(57)【要約】本発明は免疫グロブリンを精製するための方法を報告し、ここで、該方法は、単量体型の免疫グロブリンが陽イオン交換物質に結合しない条件下で単量体型及び凝集型の免疫グロブリンを含む水性緩衝化溶液を陽イオン交換物質に適用すること、及び陽イオン交換物質との接触後に溶液から単量体型の免疫グロブリンを回収することを含む。
2010528076.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単量体型及び凝集型の免疫グロブリンを含む溶液から単量体型の免疫グロブリンを得るための方法であって、該方法が以下の工程：
ａ）単量体型の免疫グロブリンが陽イオン交換物質に結合しない条件下で単量体型及び凝集型の免疫グロブリンを含む水性緩衝化溶液を陽イオン交換物質に適用すること、及び陽イオン交換物質との接触後に溶液から単量体型の免疫グロブリンを回収すること
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
工程ａ）が、単量体型の免疫グロブリンが陽イオン交換物質に結合しない条件下で単量体型及び凝集型の免疫グロブリンを含む水性緩衝化溶液を陽イオン交換物質に適用すること、及び陽イオン交換物質との接触後に溶液から単量体型の該免疫グロブリンを回収することを含むフロースルー様式で操作されるクロマトグラフィー工程であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
方法が工程ａ）の前に以下の工程：
ｂ）免疫グロブリンが陰イオン交換物質に結合しない条件下で単量体型及び凝集型の免疫グロブリンを含む水性緩衝化溶液を陰イオン交換物質に適用すること、及び陰イオン交換物質との接触後に溶液から単量体型及び凝集型の免疫グロブリンを回収すること
を含むことを特徴とする請求項１又は２のいずれか一項記載の方法。
【請求項４】
工程ｂ）が、免疫グロブリンが陰イオン交換物質に結合しない条件下で単量体型及び凝集型の免疫グロブリンを含む水性緩衝化溶液を陰イオン交換物質に適用すること、及び陰イオン交換物質との接触後に溶液から単量体型及び凝集型の免疫グロブリンを回収することを含むフロースルー様式で操作されるクロマトグラフィー工程であることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
方法が工程ａ）の後に以下の工程：
ｃ）免疫グロブリンが陰イオン交換物質に結合しない条件下で単量体型の免疫グロブリンを含む水性緩衝化溶液を陰イオン交換物質に適用すること、及び陰イオン交換物質との接触後に溶液から単量体型の免疫グロブリンを回収すること
を含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
工程ｃ）が、免疫グロブリンが陰イオン交換物質に結合しない条件下で単量体型の免疫グロブリンを含む水性緩衝化溶液を陰イオン交換物質に適用すること、及び陰イオン交換物質との接触後に溶液から単量体型の免疫グロブリンを回収することを含むフロースルー様式で操作されるクロマトグラフィー工程であることを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項７】
方法が工程ａ）の前又は工程ｂ）の前のいずれかに以下のさらなる工程：
ｄ）免疫グロブリンがアフィニティーカラムに結合する条件下で単量体型及び凝集型の免疫グロブリンを含む水性緩衝化溶液をアフィニティーカラムに適用すること、及びアフィニティーカラムから単量体型及び凝集型の免疫グロブリンを回収すること
を含むことを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
工程ｄ）が、免疫グロブリンがアフィニティーカラムに結合する条件下で単量体型及び凝集型の免疫グロブリンを含む水性緩衝化溶液をアフィニティーカラムに適用すること、及びアフィニティーカラムから単量体型及び凝集型の免疫グロブリンを回収することを含む結合及び溶出の様式で操作されるクロマトグラフィー工程であることを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項９】
工程ａ）において陽イオン交換物質が膜陽イオン交換物質であることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
膜陽イオン交換物質がＭｕｓｔａｎｇ（商標）Ｓ、Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｃ、又はＳａｒｔｏｂｉｎｄ（商標）Ｓ、又はＳａｒｔｏｂｉｎｄ（商標）Ｃであることを特徴とする、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
膜陽イオン交換物質がスルホン酸基又はカルボキシメチル基で修飾されたポリエーテルスルホンベースの膜又は再生セルロースベースの膜であることを特徴とする、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
工程ａ）の水性緩衝化溶液がｐＨ５〜ｐＨ８のｐＨ値を有することを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
工程ａ）の水性緩衝化溶液が１．０〜１５．０mS/cmの伝導率を有することを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
工程ａ）の水性緩衝化溶液が４．０〜１０．０mS/cmの伝導率を有することを特徴とする、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
フロースルーからの単量体型の免疫グロブリンの回収が、沈殿、塩析、限外ろ過、ダイアフィルトレーション、凍結乾燥、アフィニティークロマトグラフィー、又は濃縮溶液を得るための溶媒容積低下より選択される方法によることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
回収が、限外ろ過、凍結乾燥、又は溶媒容積低下によることを特徴とする、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
膜陽イオン交換物質のフロースルーから得られる免疫グロブリンの内、免疫グロブリンの少なくとも９５％が単量体型であることを特徴とする、請求項１〜１６のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
単量体型の免疫グロブリンの少なくとも９０％が陽イオン交換物質に結合しないことを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
水性緩衝化溶液がリン酸もしくはその塩、クエン酸もしくはその塩、又はヒスチジンもしくはその塩を含む溶液であることを特徴とする、請求項１〜１８のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
水性緩衝化溶液が塩化ナトリウム又は塩化カリウムを含むことを特徴とする、請求項１〜１９のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
クロマトグラフィー工程がカラムクロマトグラフィー又はカセットクロマトグラフィーであることを特徴とする、請求項１〜２０のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
工程ａ）における水性緩衝化溶液のｐＨ値及びmS/cmでの伝導率の合計が９〜１８の範囲にあることを特徴とする、請求項１〜２１のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
前記合計が１０〜１５の範囲にあることを特徴とする、請求項２２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はポリペプチド精製の分野にある。不純物から、特に凝集型の免疫グロブリンから、溶液中の免疫グロブリンを分離することにより単量体型の免疫グロブリンを提供するための方法を報告する。
【０００２】
発明の背景
タンパク質及び特に免疫グロブリンは今日の医学ポートフォリオにおいて重要な役割を果たしている。ヒトでの適用のために、全ての治療用タンパク質は別個の基準を満たさなければならない。ヒトへの生物製剤の安全性を確実にするために、重篤な危害を引き起こす核酸、ウイルス、及び宿主細胞タンパク質を特に除去しなければならない。これらの規制上の規格を満たすために、１つ又はそれ以上の精製工程が製造プロセスの後に続かなければならない。とりわけ、純度、処理量、及び収率が、適切な精製プロセスを決定する際に重要な役割を果たす。
【０００３】
微生物タンパク質を用いるアフィニティークロマトグラフィー（例えば、プロテインＡ又はプロテインＧアフィニティークロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、陽イオン交換（スルホプロピル又はカルボキシメチル樹脂））、陰イオン交換（アミノエチル樹脂）及び混合様式（mixed-mode）イオン交換）、チオフィリック（thiophilic）吸着（例えば、β−メルカプトエタノール及び他のＳＨリガンドを用いる）、疎水性相互作用又は芳香族吸着クロマトグラフィー（例えば、フェニル−セファロース、アザ−アレノフィリック（aza-arenophilic）樹脂、又はｍ−アミノフェニルボロン酸を用いる）、金属キレートアフィニティークロマトグラフィー（例えば、Ｎｉ（ＩＩ）−及びＣｕ（ＩＩ）−アフィニティ物質を用いる）、分子ふるいクロマトグラフィー、及び電気泳動法（ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動など）などの様々な方法が十分に確立されており、そしてタンパク質精製のために広範に使用されている（Vijayalakshmi, M. A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102）。
【０００４】
Necina, R. et al.（Biotechnol. Bioeng. 60 (1998) 689-698）は、高電荷密度を示すイオン交換媒体による細胞培養上清からの直接的なヒトモノクローナル抗体の捕捉を報告した。国際公開第８９／０５１５７号において、細胞培養培地を陽イオン交換処理に直接供することによる産物である免疫グロブリンの精製のための方法が報告されている。マウス腹腔からのモノクローナルＩｇＧ抗体の一工程精製が、Danielsson, A., et al., J. Immun. Meth. 115 (1988), 79-88により記載されている。
【０００５】
Mhatre, R., et al.（J. Chrom. A 707 (1995) 225-230）は、陽イオン交換クロマトグラフィー及びｐＨ勾配溶出による抗体Ｆａｂフラグメントの精製を探索した。
【０００６】
国際公開第９４／００５６１号には、ヒトモノクローナル抗アカゲザル抗体及びそれを産生する細胞株が報告されている。１つ又はそれ以上の混入物質から目的のポリペプチドを分離するために勾配洗浄が使用される、イオン交換クロマトグラフィーによるポリペプチドの精製のための方法が、国際公開第２００４／０２４８６６号において報告されている。Schwarz, A. et al.（Laborpraxis 21 (1997) 62-66）は、ＣＭ−ＨｙｐｅｒＤカラムを用いるモノクローナル抗体の精製を報告している。
【０００７】
国際公開第２００４／０７６４８５号には、プロテインＡ及びイオン交換クロマトグラフィーによる抗体精製のためのプロセスが報告されている。欧州特許出願公開第０  ５３０  ４４７号において、３つのクロマトグラフィー工程の組み合わせによりＩｇＧモノクローナル抗体を精製するためのプロセスが報告されている。抗体調製物からのプロテインＡの除去が、米国特許第４，９８３，７２２号において報告されている。
【０００８】
組換えモノクローナル抗体のプロセスはしばしば、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて、ＤＮＡ、宿主細胞タンパク質、及びウイルスなどの微量レベルの不純物及び潜在的な混入物質を結合し、抗体をフロースルーさせる（Knudsen, H. L., et al., J. Chrom. A907 (2001) 145-154）。
【０００９】
国際公開第９５／１１６０３７号には、プロテインＡ陽イオン交換クロマトグラフィーによって実施されるハブリッドハイブリドーマからの抗ＥＧＦ−Ｒ／抗ＣＤ３二重特異性モノクローナル抗体の精製が報告されている。イオン交換クロマトグラフィーの使用による抗体単量体のその多量体からの分離が、欧州特許出願公開第１  ０８４  １３６号において報告されている。米国特許第５，４２９，７４６号は、疎水性相互作用クロマトグラフィー組み合わせクロマトグラフィーの抗体分子タンパク質の精製への適用に関する。
【００１０】
荷電微粒子が混入した液体、特に非経口又は生物学的液体のろ過のために使用する陰イオン修飾ミクロ細孔膜が、米国特許第４，６０４，２０８号において報告されている。国際公開第０３／０４０１６６号には、タンパク質含有流動体中の微量不純物を除去するために設計された膜及びデバイスが報告されている。
【００１１】
ポリペプチドを回収するための方法が、米国特許第６，７１６，５９８号において報告されている。米国特許出願公開第２００６／０１９４９５３号において、漏出したプロテインＡを、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製された抗体から選択的に除去するための方法が報告されている。
【００１２】
発明の概要
本発明は、免疫グロブリン精製の分野における複数の局面を含む。一局面は、以下の工程：単量体型の免疫グロブリンが陽イオン交換物質に結合しない条件下で単量体型及び凝集型の免疫グロブリンを含む水性緩衝化溶液を陽イオン交換物質に適用すること、及び陽イオン交換物質との接触後に溶液から単量体型の免疫グロブリンを回収することを含む免疫グロブリンを精製するための方法である。一実施態様において、前記工程はフロースルー様式で操作されるクロマトグラフィー工程である。
【００１３】
一実施態様において、本発明の方法は、以下のさらなる工程：陽イオン交換工程の前又は後のいずれかで、免疫グロブリンが陰イオン交換物質に結合しない条件下で単量体型及び／又は凝集型の免疫グロブリンを含む水性緩衝化溶液を陰イオン交換物質に適用すること、及び陰イオン交換物質のフロースルーから免疫グロブリンを回収することを含む。一実施態様において、前記工程はフロースルー様式で操作されるクロマトグラフィー工程である。
【００１４】
別の実施態様において、本発明の方法は、陽イオン交換工程の前又は陰イオン交換工程の前のいずれかで、以下のさらなる工程：免疫グロブリンがアフィニティーカラムに結合する条件下で単量体型及び凝集型の免疫グロブリンを含む水性緩衝化溶液をアフィニティーカラムに適用すること、及びアフィニティーカラムから単量体型及び凝集型の免疫グロブリンを回収することを含む。一実施態様において、前記工程は結合及び溶出の様式（bind-and-elute mode）で操作されるクロマトグラフィー工程である。
【００１５】
本発明の方法のさらなる実施態様において、方法は、陽イオン交換工程として、以下の工程：単量体型の免疫グロブリンが膜陽イオン交換物質に結合しない条件下で単量体型及び凝集型の免疫グロブリンを含む水性緩衝化溶液を膜陽イオン交換物質に適用すること、及び膜陽イオン交換物質のフロースルーから単量体型の免疫グロブリンを回収することを含む。一実施態様において、前記陽イオン交換物質は膜陽イオン交換物質である。別の実施態様において、膜陽イオン交換物質はＭｕｓｔａｎｇ（商標）Ｓ、Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｃ、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（商標）Ｓ、又はＳａｒｔｏｂｉｎｄ（商標）Ｃである。さらなる別の実施態様において、膜陽イオン交換物質は、スルホン酸基又はカルボキシメチル基で修飾されたポリエーテルスルホンベースの膜又は再生セルロースベースの膜である。一実施態様において、溶液はｐＨ４〜ｐＨ８、好ましくはｐＨ５〜ｐＨ８のｐＨ値を有する。さらなる別の実施態様において、溶液は、１mS/cm〜１５mS/cm、好ましくは４．０mS/cm〜１０．０mS/cmの伝導率を有する。
【００１６】
別の実施態様は、フロースルーからの単量体型の免疫グロブリンの回収が、沈殿、塩析、限外ろ過、ダイアフィルトレーション、凍結乾燥、アフィニティークロマトグラフィー、又は濃縮溶液を得るための溶媒容積低下（solvent volume reduction）より選択される方法によることを含む。好ましくは、前記回収は、限外ろ過、凍結乾燥、又は溶媒容積低下による。
【００１７】
別の実施態様において、前記免疫グロブリンは膜陽イオン交換物質のフロースルーから得られ、そして免疫グロブリンの少なくとも９５％は単量体型である。さらなる別の実施態様において、単量体型の免疫グロブリンの少なくとも９０％は陽イオン交換物質に結合しない。一実施態様は、水性緩衝化溶液がリン酸もしくはその塩、クエン酸もしくはその塩、又はヒスチジンもしくはその塩を含む溶液であることである。別の実施態様において、水性緩衝化溶液は塩化ナトリウム又は塩化カリウムを含む。そして、さらなる別の実施態様において、クロマトグラフィー工程はカラムクロマトグラフィー又はカセットクロマトグラフィーである。
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明は、以下の工程：単量体型の免疫グロブリンが陽イオン交換物質に結合しない条件下で単量体型及び凝集型の免疫グロブリンを含む水性緩衝化溶液を陽イオン交換物質に適用すること、及び陽イオン交換物質との接触後、即ちその除去後に溶液又は上清から単量体型の免疫グロブリンを回収することを含む免疫グロブリンを精製するための方法を含む。
【００１９】
本出願内で使用する「イオン交換物質」という用語又はその文法的等価物は、共有結合した荷電置換基を保有する不動性高分子量マトリクスを示す。全体的な電荷中性のために、共有結合していない対イオンはイオン相互作用により荷電置換基に結合している。「イオン交換物質」は、その共有結合していない対イオンを、同様に荷電した結合パートナー又は周囲の溶液のイオンと交換する能力を有する。その交換可能な対イオンの電荷に応じて、「イオン交換物質」は「陽イオン交換物質」又は「陰イオン交換物質」といわれる。荷電基（置換基）の性質に応じて、「イオン交換物質」は、例えば陽イオン交換物質の場合、スルホン酸もしくはスルホプロピル樹脂（Ｓ）、又はカルボキシメチル樹脂（ＣＭ）といわれる。荷電基／置換基の化学的性質に応じて、「イオン交換物質」を、さらに、共有結合した荷電置換基の強度に応じて、強又は弱イオン交換物質として分類することができる。例えば、強陽イオン交換物質は、荷電置換基として、スルホン酸基、好ましくはスルホプロピル基を有し、弱陽イオン交換物質は、荷電置換基として、カルボン酸基、好ましくはカルボキシメチル基を有する。強陰イオン交換物質は、第四級アンモニウム基を有し、そして弱陰イオン交換物質は、荷電置換基として、ジエチルアミノエチル基を有する。
【００２０】
本出願内で使用する「膜」という用語は、ミクロ細孔膜又はマクロ細孔膜の両方を示す。膜自体は、ポリマー物質、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、エチレン酢酸ビニルコポリマー、ポリテトラフルオロエチレン、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル、ポリアミド（ナイロン、例えば、Ｚｅｔａｐｏｒｅ（商標）、Ｎ６６  Ｐｏｓｉｄｙｎｅ（商標））、ポリエステル、酢酸セルロース、再生セルロース、セルロース複合体、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアリールスルホン、ポリフェニルスルホン、ポリアクリロニトリル、フッ化ポリビニリデン、不織布及び織布（例えば、Ｔｙｖｅｋ（登録商標））、繊維性物質、又は、無機物質、例えば、ゼオライト、ＳｉＯ２、ＡｌＯ３、ＴｉＯ２、もしくはヒドロキシアパタイトから構成される。一実施態様において、膜はポリエーテルスルホン膜又は再生セルロース膜である。
【００２１】
イオン交換樹脂は、様々な名称で、多数の企業から入手可能である：例えば、陽イオン交換樹脂Ｂｉｏ−Ｒｅｘ（登録商標）（例えば、タイプ７０）、Ｃｈｅｌｅｘ（登録商標）（例えば、タイプ１００）、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（登録商標）（例えば、タイプＣＭ、Ｈｉｇｈ  Ｓ、２５  Ｓ）、ＡＧ（登録商標）（例えば、タイプ５０Ｗ、ＭＰ）（全てBioRad Laboratoriesから入手可能）、ＷＣＸ  ２（Ciphergenから入手可能）、Ｄｏｗｅｘ（登録商標）ＭＡＣ−３（Dow chemical companyから入手可能）、Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｃ及びＭｕｓｔａｎｇ  Ｓ（Pall Corporationから入手可能）、Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ＣＭ（例えば、タイプ２３、５２）、ｈｙｐｅｒ−Ｄ、ｐａｒｔｉｓｐｈｅｒｅ（Whatman plc.から入手可能）、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＩＲＣ（例えば、タイプ７６、７４７、７４８）、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＧＴ  ７３、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）（例えば、タイプＳＰ、ＣＭ、６５０Ｍ）（全てTosoh Bioscience GmbHから入手可能）、ＣＭ  １５００及びＣＭ  ３０００（BioChrom Labsから入手可能）、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）、ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）（GE Healthcareから入手可能）、Ｐｏｒｏｓ樹脂（PerSeptive Biosystemsから入手可能）、Ａｓａｈｉｐａｋ  ＥＳ（例えば、タイプ５０２Ｃ）、ＣＸｐａｋ  Ｐ、ＩＥＣ  ＣＭ（例えば、タイプ８２５、２８２５、５０２５、ＬＧ）、ＩＥＣ  ＳＰ（例えば、タイプ４２０Ｎ、８２５）、ＩＥＣ  ＱＡ（例えば、タイプＬＧ、８２５）（Shoko America Inc.から入手可能）、５０Ｗ陽イオン交換樹脂（Eichrom Technologies Inc.から入手可能）、及び、例えば、陰イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ（登録商標）１（Dow chemical companyから入手可能）、ＡＧ（登録商標）（例えば、タイプ１、２、４）、Ｂｉｏ−Ｒｅｘ（登録商標）５、ＤＥＡＥ  Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  １、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（登録商標）ＤＥＡＥ（全てBioRad Laboratoriesから入手可能）、陰イオン交換樹脂タイプ１（Eichrom Technologies Inc.から入手可能）、Ｓｏｕｒｃｅ  Ｑ、ＡＮＸ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（例えば、タイプＣＬ−６Ｂ、ＦＦ）、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｃａｐｔｏ  Ｑ、Ｃａｐｔｏ  Ｓ（全てGE Healthcareから入手可能）、ＡＸ−３００（PerkinElmerから入手可能）、Ａｓａｈｉｐａｋ  ＥＳ−５０２Ｃ、ＡＸｐａｋ  ＷＡ（例えば、タイプ６２４、Ｇ）、ＩＥＣ  ＤＥＡＥ（全てShoko America Inc.から入手可能）、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＩＲＡ−９６、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）ＤＥＡＥ、ＴＳＫｇｅｌ  ＤＥＡＥ（全てTosoh Bioscience GmbHから入手可能）、Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑ（Pall Corporationから入手可能）。膜イオン交換物質において、結合部位はフロースルー孔壁で見出され得、そして拡散孔内に隠されておらず、拡散よりも対流を介した物質移動を可能にする。膜イオン交換物質は、以下のように様々な名称でいくつの企業から入手可能である：例えば、Sartorius（膜陽イオン交換物質：Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（商標）ＣＭ、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（商標）Ｓ、膜陰イオン交換物質：Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（商標）Ｑ）、又はPall Corporation（膜陽イオン交換物質：Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｓ、Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｃ、膜陰イオン交換物質：Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ）、又はPall BioPharmaceuticals。一実施態様において、膜陽イオン交換物質は、  Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（商標）ＣＭ、又はＳａｒｔｏｂｉｎｄ（商標）Ｓ、又はＭｕｓｔａｎｇ（商標）Ｓ、又はＭｕｓｔａｎｇ（商標）Ｃである。別の実施態様において、膜陽イオン交換物質は、スルホン酸基又はカルボキシメチル基で修飾されたポリエーテルスルホンベースの膜又は再生セルロースベースの膜である。さらなる別の実施態様において、陰イオン交換物質は、Ｑタイプ（第四級アンモニウム基タイプ）膜陰イオン交換物質又はＱ陰イオン交換カラムである。
【００２２】
「ポリペプチド」は、天然に産生されるにせよ合成で産生されるにせよ、ペプチド結合により連結されたアミノ酸残基のポリマーである。約２０アミノ酸残基未満のポリペプチドを「ペプチド」という。
【００２３】
「タンパク質」は、１つ又はそれ以上のポリペプチド鎖あるいは１００アミノ酸残基超のポリペプチド鎖を含む高分子である。タンパク質は、炭水化物基などの非ペプチド性成分も含みうる。炭水化物基及び他の非ペプチド性置換基は、タンパク質が産生される細胞によりタンパク質へ付加され得、そして細胞の型により変動する。タンパク質を、それらのアミノ酸骨格構造の観点から本明細書において定義する；炭水化物基などの置換基は一般的に特定ないが、それにもかかわらず存在しうる。
【００２４】
本出願内で互換的に使用されうる「免疫グロブリン」という用語及びその文法的等価物は、少なくとも２つの軽ポリペプチド鎖及び２つの重ポリペプチド鎖を含む。重及び軽ポリペプチド鎖の各々は可変領域（一般的に、ポリペプチド鎖のアミノ末端部分）を含み、それは抗原との相互作用のための結合ドメインを含む。重及び軽ポリペプチド鎖の各々は、また、定常領域（一般的に、ポリペプチド鎖のカルボキシル末端部分）を含み、それは免疫系の種々の細胞、いくつかの食細胞、及び古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織又は因子への抗体の結合を媒介しうる。典型的には、軽及び重ポリペプチド鎖は、各々が、可変領域、即ちＶＬ又はＶＨ、及び定常領域、即ち、軽ポリペプチド鎖の場合はＣＬ、又は重ポリペプチド鎖の場合はＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、及び場合によりＣＨ４から本質的になる鎖である。
【００２５】
本明細書において使用する「免疫グロブリン」という用語は、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる１つ又はそれ以上のポリペプチドからなるタンパク質を指す。認識されている免疫グロブリン遺伝子には、様々な定常領域遺伝子ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。免疫グロブリンは、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、及びＦ（ａｂ）２ならびに単鎖を含む種々の形態で存在しうる（例えば、Huston, J.S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988) 5879-5883; Bird, R. E., et al., Science 242 (1988) 423-426；及び、一般的に、Hood et al., Immunology, Benjamin N.Y., 2nd edition (1984)；及びHunkapiller, T., and Hood, L., Nature 323 (1986) 15-16）。一実施態様において、本発明の免疫グロブリンは、モノクローナル抗体及びそのフラグメント、例えば、単離された重鎖もしくは軽鎖、又はさらなるペプチドもしくはポリペプチドに融合された重鎖もしくは軽鎖、ならびにそのフラグメントを含む。
【００２６】
「単量体型の免疫グロブリン」という用語及びその文法的等価物は、第２の免疫グロブリン分子と結合していない免疫グロブリン分子を示す（即ち、免疫グロブリン分子は第２の免疫グロブリン分子へ共有結合も非共有結合もしていない）。「凝集型の免疫グロブリン」という用語及びその文法的等価物は、少なくとも１つのさらなる免疫グロブリン分子と共有又は非共有のいずれかで結合している免疫グロブリン分子を示す。凝集型の免疫グロブリンは、分子ふるいクロマトグラフィーカラムから単一ピークとして溶出される。本出願内で使用する「単量体型の」という用語及びその文法的等価物は、免疫グロブリン分子の１００％が単量体型で存在することを必ずしも示さない。それは、さらに、免疫グロブリンの内、免疫グロブリンの少なくとも９０％が単量体型である、免疫グロブリンの少なくとも９５％が単量体型である、免疫グロブリンの少なくとも９８％が単量体型である、免疫グロブリンの少なくとも９９％が単量体型である、又は免疫グロブリンの９９％超が単量体型であることを示す。「単量体型及び凝集型の」という用語は、他の免疫グロブリン分子と結合していない免疫グロブリン分子及び他の免疫グロブリン分子と結合している免疫グロブリン分子の混合物を示す。この混合物において、単量体型も凝集型も排他的には存在しない。
【００２７】
本出願内で使用する「１００％」という用語は、特定成分以外の成分の量が、特定条件下での言及される分析方法の検出限界未満であることを示す。
【００２８】
本出願内で使用する「９０％」、「９５％」、「９８％」、「９９％」という用語は、厳密な値を示すのではなく、特定条件下での言及される分析方法の精度内の値を示す。
【００２９】
一般的なクロマトグラフィー法及びそれらの使用は、当業者に公知である。例えば、Chromatography, 5th edition, Part A: Fundamentals and Techniques, Heftmann, E. (ed.), Elsevier Science Publishing Company, New York, (1992); Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Deyl, Z. (ed.), Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands, (1998); Chromatography Today, Poole, C. F., and Poole, S. K., Elsevier Science Publishing Company, New York, (1991); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (1982); Sambrook, J., et al. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; 又はCurrent Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M., et al. (eds), John Wiley & Sons, Inc., New Yorkを参照のこと。
【００３０】
組換え産生された免疫グロブリンの精製のために、しばしば様々なカラムクロマトグラフィー工程の組み合わせが用いられる。一般的に、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーに、１つ又は２つのさらなる分離工程が続く。最終精製工程は、凝集免疫グロブリン、残留ＨＣＰ（宿主細胞タンパク質）、ＤＮＡ（宿主細胞核酸）、ウイルス、又はエンドトキシンなどの微量不純物及び混入物質の除去のための、いわゆる「ポリッシング工程（polishing step）」である。このポリッシング工程のために、しばしばフロースルー様式の陰イオン交換物質が使用される。
【００３１】
本発明内で使用する「フロースルー様式」という用語及びその文法的等価物は、精製しようとする目的の物質（例えば、単量体型の免疫グロブリン）を含む溶液を、固定相（好ましくは固相）と接触させ、ここで目的の物質はその固定相に結合しない、精製方法（例えば、クロマトグラフィー法）の操作様式を示す。その結果、目的の物質が、フルースルー（精製方法がクロマトグラフィー法である場合）又は上清（精製方法がバッチ法である場合）のいずれかにおいて得られる。これもまた溶液中に存在していた目的ではない物質（例えば、凝集型の免疫グロブリン）は、固定相に結合し、そしてその方法において溶液から除去される。これは、目的ではない物質の１００％が溶液から除去されることを必ずしも示さず、目的ではない物質の本質的に１００％が除去される、即ち、目的ではない物質の少なくとも５０％が溶液から除去される、目的ではない物質の少なくとも７５％が溶液から除去される、目的ではない物質の少なくとも９０％が溶液から除去される、又は、目的ではない物質の９５％超が溶液から除去される。
【００３２】
本出願内で使用する「に適用する」という用語及びその文法的等価物は、精製しようとする目的の物質を含む溶液を固定相と接触させる、精製方法の部分的工程を示す。これは、ａ）溶液を、固定相が配置されているクロマトグラフィーデバイスに添加すること、又は、ｂ）固定相を溶液に添加することを示す。ａ）の場合、精製しようとする目的の物質を含む溶液を固定相に通し、溶液中の物質と固定相との間の相互作用を可能にする。例えば、ｐＨ、伝導率、塩濃度、温度、及び／又は流速などの条件に応じて、溶液のいくつかの物質は固定相へ結合し、従って溶液から除去される。他の物質は溶液中に残存する。溶液中に残存する物質を、フロースルー中に見出すことができる。「フロースルー」は、クロマトグラフィーデバイスの通過後に得られる溶液を示す。好ましくは、クロマトグラフィーデバイスはカラム、又はカセットである。一実施態様において、クロマトグラフィー工程はカラムクロマトグラフィー、即ち、カラム中の固相を使用するクロマトグラフィー工程であるか、又はカセットクロマトグラフィー、即ち、カセット中の固相を使用するクロマトグラフィー工程である。好ましい実施態様において、カセットクロマトグラフィーはカセット中の膜を用いる。固定相に結合していない目的の物質を、一実施態様において、例えば、沈殿、塩析、限外ろ過、ダイアフィルトレーション、凍結乾燥、アフィニティークロマトグラフィー、又は濃縮溶液を得るための溶媒容積低下などの当業者によく知られる方法によってフロースルーから回収することができる。好ましい実施態様において、単量体型の免疫グロブリンは、凍結乾燥、限外ろ過、又は溶媒容積低下によってフロースルーから回収される。ｂ）の場合、固定相を、例えば粉末として、精製しようとする目的の物質を含む溶液に添加し、溶液中の物質と固定相との間の相互作用を可能にする。相互作用後、固定相を例えばろ過により除去し、そして固定相に結合していない目的の物質を上清中に得る。
【００３３】
本出願内で使用する「に結合しない」という用語及びその文法的等価物は、目的の物質（例えば、免疫グロブリン）が、固定相（例えばイオン交換物質）と接触させられたときに溶液中に残存することを示す。これは、目的の物質の１００％が溶液中に残存することを必ずしも示さず、目的の物質の本質的に１００％が溶液中に残存する、即ち、目的の物質の少なくとも５０％が溶液中に残存し、そして固定相に結合しない、目的の物質の少なくとも６５％が溶液中に残存し、そして固定相に結合しない、目的の物質の少なくとも８０％が溶液中に残存し、そして固定相に結合しない、目的の物質の少なくとも９０％が溶液中に残存し、そして固定相に結合しない、又は、目的の物質の９５％超が溶液中に残存し、そして固定相に結合しない。
【００３４】
本出願内で使用する「緩衝化」という用語は、酸性又は塩基性物質の添加又は遊離に起因するｐＨの変化が緩衝物質によってならされる溶液を示す。緩衝物質を含む溶液は「緩衝化溶液」である。そのような効果を生じる任意の緩衝物質を使用することができる。一実施態様において、薬学的に許容されうる緩衝物質、例えば、リン酸及びその塩、クエン酸及びその塩、モルホリン、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸及びその塩、ヒスチジン及びその塩、グリシン及びその塩、又はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）及びその塩を使用する。好ましい実施態様において、緩衝物質は、リン酸及び／又はその塩、クエン酸及び／又はその塩、又はヒスチジン及び／又はその塩である。場合により、緩衝化溶液は、さらなる塩、例えば、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、クエン酸ナトリウム、又はクエン酸カリウムなどを含みうる。一実施態様において、緩衝化溶液は塩化ナトリウム又は塩化カリウムを含む。
【００３５】
本発明において使用する「結合及び溶出の様式」という用語は、精製しようとする目的の物質を含む溶液を固定相、好ましくは固相と接触させ、それにより目的の物質が固定相に結合する、精製方法の操作様式を示す。その結果、目的の物質は固定相上に保持され、一方、目的ではない物質はフロースルー又は上清と共に除去される。目的の物質はその後、場合により洗浄工程後に、第２工程において固定相から溶出され、それにより固定相から溶出溶液と共に回収される。
【００３６】
凝集型の免疫グロブリンからの単量体型の免疫グロブリンの分離のために、一般的に、結合及び溶出の様式で操作される陽イオン交換物質を用いるクロマトグラフィー法を使用する。例えば、国際公開第２００６／１２５５９９号を参照のこと。ここで驚くべきことに、フロースルー様式で操作された陽イオン交換物質を、単量体型及び凝集型の免疫グロブリンを含む溶液からの凝集型の免疫グロブリンの除去のために使用できることが見出された。免疫グロブリンを精製するためのこの方法を用いて、凝集型の免疫グロブリンを、迅速で簡単な方法で、単量体型及び凝集型の両方の免疫グロブリンの混合物を含む溶液から除去することが可能である。
【００３７】
従って、本発明は、免疫グロブリンを精製するための方法を報告し、ここで、方法は以下の工程：
ａ）単量体型の免疫グロブリンが陽イオン交換物質に結合しない条件下で単量体型及び凝集型の免疫グロブリンを含む水性緩衝化溶液を陽イオン交換物質に適用すること、及び陽イオン交換物質との接触後に溶液から単量体型の免疫グロブリンを回収すること
を含む。
【００３８】
より詳細には、本発明は、単量体型及び凝集型の免疫グロブリンを含む溶液から単量体型の免疫グロブリンを得るための方法を含み、ここで方法は、以下の工程：単量体型の免疫グロブリンが陽イオン交換物質に結合しない条件下で単量体型及び凝集型の免疫グロブリンを含む水性緩衝化溶液を陽イオン交換物質に適用すること、及び陽イオン交換物質との接触後に溶液から単量体型の免疫グロブリンを回収することを含む。一実施態様において、前記工程はフロースルー様式で操作されるクロマトグラフィー工程である。別の実施態様において、前記陽イオン交換物質は膜陽イオン交換物質である。
【００３９】
本出願内で使用する「単量体型の免疫グロブリンが陽イオン交換物質に結合しない条件」という用語及びその文法的等価物は、単量体型の免疫グロブリンが、陽イオン交換物質と接触させられたときに、溶液中に残存することを示す。これは、単量体型の免疫グロブリンの１００％が溶液中に残存することを必ずしも示さず、単量体型の免疫グロブリンの本質的に１００％が溶液中に残存し、そして陽イオン交換物質に結合しない、即ち、単量体型の免疫グロブリンの少なくとも５０％が溶液中に残存し、そして陽イオン交換物質に結合しない、単量体型の免疫グロブリンの少なくとも６５％が溶液中に残存し、そして陽イオン交換物質に結合しない、単量体型の免疫グロブリンの少なくとも８０％が溶液中に残存し、そして陽イオン交換物質に結合しない、単量体型の免疫グロブリンの少なくとも９０％が溶液中に残存し、そして陽イオン交換物質に結合しない、又は、単量体型の免疫グロブリンの９５％超が溶液中に残存し、そして陽イオン交換物質に結合しない。そのような条件は、例えば、一実施態様において、ｐＨ５〜ｐＨ８の水性緩衝化溶液のｐＨ値、及び／又は、別の実施態様において、１．０mS/cm〜１５mS/cm、好ましくは４．０mS/cm〜１０．０mS/cmの水性緩衝化溶液の伝導率である。
【００４０】
本発明の一実施態様において、免疫グロブリンを精製するための方法は、以下の工程：単量体型の免疫グロブリンが膜陽イオン交換物質に結合しない条件下で単量体型及び凝集型の免疫グロブリンを含む水性緩衝化溶液を膜陽イオン交換物質に適用すること、及び膜陽イオン交換物質のフロースルーから単量体型の免疫グロブリンを回収することを含む。
【００４１】
この実施態様において、精製方法はフロースルー様式で操作されるクロマトグラフィー法であり、それによって免疫グロブリンの迅速な精製が可能になる。なぜなら、所望の単量体型の免疫グロブリンをカラムのフロースルーから容易に得ることができ、カラムの洗浄、結合物質の溶出、又は溶出した免疫グロブリン溶液の脱塩などのさらなる工程が不要になるからである。
【００４２】
本発明の方法を、単一工程方法として、又は、例えば、一実施態様において陰イオン交換クロマトグラフィー工程、もしくは別の実施態様においてアフィニティークロマトグラフィー工程などの他の工程と組み合わせて用いることができる。
【００４３】
従って、本発明の一実施態様は、免疫グロブリンを精製するための方法であり、ここで、方法は以下の逐次的な工程：
ｂ）免疫グロブリンが陰イオン交換物質に結合しない条件下で単量体型及び凝集型の免疫グロブリンを含む水性緩衝化溶液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに適用すること、及び水性緩衝化溶液として陰イオン交換カラムのフロースルーから単量体型及び凝集型の免疫グロブリンを回収すること、及び
ａ）単量体型の免疫グロブリンが陽イオン交換物質に結合しない条件下で単量体型及び凝集型の免疫グロブリンを含む工程ｂ）において得られた水性緩衝化溶液を陽イオン交換物質に適用すること、及び陽イオン交換物質との接触後に溶液から単量体型の免疫グロブリンを回収すること
を含む。
【００４４】
一実施態様において、工程ｂ）はフロースルー様式で操作されるクロマトグラフィー法である。別の実施態様において、工程ａ）はフロースルー様式で操作されるクロマトグラフィー法である。別の実施態様において、工程ａ）における前記陽イオン交換物質は膜陽イオン交換物質である。工程ｂ）のための条件は、当業者に公知である。工程ｂ）を用いて、免疫グロブリンを含む溶液中の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、プロテインＡ、エンドトキシン、及び／又はウイルスの量を低下させることが可能である。２つのイオン交換工程の順序を逆にすることも可能である。精製方法の１つの工程（又は後の工程）への溶液の適用前に、例えば、溶液のｐＨ値又は伝導率などのパラメーターを調節しなければならない。一実施態様において、工程ａ）において適用される水性溶液のｐＨ値は、ｐＨ４〜ｐＨ８、好ましくはｐＨ５〜ｐＨ８である。他の実施態様において、水性溶液の伝導率は、４．０mS/cm〜１０．０mS/cmである。
【００４５】
さらに、本発明は、一実施態様において、免疫グロブリンを精製するための方法を含み、ここで、方法は以下の逐次的な工程：
ａ）単量体型の免疫グロブリンが陽イオン交換物質に結合しない条件下で単量体型及び凝集型の免疫グロブリンを含む水性緩衝化溶液を陽イオン交換物質に適用すること、及び陽イオン交換物質との接触後に溶液から単量体型の免疫グロブリンを回収すること、及び
ｃ）免疫グロブリンが陰イオン交換物質に結合しない条件下で単量体型の免疫グロブリンを含む工程ａ）の水性緩衝化溶液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに適用すること、及び陰イオン交換クロマトグラフィーカラムのフロースルーから単量体型の免疫グロブリンを回収すること
を含む。
【００４６】
一実施態様において、工程ｃ）はフロースルー様式で操作されるクロマトグラフィー法である。別の実施態様において、工程ａ）はフロースルー様式で操作されるクロマトグラフィー法である。別の実施態様において、工程ａ）における前記陽イオン交換物質は膜陽イオン交換物質である。例えば、アフィニティークロマトグラフィーを用いる主要な精製工程において宿主細胞タンパク質及び培養副産物の大部分を除去することが助けになりうる。
【００４７】
本発明の一実施態様は、以下の工程：
ｄ）免疫グロブリンがアフィニティーカラムに結合する条件下で単量体型及び凝集型の免疫グロブリンを含む水性緩衝化溶液をアフィニティーカラムに適用すること、及び水性緩衝化溶液としてアフィニティーカラムから単量体型及び凝集型の免疫グロブリンを回収すること、及び
ｂ）場合により、免疫グロブリンが陰イオン交換物質に結合しない条件下で単量体型及び凝集型の免疫グロブリンを含む工程ｄ）において得られた水性緩衝化溶液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに適用すること、及び水性緩衝化溶液として陰イオン交換カラムのフロースルーから単量体型及び凝集型の免疫グロブリンを回収すること、及び
ａ）単量体型の免疫グロブリンが陽イオン交換物質に結合しない条件下で単量体型及び凝集型の免疫グロブリンを含む工程ｄ）において得られたか又は工程ｂ）において得られた水性緩衝化溶液を陽イオン交換物質に適用すること、及び陽イオン交換物質との接触後に溶液から単量体型の免疫グロブリンを回収すること
をこの順序で含む方法である。
【００４８】
一実施態様において、工程ｂ）はフロースルー様式で操作されるクロマトグラフィー法である。別の実施態様において、工程ａ）はフロースルー様式で操作されるクロマトグラフィー法である。別の実施態様において、工程ｄ）は結合及び溶出の様式で操作される。別の実施態様において、前記陽イオン交換物質は膜陽イオン交換物質である。アフィニティーカラムは、例えば、プロテインＡアフィニティーカラム、プロテインＧアフィニティーカラム、疎水性電荷誘導クロマトグラフィーカラム（hydrophobic charge induction chromatography column）（ＨＣＩＣ）、又は疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム（ＨＩＣ、例えば、フェニル−セファロース、アザ−アレノフィリック樹脂、又はｍ−アミノフェニルボロン酸を用いる）であってもよい。好ましくは、アフィニティーカラムはプロテインＡカラム又はＨＣＩＣカラムである。
【００４９】
さらなる実施態様において、工程ｂ）における単量体型及び凝集型の免疫グロブリンを含む水性緩衝化溶液及び／又は工程ｃ）における単量体型の免疫グロブリンを含む水性緩衝化溶液を、免疫グロブリンが陰イオン交換物質に結合する条件下で陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに適用し、そして水性緩衝化溶液として陰イオン交換物質から回収する。
【００５０】
本発明の一局面は、単量体型及び凝集型の免疫グロブリンを含む溶液から単量体型の免疫グロブリンを得るための方法であり、ここでこの方法は以下の工程：
ａ）単量体型の免疫グロブリンが陽イオン交換物質に結合しない条件下で単量体型及び凝集型の免疫グロブリンを含む水性緩衝化溶液を膜陽イオン交換物質に適用すること、膜陽イオン交換物質のフロースルーから単量体型の免疫グロブリンを回収することを含む、フロースルー様式で操作されるクロマトグラフィー工程
を含む。
【００５１】
一実施態様において、本発明の方法は工程ａ）の前に以下の工程：
ｂ）免疫グロブリンが陰イオン交換物質に結合しない条件下で単量体型及び凝集型の免疫グロブリンを含む水性緩衝化溶液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに適用すること、及び水性緩衝化溶液として陰イオン交換カラムのフロースルーから単量体型及び凝集型の免疫グロブリンを回収することを含む、フロースルー様式で操作されるクロマトグラフィー工程
を含む。
【００５２】
一実施態様において、本発明の方法は工程ａ）の後に以下の工程：
ｃ）免疫グロブリンが陰イオン交換物質に結合しない条件下で単量体型の免疫グロブリンを含む工程ａ）において得られた水性緩衝化溶液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに適用すること、及び陰イオン交換クロマトグラフィーカラムのフロースルーから単量体型の免疫グロブリンを回収することを含む、フロースルー様式で操作されるクロマトグラフィー工程
を含む。
【００５３】
別の実施態様において、本発明の方法は工程ａ）又は工程ｂ）の前に以下の工程：
ｄ）免疫グロブリンがアフィニティーカラムに結合する条件下で単量体型及び凝集型の免疫グロブリンを含む水性緩衝化溶液をアフィニティーカラムに適用すること、及び水性緩衝化溶液としてアフィニティーカラムから単量体型及び凝集型の免疫グロブリンを回収することを含む、結合及び溶出の様式で操作されるクロマトグラフィー工程
を含む。
【００５４】
別の実施態様において、フロースルーからの単量体型の免疫グロブリンの回収は、沈殿、塩析、限外ろ過、ダイアフィルトレーション、凍結乾燥、アフィニティークロマトグラフィー、又は濃縮溶液を得るための溶媒容積低下より選択される方法による。好ましくは、前記回収は、限外ろ過、凍結乾燥、又は溶媒容積低下による。
【００５５】
一実施態様において、免疫グロブリンは膜陽イオン交換物質のフロースルーから得られ、免疫グロブリンの少なくとも９５％は単量体型である。別の実施態様において、単量体型の免疫グロブリンの少なくとも９０％は陽イオン交換物質に結合しない。
【００５６】
さらなる別の実施態様において、水性緩衝化溶液のｐＨ値はｐＨ５〜ｐＨ８である。さらなる実施態様において、水性緩衝化溶液の伝導率は４．０mS/cm〜１０．０mS/cmである。一実施態様において、緩衝化溶液は、リン酸もしくはその塩、クエン酸もしくはその塩、又はヒスチジンもしくはその塩を含む溶液である。さらなる別の実施態様において、水性溶液は塩化ナトリウム又は塩化カリウムを含む。
【００５７】
一実施態様において、膜陽イオン交換物質は、スルホン酸基又はカルボキシメチル基で修飾されたポリエーテルスルホンベースの膜又は再生セルロースベースの膜である。さらなる実施態様において、クロマトグラフィー工程はカラムクロマトグラフィー又はカセットクロマトグラフィーである。
【００５８】
本発明の理解を助けるために以下の実施例及び図面を提供し、その真の範囲は添付の特許請求の範囲において示す。本発明の精神から逸脱することなく示した手順を改変できることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｓ膜を用いるｍＡｂ  ＩＬ１３フロースルー様式精製の図。
【図２ａ】サンブル物質ｍＡｂ  ＩＬ１３のＳＥＣ（分子ふるいクロマトグラフィー）分析。
【図２ｂ】フロースルーの画分２のＳＥＣ分析。
【図３】ｍＡｂ  ＩＬ１３を含むサンプル物質のＳａｒｔｏｂｉｎｄ（商標）Ｃ膜プロセスのフロースルーの画分２のＳＥＣ分析。
【図４】ｍＡｂ  Ｈｅｒ２を含むサンプル物質のＳａｒｔｏｂｉｎｄ（商標）Ｃ膜プロセスのフロースルーの画分４のＳＥＣ分析。
【００６０】
実施例
材料及び方法：
調整プロテインＡ溶出物：
抗（ＩＬ−１３Ｒα１）抗体（以下、ｍＡｂ  ＩＬ１３という、例えば、国際公開第２００６／０７２５６４号参照）及び抗Ｈｅｒ２抗体（以下、ｍＡｂ  Ｈｅｒ２という、例えば、米国特許第５，６７７，１７１号参照）を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いる第１工程において精製した。
【００６１】
ｍＡｂ  ＩＬ１３を、プロテインＡカラムから、酸性条件下（３．５mM塩酸、ｐＨ値２．７±０．２）で溶出した。ろ過工程前に、免疫グロブリンを含む画分のｐＨ値を、ｐＨ９．０の濃縮（例えば、１M）緩衝溶液（例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）緩衝液又はリン酸緩衝液）を用いてｐＨ５．０に調節した。この物質を、以下において、ｍＡｂ  ＩＬ１３の調整（conditioned）プロテインＡ溶出物という。
【００６２】
ｍＡｂ  Ｈｅｒ２を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いる第１工程において精製した。プロテインＡカラムからの溶出を、酸性条件下（１０mMクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ値３．０±０．５）で実施する。ろ過工程前に、免疫グロブリンを含む画分のｐＨ値を、濃縮トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）緩衝液を用いてｐＨ５．６に調節する。この物質を、以下において、ｍＡｂ  Ｈｅｒ２の調整プロテインＡ溶出物という。
【００６３】
分析方法：
分子ふるいクロマトグラフィー：
樹脂：ＴＳＫ  ３０００（Tosohaas）
カラム：３００×７．８mm
流速：０．５ml/分
緩衝液：ｐＨ７．０に調節した２５０mM塩化カリウムを含む２００mMリン酸カリウム
波長：２８０nm
ＤＮＡ閾値システム：例えば、Merrick, H., and Hawlitschek, G., Biotech Forum Europe 9 (1992) 398-403を参照のこと。
【００６４】
プロテインＡ  ＥＬＩＳＡ：マイクロタイタープレートのウェルをニワトリ由来のポリクローナル抗プロテインＡ  ＩｇＧでコーティングする。結合後、未反応抗体をサンプル緩衝液での洗浄により除去する。プロテインＡ結合のために、規定サンプル容積をウェルに添加する。サンプル中に存在するプロテインＡをニワトリ抗体により結合させ、そしてプレートのウェル中に保持する。インキュベーション後、サンプル溶液を除去し、そしてウェルを洗浄する。検出のために、続いて、ニワトリ由来のポリクローナル抗プロテインＡ  ＩｇＧビオチン抱合体及びストレプトアビジンペルオキシダーゼ抱合体を添加する。さらなる洗浄工程後、基質溶液を添加し、着色した反応産物の形成が生じる。色の強度は、サンプルのプロテインＡ含量に比例する。規定時間後、反応を停止させ、そして吸光度を測定する。
【００６５】
宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）ＥＬＩＳＡ：マイクロタイタープレートのウェルの壁を血清アルブミン及びストレプトアビジンの混合物でコーティングする。ＨＣＰに対するヤギ由来ポリクローナル抗体をマイクロタイタープレートのウェルの壁に結合させる。洗浄工程後、マイクロタイタープレートの異なるウェルを、異なる濃度の一連のＨＣＰ較正及びサンプル溶液と共にインキュベートする。インキュベーション後、結合していないサンプル物質を、緩衝溶液での洗浄により除去する。検出のために、ウェルを抗体ペルオキシダーゼ抱合体と共にインキュベートして、結合した宿主細胞タンパク質を検出する。固定されたペルオキシダーゼ活性を、ＡＢＴＳとのインキュベーション及び４０５nmでの検出により検出する。
【００６６】
実施例１
ｍＡｂ  ＩＬ１３の単量体型への精製  −  条件の比較
ｍＡｂ  ＩＬ１３の単量体型への精製において、様々な条件を評価した。
【００６７】
精製方法を、フロースルー様式でのクロマトグラフィー精製方法として操作した。ｍＡｂ  ＩＬ１３のフロースルー精製のための様々な条件を評価した。膜陽イオン交換物質として、Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｓ−Ａｄｓｏｒｂｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｓ  Ｃｏｉｎ、１．５cm2膜面積、Pall Corporation, USA）を使用した。
【００６８】
調整プロテインＡ溶出物は７．１g/lのｍＡｂ  ＩＬ１３濃度を有し、免疫グロブリンの９０．９％が単量体型であり、そして免疫グロブリンの９．１％が凝集型であった。調整プロテインＡ溶出物を、実験前にウイルス不活化し、そして０．２μmポアフィルターを通してろ過した。約１mg/mlのタンパク質濃度への対応する緩衝液での希釈（約１：７（ｖ／ｖ）の比率）、ｐＨ及び伝導率の調節後、溶液を膜陽イオン交換物質に適用した。必要な場合、ｐＨの調節をリン酸水素カリウム又はリン酸二水素カリウムを用いて実施し、そして伝導率の調節をＫＣｌ又は脱イオン水（それぞれｐＨ約５．５及び７．５）の添加により行った。そのような希釈し、調節し、そして調整したプロテインＡ溶出物を以下でサンプル物質という。
【００６９】
多様化させたパラメーターは伝導率及びｐＨであった。観察したパラメーターは、サンプル物質の単量体型のフロースルー免疫グロブリンの収率及び純度であった。サンプル物質の多様化させたパラメーターを表１にまとめる。
【００７０】
【表１】
2010528076.tif 000003
【００７１】
単量体型及び凝集型の免疫グロブリンの量を決定するために、フロースルーを分子ふるいクロマトグラフィーにより分析した。第２画分を分析のために選択した、なぜなら、クロマトグラフィーシステムのデッドボリュームに起因して定常流が存在せず、従って第１画分の未知の希釈が起こるので、プロセスの最初（第１画分）には、安定な精製プロセスが確立されなかったからである。例示的なフロースルー図を図１に示す。結果を表２にまとめる。サンプル物質及び画分２（ｐＨ６．５、５．８mS/cm）の分子ふるいクロマトグラムを図２ａ）及び２ｂ）に示す。
【００７２】
【表２】
2010528076.tif 000004
【００７３】
表２に示すデータは、ｍＡｂ  ＩＬ１３の精製、即ち、凝集型からの単量体型の免疫グロブリンの分離のために適切な条件、即ち、単量体型の免疫グロブリンが膜陽イオン交換物質に結合せず、収率の優れた条件を調節できることを示す（例えば、伝導率５．８mS/cm及びｐＨ６．５）。
【００７４】
実施例２
ｍＡｂ  ＩＬ１３の単量体型への精製  −  膜の比較
実施例１において得られた結果は一般的に適用可能であり、そしてそれを膜陽イオン交換物質Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（商標）Ｓ（７５cm2膜面積、Sartorius AG, Gottingen, Germany）に適用した。Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｓのための好ましい条件、即ち、伝導率５．８mS/cm、ｐＨ６．５を、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（商標）物質にも適用した。ｍＡｂ  ＩＬ１３を含むサンプル物質は１．３４mg/mlのタンパク質濃度を有し、免疫グロブリンの９４．８％が単量体型であり、そして免疫グロブリンの５．２％が凝集型であった。実施例１において報告するように、サンプル物質を膜に適用した。精製プロセスの結果を表３にまとめる。
【００７５】
【表３】
2010528076.tif 000005
【００７６】
同じサンプル物質をＳａｒｔｏｂｉｎｄ（商標）Ｃ膜にも適用した。結果を表４に示し、そして第３画分の例示的な分子ふるいクロマトグラムを図３に示す。
【００７７】
【表４】
2010528076.tif 000006
【００７８】
全ての実験において１つの膜物質を用いて決定した精製条件を使用することにより、実証した全ての陽イオン膜吸収体が、同じ条件でのフロースルー様式の操作において凝集体を除去し、そして単量体ＩｇＧを得る能力を有する。
【００７９】
実施例３
ｍＡｂ  Ｈｅｒ２の単量体型への精製  −  膜の比較
調整プロテインＡ溶出物は、７．６１g/lのｍＡｂ  Ｈｅｒ２濃度を有し、純度は９８．８％であった。凝集型の免疫グロブリンを、ｍＡｂ  Ｈｅｒ２溶液を３７℃に３日間加熱することにより産生／取得した。溶液は、加熱処置後、加熱処置したサンプル中に存在する低分子量物質を考慮しないで、単量体型の免疫グロブリンを９９．０％及び凝集型の免疫グロブリンを１．０％含んでいた。調整プロテインＡ溶出物を、実験前にウイルス不活化し、そして０．２μmポアサイズフィルターを通してろ過した。１．０３mg/mlのタンパク質濃度への希釈、ｐＨ及び伝導率の調節後、溶液を膜陽イオン交換物質Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（商標）Ｓ及びＣにそれぞれ適用した。伝導率の調節を、ＮａＣｌ（５mol/l）の添加により行った。結果を表５及び６に示す。
【００８０】
【表５】
2010528076.tif 000007
【００８１】
【表６】
2010528076.tif 000008
【００８２】
Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（商標）Ｃ膜のフロースルーの画分４の例示的な分子ふるいクロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析を図４に示す。
【００８３】
上記から、ｐＨ値及びmS/cmでの伝導率の合計は、好ましくは９〜１８の範囲、より好ましくは１０〜１５の範囲であるとまとめることができる。
【００８４】
実施例４
プロテインＡ、ＤＮＡ及びＨＣＰ含量の分析
実施例２において得られた画分を、プロテインＡ、ＤＮＡ、及びＨＣＰ含量について分析した。結果を表７及び８に与える。
【００８５】
Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（商標）Ｓ膜への適用前の溶液中のプロテインＡ含量は２．６ng/mlであり、ＤＮＡ含量は＜０．３pg/mgであり、そして宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）含量は１７９１ng/mgであった。
【００８６】
【表７】
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【００８７】
Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（商標）Ｃ膜への適用前の溶液中のプロテインＡ含量は３．０ng/mlであり、ＤＮＡ含量は＜０．４pg/mgであり、そして宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）含量は５２５０ng/mgであった。
【００８８】
【表８】
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【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年11月30日(2009.11.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単量体型及び凝集型の免疫グロブリンを含む溶液から単量体型の免疫グロブリンを得るための方法であって、該方法が以下の工程：
ａ）単量体型の免疫グロブリンの少なくとも９０％が陽イオン交換物質に結合しない条件下で単量体型及び凝集型の免疫グロブリンを含む水性緩衝化溶液を陽イオン交換物質に適用すること、及び陽イオン交換物質との接触後に溶液から単量体型の免疫グロブリンを回収すること
を含み、
ここで、工程ａ）はフロースルー様式で操作されるクロマトグラフィー工程であり、溶液はｐＨ４〜ｐＨ８のｐＨ値を有し、そして工程ａ）の水性緩衝化溶液は１．０〜１５．０mS/cmの伝導率を有することを特徴とする方法。
【請求項２】
工程ａ）において陽イオン交換物質が膜陽イオン交換物質であることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
膜陽イオン交換物質がＭｕｓｔａｎｇ（商標）Ｓ、Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｃ、又はＳａｒｔｏｂｉｎｄ（商標）Ｓ、又はＳａｒｔｏｂｉｎｄ（商標）Ｃであることを特徴とする、請求項２記載の方法。
【請求項４】
膜陽イオン交換物質がスルホン酸基又はカルボキシメチル基で修飾されたポリエーテルスルホンベースの膜又は再生セルロースベースの膜であることを特徴とする、請求項２記載の方法。
【請求項５】
工程ａ）の水性緩衝化溶液がｐＨ５〜ｐＨ８のｐＨ値を有することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
工程ａ）の水性緩衝化溶液が４．０〜１０．０mS/cmの伝導率を有することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
フロースルーからの単量体型の免疫グロブリンの回収が、沈殿、塩析、限外ろ過、ダイアフィルトレーション、凍結乾燥、アフィニティークロマトグラフィー、又は濃縮溶液を得るための溶媒容積低下より選択される方法によることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
回収が、限外ろ過、凍結乾燥、又は溶媒容積低下によることを特徴とする、請求項７記載の方法。
【請求項９】
膜陽イオン交換物質のフロースルーから得られる免疫グロブリンの内、免疫グロブリンの少なくとも９５％が単量体型であることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
水性緩衝化溶液がリン酸もしくはその塩、クエン酸もしくはその塩、又はヒスチジンもしくはその塩を含む溶液であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
水性緩衝化溶液が塩化ナトリウム又は塩化カリウムを含むことを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
クロマトグラフィー工程がカラムクロマトグラフィー又はカセットクロマトグラフィーであることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
工程ａ）における水性緩衝化溶液のｐＨ値及びmS/cmでの伝導率の合計が９〜１８の範囲にあることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
前記合計が１０〜１５の範囲にあることを特徴とする、請求項１３記載の方法。
【国際調査報告】
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