(57)【要約】  配列番号：１のアミノ酸ナンバリングに関して、位置４１３でプロリン残基を含む、ファミリー６セルラーゼに由来するアミノ酸配列が開示される。加えてアミノ酸配列は、配列番号：１、配列番号：２１および配列番号：２２のアミノ酸ナンバリングに関して、位置２３１でのセリンまたはスレオニン残基、位置３０５でのセリンまたはスレオニン残基、および位置４１０でのグルタミンまたはアスパラギン残基を含む群から選択される１つまたは複数の修飾を含むことができ、セルラーゼは１つまたは複数の増加した耐熱性、増加した好熱性、増加した好アルカリ性、またはその組合せを示す。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
位置４１３でプロリン残基を含む修飾したファミリー６セルラーゼであって、該位置は配列番号：１において定義されるようなトリコデルマ・リーゼイＣｅｌ６Ａアミノ酸配列と該修飾したセルラーゼの配列アライメントから決定され、該修飾したセルラーゼが対応する元のファミリー６セルラーゼと比較して強化された耐熱性、好アルカリ性、好熱性またはその組合せを示す、修飾したファミリー６セルラーゼ。
【請求項２】
ＳｅｒおよびＴｈｒからなる群から選択される位置２３１での置換アミノ酸をさらに含む、請求項１に記載の修飾したファミリー６セルラーゼ。
【請求項３】
ＳｅｒおよびＴｈｒからなる群から選択される位置３０５での置換アミノ酸をさらに含む、請求項１に記載の修飾したファミリー６セルラーゼ。
【請求項４】
ＧｌｎおよびＡｓｎからなる群から選択される位置４１０での置換アミノ酸をさらに含む、請求項１に記載の修飾したファミリー６セルラーゼ。
【請求項５】
Ｓｅｒにより位置２３１および３０５で置換されたアミノ酸ならびにＧｌｎにより位置４１０で置換されたアミノ酸をさらに含む、請求項１に記載の修飾したファミリー６セルラーゼ。
【請求項６】
２３１、３０５、４１０またはその組合せから選択される位置で１つまたは１つ以上の置換された極性アミノ酸をさらに含む、請求項１に記載の修飾したファミリー６セルラーゼ。
【請求項７】
前記修飾したファミリー６セルラーゼが糸状菌からである、請求項１に記載の修飾したファミリー６セルラーゼ。
【請求項８】
前記糸状菌がトリコデルマ・リーゼイである、請求項７に記載の修飾したファミリー６セルラーゼ。
【請求項９】
前記修飾したファミリー６セルラーゼが糸状菌からである、請求項５に記載の修飾したファミリー６セルラーゼ。
【請求項１０】
前記糸状菌がトリコデルマ・リーゼイである、請求項９に記載の修飾したファミリー６セルラーゼ。
【請求項１１】
前記修飾したファミリー６セルラーゼが、位置４１３で天然に存在するプロリン残基を備えたファミリー６セルラーゼに由来しない、請求項１に記載の修飾したファミリー６セルラーゼ。
【請求項１２】
前記修飾したファミリー６セルラーゼが、そのＴ50が少なくとも５℃増加することによって明示されるように、元のファミリー６セルラーゼの耐熱性を上回る耐熱性の増加を有する、請求項１に記載の修飾したファミリー６セルラーゼ。
【請求項１３】
前記修飾したファミリー６セルラーゼが、そのＴ50が少なくとも９℃増加することによって明示されるように、元のファミリー６セルラーゼの耐熱性を上回る耐熱性の増加を有する、請求項１に記載の修飾したファミリー６セルラーゼ。
【請求項１４】
前記修飾したファミリー６セルラーゼが、そのＴoptが少なくとも１．５℃増加することによって明示されるように、元のファミリー６セルラーゼの好熱性を上回る好熱性の増加を有する、請求項１に記載の修飾したファミリー６セルラーゼ。
【請求項１５】
前記修飾したファミリー６セルラーゼが、そのＴoptが少なくとも２．５℃増加することによって明示されるように、元のファミリー６セルラーゼの好熱性を上回る好熱性の増加を有する、請求項１に記載の修飾したファミリー６セルラーゼ。
【請求項１６】
前記修飾したファミリー６セルラーゼが、そのｐＨoptが少なくとも０．５ユニット増加することによって明示されるように、元のファミリー６セルラーゼの好アルカリ性を上回る好アルカリ性の増加を有する、請求項１に記載の修飾したファミリー６セルラーゼ。
【請求項１７】
ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：１２）；
ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｇ８２Ｅ−Ｇ２３１Ｓ−Ｎ３０５Ｓ−Ｒ４１０Ｑ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：１３）；
ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｇ２３１Ｓ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：１４）；
ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｎ３０５Ｓ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：１５）；
ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｒ４１０Ｑ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：１６）；
ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｇ２３１Ｓ−Ｎ３０５Ｓ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：１７）；
ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｇ２３１Ｓ−Ｒ４１０Ｑ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：１８）；
ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｎ３０５Ｓ−Ｒ４１０Ｑ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：１９）；
ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｇ２３１Ｓ−Ｎ３０５Ｓ−Ｒ４１０Ｑ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：２０）；
ＨｉＣｅｌ６Ａ−Ｙ４２０Ｐ  （配列番号：２１）；および
ＰｃＣｅｌ６Ａ−Ｓ４０７Ｐ（配列番号：２２）からなる群から選択される、修飾したファミリー６セルラーゼ。
【請求項１８】
請求項１において定義されるような修飾したファミリー６セルラーゼをコードするＤＮＡ配列を含み、ＤＮＡ配列が宿主微生物からの発現および分泌を調節するＤＮＡ配列に作動可能に連結される、遺伝子コンストラクト。
【請求項１９】
修飾したファミリー６セルラーゼの発現および分泌を調節するＤＮＡ配列が、前記宿主微生物に由来する、請求項１８に記載の遺伝子コンストラクト。
【請求項２０】
修飾したファミリー６セルラーゼの発現および分泌を調節するＤＮＡ配列が、酵母または糸状菌に由来する、請求項１９に記載の遺伝子コンストラクト。
【請求項２１】
修飾したファミリー６セルラーゼの発現および分泌を調節するＤＮＡ配列が、サッカロミセス属またはトリコデルマ属の種に由来する、請求項１８に記載の遺伝子コンストラクト
【請求項２２】
請求項５において定義されるような修飾したファミリー６セルラーゼをコードするＤＮＡ配列を含み、ＤＮＡ配列が宿主微生物からの発現および分泌を調節するＤＮＡ配列に作動可能に連結される、遺伝子コンストラクト。
【請求項２３】
宿主微生物からの発現および分泌を調節するＤＮＡ配列が酵母または糸状菌に由来する、請求項２２に記載の遺伝子コンストラクト。
【請求項２４】
修飾したファミリー６セルラーゼの発現および分泌を調節するＤＮＡ配列が、サッカロミセス属またはトリコデルマ属の種に由来する、請求項２３に記載の遺伝子コンストラクト。
【請求項２５】
請求項１に記載の修飾したファミリー６セルラーゼの発現および分泌が可能であり、請求項１８において定義されるような遺伝子コンストラクトを含む、遺伝子操作微生物。
【請求項２６】
前記微生物が酵母または糸状菌である、請求項２５に記載の遺伝子操作微生物。
【請求項２７】
前記微生物が、サッカロミセス属、ピチア属、ハンゼヌラ属、トリコデルマ属、アスペルギルス属、フザリウム属、フミコーラ属、ニューロスポラ属またはファネロカエテ属の種である、請求項２６に記載の遺伝子操作微生物。
【請求項２８】
前記微生物がトリコデルマ・リーゼイである、請求項２７に記載の遺伝子操作微生物。
【請求項２９】
請求項５に記載の修飾したファミリー６セルラーゼの発現および分泌が可能であり、請求項２２において定義されるような遺伝子コンストラクトを含む、遺伝子操作微生物。
【請求項３０】
前記微生物が酵母または糸状菌である、請求項２９に記載の遺伝子操作微生物。
【請求項３１】
前記微生物が、サッカロミセス属、ピチア属、ハンゼヌラ属、トリコデルマ属、アスペルギルス属、フザリウム属、フミコーラ属、ニューロスポラ属、ファネロカエテ属の種である、請求項３０に記載の遺伝子操作微生物。
【請求項３２】
前記微生物がトリコデルマ・リーゼイである、請求項３１に記載の遺伝子操作微生物。
【請求項３３】
セルロース基質の処理のための請求項１に記載の修飾したファミリー６セルラーゼの使用。
【請求項３４】
請求項１において定義されるような修飾したファミリー６セルラーゼを産生する方法であって、
（ｉ）組換え真菌株を生ずるために請求項１８において定義されるような遺伝子コンストラクトにより真菌宿主細胞を形質転換することと、
（ｉｉ）修飾したファミリー６セルラーゼを発現する組換え真菌株を選択することと、
（ｉｉｉ）修飾したファミリー６セルラーゼの発現を誘導する条件下、液内液体発酵中で、選択された組換え株を培養すること、とを含むプロセス。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は修飾したセルラーゼに関する。より具体的には、本発明は、改善された耐熱性、好アルカリ性（alkalophilicity）および／または好熱性を備えた修飾したファミリー６セルラーゼに関する。本発明は、修飾したファミリー６セルラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子コンストラクト、宿主株からの修飾したファミリー６セルラーゼの生産のための方法、およびセルロースの加水分解における修飾したファミリー６セルラーゼの使用にもまた関する。
【０００２】
背景技術
生物圏において最も多いポリサッカライドであるセルロースは、β−１，４グリコシド結合を介してともに直鎖に連結されたＤ−グルコース単位からなる。これらの鎖の長さは変化し、しばしば何千もの単位からなることができる。セルロース鎖は多数の分子内水素結合および分子間水素結合を形成し、それは不溶性セルロースミクロフィブリルの形成をもたらす。この結晶セルロースは、５００万年以上の天然の半減期を持つ抵抗性材料である。
【０００３】
この重要な再生可能な炭素源に接近するために、細菌および真菌などの微生物は、グルコースへと結晶セルロースを破壊する酵素カクテルを生ずる。一般的な３つのクラスのセルラーゼ酵素は、単純なエネルギー源のグルコースへと結晶セルロースを加水分解するために相乗的に作用する。エンド−β（ベータ）−１，４−グルカナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．４）は、ランダムに結晶セルロースの無定形領域を加水分解し、様々な長さおよび従って新しい鎖の末端のオリゴサッカライドを生じる。セロビオヒドロラーゼ（すなわちエキソ−β（ベータ）−１，４−セロビオヒドロラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．９１））は、セルロース鎖の１つの末端からセロビオース単位を前進的に加水分解する。最終的に、β（ベータ）−１，４−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２１）は、とセロビオースをグルコースへ加水分解する。
【０００４】
大部分のセロビオヒドロラーゼおよびエンド−β（ベータ）−１，４−グルカナーゼは、柔軟なリンカー領域によって隔てられた、触媒コアドメインおよびセルロース結合ドメインからなるマルチドメインタンパク質である。セルロース結合ドメインは、セルロース基質の領域へ酵素の吸着を促進し（Tomme, P., et al. 1988. Eur. J. Biochem 170:575-581; Lehtio, J., et al. 2003 Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 100:484-489）、一方触媒コアドメインはセルロースの切断に関与する。リンカー領域は、コアドメインとセルロース結合ドメインとの間の最適なドメイン間距離を保証できる（Srisodsuk, M., et al. 1993. J. Biol. Chem. 268:20756-20761）。
【０００５】
触媒ドメインは、アミノ酸配列の類似性に基づいてグリコシドヒドロラーゼファミリー（ファミリーは基質特異性は異なるが同様の折り畳みおよび加水分解機構を有する酵素を含む）へと分類される。トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）は、２つのセロビオヒドロラーゼ（すなわちＣｅｌ７Ａ（ＣＢＨ１としても公知であるファミリー７のメンバー）およびＣｅｌ６Ａ（ＣＢＨ２））、少なくとも８つのエンド−β−１，４−グルカナーゼ（すなわちＣｅｌ７Ｂ（ＥＧ１）、Ｃｅｌ５Ａ（ＥＧ２）、Ｃｅｌ１２Ａ（ＥＧ３）、Ｃｅｌ６１Ａ（ＥＧ４）、Ｃｅｌ４５Ａ（ＥＧ５）、Ｃｅｌ７４Ａ（ＥＧ６）、Ｃｅｌ６１Ｂ（ＥＧ７）およびＣｅｌ５Ｂ（ＥＧ８））、および少なくとも７つのβ−１，４−グルコシダーゼ（すなわちＣｅｌ３Ａ（ＢＧ１）、Ｃｅｌ１Ａ（ＢＧ２）、Ｃｅｌ３Ｂ（ＢＧ３）、Ｃｅｌ３Ｃ（ＢＧ４）、Ｃｅｌ１Ｂ（ＢＧ５）、Ｃｅｌ３ＤおよびＣｅｌ３Ｅ）についての公知のセルラーゼ遺伝子を含んでいる（Foreman, P.K., et al. 2003. J. Biol. Chem. 278:31988-31997）。
【０００６】
Ｔ．リーゼイのＣｅｌ６Ａ（すなわちＴｒＣｅｌ６Ａ）はこの真菌によって分泌される２つの主要セロビオヒドロラーゼの１つであり、結晶セルロースの酵素加水分解において効率的であることが示されている。ＴｒＣｅｌ６Ａはグリコシドヒドロラーゼファミリー６のメンバーであり、それは、アノマー配置の転換によりβ−１，４グリコシド結合を加水分解する酵素を含み、エンド−β−１，４−グルカナーゼに加えてセロビオヒドロラーゼも含んでいる。ＴｒＣｅｌ６Ａ（Rouvinen, J., et al. 1990. Science 249:380-386。正誤表 Science 1990 249:1359）、サーモビフィダ・フスカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ）エンド−β−１，４−グルカナーゼＣｅｌ６Ａ（ＴｆＣｅｌ６Ａ、Spezio, M., et al. 1993. Biochemistry. 32:9906-9916）、フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）セロビオヒドロラーゼＣｅｌ６Ａ（ＨｉＣｅｌ６Ａ、Varrot, A., et al. 1999 Biochem. J. 337:297-304）、フミコーラ・インソレンスのエンド−β−１，４−グルカナーゼＣｅｌ６Ｂ（HiCel6B、Davies, G.J., et al. 2000. Biochem. J. 348:201-207）および結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）Ｈ３７Ｒｖ  Ｃｅｌ６Ａ（ＭｔＣｅｌ６Ａ、Varrot, A., et al. 2005. J. Biol. Chem. 280:20181-20184）の３次元の構造が公知である。
【０００７】
工業的プロセスにおけるセルラーゼ酵素の適用は多数であり、繊維産業内では、デニムの仕上げおよび綿の軟化のために；家庭用洗剤および産業用洗剤において、色を明るくし、軟化し、泥汚れを除去するために；パルプ製紙産業において、繊維を滑らかにし、水はけを促進し、脱インキするために；食品産業において、果物および野菜からジュースを抽出し清澄化するために、および糖化のために；家畜飼料産業において、飼料の栄養価を改善するために；およびさらに、世界各国での新興産業である、発酵および蒸留されるグルコースへの植物繊維の変換において、化石燃料消費を減少させる低ＣＯ2のセルロースからエタノールを製造するために、商業上有用であることが証明されている（例えばGray, K.A., et al. 2006. Curr. Opin. Chem. Biol. 10:141-146）。
【０００８】
改善された安定特性を備えた酵素の変異型を得るために、３つの戦略が、当技術分野内で一般に使用されている。１）極端な暑さもしくは寒さ、高い塩濃度または高ｐＨもしくは低ｐＨ条件などの厳しい環境に存在する極限環境微生物からの好熱性酵素の単離（例えば米国特許第５，６７７，１５１号、米国特許出願第２００６００５３５１４号）；２）当技術分野において公知であるタンパク質安定性の原理を使用して可能性のある有益変異を同定し、タンパク質のファミリー内の配列相同性および構造的アライメントに依存する、合理的設計または部位特異的変異誘発によるタンパク質工学 （Eijsink, V.G., et al. 2004. J. Biotechnol. 113:105-20.中で概説）；および３）改善された変異型を同定するために選択またはスクリーニングを伴う変異体ライブラリーの構築を含み、所望される特性を備えた変異型を生ずる反復サイクルプロセスを含む指向性進化（最近 Eijsink VG, et al. 2005. Biomol. Eng. 22:21-30中で概説）。このアプローチは構造的または機構的情報を必要とせず、予期しない有益変異を明らかにすることができる。上の戦略を組み合わせることは、改善された酵素の同定に効率的な方法であると証明されている（Chica, R.A., et al. 2005. Curr. Opin. Biotechnol. 16:378-384）。
【０００９】
Zhang et al.（Zhang S, et al., 2000. Eur. J. Biochem. 267:3101-15）の合理的設計を使用して、２つの二重変異を用いてＴｆＣｅｌ６ＢのＮ末端ループおよびＣ末端ループを横切る新しいジスルフィド結合が導入され、４つのグリシン残基変異が耐熱性を改善するために選ばれた。どの変異もこのセロビオヒドロラーゼの耐熱性を高めず、大部分の変異は５〜１０℃耐熱性が減少した。意外にも、二重変異Ｎ２３３Ｃ−Ｄ５０６Ｃは、Ｔ50について１０℃の減少（Zhang S, et al., 2000. Eur. J. Biochem. 267:3101-15）、またはＴ50について約２℃のわずかな増加（Ai, Y.C. and Wilson, D.B. 2002. Enzyme Microb. Technol. 30:804-808）を示した。Wohlfahrt（Wohlfahrt, G., et al. 2003. Biochemistry. 42:10095-10103）は、カルボキシル−カルボキシラートペアをアミド−カルボキシラートペアへと置き換えることによって、アルカリ性ｐＨ領域でのＴｒＣｅｌ６Ａの耐熱性の増加を開示した。単一の変異体（Ｅ１０７Ｑ）および三重変異体（Ｅ１０７Ｑ／Ｄ１７０Ｎ／Ｄ３６６Ｎ）は、ｐＨ７以上で改善されたＴmを有するが、野生型ＴｒＣｅｌ６Ａの至適ｐＨであるｐＨ５ではより低いＴmを有する。これらの変異は、Ｎ末端ループおよびＣ末端ループにおいて、またはそれらの近くに見出される。Hughes et al（Hughes, S.R., et al. 2006. Proteome Sci. 4:10-23）は、より低いｐＨでの活性の改善のために最後の４つのコドン中に標的とする変化を備えたオルピノミセス属ＰＣ−２セルラーゼＦ（ＯＰＣ２Ｃｅｌ６Ｆ）の変異クローンをスクリーニングする指向性進化戦略を開示し、より低いｐＨでの改善された活性および改善された耐熱性を有する２つの変異体を同定した。
【００１０】
ファミリー６セルラーゼの合理的設計について記述する上の報告は、Ｃ末端ループの中への水素結合またはジスルフィド結合の導入が至適加水分解条件における耐熱性を高めるのに十分な戦略ではないことを示唆する。更に、変異Ｄ２４１Ｃ／Ｄ２４９Ｃによりジスルフィド結合を導入することにより、Ｔ．リーゼイのファミリー７セロビオヒドロラーゼＣｅｌ７Ａのエキソループ（それらは活性部位トンネルの天井を形成する）を安定化することは、耐熱性の改善を示さなかった（von Ossowski, I., et al. 2003. J. Mol. Biol. 333:817-829）。
【００１１】
改善された耐熱性を備えたＴｒＣｅｌ６Ａ変異型は米国特許公報２００６０２０５０４２号中で記載される。変異は、構造的情報およびモデル化プログラムを用いて、８個のファミリー６メンバーのアミノ酸配列とＴｒＣｅｌ６Ａアミノ酸配列のアライメントに基づいて同定された。このアライメントは、いわゆるコンセンサス配列の決定のための根拠として供された。ＴｒＣｅｌ６Ａの３Ｄ構造モデルに従って、障害なしに構造へと適合し、酵素の耐熱性をおそらく改善する変異は、ＴｒＣｅｌ６Ａの耐熱性を改善するための置換として選択された。ＴｒＣｅｌ６Ａの耐熱性を改善するものとして同定されたものの中には、位置４１３のセリンのチロシンへの変異（Ｓ４１３Ｙ）があった。この変異により、６１℃で１時間のプレインキュベーション後の酵素活性の保持は、元のＴｒＣｅｌ６Ａの２０〜２３％からＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｙの３９〜４３％へ増加し、しかしながら６５℃で１時間のプレインキュベーション後に、元のＴｒＣｅｌ６Ａは活性の５〜９％を保存したが、ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｙは活性の６〜８％を保存した。融解温度（すなわちＴm）は、元のＴｒＣｅｌ６Ａの６６．５℃からＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｙの６６．７〜６６．８℃へと０．２〜０．３℃だけ改善した。
【００１２】
上述のおよび関連した産業上適用のメカニズムの知識およびそれらにおけるセルラーゼの望ましい特質にもかかわらず、改善された安定性、触媒特性、または改善された安定性および触媒特性の両方を備えた耐熱性のセルラーゼの開発は有利であろう。好熱性酵素および耐熱性酵素は天然において見出されるが、これらの酵素のコスト効率の良い生産を達成することの困難さは産業的利用法のための市場へのそれらの浸透を限定してきた。したがって、Ｔ．リーゼイなどの産業用微生物によって高レベル発現で経済的に生産することができる、改善された安定したセルラーゼに対する必要性が存在する。
【００１３】
発明の概要
本発明は修飾したファミリー６セルラーゼに関する。より具体的には、本発明は、強化された耐熱性、好アルカリ性および／または好熱性を示す修飾したファミリー６セルラーゼに関する。本発明は、修飾したファミリー６セルラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子コンストラクト、宿主株からの修飾したファミリー６セルラーゼの生産のための方法、およびセルロースの加水分解における修飾したファミリー６セルラーゼの使用にもまた関する。
【００１４】
本発明は、増加した耐熱性、好熱性および好アルカリ性を備えた改善されたセルラーゼを提供することを目的とする。
【００１５】
本発明は、位置４１３でプロリンによりアミノ酸置換することによって生産された、修飾したファミリー６セルラーゼに関する。アミノ酸置換の位置は、配列番号：１において定義されるようなトリコデルマ・リーゼイＣｅｌ６Ａアミノ酸配列と修飾したセルラーゼの配列アライメントから決定される。修飾したファミリー６セルラーゼは、ファミリー６セルラーゼが由来する元の（parent）ファミリー６セルラーゼと比較して、強化された耐熱性、好アルカリ性、好熱性またはその組合せを示す。
【００１６】
修飾したファミリー６セルラーゼは、トリコデルマ・リーゼイなどの糸状菌に由来しうる。本発明の１つの実施形態において、修飾したセルラーゼは、位置４１３（ＴｒＣｅｌ６Ａナンバリング）で天然に存在するプロリン残基を有するセルラーゼ、例えば位置４１３にプロリン残基を含む天然のファミリー６セルラーゼ（オルピノミセス属の種ＰＣ−２からのＣｅｌＦ）に由来しない。
【００１７】
本発明は、位置４１３でプロリン残基を含み、２３１、３０５、４１０またはその組合せから選択される位置で極性アミノ酸をさらに含む、修飾したファミリー６セルラーゼもまた含む。
【００１８】
本発明は、位置４１３でプロリンを含み、Ｓｅｒ、またはＴｈｒからなる群から選択される位置２３１での置換アミノ酸をさらに含む、修飾したファミリー６セルラーゼにもまた関する。位置２３１で置換されたアミノ酸はＳｅｒでありえる。
【００１９】
本発明は、位置４１３でプロリンを含み、ＳｅｒおよびＴｈｒからなる群から選択される位置３０５での置換アミノ酸をさらに含む、修飾したファミリー６セルラーゼにもまた関する。
【００２０】
本発明は、位置４１３でプロリン残基を含み、ＧｌｎおよびＡｓｎからなる群から選択される位置４１０での置換アミノ酸をさらに含む、修飾したファミリー６セルラーゼにもまた関する。
【００２１】
本発明は、位置４１３でプロリン残基を含み、位置２３１および３０５でＳｅｒ残基（すなわち２３１Ｓ、３０５Ｓ）により置換されたアミノ酸、ならびに位置４１０でグルタミンにより置換されたアミノ酸をさらに含む、ファミリー６セルラーゼもまた含んでいる。これらの変異を含む修飾したファミリー６セルラーゼは、トリコデルマ・リーゼイなどの糸状菌からでありえる。
【００２２】
本発明は、位置４１３でプロリン残基を含み、元のセルラーゼと比較して、「Ｔ50」によって測定されるように、対応する元のセルラーゼよりも約５℃〜約３０℃高いまたは約９℃〜約２０℃高い耐熱性の増加を有する、修飾したファミリー６セルラーゼにもまた関する。
【００２３】
本発明は、位置４１３でプロリン残基を含み、元のファミリー６セルラーゼの最大活性温度（Ｔopt）よりも約１．５℃〜約３０℃高いまたは約２．５℃〜約２０℃高いＴoptの増加を有する、修飾したファミリー６セルラーゼにもまた関する。本発明は、位置４１３でプロリン残基を含み、元のセルラーゼと比較して、約０．５単位〜約６．０単位高い最大活性ｐＨ（ｐＨopt）の増加を有する、修飾したファミリー６セルラーゼにもまた関する
【００２４】
本発明は、以下からなる群から選択される、修飾したファミリー６セルラーゼにもまた関する：ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：１２）；ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｇ８２Ｅ−Ｇ２３１Ｓ−Ｎ３０５Ｓ−Ｒ４１０Ｑ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：１３）；ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｇ２３１Ｓ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：１４）；ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｎ３０５Ｓ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：１５）；ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｒ４１０Ｑ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：１６）；ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｇ２３１Ｓ−Ｎ３０５Ｓ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：１７）；ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｇ２３１Ｓ−Ｒ４１０Ｑ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：１８）；ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｎ３０５Ｓ−Ｒ４１０Ｑ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：１９）；ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｇ２３１Ｓ−Ｎ３０５Ｓ−Ｒ４１０Ｑ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：２０）；ＨｉＣｅｌ６Ａ−Ｙ４２０Ｐ（配列番号：２１）；およびＰｃＣｅｌ６Ａ−Ｓ４０７Ｐ（配列番号：２２）。
【００２５】
本発明は、トリコデルマ・リーゼイの株を含むが、これに限定されない宿主微生物からの修飾したファミリー６セルラーゼの発現および分泌のための遺伝子コンストラクトにもまた関する。
【００２６】
本発明は、位置４１３でプロリン残基を含む、修飾したファミリー６セルラーゼをコードするＤＮＡ配列を含む遺伝子コンストラクトに関し、このＤＮＡ配列は、宿主微生物からの発現および分泌を調節するＤＮＡ配列に操作可能に連結される。好ましくは、修飾したファミリー６セルラーゼの発現および分泌を調節するＤＮＡ配列は、修飾したセルラーゼの発現のために用いられる宿主微生物に由来する。宿主微生物は、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母またはトリコデルマ・リーゼイなどの糸状菌でありえる。
【００２７】
本発明は、位置４１３でプロリン残基を含み、位置２３１および３０５でＳｅｒにより置換されたアミノ酸ならびに位置４１０でＧｌｎにより置換されたアミノ酸をさらに含む、修飾したファミリー６セルラーゼをコードするＤＮＡ配列を含む遺伝子コンストラクトにもまた関する。ＤＮＡ配列は、宿主微生物からのその発現および分泌を調節するＤＮＡ配列に操作可能に連結される。好ましくは、修飾したファミリー６セルラーゼの発現および分泌を調節するＤＮＡ配列は、トリコデルマ・リーゼイを含むが、これに限定されない糸状菌に由来する。
【００２８】
本発明は、位置４１３でプロリン残基を含み、修飾したファミリー６セルラーゼをコードする遺伝子コンストラクトを含む、修飾したファミリー６セルラーゼの発現および分泌が可能な遺伝子操作微生物にもまた関する。１つの実施形態において、修飾したファミリー６セルラーゼは、位置２３１および３０５でＳｅｒ残基および位置４１０でＧｌｎ残基をさらに含む。好ましくは、遺伝子操作微生物は酵母または糸状菌である。遺伝子操作微生物は、サッカロミセス属、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、トリコデルマ属、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコーラ属、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ）またはファネロカエテ属（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）の種でありえる。
【００２９】
本発明は、セルロース基質の処理のための、位置４１３でプロリン残基を含む、修飾したファミリー６セルラーゼの使用にもまた関する。
【００３０】
本発明は、酵母または真菌宿主の形質転換、修飾したファミリー６セルラーゼを発現する組換え酵母または真菌株の選択、および修飾したファミリー６セルラーゼの発現を誘導する条件下での液内液体発酵（submerged liquid fermentation）における選択された組換え株の培養を含む、修飾したファミリー６セルラーゼを生産するプロセスにもまた関する。
【００３１】
位置４１３でプロリン残基を含む本発明のファミリー６セルラーゼは、野生型ファミリー６セルラーゼと比較して、改善された耐熱性、好熱性または好アルカリ性を示す。理論に束縛されるものではないが、修飾したファミリー６セルラーゼの改善された耐熱性は、小さなα−ヘリックスの安定性を高めることによるファミリー６セロビオヒドロラーゼのＣ末端ループを安定化するアミノ酸置換に起因する。
【００３２】
そのようなセルラーゼは、天然の酵素のものを超えた温度および／またはｐＨ値で酵素の安定性および活性を必要とする産業での様々な適用における使用が見出される。例えば、修飾したファミリー６セルラーゼは、本明細書において記述されるように、発酵性糖およびアルコール燃料の生産のためのリグノセルロース原料の糖化、反芻動物および非反芻動物における飼料の消化率の改善、パルプおよび紙の加工、デニムの脱色および軟化の目的のために用いることができる。
【００３３】
本発明のこの概要は、必ずしも本発明のすべての特徴について記述するとは限らない。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】ファミリー６セルラーゼの間のアミノ酸配列アライメントを示した図である。各セルラーゼについてのアミノ酸ナンバリングは、各配列の左側および右側に示されるように、トリコデルマ・リーゼイＣｅｌ６Ａ（ＴｒＣｅｌ６Ａ；  配列番号：１）のナンバリングと比較される。位置２１３、３０５、４１０および４１３における残基（ＴｒＣｅｌ６Ａと比較して）は、星印により示される。ＴｒＣｅｌ６Ａ中の対応するアミノ酸と同一の残基は太字である。セルロース結合ドメインを備えたセルラーゼについては、触媒コア配列のみが提供される。ＣｆＣｅｌ６Ｂ（配列番号：２）；ＨｉＣｅｌ６Ａ（配列番号：４）；ＨｉＣｅｌ６Ｂ（配列番号：１１）；ＭｔＣｅｌ６Ａ（配列番号：９）；ＮｐＣｅｌ６Ａ（配列番号：５）；ＯｐＣ２Ｃｅｌ６Ｆ（配列番号：６）；ＰＥ２Ｃｅｌ６Ａ（配列番号：８）；ＴｆＣｅｌ６Ａ（配列番号：１０）；ＴｆＣｅｌ６Ｂ（配列番号：３）。
【図２ａ】プラスミドベクターのＹＥｐ３５２／ＰＧＫ９１−１ΔＮｈｅＩ−ｘｙｌss−ｃｂｈ２ベクターを図示した図である。
【図２ｂ】組換えサッカロマイセス・セレヴィシエからの天然のＴｒＣｅｌ６Ａおよび修飾したＴｒＣｅｌ６Ａの発現および分泌を指令するプラスミドベクターのＹＥｐＦＬＡＧΔＫｐｎ１０ｃｂｈ２（同じ構成は同じベクター中にクローニングしたＴｒＣｅｌ６変異型について見出される）を図示した図である。
【図２ｃ】組換えサッカロマイセス・セレヴィシエからの天然のＰｃＣｅｌ６Ａおよび修飾したＰｃＣｅｌ６Ａの発現および分泌を指令するプラスミドベクターのＹＥｐＦＬＡＧΔＫｐｎ１０ＰｃＣｅｌ６Ａ（同じ構成は同じベクター中にクローニングされたＰｃＣｅｌ６変異型について見出される）を図示した図である。
【図２ｄ】組換えサッカロマイセス・セレヴィシエからの天然のＨｉＣｅｌ６Ａおよび修飾したＨｉＣｅｌ６Ａの発現および分泌を指令するプラスミドベクターのＹＥｐＦＬＡＧΔＫｐｎ１０ＨｉＣｅｌ６Ａ（同じ構成は同じベクター中にクローニングされたＨｉＣｅｌ６変異型について見出される）を図示した図である。
【図３】形質転換し、組換えトリコデルマ・リーゼイからの修飾したＴｒＣｅｌ６Ａの発現および分泌を指令するために用いられるベクターｐＣ／Ｘ−Ｓ４１３Ｐ−ＴＶを図示した図である。図示されるように、ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｐ遺伝子は、ｃｂｈ１（ＴｒＣｅｌ７Ａ）遺伝子のプロモーター、ｘｌｎ２（ＴｒＸｙｌ１１Ｂ）遺伝子の分泌シグナルペプチドおよび天然のｃｂｈ２（ＴｒＣｅｌ６Ａ）遺伝子の転写ターミネーターに作動可能に連結される。選択マーカーはアカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）ｐｙｒ４遺伝子である。
【図４ａ】４５℃〜７５℃の間の温度で１５分のインキュベーション後に、６５℃で３０分の分析中にβ（ベータ）−グルカンからの還元糖の放出によって測定される、天然のＴｒＣｅｌ６Ａならびに修飾したファミリー６セルラーゼのＴｒＣｅｌ６ＡＳ４１３Ｐ、ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｒ４１０Ｑ−Ｓ４１３Ｐ、ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｇ２３１Ｓ−Ｎ３０５Ｓ−Ｓ４１３Ｐ、ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｇ２３１Ｓ−Ｒ４１０Ｑ−Ｓ４１３Ｐ、ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｎ３０５Ｓ−Ｒ４１０Ｑ−Ｓ４１３ＰおよびＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｇ２３１Ｓ−Ｎ３０５Ｓ−Ｒ４１０Ｑ−Ｓ４１３Ｐの相対的残存活性（％）に対するプレインキュベーション温度の効果を示した図である。
【図４ｂ】４５℃〜７５℃の間の温度で１５分のインキュベーション後に、６０℃で３０分の分析中にβ（ベータ）−グルカンからの還元糖の放出によって測定される、天然のＰｃＣｅｌ６Ａおよび修飾したファミリー６セルラーゼＰｃＣｅｌ６ＡＳ４０７Ｐの相対的残存活性（％）に対するプレインキュベーション温度の効果を示した図である。
【図４ｃ】４５℃〜７５℃の間の温度での１５分のインキュベーション後に、６５℃で３０分の分析中にβ（ベータ）−グルカンからの還元糖の放出によって測定される、天然のＨｉＣｅｌ６Ａおよび修飾したファミリー６セルラーゼＨｉＣｅｌ６ＡＹ４２０Ｐの相対的残存活性（％）に対するプレインキュベーション温度の効果を示した図である。
【図５ａ】６０℃で０〜１２０分のインキュベーション後に、６５℃で、３０分の分析中に可溶性β（ベータ）−グルカン基質からの還元糖の放出によって測定される、天然のＴｒＣｅｌ６Ａならびに修飾したファミリー６セルラーゼのＴｒＣｅｌ６ＡＳ４１３Ｐ、ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｒ４１０Ｑ−Ｓ４１３Ｐ、ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｇ２３１Ｓ−Ｎ３０５Ｓ−Ｓ４１３Ｐ、ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｇ２３１Ｓ−Ｒ４１０Ｑ−Ｓ４１３Ｐ、ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｎ３０５Ｓ−Ｒ４１０Ｑ−Ｓ４１３ＰおよびＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｇ２３１Ｓ−Ｎ３０５Ｓ−Ｒ４１０Ｑ−Ｓ４１３Ｐの相対的残存活性（％）に対するプレインキュベーション時間増加の効果を示した図である。
【図５ｂ】５５℃で０〜１２０分のインキュベーション後に、６０℃で、３０分の分析中に可溶性β（ベータ）−グルカン基質からの還元糖の放出によって測定される、天然のＰｃＣｅｌ６Ａおよび修飾したファミリー６セルラーゼＰｃＣｅｌ６ＡＳ４０７Ｐの相対的残存活性（％）に対するプレインキュベーション時間増加の効果を示した図である。
【図６ａ】ｐＨ５．０で３０分のインキュベーションの間の、天然のＴｒＣｅｌ６Ａならびに修飾したファミリー６セルラーゼのＴｒＣｅｌ６ＡＳ４１３Ｐ、ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｇ８２Ｅ−Ｇ２３１Ｓ−Ｎ３０５Ｓ−Ｒ４１０Ｑ−Ｓ４１３Ｐ、ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｒ４１０Ｑ−Ｓ４１３Ｐ、ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｇ２３１Ｓ−Ｎ３０５Ｓ−Ｓ４１３Ｐ、ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｇ２３１Ｓ−Ｒ４１０Ｑ−Ｓ４１３Ｐ、ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｎ３０５Ｓ−Ｒ４１０Ｑ−Ｓ４１３ＰおよびＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｇ２３１Ｓ−Ｎ３０５Ｓ−Ｒ４１０Ｑ−Ｓ４１３Ｐの酵素活性に対する温度の効果を示した図である。データーは、各酵素についての最適温度で観察された活性に対して正規化される。
【図６ｂ】ｐＨ５．０で３０分のインキュベーションの間の、天然のＰｃＣｅｌ６Ａおよび修飾したファミリー６セルラーゼＰｃＣｅｌ６ＡＳ４０７Ｐの酵素活性に対する温度の効果を示した図である。データーは、各酵素についての最適温度で観察された活性に対して正規化される。
【図６ｃ】ｐＨ５．０で３０分のインキュベーションの間の、天然のＨｉＣｅｌ６Ａおよび修飾したファミリー６セルラーゼＨｉＣｅｌ６ＡＹ４２０Ｐの酵素活性に対する温度の効果を示した図である。データーは、各酵素についての最適温度で観察された活性に対して正規化される。
【図７ａ】ｐＨ３．９５〜７．４５で３０分のインキュベーションの間の、天然のＴｒＣｅｌ６Ａならびに修飾したファミリー６セルラーゼのＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｐ、ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｇ８２Ｅ−Ｇ２３１Ｓ−Ｎ３０５Ｓ−Ｒ４１０Ｑ−Ｓ４１３Ｐ、ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｒ４１０Ｑ−Ｓ４１３Ｐ、ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｇ２３１Ｓ−Ｎ３０５Ｓ−Ｓ４１３Ｐ、ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｇ２３１Ｓ−Ｒ４１０Ｑ−Ｓ４１３Ｐ、ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｎ３０５Ｓ−Ｒ４１０Ｑ−Ｓ４１３ＰおよびＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｇ２３１Ｓ−Ｎ３０５Ｓ−Ｒ４１０Ｑ−Ｓ４１３Ｐの酵素活性に対するｐＨの効果を示した図である。データーは、各酵素についての最適ｐＨで観察された活性に対して正規化される。
【図７ｂ】ｐＨ３．９５〜７．４５で３０分のインキュベーションの間の、天然のＰｃＣｅｌ６Ａおよび修飾したファミリー６セルラーゼＰｃＣｅｌ６ＡＳ４０７Ｐの酵素活性に対するｐＨの効果を示した図である。データーは、各酵素についての最適ｐＨで観察された活性に対して正規化される。
【図７ｃ】ｐＨ３．９５〜７．４５で３０分のインキュベーションの間の、天然のＨｉＣｅｌ６Ａおよび修飾したファミリー６セルラーゼＨｉＣｅｌ６ＡＹ４２０Ｐの酵素活性に対するｐＨの効果を示した図である。データーは、各酵素についての最適ｐＨで観察された活性に対して正規化される。
【図８】５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）中で基質の非存在下で０、４、２０．５、２８、４０．５、５２、６８、７６および９６時間５０℃のプレインキュベーション後の、前処理されたリグノセルロース基質の酵素的加水分解における、ＴｒＣｅｌ６ＡまたはＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｐ（残存する天然のトリコデルマ・リーゼイのセルラーゼ成分のすべてと共に）を含む、トリコデルマ属の全セルラーゼの相対的活性を示した図である。
【００３５】
発明を実施するための形態
これらおよび本発明の他の特徴は添付された図面が言及される以下の記述からより明らかになるだろう。
【００３６】
本発明は修飾したセルラーゼに関する。より具体的には、本発明は、強化された耐熱性、好アルカリ性および／または好熱性を備えた修飾したファミリー６セルラーゼに関する。本発明は、修飾したファミリー６セルラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子コンストラクト、宿主株からの修飾したファミリー６セルラーゼの生産のための方法、およびセルロースの加水分解における修飾したファミリー６セルラーゼの使用にもまた関する。
【００３７】
以下の記述は好ましい実施形態のただの一例であり、本発明を実行のために必要な特徴の組合せに対して限定しない。
修飾したファミリー６セルラーゼ
【００３８】
ファミリー６（以前はファミリーＢ）セルラーゼ酵素は、アノマー炭素の配置の転換によるセルロース中のβ−１，４  グルコシド結合を加水分解する酵素のグループである（Claeyssens, M. and Henrissat, B. 1992, Protein Science 1: 1293-1297）。ファミリー６セルラーゼは広汎なアミノ酸配列類似性を共有する（図１）。セルラーゼが、触媒残基として供される２つのアスパラギン酸（Ｄ）残基を含む他のファミリー６セルラーゼに共通のアミノ酸を含むならば、ファミリー６セルラーゼとして分類される。これらのアスパラギン酸残基は位置１７５および２２１で見出される（図１を参照；ＴｒＣｅｌ６Ａ（トリコデルマ・リーゼイＣｅｌ６Ａ酵素）アミノ酸ナンバリングに基づく）。今までのところ同定された大部分のファミリー６セルラーゼは中温性である。しかしながらこのファミリーは、サーモビフィダ・フスカ（ＴｆＣｅｌ６ＡおよびＴｆＣｅｌ６Ｂ）からの耐熱性のセルラーゼおよびフミコーラ・インソレンス（ＨｉＣｅｌ６ＡおよびＨｉＣｅｌ６Ｂ）からの好アルカリ性セルラーゼもまた含む。
【００３９】
ファミリー６触媒ドメインのトポロジーは、５つのα−ヘリックスによって連結された７つの平行β−ストランドを含む中心のβ−バレルを備えたα／β−バレルの変形である。ファミリー６セロビオヒドロラーゼとエンド−β−１，４−グルカナーゼとの間の重要な１つの差は、活性部位の各側に存在するＮ末端ループおよびＣ末端ループの長さであり、それはセルロースへの機能的挙動に関与する。セロビオヒドロラーゼでは、大きなＣ末端ループは活性部位を囲むＮ末端ループと共にトンネルを形成する。このことは、Ｎ末端ループおよびＣ末端ループが活性部位中の単一のセルロース鎖を維持して基質の前進的分解を促進する場合に、結晶セルロースの末端に作用するセロビオヒドロラーゼのユニークな特性を付与する。エンド−β−１，４−グルカナーゼでは、Ｃ末端ループの長さは減少し、Ｎ末端ループは活性部位から離れて短くなり、セルロース内部のβ−１，４グリコシド結合に対する接近を可能にする加水分解のためのより開いた活性部位を結果として生じる。セルロースに対するファミリー６酵素の機能的挙動におけるこれらのループの役割は、エンド−β−１，４−グルカナーゼの特性を模倣する、セルロモナス・フィミ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｆｉｍｉ）セロビオヒドロラーゼＣｅｌ６ＢのＣ末端ループの１５のアミノ酸の欠失によって確認された（Meinke, A., et al. 1995. J. Biol. Chem. 270:4383-4386）。この変異は、カルボキシメチルセルロースなどの可溶性セルロースに対する酵素のエンド−β−１，４−グルカナーゼ活性を強化し、不溶性セルロースに対する酵素のセロビオヒドロラーゼ活性を変化させた。
【００４０】
本明細書において概説されるような一般的なアプローチおよび方法に従って修飾したファミリー６セルラーゼの非限定的例は、表１中で以下に記載される。
表１：ファミリー６セルラーゼ酵素
【表１】
2010501189.tif 000003
【００４１】
好ましいファミリー６セルラーゼの例は、トリコデルマ・リーゼイＣｅｌ６Ａ、フミコーラ・インソレンスＣｅｌ６Ａ、ファネロカエテ・クリソスポリウムＣｅｌ６Ａ、セルロモナス・フィミＣｅｌ６Ｂ、サーモビフィダ・フスカＣｅｌ６Ｂを含むが、これらに限定することは意図しない。より好ましくは、本発明の修飾したセルラーゼは修飾したトリコデルマ・リーゼイＣｅｌ６Ａ酵素を含む。
【００４２】
「修飾したファミリー６セルラーゼ」または「修飾したセルラーゼ」によって、位置４１３（配列番号：１において定義されるようなトリコデルマ・リーゼイＣｅｌ６Ａアミノ酸配列と該修飾したセルラーゼの配列アライメントから決定された該位置）で、アミノ酸が、当業者に公知の技術を使用して、プロリンに変更されたファミリー６セルラーゼが意味され、それは対応する修飾していないファミリー６セルラーゼを上回る、耐熱性、好熱性、好アルカリ性またはその組合せでの改善を示す。アミノ酸置換の変更のための技術は、部位特異的変異誘発、カセット式変異誘発、ランダム変異誘発、合成オリゴヌクレオチド構築、クローニングおよび他の遺伝子工学手法を含むが、これらに限定されない（Eijsink VG, et al. 2005. Biomol. Eng. 22:21-30、参照することにより本明細書に組み入れられる）。修飾したセルラーゼが任意のファミリー６セルラーゼに由来できることが理解されるだろう。修飾したセルラーゼは、野生型セルラーゼ、または既に他のアミノ酸置換を含むセルラーゼに由来することができる。
【００４３】
本発明の目的のために、元のセルラーゼは、位置４１３（配列番号：１において定義されるようなトリコデルマ・リーゼイＣｅｌ６Ａアミノ酸配列との該修飾したセルラーゼの配列アライメントから決定された該位置）で、本来のアミノ酸のプロリンによる置換を含んでおらず、他の場所は修飾したセルラーゼと同一のセルラーゼである。それゆえ、元のセルラーゼは、遺伝子工学または他の技術によって導入された他の位置でのアミノ酸置換を含むセルラーゼでありえる。しかしながら、元のセルラーゼは、位置４１３に天然に存在するアミノ酸がプロリンであるセルラーゼを含まない。
【００４４】
「ＴｒＣｅｌ６Ａナンバリング」によって、ＴｒＣｅｌ６Ａのアミノ酸配列に基づいたアミノ酸の位置に対応するナンバリングが意味される（表１；図１；配列番号：１）。以下に開示されるように、および図１によって明らかなように、ファミリー６セルラーゼはかなりの程度の配列類似性を示す。したがって、セルラーゼ酵素との間の配列類似性を最適化するためにアミノ酸をアライメントさせることによって、およびナンバリングのための根拠としてＴｒＣｅｌ６Ａのアミノ酸ナンバリングを使用することによって、他のセルラーゼ酵素内のアミノ酸の位置をＴｒＣｅｌ６Ａと比較して決定することができる。
【００４５】
酵素耐熱性は、融解温度（Ｔm）、定義された温度での半減期（ｔ1/2）、および初期酵素活性の５０％が定義された時間にインキュベーション後に失われる温度（Ｔ50）によって定義することができる。好熱性酵素は、典型的には、それらの中温性の相当物と比較したときに、酵素耐熱性に対する寄与する因子として同定される共通の構造的要素を示す（例えば、Sadeghi, M., et al. 2006. Biophys. Chem. 119:256-270を参照）。これらの構造的要素は、高い疎水性、高度のパッキング、極性表面領域の増加、ループの欠失または短縮、相互作用、小さく多数でないキャビティー、α−ヘリックスの安定性、芳香族相互作用の増加、追加のジスルフィド架橋または金属結合および糖鎖付加部位、グリシン含量の低下およびプロリン含量の増加、水素結合および塩架橋の増加、静電的相互作用の改善、熱不安定性残基の低下、ならびに立体配座的緊張の解放を含む。
【００４６】
本発明の目的のために、セルラーゼが、元のセルラーゼのＴ50よりも少なくとも約４℃、または少なくとも約９℃高いＴ50を有するならば、または元のセルラーゼのＴ50と比較したときに、例えば約４℃〜約３０℃高いＴ50、もしくはその間の任意の量、または約９℃〜約３０℃高いＴ50、もしくはその間の任意の量を有するセルラーゼであるならば、セルラーゼは対応する元のセルラーゼに対して改善された耐熱性を示す。Ｔ50は、１５分間のプレインキュベーション後に、修飾した酵素または天然の酵素が残存活性の５０％を保持しており、実施例１０．４において詳述される分析によって決定される温度である。実施例１０．４において示されるように、６５℃での３０分の分析中のβ（ベータ）−グルカンに対する残存活性を１００％へ正規化する。
【００４７】
修飾したファミリー６セルラーゼは、対応する元のセルラーゼよりも約４℃〜約３０℃高い、もしくはその間の任意の範囲、約５℃〜約２０℃高い、もしくはその間の任意の範囲、約８℃〜約１５℃高い、もしくはその間の任意の範囲、または約９℃〜約１５℃高い、もしくはその間の任意の範囲のＴ50を有することができる。例えば、修飾したセルラーゼは、対応する元のセルラーゼよりも、少なくとも約４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８または３０℃高いＴ50を有することができる。
【００４８】
修飾したファミリー６セルラーゼは、６５℃以上のＴ50（または対応する元のファミリー６セルラーゼのＴ50を少なくとも５℃超える）を有することでもまた特徴づけることができ、例えば修飾したセルラーゼは約６５℃〜約９０℃、またはその間の任意の量のＴ50を有することができる。修飾したファミリー６セルラーゼは、７０℃以上の（または元のファミリー６セルラーゼの少なくとも９℃以上の）Ｔ50を有することができ、例えば修飾したセルラーゼは約７０℃〜約９０℃、またはその間の任意の量のＴ50を有することができる。ファミリー６セルラーゼは、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５もしくは９０℃、またはその間の任意の量のＴ50を有することができる。
【００４９】
本明細書の目的のために、セルラーゼが、対応する元のセルラーゼのＴoptよりも少なくとも約１．５℃高い最適温度（Ｔopt）を示すならば、セルラーゼは対応する元のセルラーゼに対して改善された好熱性を示す。例えばセルラーゼが、対応する元のセルラーゼのＴoptよりも約１．５℃〜約３０℃またはその間の任意の量で高い最適温度（Ｔopt）を示すならば、セルラーゼは改善された好熱性を示す。最適温度またはＴoptによって、セルラーゼが最大活性を示す最も高い温度が意味される。本明細書の目的のために、ファミリー６セルラーゼのＴoptは、実施例１０．１において詳述されるようなβ（ベータ）−グルカン基質に対する活性の温度プロフィールを測定することによって決定される。セルラーゼの活性のための温度プロフィールは最適ｐＨで測定される。
【００５０】
修飾したファミリー６セルラーゼは、対応する元のファミリー６セルラーゼのＴoptよりも少なくとも約１．５℃〜約３０℃高いＴoptを有することができる。好ましい実施形態において、修飾したファミリー６セルラーゼのＴoptは、元のファミリー６セルラーゼのＴoptよりも少なくとも約２．５℃〜約２０℃高い。例えば修飾したファミリー６セルラーゼは、対応する元セルラーゼよりも、少なくとも約１．５、２．５、４．０、５．０、６．０、８．０、１０．０、１２．０、１５．０、２０．０、２５．０または３０℃高いＴoptを有することができる。
【００５１】
「耐熱性」、「好熱性」という用語は、文献内で同じ意味で使用されている。しかしながら、本明細書において定義されるような用語の使用は、当技術分野における用語の使用法と一致している。（Mathrani, I and Ahring, B.K. 1992 Appl. Microbiol. Biotechnol. 38:23-27）。
【００５２】
本発明の目的のために、セルラーゼが、元のセルラーゼのｐＨoptよりも、少なくとも約０．５単位高いｐＨoptを示すならば、セルラーゼは対応する元のセルラーゼに対して改善された好アルカリ性を示す。ｐＨoptによって、セルラーゼが最大活性を示す最も高いｐＨが意味される。本明細書の目的のための、ｐＨoptは、実施例１０．２において設定されるようなファミリー６セルラーゼのｐＨプロフィールの測定によって決定される。
【００５３】
修飾したファミリー６セルラーゼは、元のファミリー６セルラーゼのｐＨoptよりも、少なくとも約０．５単位〜約６．０単位、またはその間の任意の量で高いｐＨoptを有することができる。好ましい実施形態において、修飾したファミリー６セルラーゼのｐＨoptは、元のファミリー６セルラーゼのｐＨoptよりも、少なくとも約０．８単位〜約５．０単位、またはその間の任意の量で高い。例えばセルラーゼのｐＨoptは、元のセルラーゼのｐＨoptよりも、約０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５または６．０単位高い。
【００５４】
本明細書において詳述されるように、強化された耐熱性、好熱性、好アルカリ性、またはその組合せを示すいくつかの変異ファミリー６セルラーゼが調製されている。いくつかの変異のリストを表２中で提供するが、それはいかなる方式でも限定するとは見なされない。
表２：修飾したファミリー６セルラーゼ
【表２】
2010501189.tif 000004
【００５５】
本発明は、宿主微生物からの修飾したファミリー６セルラーゼの発現および分泌を指令する調節性ＤＮＡ配列に作動可能に連結された修飾したファミリー６セルラーゼをコードするＤＮＡ配列を含む遺伝子コンストラクトにもまた関する。調節配列は好ましくは真菌宿主において機能性である。調節配列は、産業用発酵条件下で宿主微生物において高く発現および分泌される遺伝子に由来できる。好ましい実施形態において、調節配列は、トリコデルマ・リーゼイの任意の１つまたは複数のセルラーゼ遺伝子またはヘミセルラーゼ遺伝子に由来する。
【００５６】
遺伝子コンストラクトは、当技術分野で一般に公知であるように、コンストラクトで形質転換された遺伝子操作微生物の単離を可能にするために選択可能なマーカーをさらに含むことができる。選択可能なマーカーは、これらの条件下で他の場合には増殖することができない宿主生物に対して、抗生物質への耐性または特異的な栄養物質を欠く培地上で増殖する能力を付与できる。本発明は選択マーカーの選択により限定されず、当業者は容易に適切なマーカーを決定できる。好ましい実施形態において、選択マーカーは、ハイグロマイシン、フレオマイシン、カナマイシン、ジェネティシンまたはＧ４１８への耐性を付与するか、ｔｒｐ、ａｒｇ、ｌｅｕ、ｐｙｒ４、ｐｙｒ２、ｕｒａ３、ｕｒａ５、ｈｉｓ、またはａｄｅ遺伝子のうちの１つにおける宿主微生物の欠損を相補するか、または唯一の窒素源としてのアセトアミド上で増殖する能力を付与する。より好ましい実施形態において、選択可能なマーカーはオロチジン−５’−デカルボキシラーゼをコードするアカパンカビｐｙｒ４遺伝子である。
修飾したファミリー６セルラーゼを含む遺伝子操作微生物
【００５７】
修飾したファミリー６セルラーゼは、修飾したファミリー６セルラーゼをコードする遺伝子コンストラクトによる宿主微生物の形質転換によって生産された遺伝子操作微生物から発現および分泌できる。宿主微生物は、好ましくは、サッカロミセス属、ピチア属、ハンゼヌラ属、トリコデルマ属、ボタンタケ属、アスペルギルス属、フザリウム属、フミコーラ属、ニューロスポラ属またはファネロカエテ属の種を含むがこれらに限定されない酵母または糸状菌である。典型的には、宿主微生物は、任意のまたはすべてのファミリー６セルラーゼをコードする１つまたは複数の遺伝子が削除されたものである。最も好ましい実施形態において、宿主微生物はトリコデルマ・リーゼイの産業用株である。
【００５８】
遺伝子コンストラクトは、ＣａＣｌ2による細胞の処理、エレクトロポレーション、微粒子銃照射、ＰＥＧに仲介されるプロトプラストの融合を含むがこれらに限定されない当業者に公知の微生物形質転換の多数の方法によって宿主微生物の中へ導入されてもよい（例えばWhite et al.、  ＷＯ２００５／０９３０７２、参照することにより本明細書に組み入れられる）。
【００５９】
修飾したファミリー６セルラーゼを発現する組換え真菌株の選択後に、選択された組換え株は、修飾したファミリー６セルラーゼの発現を誘導する条件下で深部液体発酵において培養できる。
【００６０】
セルロース基質の加水分解
本発明は、セルロース基質の加水分解のための本明細書において記述される修飾したファミリー６セルラーゼの使用にもまた関する。用語「セルロース基質」によって、植物バイオマスに由来し、エタノールまたは他の高付加価値産物の生産、飼料、パルプおよび木材チップなどの林業廃棄物産物、ならびに織物のためのリグノセルロース原料を含むがこれらに限定されないセルロースを含む、任意の基質が意味される。
【００６１】
用語「リグノセルロース原料」によって、非木材植物バイオマスなどであるがこれらに限定されない任意のタイプの植物バイオマス、イネ科草本などであるがこれらに限定されない農作物（例えば、スイッチグラス、コードグラス、ライグラス、ススキ属、クサヨシまたはその組合せなどのＣ４イネ科草本であるがこれらに限定されない）、製糖残留物（例えば、バガス（ｂａｇｇａｓｅ）、ビートパルプまたはその組合せであるがこれらに限定されない）、農業残留物、（例えば、大豆茎葉、トウモロコシ茎葉、稲わら、モミガラ、大麦わら、トウモロコシ穂軸、麦わら、キャノーラわら、エンバクわら、オート麦もみ殻、トウモロコシファイバー、またはその組合せであるがこれらに限定されない）、林業バイオマス（例えば、リサイクル木材パルプファイバー、おがくず、硬材（例えばハコヤナギ材）、軟材またはその組合せであるがこれらに限定されない）が意味される。
【００６２】
エタノールまたは他の産物の生産のためのリグノセルロース原料の糖化において、本発明のセルラーゼは、例えば水蒸気爆発によるがこれに限定されずに生産された前処理済み原料を加水分解するために使用されてもよい（Foody、米国特許第４，４６１，６４８号を参照、参照することにより本明細書に組み入れられ、読者の参考のために指し示される）。セルロースのグルコースへの変換が低い状態で、繊維状原料がつやのないテクスチャーに変換されてセルロース表面領域が非常に増加されるように、前処理は、蒸気、酸、または典型的には蒸気および酸の組合せによる原料の処理を含むことができる。次に本発明のセルラーゼ酵素は、続く工程でセルロースをグルコースへ加水分解するために使用できる。次に、グルコースはエタノールまたは他の産物に変換できる。
【００６３】
漂白を強化またはパルプの叩解エネルギーを減少させるために、本発明の修飾したセルラーゼ酵素をパルプまたは木材チップに加えることができる。パルプは化学パルプ化プロセス、または機械的叩解により生産できる。
ファミリー６セルラーゼの耐熱性の増加
【００６４】
変異ファミリー６セルラーゼの耐熱性を、基質の非存在下において、異なる温度での酵素のプレインキュベーションによって比較した。１５分後に、基質として可溶性β（ベータ）−グルカンを用いてセルラーゼの残存活性を標準的な分析によって決定した。
【００６５】
ファミリー６セルラーゼの耐熱性に対するＳ４１３Ｐ変異の効果は、単独でまたは１つもしくは複数のＧ２３１Ｓ、Ｎ３０５ＳおよびＲ４１０Ｑとの組合せで、修飾したＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｐと元のＴｒＣｅｌ６Ａの比較研究によって決定された。最大１２０分間のより高い温度でのプレインキュベーション後に、前者は後者よりも高い残存活性を保持した（図５ａ）。
【００６６】
ファミリー６セルラーゼが、残存活性の５０％（Ｔ50）を保持を可能にするプレインキュベーション温度が決定された。修飾したファミリー６セルラーゼ（ＴｒＣｅｌ６ＡＳ４１３Ｐ）については、元のＴｒＣｅｌ６Ａの５９℃と比較して、Ｔ50は６４．１℃であった（図４ａ）。このことは、Ｓ４１３Ｐ変異の導入を介して５℃の耐熱性の増加を表わした。
【００６７】
他のＴｒＣｅｌ６Ａ変異型のＴ50は、少なくとも野生型ＴｒＣｅｌ６Ａよりも３．２℃高いものだった。ＰｃＣｅｌ６Ａ−Ｓ４０７ＰおよびＨｉｃｅｌ６Ａ−Ｙ４２０Ｐもまた、それぞれの元の酵素と比較したときにＴ50の増加を示した（図４ｂおよびｃ）。
ファミリー６セルラーゼの好熱性の増加
【００６８】
修飾したファミリー６セルラーゼの好熱性は、β（ベータ）−グルカンの加水分解に対する分析温度の効果の測定によって決定された。
【００６９】
他と異なり最大活性の８０％以上の広い温度領域を示す変異型ＴｒＣｅｌ６ＡＧ２３１Ｓ−Ｎ３０５Ｓ−Ｒ４１０Ｑ−Ｓ４１３Ｐ以外は、修飾したファミリー６セルラーゼはすべて、それらのそれぞれの野生型と比較したときに、β（ベータ）−グルカン加水分解について改善されたＴoptを示した（図６）。すべてのＴｒＣｅｌ６Ａ変異型の中で、ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｐは、７２．２℃のより高い至適温度（野生型ＴｒＣｅｌ６Ａと比較して５．６℃の好熱性増加）を有する（図６ａ）。それぞれの野生型と比較したときに、ＰｃＣｅｌ６Ａ−Ｓ４０７ＰおよびＨｉＣｅｌ６Ａ−Ｙ４２０Ｐもまた至適温度の増加を示す（図６ｂおよびｃ）。
【００７０】
ファミリー６セルラーゼの好アルカリ性の増加
ファミリー６セルラーゼのｐＨ／活性プロフィールに対するＳ４１３Ｐ変異の効果もまた単独でまたは１つまたは複数のＧ２３１Ｓ、Ｎ３０５ＳおよびＲ４１０Ｑの組合せで研究された。
【００７１】
それらの野生型と比較したときに、修飾したファミリー６セルラーゼはすべて増加した好アルカリ性を示す。ＴｒＣｅｌ６Ａについては、有意なシフトが変異型ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｇ２３１Ｓ−Ｒ４１０Ｑ−Ｓ４１３Ｐ（＋１．２５ｐＨ単位）で、その次にＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｇ２３１Ｓ−Ｎ３０５Ｓ−Ｒ４１０Ｑ−Ｓ４１３Ｐ（＋１．０１ｐＨ単位）で観察された。
【００７２】
ファミリー６でないセルラーゼとの組合せにおいて、修飾したファミリー６セルラーゼを含むセルラーゼ系は、改善された耐熱性を示す。ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｐを含むトリコデルマ属セルラーゼ系は、９６時間５０℃で基質の非存在下におけるインキュベーション後にその最大活性の少なくとも８０％を維持するが、元のＴｒＣｅｌ６Ａを含む対応するセルラーゼ系は、その最大活性の５０％のみしか維持しない（図８）。
【００７３】
要約すれば、本発明の改善された耐熱性、好アルカリ性および／または好熱性の変異ファミリー６セルラーゼは、位置４１３でプロリン残基を含み、以下のアミノ酸置換の１つまたは１つ以上をさらに含むことができる：
（ｉ）位置２３１で置換されたアミノ酸（Ｓｅｒを含むがこれに限定されない極性アミノ酸など）；
（ｉｉ）位置３０５で置換されたアミノ酸（Ｓｅｒを含むがこれに限定されない極性アミノ酸など）；
（ｉｉｉ）位置４１０で置換されたアミノ酸（Ｇｌｎを含むがこれに限定されない極性アミノ酸など）；および
（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）で設定された上述の変異の任意の組合せ。
【００７４】
上でリストされたアミノ酸置換との組合せでＳ４１３Ｐを含む好ましいファミリー６セルラーゼ変異の非限定例は、表２中で与えられる。
【００７５】
更に、本発明の修飾したファミリー６セルラーゼは、Ｓ４１３Ｐとの組合せで、上でリストされないアミノ酸置換を含むことができる。
【００７６】
上の記述は、いかなる方式でも請求された発明を限定するようには意図されない。更に、検討された特色の組合せは、本発明の説明に絶対に必要というわけではない。
【００７７】
本発明は以下の実施例においてさらに示される。しかしながら、これらの実施例は例示的な目的のみのためであり、いかなる方式でも本発明の範囲を限定するためには使用されるべきでないことは理解される。
【００７８】
実施例
実施例１は、以下の実施例で使用される株およびベクターについて記述する。実施例２〜５は、ＴｒＣｅｌ６Ａ遺伝子のランダム変異誘発、酵母ベクターにおけるランダム変異誘発ライブラリーのクローニング、および増加した耐熱性を備えた修飾したファミリー６セルラーゼを同定するハイスループットスクリーニングについて記述する。実施例６〜８は、より高い発現のための代替の酵母ベクター中への修飾したファミリー６セルラーゼ遺伝子および天然のファミリー６セルラーゼ遺伝子のクローニング、組換えおよび発現について記述する。実施例９は、修飾したファミリー６セルラーゼの酵素的特性評価について記述する。実施例１０は、糸状菌において修飾したファミリー６セルラーゼを発現および分泌する遺伝子コンストラクトについて記述する。実施例１１は、修飾したファミリー６セルラーゼを発現する遺伝子コンストラクトによる真菌プロトプラストの形質転換について記述する。実施例１２は、深部液体培養における修飾した微生物からの修飾したファミリー６セルラーゼの生産について記述する。実施例１３は、他のファミリーからのセルラーゼとの組合せにおける修飾したファミリー６セルラーゼを含む全トリコデルマ属セルラーゼの特性評価について記述する。
【００７９】
実施例１  株およびベクター
サッカロマイセス・セレヴィシエ株ＤＢＹ７４７（ｈｉｓ３−Δ１  ｌｅｕ２−３  ｌｅｕ２−１１２  ｕｒａ３−５２  ｔｒｐ１−２８９（アンバー変異）ｇａｌ（ｓ）  ＣＵＰ（ｒ））を、ＡＴＣＣから入手した。Ｓ．セレヴィシエ株ＢＪ３５０５（ｐｅｐ４：：ＨＩＳ３  ｐｒｂ−Δ１．６Ｒ  ＨＩＳ３  ｌｙｓ２−２０８  ｔｒｐ１−Δ１０１  ｕｒａ３−５２  ｇａｌ２  ｃａｎ１）は、シグマ（Ｓｉｇｍａ ）社から入手し、アミノ末端酵母ＦＬＡＧ発現キット（Ａｍｉｎｏ−Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｙｅａｓｔ  ＦＬＡＧ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ）の一部であった。
【００８０】
破壊した天然ＴｒＣｅｌ６Ａ遺伝子を含むＲｕｔＣ３０（ＡＴＣＣ＃５６７６５；Montenecourt, B. and Eveleigh, D. 1979. Adv. Chem. Ser. 181: 289-301）に由来する入手したトリコデルマ・リーゼイの株を、本明細書において記述された実験で使用した。
【００８１】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株ＨＢ１０１（Ｆ-  ｔｈｉ−１  ｈｓｄＳ２０  （ｒB-，  ｍB-）  ｓｕｐＥ４４  ｒｅｃＡ１３  ａｒａ−１４  ｌｅｕＢ６  ｐｒｏＡ２  ｌａｃＹ１  ｇａｌＫ２  ｒｐｓＬ２０  （ｓｔｒr）  ｘｙｌ−５  ｍｔｌ−１）およびＤＨ５α（Ｆ-  Φ８０ｌａｃＺΔＭ１５  Δ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９  ｒｅｃＡ１  ｅｎｄＡ１  ｈｓｄＲ１７（ｒk-，  ｍk+）  ｐｈｏＡ  ｓｕｐＥ４４  ｔｈｉ−１  ｇｙｒＡ９６  ｒｅｌＡ１  λ-）は、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社から入手した。
【００８２】
フミコーラ・インソレンスおよびファネロカエテ・クリソスポリウムの株は、ＡＴＣＣ（登録商標）（それぞれ＃２２０８２（商標）および＃２０１５４２（商標））から入手した。
【００８３】
ＹＥｐ３５２／ＰＧＫ９１−１ベクターは、国立衛生研究所から入手した。ＹＥｐＦＬＡＧ−１ベクターは、アミノ末端酵母ＦＬＡＧ発現キットの一部としてシグマ社から入手した。ｐＡＬＴＥＲ（登録商標）−１ベクターは、アルタード・サイト（Ａｌｔｅｒｅｄ  Ｓｉｔｅ）（登録商標）ＩＩインビトロ変異誘発システムの一部としてプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社から入手した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ  ＫＳ−ベクターは、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社から入手した。
【００８４】
実施例２  ＹＥｐ３５２／ＰＧＫ９１−１の中へのＴｒＣｅｌ６Ａ遺伝子のクローニングおよび酵母における形質転換
２．１Ｔ．リーゼイからの全ＲＮＡの単離、および全ｃＤＮＡの作製。
Ｔ．リーゼイのバイオマスを実施例１３中で記載されるような誘導条件下で増殖させ、次に５０ｍｇのバイオマスを使用して、製造者手順に従ってアブソルートリーＲＮＡ（Ａｂｓｏｌｕｔｅｌｙ  ＲＮＡ）（登録商標）ミニプレップキット（ストラタジーン社）により全ＲＮＡを単離した。製造者手順に従ってスーパースクリプト（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ）（商標）ＩＩ逆転写酵素（インビトロゲン社）を使用して、全ＲＮＡから全ｃＤＮＡを作製した。
【００８５】
２．２酵母におけるクローニングおよび形質転換。
ＮｈｅＩおよびＫｐｎＩの制限酵素を使用するクローニングを容易にするために、ＹＥｐ３５２／ＰＧＫ９１−１ベクターの位置１９３６での唯一のＮｈｅＩ部位をＤＮＡポリメラーゼＩラージ（クレノウ）フラグメントを使用してブラントにし、ＹＥｐ３５２／ＰＧＫ９１−１ΔＮｈｅＩを作製した。
【００８６】
ＴｒＣｅｌ６Ａをコードするｃｂｈ２遺伝子を、コード配列へＳｔｕＩ−ＮｈｅＩ部位を上流におよびＫｐｎＩ−ＢｇｌＩＩ−ＳｔｕＩ部位を下流に導入するプライマー（Ｃ２ＳＴＵ５およびＣ２ＳＴＵ３）を使用して、全ｃＤＮＡ（実施例２．１中に記載されるように作製された）からのＰＣＲによって増幅した。平行して、ＴｒＸｙｌ１１Ｂ遺伝子の分泌シグナルペプチドを、アンプリコンの５’端にＢｇｌＩＩおよび３’端にＮｈｅＩ部位を導入するプライマーを使用して、ＴｒＸｙｌ１１Ｂのゲノミッククローン（ｐＸＹＮ２Ｋ２、実施例１１．３）からのＰＣＲによって増幅し、続いてこれらの制限部位を使用してｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ  ＫＳ−（ストラタジーン社）の中へクローニングしてプラスミドｐＸＹＮＳＳ−Ｎｈｅを作製した。次にアンプリコンを、ｐＸＹＮＳＳ−Ｎｈｅの唯一のＮｈｅ１部位およびＢｇｌＩＩ部位の中へクローニングした。５’末端および３’末端でＢｇｌＩＩ部位を備えたＴｒＸｙｌ１１Ｂの分泌シグナルペプチドに作動可能に連結されたＴｒＣｅｌ６Ａ遺伝子を含むフラグメントは、プライマー（ＢＧＬ２ＸＹＦおよびＣ２ＳＴＵ３）を使用して、この中間コンストラクトからのＰＣＲによって続いて増幅された。このアンプリコンをＹＥｐ３５２／ＰＧＫ９１−１ΔＮｈｅＩベクターのＢｇｌＩＩ部位でクローニングしてＹＥｐ３５２／ＰＧＫ９１−１ΔＮｈｅＩ−ｘｙｌss−ｃｂｈ２ベクター（図２ａ）を作製し、Gietz, R. D. and Woods, R.A.（Gietz, R.D. and Woods, R. A. 2002. Meth. Enzym. 350: 87-96）によって記述された手順を使用して、酵母株ＤＢＹ７４７中に形質転換し、ＳＣ−Ｕｒａプレートにプレーティングした。プライマー配列は以下にリストされる。
ＳｔｕＩ  ＮｈｅＩ
Ｃ２ＳＴＵ５：５’ＧＡＴ  ＡＧＧ  ＣＣＴ ＧＣＴ  ＡＧＣ  ＴＧＣ  ＴＣＡ  ＡＧＣ  ＧＴＣ  ＴＧＧ  ＧＧＣ（配列番号：２４）
ＳｔｕＩ  ＢｇｌＩＩ  ＫｐｎＩ
Ｃ２ＳＴＵ３：５’ＡＴＣ  ＡＧＧ  ＣＣＴ ＡＧＡ  ＴＣＴ ＧＧＴ  ＡＣＣ  ＴＴＡ  ＣＡＧ  ＧＡＡ  ＣＧＡ  ＴＧＧ（配列番号：２５）
ＢｇｌＩＩ
ＢＧＬ２ＸＹＦ：５’ＧＡＴ  ＣＡＧ  ＡＴＣ  ＴＡＴ  ＧＧＴ  ＣＴＣ  ＣＴＴ  ＣＡＣ  ＣＴＣ  ＣＣＴ  Ｃ（配列番号：２６）
ＳＣ−Ｕｒａプレートは以下を含む。
成分    ｇ／Ｌ
アミノ酸および硫酸アンモニウム不含有酵母窒素ベース（ＢＤ）  １．７
（ＮＨ4）2ＳＯ4（シグマ社）  ５．０
ウリジン不含有完全添加物培地（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）社）  ０．７７
寒天（ＢＤ）  １７．０
グルコース（フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）社）  ２０．０
ｐＨ５．６
【００８７】
実施例３  ｃｂｈ２のエラープローンＰＣＲライブラリーの製造。
ランダム変異誘発ライブラリーは２つの方法（Ｍｎ2+／ｄＩＴＰ法およびバイアスヌクレオチド法）を使用して作製した。Ｍｎ2+／ｄＩＴＰ方法のために、ＴｒＣｅｌ６Ａ遺伝子を、２ステップＰＣＲ法で上述のＣ２ＳＴＵ３およびＢＧＬ２ＸＹＦプライマーを使用して、ＹＥｐ３５２／ＰＧＫ９１−１ΔＮｈｅＩ−ｘｙｌss−ｃｂｈ２ベクターから増幅した。第１のステップにおいて、２０μＭＭｎＣｌ2存在下で２０サイクルの間に増幅が生じる。第２のステップは同じプライマーで行うが、鋳型として第１のステップからの産物を、０、２５、５０、７５または１００μＭｄＩＴＰ（対照では０μＭ）と共に使用する。バイアスヌクレオチド法については、ＰＣＲはプリン塩基とピリミジン塩基との間で、１：３、１：５または１：１０モル比でそれぞれ行われる。
【００８８】
ほとんどの変異を酵素のコア中に得るように、両方の場合での最終的なアンプリコンを、ＹＥｐ３５２／ＰＧＫ９１−１ΔＮｈｅＩ−ｘｙｌss−ｃｂｈ２ベクター中のＸｈｏＩおよびＫｐｎＩの制限部位を使用し（ＸｈｏＩは、酵素のリンカー中のＳ５５のコドンをコードする配列の直後を切断する）、Ｓ．セレヴィシエの株ＤＢＹ７４７中に形質転換し、クローニングした。
【００８９】
実施例４  ＴｒＣｅｌ６Ａの部位特異的セミランダムライブラリーの作製
グリシン残基はβ−炭素を有しておらず、したがってかなりより大きな骨格の立体配座的自由度を有する。ＴｒＣｅｌ６Ａの三次元構造の解析によって、４つのグリシン残基（すなわちＧ９０、Ｇ８５、Ｇ２３１およびＧ３８４）がこの自由度を低下させるために標的とされた。Ｇ２３１位置以外のすべては飽和であり、Ｇ２３１は、以下のプライマーを使用して、メガプライマーＰＣＲによってアラニン、プロリン、セリンまたはスレオニンにランダムに変異させた。
Ｇ90をＸｘｘへ：５’ＣＣＡ  ＡＣＡ  ＡＡＡ  ＧＧＧ  ＴＴＮ  ＮＮＴ  ＧＡＡ  ＴＡＣ  ＧＴＡ  ＧＣＧ  Ｇ（配列番号：２７）
Ｇ85をＸｘｘへ：５’ＣＣＣ  ＡＡＧ  ＧＡＧ  ＴＧＡ  ＣＮＮ  ＮＡＡ  ＣＡＡ  ＡＡＧ  ＧＧＴ  ＴＧ（配列番号：２８）
Ｇ231をＡ／Ｐ／Ｓ／Ｔへ：５’ＧＧＴ  ＧＡＣ  ＣＡＡ  ＣＣＴ  ＣＮＣ  ＮＡＣ  ＴＣＣ  ＡＡＡ  ＧＴＧ  ＴＧ（配列番号：２９）
Ｇ384をＸｘｘへ：５’ＣＣＧ  ＣＡＡ  ＡＣＡ  ＣＴＮ  ＮＮＧ  ＡＣＴ  ＣＧＴ  ＴＧＣ  ＴＧ（配列番号：３０）
【００９０】
アンプリコンはすべて、実施例３で記載されているようなＹＥｐ３５２／ＰＧＫ９１−１ΔＮｈｅＩ−ｘｙｌss−ｃｂｈ２ベクター中にクローニングされた。
【００９１】
実施例５  増加した耐熱性を備えた修飾したファミリー６セルラーゼのためのＴｒＣｅｌ６Ａ遺伝子ライブラリーのスクリーニング
実施例３および４の通りに作製された合計３３７１のＴｒＣｅｌ６Ａ変異型を、以下のようにスクリーニングした。各酵母コロニーを、１ｍＬのＹＰＤ（１％酵母抽出物、２％ペプトン、２％グルコース）培地および１つの１．５ｍｍガラスビーズを含む９６ディープウェルプレートのウェル中で、ボルテンプ（Ｖｏｒｔｅｍｐ）装置（ラボネット（Ｌａｂｎｅｔ）社）において６５０ｒｐｍおよび３０℃で２日間培養した。プレートを次に５分間３，０００×ｇで遠心分離し、３００μＬの上清をバイオ−ドット（Ｂｉｏ−Ｄｏｔ）装置（バイオ−ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）社）を使用して２つのバイオダインＢ正荷電ナイロン膜（ポール・ゲルマン（Ｐａｌｌ  Ｇｅｌｍａｎ）社）のそれぞれを通して濾過した。
【００９２】
ｐＨ４．８、５０ｍＭクエン酸ナトリウムを含む、湿らせた（濡らしてない）ワットマン紙上に、膜を置いた。１つは６２℃で１２分間、および他は室温（対照）でインキュベートした。次に膜をβ（ベータ）−グルカン基質を含む寒天プレート上に置き、湿潤チャンバー中で５０℃で一晩でインキュベートした。
成分    ｇ／Ｌ
（ＮＨ4）2ＳＯ4（シグマ社）    ５．０
β−グルカン（大麦、中粘度；メガザイム（Ｍｅｇａｚｙｍｅ）社）  ２．０
寒天（ＢＤ）  １７．０
グルコース（フィッシャー社）  ２０．０
ｐＨ５．６
【００９３】
次に寒天プレートを０．１％（ｗ／ｖ）コンゴーレッド溶液でそれらを覆うことにより３０〜６０分染色し、次に脱イオン水で２〜３時間洗い流して未結合色素を除去し、１０〜１５分間１ＭＮａＣｌで覆った。透明な区域が観察でき、対照と熱処理した膜で覆われたプレートとの間で比較した。各プレートを少なくとも２人によって吟味し、野生型ＴｒＣｅｌ６Ａ対照と比較した場合、６２℃で１２分インキュベーション後に活性を維持すると思われるすべての陽性の変異型は、可能性のある陽性と判断された。追加の機会における表現型の観察を可能にし、偽陰性の可能性を減少させるために、可能性のある各々の陽性クローンをミクロ培養において再び生産した。
【００９４】
そのスクリーニングからの５つの陽性のクローンの保有する変異を同定するために配列決定した。クローンＥ６はＳ４１３Ｐ変異を含み、クローンＧ３およびＦ７の両方はＧ２３１Ｓ変異を含み、クローンＡ３はＮ３０５Ｓ変異を含み、クローン７はリンカーペプチドの端にＧ８２Ｅ変異だけでなくＲ４１０Ｑ変異も含んでいた。
【００９５】
実施例６  サッカロマイセス・セレヴィシエからのより高い発現のためのＹＥｐＦＬＡＧ−１ベクターの中へ修飾したＴｒＣｅｌ６Ａ遺伝子のクローニング
遺伝子をα接合因子分泌シグナルペプチドに作動可能に連結するような方法で、実施例５において同定された修飾したＴｒＣｅｌ６Ａ遺伝子をＹＥｐＰＬＡＧ−１ベクターの中へクローニングすることを容易にするためには、２つの修飾が必要であった。第一に、ＹＥｐＦＬＡＧ−１ベクターのα分泌シグナルペプチド配列（１４５７ｂｐ）中に存在する唯一のＫｐｎＩ部位を除去した。これは２つの相補的な変異誘発性プライマー（５’−ＦＬＡＧΔＫｐｎＩおよび３’−ＦＬＡＧΔＫｐｎＩ）を使用するＰＣＲによって行われた。次に変異誘発反応物を３７℃で１時間ＤｐｎＩにより消化し、熱湯中にチューブを置いてプラスミドを再環状化させ、室温までゆっくり冷却させた。この反応物を、大腸菌ＤＨ５αの化学的コンピテント菌中に直接形質転換した。ＫｐｎＩにより１回だけ消化したクローンを所望の変異を確認するために配列決定し、さらなる研究に使用し、ＹＥｐＦＬＡＧΔＫｐｎと命名した。プライマー配列を以下にリストする。
ΔＫｐｎＩ
５’−ＦＬＡＧΔＫｐｎＩ：５’ＣＴＡ  ＡＡＧ  ＡＡＧ  ＡＡＧ  ＧＧＧ  ＴＡＣ  ＡＴＴ  ＴＧＧ  ＡＴＡ  ＡＡＡ  ＧＡＧ  ＡＣ（配列番号：３１）
ΔＫｐｎＩ
３’−ＦＬＡＧΔＫｐｎＩ：５’ＧＴＣ  ＴＣＴ  ＴＴＴ  ＡＴＣ  ＣＡＡ  ＡＴＧ  ＴＡＣ  ＣＣＣ  ＴＴＣ  ＴＴＣ  ＴＴＴ  ＡＧ（配列番号：３２）
【００９６】
第二に、Ｔ．リーゼイｃｂｈ１遺伝子を、プライマーを使用してＰＣＲによりｐＣＯＲ１３２（実施例１１．２）から増幅し、増幅されたフラグメントの５’端にＸｈｏＩ−ＮｈｅＩ部位および３’端にＫｐｎ１−Ａｐａ１部位を導入した。次にこのフラグメントを、ＸｈｏＩ／ＡｐａＩフラグメントとしてＸｈｏＩ／ＡｐａＩで直線化したＹＥｐＦＬＡＧ−１発現ベクターへと挿入した。生じたベクター（ＹＥｐＦＬＡＧΔＫｐｎ１０）は、コード領域をα分泌シグナルペプチドに作動可能に連結するような方法で、ＮｈｅＩ／ＫｐｎＩフラグメントとして実施例５において同定された修飾したＴｒＣｅｌ６Ａ遺伝子の挿入を可能にする。
【００９７】
天然ＴｒＣｅｌ６Ａ遺伝子または修飾したＴｒＣｅｌ６Ａ遺伝子を含むＹＥｐ３５２／ＰＧＫ９１−１ΔＮｈｅＩ−ｘｙｌss−ｃｂｈ２ベクターを、Hoffman and Winstonからの修飾した方法を使用して、酵母株ＤＢＹ７４７の形質転換体から単離し（Hoffman, C. S., and Winston, F. 1987. Gene 57: 267-272）、大腸菌ＨＢ１０１化学的コンピテント菌中に形質転換した。修飾したＴｒＣｅｌ６Ａ遺伝子を、ＮｈｅＩおよびＫｐｎＩでの消化によりＹＥｐ３５２／ＰＧＫ９１−１ΔＮｈｅＩ−ｘｙｌss−ｃｂｈ２ベクターから除去し、同じ制限酵素を使用してＹＥｐＦＬＡＧΔＫｐｎ１０中にクローニングした。最終的なコンストラクトである、ＹＥｐＦＬＡＧΔＫｐｎ１０−ｃｂｈ２、ＹＥｐＦＬＡＧΔＫｐｎ１０−Ｇ８２Ｅ−Ｒ４１０Ｑ、ＹＥｐＦＬＡＧΔＫｐｎ１０−Ｎ３０５Ｓ  ＹＥｐＦＬＡＧΔＫｐｎ１０−Ｓ４１３ＰおよびＹＥｐＦＬＡＧΔＫｐｎ１０−Ｇ２３１Ｓ（図２ｂ）を、Gietz and Woods によって記述された手順を使用して、酵母株ＢＪ３５０５中に形質転換し（Gietz, R.D. and Woods, R. A. 2002. Meth. Enzym. 350: 87-96）、ＳＣ−ｔｒｐプレート上にプレーティングした。すべての変異型のクローニングされた領域の完全性は、ＤＮＡ配列分析によって確認された。この酵母ベクターによって生産された元のＴｒＣｅｌ６Ａのアミノ酸配列（配列番号：２３）は、ＦＬＡＧペプチドを含むＣ末端延長を示す。しかしながら、この小さなペプチド延長が、元のＴｒＣｅｌ６Ａセルラーゼまたは修飾したＴｒＣｅｌ６Ａセルラーゼの耐熱性、好熱性または好アルカリ性にいかなる方法でも寄与しないことは、実験的に決定された。ＳＣ−ｔｒｐプレートは以下を含む。
成分    ｇ／Ｌ
アミノ酸および硫酸アンモニウム不含有酵母窒素ベース（ＢＤ）  １．７
（ＮＨ4）2ＳＯ4（シグマ社）    ５．０
トリプトファン不含有酵母合成ドロップアウト培地添加物（シグマ社）  １
寒天（ＢＤ）  ２０
グルコース（フィッシャー社）  ２０
【００９８】
実施例７  他のＴｒＣｅｌ６Ａ変異型、ＰｃＣｅｌ６Ａ、ＰｃＣｅｌ６Ａ−Ｓ４０７Ｐ、ＨｉＣｅｌ６ＡおよびＨｉＣｅｌ６Ａ−Ｙ４２０Ｐの作製ならびにＹＥｐＦＬＡＧ−１ベクター中でのそれらのクローニング
７．１他のＴｒＣｅｌ６Ａ変異型の作製。
ＴｒＣｅｌ６Ａ変異型Ｒ４１０Ｑ−Ｓ４１３ＰはＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｐ変異型上でのエラープローンＰＣＲによって得たが、ミュータザイム（Ｍｕｔａｚｙｍｅ）（登録商標）ＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン）を使用して、ＹＥｐ３５２／ＰＧＫ９１−１ΔＮｈｅＩ中にクローニングした。次にそれは、ＹＥｐＦＬＡＧ−１ベクターに相同の配列をＮｈｅＩ部位の上流およびＡｐａＩ部位の下流にそれぞれ導入するプライマー５’ＦＬＡＧ−Ｃｅｌ６Ａ−ＧＲおよび３’ＦＬＡＧ−Ｃｅｌ６Ａ−ＧＲを使用して、そのソースから増幅された。
【００９９】
変異誘発性プライマーはプライマー３’ＦＬＡＧ−Ｃｅｌ６Ａ−ＧＲと併用して使用され、以下のＴｒＣｅｌ６Ａ変異の組合せのメガプライマーＰＣＲを産生した：Ｇ２３１Ｓ−Ｓ４１３Ｐ、Ｎ３０５Ｓ−Ｓ４１３Ｐ、Ｇ２３１Ｓ−Ｎ３０５Ｓ−Ｓ４１３Ｐ、Ｇ２３１Ｓ−Ｒ４１０Ｑ−Ｓ４１３Ｐ、Ｎ３０５Ｓ−Ｒ４１０Ｑ−Ｓ４１３ＰおよびＧ２３１Ｓ−Ｎ３０５Ｓ−Ｒ４１０Ｑ−Ｓ４１３Ｐ。生じたＰＣＲ産物を単離し、フォワードプライマー５’ＦＬＡＧ−Ｃｅｌ６Ａ−ＧＲと共にリバースプライマーを使用し、最終的なコンストラクトを作製した。プライマー配列を以下にリストする。
５’Ｇ２３１ＳＣＢＨ２    ５’ＧＧＴ  ＧＡＣ  ＣＡＡ  ＣＣＴ  ＣＴＣ  ＴＡＣ  ＴＣＣ  ＡＡＡ  ＧＴＧ  ＴＧ（配列番号：３５）
５’Ｎ３０５ＳＣＢＨ２    ５’ＣＡＡ  ＴＧＴ  ＣＧＣ  ＣＡＧ  ＣＴＡ  ＣＡＡ  ＣＧＧ  Ｇ（配列番号：３６）
５’Ｃｅｌ６Ａ−Ｅ８２Ｇ    ５’ＧＴＡ  ＣＣＴ  ＣＣＡ  ＧＴＣ  ＧＧＡ  ＴＣＧ  ＧＧＡ  ＡＣＣ  ＧＣＴ（配列番号：３８）
５’ＦＬＡＧ−Ｃｅｌ６Ａ−ＧＲ    ５’ＡＧＡ  ＧＡＣ  ＴＡＣ  ＡＡＧ  ＧＡＴ  ＧＡＣ  ＧＡＴ  ＧＡＣ  ＡＡＧ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＧＣＴ  ＡＧＣ  ＴＧＣ  ＴＣＡ  ＡＧＣ  Ｇ（配列番号：３９）
３’ＦＬＡＧ−Ｃｅｌ６Ａ−ＧＲ    ５’ＧＡＣ  ＧＧＡ  ＴＣＡ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＴ  ＴＡＣ  ＣＧＣ  ＧＧＧ  ＴＣＧ  ＡＣＧ  ＧＧＣ  ＣＣＧ  ＧＴＡ  ＣＣＴ  ＴＡＣ  ＡＧＧ  ＡＡＣ  Ｇ（配列番号：４０）
７．２  ＰｃＣｅｌ６ＡおよびＰｃＣｅｌ６Ａ−Ｓ４０７Ｐの作製。
【０１００】
凍結乾燥したＰ．クリソスポリウムを３００μＬの滅菌済みＨ2Ｏ中に再懸濁し、５０μＬをＰＤＡプレート上に塗った。プレートを４日間２４℃でインキュベートした。Ｐ．クリソスポリウムの胞子をＰＤＡプレートの上のセロハンサークル上に接種し、バイオマスを２４℃で４〜６日後に採取した。次に５０ｍｇのバイオマスを使用して、製造者手順に従ってアブソルートリーＲＮＡ（登録商標）ミニプレップキット（ストラタジーン社）により全ＲＮＡを単離した。製造者手順に従ってスーパースクリプト（商標）ＩＩ逆転写酵素（インビトロゲン社）を使用して、全ＲＮＡから全ｃＤＮＡを作製した。ＰｃＣｅｌ６Ａをコードする遺伝子は、以下のプライマーを使用してｃＤＮＡから増幅された。
５’ＰｃＣｅｌ６Ａ−ｃＤＮＡ    ５’ＣＴＡ  ＴＴＧ  ＣＴＡ  ＧＣＴ  ＣＧＧ  ＡＧＴ  ＧＧＧ  ＧＡＣ  ＡＧＴ  ＧＣＧ  ＧＴＧ  ＧＣ（配列番号：４１）
３’ＰｃＣｅｌ６Ａ−ｃＤＮＡ    ５’ＣＴＡ  ＴＴＧ  ＡＡＴ  ＴＣＧ  ＧＴＡ  ＣＣＣ  ＴＡＣ  ＡＧＣ  ＧＧＣ  ＧＧＧ  ＴＴＧ  ＧＣＡ  ＧＣＡ  ＧＡＡ  ＡＣ（配列番号：４２）
【０１０１】
ＰＣＲアンプリコンを、製造者の推奨に従ってＴＡクローニングによってｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔイージーベクター中にクローニングした。次にＰｃＣｅｌ６Ａをコードする遺伝子は、ＹＥｐＦＬＡＧ−１ベクターに相同の配列をＮｈｅＩ部位の上流およびＳｓｔＩＩ部位の下流にそれぞれ導入するプライマー５’ＦＬＡＧ−ＰｃＣｅｌ６Ａ−ＧＲおよび３’ＦＬＡＧ−ＰｃＣｅｌ６Ａ−ＧＲを使用して、そのソースから増幅された。
【０１０２】
変異誘発性プライマー５’ＰｃＣｅｌ６Ａ−Ｓ４０７Ｐはプライマー３’ＦＬＡＧ−ＰｃＣｅｌ６Ａ−ＧＲと併用して使用され、メガプライマーＰＣＲを産生した。生じたＰＣＲ産物を単離し、フォワードプライマー５’ＦＬＡＧ−ＰｃＣｅｌ６Ａ−ＧＲと共にリバースプライマーを使用し、最終的なコンストラクトを作製した。プライマー配列を以下にリストする。
５’ＦＬＡＧ−ＰｃＣｅｌ６Ａ−ＧＲ    ５’ＡＡＧＧＡＴＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡＧＧＡＡＴＴＣＣＴＣＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＧＧＡＧＴＧＧＧＧＡＣＡＧＴＧＣ（配列番号：４３）
３’ＦＬＡＧ−ＰｃＣｅｌ６Ａ−ＧＲ    ５’ＴＧＧＧＡＣＧＣＴＣＧＡＣＧＧＡＴＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＧＣＧＧＣＧＧＧＴＴＧＧＣ（配列番号：４４）
５’ＰｃＣｅｌ６Ａ−Ｓ４０７Ｐ    ５’ＣＣＣＣＧＣＴＡＣＧＡＣＣＣＴＡＣＴＴＧＴＴＣＴＣＴＧ（配列番号：４５）
７．３  ＨｉＣｅｌ６ＡおよびＨｉＣｅｌ６Ａ−Ｙ４２０Ｐの作製。
【０１０３】
凍結乾燥したＨ．インソレンスを３００μＬの滅菌済みＨ2Ｏ中に再懸濁し、５０μＬをエマーソンＹＰＳＳ（ｐＨ７）寒天プレート（０．４％酵母抽出物、０．１％Ｋ2ＨＰＯ4、０．０５％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１．５％グルコース、１．５％寒天）上に塗った。真菌を４５℃で６日間インキュベートし、次に胞子をノボ培地中に接種した（ＵＳＰ第４，４３５，３０７号Barbesgaardの通り）：１００ｍＬ増殖相培地（２．４％ＣＳＬ、２．４％グルコース、０．５％大豆油、ｐＨは５．５に調整、０．５％ＣａＣＯ3）中で３７℃４８時間インキュベーションし、次に６ｍＬの前培養を、１００ｍＬ生産期培地（０．２５％ＮＨ4ＮＯ3、０．５６％ＫＨ2ＰＯ4、０．４４％Ｋ2ＨＰＯ4、０．０７５％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、２％シグマセル（Ｓｉｇｍａｃｅｌｌ）、ｐＨ７に調整、０．２５％ＣａＣＯ3）の中へ移し、培養をバイオマス採取前に最大４日間インキュベートした。次に５０ｍｇのバイオマスを使用して、製造者手順に従ってアブソルートリーＲＮＡ（登録商標）ミニプレップキット（ストラタジーン社）により全ＲＮＡを単離した。製造者手順に従ってスーパースクリプト（商標）ＩＩ逆転写酵素（インビトロゲン社）を使用して、全ＲＮＡから全ｃＤＮＡを作製した。ＨｉＣｅｌ６Ａをコードする遺伝子は、以下のプライマーを使用してｃＤＮＡから増幅された。
５’ＨｉＣｅｌ６Ａ−ｃＤＮＡ    ５’ＣＴＡ  ＴＴＧ  ＣＴＡ  ＧＣＴ  ＧＴＧ  ＣＣＣ  ＣＧＡ  ＣＴＴ  ＧＧＧ  ＧＣＣ  ＡＧＴ  ＧＣ（配列番号：４６）
３’ＨｉＣｅｌ６Ａ−ｃＤＮＡ    ５’ＣＴＡ  ＴＴＧ  ＡＡＴ  ＴＣＧ  ＧＴＡ  ＣＣＴ  ＣＡＧ  ＡＡＣ  ＧＧＣ  ＧＧＡ  ＴＴＧ  ＧＣＡ  ＴＴＡ  ＣＧＡ  ＡＧ（配列番号：４７）
【０１０４】
ＰＣＲアンプリコンを、製造者の推奨に従ってＴＡクローニングによってｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔのイージーベクター中にクローニングした。次にＨｉＣｅｌ６Ａをコードする遺伝子はＹＥｐＦＬＡＧ−１ベクターに相同の配列をＮｈｅＩ部位の上流およびＡｐａＩ部位の下流にそれぞれ導入するプライマー５’ＦＬＡＧ−ＨｉＣｅｌ６Ａ−ＧＲおよび３’ＦＬＡＧ−ＨｉＣｅｌ６Ａ−ＧＲを使用して、そのソースから増幅された。変異誘発性プライマー５’ＨｉＣｅｌ６Ａ−Ｙ４２０Ｐはプライマー３’ＦＬＡＧ−ＨｉＣｅｌ６Ａ−ＧＲと併用して使用され、メガプライマーＰＣＲを産生した。生じたＰＣＲ産物を単離し、フォワードプライマー５’ＦＬＡＧ−ＨｉＣｅｌ６Ａ−ＧＲと共にリバースプライマーを使用し、最終的なコンストラクトを作製した。プライマー配列を以下にリストする。
５’ＦＬＡＧ−ＨｉＣｅｌ６Ａ−ＧＲ    ５’ＡＡＧＧＡＴＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡＧＧＡＡＴＴＣＣＴＣＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＧＴＧＣＣＣＣ  ＧＡＣＴＴＧＧＧＧＣ（配列番号：４８）
３’ＦＬＡＧ−ＨｉＣｅｌ６Ａ−ＧＲ    ５’ＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＣＣＧＣＧＧＧＴＣＧＡＣＧＧＧＣＣＣＧＧＴＡＣＣＴＣＡＧＡＡＣＧ  ＧＣＧＧＡＴＴＧＧＣ（配列番号：４９）
５’ＨｉＣｅｌ６Ａ−Ｙ４２０Ｐ    ５’ＧＣＣＣＧＣＴＡＣＧＡＣＣＣＴＣＡＣＴＧＣＧＧＴＣＴＣ（配列番号：５０）
７．４  ＹＥｐＦＬＡＧ−１における他のＴｒＣｅｌ６Ａ変異型、ＰｃＣｅｌ６Ａ、ＰｃＣｅｌ６Ａ−Ｓ４０７Ｐ、ＨｉＣｅｌ６ＡおよびＨｉＣｅｌ６Ａ−Ｙ４２０ＰのクローニングならびにＢＪ３５０５における形質転換。
【０１０５】
ＹＥｐＦＬＡＧΔＫｐｎ１０ベクター（実施例６）をＮｈｅＩおよびＡｐａＩにより消化し、空ベクターフラグメントを単離した。実施例８．１および８．３中で産生されたこの直線状フラグメントおよび最終的なＰＣＲ産物を、インビボの組換えによって同時にクローニングし形質転換した（Butler, T. and Alcalde, M. 2003.Methods in Molecular Biology, vol. 231:中の（F. H. Arnold and G. Georgiou編）、ヒューマナ・プレス（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）社、トトワ（ニュージャージー）、１７〜２２ページ）。
【０１０６】
ＹＥｐＦＬＡＧΔＫｐｎ１０ベクター（実施例６）をＮｈｅＩおよびＳｓｔＩＩにより消化し、空ベクターフラグメントを単離した。実施例８．２中で産生されたこの直線状フラグメントおよび最終的なＰＣＲ産物を、インビボの組換えによって同時にクローニングし形質転換した。
【０１０７】
実施例８  酵母における、天然ファミリー６セルラーゼおよび修飾したファミリー６セルラーゼの中間スケール発現
ＹＥｐＦＬＡＧ−ΔＫｐｎ１０−ｃｂｈ２を含むＢＪ３５０５酵母の単離した１つのコロニーを使用して、２０ｍＬ試験管中で５ｍＬの液体ＳＣ−ｔｒｐに接種した。３０℃２５０ｒｐｍで一晩のインキュベーション後に、６００ｎｍの光学的濃度を測定し、２５０ｍＬのエルレンマイヤーフラスコ中の５０ｍＬのＹＰＥＭ液体培地に、０．０４５の最終ＯＤ６００を得るのに必要な酵母の量を接種した。３０℃２５０ｒｐｍで７２時間のインキュベーション後に、上清を３，０００×ｇで５分間の遠心分離工程により採取した。空のＹＥｐＦＬＡＧ−１ベクターに加えて、ＴｒＣｅｌ６Ａ変異型、野生型ＨｉＣｅｌ６Ａおよび変異型、野生型ＰｃＣｅｌ６Ａおよび変異型を発現するＢＪ３５０５株を、同じ方法で培養した。
【０１０８】
ＳＣ−ｔｒｐ液体培地は、実施例７中で述べたＳＣ−ｔｒｐプレートと同じで寒天のない成分を含む。ＹＰＥＭ液体培地は以下のものを含む。
成分  １リットルあたり
酵母抽出物（ＢＤ）    １０ｇ
ペプトン（ＢＤ）    ５．０ｇ
グルコース（フィッシャー社）    １０ｇ
グリセロール（フィッシャー社）    ３０  ｍＬ
【０１０９】
実施例９  酵母培養上清からの修飾したファミリー６セルラーゼの特性評価
９．１天然ＴｒＣｅｌ６Ａと修飾したＴｒＣｅｌ６Ａの好熱性の比較。
可溶性β（ベータ）−グルカン基質からの還元糖の放出を異なる温度で測定することにより、各酵素の好熱性を決定した。具体的には、３００μＬのＰＣＲプレートにおいて、９６ウェルＰＣＲプレートの異なる１０カラム中で、５０μＬの実施例９の通りに得た粗製上清を、５５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ  ５．０）中の５０μＬのあらかじめ加熱した１％（ｗ／ｖ）β（ベータ）−グルカン（大麦、中粘度；  メガザイム社）と混合した。混合物は、１０の異なる勾配温度（５６、５８．１、５９．８、６２．６、６６、７０、７３．４、７６．２、７８．１および８０℃）で３０分間インキュベートし、次に放出された還元糖を以下のように測定した。１００μＬのＤＮＳ試薬を各ウェルに加え、プレートを９５℃で２０分インキュベートした。ＤＮＳ試薬は以下を含む。
成分    ｇ／Ｌ
３，５−ジニトサリチル酸（Ｄｉｎｉｔｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）（アクロス（Ａｃｒｏｓ）社）    １０
水酸化ナトリウム（フィッシャー社）    １０
フェノール（シグマ社）    ２
二亜硫酸ナトリウム（フィッシャー社）    ０．５
一旦温度が４０℃以下に減少したならば、各ウェル中に６５μＬのロッシェル塩（４０％酒石酸カリウムナトリウム）を含む９６ウェルマイクロプレートの個別のウェルに、１３５μＬの各反応混合物を移し、５６０ｎｍフィルターを装備したフルオスターギャラクシー（Ｆｌｕｏｓｔａｒ  Ｇａｌａｘｙ）マイクロプレートリーダーを使用してＯＤ５６０を測定した。ブランク値は、同じ方法で空ベクターを保有する株からの上清の処理により測定し、各値から引いた。次に活性は、４パラメーターの対数正規フィットが使用された変異型ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｇ２３１Ｓ−Ｎ３０５Ｓ−Ｒ４１０Ｑ−Ｓ４１３Ｐ以外は、各変異型につき４パラメーターの多項式フィットの最高値と比較してパーセンテージで表わされた（図６）。
【０１１０】
他と異なり最大活性の８０％以上の広い温度領域を示す変異型ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｇ２３１Ｓ−Ｎ３０５Ｓ−Ｒ４１０Ｑ−Ｓ４１３Ｐ以外は、修飾したファミリー６セルラーゼはすべて、それらのそれぞれの野生型と比較したときに、改善された至適温度を示した（図６）。すべてのＴｒＣｅｌ６Ａ変異型の中で、ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｐは、７２．２℃のより高い至適温度（野生型ＴｒＣｅｌ６Ａと比較して５．６℃の増加）を有する（図６ａ）。それぞれの野生型と比較したときに、ＰｃＣｅｌ６Ａ−Ｓ４０７ＰおよびＨｉＣｅｌ６Ａ−Ｙ４２０Ｐもまた至適温度の増加を示す（図６ｂおよびｃ）。
９．２  天然のファミリー６セルラーゼと修飾したファミリー６セルラーゼの好アルカリ性の比較。
【０１１１】
可溶性β（ベータ）−グルカン基質からの還元糖の放出を異なるｐＨで測定することにより、各酵素の好アルカリ性を決定した。具体的には、３００μＬのＰＣＲプレートにおいて、プレートの異なる８カラム中で、５０μＬの実施例９の通り得た粗製の上清を、５５ｍＭクエン酸ナトリウム、５５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ  ３．０、４．０、５．０、５．７５、６．２５、６．７５、７．２５  または８．５）中の５０μＬのあらかじめ加熱した１％（ｗ／ｖ）β（ベータ）−グルカン（大麦、中粘度；メガザイム社）と混合した（一旦上清と混合し６０〜６５℃で加熱したならば、ｐＨはそれぞれ３．９５、４．６５、５．６５、６．２５、６．６５、６．９５、７．１５、７．４５であった）。混合物を６５℃で（ＰｃＣｅｌ６Ａおよび変異型については６０℃）３０分間インキュベートし、次に放出された還元糖を実施例１０．１の通り測定した。酵母宿主からのバックグラウンド活性を、空ベクターを保有する株からの上清の処理により同じ方法で測定し、この活性を各変異型について活性値から引いた。次に活性は、各変異型について３パラメーターの機構的フィットの最高値と比較してパーセンテージで表わされた（図７）。
【０１１２】
すべての修飾したファミリー６セルラーゼはそれらの野生型と比較したとき増加した好アルカリ性を示す。ＴｒＣｅｌ６Ａについては、有意なシフトが、変異型ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｇ２３１Ｓ−Ｒ４１０Ｑ−Ｓ４１３Ｐ（＋１．２５ｐＨ単位）で、次にＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｇ２３１Ｓ−Ｎ３０５Ｓ−Ｒ４１０Ｑ−Ｓ４１３Ｐ（＋１．０１ｐＨ単位）で観察された。９．３  天然ＴｒＣｅｌ６Ａと修飾したＴｒＣｅｌ６Ａの耐熱性の比較。
【０１１３】
各酵素の耐熱性は、上清を６０℃（ＰｃＣｅｌ６Ａおよび変異型については５５℃）で異なる時間でプレインキュベーションした後に、可溶性β（ベータ）−グルカン基質からの還元糖の放出を測定することにより決定された。具体的には、３００μＬ  ＰＣＲプレートにおいて、５０μＬの実施例９の通りに得た粗製の上清を、６０℃（ＰｃＣｅｌ６Ａおよび変異型については５５℃）で、０、１５、３０、４５、６０、７５、９０、１２０分間インキュベートした。次に、５０μＬの５５ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ５．０中の１％（ｗ／ｖ）β（ベータ）−グルカン（大麦、中粘度；  メガザイム社）を加え、混合物を６５℃（ＰｃＣｅｌ６Ａおよび変異型については６０℃）で３０分間インキュベートした。次に放出された還元糖を実施例１０．１の通り測定した。酵母宿主からのバックグラウンド活性を空ベクターを保有する株からの上清の処理により同じ方法で測定し、この活性を各変異型について活性値から引いた。最終的に活性は、各変異型につき３パラメーターの単一指数関数崩壊フィットの最高値と比較してパーセンテージで表わされた（図５）。
【０１１４】
野生型ＴｒＣｅｌ６Ａと比較したとき、すべてのＴｒＣｅｌ６Ａ変異型は耐熱性の増加を示す（図５ａ）。Ｓ４１３Ｐ変異により、ＴｒＣｅｌ６Ａの耐熱性の有意な増加が生じる。ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｐは６０℃で６０分後に活性の４５％を保持するが、ＴｒＣｅｌ６Ａは６０分後に活性の４％のみしか保持しない。これは、米国特許公報２００６／０２０５０４２号中で開示されたＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｙ変異型（同様の条件下で平均で活性の４１％を保持する）の耐熱性と比較して、耐熱性の大きな改善を表わす。最も高い改善はＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｒ４１０Ｑ−Ｓ４１３ＰおよびＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｇ２３１Ｓ−Ｒ４１０Ｑ−Ｓ４１３Ｐで観察され、両者は６０℃で６０分後にそれぞれ活性の５８％および６０％を保持した。ＴｒＣｅｌ６Ａに類似して、ＰｃＣｅｌ６Ａ−Ｓ４０７Ｐは、５５℃で６０分後に活性の３８％を保持するが、ＰｃＣｅｌ６Ａは６０分後に活性の６％のみしか保持しない（図５ｂ）。これらの結果は、ＴｒＣｅｌ６Ａの残基４１３に同等な位置でのプロリンが耐熱性を増加させることを実証する。
９．４  天然ＴｒＣｅｌ６Ａと修飾したＴｒＣｅｌ６ＡのＴ50の比較。
【０１１５】
本明細書におけるＴ50は、基質なしの１５分間のインキュベーション後に、粗製の酵母上清がβ（ベータ）−グルカン加水分解活性の５０％を保持する温度として定義される。Ｔ50は、異なる温度での１５分間のプレインキュベーション後に、可溶性β（ベータ）−グルカン基質からの還元糖の放出を測定することにより決定された。具体的には、３００μＬのＰＣＲプレートにおいて、５０μＬの実施例９の通りに得た粗製の上清を、４５、４９．２、５３．９、５７．７、５９．５、６０．４、６２．５、６４．２、６６．４、６８．９、７２．７または７５℃で１５分間インキュベートした。次に、５０μＬの５５ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ５．０中の１％（ｗ／ｖ）β（ベータ）−グルカン（大麦、中粘度；メガザイム社）を加え、混合物を６５℃（ＰｃＣｅｌ６Ａおよび変異型については６０℃）で３０分間インキュベートした。次に放出された還元糖を実施例１０．１の通り測定した。酵母宿主からのバックグラウンド活性を、空ベクターを保有する株からの上清の処理により同じ方法で測定し、この活性を各変異型について活性値から引いた。最終的に活性は、各変異型につき４パラメーターのシグモイドフィットの最高値と比較してパーセンテージで表わされた（図４）。
【０１１６】
ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３ＰのＴ50は、元のＴｒＣｅｌ６Ａの５９℃と比較して、６４．１℃であると決定された（図４ａ）。これは、Ｓ４１３Ｐ変異の導入を介して５℃以上耐熱性が増加したことを表わす。これは米国特許公報第２００６０２０５０４２号に開示されるＳ４１３Ｙ変異（ＴｒＣｅｌ６Ａに対してＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３ＹのＴmは非常に緩やかな０．２〜０．３℃の増加を示す）に比較して、酵素安定性が有意に改善されたことを表わす。米国特許公報第２００６０２０５０４２号中で開示されるＴmを測定する方法は、本明細書において開示されるＴ50の測定とは異なるが、両方法は、不可逆的不活性化をもたらす有意かつ構造的な変化をタンパク質が受ける温度を決定しようとするものである。他のＴｒＣｅｌ６Ａ変異型のＴ50は、野生型ＴｒＣｅｌ６Ａよりも少なくとも３．２℃高かった。
【０１１７】
それぞれの元の酵素に比較したときに、ＰｃＣｅｌ６Ａ−Ｓ４０７ＰおよびＨｉｃｅｌ６Ａ−Ｙ４２０ＰもまたＴ50の増加を示した（図４ｂおよびｃ）。このことは、ＴｒＣｅｌ６Ａの残基４１３に等価の位置のプロリンがファミリー６セルラーゼ中の耐熱性を増加させるという主張もまた支持する。
【０１１８】
実施例１０  修飾したファミリー６セルラーゼＤＮＡ配列を含む遺伝子コンストラクトの作製
１０．１トリコデルマ・リーゼイのゲノムＤＮＡの単離およびＴ．リーゼイのゲノムライブラリーの構築
破壊した天然ＴｒＣｅｌ６Ａ遺伝子を含むＲｕｔＣ３０（ＡＴＣＣ＃５６７６５；Montenecourt, B. and Eveleigh, D. 1979. Adv. Chem. Ser. 181: 289-301）に由来する入手したトリコデルマ・リーゼイの株を使用した。ＲｕｔＣ３０はトリコデルマ・リーゼイＱｍ６Ａに由来する（ＡＴＣＣ＃１３６３１； Mandels, M. and Reese, E.T. 1957. J. Bacteriol. 73: 269-278）。本明細書において記述される手順、これらの株からの遺伝子コンストラクト、およびこれらの株における遺伝子コンストラクトの発現が、Ｑｍ６Ａに由来するすべてのトリコデルマ属株に適用可能であるということは、当業者によってよく理解されている。
【０１１９】
ゲノムＤＮＡを単離するために、５０ｍＬのポテトデキストロースブロス（ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）社）を、滅菌済み接種ループによりポテトデキストロース寒天プレートから回収したＴ．リーゼイ胞子で接種した。培養を２８℃２００ｒｐｍで２〜３日間振盪した。菌糸をＧＦＡガラスマイクロファイバーフィルター（ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）社）上で濾過し、冷脱イオン水により洗浄した。真菌濾塊を液体窒素中で凍結し、予冷した乳鉢および乳棒により粉末へと砕き、０．５ｇの粉末バイオマスを５ｍＬの１００ｍＭトリス、５０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）プラス１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）中に再懸濁した。溶解物を遠心分離し（２０分間４℃で５０００ｇ）、細胞残屑をペレットにした。可溶性タンパク質を除去するために、上清を１容積の緩衝液（１０ｍＭトリス、１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））で飽和させたフェノールにより抽出し、続いて緩衝液で飽和させたフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）の１容積により抽出した。０．１容積の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）および２．５容積の９５％冷エタノールを加えることにより、溶液からＤＮＡを沈殿させた。−２０℃で少なくとも１時間インキュベートした後に、ＤＮＡを遠心分離（２０分間４℃で５０００ｇ）によってペレットにし、１０ｍＬの７０％エタノールにより洗い流し、風乾し、１ｍＬの１０ｍＭトリス、１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ  ８．０）中に再懸濁した。ＲＮＡを、０．１ｍｇ／ｍＬの最終濃度まで加えたリボヌクレアーゼＡ（ロッシュ・ダイアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）社）の追加および１時間３７℃でのインキュベーションによって消化した。緩衝液で飽和させたフェノールの１容積および緩衝液飽和フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）の１容積による順次抽出を使用して、ＤＮＡ溶液からリボヌクレアーゼを除去した。ＤＮＡを、０．１容積の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）および２．５容積の９５％冷エタノールにより再び沈殿させ、遠心分離によってペレットにし、７０％エタノールにより洗い流し、風乾し、５０μＬの１０ｍＭトリス、１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）中に再懸濁した。０．１容積の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）および２．５容積の９５％冷エタノールを加えることにより、溶液からＤＮＡを沈殿させた。（Sambrook et al.、分子クローニング:実験手引き書（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）社１９８９年中のｐ．Ｃ１、今後はSambrook et al.と呼ばれる）。
【０１２０】
２つのプラスミドライブラリーおよび１つのファージライブラリーを、Ｔ．リーゼイ株Ｍ２Ｃ３８から単離されたゲノムＤＮＡを使用して構築した。ベクターｐＵＣ１１９（Viera and Messing, Methods Enzymol. 153:3, 1987）中にプラスミドライブラリーを以下のように構築した。１０μｇゲノムＤＮＡを、２ユニット／μｇのＢａｍＨ１またはＥｃｏＲ１の制限酵素を含有する１００μＬの容積中で３７℃２０時間消化した。０．０４Ｍトリス酢酸、１ｍＭＥＤＴＡ中で泳動する０．７５％アガロースゲル上で、消化したＤＮＡを分画し、エチジウムブロマイドにより染色した。対象となる遺伝子のサイズに対応するゲルスライス（出版済みの情報およびサザンブロットに基づく）を切り取り、ＤＮＡ断片を回収するために電気溶出を行なった（Sambrook et al.、pp.6.28-6.29）。遺伝子ライブラリーを作成するために、これらのＤＮＡの濃縮画分を、１６時間４℃で１０〜１５μＬの全容積中でベクター：インサートＤＮＡの２：１モル比で２０〜５０μｇ／ｍＬ  ＤＮＡ、１ｍＭＡＴＰおよび５ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼを含むライゲーション反応においてｐＵＣ１１９の中へライゲーションした。大腸菌株ＨＢ１０１を、製造者のプロトコールに従ってセル・ポレーター・システム（Ｃｅｌｌ  Ｐｏｒａｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ）（ギブコ／ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）社）を使用してライゲーション反応物でエレクトロポレーションし、形質転換体は７０ｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天上で選択した。
【０１２１】
ファージライブラリーは、ベクターλＤＡＳＨ（ストラタジーン社）において以下のように構築された。９〜２３ｋＢサイズのフラグメントを産生するために、ゲノムＤＮＡ（３μｇ）を、２、１、０．５および０．５ユニット／μｇ  ＢａｍＨＩにより３７℃で１時間消化した。各消化物からのＤＮＡを１容積のトリスで飽和させたフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）による抽出によって精製し、続いて１０μＬの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）および２５０μｌの９５％エタノール（−２０℃）により沈殿させた。消化したＤＮＡを０．５ｍＬの冷７０％のエタノールにより洗い流し、微小遠心分離によってペレットにし、風乾し、１０μＬの滅菌済み脱イオン水中に再懸濁した。９〜２３ｋＢサイズのＤＮＡ断片の濃縮は、アガロースゲル電気泳動（０．０４Ｍトリス酢酸、１ｍＭＥＤＴＡ中の０．８％アガロース）によって確認した。一晩４℃で５μｌの全容積中で２ユニットＴ４ＤＮＡリガーゼおよび１ｍＭＡＴＰを含む反応中で、消化したＤＮＡ（０．４μｇ）をＢａｍＨＩ（ストラタジーン社）により前消化した１μｇのλＤＡＳＨアームにライゲーションした。製造者のプロトコールに従ってギガパック（ＧｉｇａＰａｃｋ）（登録商標）ＩＩゴールドパッケージング抽出物（ストラタジーン社）を使用して、ライゲーションミックスをファージ粒子の中へパッケージした。ライブラリーは大腸菌の宿主株ＸＬ１ブルー（Ｂｌｕｅ）ＭＲＡ（Ｐ２）を使用して力価測定し、３×１０5の独立したクローンを含むことが見出された。
１０．２  ｐＵＣ１１９ライブラリーからのセロビオヒドロラーゼＩ（ｃｂｈ１）遺伝子およびセロビオヒドロラーゼＩＩ（ｃｂｈ２）遺伝子のクローニング
【０１２２】
組換えｐＵＣ１１９−ＢａｍＨ１または組換えｐＵＣ１１９−ＥｃｏＲＩライブラリーからのｃｂｈ１クローンまたはｃｂｈ２クローンを保有する大腸菌ＨＢ１０１形質転換体は、コロニーリフトハイブリダイゼーションによって同定された。１〜３×１０4コロニーをハイボンド（ＨｙＢｏｎｄ）（商標）ナイロン膜（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社）上に移し、０．５ＭＮａＯＨ、１ＭＮａＣｌにより飽和させたブロッティングペーパー（ＶＷＲ２３８）上にコロニー側を上にして膜を５分間置いて細菌細胞を溶解してＤＮＡを変性させ、次に１ＭＮａＣｌを加えた１．５Ｍトリス（ｐＨ７．５）により飽和させたブロッティングペーパー（ＶＷＲ２３８）上にコロニー側を上にして膜を５分間を置くことにより中和し、膜を３０分間風乾し、次に２時間８０℃でベークすることにより膜にＤＮＡを固定した。
【０１２３】
32Ｐ標識プローブは、ＢａｍＨ１フラグメントまたはＥｃｏＲ１フラグメントの濃縮プールから、それぞれｃｂｈ１およびｃｂｈ２のコード領域の短い（０．７〜１．５ｋＢ）フラグメントのＰＣＲ増幅によって、２０μＬの全容積中で１０〜５０ｎｇの標的ＤＮＡ、および０．２ｍＭ各ｄ（ＧＣＴ）ＴＰ、０．５μＭｄＡＴＰ、２０〜４０μＣｉのα−３２Ｐ−ｄＡＴＰ、１０ｐｍｏｌｅオリゴヌクレオチドプライマーおよび０．５ユニットのＴａｑポリメラーゼを含む標識反応において調製した。反応は６〜７サイクルで増幅した（９５℃、２分；５６℃、１．５分；７０℃、５分）。増幅されて32Ｐ標識されたＤＮＡは、０．５ｍＬの１０％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸および０．５ｍｇの酵母ｔＲＮＡを追加することによって沈殿させた。ＤＮＡを微小遠心分離によってペレットにし、１ｍＬの７０％のエタノールにより２回洗浄し、風乾し、１Ｍトリス（ｐＨ７．５）１ｍＭＥＤＴＡ中に再懸濁した。
【０１２４】
組換えｐＵＣ１１９プラスミドが固定されたナイロン膜を、１ＭＮａＣｌ、１％ＳＤＳ、５０ｍＭトリス、１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）中で１００μｇ／ｍＬの変性し剪断したサケ精子ＤＮＡと共に、６０〜６５℃で１時間ヒートシールバッグの中でプレハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションは、同じ緩衝液中で５０μｇ／ｍＬのみの変性し剪断したサケ精子ＤＮＡおよび５×１０6〜５×１０7ｃｐｍの変性したｃｂｈ１プローブまたはｃｂｈ２プローブと共に、６０〜６５℃で１６〜２０時間ヒートシールバッグの中で実行した。膜を１ＭＮａＣｌ、０．５％ＳＤＳにより１５分間６０℃で１回、０．３ＭＮａＣｌ、０．５％ＳＤＳにより１５分間６０℃で各２回、および０．０３ＭＮａＣｌ、０．５％ＳＤＳにより１５分間５５℃で１回洗浄した。膜をヒートシールバッグ中に再び置き、−７０℃で１６〜４８時間までコダックＲＰ  Ｘ線フィルムに暴露した。Ｘ線フィルムを製造者のプロトコールに従って現像した。強いシグナルまたは弱いシグナルを生じるコロニーを採集し、７０μｇ／ｍＬアンピシリンを追加した２×ＹＴ培地中で培養した。プラスミドＤＮＡをアルカリ溶解法（Sambrook, et al., pp. 1.25-1.28)を使用してこれらの培養から単離し、制限消化、サザンハイブリダイゼーション(Sambrook, et al., pp. 9.38-9.44）およびＰＣＲ分析（Sambrook, et al., pp. 14.18-14,19）によって解析した。
【０１２５】
ｃｂｈ１遺伝子を保有するクローンは、出版済みのｃｂｈ１配列の５９７〜１３６１ｂｐを増幅するようにデザインされたオリゴヌクレオチドプライマーを使用して調製した０．７ｋｂのｃｂｈ１プローブによるｐＵＣ１１９−ＢａｍＨ１ライブラリーのコロニーリフトハイブリダイゼーションによって同定された（Shoemaker et al., Bio/Technology 1: 691-696, 1983；参照することによって本明細書に組み入れられる）。ｃｂｈ１クローン（ｐＣＯＲ１３２）は、プロモーター（４．７ｋｂ）および１ｋｂのｃｂｈ１構造遺伝子（２．３ｋｂ）に対応する５．７ｋｂのＢａｍＨ１フラグメントを含んで単離された。これから、ｃｂｈ１プロモーター（２．１ｋｂ）およびｃｂｈ１コード領域（０．４ｋｂ）の５’末端を含む２．５ｋｂのＥｃｏＲ１フラグメントを、ｐＣＢ１５２を作製するためにｐＵＣ１１９の中へサブクローン化した。ｃｂｈ２遺伝子を保有するクローンは、出版済みのｃｂｈ２配列の５８０〜２１１４ｂｐを増幅するようにデザインされたオリゴヌクレオチドプライマーを使用して調製した１．５ｋｂのｃｂｈ２プローブによるｐＵＣ１１９−ＥｃｏＲ１ライブラリーのコロニーリフトハイブリダイゼーションによって同定された。（Chen et al. Bio/Technology 5: 274-278, 1987）。ｃｂｈ２クローン（ｐＺＵＫ６００）は、プロモーター（６００  ｂｐ）および構造遺伝子（２．３ｋｂ）およびターミネーター（１．９ｋｂ）に対応する４．８ｋｂのＥｃｏＲ１フラグメントを含んで単離された。
１０．３λＤＡＳＨライブラリーからのキシラナーゼＩＩ（ｘｌｎ２）遺伝子のクローニング
【０１２６】
ジゴキシゲン（Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎ）−１１−ｄＵＴＰで標識したプローブは、ＤＩＧ標識および検出キット（ロッシュ・ダイアグノスティックス社）を使用し、製造者のプロトコールに従って、ランダムプライム標識によって、ＰＣＲで増幅したｘｌｎ２遺伝子のコード領域から調製した。ｘｌｎ２遺伝子を含むゲノミッククローンを、λＤＡＳＨライブラリーのプラークリフトハイブリダイゼーションによって同定した。対象となる各々の遺伝子について、１×１０4クローンをナイトラン（Ｎｙｔｒａｎ）（登録商標）（シュライヒャー・アンド・シュール（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｌ）社）ナイロン膜に移した。ファージ粒子を溶解し、ファージＤＮＡを０．５ＭＮａＯＨ、１ＭＮａＣｌにより飽和させたブロッティングペーパー（ＶＷＲ２３８）上にプラーク側を上にして膜を５分間置くことにより変性した。次に１ＭＮａＣｌを加えた１．５Ｍトリス（ｐＨ  ７．５）により飽和させたブロッティングペーパー上にプラーク側を上にして膜を５分間置くことにより中和し、続いて３０分間風乾させた。次にＤＮＡを８０℃で２時間ベークすることにより膜に固定した。膜を、６×ＳＳＰＥ、５×デンハート液、１％ＳＤＳに、１００μｇ／ｍＬの変性し剪断したサケ精子ＤＮＡを加えた溶液中で、６５℃で２時間ヒートシールバッグの中でプレハイブリダイズした。次に膜を、５０μｇ／ｍＬの変性し剪断したサケ精子ＤＮＡおよび０．５μｇのジゴキシゲン（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎ）−ｄＵＴＰで標識したプローブを含む同じ溶液中でヒートシールバッグの中で６５℃で一晩ハイブリダイズした。膜を２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中で１５分間室温で２回、０．２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中で１５分間６５℃で２回、および２×ＳＳＰＥ中で５分間１回洗浄した。陽性にハイブリダイズするクローンを、製造者のプロトコールに従って、抗ジゴキシゲニン／アルカリフォスファターゼ抗体コンジュゲート、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル（ｉｎｄｏｙｌ）リン酸および４−ニトロブルーテトラゾリウムクロライド（ロッシュ・ダイアグノスティックス社）による反応によって同定した。陽性にハイブリダイズするクローンを、ジゴキシゲン（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎ）−ｄＵＴＰで標識したプローブによる第２ラウンドのスクリーニングよってさらに精製した。
【０１２７】
個別のクローンを単離し、ＣｓＣｌ勾配工程が、１容積のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）および１容積のクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）による抽出で置き換えられるという例外を除いて、Sambrook et al. pp. 2.118-2.121中に記載されているようにファージＤＮＡを精製した。ＤＮＡを０．１容積の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ  ５．２）および２．５体積の９５％冷エタノールにより沈殿させた。沈殿させたファージＤＮＡを、０．５ｍＬの７０％冷エタノールにより洗浄し、風乾し、５０μＬの１０ｍＭトリス、１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）中で再懸濁した。対象となる遺伝子を含む制限断片を、λＤＡＳＨライブラリーをスクリーニングするために使用したのと同じジゴキシゲン（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎ）−ｄＵＴＰで標識したプローブを使用して、精製したファージＤＮＡの制限消化およびサザンブロットハイブリダイゼーションによって同定した（Sambrook, et al., pp. 9.38-9.44）。膜をハイブリダイズし、陽性にハイブリダイズするフラグメントをプラークリフトに使用したのと同じ方法によって可視化した。一旦各λＤＡＳＨクローンから所望の制限断片が同定されたならば、制限消化を繰り返し、フラグメントは、ＴＡＥ中の０．８％アガロースゲル上で分離され、所望のバンドを切り取った。ＤＮＡは、製造者のプロトコールに従って、セファグラスバンドプレップ（Ｓｅｐｈａｇｌａｓ  ＢａｎｄＰｒｅｐ）キット（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社）を使用してゲルスライスから溶出した。
【０１２８】
ｘｌｎ２遺伝子を保有するクローンを、出版済みｘｌｎ２配列の１００〜７８３ｂｐを含むｘｌｎ２プローブによるλＤＡＳＨライブラリー（実施例７）のコロニーリフトハイブリダイゼーションによって同定した（Saarelainen et al., Mol. Gen. Genet. 241: 497-503, 1993）。ｘｌｎ２遺伝子のプロモーター（２．３ｋｂ）、コード領域（０．８ｋｂ）およびターミネーター（２．６ｋｂ）を含む５．７ｋｂのＫｐｎ１フラグメントを、λＤＡＳＨのｘｌｎ２クローンから精製されたファージＤＮＡの制限消化によって単離した。このフラグメントをｐＵＣ１１９のＫｐｎ１部位の中へサブクローン化し、プラスミドｐＸＹＮ２Ｋ−２を作製した。
１０．４：トリコデルマ・リーゼイにおいて修飾したファミリー６セルラーゼの発現を指令するベクターの構築。
【０１２９】
ｘｌｎ２遺伝子のプロモーターおよび分泌シグナルを含む２．３ｋｂのフラグメント（＋１がＡＴＧ開始コドンを示し、＋９７〜９９がＴｒＸｙｌ１１分泌シグナルペプチド後の第１のコドンを表わす場合に−２１５０〜＋９９ｂｐ）を、コドン３３でＧｌｎの直接下流にＮｈｅＩを含むｘｌｎ２特異的プライマー、およびｘｌｎ２遺伝子の５’端のＫｐｎ１部位の下流にアニールするｐＵＣリバースプライマー（カタログ番号１８４３２−０１３、ギブコ／ＢＲＬ社）を使用して、ゲノムｘｌｎ２サブクローンｐＸＹＮ２Ｋ−２（実施例７）からＰｗｏポリメラーゼにより増幅した。このｘｌｎ２のＰＣＲ産物を、ポリリンカーのＢａｍＨＩ部位がＮｈｅＩ部位に対して３’であるような方向においてブラント末端のフラグメントとしてｐＵＣ１１９ポリリンカーのＳｍａＩ部位へと挿入し、プラスミドｐＵＣ／ＸｙｎＰＳＳ（Ｎｈｅ）を作製した。同じｘｌｎ２のＰＣＲ産物は、ＥｃｏＲ１（ｐＸＹＮ２Ｋ−２からｐＵＣ１１９ポリリンカーの一部として増幅された）およびＢａｍＨＩによる消化によってｐＵＣ／ＸｙｎＰＳＳ（Ｎｈｅ）から再度単離し、同様にＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩにより消化したプラスミドｐＢＲ３２２Ｌ（５６５ｂｐおよび６５０ｂｐで、もとのＳｐｈ１部位およびＳａｌ１部位との間にＳｐｈ１−Ｎｏｔ１−Ｓａｌ１アダプターを含むｐＢＲ３２２の誘導体）へと挿入し、プラスミドｐＢＲ３２２ＬＸＮを作製した。修飾したキシラナーゼの高レベル発現を容易にするために、ｐＢＲ３２２ＬＸＮ中の−１４００〜−１２１ｂｐのｘｌｎ２プロモーターを含む１．３ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、ｐＣＯＲ１３２のＨｉｎｄＩＩＩ消化によって単離した−１３９９〜−２０４ｂｐのｃｂｈ１プロモーターを含む１．２ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントにより置き換え、プラスミドｐＢＲ３２２ＬＣ／ＸＮを作製した。最終的に、ｐＢＲ３２２ＬＸＣのＥｃｏＲ１部位を次にクレノウによりブラントにし、Ｓｐｅ１リンカー（カタログ番号１０８６、ニューイングランド・バイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）社）を追加し、ｐＢＲ３２２ＳｐＸＣを作製した。
【０１３０】
ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｐ遺伝子を含むフラグメントを、ＮｈｅＩおよびＫｐｎＩによる消化によってＹＥｐＦＬＡＧΔＫｐｎ１０−ｃｂｈ２ベクター（上の実施例６中に記載される）から単離し、ＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩにより消化したｐＣＢ２１９Ｎ−Ｎへと挿入し、ｐＳ４１３Ｐ／Ｃ２ｔｅｒを作製した。ｐＣＢ２１９Ｎ−Ｎを作製するために、ｃｂｈ２ターミネーターフラグメントを、５’端でＸｂａＩ−ＮｈｅＩ−ＢａｍＨＩ−ＳｍａＩ−Ｋｐｎ１部位を含む短いポリリンカーを含むｃｂｈ２遺伝子（Chen et al., 1987）の出版済みの３’非翻訳領域の２２２６〜２２４２ｂｐに相同のプライマー、およびｐＺＵＫ６００中のｃｂｈ２の３’端のＥｃｏＲ１部位の上流にアニールするｐＵＣフォワードプライマー（カタログ番号１２２４、ニューイングランド・バイオラボ社）を使用して、ｐＺＵＫ６００（実施例７中に記載されていた）鋳型から増幅した。このフラグメントを操作したＸｂａＩ部位およびＥｃｏＲ１部位で消化してｐＵＣ１１９の対応する部位へと挿入し、ｐＣＢ２１９を作製した。ＥｃｏＲ１−Ｎｏｔ１アダプター（カタログ番号３５３１０−０１０、ギブコ／ＢＲＬ社）をｐＣＢ２１９の唯一のＥｃｏＲ１部位へと挿入し、ｐＣＢ２１９Ｎを作製した。ＴｒＣｅｌ６Ａ遺伝子およびｃｂｈ２ターミネーターを含むフラグメントを、ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩによる消化によってｐＳ４１３Ｐ／Ｃ２ｔｅｒから単離し、ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩにより消化したｐＢＲ３２２ＳｐＸＣへと挿入し、発現カセットｐｃ／ｘＳ４１３Ｐ−ＥＣを作製した。
【０１３１】
プラスミドｐＮＣＢｇｌＮＳＮＢ（登録商標）を含む選択カセットは、プラスミドｐＦＢ６を含むアカパンカビｐｙｒ４に由来した（Radford, A., Buston, F.P., Newbury, S.F. and Glazebrook, J.A. (1985)ニューロスポラ属におけるピリミジン代謝の調節（Regulation of pyrimidine metabolism in Neurospora）。糸状菌の分子遺伝学（Molecular Genetics of Filamentous Fungi）中、（Timberlake, W.E.、編者）、アランＲ．リス（Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ）社（ニューヨーク）、１２７〜１４３ページ）。そのプロモーター、ターミネーターおよびいくつかの５’ＵＴＲ配列だけでなく、アカパンカビｐｙｒ４遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＭ１３４４８）も含むｐＦＢ６からの３．２ｋｂのＢｇｌＩＩフラグメントを、ポリリンカー中に（ＥｃｏＲＩとＳａｃＩとの間に）ＮｏｔＩ、ＳｍａＩ、ＮｈｅＩおよびＢｇｌＩＩ部位を含むように修飾したｐＵＣ１１９のＢａｍＨＩ部位の中にクローニングし、ｐＮＣＢｇｌ−ＮＳＮＢ（登録商標）を作製した。ｃｂｈ１プロモーター、ｘｌｎ２分泌シグナルペプチドおよびｃｂｈ２転写ターミネーターに作動可能に連結したＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｐ遺伝子を含むＳｐｅＩ／ＮｏｔＩフラグメントを、発現カセットベクターｐｃ／ｘＳ４１３Ｐ−ＥＣから単離し、ＮｈｅＩ（ＳｐｅＩおよびＮｈｅＩは適合性のある５’突出配列を有する）およびＮｏｔＩにより消化したｐＮＣＢｇｌ−ＮＳＮＢ（登録商標）へと挿入し、ｐｃ／ｘ−Ｓ４１３Ｐ−ＴＶを作製した。この最終コンストラクトをトリコデルマ・リーゼイの形質転換前にＮｏｔＩによって直線化した。
【０１３２】
実施例１１  トリコデルマ・リーゼイの形質転換。
１１．１  ｐｙｒ４栄養素要求体の単離
選択可能なマーカーとしてアカパンカビｐｙｒ４遺伝子を使用するために、自然発生のｐｙｒ４栄養素要求体を以下のように単離した。Ｔ．リーゼイのｐｙｒ４栄養素要求体の選択について以前に記述されるように、５ｍＭウリジンおよび０．１５％（ｗ／ｖ）のウリジンアナログ５−フルオロオロチン酸（ＦＯＡ）を含む最少培地上に、１×１０6のＴ．リーゼイの胞子をプレーティングした（Berges, T. and Barreau, C. 1991 Curr Genet. 19(5):359-65）。ＦＯＡ含有培地上で増殖する能力により、オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼをコードするｐｙｒ２遺伝子またはオロチジン−５′−リン酸デカルボキシラーゼをコードするｐｙｒ４遺伝子のいずれかを破壊した変異の選択が可能になる。自然発生のＦＯＡ耐性コロニーは、ウリジン含むおよび含まない最少培地の二次選択を行なった。次に、最少培地上で増殖することができないＦＯＡ耐性コロニーの胞子をｐＮＣＢｇｌＮＳＮＢ（登録商標）（実施例１１．４中に記載されている）により形質転換し、最少培地上の増殖について選択した。ｐＮＣＢｇｌＮＳＮＢ（登録商標）中のアカパンカビｐｙｒ４遺伝子によって相補された株のみが、最少培地上で増殖し、真のｐｙｒ４栄養素要求体である。これらの手順を使用して、Ｔ．リーゼイの安定したｐｙｒ４栄養素要求体を得た。
１１．２  Ｔ．リーゼイｐｙｒ４栄養素要求体のプロトプラストの形質転換。
【０１３３】
５×１０6のＴ．リーゼイの胞子を、５ｍＭウリジンを追加したポテトデキストロース寒天上の滅菌済みセロハン上にプレーティングし、胞子発芽および菌糸生長を容易にするために３０℃で２０時間インキュベートする。菌糸を有するセロハンディスクを、０．６Ｍ硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）（緩衝液Ｐ）中に７．５ｇ／Ｌのドリセラーゼおよび１２５ユニットのプロテアーゼ不含有β（ベータ）−グルカナーゼ（インタースペックス・プロダクツ（ＩｎｔｅｒＳｐｅｘ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）社、それぞれカタログ番号０４６５−１および０４１０−３）を含む、１０ｍＬのプロトプラスト形成溶液に移した。菌蓋を６０ｒｐｍでの振盪により５時間消化した。プロトプラストを、滅菌済み３０番ミラクロス（ＭＩＲＡＣＬＯＴＨ）（商標）を通した濾過によって未消化の菌糸から分離し、滅菌済み５０ｍＬ丸底遠心分離管の中に採取して室温１０分間１０００〜１５００×ｇでの遠心分離によって回収した。５ｍＬのプロトプラストを緩衝液Ｐにより洗浄し、１０００〜１５００×ｇで室温１０分間再び遠心分離した。プロトプラストを、１ｍＬのＳＴＣ緩衝液（１．２Ｍソルビトール、１０ｍＭＣａＣｌ2、１０ｍＭトリス−ＨＣＬ（ｐＨ７．５））中に再懸濁した。形質転換のために、０．１ｍＬの再懸濁したプロトプラストを、１０μｇのベクターＤＮＡおよび２５μＬのＰＥＧ溶液（２５％ＰＥＧ４０００、５０ｍＭＣａＣｌ2、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５））と組み合わせた。氷水浴中で３０分間のインキュベーション後に、１ｍＬのＰＥＧ溶液を室温で追加し、混合物を５分間インキュベートした。形質転換ミックスを２ｍＬのＰＥＧ溶液中の１．２Ｍソルビトールにより希釈し、混合物全体を２５ｍＬの約４７℃まで冷却した融解ＭＭＳＳ寒天培地（以下参照）に追加し、プロトプラスト懸濁物をＭＭＳＳ寒天の上に注いだ。コロニー増殖が見えるまで、プレートを３０℃でインキュベートした。ＭＭ寒天を含んでいる個別のプレートへ形質転換体を移して胞子を形成させた。ホモカリオン形質転換体を単離するために胞子を採取してＭＭ寒天上に高希釈でプレーティングし、次にそれを実施例１３中で以下に記載されているようなスクリーニング培養の接種のために、増殖および十分な胞子形成を可能にするＰＤＡ上にプレーティングした。
【０１３４】
最少培地（ＭＭ）寒天は下記成分を含む。
試薬  １Ｌあたり
ＫＨ2ＰＯ4  １０ｇ
（ＮＨ4）2ＳＯ4  ６ｇ
Ｎａ3クエン酸・２Ｈ2Ｏ  ３ｇ
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ５ｍｇ
ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ  １．６ｍｇ
ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  １．４ｍｇ
ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ  ２ｍｇ
寒天  ２０ｇ
２０％グルコースｆ．ｓ．  ５０ｍｌ
１ＭＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ｆ．ｓ．  ４ｍｌ
ｐＨは５．５へ
【０１３５】
ＭＭＳＳ寒天は、１．２Ｍソルビトール、１ｇ／ＬのＹＮＢ（ディフコ社からのアミノ酸不含有酵母窒素ベース、カタログ番号２９１９４０）および０．１２ｇ／Ｌのアミノ酸（ＢＤバイオサイエンス社からの−Ｕｒａ  ＤＯサプリメント、カタログ番号６３０４１６）を加えたＭＭ寒天と同じ成分を含む。
【０１３６】
実施例１２  液体培養における修飾したファミリー６セルラーゼの産生
トリコデルマ属の個別のコロニーを、各培養の増殖のためにＰＤＡプレートへ移した。増加した耐熱性を備えた修飾したＴｒＣｅｌＡ変異型を産生する培養の能力の検査に使用されるミクロ培養の一様な接種のために、胞子形成が必要だった。培養培地は以下から構成される。
成分  ｇ／Ｌ
（ＮＨ4）2ＳＯ4  １２．７
ＫＨ2ＰＯ4  ８．００
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ４．００
ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ  １．０２
コーンスティープリカー  ５．００
ＣａＣＯ3  ２０．００
炭素源**  ３０〜３５
微量元素*    ２  ｍｌ／Ｌ
*微量元素溶液は５ｇ／Ｌ  ＦｅＳＯ4・７Ｈ2０；１．６ｇ／Ｌ  ＭｎＳＯ4・Ｈ2０；１．４ｇ／Ｌ  ＺｎＳＯ4・７Ｈ2０を含む。
**グルコース、ソルカフロック（Ｓｏｌｋａ  ｆｌｏｃ）、ラクトース、セロビオース、ソフォロース、コーンシロップまたはアビセル。炭素源は、ｐＨ２〜７で水溶液として別々に滅菌することができ、残りの培地に最初にまたは発酵の過程で加えることができる。
【０１３７】
個別の形質転換体を、２４ウェルマイクロプレートにおける１ｍＬ培養で上述の培地中で増殖させた。初期ｐＨは５．５であり、培地を接種前に１２１℃で３０分間蒸気オートクレーブによって滅菌した。そのまま細胞および形質転換細胞の両方について、胞子をＰＤＡプレートから単離し、水中で懸濁し、１ｍＬあたり１０4〜１０5の胞子を各培養を接種するために使用した。培養は、６日間３０℃の温度で５００ｒｐｍで振盪された。１２，０００ｒｐｍでの遠心分離によって、分泌タンパク質を含んでいる濾液からバイオマスを分離した。タンパク質濃度は、バイオ・ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ ）社プロテインアッセイ（カタログ番号５００−０００１）を使用して決定した。実施例１４中で記載されるように、ＴｒＣｅｌＡ−Ｓ４１３Ｐの発現を決定した。
【０１３８】
実施例１３  修飾したファミリー６セルラーゼを含むＴ．リーゼイ培養濾液の特性評価
Ｔ．リーゼイ形質転換体の培養濾液中のＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｐの発現を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのウエスタンブロットハイブリダイゼーションによって決定した。具体的には、ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｐ形質転換体、元の株Ｐ１０７Ｂ、および天然で修飾されないＴｒＣｅｌ６Ａを発現する株（株ＢＴＲ２１３）からの１０〜２０μＬの培養濾液中の等量の全分泌タンパク質を、等容積の２×レムリー緩衝液（０．４ｇＳＤＳ／２ｍＬグリセロール／１ｍＬの１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）／０．３０８５ｇＤＴＴ／２ｍＬの０．５％のブロモフェノールブルー／０．２５ｍＬβ−メルカプトエタノール／全容積１０ｍＬ）へ追加した。１０ｕＬの各調製サンプルを、２４ｍＭトリス、１９２ｍＭグリシン（ｐＨ６．８）、１０ｍＭ  ＳＤＳを泳動緩衝液として使用する１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分離した。分離したタンパク質を、２０％メタノールを含む２５ｍＭトリス／１９２ｍＭグリシン緩衝液中でアクリルアミドゲルからＰＶＤＦ膜（あらかじめメタノールで濡らした）へ電気泳動的に転写した。続いて３０ｍＬのブロットー（ＢＬＯＴＴＯ）緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中に５％脱脂粉乳）中で膜を洗浄した。膜は、３０ｍＬのブロットー中で１：２０，０００に希釈したＴｒＣｅｌ６Ａ特異的ポリクローナル抗体をプローブとして室温で一晩インキュベーションし、等容積のブロットーにより室温で１０分間２回以上洗浄し、次にブロットー中で１：３０００に希釈したヤギ抗ウサギ／アルカリフォスファターゼコンジュゲートをプローブとして室温で１時間インキュベーションした。最終的に、膜は５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）の過剰量により室温で１５分間２回各々洗浄した。ハイブリダイズしたＴｒＣｅｌ６Ａを含む複合体は、４５μｌの４−ニトロブルーテトラゾリウムクロライド（ロッシュ・ダイアグノスティックス社）および３５μＬの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル（ｉｎｄｏｙｌ）リン酸（ロッシュ・ダイアグノスティックス）を含む１０ｍＬの１００ｍＭＮａＣｌ／１００  ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ  ９．５）緩衝液による膜の処理によって、バンドが明瞭に見えるまで室温で可視化した。〜６０ｋＤａの陽性にハイブリダイズするバンドは、大部分の形質転換体、陽性対照株ＢＴＲ２１３からの培養濾液において観察されたが、株Ｐ１０７Ｂからの培養濾液では観察されなかった。形質転換体Ｐ４７４Ｂは、対照株ＢＴＲ２１３によって発現および分泌される修飾されないＴｒＣｅｌ６Ａの量とほぼ同じレベルのＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｐを発現および分泌する。
【０１３９】
ＴｒＣｅｌ６ＡまたはＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｐを含むトリコデルマ属セルラーゼの安定性は、５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．８）中で５０℃で９６時間までセルラーゼをインキュベーションし、次に比濁分析によってセルラーゼの残存活性を測定して評価した（Enari, T.M. and Niku-Paavola, M.L. 1988. Meth. Enzym. 160: 117-126）。
【０１４０】
未処理のＴｒＣｅｌ６ＡおよびＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｐセルラーゼによるセルロース加水分解率は同一であったが、基質の非存在下において９６時間までインキュベーションした後に、ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３ＰセルラーゼはＴｒＣｅｌ６Ａセルラーゼよりも非常に高い活性を維持した（図８）。したがって、ＴｒＣｅｌ６Ａの耐熱性の改善は、修飾したファミリー６セルラーゼおよび他の成分を含む全トリコデルマ属セルラーゼ系の耐熱性もまた改善した。
【０１４１】
本発明は好ましい実施形態に関して記述した。しかしながら、本明細書において記述されるような本発明の範囲から逸脱せずに、多数の変化および修飾を行うことができることは当業者にとって明らかだろう。
【０１４２】
全ての参考文献及び引用は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
参照文献
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【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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