(57)【要約】本発明の開示は、運動ニューロン栄養因子（ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ：ＭＮＴＦ）またはそのペプチド類似体を用いて、神経細胞障害を治療するための方法に関する。本発明の開示は、さらに、運動ニューロン栄養因子（ＭＮＴＦ）またはそのペプチド類似体の投与により、対象における脊髄傷害、神経変性疾患、脳卒中または脳虚血、ハンチントン病、パーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ＡＬＳ）、アルツハイマー病、および糖尿病性神経障害を治療するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経細胞障害に罹患する動物において神経細胞障害を軽減する方法であって、前記障害を軽減するために十分な量の、配列番号：１〜１４２から構成される群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドであるか、またはかかるポリペプチドの塩である運動ニューロン栄養因子（ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎｏ  ｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ：ＭＮＴＦ）類似体を、前記動物に投与するステップを含む、方法。
【請求項２】
前記障害が、脊髄傷害、神経変性疾患、脳虚血、ハンチントン病、パーキンソン病、多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ＡＬＳ）、アルツハイマー病、および糖尿病性神経障害からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記障害が脊髄傷害である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記障害が神経変性疾患である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記障害が脳虚血である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記障害がハンチントン病である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記障害がパーキンソン病である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記障害がＭＳである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記障害がＡＬＳである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記障害がアルツハイマー病である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記障害が糖尿病性神経障害である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＭＮＴＦ類似体が、配列番号：１〜７から構成される群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドであるか、またはかかるポリペプチドの塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＭＮＴＦ類似体が、配列番号：１の６〜３３個の連続する残基のアミノ酸配列を有するポリペプチドであるか、またはかかるポリペプチドの塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリペプチドが、配列番号：４の少なくとも６個の連続する残基を含むアミノ酸配列を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１５】
前記ポリペプチドの前記配列が配列番号：２を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１６】
前記ポリペプチドの前記配列が配列番号：３を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ポリペプチドの前記配列が配列番号：１〜７のうちの１つである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＭＮＴＦ類似体が、配列番号：１〜１４２から構成される群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドの類似体であって、ＭＮＴＦの活性を示す類似体であるか、またはかかる類似体の塩である、請求項１に記載の請求項。
【請求項１９】
前記ＭＮＴＦ類似体が、配列番号：１〜７から構成される群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドの類似体であって、ＭＮＴＦの活性を示す類似体であるか、またはかかる類似体の塩である、請求項１に記載の請求項。
【請求項２０】
前記ＭＮＴＦ類似体が、非経口経路によって前記動物に投与される、請求項１の方法。
【請求項２１】
前記ＭＮＴＦ類似体が、前記動物に静脈内投与される、請求項１の方法。
【請求項２２】
前記ＭＮＴＦ類似体が、配列番号：１の６〜３３個の連続する残基のアミノ酸配列を有するポリペプチドの類似体であるか、またはかかるポリペプチドの塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記動物が哺乳類である、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記動物がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
動物において損傷した神経経路を修復する方法であって、前記経路を少なくとも部分的に修復するために十分な量の、配列番号：１〜１４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドであるＭＮＴＦ類似体、またはかかるポリペプチドの塩を、前記動物に投与するステップを含む、方法。
【請求項２６】
損傷した神経経路を有する動物において運動機能を向上させる方法であって、前記動物において運動機能を向上させるために十分な量の、配列番号：１〜１４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドであるＭＮＴＦ類似体、またはかかるポリペプチドの塩を、前記動物に投与するステップを含む、方法。
【請求項２７】
損傷した神経経路を有する動物において神経経路を再生する方法であって、前記動物において前記経路を再生するために十分である量の、配列番号：１〜１４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドであるＭＮＴＦ類似体、またはかかるポリペプチドの塩を、前記動物に投与するステップを含む、方法。
【請求項２８】
動物における神経細胞の欠損を軽減する方法であって、前記神経細胞の欠損を軽減するために十分である量の、配列番号：１〜１４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドであるＭＮＴＦ類似体、またはかかるポリペプチドの塩を、前記動物に投与するステップを含む、方法。
【請求項２９】
ＭＮＴＦ類似体および医薬的に許容される担体を含む医薬組成物であって、前記ＭＮＴＦ類似体が、配列番号：１〜１４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドであるか、またはかかるポリペプチドの塩である、医薬組成物。
【請求項３０】
前記ポリペプチドが、配列番号：１〜７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３１】
前記ポリペプチドが、配列番号：２〜１４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
前記ポリペプチドが、配列番号：２〜７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３３】
ＭＮＴＦ類似体および医薬的に許容される担体を含む医薬組成物であって、前記ＭＮＴＦ類似体が、配列番号：１の６〜３２個の連続する残基のアミノ酸配列を有するポリペプチドであるか、またはかかるポリペプチドの塩である、医薬組成物。
【請求項３４】
前記ポリペプチドが、配列番号：４の少なくとも６個の連続する残基を含むアミノ酸配列を有する、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３５】
前記ポリペプチドの前記配列が配列番号：２を含む、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３６】
前記ポリペプチドの前記配列が配列番号：３を含む、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
ＭＮＴＦ類似体および医薬的に許容される担体を含む医薬組成物であって、前記ＭＮＴＦ類似体が、配列番号：１〜１４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの類似体であって、ＭＴＮＦの活性を示す類似体であるか、またはかかる類似体の塩である、医薬組成物。
【請求項３８】
ＭＮＴＦ類似体および医薬的に許容される担体を含む医薬組成物であって、前記ＭＮＴＦ類似体が、配列番号：１の６〜３２個の連続する残基のアミノ酸配列を有するポリペプチドの類似体であるか、またはかかるポリペプチドの塩である、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、一般に、ＭＮＴＦペプチドおよびその類似体を用いて神経細胞障害を治療するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
以下は、本開示を理解する上で有用である可能性がある情報を含む。本明細書において提供されるいずれの情報も、従来技術であるもしくは本開示に関連性があると認めるものではなく、または明示的もしくは非明示的に参照されるいずれの出版物もしくは書類も、従来技術であると認めるものではない。
【０００３】
胎仔性運動ニューロンの生存は、関連する発達中の骨格筋に由来する特異的な栄養物質に依存することが明らかになっている。特定の骨格筋は、胎仔性運動ニューロンの変性およびその後の自然細胞死を防ぐことにより、運動ニューロンの生存および発達を促進する能力を持つ物質を産生すると報告されている。これらの物質は、広く神経栄養因子（ＮＴＦ）と言われる特殊なタンパク質のグループであり、選択された神経細胞集団の生存、成長、維持、および機能的能力を促進する役割を果たす（例えば、Ｃｈａｕ，Ｒ．Ｍ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，６  Ｃｈｉｎ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏａｎａｔｏｍｙ  １２９，１９９０を参照）。
【０００４】
中枢および／または末梢神経系に影響を及ぼす様々な神経変性、神経筋および神経の疾患、障害、または状態は、急性または進行性の機能的な神経組織の損失によって、全部または一部を特徴付けることができる。これらには、例えば、脊髄傷害（ＳＣＩ）、神経変性疾患、脳卒中または虚血（例えば、脳虚血）、ハンチントン病（ＨＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、および糖尿病性神経障害等の状態を含む。
【０００５】
米国特許第６３０９８７７号、同第７１８３３７３号、同第６８４１５３１号、同第６７５９３８９号、および同第２００６００５２２９９号は、運動ニューロンに栄養作用を発揮する能力を持つ、運動ニューロン栄養因子（ＭＮＴＦ）と称される特異的な神経栄養因子（ＮＴＦ）について報告している。これらの内容は、参照することにより、その全体が本明細書に一体化される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第６３０９８７７号
【特許文献２】米国特許第７１８３３７３号
【特許文献３】米国特許第６８４１５３１号
【特許文献４】米国特許第６７５９３８９号
【特許文献５】米国特許出願公開第２００６００５２２９９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本明細書には、これらに限定されないが、本発明の概要に規定されるまたは記載されるまたは参照される多くの特質および実施形態を有する技術が記載される。すべてを網羅することは意図されず、特許請求の範囲は、本発明の概要に同定される特性もしくは実施形態に限定されるものではなく、例証目的のためのみに含まれるものであり、制限されるものではない
【０００８】
したがって、一態様において、本開示は、神経細胞の生存率および増殖を調節するために有用なＭＮＴＦ分子の一部を含有する、新しいペプチドおよび組成物を対象とし、それにより、中枢および／または末梢神経系における幅広い神経変性、神経筋の疾患、障害、または状態を治療する上で、容易に合成することができ、治療的に有効である可能性がある神経栄養ペプチドを提供する。
【０００９】
一態様において、運動ニューロンの欠損および／または神経細胞障害を対象において治療する方法であって、運動ニューロン栄養因子（ＭＮＴＦ）の類似体を、それを必要とする対象に投与するステップを含み、該神経細胞障害は、脊髄傷害、神経変性疾患、脳卒中または脳虚血、ハンチントン病、パーキンソン病、多発性硬化症、ＡＬＳ、アルツハイマー病、および糖尿病性神経障害から選択され、該運動ニューロン栄養因子（ＭＮＴＦ）の類似体は、該神経細胞障害を治療するための十分な量で投与される方法が提供される。
【００１０】
一態様において、本開示は、ＷＭＬＳＡＦＳＲＹＡＲドメインの一部（ＷＭＬＳＡＦＳ、ＦＳＲＹＡＲ、および配列番号：１〜１４２の他の領域を含む）を含む合成および／または精製されたＭＮＴＦペプチド類似体と、神経細胞の生存率および成長を誘導または調節するために有用な、切断された配列の相同体および類似体を含む、その構造および／またはその機能を模倣する分子とを対象とする。
【００１１】
特定の実施形態において、ＭＮＴＦペプチド類似体は、配列番号：１〜７および配列番号：８〜１４２を含む配列の類似体を含んでもよい（図２５を参照）。
【００１２】
ＬＧＴＦＷＧＤＴＬＮ  ＣＷＭＬＳＡＦＳＲＹ  ＡＲＣＬＡＥＧＨＤＧ  ＰＴＱ（配列番号：１）
【００１３】
ＦＳＲＹＡＲ（配列番号：２）
【００１４】
ＷＭＬＳＡＦＳ（配列番号：３）
【００１５】
ＭＬＳＡＦＳＲＹＡＲ（配列番号：４）
【００１６】
ＦＳＲＹＡＲＣＬＡＥ  Ｇ（配列番号：５）
【００１７】
ＣＷＭＬＳＡＦＳＲＹ  ＡＲＣ（配列番号：６）
【００１８】
ＭＬＳＡＦＳＲＹＡＲ  ＣＬＡＥＧＨＤＧＰＴ  Ｑ（配列番号：７）
【００１９】
本明細書に記載されるＭＮＴＦペプチド類似体は、ＭＮＴＦに由来する（すなわち配列番号：１に由来する）ポリペプチドおよびかかる派生的なポリペプチドの類似体である。これらの化合物は、配列番号：１〜７に記載されるＭＮＴＦペプチド類似体の機能的誘導体を含む配列番号：２〜７のいずれか等の、配列番号：１〜１４２のうちの１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。かかるポリペプチドの塩、エステル、および他の通常の剤形は、本明細書に記載される技術において有用であり、１つ以上のアミノ酸残基が、非自然発生の（例えば、Ｄ異性体）アミノ酸残基によって置き換えられたポリペプチドも同様である。本明細書に記載されるように、他の類似体（配列番号：１において開示される残基の保存的な置き換えであるアミノ酸残基を含む）が、これらの残基うちの１つ以上の代わりとして用いられてもよい。
【００２０】
別の態様においては、細胞増殖を促進するため、もしくは不適切な細胞死を安定化するため、および／またはいずれかの場合において正常な細胞挙動を回復するために、インビトロで細胞培養物に、またはインビボで神経傷害または神経変性疾患に罹患する個体に、ＭＮＴＦペプチド類似体を投与することにより、神経細胞の生存率および／または成長を調節するための組成物および方法。
【００２１】
一態様においては、対象において損傷した神経経路を修復する方法であって、該方法は、運動ニューロン栄養因子（ＭＮＴＦ）の類似体をそれを必要とする対象に投与するステップを含み、上記損傷した神経経路は、脊髄傷害、神経変性疾患、脳卒中または脳虚血、ハンチントン病、パーキンソン病、多発性硬化症、ＡＬＳ、アルツハイマー病、および糖尿病性神経障害と関連し、上記運動ニューロン栄養因子（ＭＮＴＦ）の類似体は、上記神経細胞障害を治療するために十分な量で投与され、それによって上記対象において損傷した神経経路が修復される方法が提供される。
【００２２】
一態様においては、神経経路損傷の症状を有する対象において運動機能を向上する方法であって、該方法は、運動ニューロン栄養因子（ＭＮＴＦ）の類似体をそれを必要とする対象に投与するステップを含み、上記損傷した神経経路は、脊髄傷害、神経変性疾患、脳卒中または脳虚血、ハンチントン病、パーキンソン病、多発性硬化症、ＡＬＳ、アルツハイマー病、および糖尿病性神経障害と関連し、上記運動ニューロン栄養因子（ＭＮＴＦ）の類似体は、上記対象において上記損傷した神経経路を治療するために十分な量で投与され、それによって運動機能が向上される方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】野生型マウスの脳における、例示的なＭＮＴＦ６−ｍｅｒペプチドの類似体（ＧＭ６；ＦＳＲＹＡＲ，配列番号：２）のレベルを示した図である。野生型マウス：ビヒクル対照（生理食塩水）、ＭＮＴＦ０．２ｍｇ／ｋｇまたはＭＮＴＦ２ｍｇ／ｋｇ。図に示す被験物質を時間０で投与し、ＥＬＩＳＡによる分析のために４時間後に脳を採取した。
【図２】図２Ａ  一過性虚血の後で、例示的なＭＮＴＦペプチド６−ｍｅｒ（ＦＳＲＹＡＲ，ＧＭ６０２または配列番号：２）がマウスにおける梗塞容積に及ぼす影響を示した図である。すべてのマウスは１時間の脳虚血後に２４時間の再灌流に供した。虚血終了時に、ビヒクル（対照）またはＧＭ６０２を１ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇで動物の静脈内に投与した。動物は２日目に屠殺し、梗塞容積を決定するために処理した。  図２Ｂ  虚血／再灌流傷害に供し、続いてＧＭ６０２または対照の１回用量を静脈注射した２つの脳の画像であって、ＧＭ６０２は、微少のダメージ（白色の領域）（左側：処理した脳の４セクション）を示しており、ビヒクル（右側：対照脳の４セクション）は、脳内における広範囲のダメージを示している。１時間の虚血および２４時間の再潜流に供したマウスの脳の代表的な写真である。虚血終了時に、ＧＭ６０２（５ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクルを動物に注射した。
【図３】虚血／再灌流傷害に供した動物の脳血流の評価のデータを示した図である。すべてのマウスは１時間の脳虚血後に２４時間の再灌流に供した。虚血終了時に、ビヒクル（対照）またはＧＭ６０２を１ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇで動物の静脈内に投与した。各試験群につき、虚血前（第１のカラム）、虚血中（第２のカラム）、および被験物質の注射後（第３のカラム）に血流を測定した。
【図４】虚血／再灌流傷害に供したマウスの血圧測定値を示した図である。すべてのマウスは１時間の脳虚血後に２４時間の再灌流に供した。虚血終了時に、ビヒクル（対照）またはＧＭ６０２を１ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇで動物の静脈内に投与した。各試験群につき、虚血前（第１のカラム）、虚血中（第２のカラム）、および被験物質の注射後（第３のカラム）に、血圧を測定した。
【図５】虚血／再灌流傷害に供したマウスの心拍測定値を示した図である。すべてのマウスは１時間の脳虚血後に２４時間の再灌流に供した。虚血終了時に、ビヒクル（対照）またはＧＭ６０２を１ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇで動物の静脈内に投与した。各試験群につき、虚血前（第１のカラム）、虚血中（第２のカラム）、および被験物質の注射後（第３のカラム）に、心拍数を測定した。
【図６】虚血／再灌流傷害に供したマウスの血液ガス測定値を示した図である。すべてのマウスは１時間の脳虚血後に２４時間の再灌流に供した。虚血終了時に、ビヒクル（対照）またはＧＭ６０２を１ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇで動物の静脈内に投与した。各試験群につき、虚血前（第１のカラム）、虚血中（第２のカラム）、および被験物質の注射後（第３のカラム）に血液ガス（ｐＯ２およびｐＣＯ２）を測定した。
【図７】虚血／再灌流傷害に供したマウスのｐＨ測定値を示した図である。すべてのマウスは１時間の脳虚血後に２４時間の再灌流に供した。虚血終了時に、ビヒクル（対照）またはＧＭ６０２を１ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇで動物の静脈内に投与した。各試験群につき、虚血前（第１のカラム）、虚血中（第２のカラム）、および被験物質の注射後（第３のカラム）に、ｐＨを測定した。
【図８】虚血／再灌流傷害に供したマウスの神経学的欠損の測定値を示した図である。すべてのマウスは１時間の脳虚血後に２４時間の再灌流に供した。虚血終了時に、ビヒクル（対照）またはＧＭ６０２を１ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇで動物の静脈内に投与した。再灌流終了時に神経学的欠損を測定した。
【図９】脊髄傷害の後で、例示的なＭＮＴＦペプチド類似体ＧＭ６０３（ＦＳＲＹＡＲ，配列番号：２）がマウスにおける病変の容積に及ぼす影響を示した図である。すべてのマウスを脊椎傷害に供した後、１４日間回復させた。傷害後、屠殺まで毎日ビヒクル（対照）およびＧＭ６０３を動物の静脈内に投与した。動物は１４日目に屠殺し、病変の容積を決定するために処理した。
【図１０】脊髄傷害（ＳＣＩ）後の脊髄の損傷領域を示した画像である。すべてのマウスを脊髄傷害に供した後、１４日間回復させた。組織切片を切断し、損傷の領域を評価するために処理した。Ａ．ＳＣＩでビヒクル処理したマウス、Ｂ．５ｍｇ／ｋｇのＧＭ６０３で処理したマウス損傷領域は赤く着色され、損傷のない領域は青く着色される。図に見られるように、Ｂの損傷領域は、ＧＭ６０３で処理した動物において有意に小さい。
【図１１】脊髄傷害に供した動物に対するロータロッドトレッドミル試験の結果を示した図である。すべてのマウスを脊髄傷害に供した後、図に示す日数を経過させた。傷害後、行動解析を行った。
【図１２】脊髄傷害させたマウスにおけるオープンフィールド行動の測定値である。すべてのマウスを脊髄傷害に供した後、図に示す日数を経過させた。傷害後、行動解析を行った。
【図１３】例示的なＭＮＴＦペプチド類似体ＧＭ６０４（ＦＳＲＹＡＲ，配列番号：２）が、ＡＬＳマウスにおける疾患の発症年齢に及ぼす影響を示した図である。８０日目から屠殺まで毎日、すべてのマウスにビヒクル（対照）またはＧＭ６０４を静脈内に注射した。動物の疾患発症時期について記録した。
【図１４】例示的なＭＮＴＦペプチド類似体ＧＭ６０４が、ＡＬＳマウスの死亡年齢に及ぼす影響を示した図である。８０日目から屠殺まで毎日、全てのマウスにビヒクル（対照）またはＧＭ６０４を静脈内に注射した。後肢麻痺に基づいて、動物の死亡時期について記録した。
【図１５】ＡＬＳ動物のロータロッドトレッドミル試験を示した図である。すべてのマウスにＧ９３Ａ  ＳＯＤ変異株の遺伝子を導入し、図に示すように、生理食塩水または例示的なＭＮＴＦペプチド類似体ＧＭ６０４で処理した。図に示した時間に行動解析を行った。
【図１６】ＡＬＳ動物の握力試験を示した図である。すべてのマウスにＧ９３Ａ  ＳＯＤ変異株の遺伝子を導入し、図に示すように生理食塩水またはＧＭ６０４で処理した。ＡＬＳ動物の臨床スコア。すべてのマウスにＧ９３Ａ  ＳＯＤ変異株の遺伝子を導入し、図に示すように生理食塩水またはＧＭ６０４で処理した。方法のセクションに概説されるように、図に示した時間に臨床スコアを測定した。脱力感の兆候なし（０）、振戦および傾斜上での反射の喪失（１）、後肢１本の不全麻痺（２）、後肢２本の不全麻痺（３）、後肢１本または２本の麻痺（４）（図１６Ｂ）
【図１７】サルソリノール処理後、例示的なＭＮＴＦペプチド類似体（ＧＢ被験物質）が、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経細胞における細胞生存率に及ぼす影響を示した図である。方法のセクションに概説されるように、すべての培養物は培地で成長させた。培養物は、様々な濃度のビヒクル（対照）およびＭＮＴＦペプチド類似体ＧＭ６を用いて、サルソリノール（Ｓａｌ）有り／無しで培養した。また、作用の機構を決定するために、いくつかの培養物はワートマニン（Ｗ）を用いて培養した。化合物を用いて培養物を２４時間インキュベートし、細胞生存率について分析した。
【図１８】１次神経細胞の培養物における、ＣＳＦによる細胞死の誘導を示した図である。１２日間培養した後で、対照および様々な神経障害のＣＳＦを１次ラットの神経細胞培養物に２日間適用した。図に示す被験物質を時間０で投与し、ＭＴＴアッセイを用いて細胞生存率について培養物を調べた。
【図１９】ＣＳＦ誘導細胞死における、例示的なＭＮＴＦペプチドの神経細胞の喪失に対する保護効果を示した図である。１２日間培養した後で、対照および様々な神経障害のＣＳＦを１次ラットの神経細胞培養物に２日間適用した。ＣＳＦ添加の２時間前にＭＮＴＦ（＋Ｍ）を加えた。図に示す被験物質を時間０で投与し、ＭＴＴアッセイを用いて細胞生存率について培養物を調べた。
【図２０】図２０Ａおよび図２０Ｂ  ＰＤ誘導およびＧＭ６処理後のマウスにおける行動決定を示した図である。行動変化について動物を調べた。
【図２１】図２１Ａ、図２１Ｂ、図２１Ｃ  ＭＰＴＰ処理後のモノアミンおよび代謝物のレベルを示した図である。雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＭＰＴＰ、続いてＧＭ６を、図に示した用量で５日間注射した。試験終了時に、モノアミンおよび代謝物のレベルについて動物を評価した。
【図２２】ＰＤ誘導およびＧＭ６処理したマウスの黒質緻密部における細胞数を示した図である。雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＭＰＴＰ、続いてＧＭ６を、図に示した用量で５日間注射した。試験終了時に、細胞数について動物を評価した。
【図２３】ＭＳ誘導およびＧＭ６処理したマウスにおける平均臨床スコアを示した図である。雌ＪＪＬ／ＪマウスにＰＬＰ、続いてＧＭ６を、図に示した用量で７日間注射した。１日おきに臨床スコアについて動物を評価した。
【図２４】図２４Ａ、図２４Ｂ、図２４Ａ  ＭＳ誘導およびＧＭ６処理したマウスの脳内における病変数を示した図である。雌ＪＪＬ／ＪマウスにＰＬＰ、続いてＧＭ６を、図に示した用量で７日間注射した。試験終了時に、脳病変について動物を評価した。２４Ｂ．ＭＳ誘導およびＧＭ６処理したマウスの脊髄における病変数を示した図である。雌ＪＪＬ／ＪマウスにＰＬＰ、続いてＧＭ６を、図に示した用量で７日間注射した。試験終了時に、脊髄病変について動物を評価した。
【図２５】図２５Ａ、２５Ｂ、２５Ｃ、２５Ｄ、２５Ｅ、２５Ｆ、および２５Ｇから構成される図２５は、例示的なＭＮＴＦペプチド類似体の部分的なリストである。各々の配列番号に対応する配列が示されている。
【図２６】ＧＭ６０２が一過性虚血後のマウスにおける梗塞容積に及ぼす影響の試験データを示した図である。すべてのマウスは１時間の脳虚血後に１４日間再灌流を行った。虚血から図に示す時間後（３、６、１２、２４時間）に、５ｍｇ／ｋｇのビヒクル（対照）およびＧＭ６０２を動物の静脈内に注射した。さらに、障害から３日間毎日動物に注射を行った。動物は１４日目に屠殺し、梗塞容積を決定するために処理した。
【図２７】虚血／再灌流傷害に供した動物の脳血流の試験データを示した図である。すべてのマウスは１時間の脳虚血後に１４日間再灌流を行った。虚血発症から３、６、１２、および２４時間後に被験物質を投与した。虚血前、虚血後、および再灌流後に血流を測定した。
【図２８】虚血／再灌流傷害に供したマウスにおける血圧測定値を示した図である。すべてのマウスは１時間の脳虚血後に１４日間再灌流を行った。虚血発症から３、６、１２、および２４時間後に被験物質を投与した。虚血前、虚血中、および虚血終了後に血圧を測定した。
【図２９】虚血／再灌流傷害に供したマウスにおける心拍測定値を示した図である。すべてのマウスは１時間の脳虚血後に１４日間再灌流を行った。虚血発症から３、６、１２、および２４時間後に被験物質を投与した。虚血前、虚血中、および虚血終了後に心拍数を測定した。
【図３０】図３０Ａおよび３０Ｂ  虚血／再灌流傷害に供したマウスにおける血液ガス測定値を示した図である。すべてのマウスは１時間の脳虚血後に１４日間再灌流を行った。虚血発症から３、６、１２、および２４時間後に被験物質を投与した。虚血前、虚血中、および虚血終了後に血液ガスｐＯ２（３０Ａ）およびｐＣＯ２（３０Ｂ）を測定した。
【図３１】虚血／再灌流傷害に供したマウスにおけるｐＨ測定値を示した図である。すべてのマウスは１時間の脳虚血後に１４日間再灌流を行った。虚血発症から３、６、１２、および２４時間後に被験物質を投与した。虚血前、虚血中、および虚血終了後にｐＨを測定した。
【図３２】虚血／再灌流傷害に供したマウスにおける神経学的欠損の測定値を示した図である。すべてのマウスは１時間の脳虚血後に１４日間再灌流を行った。虚血発症から３、６、１２、および２４時間後に被験物質を投与した。再灌流終了時に神経学的欠損を測定した。
【図３３】虚血後のラットにおける梗塞容積へのＧＭ６０２の効果を示した図である。すべてのラットは２８日間の永久脳虚血を行った。虚血開始から３時間後、０、２．５、１０または２０ｍｇ／ｋｇのビヒクル（対照）またはＧＭ６０２を動物に静脈内投与した。動物は２８日目に屠殺して、梗塞容積を決定するために処理した。
【図３４】虚血した動物の脳血流を示した図である。すべてのラットは脳虚血してから２８日間回復させた。虚血発症から３時間後、２．５、１０または２０ｍｇ／ｋｇのビヒクル（対照）またはＧＭ６０２を、動物の静脈内に注射した。各試験群について、虚血前（第１のカラム、虚血前ベースラインのＣＢＦ）、虚血中（第２のカラム、永久虚血の３時間前かつ被験物質の投与前のＣＢＦ）、および被験物質の注射後（第３のカラム、被験物質投与から１時間後のＣＢＦ）に血流を測定した。
【図３５】虚血したラットにおける血圧測定値を示した図である。すべてのラットは永久脳虚血してから２８日間回復させた。虚血発症から３時間後、２．５、１０または２０ｍｇ／ｋｇのビヒクル（対照）またはＧＭ６０２を、動物の静脈内に注射した。各試験群について、虚血前（第１のカラム）、虚血中（第２のカラム）、および被験物質の注射後（第３のカラム）に血圧を測定した。
【図３６】虚血したラットにおける心拍測定値を示した図である。すべてのラットは永久脳虚血してから２８日間回復させた。虚血発症から３時間後、２．５、１０または２０ｍｇ／ｋｇのビヒクル（対照）またはＧＭ６０２を、動物の静脈内に注射した。各試験群について、虚血前（第１のカラム）、虚血中（第２のカラム）、および被験物質の注射後（第３のカラム）に心拍数を測定した。
【図３７】図３７Ａおよび図３７Ｂ  虚血したラットにおける血液ガス測定値を示した図である。すべてのラットは永久脳虚血してから２８日間回復させた。虚血発症から３時間後、２．５、１０または２０ｍｇ／ｋｇのビヒクル（対照）またはＧＭ６０２を、動物の静脈内に注射した。各試験群について、虚血前（第１のカラム）、虚血中（第２のカラム）、および被験物質の注射後（第３のカラム）に、血液ガスｐＯ２（図３７Ａ）およびｐＣＯ２（図３７Ｂ）を測定した。
【図３８】虚血したラットにおけるｐＨ測定値を示した図である。すべてのラットは永久脳虚血してから２８日間回復させた。虚血発症から３時間後、２．５、１０または２０ｍｇ／ｋｇのビヒクル（対照）またはＧＭ６０２を、動物の静脈内に注射した。各試験群について、虚血前（第１のカラム）、虚血中（第２のカラム）、および被験物質の注射後（第３のカラム）にｐＨを測定した。
【図３９】虚血傷害に供したラットにおける神経学的欠損の測定値を示した図である。すべてのラットは永久脳虚血してから２８日間回復させた。虚血発症から３時間後、２．５、１０または２０ｍｇ／ｋｇのビヒクル（対照）またはＧＭ６０２を、動物の静脈内に注射した。図３９Ａ．前肢留置、図３９Ｂ．後肢留置、図３９Ｃ．平均台、図３９Ｄ．神経学的欠損（自発運動活性）を測定した。図３９Ｄでは、第１の棒は被験物質投与前のスコアであり、第２の棒は被験物質投与から２８日後のスコアである。
【図４０】虚血性傷害に供したラットにおけるバイオマーカーの測定値を示した図である。すべてのラットは永久脳虚血してから２８日間回復させた。虚血発症から３時間後、２．５、１０または２０ｍｇ／ｋｇのビヒクル（対照）またはＧＭ６０２を、動物の静脈内に注射した。動物は２８日目に屠殺して、ＴＮＦ免疫組織化学解析のために脳切片を処理した。
【図４１】虚血性傷害に供したラットにおけるバイオマーカーの測定値を示した図である。すべてのラットは永久脳虚血してから２８日間回復させた。虚血発症から３時間後、２．５、１０または２０ｍｇ／ｋｇのビヒクル（対照）またはＧＭ６０２を、動物の静脈内に注射した。動物は２８日目に屠殺して、Ｆｌｕｏｒｏ−Ｊａｄｅ免疫組織化学解析のために脳切片を処理した。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
胎仔性運動ニューロンの生存は、関連する発達中の骨格筋に由来する特異的な栄養物質に依存することが明らかになっている。骨格筋は、胎仔性運動ニューロンの変性および続いて起こる自然細胞死を防ぐことにより、運動ニューロンの生存および発達を促進する能力を持つ物質を産生すると報告されている（Ｏ’Ｂｒｉａｎ，Ｒ．Ｊ．ａｎｄ  Ｆｉｓｃｈｂａｃｈ，Ｇ．Ｄ．，６  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３２６５（１９８６）；Ｈｏｌｌｙｄａｙ，Ｍ．ａｎｄ  Ｈａｍｂｕｒｇｅｒ，Ｖ．，１７０  Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．３１１（１９７６）．ＭｃＭａｎａｍａｎ，Ｊ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，２６３  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５８９０（１９８８）；Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ，Ｒ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，２４０  Ｓｃｉｅｎｃｅ，９１９（１９８８）；ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｒ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，６  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．４３９（１９８６）。
【００２５】
ヒトの運動ニューロン栄養因子（ＭＮＴＦ）は、運動ニューロン損傷部位において炎症を減少させ、神経再生を増進し、運動ニューロンの生存を促進することが明らかになっている骨格筋組織に由来する特異的なＮＴＦである。ＭＮＴＦは、末梢の坐骨神経（下肢筋肉を制御する）、末梢の筋皮神経（上肢筋肉を制御する）、脳顔面神経（顔面および頭部の筋肉を制御する）、脳舌下神経（舌を制御する）、および首、胸部、および上肢の筋肉を制御する脊髄の一部を含む、様々なラット神経系において試験されてきた。脊髄モデルにおいて、ＭＮＴＦはラットの片側脊髄の神経移植に適用された。ＭＮＴＦは、炎症を抑え、変性を制限し、移植された神経の再生を増進した。ＭＮＴＦまたはそのペプチド類似体が神経に直接適用された場合の、栄養および刺激作用のためのラット末梢神経系モデルにおける合成されたＭＮＴＦまたはそのペプチド類似体の有効性を、多くの試験が実証している。また、ＭＮＴＦは運動ニューロンの再生および生存を促進することが明らかになっている。
【００２６】
神経細胞死は、一定期間の成長および発達の間に脊椎動物の神経系で発生する。よって、関連する標的組織からの可溶性のニューロン栄養因子を添加することは、この神経細胞の死という現象を緩和する役割を果たす可能性がある。
【００２７】
したがって、本開示の態様および実施形態は、神経細胞障害の治療のための方法およびＭＮＴＦペプチド類似体およびその誘導体を含む組成物を提供する。
【００２８】
本開示の態様および実施形態は、運動ニューロン栄養因子の作用と関連する機能性タンパク質ドメインＭＮＴＦ１分子の短い重複配列に同定および位置付けされる。「ＷＭＬＳＡＦＳＲＹＡＲ」、「ＷＭＬＳＡＦＳ」、「ＦＳＲＹＡＲ」および配列番号１〜１４２からの他のドメインを含むこれらのタンパク質ドメインは、神経細胞の生存率および増殖を調節するために十分である。さらに、これらのドメインまたは類似体（配列断片の類似体またはその機能類似体）を包括する切断されたＭＮＴＦ１種は、それら自体が、運動ニューロン／神経芽細胞腫細胞のハイブリッドにおける刺激生物活性を実証するのに十分である。
【００２９】
定義
【００３０】
本開示が関連する技術を説明する文脈において用いられる、特定の用語を規定する。特に指定されない限り、本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる場合、以下の用語は以下の意味を持つ。以下または明細書の別の箇所で定義されていない用語は、当該技術分野で認められている意味を持つものとする。
【００３１】
本明細書において、「運動ニューロン栄養因子（ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）」または「運動ニューロン栄養因子（ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎ  ｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）」は、運動ニューロンの栄養または維持に関与する因子を含む。「運動ニューロン刺激因子」、「ＭＮＴＦ」、「ＭＮＴＦペプチド」、「運動ニューロン栄養因子類似体」、および「ＭＮＴＦ類似体」という用語は、それらが本明細書に定義される機能特性を有する限り、交換可能に使用され得る。これらは、基準ＭＮＴＦ配列の配列および機能的相同体を含んでもよい。運動ニューロン栄養因子は、寄与した神経系の前駆細胞の発達および分化をさらに助成する、または分化した神経系細胞の成長（例えば、神経突起伸長）および生存を誘導または促進する可能性がある。本開示の運動ニューロン栄養因子は、典型的には、ＣＮＳまたはＰＮＳの完全に分化した神経系細胞（例えば、運動ニューロン）を生成するための有効量で提供される。量についての指針は本明細書に提供されるが、本明細書に開示される既知の手順および方法に基づいて、当業者により容易に決定されてもよい。
【００３２】
例示的なＭＮＴＦペプチドおよびそのペプチド類似体は、Ｃｈａｕ，Ｒ．Ｍ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｓｃｌｅ  Ｎｅｕｒｏｎｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｆａｃｔｏｒｓ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  Ａｎｔｅｒｉｏｒ  Ｈｏｒｎ  Ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎｓ  ｏｆ  Ｒａｔ  Ｓｐｉｎａｌ  Ｃｏｒｄ．Ｉｎ：  Ｒｅｃｅｎｔ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５，Ｐｅｅｔｅｒｓ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｅｕｖｅｎ，Ｂｅｌｇｉｕｍ，ｐｐ．８９−９４（１９９２）に報告されるもの、ならびに、例えば、米国第６３０９８７７号、同第７１８３３７３、同第６８４１５３１号、同第６７５９３８９号、および同第２００６００５２２９９号に見られるものを含んでもよい。その内容全体は、参照することにより本明細書に一体化される。特定の実施形態において、例には、神経細胞の生存率および成長を誘導または調節するために有用なＷＭＬＳＡＦＳＲＹＡＲドメインの一部（ＷＭＬＳＡＦＳ、ＦＳＲＹＡＲ、および配列番号１〜１４２の他の領域を含む）と、切断された配列の相同体および類似体を含む、その構造および／またはその機能を模倣する分子とを含む、合成および／または精製されたＭＮＴＦペプチド類似体を含んでもよい。
【００３３】
また、例示的なＭＮＴＦペプチドおよびそのペプチド類似体は、Ｃｈａｕ，Ｒ．Ｍ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａ  ３０ｋＤ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｔｅｃｔａｌ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ｏｆ  Ｒａｔ  ｏｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅｄ  Ｒｅｔｉｎａｌ  Ｎｅｕｒｏｎｓ，３４  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｃｈｉｎａ，Ｓｅｒｉｅｓ  Ｂ，９０８（１９９１）；Ｃｈａｕ，Ｒ．Ｍ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｓｃｌｅ  Ｎｅｕｒｏｎｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｆａｃｔｏｒｓ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  Ａｎｔｅｒｉｏｒ  Ｈｏｒｎ  Ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎｓ  ｏｆ  Ｒａｔ  Ｓｐｉｎａｌ  Ｃｏｒｄ  Ｉｎ：Ｒｅｃｅｎｔ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５，Ｐｅｅｔｅｒｓ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｅｕｖｅｎ，Ｂｅｌｇｉｕｍ，ｐｐ．８９−９４（１９９２）；Ｃｈａｕ，Ｒ．Ｍ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａ  ３０ｋＤ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｔｅｃｔａｌ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ｏｆ  Ｒａｔ  ｏｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅｄ  Ｒｅｔｉｎａｌ  Ｎｅｕｒｏｎｓ，３４  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｃｈｉｎａ，Ｓｅｒｉｅｓ  Ｂ，９０８（１９９１）；Ｃｈａｕ，Ｒ．Ｍ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ｆｏｒ  Ｍｕｓｃｌｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｆａｃｔｏｒ  １（ＭＮＴＦ１）ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｙ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｂｅｓ，（ａｂｓｔｒａｃｔ）１９  Ｓｏｃ．ｆｏｒ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．ｐａｒｔ  １，２５２（１９９３），Ｃｈａｕ，Ｒ．Ｍ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ｆｏｒ  Ｍｕｓｃｌｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｆａｃｔｏｒ  １（ＭＮＴＦ１）ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｙ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｂｅｓ，（ａｂｓｔｒａｃｔ）１９  Ｓｏｃ．ｆｏｒ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．ｐａｒｔ  １，２５２（１９９３）に記載されるものを含んでもよく、その内容全体は、参照することにより本明細書に一体化される。特定の実施形態において、ＭＮＴＦまたはその類似体は合成であるかまたは精製される。
【００３４】
特定の実施形態において、ＭＮＴＦペプチド類似体は、ＭＮＴＦドメインの活性部位の１つ（例えば、配列番号２のような６個のアミノ酸のＭＮＴＦ類似体）からの配列を含んでもよい。
【００３５】
特定の実施形態において、ＭＮＴＦペプチド類似体は、配列番号１〜１４２を含む配列の類似体を含んでもよい。
【００３６】
特定の実施形態において、ＭＮＴＦペプチド類似体は、配列番号１〜１４２に記載されるペプチド類似体の機能的誘導体を含んでもよい。
【００３７】
他の特定の実施形態において、ＭＮＴＦペプチドの類似体および誘導体は、配列番号１〜１４２に記載される配列から構成されてもよい。
【００３８】
本出願で用いられる「類似体」とは、参照される配列における１つ以上のアミノ酸が、ＭＮＴＦの活性に実質的に影響を及ぼすことなく変更されたペプチドを意味する。特定の実施形態において、本開示に従う類似体は、「保存的」な置換を含む。保存的アミノ酸置換は、十分に類似した物理化学特性を有するために、グループのメンバー間における置換がその分子の生物学的機能を保存する、同じグループの同義アミノ酸とアミノ酸を置き換えることを含む（Ｇｒａｎｔｈａｍ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．１８５，ｐｐ．８６２−８６４（１９７４））。
【００３９】
同義アミノ酸基は、表Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩで定義されるものを含む。
【００４０】
表１
【００４１】
同義アミノ酸の広範囲な基
【００４２】
アミノ酸−同義の基
【００４３】
Ｓｅｒ―Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ
【００４４】
Ａｒｇ―Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ
【００４５】
Ｌｅｕ―Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ
【００４６】
Ｐｒｏ―Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ
【００４７】
Ｔｈｒ―Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ
【００４８】
Ａｌａ―Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ
【００４９】
Ｖａｌ―Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ
【００５０】
Ｇｌｙ―Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ
【００５１】
Ｉｌｅ―Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ
【００５２】
Ｐｈｅ―Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ
【００５３】
Ｔｙｒ―Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ
【００５４】
Ｃｙｓ―Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ
【００５５】
Ｈｉｓ―Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ
【００５６】
Ｇｌｎ―Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ
【００５７】
Ａｓｎ―Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ
【００５８】
Ｌｙｓ―Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ
【００５９】
Ａｓｐ―Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ａｓｐ
【００６０】
Ｇｌｕ―Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ
【００６１】
Ｍｅｔ―Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ
【００６２】
Ｔｒｐ―Ｔｒｐ
【００６３】
表ＩＩ
【００６４】
同義アミノ酸の中範囲の基
【００６５】
アミノ酸−同義の基
【００６６】
Ｓｅｒ―Ｓｅｒ
【００６７】
Ａｒｇ―Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ
【００６８】
Ｌｅｕ―Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ
【００６９】
Ｐｒｏ―Ａｌａ、Ｐｒｏ
【００７０】
Ｔｈｒ―Ｔｈｒ
【００７１】
Ａｌａ―Ｐｒｏ、Ａｌａ
【００７２】
Ｖａｌ―Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ
【００７３】
Ｇｌｙ―Ｇｌｙ＊＊
【００７４】
Ｉｌｅ―Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ
【００７５】
Ｐｈｅ―Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ
【００７６】
Ｔｙｒ―Ｐｈｅ、Ｔｙｒ
【００７７】
Ｃｙｓ―Ｓｅｒ、Ｃｙｓ
【００７８】
Ｈｉｓ―Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ
【００７９】
Ｇｌｎ―Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ
【００８０】
Ａｓｎ―Ａｓｐ、Ａｓｎ
【００８１】
Ｌｙｓ―Ａｒｇ、Ｌｙｓ
【００８２】
Ａｓｐ―Ａｓｎ、Ａｓｐ
【００８３】
Ｇｌｕ―Ｇｌｎ、Ｇｌｕ
【００８４】
Ｍｅｔ―Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ
【００８５】
Ｔｒｐ―Ｔｒｐ
【００８６】
表ＩＩＩ
【００８７】
同義アミノ酸の狭範囲の基
【００８８】
アミノ酸−同義の基
【００８９】
Ｓｅｒ―Ｓｅｒ
【００９０】
Ａｒｇ―Ａｒｇ
【００９１】
Ｌｅｕ―Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ
【００９２】
Ｐｒｏ―Ｐｒｏ
【００９３】
Ｔｈｒ―Ｔｈｒ
【００９４】
Ａｌａ―Ａｌａ
【００９５】
Ｖａｌ―Ｖａｌ
【００９６】
Ｇｌｙ―Ｇｌｙ
【００９７】
Ｉｌｅ―Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ
【００９８】
Ｐｈｅ―Ｐｈｅ
【００９９】
Ｔｙｒ―Ｔｙｒ
【０１００】
Ｃｙｓ―Ｓｅｒ、Ｃｙｓ
【０１０１】
Ｈｉｓ―Ｈｉｓ
【０１０２】
Ｇｌｎ―Ｇｌｎ
【０１０３】
Ａｓｎ―Ａｓｎ
【０１０４】
Ｌｙｓ―Ｌｙｓ
【０１０５】
Ａｓｐ―Ａｓｐ
【０１０６】
Ｇｌｕ―Ｇｌｕ
【０１０７】
Ｍｅｔ―Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ
【０１０８】
Ｔｒｐ―Ｔｒｐ
【０１０９】
本明細書において提供される化合物に用いられるアミノ酸（例えば、ペプチドおよびタンパク質）は、遺伝的にコードされたアミノ酸、自然発生の非遺伝的にコードされたアミノ酸、または合成のアミノ酸であってもよい。上述したうちのいずれかのＬおよびＤエナンチオマーの両方が化合物に用いられてもよい。以下の遺伝的にコードされたアミノ酸（およびその残基）には、以下の略語が本明細書において用いられてもよい。アラニン（Ａｌａ、Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）、およびバリン（Ｖａｌ、Ｖ）。
【０１１０】
遺伝的にコードされておらず、本明細書に記載する化合物に存在してもよい一般的に遭遇するアミノ酸には、β−アラニン（ｂ−Ａｌａ）および３−アミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ、Ｚ）、４−アミノ酪酸等のその他のω−アミノ酸、α−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、ε−アミノヘキサン酸（Ａｈａ）、δ−アミノ吉草酸（Ａｖａ）、メチルグリシン（ＭｅＧｌｙ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、シトルリン（Ｃｉｔ）、ｔ−ブチルアラニン（ｔ−ＢｕＡ）、ｔ−ブチルグリシン（ｔ−ＢｕＧ）、Ｎ−メチルイソロイシン（ＭｅＩｌｅ）、フェニルグリシン（Ｐｈｇ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ、Ｊ）、２−ナフチルアラニン（２−Ｎａｌ）、４−クロロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｃｌ））、２−フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（２−Ｆ））、３−フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（３−Ｆ））、４−フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｆ））、ペニシラミン（Ｐｅｎ）、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸（Ｔｉｃ）、β−２−チエニルアラニン（Ｔｈｉ）、メチオニンスルホキシド（ＭＳＯ）、ホモアルギニン（ｈＡｒｇ）、Ｎ−アセチルリジン（ＡｃＬｙｓ）、２，３−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、２，３−ジアミノ酪酸（Ｄｂｕ）、ｐ−アミノフェニルアラニン（Ｐｈｅ（ｐＮＨ２））、Ｎ−メチルバリン（ＭｅＶａｌ）、ホモシステイン（ｈＣｙｓ）、３−ベンゾチアゾール−２−イル−アラニン（ＢｚｔＡｌａ、Ｂ）、およびホモセリン（ｈＳｅｒ）を含むが、これらに限定されない。企図されるさらなるアミノ酸類似体には、リン酸化セリン、リン酸化スレオニン、リン酸化チロシン、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、馬尿酸、オクタヒドロインドール−２カルボン酸、スタチン、α−メチル−アラニン、パラ−ベンゾイル−フェニルアラニン、プロパルギルグリシン、およびサルコシンを含む。本明細書に記載されるペプチドは、Ｌ型またはＤ型構成の上記アミノ酸のうちのいずれか、あるいは本明細書に記載されるまたは現在もしくは未来において当該技術分野で既知である、他のいずれのアミノ酸を有してもよい。
【０１１１】
互いに置換可能なアミノ酸は、通常、類似するクラスまたはサブクラス内に属する。当業者には既知であるように、アミノ酸は、主にアミノ酸側鎖の化学的および物理的特性に依存して、異なるクラスに分類することができる。例えば、アミノ酸の中には、通常、親水性または極性アミノ酸であると考えられるものがある一方で、疎水性または非極性アミノ酸であると考えられるものもある。極性アミノ酸には、酸性、塩基性、または親水性の側鎖を有するアミノ酸を含み、非極性アミノ酸には、芳香族または疎水性の側鎖を有するアミノ酸を含む。非極性アミノ酸は、特に、脂肪族アミノ酸を含むようにさらに細分化されてもよい。本明細書において用いられるアミノ酸のクラスの定義は以下の通りである。
【０１１２】
「非極性アミノ酸」とは、生理的ｐＨでは電荷を帯びず、極性ではなく、通常は水溶液に忌避される側鎖を有するアミノ酸を言う。遺伝的にコードされた疎水性アミノ酸の例には、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＶａｌを含む。非遺伝的にコードされた非極性アミノ酸の例にはｔ−ＢｕＡ、ＣｈａおよびＮｌｅを含む。
【０１１３】
「芳香族アミノ酸」とは、共役π電子系を有する少なくとも１つの環（芳香族基）を含有する側鎖を有する非極性アミノ酸を言う。芳香族基は、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシル、スルホニル、ニトロ、およびアミノ基等の置換基、またその他の置換基でさらに置換されてもよい。遺伝的にコードされた芳香族アミノ酸の例には、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンを含む。一般的に遭遇する非遺伝的にコードされた芳香族アミノ酸には、フェニルグリシン、２−ナフチルアラニン、β−２−チエニルアラニン、３−ベンゾチアゾール−２−イル−アラニン、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、４−クロロフェニルアラニン、２−フルオロフェニルアラニン、３−フルオロフェニルアラニンおよび４−フルオロフェニルアラニンを含む。
【０１１４】
「脂肪族アミノ酸」とは、飽和または不飽和の直鎖、分岐鎖、または環状炭化水素の側鎖を有する非極性アミノ酸を言う。遺伝的にコードされた脂肪族アミノ酸の例には、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ＶａｌおよびＩｌｅを含む。コードされていない脂肪族アミノ酸の例にはＮｌｅを含む。
【０１１５】
「極性アミノ酸」とは、生理的ｐＨでは電荷を帯びるかまたは電荷を帯びず、２つの原子によって共有される１対の電子が、その原子のうちの１つにより密接に保持される結合を有する側鎖を有する親水性アミノ酸を言う。極性アミノ酸は一般に親水性であり、つまりは水溶液に引き付けられる側鎖を有するアミノ酸を有する。遺伝的にコードされた極性アミノ酸の例には、アスパラギン、システイン、グルタミン、リジンおよびセリンを含む。非遺伝的にコードされた極性アミノ酸の例には、シトルリン、ホモシステイン、Ｎ−アセチルリジン、およびメチオニンスルホキシドを含む。
【０１１６】
「酸性アミノ酸」とは、ｐＫ値７未満の側鎖を有する親水性アミノ酸を言う。酸性アミノ酸は、典型的には、水素イオンの損失のために、生理的ｐＨでは負電荷を帯びる側鎖を有する。遺伝的にコードされた酸性アミノ酸の例には、アスパラギン酸（アスパルテート）およびグルタミン酸（グルタメート）を含む。
【０１１７】
「塩基性アミノ酸」とは、ｐＫ値７を上回る側鎖を有する親水性アミノ酸を言う。塩基性アミノ酸は、水素イオンの会合のために、生理的ｐＨでは正電荷を帯びる側鎖を有する。遺伝的にコードされた塩基性アミノ酸の例には、アルギニン、リジン、およびヒスチジンを含む。非遺伝的にコードされた塩基性アミノ酸の例には、オルニチン、２，３−ジアミノプロピオン酸、２，４−ジアミノ酪酸、およびホモアルギニンを含む。
【０１１８】
「イオン化可能なアミノ酸」とは、生理的ｐＨで電荷を帯びることができるアミノ酸を言う。かかるイオン化可能なアミノ酸は、例えば、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−リジン、Ｄ−ヒドロキシリジン、Ｄ−オルニチン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−リジン、Ｌ−ヒドロキシリジン、またはＬ−オルニチン等の酸性および塩基性アミノ酸を含む。
【０１１９】
当業者には理解されるように、上記分類は絶対的なものではない。アミノ酸の中には、１つより多くの特徴的な特性を示すために、１つより多くのカテゴリーに含まれてもよいものもある。例えば、チロシンは、非極性芳香族環および極性ヒドロキシル基の両方を有する。よって、チロシンは、非極性、芳香族、および極性と称することのできるいくつかの特徴を有する。しかしながら、非極性の環が優性であるために、チロシンは一般的に非極性であると考えられている。同様に、ジスルフィド結合を形成することができることに加えて、システインも非極性の特徴を有する。よって、疎水性または非極性アミノ酸として厳密には分類されないものの、多くの場合、ペプチドに疎水性または非極性を与えるためにシステインを用いることができる。
【０１２０】
ある実施形態では、本明細書において企図される極性アミノ酸は、例えば、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、ホモシステイン、リジン、ヒドロキシリジン、オルニチン、セリン、スレオニン、および構造的に関連するアミノ酸を含んでもよい。一実施形態において、極性アミノは、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、ヒドロキシリジン、リジン、またはオルニチン等のイオン化可能なアミノ酸である。
【０１２１】
用いることのできる極性または非極性アミノ酸残基の例には、例えば、アラニン、バリン、ロイシン、メチオニン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン等を含む。
【０１２２】
本明細書において「塩」という用語は、カルボキシル基の塩および本明細書に記載されるペプチドおよびその類似体のアミノ基の酸付加塩の両方を言う。カルボキシル基の塩は、当該技術分野で既知である手段を用いて形成されてもよく、例えば、ナトリウム、カルシウム、アンモニウム、第二鉄または亜鉛塩等の無機塩、および、例えば、トリエタノールアミン、アルギニンまたはリジン、ピペリジン、プロカイン等のアミンで形成される有機塩基を有する塩を含んでもよい。酸性塩には、例えば塩酸または硫酸等の鉱酸を含む塩、および、例えば酢酸またはシュウ酸等の、有機酸を有する塩を含む。当然ながら、いずれのかかる塩も、本明細書に開示されるペプチドまたはそれらの類似体と実質的に同様の活性を持たなければならない。
【０１２３】
本明細書で用いられる「機能的誘導体」の定義は、アミノ酸部分の側鎖またはＮもしくはＣ基の末端に存在する官能基から、既知の方法に従って調製することができ、それらが医薬的に許容される場合、すなわちタンパク質活性を破壊しない、またはそれらを含有する医薬組成物に毒性を与えない場合に、本開示に含まれる誘導体を言う。かかる誘導体は、例えば、カルボキシル基のエステルもしくは脂肪族アミド、および遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体または遊離ヒドロキシル基のＯ−アシル誘導体を含んでもよく、例えば、アルカノイル基またはアロイル基等のアシル基で形成される。
【０１２４】
本明細書で開示される「前駆体」とは、ヒトまたは動物の体内でペプチドに変換される化合物である。
【０１２５】
本開示のペプチドは、固相合成または液相合成等、当該技術分野で周知であるいずれの手順によっても調製することができる。固相合成としては、例えば、合成されるべきペプチドのＣ末端に対応するアミノ酸は、有機溶媒に不溶性である支持部に結合され、交互に繰り返す反応により、適切な保護基で保護されたα−アミノ基および側鎖官能基を有するアミノ酸がＣ末端からＮ末端の順序で１つずつ濃縮されて、樹脂またはペプチドのα−アミノ基の保護基に結合したアミノ酸が放出される、という様式でペプチド鎖が拡張される。固相合成法は、使用される保護基の種類に依存して、ｔＢｏｃ法とＦｍｏｃにより大きく分類される。
【０１２６】
典型的に使用される保護基には、アミノ基としてｔＢｏｃ（ｔ−ブトキシカルボニル）、Ｃｌ−Ｚ（２−クロロベンジルオキシカルボニル）、Ｂｒ−Ｚ（２−ブロモベンジルオキシカルボニル）、Ｂｚｌ（ベンジル）、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）、Ｍｂｈ（４，４´−ジメトキシジベンズヒドリル）、Ｍｔｒ（４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル）、Ｔｒｔ（トリチル）、Ｔｏｓ（トシル）、Ｚ（ベンジルオキシカルボニル）およびＣｌ２−Ｂｚｌ（２，６−ジクロロベンジル）、グアニジノ基としてＮＯ２（ニトロ）およびＰｍｃ（２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル）、ヒドロキシル基としてｔＢｕ（ｔ−ブチル）を含む。
【０１２７】
所望のペプチドは合成された後、脱保護反応に供され、固体支持部より切り取られる。かかるペプチド切断反応は、Ｂｏｃ法にはフッ化水素またはトリフルオロメタンスルホン酸を用いて行われてもよく、Ｆｍｏｃ法にはＴＦＡを用いて行われてもよい。
【０１２８】
得られた粗ペプチドは、その後に精製される。精製は、本目的のために既知であるいずれの方法を用いて、すなわち、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、電気泳動等を伴う任意の従来手順によって行われる。例えば、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）が用いられてもよい。溶出は、タンパク質精製に一般的に利用される水−アセトニトリル系溶媒を用いて行われてもよい。
【０１２９】
本明細書に記載されるペプチドは、ＭＮＴＦ活性および／またはそれによる調節を必要とする病態において、有効成分として医薬組成物中で使用するために適切であるように、実質的に精製された形態で提供されてもよい。
【０１３０】
本明細書で用いられる「生物学的に活性なペプチド」および「生物学的に活性な断片」という用語は、運動ニューロン分化因子（ＭＮＤＦ）および／または運動ニューロン栄養因子（ＭＮＴＦ）の上記説明に従うペプチドまたはポリペプチドを言い、ＭＮＤＦは幹細胞を運動ニューロンおよびＭＮＴＦに分化し、ＭＮＴＦは神経の保護、修復、および治療的機能を示す。
【０１３１】
「相補的」という用語は、例えば、許容的な塩および温度条件下における、塩基対形成によるポリヌクレオチドの天然結合を言う。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」は、相補的な配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」に結合する。２本の単鎖分子間の相補性は、核酸のうちのいくつかのみが結合するように「部分的」であってもよく、または単鎖分子間に全面的な相補性が存在するように「完全」であってもよい。核酸分子間の相補性の程度は、それらの間のハイブリダイゼーションの効率および強度に有意な影響を及ぼす。「ハイブリダイズ可能な」および「相補的」という用語は、意図する作用を行うために十分に安定した結合等が、例えば、核酸の間で起こるために、十分な程度の相補性を指して用いられる。オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズされるべきその標的核酸配列に１００％相補的である必要はないことを理解されたい。
【０１３２】
「組成物」という用語は、１つ以上の成分を含む生成物を包含することが意図される。
【０１３３】
「分化した」という用語は、比較される細胞よりも発達の経路をさらに進んだ細胞である「分化細胞」の関連語である。本明細書でさらに用いられる「分化した神経細胞」とは、一般に、中枢神経系（ＣＮＳ）または末梢神経系（ＰＮＳ）の部分的に分化したまたは完全に分化した細胞を言う。前駆体細胞は、発達および分化の最中に、一連の細胞分裂により異なる細胞系列を発生させる親細胞である。神経前駆体細胞は、例えば、最終的にはＣＮＳまたはＰＮＳの完全に分化した神経細胞へと発達する細胞系列に寄与されるが、かかる神経前駆体細胞は、神経細胞の特定の種類またはサブクラスに未だ付されていない場合がある。神経前駆体細胞は、特定の種類の神経細胞へと分化する細胞株に寄与し、その後、完全に分化した神経細胞を発生させる可能性がある。したがって、本明細書に記載される部分的に分化した神経細胞は、方向性もしくは位置性の特徴を獲得した、または特定のクラスの神経細胞へと発達することが寄与されている、神経の同一性を有する細胞であってもよいが、完全に分化した神経細胞ではない。例えば、単独でまたはＲＡ等のモルフォゲンと組み合わせて、ＭＮＴＦペプチドでＥＳ細胞を処理することにより、本明細書に記載される部分的に分化した神経細胞または神経前駆体細胞を発生させることができる。
【０１３４】
「障害」とは、本明細書に記載される分子または組成物を用いた治療の恩恵を受ける任意の状態である。これには、該当する疾患に哺乳類を罹患させる病理学的な状態等の、慢性および急性の障害または疾患を含む。
【０１３５】
「支持細胞」または「フィーダー」は、通常、２番目の種類の細胞が成長できる環境を提供するために、他の種類の細胞と共培養した１種類の細胞を含む。例えば、特定の種類のｐＰＳ細胞は、１次マウスの胚線維芽細胞、固定マウス胚線維芽細胞、またはｈＥＳ細胞から分化したヒト線維芽細胞様細胞によって支持されても良い。
【０１３６】
「機能的均等物」とは、例えば、ＭＬＳＡＦＳＲＹＡＲドメイン、および保存された相同性の６−ｍｅｒ（例えば、配列番号：２）、７−ｍｅｒ、８−ｍｅｒ、９−ｍｅｒ、または１０−ｍｅｒの生物学的活性と、実質的に同様の生物学的活性を有するペプチドおよびその誘導体を意味する。それには、かかる活性または特徴を有する「断片」、「変異体」、「類似体」、「相同体」、または「化学的誘導体」を含む。ＭＬＳＡＦＳＲＹＡＲドメインおよび上記その他の機能的均等物は、同一のアミノ酸配列を共有してもまたは共有しなくてもよく、従来型または非従来型のアミノ酸の保存的または非保存的アミノ酸置換が可能である。
【０１３７】
本明細書で用いられる「ＭＬＳＡＦＳＲＹＡＲ、ＷＭＬＳＡＦＳ、およびＦＳＲＹＡＲドメイン」という用語は、幹細胞が運動ニューロン、およびペプチド、および／またはその構造および／または機能を模倣する分子に分化するために十分であることが本明細書において実証される、ポリペプチドドメインを指す。さらなるドメインは、配列番号：１〜１４２に示す通りである。
【０１３８】
特定の態様において、配列番号：１〜１４２のうちのいずれかのアミノ酸を含むペプチドおよびその機能的均等物が提供される。
【０１３９】
「遺伝子産物」という用語は、遺伝子から転写されるＲＮＡ分子、またはその分子によってコードされるもしくはそのＲＮＡから翻訳される、ポリペプチドを言う。
【０１４０】
「成長環境」とは、該当する細胞が、適切な条件下においてインビトロで増殖、分化、または成熟できる環境である。かかる条件には、例えば、細胞が培養される培地、存在することが可能ないずれの成長因子または分化誘導因子、および固体表面または支持構造を含んでもよい。
【０１４１】
本明細書でその様々な形態において用いられる「調節因子」および「調節」という用語は、具体的な標的の発現または作用または活性の全部または一部の、上方制御または抑制を包括することが意図される。
【０１４２】
本開示の目的のために、「神経前駆体細胞（ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ）」または「神経前駆体細胞（ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌ」」という用語は、神経細胞（例えば、神経細胞前駆体または成熟ニューロン）またはグリア細胞（例えば、グリア前駆体、成熟アストロサイト、または成熟オリゴデンドロサイト）のいずれかである子孫を産生することができる細胞を含む。細胞は、典型的には、細胞系列の特徴を示すいくつかの表現型マーカーを発現し、インビボにおいて単独で培養される場合、通常は他の胎仔性胚葉層の子孫は生成しない。
【０１４３】
「神経前駆体細胞（ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ）」または「神経前駆体細胞（ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌ」」は、成熟ニューロンであり、時にはグリア細胞を産生する能力を有する子孫を産生することができる細胞を含む。
【０１４４】
「多能性神経前駆体細胞集団」には、神経細胞である子孫およびグリア細胞である子孫の両方、ならびに時として他の種類の細胞を産生する能力を有する細胞集団を含む。多能性神経前駆体である個々の細胞が存在してもよいが、この用語は、集団内の個々の細胞が両方の種類の子孫を形成する能力を有することを必要としない。
【０１４５】
「ペプチド模倣物」および「模倣物」という用語は、それらが模倣するタンパク質領域と実質的に同じ構造および機能的特長を有する、自然発生および合成による化学化合物を含む。
【０１４６】
鋳型ペプチドの特性と相似する特性を有するペプチド類似体は、非ペプチド薬剤であってもよい。ペプチド系化合物を含む「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｍｅｔｉｃｓ）」または「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）」は、かかる非ペプチド系化合物も含む（Ｆａｕｃｈｅｒｅ，Ｊ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．１５：２９（１９８６）；Ｖｅｂｅｒ  ａｎｄ  Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ；ＴＩＮＳ；３９２（１９８５）；ａｎｄ  Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９（１９８７）；Ｂｅｅｌｅｙ  Ｎ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊｕｎ；１２（６）：２１３−６（１９９４）；Ｋｉｅｂｅｒ−Ｅｍｍｏｎｓ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ；Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｕｇ；８（４）：４３５−４１（１９９７）。治療的に有用なペプチドと構造的に類似するペプチド模倣物は、均等物または強化された治療効果もしくは予防効果を産生するために用いられてもよい。一般にペプチド模倣物は、パラダイムポリペプチド（すなわち、生物学的または薬理学的な機能または活性を有するポリペプチド）と構造的に同一または同様であるが、例えば、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、および−ＣＨ２ＳＯ−からなる群から選択される結合によって任意選択的に置き換えられる、１つ以上のペプチド結合を有してもよい。模倣物は、天然のアミノ酸もしくはアミノ酸の非天然類似体のいずれかから全体的に構成されていてもよいか、または部分的に天然であるペプチドアミノ酸およびアミノ酸の部分的に非天然である類似体のキメラ分子である。また、かかる置換が実質的に模倣活性を改変しない限り、模倣物は任意の量の天然アミノ酸を保存する置換を含んでもよい。
【０１４７】
本明細書で用いられる「防ぐ」とは、全体的または部分的に防ぐこと、または寛解させることもしくは制御することを意味する。
【０１４８】
本明細書で用いられる「治療する」とは、治療的処置および予防または防止手段の両方を言う。治療を必要とする対象は、既に障害を持つ対象、および障害に罹患し易い対象または障害があると診断された対象または障害が防がれるべき対象を含む。
【０１４９】
本明細書に記載される化合物または組成物に関して本明細書で用いられる「有効量」とは、所望の生物学的、医薬的、または治療的な結果を導くために十分な量を言う。上記結果は、疾患もしくは障害もしくは状態の兆候、症状、もしくは原因の軽減、または生物系の他のいずれの所望の変更であってもよい。
【０１５０】
本明細書において、「同時に」は、ＭＮＴＦ組成物が１つ以上の治療剤と同時に投与されることを意味するために用いられるのに対し、「併用して」は、同時ではない場合または物理的な組み合わせではない場合に、両方の物質が治療的に作用することが可能な時間枠内に「経時的に」投与されることを意味して用いられる。よって、ＭＮＴＦおよび１つ以上の別の薬剤の両方が有効量で同時に存在する限りは、「経時的」投与は、１つの薬剤の投与後、他方の薬剤が数分（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０分）以内、または数時間、数日、数週もしくは数ヶ月以内に投与されることを容認する可能性がある。成分の正確な性質、化合物間の相互作用、およびそれぞれの半減期に依存して、化合物の投与間の時間遅延は異なる。
【０１５１】
本明細書で用いられる「ペプチド類似体」という用語は、鋳型ペプチドの特性と相似する特性を有し、非ペプチド薬剤であってもよい、化合物を指す。ペプチド系化合物を含む「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｍｅｔｉｃｓ）」または「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）」も、ペプチド類似体等のかかる非ペプチド系化合物を含む。治療的に有用なペプチドと構造的に類似するペプチド模倣物は、均等物または強化された治療効果もしくは予防効果を産生するために用いることができる。一般にペプチド模倣物は、パラダイムポリペプチド（すなわち、生物学的または薬理学的な機能または活性を有するポリペプチド）の構造的または機能的な模倣物（例えば、同一または同様）であるが、例えば、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、および−ＣＨ２ＳＯ−からなる群から選択される結合によって任意選択的に置き換えられる、１つ以上のペプチド結合を有してもよい。模倣物は、天然のアミノ酸、合成の化学化合物、アミノ酸の非天然類似体のいずれかから全体的に構成されてもよいか、または部分的に天然であるペプチドアミノ酸およびアミノ酸の部分的に非天然である類似体のキメラ分子である。また、かかる置換が実質的に模倣物の活性を改変しない限り、模倣物は任意の量の天然アミノ酸の保存的置換を含んでもよい。
【０１５２】
本明細書で用いられる「タンパク質」という用語は、１つのアミノ酸（またはアミノ酸残基）のα炭素に結合したカルボン酸基のカルボキシル炭素原子が、隣接するアミノ酸のα炭素に結合するアミノ基のアミノ窒素原子に共有結合的に結合すると発生する、ペプチド結合を介して連結した２つ以上の別個のアミノ酸（自然発生であってもなくても）の任意のポリマーを言う。これらのペプチドの連結部分およびそれらを構成する原子（すなわち、α炭素原子、カルボキシル炭素原子（およびそれらの置換基の酸素原子）およびアミノ窒素原子（およびそれらの置換基の窒素原子））は、タンパク質の「ポリペプチド主鎖」を形成する。また、本明細書で用いられる「タンパク質」という用語は、「ポリペプチド」および「ペプチド」（本明細書において、時に交換可能に用いられてもよい）という用語を含むことを理解されたい。同様に、タンパク質の断片、類似体、誘導体、および変異体は、本明細書において「タンパク質」と称されてもよく、特に記載されない限り、「タンパク質」として見なされるものとする。タンパク質の「断片」という用語は、タンパク質のすべてのアミノ酸残基よりも少ない残基を含むポリペプチドを言う。タンパク質の「ドメイン」も断片であり、活性または機能を与えることを要求されるタンパク質のアミノ酸残基を含む。
【０１５３】
「パーセント（％）同一性」というフレーズは、２つ以上の配列を比較した際に見られる配列の類似性の割合を指す。パーセント同一性は、例えば、いずれの好適なソフトウェアを用いて、電子的に決定されてもよい。同様に、２つの配列（またはそれらのいずれかもしくは両方の１つ以上の部分）の間の「類似性」は、１つの配列を２番目の配列と比較することにより決定される。
【０１５４】
「医薬的に許容される」化合物および組成物または製剤のその他の成分（例えば、担体、希釈剤、または賦形剤）は、その受け手への投与に好適な成分である。
【０１５５】
「ストリンジェントな条件」という用語は、該当するＭＮＴＦペプチドをコードするポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションを可能にする条件を指す。ストリンジェントな条件は、塩濃度、有機溶媒（例えば、ホルムアミド）の濃度、温度、および当該技術分野で周知であるその他の条件によって定義することができる。ストリンジェンシーは、塩濃度を低下させること、有機溶媒（例えば、ホルムアミド）の濃度を上昇させること、およびハイブリダイゼーション温度を上昇させることによって高めることができる。例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常は、約５００ｍＭのＮａＣｌおよび５０ｍＭクエン酸三ナトリウム未満のように約７５０ｍＭのＮａＣｌおよび７５ｍＭクエン酸三ナトリウム未満であり、約２５０ｍＭのＮａＣｌおよび２５ｍＭクエン酸三ナトリウム未満であってもよい。低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、例えば、ホルムアミド等の有機溶媒の不在下において達成することが可能である一方、高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、有機溶媒（例えば、少なくとも約５０％ホルムアミド等、少なくとも約３５％のホルムアミド）の存在下において達成することが可能である。ストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも約３０℃、少なくとも約３７℃、または少なくとも約４２℃の温度を含む。さらなる様々なパラメータ、例えば、ハイブリダイゼーションの時間、活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））の濃度、および担体ＤＮＡの組み入れまたは除外は、当業者には周知である。様々なレベルのストリンジェンシーは、これらの様々な条件を必要に応じて組み合わせることにより達成され、当該技術分野の範囲内である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、約５℃〜約２０℃の範囲または標的配列の融解温度（Ｔｍ）を２５℃下回る温度条件、および標的に正確にまたはほぼ正確な相補性を示すプローブによっても定義することができる。本明細書で用いられる融解温度とは、二本鎖核酸分子の集団が半分解離して一本鎖になる温度である。核酸のＴｍを計算するための方法は当該技術分野において既知である（例えば、Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５２：Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９８７）：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８９）：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｖｏｌｓ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙを参照）。標準的な参考資料に示されるように、核酸が１Ｍ  ＮａＣｌで水溶液中にある場合、方程式Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）を用いて、Ｔｍ値の単純推定が計算されてもよい（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，“Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（１９８５）を参照）。ハイブリッドの融解温度（つまりはストリンジェントなハイブリッドの条件）は、プローブの���さや性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成）および標的の性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成、溶液中の存在、または固定化等）、ならびに塩および他の成分の濃度（例えば、ホルムアミド、デキストラン硫酸、ポリエチレングリコールの有無）等の様々な要因に影響される。これらの要因の影響は当該技術分野では既知であり、当該分野における標準的な参考資料に記載されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｓｕｐｒａ，ａｎｄ  Ａｕｓｕｂｅｌ，ｓｕｐｒａを参照。典型的には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、約１．０Ｍナトリウムイオン、典型的には約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン（ｐＨ７．０〜８．３）の塩濃度、および短いプローブ（例えば、１０〜５０個のヌクレオチド）には少なくとも約３０℃、長いプローブ（５０個を上回るヌクレオチド）には少なくとも約６０℃の温度である。記載したように、ストリンジェントな条件は、低めの温度が用いられる場合には、ホルムアミド等の脱安定化剤（ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）の添加により達成することができる。本明細書に記載されるように、ポリヌクレオチドは、摂氏約５０〜６０℃で０．０３Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０３Ｍクエン酸ナトリウム等の、中程度から高度のストリンジェンシーの条件下において、標的ｍＲＮＡにハイブリダイズするポリヌクレオチドであってもよい。
【０１５６】
本明細書で用いられる「対象」とは、イヌ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウシ等のヒト、家畜および農場で飼育される動物、および動物園、スポーツ用、またはペットの動物を含む、哺乳類として分類される任意の動物を言う。対象はヒトである可能性もある。
【０１５７】
「治療的な有効量」という用語は、例えば、研究者、獣医、医学博士、または他の臨床医により求められる、例えば、組織、系、動物または人間の生物学的もしくは医学的応答等、所望の応答を導く対象化合物の量を意味する。
【０１５８】
「治療」とは、治療上の処置および予防または防止手段の両方を言う。治療を必要とする対象は、既に障害を持つ対象、および、障害が防がれるべき対象を含む。
【０１５９】
「ベクター」という用語は、プラスミド、ファージ、またはウイルスが、細菌、酵母、無脊椎動物、および／または哺乳類の宿主細胞とともに機能的となる細胞に核酸を送達するために、プラスミド、ファージ、ウイルス、またはその他の系（自然発生または合成）の形態をとる核酸分子の増殖、複製、およびまたは発現ビヒクルを言う。ベクターは、宿主細胞のゲノムＤＮＡから独立した状態であってもよいか、またはゲノムＤＮＡと全体的もしくは部分的に統合していてもよい。ベクターは、必ずではないが一般的には、適合するいずれの宿主細胞においても機能的であるようにすべての必要な要素を含有する。「発現ベクター」は、適切な条件下において、外来性のポリヌクレオチド（例えば、結合ドメイン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド）の発現を導くことができるベクターである。
【０１６０】
本明細書に記載される「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）および相同体（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅｓ）」という用語は、該当するタンパク質配列に対してアミノ酸配列の相同体を有するペプチドであってもよい。かかるペプチドは、典型的には少なくとも約７０％の相同性を有し、例えば、該相同配列の少なくとも約１５、２０、３０、４０、５０、１００個のより近接したアミノ酸／ポリペプチドの領域上で、関連する配列と少なくとも約８０％、９０％、９５％、９７％または９９％相同性であってもよい。
【０１６１】
相同性は、当該技術分野における任意の方法に基づいて計算することができる。例えば、相同性を計算するために用いることができるＵＷＧＣＧ  Ｐａｃｋａｇｅは、ＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（例えば、そのデフォルト設定で用いられる）（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２，ｐ３８７−３９５（１９８４））。ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムは、相同性または整列した配列を計算するために用いることができる（典型的には、それらのデフォルト設定で）。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．Ｆ．；Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ  ３６：２９０−３００（１９９３）；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．；Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３−１０（１９９０）に記載される。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）から公的に入手可能である。このアルゴリズムは、データベース配列において同じ長さのワードと整列した時に、ある正の数の閾値スコアＴと一致するかまたはそれを満足させるかのいずれかである、問い合わせ配列にある長さＷの短いワードを同定することにより、高いスコアの配列対を最初に同定することに関与する。Ｔは隣接ワードスコア閾値（ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ  ｗｏｒｄ  ｓｃｏｒｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ）。これらの初期の隣接ワードのヒットは、それらを含有するＨＳＰを見つけ出すために検索を初期化するためのシードとしての役割を果たす。ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増加することが可能な限り、各配列に沿って両方向に拡張される。各方向におけるワードヒットの拡張は、以下の場合に停止される：累積アラインメントスコアが、その最高到達値から量Ｘの分だけ低下する場合、１つ以上の負のスコアを持つ残基アラインメントの累積により、累積スコアが０またはそれ以下となる場合、またはいずれかの配列の末端に到達する場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、１１のワード長（Ｗ）、５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１０９１９（１９９２）を参照）アラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両方の鎖の比較を、デフォルトとして用いる。
【０１６２】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計解析を行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７（１９９３）を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これにより、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間の一致が偶然に起こる確率の指標が提供される。例えば、第１の配列の比較における最小合計確率が約１未満である場合に、配列はもう１つの配列に類似すると見なされ、また配列は、約０．１、０．０１、または０．００１未満であってもよい。
【０１６３】
相同性の配列は、典型的には、少なくとも（または多くとも）約１、２、５、１０、１５、２０またはそれ以上の突然変異（置換、消失、または挿入であってもよい）により、関連する配列とは異なる。これらの突然変異は、相同性の計算と関連して、上述したいずれの領域を横断して測定されてもよい。相同配列は、典型的には、バックグラウンドを有意に上回るレベルで元の配列に選択的にハイブリダイズする選択的ハイブリダイゼーションは、典型的には、中程度から高度のストリンジェンシー（例えば、約５０℃〜約６０℃で、０．０３Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０３Ｍクエン酸ナトリウム）の条件を用いて達成される。しかしながら、かかるハイブリダイゼーションは、当該技術分野で既知であるいずれの好適な条件下で実行されてもよい（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８９）を参照）。例えば、高いストリンジェンシーを必要とする場合、好適な条件は６０℃で０．２×ＳＳＣを含む。低いストリンジェンシーを必要とする場合、好適な条件は６０℃で２×ＳＳＣを含む。
【０１６４】
「組換え」という用語は、合成されたか、もしくは別様にインビトロで操作されたポリヌクレオチド（例えば「組換えポリヌクレオチド」）、細胞もしくは他の生物系で遺伝子産物を生成するために組換えポリヌクレオチドを用いる方法、または組換えポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド（「組換えタンパク質」）を言う。そのため、「組換えポリヌクレオチド」は、その生成方法またはその構造のいずれかによって定義される。その生成方法に関連して、該プロセスは、例えば、ヌクレオチド配列における人的介入、典型的には選択または生成を伴う、組換え核酸技術の使用を参照する。代替として、天然では互いに接触していない２つ以上の断片の融合を含む、配列の産生によって作製されるポリヌクレオチドであってもよい。よって、例えば、細胞を非自然に発生する任意のベクターで転換することによって作製される生成物が包含され、任意の合成オリゴヌクレオチド過程を用いて生成される配列を含むポリヌクレオチドも包含される。同様に、「組換え」ポリペプチドは、組換えポリヌクレオチドから発現されるポリペプチドである。
【０１６５】
「組換え宿主細胞」とは、ベクター（例えば、クローニングベクターまたは発現ベクター）を含有する細胞、または別様に該当するタンパク質を発現させるための組換え技術によって操作された細胞である。
【０１６６】
治療の一般的な態様
【０１６７】
対象に運動ニューロン栄養因子（ＭＮＴＦ）ペプチド類似体を投与するステップを含む、神経細胞障害に罹患する対象を治療する方法が提供される。
【０１６８】
本明細書で用いられる神経細胞障害は、急性、進行性または漸進的な神経組織の損失に、全部または一部関連するまたは特徴付けられる疾患、障害、または状態を含んでもよい。例示的な神経細胞障害には、脊髄傷害、神経変性疾患、脳卒中または一過性もしくは持続性の虚血性状態（例えば脳虚血）、ハンチントン病（ＨＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、ＡＬＳ、アルツハイマー病、糖尿病性神経障害、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）および横断性脊髄炎を含んでもよい。
【０１６９】
また、例示的な神経変性疾患には、アレキサンダー病、アルパース病、毛細血管拡張性失調症、バッテン病（スピールマイヤー−フォークト−シェーグレン−バッテン病としても知られる）、牛海綿状脳症（ＢＳＥ），カナバン病、コケイン症候群、大脳皮質基底核変性症、クロイツフェルトヤコブ病、ＨＩＶ関連認知症、ケネディ病、クラッベ病、レウィー小体認知症、マシャドジョセフ病（３型脊髄小脳失調症）、多系統萎縮症、ナルコレプシー、神経ボレリア症、ペリツェウス・メルツバッハ病、ピック病、原発性側索硬化症、プリオン病、レフサム病、サンドホフ病、シルダー病をさらに含んでもよい。
【０１７０】
「神経変性疾患」とは、進行性、漸進的な機能的神経組織の損失によって特徴付けられる、中枢または末梢神経系と関連する条件を指す。
【０１７１】
「筋萎縮性側索硬化症」または「ＡＬＳ」は、当該技術分野において理解される用語であり、本明細書においては、上部運動ニューロン（脳内の運動ニューロン）および／または下部運動ニューロン（脊髄内の運動ニューロン）に影響を及ぼし、運動ニューロンの死をもたらす、進行性の神経変性疾患を意味するために用いられる用語である。本明細書で用いられる「ＡＬＳ」という用語は、これらに限定されないが、古典的ＡＬＳ（典型的には下部および上部両方の運動ニューロンに影響を及ぼす）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ、典型的には上部運動ニューロンのみに影響を及ぼす）、進行性球麻痺（ＰＢＰまたは球発症、典型的には嚥下、咀嚼、および発話の困難から始まるＡＬＳの種類）、行性筋萎縮症（ＰＭＡ、典型的には下部運動ニューロンのみに影響を及ぼす）および家族性ＡＬＳ（ＡＬＳの遺伝的な種類）を含む、当該技術分野において既知であるＡＬＳのすべての分類を含む。
【０１７２】
ＡＬＳの例示的な臨床症状には、筋力低下、筋消耗、筋痙攣、筋攣縮、ろれつの回らないまたはゆっくりとした話し方、嚥下困難、および緩慢な非協調性の動作を含む。ＡＬＳのさらなる例示的な臨床症状は、例えば、正常と比較して細胞比率ＣＤ４：ＣＤ８の増加、正常と比較してＣＤ１４＋細胞数の減少、正常なＣＤ１４＋細胞と比較してＣＤ１４＋細胞のＨＬＡ−ＤＲの発現増加、正常と比較して活性化した単球またはマクロファージのレベル上昇、増殖性マクロファージの存在、正常と比較して低下した血清ＩｇＧおよび／またはＩｇ等の、ＡＬＳを有するまたは有することが疑われる対象から獲得した生物学的サンプルにおいて検出可能な症状を含む。本明細書において用いられる「正常」とは、対象がＡＬＳの影響を受けていないこと、または、かかる影響を受けていない対象の細胞を意味する。よって、「治療する」とは、疾患の進行を緩和する、寛解させる、安定化させる、逆転させる、ゆっくりにするもしくは遅らせる、疾患の発症を遅らせるおよび／またはさらには防ぐ等の望ましい随伴効果が得られる可能性がある、１つ以上の臨床症状における低下を実現することを包含する。
【０１７３】
「多発性硬化症」または「ＭＳ」は、当該技術分野において理解される用語であり、本明細書においては、特に脳および脊髄の神経細胞を覆うミエリンの破壊をもたらす、進行性の神経変性疾患を意味するように用いられる。本明細書で用いられる場合、「ＭＳ」には、これらに限定されないが、再発寛解型多発性硬化症（ＲＲＭＳ）（典型的には、発作後の部分的または全体的な回復により特徴付けられる（悪化、再発、または再燃とも称される））、２次性進行型多発性硬化症（ＳＰＭＳ）（一般に、障害および症状の増加を伴う、より少ない再発によって特徴付けられる）、および１次性進行型多発性硬化症（ＰＰＭＳ）（一般に、緩解することなく症状および障害が進行することにより特徴付けられる）を含む、当該分野において既知であるＭＳのすべての分類を含む。
【０１７４】
ＭＳの例示的な臨床症状には、疲労（ＭＳ疲労感とも言われる）、筋疲労、錯感覚、歩行困難および／または平衡障害、痺れ、有棘、または疼き等の感覚異常、疼痛、膀胱機能障害、腸管機能不全、認知機能における変化（記憶力、注意力、集中力、判断力、および問題解決に関するを含む）、めまいおよび回転性めまい、情緒障害（例えばうつ病）、性機能障害、ならびに視覚障害を含む。重度の症例では、部分的または完全な麻痺（霞目もしくは複視、赤緑色盲、または片目失明等）を伴う可能性がある。その他の症状には、頭痛、難聴、痒み、発作、痙縮、発話および嚥下障害、ならびに振戦を含む。さらなるＭＳの例示的な臨床症状には、例えば、正常と比較して細胞比率ＣＤ４：ＣＤ８の増加、正常と比較してＣＤ１４＋細胞数の減少、正常なＣＤ１４＋細胞と比較してＣＤ１４＋細胞のＨＬＡ−ＤＲの発現増加、正常と比較して活性化した単球またはマクロファージのレベル上昇、増殖性マクロファージの存在、正常と比較して低下した血清ＩｇＧおよび／またはＩｇ等の、ＭＳを有するまたは有することが疑われる対象から獲得した生物学的サンプルにおいて検出可能な症状を含む。本明細書において用いられる「正常」とは、対象がＭＳの影響を受けていないこと、または、かかる影響を受けていない対象の細胞を意味する。よって、「治療する」とは、疾患の進行を緩和する、寛解させる、安定化させる、逆転させる、ゆっくりにするもしくは遅らせる、疾患の発症を遅らせるおよび／またはさらには防ぐ等の望ましい随伴効果が得られる可能性がある、１つ以上の臨床症状における低下を実現することを包含する。
【０１７５】
「アルツハイマー病」または「ＡＤ」は、当該技術分野において理解される用語であり、本明細書においては、認知症により特徴付けられ、アメリカ心理学協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）により記憶障害を含む複数の認知障害の発達として定義される（ＤＳＭ  ＩＶ）、進行性の神経変性疾患を意味するように用いられる。
【０１７６】
ＡＤの例示的な臨床症状には、最近の出来事、活動、または見慣れた人々や物の名前が思い出せない等の軽度の物忘れ；簡単な数学問題を解くのが困難である；簡単な課題をどのようにするのかが思い出せない（例えば、歯を磨くまたは髪をとかす等）；明瞭に思考することができない；話す、理解する、読む、または書くことが困難である；および不安もしくは攻撃性、または家から出て徘徊する傾向を含む。
【０１７７】
本明細書で用いられる場合、「対象」は、哺乳類（例えば、ヒト）等の脊椎動物であってもよい。哺乳類には、これらに限定されないが、農場で飼育される動物、スポーツ用の動物、げっ歯類、霊長類、およびペットを含む。
【０１７８】
本明細書で用いられる「パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）」（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅまたはＰＤとしても知られる）は、しばしば罹患者の運動能力および発話が損なわれる中枢神経系の変性状態により、全体的または部分的に特徴付けられる。パーキンソン病は、運動障害と称される状態の群に属する。該状態は、筋固縮、振戦、身体運動の緩慢化（動作緩慢）、および極端な症例においては、身体運動の喪失（アキネジア）により一部特徴付けられる。１次症状は、通常、脳のドーパミン作動性ニューロンにおいて生成されるドーパミンの不十分な形成および作用が原因となる、基底核による運動皮質の刺激不足の結果である。２次症状には、高レベルの認知障害およびわずかな言語障害を含んでもよい。ＰＤは、慢性的であり、かつ進行性である。ＰＤは、一群の類似する症状であるパーキンソニズムの最も一般的な原因である。ＰＤは、「原発性パーキンソン症候群」または「突発性ＰＤ」（原因不明の）とも称される。ほとんどのパーキンソニズムの形態が突発性である一方で、中には、毒性、薬剤、遺伝子の突然変異、頭部外傷、またはその他の医学的障害に起因する症状が見られる症例も存在する。
【０１７９】
ハンチントン病（ＨＤ）は、ハンチントン（Ｈｔｔ）遺伝子のエクソン１におけるＣＡＧＥ三ヌクレオチドの伸長に起因する、常染色体優性の神経変性により特徴付けられてもよい（Ｅ．ｇ．Ｐｅｒｕｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１９９９；２４：５８−６３；ａｎｄ  Ｒｕｂｉｎｓｚｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．１９９９；３６：２６５−２７０）。ＨＤ患者は、異常な動作、認知症、および精神医学的問題の存在により特徴付けることができる。
【０１８０】
概要
【０１８１】
ラット筋肉組織からの２つの運動ニューロン栄養因子（ＭＮＴＦ１およびＭＮＴＦ２）の単離および特徴付け、ならびにその後のヒト網膜芽細胞腫ｃＤＮＡライブラリー由来の組換えＭＮＴＦ１−Ｆ６遺伝子のクローニングは、米国特許第６，３０９，８７７号、第６，７５９，３８９号、および第６，８４１，５３１号（および同時係属中の米国特許出願第Ｕ１０／８５８，１４４号、第１０／８５８，２８６号、第１０／８５８，５４３号および第１０／８５８，５４５号）に記載され、参照することにより、それらの全体は本明細書に一体化される。それらにおいて配列番号：１と称されるＭＮＴＦ１−Ｆ６遺伝子配列は、３３番目のアミノ酸配列をコードする。国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３８６５１に記載されるように（参照することにより、その全体は本明細書に一体化される）、ＭＮＴＦ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ヒト染色体１６ｑ２２内に位置することが分かっている。
【０１８２】
ＭＮＴＦ１の既知の生物学的活性に十分であると思われるＭＮＴＦ１−Ｆ６分子内で、重複する２つのドメインが同定された。国際出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ０４／０１４６８号または米国特許出願第１０／５４１，３４３号（米国特許第７，１８３，３７３号として発行）を参照のこと（参照することにより、その全体は本明細書に一体化される）。本明細書において「ＷＭＬＳＡＦＳ」および「ＦＳＲＹＡＲ」ドメインと表されるそれぞれのドメインは、ＭＮＴＦ１−Ｆ６の３３−ｍｅｒと同様に、運動ニューロンに由来する細胞株の増殖を刺激するために十分であった。同様に、「ＦＳＲＹＡＲ」ドメインは、ＭＮＴＦ１−Ｆ６の３３−ｍｅｒと同様に、インビボで運動ニューロンによる筋肉標的の選択的な神経再生を導くために十分である。また、「ＦＳＲＹＡＲ」ドメインは、ＭＮＴＦ１−Ｆ６の３３−ｍｅｒを含む「ＦＳＲＹＡＲ」配列を含有するいかなるＭＮＴＦペプチドをも認識する抗体を産生させるために十分な抗原性エピトープを提供する。
【０１８３】
運動ニューロン栄養因子（ＭＮＴＦ）は、ヒト妊娠期間における胎仔期中９週目の発現でピークに達する（Ｄｉ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ，Ａｃｔａ  Ａｎａｔｏｍｉｃａ  Ｓｉｎｉｃａ  ２９：８６−８９，１９９８）。ヒトの発達におけるＭＮＴＦの発現に基づいて、我々は、ＭＮＴＦが運動ニューロンの分化および／または生存を促進する可能性があると判断した。これを検討するために、我々は、ＭＮＴＦが多能性胚性幹細胞の運動ニューロンへの分化を調節し、ＥＳ細胞由来の運動ニューロンの生存を促進するかどうかを定義した。
【０１８４】
本明細書に開示されるように、発明者は、ＥＳ細胞のＲＡおよびＭＮＴＦ類似体への曝露が、これらの細胞の運動ニューロン産生を導くことを決定した。
【０１８５】
使用方法
【０１８６】
本明細書において運動ニューロン分化因子（ＭＤＮＦ）と称されるＭＬＳＡＦＳＲＹＡＲドメインを含むＭＮＴＦおよび切断されたＭＮＴＦ分子が、幹細胞または部分的に分化した神経細胞の運動ニューロンへの分化を誘導することが、本明細書において実証される。かかる薬剤は、幹細胞培養物から運動ニューロンの集団を産生および／または単離するための新しい方法を提供する。
【０１８７】
本明細書に記載される方法は、胚性幹細胞をレチノイン酸（ＲＡ）および運動ニューロン分化因子（ＭＮＤＦ）に接触させるステップを含む。本明細書に記載される一実施形態において、胚性幹細胞は、運動ニューロン分化因子と同時にＲＡに接触される。代替として、当該方法は、部分的に分化した神経細胞を運動ニューロン分化因子と接触させるステップを含む。上記因子は、分化した神経細胞を生成するために有効な量で提供される。当業者は、本明細書に開示される既知の手順および方法に基づいて、これらの量を容易に決定できる。
【０１８８】
ＭＮＴＦ１および／またはそのペプチド類似体も、インビトロでの哺乳類運動ニューロンの生存を促進する。したがって、本明細書に記載される技術は、有効量のＭＮＴＦペプチド類似体を用いて幹細胞由来の神経細胞をインビトロで培養することにより、幹細胞由来の神経細胞株の生存を促進する方法を含む、神経細胞培養物の成長因子／栄養補助剤としてのＭＮＴＦペプチド類似体の使用を提供する。
【０１８９】
発明者は、神経栄養因子の存在下で培養されたニューロンは、生存して突起を発達させることも発見した。したがって、別の実施形態において、本明細書に記載される方法は、例えば、ＲＡおよび運動ニューロン分化因子との接触の後で、幹細胞由来の運動ニューロンを少なくとも１つのＭＮＴＦペプチド類似体（本明細書に記載されるＭＮＴＦペプチド類似体、または、代替として、Ｓｈｈアゴニストを含むソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）等）と接触させるステップを含む。
【０１９０】
分化した運動ニューロンは、例えば、ＦＡＣＳソーティングにより単離または濃縮される。例えば、ＧＦＰに基づく運動ニューロンのマーキング法は、ＥＳ細胞由来運動ニューロンの純粋な集団を特徴付けることを可能にする。胚様体から細胞の混合集団を、続いてそこから細胞の純粋な運動ニューロン集団を単離するために、このプロトコルを用いた。コラゲナーゼおよびディスパーゼを用いて、胚様体を単細胞に脱凝集した。ＨＢ９プロモーターに制御されたＧＦＰを発現する細胞が、集団における真の運動ニューロンであるため、これらの単細胞をＧＦＰについてＦＡＣＳソートした。
【０１９１】
したがって、本明細書に記載される技術の別の態様は、以下のステップ（ａ）〜（ｆ）により、分化した神経細胞の集団を単離および／または精製するための方法を対象とする：（ａ）運動ニューロン特異的プロモーターの制御下において、高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）を発現する胚性幹細胞の培養物を獲得または産生するステップ、（ｂ）胚性幹細胞の培養物を、ｅＧＦＰを発現する分化した神経細胞を生成するために有効な量のＲＡおよびＭＮＴＦと接触させるステップ、（ｄ）分化した神経細胞においてｅＧＦＰの発現を検出するステップ、および（ｆ）ｅＧＦＰを発現する分化した神経細胞を単離するステップ。
【０１９２】
発明者は、ＭＮＴＦおよび特定のＭＮＴＦ類似体は、哺乳類ニューロンの生存、成長、増殖、および／または維持を促進する能力により、神経細胞障害を治療するために有用であることを発見した。さらに発明者は、特定の実施形態に従うと、ＭＮＴＦペプチドまたはＭＮＴＦ類似体は、ソニックヘッジホッグ経路に非依存的（例えば、実施形態に依存して部分的または完全に非依存的である）なシグナル伝達経路を調節することを発見した。同じように、発明者は、ＭＮＴＦペプチドおよびＭＮＴＦ類似体は、特定のチロシンキナーゼおよび増殖因子受容体の発現または活性を含む、特定のタンパク質キナーゼ経路を調節することを発見した。制御されるシグナル伝達経路またはタンパク質キナーゼ経路には、例えば、ソニックヘッジホッグ非依存的経路を含む。
【０１９３】
ソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）は、その膜貫通受容体成分であるｐａｔｃｈｅｄ−ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄを介して作用する、尾側ニューロンの腹側化を司る重要な成分である。本明細書に提示されるデータは、インビトロでのマウスＥＳ細胞の分化において、ＭＮＴＦペプチドが、レチノイン酸の存在下で効率的にソニックヘッジホッグを運動ニューロンに置換することを示している（実施例５）。これらのＥＳ培養物にＭＮＴＦを添加することは、成熟運動ニューロン転写因子（ＨＢ９およびＩｓｌｅｔ  １／２）の発現、成熟運動ニューロンのマーカーであるコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）の発現、および活動電位を伝導する能力を持つニューロンの産生をもたらす。上記データは、ＭＮＴＦペプチドが、ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ受容体シグナリングの特異的阻害物質（シクロパミン−ＫＡＡＤ）の存在下において、有糸分裂後の成熟運動ニューロンを産生する能力を持つことも示している。特定の理論または機構に拘束されることなく、発明者は、上記データがＭＮＴＦシグナルが、Ｓｈｈまたは平滑化の下流にある経路とは異なる経路を通過することを示していると考える。本明細書に提示されるデータに基づき、発明者はさらに、哺乳類ニューロンの生存、成長、増殖、および／または維持を促進するために、ＭＮＴＦペプチドは、本明細書に記載されるシグナル伝達経路を通過して作用すると決定した。よって、本明細書に記載される技術の別の態様において、ＭＮＴＦ因子またはＭＮＴＦ類似体は、特定のシグナル伝達成分の発現または活性を調節するために投与される。我々のデータはさらに、ＥＳ細胞のＭＮＴＦ処理が、インスリン受容体（ＩＲ）のＴｙｒ９７２およびＴｙｒ１１６２／１１６３の自己リン酸化をもたらすことを実証した（実施例５）。これらの残基はＩＲ活性化のマーカーである。また、免疫共沈降試験は、ＥＳ細胞のＭＮＴＦ処理の結果として、特異的ＳＨ２ドメインとＩＲとの関連（ＰＩ３キナーゼのｐ８５サブユニット）を示した。実施例５は、ＩＧＦ−１ＲをブロックすることはＭＮＴＦが運動ニューロンを産生する能力に影響を及ぼさなかったが、ＩＲをブロックすることでその能力が破壊されたことも示している。
【０１９４】
特定の実施形態において、インスリン受容体基質タンパク質の発現または活性は、運動ニューロン栄養因子（ＭＮＴＦ）類似体の患者または標的器官、組織、もしくは細胞への投与に応答して調節される。インスリン受容体基質タンパク質（ＩＲＳタンパク質）は、インスリンおよびＩＧＦの両方によって開始されるシグナルのエフェクターである。それらは、Ｎ末端近くのＰＨおよびＰＴＢドメイン、およびＣ末端領域内の複数のＴｙｒリン酸化モチーフを共有する。チロシンリン酸化ＩＲＳタンパク質に結合するタンパク質は、ＰＩ３キナーゼｐ８５、ＧＲＢ２、ＳＨＰ２、Ｎｃｋ、ＣｒｋおよびＦｙｎを含む。ＩＲＳ−１は、主にＩＧＦシグナルおよび細胞骨格の成長に関与していると思われる。遺伝子除去がＩＩ型糖尿病を引き起こすため、ＩＲＳ−２は、インスリンシグナルの重要なメディエーターであると思われる。ＩＲＳ−３は、主に脂肪細胞中に発現する、ＰＤキナーゼの強力な活性化因子である。ＩＲＳ−４は、他のＩＲＳタンパク質がＳＨＰ２に結合するために用いられるチロシン残基を持たない。
【０１９５】
特定の実施形態において、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−ＩＩ、またはそのいずれかの受容体のタンパク質発現または活性は、運動ニューロン栄養因子（ＭＮＴＦ）類似体の患者または標的器官、組織、もしくは細胞への投与に応答して調節される。ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩは、インスリン受容体と相同性であるＩＧＦ−Ｉ受容体を通過する。高親和性ＩＧＦ−ＩＩ受容体は、シグナリングにおいて直接的な役割は果たさないが、遊離ＩＧＦ−ＩＩの濃度を制御する。ＩＧＦは骨格の成長に関与しており、アポトーシスの防止に不可欠である。遊離ＩＧＦの血清レベルは、ＩＧＦを封鎖するＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）の作用により低く保たれる。ＩＧＦＢＰの過剰発現は、おそらくは遊離ＩＧＦの低下により、アポトーシスを引き起こす可能性がある。ＩＧＦＢＰレベルは、特定の癌においても変更される。ＩＧＦ−Ｉ受容体は、他の成長因子受容体ほど分裂促進的ではないが、インスリン受容体基質（ＩＲＳ）タンパク質を通過してＰＩ３キナーゼ経路を活性化する能力は、細胞の生存を仲介するために非常に重要である。
【０１９６】
特定の実施形態において、ホスファチジルイノシトール−３キナーゼタンパク質の発現または活性は、運動ニューロン栄養因子（ＭＮＴＦ）類似体の患者または標的器官、組織、もしくは細胞への投与に応答して調節される。ＰＩ３キナーゼ（ホスファチジルイノシトール−３キナーゼ）は、生存シグナル、およびインスリン作用に必要とされる強力な２次メッセンジャーであるＰＩ（３、４、５）Ｐ３を産生するために、ＰＩ（４、５）Ｐ２のイノシトール環の３位のリン酸化を司る。ＰＩ３キナーゼは、８５ｋＤａ制御サブユニットおよび１１０ｋＤａ触媒サブユニットからなるヘテロ二量体複合体である。成長因子受容体のチロシンリン酸化は、受容体上のｐ８５の結合のためのドッキング部位（そのＳＨ２ドメインを介して）を作製する。ｐ８５がそれをｐ１１０に結び付けることにより、膜上のホスホリピド基質に近位となる。ＰＩ３キナーゼは、Ｒａｓ、およびヘテロ三量体Ｇタンパク質のβ：γサブユニットによっても活性化される。ＰＢキナーゼは、ＰＩ３キナーゼシグナル経路の試験に有用なツールであるワートマニンにより阻害することができる。
【０１９７】
特定の実施形態において、Ａｋｔキナーゼタンパク質の発現または活性は、運動ニューロン栄養因子（ＭＮＴＦ）類似体の患者または標的器官、組織、もしくは細胞への投与に応答して調節される。Ａｋｔは、ＰＩ３キナーゼ経路の主要な既知のエフェクターである。ＰＩＰ３の産生はＰＤＫ１の活性化をもたらし、Ｔｈｒ３０８上のＡｋｔ、およびその他のキナーゼ（予測されるＰＤＫ２）をリン酸化し、Ｓｅｒ４７３上のＡｋｔをリン酸化する。これらのリン酸化は、Ａｋｔ  Ｓｅｒ／Ｔｈｒキナーゼ活性をさらに活性化し、これらの部位のうちのいずれかを標的とするリン酸化状態特異的な抗体の使用はＡｋｔの活性化を意味する可能性がある。Ａｋｔの活性化は、免疫沈降の後で、放射標識したＡＴＰを用いて既知の基質をリン酸化することにより、直接的に測定することができる。ＡｋｔはＳｅｒ１３６上のＢａｄをリン酸化し、アポトーシスから保護する結果となる。Ａｋｔの他の基質には、ＧＬＵＴ４、心臓ＰＦＫ２、およびＧＳＫ３を含み、このリン酸により不活性化される。
【０１９８】
特定の実施形態において、Ｂａｄキナーゼタンパク質の発現または活性は、運動ニューロン栄養因子（ＭＮＴＦ）類似体の患者または標的器官、組織、もしくは細胞への投与に応答して調節される。Ｂａｄ、または「細胞死のＢｃｌ−２アゴニスト」は、Ｂｃｌ−２ファミリーのメンバーであり、生死の重要な制御因子である。非リン酸化Ｂａｄは、Ｂｃｌ−２とＢｃｌ−ＸＬとを二量体化し、それらの抗アポトーシス性の活性を中和する。ＰＩ３キナーゼ経路の活性化は、セリン１３６上のＢａｄをリン酸化するＡｋｔの活性化につながる。ＭＡＰキナーゼ経路はセリン１１２上のＢＡＤをリン酸化し、最近になって、ＰＫＡがセリン１５５上のＢＡＤをリン酸化することが明らかになった。リン酸化されたＢａｄは、アポトーシス促進性の役割からＢａｄを除外する１４−３−３タンパク質、またおそらくは他の因子に結合する。これらの部位に特異的なリン酸化状態特異的な抗体を用いたアッセイは、細胞生存経路の活性化の読み取りとしての役目を果たす。
【０１９９】
特定の実施形態において、ＰＩ（３、４、５）Ｐ３依存キナーゼタンパク質の発現または活性は、運動ニューロン栄養因子（ＭＮＴＦ）類似体の患者または標的器官、組織、もしくは細胞への投与に応答して調節される。ＰＩ（３、４、５）Ｐ３依存キナーゼ１（ＰＤＫ１）は、ＰＨドメインを有するＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼであり、ＰＩＰ３により強く刺激される。ＰＤＫ１の最も十分に特徴付けられた基質はＡｋｔであり、Ａｋｔ活性化に貢献するＴｈｒ３０８上のＰＤＫ１によってリン酸化される。ＰＤＫ１の２つのアイソフォームが同定されている。ＰＤＫ１は、ｐ７０  Ｓ６キナーゼの活性化においても役割を果たすと考えられており、Ｔ細胞の活性化中のＴ細胞受容体からＮＦＫＢへのシグナリングにとって重要である。
【０２００】
特定の実施形態において、Ｂａｘタンパク質の発現または活性は、運動ニューロン栄養因子（ＭＮＴＦ）類似体の患者または標的器官、組織、もしくは細胞への投与に応答して調節される。Ｂａｘタンパク質は、高度に保存されたドメインをＢｃｌ−２と共有し、アポトーシスを誘導するタンパク質をサイトゾル内に放出することにより多くの細胞のアポトーシス経路において重要な役割を果たす、ミトコンドリアの脂質二重層にイオン伝導チャネルを形成することができる。Ｂａｘは、癌または神経変性障害等、アポトーシスに関与する多くの疾患に対する興味深い治療標的を提示する。
【０２０１】
特定の実施形態において、ｐ５３遺伝子産物の発現または活性は、運動ニューロン栄養因子（ＭＮＴＦ）類似体の患者または標的器官、組織、もしくは細胞への投与に応答して調節される。ヒトの癌全体のおよそ半分において、ｐ５３遺伝子は突然変異している。その遺伝子産物は細胞障害性ストレスに対する細胞の応答に関与し、ｐ１９ＡＲＦとともにｐ２１Ｃｉｐｌの発現を誘導して細胞周期停止を引き起こす。また、ｐ５３は、転写性および非転写性機構の両方により、アポトーシスを誘導することができる。ｐ５３のアミノ末端の８３個のアミノ酸は、トランス活性化ドメイン、および転写非依存性の成長抑制に関与する領域を含有する。カルボキシ末端領域は、３つのリン酸化イベントおよび潜在的にはアセチル化によっても調節される、ＤＮＡ結合領域を含有する。
【０２０２】
特定の実施形態において、一酸化窒素合成酵素タンパク質の発現または活性は、運動ニューロン栄養因子（ＭＮＴＦ）類似体の患者または標的器官、組織、もしくは細胞への投与に応答して調節される。一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）は、一酸化窒素を生成する二量体のヘム含有酵素であり、Ｃ末端のレダクターゼドメインおよびＮ末端のオキシゲナーゼドメインを含有する。ＮＯＳの３つのカテゴリーには、主に神経細胞組織において発現されるｎＮＯＳ／ＮＯＳＩ／ＮＯＳ１、炎症性刺激によってマクロファージおよび他の特定の細胞内に誘導することができるｉＮＯＳ／ＮＯＳＩＩ／ＮＯＳ２、および恒常的に発現されるＮＯＳの上皮形態であるｅＮＯＳ／ＮＯＳＩＩＩ／ＮＯＳ３を含む。恒常的に発現されるｎＮＯＳおよびｅＮＯＳは、活性のためにＣａ２＋を必要とし、Ｃａ２＋の流入によって抑制される。ｉＮＯＳは、Ｃａ２＋に依存性ではない。多数の部位で異なるアイソフォームをリン酸化することは、タンパク質活性に様々な効果（あるものは阻害性、あるものは活性化を図る）を及ぼす。
【０２０３】
特定の実施形態において、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３タンパク質の発現または活性は、運動ニューロン栄養因子（ＭＮＴＦ）類似体の患者または標的器官、組織、もしくは細胞への投与に応答して調節される。グリコーゲン合成酵素キナーゼ３（ＧＳＫ）は、シグナル経路活性の不在下においても活性であるという点で、大抵のセリン／スレオニンキナーゼとは異なる。ＧＳＫ３αおよびＧＳＫ３βの２つのアイソマーが存在する。ＧＳＫ３の機能は、グリコーゲン合成酵素をリン酸化することにより、不活性化することである。インスリンの活性はＰＩ３キナーゼ経路を刺激し、ＧＳＫ３をリン酸化して不活性化するＡｋｔの活性化をもたらす。その後、グリコーゲン合成酵素は急速に脱リン酸化され、活性化される。その他のＧＳＫ３基質には、Ｊｕｎ（阻害部位上の）、およびｅＩＦ２Ｂを含む。ＧＳＫ３によるＴａｕのリン酸化は、アルツハイマー病の発達と関連する可能性がある。ＧＳＫ３上のＡｋｔ部位（Ｓｅｒ２１）を標的とするリン酸化状態特異的な抗体は、経路の活性化状態の代替アッセイに好適である。
【０２０４】
特定の実施形態において、カスパーゼタンパク質の発現または活性は、運動ニューロン栄養因子（ＭＮＴＦ）類似体の患者または標的器官、組織、もしくは細胞への投与に応答して調節される。Ｃ．エレガンスＣＥＤ−３の死に関連するタンパク質であるシステインアスパルチルプロテアーゼは、カスパーゼファミリーを含む。すべては、タンパク質分解によって活性化される酵素前駆体として発現される。アポトーシスにおける役目に関して、カスパーゼは、受容体クラスター形成によって活性化されるか（イニシエーター）またはミトコンドリアの膜透過性遷移によって活性されるか（エフェクター）に依存して、イニシエーターカスパーゼ（カスパーゼ８、９、１０）およびエフェクターカスパーゼ（カスパーゼ３、６、７）に細分類することができる。エフェクターカスパーゼ、中でも特にカスパーゼ３は、多数の基質を切断して、アポトーシスと関連する形態学的変化に影響を及ぼす。カスパーゼ３基質の中で、ＤＦＦ４５／ＩＣＡＤは、ＤＦＦのＤＮＡｓｅサブユニットを遊離させてクロマチン分解を引き起こし、ゲルゾリン、ＰＡＫ２、Ｄ４ＧＤＩは、細胞骨格系、核ラミンおよびＰＡＲＰに関与する。ＰＡＲＰ切断の有意性は明白ではないが、カスパーゼ活性化および進行中のアポトーシスの推定のための優秀なマーカーである。
【０２０５】
特定の実施形態において、ＲＡＳ遺伝子産物の発現または活性は、運動ニューロン栄養因子（ＭＮＴＦ）類似体の患者または標的器官、組織、もしくは細胞への投与に応答して調節される。Ｒａｓタンパク質は小さなＧＴＰ結合タンパク質であり、ヘテロ三量体Ｇタンパク質とは異なり、単一のポリペプチド内にすべてのＧＴＰａｓｅおよびエフェクター機能を保有する。Ｋｉ−Ｒａｓ、Ｈａ−Ｒａｓ、およびＮ−Ｒａｓの、少なくとも３のＲａｓのアイソフォームが存在し、それらの発現パターンは異なるが、類似するシグナル活性を示す。Ｒａｓは、カルボキシ末端でパルミトイル化およびファルネシル化されて、膜にアンカーされる。静止細胞において、ＲａｓはＧＤＰで充填されて受容体の成長ホルモン刺激に続いて活性化され、Ｒａｓグアニンヌクレオチド交換因子が膜の平面に補充される。交換因子のＲａｓタンパク質に対する近接性が、ＧＤＰの放出、およびそのＧＴＰによる置き換えの原因となる。そのＧＴＰ結合形態において、ＲａｓはＲａｆ、ＲａｌＧＤＳ、およびＰＩ３キナーゼを含むいくつかのタンパク質に結合する。Ｒａｓの不活性化はＧＴＰ加水分解によって起こり、既知の２つのＲａｓ  ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質であるＲａｓＧＡＰまたはＮＦ−１によって大きく加速される。ライセートを、Ｒａｓ：ＧＴＰに選択的に結合するＲａｆ−１のＲａｓ結合ドメインとともにインキュベートすることにより、Ｒａｓ活性化をアッセイすることができる。
【０２０６】
幹細胞培養物
【０２０７】
胚性幹（ＥＳ）細胞は、不確定に複製する能力を持つ胚盤胞段階の胚の多能性内部細胞塊に由来する、培養細胞である。通常、ＥＳ細胞は、他の細胞に分化する潜在性を有する（すなわち多能性である）ため、新しい細胞の持続的な源としての役割を果たす可能性を持つ。胚性幹細胞は、哺乳類（例えば、ヒト、家畜、または市販の動物）等のいずれの動物から獲得されてもよい。一実施形態において、胚性幹細胞は成熟した胚性幹細胞である。別の実施形態において、胚性幹細胞はヒトから獲得される。
【０２０８】
哺乳類幹細胞を培養するために好適である方法は、当該技術分野において既知であり、例えば、米国特許出願第１０／３６２，４３７号、第１０／７８９，２６６号、第１０／７８９，３０８号、第１０／９２８，８０５号、および米国特許第６，８３３，２６９号に規定され、参照することにより、それらの全体は本明細書に一体化される。明示的に指定されていない限り、本明細書に記載される技術は、いずれの脊椎動物種（例えば、ヒト、およびヒト以外の霊長類、家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃ  ａｎｉｍａｌｓ）、家畜（ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ）、およびその他のヒト以外の哺乳類）の幹細胞を用いても実践することができる。本明細書に記載される使用に好適である幹細胞の中には、妊娠期間中の任意の時点で採取された胚盤胞または胎仔組織または胚組織等、妊娠後に形成された組織に由来する霊長類多能性幹（ｐＰＳ）細胞を含む。限定されない例は、初代培養物または胚性幹細胞もしくは胚生殖細胞の確立された細胞株である。
【０２０９】
特定の実施形態において、原型の「霊長類多能性幹細胞」（ｐＰＳ細胞）が用いられる。ｐＰＳ細胞には、受精後の任意の時点での着床前組織、胚組織、または胎仔組織に由来する多能性細胞を含む。適切な条件下において、それらは、３つの胚葉層（内胚葉、中胚葉、および外胚葉）の誘導体であるいくつかの異なる細胞種の子孫を生成する能力を持つ。ｐＰＳ細胞は、Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５（１９９８）に記載されるヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞、アカゲザル等他の霊長類からの胚性幹細胞（Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：７８４４，（１９９５））、マーモセット幹細胞（Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５５：２５４（１９９６））およびヒト胚生殖（ｈＥＧ）細胞（Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１３７２６（１９９８）を含む、多様な種類の胚細胞、ならびに当該技術分野において既知である他の種類の多様性細胞を包含する。胚組織、胎仔組織、またはその他の源に由来するかどうかに関係なく、３つの胚葉層全部の誘導体である子孫を生成する能力を持つ霊長類由来のいずれの細胞が含まれる。通常、ｐＰＳ細胞は悪性源に由来しないため、核型正常である可能性がある。
【０２１０】
ｐＰＳ細胞培養物は、集団内における幹細胞とその誘導体との実質的な比が、胚または大人由来の分化細胞と比較して容易に明白である形態的特徴を示す場合に、「未分化」であると称される。未分化ｐＰＳ細胞は、当業者に容易に認識され、典型的には細胞コロニーにおける顕微鏡を用いた２次元画像に見られる。集団内の未分化細胞のコロニーが、分化した隣接細胞に囲まれることはよくあることである。
【０２１１】
分化神経細胞
【０２１２】
前駆細胞、部分的に分化した細胞、および完全に分化した神経細胞を培養するために好適な方法は当該技術分野において既知であり、例えば、米国特許出願第１０／３６２，４３７号、第１０／７８９，２６６号、第１０／７８９，３０８号、第１０／９２８，８０５号および米国特許第６，８３３，２６９号に規定され、それらの全体は本明細書に一体化される。
【０２１３】
また、本明細書で用いられる場合、「神経細胞」または「ニューロン」は、神経系の伝導性細胞または神経細胞であり、典型的には、核および細胞質を含有する細胞体（核周部）；いくつかの短い、放射状の突起（樹状突起）；および１つの長い突起（軸索）から構成され、枝様の分岐部（終末分枝）で終端し、その途中に分岐部（側枝）を有していてもよい。ニューロンの例には運動ニューロンを含む。
【０２１４】
分化神経細胞の特徴付け
【０２１５】
ＥＳ細胞の部分的にまたは完全に分化した神経細胞への分化は、既知の細胞または分子手順、ならびに本明細書に開示されるアッセイおよび方法を用いて検出されてもよい。例えば、細胞培養物は、ＮｅｕＮ（ニューロンマーカー）および／またはＨＢ９もしくはＣｈＡＴ等の特異的な運動ニューロンマーカー等のニューロンマーカーについて探査されてもよい。
【０２１６】
別の実施形態において、本明細書に記載されるように、分化した神経細胞は、通常、高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）を発現することでマークされる。ｅＧＦＰ遺伝子マーカーは、分化神経細胞の集団を単離および／もしくは精製するための方法において、または脊髄の再増殖を監視するための方法において、特に有用である可能性がある。
【０２１７】
レチノイン酸
【０２１８】
ＲＡ、またはビタミンＡは、モルフォゲンであると思われるアルデヒド分子である。ＲＡは容易に入手可能であり、例えば、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）から調達することができる。最終濃度約０．０．００１〜１μＭでＲＡを用いた処理は、幹細胞から神経前駆細胞への効率的な分化をもたらす。
【０２１９】
ＭＮＴＦペプチド
【０２２０】
当該技術分野および開示に精通する当業者は理解するように、ＭＮＴＦ活性ドメインおよびそのペプチド類似体を含む配列は、運動ニューロンに対する神経の保護、修復、および治療的機能をインビボおよびインビトロで与えることができる。本明細書に記載されるＭＮＴＦ因子は、合成的もしくは組換えで生成されてもよく、または天然細胞から単離されてもよい。
【０２２１】
本開示のＭＮＴＦペプチド類似体を含むタンパク質またはペプチドにおけるアミノ酸残基の配列は、本明細書において、一般的に用いられる３文字の記号表示の使用によるか、または１文字の記号表示によるかのいずれかで表される。これら３文字および１文字の記号表示のリストは、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ａ．，Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９７５）等の教科書に見ることができる。アミノ酸配列が水平に列記されている場合は、アミノ末端は左端にあることが意図され、カルボキシ末端は右端にあることが意図される。
【０２２２】
当業者は、様々なＭＮＴＦペプチド類似体を含むペプチドの正確な化学構造は、因子の数に依存して異なることを理解するであろう。例えば、イオン化可能なカルボキシル基およびアミノ基が分子中に認められるため、所与のポリペプチドは酸性または塩基性の塩として得られてもよい。開示の目的のために、ＷＭＬＳＡＦＳ、ＦＳＲＹＡＲ、ＭＬＳＡＦＳＲＹＡＲドメイン、およびＭＮＴＦ１  ３３ｍｅｒペプチドの生物学的活性を保持する配列番号：１〜１４２に列記されるその他の配列／ドメインを含む任意の形態のペプチドは、本明細書に記載される技術の範囲内であることが意図される。
【０２２３】
図２５は、本開示に従うＭＮＴＦペプチドの特定の例示的な実施形態を示した図である。
【０２２４】
ＭＮＴＦ１−Ｆ６  ３３−ｍｅｒ
【０２２５】
米国特許第６，３０９，８７７号において、次のアミノ酸配列を有するポリペプチドが提供される：ＬＧＴＦＷＧＤＴＬＮ  ＣＷＭＬＳＡＦＳＲＹ  ＡＲＣＬＡＥＧＨＤＧ  ＰＴＱ（配列番号：１）。この配列を有するポリペプチドは、本明細書においてＭＮＴＦ１  ３３−ｍｅｒと称される。
【０２２６】
この配列を含有する組換えタンパク質は、ＭＮＴＦ−１に対するモノクローナル抗体と反応し、運動ニューロンの生存率を維持し、神経突起の成長を増加し、運動ニューロンの細胞死／アポトーシスを減少し、運動ニューロンが、拡張した成長円錐を含有する軸索を有する、巨大な、活性ニューロンへと成長するおよび「広がる」ことを支持した。
【０２２７】
以下の実施例において使用するために、固相合成によりＭＮＴＦ１  ３３−ｍｅｒを合成した。このＭＮＴＦ−１分子は、以下「３３ｍｅｒ」と称される。低濃度のＲＡとともに用いられた場合に、直鎖状３３−ｍｅｒはＥＳ細胞の運動ニューロンへの分化を誘導した。さらに、ＭＮＴＦ１が誘導したＥＳ細胞の分化は、ソニックヘッジホッグシグナル伝達経路の阻害物質によってブロックされなかった。ＭＮＴＦ１  ３３−ｍｅｒを用いた胚様体の処理は、インスリン受容体（ＩＲ）および／またはインスリン様成長因子受容体（ＩＧＦ−Ｒ）の自己リン酸化と関連しており、ＭＮＴＦがＩＲ／ＩＧＦ−Ｒ媒介シグナル伝達経路を介して機能することを示唆した。
【０２２８】
本開示は、神経保護を行い、運動ニューロンの生存、維持および／または修復を促進する、または特定の場合において、幹細胞を運動ニューロンへと分化するＭＮＴＦ１の能力を保持する、ＭＮＴＦ１のペプチド類似体の使用を含む。本明細書に記載される使用のためのＭＮＴＦペプチド類似体は、典型的には６〜３３アミノ酸長であり、配列番号：１のアミノ酸残基１２〜１８に対応するＷＭＬＳＡＦＳドメイン（配列番号：３）、または配列番号：１のアミノ酸残基１７〜２２に対応するＦＳＲＹＡＲドメイン（配列番号：２）を含有してもよい。また、ＭＮＴＦペプチド類似体の特定の実施形態は、活性ドメイン（配列番号：２または３）を含有する配列番号：１の６〜３３個の連続するアミノ酸残基の断片を含む。
【０２２９】
代替の実施形態において、運動ニューロン栄養因子ペプチド類似体のアミノ酸配列は、ＢＬＡＳＴ解析によって決定されたように、配列番号：４の１０個の連続するアミノ酸残基に少なくとも６０％同一、配列番号：４の１０個の連続するアミノ酸残基に少なくとも７０％同一、配列番号：４の１０個の連続するアミノ酸残基に少なくとも８０％同一、配列番号：４の１０個の連続するアミノ酸残基に少なくとも９０％同一である。
【０２３０】
ポリペプチド配列を対応する配列番号：１断片と比較するために、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ上のｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から公的に入手可能であるＢＬＡＳＴプログラムを用いて、配列のグローバルアラインメントを行うことができる。グローバルアラインメントを行う前に、配列番号：１がＧｅｎＢａｎｋに提出されてもよい。国立バイオテクノロジー情報センターによって提供されるデフォルトのパラメータがグローバルアラインメントに用いられてもよい。
【０２３１】
１０−ｍｅｒ
【０２３２】
一実施形態において、次のアミノ酸配列を有するペプチドが提供される：配列番号：１のアミノ酸残基１３−２２に対応するＭＬＳＡＦＳＲＹＡＲ（配列番号：４）。例示的なＭＮＴＦ断片には、ＷＭＬＳＡＦＳドメインの大半およびＦＳＲＹＡＲドメイン全体を含んでもよい。この断片およびその変異体は、神経保護を行い、運動ニューロンの生存、維持および／または修復を促進する、または特定の場合において、幹細胞を運動ニューロンへと分化する、ＭＮＴＦ１の能力を保持する。
【０２３３】
ＭＮＴＦ１０ｍｅｒは、０．０１μｇ／ｍｌまでの低い濃度で、胚性幹細胞のインビトロでの運動ニューロンへの分化を刺激する際、少なくとも全長ＭＮＴＦ３３ｍｅｒと同じくらい効果的であった。また、ＭＮＴＦ１０ｍｅｒは、幹細胞由来運動ニューロンの生存を増進する際に、ほぼＭＮＴＦ３３ｍｅｒと同じくらい効果的であった。ＭＮＴＦ−１分子のこの部分は、以下「１０ｍｅｒ」と称される。
【０２３４】
６−ｍｅｒおよび類似体
【０２３５】
別の実施形態において、次のアミノ酸配列を有するペプチドが提供される：配列番号：１のアミノ酸残基１７−２２に対応するＦＳＲＹＡＲ（配列番号：２）。この断片およびその変異体は、神経保護を行い、運動ニューロン（幹細胞由来運動ニューロンを含む）の生存、維持および／または修復を促進する、ＭＮＴＦ１の能力を保持する。ＭＮＴＦ−１分子のこの部分は、以下「６ｍｅｒ」と称される。
【０２３６】
特定の実施形態において、ＭＮＴＦペプチド類似体は、６−ｍｅｒペプチドの配列または機能的類似体を含んでもよい。
【０２３７】
７−ｍｅｒ
【０２３８】
別の実施形態において、次のアミノ酸配列を有するペプチドが提供される：配列番号：１のアミノ酸残基１２−１８に対応するＷＭＬＳＡＦＳ（配列番号：３）。このＭＮＴＦ１の７個のアミノ酸断片は、ＦＳＲＹＡＲドメインのＦＳ残基と重複する。この断片およびその変異体は、神経保護を行い、運動ニューロン（幹細胞由来運動ニューロンを含む）の生存、維持および／または修復を促進する、ＭＮＴＦ１の能力を保持する。ＭＮＴＦ−１分子のこの部分は、以下「７ｍｅｒ」と称される。
【０２３９】
１１−ｍｅｒ
【０２４０】
別の実施形態において、次のアミノ酸配列を有するペプチドが提供される：配列番号：１のアミノ酸残基１７−２７に対応するＦＳＲＹＡＲＣＬＡＥ  Ｇ（配列番号：５）。ＭＮＴＦ１  １１−ｍｅｒはＦＳＲＹＡＲドメインを含有する。この断片およびその変異体は、神経保護を行い、運動ニューロン（幹細胞由来運動ニューロンを含む）の生存、維持および／または修復を促進する、ＭＮＴＦ１の能力を保持する。ＭＮＴＦ−１分子のこの部分は、以下「１１ｍｅｒ」と称される。
【０２４１】
２１−ｍｅｒ
【０２４２】
別の実施形態において、次のアミノ酸配列を有するペプチドが提供される：配列番号：１のアミノ酸残基１３−３３に対応するＭＬＳＡＦＳＲＹＡＲ  ＣＬＡＥＧＨＤＧＰＴ  Ｑ（配列番号：６）。このＭＮＴＦ１  ２１−ｍｅｒは、「ＷＭＬＳＡＦＳ」ドメインの大半およびＦＳＲＹＡＲドメイン全体を含有する。断片およびその変異体は、神経保護を行い、運動ニューロン（幹細胞由来運動ニューロンを含む）の生存、維持および／または修復を促進する、ＭＮＴＦ１の能力を保持する。ＭＮＴＦ−１分子のこの部分は、以下「２１ｍｅｒ」と称される。
【０２４３】
ＭＮＴＦペプチド類似体
【０２４４】
本明細書に記載される技術は、１つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたペプチド類似体の使用を含むことを理解されたい。１つの代替において、運動ニューロン栄養因子のペプチド類似体は、配列番号：１の６〜３２個の連続するアミノ酸残基に対して１つ以上の保存的アミノ酸置換を含有する。
【０２４５】
当然のことながら、通常、ペプチドの本質的な活性が実質的に変わらない限り、ＭＮＴＦペプチド類似体は、ＭＮＴＦペプチドの改変形態であってもよい。本明細書で用いられる「改変形態」という用語は、その自然発生による構造を変更するために処理されたペプチドを言う。改変形態は、例えば、ＭＮＴＦ１ペプチド断片を不溶性の支持マトリクスと架橋することによる、またはＭＮＴＦ１ペプチド断片を担体タンパク質と架橋することによる、ＭＮＴＦ１ペプチド断片の共有結合的な修飾によって調製することができる。
【０２４６】
ＭＮＴＦ１ペプチド類似体は、ＭＮＴＦ１ペプチド断片と抗原的に関連するペプチド断片であってもよい。抗原的に関連する２つのペプチドは、免疫学的な交差反応性を示す。例えば、第１のペプチドに対する抗体は、第２のペプチドも認識する。
【０２４７】
ＭＮＴＦ１ペプチド類似体は、異種のタンパク質に付着されたＭＮＴＦ１ペプチド断片を含有する融合タンパク質であってもよい。異種のタンパク質は、ＭＮＴＦ１ペプチド断片に実質的に類似していないアミノ酸配列を有する。異種のタンパク質は、ＭＮＴＦ１ペプチド断片のＮ末端またはＣ末端に融合されていてもよい。融合タンパク質には、これらに限定されないが、ｐｏｌｙ−Ｈｉｓ融合、ＭＹＣタグ付き融合、Ｉｇ融合、および酵素融合タンパク質（例えば、β−ガラクトシダーゼ融合）を含んでもよい。かかる融合タンパク質、特にｐｏｌｙ−Ｈｉｓ融合は、組換えＭＮＴＦ１ペプチド断片の精製を促進することができる。
【０２４８】
ＭＮＴＦペプチドのペプチド模倣物も、本明細書に記載される技術の範囲内であり、例えば、ＷＭＬＳＡＦＳ、ＦＳＲＹＡＲ、または配列番号：１〜１４２に記載される他のいずれの配列もしくは機能的ドメインを含むタンパク質の機能をブロックすることにより、神経細胞の生存率および成長を調節するための薬剤として作用することができる。医薬品産業において、ペプチド模倣物は、模倣されたペプチドの特性と類似する特性を有する非ペプチド薬剤を含むことは一般に理解される。ペプチド模倣物の設計の原理および実践は、当該技術分野において既知であり、例えば、Ｆａｕｃｈｅｒｅ  Ｊ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．１５：２９（１９８６）；およびＥｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９（１９８７）に記載される。
【０２４９】
治療的に有用なペプチドと構造的類似性を有するペプチド模倣物は、同等の治療または予防効果を生成するために用いることができる。典型的には、かかるペプチド模倣物は、任意選択的に連結部によって置き換えられた１つ以上のペプチド連結部を有し、インビボでの化学分解等の望ましい特性を変換してもよい。かかる連結部は、−ＣＨ２ＮＨ−−、−−ＣＨ２Ｓ−−、−−ＣＨ２−ＣＨ２−−、−−ＣＨ＝ＣＨ−−、−−ＣＯＣＨ２−−、−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−、および−−ＣＨ２ＳＯ−−を含んでもよい。ペプチド模倣物は、それらの治療薬としての使用を特に望ましくする、薬理学的特性（生物学的半減期、吸収率等）の強化、異なる特異性、安定化の増加、生産経済性、抗原性の低下等を示してもよい。
【０２５０】
モデル化された（または試験的に決定された）ペプチド構造に基づく、ＷＭＬＳＡＦＳ、ＦＳＲＹＡＲ、またはその他の類似するドメイン模倣物もしくは結合分子の合理的な設計は、合理的薬物設計の既知の方法を用いて当業者によって実行されてもよい。合理的薬物設計のゴールは、生物学的に活性なポリペプチドまたは標的化合物の構造的類似体を生成することである。かかる類似体を作製することで、天然の分子よりもより活性もしくは安定した、改変に対する異なる感受性を有する、または他の様々な分子の機能に影響を及ぼすことのできる、薬物を構築することが可能である。１つのアプローチにおいて、標的分子、またはその断片のための３次元構造を産生する。これは、Ｘ線結晶学、コンピュータモデル、または両方を組み合わせたアプローチによって、実現することができる。
【０２５１】
作製方法
【０２５２】
本開示のＭＮＴＦペプチド組成物は、これらに限定されないが、固相合成による化学合成およびＨＰＬＣを用いた化学反応物の他の生成物からの精製を含む当該技術分野において周知である方法によって、またはインビトロ翻訳系もしくは生細胞における、本明細書に記載されるＭＮＴＦペプチドを含むペプチドもしくはポリペプチドをコードする核酸配列（例えば、ＤＮＡ配列）の発現による生成によって、作製されてもよいことを理解されたい。上記組成物のＭＮＴＦペプチドは、単離されて１つ以上の望ましくない低分子量分子を除去するために大規模に透析されてもよいか、および／または望ましいビヒクル内により容易に使用できる製剤となるよう凍結乾燥されてもよい。ＭＮＴＦペプチド成分中で作製されるさらなるアミノ酸、突然変異、化学修飾等がある場合には、ＭＮＴＦドッキング配列の受容体認識を実質的に妨害するべきではないことをさらに理解されたい。
【０２５３】
ＭＮＴＦ１の１つ以上の断片に対応するペプチドまたはポリペプチドは、通常、少なくとも６アミノ酸残基の長さであるべきであり、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１５、約２０または約３０個くらいまでの残基を含有してもよい。ペプチド配列は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）から入手可能な自動化ペプチド合成機を用いたペプチド合成等、当業者に既知の方法によって合成されてもよい。本明細書に記載される技術は、配列番号：１〜１４２に由来する環状ペプチドの合成および使用を含む。
【０２５４】
標的とするアミノ酸残基を、選択された側鎖または末端残基と反応する能力を持つ有機誘導体化剤と反応させることにより、ペプチドに共有結合的修飾を導入することができる。有機誘導体化剤を用いたポリペプチドの共有結合的修飾は、当業者には周知である。例えば、システイニル残基を、クロロ酢酸またはクロロアセトアミド等のα−ハロアセテート（および対応するアミン）と反応させて、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を生じさせることが可能である。ヒスチジル残基は、ジエチルピロカーボネート（ｐＨ５．５〜７．０）との反応により、または１Ｍカコジル酸ナトリウム中のパラ−ブロモフェナシルブロミド（ｐＨ６）との反応により、誘導体化させることができる。リシニル（ｌｙｓｉｎｙｌ）およびアミノ末端残基は、コハク酸またはその他のカルボン酸無水物と反応させることができる。アルギニル残基は、１つまたはいくつかの従来型試薬、中でも、フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリンとの反応により修飾することができる。芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応により、スペクトルレベルをチロシル残基に導入することができる。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミダゾールおよびテトラニトロメタンが、それぞれ０−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体を形成するために用いられる。カルボキシル側鎖（アスパルチルまたはグルタミル）は、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−（４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３（４アゾニア４，４−ジメチルフェニル）カルボジイミド等のカルボジイミド（Ｒ´−Ｎ−Ｃ−Ｎ−Ｒ´）との反応により、選択的に修飾することができる。さらにアスパルチルおよびグルタミル，残基は、アンモニウムイオンとの反応により、アスパラギニルおよびグルタミニル残基に変換される。グルタミルおよびアスパラギニル残基は、対応するグルタミルおよびアスパルチル残基に脱アミドすることができる。他の修飾は、プロリンおよびリジンの水酸化、セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９８３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ．７９−８６）、Ｎ末端アミンのアセチル化を含み、ある場合においては、Ｃ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
【０２５５】
本明細書に記載されるＭＮＴＦペプチド類似体は、遊離形態またはタンパク質もしくは固体粒子等の担体分子に結合された状態のいずれか、および標識またはトレーサー（例えば、ビオチンまたはフルオレセインイソチオシアネート）に結合する修飾されたペプチドとして、アッセイまたはアッセイ用のキットにおいて用いることができる。
【０２５６】
ＭＮＴＦ１のペプチド断片の水不溶性支持マトリクスとの架橋は、１，１ビス（ジアゾアセチル）２フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシこはく酸イミドエステル（例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル）、３，３’−ジチオビス（サクシニミジルプロピオネート）等の酸ジサクシンイミジルエステルを含むホモ二機能性イミドエステル、およびビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタン等の二機能性マレイミドを含む、当該技術分野で既知である二機能性試薬を用いて行うことができる。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデート等の二機能性試薬は、光の存在下において架橋を形成する能力を持つ、光で活性化され得る中間体をもたらす。代替として、臭化シアンによって活性化した炭水化物等の反応性水不溶性マトリクスが、タンパク質の固定化に用いられてもよい。
【０２５７】
ＭＮＴＦ１ペプチド断片の第２のタンパク質（第２のＭＮＴＦ１ペプチド断片を含む）への架橋は、本明細書に記載される二機能性試薬を用いて行うことができる。別の代替において、例えば、ジチオール基またはジアミノ基または複数のアミノ酸残基（例えば、グリシン）等のスペーサーが挿入される。スペーサーは、ホモまたはヘテロの二機能性架橋剤、例えば、ヘテロ二機能性架橋剤Ｎ−（４−カルボキシ−シクロヘキシル−メチル）−マレイミドであってもよい。
【０２５８】
長めのペプチドまたはポリペプチド（例えば、融合タンパク質）は、標準的な組換えＤＮＡ技術によって生成することができる。例えば、ＭＮＴＦ１ペプチド断片をコードするＤＮＡ断片は、既に異種のタンパク質を含有する商業的に入手可能な発現ベクターにクローン化することができ、その結果、ＭＮＴＦ１ペプチド断片はフレーム内で異種のタンパク質に融合される。
【０２５９】
特定の実施形態において、ＭＮＴＦ１ペプチドおよび／または本明細書に記載される成分をコードする核酸は、例えば、本明細書に記載される様々な組成物および方法のために、ペプチドをインビトロまたはインビボで生成するために用いられてもよい。例えば、特定の実施形態において、ＭＮＴＦ１ペプチドをコードする核酸は、例えば、組換え細胞中のベクターの成分である。核酸は、ＭＮＴＦ１ペプチド配列を含むペプチドまたはポリペプチドを生成するために発現されてもよい。ペプチドまたはポリペプチドは、細胞から分泌されてもよく、または細胞の一部としてもしくは細胞内で分泌されてもよい。
【０２６０】
化合物のスクリーニング
【０２６１】
別の実施形態において、ＭＮＴＦペプチドまたはＭＮＴＦペプチドの細胞内シグナル伝達経路に関与する部分の発現レベルを変更する化合物が同定される。特定の実施形態において、これらの化合物は、本明細書に記載される様々な神経障害の治療を標的とする。
【０２６２】
神経保護のアゴニストおよびアンタゴニストを識別することができ、その後に行われる本明細書に記載されるおよび当該技術分野で既知である神経細胞を用いた試験により、化合物の有効性を評価することができる。
【０２６３】
本明細書に記載されるスクリーニング手順によって同定される化合物はさらに識別することができ、当該技術分野において容認される動物細胞培養物の疾患および障害モデル系において神経細胞障害を治療する能力に基づいて、該化合物の有効性を評価することができる。
【０２６４】
化合物および天然抽出物の信頼性を試験する多くの薬物スクリーニングアッセイにおいて、調査する化合物の数を一定期間内に最大化するためにはハイスループットアッセイが望ましい。精製されたまたは部分的に精製されたタンパク質に由来してもよい無細胞系において実施されるアッセイは、試験化合物に媒介される分子標的内の変化を急速に生じさせて、比較的容易に検出できるように産生することが可能なので、「主要な（ｐｒｉｍａｒｙ）」スクリーンとして用いられることが多い。さらに、通常、インビトロ系においては、試験化合物の細胞毒性の影響および／または生物学的利用率は無視することができるため、主にアッセイの焦点は、受容体タンパク質との結合親和性の変化に顕在する薬物の分子標的に対する影響に合わせられる。
【０２６５】
よって、別の態様において、運動ニューロンの成長または生存を促進するために有用な化合物を同定する方法が提供される。一実施形態において、当該方法は、ｉ）候補化合物を含むサンプルを調製するステップ、ｉｉ）細胞を上記サンプルと接触させるステップ、ｉｉｉ）シグナル伝達経路に関与する化合物の発現または活性が調節されたかどうかを決定するステップ、およびｉｖ）上記細胞が運動ニューロンの成長または生存を促進する能力を持つかどうかを決定するステップを含みる。特定の実施形態において、当該方法は、候補化合物を含むサンプルがインスリン受容体のＴｙｒ９７２およびＴｙｒ１１６２／１１６３の自動リン酸化をインビトロまたはインビボで刺激するかどうかを決定するステップをさらに含む。他の実施形態において、当該方法は、候補化合物を含むサンプルが、ＭＮＴＦ信号伝達経路を制御するかどうかを決定するステップをさらに含む。他の実施形態において、当該方法は、候補化合物を含むサンプルが、インスリン受容体、ＩＧＦ−１受容体、ＩＧＦ−２受容体、Ｓｈｈ、Ａｋｔ、Ｂａｄ（細胞死のｂｃｌ−２アンタゴニスト）、ＰＩ（３、４、５）Ｐ３−依存キナーゼ１（ＰＤＫ１）、Ｂａｘ、ｐ５３遺伝子産物、ｐｐ６０−Ｓｒｃ、ＪＡＫ２、一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３（ＧＳＫ）、カスパーゼ、ＰＩ３キナーゼ（ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ）、およびＲａｓから選択される１つ以上のタンパク質の発現または活性を調節するかどうかを決定するステップをさらに含む。他の実施形態において、当該方法は、候補化合物を含むサンプルが、ＭＮＴＦ類似体によって制御されるかどうか、または代替的にＭＮＴＦ類似体によって制御されるかどうか（例えば、活性、発現等）を決定するステップをさらに含む。別の態様において、本明細書に記載される技術は、本明細書に記載されるスクリーニング手順を用いて同定される化合物を投与することにより、神経細胞障害の治療のために運動ニューロンの成長または生存を促進する方法を含む。
【０２６６】
例示的なスクリーニングアッセイでは、通常ＭＮＴＦペプチドを結合することができる条件下において、該当するタンパク質を、ＭＮＴＦ結合タンパク質（例えば、ＭＮＴＦペプチド受容体を発現する細胞）とＭＮＴＦペプチドとを含む混合物に接触させる。その混合物に、試験化合物を含有する組成物を加える。受容体／ＭＮＴＦペプチド複合体の検出および定量化は、受容体タンパク質とＭＮＴＦペプチドとの複合体形成を阻害する（または増強する）際の試験化合物の有効性を決定するための手段を提供する。単離および精製されたＭＮＴＦペプチドを受容体タンパク質に加え、試験化合物の不在下において受容体／ＭＮＴＦペプチド複合体の形成を定量化するコントロールアッセイも、比較のためのベースラインを提供するために行うことができる。
【０２６７】
ＭＮＴＦペプチドとＭＮＴＦペプチドとの複合体形成は、様々な技術によって検出されてもよい。例えば、複合体形成の調節は、例えば、放射標識された、蛍光で標識された、または酵素的に標識されたＭＮＴＦペプチド等の検出可能に標識されたタンパク質を用いて、イムノアッセイによって、またはクロマトグラフィーによる検出によって、定量化することができる。無細胞アッセイでは、典型的には、タンパク質のうちの１つの非複合体形態からの受容体／ＭＮＴＦペプチド複合体の分離を促進するため、およびアッセイの自動化を図るために、ＭＮＴＦペプチドまたはＭＮＴＦペプチド結合タンパク質のいずれかを固定化することが望ましい。例えば、タンパク質がマトリクスに結合することを可能にするドメインを加える融合タンパク質が提供されてもよい。例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ／受容体（ＧＳＴ／受容体）融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上で吸収されてもよく、その後ＭＮＴＦペプチド（例えば、３５Ｓ−標識化ＭＮＴＦペプチド）および試験化合物と組み合わされ、複合体形成を助長する条件下（例えば、塩およびｐＨのための生理的条件で）においてインキュベートされるが、わずかによりストリンジェントな条件であるのが望ましい場合がある。インキュベーション後、あらゆる非結合ＭＮＴＦペプチドを除去するためにビーズを洗浄して、マトリクスビーズに結合させた放射標識が、直接的に（例えば、シンチラントに留置したビーズ）、または受容体／ヘッジホッグ複合体が解離された後で上清中に決定した。代替として、複合体をビーズから解離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用いて分離して、ビーズ断片中に見られるＭＮＴＦペプチドのレベルを標準的な電気泳動技術を用いて定量化してもよい。
【０２６８】
マトリクス上でタンパク質を固定化するための他の技術も、対象とするアッセイにおいて用いるために利用可能である。例えば、ＭＮＴＦペプチドタンパク質の可溶性タンパク質は、ビオチンとストレプトアビジンの結合を利用して固定化することができる。例えば、ビオチン化された受容体分子は、当該技術分野において周知の技術（ビオチン化キット、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ）を用いてビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−コハク酸イミド）から調製し、ストレプトアビジンでコーティングした９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）内に固定化することができる。代替として、ＭＮＴＦペプチドには反応するがヘッジホッグ結合を妨害しない抗体は、プレートのウェル、および抗体結合によってウェル内に閉じ込められた受容体に誘導体化されてもよい。上記のように、ＭＮＴＦペプチドと試験化合物の調製物を、プレートの受容体が存在するウェル内でインキュベートして、ウェル内に閉じ込められた受容体／ヘッジホッグ複合体の量を定量化することができる。ＧＳＴ固定化複合体について上述した方法の他に、かかる複合体を検出するための例示的な方法には、ＭＮＴＦペプチドに反応する抗体、または受容体タンパク質に反応してＭＮＴＦペプチドとの結合において競合する抗体を用いた複合体の免疫検出、およびＭＮＴＦペプチドと関連する酵素活性の検出に依存する酵素結合アッセイを含む。後者の場合、酵素は化学的に結合されてもよいか、またはＭＮＴＦペプチドとの融合タンパク質として提供されてもよい。例を挙げると、ＭＮＴＦペプチドは化学的に架橋されてもよいか、または遺伝子的にアルカリホスファターゼと融合されてもよく、複合体中に閉じ込められたＭＮＴＦペプチドの量は、酵素（例えば、パラニトロフェニルリン酸）の発色基質で評価することができる。同様に、ＭＮＴＦペプチドとグルタチオンＳ−トランスフェラーゼとを含む融合タンパク質を提供することも可能であり、１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼンを用いてＧＳＴ活性を検出することにより、複合体形成を定量化することができる（Ｈａｂｉｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２４９：７１３０（１９７４））。複合体中に閉じ込められたタンパク質のうちの１つを定量化するための免疫検出には、抗ＭＮＴＦペプチド抗体等のタンパク質に対する抗体を用いてもよい。代替として、複合体中に検出されるべきタンパク質は、融合タンパク質の形態をとる「エピトープタグ付き」であってもよく、それには、ＭＮＴＦペプチドまたはＭＮＴＦペプチド配列の他に、抗体が容易に入手できる（例えば、販売元から）第２のポリペプチドを含む。例えば、上述のＧＳＴ融合タンパク質は、ＧＳＴ部分に対する抗体を用いた結合の定量化のためにも用いることができる。その他の有用なペプチドタグには、ｃ−ｍｙｃからの１０残基配列を含むｍｙｃ−ペプチド（例えば、Ｅｌｌｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６６：２１１５０−２１１５７（１９９１）を参照）、およびｐＦＬＡＧ系（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）またはｐＥＺＺ−タンパク質Ａ系（Ｐｈａｒａｍａｃｉａ，Ｎ．Ｊ．）を含む。
【０２６９】
組成物
【０２７０】
医薬組成物には、本明細書に開示される１つ以上のＭＮＴＦペプチド類似体とともに、医薬的に許容される希釈剤および／または担体を含んでもよい。好適な担体／希釈剤は当該技術分野において周知であり、任意選択的に緩衝塩および保存剤、またはその糖、デンプン、塩もしくはそれらの混合物等の追加成分を含む、生理食塩水またはその他の無菌の水性培地を含む。
【０２７１】
ＭＮＴＦペプチドを含有する組成物は、投与のプロトコルおよび／または患者の必要性に適切である任意の好適な形態における使用のために提供されてもよい。
【０２７２】
本明細書に記載される技術は、幹細胞、神経前駆体細胞、分化した神経細胞、および幹細胞由来運動ニューロンを確立および増殖するために有用な培養培地を含む。該培地は、該幹細胞の分化および幹細胞由来運動ニューロンの長期培養に特に好適である。
【０２７３】
細胞培養培地は、望ましくはモルフォゲンおよび／または成長因子で補充され、培養されるのに望ましい個別の細胞種に従って最適化される。かかる補充および最適化は、通常の当該技術の範囲内である。いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、以下のモルフォゲンおよび／または成長因子のうちのいずれかまたはすべてを用いて、以下の適切なレベルで（または有効数字以下で）補充されてもよい：０．００１〜１μＭのＲＡ、０．００１〜１μＭのＳｈｈもしくはＳｈｈアゴニスト、および／または０．０１〜２５０μｇ／ｍｌの１つ以上のＭＮＴＦペプチド類似体。
【０２７４】
本明細書に記載される医薬製剤は、任意選択的な成分として、医薬的に許容される担体、希釈剤、可溶化剤または乳化剤、および当該技術分野で入手可能な種類の塩を含んでもよい。かかる物質の例には、生理的に緩衝された生理食塩溶液および水等の生理食塩溶液を含む。医薬製剤において有用な担体および／または希釈剤の特定の制限されない例には、水およびリン酸緩衝生理食塩溶液（ｐＨ７．０〜８．０）等の生理的に許容される緩衝生理食塩溶液を含む。好適な医薬担体には、これらに限定されないが、滅菌水、塩類溶液（リンゲル液等）、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロースまたはデンプン等の炭水化物、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等を含む。医薬調製物は滅菌され、所望に応じて、例えば、滑沢剤、保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼすための塩、緩衝剤、着色剤、および／または活性化合物と有害に反応しない芳香族物質等の補助剤と混合される。それらは、所望に応じて、代謝分解を低下させるために、他の活性物質（例えば、酵素阻害剤）と組み合わされてもよい。
【０２７５】
本明細書において提供される化合物は、ペプチドの他に、医薬的に許容される担体、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、保存剤、表面活性剤、中性脂質またはカチオン脂質、脂質複合体、リポソーム、浸透促進剤、担体化合物およびその他の医薬的に許容される担体もしくは賦形剤等を含む可能性がある医薬組成物中に処方されてもよい。
【０２７６】
通常、医薬組成物は、治療目的で投与されるために処方される。医薬組成物は、インターフェロン、抗菌剤、抗炎症剤、麻酔剤等の１つ以上の活性成分を含んでもよい。非経口投与のための製剤は、緩衝剤、リポソーム、希釈剤およびその他の好適な添加剤を含有する可能性がある無菌水溶液を含んでもよい。本明細書において提供されるペプチドを含む医薬組成物は、ペプチドの消化運搬を促進するために浸透促進剤を含んでもよい。浸透促進剤は、５つの広義のカテゴリー、すなわち、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート化剤、界面活性剤および非界面活性剤のうちの１つに属すると分類することができる（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ８，９１−１９２（１９９１）；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ７，１−３３（１９９０））。これらの広義のカテゴリーのうちの１つ以上からの１つ以上の浸透促進剤が含まれてもよい。
【０２７７】
様々な脂肪酸および浸透促進剤として作用するそれらの誘導体には、例えば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸、トリカプリン酸、リシノール酸、モノオレイン（１−モノオレオイル−ｒａｃ−グリセロールとしても知られる）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセリル１−モノカプリン酸、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン（ａｃｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓ）、モノグリセリドおよびジグリセリドならびに生理的にそれらの許容される塩（すなわち、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸等．）を含む。（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｐａｇｅ  ９２（１９９１）；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ７，１（１９９０）；Ｅｌ−Ｈａｒｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４４，６５１−６５４（１９９２））。
【０２７８】
胆汁の生理的な役目には、脂質および脂溶性ビタミンの分散および吸収の促進が含まれる（Ｂｒｕｎｔｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ３８  Ｉｎ：Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，９ｔｈ  Ｅｄ．，Ｈａｒｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｐａｇｅｓ  ９３４−９３５（１９９６））。様々な天然の胆汁酸塩およびそれらの合成誘導体は、浸透促進剤として作用する。よって、「胆汁酸塩」という用語には、胆汁のあらゆる自然に発生する成分およびそれらのあらゆる合成誘導体を含む。
【０２７９】
１つ以上の浸透促進剤を含む複合体製剤が用いられてもよい。例えば、胆汁酸塩は、複合体製剤を作製するために脂肪酸と組み合わせて用いることができる。キレート化剤には、これらに限定されないが、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、クエン酸、サリチル酸（例えば、サリチル酸ナトリウム、５−メトキシサリチル酸およびホモバニレート（ｈｏｍｏｖａｎｉｌａｔｅ））、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、ラウレス−９、およびβ−ジケトンのＮ−アミノ−アシル誘導体（エナミン）を含む［Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｐａｇｅ  ９２（１９９１）；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ７，１−３３（１９９０）；Ｂｕｕｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅ．１４，４３−５１（１９９０））。キレート化剤は、デオキシリボヌクレアーゼ阻害剤としての役割も果たすという付加的利点を有する。
【０２８０】
界面活性剤には、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテルおよびポリオキシエチレン−２０−セチルエーテル（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｐａｇｅ  ９２（１９９１））、およびＦＣ−４３（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｍａｃｏｌ  ４０，２５２−２５７（１９８８））等の全フッ素置換化合物乳濁液を含む。非界面活性剤には、例えば、不飽和環状尿素、１−アルキル−および１−アルケニルアザシクロ−アルカノン誘導体（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｐａｇｅ  ９２（１９９１））、およびジクロフェナクナトリウム、インドメタシンおよびフェニルブタゾン等の非ステロイド系抗炎症剤（Ｙａｍａｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ３９，６２１−６２６（１９８７））を含む。
【０２８１】
典型的な医薬的に許容される担体には、これらに限定されないが、結合剤（例えば、予めゼラチン化されたトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース等）、充填剤（ラクトースおよび他の糖、微結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリル酸又はリン酸水素カルシウム等）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、金属ステアリン酸塩、水素化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム等）、崩壊剤（例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウム等）、または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム等）を含む。
【０２８２】
本明細書において提供される組成物は、医薬組成物中に慣習的に見出される他の補助的成分を、それらの技術上確立された使用レベルでさらに含有することができる。よって、例えば、組成物は、適合性のある医薬的に活性な物質、例えば、鎮痒薬、収斂薬、局所麻酔もしくは抗炎症剤等をさらに含有してもよく、または、着色料、香味剤、保存剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤および安定化剤等、本明細書に記載される組成物の様々な剤形を物理的に処方するために有用なさらなる物質を含有してもよい。しかしながら、かかる物質は、加えられた時に、本明細書に提供される組成物の成分の生物学的活性を過度に妨害してはならない。
【０２８３】
化合物が患者に導入される方法に関係なく、ペプチドのインビボでの安定性を促進するために、および／またはペプチドを特定の器官、組織もしくは細胞種に標的化するために、コロイド状分散系が送達ビヒクルとして用いられてもよい。コロイド状分散系には、これらに限定されないが、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、および水／油エマルジョン、ミセル、混合ミセル、リポソームおよび特徴のない構造の脂質−ペプチド複合体を含む脂質系を含む。コロイド状分散系の一例は、複数のリポソームである。リポソームは、二層構成に配置された脂質からできた１つ以上の外層に囲まれた水性コアを有する顕微鏡レベルの球体である（一般に、Ｃｈｏｎｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．６，６９８−７０８（１９９５）を参照）。
【０２８４】
特定の実施形態において、ＭＮＴＦペプチドまたはＭＮＴＦ類似体または本明細書において提供される他の化合物の体内分布を所望の標的の近くに方向付けるために、またはその持続的放出を可能にするために、ＭＮＴＦペプチドおよびＭＮＴＦ類似体は、１つ以上のポリマーを含む体内分布指向部分（ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｄｉｒｅｃｔｉｎｇ  ｍｏｉｅｔｙ）に組み入れられても、またはそれと組み合わせて用いられてもよい。活性物質には、例えば、治療効果を高めるために、体内分布および生物学的利用率を最適化するために、組織損傷を低減するために、治癒を促進するために、または患者の快適さを増すために、有用な化合物を含む。例示的な活性物質には、血管作動性物質、麻酔剤、虚血の治療剤、成長因子およびサイトカインを含む。代替として、微粒子またはナノ粒子ポリマービーズの剤形が、本明細書に提供される組成物において用いられてもよい。本明細書に提供される化合物は、活性物質と組み合わせて用いられ、それに付着する多数のリガンドまたは抗リガンド分子を有する粒子剤形中に封入されてもよい。
【０２８５】
この様式において、単独または他の活性物質と組み合わされた、ＭＮＴＦペプチドおよびＭＮＴＦ類似体ならびに本明細書で提供される他の化合物は、その部位において経時的に持続する治療効果を提供するために放出される。持続する放出剤形は、成長因子、サイトカイン等の本明細書に記載される方法において有用なその他の活性物質に関しても有用である。粒子剤形からの活性物質の放出は、核酸および粒子マトリクスの侵食の両方の結果として起こる可能性がある。生分解速度は、活性物質放出動態に直接的な影響を及ぼす。
【０２８６】
特定の実施形態において、ＭＮＴＦペプチド、ＭＮＴＦ類似体、および本明細書に記載される化合物の制御放出の非経口製剤は、移植片、油性注射剤として、または粒子系として作製することができる。粒子系には、ミクロスフェア、微小粒子、マイクロカプセル、ナノカプセル、ナノ球体、およびナノ粒子を含む。マイクロカプセルは、治療タンパク質を中核として含有する。ミクロスフェアにおいて、治療薬は粒子中に分散される。リポソームは、制御放出および閉じ込められた薬物の薬物標的化のために用いることができる。
【０２８７】
特定の実施形態において、ＭＮＴＦペプチドおよびＭＮＴＦ類似体を含む本明細書に記載される医薬組成物は、局在的に、局所的に、経鼻的に、経口的に、経消化管的に、気管支内に、膀胱内に、膣内に、子宮内に、皮下に、筋肉内に、関節周囲に、関節内に、脳脊髄液（ＩＣＳＦ）内に、脳組織内に（例えば、頭蓋内投与）、脊髄内に、創傷内に、腹腔内もしくは腹膜内に、または全身に（例えば、静脈内に、動脈内に、門脈内または直接器官に）投与することができる。
【０２８８】
当該技術分野で既知であるように、冠内送達を達成するために多様なカテーテルおよび送達経路を用いることができる。例えば、様々な汎用性カテーテル、および本明細書に記載される使用に好適であるように変更されたカテーテルが、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  （ＡＣＳ）、Ｔａｒｇｅｔ  ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓおよびＣｏｒｄｉｓ等の販売供給者から入手可能である。また、当該技術分野で既知であるように、冠動脈に直接注射することにより心筋への送達が達成される場合、冠動脈にカテーテルを導入するために多くのアプローチを用いることができる。例として、カテーテルは大腿動脈に都合よく導入され、腸骨動脈および腹部大動脈を逆方向に通されて冠動脈に入る。代替として、カテーテルは、最初に上腕動脈または頚動脈に導入され、冠動脈まで逆行して通されてもよい。これらの詳細な説明およびその他の技術は、当該技術分野において見出すことができる（例えば、Ｔｏｐｏｌ，ＥＪ（ｅｄ．），Ｔｈｅ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎａｌ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  Ｅｄ．（Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．１９９４）；Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ，Ｒ  Ｂ，Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｓｕｒｇｅｒｙ，３ｒｄ  Ｅｄ．（Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．１９８９）；Ｗｙｎｇａａｒｄｅｎ  Ｊ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ  Ｃｅｃｉｌ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９ｔｈ  Ｅｄ．（Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ，１９９２）；およびＳａｂｉｓｔｏｎ，Ｄ，Ｔｈｅ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｅｒｙ，１４ｔｈ  Ｅｄ．（Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．１９９１）を参照）。
【０２８９】
本明細書において提供される化合物は、非経口的に投与されてもよい。特定の化合物は、医薬組成物を生成するために医薬的に許容される担体または希釈剤と組み合わされる。好適な担体および希釈剤には、等張性の生理食塩溶液、例えば、リン酸緩衝食塩水を含む。組成物は、非経口、筋肉内、脳内、静脈内、皮下、または経皮投与のために処方されてもよい。投与される製剤はかかる薬剤を含有してもよい。これらの薬剤の例には、カチオン剤（例えば、リン酸カルシウムおよびＤＥＡＥ−デキストラン）およびリポフェクション剤（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｎｔｓ）（例えば、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（登録商標）およびトランスフェクタム（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ）（登録商標））を含む。
【０２９０】
局所投与のための製剤は、経皮パッチ、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、ドロップ剤、座薬、スプレー剤、液剤および散剤を含んでもよい。従来の医薬担体、水性、粉末または油性の基剤、増粘剤等は必要であるかまたは望ましい場合がある。コーティングされた手袋、コンドーム等も有用である可能性がある。経口投与のための組成物は散剤または顆粒剤、水または非水性培地中の懸濁剤または溶液、カプセル剤、サシェ剤または錠剤を含む。増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤または結合剤が望ましい可能性がある。非経口投与のための組成物は、緩衝剤、希釈剤およびその他の好適な添加剤を含む無菌水溶液を含んでもよい。ある場合においては、治療計画の有効性を高めるために、ペプチドとその他の従来の治療モダリティーを合わせて患者を治療することがより効率的である場合がある。本明細書で用いられる場合、「治療計画」という用語は、治療、対症療法および予防モダリティーを包含することを意味する。
【０２９１】
投薬は、治療されるべき疾患状態の重症度および応答性、および数日から数ヶ月まで、または治癒がもたらされるもしくは疾患の状態の軽減が達成されるまで続く治療経過を含む、数多くの要因に依存する。本明細書において提供される化合物の毒性および治療有効量は、細胞培養物または実験動物における標準的な製薬手順により決定することができる。例えば、ＬＤ５０（集団における５０％致死量）および（集団における治療上の５０％有効量）を決定するためである。毒性と治療効果の用量比は治療係数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比で表すことができる。高い治療係数を示す化合物が有用である。毒性副作用を示す化合物が使用されてもよいが、非感染細胞への潜在的な損傷を最小限に抑え、それにより副作用を低減するために、かかる化合物を患部組織の部位へと標的化する送達系を設計する際には注意を払う必要がある。
【０２９２】
細胞培養アッセイおよび動物試験から取得したデータは、ヒトにおける使用のための様々な用量を処方するために用いることができる。かかる化合物の用量は、わずかな毒性があるかまたは無毒性である、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内であるべきである。用量は、用いられる剤形および用いられる投与経路に依存して変化してもよい。本明細書に記載される通りに使用されるいずれの化合物についても、細胞培養アッセイから治療上の有効量を推測することが可能である。用量は、細胞培養物において決定されるＩＣ５０（すなわち、症状の半分の阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度の範囲を達成するように動物にモデルにおいて処方されてもよい。かかる情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために用いることができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定されてもよい。投薬スケジュールは、患者の体内における薬物の蓄積の測定値から計算することができる。用量は、ＭＮＴＦペプチドおよびＭＮＴＦ類似体を含む個々の化合物の相対的な作用強度に依存して変化してもよく、通常、インビトロで、およびインビボの動物モデルにおいて効果的であるとみなされたＥＣ５０に基づいて推定することができる。当業者は、どのようにおよびどこでＭＮＴＦペプチドが投与されるか（例えば、インビトロ、インビボ、局所的に、全身に等）に依存して用量が変化することを理解するであろう。
【０２９３】
例えば、一態様において、ＭＮＴＦペプチドおよびＭＮＴＦ類似体は、１ｍｌあたり約０．０１マイクログラム（μｇ／ｍＬ）〜１ｍｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍＬ〜約５０μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ〜約１５０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ〜約２００μｇ／ｍＬ、および約０．１μｇ／ｍＬ〜約５００μｇ／ｍＬ（標的部位（例えば、ＥＳ幹細胞の細胞培養物中）での最終濃度として、これらの範囲内の任意の範囲を含む）を達成するために投与されてもよい。
【０２９４】
代替として好適な用量は、投与経路に依存して、例えば、約０．１μｇから合計用量約１グラムまで変化してもよい。具体的な用量および送達方法に関しての指針は文献に提供されており、通常は当該技術分野における実践者に入手可能である。当業者は、ヌクレオチドには、タンパク質またはそれらの阻害物質とは異なる処方を用いるであろう。同様に、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、および本明細書において提供される化合物の送達は、特定の細胞、状態、および位置に特異的である。一般に、用量は０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／体重ｋｇ、またより典型的には、例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ〜３００ｍｇ／体重ｋｇの範囲であり、毎日、毎週、毎月、もしくは毎年１回以上、または２〜２０年の期間に渡って１回以上与えられてもよい。特定の実施形態において、投薬は手術直後から２４時間以内に行われてもよく、別の実施形態においては、投薬は２時間から２４時間までの間に行われる。長時間作用性の組成物は、特定の製剤の半減期およびクリアランス速度に依存して、３〜４日ごと、毎週、または隔週で投与されてもよい。当業者は、測定された薬物の体液または組織内での常在時間および濃度に基づいて、投薬を繰り返す割合を容易に推定できる。治療の成功に続いて、疾患の再発を防ぐために、患者に維持療法を受けさせることが望ましい場合がある（選択された化合物が０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／体重ｋｇ、１日１回以上〜２０年ごとに１回以上の範囲内の維持量で投与される）。特定の状態の治療または防止において、一般に適切な用量レベルは約０．００１〜１００ｍｇ／患者の体重ｋｇ／日であり、単一または複数回の用量で投与することができる。好適な用量レベルは、約１〜約４０ｍｇ／ｋｇ／日であってもよい。特定の実施形態において、ＭＮＴＦペプチドおよびＭＮＴＦペプチド類似体を含む本明細書に提供される化合物は、約１マイクロモル〜約１マイクロモル、約１０マイクロモル〜約５００マイクロモル、または約３０マイクロモル〜約３００マイクロモル、および約２５マイクロモル〜約３００マイクロモルの損傷部位における最終濃度、および約２５マイクロモル、または約１６０マイクロモル、または約３００マイクロモルの損傷部位における最終濃度、またさらにより典型的には約１マイクロモル〜約１００マイクロモルの間のインビボ濃度を実現するための量で、投与される。
【０２９５】
特定の実施形態において、１、５、１０、２０、５０、１００、１５０、または２００ｍｇ／ｋｇの用量が投与されてもよい。
【０２９６】
本明細書に記載される化合物は、診断法、治療法、予防法、研究試薬およびキットにおいて用いることができる。該当する化合物（例えば、ＭＮＴＦペプチドおよびＭＮＴＦ類似体）を検出するための手段の提供は、ルーチン的に実現することができる。かかる提供には、酵素結合、放射標識、または他のいずれの好適な検出系を含んでもよい。該当する化合物の有無を検出するためのキットも調製することができる。
【０２９７】
本明細書で用いられる場合、脊髄傷害は、腫瘍、機械的外傷、および化学的外傷に起因する損傷を含んでもよい。同じまたは類似する方法は、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、または脊髄傷害に罹患する対象において運動機能を回復させることが企図される。
【０２９８】
特定の実施形態において、ＭＮＴＦ類似体のうちの１つを投与することは、予防的機能も提供する。かかる投与は、対象におけるまたは筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、もしくは脊髄傷害に罹患する恐れのある対象において、運動機能を保存する効果を有する。
【０２９９】
特定の実施形態において、ＭＮＴＦ類似体の投与は、ＭＮＴＦ経路の完全性を保つ。
【０３００】
特に、脊髄傷害、神経変性疾患、脳卒中もしくは脳虚血、ハンチントン病、パーキンソン病、多発性硬化症、ＡＬＳ、アルツハイマー病、および糖尿病性神経障害を治療する（症状の前または後に）ための方法は、配列番号：１〜１４２からなる群から選択されるＭＮＴＦペプチド類似体を投与するステップを含む。
【０３０１】
特定の態様において、組成物および、損傷した経路を修復するステップ、またはさらなる損傷を阻害するステップを含む、神経経路への損傷時、またはかかる損傷が見込まれる時に、神経経路を維持するために十分な時間および濃度で本明細書に定義されるように治療的有効量のＭＮＴＦ類似体タンパク質を患者に投与するステップを含む治療的な処置法が提供される。
【０３０２】
別の態様において、本明細書に記載される技術は、神経経路を維持するための組成物および治療的な処置法を含む。かかる治療的な処置法には、神経経路への損傷時、またはかかる損傷が見込まれる時に、内在するＭＮＴＦの治療的に有効な濃度を刺激する化合物を患者に投与することを含む。
【０３０３】
本明細書に記載される態様および実施形態は、神経傷害に対する身体の免疫および炎症応答に関連する組織破壊の影響からニューロンを保護するための方法を提供する。
【０３０４】
特定の実施形態において、損傷した樹状突起または軸索を再生することを含む、損傷したニューロンおよび神経経路の細胞修復を刺激するための方法、組成物およびデバイスが提供される。
【０３０５】
一態様において、本明細書に記載されるＭＮＴＦ類似体は、末梢神経系の損傷した神経経路の修復において有用である。具体的には、ＭＮＴＦは、切除されたまたは別様に損傷した神経線維を含む、損傷した神経経路を修復するために有用である。特に、本明細書に記載されるＭＮＴＦは、血管新生およびミエリン外筒の再形成を含む、完全な軸索神経再生を刺激する能力を持つ。ＭＮＴＦは、ＭＮＴＦをその部位に維持することができる生体適合性、生体吸収性の担体内において損傷部位に提供することができ、必要があれば、軸索を切断されたニューロンの近位端から遠位端へと方向付けるための手段として提供することができる。例えば、軸索の成長を方向付けるための手段は、１０ｍｍを上回るような延長距離を越えて神経再生が誘導される場合に必要である。これらの機能を提供する能力を持つ多くの担体が想定される。例えば、有用な担体には、実質的に不溶性の物質、またはラミニン、ヒアルロン酸もしくはコラーゲン、またはその他の好適な合成の生体適合性ポリマー物質（ポリ乳酸、ポリグリコール酸もしくはポリ酪酸および／またはそのコポリマー等を含む）を含む、本明細書に開示されるように調製された粘性溶液を含む。
【０３０６】
特定の実施形態において、ＭＮＴＦ類似体は、損傷した経路の距離に及ぶ神経ガイダンスチャネル（ｎｅｒｖｅ  ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｃｈａｎｎｅｌ）に配置される。チャネルは、保護用の覆いとして、および神経突起の成長を導くための物理的手段としての両方の役目を果たす。有用なチャネルは、修復されるべき神経の隙間を補うのに十分な寸法を有し、切断されたニューロン端を受けるために適応した開口部を有する管状の構造を持つ、生体適合性の膜を有する。膜は、シリコンまたは生体適合性ポリマー等（ポリエチレンまたはポリエチレンビニルアセテート等）の任意の生体適合性、非刺激性の物質から作製されてもよい。ケーシングも、例えば、コラーゲン、ヒアルロン酸、ポリ乳酸、ポリ酪産、およびポリグリコール酸を含む、生体適合性、生体吸収性のポリマーから構成されてもよい。一実施形態において、チャネルの外側表面は実質的に不透過性である。
【０３０７】
別の態様において、本明細書に記載されるＭＮＴＦは、神経組織への初期損傷に対する身体の免疫／炎症応答に関連した損傷から保護するために有用である。かかる応答は、自己免疫機能障害、腫瘍性病変感染、化学的外傷もしくは機械的外傷、疾患によって、ニューロンまたはグリア細胞への血流中断によって、または神経もしくは周囲の物質へのその他の外傷によって引き起こされる、神経組織への外傷の後に起こる可能性がある。例えば、塞栓性発作に見られるような神経の血液供給の閉塞に続いての低酸素または虚血−再潅流に起因する主な損傷は、免疫学的に関連していると考えられる。また、多くの原発性脳腫瘍と関連した損傷の少なくとも一部も、免疫学的に関連していると思われる。ＭＮＴＦ類似体の適用は、直接的または全身的のいずれかで、免疫学的に神経傷害と関連した応答を緩和および／または阻害する。
【０３０８】
別の実施形態において、本明細書に記載される技術は、保存的アミノ酸配列の変異体、変性ヌクレオチド配列の変異体によってコードされるタンパク質、および保存されたＭＮＴＦドメインを共有し、標準的なストリンジェンシー条件下において、本明細書に開示されるＭＮＴＦタンパク質をコードするＤＮＡにハイブリダイズするための能力を持つＤＮＡによってコードされるＭＮＴＦタンパク質を制限なく含む、本明細書に列挙されるあらゆるＭＮＴＦペプチドの生物学的に活性な種（系統的）変異体の使用を包含する。
【０３０９】
本明細書に記載される化合物は、研究目的のために用いられてもよい。よって、ペプチドによって示される特異的ハイブリダーゼーションは、アッセイ、精製、細胞性生物の調製、および当業者に理解される可能性のあるその他の方法論において用いることができる。
【０３１０】
本明細書において用いられる技術的および科学的用語は、他に定義されない限りは、本開示が関係する当業者に一般的に理解される意味を有する。本明細書において当業者に既知である様々な方法論が参照される。参照されるかかるそれらの方法論を規定する出版物およびその他の資料は、参照することにより、それらの全体がすべて規定されているかのごとく本明細書に一体化される。組換えＤＮＡ技術の一般原理を規定する標準的な参考資料には、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ，２００１）（本明細書において、ともにまたは個別に「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」として参照される）；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｅｄ．，Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９９１）；Ｊｏｎｅｓ，Ｊ．，Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９９２）；Ａｕｓｔｅｎ，Ｂ．Ｍ．ａｎｄ  Ｗｅｓｔｗｏｏｄ，Ｏ．Ｍ．Ｒ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  （Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ＆  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ  ＆  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，ｅｄｓ．，１９８７，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ２００１）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ，ｅｄｓ．，１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ，ｅｄｓ．，１９９１）；Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（Ｄ．Ｗｉｌｄ，ｅｄ．，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ  ＮＹ，１９９４）；Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｇｒｅｇ  Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｒ．Ｍａｓｓｅｙｅｆｆ，Ｗ．Ｈ．Ａｌｂｅｒｔ，ａｎｄ  Ｎ．Ａ．Ｓｔａｉｎｅｓ，ｅｄｓ．，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ：ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇｓ  ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ  ｍｂＨ，��９９３），Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ａｎｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９９９）Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（一緒に、および個別に、本明細書において、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅと称する），Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ  ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２０００）；ａｎｄ  Ａｇｒａｗａｌ，ｅｄ．，Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９３）；Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，ｅｄ．，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ．（１９８７）；Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｕｓｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（Ｐ．Ｍ．Ｗａｓｓｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ  ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（Ｍ．Ｖ．Ｗｉｌｅｓ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２２５：９００（１９９３）；Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｕｓｅｓ  ｏｆ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ｆｏｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｐ．Ｄ．Ｒａｔｈｊｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ  Ｄｅｖ．，１０：３１（１９９８））；ＣＮＳ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：Ｂａｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｄｖａｎｃｅｓ，Ｍ．Ｈ．Ｔｕｓｚｙｎｓｋｉ  ＆  Ｊ．Ｈ．Ｋｏｒｄｏｗｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，（１９９９）を含む。
【０３１１】
本明細書に記載される技術の実践において有用である特定の技術は、脳組織から得られる多分化脳神経幹細胞について報告する米国特許第５，８５１，８３２号；新生児の大脳半球からの神経芽細胞の生成について報告する同第５，７６６，９４８号；哺乳類の神経堤幹細胞の使用について報告する同第５，６５４，１８３号および同第５，８４９，５５３号；哺乳類の多分化性ＣＮＳ幹細胞の培養物から分化したニューロンをインビトロでの産生することについて報告する同第６，０４０，１８０号；神経上皮肝細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞、および系列限定（ｌｉｎｅａｇｅ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ）神経細胞前駆体の再生および単離を報告するＷＯ９８／５０５２６およびＷＯ９９／０１１５９；ならびに胎仔性前脳から得られ、グルコース、トランスフェリン、インスリン、セレン、プロゲステロンおよびその他の成長因子を含む培地で培養される神経幹細胞について報告する米国特許第５，９６８，８２９号を含む、様々な特許および特許出願に記載されている。
【０３１２】
当業者に既知であるいずれの好適な物質および／または方法が、本明細書に記載される技術を実施するために用いられてもよいが、物質および／または方法の制限されない例は本明細書に記載される。
【０３１３】
本明細書に開示される技術は、制限するためではなく例示のために提供される以下の実施例を参照することにより、特定の態様において理解され得る。以下の実施例において参照される物質、試薬等は、特に記載が無い限りは、販売元から入手される。
【０３１４】
以下に記載される特定の例は、本明細書において提供される参照文献を含んでいた。
【０３１５】
Ｃｈａｕ  ＲＭＷ，Ｒｅｎ  Ｆ，Ｈｕａｎｇ  Ｗ，Ｊｅｎ  ＬＳ．Ｍｕｓｃｌｅ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｈｏｒｎ  ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎｓ  ｏｆ  ｒａｔ  ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ．Ｒｅｃｅｎｔ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ．Ａｎｄ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９２，５：８９−９４．
【０３１６】
Ｃｏｐｅｌａｎｄ  ＲＬ  Ｊｒ，Ｌｅｇｇｅｔｔ  ＹＡ，Ｋａｎａａｎ  ＹＭ，Ｔａｙｌｏｒ  ＲＥ，Ｔｉｚａｂｉ  Ｙ．Ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｎｉｃｏｔｉｎｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｓａｌｓｏｌｉｎｏｌ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎｅｕｒｏｔｏｘ  Ｒｅｓ  ２００５Ｎｏｖ；８（３−４）：２８９−９３．
【０３１７】
ＫＭ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ＰＣＴ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ：ＷＯ  ９８／１３４９２，１９９８．
【０３１８】
Ｍａｒｕｙａｍａ  Ｗ，Ｙｉ  Ｈ，Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｔ，Ｓｈｉｍａｚｕ  Ｓ，Ｏｈｄｅ  Ｈ，Ｙｏｎｅｄａ  Ｆ，Ｉｗａｓａ  Ｋ，Ｎａｏｉ  Ｍ．Ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒ−（−）−１−（ｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ−２−ｙｌ）−２−ｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｏｐｅｎｔａｎｅ，［Ｒ−（−）−ＢＰＡＰ］，ａｇａｉｎｓｔ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ（Ｒ）ｓａｌｓｏｌｉｎｏｌ，ａｎ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ  ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ，ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ  ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ  ＳＨ−ＳＹ５Ｙ  ｃｅｌｌｓ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．２００４  Ｍａｙ  ２１；７５（１）：１０７−１７．
【０３１９】
Ｎｕｓｓｂａｕｍ  Ｄ，Ａｓｈ  Ｄ，Ｊａｂｓ  Ｅ，Ｂｒｕｓｈａｒｔ  Ｔ．Ｍｏｎｏｎｅｕｒｏｎ  ｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ（ＭＮＴＦ）Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅ  ｔｏ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｓｏｃ．Ｆｏｒ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｏｒｌｅａｎｓ，ＬＡ，２００３．
【０３２０】
Ｓｈａｖａｌｉ  Ｓ，Ｒｅｎ  Ｊ，Ｅｂａｄｉ  Ｍ．Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−１  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｈｕｍａｎ  ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ  ＳＨ−ＳＹ５Ｙ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｓａｌｓｏｌｉｎｏｌ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔ．２００３  Ａｐｒ  １０；３４０（２）：７９−８２．
【０３２１】
Ｗａｎｇ  ＡＭ，Ｃｈａｕ  ＲＭＷ，Ｃｈｏｗ  ＳＰ，Ｚｈａｎｇ  ＺＹ，Ｌｉ  ＺＭ．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｍｙｏｇｅｎｉｃ  ２２  ａｎｄ  ３５ｋＤ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｏｎ  ａｘｏｎａｌ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｆｒｅｅ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ａｕｔｏｇｒａｆｔｓ  ｉｎｔｏ  ｒａｔ  ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ．１９９５，５（６）：２４８−２５２．
【０３２２】
Ｄｕｂａｌ  ＤＢ，Ｚｈｕ  Ｈ，Ｙｕ  Ｊ，Ｒａｕ  ＳＷ，Ｓｈｕｇｈｒｕｅ  ＰＪ，Ｍｅｒｃｈｅｎｔｈａｌｅｒ  Ｉ，Ｋｉｎｄｙ  ＭＳ，Ｗｉｓｅ  ＰＭ．Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ，ｎｏｔ  ｂｅｔａ，ｉｓ  ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｌｉｎｋ  ｉｎ  ｅｓｔｒａｄｉｏｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｊｕｒｙ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００１，９８：１９５２−１９５７．
【０３２３】
Ｅｌｌｓｗｏｒｔｈ  ＪＬ，Ｇａｒｃｉａ  Ｒ，Ｙｕ  Ｊ，Ｋｉｎｄｙ  ＭＳ．Ｔｉｍｅ  ｗｉｎｄｏｗ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−１８−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｉｄｄｌｅ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ａｒｔｅｒｙ  ｉｎ  ｒａｔｓ．Ｊ  Ｃｅｒｅｂ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ．２００４，２４：１１４−１２３．
【０３２４】
Ｅｌｌｓｗｏｒｔｈ  ＪＬ，Ｇａｒｃｉａ  Ｒ，Ｙｕ  Ｊ，Ｋｉｎｄｙ  ＭＳ．Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−１８  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｉｎｆａｒｃｔ  ｖｏｌｕｍｅｓ  ａｎｄ  ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ  ｄｅｆｉｃｉｔｓ  ａｆｔｅｒ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｉｄｄｌｅ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ａｒｔｅｒｙ  ｉｎ  ｒａｔｓ．Ｓｔｒｏｋｅ．２００３，３４：１５０７−１５１２．
【０３２５】
Ｇａｒｙ  ＤＳ，Ｂｒｕｃｅ−Ｋｅｌｌｅｒ  ＡＪ，Ｋｉｎｄｙ  ＭＳ，Ｍａｔｔｓｏｎ  ＭＰ．Ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ａｎｄ  ｅｘｃｉｔｏｔｏｘｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｓ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｌａｃｋｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐ５５  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｊ  Ｃｅｒｅｂ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ．１９９８，１８：１２８３−１２８７．
【０３２６】
ＫＭ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐａｔｅｎｔ  ＷＯ  ９８／１３４９２，１９９８．
【０３２７】
Ｍａｔｔｓｏｎ  ＭＰ，Ｚｈｕ  Ｈ，Ｙｕ  Ｊ，Ｋｉｎｄｙ  ＭＳ．Ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ−１  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｖｕｌｎｅｒａｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ｆｏｃａｌ  ｉｓｃｈｅｍｉａ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｔｏ  ｈｙｐｏｘｉａ  ａｎｄ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ：ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｅｒｔｕｒｂｅｄ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０００，２０：１３５８−１３６４．
【０３２８】
Ｄｉ  Ｘ，Ｈｕａｎｇ  Ｗ．Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｉｃ  ｓｔｕｄｙ  ｏｎ  ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  １  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ  ｖｉｌｌｉ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｃｅｎｔａ．Ａｃｔａ  Ａｎａｔｏｍｉｃａ  Ｓｉｎｉｃａ，１９９８，２９：８６−８９．
【０３２９】
Ｘｉｎｙｕ  Ｄ，Ｗｅｉｑｕａｎ  Ｈ．Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｉｃ  ｓｔｕｄｙ  ｏｎ  ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ１  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ  ｖｉｌｌｉ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｃｅｎｔａ．Ａｃｔａ  Ａｎａｔｏｍｉｃａ  Ｓｉｎｉｃａ，１９９８，２９：８６−８９．
【０３３０】
本明細書において用いられる場合、ＭＮＴＦペプチドおよび配列ならびに／またはその機能的類似体の有効性は、以下の実施例に記載される実質的に類似するおよび／または同等のプロトコルによって決定されてもよいことが企図される。また、配列番号：１〜１４２に規定されるいずれのＭＮＴＦペプチド類似体およびその変異体の有効性は、本明細書に規定される実験条件に従って決定されてもよいことが企図される。
【０３３１】
本明細書において用いられる場合、例示的なＭＮＴＦペプチド類似体ＧＭ６、ＧＭ６０２、ＧＭ６０３、ＧＭ６０４、ＭＮＴＦ６ｍｅｒのすべては、配列ＦＳＲＹＡＲ（配列番号：２）を含有するＭＮＴＦ６−ｍｅｒを参照する。
【実施例１】
【０３３２】
ＭＮＴＦ血液脳関門通過試験
【０３３３】
本実施例に関する略語／専門用語
【０３３４】
「ＭＮＴＦ」は、運動ニューロン栄養因子、またはそのペプチド類似体を意味する。
【０３３５】
「ＧＭ６」および「６ｍｅｒ」は、ＭＮＴＦの例示的な６アミノ酸ペプチド類似体、すなわちＦＳＲＹＡＲ（配列番号：２）を意味する。
【０３３６】
「ＢＢＢ」は、血液脳関門を意味する。
【０３３７】
「Ｇｅｎｅｒｖｏｎ」および「ＧＢ」は、Ｇｅｎｅｒｖｏｎ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＬＬＣを意味する。
【０３３８】
「Ｉ．Ｖ．」は、静脈内を意味する。
【０３３９】
「抗６ｍｅｒ抗体」は、抗ＧＭ６抗体を意味する。
【０３４０】
「ＮＴＳ」は、開発業務受託機関であるＮｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｓｅｒｖｉｃｅを意味する。
【０３４１】
血液脳関門を横断して脳に至るための、運動ニューロン栄養因子（ＭＮＴＦ）の合成６アミノ酸類似体（ＧＭ６；ＦＳＲＹＡＲ）を試験する。
【０３４２】
ＧＭ６は、合成された６アミノ酸ペプチドＭＮＴＦ類自体である。ＧＭ６は固体として提供され、製剤はＮＴＳにより調製された（溶液は４℃で保存）。
【０３４３】
ＭＮＴＦは、末梢の坐骨神経、末梢の筋皮神経、脳顔面神経、脳舌下神経、および首、胸部、および上肢の筋肉を制御する脊髄の一部を含む、様々なラット神経系において試験されてきた。脊髄モデルにおいて、ＭＮＴＦはラットの片側脊髄の神経移植に適用された。ＭＮＴＦは、炎症を抑え、変性を制限し、移植された神経の再生を増進した。多くの試験が、ＭＮＴＦまたはＧＭ６が神経に直接適用された場合の栄養および刺激作用について、合成されたＭＮＴＦまたはＧＭ６の有効性を十分確立されたラット末梢神経系モデル系において実証している。また、ＭＮＴＦは運動ニューロンの再生および生存を促進することが明らかになっている。
【０３４４】
さらに、この株において運動ニューロン変性疾患につながる遺伝子欠損から運動ニューロンを救助するＭＮＴＦの能力を調査するために、二重劣性遺伝子を有する動揺病マウスのモデルを代用として選択した。予備実験において、６週齢において筋肉内投与された１回用量のＭＮＴＦは、運動ニューロン疾患の発達を減退させた。これは、未処置の動揺病マウスの生存を、９〜１２週から、処置された動揺病マウスにおける２８〜６３週まで有意に増加させた。
【０３４５】
様々な動物系に対するＭＮＴＦおよびＧＭ６の効果を評価した。１０００匹を超えるＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットならびに動揺病マウスおよび正常な同腹子の両方の１５匹を用いた研究では、安全性の問題は特定されなかった。神経保護、炎症および神経再生においてＭＮＴＦが果たす潜在的な役割のために、神経障害の処置について、ＭＮＴＦおよびそのペプチド類似体を含む医薬組成物を評価した。中枢神経系疾患および障害の処置に対する大きな障害は、薬剤を中枢神経系に送達することが困難であることである。薬剤の治療可能性を評価するために、薬剤の生物学的利用能および様々な神経障害に対する効果の決定を行った。
【０３４６】
ｇｍ６の静脈注射による脳に対する利用可能性の評価
【０３４７】
方法および材料
【０３４８】
試験デザイン
【０３４９】
Ｃ５７ＢＬ６マウスにＧＭ６を示された用量で投与し、脳内のＧＭ６を調べた。脳の半分をＧＭ６の免疫細胞化学的分析に使用し、残り半分（脳）をＥＬＩＳＡ分析用に凍結した。
【０３５０】
インビボ法
【０３５１】
それぞれ体重約２５グラムの雄Ｃ５７ＢＬ／６（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）マウスに、実験前および実験中、自由に餌および水を与えた。実験前に１週間、動物を順化させた。ビヒクルまたはＧＭ６を、０．２または２ｍｇ／ｋｇで、動物に尾静脈から静脈内ボーラス注射した。ＧＭ６を４℃で保存された１００％生理食塩溶液でもどすことにより、ＧＭ６を原液として調剤した。ビヒクル対照には生理食塩溶液を投与した。
【０３５２】
免疫組織化学解析
【０３５３】
組織切片を脱パラフィン化してトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）ｐＨ７．４中で洗浄し、適切な血清（ヤギ）でブロックした。切片を４℃で一晩ブロックし、次いで１次抗体（抗６−ｍｅｒ抗体）に４℃で一晩処理した。切片をＴＢＳ中で洗浄し、２次抗体を添加して、室温で１時間インキュベートした。洗浄後、Ｖｅｃｔｏｒ  ＡＢＣ  Ｅｌｉｔｅキットで説明される通りに切片をインキュベートし、ジアミノ安息香酸（ＤＡＢ）で染色した。水中で反応を停止し、キシレンへの処理後にカバースリップをのせた。Ｑｕｉｃｋ  Ｃａｐｔｕｒｅフレームグラバカードを備えたＰｏｗｅｒ  Ｍａｃｉｎｔｏｓｈコンピュータ、オリンパス社製顕微鏡に装着された日立ＣＣＤカメラおよびカメラスタンドで構成されるコンピュータ支援画像分析システムで、各切片において免疫細胞化学的染色された領域を決定した。ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ｖ．１．５５を使用した。１０切片に対し、画像を撮影してＧＭ６ペプチドの総領域を決定した。処置状態に対し盲検化された１人の操作者が、すべての測定を行った。
【０３５４】
ＥＬＩＳＡ分析
【０３５５】
試料中のＧＭ６レベルを測定するために、競合ＥＬＩＳＡキットを使用した。親和性精製ウサギ抗６Ｍｅｒを被覆緩衝液中１０ｕｇ／ｍｌでＥＬＩＳＡプレート上に被覆した。アッセイ系中の１μＭ（最終希釈）で６Ｍｅｒ−ビオチンを使用した。既知濃度のＧＭ６（コンペティター）を参照用標準として使用し、検量線を確立するための試験において、８０μＭから開始し、０．６２５μＭまで２桁漸減させた。検量線に基づき、被験試料の濃度をそのＯＤ４５０観察から推定した。
【０３５６】
２％ＢＳＡ含有１００ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．０、１Ｍ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＥＤＴＡ、２％トリトンＸ−１００、０．１％アジ化ナトリウム、およびプロテアーゼ阻害剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＴＭ，Ｍｉｎｉ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を含有する細胞溶解緩衝液中で、脳組織を調製した。組織湿重量に対し、１０体積量の緩衝液中でホモジネートを調製した。ホモジネートを１４，０００×ｇで３０分間遠心分離した。得られた上清を、適切な体積調整を行いＥＬＩＳＡに使用した。
【０３５７】
アッセイのために、抗６Ｍｅｒ  ｐＡｂをＥＬＩＳＡ被覆緩衝液中１０μｇ／ｍｌまで希釈した。９６ウェルマイクロタイタープレートを希釈ｐＡｂの１００μｌ／ウェルで被覆した。プレートにカバーして一晩冷蔵保存した。翌日、プレートを、３％ＢＳＡを含む２００μｌ／ウェルＴＢＳでブロックし、室温で６０分間保持した。プレートをＴＢＳＴ（ＴＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。各プレートに対し、１０ｍｌ  １μＭ  ６Ｍｅｒ−ビオチンおよび１ｍｌ標準ミックスを以下のように調製した：８０μＭ  ６Ｍｅｒを含む１μＭ  ６Ｍｅｒ−ビオチン。各プレートに対し、レーン１および２を検量線に使用した。１μＭ  ６Ｍｅｒ−ビオチン（１００μｌ）をＡ１およびＡ２以外のすべてのウェルに添加し、２００μｌ／ウェルの標準ミックスをＡ１およびＡ２に添加した。各ウェルから１００μｌ試料を取り出し次のウェルに混合する、つまり少なくともピペット操作を少なくとも８回行うことにより、ウェルＡ１およびＡ２からウェルＨ１およびＨ２までの連続的な２桁希釈を行った。最終ウェル（Ｈ１およびＨ２）での余分な１００μｌは廃棄した。試験試料（脳ホモジネート）をＡｂ希釈緩衝液中で希釈し、１μＭ  ６Ｍｅｒ−ビオチンと１：５０で混合した。加振器で、プレートを４００ｒｐｍで２時間、室温で混合した。試料をＴＢＳＴで６回洗浄した。Ａｂ希釈緩衝液中でストレプトアビジン−ＨＲＰを１：２０００に希釈することにより、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（プレート毎１０ｍｌ）溶液を調製した。加振器で、プレートをさらに１時間、室温で混合した。試料をＴＢＳＴで８回洗浄した。５０μｌ／ウェル基材（ＴＭＢＳ，Ｇｅｎｅｔｅｌ）を添加し、５分間発育させた。反応を５０μｌ  １Ｍ  ＨＣｌで停止し、すぐにＯＤ４５０を読み取った。
【０３５８】
統計解析
【０３５９】
結果は平均±標準偏差として表される（ＳＤ）。ＥＬＩＳＡおよび免疫組織学的データにおける差の有意性を、ｔ−検定を用いて分析した。
【０３６０】
試験からの動物の除外
【０３６１】
以下のいくつかの基準に基づき、動物を試験から除外する。
【０３６２】
試験の終了前に（任意の時点で）死亡した動物。
【０３６３】
被験物質の投与後に重度の合併症を発現した動物。
【０３６４】
処置群
【０３６５】
すべての群はＧＭ６に供されたか、または対照であった。動物（３０匹の動物）を、示された用量のビヒクルまたはＭＮＴＦの尾静脈による静脈内ボーラス注射に供した。
【表１】
2010509345.tif 000002
【０３６６】
評価項目
【０３６７】
脳内ＧＭ６。
【０３６８】
すべての試験群をＮＴＳに提供した。ＧＭ６は固体材料としてＮＴＳに提供した。試験群のすべての動物には、上に示した通り投与を行った。
【０３６９】
試験の終わりに、脳の１／２をＧＭ６の免疫細胞化学的分析に使用した。残り１／２をＧＭ６のＥＬＩＳＡ分析に使用した。
【０３７０】
結果
【０３７１】
マウスにおけるＭＮＴＦ。血液脳関門試験
【０３７２】
脳内のＧＭ６の相対的利用可能性を評価した。ビヒクルまたはＧＭ６の静脈注射を受けたマウス（野生型）からのデータ。
【０３７３】
免疫細胞化学的分析：
【０３７４】
ＧＭ６：ＭＮＴＦ投与後、脳を取り出し、抗６ｍｅｒ抗体を使用して、ＧＭ６の免疫細胞化学的分析のために検査した。対照動物と比較して、いずれの動物の組織においても、免疫反応性は検出されなかった。
【０３７５】
ＥＬＩＳＡ分析：
【０３７６】
競合ＥＬＩＳＡキットを使用して脳試料中のＧＭ６レベルを測定するために、上述のように試料を調製してＥＬＩＳＡに供した。図１および表４に示されるように、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて脳内にＭＮＴＦ  ＧＭ６が検出された。ＥＬＩＳＡは、基底レベルの脳内の内因性ＧＭ６を検出した（０．４μＭ）。０．２ｍｇ／ｋｇのＧＭ６を注射された動物では、ＧＭ６の４００％の増加が検出され（１．７６０μＭ）、一方、２ｍｇ／ｋｇのＧＭ６の注射は、４時間後の脳内でＧＭ６の３０００％の増加を発生させた（１２．９２μＭ）。これらのデータは、ＧＭ６の静脈注射は、脳内のペプチドの分配を可能にすることを示唆している。
【表２】
2010509345.tif 000003
【０３７７】
これらのデータに基づき、ＭＮＴＦは、神経障害からの保護を提供することができ、また傷害または移植後の神経組織の再生を可能とし得る栄養因子である。ここで行われた試験は、ＭＮＴＦ（ＧＭ６）の６アミノ酸類似体の、効果的かつ効率的に血液脳関門を横断する能力を実証している。０．２ｍｇ／ｋｇおよび２ｍｇ／ｋｇ単回ボーラス用量でのＧＭ６の静脈内投与は、脳内のＧＭ６レベルの用量依存性の増加を実証した。これは、ＧＭ６が静脈内投与を介して脳にアクセスでき、有益な効果を決定するために様々な疾患モデルに使用可能であることを示した。
【０３７８】
静脈内投与された場合、ＧＭ６は４時間後に脳に存在することが判明した。脳内のＧＭ６レベルは用量依存性であったが、ＧＭ６が静脈内投与を介して脳にアクセスできることを示している。
【０３７９】
実施例２
【０３８０】
脳卒中：ＭＣＡＯモデルにおける脳卒中のＭＮＴＦ処置
【０３８１】
ＭＮＴＦペプチド類似体ＧＭ６０２（配列番号：２，ＦＳＲＹＡＲ）を、中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）マウスモデルにおける有効性について試験した。ＭＣＡＯマウスモデルにおけるＧＭ６０２の有効性を決定するために、マウスを１時間の虚血および２４時間の再灌流に供した。再灌流開始直後に、尾静脈からの静脈内ボーラスによりＧＭ６０２をいくつかの用量でマウスに注射し、脳血流（ＣＢＦ）、心拍数（ＨＲ）、血圧（ＢＰ）、ｐＯ２、ｐＣＯ２、ｐＨ、神経学的欠損（ＮＤ）、梗塞容積（ＩＦＶ）の変化について検査した。ＧＭ６０２（１ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇ）の静脈内（ＩＶ）単回投与を検査した。ＧＭ６０２の投与は、ＨＲ、ＢＰ、ｐＯ２、ｐＣＯ２、またはｐＨの変化を示さなかった。ＧＭ６０２投与により、対照群を上回る再灌流後のＣＢＦの有意な増加が観察され、これは血流の閉塞により引き起こされた虚血効果の低減を助ける。ＧＭ６０２注射後、ＮＤおよびＩＦＶに用量依存性の変化が検出された。１ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇの両方において、ＧＭ６０２は、梗塞損傷からの有意な保護を示したが、これは、神経学的欠損の維持と解釈される。これらのデータは、ＭＣＡＯのマウスモデルにおいて、ＧＭ６０２が、ＩＶ注射後に脳に対する神経保護作用を有することを示唆している。
【０３８２】
本実施例に関する略語／専門用語
【０３８３】
「ＭＮＴＦ」は、運動ニューロン栄養因子を意味する。
【０３８４】
「ＭＮＴＦ６ｍｅｒ」は、ＭＮＴＦの６−アミノ酸ペプチド類似体、例えばＦＳＲＹＡＲを意味する。
【０３８５】
「ＧＭ６０２」は、脳卒中に対するＭＮＴＦの６−アミノ酸ペプチド類似体を意味する。
【０３８６】
「ＧＭ６０２（１）」は、１ｍｇ／ｋｇのＧＭ６０２用量を意味する。
【０３８７】
「ＧＭ６０２（５）」は、５ｍｇ／ｋｇのＧＭ６０２用量を意味する。
【０３８８】
「ＭＣＡＯ」は、中大脳動脈閉塞を意味する。
【０３８９】
「ＧＢ」は、Ｇｅｎｅｒｖｏｎ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ＬＬＣを意味する。
【０３９０】
「ＩＶ」は、静脈内を意味する。
【０３９１】
「ＣＢＦ」は、脳血流を意味する。
【０３９２】
「ＨＲ」は、心拍数を意味する。
【０３９３】
「ＢＰ」は、血圧を意味する。
【０３９４】
「ＮＤ」は、神経学的欠損を意味する。
【０３９５】
「ＩＦＶ」は、梗塞容積を意味する。
【０３９６】
ＭＮＴＦは、機能により発見される特定のヒト染色体の場所を有する内因性神経栄養因子である。ＭＮＴＦは、ヒト神経系に対し非常に特異的であり、妊娠第１期の人間の胎児における完全な神経系の発育の間に急速に発現し、９週目にピークを迎える（Ｄｉ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，１９９８）。ＭＮＴＦは、非常に特異的な受容体に完全に結合する神経信号分子である。動物試験およびインビボ試験において実証されるように、ＭＮＴＦの特異的な機能は、胚性幹細胞の運動ニューロンへの分化、運動ニューロンの維持および生存、運動性軸索の誘導による再生、および目標筋肉および器官の再弱体化である（Ｃｈａｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｎｕｓｓｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。中枢神経系（ＣＮＳ）および末梢神経系（ＰＮＳ）が、疾患、障害、または傷害により引き起こされる攻撃下にある場合、ＭＮＴＦは、神経保護、抗アポトーシス、抗酸化、抗炎症、および抗瘢痕的な神経再生および修復のための保護的および許容的な環境を形成する。
【０３９７】
多くの研究が、末梢の坐骨神経、末梢の筋皮神経、脳顔面神経、脳舌下神経、および首、胸部、および上肢の筋肉を制御する脊髄の一部を含む、様々なラット神経系におけるＭＮＴＦの有効性を実証している（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。半切片化ラット脊髄モデルにおいて、ＭＮＴＦは、炎症を抑え、変性を制限し、移植された神経の再生を増進した（ＫＭ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＰＣＴ，１９９８）。多くの試験が、合成されたＭＮＴＦまたはＭＮＴＦ  ６ｍｅｒ（ＦＳＲＹＡＲ；配列番号：２）の栄養および刺激作用を、十分確立されたラット抹消神経系モデルにおいて実証している（Ｎｕｓｓｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ，２００３）。また、ＭＮＴＦは運動ニューロンの再生および生存を促進することが明らかになっている（ＫＭ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＰＣＴ，１９９８）。さらに、６週齢時に１回用量の３５ｎｇ  ＭＮＴＦを投与された二重劣性遺伝子を有する動揺病マウス（ＮＩＨ）は、この株における神経変性遺伝疾患を減退させた（ＫＭ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＰＣＴ，１９９８）。
【０３９８】
ＭＮＴＦの活性部位の１つに対する６アミノ酸の配列類似体（ＦＳＲＹＡＲ）を、ＭＮＴＦ活性を有する薬剤候補として調査した。独立した研究グループが、独自の確立されたアッセイおよびプロトコルを用いて以下のＣＮＳおよびＰＮＳ実験を行った。１．ＭＮＴＦ６ｍｅｒ類似体は、血液脳関門を通過してＩＶ注射により脳に進入することができることが示されている。２．Ｌ−２−ヒドロキシグルタル酸（ＬＧＡ）は、神経系において酸化ストレスおよびアポトーシスを誘発する。ゼブラフィッシュバイオアッセイにおいて、ＭＮＴＦ６ｍｅｒはＣＮＳにおいてＬＧＡ誘発アポトーシスを保護し、中脳においてアポトーシスを８５％低減した。３．８ｍｍギャップでのラット坐骨神経離断試験では、ＭＮＴＦ処置動物は、用量応答的に運動ニューロン再生を有意に改善し（最適用量でｐ＜０．０００２）、ＤＲＧ神経再生を促進した。４．離断大腿神経ラットモデルにおいては、運動ニューロンの数は、ＭＮＴＦ６ｍｅｒ処置動物において用量応答的に筋肉に正確に投射した。最適用量では、筋肉に正確に投射した運動ニューロンの数は、皮膚に不正確に投射した運動ニューロンの数の３倍である（ｐ＜０．０００ｌ）。５．ゼブラフィッシュバイオアッセイにおいて、ＭＮＴＦ６ｍｅｒはＰＮＳにおいてＬＧＡ誘発アポトーシスを保護し、末梢神経筋接合部においてアポトーシスを４９％低減した。
【０３９９】
例示的なＭＮＴＦペプチドＧＭ６０２（ＦＳＲＹＡＲ；配列番号：２）、運動ニューロン栄養因子の６−アミノ酸ペプチド類似体（ＭＮＴＦ６ｍｅｒ）の、脳を急性虚血および再灌流傷害から保護する能力を評価した。ＧＭ６０２は、ＧＭＰコンプライアンス（ＣＳ  Ｂｉｏ  Ｃｏ．，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ，ＧＭＰ０１３，ｌｏｔ  Ｃ８１１）のもとで化学的に合成された。本試験は、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｉｎｃ．（ＮＴＳ，Ｃｈａｒｌｅｓｔｏｎ，ＳＣ）との契約の下で行われた。ＧＭ６０２は固体としてＮＴＳに提供され、製剤はＮＴＳにより調製された（溶液は４℃で保存）。
【０４００】
方法および材料
【０４０１】
それぞれ体重２２−２５グラムの動物Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）に、実験前に自由に餌および水を与えた。動物をハロタンで麻酔した（マスクにより７０％／３０％  ＮＯ２／Ｏ２に１％）。テールカフ装置を介して平均動脈圧（ＭＡＢＰ）を監視し、動脈ｐＨレベルおよびＰａＣＯ２およびＰａＯ２を決定するために、血液試料を採取した。Ｖｉｓｉｔｅｃｈ  Ｓｙｓｔｅｍ血圧モニタを使用して、ＭＡＢＰおよび心拍数を記録した。
【０４０２】
直腸体温計および側頭筋に挿入されたサーミスタプローブで、脳の温度を監視した。動物の体温は、ウォータージャケット付き加熱パッドを使用して３７℃に維持した。脳の温度を、虚血前１時間から虚血後６時間まで監視し、３０分間隔で記録した。
【０４０３】
実験群
【０４０４】
すべての動物を、１．０時間の虚血、続いて２４時間の再灌流に供した。ビヒクル群（ｎ＝１０）または１ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇの用量でのＧＭ６０２の静脈注射で処置した群（ｎ＝１０）に、動物を無作為に割り当てた。ＧＭ６０２の調剤（ＣＳ  Ｂｉｏ  Ｃｏ．，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ，ＧＭＰ０１３，ｌｏｔ  Ｃ８１１）は、ＮＴＳにより、ＧＭ６０２を４℃で保存された生理食塩溶液でもどすことにより原液として行われた。ビヒクル対照には生理食塩溶液を投与した。再灌流の開始直後に、尾静脈からの静脈内ボーラス注射を行った。調査者は、処置群については情報を与えられなかった。
【０４０５】
虚血の誘発
【０４０６】
本試験は、虚血の一過性モデルに関連した。各マウスを麻酔し、外頚動脈（ＥＣＡ）および総頸動脈（ＣＣＡ）を分離した。サーミスタプローブを直腸および側頭筋に挿入し、体温および脳の温度を監視し、外部加温により３６〜３７℃に維持した。左総頚動脈（ＣＣＡ）を、頸部の正中切開により露出した。上甲状腺動脈および上後頭動脈を、電気凝固して分割した。マイクロ手術クリップを外頚動脈（ＥＣＡ）の起点の周りに設置した。６−０の絹糸でＥＣＡ遠位端を結紮し、離断した。６−０絹糸は、ＥＣＡ断端の周りに緩く縛った。クリップを取り外し、５−０ナイロン縫合糸（シリコーン被覆）の火造り先端（ｆｉｒｅ−ｐｏｌｉｓｈｅｄ  ｔｉｐ）を優しくＥＣＡ断端に挿入した。６−０絹糸の輪を断端の周りで締め付け、内頸動脈（ＩＣＡ）内に、およびそれを通して、前大脳動脈（ＡＣＡ）に収まるまでナイロン縫合糸を約１３ｍｍ前進させ（体重により調節される）、それにより前交通動脈および中大脳動脈を閉塞させた。ナイロン縫合糸を１時間設置した後、それをＥＣＡに引き戻し、切開部を閉鎖した。
【０４０７】
組織学的検査
【０４０８】
虚血を誘発してから２４時間後、組織学的検査のために、ペントバルビタールナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射で動物を麻酔した。４℃の１０％リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で経心臓的に脳を灌流した。脳を取り出し、Ｒｏｄｅｎｔ  Ｂｒａｉｎ  Ｍａｔｒｉｘ内に入れる前に−２０度で１５分間冷凍した。冠状切片（１ｍｍ厚）を調製し、３７℃での２％塩化トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ）染色に供した。前頭極からの２ｍｍから始め、梗塞の吻側端−尾端を通した７つの連続した１ｍｍ厚の冠状切片を各脳から採取した。ＴＴＣ染色切片を１０％中性緩衝ホルマリンに入れ、少なくとも２４時間、暗所で４℃で保持した。Ｑｕｉｃｋ  Ｃａｐｔｕｒｅフレームグラバカードを備えたＰｏｗｅｒ  Ｍａｃｉｎｔｏｓｈコンピュータ、オリンパス社製顕微鏡に装着された日立ＣＣＤカメラおよびカメラスタンドで構成されるコンピュータ支援画像分析システムで、各切片における梗塞領域を決定した。ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ｖ．１．５５を使用した。７切片に対し、画像を撮影して損傷の総領域を決定した。処置状態に対し盲検化された１人の操作者が、すべての測定を行った。切片の梗塞容積を加算することにより、梗塞容積を計算した。以下の式を用いて、梗塞サイズ（％）を計算し、浮腫の効果を排除した：（対側容積−同側非損傷容積）×１００／対側容積。
【０４０９】
脳血流の測定
【０４１０】
レーザードップラー流量計を使用して脳血流（ＣＢＦ）を監視した。レーザードップラー流量計により表示される値は絶対値ではなかったため、ＣＢＦ値はパーセンテージとして決定された。上述のように、動物をハロタンで麻酔した（マスクにより７０％／３０％  ＮＯ２／Ｏ２に１％）。ＭＣＡ閉塞と同側の半球において、座標は以下の通りであった：Ａ点、ブレグマに対し０．５ｍｍ後方、および正中線に対し２ｍｍ側方；Ｂ点、ブレグマに対し１ｍｍ後方、および正中線に対し１．２ｍｍ側方；Ｄ点、ブレグマに対し１ｍｍ前方、および正中線に対し１．７ｍｍ側方；対側半球におけるＣ点、ブレグマに対し１ｍｍ後方、および正中線に対し２ｍｍ。虚血の発症の１５分前、被験物質の注射前の虚血の間（虚血の開始から１５分後）、および注射から３０分後で、ＣＢＦを比較した（虚血の１５分前から、化合物の注射終了後３０分まで、連続的に測定を行い、３０分ごとに記録した）。ＭＣＡ栓塞前の平均値をベースラインとして用い、それ以降のデータを、ベースライン値のパーセンテージとして表した。
【０４１１】
行動の評価
【０４１２】
虚血性傷害の前後で、マウスにおける行動解析（神経学的欠損）を決定した。神経学的スコアは以下の通りであった：０：正常な運動機能；１：動物を尾部で持ち上げた際の胴体および対側前肢の屈曲；２：平面上において尾部で保持した際の対側への旋回、ただし静止時は正常な姿勢；３：静止時の対側への傾き；４：自発運動活性なし。
【０４１３】
試験からの動物の除外
【０４１４】
以下のいくつかの基準に基づき、動物を試験から除外した：
【０４１５】
試験の終了前に（任意の時点で）死亡する動物。死亡時まで収集されたデータは、ＧＢに提供された。
【０４１６】
脳血流は、閉塞後、ベースライン値の２０±５％に減少しなかった（すなわち非虚血とみなされた）か、または、血流は再灌流後にベースライン値の９０±１５％に回復しなかった。
【０４１７】
虚血性傷害後、動物は発作様の活動を発現した。
【０４１８】
虚血中、または虚血直後に、過度の出血が検出された。
【０４１９】
統計解析
【０４２０】
結果は平均±標準偏差（ＳＤ）として表した。生理学的および組織学的データにおける差の有意性を、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）と、続いてＦｉｓｈｅｒのポストホック試験を用いて分析した。反復測定ＡＮＯＶＡは監視データに対し計算し、群間の有意差はＦｉｓｈｅｒのポストホック試験で評価した。
【０４２１】
処置群。すべての群はＧＭ６０２に供されたか、または対照であった。動物（３０匹の動物）を、示された用量のビヒクルまたはＧＭ６０２のＩＶ投与に供した。
【表３】
2010509345.tif 000004
【０４２２】
評価項目：
【０４２３】
虚血および再灌流傷害からの神経保護作用に対する、ＧＭ６０２の効果。脳血流（ＣＢＦ）、心拍数（ＨＲ）、血圧（ＢＰ）、ｐＯ２、ｐＣＯ２、ｐＨ、神経学的欠陥（ＮＤ）、および梗塞容積（ＩＦＶ）について動物を評価した。
【０４２４】
すべての試験群をＮＴＳに提供した。ＧＭ６０２は固体材料としてＮＴＳに提供した。試験群のすべての動物には、上に示した通り投与を行った。
【０４２５】
結果
【０４２６】
マウスにおける虚血（虚血試験）。これらの試験において虚血の相対的重症度を評価した。データは、ビヒクルまたはＧＭ６０２を静脈注射された虚血性傷害に罹患したマウスからのものであった。
【０４２７】
梗塞容積：ビヒクル注射群と比較して、ＧＭ６０２処置群（１ｍｇ／ｋｇと５ｍｇ／ｋｇの両方で）において脳内の梗塞容積は有意に減少した。ＧＭ６０２は、梗塞容積の用量依存的な低減を示した（表５）。梗塞容積対ＧＭ６用量が図２Ａにプロットされている。脳内の梗塞容積の減少割合を表５に示す。表に示されるように、虚血後のＧＭ６０２の０、１、または５ｍｇ／ｋｇでのＩＶ投与は、５７、３９、および１２％の梗塞サイズを示した。梗塞容積は、ビヒクル群で７３．３７ｍｍ３、１ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇでのＧＭ６０２処置群でそれぞれ４５．９３ｍｍ３および２０．２９ｍｍ３である。したがって、１ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇでのＧＭ６０２の虚血後ＩＶ投与は、ビヒクルと比較して、それぞれ３８％および７３％の梗塞容積の減少をもたらした。
【表４】
2010509345.tif 000005
【０４２８】
生理学的パラメータ
【０４２９】
虚血中、または再灌流後（図３〜７）において、ビヒクルのマウスと処置されたマウスの間で、生理学的パラメータ（平均動脈圧、血液ｐＯ２、ｐＣＯ２、およびｐＨ）においてベースラインに有意差は見られなかったが、ただし、５ｍｇ／ｋｇのＧＭ６０２で処置された群において、再灌流後にビヒクル群を超える脳血流の有意な増加があったが、これは、血流の閉塞により引き起こされた虚血効果の低減を助けるものである。
【表５】
2010509345.tif 000006
【０４３０】
行動の測定
【０４３１】
０から４のスケールに基づき、神経学的欠損について動物を評価した。ＧＭ６０２で処置した動物は、用量依存的な神経学的欠損の減少を示した（データを図８にも示す）。
【表６】
2010509345.tif 000007
【０４３２】
アメリカ合衆国では、脳卒中は３番目に多い死亡原因であり、障害の腫瘍原因である。局所性脳虚血後の結果および梗塞容積は、「壊死」（パラトーシス）細胞死、および虚血の境界における遅発性神経細胞損失（プログラム細胞死またはアポトーシス）の両方により決定される。虚血性脳卒中を処置するため、最新の療法が見られるようになった。しかしながら、これらの処置は、ほとんどの場合、血栓の溶解を扱うが、一旦神経細胞死サイクルがトリガされた際の、神経保護作用、行動の欠陥の低減、または脳梗塞容積には留意されていなかった。細胞損失に影響を与える基本的メカニズムを理解することは、虚血性傷害と関連した細胞死を低減するための薬剤や用途の設計に役立つ。
【０４３３】
ＭＮＴＦは、神経障害からの保護を提供することができ、また傷害または虚血性脳卒中後の神経組織の再生を可能とし得る栄養因子である。ここで行われた試験は、ＧＭ６０２、ＭＮＴＦの６−アミノ酸（ＦＳＲＹＡＲ）類似体の、効果的および効率的に脳虚血および再灌流傷害の有害な影響から脳を保護する能力を示している。１ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇ単回ボーラス用量でのＧＭ６０２の静脈内投与は、虚血／再灌流傷害に対する、梗塞容積の減少、行動的属性の改善、および脳血流の増加による、脳における用量依存的な保護効果を示した。これらの試験は、ＧＭ６０２が脳卒中において有益な効果を有し得ることを示唆している。
【０４３４】
静脈内投与された場合、ＧＭ６０２は、マウスにおける虚血／再灌流傷害に対する神経保護作用を有することが判明した。これらの試験は、脳卒中および他の神経変性障害におけるＧＭ６０２の有益な効果を決定するための将来の研究の基礎を築いた。
【０４３５】
実施例３
【０４３６】
脊髄傷害：脊髄傷害マウスモデルにおける、ＧＭ６０３（例示的ＭＮＴＦ６ｍｅｒ  ＦＳＲＹＡＲ）試験
【０４３７】
ＭＮＴＦ類似体ＧＭ６０３（配列番号：２；ＦＳＲＹＡＲ）を、脊髄傷害（ＳＣＩ）マウスモデルにおける有効性について試験した。ＳＣＩマウスモデルにおけるＧＭ６０３の有効性を決定するために、マウスを脊髄衝撃および１４日間の回復に供した。傷害直後および１４日間毎日、いくつかの用量でＧＭ６０３をマウスに静脈注射した。病変の容積（ＬＶ）および行動回復（ＢＲ）の変化について動物を検査した。複数回用量でのＧＭ６０３（１ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇ）の静脈内（ｉ．ｖ．）投与を検査した。ＧＭ６０３の投与は、ＬＶおよびＢＲの両方における変化を明示したが、これは用量依存的な効果を示している。１ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇ両方のＧＭ６０３は、病変の容積の有意な低減を示したが、これは、神経学的欠損の維持につながる。これらのデータは、ＳＣＩのマウスモデルにおいて、ＧＭ６０３が、ｉ．ｖ．注射後に脊髄において神経保護作用を有することを実証した。
【０４３８】
本実施例に関する略語／専門用語
【０４３９】
「ＭＮＴＦ」は、運動ニューロン栄養因子を意味する。
【０４４０】
「ＭＮＴＦ６ｍｅｒ」は、ＭＮＴＦの６−アミノ酸ペプチド類似体を意味する。
【０４４１】
「ＧＭ６０３」は、ＳＣＩに対するＭＮＴＦの６−アミノ酸ペプチド類似体（ＦＳＲＹＡＲ）を意味する。
【０４４２】
「ＧＭ６０３−１」は、ＧＭ６０３  １ｍｇ／ｋｇ；配列番号：２、ＦＳＲＹＡＲを意味する。
【０４４３】
「ＧＭ６０３−５」は、ＧＭ６０３  ５ｍｇ／ｋｇを意味する。
【０４４４】
「ＳＣＩ」は、脊髄傷害を意味する。
【０４４５】
「ＧＢ」は、Ｇｅｎｅｒｖｏｎ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＬＬＣを意味する。
【０４４６】
「Ｉ．Ｖ．」は、静脈内を意味する。
【０４４７】
「ＢＲ」は、行動回復を意味する。
【０４４８】
ＭＮＴＦ  ６ｍｅｒは比較的小さいため、安定性、溶解度、変異原性、免疫原性、または、遺伝子導入もしくは遺伝子組み換え方法による高コスト製造の点での、大きなペプチドの欠点を有しない。固相合成６ａａのコストは比較的低い。
【０４４９】
中大脳動脈閉塞（ＭＯＡＣ）マウス脳卒中モデルでは、ＩＶ注射によるＭＮＴＦ６ｍｅｒの後処理は、脳内の梗塞容積を低減し、用量依存的に神経学的欠損を低減した。高用量のＭＮＴＦ６ｍｅｒは、ビヒクルと比較して脳梗塞容積を７４％低減し、神経学的欠損をｐ＜０．０００１で有意に低減したが、これは、ＭＮＴＦ６ｍｅｒが脳卒中において有益な効果を有し得ることを示唆している。
【０４５０】
Ｌ−２−ヒドロキシグルタル酸（ＬＧＡ）は、神経系において酸化ストレスおよびアポトーシスを誘発する。ゼブラフィッシュバイオアッセイにおいて、ＭＮＴＦ６ｍｅｒはＣＮＳにおいてＬＧＡ誘発アポトーシスを保護し、中脳においてアポトーシスを８５％低減した（Ｐａｒｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２００４）。
【０４５１】
８ｍｍギャップでのラット坐骨神経離断試験では、ＭＮＴＦ６ｍｅｒ処置動物は、用量応答的に運動ニューロン再生を有意に改善し（最適用量でｐ＜０．０００２）、ＤＲＧ神経再生を促進した（Ｎｕｓｓｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ，２００３）。
【０４５２】
離断大腿神経ラットモデルにおいては、運動ニューロンの数は、ＭＮＴＦ６ｍｅｒ処置動物において用量応答的に筋肉に正確に投射した。最適用量では、筋肉に正確に投射した運動ニューロンの数は、皮膚に不正確に投射した運動ニューロンの数の３倍である（ｐ＜０．０００ｌ）。（Ｎｕｓｓｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ，２００３）。
【０４５３】
ゼブラフィッシュバイオアッセイにおいて、ＭＮＴＦ６ｍｅｒはＰＮＳにおいてＬＧＡ誘発アポトーシスを保護し、末梢神経筋接合部においてアポトーシスを４９％低減した（Ｐａｒｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２００４）。
【０４５４】
ＧＢ  ＧＭ６０３、運動ニューロン栄養因子の６−アミノ酸ペプチド類似体（ＦＳＲＹＡＲ；配列番号：２）（ＭＮＴＦ６ｍｅｒ）の、ボーラス静脈注射により脊髄を損傷または傷害から保護する能力を決定した（Ｔｙｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｅｎｇｅｓｓｅｒ−Ｃｅｓａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。ＧＭ６０３は、ＧＭＰコンプライアンス（ＣＳ  Ｂｉｏ  Ｃｏ．，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ，ＧＭＰ０ｌ３，ｌｏｔ  Ｃ８１１）のもとで化学的に合成された。本試験は、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｉｎｃ．（ＮＴＳ，Ｃｈａｒｌｅｓｔｏｎ，ＳＣ）との契約の下で行われた。ＧＭ６０３は固体としてＮＴＳに提供され、製剤はＮＴＳにより調製された（溶液は４℃で保存）。
【０４５５】
方法および材料
【０４５６】
動物
【０４５７】
それぞれ体重２２−２５グラムのＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）に、実験前に自由に餌および水を与えた。十分特性決定された空気衝撃デバイスを用いて、若年成体雌マウス（２５ｇｍ）に脊髄挫傷を与えた。
【０４５８】
実験群
【０４５９】
外科的処置の前に、所与の手術日においてすべての処置が含まれるように、マウスを乱塊法に基づき異なる処置群に割り当てた。調査者は、処置群については情報を与えられなかった。ＧＭ６０３の調剤（ＣＳ  Ｂｉｏ  Ｃｏ．，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ，ＧＭＰ０１３，ｌｏｔ  Ｃ８１１）は、ＮＴＳにより、ＧＭ６０３を４℃で保存された生理食塩溶液でもどすことにより原液として行われた。ビヒクル対照には生理食塩溶液を投与した。再灌流の開始直後に、尾静脈からの静脈内ボーラス注射を行った。
【０４６０】
脊髄傷害の誘発
【０４６１】
第１０胸椎（Ｔｌ０）で椎弓切除術を行う前に、マウスをケタミン（８０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔した。胸髄上部（Ｔ８）および腰髄上部（Ｔ１１）レベルに脊柱を角度付クランプで固定し、直径２ｍｍの真鍮チップを、背側脊髄を覆う露出した無傷硬膜上に空気圧で駆動した。衝撃器をすぐに取り外し、創傷を生理食塩水で注水し、筋肉および皮膚の開口部を縫合した。
【０４６２】
処置
【０４６３】
化合物の適用に関し、ＧＭ６０３を２週間毎日ｉ．ｖ．注射した。傷害直後、２つの異なる用量（１ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇ）でＧＭ６０３を適用した。傷害に関連した麻痺のため、および膀胱を空にしやすいことから、雌の動物を使用した。
【０４６４】
行動解析：ロータロッドおよびオープンフィールド試験
【０４６５】
行動解析に関し、手術前、ならびに手術後１、３、５、７、および１４日目に動物を試験した。Ｂａｓｓｏ−Ｂｅａｔｔｉｅ−Ｂｒｅｓｎａｈａｎ（ＢＢＢ）運動評定尺度を用いて確実にすべての被験体が最大スコアである２１を得るように、動物をオープンフィールドチャンバ（直径１２０ｃｍ、壁の高さ２５ｃｍ）に４分間入れた。マウスをオープンフィールドに４分間置き、ビデオテープに記録して評価した。さらに、ロータロッド上に留まることができる能力についてマウスを試験した。ロータロッド試験のために、マウスを１週間の学習期間に供し、その後で、マウスは加速するロータロッド上で活動することができた。第１、３、５、７、および１４日目に試験を行い、３回の連続的な試行において回転棒の上に１０秒より長く留まることができなくなるまでマウスを試験し、これをロータロッド失敗として定義する。最長時間は９０秒に設定した。処置群のスコアを記録し、傷害後の時間の関数として中央値をプロットした。
【０４６６】
組織学
【０４６７】
試験の終わりに動物を致死させ、脊髄を４％パラホルムアルデヒド中に固定した。分析のために、２０μｍ低温切開片に対しエリオクロムシアニン（ＥＣ）の染色を行い、白質と細胞体とを差別化し、病変部位を免れた組織の量を計算した。組織に対して免疫細胞化学的分析を行った。組織の温存は、傷害後Ｔ１０断片にわたる、１０個の均一に罹患した切片からのコンピュータ画像分析により決定された。総断面容積で割った壊死組織の容積を、パーセンテージに変換し、１００％から差し引いた。
【０４６８】
試験からの動物の除外
【０４６９】
以下のいくつかの基準に基づき、動物を試験から除外した：
【０４７０】
試験の終了前に（任意の時点で）動物が死亡する。死亡時まで収集されたデータは、ＧＢに提供された。
【０４７１】
傷害後、動物は発作様の活動を発現した。
【０４７２】
傷害中、または傷害直後に、過度の出血が検出された。
【０４７３】
統計解析
【０４７４】
結果は平均±標準誤差（ＳＥＭ）として表される。病変の容積および行動回復の差の有意性を、ｔ−検定を用いて分析した。
【表７】
2010509345.tif 000008
【０４７５】
評価項目
【０４７６】
行動的欠損
【０４７７】
組織学的解析
【０４７８】
ＧＭ６０３の脊髄傷害からの保護効果。脊髄傷害について動物を評価した。
【０４７９】
すべての試験群をＮＴＳに提供した。ＧＭ６０３は固体材料としてＮＴＳに提供した。試験群のすべての動物には、上に示した通り投与を行った。
【０４８０】
結果
【０４８１】
マウスにおける脊髄傷害。ＳＣＩ試験。これらの試験においてＳＣＩの相対的重症度を評価した。データは、ビヒクルまたはＧＭ６０３を静脈注射されたＳＣＩに罹患したマウスからのものであった。
【０４８２】
病変の容積：ビヒクル注射群と比較して、ＧＭ６０３群（１ｍｇ／ｋｇと５ｍｇ／ｋｇの両方）において脊髄内の病変の容積は有意に減少した。ＧＭ６０３は、１ｍｇ／ｋｇから５ｍｇ／ｋｇで病変の容積の用量依存的な低減を示した（表６）。病変の容積は図９にプロットされている。脊髄に存在する病変の容積の減少割合を表６に示す。表に示されるように、１ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇでのＧＭ６０３は、ビヒクルと比較して、病変の容積においてそれぞれ２８％または５３％の減少を示した。図１０は、傷害動物からの脊髄の代表的な写真を示す。図１０は、ビヒクル処置動物においては、病変の容積（赤色染色）が非常に大きく、一方ＧＭ６０３処置動物（５ｍｇ／ｋｇ）においては、病変の容積（赤色染色）がそれより著しく小さいことを示している。
【表８】
2010509345.tif 000009
【０４８３】
行動の測定
【０４８４】
マウスをロータロッド試験に供した。最長時間９０秒の間、ロータロッド上に留まり続ける能力について、動物を試験した。運動能力を測定するために使用したロータロッド試験でマウスを試験した。装置（モデルＤＳ３７）は、直径２５ｃｍのディスクにより６つの区画にさらに分割された、２．５ｃｍの直径を有する棒で構成された。棒は２２ｒｐｍの一定速度で回転した。１、３、５、７、および１４日目に動物を試験した。回転する棒に留まった時間（最大９０秒）を記録した。図１１に示されるように、すべての動物が、ロータロッド上に留まる初期の能力を示した。しかしながら、３日後、群間で明確な区別が見られた。３日目および５日目において差は有意であり（Ｐ＜０．０５）、７日目には有意性はさらに大きくなった（Ｐ＜０．０１）。
【０４８５】
Ｂａｓｓｏ−Ｂｅａｔｔｉｅ−Ｂｒｅｓｎａｈａｎ（ＢＢＢ）運動評定尺度を用いて確実にすべての被験体が最大スコアである２１を得るように、動物をオープンフィールドチャンバ（直径１２０ｃｍ、壁の高さ２５ｃｍ）で４分間評価した。マウスをオープンフィールドに４分間置き、ビデオテープに記録して評価した。図１２に見られるように、傷害に起因して、１日目にすべての動物が同じ運動欠損を示した。しかしながら、３日目には、ＧＭ６０３処置動物は、ビヒクル処置動物と比較して有意な改善を示した。５日目までに、有意性はＰ＜０．０１であった。
【０４８６】
考察
【０４８７】
ＭＮＴＦは、神経障害からの保護を提供することができ、また傷害または移植後の神経組織の再生を可能とし得る栄養因子である。ここで行われた試験は、ＭＮＴＦ６ｍｅｒ類似体ＧＭ６０３の、効果的および効率的にＳＣＩの有害な影響から脊髄を保護する能力を示している。１４日間毎日の１ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇでの注射によるＧＭ６０３の静脈内投与は、病変の容積および行動的属性の減少による、脊髄におけるＳＣＩに対する用量依存的な保護効果を示した。これらの試験は、ＧＭ６０３がＳＣＩにおいて有益な効果を有し得ることを示唆している。
【０４８８】
静脈内投与された場合、ＧＭ６０３は、マウスにおける脊髄傷害に対する保護作用を有することが判明した。
【０４８９】
実施例４
【０４９０】
ＡＬＳ：筋萎縮性側索硬化症マウスモデルにおけるＧｍ６０４試験
【０４９１】
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）マウスモデルにおける有効性について、ＭＮＴＦペプチド類似体ＧＭ６０４（ＦＳＲＹＡＲ；配列番号：２）を試験した。ＡＬＳマウスモデルにおけるＧＭ６０４の有効性を決定するために、ＧＭ６０４を２つの用量でマウスに８０日齢で静脈注射し、死亡するまで続けた。疾患発症年齢、死亡年齢、および疾患の行動発現の変化について動物を検査した。複数回用量でのＧＭ６０４（１ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇ）の静脈内（ｉ．ｖ．）投与を検査した。ＧＭ６０４の投与は、疾患発症年齢、死亡年齢、および疾患の行動発現の変化を示したが、これは用量依存的効果を示していた。１ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇ両方のＧＭ６０４は、動物における推定寿命の有意な延長を示したが、これは、神経学的欠損の維持につながる。これらのデータは、ＧＭ６０４がＡＬＳマウスモデルにおける神経保護作用を有し得ることを示している。
【０４９２】
本実施例に関する略語／専門用語。
【０４９３】
「ＭＮＴＦ」は、運動ニューロン栄養因子を意味する。
【０４９４】
「ＭＮＴＦ６ｍｅｒ」は、ＭＮＴＦの６−アミノ酸ペプチド類似体を意味する。
【０４９５】
「ＧＭ６０４」は、ＡＬＳに対するＭＮＴＦの６−アミノ酸ペプチド類似体（ＦＳＲＹＡＲ）を意味する。
【０４９６】
「ＧＭ６０４−１」は、ＧＭ６０４  １ｍｇ／ｋｇを意味する。
【０４９７】
「ＧＭ６０４−５」は、ＧＭ６０４  ５ｍｇ／ｋｇを意味する。
【０４９８】
「ＡＬＳ」は、筋萎縮性側索硬化症を意味する。
【０４９９】
「ＧＢ」は、Ｇｅｎｅｒｖｏｎ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＬＬＣ．を意味する。
【０５００】
「Ｉ．Ｖ．」は、静脈内を意味する。
【０５０１】
ＧＢ被験物質ＧＭ６０４、運動ニューロン栄養因子の６−アミノ酸ペプチド類似体（ＦＳＲＹＡＲ；配列番号：２）（ＭＮＴＦ６ｍｅｒ）の、ＡＬＳマウスモデルにおけるＡＬＳ疾患の臨床的兆候の発症、臨床的兆候の改善、および疾患の末期を遅延または調整する能力の評価。動物を、ＧＭＰコンプライアンス（ＣＳ  Ｂｉｏ  Ｃｏ．，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ，ＧＭＰ０ｌ３，ｌｏｔ  Ｃ８１１）のもとで化学的に合成されたＧＭ６０４の静脈注射に供した。ＧＭ６０４は固体および製剤として提供された（溶液は４℃で保存）。
【０５０２】
方法および材料
【０５０３】
動物
【０５０４】
ＡＬＳマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）を、特定病原体を含まない（ＳＰＦ）条件下で飼育および維持した。それぞれ体重２２−２５グラムの動物に、実験前に自由に餌および水を与えた。若年成体マウス（２５ｇｍ）を、ＧＭ６０４の静脈注射に供した。
【０５０５】
実験群
【０５０６】
外科的処置の前に、所与の手術日においてすべての処置が含まれるように、マウスを乱塊法（ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｂｌｏｃｋ  ｄｅｓｉｇｎ）に基づき異なる処置群に割り当てた。調査者は、処置群については情報を与えられなかった。ＧＭ６０４の調剤は、ＧＭ６０４を４℃で保存された生理食塩溶液でもどすことにより原液として行われた。ビヒクル対照には生理食塩溶液を投与した。尾静脈を介した静脈内ボーラス注射。
【０５０７】
処置
【０５０８】
化合物の適用に関し、ＧＭ６０４を、動物が死亡するまで毎日ｉ．ｖ．注射した。２つの異なる用量（１ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇ）でＧＭ６０４を適用した。この試験に必要とされる動物の数のために、雄および雌の両方を使用した。
【０５０９】
行動解析：
【０５１０】
ロータロッド
【０５１１】
行動解析に関し、疾患の発症（８０日目）前および動物が死亡するまで２日おきに動物を試験した。ロータロッド上に留まることができる能力についてマウスを試験した。ロータロッド試験のために、マウスを１週間の学習期間に供し、その後で、マウスは加速するロータロッド上で活動することができた。試験は２日おきに行い、３回の連続的な試行において回転棒の上に１０秒より長く留まることができなくなるまでマウスを試験し、これをロータロッド失敗として定義する。最長時間は１８０秒に設定した。処置群のスコアを記録し、年齢の関数として中央値をプロットした。
【０５１２】
握力
【０５１３】
握力計（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、週２回、マウスの前肢の力をニュートンで測定した。これは、尾部により直線的にセンサから引き離したときにマウスが前肢で棒に加えた力のピーク量を測定した。４回の試行後、最も高い結果を分析に使用した。
【０５１４】
尾部試験
【０５１５】
マウスを尾部で空中に持ち上げ、後肢の伸長を検査した。後肢の伸長の欠如は、尾部試験失敗と定義された。
【０５１６】
臨床評価
【０５１７】
以下の基準に基づき、マウスに対し０から４の臨床スコアを評点した。脱力感の兆候なし（０）；振戦および傾斜での反射の喪失（１）；後肢１本の不全麻痺（２）；後肢２本の不全麻痺（３）；後肢１本または２本の麻痺（４）。人道的理由から、レベル４のマウスは屠殺した。
【０５１８】
組織学
【０５１９】
試験の終わりに動物を致死させ、分析のために脊髄を４％パラホルムアルデヒド中に固定した。
【０５２０】
試験からの動物の除外
【０５２１】
いくつかの基準に基づき、動物を試験から除外した：
【０５２２】
試験から除外された動物はなかった。
【０５２３】
統計解析。
【０５２４】
結果は平均±標準誤差（ＳＥＭ）として表される。発症年齢、死亡年齢、および行動発現の差の有意性を、ｔ−検定を用いて分析した。
【表９】
2010509345.tif 000010
【０５２５】
評価項目
【０５２６】
疾患発症年齢
【０５２７】
死亡年齢
【０５２８】
行動の欠陥
【０５２９】
組織学的解析
【０５３０】
すべての試験群をＮＴＳに提供した；ＧＭ６０４は固体材料としてＮＴＳに提供した。試験群のすべての動物には、上に示した通り投与を行った。
【０５３１】
結果
【０５３２】
ＡＬＳ試験。これらの試験においてＡＬＳの相対的重症度を評価した。データは、ビヒクルまたはＧＭ６０４を静脈注射されたＡＬＳ罹患マウスからのものであった。
【０５３３】
疾患発症年齢：ビヒクル注射群と比較して、ＧＭ６０４（１ｍｇ／ｋｇと５ｍｇ／ｋｇの両方）で処置されたＡＬＳマウスにおいて、疾患発症年齢が有意に延長した。ＧＭ６０４は、１ｍｇ／ｋｇから５ｍｇ／ｋｇで疾患発症年齢の用量依存的な遅延を示した（表７）。疾患発症の特性が図１３にプロットされている。疾患発症年齢の増加割合を表７に示す。表に示されるように、１ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇでのＧＭ６０４は、ビヒクルと比較して、疾患発症年齢においてそれぞれ１２％または２７％の増加を示した。
【表１０】
2010509345.tif 000011
【０５３４】
死亡年齢
【０５３５】
ビヒクル注射群と比較して、ＧＭ６０４（１ｍｇ／ｋｇと５ｍｇ／ｋｇの両方）で処置されたＡＬＳマウスにおいて、死亡年齢が有意に延長した。ＧＭ６０４は、１ｍｇ／ｋｇから５ｍｇ／ｋｇで死亡年齢の用量依存的な遅延を示した（表８）。死亡年齢が図１４にプロットされている。死亡年齢の増加割合を表８に示す。表に示されるように、１ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇでのＧＭ６０４は、ビヒクルと比較して、死亡年齢においてそれぞれ１６％または３０％の増加を示した。
【表１１】
2010509345.tif 000012
【０５３６】
死亡率
【０５３７】
本試験において、疾患と関連しない死亡は見られなかった。
【０５３８】
行動の測定。
【０５３９】
ロータロッド：
【０５４０】
マウスをロータロッド試験に供した。最長時間１８０秒の間、ロータロッド上に留まり続ける能力について、動物を試験した。運動能力を測定するために使用されるロータロッド試験でマウスを試験した。装置（モデルＤＳ３７）は、直径２５ｃｍのディスクにより６つの区画にさらに分割された、２．５ｃｍの直径を有する棒で構成された。棒は２２ｒｐｍの一定速度で回転した。８０日目から始め、動物を週２回試験した。回転する棒に留まった時間（最大１８０秒）を記録した。図１５に見られるように、疾患の発症まで、すべての動物がロータロッド上を能率的に進むことができた（図１５参照）。
【表１２】
2010509345.tif 000013
【０５４１】
握力
【０５４２】
疾患の進行中、およびＧＭ６０４の存在下で、握力についてマウスを検査した。ＧＭ６０４で処置されたＡＬＳマウスは、対照マウスと比較すると、握力の低下において有意な遅延を示した（図１６Ａおよび表１０）。全般的に、１ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇのＧＭ６０４で処置されたマウスは、対照動物よりも能力は勝っていた。
【表１３】
2010509345.tif 000014
【０５４３】
臨床評価
【０５４４】
疾患の進行中、およびＧＭ６０４の存在下で、臨床スコアについてマウスを検査した。ＧＭ６０４で処置されたＡＬＳマウスは、対照マウスと比較すると、臨床スコアの低下において有意な遅延を示した（図１６Ｂおよび表１１）。全般的に、１ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇのＧＭ６０４で処置されたマウスは、対照動物よりも能力は勝っていた。
【表１４】
2010509345.tif 000015
【０５４５】
ＭＮＴＦは、神経障害からの保護を提供することができ、また傷害または移植後の神経組織の再生を可能とし得る栄養因子である。ここで行われた試験は、ＭＮＴＦ６ｍｅｒ類似体ＧＭ６０４の、効果的および効率的にＡＬＳの有害な影響から脊髄を保護する能力を示している。毎日１ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇでの注射のＧＭ６０４の静脈内投与は、疾患発症年齢、死亡年齢、および行動パラメータの増加による、ＡＬＳマウスモデルにおける用量依存的な保護効果を示した。これらの試験は、ＧＭ６０４がＡＬＳにおいて有益な効果を有し得ることを示した。
【０５４６】
静脈内投与された場合、ＧＭ６０４は、マウスにおけるＡＬＳに対する保護作用を有することが判明した。
【０５４７】
実施例５Ａ
【０５４８】
マウスパーキンソン病モデル
【０５４９】
ＧＭ６（ＦＳＲＹＡＲ，配列番号：２）（ＣＳ  Ｂｉｏ  Ｃｏ．，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）を、マウスパーキンソン病（ＰＤ）モデルにおける有効性について試験した。
【０５５０】
ＰＤにおけるＧＭ６の有効性を決定するために、マウスに１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）を注射してＰＤを誘発し、いくつかの用量でＧＭ６を静脈注射して、ＰＤの減衰に対する影響を決定した。ＧＭ６（１、５、１０、または２０ｍｇ／ｋｇ）の５日間（１日２回）の静脈内（ｉ．ｖ．）投与を検査した。ＧＭ６の投与は、マウスにおけるＰＤの用量依存的な減衰を示し、２０ｍｇ／ｋｇで最も高い有効性を示した。行動、生化学、および組織学的解析は、ＧＭ６のＰＤにおける独特の効果を実証する減衰を示した。これらのデータは、ＧＭ６が、ｉ．ｖ．注射後にＰＤのマウスモデルにおいて効果的であり、ＰＤ患者の潜在的な処置法となり得ることを示唆している。
【０５５１】
本実施例に関する略語／専門用語。
【０５５２】
「ＭＮＴＦ」は、運動ニューロン栄養因子を意味する。
【０５５３】
「ＧＭ６」および「６ｍｅｒ」は、それぞれ、ＭＮＴＦの６アミノ酸ペプチド類似体を意味する。
【０５５４】
「ＰＤ」は、パーキンソン病を意味する。
【０５５５】
「ＭＰＴＰ」は、１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジンを意味する。
【０５５６】
「ＤＯＰＡＣ」は、ジヒドロキシフェニル酢酸を意味する。
【０５５７】
「ＨＶＡ」は、ホモバニリン酸を意味する。
【０５５８】
「ＤＡ」は、ドーパミンを意味する。
【０５５９】
「Ｇｅｎｅｒｖｏｎ」および「ＧＢ」は、それぞれＧｅｎｅｒｖｏｎ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＬＬＣを意味する。
【０５６０】
「Ｉ．Ｖ．」は、静脈内を意味する。
【０５６１】
ＧＭ６のパーキンソン病（ＰＤ）マウスモデルにおける有効性を決定するための、運動ニューロン栄養因子（ＭＮＴＦ）の６アミノ酸類似体（ＧＭ６）の能力の決定。
【０５６２】
ＧＭ６は、合成６アミノ酸ペプチド（ＭＮＴＦ）である。ＧＭ６は固体としてＮＴＳに提供され、製剤はＮＴＳにより調製された（溶液は４℃で保存）。
【０５６３】
中枢神経系疾患および障害の処置に対する大きな障害は、薬剤を中枢神経系に送達することが困難であることである。薬剤の生物学的利用能および様々な神経障害に対する効果の決定は、可能性のある治療的介入のために重要である。
【０５６４】
静脈注射による、ＰＤマウスモデルにおけるＧＭ６の有効性の評価。
【０５６５】
方法および材料
【０５６６】
試験デザイン。雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、後述するようにＭＰＴＰを注射し、示された用量のＧＭ６によるＰＤからの保護について検査した。行動発現、生化学および組織学的変化について、動物を検査した。
【０５６７】
ＭＰＴＰ処置。Ｃ５７ＢＬ／６に注射し（ｉ．ｐ．、０．１ｍｌ水中で２０ｍｇ／ｋｇで、２時間間隔で４つの用量のｌ−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン、ＭＰＴＰ、Ｓｉｇｍａ  Ｍ−０８９６）、注射から１週間後に検査した。各群における対照マウスは、生理食塩水の４回のｉ．ｐ．注射を受けた。注射後２４時間の間、マウスを加熱ブランケット上に保持した。
【０５６８】
ＭＮＴＦ（ＧＭ６）処置のためのＭＮＴＦ投与について、マウスは１日２回（１２時間間隔）、１、５、１０、または２０ｍｇ／ｋｇの様々な用量の生理食塩水中ＭＮＴＦの静脈注射を受けたが、第１のＭＰＴＰ注射から３０分後に開始し、さらにＭＰＴＰの最後の注射から４日間を通して続けた。対照マウスには生理食塩水のみを投与した。各群Ｎ＝１０である。
【０５６９】
行動試験。行動試験には雄のマウスを使用した。すべての動物を、１２時間の明暗サイクル（０７００から１９００まで明かりをつける）に維持し、自由に餌および水を採らせた。自発運動活性を評価するために、それぞれ３つの赤外線ビームおよび自動計数システムを備えた４つのプレキシグラス円筒（２３ｃｍ×３０ｃｍ、直径×高さ）から成る活性モニタを使用した。自発運動活性試験は、マウスを円筒内に置くことで開始した。３分間の環境適応の後、５分間あたりフォトセル装置を横切る赤外線ビームの数を計数することにより、活性を評価した。感覚運動の連携を評価するために、マウスをロータロッド上のタスクで評価した。ロータロッドユニットは、回転スピンドル（直径７．３ｃｍ）、および１度に５匹のマウスを試験するための５個の個別の区画で構成される。連続２日間の１日２回のトレーニング（１日目は速度１２ｒｐｍ、２日目は１８ｒｐｍ）の後、試験セッションの３日目に試験の回転速度を２５ｒｐｍに増加させた。各マウスが回転する棒に留まった時間を、５分間隔および最大試行長さを１試行あたり６０秒として、３回の試行について記録した。データは、３回の試験試行に対する回転棒上の平均時間として示されている。
【０５７０】
脳内モノアミンの定量。
【０５７１】
解剖した脳の領域を０．１Ｍ過塩素酸および０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ（１０ｍｇ／１００μｌ）中で超音波照射した。次いで抽出物を１５分間遠心分離し、上清を回収して−２０℃で保存した。モノアミン（ドーパミン、［ＤＡ］）および代謝産物（ジヒドロキシフェニル酢酸［ＤＯＰＡＣ］、ホモバニリン酸［ＨＶＡ］）を、電気化学検出を用いた高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で測定した。
【０５７２】
免疫組織化学。すべてのマウス（１／２脳）を４％ＰＦＡ中に入れ固定した。脳を４％ＰＦＡ中で１２時間、４℃で固定し、次いでＰＢＳ中３０％スクロース中に保存した。５０マイクロメートルの切片を切り出し、免疫組織化学のために、１：１０００希釈のＴＨ抗体で処理した（Ｓｉｇｍａ  Ｔ−１２９９）。チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）免疫反応性を、モノクローナル抗ＴＨ抗体を使用して可視化した。黒質および腹側被蓋領域におけるＴＨ免疫陽性細胞の予備的定量化を、画像分析を使用して行った。切片を乾燥させてＤｅｐｅｘに設置した。細胞計数は、コンピュータ支援ステレオロジカルツールボックスを使用して行った。すべての細胞計数は、薬物処置についての情報を伏せて行い、１００倍の倍率で行った。
【０５７３】
統計解析。結果は平均±標準偏差（ＳＤ）として表した。データにおける差の有意性を、ｔ−検定を用いて分析した。
【０５７４】
試験からの動物の除外。
【０５７５】
以下のいくつかの基準に基づき、動物を試験から除外した：
【０５７６】
試験の終了前に（任意の時点で）死亡した動物。
【０５７７】
被験物質の投与後に重度の合併症を発現した動物。
【０５７８】
処置群。すべての群はＧＭ６に供されたか、または対照であった。動物（６０匹の動物）を、示された用量のビヒクルまたはＭＮＴＦの尾静脈によるボーラス注射に供した。５日間、１日あたり２回動物に注射した。
【表１５】
2010509345.tif 000016
【０５７９】
評価項目
【０５８０】
マウスにおけるＰＤの調節
【０５８１】
すべての試験群をＮＴＳに提供した。ＧＭ６は固体材料としてＮＴＳに提供した。試験群のすべての動物には、上に示した通り投与を行った。
【０５８２】
行動試験。ＭＳのマウスモデルにおけるＧＭ６の有効性を評価した。ビヒクルまたはＧＭ６の（示された用量で）静脈内注射を受けたマウスからのデータ。
【０５８３】
行動解析：ＭＰＴＰを用いてＰＤを誘発した後、上に示された用量でＧＭ６をマウスに投与した。動物を２日目および毎日検査して、ＭＰＴＰおよびＧＭ６による動物の行動を決定した。マウスにＭＰＴＰ投与を開始してから５日間、毎日、ＧＭ６を注射した。ＧＭ６を最終のＭＰＴＰを注射してから３０分後に開始し、さらに４日間継続した。表１２および１３に示されるように、ビヒクルで処置したマウスは、対照または処置動物と比較して、行動スコア（自発的活性およびロータロッド試験図）の有意な増加を示した。ＧＭ６を用いた処置は、行動において有意な改善（減衰）を示した。５、１０、２０ｍｇ／ｋｇでのＧＭ６は、有意な利益を示したが、１ｍｇ／ｋｇでは、全く改善を示さなかった。
【０５８４】
自発運動活性
【表１６】
2010509345.tif 000017
【０５８５】
ロータロッド試験
【表１７】
2010509345.tif 000018
【０５８６】
ＭＰＴＰ処置動物の脳内のモノアミンおよび代謝物のレベル。ＭＰＴＰを用いた処置中、変化し、ＰＤのマーカーである、脳におけるモノアミンおよび代謝物のレベルのＧＭ６の有効性を決定した。表１４および図２１Ａ〜２１Ｃに見られるように、ドーパミン、ＤＯＰＡＣ、およびＨＶＡのすべてのレベルは、ビヒクル処置動物と比較して、ＧＭ６処置動物において高かった。２０ｍｇ／ｋｇ／日は、ＭＰＴＰ処置後、最大の保護を示した。
【表１８】
2010509345.tif 000019
【０５８７】
細胞数。行動学的試験後、動物は、７日目で屠殺して、脳の１／２を採取し、黒質緻密部（ＳＮｐｃ）内のチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）陽性神経細胞を染色した。ＭＰＴＰは、これらの神経細胞を選択的に殺し、これは、疾患の減衰におけるＧＭ６の効果を決定するための優れたマーカーである。ＳＮｐｃ内の細胞数は、ＴＨ陽性神経細胞の数を数えることによって決定し、表１５および図２２に示した。表および図に見られるように、ＧＭ６の用量が増加すると、細胞数は、脳内で（細胞消失を阻止した）。これは、ＧＭ６がＰＤ誘発の有害な影響から脳を保護することを示唆している。
【表１９】
2010509345.tif 000020
【０５８８】
ＭＮＴＦは、神経障害からの保護を提供することができ、また傷害または移植後の神経組織の再生を可能とし得る栄養因子である。ここで行われた試験は、マウスモデルにおけるＰＤを減衰するＭＮＴＦの６アミノ酸類似体（ＧＭ６）の有効性を実証している。１、５、１０、および２０ｍｇ／ｋｇボーラス用量でのＧＭ６の静脈内投与は、５日間にわたって、ＰＤ行動、生化学、および組織学の用量依存的な減少を実証した。これは、ＧＭ６が静脈内投与を介してマウスにおけるＰＤの程度を限定するのに有効であり、本疾患を処置するのに有益であり得ることを実証した。
【０５８９】
静脈内投与された場合、ＧＭ６はＰＤのマウスモデルにおいて有効であることが判明した。ＧＭ６の有効性は、用量依存的であり、ＧＭ６がＰＤに有効であり得ることを示す。
【０５９０】
実施例５Ｂ
【０５９１】
パーキンソン病の細胞培養モデルにおけるＭＮＴＦの試験
【０５９２】
ＭＮＴＦを、パーキンソン病（ＰＤ）の細胞培養モデルにおける有効性について試験した。ＰＤの細胞培養モデルにおけるＭＮＴＦの有効性を決定するために、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を２４時間のサルソリノール（１００μＭ）暴露に供した。ＭＮＴＦの有無に関わらず、細胞を異なる濃度で処置し、細胞生存率について検査した。サルソリノールは、２４時間の暴露後、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞内に細胞死を誘発した。培地へのＭＮＴＦの付加は、サルソリノール暴露からの用量依存的な保護を示した。また、ワートマニン（ＰＩ３Ｋ阻害剤）を用いた処置は、ＭＮＴＦの効果を無効にした。これらのデータは、ＭＮＴＦがＰＤの細胞培養モデルにおいて、サルソリノールの投与後に神経保護作用を有し、ＰＩ３Ｋ経路を通じて機能を果たし得ることを実証した。
【０５９３】
本実施例に関する略語／専門用語
【０５９４】
「ＭＮＴＦ」は、運動ニューロン栄養因子を意味する。
【０５９５】
「ＰＤ」は、パーキンソン病を意味する。
【０５９６】
「ＧＢ」は、Ｇｅｎｅｒｖｏｎ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＬＬＣを意味する。
【０５９７】
「ＣＶ」は、細胞生存率を意味する。
【０５９８】
「ＧＭ」は、ＭＮＴＦを意味する。
【０５９９】
「ＷＲＴ」は、ワートマニンを意味する。
【０６００】
「Ｓａｌ」は、サルソリノールを意味する。
【０６０１】
多くの研究が、末梢の坐骨神経、末梢の筋皮神経、脳顔面神経、脳舌下神経、および首、胸部、および上肢の筋肉を制御する脊髄の一部を含む、様々なラット神経系におけるＭＮＴＦの有効性を実証している（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。さらに、６週齢時に１回用量の３５ｎｇ  ＭＮＴＦを投与された二重劣性遺伝子を有する動揺病マウス（ＮＩＨ）は、この株における神経変性遺伝疾患を停止した。
【０６０２】
独立した研究グループが、独自の確立されたアッセイおよびプロトコルを用いて以下のＣＮＳおよびＰＮＳ実験を行った。１．ＧＭ６の血液脳関門通過の研究において、０．２ｍｇ／ｋｇおよび２ｍｇ／ｋｇ単回ボーラス用量でのＧＭ６の静脈内投与は、４時間後、脳内にＧＭ６レベルの用量依存的増加を実証した。２．中大脳動脈閉塞（ＭＯＡＣ）マウス脳卒中モデルでは、ＩＶ注射によるＧＭ６の後処置は、脳内の梗塞容積を低減し、用量応答的に神経学的欠損を低減した。高用量のＧＭ６は、ビヒクルと比較して脳梗塞容積を７４％低減し、神経学的欠損をｐ＜０．０００１で有意に低減した。３．Ｌ−２−ヒドロキシグルタル酸（ＬＧＡ）は、神経系において酸化ストレスおよびアポトーシスを誘発する。ゼブラフィッシュバイオアッセイにおいて、ＧＭ６はＣＮＳにおいてＬＧＡ誘発アポトーシスを保護し、中脳においてアポトーシスを８５％低減した。４．８ｍｍギャップでのラット坐骨神経離断試験では、ＧＭ６処置動物は、用量応答的に運動ニューロン再生を有意に改善し（最適用量でｐ＜０．０００２）、ＤＲＧ神経再生を促進した。５．離断大腿神経ラットモデルにおいては、運動ニューロンの数は、ＧＭ６処置動物において用量応答的に筋肉に正確に投射した。最適用量では、筋肉に正確に投射した運動ニューロンの数は、皮膚に不正確に投射した運動ニューロンの数の３倍である（ｐ＜０．０００ｌ）。６．ゼブラフィッシュバイオアッセイにおいて、ＧＭ６はＰＮＳにおいてＬＧＡ誘発アポトーシスを保護し、末梢神経筋接合部においてアポトーシスを４９％低減した。７．ＣＮＳ疾患に罹患する患者からの脳脊髄液（ＣＳＦ）は、可溶性因子を含み、神経突起絶縁および神経細胞死を誘発する。ＧＭ６は、ハンチントン病（２７１％）、ＭＳ（２４６％）、脳卒中（２０５％）、パーキンソン（１９８％）、アルツハイマー（１９１％）、およびＡＬＳ（１７５％）に罹患する患者のＣＳＦにおいて、有意に細胞生存率を向上させた。これらのデータは、ＭＮＴＦが、動物所見の強い確証である、神経疾患に罹患する患者のＣＳＦにより刺激された細胞死に対して神経細胞を保護することができることを示唆している。
【０６０３】
パーキンソン病の細胞培養モデルにおける、ＧＭＰグレードＧＭ６の有効性（本報告書ではＭＮＴＦと称する）（Ｓｈａｖａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。本試験は、損傷からＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を保護するためのＭＮＴＦの能力を試験するために実施された。ＭＮＴＦは固体として提供され、製剤は調製された（溶液は４℃で保存）。
【０６０４】
方法および材料
【０６０５】
細胞
【０６０６】
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入し、最小必須培地、Ｈａｍｓ  Ｆ−１２培地、およびＨａｎｋｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を２：１：１の割合で含む、完全培地に培養した。培地はまた、ペニシリン（５０Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（５０ｍｇ／ｍｌ）とともに、１０％ウシ胎仔血清も含んだ。細胞は、フラスコ内で培養され、３７℃で、大気中５％ＣＯ２を含む加湿されたインキュベーターで維持された。培地は、２〜３日ごとに交換された。
【０６０７】
実験群
【０６０８】
操作前に、培養は、乱塊法計画に基づいて、異なる処置群に割り当てられた。調査者は、処置群については情報を与えられなかった。
【０６０９】
パーキンソン病の細胞モデルの誘発
【０６１０】
細胞生存率の実験のために、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（０．５×１０５／ウェル）を、９６ウェル細胞培養プレート中で培養し、（±）ＳＡＬ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）のみ、または異なる濃度の（ＧＭ６）（Ｇｅｎｅｒｖｏｎ）とともに、ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ（ＰＩ−３キナーゼ）阻害剤である、ワートマニン（ＷＲＴ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて、または用いずに、２４時間処置した。細胞生存率は、Ｔｈｉａｚｏｌｙｌ  ｂｌｕｅ（ＭＴＴ）アッセイにより決定された。
【０６１１】
統計解析
【０６１２】
結果は平均±標準偏差（ＳＤ）として表され、統計的有意性は、Ｓｉｇｍａ−ｓｔａｔソフトウェアを使用して、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−検定によって算出され、Ｐ＜０．０５を有意な値として見なされた。
【表２０】
2010509345.tif 000021
【０６１３】
評価項目
【０６１４】
細胞数
【０６１５】
すべての試験群をＮＴＳに提供した。ＭＮＴＦは固体材料としてＮＴＳに提供した。試験群のすべての培養には、上に示した通り投与を行った。サルソリノールおよびワートマニンをＳｉｇｍａから購入した。ＧＭ６＝例示的なＭＮＴＦ  ＦＳＲＹＡＲ配列番号：２。
【０６１６】
結果
【０６１７】
ＰＤの細胞培養モデル。ＰＤ試験。細胞生存率における相対的変動は、ＧＭ６±サルソリノール（Ｓａｌ）で培養された場合、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞において評価された。データは、ビヒクルまたはＭＮＴＦ（ＧＭ６）で処置された細胞培地からであった。
【０６１８】
細胞生存率。細胞培養は、様々な濃度のＧＭ６（０．１〜１０ｍｇ／ｍｌ）±サルソリノール（１００μＭ）およびワートマニン（ＷＲＴ、１０μＭ）でインキュベートし、細胞数を決定した。得られたデータに基づいて、ＧＭ６は、対照処置細胞と比較して、細胞数の用量依存的増加を示した。１０ｍｇ／ｍｌで、対照処置細胞と比較して、細胞数が１９．２％増加した。１０ｍＭで、ワートマニンを用いた細胞の処置は、ＧＭ６の作用におけるＰＩ３Ｋの役割を示唆する細胞数の増加を阻止した。
【０６１９】
１００μＭで、サルソリノールを用いた細胞の処置は、ドーパミン作動性ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞において、細胞生存率の減少を実証した。サルソリノールを用いた処置から２４時間後、細胞数が６３．７％減少した。細胞へのＧＭ６の付加は、Ｓａｌ誘発細胞死を阻止し、ＭＴＴアッセイによって評価されるように、細胞生存を有意に増加した。１００μＭ濃度で、ＳＡＬは、３６．５％まで細胞生存率を減少させ、０．１、１．０、および１０．０ｍｇ／ｍｌで、ＧＭ６を用いた同時処置は、それぞれ、６６％、８５％、および９５％まで細胞生存率を増加した（図１７）。ＷＲＴ（１０μＭ）は、ＧＭ６の神経防護作用効果をブロックした（図１７）。
【表２１】
2010509345.tif 000022
【０６２０】
サルソリノール（Ｓａｌ）を１００μＭで加え、ワートマニン（ＷＲＴ）を１０μＭで加えた。
【０６２１】
ＭＮＴＦ（ＧＭ）は、神経障害からの保護を提供することができ、また傷害または移植後の神経組織の再生を可能とし得る栄養因子である。ここで行われた試験は、効果的かつ効率的に、ＰＤ（サルソリノール）の有害な影響からドーパミン作動性ニューロン（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞）を保護するためのＭＮＴＦの能力を実証している。２４時間、０．１、１、および１０ｍｇ／ｍｌでのＭＮＴＦの投与は、細胞数の増加によって、サルソリノールを用いて細胞死に対するＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の用量依存的な保護効果を実証した。これらの試験は、ＭＮＴＦがＰＤにおいて有益な効果を有し得ることを実証した。
【０６２２】
ＭＮＴＦ（ＧＭ６）を投与した場合、細胞死（アポトーシスを誘発したサルソリノール）のＰＤ細胞培養モデルから保護することが明らかであった。
【０６２３】
実施例６
【０６２４】
ＣＳＦ傷害に対する保護におけるＭＮＴＦの試験
【０６２５】
ＧＭ６を、神経傷害のモデルにおける有効性について試験した。対照群および８つの神経疾患群のそれぞれからの５つの疾患特異的ヒト脳脊髄液（ＣＳＦ）試料を、第１次神経細胞で試験し、神経細胞死における効果を決定した。また、ＧＭ６の効果を、ＣＳＦにより誘発される傷害からの保護について検査した。疾患特異的ヒトの８つの異なる神経障害からのＣＳＦは、１０％溶液として適用する場合、神経細胞死を誘発した。ＧＭ６は、本傷害からの保護を提供した。これらの試験は、神経疾患に罹患するヒトからのＣＳＦが、細胞死を誘発するある因子を含み、ＧＭ６が、これらの効果から保護し得ることを実証した。これらの試験は、神経障害のモデルにおけるＧＭ６の有効性をさらに実証する。
【０６２６】
本実施例に関する略語／専門用語
【０６２７】
「ＭＮＴＦ」は、運動ニューロン栄養因子を意味する。
【０６２８】
「ＧＭ６」および「６ｍｅｒ」はそれぞれ、ＭＮＴＦの例示的な６アミノ酸ペプチド類似体：ＦＳＲＹＡＲ（配列番号：２）を意味する。
【０６２９】
「ＣＳＦ」は、脳脊髄液を意味する。
【０６３０】
「Ｇｅｎｅｒｖｏｎ」および「ＧＢ」はそれぞれ、Ｇｅｎｅｒｖｏｎ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＬＬＣを意味する。
【０６３１】
「ＮＣＣ」は、神経細胞培養を意味する。
【０６３２】
ＣＳＦ傷害に対する保護におけるＭＮＴＦの試験
【０６３３】
ＵＣＬＡ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｒａｉｎ  ａｎｄ  Ｓｐｉｎａｌ  Ｆｌｕｉｄ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ）により供給された同定および臨床診断、ならびに神経病理学診断とともに、９つの試験群のそれぞれの５人の疾患特異的な患者／ドナーからの死後のＣＳＦ試料を使用して、試験を行い、ＣＳＦ傷害の保護におけるＭＮＴＦペプチドの能力を評価した。ＣＳＦ試料を第１次神経細胞で試験し、神経細胞死における効果を決定した。また、ＭＮＴＦ  ６ｍｅｒ／ＧＭ６の効果を、ＣＳＦにより誘発される傷害からの保護について検査した。ＧＭ６は、ＧＭＰコンプライアンス（ＣＳ  Ｂｉｏ  Ｃｏ．，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ，ＧＭＰ０１３，ｌｏｔ  Ｃ８１１）のもとで化学的に合成された。本試験は、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｉｎｃ．（ＮＴＳ，Ｃｈａｒｌｅｓｔｏｎ，ＳＣ）との契約の下で行われた。ＧＭ６は固体としてＮＴＳに提供され、製剤はＮＴＳにより調製された（溶液は４℃で保存）。
【０６３４】
方法および材料
【０６３５】
試験デザイン
【０６３６】
Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット皮膚神経細胞を１８日齢の胎児から単離し、１２日間の培養において増殖させた。対照および神経疾患ドナーからの死後のＣＳＦを、培養に適用し、神経生存率について検査した。また、ＭＮＴＦを培養に加え、細胞を傷害から保護した。
【０６３７】
インビトロ法
【０６３８】
神経培養を１８日齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの胎児から調製した。胎児ラットの中脳を解剖し、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ＧＩＢＣＯ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｉｓｌｅｙ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）で緩衝化したＣａ２＋およびＭｇ２＋不含のハンクス緩衝液（ＨＢＳＳ）中の２ｍｇ／ｍＬのトリプシン溶液にて１５分間インキュベートした。その後、組織をダイズトリプシン阻害剤（ＨＢＳＳ中の１ｍｇ／ｍＬ）に２分間暴露し、ＨＢＳＳ中で３回洗浄処置した。細胞を、粉砕により解離し、９６ウェルまたは２４ウェルのポリ−Ｌ−リジン被覆したプラスチック製の培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）に分配した。初期のプレート密度は、約１６０〜１８０細胞／ｍｍ２であった。プレートに入れた時点で、０．２ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ＧＩＢＣＯ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＮＹ）を含んだそれぞれのウェルは、１００ｍＬ／Ｌのウシ胎仔血清（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を補った。２４時間後、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を２ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸおよび０．５％  ｗ／ｖ  Ｄ−（＋）グルコース（ＧＩＢＣＯ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で補った０．１５ｍＬの２％  ｖ／ｖ  Ｂ−２７Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地で置換した。週に２回、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地の２／３を、同一の組成物の新たに調製した培地で置換した。培養物は、培養してから１２日後、神経毒性実験に使用された。ＮＴＳの調査者らは、試験前、試験中、および予備データをＳｐｏｎｓｏｒ（ＧＢ）に提示する際、材料のことを知らなかった。
【０６３９】
ＵＣＬＡ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｒａｉｎ  ａｎｄ  Ｓｐｉｎａｌ  Ｆｌｕｉｄ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ）は、同定および臨床診断、ならびに神経病理学診断とともに、９つの試験群のそれぞれの５人のドナーからの死後のＣＳＦ試料を供給した。試料は、出荷前に−１７０℃で保存され、ドライアイスとともに出荷された。試験群は、対照（神経疾患なし）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ニューロパシー（ＮＰ）、多発性硬化症（ＭＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、バッテン病（ＢＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、および脳虚血（脳卒中）であった。
【０６４０】
神経細胞生存におけるＣＳＦの効果を試験するために、ＣＳＦを、１０％ＣＳＦを含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地中の培養に加えた。ＣＳＦを培養物に加え、４８時間後、検査した。培養の画像を取得した後、培養物はＭＴＴアッセイ（下記参照）に供され、細胞死率を決定した。さらに培養物は、ＣＳＦを加える２時間前に培養物に加えられたＭＮＴＦ（１００ｎＭ）とともにインキュベートされた。
【０６４１】
ＭＴＴアッセイ。記載されるように、第１次神経生存率を決定した。生存細胞の相対数を、ビヒクルで刺激された細胞に対する値を１００％として、３重測定で決定した。細胞生存を、ＭＴＴアッセイを介して、処置されてから２日目に評価した。ＭＴＴ（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）を、ハンクス溶液（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）中で２００ｍＭまで希釈し、３７℃で２時間培養に加えた。ＭＴＴホルマザン産物をジメチルスルホキシドを加えることにより細胞から放出させ、ＵｌｔｒｏｓｐｅｃｔＩＩＩ分光光度計（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）において、５７０ｎｍで測定した。その後、未処置の対照と比較して相対的生存を決定することができた。
【０６４２】
統計解析。結果は平均±標準偏差（ＳＤ）として表される。データにおける差の有意性を、ｔ−検定を用いて分析した。
【０６４３】
処置群。
【表２２】
2010509345.tif 000023
【０６４４】
ＭＮＴＦ効果
【表２３】
2010509345.tif 000024
【０６４５】
コード
【０６４６】
「ＡＬＳ」は、筋萎縮性側索硬化症を意味する。
【０６４７】
「ＮＰ」は、神経因性疼痛を意味する。
【０６４８】
「ＭＳ」は、多発性硬化症を意味する。
【０６４９】
「ＡＤ」は、アルツハイマー病を意味する。
【０６５０】
「ＢＤ」は、バッテン病を意味する。
【０６５１】
「ＨＤ」は、ハンチントン病を意味する。
【０６５２】
「ＰＤ」は、パーキンソン病を意味する。
【０６５３】
「脳卒中」は、脳虚血を意味する。
【０６５４】
結果
【０６５５】
神経細胞培養中のＣＳＦ−試験。神経細胞死におけるＣＳＦの効果は、神経細胞傷害のインビトロモデルにおいて評価された。ＣＳＦを、全容積の１０％で、第１次ラット神経細胞培養物に加えた。細胞を、細胞死に対する顕微解析およびＭＴＴアッセイにより検査した。
【０６５６】
顕微解析
【０６５７】
神経細胞培養物を、対照または様々な神経疾患ドナーからの１０％ＣＳＦで４８時間処置した後、細胞消失について評価した。対照ＣＳＦは、細胞生存における有意な効果を有しなかったが、神経疾患からのＣＳＦでの細胞の処置は、細胞死を誘発した。
【０６５８】
ＭＴＴアッセイ
【０６５９】
ラット第１次神経細胞培養物におけるＣＳＦにより誘発された細胞消失率を測定するために、培養物をＭＴＴアッセイについて分析した。図１８に見られるように、対照の患者からのＣＳＦは、対照試料と比較した場合、明らかな細胞死を全く誘発しなかった。しかしながら、細胞死を誘発した様々な神経疾患からのＣＳＦは、細胞消失の様々な程度をもたらした（表１７および図１８）。図および表に見られるように、ＭＳは、最大の細胞消失（７０％）を誘発するが、ＮＰは、最少量の細胞死（３２％）を誘発した。これらのデータは、神経疾患は、神経細胞消失を誘発する、または増悪させる化合物を刺激する、またはその放出をもたらすことを示唆している。
【表２４】
2010509345.tif 000025
【０６６０】
神経細胞培養中のＣＳＦにおけるＭＮＴＦの効果。神経細胞死におけるＣＳＦのＭＮＴＦの効果は、神経細胞傷害のインビトロモデルにおいて評価された。ＭＮＴＦを、ＣＳＦを加える２時間前に、細胞培養に１００ｎＭで加えた。ＣＳＦを、全容積の１０％で、第１次ラット神経細胞培養物に加えた。細胞を、細胞死に対する顕微解析およびＭＴＴアッセイにより検査した。
【０６６１】
顕微解析
【０６６２】
神経細胞培養物を、１００ｎＭのＭＮＴＦで２時間処置した後、対照または様々な神経疾患からの１０％ＣＳＦでさらに４８時間加えた後、細胞消失について評価した。ＭＮＴＦは、ＣＳＦへの細胞の前処置で、細胞生存における有意な効果を有しなかった。
【０６６３】
ＭＴＴアッセイ
【０６６４】
ＣＳＦ処置ラット第１次神経細胞培養物におけるＭＮＴＦにより誘発された細胞保護率を測定するために、培養物をＭＴＴアッセイについて分析した。図２に見られるように、ＭＮＴＦは、神経疾患に罹患する対照患者からのＣＳＦにより誘発された細胞死における神経細胞培養への保護レベルを得た（表１８および図１９）。図１９および表１８に見られるように、ＭＮＴＦは、ＨＤ  ＣＳＦにおいて最大値（２７１％）、ＭＳ（２４６％）、脳卒中（２０５％）、パーキンソン（１９８％）、アルツハイマー（１９１％）、およびＡＬＳ（１７５％）のＣＳＦにおいて有意に細胞生存率を向上させたが、ＭＮＴＦは、ＢＤ  ＣＳＦにおいて、最小の細胞生存率（１１４％）を向上させた。これらのデータは、ＭＮＴＦが、神経疾患に罹患する患者のＣＳＦにより刺激された細胞死から神経細胞を保護することができることを示唆している。
【表２５】
2010509345.tif 000026
【０６６５】
ＭＮＴＦは、神経障害からの保護を提供する可能性があり、また傷害または移植後の神経組織の再生を可能とし得る栄養因子である。ここで行われた試験は、神経傷害における神経疾患ＣＳＦの有害な影響から保護するために、ＭＮＴＦの６アミノ類似体（ＧＭ６）の能力を実証している。１００ｎＭの用量でＧＭ６のインビトロ適用は、ほとんどの場合において、神経細胞の保護を実証した。これは、ＧＭ６が様々な神経疾患に対する保護効果を有することを実証した。
【０６６６】
神経細胞にインビトロ投与された場合、ＧＭ６は、神経障害からＣＳＦに対する保護作用を有することが判明した。
【０６６７】
実施例７
【０６６８】
ＭＳモデル
【０６６９】
ＧＭ６（ＣＳ  Ｂｉｏ  Ｃｏ．，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）を、マウス多発性硬化症（ＭＳ）モデルにおける有効性について試験した。ＭＳにおけるＧＭ６の有効性を決定するために、ＭＳを誘発するためにミエリンプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）をマウスに注射した後、ＭＳの減衰における影響を決定するために数回用量でＧＭ６を静脈注射した。７回用量（１日１回）で、ＧＭ６（１、５、１０、または２０ｍｇ／ｋｇ）の静脈内（ｉ．ｖ．）投与を検査した。ＧＭ６の投与は、最も有効性を示す２０ｍｇ／ｋｇで、マウスにおけるＭＳの用量依存的減衰を実証した。臨床および組織学的解析はともに、ＭＳにおけるＧＭ６の特異的効果を示す減衰を実証した。これらのデータは、ＧＭ６が静脈注射後のＭＳのマウスモデルに効果的であり、ＭＳ患者に対する潜在的処置である可能性があることを示唆している。
【０６７０】
本実施例に関する略語／専門用語
【０６７１】
「ＭＮＴＦ」は、運動ニューロン栄養因子を意味する。
【０６７２】
「ＧＭ６」および「６ｍｅｒ」はそれぞれ、ＭＮＴＦの例示的な６アミノ酸ペプチド類似体を意味する。
【０６７３】
「ＭＳ」は、多発性硬化症を意味する。
【０６７４】
「ＥＡＥ」は、実験的自己免疫性脳脊髄炎を意味する。
【０６７５】
「ＰＬＰ」は、ミエリンプロテオリピドタンパク質を意味する。
【０６７６】
「Ｇｅｎｅｒｖｏｎ」および「ＧＢ」はそれぞれ、Ｇｅｎｅｒｖｏｎ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＬＬＣを意味する。
【０６７７】
「Ｉ．Ｖ．」は、静脈内を意味する。
【０６７８】
本実験的デザインは、多発性硬化症のマウスモデルにおけるＧＭ６の有効性を決定するために、運動ニューロン栄養因子（ＭＮＴＦ）の６アミノ酸類似体（ＧＭ６）の能力を評価することである。ＧＢ被験物質は、合成した６アミノ酸ペプチド（ＭＮＴＦ）（ＣＳ  Ｂｉｏ  Ｃｏ．，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）である。
【０６７９】
静脈注射を介してＭＳのマウスモデルにおけるＧＭ６の有効性の評価
【０６８０】
方法および材料
【０６８１】
試験デザイン。下に記載のように、ＰＬＰを雌ＳＪＬ／Ｊマウスに注射し、示された用量でＧＭ６によりＭＳを誘発されたＥＡＥからの保護について検査した。動物を、臨床所見および組織学的変化について検査した。
【０６８２】
実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）誘発。雌ＳＪＬ／Ｊマウス（８〜１０週齢、ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を実験に使用した。ＥＡＥ誘発および処置ミエリンプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）（ｐ１３９〜１５１，ＨＳＬＧＫＷＬＧＨＰＤＫＦ，ＳｙｎＰｅｐ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を免疫に使用した。ＥＡＥを完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ，Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に溶解した２５μｇのＰＬＰを皮下注射により、雌ＳＪＬ／Ｊマウスに誘発した。免疫日および４８時間後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の２００ｎｇの百日咳毒素（ＰＴ，Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）をマウス尾静脈に注射した。
【０６８３】
ＭＮＴＦの投与。マウスを無作為にＭＮＴＦ処置群（ｎ＝１０／群）に分割した：ＭＮＴＦを、臨床的な症候群の発病日に（スコア＞１）開始してから７日間連続で静脈投与し、本処置プロトコルを臨床的に関連させた。ＭＮＴＦの用量は、予備試験に基づいて、１、５、１０、または２０ｍｇ／ｋｇであった。ＥＡＥ対照群（ｎ＝１０）：ＥＡＥマウスを、実験群として使用される生理食塩水の同一量で処置した。
【０６８４】
臨床的観察。マウスを、毎日、ＥＡＥの臨床的兆候について観察し、隔日に体重を量った。臨床スコアを、以下のように指定した：０：ＥＡＥの検出可能な兆候なし；１：尾緊張に影響；２：尾麻痺；３：軽度の後肢の感覚異常；４：重度の後肢の感覚異常；５：片後肢の感覚異常；６：完全な後肢の感覚異常；７：完全な後肢および前肢の感覚異常；および８：死亡。
【０６８５】
臨床的ＥＡＥ評価に関しては、以下のパラメータを使用した：発症日は、ＥＡＥ症状の初めて出現した日として、それぞれの動物に対して定義した。ＥＡＥ持続時間は、それぞれの動物が病気である記録された日数を総記録日数で割ることによって算出し、パーセンテージで示した。累積発現率は、実験期間中、ＥＡＥに発展した動物のパーセンテージとして定義された。実験期間にわたって平均スコアは、すべての個人スコアの合計を測定数で割ることによって算出し、それぞれの動物について算出された。最大スコアは、実験期間中、それぞれの動物に対する最高の臨床スコアとして定義された。マウスが実験の進行中にＥＡＥで死亡した場合、すべての以下の時点で８のスコアをこれらのマウスに割り当てた。マウスがＥＡＥ症状の明らかな発症前に死亡した場合、これらのマウスを実験から除外した。重度にＥＡＥに罹患した動物を含む、すべての動物は、実験中、食物および水を得ることが可能であった。
【０６８６】
組織学。脳および脊髄を２０日後除去し、１０％の緩衝ホルマリン（Ｓｉｇｍａ）に固定された。パラフィン包埋切片（厚さ６μｍ）をＨ＆Ｅで染色し、脳および脊髄における損傷数を評価した。これらを得点し、記録した。
【０６８７】
統計解析。結果は平均±標準偏差（ＳＤ）として表された。データにおける差の有意性を、ｔ−検定を用いて分析した。
【０６８８】
試験からの動物の除外。いくつかの基準に基づき、動物を試験から除外した：
【０６８９】
試験の終了前に（任意の時点で）死亡した動物。
【０６９０】
被験物質の投与後に重度の合併症を発現した動物。
【０６９１】
処置群。すべての群はＧＭ６に供されたか、または対照であった。動物（５０匹の動物）を、示された用量のビヒクルまたはＭＮＴＦの尾静脈による静脈内ボーラス注射に供した。
【表２６】
2010509345.tif 000027
【０６９２】
評価項目
【０６９３】
マウスにおけるＭＳの調節
【０６９４】
すべての試験群をＮＴＳに提供した。ＧＭ６は固体材料としてＮＴＳに提供した。試験群のすべての動物には、上に示した通り投与を行った。
【０６９５】
結果
【０６９６】
臨床的スコア。ＭＳのマウスモデルにおけるＧＭ６の有効性を評価した。ビヒクルまたはＧＭ６の（示された用量で）静脈内注射を受けたマウスからのデータ。
【０６９７】
臨床的解析
【０６９８】
ＧＭ６：ＰＬＰを用いてＭＳの誘発後、示された用量でＧＭ６をマウスに投与した（図２３）。動物は、０日目の開始日から隔日で検査し、動物の臨床的スコアを決定した。マウスにＰＬＰ注射を開始してから７日間、毎日、ＧＭ６を注射した。図２３に見られるように、ビヒクルを用いて処置したマウスは、臨床的スコアの有意な増加を示した。ＧＭ６を用いた処置は、疾患の有意な改善（減衰）を示した（図２３）。５、１０、２０ｍｇ／ｋｇでのＧＭ６は、有意な有用性を示すが、１ｍｇ／ｋｇでは、全く回復を示さなかった。表２０は、ＧＭ６を用いた処置後、急性疾患を発現したマウスの数を示す。表に見られるように、１０ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇは、急性疾患状況におけるマウスの総数の低減を示したが、慢性状況では示さなかった。
【表２７】
2010509345.tif 000028
【表２８】
2010509345.tif 000029
【表２９】
2010509345.tif 000030
【０６９９】
損傷数。脳および脊髄中の損傷数を、計数によって決定し、図２４Ａおよび２４Ｂに示す。ＧＭ６の用量が増加する場合、脳および脊髄中の損傷数は減少する。これは、ＧＭ６が、ＭＳ誘発の有害な影響から脳および脊髄を保護することを示唆している。
【表３０】
2010509345.tif 000031
【０７００】
ＭＮＴＦは、神経障害からの保護を提供する可能性があり、また傷害または移植後の神経組織の再生を可能とし得る栄養因子である。ここで行われた試験は、マウスモデルにおけるＭＳを減衰するためのＭＮＴＦの６アミノ類似体（ＧＭ６）の有効性を実証している。１、５、１０、および２０ｍｇ／ｋｇボーラス用量でのＧＭ６の静脈内投与は、７日間にわたって、ＭＳ臨床的スコアおよび組織学の用量依存的な減少を実証した。これは、ＧＭ６が静脈内投与を介してマウスにおけるＭＳの程度を限定するのに有効であり、本疾患を処置するのに有益であり得ることを実証する。
【０７０１】
静脈内に投与された場合、ＧＭ６は、ＭＳのマウスモデルにおいて有効であることが判明した。ＧＭ６の有効性は、用量依存的であり、ＧＭ６がＭＳの処置に有効であり得ることを示す。
【０７０２】
実施例８
【０７０３】
中大脳動脈閉塞のマウスモデルにおけるＧＭ６０２（ＭＮＴＦ６ｍｅｒ）の試験
【０７０４】
Ｇｅｎｅｒｖｏｎ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＬＬＣの被験物質ＧＭ６０２を中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）マウスモデルについて有効性を試験した。ＭＣＡＯマウスモデルにおけるＧＭ６０２の有効性を決定するために、マウスを１時間の虚血および１４日間の再灌流に供した。再灌流の開始から０、３、６、１２、および２４時間後、尾静脈からの静脈内ボーラスによりＧＭ６０２をマウスに注射し、脳血流（ＣＢＦ）、心拍数（ＨＲ）、血圧（ＢＰ）、ｐＯ２、ｐＣＯ２、ｐＨ、神経学的欠損（ＮＤ）、および梗塞容積（ＩＦＶ）の変化について検査した。虚血後、示された時間で、および３日間毎日、ＧＭ６０２（５ｍｇ／ｋｇ）の静脈内（ｉ．ｖ．）投与を神経保護作用について検査した。ＧＭ６０２の投与は、ＣＢＦ、ＨＲ、ＢＰ、ｐＯ２、ｐＣＯ２、またはｐＨの変化を示さなかった。ＮＤおよびＩＦＶに用量依存的な変化が検出され、それは、時間依存的であった。５ｍｇ／ｋｇでのＧＭ６０２において、０、３、６、および１２時間で、梗塞損傷からの有意な保護を示したが、これは、神経学的欠損の維持につながる。これらのデータは、ＭＣＡＯのマウスモデルにおいて、ＧＭ６０２が、ｉ．ｖ．注射後に脳に対する神経保護作用を有することを示唆している。
【０７０５】
略語／専門用語
【表３１】
2010509345.tif 000032
【０７０６】
ＧＢ被験物質であるＧＭ６０２の急性虚血および再灌流傷害から脳を保護するための運動ニューロン栄養因子の６−アミノ酸ペプチド類似体（ＭＮＴＦ６ｍｅｒ；ＦＳＲＹＡＲ）の能力試験。ＧＭ６０２は、ＧＭＰコンプライアンス（ＣＳ  Ｂｉｏ  Ｃｏ．，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ，ＧＭＰ０１３，ｌｏｔ  Ｃ８１１）のもとで化学的に合成された。ＧＭ６０２は固体として提供され、製剤は調製された（溶液は４℃で保存）。
【０７０７】
方法および材料
【０７０８】
動物
【０７０９】
それぞれ体重２２〜２５グラムのＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）に、実験前に自由に餌および水を与えた。動物をハロタンで麻酔した（マスクにより７０％／３０％  ＮＯ２／Ｏ２に１％）。テールカフ装置を介して平均動脈圧（ＭＡＢＰ）を監視し、動脈ｐＨレベルおよびＰａＣＯ２およびＰａＯ２を決定するために、血液試料を採取した。Ｖｉｓｉｔｅｃｈ  Ｓｙｓｔｅｍ血圧モニタを使用して、ＭＡＢＰおよび心拍数を記録した。
【０７１０】
直腸体温計および側頭筋に挿入されたサーミスタプローブで、脳の温度を監視した。動物の体温は、ウォータージャケット付き加熱パッドを使用して３７℃に維持した。脳の温度を、虚血前１時間から虚血後６時間まで監視し、３０分間隔で記録した。
【０７１１】
実験群
【０７１２】
動物を、１．０時間の虚血、２４時間の再灌流に供し、ビヒクル群（ｎ＝１０）または５ｍｇ／ｋｇの用量でのＧＭ６０２の静脈内注射で処置した群（ｎ＝１０）に、動物を分割した。ＧＭ６０２の調剤（ＣＳ  Ｂｉｏ  Ｃｏ．，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ，ＣＳ１５０７，ＧＭＰ０１３，ｌｏｔ  Ｃ８１１）は、ＮＴＳにより、ＧＭ６０２を４℃で保存された（１００％）生理食塩溶液でもどすことにより原液として行われた。ビヒクル対照には生理食塩溶液を投与した。再灌流の開始から０、３、６、１２、および２４時間後、続いて、傷害から３日間毎日、尾静脈からのＧＭ６０２を用いたボーラスＩＶ注射を行った。調査者は、処置群については情報を与えられなかった。
【０７１３】
虚血の誘発
【０７１４】
本試験は、虚血の一過性モデルに関連した。各マウスを麻酔し、外頚動脈（ＥＣＡ）および総頸動脈（ＣＣＡ）を分離した。サーミスタプローブを直腸および側頭筋に挿入し、体温および脳の温度を監視し、外部加温により３６〜３７℃に維持した。左総頚動脈（ＣＣＡ）を、頸部の正中切開により露出した。上甲状腺動脈および上後頭動脈を、電気凝固して分割した。マイクロ手術クリップを外頚動脈（ＥＣＡ）の起点の周りに設置した。６−０の絹糸でＥＣＡ遠位端を結紮し、離断した。６−０絹糸は、ＥＣＡ断端の周りに緩く縛った。クリップを取り外し、５−０ナイロン縫合糸（シリコーン被覆）の火造り先端を優しくＥＣＡ断端に挿入した。６−０絹糸の輪を断端の周りで締め付け、内頸動脈（ＩＣＡ）内に、およびそれを通して、前大脳動脈（ＡＣＡ）に収まるまでナイロン縫合糸を約１３ｍｍ前進させ（体重により調節される）、それにより前交通動脈および中大脳動脈を閉塞させた。ナイロン縫合糸を１時間設置した後、それをＥＣＡに引き戻し、切開部を閉鎖した。
【０７１５】
組織学的検査
【０７１６】
虚血を誘発してから１４日後、組織学的検査のために、ペントバルビタールナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射で動物を麻酔した。４℃の１０％リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で経心臓的に脳を灌流した。脳を取り出し、Ｒｏｄｅｎｔ  Ｂｒａｉｎ  Ｍａｔｒｉｘ内に入れる前に−２０℃で１５分間冷凍した。冠状切片（１ｍｍ厚）を調製し、３７℃での２％塩化トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ）染色に供した。前頭極からの２ｍｍから始め、梗塞の吻側端−尾端を通した７つの連続した１ｍｍ厚の冠状切片を各脳から採取した。ＴＴＣ染色切片を１０％中性緩衝ホルマリンに入れ、少なくとも２４時間、暗所で４℃で保持した。Ｑｕｉｃｋ  Ｃａｐｔｕｒｅフレームグラバカードを備えたＰｏｗｅｒ  Ｍａｃｉｎｔｏｓｈコンピュータ、オリンパス社製顕微鏡に装着された日立ＣＣＤカメラおよびカメラスタンドで構成されるコンピュータ支援画像分析システムで、各切片における梗塞領域を決定した。ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ｖ．１．５５を使用した。７切片に対し、画像を撮影して損傷の総領域を決定した。処置状態に対し盲検化された一人の操作者が、すべての測定を行った。切片の梗塞容積を加算することにより、梗塞容積を計算した。以下の式を用いて、梗塞サイズ（％）を計算し、浮腫の効果を排除した：（対側容積−同側非損傷容積）×１００／対側容積。
【０７１７】
脳血流の測定
【０７１８】
レーザードップラー血流計を使用して脳血流（ＣＢＦ）を監視した。レーザードップラー血流計により表示される値は絶対値ではなかったため、ＣＢＦ値はパーセンテージとして決定された。上に記載のように、動物をハロタンで麻酔した（マスクにより７０％／３０％  ＮＯ２／Ｏ２に１％）。ＭＣＡ閉塞に同側の半球において、座標は以下の通りであった：ａ点、ブレグマに対し０．５ｍｍ後方、および正中線に対し２ｍｍ側方；Ｂ点、ブレグマに対し１ｍｍ後方、および正中線に対し１．２ｍｍ側方；Ｄ点、ブレグマに対し１ｍｍ前方、および正中線に対し１．７ｍｍ側方；対側半球におけるＣ点、ブレグマに対し１ｍｍ後方、および正中線に対し２ｍｍ。ＣＢＦを、虚血の発症前に測定し、注入終了後、２時間継続した。測定を化合物の注射前および注射後に行った（連続測定を、虚血前１５分から化合物の注射終了後３０分まで行い、３０分ごとに記録した）。ＭＣＡ閉塞後および投与前の平均値を、ベースライン値として用い、その以降のデータを、ベースライン値のパーセンテージとして表した。
【０７１９】
行動評価
【０７２０】
虚血性傷害の前後で、マウスにおける行動解析（神経学的欠損）を決定した。神経学的スコアは以下の通りであった：０：正常な運動機能；１：動物を尾部で持ち上げた際の胴体および対側前肢の屈曲；２：平面上において尾部で保持した際の対側への旋回、ただし静止時は正常な姿勢；３：静止時の対側への傾き；４：自発運動活性なし。
【０７２１】
試験からの動物の除外
【０７２２】
いくつかの基準に基づき、動物を試験から除外した：
【０７２３】
試験の終了前に（任意の時点で）死亡する動物。死亡時まで収集されたデータは、ＧＢに提供された。
【０７２４】
脳血流は、ベースライン値の２０±５％に減少しなかった（すなわち、非虚血とみなされた）か、または、血流は、ベースライン値の９０±１０％に回復しなかった。
【０７２５】
虚血性傷害後、動物は発作様の活動を発現した。
【０７２６】
虚血中、または虚血直後に、過度の出血が検出された。
【０７２７】
統計解析
【０７２８】
結果は平均±標準偏差（ＳＤ）として表された。生理学的および組織学的データにおける差の有意性を、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）と、続いてＦｉｓｈｅｒのポストホック試験を用いて分析した。反復測定ＡＮＯＶＡは監視データに対し計算し、群間の有意差はＦｉｓｈｅｒのポストホック試験で評価した。
【０７２９】
処置群。すべての群はＧＭ６０２に供されたか、または対照であった。動物（３０匹の動物）を、示された用量のビヒクルまたはＧＭ６０２のｉ．ｖ．投与に供した。
【表３２】
2010509345.tif 000033
【０７３０】
評価項目
【０７３１】
虚血および再灌流傷害からの神経保護作用のＭＮＴＦの効果。脳血流（ＣＢＦ）、心拍数（ＨＲ）、血圧（ＢＰ）、ｐＯ２、ＰＣＯ２、ｐＨ、神経学的欠陥（ＮＤ）、および梗塞容積（ＩＦＶ）について動物を評価する。
【０７３２】
すべての試験群をＮＴＳに提供した。ＧＭ６０２は固体材料としてＮＴＳに提供した。試験群のすべての動物には、上に示した通り投与を行った。
【０７３３】
結果
【０７３４】
マウス試験における虚血。これらの試験において虚血の相対的重症度を評価した。データは、ビヒクルまたはＧＭ６０２を静脈注射された虚血性傷害に罹患したマウスからのものであった。
【０７３５】
梗塞容積：ビヒクル注射群と比較して、脳内の梗塞容積は、ＧＭ６０２群で有意に減少した（０、３、６、および１２時間）。ＧＭ６０２は、虚血から０から１２時間後、梗塞容積の時間依存的な低減を示した（表１）。梗塞容積は図２６にプロットされている。脳内に存在する梗塞容積の減少割合を表２３に示す。表に示されるように、０、３、６、および１２時間でのＧＭ６０２は、梗塞サイズにおいて７０、６８、５８、および３６％低減を示した。しかしながら、２４時間での梗塞容積の減少は、ビヒクル処置動物からの有意差を示さなかった。
【表３３】
2010509345.tif 000034
【０７３６】
生理学的パラメータ。生理学的パラメータ（脳血流、平均動脈圧、血液ｐＯ２、ｐＣＯ２、およびｐＨ）において、虚血中、または再灌流後のベースラインにおけるビヒクルマウスと処置マウスとの間で有意差を示さなかった（図２７〜３１）。
【０７３７】
行動の測定。０から４のスケールに基づき、神経学的欠損について動物を評価した。ＧＭ６０２で処置した動物は、時間依存的な神経学的欠損の減少を示した（データを図３２にも示す）。
【表３４】
2010509345.tif 000035
【０７３８】
アメリカ合衆国では、脳卒中は３番目に多い死亡原因であり、障害の腫瘍原因である。局所性脳虚血後の結果および梗塞容積は、「壊死」（パラトーシス）細胞死、および虚血の境界における遅発性神経細胞損失（プログラム細胞死またはアポトーシス）の両方により決定される。虚血性脳卒中を処置するため、最新の療法が見られるようになったが、しかしながら、これらの処置は、ほとんどの場合、血栓の溶解を扱うが、一旦神経細胞死サイクルがトリガされた際の、神経保護作用、行動の欠陥の低減、または脳梗塞容積には留意されていなかった。細胞損失に影響を与える基本的メカニズムを理解することは、虚血性傷害と関連した細胞死を低減するための薬剤や用途の設計に役立つ。
【０７３９】
ＭＮＴＦは、神経障害からの保護を提供する可能性があり、また傷害または虚血性脳卒中後の神経組織の再生を可能とし得る栄養因子である。ここで行われた試験は、効果的かつ効率的に、脳虚血および再灌流傷害の有害な影響から脳を保護するＭＮＴＦの６アミノ酸類似体である、ＧＭ６０２の能力を実証している。虚血性傷害後の様々な時間で、５ｍｇ／ｋｇでのＧＭ６０２の静脈内投与は、梗塞容積および行動的属性の減少により虚血／再灌流からの脳内の時間依存的な保護効果を実証した。これらの試験は、ＧＭ６０２が脳卒中において有益な効果を有し得ることを示唆している。
【０７４０】
静脈内に投与された場合、ＧＭ６０２は、マウスにおける虚血／再灌流傷害に対する神経保護作用を有することが判明した。
【０７４１】
実施例９
【０７４２】
永久中大脳動脈閉塞のラットモデルにおけるＧＭ６０２（ＭＮＴＦ６ｍｅｒ）の試験
【０７４３】
Ｇｅｎｅｒｖｏｎ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＬＬＣの被験物質ＧＭ６０２を永久中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）のラットモデルにおける有効性について試験した（Ｋｉｎｄｙ，Ｓｔｕｄｙ＃２Ｃ  Ｓｔｒｏｋｅ）。永久ＭＣＡＯラットモデルにおけるＧＭ６０２の有効性を決定するために、ラットを２８日間の永久虚血に供した。虚血の開始から３時間後に、尾静脈からの静脈内ボーラスによりＧＭ６０２をラットに注射した。ラットを、脳血流（ＣＢＦ）、心拍数（ＨＲ）、血圧（ＢＰ）、ｐＯ２、ＰＣＯ２、ｐＨ、神経学的欠損（ＮＤ）、および梗塞容積（ＩＦＶ）の変化について評価した。ＧＭ６０２の投与は、ＨＲ、ＢＰ、ｐＯ２、ＰＣＯ２、またはｐＨにおいて変化を実証しなかったが、ＧＭ６０２は、虚血から３時間後に投与した場合、ＣＢＦの増加を実証した。さらに重要なことには、ＧＭ６０２投与後、用量依存的に、ＮＤ、ＩＦＶ、ＴＮＦ（炎症バイオマーカー）、およびＦｌｕｏｒｏ−Ｊａｄｅ（神経変性のバイオマーカー）の有意な減少を示した。２．５、１０、または２０ｍｇ／ｋｇでのＧＭ６０２の静脈注射は、投与した場合、梗塞損傷からの有意な保護を示したが、これは、神経学的欠損の維持につながる。これらのデータは、ＭＣＡＯの永久ラットモデルにおいて、虚血中、ＧＭ６０２の静脈内注射が、脳に対する神経保護作用を有することを示唆している。虚血の発症から３時間後、ＧＭ６０２を用いた処置は、保護効果を実証し、臨床試験に対して実行可能であり得る。
【０７４４】
略語／専門用語
【表３５】
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【０７４５】
これらのデータの管理下で、永久中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）のラットモデルにおいて、慢性虚血性傷害から脳を保護するための運動ニューロン栄養因子の６−アミノ酸ペプチド類似体（ＭＮＴＦ６ｍｅｒ）の、ＧＢ被験物質であるＧＭ６０２の能力を試験するための決定をした。ＧＭ６０２は、ＧＭＰコンプライアンス（ＣＳ  Ｂｉｏ  Ｃｏ．，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ，ｌｏｔ  Ｄ２９４）のもとで化学的に合成された。
【０７４６】
方法および材料
【０７４７】
動物
【０７４８】
それぞれ体重約２２５〜２５０グラムのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｈａｒｌａｎ）に、実験前、自由に餌および水を与えた。動物をハロタンで麻酔した（マスクにより７０％／３０％  ＮＯ２／Ｏ２に１％）。血液試料を採取し、動脈ｐＨレベル、ＰａＣＯ２、およびＰａＯ２を決定した。Ｖｉｓｉｔｅｃｈ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して、ＭＡＢＰおよび心拍数を記録した。
【０７４９】
直腸体温計および側頭筋に挿入されたサーミスタプローブで、脳の温度を監視した。動物の体温は、ウォータージャケット付き加熱パッドを使用して３７℃に維持した。脳の温度を、虚血前１時間から虚血後６時間まで監視し、３０分間隔で記録した。
【０７５０】
実験群
【０７５１】
すべてのラットは、永久虚血に供された。ビヒクル群（ｎ＝１０）または２．５、１０、または２０ｍｇ／ｋｇの用量でのＧＭ６０２の静脈注射を用いて処置した３つの群（ｎ＝１０）のうちの１つに、動物を無作為に割り当てた。虚血の発症から３時間後、尾静脈からのＧＭ６０２を用いたボーラスＩＶ注射を行った。調査者は、処置群については情報を与えられなかった。ＧＭ６の調剤は、ＮＴＳにより行われ、ＧＭ６を４℃で保存された正常な生理食塩溶液を用いて原液としてもどした。ビヒクル対照には生理食塩溶液を投与した。
【０７５２】
虚血の誘発
【０７５３】
本試験は、虚血の永久モデルに関連した。各ラットを麻酔し、外頚動脈（ＥＣＡ）および総頸動脈（ＣＣＡ）を分離した。サーミスタプローブを直腸および側頭筋に挿入し、体温および脳の温度を監視し、外部加温により３６〜３７℃にラットを維持した。左総頚動脈（ＣＣＡ）を、頸部の正中切開により露出した。上甲状腺動脈および上後頭動脈を、電気凝固して分割した。マイクロ手術クリップを外頚動脈（ＥＣＡ）の起点の周りに設置した。６−０の絹糸でＥＣＡ遠位端を結紮し、離断した。６−０絹糸は、ＥＣＡ断端の周りに緩く縛った。クリップを取り外し、５−０ナイロン縫合糸（シリコーン被覆）の火造り先端を優しくＥＣＡ断端に挿入した。６−０絹糸の輪を断端の周りで締め付け、内頸動脈（ＩＣＡ）内に、およびそれを通して、前大脳動脈（ＡＣＡ）に収まるまでナイロン縫合糸を約１７ｍｍ前進させ（体重により調節される）、それにより前交通動脈および中大脳動脈を閉塞させた。外科用ステープルを使用して、ナイロン縫合糸の挿入直後、外傷を閉じた。縫合糸は２８日間そのままにした。
【０７５４】
組織学的検査
【０７５５】
虚血を誘発してから２８日後、組織学的検査のために、ペントバルビタールナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射で動物を麻酔した。４℃の１０％リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、続いて、４％パラホルムアルデヒド（４℃）で経心臓的に脳を灌流した。脳を取り出し、４％パラホルムアルデヒド中で一晩、続いて、４℃で２４時間、３０％スクロースで固定した。組織をＯＣＴ培地に埋め込み、ドライアイスで冷凍した（−８０℃で保存）。これらを組織学的および免疫細胞化学的分析に使用した。脳を虚血の発症から２８日後に採取し、冷凍し、１６μｍ切片に分割した。冠状切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、虚血性傷害の範囲を明確にした。梗塞容積を、それぞれの脳の＋２．４６、＋１．６６、＋０．８６、＋０．０６、０．７４、１．５４、２．３４、および３．１４ｍｍのブレグマ点から採取した１６μｍの染色した冠状切片における傷害の領域を積分することにより算出した。総体的な、皮膚の、海馬の梗塞容積をコンピュータ支援画像分析システムを用いて定量化した（ＮＩＨ  ＩＭＡＧＥ，Ｖｅｒｓｉｏｎ１．６）。処置状態に対し盲検化された一人の操作者が、すべての測定を行った。切片の梗塞容積を加算することにより、梗塞容積を計算した。以下の式を用いて、梗塞サイズ（％）を計算し、浮腫の効果を排除した：（対側容積−同側非損傷容積）×１００／対側容積。
【０７５６】
脳血流の測定
【０７５７】
レーザードップラー血流計で、脳血流（ＣＢＦ）を監視した。レーザードップラー流量計により表示される値は絶対値ではなかったため、ＣＢＦ値はパーセンテージとして決定された。上述のように、動物をハロタンで麻酔した（マスクにより７０％／３０％  ＮＯ２／Ｏ２に１％）。ＭＣＡ閉塞に同側の半球において、座標は以下の通りであった：Ａ点、ブレグマに対し０．５ｍｍ後方、および正中線に対し２ｍｍ側方；Ｂ点、ブレグマに対し１ｍｍ後方、および正中線に対し１．２ｍｍ側方；Ｄ点、ブレグマに対し１ｍｍ前方、および正中線に対し１．７ｍｍ側方；対側半球におけるＣ点、ブレグマに対し１ｍｍ後方、および正中線に対し２ｍｍ。ＣＢＦを、虚血の発症前、虚血の誘発から３時間後であるが、被験物質の投与前、被験物質の投与から１時間後に測定した。ＭＣＡ栓塞前の平均値をベースラインとし用い、それ以降のデータを、ベースライン値のパーセンテージとして表した。
【０７５８】
行動評価
【０７５９】
虚血性傷害前の３日間、毎日、１０分間動物に触れた。傷害の前日、動物を行動変化について検査した。
【０７６０】
すべての行動試験を脳卒中手術直前、および被験物質の投与から２８日後に施行した。それぞれの期間で、動物を、試験を開始する３０分前に試験室に適合させた。
【０７６１】
前肢配置試験−別のスコアをそれぞれの前肢について得た。視覚性配置副試験のために、動物を検者がまっすぐに持ち、テーブル面に近づけた。テーブルで肢の正常な配置を０として採点し、遅延性の配置（＜２ｓ）を１として採点し、配置なし、または非常に遅延性の配置（＞２ｓ）を２として採点した。動物を前進させた後、再度、動物をテーブルに対して横向きにした場合に、最初に別のスコアを得た（片肢あたり最大スコア、４；いずれの場合も、高い数字がより欠陥があることを示した）。触覚配置副試験のために、動物が見えない、またはその頬ひげでテーブル面に触れないように、抑えた。前肢の背面は、動物をまず前進させた後、テーブルに横向きにした場合、若干テーブル面に触れた。配置するたびに、上述のように採点した（片肢あたり最大スコア、４）。固有覚配置副試験のために、動物を前進だけさせ、より大きな圧力を前肢の背面に適用させ、設置を上述のように採点した（片肢あたり最大スコア、２）。これらの副スコアを加え、片肢あたり前肢配置の総スコアを得た（範囲、０〜１０）。
【０７６２】
後肢配置試験−後肢配置試験を後肢に対して上述と同一の方法で行うが、触覚および固有覚副試験のみ伴う（最大スコア、それぞれ４および２；総スコア範囲、０〜６）。
【０７６３】
修正された平均台試験−修正された平均台試験は、動物が狭い梁（３０×１．３ｃｍ）上で６０秒間、平衡を保つ場合、前庭運動反射活性を検査した。梁上での平衡を保つ能力は以下の通りに採点された：動物は、梁上ですべての４本の肢で平衡を保つ、１；動物は、梁の側に肢を置く、または梁上で揺れる、２；１本または２本の肢を梁から滑らせる、３；３本の肢を梁から滑らせる、４；動物は、梁上に肢で平衡を保とうと試みるが、落下する、５；動物は、梁上にもたれるが、落下する、６；動物は、平衡を保つ試みもせず、梁から落下する、７。動物は、手術前に３回の訓練試験を受けた。これらの最終のスコアをベースラインのスコアとして得た。
【０７６４】
自発運動活性−動物は、狭いガラス円筒（１６．５×２５ｃｍ）に置かれ、手術前日、および手術から１週間後、１０分間、ビデオテープに録画した。動物を自発運動について採点した。スコアは以下の通りであった：０：運動なし；１：ほとんど、または全く探査なし（限定された動き）；２：いくつかの探査あり（いくつかの制限的な運動）；３：非制限的な運動（対照、正常探査）。
【０７６５】
バイオマーカー解析
【０７６６】
厚さ１６μｍの冠状切片を装着した後、顕微鏡のスライド上で乾燥させた。スライドを８０％アルコール（２０ｍＬの５％  ＮａＯＨを８０ｍＬの絶対アルコールに加えた）中の１％水酸化ナトリウムを含む溶液に、５分間浸漬した。その後、７０％アルコール中に２分間、蒸留水中に２分間浸漬した。スライドを０．０６％過マンガン酸カリウムの溶液に１０分間移動した。スライドを２分間蒸留水内で洗浄処置した。染色液をＦｌｕｏｒｏ−Ｊａｄｅ（登録商標）  Ｂ用の０．０１％原液から調製した。染色液中で２０分後、スライドを３つの蒸留水洗浄のそれぞれに１分間ずつ洗浄処置した。紙タオル上で垂直にスライドの水分抜きを行い、一時的に（約１５秒）過剰水を取り除いた。その後、スライドをスライドウォーマー上に設置し、それらが完全に乾燥するまで（例えば、５〜１０分）、約５０℃で設置した。乾燥スライドを、非水かつ非蛍光性のプラスチック製のマウンティング培地である、ＤＰＸ（Ｆｌｕｋａ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ  ＷＩ，またはＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いてカバースリップにのせる前の少なくとも１分間、キシレン中に浸水させることによりきれいにした。サイトカイン解析（ＴＮＦ）のために、組織切片をトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）ｐＨ７．４中で洗浄し、適切な血清（ヤギ）でブロックした。切片を４℃で一晩ブロックし、次いで１次抗体に４℃で一晩供した。切片をＴＢＳ中で洗浄し、２次抗体を添加して、室温で１時間インキュベートした。洗浄後、Ｖｅｃｔｏｒ  ＡＢＣ  Ｅｌｉｔｅキットで説明される通りに切片をインキュベートし、ジアミノ安息香酸（ＤＡＢ）で染色した。水中で反応を停止し、キシレンへの処置後にカバースリップをのせた。
【０７６７】
試験からの動物の除外
【０７６８】
いくつかの基準に基づき、動物を試験から除外した：
【０７６９】
試験の終了前に（任意の時点で）死亡した動物。死亡時まで収集されたデータは、ＧＢに提供された。
【０７７０】
脳血流は、閉塞後、ベースライン値の２０±５％に減少しなかった（すなわち非虚血とみなされた）。
【０７７１】
虚血性傷害後、動物は発作様の活動を発現した。
【０７７２】
虚血中、または虚血直後に、過度の出血が検出された。
【０７７３】
処置群。すべての群はＧＭ６０２に供されたか、または対照であった。動物は、虚血の誘発から３時間後、ビヒクルまたはＧＭ６０２の静脈投与を受けた。
【表３６】
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【０７７４】
評価項目
【０７７５】
虚血および再灌流傷害からの神経保護作用のＧＭ６０２の効果。動物は、脳血流量（ＣＢＦ）、心拍数（ＨＲ）、血圧（ＢＰ）、ｐＯ２、ｐＣＯ２、ｐＨ、神経学的欠損（ＮＤ）、梗塞量（ＩＦＶ）、炎症バイオマーカー、およびニューロン変性のバイオマーカーについて動物を評価する。
【０７７６】
すべての試験群をＮＴＳに提供した。ＧＭ６０２は固体材料としてＮＴＳに提供した。試験群のすべての動物には、上に示した通り投与を行った。
【０７７７】
統計解析
【０７７８】
結果は、平均±標準偏差（ＳＤ）として表された。生理学的および組織学的データにおける差の有意性を、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）と、続いてＦｉｓｈｅｒのポストホック試験を用いて分析した。反復測定ＡＮＯＶＡは監視データに対し計算し、群間の有意差はＦｉｓｈｅｒのポストホック試験で評価した。
【０７７９】
結果
【０７８０】
マウスにおける虚血試験。これらの試験において虚血の相対的重症度を評価した。データは、ビヒクルまたはＧＭ６０２を静脈注射された虚血性傷害に罹患したラットからのものであった。
【０７８１】
梗塞容積：すべての試験群の梗塞容積は図３３にプロットされている。ＧＭ６０２の永久虚血静脈投与から３時間後、動物の脳内の梗塞容積が低減した。梗塞容積の減少割合を表２５に示す。
【表３７】
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【０７８２】
生理学的パラメータ。生理学的パラメータ（平均動脈圧、血液ｐＯ２、ｐＣＯ２、およびｐＨ）において、虚血中、または試験薬物投与後のベースラインにおけるビヒクルマウスと処置マウスとの間で有意差を示さなかった（図３５〜３８）。しかしながら、脳血流のＧＭ６０２媒介した有意な増加を、ＧＭ６０２を用いて処置した群において監視した（図３４）。
【表３８】
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【０７８３】
行動測定。動物を、いくつかの異なるパラメータに基づいて神経学的欠損について評価し、それを下に示す。ＧＭ６０２を用いて処置した動物は、神経学的欠損の用量依存的な減少を示した（データは図３９にも示される）。
【表３９】
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【表４０】
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【表４１】
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【表４２】
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【０７８４】
バイオマーカー解析。組織断片をバイオマーカー解析のために採取した（Ｆｌｕｏｒｏ−ＪａｄｅおよびＴＮＦ）。
【０７８５】
用量依存的に、ＧＭ６０２投与群において、２８日目で組織断片に見られるＴＮＦ染色における有意的な低減を示した。（表３１および図８）。永久虚血性傷害後、ＧＭ６０２投与から２８日目に見られるＦｌｕｏｒｏ−Ｊａｄｅに対する染色における有意な低減を示した（表３２および図４１）。
【表４３】
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【表４４】
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【０７８６】
アメリカ合衆国では、脳卒中は３番目に多い死亡原因であり、障害の腫瘍原因である。局所性脳虚血後の結果および梗塞容積は、「壊死」（パラトーシス）細胞死、および虚血の境界における遅発性神経細胞損失（プログラム細胞死またはアポトーシス）の両方により決定される。虚血性脳卒中を処置するため、最新の療法が見られるようになった。しかしながら、これらの処置は、ほとんどの場合、血栓の溶解を扱うが、一旦神経細胞死サイクルがトリガされた際の、神経保護作用、行動の欠陥の低減、または脳梗塞容積には留意されていなかった。細胞損失に影響を与える基本的メカニズムを理解することは、虚血性傷害と関連した細胞死を低減するための薬剤や用途の設計に役立つ。
【０７８７】
ＭＮＴＦは、神経障害からの保護を提供する可能性があり、また傷害または虚血性脳卒中後の神経組織の再生を可能とし得る栄養因子である。ここで行われた試験は、効果的かつ効率的に、ラットにおける永久脳虚血傷害の有害な影響から脳を保護するＭＮＴＦの６アミノ酸類似体である、ＧＭ６０２の能力を実証している。虚血性傷害から３時間後、２．５、１０、または２０ｍｇ／ｋｇでのＧＭ６０２の静脈内投与は、梗塞容積の減少および改善した行動的属性、脳血流の増加、ならびに炎症およびに神経変性の減少より、虚血性傷害からの脳内の用量依存的な保護効果を実証した。これらの試験は、ＧＭ６０２が永久脳卒中において有益な効果を有し得ることを示唆している。
【０７８８】
静脈内に投与された場合、ＧＭ６０２は、ラットにおける虚血性傷害から神経保護作用を有することが判明した。
【０７８９】
すべての特許、刊行物、科学論文、ウェブサイト、および他の文書および参照された、または本明細書に記載された文献は、本開示が関連する当業者のレベルで示され、それぞれのこのような参照文書および文献は、その全体が個別に参照することにより一体化される、またはその全体が本明細書に規定されるように、同程度で参照することにより本願に一体化される。出願者は、任意のこのような特許、刊行物、科学論文、ウェブサイト、電子的に利用可能な情報、および他の参照文献もしくは文書からの任意のおよびすべての文献および情報を、本明細書に物理的に組み込む権利を留保する。
【０７９０】
本明細書に記載の特定の方法および組成物は、いくつかの実施形態の代表的かつ例示的なものであり、添付の特許請求の範囲において限定することを意図しない。他の対象、態様、および実施形態は、本明細書の検討後、当業者に生じ得、特許請求により定義されるように、本開示の精神内に含まれる。その範囲および精神から逸脱することなく、本明細書に開示された技術に、代替および修正の変更を行い得ることは、当業者に容易に明白となるであろう。本明細書に例示的に記載される技術は、任意の要素、または限定がない場合でも、適切に実践され得るが、本明細書においては不可欠なものとして具体的に開示されない。したがって、例えば、本明細書のそれぞれの例、本技術の実施形態または実施例において、「含む」、「必須としてなる」、および「〜からなる」の用語のいずれかは、本明細書の他の２つの用語のいずれかに置換されてもよい。また、「含む」、「包含する」、「含有する」等の用語は、制限されず、広範に読み取られる。本明細書に例示的に記載される方法および工程は、異なるステップの順番に実践される可能性があることが望ましく、本明細書または本特許請求の範囲に示されたステップの順番に、必ずしも限定されない。また、本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」は、文脈により明確に指示されない限りは、複数の指示対象を含む。いかなる場合でも、本特許は、本明細書に具体的に開示される具体的な実施例または実施形態または方法に限定されると解釈されない。いかなる場合でも、本特許は、特許商標庁の任意の審査官、または任意の役人、あるいは被雇用者によりなされるいかなる記述によっても限定されるものと解釈されないが、そのような記述が、具体的に、かつ無制限または無条件に、出願者によって、応答文書において、明示的に採択される場合を除く。
【０７９１】
用いられている用語および表現は、限定するものではなく、説明の用語として使用されるが、示されるおよび記載される機能またはその部分の任意の同等物を除くような用語および表現の使用に意図することはないが、様々な修正は、特許請求される技術の範囲内で可能であることを理解される。したがって、本技術は、ある実施形態および任意の機能により具体的に開示されているが、本明細書に開示される概念の修正および変更は、当業者により手段を用いられ得、このような修正および変更は、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の範囲内であると見なされることを理解されるであろう。
【０７９２】
本技術は、本明細書に広範かつ一般的に記載されている。一般的開示範囲内である下位種および亜属の分類のそれぞれもまた、開示の一部を形成する。これは、切除された材料が本明細書に具体的に示されるか否かにかかわらず、属からの任意の主題を除外する条件付き、または消極的な限定で、技術の一般的記述を含む。
【０７９３】
他の実施形態は、以下の特許請求範囲内である。また、技術の特性または態様は、Ｍａｒｋｕｓｈ  ｇｒｏｕｐに関して記載される場合、当業者は、技術もそれにより、Ｍａｒｋｕｓｈ  ｇｒｏｕｐのいずれの個別のメンバーまたはメンバーのサブグループに関して記載されることを理解するであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２５Ｅ】
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【図２５Ｆ】
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【図２５Ｇ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図３９Ｃ】
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【図３９Ｄ】
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【図４０】
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【図４１】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年7月22日(2009.7.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2010509345000001.app
【国際調査報告】
2010509345.tif 000097
2010509345.tif 000098
2010509345.tif 000099
2010509345.tif 000100