(57)【要約】本発明はC型肝炎ウイルスレプリコン増殖を抑制するRNA分解酵素抵抗性RNAアプタマーが提供される。本発明によるRNAアプタマーは、U(ウラシル)とC(シトシン）の2′ヒドロキシルがフルオロ基に置換されている配列番号3と配列番号4、及びU(ウラシル)とC(シトシン）の2′ヒドロキシルがフルオロ基に置換されており5′末端にコレステロールが付着されており3′末端にはidTが付着された配列番号4の塩基配列に構成される群から選択される少なくとも一つの塩基配列でなされ、C型肝炎ウイルス(HCV）のNS5Bに特異的に結合しHCVレプリコン増殖を抑制する。本発明のRNAアプタマーはHCV診断と治療などに有用に使うことができる。【選択図】図５
2010510805.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
U(ウラシル)とC(シトシン）の2′ヒドロキシルがフルオロ基に置換されている配列番号3と配列番号4、及びU(ウラシル)とC(シトシン）の2′ヒドロキシルがフルオロ基に置換されており、5′末端にコレステロールが付着されており、3′末端にはidTが付着された配列番号4の塩基配列に構成される群から選択される少なくとも一つの塩基配列でなされ、
C型肝炎ウイルス(HCV）のNS5Bに特異的に結合し、HCVレプリコン増殖を抑制することを特徴とする、C型肝炎ウイルスレプリコン増殖を抑制するRNA分解酵素抵抗性RNAアプタマー。
【請求項２】
U(ウラシル)とC(シトシン）の2′ヒドロキシルがフルオロ基に置換されている配列番号3と配列番号4、及びU(ウラシル)とC(シトシン）の2′ヒドロキシルがフルオロ基に置換されており5′末端にコレステロールが付着されており3′末端にはidTが付着された配列番号4のRNAアプタマーに構成される群から選択される少なくとも一つのRNAアプタマーを含み、
前記RNAアプタマーとHCVが発現する蛋白質NS5Bの特異的結合を検出してHCV感染の診断に使われるのを特徴とする、HCV感染診断キット。
【請求項３】
U(ウラシル)とC(シトシン）の2′ヒドロキシルがフルオロ基に置換されている配列番号3と配列番号4、及びU(ウラシル)とC(シトシン）の2′ヒドロキシルがフルオロ基に置換されており5′末端にコレステロールが付着されており3′末端にidTが付着された配列番号4のRNAアプタマーに構成される群から選択される少なくとも一つのRNAアプタマーを有効性分とし、
C型肝炎ウイルス(HCV）のNS5Bに特異的に結合しHCVレプリコン増殖を抑制するのを特徴とする、C型肝炎ウイルスの増殖抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はC型肝炎ウイルスレプリコンの増殖を抑制するRNA分解酵素抵抗性RNAアプタマー、これを利用したHCV感染診断キット及びC型肝炎ウイルスの増殖抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
C型肝炎ウイルス(Hepatitis  C  Virus: HCV）は、慢性肝炎と肝硬化、そしてある場合には肝癌を起こす主要病源体である(貼付の参考文献14参照、以下同一)。HCVが全世界人類の約3%以上に影響を与えていることにもかかわらずいまだこうした特異的で効率的な治療剤が開発されていない。
【０００３】
HCVはおよそ3、010個のアミノ酸で構成された重合蛋白質を解読する9、600個の塩基配列長さの単一陽性ストランドRNAゲノムを持っている(参考文献6)。前記重合蛋白質の前駆体は細胞とウイルスのプロテアーゼによって少なくとも10個の円熟した構造的、非構造的蛋白質(C、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、and  NS5B）に進行される(参考文献6及び23参照)。
【０００４】
HCVのNS5BはHCVが自身のゲノムを複製する間に陰性ストランド鋳型とゲノムのウイルスRNAの合成に重要なものと思われるRNA依存性RNA合成に活性を有している(参考文献2参照)。したがって、NS5Bはウイルスの増殖に非常に本質的なものと思われており抗ウイルス新薬開発に主要標的になっている(参考文献18参照)。
RNAはその性格のため標的蛋白質に特異的に結合する安定した構造で結合体化することができ、そのうえ化学的にも容易に合成できるので潜在的に診断、治療に有用な先駆化合物である(参考文献4及び8参照)。
【０００５】
特にSELEX(systematic  evolution  of  ligands  by  exponential  enrichment)と呼ばれる試験管での反復的な選択技術を利用して、いろいろな蛋白質に高い親和力と特異性を有する短いRNAリガンド(ligand)であるRNAアプタマーを無作為RNAライブラリーから発掘することができる(参考文献7及び28参照)。
【０００６】
多様なアプタマーが動物の疾病モデルから成功的に評価されており(参考文献9、24及び26参照)、それらの一部は現在治療的な臨床開発段階まで至っている(参考文献27参照)。最近、米国の食品医薬庁から全種類の湿性老人性黄斑変性に対して、 ペガプタニブ・ナトリウム (pegaptanib  sodium  :  Macugen)と呼ばれる新生血管抑制剤に関するRNAアプタマーが承認され(参考文献19参照)、これはRNAアプタマーの治療的な潜在性を見せる良い事例である。
【０００７】
HCV  NS5Bに特異的で高親和力を有するRNAアプタマーが最近分離され、その特性が記述されていて(参考文献3及び29参照)、たとえかかるアプタマーが試験管でRNA依存性RNA合成酵素の活性を阻害するとしても細胞内でHCV複製を抑制するいかなる研究も未だ発表されていない。
【０００８】
本発明者たちはRNA分解酵素に抵抗性がありHCV  NS5Bに対抗するRNAアプタマーを発見し、同時にこれらRNAアプタマーが人間の肝細胞株でHCVの複製過程を抑制することができるのを発見して本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、C型肝炎ウイルス(HCV）のNS5Bに特異的に結合するRNAアプタマーの提供にある。
【００１０】
本発明の他の目的は、HCVのNS5Bに特異的に結合しHCVの増殖を抑制してHCV感染を抑制しえるHCV治療及びその診断に利用できるRNAアプタマーの提供にある。
本発明のまた他の目的は、HCVのNS5Bに特異的に結合しHCVの増殖を抑制してHCV感染を抑制しえるRNAアプタマーを用いた、HCV感染診断キット及びC型肝炎ウイルスの増殖抑制剤の提供にある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明によりC型肝炎ウイルスレプリコン増殖を抑制するRNA分解酵素抵抗性RNAアプタマーが提供される。
【００１２】
本発明によるRNAアプタマーは、U(ウラシル)とC(シトシン）の2′ヒドロキシルがフルオロ基に置換されている配列番号3と配列番号4、及びU(ウラシル)とC(シトシン）の2′ヒドロキシルがフルオロ基に置換されており5′末端にコレステロールが付着されており3′末端にはidTが付着された配列番号4の塩基配列で構成される群から選択される少なくとも一つの塩基配列になっている。本発明によるRNAアプタマーは、C型肝炎ウイルス(HCV）のNS5Bに特異的に結合しHCVレプリコン増殖を抑制する。
【００１３】
本発明のRNAアプタマーが起源した配列番号1と配列番号2のRNAアプタマーと、本発明による配列番号3及び配列番号4のRNAアプタマーの塩基配列は下のようである。
【００１４】
5′-GGGAGAGCGGAAGCGUGCUGGGCCUUGAACGAUUGGUAGUAGAAUAUCGUCAGUGAACGGCAGUCAUAACCCAGAGGUCGAUGGAUCCU-3′(配列番号1) 
5′-GGGAGAGCGGAAGCGUGCUGGGCCGACAGGGUAGCUUACAGCUGCAUGAUCGCUAGAGGGCGAACAUAACCCAGAGGUCGAUGGAUCCCCCC-3′(配列番号2)
5′-GCUGGGCCUUGAACGAUUGGUAGUAGAAUAUCGUCAGUGAACGGC-3′(配列番号3)
5′-GUUGAACGAUUGGUAGUAGAAUAUCGUCAG-3′(配列番号4)
【００１５】
本発明により、U(ウラシル)とC(シトシン）の2′ヒドロキシルがフルオロ基に置換されている配列番号3と配列番号4、及びU(ウラシル)とC(シトシン）の2′ヒドロキシルがフルオロ基に置換されており5′末端にコレステロールが付着されており3′末端にはidTが付着された配列番号4のRNAアプタマーから構成される群から選択される少なくとも一つのRNAアプタマーを含み、前記RNAアプタマーとHCVが発現する蛋白質NS5Bの特異的結合を検出してHCV感染の診断に使われるHCV感染診断キットが提供される。
【００１６】
本発明により、U(ウラシル)とC(シトシン）の2′ヒドロキシルがフルオロ基に置換されている配列番号3と配列番号4、及びU(ウラシル)とC(シトシン）の2′ヒドロキシルがフルオロ基に置換されており5′末端にコレステロールが付着されており3′末端にidTが付着された配列番号4のRNAアプタマーから構成される群から選択される少なくとも一つのRNAアプタマーを有効性分とし、C型肝炎ウイルス(HCV）のNS5Bに特異的に結合しHCVレプリコン増殖を抑制するC型肝炎ウイルスの増殖抑制剤が提供される。
【００１７】
前述したように、C型肝炎ウイルス(HCV)が発現するNS5B蛋白質はRNA依存性RNA合成機能を有する酵素としてHCV増殖のために重要な機能を有する蛋白質であり、したがってHCV  NS5Bは抗HCV製剤発掘のために有用な標的分子と思われる。
【００１８】
本発明者たちは、SELEX技術を利用して、40個の無作為ヌクレオチド塩基配列を有し2′にヒドロキシル基の代わりにRNA分解酵素に抵抗性を有するフルオロ基に置換されている組合ライブラリーRNAから、HCV  NS5Bを標的にRNA分解酵素抵抗性RNAアプタマーを一次的に発掘(選別)し、発掘されたRNAアプタマーは配列番号1(RNAアプタマー#9）と配列番号2(RNAアプタマー#24）の塩基配列を持つRNAアプタマーである。
【００１９】
ライブラリーRNAは標的蛋白質とほとんど結合できない反面、発掘された前記RNAアプタマー(配列番号1及び配列番号2）はHCV  NS5Bと特異的で高い親和力を有して結合し、その結合力(Kd）はそれぞれ18nMと5nMである。
このような前記RNAアプタマーを肝癌細胞であるHuh-7に導入するとHCVのサブゲノミックレプリコン(subgenomic  replicon）のRNA合成を阻害してHCVの複製を阻害しえることを発見した。
【００２０】
本発明者たちは、配列番号1及び配列番号2のRNAアプタマーを切断したアプタマーを製作してNS5Bに対する結合力を測定することによってNS5Bに強力に結合できる最適化された本発明のRNAアプタマーである配列番号3(RNAアプタマー#9-t1）と配列番号4(RNAアプタマー#9-t2）のRNAアプタマーを発掘した。
【００２１】
最適化された本発明の配列番号4のRNAアプタマー(RNAアプタマー#9-t2）は、ただ30ntのサイズから構成されながらも2.6nMの高い結合力でNS5Bと結合し、全長のRNAアプタマー(配列番号1)より更に效果的にHCVのサブゲノミックレプリコンのRNA合成を阻害する。
【００２２】
また本発明者たちは、最適化された本発明のRNAアプタマー(Chol-RM9  t2)を化学的に合成した。この際5′末端には細胞透過性分子であるコレステロールを、3′末端にはidT(inverted  deoxy  thymidylate)を付着した変形されたRNAアプタマーを合成した後、HCVサブレプリコンの複製抑制機能を検査し、その結果NS5Bに結合できない突然変異アプタマに比して、本発明による最適RNAアプタマーの場合Huh-7細胞とインキュベーションする時、その導入量と比例して效果的にHCVサブゲノミックレプリコンのRNA合成を阻害しえることを確認した。
【００２３】
本発明のRNAアプタマーは、HCVの感染の診断と治療に用いることができ、同時にHCVのRNA依存性RNA合成酵素の機能を研究することのできる有用な道具として利用されようと期待する。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によるRNAアプタマーは、HCV  NS5B蛋白質によるRNA依存性RNA合成に対抗してRNA分解酵素に抵抗性のあるRNAアプタマーとして、本発明のRNAアプタマーはナノモールのとても低い結合常数(すなわち高結合力）で標的蛋白質に特異的に結合し、さらに本発明のRNAアプタマーは人間肝細胞に導入した場合HCVレプリコンの細胞内のRNA合成を妨害する作用効果がある。
【００２５】
最近NS5Bを含んでNS3ヘリカーゼ(参考文献10及び11参照)とプロテアーゼドメイン(参考文献13参照）のような、また他のHCV調節蛋白質に対抗するRNAアプタマーが発掘されているが、これらのアプタマーは2番位置に正常なヒドロキシルを持っていてHCV複製を妨害するための抗ウイルス製剤開発に適用するには非常に難しい点がありえるが(参考文献20参照)、本発明によるRNA分解酵素に抵抗するRNAアプタマーは小さな化学物質のように標的細胞に效果的に直接移動させることができる。
【００２６】
最適化過程を介した本発明による配列番号4のアプタマー(RNAアプタマー#9-t2）は化学的合成が容易なやや30ヌクレオチドの小さなサイズで構成されてその実效性がきわめて優秀であるものと予測される。。
【００２７】
また最適化された本発明のRNAアプタマー(配列番号4）の3′末端にidTを、そして5′末端にコレステロール基を付着したアプタマー変形体(Chol-RM9  t2)を成功的に合成するによって、アプタマーのヌクレアーゼ(nuclease)に対する安全性を付加してアプタマーの細胞透過性を附与したので、このような本発明の合成されたRNAアプタマーを細胞に直接に処理する場合にHCV複製が效果的に抑制される。
【００２８】
本発明のアプタマーはヌクレオチド連結部位をフォスフォチオエイト(phosphothioate）に変形したりその末端をPEG(polyethyleneglycol）のような他物質を付着した変形を通してその治療的な潜在性を増加させることができる(参考文献5参照)。
【００２９】
また治療的な製剤としての本発明によるRNAアプタマーはHCV感染に対する診断的なプローブ(probe）として利用できるし、HCVが増殖するあいだHCV  NS5Bの細胞内の役割を糾明する遺伝的な道具としても用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】選別された2′-F  RNAアプタマーの予想構造図である。
【図２】選別された2′-F  RNAアプタマーとHCV NS5Bとの結合を示す図である。
【図３】選別された2′-F  RNAアプタマーのHCV NS5Bレブリカゼに対する結合親和力を示す図である。
【図４】選別された2′-F  RNAアプタマーによるHCVレプリコンの増殖抑制を示す図である。
【図５】RNAアプタマー#9とその切断したアプタマーの予想構造図である。
【図６】本発明による最適化した(切断した)2′-F  RNAアプタマーによるHCVレプリコン増殖抑制を示す図である。
【図７】本発明による2′-F  RNAアプタマーの化学合成形であるChol-RM9  t2の予想構造図である。
【図８】合成した本発明によるChol-RM9  t2  RNAアプタマー、及びChol-Mu-RM9  t2  RNAアプタマー部位の塩基配列及び構造図である。
【図９】合成した本発明のChol-RM9  t2  RNAアプタマー、及びChol-Mu-RM9  t2  RNAアプタマーによるHCVレプリコンの増殖抑制を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下、実施例と貼付の図面を参照して本発明によるRNAアプタマーを詳細に説明する。以下、先ず本発明によるRNAアプタマーの配列を決定しその特徴を分析する一連の過程を説明して、続いてその具体的な実施例を説明する。
【００３２】
1.RNAアプタマーの発掘
SELEX過程を行うために必要なRNAライブラリーを製造するため、40個の塩基が無作為に入っていった76merの単一オリゴヌクレオチドを鋳型として利用して下の5′-プライマー(配列番号5)と3′-プライマー(配列番号6）でPCRを通しDNAライブラリーを製造した。5′-はRNAを合成するためのT7  RNAプロモーター部分を含んでいる。
【００３３】
5′-GGTAATACGACTCACTATAGGGAGAGCGGAAGCGTGCTGGG-3′(配列番号5)
5′-GGGGGGATCCATCGACCTCTGGGTTATG-3′(配列番号6)
【００３４】
0.25μM  5′-プライマー、0.25μM  3′-プライマー、10×PCR  バッファー、及び100μM  dNTPの混合物を混合して、先ず95℃で5分間Taqポリメラーゼ(Promega)を2.5ユニット添加した。そしてPCRサイクルで95℃の30秒、55℃の30秒及び72℃の1分の条件で20サイクル反復した後、最後に72℃の8分30秒で多様なDNAライブラリーを製造した。
【００３５】
PCRを通して作られた多様な塩基配列を有するDNAライブラリーを鋳型としてT7    RNAポリメラーゼ(Takara)を利用して試験管内で転写を通してRNAライブラリーを製造した。このときRNA分解酵素に抵抗性のあるRNAを製造するために2′-デオキシ-2′フルオロCTPとUTP(Epicentre  Technologies)及び正常なGTPとATPとT7  RNA重合酵素を利用して、試験管から合成した鋳型の転写により、すべてのピリミディンヌクレオチドの2番位置がフルオロ基に変形されたRNAを生産した(参考文献25参照)。
【００３６】
具体的に、DNAライブラリー、5×転写  バッファー、50mM  DTT、0.5mM  ATP、GTP、2′-F  CTP、2′-F  UTP、T7  RNA  ポリメラーゼ(Takara)、DEPC-H2Oで50μlにして37℃で3時間反応させた。5U  RQ1  DNaseI(promega)を処理して37℃で30分間処理して鋳型として使われたDNAを除去した後Sephadex(sigma)を利用してRNAライブラリーを抽出した。SELEX過程を通し得られたRNAは7Mウレア-6%ポリアクリルアミドゲルから抽出した。
【００３７】
得られた下のRNAライブラリーの塩基配列はA、G、C、Uがそれぞれの位置に同等な量で混入された40個のヌクレオチドを意味するN40を含む。
【００３８】
5′-GGGAGAGCGGAAGCGUGCUGGGCC N40 CAUAACCCAGAGGUCGAUGGAUCCCCCC-3′  
【００３９】
C型肝炎ウイルスRNA重合酵素はカルボキシル末端にヒスティディンでタグして発現するpET21発現ベクター(Novagen)にクローニングし、蛋白質をE.coli  BL21(DE3)菌株で過剰発現させニッケルレジン(Ni-NTAアガロス）を利用して精製した(参考文献22)。
【００４０】
SELEX技術を活用してC型肝炎ウイルスNS5Bに特異的なRNA分解酵素に抵抗性のあるRNAアプタマーを分離した(参考文献1、10及び25)。先ず、10μgのRNAライブラリーを振り上げる状態で室温で30分間20μlのニッケルNTAビード(bead)と100μl結合緩衝額(30mM  Tris-HCl、pH7.5、150mM  NaCl、1.5mM  MgCl2、2mM  ジチオトレイトール (dithiothreitol)、及び1%  BSA)で反応してビードと反応する非特異的なRNAを除去した。
【００４１】
以後、上層液を新しいチューブに移し常温からヒスティディンでタグされたC型肝炎ウイルスNS5Bと30分間培養してNS5B-RNA結合体を沈殿させてペレットを0.5mlの結合緩衝額で5回洗ってあげた。
【００４２】
このように得られたRNAを逆転写-遺伝子増幅技術と試験管転写を反復して7回以上のセレクションに利用した。8回のセレクション後に増幅されたDNAをクローニングした後14個のクローンの塩基配列を分析した。
【００４３】
2.RNAアプタマーの結合特異性
[alpha-32P]ATPを利用して先に選別したRNAアプタマーの内部を放射線同位元素で表示した。すなわち、発掘されたRNAアプタマーに対するcDNAクローンからT7  RNA重合酵素を利用してRNAを生成するとき[alpha-32P]ATPを添加してRNAアプタマーの内部を放射線同位元素で表示した。
【００４４】
製造したRNAを変性させるため95℃で2分間放置した。変性されたRNAを7Mウレア-6%ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した後X線フィルムに3分間露出して現像した後、望むRNAバンドを切って400μlの溶離バッファーに入れて37℃で3時間溶離した。溶離されたRNAはフェノール抽出及びエタノール沈殿で精製及び濃縮して液体閃光計数器(Liquid  Scintillation  Counter）で定量した。
【００４５】
定量したRNAアプタマーとHCV  NS5Bとの結合性をわかるために1nMのRNAと100nM  NS5Bを100μlの結合緩衝額(30mM  Tris-HCl(PH7.5)、150mM  NaCl、1.5mM  MgCl2、2mM  DTT)で常温で30分結合させた。
【００４６】
結合されたRNAはニッケルNTAビードで沈殿した後0.5ml結合緩衝額で5回洗い落とした後、0.1M  EDTA及び15μlフェノールを利用して抽出した後エタノールで濃縮させて6%ポリアクリルアミドウレアゲルで分析した。
結果、配列番号1(RNAアプタマー#9）と配列番号2(RNAアプタマー#24）のRNAアプタマーを発掘した。
【００４７】
3.切断RNAアプタマー製作
発掘された配列番号1(RNAアプタマー#9）と配列番号2(RNAアプタマー#24）のRNAアプタマーの切断された(truncated)形をT7重合酵素を利用した試験管転写方法を介して製作した。
【００４８】
このとき、後述する本発明によるRNAアプタマー#9-t1(配列番号3)には各々配列番号7及び配列番号8の5′及び3′プライマーを使用し、本発明のRNAアプタマー#9-t2(配列番号4)には各々配列番号9及び配列番号10の5′及び3′プライマーを使用し、RNAアプタマー#9-t3には配列番号11及び配列番号12の5′及び3′プライマーを使用して、各々PCRで増幅させた。これらプライマーの配列は下のようである。
【００４９】
5′-GGTAATACGACTCACTATAGGGCTGGGCCTTGAACGAATGGTAG-3′(配列番号7)
5′-GCCGTTCACTGACGATATTCTACTACCAATCGTTCAAGG-3′(配列番号8)
5′-GGTAATACGACTCACTATAGGGTTGAACGATTGGTA-3′(配列番号9)
5′-CTGACGATATTCTACTACCAATCGTTCAACCCTATA-3′(配列番号10)
5′-GGTAATACGACTCACTATAGGGAACGATTGGTA-3′(配列番号11)
5′-ACGATATTCTACTACCAATCGTTCCCTATAGTG-3′(配列番号12)
【００５０】
増幅させた二重螺旋DNAをT7  RNA重合酵素を利用して試験管転写を行い、このときピリミディーンヌクレオチドは2′フルオロ基に置換されたものを使用した。製作された各々のRNAアプタマーを10%変性ウレアゲルで電気泳動した後精製した。
【００５１】
結果、本発明によるRNAアプタマーである配列番号3(RNAアプタマー#9-t1)及び配列番号4(RNAアプタマー#9-t2）のRNAアプタマーを発掘した。
【００５２】
4.RNAアプタマーの合成
最適化された本発明のRNAアプタマー#9-t2(2′-フルオロピリミディーン含有)を標準固相フォスフォラミダイト化学(standard  solid-phase  phosphoramidite    chemistry）を利用して合成しHPLC(high  speed  liquid  chromatography)を利用して精製した。このときNS5Bに結合できない突然変異(mutant)アプタマーも共に合成した。
【００５３】
最適及び突然変異アプタマーのすべての3′末端にはヌクレアーゼに対して防御するためにidT(inverted  dT)を添加し5′末端にはアプタマーの細胞膜透過のためにコレステロールを付着した。
【００５４】
このような変形されたアプタマーを合成するために、idT  CPG(solid  support)を利用して1mmolスケールで合成を行い、このとき5′末端にはコレステロールTEGアミダイト(Cholesteryl  TEG  amidite)(1-dimethoxytrityloxy-3-O-(N-cholesteryl-3-aminopropyl)-triethyleneglycol-glyceryl-2-O-(2-cyanoethyl)-(N、Ndiisopropyl)-phosphoramidite)を使用してコレステロール基を付着した。
【００５５】
コレステロール基が付着されたアプタマーコンジュゲート(conjugate）の合成はポリアクリルアミドゲルエレクトロホレシス(polyacrylamide  gel  electrophoresis)、HPLC及びMALDI-TOFを利用して検証し、CentriSep(Pronceton  Separations  Inc.）を利用した沈殿及び精製(desalting）を行って用意し、水に溶かした後実験に使用した。化学的に最終合成されたアプタマーをChol-RM9  t2、突然変異アプタマーをChol-Mu-RM9  t2とした。
【００５６】
5.RNAアプタマー結合親和度測定
(1)  Gel  retardation
放射線同位元素で内部が表示されたRNAアプタマー(50pM)をNS5B蛋白質量(0-320nM）を増加しながら反応させた。このときアプタマーと蛋白質及び結合緩衝額(30mMTris-HCl(PH7.5)、150mM  NaCl、1.5mM  MgCl2、2mM  DTT)、tRNA  3μgなどを総40μlに合せたあと常温で30分間結合させた。6X  BPBを添加して4℃で120Vで6%ネイティブゲル(6%ポリアクリルアミド、1X  TBE、10mM  MgCl2、2%グリセロール)で電気泳動しX線フィルムに露出して現像した。総RNAアプタマーE対するNS5Bに結合するRNAアプタマーの量を計算して分離常数(Kd)を測定した。
【００５７】
(2)  SPR分析
Biacore2000機械を使用してNHSとDECを同量(50μl)混合物を作った後5s/minで40s間流してCM5センサーチップを活性化した。150-200RUになると固定化しようとする蛋白質をソディウムアセテート(pH4.0)に入れ混ぜて50ng/μlになるように流した。リガンド(ligand)の固定化が正しくなされたのか確認するために50mM  NaOHから5s間流した。80℃でRNAアプタマーを5分間変性させたあと常温で15分間脱変性して分析対象物RNAを準備した。その動力学(kinetics)を求めるために流速を30s/minに変更させた。用意した分析対象物を1X  HBSに希釈して6.25nMで500nM間の濃度間で流した。各段階ごとに50mM  NaOHで脱変性した。平衡解離常数(equilibrium  dissociation  constant  :  Kd）はligandと分析対象の1:1結合に設定した後センサーグラム(sensogram)から得られたReq値のプロット曲線からKa/Kd動力学同時モデルプログラム(kinetic  simultaneous  Ka/Kd  modelprogram）を利用してKD値を求めた。
【００５８】
6.RNAアプタマーによるHCV増殖抑制
最近開発されたC型肝炎ウイルスサブゲノミックレプリコンシステムを利用して人間肝細胞でC型肝炎ウイルス複製を妨害するRNAアプタマー活性を測定した(参考文献12及び17参照)。
【００５９】
サブゲノミックレプリコン構成体であるpFK-I389neo/NS3-3′/5.1(参考文献12参照）はNS3とNS4Aで適応性の変形をへたものとしてドイツのハイデルベルグのラルフバテンシュレンジャ博士(Dr.R.Bartenschlager)から獲得した。C型肝炎ウイルスレプリコンRNAプラスミドを制限酵素Ase-1とSca-1で切断した後試験管で転写して使用した(参考文献10参照)。
【００６０】
選別されたRNAが細胞内部でC型肝炎ウイルス複製を妨害するの察するためにC型肝炎ウイルスレプリコンRNAと多様のRNA競争者とを一緒にトランスフェクション (transfection) したあと72時間後に逆転写遺伝子増幅技術を利用して肝癌細胞Huh-7細胞でHCV陰性ストランドRNAが合成された量の水準を測定した。
【００６１】
500ngのHCVレプリコンRNAと5μgのサンプルRNAを電気穿孔法実験を利用して4x106個Huh-7細胞に950μF  250V状態でGene  Pulser  System(BioRad）を持って導入した。導入効率を測定するために各サンプルにレニラルシフェラーゼ(Renilla  luciferase)を暗号化するプラスミド、pCDNAlucを添加した。
【００６２】
各サンプルで等しいトランスフェクション効率がルシフェラーゼ遺伝子を逆転写遺伝子増幅分析により再確認された。
【００６３】
トランスフェクション72時間後全体RNAを分離してHCV  cDNA陰性ストランドに特異的な3′プライマー(5′-GGGGAATTCCGTAACACCAACGGGCGC:配列番号13)またはβ-actin  cDNAに対する無作為プライマーで逆転写した。
【００６４】
このように得られたcDNAはHCV  cDNA陰性ストランドに特異的な5′プライマー(5′-GGGAAGCTTCTCGTCCTGCAGTTCAT:配列番号14)と3′プライマーを有して30サイクルで増幅して結果を得て、その値は5′プライマー(5′-ATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTGCG:配列番号15)、3′-プライマー(5′-CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC:配列番号16）で増幅したβ-actin  cDNA量を利用して標準化した。
【００６５】
化学合成された本発明によるRNAアプタマー(Chol-RM9  t2)によるHCVサブレプリコンRNA複製機能抑制現状を観察するためにHCVサブゲノミックレプリコンRNAであるFK-I389neo/NS3-3′/5.1RNAが安定的に複製されているHuh-7細胞を利用した。
【００６６】
多様の濃度のChol-RM9  t2及びChol-Mu-RM9  t2アプタマーをHCVサブレプリコンが複製されているHuh-7細胞と37℃で反応した。反応後48時間後に細胞から総RNAを分離した後リアルタイムPCRを利用してHCVサブレプリコンRNAの複製抑制度も観察した。リアルタイムPCRのためでSYBR-Green  core  reagentカート及びTaqポリメラーゼ(Takara)を利用した。
【００６７】
前記で提示したHCV  cDNAの陰性ストランドに特異的なプライマーセットを使用してアプタマーを処理するときの変化するHCVのnegative-strand  RNA合成量をmock処理した細胞と相互比較した。
【００６８】
HCV  cDNA陰性ストランドを増幅するために総RNA  2mgを利用しPCR-キットマニュアルを参照して行った[12.5ml  SYBR  Green  Mix(2×)、0.2ml  cDNA、1ml  primer  pair  mix(5pmol/ml  each  primer)、及び11.3ml  H2O]。
PCR増幅は95℃で30秒、55℃で40秒、及び72℃で1分の条件で40サイクルを適用した。
【００６９】
反応産物のためのコントローラでハウスキーピング(house  keeping)遺伝子であるGAPDH遺伝子を利用することによって、cDNAローディング量の最小限の変移を補正するためにHCV  cDNAから得られた限界水準をGAPDHでの限界水準に調整した。増幅のためにRoter-Gene及びリアルタイムPCR装置(Corbett）を利用した。
【００７０】
実施例1  :  HCV  NS5Bに対するRNA分解酵素抵抗性RNAアプタマーの選別
前述した方法で1014個の互いに異なる分子の無作為プールから構成されたRNAライブラリーを生成してHCV  NS5Bに結合するRNAアプタマーを選別した。このときRNAヌクレオチドの2′基が変形されたピリミディンを利用してRNA分解酵素に抵抗性あるRNAライブラリーを製造した。RNAの2番位置変形は変形されないものと比較するとき人間血清で10、000倍以上の安全性を増加させる(参考文献15、16及び25参照)。2番位置フルオロ基を持つRNAは堅くて強い分子内螺旋を形成して熱力学的に安定に固定された3次構造を主導して高親和力を有する(参考文献21参照)。
SELEX結果2番位置でフルオロが変形され選択されたRNAアプタマーは、#9(配列番号1)と#24(配列番号2）に命名された2個の主要グループに区分された。2個になされたアプタマーグループは全体的に異なる塩基配列を持ち、MULFOLDプログラムを利用して分析した結果、図1に示したように、これらは安定した２次構造を持つものと予測された(参考文献30参照)。
【００７１】
予測された構造は2個のアプタマーグループが異なる形態を表す。選別されたRNAアプタマー#9の場合、一個のステム-ループ構造になっているものとは対照的に#24は終わり部分に2個のステム-ループ構造を持っている。
【００７２】
RNAライブラリーの無作為部分から選択された前記２グループのアプタマー塩基配列は終わり部位にステム-ループ部分が存在するが、この部分がNS5Bに直接的に結合に関与することと予測される。
【００７３】
図1は8回の試験管選択後に14個の選別されたRNAアプタマーから決定された塩基配列である。クローンのなかで二つの異なるRNA塩基配列が現れ、#9と#24は各々8回と6回の頻度で現れた。図面でCとUは各々2′-フルオロCと2′-フルオロUを表す。RNAの２次構造はMULFOLDプログラムを利用して決定された。図1の配列番号1及び配列番号2のRNAで塩基配列25から64はRNAライブラリーの無作為部分から選別された塩基配列を表す。
【００７４】
実施例2  :  RNAアプタマーの結合特異性
2番位置フルオロの選別されたRNAアプタマーの結合特異性を察するために実施例1で選別されたRNAアプタマーを放射線同位元素で表示して沈殿実験を行った(図2参照)。表示精製されたRNAを前述したように蛋白質と反応したあと結合されたRNAを抽出して分析した。
【００７５】
図2は放射線同位元素で表示された1nMオリジナルライブラリーRNA、RNAアプタマー#9及びRNAアプタマー#24を標的蛋白質(100nM）がある場合(+E)とない場合(-E)に反応させて、RNA-標的蛋白質結合体をNi-NTAビードで沈殿して結合されたRNAを抽出し、6%ポリアクリルアミドウレアゲルで分析した結果として、I番レーンは各投入された表示RNAの10%を表す。
【００７６】
図2の結果から2番位置にフルオロ基ピリミディンを有するオリジナルライブラリーRNAはニッケルビードと標的蛋白質に結合しなかったが(図2のレーン1-3)、選別されたRNAアプタマー#9と#24はビードとは結合しないが標的蛋白質に結合するのを見ることができた(図2のレーン4-9)。特に選別されたRNAアプタマー#24は#9よりもっと強く標的蛋白質に結合する。これはより高い親和力で#24がC型肝炎ウイルスNS5Bに結合するためである。
【００７７】
また選別されたRNAアプタマーはNS3ヘリカーゼ(helicase)のような、また他のC型肝炎ウイルスヒスティディンタグされた蛋白質には結合しない。したがってNS5B蛋白質のヒスティディン部分に非特異的な結合の可能性を排除することができ、またこれは標的蛋白質であるC型肝炎ウイルスNS5Bとアプタマーの特異的な相互関係を表す。
【００７８】
実施例3  :  RNAアプタマーの結合親和力
選別されたRNAアプタマーとC型肝炎ウイルスNS5Bの相互関係の親和力を測定するためにNS5B蛋白質の量を増加しながら放射線同位元素で表示されたRNAと反応後RNAの位置が変化した量を前述したようにgel  retardation実験を通して測定した(図3参照)。
【００７９】
図3はHCV  NS5Bレプリカーゼ(replicase)に選別されたRNAアプタマーの高い結合親和力を見せる。図3のA及びBは放射線同位元素が表示されたRNAアプタマー#9(A、50pM)とRNAアプタマー#24(B、50pM)を持ってHCV NS5Bレプリカーゼ(0-320nM）の量を増加させて反応したものであり、結果で得られたNS5B-RNA結合体を4%非変性アクリルアミドゲルを利用して結合しない自由のRNA(F)と分離した。
図3のCはHCV  NS5Bに結合するRNAの量の百分率に求めるために放射線同位元素を利用して計算したものとして、本結果は3回独立的に行って各々測定した後測定値の平均値である。
【００８０】
図3から分かるように、40個の無作為塩基配列を持つオリジナルライブラリーRNAの場合、蛋白質のもっとも高い濃度でさえもC型肝炎ウイルスNS5Bに極めて低い親和力を表すこととは対照的に、2番位置フルオロ選別されたRNAアプタマー#9と#24両方共に量に依存する傾向でC型肝炎ウイルスNS5Bと結合して效率的に位置変化を形成し、およそ18nM、5nMの高い親和力を有する分離常数(Kd)を示した。特に選別されたRNA#24は#9より標的蛋白質に4倍程度で強く結合できてより効率的な結合力を見せる。
【００８１】
実施例4  :  RNAアプタマーによるHCV複製抑制
C型肝炎ウイルスNS5Bに特異的、そして高結合力を有して結合する選別された前記RNAアプタマーが人間肝細胞でC型肝炎ウイルス複製を阻害する活性を、最近開発されたC型肝炎ウイルスのサブゲノミックレプリコンシステムを利用して測定した(参考文献12及び17参照)(図4参照)。
【００８２】
選別されたRNAアプタマーが細胞内部でC型肝炎ウイルス複製を妨害するのか察するためにC型肝炎ウイルスレプリコンRNAと多様のRNA競争者を共にトランスフェクションした後72時間後に逆転写遺伝子増幅技術を利用して肝癌細胞Huh-7細胞からHCV陰性ストランドRNAが合成された量の水準を測定した。HCVレプリコン一つだけトランスフェクションした細胞とRNA競争者が導入されたそれぞれの細胞においてのC型肝炎ウイルスRNAの量を相互比較した。HCVレプリコンRNAとtRNAまたは重症筋無力症(myasthenia gravis）の原因となる自己抗体のような関連されない標的蛋白質に対抗するアプタマー(参考文献25参照)、及びNS5Bに対して選別されたRNAアプタマー#9、#24などを人体肝癌細胞株であるHuh-7細胞に導入した。RNA導入後72時間後に全体RNAを分離しHCV  cDNA陰性ストランドとβ-actin  cDNAを増幅して増幅されたHCV  cDNA陰性ストランド量を増幅したβ-actin  cDNA量を利用して標準化した。
【００８３】
図4はHuh-7セルにモックトランスフェクション(mock  transfection)したものとHCVサブゲノミックレプリコンRNAをいかなる競争者無しに、MG  RNAアプタマー、HCV  NS5Bに対するRNAアプタマー#9、またはRNAアプタマー#24と一緒にトランスフェクションしたものである。HCV(-)サブゲノミックRNAを逆転写-遺伝子増幅技術を通して増幅した。RNAアプタマー#24を持ってトランスフェクションした細胞から逆転写を行わず(w/o  RT)遺伝子増幅をcDNAなしに行った。対照群は増幅したβ-actin  cDNAをロードした。HCV(-)RNA値は、先ずβ-actin  RNA量を基準として標準化し、かかるHCV  RNA値をHCVレプリコンRNAひとつだけトランスフェクションした細胞で発現した場合のHCV  RNA値に対する相対的であるHCV  RNAレベルに標準化した。本結果は3回独立的に行い各々測定した測定値の平均値である。
【００８４】
図4を参照すると、tRNAのような非特異的なRNAはHCVサブゲノミックRNA合成にほとんど影響を与えないが、これと反対にRNAアプタマー#9と#24はHCVレプリコンのRNA合成を27%と47%まで阻害(妨害)するのが分かる。
【００８５】
関連のない2番位置フルオロを含有したMG  RNAアプタマーがHCVレプリコンRNAの複製から肝細胞を保護できないことをみたとき、選別されたRNAによるHCV複製の妨害は選別されたRNAアプタマーの特異的な相互関係によることが分かる(図2及び図3)。
【００８６】
選別されたRNAの結合効率と親和力に対する分析によると選別されたRNAアプタマー#24が#9より更に效率的にHCVレプリコンRNAの増殖を妨害するのが分かる(図4)。これはHCV増殖を妨害するRNAアプタマーの生物学的活性が標的HCV蛋白質の結合親和力を増加することによって向上させることができることを見せる。
【００８７】
実施例5  :  RNAアプタマーの最適化
選別されたアプタマー#9と#24のサイズは各々89nt及び92ntとして化学的合成が容易でないサイズである。化学的合成が容易なRNAアプタマーサイズは概略40nt以下と知られている(参考文献26参照)。また長いサイズのRNAアプタマーは構造上多様の構造形態があり得るので最も適合したアプタマーにみるには限界がある。
【００８８】
発掘されたRNAアプタマーのサイズを縮めた後最適化された本発明のRNAアプタマーを発掘する実験を行った。このために発掘されたRNAアプタマー(#9と#24）の切断された形をT7重合酵素を利用した試験管転写方法を介して製作した。
【００８９】
RNAアプタマー#24の場合、サイズを縮めるほどその結合力が落ちることを観察した。これは#24の場合92nt全長の形が最も適合なRNAアプタマーであることを見せる。したがって、化学的合成側面を考慮するときRNAアプタマー#24の場合、たとえ標的蛋白質に対する結合力は優れているとしても有用なRNAアプタマーとして望ましくないこともある。
【００９０】
RNAアプタマー#9に対して三つの異なる切断されたRNAを製作した(図5のA)。
【００９１】
RNAアプタマー#9-t1は上部ループと上部ステム、そして中間膨部(bulge)及び中間ステムを含み、RNAアプタマー#9の塩基配列のうち17-61に該当する塩基配列として45ntサイズを有している。
【００９２】
RNAアプタマー#9-t2はRNAアプタマー#9の塩基配列の中25-53に該当する塩基配列として上部ループと上部ステムだけを含む30ntサイズを持っている。
【００９３】
RNAアプタマー#9-t3はRNAアプタマー#9の塩基配列の中28-50に該当する塩基配列として、ただ上部ループと上部ステム配列の一部だけを含んだ23ntサイズを有している。
【００９４】
このようなRNAアプタマーのHCV  NS5Bに対する結合力をSPR方法を介して測定した(図5のB)。その結果、これらRNAライブラリーは933nMの高いKDを表し、#9-t3の場合40.4nMのKDを示した。これは上部ループと上部ステムの一部配列だけでは高い結合力を有しないことを表す。反面、本発明によるRNAアプタマー#9-t1及び#9-t2は各々8.4nM及び2.6nM  KDの高結合力を持ってNS5Bと結合することが分かった。
【００９５】
特に上部ループと上部ステムだけを含む本発明のRNAアプタマー#9-t2はHCV  NS5B蛋白質に対して全長のRNAアプタマー#9よりもっと高い結合力を持つばかりでなく30ntの小さなサイズを有するアプタマーであるので最適化されたRNAアプタマーであることが分かる。
【００９６】
図5のA構造は大部分安定したRNA２次構造としてMULFOLDプログラムを利用して決定されたのである(参考文献30)。ここでCとUは2′-フルオロCと2′-フルオロUを示す。塩基配列25から64はRNAライブラリーの無作為部分から選別された塩基配列を示す。図5のBはSPR分析を通して観察した各RNAアプタマーのHCV  NS5Bに対するKD常数である。
【００９７】
実施例6  :  最適化されたRNAアプタマーによるHCV複製抑制
実施例5で最適化された本発明のRNAアプタマー#9-t2がHCV複製を效果的に抑制するのか察するために図4と同一実験を行った。即ち、HCVサブゲノミックレプリコンシステムを利用して人間肝細胞でC型肝炎ウイルス複製を妨害するRNAアプタマー活性を測定した(参考文献12及び17参照)(図6)。
【００９８】
HCVレプリコンRNAと多様の種類のRNAアプタマーを肝癌細胞であるHuh-7細胞にトランスフェクションした後72時間後に逆転写遺伝子増幅技術を用いて、それぞれの場合HCV陰性ストランドRNAが合成された量の水準をβ-actin  cDNA量を基準とし標準化して測定及び相互比較した。
【００９９】
図6はHuh-7セルにモックトランスフェクションしたものとHCVサブゲノミックレプリコンRNAをいかなる競争者なしに、HCV  NS5Bに対するRNAアプタマー#9、または切断されたRNAアプタマー#9-t1、#9-t2、#9-t3と共にトランスフェクションしたものである。HCV(-)サブゲノミックRNAを逆転写-遺伝子増幅技術を介して増幅した。HCV(-)RNA値は、まずβ-actin  RNA量を基準として標準化し、そういうHCV  RNA値をHCVレプリコンRNAでだけトランスフェクションした細胞から発現した場合のHCV  RNA値に対する相対的であるHCV  RNAレベルに標準化した。本結果は3回独立的に行い各々測定した測定値の平均値である。
【０１００】
図6を参照すると、RNAアプタマー#9は図4のようにHCVレプリコンのRNA合成を30%まで妨害した。NS5Bに対する結合力をなくした#9-t3の場合、HCVレプリコンのRNA合成が約15%しか妨害できなかった。このような結果は結合力の喪失によってHCV複製抑制力も喪失されたことを示唆する。
【０１０１】
反面、本発明によるRNAアプタマー#9-t1は38%まで、そして、やや30ntサイズである本発明によるRNAアプタマー#9-t2の場合は53%まで效果的にHCVレプリコンのRNA合成を妨害し、これは全長のRNAアプタマー#9よりも切断されたRNAアプタマーがHCV複製をもっとよく抑制することを示した。このような結果は全長RNAアプタマーより標的蛋白質に対する結合力がより一層大である切断されたRNAアプタマーがHCV複製を抑制できる機能もなお向上したことが分かる。
【０１０２】
特に最適化された本発明のRNAアプタマー#9-t2は化学的合成が有用な30ntの小さなサイズのRNAであり、HCV  NS5Bに対する結合力が増大されただけでなくHCV複製を抑制することができる能力もまた増大されたのでHCV複製を抑制しえる非常に有用なRNAアプタマーといえる。
【０１０３】
実施例  7:  化学的に合成されたRNAアプタマーによるHCV複製抑制
前記の最適化された本発明のRNAアプタマー#9-t2を化学的に合成した後、そういうアプタマーによるHCV複製抑制度を観察した。アプタマーの3′末端にはidTを導入してエキソヌクレアーゼ(exonuclease)によるRNA分解度を最小化し、5′末端にはコレステロール基を導入することによって何らのトランスフェクション作用剤なしにアプタマーが細胞透過できるようにアプタマーを変形した。最適化した本発明のRNAアプタマー#9-t2の化学合成形であるChol-RM9  t2の予想構造図も図7に示した。
【０１０４】
最適化された本発明のRNAアプタマー#9-t2を合成し、この時5′末端にはコレステロール基を3′末端にはidTを各々貼付した。2′-Fは2′-OH基の代わりに2′-fluoro基を有したピリミディンヌクレオチドを表す。
【０１０５】
化学的に合成された本発明のRNAアプタマー(Chol-RM9  t2)及びNS5Bに結合できない突然変異RNAアプタマー(Chol-Mu-RM9  t2、Chol-RM9  t2とループ部位塩基部位だけ違う）の塩基配列及び構造を図8に示した。
【０１０６】
本発明のRNAアプタマーChol-RM9  t2がHCV複製を效果的に抑制するのか察してみるために図9に図示の実験を行った。即ち、HCVサブゲノミックレプリコンが安定的に複製されているHuh-7細胞システムを利用して化学合成された本発明のRNAアプタマーChol-RM9  t2をトランスフェクション作用剤なしに細胞と反応させる場合、效果的にC型肝炎ウイルス複製を妨害するのかRNAアプタマー活性を測定した。
【０１０７】
いろいろな濃度のChol-RM9  t2またはChol-Mu-RM9  t2をHCVサブレプリコンが複製されているHuh-7細胞に48時間処理した後、リアルタイムPCR技術を利用してそれぞれの場合HCV陰性ストランドRNAが合成された量の水準をGAPDH  cDNA量を基準とし標準化して測定及び相互比較した。
【０１０８】
図9を参照すると、HCVサブレプリコンが複製されているHuh-7細胞にmock処理または合成したアプタマーを反応させた。その後HCV(-)サブゲノミックRNAをリアルタイムPCR技術を介して増幅した。HCV(-)RNA値は、まずGAPDH  RNA量を基準として標準化し、アプタマーを処理した時のHCV  RNA値をmock処理した細胞におけるHCV  RNA値に対する相対的であるHCV  RNAレベルに標準化した。本実験は5回独立的に行って各々測定し、測定値の平均値と標準偏差を表明したのである。
【０１０９】
図9から分かるように、突然変異RNAアプタマーを処理する場合は高農度を処理してもHCV複製にいかなる影響も及ぼさなかった。反面、本発明のRNAアプタマーであるChol-RM9  t2を処理する時には反応させたアプタマー濃度に比例してHCVサブレプリコンのRNA複製が最大80%まで效果的に抑制されることを観察した。そして本発明のRNAアプタマーChol-RM9  t2によるHCV複製抑制のためのIC50は約2mMであることがわかった。
【０１１０】
前記結果から細胞透過性を附与した化学的に合成された本発明のRNAアプタマーがHCV複製を效果的に抑制しえることがわかり、このようなHCV抑制力は本発明のRNAアプタマーに付着されたコレステロール基による非特異的反応でなく、NS5B蛋白質に特異的な特定塩基配列を持ったRNAアプタマーによる特異的反応であることを意味する。従って、化学的に合成された本発明のRNAアプタマーChol-RM9  t2は直接癌細胞内で透過することのできる非常に有用なHCV抑制用薬剤の候補になることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【０１１１】
本発明はC型肝炎ウイルスレプリコン増殖を抑制するRNA分解酵素抵抗性RNAアプタマー、これを利用したHCV感染診断キット及びC型肝炎ウイルスの増殖抑制剤に関するもので、本発明によるRNAアプタマーは、HCV  NS5B蛋白質によるRNA依存性RNA合成に対抗してRNA分解酵素に抵抗性のあるRNAアプタマーとして、本発明のRNAアプタマーはナノモールのきわめて低い結合常数(即ち、高い結合力)で標的蛋白質に特異的に結合し、さらに本発明のRNAアプタマーは人間肝細胞に導入したときHCVレプリコンの細胞内のRNA合成を妨害する作用効果がある。
【０１１２】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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