(57)【要約】  本発明は、必要のある患者に、式（Ｉ）及び式（ＩＩ）：【化１】2010523468.tif 000018［式中、フェニルはＸにおいてフッ素、塩素、臭素及びヨウ素より成る群から選ばれる１〜５個のハロゲン原子で置換されており；そしてＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は独立して水素及びＣ１−Ｃ４アルキルより成る群から選ばれ；ここでＣ１−Ｃ４アルキルは場合によりフェニルで置換されていることができる（ここでフェニルは場合によりハロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、アミノ、ニトロ及びシアノより成る群から独立して選ばれる置換基で置換されていることができる）］より成る群から選ばれる化合物あるいはその製薬学的に許容され得る塩又はエステルの治療的に有効な量を投与することを含んでなる耳保護を与えるための方法に関する。【選択図】  なし
2010523468.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
耳保護薬（ＯＰＤ）を用いる処置の必要な患者に、式（Ｉ）及び式（ＩＩ）：
【化１】
2010523468.tif 000013
［式中、
フェニルはＸにおいてフッ素、塩素、臭素及びヨウ素より成る群から選ばれる１〜５個のハロゲン原子で置換されており；そしてＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は独立して水素及びＣ１−Ｃ４アルキルより成る群から選ばれ；ここでＣ１−Ｃ４アルキルは場合によりフェニルで置換されていることができる（ここでフェニルは場合によりハロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、アミノ、ニトロ及びシアノより成る群から独立して選ばれる置換基で置換されていることができる）］
より成る群から選ばれる化合物あるいはその製薬学的に許容され得る塩又はエステルの治療的に有効な量を投与することを含んでなる耳保護を与えるための方法。
【請求項２】
Ｘがフェニル環のオルト位で置換している塩素であり、且つここでＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６が水素から選ばれる請求項１の方法。
【請求項３】
耳保護薬（ＯＰＤ）を用いる処置の必要な患者に、式（Ｉ）及び式（ＩＩ）より成る群から選ばれるエナンチオマーあるいはその製薬学的に許容され得る塩又はエステルあるいは式（Ｉ）及び式（ＩＩ）より成る群から選ばれる１つのエナンチオマーが優勢であるエナンチオマー混合物：
【化２】
2010523468.tif 000014
［式中、
フェニルはＸにおいてフッ素、塩素、臭素及びヨウ素より成る群から選ばれる１〜５個のハロゲン原子で置換されており；そしてＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は独立して水素及びＣ１−Ｃ４アルキルより成る群から選ばれ；ここでＣ１−Ｃ４アルキルは場合によりフェニルで置換されていることができる（ここでフェニルは場合によりハロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、アミノ、ニトロ及びシアノより成る群から
独立して選ばれる置換基で置換されていることができる）］
の治療的に有効な量を投与することを含んでなる耳保護を与えるための方法。
【請求項４】
Ｘがフェニル環のオルト位で置換している塩素であり、且つここでＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６が水素から選ばれる請求項３の方法。
【請求項５】
式（Ｉ）及び式（ＩＩ）より成る群から選ばれる１つのエナンチオマーが約９０％かそれより高い程度まで優勢である請求項３の方法。
【請求項６】
式（Ｉ）及び式（ＩＩ）より成る群から選ばれるエナンチオマーが式（Ｉａ）及び式（ＩＩａ）：
【化３】
2010523468.tif 000015
［式中、
フェニルはＸにおいてフッ素、塩素、臭素及びヨウ素より成る群から選ばれる１〜５個のハロゲン原子で置換されており；そしてＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は独立して水素及びＣ１−Ｃ４アルキルより成る群から選ばれ；ここでＣ１−Ｃ４アルキルは場合によりフェニルで置換されていることができる（ここでフェニルは場合によりハロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、アミノ、ニトロ及びシアノより成る群から独立して選ばれる置換基で置換されていることができる）］
より成る群から選ばれるエナンチオマーである請求項３の方法。
【請求項７】
Ｘがフェニル環のオルト位で置換している塩素であり、且つここでＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６が水素から選ばれる請求項６の方法。
【請求項８】
式（Ｉａ）及び式（ＩＩａ）より成る群から選ばれる１つのエナンチオマーが約９０％かそれより高い程度まで優勢である請求項６の方法。
【請求項９】
式（Ｉ）及び式（ＩＩ）より成る群から選ばれるエナンチオマーが式（Ｉｂ）及び式（ＩＩｂ）：
【化４】
2010523468.tif 000016
より成る群から選ばれるエナンチオマーである請求項３の方法。
【請求項１０】
式（Ｉｂ）及び式（ＩＩｂ）より成る群から選ばれる１つのエナンチオマーが約９０％かそれより高い程度まで優勢である請求項９の方法。
【請求項１１】
患者を耳保護の必要な者とする耳損傷の可能な原因が：耳毒性薬剤暴露、外傷、耳鳴、免疫−媒介メニエール病を含むメニエール病、免疫−媒介蝸牛もしくは前庭障害（ＩＭＣＶＤ）、自己免疫耳疾患（ＡＩＥＤ）、コーガン症候群、内耳又は第八神経を冒す虚血性事象ならびに鈍的又は穿通頭部外傷から選ばれる状態より成る群から選ばれる請求項１又は３に記載の方法。
【請求項１２】
患者を耳保護の必要な者とする素地となる因子が：耳鳴、メニエール病及び耳毒性薬剤暴露より成る群から選ばれる請求項１１の方法。
【請求項１３】
該素地となる因子が耳鳴である請求項１２の方法。
【請求項１４】
該素地となる因子が耳毒性薬剤暴露である請求項１２の方法。
【請求項１５】
該耳毒性薬剤が抗生物質である請求項１４の方法。
【請求項１６】
該耳毒性薬剤が化学療法薬である請求項１４の方法。
【請求項１７】
該化合物（又はエナンチオマー）あるいはその製薬学的に許容され得る塩もしくはエステルを、１種もしくはそれより多い他の化合物又は治療薬との組み合わせ投与において投与する請求項１又は３の方法。
【請求項１８】
該１種もしくはそれより多い他の化合物又は治療薬が抗生物質及び化学療法薬より成る群から選ばれ、患者における耳毒性が妨げられる請求項１７の方法。
【請求項１９】
式（Ｉｂ）及び式（ＩＩｂ）より成る群から選ばれるエナンチオマー又はその製薬学的に許容され得る塩もしくはエステルあるいは１つのエナンチオマーが式（Ｉｂ）及び式（ＩＩｂ）より成る群から選ばれるエナンチオマー混合物：
【化５】
2010523468.tif 000017
の製薬学的に有効な量を含んでなる耳保護を与えるための製薬学的組成物。
【請求項２０】
治療的に有効な量が投薬当たり約０．１ｍｇ／ｋｇ〜投薬当たり約５０ｍｇ／ｋｇである請求項１又は３における方法。
【請求項２１】
治療的に有効な量が投薬当たり約１．０ｍｇ／ｋｇ〜投薬当たり約２５ｍｇ／ｋｇである請求項１又は３における方法。
【請求項２２】
治療的に有効な量が投薬当たり約２．０〜約４０ｍｇ／ｋｇである請求項１又は３における方法。
【請求項２３】
治療的に有効な量が７０ｋｇの平均体重を有する患者の場合に約１４０ｍｇ／日〜約２８００ｍｇ／日である請求項１又は３における方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１９（ｅ）の下に、２００６年１０月２７日に申請された米国暫定出願第６０／８６３，１４４号明細書の利益を請求する。前記の関連米国特許出願の開示全体は、そのすべての目的に関して、引用することにより本明細書の内容となる。
【０００２】
発明の背景
発明の分野
本発明は一般的に薬理学及び神経学の分野ならびに蝸牛及び前庭系を含む哺乳類内耳及び蝸牛神経（ａｕｄｉｔｏｒｙ  ｎｅｒｖｅ）の細胞を損傷又は変性から保護する方法に関する。さらに特定的に、本発明は、蝸牛及び前庭障害の処置のためのある種のカルバメート化合物の使用方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
関連技術の記述
聴覚障害及び平衡障害は、何百万人もの人々を冒す重大なハンディキャップである。聴覚障害は、感染、機械的傷害、大きな音への暴露、加齢ならびに末梢聴覚系のニューロン及び／又は有毛細胞に損傷を与える化学品−誘導耳毒性を含む多様な原因のせいとされ得る。
【０００４】
末梢聴覚系は、聴覚受容器、コルティ器官中の有毛細胞及び一次聴覚ニューロン、蝸牛中の脊髄神経節ニューロンから成る。脊髄神経節ニューロン（「ＳＧＮ」）は、末梢聴覚受容器、コルティ器官中の有毛細胞からの信号を、蝸牛神経を介して脳に送達する一次求心性聴覚ニューロンである。第八神経は、脊髄神経節中の一次聴覚ニューロンを脳幹に連結する。第八神経は、平衡を担う一次求心性感覚ニューロンであり、且つ卵形嚢、内耳の小嚢及び膨大部からの信号を脳に送達する前庭神経節ニューロン（「ＶＧＮ」）も脳幹に連結する。脊髄神経節中の一次求心性ニューロン及び有毛細胞の破壊は、聴覚障害の１つの大きな原因とされてきた。抹消聴覚系への損傷は、聴覚欠陥の大部分に責任がある（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）。
【０００５】
聴覚喪失（ｈｅａｒｉｎｇ  ｌｏｓｓ）又は聴覚障害（ｈｅａｒｉｎｇ  ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ）は、人間における障害の普通の原因である。外耳道から中枢神経系への聴覚経路に沿ったどこかにおける障害は、聴覚障害又は平衡障害を生じ得る。聴覚器官（ａｕｄｉｔｏｒｙ  ａｐｐａｒａｔｕｓ）は、外耳及び中耳、内耳ならびに聴覚神経及び中枢聴覚経路に分けられ得る。種によっていくらかの変動を有するが、一般的な特性化はすべての哺乳類に関して共通である。聴覚刺激は、外耳道、鼓膜及び耳小骨連鎖を介して内耳に機械的に伝達される。
【０００６】
中耳及び乳様突起は通常、空気で満たされている。外耳及び中耳の障害は、通常、この機械的伝達を妨げることにより、伝導性聴覚障害を生ずる。伝導性聴覚障害の通常の原因には、耳の閉鎖又は耳垢により引き起こされ得るような外耳道の閉塞；外傷又は感染により引き起こされ得るような鼓膜の肥厚又は穿孔；耳小骨連鎖の成分の固定又は再吸収；ならびに流体で満たされた中耳空間を生ずるエウスターキオ管の閉塞が含まれる。
【０００７】
聴覚情報は、内耳中の神経−上皮細胞（有毛細胞）及びＳＧＮの作用により、機械的信号から神経的に伝導される電気的インパルスに変換される。ＳＧＮのすべての中心線維は、橋脳幹の蝸牛神経核（ｃｏｃｈｌｅａｒ  ｎｕｃｌｅｕｓ）においてシナプスを形成する。蝸牛神経核からの聴覚突起（ａｕｄｉｔｏｒｙ  ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎｓ）は両側性であり、主な核は視床の内側膝状体である下丘及び側頭葉の聴覚皮質に位置する。聴覚に含まれるニューロンの数は、蝸牛から聴覚脳幹及び聴覚皮質に劇的に増加する。すべての聴覚情報は、内耳中の感覚受容器である限られた数の有毛細胞により変換され、その中で比較的少数のいわゆる内部有毛細胞（ｉｎｎｅｒ  ｈａｉｒ  ｃｅｌｌｓ）は決定的に重要であり、それは、それらが一次聴覚ニューロンの約９０％とシナプスを形成するからである。
【０００８】
比較して、蝸牛神経核のレベルにおいて、含まれる神経要素の数は何十万において評価される。かくして、聴覚末梢における比較的少数の細胞への損傷又はその疾患は、実質的な聴覚障害又は平衡障害に導き得る。従って感覚神経喪失（ｓｅｎｓｏｒｉｎｅｕｒａｌ
ｌｏｓｓ）の多くの原因を、内耳における損傷に帰することができる。この聴覚障害及び平衡障害は進行性であり得る。さらに動物の年令に伴う耳の解剖学的構造における変化の故に、聴覚は有意に鋭敏性が低下する。
【０００９】
胚形成の間に、前庭神経節、脊髄神経節及び耳小胞が同じ神経原性外胚葉、耳プラコードから誘導される。かくして前庭及び聴覚系は、有毛細胞の末梢ニューロン性神経支配及び脳幹核への中心突起を含む多くの特性を共有する。これらの系の両方とも、治療薬、抗腫瘍薬、食物又は薬剤中の汚染物ならびに環境的及び工業的汚染物質を含む耳毒物に敏感である。耳毒性薬剤には広く用いられる化学療法薬、シスプラチン及びその類似体（非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献１；非特許文献９）、グラム−陰性菌により引き起こされる感染の処置のために通常用いられるアミノグリコシド抗生物質、例えばゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ）（非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２）、キニーネ及びその類似体、サリチレート及びその類似体及びループ利尿薬が含まれる。
【００１０】
聴覚細胞及び脊髄神経節ニューロンへのこれらの薬剤の毒性効果は、多くの場合にそれらの治療的有用性に関する制限因子である。例えば、ゲンタマイシン、ストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎｓ）、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎｓ）、トブラマイシン（ｔｏｂｒａｍｙｃｉｎｓ）などのような抗菌性アミノグリコシドは重大な毒性、特に耳毒性及び腎毒性を有することが既知であり、それはそのような抗微生物剤の有用性を低下させる（非特許文献１３又は最も最近の版を参照されたい）。
アミノグリコシド抗生物質は一般に、例えばグラム−陽性、グラム−陰性及び抗酸菌に対して有効な広範囲抗微生物剤として用いられる。
【００１１】
アミノグリコシドは主にグラム−陰性菌により引き起こされる感染の処置にために、且つ相乗効果のために例えばペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎｓ）と組み合わせて用いられる。その群に関する一般的名称が意味する通り、すべてのアミノグリコシド抗生物質は、グリコシド結合中にアミノ糖を含有する。中耳炎は、中耳の感染を記述するために用いられる用語であり、その感染は特に子供において非常にありふれている。典型的には、中耳の感染に関し、抗生物質が例えば応答的（ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ）又は予防的やり方で、全身的に投与される。中耳感染の防除のための抗生物質の全身的投与は一般に、中耳において治療的レベルを達成するまでの長い遅延時間を生じ、そのようなレベルを達成するために高い初期投薬量を必要とする。これらの欠点は、治療的レベルを得る能力を複雑にし、いくつかの抗生物質の使用を全く排除し得る。
【００１２】
感染が進行した段階に達してしまった時、全身的投与は最も多くの場合に有効であるが、この時点にすでに、永久的損傷は中耳及び内耳構造に与えられているかも知れない。明らかに、耳毒性は抗生物質投与の用量を制限する副作用である。例えば毎日２グラムのストレプトマイシンを６０〜１２０日与えられた患者のほとんど７５％が、いくらかの前庭障害を示したが、１日当たり１グラムにおいて、発生率は２５％に低下した。１日当たり１グラムのストレプトマイシンを１週間より長く与えられた患者の約４〜１５％で聴覚障害も観察され得、測定可能な聴覚障害を発現する。この聴覚障害は進行し得、処置が続けられると完全な永久的難聴に導き得る。
【００１３】
さらに、睾丸、卵巣、膀胱及び頭頸部ガンを含む多様な人間のガンに有効であることが証明されている白金配位錯体であるシスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）に関しても、耳毒性は重大な用量を制限する副作用である。シスプラチンは聴覚及び前庭系に損傷を与える（非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献１４；非特許文献１０；非特許文献１２）。アスピリンのようなサリチレートは、それらの抗−炎症、鎮痛、下熱及び抗−血栓効果のために最も普通に用いられる治療薬である。不運なことに、それらは耳毒性副作用を有する。それらは多くの場合に耳鳴（「耳内で鈴が鳴る」）及び一時的聴覚障害に導く（非特許文献１５）。しかしながら薬剤が高用量で長時間用いられると、臨床的に報告された通り、聴覚障害は持続性且つ不可逆性になり得る（非特許文献１６）。
【００１４】
耳毒性薬剤の他に、多様な疾患及び変性状態が内耳有毛細胞及び関連ニューロンに不利に影響を与える。例えば免疫−媒介蝸牛もしくは前庭障害（ＩＭＣＶＤ）のような免疫媒介耳障害は、耳鼻咽喉科医への管理挑戦（ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）を呈し続けている。これらの障害は、感覚神経性聴覚障害の症候群を代表し、自己免疫機構の故であると思われるめまい、耳鳴及び耳充満（ａｕｒａｌ  ｆｕｌｌｎｅｓｓ）を多くの場合に伴う。ＩＭＣＶＤｓの後遺症には破壊的廃疾（ｄｅｖａｓｔａｔｉｎｇ  ｄｉｓａｂｉｌｉｔｉｅｓ）、例えば顕著な難聴及び重症の前庭機能不全が含まれる。シクロホスホミドのような免疫抑制剤及びメトトレキセート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）のような抗リウマチ薬がＩＭＣＶＤのために用いられるが、変り得る有効性、遅い効果の開始及び時々は重大な毒性を伴う（非特許文献１７）。
【００１５】
「免疫−媒介耳障害」又は「免疫−媒介耳疾患」という用語は、免疫に基づく機構、例えば自己免疫又は炎症反応によりもたらされる耳機能の障害を指す。耳のいずれの部分も冒され得るが、内耳が最も頻繁に傷つけられる（ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ）。免疫−媒介耳障害には免疫−媒介蝸牛もしくは前庭障害（ＩＭＣＶＤ）、免疫−媒介メニエール病、自己免疫耳疾患（ＡＩＥＤ）、コーガン症候群及びヴェーゲナー肉芽腫症が含まれるが、制限ではない。免疫−媒介耳障害に関連する症状には聴覚障害（片方又は両方の耳における完全な又は部分的な聴覚障害を含む）、めまい、耳鳴、耳における充満（ｆｕｌｌｎｅｓｓ）、耳痛、耳漏／慢性中耳炎及びＴＭ穿孔が含まれる。
【００１６】
内耳を冒すさらなる障害にはメニエール病が含まれる。典型的なメニエール病の発作には片耳における充満が先行し、聴覚変動又は耳鳴も発作に先行し得る。完全な症例（ｅｐｉｓｏｄｅ）は一般に重症のめまい、平衡障害、吐気及び嘔吐を含み、２〜４時間続き得る。メニエール病は突然の転倒を引き起こし得、それは前庭反射の突然の活性化を起因とする警告なしに起こる。この疾患は致命的ではないが、非常に耐えられないもの（ｄｉｓａｂｌｉｎｇ）であり得、進行性聴覚障害を引き起こし得る。メニエール病は非常にありふれており、人口の０．２％又は米国のみで約６００，０００人の人々において起こっている。原因は未知であるが、内耳を冒すウイルス及び／又は免疫学的プロセスの故であると思われ、しかし最終的結果は、多くの場合に蝸牛及び／又は前庭系の変性である。
【００１７】
耳鳴はありふれており、患者に聞こえる鈴が鳴るかシューというか又はごうごういう音であり、それは環境中の音により引き起こされるのではない。耳鳴は非常にありふれており、約３千６百万人のアメリカ人が冒され、総人口の約６％が重症の症状を有する。耳鳴は特定の疾患ではなくて症状であり、大きな騒音への暴露からの機械的傷害、メニエール病を含む変性疾患を含む多くの原因を有するが、ほとんどの耳鳴は蝸牛又は前庭神経への
損傷から生ずる。アスピリン、ＮＳＡＩＤＳ、ラシックス（Ｌａｓｉｘ）のようなループ利尿薬、抗生物質、キニーネ及び多くの種類の化学療法薬、例えば上記のシスプラチン（ｃｉｓ  ｐｌａｔｉｎｕｍ）を含む多くの普通の薬剤も耳鳴を引き起こし得る。
【００１８】
従って、内耳組織、特に内耳有毛細胞及び関連する聴覚神経を含む内耳障害及び聴覚障害の発生及び／又は重度を妨げるか、減少させるか、又は処置するための手段に対する必要性がある。特に興味深いのは、シスプラチン及びその類似体、アミノグリコシド抗生物質、サリチレート及びその類似体又はループ利尿薬を含む耳毒性治療薬の望ましくない副作用として生ずる状態ならびに虚血を含む内耳有毛細胞及び関連するニューロンを含む変性疾患である。さらに、これらの耳毒性−誘導製薬学的薬剤を用いて、より高く、かくしてより有効な投薬ができるようにし、同時にこれらの薬剤により引き起こされる耳毒性効果を妨げるか又は低下させる方法に対する必要性がある。必要なことは、内耳組織損傷、喪失又は変性に関連する聴覚障害、特に内耳有毛細胞及び関連するニューロンを含む耳毒性−誘導疾患及び変性疾患の予防的又は治癒的処置のための安全、有効且つ長期間の手段を提供する方法である。
【００１９】
従って、聴覚障害及び平衡障害ならびに有毛細胞及び／又は第八神経を含むそれらの支持細胞への損傷と関連する他の状態の処置の方法に対する重大な必要性が存在し続けている。本発明は、これらの領域を多くの種類の毒性薬剤及び変性障害の効果から保護するための組成物及び方法を提供する。
【００２０】
蝸牛又は前庭系あるいは一次聴覚受容器、コルティ器官中の有毛細胞及び一次聴覚ニューロン及び蝸牛中の脊髄神経節ニューロン、第八神経のニューロン及び前庭神経節ニューロンを含む聴覚又は前庭神経への種々の傷害又は外傷は、顕著且つ長時間持続する聴覚障害又は平衡の問題あるいはめまい、吐気及び嘔吐のような耐えられない症状を生じ得る。これらの効果のいくつかは、内耳中のニューロン又は他の関連細胞の進行性の死、すなわち神経変性又はニューロン変性により引き起こされる。
【００２１】
ニューロン死又は機能不全の機構は様々であり、完全には理解されていないが、傷害を受けるか又は虚血性障害を受けると、損傷されたニューロンは多量の神経伝達物質グルタメートを放出し、それは回りのニューロンに対して興奮毒性（ｅｘｃｉｔｏｔｏｘｉｃ）である（非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献２０；非特許文献２１；非特許文献２２）。グルタメートは負に帯電したアミノ酸であり、それは哺乳類の神経系における興奮性シナプス伝達物質である。グルタメートの濃度は神経末端においてミリモル範囲に達することができるが、その細胞外濃度は、神経毒性を予防するために低レベルに保たれる。グルタメートは、高濃度で存在すると、ニューロンに対して毒性であり得ることが注目された。「興奮毒性（ｅｘｃｉｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）」という用語は、グルタメート（及び他のそのような興奮性アミノ酸）が高い投薬量で適用される場合にニューロンに有し得る細胞毒性効果を記述するために用いられてきた。
【００２２】
生理学的に、過剰放出、吸収の妨害あるいは両方は、グルタメートの高レベルを達成し得る。通常、細胞外グルタメートの低濃度は、ニューロン及び星状細胞の両方により保持される。ニューロンはグルタメートを細胞内貯蔵所に貯蔵し、その放出を調節する。非特許文献２３を参照されたい。星状細胞は、特殊な輸送物質により細胞外グルタメートを吸収し、グルタメートをグルタミンに転換し、それは次いでニューロン吸収のために放出される。非特許文献２４を参照されたい。興奮毒性のプロセスにおいて、グルタメートは自己−永存的（ｓｅｌｆ−ｐｅｒｐｅｔｕａｔｉｎｇ）やり方でニューロンにより放出され、グルタメート受容体の過剰な又は長時間の活性化を生ずる。
【００２３】
毒性レベルの細胞外グルタメートを隔離する神経支持性星状細胞の危うくなった能力と
、エネルギーが枯渇したニューロンへのそのような過剰なグルタメート刺激が一緒になることは、壊死及びアポトーシスを介してニューロン死に導く。中枢神経系傷害及び疾患と関連するニューロン死を減少させるために、現在種々の介入が試験されている。さらに、多くの慢性神経変性状態において、炎症及び酸化的ストレスは病理学の重要な構成要素である。非特許文献２５を参照されたい。そのような治療にはグルタメート放出阻害剤、グルタメート受容体アンタゴニスト、Ｃａ２＋チャンネル遮断薬、ＧＡＢＡ受容体アゴニスト、ガングリオシド、神経栄養因子（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒｓ）、カルパイン阻害剤、カスパーゼ阻害剤、遊離ラジカル掃去剤、免疫−及び細胞代謝調節物質が含まれる。
【００２４】
例えばいくつかの研究が：１）ハンティングトン病（ＨＤ）（非特許文献２６）；２）アルツハイマー病（ＡＤ）（非特許文献２７）；３）てんかん（非特許文献２８）；４）ラチリスム（非特許文献２９）、５）筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）及びＧｕａｍのパーキンソン症候群痴呆（非特許文献３０）の病態生理学、ならびに発作、虚血及び再灌流に関連する神経病理学（非特許文献３１を参照されたい）にグルタメートが含まれることを示した。
【００２５】
かくしてニューロンへの傷害は、グルタメート及びアスパルテートを含む興奮性アミノ酸による受容体の過剰刺激によって引き起こされ得る（非特許文献３２を参照されたい）。事実、グルタメート受容体のＮ−メチル−Ｄ−アスパルテート（ＮＭＤＡ）サブタイプは、シナプス伝達、学習及び記憶ならびにニューロン発育を含む正常な脳機能において多くの重要な役割を有することが示唆されている（非特許文献３２；非特許文献３３を参照されたい）。しかしながら、グルタメート受容体のＮＭＤＡサブタイプの過剰−刺激は、遊離ラジカル生産及びニューロン細胞死を増加させ、それは酸化防止剤により調節され得る（非特許文献３４；非特許文献３５を参照されたい）。
【００２６】
かくして蝸牛又は前庭系あるいは一次聴覚受容器、コルティ器官中の有毛細胞及び一次聴覚ニューロン及び蝸牛中の脊髄神経節ニューロン、第八神経のニューロン及び前庭神経節ニューロンを含む聴覚又は前庭神経中のニューロン及び支持細胞の死又は機能不全は、人間を含む哺乳類において顕著且つ長時間持続する聴覚障害及び／又は前庭障害を生じ得る。かくしてこの変性から哺乳類内耳の細胞を保護することができる、すなわち耳保護性である方法及び化合物の開発に対する必要性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２７】
【非特許文献１】Ｄｕｂｌｉｎ  Ｗ  Ｂ（１９７６）Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ｏｆ  ｓｅｎｓｏｒｉｎｅｕｒａｌ  ａｕｄｉｔｏｒｙ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，Ｉｌｌ．：Ｃ．Ｃ．Ｔｈｏｍａｓ．
【非特許文献２】Ｒｙｂａｋ  Ｌ  Ｐ（１９８６）Ｏｔｏｔｏｘｉｃ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｉｎ：Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｈｅａｒｉｎｇ．Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｒ  Ｒ  Ａ，Ｂｏｂｂｉｎ  Ｒ  Ｐ，Ｈｏｆｆｍａｎ  Ｄ  Ｗ，Ｅｄｓ．Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）ＰＰ４４１−４５４．
【非特許文献３】Ｌｉｍ  Ｄ  Ｊ（１９８６）Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｎｏｉｓｅ  ａｎｄ  ｏｔｏｔｏｘｉｃ  ｄｒｕｇｓ  ａｔ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｌｅｖｅｌ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｃｈｌｅａ：Ａ  ｒｅｖｉｅｗ．Ａｍ  Ｊ  Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ  ７：７３−９９．
【非特許文献４】Ｐｒｙｏｒ  Ｇ（１９９４）Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｕｄｉｔｏｒｙ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｉｎ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ．Ｃｈａｎｇ  Ｌ  Ｗ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．ＰＰ３４５−３７１．
【非特許文献５】Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎ，Ｒ．Ｗ．，Ｓｔａｄｎｉｃｋｉ，Ｓ．Ｗ．，Ｅｔｈｉｅｒ，Ｍ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｓｃｈａｅｐｐｉ，Ｕ．（１９７５）．Ｏｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｃｉｓ−ｄｉｃｈｌｏｒｏｄｉａｍｍｉｎｅ  ｐｌａｔｉｎｕｍ（ＩＩ）ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇ．Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３３：３２０−３３２．
【非特許文献６】Ｓｔａｄｎｉｃｋｉ，Ｓ．Ｗ．，Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎ，Ｒ．Ｗ．，Ｓｃｈａｅｐｐｉ，Ｕ．，ａｎｄ  Ｍｅｒｒｉａｍ，Ｐ．（１９７５）．Ｃｉｓ−ｄｉｃｈｌｏｒｏｄｉａｍｍｉｎｅｐｌａｔｉｎｕｍ（ＩＩ）（ＮＳＣ−１１９８７５）：Ｈｅａｒｉｎｇ  ｌｏｓｓ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｔｏｘｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｒｈｅｓｕｓ  ｍｏｎｋｅｙｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｒｅｐ．５９：４６７−４８０．
【非特許文献７】Ｎａｋａｉ，Ｙ．，Ｋｏｎｉｓｈｉ，Ｋ．，Ｃｈａｎｇ，Ｋ．Ｃ．，Ｏｈａｓｈｉ，Ｋ．，Ｍｏｒｉｓａｋｉ，Ｎ．，Ｍｉｎｏｗａ，Ｙ．，ａｎｄ  Ｍｏｒｉｍｏｔｏ，Ａ．（１９８２）．Ｏｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｄｒｕｇ  ｃｉｓｐｌａｔｉｎ．Ａｃｔａ  Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ  ９３：２２７−２３２．
【非特許文献８】Ｂｅｒｇｇｒｅｎ，Ｄ，Ａｎｎｉｋｏ，Ｍ，Ｔｈｏｒｎｅｌｌ，Ｌ．−Ｅ．，Ｒａｍａｅｋｅｒｓ，Ｆ．Ｃ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｖｉｒｔａｎｅｍ，Ｉ．（１９９０）．Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｆｉｌａｍｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｉｎｎｅｒ  ｅａｒ  ｏｆ  ｍｉｃｅ  ｕｎｄｅｒ  ｎｏｒｍａｌ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ａｆｔｅｒ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｔｏ  ｏｔｏｔｏｘｉｃ  ｄｒｕｇｓ．Ａｃｔａ  Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ．（Ｓｔｏｃｋｈ）１０９：５７−６５．
【非特許文献９】Ｈｏｏｄ  Ｊ  Ｌ，Ｂｅｒｌｉｎ  Ｃ  Ｉ，Ｅｄ．，Ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｈｅａｒｉｎｇ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ（Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８６）．
【非特許文献１０】Ｓｅｒａ，Ｋ．，Ｈａｒａｄａ，Ｙ．，Ｔａｇａｓｈｉｒａ，Ｎ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｍ．，Ｈｉｒａｋａｗａ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｏｈｙａ，Ｔ．（１９８７）．Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｖｅｓｔｉｂｕｌａｒ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａ  ａｎｄ  ｇａｎｇｌｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｏｔｏｔｏｘｉｃ  ｄｒｕｇ．Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｓｃ．１：１１９１−１１９７．
【非特許文献１１】Ｈｉｎｏｊｏｓａ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｌｅｒｎｅｒ，Ｓ．Ａ．（１９８７）．Ｃｏｃｈｌｅａｒ  ｎｅｕｒａｌ  ｄｅｇｅｒａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｈａｉｒ  ｃｅｌｌ  ｌｏｓｓ  ｉｎ  ｔｗｏ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  ｏｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．１５６：４４９−４５５
【非特許文献１２】Ｂａｒｅｇｇｉ，Ｒ．，Ｇｒｉｌｌ，Ｖ．，Ｎａｒｄｕｃｃｉ，Ｐ．，Ｚｗｅｙｅｒ，Ｍ．，Ｔｅｓｅｉ，Ｌ，ａｎｄ  Ｒｕｓｓｏｌｏ，Ｍ．（１９９０）．Ｇｅｎｅｔａｍｉｃｉｎ  ｏｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｕｌｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ａｆｔｅｒ  ｔｒａｎｓｔｙｍｐａｎｉｃ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．２２：６３５−６４４．
【非特許文献１３】Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，６ｔｈ  ｅｄ．，Ａ．Ｇｏｏｄｍａｎ  Ｇｉｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ；Ｍａｃｍｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１１６９−７１（１９８０）
【非特許文献１４】Ｃａｒｅｎｚａ，Ｌ．，Ｖｉｌｌａｎｉ，Ｃ．，Ｆｒａｍａｒｉｎｏ  ｄｅｉ  Ｍａｌａｔｅｓｔａ，Ｍ．Ｌ．，Ｐｒｏｓｐｅｒｉ  Ｐｏｒｔａ，Ｒ．，Ｍｉｌｌｅｆｉｏｒｉｎｅ，Ｍ．，Ａｎｔｏｎｉｎｉ，Ｇ．，Ｂｏｌａｓｃｏ，Ｐ．，Ｂａｎｄｉｅｒａ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｍａｒｚｅｔｔｉ，Ｌ．（１９８６）．Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ  ａｎｄ  ｏｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｄｉｃｈｌｏｒｏｄｉａｍｉｎｅｐｌａｔｉｎｕｍ：ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．２５：２４４−２４９．
【非特許文献１５】Ｍｙｅｒｓ  Ｅ  Ｎ，Ｂｅｒｓｔａｅｉｎ  Ｊ  Ｍ（１９６５）Ｓａｌｉｃｙｌａｔｅ  ｏｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：Ａ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｓｔｕｄｙ．Ａｒｃｈ  Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｌ  Ｈｅａｄ  Ｎｅｃｋ  Ｓｕｒｇ  ８２：４８３−４９３．
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【非特許文献１７】Ｒａｈｍａｎ，ＭＵ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．，Ｍａｙ；１３（３）：１８４−９，（２００１）
【非特許文献１８】Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８），Ｎｅｕｒｏｎ  １：６２３−６３４；
【非特許文献１９】Ｒｏｔｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４），Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．４：１８８４−１８９１；
【非特許文献２０】Ｃｈｏｉ  ｅｎｄ  Ｒｏｔｈｍａｎ，（１９９０），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１３：１７１−１８２；
【非特許文献２１】Ｄａｖｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８），Ｅｘｐ．Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．４６：６５７−６６２；
【非特許文献２２】Ｄｒｅｊｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５），Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．４５：１４５−１５１．
【非特許文献２３】Ｒｅａｇａｎ，Ｒ．Ｆ．，Ｅｘｃｉｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｎｅｒｖｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｔｒａｕｍａ，ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｎｅｒｖｏｕｓ  Ｔｒａｕｍａ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９４，ｐｐ．１７３−１８１（Ｓａｌｚｍａｎ  ＳＫ，Ｆａｄｅｎ  ＡＩ，ｅｄｓ）
【非特許文献２４】Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｍ．Ｂ．＆  Ｄｏｗｄ  ＬＡ，Ａｄｖ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，１９９７；３７：６９−１１５
【非特許文献２５】Ｋｅｒｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ  ２９８：３８３−３９５，１９９９
【非特許文献２６】Ｃｏｙｌｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｗａｒｔｚ，（１９７６），Ｎａｔｕｒｅ  ２６３：２４４−２４６；
【非特許文献２７】Ｍａｒａｇｏｓ  ｅｔ  ａｌ，（１９８７），ＴＩＮＳ  １０：６５−６８；
【非特許文献２８】Ｎａｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，（１９７８），Ｎａｔｕｒｅ  ２７１：６７６−６７７
【非特許文献２９】Ｓｐｅｎｃｅｒ  ｅｔ  ａｌ，（１９８６），Ｌａｎｃｅｔ  ２３９：１０６６−  １０６７；
【非特許文献３０】Ｃａｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ，（１９８６），Ｌａｎｃｅｔ  ２：１０６７−１０７０
【非特許文献３１】Ｄｙｋｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ，（１９８７），Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．４９：１２２２−１２２８．
【非特許文献３２】Ｌｉｐｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３０：６１３  ６２１）
【非特許文献３３】Ｍｅｌｄｒｕｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１１：３７９−３８７．
【非特許文献３４】Ｈｅｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７８：１３０７−１３１４
【非特許文献３５】Ｒｏｓｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．３１８：１３７−１４０．
【発明の概要】
【００２８】
本発明は一般に神経保護方法、そしてさらに特定的に、同じ神経原性外胚葉に由来する哺乳類内耳の神経組織及び細胞への、傷害、外傷、毒素あるいは急性又は慢性疾患プロセスから生ずる損傷の予防のための方法及び化合物に関する。
【００２９】
本発明は部分的に、カルバメート化合物の群の１つもしくはそれより多いメンバーの投与が、哺乳類神経系への一般的な保護効果を与え、そしてこの保護効果は同じ神経原性外胚葉に由来する哺乳類内耳の構成要素も含むという発見に基づく。これには；前庭神経節、蝸牛中の脊髄神経節ニューロン、耳小胞、一次聴覚受容器、すなわちコルティ器官中の有毛細胞及び一次聴覚ニューロンならびに第八神経のニューロンを含む、胚形成の間に同じ神経原性外胚葉、耳プラコードから誘導されるニューロン、蝸牛もしくは前庭系中の支持及び関連細胞あるいは聴覚もしくは前庭神経が含まれるが、これらに限られない。
【００３０】
本発明により与えられる神経保護には、神経傷害又は障害から、及び神経毒性又は耳毒性薬剤から生ずる損傷からの保護が含まれる。かくして本発明により与えられる神経保護又は耳保護は、耳毒性薬剤ならびに有毛細胞及び第八神経を含む蝸牛及び前庭系を冒すものを含む急性及び慢性変性障害からの毒性損傷の処置において有用である。
【００３１】
本発明により与えられる耳保護は、傷害を受けたか又は疾患の組織に、あるいは外傷性障害に導くと予測される事柄の間又はその前に予防的やり方で行なうことができる。
【００３２】
本発明は、本発明の化合物又はその製薬学的に許容され得る塩もしくはエステルの有効量を単独で、又は別の薬剤と組み合わせて、製薬学的に許容され得る賦形剤と一緒に患者に投与することにより、必要のある患者において耳保護を与えるためか；細胞変性又は細胞死を妨げるためか；耳変性疾患の処置又は予防のためか；あるいは化合物、例えば毒素；又は耳毒性副作用を及ぼす治療用化合物、例えば抗生物質又は化学療法薬の耳毒性効果を改善するための方法を提供する。
【００３３】
種々の態様において、患者、例えば人間は内耳への障害又は傷害に苦しみ得るか；あるいは；耳毒性薬剤暴露、外傷、耳鳴、免疫−媒介メニエール病を含むメニエール病、免疫−媒介蝸牛もしくは前庭障害（ＩＭＣＶＤ）、自己免疫耳疾患（ＡＩＥＤ）、コーガン症候群及び内耳又は第八神経を冒す虚血性事象から選ばれる状態に苦しみ得る。
【００３４】
従って、本発明は、式１又は式２：
【００３５】
【化１】
2010523468.tif 000003
【００３６】
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は独立して水素又はＣ１−Ｃ４アルキルであり；そしてＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４及びＸ５は独立して水素、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素である］
を有する少なくとも１種の化合物を含む組成物の治療的に有効な量を、必要のある患者に投与することを含んでなる耳保護を与える方法を提供する。式１又は式２の該Ｃ１−Ｃ４
アルキル基は置換されていることができるか、又は非置換であることができる。本発明の１つの側面において、Ｃ１−Ｃ４アルキル基はフェニル基で置換されている。フェニル基は非置換であるか又は置換されていることができる。ある態様において、フェニル基は非置換であるか、又はハロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、アミノ、ニトロ又はシアノで置換されている。
【００３７】
本発明において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４及びＸ５は水素、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素であることができる。ある態様において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４及びＸ５は独立して水素又は塩素である。本発明の好ましい態様において、Ｘ１はフッ素、塩素、臭素又はヨウ素である。１つの側面において、Ｘ１は塩素であり、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４及びＸ５は独立して水素である。別の好ましい態様において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は独立して水素である。
【００３８】
本発明は、患者における耳保護を与えるための式１又は式２のエナンチオマーを提供する。ある態様において、式１又は式２の化合物は、それらの単一のエナンチオマーの形態にあるであろう。他の態様において、式１又は式２の化合物は、一方のエナンチオマーが他方のエナンチオマーに関して優勢であるエナンチオマー混合物の形態にあるであろう。１つの側面において、そのエナンチオマーは９０％かもしくはそれより高い程度まで、あるいは９８％かもしくはそれより高い程度まで優勢であろう。
【００３９】
本発明は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４が独立して水素又はＣ１−Ｃ４アルキルであり；そしてＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４及びＸ５が独立して水素、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素である式１又は式２を有する少なくとも１種の化合物を含む組成物の耳保護的量を患者に投与することを含んでなる方法も提供する。１つの態様において、患者への組成物の投与の前に、患者が何らかの形態の急性又は慢性耳変性あるいは例えば毒性薬剤からの内耳傷害に苦しんでいるか否かに関して決定が成されるであろう。
【００４０】
本発明は、急性又は慢性耳変性あるいは内耳系傷害を発現する危険にある患者あるいは下記で定義される耳保護薬（ＯＰＤ）を用いる処置を必要とする患者を同定し、そして式１又は式２を有する少なくとも１種の化合物を含む組成物を患者に投与することを含んでなる方法も提供する。
【００４１】
本発明のある態様において、耳保護を与えるための式１又は式２を有する化合物の治療的に有効な量は、投薬当たり約０．０１ｍｇ／Ｋｇ〜投薬当たり約１５０ｍｇ／Ｋｇである。
【００４２】
ある態様において、１種もしくはそれより多い本発明のエナンチオマー又はその製薬学的に許容され得る塩もしくはエステル及び製薬学的に許容され得る担体又は賦形剤を含んでなる耳保護を与えるための製薬学的組成物の治療的に有効な量を、耳保護薬又はＯＰＤを用いる処置の必要な患者（ｓｕｂｊｅｃｔ）又は患者（ｐａｔｉｅｎｔ）に投与する。
【００４３】
式１又は式２を有する少なくとも１種の化合物を含んでなる製薬学的組成物を、投与の必要がある患者に投与する。ある態様において、耳保護薬又はＯＰＤを用いる処置の必要な患者（ｓｕｂｊｅｃｔ）又は患者（ｐａｔｉｅｎｔ）は、内耳の神経に由来する細胞への何らかの形態の急性外傷又は傷害を経験したか、あるいは何らかの形態の急性又は慢性耳変性障害を有する者であることができる。１つの側面において、患者（ｓｕｂｊｅｃｔ）又は患者（ｐａｔｉｅｎｔ）は、投与の時点に急性又は慢性耳変性障害を発現する危険にある、すなわち耳保護薬を用いる処置の必要な患者であると決定されるであろう。他の態様において、その必要にある患者は、投与の時点にそれらの内耳の細胞への急性傷害又は外傷を有する者である。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】Ｌｉ−Ｐｉｌｏ  ＳＥから１４日後にカウントされる海馬の種々の領域中のニューロンの数への、増加する投薬量の試験化合物の効果。値は、問題の各領域中のニューロン細胞体の数として表される。ｏｐ＜０．０５，●ｐ＜０．０１，試験化合物と標準ラットの間の統計的に有意な差；＃ｐ＜０．０５，＊ｐ＜０．０１，試験化合物とＤＺＰラットの間の統計的に有意な差。
【図２】Ｌｉ−Ｐｉｌｏ  ＳＥから１４日後にカウントされる大脳皮質の種々の領域中のニューロンの数への、増加する投薬量の試験化合物の効果。値は、問題の各領域中のニューロン細胞体の数として表される。ｏｐ＜０．０５，●ｐ＜０．０１，試験化合物と標準ラットの間の統計的に有意な差；＃ｐ＜０．０５，＊ｐ＜０．０１，試験化合物とＤＺＰラットの間の統計的に有意な差。略字：Ｄ：背側，Ｖ：腹側。
【図３】Ｌｉ−Ｐｉｌｏ  ＳＥから１４日後にカウントされる梨状皮質中のニューロンの数への、増加する投薬量の試験化合物の種々の（ｖａｒｉａｂｌｅ）神経保護効果。値は、問題の各領域中のニューロン細胞体の数として表される。ｏｐ＜０．０５，●ｐ＜０．０１，試験化合物と標準ラットの間の統計的に有意な差；＃ｐ＜０．０５，＊ｐ＜０．０１，試験化合物とＤＺＰラットの間の統計的に有意な差。θｐ＜０．０５，∞ｐ＜０．０１，与えられる量の試験化合物により処置されたラットの２つのサブグループ（Ａ及びＢ）の間の統計的に有意な差。略字：Ｄ：背側，Ｖ：腹側。
【図４】最初のＳＲＳまでの平均潜伏時間（Ａ）及び嗅内皮質の層ＩＩＩ／ＩＶ中に残るニューロンの数（Ｂ）への、増加する投薬量の試験化合物の効果。各グループ又はサブグループ中の動物の数を各棒の上に示す。  ６０、９０及び１２０ｍｇ／ｋｇの試験化合物で処置されたグループが明白に細分され、動物の大体半分がてんかんへの潜伏期の延長を示し、それは嗅内皮質の層ＩＩＩ／ＩＶ中に生き残っているニューロンの数と相関すると思われる。
【００４５】
発明の詳細な記述
前庭神経節、蝸牛中の脊髄神経節ニューロン、耳小胞、一次聴覚受容器、コルティ器官中の有毛細胞及び一次聴覚ニューロンならびに第八神経のニューロンを含む、胚形成の間に同じ神経原性外胚葉、耳プラコードから誘導されるニューロン、蝸牛もしくは前庭系中の支持及び関連細胞あるいは聴覚もしくは前庭神経を含むがこれらに限られない神経組織に由来する内耳のいずれかの種類の細胞の傷害又は損傷を有する患者は、これらの本発明の神経保護方法から利益を得るであろう。この神経系傷害は、例えば急性耳変性障害及び耳毒性薬剤、低酸素−虚血あるいは細胞の死又は瀕死（ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅ）を生ずるそれらの組み合わせにおけるように、これらの細胞への突然の障害又は急性の傷害の形態をとり得る。
【００４６】
傷害には；耳毒性薬剤暴露、外傷、耳鳴、免疫−媒介メニエール病を含むメニエール病、免疫−媒介蝸牛もしくは前庭障害（ＩＭＣＶＤ）、自己免疫耳疾患（ＡＩＥＤ）、コーガン症候群及び内耳又は第八神経を冒す虚血性事象、鈍的又は穿通頭部外傷から選ばれる状態から生じ得る内耳への障害又は傷害が含まれるが、これらに限られない。さらに酸素又は血液供給の奪取は一般に、虚血又は聴覚神経もしくは関連構造の梗塞を含むがこれらに限られない低酸素及び／又は虚血におけるような急性の傷害を引き起こし得る。
【００４７】
１つの好ましい態様において、本発明の化合物を用い、抗生物質及び化学療法薬を含むがこれらに限られない耳毒性薬剤の投与から生ずる内耳のニューロン細胞及びニューロン由来細胞への外傷及び進行性傷害を含む障害における耳保護を与える。
【００４８】
従って、本明細書で用いられる「耳保護」又は「耳保護的」という用語は、人間を含む哺乳類の：神経細胞；第八又は聴覚神経のニューロン、蝸牛を含む、胚形成の間に同じ神経原性外胚葉、耳プラコードから誘導される細胞を含む軸索又はそれらの支持もしくは関連細胞；前庭系、前庭神経；一次聴覚受容器、コルティ器官中の有毛細胞；一次聴覚ニューロン；蝸牛中の脊髄神経節ニューロン「ＳＧＮ」及び前庭神経節ニューロン（「ＶＧＮ」）の機能不全の重度、変性又は死を妨げるか、予防するか、改善するか又は減少させることを意味する。これは外傷、変性疾患の処置又は予防ならびに薬剤又は毒素（例えば抗生物質及び化学療法薬又は他の毒素）の耳毒性効果に対する保護を含む。
【００４９】
従って、本明細書で用いられる「耳保護薬（ＯＰＤ）を用いる処置の必要な患者」という用語は、上記の症候群又は障害のいずれかを現在有するか又は発現し得るか、あるいは耳毒性薬剤投与を必要としているか又は受けたか、あるいは患者の現在の臨床的状態もしくは予後が；人間を含む哺乳類の第八神経のニューロン；蝸牛；前庭系；一次聴覚受容器、コルティ器官中の有毛細胞；一次聴覚ニューロン；蝸牛中の脊髄神経節ニューロン「ＳＧＮ」及び前庭神経節ニューロン（「ＶＧＮ」）を含む疾患又は障害の発現、拡大（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）、悪化もしくはその処置への抵抗の増加を妨げるために耳保護を与えることから利益を受け得るいずれかの障害を有した患者を指す。
【００５０】
本明細書で用いられる「処置する」又は「処置」という用語は、軽減；軽快；症状の漸減又は傷害、病状もしくは状態を患者にとってより耐えられるものとすること；変性又は衰弱の速度を遅くすること；変性の最終点をあまり衰弱しないものにすること；あるいは患者の身体的もしくは精神的安寧を向上させることのような客観的もしくは主観的パラメーターを含む、傷害、病状又は状態の予防もしくは改善における成功のしるしを指す。処置又は症状の改善は；身体的試験及び／又は神経学的試験の結果を含む客観的もしくは主観的パラメーターに基づくことができる。従って「処置する」又は「処置」という用語は、耳保護を与えるための本発明の化合物又は薬剤の投与を含む。
【００５１】
本明細書で用いられる「治療的効果」という用語は、患者の内耳の細胞の死又は損傷又は機能不全を妨げるか又は最小にするための耳保護効果の有効な提供（ｐｒｏｖｉｓｉｏｎ）を指す。
【００５２】
本明細書で用いられる「治療的に有効な量」という用語は、耳保護処置の必要な患者（ｓｕｂｊｅｃｔ）又は患者（ｐａｔｉｅｎｔ）において上記で定義した治療的効果を生むのに十分な１種もしくはそれより多い本発明の化合物の量を意味する。
【００５３】
「患者（ｓｕｂｊｅｃｔ）」又は「患者（ｐａｔｉｅｎｔ）」という用語は本明細書で互換的に用いられ、本明細書で用いられる場合、本発明の組成物を投与することができる人間の患者（ｐａｔｉｅｎｔ）もしくは患者（ｓｕｂｊｅｃｔ）を含む人間を含むがこれに限られない哺乳類を意味する。哺乳類という用語は、人間の患者及びヒト以下の霊長類ならびにウサギ、ラット及びマウスのような実験動物及び他の動物を含む。
【００５４】
いくつかの態様において、本発明の方法は、カルバメート化合物を用いて有効に処置されることが当該技術分野において知られている状態に苦しんでいないか、又は苦しんでいることが知られていない患者を処置するために有利に用いられるであろう。これらの場合、本発明の方法及び化合物を用いる決定は、患者が上記で定義された「耳保護薬（ＯＰＤ）を用いる処置の必要な患者」であるかどうかの決定に基づいて成される。
【００５５】
いくつかの態様において、本発明は耳保護の方法を提供する。ある態様において、これらの方法は、内耳の細胞への傷害又は損傷の明白な臨床的兆候又は症状をまだ発現してい
ないが、疾患、傷害又は外傷の故に、あるいは耳毒性薬剤を投与する必要性のために、あるいは生化学的もしくは遺伝的な何らかの既知の素因又はこれらの障害の１つもしくはそれより多くの立証されたバイオマーカーの発見の故に、そのような損傷の発現に関する危険度の高いグループに属しているかも知れない患者に、本発明のカルバメート化合物の治療的に有効な量を投与することを含む。
【００５６】
かくしていくつかの態様において、本発明の方法及び組成物は、内耳損傷を発現する危険にあるが、臨床的証拠を発現していない患者における耳保護を目的とする。この患者は簡単に、患者又は彼らの家族中のいずれかの因子の認識、病歴、身体検査又は内耳損傷を発現する平均より高い危険を示す試験により決定される「より大きな危険」にあり得る。従って、いずれかの利用可能な手段による、患者が「より大きな危険」にあり得ることのこの決定を用い、患者を本発明の方法を用いて処置するべきかどうかを決定することができる。
【００５７】
従って、代表的な態様において、内耳損傷に関する危険因子を決定するために容認されているスクリーニング法を用い、本発明の方法及び化合物による処置から利益を受けることができる患者を同定することができる。これらのスクリーニング法は、例えば危険因子及び耳毒性である薬剤を用いる処置を決定するための通常の追及試験（ｗｏｒｋ−ｕｐｓ）を含む。
【００５８】
臨床的兆候又は症状を有していない患者の中で、どの患者がＯＰＤを用いる処置から利益を受けることができるかの決定は、多様な「代理マーカー」又は「バイオマーカー」に基づくことができる。
【００５９】
本明細書で用いられる場合、「代理マーカー」及び「バイオマーカー」という用語は互換的に用いられ、ニューロン損傷又は内耳損傷の現在の存在又は将来の発現と容易に関連づけることができるいずれかの解剖学的、生化学的、構造的、電気的、遺伝的又は化学的指示物質（ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）又はマーカーを指す。いくつかの場合、コンピューター断層撮影法（ＣＴ）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）又は陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）のような脳−画像法を用いて、患者がニューロン損傷に関する危険にあるかどうかを決定することができる。
【００６０】
多様な検出法を利用するもっと多くのそのようなバイオマーカーが将来開発されるであろうことが期待される。本明細書で用いられるそのようなニューロン損傷の存在又はあり得る将来の発現のマーカーもしくは指示物質を、本発明の方法において、本発明の化合物及び方法を用いる処置に関する必要性を決定するために用いることができることが意図されている。
【００６１】
患者が内耳損傷を有するか、又は発現に関する危険にあり得ることの決定は、例えば徹底的な病歴（ｔｈｏｒｏｕｇｈ  ｈｉｓｔｏｒｙ）、身体検査及び一系列の関連血液検査を含む医学的評価も含む。それも脳波（ＥＥＧ）、ＣＴ、ＭＲＩ又はＰＥＴ走査を含み得る。
【００６２】
本発明のカルバメート化合物
本発明は、必要のある患者に耳保護を与えるための２−フェニル−１，２−エタンジオールモノカルバメート及びジカルバメートの使用方法を提供する。
【００６３】
本発明の方法で用いられるカルバメートエナンチオマーを含むカルバメート化合物の合成及び精製のための適した方法は、当該技術分野における熟練者に周知である。例えば２−フェニル−１，２−エタンジオールモノカルバメート及びジカルバメートの純粋なエナ
ンチオマー形態及びエナンチオマー混合物は、米国特許第５，８５４，２８３号明細書、第５，６９８，５８８号明細書及び第６，１０３，７５９号明細書に記載されており、それらの開示は引用することによりその全体が本明細書の内容となる。
【００６４】
本発明に従う代表的なカルバメート化合物は、式１又は式２：
【００６５】
【化２】
2010523468.tif 000004
【００６６】
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は独立して水素又はＣ１−Ｃ４アルキルであり、そしてＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４及びＸ５は独立して水素、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素である］
を有するものを含む。
【００６７】
本明細書で用いられる「Ｃ１−Ｃ４アルキル」は、１〜４個の炭素原子を有する置換もしくは非置換脂肪族炭化水素を指す。特に「アルキル」の定義内に含まれるのは、場合により置換されていることができる脂肪族炭化水素である。本発明の好ましい態様において、Ｃ１−Ｃ４アルキルは非置換であるか、又はフェニルで置換されている。
【００６８】
本明細書で用いられる「フェニル」という用語は、単独で用いられても又は他の基の一部として用いられても、６個の炭素原子を有する置換もしくは非置換芳香族炭化水素環基として定義される。特に「フェニル」の定義内に含まれるのは、場合により置換されていることができるフェニル基である。例えば本発明の好ましい態様において、「フェニル」
基は非置換であるか、又はハロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、アミノ、ニトロ又はシアノで置換されている。
【００６９】
本発明の好ましい態様において、Ｘ１はフッ素、塩素、臭素又はヨウ素であり、そしてＸ２、Ｘ３、Ｘ４及びＸ５は水素である。
【００７０】
本発明の別の好ましい態様において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４及びＸ５は独立して塩素又は水素である。
【００７１】
本発明の別の好ましい態様において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４はすべて水素である。
【００７２】
本発明の化合物上の置換基及び置換パターンは、化学的に安定であり、且つ当該技術分野において既知の方法ならびに本明細書において与えられる方法により容易に合成することができる化合物を与えるように、当該技術分野における通常の熟練者によって選ばれ得ることが理解される。
【００７３】
代表的な２−フェニル−１，２−エタンジオールモノカルバメート及びジカルバメートには、例えば以下の化合物が含まれる：
【００７４】
【化３】
2010523468.tif 000005
【００７５】
【化４】
2010523468.tif 000006
【００７６】
本発明は、単離された式１又は式２のエナンチオマーの使用を含む。１つの好ましい態様において、単離された式１のＳ−エナンチオマーを含んでなる製薬学的組成物を用いて、患者において神経保護を与える。別の好ましい態様において、単離された式２のＲ−エナンチオマーを含んでなる製薬学的組成物を用いて、患者において神経保護を与える。他の態様において、単離された式１のＳ−エナンチオマー及び単離された式２のＲ−エナンチオマーを含んでなる製薬学的組成物を用いて、患者において神経保護を与える。
【００７７】
本発明は、式１又は２のエナンチオマーの混合物の使用も含む。本発明の１つの側面において、一つのエナンチオマーが優勢であろう。混合物中で優勢なエナンチオマーは、混合物中に存在する他のエナンチオマーのいずれよりも多い量で、例えば５０％より多い量で混合物中に存在するものである。１つの側面において、１つのエナンチオマーは、９０％の程度まで、あるいは９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％又は９８％かもしくはそれより高い程度まで優勢であろう。１つの好ましい態様において、式１の化合物を含んでなる組成物中で優勢なエナンチオマーは、式１のＳ−エナンチオマーである。他の好ましい態様において、式２の化合物を含んでなる組成物中で優勢なエナンチオマーは、式２のＲ−エナンチオマーである。
【００７８】
本発明の好ましい態様において、本発明の組成物中に単独のエナンチオマーとして又は優勢なエナンチオマーとして存在するエナンチオマーは、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４が上記の通りに定義される式３もしくは式５又は式７もしくは式８により示される。
【００７９】
【化５】
2010523468.tif 000007
【００８０】
【化６】
2010523468.tif 000008
【００８１】
本発明は、式１及び式２により示される化合物のエナンチオマー及びエナンチオマー混合物の使用方法を提供する。式１又は式２のカルバメートエナンチオマーは、フェニル環に隣接する脂肪族炭素であるベンジル位置に不斉キラル炭素を含有する。
【００８２】
単離されるエナンチオマーは、実質的に対応するエナンチオマーを含まないものである。かくして単離されるエナンチオマーは、分離法を介して分離されるか、又は対応するエナンチオマーを含まずに製造される化合物を指す。本明細書で用いられる「実質的に含まない」という用語は、化合物が有意により大きい割合の１つのエナンチオマーで構成されていることを意味する。好ましい態様において、化合物は少なくとも約９０重量％の好ましいエナンチオマーを含む。本発明の他の態様において、化合物は少なくとも約９９重量％の好ましいエナンチオマーを含む。高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及びキラル塩の形成及び結晶化を含む当該技術分野における熟練者に既知のいずれかの方法により、好ましいエナンチオマーをラセミ混合物から単離することができるか、あるいは本明細書に記載する方法により、好ましいエナンチオマーを製造することができる。
【００８３】
好ましいエナンチオマーの製造方法は、当該技術分野における熟練者に既知であり、且つ例えばＪａｃｑｕｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ，Ｒａｃｅｍａｔｅｓ
ａｎｄ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８１）；Ｗｉｌｅｎ，Ｓ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ
３３：２７２５（１９７７）；Ｅｌｉｅｌ，Ｅ．Ｌ．Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
ｏｆ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，ＮＹ，１９６２）；及びＷｉｌｅｎ，Ｓ．Ｈ．Ｔａｂｌｅｓ  ｏｆ  Ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｐ．２６８（Ｅ．Ｌ．Ｅｌｉｅｌ，Ｅｄ．，Ｕｎｉｖ．ｏｆ  Ｎｏｔｒｅ  Ｄａｍｅ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｏｔｒｅ  Ｄａｍｅ，ＩＮ  １９７２）に記載されている。
【００８４】
さらに本発明の化合物を、米国特許第３，２６５，７２８号明細書（その開示は引用することによりその記載事項全体が且つすべての目的に関して本明細書の内容となる）、第３，３１３，６９２号明細書（その開示は引用することによりその記載事項全体が且つすべての目的に関して本明細書の内容となる）ならびに前に引用した米国特許第５，８５４，２８３号明細書、第５，６９８，５８８号明細書及び第６，１０３，７５９号明細書（それらの開示は引用することによりその記載事項全体が且つすべての目的に関して本明細書の内容となる）に記載されている通りに製造することができる。
【００８５】
製薬学的薬剤としてのカルバメート化合物：
本発明は、製薬学的薬剤としての式１及び／又は式２のエナンチオマー混合物及び単離されたエナンチオマーを提供する。カルバメート化合物は、患者における神経保護を与えるための製薬学的薬剤として調製される。
【００８６】
一般に、経口的、頬的、局所的、全身的（例えば経皮的、鼻内もしくは座薬による）あるいは非経口的（例えば筋肉内、皮下もしくは静脈内注入）を含む、治療薬を投与するために当該技術分野において既知の方法により、本発明のカルバメート化合物を製薬学的組成物として投与することができる。神経系への化合物の直接の投与は、ポンプ装置を用いるかもしくは用いない頭蓋内もしくは脊椎内針もしくはカテーテルを介する送達による、例えば大脳内、脳室内（ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）、脳室内（ｉｎｔａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）、硬膜下腔内、槽内、脊髄内への投与又は脊髄−周囲投与経路を含むことができる。
【００８７】
組成物は錠剤、丸薬、カプセル、半固体、粉剤、徐放性調剤、溶液、懸濁剤、乳剤、シロップ、エリキシル剤、エアゾール又は他のいずれかの適した組成物の形態をとることができ；そして少なくとも１種の製薬学的に許容され得る賦形剤と組み合わされた少なくとも１種の本発明の化合物を含む。適した賦形剤は当該技術分野における通常の熟練者に周知であり、それら及び組成物の調製方法は、Ａｌｆｏｎｓｏ  ＡＲ：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９８５のような標準的な参照文献において見出すことができ、その開示は引用することによりその記載事項全体が、且つすべての目的に関して本明細書の内容となる。特に注入可能な溶液のために適した液体担体には、水、食塩水、デキストロース水溶液及びグリコールが含まれる。
【００８８】
カルバメート化合物を水性懸濁剤として与えることができる。本発明の水性懸濁剤は、水性懸濁剤の製造に適した賦形剤と混合されたカルバメート化合物を含有することができる。そのような賦形剤には、例えば懸濁化剤、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム及びアラビアゴムならびに分散剤又は湿潤剤、例えば天然に存在するホスファチド（例えばレシチン）、アルキレンオキシドと脂肪酸の縮合生成物（例えばポリオキシエレチンステアレート）、エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールの縮合生成物（例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール）、エチレンオキシド及び脂肪酸とヘキシトールに由来する部分的エステルの縮合生成物（例えばポリオキシエチレンソルビトールモノ−オレート）あるいはエチレンオキシド及び脂肪酸とヘキシトール無水物に由来する部分的エステルの縮合生成物（例えばポリオキシエチレンソルビタンモノ−オレート）が含まれ得る。
【００８９】
水性懸濁剤は、１種もしくはそれより多い防腐剤、例えばｐ−ヒドロキシ安息香酸エチルもしくはｎ−プロピル、１種もしくはそれより多い着色剤、１種もしくはそれより多い風味剤及び１種もしくはそれより多い甘味料、例えばスクロース、アスパルテームもしくはサッカリンも含有することができる。調剤を浸透圧（ｏｓｍｏｌａｒｉｔｙ）に関して調整することができる。
【００９０】
本方法において用いるための油懸濁剤は、アラキス油、オリーブ油、ゴマ油もしくはココナツ油のような植物油又は液体パラフィンのような鉱油；あるいはこれらの混合物中にカルバメート化合物を懸濁させることにより、調製することができる。油懸濁剤は、蜜蝋、硬質パラフィン又はセチルアルコールのような増粘剤を含有することができる。グリセロール、ソルビトール又はスクロースのような甘味料を加えて、口に合う経口用調製物を与えることができる。アスコルビン酸のような酸化防止剤の添加により、これらの調剤を防腐することができる。注入可能な油ビヒクルの例として、Ｍｉｎｔｏ，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２８１：９３−１０２，１９９７を参照されたい。本発明の製薬学的調剤は、水中油型乳剤の形態にあることもできる。油相は、上記の植物油又は鉱油あるいはこれらの混合物であることができる。
【００９１】
適した乳化剤には天然に存在するゴム、例えばアラビアゴム及びトラガカントゴム、天然に存在するホスファチド、例えば大豆レシチン、脂肪酸とヘキシトール無水物に由来するエステル又は部分的エステル、例えばソルビタンモノ−オレートならびにこれらの部分的エステルとエチレンオキシドの縮合生成物、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノ−オレートが含まれる。シロップ及びエルキシル剤の調製におけると同様に、乳剤も甘味料及び風味剤を含有することができる。そのような調剤は粘滑薬、防腐剤又は着色剤も含有することができる。
【００９２】
選ばれる化合物を単独で、又は他の適した成分と組み合わせて、吸入を介して投与されるべきエアゾール調剤とすることができる（すなわちそれらを「噴霧する」ことができる）。エアゾール調剤を、例えばジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などのような許容され得る加圧プロペラント中に入れることができる。
【００９３】
例えば関節内（ｉｎｔｒａａｒｔｉｃｕｌａｒ）（関節（ｊｏｉｎｔｓ）における）、静脈内、筋肉内、皮膚内、腹膜内及び皮下経路によるような非経口的投与に適した本発明の調剤には、酸化防止剤、緩衝剤、静菌薬及び調剤を意図される受容者の血液と等張にする溶質を含有することができる水性及び非−水性、等張無菌注入用溶液ならびに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤及び防腐剤を含むことができる水性及び非−水性無菌懸濁剤が含まれ得る。用いることができる許容され得るビヒクル及び溶媒の中には、水及びリンゲル液、等張塩化ナトリウムがある。さらに、無菌の固定油を、通常、溶媒又は懸濁媒体として用いることができる。この目的のために、合成モノ−もしくはジグリセリドを含むいずれの無刺激固定油も用いることができる。さらに、オレイン酸のような脂肪酸を、注入可能なものの調製において同様に用いることができる。これらの溶液は無菌であり、一般に望ましくない物質を含まない。
【００９４】
化合物が十分に可溶性である場合、プロピレングリコール又はポリエチレングリコールのような適した有機溶媒を用いて、又は用いずに、それらを通常の食塩水（ｎｏｒｍａｌ
ｓａｌｉｎｅ）中に直接溶解することができる。デンプン水溶液又はナトリウムカルボキシメチルセルロース溶液中、あるいはアラキス油のような適した油中で、微粉砕された化合物の分散液を構成することができる。これらの調剤を、通常の周知の滅菌法により滅菌することができる。調剤は、生理学的条件に近づけるために必要な場合、製薬学的に許容され得る補助物質、例えばｐＨ調整及び緩衝剤、毒性調整剤、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含有することができる。
【００９５】
これらの調剤中のカルバメート化合物の濃度は広く変わることができ、選ばれる特定の投与様式及び患者の必要性に従い、主に流体体積、粘度、体重などに基づいて選ばれるであろう。静脈内投与のために、調剤は無菌の注入可能な調製物、例えば無菌の注入可能な水性もしくは油性懸濁剤であることができる。この懸濁剤は、適した分散もしくは湿潤剤及び懸濁化剤を用いる既知の技術に従って調製することができる。無菌の注入可能な調製物は、無毒性の非経口的に許容され得る希釈剤又は溶媒中の無菌の注入可能な溶液又は懸濁剤、例えば１，３−ブタンジオールの溶液であることもできる。推薦される調剤は、単位−投薬量又は多−投薬量密封容器、例えばアンプル及びバイアル中で与えられ得る。注入用溶液及び懸濁剤を、前に記載した種類の無菌の粉剤、顆粒剤及び錠剤から調製することができる。
【００９６】
本発明の実施における使用に適したカルバメート化合物は経口的に投与され得、且つ好ましくは経口的に投与される。組成物中の本発明の化合物の量は、組成物の型、単位投薬量のサイズ、賦形剤の種類及び当該技術分野における通常の熟練者に周知の他の因子に依
存して、広く変わることができる。一般に最終的な組成物は、例えば１．０重量パーセント（％ｗ）〜９５％ｗのカルバメート化合物、好ましくは１０．０％ｗ〜９０％ｗのカルバメート化合物を含むことができ、残りは１種もしくはそれより多い賦形剤である。
【００９７】
経口的投与のための製薬学的調剤は、当該技術分野において周知の製薬学的に許容され得る担体を用い、経口的投与に適した投薬量で調製され得る。そのような担体は、患者が摂取するのに適した錠剤、丸薬、粉剤、糖衣丸、カプセル、液剤、ロゼンジ、ゲル、シロップ、スラリ、懸濁剤などのような単位投薬形態物において製薬学的調剤を調製することを可能にする。
【００９８】
経口的投与に適した調剤は、（ａ）水、食塩水又はＰＥＧ  ４００のような希釈剤中に懸濁された有効量の製薬学的調剤のような液体溶液（ｌｉｑｕｉｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）；（ｂ）それぞれあらかじめ決められた量の液体、固体、顆粒又はゼラチンとしての活性成分を含有するカプセル、サッシェ（ｓａｃｈｅｔｓ）又は錠剤；（ｃ）適した液体中の懸濁剤；ならびに（ｄ）適した乳剤から成ることができる。
【００９９】
本発明の化合物と固体賦形剤を合わせ、得られる混合物を場合により磨砕し、必要なら適した追加の化合物を加えた後に顆粒の混合物を処理して錠剤又は糖衣丸芯を得ることを介して、経口的使用のための製薬学的調製物を得ることができる。適した固体賦形剤は炭水化物又はタンパク質充填剤であり、ラクトース、スクロース、マンニトール又はソルビトールを含む糖類；コーン、コムギ、イネ、ポテト又は他の植物からのデンプン；セルロース、例えばメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース又はナトリウムカルボキシメチルセルロース；及びアラビアゴム及びトラガカントゴムを含むゴム；ならびにゼラチン及びコラーゲンのようなタンパク質を含むが、これらに限られない。必要なら、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸又はその塩、例えばアルギン酸ナトリウムにような崩壊剤又は可溶化剤を加えることができる。錠剤形態物は、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、リン酸カルシウム、コーンスターチ、ポテトデンプン、微結晶性セルロース、ゼラチン、コロイド二酸化ケイ素、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸及び他の賦形剤、着色剤、充填剤、結合剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、防腐剤、風味剤、染料、崩壊剤及び製薬学的に適合性の担体の１つもしくはそれより多くを含むことができる。ロゼンジ形態物は、風味剤、例えばスクロース中に活性成分を含むことができ、ならびに錠剤（ｐａｓｔｉｌｌｅｓ）は、活性成分の他に当該技術分野において既知の担体を含有するゼラチン及びグリセリン又はスクロース及びアラビアゴムエマルション（ａｃａｃｉａ  ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ）、ゲルなどのような不活性基剤中に活性成分を含む。
【０１００】
本発明の化合物を、薬剤の直腸的投与のために座薬の形態で投与することもできる。これらの調剤は、常温で固体であるが、直腸温度で液体であり、従って直腸中で融解して薬剤を放出するであろう適した非−刺激性の賦形剤と薬剤を混合することにより調製され得る。そのような材料はココアバター及びポリエチレングリコールである。
【０１０１】
本発明の化合物を、座薬、吹入剤、粉剤及びエアゾール調剤を含む鼻内、眼内、膣内及び直腸内経路により投与することもできる（ステロイド吸入剤の例に関し、Ｒｏｈａｔａｇｉ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３５：１１８７−１１９３，１９９５；Ｔｊｗａ，Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｓｔｈｍａ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．７５：１０７−１１１，１９９５を参照されたい）。
【０１０２】
アプリケータースティック、溶液、懸濁剤、乳剤、ゲル、クリーム、軟膏、パスタ剤、ジェリー、塗布剤、粉剤及びエアゾールとして調製される本発明の化合物を、局所的経路により経皮的に送達することができる。
【０１０３】
カプセル封入材料を本発明の化合物と一緒に用いることもでき、「組成物」という用語は他の担体を用いるか又は用いない調剤としてのカプセル封入材料と組み合わされた活性成分を含み得る。例えば本発明の化合物を体内における遅延放出のための微小球として送達することもできる。１つの態様において、皮下的にゆっくり放出する薬剤（例えばミフェプリストン（ｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅ）−含有微小球の皮膚内注入を介して（Ｒａｏ，Ｊ．Ｂｉｏｍａｔｅｒ  Ｓｃｉ．Ｐｏｌｙｍ．Ｅｄ．７：６２３−６４５，１９９５を参照されたい）；生分解性且つ注入可能なゲル調剤として（例えばＧａｏ，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１２：８５７−８６３，１９９５を参照されたい）；あるいは経口的投与のための微小球として（例えばＥｙｌｅｓ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４９：６６９−６７４，１９９７を参照されたい）、微小球を投与することができる。経皮的及び皮膚内経路の両方とも、数週間又は数ヶ月間の一定の送達を与える。本発明の化合物の送達においてカシェ剤を用いることもできる。
【０１０４】
他の態様において、細胞膜と融合するか、又はエンドサイトーシスされるリポソームの使用により、すなわち細胞の表面膜タンパク質受容体に結合してエンドサイトーシスを生ずるリポソームに結合するリガンドを用いることにより、本発明の化合物を送達することができる。リポソームの使用により、特にリポソーム表面が標的細胞に特異的であるか又はそうでなければ特定の器官に優先的に向かうリガンドを有している場合、カルバメート化合物の送達を生体内で標的細胞に集中させることができる。（例えばＡｌ−Ｍｕｈａｍｍｅｄ，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ．１３：２９３−３０６，１９９６；Ｃｈｏｎｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６：６９８−７０８，１９９５；Ｏｓｔｒｏ，Ａｍ．Ｊ．Ｈｏｓｐ．Ｐｈａｒｍ．４６：１５７６−１５８７，１９８９を参照されたい）。
【０１０５】
本発明の製薬学的調剤を塩として与えることができ、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などを含むがこれらに限られない多くの酸を用いて形成され得る。塩は、対応する遊離の塩基形態より水性又は他のプロトン性溶媒中で可溶性である傾向がある。他の場合、好ましい調製物は凍結乾燥された粉剤であることができ、それは４．５〜５．５のｐＨ範囲で例えば以下：１ｍＭ〜５０ｍＭ  ヒスチジン、０．１％〜２％  スクロース、２％〜７％  マンニトールのいずれか又はすべてを含有することができ、使用前に緩衝剤と合わされる。
【０１０６】
製薬学的に許容され得る塩及びエステルは、製薬学的に許容され得、且つ所望の薬理学的性質を有する塩及びエステルを指す。そのような塩は、化合物中に存在する酸性プロトンが無機もしくは有機塩基と反応することができる場合に生成し得る塩を含む。適した無機塩は、アルカリ金属、例えばナトリウム及びカリウム、マグネシウム、カルシウム及びアルミニウムと形成されるものを含む。適した有機塩は、アミン塩基、例えばエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、Ｎ  メチルグルカミンなどのような有機塩基と形成されるものを含む。
【０１０７】
製薬学的に許容され得る塩は、本化合物中のアミン部分と無機酸（例えば塩酸及び臭化水素酸）及び有機酸（例えば酢酸、クエン酸、マレイン酸ならびにアルカン−及びアレン−スルホン酸、例えばメタンスルホン酸及びベンゼンスルホン酸）の反応から形成される酸付加塩も含むことができる。製薬学的に許容され得るエステルは、化合物中に存在するカルボキシ、スルホニルオキシ及びホスホノキシ基から形成されるエステルを含む。２個の酸性基が存在する場合、製薬学的に許容され得る塩又はエステルは、モノ−酸−モノ−塩もしくはエステル又はジ−塩もしくはエステルであることができ；そして類似して、２個より多い酸性基が存在する場合、そのような基のいくつか又はすべてが塩化又はエステル化されることができる。
【０１０８】
本発明で名を挙げられる化合物は、非塩化もしくは非エステル化形態あるいは塩化及び／又はエステル化形態で存在することができ、そのような化合物の名を挙げることは、基の（非塩化及び非エステル化）化合物ならびにその製薬学的に許容され得る塩及びエステルの両方を含むことが意図されている。本発明は、式１及び式２の製薬学的に許容され得る塩及びエステル形態を含む。式１又は式２のエナンチオマーの１つより多い結晶形が存在し得、従ってそれらも本発明に含まれる。
【０１０９】
本発明の製薬学的組成物は場合により、カルバメート化合物の他に、神経保護を与えることと関連する疾患又は状態の処置において有用な少なくとも１種の他の治療薬を含有することができる。
【０１１０】
製薬学的組成物の調製方法は、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃにより出版されたＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ．Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｒｅｖｉｓｅｄ  ａｎｄ  Ｅｘｐａｎｄｅｄ．Ｖｏｌｕｍｅｓ  １−３，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ編集；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｖｏｌｕｍｅｓ
１−２，Ａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ編集；及びＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｖｏｌｕｍｅｓ  １−２，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ編集のような多数の出版物中に記載されており、それらの開示は引用することによりその記載事項全体が、且つすべての目的に関して本明細書の内容となる。
【０１１１】
製薬学的組成物は一般に無菌、実質的に等張として、且つアメリカ食品医薬品庁のすべてのＧｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（ＧＭＰ）規定に完全に従って調製される。
【０１１２】
投薬管理
本発明は、カルバメート化合物を用い、哺乳類において神経保護を与える方法を提供する。神経保護を与えるのに必要なカルバメート化合物の量は、治療的に又は製薬学的に有効な投薬量として定義される。この使用のために有効な投薬スケジュール及び量、すなわち投薬（ｄｏｓｉｎｇ）又は投薬（ｄｏｓａｇｅ）管理は、病期、患者の身体的状態、年令などを含む多様な因子に依存するであろう。患者に関する投薬管理の計算において、投与様式も考慮される。
【０１１３】
当該技術分野における通常の熟練者は、その熟練及び本開示を考慮して、過度の実験なしで、本発明の実施のための特定の置換カルバメート化合物の治療的に有効な量を決定することができるであろう（例えばＬｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ（Ｖｏｌｓ．１−３，１９９２）；Ｌｌｏｙｄ，１９９９，Ｔｈｅ  ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ；及びＰｉｃｋａｒ，１９９９，Ｄｏｓａｇｅ
Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓを参照されたい）。治療的に有効な投薬量は、活性薬剤の毒性の又は不利益な副作用が、臨床的な点で治療的に有益な効果により十二分に補われている投薬量でもある。それぞれの特定の患者に関し、個々の必要性及び化合物を投与するか又はそれを監督する人の専門的な判断に従って、特定の投薬管理が時間を経て評価され、且つ調整されるべきであることがさらに注目されるべきである。
【０１１４】
処置目的のために、本明細書で開示される組成物又は化合物を１回の大型丸薬送達において、長時間に及ぶ継続的送達を介して、あるいは繰り返し投与案において（例えば毎時、毎日又は毎週の繰り返し投与案により）患者に投与することができる。本発明の製薬学的調剤を、例えば毎日１回かもしくはそれより多数回、１週間当たり３回又は毎週投与することができる。本発明の１つの態様において、本発明の製薬学的調剤は、毎日１又は２回、経口的に投与される。
【０１１５】
例えば患者が損傷的傷害（ｄａｍａｇｉｎｇ  ｉｎｊｕｒｙ）又は他の初期障害に苦しんだ後だが、患者が内耳障害又は傷害の他の症状発現を有すると診断される前に、本発明の化合物を用いる処置管理を始めることができる。１つの態様において、内耳傷害を発現する高い危険にあると同定される患者又は内耳損傷を発現する危険と関連する疾患、例えば耳鳴、メニエール病又は耳毒性薬への暴露を有する患者は、本発明のカルバメート化合物を用いる処置管理を始めることができる。
【０１１６】
これに関し、生物学的に活性な薬剤の治療的に有効な投薬量は、神経保護を与えるために臨床的に有意な結果を与えるであろう長期処置管理内に繰り返される投薬量を含むことができる。これに関する有効な投薬量の決定は、典型的には動物モデル研究及びそれに続く人間の臨床試験に基づき、患者において標的とされる暴露症状（ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｓｙｍｐｔｏｍｓ）又は状態の発生もしくはそれらの重度を有意に軽減する有効な投薬量及び投与案の決定により導かれる。これに関して適したモデルには、例えばネズミ、ラット、ブタ、ネコ、ヒト以下の霊長類及び当該技術分野において既知の他の容認されている動物モデル被験体が含まれる。あるいはまた、試験管内モデルを用いて（例えば免疫学的及び組織病理学的アッセイ）有効な投薬量を決定することができる。そのようなモデルを用いると、生物学的に活性な薬剤の治療的に有効な量を投与するために適した濃度及び投薬量（例えば所望の反応を引き出すために鼻内的に有効、経皮的に有効、静脈内的に有効又は筋肉内的に有効である量）を決定するために、通常の計算及び調整のみが典型的に必要である。
【０１１７】
本発明の１つの代表的な態様において、標準的な投与管理のために化合物の単位投薬形態物が調製される。この方法で、医師の指示において組成物をより小さい投薬量に容易に細分することができる。例えば単位投薬量を粉剤小包、バイアル又はアンプル及び好ましくはカプセル又は錠剤形態において仕立てることができる。
【０１１８】
これらの組成物の単位投薬形態物中に存在する活性化合物は、患者の特定の必要性に従って１回もしくは多数回の毎日の投与のために、例えば約１０ｍｇ〜約１グラムかもしくはそれより多い量で存在することができる。約１グラムの最小の毎日の投薬量を用いて処置管理を開始することにより、カルバメート化合物の血液レベルを用いて、もっと多い投薬量が指示されるか又はもっと少ない投薬量が指示されるかを決定することができる。
【０１１９】
本発明のカルバメート化合物の有効な投与を、例えば投薬当たり約０．１ｍｇ／ｋｇ〜投薬当たり約５０ｍｇ／ｋｇの経口的又は非経口的投薬量において施すことができる。好ましくは、投与は投薬当たり約１．０ｍｇ／ｋｇ〜投薬当たり約２５ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは投薬当たり約２．０〜約４０ｍｇ／ｋｇであろう。従って、本明細書に記載される投薬単位当たりに含有される活性成分の治療的に有効な量は、例えば７０ｋｇの平均体重を有する患者に関し、例えば約１４０ｍｇ／日〜約２８００ｍｇ／日であることができる。
【０１２０】
本発明の方法は、神経保護の提供において用いるためのキットも提供する。治療的な利益のある１種もしくはそれより多い他の化合物が添加されていることがあり得る１種もしくはそれより多い本発明のカルバメート化合物を含んでなる製薬学的組成物を、適した担体中で調製した後、それを適した容器内に入れ、神経保護の提供に関して表示することができる。さらに、神経保護、てんかん誘発、てんかん又はニューロン傷害と関連する他の障害又は状態の処置の提供において有用な少なくとも１種の他の治療薬を含んでなる別の
薬剤を同様に容器内に入れ、適応疾患の処置に関して表示することができる。そのような表示は、例えば各薬剤の投与の量、頻度及び方法に関する指示を含むことができる。
【０１２１】
前記の本発明は、理解を明確にする目的で例として詳細に記載してきたが、ある種の変更及び修正は開示に包含され、そして制限ではなく例として示される添付の請求項の範囲内で過度の実験なくして実施され得ることが熟練者に明らかであろう。以下の実施例は、本発明の特定の側面を例示するために与えられ、制限であるつもりはない。
【０１２２】
実施例
以下の実施例は、本発明の理解を助けるために示され、後に続く請求項中に示される本発明をいかようにも制限することを意図しておらず、そのようにみなされるべきではない。神経保護の提供における使用のための式（Ｉ）及び式（ＩＩ）の化合物の活性を、以下の実験実施例において評価した。下記のすべての実施例、すなわち実施例１、２、３及び４において、単離された式１のＳ−エナンチオマー（この化合物は上記の式７として示され、下記の実施例において試験化合物（又はＴＣもしくはｔｃ）と呼ばれる）の活性を、神経保護に関する化合物の有効性を決定するために、誘導されたてんかんのラットモデルにおいて、ならびにラットにおいてリチウム及びピロカルピン（ｐｉｌｏｃａｒｐｉｎｅ）により誘導される側頭葉てんかんのモデルにおけるてんかん誘発の処置において評価した（実施例１及び２）。さらに、実施例３及び４は、血清回収（ｓｅｒｕｍ  ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ）のモデル及びラットにおける一時的大脳虚血モデルにおいて神経保護を与える同じ試験化合物の有効性を示す。これらの実施例は、多様な損傷的事象からニューロン組織を保護する試験化合物の能力を示す。これらの実施例は、本発明の種々の態様を示すためであることが意図されているが、いかようにも本発明を制限することを意図していない。
【０１２３】
試験化合物の構造を下記に示す：
【０１２４】
【化７】
2010523468.tif 000009
【実施例１】
【０１２５】
側頭葉てんかんのリチウム−ピロカルピンモデル
リチウムと会合した（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ピロカルピン（Ｌｉ−Ｐｉｌｏ）によりラットにおいて誘導されるモデルは、ヒト側頭葉てんかんの臨床的及び神経生理学的特徴のほとんどを再現する（Ｔｕｒｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｓｙｎａｐｓｅ  ３：１５４−１７１；Ｃａｖａｌｈｅｉｒｏ，１９９５，Ｉｔａｌ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｓｃｉ  １６：３３−３７）。成熟ラットにおいて、ピロカルピンの全身的投与はてんかん重積持続状態（ＳＥ）に導く。死亡率は、第１日の間に３０〜５０％に達する。生き残る動物において、ニューロン損傷は海馬構成体（ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、梨状及び嗅内皮質、視床、扁桃体、新皮質及び黒質内で優勢である。この急性の発作期間に続いて「無症候性」無発作期（“ｓｉｌｅｎｔ”ｓｅｉｚｕｒｅ−ｆｒｅｅ  ｐｈａｓｅ）があり、１４〜２５日の平均持続期間に及んで続き、その後すべての動物は１週間に２〜５回の通常の頻度で自発的繰り返し痙攣性発作（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｒ
ｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｃｏｎｖｕｌｓｉｖｅ  ｓｅｉｚｕｒｅｓ）を示す（Ｔｕｒｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｓｙｎａｐｓｅ  ３：１５４−１７１；Ｃａｖａｌｈｅｉｒｏ，１９９５，Ｉｔａｌ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｓｃｉ  １６：３３−３７；Ｄｕｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  １６７：２２７−２４１）。
【０１２６】
リチウム−ピロカルピン及び試験化合物を用いる処置
Ｊａｎｖｉｅｒ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｌｅ  Ｇｅｎｅｓｔ−Ｓｔ−Ｉｓｔｅ，Ｆｒａｎｃｅ）により与えられた２２５〜２５０ｇの体重の雄のＷｉｓｔａｒラットを、食物及び水を随意に入手できる調節された標準的条件下（明／暗サイクル，７．００ａ．ｍ．−７．００ｐ．ｍ．点灯）で収容した。すべての動物実験は、１９８６年１１月２４日のＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ（８６／６０９／ＥＥＣ）及びＦｒｅｎｃｈ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ（Ｌｉｃｅｎｓｅ  Ｎｏ  ６７−９７）の規則に従って行なわれた。電極移植のために、２．５ｍｇ／ｋｇのジアゼパム（ｄｉａｚｅｐａｍ）（ＤＺＰ，Ｖａｌｉｕｍ，Ｒｏｃｈｅ，Ｆｒａｎｃｅ）及び１ｍｇ／ｋｇのケタミン（ｋｅｔａｍｉｎｅ）クロロハイドレート（Ｉｍａｌｇｅｎｅ  １０００，Ｒｈｏｎｅ  Ｍｅｒｒｉｅｕｘ，Ｆｒａｎｃｅ）の腹膜内注入によりラットを麻酔した。４つの単接触記録電極（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｏｎｔａｃｔ  ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ）を、頭頂皮質を覆う頭蓋上に、各側に２つ置いた。
【０１２７】
てんかん重積持続状態誘導：
試験化合物を用いる処置及び自発的繰り返し発作（ＳＲＳ）の発生
すべてのラットに塩化リチウム（３ミリ当量／ｋｇ，腹膜内，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を与えた；約２０時間後、ベースライン皮質ＥＥＧを記録するために、動物をプレキシグラスの箱内に入れた。痙攣剤（ｃｏｎｖｕｌｓａｎｔ）の末梢効果を制限するために、メチルスコポラミンブロミド（１ｍｇ／ｋｇ，皮下，Ｓｉｇｍａ）を投与した。メチル−スコポラミンから３０分後、ピロカルピン・塩酸（２５ｍｇ／ｋｇ，皮下，Ｓｉｇｍａ）の注入によりＳＥを誘導した。ＳＥの全持続時間の間、両側のＥＥＧ皮質活性を記録し、行動的変化を記した。
【０１２８】
３つのグループのラットにつき、増加する投薬量の試験化合物の効果を研究した。第１のグループのラットは、１０ｍｇ／ｋｇの試験化合物をＳＥの開始から１時間後に腹膜内に与えられ（ｐｉｌｏ−ｔｅｓｔ１０）、グループ２及び３の動物は、それぞれ３０及び６０ｍｇ／ｋｇの試験化合物を与えられた（ｐｉｌｏ−ｔｅｓｔ３０及びｐｉｌｏ−ｔｅｓｔ６０）。
【０１２９】
別のグループに、ＳＥの開始から１時間後に２ｍｇ／ｋｇのジアゼパム（ＤＺＰ，筋肉内）を注射し、それはＳＥ後の動物の生き残りを向上させるための我々の標準的な処置である（ｐｉｌｏ−ＤＺＰ）。標準グループは、ピロカルピン及び試験化合物の代わりに食塩水を与えられた（食塩水−食塩水）。ＳＥに生き残ったｐｉｌｏ−試験化合物ラットに、次いで最初の試験化合物注入から約１０時間後、同じ投薬量の試験化合物の２回目の腹膜内注入を与え、さらに６日間、試験化合物を用いる毎日２回の処置下に保持した。Ｐｉｌｏ−ＤＺＰは、ＳＥの日に、１回目の注入から約１０時間後に１ｍｇ／ｋｇのＤＺＰの２回目の注入を与えられた。その後、Ｐｉｌｏ−ＤＺＰ及び食塩水−食塩水ラットは毎日２回、等しい量の食塩水を与えられた。
【０１３０】
ＥＥＧへの及びＳＲＳの発生までの潜伏時間への試験化合物の効果を、１日当たり１０時間の毎日の動物のビデオ記録及び週に２回の８時間に及ぶエレクトログラフ活性の記録により調べた。
【０１３１】
細胞密度の定量
８匹のｐｉｌｏ−ＤＺＰ、８匹のｐｉｌｏ−ｔｅｓｔ１０、７匹のｐｉｌｏ−ｔｅｓｔ３０、７匹のｐｉｌｏ−ｔｅｓｔ６０及び６匹の食塩水−食塩水ラットにつき、ＳＥから６日後に細胞密度の定量を行なった。ＳＥから１４日後、１．８ｇ／ｋｇのペントバルビタール（ｐｅｎｔｏｂａｒｂｉｔａｌ）（Ｄｏｌｅｔｈａｌ（Ｒ），Ｖｅｔｏｑｕｉｎｏｌ，Ｌｕｒｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて動物を深く麻酔した。次いで脳を取り出し、凍結した。低温槽中で２０μｍの連続切片を切断し、数日間空気乾燥してからチオニン染色した。
【０１３２】
ラット脳地図の定位座標に従い、１０ｘ１０個の仕切りの１ｃｍ２顕微鏡的格子（１０ｘ１０  ｂｏｘｅｓ  １ｃｍ２  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｇｒｉｄ）を用いて、冠状切片につき細胞密度の定量を行なった（Ｐａｘｉｎｏｓ  ａｎｄ  Ｗａｔｓｏｎ，１９８６，Ｔｈｅ  Ｒａｔ  ｂｒａｉｎ  ｉｎ  Ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ，２ｎｄ  ｅｄ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）。細胞カウンティングを盲検法（ｂｌｉｎｄ  ｍａｎｎｅｒ）で２回行い、それはそれぞれの動物における２つの隣接切片からの少なくとも３つの値の平均であった。カウントは１０μｍより大きい細胞のみを含み、それより小さいものはグリア細胞と考えられた。
【０１３３】
Ｔｉｍｍ染色
自然繰り返し発作の開始から２ヶ月後、試験化合物又はＤＺＰに暴露された慢性期におけるラットにつき、及び３匹の食塩水−食塩水ラットにおいて、苔状線維発芽を調べた。動物を深く麻酔し、食塩水ならびに続いて０．１Ｍ  リン酸塩緩衝液中の１．１５％（ｗ／ｖ）Ｎａ２Ｓの１００ｍｌ及び０．１Ｍ  リン酸塩緩衝液中の４％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒドの１００ｍｌを経噴門的に（ｔｒａｎｓｃａｒｄｉａｌｌｙ）灌流した。脳を頭蓋から取り出し、３〜５時間４％ホルムアルデヒド中で後−固定し（ｐｏｓｔ−ｆｉｘｅｄ）、スライディングビブラトーム上で４０μｍの切片を切断し、ゼラチンがコーティングされたスライド上に載せた。
【０１３４】
翌日、暗所で、５０％（ｗ／ｖ）アラビアゴム（１６０ｍｌ）、クエン酸ナトリウム緩衝液（３０ｍｌ）、５．７％（ｗ／ｖ）ヒドロキノン（８０ｍｌ）及び１０％（ｗ／ｖ）硝酸銀（２．５ｍｌ）の２６℃溶液中で、４０〜４５分間切片を現像した。次いで切片を、４０℃で水道水を用いて少なくとも４５分間濯ぎ、蒸留水を用いて迅速に濯ぎ、乾燥させた。それらをエタノール中で脱水してカバーガラスで覆った（ｃｏｖｅｒｓｌｉｐｐｅｄ）。
【０１３５】
以前に背側海馬において記載された基準（Ｃａｖａｚｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １１：２７９５−２８０３）に従って苔状線維発芽を評価し、その基準は以下の通りである：０−ＤＧの尖端と稜（ｃｒｅｓｔ）の間に顆粒がない；１−ＤＧの尖端と稜の間の顆粒上領域内に（ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｕｐｒａｇｒａｎｕｌａｒ  ｒｅｇｉｏｎ）斑状に分布して、わずかな顆粒がある；２−ＤＧの尖端と稜の間に連続して分布して、より多数の顆粒がある；３−尖端と稜の間に連続パターンにおいて顕著な顆粒があり、時々尖端と稜の間に密集した顆粒の斑がある；４−尖端と稜の間に密集した密度の高い層状の帯を形成する顕著な顆粒がある、及び５−内部分子層中に伸びる密集した密度の高い顆粒の層状の帯がある。
【０１３６】
データ分析
ｐｉｌｏ−食塩水及びｐｉｌｏ−試験化合物の動物におけるＳＥの特性を比較するために、ノン−ペアードスチューデントｔ検定（ｎｏｎ−ｐａｉｒｅｄ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ
ｔ−ｔｅｓｔ）を用いた。両グループ中の発作を起こしているラットの数の間の比較をカイ二乗検定により行なった。ニューロン損傷に関し、ＡＮＯＶＡを用い、続いてＳｔａｔｖｉｅｗソフトウェアを用いる多重比較のためのＦｉｓｈｅｒ’ｓ試験（Ｆｉｓｈｅｒ
ＲＡ，１９４６ａ，Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｗｏｒｋｅｒｓ（１０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ）Ｏｌｉｖｅｒ  ＆  Ｂｏｙｄ，Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ；Ｆｉｓｈｅｒ  ＲＡ，１９４６ｂ，Ｔｈｅ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ（４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ）Ｏｌｉｖｅｒ  ＆  Ｂｏｙｄ，Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ）Ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ  ａｎｄ  ＥＥＧ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ
ｏｆ  ｌｉｔｈｉｕｍ−ｐｉｔｏｃａｒｐｉｎｅ  ｓｔａｔｕｓ  ｅｐｉｌｅｐｔｉｃｕｓ）を用いて、グループ間の統計分析を行なった。
【０１３７】
２５０〜３３０ｇの体重のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの全数をＬｉ−ｐｉｌｏ誘導ＳＥに供した。ｐｉｌｏ−食塩水及びｐｉｌｏ−試験化合物ののグループの両方において、ＳＥの行動的特性は同じであった。ピロカルピン注入から５分後以内に、ラットは、下痢、立毛及びコリン作用性刺激の他の兆候を現した。続く１５〜２０分の間、ラットは頭の上下運動、ひっかき、噛み及び探索（ｅｘｐｌｏｒａｔｏｒｙ）行動を示した。繰り返し発作は、ピロカルピン投与から約１５〜２０分後に始まった。起立及び転倒（ｒｅａｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｆａｌｌｉｎｇ）を伴う頭及び両側前肢のミオクローヌスの事象を伴うこれらの発作は、以前に記載された通り（Ｔｕｒｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｂｅｈａｖ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  ９：３１５−３３５）、ピロカルピンから約３５〜４０分後にＳＥに進行した。
【０１３８】
ＳＥの間のＥＥＧパターン
ＳＥの最初の１時間、薬理学的処置の不在下で、ＥＥＧの振幅は漸増的に増加したが、周波数は減少した。ピロカルピンの注入から５分後以内に、正常なバックグラウンドＥＥＧ活性は皮質内において低電圧の速い（ｆａｓｔ）活性で置き換えられたが、海馬においてシータ波（５〜７Ｈｚ）が現れた。１５〜２０分までに、高電圧の速い活性が海馬のシータ波上に重なり、孤立した高電圧スパイクが海馬のみにおいて記録されたが、皮質の活性は実質的に変化しなかった。
【０１３９】
ピロカルピン注入から３５〜４０分後までに、動物は、海馬及び皮質の両方に存在する高電圧の速い活性を有する典型的なエレクトログラフ発作を現し、それは最初に発作に先行する活性の突発として起こり、それに続いて高電圧のスパイク及びポリスパイク（ｐｏｌｙｓｐｉｋｅｓ）の連続（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｔｒａｉｎｓ）が起こり、ＤＺＰ又は試験化合物の投与まで続いた。ＳＥの約３〜４時間に、ｐｉｌｏ−ＤＺＰグループにおいて海馬ＥＥＧは周期的エレクトログラフ放電（ＰＥＤｓ，１秒当たり約１回）を特性とし、ｐｉｌｏ−１０グループでは海馬及び皮質の両方においてであった。ＥＥＧバックグラウンド活性の振幅は、ｐｉｌｏ−ｔｅｓｔ６０動物において低かった。ＳＥの６〜７時間まで、スパイキング活性はＤＺＰ−及びｔｅｓｔ１０−処置されたラットにおいてまだ皮質及び海馬に存在したが、ｔｅｓｔ３０ラットの海馬及びｔｅｓｔ６０処置ラットの両構造において、ＥＥＧの振幅は減少し、ベースラインレベルに戻った。ｔｅｓｔ１０、ｔｅｓｔ３０及びｔｅｓｔ６０グループの間に差はなかった。ＳＥの９時間まで、試験化合物で処置されたラットの海馬及び時々は皮質において孤立したスパイクがまだ記録された。両構造において、その時点にバックグラウンド活性は非常に低い振幅のものであった。
【０１４０】
ＳＥにより誘導される死亡率
ＳＥから後の最初の４８時間、死亡率の程度はｐｉｌｏ−ＤＺＰラット（２３％，５／２２）、ｐｉｌｏ−ｔｅｓｔ１０ラット（２６％，６／２３）及びｐｉｌｏ−ｔｅｓｔ３０ラット（２０％，５／２５）において類似していた。死亡率はｐｉｌｏ−ｔｅｓｔ６０ラットにおいて大きく低下し、それにおいて死亡率は４％（１／２３）に達したのみであった。差は統計的に有意であった（ｐ＜０．０１）。
【０１４１】
無症候期のＥＥＧ特性及び自発的繰り返し発作の発生
無症候期の間のＥＥＧパターンは、ｐｉｌｏ−ＤＺＰ及びｐｉｌｏ−ｔｅｓｔ１０、３０又は６０ラットにおいて類似していた。ＳＥから２４及び４８時間後、ベースラインＥＥＧはまだＰＥＤｓの発生を特性とし、その上に大きな波又はスパイクが重なり得た。試験化合物の注入又はビヒクル注入から１時間後と８時間後の間に、ｐｉｌｏ−ＤＺＰ又はｐｉｌｏ−ｔｅｓｔ１０グループにおいて変化はなかった。ｔｅｓｔ３０及びｔｅｓｔ６０ラットにおいて、ＰＥＤｓの周波数及び振幅は注入から１０分後のようにすぐに低下し、ｔｅｓｔ３０グループにおいて大きな振幅のスパイクにより、及びｔｅｓｔ６０グループにおいて低振幅のスパイクにより置き換えられた。注入から４時間後までに、２つの後者のグループにおいてＥＥＧはベースラインレベルに戻った。ＳＥから６日後まで、ＥＥＧはまだピロカルピン注入前より低い振幅のものであり、そしてほとんどのグループにおいて、ｐｉｌｏ−ＤＺＰ、−ｔｅｓｔ１０及び−ｔｅｓｔ３０ラットにおいて時々、スパイクはまだ記録され得た。ｐｉｌｏ−ｔｅｓｔ６０ラットにおいて、大きな振幅のスパイクの周波数は他のすべてのグループにおけるより高かった。試験化合物又はビヒクル−注入の後、ｐｉｌｏ−ＤＺＰ及びｐｉｌｏ−ｔｅｓｔ１０グループにおいてＥＥＧ記録は注入により影響を受けなかった。注入は、ｐｉｌｏ−ｔｅｓｔ３０ラットにおいて海馬及び皮質の両方のＥＥＧ上における遅い波の発生を誘導し、ｐｉｌｏ−ｔｅｓｔ６０ラットにおいてスパイクの周波数を減少させた。
【０１４２】
ＤＺＰ、ｔｅｓｔ１０及びｔｅｓｔ３０に暴露され、慢性期まで調べられたすべてのラットは、類似の潜伏期でＳＲＳを発現した。潜伏期はｐｉｌｏ−ＤＺＰラットにおいて１８．２±６．９日（ｎ＝９）、ｐｉｌｏ−ｔｅｓｔ１０ラットにおいて１５．４±５．１日（ｎ＝７）、ｐｉｌｏ−ｔｅｓｔ３０ラットにおいて１８．９±９．０日（ｎ＝１０）であった。ｔｅｓｔ６０に供されたラットのグループにおいて、ラットの１つのサブグループは他のグループの潜伏期と類似の潜伏期、すなわち１７．６±８．７日（ｎ＝７）でてんかんになったが、ラットの別のグループはＳＥ−後１０９〜１９１日（１４９．８±３６．０日，ｎ＝４）の範囲のずっと長い遅れを以っててんかんになり、１匹のラットはＳＥ−後９ヶ月の遅延期間内にてんかんにならなかった。ｐｉｌｏ−ＤＺＰ、ｐｉｌｏ−ｔｅｓｔ１０、ｐｉｌｏ−ｔｅｓｔ３０ラット及びｐｉｌｏ−ＴＰＭ６０ラットの第１のサブグループの間のＳＲＳへの潜伏期における差は、統計的に有意でなかった。食塩水−食塩水ラット（ｎ＝５）のいずれもＳＲＳを発現しなかった。
【０１４３】
ピロカルピン−暴露されたラットにおけるＳＲＳの頻度を計算するために、発作の重度ならびに顕著な段階ＩＩＩ（顔面筋及び前脚の慢性発作）及び段階ＩＶ−Ｖ発作（起立及び転倒）を考慮した。ｐｉｌｏ−ＤＺＰ及びｐｉｌｏ−試験化合物ラットにおける１週間当たりの段階ＩＩＩ  ＳＲＳの頻度は、グループの中で様々であった。ｐｉｌｏ−ＤＺＰ及びｐｉｌｏ−ｔｅｓｔ６０（早いＳＲＳ開始を有する）グループにおいて、最初の３週間の間、それは低く、一定であり、ｐｉｌｏ−ＤＺＰグループにおいては４週間の間に消失した。段階ＩＩＩ  ＳＲＳの頻度はｐｉｌｏ−ｔｅｓｔ１０グループにおいてもっと高く、ここでそれは３及び４週間の間にｐｉｌｏ−ＤＺＰの値を超えて有意に増加した。より重症の段階ＩＶ−Ｖ  ＳＲＳの頻度は、ｐｉｌｏ−ｔｅｓｔ３０及び遅い発作の開始を有するｔｅｓｔ６０を除くほとんどのグループにおいて第１週の間に最も高く、ここでＳＲＳ頻度は、ｔｅｓｔ３０グループにおいて４週間全体に及んで、及び遅いＳＲＳの開始を有するｐｉｌｏ−ｔｅｓｔ６０グループにおいて最初の２週間に及んで一定であり、遅いＳＲＳの開始を有するｐｉｌｏ−ｔｅｓｔ６０グループにおいては第２週より後に段階ＩＶ−Ｖ発作は記録されなかった。段階ＩＶ−Ｖ  ＳＲＳの頻度は、第１週の間、ｐｉｌｏ−ＤＺＰグループ（１週間当たりに１１．３回のＳＲＳ）と比較して、ｔｅｓｔ１０、ｔｅｓｔ３０及びｔｅｓｔ６０（早いＳＲＳ開始を有する）グループ（１週間当たりに２．３〜６．１回のＳＲＳ）において有意に減少した。第２週から第４週の間に、段階ＩＶ−Ｖ  ＳＲＳの頻度は、すべてのグループにおいて第１週と比較して減少し、早いＳＲＳ開始を有するｐｉｌｏ−ｔｅｓｔ６０グループにおける場合を除いて１週間当たり２〜６回の発作の値に達し、早いＳＲＳ開始を有するｐｉｌｏ−ｔｅｓｔ６０グループでは、ＳＲＳの頻度が３．３〜５．８の範囲であったｐｉｌｏ−ＤＺＰグループと比較して発作の頻度は１週間当たり０．６〜０．９回の発作に有意に減少した。
【０１４４】
海馬、視床及び皮質における細胞密度
食塩水−食塩水ラットと比較してｐｉｌｏ−ＤＺＰラットにおいて、細胞の数は海馬のＣＡ１領域において大きく（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ）減少したが（錐体細胞層中で７０％の細胞喪失）、ＣＡＳ領域はそれ程広範囲に損傷を受けなかった（ＣＡ３ａにおいて５４％及びＣＡ３ｂにおいて３１％の細胞喪失）。歯状回において、ｐｉｌｏ−ＤＺＰラットは門中で広範囲の細胞喪失を経験したが（７３％）、顆粒細胞層は可視の損傷を示さなかった。腹側海馬において類似の損傷が観察されたが、この領域で細胞カウンティングは行なわれなかった。視床外側核においても広範囲の損傷が記録されたが（９１％の細胞喪失）、視床内側核の損傷はより穏やかであった（５６％）。梨状皮質において、細胞喪失は層ＩＩＩ−ＩＶ中で全体的であり、層ＩＩＩ−ＩＶはもはや見えず、ｐｉｌｏ−ＤＺＰラットにおいて層ＩＩ中で５３％に達した。背側嗅内皮質において、層ＩＩ及びＩＩＩ−ＩＶはわずかな損傷を受けた（それぞれ９及び１５％）。腹側嗅内皮質の層ＩＩは全体的に保存されたが、層ＩＩＩ−ＩＶは４４％の細胞喪失を経験した。
【０１４５】
ｐｉｌｏ−試験化合物動物の海馬において、細胞喪失はＣＡ１錐体層中でｐｉｌｏ−ＤＺＰラットと比較して減少し、ＣＡ１錐体層中で細胞喪失はｐｉｌｏ−ＤＺＰにおいて７５％に達し、ｐｉｌｏ−ｔｅｓｔ３０又はｐｉｌｏ−ｔｅｓｔ６０動物においてそれぞれ３５及び１６％に達した。この差は、２つの試験化合物投薬量において統計的に有意であった。ＣＡＳ錐体層において、試験化合物はＣＡ３ａ領域における保護を与えなかったが、６０ｍｇ／ｋｇの試験化合物投薬量は、ＣＡ３ｂ中で有意に神経保護的であった。歯状回において、門中の細胞喪失はｐｉｌｏ−試験化合物（６９〜７２％）及びｐｉｌｏ−ＤＺＰ動物（７３％）において類似していた。２つの視床核において、６０ｍｇ／ｋｇの投薬量はやはりニューロン損傷を外側核及び内側核中でそれぞれ６５及び４２％減少させることにおいて保護的であった。大脳皮質において、試験化合物を用いる処置は、最高の投薬量、６０ｍｇ／ｋｇのみにおいて、ＤＺＰと比較してニューロン保護を与えた。２つの最低投薬量、１０及び３０ｍｇ／ｋｇにおいて、梨状皮質の層ＩＩＩ−ＩＶ中で観察される細胞の全喪失及び組織崩壊は、ｐｉｌｏ−ＤＺＰラット及びｐｉｌｏ−試験化合物ラットにおいて同じであり、グループのいずれにおいてもカウンティングを許さなかった。梨状皮質の層ＩＩ及びＩＩＩ−ＩＶにおいて、ｔｅｓｔ６０処置は、ｐｉｌｏ−ＤＺＰラットにおいて記録されたニューロン損傷をそれぞれ４１及び４４％減少させた。腹側嗅内皮質において、層ＩＩＩ−ＩＶ中でｔｅｓｔ６０投与により神経保護が誘導され、ｐｉｌｏ−ＤＺＰラットと比較して３１％に達した。嗅内皮質において、背側嗅内皮質の層ＩＩＩ−ＩＶ中（２８％多い損傷）及び腹側嗅内皮質の層ＩＩＩ−ＩＶ中（３５％多い損傷）で、ｐｉｌｏ−ＤＺＰラットと比較してｐｉｌｏ−ｔｅｓｔ１０ラットにおいて細胞喪失のわずかな悪化があった。試験化合物の他の投薬量において、嗅内皮質における細胞喪失は、ｐｉｌｏ−ＤＺＰラットにおいて記録されたものと類似していた。
【０１４６】
海馬における苔状線維発芽
ｐｉｌｏ−ＤＺＰ及びｐｉｌｏ−ＴＰＭグループ中のＳＲＳを示すすべてのラットは、歯状回の内部分子層におけるＴｉｍｍ染色の類似の強度を示した（スコア２−４）。Ｔｉｍｍ染色は歯状回の上方及び下方ブレード（ｕｐｐｅｒ  ａｎｄ  ｌｏｗｅｒ  ｂｌａｄｅｓ）の両方の上に存在した。上ブレードにおけるＴｉｍｍスコアの平均値は、ｐｉｌｏ−ＤＺＰラットにおいて２．８±０．８（ｎ＝９）、ｐｉｌｏ−ｔｅｓｔ１０ラットにおいて１．５±０．６（ｎ＝７）、ｐｉｌｏ−ｔｅｓｔ３０ラットにおいて２．６±１．０（ｎ＝１０）及びｐｉｌｏ−ｔｅｓｔ６０ラットのグループ全体において１．５±０．７（ｎ＝１１）に達した。ｐｉｌｏ−ｔｅｓｔ６０グループをＳＲＳへの潜伏期に従って細
分すると、早いＳＲＳ発生を有するサブグループは１．８±０．６（ｎ＝６）のＴｉｍｍスコアを示し、遅い発生を有するか又はＳＲＳのないラットのサブグループは１．２±０．６（ｎ＝５）のＴｉｍｍスコアを有した。ｐｉｌｏ−ＤＺＰラットにおいて記録された値は、ｐｉｌｏ−ｔｅｓｔ１０（ｐ＝０．０３２）及び遅い発作を有するか又は発作のないｐｉｌｏ−ｔｅｓｔ６０サブグループ（ｐ＝０．０１６）における値と統計的に有意に異なった。
【０１４７】
議論及び結論
本研究の結果は、試験化合物を用いてＳＥの開始から１時間後に開始される７日間の処置が、ニューロン損傷からいくらかの脳領域を、例えばＣＡ１及びＣＡ３ｂ領域の錐体細胞層、視床内側、梨状皮質の層ＩＩ及びＩ１ＭＶならびに腹側嗅内皮質の層ＩＩＩ−ＩＶにおいて保護することができるが、試験化合物の最高の投薬量、すなわち６０ｍｇ／ｋｇにおいてのみであることを示す。後者の試験化合物の投薬量は、少なくとも他のグループの動物におけるより約９−倍長い平均遅延を有しててんかんになり、１匹の動物がＳＥから後９ヶ月の遅延期間内にてんかんにならなかったサブグループの動物において、ＳＲＳの発生を遅らせることもできる。
【０１４８】
これらの結果は、ほとんどの抗てんかん性の市販薬の古典的な性質である抗−発作性を有する１つの化合物が、てんかん誘発を遅らせることもできる、すなわち抗てんかん誘発性であることを示す。本研究のデータは、試験化合物処置が、いずれの投薬量を用いても、てんかんの重度を低下させることも示し、それは処置が主に発生の第１週の間及びｔｅｓｔ６０処置を用いる４−週間の観察の全期間、段階ＩＶ−Ｖ発作の数を減少させるからである。さらに、ｔｅｓｔ１０グループにおいて、あまり重症でない段階ＩＩＩ発作の発生の増加への変化があり、段階ＩＩＩ発作はｐｉｌｏ−ＤＺＰグループにおけるより多数である。
【実施例２】
【０１４９】
ラットにおけるてんかんのリチウム−ピロカルピンモデルでの増加する投薬量の試験化合物の可能な神経保護及び抗−てんかん誘発効果
【０１５０】
導入
本プロジェクトの目的は、側頭葉てんかんのリチウム−ピロカルピン（Ｌｉ−Ｐｉｌｏ）モデルにおける試験化合物の可能な神経保護及び抗てんかん誘発性についての我々の研究を追及することであった。この研究は、試験化合物がＬｉ−Ｐｉｌｏてんかん重積持続状態（ＳＥ）により誘導されるニューロン損傷から海馬の領域ＣＡ１及びＣＡ３、梨状及び腹側嗅内皮質を保護できることを我々が示した第１の研究（上記の実施例１）に続く。これらの神経保護性のほとんどは、研究された最高の投薬量、６０ｍｇ／ｋｇにおいて起こり、処置はラットの３６％（１１匹中の４匹）において自然発作の発生を遅らせることができた。本研究において我々は、ニューロン損傷、てんかん誘発、ニューロン興奮性及び行動への試験化合物による処置の結果を研究することを提案する。
【０１５１】
側頭葉てんかんのリチウム−ピロカルピンモデル
リチウムと会合したピロカルピン（Ｌｉ−Ｐｉｌｏ）によりラットにおいて誘導されるモデルは、ヒト側頭葉てんかんの臨床的及び神経生理学的特徴のほとんどを再現する（Ｔｕｒｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９；Ｓｙｎａｐｓｅ  ３：１５４−１７１；Ｃａｖａｌｈｅｉｒｏ，１９９５，Ｉｔａｌ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｓｃｉ  １６：３３−３７を参照されたい）。成熟ラットにおいて、ピロカルピンの全身的投与はＳＥに導き、それは最高で２４時間続き得る。死亡率は、第１日の間に３０〜５０％に達する。生き残る動物において、ニューロン損傷は海馬体、梨状及び嗅内皮質、視床、扁桃体、新皮質及び黒質内で優勢である。この急性の発作期間に続いて「無症候性」無発作期があり、１４〜２５日の平均持続期間に及んで続き、その後すべての動物は１週間に２〜５回の通常の頻度で自
発的繰り返し痙攣性発作を示す（Ｔｕｒｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９；Ｓｙｎａｐｓｅ  ３：１５４−１７１；Ｃａｖａｌｈｅｉｒｏ，１９９５，Ｉｔａｌ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｓｃｉ  １６：３３−３７；Ｄｕｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  １６７：２２７−２４１を参照されたい）。現在の抗てんかん薬は、てんかん誘発を予防せず、繰り返し発作に一時的に有効なだけである。
【０１５２】
我々の前研究において、我々はモノテラピーにおいて与えられる増加する投薬量の試験化合物の可能な神経保護及び抗てんかん誘発効果を研究し、ほとんど高い死亡率を妨げるために与えられる我々の標準的なジアゼピン処置と比較した。これらのデータは、１０、３０又は６０ｍｇ／ｋｇ（ＲＷＪ１０、ＲＷＪ３０、ＲＷＪ６０）の投薬量において試験化合物を用いてＳＥの開始から１時間後に開始される７日間の処置が、いくらかの脳領域をニューロン損傷から保護できることを示す。この効果は、ＣＡ１及びＣＡ３ｂ領域の錐体細胞層、視床内側、梨状皮質の層ＩＩ及びＩＩＩ−ＩＶならびに腹側嗅内皮質の層ＩＩＩ−ＩＶにおいて統計的に有意であるが、試験化合物の最高の投薬量、すなわち６０ｍｇ／ｋｇ（ＲＷＪ６０）においてのみである。さらに、後者の試験化合物の投薬量は、少なくとも他のグループの動物におけるより約９−倍長い平均遅延を有しててんかんになり、１匹の動物がＳＥから後９ヶ月の遅延期間内にてんかんにならなかったサブグループの動物において、自発的繰り返し発作（ＳＲＳ）の発生を遅らせることができる唯一の投薬量でもあると思われる。
【０１５３】
本研究において我々は、前研究におけると同じ設計を用い、試験化合物の異なる種々の投薬量（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｄｏｓｅｓ  ｏｆ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｄｏｓｅｓ）、すなわち３０、６０、９０及び１２０ｍｇ／ｋｇ（本明細書でＲＷＪ３０、ＲＷＪ６０、ＲＷＪ９０及びＲＷＪ１２０と呼ばれる）の効果を調べた。処置はてんかん重積持続状態（ＳＥ）の開始から１時間後に始められ、動物を同じ投薬量の２回目の注入で処置した。この初期のＳＥの処置に６日間の試験化合物処置が続いた。この報告は、海馬及び海馬傍皮質（ｐａｒａｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｃｏｒｔｉｃｅｓ）におけるニューロン損傷への４種の投薬量の試験化合物の効果に関する。てんかんの開始への潜伏期についての研究はまだ不完全であるが、我々は、限られたグループの動物について行なわれた現時点に我々が得たデータを示す。自発的てんかん発作への潜伏期を、同じラットについて、発作の回路内に含まれる領域中に残るニューロンの数に関連付けた。
【０１５４】
Ｊａｎｖｉｅｒ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｌｅ  Ｇｅｎｅｓｔ−Ｓｔ−Ｉｓｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）により与えられた雄の成熟Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを、食物及び水を随意に入手できる調節された混み合わない２０〜２２℃における標準的条件下（明／暗サイクル，７．００ａ．ｍ．−７．００ｐ．ｍ．点灯）で収容した。すべての動物実験は、１９８６年１１月２４日のＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ（８６／６０９／ＥＥＣ）及びＦｒｅｎｃｈ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ（Ｌｉｃｅｎｓｅ  Ｎｏ  ６７−９７）の規則に従って行なわれた。
【０１５５】
てんかん重積持続状態誘導、試験化合物処置及びＳＲＳの発生
すべてのラットに塩化リチウム（３ミリ当量／ｋｇ，腹膜内，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を与え、約２０時間後、すべての動物にメチルスコポラミンブロミド（１ｍｇ／ｋｇ，皮下，Ｓｉｇｍａ）も与え、それは痙攣剤の末梢効果を制限するために投与された。メチルスコポラミンから３０分後、ピロカルピン・塩酸（２５ｍｇ／ｋｇ，皮下，Ｓｉｇｍａ）の注入によりＳＥを誘導した。ラットの５つのグループにおいて、増加する投薬量の試験化合物（ＲＷＪ）の効果を研究した。動物は、ＳＥの開始から１時間後に、２．５ｍｇ／ｋｇのジアゼピンを筋肉内に（ＤＺＰ）あるいは３０、６０、９０又は１２０ｍｇ／ｋｇの試験化合物（ＲＷＪ３０、ＲＷＪ６０、ＲＷＪ９０、ＲＷＪ１２０）を腹膜内に与えられた。標準グループは、ピロカルピン及び試験化合物の代わりにビヒクルを与えられた。ＳＥに生き残ったラットに、次いで最初の試験化合物注入から約１０時間後に、ＤＺＰグループの場合には１．２５ｍｇ／ｋｇのＤＺＰの２回目の腹膜内注入あるいは朝におけると同じ投薬量の試験化合物の２回目の腹膜内注入を施して、さらに６日間に及ぶ毎日２回の試験化合物処置（皮下）下に保持し、ＤＺＰラットはビヒクル注入を受けた。自然繰り返し発作（ＳＲＳ）の発生への潜伏期への、４種の投薬量の試験化合物の効果を、１日当たり１０時間に及ぶ毎日の動物のビデオ記録により調べた。
【０１５６】
細胞密度の定量
ＳＥから後の２つの時点に、細胞密度の定量を行なった：第１のグループはＳＥから１４日後に調べられ、それは７匹のＤＺＰ、８匹のＲＷＪ３０、１１匹のＲＷＪ６０、１０匹のＲＷＪ９０、８匹のＲＷＪ１２０及び８匹のＳＥに供されなかった標準ラットにより構成された。ＳＲＳへの潜伏期の研究のために用いられる第２のグループは、最初のＳＲＳから８週間後あるいは、５ヶ月の遅延期間内にＳＲＳが見られない場合には５ヶ月後に犠牲にされ、それは７匹のＤＺＰ、２匹のＲＷＪ３０、３匹のＲＷＪ６０、３匹のＲＷＪ９０、４匹のＲＷＪ１２０ラットにより構成された。１．８ｇ／ｋｇのペントバルビタール（Ｄｏｌｅｔｈａｌ（Ｒ），Ｖｅｔｏｑｕｉｎｏｌ，Ｌｕｒｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて動物を深く麻酔した。次いで脳を取り出し、凍結した。低温槽中で２０μｍの連続切片を切断し、数日間空気乾燥してからチオニン染色した。ラット脳地図の定位座標に従い、１０ｘ１０個の仕切りの１ｃｍ２顕微鏡的格子を用いて、冠状切片につき細胞密度の定量を行なった（Ｐａｘｉｎｏｓ  ａｎｄ  Ｗａｔｓｏｎ，１９８６，Ｔｈｅ  Ｒａｔ  ｂｒａｉｎ  ｉｎ  Ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ，２ｎｄ  ｅｄ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）。カウンティングの格子を問題の大脳構造の十分に限定される領域上に置き、それぞれ１つの大脳構造に関して規定される２００−又は４００−倍の顕微鏡拡大を用いてカウンティングを行なった。動物の処置を知らない１人の観察者により、各領域に関して３つの隣接区画の各側につき、細胞カウンティングを２回行なった。各大脳構造における１２個のカウンティングされた領域内で得られた細胞の数を平均した。この方法を用い、細胞数の過大評価に導く二重カウンティングから生じ得る、起こり得る誤差を最小にした。格子の下端及び右端に接触しているニューロンは、カウンティングしなかった。カウントは１０μｍより大きい細胞体を有するニューロンのみを含んだ。小さい細胞体を有する細胞はグリア細胞と考えられ、カウンティングされなかった。
【０１５７】
データ分析
ニューロン損傷に関し、一元分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｖａｒｉａｎｃｅ）及び続くＳｔａｔｖｉｅｗソフトウェアを用いるポスト−ホックシェフ試験（ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  Ｓｃｈｅｆｆｅ’ｓ  ｔｅｓｔ）により、グループ間の統計的分析を行なった。
【０１５８】
結果
リチウム−ピロカルピンてんかん集積持続状態の行動的特性
１０１匹の合計数の２５０〜３３０ｇの体重のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットをリチウム−ピロカルピン（Ｌｉ−ｐｉｌｏ）−誘導ＳＥに供した。この数の中で、２匹はＳＥを発現しなかったが、９９匹のラットは完全な特徴的Ｌｉ−ｐｉｌｏ  ＳＥを発現した。ＳＥの行動的特性は、ｌｉｐｉｌｏ−ＤＺＰ及びｌｉｐｉｌｏ−ＲＷＪグループの両方において同じであった。ピロカルピン注入から５分後以内に、ラットは、下痢、立毛及びコリン作用性刺激の他の兆候を現した。続く１５〜２０分の間、ラットは頭の上下運動、ひっかき、噛み及び探検行動を示した。繰り返し発作は、ピロカルピン投与から約１５〜２０分後に始まった。起立及び転倒を有する頭及び両側前肢のミオクローヌスの事象を伴うこれらの発作は、以前に記載された通り（Ｔｕｒｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９；Ｓｙｎａｐｓｅ  ３：１５４−１７１；Ｄｕｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  １６７：２２７−２４１及びＡｎｄｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｅｐｉｌｅｐｓｉａ  ４４：８９３−９０３を参照されたい）、ピロカルピンから約３５〜４０分後にＳＥに進行した。
【０１５９】
初期細胞カウンティングに供された、及びＳＥから最初の４８時間を経た動物のグループにおいて、死亡率の程度は処置とともに様々であった：ＤＺＰラットの４７％（７／１５）、ＲＷＪ３０ラットの４３％（６／１４）、ＲＷＪ６０ラットの０％（０／１１）、ＲＷＪ９０ラットの０％（０／１０）及びＲＷＪ１２０ラットの４７％（７／１５）が死亡した。ＤＺＰグループにおいて、４／７のラットは最初の２４時間内に死亡し、３匹は２４〜４８時間に死亡した。ＲＷＪ３０ラットのグループにおいて、４／６のラットは最初の２４時間の間に死亡し、２匹は２４〜４８時間に死亡した。ＲＷＪ１２０ラットのグループにおいて、６／７のラットは最初の２４時間の間に死亡し、１匹は２４〜４８時間に死亡した。ＳＥに供されず、リチウム及び食塩水を与えられた標準グループは、１０匹のラットから構成された。
【０１６０】
ＳＲＳへの潜伏期の研究及び後期細胞カウンティングに供された動物のグループにおいて、死亡率の程度は以下であった：ＤＺＰラットの３０％（３／１０）、ＲＷＪ３０ラットの５０％（２／４）、ＲＷＪ６０ラットの０％（０／３）、ＲＷＪ９０ラットの０％（０／３）及びＲＷＪ１２０ラットの０％（０／４）が死亡した。ＤＺＰラットのグループにおいて、３／３のラットは最初の２４時間の間に死亡した。ＲＷＪ３０のグループにおいて、１／２のラットは最初の２４時間の間に死亡し、１匹は２４〜４８時間に死亡した。
【０１６１】
初期（ＳＥから１４日後）における海馬及び皮質中の細胞密度
標準ラットと比較してＤＺＰラットにおいて、細胞の数は海馬のＣＡ１領域において大きく減少したが（錐体細胞層中で８５％の細胞喪失）、ＣＡ３領域はそれ程広範囲に損傷を受けなかった（ＣＡ３中で４０％の細胞喪失）（表１及び図１を参照されたい）。歯状回において、ＤＺＰラットは門中で広範囲の細胞喪失を経験したが（６６％）、顆粒細胞層は通常、可視の損傷を示さなかった。腹側海馬において類似の損傷が観察されたが、この領域で細胞カウンティングは行なわれなかった。梨状皮質において、細胞喪失は層ＩＩＩ中でほとんど全体的であり（９４％）、層ＩＩＩはもはや実際に見えず、ＤＺＰラットにおいて背側及び腹側の層ＩＩ中でそれぞれ６６及び８９％に達した。背側嗅内皮質において、層ＩＩ及びＩＩＩ−ＩＶはわずかな損傷を受け（それぞれ１８及び２４％）、腹側の層ＩＩ及びＩＩＩ／ＩＶにおいて、損傷はそれぞれ２２及び７４％に達した（表１及び図２）。
【０１６２】
ＲＷＪ動物の海馬において、細胞喪失はＣＡ１錐体層中でＤＺＰラットと比較してＲＷＪ３０、６０又は９０ラットにおいていくらか減少し（３６〜５７％の細胞喪失）、ＲＷＪ１２０において顕著に減少した（１３％の細胞喪失）。差は、すべてのＲＷＪ投薬量において統計的に有意であった（表１及び図１）。ＣＡ３錐体層において、１２０ｍｇ／ｋｇ投薬量においてのみ、ＲＷＪにより誘導されるわずかな神経保護への傾向があったが、ＤＺＰグループとの差は有意でなかった。歯状回において、門中の細胞喪失はＤＺＰならびにＲＷＪ３０、６０及び９０グループにおいて類似しており（６２〜６６％の損傷）、ＲＷＪ１２０グループにおいてＤＺＰ動物（６６％の細胞喪失）と比較して減少した損傷へのわずかな傾向を示した（５４％の損傷）。これらの差のいずれも統計的に有意でなかった。
【０１６３】
大脳皮質において、試験化合物を用いる処置は、ＤＺＰ処置と比較してほとんどすべて
の皮質領域を保護した。梨状皮質において、ＲＷＪ３０の投薬量はいずれの層も保護しなかった。逆に、試験化合物の６０〜１２０ｍｇ／ｋｇの投薬量は層ＩＩＩにおいていくらかの神経保護を与えた（低い２つの投薬量において５３〜６４％の細胞喪失及び１２０ｍｇ／ｋｇ  ＲＷＪにおいて２１％の細胞喪失）。差は、最高投薬量においてのみ、統計的に有意であった。背側の層ＩＩにおいて、６０−１２０ｍｇ／ｋｇは、ＤＺＰ−処置されたラット（６６％の損傷）と比較して統計的に有意な神経保護を誘導した（４〜２１％の損傷）。腹側の層ＩＩにおいて、６０及び１２０ｍｇ／ｋｇのＲＷＪ投薬量はわずかに保護的であったが（それぞれ５６及び４５％の損傷）、１２０ｍｇ／ｋｇは、ＤＺＰラット（８９％の損傷）と比較して梨状皮質のこの層を大きく保護した（９％の損傷）。背側嗅内皮質のすべての層において、研究された試験化合物の２つの最低の投薬量、３０及び６０ｍｇ／ｋｇは神経保護を与えなかった。調べられた試験化合物の２つの最高の投薬量、９０及び１２０ｍｇ／ｋｇは、背側及び腹側嗅内皮質の層ＩＩ及びＩＩＩ／ＩＶを保護した（ＤＺＰグループにおける１８〜２４％と比較して、背側部分の層ＩＩ及びＩＩ／ＩＶならびに腹側部分の層ＩＩに残る４〜１４％の損傷ならびにＤＺＰグループにおける７４％と比較して腹側の層ＩＩＩ／ＩＶにおける１８〜２１％の細胞喪失）。しかしながら、この差は嗅内皮質の腹側部分においてのみ、統計的に有意であった。
【０１６４】
初期における梨状皮質中の細胞密度（ＳＥから１４日後）
ＳＥに供され、ＤＺＰ又は３０ｍｇ／ｋｇにおける試験化合物で処置されたラットにおいて、問題の種々の領域における細胞数（ｃｅｌｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ）は、すべての動物において同じ範囲内であった。逆に、試験化合物の３つの最高投薬量において、梨状皮質中で生き残っているニューロンの数に従ってラットの２つのサブグループを区別することができた：１つのサブグループはほとんど全体的に保護されたが、他の１つはＤＺＰグループと同様に広範囲に損傷を受けた。２つのサブグループにおけるニューロンの数の間の差は、腹側梨状皮質の層ＩＩにおいて６０及び９０ｍｇ／ｋｇの試験化合物の投薬量で、ならびにこの同じ皮質の層ＩＩＩにおいて３つのグループ、６０、９０及び１２０ｍｇ／ｋｇにおける試験化合物で統計的に有意であった（図３）。嗅内皮質において類似の傾向があったが、顕著でなく、それはおそらくこの皮質において損傷があまり広範囲でなく、差が有意まで達しなかったからである（データは示されていない）。
【０１６５】
繰り返し発作への潜伏期
この時点に我々が有する唯一のデータは、てんかん誘発についての研究を我々が始めたラットのサブグループにおける潜伏期に関する。自然発作への潜伏期は、ＤＺＰグループ（７匹のラット）において１８±８日の平均値及び３０ｍｇ／ｋｇにおける試験化合物（ＲＷＪ３０）グループの２匹のラットにおいて８及び９日の値に達した。ＤＺＰの他の３つの投薬量において、集団が細分され、ＤＺＰ及びＲＷＪ３０グループと類似の潜伏期を有するサブグループ及び最初のＳＲＳへの長い潜伏期を有するサブグループがあった。ＲＷＪ６０グループにおいて、２／３のラットはＳＥからそれぞれ７及び８日後にそれらの最初の自然発作を有したが、１匹のラットはＳＥから３８日後にその最初の発作を示した。９０ｍｇ／ｋｇの試験化合物投薬量において、２／３はＳＥからそれぞれ９及び１０日後にそれらの最初の自発的発作を有したが、１匹のラットはＳＥから５１日後にその最初の発作を示した。最後に１２０ｍｇ／ｋｇの試験化合物投薬量において、２／４のラットは長い潜伏期を有し、それらの最初の自発的発作はＳＥからそれぞれ４４及び７９日後に起こったが、２匹の他のラットはＳＥに続く５ヶ月の記録に及んで、発作を発現しなかった（図４Ａ）。
【０１６６】
繰り返し発作への潜伏期と基底皮質（ｂａｓａｌ  ｃｏｒｔｉｃｅｓ）中に生き残るニューロンの数の間の関連性
種々の潜伏期の後にてんかんになったか、あるいはてんかんにならなかった動物の皮質領域中に生き残るニューロンの数を、最初のＳＲＳへの潜伏期に従ってプロットすると、
潜伏期の持続期間はこれらの領域中に生き残るニューロンの数と関連すると思われる。これは図４Ｂ中で腹側嗅内皮質の層ＩＩＩ／ＩＶにおいて示されるが、背側嗅内皮質の層ＩＩＩ／ＩＶ及び梨状皮質の層ＩＩに関してもそうであると思われる。しかしながらその時点に、各グループ中のラットの数は、腹側皮質において試験化合物処置後にＳＥに生き残っているニューロンのパーセンテージと薬剤の抗てんかん誘発効果の間の直接の関連性について、我々が結論を引き出すのを許すにはまだずっと少なすぎる。
【０１６７】
議論及び結論
本研究の結果は、Ｌｉ−ｐｉｌｏ−誘導ＳＥの開始から１時間後に始められる試験化合物を用いる処置が、海馬のＣＡ１錐体細胞層において、ならびに梨状皮質及び腹側及び背側嗅内皮質のすべての層において神経保護性を有することを示す。しかしながらこのモデルにおいて、試験化合物は３０ｍｇ／ｋｇの投薬量で保護性でなく、６０ｍｇ／ｋｇの投薬量から神経保護性を示し始める。後者の投薬量及び２つのもっと高い投薬量、９０及び１２０ｍｇ／ｋｇにおいて、薬剤は最初の自発的発作の発生への潜伏期を遅らせることもできるが、各投薬量における動物のサブグループにおいてのみである。さらに、てんかんの発生におけるこの遅延は、同じ動物における基底皮質中のＳＥに生き残っているニューロンの数と関連すると思われる。しかしながら、研究のこの部分において、動物の数はこの関連性についてしっかり結論を下すにはまだ不十分である。
【０１６８】
本研究において得たデータは、試験化合物の６０ｍｇ／ｋｇの投薬量が海馬及び基底皮質をニューロン損傷から保護し、繰り返し発作の発生を遅らせることを報告している我々のグループからの前研究と一致する（上記の実施例１を参照されたい）。それらは基底皮質の保護がてんかんのリチウム−ピロカルピンモデルにおける疾患修正効果の誘導における重要因子であると思われることも確証し、その効果は潜在的無発作期（ｌａｔｅｎｔ  ｓｅｉｚｕｒｅ−ｆｒｅｅ  ｐｈａｓｅ）の延長又は１２０ｍｇ／ｋｇにおけるその抑制でさえある。てんかんプロセスのイニシエーター（ｉｎｉｔｉａｔｏｒｓ）としての基底皮質の重要な役割は、リチウム−ピロカルピンモデルにおいて我々のグループにより以前に示された（（Ａｎｄｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｅｐｉｌｅｐｓｉａ  ４４：８９３−９０３、Ｒｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｅｐｉｌｅｐｓｉａ  ４３：３２５−３３５及びＥｐｉｌｅｐｓｉａ  ４３：１１２９−１１３６を参照されたい）。
【０１６９】
結局、試験化合物は、このモデルにおいて非常に有望な抗てんかん誘発及び神経保護効果を示し、我々の知るところでは、それらの性質を示すことができる最初の分子である。下記の表１を参照されたい；
【０１７０】
表１．Ｌｉ−Ｐｉｌｏ  ＳＥに供されたラットの海馬及び大脳皮質におけるニューロン細胞体の数への、増加する投薬量の試験化合物の効果。ＲＷＪ３０＝３０ｍｇ／ｋｇの試験化合物，ＲＷＪ６０＝６０ｍｇ／ｋｇの試験化合物，ＲＷＪ９０＝９０ｍｇ／ｋｇの試験化合物及びＲＷＪ１２０＝１２０ｍｇ／ｋｇの試験化合物。
【０１７１】
【表１】
2010523468.tif 000010
【実施例３】
【０１７２】
ＰＣ１２細胞血清回収モデル
血清回収は細胞毒性環境的挑戦であり、それは培養細胞系ならびに神経細胞を含む種々の組織起源の一次細胞における細胞死を生ずる。特に、褐色細胞腫（ＰＣ）１２細胞は、多様な神経変性及び細胞死関連障害に関する試験管内ニューロン細胞モデルとして広く用いられてきた（Ｍｕｒｉｅｌ，ｅｔ  ａｌ，Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｆｒｅｅ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｌｅｖｅｌｓ（Ｒｈｏｄ−２  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）ａｎｄ  ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｎａｌｌｙ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ＰＣ１２  ｃｅｌｌｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｃｅｒａｍｉｄｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，２０００，４２６（２），２９７−３１５；Ｄｅｒｍｉｔｚａｋｉ，ｅｔ  ａｌ，Ｏｐｉｏｉｄｓ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔｌｙ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｓｈｏｒｔ  ｐｅｒｉｏｄｓ  ｏｆ  ｓｅｒｕｍ  ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，２０００，７４（３），９６０−９６９；Ｃａｒｌｉｌｅ，ｅｔ  ａｌ，Ｒｅｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｆｔｅｒ  ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｓｅｒｕｍ  ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ：ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｅｔｒａｍｅｒｉｃ  ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｔｏ  ａ  ｄｉｍｅｒ，Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２０００，５７（１），２−１２
）。
【０１７３】
１０％の熱不活化ウマ血清及び５％の胎児ウシ血清（ＦＢＳ）が補足された無菌の培地（ＲＰＭＩ  １６４０）中でＰＣ１２細胞を培養した。培地はペニシリン−ストレプトマイシン−ネオマイシン抗生物質（それぞれ５０．ｍｕ．ｇ，５０，ｍｕ．ｇ，１００．ｍｕ．ｇ）も含有した。培地を一日置きに交換し、細胞を密集近くの対数期において継代させた。
【０１７４】
標準細胞を、いずれの処置もなしで通常の（ｒｅｇｕｌａｒ）培地中で培養した。式７又は式８のエナンチオマー（１０．ｍｕ．Ｍ）を培地中で十分に混合し、次いで細胞に適用した。２日間のアッセイの場合、血清回収の時点に１回、式７又は式８のエナンチオマー（１０．ｍｕ．Ｍ）を細胞に適用したのみであった。７日間のアッセイの場合、血清の回収の時点及びその後４８時間毎に細胞を新鮮な新しい無−血清培地と交換する時に、式７又は式８のエナンチオマー（１０．ｍｕ．Ｍ）を細胞に適用した。血清回収グループにおいて、細胞は無−血清培地中で、式７又は式８のエナンチオマーを加えずに培養された。血清回収から２日又は７日後に、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシ−メトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム内部塩（ＭＴＳ）アッセイにより、細胞生き残りを決定した。
【０１７５】
実験の最後に、新しい培地で細胞を洗浄し、５％ＣＯ２を有する加湿された３７度Ｃのインキュベーター中で、ＭＴＳ溶液と一緒に１．５時間インキュベーションした。インキュベーション時間の後、Ｓｏｆｔｍａｘプログラム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて細胞をすぐに分析した。ＭＴＳアッセイは、与えられる環境設定において生存細胞の数を決定するための熱量測定法（ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ）である。アッセイは、組織培地中で可溶性であり、９６−ウェルアッセイプレート中で４９０ｎｍにおいて直接測定されるホルマザンへのテトラゾリウム塩、ＭＴＳの細胞変換に基づく。吸光度は培養中の生存細胞の数に正比例する。標準細胞における随意の吸光度の読取り値を、１００％生存率として表す。表２は、ＰＣ１２細胞血清回収モデルにおける、経口的に投与される式７及び式８のエナンチオマーの、細胞生き残り率への効果を示すデータを挙げている（．ｓｕｐ．１ｐ値−０．０１；．ｓｕｐ．２ｐ値−＜０．０１）。
【０１７６】
【表２】
2010523468.tif 000011
【実施例４】
【０１７７】
一時的大脳虚血ラットモデル
雄のＷｉｓｔａｒラットを用い、一時的大脳虚血中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）ラットモデル（Ｎａｇａｓａｗａ  Ｈ．ａｎｄ  Ｋｏｇｕｒｅ  Ｋ．，Ｓｔｒｏｋｅ，１９８９，２０，１０３７；及びＺｅａ  Ｌｏｎｇａ  Ｅ．，Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ  Ｐ．Ｒ．，Ｃａｒｌｓｏｎ  Ｓ．ａｎｄ  Ｃｕｍｍｉｎｓ  Ｒ．，Ｓｔｒｏｋｅ，１９８９，２０，８４に記載されている通り）において、式７のエナンチオマーを１０及び１００ｍｇ／ｋｇ（
静脈内）で調べた。正の標準としてＭＫ８０１（ジゾシルピンマレート（Ｄｉｚｏｃｉｌｐｉｎｅ  ｍａｌｅａｔｅ）；ＣＡＳ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ  ｎｕｍｂｅｒ  ７７０８６−２２−７、商業的に入手可能な神経保護性化合物）を用いた（３ｍｇ／ｋｇ，腹膜内）。
【０１７８】
ラット（ｎ＝１２）を４つの実験グループの１つに無作為に割り当て、麻酔した。内頸動脈、前大脳動脈及び後大脳動脈からの中大脳動脈への血流をこの方法により遮断した。遮断から１時間後、１時間に及んでビヒクル（１時間かけて静脈内に投与）、標準（１時間の開始時に１回の腹膜内投薬として投与）及び２つの投薬量の式７のエナンチオマー（１時間かけて静脈内に投与）を用いて、動物を処置した。遮断から２時間後に再灌流を行なった。
【０１７９】
動物を犠牲にし、それぞれの脳の２０ｍｍの厚さの冠状切片を調製した。前頭皮質から後頭皮質への４０個毎の切片中の１つ（すなわち８００ｎＭ毎）を用い、大脳損傷の程度を定量した。クレシルバイオレットを用いて染色された（Ｎｉｓｓｌ法に従って）切片を用いてスライドを調製し、光学顕微鏡下で調べた。
【０１８０】
個々のラットの冠状切片中の局所的虚血表面積を、形態学的変化を有する細胞の存在に従って決定した。ニューロン傷害又は梗塞の面積を測定し、次いで加えた。各動物に関して皮質及び線条の体積を計算した（全虚血表面積掛ける（ｔｉｍｅｓ）０．８ｍｍ（厚さ））。
【０１８１】
ＭＣＡＯモデル分析
４つの実験グループに無作為に指定された各動物に関する平均値（．＋−．Ｓ．Ｅ．Ｍ．）を、一元ＡＮＯＶＡ（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）（一元ＡＮＯＶＡは、３つもしくはそれより多い相手がいない（ｕｎｍａｔｃｈｅｄ）グループを比較する統計的方法である）及び続いてＤｕｎｎｅｔｔのｔ検定（両方法は、Ｓｔａｔｖｉｅｗ  ５１２＋ソフトウェア，ＢａｒｉｎＰｏｗｅｒ，Ｃａｌａｂａｓａｓ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡに組み込まれている）を用いて比較した。
【０１８２】
下記の表３に示す通り、ｐ値が＜０．０５である場合に、ビヒクルグループに比べて結果は統計的に有意であると考えられた（１ｐ＜０．０１；２ｐ＜０．０５）。
【０１８３】
【表３】
2010523468.tif 000012
【０１８４】
引用された参照文献
本明細書で引用したすべての参照文献は、それぞれ個々の公開文献又は特許もしくは特許出願が、引用することによりその記載事項全体がすべての目的に関して本明細書の内容となると特定的且つ個々に示されている場合と同じ程度まで、引用することによりそれらの記載事項全体が且つすべての目的に関して本明細書の内容となる。
【０１８５】
本明細書における参照文献の議論は、単にそれらの筆者により成された主張をまとめることを意図しており、いずれの参照文献も先行技術を構成するという容認は成されない。出願人等は、引用された参照文献の精度及び適切性に挑戦する権利を保有する。
【０１８６】
本発明は、本出願中に記載されている特定の態様により制限されるべきではなく、特定の態様は、本発明の個々の側面の１つの例のつもりである。当該技術分野における熟練者に明らかな通り、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、その多くの修正及び変更を行なうことができる。本明細書で挙げられたものの他に、本発明の範囲内で機能的に同等の方法及び装置は、前記の記述及び添付の図面から、当該技術分野における熟練者に明らかであろう。そのような修正及び変更は、添付の請求項の範囲内に含まれることが意図されている。本発明は、請求項が資格を与えられている同等事項の全範囲とともに、添付の請求項によってのみ制限されるべきである。
【０１８７】
参照文献
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【図１】
2010523468.tif 000019
【図２Ａ】
2010523468.tif 000020
【図２Ｂ】
2010523468.tif 000021
【図３Ａ】
2010523468.tif 000022
【図３Ｂ】
2010523468.tif 000023
【図３Ｃ】
2010523468.tif 000024
【図４Ａ】
2010523468.tif 000025
【図４Ｂ】
2010523468.tif 000026
【国際調査報告】
2010523468.tif 000027
2010523468.tif 000028