(57)【要約】本発明は、コロニー刺激因子の全身性の投与による処置を必要とする動物の器官または組織において組織内在性マクロファージ活性を増大することによって、アミロイドーシス（アミロイド症）、アミロイド斑形成に関連する疾患および障害、例えばアルツハイマー病を処置する方法に関する。例えば、器官または組織における骨髄由来小グリア細胞の活性は、コロニー刺激因子、特にマクロファージコロニー刺激因子を、単独かまたはさらなるコロニー刺激因子、幹細胞因子もしくはアミロイドーシスを処置し得る他の化合物と組み合わせるかのいずれかで全身投与することによって、増大され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミロイドーシスに罹患した動物の器官または組織における組織内在性マクロファージ活性を増大する方法であって、増大を必要とする動物に対して：
（ａ）単離されたコロニー刺激因子ポリペプチド、またはその活性改変体、フラグメントもしくは誘導体；
（ｂ）プロモーターとの作動可能な会合を通じた、コロニー刺激因子ポリペプチド、またはその活性改変体、フラグメントもしくは誘導体をコードする単離されたポリヌクレオチド；ならびに
（ｃ）（ａ）および（ｂ）の組み合わせ；
からなる群より選択される活性成分を含む組成物を全身投与し、
ここで該組成物は該動物において組織内在性マクロファージ活性を増大するのに有効な量で投与される工程を包含し、これによって該アミロイドーシスを処置する、方法。
【請求項２】
前記器官または組織中の組織内在性マクロファージ活性の前記増大が、該器官または組織における組織内在性マクロファージの数の増大によって達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記器官または組織中の組織内在性マクロファージ活性の前記増大が、該器官または組織における組織内在性マクロファージの機能的活性の増大によって達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記器官または組織中の組織内在性マクロファージ活性の前記増大が、該器官または組織における組織内在性マクロファージの標的化における増大によって達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記組織内在性マクロファージが小神経膠細胞である、請求項１から４に記載の方法。
【請求項６】
前記小神経膠細胞が骨髄由来小神経膠細胞である、請求項１から５に記載の方法。
【請求項７】
前記アミロイドーシスが、前記動物の器官または組織におけるアミロイド斑または凝集体の形成を含む、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記アミロイド斑または凝集体が前記組織内在性マクロファージによって貪食される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記組織内在性マクロファージが骨髄由来小グリア細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記アミロイド斑または凝集体が、数が減少するか、大きさが低下するか、またはその組み合わせである、請求項７から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項７から１０のいずれか１項に記載の方法であって、前記の斑または凝集体が、βアミロイド、免疫グロブリン軽鎖、血清アミロイドＡ、β２−ミクログロブリン、ドルーゼ、野性型もしくは変異型のトランスサイレチン、変異体アポリポタンパク質ＡＩ、変異体アポリポタンパク質ＡＩＩ、膵島アミロイド前駆体タンパク質、カルシトニン、心房性ナトリウム利尿タンパク質、ハンチンチン、「スクレイピー」型のヒトプリオンタンパク質、α−シヌクレイン、タウ、シスタチンＣ、ゲルソリン、アミリン、変異体リゾチーム、インスリン、スーパーオキシドジスムターゼＩ、アンドロゲンレセプター、アタキシン、ＴＡＴＡボックス結合タンパク質、変異体フィブリノーゲンＡα鎖、βタンパク質前駆体、およびアミロイドタンパク質の組み合わせからなる群より選択されるタンパク質を含む、方法。
【請求項１２】
前記アミロイドーシスが、アルツハイマー病、軽度認識障害、軽度から中等度の認識障害、血管性認知症、脳のアミロイドアンギオパチー（ＣＡＡ）、老年性認知症、トリソミー２１（ダウン症）、オランダ型遺伝性アミロイド性脳出血（ＨＣＨＷＡ−Ｄ）、封入体筋炎、加齢性黄斑変性症、多発性骨髄腫、肺性高血圧、うっ血性心不全、ＩＩ型糖尿病、関節リウマチ、家族性アミロイド・ポリニューロパシー（ＦＡＰ）、海綿状脳症、パーキンソン病、原発性全身性アミロイドーシス、二次性全身性アミロイドーシス、前頭側頭認知症、老人性全身性アミロイドーシス、遺伝性脳のアミロイドアンギオパチー、血液透析関連アミロイドーシス、家族性アミロイド多発神経障害ＩＩＩ、フィンランド遺伝性全身性アミロイドーシス、甲状腺の髄様癌、心房性アミロイドーシス、遺伝性非神経障害性全身性アミロイドーシス、注射部位限局性アミロイドーシス、遺伝性腎アミロイドーシス、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、脊髄性および延髄性の筋萎縮症、脊髄小脳失調、封入体筋炎、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記アミロイドーシスがアルツハイマー病である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
動物の前記器官または組織が、中枢神経系（ＣＮＳ）、末梢神経系（ＰＮＳ）、脳、肝臓、脾臓、膵臓、腎臓、胃、心臓、胃腸管、甲状腺、肺、唾液腺、脳血管、全身の血管およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記器官または組織が脳である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記コロニー刺激因子が、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、任意のこのようなコロニー刺激因子の活性な改変体、フラグメントまたは誘導体、および２つ以上のこのようなコロニー刺激因子またはその活性改変体、フラグメントもしくは誘導体の組み合わせからなる群より選択される、請求項１から１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記コロニー刺激因子がマクロファージコロニー刺激因子またはその活性改変体、フラグメントもしくは誘導体である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記コロニー刺激因子またはその活性改変体、フラグメントもしくは誘導体が、配列番号１、２、または３のアミノ酸残基ＸからＹまでを含み、ここでＸ＝３３から３７までであり、かつＹが１４５から１５８までである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記コロニー刺激因子またはその活性改変体、フラグメントもしくは誘導体が、配列番号１、２、または３のアミノ酸残基ＸからＹ１までを含み、ここでＹ１＝１８１から１９１までである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記コロニー刺激因子またはその活性改変体、フラグメントもしくは誘導体が、配列番号１、２、または３のアミノ酸残基ＸからＹ２までを含み、ここでＹ２＝２２０から２２４までである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記コロニー刺激因子またはその活性改変体、フラグメントもしくは誘導体が、配列番号１または２のアミノ酸残基ＸからＹ３までを含み、ここでＹ３＝３３７である、請求項２８に記載の方法。
【請求項２２】
前記コロニー刺激因子またはその活性改変体、フラグメントもしくは誘導体が、配列番号１のアミノ酸残基ＸからＹ４までを含み、ここでＹ４＝５５４である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記コロニー刺激因子またはその活性改変体、フラグメントもしくは誘導体が、配列番号１または２のアミノ酸残基ＸからＹ５までを含み、ここでＹ５＝４３８である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記コロニー刺激因子またはその活性改変体、フラグメントもしくは誘導体が、配列番号１、２または３のアミノ酸残基ＸからＹ６までを含み、ここでＹ６＝２５６である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
前記コロニー刺激因子またはその活性改変体、フラグメントもしくは誘導体が、配列番号１、２または３のアミノ酸残基Ｘ１からＹまでを含み、ここでＸ１＝１から４までである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２６】
前記コロニー刺激因子またはその活性改変体、フラグメントもしくは誘導体が、配列番号１、２または３のアミノ酸残基Ｘ１からＹ１までを含み、ここでＹ１＝１８１から１９１までである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記コロニー刺激因子またはその活性改変体、フラグメントもしくは誘導体が、配列番号１、２または３のアミノ酸残基Ｘ１からＹ２までを含み、ここでＹ２＝２２０から２２４までである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記コロニー刺激因子またはその活性改変体、フラグメントもしくは誘導体が、配列番号１、２または３のアミノ酸残基Ｘ１からＹ３までを含み、ここでＹ３＝３３７である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記コロニー刺激因子またはその活性改変体、フラグメントもしくは誘導体が、配列番号１のアミノ酸残基Ｘ１からＹ４までを含み、ここでＹ４＝５５４である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記コロニー刺激因子またはその活性改変体、フラグメントもしくは誘導体が、配列番号１または２のアミノ酸残基Ｘ１からＹ５までを含み、ここでＹ５＝４３８である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記コロニー刺激因子またはその活性改変体、フラグメントもしくは誘導体が、配列番号１、２または３のアミノ酸残基Ｘ１からＹ６までを含み、ここでＹ６＝２５６である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１７に記載の方法であって、前記コロニー刺激因子が、以下：
（ｉ）配列番号１、２または３の１から１４５まで；
（ｉｉ）配列番号１、２または３の１から１４９まで；
（ｉｉｉ）配列番号１、２または３の１から１５０まで；
（ｉｖ）配列番号１、２または３の１から１５８まで；
（ｖ）配列番号１、２または３の１から１７７まで；
（ｖｉ）配列番号１、２または３の１から１８１まで；
（ｖｉｉ）配列番号１、２または３の１から１８２まで；
（ｖｉｉｉ）配列番号１、２または３の１から１９０まで；
（ｉｘ）配列番号１、２または３の１から２２１まで；
（ｘ）配列番号１、２または３の１から２２３まで；
（ｘｉ）配列番号１または２の１から３７７まで；
（ｘｉｉ）配列番号１、２または３の３３から１７７まで；
（ｘｉｉｉ）配列番号１、２または３の３３から１８１まで；
（ｘｉｖ）配列番号１、２または３の３３から１８２まで；
（ｘｖ）配列番号１、２または３の３３から１９０まで；
（ｘｖｉ）配列番号１、２または３の３３から２２１まで；
（ｘｖｉｉ）配列番号１、２または３の３３から２２３まで；
（ｘｖｉｉｉ）配列番号１または２の３３から３７７まで；
（ｉｘｘ）配列番号１の１から５５４まで；
（ｘｘ）配列番号１の３３から５４４まで；
（ｘｘｉ）配列番号１または２の１から４３８まで；
（ｘｘｉｉ）配列番号１または２の３３から４３８まで；
（ｘｘｉｉｉ）配列番号１、２または３の１から２５６まで；
（ｘｘｉｖ）配列番号１、２または３の３３から２５６まで；
（ｉｘｘ）参照アミノ酸配列のうちの２つ以上の組み合わせ、
からなる群より選択される参照アミノ酸配列に対して少なくとも９０％の類似性を有するポリペプチドフラグメントを含む、方法。
【請求項３３】
前記ポリペプチドフラグメントの前記アミノ酸配列が前記参照アミノ酸配列に対して少なくとも９５％類似する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ポリペプチドフラグメントの前記アミノ酸配列が前記参照アミノ酸配列と同一である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記組成物が、単離されたコロニー刺激因子ポリペプチド、またはその活性改変体、フラグメントもしくは誘導体である、請求項１から３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記組成物が、請求項１８から３４に記載の２つの同一のポリペプチドフラグメントを含むホモ二量体を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項３７】
前記組成物が、配列番号１８から３４に記載の２つの異なるポリペプチドフラグメントを含むヘテロ二量体を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項３８】
前記組成物が、プロモーターとの作動可能な会合を通じたコロニー刺激因子ポリペプチド、またはその活性改変体、フラグメントもしくは誘導体をコードする単離されたポリヌクレオチドであり、該ポリヌクレオチドが発現ベクターを介して送達される、請求項１から３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
請求項３８または３９に記載の方法であって、前記送達が（ａ）前記ポリヌクレオチドまたは前記ベクターを含む、培養された宿主細胞であって、前記ＣＳＦまたはその活性なフラグメント、改変体もしくは誘導体を発現する培養された宿主細胞を提供する工程と；（ｂ）該培養された宿主細胞を哺乳動物中に導入し、その結果該ＣＳＦまたはその活性なフラグメント、改変体もしくは誘導体を該哺乳動物中で発現する工程を包含する、方法。
【請求項４１】
請求項４０に記載の方法であって、前記培養された宿主細胞が、（ａ）請求項３４に記載のポリヌクレオチドまたは請求項３４もしくは３５に記載のベクターを用いてレシピエント宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトする工程と、（ｂ）該形質転換されたかまたはトランスフェクトされた宿主細胞を培養する工程と、を包含する方法によって作製される、方法。
【請求項４２】
前記培養された宿主細胞が処置されるべき前記哺乳動物に由来する、請求項４０または４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス、アルファウイルスベクター、エンテロウイルスベクター、ペスチウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、パポバウイルスベクター、およびポックスウイルスベクターからなる群より選択される、請求項３９から４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記ウイルスベクターが複製欠損ウイルスベクターである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記コロニー刺激因子またはその活性な改変体、フラグメント、もしくは誘導体がさらに、該コロニー刺激因子またはその活性な改変体、フラグメント、もしくは誘導体に融合された第二のポリペプチドを含む、請求項１から４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記第二のポリペプチドが免疫グロブリンＦｃ領域、血清アルブミン部分、標的化部分、レポーター部分、精製促進部分、およびそれらの２つ以上の組み合わせからなる群より選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記第二のポリペプチドが免疫グロブリンＦｃ領域である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記免疫グロブリンＦｃ領域がヒンジおよびＦｃ領域である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記Ｆｃ領域がＩｇＡのＦｃ領域；ＩｇＤのＦｃ領域；ＩｇＧのＦｃ領域、ＩｇＥのＦｃ領域；およびＩｇＭのＦｃ領域からなる群より選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記コロニー刺激因子、またはその活性なフラグメント、改変体もしくは誘導体の有効量が約５０μｇ／ｋｇ／日と約１００μｇ／ｋｇ／日との間である、請求項１から４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記全身投与が、経口投与、鼻投与、非経口投与、経皮投与、局所投与、眼内投与、気管支内投与、腹腔内投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、口腔投与、舌下投与、膣投与によって、吸入によって、埋め込みポンプによって、およびそれらの２つ以上の組み合わせによって達成される、請求項１から５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記全身投与が、１日あたり１回、連続して、間欠的に、アミロイド斑の形成の前、間または後に、アミロイド斑の大きさもしくは形成のいずれかまたは両方の軽減またはそれらの２つ以上の組み合わせがあるまで行われる、請求項１から５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記コロニー刺激因子またはその活性な改変体、フラグメントもしくは誘導体を頭蓋内に投与する工程をさらに包含する、請求項１から５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
幹細胞因子またはその活性な改変体、フラグメントもしくは誘導体を投与する工程をさらに包含する、請求項１から５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記幹細胞因子が、顆粒球コロニー刺激因子、ＩＬ−３、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、キットリガンド、または該コロニー刺激因子のいずれか１つの活性改変体、フラグメント、もしくは誘導体、および該コロニー刺激因子、またはその活性な改変体、フラグメントもしくは誘導体のいずれかのうちの２つ以上の組み合わせからなる群より選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
アミロイドーシスを処置、予防または阻害するために有効な薬学的化合物を投与する工程をさらに包含する、請求項１から５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記薬学的化合物が、コリンエステラーゼインヒビター、例えば、ガランタミン、リバスチグミン、タクリンおよびドネペジル；ならびにＮ−メチルＤ−アスパルテート（ＮＭＤＡ）アンタゴニストメマンチン；メルファランに続く骨髄回復を支持するための自家の幹細胞移植（ＨＤＭ／ＳＣＴ）、コルヒチン、金属キレーター、アミロイド形成の低分子インヒビター、ベンゾチアゾール、４’−ジアニリノ−１，１’ビナフチル−５，５’−スルホナート（ビス−ＡＮＳ）、フタロシアニンテトラスルホナート、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記組成物が、結合剤、崩壊剤、安定化剤、充填剤、希釈剤、可溶化剤、流動促進剤、圧縮補助剤、緩衝剤、サーファクタント、防腐剤、懸濁剤、フィルム形成剤（film former）、着色剤、香味料、甘味料、およびそれらの２つ以上の組み合わせからなる群より選択される薬学的に受容可能な賦形剤をさらに含む、請求項１から５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記動物が脊椎動物である、請求項１から５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記動物が哺乳動物である、請求項１から５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記動物がヒトである、請求項１から６０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミロイドーシスの処置の必要な動物の組織または器官において、組織内在性マクロファージ、例えば、骨髄由来小神経膠細胞の活性を増大することによる、アミロイド斑の形成および沈着に起因する、アミロイドーシスに関連する疾患および障害を処置する方法に関する。骨髄由来小神経膠細胞細胞は、器官または組織におけるアミロイド斑、例えば脳のβアミロイド斑の大きさおよび量を減少し得る。アミロイド班は、アルツハイマー病（ＡＤ）を含む種々の疾患および障害に関連する。脳を含む器官または組織における骨髄由来小神経膠細胞細胞の活性は、コロニー刺激因子の、単独で、またはさらなるコロニー刺激因子、幹細胞因子もしくはアミロイドーシスに関連する疾患、例えば、アルツハイマー病を処置し得る他の化合物と組み合わせるかのいずれかの全身投与によって増大され得る。
【背景技術】
【０００２】
アミロイドーシスは、タンパク質折り畳み（または誤った折り畳み）の障害であり、ここでは、可溶性タンパク質が、細胞外腔に沈着される不溶性原線維凝集体を形成し、進行して、組織構造を破壊して、機能を障害する。多くの異なる関連のないタンパク質（βアミロイド、免疫グロブリン軽鎖（λ）、アミロイドＡ（血清アミロイドＡのＮ−末端フラグメント）、β２−ミクログロブリン、ドルーゼ（ｄｒｕｓｅｎ）、野性型もしくは変異型のトランスサイレチン、変異体アポリポタンパク質、膵島アミロイド前駆体タンパク質、カルシトニン、心房性ナトリウム利尿タンパク質、ハンチンチン（huntingtin）（インタクトまたはポリ（Ｑ）リッチフラグメント）、「スクレイピー」型のヒトプリオンタンパク質、α−シヌクレイン、タウ（野性型または変異体）、シスタチンＣ、ゲルソリン、アミリン、リゾチーム（変異体）、インスリン、スーパーオキシドジスムターゼＩ（野性型または変異体）、アンドロゲンレセプター（インタクトまたはポリ（Ｑ）リッチフラグメント）、アタキシン（インタクトまたはポリ（Ｑ）リッチフラグメント）、またはＴＡＴＡボックス結合タンパク質（インタクトまたはポリ（Ｑ）リッチフラグメント）はインビボでアミロイド斑を形成し得るが、これらの別個のタンパク質によって形成される原線維は、構造が極めて類似する。（非特許文献１）。アミロイド沈着は、全身性であっても局所的であってもよい。（非特許文献２）。全身性のアミロイドーシスでは、沈着は脳を除く任意の器官で生じ、かつ器官の機能の障害に起因して致死性であり得る。局所的なアミロイドーシスでは、沈着は、脳を含む特定の器官または組織に限局されるが、これらの局在する斑が重篤な疾患の発現に関連する場合、しばしば晩年まで臨床的にはサイレントなままである。アミロイド斑は、限定はしないが以下：アルツハイマー病、軽度認識障害、軽度から中等度の認識障害、血管性認知症、老年性認知症、トリソミー２１（ダウン症）、オランダ型遺伝性アミロイド性脳出血（ＨＣＨＷＡ−Ｄ）、脳のアミロイドアンギオパチー（ＣＡＡ）、加齢性黄斑変性症、多発性骨髄腫、肺性高血圧、うっ血性心不全、ＩＩ型糖尿病、関節リウマチ、家族性アミロイド・ポリニューロパシー（ＦＡＰ）、海綿状脳症、パーキンソン病、原発性全身性アミロイドーシス、二次性全身性アミロイドーシス、前頭側頭認知症、老人性全身性アミロイドーシス、遺伝性脳のアミロイドアンギオパチー、血液透析関連アミロイドーシス、家族性アミロイド多発神経障害ＩＩＩ、フィンランド遺伝性全身性アミロイドーシス、甲状腺の髄様癌、心房性アミロイドーシス、遺伝性非神経障害性全身性アミロイドーシス、注射部位限局性アミロイドーシス、遺伝性腎アミロイドーシス、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、脊髄性および延髄性の筋萎縮症、脊髄小脳失調、脊髄小脳失調１７を含む状態で観察される。（非特許文献１）。
【０００３】
局所的なアミロイドーシス障害に特有の特徴は、アルツハイマー病（ＡＤ）で観察され、このアルツハイマー病は、神経変性障害であって、記憶、認知、推論、判断および情動の安定性の進行的消失、ならびに最終的には死をもたらす。ＡＤの病理学的な特徴は、脳におけるアミロイド斑の存在である。ＡＤに関連するアミロイド斑の主要な構成は、Ａβペプチドであって、これはβセクレターゼ（βＡＣＥ）およびγセクレターゼ（プレセニリン−１，２−および関連のタンパク質）によってアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）からタンパク質分解によって誘導される。ＡＰＰはまた、α−セクレターゼおよびγ−セクレターゼによって無害なペプチドおよびタンパク質フラグメントに変換される。ヒトの家族性ＡＤ（ＦＡＤ）の遺伝的研究では、ＡＰＰおよび／またはプレセニリン類における変異が総Ａβペプチドの産生または他のＡＰＰ切断産物に対する原線維（ｆｉｂｒｉｌｌｏｇｅｎｉｃ）Ａβ４２−３ペプチドの比を変化させることが見出されている。さらに、変異体プレセニリン類の有無におけるＡＰＰの変異体ヒトＦＡＤバージョンを発現するマウスは、アミロイド斑の沈着および認知障害を示す。
【０００４】
小グリア細胞はアミロイド斑に物理的に関連しており、かつアミロイド斑に取り込まれ、それによって、アミロイドーシスの病態生理学、例えば、ＡＤに関係するとみなされる。家族性アミロイド多発神経障害（ＦＡＰ）では、炎症促進性サイトカイン、例えば、ＴＮＦα、ＩＬ−１βおよびマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）は、特に神経内膜軸索で上方制御される。（非特許文献３）。ＦＡＰ患者におけるサイトカインで観察されたこの増大は、この障害の後期段階に関連した。増大したＭ−ＣＳＦの値はまた、原発性アミロイドーシス（ＡＬ）、二次性アミロイドーシス、および全身性アミロイドーシスでも報告されている。（非特許文献４）。脳では、Ｍ−ＣＳＦはまたβアミロイド斑と物理的に関連しており、ＡＤの病態生理学に潜在的に影響する。しかし、特定の器官または組織、例えば、脳内の小グリア細胞および／またはＭ−ＣＳＦ活性の状態の変化が全身性または局所性のアミロイドーシス、例えば、ＡＤの経過に影響するか否かという疑問は残っている。
【０００５】
小グリア細胞は、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）に対して応答性である単球性の前駆体に由来する。その安全な毒性プロフィールおよび顕性の単球増加症を扇動する能力にもかかわらず、Ｍ−ＣＳＦは試験された癌モデルで十分な臨床的有効性を示すことができなかった。しかし、Ｍ−ＣＳＦが、脳を含む器官または組織において、小神経膠細胞を含む、組織内在性マクロファージの細胞生物学に影響し得、かつそれによってアミロイド障害、例えばＡＤの経過に影響し得ることを示唆する証拠がある。Ｍ−ＣＳＦは、ＡＤを含むアミロイドーシスの見込みのある処置である。
【０００６】
Ｍ−ＣＳＦは、インビトロにおける組織内在性マクロファージ増殖因子であって、抗炎症性機能および炎症促進性機能の両方を促進することが見出されている。例えば、Ｍ−ＣＳＦは、βアミロイド斑を貪食する小神経膠細胞細胞の能力を増大することがインビトロで示されている。（非特許文献５）。追加の実験によって、Ｍ−ＣＳＦレポーターの小グリア細胞へのトランスフェクションが小グリア細胞の機能、すなわちβアミロイド斑を貪食する能力の増大を生じることが示されている。（非特許文献６および非特許文献７）。
【０００７】
小グリア細胞を含む組織内在性マクロファージは、食作用を通じるか、またはメタロプロテイナーゼの限局性放出を通じてβアミロイド斑形成プロセスを減弱すると考えられる。それらはまた、アミロイド斑を毒素へ処理することによって神経変性プロセスを扇動し得、それによって炎症性応答を扇動する。これらの応答は、アミロイド斑形成の段階に時間的に依存し得る（非特許文献８）。
【０００８】
脳は、残留性および骨髄由来小グリア細胞の両方を有する。後者は、単球の造血前駆体から生じる。近年のＳｉｍａｒｄら（Ｎｅｕｒｏｎ  ４９：４８９〜５０２（２００６）による研究では、骨髄由来小グリア細胞を選択的に枯渇させることによって、ＡＤのＡＰＰ／ＰＳ１マウスモデルにおけるアミロイド斑の大きさおよび数の両方の増大がもたらされるということが示されている。しかし、骨髄由来小グリア細胞を増大するか、または骨髄由来小グリア細胞機能を増強するか（炎症促進応答または抗炎症応答のいずれか）がアミロイド斑のサイズおよび形成の減少をもたらすという逆の仮説は、今までのところ提唱もされておらず検証もされていない。
【０００９】
末梢の単球増加症が脳において小グリア細胞の再増殖を生じ得ることは、標識された造血幹細胞から十分な実験的証拠がある（非特許文献８およびＳｉｍａｒｄら（Ｎｅｕｒｏｎ  ４９：４８９〜５０２（２００６））。造血性コロニー刺激因子（ＣＳＦ）は、骨髄移植および再増殖の速度を増強することが臨床的に示されている。ＣＳＦはまた、赤血球、骨髄球およびリンパ球の細胞の数、生存および機能を増大するために、ヒトで臨床的に用いられている。
【００１０】
Ｍ−ＣＳＦは炎症促進性因子ＩＬ−１、ＩＬ−６および一酸化窒素のインビトロでの小グリア細胞産生を増強する。（Ｍｕｒｐｈｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２０９６７〜７１（１９９８））そして、βアミロイドと一緒にされた場合、小グリア細胞媒介性の神経毒性を誘導する（Ｌｉら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．９１：６２３〜６３３（２００４））。どの効果がインビボで優勢であるかはまだ探究されていない。
【００１１】
Ｍ−ＣＳＦレセプターおよびＭ−ＣＳＦは、ＡＤマウス（ＡβＰＰＶ７１７Ｆ）の脳で上方制御される。（Ｍｉｔｒｏｓｉｎｏｖｉｃら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：３０１４２〜９（２００１）、Ｍｕｒｐｈｙら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５７：８９５〜９０４（２０００））。骨粗鬆症マウス（ｏｐ−／ｏｐ−）マウスであるマウスにおけるＭ−ＣＳＦ遺伝子の天然に存在する欠失（Ｍａｒｋｓ＆Ｌａｎｅ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅｒｅｄｉｔｙ  ６７：１１〜１８（１９７６）は、単球、マクロファージ、脳小グリア細胞および破骨細胞の減少を生じる。Ｍ−ＣＳＦがない骨粗鬆症マウスでは、アミロイド斑の増大、および脳小グリア細胞の減少という報告がある（Ｓａｓａｋｉら、Ｎｅｕｒｏ．２０：１３４〜４２（２０００）、Ｋａｋｕら、Ｂｒａｉｎ．Ｒｅｓ．Ｐｒｏｔｏｃ．１２：１０４〜１０８（２００３））。Ｋａｗａｔａら（Ｊ．Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．３３：６５４〜６０（２００６））は、Ｍ−ＣＳＦの脳への直接の単回注射が、観察される小グリア細胞の数を増大し得、かつ斑の形成の速度および大きさを低減するということを示している。しかし、Ｍ−ＣＳＦの全身性投与が脳における骨髄由来の小グリア細胞の活性に影響するということは今日まで提唱もされておらず、証拠もない。
【００１２】
顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）は、骨髄系列の増殖および分化におけるその役割のために命名された造血系の増殖因子である。Ｇ−ＣＳＦの投与は、造血幹細胞（ＨＳＣ）を骨髄から末梢血へ動員した（Ｂｏｄｉｎｅ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｂｌｏｏｄ  ８４：１４８２〜１４９１（１９９４））。Ｔｓａｉら（Ｔｓａｉ，Ｋ−Ｊら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．，ＤＯＩ：１０．１０１８４／ｊｅｍ．２００６２４８１；Ｅ  ｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ（２００７））は、Ｇ−ＣＳＦが骨髄からの幹細胞放出を誘導し、マウスの脳におけるＡβ斑周囲の神経形成を刺激し、かつＡＤマウスの神経学的機能を実質的に改善したことを見出した。しかし、Ｇ−ＣＳＦの全身投与が脳において骨髄由来の小グリア細胞の活性に影響したということは現在まで提唱もされておらず、証拠もない。
【００１３】
Ｍ−ＣＳＦレポーターは、ＡＤ、ＦＡＰおよびＡＬＳの患者の脳小グリア細胞で上方制御される（Ｓｏｕｓａ，Ｍ．Ｍ．およびＳａｒａｉｖａ，Ｍ．Ｊ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ７１（５）：３８６〜３９７（２００３）およびＡｋｉｙａｍａら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．６３９：１７１〜１７４（１９９４））。ＡＤ患者の脳は、アミロイド斑および小グリア細胞の近傍におけるＭ−ＣＳＦの神経発現の増大を示している。ある研究では、アルツハイマーの患者の脳脊髄液におけるＭ−ＣＳＦの濃度は年齢の適合したコントロールと比較して５倍増大されるが、血清のＭ−ＣＳＦ抗原の値に関しては検出可能な増大も疾患もない。（Ｙａｎら、ＰＮＡＳ  ９４：５２９６〜３０１（１９９７））。対照的に、近年の研究では、ＡＤ患者の血漿におけるＭ−ＣＳＦの減少が見出されている。（Ｗｙｓｓ−Ｃｏｒａｙら、Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｐｌａｓｍａ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｎａｔ．Ｍｅｄ，Ｏｃｔ  １４，ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ（２００７））。
【００１４】
この証拠によって、身体中にわたるマクロファージ機能の調節においてＭ−ＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦに同じ役割が存在することが示唆される。アミロイド関連疾患または障害を処置するためのさらなる方法が当該分野で必要である。罹患した器官および組織における組織内在性マクロファージ、例えば、脳における小神経膠細胞は重要な治療標的である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｄｏｂｓｏｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ＆Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｅｔｔ．（２００６）１３：２１９〜２２７
【非特許文献２】Ｍｅｒｅｄｉｔｈ，Ｓ．Ｃ．Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（２００５）１０６６：１８１〜２２１
【非特許文献３】Ｓｏｕｓａ，Ｍ．Ｍ．およびＳａｒａｉｖａ  Ｍ．Ｊ．Ｐｒｏｇ．Ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．（２００３）７１：３８５〜４００
【非特許文献４】Ｒｙｓａｖａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．（１９９９）４７（５）：８４５〜８５０
【非特許文献５】Ｍｉｔｒａｓｉｎｏｖｉｃら，Ｎｅｕｒ．Ｌｅｔｔｅｒｓ（２００３）３４４：１８５〜１８８
【非特許文献６】Ｍｉｔｒｏｓｉｎｏｖｉｃ＆Ｍｕｒｐｈｙ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ（２００２）２７７：２９８８９〜２９８９６
【非特許文献７】Ｍｉｔｒｏｓｉｎｏｖｉｃ＆Ｍｕｒｐｈｙ，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ（２００３）２４：８０７〜８１５
【非特許文献８】Ｍａｌｍら，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．（２００５）１８：１３４〜４２
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
発明の要旨
本発明は、増殖因子、例えば、コロニー刺激因子、例えば、Ｍ−ＣＳＦの全身性（例えば、頭蓋内でない）投与がアミロイド斑の沈着、例えば、βアミロイド斑、およびアミロイドポリペプチド、例えば、β−アミロイドの凝集を低減するという発見に基づく。この発見に基づいて、本発明は、Ｍ−ＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦの、単独、または他のＣＳＦ、幹細胞因子もしくはアミロイドーシス、例えばＡＤを処置するのに有効な治療剤と組み合わせた全身性投与によって、ＡＤを含むアミロイド斑の沈着に関連する障害を処置する方法を特徴とする。
【００１７】
ある実施形態では、本発明は、アミロイドーシスに罹患した動物の器官または組織、例えば、脳における骨髄由来小神経膠細胞を含む組織内在性マクロファージ活性を増大する方法を提供し、この方法は、（ａ）単離されたコロニー刺激因子ポリペプチド、またはその活性改変体、フラグメントもしくは誘導体；（ｂ）プロモーターとの作動可能な会合を通じた、コロニー刺激因子ポリペプチド、またはその活性改変体、フラグメントもしくは誘導体をコードする単離されたポリヌクレオチド；または（ｃ）（ａ）および（ｂ）の組み合わせ；を含む組成物を動物に全身投与する工程を包含する。この組成物は、器官または組織、例えば、脳において骨髄由来小グリア細胞活性を含む組織内在性マクロファージ活性を増大するのに有効な量で投与される。
【００１８】
ある実施形態では、器官または組織は、中枢神経系（ＣＮＳ：脳および脊髄）、末梢神経系（ＰＮＳ：神経幹、神経叢、知覚神経節および自律神経節）、肝臓、脾臓、膵臓、腎臓、胃、心臓、胃腸管、胸腺、肺、唾液腺、脳血管またはアミロイドーシスに罹患した動物の全身の血管である。ある実施形態では、この器官は、ＡＤに罹患した動物の脳である。
【００１９】
ある実施形態では、本発明は、動物におけるアミロイドポリペプチドまたはアミロイドの沈着もしくはアミロイド斑を低減するための方法を提供し、この方法は治療上有効な量の増殖因子ポリペプチド、例えば、コロニー刺激因子、例えば、Ｍ−ＣＳＦを動物に全身投与する工程を包含する。ある実施形態では、アミロイド斑は障害と関連して存在する。ある実施形態では、この障害はＡＤ、軽度認識障害、軽度から中等度の認識障害、血管性認知症、老年性認知症、トリソミー２１（ダウン症）、オランダ型遺伝性アミロイド性脳出血（ＨＣＨＷＡ−Ｄ）、脳のアミロイドアンギオパチー（ＣＡＡ）、加齢性黄斑変性症、多発性骨髄腫、肺性高血圧、うっ血性心不全、ＩＩ型糖尿病、関節リウマチ、家族性アミロイド・ポリニューロパシー（ＦＡＰ）、海綿状脳症、パーキンソン病、原発性全身性アミロイドーシス、二次性全身性アミロイドーシス、前頭側頭認知症、老人性全身性アミロイドーシス、遺伝性脳のアミロイドアンギオパチー、血液透析関連アミロイドーシス、家族性アミロイド多発神経障害ＩＩＩ、フィンランド遺伝性全身性アミロイドーシス、甲状腺の髄様癌、心房性アミロイドーシス、遺伝性非神経障害性全身性アミロイドーシス、注射部位限局性アミロイドーシス、遺伝性腎アミロイドーシス、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、脊髄性および延髄性の筋萎縮症、ならびに脊髄小脳失調である。
【００２０】
ある実施形態では、本発明は、動物においてアミロイドポリペプチドまたはアミロイドの沈着もしくは斑を低減するための方法を提供し、この方法は治療上有効な量の増殖因子ポリペプチド、例えば、コロニー刺激因子、例えば、Ｍ−ＣＳＦを動物に全身投与する工程を包含する。ある実施形態では、アミロイド斑は、βアミロイド、免疫グロブリン軽鎖（ＡＬタイプアミロイドーシス）、血清アミロイドＡ（ＡＡ型のアミロイドーシス）、β２−ミクログロブリン（Ａβ２Ｍ型のアミロイドーシス）、ドルーゼ（ｄｒｕｓｅｎ）、野性型もしくは変異型のトランスサイレチン（ＡＴＴＲ型のアミロイドーシス）、変異体アポリポタンパク質ＡＩ（ＡＡｐｏＡＩアミロイドーシス）、変異体アポリポタンパク質ＡＩＩ（ＡＡｐｏＡＩＩアミロイドーシス）、膵島アミロイド前駆体タンパク質、カルシトニン、心房性ナトリウム利尿タンパク質、ハンチンチン（インタクトまたはポリ（Ｑ）リッチフラグメント）、「スクレイピー」型のヒトプリオンタンパク質、α−シヌクレイン、タウ（野性型または変異体）、シスタチンＣ（ＡＣｙｓ型アミロイドーシス）、ゲルソリン（ＡＧｅｌ型アミロイドーシス）、アミリン、変異体リゾチーム（ＡＬｙｓ型アミロイドーシス）、インスリン、スーパーオキシドジスムターゼＩ（野性型または変異体）、アンドロゲンレセプター（インタクトまたはポリ（Ｑ）リッチフラグメント）、アタキシン（インタクトまたはポリ（Ｑ）リッチフラグメント）、ＴＡＴＡボックス結合タンパク質（インタクトまたはポリ（Ｑ）リッチフラグメント）、変異体フィブリノーゲンＡα鎖（ＡＦｉｂ型アミロイドーシス）、βタンパク質前駆体（Ａβ型アミロイドーシス）およびアミロイドタンパク質の組み合わせからなる群より選択されるタンパク質を含む。
【００２１】
ある実施形態では、本発明は、アミロイドポリペプチドまたはアミロイドの沈着もしくは斑に関連する障害を予防または処置する方法を提供し、この方法はこの動物のアミロイドーシスに罹患した器官または組織において骨髄由来小グリア細胞の活性を増大するのに有効な量の増殖因子、例えば、コロニー刺激因子、例えば、Ｍ−ＣＳＦを全身に投与する工程を包含する。
【００２２】
ある実施形態では、このアミロイド凝集体またはアミロイド斑は、上記骨髄由来小グリア細胞によって貪食される。ある実施形態では、アミロイドーシスに罹患した器官または組織、例えば脳で観察されるアミロイド斑または凝集体の食作用は、脳を含むこのような器官または組織におけるアミロイド斑の大きさの減少を生じる。ある実施形態では、アミロイド斑の食作用は、アミロイド斑の数の減少を生じる。
【００２３】
ある実施形態では、本発明は、βアミロイドポリペプチドまたはβアミロイドの沈着もしくは斑に関連する障害を予防または処置する方法を提供し、この方法はこの動物の脳において骨髄由来小グリア細胞の活性を増大するのに有効な量の増殖因子、例えば、コロニー刺激因子、例えば、Ｍ−ＣＳＦを全身に投与する工程を包含する。ある実施形態ではこの障害はＡＤである。
【００２４】
ある実施形態では、βアミロイド斑は、この骨髄由来小グリア細胞によって貪食される。ある実施形態では、ＡＤに関連するβアミロイドの食作用は、脳でのβアミロイド斑の大きさの減少を生じる。ある実施形態では、βアミロイド斑の食作用は、βアミロイド斑の数の減少を生じる。
【００２５】
ある実施形態では、この増殖因子、例えば、コロニー刺激因子、例えば、Ｍ−ＣＳＦは単独で投与される。ある実施形態では、この増殖因子、例えば、コロニー刺激因子、例えば、Ｍ−ＣＳＦは、アミロイド斑に関連する障害、例えば、アミロイドーシスを処置、予防または寛解させるのに有効な治療剤と組み合わせて投与される。ある実施形態では、この増殖因子、例えば、コロニー刺激因子、例えば、Ｍ−ＣＳＦは、幹細胞因子、例えば、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１１またはキットリガンドと組み合わせて投与される。ある実施形態では、増殖因子、例えば、コロニー刺激因子、例えば、Ｍ−ＣＳＦは、頭蓋内に同時に投与されてもよい。
【００２６】
ある実施形態では、この増殖因子、例えば、コロニー刺激因子、例えば、Ｍ−ＣＳＦは単独で投与される。ある実施形態では、この増殖因子、例えば、コロニー刺激因子、例えば、Ｍ−ＣＳＦは、ＡＤを含む、βアミロイド斑に関連する障害を処置、予防または寛解させるのに有効な治療剤と組みわせて投与される。ある実施形態では、この増殖因子、例えば、コロニー刺激因子、例えば、Ｍ−ＣＳＦは、幹細胞因子、例えば、顆粒球コロニー刺激因子、ＩＬ−３、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１１またはキットリガンドと組み合わせて投与される。ある実施形態では、増殖因子、例えば、コロニー刺激因子、例えば、Ｍ−ＣＳＦは、頭蓋内に同時に投与されてもよい。
【００２７】
ある実施形態では、増殖因子ポリペプチドフラグメントが投与される。ある実施形態では、コロニー刺激因子ポリペプチドフラグメントが投与される。ある実施形態では、Ｍ−ＣＳＦポリペプチドフラグメントが投与される。
【００２８】
ある実施形態では、本発明は、動物の器官または組織において骨髄由来小グリア細胞の活性を増大する方法を提供し、この方法は、プロモーターとの作動可能な連結によって、コロニー刺激因子ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする単離されたポリヌクレオチドを全身投与する工程を包含する。ある実施形態では、このポリヌクレオチドは、発現ベクター、例えば、ウイルスベクターを介して送達される。
【００２９】
ある実施形態では、本発明は、動物の脳において骨髄由来小グリア細胞の活性を増大する方法を提供し、この方法は、プロモーターとの作動可能な連結によって、コロニー刺激因子ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする単離されたポリヌクレオチドを全身投与する工程を包含する。ある実施形態では、このポリヌクレオチドは、発現ベクター、例えば、ウイルスベクターを介して送達される。
【００３０】
ある実施形態では、増殖因子、例えば、コロニー刺激因子、例えば、Ｍ−ＣＳＦはさらに融合部分を含む。ある実施形態では、この融合部分は免疫グロブリン部分である。ある実施形態では、この免疫グロブリン部分はＦｃ部分である。他の実施形態では、この融合部分は血清アルブミン部分、標的化部分、レポーター部分、精製促進部分、およびそれらの２つ以上の組み合わせである。
【００３１】
ある実施形態では、増殖因子、例えば、コロニー刺激因子、例えば、Ｍ−ＣＳＦは、１日に１回、連続して、間欠的に、アミロイド斑、例えば、βアミロイド斑もしくはアミロイド凝集体、例えば、βアミロイド凝集体の形成の前、間または後に、アミロイド斑、例えば、βアミロイド斑もしくはアミロイド凝集体、例えば、βアミロイド凝集体のサイズおよび／もしくは形成、またはそれらの２つ以上の組み合わせが軽減するまで投与される。
【００３２】
ある実施形態では、治療上有効な量とは、１日あたり体重１ｋｇあたり約５０〜約１００μｇである。ある実施形態では、治療上有効な量とは、１日あたり体重１ｋｇあたり約６０〜約１００μｇである。ある実施形態では、治療上有効な量とは、１日あたり体重１ｋｇあたり約７０〜約１００μｇである。ある実施形態では、治療上有効な量とは、１日あたり体重１ｋｇあたり約８０〜約１００μｇである。ある実施形態では、治療上有効な量とは、１日あたり体重１ｋｇあたり約９０〜約１００μｇである。ある実施形態では、治療上有効な量とは、１日あたり体重１ｋｇあたり約５０〜約６０μｇである。ある実施形態では、治療上有効な量とは、１日あたり体重１ｋｇあたり約５０〜約７０μｇである。ある実施形態では、治療上有効な量とは、１日あたり体重１ｋｇあたり約５０〜約８０μｇである。ある実施形態では、治療上有効な量とは、１日あたり体重１ｋｇあたり約５０〜約９０μｇである。ある実施形態では、治療上有効な量とは、１日あたり体重１ｋｇあたり約６０〜約７０μｇである。ある実施形態では、治療上有効な量とは、１日あたり体重１ｋｇあたり約６０〜約８０μｇである。ある実施形態では、治療上有効な量とは、１日あたり体重１ｋｇあたり約６０〜約９０μｇである。ある実施形態では、治療上有効な量とは、１日あたり体重１ｋｇあたり約７０〜約８０μｇである。ある実施形態では、治療上有効な量とは、１日あたり体重１ｋｇあたり約７０〜約９０μｇである。ある実施形態では、治療上有効な量とは、１日あたり体重１ｋｇあたり約５０〜約２００μｇである。ある実施形態では、治療上有効な量とは、１日あたり体重１ｋｇあたり約１〜約５００μｇである。
【００３３】
ある実施形態では、増殖因子、例えば、コロニー刺激因子、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、動物に投与される組成物はさらに、薬学的に受容可能な賦形剤を含む。
【００３４】
ある実施形態では、動物とは脊椎動物である。ある実施形態では、この動物とは哺乳動物である。ある実施形態では、この動物はヒトである。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、アルツハイマー病モデルＡＰＰ＋マウスの記憶の改善におけるＭ−ＣＳＦでの全身治療の１０週の効果を示す。詳細には、図１は、それぞれ３日および６日におよぶ、Ｖｉｓｕａｌ（Ｖ１−Ｖ３）または隠れプラットフォーム（Ｈ１−Ｈ６）のいずれかでの潜時試験におけるマウスの能力を示す。ＡＰＰ＋、Ｍ−ＣＳＦマウスは、黒丸で示され；ＡＰＰ−、Ｍ−ＣＳＦマウスは、灰色の丸で示され；ＡＰＰ＋、ＰＢＳマウスは黒四角で示され；ＡＰＰ−、ＰＢＳマウスは灰色の四角で示される。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
発明の詳細な説明
他に規定しない限り、本明細書に用いられる全ての技術および科学的な用語は、本発明が属する当該分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、この定義を含む本出願が上回る。他を要する状況にならない限り、単数の用語は、複数を包含し、かつ複数の用語は単数を包含するものとする。本明細書に言及される全ての刊行物、特許および他の引用文献は、各々の個々の刊行物または特許出願が詳細にかつ個々に参照によって援用されるかのように、全ての目的についてその全体が参照によって援用される。
【００３７】
本明細書に記載される方法および材料に類似または均等である方法および材料は、本発明の実施または試験において用いられ得るが、適切な方法および材料が下に記載される。この材料、方法および実施例は、例示に過ぎず、限定する意図ではない。本発明の他の特徴および利点は、詳細な説明から、および特許請求の範囲から明らかになる。
【００３８】
本発明をさらに規定するためには、以下の用語および定義が提供される。
【００３９】
「１つの、ある、（「ａ」または「ａｎ」）」要素という用語は、その要素の１つ以上を指すことが注目されるべきである；例えば、「ポリペプチド」とは、１つ以上のポリペプチドを指すことが理解される。そのようなものとして、「１つの、ある（ａ）」（または「ａｎ」）、「１つ以上の」、および「少なくとも１つの」という用語は、本明細書に交換可能に用いられ得る。
【００４０】
本明細書および特許請求の範囲全体にわたって、「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、またはバリエーションである、例えば、「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、または「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言葉は、任意の言及される整数または整数の群の包含を示すが、任意の他の整数または整数の群の除外は示さない。
【００４１】
本明細書において用いる場合、「〜からなる、〜から構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｏｆ）」という用語、またはバリエーションである、例えば、「〜からなる、〜から構成される（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｏｆ）」、または「〜からなる、〜から構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語は、本明細書および特許請求の範囲全体にわたって用いる場合、任意の言及される整数または整数の群の包含を示すが、さらなる整数または整数の群はこの特定される方法、構造または組成物に追加されなくてもよい。
【００４２】
本明細書において用いる場合、「本質的に〜からなる、本質的に〜から構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」、またはバリエーションである、例えば、「本質的に〜からなる、本質的に〜から構成される（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」または「本質的に〜からなる、本質的に〜から構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という用語は、本明細書および特許請求の範囲全体にわたって用いられる場合、任意の言及される整数または整数の群の包含、ならびに特定される方法、構造または組成物の基礎的または新規な特性を物質的に変化させない任意の言及される整数または整数の群の随意的な包含を示す。
【００４３】
本明細書において用いる場合、「抗体」とは、インタクトな免疫グロブリン、またはその抗原結合フラグメントを意味する。本発明の抗体は、任意のアイソタイプまたはクラス（例えば、Ｍ、Ｄ、Ｇ、ＥおよびＡ）、または任意のサブクラス（例えば、Ｇ１−４、Ａ１−２）の抗体であってもよく、カッパ（κ）またはラムダ（λ）軽鎖を有してもよい。
【００４４】
本明細書において用いる場合、「Ｆｃ」とは、１つ以上の重鎖定常領域ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む免疫グロブリン重鎖の一部を意味する。例えば、パパイン消化によって入手可能な抗体の重鎖定常領域の一部。
【００４５】
本明細書において用いる場合、「ヒト化抗体」とは、非ヒト配列の少なくとも一部がヒト配列で置換されている抗体を意味する。ヒト化抗体を作製する方法の例は、米国特許第６，０５４，２９７号、同第５，８８６，１５２号、および同第５，８７７，２９３号に見出され得る。
【００４６】
本明細書において用いる場合、「キメラ抗体」とは、第一の抗体由来の１つ以上の領域および少なくとも１つの他の抗体由来の１つ以上の領域を含む抗体を意味する。この第一の抗体およびさらなる抗体は、同じ種由来であっても、または異なる種由来であってもよい。
【００４７】
本明細書において用いる場合、「ポリペプチド」という用語は、単数形「ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」および複数形「ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ）」を包含するものとし、かつアミド結合（ペプチド結合としても公知）によって直線的に連結される単量体（アミノ酸）から構成される分子をいう。「ポリペプチド」という用語は、２つ以上のアミノ酸の任意の鎖（単数または複数）をいい、特定の長さの生成物を指すものではない。従って、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」または２つ以上のアミノ酸の鎖（単数または複数）を指すために用いられる任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義内に包含され、「ポリペプチド」という用語は、任意のこれらの用語の代わりに、またはこれらの用語と交換可能に用いられ得る。「ポリペプチド」という用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾の生成物を指すことが意図され、この修飾としては限定はしないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解性切断、または天然には存在しないアミノ酸による修飾が挙げられる。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源に由来してもよく、または組み換え技術によって生成されてもよいが、指定された核酸配列から翻訳される必要はない。ポリペプチドは化学合成による方式を含む任意の方式で生成されてもよい。
【００４８】
本発明のポリペプチドは、約３以上、５以上、１０以上、２０以上、２５以上、５０以上、７５以上、１００以上、２００以上、５００以上、１，０００以上、または２，０００以上のサイズのアミノ酸であってもよい。ポリペプチドは、所定の三次元構造を有してもよいが、そのような構造を有する必要はない。所定の三次元構造を有するポリペプチドは、折り畳まれたといわれ、所定の三次元構造を保有しない（ただし多数の異なる高次構造をとってもよい）ポリペプチドは、折り畳まれていないと呼ばれる。
【００４９】
「単離された」ポリペプチド、またはそのフラグメント、改変体もしくは誘導体とは、その天然の環境でないポリペプチドを意図する。精製の特定のレベルというのは必要とされない。例えば、単離されたポリペプチドは、その天然または自然の環境から取り除かれてもよい。組み換え産生されたポリペプチドおよび宿主細胞で発現されたタンパク質は、本発明の目的のために単離されたとみなされ、任意の適切な技術によって、特定され分離され、分画され、または部分的にもしくは実質的に精製された天然または組み換えのポリペプチドも同様である。
【００５０】
本発明では、「ポリペプチドフラグメント」とは、より大きいポリペプチドの短いアミノ酸配列をいう。タンパク質フラグメントは、「独立して（ｆｒｅｅ−ｓｔａｎｄｉｎｇ）」であっても、またはより大きいポリペプチド（フラグメントが領域の一部を形成する）内に含まれてもよい。本発明のポリペプチドフラグメントの代表的な例としては、例えば、約５アミノ酸、約１０アミノ酸、約１５アミノ酸、約２０アミノ酸、約３０アミノ酸、約４０アミノ酸、約５０アミノ酸、約６０アミノ酸、約７０アミノ酸、約８０アミノ酸、約９０アミノ酸、約１００アミノ酸、約２００アミノ酸および約５００アミノ酸以上の長さを含むフラグメントが挙げられる。
【００５１】
本発明のポリペプチドについて言及する場合、「フラグメント」、「改変体」および「誘導体」という用語は、少なくともいくつかの生物学的活性を保持する任意のポリペプチドを包含する。本明細書に記載されるポリペプチドとしては、そのポリペプチドが機能を保持している限り、限定はしないが、フラグメント、改変体または誘導体分子を挙げることができる。本発明の増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦポリペプチドおよびポリペプチドフラグメントは、タンパク質分解性フラグメント、欠失フラグメントおよび詳細には、動物に送達された場合作用部位にさらに容易に達し得るフラグメントを含んでもよい。ポリペプチドフラグメントはさらに、天然のポリペプチドの抗原性または免疫原性エピトープ（直線および三次元のエピトープを含む）を含むポリペプチドの任意の部分を含む。本発明の増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦポリペプチドおよびポリペプチドフラグメントは、上記のようなフラグメントを含む改変体領域、およびまたアミノ酸の置換、欠失または挿入に起因してアミノ酸配列が変更されたポリペプチドを含んでもよい。改変体は、対立遺伝子改変体のように天然に存在してもよい。「対立遺伝子改変体」とは、生物体の染色体に存在する所定の遺伝子座を占める遺伝子の代替の形態を意図する。Ｇｅｎｅｓ  ＩＩ，Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．編、Ｊｏｎｅ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９５）。天然に存在しない改変体は、当該分野で公知の突然変異誘発技術を用いて生成され得る。本発明の増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦポリペプチドおよびポリペプチドフラグメントは、保存的または非保存的なアミノ酸の置換、欠失または付加を含んでもよい。本発明の増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦポリペプチドおよびポリペプチドフラグメントはまた、誘導体分子を含んでもよい。本明細書において用いる場合、ポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントの「誘導体」とは、側鎖官能基の反応によって化学的に誘導体化される１つ以上の残基を有する被験体ポリペプチドをいう。また、２０個の標準的アミノ酸の１つ以上の天然に存在するアミノ酸誘導体を含むペプチドも「誘導体」として含まれる。例えば、４−ヒドロキシプロリンがプロリンと置換されてもよく；５−ヒドロキシリジンがリジンと置換されてもよく；３−メチルヒスチジンがヒスチジンと置換されてもよく；ホモセリンがセリンと置換されてもよく；オルニチンがリジンと置換されてもよい。
【００５２】
本明細書において用いる場合、「ジスルフィド結合」という用語は、２つのイオウ原子の間で形成された共有結合を包含する。アミノ酸システインは、ジスルフィド結合または第二のチオール基との架橋を形成し得るチオール基を含む。
【００５３】
本明細書において用いる場合、「融合タンパク質」とは、第二のポリペプチドに対して、ペプチド結合を介して直線的に結合された第一のポリペプチドを含むタンパク質を意味する。この第一のポリペプチドおよび第二のポリペプチドは、同一であっても異なってもよく、それらは直接接続されても、またはペプチドリンカーを介して接続されてもよい（以下を参照のこと）。
【００５４】
「ポリヌクレオチド」という用語は、単数の核酸および複数の核酸を包含することを意図し、単離された核酸分子または構築物、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、非翻訳５’および３’配列、コード配列を含む全長ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド配列を含んでもよい。ポリヌクレオチドは、従来のホスホジエステル結合または従来とは違う結合（例えば、アミド結合、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）で見いだされる）を含んでもよい。ポリヌクレオチドは、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドから構成されてもよく、これは未改変のＲＮＡもしくはＤＮＡであっても、または修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであってもよい。例えば、ポリヌクレオチドは、一本鎖および二本鎖のＤＮＡ、一本鎖および二本鎖の領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖のＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖の領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖もしくはさらに代表的には二本鎖、または一本鎖および二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子から構成されてもよい。さらに、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む三本鎖領域から構成され得る。ポリヌクレオチドはまた、１つ以上の改変された塩基、または安定性のためにもしくは他の理由のために修飾されたＤＮＡもしくはＲＮＡ骨格を含んでもよい。「改変された、修飾された（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）」塩基としては、例えば、トリチル化塩基および通常でない塩基、例えば、イノシンが挙げられる。種々の修飾がＤＮＡおよびＲＮＡに対してなされてもよい；したがって、「ポリヌクレオチド」は、化学的、酵素的または代謝的に改変された形態を包含する。
【００５５】
「核酸」という用語は、ポリヌクレオチドに存在する、任意の１つ以上の核酸セグメント、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡフラグメントをいう。「単離された」核酸またはポリヌクレオチドとは、その天然の環境から取り出されている核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを意図する。例えば、ベクター中に含まれる本発明の増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチドもしくはポリペプチドフラグメントをコードする組み換えポリヌクレオチドは本発明の目的のために単離されたとみなされる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例としては、異種の宿主細胞中で維持される組み換えポリヌクレオチド、または溶液中の精製された（部分的にまたは実質的に）ポリヌクレオチドが挙げられる。単離されたＲＮＡ分子とは、本発明のポリヌクレオチドのインビボまたはインビトロのＲＮＡ転写物を包含する。本発明による単離されたポリヌクレオチドまたは核酸はさらに、合成的に生成されたこのような分子を含む。さらに、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、または転写ターミネーターなどの調節性エレメントであってもよいし、またはそれらを含んでもよい。
【００５６】
本明細書において用いる場合、「コード領域」とは、アミノ酸に翻訳されるコドンから構成される核酸の一部である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、またはＴＡＡ）は、アミノ酸に翻訳されないが、コード領域の一部であるとみなされてもよく、ただし任意の隣接する配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロンなどはコード領域の一部ではない。本発明の２つ以上のコード領域は、単一のポリヌクレオチド構築物に、例えば、単一のベクター上に、または別個のポリヌクレオチド構築物に、例えば別個の（異なる）ベクター上に存在してもよい。さらに、任意のベクターが、単一のコード領域を含んでもよく、または２つ以上のコード領域を含んでもよく、例えば、単一のベクターは免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を別々にコードしてもよい。さらに、本発明のベクター、ポリヌクレオチドまたは核酸は、本発明の増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントをコードする核酸に融合されるかまたは融合されていない、異種コード領域をコードしてもよい。異種コード領域としては限定はしないが、分泌シグナルペプチドまたは異種機能性ドメインなどの専門的なエレメントまたはモチーフが挙げられる。
【００５７】
特定の実施形態では、ポリヌクレオチドまたは核酸はＤＮＡである。ＤＮＡの場合、ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは正常には、１つ以上のコード領域に作動可能に会合されたプロモーター、および／または他の転写または翻訳制御エレメントを含んでもよい。作動可能な会合とは、遺伝子産物、例えばポリペプチドのコード領域が、調節性配列（単数または複数）の影響または制御のもとでその遺伝子産物の発現をするような方法で１つ以上の調節性配列と会合されている場合である。２つのＤＮＡフラグメント（例えば、ポリペプチドコード領域およびそこに会合されたプロモーター）は、プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写を生じる場合、および発現調節性配列が遺伝子産物の発現を指向するか、または転写されるべきＤＮＡテンプレートの能力を妨害する能力を２つのＤＮＡフラグメントの間の結合の性質が妨げない場合、「作動可能に連結され」ている。従って、プロモーター領域は、そのプロモーターがその核酸の転写に影響し得る場合、ポリペプチドをコードする核酸と作動可能に連結されている。プロモーターは、所定の細胞においてのみＤＮＡの実質的な転写を指向する細胞特異的プロモーターであってもよい。プロモーター以外の他の転写制御エレメント、例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、および転写終止シグナルは、ポリヌクレオチドと作動可能に連結されて、細胞特異的転写を指向し得る。適切なプロモーターおよび他の転写制御領域が本明細書で開示される。
【００５８】
種々の転写制御領域が当業者に公知である。これらとしては、限定はしないが、脊椎動物細胞で機能する転写制御領域、例えば、限定はしないが、サイトメガロウイルス（最初期プロモーター、イントロンＡと連結）、シミアンウイルス４０（初期プロモーター）、およびレトロウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルス）由来のプロモーターおよびエンハンサーセグメントが挙げられる。他の転写制御領域としては、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモンおよびウサギβグロビンなどの脊椎動物遺伝子由来の領域、ならびに真核生物細胞で遺伝子発現を制御し得る他の配列が挙げられる。さらなる適切な転写制御領域としては、組織特異的プロモーター、およびエンハンサー、ならびにリンホカイン誘導性プロモーター（例えば、インターフェロンまたはインターロイキンによって誘導性のプロモーター）が挙げられる。
【００５９】
同様に、種々の転写制御エレメントが当業者に公知である。これらとしては限定はしないが、リボソーム結合部位、転写開始および終止のコドン、ならびにピコルナウイルス由来のエレメント（特に、内部リボソーム進入部位、またはＩＲＥＳ、これはＣＩＴＥ配列とも呼ばれる）が挙げられる。
【００６０】
他の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態のＲＮＡである。
【００６１】
本発明のポリヌクレオチドおよび核酸コード領域は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指向する、分泌ペプチドまたはシグナルペプチドをコードするさらなるコード領域と会合され得る。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞によって分泌されるタンパク質は、シグナルペプチドまたは分泌リーダー配列を有し、この配列は、成長したタンパク質鎖の輸送が粗い小胞体を横切って一旦開始されれば、成熟タンパク質から切断される。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドは一般にポリペプチドのＮ末端に融合されたシグナルペプチドを有し、これは完全なまたは「全長」ポリペプチドから切断されて、ポリペプチドの分泌型または「成熟」型を生じるということを承知している。特定の実施形態では、天然のシグナルペプチド、例えば、免疫グロブリン重鎖または軽鎖のシグナルペプチドが用いられるか、またはその配列の機能的誘導体であって、それと作動可能に会合されているポリペプチドの分泌を指向する能力を保持している配列が用いられる。あるいは、異種哺乳動物シグナルペプチド、またはその機能的誘導体が用いられてもよい。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲンアクチベータ（ＴＰＡ）またはマウスβグルクロニダーゼのリーダー配列と置換されてもよい。
【００６２】
本明細書において用いる場合、「連結された」、「融合された」または「融合」という用語は、交換可能に用いられる。これらの用語は、化学的結合または組み換え手段を含むどんな手段でも２つ以上のエレメントまたは構成要素を一緒につなぐことをいう。「インフレーム融合」とは、連続的な長いＯＲＦを形成するための２つ以上のポリヌクレオチドオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の結合であって、もとのＯＲＦの正確な翻訳リーディングフレームを維持する方式での結合をいう。従って組み換え融合タンパク質とは、もとのＯＲＦによってコードされるポリペプチドに対応する２つ以上のセグメント（このセグメントは通常、そのようには自然には結合されていない）を含む単一のタンパク質である。従って、リーディングフレームはこの融合セグメント全体にまたがって連続して作成されるが、このセグメントは、例えば、インフレームのリンカー配列によって、物理的に隔てられてもまたは空間的に隔てられてもよい。
【００６３】
「リンカー」配列とは、融合タンパク質中の２つのポリペプチドコード領域を分けている一連の１つ以上のアミノ酸である。代表的なリンカーは、少なくとも５アミノ酸を含む。さらなるリンカーは、少なくとも１０アミノ酸、または少なくとも１５アミノ酸を含む。特定の実施形態では、ペプチドリンカーのアミノ酸は、リンカーが親水性であるように選択される。リンカー（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）３（配列番号７）は十分な可塑性をもたらすために多くの抗体にとって広く受容可能である好ましいリンカーである。他のリンカーとしては、Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ（配列番号８）、Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ（配列番号９）、Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｇｌｎ（配列番号１０）、Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ａｓｐ（配列番号１１）、Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ（配列番号１２）、Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｐｈｅ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ（配列番号１３）、およびＧｌｕ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ（配列番号１４）が挙げられる。それより短いリンカーの例としては、上記のリンカーのフラグメントが挙げられ、それより長いリンカーの例としては、上記のリンカーの組み合わせ、上記のリンカーのフラグメントの組み合わせ、ならびに上記のリンカーと上記のリンカーのフラグメントとの組み合わせが挙げられる。
【００６４】
ポリペプチドの状況では、「リンカー配列」または「配列」とは、アミノ末端からカルボキシル末端方向のポリペプチド中のアミノ酸の順序であって、ここでは配列中のお互いに近い残基が、ポリペプチドの一次構造中で連続する。
【００６５】
本明細書において用いる場合、「発現」という用語は、遺伝子が生化学的物質、例えば、ＲＮＡまたはポリペプチドを生じるプロセスをいう。そのプロセスは、限定はしないが、遺伝子ノックダウンならびに一過性発現および安定な発現を含む、細胞内の遺伝子の機能的な存在の任意の顕現（ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎ）を包含する。これには限定はしないが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、または任意の他のＲＮＡ産物への遺伝子の転写、およびこのようなｍＲＮＡのポリペプチド（複数を含む）への翻訳、ならびに転写または翻訳のいずれかを調節する任意のプロセスが挙げられる。最終の所望の産物が生化学的物質である場合、発現とは、その生化学的物質および任意の前駆体の作製を包含する。遺伝子の発現が「遺伝子産物」を生じる。本明細書において用いる場合、遺伝子産物は、核酸、例えば、遺伝子の転写によって生成されるメッセンジャーＲＮＡであっても、または転写物から翻訳されるポリペプチドであってもいずれでもよい。本明細書に記載される遺伝子産物はさらに、転写後修飾、例えば、ポリアデニル化を有する核酸、または翻訳後修飾、例えば、メチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットとの会合、タンパク質分解性切断などを有するポリペプチドを包含する。
【００６６】
本明細書において用いる場合、「処置する、処理する、治療する（ｔｒｅａｔ）」または「処置、処理、治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、治療処置および予防または予防的な手段の両方をいい、この目的は、所望されない生理学的変化または障害、例えばＡＤの進行を予防または遅らせる（低減させる）ことである。有益なまたは所望の臨床的結果としては、限定はしないが、検出可能であろうと不可能であろうと、症状の緩和、疾患の程度の軽減、疾患の状態の安定化（すなわち、悪化しないこと）、疾患の進行の遅延または緩徐化、疾患状態の回復（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ）または緩和（ｐａｌｌｉａｔｉｏｎ）、および寛解（ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ）（部分的または総合的いずれか）が挙げられる。「処置」とはまた、処置を受けていない場合予想される生存に比較して長期の生存を意味し得る。処置の必要なものとしては、既にその状態もしくは障害を有するもの、ならびにその状態もしくは障害を有する素因があるもの、またはその状態もしくは障害が防がれるべきものが挙げられる。
【００６７】
「被験体」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」とは、診断、予後または治療が所望される任意の被験体、詳細には哺乳動物被験体を意味する。哺乳動物被験体としては限定はしないが、ヒト、家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃ  ａｎｉｍａｌ）、家畜（ｆａｒｍ  ａｎｉｍａｌ）、動物園の動物、スポーツ用動物、ペットの動物、例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、畜牛（ｃａｔｔｌｅ）、乳牛（ｃｏｗｓ）；霊長類、例えば、類人猿、サル、オランウータンおよびチンパンジー；イヌ科、例えば、イヌおよびオオカミ；ネコ科、例えば、ネコ、ライオンおよびトラ；ウマ科、例えば、ウマ、ロバおよびシマウマ；食用動物、例えば、畜牛（ｃｏｗｓ）、ブタおよびヒツジ；有蹄動物、例えば、シカおよびキリン；げっ歯類、例えば、マウス、ラット、ハムスターおよびモルモット；などが挙げられる。特定の実施形態では、哺乳動物はヒト被験体である。
【００６８】
本明細書において用いる場合、「本発明の増殖因子、例えば、Ｍ−ＣＳＦのポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントの全身投与に由来する利点がある被験体」、および「処置の必要な動物」などの句は、哺乳動物被験体などの被験体であって、本発明の増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントでの、例えば、検出のため（例えば、診断手順のため）および／または処置、すなわちＡＤのような疾患の緩和または予防のために用いられる、本発明の増殖因子、例えば、コロニー刺激因子、例えば、Ｍ−ＣＳＦのポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントの全身投与から利益がある被験体を包含する。本明細書にさらに詳細に記載されるとおり、ポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントは、未結合型で用いられてもよいし、または例えば、薬物、プロドラッグもしくはアイソトープに対して結合体化されてもよい。
【００６９】
本明細書において用いる場合、「治療上有効な量」または「有効な量」とは、所望の治療結果を得るのに必要な投薬量で、かつ期間で有効な量をいう。治療結果は、例えば、症状の低減、生存の延長、動きの改善などであってもよい。治療結果は、「治癒」である必要はない。治療結果は、予防的であってもよい。代表的には、予防的用量は疾患の前にまたは初期段階で被験体に用いられるので、予防上有効な量とは、治療上有効な量未満である。
【００７０】
本明細書において用いる場合、「骨髄由来小グリア細胞活性」とは、骨髄由来小グリア細胞の活性のなんらかの増大をいう。活性の増大は、例えば、骨髄由来小グリア細胞の数の増大、骨髄由来小グリア細胞の活性の増大、骨髄由来小グリア細胞の標的の増大、またはそれらの２つ以上の組み合わせによって達成され得る。
【００７１】
本明細書において用いる場合、「全身投与」とは、頭蓋内以外の任意の投与形態を意味する。全身投与の例としては限定はしないが、経口投与、鼻投与、非経口投与、経皮投与、局所投与、眼内投与、気管支内投与、腹腔内投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、口腔投与、舌下投与、膣投与、肝内、心臓内、膵臓内、移植、吸入によって、埋め込みポンプによって、またはそれらの２つ以上の組み合わせが挙げられる。
【００７２】
本発明は、動物の器官または組織における組織内在性マクロファージの活性を増大するのに有用な、このような処置、増殖因子、例えば、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）またはその活性なフラグメント、誘導体もしくは改変体の必要な動物に全身投与することによって動物を処置する方法に関する。例えば、本発明は、増殖因子、例えば、ＣＳＦポリペプチドおよびポリペプチドフラグメントを提供し、これが脳などの器官または組織における骨髄由来小グリア細胞の存在、活性および／または標的化の増大を生じる。骨髄由来小グリア細胞は、脳におけるβアミロイド斑の大きさおよび量の減少などのように、器官または組織におけるアミロイド斑の大きさおよび量を減少し得る。アミロイド斑および血管のアミロイド沈着（アミロイド血管障害）は、例えば、ＡＤ、軽度認識障害、軽度から中等度の認識障害、血管性認知症、老年性認知症、トリソミー２１（ダウン症）、オランダ型遺伝性アミロイド性脳出血（ＨＣＨＷＡ−Ｄ）、脳のアミロイドアンギオパチー（ＣＡＡ）、およびＡＤに存在する。アミロイド斑はまた、加齢性黄斑変性症、多発性骨髄腫、肺性高血圧、うっ血性心不全、ＩＩ型糖尿病、関節リウマチ、家族性アミロイド・ポリニューロパシー（ＦＡＰ）、海綿状脳症、パーキンソン病、原発性全身性アミロイドーシス、二次性全身性アミロイドーシス、前頭側頭認知症、老人性全身性アミロイドーシス、遺伝性脳のアミロイドアンギオパチー、血液透析関連アミロイドーシス、家族性アミロイド多発神経障害ＩＩＩ、フィンランド遺伝性全身性アミロイドーシス、甲状腺の髄様癌、心房性アミロイドーシス、遺伝性非神経障害性全身性アミロイドーシス、注射部位限局性アミロイドーシス、遺伝性腎アミロイドーシス、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、脊髄性および延髄性の筋萎縮症、脊髄小脳失調、および脊髄小脳失調１７、および封入体筋炎にも存在する。そのようなものとして、ＣＳＦポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントの全身投与は、アミロイド斑関連の疾患または障害、例えば、ＡＤを処置するのに有効である。増殖因子、例えば、ＣＳＦのポリペプチドまたはフラグメントは、単独で投与されてもよいし、あるいは幹細胞因子および／またはアミロイド関連疾患もしくは障害、例えば、βアミロイド関連疾患もしくは障害、例えばＡＤを処置するのに有効な治療剤と組み合わせて投与されてもよい。
【００７３】
本発明はまた、動物を処置する方法であって、このような処置の必要な動物に対して、組織内在性マクロファージ、例えば、動物の脳における骨髄由来小グリア細胞の活性を増大するのに有効な特定の増殖因子、コロニー刺激因子またはＭ−ＣＳＦのポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントを全身投与することによる方法に関する。例えば、本発明は、脳における骨髄由来小グリア細胞の存在、活性および／または標的化の増大を生じる、増殖因子、コロニー刺激因子またはＭ−ＣＳＦのポリペプチドおよびポリペプチドフラグメントを提供する。そのようなものとして、増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチドもしくはポリペプチドフラグメントの全身投与は、βアミロイド班関連の疾患または障害、例えば、ＡＤを処置するために有効である。増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチドまたはフラグメントは、単独で投与されてもよいし、またはβアミロイド斑関連の疾患および障害、例えば、ＡＤを処置するために有効な他のＣＳＦ、幹細胞因子および／もしくは治療剤と組み合わせて投与されてもよい。
【００７４】
（増殖因子のポリペプチドおよびポリペプチドフラグメント）
本発明は、アミロイドポリペプチド、またはアミロイド沈着もしくはアミロイド斑に関連する障害、例えば、アミロイドーシスを処置または予防するための、特定の増殖因子のポリペプチドまたはそのフラグメント、改変体もしくは誘導体、例えば、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、顆粒球ＣＳＦ、顆粒球マクロファージＣＳＦ、またはＭ−ＣＳＦの全身投与に関する。本発明はまた、コロニー刺激因子ポリペプチドまたはその活性な改変体、フラグメントもしくは誘導体をコードする、特定された、単離されたポリヌクレオチドの全身投与に関する。このポリヌクレオチドは、発現ベクター、例えば、ウイルスベクターを介して送達され得る。
【００７５】
本発明は、βアミロイドポリペプチド、またはβアミロイド沈着もしくはβアミロイド斑に関連する障害、例えば、ＡＤを処置または予防するための、特定の増殖因子のポリペプチドまたはそのフラグメント、改変体もしくは誘導体、例えば、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、顆粒球ＣＳＦ、顆粒球マクロファージＣＳＦ、またはＭ−ＣＳＦの全身投与に関する。本発明はまた、コロニー刺激因子ポリペプチドまたはその活性な改変体、フラグメントもしくは誘導体をコードする、特定された、単離されたポリヌクレオチドの全身投与に関する。このポリヌクレオチドは、発現ベクター、例えば、ウイルスベクターを介して送達され得る。
【００７６】
本発明はまた、アミロイド斑に関連する障害、例えば、アミロイドーシスを処置または予防するための、増殖因子、例えばＣＳＦに融合された第二のポリペプチドを有する増殖因子、例えば、ＣＳＦまたはその活性な改変体、フラグメント、もしくは誘導体の全身投与に関する。第二のポリペプチドの例としては、限定はしないが、免疫グロブリンＦｃ領域、血清アルブミン部分、標的化部分、レポーター部分、精製促進部分、または２つ以上の第二のポリペプチドの組み合わせが挙げられる。
【００７７】
本発明はまた、βアミロイド斑に関連する障害、例えば、ＡＤを処置または予防するための、増殖因子、例えばＣＳＦに融合された第二のポリペプチドを有する増殖因子、例えば、ＣＳＦまたはその活性な改変体、フラグメント、もしくは誘導体の全身投与に関する。第二のポリペプチドの例としては、限定はしないが、免疫グロブリンＦｃ領域、血清アルブミン部分、標的化部分、レポーター部分、精製促進部分、または２つ以上の第二のポリペプチドの組み合わせが挙げられる。
【００７８】
アミロイドポリペプチドまたはアミロイド沈着もしくはアミロイド斑に関連する障害、例えば、ＡＤを処置または予防するための、増殖因子またはＣＳＦの全身投与はまた、幹細胞因子またはその活性な改変体、フラグメントもしくは誘導体、例えば、顆粒球コロニー刺激因子、ＩＬ−３、ＩＬ−５，ＩＬ−６、ＩＬ−１１、キットリガンドまたはそれらの２つ以上の組み合わせと組み合わせて行われてもよい。さらに増殖因子またはＣＳＦは、アミロイドのポリペプチドまたはアミロイド関連の障害または疾患、例えば、ＡＤを処置、予防または阻害するために有効な薬学的化合物と同時投与されてもよい。
【００７９】
造血性のＣＳＦは、小グリア細胞の濃度を増大し、かつ器官または組織、例えば、脳におけるそれらの機能的な生物学を増強するために適用され得る。例えば、このような小グリア細胞は、ＡＤに罹患している脳でのアミロイド斑形成の速度を軽減し、食作用を通じて斑を除去し、斑由来の神経毒を減少し、脳および認知機能を改善し得る。
【００８０】
単球由来の小グリア細胞は、単独で、または顆粒球（Ｇ）ＣＳＦ、ＩＬ−３およびキットリガンドなどの幹細胞因子と組み合わせて用いられる、Ｍ−ＣＳＦもしくは顆粒球マクロファージ（ＧＭ）ＣＳＦなどのコロニー刺激因子を指す。候補のコロニー刺激因子のうちでも、Ｍ−ＣＳＦは最も有望な第一選択である。Ｍ−ＣＳＦは単球およびマクロファージの増殖因子である。現在まで、このような因子の全身投与は、アミロイドーシスの疾患モデルにおいて骨髄由来小グリア細胞濃度を増大するか、疾患の病理学を処置するかまだ経験的に示されていない。
【００８１】
Ｍ−ＣＳＦは７０〜９０ｋＤの膜結合ジスルフィド結合ホモ二量体糖タンパク質であって、単核球食作用系列の細胞の増殖を刺激し、生存および分化を支持する。Ｐａｎｄｉｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８：１３５８〜６２（１９９２）。ヒトＭ−ＣＳＦの３つの関連するｃＤＮＡクローンが単離されており、これは単一のＭ−ＣＳＦ遺伝子由来の長（β）中間体（γ）および短（α）スプライシング改変体に相当する。Ｃｅｒｒｉｔｔｉ，Ｄ．Ｐ．ら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：７６１〜７０（１９８８）。このアイソフォーム（イソ型）は、それぞれ、配列番号１、２および３として下に示される。
【００８２】
組み換えＭ−ＣＳＦでの欠失研究によって、インビトロ活性は、成熟Ｍ−ＣＳＦの最初の１５０アミノ酸からなるアナログ中で完全に保持されていることが示された。この領域は、３つ全てのスプライシング改変体に共通であって、Ｍ−ＣＳＦと共有するアミノ酸同一性がごく小さい、あるファミリーのホルモンを規定する特有の４らせん構造を含む。このファミリーは、ヒト成長ホルモン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、白血病抑制因子、およびおそらく、ＩＬ−３およびＩＬ−６を含む。Ｃｅｒｒｉｔｔｉ，Ｄ．Ｐ．ら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：７６１〜７０（１９８８）。
【００８３】
Ｍ−ＣＳＦで見いだされる活性レセプター結合部位は共有結合された二量体である。この二量体は特有の４らせん構造のうちの２つを一緒に連結して、平坦な細長い構造を形成することによって形成される。変異実験によって、各々のらせん鎖における最初の６つのシステイン残基が生物学的活性にとって必須であることが示される。Ｐａｎｄｉｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８：１３５８〜６２（１９９２）。
【００８４】
Ｍ−ＣＳＦは、Ｃ末端の３７７残基中で最も見出されるプロリン残基リッチである（６３／５４４残基）。Ｃ末端のプロリン−リッチ組成物は、Ｃ末端プロセシングまたはグリコシル化などの翻訳後修飾の工程に関与し得る。Ｃ末端短縮Ｍ−ＣＳＦは、膜貫通ドメインを欠き、かつ分泌される。しかし、分泌されたＭ−ＣＳＦは、活性を保持しており、このことは少なくとも３７７のＣ末端アミノ酸残基が不必要であって、Ｍ−ＣＳＦ分子はその活性な二量体型に折り畳むためにＣ末端領域を必要としないということを示している。Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ  １６１（２）：８９２〜９０１（１９８９）。
【００８５】
ヒトＭ−ＣＳＦ長（β）中間体（γ）および短（α）スプライシング改変体は、それぞれ、配列番号１、２および３として下に示される。
【００８６】
全長ヒトＭ−ＣＳＦ（配列番号１）：
【００８７】
【化１】
2010510219.tif 000002
ヒトＭ−ＣＳＦγスプライスバリアント（配列番号２）
【００８８】
【化２】
2010510219.tif 000003
ヒトＭ−ＣＳＦαスプライスバリアント（配列番号３）
【００８９】
【化３】
2010510219.tif 000004
Ｍ−ＣＳＦの活性フラグメントが特定されている。例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ  １６１（２）：８９２〜９０１（１９８９）およびＹａｍａｎｉｓｈｉら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  １０９：４０４〜４０９（１９９１）を参照のこと。１実施形態では、本発明は、必要とする動物に対して、単離されたＭ−ＣＳＦポリペプチドフラグメントを提供する工程を包含し、このポリペプチドフラグメントはＭ−ＣＳＦ参照アミノ酸配列に対して少なくとも９０％類似のアミノ酸配列、Ｍ−ＣＳＦ参照アミノ酸配列に対して少なくとも９５％類似のアミノ酸配列、またはＭ−ＣＳＦ参照アミノ酸配列に対して同一のアミノ酸配列を含む。この実施形態によれば、Ｍ−ＣＳＦ参照アミノ酸配列は限定はしないが：
（ａ）Ｘが３３〜３７の任意の整数であって、かつＹが１４５〜１５８の任意の整数である、配列番号１、２または３のアミノ酸残基Ｘ〜Ｙ；
（ｂ）Ｙ１が１８１〜１９１の任意の整数である、配列番号１、２または３のアミノ酸残基Ｘ〜Ｙ１；
（ｃ）Ｙ２が２２０〜２２４の任意の整数である、配列番号１、２または３のアミノ酸残基Ｘ〜Ｙ２；
（ｄ）Ｙ３が３３７である、配列番号１または２のアミノ酸残基Ｘ〜Ｙ３；
（ｅ）Ｙ４が５５４である、配列番号１のアミノ酸残基Ｘ〜Ｙ４；
（ｆ）Ｙ５が４３８である、配列番号１または２のアミノ酸残基Ｘ〜Ｙ５；
（ｇ）Ｙ６が２５６である、配列番号１、２または３のアミノ酸残基Ｘ〜Ｙ６；
（ｈ）Ｘ１が１〜４の任意の整数である、配列番号１、２または３のアミノ酸残基Ｘ１〜Ｙ；
（ｉ）Ｙ１が１８１〜１９１の任意の整数である、配列番号１、２または３のアミノ酸残基Ｘ１〜Ｙ１；
（ｊ）Ｙ２が２２０〜２２４の任意の整数である、配列番号１、２または３のアミノ酸残基Ｘ１〜Ｙ２；
（ｋ）Ｙ３が３３７である、配列番号１、２または３のアミノ酸残基Ｘ１〜Ｙ３；
（ｌ）Ｙ４が５５４である、配列番号１のアミノ酸残基Ｘ１〜Ｙ４；
（ｍ）Ｙ５が４３８である、配列番号１または２のアミノ酸残基Ｘ１〜Ｙ５；
（ｎ）Ｙ６が２５６である、配列番号１、２または３のアミノ酸残基Ｘ１〜Ｙ６
を含む。
【００９０】
特定の実施形態では、Ｍ−ＣＳＦ参照アミノ酸配列としては、限定はしないが：
（ｉ）配列番号１、２または３の１〜１４５；
（ｉｉ）配列番号１、２または３の１〜１４９；
（ｉｉｉ）配列番号１、２または３の１〜１５０；
（ｉｖ）配列番号１、２または３の１〜１５８；
（ｖ）配列番号１、２または３の１〜１７７；
（ｖｉ）配列番号１、２または３の１〜１８１；
（ｖｉｉ）配列番号１、２または３の１〜１８２；
（ｖｉｉｉ）配列番号１、２または３の１〜１９０；
（ｉｘ）配列番号１、２または３の１〜２２１；
（ｘ）配列番号１、２または３の１〜２２３；
（ｘｉ）配列番号１または２の１〜３７７；
（ｘｉｉ）配列番号１、２または３の３３〜１７７；
（ｘｉｉｉ）配列番号１、２または３の３３〜１８１；
（ｘｉｖ）配列番号１、２または３の３３〜１８２；
（ｘｖ）配列番号１、２または３の３３〜１９０；
（ｘｖｉ）配列番号１、２または３の３３〜２２１；
（ｘｖｉｉ）配列番号１、２または３の３３〜２２３；
（ｘｖｉｉｉ）配列番号１または２の３３〜３７７；
（ｉｘｘ）配列番号１の１〜５５４；
（ｘｘ）配列番号１の３３〜５４４；
（ｘｘｉ）配列番号１または２の１〜４３８；
（ｘｘｉｉ）配列番号１または２の３３〜４３８；
（ｘｘｉｉｉ）配列番号１、２または３の１〜２５６；
（ｘｘｉｖ）配列番号１、２または３の３３〜２５６；および
（ｉｘｘ）上記の参照アミノ酸配列のうち２つ以上の組み合わせ、が挙げられる。
【００９１】
本発明の一部として投与されたＭ−ＣＳＦは、単量体であっても、または二量体であってもよい。二量体は上記で列挙されたＭ−ＣＳＦ参照アミノ酸配列を有するポリペプチドから構成されるホモ二量体であっても、または上記で列挙されたＭ−ＣＳＦ参照アミノ酸配列を有する任意の２つのポリペプチドから構成されるヘテロ二量体であってもよい。ホモ二量体またはヘテロ二量体に存在するポリペプチドは、配列番号１、２もしくは３のポリペプチド、またはそのフラグメントに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有する置換Ｍ−ＣＳＦポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントであってもよい。
【００９２】
「Ｍ−ＣＳＦ参照アミノ酸配列」または「参照アミノ酸配列」とは、なんらアミノ酸置換の導入のない特定の配列を意味する。当業者が理解するとおり、置換がない場合、本発明の「単離されたポリペプチド」は、参照アミノ酸配列に同一であるアミノ酸配列を包含する。
【００９３】
Ｍ−ＣＳＦポリペプチドまたはポリペプチドフラグメント（例えば、Ｍ−ＣＳＦ参照アミノ酸配列に対して少なくとも９０％または少なくとも９５％類似する）は、アミノ酸置換を含んでもよい。このような置換としては、例えば、異なるアミノ酸での参照アミノ酸配列中の個々のシステイン残基の置換が挙げられる。システイン残基を他のアミノ酸残基が置換することによって、ジスルフィド結合がブロックされる。ジスルフィド結合ブロッキングは、ポリペプチドの三次元形状に影響するかまたはレセプター分子へのポリペプチドの結合を妨げ得る。任意の異なるアミノ酸がアミノ酸配列を参照してシステインを置換してもよい。どの異なるアミノ酸が用いられるかは、多数の基準、例えば、ポリペプチドフラグメントの高次構造に対するその置換の影響、そのポリペプチドフラグメントの荷電、またはそのポリペプチドフラグメントの親水性に依存する。参照アミノ酸中のシステインを置換する代表的なアミノ酸としては、アラニン、セリン、トレオニン、詳細にはアラニンが挙げられる。ポリペプチドフラグメントをコードするポリヌクレオチドの操作を通じてこのような置換を作製することは、当業者の慣用的な専門的知識の十分に範囲内である。
【００９４】
１局面では、本実施形態は、融合タンパク質中に上記される２つ以上のポリペプチドフラグメントを含むポリペプチド、ならびに異種アミノ酸配列に対して融合された上記のポリペプチドフラグメントを含む融合タンパク質を含む。本発明はさらに、上記のような、ポリペプチドフラグメントの改変体、アナログまたは誘導体を包含する。
【００９５】
本明細書に記載される配列番号１、２または３のポリペプチドに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一であるＭ−ＣＳＦのポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントの対応するフラグメントもまた意図される。当該分野で公知であるとおり、２つのポリペプチドの間での「配列同一性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列を第２のポリペプチドの配列に対して比較することによって決定される。本明細書中で考察される場合には、任意の特定のポリペプチドが別のポリペプチドに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一であるかどうかは、当該分野で公知の方法およびコンピュータープログラム／ソフトウェア、例えば、限定はしないが、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１１）を用いて決定してもよい。ＢＥＳＴＦＩＴでは、２つの配列の間での相同性について最良のセグメントを見出すために、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２〜４８９（１９８１）の局所相同性アルゴリズムを用いる。特定の配列が、本発明による参照配列に対して例えば９５％同一であるか否かを決定するためにＢＥＳＴＦＩＴまたは任意の他の配列アラインメントプログラムを用いる場合、当然ながらパラメーターは、同一性の割合が、参照ポリペプチド配列の全長にわたって計算され、そして参照配列のアミノ酸の総数の５％までの相同性の中のギャップが可能であるように設定される。
【００９６】
本明細書に記載の配列番号１、２または３のポリペプチドに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％類似のＭ−ＣＳＦポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントの対応するフラグメントもまた意図される。当該分野で公知であるとおり、２つのポリペプチドの間での「配列類似性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列を第２のポリペプチドの配列に対して比較することによって決定される。
【００９７】
本発明では、ポリペプチドは、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合によって互いに結合させられたアミノ酸、すなわち、ペプチドアイソスターから構成されてもよく、そしてこれは、２０種類の遺伝子コードアミノ酸以外のアミノ酸（例えば、自然界には存在しないアミノ酸）を含んでもよい。本発明のポリペプチドは、自然な、例えば、翻訳後プロセシングによって修飾されても、または当該分野で周知の化学修飾技術によって修飾されてもよい。このような修飾は、基本的なテキストに、およびより詳細なモノグラフに、ならびに膨大な量の研究論文に十分に記載されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、およびアミノ酸末端またはカルボキシル末端を含むポリペプチドのどの場所でも生じ得る。同じタイプの修飾が、所定のポリペプチド中のいくつかの部位で、同じ程度で存在しても、または異なる程度で存在してもよいことは明らかである。また、所定のポリペプチドは、多くのタイプの修飾を含んでもよい。ポリペプチドは、例えば、ユビキチン化の結果として分岐してもよく、それらは環状であってもよく、これには分岐を伴う場合も、また分岐を伴わない場合もある。環状、分岐、および分岐環状のポリペプチドは、翻訳後の自然なプロセシングから生じてもよいし、または合成方法によって作成されてもよい。修飾としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質もしくは脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）の共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解的プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のようなトランスファーＲＮＡによって媒介されるタンパク質へのアミノ酸付加、およびエビキチン化が挙げられる。（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，第２版、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）；Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編，Ａｄａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１−１２頁（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒら、Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １８２：６２６−６４６（１９９０）；Ｒａｔｔａｎら、Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ６６３：４８−６２（１９９２）を参照のこと）。
【００９８】
本明細書に記載されるポリペプチドは環状であってもよい。ポリペプチドの環化によって、線状のペプチドの高次構造の自由度は低下し、構造的により拘束された分子が生じる。ペプチド環化の多くの方法が当該分野で公知である。例えば、ペプチドのＮ末端とＣ末端のアミノ酸残基の間のアミド結合の形成による「骨格対骨格、骨格間（ｂａｃｋｂｏｎｅ  ｔｏ  ｂａｃｋｂｏｎｅ）」の環化。「骨格対骨格」環化方法は、２つのω−チオアミノ酸残基（例えば、システイン、ホモシステイン）の間のジスルフィド架橋の形成を包含する。本発明の特定のペプチドとしては、環状ポリペプチドを形成するためのペプチドのＮ末端およびＣ末端上の修飾が挙げられる。このような修飾としては限定はしないが、システイン残基、アセチル化システイン残基、システイン残基とＮＨ２部分およびビオチンが挙げられる。ペプチド環化の他の方法は、その全体が参照によって本明細書に援用されるＬｉ＆Ｒｏｌｌｅｒ．Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３：３２５〜３４１（２００２）に記載される。
【００９９】
別の実施形態では、本発明は、第一のポリペプチドフラグメントおよび第二のポリペプチドフラグメントを有する単離されたポリペプチドを提供し、この第一のポリペプチドフラグメントは、Ｍ−ＣＳＦの参照アミノ酸配列に対して少なくとも９０％類似するアミノ酸配列を含み、この第二のポリペプチドフラグメントは、融合部分を含む。
【０１００】
本発明の方法では、増殖因子、コロニー刺激因子、もしくはＭ−ＣＳＦポリペプチド、またはその活性な改変体、フラグメントもしくは誘導体が、事前に形成されたポリペプチドとして直接投与されてもよいし、または本明細書に記載のように間接的に投与されてもよい。本発明のいくつかの実施形態では、本発明の増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチド、もしくはポリペプチドフラグメントは以下を含む処置方法で投与される：（１）核酸、例えば、本発明の増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチド、もしくはポリペプチドフラグメントを発現するベクターを用いて移植可能な宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトする工程と；（２）この形質転換された宿主細胞を、全身投与を可能にするのに有効な任意の部位で動物に投与する工程と。例えば、この形質転換された細胞は、経口的に、経鼻的に、非経口的に、経皮的に、局所的に、眼内に、気管支内に、腹腔内に、静脈内に、皮下に、筋肉内に、口腔に、舌下に、経膣的に、肝内に、心臓内に、膵臓内に、移植、吸入によって、埋め込みポンプによって投与されてもよい。
【０１０１】
本発明のある実施形態では、宿主細胞は、動物から取り出され、一時的に培養され、本発明の増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチド、もしくはポリペプチドフラグメントをコードする単離された核酸で形質転換またはトランスフェクトされて、その細胞が取り出された同じ動物中に移植し戻される。この細胞は、移植される同じ部位から（そうである必要はないが）取り出されてもよい。このような実施形態（時にはエキソビボ遺伝子療法としても公知）は、限られた期間に、増殖因子、コロニー刺激因子またはＭ−ＣＳＦのポリペプチドもしくはポリペプチドフラグメントの連続的な供給を提供し得る。
【０１０２】
本発明の方法で投与され得るさらなる例示的な増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦポリペプチド、ならびに本発明を行うためにこれらの分子を獲得するための方法および材料は下に記載される。
【０１０３】
（融合タンパク質および結合体化ポリペプチド）
本発明のいくつかの実施形態は、全長ではない増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦタンパク質である増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦポリペプチド、例えば融合タンパク質を形成するために異種ポリペプチド部分に融合された増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチドフラグメントの使用を包含する。このような融合タンパク質は、種々の目的、例えば、血清半減期の延長、バイオアベイラビリティの改善、特定の器官または組織、例えば、脳へのインビボ標的化、組み換え発現有効性の改善、宿主細胞分泌の改善、精製の容易さ、および高い結合活性を達成するために用いられ得る。達成されるべき目的（複数を含む）次第で、異種部分は、不活性であっても、生物学的に活性であってもよい。また、異種部分は、増殖因子、コロニー刺激因子もしくはＭ−ＣＳＦポリペプチドの部分に対して安定に融合するように、またはインビトロもしくはインビボで切断されるように選択されてもよい。これらの他の目的を達成するための異種部分は当該分野で公知である。
【０１０４】
融合タンパク質の発現の代わりとして、異種部分の選択を行い、かつ増殖因子、コロニー刺激因子またはＭ−ＣＳＦポリペプチド部分に対して化学的に結合させてもよい。ほとんどの場合には、増殖因子、コロニー刺激因子、もしくはＭ−ＣＳＦポリペプチド部分に対して融合させられるか、または結合させられるかにかかわらず、選択される異種部分は機能が類似している。従って、異種アミノ酸配列についての以下の考察においては、他に明記しない限り、異種配列は融合タンパク質の形態で、または化学的結合体として、増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦポリペプチド部分に結合してもよいことが理解されるべきである。
【０１０５】
本明細書に開示される処置方法での使用のための増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦポリペプチドとしては、修飾された誘導体、すなわち、その増殖因子、コロニー刺激因子またはＭ−ＣＳＦポリペプチドがその必要な機能を果たすことを共有結合が妨げないような任意のタイプの分子の共有結合によって修飾された誘導体を包含する。例えば限定しないが、本発明の増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦポリペプチドは、例えばグリコシル化、アセチル化、ペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）、ホスフィル化（ｐｏｓｐｈｙｌａｔｉｏｎ）、リン酸化、アミド化、既知の保護／ブロッキング基による誘導体化、蛋白分解性の切断、細胞リガンド又は他のタンパク質への連結等により修飾されてもよい。任意の多数の化学的修飾を、限定しないが、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成などを含む公知の方法により行うことが可能である。さらに、誘導体は、１つ以上の非古典的アミノ酸を含んでもよい。
【０１０６】
増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦポリペプチドが融合される異種ポリペプチドは、治療上有用であるか、またはその増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦポリペプチドを標的するために有用である。増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦ融合タンパク質は、種々の目的、例えば、血清半減期の延長、バイオアベイラビリティの改善、特定の器官または組織型、例えば、脳へのインビボ標的化、組み換え発現有効性の改善、宿主細胞分泌の改善、精製の容易さ、および高い結合活性を達成するために用いられ得る。達成されるべき目的（複数を含む）次第で、異種部分は、不活性であっても、生物学的に活性であってもよい。また、異種部分は、増殖因子、コロニー刺激因子、もしくはＭ−ＣＳＦポリペプチドに対して安定に融合するように、またはインビトロもしくはインビボで切断されるように選択されてもよい。これらの他の目的を達成するための異種部分は当該分野で公知である。
【０１０７】
薬学的に活性なポリペプチド、例えば、増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦポリペプチドは、急速なインビボクリアランスを示し得、身体中で治療上有効な濃度を達成するためには大きい用量を必要とする。さらに、約６０ｋＤａより小さいポリペプチドは、糸球体濾過を受ける可能性があり、これはときに腎毒性をもたらす。比較的小さいポリペプチド、例えば、増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦシグナル伝達ドメインのポリペプチドフラグメントの融合または結合体は、このような腎毒性の危険性を減らすかまたは回避するために使用され得る。種々の異種アミノ酸配列、すなわち、治療ポリペプチドのインビトロの安定性、すなわち血清半減期を増大するためのポリペプチド部分または「キャリア」が公知である。例としては血清アルブミン、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などが挙げられる。
【０１０８】
その長い半減期、インビトロ分布の広さ、および酵素的または免疫学的機能の欠失に起因して、本質的に全長のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはＨＳＡフラグメントは、通常、異種部分として用いられる。Ｙｅｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１９０４−０８（１９９２）およびＳｙｅｄら、Ｂｌｏｏｄ  ８９：３２４３〜５２（１９９７）に教示されているような方法および材料の適用によって、ＨＳＡは、融合タンパク質またはポリペプチド結合体（Ｍ−ＣＳＦポリペプチド部分のおかげで薬理学的活性を示し、一方では、有意に高いインビボでの安定性、例えば、１０倍または１００倍高い安定性を示す）を形成するために用いることができる。ＨＳＡのＣ末端は、増殖因子、コロニー刺激因子またはＭ−ＣＳＦポリペプチド部分のＮ末端に融合してもよい。ＨＳＡは自然に分泌されるタンパク質であるので、融合タンパク質が真核生物、例えば、哺乳動物の発現システムの中で生産される場合に、細胞培養培地中への融合タンパク質の分泌を得るためにＨＳＡシグナル配列を利用してもよい。
【０１０９】
特定の実施形態においては、本発明の方法において用いるための増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦポリペプチドはさらに、標的化部分を含む。標的化部分は、体の特定の部分への局在化を指向するタンパク質またはペプチドを含む。
【０１１０】
本発明のいくつかの実施形態では、ヒンジおよびＦｃ領域、すなわち、Ｉｇ重鎖定常領域のＣ末端部分に融合された増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦポリペプチド部分を使用する。ある実施形態では、ヒンジ領域中のアミノ酸は、異なるアミノ酸で置換されてもよい。これらの実施形態に従うヒンジ領域について例示的なアミノ酸置換としては、種々のアミノ酸でのヒンジ領域中の個々のシステイン残基の置換が挙げられる。任意の異なるアミノ酸が、ヒンジ領域中のシステインを置換してもよい。本発明のポリペプチドのアミノ酸および参照アミノ酸配列のアミノ酸置換としては、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を挙げることができる。参照アミノ酸中のシステインを置換する代表的なアミノ酸としては、アラニン、セリン、トレオニン、詳細にはセリンおよびアラニンが挙げられる。ポリペプチドフラグメントをコードするポリヌクレオチドの操作によってこのような置換を作製することは、当業者の慣用的な専門的技術の十分範囲内である。  
【０１１１】
Ｍ−ＣＳＦ−ポリペプチド−Ｆｃ融合物（「免疫融合体（ｉｍｍｕｎｏｆｕｓｉｎ）」）の潜在的な利点としては、溶解度、インビボの安定性、および多価化、例えば、二量体化が挙げられる。用いられるＦｃ領域は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＧ  Ｆｃ領域（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）であってもよい。あるいは、これは、ＩｇＥまたはＩｇＭのＦｃ領域（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ４）であってもよい。ＩｇＧ  Ｆｃ領域、例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域が一般的に使用される。Ｆｃ融合物をコードするＤＮＡを構築および発現するための材料および方法は、当該分野で公知であり、これを適用して過度の実験なしに融合物を得ることができる。本発明のいくつかの実施形態では、融合タンパク質、例えば、Ｃａｐｏｎら、米国特許第５，４２８，１３０号および同第５，５６５，３３５号に記載されている融合タンパク質を使用する。本発明の特定の実施形態では、天然のＭ−ＣＳＦポリペプチド、またはそのフラグメントは、Ｍ−ＣＳＦ−ポリペプチド−Ｆｃ融合物とともに二量体として存在する。
【０１１２】
シグナル配列は、小胞体の膜を通過するタンパク質の輸送を開始するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。免疫融合体（ｉｍｍｕｎｏｆｕｓｉｎ）の構築に有用なシグナル配列としては、抗体の軽鎖シグナル配列、例えば、抗体１４．１８（Ｇｉｌｌｉｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１２５：１９１〜２０２（１９８９））、抗体の重鎖シグナル配列、例えば、ＭＯＰＣ１４１抗体重鎖シグナル配列（Ｓａｋａｎｏら、Ｎａｔｕｒｅ  ２８６：５７７４（１９８０））が挙げられる。あるいは、他のシグナル配列も用いてもよい。例えば、Ｗａｔｓｏｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：５１４５（１９８４）を参照のこと。シグナルペプチドは、通常、シグナルペプチダーゼによって小胞体の内腔で切断される。これによって、Ｆｃ領域と増殖因子、コロニー刺激因子またはＭ−ＣＳＦポリペプチド部分を含む免疫融合体タンパク質の分泌が生じる。
【０１１３】
いくつかの実施形態においては、ＤＮＡ配列は、分泌カセットと、増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦポリペプチド部分との間のタンパク質分解的切断部位をコードし得る。このような切断部位によって、例えば、コードされる融合タンパク質のタンパク質分解的切断が提供され得、これによって、標的タンパク質からＦｃドメインが分離される。有用なタンパク質分解的切断部位としては、トリプシン、プラスミン、トロンビン、第Ｘａ因子、またはエンテロキナーゼＫのようなタンパク質分解酵素によって認識されるアミノ酸配列が挙げられる。
【０１１４】
分泌カセットは、複製可能な発現ベクターの中に組み込まれてもよい。有用なベクターとしては、直鎖状の核酸、プラスミド、ファージミド、コスミドなどが挙げられる。例示的な発現ベクターはｐｄＣであり、ここでは、免疫融合体ＤＮＡの転写はヒトサイトメガロウイルスのエンハンサーとプロモーターの制御下に配置されている。例えば、Ｌｏら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０８８：７１２（１９９１）およびＬｏら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １１：４９５〜５００（１９９８）を参照のこと。適切な宿主細胞は、Ｍ−ＣＳＦのポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントをコードするＤＮＡで形質転換またはトランスフェクトされてもよく、そしてこのポリペプチドの発現および分泌のために用いられてもよい。通常使用される宿主細胞としては、不死化ハイブリドーマ細胞、骨髄腫細胞、２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、およびＣＯＳ細胞が挙げられる。
【０１１５】
完全にインタクトな野生型Ｆｃ領域は、通常は本発明の方法において用いられるＦｃ融合タンパク質においては必須でなくかつ所望されないエフェクター機能を示す。従って、特定の結合部位は、代表的には、分泌カセットの構築の際にＦｃ領域から欠失させられる。例えば、軽鎖との同時発現は必要ないので、重鎖結合タンパク質Ｂｉｐ（Ｈｅｎｄｅｒｓｈｏｔら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ８：１１１〜１４（１９８７））についての結合部位が、ＩｇＥのＦｃ領域のＣＨ２ドメインから欠失させられ、その結果、この部位は免疫融合体の効率的な分泌を妨害することはない。膜貫通ドメイン配列、例えば、ＩｇＭの中に存在している膜貫通ドメイン配列もまた、通常は欠失させられる。
【０１１６】
ＩｇＧ１のＦｃ領域がほとんどの場合に用いられる。あるいは、免疫グロブリンγの他のサブクラス（γ−２、γ−３、およびγ−４）のＦｃ領域が分泌カセットの中で用いられてもよい。免疫グロブリンγ−１のＩｇＧ１のＦｃ領域が一般的に、分泌カセットの中で用いられ、これにはヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態においては、免疫グロブリンγ−１のＦｃ領域は、ＣＨ２欠失のＦｃであり、これには、ヒンジ領域とＣＨ３領域の一部が含まれるが、ＣＨ２領域は含まれない。ＣＨ２欠失のＦｃは、Ｇｉｌｌｉｅｓら、Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  １：４７（１９９０）によって記載されている。いくつかの実施形態においては、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭのうちの１つのＦｃ領域が用いられる。
【０１１７】
Ｍ−ＣＳＦポリペプチド部分−Ｆｃ融合タンパク質は、いくつかの様々な立体配置で構築することができる。１つの立体配置においては、Ｍ−ＣＳＦポリペプチド部分のＣ末端が、Ｆｃヒンジ部分のＮ末端に直接融合させられる。わずかに異なる立体配置においては、短いポリペプチド、例えば、２〜１０アミノ酸が、Ｍ−ＣＳＦポリペプチド部分のＮ末端とＦｃ部分のＣ末端との間で融合物中に取り込まれる。このようなリンカーによって、立体構造上の可撓性が提供され、これによりいくつかの状況においては生物学的活性が改善され得る。ヒンジ領域の十分な部分がＦｃ部分の中に保持されている場合には、Ｍ−ＣＳＦポリペプチド部分−Ｆｃ融合体は二量体化し、それによって二価の分子が形成される。単量体Ｆｃ融合体の均質な集団によっては、単特異的な二価の二量体が生じる。２つの単量体Ｆｃ融合体（それぞれは異なる特異性を有している）の混合によって、二重特異的な二価の二量体が生じる。
【０１１８】
対応するアミノ反応基とチオール反応基を含む任意の多数の架橋を、血清アルブミンに対して本発明の増殖因子、コロニー刺激因子またはＭ−ＣＳＦのポリペプチドもしくはポリペプチドフラグメントを連結させるために用いてもよい。適切なリンカーの例としては、チオール反応性のマレイミドを挿入するアミン反応性の架橋剤、例えば、ＳＭＣＣ、ＡＭＡＳ、ＢＭＰＳ、ＭＢＳ、ＥＭＣＳ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、ＫＭＵＳ、およびＧＭＢＳが挙げられる。他の適切なリンカーによって、チオール反応性ハロアセテート基が挿入される（例えば、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ）。スルフヒドリル基と反応して還元可能な連結を生じるための保護チオールまたは非保護チオールを提供するリンカーとしては、ＳＰＤＰ、ＳＭＰＴ、ＳＡＴＡ、およびＳＡＴＰが挙げられる。このような試薬は市販されている（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）。
【０１１９】
結合は、本発明の増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチドもしくはポリペプチドフラグメントのＮ末端または血清アルブミン上のチオール部分に関与する必要はない。例えば、Ｍ−ＣＳＦ−ポリペプチド−アルブミン融合体は、遺伝子操作技術を使用して得てもよく、ここでは増殖因子、コロニー刺激因子またはＭ−ＣＳＦのポリペプチド部分は、そのＮ末端、Ｃ末端、または両方で血清アルブミン遺伝子に融合される。
【０１２０】
本発明の方法で投与される増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチドは、ポリペプチドタグに融合されてもよい。「ポリペプチドタグ」という用語は本明細書において用いる場合、任意のアミノ酸配列であって、増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチドに結合されても、接続されても、または連結されてもよく、この増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチドを特定、精製、濃縮または単離するために用いられ得るアミノ酸配列を意味するものとする。増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチドに対するポリペプチドタグの結合は、例えば、以下を含む核酸分子を構築することによって生じ得る：（ａ）ポリペプチドタグをコードする核酸配列、および（ｂ）増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチドをコードする核酸配列。例示的なポリペプチドタグとしては、翻訳後修飾され得るアミノ酸配列、例えば、ビオチニル化されるアミノ酸配列が挙げられる。他の例示的なポリペプチドタグとしては、例えば、抗体（またはそのフラグメント）または他の特異的な結合試薬によって認識されるか、および／または結合され得るアミノ酸配列が挙げられる。抗体（またはそのフラグメント）または他の特異的な結合試薬によって認識され得るポリペプチドタグとしては、例えば、「エピトープタグ」として当該分野で公知のポリペプチドタグが挙げられる。エピトープタグは、天然のエピトープタグであっても、または人工的なエピトープタグであってもよい。天然および人工的なエピトープタグは、当該分野で公知であり、これには、例えば、人工的なエピトープ、例えば、ＦＬＡＧ、Ｓｔｒｅｐ、またはポリヒスチジンペプチドが挙げられる。ＦＬＡＧペプチドとしては限定はしないが、配列Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号１５）、またはＡｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号１６）が挙げられる（Ｅｉｎｈａｕｅｒ，ＡおよびＪｕｎｇｂａｕｅｒ，Ａ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４９：１〜３：４５５〜４６５（２００１））。Ｓｔｒｅｐエピトープは、配列Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号１７）を有する。ＶＳＶ−Ｇエピトープも用いられてもよく、配列Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（配列番号１８）を有する。別の人工的なエピトープは、６つのヒスチジン残基を有するポリ−Ｈｉｓ配列である（Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（配列番号１９）。天然に存在するエピトープとしては、モノクローナル抗体１２ＣＡ５によって認識されるインフルエンザウイルスの血球凝集素（ＨＡ）の配列Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（配列番号２０）（Ｍｕｒｒａｙら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２９：１７０〜１７９（１９９５））、およびモノクローナル抗体９Ｅ１０によって認識されるヒトｃ−ｍｙｃ（Ｍｙｃ）由来の１１のアミノ酸配列（Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙ���−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ（配列番号２１）が挙げられる（Ｍａｎｓｔｅｉｎら、Ｇｅｎｅ  １６２：１２９〜１３４（１９９５））。別の有用なエピトープは、モノクローナル抗体ＹＬ１／２によって認識されるトリペプチドＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅである（Ｓｔａｍｍｅｒｓら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２８３：２９８〜３０２（１９９１））。
【０１２１】
特定の実施形態においては、増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチドおよびポリペプチドタグは連結アミノ酸配列を介して接続されてもよい。本明細書において用いる場合、「連結アミノ酸配列」とは１つ以上のプロテアーゼによって認識および／または切断され得るアミノ酸配列であり得る。１つ以上のプロテアーゼによって認識および／または切断され得るアミノ酸配列は当該分野で公知である。例示的なアミノ酸配列は以下のプロテアーゼによって認識される配列である：第ＶＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、ＡＰＣ、ｔ−ＰＡ、ｕ−ＰＡ、トリプシン、キモトリプシン、エンテロキナーゼ、ペプシン、カテプシンＢ、Ｈ、Ｌ、Ｓ、Ｄ、カテプシンＧ、レニン、アンジオテンシン変換酵素、マトリックスメタロプロテアーゼ（コラゲナーゼ、ストロメリシン、ゼラチナーゼ）、マクロファージエラスターゼ、ＣｉｒおよびＣｉｓ。前述のプロテアーゼによって認識されるアミノ酸配列は当該分野で公知である。特定のプロテアーゼにより認識される例示的な配列は例えば米国特許第５，８１１，２５２号に見出され得る。
【０１２２】
ポリペプチドタグによって市販のクロマトグラフィー媒体を用いた精製が容易になり得る。
【０１２３】
本発明のある実施形態では、増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチドの融合構築物を用いて、細菌における増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチド部分の生産を増強する。そのような構築物においては、高レベルで通常発現および／または分泌される細菌タンパク質を本発明の増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチドもしくはポリペプチドフラグメントのＮ末端融合パートナーとして使用する。例えばＳｍｉｔｈら、Ｇｅｎｅ  ６７：３１（１９８８）；Ｈｏｐｐら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１２０４（１９８８）；Ｌａ  Ｖａｌｌｉｅら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：１８７（１９９３）を参照のこと。
【０１２４】
適切な融合パートナーのアミノ末端およびカルボキシ末端において増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチド部分を融合することにより、本発明の方法に従って投与するための増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチドもしくはポリペプチドフラグメントの２価または４価型を得ることができる。例えば増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチド部分をＩｇ部分のアミノ末端またはカルボキシ末端に融合することにより、２つの増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチド部分を含有する２価の単量体ポリペプチドを生成してもよい。Ｉｇ部分のおかげでこれらの２つの単量体の二量体化の際、増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチドの４量体型が得られる。このような多価型を用いて標的に対する増大した結合親和性を達成してもよい。本発明の増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチドもしくはポリペプチドフラグメントの多価型はまた、増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチド部分をタンデムで配置して、コンカタマー（単独で使用されてもよいしまたはＩｇもしくはＨＳＡのような融合パートナーと融合されてもよい）を形成することによって得てもよい。
【０１２５】
（結合体化したポリマー（ポリペプチド以外））
本発明のある実施形態は１つ以上のポリマーが増殖因子ポリペプチドに結合体化（共有結合）している増殖因子のポリペプチドもしくはポリペプチドフラグメントを包含する。本発明のある実施形態は、１つ以上のポリマーが増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチに結合体化（共有結合）している増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチドもしくはポリペプチドフラグメントを包含する。このような結合体化に適切なポリマーの例としては、ポリペプチド（上記で考察）、糖ポリマーおよびポリアルキレングリコール鎖が挙げられる。必然ではないが代表的には、ポリマーは、以下：溶解性、安定性またはバイオアベイラビリティのうちの１つ以上を向上させる目的のために本発明の増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチドもしくはポリペプチドフラグメントに結合体化される。
【０１２６】
本発明の増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチドもしくはポリペプチドフラグメントへの結合体化のために一般的に使用されるポリマーのクラスはポリアルキレングリコールである。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が最も頻繁に用いられる。ＰＥＧ部分、例えば１、２、３、４または５ＰＥＧのポリマーを各々の増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチドに結合体化して、その増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチド単独と比較して血清中半減期を増大してもよい。ＰＥＧ部分は非抗原性であり、かつ本質的に生物学的に不活性である。本発明の実施において用いられるＰＥＧ部分は分枝鎖であってもまたは未分枝鎖であってもよい。
【０１２７】
増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチドに結合されたＰＥＧ部分の数、および個々のＰＥＧ鎖の分子量は変動してもよい。一般的に、ポリマーの分子量が高い値であるほど、ポリペプチドに結合するポリマー鎖は少なくなる。通常は増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチドもしくはポリペプチドフラグメントに結合される総ポリマー質量は２０ｋＤａ〜４０ｋＤａである。したがって、１ポリマー鎖が結合される場合、鎖の分子量は一般的に２０〜４０ｋＤａである。２つの鎖が結合される場合、各鎖の分子量は一般的に１０〜２０ｋＤａである。３つの鎖が結合される場合、分子量は一般的に７〜１４ｋＤａである。
【０１２８】
ポリマー、例えばＰＥＧは、ポリペプチド上の任意の適切な露出された反応性の基を通じて増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦポリペプチドに連結されてもよい。露出された反応性の基（単数または複数）は、例えばＮ末端アミノ基もしくは内部リジン残基のイプシロンアミノ基、または両方であってもよい。活性化されたポリマーは増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチド上の任意の遊離のアミノ基において反応および共有結合してもよい。このｖポリペプチドの遊離のカルボキシル基、適切に活性化されたカルボニル基、ヒドロキシル、グアニジル、イミダゾール、酸化された炭水化物部分およびメルカプト基（存在する場合）もまたポリマー結合のための反応性の基として用いられてもよい。
【０１２９】
結合体化反応においては、ポリペプチド濃度に応じてポリペプチド１モルあたり活性化ポリマー約１．０〜１０モルを代表的には使用する。通常は選択された比は、増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチド部分の所望の薬理学的活性を損ない得る副反応（非特異的である場合が多い）を最小限にしながら、反応を最大限にするバランスである。好ましくは、増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチドの生物学的活性の少なくとも５０％が（例えば、本明細書に記載するか当該分野で公知である任意のアッセイにおいて示される場合）保持され、そして最も好ましくはほぼ１００％が保持される。
【０１３０】
ポリマーは従来の化学を用いて増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチドに結合体化できる。例えば、ポリアルキレングリコール部分を増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチドのリジンイプシロンアミノ基にカップリングしてもよい。リジン側鎖への連結はＮ−ヒドロキシルスクシンイミド（ＮＨＳ）活性エステル、例えばＰＥＧスクシンイミジルスクシネート（ＳＳ−ＰＥＧ）およびスクシンイミジルプロピオネート（ＳＰＡ−ＰＥＧ）を用いて行ってもよい。適切なポリアルキレングリコール部分としては、例えばカルボキシメチル−ＮＨＳおよびノルロイシン−ＮＨＳ、ＳＣが挙げられる。これらの試薬は市販されている。さらなるアミン反応性ＰＥＧリンカーをスクシンイミジル部分と置き換えてもよい。これらとしては、例えば、イソチオシアネート、ニトロフェニルカーボネート（ＰＮＰ）、エポキシド、ベンゾトリアゾールカーボネート、ＳＣ−ＰＥＧ、トレシレート、アルデヒド、エポキシド、カルボニルイミダゾールおよびＰＮＰカーボネートが挙げられる。条件は通常は選択性および反応の範囲が最大限となるように最適化される。そのような反応条件最適化は当該分野の通常の技術の範囲内である。
【０１３１】
ＰＥＧ化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）は、当該分野で公知の任意のＰＥＧ化反応によって実施できる。例えば、Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ，３：４−１０，１９９２ならびに欧州特許出願ＥＰ０１５４３１６およびＥＰ０４０１３８４を参照のこと。ＰＥＧ化は反応性のポリエチレングリコール分子（または類似の反応性の水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を用いて行ってもよい。
【０１３２】
アシル化によるＰＥＧ化では一般的にポリエチレングリコールの活性エステル誘導体を反応させる工程を包含する。任意の反応性ＰＥＧ分子をＰＥＧ化において使用してもよい。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）にエステル化されたＰＥＧが頻繁に用いられる活性化ＰＥＧエステルである。本明細書においては、「アシル化」としては限定はしないが、治療用タンパク質と水溶性ポリマーとの間の以下のタイプの結合が挙げられる、例えば、ＰＥＧ：アミド、カーバメート、ウレタンなど。例えばＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：１３３−１４０，１９９４を参照のこと。反応パラメーターは一般に、増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチドを損傷または不活性化する温度、溶媒およびｐＨの条件を回避するように選択される。
【０１３３】
一般に、接続している連結部はアミドであり、代表的には得られる生成物の少なくとも９５％がモノＰＥＧ化、ジＰＥＧ化またはトリＰＥＧ化されている。しかしながら、より高度のＰＥＧ化を有するいくつかの物質種が、用いられる特定の反応条件に依存する量で形成されてもよい。必要に応じて、精製されたＰＥＧ化物質種は、混合物、特に未反応の物質種から、従来の精製方法、例えば透析、塩析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水性交換クロマトグラフィーおよび電気泳動を含む精製方法によって分離される。
【０１３４】
アルキル化によるＰＥＧ化は一般に、還元剤の存在下において、ＰＥＧの末端アルデヒド誘導体と、本発明の増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチドもしくはポリペプチドフラグメントとを反応させる工程を包含する。さらに、当業者は、実質的にＭ−ＣＳＦのポリペプチドのＮ末端アミノ基にのみＰＥＧ化が起こるように、すなわちモノＰＥＧ化タンパク質となるように反応条件を操作し得る。モノＰＥＧ化およびポリＰＥＧ化のいずれの場合にも、ＰＥＧ基は代表的には−ＣＨ２−ＮＨ−基を介してタンパク質に結合される。−ＣＨ２−基に特に言及すれば、この型の連結部は「アルキル」連結部として公知である。
【０１３５】
Ｎ末端標的化モノＰＥＧ化生成物を生成するための還元的アルキル化を介した誘導体化は、誘導体化に利用可能な一級アミノ基の異なる型の異なる反応性を利用している（リジン対Ｎ末端）。この反応はリジン残基のイプシロン−アミノ基とタンパク質のＮ末端アミノ基との間のｐＫａの差を利用することを可能にするｐＨで行われる。そのような選択的誘導体化により、アルデヒドのような反応性の基を含む水溶性ポリマーのタンパク質への結合が制御され：ポリマーとの結合体化がタンパク質のＮ末端において優先的に起こり、そしてリジン側鎖アミノ基のような他の反応性の基の有意な修飾は起こらない。
【０１３６】
アシル化およびアルキル化のアプローチの両方において用いられるポリマー分子は水溶性ポリマーの中から選択される。選択されるポリマーは代表的には、重合の程度が本発明の方法において提示されるとおり制御され得るように、単一の反応性の基、例えばアシル化については活性エステルまたはアルキル化についてはアルデヒドを有するように修飾される。例示的な反応性のＰＥＧアルデヒドは、水安定性のポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、またはそのモノＣ１−Ｃ１０アルコキシまたはアリールオキシ誘導体である（例えばＨａｒｒｉｓらの米国特許５，２５２，７１４号を参照のこと）。ポリマーは分枝鎖であっても、または未分枝鎖であってもよい。アシル化反応のためには、選択されるポリマー（単数または複数）は代表的には単一の反応性のエステル基を有する。還元的アルキル化のためには、選択されるポリマー（単数または複数）は代表的には単一の反応性のアルデヒド基を有する。一般に、水溶性ポリマーは、それらが通常は哺乳動物組み換え発現系によりより都合よく作成されるので、天然に存在するグリコシル残基からは選択されない。
【０１３７】
本発明のＰＥＧ化された増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチドを調製するための方法は一般に以下の工程を包含する、（ａ）１つ以上のＰＥＧ基に分子が結合する条件下で、本発明の増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチドもしくはポリペプチドフラグメントと、ポリエチレングリコール（例えばＰＥＧの反応性のエステルまたはアルデヒド誘導体）とを反応させる工程と、（ｂ）この反応生成物（単数または複数）を得る工程と。一般に、アシル化反応のための最適な反応条件は、既知パラメーターおよび所望の結果に基づいて事例ごとに決定される。例えば、タンパク質に対するＰＥＧの比が高い値であるほど、一般にポリＰＥＧ化生成物の割合が大きくなる。
【０１３８】
モノポリマー／増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチドの実質的に均質な集団を製造するための還元的アルキル化は一般に以下の工程を包含する：（ａ）増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのＮ末端アミノ基の選択的修飾を可能にするために適切なｐＨにおいて、還元的アルキル化条件下で、本発明の増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチドもしくはポリペプチドフラグメントと、反応性ＰＥＧ分子とを反応させる工程；および（ｂ）反応生成物（単数または複数）を得る工程。
【０１３９】
モノポリマー／増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチドの実質的に均質な集団については、還元的アルキル化反応条件は、本発明の増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチドもしくはポリペプチドフラグメントのＮ末端への水溶性ポリマー部分の選択的結合を可能にする条件である。そのような反応条件は一般に、リジン側鎖アミノ基とＮ末端アミノ基との間のｐＫａの相違をもたらす。本発明の目的のためには、ｐＨは一般に３〜９、代表的には３〜６の範囲である。
【０１４０】
本発明の増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチドはタグ、例えばタンパク質分解により実質的に放出され得る部分を包含し得る。従って、リジン部分は最初にリジンおよびＮ末端の両方と反応するＴｒａｕｔ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）のような低分子量リンカーで修飾されたＨｉｓタグを反応させること、次に、Ｈｉｓタグを放出することにより選択的に修飾できる。次にポリペプチドは、マレイミド基、ビニルスルホン基、ハロアセテート基、または遊離もしくは保護されたＳＨのようなチオール反応性ヘッド基を含むＰＥＧで選択的に修飾できる遊離のＳＨ基を含む。
【０１４１】
Ｔｒａｕｔ試薬はＰＥＧ結合のための特定の部位を設定する任意のリンカーと置き換えてもよい。例えばＴｒａｕｔ試薬は、ＳＰＤＰ、ＳＭＰＴ、ＳＡＴＡまたはＳＡＴＰ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）と置き換えてもよい。同様に、マレイミド（例えばＳＭＣＣ、ＡＭＡＳ、ＢＭＰＳ、ＭＢＳ、ＥＭＣＳ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、ＫＭＵＳまたはＧＭＢＳ）、ハロアセテート基（ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ）またはビニルスルホン基を挿入するアミン反応性リンカーとタンパク質とを反応させ、そして得られた生成物を遊離のＳＨを含有するＰＥＧと反応させてもよい。
【０１４２】
ある実施形態においては、ポリアルキレングリコール部分は増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチドのシステイン基にカップリングされる。カップリングは例えばマレイミド基、ビニルスルホン基、ハロアセテート基またはチオール基を用いて達成されてもよい。
【０１４３】
必要に応じて、増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチドは不安定な結合を通じてポリエチレングリコール部分に結合体化される。不安定な結合は、例えば生化学的加水分解、タンパク質分解またはスルヒドリル切断において切断され得る。例えば、その結合はインビボ（生理学的）条件下で切断され得る。
【０１４４】
その反応は、反応性の基がＮ末端のαアミノ基上にある場合は、不活性ポリマーと生物学的に活性な物質とを反応させるために用いられる任意の適切な方法により、一般に約ｐＨ５〜８、例えばｐＨ５、６、７または８において行ってよい。一般に、このプロセスは活性化ポリマーを調製し、その後、タンパク質を活性化ポリマーと反応させることにより処方物に適切な可溶性タンパク質を生成する工程を包含する。
【０１４５】
（ポリヌクレオチド）
本発明は又、本明細書に記載の増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチドのうちのいずれか１つをコードする単離されたポリヌクレオチドの投与を包含する。これは、本明細書に記載の増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチドのうちのいずれか１つをコードするポリヌクレオチドの非コード鎖または相補体に対して中等度にストリンジェントか、または高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを包含する。ストリンジェントな条件は当業者に公知であって、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１〜６．３．６に見出され得る。
【０１４６】
ヒトＭ−ＣＳＦ長（β）中間体（γ）および短（α）ポリヌクレオチドを、それぞれ、配列番号４、５および６として下に示す。
【０１４７】
全長ヒトＭ−ＣＳＦポリヌクレオチド（配列番号４）：
【０１４８】
【化４】
2010510219.tif 000005
ヒトＭ−ＣＳＦγポリヌクレオチド（配列番号５）：
【０１４９】
【化５】
2010510219.tif 000006
ヒトＭ−ＣＳＦαポリヌクレオチド（配列番号６）：
【０１５０】
【化６】
2010510219.tif 000007
増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦをコードする核酸は、診断およびプローブの目的のために検出可能な標識を含むようにさらに改変されてもよい。種々のこのような標識が当該分野で公知であり、かつ本明細書に記載されるコード分子とともに容易に使用され得る。適切な標識としては限定はしないが、ビオチン、放射性標識ヌクレオチドなどが挙げられる。当業者は、当該分野で公知の任意の標識を使用して、標識された核酸コード分子を得ることができる。
【０１５１】
（本発明のベクター）
増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦポリペプチドをコードする核酸を含むベクターを本発明の方法における使用のための可溶性ポリペプチドを生成するために用いてもよい。ベクターおよびそのような核酸が作動可能に連結されている発現制御配列の選択は、所望の機能的特性、例えばタンパク質発現、および形質転換すべき宿主細胞に依存する。
【０１５２】
代表的な実施形態では、本明細書中に記載される方法において有用である増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦポリペプチドは、タンパク質をコードする外因性核酸を担持している細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）によって生産される組換え体タンパク質である。他の実施形態においては、組換え体ポリペプチドは、遺伝子の活性化として一般的に知られているプロセスによって生産され、ここでは、細胞は、ポリペプチドをコードする内因性核酸に対して作動可能に連結されたプロモーターまたはエンハンサーを含む外因性核酸を含む。
【０１５３】
組換え体ポリペプチド（例えば、増殖因子、コロニー刺激因子またはＭ−ＣＳＦポリペプチド）を作製するための慣用的な技術を用いて、適切な転写／翻訳制御シグナル、およびタンパク質コード配列を用いて目的のポリペプチドをコードする発現ベクターを構築してもよい。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ２００１）を参照のこと）。これらの方法としては、インビトロでの組換えＤＮＡおよび合成技術、ならびにインビボでの組換え、例えば、インビボでの相同組換えを挙げることができる。ポリペプチドをコードする核酸配列の発現は、ポリペプチドをコードする配列に対して作動可能に連結されている第２の核酸配列によって調節してもよく、その結果、このポリペプチドは、組換え体ＤＮＡ分子で形質転換された宿主の中で発現させられる。
【０１５４】
作動可能に連結されたコード配列の発現を調節するために有用な発現制御エレメントは当該分野で公知である。例としては限定はしないが、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、分泌シグナル、および他の調節エレメントが挙げられる。誘導性プロモーターが用いられる場合には、これは、例えば、宿主細胞培地中の栄養状態の変化、または温度の変化によって制御され得る。
【０１５５】
ポリペプチドをコードする核酸を含んでおり、細菌宿主または真核生物宿主の中で複製可能である発現ベクターを用いて、宿主をトランスフェクトし、それによってポリペプチドを生じるようにそのような核酸の発現を指示させ、このポリペプチドを次に単離してもよい。好ましい哺乳動物発現ベクターは、細菌の中でのベクターの増殖を促進するための原核生物の配列と、真核生物細胞の中で発現させられる１つ以上の真核生物の転写ユニットの両方を含む。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏ、およびｐＨｙｇに由来するベクターが、真核生物細胞のトランスフェクションに適している哺乳動物発現ベクターの例である。外因性ＤＮＡ配列での細胞のトランスフェクトのための慣用的な技術を、本発明に用いることができる。トランスフェクション方法としては、化学的手段（例えば、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、またはリポソーム）；または物理的手段、例えば、マイクロインジェクション、またはエレクトロポレーションを挙げることができる。トランスフェクトされた細胞は、慣用的な技術によって増殖させられる。例えば、Ｋｕｃｈｌｅｒら、（１９７７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙを参照のこと。発現産物はそれらの系の細胞培地から（ここでは、タンパク質が宿主細胞から分泌される）、または宿主細胞系の破壊後の細胞懸濁液から、例えば、慣用的な機械的、化学的、もしくは酵素的手段によって、単離される。
【０１５６】
これらの方法はまた、遺伝子の標的化および遺伝子の活性化（引用により本明細書中に援用されるＴｒｅｃｏら、ＷＯ９５／３１５６０を参照のこと；Ｓｅｌｄｅｎら、ＷＯ９３／０９２２２も参照のこと）を含む他の手順によって遺伝子操作されている細胞を用いて行ってもよい。
【０１５７】
このベクターは、原核生物のレプリコン、すなわち、細菌宿主細胞において染色体外での組換え体ＤＮＡ分子の自律複製および維持を指向する能力を有しているＤＮＡ配列を含んでもよい。このようなレプリコンは当該分野で周知である。さらに、原核生物のレプリコンを含むベクターはまた、その発現によって薬剤耐性のような検出可能なマーカーを付与する遺伝子も含んでもよい。細菌の薬剤耐性遺伝子の例は、アンピシリンまたはテトラサイクリンに対する耐性を付与する遺伝子である。
【０１５８】
原核生物のレプリコンを含むベクターはまた、細菌宿主細胞の中でコード遺伝子配列の発現を指示するための原核生物またはバクテリオファージプロモーターを含んでもよい。細菌宿主と適合するプロモーター配列は、通常、発現させられるＤＮＡセグメントの挿入のための通常の制限部位を含むプラスミドベクターの中に提供される。このようなプラスミドベクターの例は、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２、およびｐＢＲ３２９（ＢｉｏＲａｄ）、ｐＰＬ、およびｐＫＫ２２３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）である。任意の適切な原核生物宿主を、本発明の方法で使用されるタンパク質をコードする組換え体ＤＮＡ分子を発現させるために用いてもよい。
【０１５９】
本発明の目的について、多数の発現ベクター系を用いてもよい。例えば、ベクターの一分類では、動物ウイルス、例えば、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス−１、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶ、またはＭＯＭＬＶ）、またはＳＶ４０ウイルスに由来するＤＮＡエレメントを利用する。このようなベクターの例は、その全体が本明細書に援用されるＰＣＴ公開ＷＯ２００６／０６００８９およびＷＯ２００２／０５６９１８に見出され得る。他には、内部リボソーム結合部位を有している多シストロン性の系の使用が挙げられる。さらに、それらの染色体にＤＮＡが組み込まれている細胞を、トランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能にする１つ以上のマーカーを導入することによって選択してもよい。このマーカーは、栄養要求性宿主に対する原栄養性（ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｈｙ）、殺生物剤（例えば、抗生物質）耐性、または銅のような重金属に対する耐性を提供し得る。選択マーカー遺伝子は、発現させられるＤＮＡ配列に直接連結されてもよいし、または、同時形質転換により同じ細胞の中に導入されてもよい。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子が選択マーカー遺伝子の例である（Ｓｏｕｔｈｅｒｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｎａｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７−３４１（１９８２））。さらなるエレメントがまた、ｍＲＮＡの最適な合成に必要である場合もある。これらのエレメントとしては、シグナル配列、スプライシングシグナル、ならびに、転写プロモーター、エンハンサー、および終結シグナルを挙げることができる。
【０１６０】
１つの実施形態においては、ＮＥＯＳＰＬＡと呼ばれるＢｉｏｇｅｎ  ＩＤＥＣ，Ｉｎｃ．の特許の発現ベクター（米国特許第６，１５９，７３０号）を用いてもよい。このベクターは、サイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサー、マウスβ−グロビン主要プロモーター、ＳＶ４０複製起点、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼエキソン１およびエキソン２、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、ならびに、リーダー配列を含む。このベクターは、ＣＨＯ細胞にトランスフェクションされる際に非常に高いレベルの発現を生じることが見出されており、続いて、Ｇ４１８を含む培地の中で選択、およびメトトレキセート増幅される。当然ながら、真核生物細胞の中で発現を誘発できる任意の発現ベクターを、本発明において用いてもよい。適切なベクターの例としては、プラスミドｐｃＤＮＡ３、ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦ１／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸ１、およびｐＺｅｏＳＶ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能）、およびプラスミドｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから入手可能）が挙げられるが、これらに限定はされない。さらなる真核生物細胞発現ベクターは当該分野で公知であり、市販されている。通常、このようなベクターには、所望されるＤＮＡセグメントの挿入のための便利な制限部位が含まれる。例示的なベクターとしては、ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＢＰＶ−１、ｐｍｌ２ｄ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｐＴＤＴ１（ＡＴＣＣ３１２５５）、レトロウイルス発現ベクターｐＭＩＧおよびｐＬＬ３．７、アデノウイルスシャトルベクターｐＤＣ３１５、ならびにＡＡＶベクターが挙げられる。他の例示的なベクター系は、例えば、米国特許第６，４１３，７７７号に開示されている。
【０１６１】
一般には、アンタゴニストを適切に高レベルで発現する細胞についての多数の形質転換された細胞のスクリーニングは、例えば、ロボットによるシステムによって行うことができる慣用的な実験法である。
【０１６２】
組換え体発現ベクターは、宿主細胞の中でのベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）および選択マーカー遺伝子を担持してもよい。調節配列の選択を含む、発現ベクターの設計は、形質転換されるべき宿主細胞の選択、所望されるタンパク質の発現のレベルなどのような因子に依存し得ることが当業者には理解される。哺乳動物宿主細胞での発現のために頻繁に使用される調節配列としては、哺乳動物細胞の中での高いレベルのタンパク質発現を指向するウイルスエレメント、例えば、レトロウイルスＬＴＲに由来するプロモーターおよびエンハンサー、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来するプロモーターおよびエンハンサー（例えば、ＣＭＶプロモーター／エンハンサー）、シミアン・ウイルス４０（ＳＶ４０）に由来するプロモーターおよびエンハンサー（例えば、ＳＶ４０プロモーター／エンハンサー）、アデノウイルスに由来するプロモーターおよびエンハンサー（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄｍｌＰ））、ポリオーマおよび強い哺乳動物プロモーター、例えば、天然の免疫グロブリンおよびアクチンのプロモーターが挙げられる。ウイルスの調節エレメントおよびその配列のさらなる記載については、例えば、Ｓｔｉｎｓｋｉ，米国特許第５，１６８，０６２号；Ｂｅｌｌ，米国特許第４，５１０，２４５号；およびＳｃｈａｆｆｎｅｒ，米国特許第４，９６８，６１５号を参照のこと。
【０１６３】
選択マーカー遺伝子は、その中にベクターが導入されている宿主細胞の選択を容易にする（例えば、Ａｘｅｌ，米国特許第４，３９９，２１６号；同第４，６３４，６６５号、および同第５，１７９，０１７号を参照のこと）。例えば、通常は、選択マーカー遺伝子は、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、またはメトトレキセートのような薬剤に対する耐性を、そのベクターが導入されている宿主細胞に対して付与する。頻繁に使用される選択マーカー遺伝子としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキセート選択／増幅と共にｄｈｆｒ−宿主細胞において使用される）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のため）が挙げられる。
【０１６４】
増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを、適切な宿主細胞の形質転換に用いてもよい。形質転換は任意の適切な方法によって行うことができる。哺乳動物細胞に外因性ＤＮＡを導入するための方法は当該分野で周知であり、これには、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソームの中へのポリヌクレオチド（単数または複数）のカプセル化、および核へのＤＮＡの直接のマイクロインジェクションが挙げられる。さらに、核酸分子は、ウイルスベクターによって哺乳動物細胞に導入してもよい。
【０１６５】
宿主細胞の形質転換は、使用されるベクターおよび宿主細胞に適している従来の方法によって行ってもよい。原核生物宿主細胞の形質転換については、エレクトロポレーション、および塩処理方法を使用してもよい（Ｃｏｈｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９：２１１０〜１４（１９７２））。脊椎動物細胞の形質転換については、エレクトロポレーション、陽イオン性脂質または塩処理方法を使用してもよい。例えば、Ｇｒａｈａｍら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６〜４６７（１９７３）；Ｗｉｇｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：１３７３〜７６（１９７９）を参照のこと。
【０１６６】
タンパク質発現のために使用される宿主細胞株は、最も好ましくは、哺乳動物を起源とするものである；当業者は、特定の宿主細胞株であって、その中で発現させられる所望される遺伝子産物に最も適している株を優先的に決定する能力を承知している。例示的な宿主細胞株としては、ＮＳＯ、ＳＰ２細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞ガン細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、Ａ５４９細胞ＤＧ４４およびＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣株、ＤＨＦＲ−）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頸ガン）、ＣＶＩ（サル腎臓株）、ＣＯＳ（ＳＶ４０  Ｔ抗原を有しているＣＶＩの誘導体）、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）、ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓株）、ＳＰ２／Ｏ（マウス骨髄腫）、Ｐ３ｘ６３−Ａｇ３．６５３（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ−１ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）、および２９３（ヒト腎臓）が挙げられるがこれらに限定はされない。宿主細胞株は、代表的には、商業的に、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから、または公開されている文献から入手することができる。
【０１６７】
生産細胞株からのポリペプチドの発現は、公知の技術を用いて増強してもよい。例えば、グルタミン合成酵素（ＧＳ）系は、普通は、特定の条件下での発現を増強させるために用いられる。例えば、欧州特許第０２１６８４６号、同第０２５６０５５号、および同第０３２３９９７号、ならびに欧州特許出願番号８９３０３９６４．４を参照のこと。
【０１６８】
いくつかの実施形態においては、本発明により、コード配列を含む組み換えＤＮＡ分子（ｒＤＮＡ）が提供される。本明細書中で使用される場合、ｒＤＮＡ分子とは、分子操作が行われたＤＮＡ分子である。ｒＤＮＡ分子を作成するための方法は当該分野で周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照のこと。いくつかのｒＤＮＡ分子においては、コードＤＮＡ配列は、発現制御配列およびベクター配列に対して作動可能に連結される。本発明のベクターは少なくとも、宿主染色体への複製または挿入、好ましくは、ｒＤＮＡ分子に含まれる構造遺伝子の発現も指向し得る。
【０１６９】
真核生物細胞と適合する発現ベクター、好ましくは、脊椎動物細胞と適合する発現ベクターもまた、コード配列を含むｒＤＮＡ分子を形成させるために用いてもよい。真核生物細胞発現ベクターは、当該分野で周知であり、いくつかの商業的供給業者から入手可能である。代表的には、このようなベクターは、所望されるＤＮＡセグメントの挿入のための便利な制限部位を含んで提供される。このようなベクターの例は、ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＢＰＶ−１、ｐＭＬ２ｄ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｐＴＤＴ１（ＡＴＣＣ（登録商標）３１２５５）、および他の真核生物発現ベクターである。
【０１７０】
本発明のｒＤＮＡ分子を構築するために用いられる真核生物発現ベクターは、さらに、真核生物細胞中で有効である選択マーカー、好ましくは、薬剤耐性選択マーカーを含んでもよい。好ましい薬剤耐性マーカーは、その発現によりネオマイシン耐性を生じる遺伝子、すなわち、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子である。（Ｓｏｕｔｈｅｒｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｎａｌ．Ｇｅｎｅｔ．１，３２７〜３４１（１９８２））。あるいは、選択マーカーは、別のプラスミド上に存在してもよく、２つのベクターを宿主細胞の同時トランスフェクションによって導入し、トランスフェクタントを、選択マーカーについて適切な薬剤の中で培養することによって選択してもよい。
【０１７１】
本発明の他の方法は、本発明のポリヌクレオチドの発現のためにレンチウイルスベクターを用いる。レンチウイルスは非周期細胞および有糸分裂後細胞に感染し得、また発達の間サイレンシングではないという利点があり、これによって胚性幹細胞の感染を通じてトランスジェニック動物の作製が可能になる。Ｍｉｌｈａｖｅｔら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖ．５５：６２９〜６４８（２００３）。他のポリヌクレオチド発現ウイルスベクターが、限定はしないがアデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスまたはアルファウイルスに基づいて構築され得る。
【０１７２】
本発明のポリヌクレオチドの転写は、真核生物のＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ  Ｉ）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ  ＩＩ）またはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌＩＩＩ）のプロモーターから駆動され得る。ｐｏｌＩＩまたはｐｏｌＩＩＩのプロモーターからの転写は、全ての細胞中で高レベルで発現され；所定の細胞タイプにおける所定のｐｏｌＩＩプロモーターのレベルは、すぐ隣に存在する遺伝子調節性配列（エンハンサー、サイレンサーなど）の性質に依存する。原核生物ＲＮＡポリメラーゼプロモーターも用いられるが、ただし、原核生物ＲＮＡポリメラーゼ酵素が適切な細胞中で発現される条件である（Ｅｌｒｏｙ−ＳｔｅｉｎおよびＭｏｓｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：６７４３〜７（１９９０）；ＧａｏおよびＨｕａｎｇ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：２８６７〜７２（１９９３）；Ｌｉｅｂｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：４７〜６６（１９９３）；Ｚｈｏｕら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：４５２９〜３７（１９９０））。幾人かの研究者らによって、このようなプロモーターから発現されるポリヌクレオチドが、哺乳動物細胞で機能し得ることが示されている（例えば、Ｋａｓｈａｉ−Ｓａｂｅｔら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．２：３〜１５（１９９２）；Ｏｊｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０８０２〜６（１９９２）；Ｃｈｅｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：４５８１〜９（１９９２）；Ｙｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６３４０〜４（１９９３）；Ｌ’Ｈｕｉｌｌｉｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１１：４４１１〜８（１９９２）；Ｌｉｓｚｉｅｗｉｃｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ９０：８０００〜４（１９９３）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：２２５９（１９９５）；Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ＆Ｃｅｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１５６６（１９９３））。
【０１７３】
（本発明のタンパク質を組み換え的に産生する宿主細胞および方法）
本発明の増殖因子、コロニー刺激因子もしくはＭ−ＣＳＦのポリペプチド、または増殖因子、コロニー刺激因子もしくはＭ−ＣＳＦの融合タンパク質をコードする核酸分子、ならびにこれらの核酸分子を含むベクターを、適切な宿主細胞の形質転換のために用いてもよい。形質転換は、宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための任意の公知の方法によって行ってもよい。異種ポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に導入するための方法は当該分野で周知であり、これには、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム中へのポリヌクレオチド（単数または複数）のカプセル化、および核へのＤＮＡの直接のマイクロインジェクションが挙げられる。さらに、核酸分子を、ウイルスベクターによって哺乳動物細胞に導入してもよい。
【０１７４】
本発明のｒＤＮＡ分子での適切な細胞宿主の形質転換は、周知の方法によって達成され、この方法は、代表的には、用いられるベクターおよび使用される宿主システムのタイプに依存する。原核生物宿主細胞の形質転換に関しては、エレクトロポレーションおよび塩処理方法が使用されてもよい（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ｃｏｈｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０〜２１１４（１９７２）を参照のこと）。Ｍ−ＣＳＦは、原核生物宿主細胞、Ｅ．ｃｏｌｉから、モノマー型で首尾よく精製され、再生されて完全に活性な二量体が生成されている。（Ｈａｌｅｎｂｅｃｋら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：７１０〜４１５（１８８９））。ｒＤＮＡを含むベクターでの脊椎動物細胞の形質転換に関しては、エレクトロポレーション、陽イオン性脂質、または塩処理方法が使用されてもよい（例えば、Ｇｒａｈａｍら，（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２，４５６〜４６７；Ｗｉｇｌｅｒら，（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６，１３７３〜１３７６を参照のこと）。
【０１７５】
首尾よく形質転換された細胞、すなわち、増殖因子、コロニー刺激因子もしくはＭ−ＣＳＦをコードするｒＤＮＡ分子を含む細胞は、選択マーカーについての選択を含む、周知の技術によって同定することができる。例えば、本発明のｒＤＮＡの導入によって得られる細胞をクローニングして、単一コロニーを得てもよい。これらのコロニーに由来する細胞を、回収し、溶解させ、そしてそれらのＤＮＡ含量を、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８，５０３〜５１７（１９７５）によって記載されているような方法を用いてｒＤＮＡの存在について試験してもよく、また、細胞によって産生されるタンパク質を、免疫学的方法によってアッセイしてもよい。
【０１７６】
本発明の方法で用いるための本発明のポリペプチドまたは抗体の発現のための宿主細胞は、原核生物であっても、真核生物であってもよい。発現のための宿主として利用できる哺乳動物細胞株は当該分野で周知であり、これには、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ（登録商標））から入手可能な多くの不死化細胞株が含まれる。これらとしては、とりわけ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳＯ、ＳＰ２細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞ガン細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、Ａ５４９細胞、および多数の他の細胞株が挙げられる。特に好ましい細胞株は、どの細胞株が高い発現レベルを有しているかを決定することによって選択される。他の有用な真核生物宿主細胞としては植物細胞が挙げられる。用いられ得る他の細胞株は、昆虫細胞株、例えば、Ｓｆ９細胞である。例示的な原核生物宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓである。
【０１７７】
本発明の増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦポリペプチドをコードする組み換え発現ベクター、および増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦタンパク質が哺乳動物宿主細胞に導入される場合は、それらは、宿主細胞中においてその抗体、ポリペプチド、および融合ポリペプチドの発現を可能にするために、あるいは、さらに好ましくは、本発明の増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦポリペプチド、および増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦ融合タンパク質をその宿主が増殖させられる培養培地中に分泌させるために十分な時間の間、宿主細胞を培養することによって産生される。本発明の増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦポリペプチドおよび増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦ融合タンパク質は、標準的なタンパク質精製方法を使用して培養培地から回収することができる。
【０１７８】
さらに、本発明の増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦポリペプチド、および増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦ融合タンパク質（あるいはそれらに由来する他の部分）の、産生細胞株からの発現は、多数の公知の技術を用いて増強され得る。例えば、グルタミン合成酵素の遺伝子発現システム（ＧＳシステム）が、特定の条件下で発現を増強させるための一般的なアプローチである。ＧＳシステムは、欧州特許第０，２１６，８４６号、同第０，２５６，０５５号、および同第０，３２３，９９７号、ならびに欧州特許出願番号８９３０３９６４．４と組み合わせて、全体にまたは部分的に考察されている。
【０１７９】
本明細書中に記載されるように培養された細胞によって生産されたポリペプチドは、分泌されたポリペプチドとして培養培地から回収してもよいし、または細胞によって分泌されない場合は、これを宿主細胞溶解物から回収してもよい。ポリペプチドの単離の最初の工程として、培養培地または溶解物が、一般的には遠心分離されて、微粒子状の細胞の破片が除去される。その後、ポリペプチドが、混入している可溶性タンパク質および他の細胞性成分から、適切な精製手順の例である以下の手順を用いて、単離され、好ましくは、精製される：免疫アフィニティーカラムまたはイオン交換カラム上での分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ上または陽イオン交換樹脂、例えば、ＤＥＡＥ上でのクロマトグラフィー；クロマト分画；ＳＤＳ  ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；ならびにゲル濾過（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いる）。プロテアーゼインヒビターを、精製の間のタンパク質分解的分解を阻害するために用いてもよい。当業者は、目的のポリペプチドに適している精製方法に、組換え体細胞培養物中で発現される際のポリペプチドの特性における変化の原因となる修飾が必要である場合があることを理解する。
【０１８０】
ポリペプチドの精製には、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、通常のイオン交換クロマトグラフィー、サイジングクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過、または他の通常のタンパク質精製技術の使用が必要とされる場合がある。例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，編（１９９０）「Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１８２巻を参照のこと。
【０１８１】
（組成物）
本発明の増殖因子ポリペプチド、コロニー刺激因子ポリペプチド、Ｍ−ＣＳＦポリペプチド、ポリペプチドフラグメント、ポリヌクレオチド、ベクターおよび宿主細胞は、ヒトを含む哺乳動物への投与のための薬学的組成物に処方してもよい。ある実施形態では、本発明は、本発明の増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチドもしくは融合タンパク質を含む組成物を提供する。
【０１８２】
ある実施形態では、本発明は、増殖因子のポリペプチドまたは融合タンパク質を含む組成物を提供する。ある実施形態では、本発明は、コロニー刺激因子ポリペプチド、または融合タンパク質を含む組成物を提供する。ある実施形態では、本発明は、Ｍ−ＣＳＦポリペプチドまたは融合タンパク質を含む組成物を提供する。
【０１８３】
ある実施形態では、本発明は、増殖因子ポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。ある実施形態では、本発明は、コロニー刺激因子ポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。ある実施形態では、本発明は、Ｍ−ＣＳＦポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。
【０１８４】
ある実施形態では、この組成物は、ＭＣＳＦの単量体または二量体を含んでもよい。この二量体は上で挙げられたＭ−ＣＳＦ参照アミノ酸配列を有するポリペプチドから構成されるホモ二量体であっても、または上で挙げられたＭ−ＣＳＦ参照アミノ酸配列を有する任意の２つのポリペプチドから構成されるヘテロ二量体であってもよい。このホモ二量体またはヘテロ二量体に存在するポリペプチドは、配列番号１、２または３のポリペプチドまたはそのフラグメントに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％同一性を有する置換されたＭ−ＣＳＦポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントであってもよい。
【０１８５】
ある実施形態では、本発明は、作用部位への送達のために薬学的に用いられ得る調製物への活性化合物のプロセシングを容易にする、賦形剤および助剤を含む適切な薬学的に受容可能なキャリアを含んでもよい。非経口投与のための適切な処方物としては、水溶性型の活性化合物、例えば水溶性の塩の水溶液が挙げられる。さらに活性化合物の懸濁液は、適切な油状注射懸濁液として投与されてもよい。適切な脂溶性溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油、例えば、ゴマ油、または合成脂肪酸エステル、例えば、オレイン酸エチル、またはトリグリセリドが挙げられる。水性の注射用懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、およびデキストランを包含する、懸濁液の粘度を高める物質を含んでもよい。必要により、懸濁液にはまた安定剤も含まれてもよい。リポソームは、細胞への送達のために本発明の分子をカプセル化するためにも用いてもよい。例示的な「薬学的に受容可能なキャリア」は、任意のかつ全ての溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗生物質、および抗真菌剤、等張性剤および吸収遅延剤など（生理学的に適合している）、水、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、ならびにそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態においては、組成物には、等張化剤、例えば、糖、多価アルコール（例えば、マンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウム）が含まれる。いくつかの実施形態においては、組成物は、薬学的に受容可能な物質、例えば、湿潤剤、または少量の補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、保存剤または緩衝液（これらは、本発明の可溶性のＮｏｇｏレセプターまたは融合タンパク質の保存期間または有効性を高める）を含む。
【０１８６】
本発明の組成物は、種々の形態であってもよく、これには、例えば、液体、半固体および固体の剤形、例えば、液体溶液（例えば、注射可能および注入可能な溶液）、分散液または懸濁液が挙げられる。好ましい形態は、投与および治療の適用の意図される方式に依存する。一実施形態では、組成物は、注射可能または注入可能な溶液の形態、例えば、他の抗体でのヒトの受動免疫のために用いられる組成物と類似の組成物である。
【０１８７】
この組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソームまたは高い薬剤濃度に適している他の規則的構造として処方されてもよい。一般には、分散液は、活性な化合物を、塩基性分散媒体と上で列挙されたものから必要な他の成分とを含む無菌の媒体の中に配合することによって、調製される。無菌の注射可能な溶液の調製用の滅菌の粉末の場合には、好ましい調製方法は、減圧乾燥および凍結噴霧であり、これによって先の滅菌濾過された溶液から、活性な成分にさらに任意のさらなる所望される成分を加えた粉末が得られる。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散液の場合には必要な粒径の維持によって、そして界面活性剤の使用によって維持することができる。注射可能な組成物の吸収の延長は、組成物の中に、吸収を遅らせる物質、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを含めることによってもたらすことができる。
【０１８８】
他の実施形態では、この活性な化合物は、急速な放出に対してこの化合物を防御するキャリア、例えば、徐放性の処方物（インプラント、経皮パッチおよびマイクロカプセル化送達システムを含む）で調製されてもよい。生体分解性、生体適合性ポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸を用いてもよい。このような処方物の調製のための多くの方法が特許されているかまたは一般には当業者に公知である。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，編，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７８）を参照のこと。
【０１８９】
本発明の薬学的組成物は、「治療上有効な量」または「予防上有効な量」の本発明のポリペプチド（単数または複数）、または融合タンパク質を含んでもよい。「治療上有効な量」とは、所望の治療結果を得るのに必要な投薬量で、かつ期間で有効な量をいう。増殖因子ポリペプチド、増殖因子タンパク質、コロニー刺激因子ポリペプチド、コロニー刺激因子タンパク質、Ｍ−ＣＳＦポリペプチドまたはＭ−ＣＳＦタンパク質の治療上有効な量は、個体の疾患の状態、年齢、性別、および体重などの因子に依存して変化し得る。治療上有効な量とはまた、増殖因子ポリペプチド、増殖因子タンパク質、コロニー刺激因子ポリペプチド、コロニー刺激因子タンパク質、Ｍ−ＣＳＦポリペプチドまたはＭ−ＣＳＦタンパク質の何らかの毒性または有害な影響を治療上有益な効果が上回る量でもある。「予防上有効な量」とは、所望の予防的結果を得るのに必要な投薬量で、かつ期間で有効な量をいう。代表的には、予防的な用量は、疾患の前にまたは早期の段階で被験体に用いられるので、予防上有効な量は、治療上有効な量未満である。
【０１９０】
この組成物は、単回用量、複数回用量、または確立された期間におよぶインフュージョンとして投与されてもよい。投薬レジメンはまた、最適の所望の応答（例えば、治療または予防的応答）を得るために調節されてもよい。例えば、増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦは動物に対して、１日に１回、月のうち１週、連続して（例えば、浸透圧ポンプによって）、間欠的に、アミロイド沈着もしくはアミロイド斑の形成の前、間もしくは後に、アミロイド沈着もしくはアミロイド斑の大きさおよび／もしくは形成、またはそれらの２つ以上の組み合わせが軽減されるまで、投与されてもよい。さらに、経時的に、この用量は、治療上の状況の緊急性によって示される場合、比例して減少されても、または増大されてもよい。非経口組成物を、投与の容易な単位剤形で処方することが特に有利であり、本明細書において用いる場合、単位剤形の均質性とは、処置されるべき哺乳動物被験体の単位投薬量として適した物理的に別個の単位をいい、各々の単位は、必要な薬学的キャリアと組み合わせて所望の治療効果を生じるために計算された所定の量の活性化合物を含む。本発明の単位剤形についての説明は、以下によって決定され、かつ直接依存する（ａ）増殖因子ポリペプチド、増殖因子タンパク質、コロニー刺激因子ポリペプチド、コロニー刺激因子タンパク質、Ｍ−ＣＳＦポリペプチドまたはＭ−ＣＳＦタンパク質の固有の特徴、および達成されるべき特定の治療効果または予防効果、ならびに（ｂ）個体における感受性の処置のための増殖因子ポリペプチド、増殖因子タンパク質、コロニー刺激因子ポリペプチド、コロニー刺激因子タンパク質、Ｍ−ＣＳＦポリペプチドまたはＭ−ＣＳＦタンパク質などの配合に関する当該分野に固有の限界。ある実施形態では、増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦポリペプチドの治療上有効な用量範囲は、０．００１〜１０ｍｇ／Ｋｇ／日である。ある実施形態では、増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦポリペプチドの治療上有効な用量範囲は、０．０１〜１ｍｇ／Ｋｇ／日である。ある実施形態では、増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦポリペプチドの治療上有効な用量範囲は、０．０５〜０．５ｍｇ／Ｋｇ／日である。ある実施形態では、増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦポリペプチドの治療上有効な用量範囲は、０．０５〜０．２ｍｇ／Ｋｇ／日である。ある実施形態では、増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦポリペプチドの治療上有効な用量範囲は、０．００１〜０．５ｍｇ／Ｋｇ／日である。
【０１９１】
増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦポリペプチドでの処置に関しては、投与量は、例えば、宿主の体重１ｋｇあたり約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、約０．００１〜０．５ｍｇ／ｋｇ、または約０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇなど）の範囲であってもよい。例えば、投与量は、体重１ｋｇあたり１ｍｇ／ｋｇもしくは１０ｍｇ／ｋｇであっても、または１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であっても、好ましくは、少なくとも１ｍｇ／ｋｇであってもよい。上記の範囲の中間の用量もまた、本発明の範囲に入ると意図する。被験体は、このような用量を毎日、一日おき、毎週に投与されても、または実証的分析によって決定された任意の他のスケジュールにしたがって投与されてもよい。例示的な処置には、長期、例えば、少なくとも６ヶ月間にわたる複数回投与での投与を必然的に伴う。さらなる例示的な処置レジメンには、２週間ごとに１回、１ヶ月に１回、または３から６ヶ月に１回の投与を必然的に伴う。例示的な投与スケジュールとしては、連日の１〜１０ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ／ｋｇ、一日おきに３０ｍｇ／ｋｇ、または１週間おきに６０ｍｇ／ｋｇが挙げられる。
【０１９２】
ある方法では、２つ以上の増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチドもしくは融合タンパク質が、同時に投与され、この場合、投与される各々のポリペプチドまたは融合タンパク質の投薬量は、示される範囲におさまる。補助的な活性化合物も、本発明の方法で用いられる組成物中に組み込まれてもよい。例えば、増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチドもしくは融合タンパク質は、以下のような１つ以上のさらなる治療薬と一緒に処方してもよく、そして／または同時に投与してもよい：アドレナリン作動薬、抗アドレナリン作動薬、抗アンドロゲン、抗狭心薬、抗不安薬、抗痙攣薬、抗うつ薬、抗てんかん薬、抗脂質異常症薬、抗高リポタンパク質薬、降圧薬、抗炎症薬、抗強迫観念症薬（ａｎｔｉｏｂｅｓｓｉｏｎａｌ）、抗パーキンソン病薬、抗精神病薬、副腎皮質ステロイド；副腎皮質抑制剤；アルドステロンアンタゴニスト；アミノ酸；アナボリックステロイド；興奮剤（ａｎａｌｅｐｔｉｃ）；アンドロゲン；血糖調節剤；心保護薬；心臓血管薬；コリン作動薬または抗コリン薬；コリンエステラーゼ不活性化剤またはインヒビター、認知補助薬または賦活薬（ｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｏｒ  ｅｎｈａｎｃｅｒ）；ドーパミン作動薬；酵素インヒビター、エストロゲン、遊離酸素ラジカルスカベンジャー；ＧＡＢＡアゴニスト；グルタミン酸アンタゴニスト；ホルモン；低コレステロール血症薬；抗高脂血症薬；降圧薬；予防薬；免疫賦活薬；モノアミンオキシダーゼインヒビター、神経保護薬；ＮＭＤＡアンタゴニスト；ＡＭＰＡアンタゴニスト、競合的または非競合的ＮＭＤＡアンタゴニスト；オピオイドアンタゴニスト；カリウム・チャンネル開口薬；非ホルモン性ステロール誘導体；脳卒中後および頭部外傷後治療薬；プロスタグランジン；向精神薬；弛緩薬；鎮静薬；鎮静催眠薬；選択性アデノシンアンタゴニスト；セロトニンアンタゴニスト；セロトニンインヒビター；選択性セロトニン取り込みインヒビター；セロトニン受容体アンタゴニスト；ナトリウムチャネルブロッカーおよびカルシウムチャネルブロッカー；ステロイド；興奮剤（ｓｔｉｍｕｌａｎｔ）；ならびに甲状腺ホルモンおよびインヒビター剤。
【０１９３】
ある実施形態では、増殖因子、コロニー刺激因子またはＭ−ＣＳＦのポリペプチドもしくは融合タンパク質は、経口投与；鼻投与；非経口投与；経皮投与；局所投与；眼内投与；気管支内投与；腹腔内投与；静脈内投与；皮下投与；筋肉内投与；およびこれらの投与経路の２つ以上の組み合わせからなる群より選択される経路によって投与される。
【０１９４】
非経口注射投与は一般に、皮下、筋肉内または静脈内注射および注入のために用いられる。さらに非経口投与のための１つのアプローチは、参照によって全体が本明細書に援用される、米国特許第３，７１０，７９５号によれば、一定レベルの用量を維持することを確実にする、徐放性または持続放出性システムの移植を使用する。
【０１９５】
本発明は、選択される標的組織に対する増殖因子、コロニー刺激因子またはＭ−ＣＳＦのポリペプチドもしくは融合タンパク質について任意の適切な送達方法を包含し、この方法としては、水溶液のボーラス注射または徐放性システムの移植が挙げられる。徐放性インプラントの使用により反復投与の必要性が減る。
【０１９６】
組成物にはまた、化合物について適切な送達システムまたは支持システムとして機能する、生体適合性キャリア物質に分散させられた本発明の増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチドもしくは融合タンパク質も含まれてよい。徐放キャリアの適切な例としては、坐剤またはカプセルのような成型された製品の形態の、半透性ポリマーマトリックスが挙げられる。移植可能な、またはマイクロカプセルの徐放マトリックスとしては、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，３１９号；欧州特許第５８，４８１号）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタミン酸塩のコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７〜５６（１９８５））；ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７〜２７７（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２））、またはポリ−Ｄ−（−）−３ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３，９８８号）が挙げられる。
【０１９７】
追加補充的な活性化合物も本発明の方法で用いられる組成物中に組み込まれてもよい。例えば、増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチドもしくはそのフラグメント、またはその融合タンパク質は、１つ以上のさらなる治療薬と一緒に処方してもよく、そして／または同時に投与してもよい。例えば、増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチドもしくはそのフラグメント、またはその融合タンパク質は、ＡＤを処置、寛解または予防するのに有効な治療剤と一緒に処方してもよく、そして／または同時に投与してもよく、これには限定はしないが、コリネステラーゼインヒビター、例えば、ガランタミン、リバスチグミン、タクリンおよびドネペジル；ならびにＮ−メチルＤアスパラギン酸塩（ＮＭＤＡ）アンタゴニスト、例えば、メマンチンが挙げられる。
【０１９８】
増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチドもしくはポリペプチドフラグメントと一緒に処方してもよく、そして／または同時に投与してもよい適切なさらなる薬剤は、本明細書のほかの場所に記載される。
【０１９９】
本発明の増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチドもしくはポリペプチドフラグメントでの処置については、その投薬量は、例えば、宿主の体重１ｋｇあたり１日あたり約５０〜約１００μｇ／ｋｇ、宿主の体重１ｋｇあたり１日あたり約１〜約５００μｇ／ｋｇ、または体重１ｋｇあたり１日あたり約５０〜約２００μｇ／ｋｇに及んでもよい。上記の範囲の中間の用量、（例えば、
【０２００】
【化７】
2010510219.tif 000008
）もまた、本発明の範囲内であるものとする。被験体は、このような用量を、毎日、隔日、毎週または実験的分析により決定される任意の他のスケジュールに従って投与され得る。一実施形態では、処置は、長期間、例えば少なくとも６ヶ月に渡り、多用量で投与することを包含する。別の実施形態では、処置レジメンは、１週に１回、２週毎に一回、１ヶ月に１回、または３〜６ヶ月毎に１回投与することを包含する。
【０２０１】
全身投与に加えて、本発明の方法において用いられる増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチドおよびポリペプチドフラグメントは脳のような器官または組織中に同時に直接注入してもよい。
【０２０２】
本発明の方法において用いられる増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチドおよびポリペプチドフラグメントは脳に同時に直接注入してもよい。化合物の直接脳注入のための種々のインプラントは公知であり、そして、神経学的障害に罹患しているヒト患者への治療用化合物の送達において有効である。これらとしては、ポンプを用いる脳への長期注入、定位移植、一時的間質カテーテル、永久的頭蓋内カテーテルインプラント、および、外科的移植された生体分解性のインプラントが挙げられる。例えばＧｉｌｌら、上出；Ｓｃｈａｒｆｅｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｌ．Ｐｈｖｓ．２４（４）：５８３〜９１（１９９２）；Ｇａｓｐａｒら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．４３（５）：９７７〜８２（１９９９）；６６章，ｐ．５７７〜５８０，Ｂｅｌｌｅｚｚａら、「Ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ  Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  Ｂｒａｃｈｙｔｈｅｒａｐｙ」，Ｇｉｌｄｅｎｂｅｒｇら、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ（１９９８）；およびＢｒｅｍら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２６：１１１〜２３（１９９５）を参照のこと。
【０２０３】
ある実施形態においては、本発明の処置の方法は、脳のような器官または組織の適切な領域への直接の注入による動物への増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチドもしくはポリペプチドフラグメントの同時投与を包含する。例えばＧｉｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．９：５８９〜９５（２００３）を参照のこと。代替の手法が利用可能であり、本発明によるＭ−ＣＳＦポリペプチドの投与に適用してもよい。例えば、Ｒｉｅｃｈｅｒｔ−ＭｕｎｄｉｎｇｅｒユニットおよびＺＤ（Ｚａｍｏｒａｎｏ−Ｄｕｊｏｖｎｙ）多目的局在化ユニットを用いて、カテーテルまたはインプラントの定位設置を達成してもよい。コントラスト増強コンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャンで、オムニパーク１２０ｍｌ、３５０ｍｇヨウ素／ｍｌを注入し、２ｍｍのスライス厚を用いて、３次元多平面治療計画（ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｍｕｌｔｉｐｌａｎａｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｐｌａｎｎｉｎｇ）が可能になる（ＳＴＰ、Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。この装置によって、明確な標的の確認のためのＣＴおよびＭＲＩの標的情報を併合しながら、磁気共鳴画像化試験に基づいた計画が可能になる。
【０２０４】
ＧＥのＣＴスキャナー（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）と共に使用するように改変されたＬｅｋｓｅｌｌ定位システム（Ｄｏｗｎｓ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．，Ｄｅｃａｔｕｒ，ＧＡ）ならびにＢｒｏｗｎ−Ｒｏｂｅｒｔｓ−Ｗｅｌｌｓ（ＢＲＷ）定位システム（Ｒａｄｉｏｎｉｃｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）をこの目的のために用いてもよい。すなわち、移植当日の朝、ＢＲＷ定位フレームの環状ベースリングを患者の頭蓋に装着してもよい。ベースプレートに固定されたグラファイトロッドローカライザーフレームを用いて（標的組織）領域全体にわたって３ｍｍ間隔で一連のＣＴ断面を獲得できる。グラファイトロッド画像のＣＴ座標を用いながら、ＶＡＸ１１／７８０コンピューター（Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｙｎａｒｄ，Ｍａｓｓ．）上でコンピューター治療計画プログラムを実行することによって、ＣＴスペースとＢＲＷスペースとの間をマッピングしてもよい。
【０２０５】
本発明の方法で用いられる組成物はまた、化合物に適している送達システムまたは支持システムとして機能する、生体適合性のキャリア物質の中に分散させられた本発明の増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチドもしくはポリペプチドフラグメントを含んでもよい。徐放キャリアの適切な例としては、成型された製品、例えば、坐剤またはカプセル剤の形態の半透過性ポリマーマトリックスが挙げられる。埋め込むことができるマトリックス、またはマイクロカプセル徐放マトリックスとしては、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，３１９号；欧州特許第５８，４８１号）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７−５６（１９８５））；ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７〜２７７（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８〜１０５（１９８２））またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３，９８８号）が挙げられる。
【０２０６】
（細胞療法）
本発明のいくつかの実施形態においては、可溶性の増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦポリペプチドが処置方法において投与され、この処置方法は以下の工程を包含する：（１）核酸、例えば、可溶性の増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦポリペプチドを発現するベクターを用いて移植可能な宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトする工程と；（２）哺乳動物中に、疾患、障害、または損傷の部位に、この形質転換された宿主細胞を移植する工程と。例えば、形質転換された宿主細胞を脊髄損傷の部位に移植してもよい。本発明のいくつかの実施形態においては、移植可能な宿主細胞を哺乳動物から取り出し、一時的に培養し、可溶性の増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦポリペプチドをコードする単離された核酸を用いて形質転換するかまたはトランスフェクトし、そしてそれが取り出された同じ哺乳動物に移植して戻す。細胞は、移植される部位と同じ部位から取り出すことができるが、これは必ずしも必要ではない。エキソビボ遺伝子治療として公知の場合もあるこのような実施形態によって、限られた時間の間、作用部位に局在化させられた、可溶性の増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦポリペプチドの持続的な供給が提供され得る。
【０２０７】
（遺伝子治療）
可溶性の増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦポリペプチドは、アミロイド蓄積を軽減することが治療上有効である疾患、障害、または損傷の処置のための遺伝子治療アプローチを用いて、哺乳動物、例えば、ヒト患者においてインビボで生成してもよい。これには、適切な発現制御配列に作動可能に連結された適切な可溶性の増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦポリペプチドをコードする核酸の投与が包含される。一般的には、これらの配列は、ウイルスベクターに組み込まれる。このような遺伝子治療に適切なウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、アルファウイルスベクター、エンテロウイルスベクター、ペスチウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、エプスタイン・バーウイルスベクター、パポバウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、および単純ヘルペスウイルスベクターが挙げられる。ウイルスベクターは、複製欠損ウイルスベクターであってもよい。アデノウイルスベクターであって、そのＥ１遺伝子またはＥ３遺伝子の中に欠失を有しているベクターが、通常は用いられる。アデノウイルスベクターが用いられる場合は、ベクターは通常、選択マーカー遺伝子は有さない。このようなベクターの例は、全体が本明細書に援用される、ＰＣＴ公開ＷＯ２００６／０６００８９およびＷＯ２００２／０５６９１８に見出され得る。
【０２０８】
増殖因子、コロニー刺激因子、または可溶性のＭ−ＣＳＦポリペプチドの発現構築物は、任意の生物学的に有効であるキャリア（例えば、インビボで細胞に、可溶性の増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦポリペプチドの遺伝子を効率よく送達することができる任意の処方物または組成物）において投与してもよい。アプローチとしては、組換え体レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、および単純ヘルペスウイルス−１、または組換え体である細菌もしくは真核生物のプラスミドを含むウイルスベクターへの本発明の遺伝子の挿入が包含される。ウイルスベクターは、細胞を直接トランスフェクトし；プラスミドＤＮＡは、例えば、陽イオン性リポソーム（リポフェクチン）、または、誘導された（例えば、抗体が結合体化させられた）、ポリリジン結合体、グラマシジンＳ、人工のウイルスエンベロープ、または他のそのような細胞内キャリア、ならびに、遺伝子構築物の直接の注入、あるいは、インビボで行われるＣａＰＯ４沈殿の助けによって送達されてもよい。
【０２０９】
細胞への核酸のインビボでの導入のための好ましいアプローチは、核酸、例えば、可溶性の増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦポリペプチドをコードするｃＤＮＡ、または可溶性の増殖因子、コロニー刺激因子またはＭ−ＣＳＦポリペプチドのアンチセンス核酸を含むウイルスベクターの使用による。ウイルスベクターでの細胞の感染は、標的化された細胞の大部分が核酸を受け取ることができるという利点を有している。加えて、例えば、ウイルスベクターの中に含まれるｃＤＮＡによってウイルスベクターの中にコードされる分子は、その中にウイルスベクター核酸が取り込まれた細胞の中で効率よく発現させられる。
【０２１０】
レトロウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターを、インビボでの、特にヒトへの外因性遺伝子の移入のための組換え体遺伝子送達システムとして用いてもよい。これらのベクターによって、細胞への遺伝子の効率のよい送達が提供され、そして移入された核酸は、宿主の染色体ＤＮＡに安定に組み込まれる。複製欠損レトロウイルスだけを生じる特殊化された細胞株（「パッケージング細胞」と呼ばれる）の開発によって、遺伝子治療へのレトロウイルスの用途が拡大され、そして欠損レトロウイルスが、遺伝子治療目的のための遺伝子の導入での使用について特徴付けされる。複製欠損レトロウイルスは、標準的な技術によるヘルパーウイルスの使用を通じて標的細胞を感染させるために用いられ得るビリオンの中にパッケージしてもよい。組換え体レトロウイルスの生産、およびそのようなウイルスでのインビトロまたはインビボでの細胞の感染のためのプロトコールは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（編）Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，（１９８９），Ｓｅｃｔｉｏｎｓ  ９．１０−９．１４、および他の標準的な研究室用マニュアルに見ることができる。適切なレトロウイルスの例としては、当業者に公知であるｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥ、およびｐＥＭが挙げられる。同種指向性（ｅｃｏｔｒｏｐｉｃ）レトロウイルスシステムおよび広宿主性（ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ）レトロウイルスシステムの両方を調製するための適切なパッケージングウイルス株の例としては、．ｐｓｉ．Ｃｒｉｐ，．ｐｓｉ．Ｃｒｅ，．ｐｓｉ．２および．ｐｓｉ．Ａｍ．が挙げられる。レトロウイルスは、種々の遺伝子を多くの異なる細胞型（上皮細胞を含む）に、インビトロおよび／またはインビボで導入するために用いられている（例えば、Ｅｇｌｉｔｉｓ，ら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１３９５〜１３９８；ＤａｎｏｓおよびＭｕｌｌｉｇａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：６４６０〜６４６４；Ｗｉｌｓｏｎら、（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：３０１４〜３０１８；Ａｒｍｅｎｔａｎｏら、（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６１４１〜６１４５；Ｈｕｂｅｒら、（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：８０３９〜８０４３；Ｆｅｒｒｙら、（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：８３７７〜８３８１；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら、（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１８０２〜１８０５；ｖａｎ  Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍら、（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：７６４０〜７６４４；Ｋａｙら、（１９９２）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３：６４１〜６４７；Ｄａｉら、（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１０８９２〜１０８９５；Ｈｗｕら、（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：４１０４〜４１１５；米国特許第４，８６８，１１６号；米国特許第４，９８０，２８６号；ＰＣＴ出願番号ＷＯ８９／０７１３６；ＰＣＴ出願番号���Ｏ８９／０２４６８；ＰＣＴ出願番号ＷＯ８９／０５３４５；およびＰＣＴ出願番号ＷＯ９２／０７５７３を参照のこと）。
【０２１１】
本発明に有用である別のウイルス遺伝子送達システムでは、アデノウイルスに由来するベクターが利用される。アデノウイルスのゲノムは、それが目的の遺伝子産物をコードし、それを発現するが、正常な溶解性ウイルスのライフサイクルにおいて複製するその能力に関して不活化されるように操作してもよい。例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒら、（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１〜４３４；およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄら、（１９９２）Ｃｅｌｌ  ６８：１４３〜１５５を参照のこと。アデノウイルス株Ａｄタイプ５  ｄ１３２４または他のアデノウイルス株（例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７など）に由来する適切なアデノウイルスベクターは当業者に公知である。組換え体アデノウイルスは、それらが分裂していない細胞を感染させることはできない特定の状況において有益であり得、上皮細胞を含む広範な種々の細胞のタイプを感染させるために用いてもよい（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、（１９９２）、前出）。さらに、ウイルス粒子は比較的安定であり、精製および濃縮の影響を受けやすく、そして上記のように、感染のスペクトルに影響を生じるように改変することができる。さらに、導入されたアデノウイルスＤＮＡ（およびその中に含まれる外来ＤＮＡ）は、宿主細胞のゲノムに組み込まれることなく、エピソームのまま維持され、それによって、導入されたＤＮＡ（例えば、レトロウイルスＤＮＡ）が宿主のゲノムに組み込まれるインサイチュでの挿入突然変異の結果として起こり得る可能性のある問題を回避する。さらに、外来ＤＮＡについてのアデノウイルスゲノムの保有能力は、他の遺伝子送達ベクターに比較すると大きい（最大で８キロ塩基）（Ｂｅｒｋｎｅｒら、前出；Ｈａｊ−ＡｈｍａｎｄおよびＧｒａｈａｍ（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７）。
【０２１２】
本発明の遺伝子の送達に有用であるなお別のウイルスベクター系は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。Ａｌｉ，２００４、Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｆｏｕｎｄ  Ｓｙｍｐ．２２５：１６５〜７８；およびＬｕ，２００４，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ．１３（１）：１３３〜４５に概説されている。アデノ随伴ウイルスは、自然界に存在している欠損性ウイルスであり、これには、効率のよい複製および生産的なライフサイクルのためのヘルパーウイルスとして、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスのような別のウイルスが必要である（概説については、Ｍｕｚｙｃｚｋａら、（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏ．ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７〜１２９を参照のこと）。これはまた、分裂していない細胞にそのＤＮＡを組み込むことができ、そして安定な組み込みを高い頻度で示すわずかなウイルスの１つでもある（例えば、Ｆｌｏｔｔｅら、（１９９２）Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：３４９〜３５６；Ｓａｍｕｌｓｋｉら、（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２〜３８２８；およびＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１９６３〜１９７３を参照のこと）。ＡＡＶのうちの３００塩基対程度の小さい部分を含むベクターをパッケージすることができ、かつ組み込むことができる。外因性ＤＮＡについてのスペースは、約４．５ｋｂに限られる。Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１〜３２６０に記載されているベクターのようなＡＡＶベクターを、細胞にＤＮＡを導入するために用いてもよい。種々の核酸が、ＡＡＶベクターを用いて様々な細胞のタイプに導入されている（例えば、Ｈｅｒｍｏｎａｔら、（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６〜６４７０；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２〜２０８１；Ｗｏｎｄｉｓｆｏｒｄら、（１９８８）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２：３２〜３９；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、（１９８４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：６１１〜６１９；およびＦｌｏｔｔｅら、（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：３７８１〜３７９０を参照のこと）。
【０２１３】
上記で例示された方法のようなウイルス移入方法に加えて、非ウイルス方法もまた、動物の組織の中で可溶性の増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチド、フラグメント、もしくはアナログの発現を引き起こすために使用してもよい。遺伝子の導入のためのほとんどの非ウイルス方法は、高分子の取り込みおよび細胞内輸送のための、哺乳動物細胞によって用いられる通常の機構に依拠する。好ましい実施形態においては、本発明の非ウイルス遺伝子送達システムは、標的化された細胞による本発明の増殖因子、コロニー刺激因子またはＭ−ＣＳＦ遺伝子の取り込みのためのエンドサイトーシス経路に依拠する。このタイプの例示的な遺伝子送達システムとしては、リポソームによって誘導されるシステム、ポリリジン結合体、および人工ウイルスエンベロープが挙げられる。他の実施形態としては、Ｍｅｕｌｉら、（２００１）Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１６（１）：１３１〜１３５；Ｃｏｈｅｎら、（２０００）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ７（２２）：１８９６〜９０５；またはＴａｍら、（２０００）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ７（２１）：１８６７〜７４に記載されているような、プラスミド注入システムが挙げられる。
【０２１４】
代表的な実施形態においては、可溶性の増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチド、活性のあるフラグメント、またはアナログをコードする遺伝子は、それらの表面上に正電荷を保有しているリポソーム（例えば、リポフェクチン）の中に捕捉されてもよく、そしてこれは、（必要に応じて）標的組織の細胞表面抗原に対する抗体でタグ付けされる（Ｍｉｚｕｎｏら、（１９９２）Ｎｏ  Ｓｈｉｎｋｅｉ  Ｇｅｋａ  ２０：５４７〜５５１；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／０６３０９；日本国特許出願番号１０４７３８１；および欧州特許公開番号ＥＰ−Ａ−４３０７５）。
【０２１５】
臨床条件では、治療用の増殖因子、コロニー刺激因子またはＭ−ＣＳＦの遺伝子の遺伝子送達系は、任意の多数の方法（これらの方法の各々は、当該分野でよく知られている）によって患者に導入されてもよい。例えば、遺伝子送達システムの薬学的調製物は、全身的に、例えば、静脈内注射によって導入されてもよく、そして、標的細胞の中でのタンパク質の特異的な形質導入は、遺伝子送達ビヒクル、レセプター遺伝子の発現を制御する転写調節配列に起因する細胞型もしくは組織型の発現、またはそれらの組み合わせによって提供されるトランスフェクションの特異性によって優先的に生じる。他の実施形態においては、組換え体遺伝子の最初の送達は、極めて局所的な動物への導入によってさらに限定される。例えば、遺伝子送達ビヒクルは、カテーテルによって（米国特許第５，３２８，４７０号を参照のこと）導入しても、または定位固定注射によって（例えば、Ｃｈｅｎら、（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：３０５４〜３０５７）導入してもよい。
【０２１６】
遺伝子治療構築物の薬学的調製物は、本質的に、許容可能な希釈剤の中の遺伝子送達システムから構成されてもよいし、または、遺伝子治療構築物の薬学的調製物は、遺伝子送達ビヒクルがその中に埋め込まれる徐放マトリックスを含んでもよい。あるいは、完全な遺伝子送達システムを、組換え体細胞（例えば、レトロウイルスベクター）から完全な状態で生産させることができる場合には、薬学的調製物は、遺伝子送達システムを生じる１つ以上の細胞を含んでもよい。
【０２１７】
特に、本明細書中に記載されるようなＣＮＳの状態または障害を処置するための、遺伝子治療に関するガイダンスは、例えば、米国特許出願番号２００２／０，１９３，３３５（神経組織への、遺伝子治療用ベクターまたは形質転換された細胞の送達方法を提供する）；米国特許出願番号２００２／０，１８７，９５１（哺乳動物の脳または神経系の標的細胞へレンチウイルスベクターを用いて神経変性疾患を処置するための方法が提供される）；米国特許出願番号２００２／０，１０７，２１３（遺伝子治療用ビヒクルと、神経変性疾患の処置および予防においてそれを使用するための方法が開示されている）；米国特許出願番号２００３／０，０９９，６７１（ＣＮＳに遺伝子を送達するために適している変異させられた狂犬病ウイルスが開示されている）；および米国特許第６，４３６，７０８号（脳全体で長期間発現を生じる、遺伝子送達システムが開示されている）；米国特許第６，１４０，１１１号（種々の疾患の処置でのヒト遺伝子治療に適しているレトロウイルスベクターが開示されている）；ならびに、Ｋａｓｐａｒら、（２００２）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．５：５０−６’Ｓｕｈｒら、（１９９９）Ａｒｃｈ  Ｎｅｕｒｏｌ．５６：２８７〜９２；およびＷｏｎｇら、（２００２）Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ５：６３３〜６３９に見ることができる。
【０２１８】
（ｒＤＮＡ分子を用いる組み換えタンパク質の産生）
本発明により、さらに、本明細書に記載される核酸分子を用いる、本発明の増殖因子、コロニー刺激因子もしくはＭ−ＣＳＦのポリペプチド、および／または増殖因子、コロニー刺激因子もしくはＭ−ＣＳＦの融合タンパク質を産生するための方法が提供される。一般論として、組み換え形態のタンパク質の産生には代表的に、以下の工程が包含される：第一に、本発明のタンパク質をコードする核酸分子が得られる。コード配列にイントロンが間に挟まっていない場合は、これはいずれの宿主での発現にも直接適している。次いで、この核酸分子を必要に応じて、上記のような適切な制御配列と作動可能に配置して、タンパク質のオープンリーディングフレームを含む発現ユニットを形成する。発現ユニットは、適切な宿主を形質転換するために用いられ、形質転換された宿主が組み換えタンパク質の産生を可能にする条件下で培養される。必要に応じて、組み換えタンパク質は、培地から、または細胞から単離される；タンパク質の回収および精製は、何らかの不純物が寛容であるいくつかの場合においては必要ない場合もある。
【０２１９】
上記の工程の各々は、種々の方法で行うことができる。例えば、所望されるコード配列が、ゲノム断片から得られ、適切な宿主の中で直接用いられてもよい。種々の宿主において動作可能である発現ベクターの構築は、適切なレプリコン、および制御配列を使用して、上記のように達成される。制御配列、発現ベクター、および形質転換方法は、遺伝子を発現させるために用いられる宿主細胞のタイプに依存し、上記で詳細に考察された。適切な制限部位を、もともとは利用できない場合は、切り出し可能な遺伝子がこれらのベクターの中に挿入されることを可能にするために、コード配列の末端に付加してもよい。当業者であれば、当該分野で公知の任意の宿主／発現システムを、組み換えタンパク質を産生させるように本発明の核酸分子とともに用いるために容易に適応させることができる。
【０２２０】
（増殖因子ポリペプチド、融合タンパク質、ポリヌクレオチドおよび組成物を用いる方法）
本発明の一実施形態では、哺乳動物の器官または組織、例えば、脳における骨髄由来小グリア細胞の活性を増大するための方法が提供され、この方法は、有効量の増殖因子ポリペプチド、例えば、コロニー刺激因子、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦを全身に投与する工程を包含する。
【０２２１】
本発明の一実施形態では、哺乳動物の脳における骨髄由来小グリア細胞の活性を増大するための方法が提供され、この方法は、有効量の増殖因子ポリペプチド、例えば、コロニー刺激因子、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦを全身に投与する工程を包含する。
【０２２２】
本発明の別の実施形態では、哺乳動物の器官または組織におけるアミロイド斑を軽減するための方法が提供され、この方法は、その哺乳動物の器官または組織における骨髄由来小グリア細胞の活性を増大するのに有効な量の増殖因子ポリペプチド、例えば、コロニー刺激因子、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦを全身に投与する工程を包含する。
【０２２３】
本発明の別の実施形態では、哺乳動物の脳におけるＡβ斑を軽減するための方法が提供され、この方法は、その哺乳動物の脳における骨髄由来小グリア細胞の活性を増大するのに有効な量の増殖因子ポリペプチド、例えば、コロニー刺激因子、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦを全身に投与する工程を包含する。
【０２２４】
本発明の別の実施形態では、哺乳動物の器官または組織におけるアミロイド斑の数を減少するための方法が提供され、この方法は、その哺乳動物の器官または組織における骨髄由来小グリア細胞の活性を増大するのに有効な量の増殖因子ポリペプチド、例えば、コロニー刺激因子、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦを全身に投与する工程を包含する。
【０２２５】
本発明の別の実施形態では、哺乳動物の脳におけるＡβ斑の数を減少するための方法が提供され、この方法は、その哺乳動物の脳における骨髄由来小グリア細胞の活性を増大するのに有効な量の増殖因子ポリペプチド、例えば、コロニー刺激因子、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦを全身に投与する工程を包含する。
【０２２６】
本発明の別の実施形態では、哺乳動物の器官または組織におけるアミロイド斑の大きさを減少するための方法が提供され、この方法は、その哺乳動物の器官または組織における骨髄由来小グリア細胞の活性を増大するのに有効な量の増殖因子ポリペプチド、例えば、コロニー刺激因子、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦを全身に投与する工程を包含する。
【０２２７】
本発明の別の実施形態では、哺乳動物の脳におけるＡβ斑の大きさを減少するための方法が提供され、この方法は、その哺乳動物の脳における骨髄由来小グリア細胞の活性を増大するのに有効な量の増殖因子ポリペプチド、例えば、コロニー刺激因子、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦを全身に投与する工程を包含する。
【０２２８】
本発明のさらなる実施形態では、哺乳動物の記憶機能の改善または記憶喪失の阻害のための方法が提供され、この方法は、その哺乳動物の脳における骨髄由来小グリア細胞の活性を増大するのに有効な量の増殖因子ポリペプチド、例えば、コロニー刺激因子、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦを全身に投与する工程を包含する。
【０２２９】
本発明のさらなる実施形態では、アミロイド斑に関連する障害、例えば、アミロイドーシスを処置するための方法が提供され、この方法は、その哺乳動物の器官または組織における骨髄由来小グリア細胞の活性を増大するのに有効な量の増殖因子ポリペプチド、例えば、コロニー刺激因子、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦを全身に投与する工程を包含する。
【０２３０】
本発明の別の実施形態では、ＡＤを含む、βアミロイド斑に関連する障害を処置するための方法が提供され、この方法は、その哺乳動物の脳における骨髄由来小グリア細胞の活性を増大するのに有効な量の増殖因子ポリペプチド、例えば、コロニー刺激因子、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦを全身に投与する工程を包含する。
【０２３１】
本発明の方法を用いて処置され得る疾患としては限定はしないが、ＡＤ、軽度認識障害、軽度から中等度の認識障害、血管性認知症、脳のアミロイドアンギオパチー、遺伝性脳出血、老年性認知症、ダウン症、封入体筋炎、加齢性黄斑変性症、多発性骨髄腫、肺性高血圧、うっ血性心不全、脳のアミロイドアンギオパチー（ＣＡＡ）、ＩＩ型糖尿病、関節リウマチ、家族性アミロイド・ポリニューロパシー（ＦＡＰ）、海綿状脳症、パーキンソン病、原発性全身性アミロイドーシス、二次性全身性アミロイドーシス、前頭側頭認知症、老人性全身性アミロイドーシス、遺伝性脳のアミロイドアンギオパチー、血液透析関連アミロイドーシス、家族性アミロイド多発神経障害ＩＩＩ、フィンランド遺伝性全身性アミロイドーシス、甲状腺の髄様癌、心房性アミロイドーシス、遺伝性非神経障害性全身性アミロイドーシス、注射部位限局性アミロイドーシス、遺伝性腎アミロイドーシス、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、脊髄性および延髄性の筋萎縮症、脊髄小脳失調、および脊髄小脳失調１７、封入体筋炎またはＡＤ関連の状態が挙げられる。本発明の方法を用いて処置され得るＡＤに関連する状態としては限定はしないが、甲状腺機能低下症、脳血管疾患、心臓血管疾患、記憶喪失、不安、行動機能障害、神経学的状態、または精神状態が挙げられる。本発明の方法を用いて処置され得る行動機能障害としては限定はしないが、感情鈍麻、攻撃性または失調症が挙げられる。本発明の方法を用いて処置され得る神経学的状態としては、限定はしないが、ハンチントン、筋萎縮性側索硬化症、後天性免疫不全症、パーキンソン病、失語症、失行症、失認症、ピック病、レヴィー小体認知症、筋緊張の変化、てんかん発作、感覚消失、視野欠損、調整、歩行困難、一過性脳虚血発作または脳梗塞（卒中）、一過性の警戒、注意欠陥、頻繁なよろめき（ｆｒｅｑｕｅｎｔ  ｆａｌｌ）、失神、抗精神病薬感受性（ｎｅｕｒｏｌｅｐｔｉｃ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）、正常圧水頭症、硬膜下血腫、脳腫瘍、外傷後脳損傷、または低酸素後障害が挙げられる。本発明の方法を用いて処置され得る心理学的状態としてが限定はしないが、抑うつ、妄想、錯覚、幻覚、性的障害、体重減少、精神病、睡眠障害、不眠症、脱抑制行動、洞察力欠損、自殺念慮、憂うつな気分、過敏性（ｉｒｒｉｔａｂｉｌｉｔｙ）、無快感症、引きこもり、または過度の罪悪感が挙げられる。
【０２３２】
軽度認知障害（ＭＣＩ）は、軽度ではあるが測定可能な思考能力の障害の状態によって特徴付けられるが、ただし痴呆の存在と関連する必要はない。ＭＣＩは頻繁に、ただし必須ではないが、ＡＤに進行する。これは、ほとんどの場合、軽度の記憶の問題に関連している診断であり、ただしこれは他の思考能力（例えば、言語または計画の技術）の軽度の障害によっても特徴付けられ得る。しかし、一般には、ＭＣＩのある個体は、その年齢または教育的背景から予想されるよりも有意に大きい記憶の消滅がある。状況の進行につれて、当該分野で十分理解されるとおり、医師は診断を軽度から中度の認知障害に変化し得る。
【０２３３】
本発明の方法では、増殖因子ポリペプチド、例えば、コロニー刺激因子、例えば、Ｍ−ＣＳＦが全身投与される。「全身投与される」とは、頭蓋内を除く、任意の投与経路を包含する。
【０２３４】
本発明の増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチドもしくは融合タンパク質は、単独で提供されても、または特定の病理学的過程を調節する他の薬剤と組み合わせて、もしくは連続して併用して提供されてもよい。本明細書において用いる場合、増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦおよび増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのレセプター融合タンパク質は、２つが同時に、連続してまたは独立して投与されるとき、１つ以上のさらなる治療剤と組み合わせて投与されるといわれる。
【０２３５】
ある実施形態では、増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチドもしくは融合タンパク質は、本発明の方法での使用のための、１つ以上の抗アミロイド抗体、例えば、抗βアミロイド抗体と一緒に処方されてもよいし、そして／または同時投与されてもよい。本発明の方法での使用のための抗Ａβの例は、例えば、米国特許出願公開第２００６０１６５６８２号Ａ１、同第２００６００３９９０６号Ａ１、および同第２００４００４３４１８号Ａ１に見出すことができる。
【０２３６】
ある実施形態では、増殖因子、コロニー刺激因子、またはＭ−ＣＳＦのポリペプチドもしくは融合タンパク質は、以下のような１つ以上のさらなる治療薬と一緒に処方してもよく、そして／または同時に投与してもよい：アドレナリン作動薬、抗アドレナリン作動薬、抗アンドロゲン剤、抗狭心薬、抗不安薬、抗痙攣薬、抗うつ薬、抗てんかん薬、抗脂質異常症薬、抗高リポタンパク質薬、降圧薬、抗炎症薬、抗強迫観念症薬（ａｎｔｉｏｂｅｓｓｉｏｎａｌ）、抗パーキンソン病薬、抗精神病薬、副腎皮質ステロイド；副腎皮質抑制剤；アルドステロンアンタゴニスト；アミノ酸；アナボリックステロイド；興奮剤（ａｎａｌｅｐｔｉｃ）；アンドロゲン；血糖調節剤；心保護薬；心臓血管薬；コリン作動薬または抗コリン薬；コリンエステラーゼ不活性化剤またはインヒビター、認知補助薬または賦活薬（ｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｏｒ  ｅｎｈａｎｃｅｒ）；ドーパミン作動薬；酵素インヒビター、エストロゲン、遊離酸素ラジカルスカベンジャー；ＧＡＢＡアゴニスト；グルタミン酸アンタゴニスト；ホルモン；低コレステロール血症剤；抗高脂血症薬；降圧薬；予防薬；免疫賦活薬；モノアミンオキシダーゼインヒビター、神経保護薬；ＮＭＤＡアンタゴニスト；ＡＭＰＡアンタゴニスト、競合的または非競合的ＮＭＤＡアンタゴニスト；オピオイドアンタゴニスト；カリウム・チャンネル開口薬；非ホルモン性ステロール誘導体；脳卒中後および頭部外傷後治療薬；プロスタグランジン剤；向精神薬；弛緩薬；鎮静薬；鎮静催眠薬；選択性アデノシンアンタゴニスト；セロトニンアンタゴニスト；セロトニンインヒビター；選択性セロトニン取り込みインヒビター；セロトニン受容体アンタゴニスト；ナトリウムチャネルブロッカーおよびカルシウムチャネルブロッカー；ステロイド；興奮剤（ｓｔｉｍｕｌａｎｔ）；メルファラン、続いて骨髄回復を支持するための自家幹細胞移植（ＨＤＭ／ＳＣＴ）；コルヒチン；金属キレーター；アミロイド形成の低分子インヒビター；ベンゾチアゾール；４’−ジアリニノ−１，１−’ビナフチル−５，５’−スルホナート（ｂｉｓ−ＡＮＳ）；フタロシアニンテトラスルホナート；ならびに本発明の方法での使用のための甲状腺ホルモンおよびインヒビター剤。
【０２３７】
投与される投薬量は、レシピエントの年齢、健康状態および体重、現在の治療の種類（もしあれば）、治療の頻度、ならびに所望の効果の性質に依存する。本発明の化合物は、インビボで、通常は哺乳動物、例えば、ヒト、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ラットおよびマウスで、またはインビトロで利用され得る。
【０２３８】
本明細書に記載されるような疾患および状態の処置の方法は代表的には、ヒトでの使用の前に、インビトロで、次いで、インビボで受容可能な動物モデルで、所望の治療または予防活性について試験される。適切な動物モデル（トランスジェニック動物を含む）は、当業者に周知である。器官または組織における、例えば、脳について骨髄由来小グリア細胞の活性の増大に対する増殖因子ポリペプチド、融合タンパク質および組成物の効果は、実施例で記載されるようにインビトロで試験されてもよい。最終的に、適切な表現型を発現するトランスジェニックマウスを作製すること、および増殖因子、コロニー刺激因子またはＭ−ＣＳＦのポリペプチドを上記のようなモデルでマウスまたはラットに投与することによって、インビボの試験を行ってもよい。
【０２３９】
本明細書に記載した方法および用途に対する他の適切な変更および適合は明白であり、かつ本発明の範囲からも、その任意の実施形態からも逸脱せずに行い得ることが当業者には容易に明らかである。本発明がさらに良好に理解され得るように、以下の実施例を示している。これらの実施例は説明を目的とするだけであって、決して本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【実施例】
【０２４０】
（実施例１）
（Ｍ−ＣＳＦの産生および精製）
（例示的な哺乳動物発現ベクターｐ３ＡＣＳＦ−６９の構築）
Ｍ−ＣＳＦタンパク質の発現のための哺乳動物ベクターを構築するために、配列番号１のｃＤＮＡ配列を、制限エンドヌクレアーゼ酵素ＸｈｏＩリンカー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）と適合させて、ＸｈｏＩ消化した、ホスファターゼ処理したＣＯＳ細胞発現ベクターｐＸＭ中に連結してもよい。ｐＸＭは、ＳＶ４０エンハンサー、アデノウイルス主要後期プロモーター、ＤＨＦＲコード配列、ＳＶ４０後期メッセージポリＡ付加部位およびＶａＩ遺伝子を含む。ｐＸＭはさらに、ＫｐｎＩ、ＰｓｔＩおよびＸｈｏＩの制限エンドヌクレアーゼ部位を有するリンカー配列を含む。ｐＸＭのＸｈｏＩ消化、およびリンカーの挿入、およびＭ−ＣＳＦタンパク質をコードする配列番号１のＸｈｏＩ適合ＤＮＡ配列から得られたプラスミドを、次に、従来の技術によって、Ｍ−ＣＳＦタンパク質の発現のための適切な哺乳動物宿主細胞中に形質転換してもよい。例示的な宿主細胞は、哺乳動物の細胞および細胞株、特に霊長類の細胞株、げっ歯類の細胞株などである。
【０２４１】
類似の発現ベクターはまた、上記で特定された他のＭ−ＣＳＦ配列（配列番号２および３）を含んで、またはそれらの配列の５’および３’非コード領域の欠失されたアミノ酸コード領域のみを含んで、調製されてもよい。当業者は、ＸｈｏＩを有するプラスミドから配列番号１のＤＮＡ配列を切断すること、そして周知の組み換え遺伝子操作技術ならびに他の公知のベクター、例えば、ｐＣＤ［Ｏｋａｙａｍａら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２：１６１〜１７０（１９８２）］およびｐＪＬ３、ｐＪＬ４［Ｇｏｕｇｈら、ＥＭＢＯ  Ｊ．４：６４５〜６５３（１９８５）］を使用することによって上記のベクターに匹敵する他の哺乳動物発現ベクターを構築し得る。適切な宿主細胞へのこれらのベクターの形質転換によって、Ｍ−ＣＳＦタンパク質の発現を生じ得る。
【０２４２】
同様に、当業者は、酵母、細菌または昆虫の配列でコード配列に隣接する哺乳動物の調節性配列を排除するかまたは置き換えることによって、Ｍ−ＣＳＦ配列を操作して、酵母、細菌または昆虫の宿主細胞において発現可能な非哺乳動物発現ベクターを作製し得る。例えば、配列番号１のコード配列は、ＸｈｏＩを用いて上記の哺乳動物ベクター構築物から切断されてもよく、さらに操作されてもよい（例えば、他の公知のリンカーに連結されてもよいし、またはそれから非コード配列を欠失すること、もしくは他の公知の技術によってその中でヌクレオチドを変化させることによって改変されてもよい）。次いで、この改変されたＭ−ＣＳＦコード配列を、例えば、Ｔ．Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７７：５２３０〜５２３３（１９８０）に記載のような手順を用いて公知の細菌ベクター中に挿入してもよい。次いで、この例示的な細菌ベクターを細菌の宿主細胞に形質転換して、それによってＭ−ＣＳＦタンパク質を発現してもよい。
【０２４３】
昆虫または酵母の細胞でのＭ−ＣＳＦタンパク質の発現のために、昆虫ベクター［例えば、公開欧州特許出願第１５５，４７６号に記載の手順を参照のこと］、または酵母ベクター［例えば、公開ＰＣＴ出願ＷＯ８６００６３９に記載の手順を参照のこと］の構築と同様の操作を行ってもよい。
【０２４４】
（実施例２）
（Ｍ−ＣＳＦタンパク質の発現）
Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８２）に記載のように、上記の哺乳動物発現ベクターを含むＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１から調製したプラスミドＤＮＡは、臭化エチジウムを含有する塩化セシウム勾配中での平衡遠心分離を含む従来の方法によって精製してもよい。ＣＯＳ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５０）を、１０６個のＣＯＳ細胞あたり約５μｇのプラスミドＤＮＡという濃度で精製されたＤＮＡを用いてトランスフェクトして、Ｇ．Ｇ．Ｗｏｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８０：８１０〜８１５（１９８５）およびＲ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２：１３４０（１９８２）に記載の手順に従ってクロロキンで処理した。トランスフェクションの７２時間後、培地を収集してもよく、この培地は標準的な骨髄アッセイでＭ−ＣＳＦ活性を示すタンパク質を含む。
【０２４５】
哺乳動物細胞から高レベルのＭ−ＣＳＦを産生するための１方法は、異種Ｍ−ＣＳＦ遺伝子の複数のコピーを含む細胞の構築を包含する。異種遺伝子は、増幅可能なマーカー、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子に連結されてもよく、この遺伝子では遺伝子コピーの増大がある細胞は、増殖によってＫａｕｆｍａｎおよびＳｈａｒｐ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５９：６０１〜６２９（１９８２）の手順に従ってメトトレキサート（ＭＴＸ）の濃度の増大において選択され得る。このアプローチは、多数の異なる細胞タイプで使用され得る。
【０２４６】
上記の哺乳動物発現ベクターは、他のプラスミド配列と作動可能に連結されてその発現をし得るＭ−ＣＳＦ遺伝子を含む。Ｍ−ＣＳＦ哺乳動物発現ベクターおよびＤＨＦＲ発現プラスミドｐＡｄＡ２６ＳＶ（Ａ）３（ＫａｕｆｍａｎおよびＳｈａｒｐ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２：１３０４（１９８２））は、リン酸セシウム共沈殿およびトランスフェクションによって、ＤＨＦＲ欠損のＣＨＯ細胞、ＤＵＫＸ−ＢＩＩ中に同時導入され得る。ＤＨＦＲ発現形質転換体は、透析されたウシ胎仔血清を含むα培地中での増殖について選択され、引き続き、Ｋａｕｆｍａｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５：１７５０（１９８３）に記載の漸増濃度のＭＴＸ（０．０２、０．２、１．０および５μＭのＭＴＸという連続段階）中での増殖によって増殖について選択される。形質転換体をクローニングして、生物学的に活性なＭ−ＣＳＦタンパク質発現をマウス骨髄アッセイによってモニターする。Ｍ−ＣＳＦ発現は、ＭＴＸ耐性のレベルの増大とともに増大するはずである。
【０２４７】
（実施例３）
Ｍ−ＣＳＦは、脳中での骨髄由来小グリア細胞活性に、およびβアミロイド斑に影響する。
【０２４８】
全身投与されたＭ−ＣＳＦがマウスの脳において骨髄由来小グリア細胞の活性を増大するか否かを試験するために、脳溶解物中の骨髄由来小グリア細胞の存在をアッセイする。さらに、マウスの脳における骨髄由来小グリア細胞の活性の増大が脳でβアミロイド斑を減少させるか否かを確認するために、βアミロイド斑の存在および大きさをアッセイする。
【０２４９】
マウスをいくつかの処置群に分ける。最初の群は、正常なコントロール群として使う。各々の追加の群を、単離されたＭ−ＣＳＦまたは活性フラグメント改変体、またはその誘導体を用いて全身投与によって処置する。投与された量は、各々の処置群で変化する。例えば、群はそれぞれ１日あたり１、１０、２５、５０、７５、１００、２００、３００、４００、または５００μｇ／ｋｇを投与され得る。投与は、１回投与であってもよいし、または特定の期間、例えば、３、５、７、１０、１４または２０日にわたって毎日であってもよい。マウスを投与後３〜１４日の間に屠殺する。
【０２５０】
マウスは、ペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射（体重１ｇあたり０．５ｍｇ）による麻酔後に屠殺する。それらの脳を取り出して、４％パラホルムアルデヒド中で固定し、続いて０．１Ｍのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中でリンスする。次いで標本をパラフィンに包埋し１０μｍの前額連続切片を切断する。切片を、ＰＢＳ中で１：１０００希釈したＦ４／８００抗血清（Ｓｅｃｒｏｔｅｃ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）で１時間インキュベートする。マウスマクロファージから精製したＦ４／８０糖タンパク質に対して惹起されたウサギポリクローナル抗血清は、単球および成熟マクロファージに特異的な抗原である。ＰＢＳ−Ｔｒｉｔｏｎ中での洗浄後、ＰＢＳ中で１：２００希釈したビオチン化ヤギ抗ウサギ血清（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を４５分間適用する。その切片を洗浄し、アルコールの０．３％過酸化水素中で２０分間インキュベートして、内因性のペルオキシダーゼ活性をクエンチし、再度洗浄し、次いでアビジン−ビオチン複合体（Ｖｅｃｔｏｓｔａｔｉｎ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣキット、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とともに４５分間インキュベートする。例えば、コントロールの切片は、正常なウサギ血清であり、Ｆ４／８０抗血清を同じ希釈で置き換え、試験切片と平衡して慣用的に処理してもよい。ペルオキシダーゼは０．０５％のジアミノベンジジン塩酸塩（ＤＡＢ；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、０．０８％のイミダゾール、および０．０５％の過酸化水素を用いて可視化する。形態計測的研究のためのコントラストを増大するために、ＤＡＢ反応産物を、０．０１％の四酸化オスミウムを用いて強化してもよい。細胞核をメチルグリーンを用いて対比染色する。隣接する切片を、クレシルバイオレットアセテートを用いて染色して、試験される構造の境界を特定する。
【０２５１】
切片を、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣキットを用いて、４℃で１２時間Ａβに対する一次抗体を用いて免疫組織化学的に染色する。さらに、Ａβ沈着を確認するために、連続切片をコンゴレッド（Ｃｏｎｇｏ  ｒｅｄ）染色によって分析してもよい。
【０２５２】
原線維斑（ｆｉｂｒｉｌｌａｒ  ｐｌａｑｕｅｓ）、および小グリア細胞の数を、ＰａｘｉｎｏｓおよびＷａｔｓｏｎのアトラス（ＰａｘｉｎｏｓおよびＷａｔｓｏｎ編、Ｔｈｅ  Ｒａｔ  Ｂｒａｉｎ  ｉｎ  Ｓｔｅｒｏｔａｘｉｃ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ，第４版、ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ（１９９８））を用いてＢｒｅｇｍａ−３．１４ｍｍの周囲から採取した３つの切片由来の大脳皮質、海馬、扁桃体および視床下部において計算する。
【０２５３】
（実施例４）
骨髄由来小グリア細胞とβアミロイド斑との間の相互作用。
【０２５４】
以下の実験によって、骨髄由来小グリア細胞とβアミロイド斑との間の相互作用を決定するための手段が得られる。
【０２５５】
（Ｃｙ３標識したアミロイドβの調製）
βアミロイド１−４２（Ａｎａｓｐｅｃ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０〜７．３）中で１ｍｇ／ｍｌに溶解し、製造業者のガイドラインに従って、Ｃｙ３単機能色素（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）と結合体化する。要するに、５μｌのカップリング緩衝液を１００μｌのアミロイドペプチドの溶液に徹底的に混合し、次いで、得られた溶液をＣｙ３反応性色素のバイアルに混合して、さらに１０分ごとに混合しながら室温で３０分間インキュベートする。非結合体化色素を、３．５Ｋ  ＭＷＣＯ  Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ透析カセット（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）中で一晩、透析によって標識ペプチドから分離する。透析されたＣｙ３標識アミロイドペプチドの蛍光強度は、ＳＬＭ  ＡＭＩＮＣＯ  Ｂｏｗｍａｎ  ＡＢ２分光蛍光光度計（Ｅｘｃ：５５０±４ｎｍ；Ｅｍ：５６４±４ｎｍ；感度：８３５ボルト、高電圧可能）で測定し、透析していないもの（Ｃｙ３色素１００％）と比較する。Ｃｙ３標識アミロイドペプチドの溶液は、細胞培養培地中の非標識アミロイドタンパク質と混合した場合、後に蛍光トレーサーとして用いられる。
【０２５６】
（細胞培養および免疫組織化学）
ＢＶ２小グリア細胞は慣用的に、１０％のウシ胎仔血清（Ｗｉｓｅｎｔ，Ｓｔ−Ｂｒｕｎｏ，ＱＣ）、１ｍｌあたり１００単位のペニシリン、１ｍｌあたり１００μｇのストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）中で、ｐＨ７．４で、３７℃で、Ｈ２Ｏ飽和、５％ＣＯ２雰囲気中で増殖する。細胞は、ｈｅｉｇｈｔ−ｃｈａｍｂｅｒガラススライド中で１ウェルあたり１００００細胞で播種する（Ｌａｂ−Ｔｅｋ，Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）。２日後、細胞を２５μｇ／ｍｌのβ−アミロイド１−４２（Ａｎａｓｐｅｃ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）および２．５μｇ／ｍｌのＣｙ３標識β−アミロイド１−４２を用いて１時間インキュベートする。その後、細胞をＨＢＳＳを用いて数回リンスし、次いで１５分の間３７℃で４％のホルムアルデヒド（ｐＨ７．４）を用いて固定する。細胞をＨＢＳＳを用いて３回リンスする。チャンバをスライドから取り出して、緩衝化グリセロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中に２．５％の１，４−ジアザビシクロ（２，２，２）−オクタン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するポリビニルアルコール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）マウント培地を用いてカバースリップで細胞を覆う。
【０２５７】
（食作用実験のための共焦点レーザー走査顕微鏡）
共焦点レーザー走査顕微鏡観察は、Ｆｌｕｏｖｉｅｗ  ＳＶ５００画像ソフトウェア４．３（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｉｎｃ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を装備したＢＸ−６１顕微鏡で、１００×Ｐｌａｎ−Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ油浸対物レンズ（ＮＡ１．３５）および２〜３．５×ズーム比を目的の領域中で用いて行う。Ｃｙ３標識したアミロイドペプチドは、最大パワーの７０％に設定したアルゴン−Ｈｅレーザー（ＭｅｌｌｅｓＧｒｉｏｔ  Ｌａｓｅｒ  Ｇｒｏｕｐ［Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ］）を用いて５４３ｎｍで励起させる。Ｃｙ３色素からの蛍光発光は、ＦＶ５００ソフトウェア内でプレセットした発光フィルターで光電子増倍管によって記録する（赤い擬似カラー；ＢＡ：５６０〜６００ｎｍ）。送信チャネルは、同時に捕獲して細胞の形状を描写する。０．１μｍの共焦点ｚ−シリーズを、各々の観察領域について獲得して、３フレームのＫａｌｍａｎ低速スキャンによってフィルターする。獲得されたｚ−シリーズ画像はＩｍａｒｉｓ  Ｐｒｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ４．２．０（Ｂｉｔｐｌａｎｅ  ＡＧ，Ｚｕｒｉｃｈ，ＣＨ）中にエクスポートされる。
【０２５８】
（三次元の再構築、モデリングおよびアニメーション）
異なる実験のｚシリーズを、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＦｌｕｏｖｉｅｗフォーマットからＩｍａｒｉｓ  Ｐｒｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅにインポートして、４ＧＢのＲＡＭおよびＰＮＹ  Ｑｕａｄｒｏ  ＦＸ３０００Ｇグラフィックアクセレーターを装備したＤｅｌｌ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ６５０デュアルＩｎｔｅｌ  Ｘｅｏｎワークステーションで行う。画像の閾値およびチャネルの擬似カラーを調節し、３Ｄの再構築を以下のようにＳｕｒｐａｓｓ  Ｓｃｅｎｅ中で行う：最大強度投射（ｍａｘｉｍｕｍ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）（ＭＩＰ）、またはスタックされた画像の容積の混合投射のいずれかの直交図が最初にチャネルごとに捕獲され、次いで全てのチャネルがＳｕｒｐａｓｓモジュール中で一緒にされる。写真はＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳでトリミングされ、その後にＡｄｏｂｅ  Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｏｒ  ＣＳ中でアセンブルされる。対象物のモデリングは、透視図で、チャネルごとに行い；このとき、進行するＧａｕｓｓｉａｎフィルター／閾値レベル設定によって生成した新しいイソサーフェイス（ｉｓｏｓｕｒｆａｃｅ）と元のＭＩＰ容積からの対象物とを３Ｄ回旋で注意深く重複させる。目標物は、境界で自動的に閉じられる。光源をセットして、異なる対象物を包むテクスチャーに対する３Ｄ三次元化の効果を最適化する。アニメーションは２工程で作製する。最初に３Ｄ中のアミロイド斑の動きを、そのアニメーションのシナリオ中の重要なフレームとして追加する。第二工程では、いくつかの効果、例えば、モデルの容積／混合バックグラウンドに関するＭＩＰバックグラウンド、ズームイン／アウト、特定のチャネルの不透明性／透明性、黄色セクションのボックス、クリッピング平面、およびオルトスライサー（ｏｒｔｈｏ  ｓｌｉｃｅｒ）を特定の時点で追加して、アミロイド斑の内側および周囲を探し、アミロイド斑と周囲の小グリア細胞との間の密接な関係を証明する。高解像のムービーを．ａｖｉファイルのフォーマットでエクスポートし、次いでＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）  Ｍｏｖｉｅ  Ｍａｋｅｒで十分圧縮する。
【０２５９】
（実施例５）
Ｍ−ＣＳＦ処理したＡＰＰｓｗｅ／ＰＳＥＮ−１ΔＥ９マウスにおけるＡβ斑負荷の減少
ＡＰＰｓｗｅ／ＰＳ−１ΔＥ９トランスジェニックマウスの処置は、脳のＡβ沈着によって、および空間記憶機能の低下によって判定した場合（下を参照のこと）、このマウスが症候性になったとき７か月齢で開始する。Ｍ−ＣＳＦの全身処置の３ヶ月後、脳を免疫組織化学およびＥＬＩＳＡによって試験する。傍矢状断面のＡβ斑は、パラホルムアルデヒドで固定して、０．１Ｍのギ酸処理後に抗Ａβ−（１−１７）６Ｅ１０抗体で標識する。斑の領域を、総大脳皮質領域の割合としてＮＩＨ画像を用いて各々の動物からの２つの切片について定量する。データは±ＳＥＭである。
【０２６０】
（実施例６）
ＡＰＰｓｗｅ／ＰＳＥＮ−１ΔＥ９トランスジェニックマウスにおける放射状アーム水迷路能力（ｒａｄｉａｌ  ａｒｍ  ｗａｔｅｒ  ｍａｚｅ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）
Ｍ−ＣＳＦの全身投与がＡβ斑を減少させる能力は増強されるが、認知能力は、臨床的なＡＤでは関連のある症状である。ＡＰＰｓｗｅ／ＰＳ−１ΔＥ９（Ｐａｒｋら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２６：１３８６〜１３９５（２００６））は、Ｊａｃｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から入手した（Ｓｔｏｃｋ＃０４４６２）。ＡＰＰｓｗｅ／ＰＳ−１ΔＥ９導入遺伝子関連の障害を空間記憶において評価するために、改変した放射状アーム水迷路パラダイム（ＲＡＷＭ）を使用する。Ｍｏｒｇａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０８：９８２〜９８５（２０００）。改変、放射状アーム水迷路試験プロトコールは、Ｄ．Ｍｏｒｇａｎの私信に基づく（Ｍｏｒｇａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０８：９８２〜９８５（２０００））。この迷路は、直径１ｍの円形のプールと中央の開放領域から４０ｃｍ出た幅１９ｃｍの６つの泳路からなり、１つのアームの末端には水浸エスケープ・プラットフォームが配置されている。空間的手がかりは壁の上でかつ各々のアームの末端にある。行動主義者は、処置に対して盲検である。視覚、動きおよび泳ぎについてのコントロールとして、マウスは最大１分までオープン・ウォーターの視覚的プラットフォームパラダイムで試験され、潜時が記録される。次に、マウスをＥｘｃｅｌの関数に従ってランダムなアームに入れる（＝ＭＯＤ（＄ＣＥＬＬ＋ＲＡＮＤＢＥＴＷＥＥＮ（１，５），６）、ここで＄ＣＥＬＬは、隠れプラットフォームの位置である）。各々のマウスは、エスケープ・プラットフォームを見つけるために最大１分間泳がされる。正しくないアームに入る（四肢全てがその泳路の中）か、または２０秒後にアームの選択に失敗した際に、そのマウスを開始アームに引き戻して、１回間違えたとカウントする。全てのマウスは、各々のトライアル後、次のトライアルの開始前にプラットフォーム上で３０秒間過ごした。その後、マウスをさらに４回試験して、学習ブロックを構成する。マウスを学習ブロックの間３０分間休息させる。全部でマウスを初日に３学習ブロックにわたって試験し、翌日さらに３学習ブロックを繰り返す。
【０２６１】
処置マウスと非処置マウスとの間の泳ぎ間違いの回数の相違によって、記憶機能の障害が示される。
【０２６２】
（実施例７）
（マウス中のマクロファージおよび単球産生のマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）調節）
マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）は、単球／マクロファージ前駆体の増殖、およびこれらの前駆体細胞の成熟マクロファージへの分化を刺激する造血系の増殖因子である。この化合物の効果は、神経変性のモデルで試験する。このモデルに関しては、株Ｃ５７／Ｂ１６で１２〜２４週齢の１２８匹の雄性マウスを用いる。血液学的エンドポイントに対する組み換えヒトＭ−ＣＳＦの用量および投薬パラダイムを最初に評価する。これらの研究のための薬力学的エンドポイントとして全血球カウント、細胞化学的相違およびフローサイトメトリーの使用の評価およびバリデーションを次に行う。毎日の皮下、静脈内または腹腔内の注射に比較して、連続投薬のための皮下または腹腔内ポンプの使用の評価および比較も行う。
【０２６３】
一般には、動物を５日間毎日、Ｍ−ＣＳＦの中間用量で処理する。末梢の単球増加症は薬理学的マーカーとして用いられる。ピークの単球増加症は代表的には５〜７日に生じる。次いで動物を処置の最終日に安楽死させる。血液を血液学の装置およびＦＡＣＳによって分析し、脾臓を取り出して秤量し、次いで可能性のある組織学のために急速凍結する。
【０２６４】
（投薬の管理およびレジメン）
皮下もしくは腹腔内のポンプまたは毎日の静脈内、腹腔内もしくは皮下のボーラス注射を用いて（実験１のデータによって決定）、用量応答曲線を作成して、さらなる研究のための用量を決定する。３つのＭ−ＣＳＦ濃度を研究し、１つはコントロール群である。処置は、４週間にわたって投与する。血液を群にまたがってねじれ法（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ）でサンプリングして、血液の容積の変化に直接起因する血行動態の変化をさせることなく、１週２回で血球カウントの変化を捉える（血液は、２週ごとに個々の動物から採取する）。
【０２６５】
これらの実験のための投薬レジメンとしては以下が挙げられる：
【０２６６】
【化８】
2010510219.tif 000009
動物は、ビヒクルもしくは薬物の皮下注射を毎日受けるか、または薬物の同じ毎日濃度を送達する皮下ポンプを与えられる。皮下浸透圧ポンプの埋め込みは外科的手順であって、下に概説される。ＡＬＺＥＴポンプは、サルト・スリーブ（ｓａｌｔ  ｓｌｅｅｖｅ）と呼ばれるポンプ内の区画と、ポンプが移植されている組織環境との間の浸透圧差によって作動する。サルト・スリーブの高い浸透圧によって、水は半透性の膜をとおってポンプに流入し、これがポンプの外面を形成する。水がサルト・スリーブに入るにつれて、水は可塑性のリザーバを圧縮し、制御された所定の速度でポンプから試験溶液を置き換える。圧縮リザーバは詰め替えできないので、ポンプは単回だけの使用にデザインされる。４週の研究の場合、ポンプは、少なくとも１回取り替えられる（２０ｇのマウスは、２週間にわたってこの速度で流れる２００μｌポンプを保持し得る）。
【０２６７】
動物は、つま先ピンチ（ｔｏｅ  ｐｉｎｃｈ）にもう応答しなくなるまでイソフルランで麻酔する。一旦動物を麻酔すれば、移植部位を覆う皮膚を剃毛して、ベタジンスクラブおよび７０％のイソプロパノールを用いて（交互に３×）洗浄する。肩甲骨中央の約３ｍｍ長さの切開を行い、止血鉗子をこの切開に挿入し、この止血鉗子の顎を開け閉めすることによって、皮下組織を広げて、ポンプ用のポケットを作成する。充填ポンプをこのポケットに挿入して、最初ポータル送達する。次いで創傷クリップまたは縫合糸でその創傷を閉じる。１４日目に、動物を上述のように準備して、切開を作成し、ポンプを取り出して、別のポンプを上述のように配置する。
【０２６８】
ポンプをマウスに挿入して、長期の皮下注射を可能にする。マウスのサイズでポンプの使用は２００μｌの容積を含むものに制限し、１４日後に取り換えられる。
【０２６９】
より高いポンプ速度を有するさらなるモデルも用いる。２００μｌおよび１００μｌのポンプは、２０ｇのマウスでの皮下埋め込みのために適切である。濃度を得るために０．２５μｌ／時間から１μｌ／時間に達する範囲におよぶ速度のポンプを用いる。浸透圧ポンプの毎週または２週ごとの交換は、最終の用量範囲および動物の大きさに基づいて最初の実験後に決定される。ポンプのサイズおよび速度は、適切な投薬レジメンを可能にするが一方で動物が受ける手術の量を最小にするように選択する（すなわち、５日の研究にはより小さいポンプを用い、３０日の研究にはより大きいポンプを選択する）。
【０２７０】
さらに、例えば、もし５００μｇ／ｋｇの用量がもとの実験の後に必要であるとみなされれば、より大きい動物および増大したポンプ速度を用いる（ポンプおよび皮下毎日注射は等しいということが決定され、単球産生における変化は、ＣＢＣおよびＦａｃｓを用いて決定され得る）。
【０２７１】
実験１
１６匹のマウスに５日間、毎日Ｍ−ＣＳＦの中間範囲の皮下用量を与え（ピークの単球増加症は代表的には、５〜７日で生じた）（８匹はポンプで８匹は毎日注射）、一方、１６匹のマウスにはコントロールとしてビヒクルを与える（８匹はポンプで、８匹は毎日注射で）。統計学的有意差のため、ＣＢＣマシン対ＦＡＣＳをバリデートするために１群あたり８匹の動物が必要である。
【０２７２】
【化９】
2010510219.tif 000010
実験２
４群の動物に、３用量のＭ−ＣＳＦのうちの１つまたはビヒクルのいずれかを４週間与える。各々の群は１２匹の動物を含んでおり、交互の採血スケジュールが可能で、かつサイクル間の完全な回復が可能で、さらにＭ−ＣＳＦによって誘導されるあらゆる種類の変化が捉えられる。
【０２７３】
【化１０】
2010510219.tif 000011
当業者によって理解されるとおり、多数の変化および改変によって、本発明の趣旨から逸脱することなく本発明の好ましい実施形態を行ってもよい。全てのこのようなバリエーションが本発明の範囲内におさまるものとする。
【０２７４】
（実施例８）
マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）ＡＰＰマウスのモリス（Ｍｏｒｒｉｓ）水迷路解析
４群の６ヶ月齢のマウス（１０ＡＰＰ＋および２３ＡＰＰ−）に、Ｍ−ＣＳＦまたはビヒクル（ＰＢＳ）のいずれかを１０週間にわたって週３回腹腔内（Ｉ．Ｐ．）注射した。処置の終りの日、マウスをモリス水迷路（Ｍｏｒｒｉｓ  Ｗａｔｅｒ  Ｍａｚｅ）（ＭＷＭ）で試験した（Ｍｏｒｒｉｓ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １１（１）：４７〜６０（９１８４））。
【０２７５】
モリス水迷路のタスクは、１００ｃｍの直径の黒い円形のプールで行った。水道水を、マウスが水から逃げるためにさらに動くのに十分に冷たい、２２±１℃の温度で満たした。このプールは実質的に四分円に分割した。透明なプラットフォーム（６ｃｍの直径）を水の表面の約１ｃｍ下におき、それによって逃避行動をガイドする局所的な手がかりを与えなかった。全試験セッションの間、事前試験を除いて、そのプラットフォームは、プールの南西の四分円に置いた。
【０２７６】
ＭＷＭ試験は以下の３段階から構成された。
【０２７７】
最初は、この試験が視力を前提としているので、本発明者らは、排他的に、黒い目の動物を研究した（アルビノと比較して視覚の問題はまれにしかない）。さらに、動物を事前試験して、視力が正常か否かの判定を可能にする。この試験の間、動物は、なじみのある対象物または数種類のマーカー（例えば、黒いポールおよび白いポール）でマークされた視覚的プラットフォームに泳ぐように２つの変化（２つのトライアル）を有した。折り返しごとに、マウスは４連続日に３つの水泳トライアルを行った。単一のトライアルは、最大１分間続く。
【０２７８】
第二に、隠れプラットフォームのトレーニングにおいて、３次元の視覚的手がかりを施設の壁に追加し、黒いポールおよび白いポールを除いた。マウスをタンクに入れたところ、タンクの周りを泳いで、隠れプレットフォームを見つけた（最大９０秒）。動物が水からでる「道、道筋（ｗａｙ）」を見つけない場合、研究者は、そのプラットフォーム上にマウスを導くか、または置く。各々のトライアル後、マウスをプラットフォーム上で１０〜１５秒休息させる。この時間の間、マウスは、周囲を見当識する能力を有する。研究は淡色の光条件下で行い、トラッキングシステム上の負の影響を妨げる（Ｋａｍｉｎｓｋｉ；ＰＣＳ，Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）。プールの周囲の壁の上に、黒いポスター、太い幾何学的記号（例えば、丸および四角）を固定する。挑戦的な光の状況にもかかわらず、マウスは、これらの記号をその見当識のための目印として用いた。これが獲得段階であった。各々のマウスは６日間で４回泳いだ。
【０２７９】
第三に、隠れプラットフォームトレーニングの後、マウスをプラットフォームのないタンクに入れ、４０秒間自由に泳がせる。目的の四分円で過ごす時間の割合を空間参照記憶の測定値として計算した。視覚、動きおよび泳ぎについてのコントロールとして、マウスは最大１分までオープン・ウォーターの視覚的プラットフォームパラダイムで試験され、潜時が記録される。逃避潜時（時間［秒］−マウスは、水から逃れるために隠れプラットフォームを見つける必要がある）、経路（目標に達するための長さ［メートル］）および目標の四分円での滞在の定量のために、コンピュータ化トラッキングシステムを用いる。コンピューターをプールの中央上部に配置されたカメラに接続した。このカメラがマウスの尾の上の小さいヘアピンで固定された発光ダイオード（ＬＥＤ）のシグナルを検出した。
【０２８０】
２匹のマウスは、高レベルの走触性および浮遊性に起因して分析から除外した。これらのマウスは、最終の統計学的分析には含めなかった。
【０２８１】
（結果）
ＭＷＭの可視的プラットフォームステージにおいていかなる群の間の潜時にも相違はなく、このことは、全ての群のマウスが匹敵する動きおよびプラットフォーム発見能力を有したということを示している（群の間で視覚、動き、および泳ぎの相違はない）（図１）。
【０２８２】
観察されたデータによってまた、隠れプラットフォームトライアルの初日または２日目にいかなる群の間にも潜時の有意差はないことが示唆され、このことは、全ての群が最初の２日の間に等しく挑戦的なタスクを見出したということを示している（図１Ａ）。全体として、４つの異なる群のマウス（ＡＰＰ＋、Ｍ−ＣＳＦ、ＡＰＰ−、ＭＳＣＦ、ＡＰＰ＋、ＰＢＳ、ＡＰＰ−、ＰＢＳ）が、モリス水迷路の視覚的プラットフォームで提示した場合、等しく上手に可能で、このことは、全ての群のマウスが同様のレベルの動き、視覚的手がかりに対する応答、および運動能力（泳ぎの熟達に反映される）を有したということを示している。隠れプラットーム試験の最初の２日には、異なる群由来の試験マウスはまた匹敵するレベルで行い、このことによって、全ての群が最初に試験を等しく挑戦的と見いだしたということが実証される。
【０２８３】
隠れプラットフォームトライアルの３日目に、ＡＰＰ＋、ＰＢＳマウスは、ＡＰＰ＋、Ｍ−ＣＳＦマウス（スチューデントのｔ検定、ｐ＝０．０２）；ＡＰＰ−、Ｍ−ＣＳＦマウス（スチューデントのｔ検定、ｐ＝０．０２）；およびＡＰＰ−、ＰＢＳ、ＡＡＰ＋マウス（スチューデントのｔ検定、ｐ＝０．０２）よりもできなかった（図１）。
【０２８４】
隠れプラットフォームトライアルの４日目に、ＡＰＰ＋、ＰＢＳマウスはＡＰＰ−、Ｍ−ＣＳＦマウス（ｐ＝０．０１）、およびＡＰＰ−、ＰＢＳマウス（ｐ＝０．０３）よりも有意にできなかった（図１）。
【０２８５】
隠れプラットフォームトライアルの５日目に、ＡＰＰ＋、ＰＢＳマウスはＡＰＰ−、Ｍ−ＣＳＦマウス（ｐ＝０．０２）よりも有意にできなかった（図１）。
【０２８６】
隠れプラットフォームトライアルの６日目に、ＡＰＰ＋、ＰＢＳマウスはＡＰＰ−、Ｍ−ＣＳＦマウス（ｐ＝０．０２）よりも有意にできなかった（図１）。
【０２８７】
全体として、反復測定ＡＮＯＶＡによって比較した６日にわたる隠れプラットフォーム試験での４群のマウスの潜時の相違は、統計学的に極めて有意であった（ｐ＝０．００９）（図１）。反復測定のＡＮＯＶＡによる、ＡＰＰ＋、ＰＢＳマウスおよびＡＰＰ＋、Ｍ−ＣＳＦマウスの重要な比較はまた統計学的に有意であった（ｐ＝０．０２）（図１）。
【０２８８】
従って、ＭＳＣＦ処置によって、ＡＰＰ＋マウスの損なわれた能力が回復され、野生型のレベルまで空間記憶を回復されたと結論された。
【図１】
2010510219.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】平成21年7月16日(2009.7.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2010510219000001.app
【国際調査報告】
2010510219.tif 000013
2010510219.tif 000014