(57)【要約】【課題】本願は、軟骨形成もしくは修復のための組成物を提供する。【課題を解決するための手段】本願発明は、ＮＥＬＬペプチドもしくは関連する作用剤を使用した軟骨形成の促進もしくは修復を誘導する作用剤および方法に関する。組成物には、ＮＥＬＬペプチド、ＮＥＬＬ様ペプチド、および任意で少なくとも一つの他の活性剤、細胞、および生体適合材料を軟骨（すなわち、硝子軟骨、弾性軟骨、繊維軟骨）の修復の目的で含んでもよい。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＥＬＬペプチドもしくはＮＥＬＬ関連作用剤を含有する軟骨形成もしくは修復を促進する組成物であって、前記ＮＥＬＬペプチドもしくはＮＥＬＬ関連作用剤が、軟骨形成もしくは修復に効果的な量である組成物。
【請求項２】
前記ＮＥＬＬペプチドが、ＮＥＬＬ１ペプチドである請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＮＥＬＬ関連作用剤が、ＮＥＬＬ遺伝子産物である請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
第二作用剤をさらに有する請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
軟骨保護作用剤、アンチペインおよびまたは抗炎症剤、成長因子、サイトカイン、低分子、抗血管新生因子およびそれらの組み合わせの一群から選択される前記第二作用剤をさらに有する請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
医薬品として許容可能なキャリアをさらに有する請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
医薬品として許容可能なキャリアをさらに有する請求項４に記載の組成物。
【請求項８】
化学ゲル、物理ゲル、相互侵入網目、もしくは架橋剤を有する物質をさらに有する請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
ヒトの体内の部分に適用されたと同時に注入もしくは成形可能な物質を有する請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
刺激に対する反応として、ＮＥＬＬペプチドもしくはＮＥＬＬ関連作用剤を分解もしくは放出する材料をさらに有する請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記刺激は、機械的刺激、光、電磁界、温度変化、ｐＨ変化、イオン強度の変化から選択される請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
骨軟骨前駆細胞をさらに有する請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
間葉細胞、胎生細胞、幹細胞、骨髄細胞、脂肪幹細胞、繊維芽細胞、もしくはそれらの組み合わせから選択される骨軟骨前駆細胞をさらに有する請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
軟骨形成細胞をさらに有する請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
軟骨の形成もしくは修復は、硝子もしくは気管軟骨、弾性軟骨、または繊維軟骨の形成もしくは修復である請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
装置に配合される請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ＮＥＬＬペプチドもしくはＮＥＬＬ関連作用剤は、軟骨に関連する障害を治療、予防、向上するのに効果的な量である請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
前記軟骨に関連する障害は、種々の関節の関節症、種々の関節の関節炎、種々の関節の軟骨関節内障、もしくは脊椎関節および円板関連障害である請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
表面を持つ基材を有するヒトの体内で使用する移植片であって、前記表面の少なくとも一部分が請求項１に記載の組成物を含む移植片。
【請求項２０】
表面を持つ基材を有するヒトの体内で使用する移植片であって、前記表面の少なくとも一部分が請求項４に記載の組成物を含む移植片。
【請求項２１】
表面を持つ基材を有するヒトの体内で使用する移植片であって、前記表面の少なくとも一部分が請求項５に記載の組成物を含む移植片。
【請求項２２】
表面を持つ基材を有するヒトの体内で使用する移植片であって、前記表面の少なくとも一部分が請求項６に記載の組成物を含む移植片。
【請求項２３】
表面を持つ基材を有するヒトの体内で使用する移植片であって、前記表面の少なくとも一部分が請求項７に記載の組成物を含む移植片。
【請求項２４】
表面を持つ基材を有するヒトの体内で使用する移植片であって、前記表面の少なくとも一部分が請求項１２に記載の組成物を含む移植片。
【請求項２５】
前記基材が再吸収可能である請求項１９に記載の移植片。
【請求項２６】
前記基材がコラーゲンを有する請求項１９に記載の移植片。
【請求項２７】
前記基材が再吸収可能である請求項２０に記載の移植片。
【請求項２８】
前記基材がコラーゲンを有する請求項２０に記載の移植片。
【請求項２９】
請求項１９に記載の移植片は、
軟骨形成を促進するために椎間板に直接注入もしくは移植可能で、細胞を有するもしくは有さないＮＥＬＬタンパク質を有する注入／移植可能な装置；
椎間板の内側部分もしくは椎間板の内側部分および外側部分の両方を置換するように設計されたＮＥＬＬを含浸させた円板核置換装置；
種々の関節空間に直接注入可能、または関節鏡もしくは切開により種々の関節空間に移植可能で、細胞を有するかもしくは有さないＮＥＬＬを有する注入／移植可能な装置；
軟骨形成を促進するために椎間板に直接注入／移植可能で、移送伝達手段を有するかもしくは有せず、細胞を有するかもしくは有さないＮＥＬＬ核酸を有する注入／移植可能な装置；
椎間板の内側部分（核）もしくは椎間板の内側部分および外側部分の両方を置換するように設計された移送伝達手段を有するかもしくは有さないＮＥＬＬ核酸を含浸させた円板核置換装置；
種々の関節空間に直接注入可能、または関節鏡もしくは切開により種々の関節空間に移植可能で、移送伝達手段を有するかもしくは有せず、細胞を有するかもしくは有さないＮＥＬＬ核酸を有する注入／移植可能な装置；
軟骨形成を促進するために椎間板に直接注入／移植可能で、細胞およびその他の因子を有するかもしくは有さないＮＥＬＬタンパク質を有する注入／移植可能な装置；
椎間板の内側部分もしくは椎間板の内側部分および外側部分の両方を置換するように設計されたＮＥＬＬおよびその他の因子を含浸させた円板核置換装置；
種々の関節空間に直接注入可能、または関節鏡もしくは切開により種々の関節空間に移植可能で、細胞を有するかもしくは有さないＮＥＬＬおよびその他の因子を有する注入／移植可能な装置；
軟骨形成を促進するために椎間板に直接的に注入／移植可能で、移送伝達手段を有するかもしくは有せず、細胞を有するかもしくは有さないＮＥＬＬ核酸およびその他の因子を有する注入／移植可能な装置；
椎間板の内側部分もしくは椎間板の内側部分および外側部分の両方を置換するように設計された移送伝達手段を有するかもしくは有さないＮＥＬＬ核酸を含浸させた円板核置換装置；または、
種々の関節空間に直接注入可能、または関節鏡もしくは切開により種々の関節空間に移植可能で、移送伝達手段を有するかもしくは有せず、細胞を有するもしくは有さないＮＥＬＬ核酸を有する注入／移植可能な装置、から選択される装置である移植片。
【請求項３０】
軟骨形成もしくは修復を増進する方法であって、
軟骨形成もしくは修復が望まれる領域でＮＥＬＬ遺伝子産物の濃度を上げる工程と、
軟骨形成もしくは修復は望まれる領域に作用剤を適用する任意の工程と、
軟骨形成もしくは修復が望まれる領域で軟骨芽細胞の肥大化を少なくとも誘導する工程と、を有する方法。
【請求項３１】
軟骨形成もしくは修復は、骨治癒もしくは骨再形成を含む請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ＮＥＬＬ１遺伝子産物の濃度を上げる工程は、ＮＥＬＬペプチドもしくはＮＥＬＬ関連作用剤を軟骨形成もしくは修復が望まれる領域に適用する工程を有する請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記作用剤は、軟骨保護作用剤、アンチペインおよび／または抗炎症剤、成長因子、サイトカイン、低分子、抗血管新生因子、もしくはこれらの組み合わせから選択される請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記作用剤は、コラーゲン、骨マトリクス、靱帯マトリクス、腱マトリクス、軟骨形成細胞、もしくは骨軟骨前駆細胞から選択される請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
軟骨に関連する状態を治療、予防、もしくは向上する方法であって、対象の哺乳類に請求項１に記載の組成物を適用する工程を有する方法。
【請求項３６】
軟骨に関連する状態を治療、予防、もしくは向上する方法であって、対象の哺乳類に請求項４に記載の組成物を適用する工程を有する方法。
【請求項３７】
軟骨に関連する状態を治療、予防、もしくは向上する方法であって、対象の哺乳類に請求項１９に記載の組成物を適用する工程を有する方法。
【請求項３８】
軟骨に関連する状態を治療、予防、もしくは向上する方法であって、対象の哺乳類に請求項２１に記載の組成物を適用する工程を有する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府支援研究開発から創出された発明の権利に関する陳述
本願発明の一部は、ＮＩＨ／ＮＩＤＲ助成番号ＤＥ９４００と、ＣＲＣ／ＮＩＨ助成番号ＲＲ００８６５と、ＮＩＨ／ＮＩＤＣＲ  ＲＯ３  ＤＥ  ０１４６４９−０１と、ＮＩＨ／ＮＩＤＣＲＫ２３ＤＥ００４２２と、ＮＩＨ  ＤＥ０１６１０７−０１と、ＮＩＨ／ＳＢＩＲ  Ｒ４３−ＤＥ０１６７８１−０１との助成により創出された。米国政府は、本願発明に所定の権利を持つことが出来る。
【０００２】
関連出願とのクロスレファレンス
本願は、２００５年９月２８日に提出された米国出願番号１０／５２７，７８６の一部継続出願であり、これは２００３年９月１５日に提出された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００３／２９２８１の米国国内段階であり、これは２００２年９月１３日に提出された米国仮出願番号６０／４１０，８４６の優先権を主張している。また、本願は、２００５年８月５日に提出された米国出願番号１０／５４４，５５３の一部継続出願でもあり、これは２００４年２月９日に提出されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００３８０８の米国国内段階であり、これは、２００３年７月２日に提出された米国仮出願番号６０／４４５，６７２と、２００３年９月１５日に提出されたＰＣＴ／ＵＳ２００３／２９２８１の優先権を主張しており、これらの出願の教示内容は、本願において参照として取り入れられている。また、本願は、２００６年２月１６日に提出された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００５４７３の一部継続出願であり、これは、２００５年２月１６日に提出された米国仮出願番号６０／６５３，７２２の優先権を主張している。本願は、２００６年３月２８日に提出された米国出願１１／３９２，２９４の一部継続出願でもあり、これは米国特許７，０５２，８５６として発行された、１９９９年１０月５日に提出された米国出願番号０９／９１２，２９７の継続出願である。継続中の出願の全ての教示内容は、ここに参照によりその全体が記載されている。
【０００３】
本願は、概して、軟骨形成および再生のための組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
成長因子とは、ペプチドなどのように、規定された細胞集団の成長および分化に  ｉｎ  ｖｉｖｏもしくはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて影響を与える物質をいう。
【０００５】
軟骨とは、密度の高い結合組織である。これは、固いゲル状マトリクス内に分散する軟骨細胞から構成されている。軟骨は、無血管（血管が全くない）なため、栄養素は、マトリクスの中を浸潤する。軟骨は、関節、肋骨、耳、鼻、喉、そして脊椎板の間で見つけることが出来る。軟骨には主に３種類あり、硝子軟骨（例えば、肋軟骨、鼻の軟骨、気管および気管支、および関節の軟骨など）と、弾性軟骨（例えば、外耳、外耳道、エウスタキオ管の一部、喉頭蓋、および喉頭軟骨の一部など）と、繊維軟骨（例えば、半月板（例えば三角線維軟骨複合体や膝の半月板）、椎間板、顎関節円板、恥骨結合、および骨に結合する腱や靱帯のいくつか）とである。
【０００６】
軟骨の主な役割の一つが、骨形成が開始できる枠組みを提供することである（すなわち、軟骨内骨形成において）。軟骨のもう一つの重要な役割は、関節の骨の動作のために滑らかな表面を提供することである。例えば、膝関節にあることでよく知られる、関節軟骨は、非常に抵抗が少なく、高い耐摩耗性、および修復性の質に乏しいことが一般的な特徴である。関節軟骨は、膝関節の耐圧迫力および耐負荷の性質の多くの役割を担っており、関節軟骨なしで歩くのは、痛みを伴うか、不可能である。
【０００７】
軟骨のその他の重要な役割としては、しっかりしていて柔軟なサポートを提供することである（例えば、鼻の軟骨、脊椎円板、気管の軟骨、膝の半月板、気管支軟骨など）。例えば、半月板などの軟骨は、関節の安定性、潤滑、および力の伝達において重要な役割を果たす。重量負荷下において、半月板は、脛骨上の大腿骨の位置を調整し、接触表面を増加させることにより圧迫力を分散する。それにより、平均ストレスを２倍から３倍減少させる。
【０００８】
さらには、半月板は、関節液と接触して氷上の氷と比較して５倍も滑らかな摩擦係数を出す。他の例として、椎間板は、隔子、衝撃吸収材、動作に対応する一部などの役割を含むいくつかの重要な機能を有している。椎間板のゼラチン状の中央部分は、髄核と呼ばれており、８０−９０％水で構成されている。核の固形部分は、タイプＩＩコラーゲンと非凝集プロテオグリカンである。髄核の外側の靱帯性の輪は、繊維輪と呼ばれ、油圧式に核を密閉することで、円板に負荷がかかると円板内の圧力を上げることができる。繊維輪には、重なり合う半径方向のバンドがあり、これはラジアルタイヤの層のような感じではなく、これにより通常の負荷において破裂することなく繊維輪を介してねじりストレスを分散する。椎間板は、油圧式のシリンダーとして機能する。繊維輪は、核と相互に作用する。核に圧力が加えられるに従って、繊維輪の繊維が保持機能を果たすことで核の突出やヘルニアを防ぐ。
【０００９】
軟骨は、摩耗、怪我または病気により損傷をうける。歳をとるとともに、体内の軟骨の水分とタンパク質の含有量が変化する。この変化は、軟骨を、より弱く、より壊れやすくて薄くする。骨関節炎は、よくある軟骨損傷であり、これは、動作範囲の制限、骨損傷、痛みなどを引き起こす。激しいストレスと慢性的な疲労により、骨関節炎は、直接的に関節表面を摩耗させ、極端な場合には、骨が関節に露出される。他の例としては、保護および安定の役割を果たす半月板をなくすと、関節弛緩または関節を不安定にする異常な動きを引き起こす。
【００１０】
過度の動作や、接触表面の減少は、早期の関節炎変化を促進する。細胞レベルにおいては、まず関節軟骨の表面層から細胞が失われ、続いて軟骨が割れ、そして薄層化および浸食が起きる。そして最終的に下にある骨が突き出してくる。
【００１１】
最も早い関節炎性の変化は、全半月板がなくなってから３週間後に確認されている。他の例としては、脊椎を積層する椎間板および関節（堆間関節）の一部は軟骨を含有するために、この領域は時間が経つにつれ摩耗したり裂けたりする（変性変化）。内部の核が脱水されるにしたがって、円板の空間は減少し、重なり合う環状の靱帯が膨らむ。核の進行性の脱水の場合においては、環状の繊維は割れるか裂けてしまう。通常の軟組織の張力が失われると、脊椎の一部分が亞脱臼を起こし（例えば、部分的な関節の脱臼）、骨棘の形成（骨の突起）、孔の狭窄、機械的な不安定性、および痛みを引き起こす。環状の繊維が伸びたりもしくは破裂すると、圧迫された核の材料が膨らんだり破裂したりし、神経組織を圧迫し痛みを伴い弱めてしまう。
【００１２】
これは、神経圧迫や、椎間板脱出、もしくは椎間板ヘルニアと言われる。神経根症とは、脊椎間の椎間板の損傷に由来する神経の炎症を言う。機械的機能障害も、椎間板の損傷と痛みを引き起こすことがある（例えば、退行性椎間板変性症など）。例えば、許容範囲を超えた力が椎間板を通してかかることなどによるトラウマの結果として、椎間板が損傷することもあり、また環状の繊維の内側もしくは外側が裂けることもある。
【００１３】
これらの裂けた繊維は、負荷が増加している際には、炎症反応を起こすこともあり、直接痛みを引き起こすか、もしくは奥深くの傍脊椎線による補償的な防御痙攣を介して痛みを引き起こすことがある。
【００１４】
軟骨の損傷や機能不全には、いくつかの修復選択肢がある。骨関節炎は、米国において、お年寄りの障害を引き起こす原因の中で二番目に多いものである。一般的に軽症から始まる退行性障害で、時間と摩耗に伴って激しさを増す。軽症から普通程度の症状の患者は、この障害に対して手術によらないいくつかの治療により処理することができる。装具の使用や、薬による処置、例えば抗炎症剤（例えば、ジクロフェナク、イブプロフェン、ナプロキセン）、ＣＯＸ−２選択阻害剤、ヒドロコルチゾン、グルコサミン、およびコンドロイチンサルフェートは、軟骨の欠乏による痛みを緩和することがわかっており、退行性の進行を遅らせることができると主張する人もいる。
【００１５】
全関節の置換を除く関節軟骨の手術の殆どが、様々な処置グループに分けることができる。炎症および痛みを止めることを目的とした疾患および弱体化した軟骨を除去する処置は、切除（軟骨切除術）およびデブルドマンを含む。他の処置グループは、例えば、ドリリング、微少骨折療法、軟骨形成術、およびスポンジャライゼーションなどの軟骨形成を促進することを目的とした種々の研削処置から構成される。研削、ドリリング、および微少骨折は、２０年前に始まった。これらは、骨の軟骨下プレートへの血管損傷の後に起こる軟骨組織の自然な修復現象に依存している。
【００１６】
レーザー補助処置は、現在実験段階だが、別のカテゴリーを構成している。これらは、病気の軟骨の除去と軟骨の再形成を組み合わせており、さらに軟骨の増殖を促す。他の処置は、自己由来の軟骨移植を含む（ジェンザイム社のカーティセル）。
【００１７】
間葉系軟骨により適用可能な他の処置は、早期の外科的処置、および裂けた構造の縫合処置もしくは深刻な怪我の場合は半月板同種移植を含む。
【００１８】
椎間板ヘルニアと座骨神経痛の患者の大半が手術なしで治癒するが、手術が必要になった場合、椎弓切除術を使った椎間板ヘルニアの切除（脊髄を囲む脊椎の骨に小さな孔を開ける）、ラミネクトミー（神経組織に隣接する骨の壁を除去する）、皮膚を介する針による方法（椎間板ヘルニア手術）、椎間板溶解処置（化学的髄格融解術）等を含む。機械的異痛症を患う患者は、無反応から姑息的療法、身体障害から個人の生活などの問題を脊椎固定術、椎間板電熱凝固（繊維輪形成術）、後方動的安定術（Ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）、人工椎間板技術もしくは、まだ実験段階のタンパク質、ペプチド、遺伝子治療もしくは核酸を利用した様々な分子治療を用いた椎間板再生治療などにより解決することができる。軟骨に関する問題の治療に対して数多くの方法が提唱されてきたが、その多くが人工もしくは機械的解決に基づいており、通常の軟骨組織生体を再形成するものではないことは明らかである。したがって、軟骨形成を刺激する方法が必要である。以下に記載する実施形態は、上述の問題と需要を解決するものである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本願発明は、ＮＥＬＬペプチドもしくは関連する作用剤を使用した軟骨形成の促進もしくは修復を誘導するための作用剤および方法に関する。組成物には、ＮＥＬＬペプチド、ＮＥＬＬ様ペプチド、および任意で少なくとも一つの他の活性剤、細胞、および生体適合材料を軟骨（すなわち、硝子軟骨、弾性軟骨、繊維軟骨）の修復の目的で含んでもよい。
【００２０】
いくつかの実施形態では、本願発明は、軟骨に関連する医学的症状を治療、予防、改善するための軟骨形成を直接的もしくは間接的に促進する少なくとも一つの作用剤を効果的な量含む組成物を提供する。軟骨形成の直接的促進用の作用剤の一つとして、軟骨形成細胞には、例えば、これに限定されるわけではないが、軟骨芽細胞、軟骨細胞、もしくは軟骨前駆細胞、成体および胚性幹細胞、骨髄細胞、骨髄ストロマ細胞、間葉系細胞、繊維芽細胞、脂肪由来の細胞などに適用されるＮＥＬＬペプチドまたはＮＥＬＬを基礎とした遺伝子治療もしくはＮＥＬＬ−遺伝子産物の促進剤などがある。軟骨形成の間接的促進（例えば、軟骨芽細胞／軟骨細胞分化を通して）のための作用剤としては、例えば、ＮＥＬＬペプチドもしくはＮＥＬＬペプチドレセプターのアゴニストなどがある。
【００２１】
いくつかの実施形態では、組成物は、例えば、一以上のＮＥＬＬペプチドレセプターの阻害剤もしくはアンタゴニスト、大量のＮＥＬＬペプチド、もしくはそれらの組み合わせを含むことができる。このような組成物は、例えば、ただしこれらに限定されるものではないが、骨芽細胞、骨前駆細胞、幹細胞、骨髄細胞、繊維芽細胞、硬膜細胞、骨膜細胞、周皮細胞、および／または筋肉細胞などの軟骨形成細胞が分化する可能性もしくは分化を阻害することにより軟骨形成分化を阻害するのに効果的である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、ＮＥＬＬ１が過剰発現したマウスを同腹仔のワイルドタイプと比較した大腿骨頭における増長された軟骨の成熟と肥大を示す。左の図は、ワイルドタイプの新生大腿骨頭であり、大腿骨頭において小さくてより未熟な軟骨細胞を示している。右の図は、ＮＥＬＬ１を過剰発現させたトランスジェニックマウスであり、よく分化し、より成熟し、肥大化した軟骨細胞が大腿骨頭全体において大きな核および液胞と共に存在していることを示す。
【図２】図２Ａ〜２Ｆは、Ｅ１８  ＮＥＬＬ１を過剰発現させたマウスにおいて同腹仔のワイルドタイプと比較して増長された半月板の発達を示す。図２Ａおよび図２Ｂは、ワイルドタイプ（図２Ａ）およびＮＥＬＬ１を過剰発現させた（図２Ｂ）動物における大腿骨頭と脛骨頭の間にある半月板を指し示す矢印を付して示している。図２Ｃおよび２Ｄは、図２Ａおよび２Ｂを高倍率にしたものである。図２Ｅは、図２Ｃで示すワイルドタイプコントロールを高倍率にしたものであり、より未分化で最小限の肥大化の軟骨細胞を示す。図２Ｆは、図２Ｄで示すＮＥＬＬ１を過剰発現させた動物の図を高倍率にしたものであり、軟骨マトリクスにおいて著しくより分化した軟骨細胞を示す。肥大化した軟骨細胞内の液胞は、半月板における軟骨細胞がよく分化していることを示唆する。
【図３Ａ】図３Ａは、耳介軟骨から分離されたヤギのプライマリ軟骨細胞へのアデノウィルスの形質導入を示す。図３Ａは、βガラクトシダーゼ発現を示す多数の陽性染色細胞のアデノウィルス（Ａｄ）形質導入の効率を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、耳介軟骨から分離されたヤギのプライマリ軟骨細胞へのアデノウィルスの形質導入を示す。図３Ｂは、ＡｄＮＥＬＬ１形質導入ヤギ軟骨細胞における著しいＮＥＬＬ１発現（β−アクチンコントロールと比較して）と、ＡｄＢＭＰ２もしくはＡｄＬａｃＺ（コントロール）のＮＥＬＬ１タンパクの無発現を示すウェスタンゲルを示す。
【図４Ａ】図４Ａは、ヌードマウスに移植／注入して４週間経ったＡｄＮＥＬＬ１、ＡｄＢＭＰ２、またはＡｄＬａｃＺ（コントロール）形質導入したヤギのプライマリ軟骨細胞の肉眼的形態を示す。ＮＥＬＬ１を形質導入したサンプルは、視診（図４Ａ）および重量（図４Ｂ）の双方において、コントロールよりも著しく大きかった。加えて、ＮＥＬＬ１を形質導入したサンプルはＢＭＰ２を形質導入したサンプルに見られた変色は見られなかった。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ヌードマウスに移植／注入して４週間経ったＡｄＮＥＬＬ１、ＡｄＢＭＰ２、またはＡｄＬａｃＺ（コントロール）形質導入したヤギのプライマリ軟骨細胞の肉眼的形態を示す。ＮＥＬＬ１を形質導入したサンプルは、視診（図４Ａ）および重量（図４Ｂ）の双方において、コントロールよりも著しく大きかった。加えて、ＮＥＬＬ１を形質導入したサンプルはＢＭＰ２を形質導入したサンプルに見られた変色は見られなかった。
【図５Ａ】図５Ａは、図４で示すサンプルのマイクロコンピューター断層写真（ＣＴ）検査を示す。図５Ａは、ＡｄＢＭＰ２を形質導入した試料において望ましくないミネラル化（赤色）を示したが、ＡｄＮＥＬＬ１およびＡｄＬａｃＺ試料では示さなかった。図５Ｂは、ＡｄＬａｃＺコントロールと比較してＮＥＬＬ１がより多くの軟骨のかたまりを誘発することを示す。図５Ｃは、試料においてＡｄＢＭＰ２が著しく密度を増やしたことを示す（ミネラル化の他の指標）。
【図５Ｂ】図５Ｂは、図４で示すサンプルのマイクロコンピューター断層写真（ＣＴ）検査を示す。図５Ｂは、ＡｄＬａｃＺコントロールと比較してＮＥＬＬ１がより多くの軟骨のかたまりを誘発することを示す。
【図５Ｃ】図５Ｃは、図４で示すサンプルのマイクロコンピューター断層写真（ＣＴ）検査を示す。図５Ｃは、試料においてＡｄＢＭＰ２が著しく密度を増やしたことを示す（ミネラル化の他の指標）。
【図６】図６は、ヌードマウスに移植／注入して２週間経過したＡｄＮＥＬＬ１、ＡｄＢＭＰ２、もしくはＡｄＬａｃＺ（コントロール）を形質導入したヤギのプライマリ軟骨細胞の組織学的外観を示す。ヘマトキシリン・イオジン（Ｈ＆Ｅ）染色（１列目）は、ＡｄＬａｃＺコントロールと比較してＡｄＮＥＬＬ１およびＡｄＢＭＰ２を形質導入した試料において軟骨形成が増加した証拠を示す。軟骨を染めるアルシアンブルー染色（２列目）でも、ＡｄＬａｃＺコントロールと比較してＡｄＮＥＬＬ１およびＡｄＢＭＰ２を形質導入した試料において軟骨形成の増加を示す。より成長した軟骨細胞を染色するＸ型コラーゲン（ＣｏｌＸ）の免疫染色（３列目）では、ＡｄＮＥＬＬ１およびＡｄＢＭＰ２形質導入した試料において染色の増加を示す。
【図７】図７は、ヌードマウスに移植／注入して４週間経過したＡｄＮＥＬＬ１、ＡｄＢＭＰ２、もしくはＡｄＬａｃＺ（コントロール）を形質導入したヤギのプライマリ軟骨細胞の組織学的外観を示す。Ｈ＆Ｅ染色（１列目）は、ＡｄＮＥＬＬを形質導入したサンプルでは著しい軟骨形成が認められたが、骨形成の証拠は全くなかった。一方でＡｄＢＭＰ２サンプルは、著しい骨形成が認められた。少量の軟骨形成がＡｄＬａｃＺコントロールで認められた。アルシアンブルー染色（２列目）も、ＡｄＮＥＬＬを形質導入したサンプルでは著しい軟骨形成が認められたが、骨形成の証拠は全くなかった。一方でＡｄＢＭＰ２サンプルは、著しい骨形成が認められ、最小限の軟骨形成が認められた。少量の未成熟な軟骨形成がＡｄＬａｃＺコントロールで認められた。
【図８】図８は、ヌードマウスに移植／注入して４週間経ったＡｄＮＥＬＬ１、ＡｄＢＭＰ２、またはＡｄＬａｃＺ（コントロール）形質導入したヤギのプライマリ軟骨細胞における骨マーカーとしてのＣｄｆａ１／ＲｕｎＸ２と、軟骨マーカーとしてのＣｏｌＸおよびテネイシンの免疫染色を示す。テネイシンは、関節軟骨およびその他の恒久軟骨の発達と密接に関連しているが、一方で、テネイシンのマトリクスタンパク質の欠如もしくは減量は、突然変異を起こす一過性の軟骨を特徴とし、骨に取って代わられる（Ｐａｃｉｆｉｃｉ，  Ｍ．，  Ｍ．Ｉｗａｍｏｔｏ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｅｎｅｓｃｉｎ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｒｔｉｃｕｌａｒ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．  Ｄｅｖ  Ｄｙｎ  １９８  （２）：１２３−３４，１９９３）。Ｃｂｆａ１／Ｒｕｎｘ２は、軟骨性ＡｄＮＥＬＬ１もしくはＡｄＬａｃＺコンロール形質導入サンプルでは最小限に発現し、骨性ＡｄＢＭＰ２形質導入サンプルでは中程度に発現していた（１列目）。ＣｏｌＸは、軟骨性ＡｄＮＥＬＬ１サンプルの細胞で高く発現し、また非常に局在していたが、骨形成の証拠はなかった。一方で、ＣｏｌＸは、ＡｄＢＭＰ２処理したサンプル（２列目）の細胞内よりも、主に細胞外マトリクスと関連している。テネイシンは、ＡｄＮＥＬＬ１サンプルで高く発現し、ＡｄＢＭＰ２およびコントロールＡｄＬａｃＺでは最小限に存在する（３列目）。
【図９】図９は、ヌードマウスに移植／注入して４週間経ったＡｄＮＥＬＬ１、ＡｄＢＭＰ２、またはＡｄＬａｃＺ（コントロール）形質導入したヤギのプライマリ軟骨細胞における血管形成成長因子、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、  骨マーカーオステオカルシン（ＯＣＮ）と関連する内軟骨性骨化の免疫染色を示す。ＶＥＧＦおとびＯＣＮの両方とも、軟骨性ＡｄＮＥＬＬ１もしくはコントロールＡｄＬａｃＺ形質導入サンプルでは発現しなかったが、骨性ＡｄＢＭＰ２形質導入サンプルでは、中程度の発現をした。
【図１０】図１０は、ＮＥＬＬ−１を過剰発現させたマウスにおける長骨の軟骨の組織を示す。ＮＥＬＬ１は、内軟骨性骨化時において、関節軟骨領域（上段の図）および長骨形成領域（下段の図）の両方を含む脛骨全体で発現している。上段の図は、ＮＥＬＬ１が関節軟骨領域で軟骨の分化を調節且つ増加できることを示す。したがって、これらのデータは、増加したＮＥＬＬ１ペプチド活性が、直接的（例えば、ＮＥＬＬペプチドの添加もしくは増加したＮＥＬＬペプチド発現を通して）もしくは間接的に（例えば、ＮＥＬＬ１ペプチド促進剤および／またはＮＥＬＬ１ペプチドレセプターのアゴニストおよび／または活性剤の添加を通して）軟骨形成を促進することを示す。下段では、骨形成が始まった長骨のシャフト領域では、増加したＮＥＬＬ１は軟骨形成を起こし、その後、内軟骨性骨化を通して肥大化および増加した骨形成を引き起こす。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本願発明は、ＮＥＬＬペプチドもしくは関連する作用剤を使用した軟骨形成の促進もしくは修復を誘導するための作用剤および方法に関する。組成物には、ＮＥＬＬペプチド、ＮＥＬＬ様ペプチド、および任意で少なくとも一つの他の活性剤、細胞、および生体適合材料を軟骨（すなわち、硝子軟骨、弾性軟骨、繊維軟骨）の修復の目的で含んでもよい。
【００２４】
いくつかの実施形態では、本願発明は、軟骨に関連する医学的症状を治療、予防、改善するための軟骨形成を直接的もしくは間接的に促進する少なくとも一つの作用剤を効果的な量含む組成物を提供する。軟骨生成の直接的な促進用の作用剤の一つとしては、軟骨形成細胞には、例えば、これに限定されるわけではないが、軟骨芽細胞、軟骨細胞、もしくは軟骨前駆細胞、幹細胞、骨髄細胞、骨髄ストロマ細胞、繊維芽細胞、脂肪由来の細胞などに適用されるＮＥＬＬペプチドでもよい。軟骨形成の間接的促進（例えば、軟骨芽細胞／軟骨細胞分化を通して）のための作用剤としては、例えば、ＮＥＬＬペプチドもしくはＮＥＬＬペプチドレセプターのアゴニストなどがある。
【００２５】
いくつかの実施形態では、ここに記載する組成物を軟骨形成もしくは再生を促進するために哺乳類に対して、全身もしくは局所的に適用することを含む。
【００２６】
いくつかの実施形態では、組成物は、例えば、一以上のＮＥＬＬペプチドレセプターの阻害剤もしくはアンタゴニスト、大量のＮＥＬＬペプチド、もしくはそれらの組み合わせを含むことができる。このような組成物は、例えば、ただしこれらに限定されるものではないが、骨芽細胞、骨前駆細胞、幹細胞、骨髄細胞、繊維芽細胞、硬膜細胞、骨膜細胞、周皮細胞、および／または筋肉細胞などの軟骨形成細胞が分化する可能性もしくは分化を阻害することにより軟骨形成分化を阻害するのに効果的である。
【００２７】
軟骨形成もしくは再生に対する本願発明の効果は、図１〜１０に示す。
【００２８】
図１は、ＮＥＬＬ１が過剰発現したマウスを同腹仔のワイルドタイプと比較した大腿骨頭における増長された軟骨の成熟と肥大を示す。左の図は、ワイルドタイプの新生大腿骨頭であり、大腿骨頭において小さくてより未熟な軟骨細胞を示している。右の図は、ＮＥＬＬ１を過剰発現させたトランスジェニックマウスであり、よく分化し、より成熟し、肥大化した軟骨細胞が大腿骨頭全体において大きな核および液胞と共に存在していることを示す。肥大化した軟骨では、ミネラル化は起きていない。これらの研究は、ＮＥＬＬ１は、軟骨細胞の成熟、肥大化を必ずしもミネラル化を誘導しないでも増長できることを示す。
【００２９】
図２Ａ〜２Ｆは、Ｅ１８  ＮＥＬＬ１を過剰発現させたマウスにおいて同腹仔のワイルドタイプと比較して増長された半月板の発達を示す。図２Ａおよび図２Ｂは、ワイルドタイプ（図２Ａ）およびＮＥＬＬ１を過剰発現させた（図２Ｂ）動物における大腿骨頭と脛骨頭の間にある半月板を指し示す矢印を付して示している。図２Ｃおよび２Ｄは、図２Ａおよび２Ｂを高倍率にしたものである。図２Ｅは、図２Ｃで示すワイルドタイプコントロールを高倍率にしたものであり、より未分化で最小限の肥大化の軟骨細胞を示す。図２Ｆは、図２Ｄで示すＮＥＬＬ１を過剰発現させた動物の図を高倍率にしたものであり、軟骨マトリクスにおいて著しくより分化した軟骨細胞を示す。肥大化した軟骨細胞内の液胞は、半月板における軟骨細胞がよく分化していることを示唆する。このデータは、Ｎｅｌｌ−１が半月板の形成および分化を促進することを示す。
【００３０】
図３Ａおよび３Ｂは、耳介軟骨から分離されたヤギのプライマリ軟骨細胞へのアデノウィルスの形質導入を示す。図３Ａは、βガラクトシダーゼ発現を示す多数の陽性染色細胞のアデノウィルス（Ａｄ）形質導入の効率を示す。図３Ｂは、ＡｄＮＥＬＬ１形質導入ヤギ軟骨細胞における著しいＮＥＬＬ１発現（β−アクチンコントロールと比較して）と、ＡｄＢＭＰ２もしくはＡｄＬａｃＺ（コントロール）のＮＥＬＬ１タンパクの無発現を示すウェスタンゲルを示す。これらの研究は、アデノウィルスの形質導入が効率的であり、ＡｄＮＥＬＬ−１が、ＮＥＬＬ１タンパク質の発現を増加させるが、ＡｄＢＭＰ２はしないことを示す。
【００３１】
図４Ａおよび４Ｂは、ヌードマウスに移植／注入して４週間経ったＡｄＮＥＬＬ１、ＡｄＢＭＰ２、またはＡｄＬａｃＺ（コントロール）形質導入したヤギのプライマリ軟骨細胞の肉眼的形態を示す。ＮＥＬＬ１を形質導入したサンプルは、視診（図４Ａ）および重量（図４Ｂ）の双方において、コントロールよりも著しく大きかった。加えて、ＮＥＬＬ１を形質導入したサンプルはＢＭＰ２を形質導入したサンプルに見られた変色は見られなかった。これらの研究は、予想に反して、ＢＭＰ２がより大きい組織の固まりを示したにもかかわらず、誘発された固まりの外観は純粋な軟骨の形質とは一致しないことを示す。
【００３２】
図５Ａ〜Ｃは、図４で示すサンプルのマイクロコンピューター断層写真（ＣＴ）検査を示す。図５Ａは、ＡｄＢＭＰ２を形質導入した試料において望ましくないミネラル化（赤色）を示したが、ＡｄＮＥＬＬ１およびＡｄＬａｃＺ試料では示さなかった。図５Ｂは、ＡｄＬａｃＺコントロールと比較してＮＥＬＬ１がより多くの軟骨のかたまりを誘発することを示す。図５Ｃは、試料においてＡｄＢＭＰ２が著しく密度を増やしたことを示す（ミネラル化の他の指標）。これらの研究は、ＢＭＰ２はより大きい組織の固まりを誘導することを定量的に示すが、誘導された固まりは主にミネラル化されたものであり、純粋な軟骨の表現型とは一致しないことを示す。
【００３３】
図６は、ヌードマウスに移植／注入して２週間経過したＡｄＮＥＬＬ１、ＡｄＢＭＰ２、もしくはＡｄＬａｃＺ（コントロール）を形質導入したヤギのプライマリ軟骨細胞の組織学的外観を示す。ヘマトキシリン・イオジン（Ｈ＆Ｅ）染色（１列目）は、ＡｄＬａｃＺコントロールと比較してＡｄＮＥＬＬ１およびＡｄＢＭＰ２を形質導入した試料において軟骨形成が増加した証拠を示す。軟骨を染めるアルシアンブルー染色（２列目）でも、ＡｄＬａｃＺコントロールと比較してＡｄＮＥＬＬ１およびＡｄＢＭＰ２を形質導入した試料において軟骨形成の増加を示す。より成長した軟骨細胞を染色するＸ型コラーゲン（ＣｏｌＸ）の免疫染色（３列目）では、ＡｄＮＥＬＬ１およびＡｄＢＭＰ２形質導入した試料において染色の増加を示す。これらのデータをまとめると、ＡｄＮＥＬＬ１およびＡｄＢＭＰ２の両方が、２週間目には同程度の軟骨形成および成熟を誘導したことを示す。
【００３４】
図７は、ヌードマウスに移植／注入して４週間経過したＡｄＮＥＬＬ１、ＡｄＢＭＰ２、もしくはＡｄＬａｃＺ（コントロール）を形質導入したヤギのプライマリ軟骨細胞の組織学的外観を示す。Ｈ＆Ｅ染色（１列目）は、ＡｄＮＥＬＬを形質導入したサンプルでは著しい軟骨形成が認められたが、骨形成の証拠は全くなかった。一方でＡｄＢＭＰ２サンプルは、著しい骨形成が認められた。少量の軟骨形成がＡｄＬａｃＺコントロールで認められた。アルシアンブルー染色（２列目）も、ＡｄＮＥＬＬを形質導入したサンプルでは著しい軟骨形成が認められたが、骨形成の証拠は全くなかった。一方でＡｄＢＭＰ２サンプルは、著しい骨形成が認められ、最小限の軟骨形成が認められた。少量の未成熟な軟骨形成がＡｄＬａｃＺコントロールで認められた。これらのデータをまとめると、４週間目には、ＡｄＮＥＬＬ１は誘導を継続し、軟骨の形質を維持することができるが、一方で、ＡｄＢＭＰ２は骨を形成し、軟骨細胞において軟骨形質を維持することが出来ないことを示す。
【００３５】
図８は、ヌードマウスに移植／注入して４週間経ったＡｄＮＥＬＬ１、ＡｄＢＭＰ２、またはＡｄＬａｃＺ（コントロール）形質導入したヤギのプライマリ軟骨細胞における骨マーカーとしてのＣｄｆａ１／ＲｕｎＸ２と、軟骨マーカーとしてのＣｏｌＸおよびテネイシンの免疫染色を示す。テネイシンは、関節軟骨およびその他の恒久軟骨の発達と密接に関連しているが、一方で、テネイシンのマトリクスタンパク質の欠如もしくは減量は、突然変異を起こす一過性の軟骨を特徴とし、骨に取って代わられる（Ｐａｃｉｆｉｃｉ，  Ｍ．，  Ｍ．Ｉｗａｍｏｔｏ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｅｎｅｓｃｉｎ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｒｔｉｃｕｌａｒ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．  Ｄｅｖ  Ｄｙｎ  １９８  （２）：１２３−３４，１９９３）。Ｃｂｆａ１／Ｒｕｎｘ２は、軟骨性ＡｄＮＥＬＬ１もしくはＡｄＬａｃＺコンロール形質導入サンプルでは最小限に発現し、骨性ＡｄＢＭＰ２形質導入サンプルでは中程度に発現していた（１列目）。ＣｏｌＸは、軟骨性ＡｄＮＥＬＬ１サンプルの細胞で高く発現し、また非常に局在していたが、骨形成の証拠はなかった。一方で、ＣｏｌＸは、ＡｄＢＭＰ２処理したサンプル（２列目）の細胞内よりも、主に細胞外マトリクスと関連している。テネイシンは、ＡｄＮＥＬＬ１サンプルで高く発現し、ＡｄＢＭＰ２およびコントロールＡｄＬａｃＺでは最小限に存在する（３列目）。これらの研究は、ＮＥＬＬ１が関節軟骨およびその他の恒久軟骨の発達と関連する分子（例えば、テネイシン）を誘導できることを示す。
【００３６】
図９は、ヌードマウスに移植／注入して４週間経ったＡｄＮＥＬＬ１、ＡｄＢＭＰ２、またはＡｄＬａｃＺ（コントロール）形質導入したヤギのプライマリ軟骨細胞における血管形成成長因子、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、骨マーカーオステオカルシン（ＯＣＮ）と関連する内軟骨性骨化の免疫染色を示す。ＶＥＧＦおよびＯＣＮの両方とも、軟骨性ＡｄＮＥＬＬ１もしくはコントロールＡｄＬａｃＺ形質導入サンプルでは発現しなかったが、骨性ＡｄＢＭＰ２形質導入サンプルでは、中程度の発現をした。これらのデータは、ＮＥＬＬ１が血管形成を促進せず、またＮＥＬＬ１は軟骨サンプルにおいて血管形成を阻害している可能性があることを示す。
【００３７】
図１０は、ＮＥＬＬ−１を過剰発現させたマウスにおける長骨の軟骨の組織を示す。ＮＥＬＬ１は、内軟骨性骨化時において、関節軟骨領域（上段の図）および長骨形成領域（下段の図）の両方を含む脛骨全体で発現している。上段の図は、ＮＥＬＬ１が関節軟骨領域で軟骨の分化を調節且つ増加できることを示す。したがって、これらのデータは、増加したＮＥＬＬ１ペプチド活性が、直接的（例えば、ＮＥＬＬペプチドの添加もしくは増加したＮＥＬＬペプチド発現を通して）もしくは間接的に（例えば、ＮＥＬＬ１ペプチド促進剤および／またはＮＥＬＬ１ペプチドレセプターのアゴニストおよび／または活性剤の添加を通して）軟骨形成を促進することを示す。下段では、骨形成が始まった長骨のシャフト領域では、増加したＮＥＬＬ１は軟骨形成を起こし、その後、内軟骨性骨化を通して肥大化および増加した骨形成を引き起こす。したがって、これらのデータは、ＮＥＬＬペプチドの活性が、直接的もしくは間接的に軟骨形成、軟骨の肥大化および内軟骨性骨化を促進することを示す。ＮＥＬＬ１の欠如は、より未分化な関節軟骨芽細胞／軟骨細胞の形質、およびより肥大しないことに関連しており、これは関節軟骨が骨に取って代わられるのを防止するのに重要である。
【００３８】
したがって、ＮＥＬＬペプチドの活性阻害は、直接的に（ＮＥＬＬペプチドの添加もしくはＮＥＬＬペプチド発現の増加を通して）もしくは間接的に（例えば、ＮＥＬＬ１ペプチド促進剤および／またはＮＥＬＬ１ペプチドレセプターのアゴニストおよび／または活性剤の添加を通して）、軟骨の肥大化および内軟骨性骨化を防止し、より未分化で肥大化していない軟骨の形質を維持するのを促進する。まとめると、これらのデータはこれに限定されるものではなく、むしろＮＥＬＬが骨軟骨前駆細胞系に広く影響し、またＮＥＬＬにより誘導される正確な形質は、ＮＥＬＬの量とＮＥＬＬを適用するタイミング、正確な細胞のタイプ、細胞の分化段階、および微少環境との複雑な相互作用に依存することを示す。
【００３９】
用語「軟骨」とは、硝子、弾性および繊維性軟骨を含包し、さらに哺乳類のいずれの軟骨成分を言及できる。例えば、椎間板および半月板は、軟骨の定義に含まれる繊維性軟骨構造である。
【００４０】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、「タンパク質」は、ここではアミノ酸残基のポリマーを言及するものとし、相互に交換して使用できる。これらの用語は、一以上のアミノ酸残基が、自然下で存在するアミノ酸、さらに自然下に存在するアミノ酸ポリマーに対応する人工的な化学的アナログであるアミノ酸ポリマーにも適用されてもよい。
【００４１】
用語「ＮＥＬＬ」は、ＮＥＬＬ１およびＮＥＬＬ２ペプチドを言う。ＮＥＬＬ１ペプチドは、ＮＥＬＬ１遺伝子もしくはｃＤＮＡにより発現できるタンパク質であり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、および６を含む。ＮＥＬＬ１ペプチドは、軟骨形成のための軟骨形成細胞の分化を誘導する能力を保持するＮＥＬＬ１ペプチドのフラグメントを含むことができる。ＮＥＬＬ２ペプチドは、ＮＥＬＬ２遺伝子もしくはｃＤＮＡにより発現できるタンパク質であり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、１０、１２および１４を含む。ＮＥＬＬ２ペプチドは、全ＮＥＬＬ２ペプチドの配列と類似する活性を保持するＮＥＬＬ２ペプチドフラグメントを含むことができる。自然に存在する作用剤の生物学的特性を保持するＮｅｌｌ−１、Ｎｅｌｌ−２等、無処理のタンパク質、完全もしくは部分的に糖化、フラグメント、欠失、追加、アミノ酸の置換、突然変異、修飾。Ｎｅｌｌ活性ドメインおよびＮｅｌｌ結合サイトを有する低分子。
【００４２】
いくつかの実施形態においては、用語「ＮＥＬＬペプチド」とは、ＮＥＬＬ１もしくはＮＥＬＬ２に関連するポリペプチドのフラグメントを含むことが出来る。
【００４３】
いくつかの実施形態においては、用語「ＮＥＬＬペプチド」とは、ＮＥＬＬに関連する作用剤を含むことができる。例えば、ＮＥＬＬペプチドもしくはそのフラグメントとホモロジーが高いＮＥＬＬペプチドに関連するいずれのペプチドも含むことができる。高いホモロジーとは、ＮＥＬＬペプチドに対してホモロジーが５０％よりも高くてもよく、例えば、ＮＥＬＬペプチドに対してホモロジーが約６０％よりも高くてもよく、ＮＥＬＬペプチドに対してホモロジーが約７０％よりも高くてもよく、ＮＥＬＬペプチドに対してホモロジーが約８０％よりも高くてもよい。
【００４４】
ＮＥＬＬペプチドは、ワイルドタイプの配列に変異を含まない天然および／または遺伝子組み換えのＮＥＬＬペプチド、またはワイルドタイプの配列に変異を含むがＮＥＬＬペプチドに対して高いホモロジーを有する遺伝子組み換えＮＥＬＬペプチドでもよい。さらには、ＮＥＬＬペプチドは、ヒト細胞、バクテリア、酵母、昆虫もしくは植物細胞由来でもよいが、これに限定されない。いくつかの実施形態においては、用語「ＮＥＬＬペプチド」とは、ＮＥＬＬペプチドと同等の構造、機能、立体構造を含む。ここで使われるＮＥＬＬペプチドと同等の構造とは、ＮＥＬＬペプチドと同等の構造もしくは実質的に類似の構造、またはＮＥＬＬペプチドと同等の機能ドメインを含むタンパク質もしくはペプチドを言う。ＮＥＬＬペプチドと同等の機能とは、ＮＥＬＬペプチドと同等の機能もしくは実質的に類似の機能、またはＮＥＬＬペプチドと同等の機能ドメインを含むタンパク質もしくはペプチドを言う。ＮＥＬＬペプチドと同等の立体構造とは、ＮＥＬＬペプチドと同等の構造もしくは実質的に類似の立体構造、またはＮＥＬＬペプチドと同等の機能ドメインを含むタンパク質もしくはペプチドを言う。
【００４５】
いくつかの実施形態において、ここに記載するＮＥＬＬペプチドは、ＮＥＬＬペプチドの誘導体でもよい。ここで使用する用語「誘導体」とは、ＮＥＬＬペプチドに由来する化学的もしくは生物学的化合物もしくは物質、それらと同等の構造、もしくはそれらと同等の立体構造を言う。例えば、そのような誘導体として、プロドラッグの形態、ポリエチレングリコール化の形態、またはＮＥＬＬペプチドをより安定にし、もしくはＮＥＬＬペプチドがより親骨性もしくは親油性を有するようにするその他のあらゆるＮＥＬＬペプチドを含むことができる。いくつかの実施形態において、誘導体は、ポリエチレングリコール、ポリアミノ酸、Ｃ１〜Ｃ２０の炭素を持つヒドロカルビル短鎖、または生体適合ポリマーに結合したＮＥＬＬペプチドでもよい。いくつかの実施形態において、用語「誘導体」は、ＮＥＬＬペプチドの模倣体を含んでもよい。ペプチドの模倣体の生成は、詳細に文献に記載されている。以下は、ペプチドの模倣体を含むペプチドの生成の基本的な方法を例示として記載する。
【００４６】
ペプチドの生成を始める前に、アミノ酸（開始物質）のアミン側端末は、ＦＭＯＣ（９−フルオロメチルカーバメート）、もしくは他の保護グループにより保護されてもよく、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ樹脂（遊離アミン）などの固相支持体を開始剤として使用する。その後ステップ（１）からステップ（３）が行われ、所望のペプチドを得られるまで繰り返される：（１）遊離アミンが、カルボジイミド化学反応によりＣ端末と反応する、（２）アミノ酸配列が精製される、そして（３）遊離アミンを作るために、中程度の酸性下において例えばＦＭＯＣ保護グループが除去される。ペプチドを、樹脂から離されて独立のペプチドもしくはペプチドの模倣体が作られる。
【００４７】
いくつかの実施形態においては、ここに記載するペプチドの誘導体は、物理的および化学的に修飾させたＮＥＬＬペプチドを含む。物理的に修飾させたペプチドの修飾とは、例えば、対イオンによるイオンペアーなどのイオン力による修飾、水素結合による変化、ｐＨの変化による修飾、溶媒選択による修飾、または、フォールディング／アンフォールディングの温度、ｐＨ、溶媒、および異なる段階のフォールディングとアンフォールディングの所有時間などの選択を含むタンパク質のフォールディング／アンフォールディングの異なる方法の使用による修飾などであってもよい。
【００４８】
いくつかの実施形態において、ペプチドの誘導体は、化学的に修飾させたＮＥＬＬペプチドを含んでもよい。ペプチドの化学的および／または物理的特性を変えるためにＮＥＬＬペプチドの一カ所もしくは多数の場所に選択的に短い炭化水素グループ（例えば、メチルもしくはエチル）を結合できる。一実施形態では、一般的に知られたポリエチレングリコール化方法により、ペプチドの化学的および／または物理的特性を変えるためにＮＥＬＬペプチドの一カ所もしくは多数の場所に選択的にモノ、オリゴ、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）グループを結合できる（例えば、Ｍｏｋ，  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．，  １１（１）：６６−７９（２００５）参照）。
【００４９】
用語「ＮＥＬＬ１ｃＤＮＡ」とは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３および５のことを指し、さらに用語「ＮＥＬＬ２ｃＤＮＡ」とはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、９、１１、および１３を指す。
【００５０】
用語「抗体」は、ＮＥＬＬペプチドもしくは関連する作用剤に特異的に結合する全ての抗体を言う。用語「抗体」は、例えば、未処理の免疫グロブリン、Ｌ鎖及びＨ鎖の可変領域しか含有しないＦｖ断片、ジスルフィド結合で結合したＦｖ断片、可変領域及び定常領域の一部を含有する。Ｆａｂ又は（Ｆａｂ）’２断片、単鎖抗体などのような種々の形態の改変抗体又は改造抗体を含んでもよい。抗体は、未処理の分子を含んでもよいのと同様にその断片、例えば、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ’）２’、および／またはエピトープ決定基に結合できる単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）を含んでも良い。抗体は、動物（例えば、マウス又はラット）又はヒト由来であってもよく、あるいはキメラ抗体であってもよく、又はヒト化されていてもよい。抗体は、ポリクローナル抗体であってもよく、又はモノクローナル抗体（「ｍＡｂ」）、例えば、ＮＥＬＬ１タンパク質又はＮＥＬＬ２タンパク質によりエンコードされたポリペプチドに特異性を持つモノクローナル抗体であってもよい。
【００５１】
用語「捕捉剤」は、他の分子に特異的に結合し、例えば、抗体−抗体、レクチン−炭水化物、核酸−核酸、ビオチン−アビジンなどのような結合複合体を形成する分子を言ってもよい。
【００５２】
用語「特異的に結合する」は、生体分子（例えば、タンパク質、核酸、抗体など）を言ってもよく、異質集団の分子（例えば、タンパク質とその他の生物製剤）において存在する生体分子を同定するような結合反応を言う。従って、指定された条件下（例えば、抗体の場合は免疫アッセイ条件、核酸の場合はストリンジェントなハイブリッド）形成条件など）で、特定のリガンド又は抗体は、その特定の「標的」分子に結合してもよく、試料に存在するその他の分子には有意な量では結合できない。
【００５３】
用語「核酸」又は「オリゴヌクレオチド」は、共に共有結合する少なくとも２つのヌクレオチドを言う。本発明の核酸は、場合によっては、例えば、リンアミド結合、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、ｏ−メチルリンアミダイト結合、及び／又はペプチド核酸主鎖及び結合を含む代替主鎖を有していてもよい核酸アナログを含んでもよいが、一本鎖でもよいし、二本鎖でもよく、ホスホジエステル結合を含有してもよい。核酸アナログは正主鎖及びまたは非リボースの主鎖を有していてもよい。核酸はまた、１以上の炭素環式の糖を含んでもよい。リボース−リン酸の主鎖の修飾を行って、例えば標識のような追加部分の負荷を促進してもよいし、または例えば、生理的環境におけるそのような分子の安定性を高め、半減期を延ばしてもよい。
【００５４】
用語「特異的ハイブリッド形成」は、プローブがその標的の部分配列に優先的にハイブリッド形成し、他の配列により少ない程度にハイブリッド形成してもよい条件を含むストリンジェントな条件下での特定のヌクレオチド配列への核酸分子の優先的結合、二本鎖形成、又はハイブリッド形成を言う。
【００５５】
用語「ＮＥＬＬペプチドの阻害剤」とは、ＮＥＬＬペプチドの活性を阻害する化学的もしくは生物学的化合物を指す。また、この用語は、ＮＥＬＬペプチドの発現を抑制できる化学的もしくは生物学的化合物も含む。ＮＥＬＬペプチドの阻害剤は、ＮＥＬＬペプチド転写もしくは翻訳産物と直接的もしくは間接的に作用できる。例として、相互作用の方法は、ＮＥＬＬペプチドの転写もしくは翻訳の減少と、ＮＥＬＬペプチド転写物もしくはタンパク質の安定性の低下と、ＮＥＬＬペプチド転写物もしくはタンパク質の活性の低下と、ＮＥＬＬペプチド転写物もしくはタンパク質の分解の促進とを含むが、これに限定されるわけではない。用語「ＮＥＬＬペプチドの促進剤」とは、ＮＥＬＬペプチドの活性を促進できる化学的もしくは生物学的化合物を指す。また、この用語は、ＮＥＬＬペプチドの発現を増進できる化学的もしくは生物学的化合物も含む。例として、相互作用の方法は、ＮＥＬＬペプチドの転写もしくは翻訳の促進と、ＮＥＬＬペプチド転写物もしくはタンパク質の安定性の増進と、ＮＥＬＬペプチド転写物もしくはタンパク質の活性の増進と、ＮＥＬＬペプチド転写物もしくはタンパク質の分解の低下とを含むが、これに限定されるわけではない。
【００５６】
用語「ＮＥＬＬペプチドレセプターの調節剤」とは、ＮＥＬＬペプチドレセプターの、ＮＥＬＬペプチドとのもしくはＮＥＬＬペプチドによる結合を促進または阻害できる化学的もしくは生物学的化合物、またはＮＥＬＬペプチドが存在しているかいないかに関係なくＮＥＬＬペプチドレセプターの活性を調節できる化学的もしくは生物学的化合物、を指す。ＮＥＬＬペプチドレセプターとＮＥＬＬペプチドへのもしくはＮＥＬＬペプチドによる結合および／または活性を促進する調節剤をレセプターの「アゴニスト」言い、ＮＥＬＬペプチドレセプターとＮＥＬＬペプチドへのもしくはＮＥＬＬペプチドによる結合および／または活性を阻害する調節剤をレセプターの「アンタゴニスト」と言う。ＮＥＬＬペプチドに関係なくＮＥＬＬペプチドレセプターの活性を促進する調節剤をレセプターの「活性剤」と言い、ＮＥＬＬペプチドに関係なくＮＥＬＬペプチドレセプターの活性を阻害する調節剤をレセプターの「阻害剤」と言う。
【００５７】
用語「ＮＥＬＬペプチド」、「ＮＥＬＬ関連作用剤」、「ＮＥＬＬペプチドの阻害剤」、または「ＮＥＬＬペプチドの調節剤」は明細書において「作用剤」として言及してもよい。
【００５８】
用語「移送伝達手段」とは、生化学の分野において使われるあらゆる移送伝達手段を指す。一般的な移送伝達手段の例として、裸ＤＮＡ型伝達手段、ＲＮＡ型伝達手段、ウィルス型伝達手段がある。さらなる例として、例えば、ポリマーもしくはペプチド、持続性放出担体、人工足場剤、天然の足場剤、同種移植足場剤、異種移植足場剤などがある。
【００５９】
用語「対象哺乳類」もしくは「哺乳類」とは、全ての哺乳類を指し、例えば、ヒトおよび馬などの動物を含む。
【００６０】
軟骨形成
軟骨形成は、通常、軟骨化プロセスを経て行われる。
軟骨化は、濃縮された間葉組織から軟骨が形成されるプロセスであり、間葉組織は、間葉組織は軟骨細胞に分化しマトリクスを形成する材料を分泌し始める。軟骨は、ミネラル化を起こすことができる。例えば、成熟した硝子関節軟骨は、軟骨と骨の間で段階的にミネラル化する。ミネラル化前線は、硝子関節軟骨の基底部を通して軟骨の量およびせん断ストレスに依存する早さで進行する。進行速度およびミネラル化前線のミネラル化分泌物密度における変動により、関節のカルシウム化された軟骨は多数の潮標ができる。
【００６１】
成熟した関節のカルシム化した軟骨は、血管出芽が通っており、骨端軟骨において内軟骨性骨化に似たプロセスで新しい骨が、血管空間で作られる。関節のカルシウム化された軟骨は、セメントラインにより軟骨下骨と分けられる。軟骨では、二つのタイプの成長が起き得る：付加成長および間質成長である。付加成長は、軟骨の直径と厚みの増加の結果である。新しい細胞は、軟骨膜から発生し、軟骨モデルの表面で起きる。間質成長は、軟骨の固まりの増加の結果であり、軟骨内から起きる。軟骨細胞は、骨小腔において体細胞分裂を起こすが、マトリクスの中に閉じこめられたままであり、これは、同原グループと呼ばれる細胞の集団を作る。
【００６２】
軟骨は、内軟骨性骨化を経ることでも形成できる。哺乳類の骨格は、内軟骨性骨化および膜性骨化プロセスを経て発達する。発生学的には、骨格発達中において、ある特定の骨の端部における軟骨層の確立は、内軟骨性骨化のプロセスに密接に関連する。内軟骨性骨形成の軟骨部分は、軟骨芽細胞／軟骨細胞の分化、成熟、および軟骨形成場所によってはミネラル化を伴ったり伴わなかったりする肥大化を含む。非−ミネラル化軟骨形成は、関節軟骨、顎関節、手首、膝、および椎間板繊維軟骨を含むが、これに限定されるわけではない。
【００６３】
内軟骨性骨化もしくは長骨の形成は、骨格成長における機能的ストレスに耐えられるような骨形成に関連し、これは長骨の発達によく現れている。このプロセスでは、長骨の小モデルが固い硝子軟骨内にまず形成され、これは、シャフト（骨幹）と軟骨膜で覆われた将来の関節部分（骨端）とで構成され、長く、ダンベル型の軟骨を形成するための付加成長を起こす（例えば、Ｗｈｅａｔｅｒ，  Ｐ．Ｒ．  ａｎｄ  Ｈ．Ｇ．  Ｂｕｒｋｉｔｔ  （１９８７）．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ：  ａ  ｔｅｘｔ  ａｎｄ  ｃｏｌｏｕｒ  ａｔｌａｓ．  Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ；  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ；  Ｂｅａｕｐｒｅ，、Ｇ．Ｓ．，  Ｓ．Ｓ．  Ｓｔｅｖｅｎｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｒｅｈａｂｉｌ  Ｒｅｓ  Ｄｅｖ  ３７（２）：１４５−５１（２０００）参照）。
【００６４】
軟骨モデルのシャフト内で、その後、軟骨芽細胞が著しく大きくなり、周囲の軟骨を再吸収することにより、孔の開いたスレンダーな軟骨マトリクスの骨梁だけを残す。この軟骨マトリクスは、その後カルシウム化し、軟骨細胞が変性して、相互に繋がった大きな空間を残す。この時、シャフトの軟骨膜は、軟骨形成能力を発達させ、骨膜の役割を再開する。そして、骨膜は、薄い骨の層をシャフトの表面に置き、そして未熟な間葉系細胞および血管が、軟骨細胞の変性後のシャフトに残された空間に入り込む。未熟な間葉系細胞は、軟骨マトリクスのカルシウム化された残りの空間において、骨芽細胞および血液形成細胞へと分化し、不規則な繊維性骨の形成を開始する（Ｗｈｅａｔｅｒ  ａｎｄ  Ｂｕｒｋｉｔｔ，  １９８７，  ｓｕｐｒａ参照）。Ｗｈｅａｔｅｒ  ａｎｄ  Ｂｕｒｋｉｔｔ，  １９８７，  ｓｕｐｒａに記載された軟骨モデルでは、オリジナルの軟骨モデルの端部は、その後、シャフト内の一次骨化の大きな領域により隔てられた。しかしながら、該モデルの軟骨端部の直径は成長を続けた。
【００６５】
その間、シャフトの端部にある軟骨は、退行性の変化を続け、それに続いて骨化し、これにより、この段階で発達中の骨は、半月状の軟骨骨端を各端部に有する長くて骨っぽい骨幹シャフトから構成される。シャフトと各骨端の境界面は、成長線もしくは骨端線を構成する。成長線内では、軟骨は継続的に増殖し、骨の伸長を続ける。各成長線の骨幹の観点では、軟骨細胞は成熟して死に、軟骨の変性領域は骨に取って代わる。そのため、骨っぽい骨幹は、長くなり成長線はどんどん離れていく。体が成熟すると、ホルモンの変化が軟骨の増殖を阻害し、成長線は骨に取って代わられ、骨幹と骨端とが融合する（Ｗｈｅａｔｅｒ  ａｎｄ  Ｂｕｒｋｉｔｔ，１９８７，  ｓｕｐｒａ参照）。一方、発達中の各骨端の軟骨の固まりの中心では、退行性変化および骨幹軟骨における骨形成に似た骨形成が、骨端の全外表面での軟骨の付加成長と一緒に起こる。骨端軟骨の中心の骨へのこの変化は、二次骨化として知られている。薄い硝子軟骨の領域は、関節軟骨として表面に必ず残る（Ｗｈｅａｔｅｒ  ａｎｄ  Ｂｕｒｋｉｔｔ，１９８７，  ｓｕｐｒａ参照）。
【００６６】
したがって、内軟骨性骨形成および成長は、軟骨細胞のミネラル化があってもなくても、軟骨細胞（軟骨芽細胞および軟骨細胞）の増殖と成熟とから一部達成される。軟骨形成もしくは再形成は、軟骨細胞のミネラル化を調節することにより達成可能である。特定の理論に縛られることなく、軟骨細胞のミネラル化は、例えばａ）場所、ｂ）細胞の種類、ｃ）細胞分化の段階、ｄ）微細環境、およびｅ）生体力学的力などの調節因子により調節できる。例えば、軟骨細胞のミネラル化は、ミネラル化が通常起こる骨端成長線の近く、もしくは、ミネラル化が通常起こらない関節表面の近くに軟骨細胞を配置することで調節できる。この分野において、軟骨細胞の肥大および、上方制御されたマトリクスのカルシウム化は、分離可能な状態であること知られている（例えば、Ｊｈｏｎｓｏｎ，  ｖａｎ  Ｅｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２００３参照）（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｋ．Ａ，Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８（２１）：１８８２４−３２（２００３）参照）。例えば、内軟骨の形成は、軟骨芽細胞およびアポトーシス軟骨芽細胞の増加に見られる軟骨芽細胞の肥大で評価でき、ＴＵＮＥＬ染色により明確にできる。他の例としては、軟骨の形成は、必要なアポトーシスもしくはミネラル化なしの軟骨芽細胞の肥大によっても評価できる。
【００６７】
軟骨再形成
軟骨は、かなりの量の水分を含んでいる。例えば、関節軟骨は、ほとんど水水（６０−８０質量％）で構成され、残りのＥＣＭは、ほとんどタイプＩＩコラーゲン（５０−９０％乾燥状態の質量）およびプロテオグリカン（５−１０％）で構成される。その他のコラーゲンおよび微量のＥＣＭ分子が少量同定されている。特徴的な領域へＥＣＭをいれること、および種々の領域での水とＥＣＭの相互作用が、生体力学的な力を吸収し関節全範囲に伝達するのに必要な強靱性を付与すると同時に、関節の動きに必要な摩擦のない滑らかな表面を提供する。日頃の歩行およびジャンプ時には、それぞれ４および２０ＭＰａと高い負荷が掛かっていることが報告されている。関節軟骨は非常に驚異的ではあるが、残念なことに最小限の修復しか発揮しない。２千万人を超える米国人が、骨関節炎および変性関節疾患に苦しめられ、これには、６００億ドルを超える年間医療費負担が関連している。軟骨の組織工学用に幅広い範囲の、足場剤、サイトカイン、および成長因子が調べられた（例えば、Ｆｒｅｎｋｅｌ，  Ｓ．Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｅｎｇ．３２：２６−３４（２００４）；  Ｔｕｌｉ，  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ．  Ｔｈｅｒ．  ５：２３５−２３８（２００３））；および  Ａｓｈａｍｍａｎｋｈｉ、Ｎ．  ａｎｄ  Ｒｅｉｓ，  ＲＬ．  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ｖｏｌ．２，  ２００５などを参照）。  軟骨細胞の生物反応および組織再構築に対する静的ｖｓ動的圧力、せん断ストレス、静水圧、液体の流れ、流動電位、バイオリアクター、および複合体の役割が詳細に調べられおり、機械的シグナル伝達経路も調べられている（Ａｓｈａｍｍａｎｋｈｉ，  Ｎ．  ａｎｄ  Ｒｅｉｓ，  ＲＬ．  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ｖｏｌ．２  ２００５）（その中の図７Ａ−Ｄ参照）。
【００６８】
したがって、本願発明のさらなる点として、ここで提供される組成物は、軟骨芽細胞および軟骨細胞から軟骨を形成するのを誘導するのに効果的な量の少なくともＮＥＬＬペプチドもしくはＮＥＬＬペプチドレセプターのアゴニストを含む。ＮＥＬＬタンパク質、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ，およびＮＥＬＬアゴニスト、およびアンタゴニスト阻害剤は、細胞があってもなくても、それ単独でも足場剤との組み合わせでも、機械的刺激があってもなくても、その他の成長因子が存在してもしなくても、使用することができる。例えば、一実施形態では、該組成物は、椎間板、顎関節円板、膝および手首の繊維軟骨、および関節表面における軟骨を再生、修理、増強するのに効果的な組成物でもよい。他の実施形態では、該組成物は、生体外遺伝子治療および組織工学において足場剤があってもなくてもタンパク質の細胞への注入を経て軟骨を形成するのに効果的な組成物でもよい。
【００６９】
移送伝達手段および局所環境によっては、組成物は、軟骨細胞もしくは軟骨芽細胞などの軟骨形成細胞を誘導して分化させ、軟骨のみを形成するのにＮＥＬＬペプチド（例えばＮＥＬＬ１ペプチド）を使用することができる。例えば、関節軟骨の損傷において、ここに記載する組成物は、軟骨のみを形成するように軟骨細胞／軟骨芽細胞などの軟骨形成細胞を誘導することができる。該組成物は、足場剤／キャリアとして損傷した軟骨の領域に適用できる。いくつかの実施形態では、該組成物は、任意で細胞（幹細胞、軟骨芽細胞など）を含むことができる。いくつかの実施形態では、該組成物は、遺伝子治療として適用できる。
【００７０】
いくつかの実施形態では、ここで使われているように、細胞は、例えば分化した軟骨細胞；移植の後に分化したもしくは移植の前に分化した分化細胞（例えば、骨格筋細胞、繊維細胞）；移植の後に分化したもしくは移植の前に分化した成長した幹細胞；移植の後に分化したもしくは移植の前に分化した胚性幹細胞；ヒト細胞；核酸、タンパク質、低分子、ｓｉＲＮＡ、抗体で変化された細胞でもよい。
【００７１】
いくつかの実施形態では、該組成物は、軟骨組織工学に使用できる。例えば、「振幅する」断続的なストレス下で軟骨芽細胞が培養されている場合、ＮＥＬＬ１ペプチドは軟骨芽細胞を分化および軟骨形成のために含むことができる。これらの実施形態では、振幅ストレスの所要時間は、重要な役割を果たす。例えば、振幅力が、継続的に適用された場合、ＮＥＬＬ１ペプチドを持つ組成物は、内軟骨性骨形成を誘導できる。したがって、振幅ストレスの適用は、軟骨形成細胞（例えば、軟骨細胞／軟骨芽細胞）の分化が軟骨段階でストップでき、それにより細胞が内軟骨性骨形成へと分化するのを防止できるように断続的に行われるべきである。
【００７２】
したがって、いくつかの実施形態では、該組成物は、例えば、関節軟骨および椎間板の円板修復のためなどの、軟骨を再形成／修復に使うことができる。
【００７３】
ここに記載する組成物により治療、予防、向上できる軟骨状態の一例として、ただしこれに限定されるわけではないが、軟骨石灰化症、骨関節炎および／またはその他の病理的軟骨損傷で特徴づけられる病気などを含む。
【００７４】
いくつかの実施形態では、内軟骨骨形成を促す方法として、骨形成が望まれる領域でのＮＥＬＬ１遺伝子産物の濃度を上げることを含んでもよく、任意で、骨形成が望まれる領域に第二作用剤を適用して軟骨芽細胞の肥大を骨形成が望まれる領域で誘導することを少なくとも含むことができる。
【００７５】
該方法は、骨形成が望まれる領域にＮＥＬＬ１ペプチドを適用することにより、ＮＥＬＬ１遺伝子産物の濃度を上げることを含むことができる。また、ＮＥＬＬ１ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、を有する一群から選択でき、または軟骨および骨と関連する内軟骨骨形成を増加するのに効果的なＮＥＬＬペプチドのあらゆる領域から選択できる。
【００７６】
該第二作用剤は、ＴＧＦ−ベータ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７、ｂＦＧＦ，インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、Ｓｏｘ９、コラーゲン、軟骨形成細胞、骨、骨マトリクス、腱マトリクス、靱帯マトリクスを含むことができるが、これに限定されるわけではない。第二作用剤は、ＮＥＬＬ１と共に内軟骨骨形成を誘導する補間的もしくは相乗効果を持つように選択できる。その他の作用剤は、以下に記載する。
【００７７】
血管形成および軟骨形成／再形成の阻害
Ｓｈｕｋｕｎａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，にも記載されているように、軟骨は、胚発生においてほとんどの骨格の鋳型を形成する（Ｓｈｕｋｕｎａｍｉ  Ｃ．，  Ｙ．  Ｏｓｈｉｍａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３３３（２）：２９９−３０７）（２００５））。軟骨は、直接、骨に代わるわけではなく、血管の侵入に伴って、軟骨の骨化中心部まで運ばれる破骨細胞と骨芽細胞の活動を通して徐々に骨に変わる（内軟骨骨形成）。したがって、軟骨の血管侵入は、発達の適切な段階においては、骨形成に重要である。軟骨細胞は、血管侵入の前に成熟して肥大化し、カルシウム化されるため、軟骨は、抗血管新生性質を軟骨形成時に獲得し、急速にその性質を失う。これは、軟骨が、抗血管新生形質の大きな切り替えを行うことを示唆している。疑う余地なく、血管新生促進因子が組織内への血管侵入の動力として働いている。ＶＥＧＦ−Ａは、内軟骨骨形成における血管新生の重要なレギュレーターである。ＶＥＧＦ−Ａは、肥大化した軟骨で発現しているが、増殖中の軟骨では停止している。
【００７８】
マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰｓ）は、血管侵入時のマトリクス再構築を含む骨の発達に影響を与えることができる（例えば、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１４）。ＭＭＰ−９欠損マウスでは、血管侵入およびそれに続く骨化が遅れ、その結果成長線の伸長が進んだ。ＭＭＰ−９が欠如した肥大化軟骨細胞は、血管形成を刺激する通常レベルの血管新生活性を放出できず、さらに破骨細胞／軟骨吸収細胞を誘致出来ないため、骨化の遅れは軟骨への血管侵入に続いたものと考えられる。ＭＭＰ−１４（膜型タイプ１ＭＭＰ：ＭＴ１−ＭＭＰ）の標的不活性化は、マウスの内軟骨骨形成および膜内骨形成に深刻な損傷を与えた。これらの結果は、ＭＭＰが軟骨形質の血管新生の切り替えに重要な役割を果たしていることを示唆している。したがって、軟骨形成および再形成の重要な部分は、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１４およびＶＥＧＦなどの血管新生因子と、コンドロモジュリン−１（ＣｈＭ−Ｉ）、トロンボスポンジン（ＴＳＰ）−Ｉ、ＴＳＰ−２、メタロプロテアーゼの組織阻害剤（ＴＩＭＰ）−２、ＴＩＭＰ−３などの抗血管新生因子の分化調節を含むことができる。具体的には、血管新生因子は、軟骨が骨化している領域で比較的より顕著であり、抗血管新生因子は、軟骨が骨化を行っていない領域で比較的より顕著である。これらの結果は、転写因子Ｃｂｆａ−１／Ｒｕｘ２は、軟骨における血管新生の切り替えを制御するのに関与してもいことを示唆している。Ｃｂｆａ−１／Ｒｕｘ２ノックアウトマウスは、肥大化した軟骨の分化、軟骨跡への血管侵入、およびＶＥＧＦ発現を欠いており、さらにＣｈＭ−Ｉ遺伝子発現の抑制を維持していた。肥大化していない軟骨細胞でＣｂｆａ−１／Ｒｕｘ２導入遺伝子を発現している、Ｃｂｆａ−１／Ｒｕｘ２ノックアウトマウスでは、ＶＥＧＦの上方制御および同時にＣｈＭ−Ｉ遺伝子発現の下方制御により血管侵入および軟骨再形成が復活した。
【００７９】
特定の理論に縛られることなく、Ｃｂｆａ−１／Ｒｕｘ２効果の直接的な下流エフェクターであることから、ＮＥＬＬ１は、軟骨における血管新生の切り替えの役割を担うことができる。さらに、特定の理論に縛られることなく、ＮＥＬＬ１がトロンボスポンジン様モジュールもＮ末に有することから、軟骨形成におけるＮＥＬＬ１の役割は、ＮＥＬＬ１の抗血管新生効果の可能性にも関与できる。
【００８０】
他の作用剤
一実施形態では、ここに記載する軟骨形成および再形成のための組成物は、一以上の作用剤を含むことができる。そのような作用剤は、軟骨保護剤、アンチペインおよび／または抗炎症剤、成長因子、抗血管新生作用剤、もしくはそれらの組み合わせを含むことができる。
【００８１】
軟骨保護剤としては、例えば、（１）例えば、ＩＬ−１．ベータ、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８を含むタンパク質のインターロイキン−１ファミリーのレセプターのアンタゴニスト；（２）例えば、ＴＮＦ−Ｒ１を含む腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レセプターファミリーのアンタゴニスト；（３）インターロイキン４、１０、および１３のためのアゴニスト；（４）例えば、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、およびＢＭＰ−７を含むＴＧＦ−．ベータ．レセプタースーパーファミリーのアゴニスト；（５）ＣＯＸ−２の阻害剤；（６）例えば、Ｐ３８、ＭＡＰキナーゼを含むＭＡＰキナーゼファミリーの阻害剤；（７）例えば、ＭＭＰ−３、およびＭＭＰ−９を含むタンパク質のマトリックスメタロプロティアーゼ（ＭＭＰ）ファミリーの阻害剤；（８）例えば、Ｉ．カッパー．Ｂとのｐ５０／ｐ６５ダイマー複合体を含むタンパク質のＮＦ．カッパー．Ｂファミリーの阻害剤；（９）例えばｉＮＯＳを含む一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）ファミリーの阻害剤；（１０）例えばαｖβ３インテグリンを含むインテグリンレセプターのアゴニストおよびアンタゴニスト；（１１）タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）ファミリーの阻害剤；（１２）例えば、ｓｒｃサブファミリーを含むタンパク質チロシンキナーゼファミリーの阻害剤；（１３）タンパク質チロシンホスファターゼの調節剤；および（１４）タンパク質ｓｒｃホモロジー２（ＳＨ２）ドメインの阻害剤であってもよい。
【００８２】
他の軟骨保護作用剤としては、例えばインスリン様成長因子（例：ＩＧＦ−１）および繊維芽細胞成長因子（例：ｂＦＧＦ）などの他の成長因子を含むことができる。その他の軟骨保護作用剤としては、米国特許７、０６７、１４４に記載されており、その教示は、ここで参考として取り入れられている。軟骨保護作用剤は、単独でもしくは、ＮＥＬＬペプチドもしくは関連作用剤とともに使用できる。いくつかの実施形態では、ここに記載する組成物は、上述の軟骨保護作用剤のどれでもを除外できる。
【００８３】
アンチペインおよび／または抗炎症剤としては、例えば、（１）セラトニンレセプターのアンタゴニスト；（２）セラトニンレセプターアゴニスト；（３）ヒスタミンレセプターアンタゴニスト；（４）ブラジキニンレセプターアンタゴニスト；（５）カリクレイン阻害剤；（６）ニューロキニンサブ１およびニューロキニン２レセプターサブタイプアンタゴニストを含むタキキニンレセプターアンタゴニスト；（７）カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）レセプターアンタゴニスト；（８）インターロイキンレセプターアンタゴニスト；（９）（ａ）ＰＬＡ．サブ．２アイソフォーム阻害剤およびＰＬＣアイソフォーム阻害剤を含むホスフォリパーゼ阻害剤、（ｂ）シクロオキシゲナーゼ阻害剤、（ｃ）リポオキシゲナーゼ阻害剤、を含むアラキドン酸代謝物の合成回路で活性している酵素の阻害剤；（１０）エイコサノイドＥＰ−１およびＥＰ−４レセプターサブタイプアンタゴニストおよびトロンボキサンレセプターサブタイプアンタゴニストを含むプロスタノイドレセプターアンタゴニスト；（１１）ロイコトリエンＢ．サブ．４レセプターサブタイプアンタゴニストおよびロイコトリエンＤ．サブ．４レセプターサブタイプアンタゴニストを含むロイコトリエンレセプターのアンタゴニスト；（１２）μ―オピオイド、δ−オピオイド、カッパーオピオイドレセプターサブタイプアゴニストを含むオピオイドレセプターアゴニスト；（１３）Ｐ２ＸレセプターアンタゴニストおよびＰ２Ｙレセプターアンタゴニストを含むプリノレセプターアンタゴスト；および（１４）カルシウムチャンネルアンタゴニストであってもよい。上述の作用剤は、それぞれ抗炎症剤および／または抗侵害受容（アンチペインもしくは鎮痛剤）作用剤のいずれかとして機能する。これらの一群の化合物から選択される作用剤は特定の用途のために調整されている。これらのアンチペインおよび／または抗炎症剤は、単独でも、またはＮＥＬＬペプチドもしくは関連作用剤と組み合わせて使用してもよい。いくつかの実施形態では、ここに記載する組成物は、上述のアンチペインおよび／または抗炎症剤のどれでもを除外できる。
【００８４】
成長因子は、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−５、ＩＧＦ−１、ＴＧＦ−ベータ．、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＯＰ１、ＯＰ２、ＯＰ３、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１１、ＢＭＰ１２、ＢＮＰ１５、ＢＭＰ１６、ＤＰＰ、Ｖｇｌ、６０Ａタンパク質、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９、ＧＤＦ１０およびＧＤＦ１１であってもよい。その他の成長因子は、米国特許番号７，０６７，１２３、７，０４１，６４１に記載されており、その教示は、ここに参考として組み込まれている。これらの成長因子は、単独で使用されてもよく、またはＮＥＬＬペプチドもしくは関連作用剤と共に使用されてもよい。いくつかの実施形態では、ここに記載する組成物は、上述の成長因子のどれでもを除外できる。
【００８５】
抗血管新生作用剤としては、例えば、抗侵入因子、レチオニン酸およびその誘導体、タキソールとその誘導体およびアナログ、スラミン、組織阻害剤メタロプロテアーゼ−１、組織阻害剤メタロプロテアーゼ−２、プラスミノーゲン活性阻害剤−１およびプラスミノーゲン活性阻害剤−２、軽いｄグループの遷移金属などを含む、抗血管新生因子であってもよい。同様に、広い範囲のポリマー性キャリアが使われてもよく、代表的な例としては、ポリ（エチレン−ビニルアセテート）（４０％架橋）、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）オリゴマーおよびポリマー、ポリ（Ｌ−乳酸）オリゴマーおよびポリマー、ポリ（グリコール酸）、乳酸およびグリコール酸のコポリマー、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（バレロラクトン）、ポリ（無水物）、ポリ（カプロラクオン）もしくはポリ（乳酸）とポリエチレングリコールのコポリマー、およびこれらの混合物などを含む。ある好ましい実施形態では、組成物は、例えば、タキソール、エストラムチン、コルヒチン、メトトレキセート、キュラシンＡ、エポシロン、ビンブラスチン、もしくはｔＢＣＥＶなどの微小管の機能を崩す化合物を含有する。他の好ましい実施形態では、組成物は、新しい血管の形成を阻害するポリマー性キャリアおよび軽いｄグループの遷移金属（例えば、バナジウム類、モリブデン類タングステン類、チタン類、ニオビウム類、タンタル類）（米国特許出願２００６０２４０１１３に記載）、ＶＥＧＦの阻害剤（米国特許出願２００６０２４１０８４に記載）、血管新生の他の阻害剤（米国特許出願２００６０２３５０３４、および７，１２２，６３５に記載）、コンドロモジュリン−Ｉもしくはテノモジュリン（Ｓｈｕｋｕｎａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５，  ｓｕｐｒａ）、または当分野においてよく知られた他の内因もしくは外因性の抗血管新生因子を含有する。
【００８６】
配合
ここに記載する組成物は、所望のいかなる配合物に配合できる。該組成物は、所望の配合物に影響を与える物質およびキャリアを含んでもよい。例えば、該組成物は、予め決められた設置時間内に、注入もしくは成形可能な材料を含むことができる。そのような予め決められた時間は、例えば、１０分、３０分、１時間、２時間などである。
【００８７】
いくつかの実施形態では、該組成物は、ｐＨ、イオン環境、および溶媒濃度の変化により形成される一次結合を含む化学ゲルを含むことができる。そのようなゲルとしては、例えば、キトサンなどの多糖類、ベータ−グリセロフォスフェートなどのイオン塩＋キトサン、アルギネート＋Ｂａ２＋、Ｓｒ２＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、コラーゲン、フィブリン、血しょう、またはそれらの組み合わせがあるが、これらに限定されるわけではない。
【００８８】
いくつかの実施形態では、該組成物は、温度変化により形成される二次結合を含む物理ゲルを含むことができる。そのような物理ゲルの例としては、アルギネート、ポリ（エチレン−グリコール）−ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）−ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧ）トリブロックコポリマー、アガロース、およびセルロースがあるが、これに限定されるわけではない。いくつかの実施形態では、ここに記載する組成物内で使用される物理ゲルは、高いせんだん力下では液状で、低いせんだん力下では固体である物理ゲルを含むことができる。このような物理ゲルの例としては、ヒアルロン酸、ポリエチレンオキシドがあるが、これに限定されるわけではない。物理ゲルは、予め決められた寸法および形をした予め形成された物質を有していてもよい。
【００８９】
いくつかの実施形態では、ここに記載する組成物は、刺激に対する反応として活性作用剤を分解もしくは放出する物質を含む。そのような刺激のいくつかの例として、機械的刺激、光、温度変化、ｐＨ変化、イオン強度の変化、もしくは電磁界などがある。このような物質のいくつかの例としては、キトサン、アルギネート、プルオロニックス、メチルセルロース、ヒアルロン酸、およびポリエチレンオキサイドなどがある。その他の例としては、Ｂｒａｎｄｌ  Ｆ，  Ｓｏｍｍｅｒ  Ｆ，  Ｇｅｏｐｆｅｒｉｃｈ  Ａ．  “Ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｆｏｒ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：  Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｆａｃｔｏｒｓ  Ｏｏｎ  ｃｅｌｌ  ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｉｎ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．”  Ｅｐｕｂ  ２００６  Ｓｅｐ  ２９に記載されている。
【００９０】
いくつかの実施形態では、ここに記載する組成物は、ヒドロキシアパタイト、アパタイト、リン酸三カルシウム、リン酸カルシウム、生体活性ガラス、ヒトの同種移植骨および軟骨、ウシの骨および軟骨、またはそれらの混合物のいずれかを有するゲルを含むことができる。
【００９１】
いくつかの実施形態では、上述のゲルを含むここに記載する組成物は、分解キネティクスおよび調節された放出をさらに調整するための架橋剤をさらに含むことができる。または、いくつかの実施形態では、ここに記載する組成物は、上述のゲルのいずれかを含む相互貫入相複合物もしくは相互貫入網目（ＩＰＮ）を含むことができる。架橋剤のいくつかの例としては、一般的な架橋剤（ポリアルキレンオキシド、エチレンジメタクリレート、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、メチレンビス（４−フェニルイソシアネート）、エチレンジメタクリレート、ジビニルベンゼン、アリルメタクリレート、カルボイミダゾル、スルフォニルクロライド、クロロ炭酸塩、ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、スクシンイミドエステル、エポキシド、アリルハライド、スルホスクシンイミジルエステル、およびマレイミド）；ＰＥＧベース架橋剤（例えば、ＭＡＬ−ｄＰＥＧｘ−ＮＨＳ−エステル、ＭＡＬ−ｄＰＥＧ酸、Ｂｉｓ−ＭＡＬ−ｄＰＥＧｘなど）、光活性架橋剤、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドベース架橋剤、ジリシン（ｄｉｌｙｓｉｎｅ）、トリリシン（ｔｒｉｌｙｓｉｎｅ）、およびテトラリシン（ｔｅｔｒａｌｙｓｉｎｅ）を含むが、これに限定されるわけではない。
【００９２】
ここに記載する組成物は、キャリアを含む。キャリアは、ポリマー性のキャリアでも非ポリマー性のキャリアでもよい。いくつかの実施形態では、キャリアは、例えば、酵素もしくは加水分解により分解できる生分解可能なキャリアである。キャリアの例には、たとえば、ポリ（Ｌ−ラクチド）（ＰＬＬＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ＰＤＬＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド（ＰＬＧＡ）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（トリメチレンカーボネート）、ポリ（ｐ−ジオキサノン）、ポリ（カプロラクトン−コ−グリコリド）、ポリ（グリコリド−コ−トリメチレンカーボネート）ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−トリメチレンカーボネート）のようなポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリアリーレート類、ポリヒドロキシブチラート（ＰＨＢ）、ポリ無水物、ポリ（無水物−コ−イミド）、プロピレン−コ−フマレート類、ポリラクトン類、ポリエステル類、ポリカーボネート類、ポリアニオン系ポリマー類、ポリ無水物、ポリエステルアミド類、ポリ（アミノ酸）、ホモポリペプチド類、ポリ（ホスファゼン）、ポリ（グラクサノン）、多糖類、及びポリ（オルソエステル）、ポリグラチン、ポリグラチン酸、ポリアルドン酸、ポリアクリル酸、ポリアルカノエート類のような、しかし、これらに限定されない合成の吸収性ポリマー類、これらのコポリマー及び混合物、並びに任意の誘導体及び修飾体が挙げられるが、これらに限定されない。たとえば、参照により本出願に組み入れられる米国特許第４，５６３，４８９号及びＰＣＴ国際出願ＷＯ／０３０２４３１６を参照されたい。キャリアのそのほかの例には、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピル−メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロースのようなセルロース系ポリマー類、及びそれらのカチオン系の塩が挙げられるが、これらに限定されない。キャリアのそのほかの例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、アパタイト類、生体活性ガラス材料、及びサンゴ由来のアパタイト類のような合成及び天然のバイオセラミックスが挙げられるが、これらに限定されない。たとえば、参照により本出願に組み入れられる、米国特許出願２００２１８７１０４号、ＰＣＴ国際出願ＷＯ／９７３１６６１及びＰＣＴ国際出願ＷＯ／００７１０８３を参照されたい。
【００９３】
実施形態の１つでは、キャリアはさらに、ゾルゲル技法に由来する生体ガラス及び／又はアパタイトを含む組成物、或いは、天然の血清濃度の約１．５〜７倍の範囲内でのカルシウム及びリン酸の濃度を持ち、約１５〜６５℃の温度で約２．８〜７．８のｐＨ範囲を持つ溶液に種々の手段で調製された人工体液のような、しかし、これに限定されない浸漬技法に由来する生体ガラス及び／又はアパタイトを含む組成物によって被覆されてもよい。たとえば、参照により本出願に組み入れられる米国特許第６，４２６，１１４号及び同第６，０１３，５９１号、並びにＰＣＴ国際出願ＷＯ／９１１７９６５を参照されたい。
【００９４】
キャリアのそのほかの例には、コラーゲン（たとえば、Ｃｏｌｌｏｓｔａｔ、Ｈｅｌｉｓｔａｔコラーゲンスポンジ）、ヒアルロナン、フィブリン、キトサン、アルギネート及びゼラチンが挙げられる。たとえば、参照により本出願に組み入れられるＰＣＴ国際出願ＷＯ／９５０５８４６、ＷＯ／０２０８５４２２を参照されたい。
【００９５】
実施形態の１つでは、キャリアは、ヘパリン様ポリマー、たとえば、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、硫酸ヘパリン、フカン、アルギネート、又はそれらの誘導体を含むが、これらに限定されないヘパリン結合剤；及びアミノ酸修飾を持つペプチド断片を含んでヘパリンへの親和性を高めてもよい。たとえば、参照により本出願に組み入れられるＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （２００３），  ２７８（４４），  Ｐ．４３２２９−４３２３５を参照されたい。
【００９６】
一実施形態では、組成物は液体、固体又はゲルの形態であってもよい。一実施形態では、基材は流動性ゲルの形態であるキャリアを含んでもよい。ゲルは、軟骨形成が所望される部位に注射器を介して注入できるように選択してもよい。ゲルは、一次結合により形成され、ｐＨ、イオン基及び／又は溶媒濃度により制御される化学作用によるゲルであってもよい。ゲルはまた、二次結合により形成され、温度及び粘度により制御されてもよい物理作用によるゲルであってもよい。ゲルの例には、プルロニック類、ゼラチン、ヒアルロナン、コラーゲン、ポリアクチド−ポリエチレングリコール溶液及び抱合体、キトサン、シトサン＆ｂ−グリセロホスフェート（ＢＳＴ−ゲル）、アルギネート類、アガロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリエチレンオキシド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン中のポリアクチド／グリコリドが挙げられるが、これらに限定されない。たとえば、参照により本出願に組み入れられるＡｎａｔｏｍｉｃａｌ  Ｒｅｃｏｒｄ  （２００１），  ２６３（４），  ３４２−３４９を参照されたい。
【００９７】
一実施形態では、キャリアは、たとえば、少なくとも約２５０ｎｍの波長での電磁波照射による光重合が可能であってもよい。光重合が可能なポリマーの例には、ポリエチレン(ＰＥＧ）アクリレート誘導体、ＰＥＧメタクリレート誘導体、プロピレンフマレート−コ−エチレングリコール、ポリビニルアルコール誘導体、ＰＥＧ−コ−ポリ（ヒドロキシ酸）ジアクリレートマクロマー、並びに、たとえば、ヒアルロン酸誘導体及びデキストランメタクリレートのような修飾多糖類が挙げられる。たとえば、参照により本出願に組み入れられる米国特許第５，４１０，０１６号を参照されたい。
【００９８】
一実施形態では、基材は、温度感受性であるキャリアを含んでもよい。例には、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮｉＰＡＭ）、又は低下させた低臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）で修飾したＮｉＰＡＭ、並びにエチルメタクリレート及びＮ−アクリルオキシスクシンイミドの取り込みにより向上させたペプチド（たとえば、ＮＥＬＬ１）の結合；又はブチルメタクリレート、ヘキシルメタクリレート及びドデシルメタクリレートのようなアルキルメタクリレートから作製されたキャリアが挙げられる。参照により本出願に組み入れられるＰＣＴ国際出願ＷＯ／２００１０７０２８８；米国特許第５，１２４，１５１号。
【００９９】
一実施形態における、受容体介在性のメカニズムを介して細胞−マトリクスの結合を促進してもよい細胞接着分子、接着ペプチド及び接着ペプチド類縁体によって装飾される及び／又は固相化される表面を、及び／又はたとえば、ポリカチオン系ポリアミノ酸ペプチド（たとえば、ポリリジン）、ポリアニオン系ポリアミノ酸ペプチド、Ｍｅｆｐクラス接着分子及びそのほかのＤＯＰＡリッチペプチド（たとえば、ポリリジンＤＯＰＡ）、多糖類及びプロテオグリカン類のような、しかし、これらに限定されないものを結合する受容体非介在性のメカニズムを介して接着を促進してもよい分子部分によって装飾される及び／又は固相化される表面を、キャリアが有してもよい場合。たとえば、参照により本出願に組み入れられるＰＣＴ国際出願ＷＯ／２００４００５４２１、ＷＯ／２００３００８３７６、ＷＯ／９７３４０１６を参照されたい。
【０１００】
一実施形態では、キャリアは、失活させた軟骨マトリクス、脱ミネラル化された骨マトリクス、もしくは同種移植片、異種移植片由来のその他の組成物、もしくは、モネラ、原生生物、菌類、植物、動物由来の自然に存在する物質を含むことができる。
【０１０１】
一実施形態では、キャリアは、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、アルギネート、ポリ（エチレングリコール）、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピル−メチルセルロース及びカルボキシメチルセルロースを含むアルキルセルロース（ヒドロキシアルキルセルロースを含む）、血液、フィブリン、ポリオキシエチレンオキシド、硫酸カルシウム半水化物、アパタイト類、カルボキシビニルポリマー、及びポリ（ビニルアルコール）のような、しかし、これらに限定されない金属イオン封鎖剤を含んでもよい。たとえば、参照により本出願に組み入れられる米国特許第６，６２０，４０６号を参照されたい。
【０１０２】
一実施形態では、キャリアは、たとえば、ポリオキシエステル（たとえば、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０又はプルロニックＦ−６８）のような、しかし、これらに限定されない、キャリア物質の中におけるＮＥＬＬ１の安定性及び／又は分布を促進するための界面活性剤を含んでもよい。
【０１０３】
一実施形態では、キャリアは、たとえば、グリシン、グルタミン酸塩酸塩、塩化ナトリウム、グアニジン、ヘパリン、グルタミン酸塩酸塩、酢酸、コハク酸、ポリソルベート、デキストラン硫酸、スクロース及びアミノ酸のような、しかし、これらに限定されない緩衝剤を含んでもよい。たとえば、参照により本出願に組み入れられる米国特許第５，３８５，８８７号を参照のこと。実施形態の１つでは、上記で列記したもののような物質の組み合わせを含んでもよい。例示の目的で、キャリアは、ＰＬＧＡ／コラーゲンキャリア膜であってもよい。ＮＥＬＬ１ペプチドを含む溶液中に該膜を浸してもよい。
【０１０４】
一実施形態では、人体に使用するインプラントは、インプラントの近傍で軟骨形成を誘導するのに十分な量のＮＥＬＬ１を含む基材を含んでもよい。
【０１０５】
一実施形態では、人体に使用するインプラントは、インプラントの近傍で軟骨形成を誘導するのに十分な量のＮＥＬＬ１を含む表面を有する基材を含んでもよい。
【０１０６】
一実施形態では、人体に使用するインプラントは、軟骨形成細胞、及び軟骨形成を誘導するのに十分な量のＮＥＬＬ１を含む表面を有する基材を含んでもよい。一実施形態では、インプラントは、自己の細胞、軟骨形成細胞又は骨芽細胞、ＮＥＬＬ１又はもう１つの軟骨形成分子を発現する細胞を含むが、これらに限定されない細胞と共に播かれてもよい。
【０１０７】
インプラントは、メッシュ、ピン、プレート又は人工装具の継ぎ目に形成された基材を含んでもよい。例示の目的で、基材は歯科用インプラント又は整形外科用インプラントの形態であってもよく、ＮＥＬＬ１は、インプラント近傍の骨における統合を向上させるのに使用されてもよい。インプラントは、たとえば、コラーゲンを含む基材のような吸収可能である基材を含んでもよい。
【０１０８】
ＮＥＬＬ１を許容可能なキャリアと組み合わせて医薬組成物を形成してもよい。許容可能なキャリアは、たとえば、組成物を安定化させるように、又は作用剤の吸収を増減するように作用する生理学的に許容可能な化合物を含有することができる。生理学的に許容可能な化合物には、グルコース、スクロース又はデキストランのような炭水化物、アスコルビン酸及びグルタチオンのような抗酸化剤、キレート剤、低分子量タンパク質、細胞分裂防止剤のクリアランス又は加水分解を減らす組成物、又は賦形剤又はそのほかの安定剤及び／又は緩衝液を挙げることができる。
【０１０９】
そのほかの生理学的に許容可能な化合物には、湿潤剤、乳化剤、分散剤、微生物の増殖や作用を妨げるのに特に有用である防腐剤が挙げられる。種々の防腐剤が周知であり、たとえば、フェノール及びアスコルビン酸が挙げられる。当業者は、生理学的に許容可能な化合物を含むキャリアの選択が、たとえば、投与経路に依存することを十分理解するであろう。
【０１１０】
投与の方法に依存する種々の単位投与形態で組成物を投与することができる。たとえば、好適な単位投与形態には、散剤、錠剤、丸薬、カプセルが挙げられてもよい。
【０１１１】
本発明の組成物は、たとえば、水溶性ペプチドのための水性キャリアのような薬学上許容可能なキャリアに溶解されたＮＥＬＬ１ペプチドの溶液を含んでもよい。たとえば、緩衝化した生理食塩水などのような種々のキャリアを使用することができる。これらの溶液は無菌であり、一般に望ましくないものは含まれていない。従来の、周知の滅菌技法でこれらの組成物を滅菌してもよい。組成物は、たとえば、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、毒性調整剤などのような、必要に応じて生理的条件に近似させるための薬学上許容可能な補助的物質を含有してもよい。
【０１１２】
これらの処方におけるＮＥＬＬ１ペプチドの濃度は、幅広く変化させることができ、選択された投与形式及び患者のニーズに従って、主として液体容積、粘度、体重などに基づいて選択されるであろう。
【０１１３】
投与計画は、種々の患者の変数（たとえば、体重、年齢、性別）及び臨床提（たとえば、負傷の程度、負傷の部位など）と同様に、対処する臨床適応によって決定されるであろう。
【０１１４】
しかしながら、本発明において有用なＮＥＬＬ１ペプチド又はＮＥＬＬ１剤の治療上の有効用量は、上述の軟骨形成もしくは修復するための軟骨芽細胞の分化を向上させる作用剤の能力によって測定されるとき、患者において陽性の臨床効果を有する、又は細胞において所望の効果を有するものである。各ペプチド又は作用剤の治療上有効な用量を調節して、負の副作用をできるだけ抑える一方で、所望の臨床効果を達成することができる。ペプチド又は作用剤の投与量は、投与経路、疾患の重症度、患者の年齢及び体重、患者が服用しているそのほかの薬物、並びに通常、主治医により考慮されるそのほかの要因によって、個々の計画及び特定の患者に適した用量レベルを決定する際、個々の患者について選択されてもよい。
【０１１５】
装置
組成物は、所望の形状で注入／移植可能な装置に配合できる。例として、装置は、椎間板核置換、膝の半月板の置換、手首の三角繊維軟骨の置換、顎関節の置換、関節軟骨の置換のためである。装置は、下にある骨に固定される接着特性を持つ、予め形成された形状で多孔質な足場剤；マニュアル操作により再形成でき、光を利用することにより新しい形状に矯正できる予め形成された粘着性ゲル；ｉｎ−ｓｉｔｕで重合できる粘性の低い液体など構成されてもよい。例えば、組成物は、軟骨形成のために、一つの混合物（もしくは単純な混合物）に配合されてもよい。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、組成物は、組織特異的に特別に設計された層を有する一つの装置に配合されてもよい。例えば、固い組織に固定するには、骨の層を有することが望ましく、そして骨の層のすぐ隣に軟骨層があることが望ましい。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、組成物は、例えば、自己組み立てによりマクロ組織構造をとることのできる両性反応基を伴うポリマーおよびモノマーなどの、複数の組織形成および自己組み立てできる一つの混合物に配合されてもよい。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、ここに記載する細胞を有する組成物を含む装置では、装置は、移植前に刺激されてもよい。例えば、装置は、制御された刺激（周波数、デューティーサイクル、振幅など）を伴う機械的バイオリアクターに置かれてもよく；周波数は０．０１Ｈｚから１０，０００Ｈｚの範囲内で、デューティーサイクルは１０％以上で、振幅は０．１−１００％の範囲内の系で、細胞機能を向上することが報告されている。いくつかの実施形態では、ここに記載する装置は、制御されたマイクロ流体フローおよびせん断負荷を伴う機械的バイオリアクターに置かれてもよく、これは、少なくとも一つのフロー経路もしくはチャンネルが１ｍｍ以下の一断面を有する時に生じる。いくつかの実施形態では、装置は、細胞培養の直後に直接移植することによりヒトに移植してもよい。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、ここ提供される組成物は、以下の装置の例のいずれをも形成してもよく、これは請求する発明を示すが、これに限定されるものではない。
【０１２０】
軟骨形成を促進するために椎間板に直接注入もしくは移植可能で、（細胞を有するもしくは有さない）ＮＥＬＬタンパク質を有する注入／移植可能な装置；
椎間板の内側部分（核）もしくは椎間板の内側部分および外側部分の両方を置換するように設計されたＮＥＬＬを含浸させた円板核置換装置；
種々の関節空間（例えば、膝、顎関節、手首など）に直接注入可能、または関節鏡もしくは切開により種々の関節空間に移植可能で、（細胞を有するかもしくは有さない）ＮＥＬＬを有する注入／移植可能な装置；
軟骨形成を促進するために椎間板に直接注入／移植可能な（ウィルスなどの移送伝達手段を有するかもしくは有せず）（細胞を有するかもしくは有さない）ＮＥＬＬ核酸を有する注入／移植可能な装置；
椎間板の内側部分（核）もしくは椎間板の内側部分および外側部分の両方を置換するように設計された（ウィルスなどの移送伝達手段を有するかもしくは有さない）ＮＥＬＬ核酸を含浸させた円板核置換装置；
種々の関節空間（例えば、膝、顎関節、手首など）に直接注入可能、または関節鏡もしくは切開により種々の関節空間に移植可能な（ウィルスなどの移送伝達手段を有するかもしくは有せず）（細胞を有するかもしくは有さない）ＮＥＬＬ核酸を有する注入／移植可能な装置；
軟骨形成を促進するために椎間板に直接注入／移植可能なその他の因子を有する（細胞を有するかもしくは有さない）ＮＥＬＬタンパク質を有する注入／移植可能な装置；
椎間板の内側部分（核）もしくは椎間板の内側部分および外側部分の両方を置換するように設計されたＮＥＬＬおよびその他の因子を含浸させた円板核置換装置；
種々の関節空間（例えば、膝、顎関節、手首など）に直接注入可能、または関節鏡もしくは切開により種々の関節空間に移植可能で、（細胞を有するかもしくは有さない）ＮＥＬＬおよびその他の因子を有する注入／移植可能な装置；
軟骨形成を促進するために椎間板に直接的に注入／移植可能な（ウィルスなどの移送伝達手段を有するかもしくは有さない）（細胞を有するかもしくは有さない）ＮＥＬＬ核酸およびその他の因子を有する注入／移植可能な装置；
椎間板の内側部分（核）もしくは椎間板の内側部分および外側部分の両方を置換するように設計された（ウィルスなどの移送伝達手段を有するかもしくは有さない）ＮＥＬＬ核酸を含浸させた円板核置換装置；または、
種々の関節空間（例えば、膝、顎関節、手首など）に直接注入可能、または関節鏡もしくは切開により種々の関節空間に移植可能な（ウィルスなどの移送伝達手段を有するかもしくは有せず）（細胞を有するもしくは有さない）ＮＥＬＬ核酸を有する注入／移植可能な装置。
【０１２１】
用量
ＮＥＬＬペプチドおよび他の作用剤は、作用剤、病気、およびその他の因子例えば年齢および性別などを考慮し、当該分野において知られた方法に従い決定されてもよい。
【０１２２】
一実施形態において、軟骨形成もしくは修復のためのＮＥＬＬペプチドの用量は、特定のキャリアもしくは足場材を有しても有さなくても、通常０．００１ｐｇ／ｍｍ２から１ｐｇ／ｍｍ２、より好ましくは０．００１ｎｇ／ｍｍ２から１ｎｇ／ｍｍ２、もしくはより好ましくは０．００１μｇ／ｍｍ２から１μｇ／ｍｍ２、もしくはより好ましくは０．００１ｍｇ／ｍｍ２から１ｍｇ／ｍｍ２、もしくはより好ましくは０．００１ｇ／ｍｍ２から１ｇ／ｍｍ２の範囲内である。他の実施形態では、軟骨形成もしくは修復のためのＮＥＬＬペプチドの用量は、特定のキャリアもしくは足場材を有しても有さなくても、通常０．００１ｐｇ／ｍｌから１ｐｇ／ｍｌ、より好ましくは０．００１ｎｇ／ｍｌから１ｎｇ／ｍｌ、もしくはより好ましくは０．００１μｇ／ｍｌから１μｇ／ｍｌ、もしくはより好ましくは０．００１ｍｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌ、もしくはより好ましくは０．００１ｇ／ｍｌから１００ｇ／ｍｌの範囲内である。さらに別の実施形態では、特定のキャリアもしくは足場材を有しても有さなくても、通常０．００１ｐｇ／ｋｇから１ｐｇ／ｋｇ、より好ましくは０．００１ｎｇ／ｋｇから１ｎｇ／ｋｇ、もしくはより好ましくは０．００１μｇ／ｋｇから１μｇ／ｋｇ、もしくはより好ましくは０．００１ｍｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇ、もしくはより好ましくは０．００１ｇｍ／ｋｇから１ｇｍ／ｋｇ、さらに好ましくは０．００１ｋｇ／ｋｇから１ｋｇ／ｋｇの範囲内である。さらには、すべての用量は、与えられた時間内につき、連続的にもしくは用量を分割して投与してもよいことを理解されたい。例えば、与えられた時間内とは、１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、１２時間、２４時間、４８時間、もしくは７２時間ごと、もしくは２週間、４週間ごとに、もしくは２ヶ月、４ヶ月ごとなどを含むが、これに限定されるわけではない。
【０１２３】
しかしながら、ＮＥＬＬペプチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの骨芽細胞のアポトーシスに影響を与えられるため（Ｚｈａｎｇ，  Ｘ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ，  ２００３．  １８（１２）：ｐ．２１２６−３４）、最適な範囲を著しく超えたＮＥＬＬの用量（例えば、ＮＥＬＬ１用量）は、軟骨形成もしくは修復を増加することはできない。したがって、ＮＥＬＬペプチドのさらにより好ましい用量は、最適用量を著しく超えてはいけない。ＮＥＬＬペプチドのさらにより好ましい最適用量の範囲は、対象ほ乳類の種類、年齢、場所、および性別；使われるキャリアもしくは足場剤の材料；異なるＮＥＬＬペプチドの純度および効力；などの因子によって変わる。一実施形態では、ＮＥＬＬペプチドのさらにより好ましい最適用量は、１ｎｇ／ｍｍ２から１００ｎｇ／ｍｍ２、より好ましくは１００ｎｇ／ｍｍ２から１０００ｎｇ／ｍｍ２、もしくはより好ましくは１μｇ／ｍｍ２から１００μｇ／ｍｍ２、もしくはより好ましくは１００μｇ／ｍｍ２から１０００μｇ／ｍｍ２、の範囲内であるが、これに限定されない。他の実施形態では、ＮＥＬＬペプチドのさらにより好ましい最適用量は、１ｎｇ／ｍｌから１００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは１００ｎｇ／ｍｌから１０００ｎｇ／ｍｌ、もしくはより好ましくは１μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌ、もしくはより好ましくは１００μｇ／ｍｌから１０００μｇ／ｍｌの範囲内であるが、これに限定されない。さらに別の実施形態では、特定のキャリアもしくは足場剤を有しても有さなくても、ＮＥＬＬペプチドのさらにより好ましい最適用量は、１μｇ／ｋｇから１００μｇ／ｋｇ、より好ましくは１００μｇ／ｋｇから１０００μｇ／ｋｇ、もしくはより好ましくは１ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇの範囲内であるが、これに限定されない。さらには、すべての用量は、与えられた時間内につき、連続的にもしくは用量を分割して投与してもよいことを理解されたい。例えば、与えられた時間内とは、１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、１２時間、２４時間、４８時間、もしくは７２時間ごと、もしくは２週間、４週間ごとに、もしくは２ヶ月、４ヶ月ごとなどを含むが、これに限定されるわけではない。ここで使われている用語「最適範囲を著しく超える」とは、例えば、約１％から約５０％、約５％から約５０％、約１０％から約５０％、約２０％から約５０％、約３０％から約５０％、もしくは約４０％から約５０％、最適範囲を超えることを意味する。
【０１２４】
ＮＥＬＬペプチドの阻害剤の用量は、阻害剤の種類、治療、予防、向上される骨もしくは軟骨の状態、および阻害剤を含有する組成物を与えられる対象ほ乳類の年齢、場所、および性別により変化する。一般的に、ＮＥＬＬペプチドの阻害剤の用量は、特定のキャリアもしくは足場材を有しても有さなくても、通常０．００１ｐｇ／ｍｍ２から１ｐｇ／ｍｍ２、より好ましくは０．００１ｎｇ／ｍｍ２から１ｎｇ／ｍｍ２、もしくはより好ましくは０．００１μｇ／ｍｍ２から１μｇ／ｍｍ２、もしくはより好ましくは０．００１ｍｇ／ｍｍ２から１ｍｇ／ｍｍ２、もしくはより好ましくは０．００１ｇ／ｍｍ２から１ｇ／ｍｍ２の範囲内であるが、これに限定されるわけではない。他の実施形態では、ＮＥＬＬペプチドの阻害剤の用量は、特定のキャリアもしくは足場材を有しても有さなくても、通常０．００１ｐｇ／ｍｌから１ｐｇ／ｍｌ、より好ましくは０．００１ｎｇ／ｍｌから１ｎｇ／ｍｌ、もしくはより好ましくは０．００１μｇ／ｍｌから１μｇ／ｍｌ、もしくはより好ましくは０．００１ｍｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌ、もしくはより好ましくは０．００１ｇ／ｍｌから１００ｇ／ｍｌの範囲内である。さらに他の実施形態では、ＮＥＬＬペプチドの阻害剤の用量は、特定のキャリアもしくは足場材を有しても有さなくても、通常０．００１ｐｇ／ｋｇから１ｐｇ／ｋｇ、より好ましくは０．００１ｎｇ／ｋｇから１ｎｇ／ｋｇ、もしくはより好ましくは０．００１μｇ／ｋｇから１μｇ／ｋｇ、もしくはより好ましくは０．００１ｍｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇ、もしくはより好ましくは０．００１ｇｍ／ｋｇから１ｇｍ／ｋｇ、さらに好ましくは０．００１ｋｇ／ｋｇから１ｋｇ／ｋｇの範囲内である。さらには、すべての用量は、与えられた時間内につき、連続的にもしくは用量を分割して投与してもよいことを理解されたい。例えば、与えられた時間内とは、１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、１２時間、２４時間、４８時間、もしくは７２時間ごと、もしくは２週間、４週間ごとに、もしくは２ヶ月、４ヶ月ごとなどを含むが、これに限定されるわけではない。
【０１２５】
ＮＥＬＬペプチドレセプターの調節剤の用量は、阻害剤の種類、レセプターの種類、治療、予防、および向上される骨もしくは軟骨の状態、およびＮＥＬＬペプチドレセプターの調節剤を有する組成物を与えられる対象ほ乳類の年齢、場所、性別によって変化する。一般的に、ＮＥＬＬペプチドレセプターの調節剤の用量は、特定のキャリアもしくは足場材を有しても有さなくても、通常０．００１ｐｇ／ｍｍ２から１ｐｇ／ｍｍ２、より好ましくは０．００１ｎｇ／ｍｍ２から１ｎｇ／ｍｍ２、もしくはより好ましくは０．００１μｇ／ｍｍ２から１μｇ／ｍｍ２、もしくはより好ましくは０．００１ｍｇ／ｍｍ２から１ｍｇ／ｍｍ２、もしくはより好ましくは０．００１ｇ／ｍｍ２から１ｇ／ｍｍ２の範囲内であるが、これに限定されるわけではない。他の実施形態では、ＮＥＬＬペプチドレセプターの調節剤の用量は、特定のキャリアもしくは足場材を有しても有さなくても、通常０．００１ｐｇ／ｍｌから１ｐｇ／ｍｌ、より好ましくは０．００１ｎｇ／ｍｌから１ｎｇ／ｍｌ、もしくはより好ましくは０．００１μｇ／ｍｌから１μｇ／ｍｌ、もしくはより好ましくは０．００１ｍｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌ、もしくはより好ましくは０．００１ｇ／ｍｌから１００ｇ／ｍｌの範囲内である。さらに別の実施形態では、ＮＥＬＬペプチドレセプターの調節剤の用量は、特定のキャリアもしくは足場材を有しても有さなくても、通常０．００１ｐｇ／ｋｇから１ｐｇ／ｋｇ、より好ましくは０．００１ｎｇ／ｋｇから１ｎｇ／ｋｇ、もしくはより好ましくは０．００１μｇ／ｋｇから１μｇ／ｋｇ、もしくはより好ましくは０．００１ｍｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇ、もしくはより好ましくは０．００１ｇｍ／ｋｇから１ｇｍ／ｋｇ、さらに好ましくは０．００１ｋｇ／ｋｇから１ｋｇ／ｋｇの範囲内である。さらには、すべての用量は、与えられた時間内につき、連続的にもしくは用量を分割して投与してもよいことを理解されたい。例えば、与えられた時間内とは、１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、１２時間、２４時間、４８時間、もしくは７２時間ごと、もしくは２週間、４週間ごとに、もしくは２ヶ月、４ヶ月ごとなどを含むが、これに限定されるわけではない。
【０１２６】
用量形態
用量形態に含まれる作用剤の治療上効果的な量は、選択される作用剤の種類および投与の経路を考慮して選択してもよい。用量形態は、医薬分野の当業者にとっては知られているように、アジュバントを含む不活性物質および患者への用量を促進するための医薬的に許容可能なキャリアと組み合わせた作用剤の用量形態を含んでもよい。
【０１２７】
一実施形態において、本願発明は、軟骨形成もしくは修復を向上する方法であって、軟骨形成もしくは修復のために選択させた間隔において、効果的な用量形態で医薬的に効果的な用量のＮＥＬＬ１ペプチドを投与することを含む、軟骨形成を誘導するための患者を治療する方法を含んでもよい。該方法は、軟骨形成もしくは修復が望まれる領域に少なくとも一つの第二作用剤を投与することをさらに含み、ＴＧＦ−ベータ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、コラーゲン、骨、骨マトリクス、靱帯マトリクス、もしくは腱マトリクス、軟骨形成もしくは骨形成細胞を含むが、これに限定されるわけではない。
【０１２８】
一実施形態において、軟骨形成もしくは修復を誘導するための患者を治療する方法は、ほ乳類の軟骨形成細胞を培養する工程と、軟骨形成細胞と接触しているＮＥＬＬ１ペプチド発現の濃度を上げる工程と、軟骨形成もしくは修復が望まれる領域に軟骨形成細胞を投与する工程と、を含んでもよい。
【実施例】
【０１２９】
以下は、請求された発明を示すための実施例であるが、本願発明はこれに限定されるわけではない。
【０１３０】
軟骨形成を促進するために直接椎間板に注入できる（細胞を有するもしくは有さない）ＮＥＬＬを有する注入可能な装置。椎間板の内側部分（核）もしくは椎間板の内側部分および外側部分の両方を置換できるように設計されたＮＥＬＬを含浸した円板核置換装置。種々の関節空間（例えば、膝、顎関節、手首など）に直接注入可能、または関節鏡もしくは切開により種々の関節空間に移植可能な（細胞を有するもしくは有さない）ＮＥＬＬを有する注入可能な装置。
【０１３１】
実施例２．必須のミネラル化を伴わない軟骨の分化、成熟、および肥大化。
ＮＥＬＬ１過剰発現遺伝子導入マウスは、変異した膜内骨形成もしくは内軟骨骨形成を示すだろうという論理のもとに、ＮＥＬＬ１遺伝子導入過剰発現マウスを作った。本願発明は、ＮＥＬＬ１遺伝子導入マウスのＦ２世代に対してテストした。ＮＥＬＬ１過剰発現マウスの様々な形態からの組織学的検査は、必須のミネラル化を伴わずに軟骨分化、成熟、および肥大化が硝子軟骨領域（図１）、および繊維軟骨領域（図２Ａ―２Ｆ）で増加したことを示した。
【０１３２】
ヤギ関節軟骨は、１ｘ３ｍｍの断片に刻まれ、３０分間室温で０．２５％トリプシン／１ｍＭＥＤＴＡにより分解され、続いて３ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＩＩ（Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ，  ＵＳＡ）により３７Ｃで６時間振りながら分解した。細胞懸濁液は、７０ｍｍストレーナーを通して濾過され、軟骨細胞は遠心分離によりペレット化された。ＰＢＳで洗浄した後、細胞はＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，  ＮＹ，  ＵＳＡ）および１０％ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００ｍｇ／ｌのストレプトマイシンの中で３７℃、５％ＣＯ２で培養された。その後、細胞は、ＡｄＮＥＬＬ１、ＡｄＢＭＰ２もしくはＡｄＬａｃＺで処理／形質導入された。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの形質導入効率を、ベータガラクトシダーゼによる染色で評価した（図３）。細胞は、ヌードマウスの皮下注入／もしくは移植の共通のキャリアとしてプルオロニックＦ１２７（Ｓｉｇｍａ）と混合され、その後、２週目（図６）もしくは４週目（図４、５、７−９）において調べた。
【０１３３】
マイクロＣＴ４０（Ｓｃａｎｃｏ  Ｍｅｄｉｃａｌ，  Ｂａｓｓｅｒｄｏｒｆ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）による９−２０μｍ解析度技術を利用した高解析マイクロコンピューター断層撮影（マイクロＣＴ）が４週目のサンプルに対して行われた。マイクロＣＴデータは、５５ｋＶｐおよび１４５μＡで集められ、Ｓｃａｎｃｏ社によるマイクロＣＴスキャナーに付随してくるコーンビームアルゴリズムを使って再構築された。データの可視化および再構築は、Ｓｃａｎｃｏ  Ｍｅｄｉｃａｌより提供されたμＣＴ  Ｒａｙ  Ｔ３．３およびμＣＴ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｖ５．０を利用して行われた。
【０１３４】
培養されたサンプルは、パラフィンワックスで固定された。マイクロトーム（ＭｃＢａｉｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，  Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，  ＣＡ）を使って６ミクロンの厚さの断片に裁断され、ポリ−Ｌ−リジンコートした顕微鏡スライド（Ｅｒｉｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｐｒｔｓｍｏｕｔｈ，  ＮＨ）の上に置き３７℃で一晩焼いた。サンプルは、ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色した。さらなる分析はアルシアンブルー染色を利用した。断片は、アルシアンブルー溶液で３０分染色され、続いて、３％氷酢酸で洗浄され、その後水で洗浄された。そして、断片は、ヌクレファストレッド溶液で対比染色され、精製水で洗い流された。最後に、断片は、アルコールにより脱水され、ｐｅｒｍｏｕｎｔにマウントする前にキシレンで清浄された（図６および７）。
【０１３５】
６マイクロンの厚さの断片は、キシレンの中でワックスが取り除かれ、エタノール浴の中で再水和された。断面は、抗原を回収するために、２０μｇ／ｍｌプロテアーゼＫにより３７℃で１０分間酵素処理され、そして５％ウマ血清により２時間室温でブロックされた。断面は、一晩４℃において適切な一次抗体で処理され、その後ビオチン化アンチラビットＩｇＧ二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，  ＣＡ）で室温において１時間処理された。陽性免疫反応は、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣ溶液、およびＡＥＣ  ｃｈｒｏｍａｇｅｎ（両方ともＶｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓより）を製造者の指示に従って使うことにより検知した。各抗体のコントロールは、一次抗体を使わずに二次抗体で培養して構成した。断面は、ヘマトキシリンで２時間対比染色し、１０分間流水にさらした。カバースリップとともに水溶性封入剤を使用した。
【０１３６】
本願発明の特定の実施形態を示し記載したが、当業者にとって本願発明の範囲を逸脱することなく変更および改変ができることは当然のことである。従って、本願発明の真の精神内におけるそのような変更および改良の全てを本願発明の範囲内で、添付の特許請求の範囲は、含んでいる。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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