(57)【要約】  ヒトおよび非ヒト動物由来の単離、精製されたＭＡＲ配列が、それらに対応するかまたは基づくヌクレオチド配列として開示される。特に、高い転写および／またはタンパク質生成促進活性を有するＭＡＲおよびＭＡＲコンストラクトが開示され、かつ例えばタンパク質の高収率の生成を目的とする、かかるＭＡＲを同定し、かかるＭＡＲコンストラクトを設計し、かつそれらを用いるための方法が開示される。【選択図】図１
2010501170.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの遺伝子の高レベルの発現のための発現系であって、
目的の遺伝子をコードするヌクレオチド配列を作動可能に連結するためのプロモーターと、
前記発現系で形質転換された細胞内で前記遺伝子の発現を促進するための少なくとも１つの非ヒト哺乳類のＭＡＲヌクレオチド配列と、
を含み、
ここで前記非ヒト哺乳類のＭＡＲヌクレオチド配列は前記コンストラクトを有する前記細胞の形質転換時に前記遺伝子の発現を約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍もしくはそれ以上に増大させる、発現系。
【請求項２】
前記プロモーターと目的の遺伝子をコードする前記ヌクレオチド配列とを含む発現カセットが前記プロモーターに作動可能に連結される、請求項１に記載の発現系。
【請求項３】
前記少なくとも１つの非ヒト哺乳類のＭＡＲヌクレオチド配列が齧歯類のＭＡＲヌクレオチド配列、例えばマウスもしくはハムスターのＭＡＲヌクレオチド配列である、請求項１および２のいずれか一項に記載の発現系。
【請求項４】
前記非ヒト哺乳類のＭＡＲヌクレオチド配列が、
（ｉ）配列番号３、配列番号１０もしくはその機能的断片、または
（ｉｉ）（ｉ）の配列のいずれかと約８０％、約９０％、約９５％もしくは約９８％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の発現系。
【請求項５】
前記遺伝子が、非ヒト哺乳類細胞、例えば齧歯類細胞、特にマウスもしくはハムスター細胞、またはヒト細胞、例えばＨｅＬａ細胞において発現される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の発現系。
【請求項６】
前記少なくとも１つの非ヒト哺乳類のＭＡＲヌクレオチド配列が前記遺伝子に対してシスまたはトランスに作用する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の発現系。
【請求項７】
細胞内でのタンパク質の生成を促進するための方法であって、
−ヒトもしくは非ヒト哺乳類細胞を提供するステップと、
−請求項１〜６のいずれか一項に記載の発現系を、遺伝子発現が約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０倍もしくはそれ以上に増大するように前記細胞に導入するステップと、
を含む、方法。
【請求項８】
（ａ）配列番号３もしくは配列番号１０もしくはその機能的断片のヌクレオチド配列、または
（ｂ）（ａ）の配列と少なくとも約８０％、約９０％、約９５％もしくは約９８％の配列同一性を有しかつＭＡＲ活性を有するヌクレオチド配列
を含む、単離、精製された核酸分子。
【請求項９】
非ヒト哺乳類のＭＡＲ配列を同定するための方法であって、
−少なくとも１つの非ヒト哺乳類の核酸分子、好ましくは非ヒト哺乳類のゲノムもしくはその一部を提供するステップと、
−前記核酸分子に、
−評価対象の核酸分子におけるウインドウサイズを設定するステップと、
−少なくとも１つもしくは少なくとも２つ、好ましくは３つ、より好ましくは４つもしくはそれより多いＭＡＲ関連の特徴を選択するステップと、
−この特徴／これらの特徴を示す配列に対する閾値を設定するステップと、
−これらの閾値を超えるＭＡＲ候補ヌクレオチド配列を選択するステップと、
−前記非ヒト哺乳類のＭＡＲヌクレオチド配列が、前記非ヒト哺乳類のＭＡＲヌクレオチド配列を含む発現系を介するヒトおよび／または非ヒト哺乳類細胞の形質転換時に、遺伝子の発現を約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０倍もしくはそれ以上に増大させることを確認するステップと、
を含む、ＭＡＲ配列における走査手順を施すステップと、
を含む、方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの特徴が、ＤＮＡベンディングの角度、主溝の深さ、副溝の幅、融解温度またはそれらの組み合わせでありうる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＤＮＡベンディングの角度値が、約３〜約５°（基本的角度°）、好ましくは３．８〜約４．４°を含み、ここでは約３．９°、約４．０°、約４．１°、約４．２°および約４．３°を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
主溝の深さ値が約８．９〜約９．３Åでありかつ副溝の幅値が約５．２〜約５．８Åであり、好ましくは前記主溝の深さ値が約９．１Åを含む約９．０〜約９．２Åでありかつ前記副溝の幅値が約５．５Åおよび約５．６Åを含む約５．４〜約５．７Åでありうる、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記融解温度が約５５〜約７５℃、特に約５５〜約６２℃であり、ここで約５６℃、約５７℃、約５８℃、約５９℃、約６０℃および約６１℃を含む、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ＤＮＡベンディングの角度値が約４．０〜約５．０°であり、ここで約４．１°、約４．２°、約４．３°、約４．４°、約４．５°、約４．６°、約４．７°、約４．８°および約４．９°を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＤＮＡベンディングの角度値が約５０ｂｐｓ〜約１５０ｂｐｓの範囲のウインドウ値と組み合わされ、ここで例えば約８０ｂｐｓ、約１００ｂｐｓおよび約１２０ｂｐｓを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＤＮＡベンディングの角度値×ウインドウ値が約３２０〜１３２０、例えば約４２０〜約１２２０、約５２０〜約１１２０、約６２０〜約１０２０、約７２０〜約９２０であり、前記主溝の深さ値×前記ウインドウ値が約９００〜約４０００、例えば約１２００〜３７００、約１５００〜約３４００、約１８００〜約３１００、約２１００〜約２８００であり、かつ／または副溝の深さ値×前記ウインドウサイズが約５００〜約２５００、例えば約７５０〜約２２５０、約１０００〜約２０００、約１２５０〜１７５０である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
−実験的に検証されたヒトもしくは非ヒト由来のＭＡＲを提供するステップと、
−前記実験的に検証されたヒトもしくは非ヒト由来のＭＡＲを用いて前記閾値を判定するステップと、
をさらに含む、請求項９〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
（ａ）（ｉ）同定されたＭＡＲの末端領域の少なくとも一部を含む単離ヌクレオチド配列、および
（ｉｉ）前記同定されたＭＡＲまたは別の同定されたＭＡＲの約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％もしくはより多くを含むさらなる単離ヌクレオチド配列、
または
（ｂ）（ｉ）（ａ）（ｉ）の前記ヌクレオチド配列と約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、および
（ｉｉ）（ｂ）（ｉ）の前記ヌクレオチド配列と約７０％、約８０％、好ましくは約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
を含むＭＡＲコンストラクト。
【請求項１９】
（ａ）（ｉｉ）における前記ヌクレオチド配列がＡＴリッチ領域を含む、請求項１８に記載のＭＡＲコンストラクト
【請求項２０】
同定されたＭＡＲ配列のヌクレオチドの数の約９０％未満、好ましくは約８０％未満、さらにより好ましくは約７０％未満、約６０％未満または約５０％未満を含む、請求項１８または１９に記載のＭＡＲコンストラクト。
【請求項２１】
同定されたＭＡＲ配列のヌクレオチドの数のほぼ同数かまたは少なくとも約１１０％を含む、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載のＭＡＲコンストラクト。
【請求項２２】
連続配列内の同定されたＭＡＲ配列の領域を含み、ここで順序および／または方向が同定されたＭＡＲ配列の場合と異なる、ＭＡＲコンストラクト。
【請求項２３】
前記領域が少なくとも１つのＡＴリッチ領域および少なくとも１つの結合部位領域を含む、請求項２２に記載のＭＡＲコンストラクト。
【請求項２４】
場合により前記同定されたＭＡＲ配列に由来する、少なくとも１つの結合部位領域の少なくとも一部をさらに含む、請求項２２または２３に記載のＭＡＲコンストラクト。
【請求項２５】
前記同定されたＭＡＲ配列がヒトまたはマウスのＭＡＲである、請求項２２〜２４に記載のＭＡＲコンストラクト。
【請求項２６】
前記同定されたＭＡＲ配列の前記領域またはその一部が、前記天然のヒト１＿６８ＭＡＲまたはマウスＭＡＲ  Ｓ４またはその一部の領域と約７０％の配列同一性、約８０％の配列同一性、約９０％の配列同一性、約９５％の配列同一性もしくは約９８％の配列同一性を有する、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載のＭＡＲコンストラクト。
【請求項２７】
前記領域が、各々、天然ヒト１＿６８ＭＡＲの１〜１１８９ｂｐｓ、１１９０〜１９５２ｂｐｓおよび１９５３〜３６００ｂｐｓに対応する、請求項２２〜２６のいずれか一項に記載のＭＡＲコンストラクト。
【請求項２８】
前記領域が配列特異的な領域である、請求項２２〜２７のいずれか一項に記載のＭＡＲコンストラクト。
【請求項２９】
（ａ）（ｉ）同定されたＭＡＲ配列の少なくとも１つの単離または合成されたＡＴリッチ領域、または
（ｉｉ）（ａ）（ｉ）の前記ＡＴリッチ領域と少なくとも少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する少なくとも１つのＡＴリッチ領域
を含むコアヌクレオチド配列と、
（ｂ）（ａ）の前記ヌクレオチド配列に隣接した少なくとも１つのＤＮＡタンパク質結合部位を含むヌクレオチド配列と、
を含み、ここで前記結合部位は、
（ｉ）さらに同定されたＭＡＲ配列のＤＮＡタンパク質結合部位、
（ｉｉ）前記同定されたＭＡＲ配列内で（ａ）の前記コアヌクレオチド配列外部に位置する、（ａ）の前記同定されたＭＡＲ配列のＤＮＡタンパク質結合部位、または
（ｉｉｉ）（ａ）の前記コア内に存在するが少なくとも１つのさらなるＤＮＡタンパク質結合部位に隣接する第１のＤＮＡタンパク質結合部位であって、前記第１および前記さらなるＤＮＡタンパク質結合部位の少なくとも１つは（ａ）の前記コア内で隣接することがない、第１のＤＮＡタンパク質結合部位、または
（ｉｖ）非ＭＡＲ配列のＤＮＡタンパク質結合部位
である、ＭＡＲコンストラクト。
【請求項３０】
プロモーターに作動可能に連結される遺伝子の発現を、前記ＭＡＲコンストラクトの細胞への導入時に、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍もしくはそれ以上に促進する、請求項２９に記載のＭＡＲコンストラクト。
【請求項３１】
５００ヌクレオチド長未満、好ましくは約２５０ヌクレオチド長未満、さらにより好ましくは約２００未満、約１５０もしくは約１００ヌクレオチド長未満であり、請求項２９または３０に記載のＭＡＲコンストラクト。
【請求項３２】
（ａ）の前記コア核酸配列が、前記同定されたＭＡＲの少なくとも１つのＴＦＢＳを含み、ここで前記少なくとも１つのＴＦＢＳは前記同定されたＭＡＲ内の前記ＡＴリッチ領域の一方または両方に隣接する、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載のＭＡＲコンストラクト。
【請求項３３】
（ｂ）における前記少なくとも１つのＤＮＡタンパク質結合部位がＴＦＢＳであり、かつ１つ、２つ、３つ、４つ、５つもしくはより多くの置換、付加および／または欠失により修飾され、かつ／あるいは完全または部分的に合成されている、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載のＭＡＲコンストラクト。
【請求項３４】
前記ＡＴリッチ領域に隣接する前記ＴＦＢＳが、１つ、２つ、３つ、４つ、５つもしくはより多くの置換、付加および／または欠失により修飾される、請求項２９〜３３のいずれか一項に記載のＭＡＲコンストラクト。
【請求項３５】
前記ＴＦＢＳが既知の天然相同物を全く有しない最適化されたＴＦＢＳである、請求項３３または３４に記載のＭＡＲコンストラクト。
【請求項３６】
前記結合部位が、ＳＡＴＢ１、ＮＭＰ４、ＨＯＸ、ＨＯＸＦ、Ｇｓｈ、ＣＥＢＰ、Ｆａｓｔ１およびＳＡＴＢ１またはこれらの転写因子のうちの２つもしくはそれより多くの組み合わせからなる群から選択される、請求項２９〜３５のいずれか一項に記載のＭＡＲコンストラクト。
【請求項３７】
（ｂ）の一連の前記ＤＮＡタンパク質結合部位が（ａ）の前記核酸配列に隣接する、請求項２９〜３６のいずれか一項に記載のＭＡＲコンストラクト。
【請求項３８】
前記ＭＡＲコンストラクトが促進されたＭＡＲコンストラクトである、請求項２９〜３７のいずれか一項に記載のＭＡＲコンストラクト。
【請求項３９】
上記請求項のいずれか一項に記載のＭＡＲコンストラクトの少なくとも１つ、ならびに場合により、プロモーターおよび目的のヌクレオチド配列を前記プロモーターの制御下で導入するための少なくとも１つの制限酵素結合部位を含む、発現系。
【請求項４０】
上記請求項のいずれか一項に記載の発現系を含む細胞。
【請求項４１】
上記請求項のいずれか一項に記載の発現系を含むトランスジェニックな非ヒト動物。
【請求項４２】
上記請求項のいずれか一項に記載の発現系、および
前記発現系の使用方法についての使用説明書
を含むキット。
【請求項４３】
遺伝子の発現を促進するための方法であって、
プロモーターおよび上記請求項のいずれか一項に記載のＭＡＲコンストラクトの制御下での前記遺伝子を含む発現系を提供するステップと、
前記遺伝子の前記発現が促進されるように細胞に前記発現系を形質移入するステップと、を含む、方法。
【請求項４４】
前記発現系が前記遺伝子の発現の安定性をさらに高める、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
ヒト病原体タンパク質またはヒト細胞表面タンパク質を認識する抗体などのタンパク質、ならびにエリスロポエチン、インターフェロンまたは他の治療用もしくは診断用タンパク質などのタンパク質の生成における、上記請求項のいずれか一項に記載のＭＡＲコンストラクト、発現系、トランスジェニック非ヒト動物、キットおよび／または方法の使用。
【請求項４６】
インビトロおよび／またはインビボ遺伝子療法ならびに／あるいは細胞または組織置換療法における、上記請求項のいずれか一項に記載のＭＡＲコンストラクト、発現系、細胞、キットおよび／または方法の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００６年８月２３日に出願された米国仮特許出願第６０／８２３，３１９号明細書および２００７年８月３日に出願された米国仮特許出願第６０／９５３，９１０号明細書の優先権を主張するものであり、それら全体が参照により本明細書中に援用される。
【０００２】
本発明は、単離、精製されたヒトおよび非ヒト動物由来のＭＡＲ配列に対応するかまたはそれに基づくヌクレオチド配列を含む核酸に関する。これらの核酸は、一般に転写および／またはタンパク質生成促進活性を有する。本発明は、例えば高収率のタンパク質生成を目的としたかかる配列を同定するための方法およびそれらを用いる系にも関する。
【背景技術】
【０００３】
本発明を例示し、特に実施についてのさらなる詳細を提供するための本明細書で用いられる特許を含む出版物および他の資料は、参照により本明細書中に援用される。便宜上、出版物は、文章中に完全に記載されない限り、添付の参考文献においてアルファベット順に列挙される。ＥＭＢＬ登録番号ＡＣ１０２６６６およびＥＭＢＬ登録番号ＢＨ１０１８７０およびＢＨ１０１９０１に隣接する配列ならびにＥＭＢＬ登録番号（同義語）１２６６５８、２３１１９３９１、２２９８１７４６もまたそれら全体が参照により本明細書中に援用される。
【０００４】
現在では、真核生物染色体の約５０〜１００ｋｂのクロマチンループドメインへの組織化のモデルが広く受け入れられている［ボドナー  Ｊ．Ｗ．（Ｂｏｄｎａｒ  Ｊ．Ｗ．）、ブレイン  Ｐ．（Ｂｒｅｙｎｅ  Ｐ．）、ヴァン・モンタグ  Ｍ．（Ｖａｎ  Ｍｏｎｔａｇｕ  Ｍ．）およびゲイセン  Ｇ．（Ｇｈｅｙｓｅｎ  Ｇ．）、ラジン  Ｓ．Ｖ．（Ｒａｚｉｎ  Ｓ．Ｖ．）］。これらのループの外端は、核マトリックス、すなわちＲＮＰ（リボ核タンパク質）および他の非ヒストンタンパク質からなるタンパク質網状構造（ｐｒｏｔｅｉｎａｃｅｏｕｓ  ｎｅｔｗｏｒｋ）に付着された特定のＤＮＡ配列に対応すると考えられる［ボーデ  Ｊ．（Ｂｏｄｅ  Ｊ．）、ベンハム  Ｃ．（Ｂｅｎｈａｍ  Ｃ．）、クノップ  Ａ．（Ｋｎｏｐｐ  Ａ．）およびミエルケ  Ｃ．（Ｍｉｅｌｋｅ  Ｃ．）］。核マトリックスに付着された染色体ＤＮＡ配列は、足場付着領域（中期中）またはマトリックス付着領域（間期）の各々に対してＳＡＲまたはＭＡＲと称される。Ｓ／ＭＡＲ、ＭＡＲ要素もしくはＭＡＲ配列または略してＭＡＲは、典型的には３００〜３０００ｂｐ長の多形領域である。哺乳類の核内には約１００，０００のＭＡＲが存在すると推定されている［ボーデ  Ｊ．（Ｂｏｄｅ  Ｊ．）、ステンガート−イベル  Ｍ．（Ｓｔｅｎｇｅｒｔ−Ｉｂｅｒ  Ｍ．）、ケイ  Ｖ．（Ｋａｙ  Ｖ．）、シュラケ  Ｔ．（Ｓｃｈｌａｋｅ  Ｔ．）およびディエツ−ファイルステッター  Ａ．（Ｄｉｅｔｚ−Ｐｆｅｉｌｓｔｅｔｔｅｒ  Ａ．）］。
【０００５】
クロマチンをループドメインに構造的かつ機能的に分離することにより、ＭＡＲ要素は、遺伝子発現の複製および調節において重要な役割を果たす、例えば哺乳類の核内での転写の中心部（ｆｏｃｉ）の連続的な構築および分解を促進すると考えられている。この概念を支持するように多数の間接的証拠がもたらされており、例えば様々な真核ゲノム内でＤＮＡの複製起点がＭＡＲ要素内にマッピングされた［アマチ  Ｂ．（Ａｍａｔｉ  Ｂ．）およびガッサー  Ｓ．Ｍ．（Ｇａｓｓｅｒ  Ｓ．Ｍ．）（１９８８年）、アマチ  Ｂ．（Ａｍａｔｉ  Ｂ．）およびガッサー  Ｓ．Ｍ．（Ｇａｓｓｅｒ  Ｓ．Ｍ．）（１９９０年）］。ＭＡＲは、イントロン内部の非コード遺伝子間領域内［ジロド  Ｐ．Ａ．（Ｇｉｒｏｄ  Ｐ．Ａ．）、ザーン−ザバル  Ｍ．（Ｚａｈｎ−Ｚａｂａｌ  Ｍ．）およびマーモド  Ｎ．（Ｍｅｒｍｏｄ  Ｎ．）］または転写単位の境界［ガッサー  Ｓ．Ｍ．（Ｇａｓｓｅｒ  Ｓ．Ｍ．）およびラエムリ  Ｕ．Ｋ．（Ｌａｅｍｍｌｉ  Ｕ．Ｋ．）；国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）］にもほぼ常に見出され、そこでは遍在的でかつ／または組織特異的な転写因子に結合しうる。概して、植物や動物細胞系におけるトランスジェニックの実験では、ＭＡＲ要素を用い、トランス遺伝子の発現および安定性を増大させることに奏功している［アレン  Ｇ．Ｃ．（Ａｌｌｅｎ  Ｇ．Ｃ．）、スパイカー  Ｓ．（Ｓｐｉｋｅｒ  Ｓ．）、トンプソン  Ｗ．Ｆ．（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｗ．Ｆ．）、ボーデ  Ｊ．（Ｂｏｄｅ  Ｊ．）、シュラケ  Ｔ．（Ｓｃｈｌａｋｅ  Ｔ．）、リオス−ラミレス  Ｍ．（Ｒｉｏｓ−Ｒａｍｉｒｅｚ  Ｍ．）、ミエルケ  Ｃ．（Ｍｉｅｌｋｅ  Ｃ．）、ステンガート  Ｍ．（Ｓｔｅｎｇａｒｔ  Ｍ．）、ケイ  Ｖ．（Ｋａｙ  Ｖ．）およびクレア−ヴィルス  Ｄ．（Ｋｌｅｈｒ−Ｗｉｒｔｈ  Ｄ．）、ジロド  Ｐ．Ａ．（Ｇｉｒｏｄ  Ｐ．Ａ．）、ザーン−ザバル  Ｍ．（Ｚａｈｎ−Ｚａｂａｌ  Ｍ．）およびマーモド  Ｎ．（Ｍｅｒｍｏｄ  Ｎ．）］。例えば、ＭＡＲを用い、バイオテクノロジーや治療用途に関連する細胞、例えばＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞において様々な組換えタンパク質の生成が増大している［ジロド  Ｐ．Ａ．（Ｇｉｒｏｄ  Ｐ．Ａ．）、ザーン−ザバル  Ｍ．（Ｚａｈｎ−Ｚａｂａｌ  Ｍ．）およびマーモド  Ｎ．（Ｍｅｒｍｏｄ  Ｎ．）、キム  Ｊ．Ｍ．（Ｋｉｍ  Ｊ．Ｍ．）、キム  Ｊ．Ｓ．（Ｋｉｍ  Ｊ．Ｓ．）、パーク  Ｄ．Ｈ．（Ｐａｒｋ  Ｄ．Ｈ．）、カン  Ｈ．Ｓ．（Ｋａｎｇ  Ｈ．Ｓ．）、ユーン  Ｊ．（Ｙｏｏｎ  Ｊ．）、バエク  Ｋ．（Ｂａｅｋ  Ｋ．）およびユーン  Ｙ．（Ｙｏｏｎ  Ｙ．）、ザーン−ザバル  Ｍ．（Ｚａｈｎ−Ｚａｂａｌ  Ｍ．）、コブル  Ｍ．（Ｋｏｂｒ  Ｍ．）、ジロド  Ｐ．Ａ．（Ｇｉｒｏｄ  Ｐ．Ａ．）、イムホフ  Ｍ．（Ｉｍｈｏｆ  Ｍ．）、シャテラード  Ｐ．（Ｃｈａｔｅｌｌａｒｄ  Ｐ．）、デ・ジーザス  Ｍ．（Ｄｅ  Ｊｅｓｕｓ  Ｍ．）、ブルム  Ｆ．（Ｗｕｒｍ  Ｆ．）およびマーモド  Ｎ．（Ｍｅｒｍｏｄ  Ｎ．）］（マーモド（Ｍｅｒｍｏｄ）ら、「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｔａｂｌｅ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｒ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｒｅｇｉｏｎｓ」、国際公開第０２０７４９６９号パンフレット、また米国特許出願公開第２００３００８７３４２号明細書）。
【０００６】
ＭＡＲの機能的活性は、その主要なＤＮＡ配列ではなくその構造的特性に関連づけられている。確かにＭＡＲではＡおよびＴ含量が高く［ボウリカス  Ｔ．（Ｂｏｕｌｉｋａｓ  Ｔ．）（１９９３年）］、いくつかの特定の高次構造的かつ物理化学的な特性、例えば分子の自然曲率、狭い副溝、巻き戻し／不対の高い可能性または変性への感受性が観察されている［ボーデ  Ｊ．（Ｂｏｄｅ  Ｊ．）、シュラケ  Ｔ．（Ｓｃｈｌａｋｅ  Ｔ．）、リオス−ラミレス  Ｍ．（Ｒｉｏｓ−Ｒａｍｉｒｅｚ  Ｍ．）、ミエルケ  Ｃ．（Ｍｉｅｌｋｅ  Ｃ．）、ステンガート  Ｍ．（Ｓｔｅｎｇａｒｔ  Ｍ．）、ケイ  Ｖ．（Ｋａｙ  Ｖ．）およびクレア−ヴィルス  Ｄ．（Ｋｌｅｈｒ−Ｗｉｒｔｈ  Ｄ．）、ボウリカス  Ｔ．（Ｂｏｕｌｉｋａｓ  Ｔ．）（１９９３年）、ボウリカス  Ｔ．（Ｂｏｕｌｉｋａｓ  Ｔ．）（１９９５年）］。事実、まさしくそれらの特性を用いることで、ＭＡＲがＳＭＡＲ  Ｓｃａｎと称される方法を通じて同定されている。さらに、ＭＡＲの活性はまた、ＤＮＡ結合タンパク質、例えば一本鎖および／または曲線状のＤＮＡなどのＭＡＲ要素の特定の構造的特徴を認識しうるクロマチン改変酵素および／または転写因子に媒介されうる［ボーデ  Ｊ．（Ｂｏｄｅ  Ｊ．）、ステンガート−イベル  Ｍ．（Ｓｔｅｎｇｅｒｔ−Ｉｂｅｒ  Ｍ．）、ケイ  Ｖ．（Ｋａｙ  Ｖ．）、シュラケ  Ｔ．（Ｓｃｈｌａｋｅ  Ｔ．）およびディエツ−ファイルステッター  Ａ．（Ｄｉｅｔｚ−Ｐｆｅｉｌｓｔｅｔｔｅｒ  Ａ．）］。明確なタンパク質の結合部位またはＭＡＲコンセンサス配列は全く見出されておらず［ボウリカス  Ｔ．（Ｂｏｕｌｉｋａｓ  Ｔ．）（１９９３年）］、それはゲノム配列由来のＭＡＲの予測を困難にしている。
【０００７】
ＭＡＲの特定の機能的かつ構造的な特性については記載がなされている一方、一次構造の観点ではほとんど共有されてないことからその同定は困難である。動物のＭＡＲが植物核の足場に結合し、その逆もいえるという事実により支持される仮定では、ＭＡＲ要素が真核ゲノム内で機能的に保存されうる一方［ブレイン  Ｐ．（Ｂｒｅｙｎｅ  Ｐ．）、ヴァン・モンタグ  Ｍ．（Ｖａｎ  Ｍｏｎｔａｇｕ  Ｍ．）、デピッカー  Ａ．（Ｄｅｐｉｃｋｅｒ  Ａ．）およびゲイセン  Ｇ．（Ｇｈｅｙｓｅｎ  Ｇ．）、ミエルケ  Ｃ．（Ｍｉｅｌｋｅ  Ｃ．）、コーウイ  Ｙ．（Ｋｏｈｗｉ  Ｙ．）、コーウイ−シゲマツ  Ｔ．（Ｋｏｈｗｉ−Ｓｈｉｇｅｍａｔｓｕ  Ｔ．）およびボーデ  Ｊ．（Ｂｏｄｅ  Ｊ．）］、いかなる特徴がＭＡＲ配列、例えば強力なタンパク質を生成する配列をもたらすかについて語れることはほとんどない。また、様々な結果が用いられるアッセイに応じて得られうる［ラジン  Ｓ．Ｖ．（Ｒａｚｉｎ  Ｓ．Ｖ．）、ボウリカス  Ｔ．（Ｂｏｕｌｉｋａｓ  Ｔ．）（１９９５年）、ケイ  Ｖ．（Ｋａｙ  Ｖ．）およびボーデ  Ｊ．（Ｂｏｄｅ  Ｊ．）］。真核生物内での大量の予想されたＭＡＲおよびゲノムプロジェクトで公表された配列の量を考慮し、ＭＡＲ  ＤＮＡ配列（ＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ  Ｉ）または調節タンパク質または転写因子として作用する特定のタンパク質に対する結合部位などの機能的配列（ＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ  ＩＩ）の構造的特徴を検出するためのツール／プログラムが開発された［マーモド（Ｍｅｒｍｏｄ）らに交付された２００７年８月３日に出願された米国仮特許出願第６０／９５３，９１０号明細書、米国特許出願公開第２００７０１７８４６９号明細書］。かかるプログラムは、ＤＮＡベンディング、主溝の深さおよび副溝の幅のポテンシャルに対応する一群のＤＮＡ配列の特徴の検出により新規の有望なＭＡＲ配列を同定するとともに、特定の転写調節タンパク質に対する結合部位を同定するように設計された。これらのプログラムを用いてヒトゲノムを走査することで、推定上のＭＡＲ  ＤＮＡ配列が同定されており、それらのいくつかはＣＨＯ細胞に形質移入される発現プラスミドに導入される場合にトランス遺伝子の発現を増大させることが示された（ジロド（Ｇｉｒｏｄ）ら、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓ／ＭＡＲ  ｆｒｏｍ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｗｉｔｈ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｔｏ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ」、マーモド（Ｍｅｒｍｏｄ）らに交付された米国特許出願公開第２００７０１７８４６９号明細書］。これは、ＳＭＡＲ  Ｓｃａｎプログラムがヒト遺伝要素、つまりタンパク質の合成を増大させるのに用いられうるものを効率的に同定しうることを実証した。これまで実施された機能的スクリーニングがヒトゲノムに限定されていたが、大規模な生成では目的のタンパク質が非ヒト哺乳類細胞内で発現されることが多い。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
約１６００のＭＡＲがヒトゲノム内でＳＭＡＲ  Ｓｃａｎにより同定されており、８つのうち６つが、エンハンサー／プロモーターの上流に配置される場合、ＣＨＯ細胞内で（例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、抗体および受容体に対する）遺伝子の発現促進を引き起こすことが示された。異所性ＭＡＲ活性を有することが示されたＤＮＡの長さは２．５ｋｂ〜６ｋｂの範囲である。しかし、現段階ではＭＡＲの構造的特徴づけの欠如が「デザイナー（ｄｅｓｉｇｎｅｒ）」ＭＡＲの生成を制限している。したがって、ＭＡＲの改変や設計を可能にするため、ＭＡＲ、特にＭＡＲの機能的かつ／または構造的領域を特徴づける必要性が存在する。
【０００９】
これまで実施された機能的スクリーニングはヒトゲノムに限定された。大規模な生成では目的のタンパク質が哺乳類細胞内で発現されることが多いことから、転写および／または遺伝子発現を促進するより強力な天然のＭＡＲ、ならびに／あるいはヒトおよび／または非ヒト哺乳類細胞内で強力なタンパク質生成体（ｐｒｏｄｕｃｅｒ）の細胞を同定するという必要性も存在する。
【００１０】
概して、例えばさらなる天然のＭＡＲを同定し、同定されたＭＡＲを設計し、かつ／または合成ＭＡＲを生成することにより、有利な特性を有するＭＡＲを同定しかつ／または生成するという必要性が存在する。有利な特性、限定はされないが、転写の促進および／またはタンパク質生成／遺伝子発現の特性；天然ＭＡＲに対する長さの短縮により、例えば遺伝子工学におけるより多目的の使用が可能になる点；外的刺激物、例えば薬剤の添加時での組織、細胞または器官の特異性および／または誘発性が顕在化する。
【００１１】
これらの必要性や以下の開示から明確になる他の必要性のうちの１つもしくは複数に対処するため、推定上のＭＡＲ  ＤＮＡ配列を同定するためのマウスゲノムの大規模なバイオインフォーマティクス分析を含むいくつかのアプローチが用いられた。マウスゲノムは、ＭＡＲ予測ソフトウェアＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ  Ｉを用いて分析された。新規に同定された齧歯類配列における、培養細胞からの目的の医薬品の組換えタンパク質の生成の改善を媒介する能力について評価された。このため、トランス遺伝子の形質移入アッセイにおいて新規に同定されたＭＡＲの転写活性が評価された。
【００１２】
さらに、ＭＡＲ、例えばヒト１＿６８ＭＡＲおよびマウスＭＡＲ  Ｓ４について試験した。モジュール、特にＭＡＲの特定の構造的／配列特異的モジュールを含むモジュールが同定され、かつこれらのモジュールは有利な特性を有するＭＡＲは、例えば配列のリシャッフリング（ｒｅｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）、欠失および／または複製による設計用に用いられた。モジュールはまた、他の因子、例えば特定の結合部位、特に転写因子結合部位（ＴＦＢＳ）を含む合成ヌクレオチド配列と結合された。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、一実施形態では、少なくとも１つの遺伝子を高レベルに発現させる発現系であって、
目的の遺伝子をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結するためのプロモーターと、
前記発現系で形質転換された細胞内で前記遺伝子の発現を促進するための少なくとも１つの非ヒト哺乳類のＭＡＲヌクレオチド配列と、
を含み、ここで前記非ヒト哺乳類のＭＡＲヌクレオチド配列は、前記コンストラクトによる前記細胞の形質転換時に約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍もしくはそれ以上、前記遺伝子の発現を増大させる、発現系を対象とする。
【００１４】
前記非ヒト哺乳類のＭＡＲヌクレオチド配列は、
（ｉ）配列番号３、配列番号１０もしくはその機能的断片、または
（ｉｉ）（ｉ）の配列のいずれかと約８０％、約９０％、約９５％もしくは約９８％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
を含むか本質的にそれからなるかまたはそれからなり得る。
【００１５】
本発明は、単離、精製された核酸分子であって、
（ａ）配列番号３もしくは配列番号１０またはその機能的断片のヌクレオチド配列、または
（ｂ）（ａ）の配列と少なくとも約８０％、約９０％、約９５％もしくは約９８％の配列同一性を有しかつＭＡＲ活性を有するヌクレオチド配列
を含むか本質的にそれからなるかまたはそれからなる、核酸分子も対象とする。
【００１６】
本発明は、非ヒト哺乳類のＭＡＲ配列を同定するための方法であって、
−少なくとも１つの非ヒト哺乳類の核酸分子、好ましくは非ヒト哺乳類のゲノムもしくはその一部を提供するステップと、
−前記核酸分子に、
−評価されるべき核酸分子に対してウインドウサイズを設定するステップと、
−少なくとも１つもしくは少なくとも２つ、好ましくは３つ、より好ましくは４つもしくはそれより多いＭＡＲ関連の特徴を選択するステップと、
−この特徴／これらの特徴を示す配列に対して閾値を設定するステップと、
−これらの閾値を超えるＭＡＲ候補ヌクレオチド配列を選択するステップと、
−前記非ヒト哺乳類のＭＡＲヌクレオチド配列が、前記非ヒト哺乳類のＭＡＲヌクレオチド配列を含む発現系を介するヒトおよび／または非ヒト哺乳類細胞の形質転換時に、遺伝子の発現を約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍もしくはそれ以上、増大させることを確認するステップと、
を含む、ＭＡＲ配列のための走査手順を施すステップと、
を含む、方法をさらに対象とする。
【００１７】
本明細書における特徴は、その値にウインドウ値を乗じることにより、約３２０〜１３２０、例えば約４２０〜約１２２０、約５２０〜約１１２０、約６２０〜約１０２０、約７２０〜約９２０の乗算値が得られるＤＮＡベンディングの角度である場合があり、本明細書における特徴は、ウインドウ値を乗じることにより約９００〜約４０００、例えば約１２００〜３７００、約１５００〜約３４００、約１８００〜約３１００、約２１００〜約２８００の乗算値が得られる主溝の深さ値である場合があり、および／または本明細書における特徴は、ウインドウサイズ値を乗じることにより約５００〜約２５００、例えば約７５０〜約２２５０、約１０００〜約２０００、約１２５０〜１７５０の乗算値が得られる副溝の深さ値である場合がある。
【００１８】
本発明は、
（ａ）（ｉ）同定されたＭＡＲの末端領域の少なくとも一部を含む単離ヌクレオチド配列、および
（ｉｉ）前記同定されたＭＡＲまたは別の同定されたＭＡＲの約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％もしくはそれより多くを含むさらなる単離ヌクレオチド配列、
または
（ｂ）（ｉ）（ａ）（ｉ）のヌクレオチド配列と約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、および
（ｉｉ）（ｂ）（ｉ）のヌクレオチド配列と約７０％、約８０％、好ましくは約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
を含むＭＡＲコンストラクトも対象とする。
【００１９】
本発明に記載の他のＭＡＲコンストラクトは、同定されたＭＡＲ配列もしくはその連続して並ぶ一部の領域を含み、ここでは順序および／または方向が同定されたＭＡＲ配列の場合と異なる。
【００２０】
さらに、本発明に記載の他のＭＡＲコンストラクトは、
（ａ）（ｉ）同定されたＭＡＲ配列の少なくとも１つの単離または合成されたＡＴリッチ領域、または
（ｉｉ）（ａ）（ｉ）のＡＴリッチ領域と少なくとも少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する少なくとも１つのＡＴリッチ領域
を含むコアヌクレオチド配列と、
（ｂ）（ａ）の前記ヌクレオチド配列に隣接した少なくとも１つのＤＮＡタンパク質結合部位を含むヌクレオチド配列と、
を含み、ここで前記結合部位は、
（ｉ）さらなる同定されたＭＡＲ配列のＤＮＡタンパク質結合部位、
（ｉｉ）同定されたＭＡＲ配列内で（ａ）のコアヌクレオチド配列外部に位置する、（ａ）の同定されたＭＡＲ配列のＤＮＡタンパク質結合部位、または
（ｉｉｉ）（ａ）のコア内に存在するが少なくとも１つのさらなるＤＮＡタンパク質結合部位に隣接する第１のＤＮＡタンパク質結合部位であって、第１のＤＮＡタンパク質結合部位と前記さらなるＤＮＡタンパク質結合部位の少なくとも１つとは（ａ）のコア内で隣接することがない、第１のＤＮＡタンパク質結合部位、または、
（ｉｖ）非ＭＡＲ配列のＤＮＡタンパク質結合部位
である。
【００２１】
本発明は、特定のＭＡＲコンストラクトのいずれかを含む発現系、特定の発現系のいずれかを含むキット、ならびに、ＭＡＲコンストラクト、発現系、細胞、トランスジェニック非ヒト動物、キット、および／または、（１）ヒト病原体タンパク質またはヒト細胞表面タンパク質を認識する抗体などのタンパク質およびエリスロポエチン、インターフェロンまたは他の治療用もしくは診断用タンパク質などのタンパク質の生成、および／または（２）インビトロ、インビボ遺伝子療法、細胞療法または組織再生療法における本明細書中で参照される方法のいずれかの使用も対象とする。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】様々なＭＡＲの組換え緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の生成に対する効果を示す。
【図２】組換え緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のＣＨＯ細胞内での様々なヒトおよびマウスＭＡＲ要素の極めて高い生成体の百分率（％Ｍ３）に対する効果を示す。
【図３】様々なヒト１＿６８およびマウスＳ４  ＭＡＲ要素の組換え緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現に対する効果を示す。
【図４】マウスＭＡＲ要素の組換えモノクローナル抗体の生成に対する効果を示す。
【図５】安定なポリクローナル集団がＭＡＲを有しない（ＭＡＲなしの）場合またはシスに付加されたＭＡＲ  Ｓ４を有する場合にＩｇＧ重鎖および軽鎖の発現を駆動するベクターを形質移入されたＣＨＯ細胞の集団から生成可能であったことを示す。
【図６】図６Ａに、安定な各クローンが（Ｂ）におけるＭＡＲを有しない（ＭＡＲなしの）場合またはシスに付加されたＭＡＲ  Ｓ４およびＭＡＲ１＿６８を有する場合にＩｇＧ重鎖および軽鎖の発現を駆動するベクターを形質移入されたＣＨＯ細胞の集団から限界希釈により生成可能であったことを示す。図６Ｂに、安定な各クローンが（Ｂ）におけるＭＡＲを有しない（ＭＡＲなしの）場合またはシスに付加されたＭＡＲ  Ｓ４およびＭＡＲ１＿６８を有する場合にＩｇＧ重鎖および軽鎖の発現を駆動するベクターを形質移入されたＣＨＯ細胞の集団から限界希釈により生成可能であったことを示す。
【図７】図７Ａに、ＭＡＲを有しない場合の時間に伴う（２週および２６週）遺伝子（ＧＦＰ）の発現を示す。図７Ｂに、ＭＡＲを有する場合の時間に伴う（２週および２６週）遺伝子（ＧＦＰ）の発現を示す。
【図８】図８Ａに、はヒト１＿６８ＭＡＲの曲げの特徴を示す。図８Ｂに、ヒト１＿６８ＭＡＲの配列の特徴を示す。
【図９】図９Ａに、同定された領域のシャッフリングにより得られた異なるＭＡＲコンストラクトおよび得られた転写の増大を示す。図９Ｂに、ＭＡＲコンストラクト６の曲げパターンを示す。図９Ｃに、ＭＡＲコンストラクト６の結合部位などの構造パラメータの詳細を提供する。
【図１０】全集団の平均蛍光（Ａｖｇ  Ｇｍｅａｎ  Ｍ０）の分析により示された、様々なＭＡＲ  Ｓ４コンストラクトの組換え緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現に対する効果を示す。
【図１１】全集団の平均蛍光（Ａｖｇ  Ｇｍｅａｎ  Ｍ０）の分析により示された、組換え緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現時に得られた様々なＭＡＲ  Ｓ４コンストラクトを示す。
【図１２】ＭＡＴＩｎｓｐｅｃｔｏｒソフトウェアにより予測された、ヒト１＿６８ＭＡＲの有望な転写因子結合部位のマップを示す。
【図１３】ＡＴリッチコア（ＭＡＲ１４２９〜２８８０）とプロモーターおよび緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の上流に配置された転写因子における化学合成されたＤＮＡ結合部位との構築物から作成された合成ＭＡＲの活性について試験するのに用いられるプラスミドのマップである。
【図１４】図１３に記載のように作成された合成ＭＡＲによる転写促進を図示したものである。
【図１５】表５に詳述されるＤＮＡ結合部位を含む合成ＭＡＲによる転写促進を図示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、非ヒト動物由来の単離、精製されたＭＡＲ配列、それら配列を同定する方法およびヒト細胞内および齧歯類細胞などの非ヒト細胞内でのタンパク質の高収率の生成を目的としてそれら配列を用いる系に関する。
【００２４】
本発明は、ＭＡＲコンストラクト、特に促進されたＭＡＲコンストラクト、これらのＭＡＲコンストラクトを用いる発現系およびキット、ならびにタンパク質の生成、特に大規模生成や治療におけるそれらの使用も対象とする。
【００２５】
さらに本発明は、ヒト細胞および非ヒト哺乳類細胞におけるＭＡＲコンストラクトを介するタンパク質の高収率の生成を目的とする方法を対象とする。
【００２６】
他に特に規定されない限り、本明細書で用いられるあらゆる科学技術用語は、本発明に関係する当業者により一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書中に記載の方法および材料とは異なるものが本発明の実施において用いられうるが、典型的で（ｅｘａｍｐｌａｒａｔｏｒｙ）適切な方法および材料が下記に記載されている。
【００２７】
本発明に記載の発現カセットは、少なくとも１つの遺伝子およびこの遺伝子の転写に必要とされる要素を含む核酸である。
【００２８】
本発明に記載のプロモーターは、遺伝子の上流に位置する場合に遺伝子の転写を促進するＤＮＡの制限領域である。
【００２９】
細胞内での発現、例えば非ヒト哺乳類細胞内での発現は、本発明との関連ではインビトロおよびインビボでの発現を示す。インビトロ発現は、例えばＨｅＬａ細胞系またはＣＨＯ細胞系などの細胞系内およびインビトロ遺伝子療法において用いられる細胞内での発現を含む。インビボ発現は、トランスジェニックの非ヒト動物における発現や、遺伝子療法でのヒトレシピエントへの細胞の再導入後のインビボ遺伝子療法またはインビトロ遺伝子療法で用いられるヒト細胞内での発現を含む。
【００３０】
本発明によると、哺乳類細胞、例えば非ヒト哺乳類細胞は、細胞培養条件下で維持可能である。細胞のこのタイプの非限定例がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。
【００３１】
本発明に記載のＭＡＲコンストラクト、ＭＡＲ要素、ＭＡＲ配列、Ｓ／ＭＡＲまたは単にＭＡＲは、天然の「ＳＡＲ」または「ＭＡＲ」と１つもしくは複数の（例えば２つ、３つもしくは４つの）特性を共有しかつ前記ＭＡＲの作用により任意の遺伝子のタンパク質発現を促進する少なくとも１つの特性を有するヌクレオチド配列である。ＭＡＲコンストラクトは、ＭＡＲ活性、特に転写調節、好ましくは促進の活性だけでなく、例えば発現安定性の活性および／または「促進されたＭＡＲコンストラクト」としても記載の他の活性を伴う単離および／または精製された核酸としての特徴も有しうる。ＭＡＲコンストラクトはその主要な基礎である同定されたＭＡＲに基づいて定義される場合があり、それ故、ＭＡＲ  Ｓ４コンストラクトはそのヌクレオチドの大半（５０％以上）がＭＡＲ  Ｓ４に基づくＭＡＲコンストラクトである。一般に認められたモデルによると、天然のＳＡＲまたはＭＡＲは、特定のＤＮＡ配列の核マトリックスに対する足場を媒介し、ヘテロクロマチンコアから外部に延在するクロマチンループドメインを生成する。ＳＡＲまたはＭＡＲが任意の明確なコンセンサス配列もしくは認識可能な配列を有することはない一方、それらの最も一貫性のある特徴は全体的にＡおよびＴ含量が高くかつＣ塩基が一方の鎖で支配的であることのように見える。ＭＡＲは一般に、場合により鎖の分離を生じさせやすいベント二次構造を形成する傾向を有する。ＡおよびＴ含量の高いいくつかの簡単な配列モチーフがＳＡＲおよび／またはＭＡＲ内に見出されることが多いが、大部分ではそれらの機能的重要性および潜在的な作用様式は未解決のままである。これらは、脊椎動物またはショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）においては、Ａボックス、Ｔボックス、ＤＮＡ巻き戻しモチーフ（ＤＮＡ  ｕｎｗｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｔｉｆ）、ＳＡＴＢ１結合部位（Ｈボックス、Ａ／Ｔ／Ｃ２５）およびコンセンサストポイソメラーゼＩＩ部位を含む。
【００３２】
本発明に記載のＭＡＲ候補またはＭＡＲ候補配列は、天然のＳＡＲまたはＭＡＲと１つもしくは複数、例えば２つ、３つもしくは４つの特性を共有する配列である。
【００３３】
本発明に記載の同定されたＭＡＲまたは同定されたＭＡＲ配列は、単離ヌクレオチド配列であり、かつその天然対応物のタンパク質／遺伝子の発現の十分な促進を可能にするあらゆる領域（「モジュール」または「要素」）を含む点で天然ＭＡＲ配列に対応する。
【００３４】
同定されたＭＡＲのモジュール（本明細書中で「領域」、「ＤＮＡ領域」、「一部」、「ドメイン」とも称される）のすべては、天然ＭＡＲの能力に対してタンパク質／遺伝子の発現の促進を可能にするのに必要とされる。一般に、単独でＭＡＲの十分な活性を発揮することが可能なモジュールは全く存在しない。これらの領域の一部、例えば下記のＡＴ−ジヌクレオチドリッチのベント領域および転写因子結合部位（ＴＦＢＳ）領域は配列特異的である。他の「領域」については、それらの位置、例えば同定されたＭＡＲ配列の５’および３’末端領域により特徴づけられる。
【００３５】
ＡＴ／ＴＡ−ジヌクレオチドリッチのベントＤＮＡ領域（以後「ＡＴリッチ領域」と称される）は、特にジヌクレオチドＡＴおよびＴＡの形態で大量のＡおよびＴを含むベントＤＮＡ領域である。好ましい実施形態では、それは隣接する１００塩基対のストレッチ上のジヌクレオチドＴＡの少なくとも１０％および／またはジヌクレオチドＡＴの少なくとも１２％、好ましくは隣接する１００塩基対のストレッチ上（またはＡＴリッチ領域の長さがより短い場合にはより短い各ストレッチ上）のジヌクレオチドＴＡの少なくとも３３％および／またはジヌクレオチドＡＴの少なくとも３３％を有する一方、ベント二次構造を有する。しかし、「ＡＴリッチ領域」は、約３０ヌクレオチド長かもしくはそれに満たない程度に短い場合があるが、好ましくは約５０ヌクレオチド長、約７５ヌクレオチド長、約１００ヌクレオチド長、約１５０、約２００、約２５０、約３００、約３５０もしくは約４００ヌクレオチド長であるかまたはそれより長いものである。
【００３６】
下記に考察されるように、ＡＴリッチ領域は、例えばその比較的高い曲げ角度により、隣接領域、例えば結合部位領域から区別可能である。脊椎動物またはショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）におけるＳＡＴＢ１結合部位（Ｈボックス、Ａ／Ｔ／Ｃ２５）およびコンセンサスのトポイソメラーゼＩＩ部位などの一部の結合部位は比較的高いＡおよびＴの含量を有することも多い。しかし、一群の結合部位を含む結合部位領域（モジュール）、特にＴＦＢＳ領域は、領域の曲げパターンの比較により、ＡおよびＴ含量の高い結合部位由来のＡＴおよびＴＡジヌクレオチドリッチ領域（「ＡＴリッチ領域」）から容易に識別可能である。例えばヒトＭＡＲ１＿６８においては、ＡＴリッチ領域が平均で約３．８もしくは約４．０を超える曲度を有しうる一方、ＴＦＢＳ領域は平均で約３．５もしくは約３．３未満の曲度を有しうると思われる。同定されたＭＡＲの領域は、代替手段、例えば限定はされないが、本明細書中の他の箇所に記載の相対融解温度によっても確認可能である。しかし、かかる値は、種特異的であることから種間で異なる場合があり、例えばより低い場合がある。したがって、各々のＡＴおよびＴＡジヌクレオチドリッチ領域は、約３．２〜約３．４もしくは約３．４〜約３．６もしくは約３．６〜約３．８など、より低い曲度を有する場合があり、かつＴＦＢＳ領域は約２．７未満、約２．９未満、約３．１未満、約３．３未満など、比例的により低い曲度を有する場合がある。ＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ  ＩＩでは、各々、より小さいウインドウサイズが当業者により選択されることになる。
【００３７】
本発明に記載の同定されたＭＡＲ／ＭＡＲ配列の末端領域は、同定されたＭＡＲの少なくとも約５％、約６％、約７％、約８％、約９％もしくは約１０％を含む。
【００３８】
結合部位またはＤＮＡタンパク質結合部位は、ＤＮＡ結合タンパク質に結合可能な任意のヌクレオチド配列である。ＤＮＡ結合タンパク質に対する結合部位は典型的にはＴＦＢＳである。ＴＦＢＳは転写因子に結合可能な任意の配列である。ＴＦＢＳの供給源は、例えば限定はされないが、ヒトまたはマウスなど任意でありうる。ＴＦＢＳは設計または合成も可能である。しかし特定の実施形態では、ＴＦＢＳは、ＭＡＲ配列内、例えば同一生物、同一種または同一属のＭＡＲ配列内に相当物を有する。しかし、ＴＦＢＳは異なる種または異なる属のＭＡＲ配列に由来しうる。ＭＡＲ配列内に現在既知の相当物を全く有しないＴＦＢＳについても本発明の範囲内である。かかるＴＦＢＳは、限定はされないが、ＵＳＦ１（上流刺激因子１）またはジンクフィンガータンパク質ＣＴＣＦに対する結合部位を含みうる。ＴＦＢＳは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つもしくはそれより多くの置換、付加および／または欠失により修飾され、かつ完全または部分的に合成されうる。最適化されたＴＦＢＳは、各ＤＮＡ結合タンパク質に対して最適化された結合親和性を有するＴＦＢＳであり、既知の天然対応物を全く有しないことが多く、本発明の範囲内でもある。それらの最適化されたＴＦＢＳであれば、天然のＴＦＢＳの上記の修飾によるかまたは合成、特に化学合成により生成可能である。本発明の特定の実施形態では、結合部位またはＴＦＢＳは、例えば組織特異的な天然か、設計または合成された制御タンパク質または他の天然か、設計または合成されたタンパク質による結合により、ＭＡＲに組織特異性を与え、それは例えば特定の薬剤および分子に応答しうる。遺伝子および／または細胞療法は、組織特異性およびＭＡＲにおける特定の薬剤に特異的に応答する、つまり薬剤により誘発可能な能力から利益を得る典型的な場合である。前者の場合、例えば目的の遺伝子であれば特定の器官内または組織内に限って発現されることになり、後者の場合での発現であれば、例えば特定の薬剤への応答に限って刺激可能である。ＴＦＢＳが含められうる転写因子の他の非限定例として、例えば、ＳＡＴＢ１、ＮＭＰ４、ＭＥＦ２、Ｓ８、ＤＬＸ１、ＦＲＥＡＣ７、ＢＲＮ２、ＧＡＴＡ１／３、ＴＡＴＡ、Ｂｒｉｇｈｔ、ＭＳＸ、ＡＰ１、Ｃ／ＥＢＰ、ＣＲＥＢＰ１、ＦＯＸ、Ｆｒｅａｃ７、ＨＦＨ１、ＨＮＦ３α、Ｎｋｘ２５、ＰＯＵ３Ｆ２、Ｐｉｔ１、ＴＴＦ１、ＸＦＤ１、ＡＲ、Ｃ／ＥＢＰγ、Ｃｄｃ５、ＦＯＸＤ３、ＨＦＨ３、ＨＮＦ３β、ＭＲＦ２、Ｏｃｔ１、ＰＯＵ６Ｆ１、ＳＲＦ、Ｖ＄ＭＴＡＴＡ＿Ｂ、ＸＦＤ２、Ｂａｃｈ２、ＣＤＰ  ＣＲ３、Ｃｄｘ２、ＦＯＸＪ２、ＨＦＬ、ＨＰ１、Ｍｙｃ、ＰＢＸ、Ｐａｘ３、ＴＥＦ、ＶＢＰ、ＸＦＤ３、Ｂｒｎ２、ＣＯＭＰ１、Ｅｖｉｌ、ＦＯＸＰ３、ＧＡＴＡ４、ＨＦＮ１、Ｌｈｘ３、ＮＫＸ３Ａ、ＰＯＵ１Ｆ１、Ｐａｘ６および／またはＴＦＩＩＡが挙げられる。
【００３９】
結合部位、例えばＴＦＢＳは、コアヌクレオチド配列および結合部位の分離距離が約２００以下、好ましくは約１００ヌクレオチド以下、さらにより好ましくは約５０ヌクレオチド以下、さらにより好ましくは約２５以下、約１５以下、約５ヌクレオチド以下であるかまたは０ヌクレオチドである場合、コアヌクレオチド配列に隣接するといわれる。好ましい実施形態では、結合部位、特にＴＦＢＳは、それ自体でＴＦＢＳの両側に最大で２５ヌクレオチドの短いリンカーまたはアダプターを含む。さらにより好ましい実施形態では、ＴＦＢＳは、最大で約５０ヌクレオチド、最大で約４０ヌクレオチドまたは最大で約３０ヌクレオチドのオリゴマーの一部である。本発明に記載の一連の結合部位、例えばＴＦＢＳは、互いに隣接して配列内に並んだ一連のＴＦＢＳである。一連のＴＦＢＳは、コアに近いこの一連のＴＦＢＳが上で特定された距離を有する場合、コアヌクレオチド配列に隣接するといわれる。結合部位は、結合部位がコアヌクレオチド配列の一部の結合部位でありかつ天然のＭＡＲ内の同一位置に相当物を有する場合、「ＡＴリッチ領域」に隣接するといわれる。
【００４０】
結合部位は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つもしくはそれより多くの置換、付加および／または欠失により修飾されうる。好ましくは、これらの置換、付加および／または欠失は、結合部位が各結合部位のコンセンサス配列に一致するように導入される。
【００４１】
種々の促進されたＭＡＲコンストラクトは本発明の一部であり、かつ本発明に記載のＭＡＲコンストラクトの基礎となりうる天然でありかつ／または同定されたＭＡＲ、特にコア核酸配列の基礎となる天然のＭＡＲに対して全体的に促進をもたらす特性を有する。かかる特性は、限定はされないが、完全長で天然でありかつ／または同定されたＭＡＲに対する長さの短縮、遺伝子発現／転写の促進、発現安定性の促進、組織特異性、誘発性またはそれらの組み合わせを含む。したがって、促進されたＭＡＲコンストラクトは、例えば、同定されたＭＡＲ配列のヌクレオチド数の約９０％未満、好ましくは約８０％未満、さらにより好ましくは約７０％未満、約６０％未満、または約５０％未満を含む。ＭＡＲコンストラクトは、適切な細胞の前記コンストラクトによる形質転換時に遺伝子の発現および／または遺伝子の転写を促進しうる。本発明と関連し、「発現を促進する」か、「遺伝子発現促進活性」を有するか、「タンパク質発現を促進する」かまたはそれに類するＭＡＲコンストラクト／ＭＡＲ（ヌクレオチド）配列についての参照がなされる場合、この「促進」は、例えばかかる配列の不在下である以外は等しい条件下で発現される遺伝子の発現と比較されるものである。促進は、例えば約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍もしくは約１５倍、約２０倍もしくは約２５倍またはそれより高い可能性がある。
【００４２】
ＭＡＲコンストラクトはまた、極めて高産生の細胞の平均百分率を約５倍、約１０倍、約１５倍もしくはそれ以上に高めうる。したがって、遺伝子の発現を平均的に高める以外に、極めて高発現の細胞の百分率の増加、ならびに安定な（「耐性のある」）コロニーの発生の増加（約１００％、約２００％、約３００％もしくは約４００％もしくはそれより高い増加）、および／または発現の変動性の低下（約３０％、約４０％、約５０％もしくはそれ以上のｃｖ（変動係数）の低下）が本発明の範囲内である。
【００４３】
ＭＡＲコンストラクトまたはそれに類するものは「発現の安定性を促進する」場合がある。この「促進」は、例えばＭＡＲコンストラクト／ＭＡＲ配列の不在下である以外は等しい条件下で発現される遺伝子の発現と比較されるものである。安定性の促進では、例えば最大で約５週、１０週、２０週、２５週、３０週、３５週、４０週、４５週、もしくは５０週後に１００％の促進が維持可能である。ＭＡＲコンストラクトは、例えば筋肉、肝臓、中枢神経系もしくは他の組織に対して特異的である場合があり、および／あるいは、例えば抗生物質、ホルモンおよび／または代謝中間体などの物質の投与時に誘発されうる。
【００４４】
ＭＡＲコンストラクト／ＭＡＲ配列は、好ましくは目的の遺伝子が作動可能に連結されるかまたは連結可能であるプロモーター領域の上流に挿入されうる。しかし特定の実施形態では、ＭＡＲコンストラクトが目的の遺伝子／ヌクレオチド酸配列の上流および下流もしくは下流だけに位置することが有利である。シスおよび／またはトランスの双方の他の複数のＭＡＲ配列についても本発明の範囲内である。
【００４５】
ＭＡＲコンストラクトまたはＭＡＲの領域は、天然の「ＳＡＲ」または「ＭＡＲ」もしくはその各領域と１つもしくは複数の（例えば２つ、３つもしくは４つの）特性を共有しかつ前記ＭＡＲの作用により任意の遺伝子のタンパク質発現を促進する少なくとも１つの特性を有する場合、例えば同定されたＭＡＲまたは同定されたＭＡＲの領域に基づくといわれる。これらのＭＡＲコンストラクトまたはＭＡＲの領域は、一般に、本明細書中で提供される用語の定義によると、それらの基礎となる同定されたＭＡＲと「実質的同一性」を有する。これらおよび／またはそれらのヌクレオチド配列の修飾にもかかわらず、それらは基礎となる同定されたＭＡＲの少なくとも１つの機能性／特性を維持することになる。
【００４６】
本発明は、促進されたＭＡＲコンストラクトを含むＭＡＲコンストラクトの使用も対象とする。これらの使用では、ＭＡＲコンストラクトは、１つもしくは複数の非ＭＡＲ後生的遺伝子制御ツール、例えば限定はされないが、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）などのヒストン修飾因子、遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）などの他のＤＮＡ要素、ｃＨＳ４もしくは抗リプレッサー（ａｎｔｉｒｅｐｒｅｓｓｏｒ）要素（例えば安定剤）および抗リプレッサー要素（ＳＴＡＲもしくはＵＣＯＥ因子）などのインシュレーター、またはホットスポット（クワックス  Ｔ．Ｈ．Ｊ．（Ｋｗａｋｓ  Ｔ．Ｈ．Ｊ．）およびオッテ  Ａ．Ｐ．（Ｏｔｔｅ  Ａ．Ｐ．））とも併用可能である。
【００４７】
合成は、ＭＡＲ／ＭＡＲコンストラクトとの関連で用いられる場合、同定されたＭＡＲまたはそれに基づくＭＡＲの配列／領域または部分領域における単純なリシャッフリング、複製および／または欠失以上のものを含む設計であるＭＡＲを示す。特に、合成ＭＡＲ／ＭＡＲコンストラクトは、一般に同定されたＭＡＲの１つもしくは複数、好ましくは１つの領域を含むが、特定の実施形態では、場合によっては合成または修飾されるとともに特別に設計され、十分に特徴づけられた要素、例えば単一もしくは一連のＴＦＢＳであると思われ、それらは好ましい実施形態では合成的に生成される。これらのデザイナー要素は、多数の実施形態では比較的短く、特にそれらは一般に約３００ｂｐｓ長以下、好ましくは約１００、約５０、約４０、約３０、約２０もしくは約１０ｂｐｓ長以下である。特定の実施形態では、これらの要素は多量体化されうる。
【００４８】
本発明に記載の非ヒト哺乳類のＭＡＲは、少なくとも部分的には非ヒト哺乳類生物のゲノムまたはゲノムの一部を介して確認されるＭＡＲ／ＭＡＲ配列である。これは例えば、限定はされないがマウスゲノムなどの齧歯類ゲノムの分析を介して同定されるＭＡＲ／ＭＡＲ配列を含む。
【００４９】
本発明に記載のベクターは、連結されている別の核酸分子を輸送可能な核酸分子である。例えば、プラスミドは１種のベクターであり、レトロウイルスまたはレンチウイルスは別種のベクターである。
【００５０】
本発明に記載の形質移入は、例えば限定はされないが、エレクトロポレーション、リポフェクションによるか、ウイルスベクターまたは化学的手段を介する、核酸のレシピエント真核細胞への導入である。
【００５１】
本明細書中で用いられる形質転換は、核酸の付加による真核細胞の修飾を示す。例えば、細胞の形質転換は、例えばＤＮＡベクターのエレクトロポレーションを介する導入による細胞への核酸の形質移入を含みうると思われる。しかし、本発明の多数の実施形態では、本発明の促進されたＭＡＲを細胞に導入する方法は任意の特定の方法に限定されることはない。
【００５２】
転写はＤＮＡ鋳型からのＲＮＡの合成を意味する。
【００５３】
シスは、同一の核酸分子、例えば限定はされないが同一のベクターまたは染色体上での２種以上の要素（例えばクロマチン因子）の配置を示す。
【００５４】
トランスは、２種以上の核酸分子、例えば限定はされないが２種以上のベクターまたは染色体上での２種以上の因子（例えばクロマチン因子）の配置を示す。
【００５５】
配列は、シス／トランス位置からその活性を発揮する場合、例えば遺伝子に対してシスおよび／またはトランスで作用するといわれる。
【００５６】
本発明に記載のウインドウは、例えばＳＭＡＲ  Ｓｃａｎの方法を実施する間、ＭＡＲについて評価される塩基対の数を表す。この数は通常、約５０ｂｐｓ、約１００ｂｐｓ、約２００ｂｐｓ、約３００ｂｐｓである。しかし、４００ｂｐｓ、５００ｂｐｓ、６００ｂｐｓもしくはそれより大きいｂｐｓのウインドウも本発明の範囲内である。
【００５７】
ヌクレオチド配列またはその断片は、他のヌクレオチド配列（またはその相補鎖）と（適切なヌクレオチドの挿入または欠失により）最適に整列される場合、ヌクレオチド塩基の少なくとも約６０％、通常は少なくとも約７０％、より通常は少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、およびより好ましくは少なくとも約９５〜９８％のヌクレオチド配列の同一性がある場合に、もう一方と実質的同一性を有する。
【００５８】
同一性は、２つのヌクレオチド配列間の配列の、かかる配列、例えば十分かつ完全な配列の２つの鎖間の一致を同一性により判定するときの、関連性の程度を意味する。同一性は容易に計算可能である。２つのヌクレオチド配列間の同一性を測定するには多数の方法が存在する一方で「同一性」という用語は当業者に周知である（「Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、レスク  Ａ．Ｍ．（Ｌｅｓｋ  Ａ．Ｍ．）編、オクスフォード大学出版会（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、１９８８年；「Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ」、スミス  Ｄ．Ｗ．（Ｓｍｉｔｈ  Ｄ．Ｗ．）ら、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、１９９３年；「Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ」、グリフィン  Ａ．Ｍ．（Ｇｒｉｆｆｉｎ  Ａ．Ｍ．）およびグリフィン  Ｈ．Ｇ．（Ｇｒｉｆｆｉｎ  Ｈ．Ｇ．）編、ヒューマナ・プレス（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）、ニュージャージー（Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）、１９９４年；「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、フォン・ハインジェ  Ｇ．（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ  Ｇ．）、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、１９８７年；および「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ」、グリブスコフ  Ｍ．（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ  Ｍ．）およびデベルクス  Ｊ．（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  Ｊ．）編、エム・ストックトン・プレス（Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、１９９１年）。２つの配列間の同一性を測定するのに一般に用いられる方法は、限定はされないが、「Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｈｕｇｅ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ」、マーティン  Ｊ．ビショップ（Ｍａｒｔｉｎ  Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ）編、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）、１９９４年およびカリリョ  Ｈ．（Ｃａｒｉｌｌｏ  Ｈ．）およびリップマン  Ｄ．（Ｌｉｐｍａｎ  Ｄ．）、ＳＩＡＭ  Ｊ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．４８：１０７３頁（１９８８年）に開示された方法を含む。同一性を測定するための好ましい方法は、試験対象の２つの配列間の最大の一致が得られるように設計される。かかる方法は、コンピュータプログラム内にコード化される。２つの配列間の同一性を測定するのに好ましいコンピュータプログラムの方法は、限定はされないが、ＧＣＧ（ジェネティックス・コンピュータ・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）、ウィスコンシン州マディスン（Ｍａｄｉｓｏｎ））プログラムパッケージ（デベルクス  Ｊ．（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  Ｊ．）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２（１）．３８７頁（１９８４年））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（アルツシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら（１９９０年）；アルツシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら（１９９７年））を含む。同一性の測定のため、周知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズ���も用いられうる。
【００５９】
例として、参照ヌクレオチド配列と例えば少なくとも９５％の「同一性」を有するヌクレオチド配列を含む核酸は、核酸のヌクレオチド配列が参照配列と、各参照ヌクレオチド配列の１００個のヌクレオチド当たり最大で５つの点突然変異を含みうる点を除いて同一であることを意味する。言い換えると、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有するヌクレオチドを得るため、参照配列内のヌクレオチドの最大で５％が欠失されるかまたは別のヌクレオチドと置換されうるか、あるいは参照配列内の全ヌクレオチドの最大で５％の数のヌクレオチドが参照配列内に挿入されうる。参照配列のこれらの突然変異は、参照ヌクレオチド配列の５’もしくは３’末端位置またはそれら末端位置間のいずれかの場所で生じ、参照配列内のヌクレオチド内に別々にかまたは参照配列内の１つもしくは複数の隣接基内のいずれかで散在されうる。
【００６０】
ヌクレオチド配列の機能的断片もまた本発明の一部である。断片は天然対応物の配列における特にそれらの作用を受ける遺伝子の発現を増大させるという所望の機能を維持する限り機能的であると考えられる。ＭＡＲまたはＭＡＲ領域の断片は、その欠失がＭＡＲ／領域の転写促進活性を低下させてもそれを失わせることがない場合にはやはり機能的断片であると考えられる。「完全に機能的な断片」は、断片が他のＭＡＲ配列なしに用いられる場合に活性における任意の低下が、たとえ観察されたとしても、統計的に検証不可能である断片である。また、例えば天然ＭＡＲ、同定されたＭＡＲ、ＭＡＲ領域またはこれらのうちの任意の断片と本明細書で提供される定義に準じる実質的同一性を有する機能的断片は本発明の範囲内に含まれる。
【００６１】
本明細書中で詳細に記載のように、特定の実施形態では、モジュールもしくはその一部がリシャッフルされ、複製され、かつ／または欠失が施される。当業者が理解するであろうように、かかる領域のシャッフリングおよび／または複製により、例えば新たな制限部位が生成され、次いでそのように生成されたコンストラクトの新たな制限パターンの生成が可能であり、かつ配列の長さが調節されることになりうる。それらの調節は、限定はされないが、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１０〜１５個、１５〜２０個、２０〜２５個、２５〜３０個、３０〜３５個、３５〜４０個のヌクレオチドに作用しうる。これらの調節および他の修飾は本発明の範囲内である。各要素（または領域／モジュール）および／またはそれらの断片の各々と本明細書で提供される定義に準じる実質的同一性を有する、再配列されたＭＡＲ、特にリシャッフルされかつ／または複製されたＭＡＲの配列は本発明の範囲内である。
【００６２】
ＭＡＲ配列は、植物から哺乳類細胞またはその逆方向に移される可能性があり、異種の宿主細胞内の核マトリックス付着活性を保持することになる［ブレイン  Ｐ．（Ｂｒｅｙｎｅ  Ｐ．）、ヴァン・モンタグ  Ｍ．（Ｖａｎ  Ｍｏｎｔａｇｕ  Ｍ．）、デピッカー  Ａ．（Ｄｅｐｉｃｋｅｒ  Ａ．）およびゲイセン  Ｇ．（Ｇｈｅｙｓｅｎ  Ｇ．）、ミエルケ  Ｃ．（Ｍｉｅｌｋｅ  Ｃ．）、コーウイ  Ｙ．（Ｋｏｈｗｉ  Ｙ．）、コーウイ−シゲマツ  Ｔ．（Ｋｏｈｗｉ−Ｓｈｉｇｅｍａｔｓｕ  Ｔ．）およびボーデ  Ｊ．（Ｂｏｄｅ  Ｊ．）］。ＭＡＲのこの保持がより高等なすべての真核生物において機能すると仮定すると、ある属由来のＭＡＲ配列であれば同配列が別の属などに由来する属内で同様に機能することを想定することになる。
【００６３】
とはいえ、齧歯類由来のＭＡＲ配列であればある意味で組換えタンパク質の生成にとって有利でありうるとの判断から、全マウスゲノムがスクリーニングされ、下記のようなＤＮＡ配列の構造的特徴（例えばＤＮＡベンド）を検出するコンピュータプログラム、ＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ  Ｉを用いてＭＡＲ候補配列が同定された。
【００６４】
下記に考察のように、驚くべきことに、非ヒト、特に齧歯類（ここではマウス）のＭＡＲ配列が、例えばＣＨＯ細胞内やＨｅＬａ細胞などのヒト細胞内において発現促進に関してより強力であることが見出された。さらに一層驚くべきことに、特定の非ヒトＭＡＲ配列が、ヒトＭＡＲ配列よりも非ヒト細胞、例えばＣＨＯ細胞ならびにヒト細胞、例えばＨｅＬａ細胞の双方において実質的に優れた働きをすることが見出された。
【００６５】
マウス由来の同定された新規のＳ／ＭＡＲ  ＤＮＡ配列のいくつかがトランス遺伝子の発現を増大させることが示され、それ故、ヒトＭＡＲ配列用に設計されかつそれを用いて試験されたプログラムであるＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ  Ｉが多数のゲノムの供給源、例えばヒトに加えてマウスに由来するＳ／ＭＡＲ要素を同定するための効率的なツールであるという証拠が提供された。しかし重要なことには、より強力なＭＡＲ要素がヒトゲノムのスクリーニングよりも齧歯類（例えばマウス）ゲノムのスクリーニングにより同定可能であることが見出された。特に、本発明は、マウスゲノム由来の活性の高いＳ／ＭＡＲ要素を用い、種々の細胞内、特にマウスおよびヒト細胞内で組換えタンパク質、例えば医薬品用途を有する組換えタンパク質の生成が増大可能であることを確立している。マウスＳ／ＭＡＲ  Ｓ４は、新規に単離されたマウスＭＡＲおよび予めクローニングされたヒトＭＡＲにおいて最も強力であることが示された。したがって、本発明は、促進されたンパク質生成を有する非ヒトＭＡＲおよび／またはタンパク質発現の安定性を長期にわたり高めるＭＡＲを対象とする。
【００６６】
ＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ  Ｉは、これらの配列の構造的かつ物理化学的な特徴に基づきＭＡＲ候補配列を同定するソフトウェアツールである。本方法についての徹底した考察が他に提供されている（マーモド（Ｍｅｒｍｏｄ）らに交付された米国特許出願公開第２００７０１７８４６９号明細書）。「ＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ」は、本質的には、ジヌクレオチド重み行列に基づいて特性を認識し、ＤＮＡの高次構造的かつ生理化学的な特性における理論値を計算するアルゴリズムを含むバイオインフォーマティクスツールを示す。好ましくは、ＳＭＡＲ  Ｓｃａｎは可変サイズの走査ウインドウを用い、多種多様な組み合わせでのＤＮＡベンディング、主溝の深さおよび副溝の幅のポテンシャル、融解温度に対応するＤＮＡ配列の特徴を評価する。各特徴においては、カットオフまたは閾値が設定される必要がある。プログラムは、所与領域の計算されたスコアが設定されたカットオフ／閾値を超えるごとにヒットを返す。
【００６７】
ヒットを扱うため、２つのデータ出力モードが使用可能であり、第１のモード（「プロファイル様（ｐｒｏｆｉｌｅ−ｌｉｋｅ）」）は、単純に、クエリー配列上のあらゆるヒット位置および選択された異なる基準に対するそれらの対応する値を返す。第２のモードは（「隣接ヒット」と称される）は、いくつかの隣接ヒットの位置およびそれらの対応する配列のみを返す。このモードにおいては、隣接ヒットの最小数は、さらに調節可能なウインドウサイズで設定可能な別のカットオフ／閾値である。例えば４つの理論上の構造的基準におけるデフォルトのカットオフ／閾値を調節するため、例えばＳＭＡＲｔ  ＤＢから実験的に検証されたＭＡＲを用いてもよい。このように、例えばデータベースからのすべてのヒトＭＡＲ配列が、４つの基準を有しかつ設定されたカットオフ／閾値を全く有しない「プロファイル様」モードを用いるＳＭＡＲ  Ｓｃａｎで検索され、分析された。これは配列の全位置における各機能の設定を可能にした。次いで、各基準における分布はこれらのデータにより計算された（図１および３を参照、マーモド（Ｍｅｒｍｏｄ）らに交付された米国特許出願公開第２００７０１７８４６９号明細書）。
【００６８】
ＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ技術の利用がＭＡＲ配列の同定のために好ましいものである一方、当業者は、同程度かまたはやや低めでもある選択性を有するＳ／ＭＡＲモチーフの同定を可能にする他のバイオインフォーマティクスツールが本発明との関連で使用可能であることを理解するであろう。好ましくは、設定された閾値またはカットオフ値である特定の値を超えるこれらの特徴を示すＭＡＲに関連した特徴のみが正のヒットを生成するかまたは生成するように設定可能であるようにかかるツールを設定可能である。しかし、ＭＡＲの同定に用いられる多数のバイオインフォーマティクスツールが、マトリックス−結合活性を同定するように設計された。この活性は遺伝子発現を増大させる能力と必ずしも相関するものではない［フィー−バン  Ｌ．（Ｐｈｉ−Ｖａｎ  Ｌ．）およびストラトリング  Ｗ．Ｈ．（Ｓｔｒａｔｌｉｎｇ  Ｗ．Ｈ．）］。
【００６９】
ＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ  ＩはヒトＭＡＲの同定を目的に開発されている。したがって、それは既知のヒトＭＡＲから収集された構造データを用いて開発された。ヒトに「調節された」ＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ  Ｉプログラムが本発明との関連で用いられ、マウスゲノムのＭＡＲ配列についての評価がなされた。しかし、マウスおよびヒトゲノムの塩基組成における差異から、ヒトゲノムを走査するための予め規定された設定を有するＳＭＡＲ  Ｓｃａｎプログラムの使用が抑えられた（マーモド（Ｍｅｒｍｏｄ）らに交付された米国特許出願公開第２００７０１７８４６９号明細書）。したがって、プログラムによる管理可能に回収された候補マウスＭＡＲ配列の同定が可能になるまで、明確なウインドウサイズおよび構造パラメータの閾値が試行錯誤により規定される必要があった。それらのいくつかは、試験される場合、例えば各タンパク質をコードする遺伝子を有するベクター上に配置されかつ齧歯類細胞系に導入される場合、結局はタンパク質生成の実質的増大を可能にするＭＡＲ配列である「スーパー（ｓｕｐｅｒ）ＭＡＲ配列」となった。
【００７０】
マウスＭＡＲ  Ｓ４およびマウスＭＡＲ  Ｓ４６は、本発明の範囲内である齧歯類ＭＡＲ配列の例である。単離されたこれらのＭＡＲ配列は添付の配列表で配列番号３および配列番号１０として示される。しかし、当業者が理解するように、塩基対の挿入、欠失、置換、特に塩基対の挿入、欠失または置換を自ら有しうるこれらや他の非ヒトＭＡＲの断片は、野生型配列の特にそれらの作用により遺伝子の発現を増大させるという所望の機能を維持する限り本発明の範囲内である。例えば、ＭＡＲ配列の転写／遺伝子発現促進活性を低下させてもそれを失わせることがない挿入が、所望の機能、ここではＭＡＲの遺伝子発現促進と実質的に干渉することがないと考えられる。同様に、例えば同定されたＭＡＲの断片が、同定されたＭＡＲに対してやや低下した転写促進活性を有しても転写促進活性を完全に失わせることがない場合、やはり機能的断片であると考えられる。「完全に機能的な断片」は、活性における任意の低下が、観察されたとしても統計的に検証不可能である場合の断片である。本明細書中の他の箇所に詳述のように、天然ＭＡＲもしくはその断片のヌクレオチド配列と「実質的同一性」を有する配列も本発明の範囲内に含まれる。
【００７１】
ＭＡＲのモジュール性
同定されたＭＡＲの分析により、ＭＡＲがモジュール（または領域）、特に配列特異的モジュールを含むか否かが判定され、それを同定されたＭＡＲの設計または合成領域を含むＭＡＲを含む合成ＭＡＲの生成に利用できた。事実、同定されたＭＡＲのいくつかの配列特異的モジュールを確認できた。驚くべきことに、特定のモジュールもしくはその一部のシャッフリングおよび／または完全もしくは部分的な複製やさらには欠失により、上記のような促進されたＭＡＲがもたらされることが見出された。
【００７２】
マウス由来のヒト１＿６８ＭＡＲおよびＳ４  ＭＡＲは、領域のシャッフリング、欠失および／または複製によるＭＡＲコンストラクトを生成するためのモデルとして役立つことになる。しかし、当業者が容易に理解するように、本発明は、任意の同定されたＭＡＲの操作およびそれから得られるＭＡＲコンストラクトを対象とする。異なる由来のＭＡＲを含む異なるＭＡＲに対応するのに必要でありうる適切な調節は、当業者の技能の範囲内で十分に可能である。例として、限定はされないが、真核生物、好ましくは哺乳類、特にマウスなどのモデル動物、およびウシ、ブタ、ヒツジなどの経済的重要性のある種ならびにヒトが挙げられる。
【００７３】
ヒトＭＡＲのモジュール性
ヒト１＿６８ＭＡＲは、領域のシャッフリングおよび／または複製によりＭＡＲコンストラクトを生成するためのモデルとして役立った。下記のように確認されたモジュールもしくはその一部の使用により、ＭＡＲコンストラクトが同定されたＭＡＲ、例えばヒト１＿６８ＭＡＲに基づいて生成された。ＭＡＲコンストラクトは、特に領域（モジュール）もしくはその一部のシャッフリングおよび／または複製により生成された。
【００７４】
１＿６８ＭＡＲの例は、同定されたＭＡＲの（本明細書中で領域または要素とも称される）モジュールが遺伝子発現の促進を天然のＭＡＲの能力に対して可能にするのにすべて必要であったことを示す。ＭＡＲの完全な活性を単独で発揮できた同定されたモジュールは存在しなかった。驚くべきことに、特定のモジュールのシャッフリングおよび完全もしくは部分的な複製の結果、遺伝子発現のさらなる促進が得られることが見出された。
【００７５】
いくつかの非冗長な配列特異的モジュール（領域）が同定された。これらのモジュールは、局所クロマチン構造に作用するように協働する。ＭＡＲのこの機構は、後生動物の転写の制御にやや類似するものであり、すなわち開始部位から最大で数キロベースにわたり分散されたモジュールの多様な集合が全体として、転写が開始することになる場所を決定づける。
【００７６】
同定された配列特異的なモジュールは、特に（１）ＡおよびＴ含量の高い領域、例えば対称なＡＴリッチ領域（ＡおよびＴが交互にある）、特に「ＡＴリッチ領域」、および（２）結合部位が豊富な領域、特に、限定はされないがＡＴリッチ領域に分離されたＴＦＢＳであった。
【００７７】
ＡおよびＴ含量の高いベントＤＮＡが一般にプロモーター領域、ＭＡＲおよびレプリケーターにおいて見出されることが報告されている［アラジェ（Ａｌａｄｊｅｍ）およびファニング（Ｆａｎｎｉｎｇ）、２００４年］。従来、ＡおよびＴ含量の高い配列（上記の「対称」配列および一方の鎖には主にＡおよび他方の鎖には主にＴを有する配列である「非対称」配列）は、主に二本鎖の開鎖を促進すると考えられた。しかし、これらの領域は幅広い範囲の機能を有しうると思われる。例えば、ラミンＢ２レプリケーター内のＡおよびＴ含量の高い配列が複製開始点認識複合体（ＯＲＣ）に結合し［アブドゥラシドバ（Ａｂｄｕｒａｓｈｉｄｏｖａ）、ダナイロフ（Ｄａｎａｉｌｏｖ）ら、２００３年；ステファノヴィッチ（Ｓｔｅｆａｎｏｖｉｃ）、スタノイチッチ（Ｓｔａｎｏｊｃｉｃ）ら、２００３年］、インビトロでＭｃｍ４／６／７ヘリカーゼの負荷および二本鎖ＤＮＡの巻き戻しを促進しうる［ヨウ（Ｙｏｕ）、イシミ（Ｉｓｈｉｍｉ）ら、２００３年］。ＡおよびＴ含量の高い本質的なベントＤＮＡにおける構造的役割についても検討されている。分裂酵母ＯＲＣ４の「ＡＴ−フックＤＮＡ−結合モチーフ」は、移動度の高い集団であるタンパク質ＨＭＧ−Ｉ／Ｙのそれに類似するものであり、かかる構造的役割を有しうる［ストリック（Ｓｔｒｉｃｋ）およびラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）、１９９５年；ベル（Ｂｅｌｌ）、２００２年］。Ｖ（Ｄ）Ｊの組換えを促進するＨＭＧ−Ｉ／Ｙ媒介性のＤＮＡベンディングに類似したタンパク質媒介性のベンディング、および真核生物内のエンハンサーおよびプロモーターでの転写複合体の構築および安定化も生じうると思われる［レビン（Ｌｅｖｉｎｅ）およびチアン（Ｔｊｉａｎ）、２００３年］。高いＡおよびＴ含量を有する領域のすべてがベントＤＮＡに対応するわけではない。しかし、それらＤＮＡはベントであり、そうであればヒストンを引き付けてベントＤＮＡ全体にヌクレオソームを形成するための「ヒストンマグネット（ｈｉｓｔｏｎｅ  ｍａｇｎｅｔ）」として作用可能であり、複製／転写前タンパク質に対するランディングパッド（ｌａｎｄｉｎｇ  ｐａｄ）として自由に作用する隣接領域が残る。
【００７８】
上記のように、ＭＡＲは特に「結合部位が豊富な領域」または単に「結合部位領域」（上記（２）を参照）内に他のタンパク質に対する結合部位も有しうる。それらの他のタンパク質は、限定はされないが、１＿６８ＭＡＲ内に見出されるようなＤＮＡ巻き戻し要素−結合タンパク質（ＤＵＥ−Ｂ）およびＨｏｘタンパク質、ＳＡＴＢＩ、ＣＥＢＰなどの転写因子を含みうる。突然変異分析によると、これらの結合部位がＭＡＲ機能に寄与することが示される。
【００７９】
ヒト１＿６８ＭＡＲは、その方向を反転させかつベントＤＮＡを離すことで改善され、プロモーター領域の上流の転写因子結合部位領域のサイズの拡大が可能であった。図９でわかるように、多数のこれらの再配列されたＭＡＲ（例えばコンストラクト６）は、ＭＡＲを有しないコンストラクトに対し（１０倍）、また天然のＭＡＲを含むコンストラクトに対しても（コンストラクト１および１６；約２倍）転写をかなり増大させる。示されるデータは、末端の転写制御因子自体が下流のクロマチンにおける転写開始を制限することも明確に示す。天然ＭＡＲにおける前方の斜線ボックスとして示される、領域の３’末端に位置する２２３ｂｐの断片が、コンストラクト１１と比べ、コンストラクト７内のこの領域におけるあらゆる活性を保持する。これは、この重要な部分がこの場合にベント領域およびコンストラクト６内のこの因子の残り（ヌクレオチド１〜１４２５）の５’末端と協働することを示唆している。２つのＨＭＧ−Ｉ／Ｙ部位がこの末端の近隣に位置することが見出された。コンストラクト２では、２つの同定されたＭＡＲ配列が結合し合うことにより発現も増大されることが示される。
【００８０】
マウスＭＡＲのモジュール性およびサイズの低下
いくつかのＭＡＲがＳ４  ＭＡＲに基づき構築され（表３）、かつ特徴づけられた（図１０）。図１０で示されうるように、１６００ｂｐｓ長を超える断片における内部の欠失により、ＭＡＲの活性の低下はあまり生じなかった（Ｓ４−１−７０３＿２３２８−５４５７）。しかし、プロモーターに隣接する７９５−ｂｐ断片の欠失またはこの配列の同様の長さのルシフェラーゼ遺伝子の断片による置換（Ｓ４＿１−４６６１；Ｓ４＿１−４６６１−Ｌｕｃ５４８９）により、この活性の完全な低下が誘発された。
【００８１】
非配列特異的モジュール：３’末端のＭＡＲ配列の活性
ヒト１＿６８ＭＡＲを用いる実験（図９）では、ヒト１−６８ＭＡＲの３’ＨｏｘＦおよびＳＡＴＢＩ結合部位領域の重要性が既に示された。この領域の重要性は、図１０に示されるマウスＭＡＲ  Ｓ４を用いる実験によりさらに明示された。図１１に示されるように、ＭＡＲ  Ｓ４の３’末端配列の活性のさらなる分析のため、ＭＡＲのこの部分をその一部を取り出すかまたは複製することによってさらに分析した。図１１は、様々なＭＡＲ  Ｓ４誘導体の遺伝子発現に対する効果についても示す。興味深いことに、切断された３’末端を有する１つのかかる誘導体（元のＭＡＲ  Ｓ４における４６５８〜５０５４対４６５８〜５４５７）では、平均で、トランス遺伝子の発現がより長い元のＭＡＲ  Ｓ４配列よりもやや高い（１０４％対１００％）ことが示された。これは、ＭＡＲ要素のより強力でかつより短い誘導体が得られうることを示している。
【００８２】
したがって、本発明は長さが天然対応物よりもかなり短い高活性のＭＡＲコンストラクトを含むことから、それらは例えばベクターの設計および転移にとってより都合のよいサイズということになる。
【００８３】
特に、同定されたＭＡＲ配列のヌクレオチドの数の約９０％未満、好ましくは約８０％未満、さらにより好ましくは約７０％未満、約６０％未満もしくは約５０％未満を含むＭＡＲコンストラクトが本発明の範囲内である。それらのコンストラクトは、好ましくは同定されたＭＡＲの３’末端領域、さらにより好ましくは同定されたＭＡＲ／ＭＡＲ配列の３’末端領域の少なくとも約５％、約６％、約７％、約８％、約９％もしくは約１０％を含む。しかし、同定されたＭＡＲの５’末端領域を有するＭＡＲコンストラクトも本発明の範囲内である。
【００８４】
合成ＭＡＲ
ヒト１＿６８ＭＡＲの再配列では、特定の実施形態では、単離されたＭＡＲの前方の斜線部分の３’末端に位置するＨｏｘリッチ領域の２２３ｂｐの断片が完全長領域の活性を保持することが示された。これは、本発明の特定の実施形態ではこの部分が他の因子との協働において重要でありうることを示唆している。図１２は、ＭＡＴＩｎｓｐｅｃｔｏｒソフトウェアによる予測としてのＭＡＲ１＿６８の有望な転写因子結合部位の配列を示す。Ｃ／ＥＢＰ、ＮＭＰ４、ＦＡＳＴ１、ＳＡＴＢ１、およびＨｏｘＦ結合部位の位置が例示されており、それはそれらが５’側（前方の斜線）のフランキング配列内に豊富に存在することを図示している。
【００８５】
ヒトＭＡＲ１＿６８内のＡＴリッチのベントＤＮＡ領域と転写因子結合部位の間で協働が生じうるという発見により、１つもしくは数箇所の転写因子結合部位に隣接するＭＡＲ１−６８のＡＴリッチ領域を含むＭＡＲ／ＭＡＲコンストラクトの構築が促進された。図１３は、ＡＴリッチ領域およびＡＴリッチ領域の各末端での同定されたＭＡＲのＴＦＢＳを含むコア（ＭＡＲ１４２９〜２８８０）と緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）におけるプロモーターの上流に配置された転写因子のための化学合成されたＤＮＡ結合部位との構築物から作成された合成ＭＡＲの活性についての試験用に用いられるプラスミドのマップを示す。図１３は、特に、転写因子結合部位がＡＴリッチドメインとＧＦＰトランス遺伝子の発現を駆動するＳＶ４０プロモーターとの間に挿入され、図９で見出された状況が再現されたことを示し、ここでの最も好ましい設定では結合部位を有するＭＡＲ部分がプロモーターとベントＤＮＡ領域との間に挿入される（コンストラクト６）。表４は、用いられた化学合成されたオリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列を示す。
【００８６】
Ｃ／ＥＢＰ、ＮＭＰ４、ＦＡＳＴ１、ＳＡＴＢ１、およびＨｏｘＦ（Ｇｓｈとも称される）転写因子に対する結合部位がＭＡＲ１−６８配列から同定された（図１２）。ＭＡＲ１−６８内に存在するこれらの結合部位は変化なしに用いられるか（ＦＡＳＴ１、Ｃ／ＥＢＰ、ＨＯＸＦ／Ｇｓｈ）、またはコンセンサス（すなわち完全な）配列（ＨｏｘＦ、ＳａｔＢ１、ＮＭＰ４）と比べて１つもしくは２つのミスマッチを有する場合に訂正された。
【００８７】
図１４からわかるように、ここでの合成結合部位の付加により、ほぼすべての場合、いくつの特定の場合、ＡＴリッチ領域を含むコアＭＡＲ配列に対して有意な転写促進がもたらされた。活性ではＣ／ＥＢＰおよびＨｏｘまたはＧｓｈ２が最高でＳａｔＢ１およびＦａｓｔ１が次に高い一方、単一のＮＭＰ４部位が検出可能な効果を全く有しなかった。
【００８８】
図１４は、ＡＴリッチ領域の基礎となる同定されたＭＡＲの結合部位に隣接された、ここでのＭＡＲ１＿６８に基づくＭＡＲ１４２９〜２８８０であるコア配列の挿入により、発現においてあまり改善が得られなかったが、１つもしくは複数の結合部位をさらに含むＭＡＲコンストラクが、特にプロモーターの上流以外のＡＴリッチコアの下流に挿入される場合、プロモーターの制御下での遺伝子によるタンパク質の発現／生成においてかなりの促進が得られたという驚異的な結果を示す（ここではＭ３細胞の％により同定）。
【００８９】
好ましい実施形態では、追加の結合部位がプロモーターの上流以外のＡＴリッチコアの下流に存在する一方、例えば限定はされないが、ＡＴリッチ領域の上流、ＡＴリッチ領域内、コアのＡＴリッチ領域の隣接領域または遺伝子の下流における位置といった他の構成も本発明の範囲内である。
【００９０】
好ましい実施形態では、合成もしくは単離のいずれかのタンパク質結合部位の特定の組み合わせ、例えば２つの異なるタンパク質結合部位、３つの異なるタンパク質結合部位の組み合わせ、４、５、６、７、８、９、１０もしくはそれより多くのタンパク質結合部位の組み合わせが検討される。これらの組み合わせは完全または部分的に多量体化されうる。好ましい実施形態では、こうした組み合わせはＨｏｘ／ＧｓｈおよびＳＡＴＢ１を含む。これらの組み合わせまたは多量体化された組み合わせの例えばコアと適切なプロモーターとの間への挿入により、高発現体（ｈｉｇｈ  ｅｘｐｒｅｓｓｏｒ）クローンの発生が、ＭＡＲコンストラクト／ＭＡＲ配列を含まないベクターがそれ以外は等しい条件下で用いられる場合での高発現クローンの発生と比較し、約２倍もしくはそれ以上、例えば限定はされないが、約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍もしくはそれ以上、好ましくは約１０倍もしくはそれ以上、さらにより好ましくは、約１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍もしくはそれ以上または約２０もしくはさらに約２５倍もしくは約３０倍もしくはそれ以上に高まる可能性がある。
【００９１】
要するに、ＭＡＲコンストラクトはビルディングブロックから構築可能である。これらのビルディングブロックは、同定されたＭＡＲもしくはその一部の領域、例えば配列特異的領域、合成ビルディングブロック（その機能性を最適化するための修飾を含む）、例えば一連の化学合成された転写因子結合部位（ＴＦＢＳ）、非ＭＡＲ配列に由来するかもしくはそれに基づくビルディングブロック、または異なる種もしくは属のＭＡＲ配列に由来するかもしくはそれに基づくビルディングブロックを含むかまたはそれに基づくものでありうる。好ましい実施形態では、かかるＭＡＲは、表５に示される、ＴＦＢＳ領域に共役されたＡＴリッチ領域または特異的な転写因子ＤＮＡ結合部位の組み合わせを含む。当業者は、これらの原則が特定の配列または本明細書中に開示される結合部位に限定されず、かつ他の誘導体、相同体または配列の組み合わせも本発明の範囲内であることを理解するであろう。
【００９２】
上記のように、本発明のＭＡＲコンストラクト、発現系および／またはキットはタンパク質の生成において用いられうる。ここでＭＡＲコンストラクトは、プロモーターの制御下での目的のタンパク質、例えばインスリンに対する遺伝子を含むベクター内に含められうる。ベクターは細胞に導入され、細胞は成長される。次いで、このプロセスはインスリンの大規模なバッチ生産のために大規模化される。例えばＭＡＲコンストラクトを伴わない場合よりも３〜５倍多いインスリンの大量生産が３週にわたり維持されうる。
【００９３】
上記のように、本発明のＭＡＲコンストラクト、発現系および／またはキットは、インビトロおよび／またはインビボ遺伝子療法や細胞および組織の置換療法において用いられうる。例えば、インビトロ遺伝子療法では、ＭＡＲコンストラクトが、プロモーターの制御下での、インビトロ遺伝子療法を必要とする患者において欠損している遺伝子を含むベクター内に含められうる。次いで、ＭＡＲコンストラクトは、患者の細胞、例えば骨髄細胞に導入される。ＭＡＲコンストラクトでの形質転換後、骨髄細胞は患者に導入され、目的の遺伝子の発現がＭＡＲコンストラクトを伴わない場合よりも５倍高いレベルで先行しうる。それ故、有効量のタンパク質の発現が可能である。インビボ遺伝子療法では、ＭＡＲコンストラクトを含むベクターが、治療を必要とする患者の細胞に例えば注射で直接導入されうる。
【００９４】
同様に、本発明の発現系は、組織再生のための移植または例えば神経変性疾患に対する神経細胞療法において幹細胞に導入されうる。本発明のこの実施形態にて用いられうる幹細胞の非限定例として、任意の年齢の個体の骨髄組織または新生児の臍帯血から得られる造血幹細胞（ＨＳＣ）および間葉幹細胞（ＭＳＣ）が挙げられる。幹細胞は、本発明に記載の発現系を用いて形質移入され、奏功した形質転換体が細胞療法もしくは組織再生療法を必要とする患者に移植または再導入されうる。形質転換された幹細胞、例えばＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ（登録商標）（Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｖ（ＶＣＡ−１００３）、ドイツのアマクサ（ａｍａｘａ  ＧｍｂＨ））を入手するため、いくつかの方法が利用可能である。
【００９５】
ヒト抗原に結合する抗体を含む多種多様なタンパク質を生成可能なトランスジェニック動物は、公知の方法（例えば限定はされないが、ロンバーグ（Ｌｏｎｂｅｒｇ）らに交付された米国特許第５，７７０，４２８号明細書、米国特許第５，５６９，８２５号明細書、米国特許第５，５４５，８０６号明細書、米国特許第５，６２５，１２６号明細書、米国特許第５，６２５，８２５号明細書、米国特許第５，６３３，４２５号明細書、米国特許第５，６６１，０１６号明細書および米国特許第５，７８９，６５０号明細書）により生成可能である。発現系およびＭＡＲコンストラクトは、例えばトランスジェニックのウシ、ヒツジ、ヤギまたはブタを介した、典型的にはタンパク質の体液（例えば乳）への分泌によるタンパク質の生成において使用可能である。例えば、メーデ（Ｍｅａｄｅ）らに交付された米国特許第５，７５０，１７２号明細書を参照のこと。またトランスジェニック動物の生成については、ルボン（Ｌｕｂｏｎ）らに交付された米国特許第６，５１８，４８２号明細書を参照のこと。
【実施例】
【００９６】
本発明は以下の実施例でさらに説明されることになるが、これは、特許請求の範囲、発明の概要または本明細書中の他の箇所で示される本発明の範囲を限定するものではない。材料、方法、および実施例はあくまで例示目的であり、限定するように意図されていない。当業者は、本明細書で提供される指針に伴い、変更、追加および改善を行うことができ、そのすべては本発明の範囲内である。
【００９７】
マウスゲノムのＳ／ＭＡＲ予測：ＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ  Ｉ
ＮＣＢＩ  ｍ３４マウスの構築物に対応するすべてのマウス染色体配列を集め、ＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ  Ｉで分析した。ストリンジェンシーの低いものと高いもののスクリーニングを３．６°のＤＮＡベンディングの基準および３００ｂｐの最小ウインドウサイズにおける閾値または４．２°および１００ｂｐの最小ウインドウサイズにおける閾値のいずれかを各々用いて行った。
【００９８】
全マウスゲノムのＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ  Ｉによる低いストリンジェンシーの分析により、全体で６２２，４１０ｂｐ（全マウスゲノムの０．０２４％）を表す全部で１４９６の推定上のＳ／ＭＡＲ（候補ＭＡＲ）が得られた。表１は、各染色体におけるそのサイズ、その遺伝子数、その予測されるＭＡＲ（候補ＭＡＲ）の数、遺伝子当たりのそのＭＡＲ密度およびｋｂ単位でのＳ／ＭＡＲ間の平均距離を示す。この表は、（ＭＡＲ当たり遺伝子の密度の平均の約５０％を表す標準偏差では）異なる染色体に対する予測されるＳ／ＭＡＲ（候補ＭＡＲ）当たりの遺伝子密度が様々であることを示す。ＭＡＲ当たりの遺伝子における高い方の密度と低い方の密度との間の倍数の差異は、予測されるＭＡＲ（候補ＭＡＲ）内にそのサイズおよびその遺伝子数に対して極めて豊富に存在する染色体Ｙを考慮しない場合に６であり、これはこれらのＭＡＲの分布における強力かつ想定外のバイアスを示す。表１は、Ｓ／ＭＡＲ間の平均距離（Ｓ／ＭＡＲ当たりのｋｂ）が可変である（標準偏差はＳ／ＭＡＲ当たりのｋｂの平均の３８％を表しかつＳ／ＭＡＲ当たりのｋｂの高い方の密度と低い方の密度との間の倍数の差異は８．３である）ことも示す。染色体１０、１１、ＸおよびＹは、これらの密度の高い標準偏差に有意に寄与する。
【００９９】
ＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ  Ｉが元来ヒト配列に対して調整されていることから、最もストリンジェントなパラメータを用いる場合、マウスゲノム配列ではＭＡＲはほとんど得られず、それ故、高いストリンジェンシーのスクリーニング（ＤＮＡベンディングの基準においては４．２°の閾値）においては、デフォルトのカットオフ値をＭＡＲと考えられるような隣接ヒット（ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ  ｈｉｔｓ）の最小サイズに３００ｂｐではなく１００ｂｐのウインドウを用いて調節した。マウスゲノムのＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ  Ｉによる分析によると、ＤＮＡベンディングの基準として４．２°を超える値を有する４９の「スーパー」ＭＡＲが予測された。
【０１００】
【表１】
2010501170.tif 000003
【０１０１】
組換えタンパク質の生成を増大させるための新規に同定されたマウスＭＡＲの使用
５つのＭＡＲ要素を、ＳＭＡＲ  Ｓｃａｎを用いる完全なマウスゲノムの高いストリンジェンシーのスクリーニングで得られた推定上のＭＡＲ（候補ＭＡＲ）から選択した。それらを、オークランド小児病院研究所（Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｏａｋｌａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（ＣＨＯＲＩ、ｈｔｔｐ：／／ｂａｃｐａｃ．ｃｈｏｒｉ．ｏｒｇ／）から購入したマウスゲノムＤＮＡの細菌の人工染色体由来のプラスミドベクター内でクローニングした。
【０１０２】
これらの新規に同定されたマウスＭＡＲをＳ４、Ｓ８、Ｓ１５、Ｓ３２およびＳ４６と名づけた（ＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ  Ｉによる同定の順序による、「スーパー」ＭＡＲのＳ１〜Ｓ４９）。ヒトＭＡＲの１＿３、１＿６、１＿９、１＿４２、１＿６８、３＿Ｓ５およびＸ＿Ｓ２９は予め同定されており、ＭＡＲの１＿６８およびＸ＿Ｓ２９が最も強力なヒト因子である（マーモド（Ｍｅｒｍｏｄ）ら、「Ｈｉｇｈ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ａ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｏｆ  ＭＡＲ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」、国際公開第２００５／０４０３７７号パンフレット、またマーモド（Ｍｅｒｍｏｄ）らに交付された米国特許出願公開第２００７０１７８４６９号明細書も参照）。上記のように、これらのＭＡＲを緑色蛍光タンパク質の発現を駆動するＳＶ４０プロモーターおよびエンハンサーの上流のｐＧＥＧＦＰ対照ベクターに挿入し、これらのプラスミドを培養されたＣＨＯ細胞に形質移入した［ジロド  Ｐ．Ａ．（Ｇｉｒｏｄ  Ｐ．Ａ．）、ザーン−ザバル  Ｍ．（Ｚａｈｎ−Ｚａｂａｌ  Ｍ．）およびマーモド  Ｎ．（Ｍｅｒｍｏｄ  Ｎ．）］。次いで、安定的に形質移入された細胞の全集団内でのトランス遺伝子の発現を蛍光セルソーター（ＦＡＣＳ）機器を用いて分析した。図１は、様々なＳ／ＭＡＲの組換え緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の生成に対する効果を示す。蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ（登録商標））により示される、ＭＡＲを含むかもしくは含まないＧＦＰ発現ベクターｐＧＥＧＦＰを形質移入したＣＨＯ細胞の集団、および典型的な特性が示される。最も強力なヒトＭＡＲの１＿６８およびＸ＿Ｓ２９のみがこの図に示される。特性では、ＧＦＰ蛍光レベルの関数としての細胞数の計数値が示される。２より小さい蛍光値（Ｍ１）、または１０２より大きい相対発光量（Ｍ２）もしくは１０３より大きい相対発光量（Ｍ３）を有する細胞小集団Ｍ１、Ｍ２およびＭ３を表す水平バーが示されている。
【０１０３】
図１からわかるように、新規に同定されたすべてのマウスＭＡＲで、トランス遺伝子の発現がＭＡＲを伴わずにＧＦＰ単独で駆動される発現を有意に上回る程に増大し、ここでの「スーパー」マウスＭＡＲ  Ｓ４は示されるすべてのＭＡＲの中で最も強力であった。
【０１０４】
【表２】
2010501170.tif 000004
【０１０５】
最も強力なヒトＭＡＲの１＿６８およびＸ＿Ｓ２９の転写活性を新規に同定されたマウスＭＡＲで得られた場合と比較した。５つのマウスＭＡＲを最初にＧＦＰ発現アッセイを介して試験し、それらがすべてＧＦＰの発現を異なるレベルに増大させることが見出された。マウスＭＡＲのＳ１５およびＳ３２は、比較では転写活性が最低のＭＡＲであり（ＧＦＰ単独よりも約２倍の増大）、Ｓ８およびＳ４６は中間の活性を示し（３〜４倍の増大）、かつＭＡＲ  Ｓ４は極めて高い転写活性を示した（７倍の増大）。さらに、マウスＭＡＲ  Ｓ４は、この試験における試験対象のあらゆるＭＡＲの中で最も強力なものである。ヒトＭＡＲ１−６８およびマウスＭＡＲ  Ｓ４の間の転写活性の比較によると、全集団（Ｇｍｅａｎ  Ｍ０）および高いＧＦＰ生成細胞（Ｍ２）の平均蛍光が５０％増大したことが示される一方、マウスＭＡＲ  Ｓ４の場合、極めて高いＧＦＰ生成細胞（Ｍ３）の百分率は１７５％高めであった。マウスＭＡＲ  Ｓ４の場合、ＧＦＰ蛍光（ＣＶ  Ｍ０）の観点での全集団の同質性は常に１〜２％低く、それは細胞産生性（ｃｅｌｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）の安定性の高まりを示すことから有利である。
【０１０６】
このクローニングの第１ラウンド後、活性が高いＭＡＲ要素がマウスゲノムから常に得られうるか否かを判定しようとした。したがって、２つのさらなるマウスＭＡＲ（Ｓ６およびＳ１０）をクローニングし、特徴づけた。これらの新しいマウスＭＡＲをｐＧＥＧＦＰ対照ベクターに挿入し、上記のようにＦＡＣＳで分析した。マウスＭＡＲ  Ｓ１０はＦＡＣＳで分析されたあらゆる異なるパラメータにおいて最高のヒトＭＡＲよりも強力であるように見られ、ＭＡＲ  Ｓ４とほぼ同程度に転写活性が高く発現全体を増大させるものである。
【０１０７】
極めて高い生成体について評価するため、Ｍ３細胞の百分率をヒトＭＡＲ１＿６８において得られた百分率に正規化した。結果を図２に示す。図２は、様々なヒトおよびマウスのＳ／ＭＡＲ要素の、組換え緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の極めて高い生成体の百分率（％Ｍ３）に対する効果を示す。指定のＭＡＲ要素を有するかまたは有しないＧＦＰ発現ベクターを形質移入したＣＨＯ細胞の集団を蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ（登録商標））で分析した。極めて高い生成体の百分率をこの基準において最高のヒトＭＡＲで得られた百分率に正規化し、ＭＡＲ１＿６８の値を１００に設定した。マウスＭＡＲのＳ１０およびＳ４により、各々、ヒトＭＡＲ１＿６８よりも平均で８０％および１８０％といった極めて高い生成体細胞が得られた。全体として、７つのマウスＭＡＲと７つのヒトＭＡＲとのこの比較から、齧歯類ＭＡＲを用いたＣＨＯ細胞からより高い発現が得られると判断した。
【０１０８】
異なる細胞種内での新規に同定されたマウスＭＡＲにおける効力の評価
Ｓ４  ＭＡＲの効力をＣＨＯ細胞内で評価した。さらに、ヒトＭＡＲ１−６８、マウスＭＡＲ  Ｓ４もしくはＭＡＲなしのいずれかを含むＥＧＦＰ発現ベクターをヒトＨｅＬａ細胞内に安定的に形質移入し、ＥＧＦＰ蛍光を分析した。図３は、様々なヒト１＿６８およびマウスＳ４  ＭＡＲ要素の、組換え緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現に対する効果を示す。ＨｅＬａ細胞の集団に形質移入し、表２に記載のように分析した。ＨｅＬａ細胞内でのＳ４および１−６８ＭＡＲの効力の比較においては、Ｓ４はいくつかの観点で１＿６８より優れることが見出され、すなわちＳ４は高い平均ＧＦＰ蛍光（平均Ｇｍｅａｎ  Ｍ０）とともに中程度の発現および高い発現の範囲内（各々、Ｍ１およびＭ２）でより多くの細胞をもたらし、また発現の変動の低下（平均ＣＶ  Ｍ０）をもたらした。ＨｅＬａ細胞を用いる極めて高い発現の範囲内（Ｍ３）では全く細胞が見出されなかった。
【０１０９】
マウスＭＡＲを用いるモノクローナル抗体の発現促進
マウスＭＡＲ、特に最も強力なマウスを用い、医薬品用途のタンパク質の生成が増大するか否かを判定するため、それらをＲｈｅｓｕｓ−Ｄを認識する免疫グロブリンの重鎖および軽鎖をコードするｐＭＺ３７およびｐＭＺ５９ベクターに挿入した［ミーシャー  Ｓ．（Ｍｉｅｓｃｈｅｒ  Ｓ．）、ザーン−ザバル  Ｍ．（Ｚａｈｎ−Ｚａｂａｌ  Ｍ．）、デ・ジーザス  Ｍ．（Ｄｅ  Ｊｅｓｕｓ  Ｍ．）、マウドリ  Ｒ．（Ｍｏｕｄｒｙ  Ｒ．）、フィッシュ  Ｉ．（Ｆｉｓｃｈ  Ｉ．）、ヴォーゲル  Ｍ．（Ｖｏｇｅｌ  Ｍ．）、コブル  Ｍ．（Ｋｏｂｒ  Ｍ．）、イムボーデン  Ｍ．Ａ．（Ｉｍｂｏｄｅｎ  Ｍ．Ａ．）、クラグテン  Ｅ．（Ｋｒａｇｔｅｎ  Ｅ．）、ビヒラー  Ｊ．（Ｂｉｃｈｌｅｒ  Ｊ．）、マーモド  Ｎ．（Ｍｅｒｍｏｄ  Ｎ．）、スタドラー  Ｂ．Ｃ．（Ｓｔａｄｌｅｒ  Ｂ．Ｃ．）、アムシュトゥッツ  Ｈ．（Ａｍｓｔｕｔｚ  Ｈ．）、ブルム  Ｆ．（Ｗｕｒｍ  Ｆ．）］。上記のように、これらのプラスミドをＣＨＯ細胞内に形質移入し、選択および免疫グロブリンアッセイを行った［ジロッド  Ｐ．Ａ．（Ｇｉｒｏｄ  Ｐ．Ａ．）、ザーン−ザバル  Ｍ．（Ｚａｈｎ−Ｚａｂａｌ  Ｍ．）およびマーモド  Ｎ．（Ｍｅｒｍｏｄ  Ｎ．）］。図４は、Ｓ／ＭＡＲ要素の組換えモノクローナル抗体の生成に対する効果を示す。ここで、ＣＨＯ細胞に、ＭＡＲを有しない（ＭＡＲなし）またはシスで付加されたＭＡＲ  Ｓ４を有するＩｇＧ重鎖および軽鎖の発現を駆動する上記のベクターを形質移入した。２４、４８および７２時間後、上清中のＩｇＧの力価を測定した。さらに図５に示されるように、安定なクローンを、ＭＡＲを有しない（ＭＡＲなし）またはシスで付加されたＭＡＲ  Ｓ４を有するＩｇＧ重鎖および軽鎖の発現を駆動する上記のベクターを形質移入したＣＨＯ細胞の集団から生成した。選択後、分泌されたＩｇＧの力価を培地内で測定し、特異的な産生性を細胞計数によりアッセイした。図６（Ａ）は、安定な個々のクローンの、ＭＡＲを有しない（ＭＡＲなし）またはシスで付加されたＭＡＲ  Ｓ４を有するＩｇＧ重鎖および軽鎖の発現を駆動するベクターを形質移入したＣＨＯ細胞の集団からの限界希釈による生成後に得られた結果を示す。選択後、分泌されたＩｇＧの力価を培地内で測定し、特異的な産生性を細胞計数によりアッセイした。また、ＭＡＲ１＿６８の場合に得られた結果とＭＡＲを含まないクローンの場合に得られた（Ｂ）の結果との比較が含まれる。図３〜６で得られ示された結果は、新規に同定されたマウスＭＡＲ、特にＭＡＲ  Ｓ４を用い、一時的なトランスフェクタント（図４）内および安定的なトランスフェクタント（図５および６）内で医薬品タンパク質、例えばモノクローナル抗体の生成を増大可能であることを示す。ＭＡＲ  Ｓ４を用いる場合、５ｐｇ／細胞／日（ｐｃｄ）程度もしくはそれを超える特定の産生性を有する安定なクローンを数種の候補クローンの分析から容易に同定可能である（図６（Ａ））。実に２１の最高のクローンの平均産生性が、ＭＡＲ  Ｓ４を用いる場合または用いない場合で各々、７．２８±０．７８ｐｃｄ（図６（Ａ））および２．６１±１．０９ｐｃｄであった。これらの結果は、既知のニワトリのリゾチームＭＡＲの場合に得られた力���レベル（１．５ｍｇ／Ｌ未満）またはＭＡＲを有しない場合に得られた力価レベル（０．５ｍｇ／Ｌ未満）に対して際立つものである。特にこれらの結果は、新規に同定されたマウスＭＡＲを用いることで限定はされないがモノクローナル抗体などの医薬品用途のタンパク質の生成が増大し、マウスＭＡＲ、例えばＭＡＲ  Ｓ４が特に組換えタンパク質の生成において興味深いものになりうることを示す。
【０１１０】
ヒトＭＡＲ１＿６８の場合の発現の安定性
ＭＡＲ１＿６８の使用から、ＭＡＲを有しないクローンにより生成された遺伝子の発現が一般に無変化であり、ＭＡＲを有する同じクローンが高レベルの発現を長期間維持するだけでなく無変化の細胞が発現を回復することを実証した。
【０１１１】
図７は、ジロッド（Ｇｉｒｏｄ）ら、２００５年に記載のように、ＭＡＲ１−６８を含むｐＥＧＦＰ発現プラスミドのＧ４１８抗生物質耐性遺伝子を有するＣＨＯ細胞への同時形質移入を示し、安定的に発現された細胞をＧ４１８の存在下で３週間かけて選択した。細胞クローンを限界希釈により取得し、９つの個別のクローンにおけるＧＦＰ蛍光について分析した。さらなる分析のため、ＧＦＰを発現する典型的なクローンを２つの集団の各々から選択し、抗生物質選択の存在下および不在下でさらに最長で２６週間培養した。特性が左側に２週間の培養後のＧＦＰ蛍光レベル（ｘ軸）およびｙ軸上に細胞計数を示す一方、右側の特性は２６週間培養した細胞から得られたものである。図示のように、ＭＡＲを含まないクローンでは抗生物質の不在下での２６週後におけるＧＦＰ蛍光レベルが２週後のレベルに対して低下したことを示す一方、ＭＡＲを含むクローンでは抗生物質選択の有無にかかわらず２６週時のＧＦＰ蛍光レベルを維持できたことから、ＭＡＲを含む発現系は目的の遺伝子の安定な発現にとって有用なものとなる。
【０１１２】
ＭＡＲのモジュール性および遺伝子の発現促進との関連
ＭＡＲの構造分析により、各々が遺伝子の発現促進に寄与するＤＮＡ配列領域／モジュールが示された。図８は、１＿６８ＭＡＲの構造分析を介して得られた結果を示す。図８（Ａ）は、中央のＡＴリッチ領域がＭＡＲ１＿６８の遺伝子座内でのベントＤＮＡを決定づけることを示す。図８（Ｂ）は、このＡＴリッチ領域がＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒ（カータリウス（Ｃａｒｔｈａｒｉｕｓ）、フレック（Ｆｒｅｃｈ）ら、２００５年）により同定された転写因子結合部位に豊富に存在する領域で囲まれていることを示す。正確には７２９の有望なＴＦＢＳをＭＡＲ配列に沿ってＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒにより検出した。図８（Ｂ）の下部は、同定された領域に対するコーディングの特性を示す。
【０１１３】
図９（Ａ）は、１＿６８ＭＡＲと、左側に１＿６８ＭＡＲの領域もしくは部分を組み込み、かつその領域もしくは部分の順序および／もしくは方向を変化させ、かつ／またはそのかかる領域もしくは部分を複製する異なるＭＡＲを示す。右側ではＭＡＲ１＿６８を有するかまたはＭＡＲを全く有しない場合に得られた転写の増大の程度とともにコンストラクト１〜１６により得られた転写の増大の程度を示す。示されるすべてのＭＡＲ配列を、ｅＧＦＰ遺伝子マーカーを駆動するプロモーターの上流に挿入した。矢印は、図８に示される野生型ＭＡＲ配列と比べての、その領域もしくは断片の方向を示す。ＡＴリッチ領域を囲む配列を、矢印を付けた後方の斜線ボックス（左側）および矢印を付けた前方の斜線ボックス（縮尺不定；右側）として示す。ベント領域を斜交平行線ボックスとして示す。
【０１１４】
図９（Ｂ）は図９．Ａにおけるコンストラクト６に対応するＭＡＲの曲げパターンを示す。これらの曲げパターンをＳＭＡＲＳｃａｎＩにより測定した。
【０１１５】
図９（Ｃ）は、ＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒ［カータリウス（Ｃａｒｔｈａｒｉｕｓ）、フレック（Ｆｒｅｃｈ）ら、２００５年］分析の結果を示す。有望な転写因子結合部位（ＴＦＢＳ）をＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒ［カータリウス（Ｃａｒｔｈａｒｉｕｓ）、フレック（Ｆｒｅｃｈ）ら、２００５年］により同定した。７３１の有望な部位をＭＡＲ配列に沿ってＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒにより検出する。図９（Ｃ）最下部のコンストラクト６を図８（Ｂ）および図９（Ａ）に対応するコーディングを用いて示す。この図の最下部のコーディングは、図９（Ａ）に示され考察されたものに対応する。
【０１１６】
図９に示される実験は、単独で完全なＭＡＲ活性を示す領域が全く存在しないことを示す。例えば、ＤＮＡ転写の促進を天然のヒト１＿６８ＭＡＲから最大限得るのに、３つの異なる配列（図８）、すなわち複数の転写因子に対する結合部位を有する１１８９ｂｐのセグメント（すなわちＣＥＢＰ）（図９Ａ上部、矢印を付けた後方の斜線ボックスとして示される）、本質的には７６３ｂｐの対称性のある（ＡおよびＴが交互にある）ＡＴリッチ領域により決定づけられるベントＤＮＡ（図９Ａ上部、斜交平行線ボックス）、および多数のＨｏｘＦおよびＳＡＴＢＩ結合部位を含む追加の１６４８ｂｐのセグメント（図９Ａ上部、矢印を付けた前方の斜線ボックスとして示される）が必要である。
【０１１７】
図９は、ベントＤＮＡを離してプロモーター領域の上流の転写因子結合部位領域のサイズを拡大することにより、ヒト１＿６８ＭＡＲが改善されることを示す。この拡大を行うため、転写因子結合部位（ＴＦＢＳ）領域、ここではＡＴリッチ（配列番号１８）領域に隣接するＨｏｘリッチ領域（配列番号１９）（以後、矢印を付けた前方の斜線領域である）を、ＣＥＢＰリッチ領域（配列番号１７）（以後、後方の斜線領域でもある（図９））に隣接させた。図９Ａの右側に示される、生成された異なるＭＡＲコンストラクトの転写促進活性の比較によると、矢印を付けた前方の斜線領域の方向が転写の増大にとって重要であったことが示される（コンストラクト５および６を比較）。示されるデータは、末端の転写制御因子自体が下流のクロマチンにおける転写開始を制限することも明示している。矢印を付けた前方の斜線領域の３’末端に位置する２２３ｂｐの断片（配列番号２０）がコンストラクト７内のこの領域の完全な活性を保持すると仮定すると、この場合、この重要な部分がコンストラクト６内のこの要素のベント領域および残りの５’末端（ヌクレオチド１〜１４２５）と協働しなければならないことが示唆される。２つのＨＭＧ−Ｉ／Ｙ部位がこの末端の隣接位置に存在することが見出された。
【０１１８】
マウスＭＡＲのモジュール性およびサイズの縮小
ヒト１＿６８ＭＡＲの場合の実験結果に基づき、Ｓ４  ＭＡＲにおけるモジュール、特にその転写活性を担うモジュールについても分析した。またこの分析を、比較的長いＳ４  ＭＡＲのサイズの縮小を目標に行った。したがって、いくつかのＭＡＲをＳ４  ＭＡＲから作成し（表３）、特徴づけた（図１０）。図１０は、左側に特定のＭＡＲ  Ｓ４コンストラクト、および右側に全集団の平均蛍光（Ａｖｇ  Ｇｍｅａｎ  Ｍ０）の分析により示された様々なＭＡＲ  Ｓ４コンストラクトの組換え緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現に対する効果を示す。指定のＭＡＲコンストラクトを含むかまたは含まないＧＦＰ発現ベクターを形質移入したＣＨＯ細胞の集団を、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒサイトメーター（ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））を用いるフローサイトメトリーにより分析した。全集団の平均蛍光をヒトＭＡＲ１＿６８で得られたもの（その値を１００に設定）に対して正規化する一方、ＧＦＰはＭＡＲの不在下での発現を示す。他のＭＡＲコンストラクトを完全長の１５４７ｂｐのＳ４  ＭＡＲに対してのそれらの塩基含量に準じて名づけた（表３を参照）。ドット付きボックスは、ＭＡＲ  Ｓ４のＡＴリッチのベント領域を示す。Ｓ＿４１−４６６２−Ｌｕｃ５４８９は、末端（３’）の７９５塩基対が除去されかつルシフェラーゼ遺伝子の一部（黒色ボックス）と置換される場合のコンストラクトを示す。興味深いことに、図１０からわかるように、１６２４−ｂｐ  ＥｃｏＲＩ断片がＳ４  ＭＡＲ（Ｓ４−１−７０３＿２３２８〜５４５７）からそのＭＡＲ活性の有意な低下を伴うことなく欠失されうることが見出された。しかし、プロモーターに隣接する７９５−ｂｐの断片の欠失またはこの配列と類似の長さを有するルシフェラーゼ遺伝子の断片（Ｓ４＿１−４６６１；Ｓ４＿１−４６６１−Ｌｕｃ５４８９）との置換により、この活性の完全な低下が誘発された。これは、マウスＳ４  ＭＡＲの特定の変異体は、長さが短縮する一方で高い活性を示すことで、それが例えばベクターの設計および転移にとってより好都合なサイズになりうることを示す。
【０１１９】
【表３】
2010501170.tif 000005
【０１２０】
３’末端のＭＡＲ配列における活性
ＭＡＲ  Ｓ４の３’末端配列の活性をさらに分析するため、ＭＡＲのこの部分についての詳細な分析をその一部の除去または複製を介して行った。図１１は、全集団の平均蛍光（Ａｖｇ  Ｇｍｅａｎ  Ｍ０）の分析により示された、様々なＭＡＲ  Ｓ４誘導体の組換え緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現に対する効果を示す。ＣＨＯ細胞の集団を生成させ、上記のようにアッセイした。興味深いことに、切断された３’末端を有する１つのかかる誘導体（元のＭＡＲ  Ｓ４の４６５８〜５４５７に対して４６５８〜５０５４）では、より長い元のＭＡＲ  Ｓ４配列と比べてトランス遺伝子の発現が平均でわずかに高いことが示された（１００％に対して１０４％）。これは、より強力でかつより短いＭＡＲ要素の誘導体が得られうることを示す。
【０１２１】
合成ＭＡＲ
図１２は、ＭＡＴＩｎｓｐｅｃｔｏｒソフトウェアの予測による［１＿６８ＭＡＲの］有望な転写因子結合部位のマップを示す。Ｃ／ＥＢＰ、ＮＭＰ４、ＦＡＳＴ１、ＳＡＴＢ１、およびＨｏｘＦ（Ｇｓｈとも称される）結合部位の位置を例示し、それらが５’側の前方の斜線フランキング配列内に豊富に存在することが図示される。ＭＡＲ１−６８内に存在するこれらの結合部位を変化を加えずに用いるか（ＦＡＳＴ１、Ｃ／ＥＢＰ、ＨＯＸＦ／Ｇｓｈ）またはそれらにコンセンサス（すなわち完全）配列に対して１つもしくは２つのミスマッチを有する場合には訂正した（ＨｏｘＦ、ＳａｔＢ１、ＮＭＰ４）。
【０１２２】
ヒトＭＡＲ１＿６８内でのＡＴリッチのベントＤＮＡ領域と転写因子結合部位の間で生じうる連携に関する実験結果から、１つもしくはいくつかの転写因子結合部位に隣接するＭＡＲ１−６８のＡＴリッチ部分を含む合成ＭＡＲの作成が促進された。図１３は、ＡＴリッチ領域を含むコア（ＭＡＲ１４２９〜２８８０）とプロモーターおよび緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の上流に配置された転写因子における化学合成されたＤＮＡ結合部位との構築物から作成された合成ＭＡＲの活性について試験するのに用いられるプラスミドのマップを示す。図１３は、転写因子結合部位がＡＴリッチのコアとＧＦＰトランス遺伝子の発現を駆動するＳＶ４０プロモーターの間に挿入されたことを示し、図９に見出される状況を再現するものであり、この場合、最も好ましい設定では結合部位を有するＭＡＲ部分がプロモーターとベントＤＮＡ領域の間に挿入される。表４は、用いた化学合成されたオリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列を示す。
【０１２３】
【表４】
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【０１２４】
図１４は、図１３に記載のように構築された合成ＭＡＲによる転写促進を示す。挿入された要素は、図示のようにコアに加えて１つもしくはいくつかのタンパク質ＤＮＡ−結合部位を有する。ＡＴリッチ領域を含むコア配列（ＡＴリッチコア）に加えて１つもしくはいくつかの結合部位を有するプラスミドの形質移入では、結合部位を含めることでＡＴリッチコア単独の場合と比べて転写促進が増大し、かつ活性ではＣ／ＥＢＰおよびＨｏｘまたはＧｓｈ２が最高でＳａｔＢ１およびＦａｓｔ１が次に高い一方、単一のＮＭＰ４部位が検出可能な効果を全く有しないことが示された。
【０１２５】
活性結合部位の異なる混合物についても試験し、相乗効果が観察可能であるか否かを判定した。その実施のため、異なる転写因子に対する結合部位を有するオリゴヌクレオチドの様々な組み合わせをＤＮＡライゲーション反応において混合し、結合部位の正確な順序および配列をＤＮＡ配列決定により判定した。得られた組み合わせを表５に示す。
【０１２６】
【表５】
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【０１２７】
得られたプラスミドを上記のように形質移入により試験した。図１５は、表５に示されるＤＮＡ結合部位の組み合わせを用いて作成された合成ＭＡＲによる転写促進を示す。最も活性の高い組み合わせが星印で示され、ＨｏｘＦ／Ｇｓｈ２またはＳａｔＢ１部位の存在が示される。図１５に示される結果は、この例では合成ＭＡＲの活性が挿入された結合部位の数に依存しなくても、結合部位の特定の組み合わせが高い促進活性を示す一方、それ以外では活性がないかまたはさらに遺伝子発現が抑制されることを示す。より高い活性を有するコンストラクトがこの場合にＨｏｘ／Ｇｓｈ２およびＳＡＴＢ１タンパク質の組み合わせを含み、かつ最も活性の高いコンストラクトはこれらの要素のみからなる。この合成ＭＡＲの挿入により、発現体クローンの発生が任意のＭＡＲ配列を含まないｐＥＧＦＰ対照ベクターに対して約１０倍増大した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０１２８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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