(57)【要約】本発明は、免疫治療法をミエリン修復と組み合わせることにより多発性硬化症を処置する方法に関する。本発明は、免疫制御をもたらすため、ならびにミエリン修復、再ミエリン化、および／または軸索の維持、保護、または再生を促進するために、生物活性薬剤の組み合わせ送達または投与を提供する組成物および方法を含む。本発明は、免疫調節のための薬剤の投与が、ミエリン修復、再ミエリン化、および／または軸索保護をもたらすための他の治療法の投与により補われる多様式治療法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脱ミエリン形成状態を処置するための組成物であって、
ａ）免疫調節性である、治療に効果的な量の第１薬剤と、
ｂ）ミエリン修復を促進する、治療に効果的な量の第２薬剤と
を含み、
前記第１薬剤および前記第２薬剤を投与することが前記脱ミエリン形成状態の処置に相乗治療効果をもたらす、組成物。
【請求項２】
前記第１薬剤および前記第２薬剤が相乗作用量で存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
脱ミエリン形成状態を処置するための組成物であって、
ａ）免疫調節性である、治療に効果的な量の第１薬剤と、
ｂ）オリゴデンドロサイト分化を促進する、治療に効果的な量の第２薬剤と、
ｃ）オリゴデンドロサイト増殖を促進する、治療に効果的な量の第３薬剤と
を含み、
前記第１薬剤、前記第２薬剤、および前記第３薬剤を投与することが前記脱ミエリン形成状態の処置に相乗治療効果をもたらす、組成物。
【請求項４】
前記相乗効果が前記第１薬剤の単独または前記第２薬剤の単独の治療効果よりも１倍より多く大きい、請求項１または３に記載の組成物。
【請求項５】
前記前記脱ミエリン形成状態が多発性硬化症である、請求項１または３に記載の組成物。
【請求項６】
前記第１薬剤が自己免疫応答を抑制する、請求項１または３に記載の組成物。
【請求項７】
前記第１薬剤がＴ細胞、形質細胞、またはマクロファージを標的にする、請求項１または３に記載の組成物。
【請求項８】
前記第１薬剤が自己免疫応答においてＴ細胞受容体シグナリングを抑制する、請求項１または３に記載の組成物。
【請求項９】
前記第１薬剤または前記第２薬剤が改変ペプチドリガンド、ペプチド結合細胞、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、アプタマー、小分子、および抗体からなる群から選択される、請求項１または３に記載の組成物。
【請求項１０】
前記第１薬剤がリガンド、またはその受容体に特異的であり、前記リガンドがＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４９、ＣＤ６２、ＣＤ６９、およびＣＤ１５４からなる群から選択される、請求項１または３に記載の組成物。
【請求項１１】
前記第１薬剤がＣＤ８０抗体またはＣＤ３抗体である、請求項１または３に記載の組成物。
【請求項１２】
前記第２薬剤がＮｏｔｃｈシグナリングを抑制する、請求項１または３に記載の組成物。
【請求項１３】
前記第２薬剤がＩｇＭ抗体である、請求項１または３に記載の組成物。
【請求項１４】
前記第２薬剤がγ−セクレターゼ抑制物質である、請求項１または３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記第２薬剤がＤＡＰＴ、Ｌｙ４１１５７５、ＩＩＩ−３１−Ｃ、およびｒＨＩｇＭ２２からなる群から選択される、請求項１または３に記載の組成物。
【請求項１６】
脱ミエリン形成状態を処置するための方法であって、
ａ）免疫調節性である、治療に効果的な量の第１薬剤と、
ｂ）再ミエリン化を促進する、治療に効果的な量の第２薬剤と
を、必要とする被験者に投与することを含み、
前記第１薬剤および前記第２薬剤を投与することが再ミエリン化を促進する際に相乗治療効果をもたらす、方法。
【請求項１７】
再ミエリン化を促進する方法であって、
ａ）共培養において、細胞を、免疫調節性である第１薬剤と接触させることと、
ｂ）前記細胞を、再ミエリン化を促進する第２薬剤と接触させることと
を含み、
前記細胞を、前記第１薬剤および前記第２薬剤と接触させることが再ミエリン化を促進する際に相乗効果をもたらす、方法。
【請求項１８】
脱ミエリン形成状態を処置するための方法であって、
ａ）免疫調節性である、治療に効果的な量の第１薬剤と、
ｂ）オリゴデンドロサイト分化を促進する、治療に効果的な量の第２薬剤と、
ｃ）オリゴデンドロサイト増殖を促進する、治療に効果的な量の第３薬剤と、
を、必要とする被験者に投与することを含み、
前記第１薬剤、前記第２薬剤、および前記第３薬剤を投与することが前記脱ミエリン形成状態を処置する際に相乗治療効果をもたらす、方法。
【請求項１９】
前記第１薬剤および前記第２薬剤が同時に投与されない、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１薬剤が前記第２薬剤と同時に投与される、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記相乗効果が前記第１薬剤の単独または前記第２薬剤の単独の治療効果よりも１倍より多く大きい、請求項１６、１７、または１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１薬剤または前記第２薬剤が改変ペプチドリガンド、ペプチド結合細胞、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、アプタマー、小分子、および抗体からなる群から選択される、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１薬剤がリガンド、またはその受容体に特異的であり、前記リガンドがＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４９、ＣＤ６２、ＣＤ６９、およびＣＤ１５４からなる群から選択される、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１薬剤がＣＤ８０抗体またはＣＤ３抗体である、請求項１６、１７、または１８に記載の方法。
【請求項２５】
前記第２薬剤がＮｏｔｃｈシグナリングを抑制する、請求項１６、１７、または１８に記載の方法。
【請求項２６】
前記第２薬剤がＩｇＭ抗体またはγ−セクレターゼ抑制物質である、請求項１６、１７、または１８に記載の方法。
【請求項２７】
前記第２薬剤がＤＡＰＴ、Ｌｙ４１１５７５、ＩＩＩ−３１−Ｃ、およびｒＨＩｇＭ２２からなる群から選択される、請求項１６、１７、または１８に記載の方法。
【請求項２８】
前記脱ミエリン形成状態が多発性硬化症である、請求項１６、１７、または１８に記載の方法。
【請求項２９】
前記第１薬剤が自己免疫応答を抑制する、請求項１６、１７、または１８に記載の方法。
【請求項３０】
前記第１薬剤がＴ細胞、形質細胞、またはマクロファージを標的にする、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項３１】
前記第１薬剤が自己免疫応答においてＴ細胞受容体シグナリングを抑制する、請求項１６、１７、または１８に記載の方法。
【請求項３２】
前記接触させることがｉｎ  ｖｉｔｒｏで起こる、請求項１７に記載の方法。
【請求項３３】
前記接触させることがｉｎ  ｖｉｖｏで起こる、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（相互参照）
本出願は、２００６年１１月３日に出願された米国仮特許出願第６０／８６４，２９５号の利益を主張し、米国仮特許出願第６０／８６４，２９５号は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
多発性硬化症（ＭＳ）は、再発−寛解から慢性進行性にわたる発現パターンの臨床的障害を有する中枢神経系（ＣＮＳ）の脱髄性疾患である。ＭＳの病因は不明であるが、自己反応性ＣＤ４＋Ｔ細胞応答は、ミエリンおよびオリゴデンドロサイトに対する炎症性傷害を媒介する（非特許文献１）。ＣＮＳ病変部は、ミエリン損傷の病巣領域を有し、また、軸索病状、神経細胞の損傷、およびアストログリア瘢痕形成を伴う（非特許文献２）。臨床所見としては、失明、麻痺、感覚消失、ならびに協調障害および認知障害を含む種々の神経機能障害が挙げられる。
【０００３】
ミエリンの損傷または傷害は、伝導速度および神経細胞の軸索破壊に対する脆弱性に危険な結果をもたらす。軸索消失と進行性の臨床的能力障害との間には相互関係があり、インタクトなミエリンは、軸索の完全性の維持に重要である（非特許文献３）。ヒトＭＳの初期に、自発的な再ミエリン化が発生し（非特許文献４）、ＭＳの動物モデルにおいて神経生理学的機能が回復することが示されている（非特許文献５）。しかし、持続的なＣＮＳ炎症およびこの疾患の後期間のミエリン修復不能は、永続的な衰弱を引き起こす（非特許文献６，非特許文献７）。
【０００４】
遺伝学的証拠は、ＭＳ感受性を、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩの対立遺伝子ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）−ＤＲ２ハプロタイプに関連づけている。これは、ＭＳの病変形成にＣＤ４＋Ｔ細胞の役割が強く関係する（非特許文献８；非特許文献９）。ミエリンおよびオリゴデンドロサイトに向けられた自己反応性Ｔ細胞応答は、ＭＳの初期の間に、ミクログリアおよびアストロサイトを刺激する炎症誘発性（例えばＴｈ１およびＴｈ１７）サイトカインの分泌を含む種々のプロセスを介して、炎症ＣＮＳ病変および神経機能障害をもたらし、別の炎症細胞を補充し、およびＢ細胞による抗体産生を誘発すると、一般的に考えられている（非特許文献１０；非特許文献１１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｂｒｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  Ｓｃｉ  ２０６：１８１−１８５（２００３）
【非特許文献２】Ｃｏｍｐｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｎｃｅｔ．  ３５９：１２２１−１２３１（２００２）
【非特許文献３】Ｄｕｂｏｉｓ−Ｄａｌｃｑ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｎ．  ４８，  ９−１２（２００５）
【非特許文献４】Ｐｒｉｎｅａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  ３３：１３７−１５１（１９９３）
【非特許文献５】Ｓｔａｎｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｇ．  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．  ６８：３６１−３７６（２００２）
【非特許文献６】Ｂｒｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  Ｓｃｉ．  ２０６：１８１−１８５（２００３）
【非特許文献７】Ｋｅｉｒｓｔｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｕｎｃ．  Ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  Ｇｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓ．  ４６８：１８３−１９７（１９９９）
【非特許文献８】Ｏｋｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ＪＡＭＡ  ２７０：２３６３−２３６９（１９９３）
【非特許文献９】Ｏｌｅｒｕｐ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ３８：１−３（１９９１）
【非特許文献１０】Ｐｒａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｒｅｈａｂｉｌ．  Ｒｅｓ．  Ｄｅｖ．  ３９：１８７−１９９（２００２）
【非特許文献１１】Ｈｅｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ３：２９１−３０１（２００２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
再発性ＭＳに対する現在利用可能な処置は、インターフェロン−β、酢酸グラチラマー、およびミトキサントロンを含み、典型的には免疫応答を非特異的に抑制し、一部の患者において新規の病変の発症をわずかに減少させる。こうした処置は、疾患の進行においてほとんど利点をもたらさず、典型的にはミエリン修復を誘導しない（Ｌｕｂｅｔｚｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  １８：２３７−２４４（２００５））。成熟したオリゴデンドロサイト前駆細胞が再ミエリン化に関与していることは十分に認められており（Ｄａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ２４：４７６−４８８（２００３），  Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｒｅｓ．  ６９：８２６−８３６（２００２），  Ｋｅｉｒｓｔｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．  Ｅｘｐ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  ５６：１１９１−１２０１（１９９７），  Ｇｅｎｓｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｎ．  １９：１９７−２０３（１９９７））、従って、再ミエリン化不全は、成熟オリゴデンドロサイトの産生、ミエリン化するそれらの能力、および／またはミエリン化を受け入れない神経変性および軸索における欠損と関連している可能性が高い（Ｂｊａｒｔｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  １４：２７１−２７８（２００１），  Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  １９７：３７３−３８５（２００６））。従って、自己免疫応答を抑制し、かつ再ミエリン化を促進させるための治療戦略を策定することが必要である。
【０００７】
自己免疫応答の抑制は、所要の共刺激シグナルの非存在下でのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の関与が、通常、Ｔ細胞活性化を導くには不十分な強度のＴＣＲシグナルを生じるが、長期のアネルギー、寛容、または細胞欠乏の誘発をもたらすには十分な強度のシグナルであるとの前提に基づいてもよい。これらの免疫療法は、この疾患経過の内在的な自己免疫成分の抑制および継続したミエリン破壊の回復を典型的にはもたらすが、動物には、おそらく損傷したミエリン修復の不全により回復しない麻痺性の臨床障害が、典型的には残される。繰り返される免疫的攻撃の損傷を修復するために、十分な数のオリゴデンドロサイトを置換する必要があり、かつこれらの細胞は、効率的に接触し、剥離された軸索を再ミエリン化する必要がある。ＭＳの効果的な処置は、進行している自己免疫炎症応答を抗原特異的方法で抑制し、かつ再ミエリン化を促進するための双方に適合させる組み合わせ処置を用いて疾患の両面に取り組むべきである。
【０００８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでオリゴデンドロサイト産生およびミエリン化を増進させるための多くの因子が知られている。従って、再ミエリン化を増進させるために免疫制御戦略と組み合わせて用いることが可能な可能性のあるオリゴデンドロサイトのいくつかの再生戦略がある。かかる戦略としては、γ−セクレターゼ抑制またはオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）の転移が挙げられる。
【０００９】
活性γ−セクレターゼは、膜内のタンパク質分解に関与する多タンパク質複合体である。活性γ−セクレターゼは、典型的には、４つのタンパク質の複合体からなり、そのうちプレセニリン（ＰＳ）は、タンパク質の膜貫通ドメイン内に位置している高度に保存された２つのアスパラギン酸（Ｄ２５７およびＤ３８５）を介して活性部位を提供すると考えられる。活性になるために、未熟ＰＳはプロセシングされ、他のタンパク質と共に複合体に組み入れられ、安定化する。これには、「プレセニリナーゼ」と名付けられた酵素によるタンパク質切断が通常含まれる。この切断は、Ｎ末端フラグメントと、成熟プロテアーゼにおいて互いに結合した状態を維持し、各フラグメントがこれら２つの必須アスパラギン酸の１つを含有する複数のＣ末端フラグメントとを生成する。４つのタンパク質の複合体は、γ−セクレターゼ活性を再編成することができる。
【００１０】
ＰＳ単体それ自体も、この複合体の活性コアとしてのその提示的役割に基づいて「γ−セクレターゼ」と称されることが多い。
【００１１】
γ−セクレターゼは、多くの公知の標的（例えば膜内在性タンパク質基質）を有する。Ｎｏｔｃｈは、γ−セクレターゼの基質である。典型的には、その生物活性が細胞表面受容体としてのその機能と、転写制御因子との両方に依存するＮｏｔｃｈは、リガンド結合後にＡＤＡＭファミリーのプロテアーゼによりＳ２部位で典型的には、切断される。切断は、通常細胞外ドメインの遊離をもたらす。次いで、残っているＮｏｔｃｈの切断型膜貫通形状は、γ−セクレターゼの標的である、膜内の２つの部位（Ｓ３およびＳ４部位）での切断を、通常受けやすい。切断されたＮｏｔｃｈは、Ｎｏｔｃｈの標的遺伝子を活性化する核に移行することができる。核は、神経細胞分化の抑制、オリゴデンドロサイト分化、およびミエリン化を含む細胞プロセスの宿主の調節因子を含む。
【００１２】
γ−セレクターゼの同定された標的の一部は、それ自体がγ−セレクターゼのための公知の標的である受容体のリガンド（例えばＮｏｔｃｈリガンドのＪａｇｇｅｄおよびＤｅｌｔａ）である。ＣＮＳミエリン化の調節因子と思われる、γ−セクレターゼ切断の他の同定された基質は、Ｎ−カドヘリン、ニューレグリン−１のシステインが豊富なドメインのイソ型（ＣＲＤ−ＮＲＧ）、およびニューレグリン受容体ｅｒｂＢ４を含む。ニューレグリン（ＮＲＧ）は、シグナル伝達タンパク質の大きなファミリーであり、少なくとも４つの遺伝子によりコードされる複数の可溶性および膜貫通イソ型が含まれる。種々の神経細胞により発現される、それらのニューレグリンは、複合体、ミエリン形成グリアの発達の状況依存的な効果（例えば、前駆体の増殖の促進、またはオリゴデンドロサイト（ＯＬ）の成熟化）を有することがある。それらは、恐らくラミニン−２等のインテグリンリガンドと結合してＯＬを発達させる軸索由来の生存シグナルを提供することもできる。それらは、ｅｒｂＢファミリー（例えば、ｅｒｂＢ２／ｅｒｂＢ３およびｅｒｂＢ２／ｅｒｂＢ４のヘテロ二量体）の膜貫通受容体チロシンキナーゼを介してこれらの効果を調整することもできる。
【００１３】
本発明は、免疫制御戦略を、ミエリン修復および／または軸索保護戦略と組み合わせて、相乗治療効果をもたらすことにより神経障害を処置する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、免疫制御をもたらすため、ならびにミエリン修復、再ミエリン化、および／または軸索の維持、保護、または再生を促進するために、生物活性薬剤の組み合わせ送達または投与を提供する組成物および方法を含む。一部の実施形態において、免疫制御剤の投与は、ミエリン修復、再ミエリン化、および／または軸索保護（集合的に「軸索保護」）をもたらす薬剤の投与の前に、同時に、または後である。本発明は、免疫調節のための薬剤の投与が、ミエリン修復、再ミエリン化、および／または軸索保護をもたらすための他の治療法の投与により補われる多様式治療法に関する。
【００１５】
自己免疫抑制、ミエリン修復、および軸索の保護／再生は、成功する処置レジメンの設計において主要目的を表す（図１）。一部の実施形態において、免疫制御成分は、ミエリン特異的Ｔ細胞を特に標的にする（図２）。
【００１６】
異なるエンドポイントに向けられる薬剤の組み合わせまたは同時投与は、神経障害または神経障害に関する状態を患う被験者において、相乗効果を高めるまたは生み出すことができる。言い換えれば、１つ以上の薬剤は、向上した治療結果または相乗治療結果をもたらすために、組み合わせて送達される。従って、免疫応答を調節する薬剤は、ミエリン修復、再ミエリン化、および／または軸索再生をもたらす薬剤とともに投与され得る。
【００１７】
一部の実施形態において、薬剤は複数の効果（例えば、免疫制御およびミエリン修復の増強）を有し得る。この場合、治療の相乗作用または効果の程度が同様にうまく増強されることができる。他の実施形態において、同じ第１のエンドポイント（たとえば、免疫調節）に向けられる１つ以上の薬剤が投与され、かかる薬剤は、同じ第２のエンドポイント（例えば、ミエリン修復または軸索保護）に向けられる１つ以上の薬剤と同時投与される。異なるエンドポイントに向けられる薬剤の組み合わせレジメンは、神経障害または関連する状態を患う被験者において相乗治療効果をもたらす。
【００１８】
本発明の一態様において、脱ミエリン化状態を処置するための組成物が提供される。該組成物は、ａ）免疫調節性である第１薬剤を治療に効果的な量で、およびｂ）ミエリン修復を促進する第２薬剤を治療に効果的な量で含み、第１薬剤および第２薬剤を投与することにより脱ミエリン化状態の処置に相乗治療効果をもたらす。一部の実施形態において、第１薬剤および第２薬剤は、相乗作用量で存在する。
【００１９】
本発明は、脱ミエリン化状態を処置するための組成物も提供する。該組成物は、ａ）免疫調節性である第１薬剤を治療に効果的な量で、およびｂ）オリゴデンドロサイト分化を促進する第２薬剤を治療に効果的な量で、およびｃ）オリゴデンドロサイト増殖を促進する第３薬剤を治療に効果的な量で含み、第１薬剤、第２薬剤、および第３薬剤を投与することにより前述の脱ミエリン化状態の処置に相乗治療効果をもたらす。
【００２０】
本発明は、本明細書に記載する組成物を含む、神経障害を処置する方法も提供する。一部の実施形態において、本発明は、それを必要とする被験者に投与することを含む、脱ミエリン化状態を処置する方法を提供する。該方法は、ａ）免疫調節性である第１薬剤を治療に効果的な量で、およびｂ）再ミエリン化を促進する第２薬剤を治療に効果的な量で含み、第１薬剤および第２薬剤を投与することにより再ミエリン化の促進に相乗治療効果をもたらす。一部の実施形態において、本発明は、再ミエリン化を促進する方法を提供する。該方法は、ａ）免疫調節性である第１薬剤を共培養中の細胞に接触させることと、ｂ）再ミエリン化を促進する第２薬剤を該細胞に接触させることとを含み、第１薬剤および第２薬剤を該細胞に接触させることにより再ミエリン化の促進に相乗効果をもたらす。本発明の方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで生じ得る。本明細書では、それを必要とする被験者に投与することを含む、脱ミエリン化状態を処置する方法も提供する。該方法は、ａ）免疫調節性である第１薬剤を治療に効果的な量で、ｂ）オリゴデンドロサイト分化を促進する第２薬剤を治療に効果的な量で、およびｃ）オリゴデンドロサイト増殖を促進する第３薬剤を治療に効果的な量で含み、第１薬剤、第２薬剤、および第３薬剤を投与することにより脱ミエリン化状態の処置に相乗治療効果をもたらす。一態様において、神経障害を処置する方法は、被験者においてＴ細胞媒介免疫応答を調節する生物活性薬剤を治療に効果的な量で、ならびにミエリン修復、再ミエリン化、および／または軸索保護を促進する生物活性薬剤を治療に効果的な量で同時に送達することを含む。
【００２１】
一部の実施形態において、第１薬剤および前述の第２薬剤は、同時に投与されない。一部の実施形態において、第１薬剤は、前述の第２薬剤と同時に投与される。一部の実施形態において、組成物は、多発性硬化症を処置するために投与される。本発明の別の態様において、組成物は、前述の第１薬剤の単独または前述の第２薬剤の単独の治療効果よりも１倍より大きい相乗効果をもたらし得る。別の態様において、組成物の第１薬剤は、自己免疫応答を抑制し得る。一部の実施形態において、第１薬剤は、Ｔ細胞、形質細胞、またはマクロファージを標的にする。一部の実施形態において、第１薬剤は、自己免疫応答でのＴ細胞受容体シグナリングを抑制する。
【００２２】
本発明の第１薬剤または第２薬剤は、改変ペプチドリガンド、ペプチド結合細胞、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、アプタマー、小分子、および抗体からなる群から選択され得る。第１薬剤は、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４９、ＣＤ６２、ＣＤ６９、およびＣＤ１５４からなる群から選択されるリガンドまたはその受容体に特異的である。好ましい実施形態において、第１薬剤はＣＤ８０抗体またはＣＤ３抗体である。一部の実施形態において、第２薬剤は、Ｎｏｔｃｈシグナリングを抑制する。他の実施形態において、第２薬剤は、ＩｇＭ抗体またはγ−セクレターゼ抑制物質である。第２薬剤は、ＤＡＰＴ、Ｌｙ４１１５７５、ＩＩＩ−３１−Ｃ、およびｒＨＩｇＭ２２からなる群から選択され得る。
【００２３】
一部の実施形態において、生物活性化合物（すなわち薬剤）は、Ｔ細胞の増殖、分化、または制御と付随した抗原に特異的である。一部の実施形態において、生物活性化合物は、改変ペプチドリガンド、ペプチド結合細胞、抗体、ペプチド、アプタマー、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、小分子もしくは化学化合物、またはそれらの機能変異体である。一部の実施形態において、投与される第１薬剤は、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４９、ＣＤ６２、ＣＤ６９、およびＣＤ１５４からなる群から選択されるリガンドまたはその受容体に特異的である。一部の実施形態において、第１薬剤はＣＤ８０抗体またはＣＤ３抗体である。投与され得る第２薬剤は、Ｎｏｔｃｈシグナリングを抑制し得る。一部の実施形態において、第２薬剤は、ＩｇＭ抗体またはγ−セクレターゼ抑制物質である。第２薬剤は、ＤＡＰＴ、Ｌｙ４１１５７５、ＩＩＩ−３１−Ｃ、およびｒＨＩｇＭ２２からなる群から選択され得る。
【００２４】
一つの実施形態において、組み合わせ処置プロセスは、それを必要とする被験者の処置に関し、かかるプロセスは、Ｔ細胞の増殖、分化、またはその制御に関与する分化抗原群（ＣＤ）タンパク質に特異的な化合物を治療に効果的な量で送達することを含む。ここで、前述の方法は、再ミエリン化、ミエリン化、および／または軸索保護を促進する化合物を治療に効果的な量で送達することも、さらに含む。一実施形態において、化合物は、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）経路阻害物質である。さらなる実施形態において、化合物は、免疫細胞でＰＫＣθ経路を阻害する。さらに他の実施形態において、化合物は、Ｂリンパ球活性化抗原Ｂ７−１（ＣＤ８０）を抑制する。
【００２５】
本発明の一部の態様において、本発明の１つ以上の方法は、（１）免疫制御機能、（２）ミエリン修復、再ミエリン化、および／または（３）軸索の維持／修復をもたらすために１つ以上の化合物を任意の順序で送達することを含む送達の順序に関して変えることが可能な組み合わせ処置を含む。従って、かかる組み合わせレジメンは、前述の（１）〜（３）を任意の順序で含む（（１）〜（３）のいずれかの同時送達を含む）ことができる。一部の実施形態において、送達される化合物は、免疫制御機能をもたらすことが可能であり、ならびにミエリン修復または再ミエリン化および／または軸索保護を向上させる。例えば、化合物は、Ｔｈ１Ｔ細胞分化を減少させ得るかまたはＴｈ２Ｔ細胞分化を増加させ得る、一方、同時に、オリゴデンドロサイト再生を向上させることにより再ミエリン化／ミエリン修復を促進させる。
【００２６】
一態様において、ミエリン修復、再ミエリン化、および／または軸索維持を促進するために送達される薬剤は、小分子、医薬化合物を含む化学化合物、アンチセンス分子、アプタマー、リボザイム、ポリペプチド、ペプチド、ペプチド模倣体、またはｓｉＲＮＡである。かかる化合物は、神経細胞分化、オリゴデンドロサイト分化、ミエリン化、および／または軸索保護に関与する細胞プロセス／経路を標的にする。一実施形態において、薬剤はγ−セクレターゼ活性／機能を抑制する。さらに他の実施形態において、神経細胞分化、オリゴデンドロサイト分化、およびミエリン化に付随する１つ以上の異なる細胞経路に影響を及ぼす１つ以上の薬剤が投与される。
【００２７】
本発明の別の態様は、必要な二次刺激性シグナルの非存在下でＴＣＲに結合する１つ以上の薬剤を送達し、結果としてＴ細胞活性化（例えば、Ｔｈ１Ｔ細胞またはＴｈ２Ｔ細胞）をもたらすには不十分なＴＣＲシグナルが生じ、それによりアネルギー、寛容、または細胞欠乏が生じることに関する。一部の実施形態において、免疫調節剤の投与は、再ミエリン化、ミエリン修復、および／または軸索保護を促進または向上させる１つ以上の追加の薬剤が送達される前に、送達とともに、もしくは送達後に行なわれる。
【００２８】
ＭＳの間、ならびにＥＡＥおよびＴＭＥＶ−ＩＤＤの間、ミエリンおよびオリゴデンドロサイト（例えば、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ミエリンオリゴデンドロサイトタンパク質（ＭＯＧ）、またはミエリン関連オリゴデンドロサイト塩基性タンパク質（ＭＯＢＰ）へのＴ細胞応答）に向けられる自己反応性Ｔ細胞応答は、炎症性ＣＮＳ病変および神経機能障害を引き起こす。その後の再ミエリン化は、ＭＳの初期段階の間に神経機能が回復する限られた程度まで起こり得る。しかし、疾患の後期段階での持続性炎症およびミエリン修復不全は、永続的な衰弱をもたらす。従って、本明細書で開示する治療戦略は、相乗治療効果を作り出すために、免疫制御（例えば、Ｔ細胞の活性、分化、または増殖を抑制する）のための成分、およびオリゴデンドロサイト再生、ミエリン修復、再ミエリン化、または軸索保護を促進または向上させるための成分が含まれる。
【００２９】
本発明の別の態様において、培養または動物モデルを利用して、神経障害の処置に相乗治療効果をスクリーニングする。
【００３０】
一部の実施形態において、１つ以上の免疫調節剤を、神経障害または関連する状態のための細胞または動物モデルに投与し、一方ミエリン修復／再ミエリン化、または軸索保護に関与する１つ以上の薬剤を、免疫調節剤投与の前に、同時に、または後に投与し、それにより、向上した治療効果または相乗治療効果が観察される場合は、組み合わせ処置の候補を同定する。一部の実施形態において、免疫調節に向けられる薬剤は、医薬化合物を含む小分子、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、核酸分子、ペプチド、ポリペプチド、抗体、またはアプタマーであり得る。他の実施形態において、ミエリン修復／再ミエリン化、または軸索保護に向けられる薬剤は、医薬化合物を含む小分子、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、核酸分子、ペプチド、ポリペプチド、抗体、またはアプタマーであり得る。一実施形態において、ミエリン特異的寛容およびミエリン修復戦略は、スクリーニングされ得る単一因子の処置戦略の２つの例である。
【００３１】
参照による援用
本明細書に記述するすべての刊行物および特許出願を、それぞれ個別の刊行物または特許出願を参考として援用されることを具体的にかつ個別に示したかのように、同じ程度まで参考として本明細書で援用する。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】ＥＡＥおよびＭＳにおける炎症性脱ミエリン化のモデルを説明する。提唱する組み合わせ処置戦略を表す３つの一般的な治療戦略を示す。
【図２】ペプチドが結合した末梢血白血球（ＰＢＬ）の寛容戦略を説明する。末梢血白血球（ＰＢＬ）を、ＭＳ患者から単離し、エチレンカルボジイミド（ＥＣＤＩ）固定脾細胞を用いてミエリンペプチドのカクテルに結合する。個々の患者に由来する抗原結合ＰＢＬは、次いで、その患者の静脈内に再注入される。患者は、今後の増進した自己反応性免疫攻撃に対するそれらの長期寛容、および損なわれてない外来病原体に対するそれらの免疫応答を有する可能性がある。
【図３】組み合わせ処置の相乗的な利点を強調する結果を示す。
【図４】ＬＹ４５０１３９（γ−セクレターゼ抑制物質）を説明する。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
一般的技術：
本発明の実施は、特に明記しない限り、当該技術分野の範囲内である、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノム科学、および組換えＤＮＡの従来の技術を使用する。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  （１９８９）；  ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ  （Ｆ．  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ．，  （１９８７））；  ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．）：  ＰＣＲ  ２：  Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ  （Ｍ．Ｊ．  ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，  Ｂ．Ｄ．  Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｇ．Ｒ．  Ｔａｙｌｏｒ  ｅｄｓ．  （１９９５）），  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，  ｅｄｓ．  （１９８８）  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，およびＡＮＩＭＡＬ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ  （Ｒ．Ｉ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  ｅｄ．  （１９８７））を参照。
【００３４】
定義：
明細書および特許請求の範囲で使用するように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈の明らかな指示のない限り、複数の参照が含まれる。例えば、用語「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」は、それらの混合物を含む、複数の細胞が含まれる。
【００３５】
用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、および「オリゴヌクレオチド」は、互換的に使用される。これらは、任意の長さのヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれか、またはそれらの類似体の多量体型をいう。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造でも有することができ、公知または未知の任意の機能を行ない得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である。すなわち、遺伝子もしくは遺伝子フラグメントのコード領域または非コード領域、連鎖解析から定義される複数の遺伝子座（１つの遺伝子座）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、改変ヌクレオチド（例えば、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体）を含んでよい。存在する場合、ヌクレオチド構造への改変を、ポリマーの構築の前または後に付与してもよい。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分により中断され得る。ポリヌクレオチドは、重合（例えば、標識成分による結合）の後にさらに改変されることも可能である。
【００３６】
本明細書で使用するように、「発現」とは、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写されるプロセスと、および／または転写したｍＲＮＡ（「転写物」とも称される）が続いてペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳されるプロセスとをいう。転写物およびコードされたポリペプチドは、集合的に「遺伝子産物」と称される。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞でのｍＲＮＡのスプライシングを含んでよい。
【００３７】
本明細書では用語「送達」および「投与」を互換的に用いて、薬剤が被験者、組織、または細胞に侵入することを意味する。本明細書の開示全体にわたって用いる種々の用語には、特定の用語の文法的な変化も含まれる。例えば、「送達」には、「送達している」、「送達した」、「送達する」などが含まれる。生理活性薬剤の送達または投与の種々の方法は、当該技術分野では公知である。例えば、本明細書に記載する１つ以上の薬剤は、非経口的に、経口的に、腹腔内に、静脈内に、動脈内に、経皮的に、筋肉内に、リポソームに、カテーテルもしくはステントによる局所送達を介して、皮下に、脂肪内に、または髄腔内に送達され得る。
【００３８】
被験者におけるヌクレオチド配列またはポリペプチド配列に適用するように用語「差次的に発現する」（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）とは、対照で検出される配列と比較するとき、その配列の過剰発現または過小発現をいう。過小発現は、対照と比較するとき、試験被験者において検出可能な発現の非存在により明らかなように、特定配列の発現の欠如も包含する。
【００３９】
本明細書では用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」を互換的に用いて、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。ポリマーは、直鎖状ポリマーまたは分枝ポリマーであり得、改変アミノ酸を含むこともあり、かつ非アミノ酸により中断され得る。これらの用語は、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または他の任意の操作（例えば、標識成分による結合）により改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。本明細書で用いるように、用語「アミノ酸」とは、天然アミノ酸および／または非天然、または合成アミノ酸のいずれかをいい、グリシンおよびＤもしくはＬの両光学異性体、ならびにアミノ酸類似体およびペプチド模倣体が含まれる。
【００４０】
本明細書では「被験者」、「個体」、または「患者」を互換的に用いて、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトをいう。哺乳動物としては、マウス、ラット、イヌ、ブタ、サル（類人猿）、ヒト、家畜、スポーツ動物、およびペットが挙げられるがこれらに限定されない。ｉｎ  ｖｉｖｏで得た、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養した生物学的実体の組織、細胞、およびそれらの子孫も包含する。
【００４１】
用語「軸索維持」、「軸索修復」、「軸索保護」、および「軸索再生」は、本明細書では互換的に用いることができる。
【００４２】
本明細書で用いるように、「細胞」は、その通常の生物学的意味で用いられるが、多細胞生物全部をいうのではない。例えば、細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（例えば細胞栄養培地中）であり得、または例えばトリ、植物、および哺乳動物（例えば、ヒト、ウシ、ヒツジ、類人猿、サル、ブタ、イヌ、ネコ、マウス、またはラット）を含む多細胞生物内に存在することができる。
【００４３】
用語「薬剤」、「生物活性薬剤」（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）、「生物活性薬剤」（ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）、「生物活性化合物」（ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）、または「生物活性化合物」（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）は、互換的に用いられ、かつ記載する文脈で複数の参照も包含する。本明細書で記載する本発明の１つ以上の組み合わせ処置の方法で利用されるかかる化合物としては、生体または化学化合物（例えば、単純な有機分子もしくは複雑な有機分子、または無機分子）、ペプチド、ペプチド模倣体、タンパク質（例えば抗体）、核酸分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそれらの類似体を含む）、炭水化物含有分子、リン脂質、リポソーム、低分子干渉ＲＮＡ、またはポリヌクレオチド（例えばアンチセンス）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
用語「対照」とは、比較目的のための実験で用いられる代替の対象、細胞、または試料である。さらに、「対照」は、様々な時点の比較のための実験で、同一の対象、細胞、または試料を表す。
【００４５】
本明細書で用いる用語「抗体」としては、抗体のすべての形状（例えば、組換え抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体、融合タンパク質、モノクローナル抗体など）が挙げられる。本発明は、治療標的に結合できる（例えば、ＣＤ受容体に結合する）機能的抗体フラグメントに適用することも可能である。
【００４６】
用語「調節している」、「調節した」、または「調節」は、互換的に用いられ、ある状況下で直接的変化または間接的変化を意味する。例えば、エフェクターＴ細胞増殖／刺激の調節は、かかる増殖が下方または上方に調節され得ることを意味する。別の例において、調節は、エフェクターもしくは自己反応性Ｔ細胞またはそれらの機能／活性対制御Ｔ細胞もしくはその機能／活性のバランスであり得る。
【００４７】
用語「アプタマー」には、特定の分子に対する特異的結合特性に基づいて選択されるＤＮＡ、ＲＮＡ、またはペプチドが挙げられる。例えば、アプタマーは、当該技術分野で公知の方法を用いて特定のＣＤを結合するために選択され得る。続いて、前述のアプタマーを被験者に投与して、免疫応答を調節、または制御することができる。特定のタンパク質、ＤＮＡ、アミノ酸、およびヌクレオチドに親和性を有する一部のアプタマーは、説明されている（例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２：１８９９−１９０４（１９９３），  Ｐｉｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，６９１，１４５号，  Ｇｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６４：７６３−７９７（１９９５），  Ｓｚｏｓｔａｋ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，６３１，１４６号）。高親和性アプタマーおよび高特異性結合アプタマーは、組み合わせライブラリー（上掲、Ｇｏｌｄ，  ｅｔ  ａｌ．）に由来している。アプタマーは、使用する選択に応じて、マイクロモルからナノモル以下にわたる平衡解離定数で高親和性を有することもある。アプタマーは、高選択性（例えば、７−メチルＧとＧとの間に（Ｈａｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｓａｒｎｏｗ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９４：８５２１−８５２６（１９９７））またはＤ−とＬ−トリプトファンとの間に（上掲、Ｇｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．）千倍の識別を示す）を示すこともある。
【００４８】
用語「デコイ」とは、所定のリガントまたは未知のリガンドに優先的に結合するように設計される核酸分子（例えばＲＮＡもしくはＤＮＡ）、またはアプタマーを含むように意味する。かかる結合は、標的分子の抑制または活性化をもたらすことができる。デコイまたはアプタマーは、自然発生的な結合標的と特定のリガンドとの結合において競合することができる。例えば、ＨＩＶトランス活性化応答（ＴＡＲ）ＲＮＡの過剰発現は「デコイ」として作用することができ、ＨＩＶ  ｔａｔタンパク質に効率的に結合し、それによりそれがＨＩＶ  ＲＮＡ中のコードされるＴＡＲ配列に結合するのを防ぐことが示されている。（Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ６３，  ６０１−６０８（１９９０））。これは、ほんの１つの具体例であるが、当業者は、当該技術分野で一般に知られている技術を用いて他の実施形態が容易に作られ得ることを認識する。例えば、Ｇｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ６４，  ７６３−７９７（１９９５）；  Ｂｒｏｄｙ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄ，  Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ７４，  ５−１３（２０００）；  Ｓｕｎ，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，  ２，  １００−１０５（２０００）；  Ｋｕｓｓｅｒ，  Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ７４，  ２７−３８（２０００）；  Ｈｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｌ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２８７，  ８２０−８２５（２０００）；およびＪａｙａｓｅｎａ，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ４５，  １６２８−１６５０（１９９９）を参照。同様に、デコイは、その活性部位を占有するために標的抗原に結合するよう設計することも可能であり、またはデコイは、別のリガンドタンパク質との相互作用を防ぐために標的分子に結合するように設計することも可能であり、従って、細胞の増殖または分化に関与する細胞シグナリング経路を短絡させる。
【００４９】
用語「効果的な量」または「治療に効果的な量」とは、有益な結果または所望の結果をもたらすのに十分な、薬剤のその量をいう。これらの結果には、以下の臨床結果が挙げられるがこれらに限定されない。すなわち、脱ミエリン化病変（例えば脱ミエリン化障害と関連して）の大きさを縮小させること、ＯＰＣの遊走、増殖、および成長を促進すること、神経障害の発症を遅延させること、脱ミエリン障害の発症を遅らせること、神経障害に起因する症状を軽減させること、前記の疾患を患う人たちの生活の質を向上させること、前記の疾患を処置するために必要な他の薬物療法の用量を減少させること、例えばターゲティングおよび／または内部移行を介する別の薬物療法の効果を向上させること、疾患の進行を遅延させること、神経瘢痕を減少させること、および／または個体の生存を延長すること。治療に効果的な量は、被験者および処置される疾患の状態、被験者の体重および年齢、疾患の状態の重症度、投与方法等に応じて変わる。これらの量は、当業者により容易に決定されることができる。この用語は、本明細書で記載するいずれか１つの画像検査法による検出のための画像を提供する用量にも適用される。特定の用量は、選択される特定の薬剤、従うべき投与レジメン、他の化合物と併用して投与されるかどうか、投与のタイミング、撮像される組織、および該用量がもたらされる身体的送達系に応じて変わる。
【００５０】
用語「相乗」または「相乗作用」とは、任意の単独の薬剤と比較すると、投与されるとき２つ以上の薬剤の併用が、免疫調節性、再ミエリン化、または軸索の保護／再生であろうと、向上した治療効果をもたらすことを意味する。さらに、用語「ミエリン修復」および「再ミエリン化」（文法的なニュアンスでは同一）は、本明細書では互換的に用いる。
【００５１】
Ｉ．免疫調節
本発明は、組み合わせプロセス（すなわち、ミエリン修復、再ミエリン化、および／または軸索保護による）において免疫調節をもたらす薬剤を投与するための方法および組成物を提供する。好ましい実施形態において、この組み合わせプロセスは相乗治療効果をもたらす。
【００５２】
例えば、２つの薬剤の相乗効果は、個々の単独の薬剤の治療効果よりも１倍よりも大であり得る。一部の実施形態において、この相乗効果は、いずれの単独の薬剤よりも少なくとも１．２倍、１．３倍、１．４倍、または１．５倍大きい治療効果を有することもある。一部の実施形態において、相乗効果は、いずれの単独の薬剤よりも少なくとも２倍、２．２倍、２．４倍、２．５倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、または１００倍大きい治療効果を有することもある。例えば、ＭＳ症状を有する被験者は、ＭＳの臨床徴候に効果を及ぼさない第１薬剤を投与されることもあるが（被験者の平均臨床スコアは、その第１薬剤を投与されない、ＭＳ症状を有する被験者と同じであり、両被験者は平均臨床スコア１．５を有する）、第２薬剤で処置されるとき、平均臨床スコア１を有する。これは、０．５の減少である。両薬剤の併用は、平均臨床スコア０．４をもたらし、１．２５倍の相乗効果を示す（０．５／０．４）。別の例において、１つの薬剤が効果を及ぼさず（例えば、第１薬剤の単独、または薬剤を使用しない場合、１．２５の平均臨床スコア）、および第２薬剤が平均臨床スコア０．７５を有し、ならびに両薬剤の併用が平均臨床スコア０．２５の場合、相乗効果は２であり得る（［１，２５−０．７５］／０．２５）。両薬剤が効果を有する場合、例えば第２薬剤と同様に第１薬剤が平均臨床スコア０．５の減少を有し（処置しないスコアは１．５）、両薬剤による処置が平均臨床スコア０．１に減少する場合、これら２つの薬剤は、５倍の効果を有する（［１．５−０．５−０．５］／０．１）。
【００５３】
本明細書に開示の方法は、どのような神経病理的状態（例えば、神経細胞の変性が生じるまたは脱ミエリン化）にも関する。神経細胞の脱ミエリン化は、多数の遺伝性および後天性のＣＮＳおよびＰＮＳ障害として現れる。神経病理としては以下が含まれるが、これらに限定されない。すなわち、多発性硬化症（ＭＳ）、進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎、橋中心髄鞘崩壊症（ＣＰＭ）、抗ＭＡＧ疾患、白質ジストロフィー、副腎白質ジストロフィー（ＡＬＤ）、アレキサンダー病、カナバン病、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）、ペリツェウス・メルツバッハー病、レフサム病、コケイン症候群、ファン・デル・クナップ症候群、およびツェルウェガー症候群、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、慢性炎症性脱髄性多発根神経炎（ＣＩＤＰ）、多巣性運動ニューロパチー（ＭＭＮ）、脊髄損傷（例えば、脊髄の外傷または切断）、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、神経膠症、星膠症、および視神経炎であるが、これらはＣＮＳの特定の位置での神経細胞の変性に関連して、それらの目的とする機能を行なうための神経細胞または脳領域の無能を引き起こす。さらに、本明細書で開示の方法は、麻疹、狂犬病、スクレイピー様病原体、コイ病原体、パラミクソウイルス、コロナウイルス、エプスタイン・バーウイルス、帯状疱疹、単純ヘルペスウイルス、ヒトヘルペスウイルス６型、風疹、流行性耳下腺炎、犬ジステンパー、マレックのセムリキ森林ウイルス、動物およびヒトレトロウイルス、およびヒトＴ細胞リンパ腫ウイルスＩ型の原因となる病原体を含む病原体（本明細書に開示の方法はこれらの病原体に限定されない）により起こる神経障害、または付随した神経障害に同等に適用可能である。
【００５４】
免疫調節剤による免疫調節は、免疫細胞の活性の調節によることもある。ＣＤ４＋Ｔ細胞が典型的には、抗原特異的Ｔ細胞受容体（ＴｃＲ）を介して病原体を認識する防御免疫応答の主要なメディエイターであり得ることを、当業者は認識する。胸腺選択により、ＴｃＲの多様な集合を生成し、外来病原体からの保護を確実にし、その一方自己特異的Ｔ細胞にネガティブに選択する。ネガティブ選択からの回避または末梢サプレッサー機構の欠損は、自己寛容の崩壊を引き起こし得る（Ｃｈｒｉｓｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６：７５９−７６７（２００４））。自己反応性ＣＤ４＋Ｔ細胞は、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、およびミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）を含むミエリン抗原に向けられることが可能であり、かつＭＳ病変形成に関与すると見られている。このように、Ｔ細胞は、治療的介入のための標的を表す。本発明の一態様において、薬剤は、一般化免疫抑制なしで（例えば、外来病原体に対する応答を抑制することなく）自己反応性Ｔ細胞を特異的に抑制する。
【００５５】
本発明の一態様において、組み合わせ処置プロセスは、免疫制御／免疫調節をもたらすために投与される薬剤を含み、前述の薬剤は、自己反応性Ｔ細胞（例えばエフェクターＴ細胞）上の受容体に特異的であり、かかるＴ細胞を抑制する。薬剤は、直接的にまたは間接的にそのＴ細胞に結合することにより特定の応答を促進することも可能である。一部の実施形態において、免疫制御（「免疫調節」も同様に）は、自己反応性Ｔ細胞欠乏、アネルギー、もしくは免疫寛容をもたらす可能性があり、またはかかる制御もしくは調節は、制御Ｔ細胞に自己反応性Ｔ細胞のバランス（例えば、Ｔｈ１−Ｔｈ２のバランス）を変える可能性がある。別の態様において、薬剤は、制御Ｔ細胞に特異的であり、かつかかる制御Ｔ細胞の分化、活性化、または増殖をもたらす。
【００５６】
本明細書に開示するように、当然のことながら、本明細書で以下に記載するように１つまたは複数の免疫調節剤は、向上した治療効果または相乗治療効果を提供するために、ミエリン修復、再ミエリン化、および／または軸索の維持／修復の促進／向上に向けられる１つまたは複数の薬剤の投与の前に、同時に、もしくは後に投与される。さらに、当然のことながら、任意の特定のエンドポイント目的のためのかかる免疫調節剤は、生体または化学化合物（例えば、単純な有機分子もしくは複雑な有機分子、または無機分子）、ペプチド、ペプチド模倣体、タンパク質（例えば抗体）、炭水化物含有分子、リン脂質、リポソーム、低分子干渉ＲＮＡ、またはポリヌクレオチド（例えばアンチセンス）であり得る。
【００５７】
Ａ．サイトカインシグナリング
免疫調節剤は、サイトカイン経路を調節する薬剤を含み得る。調節され得る経路成分としては、以下を含むがこれらに限定されない。すなわち、サイトカインおよびサイトカイン受容体、ケモカインおよびケモカイン受容体、抗体、補体関連バイオマーカー、接着分子、抗原プロセシングおよび／またはプロセシングマーカー、細胞周期およびアポトーシス関連マーカー、ならびにそれらの発現または活性に影響を及ぼし得る薬剤。かかる因子、受容体、およびマーカーは、当該技術分野で公知であり、非限定的な例としては以下を含む。すなわち、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＴＮＦ−α、ＬＴ−α／β、ＴＧＦ−β、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＲ２／ＣＣＬ２、抗ミエリン特異的タンパク質／ペプチド抗体、抗−分化抗原群（ＣＤ）抗体、ＣＳＦ  ＩｇＧ、抗ＭＯＧ抗体、抗ＭＢＰ抗体、Ｃ３、Ｃ４、活性化ネオ−Ｃ９、補体活性化の調節因子、Ｅ−セレクチン、Ｌ−セレクチン、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−４、熱ショックタンパク質、パーフォリン、ＯＸ−４０、オステオポンチン、ＭＲＰ−８およびＭＲＰ−１６、ネオプテリン、アミロイドＡタンパク質、ソマトスタチン、Ｆａｓ、Ｆａｓ−Ｌ、ＦＬＩＰ、Ｂｃ１−２、またはＴＲＡＩＬ。
【００５８】
免疫調節剤は、ＳＴＡＴ経路を調節することも可能である。ＳＴＡＴタンパク質は、多数のサイトカイン誘導応答を仲介する分子のクラスであり、典型的には、チロシンキナーゼのヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）ファミリーを介して、リン酸化に続いて活性化される。それにより次いで、サイトカイン−サイトカイン受容体結合を介して、典型的には活性化される。実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、一般的に、Ｔｈ１サイトカインを分泌するミエリン特異的ＣＤ４（＋）Ｔ細胞により仲介され、一方疾患からの回復は、典型的にＴｈ２サイトカインの発現を伴う。ＳＴＡＴ４経路は、典型的には、Ｔｈ１表現型への細胞の分化をコントロールし、一方ＳＴＡＴ６経路は、典型的には、Ｔｈ２表現型への細胞の分化をコントロールする。多くの免疫介在性疾患（自己免疫疾患、アレルギー性疾患、感染症）において、ＴｈのバランスをＴｈ１またはＴｈ２のいずれかに変化させることは、疾患からの病原性または保護に関係する。例えば、ＳＴＡＴ４が欠損しているマウスは、中枢神経系に微炎症性侵潤を有し、ＥＡＥの誘導に抵抗を示す（例えばＣｈｉｔｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  １０８：７３９−４７（２００１））。さらに、ＩＬ−４およびＩＬ−４細胞表面受容体の相互作用は、典型的には、ＳＴＡＴ６の活性化をもたらし、一方類似の相互反応ＩＬ−１２は、ＩＬ−１２受容体に結合してＴｈ１分化およびＩＦＮ−γ生成を誘導する。
【００５９】
一実施形態において、薬剤は、ＳＴＡＴ４経路の抑制に特異的である。別の実施形態において、薬剤は、ＳＴＡＴ６を向上、または促進するために投与され、Ｔｈ１対Ｔｈ２のバランスの調節をもたらす。さらに別の実施形態において、薬剤はＩＬ−４受容体に特異的である。別の実施形態において、ＩＬ−４細胞受容体に特異的な薬剤は、Ｔｈ１およびＴｈ２のバランスを調節するために投与される。さらに別の実施形態において、ＩＬ−１２受容体に特異的な薬剤は、Ｔｈ１およびＴｈ２のバランスを調節するために投与される。別の実施形態において、ＪＳＫ活性または機能を抑制する薬剤は、Ｔｈ１またはＴｈ２のバランスの調節をもたらすために投与される。種々の実施形態において、薬剤は、ポリペプチド、抗体、ペプチド、アプタマー、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、小分子、化学化合物、またはそれらの機能変異体である。好ましい実施形態において、サイトカイン経路を調節する種々の薬剤は、再ミエリン化、ミエリン修復、または軸索保護を促進する、本明細書に記載する１つ以上の薬剤の投与の前に、同時に、もしくは後に投与される。
【００６０】
Ｂ．インテグリン
インテグリンは、典型的には細胞間の相互作用で機械的安定性を与え、細胞センサおよびシグナリング分子として作用する接着分子である。インテグリンは、典型的には、非共有結合したα鎖およびβ鎖からなる。例えば、α４インテグリン鎖は、β１鎖またはβ７鎖のいずれかと二量体化する。αβインテグリンは、ＣＤ４９ｄ−ＣＤ２９としても知られている。種々のインテグリンがそれぞれの内皮対受容体（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ）に結合するのを阻止することにより、リンパ球が中枢神経系に侵入するために必要とする分子相互作用が妨げられ得る（Ｖｏｎ  Ａｄｒｉａｎ  ａｎｄ  Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ，  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３４８：６８−７２（２００３））。
【００６１】
本発明の一態様において、内皮対受容体に特異的な薬剤が送達され、従ってインテグリン−受容体の相互作用が阻止され、かつ炎症性応答またはＣＮＳのリンパ球浸潤のレベルの調節がもたらされる。種々の実施形態において、薬剤は、ポリペプチドもしくは抗体、ペプチド、アプタマー、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、小分子もしくは化学化合物、またはそれらの機能変異体である。一実施形態において、薬剤は、α４インテグリンに対するモノクローナル抗体である。別の実施形態において、薬剤は、α４インテグリンに特異的なアプタマー分子である。別の実施形態において、薬剤は、α４インテグリンに特異的な任意の小分子である。インテグリンの種々のアゴニストまたはアンタゴニストは当該技術分野で公知であり、例えば、その開示内容全体が参考として本明細書で援用される、米国特許第６，６１３，９０５号、第６，６０２，９１４号、第６，５６９，９９６号、第７，０７４，９０１号、第７，０７４，６１７号、第７，０６７，５２５号、第７，０５６，７３６号、および第７，０３８，０１８号に開示されている。好ましい実施形態において、インテグリンを調節する種々の薬剤は、本明細書で記載する、再ミエリン化、ミエリン修復、または軸索保護を促進する１つ以上の薬剤の投与の前に、同時に、もしくは後に投与される。
【００６２】
Ｃ．ＣＤターゲティング
免疫調節剤は、複数のＣＤ分子、それらの受容体、および／またはそれらの随伴タンパク質も標的にすることができる。一部の実施形態において、本発明の１つ以上の組み合わせ方法で、ＣＤ３、ＣＤ８０、ＣＤ８６、もしくはＣＤ２８のリガンドまたは受容体に特異的な前記薬剤を投与して免疫制御をもたらす。一部の実施形態において、ＣＤタンパク質は、ＣＤ８０、ＣＤ２８、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４９、ＣＤ６２、ＣＤ６９、またはＣＤ１５４である。本発明の他の態様において、それぞれ異なるＣＤタンパク質に特異的な２つ以上の薬剤が送達される。他の実施形態において、薬剤は、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ６、ＩＬ−４、またはＩＬ−１２に特異的である。
【００６３】
種々の実施形態において、薬剤は、ポリペプチド、抗体、ペプチド、アプタマー、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、小分子もしくは化学化合物、またはそれらの機能変異体である。これらは、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４９、ＣＤ６２、ＣＤ６９、ＣＤ１５４、またはそれらの２つ以上の組み合わせに特異的である。
【００６４】
一部の実施形態において、薬剤は、抗ＣＤ抗体のＦａｂフラグメントであり、前述のＦａｂフラグメントは、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８０−ＣＤ８６、またはＣＤ２８に特異的である。一部の実施形態において、免疫制御をもたらし得る薬剤は、ＣＤ４０ＬまたはＣＤ３に特異的である。さらなる実施形態において、薬剤は、ＣＤ４、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ４４、ＣＤ４５、Ｃ４５ＲＢ、ＣＤ４９、ＣＤ６２、ＣＤ６９、ＣＤ１５４、ならびにそれらの変異体およびそれらの機能フラグメントに特異的である。さらに別の実施形態において、薬剤は、ＣＤ４、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ４４、ＣＤ４５、Ｃ４５ＲＢ、ＣＤ４９、ＣＤ６２、ＣＤ６９、またはＣＤ１５４のいずれかに結合するＦａｂフラグメントを含む。
【００６５】
一部の実施形態において、薬剤は、特定のＣＤシグナリング経路を選択的に抑制することによりＣＤリガンドまたはその受容体に特異的である。特定のＣＤシグナリングは、検出されたシグナルが実質的にまたは少なくとも主に特定のＣＤシグナリング経路に由来し、好ましくは、他の著しく干渉する原因または競合する原因よりもむしろ、ＣＤリガンドおよびその受容体の相互作用に由来することを意味することもある。例えば、薬剤は、その薬剤が実質的にＣＤ８０シグナリング経路に主に影響を及ぼすという点において、ＣＤ８０シグナリング経路に特異的であり得る。
【００６６】
本発明の一態様において、免疫調節剤は、神経障害の処置のためにＣＤ８０−ＣＤ２８の共刺激経路に向けられる。共刺激シグナルの遮断は、自己免疫疾患の間、Ｔ細胞活性化を下方制御するための興味深い戦略である。ＣＤ２８を発現するＴ細胞は、ＡＰＣおよび活性化Ｔ細胞上で一般的に見出されるＢ７分子（ＣＤ８０およびＣＤ８６）により結合されるとき、典型的には、重要な共刺激シグナルを送達する（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ．  １５：３５６−３６１（１９９４））。ＣＤ８０（Ｂ７−１）は、典型的には、ＥＡＥ（Ｋａｒａｎｄｔｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６１：１９２−１９９（１９９８））およびＭＳ（Ｗｉｎｄｈａｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １８２：１９８５−１９９６（１９９５））の両方でＴ細胞を浸潤するＣＮＳ上で発現される主要な共刺激分子である。ＣＤ２８がＴ細胞のＣＴＬＡ４リガンドに結合する結果として、ＣＤ８０はＴリンパ球に対する制御シグナルを提供することができる。主要組織適合性複合体クラスＩＩに付随したＴ細胞受容体の抗原との結合の後、Ｂ７のＣＤ２８との結合を介して調整される第２のシグナルは、通常、複数のリンホカインの産生を上方制御する。ＣＤ２８分子とＢ７分子との間の相互作用を遮断することで、ＣＤ４＋Ｔ細胞のアネルギーを誘発させることができる（Ｖａｎｄｅｒｌｕｇｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６４：６７０−６７８（２０００））。Ｒ−ＥＡＥの寛解中、抗ＣＤ８０のＦａｂフラグメントを用いる短期処置により、内因的に放出されたミエリンエピトープ（すなわち、エピトープ拡散）に特異的なＴ細胞の活性化を阻害することにより、さらなる再発を抑制することができる（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３：７３９−７４５（１９９５））。反対に、インタクトな抗ＣＤ８０のモノクローナル抗体は、恐らく、エフェクターＴ細胞上でＣＤ８０を交差結合させ、ＩＦＮ−γ産生をもたらし、次いで組織破壊を増進させる（Ｐｏｄｏｊｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７７，  ２９４８−２９５８（２００６））ことにより、進行中のＥＡＥを悪化させ、かつエピトープ拡散（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３：７３９−７４５（１９９５））を増加させた。他の実施形態において、免疫制御薬剤は、ＣＤ２８／Ｂ７の共刺激に拮抗するＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質である。ＣＴＬＡ４（ＣＤ１５２）は、典型的には、活性化Ｔ細胞上で上方制御され、ＣＤ８０／８６の結合に続いてＴ細胞活性化の負の制御因子として作用する（Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５８：１９８９−１９９３（１９９７））。
【００６７】
さらに別の実施形態において、ＣＤ３は、抗ＣＤ３抗体により標的にされ得る。物理的にＴｃＲと結合して、ＣＤ３複合体は、典型的には、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上で、ＴｃＲがペプチド／ＭＨＣ複合体に結合すると、Ｔ細胞に活性化シグナルを伝達するように機能する。第２の共刺激シグナルの非存在下で、ＴｃＲ交差結合は、通常、Ｔ細胞を活性化するには不十分であり、代わりにアネルギー、寛容、または細胞欠乏を誘発する。好ましい実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、非分裂促進的である。かかる非分裂促進的な抗ＣＤ３（ＮＭ−ＣＤ３）モノクローナル抗体は、Ｆｃ領域の変化を含み、当該技術分野では公知である。さらに、かかる抗体は、Ｔ細胞受容体に交差結合するためのモノクローナル抗体の能力を限定する、Ｆｃ受容体の低減した結合能を示す。従って、一部の実施形態において、１つ以上の異なる抗ＣＤ３モノクローナル抗体は、向上した治療効果または相乗治療効果を引き起こし得る組み合わせで、再ミエリン化、ミエリン修復、または軸索保護を向上させるために投与される薬剤の前に、同時に、もしくは後に投与される。
【００６８】
本発明の別の態様において、抗体を被験者に投与し、Ｂ細胞を標的にすることにより免疫調節をもたらす。一部の実施形態において、抗体は、ＣＤ２２、ＣＤ２０、ＣＤ１９、およびＣＤ７４、またはＨＬＡ−ＤＲ抗原を含むがこれらに限定されないＢ細胞抗原に特異的である。抗体は、単独でまたは併用で投与され、むきだしでも、または薬物、毒素、または治療用放射性同位体に抱合させることも可能である。Ｂ細胞抗原に結合する二重特異性抗体融合タンパク質は、１つ以上のＢ細胞抗原に結合するハイブリッド抗体を含み、本発明により使用され得る。
【００６９】
好ましい実施形態において、ＣＤを調節する種々の薬剤は、再ミエリン化、ミエリン修復、または軸索保護を促進する、本明細書に記載する１つ以上の薬剤の投与の前に、同時に、もしくは後に投与される。
【００７０】
Ｄ．変更ペプチドリガンド（ＡＰＬ）
ミエリン修復、再ミエリン化、および／または軸索保護をもたらす薬剤と組み合わせて、免疫調節剤は、自己免疫疾患の処置のために自己反応性Ｔ細胞の抗原特異的ターゲティングをもたらし得る。ＡＰＬは、ＴｃＲシグナリング親和性を低下させ、様々な機能的応答を誘発するために、典型的にはＴｃＲ接触残基で置換された自己抗原の変異ペプチドである（Ｓｌｏａｎ−Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４：１−２７（１９９６））。種々のミエリンエピトープＡＰＬをｉｎ  ｖｉｖｏで投与することにより、ＥＡＥにおいて予防に成功し、および／または進行中の臨床疾患の進行を寛解させた（Ｓａｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５５：２７３７−２７４６（１９９５））。ＡＰＬの機構的作用としては、Ｔ細胞アネルギーの導入（Ｉｌｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  １０１：１１７４９−１１７５４（２００４））、Ｔｈ１（炎症誘発性）からＴｈ２（抗炎症性）へのサイトカインスイッチ（Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．  １１０：１９５−２０８（２０００））、および制御性Ｔ細胞によるバイスタンダー免疫抑制（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９４：９２７９−９２８４（１９９７）；Ｂｉｅｌｅｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ６：１１６７−１１７５（２０００））が挙げられる。種々の実施形態において、変異体としては、抗ＡＰＣに由来する変更ペプチド、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、セラミドガラクトース転移酵素（ＣＧＴ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）、オリゴデンドロサイト−ミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）、ＮＯＧＯ、ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）、末梢ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）、タンパク質２（ｐｒｏｔｅｉｎ  ２）（Ｐ２）、ガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ）、スルファチド、およびプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）が挙げられる。
【００７１】
一部の実施形態において、ＭＨＣ固定化置換ペプチドを利用して、再ミエリン化、ミエリン修復、および／または軸索の保護／維持も促進する組み合わせ処置プロセスで免疫調節をもたらす。一部の実施形態において、変異ペプチドは、ＭＯＧ３５−５５（アミノ酸３５−５５、下付き文字はアミノ酸配列の番号を示す）（Ｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７１：１２４７−１２５４（２００３））およびＰＬＰ１３９−１５１（Ｍａｒｇｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７４：３３５２−３３５８（２００５））ペプチドであり、ＭＨＣアンカー残基にアミノ酸置換を含有し、それにより典型的には、ポリクローナルＴ細胞集団に影響を及ぼし、交差反応性Ｔ細胞の活性化を除去する。ＭＯＧ３５−５５ＡＰＬは、複数のＭＯＧ３５−５５特異的Ｔ細胞およびポリクローナル細胞系でアネルギーを誘発することが示されており、養子移植モデルにおいてＥＡＥを移植するＭＯＧ３５−５５特異的Ｔ細胞の能力を減少させた（Ｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７１：１２４７−１２５４（２００３））。ＰＬＰ１３９−１５１ＡＰＬは、確定したＲ−ＥＡＥの重症度を減少させることが示されている（Ｍａｒｇｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７４：３３５２−３３５８（２００５））。一部の実施形態において、ＡＰＬは、ＮＢＩ−５７８８であり得る。一部の実施形態において、ＭＨＣ固定化置換ペプチドは、再ミエリン化、ミエリン修復、または軸索保護を促進する、本明細書に記載する１つ以上の薬剤の投与の前に、同時に、もしくは後に投与される。
【００７２】
一部の実施形態において、変異ペプチドのより低い投与量は、ＭＲＩ病変の軽減およびＴｈ２応答の誘導を含む治療結果に影響を及ぼし得る。理論に縛られることなく、この後者の効果は、再発性／寛解性多発性硬化症の処置で認可された薬物（グラチラマー酢酸塩（ＧＡ、コポリマー１、コパクソン））の機構的特性に類似する。最初に、ＥＡＥ進行を阻害することが示されるＧＡは、ＭＢＰを模倣するよう設計されたアミノ酸のランダムコポリマー（ＹＥＡＫ）である（Ｓａｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４３：３５７−３６２（２００６））。ＧＡは、ＭＢＰ特異的自己反応性Ｔ細胞の活性化と選択的に競合して、ＭＢＰ特異的Ｔｈ２制御細胞を誘導すると報告されている。ＧＡ療法は、その作用発現は療法の開始から約６ヵ月後で、ＭＳ患者のすべてではないが一部の患者の臨床的再発において中程度の減少をもたらす。ＧＡの改変コポリマー（ＶＷＡＫおよびＦＹＡＫ）も、Ｔ細胞応答に影響を及ぼす（Ｉｌｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：１１７４９−１１７５４（２００４））。
【００７３】
好ましい実施形態において、変異ペプチドは、再ミエリン化、ミエリン修復、または軸索保護を促進する、本明細書に記載する１つ以上の薬剤の投与の前に、同時に、もしくは後に投与される。
【００７４】
Ｅ．ペプチド結合型細胞の寛容
一態様において、Ｔ細胞寛容の誘導等の免疫調節は、エチレンカルボジイミド（ＥＣＤＩ）固定脾細胞のパルスしたミエリンペプチドの静脈内注入により送達することでもたらされる（ＥＣＤＩ固定脾細胞は疾患発症の前または発症後のいずれか）（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．  １４４：２２５−２４４（１９９５））。Ｒ−ＥＡＥで拡散するエピトープは、典型的には、優性の脳炎惹起性エピトープであるＰＬＰ１３９−１５１、実質的に続いてＰＬＰ１７８−１９１およびＭＢＰ８４−１０４による階層的順序に従う（Ｖａｎｄｅｒｌｕｇｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６４：６７０−６７８（２０００））。寛容は、Ｒ−ＥＡＥではプライミングペプチド（疾患の発症を阻止するため）、拡散エピトープ（特定の再発を阻止するため）のいずれか、またはミエリンペプチドの組み合わせと結合した脾細胞を注入することにより誘導され得る（Ｖａｎｄｅｒｌｕｇｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６４：６７０−６７８（２０００））。この寛容プロトコルは、進行中のＥＡＥをうまく寛解させることができ、かつ直接経路および間接経路の両経路を介してＴ細胞アネルギーを誘導すると考えられ、制御性Ｔ細胞を活性化する。つまり、この技法は、抗原特異的寛容を回復するために効率のよい安全なプロセスであり、再発性寛解性ＭＳ患者において臨床試験第Ｉ相で試験される（図２）。
【００７５】
抗原特異的寛容を介する免疫調節は、防御免疫応答を損なうことなく自己免疫を抑制するその潜在能を考慮すれば、興味深い。ペプチド結合細胞寛容は、明らかな副作用もなく、進行中の自己免疫疾患に効果的な療法であるため、有望であり得る。
【００７６】
一態様において、免疫調節をもたらすために送達される薬剤は、寛容を誘導するためのマルチペプチド結合細胞である（図２）。種々の実施形態では，細胞に結合した免疫調節性ペプチドとしては、ＭＢＰ１３−２２、ＭＢＰ１１１−１２９、ＭＢＰ１５４−１７０、ＰＬＰ１３９−１５４、ＭＯＧ１−２０、および／またはＭＯＧ３５−５５が挙げられる（Ｂｉｅｌｅｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７２：３８９３−３９０４（２００４））。他の実施形態において、免疫調節性ペプチドとしては、ＭＢＰ８３−９９、ＭＢＰ１４６−１７０、ＭＢＰ１３１−１５５、ＰＬＰ４０−６０、ＰＬＰ８９−１０６、ＰＬＰ１７８−１９７、ＭＯＧ１１−３０、ＣＮＰ３４３−３７３、および／またはＣＮＰ３５６−３８８が挙げられる。好ましい実施形態において、種々のペプチド結合細胞は、再ミエリン化、ミエリン修復、もしくは軸索保護を促進する、本明細書に記載する１つ以上の薬剤の投与の前に、同時に、または後に投与される。
【００７７】
Ｆ．ＤＮＡワクチン接種
本発明の一部の態様において、免疫調節剤は、ＤＮＡワクチンである。ＤＮＡワクチンは、いくつかの自己免疫モデルにおいて防御免疫を生成する方法として用いられている。種々の脳炎惹起性ミエリンペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡを用いるワクチン接種は、種々のラットおよびマウスのモデルでＥＡＥ発生に保護的であることが示されている（Ｆｏｕｎｔｏｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２４：４１５−４４６（２００５））。一部の実施形態において、動物は、複数のミエリンＤＮＡコンストラクトと、Ｔｈ２型コンストラクト（例えばＩＬ−４）とを同時ワクチン接種される。動物は、ＭＯＧ、ＰＬＰ、ＭＢＰ、および／またはＭＡＧをコードするコンストラクトでワクチン接種され得る。一部の実施形態において、動物は、さらに、ＩＬ−４ワクチンをワクチン接種され得る（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２１：１０３３−１０３９（２００３））。他の実施形態において、シトシン−グアニン塩基のスイッチを有するＧｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）は、本明細書に記載する１つ以上のＤＮＡワクチンと併用して用いられてもよい（Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７５：６２２６−６２３４（２００５）；  Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７１：４９２０−４９２６（２００３））。ＤＮＡワクチンは、ＢＨＴ−３００９でもよい。好ましい実施形態において、ＤＮＡワクチンは、再ミエリン化、ミエリン修復、もしくは軸索保護を促進する、本明細書に記載する１つ以上の薬剤の投与の前に、同時に、または後に投与される。
【００７８】
Ｇ．Ｔ細胞受容体ワクチン接種
本発明の別の態様において、病原性Ｔｈ１細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ワクチンにより調節され得る。同様または類似のＴＣＲ可変（Ｖ）遺伝子の発現は、特定の自己抗原に応答するＴ細胞によく見られるため、α鎖およびβ鎖上のＴｃＲＶ領域のセット（ＡＶおよびＢＶ）を用いて、ＴＣＲワクチン用のペプチドを得られる（Ｖａｎｄｅｎｂａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０：５７−８３（２０００））。例えば、ＴＣＲペプチドは、ＡＶ２遺伝子またはＢＶ８Ｓ２遺伝子に対応し得る。ＴＣＲ  ＢＶ遺伝子ＢＶ５およびＢＶ６は、一般に、ＭＳ患者の血液および脳脊髄液（ＣＳＦ）および脳内でＭＢＰ特異的Ｔ細胞の遺伝子を発現し（Ｋｏｔｚｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８：９１６１−９１６５（１９９１）；  Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．  ７６：１５−２８（１９９７）；  Ｏｌｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：６８−７０（１９９３））、ならびにワクチンはこれらの遺伝子に由来することもある。ＭＢＰ特異的Ｔ細胞でのＢＶ１３Ｓ１の過剰発現も、同定されており（Ｖａｎｄｅｎｂａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ２：１１０９−１１１５（１９９６））、ＴＣＲワクチンを得るために使用されることができる。ＢＶ５Ｓ２に由来するペプチドによるワクチン、置換（Ｙ４９Ｔ）を有するＢＶ５Ｓ２によるワクチン、および三価ＴＣＲペプチドワクチンＩＲ９０２（ＮｅｕｒｏｖａｘＴＭ）、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）中でのＢＶ５Ｓ２、ＢＶ６Ｓ５、ＢＶ１３Ｓ１の組み合わせも、免疫調節剤として使用できる（Ｖａｎｄｅｎｂａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ２：１１０９−１１１５（１９９６）；  Ｇｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．  ７６：２９−３８（１９９７））。好ましい実施形態において、Ｔ細胞受容体ワクチンは、再ミエリン化、ミエリン修復、もしくは軸索保護を促進する、本明細書に記載する１つ以上の薬剤の投与の前に、同時に、または後に投与される。
【００７９】
ＩＩ．ミエリン修復戦略
本明細書で考察する免疫制御成分は、ミエリンに対する免疫攻撃をさらに妨害することができるが、可能性のあるＣＴＬＡ４−Ｉｇを除いて（Ｎｅｖｉｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７４：８３４９−８３５７（２０００））、ミエリン修復を促進することは示されていない。再ミエリン化は、ＭＳの初期に起こるが、ほとんどのＣＮＳ病変の修復は、通常達成されない。進行性臨床衰弱に加えてミエリン修復不全により、再ミエリン化の促進し、軸索をさらなる損傷から護るために、追加の薬理学的介入の必要性は妥当である。内因性再ミエリン化の増強およびミエリン形成の能力を有する細胞移植は、再ミエリン形成療法のための２つの一般的な方法である。本発明は、再ミエリン形成療法で免疫調節剤を投与することにより脱ミエリン化状態を処置するための組成物および方法を提供する。一部の実施形態において、再ミエリン形成の促進薬剤は、免疫調節剤と同時に、その後に、またはその前に投与される。一部の実施形態において、相乗治療効果が達成される。一部の実施形態において、軸索促進薬剤も、免疫調節性およびミエリン修復の促進薬剤と同時に、その後に、またはその前に投与される。ミエリン修復薬剤は、オリゴデンドロサイトの増殖、遊走、または分化を促進し得る。一部の実施形態において、免疫調節剤は、オリゴデンドロサイト分化を促進する薬剤と同時に、その後に、またはその前に投与される。さらに別の実施形態において、オリゴデンドロサイト増殖促進薬剤は、オリゴデンドロサイト分化および免疫調節を促進する薬剤と同時に、その後に、またはその前に被験者対象または細胞に投与される。
【００８０】
Ａ．内因性再ミエリン化
繰り返される免疫的攻撃の損傷を修復するために、十分な数のオリゴデンドロサイト（ＯＬ）は交換される必要があり、およびこれらの細胞は、露出した軸索と効率的に接触して、再ミエリン化する必要がある。オリゴデンドロサイト前駆体（ＯＰ）細胞、および脱ミエリン化エピソードを生き残る非ＯＬは、再ミエリン化に関与している（Ｄａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ２４：４７６−４８８（２００３）、Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｒｅｓ．  ６９：８２６−８３６（２００２），  Ｋｅｉｒｓｔｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．  Ｅｘｐ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  ５６：１１９１−１２０１（１９９７），  Ｇｅｎｓｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｎ．１９；１９７−２０３（１９９７））ことは十分に確定されている。従って、再ミエリン化の不全は、成体ＯＰ細胞の増殖、遊走、および／または分化の不足と関連している可能性がある。発生研究により、ミエリン化のプロセスが広範に特徴づけられ、ＯＬ生成の制御およびミエリン被覆に関与する無数の因子およびシグナリング経路は、同定されている。
【００８１】
Ｂ．成長因子
本発明の一部の態様において、本発明の組み合わせ方法のミエリン修復／再ミエリン化成分は、細胞増殖因子である薬剤である。これらに限定されないが、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、および毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）などの成長因子は、本発明で使用してもよい。ＮＧＦ（総静脈注入量＝１μｇ）が加齢ラットにおけるコリン作動性神経萎縮および空間記憶障害を回復させることがＷ．  Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：６５−６８（１９８７）に報告されている。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで強力な神経栄養活性を有する組換えヒトβＮＧＦが生成されている。Ｊ．  Ｂａｒｒｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  １１０：１１−２４（１９９０）を参照。一部の実施形態において、神経成長因子は、例えばポリペプチド医薬品製剤で外因的に投与される。他の実施形態において、神経成長因子は、後に標的部位への移植が続くｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの標的細胞のトランスフェクションにより送達され得る。
【００８２】
他の実施形態において、ミエリンを促進する薬剤としては、ニューロトロフィン、ニューロポエチンファミリーのサイトカイン、およびニューレグリン（Ａｌｏｉｓｉ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  Ｓｃｉ．  ２４  Ｓｕｐｐｌ  ５：Ｓ２９１−２９４（２００３））が挙げられるがこれらに限定されない。これらの薬剤としては、オリゴデンドロサイトの生存、増殖、遊走、および分化のプロセスに影響を及ぼすことが示されている生体分子も挙げられるがこれらに限定されない。すなわち、例えば、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）（Ｊｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ  １３：６２７−６３１（２００２））、甲状腺ホルモン（ＴＨ）（Ｃａｌｚａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９９：３２５８−３２６３（２００２））、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）（Ｚａｖａｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６８：２０１１−２０１９．（２００２））、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）（Ｌｉｎｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ８：６２０−６２４（２００２））、線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ−２）（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ２２：８５７４−８５８５（２００２））、白血病抑制因子（ＬＩＦ）（Ｂｕｔｚｋｕｅｖｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ８：６１３−６１９（２００２））、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）（Ｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｎ  １４：７１７−７３０（１９９５））、グリア成長因子−２／ニューレグリン（ＧＧＦ−２／ＮＲＧ）（Ｋｅｒｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ２１：１４９−１６５（２００３））、およびＣＸＣＬｌ／増殖調節発癌遺伝子α（Ｇｒｏ−α）（Ｏｍａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｌｉａ  ５３：２４−３１（２００６）；  Ｏｍａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｒａｉｎ  １２８：１００３−１０１５（２００５）；  Ｔｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  １１０：３７３−３８３（２００２））。
【００８３】
一部の因子は、臨床試験で検査されている（Ｆｒａｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｕｌｔ．  Ｓｃｌｅｒ．  ８：２４−２９（２００２）；  Ｖｉｌｌｏｓｌａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９１：１７９９−１８０６（２０００）；  Ａｌｔｈａｕｓ．  Ｐｒｏｇ．  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．  １４６：４１５−４３２（２００４））。サイトカインおよびケモカインは、ＯＰ細胞運命決定に影響を及ぼすことがすでに示されている（Ｆｒｅｎｃｈ−Ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １４：６７８−６８６（２００４），  Ａｇｒｅｓｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ８：１１０６−１１１６（１９９６），  Ａｍｂｒｏｓｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．  Ｒｅｓ．  ２９：１０１７−１０３８（２００４））。一部の実施形態において、相乗治療結果は、再ミエリン化を誘導するための複数の増殖因子を投与することにより向上させることができる（Ｓｃｏｌｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ  ６：４４１−４４５（１９９５），  Ｃｈａｎｄｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｌｉａ．  ４７：３１４−３２４（２００４））。一部の実施形態において、オリゴデンドロサイト前駆体の成熟化および再ミエリン化をもたらすためにニューレグリングリア成長因子２（ｎｅｕｒｏｒｅｇｕｌｉｎ  ｇｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ２）または甲状腺ホルモンを含む増殖因子が投与され得る。
【００８４】
Ｃ．ヒトモノクローナル抗体／静脈免疫グロブリン
免疫グロブリンの静脈投与（ＩＶＩｇ）は、当初、抗体欠乏症の処置のために開発されたが、以来種々の自己免疫および全身性炎症状態の処置に用いられている（Ｔｒｅｂｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｄｅｓ．  １２：２４１−２４９（２００６），  Ｈｕｍｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  Ｓｃｉ．  ２３３：６１−６５．（２００５））。ＩＶＩｇは、主として、多数の健康なドナーからの血漿をプールしたものから調製した、多様な特異性を有するＩｇＧ分子から成る。ＩＶＩｇは、抗イディオタイプ相互作用を介する自己抗体の抑制、マクロファージおよびＴ細胞機能の調節、ならびにサイトカイン産生の抑制を含む種々の機構を介する免疫系を下方制御することができる（Ｔｒｅｂｓｔ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃｕｒｒ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｄｅｓ．  １２：２４１−２４９（２００６），  Ｈｕｍｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  Ｓｃｉ．  ２３３：６１−６５（２００５））。ＩＶＩｇは、ＥＡＥ（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｌ．  Ｒｅｓ．  ２７：  ５９１−５９７（２００５））ならびに臨床試験（Ｌｅｗａｎｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  ９：５６５−５７２（２００２），  Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ５０：１２７３−１２８１（１９９８），  Ｓｏｒｅｎｓｅｎ．  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  Ｓｃｉ．  ２０６：１２３−１３０（２００３），  Ｈｏｍｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｎｃｅｔ  ３６４：１１４９−１１５６（２００４）），  Ｔｒｅｂｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｄｅｓ．  １２：２４１−２４９（２００６），  Ｈｕｍｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  Ｓｃｉ．  ２３３：６１−６５（２００５））で利用されてきた。
【００８５】
一実施形態において、ＩｇＭ抗体は、ミエリン修復または再ミエリン化を促進するために被験者に投与される。一部の実施形態において、抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏで再ミエリン化を促進するために、オリゴデンドロサイトに結合して、細胞内シグナリングを促進できるモノクローナルＩｇＭ抗体である（Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９７：６８２０−６８２５（２０００），  Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １０８：Ｓ１２１−１２５（２００１））。一実施形態において、モノクローナルＩｇＭ抗体（例えばｒＨＩｇＭ２２（ｒｓＨＩｇＭ２２、ｓＨＩｇＭ２２、およびＬＹＭ２２としても公知である））を投与して、再ミエリン化を促進する（Ｃｉｒｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．  １４６：１５３−１６１（２００４）；  Ｈｏｗｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．  Ｄｉｓ．  １５：１２０−１３１（２００４）；米国特許公開第２００７００８６９９９号）。投与可能な他のヒト抗体としては、ｅｂｖＨＩｇＭ、ＭＳ１１９Ｄ１０、ｓＨＩｇＭ４６（ＬＹＭ４６）、ｅｂｖＨＩｇＭＣＢ２ｂ−Ｇ８、またはＭＳ１１０Ｅ１０（米国特許公開第２００７００８６９９９号）が挙げられる。一部の実施形態において、抗体は、免疫調節剤の前に、後に、または同時に投与される。
【００８６】
Ｄ．γ−セクレターゼ抑制
一部の態様において、ミエリン修復または再ミエリン化を促進する薬剤は、γ−セクレターゼ活性を調節する。一部の実施形態において、ミエリン修復または再ミエリン化を促進する薬剤は、Ｎｏｔｃｈシグナリングを調節する（Ｊｕｒｙｎｃｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏ．  Ｓｃｉ．  ＰＭＩＤ：  １７９４９７５（２００７））。好ましい実施形態において、γ−セクレターゼ活性および／またはＮｏｔｃｈシグナリングを調節する薬剤は、免疫調節剤の前に、後に、または同時に投与される。
【００８７】
いずれかの特定の機構に限定されることなく、エピトープ拡散は、典型的には、ＣＮＳ（ＭｃＭａｈｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  １１：３３５−３３９（２００５））でおこり、γ−セクレターゼの阻害ならびに／またはＮｏｔｃｈシグナリングは、拡散したエピトープに特異的なＴ細胞応答を抑制できる。しかし、ＣＮＳの脱ミエリン化後、ＯＬ上でのＮｏｔｃｈ１の発現は、再ミエリン化に抑制的でなくまたは律速でもない（Ｓｔｉｄｗｏｒｔｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｒａｉｎ．  １２７：１９２８−１９４１（２００４））。
【００８８】
Ｎｏｔｃｈタンパク質（Ｎｏｔｃｈ１−４）は、Ｊａｇｇｅｄ１および２、Ｄｅｌｔａ様１、３、および４、ならびにコンタクチンを含む、少なくとも６つの同定されたリガンドと相互作用する膜貫通糖タンパク質受容体である。リガンド結合に際して、Ｎｏｔｃｈは、典型的には、酵素γ−セレクターゼにより切断され、および細胞内ドメインは核に移行する。そこで、それは神経細胞分化の抑制（Ｙｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ８：７０９−７１５（２００５））、オリゴデンドロサイト分化、およびミエリン化（Ｇｉｖｏｇｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｒｅｓ．  ６７：３０９−３２０（２００２），  Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｎ．  ２１：６３−７５（１９９８），  Ｇｅｎｏｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １５８：７０９−７１８（２００２））を含む、宿主の細胞プロセスを制御する転写因子として作用する。Ｎｏｔｃｈ１およびＪａｇｇｅｄ１は、通常、再ミエリン化の欠如したＭＳプラーク内で未成熟ＯＬおよび肥大アストロサイト上でそれぞれ発現する（Ｊｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ８：１１１５−１１２１（２００２））。Ｎｏｔｃｈシグナリングも、成熟Ｔ細胞機能の制御に関与してきた。前述で記載したＮｏｔｃｈの機能としては、寛容誘導（Ｈｏｙｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １２：１７７−１８５（２０００））、Ｔ制御細胞分化（Ｈｏｙｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １２：１７７−１８５（２０００）；  Ｙｖｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ．  １０２：３８１５−３８２１（２００３）；  Ｖｉｇｏｕｒｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７７：１０８７２−１０８８０（２００３））、およびＴ細胞増殖の促進（Ａｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７１：２８９６−２９０３（２００３）；  Ｐａｌａｇａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７１：３０１９−３０２４（２００３））またはＴ細胞増殖の抑制（Ｂｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３５：８５９−８６９（２００５）；  Ｅａｇａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．  ２０：４０７−４１５（２００４））ならびにサイトカイン産生（Ａｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７１：２８９６−２９０３（２００３）；  Ｐａｌａｇａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７１：３０１９−３０２４（２００３）；  Ｂｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３５：８５９−８６９（２００５）；  Ｅａｇａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．  ２０：４０７−４１５（２００４））が挙げられる。
【００８９】
種々の実施形態において、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、Ｎｏｔｃｈ４、Ｊａｇｇｅｄ１、Ｊａｇｇｅｄ２、Ｄｅｌｔａ様１、Ｄｅｌｔａ様２、Ｄｅｌｔａ様３、またはコンタクチンに特異的な薬剤が投与される。他の実施形態において、薬剤はγ−セクレターゼに特異的であり、γ−セクレターゼの活性または機能を抑制できる。他の実施形態において、薬剤は、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、Ｎｏｔｃｈ４、Ｊａｇｇｅｄ１、Ｊａｇｇｅｄ２、Ｄｅｌｔａ様１、Ｄｅｌｔａ様２、Ｄｅｌｔａ様３、もしくはコンタクチン、またはそれらの２つ以上の組み合わせに結合する。これらの薬剤は、Ｎｏｔｃｈシグナリングを短絡し、それにより神経細胞分化の抑制、オリゴデンドロサイト分化およびミエリン化を妨げるために（すなわち、ミエリン修復または再ミエリン化を促進する）投与される。他の実施形態において、薬剤は、間接的にＮｏｔｃｈシグナリングを制御する（例えば、Ｎｏｔｃｈ経路の下流効果を抑制する）。一部の実施形態において、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、Ｎｏｔｃｈ４、Ｊａｇｇｅｄ１、Ｊａｇｇｅｄ２、Ｄｅｌｔａ様１、Ｄｅｌｔａ様２、Ｄｅｌｔａ様３、またはコンタクチンに特異的な薬剤は、アプタマー、ペプチド、ペプチド模倣体、または抗体である。
【００９０】
他の実施形態において、本発明の薬剤は、γ−セクレターゼ抑制物質である。かかる薬剤は、当該技術分野で公知である（Ｂｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３５：８５９−８６９（２００５）、Ｅａｇａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．  ２０：４０７−４１５（２００４）、Ｍｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ６：６８０−６８８（２００５）；  米国特許公開第２００７０２２５２２８号）。γ−セクレターゼ抑制物質は、ＰＳ−１およびＰＳ−２の両方を抑制する、Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェナセチル−Ｌ−アラニル）］−Ｓ−フェニルグリシン−ｔ−ブチルエステル（ＤＡＰＴ）を含み得る。この化合物は、約２５，０００の化合物のスクリーニングでＡβ産生を抑制した分子から最適化した誘導体である。ＤＡＰＴは、置換アッセイでγ−セクレターゼ活性部位と中程度に競合できる、細胞透過性ジペプチド非遷移状態の類似体であり、ＤＡＰＴの結合部位とその活性化部位とが一部重複することを示唆している。γ−セクレターゼ抑制物質の他の例としては以下が挙げられる。すなわち、化合物ＩＩＩ−３１−Ｃ、化合物Ｅ、イソクマリン、Ｄ−へリカルペプチド２９４、エポキシド、（Ｚ−ＬＬ）２−ケトン（ＳＰＰ抑制物質）（米国特許公開第２００７０２２５２２８号を参照）。他のγ−セクレターゼ抑制物質としては、Ｓｈｅａｒｍｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９：８６９８−８７０４（２０００）に記載されたペプチド模倣体抑制物質（例えば、Ｌ−６８５，４５８（（５Ｓ）−（ｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−６−フェニル−（４Ｒ）ヒドロキシ−（２Ｒ）ベンジルヘキサノイル）−Ｌ−ロイシル−Ｌ−フェニルアラニル−アミド）。Ｗｏｌｆｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ４１：６（１９９８）に記載される、別のγ−セクレターゼ抑制物質は、ＡＬＸ−２６０−１２７（化合物１１とも称される）がある。これは、可逆性ジフルオロケトンペプチド模倣体の抑制物質である。他の抑制物質としては、以下が挙げられる。すなわち、γ−セクレターゼの活性部位に向けられる光活性化γ−セクレターゼ抑制物質（例えば、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ４０５（６７８７）：６８９−９４（２０００）に記載されるように）、およびＴａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７８：１８６６４−７０（２００３）に記載されるように、γ−セクレターゼ上で直接的に作用し、基質として組換えアミロイドβ前駆体タンパク質Ｃ１００を用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏでのγ−セクレターゼアッセイにおいてγ−セクレターゼ活性を優先的に抑制するスリンダク硫化物（ＳＳｉｄｅ）。γ−セクレターゼ抑制物質としては、以下を挙げることも可能であるがこれらに限定されない。すなわち、５−（アリールスルホニル）ピラゾロピペリジン、架橋Ｎ−環式スルホンアミド化合物、架橋Ｎ二環式スルホンアミド、ジベンゾアゼピン、膜貫通カーゴタンパク質ＴＭＰ２１、ベンゼンスルホニル−クロマン、チオクロマン、テトラヒドロナフタレン、テトラヒドロインドール、フルオロ置換２−オキソ−アゼパン誘導体、シクロアルキル、ラクタム、ラクトンおよび関連化合物、Ｎ−（アリール／ヘテロアリール／アルキルアセチル）アミノ酸アミド、トリフルオロメチル含有フェニルスルホンアミド、複素環スルホンアミド誘導体、フルオロ−  およびトリフルオロアルキル−含有複素環スルホンアミド、置換フェニルスルホンアミド誘導体（例えば、ＰＣＴ特許公開第ＷＯ２００７０６４９１４号、第ＷＯ２００７０２２５０２号、第ＷＯ２００７１１０６６７号、第ＷＯ２００７０８４５９５号、第ＷＯ２００７０５４７３９号、第ＷＯ２００７０２４６５１号、第ＷＯ１９９８２８２６８号、第ＷＯ９８２２４３３号、第ＷＯ２００３１０３６６０号、米国特許公開第２００７２２５２７３号、米国特許公開第２００７０３７７８９号、米国特許公開第２００７２４９７２２号、米国特許公開第２００５１７１１８０号、米国特許公開第２００４１９８７７８号、カナダ国特許出願第ＣＡ２５８１１０９号に記載）。γ−セクレターゼ抑制物質（□−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）は、ＬＹ４５０１３９でもよい（図４）。
【００９１】
最近の研究では、特定のγ−セクレターゼ抑制物質（ＬＹ４１５７５）は、Ｔ細胞増殖に効果を及ぼさないが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴｈ１分化を減少させ、かつ疾患の発症の前に注入される場合、ＥＡＥの重症度を軽減させ（Ｍｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ６：６８０−６８８（２００５））、臨床疾患の発症後に抑制物質（ＭＷ１６７）を脳室内に投与すると組織修復および急性ＥＡＥからの回復を向上させる（Ｊｕｒｙｎｃｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．  １７０：３−１０（２００５））ことが示された。γ−セクレターゼ抑制物質の好ましい実施形態において、ＬＹ４１１５７５、ＩＩＩ−３１−Ｃ、またはＤＡＰＴを含む。さらに他の実施形態において、γ−セクレターゼを抑制する薬剤としては、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、アプタマー、ペプチド、ポリペプチド、他の小分子、または抗体が挙げられる。
【００９２】
γ−セクレターゼ活性を抑制するために、プレセニリンの発現を直接的に抑制する遺伝因子（例えば、プレセニリン転写物の一部分にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチド等）が導入されてもよい。かかる方法は、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）技術の使用も包含する。このアプローチでは、サブユニットγ−セクレターゼ（例えばプレセニリン）に特異的な二本鎖ＲＮＡの分子が使用される。ＲＮＡｉ技術は、二本鎖ＲＮＡが細胞（例えばオリゴデンドロサイト）に導入されて、標的遺伝子の発現を抑制するために（すなわち、その発現を「沈黙させる」）γ−セクレターゼのサブユニットを発現させるプロセスをいう。ｄｓＲＮＡを選択して、標的遺伝子との実質的な同一性を有する。一般に、かかる方法は、最初に、標的遺伝子配列のすべてまたは一部を含有する核酸分子を一本鎖ＲＮＡにｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写することを含む。センスおよびアンチセンスの両ＲＮＡ鎖は、ｄｓＲＮＡを形成するために適切な条件下でアニールさせておく。ｄｓＲＮＡは、標的遺伝子の少なくとも１つのセグメントに実質的に同一であるように調製される。結果として生じるｄｓＲＮＡは、種々の方法を介して細胞に導入され、それにより標的遺伝子の発現を沈黙させる。標的遺伝子とｄｓＲＮＡとの間の実質的な配列類似性のみが必要とされるため、遺伝変異、進化的分岐、および多型性から生じるこれら２種間の配列多様性が許容され得る。さらに、ｄｓＲＮＡは、種々の改変類似体またはヌクレオチド類似体を含み得る。通常、ｄｓＲＮＡは、２つの別々の相補的ＲＮＡ鎖からなる。しかし、場合により、ｄｓＲＮＡは、鎖のループがヘアピンループを形成するためにそれ自体に折り重なるように、自己相補的であるＲＮＡの一本鎖により形成され得る。形にかかわらず、ＲＮＡ二重鎖形成は、細胞の内外部で起こり得る。確立された遺伝子治療技術の多くも、ｄｓＲＮＡを細胞に導入するために利用できる。例えば、ウイルス粒子内のウイルスコンストラクトを導入することにより、そのコンストラクトによりコードされる細胞およびＲＮＡ転写への発現コンストラクトの効率的な導入を達成できる。
【００９３】
本発明の方法は、プレセニリン−１もしくはプレセニリン−２のドミナントネガティブまたは家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）突然変異体の発現により、およびγ−セクレターゼ活性（例えば、プレセニリン、ニカストリン、Ｐｅｎ−２、またはＡｐｈ−１）に必須の遺伝子（または遺伝子産物）のノックアウト／破壊によりγ−セクレターゼを抑制することも含む。
【００９４】
Ｅ．再ミエリン形成細胞の移植
本発明の別の態様において、ミエリン修復または再ミエリン化を促進するために投与される薬剤は、ミエリン化に影響を及ぼす細胞である。一部の実施形態において、それらの細胞は、オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）、シュワン細胞（ＳＣ）、嗅覚被膜細胞、神経幹細胞（ＮＳＣ）である。これらは、１つ以上の免疫調節剤の前に、同時に、または後に投与される。一実施形態において、かかる細胞は、移植の前にｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養され伸長される。種々の実施形態において、細胞は、免疫調節および／またはミエリン修復または軸索保護をもたらすポリペプチドを発現させるため、もしくは改変したレベルで発現させるために、トランスフェクトされ得る、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏで遺伝子改変され得る。一部の実施形態において、ミエリン産生細胞またはその前駆細胞としては、胎児ＯＰＣまたは成体ＯＰＣが挙げられるがこれらに限定されない。一実施形態において、ＯＰＣは、Ａ２Ｂ５＋ＰＳＡ“ＮＣＡＭ”表現型（初期のオリゴデンドロサイトマーカーＡ２Ｂ５には陽性であり、ポリシアル酸神経細胞接着分子には陰性である）であり得る。
【００９５】
ＣＮＳ軸索の再ミエリン化は、種々の動物モデルにおいて示されている（Ｓｔａｎｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｇ．  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．  ６８：３６１−３７６（２００２）；  Ｐｌｕｃｈｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  Ｓｃｉ．  ２３３：１１７−１１９（２００５））。以来、最近の多数の研究では、脱髄性疾患で細胞移植の活用に関連する新規の技術および新規の機構が示されている。成体脳から単離されたヒトＯＰ細胞は、髄鞘形成不全のマウス変異体に移植したとき、無髄軸索をミエリン化することができた（Ｗｉｎｄｒｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  １０：９３−９７（２００４））。成体前駆細胞を用いることで倫理的な問題を回避し得る。ＯＰ細胞は、典型的には、内在性再ミエリン化に関与するが、ＮＳＣは、ミエリン修復を促進するための細胞の代替ソースである。ＮＳＣは、成体ＣＮＳに見られ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで広範に伸長されることができ、かつＯＬ、アストロサイト、または神経細胞を形成するために分化することができる。再発型ＥＡＥまたは慢性型ＥＡＥを有するげっ歯類に移植される場合、ＮＳＣは、ＣＮＳ炎症および脱ミエリン化の領域に遊走して、グリア細胞の運命を優先的に取り入れることが示されている（Ｂｅｎ−Ｈｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｌｉａ．  ４１：７３−８０（２００３），  Ｐｌｕｃｈｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ４３６：２６６−２７１（２００５），  Ｐｌｕｃｈｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ４２２：６８８−６９４（２００３），  Ｅｉｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｘｐ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  １９８：１２９−１３５（２００６））。移植されたマウスにおける臨床疾患の減弱は、脱ミエリン化病変の修復に関連し、軸索傷害を減少させた（Ｐｌｕｃｈｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ４３６：２６６−２７１（２００５），  Ｐｌｕｃｈｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ４２２：６８８−６９４（２００３），  Ｅｉｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  １９８：１２９−１３５（２００６））。組織学的解析で、移植されたＮＳＣが主にＰＤＧＦＲ＋ＯＰ細胞に分化したことが確認された（Ｐｌｕｃｈｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ．  ４２２：６８８−６９４（２００３））。
【００９６】
興味深いことに、ＯＰ細胞の数は、ＮＳＣを移植したＥＡＥマウスでは増加したが、これらの細胞の大多数は、ドナーに由来したものでなく、移植された細胞が内在性オリゴデンドログリアの伸長を制御したことを示唆した（Ｐｌｕｃｈｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ．  ４２２：６８８−６９４（２００３））。ＮＳＣがＥＡＥ寛解および病変修復を促進する機構は、免疫抑制機能および神経保護機能を示唆している。ＮＳＣは、Ｔ細胞のアポトーシスをｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏの両方で誘導し（Ｐｌｕｃｈｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ．  ４３６：２６６−２７１（２００５））、ＮＳＣ移植ＥＡＥげっ歯類においてＴ細胞を浸潤するＣＮＳを減少、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏでミエリンペプチド−特異的Ｔ細胞の増殖を抑制する（Ｅｉｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  １９８：１２９−１３５（２００６），  Ｅｉｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ２４：１０７４−１０８２（２００３））ことが示唆されてきた。免疫調節性および提案された神経保護の特徴は、神経栄養因子（Ｌｕ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  １８１：１１５−１２９（２００３））および種々の増殖因子（Ｅｉｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  １９８：１２９−１３５（２００６））により仲介され得る。これらの因子は、ＣＮＳ炎症を減少させることもあり、および／またはＯＬ系統の細胞生存を向上させ、ならびに宿主ＣＮＳで再ミエリン化を促進することもできる。
【００９７】
一部の実施形態において、オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）、シュワン細胞（ＳＣ）、嗅覚被膜細胞、および神経幹細胞（ＮＳＣ）は、１つ以上の所望の薬剤の発現を可能にするために、本明細書中上記で記載された１つ以上の発現ベクターによりトランスフェクトされる。かかる薬剤は、免疫調節、ミエリン修復／再ミエリン化、または軸索保護に向けられ得る。種々の実施形態において、細胞は、培養で伸長する前に、同時に、または後にトランスフェクトされる。
【００９８】
当然のことながら、移植は、侵襲的手技、外科手技、最小限に侵襲的な手技、および非外科手技を含む、当該技術分野で公知の方法を用いて行なわれる。被験者、標的部位、および送達される薬剤に応じて、細胞の型および数は、当該技術分野で公知の方法を用いて、所望のように選択され得る。移植は、別の薬剤（例えば免疫調節剤）の投与の前に、後に、または同時に行なうことができる。
【００９９】
ＩＩＩ．軸索保護
別の態様において、免疫調節剤またはミエリン修復薬剤と併用して、軸索の保護または再生を促進する薬剤も、相乗治療効果をもたらすために投与され得る。一部の実施形態において、抑制性軸索再生シグナルを遮断する薬剤は、被験者または細胞に投与される。種々の実施形態において、かかる生理活性薬剤は、アンチセンスプローブ、ｓｉＲＮＡ、アプタマー、ペプチド、ポリペプチド、他の小分子、または抗体であり得る。例えば、抗体は、Ｎｏｇｏに結合して、軸索再生抑制を短絡することができる。
【０１００】
Ｎｏｇｏは、レティキュロンファミリーのメンバーであり、オリゴデンドロサイトにより発現されるが、シュワン細胞には発現されず、軸索伸展を抑制する。Ｎｏｇｏ−６６受容体１、ニューロトロフィンｐ７５受容体、およびＬＩＮＧＯ−１を含むＮｏｇｏ受容体複合体は、ミエリン関連抑制因子に結合すると軸索再生を抑制する。その受容体、ｐ７５神経栄養チロシンキナーゼ受容体へのニューロトロフィン（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｉｎ）の結合は、タンパク質キナーゼＣおよびＧＴＰアーゼｒａｓ相同遺伝子ファミリーメンバーＡの活性化を消失させ、神経突起伸長を減少させる（Ｙａｍａｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｎ．  ２４：５８５−５９３（１９９９））。Ｎｏｇｏ−６６に対する抗体は、ＥＡＥから保護し、一方Ｎｏｇｏ−６６エピトープは、保護Ｔｈ２細胞系を誘導する（Ｆｒｏｎｔｏｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７３：６９８１−６９９２（２００４））。
【０１０１】
損傷したオリゴデンドロサイトおよびミエリンは、軸索再生のための負のシグナルを出す。グリアおよび炎症細胞で見られるカルパインは、生理的ｐＨでミエリンタンパク質を分解することができる。その結果、神経細胞自己修復および軸索再生は、ミエリン破壊中に放出されるシグナルにより損なわれることもある。ミエリン溶解生成物の中で、ミエリン関連糖タンパク質およびＮｏｇｏは、軸索再生を抑制し、集合的にミエリン関連抑制因子と呼ばれる。
【０１０２】
従って、一部の実施形態において、軸索再生を刺激する治療標的としては、Ｎｏｇｏシグナリング阻害剤およびタンパク質キナーゼＣ抑制物質が挙げられる。一実施形態において、Ｎｏｇｏ−６６に特異的な抗体が投与される。他の実施形態において、ペプチド、アプタマー、アンチセンス、またはｓｉＲＮＡは、Ｎｏｇｏ受容体複合体の任意のメンバーを標的にし、それによる結合はＮｏｇｏシグナリングを妨げ、従って軸索再生が抑制される。他の実施形態において、生理活性薬剤は、ニューロトロフィン（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｉｎ）、ニューロトロフィンｐ７５受容体（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｉｎ  ｐ７５  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、またはＬＩＮＧＯ−１に特異的である。
【０１０３】
好ましい実施形態において、軸索保護を促進する薬剤は、免疫調節剤の前に、後に、または同時に投与される。
【０１０４】
ＩＶ．薬剤
本明細書に記載するように、免疫調節剤、ミエリン修復促進薬剤、および軸索保護促進薬剤はとしては、ペプチド、ポリペプチド、アンチセンス分子、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、外部ガイド配列（ＥＧＳ）有機小分子、抗体、ペプチド模倣体、またはワクチンが挙げられるがこれらに限定されない。これらの薬剤は、直鎖型または閉環型で提供でき、一般に天然で見出されない少なくとも１つのアミノ酸残基、または少なくとも１つのアミドアイソスターを場合により含む。これらの化合物は、グリコシル化、リン酸化、硫酸化、脂質化、または他のプロセスにより改変され得る。
【０１０５】
薬剤は、有機分子、有機金属分子、無機分子、および遺伝子配列を含む多数の化学クラスを包含することもできる。薬剤は、構造的相互作用（特に水素結合）に必要な官能基を含む有機分子を含み、典型的には、少なくともアミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基、またはカルボキシル基を含み、これらの官能化学基から少なくとも２つを含むことも多い。薬剤は、上記官能基の１つ以上と置換した環式炭素構造もしくは複素環構造および／または芳香族構造もしくは多環芳香族構造を含み得る。薬剤は、ペプチド、ポリヌクレオチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、それらの誘導体、構造的類似体、またはそれらの組み合わせを含む生体分子間にも見られる。薬理的活性薬物および遺伝子活性分子が含まれる。薬剤は、化学療法剤、およびホルモンまたはホルモン拮抗薬を含んでよい。例えば「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」（Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ，  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．，（１９９６），  Ｎｉｎｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ）に記載される医薬品も本発明に適しているものもある。薬剤は、合成化合物または天然化合物（例えば、以下に記載したスクリーニングアッセイで同定される化合物）のライブラリーを含む多種多様なソースから取得されることも可能である。
【０１０６】
薬剤は、抗体（例えば抗ＣＤ８０または抗ＣＤ３抗体）も含み得る。本明細書に記載したようにかかる抗体を生成することは、当該技術分野で公知であり、例えば米国特許第６，４９１，９１６号、第６，９８２，３２１号、第５，５８５，０９７号、第５，８４６，５３４号、第６，９６６，４２４号、ならびに米国特許出願公開第２００５００５４８３２号、第２００４０００６２１６号、第２００３０１０８５４８号、第２００６００２９２１号、および第２００４０１６６０９９号に開示されている。これらの各々の関連する部分を参考として本明細書で援用する。ただ１つの例において、モノクローナル抗体は、抗原を含む組成物をマウスに注入し、血清試料を採取して抗体産生の存在を確認し、脾臓を摘出してＢリンパ球を得て、Ｂリンパ球を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを産生し、ハイブリドーマをクローニングし、注入した抗原に対する抗体を産生する陽性クローンを選択し、抗原に対する抗体を産生するクローンを培養し、次いでハイブリドーマ培養物から抗体を単離することにより得ることができる。モノクローナル抗体は、種々の確立した技法によりハイブリドーマ培養物から単離され、精製され得る。かかる単離法としては、プロテインＡセファロースを用いるアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーが挙げられる。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎのページ２．７．１  ２．７．１２およびページ２．９．１  ２．９．３を参照。また、Ｂａｉｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ  （ＩｇＧ），”  ｉｎ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，  ＶＯＬ．  １０，  ｐａｇｅｓ  ７９  １０４  （Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．  １９９２）を参照。
【０１０７】
抗体の産生のための特徴がはっきりした適量の抗原は、標準法を用いて得ることができる。一例として、ＣＤ抗原タンパク質は、目的の抗原を過剰に産生する、トランスフェクトした培養細胞から得ることができる。これらのタンパク質の各々をコードするＤＮＡ分子を含む発現ベクターは、公開されたヌクレオチド配列を用いて構築することができる。
例えば、Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７３：１３７−１４６（１９９１）；  Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５０：５０１３−５０２４（１９９３）を参照。例として、ＣＤ３をコードするＤＮＡ分子は、相互プライミングの長いオリゴヌクレオチドを用いてＤＮＡ分子を合成することにより得ることができる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  （ｅｄｓ），  ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，  ｐａｇｅｓ  ８．２．８  ｔｏ  ８．２．１３（１９９０）を参照。また、Ｗｏｓｎｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  ６０：１１５−１２７（１９８７）；  およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ），  ＳＨＯＲＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  ｐａｇｅｓ  ８−８  ｔｏ  ８−９（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．  １９９５）を参照。ポリメラーゼ連鎖反応を用いる確立された技法は、長さが１．８キロベースの大きさの遺伝子を合成する能力をもたらす。（Ａｄａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ．  Ｂｉｏｌ．  ２１：１１３１−１１４５（１９９３）；  Ｂａｍｂｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ２：２６６−２７１（１９９３）；  Ｄｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｇｅｎｅｓ，”  ｉｎ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，  Ｖｏｌ．  １５：ＰＣＲ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ：  ＣＵＲＲＥＮＴ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ，  Ｗｈｉｔｅ  （ｅｄ．），  ｐａｇｅｓ  ２６３  ２６８，  （Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．  １９９３））。バリエーションでは、モノクローナル抗体は、目的の抗原をコードするｃＤＮＡを安定にトランスフェクトされた、マウスプレＢ細胞系で免疫されたマウスに由来する脾細胞と、骨髄腫細胞を融合させることにより得ることができる（Ｔｅｄｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  米国特許第５，４８４，８９２号を参照）。
【０１０８】
一実施形態において、抗体全体、裸の抗体もしくは全体の組み合わせ、非標識抗体は、免疫調節剤である。一部の実施形態において、抗体フラグメントが利用され、従って、完全抗体に満たない。他の実施形態において、薬物、毒素、または治療用放射性同位元素との抗体抱合体が有用である。ＣＤ抗原に結合する二重特異性抗体融合タンパク質は、本発明により使用され得、１つ以上の抗原に結合するハイブリッド抗体を含む。好ましくは、二重特異性抗体およびハイブリッド抗体は、さらに、Ｔ細胞、形質細胞、またはマクロファージ抗原を標的にする。従って、抗体は、単一特異的または多特異的な、裸の抗体および抱合型抗体および抗体フラグメントを包含する。
【０１０９】
薬剤の特徴に応じて、薬剤は、リポソーム製剤およびミニ細胞を含む、プラスミドベクター、ウイルスベクターもしくは非ウイルスベクター系を介して送達され得る。従って、一部の実施形態において、薬剤（例えば、ミエリン修復を促進する神経成長因子）は、標的細胞にトランスフェクトされる核酸配列によりコードされる。従って、所望の成長因子は、細胞ゲノムに組み込まれ得る、またはプラスミドベクターもしくはウイルスベクター上に存在し得る核酸配列から発現される。一部の実施形態において、免疫調節、ミエリン修復／再ミエリン化、または軸索保護をもたらすために、同時投与される１つ以上の薬剤は、核酸配列から発現される。一部の実施形態において、かかる薬剤をコードする核酸配列の発現は、誘導可能であり、従って一時的である。
【０１１０】
本発明の薬剤は、Ｔ細胞活性化の活性レベル、好ましくは自己反応性Ｔ細胞の活性レベル、および／またはγ−セクレターゼ活性の活性レベルを直接的もしくは間接的に調節することができる。一部の実施形態において、グリア細胞を培養して、薬剤（例えばγ−セクレターゼの抑制物質）をコードする発現コンストラクトをｉｎ  ｖｉｔｒｏでトランスフェクトし、続いて被験者に投与する。従って、一部の実施形態において、調節される発現は、ｅｘ  ｖｉｖｏ法を介してもたらされる。
【０１１１】
一部の実施形態において、免疫応答を調節する薬剤をコードする核酸は、組み合わせ様式で再ミエリン化を促進する薬剤をコードする核酸と同時投与され得る。例えば、核酸から発現する、同時投与される２つ以上の薬剤は、グリア細胞の遊走、増殖、および／または分化を促進することが可能であり、ならびに自己免疫応答を抑制または減少させ得る。核酸から発現する薬剤は、例えば、自己反応性Ｔ細胞を抑制することにより、自己免疫応答を遮断または抑制することができる。自己免疫応答を抑制する薬剤は、例えばγ−セクレターゼ活性を抑制することで、ミエリン修復を促進する薬剤と組み合わせることができる。さらに一部の実施形態において、かかる薬剤をコードする核酸配列の発現は、誘導可能であり、従って一時的にコントロールされる。かかる誘導可能なまたは一時的にコントロールされる転写制御エレメントは、当該技術分野で、およびさらに本明細書で開示するように公知である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかで細胞を遺伝的に改変またはトランスフェクトすることは、本明細書に記述する参考文献に記載されているように（および例えば、米国特許第６，９９８，１１８号、第６，６７０，１４７号、または第６，４６５，２４６号に開示されるように）、当該技術分野で公知の方法を利用して実施され得る。
【０１１２】
他の実施形態において、かかるトランスフェクトされた細胞としては、ＳＣ細胞、ＮＳＣ細胞、ＯＰＣ細胞、アストロサイト細胞、ミクログリア細胞、またはかかる細胞の組み合わせが挙げられる。これらは、培養中で、またはｉｎ  ｖｉｖｏでトランスフェクトされ得る。一部の実施形態において、発現コンストラクトは、細胞特異的プロモーターまたは誘導可能なプロモーターを含む。これらのプロモーターは、グリア細胞に特異的であり、本明細書に記載され、ならびに当業者にとって周知である。
【０１１３】
本発明の１つ以上の方法で用いる神経系細胞の例としては、グリア細胞（例えば、オリゴデンドロサイト、オリゴデンドロサイト前駆体細胞、シュワン細胞、アストロサイト、およびミクログリア）が挙げられる。ＣＮＳの微小環境内で、アストロサイトは支持および栄養物を提供し、オリゴデンドロサイトは絶縁体を提供し、およびミクログリアは免疫防御を提供する。中間フィラメントタンパク質のグリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）の発現により通常、同定されるアストロサイトは、種々のイオンチャネル、トランスポーター、および脳の恒常性の維持に役立ち、ならびに神経細胞興奮性を変化させ得る神経伝達物質受容体を有する。さらに、アストロサイトは内皮細胞と相互作用する。これらの相互作用は、血液脳関門（ＢＢＢ）の発生および維持にとって重要であると考えられる。アストロサイトは、増殖し、それらの形態を変化させ、プロセスを拡大し、およびＧＦＡＰの発現を向上させることにより、ＣＮＳ傷害に反応することが知られている。アストロサイトーシスまたはアストログリオーシスと称されるこの活性化は、濃線維性瘢痕への細胞外基質分子（ＥＣＭ）の沈着を引き起こし得る。かかる損傷への応答は、修復にとって有害であると考えられる。さらに、傷害に続いて、アストロサイトは、グルタミン酸受容体を活性化させることができ、興奮毒性および周囲の細胞の死をもたらす。
【０１１４】
本発明の神経系細胞には、典型的には、ＣＮＳミエリン（情報が伝達される速度および信頼性を向上させるために軸索を包む脂肪性絶縁体）の産生および維持に関与するマクログリア細胞であるオリゴデンドロサイトも含まれる。オリゴデンドロサイトは、典型的には、腹側脳室帯ならびに脊髄および脳の脳室下帯からのＣＮＳで最初に発生する。脊髄においてオリゴデンドロサイトは、典型的には、胚発生期に脳室帯から生じ、続いて白質に遊走してそこで、増殖して分化する（Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｐｒｏｇ．  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  ６７：４５１−４６７（２００２））。オリゴデンドロサイトは、それらの成熟および分化期に、典型的には、細胞形態における明確な変化および特定の分子マーカーの発現により特徴づけられる一連の発生段階を経る。個々の細胞集団に対するこれらのマーカーの特異性により、異なる段階およびそれらの分離の機会での細胞の同定が可能になる。
【０１１５】
一部の実施形態において、グリア細胞はミクログリアである。その名称が示唆するように、ミクログリアは、３種類の最小のＣＮＳグリア細胞であり、骨髄に由来する単球およびそれらが関連するマクロファージと特徴を共有する。ミクログリアは、リンパ組織の骨髄前駆細胞に由来し、その発生血管新生中にＣＮＳに到達すると考えられる。静止ミクログリアは、垂直棘様突起を保って双極細胞体を伸長している。ミクログリアは、高度に運動性細胞であり、活性化すると、食作用、抗原の提示、および炎症性サイトカインの分泌によりＣＮＳ中で免疫細胞のように働くと考えられる。アストロサイトおよびミクログリアは、抗原提示細胞として作用することもあり、この性質は、免疫応答を増幅させることもあり、かつ無制御ミエリン破壊を引き起こすこともある。
【０１１６】
発現ベクターからの薬剤の発現は、恒常的プロモーターまたは誘導可能なプロモーター、組織特異的制御エレメント、およびエンハンサー等の制御エレメントからの１つ以上のエレメントのコントロール下に置かれることもある。かかる薬剤は、制御エレメントに「作用可能に連結される」と考えられている。例えば、恒常的プロモーター、誘導可能なプロモーター、または細胞／組織特異的プロモーターは、発現ベクターに組み込まれ、宿主細胞で発現される核酸配列の発現を制御することができる。
【０１１７】
一部の実施形態において、核酸配列から発現される薬剤は、神経系細胞に特異的な１つ以上の転写制御配列に作用可能に連結され得る。典型的な転写制御配列／エレメントには、以下のタンパク質をコードする遺伝子から選択される転写制御配列／エレメントが含まれる。すなわち、ＰＤＧＦα受容体、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）（ｇｌｉａｌ  ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ａｃｉｄｉｃ  ｇｅｎｅ）、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、神経細胞特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、オリゴデンドロサイト特異的タンパク質（ＯＳＰ）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）および微小管結合タンパク質１Ｂ（ＭＡＰｌＢ）、Ｔｈｙｌ．２、ＣＣｌ、セラミドガラクトース転移酵素（ＣＧＴ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、オリゴデンドロサイト−ミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）、ＮＯＧＯ、ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）、末梢ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）、タンパク質２（Ｐ２）、チロシン水酸化酵素、ＢＳＦｌ、ドパミン３−ヒドロキシラーゼ、セロトニン２受容体、コリンアセチルトランスフェラーゼ、ガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ）、ならびにスルファチド。さらに、神経系細胞特異的プロモーターの例は、当該技術分野で公知であり、例えば米国特許出願公開第２００３／０１１０５２４号に開示されている。また、ウェブサイト＜ｃｈｉｎｏｏｋ．ｕｏｒｅｇｏｎ．ｅｄｕ／ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ．ｈｔｍｌ＞を参照。さらに、細胞／組織特異的プロモーターも当該技術分野で公知である。
【０１１８】
一部の実施形態において、転写制御エレメントは誘導可能である。例えば、誘導可能なプロモーターの非限定的な例としては、メタロチオネインプロモーターおよびマウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーターが挙げられる。本発明の組換えベクターでの使用に効果的なプロモーターおよびエンハンサーの他の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない。すなわち、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）、ＳＶ４０（シミアンウイルス４０）、ＨＳＶ（単純ヘルペスウイルス）、ＥＢＶ（エプスタイン・バーウイルス）、レトロウイルス、アデノウイルスプロモーターおよびエンハンサー、ならびに平滑筋特異的プロモーターおよびエンハンサー；主要後期プロモーター、サイトメガロウイルス最初期プロモーター、β−アクチンプロモーター、またはβ−グロビンプロモーターを含む、非相同プロモーターとしての使用に適切であり得る恒常的強力プロモーター。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩにより活性化されるプロモーターも用いられ得る。
【０１１９】
一部の実施形態において、遺伝子発現をコントロールするために用いられている誘導可能なプロモーターとしては、テトラサイクリンオペロン、ＲＵ４８６、重金属イオン誘導可能プロモーター（例えばメタロチオネインプロモーター）、ステロイドホルモン誘導可能プロモーター（例えばＭＭＴＶプロモーター）、または成長ホルモンプロモーターが挙げられる。ヘルパーウイルスにより誘導可能であるプロモーター（例えば、アデノウイルスＥｌＡタンパク質により誘導可能なアデノウイルス初期遺伝子プロモーター、またはアデノウイルス主要後期プロモーター）；ＶＰ１６もしくは１ＣＰ４等のヘルペスウイルスタンパク質により誘導可能なヘルペスウイルスプロモーター；ワクシニアもしくはポックスウイルス誘導可能プロモーター、またはポックスウイルスＲＮＡポリメラーゼにより誘導可能なプロモーター；Ｔ７ファージからの、ポックスウイルスＲＮＡポリメラーゼにより誘導可能である細菌プロモーター、またはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼからの細菌プロモーター；またはエクジソンも用いられ得る。一実施形態において、プロモーターエレメントは、低酸素誘導因子１（ＨＩＦ−１）により認識される低酸素応答エレメント（ＨＲＥ）である。ＨＩＦ−１は、低酸素ストレスの間にタンパク質安定性および内在的転写作用強度の両方で著しい増加を示す、哺乳類の主要な転写因子の１つである。ＨＲＥは、ＶＥＧＦおよびＥｐｏならびにいくつかの他の遺伝子の５’または３’の隣接領域で報告されている。コアのコンセンサス配列は、（Ａ／Ｇ）ＣＧＴ（Ｇ／Ｃ）Ｃである。ＥｐｏおよびＶＥＧＦ遺伝子から単離したＨＲＥを用いて、いくつかの遺伝子を制御している（例えば、腫瘍の死滅を増強するために低酸素腫瘍における自殺遺伝子およびアポトーシス遺伝子の発現）。
【０１２０】
さらに、特定の細胞内位置での導入遺伝子の発現が所望の場合、導入遺伝子は、当該技術分野で広く行なわれている組換えＤＮＡ技術により、対応する細胞内局在配列に作用可能に結合され得る。典型的な細胞内局在配列としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない。すなわち、（ａ）遺伝子産物の分泌を細胞の外側に方向づけるシグナル配列、（ｂ）細胞膜または細胞の他の膜区画へのタンパク質の付着を可能にする膜アンカードメイン、（ｃ）核へのコード化タンパク質の移行を媒介する核局在配列、（ｄ）コード化タンパク質を主としてＥＲにとどめる小胞体保持配列（例えばＫＤＥＬ配列）、（ｅ）タンパク質を細胞膜と結合させるためにファルネシル化されるよう設計され得るタンパク質、または（ｆ）コード化タンパク質産物の異なる細胞内分布において役割を果たす他の任意の配列。
【０１２１】
ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ法で利用されるベクターとしては、ＳＶ４０の誘導体、アデノウイルス、レトロウイルス由来ＤＮＡ配列、および機能的哺乳類ベクターと機能的プラスミドとの組み合わせに由来するシャトルベクター、およびファージＤＮＡが挙げられる。真核細胞発現ベクターは周知であり、例えば、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  １：３２７−３４１（１９８２），  Ｓｕｂｒａｍｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １：８５４−８６４（１９８１），  Ｋａｕｆｉｎａｎｎ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １５９：６０１−６２１（１９８２），  Ｓｃａｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８０：４６５４−４６５９（１９８３）、およびＵｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０（１９８０）に記載されている。これらを参考として本明細書で援用する。本発明の方法で用いるベクターは、ウイルスベクター、好ましくはレトロウイルスベクターであり得る。複製欠損性アデノウイルスが好ましい。例えば、レトロウイルスの構造遺伝子が長末端繰り返し配列に含有されるウイルス制御配列のコントロール下で、目的の単一遺伝子により置換されている「単一遺伝子ベクター」は、Ｅｇｌｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｅｎ，  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６０８−６１４（１９８８）（これを参考として本明細書で援用する）に記載されているように、用いることができる。例えば、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕ１Ｖ）、Ｈａｒｖｅｙマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭｕＭＴＶ）およびマウス骨髄増殖性肉腫ウイルス（ＭｕＭＰＳＶ）、ならびにトリレトロウイルス（例えば、細網内皮症ウイルス（Ｒｅｖ）およびＲｏｕｓ肉腫ウイルス（ＲＳＶ））がある。
【０１２２】
複数の遺伝子を導入することが可能な組換えレトロウイルスベクターも、本発明の方法により用いてもよい。個々のプロモーターの制御下でｃＤＮＡを含有する内部プロモーターを有するベクター（例えば、ヒトアデノシンデアミナーゼ（ｈＡＤＡ）のためのｃＤＮＡがそれ自体の制御配列により挿入された選択可能なマーカー（ｎｅｏＲ）を有するＮ２ベクターに由来するＳＡＸベクター）、ＳＶ４０ウイルス（ＳＶ４０）由来の初期プロモーターは、当該技術分野で公知の方法による本発明の方法により設計され、使用され得る。
【０１２３】
哺乳類宿主細胞において、いくつかのウイルスに基づく発現系が利用できる。アデノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合、目的のヌクレオチド配列（例えば、治療可能な薬剤をコードする）は、アデノウイルスの転写または翻訳コントロール複合体（例えば、後期プロモーターおよび三分節系リーダー配列）に連結することができる。このキメラ遺伝子は、次いで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ組換えによりアデノウイルスゲノムに挿入され得る。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば領域Ｅ１またはＥ３）での挿入は、生存可能であり、かつ感染した宿主で遺伝子産物を発現することが可能な組換えウイルスをもたらし得る（例えば、Ｌｏｇａｎ  ＆  Ｓｈｅｎｋ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８１：３６５５−３６５９（１９８４）を参照）。
【０１２４】
特定の開始シグナルも、挿入される治療ヌクレオチド配列の効率的な翻訳のために必要とされ得る。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が含まれる。それ自体の開始コドンおよび隣接配列を含む治療遺伝子全体またはｃＤＮＡが適切な発現ベクターに挿入される場合、追加の翻訳コントロールシグナルが必要でないこともある。しかし、治療コード配列の一部分だけが挿入される場合、ＡＴＧ開始コドンを含む、外因性翻訳コントロールシグナルをおそらく与えることもある。さらに、開始コドンは、挿入断片全体の翻訳を確実にするために、所望のコード配列のリーディングフレームと一致していてもよい。これらの外因性翻訳シコントロールグナルおよび開始コドンは、種々の起源（天然および合成の）であり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーター等の包含により向上させることができる（例えば、Ｂｉｔｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，  １５３：５１６−５４４（１９８７）を参照）。
【０１２５】
Ｖ．スクリーニングアッセイ
Ａ．細胞培養
本発明は、また、免疫調節剤、およびミエリン修復誘導剤、または軸索保護誘導剤の様々な組み合わせをスクリーニングする方法を提供し、どの組み合わせが神経障害を処置する際に有益であるかを決定する。組み合わせは、相乗治療効果をもたらし得る。
【０１２６】
一部の実施形態において、神経系細胞、特にグリア細胞、さらに特に、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ＳＣ、ＯＰＣ、またはＮＳＣは培養され、および／または遺伝子改変され、スクリーニングで用いられる。本発明の一部の実施形態において、共培養系（米国特許公開第２００７０２２５２２８号を参照）は、ミエリン化を制御し、かつ純化されたＯＰＣの分化に単純に影響する様々な因子と異なる、重大な軸索−グリア相互作用を調べるために有用であり得、およびスクリーニングアッセイで用いられることができる。急性に純化された神経細胞（例えば、網膜神経節細胞、後根神経節細胞など）は、再集合に十分な期間（通常、約１日、２日、３日、またはそれ以上の間）、非粘着性基質上で高密度で播種され得る。この期間中、神経細胞は、数十から数百の細胞の再集合体中で互いに付着する。これらの再集合体を、次いで、収集してタンパク質（例えばラミニンなど）上に播種して、カバースリップで覆う。その後、再集合体は、典型的には、軸索の高密度基底を急速に放射状に広げる。樹状突起は、典型的には、これらの再集合体からほとんど伸びない。これらの条件下において、神経細胞体および樹状突起は、空間的に制限され、高密度軸索基底の複数の領域を作製する。急性に純化されたオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）を、軸索が形成されるのに十分な期間（通常、約１週間）後に添加する。ＯＰＣを添加した後、ミエリンセグメントは、わずか７日間以内の培養物中でＭＢＰ免疫染色または電子顕微鏡検査により観察されることができる。共培養物は、ミエリン化に許容的であるが、ＭＢＰ発現ＯＬの大部分は、典型的には、多数の隣接する軸索をミエリン化することが依然としてできない。
【０１２７】
培養物は、細胞が応答する増殖因子を含有することもある。本明細書で明らかにするように増殖因子は、培養物またはインタクトな組織のいずれかにおいて、膜貫通受容体への特異的効果を介して細胞の生存、増殖、および／または分化を促進することが可能な分子である。増殖因子としては、ポリペプチドおよび非ポリペプチド因子が挙げられる。特定の培養条件を選択して、特定の目的（すなわち、前駆細胞活性の維持等）を達成する。本発明の一部の実施形態において、共培養物は、培養で神経細胞の長期にわたる生存を支持するために従来から用いられている栄養素の非存在下で増殖する。典型的に培養物は、他の因子に加えて、ＣＮＴＦ，およびフォルスコリンを含有する。本発明の培養物において、神経細胞およびオリゴデンドロサイトの間の栄養支持は、これらの外因的に添加した栄養素の除去を可能する十分な因子を提供し、従って外因性因子の干渉効果を最小限に抑える。
【０１２８】
主題の共培養細胞は、種々の方法で用いられ得る。例えば、順化培地である栄養培地は、種々の段階で分離され、成分を分析され得る。分離は、ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、ゲル電気泳動、等電点電気泳動、透析、または分子量、モル体積、電荷、それらの組み合わせにより分離を可能にする他の非分解技術等を用いて達成され得る。これらの技法のうちの１つ以上を組み合わせて、ミエリン化を促進する特異的画分をさらに富化することができる。
【０１２９】
一実施形態において、１つ以上の免疫調節剤を、かかる細胞培養物と接触させて配置し、かかる接触の前に、同時に、もしくは後に、１つ以上のミエリン修復誘導剤または軸索保護誘導剤もそれらの細胞に投与して、どの免疫調節剤およびミエリン修復誘導剤または軸索保護誘導剤が所望の効果、好ましくは相乗効果をもたらすかを決定する。例えば、免疫調節剤と、ミエリン修復誘導剤または軸索保護誘導剤との組み合わせは、単独の免疫調節剤で処置した細胞またはミエリン修復誘導剤もしくは軸索保護誘導剤で処置した細胞と比較して、再ミエリン化を促進する際により大きい効果を有する。
【０１３０】
別の実施形態において、１つ以上の免疫調節剤を、かかる細胞培養物と接触させて配置し、かかる接触の前に、同時に、もしくは後に、１つ以上のミエリン修復誘導剤もそれらの細胞に投与する。第３薬剤（例えば軸索保護促進剤）は、次いで、前述の２つの薬剤の前に、同時に、もしくは後に投与されてもよい。そして、３つの薬剤のすべての効果は、どの免疫調節剤、ミエリン修復誘導剤、および軸索保護誘導剤が所望の効果、好ましくは相乗効果をもたらすかを同定するために決定され得る。例えば、免疫調節剤と、ミエリン修復誘導剤または軸索保護誘導剤との組み合わせは、これらの薬剤を単独で用いて処置した細胞、または３つの薬剤のうちの２つを用いて処置した細胞と比較すると、再ミエリン化および軸索保護を促進する際により大きい効果を有する。
【０１３１】
さらに別の実施形態において、１つ以上の免疫調節剤を、かかる細胞培養物と接触させて配置し、かかる接触の前に、同時に、もしくは後に、１つ以上のオリゴデンドロサイト分化促進剤もそれらの細胞に投与する。オリゴデンドロサイトの増殖または遊走を促進する第３薬剤は、次いで、前述の２つの薬剤の前に、同時に、もしくは後に投与されてもよい。次いで、３つの薬剤のすべての効果は、どの免疫調節剤、オリゴデンドロサイトの増殖／遊走および分化誘導剤が所望の効果、好ましくは相乗効果をもたらすかを同定するために決定され得る。例えば、これらの薬剤の組み合わせは、これらの薬剤を単独で用いて処置した細胞、または３つの薬剤のうちの２つを用いて処置した細胞と比較すると、再ミエリン化を促進する際により大きい効果を有する。
【０１３２】
相乗効果は、前駆体細胞型からミエリン形成オリゴデンドロサイトまでの遷移を明らかにする微速度顕微鏡検査法を用いることにより培養物で観察され得る。さらに、祖先細胞は、分化細胞を検出する際の使い易い蛍光顕微鏡検査法を容易にするために、増幅緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）の膜標的化の形状をトランスフェクトされ得る。従って、種々の実施形態では、細胞は培養され、および／または遺伝子改変され、併用処置またはスクリーニングプロセスの成分であるマーカータンパク質または免疫調節剤、ミエリン修復促進剤もしくは軸索保護促進剤を、当該技術分野で公知の技法（例えば、米国特許第７，００８，６３４号、第６，９７２，１９５号、第６，９８２，１６８号、第６，９６２，９８０号、第６，９０２，８８１号、第６，８５５，５０４号、または第６，８４６，６２５号に開示される）を用いて発現することができる。
【０１３３】
一実施形態において、発現ベクターは、細胞特異的プロモーターエレメント（例えば、オリゴデンドロサイトを含むグリア細胞に特異的なＰＬＰまたはＰＤＧＦα）から発現されるマーカータンパク質（例えば蛍光マーカー）をコードすることができる。さらに、それらと同様の細胞は、免疫調節剤をコードする第２の発現ベクター（例えば、ＡＰＬをコードする発現ベクター）でトランスフェクトされることができる。あるいは、単一発現コンストラクトは、複数のポリペプチド（例えば、マーカータンパク質およびＡＰＬ）をコードすることができる。他の実施形態において、複数の免疫調節剤またはミエリン修復促進剤は、１つ以上の発現ベクター（例えば、ＡＰＬおよびＰＳ−１のｓｉＲＮＡをコードするベクター）により発現され得る。１つ以上の免疫調節剤および／またはミエリン修復促進剤ならびに１つ以上のマーカータンパク質を発現する細胞は、蛍光顕微鏡検査法（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞もしくは組織培養、またはｉｎ  ｖｉｖｏ撮像を含む）を含むがこれに限定されない、当該技術分野で公知の標準顕微鏡検査法を用いて、検出され得る。
【０１３４】
一部の実施形態において、神経系細胞は、恒常的、誘導可能、または神経系細胞特異的なプロモーターに作用可能に結合され、および免疫調節剤またはミエリン修復促進剤をコードする核酸分子でトランスフェクトされる。かかる細胞は、形質転換され、変化したレベルで１つ以上の薬剤を発現させる。さらに、かかる細胞は、免疫応答を調節し、および再ミエリン化を促進するために動物対象に投与され得る。一実施形態において、細胞は、遺伝子改変され、改変型Ｔ細胞応答をもたらす。好ましい実施形態において、改変型Ｔ細胞応答は、再ミエリン化の促進と組み合わせられる。一実施形態において、神経系細胞は、ＡＰＬを発現させるために、遺伝子改変される。所望のＡＰＬおよび／またはγ−セクレターゼ抑制物質をコードする核酸は、相同的組換え、組み込みにより、または本明細書に記載され、ならびに当業者にとってよく知られている成分および方法を用いるプラスミドまたはウイルスベクターの利用により標的細胞に形質転換され得る。
【０１３５】
神経系細胞の発現レベルがかかる細胞に投与される発現コンストラクト上でコードされる所望のポリペプチドの発現により変化され得ることは、当業者にとって明らかなはずである。あるいは、発現は、それ自体が所望のポリペプチドの発現に影響を及ぼす産物（例えば、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、アプタマー）をコードする発現コンストラクトを利用することにより調節され得る。アンチセンス分子またはｓｉＲＮＡ、アプタマーは、当業者にとって周知のプロセスを利用して選択され得る。他の薬剤（例えば、抗体、および上に記載した小分子）も、シグナリング経路（例えば、Ｎｏｔｃｈ経路、Ｔ細胞の活性化、またはエピトープ拡散）に関与するタンパク質の発現または活性を変化させることもある。これらの経路は、経路に関連する成分の発現、またはその上流調節因子もしくはリガンドの発現、またはその下流エフェクターの発現を変えることにより影響され得る。
【０１３６】
一部の実施形態において、スクリーニングアッセイは、γ−セクレターゼ抑制物質（例えば、再ミエリン化を促進する免疫調節剤）と相乗的に作用する薬剤に行なわれる。免疫調節剤は、例えば、γ−セクレターゼ抑制物質の存在下で培養系に候補薬剤を添加することによりミエリン化の抑制への効果をスクリーニングされ得る。γ−セクレターゼ抑制物質を添加することで、ＭＢＰおよびＭＯＧ染色法により検出されるミエリンセグメントの数を大きく増加させることができる。ミエリンセグメントは、急性に純化されたＯＰＣを播種してからわずか３日で観察されることができ、培養で６日までには多数のミエリン形成ＯＬが観察された。正常な副結節（ｐａｒａｎｏｄａｌ）分化および節分化も免疫染色法によりこれらの培養物で観察され得る。生物活性薬剤に関するスクリーニングアッセイでは、細胞（通常は細胞の共培養物（本明細書に記載するように））を目的の薬剤と接触させて、結果のパラメータ（例えば、ミエリン化の範囲、マーカーの発現、細胞生存率など）をモニターすることにより薬剤の効果を評価する。種々のアッセイも記述されている。例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７８：１８６６４−７０（２００３）にγ−セクレターゼ抑制物質のスクリーニング；Ｐｉｎｎｉｘ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６：４８１−４８７（２００１）にＡＰＰの推定Ｃ末端フラグメント−γの検出に基づくアッセイ；ＭｃＬｅｎｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＡＳＥＢ  Ｊ  １４：２３８３−２３８６（２０００）にγ−セクレターゼ活性に関する無細胞アッセイ）。
【０１３７】
薬剤の効果を決定するために、他の細胞パラメータが定量化され得る。パラメータは、細胞の定量化可能な成分、特に、望ましくはハイスループット系で、正確に測定可能な成分である。パラメータは、任意の細胞成分または細胞産物であり得、細胞表面決定因子、受容体、タンパク質もしくはその立体構造改変または翻訳後改変、脂質、炭水化物、有機分子または無機分子、核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ＤＮＡなど）、またはかかる細胞成分に由来する部分、またはそれらの組み合わせが含まれる。大部分のパラメータは、定量的読み取りを提供するが、場合により半定量的結果もしくは定性的結果が受け入れられる。読み取りは、単一の決定値が含まれることもあり、または平均値、中央値、もしくは分散等が含まれることもある。特徴として、パラメータ読み取り値の範囲は、多様な同じアッセイからの各パラメータに得られる。可変性が予想されることもあり、試験パラメータの各セット値の範囲は、単一値をもたらすために用いられる一般的な統計的方法による標準統計的方法を用いて得られる。
【０１３８】
スクリーニングのための目的の薬剤としては、多数の化学的分類を包含する公知および未知の化合物、有機金属分子を含み得る主に有機分子、無機分子、遺伝子の配列などが挙げられる。本発明の重要な態様は、毒性試験等を含む候補薬物を評価することである。
【０１３９】
候補薬剤としては、構造的相互作用（特に水素結合）に必要な官能基を含む有機分子が挙げられ、典型的には、少なくともアミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基、またはカルボキシル基が含まれ、これらの官能化学基から少なくとも２つが含まれることが多い。候補薬剤は、多くの場合、環式炭素構造もしくは複素環構造、および／または上記の官能基のうちの１つ以上と置換した芳香族構造もしくは多環芳香族構造を含む。候補薬剤は、ペプチド、ポリヌクレオチド、単糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造的類似体、またはそれらの組み合わせを含む生体分子でも見られる。薬理活性薬、遺伝的活性分子等も挙げられる。目的の化合物としては、化学療法剤、ホルモン、またはホルモン拮抗薬等が挙げられる。本発明に適した医薬品の例は、”Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，”  Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ，  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．，  （１９９６），  Ｎｉｎｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎに記述されているものである。また、毒素、ならびに生物および化学兵器剤（例えば、Ｓｏｍａｎｉ，  Ｓ．  Ｍ．  （Ｅｄ．），  ”Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｗａｒｆａｒｅ  Ａｇｅｎｔｓ，”  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  （１９９２）を参照）が挙げられる。
【０１４０】
候補薬剤を含む化合物は、合成化合物または天然化合物のライブラリーを含む種々の供給源から得られる。例えば、ランダム化オリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を含む生体分子を含む種々の有機化合物のランダムおよび直接合成に関して、多数の方法が利用可能である。あるいは、細菌、真菌、植物、および動物の抽出物の形で天然化合物のライブラリーが入手可能であり、あるいは容易に生成される。さらに、天然のもしくは合成的に生成されたライブラリーおよび化合物は、従来の化学的、物理的、生化学的な方法を介して容易に改変され、かつ組み合わせライブラリーを生成するために用いられ得る。構造的類似体を生成するために、公知の薬理作用のある薬剤は、直接的もしくはランダム化学改変（例えば、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化など）を受けることもある。
【０１４１】
薬剤は、少なくとも１つの細胞試料に、通常は複数の細胞試料に、通常はその薬剤が欠けている細胞と組み合わせて、薬剤を添加することにより生物活性をスクリーニングされ得る。他の実施形態において、候補薬剤は、第１薬剤で処置された細胞に添加され、単独の第１薬剤、および／または単独の候補薬剤で処置された細胞と比較される。候補薬剤は、第１薬剤の前に、第１薬剤と同時に、もしくは第１薬剤の後に細胞に添加されてもよい。例えば、細胞は、第１薬剤（例えば抗ＣＤ８０（Ｆａｂ））で処置されてもよい。抗ＣＤ８０（Ｆａｂ）で処置された細胞は、その細胞が抗ＣＤ８０（Ｆａｂ）と接触する前に、同時に、もしくは後に候補薬剤と接触される。候補薬剤は、それらの能力に基づいて選択され、または単独の抗ＣＤ８０（Ｆａｂ）もしくは単独の候補薬剤で処置された細胞と比較して、より大きい効果まで再ミエリン化を促進する。あるいは、細胞は、γ−セクレターゼ抑制物質（例えばＤＡＰＴまたはＬＹ４１１５７５）である第１薬剤で処置されてもよい。γ−セクレターゼ抑制物質と相乗的に作用する候補薬剤は、分析のためにさらに選択され得る。第３薬剤との相乗効果があるかどうかを決定するために、２つ以上の薬剤がスクリーニングされ得る。例えば、前述の実施形態において、第３薬剤はスクリーニングされ、２つの薬剤だけで処置された細胞と比較され得る。
【０１４２】
薬剤に応答してパラメータの変化は測定され、その結果は参照培養物（例えば、薬剤の存在下および非存在下で、他の薬剤により得られるなど）との比較により評価される。好ましい実施形態において、スクリーニング後に選択される薬剤は、相乗効果を与える。薬剤は、培養中の細胞の培地に、簡便に溶液中（すなわち、容易に可溶な形態で）で添加される。薬剤は、断続的もしくは連続的なストリームとしてフロースルー系で添加されてもよく、あるいは化合物のボーラスを単独でもしくは増加的に他の静的溶液に添加する。フロースルー系では、２種類の液体が使用される。１種類は生理的中性溶液であり、もう１種類は同溶液に試験化合物を加えたものある。第１の液体は、細胞を通過し、その後に第２の液体が続く。単一溶液の方法では、試験化合物のボーラスが細胞を囲む多量の培地に添加される。培地の成分の全体的な濃度は、そのボーラスの添加により著しく変化しないはずであり、すなわちフロースルー方法における２種類の溶液の間である。
【０１４３】
種々の濃度に対する応答差を得るために、複数のアッセイを、様々な薬剤濃度で平行して実行してもよい。当該技術分野で公知のように、薬剤の効果的な濃度を決定するには、典型的に、１：１０の希釈（または他のログスケールの希釈）により生ずる濃度範囲を使用する。必要に応じて、濃度を、第２の一連の希釈度を用いて、さらに絞り込むことも可能である。典型的には、これらの濃度のうちの１つを負の対照として（すなわち０濃度、または薬物の検出濃度以下、あるいは表現型で検出可能な変化をもたらさない、薬剤の濃度もしくはそれ未満で）用いる。
【０１４４】
マーカーは、候補薬剤および薬剤の組み合わせの効果を検出するために用いられるパラメータであってよい。選択したマーカーの存在を定量化するために、種々の方法が利用され得る。存在する分子の量を測定するために、簡便な方法は、分子に検出可能な成分で標識することである。それらは、蛍光性、発光性、放射性、酵素的な活性等であり得、特に高親和性でパラメータへの結合に特異的な分子でもよい。蛍光成分は、実質的に任意の生体分子、構造、または細胞型の標識で容易に利用できる。免疫蛍光成分は、特異的タンパク質だけでなく、特定の立体構造、切断産物、またはリン酸化のような部位改変に結合するよう方向づけられることができる。個々のペプチドおよびタンパク質は、例えば、それらを細胞内部で緑色蛍光タンパク質キメラとして発現させることにより自己蛍光に操作されることができる（概説に関しては、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７：４７７−８１（１９９９）を参照）。
【０１４５】
マーカーの遺伝子発現レベルの検出は、増幅アッセイでリアルタイムに実行されることができる。一態様において、増幅産物は、ＤＮＡインターカレーターおよびＤＮＡグルーブバインダーを含むがこれらに限定されず、蛍光ＤＮＡ結合剤を用いて直接的に可視化され得る。二本鎖ＤＮＡ分子に組み込まれるインターカレーターの量は、典型的には増幅ＤＮＡ産物の量と比例するため、当該技術分野の従来からの光学系用いて、インターカレートされる色素の蛍光を定量化することにより増幅産物の量を簡便に決定することができる。この応用に適したＤＮＡ結合色素としては、ＳＹＢＲグリーン、ＳＹＢＲブルー、ＤＡＰＩ、ヨウ化プロピジウム、Ｈｏｅｃｈｓｔｅ、ＳＹＢＲゴールド、臭化エチジウム、アクリジン、プロフラビン、アクリジンオレンジ、アクリフラビン、フルオルクマリン（ｆｌｕｏｒｃｏｕｍａｎｉｎ）、エリプチシン、ダウノマイシン、クロロキン、ジスタマイシンＤ、クロモマイシン、ホミジウム、ミトラマイシン、ルテニウム、ポリピリジル類、アントラマイシン等が挙げられる。
【０１４６】
別の態様において、配列特異的プローブ等の他の蛍光標識を増幅反応で用いて、増幅産物の検出および定量化を容易にすることができる。プローブに基づく定量的増幅は、所望の増幅産物の配列特異的検出に頼る。それは、特異性および感度の増大をもたらす、蛍光、標的特異的プローブ（例えばＴａｑＭａｎプローブ）を利用する。プローブに基づく定量的増幅を行なう方法は、当該技術分野で確立しており、米国特許第５，２１０，０１５号に教示されている。
【０１４７】
さらに別の態様において、マーカー遺伝子と配列相同性を共有するハイブリダイゼーションプローブを用いる従来のハイブリダイゼーションアッセイが行なわれ得る。典型的には、プローブは、ハイブリダイゼーション反応で試験被験者に由来する生体試料内に含有される標的ポリヌクレオチドを有する安定した複合体の形成を可能にする。アンチセンスがプローブ核酸として用いられる場合、試料で提供された標的ポリヌクレオチドはアンチセンス核酸の配列と相補的になるように選択されることを、当業者は認識する。反対に、ヌクレオチドプローブがセンス核酸である場合、標的ポリヌクレオチドはセンス核酸の配列と相補的になるように選択される。
【０１４８】
当業者にとって公知のように、ハイブリダイゼーションは種々のストリンジェンシーの条件下で行なわれ得る。本発明の実行に適したハイブリダイゼーション条件は、プローブと標的の間の認識相互作用が十分に特異的で、かつ十分に安定であるようにすることである。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーを増加させる条件は、当該技術分野で周知であり、公表されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９）（上掲）；  Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，  ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎを参照。ハイブリダイゼーションアッセイは、ニトロセルロース、ガラス、ケイ素、および種々の遺伝子アレイを含むがこれらに限定されない任意の固体支持体の上に固定化されたプローブを用いて形成され得る。ハイブリダイゼーションアッセイは、米国特許第５，４４５，９３４号に記載されるように高密度遺伝子チップ上で行なわれる。
【０１４９】
ハイブリダイゼーションアッセイの間に形成されるプローブ−標的複合体の簡便な検出に関しては、ヌクレオチドプローブが検出可能な標的に結合される。本発明での使用に適した検出可能な標識としては、光化学的、生化学的、分光学的、免疫化学的、電気的、光学的、または化学的な方法により検出可能な任意の組成物が挙げられる。種々の適切な検出可能な標識は、当該技術分野で公知であり、蛍光標識もしくは化学発光標識、放射性同位元素標識、酵素もしくは他のリガンドが挙げられる。種々の実施形態において、蛍光ラベルまたは酵素タグ（例えば、ジゴキシゲニン、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼもしくはペルオキシダーゼ、アビジン／ビオチン複合体）の使用を所望する可能性がある。
【０１５０】
ハイブリダイゼーション強度を検出または定量化するために用いられる検出方法は、典型的には、上で選択されたラベルに依存する。例えば、放射標識は、写真フィルムまたはホスホイメージャーを用いて検出され得る。蛍光マーカーは、放出される光を検出する光検出器を用いて検出、定量化され得る。酵素ラベルは、典型的には、酵素に基質を与えることにより検出され、かつ基質に対する酵素の作用により生成される反応産物を測定し、最終的に比色ラベルが着色ラベルを単純に可視化することにより検出される。
【０１５１】
遺伝子発現における薬剤誘導変化または薬剤誘導効果も、対応する遺伝子産物を調べることにより決定され得る。タンパク質レベルを決定することは、典型的には、（ａ）ミエリン形成細胞を含む生体試料中に含有されるタンパク質を、検出されるタンパク質に特異的に結合する薬剤と接触させることと、（ｂ）そのように形成された任意の薬剤−タンパク質複合体でも同定することとを含む。この実施形態の一態様において、ＣＤに特異的に結合する薬剤は、抗体、好ましくはモノクローナル抗体である。
【０１５２】
当然のことながら、前述の組成物および方法は、本明細書で以下に記載するスクリーニングおよび、免疫調節および／またはミエリン修復の増強をもたらすＴ細胞シグナリング（例えば、Ｔ細胞受容体またはそのリガンドを介して）を遮断するように方向づけられる、効果的な量の治療剤による処置の方法に容易に適応する。
【０１５３】
遺伝子発現における薬剤誘導変化または薬剤誘導効果も、マーカータンパク質を検出することにより決定され得る。例えば、マーカータンパク質は、細胞（例えば細胞運命のマッピング）の同定を促進するための当該技術分野で公知の免疫染色技法の標的であり得る。ミエリン形成細胞（オリゴデンドロサイトおよびシュワン細胞を含む）の非限定的なマーカータンパク質の例は、ＣＣ１、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、セラミドガラクトース転移酵素（ＣＧＴ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）、オリゴデンドロサイト−ミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）、ＮＯＧＯ、ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）、末梢ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）、タンパク質２（Ｐ２）、ガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ）、スルファチドおよびプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）からなる群から選択され得る。ＭＰＺ、ＰＭＰ２２、およびＰ２は、シュワン細胞に関するマーカーである。
【０１５４】
必要に応じて、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏまたは組織培養で、細胞遊走を追跡するために、細胞（培養中またはｉｎ  ｖｉｖｏの）を改変して、蛍光マーカータンパク質を発現させることができる。本発明で使用できるマーカー遺伝子の非排他的な例としては、サンゴ由来蛍光タンパク質（ＲＣＦＰ）、ＨｃＲｅｄ１、ＡｍＣｙａｎ１、ＡｓＲｅｄ２、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ１、クラゲ由来蛍光タンパク質（ＦＰ）変異体、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ突然変異体Ｈ９、ＧＦＰＨ９−４０、ＥＧＦＰ、テトラメチルローダミン、Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ＥＢＦＰ、ＥＣＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｋａｅｄｅ、Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、Ｍｉｄｏｒｉ  Ｃｙａｎ、Ｋｕｓａｂｉｒａ  Ｏｒａｎｇｅ、およびナフトフルオレセイン、またはそれらの強化された機能変異体が挙げられる。フルオロフォアタンパク質マーカーをコードする多数の遺伝子は、当該技術分野で公知であり、それらのマーカーは、本発明で使用することができる。ウェブサイト＜ｃｇｒ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ｔｈｏｒｎｌａｂ／ｇｆｐｓ．ｈｔｍ＞を参照。より高い強度の光を放出する、または波長シフトを示す蛍光タンパク質の変異型バージョンも、本発明の組成物および方法で利用することができる。かかる変異体は、当該技術分野で公知であり、市販されている（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，  ２００５を参照）。
【０１５５】
可視化蛍光（例えば、蛍光タンパク質をコードするマーカー遺伝子）は、動物から採取した（例えば、薄片を作製し、共焦点顕微鏡を使用してのイメージング）細胞／組織の試料を調べること、ならびに生細胞を調べること、またはｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光検出による顕微鏡検査技術により行なうことができる。可視化技術としては、共焦点顕微鏡の利用または当該技術分野で公知のフォト・オプティカルスキャニング技術が挙げられるがこれらに限定されない。一般に、近赤外線での放出波長を有する蛍光ラベルは、深部組織のイメージングをより多く受ける。なぜならば、背景ノイズを増加させる散乱および自己蛍光は、波長が増加するにつれて減少するからである。ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングの例は、当該技術分野で公知であり（例えば、Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｏｐｔ．  １０：４１２０７（２００５），  Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔ．  Ｄｉｓｐ．  ３１：１０５４−１０６４（２００３），  Ｆｌｕｓｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２：９４１−９５０（２００５），  Ｍｅｈｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  １４：６１７−６２８（２００４），  Ｊｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．９２：３１２１−３１３３（２００４）；米国特許第６，９７７，７３３号および第６，８３９，５８６号に開示される）、開示内容全体が参考として本明細書で援用される。
【０１５６】
Ｂ．動物モデル
一部の態様において、免疫調節およびミエリン修復／再ミエリン化または軸索保護に向けられる有益で治療に効果的な薬剤の組み合わせを決定するためのスクリーニングアッセイは、動物モデルを利用して行なわれる。好ましい実施形態において、動物は、小げっ歯類またはサルの種である。より好ましい実施形態において、動物は、マウス、ラット、モルモット、またはサルである。
【０１５７】
一部の実施形態において、動物はトランスジェニック動物であり、１つ以上の所望の特徴を「ノックアウト」または「ノックイン」されたものであり得る。例えば、一部の実施形態において、トランスジェニック動物は、免疫調節、ミエリン修復／再ミエリン化、または軸索保護を促進する薬剤を変化したレベル（すなわち、上昇または減少）で発現するように改変され得るか、または発現し得る。従って、かかる動物を利用して、免疫調節、ミエリン修復／再ミエリン化、または軸索保護にも向けられる複数の様々な薬剤をスクリーニングする。ここでは、本明細書中で上に記載する神経障害または関連する状態に相乗治療結果をもたらす候補の治療剤の組み合わせを同定するために、トランスジェニック動物が１つのエンドポイントに向けられる薬剤を含む場合には、その動物には異なるエンドポイント（単数または複数）に向けられる薬剤を投与される。逆も同様である。
【０１５８】
上記で述べたように、トランスジェニック動物は、２つの型、「ノックアウト」および「ノックイン」に大まかに分類されることができる。「ノックアウト」は、標的遺伝子の機能の低下をもたらす（好ましくは、標的遺伝子発現がわずかにある、または検出不可能であるように）、トランスジェニック配列の導入を介して標的遺伝子に変化を有する。「ノックイン」は、標的遺伝子の増大した発現をもたらす（例えば、標的遺伝子の付加的コピーの導入により、または標的遺伝子の内在性コピーの増強された発現をもたらす制御配列を、作用可能に挿入することにより）、宿主細胞ゲノム内の変化を有するトランスジェニック動物である。「ノックイン」または「ノックアウト」トランスジェニック動物は、標的遺伝子に関してヘテロ接合性またはホモ接合性であり得る。ノックアウトおよびノックインの両方は、「バイジェニック」であり得る。バイジェニック動物は、少なくとも２つの変化する宿主細胞を有する。好ましいバイジェニック動物は、神経細胞特異的リコンビナーゼをコードする導入遺伝子および神経細胞特異的マーカー遺伝子をコードする別のトランスジェニック配列を保有する。本発明のトランスジェニック動物は、大まかにノックインとして分類されることができる。
【０１５９】
他の実施形態において、トランスジェニックモデル系も、神経細胞の再ミエリン化を促進または再ミエリン化にとって有益である生物活性薬剤の開発のために用いられることができる。例えば、免疫調節性、ミエリン修復、または軸索保護表現型をもたらす薬剤を発現するように改変されているトランスジェニック動物を、未知の化合物をスクリーニングする方法で利用して、（１）化合物が免疫寛容を増強させ、炎症性応答を抑制し、または再ミエリン化を促進するかどうか、および／または（２）化合物が動物モデルにおいて相乗治療効果をもたらすことができるかどうかを決定することができる。さらに、神経細胞は、ｅｘ  ｖｉｖｏ技術を含み、細胞に基づいた設定もしくは細胞培養の設定で行なわれるさらなる研究またはアッセイのために、本発明のトランスジェニック動物から単離され得る。さらに、モデル系を利用して、試験薬剤が有害な影響を与えるか、または再ミエリン化を減少させる（例えば、脱ミエリン化後の傷害）かどうかをアッセイすることができる。
【０１６０】
例えば、動物は、脱ミエリン化状態の後に、免疫調節剤（例えば抗ＣＤ８０（Ｆａｂ））を投与され得る。脱ミエリン化後、動物は、免疫調節剤の投与前に、同時に、もしくは後に候補薬剤（例えば、γ−セクレターゼ抑制物質）を投与される。抗ＣＤ８０（Ｆａｂ）および候補薬剤で処置される動物は、単独の抗ＣＤ８０（Ｆａｂ）を投与される動物、および単独のγ−セクレターゼ抑制物質を投与される動物と比較される。候補薬剤は、免疫調節剤とのそれらの相乗効果に基づき選択され得る。あるいは、動物に、脱ミエリン化状態の後に、ミエリン修復誘導剤および／または軸索促進剤を投与してもよく、および免疫調節性である候補薬剤を、ミエリン修復誘導剤および／または軸索促進剤の投与の前に、同時に、もしくは後に投与する。ミエリン修復誘導剤および／または軸索促進剤と相乗効果をもたらす候補薬剤は、さらなる分析のために選択されることができる。
【０１６１】
胚顕微鏡操作技術の進歩により、現在では哺乳類の受精卵への非相同ＤＮＡの導入も可能である。例えば、全能性幹細胞または多能性幹細胞は、マイクロインジェクション、リン酸カルシウム媒介沈澱、リポソーム融合、レトロウイルス感染、または他の方法による形質転換が可能である。形質転換した細胞は、次いで、胚に導入され、その胚は、次いで、トランスジェニック動物に発達する。好ましい実施形態において、発生する胚を、所望の導入遺伝子を含有するウイルスベクターに感染させ、その結果導入遺伝子を発現するトランスジェニック動物が感染した胚から産生され得る。別の好ましい実施形態において、所望の導入遺伝子は、胚（好ましくは、単一細胞段階で）の前核または細胞質に同時注入され、次いで、胚は成熟トランスジェニック動物に発達することが可能にされる。トランスジェニック動物を生成するこれらおよび様々な異なる方法は、当該技術分野で確立しており、従って本明細書に詳述しない。例えば、米国特許第５，１７５，３８５号および第５，１７５，３８４号を参照。
【０１６２】
従って、一部の実施形態において、本発明は、相乗的な併用処置を検出し、定量化するために動物モデルを使用する方法を提供する。一実施形態において、方法は、（ａ）免疫寛容−誘導剤を発現する、本発明のトランスジェニック動物において脱ミエリン化傷害を誘導するステップ、（ｂ）候補薬剤を投与し、次いで、起こるのであれば、ミエリン修復が起こる時間を考慮にいれるステップ、（ｃ）細胞特異的マーカー遺伝子の発現を検出し、および／または定量化するステップ、（ｄ）再ミエリン化が起こっているかどうか、およびその程度、ならびにかかる再ミエリン化が対照と比較して増強されているかを決定するステップを含む。かかる例において、対照は、疾患モデルが誘導される野生型、または候補薬剤が投与されないトランスジェニックであり得る。
【０１６３】
試験動物において脱ミエリン化を誘導するための多数の方法が確立されている。例えば、神経細胞脱ミエリン化は、病原体もしくは物理的損傷、試験動物において炎症および／または自己免疫応答を誘導する薬剤により与えられ得る。ＥＡＥモデルは、ヒト自己免疫疾患のために十分に研究された動物モデルである。実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、げっ歯類が特異的ミエリン成分に免疫される、多発性硬化症のためのマウスモデルである。例えば、Ｐｏｐｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．  １４：１９−３５（１９９７）；  Ｐｏｐｋｏ  ａｎｄ  Ｂａｅｒｗａｌｄ，  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．  Ｒｅｓ．  ２４：３３１−３３８（１９９９）；  Ｓｔｅｉｎｍａｎ，  Ｍｕｌｔ．  Ｓｃｌｅｒ．  ７：２７５−２７６（２００１）を参照。ＥＡＥは、動物（通常はマウスだが、ラット、ウサギ、およびサルでもよい）において、特定のＭＳ様症状（例えば、脱力、麻痺、および失禁）により免疫応答を誘発するために神経系の細胞および組織をそれらの動物に注射することにより誘導され得る。ＥＡＥは、典型的には、自己免疫ＣＤ４＋Ｔ細胞により仲介される。これらの細胞は、末梢リンパ器官で発生し、次いでＣＮＳへ移動し、自己免疫応答を引き起こす。Ｔ細胞の発生は、種々のサイトカイン、ならびに細胞接着分子の発現により大部分はコントロールされる。モデルの起源は、狂犬病ワクチンの開発まで遡る。脳筋症は、狂犬病ワクチンを投与されたヒトのうちでわずかな割合で引き起こされた。その後の研究で、ウサギを含む種々の動物においてこの麻痺性疾患を誘発することに成功した。わずかな注射で、炎症性反応ならびに脱ミエリン化を引き起こす方法が開発された。
【０１６４】
さらに、疾病状態を誘発する方法は、ＩＦＮ−γおよびクプリゾン（ビス−シクロヘキサノンオキサルジヒドラゾン）を含むがこれらに限定されない脱ミエリン化誘導剤を使用できる。クプリゾン誘導型脱ミエリン化モデルは、Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｒａｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ．  １１：１０７−１１６（２００１）に記載されている。この方法では、試験動物には、典型的には、クプリゾンを含有する飼料を、数週間（約１〜約１０週間の範囲で）与える。
【０１６５】
適切な方法による脱ミエリン化状態の誘導後に、動物は、前の脱ミエリン化病変でまたはその近くで再ミエリン化を可能にするまで十分な期間の間回復させておいてもよい。再ミエリン化軸索を発達させるのに必要な期間は、様々な動物の間で異なるが、通常、少なくとも約１週間必要であり、少なくとも約２〜１０週間必要なこともさらに多く、約４〜１０週間必要なことさえもある。再ミエリン化は、神経系（例えば、中枢もしくは末梢の神経系）においてミエリン化軸索の増加が観察されることにより、またはミエリン形成細胞のマーカータンパク質のレベルの上昇が検出されることにより確認できる。脱ミエリン化を検出するのと同じ方法を使用して、再ミエリン化が生じているかどうかを決定することができる。
【０１６６】
動物に、脱ミエリン化の前に、同時に、もしくは後に薬剤を投与してもよい。例えば、動物に、自己免疫応答を抑制する免疫調節剤を投与してもよく、次いでγ−セクレターゼ  抑制物質と共に免疫調節剤を投与された動物と比較され得る。この場合、抑制物質は、免疫調節剤の前に、同時に、もしくは後に投与される。薬剤の種々の量、薬剤の異なる数、ならびに薬剤の投与間の時間および脱ミエリン化の前、同時、または後のタイミングは、可変性であり、再ミエリン化を促進するための複数薬剤の相乗的組み合わせを決定するために行われ得る。
【０１６７】
ＶＩ．治療
Ａ．投与量
処置される患者および状態ならびに投与経路に応じて、ペプチド／ポリペプチドは、通常、１日あたり０．０１ｍｇ〜５００ｍｇＶ／体重ｋｇ（例えば、平均的な人には約２０ｍｇ／１日）の投与量で投与される。一般に、様々な哺乳類に対する治療効果の有効性は、用量により大きく異なるため、その範囲は広く、典型的には、ラットにおけるよりも人間において２０倍、３０倍、または４０倍（単位体重あたり）も小さい。同様に、投与方法は、投与量に大きい影響を及ぼすことがある。従って、例えば、ラットでの経口投与量は、注入用量の１０倍であり得る。典型的な投与量は、１日あたり１回の注入であり得る。一部の実施形態において、１種類の薬剤または組み合わせ薬剤の投与量は、０．０１〜５ｍｇ、１〜１０ｍｇ、５〜２０ｍｇ、１０〜５０ｍｇ、２０〜１００ｍｇ、５０〜１５０ｍｇ、１００〜２５０ｍｇ、１５０〜３００ｍｇ、２５０〜５００ｍｇ、３００〜６００ｍｇ、５００〜１０００ｍｇ  Ｖ／体重ｋｇであり得る。一部の実施形態において、投与量は、例えば抗ＣＤ８０（Ｆａｂ）で２０〜２０００μｇ／用量であり得る。
【０１６８】
当業者は、用量レベルが特定の化合物、症状の重症度、および副作用に対する被験者の感受性に応じて変化することもあることを容易に認識する。特異的なペプチドのなかには、他のペプチドよりもより強力なものがある。所定の複合体に対する好ましい投与量は、当業者が種々の方法により容易に決定可能である。好ましい方法は、所定の化合物の生理的効力を測定することである。
【０１６９】
好ましい実施形態において、免疫調節剤は、同時投与されるミエリン修復剤または軸索再生剤と関連して治癒力があると決定される投与量で同時投与される。一部の実施形態において、本発明の１つ以上の組み合わせ方法の範囲内で、免疫制御成分は、抗体、ＡＰＬもしくはペプチド結合型寛容性抗原を含むがこれらに限定されないペプチドまたはポリペプチドを含み、１日あたり０．０１ｍｇ〜５００ｍｇ  Ｖ／体重ｋｇの投与量で投与される。好ましい実施形態において、患者は５ｍｇを投与される。一部の実施形態において、かかる薬剤は、同じ投与量もしくは可変投与量で、３〜５日間、４〜６日間、５〜７日間、または６〜１０日間連続して投与される。一部の実施形態において、投与は複数の周期で繰り返され、各周期は、３〜５日間、４〜７日間、６〜９日間、７〜１０日間、８〜１２日間、９〜１６日間、または１０〜２１日間の薬剤投与を含む。
【０１７０】
一部の実施形態において、免疫調節をもたらす抗体は、患者の年齢、体重、身長、性別、一般的病状、および既往歴等の因子に応じた投与量で投与される。典型的には、抗体成分、免疫結合物、もしくは融合タンパク質の投与量をレシピエントに投与することが望ましい。その投与量は、状況に応じて、より低いもしくはより高い投与量も投与されることもあるが、約１ｐｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ（薬剤の量／患者の体重）の範囲である。患者への抗体（または本明細書に記述する生理活性薬剤のいずれも）の投与は、局所カテーテルを介する灌流による、または直接的な病巣内注射による静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、胸膜内、くも膜下腔内の投与であり得る。注射により治療用タンパク質を投与するとき、その方法は、連続注入または単回ボーラスもしくは複数回ボーラスによることもある。静脈内注射は、抗体を急速に分配する際の徹底的な循環の故に有用な投与方法を提供する。
【０１７１】
他の実施形態において、製剤中の治療的に活性な抗体もしくは抗体フラグメント（例えばＦａｂ部分またはＦｃ部分）の濃度は、約０．１から１００までの重量％で異なることもある。好ましい実施形態において、抗体または抗体フラグメントの濃度は、０．００３〜１．０モルの範囲である。患者を処置するために、抗体または抗体フラグメントの治療に効果的な用量が投与され得る。本明細書で「治療に効果的な用量」とは、それが投与されるための効果（例えば、Ｔ細胞またはＢ細胞の同時刺激を遮断する）をもたらす用量を意味する。正確な用量は処置の目的に依存し、かつ公知の技法を用いて当業者により確かめることができる。投与量は、０．０１〜１００ｍｇ／体重ｋｇもしくはそれよりも多く（例えば、０．１、１、１０、または５０ｍｇ／体重ｋｇ）で変動することがあり、１〜１０ｍｇ／ｋｇが好ましい。当該技術分野で公知のように、抗体もしくはＦｃ融合分解、全身送達対局在化送達、および新規プロテアーゼ合成の比率、ならびに年齢、体重、全体的な健康、性別、食事、投与時間、薬物相互作用および状態の重症度に対する調整が必要なこともあり、当業者は通例の実験法を用いて確かめることができる。
【０１７２】
抗体もしくは抗体フラグメントを含む医薬組成物の投与（好ましくは、無菌水溶液の形態で）は、種々の経路で行われることが可能であり、経口的に、皮下に、静脈内に、鼻腔内に、経耳的に（ｉｎｔｒａｏｔｉｃａｌｌｙ）、経皮的に、局所的に（例えば、ゲル、軟膏、ローション、クリームなど）、腹腔内に、筋肉内に、肺内に（例えば、ＡＥＲｘ（登録商標）Ａｒａｄｉｇｍから市販されている吸入型技術、またはＩｎｈａｎｃｅＴＭ  Ｉｎｈａｌｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓから市販されている肺送達系）、経膣的に、非経口的に、直腸内に、または眼球内に投与されることが挙げられるがこれらに限定されない。場合により、例えば、創傷、炎症などの処置のために、抗体もしくはＦｃ融合は、溶液もしくはスプレーとして直接的に適用されることもある。当該技術分野で公知のように、医薬組成物は、従って、導入方法に応じて製剤化され得る。
【０１７３】
好ましい実施形態において、抗体は、低タンパク質用量（例えば、用量あたり２０ｍｇ〜２ｇのタンパク質）で、単回でもしくは繰り返して、非経口的に投与される。あるいは、抗体は、用量あたり２０〜１０００ｍｇのタンパク質、用量あたり２０〜５００ｍｇのタンパク質、または用量あたり２０〜１００ｍｇのタンパク質の用量で投与される。一部の実施形態において、かかる薬剤は、３〜５日間、４〜７日間、６〜９日間、７〜１０日間、８〜１２日間、９〜１６日間、または１０〜２１日間の範囲で投与される。一部の実施形態において、投与は、複数の周期で繰り返され、各周期は、３〜５日間、４〜７日間、６〜９日間、７〜１０日間、８〜１２日間、９〜１６日間、または１０〜２１日間の薬剤投与を含む。
【０１７４】
抗体（単独またはリポソームと抱合して）は、公知の方法により製剤化され、医薬的に有用な組成物に調製されることができ、それにより治療用タンパク質は、薬学的に許容される担体との混合物として混合される。その投与がレシピエント患者により許容され得る場合、組成物は、「薬学的に許容される担体」であると言われる。無菌リン酸緩衝食塩水は、薬学的に許容される担体の一例である。他の適切な担体は、当業者にとって周知である。例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，  １９ｔｈ  Ｅｄ．  （１９９５）を参照。
【０１７５】
治療の目的で、抗体は、薬学的に許容される担体中で、治療に効果的な量で患者に投与される。この点において、「治療に効果的な量」は、生理的に有意であるものである。その存在がレシピエント患者の生理機能に検出可能な変化をもたらす場合、薬剤は生理的に有意である。本発明と関連して、その存在が免疫細胞の活性化、増殖、または分化を遮断する結果をもたらす場合、薬剤は生理的に有意である。好ましい実施形態において、免疫細胞はＴ細胞またはＢ細胞である。
【０１７６】
追加の製剤方法を用いて、治療応用において抗体の作用の持続時間をコントロールすることも可能である。コントロール放出剤は、抗体を複合または吸着するポリマーを用いることにより調製され得る。例えば、生体適合性のポリマーとしては、ポリ（エチレン−コ−酢酸ビニル）のマトリックス、ステアリン酸二量体およびセバシン酸のポリ酸無水物コポリマーのマトリックスが挙げられる。Ｓｈｅｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１４４６（１９９２）。かかるマトリックスからの抗体の放出速度は、タンパク質の分子量、マトリックス内の抗体の量、および分散される粒子の大きさに依存する。Ｓａｌｔｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｊ．  ５５：１６３（１９８９）；  Ｓｈｅｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，上掲。他の固形剤型は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，  １９ｔｈ  ｅｄ．  （１９９５）に記述されている。
【０１７７】
Ｂ．医薬組成物
１つの薬剤または複数の薬剤が本発明のペプチド、ポリペプチド、アプタマー、ｓｉＲＮＡもしくはアンチセンス、抗体、抗体フラグメント、または小分子を含み、次いで１つ以上の治療的活性薬剤が製剤化される、医薬組成物が予期される。かかる薬剤の製剤は、任意の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｏｓｏｌ，  Ａ．  Ｅｄ  ，１９８０）とともに所望の程度の純度を有するかかる薬剤を混合することにより、凍結乾燥製剤または水溶液の形で保存のために調製される。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、投与量および使用される濃度でレシピエントにとって無毒であり、緩衝剤（例えばリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、および他の有機酸）、抗酸化物質（アスコルビン酸およびメチオニンを含む）、防腐剤（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ヘキサメトニウムクロリド、ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド、フェノール、ブチルアルコールもしくはベンジルアルコール、アルキルパラベン（例えばメチルパラベンンもしくはプロピルパラベン）、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、およびｍ−クレゾール）、低分子量（約１０残基未満）ポリプチド、タンパク質（例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン）、親水性ポリマー（例えばポリビニルピロリドン）、アミノ酸（例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン）、単糖類、二糖類、および他の炭水化物（グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む）、キレート化剤（例えばＥＤＴＡ）、糖質（例えばショ糖、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトール）、甘味料および他の香味料、賦形剤（例えば微結晶性セルロース、ラクトース、トウモロコシ、および他のデンプン）、結合剤、添加物、着色剤、塩形成対イオン（例えばナトリウム）、金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質複合体）、および／または非イオン性界面活性剤（例えばＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭ、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））が挙げられる。
【０１７８】
好ましい実施形態において、本発明の生理活性薬剤を含む医薬組成物は、薬学的に許容される塩類として存在するなどの水溶性型である。これは、酸付加塩および塩基付加塩の両方が含まれることを意味する。「薬学的に許容される酸付加塩」とは、遊離塩基の生物学的効果を保持する塩類、および無機酸（例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸など）および有機酸（例えば酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸など）と生物学的に形成されてない塩類、さもなければ望ましくなく塩類をいう。「薬学的に許容される塩基付加塩類」には、無機塩基（例えばナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウムの塩類など）に由来する塩類が挙げられる。特に好ましいものは、アンモニウム、カリウム、ナトリウム、カルシウム、およびマグネシウムの塩類である。薬学的に許容される無毒性有機塩基に由来する塩類としては、一級アミン、二級アミン、および三級アミン、自然発生的な置換アミンを含む置換アミン、環状アミンおよび塩基イオン交換樹脂（例えばイソプロビルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、およびエタノールアミン）の塩類が挙げられる。ｉｎ  ｖｉｖｏ投与で用いられる製剤は、好ましくは無菌である。これは、無菌濾過膜を介する濾過により、または当該技術分野で公知の他の方法により容易に達成される。
【０１７９】
本明細書に開示する生理活性薬剤も、免疫リポソームとして製剤化され得る。リポソームは、種々の種類の脂質、リン脂質、および／または哺乳類への治療薬剤の送達に有用である界面活性物質を含む小さいベジクルである。生理活性薬剤を含有するリポソームは、当該技術分野で公知の方法（例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８２：３６８８−３６９２（１９８５）；  Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７７：４０３０−４０３４（１９９０）；米国特許第４，４８５，０４５号、第４，５４４，５４５号、およびＰＣＴ国際公開第ＷＯ  ９７／３８７３１号に記載）により調製される。向上した循環時間を有するリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。リポソームの成分は、通常、二重層形成で配置され、生体膜の脂質配置に類似している。特に、有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ−誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いる逆相エバポレーション（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｈａｓｅ  ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）により生成されることができる。所望の径を有するリポソームを得るには、リポソームが規定されたポアサイズのフィルターを通って押し出される。化学療法剤または他の治療的活性薬剤は、場合により、リポソーム内に含有される（Ｇａｂｉｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  ８１：１４８４−１４８８（１９８９）。
【０１８０】
主題の薬剤も、コントロール放出製剤を得るために、製剤化され得る。
【実施例】
【０１８１】
（実施例１）スクリーニングアッセイ
細胞培養アッセイでγ−セクレターゼ抑制物質ＬＹ４１１５７５を投与し、Ｔ細胞増殖には何ら効果が観察されなかったが、ＣＤ４＋Ｔ細胞の炎症性サブセットＴｈ１のＴ細胞分化の量が減少したことを示した。ＬＹ４１１５７５をＥＡＥ動物に注射すると、ＥＡＥの重症度は低下した。
【０１８２】
候補薬剤を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＬＹ４１１５７５を用いてスクリーニングし、候補薬剤または単独のＬＹ４１１５７５と比較したとき、ミエリン化を促進する相乗効果をもたらす薬剤を同定した。相乗効果をもたらす薬剤を、対照細胞と比較して増加したオリゴデンドロサイトの増殖、遊走、または分化により同定する。
【０１８３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで同定した薬剤を、動物モデルで用いる。再発性ＥＡＥ（Ｒ−ＥＡＥ）、慢性ＥＡＥ（Ｃ−ＥＡＥ）、またはＴＭＥＶ−ＩＤＤを適切なマウス株で誘発させる。急性疾患の発症後に、マウスを、臨床疾患スコアにより、同等に４つの群に分ける。すなわち、（１）対照薬剤を投与するマウス群、（２）ｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングで同定した薬剤を投与するマウス群、（３）ＬＹ４１１５７５を投与するマウス群、または（４）ｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングで同定した薬剤とＬＹ４１１５７５との併用群。３〜５日、４〜６日、５〜７日、６〜８日、７〜９日、８〜１０日、９〜１２日、１０〜１４日、または１２〜１６日の間のどこかで、腹腔内注射の処置を施す。種々の処置群のマウスを、免疫応答およびＣＮＳ組織像の両方で分析する。
【０１８４】
（実施例２）免疫アッセイ
臨床疾患スコアを毎日記録し、臨床疾患の進行に対する効果および再発率を決定する。プライミングで用いた特異的ペプチドで想起させた後、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を分析する。遅延型過敏症（ＤＴＨ）の実験を行い、ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗原特異的ＣＤ４  Ｔｈ１の活性化および遊走を決定する。増殖アッセイおよびＥＬＩＳＰＯＴＳ等のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの想起実験を行い、Ｔ細胞を産生するサイトカインの数を測定する。Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ＬｉｑｕｉＣｈｉｐ分析を行い、サイトカイン産生の量を測定する。脾臓およびリンパ節を、処置マウスおよび非処置マウスから単離し、ミエリンペプチドでの再誘発時の免疫応答を分析する。
【０１８５】
組み合わせ処置群では、低い臨床スコアが予想され得る。臨床疾患の寛解は、低いＴｈ１サイトカイン発現（すなわち、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２）および高いＴｈ２発現（すなわち、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＴＦＧ−β）をもたらすこともある。また、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）および免疫組織化学を行う。ＣＮＳに浸潤するＣＤ４＋Ｔ細胞、マクロファージ、および樹状細胞の数を分析し、ＣＮＳ組織についてのＡｇｉｌｅｎｔ遺伝子チップアレイ分析を行い、種々の処置群を比較する。予備データは、ＦＡＣＳおよび免疫組織化学によるＣＮＳ中のＴ細胞の数および発現が低いことを示し、組み合わせ処置群では樹状細胞（ＤＣ）およびマクロファージ（Ｍφ）の浸潤が減少したことを示す。
【０１８６】
（実施例３）神経生物学的実験
ＰＬＰ染色法を、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ１１ｂ＋マクロファージに対する染色法と組み合わせて、種々の処置の後にミエリンおよび浸潤の範囲を同定する。さらに、ＣＮＰａｓｅおよびＣＣ１（オリゴデンドロサイト系統細胞のマーカー）を免疫組織化学分析で用いて、処置マウスと対照マウスとの間のオリゴデンドロサイト数の相違を検出する。成功したミエリン修復の唯１つの成分であるオリゴデンドロサイト分化に加えて、トルイジンブルーおよび／またはルクソールファーストブルーの染色方法を用いて、脳および脊髄の固定部分における再ミエリン化の範囲を検出する。（トルイジンブルーまたはルクソールファーストブルーにより評価されたように）組み合わせ処置が再ミエリン化を増強する場合、増加するミエリン遺伝子発現との相互関係を、リアルタイムＰＣＲおよびマイクロアレイ解析により決定する。
【０１８７】
（実施例４）抗ＣＤ８０およびＤＡＰＴによる組み合わせ治療
脱ミエリン形成傷害を、マウスモデルにおいてＰＬＰ１３９−１５１による免疫化により誘導させた。疾患の急性期のピーク（免疫化から１５〜１６日後）で、マウスを、以下を投与される４つの処置群に分けた。すなわち、（１）５０μｇの対照抗体で１日５回の腹腔内処置、（２）５０μｇの抗ＣＤ８０（Ｆａｂ）で１日５回の腹腔内処置、（３）１００μｇのＤＡＰＴで１日５回の腹腔内処置、または（４）抗ＣＤ８０（Ｆａｂ）およびＤＡＰＴの両方を組み合わせて１日５回の腹腔内処置。その結果は、単独の抗ＣＤ８０（Ｆａｂ）または単独のＤＡＰＴのいずれかでの処置と比較すると、有意な相乗治療効果（共に保護的である）があり、抗ＣＤ８０（Ｆａｂ）およびＤＡＰＴの両方を組み合わせて処置されたマウスにおいて、臨床的麻痺の進行に回復効果を向上させることを示す（図３Ｂ）。処置したマウスからのＣＮＳ浸潤細胞の数についてのフローサイトメトリー分析は、組み合わせ処置群において、組み合わせ治療がＴ細胞、骨髄系樹状細胞（ｍＤＣ）、リンパ様／形質細胞様樹状細胞（ｌ／ｐ  ＤＣ）、およびマクロファージ（Ｍφ）の実質的に減少した数をもたらしたことを示す（図３Ｃ）。
【０１８８】
抗ＣＤ８０（Ｆａｂ）およびＤＡＰＴの同時投与は、本明細書に記載する組み合わせ方法で利用され得る種々の生理活性薬剤の一実施形態を表す。さらに、Ｒ−ＥＡＥモデルは、Ｃ−ＥＡＥおよびＴＭＥＶ−ＩＤＤを含み、利用され得る多数の適切なモデルの１つである。
【０１８９】
（実施例５）ペプチド結合細胞寛容およびＬＹ４１１５７５の組み合わせ治療
Ｒ−ＥＡＥマウスに、プライミングペプチドに結合した脾細胞（疾患の発症を遮断するため）、拡散エピトープ（特定の再発を遮断するため）、またはミエリンペプチドの組み合わせを静脈内に注射する。脾細胞を、エチレンカルボジイミド（ＥＣＤＩ）方法によりペプチドに結合する。マウスに、ペプチドをパルスしたミエリン、ＥＣＤＩ固定脾細胞の注射の前に、間に、もしくは後のいずれかにＬＹ４１１，５７５も投与し、ＬＹ４１１，５７５を投与しないマウス、およびＬＹ４１１，５７５を投与したがペプチドをパルスしたミエリン、ＥＣＤＩ固定脾細胞を注射しないマウスを比較して、再ミエリン化の範囲および進行中のＥＡＥ症状を決定する。
【０１９０】
（実施例６）抗ＣＤ８０およびｒＨＩｇＭ２２の組み合わせ治療
脱ミエリン形成傷害を、マウスモデルにおいてＰＬＰ１３９−１５１による免疫化により誘発する。疾患の急性期のピーク（免疫化から１５〜１６日後）で、マウスを、以下を投与される４つの処置群に分けた。すなわち、（１）対照抗体で１日５回の腹腔内処置、（２）抗ＣＤ８０（Ｆａｂ）で１日５回の腹腔内処置、（３）ｒＨＩｇＭ２２で１日５回の腹腔内処置、または（４）抗ＣＤ８０（Ｆａｂ）およびｒＨＩｇＭ２２の両方で１日５回の腹腔内処置。単独の抗ＣＤ８０（Ｆａｂ）または単独のｒＨＩｇＭ２２のいずれかでの処置と比較して、抗ＣＤ８０（Ｆａｂ）およびｒＨＩｇＭ２２の両方で処置したマウスにおいて、臨床麻痺の進行に対する保護効果および回復効果を決定する。処置したマウスからのＣＮＳ浸潤細胞の数についてフローサイトメトリー分析を行い、異なる群において、Ｔ細胞、骨髄系樹状細胞（ｍＤＣ）、リンパ様／形質細胞様樹状細胞（ｌ／ｐ  ＤＣ）、およびマクロファージ（Ｍφ）の数を決定する。抗ＣＤ８０（Ｆａｂ）およびｒＨＩｇＭ２２の同時投与は、Ｔ細胞、骨髄系樹状細胞（ｍＤＣ）、リンパ様／形質細胞様樹状細胞（ｌ／ｐ  ＤＣ）、およびマクロファージ（Ｍφ）の数を減少させ、臨床麻痺の進行に保護効果および回復効果を促進する相乗治療効果を有する可能性がある。
【０１９１】
本発明の好ましい実施形態を本明細書に示し、記載しているが、かかる実施形態が例示だけの目的で提供されていることは、当業者にとって明らかである。数多くのバリエーション、変更、および置換が本発明から逸脱することなく、現在、当業者に存在する。当然のことながら、本発明を実行する際に、本明細書に記載する本発明の実施形態に種々の選択肢が利用される可能性がある。本明細書の特許請求の範囲は、本発明の範囲を明確にし、これらの特許請求の範囲内の方法および構造ならびにそれらの同等物は、それらにより網羅されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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