹拌子を含む２５ｍｌのＲＢＦに、ブメタニドのイミダゾリド（０．２０７ｇ、０．９９ｍｍｏｌ）を添加し、１ｍｌのＤＣＭに溶解した。上記溶液に、アミン（０．１７２ｇ、０．９９９ｍｍｏｌ）に添加し、アルゴン下、室温で一晩撹拌した。ＥｔＯＡｃにおける１０％のＭｅＯＨにおけるＴＬＣは非常に極性のあるスポットを示した。ＥｔＯＡｃへ反応混合物を抽出し、水（２ｘ２０ｍｌ）で洗浄し、その後塩水（２ｘ２０ｍｌ）で洗浄した。有機層はＭｇＳＯ４の下で乾燥し、ろ過した。有機層を減圧下で濃縮した。最少量のＤＣＭに粗製生成物を再融解し、ヘキサンから再度沈殿させた。上記沈殿物をろ過し、やや黄色の白い固体を得た。ＤＭＳＯ−ｄ６＋２滴のＭｅＯＤにおける‘ＨＮＭＲ。
【０１７８】
'HNMR (300MHz, DMSO-d6+2 drops of MeOD) 0.80ppm (t, J=10Hz, 3H), 1.11ppm (m, 2H), 1.37ppm (m,2H), 2.50ppm (m, 8H), 3.05ppm (t, J= 6.6Hz, 2H), 3.35ppm (t, J=6.6Hz, 2H), 4.1ppm (s, br, 4H), 4.95ppm (t, br, 1H), 6.85ppm (d, J=7.8Hz, 2H), 7.00ppm (t, 7.2Hz, 1H), 7.26ppm (dd, J=7.8Hz, 2H), 7.6ppm (s, 1H)
13CNMR (75MHz, DMSO-d6) 19.23, 24.93, 35.89, 47.50, 58.45, 62.50, 107.50, 119.0, 121.16, 128.0, 134.66, 137.50, 144.0, 143.00, 147.80, 162.20, 171.0
FABMS 519 (M+H)+ calcd m/z for C25H39N6O4S+ 519.28 ; found 519.27。
【０１７９】
ＡＱＰ−００１７の作製
【化３１】
2010508300.tif 000093
【表６１】
2010508300.tif 000094
【表６２】
2010508300.tif 000095
【表６３】
2010508300.tif 000096
【表６４】
2010508300.tif 000097
【０１８０】
作製：
磁気撹拌子を含む２５ｍｌのＲＢＦに、イミダゾリド（０．２０７ｇ、０．５ｍｍｏｌ）を添加し、１ｍｌのＤＣＭに溶解した。アルゴン下、撹拌した。アミン（０．１７０ｍｌ、１ｍｍｏｌ）添加し、アルゴン下、室温で上記溶液を撹拌した。その溶液は均質になった。〜１時間後、沈殿が生じ始めた。約３時間後、ＴＬＣは、より極性のあるスポットを示し、出発原料はなくなった。ＥｔＯＡｃ（２０ｍｌ）に抽出し、水（２ｘ２０ｍＬ）および塩水（２ｘ２０ｍｌ）で洗浄した。有機層を組み合わせて、ＭｇＳＯ４で乾燥させた。ろ過し、濃縮した。最少量のＤＣＭに溶解し、ヘキサンから再度沈殿させた。
【０１８１】
'HNMR (300MHz, DMSO-d6 + 2 drops of MeOD) 0.90ppm (t, J=10Hz, 3H), 1.10ppm (m, 2H), 1.35ppm (m, 2H), 2.13ppm (s, 3H), 2.32ppm (t, J=6.3Hz, 9H), 3.07ppm (t, J=6Hz, 2H), 3.28ppm (t, J=5.4Hz, 2H), 3.35ppm (s,1H), 4.89ppm (t, br, 1H), 6.84ppm (d, J=5.1Hz, 2H), 7.00ppm (t, J= 10.5Hz, 1H), 7.23ppm (dd, J=10.5Hz, 2H), 7.35ppm (s, 1H), 7.58ppm (t, J= 2.4Hz)
13CNMR (75MHz, DMSO-d6) 19.20, 24.92, 31.93, 35.90, 43.41, 47.56, 51.27, 58.29, 60.33, 61.26, 118.73, 121.14, 127.75, 134.66, 137.60, 142.82, 143.67, 147.64, 162.06, 170.78
FABMS 504 (M+H)+ calcd m/z for C25H38N5O4S+ 504.26 ; found 504.26。
【０１８２】
ＡＱＰ−００１９の作製
【化３２】
2010508300.tif 000098
【表６５】
2010508300.tif 000099
【表６６】
2010508300.tif 000100
【表６７】
2010508300.tif 000101
【表６８】
2010508300.tif 000102
【０１８３】
作製：
磁気撹拌子を含む１０ｍｌのＲＢＦに、フロセミド（１６５ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）および３．０ｍｌのＥｔＯＡｃを添加した。アルゴン下、２５度で、その混合物を撹拌し、９７ｍｇ（０．６０ｍｍｏｌ）のカルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）を添加した。均質になるまで、混合物をホットエアーガンで加熱し、その後、冷却させた。１０分間静置させ冷却させた後、３ｍｌのＥｔＯＡｃに１０８ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ）のアミンを含む溶液を添加し、混合物は一晩撹拌した。この期間の後、非常にわずかに粘着性の固体が生じた。１０ｍｌの水を添加し、混合物を撹拌し、白く細かい固体が得られた。ろ過、その後の５ｍｌの水および５ｍｌのＥｔＯＡｃによる固体の洗浄および減圧乾燥により、１５０ｍｇの白い固体が得られた。
【０１８４】
（収率約７１％）ＴＬＣから、サンプルが十分に純粋であることが示され、ＮＭＲは次の通りであった：
プロトンNMR = NMR-GAF-60-a, カーボンNMR = NMR-GAF-60-b。
【０１８５】
化合物はＡＱＰ−００１９として登録した。
【０１８６】
'HNMR (300MHz, DMSO-d6 ) 4.41ppm (d, J=5Hz, 2H), 4.51ppm (d, J=5Hz, 2H), 6.31ppm (s, 1H), 6.41ppm (s, 3H), 7.00ppm (s,1H), 7.23ppm (bs, 2H), 7.36ppm (dd, J=5Hz, 1H), 7.61ppm (s,1H), 7.70ppm (d, J=6Hz, 1H), 8.20ppm (s, 1H), (s,1H), 8.48ppm (d, J=3Hz, 1H), 8.54ppm (s,1H), 8.72ppm (t, J= 7Hz, 1H), 9.36ppm (t, J=7Hz, 1H)。
【０１８７】
ＡＱＰ−００２０の作製
【化３３】
2010508300.tif 000103
【表６９】
2010508300.tif 000104
【表７０】
2010508300.tif 000105
【表７１】
2010508300.tif 000106
【表７２】
2010508300.tif 000107
【０１８８】
作製：
磁気撹拌子を含む１０ｍｌのＲＢＦに、フロセミド（１６５ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）および３．０ｍｌのＥｔＯＡｃを添加した。その混合物を、アルゴン下、２５度で撹拌し、９７ｍｇ（０．６０ｍｍｏｌ）のカルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）を添加した。均質になるまで、その混合物をホットエアーガンで加熱し、その後冷却させた。冷却および１０分間の静置の際に、１４３ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ）のアミンを含む３ｍｌのＥｔＯＡｃの溶液を添加した。その混合物を一晩撹拌した。その反応は、５分間撹拌させながら、１０ｍｌの水で処理した。有機層をピペットによって除去し、水層を、同様に３×５ｍｌのＥｔＯＡｃで抽出した。組み合わせた有機抽出物を濃縮した。得られる固体は、ＤＣＭで粉末にし、その後、５０％のＤＣＭヘキサンで希釈し、ろ過して、２２０ｍｇのオフホワイトの固体を得た。
【０１８９】
プロトンNMR = NMR-GAF-59-a
'HNMR (300MHz, DMSO-d6 ) 2.19ppm (s, 3H), 2.44ppm (bm, 10H), 3.36ppm (m, 1H), 5.54ppm (d, J=5.1Hz, 2H), 6.37ppm (s,1H), 6.46ppm (s, 1H), 7.00ppm (s, 1H), 7.08ppm (s,1H), 7.28ppm (d, J=6Hz, 1H), 7.66ppm (s, 1H), 7.70ppm (s,1H), 8.10ppm (s, 1H), 8.60ppm (s,1H), 8.72ppm (m, 2H)。
【０１９０】
この化合物はＡＱＰ−００２０として登録した。
【０１９１】
ＡＱＰ−００２２およびＡＱＰ−００２３の作製
【化３４】
2010508300.tif 000108
【表７３】
2010508300.tif 000109
【表７４】
2010508300.tif 000110
【表７５】
2010508300.tif 000111
【表７６】
2010508300.tif 000112
【０１９２】
作製：
８ｍｇのＫＯＨを含む６ｍｌの蒸留水および６ｍｌのＥｔＯＨを含む１００ｍｌのＲＢＦの溶液に、テフロン（登録商標）連結蒸留ヘッドを装備し、氷水バス中の受け入れフラスコおよび添加漏斗を有した冷蔵冷却器にて、１０ｍｌのＤＣＭを添加し、二相系を８５℃に加熱した。一旦蒸留が開始されると、２．１４ｇ（１０ｍｍｏｌ）のジアザルドを含む１０ｍｌのＤＣＭおよび５ｍｌのＥｔＯＨの溶液を１５分にわたって添加した。蒸留溶液がさらに黄色に変化することがなくなると、得られる黄色の蒸留液に栓をし、使用するまで氷風呂に貯蔵した。
【０１９３】
２つの実験のために、２つの５０ｍｌのエルレンマイヤーフラスコに、３３１ｍｇのフロセミド（１ｍｍｏｌ）を準備した。１個のフラスコは、非常に弱い黄色が続くまで、ＣＨ２Ｎ２溶液で処理し、ガス発生が観察された。第２のフラスコは残るＣＨ２Ｎ２溶液で処理し、ガス発生が観察され、栓が緩くしめ、一晩静置させた。
【０１９４】
２４時間後、第１の溶液は沈殿をともない無色だった。溶液にごくわずかのヘキサンを添加すると、結晶の形成が生じ、結晶化が完了するまで静置した。第２の溶液もまた、無色であった。ＴＬＣは、第１の溶液よりも、極性の低い生成物を示した。
【０１９５】
第２の溶液も同様に処理し、再結晶させた。第１の溶液からは、無色の光る結晶性固体が得られた。第２の溶液からは、オフホワイトの結晶性固体が回収された。‘ＨＮＭＲ、１３ＣＮＭＲおよびＭＳを２つの生成物について行った。
【０１９６】
フロセミドメチルエステル= NTF-2006-1-018A 
フロセミドメチルエステルモノメチルスルホンアミド=NTF-2006-1-018B。
【０１９７】
NTF-AQP-018A HNMR (CDCl3 , 300MHz) ppm 3.10 (BrS, 2H), 3.87 (s, 3H), 4.48 (d, J= 6Hz, 2H), 6.30 (q, J=0.9 D) 6.65 (brs, 2H), 6.89 (s, 1H), 7.41 (dd, J= 3Hz, 1H), 7.62 (s, 1H), 8.54 (s, 2H) 
C13 NMR (CDCl3, 75 MHz) 44.65, 44.92, 45.20, 45.47, 45.76, 57.24, 112.92, 113.06, 115.69, 118.63, 138.79, 147.62, 155.69.
MS API-ES calculated m/z for C13H14ClN2O5S+ 345.03; obtained 345.1
'HNMR NTF-AQP-018B (CDCl3, 300 MHz) ppm 2.65 (d, J= 6 Hz, 3H), 3.90 (s, 3H), 4.46 (d, J=6Hz, 2H), 4.75 (q, J=6Hz, 1H), 6.30 (q, J=0.6Hz, 1H), 6.37 (q, J=0.6Hz, 1H), 6.89 (s, 1H), 7.42 (q, J=1.2Hz, 1H), 8.62 (s, 1H), 8.67 (t, 1H)
C13 NMR (CDCl3) 29.707, 40.64, 52.47, 52.53, 108.22, 108.95, 110.91, 113.89, 118.58, 121.55, 136.72, 137.61, 143.03, 150.57, 153.53, 167.99
MS API-ES calculated m/z for C14H16ClN2O5S+ 359.05; obtained 359.1。
【０１９８】
ＡＱＰ−００２４の作製
【化３５】
2010508300.tif 000113
【表７７】
2010508300.tif 000114
【表７８】
2010508300.tif 000115
【表７９】
2010508300.tif 000116
【表８０】
2010508300.tif 000117
【０１９９】
作製：
３ｍｌの３：１のＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏに、１００ｍｇ（０．２７９ｍｍｏｌ）のエステルおよび６５ｍｇ（１．５３３ｍｍｏｌ）のＬｉＯＨ．Ｈ２Ｏを含む混合物を室温で撹拌した。〜６時間後、５０％ＥｔＯＡｃを含むヘキサンにおけるＴＬＣを行った。
【０２００】
さらに、１．０ｍｌの０．５ＭのＬｉＯＨを含む３：１のＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏを添加した。一晩撹拌した。２４時間後、ＴＬＣは、反応の完了を示した。反応溶液に１ＮのＨＣｌを添加した。沈殿物をろ過し、蒸留水で洗浄した。乾燥し、オフホワイトのけばのある固体を得た。
【０２０１】
'HNMR (CDCl3, 300 MHz) ppm 2.40 (d, J=5.1Hz, 3H), 4.58 (d, J=5.7 Hz, 2H), 6.38 (t, J=9Hz, 1H), 6.425 (t, J=2.1Hz, 1H), 7.10 (s, 1H), 7.34 (d, J=5.1Hz, 1H), 7.62 (q, J=0.9Hz, 1H), 8.34 (s, 1H), 8.68 (t, 1H)
C13NMR (CDCl3, 75 MHz) ppm 29, 108.9, 111.42, 114.5, 122.5, 136.0, 137.0, 143.63, 152.0, 153.5, 169
MS API-ES calculated m/z for C13H14ClN2O5S+ 345.03; obtained 345.1。
【０２０２】
フロセミドはＡＱＰ−００２５である。
【０２０３】
ＡＱＰ−００２６の作製
【化３６】
2010508300.tif 000118
【表８１】
2010508300.tif 000119
【表８２】
2010508300.tif 000120
【表８３】
2010508300.tif 000121
【表８４】
2010508300.tif 000122
【０２０４】
作製：
磁気撹拌子を含む２５ｍｌのＲＢＦに、１ｍｍｏｌのフロセミドのメチルエステルを含むＡＣＮ（２ｍｌ）を溶解した。上記溶液に、過剰のＫ２ＣＯ３を添加し、〜６時間還流した。ＴＬＣは、高いパーセンテージの所望の生成物（無極性）およびいくらかの二置換生成物（極性がより低い）、さらに、いくらかの出発原料を示した。水により反応を消し、水で洗浄しながら、ＥｔＯＡＣに抽出した。有機層を濃縮し、オレンジ色の粗製油を得た。残留物はＢｉｏｔａｇｅによって精製した（１０％の酢酸エチル／ヘキサンから開始し、８０％のＥｔＯＡｃまでの比率を増加させた。カラムサイズ２５＋Ｍ）。３つの画分を回収した。所望の画分を濃縮し、ヘキサン／ＤＣＭの混合液にて再結晶した。ガラス質の無色の結晶が得られた。ＮＴＦ−ＡＱＰ−０２７Ｂと命名した。
【０２０５】
'HNMR  (CDCl3 , 300 MHz) ppm 3.89 (s, 3H), 4.08 (d, J=6Hz, 2H), 4.49 (d, J=6Hz, 2H), 5.03 (t, J=6Hz, 1H), 6.29 (d, J=3Hz, 1H) , 6.37 (d, J=3Hz, 1H) , 6.82 (s, 1H), 7.24 (m, 5H), 7.41 (d, J=0.6 Hz, 1H), 8.59 (d, J=1.2Hz, 1H), 8.65 (BrS, 1H)
C13NMR (CDCl3, 75 MHz) ppm 41.0, 48.0, 52.53, 108.22, 109.0, 110.92, 114.0, 123.0, 128.35, 129.07, 136.0, 137.5, 143.03, 150.05, 153.50, 168.0
MS API-ES calculated for C20H20ClN2O5S+ 435.90; obtained 435.1。
【０２０６】
ＡＱＰ−００２７の作製
【化３７】
2010508300.tif 000123
【表８５】
2010508300.tif 000124
【表８６】
2010508300.tif 000125
【表８７】
2010508300.tif 000126
【表８８】
2010508300.tif 000127
【０２０７】
作製：
磁気撹拌子を含む２５ｍｌのＲＢＦに、フロセミド・メチルエステル（１ｍｍｏｌ）を添加し、１ｍｌのＡＣＮに溶解した。上記溶液に、Ｋ２ＣＯ３（２当量）およびアリル臭化物（２当量）を添加し、〜６時間還流した。ＴＬＣは、２つの極性のより小さい生成物を示し、一置換のものは、もう一方に比べてより顕著であった。水でクエンチし、ＥｔＯＡｃへ抽出し、水で洗浄し、所望の有機層を組み合わせ、濃縮し、オレンジ色の粗製油を得た。残留物はＢｉｏｔａｇｅによって精製した（１０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサンで開始し、８０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサンまでの比率を増加させた。カラムサイズ２５＋Ｍ）。３つの画分を集めた。所望の画分を濃縮し、ヘキサン／ＤＣＭの混合物にて再結晶した。ガラス質の無色の結晶を得た。ＮＴＦ−ＡＱＰ−０２８Ｂと命名した。
【０２０８】
'HNMR in CDCl3 (300 MHz) ppm 1.60 (s, 1H), 3.58 (m, 2H), 3.95 (s, 3H), 4.46 (d, J=5.7 Hz,2H), 4.84 (t, J=6.3Hz, 1H), 5.20 (two overlapped doublets, geminal allyl Hs), 5.78 (m, vinyl allyl H), 6.36 (dd, 2H), 6.90 (s,1H), 7.35 (s, 1H), 8.65 (s, 1H), 8.80 (t, 1H)
13CNMR (CDCl3, 75 MHz) ppm 40.66, 46.27, 52.53, 108.22, 108.89, 110.92, 113.91, 118.37, 122.98, 133.19, 136.30, 137.70, 143.04, 150.56, 153.49, 168
MS API-ES calculated for C16H18ClN2O5S+ 385.84; obtained 385。
【０２０９】
ＡＱＰ−００２８の作製
【化３８】
2010508300.tif 000128
【表８９】
2010508300.tif 000129
【表９０】
2010508300.tif 000130
【表９１】
2010508300.tif 000131
【表９２】
2010508300.tif 000132
【０２１０】
作製：
磁気撹拌子を含む２５ｍｌのＲＢＦに、フロセミドのピリジニルスルホンアミドメチルエステル（８８ｍｇ、０．２０２ｍｍｏｌ）および０．５ＭのＬｉＯＨを含む３：１のＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（２．０２３ｍｌ、１．０１２ｍｍｏｌ）を添加し、２４時間撹拌した。２４時間後、反応を少し加熱し、完了させた。結局、出発原料はなくなり、１ＮのＨＣｌ（１ｍｌ）により反応をクエンチした。形成した白い沈殿をろ過し、減圧下で乾燥し、白い粉末（７４％収率）を得た。
【０２１１】
'HNMR (DMSO-d6, 300 MHz) ppm 4.07 (d, J=12Hz, 2H), 4.56 (d, J=5.7Hz, 2H), 6.36 (d, J=1.2Hz, 1H), 6.44 (d, J=1.2Hz, 1H), 6.99 (s, 1H), 7.15 (brm, 6H), 7.64 (s,1H), 8.12 (t, J=6Hz, 1H), 8.29 (s,1H), 8.65 (t, J=6Hz, 1H)
13CNMR (DMSO-d6, 75 MHz) ppm 47.0, 108.52, 111.41, 124.15, 128.34, 128.88, 129.0, 138.00, 138.47, 142.50,  152.11, 153.5, 169.36
MS API-ES, Neg. Scan calculated for C19H18ClN2O5S+  421.87; obtained 419.0。
【０２１２】
ＡＱＰ−００２９の作製
【化３９】
2010508300.tif 000133
【表９３】
2010508300.tif 000134
【表９４】
2010508300.tif 000135
【表９５】
2010508300.tif 000136
【表９６】
2010508300.tif 000137
【０２１３】
作製：
３：１のＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（２．２３５ｍｌ、１．１１７ｍｍｏｌ）に、出発エステル（０．０８６ｍｇ、０．２２３ｍｍｏｌ）および０．５ＭのＬｉＯＨを含む混合物を室温で２４時間撹拌した。１．０ｍｌの１ＮのＨＣｌを反応混合物に添加してクエンチし、形成された白い沈殿をろ過し、吸引乾燥して、０．０５５ｇ（６６％）の白い粉末得た。
【０２１４】
'HNMR (DMSO-d6, 300 MHz) ppm 3.45 (d, J=5.7Hz, 2H), 4.65 (d, J=17.7, 2H), 5.10 (d, J=1.5, 1H), 5.19 (d, J=1.5Hz, 1H), 5.65 (m, 1H),  6.37 (d, J=3Hz, 1H0, 6.42 (d, J=1.2Hz, 1H), 7.10 (s, 1H), 7.62 (s, 1H), 7.77 (t, J=6Hz, 1H), 8.43 (s, 1H), 8.67 (t, 5.4Hz, 1H), 13.4 (brs, 1H)
13CNMR (DMSO-d6, 75 MHz) ppm 45.62, 108.54, 109.22, 111.41, 114.59, 117.19, 124.06, 135.14, 135.81, 137.30, 143.62, 152.08, 153.54, 169.38
Ms API-ES Neg. Scan calculated for C15H16ClN2O5S+ 371.82 ; obtained 368.9。
【０２１５】
ＡＱＰ−００３０の作製
【化４０】
2010508300.tif 000138
【表９７】
2010508300.tif 000139
【表９８】
2010508300.tif 000140
【表９９】
2010508300.tif 000141
【表１００】
2010508300.tif 000142
【０２１６】
作製：
出発化合物をホルムアミドに懸濁し、激しく撹拌した。反応物を含む２５ｍＬ丸底フラスコを、その後、アイスバスに静置した。ＰＯＣｌ３を滴下漏斗に添加し、反応フラスコに設置した。ＰＯＣｌ３を、２５℃未満の温度に調節しながら、３０分間にわたって滴下した。ＰＯＣｌ３の添加の後、反応を、室温でさらに４５分間続け、その後停止させた。反応の進行にともない、溶液の粘性によって撹拌が停止し、このため、さらに２当量のホルムアミドを添加し、撹拌を再開した。沈殿物が、ブフナーろ過した溶液から分離されたとき、反応フラスコに、冷却した〜２０ｍＬのＤＩ水を添加した。この固体のＴＬＣ分析は、出発原料が存在することを示した。再結晶をＤＭＦにて試みたものの、失敗したため、以前の反応条件に再度供した。最初の反応からの濾液は結晶を形成し、これは、水からろ過され、ＴＬＣおよびＮＭＲ分析によって、所望の生成物であることが示された。
【０２１７】
1H NMR analysis:  8.857 (s, 1H), 8.668 (s, 1H), 8.071 (s, 1H), 7.512 (m, 1H), 6.645 (m, 1H), 6.434 (m, 1H), 5.52 (s, 2H), 3.359 (s, 2H).
13C NMR analysis:  155.98, 147.58, 144.19, 142.18, 137.50, 130.06, 119.67, 118.36, 110.95, 110.62, 78.63, 78.20, 77.76.
MS API-ES, Pos. Scan calculated for C13H11ClN3O4S+ 340.75; octaned 340.0。
【０２１８】
ＡＱＰ−００３１の作製
【化４１】
2010508300.tif 000143
【表１０１】
2010508300.tif 000144
【表１０２】
2010508300.tif 000145
【表１０３】
2010508300.tif 000146
【表１０４】
2010508300.tif 000147
【０２１９】
作製：
化合物１は、１ｍＬの化合物２に溶解し、１００℃に加熱し、完了までＴＬＣでモニターした。ＴＬＣによって完了となったとき、反応を熱から除去した。結晶を含む、浅黄色べたべたしたものが残った。この混合物に、１ＭのＨＣｌを添加し、１０分間撹拌した。この時に、沈殿が溶液から得られ、続くろ過によってＮＭＲによって純粋と示される生成物が得られた。
【０２２０】
1H NMR: 8.25 (s, 1H), 7.5-7.2 (m, 5H), 6.71 (s, 1H), 4.54 (s, 2H), 4.0 (s, 1H), 3.3 (s, 2H).
Ms API-ES Neg. Scan calculated for C14H12ClN2O4S- 339.02. ; obtained 339.2。
【０２２１】
ＡＱＰ−００３２の作製
【化４２】
2010508300.tif 000148
【表１０５】
2010508300.tif 000149
【表１０６】
2010508300.tif 000150
【表１０７】
2010508300.tif 000151
【表１０８】
2010508300.tif 000152
【０２２２】
作製：
化合物１を化合物２に溶解し、１００℃まで加熱し、完了するまでＴＬＣにてモニターした（３．５時間）。完了時、１ＭのＨＣｌ（〜３０ｍＬ）は反応混合物に添加し、〜３０ｍＬのトルエンを反応物に混合し、フラスコ中で５分間撹拌した。これを、反応容器から分液漏斗へ注いだ。エマルションが形成され、その後、それを塩水で洗浄した。その後、水層をトルエンから分離した。この時、トルエン層を蒸発させ、沈殿は水層から析出し始めた。水および沈殿を含むこのフラスコを、一晩静置し、このときに、より多くの固体が溶液から析出した。この白い結晶性固体をろ過し、ＤＩ水で洗浄し、次にＥｔＯＡｃで洗浄した。ＮＭＲ評価にて、所望の生成物は形成された。
【０２２３】
1H NMR data: 8.06 (s, 1H), 7.54 (m, 1H), 6.77 (s, 1H), 6.34 (m, 1H), 6.30 (m, 1H), 4.39 (s, 2H), 3.73 (s, 1H).   
Ms API-ES Neg. Scan calculated for C12H10ClN2O5S- 329.00. ; obtained 329.2。
【０２２４】
ＡＱＰ−００３３の作製
【化４３】
2010508300.tif 000153
【表１０９】
2010508300.tif 000154
【表１１０】
2010508300.tif 000155
【表１１１】
2010508300.tif 000156
【表１１２】
2010508300.tif 000157
【０２２５】
作製：
磁気撹拌子を含む２５ｍｌのＲＢＦに、フロセミド（１６５ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）および４．０ｍｌのフルフリルアミンを添加した。その混合物は、１２５℃で、窒素下で７２時間撹拌した。Ｔ溶液は琥珀色になった。７２時間後、窒素の流れを反応物に通気しながら、反応物を冷却し、過剰のフルフリルアミンの大部分を蒸発させた。その後、残留物を１５ｍｌのＥｔＯＡｃに溶解し、１０ｍｌのＥｔＯＡｃと共に分液漏斗に移し、２０ｍｌの１ＮのＨＣｌで２度洗浄した。有機層はＭｇＳＯ４で乾燥させ、ろ過および濃縮し、暗褐色のフィルムを得た。
【０２２６】
ＴＬＣは、より移動性の高い青い蛍光性スポットを示した。５０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサンを使用する４０ｍｌシリカにおけるフラッシュクロマトグラフィーにより、ほとんどの暗い物質を除去した。しかしながら、１５ｍｌのシリカゲルにおける２回目のクロマトグラフィーは、きれいなサンプル（黄色半結晶性固体、１５ｍｇ）を得るために必要であった。
【０２２７】
MS API-ES, Neg. Scan calculated for C17H16N3O6S-: 390.08; obtained 390.20。
【０２２８】
ＡＱＰ−００３５の作製
【化４４】
2010508300.tif 000158
【表１１３】
2010508300.tif 000159
【表１１４】
2010508300.tif 000160
【表１１５】
2010508300.tif 000161
【表１１６】
2010508300.tif 000162
【０２２９】
作製：
テフロン（登録商標）連結蒸留ヘッド、氷水バス中の受け入れフラスコを有した冷蔵冷却器、および添加漏斗を装備した１００ｍＬ丸底フラスコに、３ｍＬの水および３ｍＬのＥｔＯＨに４ｇのＫＯＨを含む溶液を添加した。その後、５ｍＬのＤＣＭを添加し、２相系を６５℃まで加熱した。蒸留が開始したら、５ｍＬのＤＣＭおよび２．５ｍＬのＥｔＯＨに１．０７ｇ（５ｍｍｏｌ）のジアザルドを含む溶液を、１５分間にわたって添加した。蒸留溶液がそれ以上黄色に変化しなくなったとき、得られた黄色の蒸留液に栓をし、アイスバスに貯蔵した。
【０２３０】
エルレンマイヤーフラスコに、３００ｇの化合物１（０．９０７ｍｍｏｌ）を用意した。弱い黄色の色が続くまで、フラスコはＣＨ２Ｎ２溶液で処理し、ガス発生が観察され、栓をゆるく閉め、完了までＴＬＣによってモニターした。３０分後、ＴＬＣから、純粋な生成物が残ることが示された。ヘキサンはフラスコに添加し、反応をクエンチし、得られた白色固体をろ過し、２０１ｍｇの白色固体を得た。
【０２３１】
1H NMR: 7.96 (s, 1H), 7.56 (s, 1H), 6.95 (s, 2H), 6.66 (m, 1H), 6.27 (m, 2H), 4.35 (s, 2H), 3.70 (s, 1H), 3.29 (s, 3H).
MS API-ES, Neg. Scan calculated for C13H10ClN3O4S- 343.00; obtained 343.2。
【０２３２】
ＡＱＰ−００３６の作製
【化４５】
2010508300.tif 000163
【表１１７】
2010508300.tif 000164
【表１１８】
2010508300.tif 000165
【表１１９】
2010508300.tif 000166
【表１２０】
2010508300.tif 000167
【０２３３】
作製：
磁気撹拌子を含む２５ｍｌのＲＢＦに、フロセミドのイミダゾリド（０．１００ｍｇ）および２−ベンジルオキシエタノール（０．０７５ｍＬ）を添加し、２ｍｌのＥｔＯＡｃに溶解した。室温で１時間撹拌させた。ＴＬＣ（５０％ＥｔＯＡｃを含むヘキサン）によると、極性のより低いスポットの存在が示され、トップのスポットは新規であり、一方、中央のスポットは、出発原料のアルコールである。
【０２３４】
５分ごとに熱を増加させながら、ヒートガンで上記溶液を加熱して、反応をさらに進行させ、これを５回行った。新たな極性のより低いスポットがより優勢となった。反応混合物を濃縮し、所望の化合物を、フラッシュクロマトグラフィーを使用して分離した。溶剤の蒸発によって、浅黄色固体が得られた。
【０２３５】
1H NMR: 8.52 (m, 9H), 6.45 (m, 2H), 4.67 (m, 4H), 3.45 (m, 2H).
13C NMR: 167.19, 154.56, 152.98, 152.02, 143.61. 139.04, 137.52, 133.82, 129.16, 128.37, 127.86, 114.76, 111.39, 108.54, 72.98, 68.27, 41.21, 40.93, 40.37, 40.10, 39.82
MS API-ES, Neg. Scan Calculated for C21H21ClN2O6S- 463.92; obtained 463.2。
【０２３６】
ＡＱＰ−００３７の作製
【化４６】
2010508300.tif 000168
【表１２１】
2010508300.tif 000169
【表１２２】
2010508300.tif 000170
【表１２３】
2010508300.tif 000171
【表１２４】
2010508300.tif 000172
【０２３７】
作製：
５０ｍＬエルレンマイヤーフラスコに小さな撹拌子をいれ、．１００ｇフロセミドを１ｍＬのＤＩ水に懸濁させた。２当量の炭酸カリウムを１ｍＬのＤＩ水に溶解し、まとめてエルレンマイヤーフラスコに添加した。この時、フロセミドはすべて、水溶液に入れた。その後、ベンジルブロミドをフラスコに添加し、室温で１時間撹拌した。反応を開始するために、ＴＬＣプレート上で新たな極性のより低いスポットが観察されるまで、熱を加えた。これにより、浅黄色の粘つく沈殿が生じ、これをろ過および乾燥させて、生成物を得た。
【０２３８】
1H NMR: 7.65 (m, 8H), 6.50 (m, 1H), 6.04 (m,1H), 5.38 (m, 2H), 4.75 (m, 2H)
13C NMR: 166.77, 152.82, 151.24, 143.87, 138.00, 136.45, 134.87, 132.66, 131.93, 130.13, 129.53, 129.45, 129.41, 129.24, 129.12, 128.44, 111.25, 109.97, 35.39
MS API-ES, Neg. Scan Calculated for C19H17ClN2O5S- 420.87; obtained 419.2。
【０２３９】
ＡＱＰ−００３８の作製
【化４７】
2010508300.tif 000173
【表１２５】
2010508300.tif 000174
【表１２６】
2010508300.tif 000175
【表１２７】
2010508300.tif 000176
【表１２８】
2010508300.tif 000177
【０２４０】
作製：
磁気撹拌子を含む２５ｍｌのＲＢＦに、フロセミドのイミダゾリド（０．３８０ｍｇ、０．９９８ｍｍｏｌ）および２−エトキシエタノール（０．１８０ｍｇ、１．９９６ｍｍｏｌ）を添加し、２ｍｌのＥｔＯＡｃに溶解した。上記溶液を室温で１時間撹拌させた。ＴＬＣ（５０％ＥｔＯＡｃを含むヘキサン）から、極性のより低いスポットが示された。
【０２４１】
上記溶液を、ヒートガンを使用して加熱し、反応をさらに進行させた。ＴＬＣから、より極性の低いスポットは更に大きくなったものの、特定のスポットは、増大を停止したことを示した。反応混合物を濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーを使用して、所望の生成物を分離した。減圧下で乾燥させ、やや黄色の固体を得た。
【０２４２】
'H NMR (CDCl3, 300 MHz) ppm 1.10  (t, J=6.9 Hz, 3H), 3.50 (q, J=6.9 Hz, 2H),  3.67 (t, J=4.5 Hz, 2H), 4.37 (t, J=4.8 Hz, 2H), 4.60 (d, J=5.7Hz, 2H), 6.415 (2d, 2H) 7.107 (s, 1H), 7.35 (s, 2H), 7.62 (dd, J= 0.9 Hz, 1H), 8.42 (s, 1H)
C13 NMR (CDCl3, 75 MHz) ppm 15.91, 64.99, 66.49, 68.39, 108.2, 108.55, 111.39, 114.9, 128.0, 133.9, 137.5, 143.63, 152.03, 152.94, 167.1
MS API-ES  calculated for C16H20ClN2O6S+ 403.07; obtained (neg. scan) 401.2。
【０２４３】
ＡＱＰ−００３９の作製
【化４８】
2010508300.tif 000178
【表１２９】
2010508300.tif 000179
【表１３０】
2010508300.tif 000180
【表１３１】
2010508300.tif 000181
【表１３２】
2010508300.tif 000182
【０２４４】
作製：
磁気撹拌子を含む２５ｍｌのＲＢＦに、フロセミドのイミダゾリド（０．３８０ｍｇ、０．９９８ｍｍｏｌ）および１−ブタノール（０．１４８ｍｇ、１．９９６ｍｍｏｌ）を添加し、２ｍｌのＥｔＯＡｃに溶解した。上記溶液を室温で１時間撹拌させた。ＴＬＣ（５０％ＥｔＯＡｃを含むヘキサン）から、極性のより低いスポットが示された。
【０２４５】
ヒートガンを使用して上記溶液を加熱し、反応をさらに進行させた。極性のより低いスポットはより大きくなったが、特定のスポットは、それ以上増大することを停止した。反応混合物を濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーを使用して、所望の生成物を分離した。濃縮し、減圧下で乾燥させやや黄色の固体を得た。
【０２４６】
'H NMR (CDCl3, 300 MHz) ppm 0.92 (t, J=9.3 Hz, 3H), 1.40 (m, 2H), 1.68 (m,  2H),  4.26 (t, J=6.6 Hz, 2H), 4.59 (d, J=5.7 Hz, 2H), 6.41 (2d, J=3Hz, 2H), 7.09 (s, 1H), 7.36 (s, 2H), 7.62 (t, J= 0.9 Hz, 1H), 8.40 (s,1H)
13C NMR (CDCl3, 75 MHz) ppm 14.44, 19.56, 31.00, 65.38, 108.21, 108.57, 111.40, 127.86, 133.62, 137.39, 143.63, 152.03, 152.95, 167.28
MS API-ES calculated for C16H20ClN2O5S+ 387.08; obtained (neg. scan) 385.2。
【０２４７】
ＡＱＰ−００４１の作製
【化４９】
2010508300.tif 000183
【表１３３】
2010508300.tif 000184
【表１３４】
2010508300.tif 000185
【表１３５】
2010508300.tif 000186
【表１３６】
2010508300.tif 000187
【０２４８】
作製：
フロセミド（０．１００ｍｇ、０．３０２ｍｍｏｌ）を含むＲＢＦに、Ｋ２ＣＯ３（１．５当量、６３ｍｇ、０．４５４ｍｍｏｌ）を添加し、エチレングリコールジメチルエーテル（１ｍｌ）に溶解した。室温で、窒素下、１０分間撹拌した。ピバル酸クロロメチル（９１ｍｇ、０．６０５ｍｍｏｌ）を添加し、同じ条件で３０分間撹拌した。温度を５０℃まで上げ、一晩窒素下で撹拌した。１００％のＥｔＯＡｃによるＴＬＣでは、極性のより低い生成物が示された。生成された反応混合物を酢酸エチルに抽出し、水で洗浄した。有機層を組み合わせ、減圧下で濃縮した。溶剤として１００％のＥｔＯＡｃを使用して、フラッシュクロマトグラフィーで精製した。
【０２４９】
'HNMR NTF-AQP-035'HNMR in (CDCl3 , 300 MHz) ppm 1.28 (s, 9H), 3.30 (t, 2H), 4.27 (t, 2H), 4.59 (d, 2H), 5.85 (d, 1H), 5.95 (d, 1H), 6.3 (brd, 1H), 7.05 (s, 1H), 7.25 (s, 2H), 7.50 (s, 1H), 7.63 (brd, 1H), 8.40 (s,1H) NTF-AQP-035'HNMR
MS API-ES (neg. scan) calculated for C19H24ClN2O6S+ 443.10; obtained 443.2。
【０２５０】
ＡＱＰ−００４２の作製
【化５０】
2010508300.tif 000188
【表１３７】
2010508300.tif 000189
【表１３８】
2010508300.tif 000190
【表１３９】
2010508300.tif 000191
【表１４０】
2010508300.tif 000192
【０２５１】
作製：
磁気撹拌子を含む２５ｍｌのＲＢＦに、フロセミドのイミダゾリド（０．１００ｍｇ）および２−ベンジルオキシエタノール（０．０７５ｍＬ）を添加し、２ｍｌのＥｔＯＡｃに溶解した。上記溶液を室温で１時間撹拌した。ＴＬＣ（５０％のＥｔＯＡｃを含むヘキサン）は、極性のより低いスポットを示した。
【０２５２】
ヒートガンにより、５分ごとに熱を上昇させて、上記溶液を加熱し、反応をさらに進行させ、これを５回行った。新たなより極性の低いスポットが、より優勢になった。反応混合物を濃縮し、所望の化合物を、溶媒の蒸発によって得た。
【０２５３】
1H NMR: 8.42 (m, 1H), 7.73 (s, 1H), 7.37 (s, 1H), 7.16 (s, 1H), 6.90 (m, 2H), 4.64 (m, 2H), 4.36 (m, 2H), 1.39 (m, 3H).
MS API-ES, Neg. Scan Calculated for C14H15ClN2O5S- 358.80; obtained 357.2。
【０２５４】
添付物１、２および３は、本発明の化合物を示す。添付物３における化合物は、フロセミドのプロドラッグ誘導体に基づく。
【表１４１−１】
2010508300.tif 000193
【表１４１−２】
2010508300.tif 000194
【表１４１−３】
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【表１４１−４】
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【表１４１−５】
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【表１４１−６】
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【表１４１−７】
2010508300.tif 000199
【表１４２−１】
2010508300.tif 000200
【表１４２−２】
2010508300.tif 000201
【表１４２−３】
2010508300.tif 000202
【表１４２−４】
2010508300.tif 000203
【表１４３−１】
2010508300.tif 000204
【表１４３−２】
2010508300.tif 000205
【０２５５】
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【０２５６】
参照による援用
本願に引用された又は本願に参照された、それぞれの文献、特許、特許出願または特許の公開は、その全体が援用される。しかしながら、何れのそのような参照も、先行技術を構成するとは認められず、および、引用された文献の正確さおよび妥当性を検証する権利は留保される。特に、優先権の文献、米国仮出願第６０／８５４，６１８号（２００６年１０月２６日出願）は、本願に援用される。
【図１】
2010508300.tif 000209
【図２】
2010508300.tif 000210
【図３】
2010508300.tif 000211
【図４】
2010508300.tif 000212
【図５】
2010508300.tif 000213
【図６】
2010508300.tif 000214
【図７】
2010508300.tif 000215
【図８】
2010508300.tif 000216
【図９】
2010508300.tif 000217
【図１０】
2010508300.tif 000218
【手続補正書】
【提出日】平成21年8月11日(2009.8.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
医薬品、および、脳卒中、外傷、緑内障、黄斑変性、脳腫瘍および大脳感染症を含む症状に関する浮腫を患う対象において浮腫を縮小する方法における本発明の化合物を投与する様々な様式。
Manley et al., 2000（図３および図４Ｂ）には、脳卒中モデルにおける持続性の閉塞後の脳腫脹の神経学的な障害および程度が示されている。（Ａ）ＭＣＡ閉塞の２４ｈの後における、ＡＱＰ４＋／＋およびＡＱＰ４−／−マウスの脳の組織学的分析。ＡＱＰ４−／−マウス（各々ｎ＝７）にて、半球状拡大が有意に低かった。（Ｂ）ＡＱＰ４＋／＋およびＡＱＰ４−／−マウスにおける、２４時間のときのＭＣＡ閉塞に続く神経学的な結果（平均値：記号およびエラーバー）。
Dirnagl et al., 1999（図１）には、虚血性脳卒中の後の損傷およびそれらの関連する影響の時間スケールの概略図が示されている。
Brooks et al., 2000（図６）には、卵母細胞で発現される野生型および部位特異的変異型のＡＱＰ１チャネルの水透過性（Ｐｆ）値に対するテトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）の効果が示されている。
De Groot and Grubmuller (2001)（図１）には、ＡＱＰ１結晶構造が示されている。（ａ）ＡＱＰ１四量体チャネルの細胞外側から見た図。水孔はそれぞれのサブユニットの中心に位置する。（ｂ）単一のサブユニットの側面図であり、砂時計型の孔の中心に特徴的なＮＰＡ（ａｒｇ−ｐｒｏ−ａｌａ）領域が示される。Ｎ末端およびＣ末端は、タンパク質の細胞質側に存在する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
【図１】ＡＱＰ４を発現する卵母細胞薬剤が破裂する時間に対する薬剤の効果。我々の予備実験にてスクリーニングされた３０を超える化合物のうち、１００μＭブメタニドは、ＡＱＰ４を発現する卵母細胞において、破裂時間を有意に遅らせた４つの化合物のうちの１つてあった。ＡＱＰ４（「水銀非感受性水チャネル」としても知られている）は、ＨｇＣｌ２の効果を示さなかった。
【図２Ａ】ブメタニドおよび関連するループ系利尿剤化合物によるＡＱＰ４発現卵母細胞における遮断の定量分析。図２Ａ：細胞外ブメタニドによる用量依存的な遮断、および１００μＭのフロセミドによる同様の遮断。図２Ｂ：１ｍＭまでの濃度のトラセミド（ｔｏｒｓｅｍｉｄｅ）による遮断の欠如。図２Ｃ：ｎ値（Ｘ軸の下）および統計的有意性を示す、対応する概略的ヒストグラム。図２Ｄ：ループ系利尿剤化合物の構造；差異は、ＡＱＰ４遮断に関連する特徴に対する見識を提供する。図２Ｅ：卵母細胞へのブロッカーの内部注射の効果の増強、内部作用点と一致する；図２Ｆ：ブメタニドおよびフロセミドの「ｉ」細胞内、「ｅ」の細胞外の適用のためのデータの概略的ヒストグラム。記号：ｏは、未処理の野生型と異ならない；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１．独立スチューデント−ｔテスト。
【図２Ｂ】ブメタニドおよび関連するループ系利尿剤化合物によるＡＱＰ４発現卵母細胞における遮断の定量分析。図２Ａ：細胞外ブメタニドによる用量依存的な遮断、および１００μＭのフロセミドによる同様の遮断。図２Ｂ：１ｍＭまでの濃度のトラセミド（ｔｏｒｓｅｍｉｄｅ）による遮断の欠如。図２Ｃ：ｎ値（Ｘ軸の下）および統計的有意性を示す、対応する概略的ヒストグラム。図２Ｄ：ループ系利尿剤化合物の構造；差異は、ＡＱＰ４遮断に関連する特徴に対する見識を提供する。図２Ｅ：卵母細胞へのブロッカーの内部注射の効果の増強、内部作用点と一致する；図２Ｆ：ブメタニドおよびフロセミドの「ｉ」細胞内、「ｅ」の細胞外の適用のためのデータの概略的ヒストグラム。記号：ｏは、未処理の野生型と異ならない；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１．独立スチューデント−ｔテスト。
【図２Ｃ】ブメタニドおよび関連するループ系利尿剤化合物によるＡＱＰ４発現卵母細胞における遮断の定量分析。図２Ａ：細胞外ブメタニドによる用量依存的な遮断、および１００μＭのフロセミドによる同様の遮断。図２Ｂ：１ｍＭまでの濃度のトラセミド（ｔｏｒｓｅｍｉｄｅ）による遮断の欠如。図２Ｃ：ｎ値（Ｘ軸の下）および統計的有意性を示す、対応する概略的ヒストグラム。図２Ｄ：ループ系利尿剤化合物の構造；差異は、ＡＱＰ４遮断に関連する特徴に対する見識を提供する。図２Ｅ：卵母細胞へのブロッカーの内部注射の効果の増強、内部作用点と一致する；図２Ｆ：ブメタニドおよびフロセミドの「ｉ」細胞内、「ｅ」の細胞外の適用のためのデータの概略的ヒストグラム。記号：ｏは、未処理の野生型と異ならない；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１．独立スチューデント−ｔテスト。
【図２Ｄ】ブメタニドおよび関連するループ系利尿剤化合物によるＡＱＰ４発現卵母細胞における遮断の定量分析。図２Ａ：細胞外ブメタニドによる用量依存的な遮断、および１００μＭのフロセミドによる同様の遮断。図２Ｂ：１ｍＭまでの濃度のトラセミド（ｔｏｒｓｅｍｉｄｅ）による遮断の欠如。図２Ｃ：ｎ値（Ｘ軸の下）および統計的有意性を示す、対応する概略的ヒストグラム。図２Ｄ：ループ系利尿剤化合物の構造；差異は、ＡＱＰ４遮断に関連する特徴に対する見識を提供する。図２Ｅ：卵母細胞へのブロッカーの内部注射の効果の増強、内部作用点と一致する；図２Ｆ：ブメタニドおよびフロセミドの「ｉ」細胞内、「ｅ」の細胞外の適用のためのデータの概略的ヒストグラム。記号：ｏは、未処理の野生型と異ならない；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１．独立スチューデント−ｔテスト。
【図２Ｅ】ブメタニドおよび関連するループ系利尿剤化合物によるＡＱＰ４発現卵母細胞における遮断の定量分析。図２Ａ：細胞外ブメタニドによる用量依存的な遮断、および１００μＭのフロセミドによる同様の遮断。図２Ｂ：１ｍＭまでの濃度のトラセミド（ｔｏｒｓｅｍｉｄｅ）による遮断の欠如。図２Ｃ：ｎ値（Ｘ軸の下）および統計的有意性を示す、対応する概略的ヒストグラム。図２Ｄ：ループ系利尿剤化合物の構造；差異は、ＡＱＰ４遮断に関連する特徴に対する見識を提供する。図２Ｅ：卵母細胞へのブロッカーの内部注射の効果の増強、内部作用点と一致する；図２Ｆ：ブメタニドおよびフロセミドの「ｉ」細胞内、「ｅ」の細胞外の適用のためのデータの概略的ヒストグラム。記号：ｏは、未処理の野生型と異ならない；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１．独立スチューデント−ｔテスト。
【図２Ｆ】ブメタニドおよび関連するループ系利尿剤化合物によるＡＱＰ４発現卵母細胞における遮断の定量分析。図２Ａ：細胞外ブメタニドによる用量依存的な遮断、および１００μＭのフロセミドによる同様の遮断。図２Ｂ：１ｍＭまでの濃度のトラセミド（ｔｏｒｓｅｍｉｄｅ）による遮断の欠如。図２Ｃ：ｎ値（Ｘ軸の下）および統計的有意性を示す、対応する概略的ヒストグラム。図２Ｄ：ループ系利尿剤化合物の構造；差異は、ＡＱＰ４遮断に関連する特徴に対する見識を提供する。図２Ｅ：卵母細胞へのブロッカーの内部注射の効果の増強、内部作用点と一致する；図２Ｆ：ブメタニドおよびフロセミドの「ｉ」細胞内、「ｅ」の細胞外の適用のためのデータの概略的ヒストグラム。記号：ｏは、未処理の野生型と異ならない；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１．独立スチューデント−ｔテスト。
【図３Ａ】時間０における、５０％低張食塩水にさらした後の、主要な海馬の培養物（インビトロで１４−１５日）におけるアストログリアの膨潤に対するブメタニドの保護効果。図３Ａ、プロット：位相差顕微鏡法により視覚化した細胞領域。Ｓｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅ（ＮＩＨ）ソフトウェアにて定量した初期量に対して標準化した。イメージ：低張食塩水（図３Ｂ、上）の前に、および、５０％低張食塩水から１５秒（図３Ｃ、下）における、ブメタニドで処理したグリア細胞（矢印）。
【図３Ｂ】時間０における、５０％低張食塩水にさらした後の、主要な海馬の培養物（インビトロで１４−１５日）におけるアストログリアの膨潤に対するブメタニドの保護効果。図３Ａ、プロット：位相差顕微鏡法により視覚化した細胞領域。Ｓｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅ（ＮＩＨ）ソフトウェアにて定量した初期量に対して標準化した。イメージ：低張食塩水（図３Ｂ、上）の前に、および、５０％低張食塩水から１５秒（図３Ｃ、下）における、ブメタニドで処理したグリア細胞（矢印）。
【図３Ｃ】時間０における、５０％低張食塩水にさらした後の、主要な海馬の培養物（インビトロで１４−１５日）におけるアストログリアの膨潤に対するブメタニドの保護効果。図３Ａ、プロット：位相差顕微鏡法により視覚化した細胞領域。Ｓｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅ（ＮＩＨ）ソフトウェアにて定量した初期量に対して標準化した。イメージ：低張食塩水（図３Ｂ、上）の前に、および、５０％低張食塩水から１５秒（図３Ｃ、下）における、ブメタニドで処理したグリア細胞（矢印）。
【図４】図４は、オスのコントロールマウスにおける中大脳動脈閉塞による虚血性脳卒中の負荷の前、間および後における、血液の流速のドップラーレーザー測定を示す。
【図５】図５は、インビボ実験プロトコールにおける基準のためのスケジュールを示す模式図。
【図６Ａ】図６ＡおよびＢは、再灌流の１０分前に１回の大量投与で静脈内に投与するブメタニド（６０ｍｇ／ｋｇ）を受けたおよび受けない、１時間の虚血および２４時間の再灌流にさらされたマウスにおける大脳浮腫および梗塞サイズを示す（図６Ａ）。２％ＴＴＣで染色すると、梗塞した領域は白色である；領域は、治療群を知らされていない研究者によって、形態測定ソフトウェアを使用して分析される（図６Ｂ）。統計的有意性（ｐ＜０．０６）は基準を満たさないが、見込みを示し、ｎ値の増大につれて確証されてよい。
【図６Ｂ（１）】図６ＡおよびＢは、再灌流の１０分前に１回の大量投与で静脈内に投与するブメタニド（６０ｍｇ／ｋｇ）を受けたおよび受けない、１時間の虚血および２４時間の再灌流にさらされたマウスにおける大脳浮腫および梗塞サイズを示す（図６Ａ）。２％ＴＴＣで染色すると、梗塞した領域は白色である；領域は、治療群を知らされていない研究者によって、形態測定ソフトウェアを使用して分析される（図６Ｂ）。統計的有意性（ｐ＜０．０６）は基準を満たさないが、見込みを示し、ｎ値の増大につれて確証されてよい。
【図６Ｂ（２）】図６ＡおよびＢは、再灌流の１０分前に１回の大量投与で静脈内に投与するブメタニド（６０ｍｇ／ｋｇ）を受けたおよび受けない、１時間の虚血および２４時間の再灌流にさらされたマウスにおける大脳浮腫および梗塞サイズを示す（図６Ａ）。２％ＴＴＣで染色すると、梗塞した領域は白色である；領域は、治療群を知らされていない研究者によって、形態測定ソフトウェアを使用して分析される（図６Ｂ）。統計的有意性（ｐ＜０．０６）は基準を満たさないが、見込みを示し、ｎ値の増大につれて確証されてよい。
【図６Ｂ（３）】図６ＡおよびＢは、再灌流の１０分前に１回の大量投与で静脈内に投与するブメタニド（６０ｍｇ／ｋｇ）を受けたおよび受けない、１時間の虚血および２４時間の再灌流にさらされたマウスにおける大脳浮腫および梗塞サイズを示す（図６Ａ）。２％ＴＴＣで染色すると、梗塞した領域は白色である；領域は、治療群を知らされていない研究者によって、形態測定ソフトウェアを使用して分析される（図６Ｂ）。統計的有意性（ｐ＜０．０６）は基準を満たさないが、見込みを示し、ｎ値の増大につれて確証されてよい。
【図６Ｂ（４）】図６ＡおよびＢは、再灌流の１０分前に１回の大量投与で静脈内に投与するブメタニド（６０ｍｇ／ｋｇ）を受けたおよび受けない、１時間の虚血および２４時間の再灌流にさらされたマウスにおける大脳浮腫および梗塞サイズを示す（図６Ａ）。２％ＴＴＣで染色すると、梗塞した領域は白色である；領域は、治療群を知らされていない研究者によって、形態測定ソフトウェアを使用して分析される（図６Ｂ）。統計的有意性（ｐ＜０．０６）は基準を満たさないが、見込みを示し、ｎ値の増大につれて確証されてよい。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７９】
この化合物の評価方法は、ＡＱＰ１、−４、−５および−９チャネルで使用された。チャネル刺激の観察を、同様のアッセイ方法を使用して行ったが、その結果は、所定の濃度におけるコントロールに対する％刺激として報告された。Ｙｏｏｌらによる以前の研究(Brooks et al., 2000; Yool et al., 2002) は、テトラエチルアンモニウムを、ＡＱＰ１チャネルを介した水流出を遮断する最初の非水銀薬剤として同定した（Brooks et al., 2000）。ＴＥＡは、Ｋ＋チャネルサブタイプおよびニコチン性アセチルコリン受容体のブロッカーとして知られている。ＡＱＰ１のＴＥＡ感受性は、水孔の外側の前庭における、チロシン１８６をフェニルアラニンとする（Ｙ１８６Ｆ）部位特異的突然変異によって除去され、このことから、ＴＥＡの抑制作用は、内因性のチャネルに対する非特異的効果によらないことが確認された(Brooks et al., 2000)。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
腎臓における天然のＡＱＰ１チャネルおよびメイディン・ダービー・イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）細胞株における組み換えＡＱＰ１チャネルもまた、ＴＥＡによる水透過性の遮断を示し(Yool et al., 2002)、このことは、この効果が卵母細胞発現系に限定されないことを示す。ＴＥＡによる水透過性の阻害は、ラットの腎臓のヘンレ係蹄の下行脚の細い部（天然ＡＱＰ１を豊富に発現する）にて見られたが、上行脚の細い部（ａｓｃｅｎｄｉｎｇ  ｔｈｉｎ  ｌｉｍｂｓ）（それらは発現しない）では見られなかった。この働きは独立して確認および拡張され (Detmers et al., 2006; Tyagi and Namboodri, 2005)、このことは、卵母細胞発現系におけるアクアポリンチャネルのブロッカーのスクリーニングの実現可能性を提供する。Brooks et al., 2000は、卵母細胞で発現される野生型および部位特異的変異型のＡＱＰ１チャネルの水透過性（Ｐｆ）値に対するテトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）の効果を示す。ＡＱＰ遮断薬のメカニズムの理解に対する構造的な見通しは、蓄積されたウシＡＱＰ１のＸ線構造（１Ｊ４Ｎ）の研究から得られた（De Groot and Grubmuller参照）。ＡＱＰ１を通した水流出の遮断は、システイン１８９における水銀（ＨｇＣｌ２）の共有結合に関与することが報告された(Preston et al., 1993)。Ｃｙｓ−１８９が外側の水孔前庭にあるため、水銀化合物によるＡＱＰ１の遮断は、直接の閉塞の結果であると考えられる。しかしながら、分子モデリング研究は、ＡＱＰ４における対応する残基が水銀非感受性アラニンであることを明らかにする。反対に、ＡＱＰ４チャネルの阻害は、ＰＫＣによるセリン１８０のリン酸化に起因する一方で、ＡＱＰ１における等価な残基がアルギニンであることが報告された (Zelenina et al., 2002) 。更に、Ｓｅｒ−１８０が水孔から離れて位置するため、チャネル阻害は構造変化に仲介されるようであり、このことは、従って、ＡＱＰ４機能のアロステリックな調節のための能力を示唆する。これらの理由のために、本発明者は、まず、潜在的なＡＱＰ４チャネルブロッカーとしてのバイアスをかけた化合物のライブラリーを評価することを選択した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８１】
最初のＡＱＰチャネルスクリーニングのためのライブラリーの組成物は、直観および水を輸送する組織に関わる臨床的な副作用に関する手掛かりに基づいて、様々なチャネル、トランスポーターおよび受容体遮断化合物を含んでいた。単純なスクリーニグでは（図１）、コントロールおよびＡＱＰ４を発現する卵母細胞を、試験化合物を含む等張食塩水  （１００ｍＭ  ＮａＣｌ；５ｍＭ  ＭｇＣｌ２；５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．３；〜２００ｍＯｓｍ）の中で、それぞれの実験の前に１０−１５分間前培養し；その後、１００ｍＯｓｍ食塩水に移した後、卵母細胞の破裂（物理的な爆発）までの時間を視覚的にモニターした。ブロッキング化合物がない状態で、浸透圧的に生じる水浸入は、迅速な膨潤および破裂をもたらした。遮断は、低張食塩水における破裂に要する時間の増大から明らかであった。真水の環境に適用されＡＱＰを欠くコントロール卵母細胞は、１０分以上において検出可能な膨張は示さなかった。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８２】
図１は、ＡＱＰ４を発現する卵母細胞における、破裂までの時間に対する薬剤の効果を示す。本発明者によってスクリーニングされた３０を超える化合物のうち、１００μＭのブメタニドは、ＡＱＰ４発現卵母細胞において、破裂時間を有意に遅らせた４つの化合物のうちの１つだった。ＡＱＰ４（「水銀非感受性水チャネル」としても知られる）は、ＨｇＣｌ２の効果を示さなかった。これらのデータは、有意なＡＰＱ４遮断が１００μＭブメタニドによる処理に起因したことを示す。しかしながら、このアッセイの細胞の性質およびブメタニドの既知のＮａ−Ｋ−Ｃｌチャネル遮断特性により、卵母細胞膨潤に対するブメタニドの遮断効果はＡＱＰ４チャンルとの直接の相互作用に起因することを実証する必要があった。ＡＱＰ４に対するブメタニドの直接の作用は、ＡＱＰ４変異体を遮断するブメタニドの能力を減じるが、水流出の割合は変更しないような部位特異的突然変異によって、明白に実証された。これらの突然変異部位において注目すべきことは、ＡＱＰ４の細胞内表面のまたはその表面近くのそれらの位置である。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
ブメタニドに加えて、フロセミドおよびトラセミドのようなその他の古典的ループ系利尿剤薬剤が試験され、ＡＱＰ４を遮断する能力が有意に異なることがわかった。ＡＱＰ４発現卵母細胞（図２Ａ−２Ｄ）において、フロセミドは、正常な細胞外の様式で投与された場合、膨潤速度の遮断は、ブメタニドほど有効ではなかった。部位特異的突然変異の結果に基づき、これらの薬剤の提案される細胞内結合部位を試験するよう実験が設計された。ブメタニド、特にフロセミドは、より低い濃度で遮断の改善を示すという観察結果（図２Ｅおよび２Ｆ）は、これらの薬剤の推定上の結合部位は、ＡＱＰ４チャネルの細胞内またはその付近にあるという我々の仮説を支持している。さらに、この結果は、ＡＱＰ４遮断薬のための重要なファルマコフォア要素として、フロセミドおよびブメタニドの両方に共通する３−（スルファモイル）安息香酸スキャフォールドの重要性を明らかにした。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８５】
図２は、ブメタニドおよび関連するループ系利尿剤化合物による、ＡＱＰ４発現卵母細胞における遮断の定量分析を示す。（ａ）細胞外のブメタニドによる用量依存的な遮断、およびフロセミドによる１００μＭの同様の遮断。（ｂ）１ｍＭまでの濃度のトラセミドによる遮断の欠如。（ｃ）ｎ値（Ｘ軸の下）および統計的有意性を示す、対応する概略的ヒストグラム。（ｄ）ループ系利尿剤化合物の構造；差異は、ＡＱＰ４遮断に関連する特徴に対する見通しを提供する。（ｅ）卵母細胞へのブロッカーの内部注射の増強された効果、内部作用部位と一致する；（ｆ）ブメタニドおよびフロセミドの「ｉ」細胞内、「ｅ」細胞外の適用のデータの概略的ヒストグラム。（ｅ）。記号：ｏは、未処理の野生型と差がない；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１．独立スチューデント試験。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８６】
例２
ＡＱＰ４遮断のインビボの効果
ブメタニドによる遮断の標的としての本来のＡＱＰ４の役割を、星状膠細胞（図４）の初代培養にて試験した。我々は、薬剤を含むまたは含まない１５分のプレインキュベーション後に、初代の海馬カルチャーにおけるラット星状膠細胞の膨張応答を比較した。膨潤は、プレインキュベーションの条件と一致する細胞外ブメタニド（１００μＭ）と共に、またはブメタニドなしで、５０％の低張食塩水で培養プレートの迅速な潅流によって誘導した。膠細胞は、神経膠特異的マーカー（ＧＦＡＰ）に陽性の細胞との形態的比較によって同定した。低張負荷の前およびその間に、タイムラプス画像を１５秒おきに撮影した。応答は、逆位相差顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）を使用してタイムラプスデジタル画像（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＭａｇｎａＦｉｒｅ  ｃａｍｅｒａ  ａｎｄ  ｉｍａｇｅ  ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅ）によって視覚化し、時間の関数として細胞体領域における変化によって決定した；データは、Ｓｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅ（ＮＩＨ）ソフトウェアによって分析した。それぞれのカルチャーは、１度のみの膨潤試験に使用した。コントロールカルチャーは、プレインキュベーションおよび低張食塩水中での等価用量のベヒクル（ＤＭＳＯ）にて、並行に処理した。ＤＭＳＯの用量は、膠細胞応答に大きな効果はなかった（データは示さず）。神経膠の最初の膨潤および続く調節性の体積減少（ＲＶＤ）の両方は、コントロールと比較してブメタニド処理によって減少した。ＲＶＤの効果は、イオン輸送系の遮断から予測されるかもしれないが、最初の膨潤過程の遮断はＡＱＰ４水チャネルに対する直接の効果と一致する。したがって、ＡＱＰ４は、脳浮腫形成の緩和における、ブメタニド（およびより強力な誘導体）の使用の候補となる標的である。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８７】
本発明者らは、ＡＱＰ４の遮断は、膨張から星状膠細胞を保護し（図３）、従って、発作後の初期段階におけるそのような膨潤によって引き起こされる脳血液関門の物理的な破壊を減少し、および、続く損傷の拡散を緩和することができることを示した。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８８】
図３は、初代の海馬のカルチャー（インビトロで１４−１５日）における、０時における５０％低張食塩水への接触後の星状膠細胞の膨潤に対するブメタニドの保護効果を示す。プロット（左）：Ｓｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅ（ＮＩＨ）ソフトウェアによって定量された最初の体積で標準化した、位相差顕微鏡法によって視覚化された細胞領域。画像（右）：低張食塩水の前（上）および５０％低張食塩水で１５秒（下）における、ブメタニド処理を行った膠細胞（矢印）。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９１】
図４は、オスのコントロールマウスにおける中大脳動脈閉塞による虚血性脳卒中の負荷の前、間および後における血流速度のドップラーレーザー測定を示す。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９２】
マウスにおけるＭＣＡＯモデルのための典型的な手順方法：９−１１週齢の野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊのオスのマウスに麻酔し、脳の血流を、レーザードップラーを使用してベースラインとして記録する。モノフィラメントは内部の共通する頚動脈に設置し、中大脳動脈の心門に向かって進む。フィラメント設置は、脳血流の≧７５％減少によって成功とみなす。図４によるドップラーの流れの調査は、脳血流における＞８０％の減少は、虚血に十分な期間（〜６０分）維持されたことを示す。虚血の１時間後、フィラメントの収縮によって再灌流を開始すると、血流はベースラインに向けて戻る。２４時間後、動物を、神経学的な障害、行動の障害および一般的な障害の評価に供し、その後、屠殺し、梗塞および反対のコントロール半球の解剖学的な分析に供した。標準的手順は、図５に要約される。この中では、インビボの実験プロトコールにおける標準のためのスケジュールの概要的例が示される。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９３】
図６は、再灌流の１０分前に１回の大量投与で静脈内にブメタニド（６０ｍｇ／ｋｇ）を投与するおよびしない、１時間の虚血および２４時間の再灌流にさらされたマウスにおける、大脳浮腫および梗塞サイズを示す。２％ＴＴＣで染色すると、梗塞した領域は白色となる；領域は、治療群を知らされない研究者により形態測定ソフトウェアを使用して分析される。統計的有意性（ｐ＜０．０６）は基準を満たさないが、見込みを示し、ｎ値が増大によって確証されてよい。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９５】
図６は、再灌流の開始前１０分にブメタニド（６０ｍｇ／ｋｇ）を適用しおよび適用しない（コントロール）場合の、１時間の閉塞および２４時間の再灌流の後のＭＣＡＯマウスの脳における脳梗塞を示す。（Ａ）梗塞領域の概略的ヒストグラム。（Ｂ）色素（ＴＴＣ）染色の不足により視覚化される、梗塞領域の４つのスライスされた脳の画像。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2010508300.tif 000219
【図２Ａ】
2010508300.tif 000220
【図２Ｂ】
2010508300.tif 000221
【図２Ｃ】
2010508300.tif 000222
【図２Ｄ】
2010508300.tif 000223
【図２Ｅ】
2010508300.tif 000224
【図２Ｆ】
2010508300.tif 000225
【図３Ａ】
2010508300.tif 000226
【図３Ｂ】
2010508300.tif 000227
【図３Ｃ】
2010508300.tif 000228
【図４】
2010508300.tif 000229
【図５】
2010508300.tif 000230
【図６Ａ】
2010508300.tif 000231
【図６Ｂ（１）】
2010508300.tif 000232
【図６Ｂ（２）】
2010508300.tif 000233
【図６Ｂ（３）】
2010508300.tif 000234
【図６Ｂ（４）】
2010508300.tif 000235
【国際調査報告】
2010508300.tif 000236