(57)【要約】本発明は、哺乳動物における早期段階肝細胞癌または肝細胞癌の等級の変化を検出するための方法およびキットを提供する。診断マーカーは、血清などの体液中に存在する診断炭水化物のプロファイリングおよび同定に基づいている。
2010529470.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における早期段階肝細胞癌または肝細胞癌の等級の変化を検出する方法であって、ａ）哺乳動物からの血清または血漿のサンプルを得、ｂ）該サンプルにおいて、ブランチα（１，３）−フコシル化グリカンとバイセクティングＧｌｃＮａｃコアα（１，６）−フコシル化グリカンの比を測定し、そしてｃ）該比を、該哺乳動物における早期段階肝細胞癌の存在に帰することを含む方法。
【請求項２】
哺乳動物が、ヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
哺乳動物の身体の条件、例えば臨床パラメーターの定量的または定性的評価を測定することを更に含む、請求項１および２に記載の方法。
【請求項４】
前記臨床パラメーターが、血清または血液中のα−フェトプロテインの濃度の測定である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４に記載の方法を行うための、早期段階肝細胞癌または肝細胞癌の等級の変化を検出するための診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、哺乳動物における早期段階肝細胞癌(hepatocellular carcinoma)または肝細胞癌の等級の変化を検出するための方法およびキットを提供する。診断マーカーは、血清などの体液に存在する診断炭水化物のプロファイリングおよび同定に基づいている。
【０００２】
発明の背景
肝細胞癌（ＨＣＣ）または肝臓癌は、最も普通の癌の１つであり、そして世界的に死亡主な原因の１つである（１）。ＨＣＣは、最も普通には、肝炎Ｂウイルス（ＨＢＶ）または肝炎Ｃウイルス（ＨＣＶ）（２，３）による感染の後硬変した肝臓において生じる。実際、肝硬変は、死亡の重要な原因でありそしてＨＣＣの発生のための主要な危険因子であり、そしてＨＣＣの６０〜８０％は、肝硬変により先行されている（４）。したがって、早期段階ＨＣＣについて硬変母集団をスクリーニングすることは、死亡率を減少させることができる。種々のイメージング技術、例えば、超音波検査法、コンピュータ断層撮影法走査および磁気共鳴イメージング（５，６）が、ＨＣＣを診断するのに使用される。しかしながら、これらの技術は、良性の肝臓病巣、例えば、異形成結節(dysplastic nodules)および硬変マクロ結節(cirrhotic macronodules)をＨＣＣから区別することができない。長い間、血清腫瘍マーカーは、悪性腫瘍を検出するための有効な方法として使用され（７〜９）、そしてそれらは、ＨＣＣの診断における超音波検査およびコンピューター断層撮影法に対する価値ある補足手段であることができる（１０−１２）。血清ＡＦＰ（α−フェトプロテイン）は、ＨＣＣの診断および追跡のために広く使用される唯一の血清マーカーである（１３，１４）。最近のメタアナリシスは、ＡＦＰの感度(sensitivity)および特異度(specificity)は広く変わることおよびこれらの変動は使用される異なるカットオフレベルの閾値効果(threshold effect)に完全に帰することができないことを示した（１５）。他の改良された血清学的マーカーは、単独で使用されようと他のものと一緒に使用されようと、ＨＣＣの早期検出のために必要である。最も多くの血清Ｎ−結合糖タンパク質は、肝臓およびＢリンパ球により合成される。血清トータルＮ−グリカンの任意の変化は、肝臓またはＢリンパ球生理学の変化を反映することができる。糖タンパク質の糖鎖は、多細胞生物における分化した細胞の秩序ある「社会的挙動」を維持するために重要であるので、糖鎖の変化は腫瘍細胞の周囲の組織への浸潤および腫瘍細胞の転移などの異常の分子的基礎に寄与する。Ｎ−結合糖鎖の変化は、実際に種々の腫瘍で見出される（６，１６−１８）。最近まで、診断におけるグリコミクスの使用は、適切な分析技術の欠如により限定されてきたが、少なくとも血清Ｎ−グリコームの場合には、これは克服された（１９，２０）。本発明において、本発明者等は、肝炎Ｂウイルスにより誘発された硬変を有する患者における肝細胞癌（ＨＣＣ）の診断用のツールとして血清Ｎ−グリカンフィンガープリンティングの使用を評価した。特に本発明者等は、ブランチα（１，３）−フコシル化グリカン(branch alpha(1,3)-fucosylated glycans)が、硬変患者、線維症患者および健康な血液ドナーにおけるよりもＨＣＣ患者において多量であるが、これに対してバイセクティングＧｌｃＮａｃ（Ｎ−アセチルグルコサミン）−コアα（１，６）−フコシル化グリカン(bisecting GlcNac (N-acetylglucosamine)-core alpha (1,6)-fucosylated glycans)は、硬変患者において上昇していることを見出した。これらの２つのグリカン形態の濃度およびその対数比（ＧｌｙｃｏＨＣＣＴｅｓｔと新たに命名された）は、肝臓癌の腫瘍段階と関連していた。
【図面の簡単な説明】
【０００３】
【図１】上部パネルは糖質量参照としてのマルトオリゴ糖を示す。これらの構造におけるグルコース単位の数（ＤＰ、重合度）が示される。トータル血清タンパク質からの典型的な脱シアリル化Ｎ−グリカンプロフィルは、下部パネルに示される。Ｎ−グリカンピークの構造はパネルの下に示される。  ピーク１は、アガラクト，コア−α−１，６−フコシル化バイアンテナリーグリカン(agalacto, core-α-1,6-fucosylated biantennary glycan)（ＮＧＡ２Ｆ）であり、ピーク２は、アガラクト，コア−α−１，６−フコシル化バイセクティングバイアンテナリー（ＮＧＡ２ＦＢ）、ピーク３およびピーク４はシングルアガラクト，コア−α−１，６−フコシル化バイアンテナリー（ＮＧ１Ａ２Ｆ）であり、ピーク５は、ビガラクト，バイアンテナリーグリカン（ＮＡ２）であり、ピーク６は、ビガラクト，コア−α−１，６−フコシル化バイアンテナリー（ＮＡ２Ｆ）であり、ピーク７は、ビガラクト，コア−α−１，６−フコシル化バイセクティングバイアンテナリー（ＮＡ２ＦＢ）であり、ピーク８はトリアンテナリー(tri-antennary)（ＮＡ3）であり、ピーク９はブランチングα−１，３−フコシル化トリアンテナリー(branching α-1,3-fucosylated tri-antennary（ＮＡ３Ｆｂ）であり、ピーク１０は、コア−α−１，６−フコシル化トリアンテナリー（ＮＡ３Ｆｃ）であり、ピーク１１は、テトラガラクト，テトラアンテナリー（ＮＡ４）であり、そしてピーク１２は、ブランチングα−１，３−フコシル化テトラアンテナリー（ＮＡ４Ｆｂ）である。構造式で使用された記号は：■  β−結合Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）；↓  β−結合ガラクトース；
【数１】
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α−１，３／６−結合フコース；●  α／β−結合マンノース、である。
【図２Ａ】硬変患者におけるＨＣＣの検出のための誘導された診断変数の傾向。鉛直軸は、ピーク９、ピーク７およびＧｌｙｃｏＨＣＣＴｅｓｔのグリカン値を表す。ピーク９のグリカン値はＨＣＣ患者において増加したが（Ａ）、これに対してピーク７は、硬変患者において増加した（Ｂ）。ＧｌｙｃｏＨＣＣＴｅｓｔは、硬変、線維症およびコントロール群におけるよりもＨＣＣ群において有意に高かった（Ｃ）。誤差バーは、平均に対する９５％信頼区間を表す。
【図２Ｂ】硬変患者におけるＨＣＣの検出のための誘導された診断変数の傾向。鉛直軸は、ピーク９、ピーク７およびＧｌｙｃｏＨＣＣＴｅｓｔのグリカン値を表す。ピーク９のグリカン値はＨＣＣ患者において増加したが（Ａ）、これに対してピーク７は、硬変患者において増加した（Ｂ）。ＧｌｙｃｏＨＣＣＴｅｓｔは、硬変、線維症およびコントロール群におけるよりもＨＣＣ群において有意に高かった（Ｃ）。誤差バーは、平均に対する９５％信頼区間を表す。
【図２Ｃ】硬変患者におけるＨＣＣの検出のための誘導された診断変数の傾向。鉛直軸は、ピーク９、ピーク７およびＧｌｙｃｏＨＣＣＴｅｓｔのグリカン値を表す。ピーク９のグリカン値はＨＣＣ患者において増加したが（Ａ）、これに対してピーク７は、硬変患者において増加した（Ｂ）。ＧｌｙｃｏＨＣＣＴｅｓｔは、硬変、線維症およびコントロール群におけるよりもＨＣＣ群において有意に高かった（Ｃ）。誤差バーは、平均に対する９５％信頼区間を表す。
【図２Ｄ】硬変患者におけるＨＣＣの検出のための誘導された診断変数の傾向。鉛直軸は、ピーク９、ピーク７およびＧｌｙｃｏＨＣＣＴｅｓｔのグリカン値を表す。ピーク９のグリカン値はＨＣＣ患者において増加したが（Ａ）、これに対してピーク７は、硬変患者において増加した（Ｂ）。ＧｌｙｃｏＨＣＣＴｅｓｔは、硬変、線維症およびコントロール群におけるよりもＨＣＣ群において有意に高かった（Ｃ）。誤差バーは、平均に対する９５％信頼区間を表す。
【図２Ｅ】硬変患者におけるＨＣＣの検出のための誘導された診断変数の傾向。鉛直軸は、ピーク９、ピーク７およびＧｌｙｃｏＨＣＣＴｅｓｔのグリカン値を表す。ピーク９のグリカン値はＨＣＣ患者において増加したが（Ａ）、これに対してピーク７は、硬変患者において増加した（Ｂ）。ＧｌｙｃｏＨＣＣＴｅｓｔは、硬変、線維症およびコントロール群におけるよりもＨＣＣ群において有意に高かった（Ｃ）。誤差バーは、平均に対する９５％信頼区間を表す。
【図３】ＧｌｙｃｏＨＣＣＴｅｓｔおよびＡＦＰの値を使用して硬変群におけるＨＣＣを検出するための臨床的に有意な予測のための受信者作動特性（ＲＯＣ）曲線。曲線下の面積（ＡＵＣ）は、ＧｌｙｃｏＨＣＣＴｅｓｔの診断力（０．８１±０．０３）がＡＦＰ（０．７８±０．０３）に似ていることを示す。
【図４】腫瘍段階とグリカン値、ＡＦＴ、ＧＧＴ、およびＡＳＴ／ＡＬＴ比との関係。明白な腫瘍段階を有する９８人のＨＣＣ患者を分析した。ピーク９、ＧｌｙｃｏＨＣＣＴｅｓｔ、ＡＦＰおよびＧＧＴのレベルは硬変群と比較してＨＣＣ群において有意に増加したが、これに対して、ピーク７およびＡＳＴ／ＡＬＴ比は有意に減少した。ピーク９、ＧｌｙｃｏＨＣＣＴｅｓｔ、ＡＦＰおよびＧＧＴは、腫瘍段階との正の関連を示したが、これに対してピーク７は負の関連を有していた。腫瘍段階とＡＳＡＴ／ＡＬＴ比の相関は見出されなかった。鉛直軸はピーク９（Ａ）およびピーク７（Ｂ）、ＧｌｙｃｏＨＣＣＴｅｓｔ（Ｃ）、ＡＦＰレベル（Ｄ）、ＧＧＴレベル（Ｅ）およびＡＳＴ／ＡＬＴ比（Ｆ）のピーク高さを表す。誤差バーは、平均に対する９５％信頼区間を表す。
【図５】肝臓繊維症とＧｌｙｃｏＨＣＣＴｅｓｔマーカーの相関。線維症段階に対してプロットされたＧｌｙｃｏＨＣＣＴｅｓｔ値を、Scheuerスコアリングシステムを使用して評価した。ＧｌｙｃｏＨＣＣＴｅｓｔと線維症段階との間に統計的に有意な相関はなかった。上部適合線および下部適合線は、平均値（中間適合線）に対する９５％信頼区間を表す。
【図６】ピーク９（ｂ）および９’（ａ）のエキソグリコシダーゼシーケンシング。ＮＰ−ＨＰＬＣを使用してトータル血清Ｎ−グリカンを分離しそして単離された画分を示されたとおりの単一または組み合わせたエキソグリコシダーゼアレーで処理した。ピークは図１のとおりに番号付けされた。ｇａｌ＝ガラクトース；ｆｕｃ＝フコース；ｈｅｘ＝Ｎ−アセチルグルコサミン。
【図７】トータル血清Ｎ−グリカンのエキソグリコシダーゼ処理。トータル血清Ｎ−グリカンをα−１，３／４−フコシダーゼで処理して、ピーク９および１２が、ＧｌｙｃｏＨＣＣＴｅｓｔで定量されたこれらであることを示す。この酵素は、これらの構造を、それぞれ、ピーク８および１１に転換するが、これに対してそれらの異性体構造９’および１２’は変わらないままである。ピークは、図１におけると同じく番号付けされた。ｇａｌ＝ガラクトース；ｆｕｃ＝フコース；ｈｅｘ＝Ｎ−アセチルグルコサミン。
【図８】グリカントランスフェラーゼにより触媒される反応のスキーム。ＨＣＣを有する硬変患者における増加した濃度のＮＡ３Ｆｂ（ピーク９）および減少したレベルのＮＡ２ＦＢ（ピーク７）は、基質についてＧｎＴ−ＩＩＩと競合するＧｎＴ−Ｖの増加した活性およびその結果Ｎ−グリカンのβ−１，６ブランチングを生じることにより説明されうる。これは、ルイスＸグリカンを生じるα−１，３−Ｆｕｔの高められた発現をもたらす。ＧｌｃＮＡｃＴ−ＩＩＩの増加した発現の結果も示される。点線ボックスはルイス構造の例を示す。
【図９】硬変患者におけるＨＣＣの診断のためのＧｌｙｃｏＨＣＣＴｅｓｔとＬｏｇＡＦＰの関係。８０人の硬変患者に対してプロットされた２２７人のＨＣＣ患者は、ＬｏｇＡＦＰに対してプロットされたＧｌｙｃｏＨＣＣＴｅｓｔを使用して分析された。２つの鉛直線は、１ng/mlおよび４００ng/mlにおけるＡＦＰカットオフ線を表し、そして１つの鉛直線はＡＦＰのグレーゾーン（１〜４００ng/ml）において−０．３４におげるＧｌｙｃｏＨＣＣＴｅｓｔのＲＯＣで決定されたカットオフ値を表す。ＡＦＰが検出できなかったならば、本発明者等はそれに０．００１ng/mlの値を割り当てた。
【図１０】ＧｌｙｃｏＨＣＣＴｅｓｔおよびＡＦＰの値を使用してＡＦＰグレーゾーン（１〜４００ng/ml）におけるＨＣＣの検出のための臨床的有意性の予測のための受信者作動特性（ＲＯＣ）曲線。ＧｌｙｃｏＨＣＣＴｅｓｔは、ＡＦＰグレーゾーンにおける硬変患者からＨＣＣ患者を８３±３％の正確度で区別することができる。グリカンマーカーの診断力は、同じ患者群においてより低い診断正確度（５３±３％）を有する普通に使用されるＡＦＰマーカーよりもはるかに高い。
【図１１Ａ】腫瘍段階と、ＡＦＰと組み合わせたグリカン値との関係。明白な腫瘍段階を有する４４人のＨＣＣ患者およびＡＦＰグレーゾーン（１〜４００ng/ml）における５４人の硬変を分析した。ピーク９単独およびＧｌｙｃｏＨＣＣＴｅｓｔは腫瘍段階との正の関連を示したが、これに対してピーク７単独は負の関連を示した。腫瘍段階とＡＦＰ値との相関は見出されなかった。鉛直軸は、ピーク９（Ａ）およびピーク７（Ｂ）、ＧｌｙｃｏＨＣＣＴｅｓｔ（Ｃ）、ＡＦＰレベル（Ｄ）、バイセクティングＧｌｃＮａｃ（ピーク２＋ピーク７）（Ｅ）およびピーク９とＧｌｃＮａｃバイセクティングのｌｏｇ比（Ｆ）のピーク高さを示す。誤差バーは、平均に対する９５％信頼区間を表す。
【図１１Ｂ】腫瘍段階と、ＡＦＰと組み合わせたグリカン値との関係。明白な腫瘍段階を有する４４人のＨＣＣ患者およびＡＦＰグレーゾーン（１〜４００ng/ml）における５４人の硬変を分析した。ピーク９単独およびＧｌｙｃｏＨＣＣＴｅｓｔは腫瘍段階との正の関連を示したが、これに対してピーク７単独は負の関連を示した。腫瘍段階とＡＦＰ値との相関は見出されなかった。鉛直軸は、ピーク９（Ａ）およびピーク７（Ｂ）、ＧｌｙｃｏＨＣＣＴｅｓｔ（Ｃ）、ＡＦＰレベル（Ｄ）、バイセクティングＧｌｃＮａｃ（ピーク２＋ピーク７）（Ｅ）およびピーク９とＧｌｃＮａｃバイセクティングのｌｏｇ比（Ｆ）のピーク高さを示す。誤差バーは、平均に対する９５％信頼区間を表す。
【図１１Ｃ】腫瘍段階と、ＡＦＰと組み合わせたグリカン値との関係。明白な腫瘍段階を有する４４人のＨＣＣ患者およびＡＦＰグレーゾーン（１〜４００ng/ml）における５４人の硬変を分析した。ピーク９単独およびＧｌｙｃｏＨＣＣＴｅｓｔは腫瘍段階との正の関連を示したが、これに対してピーク７単独は負の関連を示した。腫瘍段階とＡＦＰ値との相関は見出されなかった。鉛直軸は、ピーク９（Ａ）およびピーク７（Ｂ）、ＧｌｙｃｏＨＣＣＴｅｓｔ（Ｃ）、ＡＦＰレベル（Ｄ）、バイセクティングＧｌｃＮａｃ（ピーク２＋ピーク７）（Ｅ）およびピーク９とＧｌｃＮａｃバイセクティングのｌｏｇ比（Ｆ）のピーク高さを示す。誤差バーは、平均に対する９５％信頼区間を表す。
【図１１Ｄ】腫瘍段階と、ＡＦＰと組み合わせたグリカン値との関係。明白な腫瘍段階を有する４４人のＨＣＣ患者およびＡＦＰグレーゾーン（１〜４００ng/ml）における５４人の硬変を分析した。ピーク９単独およびＧｌｙｃｏＨＣＣＴｅｓｔは腫瘍段階との正の関連を示したが、これに対してピーク７単独は負の関連を示した。腫瘍段階とＡＦＰ値との相関は見出されなかった。鉛直軸は、ピーク９（Ａ）およびピーク７（Ｂ）、ＧｌｙｃｏＨＣＣＴｅｓｔ（Ｃ）、ＡＦＰレベル（Ｄ）、バイセクティングＧｌｃＮａｃ（ピーク２＋ピーク７）（Ｅ）およびピーク９とＧｌｃＮａｃバイセクティングのｌｏｇ比（Ｆ）のピーク高さを示す。誤差バーは、平均に対する９５％信頼区間を表す。
【図１１Ｅ】腫瘍段階と、ＡＦＰと組み合わせたグリカン値との関係。明白な腫瘍段階を有する４４人のＨＣＣ患者およびＡＦＰグレーゾーン（１〜４００ng/ml）における５４人の硬変を分析した。ピーク９単独およびＧｌｙｃｏＨＣＣＴｅｓｔは腫瘍段階との正の関連を示したが、これに対してピーク７単独は負の関連を示した。腫瘍段階とＡＦＰ値との相関は見出されなかった。鉛直軸は、ピーク９（Ａ）およびピーク７（Ｂ）、ＧｌｙｃｏＨＣＣＴｅｓｔ（Ｃ）、ＡＦＰレベル（Ｄ）、バイセクティングＧｌｃＮａｃ（ピーク２＋ピーク７）（Ｅ）およびピーク９とＧｌｃＮａｃバイセクティングのｌｏｇ比（Ｆ）のピーク高さを示す。誤差バーは、平均に対する９５％信頼区間を表す。
【図１１Ｆ】腫瘍段階と、ＡＦＰと組み合わせたグリカン値との関係。明白な腫瘍段階を有する４４人のＨＣＣ患者およびＡＦＰグレーゾーン（１〜４００ng/ml）における５４人の硬変を分析した。ピーク９単独およびＧｌｙｃｏＨＣＣＴｅｓｔは腫瘍段階との正の関連を示したが、これに対してピーク７単独は負の関連を示した。腫瘍段階とＡＦＰ値との相関は見出されなかった。鉛直軸は、ピーク９（Ａ）およびピーク７（Ｂ）、ＧｌｙｃｏＨＣＣＴｅｓｔ（Ｃ）、ＡＦＰレベル（Ｄ）、バイセクティングＧｌｃＮａｃ（ピーク２＋ピーク７）（Ｅ）およびピーク９とＧｌｃＮａｃバイセクティングのｌｏｇ比（Ｆ）のピーク高さを示す。誤差バーは、平均に対する９５％信頼区間を表す。
【０００４】
発明の目的および詳細な説明
肝臓生検は患者に対する有意な不快感および合併症のいくらかの危険を伴う手法であるので、慢性肝臓疾患患者のルーチンな（一般に年一度の）追跡においてそれを導入することは適当ではない。したがって、肝臓疾患の進行をルーチンに評価することができ、そして早期段階肝細胞癌を信頼可能に検出することができるマーカーに対する臨床的要求がある。本発明において、本発明者等は、この要求を満足させそして早期段階肝細胞癌を検出することができる診断を開発した。「早期段階」は、肝細胞癌のＴ１またはＴ２段階（材料および方法の節で本明細書においてさらに説明されるとおり）を指す。本発明において、本発明者等は、血清中に存在する糖タンパク質に由来する炭水化物構造間の比を同定し、そしてこれらのパラメーターに由来する定量的パラメーターと研究下の患者の組織学的早期肝細胞癌段階との統計的に適切な相関を同定した。換言すれば、診断炭水化物の量または該炭水化物間の相対的量が、驚くべきことに、肝細胞癌の早期段階と相関していることが本発明において同定された。
【０００５】
第１の態様においては、本発明は、哺乳動物における早期段階肝細胞癌または肝細胞癌の等級の変化を検出する方法であって、ａ）哺乳動物からの血清または血漿のサンプルを得、ｂ）該サンプルにおいてブランチα（１，３）−フコシル化グリカンとバイセクティングＧｌｃＮａｃコアα（１，６）−フコシル化グリカンとの比を測定し、そしてｃ）該比を該哺乳動物における早期段階肝細胞癌の存在に帰することを含む方法を提供する。
【０００６】
更なる態様においては、本発明は、哺乳動物における早期段階肝細胞癌または肝細胞癌の等級の変化を検出する方法であって、哺乳動物からの血清または血漿のサンプルを得、該サンプルは血清または血液Ｎ−結合糖タンパク質のトータル混合物を表し、ｂ）Ｎ−結合炭水化物もしくはそれに由来するフラグメント、または該Ｎ−結合炭水化物もしくは該Ｎ−結合炭水化物フラグメントの標識された誘導体、または該Ｎ−結合炭水化物もしくは該Ｎ−結合炭水化物フラグメントの構造により決定される該Ｎ−結合炭水化物もしくは該Ｎ−結合炭水化物フラグメントの特徴の第１プロフィルを発生させ；該Ｎ−結合炭水化物もしくは該Ｎ−結合炭水化物フラグメントは血清または血漿サンプル中に存在する血清もしくは血漿タンパク質のトータル混合物から得られ、該第１プロフィルは、該サンプル中の血清もしくは血漿タンパク質のトータル混合物のＮ−結合炭水化物部分の相違(diversity)および濃度を表わし、ｃ）該第１プロフィルにおいてブランチα（１，３）−フコシル化グリカンとバイセクティングＧｌｃＮａｃコアα（１，６）−フコシル化グリカンの比を測定し、ｄ）工程ｃ）で得られた測定された比を、肝細胞癌のない哺乳動物由来のプロフィルから得られた該同じブランチα（１，３）−フコシル化グリカンとバイセクティングＧｌｃＮａｃコアα（１，６）−フコシル化グリカンの比と比較して肝細胞癌または肝細胞癌の等級の変化を検出し、工程ｃ）で得られたデータを該同じ哺乳動物における該比比較して肝細胞癌または肝細胞癌の等級の変化を検出し、該比は該哺乳動物の血清または血漿タンパク質のトータル混合物のブランチα（１，３）−フコシル化グリカンおよびバイセクティングＧｌｃＮａｃコアα（１，６）−フコシル化グリカンの相違および濃度を表わし、そしてｅ）工程ｄ）で得られた比較の結果を哺乳動物における肝細胞癌または肝細胞癌の等級の変化を検出することに帰することを含む方法を提供する。
【０００７】
他の態様においては、ブランチα（１，３）−フコシル化グリカンとバイセクティングＧｌｃＮａｃコアα（１，６）−フコシル化バイアンテナリーグリカンとの比は血液タンパク質の単離された血清から計算される（測定される）。「単離された」という用語は、比の計算がサンプル中に存在する血清または血液タンパク質の総量に関して測定されるのではなくて、特定のタンパク質（例えば、肝臓から分泌されることが知られているＮ−グリコシル化タンパク質）が、血液または血清サンプルから分離（または単離）されることを意味する。タンパク質の単離方法（例えば、抗体捕捉技術）は、当技術分野で周知である。
【０００８】
ブランチα（１，３）−フコシル化グリカンは図１に示されておりそしてピーク９もしくはビーク１２またはピーク９および１２の組み合わせの使用であることができる。
【０００９】
バイセクティングＧｌｃＮａｃコアα−（１，６）−フコシル化グリカンは、図１に示されておりそしてピーク７もしくはビーク２またはピーク７および２の組み合わせの使用であることができる。
【００１０】
更に他の態様において、本発明は早期段階肝細胞癌または肝細胞癌の等級の変化を検出するための診断アッセイの製作のための、血液または血清中に存在するブランチα（１，３）−フコシル化グリカンおよびバイセクティングＧｌｃＮａｃコアα−（１，６）−フコシル化グリカンの使用を提供する。
【００１１】
更に他の態様においては、本発明は、早期段階肝細胞癌または肝細胞癌の等級の変化を検出するための診断アッセイの製作のための、血液の血清中のα−フェトプロテイン濃度の測定と組み合わせた血液または血清中に存在するブランチα（１，３）−フコシル化グリカンおよびバイセクティングＧｌｃＮａｃコアα（１，６）−フコシル化グリカンの使用を提供する。
【００１２】
「肝臓癌または肝細胞癌を検出するための方法」という表現は、広くは、肝臓癌をスクリーニングするための方法、診断するための方法、肝臓癌の予後を判定する（または監視する）ための方法と理解される。「肝臓癌または肝細胞癌の等級の変化」という表現は、肝臓癌の段階の改善または肝臓癌の段階の安定化または肝臓癌の段階の悪化を意味することができる、時間に対する肝臓癌の進展(evolution)を指す。肝臓癌の等級を検出するための方法は、換言すれば、肝臓癌を有すると前もって診断された患者（または患者母集団）の予後を判定するために使用されうる監視インストルーメントでありそして肝臓癌の治療の同時開発のための助けとしてのバイオマーカーとして使用されうる監視インストルーメントである。「比較の結果を．．．に帰する」という表現において、得られうる結果の異なる形態を指す。「結果」は、値の増加、値の減少、値の安定性を含むことができる。あるいは、「結果」は、例えば肝臓癌の組織学的に確認された特定の段階を有する患者の群の分析から得られた値の範囲内（例えば、９５％信頼区間、標準偏差）に入ることができる。１つの態様では、本明細書に記載の炭水化物の比は、該炭水化物のいかなる単離工程もなしにＮ−結合糖タンパク質に関して検出され、したがって、サンプルは、そのままで使用することができ、そして炭水化物のいかなる単離工程も含まないが、これに対して、「体液のサンプルから単離される」という表現は、炭水化物がサンプル中に存在する糖コンジュゲートから単離されるということを指す。
【００１３】
特定の態様においては、本発明の方法は、肝臓癌に罹患している哺乳動物に行われる治療の効果を監視するために使用されうる。他の特定の態様においては、本発明の方法は、早期段階肝臓癌を特異的に検出する。「特異的に」という用語は、肝硬変または後期段階肝硬変すらまたは肝臓線維症または更に他の肝臓疾患を含む他の肝臓疾患とは異なって診断されるということを指す。
【００１４】
「グリカン」および「炭水化物」という語は、相互に交換可能である。「糖コンジュゲート」は、炭水化物部分を含有する任意の化合物（例えば、タンパク質または脂質）を意味する。「炭水化物またはそれに由来するフラグメント」という表現は、炭水化物がフラグメント化されて、フラグメント化プロセスの産物のなかでも少なくとも１つのオリゴ糖またはその誘導体を生じることができることを意味する。このフラグメント化プロセスの他の産物は、単糖およびオリゴ糖またはその誘導体を含むことができる。オリゴ糖は、炭水化物であって、その化学的構造が、少なくとも２個の化学的に連結された当技術分野で単糖として知られている単位からなる炭水化物である。前記フラグメント化プロセスは、酵素による処理、化学的処理および物理的処理を含むことができる。例えば、炭水化物は、グリコシダーゼ酵素（例えば、炭水化物からシアル酸残基を除去するためのシアリダーゼ）により処理される（消化される）ことができ、したがって、得られたプロフィルは、炭水化物のフラグメントからなる。
【００１５】
グリコシダーゼ消化は、例えば、炭水化物のより簡単なプロフィルを得るために行うことができる。シアル酸は、炭水化物の穏やかな酸加水分解により化学的方法で除去することもできる。質量分析法による分析法において、「フラグメント」という語は、炭水化物が分析のプロセス（例えば衝突で誘発される解離）において非常にしばしばフラグメント化されことを指し、この場合に、フラグメント化産物は、フラグメント化が起こる前に炭水化物の構造の一部であった１つ以上の単糖の残部に化学的に連結されたオリゴ糖からなるオリゴ糖誘導体を生じさせることもできる。質量分析法フラグメント化プロセスの産物であるこのようなオリゴ糖誘導体の例は、環横断開裂(cross-ring cleavage)産物イオンとして当技術分野で知られている。「該炭水化物の特徴」は、任意の測定可能なパラメーターであって、その性質および／または量が炭水化物の構造により決定される任意の測定可能なパラメーターを指す。このような測定可能なパラメーターの例は、例えば、核磁気共鳴パラメーター、例えば、化学シフト、等核カップリング定数および異核カップリング定数、核オーバーハウザー効果および残留双極子カップリングである。あるいは、このような測定可能なパラメーターは、炭水化物における特異的構造決定基またはその組み合わせを認識するレクチンおよび抗体などの他の分子への該炭水化物の結合する程度であることができる。更に他のこのような測定可能なパラメーターは、グリコシルトランスフェラーゼおよびグリコシダーゼなどのある種の炭水化物を特異的に改変する酵素のための基質として機能する炭水化物の能力の程度であることができる。
【００１６】
Ｎ−グリカンは、ペプチドＮ−グリコシダーゼＦまたは当技術分野で知られている他のエンドグリコシダーゼによる酵素的消化により血清または血液混合物中の糖タンパク質から放出されうる。Ｎ−グリカンは、当業者に知られている、ヒドラジンが関与する技法を使用して遊離されうる。プロフィルが混合物中の糖コンジュゲートに依然として化学的に結合している炭水化物に関して得られる場合には、１つの態様は、糖脂質の脂質部分を改変するプロテアーゼまたは酵素などの、プロフィルを得る前に糖コンジュゲートの非グリカン部分を改変するための酵素または化学的技法の使用を含む。「炭水化物のプロフィル」という表現は、該炭水化物に関する定性的および／または定量的情報を含む任意の実態(entity)を意味する。例えば、これは、該炭水化物の電気泳動プロフィルまたはクロマトグラフィープロフィルを意味することができる。特定の場合には、プロフィルは、該炭水化物の質量スペクトルである。あるいは、プロフィルは、核磁気共鳴分析により得られる情報であることができる。更に他の例では、プロフィルは、炭水化物へのレクチン結合の定性的または定量的局面を説明する情報であることができる。あるいは、プロフィルは、炭水化物がグリコシルトランスフェラーゼまたはグリコシダーゼなどの特異的酵素に対する基質である程度を説明する情報であることができる。このような情報は、このような酵素反応の副生物、例えば、グリコシルトランスフェラーゼ反応において等モル量の解放された(set free)ヌクレオチドの測定値の読み出しを含むことができる。特定の態様においては、「炭水化物のプロフィルを発生させるまたは炭水化物のプロファイリング」という表現は、グリカン構造が分離され、次いで検出されることを含むこともできる。通常、多数の炭水化物が炭水化物のプロフィルにおいて同定される。通常、炭水化物は、複雑な混合物において存在し、そして有効な検出のために分離が必要である。分離は、電気泳動法およびクロマトグラフィー法を含む方法により行うことができる。検出は、抗体検出、レクチン検出、ＮＭＲ、質量分析法および蛍光を含む方法により行うことができる。特定の態様においては、グリカンがプロフィル化されうる前に、糖タンパク質からＮ−グリカンを化学的におよび／または酵素的に除去することが必要である。糖タンパク質からＮ−グリカンを調製するための方法は、当技術分野で周知である。他の特定の態様においては、分離および検出の前にＮ−グリカンを誘導体化することが必要である。１つのアプローチにおいては、Ｎ−グリカンのプロファィリング（分離および検出を含む）するための本発明の方法は、ＤＮＡシーケンサーと組み合わせて行うことができる。しかしながら、この方法は、レーザー誘導蛍光検出器に適合可能なキャピラリー電気泳動システムと一緒に適用されることもできることは当業者には明らかである。このようなシステムは、例えば、ＰＡＣＥシリーズキャビラリー電気泳動システム（Beckman Instruments,Inc., Fullerton, Calif）を含む。本発明は、レーザー誘導蛍光検出器と適合可能な任意の電気泳動システムを使用して適用されることもできる。他の態様においては、質量分析検出法、例えば少なくとも１つの炭水化物またはそれに由来するフラグメントの量の測定のためのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを使用することができる。質量分析法においては、炭水化物は非常にしばしばフラグメント化され、したがって該方法においては、炭水化物のフラグメントが検出される。
【００１７】
更に他の態様においては、プロファイリングは、マイクロ流体法により行うことができる。マイクロ流体は、急速に成長している分野であり、そしてマイクロチップ工業から借用した技術（ホトリソグラフィーおよび化学的湿式エッチング）により固体媒体（主としてシリカウエーハまたは高純度ガラスプレート）に創られた細穴チャネルを通しての流体移動に基づいている。流体は、毛細管作用または能動的ポンピングによりこれらのチャネルを通って移動することができ、そしてアナライトは、流体で満たされたチャネルを電気泳動により移動することができる（Schmalzing et al(2001) Methods  Mol. Biol. 163, 163-173）。更に他の態様においては、炭水化物の分離は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、高速液体クロマトグラフィーまたはガスクロマトグラフィーを含む方法によるクロマトグラフィー分離により行うことができる。
【００１８】
「該Ｎ−結合炭水化物または該フラグメントの標識された誘導体」という用語は、炭水化物の有効な検出をもたらす作用物質で標識されているＮ−結合炭水化物を指す。該標識された炭水化物は、誘導体化された炭水化物とも呼ばれる。例として、蛍光性化合物(fluorescing compounds)を炭水化物の標識化のために使用することができる。該蛍光性化合物は、誘導体化された化合物が電気泳動条件下に移動できるように優先的に帯電もされる。発蛍光団標識(fluorophore label)が帯電していない場合には、それは電荷授与種とカップリングさせることができる。該発蛍光団標識は、蛍光による誘導体化された炭水化物の定量的測定も可能とする。蛍光性化合物、例えば、９−アミノピレン−１，４，６−トリスルホン酸（ＡＰＴＳ）および８−アミノナフタレン−１，３，６−トリスルホン酸（ＡＮＴＳ）、は、誘導体化された炭水化物の電気泳動分離のために特に適当である。炭水化物の蛍光標識化のための他の化合物は、２−アミノピリジン（ＡＰ）、５−アミノナフタレン−２−スルホネート（ＡＮＡ）、１−アミノ−４−ナフタレンスルホン酸（ＡＮＳＡ）、１−アミノ−６，８−ジスルホン酸（ＡＮＤＡ）、３−（４−カルボキシベンゾイル）−２−キノリンカルボキサルデヒド（ＣＢＱＣＡ）、ルシファーイエロー(Lucifer yellow)、２−アミノアクリドンおよび４−アミノベンゾニトリル（ＡＢＮ）を含む。
【００１９】
特定の態様においては、蛍光標識された炭水化物の検出に関しては、当技術分野で知られている任意の検出法が適用されうるが、好ましくは、検出は、レーザー、例えばダイオードレーザー、Ｈｅ／Ｃｄレーザーまたはアルゴンイオンレーザーにより行われる。特定の態様においては、電気泳動分離により作成された標識された炭水化物バンドのプロフィルは、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラに基づくイメージングシステムを使用して可視化される。ＣＣＤカメラからの情報は、次いでデジタル形態で記憶されることができ、そして診断炭水化物パターンを個体間と参照標準間で比較するために種々のコンピュータプログラムにより分析されうる。他の特定の態様においては、ゲル分離された診断炭水化物は固定化膜に移行させることができ、即ち、ブロットさせることができ、次いで該診断炭水化物に対して特異的なレクチンまたはモノクローナルもしくはポリクローナル抗体などの種々の診断炭水化物特異的試薬によりプローブされ(probed)うる。特定の態様においては、本発明は、哺乳動物における肝臓繊維症を検出するための方法であって、線維症のある個体および線維症のない個体に由来するサンプル中に異なる量を有する少なくとも１つのグリカン構造および／または糖コンジュゲートを、該少なくとも１つのグリカン構造および／または糖コンジュゲートに特異的に結合するリガンドを使用することにより、測定および検出することを含む方法を提供する。リガンドはレクチンおよび抗体を含む。例えば、体液サンプル中の「バイセクティングＧｌｃＮＡｃ」残基（ＧｎＴ−ＩＩＩ産物）を有するＮ−グリカン構造（またはそれらのコンジュゲート）の増加した量は、Phaseolus  vulgarisからのエリスロ凝集性レクチン(erythro-agglutinating lectin)(Ｅ−ＰＨＡ）、アネキシンＶ（動物レクチン）または、例えば改良された特異性を有するその突然変異体などの、バイセクティングＧｌｃＮＡｃで改変されているグリカン（またはそれらのコンジュゲート）を特異的に認識するレクチン、またはこのようにして改変されたグリカンに対して特異的な抗体により検出されうる。したがって、Ｅ−ＰＨＡレクチンは、バイセクティングＧｌｃＮａｃ  α１−６フコシル化グリカン構造（更に実施例においてグリカン（またはピーク）２および７とも名付けられる）を検出するのに使用されうる。あるいは、「バイセクティングＧｌｃＮａｃ」残基を有するＮ−グリカン構造（またはそれらのコンジュゲート）の増加した量は、Ｎ−グリカンがバイセクティングＧｌｃＮＡｃ残基で置換されていない場合にのみＮ−グリカン（またはそれらのコンジュゲート）に結合するレクチンへのＮ−グリカン（またはそれらのコンジュゲート）の結合の減少により検出されうる。このようなレクチンの例は、Ｃａｎａｖａｌｉａ  ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓからのレクチン（Ｃｏｎ  Ａ）である。α１−３フコシル化グリカン構造（実施例においてグリカン（またはピーク）９とも命名された）は、Lotus tetragonolobusからのレクチンロータスＡおよびＡｎｇｕｉｌｌａ  ＡｎｇｕｉｌｌａからのレクチンＡＡＡにより検出されうる。あるいは、バイセクティンググリカンおよびα１−３フコシル化グリカンは、（１，３）−フコースに対して特異的な抗体（抗フコー���抗体）およびバイセクティングに対して特異的な抗体（抗バイセクティング抗体）で免疫検出されうる。本発明においては、「バイセクティング」および「バイセクティングＧｌｃＮａｃ」は、相互に交換可能に使用される。
【００２０】
他の態様においては、炭水化物プロファイリング法は、炭水化物アナライトに結合した標識とは異なる発色団または発蛍光団で標識された１つ以上の内部標準を電気泳動前に補充させることができる。内部標準は、誘導体化された炭水化物の電気泳動移動度を、内部標準混合物中のその成分の移動度と関係づけることにより、誘導体化された炭水化物の電気泳動移動度の正確でかつ再現性のある決定を可能とする。例えば、ローダミン標識されたオリゴヌクレオチド標準Ｇｅｎｅｓｃａｎ（商標名）５００(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)またはローダミン標識された６マー、１８マー、３０マー、および４２マーオリゴヌクレオチドの混合物を、プロファイリングの前に誘導体化されたグリカンに加えることができる。診断標準は、分析用のサンプルの標識化の前に標識されることができるが；しかしながら診断標準は分析のための標準の標識化に付随して優先的に標識化される。更に、標準における診断炭水化物は、好ましくは、分析用サンプル中の診断炭水化物の量との定量的もしくは定性的比較を与えるように好ましくは定量される。
【００２１】
分析用の好ましい体液は、患者から普通に得られる体液であり、特に好ましい体液は血清および血漿を含む。
【００２２】
本発明は、（誘導体化された）クリカンのプロファイリングの前のサンプルの予備処理なしに行うことができるけれども、特定の態様においては、分析用のサンプルは、診断炭水化物の分離および定量の前にプロセシングを必要とすることがある。使用されるサンプルプロセシングの正確な方法は、サンプル流体の選択および診断炭水化物のアイデンティティーに起因すると考えられる多数の因子に従って変わることができ；これらの因子は、診断炭水化物の量、バックグラウンド炭水化物の濃度、干渉分子(interfering molecules)、例えば、診断炭水化物バンド移動度または診断炭水化物の蛍光標識化に不利に影響する分子、の存在、および蛍光標識が誘導体化された診断炭水化物から分離されなければならないかどうか、を含む。サンプルのこのプロセシングまたは予備処理のための適当な方法は、干渉分子（例えば有効な質量分析法検出についての塩）を除去するための透析、診断炭水化物を濃縮しそして干渉分子を除去するための限外ろ過、干渉微粒子を除去しそして細胞を濃縮するための遠心、干渉分子を除去するための沈殿、グリコシル化タンパク質およびしたがってより低い量のグリカンを濃縮するための血清からのアルブミンの除去、より簡単なグリカンプロフィルを発生させるためのグリコシダーゼによる脱グリコシル化（例えば、グリカンのシアリダーゼ消化）；血清から例えばアルブミンを除去するためのアフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー、を含む。
【００２３】
本発明の他の態様においては、炭水化物の相対的量を測定することができるために、被検体サンプル中の診断炭水化物を分析するのに使用されるゲル上に診断標準が含まれるが；しかしながら、診断標準により具体化される情報、例えばバンド移動距離および強度は、分析用のサンプルが暴露される条件と同様な条件下に発蛍光団支援式炭水化物電気泳動に前以て供された診断標準から作られた記憶された記録との比較から得ることもできる。診断標準は、ポジティブ、即ち、苦しめられている個体(afflicted individuals)における完全な炭水化物パターンに対応する、またはネガティブ、即ち、苦しめられていない個体に対応する、の両方であることができる。診断標準は、それらが実際のサンプルにおいて見出される組成と同様な組成を有する診断炭水化物およびバックグラウンド炭水化物の両方を含有することができるという点において、分析用のサンプルの組成と同様な組成を有することができる。診断標準は、苦しめられている個体および苦しめられていない個体から得られたサンプルに由来することができる。あるいは、診断標準は、バックグラウンド炭水化物のない１つ以上の診断炭水化物を含有することができる。
【００２４】
他の態様においては、本発明は、肝臓癌の診断を行うため、または肝臓癌の等級の変化を検出するための診断キットも含む。例えば、診断キットは、肝臓癌の発蛍光団支援式炭水化物電気泳動診断を行うために作成されうる。他の例として、診断キットは、肝臓癌の質量分析法による診断を行うために作成されうる。発蛍光団支援式炭水化物電気泳動診断キットは、肝臓癌の診断を行うために必要な試薬のコレクションを提供する。適当なキットは、研究室が発蛍光団支援式炭水化物電気泳動診断を便利に行うことを可能とする。キットは、肝臓癌を同定するための試験を行うための試薬を含むことができる。キットは、診断標準、蛍光標識、ブロッティングおよび結合物質、例えば、膜、炭水化物特異的結合試薬、レクチン、抗体、インストラクシヨン、サンプル容器およびポリアクリルアミドゲル試薬、プレキャストゲル、酵素バッファー、還元剤（炭水化物の発蛍光団標識化において使用するための）および診断炭水化物を構造的に変化させる反応を触媒することができるグリコシダーゼ酵素（例えば、シアリダーゼ、ガラクトシダーゼ、フコシダーゼ）を含むことができる。更に完全なキットは、発蛍光団支援式炭水化物電気泳動を行うための装置、例えば、ポリアクリルアミドゲル装置、ＣＣＤｓ、レーザー、ＤＮＡシーケンサー、コンピュータ、ソフトウエア等を含むことができる。発蛍光団支援式炭水化物電気泳動診断キットに含まれる試薬は、好ましくは、予め測定された量で提供される。キットは、好ましくは、本発明の発蛍光団支援式炭水化物電気泳動法を行うためのインストラクションを含む。
【００２５】
この診断試験は実際的に有用である。なぜならば、普通に訓練された研究室スタッフにより大規模で適用することが十分に容易であるからである。更に、ＤＮＡシーケンシングおよび突然変異検出のための電気泳動に基づく高解像力および高感度分析器は、急速に増加する臨床研究所に既に存在するかまたは大抵の臨床研究所にとって手頃な費用で購入できるので、肝臓癌の新規な診断グリコミクス試験は、それらにおいて行うことができる。更に、入手可能な範囲のＤＮＡ分析器は、サンプルスループットを、各研究所の要求に依存して容易に機械当たり日当たりほんの小数から数百のサンプルのスケールにすることを可能とする。更に、このＤＮＡ分析装置は、全体の分析プロセスの複雑性を減少させる自動化の追加の利点を与える。Ｎ−結合糖タンパク質のトータル混合物を使用する代わりに、Ｎ−グリコシル化（即ち、本明細書で説明されたピーク７および９の２つのピークプロファイリング）は、精製された糖タンパク質で検討して行うこともできる。
【００２６】
他の態様においては、肝臓癌の検出のための方法は、臨床化学パラメーターおよび／または組織学的データを更に含む。したがって、本発明は、便利には、臨床化学パラメーターおよび／または組織学および／またはイメージングパラメーターと組み合わせて行うこともできる。臨床化学パラメーターの測定は、ビリルビンおよび／またはアルブミンのレベルおよび／またはプロトロンビン時間および／またはＣ反応性タンパク質および／またはＩｇＡ量および／または血清ヒアルロン酸濃度および／またはアミノトランスフェラーゼの測定および／または当技術分野で知られているいくつかの肝臓代謝試験を含む。好ましい態様においては、本発明のｇｌｙｃｏＨＣＣ試験は、α−フェトプロテインの測定と組み合わされる。組織学は肝臓生検を含む。イメージングは、超音波および／またはＣＴスキャンおよび／またはＭＲＩスキャンおよび／または肝臓に特異的な放射性トレーサーのイメージングを含む。
【００２７】
下記する実施例は、ある態様の説明として与えられる。そのようなものとして、それらは例示的なだけであり、その性質において限定的ではない。
【００２８】
実施例
１．ＨＣＣおよび硬変患者における変化したＮ−グリカンプロフィル
ＤＳＡ−ＦＡＣＥを使用して、本発明者等は、ＨＣＣ合併症を有するもしくは有しない肝臓線維症（ｎ＝１４３）および肝硬変（ＨＣＣｎ＝２２７、硬変ｎ＝８０）を有する中国人患者の脱シアリル化血清(desialylated sera)からのＮ−グリカンプロフィルを検査した（図１）。本発明者等は、健康なドナー（ｎ＝１３０）からの血液も分析した。本発明者等は、プロフィルにおけるすべてのビークの高さの和に対して各ピークの高さを正規化することにより各ピークを定量し、次いで健康なコントロール、線維症患者、硬変患者およびＨＣＣ患者のピークを統計的に比較した。硬変バックグラウンド上の特異的ＨＣＣ検出を可能とするために、本発明者等は、その量が硬変患者では増加しないがＨＣＣ患者では高められるグリカン構造を同定することに焦点を合わせた。本発明者等は、このパターンを有する１つのピーク、即ちピーク９を見出した（図２Ａ）。このピークの量はＨＣＣと強く関連しており（ｐ＜０．０００１）、そのアップレギュレーションにおける普通の機序を潜在的に示す。更にピーク７およびトータルバイセクティング（ピーク７＋ピーク２）は、硬変患者におけるよりもＨＣＣ患者において有意に低かった（ｐ＜０．０００１）（図２Ｂおよび２Ｄ）。ｌｏｇ（ピーク９／ピーク７）比およびｌｏｇ（ピーク９／バイセクティング）は、硬変患者、繊維症患者および健康なコントロールと比較してＨＣＣ患者において有意に高かった（ｐ＜０．０００１）（図２Ｃおよび２Ｅ）。最後に、本発明者等が同じ方法を使用したが異なるピークのセットを定義した本発明者等の以前の研究において本発明者等が採用した「ＧｌｙｃｏＣｉｒｒｈｏＴｅｓｔ」命名法と並行して、ｌｏｇ（ピーク９／ピーク７）をＧｌｙｃｏＨＣＣＴｅｓｔと新たに命名した（１９）。
【００２９】
２．グリカンマーカーは、ＡＦＰと同じＨＣＣ診断の有効性を有する
血清ＡＦＰの測定はＨＣＣのスクリーニングにおいて重要であるけれども、それは、硬変においてＡＦＰレベルがしばしば穏やかに上昇することにより、肝硬変患者においてＨＣＣを検出するのには限定的に有用であることを、以前の研究（１５）は示した。低い閾値におけるＨＣＣに対するＡＦＰの低い特異性は、異なるＡＦＰカットオフ値についてのデータを与える表２に見られうるとおり、本発明者等の硬変患者母集団においても見出された。
【００３０】
ＲＯＣ曲線分析により決定されるとおり、ｇｌｙｃｏＨＣＣＴｅｓｔは、８１±３%の正確度でＨＣＣ患者を硬変患者から識別することができる（図３）。グリカンマーカーの診断正確度は、同じ患者群において７８±３%の診断正確度を有していた普通に使用されたＡＦＰマーカーと非常に類似している（図３）。更に、カットオフ値−０．３４におけるＧｌｙｃｏＨＣＣＴｅｓｔは、カットオフ１００ngでのＡＦＰの特異度および感度に類似する８８%特異度および５７%感度でＨＣＣを検出した（表２）。
【００３１】
３．グリカン変化は腫瘍段階と関連している
ＨＣＣグリコミックマーカーと腫瘍段階との相関を評価するために、明白な腫瘍サイズおよび段階を有するＨＣＣ下位群（ｎ＝９８）をグリコミクス変化について分析した。ＴＮＭ基準に従って、ＨＣＣ患者をＴ１（ｎ＝６）、Ｔ２（ｎ＝２８）、Ｔ３（ｎ＝５９）、およびＴ４（ｎ＝５）として分類した。少数の患者のみがＴ１またはＴ４として分類されたので、本発明者等は、統計的分析の目的で、１つの群としてＴ１をＴ２と組み合わせそして他の群としてＴ３をＴ４と組み合わせた。ピーク９の濃度は、Ｔ１−Ｔ２群におけるよりＴ３−Ｔ４群において高かったが（図４Ａ）、これに対してピーク７の腫瘍段階との負の相関が示された（図４Ｂ）。ＧｌｙｃｏＨＣＣＴｅｓｔは、腫瘍段階と正の関連があった（図４Ｃ）。
【００３２】
ＡＳＴ／ＡＬＴ比はウイルス肝炎における硬変進行の敏感なマーカーと考えられてきた（２４）。γ−グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）は、ウイルス肝炎が構造的損傷を引き起こす段階に到達するとき良好な感度も示した（２５）。したがって、本発明者等は、このサブセットＨＣＣ患者におけるＡＦＰ、ＧＧＴおよびＡＳＴ／ＡＬＴ比と腫瘍段階の相関を分析した。図４Ｄ−Ｅに示されたとおり、ＡＦＰおよびＧＧＴのレベルは、硬変群におけるよりもＨＣＣ群において高く（それぞれ、ｐ＜０．００１および０．００６）そしてそれらは腫瘍段階と正の関連があった（それぞれ、ｐ＜０．０２３およびｐ＜０．０１６）。ＡＳＴ／ＡＬＴ比は、硬変患者（ｐ＜０．０００１）におけるよりもＨＣＣ患者において有意に低く、そして腫瘍段階とのその相関は有意ではない（ｐ＜０．１７４）（図４Ｆ）。ピアソン相関は、ＧｌｙｃｏＨＣＣＴｅｓｔのレベルはＡＦＰのレベルと相関せず（ｐ＝０．５６８０）そしてＡＳＴ／ＡＬＴ比と相関しない（０．３５１）が、ＧＧＴ濃度と関連している（ｐ＝０．００１）ことを示した。ＧＧＴは、胆汁うっ滞肝臓酵素(cholestatic liver enzyme)とも呼ばれる。肥満、大酒、脂肪肝および肝臓に対して毒性のあるある種の医薬もしくはハーブはＧＧＴレベルを高めることができるので、ＨＣＣ患者に存在するＧｌｙｃｏＨＣＣＴｅｓｔの高いレベルは胆汁うっ滞と関連していないということは排除できない。更に、本発明者等は、慢性ＨＢＶ感染を有する患者の群（ｎ＝１４３）におけるＨＣＣグリコミクスマーカーを評価した。ＧｌｙｃｏＨＣＣＴｅｓｔ値は、線維症患者における線維症段階の間で一貫して一定であり、これはそれがＨＣＣ特異的であることを示す（図５）。
【００３３】
４．硬変患者におけるＨＣＣ診断を可能とするグリカンの構造分析
Ｎ−グリカン構造は、ＮＰ−ＨＰＬＣ精製された画分に関するエキソグリコシダーゼシーケンシングにより証明された。ここで、本発明者等はピーク９および９’について例を示す（図６）。画分Ａにおける主要な構造（ピーク９’）（図６ａ）から、β−１，４−ガラクトシダーゼを使用して３つのガラクトースが除去されうる。この酵素がＮ−アセチルヘキソサミニダーゼと組み合わされると、３つの余分のＮ−アセチルグルコサミン残基が取り除かれる。これは、３つの改変されていない(unmodified)完全にガラクトシル化された分岐を有するＮ−グリカンを示す。更に、この構造はフコシル化されている。何故ならばそれは低特異性α−フコシダーゼに感受性であるからである（示されていない）。この構造は、α−１，３／４−フコシダーゼのための基質ではなく、このフコース改変はコアＮ−アセチルグルコサミンにα−１，６−結合していることを示す。画分Ｂにおける構造（ピーク９）（図６ｂ）がガラクトシダーゼで処理されると、２個の残基のみが除去される。追加のヘキソサミニダーゼ消化は２つの他の残基を除去し、これは３つの分岐の１つが、それが該酵素活性に非感受性であるように、改変されていることを示す。これは、フコースがブランチＮ−アセチルグルコサミン残基に結合しているときのみフコースを除去することができるα−１，３／４−フコシダーゼに対するその感受性により確かめられた。３つの酵素すべてが組み合わされると、特別の(extra)ガラクトースおよびＮ−アセチルグルコサミンは、前記フコシダーゼが妨害性フコース(hindering fucose)を除去した後、除去される。全般に、これらの実験は、ピーク９および９’がフコース残基の位置においてのみ異なる異性体であることを示す。
【００３４】
ＧｌｙｃｏＨＣＣＴｅｓｔがピーク９を定量しそしてその異性体を定量しないことを確実にするために、本発明者等は、トータル血清に関するα−１，３／４−フコシダーゼ消化を行った（図７）。この酵素は、ピーク９および１２をそれぞれピーク８および１１に変換し；ピーク９’および１２’は変わらないままである。
【００３５】
５．ＧｌｙｃｏＨＣＣＴｅｓｔをＡＦＰと組み合わせることによりＨＣＣ診断の正確度を高めること
血清ＡＦＰの測定はＨＣＣのスクリーニングにおいて重要であるけれども、以前の研究（１８）は、硬変においてＡＦＰレベルがしばしば穏やかに上昇することにより、肝硬変患者においてＨＣＣを検出するのには限定的に使用されることを示した。したがって、実際には、高い特異度を維持するためにＡＦＰについてはるかに高いカットオフ値（非硬変患者において使用されうる１０または２０ng/mlの代わりに４００ng/ml）を使用しなければならないが、これは、ＨＣＣ検出の感度の付随する減少を伴う。低い閾値におけるＨＣＣに対するＡＦＰの低い特異度は、表２においてみられるとおり、本発明者等の硬変患者母集団にも見られた。表２は異なるＡＦＰカットオフ値についてのデータを示す。カットオフＡＦＰ＜１ng/mlは、ＨＣＣ検出について９６%までの高い感度を有していたが、その特異度は低かった（２６%）。しかしながら、ＨＣＣを診断するための特異度は、ＡＦＰの４００ng/mlのカットオフ値では９５%まで増加し、そして感度は４６%に下がった。したがって、ＡＦＰレベルが４００ng/mlより少ないとき、ＨＣＣを検出するために補足マーカー（１つまたは複数）を有することが必要である。ＧｌｙｃｏＨＣＣＴｅｓｔがこの問題を解決するのを助けることができるかどうかを評価するために、本発明者等は、ＬｏｇＡＦＰに対してＧｌｙｃｏＨＣＣＴｅｓｔをプロットした（図９）。本発明者等は、ＡＦＰの低いレベル（＜１ng/ml）では、図９に示されたとおり、真のＨＣＣ症例は３%しかなく（９／２２７）そして硬変症例は２６%（８０の内２１）であることに留意した。ＨＣＣを検出する特異度を増加させるために、本発明者等は、ＡＦＰ＞１ng/mlかつＡＦＰ＜４００ng/ml（２２７人のＨＣＣ患者のうち１１４人および８９人の硬変患者のうち５５人を包含したＡＦＰの「グレーゾーン」）を有する患者において本発明者等のＧｌｙｃｏＨＣＣＴｅｓｔを適用した。ＧｌｙｃｏＨＣＣＴｅｓｔ（カットオフ値−０．３４で）は、９５%の特異度（３／５５偽陽性）および５７%感度（６５／１１４真の陽性）でこのＡＦＰのグレーゾーンにおいてＨＣＣを検出した（表３；図９）。ＲＯＣ曲線分析により決定して（図１０）、ＧｌｙｃｏＨＣＣＴｅｓｔは、８３±３%の正確度でＡＦＰグレーゾーンにおいて硬変患者からＨＣＣ患者を識別することができる。グリカンマーカーの診断力は、同じ患者群においてより低い診断正確度（５３±４%）を有していた普通に使用されるＡＦＰマーカーよりもはるかに高い（図１０）。これは、ＧｌｙｃｏＨＣＣＴｅｓｔが１〜４００ng/mlのＡＦＰ値内のＨＣＣ患者について使用されうることを明らかにした。結果として、ＡＦＰ＞４００ng/mlをＡＦＰのグレーゾーンにおけるＧｌｙｃｏＨＣＣＴｅｓｔカットオフ＞−０．３４と組み合わせることにより、本発明者等は、７４%感度および９１%特異度で硬変からＨＣＣを識別することができた（表３）。換言すれば、ＨＣＣの診断においてＧｌｙｃｏＨＣＣＴｅｓｔをＡＦＰと組み合わせることは、ＡＦＰ単独（カットオフ＞４００ng/ml；４６%感度）に比べて２８%感度を増加させる。
【００３６】
６．ＡＦＰ（グレーゾーン）とＧｌｙｃｏＨＣＣＴｅｓｔの組み合わせは、ＨＣＣ腫瘍段階付けと正の関連がある
ＡＦＰグレーゾーンにおいてＨＣＣグリコミックマーカーと腫瘍段階との相関を評価するために、明白な腫瘍サイズおよびＡＦＰグレーゾーン（１〜４００ng/ml）にはいる段階を有するＨＣＣ下位群を、グリコシル化プロフィルにおける変化について分析した。ＴＮＭ基準に従って、ＨＣＣ患者を、Ｔ１（ｎ＝３）、Ｔ２（ｎ＝１５）、Ｔ３（ｎ＝２５）およびＴ４（ｎ＝１）として分類した。ＡＦＰレベル（１〜４００ng/ml）を有する硬変（ｎ＝５５）群を比較参照として使用した。ピーク９の濃度は、Ｔ１〜Ｔ２群におけるよりもＴ３〜Ｔ４群において高かったが（図１１Ａ）、これに対して、ピーク７およびバイセクティング（ピーク２＋ピーク７）の腫瘍段階との負の相関が示された（図１１ＢおよびＥ）。ＧｌｙｃｏＨＣＣＴｅｓｔは、腫瘍段階と有意に正の関連があった（ｐ＜０．０００１）（図１１Ｃ）。ピーク９／バイセクティンググリカンのｌｏｇ比も（図１１Ｆ）、腫瘍段階と有意に関連していた。しかしながら、ＡＦＰ値はグレーゾーン内の腫瘍段階と相関していない（図１１Ｄ）。
【００３７】
特異度および感度を伴えＡＦＰグレーゾーン内のＨＣＣの診断におけるＧｌｙｃｏＨＣＣＴｅｓｔのカットオフ値は表４に示される。ＧｌｙｃｏＨＣＣＴｅｓｔは、６８．２〜８８．６%間の感度の変化および８１．１〜９４．３%間の特異度の変化を伴ってＡＦＰグレーゾーンにおけるＨＣＣの検出のための診断力を示した。
【００３８】
材料および方法
患者選択
この研究は、北京大学健康科学センターの倫理委員会によりおよび上海第２医科大学、Ｒｅｎｊｉ病院の倫理委員会により認可された。各患者からインフォームドコンセントを得た。
【００３９】
中国、北京の４つの病院（Ｙｏｕａｎ病院、Ｗｕｊｉｎｇ病院、Ｄｉｔａｎ病院およびＢｅｉｄａ病院）、中国、南京の南京第二病院および中国、上海病院から患者をリクルートした。トータルで、慢性肝臓疾患を有する４９７人のＨＢＶ感染患者をリクルートし；４７人は、転移、自己免疫肝臓疾患、薬物関連肝炎、アルコール性肝炎または閉塞性黄疸により排除された。すべての患者は、ＨＡＶ、ＨＣＶおよびＨＤＶ（Ａｂｂｏｔｔ  ＥＩＡ）、ＥＢＶおよびＣＭＶ（ＥＩＡ、Ｈｕｍａｎ  Ｃｏ．Ｌｔｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＨＥＶ（ＥＩＡ，Ｇｅｎｅｌａｂｓ，Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）に対する抗体についてはネガティブであった。
【００４０】
研究室試験
患者の主要な臨床的および生物学的データを表１に要約する。すべての患者は、線維症または硬変を有しておりそしてＨｂｓＡｇ、抗ＨＢｓＡｇ（ＨＢｓＡｂ）、ＨＢｅＡｇ、抗ＨＢｅＡｇ（ＨｂｅＡｂ）、抗ＨＢｃＡｇ（ＨＢｃＡｂ）およびＨＢＶＤＮＡの血清学的検出により診断して、肝炎Ｂウイルス（ＨＢＶ）に感染していた。肝臓損傷の程度はアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、トータルビリルビン、アルブミン、トータル血清タンパク質およびγ−グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）の測定により評価された。
【００４１】
臨床的段階および腫瘍段階
肝臓線維症および肝硬変の診断は、組織学的検査、イメージング技法およびいくつかの肝機能試験によりなされた。線維症段階は、Ｓｃｈｅｕｅｒの分類を使用して決定された。肝臓サンプルは、グリコミクスの結果を知らない２人の経験を積んだ肝臓病理学者により独立に評価された。肝臓線維症患者（ｎ＝１４３）は、広範に研究されておりそしてそれらの臨床的データはMin-De Zeng et al.(21)により以前に公表されている。肝硬変患者は、Ｃｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈ分類にしたがって段階付けられた。ＨＣＣを有する硬変患者（ｎ＝２２７）は、生検、剖検および外科標本により組織学的に診断され、そして決まった検査に関して超音波検査法および／またはコンピュータ断層撮影走査により臨床的に診断されそしてＡＦＰの測定（カットオフ２０ng/ml）と組み合わされて診断された。腫瘍段階は、ＴＮＭ基準に従って等級付けられた：Ｔ１＝単発であって血管浸潤を伴わない；Ｔ２＝単発であって血管浸潤を伴う、多発性≦５ｃｍ；Ｔ３＝多発性≧５ｃｍ、肝臓の門脈または肝静脈の主要分枝を浸潤している；Ｔ４＝胆嚢パーフォレート臓側腹腔(gallbladder perforates visceral peritoneum)以外の隣接器官を浸潤している。すべての血液サンプルは、任意の処理または操作の前に取り出された。ＨＣＣが超音波により排除されている１３０人の健康な個体の参照群からの血液を、北京および上海赤十字センターから得た。
【００４２】
タンパク質Ｎ−グリコーム分析のための血液サンプルのプロセシング
血清２μl中のタンパク質上に存在するＮ−グリカンを、以前に説明されたとおり、放出させ、標識しそして分析した（３９，２３）。標識されたＮ−グリカンを、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）に基づくＡＢＩ３１３０シーケンサーを使用する、ＤＮＡシーケンサー支援式発蛍光団支援式炭水化物電気泳動（ＤＳＡ−ＦＡＣＥ）技術により分析した。データを、GeneMapper  V3.7cソフトウエア（Applied Biosystemes, Foster city, CA）を使用して分析した。本発明者等は、すべてのサンプルにおいて検出されたピークの高さを測定して、プロフィルの数値的説明を得、そしてＳＰＳＳ１２．０統計的ソフトウエアによりこれらのデータを分析した。
【００４３】
構造特徴付け
ＡＰＴＳ標識された血清Ｎ−グリカンの構造分析のために、それらは、記載のとおりの（２３）順相ＨＰＬＣにより最初に分離された。次いで適切な量を、下記の酵素：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ β−１，４−ガラクトシダーゼ（０．４mU／消化物（ｄｉｇｅｓｔ）、タチナタマメ  β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ（１０mU／消化物、ウシ腎臓α−フコシダーゼ（２mU／消化物）、アーモンドミールα−１，３／４−フコシダーゼ（１μU／消化物）（すべてProzyme, San Leandro, CAからの）；を使用して上記したエキソグリコシダーゼにより消化した。ＤＳＡ−ＦＡＣＥを使用して消化産物を分析した。
【００４４】
統計的分析
Ｗｉｎｄｏｗｓソフトウエア用のＳＰＳＳ（ＳＰＳＳ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，ＵＳＡ）により統計的分析を行った。結果は、平均±ＳＤとして表わされる。すべての報告されたP値は独立したサンプルのためのｔ−検定を使用して、両側検定である。ピアソン相関係数（９５%信頼区間）およびそれらの関連した確率（ｐ）を使用してパラメーター間の関係を評価した。受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を正確度インデックスとして使用した；１．０に近い値は高い診断正確度を示す。
【００４５】
表：
【表１】
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【００４６】
【表２】
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【００４７】
【表３】
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【００４８】
【表４】
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【００４９】
【表５】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【国際調査報告】
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