(57)【要約】【課題】単為結実性の、及び、場合により、雄性不稔性のトマト植物を作出する方法を提供する。【解決手段】前記植物に、Ｓ．ハブロカイテス（Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）ＬＹＣ４／７８、種子の標本は、２００７年１１月１３日に受託番号４１５１７としてＮＣＩＭＢに寄託、の４番、５番及び／又は１２番染色体由来の遺伝領域を遺伝子移入することを含トマト作出方法であって、Ｓ．ハブロカイテスＬＹＣ４／７８の４番染色体由来の遺伝領域は、マーカーＣＤ５９、ＲＦＬＰマーカーＣＴ２２９、及びＣＯＳマーカーＴ１０６８から選択される１以上のマーカーを含み、Ｓ．ハブロカイテスＬＹＣ４／７８の５番染色体由来の遺伝領域は、ＣＯＳマーカーＴ１１８１、ＲＦＬＰマーカーＴＧ４４１及び／又はＲＦＬＰマーカーＣＤ３１（Ａ）から選択される１以上のマーカーを含む。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
単為結実性の、又は単為結実性で雄性不稔性のトマト植物を作出する方法であって、前記植物に、Ｓ．ハブロカイテス（Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）ＬＹＣ４／７８、その種子の代表標本は、２００７年１１月１３日に受託番号４１５１７としてＮＣＩＭＢに寄託された、の４番、５番及び／又は１２番染色体由来の遺伝領域を遺伝子移入することを含み、
前記Ｓ．ハブロカイテス（Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）ＬＹＣ４／７８の４番染色体由来の前記遺伝領域が、マーカーＣＤ５９とＴＧ２７２との間の領域であり、及び
前記Ｓ．ハブロカイテス（Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）ＬＹＣ４／７８の５番染色体由来の前記遺伝領域が、ＣＯＳマーカーＴ１１８１とＲＦＬＰマーカーＣＤ３１（Ａ）との間の領域である、上記トマト植物の作出方法。
【請求項２】
Ｓ．ハブロカイテス（Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）ＬＹＣ４／７８の４番染色体由来の前記遺伝領域が、マーカーＴＧ２７２、ＴＧ２６４、ＴＧ６２、Ｔ１４０５、及び／又はＣＴ５０を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｓ．ハブロカイテス（Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）ＬＹＣ４／７８の５番染色体由来の前記遺伝領域が、ＲＦＬＰマーカーＴＧ３１８又はより下流のマーカー、ＴＧ５３８、ＴＧ６０、及び／又はＣＴ１３８を含まない、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
Ｓ．ハブロカイテス（Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）ＬＹＣ４／７８の１２番染色体由来の前記遺伝領域が、マーカーＴＧ２９６を含まない、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
単為結実性の、又は単為結実性で雄性不稔性のトマト植物を選抜する方法であって、種子を有するトマト植物を、Ｓ．ハブロカイテス（Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）ＬＹＣ４／７８の植物と交配し、種子又は前記種子から成長した植物を、Ｓ．ハブロカイテス（Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）ＬＹＣ４／７８の４番、５番及び／又は１２番染色体の遺伝領域の遺伝子移入の存在について選抜することを含み、
前記Ｓ．ハブロカイテス（Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）ＬＹＣ４／７８の４番染色体由来の前記遺伝領域が、マーカーＣＤ５９とＴＧ２７２との間の領域であり、及び
前記Ｓ．ハブロカイテス（Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）ＬＹＣ４／７８の５番染色体由来の前記遺伝領域が、ＣＯＳマーカーＴ１１８１とＲＦＬＰマーカーＣＤ３１（Ａ）との間の領域である、上記トマト植物の選抜方法。
【請求項６】
前記単為結実性の、又は単為結実性で雄性不稔性のトマト植物が、ソラヌム・リコペルシクム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）植物、栽培種のＳ．リコペルシクム（Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）植物である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる、又は請求項１０に記載の方法によって選抜されるトマト植物、又はその一部であって、前記トマト植物が、Ｓ．ハブロカイテス（Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）ＬＹＣ４／７８の植物を、Ｓ．リコペルシクム（Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）品種Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒの植物と交配することによって得られた植物ではない、トマト植物、又はその一部。
【請求項８】
単為結実性の、又は単為結実性で雄性不稔性の同系交配トマト植物を作出する方法であって、
ａ）請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法によって単為結実性のトマト植物を作出するステップと、
ｂ）前記単為結実性のトマト植物を、それ自体又は別のトマト植物と交配して後代トマト種子を得るステップと、
ｃ）前記ステップの後代トマト種子を成長させてさらなる単為結実性のトマト植物を得るステップと、
ｄ）前記交配するステップと前記成長させるステップとを０〜７回繰り返して単為結実性の耐性同系交配トマト植物を産生するステップと、
を含む、上記トマト植物の作出方法。
【請求項９】
ステップｃ）が、単為結実の表現型を示し、且つ商業的に望ましい特徴を有する植物を同定するステップをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記方法が、ホモ接合の同系交配トマト植物を選抜するステップをさらに含む、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法によって得ることのできる単為結実性の、又は単為結実性で雄性不稔性の同系交配トマト植物、又はその一部であって、前記トマト植物が、Ｓ．ハブロカイテス（Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）ＬＹＣ４／７８の植物を、Ｓ．リコペルシクム（Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）品種Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒの植物と交配することによって得られた植物ではない、トマト植物、又はその一部。
【請求項１２】
単為結実性の、又は単為結実性で雄性不稔性の表現型を示す雑種トマト植物、又はその一部であって、前記雑種トマト植物が、請求項１１の単為結実性の同系交配トマト植物を、商業的に望ましい特徴を示す同系交配トマト植物と交配することによって得ることができる、トマト植物、又はその一部。
【請求項１３】
単為結実性の、又は単為結実性で雄性不稔性のトマト植物であって、Ｓ．ハブロカイテス（Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）ＬＹＣ４／７８、その種子の代表標本は、２００７年１１月１３日に受託番号４１５１７としてＮＣＩＭＢに寄託された、の４番、５番及び／又は１２番染色体由来の遺伝領域の遺伝子移入を含み、
前記Ｓ．ハブロカイテス（Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）ＬＹＣ４／７８の４番染色体由来の前記遺伝領域が、マーカーＣＤ５９、ＲＦＬＰマーカーＣＴ２２９、及びＣＯＳマーカーＴ１０６８から選択される少なくとも１つのマーカーを含み、及び
前記Ｓ．ハブロカイテス（Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）ＬＹＣ４／７８の５番染色体由来の前記遺伝領域が、ＣＯＳマーカーＴ１１８１、ＲＦＬＰマーカーＴＧ４４１及び／又はＲＦＬＰマーカーＣＤ３１（Ａ）から選択される少なくとも１つのマーカーを含む、
前記トマト植物。
【請求項１４】
前記トマト植物が、Ｓ．リコペルシクム（Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）の植物であり、且つ前記植物が、Ｓ．リコペルシクム（Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）品種Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒではない、請求項１３に記載の植物。
【請求項１５】
請求項７又は１１〜１４のいずれか一項に記載のトマト植物の再生可能細胞の組織培養物であって、前記再生可能細胞が、葉、花粉、胚、根、根端、葯、花、果実、及び茎及び種子からなる群から選択される組織から単離された細胞又はプロトプラストを含む、前記組織培養物。
【請求項１６】
Ｓ．ハブロカイテス（Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）ＬＹＣ４／７８に由来する単為結実遺伝因子を検出するための、及び／又は単為結実性の、又は単為結実性で雄性不稔性のトマト植物を検出するための検出用遺伝子マーカーであって、Ｔａｂｌｅ  ３０、Ｔａｂｌｅ  ３１又はＴａｂｌｅ  ３２の遺伝マーカーからなる群から選択される前記検出用遺伝マーカー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、種なしトマト、種なしトマトを得る方法、並びに種なしトマトを製品、特に食品に加工するための方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現在市場に流通しているいくつかの果実及び野菜は、種を含むという欠点を有する。こうした種の存在により、多くの消費者にとって、果実は、魅力が少ないものとなり得る。また、こうした果実をベースとした様々な製品、特にトマトをベースとした食品などの調製においても、場合によっては、事前にピューレ状にしたり、煮たり、又はすり潰したりしてから、例えば、篩にかけることによって、種を取り除かなくてはならず、さらなる加工工程が関与することとなる。このことは、こうした果実をベースとしたピューレ、スープ、ジュース又はソースなどの、工業規模における製品の調製についても、家庭における料理又は食品の準備に関しても当てはまる。
【０００３】
従って、パイナップル、バナナ、オレンジ、グレープフルーツ、サマースカッシュ及びメロンなどの硬実種子の食用果実、並びに、トマト、コショウ、キュウリ及びナスなどの、一般に野菜と見なされる果実において、種なしであることは、極めて望ましい形質である。植物のなかには、パイナップルなどのように、その自殖性ゆえに、単一の栽培品種を成長させると、種なし果実を結実するものもある。一部のキュウリは、花粉媒介者を排除した場合に、種なし果実を結実する。かかる植物が果実を結実するという事実は、単為結実と呼ばれる形質の結果である。単為結実（字義通りには、処女の果実を意味する）は、胚珠が受精することなく、自然に、又は人工的に誘導されて果実が結実することである。従って、その果実は、種なしである。単為結実は、時に自然界において突然変異として起こるが、その植物は、それ以上有性生殖できないため、無性生殖的手段によって繁殖し得るものの、これは、通常は、欠陥と見なされる。園芸家は、イチジク、カクタスペア（ウチワサボテン属（Ｏｐｕｎｔｉａ））、パンノキ及びナスを含め、多くの植物の単為結実品種を選抜し、繁殖させている。
【０００４】
しかしながら、植物における一部の果実の単為結実性は、価値を有し得る。種なしスイカなどの一部の植物では、単為結実に受粉又は他の刺激が必要とされる。これは、刺激的単為結実と称される。バナナは、三倍体である−つまり、親が二倍体と四倍体であった結果である−ことから、種子をつけることができないため、刺激的単為結実性を示す。単為結実果実を結実するのに、受粉又は他の刺激を必要としない植物は、栄養的単為結実性を有する。キュウリは、栄養的単為結実の一例である。
【０００５】
植物ホルモンのジベレリン、オーキシン及びサイトカイニンのいずれかを花に噴霧すると、多くの場合に、単為結実果実の発育を刺激することができる。これは、人工的単為結実と称される。植物ホルモンは、果実の奇形をもたらし得るため、単為結実果実の生産に、商業的に利用されることはほとんどない。
【０００６】
自然界では、二重劣性の単為結実性と二重劣性の機能的不稔性との遺伝子型の組み合わせが生き残る可能性はなく（種子が形成されないため）、従って、この遺伝子が次世代に伝わることはない。
【０００７】
単為結実品種のなかには、遺伝的に改変された有機体として開発されたものもある。しかしながら、後述されるとおり、この方法には、選抜育種も関わる。
【０００８】
トマトの花は、子房と、その上側にある雌蕊（花柱と柱頭）とからなる。雌蕊の周りには、数本の雄蕊（花糸と葯）があり、これが花粉を作る。子房には、数個の前胚／胚があり、これらが（花粉を受粉した後に）発育して種子となる。
【０００９】
トマト植物は、「絶対的な自己花粉媒介者」と見なすことができ、つまり、ほぼ完全にそれ自身の花粉のみが同じ植物の花の雄蕊にたどり着き、従って、前胚を受粉させる。受粉した前胚から子房が形成されると、その子房は、直ちに成長し始めて、トマト（果実）となり、それと同時に、その内部には、発育中の種子が含まれる。原則的に、子房内に発育する種子がなければ（例えば、前胚が受粉しなかった結果として）、果実は形成されない。
【００１０】
種なしトマトに関する文献（例えば、国際公開第９８／２４３０１号パンフレット：特許文献１）は、ＰＫ遺伝子と呼ばれる、トマトにおける単為結実特性をコードする遺伝子の存在について言及している。この遺伝子が、二重劣性（ｐｋ，ｐｋ：すなわち、ホモ接合の劣性遺伝子型）として存在するとき、種子の発育を伴わない、果実（果肉）の発育をもたらすと思われる。
【００１１】
自然界では、又は温室においては、単為結実（の表現型）は、一部に限られている；種子がない、又は部分的にしか存在しないことの原因となっている事実は、対立遺伝子にある。部分的単為結実では、種子は、果実の（別の）一部分に形成され、その結果として、果実は、不規則に成長し、これは、望ましくない。従って、部分的単為結実は、不規則な形の果実をもたらし、果実は奇形となる。
【００１２】
果実が完全な単為結実に基づき形成されると、果実内で発育する種子はなく、その結果、単為結実性をコードする遺伝子は、次世代に伝わらず、従って、世代系統が途絶える。
【００１３】
このため、この遺伝子は、自然界では極めてまれである。また、完全な単為結実（の表現型）は、種子のない果実をもたらすため、種子の生産は不可能である。
【００１４】
単為結実の特性は、いくつかの対立遺伝子にある。完全な単為結実の表現型は、「母親」（すなわち、トマト植物、その花が花粉を受粉する）並びに「父親」（すなわち、花粉を供給するトマト植物）が、双方とも、ＰＫ遺伝子に関して、二重劣性であるときにのみ生じ得る。これは、「その原初のままの」果実では、親の一方がヘテロ接合であれば発育する種子がいくつかあり、その少なくとも１つは、ホモ接合の劣性にはならないであろうためである。
【００１５】
部分的単為結実（トマトの発育中に、少なくとも１つの種子が、ＰＫ遺伝子に関して、二重劣性でない結果としての）により、果実は、奇形化する形で発育する。
【００１６】
トマトにおいては、ＰＫ遺伝子の他に、機能的不稔性（ＦＳ）の特性をコードする遺伝子が公知である。ＦＳに関して、二重劣性の植物（ｆｓ，ｆｓ）は、花粉管が完全に閉鎖されたトマト植物をもたらし、従って、振動したり、又は他の機械的な影響を受けたり（マルハナバチ、昆虫又は振動を発生するもの）したとしても、完全且つ稔性の花粉が花粉管から放たれ得ない。
【００１７】
二重劣性（ｆｓ，ｆｓ）の表現型を有するトマト植物の花粉は、花粉管を手で（切り込みを入れるか、又は鋏で切ることにより）物理的に開けることによってしか放出させることができず、その後−実際には−開いた花粉管から花粉を手で取り出し、すなわち、掻き取る必要がある。
【００１８】
同じ又は別のトマト植物の受精については、次に、花粉を花の雌蕊に付着させる必要があり、これも、実際には、手作業で行わなければならない。
【００１９】
他の「自然の」（すなわち、上述された人による介入のない）方法では、いずれも機能的不稔性の花の花粉は放出されず、従って、それが前胚の受精に利用されることはない。従って、二重劣性の機能的不稔性の植物（ｆｓ，ｆｓ）は、前胚を受精させず、それにより、世代系統が途絶えるため、機能的不稔性についての劣性遺伝子は、次世代に伝わらない。自然界では、機能的不稔性の二重劣性表現型（ｆｓ，ｆｓ）では、前胚の受精が起こらず、従って、果実（トマト）が形成されない。
【００２０】
国際公開第９８／２４３０１号パンフレットは、単為結実性の劣性表現型（二重劣性遺伝子ｐｋに基づく：すなわち、ｐｋ，ｐｋ）を、機能的不稔性の劣性表現型（二重劣性遺伝子ｆｓに基づく：すなわちｆｓ，ｆｓ）と組み合わせたトマト植物を用いて、有利に種子／ピップのないトマトを作出できることを記載している。完全な種なし果実は、通常の選択以外の、物理的な人の介入によってのみ作出することができる。（親の）花粉管を手で開かねばならず、その後、開いた花粉管から掻き取ることによって、花粉を取り出し、次に、これも同様に、手で、受精させるトマト植物の雌蕊に付着させなければならない。特に、上述された３つのステップのうち、最初の２つは、実施に手間がかかる。ｆｓ遺伝子及びｐｋ遺伝子の遺伝学的基礎又は植物学的情報源は、国際公開第９８／２４３０１号パンフレットには開示されていない。
【００２１】
Ｈ．Ｇｅｏｒｇｉｅｖら（Ｅｕｃａｒｐｉａ  Ｔｏｍａｔｏ−９０、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＸＩ  Ｅｕｃａｒｐｉａ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｎ  Ｔｏｍａｔｏ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ、Ｍａｌａｇａ、スペイン、１９９０年３月に所収：「Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  Ｓｅｅｄｌｅｓｓ  Ｔｏｍａｔｏｅｓ：非特許文献１」」）は、単為結実について、ホモ接合の遺伝子ｐａｔ−２と花の自家不稔性について、ホモ接合の遺伝子ｐｓ−２とを１つの栽培品種に組み合わせることにより、完全に種のないトマト果実を着生するトマト植物を得る方法を記載している。このようにして得られたｐａｔ−２，ｐｓ−２品種は、完全に種のないトマト果実を着生する（Ｇｅｏｒｇｉｅｖの参考文献の表１及び表２に示されるとおり）。Ｇｅｏｒｇｉｅｖらは、さらに、２つのかかる栽培品種を交配させることにより、完全に種なしの標準的な果実をつけるＦ１雑種を作り出すことができることを記載している。
【００２２】
しかしながら、Ｇｅｏｒｇｉｅｖによって記載される系統についての国際公開第９８／２４３０１号パンフレットの出願人による広範な研究により、単為結実の特性と自家不稔の特性とが組み合わされて親系統が提供され、それらの親系統の２つから−すなわち以下に記載されるとおりの人の介入によって−雑種種子が得られても、実際には、二重劣性のｐａｔ−２遺伝子のみと二重劣性のｐｓ−２遺伝子のみとが存在するだけでは、あらゆる成長条件下で、安定且つ確実に、種なしトマトを形成し得る雑種を提供するには不十分であることが示されている。従って、双方とも二重劣性遺伝子のみを含む２つの親系統（ｐａｔ−２，ｐａｔ−２）及び（ｐｓ−２，ｐｓ−２）を交配しても、その植物が、必ずしも常に、且つあらゆる状況下で、十分に形成されたトマトを提供するとは限らないため、商業的に許容可能な種なし雑種がもたらされることはない。
【００２３】
従って、国際公開第９８／２４３０１号パンフレットの教示に対する改良が必要とされており、特に、熱帯気候並びに温和な気候の双方で一般的であり得るような種々の受光条件及び温度条件を含め、あらゆる環境条件下で、種なしトマトを確実に生産することが可能な雑種（及びその種子）が必要とされている。これは、世界のあらゆる国で商品化及び栽培を成功させることのできる雑種及びその種子を提供するためには不可欠である。
【００２４】
国際公開第００／７４４６８号パンフレット（特許文献２）は、国際公開第９８／２４３０１号パンフレットに対するかかる改良について記載しているが、これもまた、「ｐｋ複合体」及び「ｆｓ複合体」を含むトマト系統の種子のブダペスト条約に基づく寄託情報といった植物学的情報源を開示していない。欧州特許第１４２８４２５号明細書（特許文献３）は、その種子が２００１年１２月５日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ  ２０１１０−２２０９、米国）に寄託されたトマト系統として、かかる寄託情報を開示している。寄託された種子には、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３９０７が割り当てられている。ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−３９０７は、欧州特許第１４２８４２５号明細書に記載される方法で得られるとおりの、単為結実性（ｐａｔ−２遺伝子に基づく）及び機能的不稔性（ｐｓ−２遺伝子に基づく）の表現型の良好な発現を示す「第１のＦ３世代」からの植物である。このトマト系統は、ｐｋ／ｆｓ複合体についてホモ接合であり、これは、ｐａｔ−２により、単為結実性を、及び、ｐｓ−２により、位置的不稔性を強力に発現するためのあらゆる遺伝情報を含む。従って、おそらくは、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３９０７から始めることで、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３９０７を所望の非種なし親と交配し、続いて、手作業による自家受粉によって、自殖を繰り返すことにより、単為結実性及び位置的不稔性の強力な発現を任意の所望のトマト品種に導入することが可能であると思われる。
【００２５】
しかしながら、遺伝的な情報源を提供するＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３９０７寄託系統が利用可能であるにもかかわらず、単為結実の遺伝学的事象は、今のところ未知である。しかし、その形質の染色体位置についての知識、並びに植物及び植物間の交配種においてその形質の存在を追跡する方法は、単為結実植物の生産量を増加させるうえで、非常に有益であり得る。事実、欧州特許第１４２８４２５号明細書は、１０年超の期間にわたる広範な研究によっても、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−３９０７寄託系統に含まれるｐｋ，ｆｓ複合体を構成するのに必要な遺伝子、対立遺伝子又は他の遺伝要因の数及び／又は性質を明らかにし得るか、又はさらには、種なしの（又はさらには機能的不稔性の）表現型が、元の種なし親と非種なし親とから得られるＦ１、Ｆ２、Ｆ３、及びさらにはＦ４においてさえ、出現率が極めて低く、又は時には全く現れないことさえあるということを説明し得る満足のいくモデルを提供できなかったことに言及した。欧州特許第１４２８４２５号明細書は、これが、その発明の純種の種なしの表現型を決定している事実が、上記の先行技術に示唆されるものよりはるかに複雑である（すなわち、（１＋１）、（２＋１）又はさらには（３＋１）の別個の遺伝子の組み合わせによって決定されるものではない）ことを示すものであり、また、なぜ先行技術が、種なしの雑種を安定且つ確実な方法によって、あらゆる環境条件下で生産するために用いることのできるトマト植物又は系統を提供することができないかについて、説明するものでもあることに言及している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２６】
【特許文献１】国際公開第９８／２４３０１号パンフレット
【特許文献２】国際公開第００／７４４６８号パンフレット
【特許文献３】欧州特許第１４２８４２５号明細書
【非特許文献】
【００２７】
【非特許文献１】Ｅｕｃａｒｐｉａ  Ｔｏｍａｔｏ−９０、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＸＩ  Ｅｕｃａｒｐｉａ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｎ  Ｔｏｍａｔｏ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ、Ｍａｌａｇａ、スペイン、１９９０年３月に所収：「Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  Ｓｅｅｄｌｅｓｓ  Ｔｏｍａｔｏｅｓ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２８】
本発明の目的は、上述の問題を解決することである。本発明は、単為結実植物を作出する方法を提供することを目的とするものである。本発明は、単為結実の遺伝学的基礎に関して、より深い洞察を提供することをもう１つの目的とするものである。特に、本発明は、特に野菜及び果実植物の商業品種の作出において、育種及び選抜プロセスの間に植物における単為結実性付与遺伝因子の存在をモニタすることに成功し得るゲノムマーカーを提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
本発明者らは、供与種としてのソラヌム・ハブロカイテス（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）ＬＹＣ４／７８と、反復親植物としてのソラヌム・リコペルシクム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）品種Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒとの間の種間交配によって作出された特定の遺伝子移入系統が、種子を形成できなかったと同時に、これらの植物が、果実重量の増加を示したことを発見しており、且つ、これらの植物が、完全な単為結実の表現型を示したことが発見された。種間交配については、本出願人の国際公開第２００６／０４６８６１号パンフレットに既に記載した。完全な単為結実の表現型は、５番染色体上の遺伝子移入についてホモ接合の供与親（ソラヌム・ハブロカイテス（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）ＬＹＣ４／７８）であるように選択された植物によって示され、この系統は、ＩＬ５−１と表された。この系統は、また、本明細書では、ＤＲＳ５．１とも称される。ソラヌム・ハブロカイテス（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）ＬＹＣ４／７８の種子の代表標本は、ブダペスト条約に基づく規則６．１（ｉｖ）の意義の範囲内で、２００７年１１月１３日に、受託番号ＮＣＩＭＢ  ４１５２１７として、ＮＣＩＭＢに寄託された。
【００３０】
ＩＬ系統ＤＲＳ５．１並びに５番染色体に遺伝子移入を含む別のＩＬ系統（本明細書に記載されるとおりの系統ＩＬ５−２、これもまた種子を形成できなかったが、果実重量の増加は示さず、しかし、許容可能なサイズの果実を結実した）を維持するためには、そのヘテロ接合状態を保たなければならなかった。形態学的調査から、これらの植物は、機能的不稔性である（花柱が長く、花糸が短い）ことが認められた。
【００３１】
また、１２番染色体に遺伝子移入を有する一系統も、許容可能なサイズの種なし果実を示し、単為結実性と見なすことができた。また、この系統は、４番染色体にも、ヘテロ接合の遺伝子移入を含んでいた。綿密に分析することにより、本発明者らは、Ｓ．ハブロカイテス（Ｓ．Ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）からの遺伝子移入が、商業的なトマト品種のＳ．リコペルシクム（Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）において、単為結実の表現型を生じさせ得ることを発見した。
【００３２】
第１の態様において、本発明は、単為結実性の、及び、場合により、雄性不稔性のトマト植物を作出する方法を提供し、これは、Ｓ．ハブロカイテス（Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）ＬＹＣ４／７８（その種子の代表標本は、２００７年１１月１３日に、受託番号４１５１７として、ＮＣＩＭＢに寄託された）の４番、５番及び／又は１２番染色体由来の遺伝領域を前記植物に遺伝子移入することを含み、
−Ｓ．ハブロカイテス（Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）ＬＹＣ４／７８の４番染色体由来の遺伝領域は、マーカーＣＤ５９とＴＧ２７２との間の領域であり、及び
−Ｓ．ハブロカイテス（Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）ＬＹＣ４／７８の５番染色体由来の遺伝領域は、ＣＯＳマーカーＴ１１８１とＲＦＬＰマーカーＣＤ３１（Ａ）との間の領域である。
【００３３】
本発明の方法の好ましい実施形態において、Ｓ．ハブロカイテス（Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）ＬＹＣ４／７８の４番染色体由来の遺伝領域は、マーカーＣＤ５９、ＲＦＬＰマーカーＣＴ２２９、及びＣＯＳマーカーＴ１０６８から選択される少なくとも１つのマーカーを含む。
【００３４】
本発明の方法の別の好ましい実施形態において、Ｓ．ハブロカイテス（Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）ＬＹＣ４／７８の５番染色体由来の遺伝領域は、ＣＯＳマーカーＴ１１８１、ＲＦＬＰマーカーＴＧ４４１及び／又はＲＦＬＰマーカーＣＤ３１（Ａ）から選択される少なくとも１つのマーカーを含む。
【００３５】
本明細書に記載されるとおりの単為結実性のトマト植物は、場合により（及び好ましくは）雄性不稔性である。
【００３６】
好ましい実施形態において、Ｓ．ハブロカイテス（Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）ＬＹＣ４／７８の４番染色体由来の遺伝領域は、マーカーＴＧ２７２、ＴＧ２６４、ＴＧ６２、Ｔ１４０５、及び／又はＣＴ５０を含まない。
【００３７】
別の好ましい実施形態において、Ｓ．ハブロカイテス（Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）ＬＹＣ４／７８の５番染色体由来の遺伝領域は、ＲＦＬＰマーカーＴＧ３１８又はより下流のマーカー、例えば、ＴＧ５３８、ＴＧ６０、及び／又はＣＴ１３８を含まない。
【００３８】
当業者は、トマト植物において、当該植物を単為結実性にするため、Ｓ．ハブロカイテス（Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）ＬＹＣ４／７８の４番、５番及び１２番染色体由来の本明細書に定義されるとおりの領域、４番及び５番、又は５番及び１２番、又は４番及び１２番染色体由来の本明細書に定義されるとおりの領域など、本明細書に定義される遺伝領域の任意の組み合わせが遺伝子移入され得ることを理解するであろう。
【００３９】
好ましい一実施形態におけるＳ．ハブロカイテス（Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）ＬＹＣ４／７８の１２番染色体由来の遺伝領域は、本質的に図３に提示されるとおりである。好ましくは、この領域は、Ｓ．リコペルシクム（Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）ＬＡ９２５×Ｓ．ペンネルリイ（Ｓ．ｐｅｎｎｅｌｌｉｉ）ＬＡ７１６  Ｆ２型のＴｏｍａｔｏ−ＥＸＰＥＮ  ２０００  Ｍａｐで位置が確認されるとおりのＲＦＬＰマーカーＴＧ２９６（９６．００ｃＭ）を含まない。特に、好ましい遺伝領域は、図１に黒色領域で示されるとおりである。
【００４０】
別の態様において、本発明は、単為結実性の（及び、場合により、雄性不稔性の）トマト植物を選抜する方法に関し、これは、種子を有するトマト植物をＳ．ハブロカイテス（Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）ＬＹＣ４／７８の植物と交配し、Ｓ．ハブロカイテス（Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）ＬＹＣ４／７８の４番、５番及び／又は１２番染色体の遺伝領域の遺伝子移入の存在について、種子又は前記種子から成長した植物を選抜することを含み、
−Ｓ．ハブロカイテス（Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）ＬＹＣ４／７８の４番染色体由来の遺伝領域は、マーカーＣＤ５９、ＲＦＬＰマーカーＣＴ２２９、及びＣＯＳマーカーＴ１０６８から選択される少なくとも１つのマーカーを含み、及び
−Ｓ．ハブロカイテス（Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）ＬＹＣ４／７８の５番染色体由来の遺伝領域は、ＣＯＳマーカーＴ１１８１、ＲＦＬＰマーカーＴＧ４４１及び／又はＲＦＬＰマーカーＣＤ３１（Ａ）から選択される少なくとも１つのマーカーを含む。
【００４１】
単為結実植物を作出する態様について、上述される好ましい実施形態は、植物を選抜する本方法にも適用することができる。
【００４２】
単為結実植物を作出又は選抜する方法の好ましい実施形態において、前記単為結実植物は、ソラヌム・リコペルシクム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）植物であり、より好ましくは、ソラヌム・リコペルシクム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）の栽培植物である。前記植物は、好ましくは、ソラヌム・リコペルシクム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）品種Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒではない。
【００４３】
別の態様において、本発明は、上述されるとおりの植物を作出するための方法によって得ることができるか、又は上述されるとおりの方法によって選抜されたトマト植物、又はその一部に関するものである。
【００４４】
別の態様において、本発明は、単為結実性の同系交配トマト植物を作出する方法に関し、これは、
ａ）上述されるとおりの、Ｓ．ハブロカイテス（Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）ＬＹＣ４／７８由来の遺伝領域を遺伝子移入することによる単為結実植物を作出する方法によって単為結実性のトマト植物を作出するステップと、
ｂ）前記単為結実性のトマト植物をそれ自体又は別のトマト植物と交配して後代トマト種子を得るステップと、
ｃ）前記ステップの後代トマト種子を成長させてさらなる単為結実性のトマト植物を得るステップと、
ｄ）交配するステップと成長させるステップとを０〜７回繰り返して単為結実性の耐性同系交配トマト植物を産生するステップと、
を含む。
【００４５】
前記方法の好ましい実施形態において、前記ステップｃ）は、単為結実の表現型を示し、且つ、商業的に望ましい特徴を有する植物を同定するステップをさらに含む。
【００４６】
前記方法の別の好ましい実施形態において、前記方法は、ホモ接合の同系交配トマト植物を選択するステップをさらに含む。
【００４７】
別の態様において、本発明は、本発明の方法によって得ることのできる単為結実性の同系交配トマト植物、又はその一部に関するものである。
【００４８】
別の態様において、本発明は、単為結実の表現型を示す雑種トマト植物、又はその一部に関し、ここで、前記雑種トマト植物は、本発明の方法によって得ることのできる単為結実性の同系交配トマト植物を、商業的に望ましい特徴を示す同系交配トマト植物と交配することによって得ることができる。
【００４９】
別の態様において、本発明は、本明細書において、上記に定義されるとおりのトマト植物の再生可能細胞の組織培養物に関し、好ましくは、前記再生可能細胞は、葉、花粉、胚、根、根端、葯、花、果実、及び茎及び種子からなる群から選択される組織から単離された細胞又はプロトプラストを含む。
【００５０】
別の態様において、本発明は、Ｓ．ハブロカイテス（Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）ＬＹＣ４／７８に由来する単為結実遺伝因子を検出するための、及び／又は単為結実性のトマト植物を検出するための、表３０、表３１又は表３２の遺伝マーカーからなる群から選択される遺伝マーカーの使用に関するものである。
【００５１】
好適なマーカーとしては、本明細書に記載されるとおりのマーカーの断片、例えば、表３２に示されるとおりの、Ｓ．ハブロカイテス（Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）Ｌｙｃ４／７８とＳ．リコペルシクム（Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）品種Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒとの間を特徴付けるヌクレオチド多型を含む断片が挙げられる。当業者は、どのようにすれば、かかる多型を検出できるかについて、十分に承知しているであろう。
【００５２】
別の態様において、本発明は、上記のとおりに由来する単為結実遺伝因子として定義されるＳ．ハブロカイテス（Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）ＬＹＣ４／７８からの遺伝子移入を含む単為結実植物に関するものである。前記態様の好ましい実施形態において、前記植物は、Ｓ．リコペルシクム（Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）種の植物であり、より好ましくは、前記植物は、栽培品種Ｓ．リコペルシクム（Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）品種Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒの植物ではない。
【００５３】
マーカーによる選抜は、好適には、表３２に示されるとおりの供与種（Ｓ．ハブロカイテス（Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）ＬＹＣ４／７８）又は受容種（例えば、Ｓ．リコペルシコン（Ｓ．Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ）品種Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒ）に特異的なヌクレオチド多型を選択するように構成されることができ、ここで、多型は、［Ｓ．ハブロカイテス（Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）ＬＹＣ４／７８の位置／Ｓ．リコペルシコン（Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ）品種Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒ］として求められる塩基の変異によって示される。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】トマトの１２番染色体の遺伝地図を示し、本明細書において参照されるマーカー位置を表示する。
【図２】Ｓ．リコペルシクム（Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）品種Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒ（ＳＬ）の遺伝的背景におけるＳ．ハブロカイテス（Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）ＬＹＣ４／７８（ＳＨ）の遺伝子移入系統（ＩＬ）集団を育成するための交配スキームを図示する。ＭＡＳを用いて、同定された２つの単為結実性付与遺伝因子の一方を含むＢＣ２、ＢＣ３、及びＢＣ４遺伝子型を選択し、一部のＢＣ２を自家受粉させてＢＣ５Ｓ１種子を作出した。
【図３】実施例に記載されるとおりの３０個のＩＬの中心セットを示す。この中心セットは、可能な限り少ないＩＬにおいて最大限に網羅されたＳＨゲノムに相当する（各系統の標示は一番下に示される）。中心セットは、単一の遺伝子移入を含む１５個のＩＬと、２つの遺伝子移入を含む１０個のＩＬと、３つの遺伝子移入を含む４個のＩＬと、一方でさらに４つのホモ接合の遺伝子移入を含んだ１つのＩＬとからなる。１２個の全ての染色体が、Ｓ．ハブロカイテス（Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）ＬＹＣ４、Ｓ．リコペルソコン（Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ）及び参照ＤＲＳ５を基準として示される。
【図４】トマトの４番及び５番染色体の遺伝地図を示し、本明細書において参照されるマーカー位置を表示する。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
定義
本明細書で使用されるとき、用語「単為結実」は、受粉及び／又は受精なしに発育する種なし果実の結実を指す。特に指示されない限り、この用語は、遺伝的な単為結実を指す。特に指示されない限り、この用語は、完全な単為結実を指し、つまり、果実は、完全に種なしであり、且つ奇形化することなく、正常な規則的形状を有する。単為結実植物は、それ以上有性生殖することはできないが、無性生殖的な手段によって繁殖させ得る。特に、用語「単為結実性の」、又は関連する用語「単為結実」は、本明細書では、他の点では通常のサイズの種なし果実を結実する植物の表現型を定義して用いられる。この用語が、本明細書において用いられるとき、大幅に小さい果実を結実する種なし植物は、単為結実性とはみなされない。種子が形成されにくい植物は、必ずしも単為結実性とは限らない。実際に、この用語は、完全に種なしの植物を指す。本明細書の記載において、用語「単為結実植物」は、本明細書に定義されるとおりのＳ．ハブロカイテス（Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）ＬＹＣ４／７８由来の遺伝因子を含む植物を指し、これは、元の受容親と本質的に等しいサイズで、且つ奇形化していない種なし果実を結実する。
【００５６】
本明細書で使用されるとき、用語「対立遺伝子」は、１つ又は複数の相対する形態の遺伝子のいずれかを意味し、それらの対立遺伝子の全てが少なくとも１つの形質又は特徴に関わる。二倍体細胞又は有機体では、所与の遺伝子の２つの対立遺伝子が、一対の相同染色体上の対応する遺伝子座を占有する。本発明は、ＱＴＬ、すなわち、１つ又は複数の遺伝子と、さらに調節配列も含み得るゲノム領域に関するため、ある場合には、「対立遺伝子」ではなく、「ハプロタイプ」（すなわち、ある染色体セグメントの対立遺伝子）を指すほうがより正確であるが、しかしながら、そうした場合に、用語「対立遺伝子」は、用語「ハプロタイプ」を含むものと理解されなければならない。
【００５７】
「遺伝子」は、本明細書では、染色体上で特定の位置を占有し、且つ有機体における特有の特徴又は形質についての遺伝命令を含むＤＮＡの配列からなる遺伝単位と定義される。
【００５８】
「遺伝子座」は、本明細書では、所与の遺伝子が所与の種の染色体上で占有する位置と定義される。
【００５９】
本明細書で使用されるとき、用語「ヘテロ接合の」は、異なる対立遺伝子が相同染色体上の対応する遺伝子座にあるときに存在する遺伝子の状態を意味する。
【００６０】
本明細書で使用されるとき、用語「ホモ接合の」は、同一の対立遺伝子が相同染色体上の対応する遺伝子座にあるときに存在する遺伝子の状態を意味する。
【００６１】
本明細書で使用されるとき、用語「雑種」は、限定はされないが、２つの同系交配系統間の交配種を含む、２つの遺伝的に異なる個体間の交配種の任意の子孫を意味する。
【００６２】
本明細書で使用されるとき、用語「同系交配された」は、実質的にホモ接合の個体又は系統を意味する。
【００６３】
本願において、「組換え現象」は、減数分裂乗換えを意味するものと理解される。
【００６４】
本明細書で使用されるとき、用語「遺伝子移入」、「遺伝子移入された」及び「遺伝子移入している」は、１つの種、品種又は栽培品種の遺伝子が、別の種、品種又は栽培品種のゲノムにそれらの種の交配によって移入される、自然の、及び人工的の双方の過程を指す。この過程は、場合により、反復親に戻し交配することによって達成され得る。
【００６５】
「遺伝子操作」、「形質転換」及び「遺伝子修飾」は、全て、本明細書では、単離されてクローン化された遺伝子を別の有機体のＤＮＡ、通常は、染色体ＤＮＡ又はゲノムに導入することについての同義語として用いられる。
【００６６】
本明細書で使用されるとき、用語「分子マーカー」は、核酸配列の特徴の違いを可視化する方法において用いられる指標となるものを指す。かかる指標の例は、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）マーカー、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）マーカー、一塩基変異多型（ＳＮＰ）、マイクロサテライトマーカー（例えば、ＳＳＲ）、配列決定型増幅領域（ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ：ＳＣＡＲ）マーカー、切断型増幅多型配列（ｃｌｅａｖｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＣＡＰＳ）マーカー又はアイソザイムマーカー又は特異的遺伝子及び染色体位置を定義する本明細書に記載のマーカーの組み合わせである。
【００６７】
本明細書で使用されるとき、用語「植物部分」は、植物において損なわれていない植物細胞などの単細胞及び細胞組織、細胞集塊並びにトマト植物を再生することのできる組織培養物を含むトマト植物の一部を指す。植物部分の例としては、限定はされないが、花粉、胚珠、葉、胚、根、根端、葯、花、果実、茎、苗条、及び種子由来の単細胞及び組織；並びに、花粉、胚珠、葉、胚、根、根端、葯、花、果実、茎、苗条、接ぎ穂、台木、種子、プロトプラスト、及びカルスなどが挙げられる。
【００６８】
本明細書で使用されるとき、用語「集団」は、共通の遺伝学的起源を共有する遺伝的に異種の植物の集合を意味する。
【００６９】
本明細書で使用されるとき、用語「トマト」は、限定はされないが、リコペルシコン・セラシホルメ（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｃｅｒａｓｉｆｏｒｍｅ）、リコペルシコン・ケエスマニイ（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｃｈｅｅｓｍａｎｉｉ）、リコペルシコン・キレンセ（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｃｈｉｌｅｎｓｅ）、リコペルシコン・クミエレウスキイ（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋｉｉ）、リコペルシコン・エスクレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）（現在は、ソラヌム・リコペルシクム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ））、リコペルシコン・ヒルスタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、リコペルシコン・パルビフロルム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｐａｒｖｉｆｌｏｒｕｍ）、リコペルシコン・ペンネリイ（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｐｅｎｎｅｌｌｉｉ）、リコペルシコン・ペルビアヌム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ）、リコペルシコン・ピムピネルリホリウム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍ）、又はソラヌム・リコペルシコイデス（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｉｄｅｓ）を含む、以前は、リコペルシコン（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ）という属名で知られていた任意の植物、系統又は集団を意味する。リコペルシコン・エスクレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）について、新しく提唱されている学名は、ソラヌム・リコペルシクム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）である。同様に、野生種名も変化し得る。Ｌ．ペンネルリイ（Ｌ．ｐｅｎｎｅｌｌｉｉ）は、ソラヌム・ペンネルリイ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｐｅｎｎｅｌｌｉｉ）となっており、Ｌ．ヒルスタム（Ｌ．ｈｉｒｓｕｔｕｍ）は、Ｓ．ハブロカイテス（Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）となってもよく、Ｌ．ペルビアヌム（Ｌ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ）は、Ｓ．「Ｎ  ペルビアヌム（Ｎ  ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ）」及びＳ．「カレホン・デ・ウアイレス（Ｃｅｌｌｅｊｏｎ  ｄｅ  Ｈｕａｙｌｅｓ）」、Ｓ．ペルビアヌム（Ｓ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ）、並びにＳ．コルネリオムエルレリ（Ｓ．ｃｏｒｎｅｌｉｏｍｕｅｌｌｅｒｉ）に分割されてもよく、Ｌ．パルビフロルム（Ｌ．ｐａｒｖｉｆｌｏｒｕｍ）は、Ｓ．ネオリキイ（Ｓ．ｎｅｏｒｉｃｋｉｉ）となってもよく、Ｌ．クミエレウスキイ（Ｌ．ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋｉｉ）は、Ｓ．クミエレウスキイ（Ｓ．ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋｉｉ）となってもよく、Ｌ．キレンセ（Ｌ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ）は、Ｓ．キレンセ（Ｓ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ）となってもよく、Ｌ．ケエスマニアエ（Ｌ．ｃｈｅｅｓｍａｎｉａｅ）は、Ｓ．ケエスマニアエ（Ｓ．ｃｈｅｅｓｍａｎｉａｅ）又はＳ．ガラパゲンセ（Ｓ．ｇａｌａｐａｇｅｎｓｅ）となってもよく、及び、Ｌ．ピムピネルリホリウム（Ｌ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍ）は、Ｓ．ピムピネルリホリウム（Ｓ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍ）となってもよい（「Ｓｏｌａｎａｃｅａ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｎｅｔｗｏｒｋ」（２００５年）Ｓｐｏｏｎｅｒ及びＫｎａｐｐ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｇｎ．ｃｏｒｎｅｌｌ．ｅｄｕ／ｈｅｌｐ／ａｂｏｕｔ／ｓｏｌａｎｕｍ＿ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ．ｈｔｍｌ）。
【００７０】
特に、Ｓ．ハブロカイテス（Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）は、毛で覆われた果実を着生するトマト種として定義することができ、一方、Ｓ．リコペルシクム（Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）は、毛のない果実を着生するトマト種であることが注記される。
【００７１】
本明細書で使用されるとき、用語「品種」又は「栽培品種」は、構造的又は遺伝的な特徴及び／又は能力によって、同じ種のなかの他の品種と区別することができる類似した植物群を意味する。
【００７２】
「栽培植物」は、本明細書において、農学的に望ましい特徴を示す植物と定義される。この用語は、用語「野生」と対照して用いられ、「野生」は、望ましくない形質に起因して直接的な商業的利点のない品種を指す。Ｓ．ハブロカイテス（Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）は、望ましくない形質（毛で覆われた果実）に起因して、直接的な商業的利点のないトマト種と定義することができる。
【００７３】
植物において、本明細書に定義されるとおりのＳ．ハブロカイテス（Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）に由来する単為結実性を付与する遺伝領域が特許請求され、ここで、この領域は、その遺伝的背景のなかにはない。用語「天然の遺伝的背景」は、本明細書において、その遺伝因子の起源となる遺伝的背景を指して用いられる。かかる背景は、例えば、種子を有するトマト野生受入種のゲノムであり得る。例えば、本発明の単為結実性付与遺伝因子は、ソラヌム・ハブロカイテス（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）ＬＹＣ４／７８の４番、５番及び／又は１２番染色体上の特定の位置に発見された。例として、ソラヌム・ハブロカイテス（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）ＬＹＣ４／７８は、ソラヌム・ハブロカイテス（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）ＬＹＣ４／７８の４番、５番及び／又は１２番染色体上のＱＴＬの天然の遺伝的背景に相当する。ソラヌム・ハブロカイテス（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）ＬＹＣ４／７８の４番染色体から、別のトマト種、最も明らかなところでは、Ｓ．リコペルシクム（Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）の４番染色体上の同じ位置への単為結実性付与遺伝因子又はその単為結実性付与部分を含むＤＮＡの導入が関与する方法は、結果として、その天然の遺伝的背景にはない、単為結実性付与遺伝因子、又はその前記単為結実性付与遺伝子の一部をもたらし得る。
【００７４】
用語「機能的不稔性の」は、本明細書において、その当該技術分野で認知されている意味で用いられる。機能的不稔は、トマトに、いわゆる自家不稔を引き起こす特性のより一般的な形態であると考えられ、以下の２つのタイプで引き起こされ得るもので、すなわち：−雄性不稔：生存花粉がないため（ｍｓ）か、又は雄蕊が退化している（ｓｌ、雄蕊なし）ため、自家受粉できない。商業的な種子の雑種トマト（種子）に、雄性不稔性が導入されたとしたとき、栽培者は、２倍の量の種子を播種し、植付け前に、ｍｓのマーカー遺伝子によって認識可能なヘテロ接合のｍｓ  ｐｋ植物の５０％を取り除かねばならない。交差問題から、これは、完全には不可能である。
−機能的不稔；生存花粉は存在するが、花の何らかの形態学的な異常によって雌蕊に到達できない。機能的不稔性（ｆｓ）それ自体は、４つの異なるタイプに区別することができ、すなわち：
−ｐｓ型：雄蕊が強く捩れていたり、短かったりする結果として、花柱が突き出る現象；この特性は、一般に容易な自家受粉及び花柱の受容性の低下をもたらし、そのため、これは、雑種種子の作出にあまり好適とはいえない；
−ｐｓ−２型：雑種種子の作出に用いられ、成功している、葯袋が開裂しないタイプ；
−ｅｘ型：雄蕊を越えて突き出た花柱、自家受粉が容易で、且つ柱頭（ｓｉｇｍａ）の受容性が低下するため、これは、雑種種子の作出に、それほど好適とはいえない；及び
−短花柱型：柱頭が葯の下に位置する、主な欠点は、その高レベルの自家受粉性である。
【００７５】
雑種は、遺伝的に異なる親の間の交配によって作出されるものである。植物の育種計画において、雑種を育成するには、一般に、ホモ接合の同系交配系統を育成し、それらの系統を交配したうえ、交配種を評価する必要がある。多くの植物育種計画は、２つ以上の同系交配系統又は様々な他の広範なベースをもつ供給源からの遺伝的背景を組み合わせて、育種プールに入れ、そこから、所望の表現型の自殖と選抜によって、新規の同系交配系統を育成する。雑種は、また、植物の育種材料の供給源又は供給源集団としても用いられ、そこから、新規の植物系統を開発したり、又は導出したりすることができる。雑種における形質の発現量が、２つの親によって発現する量の中間値を超えることがあり、これは、雑種強勢として公知である。
【００７６】
当該技術分野において、公知の植物育種技術としては、限定はされないが、循環選抜、系統育種、制限断片長多型促進選抜、遺伝マーカー促進選抜及び形質転換が挙げられる。同系交配系統は、系統育種及び循環選抜育種のような、前記方法を用いることにより、例えば、雑種から得てもよい。新規に育成した同系交配種を他の同系交配系統と交配し、それらの交配種からの雑種を評価して、それらのうち、どれが商業的可能性を有するかを決定する。
【００７７】
系統育種は、交配種からの分離世代において、個別に判定されるそれらの望ましさに基づくとともに、系譜に基づいて、個々の植物が選抜される育種システムである。
【００７８】
循環選抜は、選抜された個体の交雑と、それに続く、その集団における所望の対立遺伝子の頻度を高めるための選抜と交雑との連続サイクルに基づく育種方法である。
【００７９】
循環選抜は、例えば、戻し交配育種によって実施されてもよく、これには、雑種の親の一方に対して反復戻し交配を行い、それに伴って、１つ又は複数の特定の性質が選抜されることによる育種システムが関わる。戻し交配は、雑種の、その親のいずれかとの交配である。例えば、戻し交配を用いて、供与植物系統に存在する特定の望ましい形質を、当該形質を欠いた別の優良植物系統（例えば、同系交配系統）に導入することができる。このプロセスの第１のステップは、優良植物系統（反復親）を、対象とする形質に適切な遺伝子を保因する供与植物系統（非反復親）と交配することを伴う。次に、この交配種の後代を優良反復親と再び交雑させ、続いて、得られた後代のなかで、非反復親から導入されるべき所望の形質について選抜する。反復親から受け継がれる所望の形質及び生殖質について選抜して、第５代か、又はそれ以降の戻し交配世代になると、後代は、導入対象の特徴を制御する遺伝子座について、ホモ接合となり得るとともに、しかし、本質的に、他の遺伝子は、全て、優良親と同等となる。次に、最後の戻し交配世代を自殖させて、導入対象の遺伝子について、純粋種の後代を生じさせる。導入遺伝子を含む同系交配種から育成した雑種は、導入遺伝子なしに、同じ同系交配種から育成した雑種と、本質的に同じである。
【００８０】
トマトを含め、様々な作物において、異なる形質を獲得するために、一般に用いられている育種方法についての概要は、例えば、Ａｌｌａｒｄ，Ｒ．Ｗ．（１９６０年）「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ」；Ｓｉｍｍｏｎｄｓ，Ｎ．Ｗ．（１９７９年）「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｃｒｏｐ  Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ」；Ｓｎｅｅｐ，Ｊ．ら、（１９７９年）「Ｔｏｍａｔｏ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ」（１３５−１７１頁）：「Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  Ｖｅｇｅｔａｂｌｅ  Ｃｒｏｐｓ」、Ｍａｒｋ  Ｊ．Ｂａｓｓｅｔ、（１９８６年、編者）に所収、「Ｔｈｅ  Ｔｏｍａｔｏ  ｃｒｏｐ：ａ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ」、Ａｔｈｅｒｔｏｎ，Ｊ．Ｇ．及びＪ．Ｒｕｄｉｃｈ著、（１９８６年、編者）；「Ｐｌａｎｔ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ」；Ｆｅｈｒ（１９８７年）「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｃｕｌｔｉｖａｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」などの参考文献に見ることができる。
【００８１】
農作物は、植物の受粉方法を利用した技術を用いて育種される。植物は、１つの花からの花粉が同じ植物の同じ、又は別の花に移る場合に、自家受粉する。花粉が異なる植物の花から来た場合には、植物は、他家受粉する。何世代にもわたり自家受粉させて品種選抜した植物は、ほぼ全ての遺伝子座において、ホモ接合となり、均質な純種の後代集団が生じる。２つの異なるホモ接合系統の間で交配すると、多くの遺伝子座について、ヘテロ接合であり得る雑種植物の均質な集団が生じる。各々が、数多くの遺伝子座において、ヘテロ接合性である２つの植物を交配すると、遺伝的に異なり、均質ではないであろう雑種植物の集団が生じ得る。
【００８２】
トマト（リコペルシコン・エスクレンタム  Ｌ．（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ  Ｌ．）、すなわちガーデントマト）は、ナス（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）科（ナイトシェード）、ソラヌム（Ｓｏｌａｎｕｍ）属、リコペルシコン（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ）亜属に属する。他の重要なナス科植物としては、ジャガイモ（ソラヌム・ツベロスム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ））及びナス（ａｕｂｅｒｇｉｎｅ）又はナス（ｅｇｇｐｌａｎｔ）（ソラヌム・メロンゲナ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｍｅｌｏｎｇｅｎａ））が挙げられる。Ｌ．エスクレンタム（Ｌ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）種におけるあらゆる品種が、自家受粉性である。Ｌ．ピムピネルリホリウム（Ｌ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍ）（カラントトマト）、Ｌ．ヒルスタム（Ｌ．ｈｉｒｓｕｔｕｍ）（ヘアリートマト）及びＬ．ペルビアヌム（Ｌ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ）（ペルー産トマト）などのリコペルシコン（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ）亜属の他の多くの種が、他家受粉性である。従って、好ましくは、Ｌ．エスクレンタム（Ｌ．ｅｓｃｕｌｅａｔｕｍ）の同系交配原種系統は、望ましくない自家受粉性に起因して遺伝的に変化することを防ぐため、雄性不稔性である。有利には、かかる雄性不稔植物では、種子の作出費用が低減される。
【００８３】
トマト植物育種計画における雑種トマト品種の育成には、一般に、３つのステップが関わる：（１）初期育種交配種用の様々な生殖質プールから植物を選択するステップ；（２）育種交配種から選択された植物を数世代にわたり自殖して一連の同系交配系統を作出するステップ。この同系交配系統は、互いに異なるものの純種を生み、且つ高度に均質化されている；及び（３）選択された同系交配系統を、無関係な同系交配系統の、又は野生種のトマトと交配して雑種後代（Ｆ１）を作出するステップ。トマトにおける同系交配過程において、系統の生育力は、一般には、低下する。生育力は、同系交配系統が、別のトマト植物（例えば、別の同系交配種又は野生品種）と交配されて、雑種後代（Ｆ１）が作出されると、回復する。同系交配系統のホモ接合性及び同質性の重要な帰結は、一定の対の同系交配種を交配させることによって作り出された雑種は、常に同じであるということである。優良雑種を作り出す同系交配種が同定されたなら、それらの同系交配親を用いて、その雑種種子の継続的な供給を生み出すことができ、ひいては、この雑種種子の供給を受けて、雑種トマト植物を産生することができる。
【００８４】
植物育種の技術分野においては、考慮すべき重要な要因が多くあり、例えば、重要な形態学的及び生理学的特徴を認識する能力、目的とする遺伝子型及び表現型の形質についての評価技術を設計する能力、及び新規の、又は改良された組み合わせにおいて、所望の形質の遺伝子を探し出して利用する能力などである。
【００８５】
トマト植物育種計画から得られる商業的なトマト雑種系統を育成する目的は、新規の同系交配系統を育成することにより、組み合わせると高収量及び優れた農学的成果を生み出す雑種を開発することである。育種家が求める一次形質が得られたとしても、他の多くの主要な農学的形質が、雑種の組み合わせには重要であり、収量に影響を有したり、又は他の形で雑種の組み合わせに、優れた成果をもたらしたりする。かかる形質としては、作物の高い潜在能力、害虫を含む病気に対する耐性、干害及び熱ストレスなどのストレスに対する耐性、並びにトマト果実の風味、色、形及び保存性が挙げられる。加えて、系統それ自体は、種子の収量及び花粉の生成量などの、雑種形成に十分な量及び質の親系統を提供する能力に影響を及ぼす親形質について、許容可能な能力を有しなければならない。こうした形質は、遺伝的な制御下にあることが示されており、且つ、全てではないにしろ、多くの形質が、複数の遺伝子の影響を受ける。
【００８６】
雑種トマト植物の作出について、いずれのリコペルシコン・エスクレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）同系交配系統も、様々な育種系統の連続的な自殖及び選抜によって、そうした系統の遺伝子をホモ接合系統に組み合わせることを含む、従来の育種方法によって育成され得る。次に、土壌病原体並びに根及び茎の病気に対する耐性、大きいサイズ、果実の硬さ及び色、並びに好ましい根及び茎の発育に基づく系統選択が、数多くの後続の世代に適用されることにより、記載される同系交配親系統が生じ得る。次に、同系交配系統を、好ましくは、十分な世代数にわたり、自家受粉させて植え付け、そのホモ接合遺伝子型を特徴とするその形質の均質性及び表現型の安定性を確保する。異なる形質が認められなければ、その特徴は安定している。
【００８７】
ソラヌム属（Ｓｏｌａｎｕｍ）のなかで、ソラヌム・ペンネルリイ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｐｅｎｎｅｌｌｉｉ）ＬＡ７１６（Ｅｓｈｅｄら  １９９４年）、Ｓ．ハブロカイテス（Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）ＬＡ１７７７（Ｍｏｎｆｏｒｔｅら  ２０００ａ年）及びソラヌム・リコペルシコイデス（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｉｄｅｓ）ＬＡ２９５１（Ｃａｎａｄｙら  ２００５年）について、ＩＬが開発されている。かかる集団は、定量的形質の同定（Ｅｓｈｅｄら  １９９５年；Ｒｏｕｓｓｅａｕｘら  ２００５年）、ＱＴＬのファインマッピング（Ｆｒｉｄｍａｎら  ２００４年；Ｍｏｎｆｏｒｔｅら  ２００１年；Ｍｏｎｆｏｒｔｅら  ２０００ｂ年）及びＱＴＬクローニング（Ｆｒａｒｙら  ２０００年；Ｆｒｉｄｍａｎら  ２０００年；Ｋｕら  ２００１年）に、極めて有用であることが示されている。
【００８８】
現在、有限成長性のＳ．リコペルシクム（Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）Ｅ６２０３に、１つのＳ．ハブロカイテス（Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）ＬＡ１７７７  ＩＬ集団が存在する（Ｍｏｎｆｏｒｔｅら  ２０００ａ年）。
【００８９】
本明細書において、本出願人らは、有限成長性の栽培種トマトＳ．リコペルシクム（Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）品種Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒの背景におけるＳ．ハブロカイテス（Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）ＬＹＣ４／７８からの遺伝子移入に基づくＳ．ハブロカイテス（Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）の第２のＩＬ集団の育成と、種なしの単為結実性トマト植物の作出における、その系統の使用とについて記載する。
【００９０】
本発明の植物は、好ましくは雄性不稔である。雄性不稔性は、系統ＤＲＳ  ５．１に見られる機能的雄性不稔性（ｍａｌｅ  ｓｔｅｒｌｉｔｙ）などのように、特定の交配種に存在し得る。或いは、雄性不稔性は、機能的雄性不稔性を付与するｐｓ−２遺伝子を含む系統を供与植物として使用し、その遺伝子を、所望の植物系統に遺伝子移入することによって導入されてもよい。
【００９１】
機能的雄性不稔性は、雑種種子の作出にとって、重要な形質である。トマトにおいて、機能的雄性不稔性をコードする遺伝子のなかには、位置的不稔遺伝子ｐｓ−２がある。ｐｓ−２は、一遺伝子劣性であり、葯に不裂開性を付与するもので、実際の使用に最も好適である。分子利用選抜（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ：ＭＡＳ）用のマーカーが開発されている（Ｇｏｒｇｕｅｔら、２００６年、Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ、１１３（８）：１４３７−１４４８頁）。これは、機能的雄性不稔系統（ｐｓ−２／ｐｓ−２；ソラヌム・リコペルシクム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ））と機能的雄性稔性系統（Ｓ．ピムピネルリホリウム（Ｓ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍ））との間の種間交配種に由来するＦ２世代分離集団において行われた。ｐｓ−２遺伝子座は、４番染色体の短腕上で、マーカーＴ０９５８とＴ０６３５とによって区切られる１．６５ｃＭの間隔内にあることが分かった。この領域は、ＭＡＳに有用であり得るＣＯＳマーカーも多く含む。
【００９２】
本発明の方法は、例えば、欧州特許第１４２８４２５号明細書に記載されるとおりの、種なし植物を作出する方法を利用してもよく、そこでは、以降に、さらに考察される、以下のステップを含む方法によって、ｆｓ／ｐｋ複合植物が作出され得る：
ａ．本明細書に定義されるとおりの「元の種なし親」を、本明細書に定義されるとおりの「元の非種なし親」と交配することにより、非種なしＦ１世代を提供するステップ；
ｂ．そのように得られたＦ１世代を、自家受粉させて、本明細書で、Ｆ２世代と称される、後続の世代を提供するステップ。
ｃ１．そのように得られたＦ２のうち、種なし表現型を有する任意の植物を選抜し、それらの種なし植物を自家受粉させて、第１のＦ３世代を提供するステップ；並びに
ｃ２．そのように得られたＦ２のうち、機能的不稔性の表現型を有する任意の植物を選抜し、それらの植物を自家受粉させ、それによって、第２のＦ３世代を提供するステップ；
ｄ．第１のＦ３世代又は第２のＦ３世代のうち、種なし表現型を有する任意の植物を選抜するステップ；
ｅ．第１のＦ３世代又は第２のＦ３世代のうち、種なし表現型を有する植物を自家受粉させ、それによって、Ｆ４世代を提供するステップ；
ｆ．そのように得られたＦ４世代のうち、種なし表現型を有する植物を自家受粉させ、それによって、Ｆ５世代を提供するステップ；及び場合により、そのように得られたＦ５世代のうち、種なし表現型を有する植物を自家受粉させ、それによって、Ｆ６世代を提供するステップ。
【００９３】
欧州特許第１４２８４２５号明細書には、通常、ステップｅ）で得られるＦ５世代、及び特にＦ６世代までには、そのように得られた植物のｐｋ，ｆｓ複合体は、十分に安定している、すなわち「定着した」状態となっているであろうことから、そのトマト植物を、その発明におけるｐｋ，ｆｓ親として用いるか、又は他のｐｋ，ｆｓ親（の系統）を、すなわち、さらに別の特性で交配するか、若しくは戻し交配によって得るための出発植物若しくは系統として用いることができることが報告された。Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５、Ｆ６及びそれ以降の世代が、種なし表現型−又は「第２のＦ３世代」の場合には、少なくとも、機能的不稔性の表現型−を有するとき、Ｆ４、Ｆ５、Ｆ６及びそれ以降の世代を得て、同時に、種なし雑種を作出するため、ｐｋ，ｆｓ親系統を維持するには、以下に定義されるとおりの、人の介入が必要とされ得る。後続の世代を提供するためのこの人の介入に対する要件は、概して、本明細書では、「誘発性の自家受粉（ｃａｕｓｉｎｇ  ｓｅｌｆ−ｐｏｌｌｉｎａｔｉｏｎ）」とも称される。欧州特許第１４２８４２５号明細書では、Ｆ２が、通常、１００個のＦ２植物のうち、多くとも約１個又は２個の種なし植物しか含まないばかりか、使用される元の種なし親及び特に元の非種なし親によっては、種なし植物を提供しないこともあると報告した。種なしＦ２植物が得られるときでさえ、その量（すなわち、１〜５％）は、二重劣性のｐａｔ−２遺伝子及びｐｓ−２遺伝子が、単独で種なし表現型を提供するのに十分に存在する場合に、メンデルの法則に従って、期待される８．２５％（すなわち、１６個のうち１個の植物）より大幅に少ないことが分かった。これは、元の非種なし親との交配が、明らかに、何らかの−おそらくは優性の−遺伝子、対立遺伝子又はその他の遺伝要因を導入し、それが、Ｆ２における種なし表現型の出現に負の影響を及ぼすことを示している。Ｆ２は、通常は、ある機能的不稔性の植物を含み、すなわち、これもまた、元の種なし親及び特に元の非種なし親によって、通常は、１００個のうち約１０〜１５個の植物を含むことが分かった。これもまた、二重劣性のｐｓ−２が、単独で機能的不稔性の表現型を提供するのに十分に存在する場合に、メンデルの法則に従って、期待される２５％未満である。これは、所望の機能的不稔性の表現型の存在も、また、遺伝要因の複合体によって決定されることを示している。
【００９４】
欧州特許第１４２８４２５号明細書に記載される方法には、さらに、Ｆ２の種なし植物を選抜して自家受粉させることによって、本明細書で、「第１のＦ３世代」と称されるＦ３を提供することが含まれる。Ｆ２植物が、種なし表現型であるにもかかわらず、Ｆ２植物の種なし表現型を示すのは、時にこのように得られたＦ３植物の一部であり、Ｆ３植物の０〜１００％を構成し得るが、ほとんどの場合には、約１０〜２０％しか構成しないことが報告された。これは、おそらく、このＦ２植物における種なし表現型が、遺伝子の複合体（すなわち、本発明のｐｋ，ｆｓ複合体）によって引き起こされ、元の種なし親にあるとおりのホモ接合の劣性ｐａｔ−２遺伝子及びｐｓ−２遺伝子のみによって引き起こされるのではないことを裏付けたものと思われる。また、Ｆ２においては、ｐｋ，ｆｓ複合体が、完全に種のない子孫を提供するには、十分には定着していない−すなわち、遺伝的に十分に同質でない−ことも示したものと思われる。
【００９５】
このため、上記のとおり得られる種なしＦ２植物も、また、欧州特許第１４２８４２５号明細書に記載される発明において、ｐｋ，ｆｓ親として使用するには好適ではなかった。種なし表現型を示す第１のＦ３世代の植物を選抜して自家受粉させることで、Ｆ４が提供された。ここでも、種なし表現型を示し得るのは、通常は、種なしＦ３植物から得られるＦ４植物の一部であることが分かった：種なしＦ４植物の量は、０〜１００％まで異なり得るが、通常は、全てのＦ４植物の約１０〜２０％である。また、あらゆる環境条件下で、全てのＦ４植物が種なしであるわけではないことが分かった。これもまた、これらのＦ３又はＦ４植物においては、ｐｋ，ｆｓ複合体が、欧州特許第１４２８４２５号明細書に記載される発明において、ｐｋ，ｆｓ親として用いられるには、まだ十分に定着していないことを示したものと思われる。次に、Ｆ４からの種なし植物を、再び自家受粉させて、Ｆ５を提供し、Ｆ５からの前記種なし植物を、自家受粉させて、Ｆ６を提供した。ここでも、おそらく種なしのＦ４又はＦ５において、それぞれ、ｐｋ，ｆｓ複合体が、まだ十分に定着していなかったと思われるため、Ｆ５において、及び時にＦ６においても、一部に非種なし植物が得られた。通常は、Ｆ６世代までに、種なしＦ６植物におけるｐｋ，ｆｓ複合体は、十分に安定し、従って、全ての種なしＦ６植物が、自家受粉させると、種なしＦ７植物のみを提供すると考えられた。これはまた、このようにして得られたＦ６同系交配種が、欧州特許第１４２８４２５号明細書に記載される発明において、ｐｋ，ｆｓ親として用いられ得ることを示したものとも思われる。Ｆ７が、なおいくらかの非種なし植物を提供したならば、Ｆ７を再び自家受粉して、Ｆ８を提供し得るなど、ｐｋ，ｆｓ複合体が、十分に定着する世代が得られるまで行われる。しかしながら、これは、通常は、不要であり、また好ましいことでもない。また、Ｆ９までに、特にＦ１０世代までに、ｐｋ，ｆｓ複合体が、なお十分に定着するようにならなかった場合、通常、それは、その同系交配系統が、欧州特許第１４２８４２５号明細書に記載される発明において、ｐｋ，ｆｓ親系統として用いることができないと考えられる。
【００９６】
一般に、使用される元の種なし親、しかし、特に非種なし親によっては、少数の種なしＦ２植物しか、Ｆ６まで「たどり着く」ことができない。また、Ｆ６の産生においても、あらゆる環境条件下で、種なし表現型の安定性及び確実性を試験するため、何らかの選択圧が加えられ得る。例えば、光、温度などの要因を用いて、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５又はＦ６の種なし表現型の安定性を「試験」し、及び／又は定着させることができる。種なしＦ２植物以外に、機能的不稔性の表現型のみを示すＦ２植物も自家受粉され、それによって、本明細書で「第２のＦ３世代」と称されるＦ３世代が提供される。この第２のＦ３世代は、通常、本質的に全ての機能的不稔性の植物を含み、且ついくらかの種なし植物、すなわち４０個のＦ３植物のうち約１〜３個を含み得る（これらは、この第２のＦ３において果実が成長する唯一のものであるため、容易に見分けて選抜することができる）。種なしであれば、本質的に、第１のＦ３世代について記載されるとおり、これらの種なしＦ３植物を自家受粉させて、Ｆ４を、続いて、Ｆ５及びＦ６、場合により、Ｆ７及びＦ８などを提供する。この場合も、やはり使用される同様に元の種なし親、及び特に元の非種なし親によって、Ｆ６までたどり着くのは、第２のＦ３世代のうち一部の種なし植物である。
【００９７】
上記の方法論では、元の種なし親と元の非種なし親との所与の組み合わせについて、Ｆ２において、種なし植物が全く得られず、且つ機能的不稔性の植物が僅かしか得られない可能性がある。次に、これらの機能的不稔性のＦ２植物が自家受粉される。しかしながら、このようにして得られたＦ３において、再び種なし植物が見られなかった場合、通常、この特定の組み合わせの元の種なし親と元の非種なし親とは、その発明に係るｐｋ，ｆｓ親の提供に用いることができないと考えられる。これについての可能な説明としては、使用される元の非種なし親が、使用される元の種なし親に既に存在する遺伝子に対し、ｐｋ，ｆｓ複合体を「完成」させるために必要な全ての遺伝要因（すなわち、遺伝子、対立遺伝子又は他の要因）を含まなかったということがあり得る。
【００９８】
従って、本発明は、さらなる態様において、上記に記載されるとおりに得られ、及び／又は得ることができ、及び／又は本明細書に記載される方法における使用に適した種子又は苗などの（場合により容器に入った）トマト用栽培材料、並びに種なしトマトに関するものである。
【００９９】
本発明に係る単為結実性トマトは、また、それ自体公知の方法で、トマト製品、特に食品にさらに加工されてもよく、それは、最終消費向けに準備されるか、又はそれに適した形態であっても、又はなくてもよい。この点で、本発明に係るトマトは、製品加工において種子／ピップを取り除くための追加的なステップなしに、直接加工することができるという利点を有する。
【０１００】
従って、本発明は、さらなる態様において、本発明に係る種なしトマトから得られる製品、特に食品、並びに前記食品を得るための方法に関し、ここで、トマトは、種を取り除くための別個のステップなしに、これらの製品に加工される。従って、かかる方法は−とりわけ−、トマトを別の方法でピューレ状にしたり、又はすり潰したりするステップと、場合により、それに続いて追加的な所望の成分を取り入れたり、又は添加したりするステップと、そのようにして得られた、種子又はその残留物のないトマト製品を、保管、輸送又は販売に好適な容器に包装するステップとを含んでもよく、ここで、前記方法は、トマトをすり潰すステップと製品を包装するステップとの間に、いかなるピップ／種子を取り除くステップも含まない。
【０１０１】
本明細書に開示されるとおりの遺伝因子は、雄性不稔性を提供し、その結果、形成される種子は繁殖能を有しない。
【０１０２】
本発明の方法及び植物は、単為結実性であることに加え、好ましくは、雄性不稔性、最も好ましくは、機能的不稔性、例えば、位置的不稔性でもある。さらに、本明細書に開示されるとおりの遺伝因子は、受精なしに着果が起こる現象である単為結実をもたらす。
【０１０３】
本明細書に開示されるとおりの遺伝学的因子（ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｌｅｍｅｎｔ）は、単為結実性及び／又は雄性不稔性を提供することに加え、果実収量の増加を提供する。本発明の単為結実植物の利点は、同一時期に収穫された非種なしトマトと比較して、それらが、（乾燥重量で表されるとき）果肉含有量が高い、すなわち、トマトの総重量を基準として、１、２、５、１０、２５、若しくは３５％、又はそれ以上の果実を結実することである（すなわち、約１１０〜１２０グラムの収穫時の総重量に対し、平均して種なしトマトについては、約５．５〜６．５グラムの乾燥物質、それと比較して、非種なしトマトについては、約４．５〜５．５グラムの乾燥物質）。乾燥物質収量で見れば、これは、少なくとも約２０％の増量を意味する（ここで、さらに、非種なしトマトの乾燥物質は、なおピップを含み得る）。
【０１０４】
発明の効果
以上から、当業者は、雄性不稔性を用いることにより、植物における単為結実を見出すことができる。通常、種子形成が起こらないときには、単為結実性は発見されないままであり得る（表に現れない）。この隠れた単為結実性は、単為結実植物と隠れた単為結実性を有する植物との間の交配種の子孫を交配し、種子のない着果についてその交配種を検査することによって見出すことができる。
【０１０５】
好ましくは、本明細書に定義されるとおりの遺伝子移入は、ホモ接合形態で存在する。
【０１０６】
ここで、本発明は、Ｓ．ハブロカイテス（Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）ＬＹＣ４／７８に由来する単為結実の表現型に関与する遺伝子をクローニングする方法を提供する可能性についても提供する。
【実施例】
【０１０７】
実施例１
適切な遺伝的構成を有する候補親植物の選抜を伴う、より効果的な育種プロセスを作るためには、候補親植物の少なくとも１つにおける当該の遺伝的構成の存在を示す１つ又は複数の遺伝マーカーを自在に使えるようにする必要がある。このプロセスは、選抜された植物の交配を含む、マーカー利用選抜（ＭＡＳ）と称されるもので、好ましい親の対立遺伝子を供与種から受容集団に効率的に導入し、且つ、当該育種が、もはや偶然に依存することなく、育成コストの点で、経済的に、はるかに効果的であることを保証する。
【０１０８】
材料及び方法
植物材料及びＩＬの育成
ソラヌム・ハブロカイテス（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）ＬＹＣ４／７８（これ以降、ＬＹＣ４／７８と称される；１９７８年の種子バッチ）の種子は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｃｒｏｐ  Ｐｌａｎｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｇａｔｅｒｓｌｅｂｅｎ、独国にある遺伝子バンクから入手した。
【０１０９】
ソラヌム・リコペルシクム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）品種Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒ（これ以降、Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒと称される）の種子は、Ｄｅ  Ｒｕｉｔｅｒ  Ｓｅｅｄｓ  Ｒ＆Ｄ  ＢＶ、Ｂｅｒｇｓｃｈｅｎｈｏｅｋ、オランダ国の種子バンクから入手した。
【０１１０】
ＭｏｎｅｙｍａｋｅｒとＬＹＣ４／７８との間の種間交配を行って、Ｆ１種子を作った。Ｆ１種子を成長させて、Ｆ１植物とした。１つのＦ１植物の自殖から得たＦ２種子を播種し、１７４個体のＦ２集団を得た。Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒを反復雌性親とした２回の戻し交配によって、５９個体のＢＣ２（戻し交配第２代）集団を産生した。ＭＡＳを用いて、同定された２つの単為結実性付与遺伝因子のうちの一方を含むＢＣ２、ＢＣ３、及びＢＣ４遺伝子型を選抜し、いくつかのＢＣ２を自家受粉して、ＢＣ５Ｓ１種子を作出した（図２を参照）。上述されたとおり、１つのＦ１植物を自家受粉して、Ｆ２種子を得て、ＳＬに戻し交配して、ＢＣ１種子を得た。最初に、Ｆ２種子を用いて、遺伝子連鎖地図を作成した。ＢＣ１種子を用いて、ＩＬを育成した（図３）。
【０１１１】
ＤＮＡ単離及びマーカー解析
２枚の幼葉（巻き上がった葉）から、Ｓｔｅｗａｒｄ及びＶｉａ（１９９３年）によるプロトコルに基づき、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）を用いて、それを１ｍｌマイクロ試験管（Ｍｉｃｒｏｎｉｃ  ＢＶ、Ｌｅｌｙｓｔａｄ、オランダ国）を使用したハイスループットＤＮＡ単離用に調整し、且つ最高速度でＲｅｔｓｃｈ  ３００ｍｍ振盪機（Ｒｅｔｓｃｈ  ＢＶ、Ｏｃｈｔｅｎ、オランダ国）を用いて粉砕して、ゲノムＤＮＡを単離した。本質的に、Ｍｙｂｕｒｇ（Ｍｙｂｕｒｇら  ２００１年）によって公表されている方法に従い、Ｆ２、ＢＣ２、ＢＣ３、ＢＣ４及びＢＣ５Ｓ１集団のＡＦＬＰ分析（Ｖｏｓら、１９９５年）を行い、ＬＩ−ＣＯＲ  ４２００  ＤＮＡシーケンサーでＡＦＬＰ断片を解像した。選択的ＰｓｔプライマーをＩＲＤ  ７００又はＩＲＤ  ８００蛍光標識で標識した。ＡＦＬＰ−Ｑｕａｎｔａｒ  Ｐｒｏソフトウェアパッケージ（Ｋｅｙｇｅｎｅ  ＢＶ、Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ、オランダ国）を使用して、ＡＦＬＰゲル画像をスコアリングした。Ｂａｉら（２００３年）によって記載されるとおり、以下の１０組のプライマーの組み合わせ、すなわち、Ｐ１４Ｍ４８、Ｐ１４Ｍ４９、Ｐ１４Ｍ５０、Ｐ１４Ｍ６０、Ｐ１４Ｍ６１、Ｐ１５Ｍ４８、Ｐ１８Ｍ５０、Ｐ１８Ｍ５１、Ｐ２２Ｍ５０及びＰ２２Ｍ５１とアダプター配列とを用いて、遺伝子型を決定した。
【０１１２】
Ｆ２集団の表現型分析
Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒ×ＬＹＣ４／７８の間の交配種から得られたＦ２集団の個体を交配して得られた植物において、果実サイズ（収量、果実の重量、果実の高さ、果実の直径）及び種子形成（ＳＳ）の違いを観測した（表１を参照）。種なし（ＳＳ−）で、且つ対照（Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒ［ＳＬ］最下行）と比較して、正常な果実サイズを示した植物を、単為結実性とみなした。
【０１１３】
【表１】
2010527586.tif 000002
【０１１４】
分子マーカー及び遺伝子連鎖地図
Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒ×ＬＹＣ４／７８の交配種から得られたＦ２集団（ｎ＝１７４）について、遺伝子連鎖地図を計算した。Ｆ２集団（ｎ＝１７４）において、１０組のプライマーの組み合わせを用いて、２１８個の増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）マーカーを得た。合計６９個のマーカー（３１．７％）は、容易に共優性としてスコアリングすることができ、従って、統合的なＦ２遺伝子連鎖地図の計算が可能となった。ＢＣ２、ＢＣ３及びＢＣ２Ｓ１遺伝子型に対して実施したマーカー解析により、さらなる１４５個のＡＦＬＰマーカーが追加された。これらの１４５個のさらなるＡＦＬＰマーカーのうち、合計１０２個は、Ｆ２ゲルの複雑性に起因して、それまでスコアリングされていなかった。全体的な遺伝子連鎖地図は、１４個の連鎖群の３１５個のＡＦＬＰマーカーからなったとともに、全長は、９５８ｃＭである。種内で同時に移動するＡＦＬＰマーカーは、一般には、対立遺伝子に特異的であるため、他のＡＦＬＰ連鎖地図との共直線性を用いて、連鎖群を染色体に割り当てた。一部のＭｏｎｅｙｍａｋｅｒ特異的ＡＦＬＰマーカーが、公表されているとおりの遺伝子連鎖地図（Ｈａａｎｓｔｒａら  １９９９年；Ｂａｉら  ２００３年）と共通していたことから、同定された単為結実性付与遺伝因子を有する連鎖群を含め、一部の連鎖群を染色体に割り当てることができた。単為結実性付与遺伝因子の間隔について、連鎖地図を改良するため、公表されているＳ．リコペルシクム（Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）×Ｌ．ペンネルリイ（Ｌ．ｐｅｎｎｅｌｌｉｉ）地図（Ｔａｎｋｓｌｅｙら  １９９２年；Ｈａａｎｓｔｒａら  １９９９年）に基づき、これらの領域に、診断用ＣＡＰＳマーカーを加えた。
【０１１５】
マーカー解析
２枚の幼葉（巻き上がった葉）から、Ｓｔｅｗａｒｄら（１９９３年）によるプロトコルに基づき、ＣＴＡＢを用いて、それを１ｍｌマイクロ試験管（Ｍｉｃｒｏｎｉｃ  ＢＶ、Ｌｅｌｙｓｔａｄ、オランダ国）を使用したハイスループットＤＮＡ単離用に調整し、且つ最高速度でＲｅｔｓｃｈ  ３００ｍｍ振盪機（Ｒｅｔｓｃｈ  ＢＶ、Ｏｃｈｔｅｎ、オランダ国）を用いて粉砕して、ゲノムＤＮＡを単離した。
【０１１６】
本質的に、Ｍｙｂｕｒｇ（２００１年）によって公表されている方法に従い、各戻し交配種及びＩＬのＡＦＬＰ（商標）分析（Ｖｏｓら  １９９５年）を行い、ＬＩ−ＣＯＲ  ４２００  ＤＮＡシーケンサーでＡＦＬＰ断片を解像した。選択的ＰｓｔプライマーをＩＲＤ  ７００又はＩＲＤ  ８００蛍光標識で標識した。ＡＦＬＰ−Ｑｕａｎｔａｒ（商標）Ｐｒｏソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋｅｙｇｅｎｅ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ．ｃｏｍ）を用いて、ＡＦＬＰゲル画像をスコアリングした。プライマー及びアダプター配列は、Ｂａｉら（２００３年）によって記載される。
【０１１７】
ＣＡＰＳプライマーの各セットは、「Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｗｅｂｓｉｔｅ」（ｈｔｔｐ：／／ｓｇｎ．ｃｏｒｎｅｌｌ．ｅｄｕ）から入手するか、又は同じ情報源から入手可能な遺伝子クローン又はｃＤＮＡクローンの配列上で設計した。Ｂｒｕｇｍａｎｓら（２００３年）によって記載されるＣＡＰＳ消化手法を用いて、Ｓ．ハブロカイテス（Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）とＳ．リコペルシクム（Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）との間の多型を決定した。遺伝子型に対して用いられたマーカー配列、ＰＣＲ条件、及び特異的制限エンドヌクレアーゼが、Ｔａｂｌｅ  ３０に提示される。ＰＣＲ産物は、概して２．５％アガロースゲルを用いて分離した。Ｔａｂｌｅ  ３１には、目的のＱＴＬに見られる表３０のマーカーの各々について、Ｓ．リコペルシクム（Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）とＳ．ハブロカイテス（Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）とを識別する種々の消化産物が示される。
【０１１８】
結果
ＩＬ集団
Ｓ．リコペルシクム（Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）品種Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒ（ＳＬ）の遺伝的背景におけるＳ．ハブロカイテス（Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）ＬＹＣ４／７８（ＳＨ）の遺伝子移入系統（ＩＬ）集団を育成した。ＳＬとＳＨとの間の交配から得られたあるＦ１植物をＳＬに戻し交配した（図２）。続いて、１４個のＢＣ１植物の無作為集合をＳＬに戻し交配して、ＢＣ２後代を得た（ｎ＝５９）。全てのＢＣ２植物の遺伝子型を決定し、選抜された集合をＳＬに戻し交配した。この集合は、組み合わされた遺伝子移入が可能な限り多くのＳＨゲノムを網羅し、同時に、各外来染色体が３つのＩＬによって代表されるように組換え体が選択されるような方法で選抜した。この選抜と戻し交配とのプロセスを、ＢＣ５まで繰り返した。大部分が１つ又は２つの遺伝子移入を含む３１個の選抜されたＢＣ５植物を自家受粉させた。３１個のＢＣ５Ｓ１系統群の各々のうち、最高１２個の植物を自家受粉させ、ＡＦＬＰマーカーでスクリーニングして、遺伝子移入のためのホモ接合のＢＣ５Ｓ２後代を得た（ｎ＝４４）。４４個のＩＬのマーカーを再度スクリーニングし、３０個のＩＬの中心セットを選択した。この中心セットは、可能な限り少ないＩＬにおいて、最大限に網羅されたＳＨゲノムに相当する（図３）。中心セットは、単一の遺伝子移入を有する１５個のＩＬと、２つの遺伝子移入を含む１０個のＩＬと、３つの遺伝子移入を含む４個のＩＬと、一方で、さらに４つのホモ接合の遺伝子移入を含んだ１個のＩＬとからなる。平均して、各ＩＬは、６０ｃＭ（＝５．２％）のＳＨゲノムを含み、遺伝子移入の長さは、２０（１．７％）〜１２２ｃＭ（１０．６％）まで異なった。本出願人のＩＬ集団は、元のＦ２連鎖地図の長さの９５％を網羅した。しかしながら、本出願人は、このＦ２連鎖地図がゲノムを完全には網羅していないと理解している。これは、３番染色体（短腕の上端）、４番染色体（短腕の上端）、５番染色体（長腕）及び９番染色体（短腕の上端）における追加的なＣＡＰＳ分析によって示され、ここで、ＣＡＰＳマーカーにより、ＡＦＬＰに基づくＦ２連鎖地図において、マーカーのない遺伝子移入が明らかとなった。これらの遺伝子移入のサイズを、高密度ＲＦＬＰ地図（Ｔａｎｋｓｌｅｙら  １９９２年；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｇｎ．ｃｏｒｎｅｌｌ．ｅｄｕ）に基づき推定した。３番染色体の上端については、これまでのスクリーニングにかからなかったため、この領域についてのＩＬは、ヘテロ接合である。ＩＬ５−１及び５−２について、ホモ接合のＳＨであるように選抜された植物は、種子を形成できなかったことから、これらの系統をヘテロ接合状態に維持した。８番染色体の短腕の上端及び２番染色体の長腕の下端を含むＩＬは存在しなかった。７番及び９番染色体の短腕の上端にある遺伝子移入は、複数のＩＬに存在した。９番染色体の上端についての選抜は、この領域に特異的なＣＡＰＳマーカーを開発した後にのみ可能であった。本明細書の上記の説明において、ＩＬ５−１は、ＤＲＳ５．１と称される。
【０１１９】
本明細書で使用されるマーカー配列
以下の表は、様々な連鎖地図に示され、且つ本発明のＱＴＬとの関連について示される様々なＲＦＬＰマーカー及びＣＯＳ−ＩＩマーカーに関する詳細な情報を提供する。Ｔａｂｌｅｓ１０〜２９の情報は、Ｃｏｒｎｅｌｌ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙにホスティングされるＳＯＬ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＳＧＮ）データベースの２００５年１０月７日版から、そのままコピーした。
【０１２０】
本明細書に記載されるとおりのＩＬライブラリスクリーニングによって単為結実形質と関連することが認められたいくつかのマーカーの配列を配列決定したうえで、本明細書に開示される単為結実性付与因子の領域におけるＳ．ハブロカイテス（Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）ＬＹＣ４／７８の配列に関する詳細な情報を提供する。
【０１２１】
【表２】
2010527586.tif 000003
【０１２２】
【表３】
2010527586.tif 000004
【０１２３】
【表４】
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【０１２４】
【表５】
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【０１２５】
【表６】
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【０１２６】
【表７】
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【０１２７】
【表８】
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【０１２８】
【表９】
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【０１２９】
【表１０】
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【０１３０】
【表１１】
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【０１３１】
【表１２】
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【０１３２】
【表１３】
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【０１３３】
【表１４】
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【０１３４】
【表１５】
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【０１３５】
【表１６】
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【０１３６】
【表１７】
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【０１３７】
【表１８】
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【０１３８】
【表１９】
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【０１３９】
【表２０】
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【０１４０】
【表２１】
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【０１４１】
【表２２】
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【０１４２】
【表２３】
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【０１４３】
【表２４】
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【０１４４】
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【図１】
2010527586.tif 000026
【図２】
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【図４】
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【図３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年3月11日(2010.3.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１３】
【表１】
2010527586.tif 000059
【国際調査報告】
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2010527586.tif 000061
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