(57)【要約】本発明は、新規な細胞質−遺伝子的雄性不稔（ＣＧＭＳ）大根（Ｒａｐｈａｎｕｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）系統植物体を使用した雑種種子生産方法及び前記大根系統植物体選抜用ＤＮＡ標識因子に関するもので、詳細には、新規なＣＧＭＳ（Ｄ−ＣＧＭＳ）大根系統植物体、それを使用した雑種種子生産方法、配列番号５で表わされる塩基配列を有するＤ−ＣＧＭＳ大根系統植物体選抜用葉緑体ＤＮＡ標識因子及び配列番号１２の１７１番目塩基配列に位置するＤ−ＣＧＭＳ大根系統植物体選抜用ミトコンドリアＤＮＡ基盤ＳＮＰ標識因子に関するもので、本発明のＤ−ＣＧＭＳ大根系統植物体は、雄性不稔安定性が高くて雑種種子を生産するのに非常に有用に使用でき、本発明のＤ−ＣＧＭＳ大根系統植物体選抜用葉緑体ＤＮＡ標識因子及びミトコンドリアＤＮＡ基盤ＳＮＰ標識因子は、育種過程中にＤ−ＣＧＭＳ大根系統植物体を選抜するのに有用に使用できる。
2010523106.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号５で表わされる塩基配列を含み、配列番号１２で表わされる塩基配列の１７１番目に位置する塩基によってＤ−ＣＧＭＳ特異的ＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）を有する新規な細胞質−遺伝子的雄性不稔性（Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ−Ｇｅｎｉｃ  Ｍａｌｅ  Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ；ＣＧＭＳ）Ｄ−ＣＧＭＳ大根（Ｒａｐｈａｎｕｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）系統植物体。
【請求項２】
前記配列番号１２で表わされる塩基配列の１７１番目に位置する塩基が、グアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ）であることを特徴とする、請求項１に記載のＤ−ＣＧＭＳ大根系統植物体。
【請求項３】
前記Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統植物体が、Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統のカルス（寄託番号：ＫＣＴＣ１１１０１ＢＰ）から誘導されることを特徴とする、請求項１に記載のＤ−ＣＧＭＳ大根系統植物体。
【請求項４】
寄託番号ＫＣＴＣ１１１０１ＢＰで示されるＤ−ＣＧＭＳ大根系統のカルス。
【請求項５】
請求項１のＤ−ＣＧＭＳ大根系統植物体を交配母本にして雄性不稔を導入しようとする雄性可稔植物体と交配する工程を含む、細胞質−遺伝子的雄性不稔性を有するＣＧＭＳ大根系統雑種種子の生産方法。
【請求項６】
雄性可稔植物体が、Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統の回復遺伝子を有しない雄性可稔系統から選択されたことを特徴とする、請求項５に記載のＣＧＭＳ大根系統雑種種子の生産方法。
【請求項７】
配列番号５で表わされる塩基配列または前記配列番号５で表わされる塩基配列を含むＤＮＡとストリージェントな条件下で混成化される塩基配列を有するＤ−ＣＧＭＳ大根系統植物体選抜用ＤＮＡ標識因子。
【請求項８】
請求項７のＤＮＡ標識因子を増幅するためのプライマー対。
【請求項９】
プライマー対が、配列番号３及び配列番号４で表わされる塩基配列を有することを特徴とする、請求項８に記載のプライマー対。
【請求項１０】
配列番号１２で表わされる塩基配列から選択され、前記塩基配列の１７１番目の塩基を含む１５ないし２２５個の連続する塩基配列またはそれに相補的な塩基配列で構成されたオリゴヌクレオチドを有する、Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統植物体選抜用ＳＮＰ標識因子。
【請求項１１】
前記配列番号１２で表わされる塩基配列の１７１番目に位置する塩基が、グアニンであることを特徴とする、請求項１０に記載のＤ−ＣＧＭＳ大根系統植物体選抜用ＳＮＰ標識因子。
【請求項１２】
請求項１０のＳＮＰ標識因子を増幅するためのプライマー対。
【請求項１３】
プライマー対が、配列番号１５及び配列番号１６で表わされる塩基配列を有することを特徴とする、請求項１２に記載のプライマー対。
【請求項１４】
請求項７の塩基配列または、請求項１０のオリゴヌクレオチドを検出することができるプライマー対またはプローブを含む、Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統植物体の選抜キット。
【請求項１５】
前記プライマー対が、配列番号３及び配列番号４で表わされるプライマー対、または配列番号１５及び配列番号１６で表わされるプライマー対であることを特徴とする、請求項１４に記載の選抜キット。
【請求項１６】
１）鑑別しようとする植物のＤＮＡ試料を抽出する工程；
２）工程１）のＤＮＡ試料を請求項８のプライマー対または請求項１２のプライマー対を使用してＰＣＲで増幅する工程；及び
３）工程２）の増幅された産物を電気泳動して請求項７のＤＮＡ標識因子または請求項１０のＳＮＰ標識因子が検出されるかどうかを確認する工程とを含む、Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統植物体の選抜方法。
【請求項１７】
１）鑑別しようとする植物のＤＮＡ試料を抽出する工程；
２）工程１）のＤＮＡ試料を請求項１４のキットを使用して増幅する工程；及び
３）工程２）の増幅された産物を電気泳動して請求項７のＤＮＡ標識因子または請求項１０のＳＮＰ標識因子が検出されるかどうかを確認する工程とを含む、Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統植物体の選抜方法。
【請求項１８】
請求項７のＤＮＡ標識因子または請求項１０のＳＮＰ標識因子をＤ−ＣＧＭＳ大根系統植物体の選抜に使用する用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な細胞質−遺伝子的雄性不稔（Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ−Ｇｅｎｉｃ  Ｍａｌｅ  Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ：ＣＧＭＳ）大根（Ｒａｐｈａｎｕｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）系統植物体を使用した雑種種子生産方法及び前記大根系統植物体選抜用ＤＮＡ標識因子に関するもので、より詳細には、新規なＣＧＭＳ（Ｄ−ＣＧＭＳ）大根系統植物体、これを使用した雑種種子を生産する方法、配列番号５記載の塩基配列を有するＤ−ＣＧＭＳ大根系統植物体選抜用葉緑体ＤＮＡ標識因子及び配列番号１２の１７１番目塩基配列に位置するＤ−ＣＧＭＳ大根系統植物体選抜用ミトコンドリアＤＮＡ基盤ＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）標識因子に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
植物において雑種強勢現象を使用した１代雑種品種育成は、ずいぶん以前から継続されている。現在、市販される野菜種子の大部分がＦ１雑種種子である。Ｆ１雑種種子採種方法としては、人工交配、自家不和合成、雌雄株、雄性不稔性、種間交雑などがあるが、雄性不稔性を使用する方法を除き、時間、努力、均一度及び経済性において難しい問題が多いので、多くの作物で雄性不稔資源を開発して育種に使用するための研究が継続されている。
【０００３】
大根では、自家不和合成を用いたＦ１雑種の採種が一般化されている。しかし、自家不和合成を使用する場合には自殖体を減らすのに限界がある。たとえ自家不和合成がよく固定された両親系を使用しても老花受粉によって若干の自殖体が混じって出るからである。Ｆ１雑種品種に自殖体が混じると種子の純度が下がり、ひどい場合には消費者から補償要求がだされるようになり、種子紛糾の原因になり得る。
【０００４】
雄性不稔性というのは、花粉、葯、雄しべなどの雄性器官に異常が生じて不稔が生じる現象で、多くの種類の植物でこのような現象が起きている。これは、主に自然突然変異、種属間雑種または突然変異有機剤処理などによって人為的または自然的に発生している。雄性不稔の原因には、遺伝的な原因によるものと環境的な原因によるものがあるが、大部分育種に使用される雄性不稔系統は、遺伝的な原因による雄性不稔系統である。このような遺伝的な原因による雄性不稔は、３種の型に分けることができ、核遺伝子的雄性不稔性（ＧＭＳ）、細胞質的雄性不稔性（ＣＭＳ）及び細胞質−遺伝子的雄性不稔性（ＣＧＭＳ）に分けられる。ＣＭＳとＣＧＭＳは、細胞質内ミトコンドリア異常によるもので、稔性遺伝子の存在の有無によって、ＣＭＳとＣＧＭＳを分けたりする（Ｒｕｎｄｆｅｌｄｔ，Ｊ．，Ｐｆｌａｎｚｅｎｚｕｃｈｔｕｎｇ，１９６０年，第４４巻，３０−６２頁；Ｓｈｉｖａｎｎａ，Ｋ．Ｒ．ａｎｄ  Ｂ．Ｍ．Ｊｏｈｒｉ．，Ｐｏｌｌｅｎ  ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ，ｉｎ  ｔｈｅ  ａｎｇｉｏｓｐｅｒｍ  ｐｏｌｌｅｎ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．１９８５年．Ｗｉｌｅｙ  Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｌｔｄ．Ｎｅｗ  Ｄｅｌｈｉ）。
【０００５】
核遺伝子的雄性不稔性（ＧＭＳ）は、主に劣性遺伝をして劣性同型の場合に不稔性が示され、これを使用してＦ１雑種種子を生産する場合、採種圃で５０％だけの不稔株を得ることができる。したがって雄性不稔系の維持及び増殖のためには、各個体を開化させて花粉生成有無を確認しなければならない過程が必要であるため多くの努力と費用が発生する。一方、細胞質的雄性不稔（ＣＭＳ）及び細胞質−遺伝子的雄性不稔（ＣＧＭＳ）は、細胞質内ミトコンドリアに異常が生じて非正常的な花粉を生成することによって、自己受精能力を喪失することであるので、母系遺伝をする特徴を有する。
【０００６】
ＣＭＳの場合には、稔性回復遺伝子がないのでどの可稔系を交配しても１００％不稔株が出るので雄性不稔系維持が易しいという長所があるが、菜の花のように種子産物を使用する植物体では、雄性不稔回復機序がなく種子を形成することができないので商業的に使用することができず、葉菜類及び根菜類に限ってのみ使用が可能である。一方、ＣＧＭＳは、雄性不稔を回復する遺伝子を持たない雄性可稔系を交配する時は、１００％雄性不稔株が出て、回復遺伝子を同型接合体形態で有している可稔系と交配する時は、１００％雄性可稔株が出る。したがって、葉菜類及び根菜類のＦ１種子生産においてＣＧＭＳの維持及び増殖は、回復遺伝子を持たない系統との交配を通じて行われる。また、菜の花のように種子産物を使用する植物体のＦ１雑種種子生産においては、原形質体融合や種間交雑を通じてＣＧＭＳ雄性不稔性を導入して回復遺伝子を有する植物体を製作後、それを使用してＦ１雑種種子を生産するのに活用する。このような種子産物を使用する植物体のＦ１雑種種子生産方法は、雄性不稔回復機序を有するＣＧＭＳ系統だけが可能で、雄性不稔回復機序がないＣＭＳ系統植物体では不可能である。
【０００７】
現在まで知られた大根の雄性不稔系統の中には、ＮＷＢ−ＣＭＳ（Ｒａｐｈａｎｕｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  ｖａｒ  ＮＷＢ）、オグラ−ＣＧＭＳ（Ｒａｐｈａｎｕｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  ｖａｒ  Ｏｇｕｒａ）及びコセナ−ＣＧＭＳ（Ｒａｐｈａｎｕｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  ｃｖ  Ｋｏｓｅｎａ）などがある。この中でＮＷＢ−ＣＭＳは、雄性不稔を回復させる遺伝資源が明かされない純粋細胞質因子によって雄性不稔性が惹起されることが知られている（大韓民国特許登録第０３９９３３３号，Ｎａｈｍ等，Ｔｈｅｏｒ．ＡｐｐＬ．Ｇｅｎｅｔ．２００５年，第１１１巻，１１９１−１２００頁）。一方、オグラ−ＣＧＭＳ及びコセナ−ＣＧＭＳは、完全な細胞質因子によって雄性不稔が惹起されるのではなく、核内因子によっても雄性不稔性が影響を受ける細胞質−遺伝子的雄性不稔性であると知られている。
【０００８】
オグラ−ＣＧＭＳ及びコセナ−ＣＧＭＳは、細胞質内のミトコンドリアに新しいＯＲＦ生成で雄性不稔を惹起させることが知られている。またこれらは、核内に雄性不稔性を回復させる回復遺伝子が存在すると知られている（Ｄｅｓｌｏｉｒｅ  Ｓ．等，ＥＭＢＯ  ｒｅｐｏｒｔ，２０３年，第４巻，５８８−５９４頁）。特に、オグラ−ＣＧＭＳ及びコセナ−ＣＧＭＳは、雄性不稔遺伝子及び回復遺伝子の特徴がほとんど類似であることが既存に報告されていて、雄性不稔回復機序もほとんど類似であると報告され（Ｋｏｉｚｕｋａ等，Ｔｈｅｏｒ．ＡｐｐＬ．Ｇｅｎｅｔ．２０００年，第１００巻，９４９−９５５頁；Ｋｏｉｚｕｋａ等，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，２００３年，第３４案，４０７−４１５頁；Ｋｏｉｚｕｋａ  Ｎ，等，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，２００３年，第３４巻，４０７−４１５頁；Ｋｏｉｚｕｋａ  Ｎ，等，Ｔｈｅｏｒ．ＡｐｐＬ．Ｇｅｎｅｔ．２０００年，第１００巻，９４９−９５５頁）。オグラ−ＣＧＭＳは、比較的安定的な雄性不稔導入率によって大根Ｆ１雑種種子生産に多く使用されていて、雄性不稔回復機序が存在するので菜の花等のように種子産物を使用する植物体に、オグラ−ＣＧＭＳの雄性不稔性を導入してＦ１雑種種子を生産する方法が広く使用されている。オグラ−ＣＧＭＳは、このような長所のため最も広く使用される雄性不稔資源であるが、維持系統が稀であるため多様な維持系統確保に困難がある。したがって雄性不稔回復遺伝子が存在しながらも維持系統確保が容易で雄性不稔導入率が高い雄性不稔資源の開発が必要で、このような資源は、大根Ｆ１雑種種子生産に効果的に使用され得るだけでなく、菜の花のように種子産物を使用する植物体に雄性不稔性を導入させることができる資源として使用することができる。
【０００９】
慣行的育種では、所望する形質の系統を選抜するために形態学的マーカーを使用してきたが、このような方法は、その数において非常に制限的で環境的な要因が作用するので不確実であるという短所がある。したがって最近は、目的形質と関連しているＤＮＡマーカーを使用して育種に使用する分子育種に対する研究が活発に進行されている。このようなＤＮＡマーカーの使用は、育種初期世代に選抜可能性、環境影響排除及び量的形質分析などができるようにし、育種において非常に有用である。実際に多くの作物でこのようなＤＮＡマーカー開発が活発に行なわれていて、育種の新しい技術として選抜効率を増大させている。雄性不稔判別用ＤＮＡマーカーは、大部分遺伝子的変異が比較的大きいミトコンドリアＤＮＡを基にする分子マーカーである。しかし、ミトコンドリアは、小さなリピート塩基配列を媒介に使用した頻繁な遺伝体組換え及び再配列によって同じ塩基配列を有する遺伝子であると言っても、さまざまな形態のサブゲノムＤＮＡで存在する複雑な構造を有している（Ｍ．Ｂｅｌｌａｏｕｉ等，ＭｏＬ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９８年，第２５７巻，１７７−１８５頁；Ｍ．Ａｒｒｉｅｔａ−Ｍｏｎｔｉｅｌ等，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００１年，第１５８（２）巻，８５１−８６４頁）。またミトコンドリア遺伝体は、量的な差を示すさまざまな遺伝子構造が混在するので、ＤＮＡマーカー開発時に遺伝体の量的差によって雄性不稔株及び可稔株に差異が出るのかどうかに対する実験が必要である。
【００１０】
しかし、葉緑体ＤＮＡは、遺伝子的変異が少なくて安定的な遺伝をすることが知られていて特定遺伝子構造の量的な差がない。したがって、葉緑体ＤＮＡを基にした雄性不稔判別用分子マーカーの開発は、より安定的で正確な雄性不稔判別を可能にできる（Ｍ．Ｊ．Ｈａｖｅｙ等，Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ．１９９５年，第９０巻，２６３−２６８頁；Ｔ．Ｍｏｔｅｇｉ等，Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ，２００３年，第１２９巻，３１９−３２３頁）。
【００１１】
植物育種において分子マーカーの有用性は、すでに検証されたが、既存の分子マーカーより経済的で、大容量で迅速に試料を検証することができる分子マーカーの開発が持続的に研究されている。分子マーカー技術が発達するにつれて、ＲＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、ＲＡＰＤ（Ｒａｎｄｏｍ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ＤＮＡ）及びＡＦＬＰ（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）など多様な形態の分子マーカーが開発されたが、このような分子マーカーは、比較的費用が多くかかり、大量に試料を分析するには多くの限界がある。したがって、最近は、より経済的で大量分析が可能なＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｐｅａｔ）及びＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）マーカーの開発が活発に行なわれている。特に、ＳＮＰマーカーの場合には、蛍光技法及び毛細管式電気泳動法の発達で、試料検出を自動化することができて大量に分析することができるので、育種において効率的に使用することができるという長所がある。
【００１２】
それで、本発明者等は、新規な雄性不稔資源を開発するために資源を収集した後、従来から知られたＮＷＢ−ＣＭＳ及びＣＧＭＳ（オグラ及びコセナ）とは異なる雄性不稔機序を有したＣＧＭＳ（Ｄ−ＣＧＭＳ）大根系統植物体を選抜して、その特性を解明し、前記Ｄ−ＣＧＭＳの雄性不稔導入率が、既存のオグラ−ＣＧＭＳより高くて維持親系統確保が容易であることを確認し、さらに前記Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統植物体の選抜のための安定的な葉緑体ＤＮＡ基盤のＤＮＡ分子マーカー及びミトコンドリアＤＮＡ基盤のＳＮＰ分子マーカーを開発することによって本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、新規な細胞質−遺伝子的雄性不稔（ＣＧＭＳ）大根（Ｒａｐｈａｎｕｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）系統の植物体、それを使用した雑種種子を生産する方法及び前記大根系統植物体選抜用ＤＮＡ標識因子を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
前記目的を達成するために、本発明は、配列番号５で表わされる塩基配列を含み、配列番号１２で表わされる塩基配列の１７１番目に位置する塩基によってＤ−ＣＧＭＳ特異的ＳＮＰを有する新規な細胞質−遺伝子的雄性不稔性Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統植物体を提供する。
【００１５】
また、本発明は、寄託番号ＫＣＴＣ１１１０１ＢＰで示されるＤ−ＣＧＭＳ大根系統のカルスを提供する。
【００１６】
また、本発明は、前記Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統植物体を交配母本にして雄性不稔を導入しようとする雄性可稔植物体と交配させる工程を含む、細胞質−遺伝子的雄性不稔性を有するＣＧＭＳ大根系統雑種種子の生産方法を提供する。
【００１７】
また、本発明は、配列番号５で表わされる塩基配列または前記配列番号５で表わされる塩基配列を含むＤＮＡとストリージェントな条件下で混成化される塩基配列を有するＤ−ＣＧＭＳ大根系統植物体選抜用ＤＮＡ標識因子を提供する。
【００１８】
また、本発明は、配列番号１２で表わされる塩基配列から選択され、前記塩基配列の１７１番目の塩基を含む１５ないし２２５個の連続する塩基配列またはそれに相補的な塩基配列で構成されたオリゴヌクレオチドを有するＤ−ＣＧＭＳ大根系統植物体選抜用ＳＮＰ標識因子提供する。
【００１９】
また、本発明は、前記ＤＮＡ標識因子の塩基配列またはＳＮＰ標識因子のオリゴヌクレオチドを検出することができるプライマー対またはプローブを含むＤ−ＣＧＭＳ大根系統植物体の選抜キットを提供する。
【００２０】
また、本発明は、
１）鑑別しようとする植物のＤＮＡ試料を抽出する工程；
２）工程１）のＤＮＡ試料を前記ＤＮＡ標識因子またはＳＮＰ標識因子を増幅するためのプライマー対を使用してＰＣＲで増幅する工程；及び
３）工程２）の増幅された産物を電気泳動して前記ＤＮＡ標識因子またはＳＮＰ標識因子が検出されるかどうかを確認する工程とを含む、Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統植物体の選抜方法を提供する。
【００２１】
また、本発明は、
１）鑑別しようとする植物のＤＮＡ試料を抽出する工程；
２）工程１）のＤＮＡ試料を前記Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統植物体の選抜キットを使用して増幅する工程；及び
３）工程２）の増幅された産物を電気泳動して前記ＤＮＡ標識因子またはＳＮＰ標識因子が検出されるかどうかを確認する工程とを含む、Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統植物体の選抜方法を提供する。
【００２２】
同時に、本発明は、前記ＤＮＡ標識因子またはＳＮＰ標識因子をＤ−ＣＧＭＳ大根系統植物体の選抜に使用する用途を提供する。
【００２３】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００２４】
本発明で「Ｄ−ＣＧＭＳ（Ｒａｐｈａｎｕｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  ｖａｒ  Ｄ−ＣＧＭＳ）大根系統」というのは、本発明で分離・同定した大根系統であり、従来のＣＧＭＳとは異なる新しい遺伝子型のＣＧＭＳを有する大根系統を意味する。
【００２５】
また、本発明で「植物体」は、植物器官、植物組織、実物細胞、種子及びカルスを含む。
【００２６】
本発明は、配列番号５で表わされる塩基配列を含み、配列番号１２で表わされる塩基配列の１７１番目に位置する塩基によってＤ−ＣＧＭＳ特異的ＳＮＰを有する新規な細胞質−遺伝子的雄性不稔性Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統植物体を提供する。
【００２７】
本発明者等は、Ｆ１雑種種子の生産性向上のために新規な細胞質−遺伝子的雄性不稔性を有する大根系統を開発するために、農村進興庁園芸研究所から分譲を受けた大根系統（ウズベキスタン等の地で収集された２０余種の大根系統）を対象に花器組織及び花粉発達の程度を調査した。その結果、一つの系統から花粉発達が阻害された雄性不稔性が発見され、これを「Ｄ−ＣＧＭＳ（Ｒａｐｈａｎｕｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  ｖａｒ  Ｄ−ＣＧＭＳ）」と命名した。新規に発見されたＣＧＭＳ（Ｄ−ＣＧＭＳ）大根系統は、正常可稔個体よりは花粉が少なく、従来の雑種種子生産に主に使用されて花粉が全くないオグラ（Ｏｇｕｒａ）−ＣＧＭＳとは異なり、少量の不稔花粉が生成される（図１参照）。
【００２８】
また、電子顕微鏡（ＳＥＭ）観察及びＦＤＡ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｄｉａｃｅｔａｔｅ）染色を通じてＤ−ＣＧＭＳ花粉の模様及び花粉の活力を調査した結果、Ｄ−ＣＧＭＳの花粉は少ない量で生成されて、模様が極めて非正常的で活力がないことが分かった（図２参照）。このような表現型は、既存に報告されたオグラ−ＣＧＭＳとは異なる形態であり、昆虫媒介集団交配時、花器が正常個体に似ているので昆虫を誘引するのに効率性を高めることができる。
【００２９】
さらに、本発明者等は、より正確な雄性不稔機序を調査するために細胞組織学的観察を実施した結果、正常可稔個体は、花粉が正常に発達する一方、オグラ−ＣＧＭＳ大根系統では、花粉形成過程のテトラド（Ｔｅｔｒａｄ）発達工程から異常が生じるが、Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統植物体ではテトラド発達工程では正常個体と類似であるが、小胞子発達工程で異常が生じて、結果的に花粉が非正常的に発達する雄性不稔機序を有することが分かった（図３参照）。
【００３０】
また、Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統の花粉を正常可稔個体を母本にして交配すると、全く種子が生成されない表現型を示すので、花粉の活力が全くない雄性不稔系統であることが確実であることが分かった。しかし、Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統を母本にして他の花粉と交配すると、種子が正常に生成される（表１参照）。これは、雌性器官には全く異常がなく、単に花粉の発達に異常が生じて雄性不稔性を有することを明確に確認した結果である。ゆえに、Ｄ−ＣＧＭＳを交配母本に使用すると、人工交配で花粉を除去する除雄をする必要がないので、本発明のＤ−ＣＧＭＳは、雑種種子の改良及び雑種強勢育種法でＦ１採種に効率的に使用できる。
【００３１】
前記Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統は、既存のオグラ−ＣＧＭＳとは雄性不稔機序から確実な差があり、雌性器官には異常がなく花粉の非正常的な発達による雄性不稔性を有し、花器の模様が正常可稔個体に似ていながらも花粉の活力が全くないので、Ｆ１雑種種子生産で昆虫媒介集団交配時に昆虫を誘引するのに有用に使用することができる。
【００３２】
また、本発明は、寄託番号ＫＣＴＣ１１１０１ＢＰで示されるＤ−ＣＧＭＳ大根系統のカルスを提供する。
【００３３】
また、本発明は、前記Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統植物体を交配母本にして雄性不稔を導入しようとする雄性可稔植物体と交配する工程を含む細胞質−遺伝子的雄性不稔性を有するＣＧＭＳ大根系統雑種種子の生産方法を提供する。
【００３４】
本発明のＤ−ＣＧＭＳ大根系統の細胞質−遺伝子的雄性不稔性を導入しようとする雄性可稔植物体と交配をさせることで、細胞質−遺伝子的雄性不稔を導入したＦ１種子を生産することができた。また、Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統の細胞質−遺伝子的雄性不稔性導入能力をオグラ−ＣＧＭＳ大根系統と比較するために、同一雄性可稔植物体をＤ−ＣＧＭＳとオグラ−ＣＧＭＳを母本にしてそれぞれ交配を実施した。その結果、育種時の雄性不稔性導入率は、既存のオグラ−ＣＧＭＳより非常に高かったし、Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統の維持親育成がより容易であることを確認した。特に、オグラ−ＣＧＭＳ大根系統の回復遺伝子を有する系統とＤ−ＣＧＭＳ大根系統との交配で生産されたＦ１雑種種子が１００％雄性不稔株が出た。これは、雄性不稔性を回復させる回復遺伝子が既存のオグラ−ＣＧＭＳ大根系統とは全く異なったものであることを意味する。結果的に、Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統の細胞質−遺伝子的雄性不稔性を使用したＦ１種子生産方法は、既存のオグラ−ＣＧＭＳ大根系統より雄性不稔性導入率が非常に高くて、Ｆ１雑種種子生産時により広範囲に交配母本として使用できることを確認した（表２参照）。
【００３５】
また、Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統の回復遺伝子の存在有無を確認するために、Ｄ−ＣＧＭＳを母本にしてウズベキスタン及びロシアで収集した１０系統と交配をした。その結果、そのうち「ＤＢ１１２系統」及び「ＤＢ１１７系統」との交配で生産されたＦ１雑種種子から可稔株が出たことを確認した。これは、「ＤＢ１１２系統」及び「ＤＢ１１７系統」がＤ−ＣＧＭＳ大根系統の回復遺伝子を有しているということを意味する。したがって、新規なＤ−ＣＧＭＳ大根系統は、回復遺伝子が存在する細胞質−遺伝子的雄性不稔性（Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ−Ｇｅｎｉｃ  Ｍａｌｅ  Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ；ＣＧＭＳ）大根系統であることを確認した（表３参照）。
【００３６】
結果的に、Ｄ−ＣＧＭＳは、回復遺伝子が存在する細胞質−遺伝子的雄性不稔性（ＣＧＭＳ）大根系統であることを確認し、交配育種時の雄性不稔性導入率の面で、既存のオグラ−ＣＧＭＳよりＤ−ＣＧＭＳが非常に優れていて、これは多くの育種系統において既存のオグラ−ＣＧＭＳ雄性不稔性を導入させることができないという既存の短所を補うことができる。前記Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統の植物体を使用して、雄性不稔性を導入しようとする正常可稔個体と交配をさせることで、Ｆ１雑種種子を生産することができる。本発明の方法は、Ｄ−ＣＧＭＳ回復遺伝子を持たないすべての雄性可稔系統に適用することができ、前記雄性可稔系統には、サミャン大根（系統名：Ｒ０１２）、ソンゴン大根（Ｒ０１５）、正常夏大根（Ｒ０２０）、ハチュ大根（Ｒ０２９）、正常夏大根分離系統（ＤＢ００２）、ハンノン夏大根（ＤＢ００３）、ハンノン夏大根分離系統（ＤＢ１１１）、デブリョン夏大根（ＤＢ０８４）、ハッチュ分離系統（ＤＢ０９２）、及び海外収集資源であるＤＢ０１９、ＤＢ４２１、ＤＢ０３７、ＤＢ０６７、ＤＢ１２１、ＤＢ２６１、ＤＢ３２１、ＤＢ４０１、ＤＢ５０１及びＤＢ９０１であることが好ましいが、これに限定されない。
【００３７】
本発明者等は、Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統の種子を分化させてカルスを誘導し、誘導されたＤ−ＣＧＭＳ大根系統のカルスを２００７年３月２７日付けで韓国生命工学研究院遺伝子銀行に寄託した（寄託番号：ＫＣＴＣ１１１０１ＢＰ）。
【００３８】
また、本発明は、配列番号５で表わされる塩基配列または配列番号５で表わされる塩基配列を含むＤＮＡとストリージェントな条件下で混成化される塩基配列を有するＤ−ＣＧＭＳ大根系統植物体選抜用ＤＮＡ標識因子を提供する。
【００３９】
前記で見たように、Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統は、従来のオグラ−ＣＧＭＳ大根系統とは全く異なった雄性不稔系統であり、これを使用すると、効果的にＦ１雑種種子を生産することができるので、本発明者等は、安定的な葉緑体遺伝体を基盤にしたＤ−ＣＧＭＳ大根系統植物体を選抜することができるＤＮＡ分子マーカーを開発した。
【００４０】
十字花科の白菜（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ  ｓｓｐ．ｐｅｋｉｎｅｎｓｉｓ）のＧｅｎＢａｎｋに登録された葉緑体塩基配列（ＤＱ２３１５４８）情報を基盤にして、比較的種間保存的な部分で２０個の葉緑体基盤プライマー対を製作して正常可稔系統、オグラ−ＣＧＭＳ大根系統及びＤ−ＣＧＭＳ大根系統のＰＣＲを行なった。この過程から正常可稔系統が互いに異なる葉緑体塩基配列を有する二つの系統に分類されるということを確認し、これを「ＤＢＲＭＦ１」及び「ＤＢＲＭＦ２」と命名した。このような結果は、既存に報告されたミトコンドリア塩基配列を基盤に、正常可稔大根系統を二つの系統に分類することができるという報告と一致する結果だった（Ｋｉｍ等，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．２００７年，第１１５巻，１１３７−１１４５頁）。
【００４１】
結果的に、配列番号１（５’−ＡＧＧＧＣＧＧＴＧＣＴＣＴＧＡＣＣＡＡＴＴＧＡＡＣＴＡ−３’）で表わされる順方向プライマー及び配列番号２（５’−ＧＡＧＣＧＧＴＴＡＡＴＧＧＧＧＡＣＧＧＡＣＴＧＴＡＡＡ−３’）で表わされる逆方向プライマーを使用してＰＣＲを行なった産物が、Ｄ−ＣＧＭＳで差異を示した（図４参照）。これは、他の個体とは異なりＤ−ＣＧＭＳでは、「ＡＴＡＴＡＴＴＧＡＴＡＴＣＴＡＴＡ」の塩基配列が一度反覆された遺伝因子型だった。このようなＤ−ＣＧＭＳ大根系統の選抜を容易にするために、配列番号３（５’−ＧＣＧＧＧＴＡＧＣＴＴＡＣＡＴＡＴＴＣＣＴＴＣＴＴＡＴＧ−３’）で表わされる順方向プライマー及び配列番号４（５’−ＣＧＧＣＣＴＴＧＣＴＡＴＣＡＣＴＡＡＡＧＴＧＡＴＡＴＣ−３’）で表わされる逆方向プライマーを製作して、ＰＣＲを行なって塩基配列を再確認した。その結果、正常可稔系統、オグラ−ＣＧＭＳ系統及びＤ−ＣＧＭＳ系統の中で、Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統でのみ１５６ｂｐのＰＣＲ増幅産物が確認され（図５参照）、本発明では、この塩基配列を配列番号５（５’−ＧＣＧＧＧＴＡＧＣＴＴＡＣＡＴＡＴＴＣＣＴＴＣＴＴＡＴＧＡＴＴＴＡＡＴＣＴＴＡＡＴＣＡＴＴＴＡＡＡＴＴＴＴＡＧＡＴＴＣＡＡＡＴＴＡＧＴＧＴＴＴＴＧＴＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＴＣＡＣＡＡＧＴＡＡＴＡＴＡＴＴＧＡＴＡＴＣＴＡＴＡＡＴＡＴＡＴＴＧＡＴＡＴＣＴＡＴＡＴＧＧＡＴＡＴＣＡＣＴＴＴＡＧＴＧＡＴＡＧＣＡＡＧＧＣＣ−３’）で表わした。
【００４２】
しかし、本発明のＤ−ＣＧＭＳ特異的なＤＮＡ分子マーカー増幅のためのプライマーは、配列番号５で表わされるＤＮＡ標識因子のみを増幅させるものは、すべて使用可能で、配列番号３及び配列番号４で表わされるものを使用することが、より好ましいが、これに限定されるのではない。
【００４３】
また、本発明のＤＮＡ標識因子は、配列番号５で表わした塩基配列を含むＤＮＡとストリージェントな条件下で混成化される塩基配列なら好ましく、配列番号５で表わされる塩基配列が最も好ましい。ストリージェントな条件は、混成化後の洗浄時に決定される。ストリージェントな条件の一つは、常温で６×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳで１５分洗浄した後、４５℃で２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳで３０分間の洗浄して、５０℃で２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳで３０分間の洗浄を二度反覆する。当業者なら必要なストリージェントな条件を得るために、このような条件を明白に設定することができる。
【００４４】
本発明のＤＮＡ分子マーカーが、Ｄ−ＣＧＭＳ特異的な選抜が可能なのかどうかを確認するために、従来から知られた市販３０品種を対象に配列番号３記載の順方向プライマー及び配列番号４記載の逆方向プライマーを使用して、ＰＣＲを行なった。その結果、Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統でのみ、１５６ｂｐの増幅産物が確認され（図６参照）、これを通じてＤ−ＣＧＭＳ大根系統を選抜することができることを再度確認した。
【００４５】
したがって、本発明のＤ−ＣＧＭＳ大根系統を選抜することができる安定的な葉緑体基盤ＤＮＡ標識因子は、Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統選抜及び新品種開発に非常に有用に使用することができる。
【００４６】
また、本発明は、配列番号１２で表わされる塩基配列から選択されて、前記塩基配列の１７１番目の塩基を含む１５ないし２２５個の連続する塩基配列またはそれに相補的な塩基配列で構成されたオリゴヌクレオチドを有するＤ−ＣＧＭＳ大根系統植物体選抜用ＳＮＰ標識因子提供する。
【００４７】
前記配列番号１２で表わされる塩基配列の１７１番目塩基は、グアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ）１ｂｐが挿入されることが好ましいが、これに限定されない。
【００４８】
本発明者等は、より経済的で大容量で迅速に試料を検証することができるＤ−ＣＧＭＳ大根系統特異的なＳＮＰ標識因子を開発した。
【００４９】
大根（Ｒａｐｈａｎｕｓ  ｓａｔｉｖｕｓ）のａｔｐ６遺伝子塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ；Ｍ２４６７１）を基礎に、ａｔｐ６  ＯＲＦ遺伝子の５’−方向で配列番号６（５’−ＡＡＴＣＡＡＡＴＡＧＧＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＣＡＧＴ−３’）で表わされる１次順方向プライマーと配列番号７（５’−ＣＧＣＡＧＴＣＣＣＣＡＣＴＴＧＡＣＣＡＡＴＴＴＧＡ−３’）で表わされる２次順方向プライマーを製作して、３’−ゲノムウォーキングを実施した。その結果、配列番号ＴＡＴＧＧＴＴＴＧＴＡＴＴ−３’）で表わされる塩基配列を得ることができ、図７に示したように正常なａｔｐ６遺伝子の３’−部分が欠失されて新しい塩基配列が組換えられている新しいａｔｐ６遺伝子型を発見した。また、正常なａｔｐ６遺伝子のＯＲＦ部分でも、既存に知られた大根のａｔｐ６遺伝子と比較時、１個の塩基が挿入されている特徴を示した（図７参照）。
【００５０】
また、本発明者等は、新規なａｔｐ６遺伝子型の５’−方向の塩基配列を確認するために、配列番号８で表わされた塩基配列を基に、配列番号９（５’−ＴＡＧＣＣＡＴＴＴＧＧＴＧＴＧＡＣＣＴＣＴＧＡＣＣＧ−３’）の１次逆方向プライマーと配列番号１０（５’−ＴＡＡＣＣＧＧＣＣＴＣＡＡＣＣＡＴＧＧＴＣＴＡＧＣ−３’）の２次逆方向プライマーを製作して、５’−ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡＥｎｄｓ）ＰＣＲを行なった。その結果、配列番号１１（５’−ＧＧＡＧＴＧＡＴＣＴＴＴＣＴＣＧＡＡＡＴＧＡＡＴＴＡＡＧＴＡＡＧＧＧＣＧＣＴＡＴＧＴＴＣＡＧＡＴＴＣＴＧＡＡＣＣＡＡＡＧＣＡＣＴＡＧＴＴＧＡＧＧＴＣＴＧＡＡＡＧＣＣＴＴＡＴＧＡＧＣＡＧＡＡＧＴＡＡＴＡＡＡＴＡＣＣＴＣＧＧＧＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧＧＧＴＡＧＡＧＧＡＡＴＴＧＧＴＣＡＡＣＴＣＡＴＣＡＧＧＣＴＣＡＴＧＡＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＡＣＡＧＧＴＴＣＧＡＡＴＣＣＴＧＴＣＣＣＣＧＣＡＣＴＡＡＧＴＡＡＧＧＧＴＴＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＴＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＧＴＣＧＴＴＣＴＣＧＡＣＣＴＣＧＣＡＡＧＧＴＴＴＴＴＧＡＡＧＣＧＧＣＣＧＡＡＧＣＧＧＧＡＡＧＴＧＡＣＡＡＴＡＣＣＧＣＴＴＴＴＣＴＴＣＡＧＣＡＣＡＴＴＴＴＧＧＡＴＧＡＴＴＴＧＡＧＣＧＡＡＡＡＣＧＧＡＧＴＡＣＡＡＡＧＴＴＣＡＧＣＣＴＴＴＡＡＧＧＡＧＧＣＴＡＴＧＡＡＴＣＡＡＡＴＡＧＧＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＣＡＧＴＣＣＣＣＡＣＴＴＧＡＣＣＡＡＴＴＴＧＡＧＡＴＴＧＴＣＣＣＡＴＴＧＡＴＴＣＣＴＡＴＧＡＡＴＡＴＣＧＧＡＡＡＣＴＴＣＴＡＴＴＴＣＴＣＡＴＴＣＡＣＡＡＡＴＣＣＡＴＣＴＴＴＧＴＴＣＡＴＧＣＴＧＣＴＡＡＣＴＣＴＧＡＧＴＴＴＴＴＴＣＣＴＡＣＴＴＣＴＧＡＴＴＣＡＴＴＴＴＡＴＴＡＣＴＡＡＡＡＡＧＧＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＡＣＴＴＡＧＴＣＣＣＡＡＡＴＧＣＴＴＧＧＣＡＡＴＣＣＴＴＧＧＴＡＧＡＧＣＴＴＣＴＴＴＡＴＧＡＴＴＴＣＧＴＧＣＴＧＡＡＣＣＴＧＧＴＡＡＡＧＧＡＡＣＡＡＡＴＴＴＴＡＡＧＡＴＴＴＴＧＡＡＡＴＡＡＡＴＴＧＡＡＴＴＴＣＡＡＧＡＣＡＧＴＴＡＧＴＣＴＡＡＴＣＡＡＣＣＡＡＧＣＴＡＧＡＣＣＡＴＧＧＴＴＧＡＧＧＣＣＧＧＴＴＡ−３’）で表わされる塩基配列を得ることができ、図８に示したように大根由来の正常なａｔｐ６遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ；Ｍ２４６７１）と比較した時、Ｄ−ＣＧＭＳ植物体の新規なａｔｐ６遺伝子型は、５’−部分が正常なａｔｐ６遺伝子と塩基配列が一致し、ＯＲＦ内に塩基が１ｂｐ挿入されて、３’−部分が組換えによって変形されたことを確認した。このような塩基１ｂｐ挿入と組換えによって、新規なａｔｐ６遺伝子型のＯＲＦの生成を確認することができた。この遺伝子を「ｏｒｆ２２５」と命名して配列番号１２（５’−ＡＴＧＡＡＴＣＡＡＡＴＡＧＧＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＣＡＧＴＣＣＣＣＡＣＴＴＧＡＣＣＡＡＴＴＴＧＡＧＡＴＴＧＴＣＣＣＡＴＴＧＡＴＴＣＣＴＡＴＧＡＡＴＡＴＣＧＧＡＡＡＣＴＴＣＴＡＴＴＴＣＴＣＡＴＴＣＡＣＡＡＡＴＣＣＡＴＣＴＴＴＧＴＴＣＡＴＧＣＴＧＣＴＡＡＣＴＣＴＧＡＧＴＴＴＴＴＴＣＣＴＡＣＴＴＣＴＧＡＴＴＣＡＴＴＴＴＡＴＴＡＣＴＡＡＡＡＡＧＧＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＡＣＴＴＡＧＴＣＣＣＡＡＡＴＧＣＴ��ＧＧＣＡＡＴＣＣＴＴＧＧＴＡＧＡＧＣＴＴＣＴＴＴＡＴＧＡ−３’）で表わした（図８参照）。新規なａｔｐ６遺伝子型の遺伝子発現有無を確認するために、正常可稔系統（ＤＢＲＭＦ２）とＤ−ＣＧＭＳ系統のｃＤＮＡを鋳型に、配列番号１３（５’−ＧＴＡＣＡＡＡＧＴＴＣＡＧＣＣＴＴＴＡＡＧＧＡＧＧＣ−３’）の順方向プライマーと５’−ＲＡＣＥに使用した配列番号１０（５’−ＴＡＡＣＣＧＧＣＣＴＣＡＡＣＣＡＴＧＧＴＣＴＡＧＣ−３’）のプライマーを使用して発現有無を再確認した。その結果、図９に示されたように、増幅産物の大きさは、比較することができないが、正常可稔系統とＤ−ＣＧＭＳ系統で発現されることが分かった（図９参照）。
【００５１】
また、本発明者等は、３’−ゲノムウォーキングと５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲを通じて確保された塩基配列を基に配列番号１４（ＡＴＴＣＣＴＡＴＴＧＣＡＡＣＡＧＧＴＣＣＡＧＴＣＡＡＡＧＡＧＧＣＧＧＣＣＣＡＴＴＡＴＣＴＴＴＴＣＴＴＣＴＴＣＧＴＴＡＡＡＴＡＣＡＡＴＴＡＴＴＴＣＴＧＴＡＡＡＡＡＡＡＴＣＴＴＴＧＡＴＡＡＣＣＡＧＴＴＧＧＴＴＡＡＴＴＣＴＴＡＴＴＴＣＴＡＡＡＴＧＧＴＧＣＣＧＧＴＧＡＡＡＡＡＧＣＡＴＣＧＡＧＧＴＴＡＴＴＴＴＡＣＧＡＴＴＡＧＴＧＡＡＣＣＴＧＡＡＣＴＧＡＣＡＴＴＧＧＴＴＣＡＣＣＴＴＴＧＴＡＡＧＣＣＡＧＴＴＴＡＴＴＡＴＧＴＴＴＡＣＴＧＴＴＣＣＣＣＡＴＧＡＴＣＧＣＡＴＣＡＡＡＴＧＴＴＡＡＡＡＡＴＧＧＴＴＡＣＡＴＴＴＧＴＧＣＡＡＡＡＴＴＣＡＡＣＣＡＣＡＡＴＴＴＴＡＣＣＣＣＡＡＡＡＡＡＧＧＧＡＡＡＡＧＡＡＡＡＴＣＡＡＣＣＡＣＡＧＣＧＴＡＧＣＣＴＣＣＧＣＡＧＴＧＣＡＣＡＧＡＣＴＴＧＴＧＴＴＴＣＡＡＧＴＴＴＧＡＡＣＣＡＣＡＡＡＡＴＡＧＴＴＴＴＧＡＣＴＡＧＡＴＡＴＴＣＴＴＧＴＴＣＴＡＴＣＣＣＴＡＡＡＡＡＣＡＧＡＣＴＡＡＧＡＡＡＣＴＴＴＴＴＧＡＡＴＧＡＴＧＴＡＣＴＴＴＴＣＴＧＧＴＡＧＴＡＴＧＴＡＧＧＴＧＣＣＴＡＧＧＴＧＧＴＧＡＣＴＣＧＧＴＡＣＴＡＴＡＡＴＡＴＧＣＣＡＴＡＧＣＡＡＡＧＴＣＡＴＣＧＡＴＣＡＡＴＡＴＡＴＡＣＣＣＡＴＣＧＡＡＣＧＴＡＴＧＧＴＴＴＧＴＡＴＴ−３’）で表わされる塩基配列を得ることができ、図１０に示したように、ｏｒｆ２２５遺伝子は、総２２５ｂｐの塩基で構成され、７５個のタンパク質コドンを暗号化していた。また、配列番号１４の１番目塩基配列から６０３番目塩基配列までは、大根植物体由来の正常なａｔｐ６遺伝子と一致した。ただ、５１９番目塩基配列（配列番号１２では１７１番目塩基配列）でグアニン塩基が１ｂｐ挿入されるＳＮＰを確認することができ、６０４番目塩基配列で組換えが起きて正常なａｔｐ６遺伝子塩基配列と全く異なった遺伝子が生成されたことを確認することができた（図１０参照）。
【００５２】
本発明者等は、正常可稔（ＤＢＲＭＦ１、ＤＢＲＭＦ２）、オグラ−ＣＧＭＳ及びＮＷＢ−ＣＭＳ系統にも、ｏｒｆ２２５遺伝子が存在するかどうかを確認するために、配列番号１５（５’−ＡＴＡＣＣＴＣＧＧＧＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧＧＧＴ−３’）で表わされる順方向プライマーと配列番号１６（５’−ＴＡＧＣＣＡＴＴＴＧＧＴＧＴＧＡＣＣＴＣＴＧＡＣＣＧ−３’）で表わされる逆方向プライマーを製作して、ＰＣＲ及び塩基配列分析を通じて確認した。その結果、図１１に示したように、アガロースゲル上では増幅された産物に系統間差異がないように思われたが、これら増幅産物の塩基配列を分析してみた結果、図１２に示したように正常可稔（ＤＢＲＭＦ１、ＤＢＲＭＦ２）、オグラ−ＣＧＭＳ及びＮＷＢ−ＣＭＳ大根系統は、塩基配列の差異がなく、Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統でのみ１ｂｐ塩基が挿入されているＳＮＰを確認することができた（図１１及び図１２参照）。
【００５３】
結果的に、図１３に示したように正常可稔（ＤＢＲＭＦ１、ＤＢＲＭＦ２）、オグラ−ＣＧＭＳ及びＮＷＢ−ＣＭＳ系統は、単に正常なａｔｐ６遺伝子ＯＲＦの２５４番目塩基で組換えが起きて、総２６７ｂｐの新規なＯＲＦが作られたことを確認し、これを「ｏｒｆ２６７」と命名して、配列番号１７（５’−ＡＴＧＡＡＴＣＡＡＡＴＡＧＧＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＣＡＧＴＣＣＣＣＡＣＴＴＧＡＣＣＡＡＴＴＴＧＡＧＡＴＴＧＴＣＣＣＡＴＴＧＡＴＴＣＣＴＡＴＧＡＡＴＡＴＣＧＧＡＡＡＣＴＴＣＴＡＴＴＴＣＴＣＡＴＴＣＡＣＡＡＡＴＣＣＡＴＣＴＴＴＧＴＴＣＡＴＧＣＴＧＣＴＡＡＣＴＣＴＧＡＧＴＴＴＴＴＴＣＣＴＡＣＴＴＣＴＧＡＴＴＣＡＴＴＴＴＡＴＴＡＣＴＡＡＡＡＡＧＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＡＣＴＴＡＧＴＣＣＣＡＡＡＴＧＣＴＴＧＧＣＡＡＴＣＣＴＴＧＧＴＡＧＡＧＣＴＴＣＴＴＴＡＴＧＡＴＴＴＣＧＴＧＣＴＧＡＡＣＣＴＧＧＴＡＡＡＧＧＡＡＣＡＡＡＴＴＴＴＡＡＧＡＴＴＴＴＧＡ−３’）で表わした。しかし、Ｄ−ＣＧＭＳ系統では、正常なａｔｐ６遺伝子ＯＲＦの１７１番目塩基配列にグアニン１ｂｐが挿入されたＳＮＰが存在しながら、２５５番目塩基で組換えが起きて総２２５ｂｐの新規なＯＲＦ（ｏｒｆ２２５）が作られたことを確認した（図１３参照）。
【００５４】
また、図１４に示したように、Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統では、正常なａｔｐ６遺伝子ＯＲＦのグアニン１ｂｐが挿入されたＳＮＰによって、タンパク質コドンが変化される特徴を示し、正常可稔（ＤＢＲＭＦ１、ＤＢＲＭＦ２）、オグラ−ＣＧＭＳ、ＮＷＢ−ＣＭＳ系統及びＤ−ＣＧＭＳ系統のカルボキシル基末端部分に差異がでるということを確認した（図１４参照）。
【００５５】
本発明者等は、グアニン１ｂｐが挿入されたＳＮＰを使用して、Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統を特異的に選抜することができるかどうかを確認するために、正常可稔（ＤＢＲＭＦ１、ＤＢＲＭＦ２）、オグラ−ＣＧＭＳ、ＮＷＢ−ＣＭＳ及びＤ−ＣＧＭＳ系統の３個体ずつを対象に実験を実施した。結果的に、図１５に示したように、正常可稔（ＤＢＲＭＦ１、ＤＢＲＭＦ２）、オグラ−ＣＧＭＳ、ＮＷＢ−ＣＭＳ、Ｄ−ＣＧＭＳ系統すべてでＰＣＲ増幅産物があることを確認し、この増幅産物の塩基配列分析を通じて、Ｄ−ＣＧＭＳ特異的なＳＮＰを確認した（図１５参照）。
【００５６】
結果的に、図１６に示したように、正常可稔（ＤＢＲＭＦ１、ＤＢＲＭＦ２）、オグラ−ＣＧＭＳ及びＮＷＢ−ＣＭＳ系統すべてで、「ＧＧＧ」で分析され、唯一Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統でのみ「ＧＧＧＧ」で、グアニン１ｂｐが挿入されたＳＮＰを有しているということを証明した。したがって、前記確認されたＤ−ＣＧＭＳ特異的なＳＮＰは、正常可稔（ＤＢＲＭＦ１、ＤＢＲＭＦ２）、オグラ−ＣＧＭＳ及びＮＷＢ−ＣＭＳ大根系統ではないことが確認され、配列番号１２記載の１７１番目塩基配列に位置するＤ−ＣＧＭＳ特異的なＳＮＰを使用して、Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統のみ特異的に選抜することができる分子マーカーに活用することができることが分かった（図１６参照）。
【００５７】
また、本発明は、Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統植物体選抜キットを提供する。
【００５８】
前記選抜キットは、Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統に特異的なＤＮＡ標識因子の塩基配列またはＳＮＰ標識因子のオリゴヌクレオチドを検出することができるプライマー対またはプローブ及びＰＣＲ反応混合物を含む。
【００５９】
前記Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統に特異的なＤＮＡ標識因子を増幅するためのプライマー対は、配列番号５で表わされるＤＮＡ標識因子を増幅することができ、当業者が設計可能なプライマーならすべて使用可能で、配列番号３及び配列番号４で表わされるプライマー対を使用することが好ましい。また、Ｄ−ＣＧＭＳ特異的なＳＮＰ標識因子を増幅するためのプライマー対は、Ｄ−ＣＧＭＳ特異的なＳＮＰ標識因子を増幅することができ、当業者が設計可能なプライマーならすべて使用可能で、配列番号１５及び配列番号１６で表わされるプライマー対を使用することが好ましい。
【００６０】
前記ＰＣＲ反応混合物には、ＰＣＲ反応に必要な一般的な物質、例えば、Ｔａｇポリマラーゼ、反応緩衝液、ｄＮＴＰ、ＭｇＣｌ２、ＢＳＡ及び蒸留水などを含むことができ、ＰＣＲ産物の検出有無を確認することができるアガロース及び電気泳動緩衝液を追加で含むことができる。
【００６１】
また、本発明は、
１）鑑別しようとする植物のＤＮＡ試料を抽出する工程；
２）工程１）のＤＮＡ試料を前記Ｄ−ＣＧＭＳ特異的なＤＮＡ標識因子またはＳＮＰ標識因子を増幅するためのプライマー対を使用してＰＣＲで増幅する工程；及び
３）工程２）の増幅された産物を電気泳動して前記Ｄ−ＣＧＭＳ特異的なＤＮＡ標識因子またはＳＮＰ標識因子が検出されるかどうかを確認する工程とを含む、Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統植物体の選抜方法を提供する。
【００６２】
また、本発明は、
１）鑑別しようとする植物のＤＮＡ試料を抽出する工程；
２）工程１）のＤＮＡ試料を前記Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統植物体の選抜キットを使用して増幅する工程；及び
３）工程２）の増幅された産物を電気泳動して前記Ｄ−ＣＧＭＳ特異的なＤＮＡ標識因子またはＳＮＰ標識因子が検出されるかどうかを確認する工程とを含む、Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統植物体の選抜方法を提供する。
【００６３】
同時に、本発明は、前記Ｄ−ＣＧＭＳ特異的なＤＮＡ標識因子またはＳＮＰ標識因子をＤ−ＣＧＭＳ大根系統植物体の選抜に使用する用途を提供する。
【発明の効果】
【００６４】
本発明のＤ−ＣＧＭＳ大根系統植物体は、Ｆ１植物体に対する細胞質−遺伝子的雄性不稔性導入率が高いので、Ｄ−ＣＧＭＳは、ＣＧＭＳ系統の雑種種子を生産するのに非常に有用に使用することができ、本発明のＤ−ＣＧＭＳ大根系統に特異的なＤＮＡ標識因子は、配列番号３及び配列番号４で表わされるプライマーを使用して増幅することで、容易かつ迅速にＤ−ＣＧＭＳ大根系統植物体を選抜することができる。また、配列番号１５及び配列番号１６で表わされるプライマーを使用して、配列番号１２の１７１番目塩基配列に位置するＤ−ＣＧＭＳ特異的なＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）を確認して、Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統植物体を選抜することができる。同時に、前記のプライマーは、Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統植物体の選抜用キットに有用に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】正常可稔個体、オグラ（Ｏｇｕｒａ）−ＣＧＭＳ（雄性不稔；Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ−Ｇｅｎｉｃ  Ｍａｌｅ  Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ）大根系統及び新規なＣＧＭＳ（Ｄ−ＣＧＭＳ）大根系統の花器及び手術の形態比較写真：   Ａ：正常可稔個体の花器；   Ｂ：オグラ−ＣＧＭＳ大根系統の花器；   Ｃ：Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統の花器；   Ｄ：正常可稔個体の雄しべ；   Ｅ：オグラ−ＣＧＭＳ大根系統の雄しべ；   Ｆ：Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統の雄しべ。
【図２】正常可稔個体とＤ−ＣＧＭＳ大根系統の花粉比較写真：   Ａ：正常可稔個体の花粉の電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真；   Ｂ：Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統の花粉の電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真；   Ｃ：正常可稔個体の花粉のＦＤＡ染色写真；   Ｄ：Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統の花粉のＦＤＡ染色写真。
【図３】正常可稔個体、オグラ−ＣＧＭＳ大根系統及びＤ−ＣＧＭＳ大根系統の細胞組織学的観察写真：   Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｊ及びＭ：正常可稔個体花粉の発達工程別細胞組織学的観察写真；   Ｂ、Ｅ、Ｈ、Ｋ及びＮ：オグラ−ＣＧＭＳ大根系統花粉の発達工程別細胞組織学的観察写真；及び   Ｃ、Ｆ、Ｉ、Ｌ及びＯ：Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統花粉の発達工程別細胞組織学的観察写真。
【図４】配列番号１及び配列番号２を使用して増幅されたＰＣＲ産物の塩基配列を比較した写真。
【図５】配列番号３及び配列番号４を使用して増幅されたＰＣＲ産物をアガロースゲル上で比較した写真。
【図６】Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統を選抜することができるＤＮＡ分子マーカーを使用して、Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統及び市販３０品種のＰＣＲ結果を示す写真：  Ｍ；マーカー、１；Ｄ−ＣＧＭＳ、２；ギルゾ、３；ペギャン、４；サミャン、５；チョンジンジュ、６；チョンハク、７；テヤン、８；ヨンサン、９；ピョンガンキムジャン、１０；ハチュ、１１；ハンノンヨルム、１２；Ｄ−ＣＧＭＳ、１３；ハンガンウル、１４；ミョンサン、１５；ぺギョン、１６；ヨンクァン、１７；チャンウォン、１８；チォンクァン、１９；パルクァン、２０；チォンウン、２１；テビェク、２２；クァンドンヨルム、２３；Ｄ−ＣＧＭＳ、２４；大型チュソク、２５；チュンアンキンジャン、２６；チォンボック、２７；テワン、２８；テピョン、２９；ハンオルデヒョンボム、３０；ノックドボム、３１；ペッカン、３２；ペェクボン及び３３；チョンイルプン。
【図７】配列番号６及び配列番号７を使用して３’−方向ゲノムウォーキングを実施して得た塩基配列を分析した写真。
【図８】配列番号９及び配列番号１０を使用して５’−方向ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡＥｎｄｓ）ＰＣＲを通じて得た塩基配列を既存に報告された大根由来の正常なａｔｐ６遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ；Ｍ２４６７１）と比較分析した写真：  下線表示：新規発見されたＤ−ＣＧＭＳ特異的なｏｒｆ２２５遺伝子のＯＲＦ（Ｏｐｅｎ  Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｆｒａｍｅ）。
【図９】正常可稔系統とＤ−ＣＧＭＳ大根系統のｃＤＮＡを対象に新規なａｔｐ６遺伝子型の発現有無を確認した結果を示す写真。
【図１０】Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統で３’−方向ゲノムウォーキング及び５’−方向ＲＡＣＥ  ＰＣＲを実施して得た新規なａｔｐ６遺伝子型の塩基配列分析写真：  矢印表示（１０２−１２４及び７８１−８０６）：Ｄ−ＣＧＭＳ特異的なＳＮＰマーカーを開発するための配列番号１５及び配列番号１６で表わされる順方向プライマー及び逆方向プライマー。
【図１１】配列番号１５及び配列番号１６を使用して増幅されたＰＣＲ産物をアガロースゲル上で比較した写真。
【図１２】配列番号１５及び配列番号１６を使用して増幅されたＰＣＲ産物の塩基配列分析を通じて比較分析した結果写真。
【図１３】既存に報告された大根系統の正常なａｔｐ６遺伝子、正常可稔（ＤＢＲＭＦ１、ＤＢＲＦＭ２）、オグラ−ＣＧＭＳ及びＮＷＢ−ＣＭＳの新規なａｔｐ６遺伝子型（ｏｒｆ２６７遺伝子）、及びＤ−ＣＧＭＳ大根系統特異的な新規なａｔｐ６遺伝子型（ｏｒｆ２２５遺伝子）の構造を比較分析した図。
【図１４】Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統特異的なＳＮＰによってタンパク質コドンが変化され、正常可稔（ＤＢＲＭＦ１、ＤＢＲＦＭ２）、オグラ−ＣＧＭＳ及びＮＷＢ−ＣＭＳ大根系統、及びＤ−ＣＧＭＳ大根系統が差異があることを示す分析結果写真。
【図１５】正常可稔（ＤＢＲＭＦ１、ＤＢＲＦＭ２）、オグラ−ＣＧＭＳ、ＮＷＢ−ＣＭＳ及びＤ−ＣＧＭＳ大根系統で、配列番号１５及び配列番号１６を使用して増幅されたＰＣＲ産物をアガロースゲル上で比較した写真（各系統別３個体）。
【図１６】正常可稔（ＤＢＲＭＦ１、ＤＢＲＦＭ２）、オグラ−ＣＧＭＳ、ＮＷＢ−ＣＭＳ及びＤ−ＣＧＭＳ大根系統で、配列番号１５及び配列番号１６を使用して増幅されたＰＣＲ産物の塩基配列分析を通じたクロマトグラムピーク写真：  Ａ：ＤＢＲＭＦ１系統；  Ｂ：ＤＢＲＭＦ２系統；  Ｃ：オグラ−ＣＧＭＳ系統；  Ｄ：ＮＷＢ−ＣＭＳ系統；  Ｅ：Ｄ−ＣＧＭＳ系統。
【発明を実施するための形態】
【００６６】
以下、本発明を実施例によって詳しく説明する。
【００６７】
但し、下記実施例は、本発明を例示するだけのものであって、本発明の内容が下記実施例に限定されるのではない。
【００６８】
＜実施例１＞新規Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統開発及び特性の調査
＜１−１＞新規なＤ−ＣＧＭＳ選別
本発明者等は、Ｆ１雑種種子の生産性向上のために新規な雄性不稔資源を収集した。その中で農村進興庁園芸研究所から分譲を受けた２０余種のウズベキスタン等の地で収集された大根系統を対象に花器組織及び花粉発達の程度を調査した。
【００６９】
その結果、花粉発達が阻害されて雄性不稔性（Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ−Ｇｅｎｉｃ  Ｍａｌｅ  Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ；ＣＧＭＳ）を示す一つの系統を選別することができ、これを「Ｄ−ＣＧＭＳ（Ｒａｐｈａｎｕｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  ｖａｒ  Ｄ−ＣＧＭＳ）」と命名した。
【００７０】
選別したＤ−ＣＧＭＳの花と雄しべ、開化した正常可稔個体及びオグラ（Ｏｇｕｒａ）大根系統（オグラ−ＣＧＭＳ）の花と雄しべを解剖顕微鏡で観察した。前記オグラ−ＣＧＭＳは、従来から雑種種子生産に主に使用されているものなので、対照群に使用した。
【００７１】
その結果、新規に発見された雄性不稔系統（Ｄ−ＣＧＭＳ）は、正常可稔個体より花粉が少なくて、既存に報告された花粉が全くないオグラ−ＣＧＭＳとは異なり少ない量の花粉が生成されていることを発見することができた（図１）。
【００７２】
＜１−２＞Ｄ−ＣＧＭＳの花粉活力の調査
前記実施例＜１−１＞で選別したＤ−ＣＧＭＳの花粉の活力を調査するために電子顕微鏡（ＳＥＭ）及びＦＤＡ染色を通じて新規に発見された雄性不稔系統の花粉の模様及び花粉の活力を精緻に観察した。電子顕微鏡観察及びＦＤＡ染色は、開化した正常可稔個体とＤ−ＣＧＭＳ大根系統の花粉を採取して実施し、オグラ−ＣＧＭＳ大根系統は花粉が全く生成されないので観察対象から除外した。花粉活力の調査のためのＦＤＡ染色は、正常可稔個体及びＤ−ＣＧＭＳ大根系統の開化した花の花粉を０．００２％ＦＤＡ溶液で染色した後、蛍光顕微鏡で観察した。
【００７３】
その結果、新規に発見された雄性不稔個体の花粉は、正常可稔個体とは異なり歪んだ形態に変わっていて、花粉活力の調査でも活力がないことが示された（図２）。
【００７４】
＜１−３＞Ｄ−ＣＧＭＳの細胞組織学的観察
本発明者等は、Ｄ−ＣＧＭＳのより正確な雄性不稔の機序を調査するために、細胞組織学的観察を実施した。まず、正常可稔個体、オグラ−ＣＧＭＳ及びＤ−ＣＧＭＳ大根系統の葯を同じ発達段階で採取した後、固定液（Ｐｉｐｅｓ  ５０ｍＭ、４％  ｐ−ホルムアルデヒド）で４℃で２４時間固定させた。その後、常温で２５％から濃度上昇順序で５０％、７５％及び１００％アルコールで２時間ずつ１回脱水した後、１００％アルコールで２４時間脱水した。そして、常温で２５％から濃度上昇順序で５０％、７５％及び１００％キシレンを２時間ずつ１回処理した後、１００％キシレンを２時間ずつ２回処理することで前処理をし、パラフィン浸透のために液状パラフィンで２時間ずつ３回処理後、試料をパラフィンで包埋した。パラフィンブロック製作後、標本製作は、組織切片器（ｒｏｔａｒｙ  ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ）を使用して１０μｍ厚の薄い切片を作ってアルブミンでコーティングされたスライドグラスに付着させた後、温熱装置（Ｓｌｉｄｅ  ｗａｒｍｅｒ、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，米国）を使用して、４０±３℃で乾燥させた。完全に乾燥したスライドは、キシレンを使用してパラフィンを除去してアルコールを使用して脱水した後、０．２５％トルイジンブルー及び０．０５％アニリンブルーで染色を実施した。染色した組織に再度アルコールとキシレンを通過させた後、封入剤でスライドを封入し、６０℃温熱装置で一日乾燥させた後、光学顕微鏡で検鏡及び撮影を実施した。
【００７５】
その結果、正常可稔個体（図３のＡ、Ｄ、Ｇ、Ｊ及びＭ）は、花粉が正常に発達する一方、オグラ−ＣＧＭＳ大根系統（図３のＢ、Ｅ、Ｈ、Ｋ及びＮ）では、テトラド発達段階（図３のＥ）から異常が生じて花粉が全く発達しない形態で雄性不稔性機序を有するため、花粉が全く生成されないことを確認した。これとは異なりＤ−ＣＧＭＳ大根系統（図３のＣ、Ｆ、Ｉ、Ｌ及びＯ）では、テトラド発達段階（図３のＦ）では正常個体と類似であるが小胞子発達段階（図３のＩ及びＬ）で異常が生じて、結果的に花粉が非正常的に発達する雄性不稔機序を有することが確認された（図３）。
【００７６】
＜１−４＞交配を通じたＤ−ＣＧＭＳの花粉活力の調査
本発明者等は、また、交配を通じたＤ−ＣＧＭＳの花粉の活力を調査した結果、Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統の花粉を正常可稔個体を母本にして交配した場合には、全く種子が生成されない表現型を確認することができた。しかし、Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統を母本にして雌性器官の正常発達有無を確認してみた結果、他の花粉と交配時に種子が正常に生成されることを確認することができた（表１）。ここでＤ−ＣＧＭＳの雌性器官の正常有無を確認するために、父系に使用した雄性可稔植物体は、サミャン大根（系統名：Ｒ０１２）、ソンゴン大根（Ｒ０１５）、正常夏大根（Ｒ０２０）、ハチュ大根（Ｒ０２９）を使用して交配を実施し、雄性器官が正常かどうか調査するために母系に使用した植物体は、大型チュソク大根（Ｒ０４９）、ペェクボン大根（Ｒ１０６）及び本発明者が保有している海外収集資源である「Ｒ１２２」、「Ｒ１２６」、「Ｒ１２７」雄性可稔系統を使用して交配を実施した。
【００７７】
【表１】
2010523106.tif 000003
【００７８】
−：種子が形成されない；及び＋：種子が形成される。
【００７９】
＜実施例２＞Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統雄性不稔性導入能力確認及びＦ１雑種種子生産
前記実施例１で選抜したＤ−ＣＧＭＳ大根系統を交配母本にして、細胞質−遺伝子的雄性不稔性（ＣＧＭＳ）を有するＣＧＭＳ大根系統Ｆ１雑種種子の生産するために雄性不稔性を導入しようとする雄性可稔植物体と交配を実施した。また、Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統の細胞質−遺伝子的雄性不稔性導入能力をオグラ−ＣＧＭＳ大根系統と比較するためにＤ−ＣＧＭＳ大根系統と交配をした雄性可稔植物体をオグラ−ＣＧＭＳを母本にして交配を実施した。生産されたＦ１雑種種子で雄性不稔性が導入されたかどうかは、花器組織の花粉発達及び花粉の活力を調査して確認した。ここで、雄性不稔性を導入しようとする雄性可稔植物体（父系）は、正常夏大根分離系統（ＤＢ００２）、ハンノン夏大根（ＤＢ００３）、ハンノン夏大根分離系統（ＤＢ１１１）、サミャン大根（ＤＢ０２１）、デブリョン夏大根（ＤＢ０８４）、ハチュ大根分離系統（ＤＢ０９２）と本発明者が収集した雄性可稔系統である「ＤＢ０１９」、「ＤＢ４２１」大根系統を使用して交配を実施した。また、対照区に使用したオグラ−ＣＧＭＳ大根系統は、大型チュソク大根（Ｒ０４９）、ペェクボン大根（Ｒ１０６）を母系に使用した。
【００８０】
その結果、オグラ−ＣＧＭＳと互いに異なる８個の雄性可稔系統との交配組み合わせでは  、６個の交配組み合わせで生成されたＦ１雑種種子の１００％が雄性可稔株で、交配組み合わせの一つ（Ｒ１０６×ＤＢ４２１）では、約１：１の割合で雄性可稔株と雄性不稔株に分離した。また、交配組み合わせの一つ（Ｒ１０６×ＤＢ０１９）では、生成されたＦ１雑種種子の１００％が雄性不稔株だった。しかし、Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統と互いに異なる８個の雄性可稔系統との交配組み合わせでは、すべての交配組み合わせで生産されたＦ１雑種種子が、１００％雄性不稔株と示された（表２）。したがって、Ｄ−ＣＧＭＳを使用した雄性不稔性導入率は、既存のオグラ−ＣＧＭＳより非常に高いということを確認し、維持親系統の育成がより容易であるということを確認することができた。また、オグラ−ＣＧＭＳ大根系統の回復遺伝子を有する系統とＤ−ＣＧＭＳ大根系統との交配で生産されたＦ１雑種種子は、１００％雄性不稔株が出た。これは、雄性不稔性を回復させる回復遺伝子が、既存オグラ−ＣＧＭＳ大根系統とは全く違ったものであることを意味する。結果的にＤ−ＣＧＭＳ大根系統の細胞質−遺伝子的雄性不稔性を使用したＦ１種子生産方法は、既存オグラ−ＣＧＭＳ大根系統より雄性不稔性導入率が非常に高く、Ｆ１雑種種子生産時より広範囲に交配母本に使用できることを確認した。
【００８１】
【表２】
2010523106.tif 000004
【００８２】
＜実施例３＞Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統の雄性不稔回復遺伝資源開発
前記＜実施例１＞で選抜したＤ−ＣＧＭＳ大根系統の雄性不稔回復系統を捜すためにウズベキスタン及びロシアで収集した１０個の雄性可稔系統とＤ−ＣＧＭＳ大根系統を母本に交配を実施した。ここで、父系に使用された１０個の雄性可稔系統は、海外（ウズベキスタン、ロシア）で収集された系統であり、品種名がないので系統名のみ記入した。生産されたＦ１雑種種子で雄性不稔性が導入されたかどうかは、花器組織の花粉発達及び花粉の活力を調査して確認した。
【００８３】
その結果、１０個の交配組み合わせの中で、２個の雄性可稔系統との交配で生産されたＦ１雑種種子から雄性可稔株が出た。Ｄ−ＣＧＭＳとＤＢ１１２大根系統との交配で生産されたＦ１雑種種子では、雄性不稔株と雄性可稔株の分離が生じた。このような結果は、ＤＢ１１２大根系統がＤ−ＣＧＭＳ大根系統の雄性不稔回復遺伝子を異形接合体形態で有しているということを立証した。また、Ｄ−ＣＧＭＳとＤＢ１１７大根系統との交配で生産されたＦ１雑種種子は、１００％雄性可稔株が現れた。このような結果は、ＤＢ１１７大根系統がＤ−ＣＧＭＳ大根系統の雄性不稔回復遺伝子を優性同型接合体形態で有しているということを立証した。したがって、新規なＤ−ＣＧＭＳ大根系統は、回復遺伝子が存在する細胞質−遺伝子的雄性不稔性（ＣＧＭＳ）大根系統であることを確認した。
【００８４】
【表３】
2010523106.tif 000005
【００８５】
＜実施例４＞Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統のカルス誘導
本発明のＤ−ＣＧＭＳ大根系統の種子を７０％（ｖ／ｖ）エチルアルコールに１分間浸漬した後、滅菌水で２回洗浄した。次に、２％の次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＯＣｌ）溶液に１５分間浸漬させた後、表面を滅菌水で３回洗浄した。消毒された種子を発芽培地（１／２  ＭＳｓａｌｔｓ、３％スクロース、０．８％アガー）に置床して芽生えさせた後、７日目伸びた下胚軸を５ｍｍ間隔で切ってこれをＭＳ培地（ＢＡＰ  ４ｍｇ／ｌｉｔｅｒ，ＮＡＡ  ２ｍｇ／ｌｉｔｅｒ  含有）で分化させてカルスを誘導した。誘導されたカルスは、４週周期でＭＳ培地（ＢＡＰ  １ｍｇ／ｌｉｔｅｒ，ＩＢＡ  ０．５ｍｇ／ｌｉｔｅｒ含有）で継代培養を実施して、安定的に育つカルス（Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統のカルス）を２００７年３月２７日付けで韓国生命工学研究院遺伝子銀行に寄託した（寄託番号：ＫＣＴＣ１１１０１ＢＰ）。
【００８６】
＜実施例５＞Ｄ−ＣＧＭＳを識別することができる葉緑体基盤分子マーカー開発
本発明者等は、前記＜実施例１ないし３＞を通じて、Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統が従来のオグラ−ＣＧＭＳ大根系統とは全く異なった雄性不稔系統であることを確認し、前記Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統を使用して効果的にＦ１雑種種子を生産することができることを確認した。このようなＤ−ＣＧＭＳ大根系統を判別することができる、安定的な葉緑体遺伝体を基盤とするＤＮＡ分子マーカーを開発するために、正常可稔個体、オグラ−ＣＧＭＳ及びＤ−ＣＧＭＳのＰＣＲ及び塩基配列分析を通じて葉緑体塩基配列の差異を確認した。
【００８７】
＜５−１＞Ｄ−ＣＧＭＳの遺伝因子型確認
まず、ＧｅｎＢａｎｋに登録された同じ十字花科の白菜の葉緑体塩基配列（ＤＱ２３１５４８）情報を基に、比較的種間保存的な部分で葉緑体を基にした２０個のプライマー対を製作した。そして、正常可稔系統、オグラ−ＣＧＭＳ系統及びＤ−ＣＧＭＳ系統各５個体ずつを対象にＰＣＲを行なった。各個体で採取した葉０．１ｇを液体窒素を使用して完全に破砕した後、キット（ＤＮｅａｓｙ  ｐｌａｎｔ  ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ，米国）を使用してＤＮＡを抽出し、抽出したＤＮＡ  ５０ｎｇを鋳型にしてＰＣＲを行なった。ＰＣＲは、キット（Ａｄｖａｎｔａｇｅ２  ＰＣＲ  ｋｉｔ，Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，米国）を使用し、ＰＣＲ条件は、９４℃で５分間のプレ変性化させた後、９４℃で３０秒；６５℃で３０秒；及び７２℃で２分の一サイクルを４０回反覆した後、７２℃で１０分間最終拡張させて反応を終結させた。反応終結後、ＰＣＲ産物の塩基配列を分析することで、正常可稔系統、オグラ−ＣＧＭＳ系統及びＤ−ＣＧＭＳ系統間の葉緑体塩基配列の差異を確認した。塩基配列分析は、（株）ジェノテック社に依頼して行なった。
【００８８】
多くの葉緑体基盤ＰＣＲ産物の塩基配列を確認してみた結果、正常可稔個体でも葉緑体の変異がある、互いに異なる二つの形態の葉緑体塩基配列を確認することができた。正常可稔個体間で塩基配列が異なる葉緑体を有する個体をそれぞれ「ＤＢＲＭＦ１」及び「ＤＢＲＭＦ２」と命名した。葉緑体基盤ＰＣＲ産物の中で配列番号１記載のプライマー（順方向プライマー）と配列番号２記載のプライマー（逆方向プライマー）を使用してＰＣＲを行なった産物が、Ｄ−ＣＧＭＳで差異を示した。この増幅産物の塩基配列を分析した結果、Ｄ−ＣＧＭＳでのみ１７ｂｐの塩基配列（ＡＴＡＴＡＴＴＧＡＴＡＴＣＴＡＴＡ）挿入が起きたことを確認することができた（図４）。
【００８９】
＜５−２＞Ｄ−ＣＧＭＳに特異的なＤＮＡ標識因子開発
前記＜５−１＞で詳しくみたように、Ｄ−ＣＧＭＳは、他の個体とは異なりＡＴＡＴＡＴＴＧＡＴＡＴＣＴＡＴＡの塩基配列がもう一度反覆される特徴があった。このようなＤ−ＣＧＭＳ大根系統の選抜を容易にするために、配列番号３記載の順方向プライマーと配列番号４記載の逆方向プライマーを製作してＰＣＲを行なった。
ＰＣＲは、正常可稔系統、オグラ−ＣＧＭＳ系統及びＤ−ＣＧＭＳ系統それぞれの葉で、前記＜５−１＞と同じ方法で用意したＤＮＡ５０ｎｇを鋳型にしてキット（Ａｄｖａｎｔａｇｅ２  ＰＣＲ  ｋｉｔ，Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，米国）を使用してＰＣＲを行なった。
【００９０】
ＰＣＲ条件は、９４℃で５分間プレ変性化させた後、９４℃で２５秒；６８℃で２５秒；及び７２℃で２５秒としたサイクルを４０回反覆した後、７２℃で１分間最終拡張させて反応を終結させた。反応終結後、アガロースゲルで増幅産物の大きさを観察した結果、Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統でのみＰＣＲ増幅産物が大きくなったことを確認することができた（図５）。前記ＰＣＲ増幅産物の塩基配列を再確認した結果、１５６ｂｐのＰＣＲ増幅産物が確認され、これを配列番号５で表わした。
【００９１】
＜５−３＞特異的ＤＮＡ標識因子を使用したＤ−ＣＧＭＳの選抜
前記実施例＜５−２＞で開発されたＤＮＡ分子マーカーが、新規開発されたＤ−ＣＧＭＳの特異的な選抜が可能であるかどうかを確認するために従来から知られた市販３０品種を対象に配列番号３で表わされる順方向プライマーと配列番号４で表わされる逆方向プライマーを使用して、前記実施例＜５−２＞と同じ方法でＰＣＲを行なうことで確認した。
【００９２】
その結果、Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統でのみ増幅産物の大きさが大きくなったことが示された。これを通じて本発明のＤＮＡ分子マーカーは、新規なＤ−ＣＧＭＳ大根系統を選抜することができることを確認し（図６）、ＰＣＲ増幅産物（１５６ｂｐ）の塩基配列を再確認した結果、配列番号５で表わされる塩基配列を得ることができた。
【００９３】
＜実施例６＞Ｄ−ＣＧＭＳ特異的なａｔｐ６遺伝子型の確認とＤ−ＣＧＭＳを識別することができるミトコンドリア基盤ＳＮＰマーカーの開発
＜６−１＞ゲノムウォーキングを通じたＤ−ＣＧＭＳのａｔｐ６遺伝子型確認
本発明者等は、ａｔｐ６遺伝子を対象にゲノムウォーキングを通じてＤ−ＣＧＭＳ特異的な遺伝子型を調査した。ａｔｐ６遺伝子は、ミトコンドリア遺伝体内に存在する遺伝子で、ＡＴＰ合成に関するＡＴＰａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ６タンパク質をコードする遺伝子である。既存報告によると雄性可稔及び雄性不稔系統の特性によって、ａｔｐ６遺伝子の構造的な特徴が異なると報告されている（Ｍａｋａｒｏｆｆ  ＣＡ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８９年，第２６４巻，１１７０６−１１７１３頁；Ｋｉｍ等，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．２００７年，第１１５巻，１１３７−１１４５頁）。特に、唐辛子雄性不稔資源の場合には、雄性不稔系統でのみａｔｐ６遺伝子の３’−部分の一部が欠失されたａｔｐ６遺伝子構造が発見された。このような特性を使用して、唐辛子雄性不稔資源特異的なＳＣＡＲ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）マーカーに転換して唐辛子雄性不稔資源探索に効果的に使用したことがある（Ｋｉｍ等，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ，２００５年，第２０巻，４１６−４２２頁）。
【００９４】
まず、Ｄ−ＣＧＭＳのａｔｐ６遺伝子の構造的特性を調べるために既存に知られた大根のａｔｐ６遺伝子塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ；Ｍ２４６７１）を基にａｔｐ６  ＯＲＦの５’−方向で３’ゲノムウォーキングのための配列番号６で表わされる１次順方向プライマー（Ｐｒｉｍａｒｙ  ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ）と配列番号７で表わされる２次順方向プライマー（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ）を製作した。ゲノムウォーキングライブラリは、Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統の葉０．１ｇを液体窒素を使用して完全に破砕した後、キット（ＤＮｅａｓｙ  ｐｌａｎｔ  ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ，米国）を使用してＤＮＡを抽出して、抽出したＤＮＡ  ３μｇを用いてゲノムウォーキングライブラリキット（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒＴＭ  Ｋｉｔ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，米国）を使用してゲノムウォーキングライブラリを製作した。ゲノムウォーキングライブラリ１μｌを鋳型にして配列番号６で表わされるプライマーを使用して１次ＰＣＲを行なった。前記ＰＣＲ条件は、９４℃で３分間プレ変性化させた後、９４℃で２５秒、７２℃で３分のサイクルを７回反覆した後、再び９４℃で２５秒、６７℃で３分のサイクルを３２回反覆した後、６７℃で７分間最終拡張させて反応を終結させた。反応終結後、反応物を５０倍に希釈して１μｌを鋳型に配列番号７で表わされるプライマーと共に２次ＰＣＲ（ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ）を行なった。前記ＰＣＲ条件は、９４℃で３分間プレ変性化させた後、９４℃で２５秒、７２℃で３分のサイクルを５回反覆した後、再び９４℃で２５秒、６７℃で３分のサイクルを２０回反覆した後、６７℃で７分間最終拡張させて反応を終結させた。
【００９５】
その結果、アガロースゲルでの増幅産物は、多くのバンドが生成されたことを確認することができ、これらの塩基配列を分析してみた結果、図７に示したように正常なａｔｐ６遺伝子の３’−部分が欠失されて新しい塩基配列（配列番号：８）が組換えられている新しいａｔｐ６遺伝子型を発見した。正常なａｔｐ６遺伝子のＯＲＦ部分でも既存に知られた大根のａｔｐ６遺伝子と比較する時、１個の塩基が挿入されている特徴を示した（図７）。
【００９６】
＜６−２＞５’−ＲＡＣＥを通じたＤ−ＣＧＭＳの新規なａｔｐ６遺伝子型確認
前記実施例＜６−１＞で詳しくみたように、既存に知られた正常なａｔｐ６遺伝子とは異なる３’−部分が欠失されて新しい塩基配列が組換えられた新規なａｔｐ６遺伝子を確認することができ、新規なａｔｐ６遺伝子の５’−方向の塩基配列を確認するために  ５’−ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡＥｎｄｓ）ＰＣＲを行なった。ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ製作に使用されたＲＮＡは、Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統の花０．１ｇを液体窒素を使用して完全に破砕した後、Ｔｒｉ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ，米国）を使用してすべてのＲＮＡを抽出した。抽出したすべてのＲＮＡで、ＰｏｌｙＡＴｔｒａｃｔ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＩＶ（Ｐｒｏｍｅｇａ，米国）を使用してｍＲＮＡを分離した。分離したｍＲＮＡ  １μｇを用いてＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ合成キット（ＳＭＡＲＴＴＭ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，米国）を使用してＲＡＣＥ  ｃＤＮＡを製作した。また、配列番号８で表わされた塩基配列を基に配列番号９と配列番号１０で表わされる新規なａｔｐ６遺伝子型に特異的な逆方向プライマーを製作した。ＰＣＲ反応は、ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  １μｌを鋳型に配列番号９で表わされる逆方向プライマーを使用して１次５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲを行なった。ＰＣＲ条件は、９４℃で５分間プレ変性化させた後、９４℃で３０秒、７０℃で３分のサイクルを５回反覆した後、再び９４℃で３０秒、６８℃で３０秒、７２℃で３分のサイクルを２５回反覆した後、７２℃で１０分間最終拡張させて反応を終結させた。反応終結後、反応物を５０倍に希釈して、１μｌを鋳型に配列番号１０で表わされる逆方向プライマーと共に２次５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲ（ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ）を行なった。前記ＰＣＲ条件は、９４℃で５分間プレ変性化させた後、９４℃で３０秒、６８℃で３０秒、７２℃で３分のサイクルを３５回反覆した後、７２℃で１０分間最終拡張させて反応を終結させた。反応終結後、アガロースゲルで増幅産物を確認した。増幅産物をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ，米国）でクローニングした後、塩基配列分析を実施した。確保された塩基配列は、配列番号１１で表わした。また、図８に示したように、すでに報告されたことがある大根由来の正常なａｔｐ６遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ；Ｍ２４６７１）と比較をした時、Ｄ−ＣＧＭＳ植物体の新規なａｔｐ６遺伝子型は、５’−部分が正常なａｔｐ６遺伝子と塩基配列が一致し、ＯＲＦ内に塩基が１ｂｐ挿入されて３’−部分が組換えによって変形されたことを確認した。これは、前記実施例＜６−１＞の結果と一致することを確認することができた。また、新規なａｔｐ６遺伝子型のＯＲＦを確認することができ、この遺伝子を「ｏｒｆ２２５」と命名して配列番号１２で表わした。
【００９７】
また、新規なａｔｐ６遺伝子型が発現されるかどうかを再検証するために、正常可稔系統（ＤＢＲＭＦ２）とＤ−ＣＧＭＳ系統のｃＤＮＡを対象にＲＴ−ＰＣＲを通じて発現有無を確認した。ｃＤＮＡは、正常可稔系統とＤ−ＣＧＭＳの花０．１ｇを液体窒素を使用して完全に破砕した後、Ｔｒｉ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ，米国）を使用してすべてのＲＮＡを抽出して、分離したＲＮＡ  ２μｇを用いてｃＤＮＡ合成キット（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ  Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，米国）を使用して製作した。また、配列番号１３で表わされる順方向プライマーを製作して、５’−ＲＡＣＥに使用した配列番号１０の逆方向プライマーとともにＲＴ−ＰＣＲを行なった。前記ＲＴ−ＰＣＲ条件は、９４℃で５分間プレ変性化させた後、９４℃で３０秒、６４℃で３０秒、７２℃で４０秒のサイクルを４５回反覆した後、７２℃で５分間最終拡張させて反応を終結させた。反応終結後、アガロースゲルで増幅産物を確認した。その結果、図９に図示されたように、Ｄ−ＣＧＭＳ系統のみならず正常可稔系統でも増幅されることを確認し、新規なａｔｐ６遺伝子型が発現される遺伝子であることを確認することができた（図９）。
【００９８】
＜６−３＞ｏｒｆ２２５遺伝子の塩基配列分析及びＳＮＰ探索
前記実施例＜６−１＞及び＜６−２＞を通じて確認された塩基配列を基に図１０に示したような塩基配列を確保することができ、これを配列番号１４で表わした。配列番号１４で表わされる確保された塩基配列は、総１５４０ｂｐの塩基で構成されていて、図１０に示したようにｏｒｆ２２５遺伝子は、３４９番目塩基配列から５７３番目塩基配列まで総２２５ｂｐの塩基で構成され、７５個のタンパク質コドンを暗号化していた（図１０）。また、配列番号１４で表わされた１番目塩基配列から６０３番目塩基配列までは、大根植物体由来の正常なａｔｐ６遺伝子と一致した。但し、５１９番目塩基配列（配列番号１２の１７１番目塩基配列）でグアニン塩基が１ｂｐ挿入されるＳＮＰを発見することができた。また、６０４番目塩基配列で組換えが起き、正常なａｔｐ６遺伝子塩基配列と全く異なった遺伝子が生成されたことを確認することができた。６０４番目塩基配列から１５４０番目塩基配列までの組換えされた遺伝子は、遺伝子相同性プログラム（ＢｌａｓｔＮ）で分析してみた結果、一部分だけがシロイヌナズナ遺伝子塩基配列と低い相同性（相同性７３％）を示し、全般的に相同性ある遺伝子が検索されなかった。
【００９９】
正常可稔（ＤＢＲＭＦ１、ＤＢＲＭＦ２）、オグラ−ＣＧＭＳ及びＮＷＢ−ＣＭＳ系統にもｏｒｆ２２５遺伝子が存在するかどうかを確認するために、配列番号１５で表わされる順方向プライマー及び配列番号１６で表わされる逆方向プライマーを製作して、ＰＣＲ及び塩基配列分析を通じて確認した。製作された順方向プライマー及び逆方向プライマーの位置は、図１０に示したとおりである。ＰＣＲ反応は、正常可稔（ＤＢＲＭＦ１、ＤＢＲＭＦ２）、オグラ−ＣＧＭＳ及びＮＷＢ−ＣＭＳ系統の植物体葉０．１ｇを液体窒素を使用して完全に破砕した後、キット（ＤＮｅａｓｙ  ｐｌａｎｔ  ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ，米国）を使用して抽出し、抽出されたＤＮＡ  １μｌずつを鋳型にして配列番号１５で表わされる順方向プライマー及び配列番号１６で表わされる逆方向プライマーを使用してＰＣＲを行なった。前記ＰＣＲ条件は、９４℃で５分間プレ変性化させた後、９４℃で３０秒、６６℃で３０秒、７２℃で１分のサイクルを４５回反覆した後、７２℃で５分間最終拡張させて反応を終結させた。
【０１００】
その結果、ＰＣＲ増幅産物は、図１１に示したように正常可稔（ＤＢＲＭＦ１、ＤＢＲＭＦ２）、オグラ−ＣＧＭＳ、ＮＷＢ−ＣＭＳ及びＤ−ＣＧＭＳ大根系統間に差異がないように見えた（図１１）。これら増幅産物の塩基配列を分析してみた結果、図１２に示したように、正常可稔（ＤＢＲＭＦ１、ＤＢＲＭＦ２）、オグラ−ＣＧＭＳ及びＮＷＢ−ＣＭＳ系統は、塩基配列の差異がないが、Ｄ−ＣＧＭＳ系統は、１ｂｐ塩基が挿入されているＳＮＰを確認することができた（図１２）。結果的に、図１３に示したように、正常可稔（ＤＢＲＭＦ１、ＤＢＲＭＦ２）、オグラ−ＣＧＭＳ、ＮＷＢ−ＣＭＳ系統は、単に正常なａｔｐ６遺伝子ＯＲＦの２５４番目塩基で組換えが起きて総２６７ｂｐの新規なＯＲＦが作られたことを確認し、これを「ｏｒｆ２６７（配列番号１７）」と命名した。ｏｒｆ２６７遺伝子は、総８９個のタンパク質コドンを暗号化することが示された。
【０１０１】
しかし、Ｄ−ＣＧＭＳ系統では、正常なａｔｐ６遺伝子ＯＲＦの１７１番目塩基配列にグアニン１ｂｐが挿入されたＳＮＰが存在しながら、２５５番目塩基で組換えが起きて総２２５ｂｐの新規なＯＲＦ（ｏｒｆ２２５）が作られたことを確認した（図１３）。また、図１４に示したように、Ｄ−ＣＧＭＳ系統では、正常なａｔｐ６遺伝子ＯＲＦの１７１番目塩基配列にグアニン１ｂｐが挿入されたＳＮＰによってタンパク質コドンが変化される特徴を示し、正常可稔（ＤＢＲＭＦ１、ＤＢＲＭＦ２）、オグラ−ＣＧＭＳ、ＮＷＢ−ＣＭＳ系統とＤ−ＣＧＭＳ系統のカルボキシル基末端部分で差異がでるということを確認した（図１４）。
【０１０２】
＜６−４＞Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統に特異的なＳＮＰマーカー開発
前記実施例＜６−３＞で確認されたＳＮＰが、Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統を特異的に選抜することができるかどうかを確認するために、正常可稔（ＤＢＲＭＦ１、ＤＢＲＭＦ２）、オグラ−ＣＧＭＳ、ＮＷＢ−ＣＭＳ及びＤ−ＣＧＭＳ系統３個体ずつを対象に実験を実施した。特に、Ｄ−ＣＧＭＳ−２及びＤ−ＣＧＭＳ−３大根個体は、Ｄ−ＣＧＭＳ無系統を母本に正常可稔系統と交配して得た個体であり、後代でもＤ−ＣＧＭＳ特異的なＳＮＰが遺伝されるかどうかを確認した。ＰＣＲ反応は、正常可稔（ＤＢＲＭＦ１、ＤＢＲＭＦ２）、オグラ−ＣＧＭＳ、ＮＷＢ−ＣＭＳ及びＤ−ＣＧＭＳ系統の総１５の植物体で葉０．１ｇを液体窒素を使用して完全に破砕した後、キット（ＤＮｅａｓｙ  ｐｌａｎｔ  ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ，米国）を使用して抽出し、抽出されたＤＮＡ  １μｌずつを鋳型にして配列番号１５で表わされる順方向プライマー及び配列番号１６で表わされる逆方向プライマーを使用してＰＣＲを行なった。ＰＣＲ条件は、前記実施例＜６−３＞と同一条件で行なった。
【０１０３】
結果的に図１５に示したように、正常可稔（ＤＢＲＭＦ１、ＤＢＲＭＦ２）、オグラ−ＣＧＭＳ、ＮＷＢ−ＣＭＳ及びＤ−ＣＧＭＳ系統すべてでＰＣＲ増幅産物があることを確認し、この増幅産物の塩基配列分析を通じてＤ−ＣＧＭＳ特異的なＳＮＰを確認した（図１５）。図１６に示したように、正常可稔（ＤＢＲＭＦ１、ＤＢＲＭＦ２）、オグラ−ＣＧＭＳ及びＮＷＢ−ＣＭＳ系統では、全て「ＧＧＧ」と分析された。但し、Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統でのみ「ＧＧＧＧ」で、グアニン１ｂｐが挿入された  ＳＮＰを有しているということを証明した（図１６）。また、Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統を母本に正常可稔系統と交配して得たＤ−ＣＧＭＳ−２及びＤ−ＣＧＭＳ−３大根個体でも、Ｄ−ＣＧＭＳ特異的なＳＮＰが存在して、特異的なＳＮＰが後代で正常に母系遺伝されるということを確認した。したがって、前記実施例で確認されたＤ−ＣＧＭＳ特異的なＳＮＰは、正常可稔（ＤＢＲＭＦ１、ＤＢＲＭＦ２）、オグラ−ＣＧＭＳ及びＮＷＢ−ＣＭＳ大根系統ではない特徴であることが確認され、Ｄ−ＣＧＭＳ特異的なＳＮＰを使用して、Ｄ−ＣＧＭＳ大根系統のみを特異的に選抜することができる分子マーカーとして活用できることが分かった。
【受託番号】
【０１０４】
ＫＣＴＣ１１１０１ＢＰ
【配列表フリーテキスト】
【０１０５】
配列番号１：プライマー１
配列番号２：プライマー２
配列番号３：プライマー３
配列番号４：プライマー４
配列番号５：Ｄ−ＣＧＭＳ大根のＰＣＲ増幅産物
配列番号６：プライマー６
配列番号７：プライマー７
配列番号８：Ｄ−ＣＧＭＳ大根のゲノムウォーキング産物
配列番号９：プライマー９
配列番号１０：プライマー１０
配列番号１１：Ｄ−ＣＧＭＳ大根の５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲ増幅産物
配列番号１２：ｏｒｆ２２５
配列番号１３：プライマー１３
配列番号１４：Ｄ−ＣＧＭＳ大根の新規なａｔｐ６
配列番号１５：プライマー１５
配列番号１６：プライマー１６
配列番号１７：ｏｒｆ２６７
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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