(57)【要約】  添加した外因性エピカテキンの存在下で茶の供給材料を酵素的発酵に供する工程を含む、テアフラビン富化茶製品の調製方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
添加した外因性エピカテキンの存在下で茶の供給材料を酵素的発酵に供する工程を含む、テアフラビン富化茶製品の調製方法。
【請求項２】
前記エピカテキンの量が、前記茶の供給材料中の可溶性固形分の乾燥重量のグラム当たり３５から７５０ｍｇである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記発酵の前または最中に前記茶の供給材料をタンナーゼで処理する工程を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記タンナーゼの量が、前記可溶性固形分の乾燥重量のグラム当たり０．０８から８ｍｇである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記発酵が添加した水の存在下で実施される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記水の量が、前記茶の供給材料中の可溶性固形分の乾燥重量のグラム当たり０．１から５００グラムである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記茶の供給材料が前記酵素的発酵が可能な内因性酵素を含む茶葉であり、
（ａ）前記茶葉を干す工程；
（ｂ）干した葉を浸漬する工程；
（ｃ）添加した外因性エピカテキンの存在下で浸漬した茶葉を酵素的発酵に供する工程；及び
（ｄ）焙煎してテアフラビン富化紅茶を得る工程
を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記茶の供給材料が酵素的発酵が可能な内因性酵素を含む茶葉であり、
（ａ）前記茶葉を干す工程；
（ｂ）干した茶葉を浸漬し、浸漬した茶葉に可溶性固形分のグラム当たり１７から５００グラムの水を添加し、スラリーを調製する工程；
（ｃ）添加した外因性エピカテキンの存在下で前記スラリーを酵素的発酵に供し、テアフラビン富化スラリーを得る工程
を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記発酵が外因性酵素と共基質とを添加することによって実施される、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記茶の供給材料が実質的に不活性化した内因性酵素を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記外因性酵素がポリフェノールオキシダーゼであり、前記共基質が酸素である、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記外因性酵素がペルオキシダーゼであり、前記共基質が過酸化水素である、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１３】
茶の供給材料が緑茶またはインスタント茶であり、
（ａ）茶の供給材料に対して可溶性固形分のグラム当たり１７から５００グラムの水を添加し、スラリーを調製する工程；
（ｂ）添加した外因性エピカテキンの存在下で外因性酵素と共基質を添加することにより前記スラリーを酵素的発酵に供し、テアフラビン富化スラリーを得る工程
を含む、請求項９から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記茶の供給材料中のテアフラビン類に対する全カテキンの重量比が１０より大きい、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記茶の供給材料が、可溶性固形分の乾燥重量のグラム当たり１０ｍｇ以下のテアフラビン類を有する、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、茶の加工の分野に関する。本発明は特に、テアフラビン富化茶製品の調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書を通じて従来技術のいずれの議論も、そのような従来技術が広く知られているか、当該分野の共通の一般的知見の一部を形成することを認めるものとして、いずれの態様でも考慮されるべきではない。
【０００３】
テアフラビン類は、ベンゾトロポロン環の存在によって特徴付けられる化合物であり、茶葉が酵素的に酸化されるか、または発酵されて紅茶を生産する際に形成される。テアフラビン類は、テアフラビン（ＴＦ１）、テアフラビン−３−モノガレート（ＴＦ２）、テアフラビン−３'−モノガレート（ＴＦ３）、及びテアフラビン−３−３'−ジガレート（ＴＦ４）の４種の主要な種として存在する、紅茶及びウーロン茶に独特なものである。茶葉では、エピカテキン（ＥＣ）及びエピカテキンガレート（ＥＣＧ）が単純なカテキン類であり、エピガロカテキン（ＥＧＣ）及びエピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）が、４種のテアフラビン種の形成に関与するガロカテキン類である。他の生体内変化と同様に、カテキン類の酸化的生体内変化は複雑であり、二量体テアフラビン類と、テアルビギン類として既知の高分子量化合物とを生じる多数の反応経路を含む。
【０００４】
テアフラビン類は、抗酸化特性、抗菌特性、及び抗炎症特性を有することが既知である。テアフラビン類は、癌、心臓血管疾患及び脳血管疾患、糖尿病、並びに高コレステロール血症を含む各種の疾患に対して有効であることが報告されている。しかしながら、茶中に存在するテアフラビン類の通常濃度は、茶の地理的な位置と茶の品種のような因子に依存して、乾燥重量基準で１−２％である。それ故、増大した濃度のテアフラビンを有する茶製品を得ることが所望されている。過去において、研究者は各種のアプローチによって茶製品中でテアフラビンを富化することを試している。
【０００５】
Cloughley及びEllis (J. Sci. Food Agric. 31 (1980) 924-934)（非特許文献１）は、低ｐＨで発酵工程を実施することによる茶のテアフラビン富化方法を記載している。しかしながら、この方法によって得られた茶は、混乳茶飲料を調製する間で添加した乳の凝乳を引き起こすことができる残余の酸度を有するであろう。
【０００６】
ＵＳ６１１３９６５(2000, Lipton)（特許文献１）は、スラリー酸化的発酵の前にタンナーゼで処理されている緑茶葉のスラリー酸化的発酵製品からテアフラビンを分離することによる、テアフラビンの生産方法を開示している。この文献は更に、テアフラビン富化抽出物の製造方法も教示しており、冷水可溶性茶パウダー及び製品が提供されている。
【０００７】
しかしながら、上記方法によって得ることができるテアフラビンの富化は制限されており、更に富化された濃度のテアフラビンを有する茶製品に対する継続した必要性が存在する。
【０００８】
更に、従来技術で報告されている方法は高価であることが見出されており、それ故、テアフラビン富化茶製品を調製するためのコスト的に有効な方法についての更なる必要性が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】ＵＳ６１１３９６５(2000, Lipton)
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Cloughley及びEllis (J. Sci. Food Agric. 31 (1980) 924-934)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の一つの目的は、従来技術の欠点の少なくとも一つを解消することまたは改良すること、あるいは有用な代替法を提供することである。
【００１２】
本発明の目的の一つは、従来技術の方法と比較して、より高濃度の全テアフラビンを含むテアフラビン富化茶製品を調製する方法を提供することである。
【００１３】
本発明の別の目的は、コスト的に有効な態様で、テアフラビン富化茶製品を調製する方法を提供することである。
【００１４】
本発明者は驚くべきことに、茶の供給材料の酵素的発酵の間の外因性エピカテキンの存在が、テアフラビン富化茶製品を導くことを見出した。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明によれば、添加した外因性エピカテキンの存在下で、茶の供給材料を酵素的発酵に供する工程を含む、テアフラビン富化茶製品の調製方法が提供される。
【００１６】
好ましくは、本発明に係る酵素的発酵は、茶の供給材料中の内因性酵素によってなされる。
【００１７】
本発明の好ましい特徴点の一つによれば、前記エピカテキンの量は、前記茶の供給材料中の可溶性固形分の乾燥重量のグラム当たり３５から７５０、より好ましくは７５から５２０、最も好ましくは１２０から２６０ｍｇである。好ましい特徴点によれば、エピカテキンは、茶の供給材料の発酵前に添加される。
【００１８】
茶の供給材料は好ましくは、発酵の前または最中にタンナーゼで処理される。
【００１９】
好ましい特徴点によれば、発酵は添加した水の存在下で実施される。添加した水の量は好ましくは、茶の供給材料中の可溶性固形分のグラム当たり０．１−５００グラムである。
【００２０】
定義
ここで使用される用語「茶の供給材料」は、植物Camellia sinensisまたはCamellia assamicaから得られる、あるいはそのような植物材料を加工した後にそれらから由来するいずれかの材料を指す。
【００２１】
ここで使用される用語「茶製品」は、茶の供給材料から由来するいずれかの製品を意味する。それは、紅茶、ウーロン茶、インスタント茶、及び緑茶を含むがそれらに制限されない。それはまた、水と茶製品との混合物を含むスラリーをも含む。
【００２２】
ここで使用される用語「テアフラビン富化」は、茶の供給材料と比較して、ＴＦ１、ＴＦ２、ＴＦ３、及びＴＦ４を含む全テアフラビンの増大した濃度を有する茶製品を指す。特に前記茶製品は、茶の供給材料中の可溶性固形分の乾燥重量のグラム当たりのテアフラビンの量と比較して、前記茶製品中の可溶性固形分の乾燥重量のグラム当たり、より高量のテアフラビンを通常有するであろう。
【００２３】
ここで使用される用語「茶葉」は、植物Camellia sinensisまたはCamellia assamicaの茶葉、芽、及び他の部分を含む。
【００２４】
ここで使用される用語「ドゥール(dhool)」は、浸漬した茶葉を意味する。茶葉は、ローリング、クラッシュ・ティアー・カール（ＣＴＣ）、キッチンブレンダーを使用するブレンディング等のような通常使用される方法によって浸漬されてよい。
【００２５】
ここで使用される用語、酵素的発酵は、酵素によって介在される酸化的生体内変化を意味する。発酵は、茶の供給材料中で内因性であり、酵素的発酵が可能な酵素によって実施されて良い。そのような茶の供給材料の非制限的な例として、茶葉とドゥールが含まれる。発酵はまた、外因性酵素と対応する共基質によっても実施できる。
【００２６】
用語「実質的に不活性化された内因性酵素」は、茶の供給材料内に内因的に存在する酵素の不活性化工程に供された茶の供給材料を指す。典型的に不活性化は熱的であり、即ち焙煎と称される１００℃を超える温度に曝露する工程に供することにより実施される。実質的に不活性化された内因性酵素を有する茶の供給材料の例は、インスタント茶及び緑茶を含む。
【００２７】
ここで使用される用語「茶の供給材料中の可溶性固形分」は、（ａ）茶の供給材料を９０℃で１時間水と接触させる工程、（ｂ）遠心／濾過(Whatman 541フィルター)により不溶性固形分から液体を分離する工程、及び（ｃ）前記液体から水を蒸発して可溶性固形分を得る工程によって得られる固形分の量を意味する。
【００２８】
ここで使用される用語「乾燥重量基準」は、水分を含まない基準で表される組成物の比または重量％を指す。ここで使用される用語「新鮮な重量基準」は、水分を含む材料の重量％として表される組成物を指す。典型的には、茶葉は約７０％の水分と約３０％の固形分を含む。全固形分のうち、可溶性固形分は通常約４０重量％である（乾燥重量基準で）。かくして、新鮮な重量基準で〜１２％の可溶性固形分は、乾燥重量基準で〜４０％の可溶性固形分に等しい。上記の典型的な数字は代表的なものであり、実際の数字は地理的な起源、茶の種類、及び湿度に依存して幾分変化するであろうことに注意すべきである。
【００２９】
ここで使用される用語「スラリー発酵」は、茶の供給材料に対する添加した水の比が、新鮮な重量基準で２：１より大きく、乾燥重量基準で６．７：１より大きく、可溶性固形分基準で１７：１より大きい茶の供給材料の発酵を意味する。
【００３０】
ここで使用される用語「固体状態の発酵」は、茶の供給材料に対する添加した水の比が、新鮮な重量基準で２：１未満、乾燥重量基準で６．７：１未満、可溶性固形分基準で１７：１未満である茶の供給材料の酵素的発酵を意味する。典型的には、茶の供給材料に対する添加した水の比は、可溶性固形分基準で２：１未満である。
【００３１】
ここで使用される用語「外因性エピカテキン」は、茶の供給材料に外的に添加され、茶の供給材料中に存在してよいいずれかのエピカテキンを除外したエピカテキンを指す。
【００３２】
酵素活性は、活性ユニットまたは単純にユニットとして表される。タンナーゼ活性ユニットは、供給者のデータから引用される。ポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ）及びペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）のような外因性酵素については、酵素活性は以下のように測定できる。
【００３３】
ポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ）についてのアッセイ
ＰＰＯは、基質として（＋）−カテキンを使用して分光光度測定法でアッセイされる。このアッセイは、０．１Ｍリン酸クエン酸バッファー（ｐＨ５．５）中に３ｍＭカテキンを含む３ｍＬの反応ボリュームで実施される。水（７０％ｖ／ｖ）−エタノール（３０％ｖ／ｖ）混合物中で新たに調製された６０ｍＭのカテキンストック溶液の１５０μＬ等量物を使用して、反応混合物中に３ｍＭのカテキン濃度を得る。適切な希釈の酵素溶液を反応を開始するために添加し、混合物を４０℃で１０−２０分インキュベートする。アセトニトリル（６０％ｖ／ｖ）、酢酸（１０％ｖ／ｖ）、及び水（３０％ｖ／ｖ）を含む２００μＬの溶液を使用して反応を停止する。次いで４００ｎｍの吸光度を記録し、以下の関係式に基づいて活性を計算する：１ユニットの活性＝０．００１の吸光度の増大。
【００３４】
ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）についてのアッセイ
ＰＯＤについてのアッセイは、反応混合物が更に７．３ｍＭの過酸化水素を含む点を除き、ＰＰＯについてのものと同一である。必要量の過酸化水素は、１．５％ｗ／ｖのストック溶液を使用してもたらされる。反応混合物を３０℃で１０−２０分インキュベートする。次いで上述のように反応を終結し、４００ｎｍでの吸光度を測定する。活性を再び以下の関係式に基づいて計算した：１ユニットの活性＝０．００１の吸光度の増大。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明によれば、添加した外因性エピカテキンの存在下で、茶の供給材料を酵素的発酵に供する工程を含む、テアフラビン富化茶製品の調製方法が提供される。
【００３６】
好ましくは、本発明に係る酵素的発酵は、発酵を実施することが可能な茶の供給材料中の内因性酵素によってなされる。
【００３７】
市販品の外因性エピカテキン（例えばSigma社製、Herbs-Tech社製等）を添加することができる。本発明によって添加できる他の外因性エピカテキンの供給源は、ココア、グレープジュース等の他の植物材料のエピカテキン富化抽出物を含む。
【００３８】
本発明に係る方法は、外因性エピカテキンと共に添加された他の外因性カテキン類（エピカテキンガレート、エピガラクトカテキン、及びエピガラクトカテキンガレートを含む）の存在下で実施できる。好ましくは、全外因性カテキン類に対する外因性エピカテキンの比は、茶の供給材料中の全内因性カテキン類に対する内因性エピカテキンの比よりも大きい。
【００３９】
添加される外因性エピカテキンの好ましい量は、全エピカテキンに対する全エピガラクトカテキンのモル比が１：１から１：１６、好ましくは１：１．５から１：１０、より好ましくは１：２から１：９となるように選択される。
【００４０】
本発明の好ましい特徴点の一つによれば、添加されるエピカテキンの量は、茶の供給材料中の可溶性固形分の乾燥重量のグラム当たり３５から７５０、好ましくは７５から５２０、より好ましくは１２０から２６０ｍｇである。
【００４１】
好ましい特徴点によれば、茶の供給材料が茶葉である場合、エピカテキンは摘採後の茶葉に添加される。代替的な好ましい特徴点によれば、エピカテキンは摘採前の茶葉に添加される。
【００４２】
茶の供給材料は、実質的に発酵されていないことが好ましい、即ちそれは、酵素的発酵の工程に事前に供されていない。特に、前記茶の供給材料中のテアフラビン類に対する全カテキン類の重量比は１０より大きく、好ましくは２０より大きく、より好ましくは５０から１００００であることが好ましい。別法としてまたは加えて、茶の供給材料は、可溶性固形分の乾燥重量のグラム当たり好ましくは１０ｍｇ以下、より好ましくは５ｍｇ以下、最も好ましくは２ｍｇ以下のテアフラビンを有する。茶の供給材料は実質的にテアフラビン類を含まないことがとりわけ好ましい。
【００４３】
本発明に係る方法は好ましくは、前記発酵の前または最中にタンナーゼで茶の供給材料を処理する工程を含む。
【００４４】
好ましい特徴点によれば、茶の供給材料をタンナーゼで処理する工程は、発酵の前に実施される。タンナーゼでの処理は、好ましくは適切な温度で適切な時間に亘り窒素の雰囲気で実施される（発酵を防止するため）。適切な条件は実験により決定できる。別の好ましい特徴点によれば、茶の供給材料をタンナーゼで処理する工程は発酵の最中に実施される。タンナーゼの量は、茶の供給材料中の可溶性固形分の乾燥重量のグラム当たり０．０８から８、より好ましくは０．２から４、最も好ましくは０．４から２ｍｇであることが好ましい。
【００４５】
好ましい特徴点によれば、発酵は添加した水の存在下で実施される。添加した水の量は、茶の供給材料中の可溶性固形分のグラム当たり、好ましくは０．１から５００グラムである。好ましい特徴点の一つでは、添加した水は、茶の供給材料中の可溶性固形分のグラム当たり０．１から１７、より好ましくは０．１から１０、最も好ましくは０．１から２グラムであり、固体状態の発酵を導く。別の好ましい特徴点によれば、添加した水の量は、茶の供給材料中の可溶性固形分のグラム当たり１７から５００、より好ましくは２０から４００、最も好ましくは２５から２００グラムであり、スラリー発酵を導く。
【００４６】
好ましい特徴点によれば、茶の供給材料は、酵素的発酵が可能な内因性酵素を含む茶葉であり、前記方法は、
（ａ）前記茶葉を干す工程；
（ｂ）干した葉を浸漬する工程；
（ｃ）添加した外因性エピカテキンの存在下で浸漬した茶葉を酵素的発酵に供する工程；及び
（ｄ）好ましくは約１２０℃の温度で焙煎し、テアフラビン富化紅茶を得る工程
を含む。
【００４７】
上述の方法は好ましくは、工程（ｃ）の酵素的発酵の前または最中に、茶の供給材料をタンナーゼで処理する工程を含む。
【００４８】
別の好ましい特徴点によれば、茶の供給材料は、酵素的発酵が可能な内因性酵素を含む茶葉であり、前記方法は、
（ａ）前記茶葉を干す工程；
（ｂ）干した茶葉を浸漬し、浸漬した茶葉に可溶性固形分のグラム当たり１７から５００グラムの水を添加し、スラリーを調製する工程；
（ｃ）添加した外因性エピカテキンの存在下で前記スラリーを酵素的発酵に供し、テアフラビン富化スラリーを得る工程
を含む。
【００４９】
上述の方法は好ましくは、工程（ｃ）の酵素的発酵の前または最中に、茶の供給材料をタンナーゼで処理する工程を含む。
【００５０】
テアフラビン富化スラリーは好ましくは乾かし、５％未満に含水量を減少し、テアフラビン富化紅茶を得る。別の好ましい特徴点では、不溶性固形分をテアフラビン富化スラリーから分離し、テアフラビン富化溶液を得ることができる。テアフラビン富化溶液は好ましくは乾かし、テアフラビン富化茶製品を得て、それを例えば紅茶、緑茶、ウーロン茶、またはインスタント茶に添加してよい。別の好ましい特徴点によれば、テアフラビン富化溶液を紅茶、緑茶、またはウーロン茶に重ねて乾かし、テアフラビン富化茶を得ることができる。
【００５１】
別の好ましい特徴点によれば、酵素的発酵は、外因性酵素と共基質によって実施される。外因性酵素と共基質による発酵は、茶の供給材料が実質的に不活性な内因性酵素を有する場合に好ましい。実質的に不活性な内因性酵素を有する茶の供給材料の例は、緑茶またはインスタント茶である。スラリー発酵は、茶の供給材料が実質的に不活性な内因性酵素を有する場合に好ましい。
【００５２】
外因性酵素と対応する共基質との適切な組み合わせは、前記組み合わせが茶の供給材料の発酵が可能なように選択される。
【００５３】
好ましい特徴点によれば、外因性酵素はポリフェノールオキシダーゼであり、対応する共基質は酸素である。更に好ましい特徴点によれば、前記ポリフェノールオキシダーゼの量は、前記茶の供給材料中の可溶性固形分の乾燥重量のグラム当たり１×１０４から１×１０７、より好ましくは３．５×１０４から１．５×１０６、最も好ましくは７．５×１０４から７．５×１０５ユニットである。ポリフェノールオキシダーゼは市販品、例えばWorthington社から得ることができ、または適切な植物材料から抽出して精製できる。
【００５４】
別の好ましい特徴点によれば、外因性酵素はペルオキシダーゼであり、共基質は過酸化水素である。ペルオキシダーゼはSigma社のような市場の供給者から得ることができ、または適切な植物材料から抽出して精製できる。更に好ましい特徴点によれば、前記ペルオキシダーゼの量は、前記茶の供給材料中の可溶性固形分の乾燥重量のグラム当たり１．５×１０４から１．５×１０７、より好ましくは３．５×１０４から１．５×１０６、最も好ましくは７．５×１０４から７．５×１０５ユニットである。
【００５５】
前記過酸化水素の量は、前記茶の供給材料中の可溶性固形分の乾燥重量のグラム当たり７から７００ｍｇ、より好ましくは１５から３００ｍｇ、最も好ましくは３５から１００ｍｇであることが好ましい。
【００５６】
好ましい特徴点によれば、茶の供給材料は緑茶またはインスタント茶であり、前記方法は、
（ａ）茶の供給材料に対して可溶性固形分のグラム当たり１７から５００グラムの水を添加し、スラリーを調製する工程；
（ｂ）添加した外因性エピカテキンの存在下で外因性酵素と共基質を添加することにより前記スラリーを酵素的発酵に供し、テアフラビン富化スラリーを得る工程
を含む。
【００５７】
上述の方法は好ましくは、工程（ｂ）の酵素的発酵の前または最中に、茶の供給材料をタンナーゼで処理する工程を含む。
【００５８】
テアフラビン富化スラリーは好ましくは乾かされ、５（重量）％未満に含水量を減少し、テアフラビン富化紅茶を得ることができる。別の好ましい特徴点では、不溶性固形分をテアフラビン富化スラリーから分離し、テアフラビン富化溶液を得る。テアフラビン富化溶液は好ましくは乾かし、テアフラビン富化茶製品を得て、それを例えば紅茶、緑茶、ウーロン茶、またはインスタント茶に添加しても良い。別の好ましい特徴点によれば、テアフラビン富化溶液を紅茶に重ねて乾かし、テアフラビン富化紅茶を得ることができる。
【００５９】
別の好ましい特徴点によれば、上述の方法で得られたテアフラビン富化スラリーを紅茶に重ねて、テアフラビン富化紅茶を得る。
【００６０】
別の好ましい特徴点によれば、テアフラビン富化スラリーをインスタント茶に重ねて、テアフラビン富化インスタント茶を得る。
【実施例】
【００６１】
本発明は、特定の実施例を参考にして記載されるであろう。以下の実施例は説明の目的のみによって提供され、いずれの態様でも本発明の範囲を制限するものではない。
【００６２】
材料と方法
表１は、実施例で使用される材料のリストを提供する。
【００６３】
【表１】
2010510786.tif 000002
【００６４】
テアフラビンの分析方法
テアフラビンの抽出
全テアフラビン濃度は、水性メタノール性抽出を使用して測定された。
【００６５】
固体状態の発酵から得られたサンプルを、新鮮な重量基準で１６．７：１のドゥール比に高水性メタノール性溶液で〜８０℃で１０分間の７０％メタノール抽出を使用して抽出した。抽出物のサンプルを、９０％ｖ／ｖの水、１０％ｖ/ｖのアセトニトリル、０．５ｇ／Ｌのアスコルビン酸、及び０．５ｇ／Ｌのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む溶液を使用して１：１に希釈し、テアフラビンとカテキンの酸化を防止した。
【００６６】
スラリー発酵システムについては、水性スラリーに対して１００％メタノールの必要量を添加することによりこの抽出物を調製し、７０％メタノールと３０％水の組成物を得た。添加したメタノールの量は、存在する水の体積の２．３３倍であり、それ故、新鮮な重量基準で１６．７：１または乾燥重量基準で〜５５．７：１のドゥール比に水性メタノール性溶液で抽出を実施した。  ドゥールに対する７０％のメタノールのこの高い比で、テアフラビンの定量的抽出は、１０分の抽出時間で〜８０℃で得られる。
【００６７】
テアフラビンの分析
サンプルを−８０℃で貯蔵し、ダイオードアレイ検出を備えた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用してテアフラビンを分析した。
【００６８】
テアフラビンを、３８０ｎｍでの検出、４０℃のカラム温度、２０μＬの注入体積、及び１ｍＬ／分の流速でＨＰＬＣ(Shimadzu)によって分析した。テアフラビン分析の移動相は、水中に２％（ｖ／ｖ）の酢酸（移動相Ａ）及びアセトニトリル（移動相Ｂ）であった。５０分に亘り８％のＢから６９％のＢへの勾配を使用してテアフラビンを分離し、次いでカラムを８％のバッファーＡで５分間平衡化した。市販品の高純度テアフラビンを定量のためのスタンダードとして使用した。
【００６９】
固体状態の発酵
固体状態の発酵は、大気に曝露した平坦な表面に５ｇのドゥールを広げることにより、室温（〜２５℃）で実施した。発酵時間は９０−１２０分であった。固体状態の発酵をタンナーゼで実施する場合、タンナーゼの投与量は茶の供給材料中の可溶性固形分のグラム当たり１．６７ｍｇであった。エピカテキン、またはエピカテキンとタンナーゼの必要量を含む水を、１．７：１（可溶性固形分基準）の比でドゥールに添加した。
【００７０】
固体状態の発酵で添加されるエピカテキンとタンナーゼの量は、各種の実施例について表２に示されている。
【００７１】
【表２】
2010510786.tif 000003
【００７２】
実施例１〜７は本発明に係る方法の実施例であり、比較例Ａ、Ｂ１及びＢ２は本発明の範囲外のものである。
【００７３】
スラリー発酵
スラリー発酵は、３０℃で１９０−２００ｒｐｍでの軌道シェイカーを使用してシェイクフラスコで実施された。５ｇ（新鮮な重量）のドゥールを、４１．７：１（または新鮮な重量基準で５：１）の可溶性固形分比で水を使用して発酵実験のために使用した。エピカテキンの必要量を、発酵前にスラリーに添加した。発酵時間は９０分であった。スラリー発酵を添加したタンナーゼ（グラム当たり５００００タンナーゼ活性ユニットの活性、例えばKikkoman）で実施する際に、１ｇ／ｌのストック溶液を使用してタンナーゼを可溶性固形分基準で０．８３ｍｇ／ｇで投与した。
【００７４】
スラリー発酵で添加されたエピカテキンとタンナーゼの量が、各種の実施例について表３に示されている。
【００７５】
【表３】
2010510786.tif 000004
【００７６】
実施例８−１５は本発明に係る方法の実施例であり、比較例Ｃ、Ｄ１及びＤ２は本発明の範囲外である。
【００７７】
結果
全テアフラビンを全ての実施例の茶製品について分析し、その結果が固体状態の発酵について表４に、スラリー発酵について表５に示されている。
【００７８】
【表４】
2010510786.tif 000005
【００７９】
外因性エピカテキンの存在下での酵素的発酵の工程を含む方法によって調製された実施例１〜４の茶製品は、比較例Ａの茶製品と比較して富化した濃度のテアフラビンを有することが上記結果から明らかである。
【００８０】
同様に、外因性エピカテキンとタンナーゼの存在下での酵素的発酵の工程を含む方法によって調製された実施例５〜８の茶製品は、比較例Ｂ１及びＢ２の茶製品と比較して富化した濃度のテアフラビンを有する。
【００８１】
【表５】
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【００８２】
外因性エピカテキンと外的に添加した水の存在下での酵素的発酵の工程を含む方法によって調製された実施例８〜１１の茶製品は、比較例Ｃの茶製品と比較して富化した濃度のテアフラビンを有することが上記結果から明らかである。
【００８３】
同様に、外因性エピカテキン、タンナーゼ、及び外的に添加した水の存在下での酵素的発酵の工程を含む方法によって調製された実施例１２〜１５の茶製品は、比較例Ｄ１及びＤ２の茶製品と比較して富化した濃度のテアフラビンを有する。
【００８４】
更に、テアフラビン濃度は、ドゥールの乾燥重量当たり約３００ｍｇ／ｇまでのエピカテキンのエピカテキン濃度の増大で増大することが全ての上記実施例から明らかである。ドゥールの乾燥重量当たり約５００ｍｇ／ｇへのエピカテキン濃度の更なる増大では、テアフラビン濃度は一定または減少するという傾向が示されている。それ故、ドゥールの乾燥重量のグラム当たり７５０ｍｇを超える濃度でのエピカテキンの取り込みは、テアフラビンの更なる富化を与えたり経済的に実用的であることはなさそうである。
【００８５】
かくして本発明によれば、タンナーゼの存在下または非存在下のいずれかで、外因性エピカテキンの存在下での酵素的発酵を実施することによる、固体状態の発酵並びにスラリー発酵を使用するテアフラビン富化茶製品の調製が可能であった。
【国際調査報告】
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