(57)【要約】  本発明は、その癌患者中のマイクロＲＮＡ  ｈｓａ−ｍｉＲ１３７、ｈｓａ−ｍｉＲ３７２、ｈｓａ−ｍｉＲ１８２＊、ｈｓａ−ｍｉＲ２２１およびｈｓａ−ｌｅｔ−７ａの発現レベルに基づいた癌患者の治療後生存見込みを予測する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌患者の治療後生存を予測する方法であって、
治療を受けた癌患者のマイクロＲＮＡであるｈｓａ−ｍｉＲ１３７、ｈｓａ−ｍｉＲ３７２、ｈｓａ−ｍｉＲ１８２＊、ｈｓａ−ｍｉＲ２２１およびｈｓａ−ｌｅｔ−７ａの発現レベルを検出すること、
前記マイクロＲＮＡの発現レベルに基づいて患者のリスクスコアを計算すること、および
リスクスコアの値に基づいて治療後生存の見通しを決定すること、
からなる方法。
【請求項２】
前記リスクスコアが、
（０．１５×ｈｓａ−ｍｉＲ１３７の発現レベル）＋（０．３１×ｈｓａ−ｍｉＲ３７２の発現レベル）＋（０．２８×ｈｓａ−ｍｉＲ１８２＊の発現レベル）＋（−０．１３×ｈｓａ−ｍｉＲ２２１の発現レベル）＋（−０．１４×ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａの発現レベル）として計算される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
−７．１以下のリスクスコアは患者が治療後生存の十分な見通しを有することを示す請求項２に記載の方法。
【請求項４】
患者は肺癌、白血病、乳癌、膵臓癌、腺癌、扁平上皮癌、結腸癌または肝細胞癌を有する請求項１に記載の方法。
【請求項５】
患者は非小細胞肺癌を有する請求項１に記載の方法。
【請求項６】
患者は、非小細胞肺癌のＩ、ＩＩまたはＩＩＩ段階にいる請求項５に記載の方法。
【請求項７】
患者は、外科治療、化学治療、放射線治療またはその組み合わせを受けた請求項１に記載の方法。
【請求項８】
癌患者の治療後生存を予測する方法であって、
治療を受けた癌患者におけるｈｓａ−ｍｉＲ１３７、ｈｓａ−ｍｉＲ３７２、ｈｓａ−ｍｉＲ１８２＊およびｈｓａ−ｍｉＲ２２１から成るグループから選択されたマイクロＲＮＡの発現レベルを検出すること、
前記発現レベルに基づいてマイクロＲＮＡの−ｄＣｔ値を決定すること、および
前記マイクロＲＮＡの−ｄＣｔ値に基づいて治療後生存の見通しを予測すること、
からなる方法。
【請求項９】
−８．２２以下のｈｓａ−ｍｉＲ１３７の−ｄＣｔ値は、患者が治療後生存の十分な見通しを有することを示す請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
−７．８３以下のｈｓａ−ｍｉＲ１８２＊の―ｄＣｔ値は、患者が治療後生存の十分な見通しを有することを示す請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
−０．５７以上のｈｓａ−ｍｉＲ２２１の−ｄＣｔ値は、患者が治療後生存の十分な見通しを有することを示す請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
−１１．２５以下のｈｓａ−ｍｉＲ３７２の−ｄＣｔ値は、患者が治療後生存の十分な見通しを有することを示す請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
患者は肺癌、白血病、乳癌、膵臓癌、腺癌、扁平上皮癌、結腸癌または肝細胞癌を有する請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
患者は非小細胞肺癌を有する請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
患者は、非小細胞肺癌のＩ、ＩＩまたはＩＩＩ段階にいる請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
患者は、外科治療、化学治療、放射線治療またはその組み合わせを受けた請求項８に記載の方法。
【請求項１７】
癌患者の治療後生存を予測する方法であって、
治療を受けた癌患者のｌｅｔ−７ａの発現レベルを検出すること、
前記発現レベルに基づいてｌｅｔ−７ａの−ｄＣｔ値を決定すること、および
前記ｌｅｔ−７ａの−ｄＣｔ値に基づいて治療後生存の見通しを予測すること、
からなり、２．２１以上の−ｄＣｔ値は、患者が治療後生存の十分な見通しを有することを示す方法。
【請求項１８】
癌患者の治療後生存を予測する方法であって、
治療を受けた癌患者におけるｈｓａ−ｍｉＲ１３７、ｈｓａ−ｍｉＲ３７２、ｈｓａ−ｍｉＲ１８２＊、ｈｓａ−ｍｉＲ２２１およびｈｓａ−ｌｅｔ−７ａから成るグループから選択された４つのマイクロＲＮＡの発現レベルを検出すること、
マイクロＲＮＡの発現レベルに基づいてリスクスコアを計算すること、および
リスクスコアの値に基づいて治療後生存の見通しを決定すること、
からなる方法。
【請求項１９】
ｈｓａ−ｍｉＲ３７２、ｈｓａ−ｍｉＲ１８２＊、ｈｓａ−ｍｉＲ２２１およびｈｓａ−ｌｅｔ−７ａの発現レベルを決定し、
リスクスコアを次のように決定し：（０．３１×ｈｓａ−ｍｉＲ３７２の発現レベル）＋（０．２８×ｈｓａｍｉＲ１８２＊の発現レベル）＋（−０．１３×ｈｓａ−ｍｉＲ２２１の発現レベル）＋（−０．１４×ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａの発現レベル）、
−５．９０以下のリスクスコアは、患者が治療後生存の十分な見通しを有することを示す請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ｈｓａ−ｍｉＲ１３７、ｈｓａ−ｍｉＲ１８２＊、ｈｓａ−ｍｉＲ２２１およびｈｓａ−ｌｅｔ−７ａの発現レベルを決定し、
リスクスコアを次のように決定し：（０．１５×ｈｓａ−ｍｉＲ１３７の発現レベル）＋（０．２８×ｈｓａｍｉＲ１８２＊の発現レベル）＋（−０．１３×ｈｓａ−ｍｉＲ２２１の発現レベル）＋（−０．１４×ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａの発現レベル）、
−３．７１以下のリスクスコアは、患者が治療後生存の十分な見通しを有することを示す請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
ｈｓａ−ｍｉＲ−１３７、ｈｓａ−ｍｉＲ３７２、ｈｓａ−ｍｉＲ２２１およびｈｓａ−ｌｅｔ−７ａの発現レベルを決定し、
リスクスコアを次のように決定し：（０．１５×ｈｓａ−ｍｉＲ１３７の発現レベル）＋（０．３１×ｈｓａｍｉＲ３７２の発現レベル）＋（−０．１３×ｈｓａ−ｍｉＲ２２１の発現レベル）＋（−０．１４×ｈｓａ−ｌｅｔ７ａの発現レベル）、
−４．８７以下のリスクスコアは、患者が治療後生存の十分な見通しを有することを示す請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
ｈｓａ−ｍｉＲ１３７、ｈｓａ−ｍｉＲ１８２＊、ｈｓａ−ｍｉＲ３７２およびｈｓａ−
ｌｅｔ−７ａの発現レベルを決定し、
リスクスコアを次のように決定し：（０．１５×ｈｓａ−ｍｉＲ１３７の発現レベル）＋（０．２８×ｈｓａｍｉＲ１８２＊の発現レベル）＋（０．３１×ｈｓａ−ｍｉＲ３７２の発現レベル）＋（−０．１４×ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａの発現レベル）、
−７．０２以下のリスクスコアは、患者が治療後生存の十分な見通しを有することを示す請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
ｈｓａ−ｍｉＲ１３７、ｈｓａ−ｍｉＲ１８２＊、ｈｓａ−ｍｉＲ２２１およびｈｓａ−ｍｉＲ３７２の発現レベルを決定し、
リスクスコアを次のように決定し：（０．１５×ｈｓａ−ｍｉＲ１３７の発現レベル（＋（０．２８×ｈｓａｍｉＲ１８２＊の発現レベル）＋（−０．１３×ｈｓａ−ｍｉＲ２２１の発現レベル）＋（０．３１×ｈｓａ−ｍｉＲ３７２の発現レベル）、
−６．８６以下のリスクスコアは、患者が治療後生存の十分な見通しを有することを示す請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
癌患者の治療後生存を予測する方法であって、
治療を受けた癌患者のｈｓａ−ｍｉＲ２２１、ｈｓａ−ｍｉＲ３７２およびｈｓａ−ｍｉＲ１３７の発現レベルを検出すること、
前記マイクロＲＮＡの発現レベルに基づいてリスクスコアを計算すること、および
前記リスクスコアの値に基づいて治療後生存の見通しを決定すること、
からなる方法。
【請求項２５】
前記リスクスコアは次のように計算され：（０．１５×ｈｓａ−ｍｉＲ１３７の発現レベル）＋（０．３１×ｈｓａ−ｍｉＲ３７２の発現レベル）＋（−０．１３×ｈｓａ−ｍｉＲ２２１の発現レベル）、
−４．７以下のリスクスコアは、患者が治療後生存の十分な見通しを有することを示す請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
マイクロＲＮＡの発現を検出するキットであって、
ｈｓａ−ｍｉＲ２２１、ｈｓａ−ｍｉＲ３７２およびｈｓａ−ｍｉＲ１３７の発現を検出可能なオリゴヌクレオチドを含むキット。
【請求項２７】
マイクロＲＮＡの発現を検出するキットであって、
ｈｓａ−ｍｉＲ１３７、ｈｓａ−ｍｉＲ３７２、ｈｓａ−ｍｉＲ１８２＊、ｈｓａ−ｍｉＲ２２１およびｈｓａ−ｌｅｔ−７ａから成るグループから選択された少なくとも４つのマイクロＲＮＡの発現を検知可能なオリゴヌクレオチドを含むキット。
【請求項２８】
ｈｓａ−ｍｉＲ１３７、ｈｓａ−ｍｉＲ３７２、ｈｓａ−ｍｉＲ１８２＊、ｈｓａ−ｍｉＲ２２１およびｈｓａ−ｌｅｔ−７ａの発現を検出可能なオリゴヌクレオチドを含む請求項２７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はマイクロＲＮＡによる癌患者における治療後生存の予測に関する。
（関連出願の相互参照）
本願は、その内容全体が本明細書に組み込まれる２００７年４月１０日出願の米国仮出願第６０／９１０，９９３号の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
肺癌、主に非小細胞細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）は世界中の癌による死のうちの最も一般的な原因である。非特許文献１参照。初期段階のＮＳＣＬＣ患者は、治療後５年以内に４０％の再発率を示すが、これは疾病の段階が臨床転帰に関連する要因であり得ることを示唆している。非特許文献２参照。しかしながら、この要因のみではそのような転帰を予測するのに不十分である。
【０００３】
遺伝子発現プロファイル、特にマイクロＲＮＡプロファイルが、癌の診断および予後の両方で有用であることが示唆された。非特許文献３および４参照。例えば、あるマイクロＲＮＡの発現パターンは、癌サブタイプの決定において、タンパク質をコードする遺伝子の発現パターンよりも正確であることが判明している。非特許文献５および６参照。
【０００４】
マイクロＲＮＡは、ＲＮＡ干渉により何百もの遺伝子の発現を制御するタンパク質をコードしない小さなＲＮＡであり、それゆえ例えば細胞増殖、分化、アポトーシス等の広範な生体内経路を制御する。非特許文献５参照。あるマイクロＲＮＡのサイン、つまり患者群における特定の発現パターンを示す１つまたは複数のマイクロＲＮＡが、慢性リンパ球白血病、肺腺癌、乳癌、および膵臓癌の臨床転帰に関連することが報告された。非特許文献５参照。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Jemal et al., CA Cancer J. Clin. 56:106-130 (2006)
【非特許文献２】Miller, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 33: 216-223 (2005)
【非特許文献３】Endoh et al., J. Clin. Oncol. 22:811-819 (2004)
【非特許文献４】Potti et al., N. Engl. J. Med. 355:570-580 (2006)
【非特許文献５】Calin et al., Nat. Rev. Cancer 6:857-866 (2006)
【非特許文献６】Volinia et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103:2257-2261 (2006)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
新しいマイクロＲＮＡサインの同定は、そのようなサインが種々の癌、特にＮＳＣＬＣでの臨床転帰を予測する際の有用なツールになると思われるため、大いに興味が持たれている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ｈｓａ−ｍｉＲ１３７、ｈｓａ−ｍｉＲＮＡ３７２、ｈｓａ−ｍｉＲ１８２＊、ｈｓａ−ｍｉＲ２２１およびｈｓａ−ｌｅｔ−7ａ等の特定のマイクロＲＮＡの発現
レベルが、癌患者の治療後生存見込みと関連するという知見に基づいている。
【０００８】
１態様では、本発明は、ｈｓａ−ｍｉＲ１３７、ｈｓａ−ｍｉＲ３７２、ｈｓａ−ｍｉ
Ｒ１８２＊、ｈｓａ−ｍｉＲ２２１またはｈｓａ−ｌｅｔ−７ａの発現レベルに基づいて正規化閾値サイクル値（−ｄＣｔ）を決定することにより、癌患者の治療後生存見込みを予測する方法を提供する。ｈｓａ−ｍｉＲ１３７、ｈｓａ−ｍｉＲ１８２＊およびｈｓａ−ｍｉＲ３７２のｄＣｔ値がそれぞれ−８．２２、−７．８３および−１１．２５以下の場合、またはｈｓａ−ｍｉＲ２２１およびｈｓａ−ｌｅｔ−７ａの−ｄＣｔ値がそれぞれ−０．５７および２．２１以上の場合、患者は治療後生存の十分な見通しを有すると決定される。
【０００９】
別の態様では、癌患者の治療後生存見込みは、ｈｓａ−ｍｉＲ１３７、ｈｓａ−ｍｉＲ３７２、ｈｓａ−ｍｉＲ１８２＊、ｈｓａ−ｍｉＲ２２１およびｈｓａ−ｌｅｔ−７ａから選択されたマイクロＲＮＡのうちの４つの発現レベルに基づいて予測することが可能である。より詳細には、
１．ｈｓａ−ｍｉＲ３７２、ｈｓａ−ｍｉＲ１８２＊、ｈｓａ−ｍｉＲ２２１およびｈｓａ−ｌｅｔ−７ａの発現レベルを調べる場合、リスクスコアは次のように計算される：（０．３１×ｈｓａ−ｍｉＲ３７２の発現レベル）＋（０．２８×ｈｓａ−ｍｉＲ１８２＊の発現レベル）＋（−０．１３×ｈｓａ−ｍｉＲ２２１の発現レベル）＋（−０．１４×ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａの発現レベル）。−５．９０以下のリスクスコアは、患者が十分な治療後生存見込みを有することを示す。
【００１０】
２．ｈｓａ−ｍｉＲ１３７、ｈｓａ−ｍｉＲ１８２＊、ｈｓａ−ｍｉＲ２２１およびｈｓａ−ｌｅｔ−７ａの発現レベルを調べる場合、リスクスコアは次のように計算される：（０．１５×ｈｓａ−ｍｉＲ１３７の発現レベル）＋（０．２８×ｈｓａ−ｍｉＲ１８２＊の発現レベル）＋（−０．１３×ｈｓａ−ｍｉＲ２２１の発現レベル）＋（−０．１４×ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａの発現レベル）。−３．７１以下のリスクスコアは、患者が十分な治療後生存見込みを有することを示す。
【００１１】
３．ｈｓａ−ｍｉＲ１３７、ｈｓａ−ｍｉＲ３７２、ｈｓａ−ｍｉＲ２２１およびｈｓａ−ｌｅｔ−７ａの発現レベルを調べる場合、リスクスコアは次のように計算される：（０．１５×ｈｓａ−ｍｉＲ１３７の発現レベル）＋（０．３１×ｈｓａ−ｍｉＲ３７２の発現レベル）＋（−０．１３×ｈｓａ−ｍｉＲ２２１の発現レベル）＋（−０．１４×ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａの発現レベル）。−４．８７以下のリスクスコアは、患者が十分な治療後生存見込みを有することを示す。
【００１２】
４．ｈｓａ−ｍｉＲ１３７、ｈｓａ−ｍｉＲ１８２＊、ｈｓａ−ｍｉＲ３７２およびｈｓａ−ｌｅｔ−７ａの発現レベルを調べる場合、リスクスコアは次のように計算される：（０．１５×ｈｓａ−ｍｉＲ１３７の発現レベル）＋（０．２８×ｈｓａ−ｍｉＲ１８２＊の発現レベル）＋（０．３１×ｈｓａ−ｍｉＲ３７２の発現レベル）＋（−０．１４×ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａの発現レベル）。−７．０２以下のリスクスコアは、患者が十分な治療後生存見込みを有することを示す。
【００１３】
５．ｈｓａ−ｍｉＲ１３７、ｈｓａ−ｍｉＲ１８２＊、ｈｓａ−ｍｉＲ２２１およびｈｓａ−ｍｉＲ３７２の発現レベルを調べる場合、リスクスコアは次のように計算される：（０．１５×ｈｓａ−ｍｉＲ１３７の発現レベル）＋（０．２８×ｈｓａ−ｍｉＲ１８２＊の発現レベル）＋（−０．１３×ｈｓａ−ｍｉＲ２２１の発現レベル）＋（０．３１×ｈｓａ−ｍｉＲ３７２の発現レベル）。−６．８６以下のリスクスコアは、患者が十分な治療後生存見込みを有することを示す。
【００１４】
さらに別の実施形態では、癌患者の治療後生存見込みは、上述の５つのマイクロＲＮＡの患者の発現レベルに基づいて予測することが可能である。リスクスコアは次のように計算される：（０．１５×ｈｓａ−ｍｉＲ１３７の発現レベル）＋（０．３１×ｈｓａ−ｍ
ｉＲ３７２の発現レベル）＋（０．２８×ｈｓａ−ｍｉＲ−１８２＊の発現レベル）＋（−０．１３×ｈｓａ−ｍｉＲ２２１の発現レベル）＋（−０．１４×ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａの発現レベル）。患者のリスクスコアが−７．１以上の場合、その癌患者は十分な治療後生存見込みを有する。
【００１５】
さらに別の態様では、治療後生存見込みはｈｓａ−ｍｉＲ２２１、ｈｓａ−ｍｉＲ３７２およびｈｓａ−ｍｉＲ１３７の発現レベルに基づいて予測することが可能である。リスクスコアは次のように計算される：（０．１５×ｈｓａ−ｍｉＲ１３７の発現レベル）＋（０．３１×ｈｓａ−ｍｉＲ３７２の発現レベル）＋（−０．１３×ｈｓａ−ｍｉＲ２２１の発現レベル）。リスクスコアが−４．７以下の場合、癌患者は治療後生存の十分な見通しを有する。
【００１６】
「治療後生存の十分な見通し」を有する癌患者とは、治療後に死ぬその患者のリスクが同じ種類の癌に罹っている患者が死ぬ平均リスクよりも少なくとも５０％（例えば１００％または１５０％）低いことを意味する。
【００１７】
マイクロＲＮＡの発現を検知するためのキットも本発明の範囲内にある。１例において、キットは、ｈｓａ−ｍｉＲ２２１、ｈｓａ−ｍｉＲ３７２およびｈｓａ−ｍｉＲ１３７の発現を検知可能なオリゴヌクレオチドを含む。別の例において、キットは、ｈｓａ−ｍｉＲ１３７、ｈｓａ−ｍｉＲ３７２、ｈｓａ−ｍｉＲ１８２＊、ｈｓａ−ｍｉＲ２２１およびｈｓａ−ｌｅｔ−７ａから選択された少なくとも４つのマイクロＲＮＡの発現を検知可能なオリゴヌクレオチドを含む。上述のキットの任意のものに含まれるオリゴヌクレオチドは、核酸チップを形成すべく、支持部材（例えばポリマー基質）上に固定化することが可能である。
【００１８】
治療（例えば外科治療、化学治療または放射線治療）を受けた癌患者は、肺癌（例えばすべての段階の非小細胞肺癌）、白血病、乳癌、膵臓癌、腺癌、扁平上皮癌、結腸癌または肝細胞癌を有する。
【００１９】
本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細は以下に説明する。本発明の他の特徴、目的および利点は以下の説明および請求項から明らかとなるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】１１２人のＮＳＣＬＣ患者におけるｈｓａ−ｍｉＲ１３７、ｈｓａ−ｍｉＲ３７２、ｈｓａ−ｍｉＲ１８２＊、ｈｓａ−ｍｉＲ２２１およびｈｓａ−ｌｅｔ−７ａの発現レベルに基づくかかるＮＳＣＬＣ患者のマイクロＲＮＡリスクスコア分析を示す図。上部パネル：マイクロＲＮＡリスクスコア分布。中央パネル：患者の死／生存状態。下部パネル：患者のマイクロＲＮＡの発現プロフィール；下から上まで５つの列はｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ２２１、ｈｓａ−ｍｉＲ３７２、ｈｓａ−ｍｉＲ１８２＊およびｈｓａ−ｍｉＲ１３７をそれぞれ指す；各カラムは患者を表わす。点線は患者をローリスク群（すなわち低リスク群）とハイリスク群（すなわち高リスク群）に分ける境界線（リスクスコア７．１）を表わす。
【図２】ローリスク群およびハイリスク群の両方におけるＮＳＣＬＣ患者の全体生存および無再発生存を示すカプラン・マイヤー（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ）評価を示す図。パネルＡは訓練データセットの５６人の患者から得られた結果を示し、パネルＢは試験データセットの５６人の患者から得られた結果を示し、パネルＣは独立コホートの６２人の患者から得られた結果を示す。
【図３】ローリスク群およびハイリスク群の両方におけるＮＳＣＬＣ患者の全体生存および無再発生存を示すカプラン・マイヤー（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ）評価を示す図。パネルＡはＩ段階のＮＳＣＬＣ患者（ｎ＝４７）から得られた結果を示し、パネルＢはＩＩ段階のＮＳＣＬＣ患者（ｎ＝２８）から得られた結果を示し、パネルＣはＩＩＩ段階のＮＳＣＬＣ患者（ｎ＝３７）から得られた結果を示し、パネルＤは腺癌患者（ｎ＝５５）から得られた結果を示し、パネルＥは扁平上皮癌患者（ｎ＝５０）から得られた結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本願は、臨床転帰に関連する１つまたは複数のマイクロＲＮＡの発現パターンに基づいて癌患者の臨床転帰（例えば治療後生存見込み）を予測する方法を提供する。
転帰に関連する１つまたは複数のマイクロＲＮＡは次のように同定することができる。
【００２２】
治療後癌患者の群を募集する。同じ種類の癌に離間している患者を、学習グループおよび試験グループに任意に割り当てる。癌組織／細胞（例えば生検、ホルマリン固定パラフィン埋設組織、または凍結組織に含まれるもの）中の多くのマイクロＲＮＡの発現レベルを、両方の群の患者について、当該技術分野で周知の方法、例えばリアルタイムＰＣＲまたはマイクロアレイ分析に従って決定する。そのようにして決定された各マイクロＲＮＡの発現レベルを、正規化発現レベルを同じ患者で得るために、低分子核内ＲＮＡ（例えばＵ１、Ｕ２またはＵ６）等の内部対照の発現レベルにより正規化する。
【００２３】
どのマイクロＲＮＡが癌患者の臨床転帰（例えば治療後生存）に関係しているか決定するために、学習群から得られたマイクロＲＮＡの正規化発現レベルを統計分析（例えばコックス回帰分析）する。１例において、一変量コックス回帰分析から得られたハザード比は、癌または他の原因の再発による死に関連するマイクロＲＮＡ（ｓ）を同定するために使用される。Cox, J. Royal Statistical Society Series B 34:187-220 (1972)参照。マイクロＲＮＡのハザード比が１未満の場合、そのマイクロＲＮＡは保護マイクロＲＮＡとみなされ、マイクロＲＮＡのハザード比が１よりも大きい場合、そのマイクロＲＮＡは危険マイクロＲＮＡとみなされる。
【００２４】
一旦、臨床転帰に関連するマイクロＲＮＡ（例えば保護マイクロＲＮＡと危険マイクロＲＮＡ）が同定されると、当該技術分野で周知の統計分析により、それらの発現パターンと臨床転帰との間の相関性を決定することができる。１一例では、１つまたは複数の保護マイクロＲＮＡおよび／または危険マイクロＲＮＡの発現レベルに基づいて各患者のリスクスコアが計算され、次にリスクスコアの値と治療後の患者の生存期間との関係が決定される。そのように決定された相関性が、マイクロＲＮＡ発現パターンが本当に対象の臨床転帰と関連していることを確認するために試験群で確認される。好ましくは、この相関性は、学習群および試験群と同じく同じ種類の癌に罹っている多くの患者を含む独立コホートでさらに確認される。
【００２５】
確認後、好ましくは検証後、同定されたマイクロＲＮＡを使用して、同じ種類の癌に罹っている患者におけるその発現パターンに基づいて、臨床転帰を予測することが可能である。例えば、これらのマイクロＲＮＡの発現レベルと、上述の統計分析の重要性との両方を考慮して、数式を構築してもよい。この数式に続いて、患者に対してリスクスコアを計算する。リスクスコアの値は患者の臨床転帰を示す。
【００２６】
癌患者の臨床転帰に関連するマイクロＲＮＡは、癌治療の潜在的標的を同定するためにも使用することが可能である。Czech, N. Engl. J. Med. 354:1194-1195 (2006)参照。これらのマイクロＲＮＡによって標的とされた遺伝子は、マイクロＲＮＡ標的予測アルゴリズム（例えばＰｉｃＴａｒ）を使用して同定することができる。Krek et al., Nat. Genet. 37:495-500 (2005)、TargetScan, see Lewis et al., Cell 115:787-798 (2003) 、miRNAMap（Hsu et al., Nucleic Acids Res. 34:D135-139 (2006)参照）、miRBase（Griffiths-Jones et al., Nucleic Acids Res. 34:D140-144 (2006)参照）、GenMAPP（http://w
ww.genmapp.org参照）、Reactome（http://www.reactome.org参照）これらの遺伝子とそ
の産物は癌治療のための潜在的な標的または作用物質である。
【００２７】
これ以上詳述しなくとも、上記の説明は本発明を十分に実施可能にしているものと考えられる。以下の実施例は、ＮＳＣＬＣ患者における治療後生存見込みの予測のために使用可能なマイクロＲＮＡサインを示す。この実施例は、単なる例示であって、如何ようにも本会時の残りの部分を制限するものとは解釈されない。本明細書に引用された公表物はすべて、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００２８】
材料および方法
（ａ）患者および組織標本
全員外科切除手術を受けた１１２人の一連のＮＳＣＬＣ患者をＴａｉｃｈｕｎｇ  Ｖｅｔｅｒａｎｓ総合病院から募集した。これらの患者を、訓練データセット（ｎ＝５６）および試験データセット（ｎ＝５６）に任意に割り当てた。さらに、また外科切除手術を受けた一連の６２人の患者を国立台湾大学病院から募集した。これらの６２人の患者は独立コホートを形成した。肺癌組織の凍結標本を、この研究のために募った患者全員から得た。患者はすべて漢族の中国人である。
（ｂ）マイクロＲＮＡプロファイル
マイクロＲＮＡ発現プロファイリングをＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７９００リアルタイムＰＣＲシステムおよび１５７個の成熟したヒトマイクロＲＮＡを決定するためのプライマーを含むＴａｑＭａｎ  マイクロＲＮＡ  ヒトパネル  初期アクセスキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して行なった。まず、各マイクロＲＮＡのｃＤＮＡを、ＴａｑＭａｎ  マイクロＲＮＡ  ＲＴ試薬およびそのマイクロＲＮＡに特異的なプライマーを使用して増幅し、ＴａｑＭａｎ  ２×ユニバーサルＰＣＲマスター混合物を使用してさらに増幅した。増幅中、蛍光染料をｃＤＮＡ生成物に組み込んだ。閾値サイクル（Ｃｔ）値により表わされる各マイクロＲＮＡの発現レベルは、ｃＤＮＡ生成物に組み込まれた蛍光染料により生成された蛍光レベルに基づいて決定した。Ｃｔは、蛍光が一定の閾値を超えるサイクル数を指す。その後、各マイクロＲＮＡのＣｔ値はマイクロＲＮＡ定量化アッセイの一般的な内部対照であるＵ６値により正規化される。Jiang et al., Nucleic Acids Res. 33:5394-5403 (2005)およびYanaihara et al., Cancer Cell 9:189-198 (2006)参照。より詳細には、正規化Ｃｔ値（−ｄＣｔ）は次のように計算された：−ｄＣｔ＝（ＣｔmicroRNA−ＣｔU6）。
（ｃ）統計分析
一変量コックス回帰分析から得られたハザード比を使用して、その発現レベルが患者の治療後の死／生存に関係するマイクロＲＮＡを同定した。偽陰性結果を低減するために、各マイクロＲＮＡの一変量コックスのＰ値を、患者の生存期間をステータスの検知と共に合計１０，０００の反復のためにランダムに並び替えた並び替え試験により評価した。
【００２９】
各患者のリスクスコアを計算するために数式を構築した。数式は、治療後の死／生存に関係していることが同定された１つまたは複数のマイクロＲＮＡの発現レベルと、前記一変量コックス回帰分析に由来する回帰係数との両方を考慮している。Lossos et al., N. Engl. J. Med. 350:1828-1837; and Cox, 1972参照。患者のリスクスコアは患者の治療後生存期間と相関があり、ハイリスクのスコアを有する患者は治療後により短い生存期間を有すると予想され、ローリスクのスコアを有する患者は治療後に長くより生きると予想される。
【００３０】
本研究を受けた患者はすべて、自身のリスクスコアに基づき、ハイリスク群とローリスク群とに割り当てられた。ハイリスク群とローリスク群との間の患者特性の差を、連続変数に対するスチューデントｔ検定またはカテゴリー変数に対するフィッシャーの正確確率検定を使用して分析した。カプラン−マイヤー方を使用して、両群の患者に対する全体生
存率および無再発生存率を評価した。２つの群の患者間の全体生存率および無再発生存率に関する差異を、対数階級検定を用いて分析した。したがって訓練データセットから得られたすべての結果は、試験データセットの患者および独立コホートの患者で有効であった。
【００３１】
多変数コックスの比例ハザード回帰分析およびステップワイズ変数選択法を行い、患者生存に関連する独立した予後因子の貢献を評価した。マイクロＲＮＡサインのリスクスコア、年齢、性別、段階および組織学を同時変量として使用した。分析はすべてＳＡＳ９．１バージョンソフトウェア（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ）を使用して行なった。２−テイル検定およびＰ値＜０．０５は、結果が統計学的に有意であることを示す。
【００３２】
上述の方法を行なうためのより多くの詳細はＹｕら（Yu et al., Cancer Cell 13, 48-57 (2008).に見出すことが可能である。 
結果
（ａ）ＮＳＣＬＣ患者の全体生存および無再発生存を予測するためのマイクロＲＮＡサインの同定および確認
表１は、訓練データセットに割り当てられた５６人のＮＳＣＬＣ患者と、試験データベースに割り当てられた５６人のＮＳＣＬＣ患者の臨床特性を示す。臨床特性に関して、これらの２つのデータセットに患者間の有意な違いはなかった。
【００３３】
マイクロＲＮＡの発現レベルを、上述の方法に続いてすべての患者で決定した。訓練データセットから得た結果を、一変量コックス回帰分析し、その発現レベルが治療後の死／生存に関連するマイクロＲＮＡを同定する。５つのマイクロＲＮＡ、つまりｈｓａ−ｍｉＲ１３７、ｈｓａ−ｍｉＲ３７２、ｈｓａ−ｍｉＲ１８２＊、ｈｓａ−ｍｉＲ２２１、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ）は、訓練データセットの中で患者の全体生存に関係していると分かった。とくにそのうち、前者３つはハイリスクのマイクロＲＮＡであり、後の２つは保護マイクロＲＮＡである。
【００３４】
これらの５つのマイクロＲＮＡの発現レベルに基づいて、患者のリスクスコアを以下の式に従って計算した：（０．１５×発現レベルのｈｓａ−ｍｉＲ−１３７）＋（０．３１×発現レベルのｈｓａ−ｍｉＲ−３７２）＋（０．２８×発現レベルのｈｓａ−ｍｉＲ−１８２＊）＋（−０．１３×発現レベルのｈｓａ−ｍｉＲ−２２１）＋（０．１４×ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａの発現レベル）。ハイリスクグループに７．１より高いリスクスコアを有する患者はハイリスク群に割り当てられ、７．１よりも低いリスクスコアを有する患者はローリスク群に割り当てられる。
【００３５】
【表１】
2010523156.tif 000002
【００３６】
ハイリスク群およびローリスク群の両方における患者の臨床特性を以下表２に要約する。
【００３７】
【表２】
2010523156.tif 000003
【００３８】
2010523156.tif 000004
【００３９】
図１は、訓練データセットと試験データセットの両方におけるＮＳＣＬＣ患者のリスクスコア、生存状態およびマイクロＲＮＡ発現プロフィールを示す。高いリスクスコアを有
する患者は、３つのハイリスクマイクロＲＮＡのうちのいずれかが高レベルで発現し、２つの保護マイクロＲＮＡのうちのいずれかが低レベルで発現している。それとは逆に、低いリスクスコアを有する患者は、ハイリスクのマイクロＲＮＡのうちのいずれかが低レベルで発現し、保護マイクロＲＮＡのうちのいずれかが高レベルで発現している。
【００４０】
訓練データセットでは、ハイリスク群の患者はローリスク群の患者よりも短い治療後生存期間を示した。図２のパネルＡを参照のこと。ハイリスク郡の患者の全体生存期間の中央値は、約２０か月であり、ローリスク郡の患者の全体生存期間の中央値は５０か月より長かった。無再発生存期間の中央値に関して、ハイリスク群では約１０か月で、ローリスク群では４５か月より長かった。図２のパネルＡを参照のこと。これらの結果は、上述の５つのマイクロＲＮＡの発現パターン（つまりマイクロＲＮＡサイン）が、患者がハイリスク群とローリスク群とのどちらに割り当てられるかに基づいて、癌患者の治療後生存期間に関係している。
【００４１】
マイクロＲＮＡサインと生存見込みとの間のちょうど今述べた関係を、試験データセットで確認した。訓練データセットから得られた結果と同様に、試験データセットから得られた結果も、ローリスク群の患者の方がハイリスク群の患者よりも治療後にはるかに長く生きていたことを示した。図２のパネルＢを参照のこと。ハイリスク群では、全体生存期間の中央値が約２５か月であり、無再発生存期間の中央値は約１４か月であった。ローリスク群では、全体生存期間の中間値および無再発生存期間の中間値は、それぞれ５０か月よりも長く、また４０か月よりも長かった。これらの結果はすべて統計学的に有意であった。
【００４２】
多変数コックス回帰分析は、以下表３に列挙した因子の中で、このマイクロＲＮＡサインのみがＮＳＣＬＣ患者中で、全体生存率（ハザード比［ＨＲ］＝１０．３１、Ｐ＝０．００２）に関連するただ一つの因子であることを示した。
【００４３】
【表３】
2010523156.tif 000005
【００４４】
（ｂ）  独立コホートにおける生存予測のためのマイクロＲＮＡサインの検証
上述のマイクロＲＮＡサインを、６２人のＮＳＣＬＣ患者を含む独立コホートにおける治療後生存見込みを予測する際に有用であるかどうかを検証した。
【００４５】
６２人の患者の臨床特性は、上記の表２に要約してある。各患者のリスクスコアを、上述の方法に従って患者の５つのマイクロＲＮＡの発現パターンに基づいて計算した。７．１よりも高いリスクスコアを有する患者はハイリスク群に割り当て、７．１以下のリスクスコアを有する患者はローリスク群に割り当てた。図２のパネルＣに示されるように、ハイリスク群の患者はローリスク群の患者よりも治療後生存期間が短かった。すなわち、全体生存期間の中央値に関しては４０か月対１２０ヶ月より長い期間であり、無再発生存期間の中央地に関しては２０か月対４８か月である。図２Ｃを参照のこと。多変数コックス回帰分析は、マイクロＲＮＡサインおよび段階が、全体生存および無再発生存に関係することを示した（前掲の表３参照）。
【００４６】
これらの結果は、癌患者の治療後生存見込みを予測するのにマイクロＲＮＡサインを使用することができることを裏付けている。
（ｃ）異なる疾病段階および異なる組織学的サブグループにおけるＮＳＣＬＣ患者のマイクロＲＮＡサインおよび治療後生存の間の関係
異なる疾病段階の、および異なる組織学的サブグループにおけるＮＳＣＬＣ患者を、上述の方法に続いて、患者のマイクロＲＮＡサインに基づいてハイリスク群とローリスク群に割り当てた。図３に示されるように、ローリスク群の患者はハイリスクグループ群の患者よりも治療後に長く生きていた。パネルＡＥ参照。これらの結果は、異なる疾病段階（つまりＩ、ＩＩ、ＩＩＩ段階）にいて、かつおよび異なる組織学的サブグループ（つまり腺癌または扁平上皮癌サブグループ）のＮＳＣＬＣ患者の治療後生存見込みを予測するのにマイクロＲＮＡサインを使用可能であることを示している。
【００４７】
（ｄ）ＮＳＣＬＣにおける患者の生存率の予測手段としてのマイクロＲＮＡサイン
一変量コックス回帰分析は、５つのマイクロＲＮＡ（つまりｈｓａ−ｍｉＲ１３７、ｈｓａ−ｍｉＲ３７２、ｈｓａ−ｍｉＲ１８２＊、ｈｓａ−ｍｉＲ２２１、またはｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ）の各々の発現レベルがＮＳＣＬＣ生存に関連することを示した。下記の表４参照。対数階級分析は、５つのマイクロＲＮＡすべてから構成されたマイクロＲＮＡサインは、患者の生存のための最適の予測手段であることを示した。下記の表４も参照。
【００４８】
さらに、一変量コックス回帰分析は、５つのマイクロＲＮＡのうちの任意の４つから構成されたマイクロＲＮＡサインも、患者の治療後生存に関連することを示した。下記の表５参照。
【００４９】
【表４】
2010523156.tif 000006
【００５０】
【表５】
2010523156.tif 000007
【００５１】
（ｅ）  マイクロＲＮＡの推定遺伝子標的
ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ経路アノテーションソフトウェア（Silicon Genetics社）を適用して、５つのマイクロＲＮＡが関与し得る推定経路を予測するために適用し、そのようにして得られた結果を表６および７に要約する。
【００５２】
【表６】
2010523156.tif 000008
【００５３】
2010523156.tif 000009
【００５４】
2010523156.tif 000010
【００５５】
2010523156.tif 000011
【００５６】
2010523156.tif 000012
【００５７】
2010523156.tif 000013
【００５８】
2010523156.tif 000014
【００５９】
2010523156.tif 000015
【００６０】
2010523156.tif 000016
【００６１】
2010523156.tif 000017
【００６２】
2010523156.tif 000018
【００６３】
2010523156.tif 000019
【００６４】
2010523156.tif 000020
【００６５】
2010523156.tif 000021
【００６６】
2010523156.tif 000022
【００６７】
2010523156.tif 000023
【００６８】
2010523156.tif 000024
【００６９】
2010523156.tif 000025
【００７０】
2010523156.tif 000026
【００７１】
2010523156.tif 000027
【００７２】
2010523156.tif 000028
【００７３】
2010523156.tif 000029
【００７４】
2010523156.tif 000030
【００７５】
2010523156.tif 000031
【００７６】
2010523156.tif 000032
【００７７】
2010523156.tif 000033
【００７８】
2010523156.tif 000034
【００７９】
2010523156.tif 000035
【００８０】
2010523156.tif 000036
【００８１】
2010523156.tif 000037
【００８２】
2010523156.tif 000038
【００８３】
2010523156.tif 000039
【００８４】
2010523156.tif 000040
【００８５】
2010523156.tif 000041
【００８６】
2010523156.tif 000042
【００８７】
2010523156.tif 000043
【００８８】
2010523156.tif 000044
【００８９】
2010523156.tif 000045
【００９０】
2010523156.tif 000046
【００９１】
2010523156.tif 000047
【００９２】
【表７】
2010523156.tif 000048
【００９３】
2010523156.tif 000049
【００９４】
（ｆ）３つのマイクロＲＮＡサインのカプラン・マイヤー（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ）生存分析
カプラン・マイヤー生存分析を適用して、ｈｓａ−ｍｉＲ２２１、ｈｓａ−ｍｉＲ３７２およびｈｓａ−ｍｉＲ１３７から構成された３つのマイクロＲＮＡのサインも、患者の治療後生存に関連することが分かった。以下に示されるように、この結果は統計学的に重要である。
【００９５】
訓練データセット（ｎ＝５６）：
全体生存分析、Ｐ値＝０．００１３
無再発生存分析、Ｐ値＝０．０４３７
試験データセット（ｎ＝５６）：
全体生存分析、Ｐ値＝０．１４６８
無再発生存分析、Ｐ値＝０．０８４１
独立コホート（ｎ＝６２）：
全体生存分析、Ｐ値＝０．０３５９
無再発生存分析、Ｐ値＝０．０９８５
訓練データセットおよび試験データセット（ｎ＝１１２）：
全体生存、Ｐ値＝０．００１１
無再発生存、Ｐ値＝０．０１１９
Ｐ値は、患者のハイリスク群とローリスク群間の異なる生存曲線を試験するための対数順位検定から得られた。
【００９６】
他の実施形態
本明細書で開示したすべての特徴は、任意の組み合わせで組み合わせてもよい。本明細書で開示した各特徴は、同一の、均等な、または類似の目的に役立つ代替特徴と取り替えてもよい。したがって、別段の明記がない限り、開示された各特徴は、包括的な一連の均等な特徴または類似の特徴の一例にすぎない。
【００９７】
上述から、当業者には、本発明の本質的特性を容易に確認でき、かつ本発明の範囲の精神および範囲から逸脱せずに本発明を様々な使用法および条件に適合させるべく本発明の種々の変更および改変をなすことが可能である。例えば、上記のオキサジアゾール化合物に構造が類似する化合物を製造してもよいし、情ずつの活性についてスクリーニングしてもよいし、本発明を実施すべく使用されてもよい。したがって、他の実施形態もまた請求項の範囲内にある。
【図１】
2010523156.tif 000050
【図２】
2010523156.tif 000051
【図３】
2010523156.tif 000052
【国際調査報告】
2010523156.tif 000053