(57)【要約】  本発明は、他の細胞から多能性細胞を単離せずに、着床前胚から前記多能性細胞を単離する方法であって、フィーダー細胞層に包埋され、実質的に血清のない培地で培養される、１つ又は複数の多能性細胞を含む着床前胚全体を増殖させること、及び、前記１つ又は複数の多能性細胞から多能性細胞を単離することを含む方法を提供する。本発明は、前記方法により作製される多能性細胞及びその使用も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ又は複数の多能性細胞を含む着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、
（ｉ）（ａ）前記１つ又は複数の多能性細胞の未分化増殖を可能にし、（ｂ）前記胚由来の非多能性細胞の増殖を許容しない、条件の下で、前記胚由来の前記１つ又は複数の多能性細胞を増殖させること、
（ｉｉ）前記１つ又は複数の多能性細胞から多能性細胞を単離すること
を含む方法。
【請求項２】
前記条件が実質的に血清のない培地中での増殖を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記条件が血清代替物及び／又はアルブミンを含む培地中での増殖を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記培地が５〜２５％血清代替物を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記胚由来の非多能性細胞が、栄養外胚葉細胞、分化細胞、分化するよう方向付けられた細胞及び胚外内胚葉細胞を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記１つ又は複数の多能性細胞の増殖が、前記１つ又は複数の多能性細胞を含有する胚全体の増殖を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記方法が、他の細胞からの前記多能性細胞の単離を含まない、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記方法が、前記１つ又は複数の多能性細胞を含む、前記胚由来の細胞の初代培養を樹立することを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記初代培養が、フィーダー細胞の存在下で前記胚の全部又は一部を増殖させることによって樹立される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記フィーダー細胞が、前記フィーダー細胞の増殖を阻害するように処理されたものである請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記フィーダー細胞が、前記フィーダー細胞の増殖を阻害するように照射されたものである請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記初代培養が、前記フィーダー細胞の存在下で胚全体を増殖させることにより樹立される、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記初代培養が、前記胚の全部又は一部を前記フィーダー細胞に押圧することにより樹立される、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記初代培養が、前記胚の全部又は一部を適切な細胞増殖基質上で増殖させることにより樹立される、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
前記胚の透明帯が、前記１つ又は複数の多能性細胞の増殖前に除去される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記１つ又は複数の多能性細胞を、前記１つ又は複数の多能性細胞が細胞のコロニーを形成するまで増殖させる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記コロニーが実質的に栄養外胚葉細胞を含まない、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記コロニーが実質的に分化細胞及び分化するよう方向付けられた細胞を含まない、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記着床前胚が胚盤胞である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記胚盤胞が孵化又は拡張胚盤胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記着床前胚が、卵母細胞の体外受精により生じる、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法に従って作製される多能性細胞。
【請求項２３】
請求項２２に記載の多能性細胞に由来する多分化能性又は分化細胞。
【請求項２４】
請求項２２に記載の多能性細胞の均質な集団。
【請求項２５】
請求項２２に記載の多能性細胞に由来する１つ又は複数の細胞を含む非ヒト動物。
【請求項２６】
請求項２２に記載の１つ又は複数の多能性細胞を含む組成物。
【請求項２７】
１つ又は複数の多能性細胞を含む着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、
（ｉ）（ａ）前記１つ又は複数の多能性細胞の未分化増殖を可能にし、（ｂ）前記胚由来の非多能性細胞の増殖を許容しない条件の下で、着床前胚全体を増殖させること、
（ｉｉ）前記１つ又は複数の多能性細胞から多能性細胞を単離すること
を含む方法。
【請求項２８】
他の細胞から多能性細胞を単離せずに、着床前胚から前記多能性細胞を単離する方法であって、
（ｉ）（ａ）前記１つ又は複数の多能性細胞の未分化増殖を可能にし、（ｂ）前記胚由来の非多能性細胞の増殖を許容しない条件の下で、１つ又は複数の多能性細胞を含む着床前胚全体を増殖させること、
（ｉｉ）前記１つ又は複数の多能性細胞から多能性細胞を単離すること
を含む方法。
【請求項２９】
前記単離が、機械的、免疫外科的又は酵素的単離のうち１つ又は複数である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、実質的に血清のない培地中で前記胚由来の１つ又は複数の多能性細胞を増殖させること、及び、前記１つ又は複数の多能性細胞から多能性細胞を単離することを含む方法。
【請求項３１】
前記培地が血清代替物及び／又はアルブミンを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記培地が５〜２５％血清代替物を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記胚由来の非多能性細胞が、栄養外胚葉細胞、分化細胞、分化するよう方向付けられた細胞及び胚外内胚葉細胞を含む、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記１つ又は複数の多能性細胞の増殖が、前記１つ又は複数の多能性細胞を含有する胚全体の増殖である、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記方法が、他の細胞からの前記多能性細胞の単離を含まない、請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記単離が、機械的、免疫外科的又は酵素的単離のうち１つ又は複数である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記方法が、前記胚から、前記１つ又は複数の多能性細胞を含む、細胞の初代培養を樹立することを含む、請求項３０〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記初代培養が、フィーダー細胞の存在下で前記胚の全部又は一部を増殖させることによって樹立される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記フィーダー細胞が、前記フィーダー細胞の増殖を阻害するように処理されたものである請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記フィーダー細胞が、前記フィーダー細胞の増殖を阻害するように照射されたものである請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記初代培養が、前記フィーダー細胞の存在下で胚全体を増殖させることにより樹立される、請求項３８〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記初代培養が、前記胚の全部又は一部を前記フィーダー細胞に押圧することにより樹立される、請求項３８〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記初代培養が、前記胚の全部又は一部を適切な細胞増殖基質上で増殖させることにより樹立される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４４】
前記胚の透明帯が、前記１つ又は複数の多能性細胞の増殖前に除去される、請求項３０〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記１つ又は複数の多能性細胞を、前記細胞が細胞のコロニーを形成するまで増殖させる、請求項３０〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記コロニーが実質的に栄養外胚葉細胞を含まない、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記コロニーが実質的に分化細胞及び分化するよう方向付けられた細胞を含まない、請求項４５又は４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記着床前胚が胚盤胞である、請求項３０〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記胚盤胞が孵化又は拡張胚盤胞である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記着床前が卵母細胞の体外受精により生じる、請求項３０〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
請求項３０〜５０のいずれか一項に記載の方法に従って作製される多能性細胞。
【請求項５２】
請求項５１に記載の多能性細胞に由来する多分化能性又は分化細胞。
【請求項５３】
請求項５１に記載の多能性細胞の均質な集団。
【請求項５４】
請求項５１に記載の多能性細胞に由来する１つ又は複数の細胞を含む非ヒト動物。
【請求項５５】
請求項５１に記載の１つ又は複数の多能性細胞を含む組成物。
【請求項５６】
着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、実質的に血清のない培地中で１つ又は複数の多能性細胞を含む胚全体を増殖させること、及び、前記１つ又は複数の多能性細胞から多能性細胞を単離することを含む方法。
【請求項５７】
他の細胞から多能性細胞を単離せずに、着床前胚から前記多能性細胞を単離する方法であって、実質的に血清のない培地中で着床前胚全体を増殖させること、及び、前記１つ又は複数の多能性細胞から多能性細胞を単離することを含む方法。
【請求項５８】
前記単離が、機械的、免疫外科的又は酵素的単離のうち１つ又は複数である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、
（ｉ）前記胚から、１つ又は複数の多能性細胞を含む、細胞の初代培養を樹立すること、
（ｉｉ）前記１つ又は複数の多能性細胞の未分化増殖を可能にし、前記胚由来の非多能性細胞の増殖は許容しない培地中で前記初代培養を増殖させること、
（ｉｉｉ）前記増殖した初代培養から多能性細胞を単離すること
を含む方法。
【請求項６０】
前記培地が実質的に血清のない、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記培地が血清代替物及び／又はアルブミンを含む、請求項５９又は６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記培地が５〜２５％血清代替物を含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記胚由来の非多能性細胞が、栄養外胚葉細胞、分化細胞、分化するよう方向付けられた細胞及び胚外内胚葉細胞を含む、請求項５９〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記初代培養が胚全体から樹立される、請求項５９〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記方法が、他の細胞からの前記多能性細胞の単離を含まない、請求項５９〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記単離が、機械的、免疫外科的又は酵素的単離のうち１つ又は複数である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記初代培養が、フィーダー細胞の存在下で前記胚の全部又は一部を増殖させることにより樹立される、請求項５９〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記フィーダー細胞が、前記フィーダー細胞の増殖を阻害するように処理されたものである請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記フィーダー細胞が、前記フィーダー細胞の増殖を阻害するように照射されたものである請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記初代培養が、フィーダー細胞の存在下で胚全体を増殖させることにより樹立される、請求項５９〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記初代培養が、前記胚の全部又は一部を前記フィーダー細胞に押圧することにより樹立される、請求項６８〜７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記初代培養が、前記胚の全部又は一部を適切な細胞増殖基質上で増殖させることにより樹立される、請求項５９〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記胚の透明帯が、前記１つ又は複数の多能性細胞の増殖前に除去される、請求項５９〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記１つ又は複数の多能性細胞を、前記１つ又は複数の多能性細胞が細胞のコロニーを形成するまで増殖させる、請求項５９〜７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記コロニーが実質的に栄養外胚葉細胞を含まない、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記コロニーが実質的に分化細胞及び分化するよう方向付けられた細胞を含まない、請求項７４又は７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記着床前胚が胚盤胞である、請求項５９〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記胚盤胞が孵化又は拡張胚盤胞である、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記着床前が、卵母細胞の体外受精により生じる、請求項５９〜７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
請求項５６〜７９のいずれか一項に記載の方法に従って作製される多能性細胞。
【請求項８１】
請求項８０に記載の多能性細胞に由来する多分化能性又は分化細胞。
【請求項８２】
請求項７９に記載の多能性細胞の均質な集団。
【請求項８３】
請求項８０に記載の多能性細胞由来の１つ又は複数の細胞を含む非ヒト動物。
【請求項８４】
請求項８０に記載の１つ又は複数の多能性細胞を含む組成物。
【請求項８５】
着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、
（ｉ）前記胚から、１つ又は複数の多能性細胞を含む、細胞の初代培養を樹立すること、
（ｉｉ）実質的に血清のない培地中で前記初代培養を増殖させること、
（ｉｉｉ）前記増殖した初代培養から多能性細胞を単離すること
を含む方法。
【請求項８６】
着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、
（ｉ）着床前胚全体から細胞の初代培養を樹立すること、
（ｉｉ）実質的に血清のない培地中で前記初代培養を増殖させること、
（ｉｉｉ）前記増殖した初代培養から多能性細胞を単離すること
を含む方法。
【請求項８７】
着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、
（ｉ）前記胚全体をフィーダー細胞の層に押圧することにより着床前胚全体から細胞の初代培養を樹立すること、
（ｉｉ）実質的に血清のない培地中で前記初代培養を増殖させること、
（ｉｉｉ）前記増殖した初代培養から多能性細胞を単離すること
を含む方法。
【請求項８８】
実質的に血清を含まない、１つ又は複数の多能性細胞を増殖させるのに使用するときの培養培地。
【請求項８９】
前記培地が、血清代替物及び／又はアルブミンを含む、請求項８８に記載の培地。
【請求項９０】
前記培地が、５〜２５％血清代替物を含む、請求項８９に記載の培地。
【請求項９１】
着床前胚から多能性細胞を単離するためのキットであって、実質的に血清を含まない、１つ又は複数の多能性細胞を増殖させるための培地を含み、前記胚から多能性細胞を単離するための使用説明書をさらに随意に含むキット。
【請求項９２】
前記培地が血清代替物及び／又はアルブミンを含む、請求項９１に記載のキット。
【請求項９３】
着床前胚から単離された多能性細胞であって、前記胚由来の他の細胞から前記多能性細胞を単離せずに、胚全体由来の１つ又は複数の多能性細胞から増殖させる多能性細胞。
【請求項９４】
着床前胚から単離された複数の多能性細胞であって、前記胚由来の他の細胞から前記多能性細胞を単離せずに、胚全体由来の１つ又は複数の多能性細胞から増殖させる複数の多能性細胞。
【請求項９５】
実質的に非多能性細胞を含まない、請求項９４に記載の複数の細胞。
【請求項９６】
着床前胚から単離された多能性細胞であって、実質的に血清のない培地中で前記胚由来の１つ又は複数の多能性細胞から増殖させる多能性細胞。
【請求項９７】
着床前胚から単離された複数の多能性細胞であって、実質的に血清のない培地中で前記胚由来の１つ又は複数の多能性細胞から増殖させる複数の多能性細胞。
【請求項９８】
実質的に非多能性細胞を含まない、請求項９７に記載の複数の細胞。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、２００６年１０月２４日出願のオーストラリア特許仮出願第２００６９０５８８９号からの優先権を主張するものであり、その内容はこの参照により本明細書に組み込まれているものと解釈すべきである。
【０００２】
［発明の分野］
本発明は、胚から多能性細胞を単離する方法、及び該方法により単離される多能性細胞に関する。
【０００３】
［発明の背景］
胚性幹（ＥＳ）細胞は、胚に由来する多能性細胞であり、３種類の胚葉すべてに分化する能力を有する。胚では、そのような細胞は、生殖細胞も含めて、生物の全組織及び器官の形成に寄与する。
【０００４】
ＥＳ細胞は、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｒｅｘ１及びアルカリホスファターゼなどのいくつかの特異的な分子マーカーを発現する。ＥＳ細胞は、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−２、ＴＲＡ１−６０、及びＴＲＡ１−８１などのいくつかの特異的な細胞表面マーカーも発現する。未分化ＥＳ細胞の追加のさらなる特徴は、関連する非筋ミオシンを伴うＦ−アクチンの細胞質組織化である。未分化ＥＳ細胞では、Ｆ−アクチンは末梢組織化皮質環に組織化され、そこでは細胞が相互に直接接触している。
【０００５】
ＥＳ細胞の主供給源は、胚結節、即ち着床前胚の内部多能性成分である。マウスや他のげっ歯類、霊長類及びヒトなどの哺乳動物では、この多能性成分は、その細胞が初期胚内部で多能性細胞の凝集塊として組織化されているために、内部細胞塊（ＩＣＭ）と呼ばれている。有蹄動物では、この成分は、この成分の細胞が平板的な、大部分が一層構造として組織化されているために、胚性円板（ＥＤ）と呼ばれている。
【０００６】
ＥＳ細胞の研究及び医学的応用はよく認識されている。しかし、これらの応用は、ほぼすべての種からのＥＳ細胞の単離方法が不可能であり、及び／又は効率的でないことにより妨げられてきた。
【０００７】
例えば、ＥＳ細胞の単離及びＥＳ系統の樹立の効率は低い。ＥＳ系統を樹立するために常用されているマウス株でも、単離の効率は、通常、使用される胚の２〜３％を超えることはない。
【０００８】
ＥＳ細胞を単離する方法は、一般に、栄養外胚葉及び胚外内胚葉などの他の非多能性細胞の過剰増殖を減少させるために、これらの細胞から多能性成分を分離するステップも必要である。多能性成分を他の細胞から分離するこれらの方法は、通常、免疫外科的ステップ、又は内部細胞塊からの栄養外胚葉細胞の機械的除去を含むステップのいずれかを含む。
【０００９】
この点に関して、胚中の他の細胞からの多能性成分のある種の分離を行わずに、胚全体から多能性細胞を単離することもこれまで可能ではなかった。
【００１０】
さらに、大半の哺乳動物では、キメラ動物のすべての器官及び組織（生殖系列の系統を含む）の形成に関与するその能力という点で、真のＥＳ細胞株の樹立はまだ報告されてはいない。
【００１１】
ＥＳ細胞の単離ができないこと及び／又は効率が悪いことに対する理由はいくつかあるが、胚中の多能性である細胞の数が少ない、及び胚から単離される多能性細胞を未分化状態で維持することができないことが、この単離ができないこと及び／又は効率が悪いことの一因である可能性がある。
【００１２】
本発明は、胚から多能性細胞を単離する方法であって、他の細胞型から多能性成分の分離を必要とせず、胚全体から多能性細胞を直接単離することにも使うことができる方法に関する。
【００１３】
先行技術として与えられる特許文書又は他の物への本明細書における参照は、前記文書若しくは物が公知であったこと、又はそれに含まれる情報が特許請求の範囲のすべての優先日の時点でありふれた一般知識であったことを承認したこととして解釈すべきではない。
【００１４】
［発明の概要］
本発明は、１つ又は複数の多能性細胞を含む着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、
（ｉ）（ａ）１つ又は複数の多能性細胞の未分化増殖を可能にし、（ｂ）胚由来の非多能性細胞の増殖を許容しない条件の下で、胚由来の１つ又は複数の多能性細胞を増殖させること、
（ｉｉ）１つ又は複数の多能性細胞から多能性細胞を単離すること
を含む方法を提供する。
【００１５】
本発明は、１つ又は複数の多能性細胞を含む着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、
（ｉ）（ａ）１つ又は複数の多能性細胞の未分化増殖を可能にし、（ｂ）胚由来の非多能性細胞の増殖を許容しない条件の下で、着床前胚全体を増殖させること、
（ｉｉ）１つ又は複数の多能性細胞から多能性細胞を単離すること
を含む方法も提供する。
【００１６】
本発明は、他の細胞から多能性細胞を単離せずに、着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、
（ｉ）（ａ）１つ又は複数の多能性細胞の未分化増殖を可能にし、（ｂ）胚由来の非多能性細胞の増殖を許容しない条件の下で、１つ又は複数の多能性細胞を含む着床前胚全体を増殖させること、
（ｉｉ）１つ又は複数の多能性細胞から多能性細胞を単離すること
を含む方法も提供する。
【００１７】
本発明は、着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、実質的に血清のない培地中で着床前胚由来の１つ又は複数の多能性細胞を増殖させること、及び、１つ又は複数の多能性細胞から多能性細胞を単離することを含む方法も提供する。
【００１８】
本発明は、着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、実質的に血清のない培地中で１つ又は複数の多能性細胞を含む着床前胚全体を増殖させること、及び、１つ又は複数の多能性細胞から多能性細胞を単離することを含む方法も提供する。
【００１９】
本発明は、他の細胞から多能性細胞を単離せずに、着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、実質的に血清のない培地中で１つ又は複数の多能性細胞を含む着床前胚全体を増殖させること、及び、１つ又は複数の多能性細胞から多能性細胞を単離することを含む方法も提供する。
【００２０】
本発明は、着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、
（ｉ）胚から、１つ又は複数の多能性細胞を含む、初代培養を樹立すること、
（ｉｉ）１つ又は複数の多能性細胞の未分化増殖を可能にし、胚由来の非多能性細胞の増殖は許容しない培地中で初代培養を増殖させること、
（ｉｉｉ）増殖した初代培養から多能性細胞を単離すること
を含む方法も提供する。
【００２１】
本発明は、着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、
（ｉ）着床前胚全体から細胞の初代培養を樹立すること、
（ｉｉ）胚由来の１つ又は複数の多能性細胞の未分化増殖を可能にし、胚由来の非多能性細胞の増殖は許容しない培地中で初代培養を増殖させること、
（ｉｉｉ）増殖した初代培養から多能性細胞を単離すること
を含む方法も提供する。
【００２２】
本発明は、着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、
（ｉ）胚から、１つ又は複数の多能性細胞を含む、細胞の初代培養を樹立すること、
（ｉｉ）実質的に血清のない培地中で初代培養を増殖させること、
（ｉｉｉ）増殖した初代培養から多能性細胞を単離すること
を含む方法も提供する。
【００２３】
本発明は、着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、
（ｉ）着床前胚全体から細胞の初代培養を樹立すること、
（ｉｉ）実質的に血清のない培地中で初代培養を増殖させること、
（ｉｉｉ）増殖した初代培養から多能性細胞を単離すること
を含む方法も提供する。
【００２４】
本発明は、実質的に血清を含まない、１つ又は複数の多能性細胞を増殖させるのに使用するときの培養培地も提供する。
【００２５】
本発明は、着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、
（ｉ）胚全体をフィーダー細胞の層に押圧することにより、着床前胚全体から細胞の初代培養を樹立すること、
（ｉｉ）実質的に血清のない培地中で初代培養を増殖させること、
（ｉｉｉ）増殖した初代培養から多能性細胞を単離すること
を含む方法も提供する。
【００２６】
本発明は、着床前胚から多能性細胞を単離するためのキットであって、実質的に血清を含まない、１つ又は複数の多能性細胞を増殖させるための培地を含み、胚から多能性細胞を単離するための使用説明書をさらに随意に含むキットも提供する。
【００２７】
本発明は、着床前胚から単離された多能性細胞であって、胚由来の他の細胞から多能性細胞を単離せずに、胚全体由来の１つ又は複数の多能性細胞から増殖させる、多能性細胞も提供する。
【００２８】
本発明は、着床前胚から単離された複数の多能性細胞であって、胚由来の他の細胞から１つ又は複数の多能性細胞を単離せずに、胚全体由来の１つ又は複数の多能性細胞から増殖させる、複数の多能性細胞も提供する。
【００２９】
本発明は、着床前胚から単離された多能性細胞であって、実質的に血清のない培地中で胚由来の１つ又は複数の多能性細胞から増殖させる、多能性細胞も提供する。
【００３０】
本発明は、着床前胚から単離された複数の多能性細胞であって、実質的に血清のない培地中で胚由来の１つ又は複数の多能性細胞から増殖させる複数の多能性細胞も提供する。
【００３１】
本発明は、哺乳動物着床前胚からのＥＳ細胞の単離に向けての研究から生まれている。特に、血清を欠く培地中で胚由来の多能性細胞を増殖させると、胚外及び他の分化細胞の過剰増殖が減少し、また、多能性細胞の未分化状態での維持も支持されることが実証されている。
【００３２】
このような形で多能性細胞を単離すると、他の細胞から多能性成分を人為的に単離する必要がなくなり、多能性細胞を胚全体から単離することも可能になる。このような形で多能性細胞を単離すると、血清に付随する１つ又は複数の病原体による汚染の可能性を一緒にもたらす血清の供給源の存在下で細胞を増殖させる必要もなくなる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、使用する代表的なブタ胚盤胞を示す。
【図２】図２は、透明帯の除去及びマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダー細胞層への押圧後の胚盤胞を示す。
【図３】図３は、フィーダー層への押圧前（パネルＡ）及び押圧後（パネルＢ）のブタ胚盤胞の細胞数を示す。細胞数は、胚盤胞全体のフィーダー層への押圧後に減少してはいないこと、及びフィーダー層への押圧によっても胚性円板と栄養膜細胞の機械的分離が生じていないことに注目すべきである。
【図４】図４は、対照（ＦＣＳ）グループと実験（血清代替物、ＳＲ）グループにおける初代胚性増殖の形成を示す。両グループで、胚性増殖は栄養外胚葉細胞と推定ＥＳ細胞からなっていた。
【図５】図５は、培養７日後のＦＣＳグループにおける初代胚性増殖の発生を示す。胚性増殖は、分化細胞からなり、推定ＥＳ細胞が存在する徴候は何もなかった。
【図６】図６は、培養７日後のＦＣＳグループにおける初代胚性増殖の発生を示す。この胚性増殖では、推定ＥＳ細胞の小コロニーが分化細胞に取り囲まれている。
【図７】図７は、培養７日後のＳＲグループにおける初代胚性増殖を示す。胚性増殖は、ＥＳ細胞に特徴的な形態（小さな細胞質／核比、複数の核小体のある核、及び細胞質における複数の脂質封入体）を有し、少量のアポトーシス栄養外胚葉細胞を有する推定ブタＥＳ細胞からなる。
【図８】図８は、培養７日後のＳＲグループにおける初代胚性増殖を示す。増殖は、特徴的な形態を有する均質な推定ブタＥＳ細胞のみからなる。
【図９】図９は、培養１４日後のＳＲグループにおける初代胚性増殖を示す。初代胚性増殖は著しく拡大し、均質な推定ＥＳコロニーからなり、栄養外胚葉又は他の分化細胞の徴候は何もない。
【図１０】図１０は、栄養膜細胞の残り及び多能性細胞として同定された細胞（黄色矢印）からなる（パネルＡ）初代２日目初代増殖におけるＯＣＴ−４の発現を示す。パネルＢは、多能性細胞（黄色矢印）のみがＯｃｔ−４（緑色）を発現していることを示している。
【図１１】図１１は、単一ブタＥＳ細胞における高い細胞質／核比を示す。これらの細胞は直径が小さく（パネルＡ）、その細胞質に脂質封入体を有している。これらの細胞の核（パネルＢ、核は赤色に染色されている）が細胞のほとんど全容積を占めている。
【図１２】図１２は、ブタ胚盤胞へのブタＥＳ細胞の注入の結果を示す。赤色蛍光染色剤で標識した単一ブタＥＳ細胞のセット（パネルＡ及びパネルＢ）を宿主ブタ胚盤胞に注入した。注入の次の日、宿主胚盤胞はその形状を回復し（パネルＣ）、注入されたブタＥＳ細胞は胚盤胞のＩＣＭに組み込むことができた（パネルＤ）。
【図１３】図１３は、ブタ栄養膜細胞（パネルＡ）、マウス胚線維芽細胞及びブタＥＳ細胞（パネルＢ）におけるＦ−アクチン組織化（緑色）を示す。ブタＥＳ細胞は、ＥＳ細胞に特徴的なＦ−アクチン分布パターンを有している。
【図１４】図１４は、ブタＥＳ細胞におけるＳＳＥＡ−１発現（赤色）を示す。
【図１５】図１５は、ブタＥＳ細胞におけるＯｃｔ−４発現（緑色）を示す。
【図１６】図１６は、ブタ胚盤胞（パネルＡ）のＩＣＭ細胞（黄色矢印）における、及びブタＥＳ細胞（赤色矢印）を注入したブタ胚盤胞（パネルＢ）におけるＯｃｔ−４発現（緑色）を示す。
【００３４】
［発明の全般的な説明］
上記のように、一実施形態では、本発明は、１つ又は複数の多能性細胞を含む着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、
（ｉ）（ａ）１つ又は複数の多能性細胞の未分化増殖を可能にし、（ｂ）胚由来の非多能性細胞の増殖を許容しない条件の下で、胚由来の１つ又は複数の多能性細胞を増殖させること、
（ｉｉ）１つ又は複数の多能性細胞から多能性細胞を単離すること
を含む方法を提供する。
【００３５】
本発明は、胚から多能性細胞を単離するための改良された方法を対象とする。本発明は、多能性細胞株の樹立のために使用してもよい。
【００３６】
この点に関して、本明細書のいたるところで使用される用語「多能性細胞」とは、以下の特徴、（ｉ）外胚葉、中胚葉、及び内胚葉派生物を含むいかなる細胞型にも分化することができる、（ｉｉ）生殖系列の系統を含むキメラ生物におけるいかなる器官及び組織にも寄与することができる、（ｉｉｉ）その多能性状態を示す特異的分子マーカー（例えば、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｒｅｘ１、アルカリホスファターゼ）及び細胞表面マーカー（例えば、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ１−６０、ＴＲＡ１−８１）を発現する、並びに（ｉｖ）細胞質にＦ−アクチンの特徴的な分布を有する、のうち１つ又は複数を有する細胞を意味すると理解されている。
【００３７】
本明細書のいたるところで使用される用語「胚由来の１つ又は複数の多能性細胞」とは、胚に存在する多能性細胞などの胚起源の１つ若しくは複数の多能性細胞、又は胚に本来存在する多能性細胞由来の１つ若しくは複数の多能性細胞を意味すると理解されるべきである。
【００３８】
細胞が多能性細胞かどうかを評価するための方法は、本技術分野では公知である。
【００３９】
例えば、多能性細胞は、形態上の特徴により同定することができる（例えば、Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、「Ｅｍｂｒｙｏ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｅｍ  ｌｉｎｅｓ」、Ｉｎ：Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ−ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ、ＥＪ  Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９８７、ｐｐ７１〜１１２；及びＳｔｉｃｅ  ＳＬ  ａｎｄ  Ｇｏｌｕｅｋｅ  ＰＪ、Ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｉｎｎｅｒ  ｃｅｌｌ  ｍａｓｓ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｂｏｖｉｎｅ  ｏｒ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｅｍｂｒｙｏｓ、米国特許第５９０５０４２号を参照されたい）。
【００４０】
例えば、マウスＥＳ細胞は典型的には小さく、大きな核及び最小の細胞質を有し、核には１つ又は複数の顕著な濃い核小体構造物が含有されるが、ウシ及びブタ多能性細胞は、以下の特性、即ち、ａ）小さな細胞質／核容積比；ｂ）細胞質小胞；及びｃ）小さな個々の細胞、を示している。ある種のマーカー（Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｒｅｘ１、アルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ１−６０、ＴＲＡ１−８１などの）の発現及び／又は種々の細胞型、即ち外胚葉、中胚葉及び内胚葉胚葉の派生物に分化する細胞の能力も、多能性細胞の同定の判定基準である。
【００４１】
ＥＳ細胞の同定のもう１つの判定基準は、Ｆ−アクチン分布である。マウスＥＳ細胞では、Ｆ−アクチンは、末梢組織化皮質環に組織化されており、そこでは細胞は相互に直接接触している（例えば、Ｓｌａｇｅｒ  ＨＧら、Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｎ−ｍｕｓｃｌｅ  ｍｙｏｓｉｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｅａｒｌｙ  ｍｕｒｉｎｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．１９９２．ｖ．５０．ｐｐ．４７〜５６；Ｆｌｅｃｈｏｎ，Ｊ．−Ｅ．Ｗｈａｔ  ａｒｅ  ＥＳ  Ｃｅｌｌｓ？  Ｉｎ：Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ａｎｉｍａｌｓ−Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｕｓｅ（Ｈｏｕｎｄｅｂｉｎｅ  ＬＭ  編）、Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９７、ｐｐ１５７〜１６６を参照されたい）。
【００４２】
本明細書のいたるところで使用される用語「胚由来の非多能性細胞」とは、多能性能がない胚起源の細胞を意味すると理解されるべきである。そのような細胞には、例えば、栄養膜細胞などの分化細胞、分化するよう方向付けられた細胞、及び胚外内胚葉細胞が挙げられる。非多能性細胞は胚に存在することもあれば、胚に本来存在する多能性又は非多能性細胞から増殖した細胞などの、胚に本来存在する細胞由来であることもある。多能性及び非多能性として細胞を特徴付けるための方法は本技術分野では公知である。
【００４３】
胚は適切な種由来でよい。哺乳動物胚の例には、ヒト、霊長類、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ若しくはヤギを含む家畜動物、イヌ、ネコを含むコンパニオンアニマル、又はマウス、ラット、モルモット、若しくはウサギを含む臨床検査動物由来の胚が挙げられる。
【００４４】
本発明の種々の実施形態での着床前胚は、例えば、卵母細胞の精子による受精から生じる胚でも、核移植により産生される胚でも、単為生殖活性化により産生される胚でもよい。本発明の範囲には、インビトロ産生胚又はインビボ産生胚由来の多能性細胞の単離が含まれることが認識されるであろう。
【００４５】
胚を単離する又は産生するための方法は本技術分野では公知である。例えば、胚は適切なメス哺乳動物から単離することができる。或いは、胚は、補助生殖医療技術の使用などによりインビトロで生じさせることができる。適切な補助生殖医療技術の例は、体外受精である。
【００４６】
本発明の種々の実施形態での着床前胚は、着床に先立って１つ又は複数の多能性細胞を含有する胚である。
【００４７】
胚は、接合期からのすべての適切な胚形成期を含む適切な着床前胚である。
【００４８】
一実施形態では、着床前胚は、桑実胚又は、拡張胚盤胞若しくは孵化胚盤胞を含む胚盤胞である。
【００４９】
この点に関して、受精により産生される胚の場合には、胚は受精後一連の卵割を受け、２細胞、４細胞、８細胞及び１６細胞期と進行することは理解されるであろう。８細胞又は１６細胞胚（種に依存）の発生後、卵割球は相互に緊密な接合部を形成し始め、その円い形は変形し、桑実胚と呼ばれる球形の細胞塊を形成する。
【００５０】
卵割球間の接合複合体の形成に続いて、体液が胚内部に蓄積して、胚盤胞形成のシグナルを送る。胚盤胞は栄養膜細胞の中空球から構成されており、その内部には、一般に内部細胞塊／胚結節と呼ばれる細胞の小さなクラスターがある。栄養膜は続けて胎膜系に寄与し、内部細胞塊細胞の一部は胎児になるよう運命付けられている。一般に、着床前の胚の最終発生段階は孵化胚盤胞である。
【００５１】
ヒトでは及び他の哺乳動物では、内部細胞塊での細胞の発生及びそれに引き続き胚性胚葉及び分化細胞を形成する分化を含む胚盤胞の形成は、すべて類似の発生過程をたどる。
【００５２】
典型的には、本発明の種々の実施形態における適切な着床前胚は、多能性細胞の単離のために選択される。この点に関して、当業者ならば、胚は異なる発生能を有していることがあり、大きく明瞭な内部細胞塊を有する胚が一般に、多能性細胞の単離にもっとも適切な胚を提供することを認識するであろう。例えば、大きく明瞭な内部細胞塊のある拡張胚盤胞を使用してもよい。胚を類別するための方法は本技術分野では公知であり、例えば、胚盤胞類別方式は、Ｖｅｅｋら（２００３）「Ｈｕｍａｎ  ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」、Ｖｅｅｋ  Ｌ．Ｌ．及びＺａｎｉｎｏｖｉｃ  Ｎ．編、Ａｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ｐｐ９９〜１３７；Ｔｈｅ  Ｐａｒｔｈｅｎｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ、２００３に記載されている。
【００５３】
本明細書において先述したように、本発明は、胚から多能性細胞を単離するための改良された方法を対象とする。
【００５４】
この点に関して、用語「単離する」とは、多能性細胞を、胚において存在するその天然の環境から取り出すことを意味すると理解されるであろう。
【００５５】
したがって、本発明は、着床前胚由来の１つ又は複数の多能性細胞を増殖させるステップと、そのようにして増殖させた細胞から多能性細胞を単離するステップとを含む。
【００５６】
この点に関して、胚由来の１つ又は複数の多能性細胞には、胚に存在する１つ若しくは複数の多能性細胞、又は胚に本来存在する多能性細胞から生じる１つ若しくは複数の多能性細胞が含まれることは理解されるであろう。同様に、胚由来の非多能性細胞には、胚に存在する非多能性細胞、又は胚に存在する多能性若しくは非多能性細胞から生じる非多能性細胞が挙げられる。
【００５７】
一実施形態では、本発明を使用して、他の非多能性細胞と比較して胚由来の１つ又は複数の多能性細胞を濃縮することができる。
【００５８】
別の実施形態では、本発明を使用して、胚由来の多能性細胞の数を増やすことができる。
【００５９】
例えば、多能性細胞は、栄養膜細胞、分化細胞、分化するよう方向付けられた細胞、及び胚外内胚葉細胞などの胚由来の非多能性細胞が実質的にない１つ又は複数の多能性細胞でよい。
【００６０】
この点に関して、特に栄養外胚葉細胞のせいで、培養期間中ＩＣＭの増殖は妨げられ、多能性細胞及び多能性細胞株の樹立は厄介になることがある。
【００６１】
一実施形態では、そのようにして単離される多能性細胞は、栄養膜細胞、分化細胞、分化するよう方向付けられた細胞、及び胚外内胚葉細胞などの胚由来の１つ又は複数の非アポトーシス非多能性細胞が実質的にない。細胞のアポトーシス状態を判定するための方法は本技術分野では公知である。
【００６２】
本明細書において先述するように、本発明を使用して、例えば、胚に存在する多能性細胞に由来する多能性細胞株を樹立することもできる。
【００６３】
一実施形態では、本発明を使用して、胚外細胞及び／又は分化細胞（分化するよう方向付けられた細胞を含む）が実質的にない複数個のインビトロ多能性細胞を得ることができる。例えば、本発明を使用して、多能性細胞の均質なコロニーなどの多能性細胞の均質な集団を得ることができる。
【００６４】
例えば、一実施形態では、本発明の１つ又は複数の多能性細胞を、細胞が細胞のコロニーを形成するまで増殖させることができる。
【００６５】
一実施形態では、このようにして形成されるコロニーは、栄養膜細胞、分化細胞、分化するよう方向付けられた細胞、及び胚外内胚葉細胞などの１つ又は複数の非アポトーシス非多能性細胞が実質的に存在しない。
【００６６】
特定の一実施形態では、本発明を使用して、胚の一部から多能性細胞を単離することができるだけではなく、本発明を使用して、胚全体から多能性細胞を直接単離することもできることが認識されている。
【００６７】
したがって、本発明の種々の実施形態での１つ又は複数の多能性細胞の増殖は、１つ又は複数の多能性細胞を含有する胚全体の増殖でよい。
【００６８】
したがって、別の実施形態では、本発明は、１つ又は複数の多能性細胞を含む着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、
（ｉ）（ａ）１つ又は複数の多能性細胞の未分化増殖を可能にし、（ｂ）胚由来の非多能性細胞の増殖を許容しない条件の下で、着床前胚全体を増殖させること、
（ｉｉ）１つ又は複数の多能性細胞から多能性細胞を単離すること
を含む方法を提供する。
【００６９】
先述するように、本発明を使用して、栄養外胚葉細胞などの他の細胞から前記多能性細胞を単離する１つ又は複数のステップを用いずに、着床前胚から多能性細胞を単離することもできる。
【００７０】
したがって、一実施形態では、本発明は、他の細胞から多能性細胞を単離せずに、着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、
（ｉ）（ａ）１つ又は複数の多能性細胞の未分化増殖を可能にし、（ｂ）胚由来の非多能性細胞の増殖を許容しない条件の下で、１つ又は複数の多能性細胞を含む着床前胚を増殖させること、
（ｉｉ）１つ又は複数の多能性細胞から多能性細胞を単離すること
を含む方法を提供する。
【００７１】
先述のように、一実施形態では、胚は胚全体である。
【００７２】
したがって、本発明を使用して、他の細胞から多能性細胞を単離せずに、胚全体から多能性細胞を単離することもできる。
【００７３】
したがって、別の実施形態では、本発明は、他の細胞から多能性細胞を単離せずに、着床前胚全体から多能性細胞を単離する方法であって、
（ｉ）（ａ）１つ又は複数の多能性細胞の未分化増殖を可能にし、（ｂ）胚由来の非多能性細胞の増殖を許容しない条件の下で、１つ又は複数の多能性細胞を含む着床前胚全体を増殖させること、
（ｉｉ）１つ又は複数の多能性細胞から多能性細胞を単離すること
を含む方法を提供する。
【００７４】
他の細胞（栄養膜細胞などの）から多能性細胞を単離するのに使われるそのような方法の例には、機械的、免疫外科的、非酵素的又は酵素的単離方法が挙げられる。
【００７５】
本発明は、本発明に従って単離された多能性細胞も提供する。本発明は、多能性細胞に由来する多分化能性又は分化細胞も提供する。特定の発生系列に沿って多能性細胞を分化させ、細胞を特徴付けるための方法は本技術分野では公知である。
【００７６】
したがって、別の実施形態では、本発明は、着床前胚から単離された多能性細胞であって、胚由来の他の細胞から多能性細胞を単離せずに、胚全体由来の１つ又は複数の多能性細胞から増殖させる多能性細胞を提供する。
【００７７】
本発明は、細胞の均質な集団などの複数の多能性細胞も提供する。例えば、細胞の集団は多能性細胞のコロニーでもよい。
【００７８】
したがって、別の実施形態では、本発明は、着床前胚から単離された複数個の多能性細胞であって、胚由来の他の細胞から多能性細胞を単離せずに、胚全体由来の１つ又は複数の多能性細胞から増殖させる複数の多能性細胞を提供する。
【００７９】
本明細書において先述するように、本発明の種々の実施形態における１つ又は複数の多能性細胞の増殖は、多能性細胞の未分化増殖を可能にするが胚由来の非多能性細胞の増殖を許容しない条件の下での細胞の増殖である。培養条件がこれらの基準を満たしているかどうかを判定するための方法は本技術分野では公知である。
【００８０】
一実施形態では、１つ又は複数の多能性細胞の増殖は、実質的に血清の不在下での増殖である。
【００８１】
一実施形態では、胚由来の前記１つ又は複数の多能性細胞を、実質的に血清のない培養培地中で増殖させる。
【００８２】
したがって、本発明は、血清を含有しない培地などの実質的に血清のない適切な培地中で細胞を増殖させることを含む。
【００８３】
したがって、別の実施形態では、本発明は、着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、実質的に血清のない培地中で胚由来の１つ又は複数の多能性細胞を増殖させることを含む方法を提供する。
【００８４】
この点に関して、培養培地に血清が存在すると、多能性細胞の単離及び維持の低効率の一因となることがあることは認識されている。理論に縛られることなく、培養培地中の血清の存在は、胚外細胞の過剰増殖だけではなく、多能性細胞の分化を促進することの原因にもなると考えられている。したがって、血清は、増殖している細胞に栄養分を提供するだけではなく、血清は、多能性細胞の分化を促進し及び／又は細胞の分化を支援することができる不確定因子も含有することがある。
【００８５】
したがって、このような形での胚由来の多能性細胞の増殖は、胚外細胞（栄養外胚葉及び胚外内胚葉などの）の除去、並びに、分化している及び／又は分化するよう方向付けられた細胞の除去を可能にする。
【００８６】
一実施形態では、胚の透明帯は、１つ又は複数の多能性細胞の増殖前に除去される。例えば、透明帯は、酵素的な又は機械的な除去によって除去してよい。哺乳動物胚の透明帯を除去するための方法は本技術分野では公知である。
【００８７】
本発明は、この方法により単離される多能性細胞又は複数の細胞も提供する。
【００８８】
したがって、別の実施形態では、本発明は、着床前胚から単離された多能性細胞であって、実質的に血清のない培地において胚由来の１つ又は複数の多能性細胞から増殖させる多能性細胞を提供する。
【００８９】
別の実施形態では、本発明は、着床前胚から単離された複数の多能性細胞であって、実質的に血清のない培地において胚由来の１つ又は複数の多能性細胞から増殖した複数の多能性細胞を提供する。
【００９０】
この点に関して、実質的な無血清培地とは、血清のない培地又は、胚外細胞の除去、並びに、すでに分化した及び／若しくは分化するよう方向付けられた細胞の除去をそれでも可能にするレベルの血清タンパク質（複数可）若しくは他の成分を含む培地のことである。
【００９１】
一実施形態では、培地は無血清である。
【００９２】
この点に関して、血清は種々の成分の混合物であるので、実質的に血清のない培地は、通常は血清に存在するが、非多能性細胞の分化及び増殖を促進しない１つ又は複数の成分をそれでも含有することがあることは認識されるであろう。
【００９３】
非多能性細胞の分化及び増殖を促進する特定の因子の能力を判定するための方法は本技術分野では公知である。
【００９４】
一実施形態では、１つ又は複数の多能性細胞の増殖は、血清代替物を含む培地中である。適切な血清代替物は、例えば、インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（カタログ番号１０８２８−０２８）から入手可能である、又はＵｌｔｒｏｓｅｒＧ（ポール社（Ｐａｌｌ））などの血清代替物がある。血清代替物は、血清アルブミン、インスリン及びトランスフェリンなどの高純度動物（一般にウシ）タンパク質を含有する血清代替物と定義される。血清代替物は、増殖因子、ステロイドホルモン、グルココルチコイド及び細胞接着因子を通常は含有しないが、これらを含有することもある。
【００９５】
血清代替物の適切な濃度は５〜２５％の範囲にある。
【００９６】
別の実施形態では、１つ又は複数の多能性細胞の増殖は、アルブミンを含む培地においてである。
【００９７】
アルブミンの適切な濃度は０．１〜１０％の範囲にある。
【００９８】
胚由来の１つ又は複数の多能性細胞の増殖のための適切な培地は、Ｌ−グルタミンをモル当量単位で置換したＧｌｕｔａＭａｘ−Ｉ（ジペプチドＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン）、リボヌクレオシド及びデオキシリボヌクレオシドを含有し、０．１ｍＭ〜１０ｍＭピルビン酸ナトリウム、１〜１００ｎｇ／ｍＬ  ｂＦＧＦ、１〜１００ｎｇ／ｍＬ  ｈｒＥＧＦ、１×ＩＴＳ、５５μＭ  β−メルカプトエタノール、１×非必須アミノ酸（すべてインビトロジェン社製）及び１〜１００ｎｇ／ｍＬ  ｈｒＬＩＦ（ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））を補充したα−ＭＥＭ培地（インビトロジェン社、カタログ番号３２５７１−０３６）である。
【００９９】
この点に関して、例えば、Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、「Ｅｍｂｒｙｏ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｅｍ  ｌｉｎｅｓ」、Ｉｎ：Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ−ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ、ＥＪ  Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９８７、ｐｐ７１〜１１２に記載の多種多様な種由来の胚の培養条件は本技術分野では公知である。
【０１００】
適切な基礎培地には、例えば、ＤＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、アルファ−ＭＥＭ培地及びＨＥＳｃＧＲＯ培地が含まれる。他の適切な基礎培地は当業者が決定してよい。
【０１０１】
一実施形態では、着床前胚は胚全体である。
【０１０２】
したがって、別の実施形態では、本発明は、着床前胚由来の多能性細胞を単離する方法であって、実質的に血清のない培地中で１つ又は複数の多能性細胞を含む着床前胚全体を増殖させることを含む方法を提供する。
【０１０３】
本発明は、実質的に血清を含まない、１つ又は複数の多能性細胞を増殖させるのに使用するときの培養培地も提供する。一実施形態では、培地は血清代替物を含む。
【０１０４】
適切な培養培地は本明細書で前述している通りである。
【０１０５】
本発明は、着床前胚から多能性細胞を単離するためのキットも提供する。キットは、実質的に血清を含まない、胚を増殖させるための培地を含み、多能性細胞を単離するための使用説明書をさらに含んでもよい。
【０１０６】
したがって、別の実施形態では、本発明は、着床前胚から多能性細胞を単離するためのキットであって、実質的に血清を含まない、１つ又は複数の多能性細胞を増殖するための培地を含み、胚から多能性細胞を単離するための使用説明書をさらに随意に含むキットを提供する。
【０１０７】
一実施形態では、キット中の培地は血清代替物も含む。
【０１０８】
或いは、キットは別々に血清代替物も含有し、この血清代替物は使用のために培地に添加される。
【０１０９】
一実施形態では、１つ又は複数の多能性細胞の増殖は、１つ又は複数の多能性細胞を含有する胚の全部又は一部からの細胞の初代培養の樹立を含む。
【０１１０】
したがって、別の実施形態では、本発明は、着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、
（ｉ）胚から、１つ又は複数の多能性細胞を含む、細胞の初代培養を樹立すること、
（ｉｉ）１つ又は複数の多能性細胞の未分化増殖を可能にし、胚由来の非多能性細胞の増殖は許容しない培地中で初代培養を増殖させること、
（ｉｉｉ）増殖した初代培養から多能性細胞を単離すること
を含む方法を提供する。
【０１１１】
一実施形態では、初代培養は、フィーダー細胞の存在下で胚の全部又は一部を増殖させることにより樹立される。
【０１１２】
この場合、胚の全部又は一部は、例えば、フィーダー細胞の層に押圧されていてもよく、包埋されていてもよく、又は平板化されていてもよい。
【０１１３】
一般に、フィーダー層は、フィーダー細胞の増殖を阻害するように処理された不活化フィーダー層でなる。増殖を阻害するようフィーダー層を処理する方法には、照射（例えば、γ−照射）又はマイトマイシンＣなどの化学薬品による処理が含まれる。フィーダー層として使用するのに適切な細胞には、マウス胚線維芽細胞などの細胞が含まれる。適切なフィーダー層を調製するための方法は本技術分野では公知である。
【０１１４】
一実施形態では、初代培養は、フィーダー細胞の存在下で胚全体を直接増殖させることにより樹立される。
【０１１５】
したがって、別の実施形態では、本発明は、着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、
（ｉ）着床前胚全体から細胞の初代培養を樹立すること、
（ｉｉ）胚由来の１つ又は複数の多能性細胞の未分化増殖を可能にし、胚由来の非多能性細胞の増殖は許容しない培地中で初代培養を増殖させること、
（ｉｉｉ）増殖した初代培養から多能性細胞を単離すること
を含む方法を提供する。
【０１１６】
或いは、初代培養は、胚の全部又は一部を適切な細胞増殖基質上で増殖させることにより樹立することができる。
【０１１７】
本明細書において先述するように、一実施形態では、初代培養の増殖は実質的に血清のない培地中で行う。
【０１１８】
したがって、別の実施形態では、本発明は、着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、
（ｉ）胚から、１つ又は複数の多能性細胞を含む、細胞の初代培養を樹立すること、
（ｉｉ）実質的に血清のない培地中で初代培養を増殖させること、
（ｉｉｉ）増殖した初代培養から多能性細胞を単離すること
を含む方法を提供する。
【０１１９】
一実施形態では、初代培養は、着床前胚全体から直接樹立される。
【０１２０】
したがって、別の実施形態では、本発明は、着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、
（ｉ）着床前胚全体から細胞の初代培養を樹立すること、
（ｉｉ）実質的に血清のない培地中で初代培養を増殖させること、
（ｉｉｉ）増殖した初代培養から多能性細胞を単離すること
を含む方法を提供する。
【０１２１】
一実施形態では、胚の透明帯は、１つ又は複数の多能性細胞の増殖前に除去される。例えば、透明帯は、酵素的又は機械的除去により除去してもよい。哺乳動物胚の透明帯を取り除くための方法は本技術分野では公知である。
【０１２２】
本明細書において先述するように、初代培養は、胚の全部又は一部をフィーダー層に押圧することにより樹立することができる。
【０１２３】
したがって、別の実施形態では、本発明は、着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、
（ｉ）胚全体をフィーダー細胞の層に押圧することにより着床前胚全体から細胞の初代培養を樹立すること、
（ｉｉ）実質的に血清のない培地中で初代培養を増殖させること、
（ｉｉｉ）増殖した初代培養から多能性細胞を単離すること
を含む方法を提供する。
【０１２４】
初代培養の増殖は、例えば、必要な細胞の富化及び／又は拡張に応じて、１つ又は複数の多能性細胞の増殖又は維持を可能にするのに適切な時間の間であってよい。
【０１２５】
一実施形態では、胚の透明帯は、１つ又は複数の多能性細胞の増殖前に取り除かれる。例えば、透明帯は、酵素的又は機械的除去により除去することができる。哺乳動物胚の透明帯を除去するための方法は本技術分野では公知である。
【０１２６】
例えば、初代培養は、実質的に胚外細胞のない、又は栄養外胚葉細胞などの少量のアポトーシス胚外細胞を含有する多能性細胞の均質な集団の作製を可能にする７〜１４日の期間培養することができる。
【０１２７】
一実施形態では、初代培養は、均質な多能性細胞のコロニーの形成を可能にするのに十分な期間培養される。したがって、コロニーは、栄養外胚葉及び他の分化細胞、分化するよう方向付けられた細胞並びに胚外内胚葉細胞などの非多能性細胞が実質的にないことがある。
【０１２８】
そのようにして単離された多能性細胞は、未分化細胞の形態上の判定基準及び多能性をまったく喪失することなく何度も継代することができる。
【０１２９】
本発明は、本発明に従って作製される多能性細胞、又は多能性細胞株も提供する。
【０１３０】
本発明は、本発明に従って作製される多能性細胞由来のさらに限定された能力の細胞（例えば、多分化能性細胞）又は分化細胞、及び多能性細胞由来の遺伝子操作された細胞も提供する。多能性細胞を分化させる方法及び遺伝子操作する方法は本技術分野では公知である。
【０１３１】
本発明は、本発明に従って作製される多能性細胞由来の１つ又は複数の細胞を含む非ヒト動物も提供する。そのような動物を作製するための方法は本技術分野では公知である。
【０１３２】
例えば、キメラ動物などの動物は、本発明に従って作製される多能性細胞由来のいくつかの細胞を含有することができる。
【０１３３】
本発明は、本発明に従って作製される１つ又は複数の多能性細胞を含む組成物も提供する。組成物はインビトロでもインビボでも使用することができる。
【０１３４】
この点に関して、本発明は、細胞を組織又は被検体に導入することにより組織中又は被検体中で細胞を再生するために、本発明に従って作製される多能性細胞（並びにその分化した及び遺伝子操作された形）の使用も企図している。
【０１３５】
したがって、別の実施形態では、本発明は、本発明に従って作製される細胞を含む医薬組成物、並びに／又は多能性細胞由来の分化細胞及び／若しくは多能性細胞由来の遺伝子操作された細胞を含む医薬組成物を企図している。
【０１３６】
細胞療法のための医薬組成物を処方するための方法は本技術分野では公知であり、例えば、「Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ−Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、（２００６）、Ａｎｔｈｏｎｙ  Ｄ．Ｈ．Ｒｏｎａｌｄ−Ｈｏｆｆｍａｎ及びＥｓｍａｉｌ  Ｐ．Ｚａｎｊａｎｉ編、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ＆ｃｏ  ｋＧａＡ；「Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、（２００６）、Ｐａｕｌ  Ｒ．Ｓｕｎｂｅｒｇ及びＣｙｎｄｙ  Ｄ．Ｄａｖｉｓ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓに記載されている。
【０１３７】
一般に、そのような医薬組成物は、細胞及び医薬的に許容可能なキャリアを含んでいる。
【０１３８】
細胞療法が標的組織において細胞を再生させる必要性は、細胞消失、損傷又は機能障害に付随するいくつかの疾患又は状態に関連することがある。
【０１３９】
したがって、本発明を使用して、細胞消失、細胞損傷又は細胞機能障害に付随する被検体の疾患又は状態を予防及び／又は治療することもでき、その方法は本発明に従って細胞を被検体に導入するステップを含む。
【０１４０】
被検体は、本明細書において先述する哺乳動物を含む、任意の適切なレシピエントでよい。レシピエント哺乳動物及びヒトに細胞を導入するための方法は、本技術分野では公知である。
【０１４１】
［特定の実施形態の説明］
ここで、本発明の上記の一般的原理を具体化する実験に言及する。しかし、以下の説明は、上記説明の一般性を限定するためのものではないことは理解されるべきである。
【０１４２】
実施例１
（ブタ胚盤胞のインビトロ作製）
ブタ卵巣は地元の屠殺場から入手した。卵母細胞は吸引して、３９℃で５％二酸化炭素の加湿環境の下、ＴＣＭ−１９９培地で成熟させた。４２〜４４時間の成熟後、卵母細胞は、ＴＡＬＰ−ＰＶＡ培地において濃度５×１０６精子／ｍＬで使う成熟オスの精子で６時間受精させた。受精後、受精卵母細胞はＮＣＳＵ−２３培地で７日間培養した。受精日は０日目である。インビトロ培養の７日目に発生した孵化又は拡張胚盤胞（図１）を、推定多能性ブタＥＳ細胞の単離のために使った。
【０１４３】
実施例２
（ブタ胚盤胞のインビボ作製）
発情期のメス豚を成熟オスの精子で人為的に授精させた。授精後４．５日目に、インビボ作製した新しい胚を後期桑実胚−初期胚盤胞期に子宮角から流し出し、実施例１に記載するようにＮＣＳＵ−２３培地で一晩培養した。人為的授精後６日目に発生した拡張胚盤胞を、推定多能性ＥＳ細胞の単離のために使った。
【０１４４】
実施例３
（一次マウス胚線維芽細胞からのフィーダー層の調製）
一次マウス胚線維芽細胞からのフィーダー層の調製のための方法は、Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、「Ｅｍｂｒｙｏ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｅｍ  ｌｉｎｅｓ」、Ｉｎ：Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ−ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ、ＥＪ  Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９８７、ｐｐ７１〜１１２に記載の通りである。手短に言えば、１２９／Ｓｖ妊娠メスマウスを妊娠１４日目に屠殺した。胎児を取り出し、肝臓、心臓及び他の内臓器官は処分した。残った胎児は、トリプシン及びＥＤＴＡの存在下で細かく切り刻み、３７℃で１０〜１５分間インキュベートした。次に、トリプシンは中和し、細胞はＦａｌｃｏｎ組織フラスコ上に蒔いて、細胞がコンフルエントになるまで５％二酸化炭素の加湿環境の下３７℃でインキュベートした。細胞がコンフルエントに到達したところで、細胞をトリプシン処理により回収し、トリプシンを不活化し、細胞は、血清中１０％ＤＭＳＯで、濃度２〜５×１０６細胞／ｍＬ／チューブでクライオチューブ（ｃｒｙｏｔｕｂｅ）中で凍結し、−８０℃以下で保存した。フィーダー層の調製のために、チューブを解凍し、細胞は洗浄してＤＭＳＯを取り除き、コンフルエントに到達するまで培養フラスコで増殖させた。コンフルエントになると、細胞はトリプシン処理し、トリプシンを不活化し、洗浄した細胞はガンマ照射にかけ、使用までの２日間、１．２〜１．５×１０５細胞／ｃｍ２でＦａｌｃｏｎ器官培養皿に蒔いた。
【０１４５】
実施例４
（透明帯のないブタ胚盤胞のフィーダー層への押圧）
ブタ孵化又は拡張胚盤胞は、実施例１及び実施例２に記載の通りに得られた。代表的な胚盤胞を図１に示す。拡張胚盤胞から透明帯を機械的に取り除くために、先端部分の内径が胚盤胞の直径よりもわずかに小さい口で調節するガラスピペットで透明帯を慎重に取り除いた。２〜３回のピペット操作の後、胚盤胞を損傷することなく透明帯は容易に除かれた。次に、透明帯のないブタ胚を、フィーダー層を含有するＦａｌｃｏｎ器官培養皿に移し、３０Ｇ針の付いたインスリン用注射筒を使用してフィーダー層に慎重に押圧した。胚をフィーダー層に押圧しても、細胞が消失したり、又は、多能性細胞が栄養膜細胞から機械的に分離することはない。これは、図２及び図３に示している。胚は、濃度５０ｎＭの生体ＤＮＡ染色剤Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色し、押圧の前と後で細胞数を計数した。この研究の結果（図３Ａと図３Ｂに示す）により、押圧手順の間、細胞消失も胚の多能性成分と非多能性成分の分離も起こらないことが実証された。
【０１４６】
実施例５
（多能性細胞の単離）
ブタ６日目〜７日目孵化又は拡張胚盤胞は、実施例１及び実施例２に記載した通りに得られた。代表的な胚盤胞は図１に示している。
【０１４７】
透明帯の除去後、胚は、実施例３に記載し図２に示す通りに、マウス胚線維芽細胞フィーダー層に押圧し、Ｌ−グルタミンをモル当量単位で置換したＧｌｕｔａＭａｘ−Ｉ（ジペプチドＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン）、リボヌクレオシド及びデオキシリボヌクレオシドを含有し、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１０ｎｇ／ｍＬ  ｂＦＧＦ、１０ｎｇ／ｍＬ  ｎｒＥＧＦ、１×ＩＴＳ、５５μＭ  β−メルカプトエタノール、１×非必須アミノ酸（すべてインビトロジェン社製）及び１０ｎｇ／ｍＬ  ｈｒＬＩＦ（ミリポア社）を補充したα−ＭＥＭ培地（インビトロジェン社、カタログ番号３２５７１−０３６）で１２〜１５日間培養した。
【０１４８】
培養培地に、２０％のＨｙｃｌｏｎｅ  ＥＳ  ｓｃｒｅｅｎｅｄ  ＦＣＳ（対照ＦＣＳグループ）又は１０％のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＳＲ（実験ＳＲグループ）を添加した。
【０１４９】
各グループでフィーダー層に押圧された胚の発生は、日単位でモニターし、各グループの培地は３日ごとに取り換えた。
【０１５０】
培養２日目、両グループの押圧した胚は、栄養外胚葉細胞と推定ＥＳ細胞からなる胚性増殖物を形成した（図４）。
【０１５１】
長期間の胚性増殖物の追加の培養により、対照（ＦＣＳグループ）と実験グループ（ＳＲグループ）に発生形態学的に識別可能な構造体が生じた。
【０１５２】
７日間培養した後、ＦＣＳグループの胚性増殖物は、分化細胞（図５）又は分化細胞に取り囲まれた非常に小さな推定ＥＳ細胞成分（図６）からなっていた。このグループの最良の場合では、培養２週間後の一次胚性増殖形成により、分化細胞で取り囲まれたほとんど継代できない（直径０．５ｍｍ未満）ＰＣからなるコロニーが形成された。
【０１５３】
ＳＲグループでは、培養７日後、胚性増殖物は、ＥＳ細胞の形態的特徴（小さな細胞質／核比、複数の核小体のある核、及び細胞質中の複数の脂質封入体）のある推定ブタＥＳ細胞とわずかな量のアポトーシス栄養外胚葉細胞からなり（図７）、又は胚性増殖物は、特徴的な形態を有する均質な推定ブタＥＳ細胞のみからなっていた（図８）。
【０１５４】
次の７日間のＳＲ胚性増殖物の追加の培養により、栄養外胚葉又は他の分化細胞の徴候がまったくない均質な推定ＥＳ細胞株コロニーが形成された（図９）。
【０１５５】
これらのブタＥＳ細胞株コロニーは、その時点で直径約３ｍｍに到達していたので、簡単に機械的継代が可能である。ブタＥＳ細胞株は、記載する上記の方法を使用して作製すれば、解凍後９５％近くの生存率で大きな塊又は集団のコロニーとして凍結状態で液体窒素中に保存することが可能であろう。本明細書に記載する条件の下で増殖させた凍結解凍ブタＥＳコロニーは、樹立コロニーとして同一判定基準の未分化状態を有する。これらのブタＥＳ細胞株は、形態学的基準又は未分化細胞及び多能性を喪失せずに複数回の継代の間培養下で維持することができる。
【０１５６】
実施例６
（ブタ胚盤胞の２日目初代増殖物におけるＯｃｔ４発現）
ブタ６日目〜７日目孵化又は拡張胚盤胞は、実施例１及び実施例２に記載の通りに得られ、実施例５に記載の通りにフィーダー層上に蒔いた。培養下２日後、胚性増殖物は４％パラホルムアルデヒド中に固定し、一次ヤギ抗−Ｏｃｔ−４ポリクローナル（ＩｇＧ）抗体で染色した。二次抗体は、ＦＩＴＣで標識したロバ抗−ヤギＩｇＧ抗体であった。試料は、落射蛍光顕微鏡下で解析した。図１０Ａに示すように、ブタ胚性増殖物は、形態によって推定ＥＳ細胞（黄色矢印）と同定される細胞のグループと残りの栄養膜細胞からなっていた。図１０Ｂに示すように、形態によって推定ＥＳ細胞と同定される細胞のみがＯｃｔ−４を発現した（黄色矢印）。
【０１５７】
実施例７
（ブタＥＳ細胞における細胞質／核比）
ブタ胚幹細胞（ＥＳ細胞）は、実施例５に記載の通りに単離した。インビトロで数回継代した後、ブタＥＳ細胞を、ＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（インビトロジェン社）で酵素的に分離させて、ブタＥＳ細胞の単一細胞懸濁液を作製した。作製した単一細胞の核は、濃度５０ｎＭのＣｙｔｏ−６４Ｒｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｔａｉｎ（インビトロジェン社）で染色した。図１１Ａに示すように、ブタＥＳ細胞は、直径約１１〜１３μｍの小型細胞である。図１１Ｂに示すように、ブタＥＳ細胞の核は、細胞のほぼ全容積を占めており、即ち、これらの細胞は、ＥＳ細胞に特徴的な低細胞質／核比（又は高核／細胞質比）を有する。
【０１５８】
実施例８
（ブタ胚盤胞のＩＣＭ細胞に対するブタＥＳ細胞の高親和性）
図１２Ａと図１２Ｂで示すように、単一細胞懸濁液として調製し（実施例７に記載したように）Ｃｙｔｏ６４で染色した、数回継代した後のブタＥＳ細胞を、５日目インビトロ作製レシピエントブタ胚盤胞に注入した。レシピエントブタ胚盤胞は、実施例１に記載の通りに作製した。注入後、胚盤胞は、実施例１に記載した培養培地で一晩培養した。注入直後、胚盤胞は崩壊した（図１２Ａ及び図１２Ｂ）が、一晩培養後その形状は回復した（図１２Ｃ）。図１２Ｄに示すように、注入したブタＥＳ細胞は、レシピエント胚盤胞のＩＣＭに組み込むことができ、それによって、ブタ胚盤胞のＩＣＭ細胞に対するブタＥＳ細胞の高親和性が実証された。
【０１５９】
実施例９
（ブタ栄養膜細胞及びブタＥＳ細胞におけるＦ−アクチンパターン）
ブタ７日目インビトロ胚盤胞は、実施例１に記載の通りに作製した。ブタＥＳ細胞は、実施例５に記載の通りに、単離され数回の継代の間培養を維持された。ブタ胚盤胞とブタＥＳ細胞のコロニーを４％パラホルムアルデヒド中で固定し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８（インビトロジェン社）で標識したファロイジン（二環式ヘプタペプチド、Ｆ−アクチンフィラメントに結合する）で染色した。図１３Ａで示すように、ブタ胚における最初の分化細胞である栄養膜細胞（赤色矢印）は、細胞質全体にＦ−アクチンの拡散分布（緑色）を有する。図１３Ｂで示すように、マウス胚線維芽細胞は、その細胞質全体に広範なＦ−アクチン（緑色）微小線維束（黄色矢印）を含有し、一方ブタＥＳコロニーの細胞中のＦ−アクチン（緑色）は細胞の周辺に組織化されていて（赤色矢印）、そこでは細胞は相互に直接接触している。Ｆ−アクチン組織化のこのパターンはＥＳ細胞に特徴的である。
【０１６０】
実施例１０
（ブタＥＳ細胞におけるＳＳＥＡ−１発現）
実施例５に記載の通りに、単離され数回の継代の間培養を維持されたブタＥＳ細胞は、４％パラホルムアルデヒドで固定し、一次マウス抗−ＳＳＥＡ−１抗体（ＩｇＭ）で染色した。二次抗体は、ローダミンで標識したヤギ抗−マウス（ＩｇＭ）抗体であった。染色後、ブタＥＳ細胞コロニーは、ＤＡＰＩ付きＳｌｏｗＦａｄｅ  ａｎｔｉｆａｇｅ  ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社）に包埋した。図１４に示すように、ブタＥＳ細胞は、多能性のマーカーであるＳＳＥＡ−１（赤色）を集中的に発現している。
【０１６１】
実施例１１
（ブタＥＳ細胞におけるＯｃｔ−４発現）
実施例５に記載の通りに、単離され数回の継代の間培養を維持されたブタＥＳ細胞は、４％パラホルムアルデヒドで固定し、一次ヤギ抗−Ｏｃｔ−４ポリクローナル（ＩｇＧ）抗体で染色した。二次抗体は、ＦＩＴＣで標識したロバ抗−ヤギＩｇＧ抗体であった。試料は落射蛍光顕微鏡下で解析した。図１５に示すように、ブタＥＳ細胞は、多能性のマーカーであるＯｃｔ−４を発現している。
【０１６２】
実施例１２
（マウス胚盤胞に注入されたブタＥＳ細胞におけるＯｃｔ４の発現）
実施例５に記載の通りに、単離され数回の継代の間培養を維持されたブタＥＳ細胞を、実施例８に記載の通りに、５日目インビトロ作製レシピエントブタ胚盤胞に注入した。注入後次の日に、形状が回復した胚盤胞は実施例１１に記載の通りに、Ｏｃｔ４発現を調べた。図１６Ａで示すように、ブタ６日目非注入胚盤胞では、胚盤胞の多くの細胞がＯｃｔ−４を発現するが、ＩＣＭ細胞は核のサイズにより容易に識別できるであろう。Ｏｃｔ−４を発現し、円板として組織化されているＩＣＭ細胞（黄色矢印）はほとんど存在しない。図１６Ｂは、ブタＥＳ細胞を注入した孵化６日目ブタ胚盤胞を表している。ブタＩＣＭ細胞（黄色矢印）はより拡散した形で組織化され、注入されたブタＥＳ細胞（赤色矢印）は、それが注入された方法に従って条片として組織化されている（図１２Ａと１２Ｂを参照されたい）。ブタＥＳ細胞は高レベルのＯｃｔ−４発現を有している（又はＩＣＭ細胞は減少レベルを有する）ようにみえるが、両種類の細胞がＯｃｔ−４を発現する。
【０１６３】
したがって、本明細書に記載する多能性細胞を単離する方法は、胚外細胞の増殖を除去し多能性幹細胞を未分化状態で維持することにより、多能性幹細胞の単離の容易さと効率の改良をもたらす。さらに、血清の使用を回避することにより、血清に付随する病原体による細胞汚染の危険性が減少される。
【０１６４】
最後に、本明細書に記載する発明の種々の改変及び変更は、本発明の範囲と精神から逸脱しない限りにおいて、当業者には自明であることが理解されるであろう。本発明を特定の実施形態に関連して説明してきたが、請求の範囲に記載される本発明をそのような特定の実施形態に過度に限定するべきではないことを理解されたい。実際、当業者には明らかな、本発明の実施について記載された形態の種々の改変は、本発明の範囲内にあるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１４】
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【図１５】
2010507373.tif 000021
【図１３】
2010507373.tif 000022
【図１６】
2010507373.tif 000023
【国際調査報告】
2010507373.tif 000024
2010507373.tif 000025
2010507373.tif 000026