(57)【要約】米国で新規に癌診断を受けた推定１３０万人の患者のうちの２／３が、最終的にその治療レジメンの一部としていくつかの放射線療法形態を受けている。放射線療法は、多数の癌、特に、転移していない局在性癌の最も重要且つ強力な治療の１つと考えられている。放射線療法によって治療される腫瘍のうち、ほんのわずかの腫瘍（リンパ腫およびセミノーマが含まれる）しか反応性が高くない。多数の他の固形腫瘍（黒色腫、膠芽細胞腫、および前立腺癌など）は、典型的には、照射に非常に高い耐性を示し、高線量の照射後でさえも進行する傾向がある。本発明は、新規の放射線増感剤、その作製方法、および使用に関する。照射および化学療法に対して癌細胞を感受性にする工程における使用のための組成物および方法を本明細書中に提供する。
2010508022.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＢＳ１のカルボキシ末端アミノ酸配列またはその保存的変異体を含む単離されたペプチドであって、ここでポリペプチドが全長ＮＢＳ１を含まない、単離されたペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、配列番号１と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、ＮＢＳ１のカルボキシ末端へのＡＴＭの結合を阻害する、請求項１または請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、ＮＢＳ１のカルボキシ末端の４〜３０個の連続するアミノ酸を含む、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、ＮＢＳ１（配列番号１）のアミノ酸７３４〜７４４を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、ＮＢＳ１のアミノ酸７３４〜７５４内に保存的アミノ酸置換を含む、請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記ポリペプチドが、配列番号３と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
細胞内在化配列をさらに含む、請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記細胞内在化が、ポリアルギニン、アンテナペディア、ＴＡＴ、ＨＩＶ−Ｔａｔ、ペネトラチン（Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ）、Ａｎｔｐ−３Ａ（Ａｎｔｐ変異体）、ブフォリンＩＩ（Ｂｕｆｏｒｉｎ  ＩＩ）、トランスポータン（Ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ）、ＭＡＰ（両親媒性モデルペプチド）、Ｋ−ＦＧＦ、Ｋｕ７０、プリオン、ｐＶＥＣ、Ｐｅｐ−１、ＳｙｎＢｌ、Ｐｅｐ−７、ＨＮ−１、ＢＧＳＣ（Ｂｉｓ−グアニジニウム−スペルミジン−コレステロール）、およびＢＧＴＣ（Ｂｉｓ−グアニジニウム−Ｔｒｅｎ−コレステロール）からなる群から選択されるタンパク質のアミノ酸配列を含む、請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記ポリペプチドが、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、および配列番号４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜請求項１０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
腫瘍特異的ターゲティング配列をさらに含む、請求項１〜請求項１１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記腫瘍特異的ターゲティング配列が、ＲＧＤモチーフ、ＮＧＲモチーフ、またはＧＳＬモチーフを含む、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記ポリペプチドが、配列番号１１または配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１のポリペプチドをコードする単離核酸。
【請求項１６】
コードされたポリペプチドが、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載の単離核酸。
【請求項１７】
配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、および配列番号５０の核酸を含む、請求項１６に記載の単離核酸。
【請求項１８】
前記核酸が発現調節配列に作動可能に連結する、請求項１５〜請求項１７のいずれか１項に記載の単離核酸。
【請求項１９】
発現調節配列に作動可能に連結された、請求項１５〜請求項１７のいずれか１項に記載の核酸を含むベクター。
【請求項２０】
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項１９に記載のベクター。
【請求項２１】
前記ベクターがアデノウイルスベクターである、請求項２０に記載のベクター。
【請求項２２】
請求項１５〜請求項１７のいずれか１項に記載の核酸を含む細胞。
【請求項２３】
請求項１９に記載のベクターを含む細胞。
【請求項２４】
請求項１５〜請求項１７のいずれか１項に記載の核酸を含む生物。
【請求項２５】
請求項１９に記載のベクターを含む生物。
【請求項２６】
薬学的に許容可能なキャリア中に請求項１〜請求項１４のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む組成物。
【請求項２７】
薬学的に許容可能なキャリア中に請求項１５〜請求項１７のいずれか１項に記載の核酸を含む組成物。
【請求項２８】
薬学的に許容可能なキャリア中に請求項１９〜請求項２１のいずれか１項に記載のベクターを含む組成物。
【請求項２９】
放射線療法に対する組織の感受性を増加させる方法であって、
ａ）ＮＢＳ１のＡＴＭとの相互作用を阻害する組成物を組織に投与する工程、および
ｂ）前記組織に照射する工程
を含む、方法。
【請求項３０】
前記組織が良性腫瘍を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記組織が癌を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
被験体において癌を治療する方法であって、
ａ）ＮＢＳ１のＡＴＭとの相互作用を阻害する組成物を癌に投与する工程、および
ｂ）前記癌に照射する工程
を含む、方法。
【請求項３３】
放射線感受性薬を同定する方法であって、
ａ）ＮＢＳ１およびＡＴＭポリペプチドを含むサンプルを候補薬剤と接触させる工程、および
ｂ）ＮＢＳ１とＡＴＭポリペプチドとの間の相互作用を検出する工程を含み、
コントロールと比較した場合、前記ＮＢＳ１とＡＴＭポリペプチドとの間の相互作用の減少が、前記候補薬剤が放射線感受性であることを示す、方法。
【請求項３４】
前記ＮＢＳ１とＡＴＭポリペプチドとの間の相互作用を、蛍光偏光を使用して検出する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＮＢＳ１またはＡＴＭポリペプチドがフルオロフォアを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
請求項１〜請求項１４のいずれか１項に記載のポリペプチドをポジティブコントロールとして使用する、請求項３３〜請求項３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
被験体の癌を治療する方法であって、
ａ）ＮＢＳ１のＡＴＭとの相互作用を阻害する組成物を癌に投与する工程、および
ｂ）前記癌に抗新生物薬を投与する工程
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連する出願への相互参照）
本願は、２００６年１０月３０日出願された米国仮特許出願第６０／８６３，４５７号の利益を主張する。米国仮特許出願第６０／８６３，４５７号は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
米国で新規に癌診断を受けた推定１３０万人の患者のうちの２／３が、最終的にその治療レジメンの一部としていくつかの放射線療法形態を受けている。放射線療法は、多数の癌、特に、転移していない局在性癌の最も重要且つ強力な治療の１つと考えられている。放射線療法によって治療される腫瘍のうち、ほんのわずかの腫瘍（リンパ腫およびセミノーマが含まれる）しか反応が高くない。しかし、多数の他の固形腫瘍（黒色腫、膠芽細胞腫、および前立腺癌など）は、典型的には、照射に非常に高い耐性を示し、高線量の照射後でさえも進行する傾向がある。治療レジメンは、しばしば、放射線腫瘍医が正常組織の損傷（治療プロトコールにおける線量および照射数が制限される応答）を考慮する場合により複雑となる。治療の失敗の理由は、しばしば、複合的で多様である（Ｐａｗｌｉｋ  ａｎｄ  Ｋｅｙｏｍａｒｓｉ，２００４）。腫瘍要因（位置、サイズ、および不適切な血管供給（低酸素症））は全て、電離放射線（ＩＲ）に対する新生物の応答性の欠如で役割を果たし得る。おそらく、放射線感受性の調節に関連し、照射耐性細胞表現型となり得る細胞的および遺伝的要因（差分的組織特異的遺伝子発現など）が最も重要である。科学者は、長きに渡ってＩＲに対する腫瘍細胞感受性を増大させるための種々の方法を開発してきている。これらには、低酸素性放射線増感剤、高濃度酸素、より最近では、放射線感受性に関与する多数の遺伝的要因のターゲティングが含まれる（Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙら，２００６）。しかし、分子生物学分野および生化学分野、癌遺伝学および分子放射線生物学において数十年に及び科学の飛躍的進歩が認められるにもかかわらず、有効且つ特異的な放射線増感剤の進歩は限定的である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本発明の目的によれば、本明細書中に具体化され、広く記載されているように、本発明は、新規の放射線増感剤、その作製方法、および使用に関する。
【０００４】
開示の方法および組成物のさらなる利点を、以下の説明で一部記載し、その説明から一部が理解されるか、開示の方法の実施および組成物によって確認する事ができる。開示の方法および組成物の利点は、添付の特許請求の範囲で特に指摘した要素および組み合わせによって理解および達成されるであろう。上記の一般的説明および以下の詳細な説明は共に例示および解説のみを目的とし、特許請求の範囲に記載の発明を制限しないと理解すべきである。
【０００５】
添付の図面は、本明細書中に組み込まれ、その一部を構成し、開示の方法および組成物のいくつかの実施形態を例示し、その説明と共に、開示の方法および組成物の原理を説明するのに役立つ。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１は、ＮＢＳ１阻害ペプチドの構築を示す。図１Ａは、ＡＴＭおよびＮＢＳ１の機能ドメインおよびその相互作用の略図を示す。ＮＢＳ１のＣ末端は、ＡＴＭ活性化およびＤＮＡ損傷部位の補充に必要である。これは、少なくとも２つのアミノ酸残基組（７３６〜７３７（ＥＥ）および７４１〜７４３（ＤＤＬ）からなり、これらは、進化的に保存されており、ＡＴＭ結合に必要である。ＮＢＳ１は、ＡＴＭ中の２組のＨｅａｔ反復（Ｈｅａｔ反復２（ａ．ａ．２４８〜５２２）およびＨｅａｔ反復７（ａ．ａ．１４３６〜１７７０）に結合する。図１Ｂは、構築されたＲ９、ｗｔＮＩＰ、およびｓｃＮＩＰペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図２Ａ】図２は、ペプチド内在化および細胞傷害性を示す。図２Ａは、ＨｅＬａ細胞を１０μＭのＲ９、ｗｔＮＩＰ、またはｓｃＮＩＰで１時間処理し、フルオレセイン抱合ストレプトアビジンでの染色後に免疫蛍光顕微鏡法によって分析したことを示す。図２Ｂは、ＨｅＬａ細胞を表示用量のタキソールおよびＮＩＰペプチドで処理したことを示す。処理の２４時間後、細胞生存を、標準的なＭＴＴアッセイによって定量した。
【図２Ｂ】図２は、ペプチド内在化および細胞傷害性を示す。図２Ａは、ＨｅＬａ細胞を１０μＭのＲ９、ｗｔＮＩＰ、またはｓｃＮＩＰで１時間処理し、フルオレセイン抱合ストレプトアビジンでの染色後に免疫蛍光顕微鏡法によって分析したことを示す。図２Ｂは、ＨｅＬａ細胞を表示用量のタキソールおよびＮＩＰペプチドで処理したことを示す。処理の２４時間後、細胞生存を、標準的なＭＴＴアッセイによって定量した。
【図３】図３は、ｗｔＮＩＰがＮＢＳ１−ＡＴＭ結合を阻害することを示す。ＮＩＰペプチドで処理したＨｅＬａ細胞を照射した（０または６Ｇｙ）。ウサギＮＢＳ１抗体を使用して免疫沈降を行い、ＡＴＭ、ＮＢＳ１、またはＭＲＥ１１に対するモノクローナル抗体を使用して、ウェスタンブロッティングを行った。
【図４Ａ】図４は、ｗｔＮＩＰがγ−Ｈ２ＡＸフォーカス形成を阻害することができることを示す。図４Ａは、ＨｅＬａ細胞を１０μＭのＲ９、ｗｔＮＩＰ、またはｓｃＮＩＰで１時間処理し、０または６Ｇｙで照射し、３０分後に回収し、その後に免疫蛍光顕微鏡法を使用して照射誘導γ−Ｈ２ＡＸフォーカスを検出したことを示す。図４Ｂは、任意の単位で示した、Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ  ５．１ソフトウェアを使用して各画像について決定した核あたりの平均γ−Ｈ２ＡＸ核フォーカスを示す。エラーバーは、＋／−１ＳＤを示し、グラフは３つの独立した実験の平均である。
【図４Ｂ】図４は、ｗｔＮＩＰがγ−Ｈ２ＡＸフォーカス形成を阻害することができることを示す。図４Ａは、ＨｅＬａ細胞を１０μＭのＲ９、ｗｔＮＩＰ、またはｓｃＮＩＰで１時間処理し、０または６Ｇｙで照射し、３０分後に回収し、その後に免疫蛍光顕微鏡法を使用して照射誘導γ−Ｈ２ＡＸフォーカスを検出したことを示す。図４Ｂは、任意の単位で示した、Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ  ５．１ソフトウェアを使用して各画像について決定した核あたりの平均γ−Ｈ２ＡＸ核フォーカスを示す。エラーバーは、＋／−１ＳＤを示し、グラフは３つの独立した実験の平均である。
【図５Ａ】図５は、ｗｔＮＩＰペプチドへの曝露によってＩＲ誘導性ＮＢＳ１リン酸化が無効になることを示す。図５Ａは、ＨｅＬａ細胞を１０μＭのＲ９、ｗｔＮＩＰ、またはｓｃＮＩＰで１時間処理し、０または６Ｇｙで照射し、１２０分後に回収し、その後に抗Ｓｅｒ３４３  ＮＢＳ１抗体を使用した免疫蛍光顕微鏡法を使用して照射誘導ＮＢＳ１フォーカス形成を検出したことを示す。図４Ｂは、３つの独立した実験における少なくとも２５個の細胞集団から決定した核あたりの平均ＮＢＳ１フォーカス数を示す。エラーバーは、＋／−１ＳＤを示し、グラフは３つの独立した実験の平均である。
【図５Ｂ】図５は、ｗｔＮＩＰペプチドへの曝露によってＩＲ誘導性ＮＢＳ１リン酸化が無効になることを示す。図５Ａは、ＨｅＬａ細胞を１０μＭのＲ９、ｗｔＮＩＰ、またはｓｃＮＩＰで１時間処理し、０または６Ｇｙで照射し、１２０分後に回収し、その後に抗Ｓｅｒ３４３  ＮＢＳ１抗体を使用した免疫蛍光顕微鏡法を使用して照射誘導ＮＢＳ１フォーカス形成を検出したことを示す。図４Ｂは、３つの独立した実験における少なくとも２５個の細胞集団から決定した核あたりの平均ＮＢＳ１フォーカス数を示す。エラーバーは、＋／−１ＳＤを示し、グラフは３つの独立した実験の平均である。
【図６Ａ】図６は、ｗｔＮＩＰが細胞放射線感受性を増大させることを示す。図６Ａは、細胞を限界希釈で播種し、１０μＭのＲ９、ｗｔＮＩＰ、またはｓｃＮＩＰで照射前に１時間処理し、２４時間ペプチドに曝露し続け、１０〜１２日後に回収し、クリスタルバイオレットで染色したことを示す。Ａ（ＨｅＬａ）、Ｃ（ＭＯ５９Ｊ）、およびＤ（ＧＭ９６０７）には、表示の線量での照射後の生存曲線を示す。エラーバーは、＋／−１  ＳＥＭを示し、グラフは３つの独立した実験の平均である。図６Ｂは、ＨｅＬａ細胞におけるＮＩＰ媒介性放射線感受性のクローン原性アッセイの代表的なプレートを示す。
【図６Ｂ】図６は、ｗｔＮＩＰが細胞放射線感受性を増大させることを示す。図６Ａは、細胞を限界希釈で播種し、１０μＭのＲ９、ｗｔＮＩＰ、またはｓｃＮＩＰで照射前に１時間処理し、２４時間ペプチドに曝露し続け、１０〜１２日後に回収し、クリスタルバイオレットで染色したことを示す。Ａ（ＨｅＬａ）、Ｃ（ＭＯ５９Ｊ）、およびＤ（ＧＭ９６０７）には、表示の線量での照射後の生存曲線を示す。エラーバーは、＋／−１  ＳＥＭを示し、グラフは３つの独立した実験の平均である。図６Ｂは、ＨｅＬａ細胞におけるＮＩＰ媒介性放射線感受性のクローン原性アッセイの代表的なプレートを示す。
【図６Ｃ】図６は、ｗｔＮＩＰが細胞放射線感受性を増大させることを示す。図６Ａは、細胞を限界希釈で播種し、１０μＭのＲ９、ｗｔＮＩＰ、またはｓｃＮＩＰで照射前に１時間処理し、２４時間ペプチドに曝露し続け、１０〜１２日後に回収し、クリスタルバイオレットで染色したことを示す。Ａ（ＨｅＬａ）、Ｃ（ＭＯ５９Ｊ）、およびＤ（ＧＭ９６０７）には、表示の線量での照射後の生存曲線を示す。エラーバーは、＋／−１  ＳＥＭを示し、グラフは３つの独立した実験の平均である。図６Ｂは、ＨｅＬａ細胞におけるＮＩＰ媒介性放射線感受性のクローン原性アッセイの代表的なプレートを示す。
【図６Ｄ】図６は、ｗｔＮＩＰが細胞放射線感受性を増大させることを示す。図６Ａは、細胞を限界希釈で播種し、１０μＭのＲ９、ｗｔＮＩＰ、またはｓｃＮＩＰで照射前に１時間処理し、２４時間ペプチドに曝露し続け、１０〜１２日後に回収し、クリスタルバイオレットで染色したことを示す。Ａ（ＨｅＬａ）、Ｃ（ＭＯ５９Ｊ）、およびＤ（ＧＭ９６０７）には、表示の線量での照射後の生存曲線を示す。エラーバーは、＋／−１  ＳＥＭを示し、グラフは３つの独立した実験の平均である。図６Ｂは、ＨｅＬａ細胞におけるＮＩＰ媒介性放射線感受性のクローン原性アッセイの代表的なプレートを示す。
【図７】図７は、Ｒ９、ｗｔＮＩＰ、またはｓｃＮＩＰペプチドの分解を示す。ＨｅＬａ細胞を、１０μＭのＲ９、ｗｔＮＩＰ、またはｓｃＮＩＰで１時間処理し、表示の時点で回収し、その後に、抗ストレプトアビジン抗体で染色して免疫蛍光顕微鏡法によって分析した。
【図８Ａ】図８は、ｗｔＮＩＰが前立腺癌細胞株ＤＵ−１４５におけるγ−Ｈ２ＡＸフォーカス形成を阻害することを示す。図８Ａは、ＤＵ−１４５細胞を１０μＭのＲ９、ｗｔＮＩＰ、またはｓｃＮＩＰで１時間処理し、０または６Ｇｙで照射し、３０分後に回収し、その後に免疫蛍光顕微鏡法を使用して照射誘導性γ−Ｈ２ＡＸフォーカスを検出したことを示す。図８Ｂは、Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ  ５．１ソフトウェアを使用して各画像について決定し、任意の単位で示した核あたりの平均γ−Ｈ２ＡＸ核フォーカスを示す。エラーバーは、＋／−１ＳＤを示し、グラフは３つの独立した実験の平均である。
【図８Ｂ】図８は、ｗｔＮＩＰが前立腺癌細胞株ＤＵ−１４５におけるγ−Ｈ２ＡＸフォーカス形成を阻害することを示す。図８Ａは、ＤＵ−１４５細胞を１０μＭのＲ９、ｗｔＮＩＰ、またはｓｃＮＩＰで１時間処理し、０または６Ｇｙで照射し、３０分後に回収し、その後に免疫蛍光顕微鏡法を使用して照射誘導性γ−Ｈ２ＡＸフォーカスを検出したことを示す。図８Ｂは、Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ  ５．１ソフトウェアを使用して各画像について決定し、任意の単位で示した核あたりの平均γ−Ｈ２ＡＸ核フォーカスを示す。エラーバーは、＋／−１ＳＤを示し、グラフは３つの独立した実験の平均である。
【図９Ａ】図９は、ｗｔＮＩＰペプチドへの暴露が、前立腺癌細胞株ＤＵ−１４５におけるＩＲ誘導性ＮＢＳ１リン酸化を無効にすることを示す。図９Ａは、ＤＵ−１４５細胞を１０μＭのＲ９、ｗｔＮＩＰ、またはｓｃＮＩＰで１時間処理し、０または６Ｇｙで照射し、１２０分後に回収し、その後に抗Ｓｅｒ３４３  ＮＢＳ１抗体を使用した免疫蛍光顕微鏡法を使用して照射誘導ＮＢＳ１フォーカス形成を検出したことを示す。図９Ｂは、３つの独立した実験における少なくとも２５個の細胞集団から決定した核あたりの平均ＮＢＳ１フォーカス数を示す。エラーバーは、＋／−１ＳＤを示し、グラフは３つの独立した実験の平均である。
【図９Ｂ】図９は、ｗｔＮＩＰペプチドへの暴露が、前立腺癌細胞株ＤＵ−１４５におけるＩＲ誘導性ＮＢＳ１リン酸化を無効にすることを示す。図９Ａは、ＤＵ−１４５細胞を１０μＭのＲ９、ｗｔＮＩＰ、またはｓｃＮＩＰで１時間処理し、０または６Ｇｙで照射し、１２０分後に回収し、その後に抗Ｓｅｒ３４３  ＮＢＳ１抗体を使用した免疫蛍光顕微鏡法を使用して照射誘導ＮＢＳ１フォーカス形成を検出したことを示す。図９Ｂは、３つの独立した実験における少なくとも２５個の細胞集団から決定した核あたりの平均ＮＢＳ１フォーカス数を示す。エラーバーは、＋／−１ＳＤを示し、グラフは３つの独立した実験の平均である。
【図１０】図１０は、結合したか遊離のテキサスレッド標識ＮＢＳ１ペプチドを使用した蛍光偏光を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
詳細な説明
開示の方法および組成物を、以下の本明細書中に含まれる特定の実施形態および実施例の詳細な説明ならびに図面およびその上記および下記の説明を参照することによってより容易に理解することができる。
【０００８】
開示の方法および組成物のために使用することができるか、これらと併せて使用することができるか、その調製で使用することができるか、その製品である材料、組成物、および成分を開示する。これらおよび他の材料を本明細書中に開示し、これらの材料の組み合わせ、小集団、相互作用、群などを開示する場合、これらの化合物の種々の個別および集合的な組み合わせおよび置換の特定の言及を明確に開示しないかもしれないが、それぞれ本明細書中で特に意図および記載されると理解される。例えば、ペプチドを開示および考察し、多数の分子（ペプチドが含まれる）に合わせて作製することができる多数の修正形態を考察する場合、特に別の記載がない限り、可能なペプチドのありとあらゆる組み合わせおよび置換ならびに修正形態を特に意図する。したがって、分子クラスＡ、Ｂ、およびＣを分子クラスＤ、Ｅ、およびＦと同様に開示する場合、分子Ａ−Ｄの組み合わせ例が開示され、それぞれが個別に引用されない場合でさえも、それぞれ個別および集合的であることが意図される。したがって、この例では、各組み合わせＡ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−Ｅ、およびＣ−Ｆは特に意図され、Ａ、Ｂ、およびＣ；Ｄ、Ｅ、およびＦ；ならびに例示的組み合わせＡ−Ｄの開示からこれらが開示されると見なすべきである。同様に、これらの任意の小集団または組み合わせも特に意図および開示される。したがって、例えば、小集団Ａ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、およびＣ−Ｅが特に意図され、Ａ、Ｂ、およびＣ；Ｄ、Ｅ、およびＦ；ならびに例示的組み合わせＡ−Ｄから開示されると見なすべきである。この概念を、本出願の全ての態様（開示の組成物の作製方法および使用方法における工程が含まれるが、これらに限定されない）に適用する。したがって、実施することができる多数のさらなる工程が存在する場合、これらのさらなる各工程を開示の方法の任意の特定の実施形態または実施形態の組み合わせを使用して実施することができ、それぞれのかかる組み合わせが特に意図され、開示されると見なすべきであると理解される。
【０００９】
開示の方法および組成物が記載の特定の方法、プロトコール、および試薬に制限されず、これらは変化し得ると理解される。本明細書中で使用した専門用語は特定の実施形態の説明のみを目的とし、本発明の範囲を制限することを意図せず、該範囲は、添付の特許請求の範囲にのみ制限されるとも理解される。
【００１０】
開示の方法および組成物を、以下の本明細書中に含まれる特定の実施形態および実施例の詳細な説明ならびに図面および上記および下記のその説明を参照することによってより容易に理解することができる。
Ａ．組成物
１．ＡＴＭ媒介性ＤＮＡ損傷応答
放射線療法および化学療法に対する細胞（癌細胞など）の感受性を増加させるためのＡＴＭの活性化を阻害するための組成物および方法を本明細書中に開示する。放射線療法はまた、非悪性容態（三叉神経痛、重症甲状腺眼症（ｓｅｖｅｒｅ  ｔｈｙｒｏｉｄ  ｅｙｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）、翼状片）の治療、瘢痕ケロイド成長の防止、および異所性骨化の防止）で適用される。
【００１１】
現代の分子放射線腫瘍学では、生物学的ターゲティングには、細胞増殖、ＤＮＡ修復、および細胞死に関連する細胞応答機構の深い理解が必要である。照射（ＩＲ）誘導性ＤＮＡ損傷に対する細胞応答が簡潔に組織化されたシグナル伝達ネットワークによって調節されることが周知である。このネットワークは、多数の遺伝子産物（センサー、トランスデューサー、およびエフェクターが含まれる）から構成される。ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を、形質導入キナーゼの活性化を誘発するセンサー分子によって検出する。次いで、これらのトランスデューサーは、エフェクター分子をリン酸化してシグナル伝達カスケードを調製し、それにより、細胞周期チェックポイントを調節するか、ＤＮＡ修復機構に影響を及ぼすか、アポトーシス経路を誘発する。ネットワーク中の１つの中心的要素は、ＡＴＭタンパク質であり、その変異は、毛細管拡張性失調症（Ａ−Ｔ）と命名されたヒト常染色体劣性疾患に寄与する（Ｓｈｉｌｏｈ，２００３）。Ａ−Ｔは、進行性神経変性、一般免疫不全（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）、リンパ性悪性疾患の発症に対する極めて高い素因、およびＩＲに対する過敏症によって特徴づけられる。Ａ−Ｔ患者由来の細胞は、種々の異常（細胞周期チェックポイントの欠損、染色体不安定性、および過敏なＩＲ応答が含まれる）を示す。疾患を担う遺伝子は、１９９５年にクローニングされており、毛細管拡張性失調症変異（ＡＴＭ）と呼ばれている（Ｓａｖｉｔｓｋｙら，１９９５）。ＡＴＭ遺伝子は、その巨大なサイズおよびＰＩ−３キナーゼに類似するそのカルボキシル末端中の配列の存在が顕著である。遺伝子ファミリー（酵母におけるＴｅｌｌ、Ｍｅｃｌ、およびＲａｄ３、ショウジョウバエにおけるＭｅｉ−４１、ならびに脊椎動物におけるＡＴＲおよびＤＮＡ−ＰＫ）は、サイズおよびカルボキシル末端キナーゼ配列が類似しており、これらは全てＤＮＡ損傷応答の調節に関与する（Ａｂｒａｈａｍ，２００１）。ＡＴＭ遺伝子は、３７０−ＫＤタンパク質キナーゼをコードし、上記ＰＩ３キナーゼで保存されており、タンパク質−タンパク質相互作用ドメインとして機能することができるいくつかの機能ドメイン（ＦＡＴドメインが含まれる）からなる。キナーゼドメインは、セリン／トレオニンをリン酸化し、その後にグルタミン（Ｓ／Ｔ−Ｑコンセンサス配列）をリン酸化することができ、ＦＡＴカルボキシ末端ドメイン（ＦＡＴＣ）はタンパク質の活性および安定性を調節することができる。以前の研究により、ＤＮＡ損傷後、セリン１９８１（ＦＡＴドメイン内のセリン部位の１つ）上のＡＴＭの細胞間自己リン酸化がＡＴＭの不活性二量体を活性単量体に解離することが証明された（Ｂａｋｋｅｎｉｓｔ  ａｎｄ  Ｋａｓｔａｎ，２００３）。しかし、マウス研究により、Ｓｅｒ１９８７（マウスで保存されるセリン残基）でセリンがアラニンに変異したＡＴＭはＡＴＭ媒介性ＤＮＡ損傷応答の修復に関して完全に機能的であることが明らかとなった（Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｉら，２００６）。したがって、ＡＴＭ活性化におけるＳｅｒｌ９８１の自己リン酸化の役割が除外された。
【００１２】
ＡＴＭ活性化のための他のモデルは、ＡＴＭ活性化がＮＢＳ１およびＭｒｅ１１の非存在下で減少し、その両方がＲａｄ５０と複合体（いわゆるＭＲＮ複合体）を形成するという事実に基づく。ＭＲＮ複合体は高度に保存されており、各染色体切断機構局面に影響を及ぼし、鎖切断を検出するためのＤＮＡ損傷センサーと見なされる（Ｄｉｆｉｌｉｐｐａｎｔｏｎｉｏら，２００５；Ｄｕｐｒｅら，２００６）。ＮＢＳ１の保存されたＣ末端モチーフは、ＡＴＭのいくつかのＨｅａｔ反復に結合する（キナーゼを活性化するために不可欠な相互作用）（Ｆａｌｃｋら，２００５）。研究により、ＭＲＮ複合体がＤＮＡ二本鎖切断を検出し、ＡＴＭを損傷ＤＮＡ分子に補充することが示されている（Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｐａｕｌｌ，２００４；Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｐａｕｌｌ，２００５；Ｄｉｆｉｌｉｐｐａｎｔｏｎｉｏら，２００５）。活性化ＡＴＭは多数の下流標的をリン酸化して、最適な細胞応答を容易にすることができる。最近の１０年間にわたり、ＤＮＡ損傷に対する最適な細胞応答に不可欠な多数のタンパク質がＡＴＭ酵素基質として認識されている。この継続的に成長するＡＴＭ基質リストの好例は、ＡＴＭによってＥ３ユビキチンリガーゼＣＯＰ１をリン酸化することができ、その後の機能がＤＮＡ損傷に応答してｐ５３を安定化することであるという最新の所見である（Ｄｏｒｎａｎら，２００６）。
【００１３】
ＡＴＭが照射に対する細胞応答の中心となるので、その活性化または活性の遮断によって事実上任意の腫瘍型で照射に対する感受性をさらにより高くすることができる。１９９５年の遺伝子クローニング以来、多数の研究者がＡＴＭをターゲティングするためにいくつかの方法を使用している。これらの方法には、アンチセンスＲＮＡ、小さな干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、およびＡＴＭの小分子インヒビターのスクリーニングが含まれる。Ｚｈａｎｇらは、ＣＢ３ＡＲ細胞に反対方向でＡＴＭの全長ｃＤＮＡを首尾よくサブクローニングし、放射線感受性を有意に増加させることを示した。アンチセンス構築物により、照射感受性が約３倍になり、これはＡ−Ｔ細胞に類似する。トランスフェクトした細胞における染色体切断数および見かけの照射耐性ＤＮＡ合成数が増加した（Ｚｈａｎｇら，１９９８）。さらに、膠芽細胞腫細胞および前立腺癌細胞におけるアンチセンスＡＴＭによって付与された放射線感受性は、非トランスフェクション細胞の４倍であることが示されている（Ｇｕｈａら，２０００；Ｆａｎら，２０００）。
【００１４】
最近のｓｉＲＮＡの開発により、前立腺癌細胞中でＡＴＭ機能を阻害することができるｓｉＲＮＡが生成された。Ｃｏｌｌｉｓらは、ヒト癌細胞中でＡＴＭをターゲティングするｓｉＲＮＡをコードする外因性プラスミドをデザインし、供給した。ＤＵ−１４５細胞およびＰＣ−３細胞の両方は、これらのプラスミドでトランスフェクトした場合、臨床的に関連する放射線量で放射線感受性の増加を示した（Ｃｏｌｌｉｓら，２００３）。最近になって、ＡＴＭ特異的ｓｉＲＮＡでのＨｅｌａ細胞の安定なトランスフェクションにより、電離放射線に対する感受性が１０倍になった。ｐ５３欠損細胞におけるＡＴＭサイレンシングによって細胞サイクルチェックポイントに妥協し、ドキソルビシンと組み合わせた場合、化学的感受性が３．１倍に増大したことも示されている（Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙら，２００５）。ｓｉＲＮＡがｉｎ  ｖｉｖｏで有望な結果を示したが、臨床研究への移行は緩やかであった。
【００１５】
ＤＮＡ−ＰＫインヒビターＬＹ２９４００２周辺の化合物の組み合わせライブラリーのスクリーニングにより、Ｈｉｃｋｓｏｎらは化合物（ＫＵ５５９３３）がＡＴＭキナーゼを選択的に阻害することを報告した。その研究は、Ｈｅｌａ細胞における放射線感受性の有意な増加を示し、その増加がエトポシドに対する感受性の３５．５倍ほどになることを示した（Ｈｉｃｋｓｏｎら，２００４）。しかし、化合物のｉｎ  ｖｉｖｏ放射線増感効果および毒性は報告されていない。上記で引用した方法の適用におけるいくつかの障害が存在し、以下が含まれる：１）遺伝子のサイズが巨大であるので、臨床的状況におけるアンチセンスストラテジーまたはｓｉＲＮＡ技術によるＡＴＭ遺伝子の遺伝子操作が面倒であること、２）これらの方法が腫瘍特異的ターゲティングを保証しておらず、それにより、治療指数の増加が不確定であること、および３）より重要には、遺伝子変異の多面発現効果により、直接ターゲティングしたＡＴＭキナーゼ活性の結果が複雑になり得、これらの試薬のみの効果によって放射線増感が付与されているかどうか不明であること。
２．小阻害ペプチド
ＮＢＳ１−ＡＴＭ相互作用がＡＴＭのＩＲ誘導性活性化および放射線感受性の制限に重要であるので、シグナル伝達経路を選択的に破壊する放射線増感剤の開発アプローチを本明細書中に開示する。１つの提供した方法は、ＮＢＳ１−ＡＴＭ相互作用を遮断するための非機能性小ペプチドの使用である。例えば、野生型Ｃ末端ＮＢＳ１配列を含む小ペプチドは、ＮＢＳ１−ＡＴＭ相互作用およびＡＴＭ活性化を阻害することができる。同様に、ＡＴＭのｈｅａｔ反復配列を含む小ペプチドはＮＢＳ１−ＡＴＭ相互作用およびＡＴＭ活性化を阻害することができる。
【００１６】
用語「ペプチド」および「ポリペプチド」は、本明細書中で、２つ以上のアミノ酸のポリマーをいう同義語として使用し、特定の長さまたは作製方法を示すことを意味しない。
【００１７】
したがって、ＮＢＳ１のカルボキシ末端アミノ酸配列またはその保存的変異体（本明細書中でＮＩＰともいう）を含む単離ポリペプチドを本明細書中に提供する。例えば、提供したペプチドは、配列番号１のアミノ酸７３４〜７５４を含むことができる。提供したペプチドは、ＮＢＳ１（配列番号１）のＣ末端のほとんどの４〜３０アミノ酸（アミノ酸７３４〜７５４が含まれる）内に保存的アミノ酸置換を含むことができる。この文脈では、ペプチドは、１、２、または３個の保存的アミノ酸置換を含むことができる。いくつかの態様では、ペプチドは、アミノ酸配列ｘＥＥｘｘｘＤＤＬｘ（ｘは任意のアミノ酸である）（配列番号５５）を含む。
【００１８】
ペプチドは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことができる。ポリペプチドは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
【００１９】
ＡＴＭのＮＢＳ１結合配列またはその保存的変異体を含む単離ポリペプチドも本明細書中に提供する。例えば、ポリペプチドは、ＮＢＳ１に結合するＡＴＭのｈｅａｔ反復配列またはそのフラグメントを含むことができる。例えば、提供したポリペプチドは、配列番号５６を含むことができる。提供したポリペプチドは、配列番号５７を含むことができる。ポリペプチドは、ＮＢＳ１に結合する配列番号５６と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列またはそのフラグメントを含むことができる。ポリペプチドは、ＮＢＳ１に結合する配列番号５７と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列またはそのフラグメントを含むことができる。
【００２０】
本明細書中で開示される場合、提供したポリペプチドは、ＮＢＳ１のカルボキシ末端へのＡＴＭの結合を阻害することができる。同様に、本明細書中で開示される場合、提供したポリペプチドは、放射線療法および化学療法に対する細胞（癌細胞など）の感受性を増大させることができる。したがって、１つの態様では、本明細書中に提供した単離ポリペプチドは、被験体への投与に適切な薬学的組成物中に存在する。
【００２１】
１つの態様では、本明細書中に提供したポリペプチドは、ＮＢＳ１のカルボキシ末端のほとんどのアミノ酸を含む任意のポリペプチドであり得るが、ペプチドは全長ＮＢＳ１ではない。したがって、提供したポリペプチドは、ＮＢＳ１のＣ末端のほとんどの４〜３０アミノ酸（ＮＢＳ１のＣ末端のほとんどの４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個のアミノ酸またはそのフラグメントが含まれる）を含むことができる。例えば、提供したポリペプチドは、ＮＢＳ１（配列番号１）のアミノ酸７３４〜７５４を含むことができる。提供したポリペプチドは、ＮＢＳ１（配列番号１）のＣ末端のほとんどの４〜３０アミノ酸（アミノ酸７３４〜７５４が含まれる）内に保存的アミノ酸置換を含むことができる。この文脈では、ペプチドは、１、２、または３個の保存的アミノ酸置換を含むことができる。ポリペプチドは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことができる。ポリペプチドは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。ポリペプチドは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０と少なくとも９６％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。ポリペプチドは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０と少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。ポリペプチドは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。ポリペプチドは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０と少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
【００２２】
別の態様では、ポリペプチドは、例えば、Ｃ末端のほとんどの１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸を含まない。したがって、ペプチドは、ＮＢＳ１のアミノ酸７３４〜７５３、７３４〜７５２、７３４〜７５１、７３４〜７５０、７３４〜７４９、７３４〜７４８、７３４〜７４７、７３４〜７４６、７３４〜７４５、７３４〜７４４を含むことができる。したがって、ペプチドは、いくつかの態様では、ＮＢＳ１のアミノ酸７５４、７５３、７５２、７５１、７５０、７４９、７４８、７４７、７４６、７４５を含まない。
【００２３】
ＮＢＳ１のＣ末端は、ＡＴＭ活性化およびＤＮＡ損傷部位の補充に必要である。これは、少なくとも２つのアミノ酸残基組（７３６〜７３７（ＥＥ）および７４１〜７４３（ＤＤＬ）からなり、これらは、進化的に保存されており、ＡＴＭ結合に必要である。したがって、ＮＢＳ１は、アミノ酸配列ｘＥＥｘｘｘＤＤＬｘ（ｘは任意のアミノ酸配列である）（配列番号５５）を含むことができる。
【００２４】
さらなる態様では、本明細書中に提供したポリペプチドは、ＡＴＭのＮＢＳ１結合ドメインを含む任意のポリペプチドであり得るが、ペプチドは全長ＡＴＭではない。したがって、本明細書中に提供したポリペプチドは、ＡＴＭのＨｅａｔ反復２および／または７を含む任意のポリペプチドであり得る。したがって、本明細書中に提供したポリペプチドは、配列番号５１に開示のＡＴＭ配列のアミノ酸２４８〜５２２を含む任意のポリペプチドであり得る。したがって、本明細書中に提供したポリペプチドは、配列番号５６のアミノ酸を含む任意のポリペプチドであり得る。したがって、本明細書中に提供したポリペプチドは、ＡＴＭ（配列番号５１）のアミノ酸１４３６〜１７７０を含む任意のポリペプチドであり得る。したがって、本明細書中に提供したポリペプチドは、配列番号５７のアミノ酸を含む任意のポリペプチドであり得る。提供したポリペプチドは、ＡＴＭのＨｅａｔ反復２および／または７内に保存的アミノ酸置換を含むことができる。この文脈では、ペプチドは、１、２、または３個の保存的アミノ酸置換を含むことができる。ポリペプチドは、配列番号５６または配列番号５７と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。ポリペプチドは、配列番号５６または配列番号５７と少なくとも９６％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。ポリペプチドは、配列番号５６または配列番号５７と少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。ポリペプチドは、配列番号５６または配列番号５７と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。ポリペプチドは、配列番号５６または配列番号５７と少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
【００２５】
提供したポリペプチドは、融合タンパク質をさらに構成することができるか、そうでなければ、さらなるＮ末端、Ｃ末端、または中間のアミノ酸配列（例えば、リンカーまたはタグ）を有することができる。本明細書中で使用される場合、「リンカー」は、２つの異なるポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントを連結または分離するために使用することができるアミノ酸配列または挿入物であり、そのほかの点では、リンカーは組成物の不可欠な機能に寄与しない。本明細書中に提供したポリペプチドは、例えば、アミノ酸ＧＬＳ、ＡＬＳ、またはＬＬＡを含むアミノ酸リンカーを有することができる。本明細書中で使用される場合、「タグ」は、提供したポリペプチドを検出または精製するために使用することができる個別のアミノ酸配列をいい、そのほかの点では、タグは組成物の不可欠の機能に寄与しない。提供したポリペプチドは、さらに、ポリペプチドの不可欠な活性に寄与しないＮ末端、Ｃ末端、または中間のアミノ酸を欠失することができる。
３．融合タンパク質
本明細書中に開示のポリペプチドは、融合タンパク質であり得る。キメラタンパク質としても公知の融合タンパク質は、本来は個別のタンパク質をコードした２つ以上の遺伝子の連結によって作製されたタンパク質である。この融合遺伝子の翻訳により、それぞれの元のタンパク質に由来する機能性を有する単一のポリペプチドが得られる。組換え融合タンパク質を、生物学的調査または治療で使用する組換えＤＮＡテクノロジーによって人工的に作製することができる。大規模変異（典型的には、染色体転座）によって２つの異なる遺伝子由来のコード配列の一部を含む新規のコード配列が作製される場合にキメラ変異タンパク質が天然に生じる。
【００２６】
融合タンパク質の機能性は、多数のタンパク質機能ドメインがモジュラーであるという事実によって可能になる。言い換えれば、所与のドメイン（チロシンキナーゼドメインなど）に対応するポリペプチドの線状部分をその本来の酵素能力を破壊することなく残りのタンパク質から除去することができる。したがって、任意の本明細書中に開示の機能ドメインを使用して、融合タンパク質をデザインすることができる。
【００２７】
組換え融合タンパク質は、融合遺伝子の遺伝子操作によって作製されたタンパク質である。これは、典型的には、第１のタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列から終止コドンを除去し、その後にライゲーションまたは重複伸長ＰＣＲによって第２のタンパク質のｃＤＮＡ配列をインフレームで付加することを含む。次いで、そのＤＮＡ配列を、単一のタンパク質として細胞によって発現する。タンパク質を、両方の元のタンパク質の全長またはいずれかの一部のみを含むように操作することができる。
【００２８】
２つの物質（ｅｎｔｉｔｉｅｓ）がタンパク質である場合、しばしばリンカー（また「スペーサー」）ペプチドも添加し、それにより、タンパク質が独立して折り畳まれて予想通りに挙動する可能性がより高くなる。特にリンカーがタンパク質を精製することができる場合、タンパク質またはペプチド融合物中のリンカーを、時折、２つの個別のタンパク質を遊離することができるプロテアーゼまたは化学物質の切断部位で操作する。この技術を、しばしば、ニッケル樹脂またはコバルト樹脂（アフィニティクロマトグラフィ）を使用して単離することができるＧＳＴタンパク質、ＦＬＡＧペプチド、またはヘキサ−ｈｉｓペプチド（ａｋａ：６ｘｈｉｓ−タグ）の融合によるタンパク質の同定および精製のために使用する。疾患の発症を研究するためのキメラタンパク質を、毒素または毒素に結合した抗体を使用して製造することもできる。
【００２９】
あるいは、配列内リボゾーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントを使用して、多重遺伝子、すなわち多シストロン性のメッセージを作製することができる。ＩＲＥＳエレメントは、５’メチル化Ｃａｐ依存性翻訳のリボゾームスキャニングモデルを迂回して、内部部位での翻訳を開始することができる（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ  ａｎｄ  Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，１９８８）。ピコルナウイルスファミリーの２つのメンバー（ポリオおよび脳心筋炎）由来のＩＲＥＳエレメントが記載されており（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ  ａｎｄ  Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，１９８８）、哺乳動物メッセージ由来のＩＲＥＳも記載されている（Ｍａｃｅｊａｋ  ａｎｄ  Ｓａｒｎｏｗ，１９９１）。ＩＲＥＳエレメントを、異種読み取り枠に連結することができる。それぞれＩＲＥＳによって分離される複数の読み取り枠を共に転写して、多シストロン性メッセージを作製することができる。ＩＲＥＳエレメントによって、各読み取り枠は、有効な翻訳のためにリボゾームに接近可能である。１つのメッセージを転写するための１つのプロモーター／エンハンサーを使用して、複数の遺伝子を効率的に発現することができる（米国特許第５，９２５，５６５号および同第５，９３５，８１９号；ＰＣＴ／ＵＳ９９／０５７８１号）。ＩＲＥＳ配列は当該分野で公知であり、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）（Ｇｈａｔｔａｓ，Ｉ．Ｒ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，１１：５８４８−５８４９（１９９１）；ＢｉＰタンパク質（Ｍａｃｅｊａｋ  ａｎｄ  Ｓａｒｎｏｗ，Ｎａｔｕｒｅ，３５３：９１（１９９１））；ショウジョウバエのアンテナペディア遺伝子（エクソンｄおよびｅ）（Ｏｈら，Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，６：１６４３−１６５３（１９９２））；ポリオウイルス（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ  ａｎｄ  Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｎａｔｕｒｅ，３３４：３２０３２５（１９８８）（Ｍｏｕｎｔｆｏｒｄ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，ＴＩＧ，１１：１７９−１８４（１９８５）も参照のこと）に由来するＩＲＥＳ配列が含まれる。
４．内在化配列
細胞に有効に侵入するために、ＮＢＳ１ペプチドを内在化配列またはタンパク質形質導入ドメインに連結することができる。最近の研究により、いくつかの細胞貫通ペプチド（ＨＩＶウイルスのＴＡＴトランス活性化ドメイン、アンテナペディア、および原形質膜を介して分子および小ペプチドを容易に輸送することができるトランスポータン（ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ）が含まれる）が同定されている（Ｓｃｈｗａｒｚｅら，１９９９；Ｄｅｒｏｓｓｉら，１９９６；Ｙｕａｎら，２００２）。より最近では、ポリアルギニンは原形質膜を介したペプチドおよびタンパク質の輸送をさらにより効率的にすることが示されており、このことがポリアルギニンをペプチド媒介性輸送のための魅力的なツールにしている（Ｆｕｃｈｓ  ａｎｄ  Ｒａｉｎｅｓ，２００４）。ノナアルギニン（Ｒ９、配列番号１８）は、最も効率的なポリアルギニンベースのタンパク質形質導入ドメインの１つといわれており、その最大取り込みはＴＡＴまたはアンテナペディアよりも有意に高い。ポリアルギニンベースの内在化配列の使用によるペプチド媒介性細胞傷害性がより低いことも示されている。Ｒ９媒介性膜輸送は、ヘパラン硫酸プロテオグリカン結合およびエンドサイトーシスパッケージング（ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ）によって容易になる。一旦内在化すると、ヘパランをヘパラナーゼによって分解してＲ９を放出し、これが細胞質に漏出する（Ｄｅｓｈａｙｅｓら，２００５）。研究により、最近、ポリアルギニン誘導体が全長ｐ５３タンパク質を口腔癌細胞に輸送し、その成長および転移を抑制することが示されている。それにより、ポリアルギニンは強力な細胞貫通ペプチドと考えられている（Ｔａｋｅｎｏｂｕら，２００２）。
【００３０】
したがって、提供したポリペプチドは、細胞内在化輸送体または細胞内在化配列を含むことができる。細胞内在化配列は、当該分野で公知であるか新規に発見された任意の内在化配列またはその保存的変異体であり得る。細胞内在化輸送体および細胞内在化配列の制限されない例には、ポリアルギニン（例えば、Ｒ９）、アンテナペディア配列、ＴＡＴ、ＨＩＶ−Ｔａｔ、ペネトラチン（Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ）、Ａｎｔｐ−３Ａ（Ａｎｔｐ変異体）、ブフォリンＩＩ（ブホリンＩＩ）、トランスポータン、ＭＡＰ（両親媒性モデルペプチド）、Ｋ−ＦＧＦ、Ｋｕ７０、プリオン、ｐＶＥＣ、Ｐｅｐ−１、ＳｙｎＢｌ、Ｐｅｐ−７、ＨＮ−１、ＢＧＳＣ（ビス−グアニジニウム−スペルミジン−コレステロール、およびＢＧＴＣ（ビス−グアニジニウム−Ｔｒｅｎ−コレステロール）が含まれる（表１を参照のこと）。
【００３１】
【表１−１】
2010508022.tif 000003
【００３２】
【表１−２】
2010508022.tif 000004
したがって、提供したポリペプチドは、アミノ酸配列
【００３３】
【化１】
2010508022.tif 000005
をさらに含むことができる。Ｂｕｃｃｉ，Ｍ．ら２０００．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６，１３６２−１３６７；Ｄｅｒｏｓｓｉ，Ｄ．ら１９９４．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，１０４４４−１０４５０；Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｐ．Ｍ．ら２０００．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．５５，１６３−１７２；Ｆｒａｎｋｅｌ，Ａ．Ｄ．＆  Ｐａｂｏ，Ｃ．Ｏ．１９８８．Ｃｅｌｌ  ５５，１１８９−１１９３；Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．＆  Ｌｏｅｗｅｎｓｔｅｉｎ，Ｐ．Ｍ．１９８８．Ｃｅｌｌ  ５５，１１７９−１１８８；Ｐａｒｋ，Ｃ．Ｂ．ら２０００．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７，８２４５−８２５０；Ｐｏｏｇａ，Ｍ．ら、１９９８．ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１２，６７−７７；Ｏｅｈｌｋｅ，Ｊ．ら１９９８．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１４１４，１２７−１３９；Ｌｉｎ，Ｙ．Ｚ．ら１９９５．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，１４２５５−１４２５８；Ｓａｗａｄａ，Ｍ．ら２００３．Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５，３５２−３５７；Ｌｕｎｄｂｅｒｇ，Ｐ．ら２００２．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２９９，８５−９０；Ｅｌｍｑｕｉｓｔ，Ａ．ら２００１．Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２６９，２３７−２４４；Ｍｏｒｒｉｓ，Ｍ．Ｃら２００１．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９，１１７３−１１７６；Ｒｏｕｓｓｅｌｌｅ，Ｃ．ら２０００．Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５７，６７９−６８６；Ｇａｏ，Ｃ．ら２００２．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１０，４０５７−４０６５；Ｈｏｎｇ，Ｆ．Ｄ．＆  Ｃｌａｙｍａｎ，Ｇ．Ｌ．２０００．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０，６５５１−６５５６）を参照のこと。提供したポリペプチドは、さらに、ＢＧＳＣ（ビス−グアニジニウム−スペルミジン−コレステロール）またはＢＧＴＣ（ビス−グアニジニウム−Ｔｒｅｎ−コレステロール）を含むことができる（Ｖｉｇｎｅｒｏｎ，Ｊ．Ｐ．ら１９９８．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９３，９６８２−９６８６）。前記引例は、細胞内在化ベクターおよび細胞内在化配列の教示についてその全体が本明細書中で参照により援用される。現在公知であるか、その後に同定される任意の他の内在化配列を、本発明のペプチドと組み合わせることができる。
【００３４】
例えば、ポリペプチドは、ＮＢＳ１のカルボキシ末端のほとんどのアミノ酸およびポリアルギニン内在化配列を含むことができる。したがって、例えば、ポリペプチドは、アミノ酸配列である配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、または配列番号４２を含むことができる。
５．腫瘍特異的ターゲティング
好ましい放射線増感剤は、腫瘍細胞のみを感受性にし、正常細胞を容赦する。これを達成するための１つのアプローチは、内在化および腫瘍特異的ターゲティング能力の両方を有するポリペプチド（例えば、修飾タンパク質または融合タンパク質）を使用することである。腫瘍脈管構造が周辺の正常組織の脈管構造と異なるので、形態学および生化学の両方において、この相違は、腫瘍進行の重要な決定要因および新規の抗癌療法のための強力な標的として近年注目を集めている。生化学的に、腫瘍血管は、多数の血管形成関連分子（一定のインテグリン、内皮細胞成長因子受容体、プロテアーゼ、細胞表面プロテオグリカン、および細胞外基質成分など）の発現によって腫瘍血管自体を残りの血管と区別する（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，２０００）。マウスに注射した場合に腫瘍脈管構造にホーミングする（ｈｏｍｅ）ペプチドのファージディスプレイライブラリーのｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニングにより、腫瘍ホーミングのためのいくつかのモチーフが示唆されている。これらには、環状ペプチドＣＤＣＲＧＤＣＦＣ（配列番号１２）中のＲＧＤおよび環状腫瘍ホーミングペプチドＣＮＧＲＣ（配列番号１１）中のＮＧＲが含まれる。ＮＧＲ含有ペプチドは、細胞傷害性薬剤、アポトーシス促進性ペプチド、および腫瘍壊死因子αの腫瘍脈管構造への送達に有用であることが証明されている（Ｅｌｌｅｒｂｙら，１９９９；Ａｒａｐら，１９９８；Ａｒａｐら，２００２；Ｃｕｒｎｉｓら，２００２）。第３のモチーフＧＳＬも、種々の腫瘍型を使用したスクリーニングで頻繁に単離された（Ａｒａｐら，１９９８）。ＲＧＤ、ＮＧＲ、およびＧＳＬモチーフペプチドを保有するファージの腫瘍ホーミングは、腫瘍型と無関係であり（Ａｒａｐら，１９９８；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら，２０００；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら，１９９７）、むしろ、ホーミングは腫瘍脈管構造の血管形成特性に依存する。ＮＧＲ腫瘍ホーミングペプチドの受容体はインテグリンではない。その代わりに、腫瘍脈管構造中のＮＧＲモチーフペプチドの受容体としてアミノペプチダーゼＮ（ＡＰＮまたはＣＤ１３）が同定されている（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら，２０００）。ＮＧＲ含有ペプチドは、細胞傷害性薬剤、アポトーシス促進性ペプチド、および腫瘍壊死因子αの腫瘍脈管構造への送達に有用であることが証明されている（Ｅｌｌｅｒｂｙら，１９９９；Ａｒａｐら，１９９８；Ａｒａｐら，２００２；Ｃｕｒｎｉｓら，２００２）。より興味深いことに、ＮＧＲペプチドは原発性および転移性の前立腺腫瘍に結合することができるが、正常な前立腺組織に結合しないことが示されている（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら，２０００）。ＮＧＲペプチドはまた、細胞質内在化能力を示す（Ａｒａｐら，１９９８）。
【００３５】
特定の組織をターゲティングすることができる任意の分子を、（例えば、ＮＩＰを含む融合タンパク質中の）本発明のポリペプチドのターゲティング分子として使用することができる。例えば、ターゲティング分子は、ヒト上皮細胞ムチン（Ｍｕｃ−１；乳癌細胞および膵臓癌細胞上に存在するＭｕｃ−１糖タンパク質の２０アミノ酸コア反復）、Ｈａ−ｒａｓ癌遺伝子産物、ｐ５３、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ｒａｆ癌遺伝子産物、ｇｐｌ００／ｐｍｅｌ１７、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、ＴＦ、ｓＴｎ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、チロシナーゼ、ｇｐ７５、Ｍｅｌａｎ−Ａ／Ｍａｒｔ−１、ｇｐ１００、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＥＢＶ−ＬＭＰ１および２、ＨＰＶ−Ｆ４、６、７、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＨＰＶ−１６、ＭＵＭ、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＣＯ１７−１Ａ、ＧＡ７３３、ｇｐ７２、ｐ５３、ｒａｓ癌遺伝子産物、ＨＰＶ  Ｅ７、ウィルムス腫瘍抗原−１、テロメラーゼ、黒色腫ガングリオシド、または簡潔な膜貫通配列と相互作用する分子（例えば、抗体またはアプタマー）であり得る。
【００３６】
生体内の癌細胞への治療薬の選択的送達は、癌特異的バイオマーカーのターゲティングを集中的に研究する別の研究分野である（Ｅ．Ｍａｓｔｒｏｂａｔｔｉｓｔａ，Ｇ．Ａ．Ｋｏｎｉｎｇ，ａｎｄ  Ｇ．Ｓｔｏｒｍ，“Ｉｍｍｏｎｏｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  Ｄｒｕｇｓ，”Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １９９９，４０：１０３−２７；Ｊ．Ｓｕｄｉｍａｃｋ  ａｎｄ  Ｒ．Ｊ．Ｌｅｅ，“Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｖｉａ  Ｆｏｌａｔｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，”Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２０００，４１：１４７−６２；Ｓ．Ｐ．Ｖｙａｓ  ａｎｄ  Ｖ．Ｓｉｈｏｒｋａｒ，“Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ａｎｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｉｎ  Ｎｏｎ−Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２０００，４３：１０１−６４）。葉酸受容体（Ｅ．Ｍａｓｔｒｏｂａｔｔｉｓｔａ，Ｇ．Ａ．Ｋｏｎｉｎｇ，ａｎｄ  Ｇ．Ｓｔｏｒｍ，“Ｉｍｍｏｎｏｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  Ｄｒｕｇｓ，”Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １９９９，４０：１０３−２７；Ｊ．Ｓｕｄｉｍａｃｋ  ａｎｄ  Ｒ．Ｊ．Ｌｅｅ，“Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｖｉａ  Ｆｏｌａｔｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，”Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２０００，４１：１４７−６２）、ＣＡ−１２５（Ｅ．Ｍａｓｔｒｏｂａｔｔｉｓｔａ，Ｇ．Ａ．Ｋｏｎｉｎｇ，ａｎｄ  Ｇ．Ｓｔｏｒｍ，“Ｉｍｍｏｎｏｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  Ｄｒｕｇｓ，”Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １９９９，４０：１０３−２７）、およびＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原（Ｄ．Ｂ．Ｋｉｒｐｏｔｉｎ，Ｊ．Ｗ．Ｐａｒｋ，Ｋ．Ｈｏｎｇ，Ｓ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｗ．Ｌ．Ｌｉ，Ｐ．Ｃａｒｔｅｒ，Ｃ．Ｃ．Ｂｅｎｚ，ａｎｄ  Ｄ．Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，“Ｓｔｅｒｉｃａｌｌｙ  Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ａｎｔｉ−ＨＥＲ２  ｉｍｍｕｎｏｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ，”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９７，３６：６６−７５）に対するモノクローナル抗体を使用した免疫リポソーム媒介性ターゲティングが記載されている。
【００３７】
したがって、本明細書中に提供したポリペプチドは、腫瘍特異的ターゲティング配列をさらに含むことができる。例えば、腫瘍特異的ターゲティング配列は、ＲＧＤモチーフ、ＮＧＲモチーフ、またはＧＳＬモチーフを含むことができる。１つの態様では、腫瘍特異的ターゲティング配列は、腫瘍血管内皮細胞をターゲティングする。したがって、ポリペプチドは、配列番号１１または配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含むことができる。
６．エフェクター
本明細書中に提供した組成物は、エフェクター分子をさらに含むことができる。「エフェクター分子」は、標的細胞または標的組織に作用して所望の効果が得られる物質を意味する。効果は、例えば、標的細胞または標的組織の標識、活性化、抑制、または死滅であり得る。したがって、エフェクター分子は、例えば、小分子、薬品（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｄｒｕｇ）、毒素、脂肪酸、検出可能なマーカー、抱合タグ（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ  ｔａｇ）、ナノ粒子、または酵素であり得る。
【００３８】
ターゲティングペプチドに抱合することができる小分子および薬品の例は、当該分野で公知である。エフェクターは、標的細胞を死滅させる細胞傷害性小分子または薬物であり得る。小分子または薬物を、任意の重要な細胞機能または経路に対して作用するようにデザインすることができる。例えば、小分子または薬物は、細胞周期を阻害することができるか、タンパク質分解を活性化することができるか、アポトーシスを誘導することができるか、キナーゼ活性を調整することができるか、細胞骨格タンパク質を改変することができる。任意の公知または新規に発見された細胞傷害性小分子または薬物は、ターゲティングペプチドとの使用が意図される。
【００３９】
エフェクターは、ターゲティングされた細胞を死滅させる毒素であり得る。毒素の非限定的な例には、アブリン、モデッシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）、リシン、およびジフテリア毒素が含まれる。他の公知または新規に発見された毒素は、提供した組成物との使用が考慮される。
【００４０】
提供した組成物に抱合することができる脂肪酸（すなわち、脂質）には、ペプチドをリポソームに有効に組み込むことが可能な脂肪酸が含まれる。一般に、脂肪酸は、極性脂質である。したがって、脂肪酸は、リン脂質であり得る。提供した組成物は、天然または合成のリン脂質のいずれかを含むことができる。リン脂質を、飽和または不飽和の一置換または二置換の脂肪酸およびその組み合わせを含むリン脂質から選択することができる。これらのリン脂質は、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルセリン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、パルミトイルオレオイルホスファチジルセリン、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール、パルミトイルオレオイルホスファチジン酸、パルミテライドイルオレオイル（ｐａｌｍｉｔｅｌａｉｄｏｙｌｏｌｅｏｙｌ）ホスファチジルコリン、パルミテライドイルオレオイルホスファチジルセリン、パルミテライドイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン、パルミテライドイルオレオイルホスファチジルグリセロール、パルミテライドイルオレオイルホスファチジン酸、ミリストレオイルオレオイルホスファチジルコリン、ミリストレオイルオレオイルホスファチジルセリン、ミリストレオイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ｅｔｈａｎｏａｍｉｎｅ）、ミリストレオイルオレオイルホスファチジルグリセロール、ミリストレオイルオレオイルホスファチジン酸、ジリノレオイルホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルセリン、ジリノレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジリノレオイルホスファチジルグリセロール、ジリノレオイルホスファチジン酸、パルミチクリノレオイル（ｐａｌｍｉｔｉｃｌｉｎｏｌｅｏｙｌ）ホスファチジルコリン、パルミチクリノレオイルホスファチジルセリン、パルミチクリノレオイルホスファチジルエタノールアミン、パルミチクリノレオイルホスファチジルグリセロール、パルミチクリノレオイルホスファチジン酸であり得る。これらのリン脂質はまた、ホスファチジルコリン（リソホスファチジルコリン（ｌｙｓｏｐｈｏｐｈａｔｉｄｙｌｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ））、ホスファチジルセリン（リソホスファチジルセリン）、ホスファチジルエタノールアミン（リソホスファチジルエタノールアミン）、ホスファチジルグリセロール（リソホスファチジルグリセロール）、およびホスファチジン酸（リソホスファチジン酸）のモノアシル化誘導体であり得る。これらのリソホスファチジル誘導体中のモノアシル鎖は、パルミトイル、オレオイル、パルミトレオイル、リノレオイル、ミリストイル、またはミリストレオイルであり得る。リン脂質は合成でもあり得る。合成リン脂質は、種々の供給元（ＡＶＡＮＴＩ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌｂａｓｔｅｒ，Ａｌａ．）；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）など）から容易に購入することができる。これらの合成化合物は多様であり得、天然に存在するリン脂質で見���されない変化した脂肪酸側鎖を有し得る。脂肪酸は、ＰＳまたはＰＣのいずれかまたは両方でＣ１４、Ｃ１６、Ｃ１８、またはＣ２０鎖長の不飽和脂肪酸側鎖を有することができる。合成リン脂質は、構成要素としてジオレオイル（１８：１）−ＰＳ；パルミトイル（１６：０）−オレオイル（１８：１）−ＰＳ、ジミリストイル（１４：０）−ＰＳ；ジパルミトレオイル（１６：１）−ＰＣ、ジパルミトイル（１６：０）−ＰＣ、ジオレオイル（１８：１）−ＰＣ、パルミトイル（１６：０）−オレオイル（１８：１）−ＰＣ、およびミリストイル（１４：０）−オレオイル（１８：１）−ＰＣを有することができる。したがって、例として、提供した組成物は、パルミトイル１６：０を含むことができる。
【００４１】
検出可能なマーカーには、標的組織または標的細胞を標識または染色するために使用することができる任意の物質が含まれる。検出可能なマーカーの非限定的な例には、放射性同位体、酵素、蛍光色素、および量子ドット（Ｑｄｏｔ（登録商標））が含まれる。他の公知または新規に発見された検出可能なマーカーは、提供した組成物との使用が考慮される。
【００４２】
エフェクター分子は、発熱ナノシェルなどのナノ粒子であり得る。本明細書中で使用される場合、「ナノシェル」は、１つ以上の導電性シェルレイヤーに囲まれた個別の誘電性または半導体のコア区分を有するナノ粒子である。米国特許第６，５３０，９４４号は、金属ナノシェルの作製および使用方法の教示についてその全体が本明細書中で参照により援用される。ナノシェルを、近赤外線（約８００〜１３００ｎｍ）などの照射を使用して励起することができる高導電性金属などの物質でコーティングした誘電性または不活性の物質（ケイ素など）のコアを使用して形成することができる。励起の際、ナノシェルは放熱する。得られた高熱は、周辺の細胞または組織を死滅させることができる。ナノシェルのシェルおよびコアを合わせた直径は、数十〜数百ナノメートルの範囲である。近赤外線は、その組織貫通能力が利点である。ナノ粒子コーティングおよび標的細胞の選択に応じて、他の照射型も使用することができる。例には、Ｘ線、磁場、電場、および超音波が含まれる。本明細書中に記載のように使用した照射レベルは、エネルギーが誘電体の金属表面によってより効率的に集中するナノ粒子表面以外に高熱を誘導するのに不十分であるので、特に癌療法で使用するための高熱（加熱プローブ、マイクロ波、超音波、レーザー、潅流、高周波エネルギー、および放射加熱の使用など）についての既存の方法の問題点は回避される。特に、赤外拡散光子画像検査法（ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｄｉｆｆｕｓｅ  ｐｈｏｔｏｎ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ）を使用して、画像化を増強するためにこの粒子を使用することもできる。ターゲティング分子は、抗体もしくはそのフラグメント、特定の受容体のリガンド、またはターゲティングすべき細胞表面に特異的に結合する他のタンパク質であり得る。
【００４３】
エフェクター分子は、放射性同位体であり得る。例えば、エフェクター分子は、移植に適切な任意の放射性同位体を含む「シード（ｓｅｅｄ）」またはワイヤーなどの物質であり得る。放射性シードを組織に移植するために多数のデバイスが使用されている。例えば、Ｗａｐｐｌｅｒに付与された米国特許第２，２６９，９６３号；Ｓｃｏｔｔに付与された米国特許第４，４０２，３０８号；Ｍｉｃｋに付与された米国特許第５，８６０，９０９号；およびＲｙｄｅｌｌに付与された米国特許第６，００７，４７４号を参照のこと。典型的な前立腺癌の治療プロトコールでは、特殊なニードルを有する移植デバイスを、前立腺に放射性シードが送達されるように直腸と陰嚢との間の皮膚を介して前立腺に挿入する。シードが移植される前立腺中の他の部位にニードルを再配置するか、新規のニードルを使用することができる。典型的には、２０〜４０本のニードルを使用して、前立腺あたり約５０〜１５０個のシードを送達させる。超音波プローブを使用して、ニードルの位置を追跡することができる。
【００４４】
現在市販されている放射性シードは、放射性同位体をカプセル化したカプセルの形態を取っている。例えば、Ｓｙｍｍｅｔｒａ（登録商標）Ｉ−１２５（Ｂｅｂｉｇ  ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）；ＩｏＧｏｌｄ（商標）Ｉ−１２５およびＩｏＧｏｌｄ（商標）Ｐｄ−１０３（Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，Ｃａｌｉｆ．）；Ｂｅｓｔ（登録商標）１−１２５およびＢｅｓｔ  Ｐｄ−１０３（Ｂｅｓｔ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，Ｖａ．）；Ｂｒａｃｈｙｓｅｅｄ（登録商標）Ｉ−１２５（Ｄｒａｘｉｍａｇｅ，Ｉｎｃ．，Ｃａｎａｄａ）；Ｉｎｔｅｒｓｏｕｒｃｅ（登録商標）Ｐｄ−１０３（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｒａｃｈｙｔｈｅｒａｐｙ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）；Ｏｎｃｏｓｅｅｄ（登録商標）１−１２５（Ｎｙｃｏｍｅｄ  Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＵＫ）；ＳＴＭ  １２５０  Ｉ−１２５（Ｓｏｕｒｃｅｔｅｃｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｃａｒｏｌ  Ｓｔｒｅａｍ，Ｉ１１．）；Ｐｈａｒｍａｓｅｅｄ（登録商標）Ｉ−１２５（Ｓｙｎｃｏｒ，Ｗｏｏｄｌａｎｄ  Ｈｉｌｌｓ，Ｃａｌｉｆ．）；Ｐｒｏｓｔａｓｅｅｄ（商標）Ｉ−１２５（Ｕｒｏｃｏｒ，Ｏｋｌａｈｏｍａ  Ｃｉｔｙ，Ｏｋｌａ．）；およびＩ−ｐｌａｎｔ（登録商標）Ｉ−１２５（Ｉｍｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｗａｋｅｆｉｅｌｄ，Ｍａｓｓ．）を参照のこと。これらのシードのカプセルは、チタンまたはステンレススチールなどの生体適合性物質でできており、放射性同位体の浸出を防止するためにしっかりと密封することができる。カプセルを、移植デバイスで使用されるニードルの１つの内径に適合するように順々に小さくすることができる。ほとんどのかかるニードルが約１８ゲージであるので、カプセルは、典型的には、直径が約０．８ｍｍであり、長さが約４．５ｍｍである。近接照射療法のシードで最も一般的に使用される２つの放射性同位体は、ヨウ素（Ｉ−１２５）およびパラジウム（Ｐｄ−１０３）である。これらは共に低エネルギー照射で放射し、腫瘍治療に理想的な半減期特性を有する。例えば、Ｉ−１２５シードは、６０日毎に５０％の比率で崩壊するので、典型的な開始用量を使用して、その放射能は１０ヶ月でほぼ消費される。Ｐｄ−１０３シードは、なおさらに急速に崩壊し、１７日毎にそのエネルギーの半分が喪失され、わずか３ヶ月後にほとんど不活性になる。
【００４５】
放射性近接照射療法シードは、他の成分も含むことができる。例えば、標準的なＸ線画像化技術を使用してその適切な配置の追跡を補助するために、かかるシードは放射線不透過性マーカーを含むことができる。マーカーは、典型的には、原子番号の高い（すなわち、「「ｈｉｇｈ  Ｚ」」）元素またはかかる元素を含む合金もしくは混合物からできている。これらの例には、白金、イリジウム、レニウム、金、タンタラム、鉛、ビスマス合金、インジウム合金、はんだ、または低融点の他の合金、タングステン、および銀が含まれる。多数の放射線不透過性マーカーは、現在、以下が販売されている：白金／イリジウムマーカー（Ｄｒａｘｉｍａｇｅ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｒａｃｈｙｔｈｅｒａｐｈｙ）、金ロッド（ｇｏｌｄ  ｒｏｄ）（Ｂｅｂｉｇ  ＧｍｂＨ）、金／銅合金マーカー（Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、パラジウムロッド（Ｓｙｎｃｏｒ）、タングステンマーカー（Ｂｅｓｔ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、銀ロッド（Ｎｙｃｏｍｅｄ  Ａｍｅｒｓｈａｍ）、銀スフェア（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｓｏｔｏｐｅｓ  Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｕｒｏｃｏｒ）、および銀ワイヤー（Ｉｍｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．）が含まれる。他の放射線不透過性マーカーには、種々の物質を含浸させたポリマーが含まれる（例えば、米国特許第６，０７７，８８０号を参照のこと）。
【００４６】
多数の異なる米国特許は、近接照射療法に関するテクノロジーを開示している。例えば、米国特許第３，３５１，０４９号は、近接照射療源としての低エネルギーＸ線放射侵入型インプラントの使用を開示している。さらに、米国特許第４，３２３，０５５号；米国特許第４，７０２，２２８号；米国特許第４，８９１，１６５号；米国特許第５，４０５，３０９号；米国特許第５，７１３，８２８号；米国特許第５，９９７，４６３号；米国特許第６，０６６，０８３号；および同第６，０７４，３３７号は、近接照射療法デバイスに関するテクノロジーを開示している。
【００４７】
エフェクター分子を、開示のペプチドに共有結合することができる。エフェクター分子を、開示のペプチドのアミノ末端に結合することができる。エフェクター分子を、開示のペプチドのカルボキシ末端に結合することができる。エフェクター分子を、開示のペプチド内のアミノ酸に結合することができる。本明細書中に提供した組成物は、さらに、エフェクター分子および開示のペプチドに連結したリンカーを含むことができる。開示のペプチドを、ペプチドでナノシェルをコーディングするために使用することができるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｔｋａｃｈｅｎｋｏら，（２００３）Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ，１２５，４７００−４７０１を参照のこと）などのコーティング分子に抱合することもできる。
【００４８】
開示のペプチドにエフェクター分子を架橋するために使用することができるタンパク質架橋剤は、当該分野で公知であり、その有用性および構造に基づいて定義されており、この架橋剤には、ＤＳＳ（スベリン酸ジスクシンイミジル）、ＤＳＰ（ジチオビス（スクシンイミジルプロピオナート））、ＤＴＳＳＰ（３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオナート））、ＳＵＬＦＯ  ＢＳＯＣＯＥＳ（ビス［２−（スルホスクシンイムドオキシカルボニルオキシ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｄｏｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌｏｘｙ））エチル］スルホン）、ＢＳＯＣＯＥＳ（ビス［２−（スクシンイムドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン）、ＳＵＬＦＯ  ＤＳＴ（ジスルホスクシンイミジルタートラート）、ＤＳＴ（ジスクシンイミジルタートラート（Ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｄｙｌｔａｒｔｒａｔｅ））、ＳＵＬＦＯ  ＥＧＳ（エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシナート））、ＥＧＳ（エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシナート））、ＤＰＤＰＢ（１，２−ジ［３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ブタン）、ＢＳＳＳ（ビス（スルホスクシンイミジル）スベラート）、ＳＭＰＢ（スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチラート）、ＳＵＬＦＯ  ＳＭＰＢ（スルホスクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチラート）、ＭＢＳ（３−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、ＳＵＬＦＯ  ＭＢＳ（３−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル）、ＳＩＡＢ（Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾアート）、ＳＵＬＦＯ  ＳＩＡＢ（Ｎ−スルホスクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾアート）、ＳＭＣＣ（スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート）、ＳＵＬＦＯ  ＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート）、ＮＨＳ  ＬＣ  ＳＰＤＰ（スクシンイミジル−６−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド）ヘキサノアート）、ＳＵＬＦＯ  ＮＨＳ  ＬＣ  ＳＰＤＰ（スルホスクシンイミジル−６−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド）ヘキサノアート）、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート）、ＮＨＳ  ＢＲＯＭＯＡＣＥＴＡＴＥ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルブロモアセタート）、ＮＨＳ  ＩＯＤＯＡＣＥＴＡＴＥ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルヨードアセタート）、ＭＰＢＨ（４−（Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジドヒドロクロリド）、ＭＣＣＨ（４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸ヒドラジドヒドロクロリド）、ＭＢＨ（ｍ−マレイミド安息香酸ヒドラジドヒドロクロリド）、ＳＵＬＦＯ  ＥＭＣＳ（Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）スルホスクシンイミド）、ＥＭＣＳ（Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド）、ＰＭＰＩ（Ｎ−（ｐ−マレイミドフェニル）イソシアナート）、ＫＭＵＨ（Ｎ−（κ−マレイミドウンデカン酸）ヒドラジド）、ＬＣ  ＳＭＣＣ（スクシンイミジル−４���（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−ｌ−カルボキシ（６−アミドカプロアート））、ＳＵＬＦＯ  ＧＭＢＳ（Ｎ−（γ−マレイミドブトリルオキシ（ｂｕｔｒｙｌｏｘｙ））スルホスクシンイミドエステル）、ＳＭＰＨ（スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオンアミドヘキサノアート））、ＳＵＬＦＯ  ＫＭＵＳ（Ｎ−（κ−マレイミドウンデカノイルオキシ）スルホスクシンイミドエステル）、ＧＭＢＳ（Ｎ−（γ−マレイミドブチロキシ（ｂｕｔｙｒｌｏｘｙ））スクシンイミド）、ＤＭＰ（ピメルイミド酸ジメチル塩酸塩）、ＤＭＳ（スベルイミド酸ジメチル塩酸塩）、ＭＨＢＨ（ウッド試薬）（メチル−ｐ−ヒドロキシベンズイミダートヒドロクロリド、９８％）、ＤＭＡ（アジポイミド酸ジメチル塩酸塩）が含まれる。
７．併用療法
癌に投与することができるＮＩＰおよび任意の公知または新規に発見された物質を含む組成物を本明細書中に提供する。例えば、提供した組成物は、さらに、１つ以上の以下のクラスを含むことができる：抗生物質（例えば、アミノグリコシド、セファロスポリン、クロラムフェニコール、クリンダマイシン、エリスロマイシン、フルオロキノロン、マクロライド、アゾライド（Ａｚｏｌｉｄｅ）、メトロニダゾール、ペニシリン、テトラサイクリン、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、バンコマイシン）、ステロイド（例えば、アンドラン（Ａｎｄｒａｎｅ）（例えば、テストステロン）、コレスタン（例えば、コレステロール）、コール酸（例えば、コール酸）、コルチコステロイド（例えば、デキサメタゾン）、エストラン（例えば、エストラジオール）、プレグナン（例えば、プロゲステロン）、麻薬性および非麻薬性鎮痛薬（例えば、モルヒネ、コデイン、ヘロイン、ヒドロモルフォン、レボルファノール、メペリジン、メタドン、オキシドン、プロポキシフェン、フェンタニル、メタドン、ナロキソン、ブプレノルフィン、ブトルファノール、ナルブフィン、ペンタゾシン）、抗炎症薬（例えば、アルクロフェナク；ジプロピオン酸アルクロメタゾン；アルゲストンアセトニド；αアミラーゼ；アムシナファル；アムシナフィド；アンフェナクナトリウム；塩酸アミプリロース；アナキンラ；アニロラク；アニトラザフェン；アパゾン；バルサラジド二ナトリウム；ベンダザック；ベノキサプロフェン；塩酸ベンジダミン；ブロメライン；ブロペラモール；ブデソニド；カルプロフェン；シクロプロフェン；シンタゾン；クリプロフェン；プロピオン酸クロベタゾール；酪酸クロベタゾン；クロピラック；プロピオン酸クロチカソン；コルメタソンアセタート；コルトドキソン；デカノアート；デフラザコルト；デラテストリル；デポテストステロン；デソニド；デスオキシメタゾン；ジプロピオン酸デキサメタゾン；ジクロフェナックカリウム；ジクロフェナックナトリウム；ジフロラゾンジアセタート；ジフルミドンナトリウム；ジフルニサル；ジフルプレドナート；ジフタロン；ジメチルスルホキシド；ドロシノニド；エンドリソン；エンリモマブ（Ｅｎｌｉｍｏｍａｂ）；エノリカムナトリウム（Ｅｎｏｌｉｃａｍ  Ｓｏｄｉｕｍ）；エピリゾール；エトドラク；エトフェナマート；フェルビナク；フェナモール；フェンブフェン；フェンクロフェナック；フェンクロラック；フェンドサール；フェンピパロン；フェンチアザク；フラザロン；フルアザコート；フルフェナム酸；フルミゾール；酢酸フルニソリド；フルニキシン；フルニキシンメグルミン；フルオコルチンブチル；酢酸フルオロメトロン；フルクアゾン；フルルビプロフェン；フルレトフェン；プロピオン酸フルチカゾン；フラプロフェン；フロブフェン；ハルシノニド；プロピオン酸ハロベタソール；酢酸ハロプレドン；イブフェナック；イブプロフェン；イブプロフェンアルミニウム；イブプロフェンピコノール；イロニダップ；インドメタシン；インドメタシンナトリウム；インドプロフェン；インドキソール；イントラゾール；酢酸イソフルプレドン；イソキセパック；イソキシカム；ケトプロフェン；塩酸ロフェミゾール；ロ��キシカム（Ｌｏｍｏｘｉｃａｍ）；ロテプレドノールエタボナート；メクロフェナム酸ナトリウム；メクロフェナム酸；メクロリソンジブチラート；メフェナム酸；メサラミン；メセクラゾン；メステロロン；メタンドロステノロン；メテノロン；酢酸メテノロン；メチルプレドニゾロンサルプタナート（Ｍｅｔｈｙｌｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ  Ｓｕｌｅｐｔａｎａｔｅ）；モミフルマート（Ｍｏｍｉｆｌｕｍａｔｅ）；ナブメトン；ナンドロロン；ナプロキセン；ナプロキセンナトリウム；ナプロキソール；ニマゾン；オルサラジンナトリウム；オルゴテイン；オルパノキシン；オキサンドロラン（Ｏｘａｎｄｒｏｌａｎｅ）；オキサプロジン；オキシフェンブタゾン；オキシメトロン；塩酸パラニリン；ペントサンポリ硫酸ナトリウム；フェンブタゾングリセリン酸ナトリウム（Ｐｈｅｎｂｕｔａｚｏｎｅ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｇｌｙｃｅｒａｔｅ）；ピルフェニドン；ピロキシカム；桂皮酸ピロキシカム；ピロキシカムオラミン；ピルプロフェン；ピプレドナザート（Ｐｒｅｄｎａｚａｔｅ）；プリフェロン（Ｐｒｉｆｅｌｏｎｅ）；プロドール酸；プロクアゾン；プロキサゾール；クエン酸プロキサゾール；リメキソロン；ロマザリット；サルコレックス（Ｓａｌｃｏｌｅｘ）；サルナセジン（Ｓａｌｎａｃｅｄｉｎ）；サルサラート；サンギナリンクロリド；セクラゾン；セルメタシン；スタノゾロール；スドキシカム；スリンダク；スプロフェン；タルメタシン；タルニフルマート；タロサラート；テブフェロン；テニダップ；テニダップナトリウム；テノキシカム；テシカム；テシミド；テストステロン；テストステロンブレンド；テトリダミン；チオピナック；ピバリン酸チキソコルトール；トルメチン；トルメチンナトリム；トリクロニド；トリフルミダート；ジドメタシン；ゾメピラックナトリウム）、または抗ヒスタミン剤（例えば、エタノールアミン（ジフェンヒドルミン（ｄｉｐｈｅｎｈｙｄｒｍｉｎｅ）カルビノキサミンなど）、エチレンジアミン（トリペレンナミン、ピリラミンなど）、アルキルアミン（クロルフェニラミン、デックスクロルフェニラミン、ブロムフェニラミン、トリプロリジンなど）、他の抗ヒスタミン薬（アステミゾール、ロラタジン、フェノキソフェナジン、ブロフェニラミン（Ｂｒｏｐｈｅｎｉｒａｍｉｎｅ）、クレマスチン、アセトアミノフェン、プソイドエフェドリン、トリプロリジンなど）。
【００４９】
多数の抗癌薬を、本発明の方法および組成物と組み合わせて利用可能である。以下は、現在開示されているＤＯＣ１活性増強方法または発現増強方法と併せて使用することができる抗癌（抗新生物）薬のリストである。
【００５０】
抗新生物薬：アシビシン；アクラルビシン；塩酸アコダゾール；アルクニン（ＡｃｒＱｎｉｎｅ）；アドゼレシン；アルデスロイキン；アルトレタミン；アムボマイシン（Ａｍｂｏｍｙｃｉｎ）；酢酸アメタントロン；アミノグルテチミド；アムサクリン；アナストロゾール；アントラマイシン；アスパラギナーゼ；アスペルリン；アザシチジン；アゼテパ；アゾトマイシン；バチマスタット；ベンゾデパ；ビカルタミド；塩酸ビサントレン；ビスナフィドジメシラート；ビセレシン；硫酸ブレオマイシン；ブレキナルナトリウム；ブロピリミン；ブスルファン；カクチノマイシン；カルステロン；カラセミド；カルベチマー（Ｃａｒｂｅｔｉｍｅｒ）；カルボプラチン；カルムスチン；塩酸カルビシン；カルゼレシン；セデフィンゴール；クロラムブシル；シロレマイシン（Ｃｉｒｏｌｅｍｙｃｉｎ）；シスプラチン；クラドリビン；クリスナトールメシラート；シクロホスファミド；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；塩酸ダウノルビシン；デシタビン；デキソルマプラチン；デザグアニン；デザグアニンメシラート；ジアジクオン；ドセタキセル；ドキソルビシン；塩酸ドキソルビシン；ドロロキシフェン；クエン酸ドロロキシフェン；ドロモスタノロンプロピオナート；デュアゾマイシン；エダトレキサート；塩酸エフロミチン（Ｅｆｌｏｍｉｔｈｉｎｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；エルサミトルシン；エンロプラチン；エンプロマート；エピプロピジン；塩酸エピルビシン；エルブロゾール；塩酸エソルビシン；エストラムスチン；リン酸エストラムスチンナトリウム；エタニダゾール；エチオン化油Ｉ１３１；エトポシド；エトポシドホスファート；エトプリン；塩酸ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フロクスウリジン；リン酸フルダラビン；フルオロウラシル；フルロシタビン；ホスキドン；ホストリエシンナトリウム；ゲムシタビン；塩酸ゲムシタビン；金Ａｕ  １９８；ヒドロキシ尿素；塩酸イダルビシン；イフォスファミド；イルモホシン；インターフェロンα−２ａ；インターフェロンα−２ｂ；インターフェロンα−ｎ１；インターフェロンα−ｎ３；インターフェロンβ−Ｉａ；インターフェロンγ−Ｉｂ；イプロプラチン（Ｉｐｒｏｐｌａｔｉｎ）；塩酸イリノテカン；酢酸ランレオチド；レトロゾール；酢酸ロイプロリド；塩酸リアロゾール；ロメトレキソールナトリウム；ロムスチン；塩酸ロソキサントロン；マソプロコール；メイタンシン；塩酸メクロレタミン；酢酸メゲストロール；メレンゲストロールアセタート；メルファラン；メノガリル；メルカプトプリン；メトトレキサート；メトトレキサートナトリウム；メトプリン；メツルデパ；ミチンドミド；ミトカルシン（Ｍｉｔｏｃａｒｃｉｎ）；ミトクロミン（Ｍｉｔｏｃｒｏｍｉｎ）；ミトギリン（Ｍｉｔｏｇｉｌｌｉｎ）；ミトマルシン（Ｍｉｔｏｍａｌｃｉｎ）；マイトマイシン；ミトスペル（Ｍｉｔｏｓｐｅｒ）；ミトタン；塩酸ミトキサントロン；ミコフェノール酸；ノコダゾール；ノガラマイシン；オルマプラチン（Ｏｒｍａｐｌａｔｉｎ）；オキシスラン；パクリタキセル；ペガスパルガーゼ；ペリオマイシン（Ｐｅｌｉｏｍｙｃｉｎ）；ペンタムスチン；硫酸ぺプロマイシン；ペルホスフ��ミド；ピポブロマン；ピポスルファン；塩酸ピロキサントロン；プリカマイシン；プロメスタン；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニムスチン；塩酸プロカルバジン；ピューロマイシン；塩酸ピューロマイシン；ピラゾフリン；リボプリン；ログレチミド；サフムゴール（Ｓａｆｍｇｏｌ）；塩酸サフィンゴール；セムスチン；シムトラゼン；スパルホサートナトリウム；スパルソマイシン；塩酸スピロゲルマニウム；スピロムスチン（Ｓｐｉｒｏｍｕｓｔｉｎｅ）；スピロプラチン（Ｓｐｉｒｏｐｌａｔｉｎ）；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン；塩化ストロンチウムＳｒ８９；スロフェヌル；タリソマイシン；タキサン；タキソイド；テコガランナトリウム（Ｔｅｃｏｇａｌａｎ  Ｓｏｄｉｕｍ）；テガフール；塩酸テロキサントロン；テモポルフィン；テニポシド；テロキシロン（Ｔｅｒｏｘｉｒｏｎｅ）；テストラクトン；チアミプリン；チオグアニン；チオテパ；チアゾフリン；チラパザミン；塩酸トポテカン；クエン酸トレミフェン；トレストロンアセタート；トリシリビンホスファート；トリメトレキサート；トリメトレキサートグルクロナート；トリプトレリン；塩酸ツブロゾール；ウラシルマスタード；ウレデパ；バプレオチド；ベルテポルフィン；硫酸ビンブラスチン；硫酸ビンクリスチン；ビンデシン；硫酸ビンデシン；硫酸ビネピジン；硫酸ビングリシナート；硫酸ビンロイロシン；酒石酸ビノレルビン；硫酸ビンロシジン；硫酸ビンゾリジン；ボロゾール；ゼニプラチン（Ｚｅｎｉｐｌａｔｉｎ）；ジノスタチン；塩酸ゾルビシン。
他の抗新生物化合物には以下が含まれる：２０−ｅｐｉ−ｌ，２５  ジヒドロキシビタミンＤ３；５−エチニルウラシル；アビラテロン；アクラルビシン；アシルフルベン；アデシペノール；アドゼレシン；アルデスロイキン；ＡＬＬ−ＴＫアンタゴニスト；アルトレタミン；アンバムスチン；アミドックス；アミホスチン；アミノレブリン酸；アムルビシン；アストルサクリン（ａｔｒｓａｃｒｉｎｅ）；アナグレリド；アナストロゾール；アンドログラホリド；血管形成インヒビター；アンタゴニストＤ；アンタゴニストＧ；アンタレリックス；抗背側化形態形成タンパク質−１（ａｎｔｉ−ｄｏｒｓａｌｉｚｉｎｇ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）；抗アンドロゲン（前立腺癌）；抗エストロゲン；アンチネオプラストン；アンチセンスオリゴヌクレオチド；アフィジコリングリシナート；アポトーシス遺伝子モジュレーター；アポトーシスレギュレーター；アプリン酸；アラ−ＣＤＰ−ＤＬ−ＰＴＢＡ；アルギニンデアミナーゼ；アスラクリン；アタメスタン；アトリムスチン；アキシナスタチン１；アキシナスタチン２；アキシナスタチン３；アザセトロン；アザトキシン；アザチロシン；バッカチンＩＩＩ誘導体；バラノール；バチマスタット；ＢＣＲ／ＡＢＬ  アンタゴニスト；ベンゾクロリン；ベンゾイルスタウロスポリン；βラクタム誘導体；β−アレチン；ベタクラマイシンＢ；ベツリン酸；ｂＦＧＦインヒビター；ビカルタミド；ビサントレン；ビスアジリジニルスペルミン（ｂｉｓａｚｉｒｉｄｉｎｙｌｓｐｅｒｍｉｎｅ）；ビスナフィド；ビストラテンＡ；ビセレシン；ブレフラート；ブロピリミン；ブドチタン（ｂｕｄｏｔｉｔａｎｅ）；ブチオニンスルホキシミン；カルシポトリオール；カルホスチンＣ；カンプトセシン誘導体；カナリアポックスＩＬ−２；カペシタビン；カルボキシアミド−アミノ−トリアゾール；カルボキシアミドトリアゾール；ＣａＲｅｓｔ  Ｍ３；ＣＡＲＮ  ７００；軟骨由来インヒビター；カルゼレシン；カゼインキナーゼインヒビター（ＩＣＯＳ）；カスタノスペルミン；セクロピンＢ；セトロレリックス；クロリン（ｃｈｌｏｒｉｎ）；クロロキノキサリンスルホンアミド；シカプロスト；シス−ポルフィリン；クラドリビン；クロミフェンアナログ；クロトリマゾール；コリスマイシンＡ；コリスマイシンＢ；コンブレタスタチンＡ４；コンブレタスタチンアナログ；コナゲニン；クランベシジン８１６；クリスナトール；クリプトフィシン８；クリプトフィシンＡ誘導体；クラシンＡ；シクロペントアントラキノン（ｃｙｃｌｏｐｅｎｔａｎｔｈｒａｑｕｉｎｏｎｅ）；シクロプラタム（ｃｙｃｌｏｐｌａｔａｍ）；シペマイシン；シタラビンオクホスファート；細胞溶解因子；シトスタチン；ダクリキシマブ（ｄａｃｌｉｘｉｍａｂ）；デシタビン；デヒドロジデムニンＢ；デスロレリン；デックスイフォスファミド（ｄｅｘｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）；デクスラゾキサン；デクスベラパミル；ジアジクオン；ジデムニンＢ；ジドックス；ジエチルノルスペルミン；ジヒドロ−５−アザシチジン；ジヒドロタキソール，９−；ジオキサマイシン；ジフェニルスピロムスチン；ドコサノール；ドラセトロン；ドキシフルリジン；ドロロキシフェン；ドロ��ビノール；デュオカニシンＳＡ（ｄｕｏｃａｎｎｙｃｉｎ  ＳＡ）；エブセレン；エコムスチン；エデルホシン；エドレコロマブ；エフロルニチン；エレメン；エミテフル；エピルビシン；エプリステリド；エストラムスチンアナログ；エストロゲンアゴニスト；エストロゲンアンタゴニスト；エタニダゾール；エトポシドホスファート；エキセメスタン；ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フィルグラスチム；フマステリド；フラボピリドール；フレゼラスチン；フルアステロン；フルダラビン；塩酸フルオロダウノルニシン（ｆｌｕｏｒｏｄａｕｎｏｒｕｎｉｃｉｎ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；ホルフェニメックス；ホルメスタン；ホストリエシン；ホテムスチン；ガドリニウムテキサフィリン；硝酸ガリウム；ガロシタビン；ガニレリックス；ゼラチナーゼインヒビター；ゲムシタビン；グルタチオンインヒビター；ヘプスルファム；ヘレグリン；ヘキサメチレンビスアセトアミド；ヒペリシン；イバンドロン酸；イダルビシン；イドキシフェン；イドラマントン；イルモホシン；イロマスタット；イミダゾアクリドン（ｉｍｉｄａｚｏアクリドン）；イミキモド；免疫賦活ペプチド；インスリン様成長因子−１受容体インヒビター；インターフェロンアゴニスト；インターフェロン；インターロイキン；ヨーベングアン；ヨードドキソルビシン；イポメアノール，４−；イリノテカン；イロプラクト（ｉｒｏｐｌａｃｔ）；イルソグラジン；イソベンガゾール（ｉｓｏｂｅｎｇａｚｏｌｅ）；イソホモハリコンドリンＢ（ｉｓｏｈｏｍｏｈａｌｉｃｏｎｄｒｉｎ  Ｂ）；イタセトロン；ジャスプラキノリド；カハラリドＦ；ラメラリンＮトリアセタート；ランレオチド；レイナマイシン；レノグラスチム；硫酸レンチナン；レプトルスタチン；レトロゾール；白血病阻害因子；白血球αインターフェロン；ロイプロリド＋エストロゲン＋プロゲステロン；リュープロレリン；レバミソール；リアロゾール；直鎖ポリアミンアナログ；親油性ジサッカリドペプチド；親油性白金化合物；リッソクリナミド７；ロバプラチン（ｌｏｂａｐｌａｔｉｎ）；ロンブリシン；ロメトレキソール；ロニダミン；ロソキサントロン；ロバスタチン；ロキソリビン；ルルトテカン；ルテチウムテキサフィリン；リソフィリン（ｌｙｓｏｆｙｌｌｉｎｅ）；溶解性ペプチド；メイタンシン；マンノスタチンＡ；マリマスタット；マソプロコール；マスピン；マトリライシンインヒビター；マトリックスメタロプロテイナーゼインヒビター；メノガリル；メルバロン；メテレリン；メチオニナーゼ（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎａｓｅ）；メトクロプラミド；ＭＩＦインヒビター；ミフェプリストン；ミルテホシン；ミリモスチム；不適正二本鎖ＲＮＡ；ミトグアゾン；ミトラクトール；マイトマイシンアナログ；ミトナフィド；マイトトキシン（ｍｉｔｏｔｏｘｉｎ）線維芽細胞成長因子−サポリン；ミトキサントロン；モファロテン；モルグラモスチム；モノクローナル抗体，ヒト絨毛性ゴナドトロピン；モノホスホリル脂質Ａ＋ミオバクテリウム細胞壁ｓｋ；モピダモール；多剤耐性ジーニー（ｇｅｎｉｅ）インヒビター；多発性腫瘍抑制因子１ベースの療法；マスタード抗癌薬；ミカペルオキシドＢ；マイコバクテリア細胞壁抽出物；ミリアポロン；Ｎ−アセチルジナリン；Ｎ置換ベンズアミド；ナファレリン；ナグレスチプ（ｎａｇｒｅｓｔｉｐ）；ナロキソン＋ペンタゾシン；ナパビン（ｎａｐａｖｉｎ）；ナフテルピン；ナルトグラスチム；ネダプラチン；ネモルビシン；ネリドロン酸；中性エンドペプチダーゼ；ニルタミド；ニサマイシン；一酸化窒素モジュレーター；ニトロキシド（ｎｉｔｒｏｘｉｄｅ）抗酸化剤；ニトルリン（ｎｉｔｒｕｌｌｙｎ）；Ｏ６−ベンジルグアニン；オクトレオチド；オキセノン；オリゴヌクレオチド；オナプリストン；オンダンセトロン；オンダンセトロン；オラシン；経口サイトカインインデューサー；オルマプラチン；オサテロン；オキサリプラチン；オキサウノマイシン；パクリタキセルアナログ；パクリタキセル誘導体；パラウアミン（ｐａｌａｕａｍｉｎｅ）；パルミトイルリゾキシン；パミドロン酸；パナキシトリオール；パノミフェン；パラバクチン；パゼリプチン；ペガスパルガーゼ；ペルデシン；ペントサンポリ硫酸ナトリウム；ペントスタチン；ペントロゾール（ｐｅｎｔｒｏｚｏｌｅ）；ペルフルブロン；ペルホスファミド；ペリリルアルコール；フェナジノマイシン；酢酸フェニル；ホスファターゼインヒビター；ピシバニル；塩酸ピロカルピン；ピラルビシン；ピリトレキシム；プラセチン（ｐｌａｃｅｔｉｎ）Ａ；プラセチンＢ；プラスミノゲンアクチベーターインヒビター；白金複合体；白金化合物；白金−トリアミン複合体；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プロピルビス−アクリドン；プロスタグランジンＪ２；プロテアソームインヒビター；プロテインＡベースの免疫モジュレーター；タンパク質キナーゼＣインヒビター；タンパク質キナーゼＣインヒビター（微細藻類）；タンパク質チロシンホスファターゼインヒビター；プリンヌクレオシドホスホリラーゼインヒビター；プルプリン；ピラゾロアクリジン；ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレン抱合体；ｒａｆアンタゴニスト；ラルチトレキシド；ラモセトロン；ｒａｓフェネシルタンパク質トランスフェラーゼインヒビター；ｒａｓインヒビター；ｒａｓ−ＧＡＰインヒビター；脱メチル化レテリプチン；レニウムＲｅ１８６エチドロネート；リゾキシン；リボザイム；ＲＩＩレチンアミド；ログレチミド；ロヒツキン（ｒｏｈｉｔｕｋｉｎｅ）；ロムルチド；ロキニメクス；ルビギノンＢｌ；ルボキシル；サフィンゴール；サイントピン；ＳａｒＣＮＵ；サルコフィトールＡ；サルグラモスチム；Ｓｄｉ１模倣物；セムスチン；老化由来インヒビター１；センスオリゴヌクレオチド；シグナル伝達インヒビター；シグナル伝達モジュレーター；単鎖抗原結合タンパク質；シゾフィラン；ソブゾキサン；ナトリウムボロカプタート（ｓｏｄｉｕｍ  ｂｏｒｏｃａｐｔａｔｅ）；フェニル酢酸ナトリウム；ソルベロール（ｓｏｌｖｅｒｏｌ）；ソマトメジン結合タンパク質；ソネルミン（ｓｏｎｅｒｍｉｎ）；スパルフォス酸（ｓｐａｒｆｏｓｉｃ  ａｃｉｄ）；スピカマイシンＤ；スピロムスチン；スプレノペンチン；スポンギスタチン１；スクアラミン；幹細胞インヒビター；幹細胞分裂インヒビター；スチピアミド；ストロメライシンインヒビター；スルフモシン（ｓｕｌｆｍｏｓｉｎｅ��；スーパーアクティブ（ｓｕｐｅｒａｃｔｉｖｅ）血管作用性腸管ペプチドアンタゴニスト；スラジスタ（ｓｕｒａｄｉｓｔａ）；スラミン；スワインソニン；合成グリコサミノグリカン；タリムスチン；タモキシフェンメチオジド；タウロムスチン；タザロテン；テコガランナトリウム；テガフール；テルラピリリウム（ｔｅｌｌｕｒａｐｙｒｙｌｉｕｍ）；テロメラーゼインヒビター；テモポルフィン；テモゾロミド；テニポシド；テトラクロロデカオキシド（ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｄｅｃａｏｘｉｄｅ）；テトラゾミン；タリブラスチン；サリドマイド；チオコラリン；トロンボポイエチン；トロンボポイエチン模倣物；チマルファシン（ｔｈｙｍａｌｆａｓｉｎ）；サイモポイエチン受容体アゴニスト；サイモトリナン；甲状腺刺激ホルモン；スズエチルエチオプルプリン（ｔｉｎ  ｅｔｈｙｌ  ｅｔｉｏｐｕｒｐｕｒｉｎ）；チラパザミン；チタノセンジクロリド（ｔｉｔａｎｏｃｅｎｅ  ｄｉｃｈｌｏｒｉｄｅ）；トポテカン；トプセンチン；トレミフェン；全能性幹細胞因子；翻訳インヒビター；トレチノイン；トリアセチルウリジン；トリシリビン；トリメトレキサート；トリプトレリン；トロピセトロン；ツロステリド；チロシンキナーゼインヒビター；チルホスチン；ＵＢＣインヒビター；ウベニメクス；尿生殖洞由来成長阻害因子；ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト；バプレオチド；バリオリンＢ；ベクター系（赤血球遺伝子療法）；ベラレソール；ベラミン（ｖｅｒａｍｉｎｅ）；ベルジン（ｖｅｒｄｉｎ）；ベルテポルフィン；ビノレルビン；ビンキサルチン（ｖｉｎｘａｌｔｉｎｅ）；ビタキシン（ｖｉｔａｘｉｎ）；ボロゾール；ザノテロン；ゼニプラチン；ジラスコルブ；ジノスタチンスチマラマー。
【００５１】
本明細書中に提供した組成物は、１つ以上のさらなる放射線増感剤をさらに含むことができる。公知の放射線増感剤の例には、ゲムシタビン、５−フルオロウラシル、ペントキシフィリン、およびビノレルビンが含まれる（Ｚｈａｎｇら，１９９８；Ｌａｗｒｅｎｃｅら，２００１；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓｈｅｗａｃｈ，２００１；Ｓｔｒｕｎｚら，２００２；Ｃｏｌｌｉｓら，２００３；Ｚｈａｎｇら，２００４）。
８．タンパク質変異体
本明細書中で特定のタンパク質について言及する場合、変異体、誘導体、およびフラグメントを意図する。タンパク質変異体および誘導体は、当業者に十分に理解されており、アミノ酸配列修飾物を含むことができる。例えば、アミノ酸配列修飾物は、典型的には、以下の３つのクラスの１つ以上に分類される：置換変異体、挿入変異体、または欠失変異体。挿入には、アミノ末端および／またはカルボキシル末端融合物ならびに１つまたは複数のアミノ酸残基の配列内挿入物が含まれる。挿入は、通常、例えば、約１〜４個の残基上のアミノ末端融合物またはカルボキシル末端融合物よりも小さな挿入物であろう。欠失は、タンパク質配列からの１つ以上のアミノ酸残基の除去によって特徴づけられる。これらの変異体を、通常、タンパク質をコードするＤＮＡ中のヌクレオチドの部位特異的変異誘発、それによる変異体をコードするＤＮＡの産生、その後の組換え細胞培養物中でのＤＮＡの発現によって調製する。既知の配列を有するＤＮＡ中の所定の部位に置換変異を作製する技術は周知であり、例えば、Ｍ１３プライマー変異誘発およびＰＣＲ変異誘発が含まれる。アミノ置換は、典型的には、１残基のアミノ酸置換であるが、一度に多数の異なる位置で起こり得、挿入は、通常、約１〜１０アミノ酸残基上に存在するであろう。欠失または挿入を、好ましくは、隣接対で作製する（すなわち、２残基の欠失または２残基の挿入）。置換、欠失、挿入、またはその任意の組み合わせを、最終構築物に到達するように組み合わせることができる。変異は、読み取り枠外の配列に存在してはならず、好ましくは、ｍＲＮＡの二次構造のかかる変化が望ましくない限り、ｍＲＮＡの二次構造を産生することができる相補領域を作製しないであろう。置換変異体は、少なくとも１つの残基が除去され、その場所に異なる残基が挿入されている変異体である。かかる置換を、一般に、以下の表２にしたがって作製し、これを、保存的置換という。
【００５２】
【表２】
2010508022.tif 000006
例えば、あるアミノ酸残基の生物学的および／または化学的に類似する別のアミノ酸残基への置換は、保存的置換として当業者に公知である。例えば、保存的置換は、ある疎水性残基の別の疎水性残基への置換またはある極性残基の別の極性残基への置換であろう。置換には、表２に示す組み合わせが含まれる。それぞれ明確に開示した配列の保存的に置換されたバリエーションは、本明細書中に提供したポリペプチドの範囲内に含まれる。
【００５３】
典型的には、保存的置換は、得られたポリペプチドの生物活性にほとんど影響を及ぼさないか全く影響を及ぼさない。特定の例では、保存的置換は、ペプチドの生物学的機能に実質的に影響を及ぼさないペプチド中のアミノ酸置換である。ペプチドは、１つ以上のアミノ酸置換（例えば、２〜１０個の保存的置換、２〜５個の保存的置換、４〜９個の保存的置換（２、５、または１０個の保存的置換など））を含むことができる。
【００５４】
例えば、部位特異的変異誘発またはＰＣＲなどの標準的な手順を使用したポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の操作によって、１つ以上の保存的置換を含むポリペプチドを産生することができる。あるいは、標準的なペプチド合成方法の使用によって、１つ以上の保存的置換を含むポリペプチドを産生することができる。アラニンスキャンを使用して、タンパク質中のどのアミノ酸残基がアミノ酸置換を許容することができるのかを同定することができる。一例を挙げれば、アラニンまたは他の保存的アミノ酸（以下に列挙のアミノ酸など）を１つ以上の元のアミノ酸と置換した場合、タンパク質の生物活性は２５％を超えて減少せず、例えば、せいぜい２０％、例えば、せいぜい１０％である。
【００５５】
保存的置換についてのさらなる情報を、他にもあるが、Ｂｅｎ−Ｂａｓｓａｔら（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：７５１−７，１９８７）、Ｏ’Ｒｅｇａｎら（Ｇｅｎｅ  ７７：２３７−５１，１９８９）、Ｓａｈｉｎ−Ｔｏｔｈら（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．３：２４０−７，１９９４）、Ｈｏｃｈｕｌｉら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１３２１−５，１９８８）、ならびに遺伝学および分子生物学の標準的なテキストに見出すことができる。
【００５６】
置換変異誘発または欠失変異誘発を使用して、Ｎ−グリコシル化部位（Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ）またはＯ−グリコシル化部位（ＳｅｒまたはＴｈｒ）を挿入することができる。システインまたは他の不安定性残基の欠失も望ましいかもしれない。潜在的タンパク質分解部位（例えば、Ａｒｇ）の欠失または置換を、例えば、１つの塩基性残基の欠失またはそのグルタミニル残基もしくはヒスチジル残基への置換によって行う。
【００５７】
一定の翻訳後誘導は、発現したポリペプチドに対する組換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミニル残基およびアスパラギニル残基を、頻繁に、翻訳後に対応するグルタミル残基およびアスパリル残基に脱アミド化する。あるいは、これらの残基を、弱酸性条件下で脱アミド化する。他の翻訳後修飾には、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリル残基もしくはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のｏ−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ｐｐ  ７９−８６  ［１９８３］）、Ｎ末端アミンのアセチル化、いくつかの例では、Ｃ末端カルボキシルのアミド化が含まれる。
【００５８】
開示の組成物に組み込むことができる多数のアミノ酸およびペプチドのアナログが存在することが理解される。例えば、表３に示したアミノ酸と異なる機能的置換を有する多数のＤアミノ酸またはアミノ酸が存在する。天然に存在するペプチドと反対の立体異性体およびペプチドアナログの立体異性体を開示する。これらのアミノ酸を、ｔＲＮＡ分子への最適なアミノ酸の補充および部位特異的方法でペプチド鎖へアナログアミノ酸を挿入するために例えばアンバーコドンを使用する遺伝子構築物の操作によってポリペプチド鎖に容易に組み込むことができる（Ｔｈｏｒｓｏｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．７７：４３−７３（１９９１），Ｚｏｌｌｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３：３４８−３５４（１９９２）；Ｉｂｂａ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＆  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｒｒｉｎｇ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １３：１９７−２１６（１９９５），Ｃａｈｉｌｌら，ＴＩＢＳ，１４（１０）：４００−４０３（１９８９）；Ｂｅｎｎｅｒ，ＴＩＢ  Ｔｅｃｈ，１２：１５８−１６３（１９９４）；Ｉｂｂａ  ａｎｄ  Ｈｅｎｎｅｃｋｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２：６７８−６８２（１９９４）（その全てが、少なくともアミノ酸アナログに関連する材料について本明細書中で参照により援用される）。
【００５９】
ポリペプチドに類似しているが、天然のペプチド結合を介して連結されていない分子を産生することができる。例えば、アミノ酸またはアミノ酸アナログの結合には、ＣＨ２ＮＨ−−、−−ＣＨ２Ｓ−−、−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ＝ＣＨ−−（シスおよびトランス）、−−ＣＯＣＨ２−−、−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−、および−−ＣＨＨ２ＳＯ−が含まれ得る（これらおよびその他を、Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，ｅｄｓ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐ．２６７（１９８３）；Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．，Ｖｅｇａ  Ｄａｔａ（Ｍａｒｃｈ  １９８３），Ｖｏｌ．１，Ｉｓｓｕｅ  ３，Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ（ｇｅｎｅｒａｌ  ｒｅｖｉｅｗ）；Ｍｏｒｌｅｙ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ（１９８０）ｐｐ．４６３−４６８；Ｈｕｄｓｏｎ，Ｄ．ら，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｐｒｏｔ  Ｒｅｓ  １４：１７７−１８５（１９７９）（−−ＣＨ２ＮＨ−−、ＣＨ２ＣＨ２−−）；Ｓｐａｔｏｌａら、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ３８：１２４３−１２４９（１９８６）（−−ＣＨ  Ｈ２−−Ｓ）；Ｈａｎｎ  Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．Ｉ  ３０７−３１４（１９８２）（−−ＣＨ−−ＣＨ−−、シスおよびトランス）；Ａｌｍｑｕｉｓｔら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２３：１３９２−１３９８（１９８０）（−−ＣＯＣＨ２−−）；Ｊｅｎｎｉｎｇｓ−Ｗｈｉｔｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２３：２５３３（１９８２）（−−ＣＯＣＨ２−−）；Ｓｚｅｌｋｅら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ａｐｐｌｎ，ＥＰ  ４５６６５  ＣＡ（１９８２）：９７：３９４０５（１９８２）（−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−）；Ｈｏｌｌａｄａｙら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ．Ｌｅｔｔ  ２４：４４０１−４４０４（１９８３）（−−Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２−−）；およびＨｒｕｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ３１：１８９−１９９（１９８２）（−−ＣＨ２−−Ｓ−−）（それぞれ、本明細書中で参照により援用される）に見出すことができる）。ペプチドアナログが結合原子の間に１つを超える原子（ｂ−アラニンおよびｇ−アミノ酪酸など）を有することができると理解される。
【００６０】
アミノ酸アナログおよびペプチドアナログは、しばしば、強化されたか望ましい性質（より経済的な産生、より高い化学的安定性、強化された薬理学的性質（半減期、吸収、力価、効力など）、特異性の変化（例えば、広範な生物活性）、抗原性の減少、より高い生物学的障壁（例えば、腸、血管、血液脳関門）を通過する能力など）を有する。
【００６１】
Ｄ型アミノ酸を使用して、より安定なペプチドを生成することができる。これは、Ｄ型アミノ酸がペプチダーゼなどによって認識されないからである。コンセンサス配列の１つ以上のアミノ酸の同型のＤ型アミノ酸との体系的置換（例えば、Ｌ−リジンのＤ−リジンとの置換）を使用して、より安定なペプチドを生成することができる。システイン残基を使用して、２つ以上のペプチドを環状化するか結合することができる。これは、ペプチドを特定の高次構造に制約するのに有利であり得る（Ｒｉｚｏ  ａｎｄ  Ｇｉｅｒａｓｃｈ  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３８７（１９９２）（本明細書中で参照により援用される）。
【００６２】
本明細書中に開示の遺伝子およびタンパク質の任意の変異体、修飾物、または誘導体を定義するための１つの方法が、特定の公知の配列に対する配列同一性（本明細書中で相同性ともいう）に関する変異体、修飾物、および誘導体の定義によると理解される。記載または公知の配列に対して少なくとも６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％の配列同一性を有する本明細書中に開示の核酸およびポリペプチドの変異体を特に開示する。当業者は、どのようにして２つのタンパク質または核酸の配列同一性を決定するかを容易に理解している。例えば、配列同一性を、配列同一性がその最も高いレベルとなるような２つの配列のアラインメント後に計算することができる。
【００６３】
配列同一性の別の計算方法を、公開されたアルゴリズムによって行うことができる。比較に最適な配列アラインメントを、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ  Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的配列同一性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．ＭｏＬ  Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の配列同一性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４（１９８８）の方法に類似の検索、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実施（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ，およびＴＦＡＳＴＡ）、または目視（ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ）によって行うことができる。これらの引例は、配列同一性の計算方法についてその全体が本明細書中で参照により援用される。
【００６４】
核酸についての同型の配列同一性を、例えば、Ｚｕｋｅｒ，Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：４８−５２，１９８９，Ｊａｅｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：７７０６−７７１０，１９８９，Ｊａｅｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：２８１−３０６，１９８９（少なくとも核酸アラインメントに関連する材料について本明細書中で参照により援用される）に開示のアルゴリズムによって得ることができる。
【００６５】
したがって、提供したポリペプチドは、ＮＢＳ１のｃ末端と少なくとも６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。したがって、１つの態様では、提供したポリペプチドは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０と少なくとも６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
９．核酸
本明細書中に提供したポリペプチドをコードする単離核酸も提供する。例えば、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする単離核酸を開示する。したがって、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、または配列番号５０に記載の核酸配列を含む単離核酸を開示する。
【００６６】
開示の核酸は、例えば、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、またはヌクレオチド置換物からできている。これらおよび他の分子の非限定的な例は、本明細書中に考察されている。例えば、ベクターが細胞中で発現する場合、発現したｍＲＮＡは、典型的には、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＵでできているであろうと理解される。
【００６７】
「単離核酸」または「精製核酸」は、本発明のＤＮＡが由来する生物の天然に存在するゲノム中の遺伝子に隣接する遺伝子を含まないＤＮＡを意味する。したがって、この用語には、例えば、ベクター（自律複製するプラスミドまたはウイルスなど）に組み込まれたか、原核生物または真核生物のゲノムＤＮＡ（例えば、導入遺伝子）に組み込まれたか、個別の分子（例えば、ＰＣＲ、制限エンドヌクレアーゼ消化、または化学合成もしくはｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成によって産生されたｃＤＮＡ、ゲノム、またはｃＤＮＡフラグメント）として存在する組換えＤＮＡが含まれる。これには、さらなるポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡも含まれる。用語「単離核酸」は、ＲＮＡ（例えば、単離ＤＮＡ分子によってコードされるｍＲＮＡ分子、化学合成されたｍＲＮＡ分子、または少なくともいくつかの細胞成分から分離されているか実質的に含まないｍＲＮＡ分子（例えば、他の型のＲＮＡ分子またはポリペプチド分子））もいう。
【００６８】
したがって、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離核酸を提供する。したがって、提供した核酸は、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、または配列番号５０の核酸配列を含むことができる。
【００６９】
本明細書中に提供した核酸を、発現調節配列に作動可能に連結することができる。核酸が発現調節配列に作動可能に連結された、１つ以上の本明細書中に提供した核酸を含むベクターも提供する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかで核酸を細胞に送達するために使用することができる多数の組成物および方法が存在する。これらの方法および組成物を、以下の２つのクラスに大まかに分類することができる：ウイルスベースの送達系および非ウイルスベースの送達系。例えば、核酸を、多数の直接送達系（エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム沈降、プラスミド、ウイルスベクター、ウイルス核酸、ファージ核酸、ファージ、コスミドなど）または細胞もしくはカチオン性リポソームなどのキャリア中の遺伝子材料の導入によって送達することができる。適切なトランスフェクション手段（ウイルスベクター、化学的トランスフェクタント、または物理機械的方法（エレクトロポレーションおよびＤＮＡの直接拡散など）が含まれる）は、例えば、Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．，ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１４６５−１４６８，（１９９０）；およびＷｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．Ｎａｔｕｒｅ，３５２，８１５−８１８，（１９９１）に記載されている。かかる方法は、当該分野で周知であり、本明細書中に記載の組成物および方法との使用に容易に適用可能である。一定の場合、巨大なＤＮＡ分子で特異的に機能するように方法を修正するであろう。さらに、これらの方法を使用して、キャリアのターゲティング特性の使用によって一定の疾患および細胞集団を標的することができる。
１０．ベクター
ポリペプチドが全長ＮＢＳ１を含まない、ＮＢＳ１のカルボキシ末端アミノ酸配列またはその保存的変異体をコードする核酸を含むベクターを本明細書中に提供する。ＡＴＭのＮＢＳ１結合配列またはその保存的変異体をコードする核酸を含むベクターも本明細書中に提供する。例えば、ポリペプチドは、ＮＢＳ１に結合するＡＴＭのｈｅａｔ反復配列またはそのフラグメントを含むことができる。好ましいベクターは、低酸素症腫瘍組織を標的する。したがって、ベクターは、低酸素症−標的アデノウイルスベクターであり得る。
【００７０】
導入ベクターは、遺伝子を細胞（例えば、プラスミド）に送達させるために使用される任意のヌクレオチド構築物または一般的な遺伝子送達ストラテジーの一部（例えば、組換えレトロウイルスまたはアデノウイルスの一部）であり得る（Ｒａｍｒ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：８３−８８，（１９９３））。
【００７１】
本明細書中で使用される場合、プラスミドまたはウイルスベクターは、分解することなく開示の核酸（配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、または配列番号５０など）を細胞に輸送する媒介物（ａｇｅｎｔ）であり、送達される細胞中で遺伝子を発現するプロモーターが含まれる。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ウイルスまたはレトロウイルスのいずれかに由来する。ウイルスベクターは、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、ＡＩＤＳウイルス、神経栄養性ウイルス（ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｔｒｏｐｈｉｃ  ｖｉｒｕｓ）、シンドビスウイルス、および他のＲＮＡウイルス（ＨＩＶ骨格を有するこれらのウイルスが含まれる）である。ベクターとしての使用を適切にするこれらのウイルスの性質を共有する任意のウイルスファミリーも開示する。レトロウイルスには、マウスモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）およびベクターとしてＭＭＬＶの所望の性質を発現するレトロウイルスが含まれる。レトロウイルスベクターは、他のウイルスベクターより大きな遺伝子負荷量（すなわち、導入遺伝子またはマーカー遺伝子）を保有することができ、この理由のために、一般的に使用されているベクターである。しかし、これらは、非増殖細胞で有用ではない。アデノウイルスベクターは、比較的安定であり、操作しやすく、力価が高く、エアロゾール処方物中に送達させることができ、非分割細胞にトランスフェクトすることができる。ポックスウイルスベクターは、巨大であり、いくつかの遺伝子挿入部位を有し、熱安定性であり、室温で保存することができる。ウイルス抗原によって惹起される宿主生物の免疫応答を抑制するように操作されたウイルスベクターも開示する。この型のベクターは、インターロイキン８または１０のコード領域を保有することができる。
【００７２】
ウイルスベクターは、化学的または物理的に遺伝子を細胞に導入する方法よりも高い処理能力（遺伝子導入能力）を有することができる。典型的には、ウイルスベクターは、非構造初期遺伝子、構造後期遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写物、複製およびキャプシド形成に必要な逆末端反復、ならびにウイルスゲノムの転写および複製を調節するためのプロモーターを含む。ベクターとして操作する場合、ウイルスは、典型的には、１つ以上の初期遺伝子を除去するか、遺伝子または遺伝子／プロモーターカセットを除去したウイルスＤＮＡの代わりにウイルスゲノムに挿入する。この構築物型は、約８ｋｂまでの外来遺伝子材料を保有することができる。除去した初期遺伝子の必要な機能を、典型的には、初期遺伝子の遺伝子産物をトランスで発現するように操作された細胞株によって供給する。
【００７３】
レトロウイルスは、レトロウイルス科のウイルスファミリーに属する動物ウイルス（任意の型、亜科、属、または向性が含まれる）である。レトロウイルスベクターは、一般に、Ｖｅｒｍａ，ＬＭ．，Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ−１９８５，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｐ．２２９−２３２，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，（１９８５）（本明細書中で参照により援用される）に記載されている。遺伝子療法のためのレトロウイルスベクターの使用方法の例は、米国特許第４，８６８，１１６号および同第４，９８０，２８６号；ＰＣＴ出願ＷＯ９０／０２８０６号およびＷＯ８９／０７１３６号；およびＭｕｌｌｉｇａｎ，（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２（１９９３））（その教示が本明細書中で参照により援用される）に記載されている。
【００７４】
レトロウイルスは、本質的に、核酸カーゴ（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｃａｒｇｏ）にパッケージングしたパッケージである。核酸カーゴは、パッケージングシグナルを備え、それにより、複製された娘分子が確実にパッケージコート内に有効にパッケージングされる。パッケージシグナルに加えて、シスで複製および複製されたウイルスのパッケージングに必要な多数の分子が存在する。典型的には、レトロウイルスゲノムは、タンパク質コートの作製に関与するｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子を含む。このｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子は、典型的には、標的細胞に導入されるべき外来ＤＮＡと置換される。レトロウイルスベクターは、典型的には、パッケージコートへの組み込みのためのパッケージングシグナル、ｇａｇ転写単位の開始をシグナル伝達する配列、逆転写に必要なエレメント（逆転写のｔＲＮＡプライマーに結合するためのプライマー結合部位が含まれる）、ＤＮＡ合成中にＲＮＡ鎖の切り替えをガイドする末端反復配列、第２のＤＮＡ合成鎖の合成のためのプライミング部位としての機能を果たすプリンリッチ配列５’〜３’ＬＴＲおよび宿主ゲノムに挿入するためのレトロウイルスのＤＮＡ状態（ＤＮＡ  ｓｔａｔｅ）を挿入することができるＬＴＲの末端付近の特異的配列を含む。ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子の除去によって約８ｋｂの外来配列をウイルスゲノムに挿入することが可能であり、逆転写が可能になり、複製の際に新規のレトロウイルス粒子にパッケージング可能になる。この核酸の量は、各転写物のサイズに応じて、１つから多数の遺伝子の送達に十分である。
【００７５】
ほとんどのレトロウイルスベクターにおいて複製機構およびパッケージングタンパク質（ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ）が除去されているので、典型的には、パッケージング細胞株にベクターを配置することによってベクターを生成する。パッケージング細胞株は、複製およびパッケージング機構を含むが、いかなるパッケージングシグナルも欠くレトロウイルスでトランスフェクトまたは形質転換された細胞株である。最適なＤＮＡを保有するベクターをこれらの細胞株にトランスフェクトする場合、目的の遺伝子を含むベクターは、ヘルパー細胞によってシスで提供される機構によって新規のレトロウイルス粒子に複製およびパッケージングされる。必要なシグナルを欠くので、この機構のためのゲノムはパッケージングされない。
【００７６】
複製欠損アデノウイルスの構築物は、記載されている（Ｂｅｒｋｎｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６１：１２１３−１２２０（１９８７）；Ｍａｓｓｉｅら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８７２−２８８３（１９８６）；Ｈａｊ−Ａｈｍａｄら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５７：２６７−２７４（１９８６）；Ｄａｖｉｄｓｏｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６１：１２２６−１２３９（１９８７）；Ｚｈａｎｇ‘Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｂｙ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＰＣＲ  ａｎａｌｙｓｉｓ’ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １５：８６８−８７２（１９９３））。これらのウイルスのベクターとしての使用の利点は、これらのウイルスが最初の感染細胞内で複製することができるが新規の感染性ウイルス粒子を形成することができないので、他の細胞型に拡大することができる範囲が制限されるという点である。組換えアデノウイルスは、気道上皮、肝細胞、血管内皮、ＣＮＳ実質、および多数の他の組織部位への直接ｉｎ  ｖｉｖｏ送達後に高効率遺伝子導入を達成することが示されている（Ｍｏｒｓｙ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：１５８０−１５８６（１９９３）；Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：３８１−３８７（１９９３）；Ｒｏｅｓｓｌｅｒ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：１０８５−１０９２（１９９３）；Ｍｏｕｌｌｉｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４：１５４−１５９（１９９３）；Ｌａ  Ｓａｌｌｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：９８８−９９０（１９９３）；Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２５１２９−２５１３４（１９９２）；Ｒｉｃｈ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：４６１−４７６（１９９３）；Ｚａｂｎｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６：７５−８３（１９９４）；Ｇｕｚｍａｎ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７３：１２０１−１２０７（１９９３）；Ｂｏｕｔ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：３−１０（１９９４）；Ｚａｂｎｅｒ，Ｃｅｌｌ  ７５：２０７−２１６（１９９３）；Ｃａｉｌｌａｕｄ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ５：１２８７−１２９１（１９９３）；およびＲａｇｏｔ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７４：５０１−５０７（１９９３））。組換えアデノウイルスは、特定の細胞表面受容体への結合によって遺伝子形質導入が実現され、その後、野生型または複製欠損アデノウイルスと同一の様式での受容体媒介性エンドサイトーシスによってウイルスを内在化する（Ｃｈａｒｄｏｎｎｅｔ  ａｎｄ  Ｄａｌｅｓ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４０：４６２−４７７（１９７０）；Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｂｕｒｌｉｎｇｈａｍ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １２：３８６−３９６（１９７３）；Ｓｖｅｎｓｓｏｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｓｓｏｎ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５５：４４２−４４９（１９８５）；Ｓｅｔｈ，ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：６５０−６５５（１９８４）；Ｓｅｔｈ，ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１５２８−１５３３（１９８４）；Ｖａｒｇａら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６５：６０６１−６０７０（１９９１）；Ｗｉｃｋｈａｍら，Ｃｅｌｌ  ７３：３０９−３１９（１９９３））。
【００７７】
ウイルスベクターは、Ｅ１遺伝子が除去されたアデノウイルスを基本としたウイルスであり得、これらのビリオン（ｖｉｒｏｎ）を、ヒト２９３細胞株などの細胞株中で生成する。１つの態様では、Ｅ１遺伝子およびＥ３遺伝子の両方を、アデノウイルスゲノムから除去する。
【００７８】
別のウイルスベクター型は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づく。この欠損パルボウイルスは、多数の細胞型に感染することができ、ヒトに対して非病原性を示す。ＡＡＶ型ベクターは、約４〜５ｋｂを輸送することができ、野生型ＡＡＶは第１９染色体に安定に挿入されることが公知である。一例として、このベクターは、Ａｖｉｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡによって産生されたＰ４．１Ｃベクターであり得、これは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、ＨＳＶ−ｔｋ、および／またはマーカー遺伝子（緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子など）を含むことができる。
【００７９】
別のＡＡＶウイルス型では、ＡＡＶは、異種遺伝子に作動可能に連結された細胞特異的発現を指示するプロモーターを含む少なくとも１つのカセットに隣接する逆末端反復（ＩＴＲ）対を含む。この文脈における異種は、ＡＡＶまたはＢ１９パルボウイルスを起源としない任意のヌクレオチド配列または遺伝子をいう。
【００８０】
典型的には、ＡＡＶおよびＢ１９コード領域が欠失されると、安全で非毒性のベクターが得られる。ＡＡＶ  ＩＴＲまたはその修飾物は、感染性および部位特異的組み込みを付与するが、細胞傷害性を示さず、プロモーターは細胞特異的発現を指示する。米国特許第６，２６１，８３４号は、ＡＡＶベクターに関連する材料について本明細書中で参照により援用される。
【００８１】
したがって、開示のベクターは、実質的な毒性を示さずに哺乳動物染色体に組み込むことができるＤＮＡ分子を提供する。
【００８２】
ウイルスおよびレトロウイルス中の挿入遺伝子は、通常、プロモーターおよび／または所望の遺伝子産物の発現の調節を補助するためのエンハンサーを含む。プロモーターは、一般に、転写開始部位に関して比較的固定された位置に存在する場合に機能するＤＮＡ配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの基本的相互作用に必要なコアエレメントおよび転写因子を含み、上流エレメントおよび応答エレメントを含むことができる。
【００８３】
巨大なヒトヘルペスウイルスを使用した分子遺伝学的実験により、巨大な異種ＤＮＡフラグメントをクローン化し、増殖させ、ヘルペスウイルスの感染に許容状態の細胞中に確立することができる手段が得られた（Ｓｕｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８：３３−４１，１９９４；Ｃｏｔｔｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ５：６３３−６４４，１９９９）。これらの巨大なＤＮＡウイルス（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）およびエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ））は、１５０ｋｂを超えるヒト異種ＤＮＡフラグメントを特定の細胞に送達させる能力を有する。ＥＢＶ組換え体は、感染Ｂ細胞中にエピソームＤＮＡとして巨大なＤＮＡ片を保持することができる。３３０ｋｂまでのヒトゲノムインサートを保持した各クローンは遺伝的に安定なようである。これらのエピソームの維持には、ＥＢＶの感染中に構成性に発現される特定のＥＢＶ核タンパク質（ＥＢＮＡ１）が必要である。さらに、これらのベクターをトランスフェクションのために使用することができ、それにより、大量のタンパク質をｉｎ  ｖｉｔｒｏで一過性に生成することができる。ヘルペスウイルスアンプリコン系を使用して、２２０ｋｂを超えるＤＮＡ片をパッケージングして細胞に感染し、エピソームとしてＤＮＡを安定に保持することもできる。
【００８４】
他の有用な系には、例えば、複製および宿主制限非複製ワクシニアウイルスベクターが含まれる。
【００８５】
開示の組成物を、種々の方法で標的細胞に送達させることができる。例えば、組成物を、エレクトロポレーション、リポフェクション、またはリン酸カルシウム沈降によって送達させることができる。送達機構の選択は、ターゲティングした細胞型および送達が、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏのいずれでおこるかに一部依存するであろう。
【００８６】
したがって、組成物は、開示のポリペプチド、核酸、またはベクターに加えて、例えば、リポソーム（カチオン性リポソーム（例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ−コレステロール）またはアニオン性リポソームなど）などの脂質を含むことができる。リポソームは、さらに、必要に応じて、特定の細胞のターゲティングを容易にするためのタンパク質を含むことができる。化合物およびカチオン性リポソームを含む組成物を、標的器官に向かう（ａｆｆｅｒｅｎｔ  ｔｏ）血液に投与することができるか、気道の標的細胞に向かう気道に吸入することができる。リポソームについては、例えば、Ｂｒｉｇｈａｍら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１：９５−１００（１９８９）；Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８４：７４１３−７４１７（１９８７）；米国特許第４，８９７，３５５号を参照のこと。さらに、化合物を、特定の細胞型（マクロファージなど）にターゲティングすることができるマイクロカプセル成分として投与することができるか、特定の速度または投薬量にするためにマイクロカプセルからの化合物の拡散または化合物の送達をデザインする。
【００８７】
被験体の細胞への外因性ＤＮＡの投与および取り込みを含む上記の方法（すなわち、遺伝子形質導入またはトランスフェクション）では、細胞への組成物の送達は種々の機構を経由し得る。一例として、送達は、リポソーム（市販のリポソーム調製物（リポフェクチン、リポフェクタミン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、およびＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）など）および当該分野で標準的な手順に従って開発された他のリポソームを使用）を経由し得る。さらに、開示の核酸またはベクターを、エレクトロポレーション（Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から利用可能なテクノロジー）およびＳＯＮＯＰＯＲＡＴＩＯＮ装置（ＩｍａＲｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）によってｉｎ  ｖｉｖｏで送達させることができる。
【００８８】
宿主細胞ゲノムに組み込まれるべき細胞に送達される核酸は、典型的には、組み込み配列を含む。これらの配列は、しばしば、特に、ウイルスベースの系を使用する場合、ウイルス関連配列である。これらのウイルス組み込み系を、非核酸ベースの送達系（リポソームなど）を使用して送達すべき核酸に組み込むこともでき、その結果、送達系に含まれる核酸が宿主ゲノムに組み込まれるようになり得る。
【００８９】
他の一般的な宿主ゲノムへの組み込み技術には、例えば、宿主ゲノムでの相同組換えが促進されるようにデザインされた系が含まれる。これらの系は、典型的には、宿主細胞ゲノム内の標的配列と十分な相同性を有する発現すべき核酸に隣接する配列に依存する。この系により、ベクター核酸と標的核酸との間で組換えが起こり、送達された核酸が宿主ゲノムに組み込まれる。相同組換えを促進するために必要なこれらの系および方法は、当業者に公知である。
【００９０】
当該分野で周知の種々の機構（例えば、裸のＤＮＡの取り込み、リポソーム融合、遺伝子銃によるＤＮＡの筋肉内注射、およびエンドサイトーシスなど）によってｉｎ  ｖｉｖｏおよび／またはｅｘ  ｖｉｖｏで組成物を被験体の細胞に送達させることができる。
【００９１】
ｅｘ  ｖｉｖｏ法を使用する場合、当該分野で周知の標準的プロトコールに従って、細胞または組織を除去し、体外に保持することができる。組成物を、任意の遺伝子導入機構（例えば、リン酸カルシウム媒介遺伝子送達、エレクトロポレーション、微量注入、またはプロテオリポソームなど）によって細胞に導入することができる。次いで、形質導入された細胞を、細胞または組織型についての標準的方法によって、（例えば、薬学的に許容可能なキャリア中で）融合するか、被験体中の同位置に移植して戻すことができる。被験体への種々の細胞の移植または注入についての標準的方法は公知である。
【００９２】
細胞に送達される核酸は、典型的には、発現調節系を含む。例えば、ウイルス系およびレトロウイルス系中の挿入遺伝子は、通常、プロモーターおよび／または所望の遺伝子産物の発現の調節を補助するためのエンハンサーを含む。プロモーターは、一般に、転写開始部位に関して比較的固定された位置に存在する場合に機能するＤＮＡ配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの基本的相互作用に必要なコアエレメントおよび転写因子を含み、上流エレメントおよび応答エレメントを含むことができる。
【００９３】
哺乳動物宿主細胞中でベクター由来の転写を調節するプロモーターを、種々の供給源（例えば、ポリオーマ、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、サイトメガロウイルスなどのウイルスのゲノム、または異種哺乳動物プロモーター（例えば、βアクチンプロモーター）から得ることができる。ＳＶ４０ウイルスの初期プロモーターおよび後期プロモーターを、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含むＳＶ４０制限フラグメントとして得ることが都合が良い（Ｆｉｅｒｓら，Ｎａｔｕｒｅ，２７３：１１３（１９７８））。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターを、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限フラグメントとして得ることが都合が良い（Ｇｒｅｅｎｗａｙ，ＰＪ．ら，Ｇｅｎｅ  １８：３５５−３６０（１９８２））。勿論、宿主細胞または関連種由来のプロモーターも本明細書中で有用である。
【００９４】
エンハンサーは、一般に、固定されていない転写開始部位からの距離で機能するＤＮＡ配列をいい、転写単位に対して５’（Ｌａｉｍｉｎｓ，Ｌ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：９９３（１９８１））または３’（Ｌｕｓｋｙ，Ｍ．Ｌ．，ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．３：１１０８（１９８３））のいずれかであり得る。さらに、エンハンサーは、イントロン内（Ｂａｎｅｒｊｉ，Ｊ．Ｌ．ら，Ｃｅｌｌ  ３３：７２９（１９８３））およびコード配列内（Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｔ．Ｆ．，ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．４：１２９３（１９８４））に存在し得る。エンハンサーは、通常、長さが１０ｂｐと３００ｂｐとの間であり、シスで機能する。エンハンサーは隣接プロモーター由来の転写を増加させるように機能する。エンハンサーはまた、しばしば、転写調節を媒介する応答エレメントを含む。プロモーターはまた、転写調節を媒介する応答エレメントを含むことができる。エンハンサーは、しばしば、遺伝子発現の調節を決定する。哺乳動物遺伝子由来の多数のエンハンサー配列が現在公知である一方で（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトタンパク質、およびインスリン）、典型的には、一般的発現のために真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用するであろう。例は、複製起点の後期側（ｂｐ１００−２７０）のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーである。
【００９５】
プロモーターおよび／またはエンハンサーを、その機能を惹起する光または特定の化学的事象のいずれかによって特異的に活性化することができる。系を、テトラサイクリンおよびデキサメタゾンなどの試薬によって調節することができる。γ線などの照射またはアルキル化化学療法薬への曝露によってウイルスベクターの遺伝子発現を増強する方法も存在する。
【００９６】
一定の実施形態では、プロモーターおよび／またはエンハンサー領域は、転写されるべき転写単位領域の発現を最大にするための構成性プロモーターおよび／またはエンハンサーとして作用することができる。一定の構築物では、特定の期間に特定の細胞型のみで発現する場合であっても、プロモーターおよび／またはエンハンサー領域は全ての真核細胞型で活性である。このプロモーター型は、ＣＭＶプロモーター（６５０塩基）である。他のかかるプロモーターは、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（全長プロモーター）、およびレトロウイルスベクターＬＴＲである。
【００９７】
全ての特異的調節エレメントをクローン化し、これを使用して黒色腫細胞などの特定の細胞型で選択的に発現する発現ベクターを構築することができる。グリア細胞線維性酸性タンパク質（ｇｌｉａｌ  ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ａｃｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＧＦＡＰ）プロモーターを使用して、グリア起源の細胞中で遺伝子が選択的に発現されている。
【００９８】
真核宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または有核細胞）中で使用される発現ベクターは、ｍＲＮＡ発現に影響を及ぼすことができる転写終結に必要な配列を含むこともできる。これらの領域は、組織因子タンパク質をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分中のポリアデニル化セグメントとして転写される。３’非翻訳領域には、転写終結部位も含まれる。転写単位は、ポリアデニル化領域も含むことができる。この領域の１つの利点は、転写された単位をプロセシングしてｍＲＮＡのように輸送される可能性が増大するという点である。発現構築物中のポリアデニル化シグナルの同定および使用は十分に確立されている。相同ポリアデニル化シグナルを、導入遺伝子構築物中で使用することができる。一定の転写単位では、ポリアデニル化領域は、ＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナルに由来し、約４００塩基からなる。転写された単位は、他の標準的配列を単独で含むか、上記の配列と組み合わせて、構築物由来の発現または構築物の安定性を改善する。
【００９９】
ウイルスベクターは、マーカー産物をコードする核酸配列を含むことができる。このマーカー産物を使用して、遺伝子が細胞に送達され、一旦送達されると、発現するかどうかを決定する。例示的マーカー遺伝子は、β−ガラクトシダーゼをコードする大腸菌ｌａｃＺ遺伝子および緑色蛍光タンパク質である。
【０１００】
いくつかの実施形態では、マーカーは選択マーカーであり得る。哺乳動物細胞に適切な選択マーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシンアナログＧ４１８、ハイグロマイシン（ｈｙｄｒｏｍｙｃｉｎ）、およびピューロマイシンである。かかる選択マーカーが哺乳動物宿主細胞に首尾よく導入される場合、形質転換された哺乳動物宿主細胞は、選択圧下におかれた場合に生存することができる。２つの広範に使用されている異なる選択レジーム（ｒｅｇｉｍｅ）カテゴリーが存在する。第１のカテゴリーは、細胞の代謝および補足培地と無関係に成長する能力を欠く変異細胞株の使用に基づく。２つの例は以下である：チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）ＤＨＦＲ−細胞およびマウスＬＴＫ−細胞。これらの細胞は、チミジンまたはヒポキサンチンなどの栄養素を添加することなく成長する能力を欠く。これらの細胞が完全なヌクレオチド合成経路に必要な一定の遺伝子を欠くので、これらの細胞は、補足培地中に失われたヌクレオチドを供給しない限り、成長できない。培地への補足の代替方法は、各遺伝子を欠く細胞にインタクトなＤＨＦＲ遺伝子またはＴＫ遺伝子を導入し、それにより、その成長要件を変更することである。ＤＨＦＲ遺伝子またはＴＫ遺伝子で形質転換されなかった各細胞は、非補足培地中で成長することができないであろう。
【０１０１】
第２のカテゴリーは、優性選択（ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）であり、これは、任意の細胞型で使用される選択スキームをいい、変異細胞株の使用を必要としない。これらのスキームは、典型的には、宿主細胞の成長を停止させるための薬物を使用する。新規の遺伝子を有する細胞は、薬物耐性を伝達するタンパク質を発現し、選択を生き延びるであろう。かかる優性選択の例は、薬物ネオマイシン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｐ．ａｎｄ  Ｂｅｒｇ，Ｐ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７（１９８２））、ミコフェノール酸（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．ａｎｄ  Ｂｅｒｇ，Ｐ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０９：１４２２（１９８０））、またはハイグロマイシン（Ｓｕｇｄｅｎ，Ｂ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４１０−４１３（１９８５））を使用する。この３つの例は、真核生物調節下で、それぞれ適切な薬物Ｇ４１８またはネオマイシン（ジェネテシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）、またはハイグロマイシンに対する耐性を伝達するための細菌遺伝子を使用する。他には、ネオマイシンアナログＧ４１８およびピューロマイシン（ｐｕｒａｍｙｃｉｎ）が含まれる。
１１．アデノウイルス媒介性腫瘍遺伝子療法
腫瘍ウイルス療法は、癌治療の新規のプラットフォームを示す。魅力的な特徴には、腫瘍選択的ターゲティングおよび現在の治療に対する交差耐性がないことが含まれる。サブグループＣにおけるヒトアデノウイルス（Ａｄ）（例えば、Ａｄ５）は、若年小児において無症候性または軽度の呼吸器感染を引き起こす病原体であり、終生免疫（ｌｉｆｅｌｏｎｇ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ）を誘導する。その結果、腫瘍遺伝子療法のためのアデノウイルスベクターは、魅力的で非常に興味深い。抗癌療法のための２つのＡｄベクター型（複製欠損およびよび複製コンピテント）が開発されている（Ａｄａｍ  ａｎｄ  Ｎａｓｚ，２００１；Ｇｌａｓｇｏｗら，２００６）。広範な種々の腫瘍ターゲティング機構（免疫調節遺伝子療法、腫瘍抑制因子遺伝子療法、および化学遺伝子療法）を有する非常に多数の非複製抗腫瘍アデノウイルスベクターがデザインされている。腫瘍細胞中で選択的に複製され、それにより、腫瘍が溶解するような複製コンピテントベクターがデザインされている。両ベクター型において臨床試験から抗腫瘍効果の証拠が報告されているにもかかわらず、実質的な臨床上の利点を得るために有効性を改善しなければならない。従来の放射線療法を使用した組み込み遺伝子療法のアプローチはあまり調査および開発されていないが、標的療法に有望である。異なる腫瘍ターゲティング機構を同時に使用するかかる組み合わせにより、相乗的な抗腫瘍効果が得られ、最大の抗腫瘍効果を得ることができる。したがって、低酸素症腫瘍組織中でｗｔＮＩＰを発現する低酸素症誘導性アデノウイルスベクターを本明細書中に開示する。この遺伝子治療ベクターは、以下の２つの特徴を有する：１）腫瘍選択性ターゲティングおよび低酸素症特異的ターゲティング、および２）腫瘍放射線増感。
１２．細胞
１つ以上の本明細書中に提供したベクターを含む細胞も提供する。本明細書中で使用される場合、「細胞」、「細胞株」、および「細胞培養物」を、交換可能に使用することができ、全てのかかる名称には子孫が含まれる。開示の細胞は、本明細書中に提供したベクターをクローン化または増殖するために使用される任意の細胞であり得る。したがって、細胞は、任意の初代細胞培養物または株化細胞株に由来し得る。本方法を、任意の細胞（原核細胞または真核細胞（細菌、植物、および動物など）が含まれる）に適用することができる。当業者は、細胞型を、ベクターおよび所望の用途の選択に基づいて選択することができる。細胞は、単離細胞または生物中の細胞であり得る。
【０１０２】
動物内での本明細書中に開示の任意の核酸分子またはベクターでの細胞のトランスフェクションプロセスによって産生された動物を開示する。動物が哺乳動物である、動物内での本明細書中に開示の任意の核酸分子またはベクターでの細胞のトランスフェクションプロセスによって産生された動物を開示する。哺乳動物が、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、または霊長類である、動物内での本明細書中に開示の任意の核酸分子またはベクターでの細胞のトランスフェクションプロセスによって産生された動物も開示する。
１３．薬学的に許容可能なキャリア
開示の組成物を、投与、送達、またはインヒビターおよびその使用の他の態様を補助するためにキャリアおよび他の組成物と組み合わせるか、抱合するか、カップリングすることができる。便宜上、かかる組成物を、本明細書中でキャリアという。キャリアは、例えば、小分子、薬品、脂肪酸、検出可能なマーカー、抱合タグ、ナノ粒子、または酵素であり得る。
【０１０３】
開示の組成物を、治療的に、薬学的に許容可能なキャリアと組み合わせて使用することができる。「薬学的に許容可能な」は、生物学的またはその他で望ましくないわけではない材料を意味する。すなわち、この材料を、いかなる望ましくない生物学的影響を生じることがないか、薬学的組成物中に含まれる薬学的組成物の任意の他の成分と有害な様式で相互作用することなく組成物と共に被験体に投与することができる。当業者に周知のように、キャリアを、必然的に、有効成分の任意の分解を最少にし、被験体における任意の副作用を最小にするように選択するであろう。
【０１０４】
したがって、薬学的に許容可能なキャリア中に１つ以上の本明細書中に提供したポリペプチド、核酸、ベクターを含む組成物を提供する。したがって、薬学的に許容可能なキャリア中に２つ以上の任意の本明細書中に提供したＮＢＳ１ポリペプチドの組み合わせを含む組成物を提供する。例えば、薬学的に許容可能なキャリア中に
【０１０５】
【化２】
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を含む組成物を提供する。
【０１０６】
適切なキャリアおよびその処方物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（１９ｔｈ  ｅｄ．）ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ  １９９５に記載されている。典型的には、適量の薬学的に許容可能な塩を処方物中で使用して、処方物を等張にする。薬学的に許容可能なキャリアの例には、生理食塩水、リンゲル液、およびデキストロース溶液が含まれるが、これらに限定されない。溶液のｐＨは、好ましくは、約ｐＨ５〜約ｐＨ８、より好ましくは、約ｐＨ７〜約ｐＨ７．５である。さらに、キャリアは、徐放性調製物（抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックス（マトリックスは、造形品（例えば、フィルム、リポソーム、または微粒子）の形態である）など）を含む。一定のキャリアが、例えば、投与される組成物の投与経路および濃度に依存し得ることがより好ましいことが当業者に明らかであろう。
【０１０７】
薬学的キャリアは、当業者に公知である。これらは、最も典型的には、ヒトへの薬物投与のための標準的なキャリアであろう（滅菌水、生理食塩水、および生理学的ｐＨの緩衝液などの溶液が含まれる）。組成物を、筋肉内または皮下に投与することができる。他の化合物を、当業者によって使用される標準的手順にしたがって投与することができる。
【０１０８】
薬学的組成物は、選択した分子に加えて、キャリア、増粘剤、希釈剤、緩衝液、防腐剤、および界面活性剤などを含むことができる。薬学的組成物は、抗菌薬、抗炎症薬、および麻酔薬などの１つ以上の有効成分を含むこともできる。
【０１０９】
非経口投与用調製物は、滅菌水溶液または非水溶液、懸濁液、および乳濁液を含む。非水溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（オリーブ油など）、および注射用有機エステル（オレイン酸エチルなど）である。水性キャリアには、水、アルコール／水溶液、乳濁液、または懸濁液（生理食塩水および緩衝化媒質が含まれる）が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース、および塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液、または固定油が含まれる。静脈内ビヒクルには、流動物および栄養補充液、および電解質補充液（リンゲルデキストロースベースのものなど）などが含まれる。例えば、抗菌薬、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどの防腐剤および他の添加物も存在し得る。
【０１１０】
局所投与用処方物には、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、点滴薬、座剤、スプレー、液体、および粉末が含まれ得る。従来の薬学的キャリア、水性基剤、粉末基剤、または油性基剤、および増粘剤などが必要であるか望ましいかもしれない。
【０１１１】
経口投与用組成物には、粉末または顆粒、水性媒質または非水性媒質の懸濁液または溶液、カプセル、サシェ、または錠剤が含まれる。増粘剤、香味料、希釈剤、乳化剤、分散助剤、または結合剤が望ましいかもしれない。
【０１１２】
いくつかの組成物を、無機酸（塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、およびリン酸など）および有機酸（ギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、およびフマル酸など）との反応または無機塩基（水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムなど）および有機塩基（モノ、ジ、トリアルキルおよびアリールアミンならびに置換エタノールアミンなど）との反応によって形成された薬学的に許容可能な酸付加塩または塩基付加塩として投与することができる場合がある。
【０１１３】
材料は、（例えば、微粒子、リポソーム、または細胞に組み込まれた）溶液、懸濁液中に存在し得る。これらを、抗体、受容体、または受容体リガンドを介して特定の細胞型にターゲティングすることができる。以下の引例は、特定のタンパク質を腫瘍組織にターゲティングするためのこの技術の使用例である（Ｓｅｎｔｅｒら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，２：４４７−４５１，（１９９１）；Ｂａｇｓｈａｗｅ，Ｋ．Ｄ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６０：２７５−２８１，（１９８９）；Ｂａｇｓｈａｗｅら，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５８：７００−７０３，（１９８８）；Ｓｅｎｔｅｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，４：３−９，（１９９３）；Ｂａｔｔｅｌｌｉら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３５：４２１−４２５，（１９９２）；Ｐｉｅｔｅｒｓｚ  ａｎｄ  ＭｃＫｅｎｚｉｅ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｒｅｖｉｅｗｓ，１２９：５７−８０，（１９９２）；ａｎｄ  Ｒｏｆｆｌｅｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，４２：２０６２−２０６５，（１９９１））。「ステルス（ｓｔｅａｌｔｈ）」などのビヒクルおよび他の抗体を、リポソーム（結腸癌に対する脂質媒介性薬物ターゲティング）、細胞特異的リガンドによるＤＮＡの受容体媒介性ターゲティング、リンパ球指向性腫瘍ターゲティング、およびｉｎ  ｖｉｖｏでのマウスグリオーマ細胞の高特異的治療レトロウイルスターゲティングが含まれる）に抱合する。以下の引例は、腫瘍組織に特定のタンパク質をターゲティングするためのこのテクノロジーの使用例である（Ｈｕｇｈｅｓら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４９：６２１４−６２２０，（１９８９）；およびＬｉｔｚｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１１０４：１７９−１８７，（１９９２））。一般に、受容体は、構成性またはリガンド誘導性のエンドサイトーシス経路に関与する。これらの受容体は、クラスリンコーティングピット中に凝集し、クラスリンコーティング小胞を介して細胞に侵入し、酸性化エンドソームを通過して受容体が分類され、細胞表面に再利用されるか、細胞内で保存されるようになるか、リソソーム中で分解される。内在化経路は、種々の機能（栄養取り込み、活性化タンパク質の除去、高分子の排除、ウイルスおよび毒素の日和見性侵入（ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｓｔｉｃ  ｅｎｔｒｙ）、リガンドの解離および分解、ならびに受容体レベルの調節など）に携わる。多数の受容体は、細胞型、受容体濃度、リガンド型、リガンド結合価、およびリガンド濃度に応じて、１つを超える細胞内経路をたどる。受容体媒介性エンドサイトーシスの分子機構および細胞機構は概説されている（Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｅ，ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：６，３９９−４０９（１９９１））。
【０１１４】
キャリア分子を、開示のインヒビターに共有結合することができる。キャリア分子を、開示のペプチドのアミノ末端に結合することができる。キャリア分子を、開示のペプチドのカルボキシ末端に結合することができる。キャリア分子を、開示のペプチド内のアミノ酸に結合することができる。本明細書中に提供した組成物は、さらに、キャリア分子および開示のインヒビターを連結するリンカーを含むことができる。開示のインヒビターを、インヒビターでナノシェルの微粒子、ナノ粒子をコーディングするために使用することができるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｔｋａｃｈｅｎｋｏら，（２００３）Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ，１２５，４７００−４７０１を参照のこと）などのコーティング分子に抱合することもできる。
【０１１５】
インヒビターにキャリア分子を架橋するために使用することができるタンパク質架橋剤（開示のペプチドなど）は、当該分野で公知であり、その有用性および構造に基づいて定義されており、この架橋剤には、ＤＳＳ（スベリン酸ジスクシンイミジル）、ＤＳＰ（ジチオビス（スクシンイミジルプロピオナート））、ＤＴＳＳＰ（３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオナート））、ＳＵＬＦＯ  ＢＳＯＣＯＥＳ（ビス［２−（スルホスクシンイムドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン）、ＢＳＯＣＯＥＳ（ビス［２−（スクシンイムドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン）、ＳＵＬＦＯ  ＤＳＴ（ジスルホスクシンイミジルタートラート）、ＤＳＴ（ジスクシンイミジルタートラート）、ＳＵＬＦＯ  ＥＧＳ（エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシナート））、ＥＧＳ（エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシナート））、ＤＰＤＰＢ（１，２−ジ［３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ブタン）、ＢＳＳＳ（ビス（スルホスクシンイミジル）スベラート）、ＳＭＰＢ（スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチラート）、ＳＵＬＦＯ  ＳＭＰＢ（スルホスクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチラート）、ＭＢＳ（３−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、ＳＵＬＦＯ  ＭＢＳ（３−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル）、ＳＩＡＢ（Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾアート）、ＳＵＬＦＯ  ＳＩＡＢ（Ｎ−スルホスクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾアート）、ＳＭＣＣ（スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート）、ＳＵＬＦＯ  ＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート）、ＮＨＳ  ＬＣ  ＳＰＤＰ（スクシンイミジル−６−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド）ヘキサノアート）、ＳＵＬＦＯ  ＮＨＳ  ＬＣ  ＳＰＤＰ（スルホスクシンイミジル−６−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド）ヘキサノアート）、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート）、ＮＨＳ  ブロモＡＣＥＴＡＴＥ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルブロモアセタート）、ＮＨＳ  ヨードＡＣＥＴＡＴＥ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルヨードアセタート）、ＭＰＢＨ（４−（Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジドヒドロクロリド）、ＭＣＣＨ（４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸ヒドラジドヒドロクロリド）、ＭＢＨ（ｍ−マレイミド安息香酸ヒドラジドヒドロクロリド）、ＳＵＬＦＯ  ＥＭＣＳ（Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）スルホスクシンイミド）、ＥＭＣＳ（Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド）、ＰＭＰＩ（Ｎ−（ｐ−マレイミドフェニル）イソシアナート）、ＫＭＵＨ（Ｎ−（κ−マレイミドウンデカン酸）ヒドラジド）、ＬＣ  ＳＭＣＣ（スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−ｌ−カルボキシ（６−アミドカプロアート））、ＳＵＬＦＯ  ＧＭＢＳ（Ｎ−（γ−マレイミドブトリルオキシ）スルホスクシンイミドエステル）、ＳＭＰＨ（スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオンアミドヘキサノアート））、ＳＵＬＦＯ  ＫＭＵＳ（Ｎ−（κ−マレイミドウンデカノイルオキシ）スルホスクシンイミドエステル）、ＧＭＢＳ（Ｎ−（γ−マレイミドブチロキシ）スクシンイミド）、ＤＭＰ（ピメルイミド酸ジメチル塩酸塩）、ＤＭＳ（スベルイミド酸ジメチル塩酸塩）、ＭＨＢＨ（ウッド試薬）（メチル−ｐ−ヒドロキシベンズイミダートヒドロクロリド、９８％）、ＤＭＡ（アジポイミド酸ジメチル塩酸塩）が含まれる。
ｉ．ナノ粒子、微粒子、および微小気泡
用語「ナノ粒子」は、ナノメートルで測定されるサイズを有するナノスケールの粒子（例えば、少なくとも一方の直径が約１００ｎｍ未満のナノスケールの粒子）をいう。ナノ粒子の例には、常磁性ナノ粒子、超常磁性ナノ粒子、金属ナノ粒子、フラーレン様材料、無機ナノチューブ、デンドリマー（共有結合金属キレートなど）、ナノファイバー、ナノホム（ｎａｎｏｈｏｍ）、ナノオニオン（ｎａｎｏ−ｏｎｉｏｎ）、ナノロッド（ｎａｎｏｒｏｄ）、ナノロープ（ｎａｎｏｒｏｐｅ）、および量子ドットが含まれる。ナノ粒子は、例えば、光子（高周波および可視光子が含まれる）の吸収および／または放射ならびにプラズモン共鳴によって検出可能なシグナルを生成することができる。
【０１１６】
ミクロスフィア（または微小気泡）を、本明細書中に開示の方法と共に使用することもできる。発色団を含むミクロスフィアは、広範な種々の適用（光結晶、生体標識、およびマイクロ流体チャネル中での流れの視覚化が含まれる）で利用されている。例えば、Ｙ．Ｌｉｎ，ら，Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ  Ｌｅｔｔ．２００２，８１，３１３４；Ｄ．Ｗａｎｇ，ら，Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．２００３，１５，２７２４；Ｘ．Ｇａｏ，ら，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｏｐｔ．２００２，７，５３２；Ｍ．Ｈａｎ，ら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２００１，１９，６３１；Ｖ．Ｍ．Ｐａｉ，ら，Ｍａｇ．＆  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｍａｔｅｒ．１９９９，１９４，２６２（それぞれ、その全体が本明細書中で参照により援用される）を参照のこと。発色団の光安定性およびミクロスフィアの単分散度は共に重要であり得る。
【０１１７】
ナノ粒子（例えば、シリカナノ粒子、金属ナノ粒子、金属酸化物ナノ粒子、または半導体ナノ結晶など）を、ミクロスフィアに組み込むことができる。ナノ粒子の光学的性質、磁性、および電子的性質により、ミクロスフィアに会合しながら観察することができ、ミクロスフィアを同定し、空間的にモニタリングすることができる。例えば、コロイド状に合成した半導体ナノ結晶の高光安定性、良好な蛍光効率、および広範な放射波長可変性により、優れた発色団の選択が可能になる。有機色素と異なり、異なる色（すなわち、異なる波長）を放射するナノ結晶を、単色光源を使用して同時に励起することができる。コロイド状に合成した半導体ナノ結晶（例えば、コア−シェルＣｄＳｅ／ＺｎＳおよびＣｄＳ／ＺｎＳ  ナノ結晶など）を、ミクロスフィアに組み込むことができる。ミクロスフィアは、単分散シリカミクロスフィアであり得る。
【０１１８】
ナノ粒子は、金属ナノ粒子、金属酸化物ナノ粒子、または半導体ナノ結晶であり得る。金属ナノ粒子または金属酸化物ナノ粒子の金属には、チタン、ジルコニウム、ハフニウム、バナジウム、ニオビウム、タンタラム、クロム、モリブデン、タングステン、マンガン、テクネチウム、レニウム、鉄、ルテニウム、オスミウム、コバルト、ロジウム、インジウム、ニッケル、パラジウム、白金、銅、銀、金、亜鉛、カドミウム、スカンジウム、イットリウム、ランタン、ランタニド系列およびアクチニド系列の元素（例えば、セリウム、プラセオジウム、ネオジウム、プロメチウム、サマリウム、ユーロピウム、ガドリニウム、テルビウム、ジスプロシウム、ホルミウム、エルビウム、ツリウム、イッテルビウム、ルテチウム、トリウム、プロトアクチニウム、およびウラン）、ホウ素、アルミニウム、ガリウム、インジウム、タリウム、ケイ素、ゲルマニウム、スズ、鉛、アンチモン、ビスマス、ポロニウム、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウム、およびバリウムが含まれ得る。一定の実施形態では、金属は、鉄、ルテニウム、コバルト、ロジウム、ニッケル、パラジウム、白金、銀、金、セリウム、サマリウムであり得る。金属酸化物は、任意のこれらの材料または材料の組み合わせの酸化物であり得る。例えば、金属は金であり得るか、金属酸化物は酸化鉄、酸化コバルト、酸化亜鉛、酸化セリウム、または酸化チタンであり得る。金属および金属酸化物ナノ粒子の調製物は、例えば、米国特許第５，８９７，９４５号および同第６，７５９，１９９号（それぞれ、その全体が本明細書中で参照により援用される）に記載されている。
【０１１９】
例えば、開示の組成物を、シリカナノ粒子（ＳＮＰ）上に固定することができる。その有利な表面積−体積比、製造の簡潔さ、および蛍光標識、磁性ナノ粒子（Ｙａｎｇ，Ｈ．Ｈ．ら、２００５）、および半導体ナノ結晶（Ｌｉｎ，Ｙ．Ｗ．，ら、２００６）を結合することができることによって、ＳＮＰはバイオセンシングおよび触媒のために広く使用されている。
【０１２０】
ナノ粒子はまた、例えば、発熱ナノシェルであり得る。本明細書中で使用される場合、「ナノシェル」は、１つ以上の導電性シェル層に囲まれた個別の誘電性または半導体コア区分を有するナノ粒子である。米国特許第６，５３０，９４４号は、金属ナノシェルの作製および使用方法の教示についてその全体が本明細書中で参照により援用される。
【０１２１】
ターゲティング分子を、開示の組成物および／またはキャリアに結合することができる。例えば、ターゲティング分子は、抗体もしくはそのフラグメント、特定の受容体のリガンド、またはターゲティングすべき細胞表面に特異的に結合する他のタンパク質であり得る。
ｉｉ．リポソーム
「リポソーム」は、この用語を本明細書中で使用する場合、内部の水性空間を取り囲む外側の脂質二重層または多重層を含む構造をいう。リポソームを使用して、細胞への送達のために任意の生物活性因子（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）をパッケージングすることができる。
【０１２２】
リポソーム形成のための材料および手順は、当業者に周知である。適切な媒質中での分散の際、広範な種々のリン脂質が膨潤し、水和し、脂質二重層を分離する水性媒質を有する多重膜の同心円状の二重層小胞を形成する。これらの系を、多重膜リポソームまたは多重膜脂質小胞（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｌｉｐｉｄ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ）（「ＭＬＶ」）といい、１０ｎｍ〜１００μＭの範囲内の直径を有する。これらのＭＬＶは、最初に、Ｂａｎｇｈａｍら，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３：２３８−２５２（１９６５）に記載された。一般に、脂質または親油性物質は、有機溶媒に溶解する。回転蒸発によって真空下などで溶媒を除去する場合、脂質残渣は、容器の壁にフィルムを形成する。次いで、典型的には電解質または親油性の生物活性材料を含む水溶液をフィルムに添加する。撹拌の際に巨大なＭＬＶが産生される。より小さなＭＬＶが望ましい場合、より大きな小胞を、超音波処理、孔サイズが漸減するフィルターによる連続濾過に供するか、他の機械的剪断形態によって小さくする。例えば、加圧射出によってＭＬＶのサイズおよび膜数の両方を減少させることができる技術も存在する（Ｂａｒｅｎｈｏｌｚ，ら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．９９：２１０−２１４（１９７９））。
【０１２３】
リポソームは、ＭＬＶのより広範な超音波処理によって調製された単層小胞の形態を取ることもできる。単層小胞は、水溶液を囲む単一の球状脂質二重層からなる。単層小胞（「ＵＬＶ」）は、小さく、２０〜２００ｎｍの範囲内の直径を有し得る一方で、より大きなＵＬＶは、２００ｎｍ〜２μｍの範囲内の直径を有し得る。いくつかの公知の単層小胞の作製技術が存在する。Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，ら，Ｂｉｏｃｈｉｍ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １３５：６２４−２３８（１９６８）では、リン脂質の水性分散物の超音波処理により、水溶液を囲む脂質二重層を有する小さなＵＬＶを産生している。Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒの米国特許第４，０８９，８０１号は、超音波処理し、その後に両親媒性化合物を含む水性媒質を添加し、遠心分離して生体分子脂質層系を形成する、リポソーム前駆体の形成を記載している。
【０１２４】
小さなＵＬＶを、Ｂａｔｚｒｉら，Ｂｉｏｃｈｉｍ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ２９８：１０１５−１０１９（１９７３）に記載のエタノール注入技術およびＤｅａｍｅｒら，Ｂｉｏｃｈｉｍ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ４４３：６２９−６３４（１９７６）のエーテル注入技術によって調製することもできる。これらの方法は、緩衝液への脂質の有機溶液の迅速な注入を含み、これにより、単層リポソームが迅速に形成される。別のＵＬＶ作製技術は、Ｗｅｄｅｒら、ｉｎ‘Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ’，ｅｄ．Ｇ．Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．，Ｖｏｌ．Ｉ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ７，ｐｇ．７９−１０７（１９８４）で教示されている。この界面活性剤除去方法は、撹拌または超音波処理によって界面活性剤を使用して脂質および添加物を可溶化して所望の小胞を生成する工程を含む。
【０１２５】
Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，らの米国特許第４，２３５，８７１号は、有機溶液中の脂質および水性緩衝液中にカプセル化すべき薬物の油中水滴型乳濁液の形成を含む逆相蒸発技術による巨大ＵＬＶの調製を記載している。有機溶媒を加圧下で除去して混合物を得て、これを水性媒質中での撹拌または分散の際に巨大ＵＬＶに変換する。Ｓｕｚｕｋｉらの米国特許第４，０１６，１００号は、薬剤および脂質の水性リン脂質分散物の凍結融解による単層小胞中への薬剤の別のカプセル化方法を記載している。
【０１２６】
ＭＬＶおよびＵＬＶに加えて、リポソームはまた、多小胞（ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ）であり得る。Ｋｉｍら，Ｂｉｏｃｈｉｍ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ７２８：３３９−３４８（１９８３）に記載のように、これらの多小胞リポソームは、球状であり、内部粒状構造を含む。外膜は、脂質二重層であり、内部領域は二層隔膜によって分離された小区画を含む。なおさらに別のリポソーム型は、オリゴラメラ小胞（ｏｌｉｇｏｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）（「ＯＬＶ」）であり、これは、いくつかの周辺脂質層に囲まれた巨大な中心区画を有する。直径が２〜１５μｍのこれらの小胞は、Ｃａｌｌｏら，Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２２（３）：２５１−２６７（１９８５）に記載されている。
【０１２７】
Ｍｅｚｅｉ，らの米国特許第４，４８５，０５４号および同第４，７６１，２８８号はまた、脂質小胞の調製方法を記載している。より最近では、Ｈｓｕの米国特許第５，６５３，９９６号がエアゾール化を利用したリポソームの調製方法を記載しており、Ｙｉｏｕｒｎａｓ，らの米国特許第５，０１３，４９７号が高速剪断混合チャンバーを利用したリポソームの調製方法を記載している。ＵＬＶ（Ｗａｌｌａｃｈ，らの米国特許第４，８５３，２２８号）またはＯＬＶ（Ｗａｌｌａｃｈの米国特許第５，４７４，８４８号および同第５，６２８，９３６号）を生成するために特定の出発物質を使用する方法も記載されている。
【０１２８】
上記脂質小胞およびその調製方法についての包括的概説は、‘Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ’，ｅｄ．Ｇ．Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＩａ．，Ｖｏｌ．Ｉ，ＩＩ  ＆  ＩＩＩ（１９８４）に記載されている。本発明での使用に適切な種々の脂質小胞を記載したこの引例および上記引例は、本明細書中で参照により援用される。
【０１２９】
提供した組成物に抱合することができる脂肪酸（すなわち、脂質）には、プロプロテインコンバターゼインヒビターをリポソームに有効に組み込むことが可能な脂肪酸が含まれる。一般に、脂肪酸は、極性脂質である。したがって、脂肪酸は、リン脂質であり得る。提供した組成物は、天然または合成のリン脂質のいずれかを含むことができる。リン脂質を、飽和または不飽和の一置換または二置換の脂肪酸およびその組み合わせを含むリン脂質から選択することができる。これらのリン脂質は、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルセリン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、パルミトイルオレオイルホスファチジルセリン、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール、パルミトイルオレオイルホスファチジン酸、パルミテライドイルオレオイルホスファチジルコリン、パルミテライドイルオレオイルホスファチジルセリン、パルミテライドイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン、パルミテライドイルオレオイルホスファチジルグリセロール、パルミテライドイルオレオイルホスファチジン酸、ミリストレオイルオレオイルホスファチジルコリン、ミリストレオイルオレオイルホスファチジルセリン、ミリストレオイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ミリストレオイルオレオイルホスファチジルグリセロール、ミリストレオイルオレオイルホスファチジン酸、ジリノレオイルホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルセリン、ジリノレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジリノレオイルホスファチジルグリセロール、ジリノレオイルホスファチジン酸、パルミチクリノレオイルホスファチジルコリン、パルミチクリノレオイルホスファチジルセリン、パルミチクリノレオイルホスファチジルエタノールアミン、パルミチクリノレオイルホスファチジルグリセロール、パルミチクリノレオイルホスファチジン酸であり得る。これらのリン脂質はまた、ホスファチジルコリン（リソホスファチジルコリン）、ホスファチジルセリン（リソホスファチジルセリン）、ホスファチジルエタノールアミン（リソホスファチジルエタノールアミン）、ホスファチジルグリセロール（リソホスファチジルグリセロール）、およびホスファチジン酸（リソホスファチジン酸）のモノアシル化誘導体であり得る。これらのリソホスファチジル誘導体中のモノアシル鎖は、パルミトイル、オレオイル、パルミトレオイル、リノレオイル、ミリストイル、またはミリストレオイルであり得る。リン脂質は合成でもあり得る。合成リン脂質は、種々の供給元（ＡＶＡＮＴＩ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌｂａｓｔｅｒ，Ａｌａ．）；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）など）から容易に購入することができる。これらの合成化合物は多様であり得、天然に存在するリン脂質で見出されない変化した脂肪酸側鎖を有し得る。脂肪酸は、ＰＳまたはＰＣのいずれかまたは両方でＣ１４、Ｃ１６、Ｃ１８、またはＣ２０鎖長の不飽和���肪酸側鎖を有することができる。合成リン脂質は、構成要素としてジオレオイル（１８：１）−ＰＳ；パルミトイル（１６：０）−オレオイル（１８：１）−ＰＳ、ジミリストイル（１４：０）−ＰＳ；ジパルミトレオイル（１６：１）−ＰＣ、ジパルミトイル（１６：０）−ＰＣ、ジオレオイル（１８：１）−ＰＣ、パルミトイル（１６：０）−オレオイル（１８：１）−ＰＣ、およびミリストイル（１４：０）−オレオイル（１８：１）−ＰＣを有し得る。したがって、例として、提供した組成物は、パルミトイル１６：０を含むことができる。
ｉｉｉ．ｉｎ  ｖｉｖｏ／ｅｘ  ｖｉｖｏ
上記のように、組成物を薬学的に許容可能なキャリア中で投与することが可能であり、当該分野で周知の種々の機構（例えば、裸のＤＮＡの取り込み、リポソーム融合、遺伝子銃によるＤＮＡの筋肉内注射、およびエンドサイトーシスなど）によってｉｎ  ｖｉｖｏおよび／またはｅｘ  ｖｉｖｏで被験体の細胞に送達させることができる。
【０１３０】
ｅｘ  ｖｉｖｏ法を使用する場合、当該分野で周知の標準的プロトコールに従って、細胞または組織を除去し、体外に保持することができる。組成物を、任意の遺伝子導入機構（例えば、リン酸カルシウム媒介遺伝子送達、エレクトロポレーション、微量注入、またはプロテオリポソームなど）によって細胞に導入することができる。次いで、形質導入された細胞を、細胞または組織型についての標準的方法によって、（例えば、薬学的に許容可能なキャリア中で）融合するか、被験体中の同位置に移植して戻すことができる。被験体への種々の細胞の移植または注入についての標準的方法は公知である。
Ｂ．方法
１．治療方法
ＮＢＳ１のＡＴＭとの相互作用を阻害する組成物を組織に投与する工程および組織に照射する工程を含む、放射線療法に対する組織の感受性を増加させる方法を本明細書中に提供する。組織は、放射線療法が望ましい任意の組織（癌または良性腫瘍（ｂｅｎｉｇｎ  ｇｒｏｗｔｈ）が含まれる）であり得る。
ｉ．癌
したがって、ＮＢＳ１のＡＴＭとの相互作用を阻害する組成物を癌に投与する工程および癌に照射する工程を含む、被験体の癌を治療する方法を本明細書中に提供する。
【０１３１】
ＮＢＳ１のＡＴＭとの相互作用を阻害する組成物を被験体に投与する工程および癌に化学療法薬を投与する工程を含む、被験体の癌を治療する方法も本明細書中に提供する。したがって、開示の方法の化学療法薬は、例えば、任意の本明細書中に開示の新生物薬（ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｄｒｕｇ）であり得る。
【０１３２】
開示の方法の癌は、無秩序の成長、浸潤、または転移を受けた被験体中の任意の細胞であり得る。いくつかの態様では、癌は、現在放射線療法を使用している任意の新生物または腫瘍であり得る。あるいは、癌は、標準的方法を使用した放射線療法に十分な感受性を示さない新生物または腫瘍であり得る。したがって、癌は、肉腫、リンパ腫、白血病、癌腫、芽腫、または胚細胞腫瘍であり得る。開示の組成物を使用して治療することができる代表であるが制限されない癌のリストには、リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉症、ホジキン病、骨髄性白血病、膀胱癌、脳腫瘍、神経系癌、頭頸部癌、頭頸部の扁平上皮癌、腎臓癌、肺癌（小細胞肺癌および非小細胞肺癌など）、神経芽細胞腫／膠芽細胞腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、肝臓癌、黒色腫、口腔、咽頭、喉頭、および肺の扁平上皮癌、結腸癌、子宮頸癌、子宮頸癌、乳癌、上皮癌、腎癌、尿生殖器癌、肺癌、食道癌、頭頸部癌、大腸癌、造血器癌（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）；睾丸癌；結腸癌および直腸癌、前立腺癌、および膵臓癌が含まれる。
ａ．頭頸部癌
提供した組成物および方法を使用して、頭頸部癌を治療することができる。頭頸部癌患者では、一次治療および術後治療として照射を使用することができる。時折、化学療法と組み合わせて照射を行う。放射線療法の最も有益な結果の１つは、声帯癌患者における咽頭保存である。その位置のために、鼻咽喉癌を、主に放射線療法で治療する。腫瘍が再発するようなことがあれば、多数の患者は、首尾よく再治療することができる。術後、辺縁陽性またはクローズマージン（ｃｌｏｓｅ  ｍａｒｇｉｎ）を有する巨大な広範囲にわたる侵襲性腫瘍を有する患者および陽性リンパ節を有する患者は、局所的（ｌｏｃａｌ）または局所性（ｒｅｇｉｏｎａｌ）の再発リスクが高い。放射線療法は、これらの腫瘍の局所制御の機会が増大し、しばしば、頭頸部腫瘍患者の生存率を改善する。
ｂ．皮膚癌
提供した組成物および方法を使用して、皮膚癌を治療することができる。皮膚癌を、照射を使用して最初または術後に治療することができる。一般に、一次治療は、手術による美容的結果が適切でないかもしれない領域でのみ使用される。最も一般的には、これらの領域には、鼻、耳、上唇および唇交連、瞼、および眼角の周辺領域が含まれる。同様に、術後照射により、高リスク患者の局所制御が増大する。
ｃ．中枢神経系腫瘍
提供した組成物および方法を使用して、中枢神経系癌を治療することができる。これらの腫瘍では、腫瘍が手術不可能な位置にあるので、一次放射線療法を必要とし得る。しかし、最も一般的には、術後照射を使用する。放射線療法は、多数の高悪性度のグリオーマ患者およびいくらかの低悪性度のグリオーマ患者の生存率を改善する。新規の原体照射療法および定位放射線療法は、三次元技術を使用して治療ビームをより正確に集中させ、より高い線量の照射を安全且つ正確に照射可能である。これらの技術は、脳腫瘍の治療で特に有望であり得る。
ｄ．尿生殖器癌
提供した組成物および方法を使用して、尿生殖器癌を治療することができる。選択された浸潤性膀胱癌患者では、化学療法と共に使用する照射は、膀胱およびその機能の保存を補助することができる。前立腺癌を、最初または術後に照射で治療することができる。根治的前立腺適除および一次放射線療法による前立癌患者の無病生存率の機会は病期間で同一のようである。最近、アンドロゲン遮断（ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｂｌｏｃｋａｄｅ）が局所制御を強化し、生存率を改善することが見出された。放射線療法は、特に、原体照射療法または放射性シード移植片（ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  ｓｅｅｄ  ｉｍｐｌａｎｔ）を使用する場合、前立腺癌患者の罹患率の低下に関連する。照射を使用して、しばしば、他の療法を用いてもよく起こるインポテンスおよび失禁の発症を回避することが可能である。
【０１３３】
前立腺適除し、局所的再発のリスクが高い患者（辺縁陽性または高レベルの前立腺特異抗原（ＰＳＡ）を有する腫瘍患者など）では、照射によって局所制御および生存率を改良することができる。早期精巣セミノーマ患者は、根治的精巣摘除術後に低線量照射で治療した場合生存率が非常に高い。
ｅ．婦人科腫瘍
提供した組成物および方法を使用して、婦人科腫瘍を治療することができる。早期（Ｉ期）子宮頸癌を、放射線療法を使用して、手術と同程度の有効性で治療することができる。後期（ＩＩ期およびＩＩＩ期）腫瘍は、照射での治療が最適である。組織学的特徴が好ましくない多数の子宮頸癌および子宮内膜癌を、術後照射で制御することがより良い。一定の卵巣癌患者は、術後に投与される腹腔内放射性リンから恩恵を受けることができる。しばしば非常に広範に手術する必要があり、しばしば患者が高齢者であるので、膣癌および外陰癌を、頻繁に、放射線療法で治療する。
ｆ．乳癌
提供した組成物および方法を使用して、乳癌を治療することができる。照射により、原発性乳癌の管理が劇的に変化した。乳腺腫瘤摘出および放射線療法を使用した乳房温存（ｂｒｅａｓｔ  ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ）は、早期乳癌の最適な治療法である。ほとんどの患者で美容的結果が良好であり、生存率を犠牲にしない。乳腺腫瘤摘出のみを使用して管理することができる低リスクの患者の同定が試みられているが、これまでのところ、全患者群で、照射を加えた方がより良く局所制御される。局所的に進行した乳癌を有する多数の患者は、放射線療法を使用した局所制御で改善が認められ、照射後の生存率が増加する。
ｇ．胃腸管腫瘍
提供した組成物および方法を使用して、胃腸管腫瘍を治療することができる。食道癌は、通常、患者が治療を模索するまでに進行している。化学療法と共に使用した放射線療法は、ほとんどの食道癌患者で手術と同様に有効なようである。選択された患者では、術前化学放射線療法により、最良の結果を得ることができる。胃癌患者も、しばしば、進行性疾患を示す。いくつかの研究により、これらの患者における最良の治療は、腫瘍が切除可能である場合は術後化学放射線療法であり、切除不可能である場合は化学放射線療法のみであることが示唆されている。同様に、術後化学放射線療法または化学放射線療法のみは、切除可能および切除不可能な膵臓癌の好ましい治療である。
【０１３４】
局所的に進行した結腸癌を有する一定の高リスク患者は、補助放射線療法を使用して局所制御および生存率をより良好にすることができる。しばしば化学療法と共に行われる術前放射線療法により、進行性直腸癌または下部（ｌｏｗ−ｌｙｉｎｇ）直腸癌をダウンステージする（ｄｏｗｎｓｔａｇｅ）ことができ、括約筋の切除および温存が可能になる。高リスク外科患者では、放射線療法も術後に有益であり得る。優れた結果および括約筋保存が可能であるので、肛門癌および肛門周囲癌は、通常、複合照射および化学療法で治療する。
ｈ．肺癌
提供した組成物および方法を使用して、肺癌を治療することができる。肺癌は、可能ならいつでも外科的に治療すべきである。術後照射により、一定の高リスク外科患者における局所制御が改善され、生存率を改善することができる。切除不可能な肺癌を、時折、術前照射によって切除可能にすることができる。切除が可能でない場合、照射および化学療法を組み合わせたアプローチが好ましい。化学療法を、放射線療法の前または同時に施すことができる。
ｉ．肉腫
提供した組成物および方法を使用して、肉腫を治療することができる。機能を温存した広範囲局所切除は、軟組織肉腫に適用される。術前照射または術後照射を受ける高リスク患者は、局所制御および生存率の改善を示す。腫瘍の萎縮により、術前照射によって手術をより制限して局所制御を改善することができ、患肢温存も可能である。
ｊ．リンパ腫
提供した組成物および方法を使用して、リンパ腫を治療することができる。いくらかの非ホジキンリンパ腫患者またはホジキンリンパ腫患者を、放射線療法を使用して最良に治療することができる。多数の低悪性度非ホジキンリンパ腫患者を照射のみで治療することができ、優れた局所制御が得られる。Ｉ期またはＩＩ期の高悪性度非ホジキンリンパ腫を有するいくらかの患者は、化学療法後に照射を使用して、より良好な生存率が得られる。早期疾患を有する選択された患者におけるホジキンリンパ腫を、照射のみまたは化学療法と組み合わせて治療すべきである。放射線療法は、より進行したホジキンリンパ腫の制御を補助することもできる。
ｋ．小児癌
提供した組成物および方法を使用して、小児癌を治療することができる。小児癌患者は、中枢神経系腫瘍（上衣腫、星状細胞腫、髄芽腫、胎児性腫瘍、脳幹部神経膠腫、頭蓋咽頭腫、松果体部腫瘍、小脳星状細胞腫、視神経膠腫、網膜芽細胞腫、脊髄腫瘍）、神経芽細胞腫、リンパ腫、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫、およびウィルムス腫瘍の照射から恩恵を受けることができる。
１．緩和ケア
提供した組成物および方法を、緩和ケアに使用することができる。転移癌患者では、照射により、しばしば、生活の質が改善され、生存率も改善される。照射は、骨転移の痛みを除去し、体重支持骨の病理骨折を防止することができる。一般に、照射によって得られる鎮痛により、鎮痛剤および薬物の副作用が軽減される。癌の結果としての脊髄圧迫は緊急事態であり、しばしば、放射線療法のみで有効に治療することができる。背部痛、四肢の脆弱性、または腸もしくは膀胱調節に関連する問題を有する患者を直ちに評価して、脊髄圧迫を除外すべきである。上大静脈症候群（別の潜在的な緊急事態）は、通常、放射線療法に対して十分に応答する。患者は、通常、呼吸困難、起坐呼吸、ならびに頸部および上肢における静脈系鬱血を示す。同様に、癌に起因する気道圧迫を、しばしば、放射線療法によって有効に治療することができる。短期間の照射により、脳転移患者における生存期間の中央値および生活の質を改善することができる。唯一の臨床的疾患が単一の脳転移である場合、手術と全脳照射との組み合わせアプローチまたは定位照射と全脳照射との組み合わせアプローチのいずれかにより、生存率の中央値が最も劇的に改善される。
ｉｉ．良性疾患
提供した組成物および方法を使用して、良性疾患を治療することができる。例えば、放射線療法を使用して、以下を治療することができる：エナメル芽細胞腫、動脈瘤様骨嚢腫、血管線維腫、動静脈奇形、化学感受体腫、脊索腫、頭蓋咽頭腫、硬性線維腫、グレーブス眼病、前立腺癌のホルモン管理に関連する女性化乳房、血管腫、異所性骨形成、脾機能亢進、ケロイド、ケラトアカントーマ、髄膜腫、ペーロニ病、下垂体腺腫、翼状片、自己免疫疾患または臓器移植術のための全リンパ照射、三叉神経痛、甲状腺眼症、および血管再狭窄の防止。
ａ．三叉神経痛
したがって、ＮＢＳ１のＡＴＭとの相互作用を阻害する組成物を三叉神経に投与する工程および三叉神経に照射する工程を含む、被験体の三叉神経痛を治療する方法を本明細書中に提供する。
【０１３５】
三叉神経痛は、眼、唇、鼻、頭皮、額、および顎に激痛発作を引き起こす三叉神経の神経障害である。三叉神経痛は、最も痛みのある容態と見なされ、かなり多数が有効な治療が発見される前に自殺していたので、以前は自殺疾患（ｓｕｉｃｉｄｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）と呼ばれていた。推定１５０００人に１人が三叉神経痛を発症するが、この数は、頻繁な誤診により、さらに著しく多い可能性がある。
【０１３６】
三叉神経は、第Ｖ脳神経（下顎輪郭より上の顔に由来するタクティション（ｔａｃｔｉｔｉｏｎ）（圧力）、サーモセプション（ｔｈｅｒｍｏｃｅｐｔｉｏｎ）（温度）、および侵害受容（疼痛）などの感覚データ担う混合脳神経）であり、咀嚼筋（咀嚼に関与するが、顔の表情には関与しない筋肉）の運動機能も担う。この疼痛症候群の考えられる原因を説明するための理論がいくつか存在する。血管が橋とのその連結付近の三叉神経を圧迫する可能性が高いという説明が有力である。上小脳動脈は、最も引用されている原因（ｃｕｌｐｒｉｔ）である。かかる圧迫は、神経の防護髄鞘（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｍｙｅｌｉｎ  ｓｈｅａｔｈ）を損傷し、迷走および過活動するように神経を機能させる。これにより、神経に支配された任意の領域が最も小さな刺激で疼痛発作を起こし、刺激終了後に疼痛シグナルを遮断する神経の能力を妨害し得る。この損傷型は、動脈瘤（血管のアウトパウチング（ｏｕｔｐｏｕｃｈｉｎｇ））；腫瘍；小脳橋角中のクモ膜嚢胞、または乗用車事故または舌の貫通などの外傷にも起因し得る。２〜４％のＴＮ患者（通常、若年）は、多発性硬化症の証拠があり、多発性硬化症は、三叉神経または脳の他の関連部分のいずれかを損傷し得る。構造上の原因が存在しない場合、この症候群を特発性と呼ぶ。帯状疱疹後に起こる疱疹後神経痛は、三叉神経が影響を受ける場合に類似の症状を生じ得る。
【０１３７】
γナイフまたはＮｏｖａｌｉｓシェープビーム（Ｎｏｖａｌｉｓ  ｓｈａｐｅｄ  ｂｅａｍ）などの類似の放射線外科デバイスを使用して、神経を損傷させて疼痛シグナル伝達を防止することができる。この手順に切開は関与しない。このデバイスは神経根を衝撃するために照射を使用し、この時点で血管圧迫がしばしば見出される地点での選択的損傷を狙う。この選択肢を、特に、長期の全身麻酔に医学的に適合しないか、凝血防止のために投薬（例えば、ワルファリン）を受けている患者に使用する。
【０１３８】
したがって、開示の組成物を使用して、放射線外科手順前に神経の放射線感受性を増感させることができる。
ｂ．翼状片
ストロンチウムの局所適用は、外科的に切除した眼の翼状片の局所再発の防止に役立ち得る。表層の低線量照射治療は、外科的に切除したケロイドの局所再発の防止に役立ち得る。放射線療法をしばしば使用して、下垂体腺腫が最小の罹患率で首尾よく治療される。低線量照射は、しばしば、他の治療型が失敗した選択された患者でグレーブス眼病を改善することができる。同様に、他の治療に対する応答に失敗したケラトアカントーマは、通常、照射に十分に応答する。血管腫も低線量照射に十分に応答する。放射線療法は、高リスクデスモイドおよびペーロニ病の制御に役立ち得る。いくらかの術後整形外科患者では、低線量照射は異所性骨形成の防止に役立ち得る。最後に、奇形が手術不可能である場合、中枢神経系の動静脈奇形を、定位放射線療法を使用して除去することができる。
【０１３９】
ＮＢＳ１のＡＴＭとの相互作用を阻害する組成物を結膜に投与する工程および結膜に照射する工程を含む、被験体の翼状片の治療方法も本明細書中に提供する。
【０１４０】
翼状片は、結膜の良性腫瘍ということができる。あるいは、翼状片は、頸部、瞼、膝、肘、足首、または指に生じる任意の翼様の三角形の膜をいう（Ｊ  Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｂ  ２００４，１３：１９７−２０１）。例は、脚に発症する膝窩翼状片症候群（ｐｏｐｌｉｔｅａｌ  ｐｔｅｒｙｇｉｕｍ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）である。
【０１４１】
結膜に関連する場合、翼状片は、一般に、強膜の鼻側から成長する。翼状片は、紫外線曝露（例えば、日光）、低い湿度、および埃に関連し、これらによって発症すると考えられる。鼻側の翼状片の支配は、おそらく、角膜を通して側面に沿って通過する太陽光の結果であり、この太陽光が屈折して周辺領域に集中するようになる。日光は、眼の側面から妨害されることなく通過し、角膜通過後に縁内側に集中する。しかし、反対側では、鼻の影が側面／側頭部の縁に集中した日光の強度が内側で減少する。
【０１４２】
結膜中の翼状片は、コラーゲンの弾性線維様分解（ｅｌａｓｔｏｔｉｃ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）および線維性血管増殖によって特徴づけられる。これは、翼状片の頭部（ｈｅａｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｔｅｒｙｇｉｕｍ）と呼ばれる進行部分を有し、この頭部は、頸部（ｎｅｃｋ）によって翼様片の本体に連結している。時折、翼様片の頭部に隣接して鉄分の沈着線が認められ、これを、ストッカー線と呼ぶ。線の位置は、成長パターンを示し得る。良性腫瘍である場合、瞳孔を覆って視界を妨げる範囲に成長しない限り、治療の必要はない。いくらかの患者は、成長が非常に見苦しくなる場合に手術を選択することもできる。正確な原因は不明であるが、風、日光、または砂への過剰な曝露に関連する。側面が保護された防護サングラスおよびつば広帽の着用ならびに終日の人工涙液の使用は、その形成の防止またはさらなる成長の停止に役立ち得る。サーファーおよび他の水上競技の選手について、水からの紫外線を１００％遮断する遮光保護具を装着すべきである。
【０１４３】
時折、翼様片は、長時間日向で過ごした中高年の患者での偶発的所見として見出される。翼状片は、サーフィン、ウェークボード、およびカイトボードを行う若年の男性および女性でも認められ、これは、水から反射した紫外線に対する過剰な曝露に起因する。スキーヤーおよびスノーボーダーは、雪上で眼を防御しているので、水上競技の選手も紫外線に留意してその眼を防護する必要がある。
【０１４４】
患者の症状を人工涙液で治療することができる一方で、翼状片を軽減し、さらに進行を防止するための信頼できる医学的治療は存在しない。外科的除去によってのみ限定的治療を行う。完全な外科的矯正後でさえも翼状片は再発し得るので、長期追跡が必要である。
ｃ．甲状腺眼症
ＮＢＳ１のＡＴＭとの相互作用を阻害する組成物を眼に投与する工程および眼に照射する工程を含む、被験体の重症甲状腺眼症の治療方法も本明細書中に提供する。
【０１４５】
甲状腺眼症は、しばしば、活動亢進甲状腺を発症する患者で起こる。眼窩中の筋肉および他の組織の腫脹により、眼が前に押し出され、より突き出すようになる。眼は、しばしば、よりじろじろとした目つきになる。より重症な場合、腫脹によって眼球を動かす筋肉が硬くなり得る。これにより、「斜視」を発症し、複視になり得る。時折、眼球後部の腫脹によって眼から脳への神経が圧迫され、失明し得る。甲状腺眼症は、甲状腺オフタモパシー（ｔｈｙｒｏｉｄ  ｏｐｔｈａｌｍｏｐａｔｈｙ）、グレーブス眼疾患（Ｇｒａｖｅｓ’  ｅｙｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）、または甲状腺機能異常眼症（ｄｙｓｔｈｙｒｏｉｄ  ｅｙｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）とも呼ばれる。
【０１４６】
甲状腺の活動亢進は、通常、「自己免疫容態」によって生じる。これは、通常は感染から身体を防御する細胞が「過ちを犯し」、甲状腺を異物と認識し、攻撃しはじめることを意味する。これによって甲状腺が刺激されて、過剰な甲状腺ホルモンを産生する。攻撃過程は、眼の後部の細胞に波及し、腫脹し得る。
【０１４７】
放射線療法を、眼球後部の組織に施すことができる。放射線療法は、通常、２週間にわたって１０回行われる。患者の２／３は有意に有益であったが、残念ながら、１／３は有益でなく、眼窩減圧術などの他の療法が必要である。しばしば、この療法を、ステロイドおよび免疫抑制と組み合わせる。
ｄ．ケロイド
ＮＢＳ１のＡＴＭとの相互作用を阻害する組成物を瘢痕ケロイドに投与する工程および瘢痕ケロイドに照射する工程を含む、被験体の瘢痕ケロイドの治療方法も本明細書中に提供する。
【０１４８】
ケロイドは、治癒した皮膚損傷部位の組織が過成長する瘢痕型である。ケロイドは、固いもしくは弾性のある病変または光沢のある線維性小結節であり、桃色から肉色または赤色から暗褐色に変化し得る。瘢痕ケロイドは、良性且つ非伝染性であり、通常、重篤な痒み、鋭痛、および質感の変化を伴う。重症な例では、皮膚の運動に影響を及ぼし得る。ケロイドは肥厚性瘢痕と混同すべきではない。肥厚性瘢痕は、最初の創傷の境界状に成長せず、経時的に減少し得る盛り上がった瘢痕である。
【０１４９】
ケロイドは、正常な皮膚上の爪様に成長して拡大する。ケロイドは、刺すような痛みまたは前兆のない痒みを生じるが、感覚の程度は患者によって異なる。ケロイドが感染するようになる場合、ケロイドは潰瘍を起こし得る。唯一の治療法は、瘢痕を完全に除去することである。
【０１５０】
ケロイドは、瘢痕組織内で形成される。創傷治癒で使用されるコラーゲンは、この領域を過成長させる傾向があり、時折、最初の瘢痕よりも何倍も大きな塊を生成する。ケロイドは、通常、損傷部位で生じるが、自発的にも生じ得る。ケロイドは突き刺し部位で生じ得るが、面皰または掻爬ほどの単純なものからでさえも生じ得る。ケロイドは、重症座瘡または水痘瘢痕、創傷部位の感染、反復創傷領域、創縫合時の過剰な皮膚の引張り、または創傷内の異物の結果として生じ得る。
【０１５１】
電子ビーム照射を、内部臓器に影響を及ぼすのに十分に深く身体を貫通しないレベルで使用することができる。慣用電圧照射は、より貫通するが、わずかにより有効である。放射線療法は、手術直後に使用する場合、瘢痕形成を減少させる一方で、手術創が治癒する。
ｅ．異所性骨化
ＮＢＳ１のＡＴＭとの相互作用を阻害する組成物を組織に投与する工程および組織に照射する工程を含む、被験体の異所性骨化の治療方法も本明細書中に提供する。
【０１５２】
異所性骨化（ＨＯ）は、骨外性軟組織内の真の骨（ｔｒｕｅ  ｂｏｎｅ）の異常な形成である。古典的には、この共通の特徴を有する多数の疾患が化骨性筋炎（嫌悪感（ｄｉｓｆａｖｏｒ）に分類される用語）のカテゴリーにまとめられていた。これは、原発性筋炎が必要な前兆ではなく、且つ、骨化は、筋膜、腱、他の間葉軟組織で頻繁に好発し、骨化が常に筋肉組織中で起こるわけではないからである。
【０１５３】
伝統的には、種々のＨＯ型が臨床的状況、病変の位置、および病変が進行性または孤立性のいずれで発症するかどうかに従って分類されている。用語「外傷性化骨性筋炎」を、鈍的損傷、手術、または熱傷などの外傷の再現（ｒｅｃａｌｌｅｄ  ｔｒａｕｍａ）後に生じるＨＯに適用する。論理的には、外傷の誘発を同定することができない場合、病変を非外傷性化骨性筋炎と呼ぶ。病変は、皮下脂肪に制限される場合に骨化性脂肪織炎（ｐａｎｎｉｃｕｌｉｔｉｓ  ｏｓｓｉｆｉｃａｎｓ）と分類され、内転筋中で見出される場合に乗馬骨と分類され、三角筋中に存在する場合にシューターボーン（ｓｈｏｏｔｅｒ’ｓ  ｂｏｎｅ）と分類されている。
【０１５４】
ＨＯと脊髄損傷との間に強い関連性があり、共に複数の部位で発症し、再発するという強い傾向がある。同様に、関節周囲のＨＯは外傷性脳損傷患者で認められ、ＨＯの範囲および機能的重症度は、頭蓋内損傷の重症度に直接関連する。神経障害（ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃ  ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅ）（破傷風、灰白髄炎、ギラン・バレー症候群、および機械的換気中の長期の薬理学的麻痺が含まれる）の多数の他の原因もＨＯ形成に関連している。
【０１５５】
進行性骨化性線維異形成（ＦＯＰ）（すなわち、ミュンクマイエル病）は、筋膜面、筋肉、腱、および靭帯が進行性骨化を生じる、常染色体優性の重症に身体に障害を引き起こす疾患である。母指の先天性奇形は、ＦＯＰに関連する。ＨＯは、いくつかの他の疾患（オールブライト遺伝性骨異栄養症（Ａｌｂｒｉｇｈｔ  ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  ｏｓｔｅｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、進行性骨性異形成（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｏｓｓｅｏｕｓ  ｈｅｔｅｒｏｐｌａｓｉａ）、および原発性皮膚骨腫が含まれる）の特徴である。
【０１５６】
ＨＯは、罹患軟組織内で休止している前骨芽幹細胞（ｏｓｔｅｏｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）を起源とする。適切な刺激があれば、幹細胞は骨芽細胞に分化し、オステオイド形成過程を開始し、最終的に、成熟異所骨になる。種々の骨形成タンパク質（ＢＭＰ）は、実験的に軟組織に沈着した場合にＨＯを刺激することができる。それにより、ＢＭＰがＨＯの開始に役割を果たすことが示唆される。ある程度の神経学的制御が暗示しているが、十分に理解されていない。
ｉｉｉ．放射線療法
放射線療法は、悪性細胞のＤＮＡ損傷によって作用する局所治療法である。正常細胞は、腫瘍細胞よりもこの損傷の修復能力が高い。放射線療法は、この相違を活用する。損傷細胞が治療直後に死滅しないので、放射線療法が首尾よく完了した後に腫瘍がしばしば生き残ることに留意することが重要である。
【０１５７】
処置・処方（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｐｒｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）は、治療目的および副作用の可能性に基づく。一連の治療は、短くて１日または長くて１０週間であるが、典型的な持続時間は２週間と７週間との間であり、通常、１週間に５日間の治療からなる。患者は、最も一般的には、治療ビームとして使用すべき電子を加速させるか、治療ビームとして使用すべきＸ線を発生する線形加速装置によって照射する。治療は痛みを伴わず、しばしば、５分未満持続する。
【０１５８】
治療目的は、治癒または姑息的である。放射線療法で治癒する可能性がある場合、治療期間はしばしばより長く、通常、長期間にわたってより少ない１日量を照射する。このアプローチによって遅発性副作用が最小になる。治療が厳格に言えば姑息的であることを意図する場合、より短い期間にわたるより高い１日治療量からなるより短期の治療スケジュールを使用する。かかる場合、遅発性副作用は、患者の寿命内に起こりそうにない。さらに、より短期の治療プログラムは、患者の余命に負の影響を及ぼす程度が低い。
【０１５９】
照射は局所療法であるので、副作用は、通常、治療領域に限定される。しかし、倦怠は、１つの一般的な全身症状である。通常、照射の副作用は軽度であるが、時折、重症である。副作用を、早発性影響および遅発性影響に分類することができる。早発性影響は、治療中または治療直後に起こり、典型的には、治療から３〜６週間以内に解決する。遅発性副作用は治療から数ヵ月後〜数年後に起こり、しばしば永続する。これらの影響は、組織損傷の結果であり、壊死または瘢痕化し、稀に、発癌する。放射線療法に続発する悪性疾患の発症は、周知となっている。患者によっては多くの遺伝因子によって二次癌を生じやすいことが真実である一方で、照射も相対リスク増加の一因である。本明細書中に開示の組成物および方法は、必要な照射量の減少によってこれらの副作用を軽減することができる。
【０１６０】
放射線療法は、潜在的に多数の特定の適応症がある。放射線療法を、原発性腫瘍治療、術前療法もしくは術後療法、または併用療法もしくは強化療法の構成要素として施すことができる。
【０１６１】
放射線療法は、癌患者のほぼ２／３に適切であり、治癒目的および姑息的目的で使用する。多数の腫瘍（前立腺癌、乳癌、頭頸部癌、肺癌、脳腫瘍、胃腸の腫瘍、肝臓癌、軟組織肉腫、子宮頸癌、リンパ腫など）に、治療レジメンの一部として放射線療法を施すであろう。放射線療法には、外部ビーム照射（Ｘ線、γ線、陽子、および中性子など）、近接照射療法、および放射性物質の実行（ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）が含まれる。放射線療法を、二次元放射線療法、三次元放射線療法、原体放射線療法、強度変調放射線療法（ＩＭＲＴ）、および画像誘導調放射線療法（ＩＧＲＴ）アプローチで行うことができる。ほとんどの固形腫瘍のための標準的な放射線療法は、２Ｇｙ／日で照射し、総線量は約６０Ｇｙ（５０〜７０Ｇｙ）である。しかし、特定の被験体、装置、および腫瘍型に基づいて好ましい線量を選択することは、当業者の日常業務である。本発明の方法は、癌細胞の照射に対する感受性を増大させることによって既存の放射線療法を改良する。例えば、提供した方法により、癌細胞の照射に対する感受性を、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％またはそれを超えて高くすることができる。本明細書中で使用する場合、用語「感受性」および「放射線感受性」は、ある線量の照射に基づいた細胞の生存数をいう。したがって、放射線感受性の増加により、ある線量の照射での細胞の生存数が減少するか、致死に必要な線量が減少するか、その組み合わせが可能である。
【０１６２】
密封線源放射線療法またはエンドキュリー療法（ｅｎｄｏｃｕｒｉｅｔｈｅｒａｐｙ）としても公知の近接照射療法は、放射性線源（ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  ｓｏｕｒｃｅ）を治療を必要とする領域の内部またはその隣りに配置する放射線療法形態である。逆に、外部ビーム放射線療法（すなわち、遠隔照射療法）は、線形加速装置によって外部に生成された照射の適用である。一般に近接照射療法を使用して、局在性前立腺癌および頭頸部癌を治療する。
【０１６３】
近接照射療法には、モールド近接照射療法（Ｍｏｌｄ  ｂｒａｃｈｙｔｈｅｒａｐｙ）、ストロンチウムプラーク療法（Ｓｔｒｏｎｔｉｕｍ  ｐｌａｑｕｅ  ｔｈｅｒａｐｙ）、間質小線源治療、腔内小線源治療、および血管内小線源治療が含まれる。モールド近接照射療法では、表在性腫瘍を、皮膚の近くに配置した密封線源を使用して治療することができる。線量計測を、しばしば、マンチェスター法（確実に全標的体積に対する線量を規定の線量の１０％以内にするようにデザインした規則に基づいたアプローチ）を参照して行う。表面アプリケータは、通常、ストロンチウムプラーク療法で必要であり、厚さ１ｍｍ未満の非常に表層の病変のために使用される。プラークは、放射性ストロンチウム９０粉末塩を含む中空の薄い銀ケーシングである。ストロンチウムの放射性崩壊から生成されたβ（電子）粒子は、透過性が非常に浅い。典型的には、Ｓｒ９０プラークを、切除した翼状片のベッド上に配置する。約１０〜１２Ｇｙの開始用量（ｓｔａｔ  ｄｏｓｅ）を、接触時期を選択することによって送達させる。電子が大気の数ｍｍしか透過しないので、放射線防護問題はわずかに少なくなるが、他の放射線源と非常に異なる。眼の強膜上に配置したプラークを除去する必要があるが、銀ケーシングが薄くて容易に傷がつくので穏やかに行わなければなない。ストロンチウムは、カルシウムと同一の化学的クラス（すなわち、アルカリ土類金属）に属するので、任意のストロンチウム塩が眼と接触して吸収する場合に骨において共存するであろう。オペレーターは、その本体から顔をそらすようにアプリケータを保持することによってβ線への曝露を防止することができる。間質小線源治療では、線源を組織内に挿入する。この種の第１の治療は、マンチェスター法に従って準備したラジウム２２６を含むニードルを使用したが、現代の方法はイリジウム１９２ワイヤーを使用する傾向がある。イリジウムワイヤーを、マンチェスター法またはパリ法のいずれかを使用して準備することができる。後者は新規の核種を活用するために特にデザインされた。ヨウ素１２５シードを使用した前立腺癌治療も、間質小線源治療に分類される。γ放出体の詳細については、一般的に使用されるγ放射同位体を参照のこと。腔内小線源治療は、線源を既存の体腔内に配置する。この方法は、事実上産婦人科疾患で最も一般的に適用されているが、上咽頭に対しても実施することができる。血管内小線源治療は、線源を有するカテーテルを脈管構造内に配置する。この方法を、ステント内再狭窄で最も一般的に適用されているが、この療法は、末梢脈管構造狭窄治療での使用も調査されている。
【０１６４】
高線量率（ＨＤＲ）近接照射療法は、一般的な近接照射療法である。カテーテル形態のアプリケータを、通常、マンチェスター法またはパリ法にしたがうか患者に応じて準備する。高線量率の線源（しばしば、イリジウム１９２、Ｉｒ−１９２）を、装置によってワイヤの末端上のカテーテルに沿って駆動する一方で、患者を室内に隔離する。線源を、事前に設定した期間で予め計画した位置に配置し、その後にカテーテルに沿って進行させ、これを繰り返して必要な線量分布に増加させる。放射性線源の直接埋め込みを超えるこの治療の利点は、スタッフの被爆がより少なく、スタッフ曝露の低さによって線源の放射能をより高くでき、それにより、治療時間がより速くなることである。
【０１６５】
高線量率（ＨＤＲ）と同様に、低線量率（ＬＤＲ）は、放射性物質の埋め込みを含み、これを、一過性または恒久的に埋め込むことができる。装置を使用したＬＤＲ近接照射療法は、類似の方法で作用する。別の変形形態は、線源が、装置を使用して患者に再度駆動する活性または不活性のボールの形態であることである。
【０１６６】
いくつかの態様では、開示の方法は、さらに、被験体の健康な組織に放射線防護剤を投与する工程を含むことができる。一般に、放射線防護剤は、フリーラジカルを補足し、酸化による損傷を防止する組成物を含むであろう。
ｉｖ．化学療法
大多数の化学療法薬を、以下のように分類することができる：アルキル化剤、代謝拮抗物質、アントラサイクリン、植物アルカロイド、トポイソメラーゼインヒビター、モノクローナル抗体、および他の抗癌剤。これらの全薬物は、細胞分裂またはＤＮＡ合成に影響を及ぼす。いくつかの新規の薬剤は、ＤＮＡを直接干渉しない。これらには、新規のチロシンキナーゼインヒビターであるメシル酸イマチニブ（グリベック（登録商標）またはグリベック（登録商標））が含まれ、これは、一定の癌型（慢性骨髄性白血病、消化管間質腫瘍）における分子の異常を直接ターゲティングする。さらに、腫瘍細胞を直接攻撃することなく腫瘍細胞の挙動を調整するいくつかの薬物を使用することができる。ホルモン治療は、この補助療法カテゴリーに分類される。
【０１６７】
開示の方法の化学療法薬はアルキル化剤であり得る。アルキル化剤、細胞中に存在する条件下で多数の電気陰性基にアルキル基を付加する能力により、このように命名されている。シスプラチンおよびカルボプラチンならびにオキサリプラチンはアルキル化剤である。他の薬剤は、メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシルである。これらは、細胞ＤＮＡの化学修飾によって作用する。
【０１６８】
開示の方法の化学療法薬は、代謝拮抗物質であり得る。代謝拮抗物質は、プリン（（アザチオプリン、メルカプトプリン））またはピリミジンになりすまし、ＤＮＡの基礎単位になる。代謝拮抗物質は、これらの物質が（細胞周期の）「Ｓ」期にＤＮＡに組み込まれるようになるのを防止し、正常な発達および分裂を停止させる。代謝拮抗物質は、ＲＮＡ合成にも影響を及ぼす。その有効性により、これらの薬物は、最も広く使用されている細胞増殖抑制剤である。
【０１６９】
開示の方法の化学療法薬は、植物アルカロイドまたはテルペノイドであり得る。これらのアルカロイドは、植物に由来し、微小管機能の防止によって細胞分裂を遮断する。微小管は、細胞分裂に極めて重要であり、微小管無しでは細胞分裂できない。主な例は、ビンカアルカロイドおよびタキサンである。
【０１７０】
開示の方法の化学療法薬は、ビンカアルカロイドであり得る。ビンカアルカロイドは、チューブリンの特定の部位に結合し、チューブリンの微小管へのアセンブリ（細胞周期のＭ期）を阻害する。これらは、マダガスカルニチニチソウ、カサランツ・ロセウス（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ  ｒｏｓｅｕｓ）（以前はツルニチニチソウとして公知）に由来する。ビンカアルカロイドには、以下が含まれる：ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン、およびポドフィロトキシン。ポドフィロトキシンは、２つの他の細胞増殖抑制薬であるエトポシドおよびテニポシドを産生するために使用される植物由来化合物である。これらは、細胞のＧ１期（ＤＮＡ複製の開始）への侵入およびＤＮＡの複製（Ｓ期）を防止する。正確なその作用機構は依然として解明されていない。この物質は、アメリカメイアップル（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍａｙａｐｐｌｅ）（ポドフィルム）から最初に得られた。最近、ヒマラヤメイアップル（ポドフィルム・ヘキサンドルム（Ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｈｅｘａｎｄｒｕｍ））は、さらにより大量にこの物質を含むことが発見されが、この植物は絶滅寸前であるので、その供給量は限られている。物質の産生に関与する遺伝子を単離する研究が行われており、その結果、組換えによって得ることができる。
【０１７１】
開示の方法の化学療法薬は、タキサンであり得る。タキサンの原型は、タキソールとしても公知の天然産物のパクリタキセルであり、西洋イチイ（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｙｅｗ  ｔｒｅｅ）の樹皮から最初に得られた。ドセタキセルは、パクリタキセルの半合成アナログである。タキサンは、微小管の安定を増強し、後期の染色体の分離を防止する。
【０１７２】
開示の方法の化学療法薬は、トポイソメラーゼインヒビターであり得る。トポイソメラーゼは、ＤＮＡのトポロジーを維持するのに不可欠な酵素である。Ｉ型およびＩＩ型トポイソメラーゼの阻害により、適切なＤＮＡのスーパーコイル化の混乱によってＤＮＡの転写および複製の両方を干渉する。いくつかのＩ型トポイソメラーゼインヒビターには、カンプトセシン、イリノテカン、およびトポテカンが含まれる。ＩＩ型インヒビターの例には、アムサクリン、エトポシド、エトポシドホスファート、およびテニポシドが含まれる。これらは、エピポドフィロトキシン（アメリカメイアップル（ポドフィルム）の根中に天然に存在するアルカロイド）の半合成誘導体である。
【０１７３】
開示の方法の化学療法薬は、抗腫瘍抗生物質（抗新生物薬）であり得る。最も重要なこの群由来の免疫抑制薬は、ダクチノマイシンであり、腎臓移植で使用される。
【０１７４】
開示の方法の化学療法薬は、（モノクローナル）抗体であり得る。モノクローナル抗体は、腫瘍特異的抗原のターゲティングによって作用し、それにより、薬剤自体が結合する腫瘍細胞に対する宿主の免疫応答を増強する。例は、トラスツズマブ（ハーセプチン）、セツキシマブ、およびリツキシマブ（リツキサンまたはマブセラ（Ｍａｂｔｈｅｒａ））である。ベバシズマブは、腫瘍細胞を直接攻撃しないが、その代わりに新規の腫瘍血管の形成を遮断するモノクローナル抗体である。
【０１７５】
開示の方法の化学療法は、ホルモン療法であり得る。いくつかの悪性疾患がホルモン療法に応答する。厳密に言えば、これは、化学療法ではない。一定の組織（乳腺および前立腺が含まれる）から生じた癌を、ホルモンバランスの適切な変化によって阻害または刺激することができる。ステロイド（しばしば、デキサメタゾン）は、腫瘍成長および関連する浮腫（組織の腫脹）を阻害し、リンパ節悪性疾患を後退させることができる。前立腺癌は、しばしば、フィナステリド（テストステロンのジヒドロテストステロンへの末梢変換を遮断する薬剤）に感受性を示す。乳癌細胞は、しばしば、エストロゲンおよび／またはプロゲステロン受容体を高度に発現する。これらのホルモンの産生（アロマターゼインヒビター）または作用（タモキシフェン）の阻害を、しばしば、治療の補足として使用することができる。連続投与した場合に、性腺刺激ホルモン放出ホルモンアゴニスト（ＧｎＲＨ）（ゴセレリンなど）は、逆説的な負のフィードバックを行い、その後にＦＳＨ（濾胞刺激ホルモン）およびＬＨ（黄体形成ホルモン）の放出を阻害する。いくつかの他の腫瘍もホルモン依存性を示すが、特定の機構は依然として不明である。
【０１７６】
開示の方法の組成物は、ＮＢＳ１のＡＴＭとの相互作用を阻害するペプチド（例えば、本明細書中に記載のＮＢＳ１のカルボキシ末端アミノ酸配列またはその保存的変異体（例えば、ＮＴＰ）を含む単離ポリペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸）を含むことができる。本方法の組成物は、ＡＴＭのＮＢＳ１結合配列またはその保存的変異体を含む単離ポリペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸を含むことができる。例えば、ポリペプチドは、ＮＢＳ１に結合するＡＴＭまたはＡＴＭのフラグメントのｈｅａｔ反復配列を含むことができる。
【０１７７】
１つの態様では、ポリペプチドは、ＮＢＳ１のカルボキシ末端のほとんどのアミノ酸を含む任意のポリペプチドであり得る。したがって、提供したポリペプチドは、ＮＢＳ１のＣ末端のほとんどの４〜３０アミノ酸（ＮＢＳ１のＣ末端のほとんどの４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個のアミノ酸またはそのフラグメントが含まれる）を含むことができる。例えば、提供したポリペプチドは、ＮＢＳ１（配列番号１）のアミノ酸７３４〜７５４を含むことができる。提供したポリペプチドは、ＮＢＳ１（配列番号１）のＣ末端のほとんどの４〜３０アミノ酸（アミノ酸７３４〜７５４が含まれる）内に保存的アミノ酸置換を含むことができる。この文脈では、ペプチドは、１、２、または３個の保存的アミノ酸置換を含むことができる。ポリペプチドは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことができる。ポリペプチドは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
【０１７８】
別の態様では、ポリペプチドは、例えば、Ｃ末端のほとんどの１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸を含まない。
【０１７９】
さらなる態様では、ポリペプチドは、ＡＴＭのＮＢＳ１結合ドメインを含む任意のポリペプチドであり得る。したがって、本明細書中に提供したポリペプチドは、ＡＴＭのＨｅａｔ反復２および／または７を含む任意のポリペプチドであり得る。したがって、本明細書中に提供したポリペプチドは、ＡＴＭ（配列番号５１）のアミノ酸２４８〜５２２を含む任意のポリペプチドであり得る。したがって、本明細書中に提供したポリペプチドは、配列番号５６を含む任意のポリペプチドであり得る。したがって、本明細書中に提供したポリペプチドは、ＡＴＭ（配列番号５１）のアミノ酸１４３６〜１７７０を含む任意のポリペプチドであり得る。したがって、本明細書中に提供したポリペプチドは、配列番号５７を含む任意のポリペプチドであり得る。提供したポリペプチドは、ＡＴＭのＨｅａｔ反復２および／または７内に保存的アミノ酸置換を含むことができる。この文脈では、ペプチドは、１、２、または３個の保存的アミノ酸置換を含むことができる。ポリペプチドは、ＡＴＭ（配列番号５１）のアミノ酸２４８〜５２２またはＡＴＭ（配列番号５１）のアミノ酸１４３６〜１７７０と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。ポリペプチドは、配列番号５６と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。ポリペプチドは、配列番号５７と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
２．スクリーニング方法
ＮＢＳ１およびＡＴＭポリペプチドを含むサンプルを候補薬剤と接触させる工程、およびＮＢＳ１とＡＴＭポリペプチドとの間の相互作用を検出する工程を含み、候補薬剤を示すコントロールと比較したＮＢＳ１とＡＴＭポリペプチドとの間の相互作用の減少が、候補薬剤が放射線感受性であることを示す、放射線感受性薬を同定する方法を本明細書中に開示する。本方法は、１つの態様では、スクリーニングアッセイ（高速処理スクリーニングアッセイなど）である。したがって、接触工程は、細胞ベースのアッセイまたは無細胞アッセイで行うことができる。例えば、ＮＢＳ１とＡＴＭポリペプチドとの間の相互作用を、蛍光偏光を使用して検出することができる。したがって、ＮＢＳ１および／またはＡＴＭポリペプチドは、フルオロフォアを含むことができる。本明細書中に開示のＮＢＳ１ポリペプチドを、ポジティブコントロールとして使用することができる。
【０１８０】
一般に、当該分野で公知の方法にしたがって、天然産物の巨大ライブラリーまたは合成（または半合成）抽出物もしくは化合物のライブラリーから候補薬剤を同定することができる。創薬分野および薬物開発分野の当業者は、試験抽出物または化合物の正確な供給源は本発明のスクリーニング手順に重要ではないことを理解するであろう。したがって、事実上、多数の化学的抽出物または化合物を、本明細書中に記載の例示的方法を使用してスクリーニングすることができる。かかる抽出物または化合物の例には、植物、真菌、原核生物、または動物ベースの抽出物、発酵ブロス、および合成化合物、ならびに既存の化合物の修飾物が含まれるが、これらに限定されない。多数の化合物（サッカリド、脂質、ペプチド、ポリペプチド、および核酸ベースの化合物が含まれるが、これらに限定されない）の無作為または有向性の（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）合成（例えば、半合成または全合成）にも多数の方法を利用可能である。合成化合物ライブラリーは、例えば、Ｂｒａｎｄｏｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ，ＮＨ）およびＡｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から市販されている。あるいは、細菌、真菌、植物、および動物の抽出物の形態の天然化合物のライブラリーは、多数の供給元（Ｂｉｏｔｉｃｓ（Ｓｕｓｓｅｘ，ＵＫ）、Ｘｅｎｏｖａ（Ｓｌｏｕｇｈ，ＵＫ）、Ｈａｒｂｏｒ  Ｂｒａｎｃｈ  Ｏｃｅａｎｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｆｔ．Ｐｉｅｒｃｅ，ＦＩａ．）、およびＰｈａｒｍａＭａｒ，Ｕ．Ｓ．Ａ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）が含まれる）から市販されている。さらに、天然および合成で産生するライブラリーを、必要に応じて、当該分野で公知の方法にしたがって、例えば、標準的な抽出方法および分画方法によって産生する。さらに、必要に応じて、任意のライブラリーまたは化合物を、標準的な化学的方法、物理的方法、または生化学的方法を使用して容易に修飾する。さらに、創薬分野および薬物開発分野の当業者は、脱複製（ｄｅｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（例えば、分類学的脱複製、生物学的脱複製、および化学的脱複製またはその任意の組み合わせ）の方法またはＮＢＳ１−ＡＴＭ相互作用に及ぼすその影響が既に知られている材料の複製物または反復物の排除方法を、可能ならいつでも使用すべきであることを容易に理解する。
【０１８１】
粗抽出物が所望の活性を有することが見出された場合、正のリード抽出物をさらに分画して認められた影響を担う化学的構成要素を単離する必要がある。したがって、抽出過程、分画過程、および生成過程の目的は、粗抽出物内のＮＢＳ１−ＡＴＭ相互作用を刺激または阻害する活性を有する化学物質の慎重な特徴づけおよび同定である。化合物の混合物における活性を検出するための本明細書中に記載の同一のアッセイを使用して、有効成分を精製し、その誘導体を試験することができる。かかる異種抽出物の分画および精製方法は、当該分野で公知である。必要に応じて、治療に有用な薬剤であることが示された化合物を、当該分野で公知の方法にしたがって化学修飾する。治療的価値があると同定された化合物を、疾患または容態の動物モデルを使用してその後に分析することができる。
３．投与方法
組成物を、局所、経口、または非経口で投与することができる。例えば、組成物を、体外、頭蓋内、膣内、肛門内、皮下、皮内、心臓内、胃内、静脈内、筋肉内、腹腔内注射、経皮、鼻腔内、または吸入剤によって投与することができる。本明細書中で使用する場合、「頭蓋内投与」は、物質の脳への直接送達（例えば、カテーテルまたはニードルを介した髄腔内、槽内、脳室内、または経蝶形骨送達が含まれる）を意味する。
【０１８２】
組成物の非経口投与は、使用する場合、一般に、注射によって特徴づけられる。注射液を従来の形態（溶液または懸濁液、注射前に液体に含めて懸濁液にするのに適切な固体形態、または乳濁液いずれかとして）で調製することができる。より最近修正された非経口投与アプローチは、一定の投薬量が維持されるような遅延放出系または徐放系の使用を含む。例えば、米国特許第３，６１０，７９５号（本明細書中で参照により援用される）を参照のこと。
【０１８３】
本明細書中で使用する場合、「局所鼻腔内投与」は、鼻孔の片方または両方を介した鼻および鼻腔への組成物の送達を意味し、核酸もしくはベクターの噴霧機構もしくは液滴機構、またはエアゾール化による送達を含むことができる。吸入による組成物の投与は、噴霧機構または液滴機構による送達を介した鼻または口腔による投与であり得る。挿管法を介して呼吸器系（例えば、肺）の任意の領域に直接送達させることもできる。
【０１８４】
正確な組成物の必要量は、被験体の種、年齢、体重、および一般的状態、治療を受けるアレルギー性障害の重症度、使用する特定の核酸またはベクター、およびその投与様式などに応じて、被験体毎に異なるであろう。したがって、各組成物についての正確な量を特定することは不可能である。しかし、当業者は、本明細書中の教示で与えられた日常的実験のみを使用して、適量を決定することができる。
【０１８５】
材料は、（例えば、微粒子、リポソーム、または細胞に組み込まれた）溶液または懸濁液中に存在し得る。これらを、抗体、受容体、または受容体リガンドを介して特定の細胞型にターゲティングすることができる。以下の引例は、特定のタンパク質を腫瘍細胞にターゲティングするためのこのテクノロジーの使用例である（Ｓｅｎｔｅｒら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，２：４４７−４５１，（１９９１）；Ｂａｇｓｈａｗｅ，Ｋ．Ｄ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６０：２７５−２８１，（１９８９）；Ｂａｇｓｈａｗｅら，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５８：７００−７０３，（１９８８）；Ｓｅｎｔｅｒら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，４：３−９，（１９９３）；Ｂａｔｔｅｌｌｉら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３５：４２１−４２５，（１９９２）；Ｐｉｅｔｅｒｓｚ  ａｎｄ  ＭｃＫｅｎｚｉｅ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｒｅｖｉｅｗｓ，１２９：５７−８０，（１９９２）；およびＲｏｆｆｌｅｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，４２：２０６２−２０６５，（１９９１））。「ステルス」などのビヒクルおよび他の抗体を、リポソーム（結腸癌に対する脂質媒介性薬物ターゲティング、細胞特異的リガンドによるＤＮＡの受容体媒介性ターゲティング、リンパ球指向性腫瘍ターゲティング、およびｉｎ  ｖｉｖｏでのマウスグリオーマ細胞の高特異的治療レトロウイルスターゲティングが含まれる）に抱合する。以下の引例は、腫瘍組織に特定のタンパク質をターゲティングするためのこのテクノロジーの使用例である（Ｈｕｇｈｅｓら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４９：６２１４−６２２０，（１９８９）；およびＬｉｔｚｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１１０４：１７９−１８７，（１９９２））。一般に、受容体は、構成性またはリガンド誘導性のエンドサイトーシス経路に関与する。これらの受容体は、クラスリンコーティングピット中に凝集し、クラスリンコーティング小胞を介して細胞に侵入し、酸性化エンドソームを通過して受容体が分類され、細胞表面に再利用されるか、細胞内で保存されるようになるか、リソソーム中で分解される。内在化経路は、種々の機能（栄養取り込み、活性化タンパク質の除去、高分子の排除、ウイルスおよび毒素の日和見性侵入、リガンドの解離および分解、ならびに受容体レベルの調節など）に携わる。多数の受容体は、細胞型、受容体濃度、リガンド型、リガンド結合価、およびリガンド濃度に応じて、１つを超える細胞内経路をたどる。受容体媒介性エンドサイトーシスの分子機構および細胞機構は概説されている（Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｅ，ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：６，３９９−４０９（１９９１））。
【０１８６】
適切なキャリアおよびその処方物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（１９ｔｈ  ｅｄ．）ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ  １９９５に記載されている。典型的には、適量の薬学的に許容可能な塩を処方物中で使用して、処方物を等張にする。薬学的に許容可能なキャリアの例には、生理食塩水、リンゲル液、およびデキストロース溶液が含まれるが、これらに限定されない。溶液のｐＨは、約ｐＨ５〜約ｐＨ８、約ｐＨ７〜約ｐＨ７．５である。さらに、キャリアは、徐放性調製物（抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックス（マトリックスは、造形品（例えば、フィルム、リポソーム、または微粒子）の形態である）など）を含む。一定のキャリアが、例えば、投与される組成物の投与経路および濃度に依存することがより好ましいかもしれないことが当業者に明らかであろう。
【０１８７】
薬学的キャリアは、当業者に公知である。これらは、最も典型的には、ヒトへの薬物投与のための標準的なキャリアであろう（滅菌水、生理食塩水、および生理学的ｐＨの緩衝液などの溶液が含まれる）。組成物を、筋肉内または皮下に投与することができる。他の化合物を、当業者によって使用される標準的手順にしたがって投与するであろう。
【０１８８】
薬学的組成物は、最適な分子に加えて、キャリア、増粘剤、希釈剤、緩衝液、防腐剤、および界面活性剤などを含むことができる。薬学的組成物は、抗菌薬、抗炎症薬、および麻酔薬などの１つ以上の有効成分を含むこともできる。
【０１８９】
局所治療または全身治療のいずれが望ましいか、および治療すべき領域に応じて、薬学的組成物を多数の方法で投与することができる。局所（眼科的、膣、直腸、鼻腔内が含まれる）、経口、吸入、または非経口（例えば、静脈内点滴、皮下、腹腔内、または筋肉内注射）で投与することができる。
【０１９０】
非経口投与用調製物は、滅菌水溶液または非水溶液、懸濁液、および乳濁液を含む。非水溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（オリーブ油など）、および注射用有機エステル（オレイン酸エチルなど）である。水性キャリアには、水、アルコール／水溶液、乳濁液、または懸濁液（生理食塩水および緩衝化媒質が含まれる）が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース、および塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液、または固定油が含まれる。静脈内ビヒクルには、流動物および栄養補充液、および電解質補充液（リンゲルデキストロースベースのものなど）などが含まれる。例えば、抗菌薬、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどの防腐剤および他の添加物も存在し得る。
【０１９１】
局所投与用処方物には、軟膏、ローション、クリーム、ゲル（例えば、ポロクサマーゲル）、点滴薬、座剤、スプレー、液体、および粉末が含まれ得る。従来の薬学的キャリア、水性基剤、粉末基剤、または油性基剤、および増粘剤などが必要であるか望ましいかもしれない。開示の組成物を、例えば、マイクロファイバー、ポリマー（例えば、コラーゲン）、ナノスフェア、エアゾール、ローション、クリーム、織物、プラスチック、組織操作足場（ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｓｃａｆｆｏｌｄ）、マトリックス材、錠剤、埋め込み容器（ｉｍｐｌａｎｔｅｄ  ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）、粉末、オイル、樹脂、創傷包帯、ビーズ、マイクロビーズ、遅延放出ビーズ、カプセル、注射液、静脈内点滴、ポンプデバイス、シリコンインプラント、または任意のバイオ工学処理材料中で投与することができる。
【０１９２】
１つの態様では、提供した薬学的に許容可能なキャリアは、ポロクサマーである。商標名プルロニック（登録商標）と呼ばれるポロクサマーは、水中で透明の熱可逆性ゲルを形成する非イオン性界面活性剤である。ポロクサマーは、ポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシド−ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロック共重合体である。２つのポリエチレンオキシド鎖は親水性であるが、ポリプロピレン鎖は疎水性である。これらの疎水性および親水性は、水溶液中に入れた場合に帯電する。ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ鎖は、疎水性中心が共にミセルを形成する小さな鎖の形態を取る。ミセルは、連続して、ゲル化特性を有する傾向がある。これは、基内で共に固体（ゲル）を形成し、このゲルは、親水性末端付近に水がわずかに存在するからである。冷却する場合に液体になるが、加温した場合に硬化する。冷却した場合にシリンジに吸い込んで正確な用量を測定することができるので、この特徴により、薬学的複合で有用になる。体温に加温した場合（皮膚に適用した場合）、完全な稠度に濃縮されて（特に、ダイズレシチン／パルミチン酸イソプロピルと組み合わせた場合）、適切な塗擦および接着を容易にする。容易に入手され、それによってかかる薬学的適用で使用されているので、プルロニック（登録商標）Ｆ１２７（Ｆ１２７）は広く使用されている。Ｆ１２７は、ＥＯ：ＰＯ：ＥＯ比が１００：６５：１００であり、重量比ＰＥＯ：ＰＰＯは２：１である。プルロニックゲルは水溶液であり、典型的には、２０〜３０％のＦ−１２７を含む。したがって、提供した組成物を、Ｆ１２７で投与することができる。
【０１９３】
経口投与用組成物には、粉末または顆粒、水性媒質または非水性媒質の懸濁液または溶液、カプセル、サシェ、または錠剤が含まれる。増粘剤、香味料、希釈剤、乳化剤、分散助剤、または結合剤が望ましいかもしれない。
【０１９４】
いくつかの組成物を、無機酸（塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、およびリン酸など）および有機酸（ギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、およびフマル酸など）との反応または無機塩基（水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムなど）および有機塩基（モノ、ジ、トリアルキルおよびアリールアミンならびに置換エタノールアミンなど）との反応によって形成された薬学的に許容可能な酸付加塩または塩基付加塩として投与することができる場合がある。
【０１９５】
組成物の投与に有効な投薬量およびスケジュールを、経験的に決定することができ、かかる決定は当業者の範囲内である。組成物投与のための投薬量範囲は所望の効果を得るのに十分な範囲であり、この効果が障害の症状に影響を及ぼす範囲である。投薬量は、副作用（望ましくない交差反応、アナフィラキシー反応など）を生じるほど大量であってはならない。一般に、投薬量は、患者の年齢、容態、性別、および疾患の範囲、投与経路、またはレジメンに他の薬物が含まれるかどうかに応じて変化し、当業者が決定することができる。投薬量を、各医師が任意の反対指示（ｃｏｕｎｔｅｒｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ）事象で判断することができる。投薬量は変化し得、１日に１回以上を１日または数日間投与することができる。所与の医薬品（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔ）クラスに適切な投薬量のためのガイダンスを、文献中に見出すことができる。投薬量の範囲は、本明細書中の組成物の適用、容態の重症度、およびその投与経路に大きく依存する。
【０１９６】
例えば、研究用実験ツールとして適用する場合、ＮＢＳ１ペプチド組成物を、０．０１％ｗ／ｖの低用量で使用することができる。局所治療では、低投薬量は０．０２％ｗ／ｖであり、高投薬量はおそらく２％ｗ／ｖであり得る。有意により高い濃度の組成物自体または他の化合物との組み合わせを、癌／腫瘍療法のような適用または急性組織損傷の直後の早期濃縮ボーラスとして使用することができる。したがって、提供したポリペプチドの上限は、例えば、腫瘤に直接送達させる初期ボーラスとして投与する場合、２〜５％ｗ／ｖまたはｖ／ｖまでであり得る。非経口投与経路（例えば、筋肉内、脳内、心臓内、および脊髄内）のための投薬量の推奨される上限は、損傷の重症度に応じて、１％ｗ／ｖまたはｖ／ｖまでであり得る。この投薬量の上限は、例えば、どのようにしてポリペプチドをその作用を促進するかポリペプチドと協力して作用する他の薬剤と組み合わせるのかに応じて、処方によって変化し得る。
【０１９７】
提供したポリペプチドの連続送達のために、例えば、静脈内点滴と組み合わせて、容態の改善に基づいて医師によって決定された上限が０．０１ｇ／Ｋｇ体重の長期間の送達を使用することができる。別の例では、局所送達される提供した核酸濃度の上限は、例えば、どのようにして核酸をその作用を促進するか核酸と協力して作用する他の薬剤と組み合わせるのかに応じて、５〜１０μｇ／ｃｍ２であろう。これを、改善に基づいて医師によって決定された頻度で繰り返すであろう。別の例では、例えば、筋肉内、脳内、心臓内、および脊髄内に内部送達される提供した核酸濃度の上限は、５０〜１００μｇ／ｍｌ溶液であろう。また、頻度は、改善に基づいて医師によって決定されるであろう。
【０１９８】
手術前に提供したポリペプチドでの領域の前準備も開示する。手術前の少なくとも３〜６時間、１０〜３０％のプルロニックゲルまたは目的の部位内にペプチドを透過させることができる任意のかかるキャリアと混合したポリペプチドの濃度は、１０〜２００μＭであり得る。この手順前の馴化は、その後の手術に対する治癒応答を改善することができる（炎症応答の減少が含まれる）。
【０１９９】
ウイルスベクターは、臨床応用で高い可能性を示すにもかかわらず、高度な実験ツールのままである。そのようなものとして、ウイルスベクターのための期待される投薬レジメンの計算には注意が必要であり、使用するベクター型に非常に依存するであろう。例えば、レトロウイルスベクターは、癌細胞などの分裂細胞に有効に感染し、宿主細胞ゲノムに挿入され、コードタンパク質を無制限に発現し続ける。動物モデルにおけるレトロウイルスの典型的な投薬量は、１０７〜１０９感染単位／ｍｌの範囲である。それに反して、アデノウイルスは有糸分裂後の細胞を最も有効にターゲティングするが、細胞は、宿主免疫系によって迅速に排除されるか、感染細胞が増殖を再開し、その後にウイルスエピソームＤＮＡを希釈する場合にウイルスは最終的に喪失する。実際、この一過性の感染の経時変化は、一定の臨床的状況（例えば、小さな損傷の改善）における本明細書中に記載の組成物の短期送達に有用であり得る。動物モデルでは、１０８〜１０１１感染単位／ｍｌのアデノウイルスは、研究用として典型的である。動物モデル由来のデータに基づいたベクターの用量範囲を、最終的に臨床状況で使用されるように予想するであろう。薬学的に許容可能な処方物は開発中である。
【０２００】
放射線増感の促進のためのポリペプチドなどの開示の組成物の投与後、治療組成物の有効性を、当業者に周知の種々の方法で評価することができる。例えば、当業者は、本明細書中に開示のポリペプチドなどの組成物は、組成物が組織損傷後の被験体の瘢痕組織形成を減少させるか、線維化組織形成を減少させるか、組織再生を改良するか、炎症を減少させることができるという所見によって被験体の放射線増感の促進に有効であることを理解する。これらの基準の測定方法は、当該分野で公知であり、本明細書中で考察されている。
４．組成物の作製方法
他で特に言及しない限り、本明細書中に開示の組成物および開示の方法の実施に必要な組成物を、特定の試薬または化合物について当業者に公知の任意の方法を使用して作製することができる。
【０２０１】
例えば、提供した核酸を、標準的な化学合成を使用して作製することができるか、酵素的方法または任意の他の公知の方法を使用して生成することができる。かかる方法は、標準的な酵素消化およびその後のヌクレオチドフラグメント単離（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ５，６を参照のこと）から純粋な合成方法（例えば、ＭｉｌｌｉｇｅｎまたはＢｅｃｋｍａｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  １Ｐｌｕｓ  ＤＮＡ合成機（例えば、Ｍｉｌｌｉｇｅｎ−Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡのＭｏｄｅｌ  ８７００自動化合成機またはＡＢＩ  Ｍｏｄｅｌ  ３８０Ｂ）を使用したシアノエチルホスホルアミダイト法による）の範囲であり得る。オリゴヌクレオチド作製に有用な合成方法は、Ｉｋｕｔａら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３−３５６（１９８４）（ホスホトリエステルおよびホスファイト−トリエステル法）およびＮａｒａｎｇら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，６５：６１０−６２０（１９８０）（ホスホトリエステル法）にも記載されている。タンパク質核酸分子を、Ｎｉｅｌｓｅｎら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．５：３−７（１９９４）に記載の方法などの公知の方法を使用して作製することができる。
【０２０２】
開示のポリペプチド（配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０など）の１つの生成方法は、タンパク質の化学的技術によって２つ以上のペプチドまたはポリペプチドを連結することである。例えば、ペプチドまたはポリペプチドを、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）またはＢｏｃ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボノイル）化学のいずれかを使用した現在利用可能な実験装置を使用して化学合成することができる（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）。当業者は、開示のタンパク質に対応するペプチドまたはポリペプチドを、例えば、標準的な化学反応によって合成することができることを容易に認識することができる。例えば、ペプチドまたはポリペプチドを合成し、その合成樹脂から切断しないのに対して、ペプチドまたはタンパク質の他のフラグメントを合成し、その後に樹脂から切断し、それによって他のフラグメント上で機能的に遮断される末端基を曝露することができる。ペプチド縮合反応により、これらの２つのフラグメントを、そのカルボキシル末端およびアミノ末端のペプチド結合を介して共有結合して、タンパク質またはそのフラグメントを形成することができる（Ｇｒａｎｔ  ＧＡ（１９９２）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．（１９９２）；Ｂｏｄａｎｓｋｙ  Ｍ  ａｎｄ  Ｔｒｏｓｔ  Ｂ．，Ｅｄ．（１９９３）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｉｎｃ．，ＮＹ（少なくともペプチド合成に関連する材料について本明細書中で参照により援用される）。あるいは、ペプチドまたはポリペプチドを、本明細書中に記載のようにｉｎ  ｖｉｖｏで独立して合成する。一旦単離されると、これらの独立したペプチドまたはポリペプチドを類似のペプチド縮重反応によって結合して、ペプチドまたはそのフラグメントを形成することができる。
【０２０３】
例えば、クローン化したか合成のペプチドセグメントの酵素的ライゲーションにより、比較的短いペプチドフラグメントを連結してより大きなタンパク質フラグメント、ポリペプチド、または全タンパク質ドメインを生成することが可能である（Ａｂｒａｈｍｓｅｎ  Ｌら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：４１５１（１９９１））。あるいは、合成ペプチドの未変性化学ライゲーションを使用して、より短いペプチドフラグメントから巨大なペプチドまたはポリペプチドを合成的に構築することができる。この方法は、２工程の化学反応からなる（Ｄａｗｓｏｎら、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  Ｎａｔｉｖｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６：７７６−７７９（１９９４））。第１の工程は、非保護合成ペプチド−−チオエステルのアミノ末端Ｃｙｓ残基を含む別の非保護ペプチドセグメントとの化学選択的反応であり、これにより、最初の共有結合生成物としてチオエステル結合中間体が得られる。反応条件を変更せずに、この中間体は、自発的で急速な分子内反応を受けてライゲーション部位に未変性ペプチド結合を形成する（Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ  Ｍら（１９９２）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３０７：９７−１０１；Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ  Ｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：１６０７５（１９９４）；Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ  Ｉら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：３１２８（１９９１）；Ｒａｊａｒａｔｈｎａｍ  Ｋら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：６６２３−３０（１９９４））。
【０２０４】
あるいは、非保護ペプチドセグメントを化学的に結合する。ここで、化学的ライゲーションの結果としてペプチドセグメント間に形成された結合は非天然（非ペプチド）結合である（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ，Ｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６：２２１（１９９２））。この技術を使用して、タンパク質ドメインのアナログおよび大量の完全な生物活性を有する比較的純粋なタンパク質が合成する（ｄｅＬｉｓｌｅ  Ｍｉｌｔｏｎ  ＲＣら，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＩＶ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２５７−２６７（１９９２））。
【０２０５】
組成物および組成物を誘導する中間体の作製プロセスを開示する。これらの組成物を作製するために使用することができる種々の方法（化学合成法および標準的な分子生物学法など）が存在する。これらおよび他の開示の組成物の作製方法を詳細に開示すると理解される。有効な方法で本明細書中に開示のポリペプチドをコードする核酸および核酸の発現を調節する配列を作動可能に連結する工程を含むプロセスによって生成された核酸分子を開示する。任意の本明細書中に開示の核酸での細胞の形質転換プロセスによって産生された細胞を開示する。任意の本明細書中に開示の核酸の発現プロセスによって産生された任意の開示のペプチドを開示する。任意の本明細書中に開示の核酸分子での動物内の細胞のトランスフェクションプロセスによって産生された動物を開示する。動物が哺乳動物である、任意の本明細書中に開示の核酸での動物内の細胞のトランスフェクションプロセスによって産生された動物を開示する。哺乳動物が、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、または霊長類である、本明細書中に開示の任意の核酸分子での動物内の細胞のトランスフェクションプロセスによって産生された動物も開示する。本明細書中に開示の任意の細胞を動物に添加するプロセスによって産生されたれた動物も開示する。
Ｃ．用途
開示の組成物を、研究ツールとして種々の方法で使用することができる。例えば、開示の組成物（配列番号３、４、５、６、７、８、９、および１０を含む単離ポリペプチドなど）を使用して、例えば、結合インヒビターとしての作用によるＮＢＳ１とＡＴＭとの間の相互作用を研究することができる。開示から明らかであり、そして／または当業者に理解される他の用途を開示する。開示から明らかであり、そして／または当業者に理解される他の用途を開示する。
Ｄ．定義
本明細書中および添付の特許請求の範囲で使用される場合、文脈で明らかに別と記載されていない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、複数形が含まれることに留意しなければならない。したがって、例えば、「ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ」の言及には、複数のかかるペプチドが含まれ、「ｔｈｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ」は、１つ以上のペプチドおよび当業者に公知のその等価物などをいう。
【０２０６】
「任意選択的な」または「任意選択的に」は、その後に記載された事象、環境、または材料が生じても生じなくてもよく、存在しても存在しなくてもよく、記載には、事象、環境、または材料が生じるか存在する例およびこれらが生じないか存在しない例が含まれることを意味する。
【０２０７】
範囲を、本明細書中で、「約」一方の特定の値から、および／または「約」他方の特定の値までと示すことができる。かかる範囲を示す場合、別の実施形態には、一方の特定の値から、および／または他方の特定の値までが含まれる。同様に、先行詞「約」の使用によって値を近似で示す場合、特定の値は別の実施形態を形成すると理解されるであろう。各範囲の終点は、他の終点と関連するかおよび他の終点と無関係であるかの両方で重要であることが理解される。本明細書中に開示の多数の値が存在し、各値は、値自体に加えた「約」特定の値として本明細書中に開示されるとも理解される。例えば、値「１０」を開示する場合、「約１０」も開示される。値「以下」、「値以上」である値を開示する場合、当業者に適切に理解されるように、値の間の可能な範囲も開示されるとも理解される。例えば、値「１０」を開示する場合、「１０以下」および「１０以上」も開示される。出願を通して、データは、多数の異なる形式で提供され、このデータが終点および出発点ならびにデータポイントの任意の組み合わせについての範囲を示すとも理解される。例えば、特定のデータポイント「１０」および特定のデータポイント１５を開示する場合、１０および１５を超える値、それ以上の値、それ未満の値、それ以下の値、およびそれと等しい値ならびに１０と１５との間が開示されると見なされると理解される。２つの特定の単位の間の各単位も開示されるとも理解される。例えば、１０および１５を開示する場合、１１、１２、１３、および１４も開示される。
【０２０８】
他で定義しない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、開示の方法および組成物が属する当業者によって一般的に理解されている意味を有する。本明細書中に記載のものと類似するか等価な任意の方法および材料を本発明の方法および組成物の実施または試験で使用することができるが、特に有用な方法、デバイス、および材料を記載する。本明細書中で引用された刊行物および引用される材料は、本明細書中で特に参照により援用される。本明細書中で、本発明が先行発明に照らしてかかる開示に先行しないと見なされると解釈されない。任意の引例が先行技術を構成すると認めない。引例の考察は、その著者が主張する事項を述べ、出願人が引用した書類の正確さおよび妥当性に取り組む権利を留保する。多数の刊行物が本明細書中で参照されているが、かかる引例は、任意のこれらの書類が当該分野の一般的知識の一部を形成すると見なさないことが明確に理解されるであろう。
【０２０９】
本明細書の説明および特許請求の範囲を通して、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」およびこの用語の変形形態（「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」など）は、「〜が含まれるが、これらに限定されない」を意味し、例えば、他の添加物、成分、整数、または工程を排除することを意図しない。
【０２１０】
本明細書中で使用される場合、「ｉｎｈｉｂｉｔ」、「ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ」、および「ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ」は、活性、応答、容態、疾患、または他の生物学的パラメーターを減少させることを意味する。これには、活性、応答、容態、または疾患の完全な喪失が含まれ得るが、これに限定されない。これには、例えば、未変性レベルまたはコントロールレベルと比較した場合、活性、応答、容態、または疾患の１０％減少も含まれ得る。したがって、減少は、未変性レベルまたはコントロールレベルと比較した場合、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％、または任意の量の減少であり得る。
【実施例】
【０２１１】
Ｅ．実施例
（実施例１）
１．毛細管拡張性失調症変異（ＡＴＭ）媒介性ＤＮＡ損傷応答を阻害して放射線感受性を増強することができるＮＢＳ１Ｃ末端ペプチドの特徴づけ。
ｉ．材料と方法
細胞培養：ヒト腫瘍細胞株ＨｅＬａおよびＤＵ−１４５（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）、ならびにヒトＳＶ−４０形質転換線維芽細胞株ＧＭ９６０７（Ｃｏｒｒｉｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ，Ｃａｍｄｅｎ，ＮＪ）を、ＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳ中にて５％ＣＯ２加湿大気下で指数関数的成長を維持した。グリア細胞株Ｍ０５９Ｊ（Ｃｏｒｒｉｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ）を、ＲＰＭＩ−１５％ＦＢＳ中にて５％ＣＯ２加湿大気下で指数関数的成長を維持した。
【０２１２】
ペプチド合成：全ペプチドを、Ａｂｇｅｎｔ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によって合成し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの検出のためにＮ末端をビオチンタグで標識した。３つのペプチド（ポリアルギニン（Ｒ９）内在化配列のみを含むペプチド、ヒトＮＢＳ１のアミノ酸７３５〜７４４に対応する野生型ＮＢＳ１阻害ペプチド（ｗｔＮＩＰ）、およびヒトＮＢＳ１のａ．ａ．７３５−７４４がスクランブルされたランダム配列ペプチド（ｓｃＮＩＰ））を産生した。ペプチドをＤＭＳＯに溶解し、−２０℃で保存し、使用前にＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳで再構成した。
【０２１３】
照射：Ｘ−ＲＡＤ３２０照射キャビネット（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｘ−ｒａｙ，Ｅａｓｔ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）を、３２０ＫＶおよび１６ＯｍＡで、
【化１３】
2010508022.tif 000008
フィルターを２０ｃｍのＴＳＤおよび線量率３．４Ｇｙ／分で使用した。全照射を、通常の大気圧および温度下で行った。
【０２１４】
免疫沈降およびウェスタンブロッティング：ＡＴＭ、ＮＢＳ１、およびＭＲＥ１１の免疫共沈降のために、細胞を氷冷溶解緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  ＮＰ−４０、５ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ  ＮａＦ、および１ｍＭ  ＰＭＳＦからなる）中で１時間溶解した。遠心分離後、上清を表示の抗体と共にインキュベートした。溶解緩衝液での十分な洗浄後、免疫沈降物を、特異的抗体を使用した免疫ブロットによって分析した。ウェスタンブロッティング分析のために、サンプル（細胞溶解物または免疫沈降物）を、４〜１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分離し、ニトロセルロース膜に移し、種々の抗体で探索した。
【０２１５】
免疫蛍光顕微鏡法：指数関数的に成長した細胞培養物を、滅菌した２２ｃｍ２カバースリップ上にプレートし、３７℃の５％ＣＯ２加湿大気中で２４時間インキュベート後、室温でＮＩＰペプチドにて処理する。カバースリップをＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒド−０．２５％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００にて室温で１５分間固定し、室温で３０分間ブロッキングし、ＦＩＴＣ抱合ストレプトアビジンまたは抗γＨ２ＡＸ抗体およびホスホ−ＮＢＳ１抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ，ＰＡ）と室温で１時間インキュベートした。次いで、カバースリップをＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ  Ｅｌｉｔｅ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）上にマウントし、Ｌｅｉｃａ蛍光顕微鏡で観察した。Ｑ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｒｅｔｉｇａ  Ｅｘｉデジタルカメラを使用して４０倍で画像を取り込み、Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ−Ｐｌｕｓ  ５．１ソフトウェアを使用して分析した。
【０２１６】
ＭＴＴアッセイ：細胞傷害性研究のために、指数関数的に成長したＨｅＬａ細胞またはＤＵ−１４５細胞の培養物を回収し、完全培地中の９６ウェルプレート（５０００細胞／ウェル）にプレートし、一晩インキュベートした。翌日、細胞を、ＮＩＰペプチド（０、５、１０、２０、５０、または１００μＭ）またはポジティブコントロールとしてのタキソール（０、１０、５０、または１００ｕＭ）で処理した。経時変化の終点で、製造者のガイダンスにしたがってＭＴＴ細胞生存アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、ペプチド細胞傷害性を決定した。
【０２１７】
コロニー形成アッセイ：放射線感受性を決定するために、コロニー形成アッセイを組み込んだ。細胞を、０．１２５％トリプシン−０．０５％ＥＤＴＡを使用して回収し、ペレット化し、１ｍｌの新鮮な培地中に再溶解し、２２ｇニードルを使用してクランプを分散させ、その後にトリパンブルー中にて血球計算板で計数した。次いで、細胞を限界希釈にて６ウェルプレートにプレートし、一晩接着させた。培養物を、ＰＢＳ、Ｒ９、ｗｔＮＩＰ、またはｓｃＮＩＰで１時間処理し、照射した（０〜６Ｇｙ）。培地を無ペプチド培地と置換した時に、新鮮なペプチドを４時間毎にＩＲの２４時間後まで添加した。培養物を１０〜１２日間インキュベートし、回収し、０．５％クリスタルバイオレットのメタノール溶液で染色した。解剖顕微鏡を使用してコロニー数を決定した。５０個超の細胞集団を１コロニーとして計数し、コロニー数を未処理偽照射コントロール細胞の値の比率として示した。線形回帰分析によって生存曲線をプロットし、Ｄ０値は、生存率を３７％にする線量を示す。他の小分子インヒビターと比較したペプチドの放射線感受能力を決定するために、感受性増強比（ｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｒａｔｉｏ）（ＳＥＲ）を、ｓｃＮＩＰまたはｗｔＮＩＰの存在下で生存率を３７％に減少させるのに必要な線量に基づいて計算した。以下の式を使用した：
【０２１８】
【数１】
2010508022.tif 000009
統計学：統計的有意性を確立するために、スチューデントｔ検定を組み込んだ。データを、最初に、０〜６Ｇｙの線量範囲にわって各実験群にフィッティングした。有意差を、ｐ＜０．０５で確立した。
ｉ．結果
Ｃ末端ＮＢＳ１阻害ペプチド（ＮＩＰ融合タンパク質）の内在化および細胞傷害性：Ｃ末端ＮＢＳ１ドメインは、ＡＴＭへの結合に重要であり、Ｃ末端の２０残基を欠くＮＢＳ１短縮誘導体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＡＴＭに会合しない（Ｃｅｒｏｓａｌｅｔｔｉ  ａｎｄ  Ｃｏｎｃａｎｎｏｎ，２００３，２００４；Ｆａｌｃｋら，２００５；Ｃｅｒｏｓａｌｅｔｔｉら，２００６）。さらに、ＮＢＳ細胞中のＡＴＭ結合ドメインを欠くＮＢＳ１導入遺伝子の発現により、ＡＴＭ活性化が劇的に減少する（Ｄｉｆｉｌｉｐｐａｎｔｏｎｉｏら，２００５）。ＡＴＭとのＮＢＳ１会合の阻害によってＩＲ後に最適以下のＡＴＭ活性化が導かれるので、ＮＢＳ１−ＡＴＭ相互作用は、放射線増感剤開発のための新規の標的であり得る。ＮＢＳ１−ＡＴＭ相互作用を阻害するための１つのアプローチは、内因性のＮＢＳ１−ＡＴＭ相互作用と競合することができる保存Ｃ末端配列を含む小ペプチドを使用することである（図１Ａ）。したがって、以下の２つの機能ドメインを含むペプチドをデザインした：一方はＮＢＳ１−ＡＴＭ会合を阻害する干渉ドメインであり、他方は、干渉ペプチドを細胞に輸送する内在化ドメイン。干渉ドメインのために、図１Ｂに示すように、保存されたＮＢＳ１のＣ末端モチーフを含むアミノ酸配列を使用した。この配列は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏデータに基づいた最も短いＡＴＭ結合モチーフを含む。内在化ドメインのために、ポリアルギニン（Ｒ９）配列を使用した。ポリアルギニン配列は、原形質膜を介した小ペプチドおよびタンパク質を有意に有効に輸送することが示されている（Ｆｕｃｈｓ  ａｎｄ  Ｒａｉｎｅｓ，２００４；Ｄｅｓｈａｙｅｓら，２００５）。Ｒ９のみおよびヒトＮＢＳ１のアミノ酸７３〜４４に対応するｗｔＮＩＰを含む３つのペプチドを生成した。ＮＢＳ１のアミノ酸７３５〜７４４をスクランブルしたペプチド（ｓｃＮＩＰ）を産生するためのランダム配列ジェネレーターを使用して、第３のペプチドをネガティブコントロールとしてデザインした。これらのペプチドを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの検出のためにそのＮ末端にビオチンタグで標識した。
【０２１９】
第１に、ペプチドの内在化を評価した。ペプチドで処理した細胞を、フルオレセイン抱合ストレプトアビジン抗体で探索して、ビオチン化ペプチドの存在を決定した。１０μＭ濃度のＲ９、ｗｔＮＩＰ、またはｓｃＮＩＰでのＨｅＬａ細胞の１時間の処理により、ペプチドが有意に細胞に取り込まれた（図２）。Ｒ９、ｗｔＮＩＰ、およびｓｃＮＩＰ内在化が細胞質区画および核区画に局在化したのに対して、ＤＭＥＭのみで処理したコントロール群は蛍光シグナルを示さなかった。
【０２２０】
ペプチドを照射研究で使用するので、ペプチドが細胞中に残存する期間が、ペプチドがＩＲ後のＤＮＡ修復プロセスを通して確実に存在すると判断された。図７に示すように、ペプチドとのインキュベーションの直後に、全サンプル群は明らかなペプチドの存在を示した。処理から２時間以内に、細胞は、Ｒ９、ｗｔＮＩＰ、およびｓｃＮＩＰの強い分布を示し続けたが、ｗｔＮＩＰおよびｓｃＮＩＰの蛍光強度レベルは４時間以内に減少し始め、８時間まで実質的に減少した。Ｒ９は８時間でわずかに上昇した一方で、ｗｔＮＩＰおよびｓｃＮＩＰの強度ははるかに弱かった。これは、Ｒ９配列がより容易に転座し、分子またはペプチドにカップリングしない場合よりも長く存在し続けることを示唆する文献と一致する（Ｊｏｎｅｓら、２００５）。１２時間までに、Ｒ９ペプチドで処理した細胞は、依然として顕著な染色を示した一方で、ｗｔＮＩＰまたはｓｃＮＩＰで処理した細胞ははるかに弱い細胞質染色を示し、核染色は認められなかった。２４時間以内に、Ｒ９で処理した細胞は細胞質染色を示したが、核シグナルはもはや認められず、ｗｔＮＩＰまたはｓｃＮＩＰで処理した細胞は検出可能なペプチドの存在を示さなかった。これらのデータは、ＮＩＰペプチドが細胞中に少なくとも４時間滞在することができることを示す。これらのデータは、ＮＩＰペプチドを時間０で細胞に添加し、次いでＩＲを使用した処理後の最初の２４時間は４〜６時間毎に添加することによって最大の阻害効果を得ることができることを示す。
【０２２１】
次に、Ｒ９、ｗｔＮＩＰ、およびｓｃＮＩＰ  のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性を決定した。９６ウェルプレート中で成長したＨｅＬａ細胞を、ペプチド（０、５、１０、２０、５０、または１００μＭ）またはパクリタキセル（０、１０、２０、５０、または１００μＭ）で２４時間処理した。処理後、ＭＴＴアッセイを使用して、可溶化ホルマザン（細胞増殖の代謝指標）の産生を測定した。ペプチド用量が２０μＭ未満である場合、ペプチドは、処理から７２時間後まで成長阻害効果または細胞傷害効果を示さなかった（図２Ｂ）。ＭＴＴアッセイで認められた細胞傷害性に基づいて、次の全実験の作業濃度（ｗｏｒｋｉｎｇ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）として１０μＭを選択した。１０μＭのＲ９、ｗｔＮＩＰ、およびｓｃＮＩＰのクローン原性生存に及ぼす影響は、治療群間で有意差を示さなかった（ｐ＜０．０５）。用量および経時時間実験をいくつかの他の細胞株において行い、データによってこれらのペプチドの迅速な内在化および最小の細胞傷害性が確認されたことに注目すべきである。
【０２２２】
ｗｔＮＩＰはＮＢＳ１−ＡＴＭ相互作用を無効にする：Ｒ９抱合ＮＩＰペプチドがＮＢＳ１−ＡＴＭ相互作用を阻害することができるかどうかを調査するために、ＮＩＰペプチドで処理した細胞において免疫共沈降実験を行った。ペプチド処理から４時間後、ＨｅＬａ細胞を回収し、抗ＮＢＳ１抗体を使用した免疫沈降に供した。次いで、免疫沈降物を、抗ＡＴＭ、ＮＢＳ１、およびＭＲＥ１１抗体でブロッティングした。コントロール細胞と比較してＲ９処理細胞で正常レベルのＡＴＭ−ＮＢＳ１会合が認められた。しかし、ｗｔＮＩＰ処理細胞では、ＮＢＳ１は、もはやＡＴＭを減少させることができなかった（図３）。さらに、ｗｔＮＩＰは、ＮＢＳ１−ＡＴＭ相互作用にのみ影響を及ぼし、ＮＢＳ１のＭＲＥ１１への結合を干渉しなかった。逆に、ｓｃＮＩＰは、ＮＢＳ１−ＡＴＭ相互作用に影響を及ぼさなかった。ＩＲで処理した細胞では、ｗｔＮＩＰは、非照射細胞と類似の影響を示した。これらの所見は、ＤＮＡ損傷の非存在下または存在下で、ｗｔＮＩＰがＮＢＳ１−ＡＴＭ相互作用を無効にすることができることを証明している。
【０２２３】
ｗｔＮＩＰはＩＲ誘導性γ−Ｈ２ＡＸおよびＮＢＳ１  ｐＳｅｒ３４３フォーカス形成を阻害する：ＩＲ誘導性ＤＮＡ損傷に対する最も早い応答の１つは、機能的ＡＴＭが必要なγ−Ｈ２ＡＸフォーカスの形成である（Ｂｕｒｍａら，２００１；Ｆｕｒｕｔａら，２００３）。ｗｔＮＩＰがＮＢＳ１−ＡＴＭ相互作用に対して阻害効果を示したので、ＩＲ誘導性γ−Ｈ２ＡＸフォーカス形成がペプチドによって阻害されるかどうかを調査した。免疫蛍光顕微鏡法を使用して、Ｒ９、ｗｔＮＩＰ、またはｓｃＮＩＰの存在下での偽照射細胞または照射細胞中のγ−Ｈ２ＡＸフォーカスの存在を検出した。Ｒ９がγ−Ｈ２ＡＸフォーカス形成を有意に阻害しない一方で、ｗｔＮＩＰは、６Ｇｙ  ＩＲでの処理から３０分後にγ−Ｈ２ＡＸフォーカス形成を阻害することができる（図４）。ＨｅＬａ細胞中の平均γ−Ｈ２ＡＸフォーカス／核数は、ＩＲ後にＲ９（４２フォーカス／核）またはｓｃＮＩＰ（４１フォーカス／核）で処理した細胞中で有意に増加したのに対して、ｗｔＮＩＰで処理した細胞は平均の６．９  γ−Ｈ２ＡＸフォーカス／核しか示さず、これは、偽照射細胞に類似する（図４）。ＤＵ−１４５細胞で類似の結果が認められたのに対して、Ｒ９またはｓｃＮＩＰ曝露はＩＲ誘導性フォーカス形成に影響を及ぼさず、ｗｔＮＩＰはＨ２ＡＸフォーカス／核の有意な減少を示した（図８）。したがって、ＩＲ誘導性γ−Ｈ２ＡＸフォーカス形成を、ｗｔ−ＮＩＰによって阻害することができる。
【０２２４】
ｗｔＮＩＰがＡＴＭ媒介性ＤＮＡ損傷経路を阻害することができるという見解をさらに支持するために、ＩＲ誘導性ＮＢＳ１フォーカス形成（ＤＳＢ部位でのＡＴＭ依存性プロセスであると考えられる事象）（Ｌｉｍら，２０００）を調査した。ＮＢＳ１フォーカスは、セリン３４３に対するＡＴＭ媒介性ＮＢＳ１リン酸化の結果である。抗ホスホ−Ｓｅｒ３４３  ＮＢＳ１抗体を使用して、Ｒ９またはｓｃＮＩＰで処理した細胞と比較してｗｔＮＩＰで処理した細胞でＮＢＳ１リン酸化が有意に阻害されることが認められた（図５Ａおよび９Ａ）。偽照射ＨｅＬａ細胞中の平均フォーカス数は、Ｒ９、ｗｔＮＩＰ、およびｓｃＮＩＰについてそれぞれ６、８、および６であった。Ｒ９またはｓｃＮＩＰで処理した細胞は２５および３１フォーカス／核を示したのに対して、ｗｔＮＩＰで処理した細胞は、６−Ｇｙ  ＩＲでの処理後にわずか６フォーカス／核しか示さなかった（図５Ｂ）。
【０２２５】
ＮＢＳ１およびγ−Ｈ２ＡＸリン酸化の両方について低レベルのバックグラウンドフォーカス形成が存在し、これは、正常に成長する哺乳動物細胞培養物における有糸分裂に相関していた（ＭｃＭａｎｕｓ  ａｎｄ  Ｈｅｎｄｚｅｌ，２００５）。
【０２２６】
ｗｔＮＩＰは照射感受性を増加させる：次いで、ＮＩＰペプチドへの曝露によって細胞放射線感受性が増加するかどうかを、コロニー形成アッセイを使用して試験した。図６Ａは、０〜６Ｇｙの線量範囲にわたってＲ９、ｗｔＮＩＰ、またはｓｃＮＩＰで処理したＨｅＬａ細胞の生存曲線を示す。Ｒ９やｓｃＮＩＰはいずれも放射線感受性に影響を及ぼさないのに対して、ｗｔＮＩＰはＩＲ誘導性生存率を有意に減少させることができる。
【０２２７】
２Ｇｙでの処理後、ｗｔＮＩＰで処理した細胞の生存率は、Ｒ９およびｓｃＮＩＰで処理した細胞の５２％および４９．７％と比較して３１．４％であった。４Ｇｙでは、ｗｔＮＩＰで処理した細胞の生存率は、Ｒ９およびｓｃＮＩＰで処理した細胞の１１．８％および１１．２％と比較して、４．５％に減少した。６Ｇｙへの線量の増加により、それぞれＲ９またはｓｃＮＩＰで処理した細胞の５．３％および６．９％と比較して、ｗｔＮＩＰで処理した細胞の生存率は小幅に減少する（１．７％）。ｗｔＮＩＰ処理細胞の増感剤増強比（ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｒａｔｉｏ）（増感剤の相対有効性）は、２、４、および６Ｇｙでそれぞれ１．６６、２．６１、および３．１２であった。
【０２２８】
照射生存曲線を、放射線感受性に及ぼすＮＩＰの影響を定義するためのＤ０に基づいて特徴づけた。Ｄ０は、生存率３７％に必要な平均致死線量を示し、細胞固有の放射線感受性の基準である。ｗｔＮＩＰで処理したＨｅＬａのＤ０値は、ｓｃＮＩＰで処理した細胞の３．０と比較して１．９であった。ｗｔＮＩＰ誘導性放射線感受性の統計的有意性を確立するために、スチューデントｔ検定（対応のある２サンプルの平均）を組み込んだ。データを、最初に、０〜６Ｇｙの線量範囲にわって各実験群にフィッティングした。ｗｔＮＩＰで処理した細胞とＤＭＥＭ、Ｒ９、またはｓｃＮＩＰで処理した細胞との間で、クローン原性生存率に有意差（ｐ＜０．０５）が認められた。ＳＥＲは１．５８であった。これは、他の試験した放射線増感剤（ゲムシタビン、５−フルオロウラシル、ペントキシフィリン、ビノレルビン）およびいくつかのＡＴＭ特異的放射線増感剤と類似している（ＳＥＲは１．１〜２．５）（Ｚｈａｎｇら，１９９８；Ｌａｗｒｅｎｃｅら，２００１；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓｈｅｗａｃｈ，２００１；Ｓｔｒｕｎｚら，２００２；Ｃｏｌｌｉｓら，２００３；Ｚｈａｎｇら，２００４）。これらの所見は、前立腺癌細胞株ＤＵ−１４５で確認されている（ＳＥＲは１．４６）。全体として見ると、ｗｔＮＩＰペプチドの放射線増感能力が強く証明される。
【０２２９】
ｗｔＮＩＰがＮＢＳ１の保存ＡＴＭ結合配列を含み、この配列はＡＴＲ相互作用タンパク質およびＫＵ８０（それぞれＡＴＲおよびＤＮＡ−ＰＫｃｓの相互作用タンパク質）のＣ末端中にも保存されているので、ＡＴＲまたはＤＮＡ−ＰＫｃｓも阻害することができる（Ａｂｒａｈａｍ，２００１）。この可能性を試験するために、欠損ＡＴＭ（ＧＭ９６０７）またはＤＮＡ−ＰＫｃｓ（Ｍ０５９Ｊ）を使用して、細胞株においてコロニー形成アッセイを行った。ｗｔＮＩＰでの処理によってＭ０５９Ｊ細胞の放射線感受性が増大するにもかかわらず（図６Ｃ）（ＳＥＲは１．８３）、ＧＭ９６０７（図６Ｄ）は放射線感受性の変化を示さなかった。ＧＭ９６０７細胞がＡＴＭを欠損し、且つ機能的ＡＴＲおよびＤＮＡ−ＰＫｃｓを有するので、これらの所見は、ｗｔＮＩＰがＡＴＭを特異的にターゲティングすることができるが、ＡＴＲやＤＮＡ−ＰＫｃｓをターゲティングせず、放射線増感を達成することを強く示す。
【０２３０】
（実施例２）
２．動物研究
これらのペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ放射線増感効果を、マウス腫瘍異種移植片モデルおよびゼブラフィッシュ胚モデルに対して行う。腫瘍細胞中に特異的に蓄積する腫瘍ターゲティングＮＩＰペプチドを投与する。マウス乳癌および前立腺癌の異種移植片モデルに及ぼすｗｔＮＩＰペプチドおよびその保存的変異体の放射線増感効果の確認に加えて、以下の疑問に取り組む：１）どのようにしてＮＩＰが腫瘍細胞を特異的に放射線増感させるのか、２）ペプチドが正常組織も放射線増感するのか、３）どのようにして腫瘍微小管密度が放射線増感剤増強比に影響を及ぼすのか、および４）ゼブラフィッシュ胚に及ぼすｗｔＮＩＰペプチドの放射線増感効果はどれぐらいか。
ｉ．マウスモデル
異種移植片に対する適切なレベルのＮＧＲ（腫瘍ホーミングモチーフ）抱合融合ペプチドを得るのに必要な経時時間を決定する。次いで、マウス中で成長した異種移植片に及ぼす放射線増感ペプチドの影響を決定する。これを達成するために、ヒトの乳房腫瘍および前立腺腫瘍の異種移植片を、マウス中に構築し、マウスにペプチドを注射し、適切な期間、ペプチドに異種移植片細胞をターゲティングさせる。
【０２３１】
ＮＧＲ−−腫瘍ホーミングモチーフ：ポリアルギニン配列は、融合ＮＩＰペプチドの有効な内在化を行うことができる。しかし、このゴールに到達するための別のアプローチは、内在化および腫瘍特異的ターゲティング能力の両方を有する配列を使用することである。１つのかかるペプチドは、環状ホーミングペプチドＣＮＧＲＣ（配列番号１１）を含むＮＧＲモチーフである。ＮＧＲ含有ペプチドは、細胞傷害性薬剤、アポトーシス促進性ペプチド、および腫瘍壊死因子αの腫瘍脈管構造への送達に有用であることが証明されている（Ｅｌｌｅｒｂｙら，１９９９；Ａｒａｐら，１９９８；Ａｒａｐら，２００２；Ｃｕｒｎｉｓら，２００２）。より興味深いことに、ＮＧＲペプチドは、原発性および転移性の前立腺腫瘍に結合することができるが、正常な前立腺組織に結合することができないことが証明されている（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら，２０００）。したがって、ＮＧＲ配列を、動物研究で使用する。３つのＮＧＲ−ＮＩＰ融合ペプチド（ＮＧＲのみ、ＮＧＲ−ｗｔＮＩＰ、およびＮＧＲ−ｓｃＮＩＰが含まれる）を合成する。ＮＧＲ配列が首尾よく使用され、これは、腫瘍ホーミングおよび内在化能力を示している。
【０２３２】
ＭＣＦ−７およびＰＣ−３異種移植片の確立：ＭＣＦ−７乳癌およびＰＣ−３前立腺癌の異種移植片を確立する。特定の発熱物質を含まない４〜６週齢の雄ｎｕ／ｎｕ（ヌード）マウスを入手し、層流隔離飼育器中に保持した滅菌フィルタートップケージ中に収容する。マウスにオートクレーブした飼料および水を自由に与える。マウスを、研究プロトコールでの使用前に１週間馴化させる。動物を含む全手順を、層流フード中の滅菌条件下で行う。ＭＣＦ−７またはＰＣ−３腫瘍細胞（ＰＢＳ中に２×１０６／マウス）を、胸腺欠損ヌードマウスの側腹部に皮下注射する。全実験では、任意の治療を開始する前に、腫瘍を確立し、成長させる。
【０２３３】
ペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ分布：一旦腫瘍が約１００ｍｍ３に到達すると、動物を無作為に分類し、０．５〜２ｍｇ／ｋｇの範囲の用量のＮＧＲのみ、ＮＧＲ−ｗｔＮＩＰ、またはＮＧＲ−ｓｃＮＩＰペプチドにて、以下の２つの経路のうちの１つによって処理する：腹腔内注射（ｉｐ）または腫瘍内注射（ｉｔ）。注射から０、６、１２、または２４時間後、マウスを安楽死させ、腫瘍組織および腫瘍組織周辺の正常組織を得る。ペプチド注射から２４時間後までに全血を単離する。サンプルを、ＦＩＴＣ抱合ストレプトアビジン抗体で染色した場合、蛍光標示式細胞分取（ｆｌｏｗ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）（ＦＡＣＳ）分析によって評価する。脾細胞を、マウスへのペプチド注射から２４時間後までに脾適除によって分析する。これらの実験により、どれぐらいの速さでペプチドが腫瘍組織に到達することができるのか、どのぐらいの期間腫瘍中に保持されるのか、およびペプチドが正常組織中にも蓄積されるのかどうかに関する情報が得られる。腫瘍組織内のペプチドの局在化を、ペプチド注射から２４時間後までの腫瘍組織の切開によって分析する。腫瘍組織標本を、ＦＩＴＣ抱合ストレプトアビジンで染色し、免疫蛍光顕微鏡法を行う。
【０２３４】
照射の送達：異種移植片を、２３Ｇニードルを使用した２×１０６個のヒトＭＣＦ−７またはＰＣ−３癌細胞を含む０．１ｍｌのＰＢＳの皮下注射によってマウスの側腹部に移植する。一旦腫瘍が１００ｍｍ３に到達すると、マウスを無作為に分類し、ｉｐまたはｉｔでペプチドを注射する。ペプチド曝露のための用量および時間を決定する。腹腔内注射のために、ペプチドの体積は２０ｍｌ／Ｋｇ未満である。腫瘍内注射のために、体積は１０ｍｌ／ｋｇ未満である。ペプチドを腫瘍にターゲティングするための短期間の間隔後、マウスを、フィルタートップケージ中の動物センターから照射室に移動する。照射ユニットは、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｘ−ＲＡＤ  ３２０照射システムである。５０ｃｍ離れた照射器の線量率は２．８Ｇｙ／分である一方で、２５ｃｍの距離では５．６Ｇｙ／分である。単回線量（１０または２０Ｇｙ）および分割線量（２Ｇｙ×５回または２Ｇｙ×１０回）の両方を行う。分割照射の間隔は２４時間であり、照射持続時間は４分未満である。照射手順の間、Ｐｌａｓ  Ｌａｂｓ（Ｌａｎｓｉｎｇ，ＭＩ）の透明なプラスチック製のマウス拘束デバイス（チューブ）中でマウスの動きを短期間（５分未満）制限して、腫瘍に照射をターゲティングさせる。
【０２３５】
腫瘍照射反応の測定：照射後、腫瘍体積を、ダイアルカリパスを使用して、さらにわずか８週間の間、２週間毎にモニタリングする。腫瘍の１０００ｍｍ３を超えた成長、発疹、または潰瘍化を行わせない。これらのエンドポイントのいずれかに到達した場合、マウスを安楽死させる。腫瘍成長を、π＊（ｗ＊ｌ＊ｈ）／２（式中、ｗは幅であり、ｌは長さであり、ｈは高さ（ｍｍ）である）として計算した平均腫瘍体積で報告する。腫瘍体積を時間の関数としてプロットして、放射線療法後のペプチドの増感効果を比較する。
【０２３６】
正常組織応答の測定：ＮＧＲ−ｗｔＮＩＰペプチドは、腫瘍細胞を特異的にターゲティングする傾向がある。この治療薬がクリニックで有用であることを評価するための臨界エンドポイントは、どのようにしてこの治療薬が正常組織の照射応答に影響を及ぼすのかということにある。早期（皮膚）および後期（肺）応答正常組織に対する照射応答を調査する。これらの組織が多数の癌型（特に乳癌放射線療法）についての照射野に分類されるので、これらの組織を選択する。これらの組織が選択される第２の理由は、皮膚および肺の照射応答を評価するための確立された方法および標準が存在することである。マウスを、ＮＧＲ融合ペプチドで処理し、その後に１０Ｇｙ照射を送達させる。皮膚損傷を研究するために、拘束した非麻酔マウスの右後足に局所照射する。（血流に影響を及ぼし得る）麻酔の使用を回避するために、脚の最上領域中の拘束治具に組織アクリル系接着剤（ｈｉｓｔｏａｃｒｙｌｉｃ  ｇｌｕｅ）の小滴を適用することによって治療に正確な位置に脚を固定する。処置後、脚は、治具から容易且つ苦痛なく引き離される。マウスを、処置後１１〜３０日間毎日観察し、処置した足の湿性剥離（ｍｏｉｓｔ  ｄｅｓｑｕａｍａｔｉｏｎ）を示す各治療群中の動物の比率を記録する（Ｈｏｒｓｍａｎら，１９９７）。肺照射のために、左肺に照射する場合、マウスを吸入全身麻酔（イソフルレン）下におく。右肺を、鉛を使用して照射から遮断し、ネガティブコントロールとして使用する。肺損傷を評価するために、８ヶ月生存したマウスの肺組織学を、左肺のペプチドを組み合わせた照射後に研究する。両肺を解剖し、１０％ホルマリン中で２４時間固定し、厚さ５μｍの切片にし、スライドガラス上にマウントし、染色する。マッソン三色染料を使用して、線維症を検出する（Ｄｉｌｅｔｏ  ａｎｄ  Ｔｒａｖｉｓ，１９９６）。
ｉｉ．ゼブラフィッシュ胚モデル
ゼブラフィッシュ（ダニオ・レリオ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ））は、そのヒトとの比較的近い系統関係、生殖能力および接触性、胚発生期間の短さ、観察の容易さ、および直接観察できることにより、治療薬を迅速且つ有効にスクリーニングするための固有の脊椎動物モデルとして使用することができる（Ｓｔｅｒｎ  ａｎｄ  Ｚｏｎ，２００３）。ヒト遺伝子に関連する２つのゼブラフィッシュ遺伝子がクローン化されている。ゼブラフィッシュＡＴＭ（ｚＡＴＭ）（Ｇａｒｇら，２００４）およびゼブラフィッシュＮＢＳ１（ｚＮＢＳ１、ＮＣＢＩ番号ＡＡＷ５０７０８）は、ヒトパートナーであるｈＡＴＭおよびｈＮＢＳ１と少なくとも７０％の相同性を有する。いくつかの研究で、電離放射線への曝露後のゼブラフィッシュ胚生存の発達期間および線量依存性を調査した（Ｇｅｉｇｅｒら，２００６；Ｔｒａｖｅｒら，２００４；Ｂｅｒｇｈｍａｎｓら，２００５）。これらの研究により、提案されたＮＩＰペプチドの放射線増感効果を評価するためにこの系を使用するための有用な情報が得られた。
【０２３７】
胚の採取および維持：野生型成体ゼブラフィッシュを入手し、標準的な操作手順にしたがって保存する。ゼブラフィッシュを、２８．５℃にて１４時間の日中／１０時間夜間サイクルで保持する。成体ゼブラフィッシュを性別によって隔離し続け、胚採取タンク（Ａｑｕａｔｉｃ  Ｈａｂｉｔａｔｓ，Ａｐｏｐｋａ，ＦＬ）中で交配させる。これらの交配由来の胚を、明期サイクルの開始直後に回収し、１ｍＭ  ＮａＣｌを含むタンク水（ｔａｎｋ  ｗａｔｅｒ）を含むペトリ皿に移す。防腐剤としてメチレンブルー（最終濃度０．５ｍｇ／Ｌ）を日常的に添加する。生きている胚を洗浄し、２ｍｌ胚培地中で１〜２細胞期（受精から約０．５〜１時間後（ｈｐｆ））によって分類し（標準的な１２ウェル培養プレートの１ウェルにつき１０胚）、正常な発生を遅延させるために正常酸素圧条件下にて２５℃で保持する。２４〜４８ｈｐｆのデコリオネーション（ｄｅｃｈｏｒｉｏｎａｔｉｏｎ）および７２〜９６ｈｐｆの再デコリオネーション後にＥＭが変化する。
【０２３８】
胚照射およびＮＧＲ−ペプチド曝露：２、４、６、８、または２４ｈｐｆの胚を、異なる用量（１０〜５０μＭ）のＮＧＲ−ペプチドに１時間曝露し、その後に１回のＸ線照射（５、１０、または２０Ｇｙ）に曝露する。照射後、胚を２５℃で２４時間インキュベートし、デコリオネーションし、次いで、２５℃で１４４時間まで維持して、形態学および生存を評価する。ここでは、ポリアルギニン抱合ペプチド（Ｒ９、ｗｔＮＩＰ、およびｓｃＮＩＰ）およびＮＧＲ抱合ペプチド（ＮＧＲのみ、ＮＧＲ−ｗｔＮＩＰ、およびＮＧＲ−ｓｃＮＩＰ）の両方を実験で試験することに留意のこと。
【０２３９】
生存率アッセイおよび形態学分析：各胚の生存率を、１４４ｈｐｆまでの受精点または各実験の結論から継続的に評価する。光学顕微鏡を使用して、全ての観察を行う。最初の２４ｈｐｆについて、Ｋｉｍｍｅｌら（Ｋｉｍｍｅｌら，１９９５）によって記載された方法を使用した適切な細胞分裂の評価によって生存率を決定する。２４ｈｐｆ後、心筋収縮能を、継続的生存と定義する。各治療群についての胚総数に対する生きている胚の比率として生存率を計算し、生存曲線は３つの個別の実験の平均を示す。分子としてのＮＩＰ−ペプチド前処置胚および分母（ｄｏｍｉｎａｔｏｒ）としての非ＮＩＰ−ペプチド前処置胚を使用した生存比として放射線増感剤増強比を計算する。組織学的評価のために、胚を４％パラホルムアルデヒド中で固定し、パラフィンに包埋する。サンプルを切片にし、組織スライス（５μＭ）をＨ＆Ｅで染色し、Ｌｅｉｃａ顕微鏡にて４０倍で評価し、Ｑ  ｉｍａｇｉｎｇ  Ｒｅｔｉｇａ  Ｅｘｉデジタルカメラを使用して撮影し、Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ  ５．１ソフトウェアで分析する。各治療群由来の少なくとも２０個の胚を評価し、実験を少なくとも３回繰り返す。
（実施例３）
３．高速処理スクリーニング（ＨＴＳ）
高速処理スクリーニング（ＨＴＳ）は、創薬分野で有意に有利であり、タンパク質−タンパク質相互作用を破壊して酵素活性を阻害する化合物について巨大ライブラリーをスクリーニングすることが可能になる（Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ，１９９８；Ｓｉｔｔａｍｐａｌａｍら，１９９７）。ＨＴＳアッセイの構築のための１つの実現可能なアプローチは蛍光偏光（ＦＰ）であり、これは、巨大分子ライブラリーをスクリーニングするための無細胞ベースアッセイである（Ｒｏｅｈｒｌら，２００４）。蛍光偏光（ＦＰ）アッセイは、偏光によって励起されるフルオロフォアを使用し、光に平行なフルオロフォアのみが励起される（Ｎａｓｉｒ  ａｎｄ  Ｊｏｌｌｅｙ，１９９９；Ｓｉｌｖｅｒｍａｎら，１９９８）。分子の回転速度は分子サイズに依存し、その結果、５０００Ｄａ未満のリガンドで有意に脱分極して急速な分子回転が起こり、脱分極蛍光シグナルを放射することができる。有意により大きなサイズ（５０００Ｄａ超）の分子のために、フルオロフォアが光を脱分極する能力を著しく減少させて分極シグナルを増加させる（図１０）（Ｓｐｏｒｔｓｍａｎら，２００３；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，２００２）。ＦＰ  ＨＴＳを使用して、乳癌関連遺伝子であるＢＲＣＡ１、Ｈｓｐ９０、およびＢｃｌ−ｘＬのＢＲＣＴドメインをターゲティングするためのインヒビターを同定した（Ｈｏｗｅｓら，２００６；Ｋｉｍら，２００４；Ｑｉａｎら，２００４）。
【０２４０】
ＦＰアッセイを使用して、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（２０Ｋ化合物）およびＣＢ２ライブラリー（１００Ｋ）で開発した化合物のライブラリーならびにこのライブラリー由来の多様な組（１０Ｋおよび３Ｋ）をスクリーニングし、ＮＢＳ１−ＡＴＭ相互作用を遮断することができる化合物を同定する。ＡＴＭ中でＮＢＳ１の保存Ｃ末端が一連のｈｅａｔ反復（ＨＲ２（ａ．ａ．２４８〜５２２）およびＨＲ７（ａ．ａ．１４３６〜１７７０）に結合することが証明されているので（図１）、ＧＳＴ−ＡＴＭペプチド（受容体として）およびＮＢＳ１ペプチド（トレーサーとして）の混合物を使用した無細胞アッセイでの蛍光分極シグナルの変化の検出によって、ＦＰアッセイを行う。アッセイの評価のために、統計実験をデザインする。いくつかのパラメーターを確認および最適化する（受容体濃度、トレーサー濃度、プレート型、ＤＭＳＯ耐性、およびインキュベーション時間が含まれる）。
ｉ．アッセイの構築および至適化
ＧＳＴ−ＡＴＭペプチドの生成および精製：ＡＴＭのＨＲ２およびＨＲ７を含む精製ＧＳＴ融合タンパク質を生成する。ＧＳＴ−ＡＴＭ構築物を産生するために、残基２４８〜１７７０（ＧＳＴ−ＡＴＭ）を含むグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）をコードする発現ベクターを、ヒトＡＴＭ  ｃＤＮＡの対応するＰＣＲ生成ＢａｍＨ１−ＥｃｏＲ１フラグメントのｐＧＥＸ−２Ｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）への挿入によって生成する。ＧＳＴ−ＡＴＭ融合タンパク質を標準的なＧＳＴ−融合ペプチド調製方法によって精製し、タンパク質の均一性をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析する。
【０２４１】
ＮＢＳ１−ＡＴＭ結合に及ぼすテキサスレッド標識の影響：第２の工程は、ＮＢＳ１Ｃ末端ペプチド（ａ．ａ．７３４〜７５４）上のテキサスレッド（ＴＲ）標識の最適な位置を決定することである。化合物の自己蛍光によって生じ得る偽陽性を排除するために、フルオレセインの代わりにＴＲを選択した。最初に、Ｎ末端またはＣ末端上のＴＲ標識がＮＢＳ１−ＡＴＭ結合に影響を及ぼし得るかどうかを試験する。ＮＢＳ１保存Ｃ末端配列（ＱＨＡＫＥＥＳＬＡＤＤＬＦＲＹＮＰＹＬＫＲＲ、配列番号３）（３つの重要なＡＴＭの結合部位（７３６−７３７（ＥＥ）、７４１−７４２（ＤＤ）、および７４５−７４６（ＲＹ））を含む）を、結合アッセイに使用する。ＴＲ標識がＡＴＭ結合を妨害しない部位を同定するために、表３に示すペプチドのＮ末端（ＴＲ−ＮＢＳ１）またはＣ末端（ＮＢＳ１−ＴＲ）のいずれかにＴＲ標識を有する２つのペプチドを合成する。次いで、漸増濃度のＧＳＴ−ＡＴＭタンパク質を使用した一定濃度のＴＲ標識タンパク質（１００μＭ）の滴定によって、各標識ペプチドについての解離定数（Ｋｄ）を決定する。分極はタンパク質の分子量に直接関連するので、ＧＳＴタグは置いておく。結合ペプチドと遊離ペプチドとの間の分極の相違によってアッセイ範囲を定義し、Ｋｄ値を使用して、ＴＲ標識の最良の位置を決定する。
【０２４２】
【表３】
2010508022.tif 000010
ＮＢＳ１−ＡＴＭ結合の親和性、ＦＰアッセイの安定性、およびＦＰ  ＤＭＳＯの耐性：標識ＮＢＳ１ペプチドがＡＴＭに結合する能力を決定するために、標識ペプチドと同一の長さの非標識ｗｔＮＢＳ１ペプチドを使用して、競合ベースのアッセイを行う（表１）。非標識ＮＢＳ１ペプチドを、至適濃度（前述で定義）のＧＳＴ−ＡＴＭおよび標識ＮＢＳ１に滴定して、非標識ＮＢＳ１ペプチドの存在下で標識ＮＢＳ１ペプチドがＡＴＭに結合する能力を決定する。アッセイの安定性は、ＦＰスクリーニングの処理能力を決定する重要なパラメーターである。ＮＢＳ１−ＡＴＭ結合の経時変化研究を組み込み、シグナルの安定性を決定する。結合アッセイ物を、１２時間にわたって室温でインキュベートし、アッセイプレートを、この時間にわたって４時間間隔で読み取る。この研究により、ＮＢＳ１−ＡＴＭ複合体の結合時間が洞察される。スクリーニングライブラリー中の全ての化合物をＤＭＳＯに溶解するので、ＤＭＳＯ耐性（すなわち、ペプチド−ＧＳＴ融合タンパク質相互作用を阻害することなく溶液中で化合物を保持するために必要な濃度）の試験は、高速処理スクリーニングのためのＦＰアッセイにおける最終ＤＭＳＯ濃度の決定で重要である。０〜８％の範囲の最終濃度のＤＭＳＯを各ウェルに添加し、その後に標識ＮＢＳ１ペプチドおよびＧＳＴ−ＡＴＭを添加する。
【０２４３】
アッセイ能力指標の生物統計分析：Ｚ’因子は、アッセイの質および適切性を評価し（０〜１．０、１．０が最良のアッセイであるが、０．５〜１．０が信頼できる（ｒｏｂｕｓｔ）アッセイと見なされる）、ポジティブ（ｐ）コントロールおよびネガティブ（ｎ）コントロールの両方の平均（μ）および標準偏差（σ）（μｐ、μｎ、σｐ、σｎ）に基づく。Ｚ’因子を確立するために、ＦＰアッセイを使用した競合的阻害を使用して、酵素阻害定数Ｋｉを確立するであろう。Ｋｉ値を確立するために、漸増濃度（０−５００μＭ）の非標識ＮＢＳ１ペプチドおよび２μＭの標識ＮＢＳ１ペプチドを、適切な濃度のＧＳＴ−ＡＴＭに添加する。ＧＳＴ−ＡＴＭの濃度を、前記実験のＫｄ値（少なくとも１であるべきである）から確立し、この濃度は、受容体（ＡＴＭ）と標識ＮＢＳ１ペプチドのＫｄとの間の比に基づく。これらの値から、Ｚ’因子を、以下の式にしたがって計算する：
【０２４４】
【数２】
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０．５以上のＺ’因子は、ＦＰ高速処理スクリーニングにふさわしいと見なされる。
【０２４５】
信号雑音比（Ｓ／Ｎ）は、別の重要な能力表示である。Ｓ／Ｎを使用して、非特異的結合（ＮＳＢ）の範囲を定量し、１０以上の信号雑音比が許容可能な能力レベルである。しかし、ＦＰでは、非特異的結合の範囲によってノイズを定量できないので、Ｓ／Ｎを使用することができない。ＦＰアッセイでは、非結合トレーサーが存在し、これがＮＳＢシグナル全体に寄与し、ＮＳＢシグナルのみよりも大きくなる。したがって、Ｓ／Ｎ値は、非結合トレーサーを除去するか、結合トレーサーと区別しなければならない他のアッセイと比較して小さい。
ｉｉ．ＨＴＳおよびヒットの検証
Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（２０，０００化合物）およびＣｈｅｍｂｒｉｄｇｅ  ｌｉｂｒａｒｙ（１００，０００化合物＋このライブラリー内の３０，０００および２０，０００の多様性組（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｓｅｔ））で確立された多様性ライブラリー（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｌｉｂｒａｒｙ）を、１０μμＭ  ＴＲ標識ＮＢＳ１ペプチドおよび至適濃度（前述の実験で定義のとおり）のＤＭＳＯ溶液中にて室温で１５分間インキュベーションするＧＳＴ−ＡＴＭを使用して、１０μＭでスクリーニングする。阻害ポジティブコントロールとして使用した非標識ｗｔＮＩＰペプチドを使用して、３８４または１５３６ウェルプレート中でアッセイを行う。この実験から同定されたヒット（ｈｉｔ）を連続希釈し、アッセイを繰り返し、Ｋｉ値を確立する。１０個のもっとも低いＫｉ値の化合物を、さらなる評価のために選択する。
ｉｉｉ．ヒット化合物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価
一旦ＮＢＳ１−ＡＴＭ相互作用を最良に阻害することができる化合物が同定されると、これらの化合物を、組織培養モデルで試験する。第１に、細胞傷害性を示し、そして／または放射線増感剤であることが既に公知の化合物を同定する。これらの公知の化合物を、さらなるｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究のためにさらに除外する。残りの化合物を、ＭＴＴアッセイおよびいくつかの腫瘍細胞株（ＨｅＬａ、ＭＣＦ−７、およびＰＣ−３が含まれる）におけるコロニー形成を使用して細胞傷害性について最初に評価する。細胞傷害性をもたない化合物を、放射線増感研究のために選択する。コロニー形成アッセイを使用して放射線増感アッセイを行い、照射誘導性の生存率を評価する。ＩＲ誘導性γＨ２ＡＸおよびＮＢＳ１フォーカス形成を、化合物の存在下で評価する。
（実施例４）
４．放射線増感ペプチドの遺伝子送達
低酸素性腫瘍細胞は、照射に高耐性を示し、放射線療法が失敗すると見なされている。ｗｔＮＩＰ放射線増感ペプチドを低酸素性腫瘍組織中で特異的に発現することができる場合、放射線療法による腫瘍コントロールの劇的増加が予想される。この目的に到達するために、低酸素性組織中のｗｔＮＩＰを発現することができる低酸素症駆動アデノウイルスベクターを準備する。組織培養物および動物モデルの両方におけるウイルスの有効性を評価する。
【０２４６】
第１に、低酸素症応答プロモーターがｗｔＮＩＰ発現を駆動する発現カセットを生成する。ＮｈｅＩコンパチブル末端：
【０２４７】
【化３】
2010508022.tif 000012
を有するマウスホスホグリセリン酸キナーゼＩの５’隣接配列（−３０７〜−２９０）由来の低酸素症応答エンハンサーエレメントに基づいて２つの合成オリゴヌクレオチドの相補対を生成する。
【０２４８】
２つのオリゴをアニーリングして二本鎖ＤＮＡを形成し、ｐＧＬ３−プロモーターベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＮｈｅＩ部位に直接クローン化する。ｐＧＬ３−プロモーターベクターはＳＶ４０基本プロモーターを有し、ＳＶ４０基本プロモーターと組み合わせた低酸素症応答エンハンサーの構造は、受容体遺伝子および腫瘍自殺遺伝子を低酸素性腫瘍中で特異的に発現するように駆動することが証明された。次いで、５’ＮｃｏＩおよび３’Ｘｂａｌコンパチブル部位を有する小ペプチド配列に基づいて別のオリゴ対を作製する。小ペプチド発現の検出を容易にするために、ペプチドの３’末端に連結したＨｉｓタグ配列をデザインする。オリゴ配列は以下である：
【０２４９】
【化４】
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スラッシュの間の配列は、６ヒスチジンの縦列反復である。二本鎖ＤＮＡへのアニーリング後、フラグメントをｐＧＬ−３プロモーターベクターのＮｃｏＩおよびＸｂａｌ部位に直接クローン化して、元のルシフェラーゼレポーター遺伝子と置換する。得られた構築物を、配列によって確認する。ＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩによって放出された全発現カセットを、アデノウイルスベクターシャトルプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＣＡ）にライゲーションする。次いで、Ｅ１およびＥ３欠失ｐＡｄＥａｓｙ−１アデノウイルス骨格ベクターでの相同組換えによってシャトルベクターを組換えて、パッケージング可能なＡｄゲノムを生成する。有効な組換えを達成するために、ＢＪ５１８３コンピテント細菌をエレクトロポレーションによって形質転換し、正確なクローンプラスミド（ｐＡｄ５−低酸素症−ＳＩＰ２）をアデノウイルスベクター産生のために選択する。アデノベクターを生成するために、９１１アデノウイルスパッケージング細胞株を使用し、リン酸カルシウム沈殿によってトランスフェクトする。産生したベクターを、９１１細胞中で増殖させる。塩化セシウム勾配遠心分離およびＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−６Ｂカラム脱塩を行って、ベクター調製物を濃縮および精製する。
【０２５０】
ベクターの生成後、ベクターを低酸素性ヒト癌細胞培養物中で発現させて、ＮＩＰを発現するかどうかを試験する。発現を確認後、放射線増感効果を調査する。さらに、ウイルスをマウス異種移植片モデルに注射し、ｉｎ  ｖｉｖｏ放射線増感効果を評価する。
【０２５１】
【化５−１】
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【０２５２】
【化５−２】
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【０２５３】
【化５−３】
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【０２５４】
【化５−４】
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【０２５５】
【化５−５】
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Ｃ．  配列表
【０２５６】
【化６】
2010508022.tif 000019
【０２５７】
【化７】
2010508022.tif 000020
【０２５８】
【化８】
2010508022.tif 000021
【０２５９】
【化９】
2010508022.tif 000022
【０２６０】
【化１０】
2010508022.tif 000023
【０２６１】
【化１１】
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【０２６２】
【化１２】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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