(57)【要約】  プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型(ＰＣＳＫ９)のエピトープ、ＰＣＳＫ９およびＰＣＳＫ９エピトープに結合する組成物、ならびにその組成物を使用する方法を本明細書に記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＣＳＫ９に特異的に結合する抗体の抗原結合部分を含み、ここで抗原結合部分が以下：
(ａ)配列番号１のアミノ酸１６６−１７７；
(ｂ)配列番号１のアミノ酸１８７−２０２；
(ｃ)配列番号１のアミノ酸２０６−２１９；
(ｄ)配列番号１のアミノ酸２３１−２４６；
(ｅ)配列番号１のアミノ酸２７７−２８３；
(ｆ)配列番号１のアミノ酸３３６−３４９；
(ｇ)配列番号１のアミノ酸３６８−３８３；または
(ｈ)配列番号１のアミノ酸４２６−４３９；
のうちの１つの配列内かまたはそれと重複するヒトＰＣＳＫ９(配列番号１)の触媒ドメイン内のエピトープに結合する単離されたプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型ポリペプチド(ＰＣＳＫ９)結合分子。
【請求項２】
ＰＣＳＫ９に特異的に結合する抗体の抗原結合部分を含み、ここで抗原結合部分が以下：
(ａ)配列番号１のアミノ酸４４３−５００；
(ｂ)配列番号１のアミノ酸５５７−５９０；または
(ｃ)配列番号１のアミノ酸６３６−６７８；
のうちの１つの配列内かまたはそれと重複するヒトＰＣＳＫ９のシステインリッチドメイン内のエピトープに結合する単離されたＰＣＳＫ９結合分子。
【請求項３】
ＰＣＳＫ９に特異的に結合する抗体の抗原結合部分を含み、ここで抗原結合部分が配列番号１のアミノ酸８９−１３４内かまたはそれと重複するヒトＰＣＳＫ９のプロドメイン内のエピトープに結合する単離されたＰＣＳＫ９結合分子。
【請求項４】
抗原結合部分が非ヒト霊長類のＰＣＳＫ９と交差反応性である請求項１から３のいずれかに記載のＰＣＳＫ９結合分子。
【請求項５】
抗原結合部分がげっ歯類のＰＣＳＫ９と交差反応性である請求項１から３のいずれかに記載のＰＣＳＫ９結合分子。
【請求項６】
抗原結合部分が直線エピトープに結合する請求項１から３のいずれかに記載のＰＣＳＫ９結合分子。
【請求項７】
抗原結合部分が非直線エピトープに結合する請求項１から３のいずれかに記載のＰＣＳＫ９結合分子。
【請求項８】
抗原結合部分が以下の直線エピトープ：
(ａ)配列番号１のアミノ酸８９−１０１；および
(ｂ)配列番号１のアミノ酸１０６−１３４；
の各々の少なくとも一部からなる非直線エピトープに結合する請求項７に記載のＰＣＳＫ９結合分子。
【請求項９】
抗原結合部分が以下の直線エピトープ：
(ａ)配列番号１のアミノ酸１６６−１７７；および
(ｂ)配列番号１のアミノ酸４４３−４５８；
の各々の少なくとも一部からなる非直線エピトープに結合する請求項７に記載のＰＣＳＫ９結合分子。
【請求項１０】
抗原結合部分が以下の直線エピトープ：
(ａ)配列番号１のアミノ酸１８７−２０２；
(ｂ)配列番号１のアミノ酸２３１−２４６；および
(ｃ)配列番号１のアミノ酸３６８−３８３；
のうちの２つまたは３つの少なくとも一部からなる非直線エピトープに結合する請求項７に記載のＰＣＳＫ９結合分子。
【請求項１１】
抗原結合部分が以下の直線エピトープ：
(ａ)配列番号１のアミノ酸２０６−２１９；および
(ｂ)配列番号１のアミノ酸２７７−２８３；
の各々の少なくとも一部からなる非直線エピトープに結合する請求項７に記載のＰＣＳＫ９結合分子。
【請求項１２】
抗原結合部分が以下の直線エピトープ：
(ａ)配列番号１のアミノ酸３３６−３４９；および
(ｂ)配列番号１のアミノ酸４２６−４３９；
の各々の少なくとも一部からなる非直線エピトープに結合する請求項７に記載のＰＣＳＫ９結合分子。
【請求項１３】
抗原結合部分が以下の直線エピトープ：
(ａ)配列番号１のアミノ酸４５９−４７６；
(ｂ)配列番号１のアミノ酸４８６−５００；および
(ｃ)配列番号１のアミノ酸５５７−５７３；
のうちの２つまたは３つの少なくとも一部からなる非直線エピトープに結合する請求項７に記載のＰＣＳＫ９結合分子。
【請求項１４】
抗原結合部分が以下の直線エピトープ：
(ａ)配列番号１のアミノ酸５７７−５９０；
(ｂ)配列番号１のアミノ酸６３６−６４５；および
(ｃ)配列番号１のアミノ酸６５９−６７７；
のうちの２つまたは３つの少なくとも一部からなる非直線エピトープに結合する請求項７に記載のＰＣＳＫ９結合分子。
【請求項１５】
抗原結合部分が以下：
(ａ)配列番号１のアミノ酸４４３−４５８；
(ｂ)配列番号１のアミノ酸４５９−４７６；
(ｃ)配列番号１のアミノ酸４８６−５００；
(ｄ)配列番号１のアミノ酸５５７−５７３；
(ｅ)配列番号１のアミノ酸５７７−５９０；
(ｆ)配列番号１のアミノ酸６３６−６４５；または
(ｇ)配列番号１のアミノ酸６５９−６７７；
のうちの１つの配列内かまたはそれと重複するヒトＰＣＳＫ９のエピトープに特異的に結合する請求項２に記載のＰＣＳＫ９結合分子。
【請求項１６】
抗原結合部分が以下：
(ａ)配列番号１のアミノ酸８９−１０１；または
(ｂ)配列番号１のアミノ酸１０６−１３４；
のうちの１つの配列内かまたはそれと重複するヒトＰＣＳＫ９のエピトープに特異的に結合する請求項３に記載のＰＣＳＫ９結合分子。
【請求項１７】
抗原結合部分が１０ｎＭ以下の解離定数(ＫＤ)でＰＣＳＫ９に結合する請求項１から１６のいずれかに記載のＰＣＳＫ９結合分子。
【請求項１８】
抗原結合部分が１ｎＭ以下の解離定数(ＫＤ)でＰＣＳＫ９に結合する請求項１から１７のいずれかに記載のＰＣＳＫ９結合分子。
【請求項１９】
抗原結合部分が０.５ｎＭ以下のＫＤでＰＣＳＫ９に結合する請求項１８に記載のＰＣＳＫ９結合分子。
【請求項２０】
抗原結合部分が０.１ｎＭ以下のＫＤでヒトＰＣＳＫ９に結合する請求項１９に記載のＰＣＳＫ９結合分子。
【請求項２１】
抗原結合部分が０.３ｎＭ以下のＫＤで非ヒト霊長類のＰＣＳＫ９に結合する請求項１８に記載のＰＣＳＫ９結合分子。
【請求項２２】
その抗原結合部分が０.５ｎＭ以下のＫＤでマウスＰＣＳＫ９に結合する請求項１８に記載のＰＣＳＫ９結合分子。
【請求項２３】
抗原結合部分がヒト抗体の抗原結合部分である請求項１から２２のいずれかに記載のＰＣＳＫ９結合分子。
【請求項２４】
抗体がヒト化またはhumaneered抗体である請求項２３に記載のＰＣＳＫ９結合分子。
【請求項２５】
抗原結合部分がモノクローナル抗体の抗原結合部分である請求項１から２４のいずれかに記載のＰＣＳＫ９結合分子。
【請求項２６】
抗原結合部分がポリクローナル抗体の抗原結合部分である請求項２３に記載のＰＣＳＫ９結合分子。
【請求項２７】
ＰＣＳＫ９結合分子がキメラ抗体である請求項１から２６のいずれかに記載のＰＣＳＫ９結合分子。
【請求項２８】
ＰＣＳＫ９結合分子が抗体のＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ(ａｂ’)２またはＦｖフラグメントを含む請求項１から２６のいずれかに記載のＰＣＳＫ９結合分子。
【請求項２９】
ＰＣＳＫ９結合分子が一本鎖Ｆｖを含む請求項１から２６のいずれかに記載のＰＣＳＫ９結合分子。
【請求項３０】
ＰＣＳＫ９結合分子がダイアボディーを含む請求項１から２６のいずれかに記載のＰＣＳＫ９結合分子。
【請求項３１】
抗原結合部分が以下のアイソタイプ：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４；のうちの１つの抗体から誘導される請求項１から３０のいずれかに記載のＰＣＳＫ９結合分子。
【請求項３２】
ＰＣＳＫ９結合分子がＰＣＳＫ９リガンドに対するＰＣＳＫ９結合を阻止する請求項１から３１のいずれかに記載のＰＣＳＫ９結合分子。
【請求項３３】
ＰＣＳＫ９結合分子が低密度リポタンパク質受容体(ＬＤＬ−Ｒ)に対するＰＣＳＫ９結合を阻止する請求項１から３２のいずれかに記載のＰＣＳＫ９結合分子。
【請求項３４】
ＰＣＳＫ９結合分子がＰＣＳＫ９のタンパク質分解活性を阻止する請求項１から３３のいずれかに記載のＰＣＳＫ９結合分子。
【請求項３５】
ＰＣＳＫ９結合分子がＰＣＳＫ９プロドメインのタンパク質分解を阻止する請求項３４に記載のＰＣＳＫ９結合分子。
【請求項３６】
ＰＣＳＫ９結合分子が肝細胞におけるＬＤＬ−ＲのＰＣＳＫ９依存性の低下を阻止する請求項１から３５のいずれかに記載のＰＣＳＫ９結合分子。
【請求項３７】
ＰＣＳＫ９結合分子が肝細胞におけるＬＤＬ−ＲのＰＣＳＫ９依存性の分解を阻止する請求項３６に記載のＰＣＳＫ９結合分子。
【請求項３８】
ＰＣＳＫ９が存在する条件下で肝細胞と接触させる場合、ＰＣＳＫ９結合分子の不在下での肝細胞による低密度リポタンパク質コレステロール(ＬＤＬ−ｃ)取り込みに相対してＰＣＳＫ９結合分子が肝細胞によるＬＤＬ−ｃ取り込みを増大させる請求項１から３７のいずれかに記載のＰＣＳＫ９結合分子。
【請求項３９】
ＰＣＳＫ９結合分子がＬＤＬ−Ｃの存在下でＰＣＳＫ９に結合する請求項１から３８のいずれかに記載のＰＣＳＫ９結合分子。
【請求項４０】
ＰＣＳＫ９結合分子が血清の存在下でＰＣＳＫ９に結合する請求項１から３９のいずれかに記載のＰＣＳＫ９結合分子。
【請求項４１】
ＰＣＳＫ９結合ドメインのアミノ酸配列がフィブロネクチン、サイトカイン受容体またはカドヘリンの免疫グロブリン様フォールドのアミノ酸配列に少なくとも７５％同一であり、そしてＰＣＳＫ９結合ドメインのアミノ酸配列が免疫グロブリン様フォールドのアミノ酸配列に相対してＰＣＳＫ９結合ドメインがＰＣＳＫ９に特異的に結合するように改変されているＰＣＳＫ９結合ドメインを含むＰＣＳＫ９結合分子。
【請求項４２】
ＰＣＳＫ９結合ドメインが１０ｎＭ以下のＫＤでＰＣＳＫ９に結合する請求項４１に記載のＰＣＳＫ９結合分子。
【請求項４３】
ＰＣＳＫ９結合ドメインが１ｎＭ以下のＫＤでＰＣＳＫ９に結合する請求項４１に記載のＰＣＳＫ９結合分子。
【請求項４４】
Ｉｇ様フォールドがフィブロネクチンのＩｇ様フォールドである請求項４１に記載のＰＣＳＫ９結合分子。
【請求項４５】
Ｉｇ様フォールドがフィブロネクチンＩＩＩ型のＩｇ様フォールドである請求項４４に記載のＰＣＳＫ９結合分子。
【請求項４６】
請求項１から４５のいずれかのＰＣＳＫ９結合分子を含む医薬組成物。
【請求項４７】
肝細胞をＰＣＳＫ９結合分子と接触させることを含む肝細胞におけるＬＤＬ−Ｒレベルを増大させる方法。
【請求項４８】
肝細胞をＰＣＳＫ９結合分子と接触させ、それによりＰＣＳＫ９によるＬＤＬ−Ｒの下方調節を低減させ、そして肝細胞によるＬＤＬ−ｃ取り込みを増大させることを含む肝細胞によるＬＤＬ−ｃ取り込みを増大させる方法。
【請求項４９】
以下のアミノ酸配列：
ＹＲＡＤＥＹＱＰＰＤＧＧ(配列番号４)；
ＴＳＩＱＳＤＨＲＥＩＥＧＲＶＭＶ(配列番号５)；
ＥＮＶＰＥＥＤＧＴＲＦＨＲＱ(配列番号６)；
ＡＧＶＶＳＧＲＤＡＧＶＡＫＧＡＳ(配列番号７)；
ＶＱＰＶＧＰＬ(配列番号８)；
ＶＧＡＴＮＡＱＤＱＰＶＴＬＧ(配列番号９)；
ＩＩＧＡＳＳＤＣＳＴＣＦＶＳＱＳ(配列番号１０)；
ＥＡＷＦＰＥＤＱＲＶＬＴＰＮ(配列番号１１)；
ＡＬＰＰＳＴＨＧＡＧＷＱＬＦＣＲ(配列番号１２)；
ＴＶＷＳＡＨＳＧＰＴＲＭＡＴＡＩＡＲ(配列番号１３)；
ＣＳＳＦＳＲＳＧＫＲＲＧＥＲＭ(配列番号１４)；
ＨＶＬＴＧＣＳＳＨＷＥＶＥＤＬＧＴ(配列番号１５)；
ＰＶＬＲＰＲＧＱＰＮＱＣＶＧ(配列番号１６)；
ＳＡＬＰＧＴＳＨＶＬ(配列番号１７)；
ＲＤＶＳＴＴＧＳＴＳＥＥＡＶＴＡＶＡＩ(配列番号１８)；
ＳＱＳＥＲＴＡＲＲＬＱＡＱ(配列番号２)；または
ＧＹＬＴＫＩＬＨＶＦＨＧＬＬＰＧＦＬＶＫＭＳＧＤＬＬＥＬＡ(配列番号３)；
のうちの１つに少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項５０】
ＰＣＳＫ９の生物学的活性を調整するＰＣＳＫ９結合分子を対象に投与することを含み、ここでＰＣＳＫ９結合分子が以下の活性：
(ａ)ＬＤＬ−Ｒに対するＰＣＳＫ９結合を阻止すること；
(ｂ)ＰＣＳＫ９のタンパク質分解活性を阻止すること；
(ｃ)肝細胞におけるＬＤＬ−ＲのＰＣＳＫ９依存性の低下を阻止すること；および
(ｄ)肝細胞におけるＬＤＬ−ＲのＰＣＳＫ９依存性の分解を阻止すること；
のうちの１つまたはそれより多くを呈する対象におけるＰＣＳＫ９活性を調整する方法。
【請求項５１】
対象における血漿コレステロールを低減させるのに有効な量の請求項４６に記載の組成物を対象に投与することを含む対象の血漿コレステロールを低減させる方法。
【請求項５２】
その量がＬＤＬ−ｃを低減させるのに有効である請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
組成物を投与する前の血漿ＬＤＬ−ｃに相対して対象の血漿ＬＤＬ−ｃの濃度を少なくとも５％まで低減させる請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
対象が第２のコレステロール低下薬での治療も受けている請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
第２のコレステロール低下薬がスタチンである請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
対象が脂質障害を有するかまたはその危険性がある請求項５１に記載の方法。
【請求項５７】
対象が高コレステロール血症であるかまたは高コレステロール血症の危険性がある請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
対象がアテローム性動脈硬化症を有するかまたはその危険性がある請求項５１に記載の方法。
【請求項５９】
対象が心血管障害を有するかまたはその危険性がある請求項５１に記載の方法。
【請求項６０】
対象がスタチン不耐性である請求項５１に記載の方法。
【請求項６１】
対象がスタチン治療に抵抗する請求項５１に記載の方法。
【請求項６２】
組成物の投与の前に対象の全血漿コレステロールレベルが２００ｍｇ／ｄｌまたはそれより大きい請求項５１に記載の方法。
【請求項６３】
組成物の投与の前に対象の血漿ＬＤＬ−ｃレベルが１６０ｍｇ／ｄｌまたはそれより大きい請求項５１に記載の方法。
【請求項６４】
組成物を静脈内投与する請求項５１に記載の方法。
【請求項６５】
ＰＣＳＫ９に特異的に結合する抗体の抗原結合部分を含み、ここで抗原結合部分が以下：
(ａ)配列番号１のアミノ酸１０１−１０７；または
(ｂ)配列番号１のアミノ酸１２３−１３２；
のうちの１つの配列内かまたはそれと重複するヒトＰＣＳＫ９のプロドメイン内のエピトープに結合する単離されたＰＣＳＫ９結合分子。
【請求項６６】
抗原結合部分が配列番号１のアミノ酸１０１−１０７内かまたはそれと重複するヒトＰＣＳＫ９のプロドメイン内のエピトープに結合する請求項６５に記載の単離されたＰＣＳＫ９結合分子。
【請求項６７】
抗原結合部分が配列番号１のアミノ酸１２３−１３２内かまたはそれと重複するヒトＰＣＳＫ９のプロドメイン内のエピトープに結合する請求項６５に記載の単離されたＰＣＳＫ９結合分子。
【請求項６８】
以下：
(ａ)配列番号１のアミノ酸１０１−１０７；または
(ｂ)配列番号１のアミノ酸１２３−１３２；
のうちの１つの配列内かまたはそれと重複するヒトＰＣＳＫ９のプロドメイン内のエピトープに結合するＰＣＳＫ９結合分子とＰＣＳＫ９との結合に関して交差競合する単離されたＰＣＳＫ９結合分子。
【請求項６９】
抗原結合部分が非直線エピトープに結合する請求項６５から６７のいずれかに記載のＰＣＳＫ９結合分子。
【請求項７０】
抗原結合部分が以下の直線エピトープ：
(ａ)配列番号１のアミノ酸１０１−１０７；および
(ｂ)配列番号１のアミノ酸１２３−１３２；
の各々の全てまたは少なくとも一部を含む非直線エピトープに結合する請求項６９に記載のＰＣＳＫ９結合分子。
【請求項７１】
ＰＣＳＫ９に特異的に結合する抗体の抗原結合部分を含み、ここで抗原結合部分が配列番号１のアミノ酸１０１−１３２内で結合する単離されたＰＣＳＫ９結合分子。
【請求項７２】
抗原結合部分が配列番号１のアミノ酸１０１−１３２内で結合し、そして配列番号２からの少なくとも１つのアミノ酸および配列番号３からの少なくとも１つのアミノ酸を含む請求項７１に記載の単離されたＰＣＳＫ９結合分子。
【請求項７３】
抗原結合部分が配列番号２からの少なくとも１つのアミノ酸および配列番号３からの少なくとも１つのアミノ酸の表面を覆うエピトープに結合するＰＣＳＫ９に特異的に結合する抗体の抗原結合部分を含む単離されたＰＣＳＫ９結合分子。
【請求項７４】
ＰＣＳＫ９に特異的に結合する抗体の抗原結合部分を含み、ここで抗原結合部分が配列番号２内のエピトープ、配列番号３内のエピトープまたは配列番号２からの少なくとも１つのアミノ酸および配列番号３からの少なくとも１つのアミノ酸と重複するエピトープからなる群から選択されるエピトープに結合する単離されたＰＣＳＫ９結合分子。
【請求項７５】
配列番号２のアミノ酸がグルタミンである請求項７３または７４に記載の単離されたＰＣＳＫ９結合分子。
【請求項７６】
抗原結合部分が配列番号３からの少なくとも２つのアミノ酸と重複する請求項７３または７４に記載の単離されたＰＣＳＫ９結合分子。
【請求項７７】
アミノ酸がグリシンおよびチロシンである請求項７６に記載の単離されたＰＣＳＫ９結合分子。
【請求項７８】
抗体がヒト、ヒト化、humaneeredまたはキメラ抗体である請求項６５から６７および６９から７７のいずれかに記載のＰＣＳＫ９結合分子。
【請求項７９】
抗原結合部分がモノクローナルまたはポリクローナル抗体の抗原結合部分である請求項６５から６７および６９から７７のいずれかに記載のＰＣＳＫ９結合分子。
【請求項８０】
ＰＣＳＫ９結合分子が抗体のＦａｂフラグメント、一本鎖Ｆｖ、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ(ａｂ’)２、ダイアボディーまたはＦｖフラグメントを含む請求項６５から７７のいずれかに記載のＰＣＳＫ９結合分子。
【請求項８１】
抗原結合部分が以下のアイソタイプ：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４；のうちの１つの抗体から誘導される請求項６５から６７および６９から７７のいずれかに記載のＰＣＳＫ９結合分子。
【請求項８２】
高コレステロールレベルに関連する疾患の処置のための医薬品を調製するための請求項１から８１のいずれかに記載のＰＣＳＫ９結合分子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗原結合分子、これらの分子により結合されるエピトープおよびその分子を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型(ＰＣＳＫ９)(神経アポトーシス調節転換酵素１またはＮＡＲＣ−１としても公知)はセリンプロテアーゼのプロテイナーゼＫ分泌型サブチリシン様サブファミリーである(Naureckiene et al., Arc. Biochem. Biophys. ４２０：５５−６７(２００３))である。ヒトＰＣＳＫ９は腎臓、肝臓および腸で主に発現される分泌タンパク質である。それは３つのドメイン：阻害性プロドメイン(アミノ酸１−１５２；アミノ酸１−３０にシグナル配列を含む)、セリンプロテアーゼドメイン(アミノ酸１５３−４４８)およびシステイン残基に富むＣ末端ドメイン２１０残基長(アミノ酸４４９−６９２)を有する。ＰＣＳＫ９は小胞体においてプロドメインと触媒性ドメインとの間で自己触媒性切断を行うチモーゲンとして合成される。プロドメインは切断後成熟タンパク質に結合したままであり、そして複合体が分泌される。システインリッチドメインは活性化プロテアーゼのフォールディングおよび調節に必須であると考えられるその他のフューリン／ケキシン／サブチリシン様セリンプロテアーゼのＰ−(プロセシング)ドメインに類似する役割を果たし得る。ＰＣＳＫ９における変異は血漿中の低密度リポタンパク質コレステロール(ＬＤＬ−ｃ)のレベル異常に関連する(Horton et al., Trends. Biochem. Sci. ３２(２)：７１−７７(２００６))。
【発明の概要】
【０００３】
本発明はＰＣＳＫ９のエピトープ、ＰＣＳＫ９結合分子、およびその分子を使用する方法に関する。ＰＣＳＫ９結合分子はＰＣＳＫ９と相互作用し、そしてＰＣＳＫ９機能を調整する。ＰＣＳＫ９結合分子を用いてＬＤＬ−受容体(ＬＤＬ−Ｒ)レベルを増大させ、そしてコレステロールレベルを低減させることができる。
【０００４】
種々の態様では、本発明はＰＣＳＫ９の１つまたはそれより多い生物学的機能を調整(例えば阻止)するＰＣＳＫ９結合分子を提供する。例えばＰＣＳＫ９結合分子はＰＣＳＫ９のタンパク質分解活性(例えばＰＣＳＫ９プロドメインのタンパク質分解)および／またはＰＣＳＫ９とＰＣＳＫ９受容体との間の相互作用(例えばＬＤＬ−Ｒに対するＰＣＳＫ９結合)を阻止することができる。ＰＣＳＫ９は転写後の様式でＬＤＬ−Ｒを下方調節する。故にＰＣＳＫ９の阻止の結果、ＬＤＬ−Ｒレベルの増大に至る。インビボでのＬＤＬ−Ｒのレベル増大によりＬＤＬ−Ｒ媒介のＬＤＬ−ｃの取り込みを増大させることが可能になる。故にＬＤＬ−ＲのＰＣＳＫ９調節と干渉する結合分子は最終的に循環ＬＤＬ−ｃのレベルを低減させる。
【０００５】
ＰＣＳＫ９結合分子には、例えばＰＣＳＫ９に結合する抗体(例えばＰＣＳＫ９の、触媒ドメインまたはシステインリッチドメインのような特定のドメインまたはエピトープ内)およびかかる抗体の結合部分を含むポリペプチドが含まれる。ＰＣＳＫ９結合分子にはまた結合部分が抗体、例えば免疫グロブリン様フォールドを有するポリペプチドから誘導されるＰＣＳＫ９結合分子から誘導されない分子も含まれ、そしてここで抗原結合部分は無作為化、選択および親和性成熟を介してＰＣＳＫ９に結合するように操作される。
【０００６】
したがって、１つの態様では、本発明はＰＣＳＫ９に結合する(例えば特異的に結合する)抗体の抗原結合部分を含むＰＣＳＫ９結合分子を特色とし、ここで抗原結合部分は以下：(ａ)配列番号１のアミノ酸１６６−１７７(すなわち以下：ＹＲＡＤＥＹＱＰＰＤＧＧ(配列番号４)の配列内かまたはそれと重複するエピトープ)；(ｂ)配列番号１のアミノ酸１８７−２０２(すなわち以下：ＴＳＩＱＳＤＨＲＥＩＥＧＲＶＭＶ(配列番号５)の配列内かまたはそれと重複するエピトープ)；(ｃ)配列番号１のアミノ酸２０６−２１９(すなわち以下：ＥＮＶＰＥＥＤＧＴＲＦＨＲＱ(配列番号６)の配列内かまたはそれと重複するエピトープ)；(ｄ)配列番号１のアミノ酸２３１−２４６(すなわち以下：ＡＧＶＶＳＧＲＤＡＧＶＡＫＧＡＳ(配列番号７)の配列内かまたはそれと重複するエピトープ)；(ｅ)配列番号１のアミノ酸２７７−２８３(すなわち以下：ＶＱＰＶＧＰＬ(配列番号８)の配列内かまたはそれと重複するエピトープ)；(ｆ)配列番号１のアミノ酸３３６−３４９(すなわち以下：ＶＧＡＴＮＡＱＤＱＰＶＴＬＧ(配列番号９)の配列内かまたはそれと重複するエピトープ)；(ｇ)配列番号１のアミノ酸３６８−３８３(すなわち以下：ＩＩＧＡＳＳＤＣＳＴＣＦＶＳＱＳ(配列番号１０)の配列内かまたはそれと重複するエピトープ)；または(ｈ)配列番号１のアミノ酸４２６−４３９(すなわち以下：ＥＡＷＦＰＥＤＱＲＶＬＴＰＮ(配列番号１１)の配列内かまたはそれと重複するエピトープ)；のうちの１つ内かまたはそれと重複する(例えば全てまたは一部を含むかまたはそれからなる)ヒトＰＣＳＫ９(配列番号１)の触媒ドメイン内のエピトープに結合する。
【０００７】
例えば抗原結合部分は配列番号１のアミノ酸１６６−１７１、１６９−１７４または１７２−１７７内のエピトープに結合する；抗原結合部分は配列番号１のアミノ酸１８７−１９３、１９１−１９６、１９４−１９９または１９７−２０２内のエピトープに結合する；抗原結合部分は配列番号１のアミノ酸２０６−２１１、２０９−２１４、２１２−２１７、２１５−２１９内のエピトープに結合する；抗原結合部分は配列番号１のアミノ酸２３１−２３７、２３５−２４０、２３８−２４３、２４１−２４６内のエピトープに結合する；抗原結合部分は配列番号１のアミノ酸２７７−２８２または２７９−２８３内のエピトープに結合する；抗原結合部分は配列番号１のアミノ酸３３６−３４１、３３９−３４３、３４１−３４６または３４４−３４９内のエピトープに結合する；抗原結合部分は配列番号１のアミノ酸３６８−３７４、３７２−３７７、３７５−３８０または３７８−３８３内のエピトープに結合する；抗原結合部分は配列番号１のアミノ酸４２６−４３１、４２９−４３４、４３２−４３７または４３５−４３９内のエピトープに結合する。
【０００８】
別の態様では、本発明はＰＣＳＫ９に結合する(例えば特異的に結合する)抗体の抗原結合部分を含む単離されたＰＣＳＫ９結合分子を特色とし、ここで抗原結合部分は以下：(ａ)配列番号１のアミノ酸４４３−５００；(ｂ)アミノ酸５５７−５９０；または(ｃ)アミノ酸６３６−６７８；のうちの１つの配列内かまたはそれと重複するヒトＰＣＳＫ９のシステインリッチドメイン内のエピトープに結合する。
【０００９】
種々の実施態様では、抗原結合部分は以下：(ａ)配列番号１のアミノ酸４４３−４５８(すなわち以下：ＡＬＰＰＳＴＨＧＡＧＷＱＬＦＣＲ(配列番号１２)の配列内かまたはそれと重複するエピトープ)；(ｂ)配列番号１のアミノ酸４５９−４７６(すなわち以下：ＴＶＷＳＡＨＳＧＰＴＲＭＡＴＡＩＡＲ(配列番号１３)の配列内かまたはそれと重複するエピトープ)；(ｃ)配列番号１のアミノ酸４８６−５００(すなわち以下：ＣＳＳＦＳＲＳＧＫＲＲＧＥＲＭ(配列番号１４)の配列内かまたはそれと重複するエピトープ)；(ｄ)配列番号１のアミノ酸５５７−５７３(すなわち以下：ＨＶＬＴＧＣＳＳＨＷＥＶＥＤＬＧＴ(配列番号１５)の配列内かまたはそれと重複するエピトープ)；(ｅ)配列番号１のアミノ酸５７７−５９０(すなわち以下：ＰＶＬＲＰＲＧＱＰＮＱＣＶＧ(配列番号１６)の配列内かまたはそれと重複するエピトープ)；(ｆ)配列番号１のアミノ酸６３６−６４５(すなわち以下：ＳＡＬＰＧＴＳＨＶＬ(配列番号１７)の配列内かまたはそれと重複するエピトープ)；(ｇ)配列番号１のアミノ酸６５９−６７７(すなわち以下：ＲＤＶＳＴＴＧＳＴＳＥＥＡＶＴＡＶＡＩ(配列番号１８)の配列内かまたはそれと重複するエピトープ)；のうちの１つの配列内かまたはそれと重複するヒトＰＣＳＫ９のエピトープに特異的に結合する。
【００１０】
例えば抗原結合部分は配列番号１のアミノ酸４４３−４４９、４４７−４５２、４５０−４５５、４５３−４５８内のエピトープに結合する；抗原結合部分は配列番号１のアミノ酸４５９−４６５、４６３−４６８、４６６−４７１、４６９−４７４または４７２−４７６内のエピトープに結合する；抗原結合部分は配列番号１のアミノ酸４８６−４９１、４８９−４９４、４９２−４９７または４９５−５００内のエピトープに結合する；抗原結合部分は配列番号１のアミノ酸５５７−５６３、５６１−５６６、５６４−５６９、５６７−５７２または５６９−５７３内のエピトープに結合する；抗原結合部分は配列番号１のアミノ酸５７７−５８２、５８０−５８５、５８３−５８８または５８６−５９０内のエピトープに結合する；抗原結合部分は配列番号１のアミノ酸６３６−６４３または６４０−６４５内のエピトープに結合する；抗原結合部分は配列番号１のアミノ酸６５９−６６５、６６３−６６８、６６５−６７０、６６８−６７３または６７１−６７７内のエピトープに結合する。
【００１１】
別の態様では、本発明はＰＣＳＫ９に結合する(例えば特異的に結合する)抗体の抗原結合部分を含む単離されたＰＣＳＫ９結合分子を特色とし、ここで抗原結合部分は配列番号１のアミノ酸８９−１３４内かまたはそれと重複するヒトＰＣＳＫ９のプロドメイン内のエピトープに結合する。
【００１２】
種々の実施態様では、抗原結合部分は以下：(ａ)配列番号１のアミノ酸８９−１０１(すなわち以下：ＳＱＳＥＲＴＡＲＲＬＱＡＱ(配列番号２)の配列内かまたはそれと重複するエピトープ)；または(ｂ)配列番号１のアミノ酸１０６−１３４(すなわち以下：ＧＹＬＴＫＩＬＨＶＦＨＧＬＬＰＧＦＬＶＫＭＳＧＤＬＬＥＬＡ(配列番号３)の配列内かまたはそれと重複するエピトープ)；のうちの１つの配列内かまたはそれと重複するヒトＰＣＳＫ９のエピトープに特異的に結合する。例えば抗原結合部分は配列番号１のアミノ酸１２３−１３１内のエピトープに特異的に結合する。
【００１３】
例えば抗原結合部分は配列番号１のアミノ酸８９−９４、９２−９７または９５−１０１内のエピトープに結合する；抗原結合部分は配列番号１のアミノ酸１０６−１１１、１０９−１１４、１１２−１１７、１１５−１２０、１１８−１２３、１２１−１２６、１２４−１２９または１２７−１３４内のエピトープに結合する。
【００１４】
特定の実施態様では、抗原結合部分は配列番号１のアミノ酸１０１−１０７内かまたはそれと重複するヒトＰＣＳＫ９のプロドメイン内のエピトープに特異的に結合する(アミノ酸ＱＡＡＲＲＧＹ)。
【００１５】
別の実施態様では、抗原結合部分は配列番号１のアミノ酸１２３−１３２(アミノ酸ＬＶＫＭＳＧＤＬＬＥ)内かまたはそれと重複するヒトＰＣＳＫ９のプロドメイン内のエピトープに特異的に結合する。これらのアミノ酸はＰＣＳＫ９のプロドメインのアミノ酸１０６−１３４(配列番号３；ＧＹＬＴＫＩＬＨＶＦＨＧＬＬＰＧＦＬＶＫＭＳＧＤＬＬＥＬＡ)に入る。
【００１６】
別の実施態様では、抗原結合部分は配列番号１のアミノ酸１０１−１３２を有するＰＣＳＫ９に特異的に結合する(すなわち配列番号２内のエピトープ、配列番号３内のエピトープまたは配列番号２および３に重複する、すなわち配列番号２および配列番号３からの少なくとも１つのアミノ酸を含むエピトープに結合する)。
【００１７】
別の実施態様では、抗原結合部分は配列番号１のアミノ酸１０１−１３２内のＰＣＳＫ９に特異的に結合し、そして配列番号２からの少なくとも１つのアミノ酸(例えばグルタミン)および配列番号３からの少なくとも１つのアミノ酸(例えばグリシンおよび／またはチロシン)を含む。
【００１８】
別の実施態様では、抗原結合部分は配列番号１のアミノ酸１０１−１３２内のＰＣＳＫ９に特異的に結合し、そして配列番号２からの少なくとも１つのアミノ酸(例えばグルタミン)および配列番号３からの少なくとも１つのアミノ酸(例えばグリシンおよび／またはチロシン)を含む。
【００１９】
別の実施態様では、抗原結合部分は配列番号２からの少なくとも１つのアミノ酸(例えばグルタミン)および配列番号３からの少なくとも１つのアミノ酸(例えばグリシンおよび／またはチロシン)と重複するエピトープでＰＣＳＫ９に特異的に結合する。
【００２０】
別の態様では、本発明は前記で言及されたＰＣＳＫ９結合分子のいずれかとの結合に関して交差競合する単離されたＰＣＳＫ９結合分子を特色とする。したがってかかる交差競合結合分子は、例えば空間的に近接するエピトープに対する結合により配列番号１のアミノ酸１０１−１０７または１２３−１３２に対する(例えば抗体または結合する抗体の抗原結合部分を含むその他のＰＣＳＫ９結合分子の)結合と干渉することができる。
【００２１】
種々の実施態様では、ＰＣＳＫ９結合分子(例えば触媒ドメイン内、システインリッチドメイン内またはプロドメイン内のエピトープに結合するＰＣＳＫ９結合分子)は非ヒト霊長類(例えばカニクイザルまたはアカゲザル)のＰＣＳＫ９と交差反応性である。種々の実施態様では、抗原結合部分はげっ歯類のＰＣＳＫ９と交差反性である(例えばマウスＰＣＳＫ９、ラットＰＣＳＫ９)。
種々の実施態様では、抗原結合部分は直線エピトープに結合する。
【００２２】
種々の実施態様では、抗原結合部分は非直線エピトープに結合する。一例では、抗原結合部分は以下の直線エピトープ：(ａ)配列番号１のアミノ酸８９−１０１；および(ｂ)アミノ酸１０６−１３４；の各々の少なくとも一部を含むかまたはそれからなる非直線エピトープに結合する。別の実例では、抗原結合部分は以下の直線エピトープ：(ａ)配列番号１のアミノ酸１６６−１７７；および(ｂ)配列番号１のアミノ酸４４３−４５８；の各々の少なくとも一部を含むかまたはそれからなる非直線エピトープに結合する。なお別の実例では抗原結合部分は以下の直線エピトープ：(ａ)配列番号１のアミノ酸１８７−２０２；(ｂ)配列番号１のアミノ酸２３１−２４６；および(ｃ)配列番号１のアミノ酸３６８−３８３；のうちの２つまたは３つのうちの少なくとも一部を含むかまたはそれからなる非直線エピトープに結合する。別の実例では、抗原結合部分は以下の直線エピトープ：(ａ)配列番号１のアミノ酸２０６−２１９；および(ｂ)配列番号１のアミノ酸２７７−２８３；の各々の少なくとも一部を含むかまたはそれからなる非直線エピトープに結合する。別の実例では、抗原結合部分は以下の直線エピトープ：(ａ)配列番号１のアミノ酸３３６−３４９；および(ｂ)配列番号１のアミノ酸４２６−４３９；の各々の少なくとも一部を含むかまたはそれからなる非直線エピトープに結合する。別の実例では、抗原結合部分は以下の直線エピトープ：(ａ)配列番号１のアミノ酸４５９−４７６；(ｂ)配列番号１のアミノ酸４８６−５００；および(ｃ)配列番号１のアミノ酸５５７−５７３；のうちの２つまたは３つのうちの少なくとも一部を含むかまたはそれからなる非直線エピトープに結合する。別の実例では、抗原結合部分は以下の直線エピトープ：(ａ)配列番号１のアミノ酸５７７−５９０；(ｂ)配列番号１のアミノ酸６３６−６４５；および(ｃ)配列番号１のアミノ酸６５９−６７７；のうちの２つまたは３つの少なくとも一部を含むかまたはそれからなる非直線エピトープに結合する。
【００２３】
特定の実施態様では、抗原結合部分は(ａ)配列番号１のアミノ酸１０１−１０７；および(ｂ)配列番号１のアミノ酸１２３−１３２の全てまたは一部を含む非直線エピトープ(例えば立体構造的エピトープ)に結合する。
種々の実施態様では、ＰＣＳＫ９結合分子の結合の効率はＰＣＳＫ９の特定のドメインまたはエピトープ内の結合の位置に相関する。
【００２４】
種々の実施態様では、ＰＣＳＫ９結合分子の抗原結合部分は１０ｎＭ、１ｎＭ、０.５ｎＭ、０.２５ｎＭまたは０.１ｎＭ以下の解離定数(ＫＤ)でＰＣＳＫ９に結合する。
種々の実施態様では、ＰＣＳＫ９結合分子の抗原結合部分は０.３ｎＭ以下のＫＤで非ヒト霊長類(例えばカニクイザルまたはチンパンジー)のＰＣＳＫ９に結合する。
種々の実施態様では、抗原結合部分は０.５ｎＭ以下のＫＤでマウスＰＣＳＫ９に結合する。
【００２５】
抗体はキメラ(例えばヒト化)抗体もしくはヒト抗体、またはhumaneered抗体でよい。
１つの実施態様では、抗原結合部分はヒト抗体の抗原結合部分である。
抗原結合部分はモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の抗原結合部分でよい。
ＰＣＳＫ９結合分子には、例えば抗体のＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ(ａｂ’)２またはＦｖフラグメントが含まれる。
【００２６】
１つの実施態様では、ＰＣＳＫ９結合分子はヒト抗体である。
１つの実施態様では、ＰＣＳＫ９結合分子には一本鎖Ｆｖが含まれる。
１つの実施態様では、ＰＣＳＫ９結合分子にはダイアボディー(例えば一本鎖ダイアボディーまたは２本のペプチド鎖を有するダイアボディー)が含まれる。
【００２７】
いくつかの実施態様では、抗体の抗原結合部分は以下のアイソタイプ：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のうちの１つの抗体から誘導される。いくつかの実施態様では、抗体の抗原結合部分は抗体のＩｇＡまたはＩｇＥアイソタイプから誘導される。
【００２８】
ＰＣＳＫ９結合分子(例えば触媒ドメイン内、システインリッチドメイン内、またはプロドメイン内のエピトープに結合するＰＣＳＫ９結合分子)は数多くの生物学的活性のうちの１つまたはそれより多くを呈することができる。種々の実施態様では、ＰＣＳＫ９結合分子はＰＣＳＫ９リガンドに対するＰＣＳＫ９結合を阻止する。いくつかの実施態様では、ＰＣＳＫ９結合分子はｐＨ７−８でＰＣＳＫ９リガンドに対する結合を阻止する。いくつかの実施態様では、ＰＣＳＫ９結合分子はｐＨ７を下まわるｐＨで(例えばｐＨ５−７で)結合を阻止する。例えばＰＣＳＫ９結合分子はＰＣＳＫ９リガンドに対するＰＣＳＫ９結合を、対照と相対して(例えばＰＣＳＫ９結合分子の不在下での結合に相対して)少なくとも５％、１０％、１５％、２５％または５０％まで阻止する。
【００２９】
例えばＰＣＳＫ９結合分子は低密度リポタンパク質受容体(ＬＤＬ−Ｒ)に対するＰＣＳＫ９結合を阻止することができる(例えばＰＣＳＫ９結合分子はｐＨ７およびより低いｐＨ、例えばｐＨ５−７でＬＤＬ−Ｒに対するＰＣＳＫ９結合を阻止する)。
【００３０】
ＰＣＳＫ９プロドメインは成熟ＰＣＳＫ９ポリペプチドから切断され、そしてそれと非共有結合したままである。１つの実施態様では、ＰＣＳＫ９結合分子は触媒またはシステインリッチドメインに対する結合に関してＰＣＳＫ９プロドメインと競合し(またはその逆)、そしてＰＣＳＫ９の生物学的活性を阻止する。
【００３１】
いくつかの実施態様では、ＰＣＳＫ９結合分子はＰＣＳＫ９のタンパク質分解活性(例えばＰＣＳＫ９プロドメインの、または別のＰＣＳＫ９基質のタンパク質分解)を阻止する。例えばＰＣＳＫ９結合分子はＰＣＳＫ９タンパク質分解活性を、対照と相対して(例えばＰＣＳＫ９結合分子の不在下での活性に相対して)少なくとも５％、１０％、１５％、２５％または５０％まで阻止する。
【００３２】
いくつかの実施態様では、ＰＣＳＫ９結合分子は細胞、例えば肝細胞においてＬＤＬ−ＲのＰＣＳＫ９依存性の低下(例えばＬＤＬ−ＲのＰＣＳＫ９依存性の分解)を阻止する。例えばＰＣＳＫ９結合分子はＬＤＬ−ＲのＰＣＳＫ９依存性の低下を、対照と相対して(例えばＰＣＳＫ９結合分子の不在下でのＬＤＬ−Ｒの低下に相対して)少なくとも５％、１０％、１５％、２５％または５０％まで阻止する。これらの実施態様では、ＬＤＬ−Ｒレベルにおける増大により、ＰＣＳＫ９結合分子はＬＤＬ−ＲのＰＣＳＫ９依存性の低下を阻止することが示される。
【００３３】
特定の実施態様では、ＰＣＳＫ９結合分子はＰＣＳＫ９が存在する条件下で細胞、例えば肝細胞と接触した場合に、ＰＣＳＫ９結合分子の不在下での肝細胞によるＬＤＬ−ｃ取り込みと相対して、肝細胞によるＬＤＬ−ｃ取り込みを増大させる。例えばＰＣＳＫ９結合分子は対照と相対して(例えばＰＣＳＫ９結合分子の不在下での結合に相対して)ＬＤＬ−ｃ取り込みを、少なくとも５％、１０％、１５％、２５％または５０％まで増大させる。
【００３４】
ＰＣＳＫ９結合分子はＬＤＬ−ｃの存在下でＰＣＳＫ９に結合することができ、そして／またはそれは血清の存在下で(例えば少なくとも１％、５％、１０％、２５％、５０％血清の存在下で)ＰＣＳＫ９に結合することができる。
【００３５】
本発明はまた非抗体ＰＣＳＫ９結合分子も特色とする。非抗体ＰＣＳＫ９結合分子には、以下：テネイシン、Ｎ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリン、ＩＣＡＭ、タイチン、ＧＣＳＦ受容体、サイトカイン受容体、グリコシダーゼ阻害剤、抗菌性色素タンパク質、ミエリン膜接着分子Ｐ０、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２、クラスＩ  ＭＨＣ、Ｔ細胞抗原受容体、ＣＤ１、ＶＣＡＭ−１のＣ２およびＩセットドメイン、ミオシン結合タンパク質ＣのＩセット免疫グロブリンドメイン、ミオシン結合タンパク質ＨのＩセット免疫グロブリンドメイン、テロキンのＩセット免疫グロブリンドメイン、ＮＣＡＭ、トゥイッチン、ニューログリアン、成長ホルモン受容体、エリトロポイエチン受容体、プロラクチン受容体、インターフェロンガンマ受容体、β−ガラクトシダーゼ／グルクロニダーゼ、β−グルクロニダーゼ、トランスグルタミナーゼ、Ｔ細胞抗原受容体、スーパーオキシドジスムターゼ、組織因子ドメイン、チトクロムＦ、緑色蛍光タンパク質、ＧｒｏＥＬまたはタウマチン；のうちの１つのような非抗体ポリペプチドの免疫グロブリン様(Ｉｇ様)フォールドから誘導されるアミノ酸配列を有するＰＣＳＫ９結合ドメインが含まれる。一般的には、ＰＣＳＫ９結合ドメインがＰＣＳＫ９に特異的に結合するように(すなわちここで免疫グロブリン様フォールドはＰＣＳＫ９に特異的に結合しない)免疫グロブリン様フォールドのアミノ酸配列に相対してＰＣＳＫ９結合ドメインのアミノ酸配列を改変する。
【００３６】
種々の実施態様では、ＰＣＳＫ９結合ドメインのアミノ酸配列はフィブロネクチン、サイトカイン受容体またはカドヘリンの免疫グロブリン様フォールドのアミノ酸配列と少なくとも６０％同一(例えば少なくとも６５％、７５％、８０％、８５％または９０％同一)である。
【００３７】
種々の実施態様では、ＰＣＳＫ９結合ドメインのアミノ酸配列は以下：テネイシン、Ｎ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリン、ＩＣＡＭ、タイチン、ＧＣＳＦ受容体、サイトカイン受容体、グリコシダーゼ阻害剤、抗菌性色素タンパク質、ミエリン膜接着分子Ｐ０、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２、クラスＩ  ＭＨＣ、Ｔ細胞抗原受容体、ＣＤ１、ＶＣＡＭ−１のＣ２およびＩセットドメイン、ミオシン結合タンパク質ＣのＩセット免疫グロブリンドメイン、ミオシン結合タンパク質ＨのＩセット免疫グロブリンドメイン、テロキンのＩセット免疫グロブリンドメイン、ＮＣＡＭ、トゥイッチン、ニューログリアン、成長ホルモン受容体、エリトロポイエチン受容体、プロラクチン受容体、インターフェロンガンマ受容体、β−ガラクトシダーゼ／グルクロニダーゼ、β−グルクロニダーゼ、トランスグルタミナーゼ、Ｔ細胞抗原受容体、スーパーオキシドジスムターゼ、組織因子ドメイン、チトクロムＦ、緑色蛍光タンパク質、ＧｒｏＥＬまたはタウマチン；のうちの１つの免疫グロブリン様フォールドのアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７５％、８０％、８５％または９０％同一である。
【００３８】
種々の実施態様では、ＰＣＳＫ９結合ドメインは１０ｎＭ以下(例えば１ｎＭ、０.５ｎＭ、０.１ｎＭ)のＫＤでＰＣＳＫ９に結合する。
いくつかの実施態様では、Ｉｇ様フォールドはフィブロネクチンのＩｇ様フォールド、例えばフィブロネクチンＩＩＩ型のＩｇ様フォールド(例えばフィブロネクチンＩＩＩのモジュール１０のＩｇ様フォールド)である。
【００３９】
本発明はまたＰＣＳＫ９の抗原性エピトープに相当するペプチドも提供する。１つの態様では、本発明は以下のアミノ酸配列：ＹＲＡＤＥＹＱＰＰＤＧＧ(配列番号４)；ＴＳＩＱＳＤＨＲＥＩＥＧＲＶＭＶ(配列番号５)；ＥＮＶＰＥＥＤＧＴＲＦＨＲＱ(配列番号６)；ＡＧＶＶＳＧＲＤＡＧＶＡＫＧＡＳ(配列番号７)；ＶＱＰＶＧＰＬ(配列番号８)；ＶＧＡＴＮＡＱＤＱＰＶＴＬＧ(配列番号９)；ＩＩＧＡＳＳＤＣＳＴＣＦＶＳＱＳ(配列番号１０)；ＥＡＷＦＰＥＤＱＲＶＬＴＰＮ(配列番号１１)；ＡＬＰＰＳＴＨＧＡＧＷＱＬＦＣＲ(配列番号１２)；ＴＶＷＳＡＨＳＧＰＴＲＭＡＴＡＩＡＲ(配列番号１３)；ＣＳＳＦＳＲＳＧＫＲＲＧＥＲＭ(配列番号１４)；ＨＶＬＴＧＣＳＳＨＷＥＶＥＤＬＧＴ(配列番号１５)；ＰＶＬＲＰＲＧＱＰＮＱＣＶＧ(配列番号１６)；ＳＡＬＰＧＴＳＨＶＬ(配列番号１７)；ＲＤＶＳＴＴＧＳＴＳＥＥＡＶＴＡＶＡＩ(配列番号１８)；ＳＱＳＥＲＴＡＲＲＬＱＡＱ(配列番号２)；またはＧＹＬＴＫＩＬＨＶＦＨＧＬＬＰＧＦＬＶＫＭＳＧＤＬＬＥＬＡ(配列番号３)；のうちの１つに少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列からなるペプチドを特色とする。
【００４０】
別の態様では、本発明は組成物が動物に投与される場合、ＰＣＳＫ９に特異的に結合する抗体を誘発するための組成物を提供する。組成物には例えば以下のペプチド：ＹＲＡＤＥＹＱＰＰＤＧＧ(配列番号４)；ＴＳＩＱＳＤＨＲＥＩＥＧＲＶＭＶ(配列番号５)；ＥＮＶＰＥＥＤＧＴＲＦＨＲＱ(配列番号６)；ＡＧＶＶＳＧＲＤＡＧＶＡＫＧＡＳ(配列番号７)；ＶＱＰＶＧＰＬ(配列番号８)；ＶＧＡＴＮＡＱＤＱＰＶＴＬＧ(配列番号９)；ＩＩＧＡＳＳＤＣＳＴＣＦＶＳＱＳ(配列番号１０)；ＥＡＷＦＰＥＤＱＲＶＬＴＰＮ(配列番号１１)；ＡＬＰＰＳＴＨＧＡＧＷＱＬＦＣＲ(配列番号１２)；ＴＶＷＳＡＨＳＧＰＴＲＭＡＴＡＩＡＲ(配列番号１３)；ＣＳＳＦＳＲＳＧＫＲＲＧＥＲＭ(配列番号１４)；ＨＶＬＴＧＣＳＳＨＷＥＶＥＤＬＧＴ(配列番号１５)；ＰＶＬＲＰＲＧＱＰＮＱＣＶＧ(配列番号１６)；ＳＡＬＰＧＴＳＨＶＬ(配列番号１７)ＲＤＶＳＴＴＧＳＴＳＥＥＡＶＴＡＶＡＩ(配列番号１８)；ＳＱＳＥＲＴＡＲＲＬＱＡＱ(配列番号２)；ＧＹＬＴＫＩＬＨＶＦＨＧＬＬＰＧＦＬＶＫＭＳＧＤＬＬＥＬＡ(配列番号３)；５つ未満のアミノ酸変化を伴うそのペプチド；またはそのフラグメント(例えば５、６、７、８、９、１０、１１または１２個のアミノ酸を含有するフラグメント)；のうちの１つが含まれる。ペプチドを例えばキャリアタンパク質に結合することにより修飾して抗原性を増大させることができる。
【００４１】
本発明はまた本明細書に記載されるＰＣＳＫ９結合分子を含む医薬組成物を特色とする。その組成物には例えばＰＣＳＫ９結合分子および薬学的に許容される担体が含まれる。
本発明はまた本明細書に記載されるＰＣＳＫ９結合分子を使用する方法を特色とする。
【００４２】
例えば１つの態様では、本発明は細胞、例えば肝細胞におけるＬＤＬ−Ｒレベルを増大させる方法を特色とする。その方法には、肝細胞をＰＣＳＫ９結合分子(例えばＰＣＳＫ９に特異的に結合する抗体の抗原結合部分を含むＰＣＳＫ９結合分子)と接触させ、それによりＰＣＳＫ９によるＬＤＬ−Ｒの下方調節を低減させ、そして肝細胞におけるＬＤＬ−Ｒレベルを増大させることが含まれる。
【００４３】
別の態様では、本発明は細胞、例えば肝細胞によるＬＤＬ−ｃ取り込みを増大させる方法を特色とする。その方法には、肝細胞をＰＣＳＫ９結合分子(例えばＰＣＳＫ９に特異的に結合する抗体の抗原結合部分を含むＰＣＳＫ９結合分子)と接触させ、それによりＰＣＳＫ９によるＬＤＬ−Ｒの下方調節を低減させ、そして肝細胞におけるＬＤＬ−ｃ取り込みを増大させることが含まれる。
【００４４】
別の態様では、本発明は対象におけるＰＣＳＫ９活性を調整する方法を特色とする。その方法には、ＰＣＳＫ９の生物学的活性を調整するＰＣＳＫ９結合分子(例えばＰＣＳＫ９に特異的に結合する抗体の抗原結合部分を含むＰＣＳＫ９結合分子)を対象に投与することが含まれる。ＰＣＳＫ９結合分子は以下の活性：(ａ)ＬＤＬ−Ｒに対するＰＣＳＫ９結合の阻止；(ｂ)ＰＣＳＫ９のタンパク質分解活性の阻止；(ｃ)肝細胞におけるＬＤＬ−ＲのＰＣＳＫ９依存性の低下の阻止；および(ｄ)肝細胞におけるＬＤＬ−ＲのＰＣＳＫ９依存性の分解の阻止；のうちの１つまたはそれより多くを呈する。
【００４５】
別の態様では、本発明は対象における血漿コレステロールを低減させる方法を特色とする。その方法には、対象における血漿コレステロールを低減させるのに有効な量で本明細書に記載されるＰＣＳＫ９結合分子を含む医薬組成物を対象に投与することが含まれる。その量はＬＤＬ−ｃを低減させるのに有効な量でよい。対象の血漿ＬＤＬ−ｃの濃度を、組成物を投与する前の血漿ＬＤＬ−ｃに相対して、少なくとも５％まで低減させることができる(例えば血漿ＬＤＬ−ｃの濃度を少なくとも１０％、１５％または２０％まで低減させる)。いくつかの実施態様では、対象はまたスタチンのような第２のコレステロール低下薬も投与される。
【００４６】
種々の実施態様では、対象は脂質障害(例えば高脂質血症、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型またはＶ型高脂質血症、続発性高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、黄色腫症、コレステロールアセチルトランスフェラーゼ欠損症)を有するか、またはその危険性がある。例えば対象は高コレステロール血症であるかまたは高コレステロール血症の危険性がある；対象はアテローム性動脈硬化症を有するか、またはその危険性がある；対象は心血管障害を有するか、またはその危険性がある。
【００４７】
いくつかの実施態様では、対象はスタチン不耐性である(例えば対象はスタチン薬物を摂取した場合、副作用を被る)、および／または対象はスタチン治療に抵抗する(例えばスタチン治療は対象におけるコレステロール低減を引き起こさなかった)。
いくつかの実施態様では、組成物の投与の前に対象の全血漿コレステロールレベルは２００ｍｇ／ｄｌ以上である。
【００４８】
いくつかの実施態様では、組成物の投与の前に対象の血漿ＬＤＬ−ｃレベルは１６０ｍｇ／ｄｌ以上である。
いくつかの実施態様では、組成物を静脈内に投与する。
いくつかの実施態様では、ＰＳＣＫ９結合分子を用いて高コレステロールレベルに関連する疾患の処置のための医薬品を調製することができる。
【００４９】
本発明の１つまたはそれより多い実施態様の詳細を添付の図面および以下の記載で示す。本発明のその他の特色、目的および利点は記載および図面から、および請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図１は直線配列におけるシグナルペプチド、プロドメイン、触媒ドメインおよびＣ末端(システインリッチ)ドメインの位置を示すヒトＰＣＳＫ９の模式図である。
【図２】図２はヒトＰＣＳＫ９の三次元構造モデルの描写である。数字は表２に列挙されるエピトープの位置を示す。
【図３】図３はｈＰＣＳＫ９に結合するＨ１−Ｆａｂ結合のBiacore結合親和性研究の結果を描く。センサーグラム(黒色のぎざぎざの線)は０.７８、１.５６、３.１２、６.２５および１２.５ｎＭの濃度でのＨ１−Ｆａｂの結合曲線である。１：１全体的適合(黒色の滑らかな線)により以下の結合パラメーター：κｄ＝３.４１×１０−３(１／秒)、κａ＝３.２３×１０５(１／Ｍ秒)およびＫＤ＝１.０５および１０−８(Ｍ)。
【図４】図４Ａ−Ｃは、Ｈ１−Ｆａｂが(４Ａ)ｈＰＣＳＫ９／ＬＤＬ−Ｒ相互作用を破壊し、そして(４Ｂ)表面ＬＤＬ−Ｒレベルの増大および(４Ｃ)ＨｅｐＧ２細胞によるＬＤＬ取り込みの増大に至り得ることを説明する。
【図５】図５Ａ−Ｃは自動重水素交換質量分析(ＤＸＭＳ)システムの流体接続スキームを描く。実験のローディング／インラインタンパク質分解相、脱塩段階および分離段階のためのバルブ位置を図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃの各々で説明する。
【図６】図６は補完的な水素／重水素(Ｈ／Ｄ)交換実験(すなわち保護、対照およびＤ２Ｏ中(Ｉｎ−Ｄ２Ｏ)実験)および予期される結果を描く概略図である。
【図７】図７Ａ−Ｂは(Ａ)保護実験および(Ｂ)ｈＰＣＳＫ９およびｈＰＣＳＫ９：Ｈ１−Ｆａｂ複合体において実施されたＤ２Ｏ中実験に関するｈＰＣＳＫ９の残基数の関数として重水素において観察された変化を描く。
【図８】図８は非直線エピトープを形成するために予想された２つのアミノ酸ストレッチ(すなわちアミノ酸残基１０１−１０７(ＱＡＡＲＲＧＹ)および１２３−１３２(ＬＶＫＭＳＧＤＬＬＥ))を有するｈＰＣＳＫ９のカートゥーン結晶構造を描く。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
詳細な説明
本発明はＰＣＳＫ９に結合する分子(「ＰＣＳＫ９結合分子」)、特にヒトＰＣＳＫ９に結合し、そしてその機能を調整するヒト抗体およびその部分を提供する。ＰＣＳＫ９のエピトープおよびこれらのエピトープに結合する薬剤もまた本明細書にて提供される。
ヒトＰＣＳＫ９(ｈＰＣＳＫ９)の全長配列はGenbank(登録商標)受け入れ番号ＧＩ：１１９６２７０６５、ｇｂ｜ＥＡＸ０６６６０.１の下で見出され、そして表１にて配列番号１として示される。ｈＰＣＳＫ９をコードするｍＲＮＡ配列が受け入れ番号ＧＩ：３１３１７３０６、ＮＭ  １７４９３６の下で見出される。
【００５２】
【表１】
2010523135.tif 000002
【００５３】
配列番号１の直線配列におけるシグナルペプチド、プロドメイン、触媒ドメインおよびＣ末端システインリッチドメインの位置を図１に示す。ヒトＰＣＳＫ９はＮ５３３でＮ−グリコシル化される。それはＹ５３および触媒(プロテアーゼ)ドメインで硫酸化される。ヒト血漿中のｈＰＣＳＫ９の濃度は５０−６００ｎｇ／ｍｌの範囲である(Lagace et al., J. Clin. Inv. 116(11):2995-3005(2006))。ｈＰＣＳＫ９における特定の変異はＬＤＬ−ｃの血漿レベルの上昇および低減に関連する(Horton et al., Trends. Biochem. Sci. 32(2):71-77(2006))。以下の変異：Ｓ１２７Ｒ、Ｆ２１６Ｌ、Ｄ３７４Ｙ、Ｎ４２５ＳおよびＲ４９６Ｗ；はＬＤＬ−ｃの上昇に関連する。以下の変異：Ｒ４６Ｌ、ΔＲ９７、Ｇ１０６Ｒ、Ｙ１４２Ｘ、Ｌ２５３Ｆ、Ａ４４３ＴおよびＣ６７９Ｘ；はＬＤＬ−ｃの低減に関連する。
【００５４】
予想されるチンパンジーＰＣＳＫ９アミノ酸配列はGenbank(登録商標)にて受け入れ番号ＧＩ：１１４５５６７９０、ＸＰ  ００１１５４１２６；および受け入れ番号ＧＩ：１１４５５６７８８、ＸＰ  ５１３４３０の下で見出される。マウスＰＣＳＫ９のアミノ酸配列は受け入れ番号ＧＩ：２３９５６３５２、ＮＰ  ７０５７９３の下で見出される。ラットＰＣＳＫ９アミノ酸配列は受け入れ番号ＧＩ：７７０２０２５０、ＮＰ  ９５４８６２の下で見出される。ｈＰＣＳＫ９のアミノ酸配列はチンパンジーＰＣＳＫ９と９８.７％同一であり、ラットＰＣＳＫ９と７９.５％同一であり、そしてマウスＰＣＳＫ９と７８.９％同一である。
【００５５】
ｈＰＣＳＫ９の抗原性エピトープのアミノ酸配列および配列番号１のｈＰＣＳＫ９配列内のその位置を表２に列挙する。
【表２】
2010523135.tif 000003
ｐｒｏ＝プロドメイン、ｃａｔ＝触媒ドメイン、ｃｒｄ＝システインリッチドメイン
【００５６】
図２はｈＰＣＳＫ９の三次元構造モデルの描写である。直線エピトープの以下のセット
：プロドメインにおける領域１(配列番号２および配列番号３)；触媒ドメインおよび触媒／システインリッチドメインにおける領域２(配列番号４および配列番号１２)；触媒ドメインにおける領域３(配列番号５、配列番号７および配列番号１０)；触媒ドメインにおける領域４(配列番号６および配列番号８)；触媒ドメインにおける領域５(配列番号９および配列番号１１)；システインリッチドメインにおける領域６(配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５)；およびシステインリッチドメインにおける領域７(配列番号１６、配列番号１７および配列番号１８)は三次元モデルにおいて近位である。
エピトープのこれらのセットにおけるアミノ酸残基は非直線エピトープを形成する。
【００５７】
「抗体」なる用語は本明細書にて使用される際にはインタクトな抗体またはその抗原結合フラグメント(すなわち「抗原結合部分」)もしくは一本鎖(すなわち軽または重鎖)を指す。インタクトな抗体はジスルフィド結合により相互接続された少なくとも２つの重(Ｈ)鎖および２つの軽(Ｌ)鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は重鎖可変領域(本明細書ではＶＨと略する)および重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３からなる。各軽鎖は軽鎖可変領域(本明細書ではＶＬと略する)および軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は１つのドメインＣＬからなる。ＶＨおよびＶＬ領域はさらに相補性決定領域(ＣＤＲ)と称される超可変の領域に細分され、フレームワーク領域(ＦＲ)と称されるさらに保存された領域が散在する。各ＶＨおよびＶＬは以下の順：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４；でアミノ末端からカルボキシ末端へ配列された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される。重および軽鎖の可変領域は抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は免疫系の種々の細胞(例えばエフェクター細胞)および古典的な補体系の第１成分(Ｃｌｑ)を含む宿主組織または因子に対する免疫グロブリンの結合を媒介できる。
【００５８】
抗体の「抗原結合部分」なる用語は本明細書にて使用される際には、所定の抗原(例えばｈＰＣＳＫ９)に特異的に結合する能力を保持するインタクトな抗体の１つまたはそれより多いフラグメントを指す。インタクトな抗体のフラグメントにより抗体の抗原結合機能を実施することができる。抗体の「抗原結合部分」なる用語に包含される結合フラグメントの実例にはＦａｂフラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメント；Ｆ(ａｂ)２フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド橋により連結された２つのＦａｂフラグメント(一般的に重鎖から１つおよび軽鎖から１つ)を含む二価フラグメント；ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；抗体の１本のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；ＶＨドメインからなる単一ドメイン抗体(ｄＡｂ)フラグメント(Ward et al., Nature 341:544-546(1989))；ならびに単離された相補性決定領域(ＣＤＲ)が含まれる。
【００５９】
さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメインＶＬおよびＶＨは別個の遺伝子によりコードされるが、組換え法を用いて１本のタンパク質鎖としてそれらを作製することを可能にする人工ペプチドリンカーによりそれらを結合させることができ、ここでＶＬおよびＶＨ領域は対になって一価分子(一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)としても公知；例えばBird et al., Science 242:423-426(1988)；およびHuston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883(1988)参照))を形成する。かかる一本鎖抗体には抗体の１つまたはそれより多い「抗原結合部分」が含まれる。これらの抗体フラグメントは当業者に公知の従来技術を用いて得られ、そしてそのフラグメントをインタクトな抗体と同一の様式で有用性に関してスクリーニングする。
【００６０】
抗原結合部分を単一ドメイン抗体、マキシボディー(maxibody)、ミニボディー、イントラボディー、ダイアボディー、トリアボディー、テトラボディー、ｖ−ＮＡＲおよびビス−ｓｃＦｖに組み込むこともできる(例えばHollinger and Hudson, Nature Biotechnology, 23(9):1126-1136(2005)参照)。抗体の抗原結合部分をフィブロネクチンＩＩＩ型(Ｆｎ３)のようなポリペプチドに基づく足場にグラフト化することができる(フィブロネクチンポリペプチドモノボディーについて記載する米国特許第６７０３１９９号を参照のこと)。
【００６１】
相補的軽鎖ポリペプチドと一緒に抗原結合領域の対を形成するタンデムＦｖセグメントの対(ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１)を含む一本鎖分子に抗原結合部分を組み込むことができる(Zapata et al.,  Protein Eng. 8(10):1057-1062(1995)；および米国特許第５６４１８７０号)。
【００６２】
「単離されたＰＣＳＫ９結合分子」は本明細書で使用される際には、ＰＣＳＫ９以外の抗原に関する抗原特異性を有する分子を実質的に含まない結合分子を指す(例えばｈＰＣＳＫ９に特異的に結合する単離された抗体はｈＰＣＳＫ９以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない)。しかしながらｈＰＣＳＫ９に特異的に結合する単離された結合分子はその他の種からのＰＣＳＫ９分子のようなその他の抗原に交差反応性を有し得る。結合分子が実質的に細胞材料を含まない場合、それは「精製されている」。
【００６３】
「モノクローナル抗体組成物」なる用語は本明細書で使用される際には単一の分子組成物の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は特定のエピトープに関して単一の結合特異性および親和性を表示する。
【００６４】
「ヒト抗体」なる用語は本明細書で使用される際には、フレームワークおよびＣＤＲ領域の双方がヒト起源の配列から誘導される可変領域を有する抗体を含むと意図される。さらに抗体が定常領域を含有する場合、定常領域もまたかかるヒト配列、例えばヒト生殖系列配列またはヒト生殖系列配列の変異体から誘導される。本発明のヒト抗体はヒト配列によりコードされないアミノ酸残基(例えばインビトロ無作為または部位特異的変異誘発により、またはインビボ体細胞変異により導入された変異)を含み得る。しかしながら「ヒト抗体」なる用語は本明細書で使用される際には、マウスのような別の哺乳動物種の生殖系列から誘導されたＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列にグラフト化されている抗体を含むことを意図するものではない。
【００６５】
「ヒトモノクローナル抗体」なる用語は、フレームワークおよびＣＤＲ領域の双方がヒト配列から誘導される可変領域を有する単一の結合特異性を表示する抗体を指す。１つの実施態様では、不死化細胞に融合された非ヒト遺伝子導入動物(例えばヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する遺伝子導入マウス)から得られたＢ細胞を含むハイブリドーマによりヒトモノクローナル抗体を生成する。
【００６６】
「組換えヒト抗体」なる用語は本明細書で使用される際には、ヒト免疫グロブリン遺伝子に関して遺伝子導入もしくは染色体導入された動物(例えばマウス)から単離された抗体、またはそこから調製されたハイブリドーマのような組換え手段により調製、発現、創成または単離された任意のヒト抗体；ヒト抗体を発現するために形質転換された宿主細胞から、例えばトランスフェクトーマ(transfectoma)から単離された抗体；組換えコンビナトリアルヒト抗体から単離された抗体；およびヒト免疫グロブリン遺伝子配列の全てまたは一部の別のＤＮＡ配列へのスプライシングを伴う任意のその他の手段により調製、発現、創成または単離された抗体を含む。かかる組換えヒト抗体はフレームワークおよびＣＤＲ領域がヒト生殖系列免疫グロブリン配列から誘導された可変領域を有する。しかしながら特定の実施態様では、かかる組換えヒト抗体をインビトロ変異誘発(またはヒトＩｇ配列に関して遺伝子導入された動物を使用する場合、インビボ体細胞変異誘発)に供することができ、そして故に組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列から誘導され、そしてそれに関係するが、ヒトにおけるヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然には存在しないかもしれない配列である。
【００６７】
「アイソタイプ」は本明細書で使用される際には、重鎖定常領域遺伝子によりコードされる抗体クラス(例えばＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４のようなＩｇＧ)を指す。
「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」なる語句は本明細書では「抗原に特異的に結合する抗体」なる用語と互換的に用いられる。
【００６８】
本明細書で使用される際には、「ＰＣＳＫ９に特異的に結合する」ＰＣＳＫ９結合分子(例えば抗体またはその抗原結合部分)は、１×１０−７Ｍ以下のＫＤでＰＣＳＫ９に結合するＰＣＳＫ９結合分子を指すと意図される。「抗原と交差反応する」ＰＣＳＫ９結合分子(例えば抗体)は１×１０−６Ｍ以下のＫＤでその抗原と結合するＰＣＳＫ９結合分子を指すと意図される。所定の抗原と「交差反応しない」ＰＣＳＫ９結合分子(例えば抗体)は、所定の抗原と検出可能な結合をしないか、または１×１０−５Ｍ以上のＫＤで結合するＰＣＳＫ９結合分子を指すと意図される。特定の実施態様では、抗原と交差反応しないかかる結合分子は標準的な結合アッセイにおいてこれらのタンパク質に対して本質的に検出不能な結合を呈する。
【００６９】
本明細書で使用される際には「高親和性」なる用語は、ＩｇＧ抗体に言及する場合、抗体が標的抗原に関して１０−９Ｍ以下のＫＤを有することを示す。
本明細書で使用される際には、特定のアミノ酸残基「内またはそれと重複するエピトープ」なる用語は、かかる残基の全てまたは一部を含む、それからなるまたはそれと重複するエピトープを指す。
【００７０】
「エピトープ」または「抗原性決定基」なる用語は、本発明のＰＣＳＫ９結合分子が特異的に結合する抗原上の部位を指す。エピトープを隣接アミノ酸またはタンパク質の三次フォールディングにより並置される非隣接アミノ酸の双方から形成することができる。近接アミノ酸から形成されるエピトープは典型的には変性溶媒への暴露時に保持されるが、三次フォールディングにより形成されるエピトープは典型的には変性溶媒での処理時に喪失される。エピトープは典型的には独特な空間的立体構造で少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸を含む。エピトープの空間的立体構造を決定する方法には当分野における技術および本明細書に記載されるもの、例えばＸ線結晶学および二次元核磁気共鳴が含まれる(例えばEpitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed.(1996)参照)。
【００７１】
本明細書に記載されるＰＣＳＫ９結合分子と同一のエピトープに結合する(すなわち認識する)ＰＣＳＫ９結合分子もまた本発明に包含される。統計的に有意な様式で標的抗原に対して参照ＰＣＳＫ９結合分子と交差競合する(すなわちその結合を競合的に阻止する)その能力により、同一のエピトープに結合するＰＣＳＫ９結合分子を同定することができる。例えばＰＣＳＫ９結合分子が同一のもしくは構造的に類似のエピトープ(例えば重複エピトープ)、または結合したときに抗体間で立体障害を引き起こす、空間的に近位のエピトープに結合する場合、競合的阻止を生じることができる。
【００７２】
被験ＰＣＳＫ９結合分子が共通の抗原に対する参照ＰＣＳＫ９結合分子の特異的結合を阻止する日常的なアッセイを用いて競合阻止を決定することができる。非常に多くの型の競合結合アッセイ、例えば：固相直接または間接ラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)、固相直接または間接酵素イムノアッセイ(ＥＩＡ)、サンドイッチ競合アッセイ(Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242(1983)参照)；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ(Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614(1986)参照)；固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ(Harlow and Lane, Antibodies： A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press(1988)参照)；Ｉ−１２５標識を用いる固相直接標識ＲＩＡ(Morel et al., Mol. Immunol. 25(1):7(1988)参照)；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ(Cheung et al., Virology 176:546(1990))；および直接標識ＲＩＡ(Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77(1990))；が公知である。典型的にはかかるアッセイはこれらの未標識被験ＰＣＳＫ９結合分子および標識された参照ＰＣＳＫ９結合分子のいずれかを担持する固体表面または細胞に結合した精製された抗原の使用を伴う。被験ＰＣＳＫ９結合分子の存在下で固体表面または細胞に結合した標識の量を決定することにより競合阻止を測定する。通常被験ＰＣＳＫ９結合分子は過剰に存在する。通常競合ＰＣＳＫ９結合分子が過剰に存在する場合、それは参照ＰＣＳＫ９結合分子の共通の抗原に対する特異的結合を少なくとも５０−５５％、５５−６０％、６０−６５％、６５−７０％、７０−７５％またはそれより多くまで阻止する。
【００７３】
その他の技術には、例えばエピトープの原子分解を提供する、抗原：ＰＣＳＫ９結合分子複合体の結晶のＸ線分析のようなエピトープマッピング法が含まれる。その他の方法は抗原フラグメントまたは抗原の変異体に対するＰＣＳＫ９結合分子の結合をモニタリングし、ここで抗原配列内のアミノ酸残基の修飾による結合の喪失がエピトープ構成成分の指標であるとしばしば考えられる。加えて、エピトープマッピングのためのコンピューターによるコンビナトリアル法を用いることもできる。これらの方法は、目的のＰＣＳＫ９結合分子がコンビナトリアルファージディスプレイペプチドライブラリーから特異的な短いペプチドを親和性単離する能力に依存する。次いでペプチドは、ペプチドライブラリーをスクリーニングするために用いられるＰＣＳＫ９結合分子に相当するエピトープを定義するためのリードと見なされる。エピトープマッピングのために、立体構造的に不連続なエピトープをマッピングすることが示されているコンピューターアルゴリズムもまた開発されている。
【００７４】
本明細書で使用される際には、「対象」なる用語には任意のヒトまたは非ヒト動物が含まれる。
「非ヒト動物」なる用語には全ての非ヒト脊椎動、例えば非ヒト霊長類、げっ歯類、ウサギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、鳥類、両生類、爬虫類等のような哺乳動物および非哺乳動物が含まれる。
【００７５】
ヌクレオチド配列は生成細胞または生物、一般的には真核細胞、例えばピキアのような酵母の細胞、昆虫細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞(ＣＨＯ)またはヒト細胞のような哺乳動物細胞において好ましいコドンを用いてアミノ酸配列をコードするように改変されている場合、それは「最適化」されると称される。最適化されたヌクレオチド配列を、「親」配列としても公知である元来の出発ヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列に同一かまたはほぼ同一なアミノ酸配列をコードするように操作する。
【００７６】
本明細書で使用される際には「humaneered抗体」なる用語は、同一のエピトープに結合するが、配列が異なる抗体を意味する。テクノロジーの実例には、Kalobiosのhumaneerd化テクノロジーにより生成されたhumaneered抗体が含まれ、ここで抗原結合領域の配列は、保存アミノ酸置換によるよりもむしろ、例えば変異により誘導される(例えば第ＷＯ２００４／０７２２６６号、第ＷＯ２００５／０６９９７０号参照)。
本発明の種々の態様を以下のサブセクションにおいてさらに詳細に記載する。
【００７７】
種々の種のＰＣＳＫ９およびＰＣＳＫ９の特定のエピトープに結合する分子の能力を評価するための標準的なアッセイは当分野において公知であり、例えばＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットを含む。ＰＣＳＫ９結合分子がＰＣＳＫ９の特異的エピトープに結合するかどうかの決定にはペプチドエピトープ競合アッセイを用いることができる。例えばＰＣＳＫ９結合分子を目的のＰＣＳＫ９エピトープに相当するペプチドと共にペプチドの飽和濃度でインキュベートする。プレインキュベートされたＰＣＳＫ９結合分子を、固定されたＰＣＳＫ９に対する結合に関して、例えばBiacore(登録商標)分析により試験する。ペプチドとのプレインキュベーションによるＰＣＳＫ９結合の阻止により、ＰＣＳＫ９結合分子がペプチドエピトープに結合することが示される(例えば米国特許公開第２００７００７２７９７号参照)。結合動態もまたBiacore(登録商標)分析のような当分野において公知の標準的なアッセイにより検定することができる。ＰＣＳＫ９の機能的特性に及ぼすＰＣＳＫ９結合分子の影響を評価するためのアッセイを以下でさらに詳細に記載する。
【００７８】
したがって１つまたはそれより多いこれらのＰＣＳＫ９機能的特性(例えば生化学的、細胞性、生理学的またはその他の生物学的活性等)を「阻止する」ＰＣＳＫ９結合分子は、当分野において公知の、および本明細書に記載される方法論にしたがって決定されように、結合分子の不在下で認められるもの(例えば不適切な特異性の制御分子が存在する場合)に相対して特定の機能的特性において統計的に有意な低下を生じることが理解されよう。ＰＣＳＫ９活性を阻止するＰＣＳＫ９結合分子は、測定されるパラメーターの少なくとも５％までかかる統計的に有意な低下を生じさせる。特定の実施態様では、抗体またはその他のＰＣＳＫ９結合分子は対照と比較して少なくとも１０％、２０％、３０％または５０％の選択された機能的特性における低下を生じることができる。いくつかの実施態様では、ＬＤＬ−Ｒレベルを測定することによりＰＣＳＫ９阻止を決定する。ＰＣＳＫ９結合分子の存在下でのＬＤＬ−Ｒレベルにおける増大により、ＰＣＳＫ９結合分子がＰＣＳＫ９を阻止することが示される。
【００７９】
抗体
本明細書に記載される抗ＰＣＳＫ９抗体にはヒトモノクローナル抗体が含まれる。いくつかの実施態様では、ＰＣＳＫ９に結合する抗体の抗原結合部分(例えばＶＨおよびＶＬ鎖)を「混合およびマッチング(mixed and matched)」して、その他の抗ＰＣＳＫ９結合分子を創成する。前記で言及された結合アッセイ(例えばＥＬＩＳＡ)を用いてかかる「混合およびマッチング」された抗体の結合を試験することができる。特定のＶＬ配列と混合およびマッチングするためにＶＨを選択する場合、典型的にはそのＶＬとの対形成において置き換えるＶＨと構造的に類似するＶＨを選択する。同様に特定の全長重鎖／全長軽鎖対形成から全長重鎖配列を一般的に構造的に類似する全長重鎖配列で置き換える。同様に特定のＶＨ／ＶＬ対形成からのＶＬ配列を構造的に類似するＶＬ配列で置き換えるべきである。同様に特定の全長重鎖／全長軽鎖対形成から全長軽鎖配列を構造的に類似する全長軽鎖配列で置き換えるべきである。この局面で構造的類似性を同定することは当分野において周知の過程である。
【００８０】
その他の態様では、本発明は１つまたはそれより多いＰＣＳＫ９結合抗体の重鎖ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を種々の組み合わせで含む抗体を提供する。これらの抗体の各々がＰＣＳＫ９に結合でき、そして抗原結合特異性がＣＤＲ１、２および３領域により一次的に提供される場合、ＶＨＣＤＲ１、２および３配列ならびにＶＬＣＤＲ１、２および３配列を「混合およびマッチング」することができる(すなわち異なる抗体からのＣＤＲを混合およびマッチングすることができる)。かかる「混合およびマッチング」された抗体のＰＣＳＫ９結合を本明細書に記載される結合アッセイ(例えばＥＬＩＳＡ)を用いて試験することができる。ＶＨＣＤＲ配列を混合およびマッチングする場合、特定のＶＨ配列からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列を構造的に類似する(複数の)ＣＤＲ配列で置き換えるべきである。同様にＶＬＣＤＲ配列を混合およびマッチングする場合、特定のＶＬ配列からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列を構造的に類似する(複数の)ＣＤＲ配列で置き換えるべきである。この局面で構造的類似性を同定することは当分野において周知の過程である。
【００８１】
本明細書で使用される際には、抗体の可変領域または全長鎖が配列の供給源としてヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子を用いる系から得られる場合、ヒト抗体は特定の生殖系列配列「の生成物」であるか、またはそれ「から誘導される」重もしくは軽鎖可変領域または全長重もしくは軽鎖を含む。１つのかかる系では、ヒト免疫グロブリン遺伝子を担持する遺伝子導入マウスにおいてヒト抗体を上昇させる。遺伝子導入されたものを目的の遺伝子(例えば本明細書に記載されるｈＰＣＳＫ９のエピトープ)で免役する。あるいは、ファージ上に表示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーを提供し、そして目的の抗原(例えば本明細書に記載されるｈＰＣＳＫ９またはｈＰＣＳＫ９エピトープ)でライブラリーをスクリーニングすることによりヒト抗体を同定する。
【００８２】
ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖系列免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較し、そして配列がヒト抗体の配列に最も近い(すなわち同一性％が最大)ヒト生殖系列免疫グロブリン配列を選択することにより、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列「の生成物」であるか、またはそれ「から誘導される」ヒト抗体をそのように同定することができる。特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列「の生成物」であるか、またはそれ「から誘導される」ヒト抗体は、例えば自然発生体細胞変異または人工的な部位特異的変異により、生殖系列コード化配列と比較してアミノ酸相違を含有し得る。しかしながら選択されたヒト抗体は典型的には、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を有し、そしてその他の種(例えばマウス生殖系列配列)の生殖系列免疫グロブリンアミノ酸配列と比較した場合、ヒト抗体をヒトのものであるとして同定するアミノ酸残基を含有する。特定の事例では、ヒト抗体はアミノ酸配列において生殖系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％もしくは少なくとも９５％、またはさらに少なくとも９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一でよい。
【００８３】
２つの配列間の同一性パーセントは配列により共有される同一の位置の数の関数(すなわち％同一性＝同一の位置の数／位置の全数×１００)であり、２つの配列の最適なアラインメントのための導入される必要のあるギャップの数、および各ギャップの長さを考慮に入れる。配列の比較および２つの配列間の同一性パーセントの決定をALIGNプログラム(バージョン２.０)に組み込まれているE. MeyersおよびW. Miller(Comput. Appl. Biosci., 4:11-17(1988))のアルゴリズムを用い、ＰＡＭ１２０重み残基表(weight residue table)、ギャップ長ペナルティー１２およびギャップペナルティー４を用いて決定する。
【００８４】
典型的には特定のヒト生殖系列配列から誘導されたヒト抗体のＶＨまたはＶＬは、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列とは１０個しかアミノ酸相違を表示しない。特定の事例ではヒト抗体のＶＨまたはＶＬは生殖系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列とは４、３、２または１個しかアミノ酸相違を表示できない。
【００８５】
ラクダ抗体
ラマ種(アルパカ(Lama paccos)、ラマ(Lama glama)およびビクーニャ(Lama vicugna))のような新世界メンバーを含むラクダおよびヒトコブラクダ(フタコブラクダ(Camelus bactrianus)およびヒトコブラクダ(Calelus dromaderius))ファミリーのメンバーから得られた抗体タンパク質は大きさ、構造複雑性およびヒト対象に関する抗原性について特徴付けされている。哺乳動物のこのファミリーにおいて天然に見出される特定のＩｇＧ抗体は軽鎖を欠如し、そして故にその他の動物からの抗体に典型的な２つの重および２つの軽鎖を有する四本鎖の４要素からなる構造とは構造的に区別される。第ＷＯ９４／０４６７８号参照。
【００８６】
標的に関して高親和性を有する小型タンパク質を生じるように遺伝子操作し、結果的に低分子量の抗体由来の「ラクダ抗体」として公知のタンパク質に至ることにより、ＶＨＨとして同定される小型の単一の可変ドメインであるラクダ抗体の領域を得ることができる。米国特許第５７５９８０８号参照；Stijlemans et al., J. Biol. Chem. 279:1256-1261(2004)；Dumoulin et al., Nature 424:783-788(2003)；Pleschberger et al., Bioconjugate Chem. 14:440-448(2003)；Cortez-Retamozo et al., Int. J. Cancer 89:456-62(2002)；およびLauwereys. et al., EMBO J. 17:3512-3520(1998)もまた参照のこと。ラクダ抗体および抗体フラグメントの操作されたライブラリーは例えばAblynx、Ghent、Belgiumから市販により入手可能である。非ヒト起源のその他の抗体と同様に、ラクダ抗体のアミノ酸配列を組換えにより改変してヒト配列にさらに極めて類似している配列を得ることができ、すなわちナノボディを「ヒト化」することができる。故にラクダ抗体の天然の低抗原性をさらに低減させることができる。
【００８７】
ラクダナノボディはヒトＩｇＧ分子のおよそ１０分の１の分子量を有し、そしてそのタンパク質の物理的直径は数ナノメートルしかない。小型サイズの１つの結果は、ラクダナノボディが大きな抗体タンパク質には機能的に無視される抗原性部位に結合する能力であり、すなわちラクダナノボディは古典的な免疫学的技術を用いて、さもなければ隠蔽される抗原を検出する試薬として、および可能性のある治療薬として有用である。故に小型サイズのなお別の結果は、ラクダナノボディは標的タンパク質の溝または狭い間隙における特異的部位に対する結合の結果として阻止することができ、そしてしたがって古典的な抗体のものよりも、古典的な低分子量薬物の機能にさらに極めて類似する能力で機能できるということである。
【００８８】
さらに低分子量およびコンパクトサイズの結果、ラクダナノボディは極度に熱安定性で、極端なｐＨおよびタンパク質分解性消化に安定であり、抗原性が低い。別の結果は、ラクダナノボディを循環系から組織に迅速に移動し、そしてさらに血液脳関門を通過し、そして神経組織に影響を及ぼす障害を処置できることである。ナノボディはさらに血液脳関門をわたる薬物輸送を促進することができる。２００４年８月１９日公開の米国特許公開第２００４０１６１７３８号を参照のこと。ヒトにおける低抗原性と組み合わされたこれらの特性は大きな治療上の潜在力を示す。さらにこれらの分子を大腸菌のような原核細胞において十分に発現させることができる。
【００８９】
したがって、本発明の特性はＰＣＳＫ９に関して高親和性を有するラクダ抗体またはラクダナノボディである。本明細書における特定の実施態様では、ラクダ抗体またはナノボディはラクダ動物において天然に生成される、すなわちその他の抗体に関して本明細書に記載される技術を用いてＰＣＳＫ９またはそのペプチドフラグメントでの免疫に続いてラクダにより生成される。あるいは抗ＰＣＳＫ９ラクダナノボディを操作する、すなわち例えば標的として本明細書に記載されるＰＣＳＫ９またはＰＣＳＫ９エピトープを用いるパニング手順を用いて、適切に変異誘発されたラクダナノボディタンパク質を表示するファージのライブラリーからの選択により生成する。操作されたナノボディを遺伝子操作によりさらにカスタマイズしてレシピエント対象における半減期を４５分から２週間まで増大させることができる。
【００９０】
ダイアボディー
ダイアボディーは、短かすぎて同一鎖上の２つのドメイン間で対形成できないリンカーにより接続された一本鎖ポリペプチド上でＶＨおよびＶＬが発現される二価の二特異性分子である。ＶＨおよびＶＬドメインは別の鎖の相補的ドメインと対形成し、それにより２つの抗原結合部位を創成する(例えばHolliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448(1993)；Poljak et al., Structure 2:1121-1123(1994)参照)。同一細胞内でＶＨＡ−ＶＬＢおよびＶＨＢ−ＶＬＡ(ＶＨ−ＶＬ立体配置)またはＶＬＡ−ＶＨＢおよびＶＬＢ−ＶＨＡ(ＶＬ−ＶＨ立体配置)のいずれかの構造を伴う２つのポリペプチド鎖を発現することによりダイアボディーを生成することができる。これらの大部分は細菌内で可溶性形態で発現され得る。
【００９１】
２つのダイアボディー形成ポリペプチド鎖をおよそ１５個のアミノ酸残基のリンカーで接続することにより一本鎖ダイアボディー(ｓｃＤｂ)を生成する(Holliger and Winter, Cancer Immunol. Immunother., 45(3-4):128-30(1997)；Wu et al., Immunotechnology, 2(1):21-36(1996)参照)。ｓｃＤｂは細菌内で可溶性の活性な単量体形態で発現され得る(Holliger and Winter, Cancer Immunol. Immunother., 45(34):128-30(1997)；Wu et al., Immunotechnology, 2(1):21-36(1996)；Pluckthun and Pack, Immunotechnology, 3(2):83-105(1997)；Ridgway et al., Protein Eng., 9(7):617-21(1996)参照)。
ダイアボディーをＦｃに融合させて「ジダイアボディー(di-diabody)」を作製することができる(Lu et al., J. Biol. Chem., 279(4):2856-65(2004)参照)。
【００９２】
操作および修飾された抗体
出発材料として１つまたはそれより多いＶＨおよび／またはＶＬ配列を有する抗体を用いて出発抗体から改変された特性を有し得る修飾された抗体を操作して本発明の抗体を調製することができる。１つもしくは双方の可変領域(すなわちＶＨおよび／またはＶＬ)内の、例えば１つもしくはそれより多いＣＤＲ領域内の、および／または１つもしくはそれより多いフレームワーク領域内の１つまたはそれより多い残基を修飾することにより抗体を操作することができる。加えて、あるいは、例えば抗体の(複数の)エフェクター機能を改変するために、(複数の)定常領域内の残基を修飾することにより抗体を操作することができる。
【００９３】
実施できる可変領域操作の１つの型はＣＤＲグラフティングである。抗体は優勢には６つの重および軽鎖ＣＤＲに位置するアミノ酸残基を介して標的抗原と相互作用する。この理由のために、ＣＤＲ内のアミノ酸配列はＣＤＲの外側の配列よりも個々の個体間でさらに多様化する。ＣＤＲ配列が大部分の抗体−抗原相互作用に寄与するので、異なる特性を有する異なる抗体からのフレームワーク配列にグラフト化された特異的な自然発生抗体からのＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することにより、特異的な自然発生抗体の特性を擬似する組換え抗体を発現することが可能である(例えばRiechmann et al., Nature 332:323-327(1998)；Jones et al., Nature 321：522-525(1986)；Queen et al., Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033(1989)；米国特許第５２２５５３９号および米国特許第５５３０１０１号；第５５８５０８９号；第５６９３７６２号および第６１８０３７０号参照)。
【００９４】
生殖系列抗体遺伝子配列を含む公のＤＮＡデータベースまたは公開された参照文献からフレームワークを得ることができる。例えばヒト重および軽鎖可変領域遺伝子に関する生殖系列ＤＮＡ配列を「VBase」ヒト生殖系列配列データベース(インターネットwww.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbaseで利用可能)、ならびにKabat et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242；Tomlinson et al., J. Mol. Biol. 227:776-798(1992)；およびCox et al., Eur. J. Immunol. 24:827-836(1994)；において見出すことができ、その各々の内容を出典明示により本明細書の一部とする。
【００９５】
ＶＨＣＤＲ１、２および３配列ならびにＶＬＣＤＲ１、２および３配列を、そのフレームワーク配列が誘導される生殖系列免疫グロブリン遺伝子において見出されるものと同一の配列を有するフレームワーク領域にグラフト化することができるか、またはＣＤＲ配列を生殖系列配列と比較して１つもしくはそれより多い変異を含有するフレームワーク領域にグラフト化することができる。例えば特定の場合では、抗体の抗原結合能力を維持または強化するためにフレームワーク領域内の残基を変異するのが有益であることが見出されている(例えば米国特許第５５３０１０１号；第５５８５０８９号；第５６９３７６２号および第６１８０３７０号参照)。
【００９６】
免疫グロブリンドメイン以外のポリペプチドのフレームワーク領域にＣＤＲをグラフト化することもできる。適切な足場は、グラフト化された残基が局在された表面を形成し、そして目的の標的(例えばＰＣＳＫ９)に結合するようにグラフト化された残基を表示する立体構造的に安定なフレームワークを形成する。例えばフレームワーク領域がフィブロネクチン、アンキリン、リポカリン、ネオカルジノスタイン(neocarzinostain)、チトクロムｂ、ＣＰ１ジンクフィンガー、ＰＳＴ１、コイルドコイル、ＬＡＣＩ−Ｄ１、Ｚドメインまたはテンドラミサット(tendramisat)に基づく足場上にＣＤＲをグラフト化することができる(例えばNygren and Uhlen, Current Opinion in Structural Biology, 7:463-469(1997)参照)。
【００９７】
別の型の可変領域修飾は、それにより目的の抗体の１つまたはそれより多い結合特性(例えば親和性)を改善するためのＶＨならびに／またはＶＬＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／もしくはＣＤＲ３領域内のアミノ酸残基の変異であり、「親和性成熟」として公知である。部位特異的変異誘発またはＰＣＲ媒介変異誘発を実施して(複数の)変異を導入し、そして抗体結合またはその他の目的の機能特性に及ぼす影響を、本明細書に記載されるようなインビトロまたはインビボアッセイにおいて評価することができる。保存修飾を導入することができる。変異はアミノ酸置換、付加または欠失でよい。さらに典型的にはＣＤＲ領域内の１、２、３、４または５個だけの残基を改変する。
【００９８】
本発明の操作された抗体には、抗体の特性を改善するためにＶＨおよび／またはＶＬ内のフレームワーク残基に修飾が為されているものが含まれる。典型的には抗体の免疫原性を低下させるためにかかるフレームワーク修飾が為される。例えば１つの研究法は１つまたはそれより多いフレームワーク残基を対応する生殖系列配列に「復帰変異する」ことである。さらに具体的には体細胞変異を被っている抗体は、抗体が誘導される生殖系列とは異なるフレームワーク残基を含有し得る。抗体フレームワーク配列を、抗体が誘導される生殖系列と比較することにより、かかる残基を同定することができる。フレームワーク領域配列をその生殖系列立体配置に戻すために、例えば部位特異的変異誘発またはＰＣＲ媒介変異誘発により体細胞変異を生殖系列配列に「復帰変異」することができる。かかる「復帰変異」された抗体もまた本発明に包含されると意図される。
【００９９】
別の型のフレームワーク修飾はフレームワーク領域内の、またはさらには１つまたはそれより多いＣＤＲ領域内の１つまたはそれより多い残基を変異して、Ｔ細胞エピトープを除去し、それにより抗体の潜在的免疫原性を低減させることを伴う。この研究法は「脱免疫化」とも称され、そしてCarrらによる米国特許公開第２００３０１５３０４３号にてさらに詳細に記載される。
【０１００】
フレームワークまたはＣＤＲ領域内で為された修飾に加えて、あるいは、本発明の抗体を操作してＦｃ領域内に修飾を含み、典型的には血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合および／または抗原依存性細胞毒性のような抗体の１つまたはそれより多い機能的特性を改変することができる。さらに本発明の抗体を化学的に修飾する(例えば１つまたはそれより多い化学的部分を抗体に結合させることができる)か、またはそのグリコシル化を改変し、再度抗体の１つまたはそれより多い機能的特性を改変するように修飾することができる。
【０１０１】
１つの実施態様ではＣＨ１のヒンジ領域を、ヒンジ領域におけるシステイン残基の数が改変される、例えば増大または低下するように修飾する。この研究法はBodmerらにより米国特許第５６７７４２５号にてさらに記載される。ＣＨ１のヒンジ領域におけるシステイン残基の数を改変して、例えば軽および重鎖の会合を促進するか、または抗体の安定性を増大もしくは低下させる。
【０１０２】
別の実施態様では、抗体のＦｃヒンジ領域を変異させて抗体の生物学的半減期を低下させる。さらに具体的には、抗体が未変性のＦｃヒンジドメインＳｐＡ結合と相対してブドウ球菌タンパク質Ａ(ＳｐＡ)結合を損なっているように、１つまたはそれより多いアミノ酸変異をＦｃヒンジフラグメントのＣＨ２−ＣＨ３ドメイン界面領域に導入する。この研究法はWardらにより米国特許第６１６５７４５号にてさらに詳細に記載される。
【０１０３】
別の実施態様では、抗体をその生物学的半減期を増大させるように修飾する。種々の研究法が可能である。例えば米国特許第６２７７３７５号ではインビボでその半減期を増大させるＩｇＧにおける以下の変異：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆが記載される。あるいは、Prestaらにより米国特許第５８６９０４６号および第６１２１０２２号にて記載されるように、生物学的半減期を増大させるために、抗体をＣＨ１またはＣＬ領域内で改変してＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから取られたサルベージ受容体結合エピトープを含有させることができる。
【０１０４】
なおその他の実施態様では、抗体のエフェクター機能を改変するために、少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置き換えることによりＦｃ領域を改変する。例えば抗体がエフェクターリガンドに関して改変された親和性を有するが、親抗体の抗原結合能力を保持するように、１つまたはそれより多いアミノ酸を異なるアミノ酸残基で置き換えることができる。親和性が改変されるエフェクターリガンドは、例えばＦｃ受容体または補体のＣ１構成要素でよい。この研究法は双方共にWinterらによる米国特許第５６２４８２１号および第５６４８２６０号にてさらに詳細に記載される。
【０１０５】
別の実施態様では、抗体のＣ１ｑ結合が改変され、そして／または補体依存性細胞毒性(ＣＤＣ)が低減されるか、もしくは無効になるように、アミノ酸残基から選択される１つまたはそれより多いアミノ酸を異なるアミノ酸残基で置き換えることができる。この研究法はIdusogieらにより米国特許第６１９４５５１号にてさらに詳細に記載される。
【０１０６】
別の実施態様では、１つまたはそれより多いアミノ酸残基が改変され、それにより抗体が補体を固定する能力を改変する。この研究法はBodmerらにより第ＷＯ９４／２９３５１号にてさらに詳細に記載される。
【０１０７】
なお別の実施態様では、抗体依存性細胞毒性(ＡＤＣＣ)を媒介する抗体の能力を増大させる、および／またはＦｃγ受容体に関する抗体の親和性を増大させるために、１つまたはそれより多いアミノ酸を修飾することによりＦｃ領域を修飾する。この研究法はPrestaにより第ＷＯ００／４２０７２号にてさらに記載される。さらにヒトＩｇＧ１におけるＦｃγＲｌ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃＲｎに関する結合部位がマッピングされており、そして結合が改善されたバリアントが記載されている(Shields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 276:6591-6604(2001)参照)。
【０１０８】
さらに別の実施態様では、抗体のグリコシル化が修飾される。例えばグリコシル化抗体を作製することができる(すなわち抗体はグリコシル化を欠如する)。グリコシル化を改変して、例えば抗体の抗原に関する親和性を増大させることができる。例えば抗体配列内の１つまたはそれより多いグリコシル化の部位を改変することにより、かかる炭水化物修飾を達成することができる。例えば結果的に１つまたはそれより多い可変領域フレームワークグリコシル化部位が排除され、それによりその部位でのグリコシル化が排除される、１つまたはそれより多いアミノ酸置換を行うことができる。かかるグリコシル化は抗体の抗原に関する親和性を増大させることができる。かかる研究法はCoらにより米国特許第５７１４３５０号および第６３５０８６１号にてさらに詳細に記載される。
【０１０９】
これに加えてまたは代えて、フコシル残基の量が低減されている低フコシル化抗体またはバイセクティングＧｌｃＮａｃ構造が増大した抗体のような、グリコシル化の型が改変された抗体を作製することができる。かかる改変されたグリコシル化パターンは抗体のＡＤＣＣ能力を増大させることが実証されている。例えばグリコシル化機構が改変された宿主細胞において抗体を発現することにより、かかる炭水化物修飾を達成することができる。グリコシル化機構が改変された細胞は当分野において記載されており、そして宿主細胞として用いることができ、そこで本発明の組換え抗体を発現し、それによりグリコシル化が改変された抗体を生成する。例えばHangらによる欧州特許第１１７６１９５号には機能的に破壊された、フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子を伴う細胞系が記載され、かかる細胞系において発現された抗体は低フコシル化を呈するようになる。PrestaによるＰＣＴ公開第ＷＯ０３／０３５８３５号にはフコースがＡｓｎ(２９７)連結炭水化物に結合する能力が低減され、これもまた結果的に宿主細胞において発現される抗体の低フコシル化に至るバリアントＣＨＯ細胞系、Ｌｅｃｌ３細胞が記載される(Shields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 277:26733-26740(2002)もまた参照)。Umanaらによる第ＷＯ９９／５４３４２号には、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ(例えばベータ(１,４)−ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ(ＧｎＴＩＩＩ))を発現するように操作され、操作された細胞系において発現される抗体が、抗体のＡＤＣＣ活性の増大に至るバイセクティングＧｌｃＮａｃ構造の増大を呈するようになる細胞系が記載される(Umana et al., Nat. Biotech. 17:176-180(1999)もまた参照)。
【０１１０】
本発明により企図される本明細書における抗体の別の修飾はペグ化である。抗体をペグ化して、例えば抗体の生物学的(例えば血清)半減期を増大させることができる。抗体をペグ化するために、１つまたはそれより多いポリエチレングリコール(ＰＥＧ)部分が抗体または抗体フラグメントに結合するようになる条件下で、抗体またはそのフラグメントを典型的にはＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体のようなＰＥＧと反応させる。反応性ＰＥＧ分子(または類似の反応性水溶性重合体)でのアシル化反応またはアルキル化反応によりペグ化を実施することができる。本明細書で使用される際には「ポリエチレングリコール」なる用語は、モノ(Ｃ１−Ｃ１０)アルコキシ−もしくはアリールオキシポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコールマレイミドのようなその他のタンパク質を誘導体化するために用いられているＰＥＧのいずれかの形態を包含すると意図される。特定の実施態様では、ペグ化されるべき抗体はアグリコシル化(aglycosylated)抗体である。タンパク質をペグ化するための方法は当分野において公知であり、そして本発明の抗体に適用することができる。例えばNishimuraらによる欧州特許第０１５４３１６号およびIshikawaらによる欧州特許第０４０１３８４号を参照のこと。
【０１１１】
加えて本発明のＰＣＳＫ９結合ポリペプチドの任意の部分における非天然アミノ酸の導入によりペグ化を達成することができる。Deiters et al., J Am Chem Soc 125:11782-11783(2003)；Wang and Schultz, Science 301:964-967(2003);Wang et al., Science 292:498-500(2001);Zhang et al., Science 303:371-373(2004)または米国特許第７０８３９７０号において記載されるテクノロジーにより、特定の非天然アミノ酸を導入することができる。簡単には、これらの発現系のいくつかは、アンバーＴＡＧのようなナンセンスコドンを本発明のポリペプチドをコードするオープンリーディグフレームに導入するための部位特異的変異誘発を伴う。次いで導入されたナンセンスコドンに特異的なｔＲＮＡを利用できる宿主にかかる発現ベクターを導入し、そして最適な非天然アミノ酸を負荷する。本発明のポリペプチドに部分を抱合する目的のために有益である特定の非天然アミノ酸には、アセチレンおよびアジド側鎖を有するものが含まれる。次いでこれらの新規アミノ酸を含有するポリペプチドをタンパク質のこれらの選択された部位でペグ化することができる。
【０１１２】
抗体を操作する方法
上記の通り、抗ＰＣＳＫ９抗体を用いて全長重鎖および／もしくは軽鎖配列、ＶＨおよび／もしくはＶＬ配列、またはそれに結合した(複数の)定常領域を修飾することにより、新しい抗ＰＣＳＫ９抗体を創成することができる。例えば抗体の１つまたはそれより多いＣＤＲ領域を組換えにより公知のフレームワーク領域および／またはその他のＣＤＲと組み合わせて、新しい組換えにより操作された抗ＰＣＳＫ９抗体を創成することができる。その他の型の修飾には、先行のセクションで記載されたものが含まれる。操作する方法のための出発材料は１つもしくはそれより多いＶＨおよび／もしくはＶＬ配列、または１つもしくはそれより多いそのＣＤＲ領域である。操作された抗体を創成するために、１つもしくはそれより多いＶＨおよび／もしくはＶＬ配列、または１つもしくはそれより多いそのＣＤＲ領域を有する抗体を実際に調製する(すなわちタンパク質として発現する)ことは必要ではない。むしろ(複数の)配列に含有される情報を出発材料として用いて(複数の)元来の配列から誘導される(複数の)「第２世代」配列を創成し、そして次に(複数の)「第２世代」配列を調製し、そしてタンパク質として発現させる。
【０１１３】
標準的な分子生物学的技術を用いて改変された抗体配列を調製および発現させることができる。(複数の)改変された抗体配列によりコードされる抗体は、それが誘導される抗ＰＣＳＫ９抗体の１つ、いくつかの、または全ての機能的特性を保持するものであり、その機能的特性には限定するものではないが、ＰＣＳＫ９に対する特異的結合、自己触媒性切断の阻止、ＬＤＬ−Ｒ結合の阻止、ＬＤＬ−Ｒ分解の阻止が含まれる。当分野において利用可能な、および／または本明細書に記載される標準的なアッセイ(例えばＥＬＩＳＡ)を用いて改変された抗体の機能的特性を評価することができる。
【０１１４】
本発明の抗体を操作する方法の特定の実施態様では、抗ＰＣＳＫ９抗体コード化配列の全てまたは部分に沿って無作為に、または選択的に変異を導入することができ、そして得られた修飾された抗ＰＣＳＫ９抗体を結合活性および／または本明細書に記載されるようなその他の機能的特性(例えば自己触媒性切断の阻止、ＬＤＬ−Ｒ結合の阻止、ＬＤＬ−Ｒ分解の阻止)に関してスクリーニングすることができる。変異の方法は当分野において記載されている。例えばShortによるＰＣＴ公開第ＷＯ０２／０９２７８０号には飽和変異誘発、合成ライゲーションアセンブリ(synthetic ligation assembly)またはその組み合わせを用いて抗体を創成およびスクリーニングする方法が記載される。あるいはLazarらによる第ＷＯ０３／０７４６７９号には抗体の生理化学的特性を最適化するためのコンピューターによるスクリーニング方法を用いる方法が記載される。
【０１１５】
非抗体ＰＣＳＫ９結合分子
本発明はさらに抗体の機能的特性を呈するが、その他のポリペプチド(例えば抗体遺伝子によりコードされるかまたはインビボで抗体遺伝子の組換えにより作製されるもの以外のポリペプチド)からそのフレームワークおよび抗原結合部分を誘導するＰＣＳＫ９結合分子を提供する。これらの結合分子の抗原結合ドメイン(例えばＰＣＳＫ９結合ドメイン)を定向進化法により作製する。米国特許第７１１５３９６号を参照のこと。抗体の可変ドメインのものに類似した全体的なフォールドを有する分子(「免疫グロブリン様」フォールド)は適切な足場タンパク質である。抗原結合分子を誘導するのに適当な足場タンパク質には、フィブロネクチンまたはフィブロネクチン二量体、テネイシン、Ｎ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリン、ＩＣＡＭ、タイチン、ＧＣＳＦ受容体、サイトカイン受容体、グリコシダーゼ阻害剤、抗菌性色素タンパク質、ミエリン膜接着分子Ｐ０、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２、クラスＩ  ＭＨＣ、Ｔ細胞抗原受容体、ＣＤ１、Ｃ２およびＶＣＡＭ−１のＩセットドメイン、ミオシン結合タンパク質ＣのＩセット免疫グロブリンドメイン、ミオシン結合タンパク質ＨのＩセット免疫グロブリンドメイン、テロキンのＩセット免疫グロブリンドメイン、ＮＣＡＭ、トゥイッチン、ニューログリアン、成長ホルモン受容体、エリトロポイエチン受容体、プロラクチン受容体、インターフェロンガンマ受容体、β−ガラクトシダーゼ／グルクロニダーゼ、β−グルクロニダーゼ、トランスグルタミナーゼ、Ｔ細胞抗原受容体、スーパーオキシドジスムターゼ、組織因子ドメイン、チトクロムＦ、緑色蛍光タンパク質、ＧｒｏＥＬおよびタウマチンが含まれる。
【０１１６】
非抗体性結合分子の抗原結合ドメイン(例えば免疫グロブリン様フォールド)は１０ｋＤ未満または７.５ｋＤより大きい分子量(例えば７.５−１０ｋＤの間の分子量)を有し得る。抗原結合ドメインを誘導するために用いられるタンパク質は自然発生哺乳動物タンパク質(例えばヒトタンパク質)であり、そして抗原結合ドメインは、それが誘導されるタンパク質の免疫グロブリン様フォールドと比較して、５０％まで(例えば３４％、２５％、２０％または１５％まで)の変異アミノ酸を含む。免疫グロブリン様フォールドを有するドメインは一般的に５０−１５０個のアミノ酸(例えば４０−６０個のアミノ酸)からなる。
【０１１７】
非抗体性結合分子を作製するために、抗原結合表面を形成する足場タンパク質の領域(例えば位置および構造において抗体可変ドメイン免疫グロブリンフォールドのＣＤＲに類似した領域)における配列が無作為化されたクローンのライブラリーを創成する。ライブラリークローンを目的の抗原(例えばｈＰＣＳＫ９)に対する特異的結合に関して、およびその他の機能(例えばＰＣＳＫ９の生物学的活性の阻止)に関して試験する。選択されたクローンをさらなる無作為化および選択のための基礎として用いて、抗原に関して高親和性の誘導体を生成することができる。
【０１１８】
例えば足場としてフィブロネクチンＩＩＩ(１０Ｆｎ３)の第１０モジュールを用いて高親和性結合分子を作製する。残基２３−２９、５２−５５および７８−８７で１０Ｆｎ３の３つのＣＤＲ様ループの各々に関してライブラリーを構築する。各ライブラリーを構築するために、各ＣＤＲ様領域と重複する配列をコードするＤＮＡをオリゴヌクレオチド合成により無作為化する。選択可能な１０Ｆｎ３ライブラリーを生成するための技術は米国特許第６８１８４１８号および第７１１５３９６号；Roberts and Szostak, Proc. Natl. Acad. Sci USA 94:12297(1997)；米国特許第６２６１８０４号；米国特許第６２５８５５８号；およびSzostak et al. 第ＷＯ９８／３１７００号に記載される。
【０１１９】
標的抗原に関する結合力を増大させるために、非抗体性結合分子を二量体または多量体として生成することができる。例えばＦｃ−Ｆｃ二量体を形成する抗体の定常領域(Ｆｃ)との融合体として抗原結合ドメインを発現する。例えば米国特許第７１１５３９６号を参照のこと。
【０１２０】
本発明の抗体をコードする核酸分子
本発明の別の態様は本発明のＰＣＳＫ９結合分子をコードする核酸分子に関係する。核酸は全細胞で、細胞ライゼートで存在できるか、または部分的に精製された、もしくは実質的に純粋な形態の核酸でよい。アルカリ性／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および当分野において周知のその他のものを含む標準的な技術により、核酸はその他の細胞構成要素またはその他の夾雑物、例えばその他の細胞性核酸またはタンパク質から精製された場合、「単離される」または「実質的に純粋にされる」。F. Ausubel, et al., ed. 1987 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New Yorkを参照のこと。本発明の核酸は、例えばＤＮＡまたはＲＮＡでよく、そしてイントロン配列を含有してもしなくてもよい。実施態様では、核酸はｃＤＮＡ分子である。核酸はファージディスプレイベクターのようなベクター中に、または組換えプラスミドベクター中に存在し得る。
【０１２１】
標準的な分子生物学的技術により本発明の核酸を得ることができる。ハイブリドーマ(例えば以下にさらに記載されるようなヒト免疫グロブリン遺伝子を担持する遺伝子導入マウスから調製されたハイブリドーマ)により発現される抗体に関して、標準的なＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング技術により、ハイブリドーマにより作製される抗体の軽および重鎖をコードするｃＤＮＡを得ることができる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリーから(例えばファージディスプレイ技術を用いて)得られる抗体に関して、ライブラリーのメンバーである種々のファージクローンから抗体をコードする核酸を回収することができる。
【０１２２】
一度ＶＨおよびＶＬセグメントをコードするＤＮＡフラグメントが得られると、例えば種々の領域遺伝子を全長抗体鎖遺伝子に、Ｆａｂフラグメント遺伝子に、またはｓｃＦｖ遺伝子に変換するために標準的な組換えＤＮＡ技術により、これらのＤＮＡフラグメントをさらにマニピュレートすることができる。これらのマニピュレーションでは、ＶＬまたはＶＨコード化ＤＮＡフラグメントを抗体定常領域または可動性リンカーのような別のＤＮＡ分子に、または別のタンパク質をコードするフラグメントに作動可能なように連結する。「作動可能なように連結された」なる用語はこの局面で使用される際には、２つのＤＮＡフラグメントを機能的な様式で、例えば２つのＤＮＡフラグメントによりコードされるアミノ酸配列がインフレームのまま残るように、またはタンパク質が望ましいプロモーターの制御下で発現されるように結合することを意味すると意図される。
【０１２３】
ＶＨコード化ＤＮＡを、重鎖定常領域(ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３)をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能なように連結することにより、ＶＨ領域をコードする単離されたＤＮＡを全長重鎖遺伝子に変換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当分野において公知であり(例えばKabat et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242参照)、そしてこれらの領域を包含するＤＮＡフラグメントを標準的なＰＣＲ増幅により得ることができる。重鎖定常領域はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域でよい。Ｆａｂフラグメント重鎖遺伝子に関して、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子にＶＨコード化ＤＮＡを作動可能なように連結することができる。
【０１２４】
ＶＬコード化ＤＮＡを、軽鎖定常領域ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能なように連結することにより、ＶＬ領域をコードする単離されたＤＮＡを全長軽鎖遺伝子に(およびＦａｂ軽鎖遺伝子に)変換することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当分野において公知であり(例えばKabat et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242参照)、そしてこれらの領域を包含するＤＮＡフラグメントを標準的なＰＣＲ増幅により得ることができる。軽鎖定常領域はカッパまたはラムダ定常領域でよい。
【０１２５】
ｓｃＦｖ遺伝子を創成するために、ＶＨおよびＶＬ配列を隣接する一本鎖タンパク質として発現でき、ＶＬおよびＶＨ領域は可動性リンカーにより結合されるように、ＶＨおよびＶＬコード化ＤＮＡフラグメントを、可動性リンカーをコードする、例えばアミノ酸配列(Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ)３をコードする別のフラグメントに作動可能なように連結する(例えばBird et al., Science 242:423-426(1988);Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883(1988)；McCafferty et al., Nature 348:552-554(1990)参照)。
【０１２６】
モノクローナル抗体作製
従来のモノクローナル抗体方法論、例えばKohler and Milstein(Nature, ２５６：４９５(１９７５))の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術を含む種々の技術により、またはファージディスプレイのようなライブラリーディスプレイ法を用いてモノクローナル抗体(ｍＡｂ)を生成することができる。
【０１２７】
ハイブリドーマを調製するための動物の系はマウス系である。マウスにおけるハイブリドーマ生成は十分に確立された手順である。免疫プロトコールおよび融合のための免疫脾細胞の単離のための技術は当分野において公知である。融合パートナー(例えばマウス骨髄腫細胞)および融合手順もまた公知である。
【０１２８】
前記されたように調製されたマウスモノクローナル抗体の配列に基づいて本発明のキメラまたはヒト化抗体を調製することができる。重および軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡを目的のマウスハイブリドーマから得て、そして標準的な分子生物学的技術を用いて非マウス(例えばヒト)免疫グロブリン配列を含有するように操作することができる。例えばキメラ抗体を創成するために、当分野において公知の方法を用いてマウス可変領域をヒト定常領域に連結することができる(例えばCabillyらに対する米国特許第４８１６５６７号参照)。ヒト化抗体を創成するために、当分野において公知の方法を用いてマウスＣＤＲ領域をヒトフレームワークに挿入することができる。例えば米国特許第５２２５５３９号および米国特許第５５３０１０１号；第５５８５０８９号；第５６９３７６２号および第６１８０３７０号参照。
【０１２９】
特定の実施態様では、本発明の抗体はヒトモノクローナル抗体である。マウス系よりもむしろヒト免疫系の部分を担持する遺伝子導入または染色体導入マウスを用いて、ＰＣＳＫ９に対して指向するかかるヒトモノクローナル抗体を作製することができる。これらの遺伝子導入および染色体導入マウスには本明細書で各々HuMAbマウスおよびＫＭマウスと称されるマウスが含まれ、そして本明細書では「ヒトＩｇマウス」と総称される。
【０１３０】
HuMAbマウス(登録商標)(Medarex, Inc.)は再構成されていないヒト重(μおよびγ)およびκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座(miniloci)を、内因性μおよびκ鎖遺伝子座を不活化する標的とされた変異と一緒に含有する(例えばLonberg et al., Nature ３６８(６４７４)：８５６−８５９(１９９４)参照)。したがって、マウスはマウスＩｇＭまたはκの発現の低減を呈し、そして免疫に応答して導入されたヒト重および軽鎖導入遺伝子はクラススイッチおよび体細胞変異を行い、高親和性ヒトＩｇＧκモノクローナルを作製する(Lonberg, N. et al.,(1994) supra; Lonberg, N., Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101(1994)にて概説;Lonberg, N. and Huszar, D., Intern. Rev. Immunol.13:65-93(1995)およびHarding, F. and Lonberg, N., Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546(1995))。HuMAbマウスの調製および使用、ならびにかかるマウスにより担持されるゲノム修飾はTaylor, L. et al., Nucleic Acids Research 20:6287-6295(1992)；Chen, J. et at., International Immunology 5:647-656(1993);Tuaillon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3720-3724(1993)；Choi et al., Nature Genetics 4:117-123(1993)；Chen, J. et al., EMBO J. 12:821-830(1993);Tuaillon et al., J. Immunol. 152:2912-2920(1994)；Taylor, L. et al., International Immunology 579-591(1994)；およびFishwild, D. et al., Nature Biotechnology 14:845-851(1996)にてさらに記載され、その全ての内容はその全体において出典明示によりそのまま本明細書の一部とする。さらに米国特許第５５４５８０６号；第５５６９８２５号；第５６２５１２６号；第５６３３４２５号；第５７８９６５０号；第５８７７３９７号；第５６６１０１６号；第５８１４３１８号；第５８７４２９９号；および第５７７０４２９号(全てLonbergおよびKayに対する)；Suraniらに対する米国特許第５５４５８０７号；ＰＣＴ公開第ＷＯ９２１０３９１８号、第ＷＯ９３／１２２２７号、第ＷＯ９４／２５５８５号、第ＷＯ９７１１３８５２号、第ＷＯ９８／２４８８４号および第ＷＯ９９／４５９６２号(全てLonbergおよびKayに対する)；ならびにKormanらに対するＰＣＴ公開第ＷＯ０１／１４４２４号を参照のこと。
【０１３１】
別の実施態様では、ヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入染色体を担持するマウスのような導入遺伝子および導入染色体にヒト免疫グロブリン配列を担持するマウスを用いて、本発明のヒト抗体を上昇させることができる。かかるマウスは本明細書では「ＫＭマウス」と称され、第ＷＯ０２／４３４７８号にて詳細に記載される。
【０１３２】
なおさらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替えの遺伝子導入動物系が当分野において利用可能であり、そして本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体を上昇させるために使用され得る。例えばXenomouse(登録商標)(Abgenix, Inc.)と称される代替えの遺伝子導入系を使用することができる。かかるマウスは例えばKucherlapatiらに対する米国特許第５９３９５９８号；第６０７５１８１号；第６１１４５９８号；第６１５０５８４号；および第６１６２９６３号にて記載される。
【０１３３】
さらにヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替えの染色体導入動物系が当分野において利用可能であり、そして本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体を上昇させるために使用することができる。例えば「ＴＣマウス」と称されるヒト重鎖導入染色体およびヒト軽鎖導入染色体の双方を担持するマウスを使用することができ；かかるマウスはTomizuka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727(2000)に記載される。さらにヒト重および軽鎖導入染色体を担持するウシが当分野において記載されており(Kuroiwa et al., Nature Biotechnology 20:889-894(2002))、そして本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体を上昇させるために使用され得る。
【０１３４】
ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリーをスクリーニングするためのファージディスプレイ法を用いて本発明のヒトモノクローナル抗体を調製することもできる。ヒト抗体を単離するためのかかるファージディスプレイ法が当分野において確立されている。例えば：Ladnerらに対する米国特許第５２２３４０９号；第５４０３４８４号；および第５５７１６９８号；Dowerらに対する米国特許第５４２７９０８号および第５５８０７１７号；McCaffertyらに対する米国特許第号５９６９１０８号および第６１７２１９７号；ならびにGriffithsらに対する米国特許第５８８５７９３号；第６５２１４０４号；第６５４４７３１号；第６５５５３１３号；第６５８２９１５号および第６５９３０８１号を参照のこと。全長ＰＣＳＫ９に対する、またはＰＣＳＫ９の特定のエピトープに対する結合に関してライブラリーをスクリーニングすることができる。
【０１３５】
免疫時にヒト抗体応答を生じることができるようにヒト免疫細胞が再構築されているＳＣＩＤマウスを用いて、本発明のヒトモノクローナル抗体を調製することもできる。かかるマウスは例えばWilsonらに対する米国特許第５４７６９９６号および第５６９８７６７号に記載される。
【０１３６】
ヒトＩｇマウスにおけるヒトモノクローナル抗体の作製
原核細胞(例えば大腸菌)または真核細胞(例えば哺乳動物細胞、例えばＨＥＫ２９３細胞)において発現された精製された組換えヒトＰＣＳＫ９を抗原として使用することができる。タンパク質をキーホールリンペットヘモシアニン(ＫＬＨ)のようなキャリアに抱合させることができる。
【０１３７】
HuMab遺伝子導入マウスのＨＣｏ７、ＨＣｏ１２およびＨＣｏ１７株ならびに遺伝子導入染色体導入マウスのＫＭ株を用いてＰＣＳＫ９に対する完全なヒトモノクローナル抗体を調製し、その各々はヒト抗体遺伝子を発現する。こららのマウス株の各々では、Chen et al., EMBO J.12:811-820(1993)に記載されるように内因性マウスカッパ軽鎖遺伝子をホモ接合的に破壊することができ、そして第ＷＯ０１１０９１８７号の実施例１に記載されるように内因性マウス重鎖遺伝子をホモ接合的に破壊することができる。これらのマウス株の各々はFishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-851(1996)に記載されるようにヒトカッパ軽鎖導入遺伝子ＫＣｏ５を担持する。米国特許第５５４５８０６号；第５６２５８２５号；および第５５４５８０７号に記載されるようにＨＣｏ７株はＨＣｏ７ヒト重鎖導入遺伝子を担持する。第ＷＯ０１／０９１８７号の実施例２に記載されるようにＨＣｏ１２株はＨＣｏ１２ヒト重鎖導入遺伝子を担持する。ＨＣｏ１７株はＨＣｏ１７ヒト重鎖導入遺伝子を担持する。第ＷＯ０２／４３４７８号に記載されるようにＫＮＭ株はＳＣ２０導入染色体を含有する。
【０１３８】
ＰＣＳＫ９に対する完全なヒトモノクローナル抗体を作製するために、抗原として精製された組換えＰＣＳＫ９、ＰＣＳＫ９フラグメントまたはその抱合体(例えばＰＣＳＫ９−ＫＬＨ)を用いてHuMabマウスおよびＫＭマウスを免役する。HuMabマウスのための一般的な免疫スキームはLonberg, N. et al., Nature 368(6474):856-859(1994)；Fishwild, D. et al., Nature Biotechnology 14:845-851(1996)および第ＷＯ９８／２４８８４号に記載される。最初の抗原の注入時にマウスは６−１６週齢である。抗原の精製された組換え調製物(５−５０μｇ)を用いてHuMabマウスおよびＫＭマウスを腹腔内、皮下(Ｓｃ)で、または足蹠注射により免疫する。
【０１３９】
フロイント完全アジュバントまたはリビアジュバント中の抗原で遺伝子導入マウスを腹腔内(ＩＰ)、皮下(Ｓｃ)で、または足蹠(ＦＰ)によるかのいずれかで２回、続いてフロイント不完全またはリビアジュバント中の抗原で３−２１日のＩＰ、ＳｃまたはＦＰ免疫する(免疫は全部で１１回まで)。後眼窩出血により免疫応答をモニタリングする。ＥＬＩＳＡにより血漿をスクリーニングし、そして抗ＰＣＳＫ９ヒト免疫グロブリンの力価が十分であるマウスを融合に用いる。剖検前３および２日にマウスを抗原で静脈内にブーストし、そして脾臓を除去する。典型的には各抗原に関して１０−３５の融合を実施する。数十匹のマウスを各抗原に関して免疫する。ＨＣｏ７、ＨＣｏ１２、ＨＣｏ１７およびＫＭマウス株の全部で８２匹のマウスをＰＣＳＫ９で免疫する。
【０１４０】
ＰＣＳＫ９に結合する抗体を生成するHuMabまたはＫＭマウスを選択するために、免疫マウスからの血清をFishwild, D. et al.,(１９９６)に記載されるようにＥＬＩＳＡにより試験することができる。簡単には、マイクロタイタープレートを精製された組換えＰＣＳＫ９でＰＢＳ中１−２μｇ／ｍｌ、５０μｌ／ウェルでコーティングし、４℃で一晩インキュベートし、次いでＰＢＳ／Tween(０.０５％)中５％ニワトリ血清２００μｌ／ウェルで遮断する。ＰＣＳＫ９免疫マウスからの血漿の希釈剤を各ウェルに加え、そして周囲温度で１−２時間インキュベートする。プレートをＰＢＳ／Tweenで洗浄し、そして次に西洋ワサビペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)で抱合されたヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃポリクローナル抗体と共に室温で１時間インキュベートする。洗浄後、プレートをＡＢＴＳ基質(Sigma、Ａ−１８８８、０.２２ｍｇ／ｍｌ)で展開し、そして分光光度計によりＯＤ４１５−４９５で分析する。最高力価の抗ＰＣＳＫ９抗体を発達させたマウスの脾細胞を融合に使用する。融合を実施し、そしてＥＬＩＳＡによりハイブリドーマ上澄を抗ＰＣＳＫ９活性に関して試験する。
【０１４１】
標準的なプロトコールに基づいて、ＰＥＧを用いてHuMabマウスおよびＫＭマウスから単離されたマウス脾細胞をマウス骨髄腫細胞系と融合させる。次いで得られたハイブリドーマを抗原特異的抗体の生成に関してスクリーニングする。５０％ＰＥＧ(Sigma)を用いて免疫マウスからの脾臓リンパ球の単一細胞懸濁液を４分の１の数のＳＰ２／０非分泌性マウス骨髄腫細胞(ＡＴＣＣ、ＣＲＬ１５８１)と融合させる。細胞をおよそ１×１０５／ウェルで平底マイクロタイタープレートに蒔き、続いて１０％ウシ胎仔血清、１０％Ｐ３８８Ｄ  １(ＡＴＣＣ、ＣＲＬ  ＴＩＢ−６３)条件培地、ＤＭＥＭ(Mediatech、ＣＲＬ１００１３、高グルコース、Ｌ−グルタミンおよびピルビン酸ナトリウム含有)＋５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ中３−５％Origen(登録商標)(ＩＧＥＮ)、０.０５５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンおよび１倍ＨＡＴ(Sigma、ＣＲＬ  Ｐ−７１８５)を含有する選択培地中で約２週間インキュベートする。１−２週間後、ＨＡＴがＨＴで置き換えられた培地中で細胞を培養する。次いで個々のウェルをＥＬＩＳＡによりヒト抗ＰＣＳＫ９モノクローナルＩｇＧ抗体に関してスクリーニングする。一度大規模なハイブリドーマ成長を生じると、通常１０−１４日後に培地をモニタリングする。抗体分泌ハイブリドーマを再度蒔き、再度スクリーニングし、そして依然ヒトＩｇＧに関して陽性である場合、抗ＰＣＳＫ９モノクローナル抗体を限界希釈により少なくとも２回サブクローニングする。次いで安定したサブクローンをインビトロで培養して、組織培養培地中でさらなる特徴付けのために少量の抗体を作製する。
【０１４２】
ヒトモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマの作製
本発明のヒトモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマを作製するために、免疫マウスからの脾細胞および／またはリンパ節細胞を単離し、そしてマウス骨髄腫細胞系のような適切な不死化細胞に融合させる。得られたハイブリドーマを抗原特異的抗体の生成に関してスクリーニングすることができる。例えば５０％ＰＥＧを用いて免疫マウスからの脾臓リンパ球の単一細胞懸濁液を６分の１の数のＰ３Ｘ６３−Ａｇ８.６５３非分泌性マウス骨髄腫細胞(ＡＴＣＣ、ＣＲＬ１５８０)と融合させることができる。細胞をおよそ２×１４５で平底マイクロタイタープレートに蒔き、続いて２０％胎性クローン血清、１８％「６５３」条件培地、５％Origen(登録商標)(ＩＧＥＮ)、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０.０５５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、５０単位／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンおよび１倍ＨＡＴ(Sigma；ＨＡＴは融合後２４時間に添加する)を含有する選択培地中で約２週間インキュベートする。およそ２週間後、ＨＡＴをＨＴで置き換えた培地中で細胞を培養することができる。次いで個々のウェルをＥＬＩＳＡによりヒトモノクローナルＩｇＭおよびＩｇＧ抗体に関してスクリーニングすることができる。一度大規模なハイブリドーマ成長を生じると、通常１０−１４日後に培地を観察することができる。抗体分泌ハイブリドーマを再度蒔き、再度スクリーニングすることができ、そして依然ヒトＩｇＧに関して陽性である場合、モノクローナル抗体を限界希釈により少なくとも２回サブクローニングすることができる。次いで安定したサブクローンをインビトロで培養して、組織培養培地中でさらなる特徴付けのために少量の抗体を作製することができる。
【０１４３】
ヒトモノクローナル抗体を精製するために、モノクローナル抗体精製用の２リットルスピナーフラスコ中で選択されたハイブリドーマを成長させることができる。上澄を濾過し、そしてプロテインＡセファロースを伴うアフィニティークロマトグラフィー(Pharmacia、Piscataway, N.J.)の前に濃縮することができる。溶出されたＩｇＧをゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィーにより検査して純度を確認することができる。バッファー溶液をＰＢＳに交換し、そして濃度をＯＤ２８０により吸光係数１.４３を用いて決定することができる。モノクローナル抗体を等分し、そして−８０℃で保存することができる。
【０１４４】
モノクローナル抗体を生成するトランスフェクトーマの作製
例えば当分野において周知であるような組換えＤＮＡ技術および遺伝子トランスフェクション法の組み合わせを用いて宿主細胞トランスフェクトーマにおいて本発明の抗体を生成することもできる(例えばMorrison, Science ２２９：１２０２(１９８５))。
【０１４５】
例えば抗体またはその抗体フラグメントを発現するために、標準的な分子生物学的技術(例えばＰＣＲ増幅または目的の抗体を発現するハイブリドーマを使用するｃＤＮＡクローニング)により部分的または全長軽および重鎖をコードするＤＮＡを得ることができ、そして遺伝子が転写および翻訳制御配列に作動可能なように連結されるようにＤＮＡを発現ベクターに挿入することができる。この局面で「作動可能なように連結された」なる用語は、ベクター内の転写および翻訳制御配列が抗体遺伝子の転写および翻訳を制御するその意図される機能を提供するように、抗体遺伝子をベクターにライゲートすることを意味すると意図される。発現ベクターおよび発現制御配列は用いられる発現宿主細胞に適合するように選択される。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子を別個のベクターに挿入することができるか、またはさらに典型的には双方の遺伝子を同一の発現ベクターに挿入する。標準的な方法(例えば抗体遺伝子フラグメントおよびベクター上の相補的制限部位のライゲーション、または制限部位が存在しない場合、平滑末端ライゲーション)により抗体遺伝子を発現ベクターに挿入する。本明細書に記載される抗体の軽および重鎖可変領域を用いて、ＶＨセグメントがベクター内の(複数の)ＣＨセグメントに作動可能なように連結され、そしてＶＬセグメントがベクター内のＣＬセグメントに作動可能なように連結されるように、望ましいアイソタイプの重鎖定常および軽鎖定常領域を既にコードする発現ベクターにそれらを挿入することにより任意の抗体アイソタイプの全長抗体遺伝子を創成することができる。それに加えてまたは代わりに組換え発現ベクターは、宿主細胞から抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることができる。シグナルペプチドを抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレーム連結するように、抗体鎖遺伝子をベクターにクローン化することができる。シグナルペプチドは免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種性シグナルペプチド(すなわち非免疫グロブリンタンパク質からのシグナルペプチド)でよい。
【０１４６】
抗体鎖遺伝子に加えて、本発明の組換え発現ベクターは宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現を制限する調節配列を担持する。「調節配列」なる用語は抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制限するプロモーター、エンハンサーおよびその他の発現制限エレメント(例えばポリアデニル化シグナル)を含むと意図される。かかる調節配列は例えばGoeddel(Gene Expression Technology. 1990 Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA)にて記載される。調節配列の選択を含む発現ベクターの設計は、形質転換されるべき宿主細胞の選択、望ましいタンパク質の発現のレベル等のような因子に依存し得ることは当業者には理解されよう。哺乳動物宿主細胞発現のための調節配列には、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)、サルウイルス４０(ＳＶ４０)、アデノウイルス(例えばアデノウイルス主要後期プロモーター(ＡｄＭＬＰ))およびポリオーマから誘導されるプロモーターおよび／またはエンハンサーのような、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を志向するウイルスエレメントが含まれる。あるいは、ユビキチンプロモーターまたはＰ−グロビンプロモーターのような非ウイルス調節配列を使用することができる。なおさらに調節エレメントは、ＳＶ４０初期プロモーターおよび１型ヒトＴ細胞白血病ウイルスの末端反復配列からの配列を含有するＳＲａプロモーター系のような異なる供給源からの配列から構成される(Takebe et al., Mol. Cell. Biol. 8:466-472(1988))。
【０１４７】
抗体鎖遺伝子および調節配列に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列(例えば複製起点)および選択マーカー遺伝子のようなさらなる配列を担持できる。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を促進する(例えば全てAxelらによる米国特許第４３９９２１６号；第４６３４６６５号；および第５１７９０１７号参照)。例えば典型的には選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞においてＧ４１８、ハイグロマイシンまたはメソトレキセートのような薬物に対する抵抗性を付与する。選択マーカー遺伝子には、ジヒドロ葉酸リダクターゼ(ＤＨＦＲ)遺伝子(メソトレキセート選択／増幅を伴うｄｈｆｒ宿主細胞において使用するため)およびネオ遺伝子(Ｇ４１８選択のため)が含まれる。
【０１４８】
軽および重鎖の発現のために、重および軽鎖をコードする(複数の)発現ベクターを標準的な技術により宿主細胞にトランスフェクトする。「トランスフェクション」なる用語の種々の形態は、外因性ＤＮＡの原核生物または真核生物宿主細胞への導入のために一般的に用いられる広範な技術、例えばエレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈降、ＤＥＡＥデキストラントランスフェクション等を包含すると意図される。原核生物または真核生物宿主細胞において本発明の抗体を発現することは理論的に可能である。かかる真核細胞、とりわけ哺乳動物細胞は原核細胞よりも会合し、そして適切にフォールドされた、および免疫学的に活性な抗体を分泌する可能性がさらに高いので、真核細胞、とりわけ哺乳動物宿主細胞における抗体の発現が論じられる。抗体遺伝子の原核生物発現は高収率の活性抗体の生成に関して無効であると報告されている(Boss and Wood, Immunology Today 6:12-13(1985))。
【０１４９】
本発明の組換え抗体を発現するための哺乳動物宿主細胞には、ＤＨＦＲ選択マーカー(例えばKaufman and Sharp, Mol. Biol. 159:601-621(1982)に記載される)と共に用いられるチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ細胞)(Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220(1980)に記載されるｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む)、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞が含まれる。とりわけＮＳＯ骨髄腫細胞と共に使用するための別の発現系は第ＷＯ８７／０４４６２号、第ＷＯ８９／０１０３６号および欧州特許第３３８８４１号に示されるＧＳ遺伝子発現系である。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入する場合、宿主細胞における抗体の発現または、宿主細胞が成長する培養培地への抗体の分泌を可能にするのに十分な時間、宿主細胞を培養することにより抗体を生成する。標準的なタンパク質精製法を用いて抗体を培養培地から回収することができる。
【０１５０】
二特異性分子
別の態様では、本発明は本発明のＰＣＳＫ９結合分子(例えば抗ＰＣＳＫ９抗体またはそのフラグメント)を含む二特異性分子を特徴とする。本発明のＰＣＳＫ９結合分子を誘導体化するか、または別の機能的分子、例えば別のペプチドもしくはタンパク質(例えば別の抗体または受容体に関するリガンド)に連結させて、少なくとも２つの異なる結合部位または標的分子に結合する二特異性分子を作製することができる。本発明のＰＣＳＫ９結合分子を実際に誘導体化するか、または１を超えるその他の機能的分子に連結させて、２を超える異なる結合部位および／または標的分子に結合する多特異性分子を作製できる；かかる多特異性分子はまた本明細書で使用される際には「二特異性分子」なる用語に包含されると意図される。本発明の二特異性分子を創成するために、本発明の抗体を別の抗体、抗体フラグメント、ペプチドまたは結合擬似物質のような１つまたはそれより多いその他の結合分子に機能的に(例えば化学的結合、遺伝子融合、非共有結合またはその他により)に連結させることができ、結果的に二特異性分子に至るようにする。
【０１５１】
したがって本発明はＰＣＳＫ９に関する少なくとも１つの第１の結合特異性および第２の標的エピトープに関する第２の結合特異性を含む二特異性分子を含む。
【０１５２】
１つの実施態様では、本発明の二特異性分子は結合特異性として、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、Ｆｖまたは一本鎖Ｆｖを含む少なくとも１つの抗体、またはその抗体フラグメントを含む。抗体はまた軽鎖もしくは重鎖二量体、またはLadnerら、米国特許第４９４６７７８号(その内容を出典明示により本明細書の一部とする)に記載されるようなＦｖもしくは一本鎖構築物のようなその任意の最小フラグメントでもよい。
【０１５３】
当分野において公知の方法を用いて構成成分結合特異性を抱合することにより本発明の二特異性分子を調製することができる。例えば二特異性分子の各結合特異性を別個に作製し、そして次に互いに抱合することができる。結合特異性がタンパク質またはペプチドである場合、種々の結合剤または架橋剤を共有結合性抱合に使用することができる。架橋剤の実例には、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセタート(ＳＡＴＡ)、５,５’−ジチオビス(２−ニトロ安息香酸)(ＤＴＮＢ)、ｏ−フェニレンジマレイミド(ｏＰＤＭ)、Ｎ−スクシンイミジル−３−(２−ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)およびスルホスクシンイミジル４−(Ｎ−マレイミドメチル)シクロヘキサン(cyclohaxane)−１−カルボキシラート(スルホ−ＳＭＣＣ)(例えばKarpovsky et al., J. Exp. Med. 160:1686(1984);Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648(1985))が含まれる。その他の方法にはPaulus, Behring Ins. Mitt. No. 78:118-132(1985)；Brennan et al., Science 229:81-83(1985)およびGlennie et al., J. Immunol. 139:2367-2375(1987)に記載されるものが含まれる。抱合剤はＳＡＴＡおよびスルホ−ＳＭＣＣであり、双方共にPierce Chemical Co.(Rockford, IL)から入手可能である。
【０１５４】
結合特異性が抗体である場合、それらを２つの重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合により抱合することができる。特定の実施態様では、抱合の前に奇数の、例えば１個のスルフヒドリル残基を含有するようにヒンジ領域を修飾する。
【０１５５】
あるいは双方の結合特異性を同一ベクター内でコードし、そして同一宿主細胞内で発現および組み立てることができる。この方法は特に二特異性分子がｍＡｂ×ｍＡｂ、ｍＡｂ×Ｆａｂ、Ｆａｂ×Ｆ(ａｂ’)２またはリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質である場合に有用である。本発明の二特異性分子は一本鎖抗体および結合決定基を含む一本鎖分子、または２つの結合決定基を含む一本鎖二特異性分子でよい。二特異性分子は少なくとも２つの一本鎖分子を含むことができる。二特異性分子を調製するための方法は例えば米国特許第５２６０２０３号；第５４５５０３０号；第４８８１１７５号；第５１３２４０５号；第５０９１５１３号；第５４７６７８６号；第５０１３６５３号；第５２５８４９８号；および第５４８２８５８号に記載される。
【０１５６】
二特異性分子のその特異的標的に対する結合を例えば酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)、ラジオイムノアッセイ(ＲＥＡ)、ＦＡＣＳ分析、バイオアッセイ(例えば成長阻止)またはウェスタンブロットアッセイにより確認することができる。これらのアッセイの各々は一般的に、目的の複合体に特異的な標識試薬(例えば抗体)を用いることにより特定の目的のタンパク質−抗体複合体の存在を検出する。
【０１５７】
機能的アッセイ
ＰＣＳＫ９結合分子の機能的特徴をインビトロおよびインビボで試験することができる。例えばＰＣＳＫ９のＬＤＬ−Ｒとの相互作用を阻止する能力、ＬＤＬ−Ｒに及ぼすＰＣＳＫ９依存性の効果(例えばＬＤＬ−ｃのＬＤＬ−Ｒ媒介の取り込み)の阻止、ＰＣＳＫ９タンパク質分解活性の阻止およびインビボでのＬＤＬ−ｃの低下に関して結合分子を試験することができる。
【０１５８】
Biacore(登録商標)を用いてＬＤＬ−Ｒを固体支持体に固定し、そしてＬＤＬ−Ｒに対する可溶性ＰＣＳＫ９結合を検出することにより、ＬＤＬ−Ｒに対するＰＣＳＫ９結合を検出することができる。あるいはＰＣＳＫ９を固定し、そしてＬＤＬ−Ｒ結合を検出することができる。ＰＣＳＫ−９／ＬＤＬ−Ｒ結合をＥＬＩＳＡにより(例えば固定ＬＤＬ−Ｒに対するＰＣＳＫ９結合を検出することにより)、または蛍光共鳴エネルギー転移(ＦＲＥＴ)により分析することもできる。ＦＲＥＴを実施するために、ＬＤＬ−Ｒに対するフルオロフォア標識ＰＣＳＫ９結合を溶液中で検出することができる(例えば米国特許第５６３１１６９号参照)。
【０１５９】
ＬＤＬ−Ｒに対するＰＣＳＫ９結合は免疫共沈降(Lagace et al., J. Clin. Inv. 116(11):2995-3005(2006))により検出されている。この様式でＰＣＳＫ９−ＬＤＬ−Ｒ結合を試験するために、ＨｅｐＧ２細胞をステロール枯渇培地中で１８時間培養する。精製されたＰＣＳＫ９を０.１ｍＭクロロキンの存在下で培地に添加し、そして細胞を１時間インキュベートする。穏やかなデタージェント(１(重量／容量)％ジギトニン)中で細胞を溶解する。ＰＣＳＫ９またはＬＤＬ−Ｒを細胞ライゼートから免疫沈降し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、そして免疫ブロットして免疫共沈降したＬＤＬ−ＲまたはＰＣＳＫ９の各々の存在を検出する(Lagace et al., J. Clin. Inv. 116(11):2995-3005(2006))。高い結合力でＬＤＬ−Ｒに結合するＰＣＳＫ９の変異体形態でこれらのアッセイを行うことができる(例えばｈＰＣＳＫ９  Ｄ３７４Ｙ)(Lagace et al.,(2006), supra)。
【０１６０】
肝細胞は細胞表面でＬＤＬ−Ｒを発現する。培養肝細胞(例えばＨｅｐＧ２細胞、ＡＴＣＣ、ＨＢ−８０６５)への精製されたＰＣＳＫ９の添加により、用量および時間依存的な様式でＬＤＬ−Ｒ発現の低下を生じる(Lagace et al., J. Clin. Inv. 116(11):2995-3005(2006))。肝細胞によるＬＤＬ−Ｒレベルを増大させる能力に関してＰＣＳＫ９結合分子を試験することができる。例えばＨｅｐＧ２細胞をステロール枯渇培地(１００単位／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシンおよび１ｇ／ｌグルコース、５(容量／容量)％新生仔ウシリポタンパク質欠乏血清(ＮＣＬＰＤＳ)、１０μＭコンパクチンナトリウムおよび５０μＭメバロン酸ナトリウムを補充したＤＭＥＭ)中で１８時間培養してＬＤＬ−Ｒ発現を誘起する。精製されたＰＣＳＫ９(５μｇ／ｍｌ)を培地に添加する。ＰＣＳＫ９の添加後０、０.５、１、２および４時間に収集された細胞におけるＬＤＬ−Ｒレベルを決定する(Lagace et al., J. Clin. Inv. 116(11):2995-3005(2006))。フローサイトメトリー、ＦＲＥＴ、免疫ブロットまたはその他の手段によりＬＤＬ−Ｒレベルを決定することができる。
【０１６１】
Stephan and Yurachek(J. Lipid Res. 34:325-330(1993))により記載されるように蛍光標識ＬＤＬ−ｃ、ＤｉＩ−ＬＤＬ(３,３’−ジオクタデシルインドカルボシアニン低密度リポタンパク質)を用いて細胞(例えばＨｅｐＧ２細胞)によるＬＤＬ−ｃ取り込みを測定することができる。簡単には、細胞を培養中でＤｉＩ−ＬＤＬ(２０−１００μｇタンパク質／ｍｌ)と共に３７℃で２時間インキュベートする。細胞を洗浄し、溶解し、そして内部移行したＤｉＩ−ＬＤＬの濃度を、分光蛍光光度計を用いて定量する。ＰＣＳＫ９結合剤と接触させた細胞においてＬＤＬ−ｃ取り込みを測定することができる(ＤｉＩ−ＬＤＬが細胞培養中に存在する期間の前、および／またはその間)。
【０１６２】
合成ペプチド基質を用いてＰＣＳＫ９タンパク質分解活性をインビトロで測定することができる。例えばSeidah et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100(3):928-933(2003)を参照のこと。１つの実例的な方法では、精製されたＰＣＳＫ９を２５ｍＭ  Tris／Ｍｅｓ、ｐＨ７.４＋２.５ｍＭ  ＣａＣｌ２および０.５％ＳＤＳ中５０μＭ  Ｓｕｃ−ＲＰＦＨＬＬＶＹ−ＭＣＡ(４−メチルクマリン−７−アミド)と共に３７℃で３−１８時間インキュベートする。生成物の蛍光およびマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間分析を用いて切断生成物を検出する(Seidah et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100(3):928-933(2003);Basak et al., FEBS Lett. 514:333-339(2002))。このアッセイを用いてＰＣＳＫ９結合分子の存在下での切断効率における差異を検出できる。
【０１６３】
肝臓においてヒトＰＣＳＫ９を過剰発現する遺伝子導入マウスは非遺伝子導入マウスに相対して血漿ＬＤＬ−ｃのレベルが増大している(Lagace et al., J. Clin. Inv. 116(11):2995-3005(2006))。マウスにおいてアデノウイルスベクターを用いるＰＣＳＫ９の過剰発現を記載するMaxwell and Breslow, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101:7100(2004)もまた参照のこと。ＰＣＳＫ９−／−マウスが生成されている(Rashid et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 102(5):5374-5379(2005))。これらのマウスを遺伝子修飾してｈＰＣＳＫ９導入遺伝子を発現させることができる。これらのモデルのいずれかで、または遺伝子修飾されていない動物において、ＰＣＳＫ９結合分子を全コレステロールおよび／またはＬＤＬ−ｃを取り除く、または低減させる能力に関して試験することができる。
【０１６４】
動物に［１２５Ｉ］標識ＬＤＬを注射し、注射後０、５、１０、１５および３０分に血液試料を入手し、そして試料中の［１２５Ｉ］−ＬＤＬを定量することにより、血漿からのＬＤＬクリアランスの動態を決定することができる(Rashid et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 102(5):5374-5379(2005))。ＬＤＬクリアランスの速度は野生型マウスに相対してＰＣＳＫ９−／−マウスにおいて増大する(Rashid et al.,(2005) supra)。ＰＣＳＫ９結合分子を投与された動物におけるＬＤＬクリアランスの増大は、薬剤がインビボでＰＣＳＫ９活性を阻止することを示す。
【０１６５】
ＰＣＳＫ９結合分子での処置に応答した全血漿コレステロール、血漿トリグリセリドまたはＬＤＬ−ｃにおける低下は、ＰＣＫＳ９結合分子の治療効率の指標である。比色分析、ガス−液体クロマトグラフィーまたは市販により入手可能なキットを用いる酵素的手段によりコレステロールおよび脂質プロフィールを決定することができる。
【０１６６】
医薬組成物
別の態様では本発明は、薬学的に許容される担体と一緒に処方された本発明のＰＣＳＫ９結合分子(例えばモノクローナル抗体またはその(複数の)抗原結合部分)の１つまたは組み合わせを含有する組成物、例えば医薬組成物を提供する。かかる組成物は結合分子の１つまたは(例えば２つまたはそれより多い異なる結合分子の)組み合わせを含み得る。例えば本発明の医薬組成物は標的抗原上の異なるエピトープに結合する、または祖補的活性を有する抗体または薬剤の組み合わせを含むことができる。
【０１６７】
本発明の医薬組成物を組み合わせ治療で、すなわちその他の薬剤と組み合わせて投与することもできる。例えば組み合わせ治療は少なくとも１つのその他のコレステロール低下薬と組み合わされた抗ＰＣＳＫ９抗体を含むことができる。組み合わせ治療で用いることができる治療薬の実例を以下の本発明の薬剤の使用に関するセクションでさらに詳細に記載する。
【０１６８】
本明細書で使用される際には「薬学的に許容される担体」には生理学的に適合する任意の、および全ての溶媒、分散培地、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤等が含まれる。担体は静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊椎または表皮投与(例えば注射または注入による)に適当であるべきである。投与経路に依存して、化合物を不活化し得る酸およびその他の自然条件の作用から化合物を保護するための材料で活性化合物をコーティングできる。
【０１６９】
本発明の医薬用化合物は１つまたはそれより多い薬学的に許容される塩を含むことができる。「薬学的に許容される塩」とは親化合物の望ましい生物学的活性を保持し、そして任意の望ましくない毒性学的影響を付与しない塩を指す(例えばBerge, S.M., et al., J. Pharm. Sci. 66:1-19(1977)参照)。かかる塩の実例には酸付加塩および塩基付加塩が含まれる。酸付加塩には塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸等のような無毒性の無機酸から、ならびに脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸等のような無毒性の有機酸から誘導されたものが含まれる。塩基付加塩にはナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等のようなアルカリ土類金属から、ならびにＮ,Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカイン等のような無毒性の有機アミンから誘導されたものが含まれる。
【０１７０】
本発明の医薬組成物はまた薬学的に許容される抗酸化剤を含むことができる。薬学的に許容される抗酸化剤の実例には：アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等のような水溶性抗酸化剤；パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール(ＢＨＡ)、ブチル化ヒドロキシトルエン(ＢＨＴ)、レシチン、没食子酸プロピル、アルファトコフェロール等のような油溶性抗酸化剤；およびクエン酸、エチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)、ソルビトール、酒石酸、リン酸等のような金属キレート剤；が含まれる。
【０１７１】
本発明の医薬組成物において用いることができる適当な水性および非水性担体の実例には、水、エタノール、ポリオール(例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等)および適当なその混合物、オリーブ油のような植物油、ならびにオレイン酸エチルのような注射用有機エステルが含まれる。例えばレシチンのようなコーティング材料の使用により、分散物の場合、必要とされる粒子径の維持により、および界面活性剤の使用により適切な流動性を維持することができる。
【０１７２】
これらの組成物は保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤のような佐剤を含有することもできる。前出の滅菌手順ならびに種々の抗菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸等を含めることの双方により微生物の存在の防御を確実にすることができる。組成物中に糖、塩化ナトリウム等のような等張剤を含むことも望ましいかもしれない。加えて、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような吸収を遅延させる薬剤を含むことにより注射用医薬形態の吸収の延長をもたらすことができる。
【０１７３】
薬学的に許容される担体には、滅菌水溶液または分散物および滅菌注射用溶液または分散物の即時調製のための滅菌粉末が含まれる。医薬的に活性な物質のためのかかる培地および薬剤の使用は当分野において公知である。任意の従来の培地または薬剤が活性化合物と不適合である場合を除いて、本発明の医薬組成物におけるその使用が企図される。補足的な活性化合物を組成物に組み込むこともできる。
【０１７４】
治療用組成物は典型的には無菌であり、そして製造および保存の条件下で安定でなければならない。組成物を薬物高濃度に適当な溶液、マイクロエマルジョン、リポソームまたはその他の秩序構造として処方することができる。担体は例えば水、エタノール、ポリオール(例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール等)を含有する溶媒または分散培地、および適当なその混合物でよい。例えばレシチンのようなコーティング材料の使用により、分散物の場合、必要とされる粒子径の維持により、および界面活性剤の使用により、適切な流動性を維持することができる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば糖、マンニトールのようなポリアルコール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムを含むことができる。吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物中に含むことにより注射用組成物の吸収の延長をもたらすことができる。
【０１７５】
必要とされる量の活性化合物を適切な溶媒中、前記で列挙された成分の１つまたは組み合わせと共に組み込み、必要により続いて滅菌精密濾過することにより滅菌注射用溶液を調製することができる。一般的には、基本的な分散培地および前記で列挙されたものからの必要とされるその他の成分を含有する滅菌ベヒクルに活性化合物を組み込むことにより分散物を調製する。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の方法は、先に滅菌濾過されたその溶液から任意のさらなる望ましい成分に加えて活性成分の粉末を生じる真空乾燥および凍結−乾燥(凍結乾燥)である。
【０１７６】
単一の投薬形態を生成するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は処置されている対象および投与の特定の様式に依存して異なる。単一の投薬形態を生成するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、一般的には治療効果を生じる組成物の量である。一般的には、１００％のうちこの量は薬学的に許容される担体と組み合わされた活性成分の約０.０１％から約９９％、約０.１％から約７０％、または活性成分の約１％から約３０％の範囲である。
【０１７７】
最適な望ましい応答(例えば治療応答)を提供するために投薬計画を調整する。例えば単一のボーラスを投与できるか、いくつかに分割された用量を時間をかけて投与できるか、または治療状況の緊急事態により示される通り用量を比例的に低減または増大させることができる。投与の容易さおよび投薬の均一性のために非経口組成物を投薬単位で処方するのが特に有利である。本明細書で使用される際には投薬単位形態とは処置されるべき対象に単位投薬として適合した物理的に別個の単位を指す；各単位は望ましい治療効果を生じるように計算された予め決定された量の活性化合物を必要とされる医薬用担体に随伴されて含有する。本発明の投薬単位形態の明細は活性化合物の独特な特徴および達成されるべき特定の治療効果、ならびに個体における感受性の処置のためにかかる活性化合物を配合する分野における固有の制限により決定づけられ、そしてそれに直接依存する。
【０１７８】
抗体の投与のために、投薬量範囲は約０.０００１から１００ｍｇ／ｋｇ、およびさらに通常的には０.０１から５ｍｇ／ｋｇ宿主体重の範囲である。例えば投薬量は０.３ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重もしくは１０ｍｇ／ｋｇ体重、または１−１０ｍｇ／ｋｇの範囲内でよい。処置計画の実例は週１回、隔週１回、３週毎に１回、４週毎に１回、１月１回、３か月毎に１回または３から６か月毎に１回の投与を課す。本発明のＰＣＳＫ９結合分子のための投薬計画には静脈内投与による１ｍｇ／ｋｇ体重または３ｍｇ／ｋｇ体重が含まれ、抗体は以下の投与スケジュールの１つを用いて与えられる：４週毎に６回投薬、次いで３か月毎；３週毎；３ｍｇ／ｋｇ体重を１回、続いて３週毎に１ｍｇ／ｋｇ体重。
【０１７９】
いくつかの方法では、異なる結合特異性を有する２つまたはそれより多い結合分子(例えばモノクローナル抗体)を同時に投与し、この場合、投与される各抗体の投薬量は示された範囲内に入る。通常ＰＣＳＫ９結合分子を複数回投与する。１回の投薬の間の間隔は例えば毎週、毎月、３か月毎または毎年でよい。患者におけるＰＣＳＫ９に対する結合分子の血液レベルを測定することにより示される通り、間隔を不規則にすることもできる。いくつかの方法では、約１−１０００μｇ／ｍｌおよびいくつかの方法では約２５−３００μｇ／ｍｌのＰＣＳＫ９結合分子の血漿濃度を達成するように投薬量を調整する。
【０１８０】
あるいは、ＰＣＳＫ９結合分子を徐放製剤として投与することができ、この場合、必要とされる投与頻度は少ない。投薬量および頻度は患者におけるＰＣＳＫ９結合分子の半減期に依存して異なる。一般に、ヒト抗体は最長の半減期を示し、ヒト化抗体、humaneered抗体、キメラ抗体および非ヒト抗体が続く。処置が予防的かまたは治療的かに依存して、投薬量および投与の頻度は異なり得る。予防的適用では、相対的に低い投薬量が相対的に低頻度の間隔で長期間にわたって投与される。死ぬまでずっと処置を受け続ける患者もいる。治療適用では、疾患の進行が低減されるかもしくは終止するまで、または患者が疾患の病徴の部分的もしくは完全な寛解を示すまで、ときに相対的に高い用量が相対的に短い間隔で必要とされる。その後、患者に予防的計画で投与することができる。
【０１８１】
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルは、患者に毒性でなく、特定の患者、組成物および投与の様式に関して望ましい治療応答を達成するために有効である活性成分の量を得るために異なり得る。選択された投薬量レベルは、用いられる本発明の特定の組成物またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与の経路、投与の時間、用いられている特定の化合物の排泄速度、処置の持続時間、用いられる特定の組成物との組み合わせで使用されるその他の薬物、化合物および／または材料、年齢、性別、体重、症状、一般健康状態および処置されている患者の以前の病歴を含む種々の薬物動態因子、ならびに医学の分野で周知の同様の因子に依存する。
【０１８２】
本発明のＰＣＳＫ９結合分子の「治療上有効な投薬量」は結果的に疾患病徴の重篤度の低下(例えば血漿コレステロールにおける低下、コレステロール関連障害の病徴における低下)、疾患病徴のない期間の頻度および持続時間の増大、または疾患の苦痛のための機能障害もしくは能力障害の予防に至り得る。
【０１８３】
当分野において公知の種々の方法のうちの１つまたはそれより多くを用いて本発明の組成物を１つまたはそれより多い投与経路により投与することができる。当業者には理解されるように、投与の経路および／または様式は望まれる結果に依存して異なるであろう。本発明のＰＣＳＫ９結合分子のための投薬経路には、例えば注射または注入による静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊椎またはその他の非経口投与経路が含まれる。「非経口投与」なる語句は本明細書で使用される際には、通常注射による経腸および局所投与以外の投与の様式を意味し、そして限定するものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊椎内、硬膜外およびイントラステマル(intrastemal)注射および注入を含む。
【０１８４】
あるいは本発明のＰＣＳＫ９結合分子を局所、表皮または粘膜投与経路のような、例えば鼻腔内、経口、経膣、直腸、舌下または局所的に非経口でない経路により投与することができる。
【０１８５】
埋込錠、経皮パッチおよびマイクロカプセル化分配系を含む放出制御処方のような迅速な放出に対して化合物を保護する担体と共に活性化合物を調製することができる。酢酸エチレンビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸のような生分解性、生体適合性重合体を使用することができる。かかる処方の調製のための多くの方法が特許取得されているか、または一般的に当業者に公知である。例えばSustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York(1978)を参照のこと。
【０１８６】
当分野において公知の医学的装置を用いて治療用組成物を投与することができる。例えば１つの実施態様では、米国特許第５３９９１６３号；第５３８３８５１号；第５３１２３３５号；第５０６４４１３号；第４９４１８８０号；第４７９０８２４号または第４５９６５５６号にて示される装置のような無針皮下注射装置を用いて本発明の治療用組成物を投与することができる。本発明において有用な周知の埋込錠およびモジュールの実例には：制御された速度で医薬品を配するための埋め込み可能なマイクロ注入ポンプを示す米国特許第４４８７６０３号；皮膚を通して医薬品を投与するための治療用装置を示す米国特許第４４８６１９４号；正確な注入速度で医薬品を分配するための医薬品注入ポンプを示す米国特許第４４４７２３３号；連続的な薬物分配のための埋め込み可能な変流量注入器具を示す米国特許第４４４７２２４号；多室コンパートメントを有する浸透圧薬物分配系を示す米国特許第４４３９１９６号；および浸透圧薬物分配系を示す米国特許第４４７５１９６号；が含まれる。これらの特許を出典明示により本明細書の一部とする。多くのその他のかかる埋込錠、分配系およびモジュールが当業者に公知である。
【０１８７】
特定の実施態様では、本発明のＰＣＳＫ９結合分子をインビボで適切な分布を確実にするように処方することができる。例えば血液脳関門(ＢＢＢ)は多くの高親水性化合物を排除する。本発明の治療用化合物がＢＢＢを越えるのを確実にするために(所望により)、それらを例えばリポソーム中に処方することができる。リポソームを製造する方法に関しては、例えば米国特許第４５２２８１１号；第５３７４５４８号；および第５３９９３３１号を参照のこと。リポソームは、特異的な細胞または器官に選択的に輸送され、故に薬物分配のターゲティングを強化する１つまたはそれより多い部分を含むことができる(例えばV.V. Ranade, J. Cline Pharmacol. ２９：６８５(１９８９)参照)。ターゲティング部分の実例には、葉酸またはビオチン(例えばLowらに対する米国特許第５４１６０１６号参照)；マンノシド(Umezawa et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038(1988))；抗体(P.G. Bloeman et al., FEBS Lett. 357:140(1995)；M. Owais et al., Antimicrob. Agents Chernother. 39:180(1995))；サーファクタントプロテインＡ受容体(Briscoe et al., Am. J. Physiol.1233:134(1995))；p120(Schreier et al., J. Biol. Chem. 269:9090(1994))が含まれ；K. Keinanen;M.L. Laukkanen, FEBSLett. 346:123(1994);J.J. Killion;I.J. Fidler, Immunomethods 4:273(1994)もまた参照のこと。
【０１８８】
本発明の使用および方法
本明細書に記載されるＰＣＳＫ９結合分子はインビトロおよびインビボ診断および治療用途を有する。例えばこれらの分子を例えばインビトロもしくはインビボで培養中の、または例えばインビボで対象における細胞に投与して、種々の障害を処置、防御または診断することができる。ＰＣＳＫ９結合分子はコレステロール上昇またはコレステロール上昇に関連した症状、例えば脂質障害(例えば高脂質血症、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型またはＶ型高脂質血症、続発性高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、黄色腫症、コレステロールアセチルトランスフェラーゼ欠乏)を有するかまたはその危険性のあるヒト患者を処置するのに特に適当である。ＰＣＳＫ９結合分子はまた動脈硬化症の症状(例えばアテローム性動脈硬化症)、冠動脈疾患、心血管疾患を有するヒト患者、および例えば１つまたはそれより多い危険性因子(例えば高血圧、喫煙、糖尿病、肥満または高ホモシステイン血症)の存在のためにこれらの障害の危険性のある患者を処置するのにも適当である。
【０１８９】
別の薬剤と一緒にＰＣＳＫ９結合分子を投与するとき、２つをいずれかの順序で逐次的に、または同時に投与することができる。いくつかの実施態様では、第２の薬剤(例えば第２のコレステロール低下薬)での処置も受けている対象にＰＣＳＫ９結合分子を投与する。コレステロール低下薬にはスタチン系、胆汁酸捕捉剤、ナイアシン、フィブリン酸誘導体および長鎖アルファ、オメガ−ジカルボン酸が含まれる。スタチン系はコレステロール生合成における重要な酵素であるＨＭＧＣｏＡを遮断することによりコレステロール合成を阻止する。スタチン系の実例はロバスタチン、プラバスタチン、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチンおよびシンバスタチンである。胆汁酸捕捉剤は腸から肝臓への胆汁酸の再循環を妨害する。これらの薬剤の実例はコレスチラミンおよび塩酸コレスチポールである。フィブリン酸誘導体の実例はクロフィブラートおよびゲムフィブロジルである。長鎖アルファ、オメガ−ジカルボン酸は例えばBisgaier et al., J. Lipid Res. ３９：１７−３０(１９９８)；第ＷＯ９８／３０５３０号；米国特許第４６８９３４４号；第ＷＯ９９／００１１６号；米国特許第５７５６３４４号；米国特許第３７７３９４６号；米国特許第４６８９３４４号；米国特許第４６８９３４４号；米国特許第４６８９３４４号；および米国特許第３９３００２４号)；エーテル(例えば米国特許第４７１１８９６号；米国特許第５７５６５４４号；米国特許第６５０６７９９号参照)により記載される。ドリコールのリン酸塩(米国特許第４６１３５９３号)およびアゾリジンジオン誘導体(米国特許第４２８７２００号)を用いてコレステロールレベルを低減させることもできる。
【０１９０】
組み合わせ治療計画は相加的であってよく、またはそれは相乗的な結果(例えば２つの薬剤の組み合わせ使用に関して予期されるよりも大きなコレステロールの低減)を生じ得る。いくつかの実施態様では、ＰＣＳＫ９結合分子およびスタチンとの組み合わせ治療は相乗的な結果(例えばコレステロールにおける相乗的な低減)を生じる。これによりスタチン投薬量を低減させて望ましいコレステロールレベルを達成することが可能な対象もある。
【０１９１】
ＰＣＳＫ９結合分子は、別のコレステロール低下薬での治療に不耐性であるか、または別のコレステロール低下薬での治療が不十分な結果を生じている対象(例えばスタチン治療で不十分なＬＤＬ−ｃ低減を経験する対象)に有用である。
【０１９２】
コレステロールが上昇した対象(例えば全血漿コレステロールレベルが２００ｍｇ／ｄｌ以上のヒト対象、ＬＤＬ−ｃレベルが１６０ｍｇ／ｄｌ以上のヒト対象)に本明細書に記載されるＰＣＳＫ９結合分子を投与することができる。
【０１９３】
１つの実施態様では、本発明の結合分子を用いてＰＣＳＫ９のレベルを検出することができる。例えば結合分子とＰＣＳＫ９との間で複合体の形成を可能にする条件下で試料(例えばインビトロ試料)および対照試料をＰＣＳＫ９結合分子と接触させることによりこれを達成することができる。その分子とＰＣＳＫ９との間で形成される任意の複合体を検出し、そして試料および対照においてで比較する。例えば本発明の組成物を用いてＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーアッセイのような当分野において周知の標準的な検出方法を実施することができる。
【０１９４】
したがって１つの態様では本発明はさらに、抗体またはその部分とＰＣＳＫ９との間で複合体の形成を可能にする条件下で、試料および対照試料を本発明のＰＣＳＫ９結合分子(例えば抗体)と接触させることを含む、試料中のＰＣＳＫ９(例えばｈＰＣＳＫ９)の存在を検出するか、またはＰＣＳＫ９の量を測定するための方法を提供する。次いで複合体の形成を検出し、ここで対照試料と比較して試料間の複合体形成における差異は試料中のＰＣＳＫ９の存在の指標である。
【０１９５】
本発明の組成物および使用のための説明書からなるキットもまた本発明の範囲内である。キットはさらに少なくとも１つのさらなる試薬、または１つもしくはそれより多いさらなる本発明の抗体(例えば第１の抗体とは区別される標的抗原上のエピトープに結合する相補的活性を有する抗体)を含有できる。キットは典型的にはキットの内容物の意図される使用を示すラベルを含む。ラベルなる用語には任意の記述またはキット上で、もしくはキットと共に提供される、またはそうでなければキットに添付される記録材料が含まれる。
【０１９６】
本発明を十分に記載してきたが、それを以下の実施例および請求の範囲によりそれをさらに説明し、それらは説明のためであり、そしてさらなる限定を意味するものではない。当業者は日常的な実験のみを用いて、本明細書に記載される具体的な手順に対する非常に多くの均等物を認識するか、または究明することが可能である。かかる均等物は本発明および請求の範囲の範囲内である。本出願全体にわたって引用された、発行された特許および公開された特許出願を含む全ての参照文献の内容を出典明示により本明細書の一部とする。
【実施例】
【０１９７】
実施例１：ファージディスプレイによるヒト抗体の作製
ｈＰＣＳＫ９に対する抗体を作製するために、MorphoSys HuCAL GOLD(登録商標)ファージディスプレイライブラリーを用いる選択を実施する。HuCAL GOLD(登録商標)は、６つのＣＤＲ全てが多様化され、そしてＦａｂフラグメントをファージ表面に連結するためにCysDisplay(商標)テクノロジーを用いるHuCAL(登録商標)概念に基づくＦａｂライブラリーである(Knappik et al., J.Mol. Biol. 296:57-86(2000)；Krebs et al., J Immunol. Methods 254:67-84(2001)；Rauchenberger et al., J Biol Chem. 278(40):38194-38205(2003);第ＷＯ０１／０５９５０号、Loehning,(2001))。
【０１９８】
ファージミドレスキュー、ファージ増幅および精製
３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールおよび１％グルコース(２ｘＹＴ−ＣＧ)を含有する２ｘＹＴ培地中でHuCAL GOLD(登録商標)ライブラリーを増幅する。ハイパーファージ(hyperphage)ヘルパーファージでＯＤ６００ｎｍ０.５の感染の後(振盪せずに３７℃で３０分間；２５０ｒｐｍで振盪して３７℃で３０分間)、細胞を遠沈して(４１２０ｇ；５分間；４℃)、２ｘＹＴ／３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコール／５０μｇ／ｍｌカナマイシン／０.２５ｍＭ  ＩＰＴＧ中に再懸濁し、そして２２℃で一晩成長させる。上澄からファージを２回ＰＥＧ沈降して、ＰＢＳ／２０％グリセロール中に再懸濁し、そして−８０℃で保存する。
【０１９９】
２ラウンドのパニングの間にファージ増幅を以下のとおり行う：対数期中間部の大腸菌ＴＧ１細胞を溶出ファージで感染し、そして１％グルコースおよび３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを補充したＬＢ寒天(ＬＢ−ＣＧプレート)に蒔く。３０℃で一晩インキュベートした後、ＴＧ１コロニーを寒天プレートから掻き取り、そしてそれを用いてＯＤ６００ｎｍ０.５に到達するまで２ｘＹＴ−ＣＧを接種し、そして前記で記載されたような感染のためにハイパーファージヘルパーファージを添加する。
【０２００】
HuCAL GOLD(登録商標)を用いるパニング
ｈＰＣＳＫ９を認識する抗体を選択するために、２つの異なるパニング計画を適用した。要約すれば、HuCAL GOLD(登録商標)ファージ−抗体を、ＶＨマスター遺伝子の異なる組み合わせを含む４つのプール(プール１：ＶＨ１／５λκ、プール２：ＶＨ３λκ、プール３：ＶＨ２／４／６λκ、プール４：ＶＨ１−６λκ)に分ける。これらのプールを別個に、Maxisorpプレートに直接コーティングしたヒトｈＰＣＳＫ９上で３ラウンドの固相パニング、および加えてビオチン化ｈＰＣＳＫ９上の３回の溶液パニングに供する。
【０２０１】
第１のパニングバリアントはｈＰＣＳＫ９に対する固相パニングであり：Maxisorpプレート(Ｆ９６ Nunc−Immunoplate)上の２つのウェルを５μｇ／ｍｌ  ｈＰＣＳＫ９  ３００μｌで各々４℃で一晩コーティングする。コーティングしたウェルをＰＢＳ  ３５０μｌで２回洗浄し、そしてマイクロプレートシェーカー上、５％  ＭＰＢＳ  ３５０μｌで室温で２時間遮断する。各パニングに関して、約１０１３  HuCAL GOLD(登録商標)ファージ−抗体を均等容量のＰＢＳＴ／５％ＭＰで、室温で２時間遮断する。コーティングしたウェルを遮断後ＰＢＳ  ３５０μｌで２回洗浄する。予め遮断されたHuCAL GOLD(登録商標)ファージ−抗体３００μｌを各コーティングウェルに添加し、そしてシェーカー上、室温で２時間インキュベートする。ＰＢＳ  ／０.０５％Tween３５０μｌを５回添加することにより洗浄を実施し、続いてＰＢＳでさらに４回洗浄する。ウェルあたり１０ｍＭ  Tris／ＨＣｌ(ｐＨ８)中、２０ｍＭ  ＤＴＴ  ３００μｌで１０分間、プレートからのファージの溶出を実施する。ＤＴＴファージ溶出液を大腸菌ＴＧ１  １４ｍｌに添加し、それを２ＹＴ培地中３７℃でＯＤ６０００.６−０.８まで成長させ、そしてファージ感染のために５０ｍｌプラスチック管中３７℃で４５分間振盪せずにインキュベートする。５０００ｒｐｍで１０分間遠心した後、細菌ペレットを各々２ｘＹＴ培地５００μｌに再懸濁し、２ｘＹＴ−ＣＧ寒天プレート上に蒔き、そして３０℃で一晩インキュベートする。次いでコロニーをプレートから掻き取り、そして前記で記載されたようにファージをレスキューし、そして増幅した。直接コーティングされたｈＰＣＳＫ９上の固相パニングの第２および第３ラウンドを第１ラウンドのプロトコールにしたがって実施するが、洗浄手順におけるストリンジェンシーは増大させる。
【０２０２】
第２パニングバリアントはビオチン化ヒトｈＰＣＳＫ９に対する溶液パニングである：溶液パニングのために、Dynabeads Ｍ−２８０(Dynal)に結合したビオチン化ｈＰＣＳＫ９を使用し、以下のプロトコールを適用する：１.５ｍｌエッペンドルフ管をＰＢＳ中１％ウシ血清アルブミン１.５ｍｌで、４℃で一晩遮断する。２００μｌストレプトアビジンコーティングした磁気Dynabeads Ｍ−２８０(Dynal)をＰＢＳ２００μｌで１回洗浄し、そして１倍Chemiblocker(１倍ＰＢＳで希釈)２００μｌに再懸濁する。予め遮断されたチューブ中でビーズの遮断を４℃で一晩実施する。各パニング条件に関してＰＢＳ５００μｌで希釈されたファージを２倍Chemiblocker／０.１％Tween５００μｌと室温で１時間混合する(ローテータ)。ファージの予備吸着を２回実施する：遮断されたストレプトアビジン磁気ビーズ５０μｌを遮断されたファージに添加し、そしてローテータ上で室温で３０分間インキュベートする。磁気装置(Dynal ＭＰＣ−Ｅ)によるビーズの分離の後、ファージ上澄(〜１ｍｌ)を新しい遮断されたチューブに移し、そして遮断されたビーズ５０μｌ上で予備吸着を３０分間繰り返した。次いで新しい遮断された１.５ｍｌチューブ中で２００ｎＭビオチン化ｈＰＣＳＫ９を遮断されたファージに添加し、そしてローテータ上で室温で１時間インキュベートする。遮断されたストレプトアビジン磁気ビーズ１００μｌを各パニングファージプールに添加し、そしてローテータ上、室温で１０分間インキュベートする。ビオチン化ｈＰＣＳＫ９に結合したファージを磁気ビーズに固定し、そして磁気粒子セパレーター(Dynal ＭＰＣ−Ｅ)を用いて収集する。次いでローテータを用いてビーズをＰＢＳ／０.０５％Tween中で７回洗浄し、続いてＰＢＳでさらに３回洗浄する。１０ｍＭ  Tris／ＨＣｌ(ｐＨ８)中２０ｍＭ  ＤＴＴ  ３００μｌを各チューブに１０分間添加して、Dynabeadsからのファージの溶出を実施する。磁気粒子セパレーターによりDynabeadsを除去し、そしてＯＤ６００ｎｍ０.６−０.８まで成長させた大腸菌ＴＧ−１培養１４ｍｌに上澄を添加する。次いでビーズをＰＢＳ  ２００μｌで1回洗浄し、そしてさらに除去されたファージと一緒に、ＰＢＳを大腸菌ＴＧ−１培養１４ｍｌに添加した。ファージ感染のために、培養を５０ｍｌプラスチック管中、振盪せずに３７℃で４５分間インキュベートする。５０００ｒｐｍで１０分間遠心した後、細菌ペレットを各々２ｘＹＴ培地５００μｌに再懸濁し、２ｘＹＴ−ＣＧ寒天プレート上に蒔き、そして３０℃で一晩インキュベートする。次いでコロニーをプレートから掻き取り、そしてファージをレスキューし、そして前記されたように増幅する。
【０２０３】
ビオチン化ｈＰＣＳＫ９に関する溶液パニングの第２および第３ラウンドを、第１ラウンドのプロトコールにしたがって実施するが、洗浄手順におけるストリンジェンシーは増大させる。
【０２０４】
可溶性Ｆａｂフラグメントのサブクローニングおよび発現
選択されたHuCAL GOLD(登録商標)ファージミドのＦａｂコード化インサートを発現ベクターpMORPH(登録商標)Ｘ９  Ｆａｂ  ＦＨにサブクローニングして可溶性Ｆａｂの迅速なおよび効率的な発現を促進する。この目的のために、選択されたクローンのプラスミドＤＮＡをＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、それによりＦａｂコード化インサート(ｏｍｐＡ−ＶＬＣＬおよびｐｈｏＡ−Ｆｄ)を切り取り、そしてＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩ消化された発現ベクターpMORPH(登録商標)Ｘ９  Ｆａｂ  ＦＨにクローン化する。このベクターから発現されたＦａｂは検出および精製双方のための２つのＣ末端タグ(各々ＦＬＡＧ(商標)および６ｘＨｉｓ)を担持する。
【０２０５】
大腸菌におけるHuCAL GOLD(登録商標)Ｆａｂ抗体のマイクロ発現(Microexpression)
pMORPH(登録商標)Ｘ９  Ｆａｂ  ＦＨ発現ベクターへの選択されたＦａｂのサブクローニングの後に得られたクロラムフェニコール抵抗性のシングルコロニーを用いて、ウェルあたり２ｘＹＴ−ＣＧ培地１００μｌを含有する滅菌９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルに接種し、そして３７℃で一晩成長させる。各大腸菌ＴＧ−１培養５μｌを、ウェルあたり３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールおよび０.１％グルコースを補充した２ｘＹＴ培地１００μｌで予め満たした未使用の滅菌９６ウェルマイクロタイタープレートに移す。培養物がＯＤ６００ｎｍ  〜０.５でわずかに濁るまで(〜２−４時間)、マイクロタイタープレートをマイクロプレートシェーカー上、４００ｒｐｍで振盪して３０℃でインキュベートする。
【０２０６】
これらの発現プレートにウェルあたり３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコーおよび３ｍＭ  ＩＰＴＧ(イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド)を補充した２ｘＹＴ培地２０μｌを添加し(最終濃度０.５ｍＭ  ＩＰＴＧ)、マイクロタイタープレートを気体透過性テープで密封し、そしてプレートを４００ｒｐｍで振盪して３０℃で一晩インキュベートする。
【０２０７】
全細胞ライゼート(ＢＥＬ抽出物)の作製：細菌細胞ペレットをドライアイス上で凍結し、そして次に１ｍｇ／ｍｌリゾチーム、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２およびベンゾナーゼを含有するＰＢＳ中に再懸濁し、そしてシェーカー上で１時間インキュベートした。１％(最終濃度)ＢＳＡの添加によりライゼートを遮断し、そして除去処理を経たライゼートを適切にコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに添加してＰＣＳＫ９に対する結合を評価した。ＢＥＬ抽出物をＥＬＩＳＡによる結合分析に使用した。
【０２０８】
酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)技術
ＰＢＳ中５μｇ／ｍｌヒト組換えｈＰＣＳＫ９を３８４ウェルMaxisorpプレート(Nunc−Immunoplate)に４℃で一晩コーティングする。コーティングの後、ウェルをＰＢＳ／０.０５％Tween(ＰＢＳ−Ｔ)で１回およびＰＢＳで２回洗浄する。次いでウェルを２％ＢＳＡを伴うＰＢＳ−Ｔで室温で２時間遮断する。並行してＢＥＬ抽出物１５μｌおよび２％ＢＳＡを伴うＰＢＳ−Ｔ  １５μｌを室温で２時間インキュベートする。遮断されたMaxisorpプレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、遮断されたＢＥＬ抽出物１０μｌをウェルに添加し、室温で１時間インキュベートする。一次Ｆａｂ抗体を検出するために、以下の二次抗体：アルカリ性ホスファターゼ(ＡＰ)抱合AffiniPure Ｆ(ａｂ’)２フラグメント、ヤギ抗ヒト、−抗マウスまたは−抗ヒツジＩｇＧ(Jackson Immuno Research)；を適用する。ＡＰ抱合体を検出するためにAttoPhos(Roche)のような蛍光発生基質を製造者による説明書にしたがって使用する。全てのインキュベーション工程の間で、マイクロタイタープレートのウェルをＰＢＳ−Ｔで３回、および二次抗体との最終インキュベーションの後３回洗浄する。Thermo Multiskanプレートリーダーを用いて蛍光を測定することができる。
【０２０９】
大腸菌におけるHuCAL GOLD(登録商標)Ｆａｂ抗体の発現および精製
ＴＧ−１細胞におけるpMORPH(登録商標)Ｘ９  Ｆａｂ  ＦＨによりコードされるＦａｂフラグメントの発現をシェーカーフラスコ培養中、３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを補充した２ｘＹＴ培地７５０ｍｌを用いて実施する。ＯＤ６００ｎｍが０.５に到達するまで培養物を３０℃で振盪する。０.７５ｍＭ  ＩＰＴＧの添加により、３０℃で２０時間、発現を誘起する。リゾチームを用いて細胞を破壊し、そしてＮｉ−ＮＴＡクロマトグラフィー(Qiagen, Hilden, Germany)によりＦａｂフラグメントを単離する。ＵＶ分光光度法によりタンパク質濃度を決定することができる(Krebs et al. J Immunol Methods 254:67-84(2001))。
【０２１０】
実施例２：ＬＣＤＲ３およびＨＣＤＲ２カセットの並行交換(parallel exchange)により選択された抗ＰＣＳＫ９  Ｆａｂの親和性成熟
親和性成熟のためのＦａｂライブラリーの作製
同定された抗ＰＣＳＫ９抗体の親和性および阻止活性を増大させるために、Ｆａｂクローンを親和性成熟に供する。この目的のために、トリヌクレオチド指定変異誘発(trinucleotide directed mutagenesis)を用いるカセット変異誘発によりＣＤＲ領域を最適化する(Virnekas et al. Nucleic Acids Res ２２：５６００−５６０７(１９９４))。
【０２１１】
以下のパラグラフは成熟ライブラリーのクローニングおよびＦａｂ最適化のために使用することができるプロトコールを簡単に記載する。発現ベクターpMORPH(登録商標)Ｘ９  Ｆａｂ  ＦＨからのＦａｂフラグメントをファージミドベクターpMORPH(登録商標)２５(米国特許第６７５３１３６号)にクローン化する。２つの異なる計画を並行して適用して親Ｆａｂの親和性および効率の双方を最適化する。
【０２１２】
６つの選択された成熟候補(「親」クローン)のうちのＬＣＤＲ３が個々の軽鎖ＣＤＲ３配列のレパートリーにより置き換えられたファージ抗体Ｆａｂライブラリーを作製する。並行して各親クローンのＨＣＤＲ２領域を個々の重鎖ＣＤＲ２配列のレパートリーにより置き換える。標準的なクローニング手順および多様化されたクローンのエレクトロコンピテント大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’細胞(Invitrogen)への形質転換により親和性成熟ライブラリーを作製する。Ｆａｂ提示ファージを実施例１に記載されるように調製する。各ライブラリーに対応する成熟プールを構築し、そして続く選択過程の間、別個に維持する。
【０２１３】
成熟パニング計画
４つの抗体プールを用いるパニングを溶液中のビオチン化組換えｈＰＣＳＫ９に関して、各々実施例１、ビオチン化ｈＰＣＳＫ９に対する溶液パニングにおいて記載されるように３ラウンド実施する。パニングラウンド毎のビオチン化抗原の低減により、洗浄工程の延長により、およびオフレート選択のための非ビオチン化抗原の添加により、選択ストリンジェンシーを増大させる。
【０２１４】
細菌ライゼート中のｈＰＣＳＫ９結合Ｆａｂを検出するための電気化学発光(BioVeris)基盤の結合分析
大腸菌ライゼート(ＢＥＬ抽出物)中で最適化されたＦａｂ抗体のｈＰＣＳＫ９に対する結合をBioVeris M−SERIES(登録商標)３８４(AnalyzerBioVeris, Europe, Witney, Oxforfshire, UK)で分析する。BioVerisスクリーニングにおいて使用するためにＢＥＬ抽出物をアッセイバッファー(ＰＢＳ／０.０５％Tween２０／０.５％ＢＳＡ)で希釈する。ビオチン化ｈＰＣＳＫ９をストレプトアビジンコーティングした常磁性ビーズに結合させ、BV−tag(商標)(BioVeris Europe, Witney, Oxfordshire, UK)を用いて抗ヒト(Ｆａｂ)’２(Dianova)をルテニウム標識した。この二次抗体をｈＰＣＳＫ９結合ビーズに添加した後、BioVeris M−SERIES(登録商標)３８４分析器で測定する。BioVerisスクリーニングからのヒットの配列分析を行い、Ｆａｂクローンを同定する。選択されたＦａｂ抗体をＩｇＧ１形式にサブクローニングする。
【０２１５】
溶液平衡滴定(Solution Equilibrium Titration(SET))を用いるピコモル濃度親和性の決定
ＫＤ決定のために、Ｆａｂの単量体分画(単量体含量少なくとも９０％、分析用ＳＥＣにより分析；Superdex７５、Amersham Pharmacia)を使用する。溶液中の電気化学発光(ＥＣＬ)基盤の親和性決定およびデータ評価を、本質的にHaenel et al.,(２００５)に記載されるように実施することができる。Ｆａｂの一定量を溶液中の異なる濃度の組換えｈＰＣＳＫ９(連続３ｎ希釈)で平衡にする。常磁性ビーズ(Ｍ−２８０ストレプトアビジン、Dynal)に結合したビオチン化ｈＰＣＳＫ９およびBV−tag(商標)(BioVeris Europe, Witney, Oxfordshire, UK)標識抗ヒト(Ｆａｂ)’２(Dianova)を添加し、そして混合物を３０分間インキュベートする。続いてM−SERIES(登録商標)３８４分析器(BioVeris Europe)を用いて未結合Ｆａｂの濃度をＥＣＬ検出により定量する。
【０２１６】
溶液中の別の種(例えばチンパンジーまたはカニクイザル)のＰＣＳＫ９に対する親和性の決定を本質的に前記で記載されたように行い、ヒトＰＣＳＫ９をチンパンジーまたはカニクイザルＰＣＳＫ９と置き換える。遊離のＦａｂを検出するために、常磁性ビーズに結合したビオチン化ｈＰＣＳＫ９を使用する。Haenel et al.(Anal Biochem 339:182-184(2005))にしたがって親和性を計算する。
【０２１７】
実施例３：ファージディスプレイによる抗ＰＣＳＫ９Ｆａｂの作製
以下のファージディスプレイ技術を用いて抗ＰＣＳＫ９  Ｆａｂを作製した。製造者のプロトコールを用いて、モル比２０：１のビオチン：ＰＣＳＫ９を用いて、精製されたヒトＰＣＳＫ９をＰＥＯ４ビオチン(Pierce、２１３２９)で標識した。低モル比により標識されているタンパク質の限定された修飾を確実にし、そしてＰＥＯ４リンカーの選択によりビオチン部分がタンパク質から分離され、そしてビオチン化タンパク質の全体的な親水性が強化される。ビオチン化ヒトＰＣＳＫ９を用いてDynal Ｍ２８０ストレプトアビジンビーズをコーティングし、そして標準的なパニング技術を用いてMorphosys Hucalライブラリーを３ラウンドパニングした。３ラウンド繰り返したパニングの後、プールされたラウンド３プラスミドＤＮＡを精製し、そして制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化した。アガロースゲル電気泳動によりプラスミドＤＮＡを分離し、そして２つの遺伝子セグメント(免疫グロブリン重鎖(ＶＨ／ＣＨ)および軽鎖(ＶＬ／ＣＬ))を含有する１.５ｋＢインサートを切り取り、そして精製した。この１.５ｋＢフラグメント(Ｆａｂインサート)をMorphosys発現ベクターｐＭＯＲＰＨＸ９  ＦＨにサブクローニングし、そしてエレクトロコンピテントＴＧ−１細胞に形質転換した。個々のコロニーを取り、そしてマスタープレートを調製した。マスタープレートから接種された娘プレートを低グルコース培地中で再成長させ、そしてＩＰＴＧの存在下で一晩培養することによりＦａｂ発現を誘起した。細胞ペレットを凍結し、リゾチームで溶解し、そしてニュートラアビジンコーティングしたウェル上にコーティングされたＰＥＯ−ビオチン化ＰＣＳＫ９でコーティングしたプレート上で除去処理を経たライゼートをＥＬＩＳＡにより評価した(陰性対照ニュートラアビジン単独)。マスタープレートを寒天プレートに画線し、そして再試験用に３つの別個のコロニーを取った後にＥＬＩＳＡ陽性を再試験した。ＰＣＳＫ９クローンからのプラスミドＤＮＡをまたＤＮＡシークエンシング用に調製した。独特なクローンからのＦａｂタンパク質を、ＩＰＴＧで誘起されたリッタースケールの培養物中で調製し、そして次にＩＭＡＣおよびサイズ排除クロマトグラフィーにより逐次的に精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥに連動したBradfordアッセイによりタンパク質濃度を決定した。
【０２１８】
実施例４：ＰＣＳＫ９競合ＥＬＩＳＡ
ＮＨＳ−ＰＥＯ４−ビオチン(Pierce、21329)で標識された、精製されたヒトＰＣＳＫ９を用いて、ニュートラアビジンコーティングしたNunc Maxisorpプレートをコーティングした。ＢＳＡでの非特異的結合の遮断に続いて、ＰＣＳＫ９コーティングしたウェルを最初に飽和濃度の抗ヒトＰＣＳＫ９  Ｆａｂ(陽性対照Ｆａｂ)またはバッファー単独と共にインキュベートした。陽性対照Ｆａｂ(またはバッファー単独)の結合に続いて、代替えの抗ヒトＰＣＳＫ９  Ｆａｂ(被験Ｆａｂ)をバッファー単独および抗ヒトＰＣＳＫ９  Ｆａｂ処理したウェルの双方に添加した。インキュベーションおよび洗浄工程の後、ペルオキシダーゼ抱合ヤギ抗ヒト軽鎖抗体と３,３’,５,５’−テトラメチルベンジジン(ＴＭＢ)基質とのカクテルを用いてプレート結合ヒトＰＣＳＫ９に結合した抗体フラグメントを検出した。ヒトＰＣＳＫ９上の類似の、または重複する結合部位に関して競合するＦａｂは、陽性対照Ｆａｂ単独と比較して、さらなる結合シグナル(すなわちヒトＰＣＳＫ９上の類似の、または重複する部位に関する結合競合)を誘発する。あるいは、陽性対照Ｆａｂとは独立して結合するＦａｂは、ＴＭＢ基質変換のレベルの増大により反映されるような結合シグナルの増大を呈する(すなわちヒトＰＣＳＫ９に対するＦａｂの非競合結合)。この計画を用いて、ヒトＰＣＳＫ９に対する互いの結合を遮断するメンバーの能力に基づいてＦａｂを群分けした。陽性対照としてのＨ１−抗ＰＣＳＫ９−Ｆａｂでの最初の特徴付けにより抗体を２群に分けた：Ｈ１により阻止される(第１群)またはＨ１により阻止されない(第２群)。さらなる結合競合実験により、各群内のＦａｂがその群のその他のメンバーの結合を阻止することが実証された。これらの研究から、Ｆａｂの第３の群(第３群)を第１群または第２群Ｆａｂのいずれかとの非競合により同定した。結合親和性、ｈＰＣＳＫ９／ＬＤＬ−Ｒを破壊する能力およびＨｅｐＧ２細胞に及ぼす影響に関して特徴付けするために抗ＰＣＳＫ９  Ｆａｂのうちのどれを決定するかのガイドとしてＦａｂ群分けを利用した。次いで実施例４にて説明されるように、ＤＸＭＳのような生物物理学的技術を用いて、インビトロでＨ１のような望ましい特性を有するＦａｂのヒトＰＣＳＫ９上の正確な結合部位をマッピングした。
【０２１９】
実施例５：抗ＰＣＳＫ９  Ｆａｂの機能分析
この実施例では、結合親和性、ｈＰＣＳＫ９／ＬＤＬ−Ｒを破壊する能力およびＨｅｐＧ２細胞に及ぼす影響を含むＨ１−抗ＰＣＳＫ９  Ｆａｂの機能的特性を試験した。
【０２２０】
１．結合親和性
Biacore結合アッセイをＴ１００装置において２５℃で実施した。ＨＢＳ−Ｐ＋Ｃａ(１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７.４、０.００５％Ｐ−２０、２ｍＭ  ＣａＣｌ２)をランニングバッファーとして使用した。固定のために、使用の直前にｈＰＣＳＫ９をｐＨ５.５酢酸塩バッファーに３０μｇ／ｍｌで希釈した。標準的なアミン結合プロトコールに従って、ｈＰＣＳＫ９約２００ＲＵ(レゾナンスユニット)をＣＭ５センサーチップ(Ｓシリーズ)上に固定した。Ｆａｂ溶液(０−２０ｎＭ、ランニングバッファーで希釈)をＰＣＳＫ９および参照表面(アミン結合ブランク)に流速３０μｌ／分で注射した。ＰＣＳＫ９表面を１ｍＭ  ＮａＯＨおよび１Ｍ  ＮａＣｌの６０秒間の注射で再生した。
【０２２１】
BIAevluationソフトウェアを用いて全データ分析を行った。結合曲線は補正済み二重参照であり、最初は参照細胞からの結合曲線で、続いてランニンバッファーのブランクからの結合曲線であった。次いでデータを１：１結合モデルで包括的に分析し、結合定数ＫＤ(ｎＭ)、会合(ｋａ、１／Ｍ秒)および解離速度定数(ｋｄ、１／秒)を導き出した。
Ｈ１−Ｆａｂはｋａ３.２３×１０５(１／Ｍ秒)、ｋｄ３.４１×１０−３(１／秒)およびＫＤ１.０５×１０−８Ｍを呈することが決定された(図３)。
【０２２２】
２.  Ｈ１−抗ＰＣＳＫ９  ＦａｂがｈＰＣＳＫ９／ＬＤＬ−Ｒを破壊する能力
ＰＣＳＫ９／ＬＤＬ−Ｒ  ＦＲＥＴ破壊アッセイを以下のとおりに実施して、Ｈ１−ＦａｂがｈＰＣＳＫ９／ＬＤＬ−Ｒ相互作用を破壊する能力を評価した。ＬＤＬ−Ｒ細胞外ドメイン(Ａｌａ２２−Ａｒｇ７８８)(R&D Systems)をユーロピウムクリプテート(ＬＤＬ−Ｒ−Ｅｕ)(Perkin Elmer)で標識し、そしてＰＣＳＫ９精製タンパク質をAlexa Fluor６４７(ＰＣＳＫ９−Alexa)(Invitrogen)で標識した。アッセイバッファーは２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ(ｐＨ７.０)、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、０.１％Tween２０および１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡからなる。ＦａｂをＰＣＳＫ９−Alexaと共に室温で３０分間プレインキュベートした後、ＬＤＬ−Ｒ−Ｅｕを添加した。ＰＣＳＫ９−ALexaおよびＬＤＬ−Ｒ−Ｅｕの最終濃度は各々８ｎＭおよび１ｎＭであった。２時間のインキュベーションの後、以下の設定のEnvision(Perkin Elmer)でプレートを読み取った：励起３３０ｎｍおよび発光６２０ｎｍおよび６６５ｎｍの双方、励起および読み取りとの間で１００マイクロ秒の遅延。６２０ｎｍでの読み取りに対する６６５ｎｍの読み取りの比率を正規化し、そして図４にて報告する。
図４Ａで示される通り、Ｈ１−ＦａｂはｈＰＣＳＫ９／ＬＤＬ−Ｒ相互作用を破壊した。
【０２２３】
３.  ＨｅｐＧ２細胞に及ぼす影響
フローサイトメトリーを用いてＬＤＬ取り込みを測定した。１０(容量／容量)％ウシ胎仔血清(ＦＢＳ)を伴うＤＭＥＭ中でＨｅｐＧ２細胞(ＡＴＣＣ)を維持した。ＰＣＳＫ９  Ａｂ処理の前夜に細胞を９６ウェルコラーゲンコーティングした９６−ウェルプレート(BD Biosciences)に播種した。２００ｎＭ  ＰＣＳＫ９タンパク質を抗ＰＣＳＫ９  Ｆａｂと共に指示された濃度で３０分間プレインキュベートした後、細胞に添加した。
３時間のＰＣＳＫ９およびＦａｂ処理の後、ｄｉｌ−ＬＤＬ(Intracel)を最終濃度５μｇ／ｍｌまで各ウェルに直接添加し、そして３７℃、５％ＣＯ２でさらに１時間インキュベートした。細胞をトリプシン処理し、収集し、そしてｄｉｌ−ＬＤＬ陽性細胞をフローサイトメトリー(ＬＳＲＩＩ、BD Biosciences)により測定した。FlowJo５.７.２ソフトウェアを用いて幾何平均を分析し、バッファー対照に正規化し、そして図４にて報告した。
【０２２４】
フローサイトメトリーを用いて表面ＬＤＬも測定した(図４Ｂ)。ＨｅｐＧ２細胞をトリプシン処理し、コラーゲンコーティングしたプレートに播種し、そして５％ＣＯ２を伴って３７℃で一晩インキュベートして、ＬＤＬ−Ｒ発現を回復させた。翌日にＰＣＳＫ９タンパク質およびＰＣＳＫ９  Ｆａｂを３０分間予備混合した後、細胞と共に４時間インキュベートした。Versene(Invitrogen)で細胞を収集し、そしてロバ血清(Jackson Immunoresearch Laboratories)で遮断した後、ウサギ抗ヒトＬＤＬ−Ｒポリクローナル抗体(Fitzgerald)で、および続いてＡＰＣ抱合ロバ抗ウサギＩｇＧ抗体(Jackson Immunoresearch Laboratories)で染色した。洗浄後、細胞を２％パラホルムアルデヒドで固定し、そしてＢＤ  ＬＳＲ−ＩＩサイトメーターにおいてフローサイトメトリー分析に供した。FlowJo５.７.２ソフトウェアを用いて幾何平均の代表値を計算し、そして図４にて報告した。
図に示される通り、Ｈ１−Ｆａｂは表面ＬＤＬ−Ｒレベル(図４Ｂ)の増大およびＨｅｐ２細胞によるＬＤＬ取り込みの増大に至った(図４Ｃ)。
【０２２５】
実施例６：エピトープマッピング
この実施例では、重水素交換質量分析(ＤＸＭＳ)を用いて、以下のとおりにＨ１−Ｆａｂにより認識される(複数の)エピトープを決定した。
【０２２６】
Ａ.  材料
タンパク質希釈剤(Ｈ２ＯまたはＤ２Ｏ)は１５０ｍＭ  ＮａＣｌを伴う２０ｍＭリン酸ナトリウム(ｐＨ７.３)であった。クエンチング溶液は０.５(容量／容量)％トリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)水溶液であった。全てのその他の化学物質をSigmaから購入し、そしてＨＰＬＣ用溶媒はFisher Scientificからであった。タンパク質：Ｆａｂインキュベーションを準備し、そして４℃で少なくとも２時間のインキュベートを可能にした。
【０２２７】
Ｂ.  溶液水素／重水素(Ｈ／Ｄ)交換
文献(Anal. Chem., 78:1005-1014(2006))に記載されたものと類似の設定および類似の様式で、自動Ｈ／Ｄ交換質量分析実験を実施した。要するに、LEAP Technologies Ｐａｌ  ＨＴＳ液体ハンドラー(LEAP Technologies、Carrboro, NC)を全ての液体処理操作に使用した。液体ハンドラーは製造者によりプログラムされたLEAPシェルに記載される自動化スクリプトにより制御された。２℃で維持された冷蔵機能付き容器にロボットを格納した。実験順序の開始の前に試料用のプレート、希釈剤およびクエンチ溶液を液体ハンドラートレイに充填した。６ポート注射用バルブおよび洗浄場所もまた液体ハンドラーレールに取り付け、そしてクロマトグラフィーシステムおよびシリンジ洗浄の各々への試料注射を促進にした。２つのさらなるバルブ、酵素カラム、逆相トラップカートリッジおよび分析用カラムからなるクロマトグラフィーシステムを所内で構築された別個のチャンバーに格納し、そしてペルティエスタックにより２℃で維持した。流体接続ならびに固定されたペプシン、逆相トラップカートリッジおよび分析用カラムのバルブへの取り付けを図５にて説明する。インラインタンパク質消化、ペプチド脱塩および逆相クロマトグラフィーを可能にするような方式でバルブおよびカラムを構成した後、試料をエレクトロスプレイイオン化(ＥＳＩ)ソースの質量分析に導入した。操作に必要とされる液体の流れは２つの別個のAgilent ＨＰＬＣシステム(Agilent 1100、Palo Alto, CA)により提供された。第１のＨＰＬＣポンプ(ローディングポンプ)は０.０５(容量／容量)％トリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)水溶液を１２５μｌ／分で分配した。ローディング相の間のバルブ位置を図５Ａにて説明する。この相では試料を試料ループから固定されたペプシンカートリッジ(２ｍｍ×２０ｍｍ、ＵＣＳＤのProf. Virgil Woodsから厚意により提供された)を経て逆相トラップカートリッジ(１ｍｍ×８ｍｍ、Michrom Bioresources Inc., Auburn, CA)へ移す。続いて第２のＨＰＬＣポンプ(グラジエントポンプ)が逆相トラップカートリッジおよび分析用カラムを経て補助バルブ３にグラジエントを分配するように補助バルブ２を切り替えた。固定された酵素カートリッジをこの位置で単離して廃棄した。補助バルブ３はトラップカートリッジに充填された試料の脱塩のために、プリセット時間の廃棄のために流れを迂回させるようにプログラムされた。脱塩期間の後、グラジエントポンプからの流れを質量分析器のイオンソースに到達させるようにバルブを切り替えた(トラップカートリッジおよび分析用カラムを通過した後、図５Ｃ)。グラジエントポンプは５５分間にわたって５０μｌ／分で０から４０％可動相Ｂのグラジエントを分配した(可動相Ａ＝０.２％ギ酸水溶液、Ｂ＝アセトニトリル中０.２％ギ酸)。
【０２２８】
Ｃ.  質量分析
液体クロマトグラフィーエレクトロスプレイイオン化タンデム質量分析(ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ)をＶモードで操作されるQTof Ultima Global(Waters, Milford, MA)で実施した。２つのデータ依存的ＭＳ／ＭＳスイッチング実験を実施して、オンラインタンパク質分解により作製されたペプチドの配列を同定する目的のために、タンデム質量スペクトルを収集した。重水素化レベル決定の目的のために実施された取得はＭＳのみであった(ｍ／ｚ４００−１５００にわたって５秒スキャン)。
【０２２９】
Ｄ.  補完的な水素／重水素(Ｈ／Ｄ)交換実験
タンパク質(ｈＰＣＳＫ９およびそのプロドメインＰＤ)をいくつかのオンおよびオフ交換条件に供し、予期された正味の結果は保護実験(以下に記載される)における対照に関する重水素化レベルの増大およびＤ２Ｏ中実験(以下に記載される)における対照に関する重水素化レベルの低減による任意の潜在的エピトープのマーキングであった。
重水素での標識は標識されたタンパク質の構造または機能を変化させないので、タンパク質上のアミド水素の重水素との交換である重水素化は、タンパク質の構造および機能の精査のための特に有用な手段である。重水素は水素の２倍の質量を有する水素の同位体であり、図６で星印により示す。これは新たな部分をタンパク質上の既存の官能基に結合させるその他の標識の方法とは全く対照的である。
【０２３０】
１.  保護実験
保護実験では、Ｄ２Ｏ中１５０ｍＭ  ＮａＣｌを伴う２０ｍＭリン酸ナトリウム(ｐＨ７.３)中でタンパク質を一晩インキュベートすることにより重水素化タンパク質溶液を調製した。対照実験では、重水素化タンパク質をＨ２Ｏで希釈し、様々な時間のオフ交換(例えば５分間)の後にクエンチ溶液を添加した。これに続いて前記したようなペプシンおよびＬＣＭＳでのオンライン消化を行った。重水素化タンパク質溶液を等モル量のＦａｂ溶液(非重水素化、図６の概略図の右欄を参照)で希釈し、そして１５分間インキュベートしてタンパク質(重水素化)：Ｆａｂ複合体を形成することによりタンパク質：Ｆａｂ複合体のオフ交換を実施した。複合体を形成した後、対照に関して以下に記載されるように試料を処理した。
【０２３１】
図６の左欄は保護実験のための実験順序を説明し、それは重水素化ＰＣＳＫ９で出発した。「重水素化」とは、重水素バッファー中数時間の間タンパク質をインキュベートすることにより、タンパク質のアミド水素が重水素で置き換えられていることを意味する。図６の左欄の第２列で説明されるように、重水素化ＰＣＳＫ９タンパク質上でのＦａｂのそのエピトープに対する結合は、エピトープの区域の周囲のＰＣＳＫ９の表面の一部を遮断するであろう。表面の遮断はまた水素／重水素交換を生じるのに重要である溶媒接触も低減させる。図６の左欄の第３列では、非重水素化バッファー中の重水素化ＰＣＳＫ９／Ｆａｂ複合体のインキュベーションの影響を説明する。
【０２３２】
図６で示される通り、Ｈ／Ｄ交換を自由に行うことができるので、ＰＣＳＫ９における重水素化レベルは溶媒接触区域において迅速に低減する。対照的に、表面を覆うＦａｂの遮断作用のために、エピトープの区域への溶媒接触の低減は、Ｈ／Ｄ交換を遅延させる。これは結果的にエピトープの区域における大部分の重水素化の防御に至る。
酵素でタンパク質Ｆａｂ複合体を小片に切断し、そして質量分析器でフラグメントの各々の重水素化レベルを測定することにより、タンパク質配列に沿って重水素化のレベルの増大(エピトープのマーキング)を位置決定することが可能である。重水素は水素よりも重いので、重水素化の結果である質量変化のためにこれが可能である。フラグメントから収集された情報を一緒にまとめることにより、タンパク質配列全体にわたる重水素の分布を導き出すことが可能になる。
【０２３３】
２.  対照
タンパク質構造および結果的に溶媒接触の可能性における変動、ならびに異なるアミノ酸間で形成されたアミド結合に関して観察されるＨ／Ｄ交換速度における差異のために、タンパク質配列全体にわたって重水素化レベルが大きく異なるので、エピトープの存在時の保護実験(図６の左欄により記載される)にて観察された重水素化レベル上昇から単純に結論付けることは不可能である。幸い、重水素化レベルの天然の変動は差次的実験において相殺される。差次的実験はＦａｂの存在下および不在下(対照実験、図６の中央の欄)での重水素化レベルの測定ならびに重水素化における差異の計算からなる。重水素化レベルにおける観察された差異は純粋にＦａｂの影響に起因し、そして大きな値はエピトープの存在および位置の指標であろう。
【０２３４】
３.  Ｄ２Ｏ中実験
図６の右欄で説明されるさらに補完的な差次的実験(すなわちＤ２Ｏ中実験)を実施し、そして左欄の実験に関して提出されたものに類似する推論を用いて予期される結果を推定することができる。主要な差異は、右欄の実験に関して重水素化において観察された差異は左欄のものと符号が逆であるはずであるということであり、そしてそれ故に潜在的なエピトープの存在および位置に関する補完的な証拠ならびにお互いに対する結果の検証を提供する。
【０２３５】
典型的なＤ２Ｏ中実験では(図６の概略図の中央および右欄を参照)、タンパク質(対照)あるいはタンパク質：Ｆａｂ複合体をＤ２Ｏバッファーで希釈する。一定期間のオン交換の後、混合物をさらにＨ２Ｏバッファーで希釈してオフ交換を引き起こし、そして最後にクエンチバッファーでクエンチする。一度混合すると、クエンチされた溶液を完全に自動的にタンパク質分解し、分離し、そして前記されたようにＬＣＭＳにより分析する。種々のＤ２Ｏインキュベーション期間(例えば４５秒間)を実験で用いて対照(タンパク質のみ)とタンパク質：Ｆａｂ試料との間の重水素化における観察される差異を最適化した。試料と対照との間の重水素化における代表値変化を試料および対照の重水素取り込みレベル間の差異として計算し、ここで重水素取り込みレベルを以下のデータ処理の下で記載されるように決定した。
【０２３６】
Ｅ.  データ処理
タンデムＭＳ取得をMassLynx(Waters、Milford, MA)を用いてピークリストまで低減させ、そしてMascot(Matrix Sciences、London, UK)を用いてタンパク質配列に対して検索した。データベース検索により戻された推定ペプチド配列同定の一覧を手作業で検証した。MassLynxを用いて検証された前駆体イオン質量の単一イオンクロマトグラムを作製した。各前駆体の同位体分布の質量スペクトルをクロマトグラフのピーク全体にわたって合計し、重水素取り込みのレベルを決定するために平滑化し、そして中心に置いた。重水素取り込みレベルをタンパク質配列の各残基に割り当てるために、以下の手順に従った。残基を、それを覆うペプチドの正規化された重水素取り込みに割り当てた。１を超えるペプチドが同一残基を覆う場合、その残基を覆う全てのペプチドの正規化された重水素取り込みの代表値を用いた。観察された重水素化レベルをそのペプチドにおけるアミノ酸の数により除することにより、各ペプチドに関する正規化された重水素取り込みを計算した。
【０２３７】
Ｆ.  結果
ＰＣＳＫ９およびｈＰＣＳＫ９：Ｈ１−Ｆａｂ複合体に関して実施された保護およびＤ２Ｏ中実験に関して重水素化において観察された代表値変化を、ｈＰＣＳＫ９(プロドメインを含む、システインリッチドメインは実験に含まれなかったので、それを除外する)の残基数の関数として図７に示す。潜在的なエピトープの予期される挙動を示す領域のアミノ酸配列もまた図７に示す。
【０２３８】
図７Ａは保護実験に関する重水素化における変化を示す。重水素化における変化を、図６(左欄、存在するＦａｂを伴う)およびその対照(中央欄、Ｆａｂなし)にて説明される実験の重水素化レベル間の差異として定義する。ＰＣＳＫ９配列(プロドメインで出発し、そしてシステインリッチドメインを除外する)のアミノ酸残基４０から４２０に関する残基数で割って、残基あたり質量シフトの代表値として重水素化における変化をプロットする。重水素化における変化に関する高値(残基あたりの陽性質量シフトとして示される)はエピトープの指標である。残基１２３−１３２(プロットで注釈を付けられた配列)はこの点で卓越し、そしてそれ故にエピトープの全てまたは一部を覆うと考えられる。
【０２３９】
Ｄ２Ｏ中実験(図６の右欄にて説明)からの補完的なデータを図７Ａにおいてプロットする。図７にて描かれる２つのプロットの比較により、アミノ酸残基１２３−１３２ＬＶＫＭＳＧＤＬＬＥのストレッチが実験設計から予期されるようなエピトープに関する重水素化レベルの予測された変化を示すこが表される(図６)。ｈＰＣＳＫ９結晶構造(図８参照)における領域１２３−１３２(ＬＶＫＭＳＧＤＬＬＥ)はらせんおよびループの一部を覆い、そしてそれは高度に接近可能であるので、潜在的エピトープとして物理的に意味がある。
【０２４０】
図７において示されるデータから即座に明らかでないのは残基１０１−１０７(ＱＡＡＲＲＧＹ)にわたる第２領域であり(図８参照)、それは潜在的エピトープに特徴的である図７の重水素化レベルにおける予期される補完的な挙動も示すより大きな領域の小区域である。一次配列上に観察されたペプチドの重水素化から一次配列に重水素化レベルにおける変化を戻してマッピングするために使用された方法は強い平滑化効果を有し、測定において観察される変動がかなり大きいので、それは望ましい。
【０２４１】
一方、重水素化レベルの非局在化により、図７においてプロットされたようなデータからのエピトープにおける残基１０１−１０７により覆われる領域の参加の可能性を検出することが困難になる。しかも大きな領域を覆うことが観察されたペプチドの詳細な検査により、大部分の観察された交換がさらに短い領域１０１−１０７に起因すると考えることが可能になる。
【０２４２】
さらにこのより短い領域が空間的に領域１２３−１３２の直ぐ右に位置する結晶構造では、それにより双方のストレッチがｈＰＣＳＫ９上のＨ１−Ｆａｂの非直線エピトープを形成することが示唆される。重要なことには、図７のデータにより関係する２つのアミノ酸ストレッチはＨ１−Ｆａｂに関する非直線エピトープを形成し、それはｈＰＣＳＫ９の抗原性エピトープに関する予想される配列番号２および３アミノ酸配列と相関する(表２)。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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