(57)【要約】  エクスビボ培養された造血細胞の局所投与による、末梢血管疾患の細胞療法のための方法が提供される。この造血細胞は、（ａ）造血細胞を、細胞増殖を可能にする条件のもとで培養すること、および、（ｂ）前記造血細胞を、所定の培養期間にわたって所定量のニコチンアミドの存在下で培養し、その治療の必要性のある対象の虚血組織における灌流を高めることができる未分化造血細胞の拡大された集団をもたらすことによるエクスビボでの拡大培養によって拡大される。【選択図】  なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
末梢血管疾患をその治療の必要性のある対象において治療する方法であって、治療量のエクスビボ拡大された造血細胞を前記対象の虚血組織に投与し、それにより、前記末梢血管疾患を治療することを含む、方法。
【請求項２】
前記造血細胞は、
（ａ）造血細胞を、細胞増殖を可能にする条件のもとで培養すること、および、
（ｂ）前記造血細胞を、所定の培養期間にわたって所定量のニコチンアミドの存在下で培養し、前記治療の必要性のある対象の虚血組織における灌流を高めることができる未分化造血細胞の拡大された集団をもたらすこと
によるエクスビボでの拡大培養によって拡大される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記造血細胞は、骨髄、末梢血および新生児臍帯血からなる群から選択される供給源に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記方法はさらに、前記造血細胞を前記培養の前に造血幹細胞について富化することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記拡大された造血細胞を前記対象への前記投与の前に造血幹細胞について富化することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ニコチンアミドの量が約０．１ｍＭ〜約２０ｍＭである、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記ニコチンアミドの量が約０．２５ｍＭ〜約１５ｍＭである、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記ニコチンアミドの量が約０．５ｍＭ〜約１０ｍＭである、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記ニコチンアミドの量が約１．０ｍＭ〜約１０ｍＭである、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記ニコチンアミドの量が約５．０ｍＭである、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記培養期間が約６日〜約６週間である、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
前記培養期間が約１０日〜約５週間である、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
前記培養期間が約２週間〜約４週間である、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
前記培養期間が約３週間である、請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
前記投与することが、静脈内投与および直接注入からなる群から選択される方法によって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記対象が、前記造血細胞の前記投与の前に免疫抑制治療により治療される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記対象が、前記造血細胞の前記投与の後に免疫抑制治療により治療される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記投与することが前記対象への前記細胞の少なくとも２回の投与を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記拡大された造血細胞が、末梢血管疾患のためのさらなる治療と併せて同時投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記さらなる治療は、免疫抑制治療、抗高血圧治療および抗血小板治療からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記灌流の高まりは、ドップラー超音波、血管造影およびＭＲＩからなる群から選択されるパラメーターに従って決定される、請求項２に記載の方法。
【請求項２２】
前記灌流の高まりは、組織の壊死、組織の潰瘍形成、指切断および肢切断からなる群から選択される臨床パラメーターに従って決定される、請求項２に記載の方法。
【請求項２３】
前記増殖のための条件が、サイトカインを与えることを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２４】
前記サイトカインは初期作用サイトカインである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記初期作用サイトカインが、幹細胞因子、ＦＬＴ３リガンド、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−６、インターロイキン−１０、インターロイキン−１２、腫瘍壊死因子−αおよびトロンボポイエチンからなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
後期作用サイトカインを与えることをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記後期作用サイトカインが、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポイエチン、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＮＧＦ、ＶＥＧＦ、ＬＩＦ、肝細胞増殖因子およびマクロファージコロニー刺激因子からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
虚血性疾患または虚血状態をその治療の必要性のある対象において治療する方法であって、
（ａ）造血細胞を、細胞増殖を可能にする条件のもとで培養すること、および、
（ｂ）前記造血細胞を、所定の培養期間にわたって所定量のニコチンアミドの存在下で培養し、前記治療の必要性のある対象の虚血組織における灌流を高めることができる未分化造血細胞の拡大された集団をもたらすこと
によってエクスビボで拡大培養された造血細胞の治療量をその必要性のある対象に投与すること、ならびに、
（ｃ）前記拡大された造血細胞の治療量を前記対象に投与し、それにより、前記対象における前記虚血性疾患を治療および／または予防すること
を含む、方法。
【請求項２９】
前記造血細胞は、骨髄、末梢血および新生児臍帯血からなる群から選択される供給源に由来する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記造血細胞を前記培養の前に造血幹細胞について富化することをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記拡大された造血細胞を前記対象への前記投与の前に造血幹細胞について富化することをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記虚血性疾患または虚血状態は末梢血管疾患である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記ニコチンアミドの量が約０．１ｍＭ〜約２０ｍＭである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記ニコチンアミドの量が約０．２５ｍＭ〜約１５ｍＭである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
前記ニコチンアミドの量が約０．５ｍＭ〜約１０ｍＭである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
前記ニコチンアミドの量が約１．０ｍＭ〜約１０ｍＭである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
前記ニコチンアミドの量が約５．０ｍＭである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３８】
前記培養期間が約６日〜約６週間である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３９】
前記培養期間が約１０日〜約５週間である、請求項２８に記載の方法。
【請求項４０】
前記培養期間が約２週間〜約４週間である、請求項２８に記載の方法。
【請求項４１】
前記培養期間が約３週間である、請求項２８に記載の方法。
【請求項４２】
前記培養期間が約３週間であり、前記ニコチンアミドの量が約５ｍＭ／Ｌである、請求項２８に記載の方法。
【請求項４３】
造血細胞を、虚血性疾患または虚血状態に苦しむ対象への投与のために調製する方法であって、
（ａ）造血細胞を、細胞増殖を可能にする条件のもとで培養すること、および、
（ｂ）前記造血細胞を、所定の培養期間にわたって所定量のニコチンアミドの存在下で培養し、その必要性のある対象の虚血組織における灌流を高めることができる未分化造血細胞の拡大された集団をもたらすこと
を含む、方法。
【請求項４４】
前記培養期間が約３週間であり、前記ニコチンアミドの量が約５ｍＭ／Ｌである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記虚血性疾患または虚血状態は末梢血管疾患である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
包装材と、エクスビボ培養された造血細胞集団とを含む、末梢血管疾患を治療するための製造物であって、前記造血細胞集団は、
（ａ）造血細胞を、細胞増殖を可能にする条件のもとで培養すること、および、
（ｂ）前記造血細胞を、所定の培養期間にわたって所定量のニコチンアミドの存在下で培養し、虚血組織における灌流を高めることができる未分化造血細胞の拡大された集団をもたらすこと
によってエクスビボで拡大培養され、また、
前記包装材は、前記造血細胞集団が、末梢血管疾患をその治療の必要性のある対象において治療するためのものであることを示すラベル、説明書または添付文書を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は米国仮特許出願第６０／８５７７８７号（２００６年１１月９日出願）の優先権の利益を主張する（その内容は、全体が本明細書中に示されるかのように参考として組み込まれる）。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、そのいくつかの実施形態において、末梢血管疾患の細胞療法に関連し、より具体的には、限定されないが、エクスビボ培養された造血細胞、および、末梢血管疾患を治療するためのその使用に関連する。
【背景技術】
【０００３】
末梢動脈閉塞疾患（ＰＡＯＤ、これはまた末梢血管疾患またはＰＶＤとして知られている）は、アテローム性動脈硬化、狭窄症につながる炎症性プロセス、塞栓または血栓の形成から生じ得る、大きな末梢動脈の閉塞によって引き起こされるすべての疾患をまとめて示すものである。末梢動脈閉塞疾患は急性虚血または慢性虚血のどちらかを引き起こす。ＰＶＤは心臓および脳の外部における血管の疾患を示し、多くの場合、血液を、脚、腕、胃または腎臓に運ぶ血管が狭くなることである。推定では１千万人を超えるアメリカ人が、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）に関連する循環障害（一般には脚における循環障害）に罹患する。末梢動脈疾患（ＰＡＤ）は、動脈硬化症、すなわち、心臓発作を引き起こし得る動脈の閉塞および硬化によって引き起こされる。ＰＡＤ患者の約半数は症状を経験することがほとんどないか、または全くないが、他のＰＡＤ患者は、脚および足の感覚異常（しびれ感）および潰瘍形成を含めて様々なレベルの痛みおよび他の症状を報告する。初期の治療は、心臓病の危険性を低下させることに向けられる生活スタイルの変化に類似する（例えば、食事療法、禁煙、体重減少、および、適するならば、コレステロール低下薬物など）。ＰＡＤが進行するならば、患者は、閉塞した血管を広げるための動脈バイパス移植手法または血管形成術手法を必要とする場合がある。しかしながら、ＰＡＤ患者の１２パーセントもの多くが手術の候補者ではなく、また、米国では毎年、３００００人〜５００００人もの多くの人々が、ＰＡＤのために切断を受けることを余儀なくされる。これらの重篤なＰＡＤ患者の多くについては、その生活の質が不可逆的に損なわれる。
【０００４】
現在、ＰＶＤは保存的に治療され、最初に選ばれる治療選択肢には、疼痛の薬物療法（緩和的）、「血栓予防」薬物および「血栓予防」治療が含まれる。しかしながら、重症の症状および／または進行性症状の場合には、外科的介入、例えば、血管形成術、バイパス手術、粥腫切除術、および、切断までもが必要となる場合がある。これらの分野における大きな進歩にもかかわらず、ＰＶＤは依然として臨床的課題が残っており、そのため、多くの場合、進行した段階の疾患を有する治療された患者における結果は満足すべきものではない。従って、側副血管の形成を刺激すること、血管分布を増大させること、および、骨格筋機能を改善することを目指す新規な治療選択肢を求める臨床要求がますます大きくなっている。
【０００５】
幹細胞移植による治療的血管形成の誘導は治療的利益をもたらすことができ、ＰＶＤ患者における傷の治癒および患肢救済に役立つ場合がある。血管形成（側副血管の形成）を、増殖因子の投与によって、または、増殖因子タンパク質をコードする遺伝子の発現によって達成することができる。近年の研究では、骨髄造血幹細胞および血液造血幹細胞が多くの器官系において非造血系組織の修復に寄与し得ることが示唆されている。動物モデルにおいて、また、より近年では、限定されたヒト試験において、造血幹細胞が血管新生に寄与することが報告されている（Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、２００３（Ａｕｇ）、３２  Ｓｕｐｐｌ  １：Ｓ２９〜３１；Ａｓａｈａｒａら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、２０００、９：４５１〜５７；Ｙｌａ  Ｈｅｒｔｔｕａｌａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２００３、９：６９４〜７０１；Ｔａｔｅｉｓｈｉら、Ｌａｎｃｅｔ、２００２、３６０：４２７〜３５；Ｈｉｇａｓｈｉら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、２００４、１０９：１２１５〜１２１８；総説については、Ｐｅｒｉｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、２００３、１０７：９３５参照）。
【０００６】
造血細胞集団の拡大：
造血細胞集団の増殖を刺激するための多くの方法が開示されているが［例えば、Ｃｚｙｚら、Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２００３、３８４：１３９１〜４０９；Ｋｒａｕｓら（米国特許第６３３８９４２号、２００２年１月１５日発行）；Ｒｏｄｇｅｒｓら（米国特許第６３３５１９５号、２００２年１月１日発行）；Ｅｍｅｒｓｏｎら（Ｅｍｅｒｓｏｎら、米国特許第６３２６１９８号、２００１年１２月４日発行）およびＨｕら（国際特許出願公開ＷＯ００／７３４２１、２０００年１２月７日公開）ならびにＨａｒｉｒｉら（米国特許出願公開第２００３０２３５９０９号）参照］、培養における造血細胞の成長とともに当然のこととして生じる付随した分化を伴わない確実な、長期に及ぶ拡大を提供する方法はほとんどない。
【０００７】
造血細胞の分化
１種類のＨＳＣが、すべてのタイプの造血細胞を生じさせることができ、主として骨髄において見出される数は非常に少ない（だが、様々なＨＳＣがまた、臍帯血（ＵＢＣ）および他の組織において見出される）。様々な研究により、ヒトＨＳＣが、高いレベルの表面糖タンパク質ＣＤ３４を発現し（ＣＤ３４＋）、より成熟した前駆体集団であることを意味するマーカー（例えば、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ｔｈｙ−１およびＣＤ７１）の低いレベルまたは検出されないレベルを発現する小さい静止細胞として特徴づけられる。ＣＤ３４＋ＣＤ３８−の細胞（これは、限定されたＣＤ３４＋細胞集団の１０％未満を表す）は、リンパ系細胞および骨髄系細胞の両方をインビトロで生じさせることができ、免疫低下マウスに大きな程度に生着することができ、また、自家血液細胞移植を受けている患者の造血回復にとって非常に重要であるようであり得る。エクスビボ拡大の現在使用されている方法のすべてにおいて、中間期および後期の前駆体集団の著しい蓄積が達成され、一方で、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−の亜集団の拡大は限定的であり、このことが、培養された初期造血細胞を細胞療法および遺伝子療法において利用することの何らかの将来性に対する大きな障害となっている。
【０００８】
最近まで、前駆体細胞サブセットの限定された拡大が、幹細胞を線維芽細胞のフィーダー層の上で成長させることによって、または、細胞を初期作用サイトカインのトロンボポイエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、ＦＬＴ−３リガンドおよび幹細胞因子（ＳＣＦ）の存在下で成長させることによって達成されている（Ｍａｄｌａｍｂａｙａｎ  ＧＪら（２００１）、Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ、１０：４８１；Ｐｕｎｚｅｌ  Ｍら（１９９９）、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、１３：９２；および、Ｌａｎｇｅ  Ｗら（１９９６）、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、１０：９４３）。しかしながら、近年では、造血細胞をエクスビボで拡大するための他の方法が開示されている。ＰＣＴ  ＩＬ９９／００４４４（Ｐｅｌｅｄら、１９９９年８月１７日出願）（これは、全体が本明細書中に参考として示されるかのように参考として組み込まれる）では、エクスビボ培養された造血細胞の分化を、細胞を遷移金属のキレーターにより処理することによって制限する方法が開示されている。この発明を実施に移しているとき、Ｐｅｌｅｄらは、銅に対する高い親和性を有する重金属キレーター（例えば、テトラエチルペンタミン（ＴＥＰＡ）など）が、フィーダー層を用いることなく成長させた臍帯血由来造血細胞、骨髄由来造血細胞および末梢血由来造血細胞におけるＣＤ３４＋細胞の割合およびその長期クローン性を大きく高めたことを発見した。分化を阻害する一方で、増殖を促進させることもまた、ＴＥＰＡにより処理された赤球前駆細胞、培養されたマウス赤白血病細胞、胚性幹細胞、および、初代肝細胞培養における肝細胞において観測された。
【０００９】
ＰＣＴ  ＩＬ０３／０００６２（これもまたＰｅｌｅｄらによる。２００３年１月２３日出願）（これは、全体が本明細書中に示されるかのように参考として組み込まれる）は、ＴＥＰＡ−ＣｕキレートをキレーターのＴＥＰＡと同様に使用して、分化を阻害しながら、長期のエクスビボでの造血細胞増殖を同様に効果的に促進させることを開示する。驚くべきことに、ＴＥＰＡおよびＴＥＰＡ−キレートのこの作用はまた、選択されていない末梢単核画分を開始集団として使用することが明らかになった。それに記載された結果は、造血細胞が、ＣＤ３４＋細胞を前もって精製することなく、混合された（単核画分の）血液細胞の培養において、少なくとも１２週間の期間にわたって連続的にエクスビボで実質的に拡大され得ることを明瞭に示す。
【００１０】
ＰＣＴ  ＩＬ０３／０００６４（これもまたＰｅｌｅｄらによる。２００３年１月２６日出願）（これは、全体が本明細書中に示されるかのように参考として組み込まれる）は、造血細胞集団のエクスビボ拡大を誘導するために、ＣＤ３８の発現および／または活性、ならびに／あるいは、細胞内の銅含有量を妨げる条件および様々な分子を使用する造血細胞のエクスビボ拡大および阻害を教示する。そのような小分子および方法には、線状ポリアミンキレーターおよびそのキレート、ニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドまたはニコチンアミドアナログの誘導体、あるいは、ニコチンアミドまたはニコチンアミドアナログの代謝産物、ＰＩ  ３−キナーゼ阻害剤、レチノイン酸、レチノイドおよび／またはビタミンＤに応答することにおいて造血細胞の能力を低下させるための条件、ならびに、ＰＩ  ３−キナーゼを伴うシグナル伝達経路に応答することにおいて細胞の能力を低下させるための条件が含まれる。
【００１１】
ＰＣＴ  ＩＬ２００３／００６８１（これもまたＰｅｌｅｄらによる。２００３年８月１７日出願）（これは、全体が本明細書中に示されるかのように参考として組み込まれる）は、小さい割合としてでさえ、造血細胞に存在する造血細胞の集団を、最初に細胞を富化することなく、また、同時に造血細胞の分化を実質的に阻害しながら、エクスビボ拡大する方法を開示する。そのようにして拡大された細胞は、造血細胞移植のために好適な細胞について、細胞の遺伝子療法のための遺伝子操作のために好適な細胞について、養子免疫療法、インビボでの分化転換のための幹細胞の移植、同様にまた、シス分化およびトランス分化におけるエクスビボ組織工学のために好適な細胞について造血単核細胞を前もって富化することなく、造血細胞のエクスビボ培養された集団を効率的に提供するために使用することができる。
【００１２】
ＰＣＴ  ＩＬ２００４／０００２１５（これもまたＰｅｌｅｄらによる。２００４年３月４日出願）（これは、全体が本明細書中に示されるかのように参考として組み込まれる）では、ＰＩ  ３−キナーゼの低分子量阻害剤にさらし、細胞のＰＩ  ３−Ｋシグナル伝達経路を中断させることによって造血系起源の細胞および非造血系起源の細胞における拡大および分化阻害をもたらす、幹細胞／初期前駆体細胞の自己複製がさらに明らかにされた。
【００１３】
ＰＣＴ  ＩＬ２００４／０００６４４（これもまたＰｅｌｅｄらによる。２００４年７月１５日出願）（これは、全体が本明細書中に示されるかのように参考として組み込まれる）は、内胚葉系器官の移植および生着のための内胚葉由来細胞および非内胚葉由来細胞の拡大を開示する。
【００１４】
ＰＣＴ  ＩＬ２００５／００９９４（これもまたＰｅｌｅｄらによる。２００５年９月１５日出願）（これは、全体が本明細書中に示されるかのように参考として組み込まれる）は、間葉系細胞と同時培養することによる幹細胞の拡大および分化阻害、自己複製することができる未分化細胞の拡大された集団の単離、ならびに、幹細胞移植、細胞遺伝子療法のための遺伝子操作、養子免疫療法および組織工学などのためのそのような細胞および細胞集団の使用を開示する。
【００１５】
ＰＣＴ  ＩＬ２００５／００７５３（これもまたＰｅｌｅｄらによる。２００５年７月１４日出願）（これは、全体が本明細書中に示されるかのように参考として組み込まれる）は、エクスビボおよび／またはインビトロにおいて幹細胞の集団を拡大し、かつ、幹細胞の集団における分化を実質的に阻害する方法、再生可能な未分化幹細胞の拡大された大きい集団、ならびに、造血細胞移植、遺伝子操作および細胞の遺伝子療法、養子免疫療法、多数の疾患（例えば、β−異常ヘモグロビン症など）のための治療、エクスビボ組織工学などのためのその治療的使用を開示する。
【００１６】
従って、様々な方法が、造血細胞移植および他の細胞移植、細胞の遺伝子療法のための遺伝子操作、養子免疫療法、インビボおよびエクスビボでのシス分化およびトランス分化、臓器生着などのために好適な、自己複製によって特徴づけられる細胞の集団をもたらす造血細胞の拡大および分化阻害のために利用可能である。しかしながら、細胞療法はこれまで、ＰＶＤのための従来の薬物治療および外科的治療において固有的な問題に対する有効な解決策を提供することには成功していない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
実施に移しているとき、本発明の方法を使用して培養および拡大された造血細胞が、末梢血管疾患を患う対象に移植されたときに治療的であることが示された。従って、いくつかの実施形態のいくつかの局面によれば、本発明の方法は、その必要性のある対象に施すことによって末梢血管疾患の治療および予防のために使用することができる。別の実施形態によれば、製造物は、本発明の方法による培養された造血細胞の集団と、包装材と、造血細胞集団が、末梢血管疾患を対象において治療するためのものであることを示すラベルまたは添付文書とを含む。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、末梢血管疾患をその必要性のある対象において治療する方法が提供され、この場合、この方法は、治療量のエクスビボ拡大された造血細胞を前記対象の虚血組織に投与し、それにより、前記末梢血管疾患を治療することを含む。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、造血細胞は、（ａ）造血細胞を、細胞増殖を可能にする条件のもとで培養すること、および、（ｂ）その造血細胞を、所定の培養期間にわたって所定量のニコチンアミドの存在下で培養し、その必要性のある対象の虚血組織における灌流を高めることができる未分化造血細胞の拡大された集団をもたらすことによるエクスビボでの拡大培養によって拡大される。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、虚血性疾患または虚血状態をその必要性のある対象において治療する方法が提供され、この場合、この方法は、（ａ）造血細胞を、細胞増殖を可能にする条件のもとで培養すること、および、（ｂ）その造血細胞を、所定の培養期間にわたって所定量のニコチンアミドの存在下で培養し、その必要性のある対象の虚血組織における灌流を高めることができる未分化造血細胞の拡大された集団をもたらすことによってエクスビボで拡大培養された造血細胞の治療量をその必要性のある対象に投与すること、ならびに、（ｃ）拡大された造血細胞の治療量を対象に投与し、それにより、対象における虚血性疾患を治療および／または予防することを含む。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、この方法はさらに、拡大された造血細胞を、対象に投与する前に造血幹細胞について富化することを含む。
【００２２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、投与することが、静脈内投与および直接注入からなる群から選択される方法によって行われる。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、対象が造血細胞投与前および／または造血細胞投与後において免疫抑制治療により治療される。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、投与することが対象への細胞の少なくとも２回の投与を含む。
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、拡大された造血細胞が、末梢血管疾患のためのさらなる治療と併せて同時投与される。さらなる治療は、免疫抑制治療、抗高血圧治療および抗血小板治療からなる群から選択することができる。
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、灌流の高まりを、ドップラー超音波、血管造影およびＭＲＩからなる群から選択されるパラメーターに従って求める。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、灌流の高まりを、組織の壊死、組織の潰瘍形成、指切断および肢切断からなる群から選択される臨床パラメーターに従って求める。
【００２８】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、造血細胞を、虚血性疾患または虚血状態に苦しむ対象への投与のために調製する方法が提供され、この場合、この方法は、（ａ）造血細胞を、細胞増殖を可能にする条件のもとで培養すること、および、（ｂ）その造血細胞を、所定の培養期間にわたって所定量のニコチンアミドの存在下で培養し、その必要性のある対象の虚血組織における灌流を高めることができる未分化造血細胞の拡大された集団をもたらすことを含む。
【００２９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、虚血性疾患または虚血状態は末梢血管疾患である。
【００３０】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、包装材と、エクスビボ培養された造血細胞集団とを含む、末梢血管疾患を治療するための製造物が提供され、この場合、造血細胞集団は、（ａ）造血細胞を、細胞増殖を可能にする条件のもとで培養すること、および、（ｂ）その造血細胞を、所定の培養期間にわたって所定量のニコチンアミドの存在下で培養し、虚血組織における灌流を高めることができる未分化造血細胞の拡大された集団をもたらすことによってエクスビボで拡大培養され、また、包装材は、造血細胞集団が、末梢血管疾患をその必要性のある対象において治療するためのものであることを示すラベル、説明書または添付文書を含む。
【００３１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、造血細胞は、骨髄、末梢血および新生児臍帯血からなる群から選択される供給源に由来する。
【００３２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、この方法はさらに、造血細胞を培養の前に造血幹細胞について富化することを含む。
【００３３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、この方法はさらに、拡大された造血細胞を培養の前に造血幹細胞について富化することを含む。
【００３４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、虚血性疾患または虚血状態は末梢血管疾患である。
【００３５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ニコチンアミドの量が約０．１ｍＭ〜約２０ｍＭである。
【００３６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ニコチンアミドの量が約０．２５ｍＭ〜約１５ｍＭである。
【００３７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ニコチンアミドの量が約０．５ｍＭ〜約１０ｍＭである。
【００３８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ニコチンアミドの量が約１．０ｍＭ〜約１０ｍＭである。
【００３９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ニコチンアミドの量が約５．０ｍＭである。
【００４０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養期間が約６日〜約６週間である。
【００４１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養期間が約１０日〜約５週間である。
【００４２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養期間が約２週間〜約４週間である。
【００４３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養期間が約３週間である。
【００４４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ニコチンアミドの量が５．０ｍＭ／Ｌであり、培養期間が約３週間である。
【００４５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、増殖のための条件が、サイトカインを与えることを含む。
【００４６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、サイトカインは初期作用サイトカインである。
【００４７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、初期作用サイトカインが、幹細胞因子、ＦＬＴ３リガンド、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−６、インターロイキン−１０、インターロイキン−１２、腫瘍壊死因子−αおよびトロンボポイエチンからなる群から選択される。
【００４８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、この方法はさらに、後期作用サイトカインを与えることを含む。
【００４９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、後期作用サイトカインが、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポイエチン、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＮＧＦ、ＶＥＧＦ、ＬＩＦ、肝細胞増殖因子およびマクロファージコロニー刺激因子からなる群から選択される。
【００５０】
別途定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術的用語および／または科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法および／または材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
【００５１】
本明細書では本発明のいくつかの実施形態を単に例示し図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の好ましい実施形態を例示考察することだけを目的としており、本発明の原理や概念の側面の最も有用でかつ容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために提示していることを強調するものである。この点について、図面について行う説明によって本発明のいくつもの形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】実施例において使用される末梢血管疾患（ＰＶＤ）の後肢虚血モデルのグラフィック表示である。矢印は大腿動脈の結紮位置を示す。細胞が肢の結紮部分の遠位側に筋肉内投与されたことに留意すること。
【図２】免疫適格ＢａｌｂＣマウスの後肢虚血モデルにおける結果（切断）に対する、増大する用量（５×１０４細胞／マウス、５×１０５細胞／マウスおよび２．５×１０６細胞／マウス）の培養および拡大された造血細胞の影響を示すヒストグラムである。低用量による虚血影響の著しい防止（４０％超）、および、高用量群における虚血影響のほぼ完全な逆戻りに留意すること。
【図３】結紮後７日目（図３ａ）および結紮後１４日目（図３ｂ）で測定された免疫適格ＢａｌｂＣマウスの後肢虚血モデルにおける結果（灌流）に対する、増大する用量（５×１０４細胞／マウス、５×１０５細胞／マウスおよび２．５×１０６細胞／マウス）の注入された、培養および拡大された造血細胞の影響を示すヒストグラムである。非処置群と比較して、すべての投薬群における処置された肢の迅速な、著しく優れた回復に留意すること。結果が灌流における変化パーセントとして表される（灌流の変化＝灌流７日目−灌流０日目）。それぞれの時点において、パーセント灌流が反対側の非虚血肢に対して計算される。
【図４】結紮後の肢の灌流に対する、拡大された造血細胞の注入の影響を示す一連のレーザードップラー血流画像である。マウスのレーザードップラー走査を、シクロスポリン（図４ａ）、または、シクロスポリンおよび５×１０５個の培養細胞（図４ｂ）が注入されたマウスにおいて、左後肢の腸骨動脈結紮の後７日で行った。それぞれの群の代表的なマウスが示される。赤色の色調により、最大灌流の領域が示される；黄色の色調により、中間的な灌流が示される（値が黄色で示される）；最も低い灌流の値が青色として表される。
【図５】結紮後の肢の灌流に対する、拡大された造血細胞の注入の影響を示す一連のレーザードップラー血流画像である。マウスのレーザードップラー走査を、緩衝液（図５ａ）または５×１０５個の細胞（図５ｂ）が注入されたマウスにおいて、左後肢の腸骨動脈結紮の後７日で行った。代表的なマウスが示される。赤色の色調により、最大灌流の領域が示される；黄色の色調により、中間的な灌流が示される（値が黄色で示される）；最も低い灌流の値が青色として表される。
【図６】結紮後１２日で測定されたヌードマウスでの後肢虚血モデルにおける結果（灌流）に対する、注入された新鮮な造血細胞、または、注入された、培養および拡大された造血細胞の治療効果を示すヒストグラムである。ニコチンアミドとともに培養された細胞により処置されたマウスの虚血肢の血流の優れた回復に留意すること。この実験の結果により、ニコチンアミドの非存在下で培養された細胞の類似した数の活性、または、培養前の細胞（非培養細胞）の類似した数の活性を上回る、ニコチンアミドとともに培養された細胞の優れた活性が明らかにされる。従って、ニコチンアミドの存在下で培養された細胞は、培養細胞または新鮮な非培養細胞を上回る増大した治療的可能性を明瞭に示す。
【図７】結紮後１２日で測定されたヌードマウスの後肢虚血モデルにおける指および／または肢の切断に対する、注入された新鮮な（非培養細胞）造血幹細胞、または、注入された、培養および拡大された造血幹細胞（１×１０６個／マウス）の影響を示すヒストグラムである。ニコチンアミドとともに培養された造血細胞によってもたらされる、後肢虚血の影響からの完全な保護に留意すること。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、末梢血管疾患の細胞療法に関連し、より具体的には、限定されないが、エクスビボ培養された造血細胞、および、末梢血管疾患を治療するためのその使用に関連する。
【００５４】
本発明の原理および操作は、付随する説明および実施例を参照してより良く理解されることができる。
【００５５】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適用において、下記の記載に示されるか、または実施例の節において例示される構成要素の組み立ておよび構成の細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、または様々な方法で実施することができ、または様々な方法で実施される。また、本明細書中で用いられている表現法および用語法は説明目的のためであり、限定であるとして見なすべきでないことを理解しなければならない。
【００５６】
末梢血管疾患（ＰＶＤ、これはまた末梢動脈閉塞疾患（ＰＡＯＤ）として知られている）は、より多くの若年者および高齢者の間での高まる懸念を生じさせている、複雑で、潜在的には消耗性で、多くの場合には治療不能な状態である。関与する血管傷害の慢性的で、ほとんどの場合には不可逆的な性質のために、血管新生がこれまで、ＰＶＤのための多くの近年に提案された解決策の目標であった。
【００５７】
本発明のいくつかの実施形態を実施に移しているとき、本発明の方法を使用して培養された造血細胞が、末梢血管疾患に苦しむ対象に移植されたとき、灌流を高めること、および、四肢の切断を低下させることにおいて効果的であったことが示された。
【００５８】
従って、本発明の１つの局面によれば、末梢血管疾患をその必要性のある対象において治療する方法が提供され、この場合、この方法は、治療量のエクスビボ拡大された造血細胞を対象の虚血組織に投与し、それにより、末梢血管疾患を治療することを含む。
【００５９】
本明細書中で使用される場合、「末梢血管疾患（ＰＶＤ、これはまた末梢閉塞性動脈疾患（ＰＯＡＤ）として知られている）」は、例えば、疾患または傷害の結果として、例えば、炎症、糖尿病、冠状動脈疾患、心筋梗塞（ＭＩ）、心房細動、一過性虚血性発作、脳卒中、肢虚血および腎臓疾患などの結果として、末梢循環（すなわち、心臓および脳の血管の外側での血管）の障害から生じる状態を含む。具体的には、末梢血管疾患は、頸動脈または大腿動脈における閉塞、腸骨動脈における閉塞、あるいは、大腿動脈または頸動脈の遠位側にある動脈（例えば、下肢における脛骨動脈およびその分枝、ならびに、上肢における上腕動脈およびその分枝）における閉塞を伴う血管障害である。より小さい血管（例えば、閉塞部の遠位側にある組織の毛細血管床など）もまた冒される。末梢動脈における閉塞は、痛みおよび制限された動き、罹患組織の活力喪失および無酸素症を引き起こし、また、壊死および二次的感染をもたらす場合がある。閉塞性末梢血管疾患に関連する具体的な障害の１つが、多くの場合には足の切断を生じさせる、糖尿病患者を冒す糖尿病性足である。
【００６０】
本明細書中で使用される用語「虚血」は、組織への血流の部分的中断または完全な中断を示す。
【００６１】
本明細書中で使用される表現「その必要性のある対象」は、明白な症状を有しようとも、もしくは、見かけ上は症状を有しないとしても、末梢血管疾患と診断されている個体、および／または、末梢血管疾患の症状を発症する危険性がある個体を示す。
【００６２】
本明細書中で使用される表現「造血幹細胞」は、適切な成長条件が与えられたならば、造血幹細胞が得られた生物に存在する任意の血液細胞系譜に発達することができる多能性細胞を示す。この表現は、本明細書中で使用される場合、血液組織を生じさせることに関わる最も初期の再生可能な細胞集団と、幾分かより分化した、それにもかかわらず、決定づけられておらず、最も初期の再生可能な細胞集団の一部になるために容易に逆戻りすることができる非常に初期の骨髄系およびリンパ系の前駆体細胞との両方を示す。造血幹細胞および造血前駆体細胞は一般には、ＣＤ３４およびＣＤ１３３などのマーカーの存在、ならびに、他の分化マーカー（例えば、ＣＤ３８など）および様々な系譜（Ｌｉｎ）マーカーの非存在に従って特定される。組織起原が異なる幹細胞をエクスビボ培養する様々な方法が細胞培養の技術分野では広く知られている。この趣旨で、例えば、教本「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ−Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９９４）、第３版）を参照のこと（その教示は本明細書により参考として組み込まれる）。
【００６３】
表現「細胞拡大」は、細胞分化を実質的に欠いている細胞増殖のプロセスを表すために本明細書中では使用される。本発明のいくつかの実施形態において、細胞を細胞分化の阻害剤とともに培養することにより、拡大のために採取された最初の細胞集団の特定の未分化な部分集団（例えば、ＰＶＤの細胞療法のために好都合であり、また、望ましいと見なされる、ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−、ＣＤ３４＋／Ｌｉｎ−の各細胞タイプなど）の拡大がもたらされる。そのような造血幹細胞および／または造血前駆体細胞の拡大は、本明細書中下記においてさらに詳述されるように、適切な細胞マーカーの検出によって培養期間を通してモニターすることができる。
【００６４】
本明細書中で使用される用語「エクスビボ」は、細胞が、生存している生物から取り出され、その生物の体外において（例えば、試験管、培養バッグ、バイオリアクターにおいて）増殖させられるプロセスを示す。しかしながら、本明細書中で使用される用語「エクスビボ」は、インビトロのみで増殖することが知られている細胞（例えば、様々な細胞株（例えば、ＨＬ−６０、ＭＥＬ、ＨｅＬａなど））が培養されるプロセスを示さない。すなわち、本発明のいくつかの実施形態に従ってエクスビボ培養される細胞は、その細胞が最終的には分化を受けるという点で、細胞株に形質転換しない。エクスビボで成長させられた細胞にエクスビボでの細胞増殖のための条件を与えることには、本明細書中下記においてさらに詳述されるように、細胞に栄養分を与えること、好ましくは、細胞に１つまたは複数のサイトカインを与えることが含まれる。
【００６５】
本明細書中で使用される用語「分化」は、発達期間中の比較的一般化された変化または特殊化された変化を示す。様々な系譜の細胞分化は、十分に立証されたプロセスであり、さらなる説明を本明細書中では必要としない。本明細書中で使用される場合、分化の用語は成熟化および老化とは異なり、ときには細胞分裂を伴うが、特定の細胞タイプが成熟化して機能を果たし、その後、例えば、プログラム化された細胞死によって死に至るプロセスである。
【００６６】
本明細書中で使用される用語「治療する」には、疾患または状態の進行を無効にするか、または、実質的に阻害するか、または遅くするか、または逆転させること、あるいは、疾患または状態の臨床的症状または美学的症状を実質的に改善すること、あるいは、疾患または状態の臨床的症状、機能的症状または美学的症状の出現を実質的に予防することが含まれる。
【００６７】
分化を実質的に阻害する条件のもとでの造血細胞のエクスビボ拡大が記載されており、また、ポリアミンの銅キレーターであるＴＥＰＡとともに培養することによって、または、ＰＩ  ３−キナーゼ阻害剤とともに培養することによって造血細胞を拡大するための様々なプロトコル（これらは参考として本明細書中に組み込まれる）がさらには下記において記載される。例えば、ＰＣＴ  ＩＬ０３／０００６４（Ｐｅｌｅｄら）（これは、全体が本明細書中に示されるかのように参考として組み込まれる）は、細胞におけるＣＤ３８の発現および／または活性を低下させる方法、細胞においてＣＤ３８を伴うシグナル伝達経路に応答することにおける細胞の能力を低下させる方法、細胞においてレチノイン酸、レチノイドおよび／またはビタミンＤに応答することにおける細胞の能力を低下させる方法、細胞においてレチノイン酸受容体、レチノイドＸ受容体および／またはビタミンＤ受容体を伴うシグナル伝達経路に応答することにおける細胞の能力を低下させる方法、ＰＩ  ３−キナーゼを伴うシグナル伝達経路に応答することにおける細胞の能力を低下させる方法、細胞が、ニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコンチンアミドまたはニコチンアミドアナログの誘導体、あるいは、ニコンチンアミドまたはニコチンアミドアナログの代謝産物の存在下で培養される条件、ならびに、細胞がＰＩ  ３−キナーゼ阻害剤の存在下で培養される条件を教示する。
【００６８】
本発明のこの局面の現在知られている実施形態によれば、ニコチンアミドが、効果的なＣＤ３８阻害剤として使用される。従って、１つの実施形態において、本発明のこの局面による方法は、細胞にニコチンアミドそのものを与えることによって、そうでなければ、細胞に、ニコチンアミドアナログ、ニコンチンアミドまたはニコチンアミドアナログの誘導体、あるいは、ニコンチンアミドまたはニコチンアミドアナログの代謝産物を与えることによって行われる。
【００６９】
本明細書中で使用される表現「ニコチンアミドアナログ」は、ニコチンアミドと同様に作用することが知られている任意の分子を示す。ニコチンアミドアナログの代表的な例には、限定されないが、ベンズアミド、ニコチンチオアミド（ニコチンアミドのチオールアナログ）、ニコチン酸およびα−アミノ−３−インドールプロピオン酸が含まれる。
【００７０】
表現「ニコンチンアミドまたはニコチンアミドアナログの誘導体」は、ニコチンアミドそのものの任意の構造的誘導体、または、ニコチンアミドのアナログの任意の構造的誘導体を示す。そのような誘導体の例には、限定されないが、置換されたベンズアミド、置換されたニコチンアミドおよびニコチンチオアミド、ならびに、Ｎ置換されたニコチンアミドおよびニコチンチオアミドが含まれる。
【００７１】
表現「ニコンチンアミドまたはニコチンアミドアナログの代謝産物」は、ニコチンに由来する産物、または、そのアナログに由来する産物を示し、例えば、ＮＡＤ、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨなどを示す。
【００７２】
造血細胞を、様々な条件を使用して培養において拡大することができる。末梢血管疾患を治療するための移植のための造血細胞のエクスビボ拡大および調製が、末梢血管閉塞および／または末梢血管疾患に関連する虚血組織における灌流を高める能力がより大きい拡大された造血細胞をもたらすパラメーターを含むプロトコルに従って行われる。加えて、本明細書中に記載されるようにエクスビボ拡大された造血細胞は、末梢血管疾患に限定されないさらなる虚血性疾患または虚血状態を治療するために使用することができる。
【００７３】
いくつかの実施形態において、造血細胞は、最終的濃度がミリモル濃度の範囲にある所定量のニコチンアミド、あるいは、そのアナログ、誘導体または代謝産物の存在下で培養される。例えば、ニコチンアミド濃度は、約０．０７５ｍＭ、約０．１ｍＭ、約０．１２５ｍＭ、約０．１５ｍＭ、約０．２ｍＭ、約０．２５ｍＭ、約０．３ｍＭ、約０．３５ｍＭ、約０．４ｍＭ、約０．４５ｍＭ、約０．５ｍＭ、約０．６ｍＭ、約０．７ｍＭ、約０．８ｍＭ、約０．９ｍＭ、約１．０ｍＭ、約１．２５ｍＭ、約１．５ｍＭ、約２．０ｍＭ、約２．５ｍＭ、約３．０ｍＭ、約３．５ｍＭ、約４．０ｍＭ、約４．５ｍＭ、約５．０ｍＭ、約６．０ｍＭ、約７．０ｍＭ、約８．０ｍＭ、約９．０ｍＭ、約１０．０ｍＭ、約１１ｍＭ、約１２ｍＭ、約１３ｍＭ、約１４ｍＭ、約１５ｍＭ、約１６ｍＭ、約１７ｍＭ、約１８ｍＭ、約１９ｍＭ、約２０ｍＭまたはそれ以上、あるいは、約０．１ｍＭ〜約２０ｍＭの範囲内、約０．２５ｍＭ〜約１５ｍＭの範囲内、約０．５ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲内、１．０ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲内、１．０ｍＭ〜約５ｍＭの範囲内が可能である。本明細書中で使用される用語「約」は、示された値の±１０％を示す。１つの例示的な実施形態において、ニコチンアミド濃度は約５ｍＭ／Ｌである。
【００７４】
いくつかの実施形態において、ニコチンアミド、あるいは、そのアナログ、誘導体または代謝産物は、数日から数週間までの間の培養期間にわたって、例えば、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、２週間、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、３週間、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、４週間、２９日、３０日、３１日、３２日、３３日、３４日、５週間、３８日、４０日、６週間、４５日、７週間またはそれ以上にわたって、あるいは、約６日〜約５週間の範囲内、約１０日〜約４週間の範囲内、約２週間〜約３週間の範囲内で与えられる。１つの例示的な実施形態において、培養期間は約３週間である。
【００７５】
さらに、本発明のいくつかの実施形態によれば、造血細胞のエクスビボ拡大は、細胞に、エクスビボ細胞増殖のための条件（例えば、栄養分など）およびサイトカインを与えることを含む。そのようなサイトカインは初期作用サイトカインが可能であり、例えば、幹細胞因子、ＦＬＴ３リガンド、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−６、インターロイキン−１０、インターロイキン−１２、腫瘍壊死因子−αおよびトロンボポイエチンなどが可能であるが、これらに限定されない。１つの例示的な実施形態において、造血細胞は、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、ＩＬ−６およびＦＬＴ３リガンドの組合せの存在下で培養される。
【００７６】
後期作用サイトカインもまた使用することができる。これらには、例えば、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポイエチン、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＮＧＦ、ＶＥＧＦ、ＬＩＦ、肝細胞増殖因子およびマクロファージコロニー刺激因子が含まれる。
【００７７】
新規なサイトカインが引き続き発見され、それらのいくつかは、本発明の細胞拡大方法における使用が見出され得ることが、これに関連して理解される。
【００７８】
本発明において使用される造血細胞は様々な起原のものが可能である。本発明の１つの例示的な実施形態によれば、造血細胞は、造血細胞、臍帯血細胞、動員された末梢血細胞、骨髄細胞からなる群から選択される供給源に由来し、同様に、主に非造血性の組織からも由来し、例えば、肝細胞、膵臓細胞、神経細胞、乏突起神経膠細胞、皮膚細胞、胚性幹細胞、筋細胞、骨細胞、間葉細胞、軟骨細胞および間質細胞などからも由来する。造血幹細胞を様々な供給源から調製する様々な方法がこの技術分野では広く知られており、これらの方法では、一般に、１つまたは複数の造血細胞マーカー（例えば、ＣＤ３４、ＣＤ１３３など）を発現するか、または、分化した細胞のマーカーを有しない細胞が選択される。選択は、通常、ＦＡＣＳまたは免疫磁石分離によって行われるが、ＰＣＲなどの核酸法によることもまた可能である（本明細書中下記における材料および実験方法を参照のこと）。胚性造血細胞およびその回収方法がこの技術分野では広く知られており、例えば、Ｔｒｏｕｎｓｏｎ  ＡＯ（Ｒｅｐｒｏｄ  Ｆｅｒｔｉｌ  Ｄｅｖ（２００１）、１３：５２３）、Ｒｏａｃｈ  ＭＬ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（２００２）、１８５：１）およびＳｍｉｔｈ  ＡＧ（Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ（２００１）、１７：４３５）に記載される。成体造血細胞を成体の組織から得ることができ、成体造血細胞もまたこの技術分野では広く知られている。成体細胞を単離する方法、または、成体細胞について富化する方法が、例えば、Ｍｉｒａｇｌｉａ，Ｓ．ら（１９９７）、Ｂｌｏｏｄ、９０：５０１３；Ｕｃｈｉｄａ，Ｎ．ら（２０００）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９７：１４７２０；Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｐ．Ｊ．ら（１９９１）、Ｂｌｏｏｄ、７８：５５；Ｐｒｏｃｋｏｐ  ＤＪ（Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ（２００１）、３：３９３）、Ｂｏｈｍｅｒ  ＲＭ（Ｆｅｔａｌ  Ｄｉａｇｎ  Ｔｈｅｒ（２００２）、１７：８３）およびＲｏｗｌｅｙ  ＳＤら（Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ（１９９８）、２１：１２５３）、Ｓｒｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｄａｎｉｅｌ  Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ（編者）、Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｌ．Ｇａｒｄｎｅｒ（編者）、発行者：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００１））、および、Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（Ａｎｔｈｏｎｙ  Ｄ．Ｈｏ（編者）、Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｃｈａｍｐｌｉｎ（編者）、発行者：Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ（２０００））に記載される。
【００７９】
ＰＣＴ  ＩＬ０３／００６８１（Ｐｅｌｅｄら）（これは、全体が本明細書中に示されるかのように参考として組み込まれる）は、細胞の供給源が単核血液細胞の画分全体（すなわち、富化されていない細胞）を含むとき、造血幹細胞の分化を抑制することができ、かつ、その増殖を刺激し、延ばすことができる分子の拡大での使用を開示する。従って、本発明の１つの実施形態において、造血細胞を含む細胞の集団は、選択されていない単核細胞である。
【００８０】
表現「選択されていない造血単核細胞」は、白血球画分の任意の部分を表すために本明細書中では使用され、この場合、細胞の大部分が造血系の決定づけられた細胞であり、一方で、細胞の少数が造血幹細胞および造血前駆体細胞である（これらの用語は本明細書中下記においてさらに定義される）。健康なヒトにおいて、白血球は、例えば、系譜決定された前駆体細胞であるＣＤ３４＋ＣＤ３３＋（骨髄系の決定づけられた細胞）、ＣＤ３４＋ＣＤ３＋（リンパ系の決定づけられた細胞）、ＣＤ３４＋ＣＤ４１＋（巨核球性の決定づけられた細胞）、および、分化した細胞、すなわち、ＣＤ３４−ＣＤ３３＋（骨髄系、例えば、顆粒球および単球など）、ＣＤ３４−ＣＤ３＋、ＣＤ３４−ＣＤ１９＋（それぞれ、Ｔ細胞およびＢ細胞）、ＣＤ３４−ＣＤ４１＋（巨核球）を含む、造血系の系譜決定された細胞および分化した細胞（典型的には、単核細胞の９９％超が、系譜決定された細胞である）と、造血幹細胞および造血系の初期前駆体細胞（例えば、ＣＤ３４＋Ｌｉｎｅａｇｅ陰性（Ｌｉｎ−）、ＣＤ３４−Ｌｉｎｅａｇｅ陰性ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋など）（典型的には１％未満）との混合物を含む。
【００８１】
造血単核細胞は典型的には、血液サンプルをＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ層の上に載せ、密度クッションでの遠心分離の後、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅと、血清との間に存在する境界層を集めることによって血液サンプルから得られ、この場合、そのような境界層は、血液サンプルに存在する白血球から本質的になる。
【００８２】
造血幹細胞および造血前駆体細胞を、上記のような示差的密度遠心分離により得られる造血単核細胞のさらなる選択または富化によって得ることができる。このさらなる富化プロセスは典型的には、免疫分離によって、例えば、免疫磁石分離またはＦＡＣＳなどによって行われ、造血細胞について富化される細胞画分をもたらす（造血細胞の富化の詳細な説明については、実施例の節における材料および実験手順を参照）。
【００８３】
上記マーカーに従う選択による富化を、造血細胞の拡大の前に、または、培養している期間の期間中に、または、拡大した後、細胞をレシピエントに投与する前に行うことができる。別の実施形態において、選択されていない造血単核細胞を、造血細胞の拡大された集団を得るための直接の供給源として使用することができ、これにより、幹細胞を拡大の前に富化する必要性が回避され、従って、プロセスが効率および費用の両方に関して実質的に簡略化される。
【００８４】
治療のためのプロトコルの確立は、様々なパラメーター（例えば、ニコチンアミド濃度、培養期間の継続期間、１回の服用あたり投与される細胞の量、および、服用回数など）を調整することを伴い得ることが理解される。そのようなパラメーターの影響を、日常的な実験によって、例えば、下記の実施例の節において記載されるモデルなどによって評価することができる。結果の尺度（例えば、灌流および生存など）、ならびに、組織学的および機能的な判断基準を、末梢血管疾患を治療することにおいて最大の治療的価値を有する細胞の数での最適な効率に近づけるために、これらの種々のパラメーターを変化させることの効力を評価するために用いることができる。罹患組織における灌流を決定するために定量化することができる、この技術分野で知られているさらなるパラメーターが、血管造影およびＭＲＩ、ならびに、臨床的パラメーター、例えば、罹患領域における組織壊死の程度、虚血領域における組織の潰瘍形成、ならびに、指および／または肢の切断などである。
【００８５】
これらの動物研究から得られるデータは、ヒトにおける使用のための投薬量の範囲を定める際に使用することができる。例えば、末梢血管疾患の治療のために好適である治療効果的な用量を、これらの疾患の動物モデルを用いた実験から決定することができる。
【００８６】
投薬量は、用いられる投薬形態物および利用される投与経路に依存して変化し得る。的確な配合、投与経路および投薬量を、患者の状態を考慮して個々の医師によって選ぶことができる（例えば、Ｆｉｎｇｌら、１９７５、「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」、第１章、１頁参照）。
【００８７】
投薬量および投薬間隔を、調節効果を維持するために十分である数の造血細胞を提供するために個々に調節することができる。１つの実施形態において、対象は造血細胞の１回の服用により治療される。別の実施形態において、造血細胞を投与することには、対象への細胞の少なくとも２回の投与またはそれ以上の投与が含まれる。
【００８８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、拡大された造血細胞は対象への埋め込みによって投与される。細胞療法の様々な方法、すなわち、造血細胞をレシピエントに移植する様々な方法がこの技術分野では広く知られている（例えば、本明細書中上記の背景の節における数多くの参考文献を参照）。移植の好適な方法を、埋め込まれた細胞の所望される組織へのホーミング、所望される組織特異的な遺伝子またはマーカーの発現、および、レシピエントにおける移植組織の機能をモニターすることによって決定することができる。いくつかの実施形態において、拡大された造血細胞は、組織への直接の注入によって、末梢血管疾患の虚血プロセスにより冒された領域、器官、組織または肢に局所投与される。そのような局所投与は、例えば、限定されないが、筋肉内投与のための皮下ニードルまたはカテーテルを使用して、あるいは、罹患領域への血管内投与によって行うことができる。
【００８９】
本発明の方法に従って投与される造血細胞は、移植のための好適な培地において調製される。そのような培地は、医薬的に許容され得るビヒクルを含むことができ、例えば、生理学的な緩衝剤溶液（例えば、ＰＢＳまたはリンゲル溶液など）などを含むことができ、あるいは、培地には、投与医師または個体によって決定されるように、さらなる因子（例えば、栄養分、ビタミン、電解質など）を補充することができる。
【００９０】
拡大された造血細胞のドナーおよびレシピエントは１人の個体または異なる個体（例えば、同種の個体）であり得る。同種移植が実施されるとき、この技術分野では広く知られているように、移植物の拒絶および／または移植片対宿主病を低下させるための治療措置を試みなければならない。そのような治療措置は現在、ヒトの治療で実施されている。最も進んだ治療措置が、Ｓｌａｖｉｎ  Ｓ．ら（例えば、Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００２）、２２：６４、および、Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ（２００２）、１１：２６５）；Ｇｕｒ  Ｈ．ら（Ｂｌｏｏｄ（２００２）、９９：４１７４）、および、Ｍａｒｔｅｌｌｉ  Ｍ  Ｆら（Ｓｅｍｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ（２００２）、３９：４８）による刊行物に開示される（これらは参考として本明細書中に組み込まれる）。
【００９１】
処置されている虚血組織に対するさらなる治療的価値を提供するために、本発明の拡大された造血細胞は、ＰＶＤにおける虚血損傷と闘うことにおいて効果的である因子（１つまたは複数）を発現するように、すなわち、遺伝子療法において効果的である因子（１つまたは複数）を発現するように遺伝子改変することができる。本明細書中で使用されるような遺伝子療法は、遺伝的または後天的な疾患または状態または表現型を治療または予防するための宿主内への目的とする遺伝物質（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）の移入を示す。目的とする遺伝物質は、インビボでのその産生が所望される産物（例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、機能的ＲＮＡ、アンチセンス）をコードする。例えば、目的とする遺伝物質は、治療的価値を有するホルモン、受容体、酵素、ポリペプチドまたはペプチドをコードすることができる。総説については、一般には、教本「Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ」（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ４０、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９７）を参照。
【００９２】
細胞はエクスビボで遺伝子改変することができ、あるいは、遺伝子改変された組織または宿主に由来することができる。エクスビボ遺伝子療法において、細胞が患者から取り出され、培養されながら、インビトロで処置される。一般には、機能的な置換遺伝子が、必要に応じて、適切な遺伝子送達ビヒクル／方法（トランスフェクション、形質導入、相同的組換えなど）および発現システムによって細胞内に導入され、その後、改変された細胞が培養で拡大され、宿主／患者に戻される。これらの遺伝的に再び埋め込まれた細胞は、トランスフェクションされた遺伝物質をその場で発現することが示されている。
【００９３】
従って、さらに、本発明の１つの局面によれば、拡大された造血細胞は、遺伝子改変された細胞である。拡大された造血細胞を導入遺伝子により形質導入するための様々な方法がこの技術分野では知られている（例えば、ＰＣＴ  ＩＬ２００４／０００２１５（Ｐｅｌｅｄ）（これは参考として本明細書中に組み込まれる）参照）。簡単に記載すると、核酸分子が、核酸によってコードされる遺伝子産物の細胞における発現のために好適な形態で造血細胞に導入される。従って、核酸分子には、コード配列、および、遺伝子（またはその一部）の転写のために要求される調節配列、ならびに、遺伝子産物がタンパク質またはペプチドであるときには、核酸分子の翻訳のために要求される調節配列が含まれ、そのような調節配列には、プロモーター、エンハンサーおよびポリアデニル化シグナル、ならびに、コードされたタンパク質またはペプチドの輸送のために必要な配列、例えば、細胞の表面へのタンパク質またはペプチドの輸送のための、あるいは、分泌のためのＮ末端のシグナル配列が含まれる。
【００９４】
本発明の方法とともに方法するために好適な遺伝子産物には、限定されないが、前血管形成因子（例えば、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、Ｄ１１４、ＭＭＰ、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２など）、抗炎症性因子（例えば、抗炎症性サイトカインのＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３など）およびその他が含まれ得る。そのような因子を拡大された造血細胞の移植によって提供することは、損傷を受けた組織における血管新生を強化するために、また、ＰＶＤに関連した虚血からの回復を早めるために役立ち得る。
【００９５】
本発明の方法は、末梢血管疾患のための他の治療法（例えば、補助療法など）と一緒に、または、同時投与で施すことができる。従って、１つの実施形態において、拡大された造血細胞は、末梢血管疾患に影響を及ぼすさらなる治療と併せて、例えば、抗炎症治療、敗血症予防治療および抗生物質治療、ホルモン補充（例えば、インスリン、エストロゲンなど）、緩和治療（例えば、抗侵害受容治療など）、スタチン類、ならびに、抗凝固治療および血栓溶解治療（例えば、ヘパリンおよびクマジンなど）などと併せて同時投与される。同時投与は、拡大された造血細胞と同時にさらなる治療を実際に施すことによって、あるいは、より可能性があるが、拡大された造血細胞の投与に近い期間にわたって、または、拡大された造血細胞の投与の期間中に、または、拡大された造血細胞の投与の直後にさらなる治療を施すことによって行うことができる。
【００９６】
本明細書中で使用される用語「血管の再生」、用語「血管形成」、用語「血管新生」、用語「脈管再生」および用語「側副循環増大」（または、そのような趣旨の言葉）は同義的であると見なされる。用語「医薬的に許容され得る」は、天然物質または合成物質を示すとき、その物質が、そのはるかにより大きい有益な作用を考慮して、許容され得る毒性作用を有することを意味し、一方で、関連する用語「生理学的に許容され得る」は、その物質が比較的低い毒性を有することを意味する。用語「同時投与される」は、２つ以上の薬物が、ほぼ同時に、または、接近した順で患者に与えられ、その結果、それらの作用がほぼ同時に働くか、または、実質的に重なることを意味する。この用語は、同時だけでなく、逐次的な薬物投与を包含する。
【００９７】
本明細書中上記で述べられたように、他の方法が培養での造血細胞の拡大のために利用可能であり、例えば、ＰＩ  ３−キナーゼの活性または発現の阻害剤などがある。ＰＣＴ  ＩＬ２００４／０００２１５（Ｐｅｌｅｄら）（これは、全体が本明細書中に示されるかのように参考として組み込まれる）は、幹細胞および／または前駆体細胞を、その分化を阻害しながらエクスビボ拡大するための、ＰＩ  ３−Ｋの活性または発現の阻害剤の使用を開示する。
【００９８】
従って、本発明のこの局面のさらに別の具体的な実施形態において、幹細胞および／または前駆体細胞を、細胞増殖を可能にし、かつ、同時に、分化を阻害する条件のもとでのエクスビボで培養することが、細胞を、ＰＩ  ３−キナーゼを伴うシグナル伝達経路に応答することにおける細胞の能力を低下させる条件で培養することによって、または、細胞がＰＩ  ３−キナーゼ阻害剤の存在下で培養される条件で培養することによって行われる。
【００９９】
いくつかの実施形態において、ＰＩ  ３−キナーゼ活性の阻害を、知られているＰＩ  ３−キナーゼ阻害剤によって、例えば、ワートマニンおよびＬＹ２９４００２、ならびに、例えば、米国特許第５３７８７２５号（これは参考として本明細書中に組み込まれる）に記載される阻害剤などによって行うことができる。
【０１００】
これらのアンタゴニストの最終的濃度は、具体的な適用に依存して、マイクロモル濃度またはミリモル濃度の範囲であり得る。例えば、約０．１μＭ〜約１００ｍＭの範囲内、好ましくは約４μＭ〜約５０ｍＭの範囲内、より好ましくは約５μＭ〜約４０ｍＭの範囲内であり得る。
【０１０１】
本発明のこの局面のさらに別の具体的な実施形態において、造血細胞を、細胞増殖を可能にし、かつ、同時に、分化を阻害する条件のもとでのエクスビボで培養することが、細胞を銅キレーターの存在下で培養することによって行われる。造血細胞を、その分化を本発明において実質的に阻害しながら効率的にエクスビボ拡大するために好適な、銅に対する大きい親和性を有する遷移金属キレーターの詳細な説明が、ＰＣＴ  ＩＬ９９／００４４４、ＰＣＴ  ＩＬ０３／０００６４、ＰＣＴ  ＩＬ０３／００６８１、ＰＣＴ  ＩＬ２００４／０００２１５およびＰＣＴ  ＩＬ２００５／００９９４（Ｐｅｌｅｄら）に見出され得る（これらは、全体が本明細書中に示されるかのように参考として組み込まれる）。
【０１０２】
本発明のこの局面のさらに別の具体的な実施形態において、造血細胞を、細胞増殖を可能にし、かつ、同時に、分化を阻害する条件のもとでのエクスビボで培養することが、細胞を銅キレート（キレーター−銅錯体）の存在下で培養することによって行われる。ＰＣＴ  ＩＬ０３／０００６２（Ｐｅｌｅｄら）（これは、全体が本明細書中に示されるかのように参考として組み込まれる）は、造血細胞を、その分化を実質的に阻害しながら効率的にエクスビボ拡大するための、銅キレート（銅と、銅に対する大きい親和性を有する重金属キレーターとの錯体）の使用を開示する。
【０１０３】
キレーターの最終的濃度は、具体的な適用に依存して、マイクロモル濃度またはミリモル濃度の範囲であり得る。例えば、約０．１μＭ〜約１００ｍＭの範囲内、好ましくは約４μＭ〜約５０ｍＭの範囲内、より好ましくは約５μＭ〜約４０ｍＭの範囲内であり得る。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、銅キレーターには、ポリアミンに存在する２つ以上のアミン基により銅イオンとの環状の錯体を形成することができるポリアミン分子が含まれる。ポリアミンキレーターは、線状ポリアミン、環状ポリアミンまたはそれらの組合せが可能である。
【０１０５】
本発明の拡大された造血細胞集団は、所望されるならば、有効成分を含有する１つまたは複数の単位投薬形態物を含有し得るパックまたはディスペンサーデバイス（例えば、ＦＤＡ承認キットなど）で提供され得る。パックは、例えば、ブリスターパックのような、金属ホイルまたはプラスチックホイルを含むことができる。パックまたはディスペンサーデバイスには、末梢血管疾患の治療のための投与についての説明書が付随し得る。パックまたはディスペンサーデバイスはまた、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府当局によって定められた形式で、容器に関連した通知によって適応させることがあり、この場合、そのような通知は、組成物の形態、あるいはヒトまたは動物への投与の当局による承認を反映する。そのような通知は、例えば、処方薬物について米国食品医薬品局によって承認されたラベル書きであり得るか、または、承認された製品添付文書であり得る。医薬的に適合し得るキャリアに配合された本発明の拡大された造血細胞を含む組成物もまた、上でさらに詳述されたように、適応される状態を処置または予防するために、または末梢血管疾患に関連する望ましい事象の誘導のために調製され、適切な容器に入れられ、かつ標識され得る。ラベル上の好適な表示は、末梢血管疾患の治療および／または予防を含むことができる。
【０１０６】
本明細書中で使用される場合、単数形態（「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」）は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の参照物を包含する。例えば、用語「化合物（ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または用語「少なくとも１つの化合物」は、その混合物を含めて、複数の化合物を包含し得る。
【０１０７】
明確にするため別個の実施態様で説明されている本発明の特定の特徴は単一の実施態様に組み合わせて提供することもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施態様で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで、あるいは本発明の他の実施形態のいずれかにおいて適切なように提供することもできる。各種の実施形態の文脈において記載される特定の特徴は、その実施形態がそれらの要素無しで実行できない場合を除いて、それらの実施形態の必須の特徴と見なされることはない。
【０１０８】
上記の本発明および以下の特許請求の範囲に記載の各々の種々の実施形態および態様は、以下の実験により支持される。
【実施例】
【０１０９】
ここでは、上記説明と共に以下の実施例を参照して、非限定的様式で本発明のいくつかの実施形態を例示する。
【０１１０】
材料および実験方法
拡大および注入のための細胞および細胞処理：
細胞源：造血細胞は、骨髄（ＢＭ）、Ｇ−ＣＳＦ動員末梢血（ＭＰＢ）または臍帯血（ＵＣＢ）のいずれかに由来する造血幹細胞（ＨＳＣ）または前駆体細胞（ＨＰＣ）のいずれかであった。
【０１１１】
ヒト造血細胞の細胞培養：ヒト臍帯血細胞を、（インフォームドコンセントが得られた）正常な満期出産の後の臍帯血から得た。ＭＰＢまたはＢＭを、（インフォームドコンセントが得られた）提供者から得た。サンプルは新鮮なまま使用されたか、そうでなければ、採取され、その後、ＵＣＢについては、分娩後２４時間以内に、広く知られている臍帯血冷凍保存プロトコル（Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎら、１９９５）に従って、または、ＭＰＢおよびＢＭに関しては、一般的な実施に従って凍結された。冷凍保存する前に、血液をＨＥＳＰＡＮデンプン（ヒドロキシエチルデンプン）で３０分間沈降させて、ほとんどのＲＢＣを除いた。それらを使用する前に、細胞を、２．５％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（Ｂａｙｅｒ  Ｃｏｒｐ．、Ｅｌｋｈａｒｔ、ＩＮ、米国）を含有するデキストラン緩衝液（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）において解凍し、本明細書中下記において記載されるように処理した。解凍後、示される場合には、白血球富化画分を集め、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅグラジエント（１．０７７ｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ  Ｉｎｃ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）に重層し、４００Ｘｇで３０分間遠心分離した。その後、境界層における単核細胞画分を採取し、３回洗浄し、０．５％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（Ｂａｙｅｒ  Ｃｏｒｐ．、Ｅｌｋｈａｒｔ、ＩＮ、米国）を含有するリン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｂｅｔ  ＨａＥｍｅｋ、イスラエル）に再懸濁した。ＣＤ３４＋細胞を、「ＭｉｎｉＭＡＣＳ  ＣＤ３４＋前駆体細胞単離キット」（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）を製造者の推奨法に従って使用する免疫磁石分離によって単離および精製した。得られたＣＤ３４＋細胞の純度は、フローサイトメトリー評価に基づいて９５％〜９８％の間であった。ＣＤ１３３＋細胞画分を下記のように精製した：単核細胞画分を、「ＭｉｎｉＭＡＣＳ  ＣＤ１３３幹細胞単離キット」（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）を使用する２回の免疫磁石分離に供したか、または、未分画の調節物を、ＣＤ１３３＋ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）試薬を使用して、それに従って、すなわち、製造者の推奨法に従ってＣｌｉｎｉＭＡＣＳデバイスで単離した（後者では、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅグラジエントの段階が省略された）。このようにして得られたＣＤ１３３＋集団の純度は、フローサイトメトリーによって評価されたとき、８０％〜９５％であった。
【０１１２】
造血細胞のエクスビボ拡大
末梢血、骨髄または臍帯血に由来する造血細胞または精製された造血幹細胞／前駆体細胞（ＣＤ３４＋またはＣＤ１３３＋）を、培養期間の示された継続期間にわたって、サイトカイン、および、示された濃度でのＰＩ  ３Ｋ酵素活性阻害剤（ＬＹ２９４００２）またはニコチンアミドのいずれかとともに培養した。培養をこれらの分化阻害剤とともに行った後、得られた細胞集団は、サイトカインだけの存在下で培養された細胞と比較して、幹細胞／初期前駆体細胞（例えば、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞およびＣＤ３４＋Ｌｉｎ−細胞など）により富化されていることが明らかにされた。
【０１１３】
マウス後肢虚血モデル
体重が２６ｇ〜３０ｇの間である１２週齢のＢａｌｂ／Ｃマウスまたは「ヌード」マウスを末梢血管疾患のこのモデルのために使用した。短時間の麻酔のもとで、左大腿動脈を露出させ、解剖して遊離させ、切除した（Ｍａｄｅｄｄｕ，Ｅｍａｎｕｅｌｉら、２００４）（Ｃｏｕｆｆｉｎｈａｌ，Ｓｉｌｖｅｒら、１９９８；Ｂａｂｉａｋ，Ｓｃｈｕｍｍら、２００４）。
【０１１４】
細胞注入
治療的血管新生に対する培養細胞の投与の影響を後肢虚血のマウスモデルにおいて調べた（Ｋａｌｋａ，Ｍａｓｕｄａら、２０００；Ｍａｄｅｄｄｕ，Ｅｍａｎｕｅｌｉら、２００４）。一方の大腿動脈を手術により切除した１日後、マウスは、上記で記載されるように拡大された細胞の１〜２０００×１０３個の筋肉内注射を受ける。コントロール群には、同じ数の拡大されていない細胞またはＰＢＳが注入された（Ｍａｄｅｄｄｕ，Ｅｍａｎｕｅｌｉら、２００４）。
【０１１５】
インビボ灌流の測定
灌流の分析を、大腿動脈結紮後、細胞移植前、および、細胞移植後７日〜１４日で行った（Ｂａｂｉａｋ，Ｓｃｈｕｍｍら、２００４）。レーザードップラー灌流画像化（Ｍｏｏｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）を使用して、連続血流測定を手術後１４日の経過にわたって記録した。これらのデジタル着色画像において、赤色の色調により、最大灌流の領域を示される；中程度の灌流の値が黄色で示される；最も低い灌流の値が青色として表される。個体間の差、ならびに、試験者に依存する偏りを排除するために、結紮肢と非結紮肢との間での比率を標準化された様式で測定した。
【０１１６】
実験結果
実施例Ｉ：ＰＩ  ３キナーゼ阻害剤とともに拡大された造血細胞はＢａｌｂ／Ｃマウスの虚血肢における切断を防止する
臍帯血由来ＣＤ１３３＋細胞がサイトカイン（ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−６およびＦＬＴ３）とともに培養され、ＰＩ  ３Ｋ特異的阻害剤のＬＹ２９４００２が５マイクロモル／Ｌの最終的濃度で補充された。培養で３週間後、得られた細胞集団を計数し、特徴づけし、示されるような異なる用量（５×１０４細胞／被験体、５×１０５細胞／被験体および２．５×１０４細胞／被験体）で免疫適格Ｂａｌｂ／Ｃマウスの虚血肢に筋肉内注入した。コントロールマウスには、緩衝液が注入された。マウスを、肢虚血誘導の前日から開始してその後もシクロスポリンで処置した。肢切断率を細胞注入後７日で評価した（切断が７日目以降は生じなかった）。図２は、造血細胞を受けているマウスにおける肢切断の用量依存的な防止を示す。
【０１１７】
実施例ＩＩ：ＰＩ  ３キナーゼ阻害剤とともに拡大された造血細胞はＢａｌｂ／Ｃマウスの虚血肢における灌流を高める
臍帯血由来ＣＤ１３３＋がサイトカイン（ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−６およびＦＬＴ３）とともに培養され、ＰＩ−３Ｋ特異的阻害剤のＬＹ２９４００２が５マイクロモル／Ｌの最終的濃度で補充された。培養で３週間後、得られた細胞集団を計数し、特徴づけし、示されるような異なる用量（５×１０４細胞／被験体、５×１０５細胞／被験体および２．５×１０４細胞／被験体）で免疫適格Ｂａｌｂ／Ｃマウスの虚血肢に筋肉内注入した。コントロールマウスには、緩衝液が注入された。マウスを、肢虚血誘導の前日から開始してその後もシクロスポリンで処置した。肢の灌流を、０日目（虚血誘導後）、７日目および１４日目で評価した。結果が非虚血肢に対するパーセント灌流として示される。図３ａは、造血細胞注入後７日での肢の灌流における劇的な用量依存的改善を示す。造血細胞注入後１４日において（図３ｂ）、大きく改善された灌流が観測された。すべての投薬群における処置された肢の迅速な、著しく優れた回復に留意すること。
【０１１８】
まとめると、これらの結果により、造血細胞は、ＰＩ  ３−キナーゼの阻害剤とともに拡大された場合、５×１０４細胞／被験体の低い用量でさえ、免疫適格宿主の肢における末梢血管動脈閉塞において、灌流を迅速に増大させて、かつ、切断率を低下させて、結果を著しく改善することができることが示される。
【０１１９】
実施例ＩＩＩ：ニコチンアミドとともに拡大された造血細胞はＢａｌｂ／Ｃマウスの虚血肢における灌流を高める
臍帯血由来ＣＤ１３３＋がサイトカイン（ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−６およびＦＬＴ３）とともに培養され、５ｍＭ／Ｌの最終的濃度のニコチンアミドが補充された。培養で３週間後、得られた細胞集団を計数し、特徴づけし、５×１０５細胞／被験体を、示されるような異なる用量で虚血肢に筋肉内注入した。コントロールマウスには、緩衝液が注入された。肢の灌流を７日目にドップラー超音波によって評価した。赤色の色調により、最大灌流の領域を示される；黄色の色調により、中間的な灌流が示される（値が黄色で示される）；最も低い灌流の値が青色として表される。
【０１２０】
図４ａおよび図４ｂは、細胞注入当日およびその後のさらに２日、シクロスポリンで処置されたマウスにおいて虚血肢での灌流における改善を示す。図５ａおよび図５ｂは、シクロスポリンを受けていないマウスにおいて虚血肢での灌流における改善を示す。
【０１２１】
実施例ＩＶ：ニコチンアミドとともに拡大された造血細胞はヌードマウスの虚血肢における灌流を高める
臍帯血由来ＣＤ１３３＋がサイトカイン（ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−６およびＦＬＴ３）とともに培養され、５ｍＭ／Ｌの最終的濃度のニコチンアミドが補充された。培養で３週間後、得られた細胞集団を計数し、特徴づけし、１×１０６細胞／被験体を、示されるような異なる用量でヌード（無胸腺）マウスの虚血肢に筋肉内注入した。シクロスポリンが投与されなかった。コントロールマウスには、示されるように、非培養細胞または緩衝液が注入された。肢の灌流を７日目にドップラー超音波によって評価し、それぞれの場合において反対側の結紮されていない健全な肢に対するパーセント灌流として表した。
【０１２２】
図６に例示されるように、結紮後１２日において、非培養の細胞を受けている肢は、非処置（緩衝液）の結紮肢の灌流と類似する損なわれた灌流を示した一方で、ニコチンアミドとともに拡大された細胞を受けている虚血肢は血流の著しくより大きい回復を示した。この実験の結果は、ニコチンアミドの非存在下で培養された細胞の類似する数の活性、または、培養前の細胞（非培養細胞）の類似する数の活性を上回る、ニコチンアミドとともに培養された細胞の優れた活性を明らかにする。従って、ニコチンアミドの存在下で培養された細胞は、培養細胞または新鮮な非培養細胞を上回る、末梢血管疾患に関連する虚血組織における灌流を高めることについての増大した可能性を明瞭に示す。
【０１２３】
実施例Ｖ：ニコチンアミドとともに拡大された造血細胞はＢａｌｂ／Ｃマウスの虚血肢における指および肢の生存を高める
臍帯血由来ＣＤ１３３＋がサイトカイン（ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−６およびＦＬＴ３）とともに培養され、５ｍＭ／Ｌの最終的濃度のニコチンアミドが補充された。培養で３週間後、得られた細胞集団を計数し、特徴づけし、１×１０６細胞／被験体を、示されるような異なる用量でヌード（無胸腺）マウスの虚血肢に筋肉内注入した。コントロールマウスには、示されるように、同じ量の非培養細胞または緩衝液が注入された。肢切断率を細胞注入後１２日で評価した（切断が１２日目以降は生じなかった）。
【０１２４】
図７に示される結果によって立証されるように、ニコチンアミドとともに拡大された細胞の筋肉内注入は虚血肢の切断の完全な防止をもたらし、一方で、新鮮な非培養細胞を受けている肢は、処置されていない虚血肢に類似する切断率を示した。
【０１２５】
まとめると、上記で示された結果は、ニコチンアミドを伴う培養で拡大された造血細胞は、末梢血管閉塞に関連する虚血組織における灌流を高め、かつ、冒された肢における臨床的結果（例えば、肢および指の生存）を著しく改善する優れた能力を有することを示している。ニコチンアミドとともに拡大された造血細胞の輸液の効果は、シクロスポリン処置を伴う免疫適格宿主およびシクロスポリン処置を伴わない免疫適格宿主（Ｂａｌｂ／Ｃマウス）において、また、免疫低下している（無胸腺）ヌードマウスにおいて、それらの両方で著しいことが認められる。
【０１２６】
本発明を特定の実施形態と共に記載しているが、多数の変更形態、修正形態、および変形形態が当業者に明らかであることが明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の精神および範囲に含まれるこのような全ての変更形態、修正形態、および変形形態が含まれることが意図される。
【０１２７】
全ての刊行物、本明細書中に記載した特許および特許出願は、その全体が、それぞれの刊行物、本明細書中に記載した特許および特許出願があたかも特別または個別に本明細書中で参考として援用されるように示されるような範囲に本明細書中で参考として援用される。さらに、本出願における任意の引例の引用または識別により、このような引例が先行技術として本発明で利用可能であることを承認すべきではない。節の見出しが使用されている範囲まで、それらは必ずしも限定として見なされるべきではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【国際調査報告】
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