(57)【要約】  本発明は、とりわけがんを処置する方法、がんを処置するための組成物、ならびにがんを診断および／または検出するための方法および組成物を提供する。とりわけ、本発明はＦＺＤ１０過剰発現に関連するがんを処置、診断および検出するための組成物および方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＺＤ１０調節剤および１種以上の薬学的に許容される担体を含む組成物であって、当該ＦＺＤ１０調節剤が非正統的タンパク質（Dishevelled）リン酸化、ｃ−Ｊｕｎリン酸化およびβ−カテニンリン酸化から成る群から選択される活性の１種以上を有する、組成物。
【請求項２】
組成物が滅菌された注射剤である、請求項１の組成物。
【請求項３】
ＦＺＤ１０調節剤がDishevelledのリン酸化を低下させ、ｃ−Ｊｕｎのリン酸化を低下させ、そしてβ−カテニンのリン酸化を増加させる阻害剤である、請求項１の組成物。
【請求項４】
ＦＺＤ１０調節剤がDishevelledのリン酸化を減少させる、請求項１の組成物。
【請求項５】
ＦＺＤ１０調節剤がＦＺＤ１０とDishevelledの結合を阻害する、請求項１の組成物。
【請求項６】
ＦＺＤ１０調節剤がオリゴヌクレオチド、小分子、模倣物、可溶性受容体、デコイ受容体または抗体である、請求項１の組成物。
【請求項７】
ＦＺＤ１０調節剤が少なくとも１×１０８Ｋａの親和性でＦＺＤ１０と結合するモノクローナル抗体である、請求項１の組成物。
【請求項８】
ＦＺＤ１０調節剤がＦＺＤ１０と選択的に結合し、ＦＺＤ１０−関連生物学的活性の１種以上を調節するモノクローナル抗体である、請求項１の組成物。
【請求項９】
モノクローナル抗体がヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体である、請求項７の組成物。
【請求項１０】
モノクローナル抗体がＦＺＤ１０のエピトープと結合し、当該エピトープが第１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、第２のＥＣＤ、第３のＥＣＤ、第４のＥＣＤおよびリガンド結合ドメインから成る群から選択される、請求項７の組成物。
【請求項１１】
モノクローナル抗体がＦＺＤ１０のＥＣＤのエピトープと結合する、請求項７の組成物。
【請求項１２】
モノクローナル抗体が第１のＥＣＤのエピトープと結合する、請求項１１の組成物。
【請求項１３】
モノクローナル抗体が第１のＥＣＤと結合しない、請求項７の組成物。
【請求項１４】
モノクローナル抗体がＦＺＤ９と交叉反応しない、請求項７の組成物。
【請求項１５】
モノクローナル抗体が他の診断薬または治療剤と複合されている（conjugated）、請求項７の組成物。
【請求項１６】
必要とする患者におけるがんまたはがん症状を処置する方法であって、当該患者に治療上有効量の請求項１のＦＺＤ１０調節剤を投与することを含む方法。
【請求項１７】
ＦＺＤ１０調節剤がDishevelledのリン酸化を低下させる、請求項１６の方法。
【請求項１８】
ＦＺＤ１０調節剤が対照と比較して少なくとも５０％ＦＺＤ１０発現を阻害する、請求項１７の方法。
【請求項１９】
ＦＺＤ１０調節剤がオリゴヌクレオチド、小分子、模倣物、可溶性受容体、デコイ受容体または抗体である、請求項１６の方法。
【請求項２０】
ＦＺＤ１０調節剤がモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、またはＦａｂフラグメントである、請求項１６の方法。
【請求項２１】
抗体が標識化されている、請求項２０の方法。
【請求項２２】
標識が酵素、ラジオアイソトープ、毒素または蛍光色素である、請求項２１の方法。
【請求項２３】
抗体がＦＺＤ１０以外のポリペプチドについて約１×１０５Ｋａ未満の結合親和性を有する、請求項２０の方法。
【請求項２４】
ＦＺＤ１０調節剤がモノクローナル抗体である、請求項１６の方法。
【請求項２５】
モノクローナル抗体が少なくとも１×１０８Ｋａの親和性でＦＺＤ１０と結合する、請求項２４の方法。
【請求項２６】
モノクローナル抗体がＦＺＤ１０のエピトープと結合し、当該エピトープが第１のＥＣＤ、第２のＥＣＤ、第３のＥＣＤ、第４のＥＣＤおよびリガンド結合ドメインから成る群から選択される、請求項２４の方法。
【請求項２７】
モノクローナル抗体がＦＺＤ１０の第１のＥＣＤのエピトープと結合する、請求項２４の方法。
【請求項２８】
モノクローナル抗体がＦＺＤ１０の第１のＥＣＤと結合しない、請求項２４の方法。
【請求項２９】
モノクローナル抗体がＦＺＤ９と結合しない、請求項２４の方法。
【請求項３０】
モノクローナル抗体がDishevelledのリン酸化を低下させ、ｃ−Ｊｕｎのリン酸化を低下させ、そしてβ−カテニンのリン酸化を増加させる、請求項２４の方法。
【請求項３１】
がんが卵巣がん、大腸がん、肺がん、胃がんまたは子宮がんである、請求項１６の方法。
【請求項３２】
患者に常套のがん治療薬を投与することをさらに含む、請求項１６の方法。
【請求項３３】
化学療法、放射線療法または外科手術による患者の処置をさらに含む、請求項１６の方法。
【請求項３４】
がん症状が疼痛、死亡、体重減少、衰弱、食欲不振、血便、吐き気、嘔吐、肝臓転移、肺転移、骨転移、腹部膨満、腫張、腹腔内体液、膣出血、便秘症、腹部膨満、大腸の穿孔、急性腹膜炎（感染、熱、疼痛）、吐血および嚥下困難から成る群から選択される、請求項１６の方法。
【請求項３５】
患者におけるＦＺＤ１０−関連生物学的活性を調節する方法であって、当該患者にＦＺＤ１０生物学的活性を調節するのに有効な量の請求項１のＦＺＤ１０調節剤を投与することを含む方法。
【請求項３６】
ＦＺＤ１０調節剤がＦＺＤ１０と選択的に結合するモノクローナル抗体である、請求項３５の方法。
【請求項３７】
患者が卵巣がん、大腸がん、肺がんまたは子宮がんの１種以上を有するかまたはその素因を有する、請求項３５の方法。
【請求項３８】
ＦＺＤ１０調節剤が抗体であり、そして対象にインビボ治療抗体遺伝子導入によって投与される、請求項１６の方法。
【請求項３９】
ＦＺＤ１０治療に受容性である患者を同定する方法であって：
（ａ）サンプルにおけるＦＺＤ１０発現の証拠の有無を検出し、ここで当該サンプルにおけるＦＺＤ１０発現の証拠の存在がＦＺＤ１０治療の候補である患者の指標であり、そしてサンプルにおけるＦＺＤ１０発現の証拠の非存在がＦＺＤ１０治療の候補ではない患者の指標であり；
（ｂ）患者がＦＺＤ１０治療の候補であるとき、当該患者に治療上有効量の請求項１の組成物を投与し； 
（ｃ）患者がＦＺＤ１０治療の候補でないとき、当該患者に常套のがん治療薬を投与する；
ことを含む方法。
【請求項４０】
ＦＺＤ１０の発現が、対照と比較して少なくとも３０％の増加である、請求項３９の方法。
【請求項４１】
ＦＺＤ１０の発現が、対照と比較して少なくとも５０％の増加である、請求項３９の方法。
（請求項４１）
ＦＺＤ１０の発現が、対照と比較して少なくとも１００％の増加である、請求項３９の方法。
【請求項４２】
ＦＺＤ１０発現の証拠がＦＺＤ１０  ＲＮＡを測定することによって検出される、請求項３９の方法。
【請求項４３】
ＦＺＤ１０発現の証拠がＦＺＤ１０発現生成物を測定することによって検出される、請求項３９の方法。
【請求項４４】
患者が卵巣がん、大腸がん、肺がんまたは子宮がんの１種以上を有するかまたはその素因を有する、請求項３９の方法。
【請求項４５】
患者に常套のがん治療薬を投与することをさらに含む、請求項３９の方法。
【請求項４６】
必要とする患者におけるがん細胞増殖を阻害する方法であって、当該患者に治療上有効量の請求項１のＦＺＤ１０調節剤を投与することを含む方法。
【請求項４７】
ＦＺＤ１０調節剤が、ＦＺＤ１０と特異的に結合し、そしてDishevelledのリン酸化を低下させるモノクローナル抗体である、請求項４６の方法。
【請求項４８】
必要とする患者におけるがん細胞表現型を阻害する方法であって、当該患者に治療上有効量の請求項１のＦＺＤ１０調節剤を投与することを含む方法。
【請求項４９】
がん細胞表現型が軟寒天におけるコロニー形成および３次元基底膜または細胞外膜分画（membrane preparation）における管状ネットワーク形成の１種以上である、請求項４８の方法。
【請求項５０】
患者に常套のがん治療薬を投与することをさらに含む、請求項４８の方法。
【請求項５１】
化学療法、放射線療法または外科手術による患者の処置をさらに含む、請求項４８の方法。
【請求項５２】
がん細胞が卵巣がん細胞、大腸がん細胞、肺がん細胞または子宮がん細胞から成る群から選択される、請求項４８の方法。
【請求項５３】
患者における腫瘍を検出する方法であって、当該患者に造影剤と結合した請求項１のＦＺＤ１０調節剤を含む組成物を投与して、患者における該造影剤の局在を検出することを含む方法。
【請求項５４】
ＦＺＤ１０調節剤が小分子、オリゴヌクレオチド、模倣物、可溶性受容体、デコイ受容体または抗体から成る群から選択される、請求項５３の方法。
【請求項５５】
組成物が造影剤と結合した抗ＦＺＤ１０抗体を含む、請求項５３の方法。
【請求項５６】
造影剤が１８Ｆ、４３Ｋ、５２Ｆｅ、５７Ｃｏ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、７７Ｂｒ、８７ＭＳｒ、８６Ｙ、９０Ｙ、９９ＭＴｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１２７Ｃｓ、１２９Ｃｓ、１３１Ｉ、１３２Ｉ、１９７Ｈｇ、２０３Ｐｂまたは２０６Ｂｉである、請求項５５の方法。
【請求項５７】
ＦＺＤ１０調節剤が小分子、オリゴヌクレオチド、模倣物、可溶性受容体、デコイ受容体または抗体から成る群から選択される、請求項５３の方法。
【請求項５８】
ＦＺＤ１０調節剤がＦＺＤ１０と選択的に結合し、そしてDishevelledのリン酸化を低下させるモノクローナル抗体であ、請求項５３の方法。
【請求項５９】
ＣＨＯ細胞または骨髄腫細胞における抗ＦＺＤ１０抗体を発現させる方法であって、当該ＣＨＯ細胞または骨髄腫細胞における抗ＦＺＤ１０抗体をコードする核酸を発現させることを含み、ここで該抗ＦＺＤ１０抗体がＦＺＤ１０−関連生物学的活性の１種以上を阻害する方法。
【請求項６０】
対照と比較してＦＺＤ１０の過剰発現によって特徴付けられるがんのがん阻害剤を同定する方法であって、ＦＺＤ１０を発現する細胞を候補化合物と接触させ、そしてＦＺＤ１０−関連生物学的活性が調節されるかを測定することを含む方法：ここで誘導性ＦＺＤ１０−関連生物学的活性がDishevelled、ｃ−Ｊｕｎおよびβ−カテニンのリン酸化から成る群から選択され、ＦＺＤ１０−関連生物学的活性の調節ががん阻害剤の指標となる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は一般に、腫瘍学の分野に関する。より具体的には、本発明はがんを処置する方法、がんを処置するための組成物、ならびにがんを診断および／または検出するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
がんは米国における第２の主たる死亡原因である。「がん」は多くの異なるタイプのがん、すなわち乳がん、前立腺がん、肺がん、大腸がん、膵臓がんを記述するために使用されるが、がんの各タイプは表現型レベルおよび遺伝子的レベルのいずれにおいても異なる。がんの脱制御増殖特性は変異のために１個以上の遺伝子の発現が脱制御されるときに発生し、そうすると細胞増殖を最早制御することができない。
【０００３】
Frizzled抗原はWntタンパク質リガンドに対する結合部位を有するＧタンパク質結合受容体様受容体のファミリーであり、これは遺伝子発現の上方制御因子として作用する分泌型分子である。受容体−リガンド対のこのファミリーのメンバーは、胚発生に関与しており、そして細胞増殖および胚発生中の細胞の最終的帰趨に関与し得る。ほとんどのfrizzled受容体は、非正統的（dishevelled）タンパク質の活性化、ＧＳＫ−３キナーゼの阻害、β−カテニンの核蓄積およびWnt標的遺伝子の活性化を導くβ−カテニンの正統的（canonical）シグナル伝達経路に結合する。ＰＫＣおよびカルシウム流動を含む第２のシグナル伝達経路はいくつかのファミリーメンバーについて見られるが、これは異なる経路を意味するのか、またはこれは正統的経路に統合され得るのかまだ不明である。
【０００４】
１８種のWnt遺伝子および１０種のFrizzled遺伝子が存在し、これらは全て構造的に高度に類似していて、これらが現在までにヒトゲノムデータベースから同定されている（Science, 291:1304-1351 (2001)）。また、５種の分泌型Frizzled形態も存在する。各Ｆｚ遺伝子は、大きな細胞外部分、７個の推定膜貫通ドメインおよび細胞質尾部を有する内在性膜タンパク質をコードする（Wang, et al., J. Biol. Chem. 271, 4468-4476(1996)； Vinson et al., Nature (London) 338, 263-264(1989)）。細胞外部分のＮＨ２末端付近は、ＦＺファミリーの他のメンバーでも良好に保存されているシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）である（Wang, et al., J. Biol. Chem. 271, 4468-4476(1996)）。１０個の不変システインを含む１１０アミノ酸残基から成るＣＲＤは、Wntリガンドの推定結合部位である（Bhanot et al., Nature (London) 382, 225-230(1996)）。
【０００５】
Frizzled受容体は２量体化することができ、この２量体化はＷｎｔ／β−カテニン経路の活性化に関連している（Carron et al., Journal of Cell Science, 116:2541-2550 (2003)）。
【０００６】
Frizzled-10（ＦＺＤ１０）はクローン化され、特徴付けられている（Koike et al., Biochem Biophys Res Commun., 262(1):39-43(1999)）。ヌクレオチド配列分析によってヒトＦＺＤ１０遺伝子が、Ｎ末端システインリッチドメインおよびＣ末端Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｘｘｘ−Ｖａｌモチーフを有する５８１アミノ酸の７膜貫通受容体をコードすることが示された。４．０ｋｂサイズの大量のＦＺＤ１０  ｍＲＮＡが、胎盤および胎児腎臓において、さらに胎児肺および脳において検出された。成人脳においてＦＺＤ１０  ｍＲＮＡは小脳で豊富であった。ＦＺＤ１０遺伝子はヒト染色体地図の１２ｑ２４．３３に存在した。ＦＺＤ１０はFrizzled-9（ＦＺＤ９）と６５．７％同一のアミノ酸を共有する。ＦＺＤ１０およびＦＺＤ９はFrizzled遺伝子のサブファミリーを構成する。
【０００７】
がんに関与する分子を調節する組成物および方法を同定することが必要とされている。本発明は、これらおよび他の、重要な必要性を対象とする。
【発明の概要】
【０００８】
発明の要約
本発明の物質および方法は、上記および当該技術分野における他の関連する必要を満足する。
【０００９】
本発明の１つの態様において、ＦＺＤ１０調節剤および１種以上の薬学的に許容される担体を含む組成物であって、当該ＦＺＤ１０調節剤がDishevelledリン酸化、ｃ−Ｊｕｎリン酸化、およびβ−カテニンリン酸化から成る群から選択される１種以上の活性を有する組成物を提供する。他の態様において、滅菌された注射液である上記組成物を提供する。さらに他の態様において、ＦＺＤ１０調節剤がDishevelledリン酸化を低下させ、ｃ−Ｊｕｎのリン酸化を低下させ、そしてβ−カテニンのリン酸化を増加させる阻害剤である上記組成物を提供する。関連する態様において、ＦＺＤ１０調節剤がDishevelledリン酸化を低下させるか、またはＦＺＤ１０調節剤がＦＺＤ１０とDishevelledの結合を阻害する上記組成物を提供する。
【００１０】
本発明の他の態様において、ＦＺＤ１０調節剤がオリゴヌクレオチド、小分子、模倣物、可溶性受容体、デコイまたは抗体である上記組成物を提供する。他の態様において、ＦＺＤ１０調節剤が少なくとも１×１０８Ｋａの親和性でＦＺＤ１０と結合するモノクローナル抗体である上記組成物を提供する。他の態様において、ＦＺＤ１０調節剤が少なくとも１×１０７Ｋａ、少なくとも１×１０６Ｋａ、少なくとも１×１０５Ｋａ、少なくとも１×１０４Ｋａの親和性でＦＺＤ１０と結合するモノクローナル抗体である上記組成物を提供する。さらに他の態様において、ＦＺＤ１０調節剤がＦＺＤ１０と選択的に結合し、ＦＺＤ−１０関連生物学的活性の１種以上を調節する上記組成物を提供する。さらに他の態様において、モノクローナル抗体はヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体である。関連する態様において、モノクローナル抗体は第１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、第２のＥＣＤ、第３のＥＣＤ、第４のＥＣＤおよびリガンド結合ドメインから成る群から選択される、ＦＺＤ１０のエピトープと結合する。さらに他の態様において、モノクローナル抗体はＥＣＤのエピトープと結合する。さらに他の態様において、モノクローナル抗体は第１のＥＣＤのエピトープと結合する。他の態様において、モノクローナル抗体は第１のＥＣＤと結合しない。さらに他の態様において、モノクローナル抗体はＦＺＤ９と交叉反応しない。さらに他の態様において、モノクローナル抗体は他の診断薬または治療剤と結合する。
【００１１】
本発明の他の態様において、それを必要とする患者におけるがんまたはがん症状を処置する方法であって、当該患者に治療上有効量の上記ＦＺＤ１０調節剤を投与することを含む方法を提供する。他の態様において、ＦＺＤ１０調節剤がDishevelledリン酸化を低下させる上記方法を提供する。さらに他の態様において、ＦＺＤ１０調節剤が対照と比較して少なくとも５０％のＦＺＤ発現を阻害する上記方法を提供する。他の態様において、ＦＺＤ１０調節剤がオリゴヌクレオチド、小分子、模倣物、可溶性受容体、デコイ受容体、または抗体である上記方法を提供する。関連する態様において、ＦＺＤ１０調節剤はモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、またはＦａｂフラグメントである。他の態様において、抗体が標識化されている上記方法を提供する。関連する態様において、標識は酵素、放射性同位体、毒素または蛍光色素である。
【００１２】
他の態様において、抗体がＦＺＤ１０以外のポリペプチドについて約１×１０５Ｋａ未満の結合親和性を有する上記方法を提供する。さらに他の態様において、ＦＺＤ１０調節剤がモノクローナル抗体である上記方法を提供する。関連する態様において、モノクローナル抗体は少なくとも１×１０８Ｋａの親和性でＦＺＤ１０と結合する。さらに他の態様において、モノクローナル抗体は、第１のＥＣＤ、第２のＥＣＤ、第３のＥＣＤ、第４のＥＣＤおよびリガンド結合ドメインから成る群から選択されるＦＺＤ１０のエピトープと結合する。他の態様において、モノクローナル抗体はＦＺＤ１０の第１のＥＣＤのエピトープと結合する。別の態様において、モノクローナル抗体はＦＺＤ１０の第１のＥＣＤと結合しない。他の態様において、モノクローナル抗体がＦＺＤ９と結合しない上記方法を提供する。
【００１３】
本発明のさらに他の態様において、モノクローナル抗体がDishevelledリン酸化を低下させ、ｃ−Ｊｕｎのリン酸化を低下させ、そしてβ−カテニンのリン酸化を増加させる、上記方法を提供する。他の態様において、がんが卵巣がん、大腸がん、肺がん、胃がんまたは子宮がんである上記方法を提供する。
【００１４】
他の態様において、ＦＺＤ１０調節剤がオリゴヌクレオチドである上記方法を提供する。さらに他の態様において、患者に常套のがん治療薬を投与することをさらに含む上記方法を提供する。他の態様において、化学療法、放射線療法または外科手術で患者を処置することをさらに含む上記方法を提供する。さらに他の態様において、がん症状が疼痛、死亡、体重減少、衰弱、食欲不振、血便、吐き気、嘔吐、肝臓転移、肺転移、骨転移、腹部膨満、腫張、腹腔内体液、膣出血、便秘症、腹部膨満、大腸の穿孔、急性腹膜炎（感染、熱、疼痛）、吐血および嚥下困難から成る群から選択される、上記方法を提供する。
【００１５】
本発明の他の態様は、患者におけるＦＺＤ１０−関連生物学的活性を調節する方法であって、当該患者にＦＺＤ１０生物学的活性の調節に有効な量の上記ＦＺＤ１０調節剤を投与することを含む方法を提供する。他の態様において、ＦＺＤ１０調節剤はＦＺＤ１０と選択的に結合するモノクローナル抗体である。さらに他の態様において、患者は卵巣がん、大腸がん、肺がんまたは卵巣がんの１種以上を有するかまたはその素因を有する。さらに他の態様において、ＦＺＤ１０調節剤は抗体であり、対象にインビボ治療抗体遺伝子導入によって投与される。
【００１６】
本発明の他の態様において、ＦＺＤ１０治療に受容性である患者を同定する方法であって、サンプルにおけるＦＺＤ１０発現の証拠の有無を検出し、ここで当該サンプルにおけるＦＺＤ１０発現の証拠の存在がＦＺＤ１０治療の候補である患者の指標であり、そしてサンプルにおけるＦＺＤ１０発現の証拠の非存在がＦＺＤ１０治療の候補ではない患者の指標であり；患者がＦＺＤ１０治療の候補であるとき、当該患者に治療上有効量の上記組成物を投与し；そして患者がＦＺＤ１０治療の候補でないとき、当該患者に常套のがん治療薬を投与することを含む方法を提供する。関連する態様において、ＦＺＤ１０の発現が、対照と比較して少なくとも３０％の増加である。他の関連する態様において、ＦＺＤ１０の発現が、対照と比較して少なくとも５０％の増加である。さらに他の態様において、ＦＺＤ１０の発現が、対照と比較して少なくとも１００％の増加である。
【００１７】
他の方法において、ＦＺＤ１０発現の証拠がＦＺＤ１０  ＲＮＡを測定することによって検出される上記方法を提供する。他の態様において、ＦＺＤ１０発現の証拠がＦＺＤ１０発現生成物を測定することによって検出される。他の態様において、患者が卵巣がん、大腸がん、肺がんまたは子宮がんの１種以上を有するかまたはその素因を有する、上記方法を提供する。他の態様において、患者に常套のがん治療薬を投与することをさらに含む上記方法を提供する。
【００１８】
他の態様において、それを必要とする患者におけるがん細胞増殖を阻害する方法であって、当該患者に治療上有効量の上記ＦＺＤ１０調節剤を投与することを含む方法を提供する。他の態様において、ＦＺＤ１０調節剤が、ＦＺＤ１０と特異的に結合し、そしてDishevelledのリン酸化を低下させるモノクローナル抗体である上記方法を提供する。
【００１９】
本発明の他の態様において、それを必要とする患者におけるがん細胞表現型を阻害する方法であって、当該患者に治療上有効量の上記ＦＺＤ１０調節剤を投与することを含む方法を提供する。他の態様において、がん細胞表現型が軟寒天におけるコロニー形成および３次元基底膜または細胞外膜分画（membrane preparation）における管状ネットワーク形成の１種以上である上記方法を提供する。他の態様において、患者に常套のがん治療薬を投与することをさらに含む上記方法を提供する。さらに他の態様において、化学療法、放射線療法または外科手術による患者の処置をさらに含む上記方法を提供する。さらに他の態様において、がん細胞が卵巣がん細胞、大腸がん細胞、肺がん細胞または子宮がん細胞から成る群から選択される上記方法を提供する。
【００２０】
本発明のさらに他の態様において、患者における腫瘍を検出する方法であって、当該患者に造影剤と結合した上記ＦＺＤ１０調節剤を含む組成物を投与して、患者における該造影剤の局在を検出することを含む方法を提供する。他の態様において、ＦＺＤ１０調節剤が小分子、オリゴヌクレオチド、模倣物、可溶性受容体、デコイ受容体または抗体から成る群から選択される上記方法を提供する。さらに他の態様において、組成物が造影剤と結合した抗ＦＺＤ１０抗体を含む上記方法を提供する。関連する態様において、造影剤が１８Ｆ、４３Ｋ、５２Ｆｅ、５７Ｃｏ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、７７Ｂｒ、８７ＭＳｒ、８６Ｙ、９０Ｙ、９９ＭＴｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１２７Ｃｓ、１２９Ｃｓ、１３１Ｉ、１３２Ｉ、１９７Ｈｇ、２０３Ｐｂまたは２０６Ｂｉである。
【００２１】
他の態様において、ＦＺＤ１０調節剤が小分子、オリゴヌクレオチド、模倣物、可溶性受容体、デコイ受容体または抗体から成る群から選択される上記方法を提供する。他の態様において、ＦＺＤ１０調節剤がＦＺＤ１０と選択的に結合し、そしてDishevelledのリン酸化を低下させるモノクローナル抗体である上記方法を提供する。さらに他の態様において、抗体が毒性エフェクター分子と結合する上記方法を提供する。
【００２２】
本発明のさらに他の態様において、ＣＨＯ細胞または骨髄腫細胞における抗ＦＺＤ１０抗体を発現させる方法であって、当該ＣＨＯ細胞または骨髄腫細胞における抗ＦＺＤ１０抗体をコードする核酸を発現させることを含み、ここで該抗ＦＺＤ１０抗体がＦＺＤ１０−関連生物学的活性の１種以上を阻害する方法を提供する。さらに他の態様において、対照と比較してＦＺＤ１０の過剰発現によって特徴付けられるがんのがん阻害剤を同定する方法であって、ＦＺＤ１０を発現する細胞を候補化合物と接触させ、そしてＦＺＤ１０−関連生物学的活性が調節されるかを測定することを含む方法を提供する：ここで調節されるＦＺＤ１０−関連生物学的活性がDishevelled、ｃ−Ｊｕｎおよびβ−カテニンのリン酸化から成る群から選択され、ＦＺＤ１０−関連生物学的活性の調節ががん阻害剤の指標となる。
【００２３】
本発明のこれらおよび他の局面は、下記発明の詳細な説明において説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
図面の簡単な説明
【図１】図１は肺がん、卵巣がんおよび子宮がんにおけるＦＺＤ１０の上方制御を示す。
【００２５】
【図２】図２はＬＣＭ解剖大腸がんにおけるＦＺＤ１０の上方制御を示す。
【００２６】
【図３】図３は原発性大腸がん、肺がんおよび卵巣がん患者のＦＺＤ１０定量ＲＴ−ＰＣＲを示す。
【００２７】
【図４】図４は異なるがん細胞系におけるＦＺＤ１０の表面発現を示す。
【００２８】
【図５】図５はｓｉＲＮＡによるＮＣＩ−Ｈ４６０細胞におけるＦＺＤ１０タンパク質およびｍＲＮＡの表面発現の減少を示す。
【００２９】
【図６】図６はＦＺＤ１０ノックダウンによるＮＣＩ−Ｈ４６０細胞における成長の阻害とアポトーシスの誘導を示す。
【００３０】
【図７】図７はＦＺＤ１０ノックダウンによるＥＫＶＸ  ＮＳＣＬＣ細胞系における成長の阻害とアポトーシスの誘導を示す。
【００３１】
【図８】図８はＦＺＤ１０ノックダウンによってＡＰＣ変異大腸がん細胞系ＳＷ６２０において成長が阻害されず、そしてアポトーシスが誘導されないことを示す。
【００３２】
【図９】図９はＦＺＤ１０ノックダウンによってＡＰＣ変異大腸がん細胞系Ｃｏｌｏ３２０ＤＭにおいて成長が阻害されず、そしてアポトーシスが誘導されないことを示す。
【００３３】
【図１０】図１０は抗−ＦＺＤ１−抗体ががん細胞系においてＦＺＤ１０を認識することを示す。
【００３４】
【図１１】図１１はＤｖｌ２とＤｖｌ３の両方の超リン酸化を引き起こすＦＺＤ９またはＦＺＤ１０の過剰発現を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
詳細な説明
本発明は、がんの処置、診断および造影のための、とりわけＦＺＤ１０関連がんの処置、診断および造影のための方法および組成物を提供する。
【００３６】
定義
本明細書を通じて様々な定義を用いる。多くの語は当業者によって理解される意味を有する。本明細書において具体的に定義した語は、本発明の文脈において全体として、そして典型的には当業者に理解されるとおりに提供される意味を有する。
【００３７】
本発明の実施は、そうでないと断らない限り、化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬学の分野における常套の方法を使用する。かかる技術は文献に十分に説明されている。例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990)； Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.)；および Handbook of Experimental Immunology, Vols. I IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications)；および Sambrook et al., Molecular cloning:  A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989)参照。
【００３８】
本明細書において使用するとき、単数形“ａ”、“ａｎ”および“ｔｈｅ”には、異なると明確に断らない限り、複数についての言及を含む。したがって例えば、「抗体」という記述には、かかる抗体の２種以上の混合物が含まれる。
【００３９】
本明細書において使用するとき、「約」なる用語は、＋／−３０％、＋／−２０％、＋／−１０％、または＋／−５％の値を意味する。本明細書において使用するとき、「ＦＺＤ１０」または「Frizzled-10」なる用語は、配列番号２の受容体、またはその天然に生じるスプライシング多型もしくは対立遺伝子多型を意味する。Wnt-1、Wnt3a（Munji, R. N et al., Developmental Biology 271 (2): 605-605, 2004-abstract from Meeting）、Wnt-2（Saitoh, T et al., International Journal of Oncology 20 (1): 117-120, 2002）、Wnt-7a（Kawakami, Y. et al., Dev Growth Differ 42 (6): 561-9, 2000）、Wnt7b（Wang, Z. et al., Mol Cell Biol 25 (12): 5022-30, 2005）、Wnt-8（Terasaki, H. et al., Int J Mol Med  9(2):107-12, 2002）、Wnt-3および非−WNTリガンドHIG2（Togashi, A. et al., Cancer Res 65 (11): 4817-26, 2005 ）は、Frizzled-10のリガンドであると考えられている。
【００４０】
GeneCardにおいて、ＦＺＤ１０はＦＺ−１０、frizzled（Drosophila）ホモログ１０、frizzled ホモログ １０（Drosophila）、Frizzled 10前駆体、Frizzled-10、Fz-10、FzE7、FzE7、hFz10、およびhFz10としても知られている。ＦＺＤ１０の配列は受託番号NM_007197に示されている。ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列はそれぞれ配列番号１および配列番号２に示す。Frizzled-10は、推定細胞外結合ドメインを含む配列番号２の２９−１５０位にＮ−末端システインリッチ細胞外ドメインを有する、５８１アミノ酸の７個の膜貫通受容体である。他のドメインは、大型の第１細胞外ドメインとして配列番号２の２１−２２１位に；第２の細胞外ドメインとして配列番号２の２８４−３１２位に；第３の細胞外ドメインとして配列番号２の３７３−３９４位に；そして第４の細胞外ドメインとして配列番号２の４６５−５０３位に；第１の膜貫通ドメインとして配列番号２の２２６−２４６位に；第２の膜貫通ドメインとして配列番号２の２６３−２８３位に；第３の膜貫通ドメインとして配列番号２の３１２−３３２位に；第４の膜貫通ドメインとして配列番号２の３５２−３７２位に；第５の膜貫通ドメインとして配列番号２の３９４−４１４位に；第６の膜貫通ドメインとして配列番号２の４４４−４６４位に；第７の膜貫通ドメインとして配列番号２の５０３−５２３位に、位置する。
【００４１】
「ポリペプチド」および「タンパク質」なる用語は、相互に交換可能に使用され、そしてあらゆる長さのアミノ酸のポリマー形態を意味し、これはコードおよび非コードアミノ酸、化学的もしくは生化学的修飾もしくは誘導化アミノ酸、および修飾ペプチド主鎖を含み得る。当該用語には、異種アミノ酸配列との融合タンパク質、Ｎ末端メチオニン残基を有するかまたは有さない異種および同種リーダー配列との融合物；免疫標識タンパク質等を含む融合タンパク質が含まれるが、これらに限らない。
【００４２】
「個体」、「対象」、「宿主」および「患者」なる用語は、相互に交換可能に使用され、そして診断、処置または治療が望まれるあらゆる対象、とりわけヒトを意味する。他の対象には、ウシ、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ等が含まれ得る。好ましい態様において、対象はヒトである。
【００４３】
本明細書において使用するとき、「がん」は原発性または転移性がんを意味する。「がん細胞」なる用語は、形質転換した細胞を意味する。これらの細胞はがんを有する患者から単離することができるか、またはインビトロでがん様になるように形質転換した細胞である。がん細胞はあらゆる組織または細胞培養系を含む多くのタイプのサンプルに由来し得る。いくつかの態様において、がん細胞は過形成、腫瘍細胞、または新生物である。いくつかの態様において、がん細胞は卵巣、子宮、大腸、食道、胸、前立腺、白血病、黒色腫、肺、脳、肝臓、膵臓、およびリンパ腫がんから単離される。いくつかの態様において、がん細胞は一般に利用可能な確立された細胞系から得る。いくつかの態様において、がん細胞は既存の患者サンプルまたはがん細胞を含むライブラリーから単離する。いくつかの態様において、がん細胞は異なる宿主に、例えば異種移植片で単離および移植する。いくつかの態様において、がん細胞はＳＣＩＤマウスモデルにおいて移植および使用する。いくつかの態様において、がんは卵巣がん、大腸がん、肺がんまたは子宮がんである。
【００４４】
本明細書において使用するとき、「形質転換」なる用語は、子孫によって安定的に受け継がれる細胞の特性のあらゆる変化を意味する。好ましい態様において、「形質転換」は正常細胞からがん様細胞、例えば腫瘍を惹起し得るものへの変化を意味する。いくつかの態様において、形質転換細胞は不死化されている。
【００４５】
本明細書において使用するとき、「転移」なる用語は、がんの起源から、例えば原発性腫瘍から離れた場所に広がったがんを意味する。転移位置は、骨、リンパ節、肺、肝臓および脳を含むが、これらに限定されない。
【００４６】
本明細書において使用するとき、「臨床的エンドポイント」なる用語は、がんの測定可能な事象指標を意味する。臨床的エンドポイントには、これらに限定されないが、第１転移の時間、続く転移の時間、転移のサイズおよび／または数、腫瘍のサイズおよび／または数、腫瘍の位置、腫瘍の悪性度、生活の質、疼痛等が含まれる。当業者は臨床的エンドポイントを決定し、測定する能力を有すると考えられる。臨床的エンドポイントを測定する方法は当業者に既知である。
【００４７】
本明細書において使用するとき、「サンプル」なる用語は、患者由来の生物学的材料を意味する。本発明によってアッセイされるサンプルは、いずれかの具体的なタイプに限定されない。サンプルには、１種の細胞、複数種の細胞、組織、腫瘍、生物学的体液、生物学的分子、または上記のいずれかの上清もしくは抽出物が含まれるが、これらに限定されない。例えば、生検のために採取された組織、解剖中に採取された組織、血液、尿、リンパ組織、リンパ液、脳脊髄液、粘膜および糞便サンプルが含まれる。使用するサンプルはアッセイフォーマット、検出方法ならびにアッセイする腫瘍、組織、細胞または抽出物の性質にによって変る。サンプルを製造する方法は当業者に周知であり、利用する方法に適合するサンプルを得るために容易に採用することができる。
【００４８】
本明細書において使用するとき、「生物学的分子」なる用語には、ポリペプチド、核酸および糖が含まれるが、これらに限定されない。
【００４９】
本明細書において使用するとき、「調節」なる用語は、細胞内、外または表面の遺伝子、タンパク質またはいずれかの分子の質または量の変化を意味する。変化は分子の発現またはレベルの増加または減少であり得る。「調節する」なる用語も、生物学的機能／活性、例えば増殖、分泌、接着、アポトーシス、細胞から細胞へのシグナル伝達等の質または量の変化を含むが、これらに限定されない。例えば、「細胞分裂の調節」という文脈において、当該用語は細胞分裂の速度、量または程度に影響することを意味する。いくつかの態様において、当該方法は細胞分裂を完全に阻害する。他の態様において、当該方法は細胞分裂の量を減少させる。他の態様において、当該方法は細胞分裂を予防する。
【００５０】
本明細書において使用するとき、「Ｎ末端」なる用語は、タンパク質の最初の１０アミノ酸を意味する。
【００５１】
本明細書において使用するとき、「Ｃ末端」なる用語は、タンパク質の最後の１０アミノ酸を意味する。
【００５２】
本明細書において使用するとき、「細胞−細胞相互作用」なる用語は、２種以上の細胞間の相互作用を意味する。いくつかの態様において、細胞間の相互作用は細胞シグナルを導く。細胞−細胞相互作用は、当業者に既知の種々の方法、例えばＰＫＨ２６およびＰＫＨ６７（Sigma）を含む異なる蛍光膜染色で標識化した共培養、前標識化細胞間の膜交換の観察によって検出することができるが、検出法はこれに限られない。
【００５３】
「ドメイン」なる用語は、本明細書において使用するとき、生物分子の既知の、または推定される機能に寄与する生物分子の構造部分を意味する。ドメインは複数の領域または部分に共存してもよく、そしてまた特定の領域の全てまたは部分に加えて該領域から区別される生物分子の部分を含んでもよい。
【００５４】
本明細書において使用するとき、「リガンド結合ドメイン」なる用語は、対応する天然配列ＦＺＤ１０受容体の少なくとも１つの定性的結合活性を保持した受容体のいずれかの部分または領域を意味する。
【００５５】
「領域」なる用語は、生物分子の１次構造の物理的に連続した部分を意味する。タンパク質の場合、領域はタンパク質のアミノ酸配列の連続部分によって定義される。いくつかの態様において、「領域」は生物分子の機能に関連する。
【００５６】
「部分」なる用語は、本明細書において使用するとき、生物分子の１次構造の物理的に連続した部分を意味する。タンパク質の場合、部分はタンパク質のアミノ酸配列の連続部分によって定義され、そして少なくとも３−５アミノ酸、少なくとも５−７アミノ酸、少なくとも８−１０アミノ酸、少なくとも１１−１５アミノ酸、少なくとも１７−２４アミノ酸、少なくとも２５−３０アミノ酸、および少なくとも３０−４５アミノ酸を意味する。オリゴヌクレオチドの場合、部分はオリゴヌクレオチドの核酸配列の連続部分によって定義され、そして少なくとも９−１５ヌクレオチド、少なくとも１８−３０ヌクレオチド、少なくとも３３−４５ヌクレオチド、少なくとも４８−７２ヌクレオチド、少なくとも７５−９０ヌクレオチド、および少なくとも９０−１３０ヌクレオチドを意味する。いくつかの態様において、生物分子の部分は生物学的活性を有する。
【００５７】
本明細書において使用するとき、「アゴニスト」なる用語は、ＦＺＤ１０と結合することができ、そしてＦＺＤ１０の１種以上の生物学的活性を活性化することができる分子を意味する。ＦＺＤ１０アゴニストには、Wnt-1、Wnt-3およびWnt-7bを含む天然ＦＺＤ１０リガンド、ならびにＦＺＤ１０と結合し、その１種以上の生物学的活性を活性化させる抗体、他のタンパク質または小分子を含む。
【００５８】
本明細書において使用するとき、「誘導する」なる用語は、活性の刺激を意味する。
【００５９】
本明細書において使用するとき、「ＦＺＤ１０生物学的活性」なる用語は、受容体の活性化によって影響されるＦＺＤ１０の生物学的、生理的または生化学的活性を意味する。ＦＺＤ１０はＦＺＤ１０のリガンドまたはその変異タンパク質、オリゴヌクレオチド調節剤、小分子、模倣物、デコイまたは抗体を含むＦＺＤ１０調節剤によって活性化または阻害され得る。ＦＺＤ１０生物学的活性の例には、ＲＨＯＡ、ＲＡＣ、ＡＰＣ、β−カテニン、ＪＮＫ、ｐＳ６３ｃ−Ｊｕｎの活性化、細胞接着、細胞遊走、細胞生存、細胞増殖、細胞アポトーシス、受容体の二量体化、受容体の内部移行、Disheveledの活性化、およびβ−カテニンの誘導もしくは安定化、または上記活性の２種以上もしくは３種以上等が含まれるが、これらに限定されない。
【００６０】
本明細書において使用するとき、「ＦＺＤ１０−関連細胞／腫瘍／サンプル」等の用語は、非がん様および／または非転移性細胞、サンプル、腫瘍または他の病理と比較して、増加したＦＺＤ１０発現の証拠によって特徴付けられる細胞、サンプル、腫瘍または他の病理を意味する。好ましい態様において、ＦＺＤ１０−関連細胞、サンプル、腫瘍または他の病理は、非転移性細胞、サンプル、腫瘍または他の病理と比較して増加したＦＺＤ１０発現の証拠によって特徴付けられる。
【００６１】
本明細書において使用するとき、「調節剤」なる用語は、がんに関連した１種以上の生理的または生化学的事象を調節する組成物に関する。いくつかの好ましい態様において、調節剤はがんに関連した１種以上の生物学的活性を阻害する。いくつかの態様において、調節剤は小分子、本明細書に定義の抗体、模倣物、可溶性受容体、デコイ受容体または本明細書に定義のオリゴヌクレオチド調節剤である。いくつかの態様において、調節剤はリガンド結合を阻止することによって、またはリガンド結合部位について競合することによって作用する。いくつかの態様において、調節剤はリガンド結合と独立して作用する。いくつかの態様において、調節剤はリガンド結合部位と競合しない。いくつかの態様において、調節剤はがんに関連する遺伝子生成物の発現を阻止する。いくつかの態様において、調節剤はがんに関連する２種以上の生物分子の物理的相互作用を阻止する。いくつかの態様において、本発明の調節剤はＦＺＤ１０生物学的活性の１種以上を誘導または阻害する。いくつかの態様において、ＦＺＤ１０調節剤はＦＺＤ１０発現を阻害する。
【００６２】
本明細書において使用するとき、「抗体」なる用語は、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、二機能性／二重特異性抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、および標的タンパク質またはそのフラグメントに特異的である相補性決定領域（ＣＤＲ）−グラフト化抗体を意味する。本明細書において使用するとき、「抗体」なる用語は、無傷の分子ならびにそのフラグメント、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖを意味し、これは問題の抗原性決定基と結合することができる。抗体のさらなる例には、十分に集合した抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、一本鎖抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト化操作した（Human Engeneering）抗体、ヒト抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、小抗体（minibody）、リニア（linear）抗体、キレート化組換え抗体、細胞内抗体（intrabody）、ナノ抗体（nanobody）、小モジュール免疫薬剤（ＳＭＩＰ）、抗原結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質、ラクダ化抗体、ＶＨＨ含有抗体、または抗体のＣＤＲ配列の１種以上を含むこれらの抗体のいずれか１個の変異タンパク質、および所望の生物学的活性（例えばＦＺＤ１０の細胞外ドメインとの結合）を示す上記のものを含む組換えペプチドが含まれる。
【００６３】
本明細書において使用するとき、「エピトープ」なる用語は、ポリペプチドの抗原性決定基を意味する。いくつかの態様において、エピトープはエピトープに特異的である空間的コンホメーションで３個以上のアミノ酸を含んでいてもよい。いくつかの態様において、エピトープは線形またはコンホメーション形エピトープである。一般に、エピトープは少なくとも４アミノ酸、少なくとも５−７アミノ酸からなり、より通常、少なくとも８−１０アミノ酸からなる。アミノ酸の空間的コンホメーションを決定する方法は、当該技術分野において既知であり、例えばｘ線結晶学および２次元核磁気共鳴を含む。
【００６４】
本明細書において使用するとき、「オリゴヌクレオチド」なる用語は、結合したヌクレオチド残基または塩基のシリーズを意味し、そして天然に生じるか、または人工的もしくは修飾塩基を含み得る。「オリゴヌクレオチド調節剤」なる用語は、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡｉ、リボザイムおよびＤＮＡザイムを含み、そして配列番号１のフラグメントと相補的であり、そしてそのタンパク質生成物の発現を調節する少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上の連続塩基（これは非天然修飾塩基を含んでいてもよい）を含むオリゴヌクレオチドを意味する。
【００６５】
本明細書において使用するとき、「デコイ受容体」なる用語は、ポリペプチド、模倣物、またはＦＺＤ１０リガンドと結合することができる他の巨大分子の少なくとも部分を含む受容体を意味する。
【００６６】
本明細書において使用するとき、「治療上有効量」なる用語は、個体に治療上有効量の医薬を投与したときに、臨床的エンドポイント、がん細胞の増殖および／または生存、または個体におけるがん細胞の転移の１つ以上の減少または逆転として観察される薬学的効果を生み出す医薬の量を意味する。治療上有効量は典型的には、同様の状態の個体に有効成分を含まない組成物を投与したとき観察される効果と比較して、それらが有する効果によって決定される。対象についての正確な有効量は、対象のサイズおよび健康、状態の性質および程度、投与に選択される治療薬または治療薬の組合せに依存する。しかし、ある状態のための有効量は、常套の実験によって決定され、臨床医の判断の範囲内にある。
【００６７】
本明細書において使用するとき、「細胞−細胞接着の調節」なる用語は、細胞と細胞の接着またはある細胞と他の細胞の接触の変化を意味する。いくつかの態様において、細胞接着は本発明の調節剤によって阻害される。
【００６８】
本明細書において使用するとき、「との組合せで」または「と共に」なる用語は、本発明のＦＺＤ１０調節剤と他の治療レジメンの投与を意味する。ＦＺＤ１０調節剤の１種以上を含む組成物は、がんを有するかまたはその素因を有する個人または哺乳類に投与することができる。ＦＺＤ１０調節剤はまた、他の治療剤、例えば細胞毒性剤またはがん化学療法剤と投与することができる。２種の治療剤の同時投与は、薬剤が治療効果を発揮する期間が重複している限り、薬剤を同時に、または同じ経路で投与する必要がない。異なる日または週で投与する同時または逐次投与が意図される。
【００６９】
本明細書において使用するとき、「感受性の」なる用語は、ＦＺＤ１０治療が受容性な処置方法である患者、すなわちポジティブな応答を有する可能性のある患者を意味する。ＦＺＤ１０治療に感受性のがん患者は、ＦＺＤ１０治療に感受性でない患者と比較して高レベルのＦＺＤ１０を発現する。ＦＺＤ１０治療の良好な候補ではない可能性があるがん患者は、それらのがん細胞にＦＺＤ１０が存在しないか、または低いレベルである腫瘍サンプルを有するがん患者を含む。
【００７０】
本明細書において使用するとき、「検出する」なる用語は、活性の証拠（例えば遺伝子発現）または生物分子（例えばポリペプチド）を確立、発見または確認することを意味する。
【００７１】
本明細書において使用するとき、「ホモログヌクレオチド配列」または「ホモログアミノ酸配列」等の用語は、少なくとも特定の割合で、「配列相同性」と交換可能なように用いられるヌクレオチドレベルまたはアミノ酸レベルのホモロジーによって特徴付けられる配列を意味する。ホモログのヌクレオチド配列には、タンパク質のアイソフォームをコードする配列を含む。かかるアイソフォームは同じ生物の異なる組織で、例えば異なるＲＮＡスプライシングの結果として発現し得る。あるいは、アイソフォームは異なる遺伝子によってコードされ得る。ホモログのヌクレオチド配列には、ヒト以外の種、例えばこれに限定されないが哺乳類のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。ホモログのヌクレオチド配列はまた、これらに限定されないが、天然に生じる対立遺伝子変異体および本明細書に記載のヌクレオチド配列の変異体を含む。ホモログのアミノ酸配列は、保存的アミノ酸置換を含み、そしてポリペプチドが同じ結合および／または活性を有するアミノ酸配列を含む。
【００７２】
ホモロジーまたは相同性率は、例えばＧａｐプログラム（Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison WI）によって、Smith and Watermanのアルゴリズム（Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482-489）を用いる初期設定を用いて決定することができる。いくつかの好ましい態様において、プローブと標的のホモロジーは約５０％〜約６０％である。いくつかの態様において、核酸は配列番号１と約６０％、好ましくは約７０％、より好ましくは約８０％、より好ましくは約８５％、より好ましくは約９０％、より好ましくは約９２％、より好ましくは約９４％、より好ましくは約９５％、より好ましくは約９７％、より好ましくは約９８％、より好ましくは約９９％、最も好ましくは約１００％の相同性であるヌクレオチドまたはその部分を有する。
【００７３】
ホモロジーはまた、ポリペプチドレベルであり得る。いくつかの態様において、ポリペプチドは配列番号２の約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９２％、約９４％、約９５％、約９７％、約９８％、約９９％および約１００％相同性、またはその部分である。
【００７４】
本明細書において使用するとき、「プローブ」なる用語は、多様な長さの核酸配列を意味する。いくつかの態様において、プローブは少なくとも約１０から約６，０００ヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、プローブは少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも５０または少なくとも７５連続ヌクレオチドを含む。プローブは同一、類似または相補的核酸配列の検出に使用する。より長いプローブは通常、天然または組換え源から得られ、標的配列に高度に特異的であり、そしてオリゴマーよりもゆっくりと標的にハイブリダイズする。プローブは一本鎖または二本鎖であってよく、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション膜ベースの、インサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、またはＥＬＩＳＡ様技術において特異性を有するように設計する。
【００７５】
本明細書において使用するとき、「混合する」なる用語は、１種以上の化合物、細胞、分子等を一緒に、同じ場所で合併する過程を意味する。これは例えば、試験管、ペトリ皿または１種以上の化合物、細胞または分子を混合することができるあらゆる容器内で行うことができる。
【００７６】
本明細書において使用するとき、「単離」なる用語は、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは抗体が天然に生じるものと異なる環境に存在するポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体または宿主細胞を意味する。細胞を単離する方法は当業者に周知である。単離されたポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは抗体は、一般に、実質的に精製されている。
【００７７】
本明細書において使用するとき、「実質的に精製される」なる用語は、その天然環境から分離され、天然由来の他の成分を少なくとも６０％含まない、少なくとも７５％含まない、少なくとも８５％含まない、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９８％および９９％含まない、化合物（例えばポリヌクレオチドまたはポリペプチドまたは抗体）を意味する。
【００７８】
本明細書において使用するとき、「結合」なる用語は、生物分子または化合物の２種以上の間の物理的または化学的相互作用を意味する。結合にはイオン性、非イオン性、水素結合、Van der Waals、疎水性相互作用等が含まれる。結合は直接または他の生物分子または化合物の作用を介するかまたはそれによる間接であってよい。直接結合は、他の生物分子または化合物の作用を介するかまたはそれによって生じることがなく、他の実質的な化学的中間物が存在しない相互作用を意味する。
【００７９】
本明細書において使用するとき、「含む」なる用語は、直接または間接的に、一つの分子が第２の分子と物理的に隣接して共に存在することを意味する。分子は任意の数のバッファー、塩、溶液等に存在していてもよい。「含む」には、例えば核酸分子を含むビーカー、マイクロタイタープレート、細胞培養フラスコまたはマイクロアレイ等中にポリヌクレオチドが置かれていることを含む。含むとは、例えばポリペプチドを含むビーカー、マイクロタイタープレート、細胞培養フラスコまたはマイクロアレイ等中に抗体が置かれていることも含む。含むとは、インビボ、エクスビボまたはインビトロで起こり得る。
【００８０】
本明細書において使用するとき、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」または「ストリンジェントな条件」なる用語は、プローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドが標的配列とハイブリダイズするが、最低数の他の配列とハイブリダイズする条件を意味する。ストリンジェントな条件は配列に依存し、異なる環境において異なる。長い配列は高温で適切な補体と特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は特定されたイオン強度およびｐＨでは特定の配列の熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低いように選択される。Ｔｍは、標的配列と相補的なプローブの５０％が標的配列と平衡でハイブリダイズする温度（定義のイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下で）である。標的配列は一般に過剰に存在するため、Ｔｍで、プローブの５０％がそれらの補体と平衡でハイブリダイズする。典型的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、典型的には約０．０１〜約１．０Ｍナトリウムイオン（または他の塩）、ｐＨ７．０〜８．３であり、そして温度が短いプローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチド（例えば１０〜５０ヌクレオチド）について少なくとも約３０℃、長いプローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドについて少なくとも約６０℃であるものである。ストリンジェントな条件はまた、脱安定化剤、例えばホルムアミドの添加によって達成することができる。
【００８１】
本明細書において使用するとき、「緩いストリンジェントな条件」なる用語は、プローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドがその標的配列とハイブリダイズするが、限られた数の他の配列とハイブリダイズする条件を意味する。緩い条件は配列に依存し、異なる環境において異なる。緩い条件は当業者に周知であり、とりわけManiatis et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; 2nd Edition (December 1989))に記載されている。
【００８２】
本明細書に記載の核酸組成物は、例えば生物学的サンプル（例えばヒト細胞の抽出物）におけるｍＲＮＡまたはかかるサンプルから産生されるｃＤＮＡの検出のためのプローブとしてのポリペプチドを製造するために、ポリヌクレオチドのさらなるコピーを製造するために、リボザイムまたはオリゴヌクレオチド（一本鎖または二本鎖）を製造するために、そして一本鎖ＤＮＡプローブとしてまたは三本鎖オリゴヌクレオチドとして使用することができる。本明細書に記載のプローブは、例えば本明細書において提供されるポリヌクレオチドの、サンプル中における存在、不存在を決定するために使用することができる。ポリペプチドは、がんに関連したポリペプチドに特異的な抗体を製造するために使用することができ、当該抗体は本明細書により詳細に記載されている診断方法、予後方法等において有用である。ポリペプチドはまた、本明細書により詳細に説明されている治療的介入のための標的として有用である。本発明の抗体を用いて、例えばインビトロおよびインビボ診断および治療方法のいずれをも含む本発明のポリペプチドを精製、検出および標的とすることもできる。例えば、抗体は生物学的サンプル中の本発明のポリペプチドのレベルを定性的および定量的に測定するためのイムノアッセイにおいて有用である。例えば、Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)参照。これらおよび他の使用は以下により詳細に記載されている。
【００８３】
本明細書において使用するとき、「造影剤」なる用語は、当業者に既知の技術を用いて検出することができる本発明の抗体、小分子またはプローブと結合した組成物を意味する。本明細書において使用するとき、「遺伝子発現の証拠」なる用語は、遺伝子が発現しているあらゆる測定可能な指標を意味する。
【００８４】
「薬学的に許容される担体」なる用語は、治療剤、例えば抗体またはポリペプチド、遺伝子および他の治療剤の投与のための担体を意味する。当該用語は、それ自体が組成物を投与された個体に有害な抗体の生産を誘導せず、過度の毒性なく投与することができるあらゆる医薬担体を意味する。好適な担体は、大きな、ゆっくりと代謝されるマクロ分子、例えばタンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集体および不活性化ウイルス粒子であり得る。かかる担体は当業者に周知である。医薬組成物において薬学的に許容される担体には、液体、例えば水、食塩水、グリセロールおよびエタノールが含まれ得る。補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝化物質等もかかるビークル中に存在していてもよい。
【００８５】
本発明の方法および組成物によって標的とされ得るがんの具体的な例には、ＦＺＤ１０を過剰発現しているがんが含まれるが、これに限定されない。本発明はまた、ＦＺＤ１０が細胞接着、遊走または反発に関与するあらゆる腫瘍細胞タイプに適用される。いくつかの態様において、がんは卵巣がん、大腸がん、肺がんまたは子宮がんである。いくつかの態様において、本発明の処置および／または診断に受容性であるがんは、ＦＺＤ１０の過剰発現によって特徴付けられる。いくつかの態様において、かかるがんは、対照非がん様細胞または非がん様組織と比較して、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、または少なくとも約３００％のＦＺＤ１０の過剰発現を示す。
【００８６】
本発明はＦＺＤ１０過剰発現に関連した疾患および障害の処置、阻害および管理のための、ならびにかかる疾患および障害の症状の処置、阻害および管理のための方法および組成物を提供する。本発明のいくつかの態様は、がん細胞増殖および侵襲を阻害する組成物を含む方法および組成物に関する。
【００８７】
本発明はさらに、がんまたはがん転移の処置、阻害または管理のための方法および組成物を提供する。さらなる本発明の組成物および方法は、本発明のＦＺＤ１０調節剤と組み合わせた他の有効成分を含む。いくつかの態様において、当該方法はさらに、１種以上の常套のがん治療薬を患者に投与することを含む。いくつかの態様において、本発明の方法はさらに、化学療法、放射線療法または外科手術によって患者を処置することを含む。
【００８８】
本発明はまた、現行のまたは標準的ながん処置、例えば外科手術、化学療法、放射線療法、ホルモン療法および生物学的治療に部分的または完全に応答性となるがんまたは他の過増殖性細胞障害もしくは疾患の処置、阻害および管理のための方法及び組成物を提供する。
【００８９】
本発明はまた、がんを診断するおよび／またはがん進行を予測するための本発明のＦＺＤ１０調節剤、とりわけＦＺＤ１０抗体を用いた診断および／またはイメージング方法を提供する。いくつかの好ましい態様において、本発明の方法は腫瘍および／または転移を造影および位置決定する方法、および診断および予後の方法を提供する。いくつかの態様において、本発明の方法はＦＺＤ１０関連治療の適切さを評価するための方法を提供する。
【００９０】
ＦＺＤ１０調節剤
本発明は、とりわけがんの処置、診断、検出またはイメージングのためのＦＺＤ１０調節剤を提供する。いくつかの態様において、ＦＺＤ１０調節剤はオリゴヌクレオチド、小分子、模倣物、可溶性受容体、デコイ受容体、または抗体である。いくつかの態様においてＦＺＤ１０調節剤はＲＨＯＡ、ＲＡＣ、ＡＰＣ、β−カテニン、ＪＮＫ、ｐＳ６３ｃ−Ｊｕｎの活性化、細胞接着、細胞遊走、細胞生存、細胞増殖、細胞アポトーシス、受容体の二量体化、受容体の内部移行、Disheveledのリン酸化、およびβ−カテニンの誘導もしくは安定化、または上記活性のいずれか２種以上もしくは３種以上等を誘導する。いくつかの態様において、ＦＺＤ１０調節剤はＦＺＤ１０と細胞内アダプタータンパク質の結合を阻害する。いくつかの態様において、ＦＺＤ１０調節剤は細胞内アダプタータンパク質、例えばDishevelledとの結合を刺激する。いくつかの態様において、ＦＺＤ１０調節剤はｃ−Ｊｕｎおよび／またはβ−カテニン経路を阻害および／または不活性化する。
【００９１】
本明細書において使用するとき、「細胞内アダプタータンパク質」なる用語は、シグナル伝達複合体の異なるセグメントを接続するタンパク質を意味する。アダプタータンパク質は酵素活性を有していても、有していなくともよい。いくつかの態様において、アダプタータンパク質はDishevelledである。
【００９２】
いくつかの態様において、ＦＺＤ１０調節剤は、対照と比較して２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％、β−カテニンリン酸化を増加させ、ｃ−Ｊｕｎリン酸化を低下させ、および／または正統的リン酸化を低下させる。受容体リン酸化のレベルを測定する方法は当業者に既知であり、候補ＦＺＤ１０調節剤をその特性について測定するためにアッセイするために使用することができる。かかる方法の例は本明細書に記載されている。
【００９３】
いくつかの態様において、ＦＺＤ１０調節剤はＦＺＤ１０発現を阻害する。いくつかの態様において、ＦＺＤ１０発現は対照と比較して２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％阻害する。ＦＺＤ１０発現のレベルを測定する方法は当業者に既知である。
【００９４】
抗体
本発明はＦＺＤ１０遺伝子によって発現されるＦＺＤ１０ポリペプチドと結合する、好ましくはかかるポリペプチドと特異的に結合する抗体を用いる。「特異的に結合する」なる用語は、抗体が他の関連ポリペプチドの親和性よりも実質的に大きい標的ＦＺＤ１０ポリペプチドに対する親和性を有することを意味する。本明細書において使用するとき、「抗体」なる用語は、無傷の分子ならびにそのフラグメント、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖを意味し、これは問題の抗原性決定基と結合することができる。抗体のさらなる例には、十分に集合した抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、一本鎖抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト化操作した（Human Engeneering）抗体、ヒト抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、小抗体（minibody）、リニア（linear）抗体、キレート化組換え抗体、細胞内抗体（intrabody）、ナノ抗体（nanobody）、小モジュール免疫薬剤（ＳＭＩＰ）、抗原結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質、ラクダ化抗体、ＶＨＨ含有抗体、または抗体のＣＤＲ配列の１種以上を含むこれらの抗体のいずれか１個の変異タンパク質、および所望の生物学的活性（例えばＦＺＤ１０の細胞外ドメインとの結合）を示す上記のものを含む組換えペプチドが含まれる。「実質的に大きな親和性」とは、本発明において、他の関連ポリペプチドの親和性と比較して本発明の標的ＦＺＤ１０ポリペプチドの親和性における測定可能な増加が存在することを意味する。好ましくは、親和性は標的ＦＺＤ１０ポリペプチドについて少なくとも１．５倍、２倍、５倍、１０倍、１００倍、１０３倍、１０４倍、１０５倍、１０６倍またはそれ以上である。
【００９５】
好ましくは、抗体はＦＺＤ１０と、高い親和性で、好ましくは解離定数１０−４Ｍ、１０−５Ｍ、１０−６Ｍ未満、好ましくは１０−７Ｍ、１０−８Ｍ未満、最も好ましくは１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満で結合し；ナノモル未満の親和性（０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１ｎＭまたはそれ未満）が好ましい。抗体は細胞外ドメインＦＺＤ１０と特異的に結合し得る。
【００９６】
ＦＺＤ１０ポリペプチドを例えば免疫療法のための抗体を製造するために使用するとき、ＦＺＤ１０は全長タンパク質と少なくとも１個のエピトープまたは決定基を共有しているべきである。「エピトープ」または「決定基」は、本明細書において、ＭＨＣと関連して抗体またはＴ細胞受容体と製造および／または結合するタンパク質の一部を意味する。したがって、多くの場合、小さいＦＺＤ１０ポリペプチドを構成する抗体は、全長タンパク質と結合することができる。他の態様において、エピトープはユニークである；すなわちユニークなエピトープを生産する抗体は交叉反応性をほとんどまたは全く示さない。
【００９７】
ＦＺＤ１０遺伝子によってコードされるあらゆるポリペプチド配列を分析して、ポリペプチドの好ましい領域を決定することができる。抗原性の高い領域は、抗原認識が免疫応答の開始のプロセスにおいて生じ得る環境におけるポリペプチドの表面で曝露される可能性のあるポリペプチドの領域を示す値を選択することによって、ＤＮＡＳＴＡＲ分析によってデータから決定する。例えば、ＦＺＤ１０遺伝子によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列をＤＮＡＳＴＡＲコンピューターアルゴリズム（DNASTAR, Inc., Madison, Wis.; http://www.dnastar.com/）を用いて分析することができる。
【００９８】
好ましくは、本発明の抗体はＦＺＤ１０の非保存領域に対して特異的である。「非保存領域」は、Frizzledファミリーの他のメンバーとホモロジーが低い領域を意味する。好ましくは、これらの非保存的領域における他のFrizzledファミリーメンバーとの類似性は５０％未満である。
【００９９】
１つの態様において、抗ＦＺＤ１０抗体はＦＺＤ１０に特異的であり、Frizzledファミリーの他のメンバー（例えばＦＺＤ９）と交叉反応しない。あるいは、抗ＦＺＤ１０抗体はまた、重複した機能を有し得る他のＦＺＤファミリーメンバーを阻止する。他の態様において、抗ＦＺＤ１０抗体はまた、マウスＦＺＤ１０と結合する。あるいは、抗ＦＺＤ１０抗体はマウスＦＺＤ１０と交叉反応しない。
【０１００】
ＤＮＡＳＴＡＲコンピューターアルゴリズムを用いて簡単に得ることができるポリペプチドの特徴は、これらに限定されないが、Garnier-Robsonアルファ領域、ベータ領域、ターン領域およびコイル領域（Garnier et al. J. Mol. Biol., 120: 97 (1978)）；Chou-Fasmanアルファ領域、ベータ領域、およびターン領域（Adv. in Enzymol., 47:45-148 (1978)）；Kyte-Doolittle親水性領域および疎水性領域（J. Mol. Biol., 157:105-132 (1982)）；Eisenbergアルファ−およびベータ−両親媒性領域；Karplus-Schulzフレキシブル領域；Emini表面形成領域（J. Virol., 55(3):836-839 (1985)）；および高い抗原性指標のJameson-Wolf領域（CABIOS, 4(1):181-186 (1988)）を含む。Kyte-Doolittle親水性領域および疎水性領域、Emini表面形成領域、および高い抗原性指標の（すなわちJameson-Wolfプログラムの初期パラメーターを用いて同定したとき１．５以上の抗原性指標を有する４個以上の近接アミノ酸を含む）Jameson-Wolf領域は抗原性について高い程度の能力を示すポリペプチド領域を決定するために通常使用することができる。タンパク質に対する抗体を製造するための一つのアプローチは、タンパク質の全てまたは一部のアミノ酸配列の選択および製造、当該配列の化学的合成および適切な動物、典型的にはウサギ、ハムスターまたはマウスへの注射である。オリゴペプチドは、ＦＺＤ１０タンパク質に対する抗体の製造のための候補として疎水性領域に存在するオリゴペプチドに基づいて選択することができ、これはしたがって、成熟タンパク質において外側に露出されている可能性がある。さらなるオリゴペプチドは例えば、Antigenicity Index, Welling, G.W. et al., FEBS Lett. 188:215-218 (1985)（参照により本明細書の一部とする）を用いて決定することができる。
【０１０１】
「モノクローナル抗体」なる用語は、本明細書において使用するとき、実質的に同種の抗体集団から得られる抗体を意味し、すなわち当該集団に含まれるそれぞれの抗体は少量存在する可能性がある天然の変異を除き同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原性部位に指向されている。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対して指向される異なる抗体を含む常套の（ポリクローナル）抗体製品とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に対して指向されている。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、異なる特異性および特徴を有する他の免疫グロブリンによって汚染されていない同種培養によって生成されるという利点を有する。
【０１０２】
修飾語「モノクローナル」は、実質的に同種集団の抗体から得られた抗体の特徴を示し、何らかの特定の方法による抗体の製造法を要すると解釈されてはならない。例えば、本明細書に使用するモノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature, 256:495 [19751によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって製造されてもよく、また組換えＤＮＡ法によって製造されてもよい（例えば米国特許第4,816,567号参照）。「モノクローナル抗体」はまた、ファージ抗体ライブラリーから、例えばClackson et al.,Nature,352:624628[1991]および Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)に記載の技術を用いて単離することができる。
【０１０３】
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは異なるクラスに分類され得る。５つの主要なクラス、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭが存在し、これらのいくつかはさらにサブクラスまたはアイソタイプ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２に分類され得る。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマおよびミューと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および３次元立体配置は周知である。異なるアイソタイプは異なるエフェクター機能を有しており；例えばＩｇＧ１およびＩｇＧ３アイソタイプはＡＤＣＣ活性を有する。
【０１０４】
「抗体フラグメント」は、無傷の全長抗体の一部、好ましくは無傷（intact）の抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；二重特異性抗体；リニアー抗体（Zapata et al., Protein Eng.,8(10):1057-1062 (1995)）；一本鎖抗体分子；および抗体フラグメントから形成した多重特異性抗体が含まれる。抗体のパパイン消化によって、各々１個の抗原結合部位を有する２個の同一の抗原結合フラグメント（「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる）、および残余の「Ｆｃ」フラグメント（この名称は容易に結晶化する能力を反映している）が生じる。ペプシン処理によって、抗体のＶＨおよびＶＬドメイン（これらのドメインは１個のポリペプチド鎖に存在する）を含む２個の「一本鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」を有するＦ（ａｂ’）２フラグメントが得られる。好ましくは、Ｆｖポリペプチドはさらに、Ｆｖを抗原結合に望ましい構造に形成することができるＶＨとＶＬドメイン間のポリペプチドリンカーを含む。ｓＦｖの概説のために、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. l 13, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)参照のこと。
【０１０５】
「超可変」領域なる用語は、抗原結合性に寄与する抗体のアミノ酸残基を意味する。超可変領域は、相補性決定領域またはＣＤＲ由来のアミノ酸残基［すなわち、軽鎖可変ドメインの残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）および８９−９７（Ｌ３）および重鎖可変ドメインの３１−３５（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）および９５−１０２（Ｈ３）、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)に記載］および／または超可変ループ由来の残基（すなわち、軽鎖ドメインの残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）および９１−９６（Ｌ３）および重鎖可変ドメインの２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）および９６−１０１（Ｈ３）、［Chothia et al., J. Mol.Biol. 196: 901-917 (1987)］に記載）を含む。
【０１０６】
「フレームワーク」またはＦＲ残基は、超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【０１０７】
ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体を製造する方法は当業者に既知である。ポリクローナル抗体は哺乳類に、例えば免疫化剤および所望によりアジュバントを１回以上注射することによって生じ得る。典型的には、免疫化剤および／またはアジュバントは哺乳類に、複数回皮下または腹腔内注射することによって注射する。免疫化剤は構成核酸またはそのフラグメント、またはその融合タンパク質によってコードされるタンパク質を含んでいてもよい。免疫化剤を、免疫化する哺乳類において免疫原性であると知られているタンパク質と組み合わせることが有用であり得る。かかる免疫原性タンパク質の例には、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリンおよびダイズトリプシン阻害剤が含まれるが、これらに限定されない。使用することができるアジュバントの例には、Freund完全アジュバントおよびＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリルLipid A、合成トレハロースジコリノミコレート）が含まれる。免疫化プロトコルは過度の実験なしに当業者によって選択され得る。
【０１０８】
モノクローナル抗体
好ましくは、抗体はモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体はハイブリドーマ法、例えばKohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)に記載のものを用いて製造することができる。ハイブリドーマ法において、マウス、ハムスターまたは他の適切な宿主動物を典型的には免疫化剤で免疫化して、免疫化剤と特異的に結合する抗体を産生するかまたは産生することができるリンパ球を誘導する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫化してもよい。免疫化剤は典型的には、ＦＺＤ１０ポリペプチドまたはそのフラグメント、またはその融合タンパク質を含む。一般に、ヒト起源の細胞が望ましいときは末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を用い、あるいは非ヒト哺乳類起源が望ましいときは脾臓細胞またはリンパ節細胞を用いる。次にリンパ球を不死化細胞系と、好適な融合剤、例えばポリエチレングリコールを用いて融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103）。不死化細胞系は通常、哺乳類細胞、とりわけげっ歯類、ウシおよびヒト起源の骨髄腫細胞を形質転換する。通常は、ラットまたはマウス骨髄腫細胞系を用いる。ハイブリドーマ細胞を、好ましくは非融合免疫化細胞の増殖または生存を阻害する１種以上の物質を含む適切な培養培地で培養することができる。例えば、親細胞が酵素ハイポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠くとき、ハイブリドーマのための培養培地は典型的には、ＨＧＰＲＴ−欠損細胞の増殖を妨げる物質であるハイポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む（ＨＡＴ培地）。
【０１０９】
モノクローナル抗体技術を、研究、診断および治療を実施するために使用する。モノクローナル抗体をラジオイムノアッセイ、酵素免疫測定、免疫細胞病理法、ならびにインビトロ診断およびヒト疾患の診断および免疫療法のためのインビボでのフローサイトメトリーにおいて使用する。Waldmann, T. A. (1991) Science 252:1657-1662。とりわけ、モノクローナル抗体はがんの診断および治療に広く適用されており、正常組織を回避しながら悪性領域を標的とすることが望まれている。例えばFrankel, et al.の米国特許第4,753,894号；Ring et al.の第4,938,948号；およびBjorn et al.の第4,956,453号参照。
【０１１０】
ＦＺＤ１０のモノクローナル抗体を、卵巣がん、大腸がん、肺がんまたは子宮がんの診断方法において単独で、または血清中のＬ１接着分子の検出方法と組み合わせて使用することができる。
【０１１１】
抗体フラグメント
「抗体」なる用語は、本明細書において使用するとき、当業者に知られているとおり、抗体フラグメント、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメント；二重特異性抗体；リニアー抗体；一本鎖抗体分子；多重特異性抗体、例えば二重特異性、三重特異性等の抗体；小抗体；キレート化組換え抗体；三重特異性抗体；二重特異性抗体；細胞内抗体（intrabody）；ナノ抗体（nanobody）；小モジュール免疫薬剤（ＳＭＩＰ）；抗原結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質；ラクダ化抗体；ＶＨＨ含有抗体；キメラ抗体等、および全長抗体の修飾によって製造された抗体フラグメントまたは組換えＤＮＡ技術を用いてデノボ合成されたものから形成された、他のポリペプチドを含む。
【０１１２】
「二重特異性抗体」なる用語は、２個の抗原結合部位を有する小抗体フラグメントを意味し、当該フラグメントは同じポリペプチド鎖に軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と結合した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む（ＶＨ  ＶＬ）。同じ鎖の２個のドメイン間で対を形成するには短すぎるリンカーを用いることによって、当該ドメインは他の鎖の相補的ドメインと対を形成することを余儀なくされ、２個の抗原結合部位を形成する。二重特異性抗体は、例えばEP 404,097；WO 93/11161；および30 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)に十分に記載されている。
【０１１３】
抗体のパパイン消化によって、各々１個の抗原結合部位を有するＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨドメインからなる１価フラグメントである２個の同一の抗原結合フラグメント（「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる）、および残余の「Ｆｃ」フラグメント（この名称は容易に結晶化する能力を反映している）が生じる。ペプシン処理によって、抗体のＶＨおよびＶＬドメイン（これらのドメインは１個のポリペプチド鎖に存在する）を含む２個の「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」を有する、ヒンジ領域でジスルフィド結合によって結合した２個のＦａｂフラグメントを含む２価フラグメントである、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントが得られる。好ましくは、Ｆｖポリペプチドはさらに、Ｆｖを抗原結合に望ましい構造に形成して、ＶＬとＶＨ領域が対となって１個のタンパク質鎖として製造することができる合成リンカーによって１価分子を形成することができる一本鎖抗体（ｓｃＦＶ）となる、ＶＨとＶＬドメイン間のポリペプチドリンカーを含む（Bird et al., Science 242:423-426, 1988, and Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, 1988）。ｓＦｖの概説のために、Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. l 13, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)を参照されたい。ＦｄフラグメントはＶＨおよびＣＨ１ドメインから成る。
【０１１４】
さらなる抗体フラグメントは、ＶＨドメインから成るドメイン抗体（ｄＡｂ）フラグメントを含む（Ward et al., Nature 341:544-546, 1989）。
【０１１５】
「リニアー抗体」は、抗原結合領域の対を形成するタンデムＦｄセグメントの対（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む。リニアー抗体は二重特異性または一重特異性であってよい（Zapata et al. Protein Eng. 8:1057-62 (1995)）。
【０１１６】
ＣＨ３とペプチドリンカーを介して（ヒンジ無し）、またはＩｇＧヒンジを介して融合したｓｃＦｖから成る「小抗体」は、Olafsen, et al., Protein Eng Des Sel. 2004 Apr;17(4):315-23に記載されている。
【０１１７】
軽鎖を欠いた機能的重鎖抗体は、テンジクザメ（nurse shark）（Greenberg et al., Nature 374:168-73, 1995）、テンジクザメ（wobbegong shark）（Nuttall et al., Mol Immunol. 38:313-26, 2001）およびラクダ科（Hamers-Casterman et al., Nature 363: 446-8, 1993; Nguyen et al., J. Mol. Biol. 275: 413, 1998）、例えばラクダ、ヒトコブラクダ、アルカパおよびラマにおいて天然に生じる。抗原結合部位はこれらの動物において１個のドメイン、ＶＨＨドメインに減少している。これらの抗体は重鎖可変領域のみを用いて抗原結合領域を形成しており、すなわちこれらの機能的抗体はＨ２Ｌ２構造のみを有する重鎖のホモダイマーである（「重鎖抗体」または「ＨＣＡｂ」と称する）。報告によれば、ラクダ化ＶＨＨは、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含み、ＣＨ１ドメインを含まないＩｇＧ２およびＩｇＧ３定常領域と再結合する（Hamers-Casterman et al., supra）。例えば、ラマＩｇＧ１は、ＶＨがヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む定常領域と再結合する常套の（Ｈ２Ｌ２）抗体アイソタイプであるが、ラマＩｇＧ２およびＩｇＧ３はＣＨ１を含まず、そして軽鎖を含まない重鎖のみのアイソタイプである。通常のＶＨのみのフラグメントは可溶形態で製造することが困難であるが、フレームワーク残基をよりＶＨＨ様に改変すると溶解性および特異的結合性が改善され得る（例えば、Reichman, et al.参照）。
【０１１８】
J Immunol Methods 1999, 231:25-38）。ラクダ化ＶＨＨドメインは抗原と高い親和性で結合すること（Desmyter et al., J. Biol. Chem. 276:26285-90, 2001）および溶液中で高い安定性を有することが見出されている（Ewert et al., Biochemistry 41:3628-36, 2002）。ラクダ化重鎖を有する抗体を製造する方法は、例えば米国特許公開番号第20050136049号および第20050037421号に記載されている。
【０１１９】
重鎖抗体の可変ドメインが分子量１５ｋＤａのみの最小の十分に機能的な抗原結合フラグメントであるため、この物質をナノ抗体と称する（Cortez-Retamozo et al., Cancer Research 64:2853-57, 2004）。ナノ抗体ライブラリーはConrath et al., （Antimicrob Agents Chemother 45: 2807-12, 2001）に記載のとおり、または記載の組換え法を用いて免疫化したヒトコブラクダから製造することができる。
【０１２０】
二重特異性Ｆａｂ−ｓｃＦｖ（“bibody”）および三重特異性Ｆａｂ−（ｓｃＦｖ）（２）（“tribody”）の製造は、Schoonjans et al. （J Immunol. 165:7050-57, 2000）およびWillems et al. （J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 786:161-76, 2003）に記載されている。二重特異性抗体または三重特異性抗体のために、ｓｃＦｖ分子はＶＬ−ＣＬ（Ｌ）およびＶＨ−ＣＨ１（Ｆｄ）鎖の一方または両方と融合する。例えば三重特異性抗体を製造するために２個のｓｃＦｖが二重特異性抗体において１個のｓｃＦｖがＦａｂのＣ末端と融合するＦａｂのＣ末端と融合する。
【０１２１】
細胞内抗体は細胞内発現を示し、そして細胞内タンパク質機能を操作することができる一本鎖抗体である（Biocca， et al.， EMBO J． 9:101‐108， 1990； Colby et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 101:17616-21, 2004）。細胞内領域に構築される抗体を有する細胞シグナル配列を含む細胞内抗体は、Mhashilkar et al（EMBO J 14:1542-51, 1995）および Wheeler et al. （FASEB J. 17:1733-5. 2003）に記載のとおりに製造することができる。トランス抗体は、タンパク質変換ドメイン（ＰＴＤ）が一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）抗体と融合する細胞浸透抗体であるHeng et al., （Med Hypotheses. 64:1105-8, 2005）。
【０１２２】
ＳＭＩＰまたは標的タンパク質に特異的な結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質である抗体がさらに意図される。これらの構造は、抗体エフェクター機能を実施するのに必要な免疫グロブリンドメインと融合する抗原結合ドメインを含む一本鎖ポリペプチドである。例えば、WO03/041600、米国特許公開番号第20030133939号および米国特許公開番号第20030118592号参照。
【０１２３】
多重特異性抗体
いくつかの態様において、少なくとも２個の異なるエピトープについて結合特異性を有する多重特異性（例えば二重特異性、三重特異性等）モノクローナル抗体を製造することが望まれ得る。例えば、二重特異性抗体はＦＺＤ１０の２個の異なるエピトープと結合することができる。あるいは、抗ＦＺＤ１０アームは白血球、例えばＴ細胞受容体分子（例えばＣＤ２またはＣＤ３）またはＩｇＧのＦｃ受容体（ＦｃγＲ）、例えばＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）に対するトリガー分子と結合してＦＺＤ１０発現細胞の細胞防御機構を標的とするアームと結合し得る。
【０１２４】
他の例において、一方の結合特異性がＦＺＤ１０ポリペプチドまたはそのフラグメントについてであり、他方が他の抗原、例えば細胞表面タンパク質または受容体または受容体サブユニット、好ましくは腫瘍特異的または組織特異的であるものについてである。例えば、腎臓がん特異的抗原、卵巣がん特異的抗原、大腸がん特異的抗原、肺がん特異的抗原または子宮がん特異的抗原を含む。
【０１２５】
二重特異性抗体はまた、ＦＺＤ１０を発現する細胞に細胞毒性剤を局在化するために使用することができる。これらの抗体はＦＺＤ１０結合アームおよび細胞毒性剤（例えばサポリン、抗インターフェロン−６０、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキサートまたは放射活性アイソトープヘプテン）と結合するアームを有する。二重特異性抗体は全長抗体または抗体フラグメントとして製造することができる。
【０１２６】
二重特異性抗体を製造するための他のアプローチによると、抗体分子の対のインターフェースを操作してヘテロダイマーの割合を最大化して、これを組換え細胞培養から回収する。好ましいインターフェースは少なくとも抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの対を含む。この方法において、第１の抗体分子のインターフェース由来の小アミノ酸側鎖の１種以上が、大きな側鎖（例えばチロシンまたはトリプトファン）に置換される。大きな側鎖と同じまたは類似のサイズの補償「空隙」は、第２の抗体分子のインターフェース上に、大きなアミノ酸側鎖をより小さなもの（例えばアラニンまたはスレオニン）で置換することによって作成する。これによって他の望ましくない最終生成物、例えばホモダイマー以上のヘテロダイマーの収率増加機構を提供する。
【０１２７】
二重特異性抗体は架橋または「ヘテロ結合」抗体を含む。例えば、ヘテロ結合体の抗体の一方がアビジンと、他方がビオチンと結合することができる。ヘテロ結合抗体はあらゆる簡便な架橋方法を用いて製造することができる。好適な架橋剤は当業者に周知であり、米国特許第4,676,980号に、架橋技術の番号と共に記載されている。
【０１２８】
抗体フラグメントから二重特異性抗体を製造する技術は文献にも記載されている。例えば、二重特異性抗体を化学的結合を用いて製造することができる。Brennan et al., Science 229:81 (1985)は、無傷の抗体をタンパク質分解酵素で切断してＦ（ａｂ’）２フラグメントを製造する方法が記載されている。これらのフラグメントはジチオール錯化剤ナトリウム亜ヒ酸塩の存在下で還元して、近接ジチオールを安定化し、分子間ジスルフィド形成を防止する。製造したＦａｂ’フラグメントを次にチオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換する。Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の一方は、次に、メルカプトエチルアミンでの還元によってＦａｂ’−チオールに再変換し、等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して二重特異性抗体を形成する。製造した二重特異性抗体は、酵素の選択的固定剤として使用することができる。さらなる態様において、E. coliから直接回収したＦａｂ’−ＳＨフラグメントをインビトロで化学的に結合させて二重特異性抗体を形成することができる（Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)）。
【０１２９】
Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992) は完全にヒト化した二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の製造を開示している。各Ｆａｂ’フラグメントは個別にE.coliから分泌されており、これをインビトロで有向化学カップリングに供して二重特異性抗体を形成した。形成した二重特異性抗体はしたがって、ＨＥＲ２受容体を過剰発現している細胞および正常ヒトＴ細胞と結合することができ、そしてヒト乳がん標的に対するヒト細胞毒性リンパ球の細胞破壊活性を発現させることができた。
【０１３０】
組換え細胞培地から直接二重特異性抗体フラグメントを製造および単離する様々な技術も開示されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを用いて製造する（Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)）。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質のロイシンジッパーペプチドを２個の異なる抗体のＦａｂ’部分に遺伝子融合によって結合させた。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、次に再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成した。この方法は抗体ホモダイマーの製造にも利用することができる。Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)に記載の「二重特異性抗体（diabody）」技術は、二重特異性抗体フラグメントを製造する別の機構を提供する。
【０１３１】
該フラグメントは、同じ鎖の２個のドメイン間で対を形成するには短すぎるリンカーによって、軽鎖可変領域（ＶＬ）と結合した重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。したがって、１個のフラグメントのＶＨおよびＶＬドメインは他のフラグメントの相補的ＶＬおよびＶＨドメインと対を形成することを強制され、２個の抗原結合部位を形成する。一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーの使用によって二重特異性抗体フラグメントを製造する他の戦略も報告されている。Gruber et al., J. Immunol. 152: 5368 (1994)参照。
【０１３２】
あるいは、二重特異性抗体は、Zapata et al. Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)に記載のとおりに製造した「リニアー抗体」であり得る。簡潔には、この抗体は抗原結合領域の対を形成するタンデムＦｂセグメントの対（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む。リニアー抗体は二重特異性または一重特異性であり得る。
【０１３３】
２価を超える抗体も意図される。例えば、三重特異性抗体を製造することができる（Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)）。「キレート化組換え抗体」は、標的抗原の隣接非オーバーラップエピトープを認識し、そして両方のエピトープに同時に結合できるほど柔軟である二重特異性抗体である（Neri et al., J Mol Biol. 246:367-73, 1995）。
【０１３４】
他の態様において、ＦＺＤ１０に対する抗体は、本明細書に記載のとおり、ＦＺＤ１０の生物学的機能を低下または停止させることができる。すなわち、抗ＦＺＤ１０抗体（ポリクローナルまたは好ましくはモノクローナル）の添加によって、ＦＺＤ１０活性を低下または停止させることができる。一般に、例示的な態様において、少なくとも２５％の活性の減少、少なくとも約５０％、約９５〜１００％の減少が検出される。
【０１３５】
抗体の組換え製造
抗体の組換え製造のために、それをコードする核酸を単離し、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のために複製ベクターに挿入する。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは容易に単離することができ、常套の方法を用いて（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いて）配列決定することができる。多くのベクターが利用可能である。ベクター成分には、一般に、これらに限定されないが、下記の１個以上が含まれる：シグナル配列、複製起点、１個以上の選択マーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写停止配列、これらの例は当業者に周知である。
【０１３６】
多様な異種システムを組換えポリペプチドの機能的発現に利用することができ、これは当業者に周知である。かかるシステムには、バクテリア（Strosberg, et al., Trends in Pharmacological Sciences (1992) 13:95-98）、酵母（Pausch, Trends in Biotechnology (1997) 15:487-494）、多くの種類の昆虫細胞（Vanden Broeck, Int. Rev. Cytology (1996) 164:189-268）、両生類細胞（Jayawickreme et al., Current Opinion in Biotechnology (1997) 8: 629-634）および様々な哺乳類細胞系（ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ等； Gerhardt, et al., Eur. J. Pharmacology (1997) 334:1-23参照）が含まれる。これらの例は、線虫から得られる細胞系（ＰＣＴ出願WO 98/37177）を含む他の可能性のある細胞の使用を除外するものではない。
【０１３７】
キメラ、ヒト、ヒト化、ヒト化操作（Human Engeneering）ＴＭおよびヒト抗体
【０１３８】
げっ歯類抗体をインビボでヒトに単独で、または結合体（conjugate）として反復投与すると、受容者にげっ歯類抗体に対する免疫応答；いわゆるＨＡＭＡ応答（ヒト抗マウス抗体）が生じる。ＨＡＭＡ応答は反復投与が必要であるとき、医薬の効果を制限し得る。抗体の免疫原性は、親水性ポリマー、例えばポリエチレングリコールでの抗体の化学的修飾によって、あるいはヒトにより類似した抗体結合構造を構築する遺伝子工学の方法を用いて、減少させることができる。
【０１３９】
他の態様において、ＦＺＤ１０に対する抗体はヒト化抗体またはキメラ抗体である。「ヒト化」抗体は、非ヒト種からの免疫グロブリンに実質的に由来する抗原結合部位、およびヒト免疫グロブリンの構造および／または配列に基づく分子の残余免疫グロブリン構造を有する分子を意味する。抗原結合部位は定常ドメインと融合した完全可変ドメインまたは可変ドメインにおける適切なフレームワーク領域に結合させた相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでいてもよい。抗原結合部位は野生型であってよく、１個以上のアミノ酸置換で修飾、例えばヒト免疫グロブリンにより近く類似するように修飾することができる。あるいは、ヒト化抗体は親の非ヒト抗体の抗原結合特性を有するかまたは実質的に有するキメラ抗体に由来し得るが、これはヒトに投与したとき親抗体と比較して減少した免疫原性を示す。「キメラ抗体」なる用語は、本明細書において使用するとき、典型的には別種から生じた２種の異なる抗体に由来する配列を含む抗体を意味する（例えば、米国特許第4,816,567号参照）。典型的には、これらのキメラ抗体において、軽鎖と重鎖の両方の可変領域が哺乳類のある種に由来する抗体の可変領域を模倣するが、一定割合が他の物に由来する抗体の配列と類似する。最も典型的には、キメラ抗体はヒトおよびマウス抗体フラグメント、一般にヒト定常領域およびマウス可変領域を含む。げっ歯類のモノクローナル抗体の可変Ｉｇドメインがヒト定常Ｉｇドメインと融合するキメラモノクローナル抗体は、当業者に既知の標準的な方法を用いて製造することができる（Morrison, S. L., et al. (1984) Chimeric Human Antibody Molecules： Mouse Antigen Binding Domains with Human Constant Region Domains, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6841-6855；および Boulianne, G. L., et al, Nature 312, 643-646 (1984)）。キメラモノクローナル抗体がヒトにおいて少ない免疫原性であると明らかにされているものもあるが、マウス可変Ｉｇドメインはなおも顕著なヒト抗マウス応答を導く。
【０１４０】
ヒト化抗体はヒト抗体（アクセプター抗体）の相補性決定領域（ＣＤＲ）を、望ましい特異性、親和性および能力を有する非ヒト抗体由来のもの（ドナー抗体）、例えばマウス、ラットまたはウサギで置換して製造する。いくつかの例において、ヒト「アクセプター」抗体のＦｖフレームワーク残基は、「ドナー」抗体の対応する非ヒト残基によって置換される。ヒト化抗体は、レシピエント抗体においてもインポートＣＤＲもしくはフレームワーク配列においても見られない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、実質的に全ての、少なくとも１個、典型的には２個の可変ドメインを含み、ここで全てまたは実質的に全てのＣＤＲ領域は非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、そして全てまたは実質的に全てのフレームワーク残基（ＦＲ）領域はヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体は最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含む（Jones et al., Nature, 321:522 525 (1986)； Riechmann et al., Nature, 332:323 329 (1988)；およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593 596 (1992)）。かかるキメラ形態の一つの明白な利点は、例えば、可変領域が簡便には現在既知のソースに由来し、容易に非ヒト宿主動物由来のハイブリドーマまたはＢ細胞を例えばヒト細胞調製物由来の定常領域と組み合わせて利用可能であるということである。可変領域は製造の容易さという利点を有し、特異性はそのソースによって影響されないが、ヒトである定常領域は抗体を注射したとき、非ヒトソース由来の定常領域によるものよりも、ヒト対象から免疫応答を誘導する可能性がより低い。しかし、この定義は具体的な例に限定されない。
【０１４１】
ヒト化抗体は親マウスモノクローナル抗体よりもヒトにおける免疫原性が遙かに低いため、これはアナフィラキシーのリスクがほとんど無くヒトの処置に使用できる。したがって、この抗体がインビボでのヒトへの投与を含む治療適用、例えば腫瘍性疾患の処置用放射線増感剤としての使用、または例えばがん治療の副作用を低減する方法における使用において好ましい。非ヒト抗体をヒト化する方法は当業者に周知である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト起源から導入された１個以上のアミノ酸配列を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基はしばしば、インポート残基と呼ばれ、これは典型的にはインポート可変ドメインから取られている。ヒト化は、本質的には、Winterおよび共同研究者らの方法（Jones et al., Nature 321:522 525 (1986）；Riechmann et al., Nature 332:323 327 (1988)； Verhoeyen et al., Science 239:1534 1536 (1988)）によって、げっ歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列を対応するヒト抗体配列によって置換することによって行うことができる。したがって、かかるヒト化抗体はキメラ抗体であり（米国特許第4,816,567号）、そこでは無傷のヒト可変ドメインよりも実質的に少ない部分が非ヒト種由来の対応する配列によって置換されている。実際、ヒト化抗体は、典型的にはＣＤＲ残基および可能であればＦＲ残基がげっ歯類抗体における同様の部位の残基によって置換されたヒト抗体である。
【０１４２】
しかし、ＣＤＲ移植の欠点は、フレームワーク領域のアミノ酸が抗原結合に寄与し得るため、そしてＣＤＲループのアミノ酸が２個の可変Ｉｇドメインの結合に影響し得るため、元のマウス抗体よりも実質的に低い結合親和性を有するヒト化抗体となり得る点である。ヒト化モノクローナル抗体の親和性を維持するために、元のマウス抗体のフレームワーク領域に最も類似しているヒトフレームワーク領域を選択することによって、そして抗原結合部位のコンピューターモデリングを利用したフレームワークまたはＣＤＲ中の１アミノ酸の部位指向的変異によって、ＣＤＲ移植技術を改良することができる（例えば、Co, M. S., et al. (1994), J. Immunol. 152, 2968-2976）。
【０１４３】
抗体をヒト化する一つの方法は、非ヒト重鎖および軽鎖配列をヒト重鎖および軽鎖配列と整列させ、そのようなアラインメント、ヒト化配列のコンホメーションを予測する分子モデリングおよび親抗体のコンホメーションとの比較に基づき、選択し、非ヒトフレームワークをヒトフレームワークで置換することを含む。この過程の後、ヒト化配列モデルの予測コンホメーションが親非ヒト抗体の非ヒトＣＤＲのコンホメーションとほぼ近似するまで、ＣＤＲの構造の障害となるＣＤＲ領域の残基の復帰変異（back mutation）を反復する。
【０１４４】
多くの非ヒト免疫グロブリン由来の抗原結合部位を有する「ヒト化」抗体分子が開示されており、例えばヒト定常ドメインに結合したげっ歯類Ｖ領域および関連ＣＤＲを有するキメラ抗体（Winter et al. (1991) Nature 349:293-299； Lobuglio et al. (1989) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:4220-4224； Shaw et al. (1987) J Immunol. 138:4534-4538；および Brown et al. (1987) Cancer Res. 47:3577-3583）、ヒト支持ＦＲに移植し、適切なヒト抗体定常ドメインと融合させたげっ歯類ＣＤＲ（Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327； Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536；および Jones et al. (1986) Nature 321:522-525）、および組換的に貼合せた（veneered）げっ歯類ＦＲによって支持されるげっ歯類ＣＤＲ（欧州特許公表番号第519,596号、１９９２年１２月２３日公表）が含まれる。
【０１４５】
ヒト化抗体は多様な方法、例えば以下の方法によって得ることができる：（１）非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒトフレームワークおよび定常領域に移植すること（当該技術分野で「ヒト化」と呼ばれる工程）または、（２）非ヒト変異ドメイン全体を移植するが、それをヒト様表面で表面残基を置換して「覆う」(cloaking）こと（当該技術分野で「貼合せ」と呼ばれる工程）。本発明において、ヒト化抗体は「ヒト化」および「貼合せ」抗体のいずれをも含む。同様に、ヒト抗体は、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されているトランスジェニック動物、例えばマウスにヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入して製造することができる。チャレンジによって、ヒト抗体製造が観察され、これは遺伝子配置、集合および抗体レパートリーを含むあらゆる点でヒトに見られるものと極めて類似している。このアプローチは例えば、米国特許第5,545,807号；第5,545,806号；第5,569,825号；第5,625,126号；第5,633,425号；第5,661,016号、および下記科学文献：Marks et al., Bio/Technology 10, 779 783 (1992)； Lonberg et al., Nature 368 856 859 (1994)； Morrison, Nature 368, 812 13 (1994)； Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845 51 (1996)； Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996)； Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65 93 (1995)； Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)； Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci, US.A., 81:6851-6855 (1984)； Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988)； Verhoeyer et al., Science 239:1534-1536 (1988)； Padlan, Molec. Immun. 28:489-498 (1991)； Padlan, Molec. Immunol. 31(3):169-217 (1994)；および Kettleborough, C.A. et al., Protein Eng. 4(7):773-83 (1991)（各々参照により本明細書の一部とする）に記載されている。「相補性決定領域」なる用語は、天然免疫グロブリン結合部位の天然Ｆｖ領域の結合親和性および特異性を共に定義するアミノ酸配列を意味する。例えばChothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)； Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services NIH Publication No. 91-3242 (1991)参照。「定常領域」なる用語は、エフェクター機能を与える抗体分子の部分を意味する。本発明において、マウス定常領域はヒト定常領域によって置換される。対象ヒト化抗体の定常領域はヒト免疫グロブリン由来である。重鎖定常領域は５つのアイソタイプ：アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマまたはミューから選択され得る。抗体をヒト化ずる一つの方法は、非ヒト重鎖および軽鎖配列をヒト重鎖および軽鎖配列と整列させ、選択し、そしてかかるアラインメント、ヒト化配列のコンホメーションを予測する分子モデリングおよび親抗体のコンホメーションとの比較に基づき、非ヒトフレームワークをヒトフレームワークで置換することを含む。このプロセスの後、ヒト化配列モデルの予測コンホメーションが親非ヒト抗体の非ヒトＣＤＲのコンホメーションとほぼ近似するまで、ＣＤＲの構造を障害するＣＤＲ領域の残基の復帰変異を反復する。かかるヒト化抗体はさらに誘導化して、例えばAshwell受容体による取り込みおよびクリアランスを促進することができる。例えば米国特許第5,530,101号および第5,585,089号（出典明示により本明細書の一部とする）参照。
【０１４６】
ヒト化操作（Human Engeneering）ＴＭ
抗体可変ドメインのヒト化操作（Human Engeneering）ＴＭはStudnicka［例えば、Studnicka et al.米国特許第5,766,886号； Studnicka et al. Protein Engineering 7: 805-814 (1994)参照］に抗体分子の結合活性を維持しながら免疫原性を低下させる方法として開示されている。この方法によって、各可変領域アミノ酸は置換のリスクを有する。アミノ酸置換は３つのリスクカテゴリーの１つに分類される：（１）低リスク変化は抗原結合を阻害する可能性がほとんど無く、免疫原性が減少する可能性が最も大きいものである；（２）中リスク変化は免疫原性をさらに減少させるが、抗原結合またはタンパク質折り畳みに影響する可能性があるものである；（３）高リスクである残りは、結合または抗体構造の維持に重要であり、そして抗原結合またはタンパク質折り畳みが影響される危険が最も高いものである。プロリンの３次元構造的役割のため、プロリンの修飾は一般に、その位置が典型的には低リスク位置であったとしても少なくとも中リスク変化であると理解される。
【０１４７】
げっ歯類抗体の軽鎖および重鎖の可変領域を下記のとおりヒト化操作（Human Engineered）ＴＭして、抗原結合またはタンパク質折り畳みに有害な影響が無いと思われるが、ヒト環境で免疫原性を減少させる可能性がある位置でヒトアミノ酸を置換する。「低リスク」位置であり、そして当該方法によって修飾する候補であるアミノ酸残基は、げっ歯類可変領域のアミノ酸配列とヒト可変領域配列を整列して同定する。個々のＶＨもしくはＶＬ配列、またはヒトコンセンサスＶＨもしくはＶＬ配列、または個々のもしくはコンセンサスヒト生殖細胞配列を含むあらゆるヒト可変領域を用いることができる。低リスク位置のあらゆる数の、または低リスク位置の全てのアミノ酸残基を変化させることができる。例えば、整列マウスおよびヒトアミノ酸残基が異なる各低リスク位置で、げっ歯類残基をヒト残基で置換するアミノ酸修飾を導入する。あるいは、低リスク位置の全てまたは中リスク位置のあらゆる数でのアミノ酸残基を変化させることができる。理想的には、最も免疫原性が少なくなるように低および中リスク位置をげっ歯類からヒト配列に変化させる。
【０１４８】
修飾重鎖および／または軽鎖可変領域を含む合成遺伝子が構成され、ヒトγ重鎖および／またはカッパ軽鎖定常領域と結合する。あらゆるヒト重鎖および軽鎖定常領域を、ＩｇＡ（そのいずれかのサブクラス、例えばＩｇＡ１またはＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（そのいずれかのサブクラス、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）、またはＩｇＭを含むヒト化操作（Human Engineered）ＴＭ抗体可変領域との組合せで使用することができる。ヒト重鎖および軽鎖遺伝子を宿主細胞、例えば哺乳類細胞に導入し、形成される組換え免疫グロブリン生成物を得て、特徴付ける。ヒト抗体はまた、ファージディスプレーライブラリーを含む当該技術分野において知られている様々な技術を用いて製造することができる［Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)； Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)］。Cole et al. および Boerner et al.の技術もヒトモノクローナル抗体の製造に利用可能である［Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) および Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86 95 (1991)］。ＦＺＤ１０ポリペプチドに対するヒト抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むように操作するトランスジェニック動物を用いて製造することができる。例えば、WO 98/24893はヒトＩｇ遺伝子座を有するトランスジェニック動物であって、内因性重鎖および軽鎖遺伝子座の不活性化のために機能的内因性免疫グロブリンを生産しない動物を開示している。WO 91/10741はまた、免疫原に対する免疫応答を付加することができるトランスジェニック非霊長類哺乳類宿主であって、抗体が霊長類定常領域および／または可変領域を有しており、そして内因性免疫グロブリンコード化遺伝子座が置換または不活性化されている宿主を開示している。WO 96/30498は、哺乳類における免疫グロブリン遺伝子座を修飾するための、例えば定常または可変領域の全てまたは一部を置換して修飾抗体分子を形成するためのCre/Loxシステムの使用を開示している。WO 94/02602は、不活性化された内因性Ｉｇ遺伝子座および機能的ヒトＩｇ遺伝子座を有する非ヒト哺乳類宿主を開示している。米国特許第5,939,598号は、マウスが内因性重鎖を欠いており、１個以上の異種定常領域を含む異種免疫グロブリン遺伝子座を発現するトランスジェニックマウスを製造する方法を開示している。
【０１４９】
上記トランスジェニック動物を用いて、免疫応答を作成して抗原分子を選択することができ、そして抗体産生細胞を動物から除去してヒトモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを製造するために使用することができる。免疫化プロトコル、アジュバント等は当業者に既知であり、例えばWO 96/33735に記載のトランスジェニックマウスの免疫化に用いる。モノクローナル抗体は対応するタンパク質の生物学的活性を阻害または中和する能力について試験することができる。Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)； Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993)； Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993)；および米国特許第5,591,669号、米国特許第5,589,369号、米国特許第5,545,807号；および米国特許出願第20020199213号、WO 96/34096および米国特許出願第20030194404号；および米国特許出願第20030031667号も参照のこと。米国特許出願第20030092125号は動物の免疫応答を所望のエピトープにバイアスをかける方法を開示している。ヒト抗体をインビトロ活性化Ｂ細胞によって製造することもできる（米国特許第5,567,610号および第5,229,275号参照）。
【０１５０】
モノクローナル抗体の製造に有用なさらなるトランスジェニック動物は、米国特許第5,770,429号およびFishwild, et al. （Nat. Biotechnol. 14:845-851, 1996）に記載のMedarex HuMAb-MOUSE（登録商標）を含み、これはヒト抗体の重鎖および軽鎖をコードする未反応ヒト抗体遺伝子由来の遺伝子配列を含む。HuMAb-MOUSE（登録商標）の免疫化によって、標的タンパク質に対するモノクローナル抗体を製造することができる。
【０１５１】
また、Ishida et al. （Cloning Stem Cells. 4:91-102, 2002）は、ヒトＤＮＡのメガベースサイズセグメントを含み、そして全ヒト免疫グロブリン（ｈＩｇ）遺伝子座を含むTrans Chromo Mouse（TCMOUSE（商標））を開示している。TCMOUSEはＩｇＧの全てのサブクラス（ＩｇＧ１−Ｇ４）を含むｈＩｇの完全に多様化されたレパートリーを有する。TC Mouseを様々なヒト抗原で免疫化して、ヒト抗体を含む抗体応答を作成する。
【０１５２】
組換えヒト抗体遺伝子のレパートリーを形成するための技術の進歩、および線状バクテリオファージの表面のコード抗体フラグメントの呈示は、ヒト抗体を直接製造する手段を提供する。ファージ技術によって製造した抗体は、バクテリア内の抗原結合フラグメント（通常ＦｖまたはＦａｂフラグメント）として製造され、従ってエフェクター機能を有さない。エフェクター機能は２つの戦略の何れかによって導入することができる：フラグメントを哺乳類細胞中で発現するための完全抗体に組み込むか、またはエフェクター機能を惹起することができる第２の結合部位を有する二重特異性抗体フラグメントに組み込むことができる。
【０１５３】
典型的には、抗体のＦｄフラグメント（ＶＨ−ＣＨ１）および軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）をＰＣＲによって個別にクローン化し、そしてコンビナトリアルファージディスプレーライブラリーでランダムに組み換えて、これを特定の抗原に対する結合性について選択することができる。Ｆａｂフラグメントはファージ表面上で発現しており、すなわち物理的にそれらをコードする遺伝子と結合している。したがって、抗原結合性によるＦａｂの選択は、その後に増幅することができるＦａｂコード化配列について共選択する。抗原結合と再増幅の反復によって（パニングと呼ばれる方法）、抗原に対して特異的なＦａｂを富化し、最終的に単離する。
【０１５４】
１９９４年に、「ガイド選択」と呼ばれる抗体のヒト化アプローチが開示された。ガイド選択はマウスモノクローナル抗体のヒト化のためのファージディスプレー技術の能力を利用する（Jespers, L. S., et al., Bio/Technology 12, 899-903 (1994)参照）。このためマウスモノクローナル抗体のＦｄフラグメントをヒト軽鎖ライブラリーとの組合せで表示することができ、得られたハイブリッドＦａｂライブラリーを抗原で選択することができる。マウスＦｄフラグメントは選択をガイドするテンプレートを提供する。その後、選択ヒト軽鎖をヒトＦｄフラグメントライブラリーと組み合わせる。得られたライブラリーの選択によって完全にヒトＦａｂを得る。
【０１５５】
ファージディスプレーライブラリーからヒト抗体を抽出するための各種方法が開示されている（例えば、Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991)； Marks et al., J. Mol. Biol, 222:581-597 (1991)；米国特許第5,565,332号および第5,573,905号； Clackson, T., and Wells, J. A., TIBTECH 12, 173-184 (1994)参照）。とりわけ、インビトロ選択およびファージディスプレーライブラリーに由来する抗体の発展は、強力なツールとなっている（Burton, D. R., and Barbas III, C. F., Adv. Immunol. 57, 191-280 (1994)；およびWinter, G., et al., Annu. Rev. Immunol. 12, 433-455 (1994)；米国特許出願第20020004215号およびWO92/01047；２００３年１０月９日に公開された米国特許出願第20030190317号および米国特許第6,054,287号；米国特許第5,877,293号参照）。
【０１５６】
Watkinsの“Screening of Phage-Expressed Antibody Libraries by Capture Lift,” Methods in Molecular Biology, Antibody Phage Display: Methods and Protocols 178: 187-193、および２００３年３月６日に公開された米国特許出願第200120030044772は、ファージ発現抗体ライブラリーまたは他の結合分子をキャプチャーリフトによってスクリーニングする方法であって、候補結合分子を固体支持体に固定化することを含む方法を開示している。
【０１５７】
抗体生成物を、本明細書の「スクリーニング法」と題して記載したアッセイを用いて、または当業者に既知の好適な何れかのアッセイを用いて、本発明の処置方法における活性および適応についてスクリーニングすることができる。
【０１５８】
本発明において、上記のＦＺＤ１０ポリペプチドおよびその変異体は、上記のとおりトランスジェニック動物を免役するために用いることができる。モノクローナル抗体を当業者に既知の方法を用いて製造し、抗体の特異性を単離ＦＺＤ１０ポリペプチドを用いて試験する。ヒトまたは霊長類ＦＺＤ１０またはそのエピトープの製造方法は、化学合成、組換えＤＮＡ技術または生物学的サンプルからの単離を含むが、これらに限定されない。ペプチドの化学合成は、例えば、古典的な固相ペプチド合成のMerrifeld法（Merrifeld, J. Am. Chem. Soc. 85:2149, 1963、参照により本明細書の一部とする）またはRapid Automated Multiple Peptide SynthesisシステムのＦＭＯＣ戦略（E. I. du Pont de Nemours Company, Wilmington, DE）（Caprino and Han, J. Org. Chem. 37:3404, 1972、参照により本明細書の一部とする）によって行うことができる。
【０１５９】
ポリクローナル抗体は、ウサギまたは他の動物に抗原を注射して免疫化し、その後適切な間隔でブーストすることよって作成することができる。他の動物には、マウス、ラット、ニワトリ、モルモット、ヒツジ、ウマ、サル、ラクダおよびサメが含まれる。動物から採血し、血清を精製ＦＺＤ１０タンパク質に対して、通常はＥＬＩＳＡによって、またはＦＺＤ１０の作用を阻止する能力に基づいてアッセイする。鳥類、例えばニワトリ、シチメンチョウ等を用いるとき、抗体を卵黄から単離することができる。モノクローナル抗体は、免疫化マウス由来の脾臓細胞を継続的に複製している腫瘍細胞、例えば骨髄腫またはリンパ腫と融合させるMilstein and Kohler法に従って製造することができる（Milstein and Kohler, Nature 256:495-497, 1975； Gulfre and Milstein, Methods in Enzymology: Immunochemical Techniques 73:1-46, Langone and Banatis eds., Academic Press, 1981、参照により本明細書の一部とする）。そうして形成されたハイブリドーマ細胞は、限界希釈法よってクローン化し、上清は、ＬＩＳＡ、ＲＩＡまたはバイオアッセイによって抗体生産についてアッセイする。
【０１６０】
標的タンパク質を認識し、特異的に結合する抗体固有の能力は、タンパク質の過剰発現を処置するアプローチを提供する。したがって、本発明の他の局面は、ＦＺＤポリペプチドの過剰発現が関与している疾患を予防または処置する方法であって、ＦＺＤ１０に特異的な抗体で患者を処置することによる方法を提供する。
【０１６１】
ＦＺＤ１０に特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体を、上記のとおり当業者に既知のあらゆる適切な方法によって製造することができる。例えば、マウスまたはヒトモノクローナル抗体をハイブリドーマ技術によって製造することができるか、あるいはＦＺＤ１０タンパク質、もしくは免疫学的に活性なそのフラグメント、または抗イディオタイプ抗体、もしくはそのフラグメントを動物に投与して、ＦＺＤ１０を認識し、それに結合することができる抗体の製造を惹起することができる。かかる抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥ、または鳥類の場合ＩｇＹ、および抗体のあらゆるサブクラス由来であり得るが、これらに限定されない。
【０１６２】
アミノ酸配列変異体
突然変異の発生に好ましい位置である抗体のある残基または領域を同定するのに有用な方法は、「アラニン探査変異」と呼ばれ、Cunningham and Wells Science, 244:1081-1085 (1989)に記載されている。標的残基の残基または基を同定し（例えば荷電残基、例えばａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、およびｇｌｕ）、そして中性または負に荷電したアミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）で置換して、アミノ酸と抗原の相互作用に影響を与える。置換に機能的感受性を示すこれらのアミノ酸位置を、さらなるまたは他の変異を置換位置で、またはそれについて導入して改善する。したがって、アミノ酸配列変化を含む部位が予め決定されているが、変異の性質それ自体は予め決定されている必要がない。例えば、ある部位で変異のパフォーマンスを分析するため、ａｌａスキャンまたはランダム変異発生を標的コドンまたは領域で行い、発現した抗体変異体を所望の活性についてスクリーニングする。
【０１６３】
アミノ酸配列挿入は、１残基から１００以上の残基を含むポリペプチドまでの長さのアミノ−および／またはカルボキシル−末端融合、ならびに１または複数アミノ酸残基の内部配列挿入を含む。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基との抗体またはエピトープタグもしくはサルベージレセプターエピトープと融合した抗体（抗体フラグメントを含む）が含まれる。他の抗体分子の挿入変異には、例えばＮ末端またはＣ末端での抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドとの融合が含まれる。
【０１６４】
「エピトープ標識化」なる用語は、エピトープタグと融合した抗体を意味する。エピトープタグポリペプチドは、それに対する抗体を製造することができるが抗体のそれに対する活性とは干渉しないほど短いエピトープを提供するのに十分な残基である。エピトープタグは好ましくは、それに対する抗体が実質的に他のエピトープと交叉反応しないように十分ユニークである。好適なタグポリペプチドは一般に、少なくとも６アミノ酸残基、通常約８−５０アミノ酸残基（好ましくは約９−３０残基）を有する。例えば、ｆｌｕ  ＨＡタグポリペプチドおよびその抗体１２ＣＡ５［Field et al., Mol. Cell. Biol. 8: 2159-2165 (1988)］；ｃ−ｍｙｃタグおよびその８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７および９Ｅ１０抗体［Evan et al., Mol. Cell. Biol. 5(12): 3610-3616 (1985)］；ならびに単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグおよびその抗体［Paborsky et al., Protein Engineering 3(6): 547-553 (1990)］を含む。他の例示的タグは、ニッケルキレート化を用いて標識化した化合物の単離が可能なポリヒスチジン配列、一般的には約６ヒスチジン残基である。周知であり、当該技術分野において通常使用されている他のラベルおよびタグ、例えばＦＬＡＧ（登録商標）タグ（Eastman Kodak, Rochester, NY）は、本発明に含まれる。
【０１６５】
他のタイプの変異はアミノ酸置換変異である。これらの変異体では、抗体分子において少なくとも１個のアミノ酸が除去され、その場所に１個の異なる残基が挿入されている。超可変またはＣＤＲ領域またはフレームワーク領域の置換的変異形成が意図される。保存的置換を表１に示す。最も保存的な置換を「好ましい置換」のタイトルの下に示す。かかる置換によって生物学的活性の変化が生じないとき、表１において「例示的置換」と示されているかまたはアミノ酸クラスについてさらに記載している下記記述のとおり、さらなる置換変化を導入することができ、そして生成物をスクリーニングすることができる。
【表１】
2010509368.tif 000002
【０１６６】
抗体の生物学的特性の実質的修飾は、（ａ）例えばシートまたはらせんコンホメーションとしての、置換領域のポリペプチド主鎖の構造、（ｂ）標的部位での電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖のかさ高さを維持する効果において顕著に異なる置換を選択することによって行う。天然に生じる残基を一般的な側鎖特性に基づいて分類する：
【０１６７】
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；
【０１６８】
（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；
【０１６９】
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
【０１７０】
（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；
【０１７１】
（５）鎖の方向に影響する残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；および
【０１７２】
（６）芳香族性：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
【０１７３】
保存的置換は、アミノ酸をそのクラスの他のメンバーと置換することを含む。非保存的置換はこれらのクラスの１個のメンバーを他のクラスのメンバーと置換することを含む。
【０１７４】
モノクローナル、ヒト、ヒト化または変異抗体の適切なコンホメーションの維持に関与しないあらゆるシステイン残基も、一般に、分子の酸化安定性を改善し、異常な架橋を防止するためにセリンで置換することができる。逆に、システイン結合を抗体に加えてその安定性を改善することができる（とりわけ抗体が抗体フラグメント、例えばＦｖフラグメントであるとき）。
【０１７５】
親和性成熟には、親抗体のＣＤＲ内に置換を有する抗体変異体を作成し、スクリーニングして親抗体と比較して改善された生物学的特性、例えば結合親和性を有する変異体を選択することを含む。かかる置換変異体を製造するための常套の方法は、ファージディスプレーを用いた親和性成熟である。簡潔には、いくつかの超可変領域部位（例えば６−７部位）を、各部位で全ての可能性のあるアミノ酸置換を製造することにより変異させる。このように製造した抗体変異体は、各粒子にパッケージされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ生成物と融合する線状ファージ粒子由来の１価様式で示される。次にファージディスプレー変異体をそれらの生物学的活性（例えば結合親和性）についてスクリーニングする。
【０１７６】
アラニン探査変異を行って抗原結合に顕著に寄与する超可変領域残基を同定することができる。別法として、またはこれに加えて、抗体と抗原間の接触位置を同定するために、抗原−抗体複合体の結晶構造を分析することが有益であり得る。かかる接触残基および隣接する残基は、本明細書に記載の技術による置換の候補である。かかる変異体が形成されると、変異体のパネルを本明細書に記載のスクリーニングに供して、１個以上のより適切なアッセイで優れた特性を有する抗体をさらなる開発のために選択することができる。
【０１７７】
親抗体と比較して修飾された糖化パターンを有する、例えば当該抗体に見られる１個以上の炭水化物基が欠失している、および／または当該抗体に存在しない１個以上の糖化部位が加えられている抗体変異体も、製造することができる。
【０１７８】
抗体の糖化は典型的には、Ｎ結合またはＯ結合である。Ｎ結合は、アスパラギン残基の側鎖と炭水化物基の結合を意味する。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニン（ここで、Ｘはプロリン以外のいずれかのアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖と炭水化物基の酵素的結合のための配列を認識する。ポリペプチドにおけるこれらのポリペプチド配列の存在は、潜在的な糖化部位を作成する。したがって、Ｎ結合糖化部位を抗体に、これが１個以上のこれらトリペプチド配列を含むようにアミノ酸配列を変化させて加えることができる。Ｏ結合糖化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニンと糖Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシロースのひとつとの結合を意味するが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンも使用することができる。Ｏ結合糖化部位は抗体に、セリンまたはスレオニン残基の１個以上を元の抗体配列に挿入または置換することによって加えることができる。
【０１７９】
変化したエフェクター機能
抗体の他の修飾が意図される。例えば、本発明の抗体をエフェクター機能、例えば半減期、ＣＤＣまたはＡＤＣＣ活性について、例えばがんの処置における抗体の効果を増加させるために修飾することが望まれ得る。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入することができ、それによってこの領域での鎖間ジスルフィド結合形成が可能となる。このように製造したホモダイマー抗体は、内在化能力および／または増加した補体介在細胞殺傷および抗体依存細胞毒性（ＡＤＣＣ）を改善することができる。Caron et al., J. Exp Med. 176: 1191-1195 (1992) およびShopes, B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)参照。増加した抗腫瘍活性を有するホモダイマー抗体はまた、Wolff et al., Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)に記載のヘテロ二重機能性クロスリンカーを用いて製造することができる。あるいは、抗体を２個のＦｃ領域を有し、それによって増加した補体溶解およびＡＤＣＣ能力を有し得るものに設計することができる。Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)参照。さらに、ＣＤＲ内の配列が抗体とＭＨＣクラスＩＩの結合を惹起し、そして望ましくないヘルパーＴ細胞応答の引き金となることが示されている。保存的置換によって、抗体が結合活性を保持するが、望ましくないＴ細胞応答の引き金となる能力を喪失させることさえ可能であり得る。Steplewski et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1988;85(13):4852-6も参照し、その全体を参照により本明細書の一部とする。これはマウス可変領域がヒトガンマ１、ガンマ２、ガンマ３およびガンマ４定常領域と結合したキメラ抗体を開示している。Presta et al., Biochem Soc Trans. 2002;30(4):487-90も参照し、その全体を参照により本明細書の一部とする。これはＩｇＧ１のＦｃ領域における、特異的Ｆｃガンマ受容体（Ｒ）との結合のみが増加したかまたは、同時にＦｃガンマＲの一つのタイプとの結合が増加し、そして他のタイプとの結合が減少する様々な位置が見出されたことを開示している。ＦｃガンマＲＩＩＩａとの結合が増加した選択的ＩｇＧ１変異体を次に、インビトロ抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）アッセイで試験し、末梢血単核細胞またはナチュラルキラー細胞を用いたときＡＤＣＣで増加が見られた。
【０１８０】
本発明のある態様において、例えば腫瘍浸透性を増加させるために、無傷の抗体よりも抗体フラグメントを用いることが望まれ得る。この場合、血清半減期を増加させるために抗体フラグメントを修飾することが望まれ、例えばＰＥＧまたは多糖類ポリマーを含む他の水溶性ポリマーのような分子を抗体フラグメントに加えることによって、半減期を増加させることができる。これはまた、例えば抗体フラグメントにサルベージ受容体結合エピトープを導入することによって（例えば、抗体フラグメントの適切な領域の変異によって、または何れかの末端または中間で抗体フラグメントと融合するペプチドタグにエピトープを、例えばＤＮＡもしくはペプチド合成によって導入することによって）達成することができる（例えばWO96/32478参照）。
【０１８１】
さらに、ポリマーとの共有結合によって抗体を化学的に修飾して、例えばその循環半減期を増加させることができる。各抗体分子は１個以上（すなわち、１、２、３、４、５またそれ以上）のポリマー分子と結合することができる。ポリマー分子は好ましくは、抗体とリンカー分子によって結合する。ポリマーは一般に、合成または天然由来のポリマー、例えば所望により置換された直鎖または分枝鎖ポリアルケン、ポリアルケニレンまたはポリオキシアルキレンポリマー、または分枝鎖もしくは非分枝鎖多糖類、例えばホモもしくはヘテロ多糖類であり得る。好ましいポリマーはポリオキシエチレンポリオールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧは室温で水溶性であり、一般式：Ｒ（Ｏ−−ＣＨ２−−ＣＨ２）ｎ Ｏ−−Ｒ〔式中、Ｒは水素、または保護基、例えばアルキルまたはアルカノール基であり得る。好ましくは、保護基は１〜８個の炭素を有し、より好ましくはメチルである。記号ｎは正の整数、好ましくは１〜１，０００、より好ましくは２〜５００である）を有する。ＰＥＧは好ましい平均分子量１０００〜４０，０００、より好ましくは２０００〜２０，０００、最も好ましくは３，０００〜１２，０００を有する。好ましくは、ＰＥＧは少なくとも１個のヒドロキシ基を有し、より好ましくはそれは末端ヒドロキシ基である。これは好ましくは阻害剤の遊離アミノ基と反応して活性化されるヒドロキシ基である。しかし、本発明の共有結合したＰＥＧ／抗体を得るための反応基のタイプおよび量が変化し得ると理解される。好ましいポリマーおよびそれをペプチドと結合する方法は、米国特許第4,766, 106号；第4,179, 337号；第4,495, 285号；および第4,609, 546号に示されており、これらを全体について、出典明示により本明細書の一部とする。
【０１８２】
本明細書において使用するとき、「サルベージ受容体結合エピトープ」なる用語は、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期の増加に関与するＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープを意味する。
【０１８３】
サルベージ受容体結合エピトープは好ましくは、Ｆｃドメインの１または２個のループ由来のいずれか１個以上のアミノ酸残基が抗体フラグメントの類似の位置に移動する領域を構成する。より好ましくは、Ｆｃドメインの１または２個のループ由来の３個以上の残基を移動する。より好ましくは、エピトープをＦｃ領域の（例えばＩｇＧの）ＣＨ２ドメインから取り、そして抗体のＣＨ１、ＣＨ３またはＶＨ領域またはかかる領域の１個より多くに移動する。あるいは、エピトープをＦｃ領域のＣＨ２ドメインから取り、抗体フラグメントのＣＬ領域またはＶＬ領域、またはその両方に移動させる。Ｆｃ変異体およびそのサルベージ受容体との相互作用を開示している国際出願WO 97/34631およびWO 96/32478も参照。
【０１８４】
したがって、本発明の抗体は、ジスルフィド結合に関与しいているシステインが修飾または除去されているおよび／またはｍｅｔがＮ末端で加えられているおよび／または１個以上のＮ末端２０アミノ酸が除去されているおよび／または補体と相互作用する領域、例えばＣ１ｑ結合部位が変化または除去されているおよび／またはＡＤＣＣ部位が変化または除去されている変異体を含むＦｃサルベージ受容体と相互作用する能力を保持しているヒトＦｃ部分、ヒトコンセンサスＦｃ部分またはその変異体を含み得る［例えば、Molec. Immunol. 29 (5): 633-9 (1992)参照］。
【０１８５】
先の研究では、主としてＩｇＧ残基２３３−２３９から成る低位ヒンジ領域について、ヒトおよびマウスＩｇＧのＦｃＲに対する結合部位をマップした。他の研究は、さらなる広いセグメント、例えばヒトＦｃ受容体ＩのＧｌｙ３１６−Ｌｙｓ３３８、ヒトＦｃ受容体ＩＩＩのＬｙｓ２７４−Ａｒｇ３０１およびＴｙｒ４０７−Ａｒｇ４１６を提案し、または低級ヒンジ以外のいくつかの特異的残基、例えばマウスＦｃ受容体ＩＩと相互作用するマウスＩｇＧ２ｂのＡｓｎ２９７およびＧｌｕ３１８を発見した。ヒトＦｃ受容体ＩＩＩＡを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃフラグメントの３．２Å結晶構造のレポーターは、Ｆｃ受容体ＩＩＩＡとの結合に関与するＩｇＧ１残基Ｌｅｕ２３４−Ｓｅｒ２３９、Ａｓｐ２６５−Ｇｌｕ２６９、Ａｓｎ２９７−Ｔｈｒ２９９、およびＡｌａ３２７−Ｉｌｅ３３２を明らかにした。結晶構造に基づいて、低位ヒンジ（Ｌｅｕ２３４−Ｇｌｙ２３７）に加えて、ＩｇＧ  ＣＨ２ドメインループＦＧ（残基３２６−３３０）およびＢＣ（残基２６５−２７１）の残基がＦｃ受容体ＩＩＡとの結合に関与し得ることが示唆されている。Shields et al., J. Biol. Chem., 276(9):6591-6604 (2001)を参照し、その全体を参照により本明細書の一部とする。Ｆｃ受容体結合部位の残基の変異は、エフェクター機能、例えばＡＤＣＣもしくはＣＤＣ活性、または半減期を変化させ得る。上記のとおり、潜在的変異は１個以上の残基の挿入、欠失または置換、例えばアラニンでの置換、保存的置換、非保存的置換、または同じ位置で異なるＩｇＧサブクラスから対応するアミノ酸残基での置換（例えばＩｇＧ１残基を対応する当該位置のＩｇＧ２残基で置換すること）を含む。
【０１８６】
Shields et al.は、全ヒトＦｃ受容体との結合に関与するＩｇＧ１残基はヒンジに近接するＣＨ２ドメインに位置し、下記２つのカテゴリーに分類されることを報告した：  １）直接全てのＦｃＲと相互作用し得る位置はＬｅｕ２３４−Ｐｒｏ２３８、Ａｌａ３２７、およびＰｒｏ３２９（およびおそらくＡｓｐ２６５）を含む；  ２）炭水化物の性質または位置に影響する位置はＡｓｐ２６５およびＡｓｎ２９７を含む。Ｆｃ受容体ＩＩとの結合に影響するさらなるＩｇＧ１残基は下記のとおりである：（最も大きな影響）Ａｒｇ２５５、Ｔｈｒ２５６、Ｇｌｕ２５８、Ｓｅｒ２６７、Ａｓｐ２７０、Ｇｌｕ２７２、Ａｓｐ２８０、Ａｒｇ２９２、Ｓｅｒ２９８、および（低い影響）Ｈｉｓ２６８、Ａｓｎ２７６、Ｈｉｓ２８５、Ａｓｎ２８６、Ｌｙｓ２９０、Ｇｌｎ２９５、Ａｒｇ３０１、Ｔｈｒ３０７、Ｌｅｕ３０９、Ａｓｎ３１５、Ｌｙｓ３２２、Ｌｙｓ３２６、Ｐｒｏ３３１、Ｓｅｒ３３７、Ａｌａ３３９、Ａｌａ３７８、およびＬｙｓ４１４。Ａ３２７Ｑ、Ａ３２７Ｓ、Ｐ３２９Ａ、Ｄ２６５ＡおよびＤ２７０Ａによって結合が減少した。上で同定した全ＦｃＲについての残基に加えて、Ｆｃ受容体ＩＩＩＡとの結合を４０％以上減少させるさらなるＩｇＧ１残基は下記のとおりである：Ｓｅｒ２３９、Ｓｅｒ２６７（Ｇｌｙのみ）、Ｈｉｓ２６８、Ｇｌｕ２９３、Ｇｌｎ２９５、Ｔｙｒ２９６、Ａｒｇ３０１、Ｖａｌ３０３、Ｌｙｓ３３８およびＡｓｐ３７６。ＦｃＲＩＩＩＡとの結合が改善された変異には、Ｔ２５６Ａ、Ｋ２９０Ａ、Ｓ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、およびＡ３３９Ｔが含まれる。Ｌｙｓ４１４はＦｃＲＩＩＡおよびＦｃＲＩＩＢの結合における４０％の減少を示し、Ａｒｇ４１６はＦｃＲＩＩＡおよびＦｃＲＩＩＩＡについて３０％減少、Ｇｌｎ４１９はＦｃＲＩＩＡに対して３０％減少およびＦｃＲＩＩＢに対して４０％減少、そしてＬｙｓ３６０はＦｃＲＩＩＩＡに対して２３％増加を示した。Presta et al．， Biochem． Soc． Trans． (2001) 30， 487‐490も参照。
【０１８７】
例えば、米国特許第6,194,551号（その全体について出典明示により本明細書の一部とする）は、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域における、アミノ酸位置３２９、３３１または３２２（Ｋａｂａｔナンバリングを用いた）での変異を含む変化したエフェクター機能を有する変異を開示しており、このいくつかはＣ１ｑ結合またはＣＤＣ活性の減少を示す。他の例として、米国特許第6,737,056号（その全体について出典明示により本明細書の一部とする）は、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域における、アミノ酸位置２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８または４３９（Ｋａｂａｔナンバリングを用いた）での変異を含む変化したエフェクターまたはＦｃ−ガンマ受容体結合性を有する変異を開示しており、このいくつかはＡＤＣＣまたはＣＤＣ活性の減少に関連した受容体結合プロファイルを示す。これらの、アミノ酸位置２３８、２６５、２６９、２７０、３２７または３２９での変異によってＦｃＲＩとの結合が減少すると記載されており、アミノ酸位置２３８、２６５、２６９、２７０、２９２、２９４、２９５、２９８、３０３、３２４、３２７、３２９、３３３、３３５、３３８、３７３、３７６、４１４、４１６、４１９、４３５、４３８または４３９での変異によってＦｃＲＩＩとの結合が減少すると記載されており、そしてアミノ酸位置２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２６５、２６８、２６９、２７０、２７２、２７８、２８９、２９３、２９４、２９５、２９６、３０１、３０３、３２２、３２７、３２９、３３８、３４０、３７３、３７６、３８２、３８８、３８９、４１６、４３４、４３５または４３７での変異によってＦｃＲＩＩＩとの結合が減少すると記載されている。
【０１８８】
米国特許第5,624,821号（その全体について出典明示により本明細書の一部とする）は、マウス抗体のＣｌｑ結合活性は重鎖のアミノ酸残基３１８、３２０または３２２を変異により変化させることができ、そして残基２９７（Ａｓｎ）の置換によって溶解活性が除去されると報告している。
【０１８９】
米国特許出願公開番号20040132101（その全体について出典明示により本明細書の一部とする）は、アミノ酸位置２４０、２４４、２４５、２４７、２６２、２６３、２６６、２９９、３１３、３２５、３２８または３３２（Ｋａｂａｔナンバリングを用いた）または位置２３４、２３５、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４、２４５、２４７、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６９、２９６、２９７、２９８、２９９、３１３、３２５、３２７、３２８、３２９、３３０または３３２（Ｋａｂａｔナンバリングを用いた）での変異を有する変異体を開示しており、２３４、２３５、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４、２４５、２４７、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６９、２９６、２９７、２９８、２９９、３１３、３２５、３２７、３２８、３２９、３３０または３３２位置での変異のものはＡＤＣＣ活性が減少し、あるいはＦｃガンマ受容体との結合性が減少し得る。
【０１９０】
Chappel et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1991;88(20):9036-40（その全体について参照により本明細書の一部とする）は、ＩｇＧ１の細胞親和活性が重鎖ＣＨ２ドメインの内因的特性であると報告している。ＩｇＧ１のアミノ酸残基２３４−２３７のいずれかでの１個の点変異によってその活性が顕著に低下するかまたは削除される。ＩｇＧ１残基２３４−２３７（ＬＬＧＧ）の全てのＩｇＧ２およびＩｇＧ４への置換は、全結合活性を回復する必要があった。全ＥＬＬＧＧＰ配列（残基２３３−２３８）を含むＩｇＧ２抗体が野生型ＩｇＧ１よりも活性であると観察された。
【０１９１】
Isaacs et al., J Immunol. 1998;161(8):3862-9（その全体について参照により本明細書の一部とする）は、ＦｃガンマＲ結合についてクリティカルなモチーフの変異（グルタミン酸２３３からプロリン、ロイシン／フェニルアラニン２３４からバリン、およびロイシン２３５からアラニン）は、標的細胞の減少を完全に防止したと報告している。グルタミン酸３１８のアラニンへの変異によってマウスＩｇＧ２ｂのエフェクター機能が削除され、そしてヒトＩｇＧ４の能力も減少した。
【０１９２】
Armour et al., Mol Immunol. 2003;40(9):585-93（その全体について参照により本明細書の一部とする）は、野生型ＩｇＧ１よりも少なくとも１０倍低い効率で活性化受容体ＦｃガンマＲＩＩａと反応するが、阻害受容体ＦｃガンマＲＩＩｂとは４倍のみ結合が低下したＩｇＧ１変異体を同定した。変異をアミノ酸２３３−２３６の領域で、および／またはアミノ酸位置３２７、３３０および３３１で作成した。WO 99/58572も参照し、その全体について出典明示により本明細書の一部とする。
【０１９３】
Xu et al., J Biol Chem. 1994;269(5):3469-74（その全体について参照により本明細書の一部とする）は、ＩｇＧ１  Ｐｒｏ３３１からＳｅｒへの変異によってＣ１ｑ結合が顕著に減少し、溶解活性が実質的に削除されたと報告している。対照的に、ＩｇＧ４のＳｅｒ３３１についてＰｒｏの置換によって、ＩｇＧ４  Ｐｒｏ３３１変異体に溶解活性を部分的に（４０％）賦与された。
【０１９４】
Schuurman et al,. Mol Immunol. 2001;38(1):1-8（その全体について参照により本明細書の一部とする）は、内部重鎖結合形成に関与するヒンジシステインの一つ、Ｃｙｓ２２６をセリンに変異させるとより安定な内部重鎖結合が得られたと報告している。ＩｇＧ４ヒンジ配列Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−ＣｙｓをＩｇＧ１ヒンジ配列Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓに変異させると、重鎖間の共有相互作用が顕著に安定化する。
【０１９５】
Angal et al., Mol Immunol. 1993;30(1):105-8（その全体について参照により本明細書の一部とする）は、ＩｇＧ４のアミノ酸位置２４１でセリンをプロリンに変異させると（ＩｇＧ１およびＩｇＧ２の当該位置で見出される）、均一な抗体の製造ならびに元のキメラＩｇＧ４と比較して延長された血清半減期および上昇した組織分布が導かれたと報告している。
【０１９６】
本発明はまた、増加したＡＤＣＣ活性を示すフコシル化が存在しないかまたは減少した抗体分子を含む、変化したエフェクター活性をもたらす変化した炭水化物構造を有する抗体分子の製造を意図する。これを行うための様々な方法が当該技術分野において既知である。例えば、ＡＤＣＣエフェクター活性は、抗体分子と、ＣＨ２ドメインのＡｓｎ−２９７でＮ結合グリコシル化の炭水化物構造に依存することが示されているＦｃγＲＩＩＩ受容体の結合によって介在される。非フコシル化抗体はこの受容体と増加した親和性で結合し、そして天然、フコシル化抗体よりもより効果的にＦｃγＲＩＩＩ−介在性エフェクター機能の引き金となる。例えば、アルファ−１，６−フコシルトランスフェラーゼ酵素がノックアウトされているＣＨＯ細胞の非フコシル化抗体の組換え製造によって、１００倍増加したＡＤＣＣ活性を有する抗体が生じる［Yamane-Ohnuki et al., Biotechnol Bioeng. 2004 Sep 5;87(5):614-22］。同様の効果が、フコシル化経路におけるこのまたは他の酵素の活性を減少させることによって、例えばｓｉＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡ処理によって、細胞系を操作して酵素をノックアウトするか、または選択的グリコシル化阻害剤と共に培養して、達成される［Rothman et al., Mol Immunol. 1989 Dec;26(12):1113-23］。宿主細胞系のいくつか、例えばＬｅｃ１３またはラットハイブリドーマＹＢ２／０細胞系は、より低いフコシル化レベルを有する抗体を天然に生産する。Shields et al., J Biol Chem. 2002 Jul 26;277(30):26733-40； Shinkawa et al., J Biol Chem. 2003 Jan 31;278(5):3466-73。例えばＧｎＴＩＩＩ酵素を過剰発現する細胞で抗体を組換え製造することによって、切断された(bisected)炭水化物のレベルの増加も、ＡＤＣＣ活性の増加のために測定された。Umana et al., Nat Biotechnol. 1999 Feb;17(2):176-80。２個のフコース残基の１個のみの欠失が、ＡＤＣＣ活性の増加に十分であり得ると予測されている（Ferrara et al., Biotechnol Bioeng. 2006 Apr 5;93(5):851-61）。
【０１９７】
他の共有修飾
抗体の共有結合修飾はまた、本発明の範囲内に含まれる。これは化学合成によって、または適切であるとき抗体の酵素的もしくは化学的切断によって実施することができる。抗体の他のタイプの共有結合修飾は、抗体の標的アミノ酸残基を、選択した側鎖またはＮもしくはＣ末端残基と反応することができる有機誘導化剤と反応させて当該分子に導入する。
【０１９８】
システイニル残基は、最も一般的に、α−ハロアセテート（および対応するアミン）、例えばクロロ酢酸またはクロロアセトアミドと反応させて、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を得る。システイニル残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、．アルファ．−ブロモ−β−（５−イミドゾリル）プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロメルクリベンゾエート、２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールと反応させて誘導化する。
【０１９９】
ヒスチジル残基は、ジエチルピロカルボネートとｐＨ５．５−７．０で反応させて（この薬剤が比較的ヒスチジル側鎖に特異的であるため）誘導化する。パラ−ブロモフェンアシルブロマイドも有用であり；該反応は好ましくは０．１Ｍ  ナトリウムカコジレート中、ｐＨ  ６．０で行う。
【０２００】
リシニルおよびアミノ末端残基は、スクシン酸無水物または他のカルボン酸無水物と反応する。これらの薬剤での誘導化は、リシニル残基の電荷を逆転する効果を有する。アルファ．−アミノ−含有残基を誘導化するのに好適な他の薬剤は、イミドエステル、例えばメチルピコリンイミデート、ピリドキサルホスフェート、ピリドキサル、クロロホウ化水素、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソウレア、２，４−ペンタンジオン、およびグリオキシレートとのトランスアミナーゼ−触媒反応を含む。
【０２０１】
アルギニル残基を１または複数の常套の試薬、中でもフェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオンおよびニンヒドリルと反応させて修飾する。アルギニン残基の誘導化は、グアニジンは、グアニジン官能基の高いｐＫａのため当該反応をアルカリ条件で行う必要がある。さらに、これらの薬剤はリシンの基およびアルギニンエプシロン−アミノ基と反応し得る。
【０２０２】
チロシル残基の特異的修飾は、とりわけ興味深くは、芳香族性ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によってチロシル残基にスペクトル標識を導入ことにより実施される。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミジゾールおよびテトラニトロメタンを用いて、Ｏ−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体をそれぞれ形成する。チロシル残基は１２５Ｉまたは１３１Ｉを用いてヨウ素化して、ラジオイムノアッセイに使用するための標識化タンパク質を製造する。
【０２０３】
カルボキシル側鎖基（アスパルチルまたはグルタミル）は、カルボジイミド（Ｒ−Ｎ．ｄｂｄ．Ｃ．ｄｂｄ．Ｎ−Ｒ’）（ここで、ＲおよびＲ’は異なるアルキル基、例えば１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドである）との反応によって選択的に修飾される。さらに、アンモニウムイオンとの反応によって、アスパルチルおよびグルタミル残基をアスパラギニルおよびグルタミニル残基に変換する。
【０２０４】
グルタミニルおよびアスパラギニル残基はしばしば脱アミド化されて、それぞれ対応するグルタミルおよびアスパルチル残基となる。これらの残基は中性または塩基性条件下で脱アミド化される。これらの残基の脱アミド化形態は、本発明の範囲に含まれる。
【０２０５】
他の修飾には、プロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖の．アルファ．−アミノ基のメチル化（T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)）、Ｎ末端アミンのアセチル化、およびＣ末端カルボキシル基のアミド化が含まれる。
【０２０６】
他のタイプの共有結合修飾には、抗体の化学的または酵素的グリコシド化が含まれる。これらの方法は、Ｎ−またはＯ−結合グリコシル化のためのグリコシル化能を有する宿主細胞による抗体の製造を必要としないという利点を有する。使用するカップリング態様に依存して、糖を（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）遊離スルホヒドリル基、例えばシステインのもの、（ｄ）遊離ヒドロキシル基、例えばセリン、スレオニンまたはヒドロキシプロリンのもの、（ｅ）芳香族性残基、例えばフェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンのもの、または（ｆ）グルタミンのアミド基と結合させることができる。当該方法は、１９８７年９月１１日に公開されたWO87/05330、およびAplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)に記載されている。
【０２０７】
抗体に存在する何れかの炭水化物部分の除去は、化学的または酵素的に行うことができる。化学的脱グリコシル化は、抗体をトリフルオロメタンスルホン酸化合物、または均等な化合物に曝露することが必要である。この処理によって、結合糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除くほとんどまたは全ての糖を、抗体は無傷なままで、切断する。化学的脱グリコシル化は、Hakimuddin, et al. Arch. Biochem. Biophys. 259: 52 (1987)およびEdge et al. Anal. Biochem., 118: 131 (1981)に記載されている。抗体の炭水化物基の酵素的切断を、Thotakura et al. Meth. Enzymol. 138: 350 (1987)に記載のとおり、様々なエンド−およびエキソ−グリコシダーゼの使用によって行うことができる。
【０２０８】
抗体の他のタイプの共有結合結合修飾は、抗体と種々の非タンパク質性ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリオキシエチル化ソルビトール、ポリオキシエチル化グルコース、ポリオキシエチル化グリセロール、ポリオキシアルキレン、またはデキストランのようなポリサッカリドポリマーの一つとの結合を含む。当該方法は当該技術分野において既知であり、例えば米国特許第4,640,835号；第4,496,689号；第4,301,144号；第4,670,417号；第4,791,192号、第4,179,337号、第4,766,106号、第4,179,337号、第4,495,285号、第4,609,546号、またはEP 315 456を参照されたい。
【０２０９】
遺伝子治療
適切な細胞への治療抗体の送達は、エクスビボ、インサイチュまたはインビボでの遺伝子治療によって、当該技術分野で既知のあらゆる好適なアプローチの使用によって、例えば物理的ＤＮＡ輸送方法（例えばリポソームまたは化学的処理）の使用によって、またはウイルスベクター（例えばアデノウイルス、アデノ随伴ウイルスまたはレトロウイルス）の使用によって、行うことができる。例えばインビボ治療のために、所望の抗体をコード化する核酸を単独で、またはベクター、リポソームもしくは結合物（precipitate）と組み合わせて、対象に直接注射することができ、そしていくつかの態様において、抗体化合物の発現が望まれる部位に注射することができる。エクスビボ処置のために、対象の細胞を採取し、核酸を当該細胞に導入して、当該修飾細胞を前記対象に直接、または例えば前記患者に埋め込む多孔膜に封入して、戻す。例えば、米国特許第4,892,538号および第5,283,187号参照。核酸を生細胞に導入するために利用可能な様々な技術が存在する。当該技術は核酸を培養細胞にインビトロで、またはインビボで意図した宿主の細胞に移送するかに依存して変化する。哺乳類細胞にインビボで核酸を移送するのに好適な技術は、リポソーム、電気穿孔、マイクロ注射、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、およびカルシウムリン酸沈殿の使用を含む。核酸のエクスビボ送達に一般的に使用するベクターは、レトロウイルスである。
【０２１０】
他のインビボ核酸移送技術には、ウイルスベクター（例えばアデノウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、またはアデノ随伴ウイルス）でのトランスフェクションおよび脂質利用システムが含まれる。核酸およびトランスフェクション剤は所望によりマイクロパーティクルに随伴している。トランスフェクション剤の例には、リン酸カルシウムまたは塩酸カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン−介在性トランスフェクション、４級アンモニウム両親媒性ＤＯＴＭＡ（（ジオレオイルオキシプロピル）トリメチルアンモニウムブロマイド、LipofectinとしてGIBCO-BRLより市販されている））（Felgner et al, (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7413-7417； Malone et al. (1989) Proc. Natl Acad. Sci. USA 86 6077-6081）；突出したトリメエチルアンモニウム端部を有する親油性グルタメートジエステル（Ito et al. (1990) Biochem. Biophys. Acta 1023, 124-132）；代謝可能な親脂質、例えばカチオン性脂質ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ、Transfectam、Promega）およびジパルミトイルホスファチジルエタノラミルペルミン（ＤＰＰＥＳ）（J. P. Behr (1986) Tetrahedron Lett. 27, 5861-5864； J. P. Behr et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6982-6986）；代謝可能な４級アンモニウム塩（ＤＯＴＢ、Ｎ−（１−［２，３−ジオレオイルオキシ］プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルスルフェート（ＤＯＴＡＰ）（Boehringer Mannheim）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ジオレオイルエステル、ＣｈｏＴＢ、ＣｈｏＳＣ、ＤＯＳＣ）（Leventis et al. (1990) Biochim. Inter. 22, 235-241）；３ベータ［Ｎ−（Ｎ’、Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）および３ベータ［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロールＤＣ−Ｃｈｏｌ：１混合物（Gao et al., (1991) Biochim. Biophys. Acta 1065, 8-14）、スペルミン、スペルミジン、リポポリアミン（Behr et al., Bioconjugate Chem, 1994, 5: 382-389）、親油性ポリリシン（ＬＰＬＬ）（Zhou et al., (1991) Biochim. Biophys. Acta 939, 8-18）、［［（１，１，３，３−テトラメチルブチル）クレスオキシ］エトキシ］エチル］ジメチルベンジルアンモニウムヒドロキシド（ＤＥＢＤＡヒドロキシド）と過剰のホスファチジルコリン／コレステロール（Ballas et al., (1988) Biochim. Biophys. Acta 939, 8-18）、セチルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＣＴＡＢ）／ＤＯＰＥ混合物（Pinnaduwage et al, (1989) Biochim. Biophys. Acta 985, 33-37）、ＤＯＰＥ、ＣＴＡＢ、ＤＥＢＤＡ、ジドデシルアンモニウムブロマイド（ＤＤＡＢ）、およびステアリールアミンのホスファチジルエタノールアミンとの混合物とのグルタミン酸の親油性ジエステル（ＴＭＡＧ）（Rose et al., (1991) Biotechnique 10, 520-525）、ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ（ＴｒａｎｓｆｅｃｔＡＣＥ、GIBCO BRL）、および脂質を有するオリゴガラクトースが含まれる。移動の効果を増加させるトランスフェクションエンハンサー剤の例には、例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリブレン、リソソーム破壊ペプチド（Ohmori N I et al, Biochem Biophys Res Commun Jun. 27, 1997;235(3):726-9）、コンドロイタンベースのプロテオグリカン、硫酸化プロテオグリカン、ポリエチレンイミン、ポリリシン（Pollard H et al. J Biol Chem, 1998 273 (13):7507-11）、インテグリン結合ペプチドＣＹＧＧＲＧＤＴＰ、線状デキストラン非サッカリド、グリセロール、オリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオシド間結合位置で結合しているコレステリル基（Letsinger, R. L. 1989 Proc Natl Acad Sci USA 86: (17):6553-6）、リソホスファチド、リソホスファチジルコリン、リソホスファチジルエタノールアミン、および１−オレオイルリソホスファチジルコリンが含まれる。
【０２１１】
いくつかの状況では、核酸含有ベクターを標的細胞に指向させる薬剤と共に核酸を送達することが望まれ得る。かかる「指向的」分子には、標的細胞の細胞表面膜タンパク質に特異的な抗体、または標的細胞の受容体に対するリガンドが含まれる。リポソームを使用するとき、エンドサイトーシスに関連する細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質を指向化および／または取込みの促進のために使用することができる。かかるタンパク質の例には、特定の細胞タイプに指向性の（tropic）カプシドタンパク質およびそのフラグメント、循環の内部移行を受けるタンパク質に対する抗体、および細胞内局在化を指向し、細胞内半減期を増加させるタンパク質が含まれる。他の態様において、受容体介在性エンドサイトーシスを用いることができる。かかる方法は、例えばWu et al., 1987 または Wagner et al., 1990に記載されている。現在知られている遺伝子マーキングおよび遺伝子治療プロトコルの概説のために、Anderson 1992を参照のこと。また、WO 93/25673および本明細書に記載の文献も参照のこと。さらなる遺伝子治療技術の概説は、Friedmann, Science, 244: 1275-1281 (1989)； Anderson, Nature, supplement to vol. 392, no 6679, pp. 25-30 (1998)； Verma, Scientific American: 68-84 (1990)； および Miller, Nature, 357: 455460 (1992)参照のこと。
【０２１２】
スクリーニング方法
有効な治療薬は顕著な毒性のない有効な薬剤を同定すること依存する。抗体を、当該技術分野において既知の方法によって結合親和性についてスクリーニングすることができる。例えば、ゲルシフトアッセイ、ウェスタンブロット、放射線標識競合アッセイ、クロマトグラフィーによる共分画、共沈、架橋結合、ＥＬＩＳＡ等を使用することができ、これは例えば、Current Protocols in Molecular Biology (1999) John Wiley & Sons, NYに記載されている（その全体について参照により本明細書の一部とする）。
【０２１３】
ＦＺＤ１０の所望のエピトープ（例えば、ＦＺＤ１０の細胞外ドメイン）と結合する抗体について初期スクリーニングをするために、常套の、例えばAntibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)に記載されている交叉ブロッキングアッセイを行うことができる。常套の競合結合アッセイも用いることができ、これによって未知の抗体を、ＦＺＤ１０と本発明のＦＺＤ１０特異的抗体との結合を阻害する能力によって特徴付ける。エピトープマッピングはChampe et al., J. Biol. Chem. 270: 1388-1394 (1995)に記載されている。
【０２１４】
インビトロ結合アッセイの一つの変形において、本発明は、（ａ）固定化したＦＺＤ１０と候補抗体を接触させること、そして（ｂ）候補抗体とＦＺＤ１０の結合を検出することの工程を含む方法を提供する。別の態様において、候補抗体を固定化し、ＦＺＤ１０の結合を検出する。固定化は、支持体、ビーズまたはクロマトグラフ樹脂と共有結合、ならびに抗体結合性のような非共有結合的高親和性相互作用、または固定化化合物がビオチン基を含むストレプトアビジン／ビオチン結合性の使用を含む、当該技術分野において周知の方法の何れかを用いて行う。結合の検出は、（ｉ）固定化していない化合物の放射活性標識を用いること、（ｉｉ）非固定化化合物上の蛍光標識を用いること、（ｉｉｉ）非固定化化合物に対して免疫特異的な抗体を用いること、（ｉｖ）非固定化合物が結合している蛍光支持体を励起する非固定化化合物の標識を用いること、ならびに当該技術分野で周知および通常実施されている他の技術によって、行うことができる。
【０２１５】
ＦＺＤ１０の活性または発現を調節（すなわち増進、低下または阻止）する抗体は、推定される調節剤をＦＺＤ１０を発現する細胞と共にインキュベートし、そしてＦＺＤ１０の活性または発現に対する推定される調節剤の効果を測定することによって同定することができる。ＦＺＤ１０ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性を調節する抗体の選択性は、ＦＺＤ１０ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対するその効果を他の関連化合物に対する効果と比較することによって評価することができる。選択的調節剤は、例えばＦＺＤ１０ポリペプチドと、またはＦＺＤ１０ポリペプチドをコードする核酸と特異的に結合する抗体および他のタンパク質、ペプチドまたは有機分子を含んでいてもよい。ＦＺＤ１０活性の調節剤は、ＦＺＤ１０ポリペプチドの正常または異常活性が関与する疾患および生理的条件の処置に治療上有用である。
【０２１６】
がんの予防または処置に潜在的に有用な化合物を、様々なアッセイを用いてスクリーニングすることができる。例えば、候補アンタゴニストを第１に、培養細胞系中で特徴付けて、Dishevelledのリン酸化を減少させ、ｃ−Ｊｕｎのリン酸化を減少させ、そしてβ−カテニンのリン酸化を増加させる能力を測定することができる。
【０２１７】
特定のＦＺＤ１０抗体、またはＦＺＤ１０抗体の組合せの抗腫瘍活性は、好適な動物モデルを用いてインビボで評価することができる（Loukopoulos et al., Pancreas, 29(3):193-203 (2004)）。さらに、特定のＦＺＤ１０抗体の抗腫瘍活性を、例えば非正統-1、非正統-2、非正統-3、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６およびβ−カテニンのリン酸化状態、ならびにβ−カテニン制御遺伝子、例えばｃ−ｍｙｃ（He TC et al., Science. 1998 Sep 4;281(5382):1509-12）およびサイクリンＤ１（Tetsu O & McCormick F Nature. 1999 Apr 1;398(6726):422-6）の発現レベルをアッセイすることによって、評価することができる。リン酸化状態、例えばｃ−ＪＵＮのセリン６３およびセリン７３を用いて、非β−カテニンまたはＦＺＤ１０の非正統（non-canonical）シグナル伝達活性をモニターすることもできる。さらに、本明細書に記載の増殖アッセイ、軟寒天アッセイおよび／または細胞毒性アッセイを含む細胞アッセイを用いて、特定のＦＺＤ１０抗体を評価することができる。１つの態様において、ＷＮＴ−７ｂの既知のコ−レセプターであるＬＲＰ５（Wang, Z. et al., Mol Cell Biol 25 (12): 5022-30, 2005）のリン酸化状態を評価して、抗ＦＺＤ１０抗体に良好に応答する細胞集団を同定する。他の態様において、ＬＲＰ５のリン酸化状態を所望により、抗ＦＺＤ１０抗体での処置の間モニターする。
【０２１８】
本発明はまた、ＦＺＤ１０ポリペプチドの生物学的活性と相互作用するかまたは阻害する（すなわち酵素活性、結合活性等を阻害する）抗体を同定するためのハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）アッセイを含む。ＨＴＳアッセイは効果的な方法で多数の化合物のスクリーニングを可能とする。細胞利用ＨＴＳシステムは、ＦＺＤ１０ポリペプチドとその結合パートナーの相互作用を調査することを意図している。ＨＴＳアッセイは、所望の特性を有する「ヒット」または「リード化合物」を同定するために設計し、後者の化合物から所望の特性を改善するために修飾を設計することができる。「ヒット」または「リーディング化合物」の化学的修飾はしばしば、「ヒット」とＦＺＤ１０ポリペプチド間の同定可能な構造的／活性的関連性に基づく。
【０２１９】
本発明の他の局面は、ＦＺＤ１０の活性を調節する（すなわち減少させる）抗体を同定する方法であって、ＦＺＤ１０を抗体と接触させ、そして抗体がＦＺＤ１０の活性を変化させるかを決定することを含む方法に関する。試験抗体の存在下での活性を、試験抗体の非存在下での活性と比較する。試験抗体を含むサンプルの活性が試験抗体を含まないサンプルの活性よりも低いとき、当該抗体は活性を阻害している。
【０２２０】
抗体複合体
抗ＦＺＤ１０抗体は、それらの「裸」または非複合形態で投与することができ、そして他の治療剤または診断剤と直接複合化することができるか、または前記他の治療剤または診断剤を含む担体ポリマーと間接的に結合することができる。
【０２２１】
抗体は、ラジオアイソトープ、親和性ラベル（例えばビオチン、アビジン等）、酵素ラベル（例えばワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等）、蛍光または発光もしくは生物発光ラベル（例えばＦＩＴＣまたはローダミン等）、常磁性原子等を用いて検出可能に標識することができる。かかる標識化を行う方法は当該技術分野において周知であり；例えば（Sternberger, L.A. et al., J. Histochem. Cytochem. 18:315 (1970)； Bayer, E.A. et al., Meth. Enzym. 62:308 (1979)； Engval, E. et al., Immunol. 109:129 (1972)； Goding, J.W. J. Immunol. Meth. 13:215 (1976)）を参照されたい。
【０２２２】
抗体分子の複合化は、米国特許第6,306,393号に記載されている。一般的な技術はまた、Shih et al., Int. J. Cancer 41:832-839 (1988)； Shih et al., Int. J. Cancer 46:1101-1106 (1990)；および Shih et al.、米国特許第5,057,313号に記載されている。この一般的な方法には、酸化炭水化物部分を有する抗体成分を、少なくとも１個の遊離アミン官能基を有しており、そして複数の薬剤、毒素、キレーター、ホウ素付加物（addend）または他の治療剤でロードされている担体ポリマーと反応させることを含む。この反応によって、最初のSchiff塩基（イミン）結合が得られ、これを２級アミンに還元することによって安定化して、最終複合体を形成することができる。
【０２２３】
担体ポリマーは例えば、少なくとも５０アミノ酸残基のアミノデキストランまたはポリペプチドであり得る。薬剤または他の薬剤と担体ポリマーを複合化するための多様な方法が当該技術分野において周知である。アミノデキストランの代わりにポリペプチド担体を用いることができるが、該ポリペプチド担体は鎖内に少なくとも５０アミノ酸残基、好ましくは１００−５０００アミノ酸残基を有するべきである。少なくとも当該アミノ酸のいくつかはリシン残基、またはグルタミン酸残基もしくはアスパラギン酸残基であるべきである。リシン残基のペンダントアミン、ならびにグルタミンおよびアスパラギン酸のペンダントカルボキシル基は薬剤、毒素、免疫調節剤、キレーター、ホウ素付加物（addend）または他の治療剤を結合するのに簡便である。好適なポリペプチド担体の例には、ポリリシン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、そのコポリマー、および所望の溶解特性を得られたロード担体および複合体に与えるための、これらのアミノ酸および他のもの、例えばセリンの混合ポリマーを含む。
【０２２４】
あるいは、複合抗体は抗体成分と治療剤を直接複合化させて作成することができる。一般的な方法は間接的な複合化の方法と同様であるが、治療剤を酸化抗体成分に直接結合する。例えば、半減期を延長するため、抗体の炭水化物基をポリエチレングリコールと結合させることができる。
【０２２５】
あるいは、治療剤を、還元した抗体成分のヒンジ領域で、ジスルフィド結合形成によってまたはヘテロ二官能性クロスリンカー、例えばＮ−スクシニル３−（２−ピリジルジチオ）プロプリオネート（ＳＰＤＰ）を用いて結合することができる。Yu et al., Int. J. Cancer 56:244 (1994)。かかる複合化のための一般的な技術は、当該技術分野において周知である。例えば、Wong, Chemistry Of Protein Conjugation and Cross-Linking (CRC Press 1991)； Upeslacis et al., “Modification of Antibodies by Chemical Methods,” in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et al. (eds.), pages 187-230 (Wiley-Liss, Inc. 1995)； Price, “Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies,“ in Monoclonal Antibodies: Production, Enineering and Clinical Application, Ritter et al. (eds.), pages 60-84 (Cambridge University Press 1995)参照。様々な二官能性タンパク質カップリング剤が当該技術分野において周知であり、例えばＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えばジメチルアジピミデート  ＨＣＬ）、活性エステル（例えばジスクシンイミジルスベラート）、アルデヒド（例えばグルタレルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えばビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトリエン２，６−ジイソシアネート）、およびビス−活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）である。
【０２２６】
最後に、１個以上の抗ＦＺＤ１０抗体部分および他のポリペプチドを含む融合タンパク質を構成することができる。抗体融合タンパク質を作成する方法は当該技術分野において周知である。例えば、米国特許第6,306,393号参照。インターロイキン−２部分を含む抗体融合タンパク質は、Boleti et al., Ann. Oncol. 6:945 (1995)、Nicolet et al., Cancer Gene Ther. 2:161 (1995)、Becker et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 93:7826 (1996)、Hank et al., Clin. Cancer Res. 2:1951 (1996)、およびHu et al., Cancer Res. 56:4998 (1996)に開示されている。
【０２２７】
免疫複合体
本発明はまた、細胞毒性剤、例えば化学療法剤、毒素（例えば酵素活性毒素または、細菌、真菌、植物もしくは動物起源の酵素活性毒素、およびそのフラグメントおよび／または変異体）、プロドラッグまたは他の薬剤、例えば免疫調節剤、ホルモン剤またはホルモンアンタゴニスト、および酵素もしくは酵素阻害剤、光活性治療剤、例えばクロマジェン（chromagen）もしくは染料、血管新生阻害剤、代替抗体もしくはそのフラグメント、または放射活性アイソトープ（すなわち放射性複合体）に複合化した抗体を含む免疫複合体に関する（概説のために、Schrama et al, (2006) Nature Reviews 5: 147- 159参照）。
【０２２８】
かかる免疫複合体の作成に有用な化学療法剤は上記されている。抗体と１個以上の小分子毒素、例えばカリケアマイシン、マイタンシン（米国特許第5,208,020合）、トリコセン、デュオカルマイシン（‘Ultra Potent Toxins’；一般に、Lillo et al, (2004) Chemistry and Biology 11; p. 897- 906参照）およびＣＣ−１０６５の複合体も本明細書において意図される。
【０２２９】
本発明の好ましい態様において、抗体は１個以上のマイタンシン分子（例えば抗体分子あたり約１〜約１０マイタンシン分子）と結合する。マイタンシンは例えば、Ｍａｙ−ＳＨ３に還元されて、修飾抗体と反応して（Chari et al. Cancer Research 52: 127-131 (1992)）マイタンシノイド−抗体免疫複合体を生成するＭａｙ−ＳＳ−Ｍｅに変換することができる。あるいは、選択された薬剤は、極めて強力なマイタンシン誘導体ＤＭ１（Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−マイタンシン）（例えば２００２年１２月１２日に公開されたWO02/098883参照）（これは約１０−１１ＭのＩＣ５０を有する）（概説は、Payne (2003) Cancer Cell 3:207- 212参照）またはＤＭ４（Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’（４−メチル−  −４−メルカプト−１−オキソペンチル）−マイタンシン）（例えば、１２月２日に公開されたWO2004/103272参照）であってよい。
【０２３０】
興味のある他の免疫複合体は、１個以上のカリケアマイシン分子と複合化した抗腫瘍細胞抗原抗体を含む。カリケアマイシンファミリーの抗生物質は、サブピコモルの濃度で二本鎖ＤＮＡを破壊することができる。使用することができるカリケアマイシンの構造アナログは、．γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ−アセチル−γ１Ｉ、ＰＳＡＧおよびθＩ１を含むが、これらに限定されない（Hinman et al. Cancer Research 53: 3336-3342 (1993) および Lode et al. Cancer Research 58: 2925-2928 (1998)）。また、米国特許第5,714,586号；第5,712,374号；第5,264,586号；および第5,773,001号も参照のこと（出典明示により、明示的に本明細書の一部とする）。
【０２３１】
さらに他のアプローチは、多くのがんにおいて過剰生産される酵素によってその活性形態で放出され得るプロドラッグに、腫瘍細胞抗原抗体を複合化させることを含む。例えば、抗体複合体を、活性成分がプラスミンによって複合体から放出されるドキソルビシンのプロドラッグ形態と製造することができる。プラスミンは多くのがん様組織において過剰に生産されることが知られている（Decy et al, (2004) FASEB Journal 18(3): 565-567参照）。
【０２３２】
使用することができる酵素的に活性な毒素およびそのフラグメントは、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（緑膿菌由来）、シュードモナス属内毒素、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファサルシン、アレウリテス・フォルディイ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンシンタンパク質、フィトラカ・アメリカーナ（Phytolaca americana）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ）、リボヌクレアーゼ（Ｒｎａｓｅ）、デオキシリボヌクレアーゼ（Ｄｎａｓｅ）、ヤマゴボウ（pokewood）抗ウイルス性タンパク質、モモルディカ・カランチア (momordica charantia）阻害剤、クルシン、クロチン、サパオナリア・オフィシナリス（sapaonaria officinalis）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、リストリクトシン、フェノマイシン、ネオマイシンおよびトリコテセンを含む。例えば、１９９３年１０月２８日に公開されたWO 93/21232参照。低内因性免疫原性およびがん様細胞が毒素に抵抗性となる可能性を減少させる作用機構（例えば、細胞毒性機構対細胞増殖抑制機構）が特に好ましい。
【０２３３】
本発明の抗体と免疫調節剤の間で製造した複合体が意図される。例えば、免疫刺激オリゴヌクレオチドを用いることができる。これらの分子は抗原特異的抗体応答を誘導することができる強力な免疫原である（Datta et al, (2003) Ann N.Y. Acad. Sci 1002: 105-111参照）。さらなる免疫調節化合物は幹細胞増殖因子、例えば“Ｓ１因子”、リンホトキシン、例えば腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、造血因子、例えばインターロイキン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）または顆粒球マクロファージ−刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、例えばインターフェロンアルファ、ベータもしくはガンマ、エリスロポエチンおよびトロンボポエチンを含み得る。
【０２３４】
多様な放射性同位体を放射性抗腫瘍細胞抗原抗体複合体の製造のために利用することができる。治療的放射性複合体を、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、５９Ｆｅ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、７５Ｓｅ、７７Ａｓ、８９Ｓｒ、９０Ｙ、９９Ｍｏ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、Ａｇ−ＩＩ  ｌ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｈ、１６６Ｈｏ、１６９Ｅｒ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、１９４Ｉｒ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２１１Ｐｂ、２１２Ｐｂ、および２１３Ｂｉ、５８Ｃｏ、６７Ｇａ、８０Ｂｒｍ、９９Ｔｃｍ、１０３Ｒｈｍ、１０９Ｐｔ、Ｉｎ−ｉｌｌ、ｌ  １９Ｓｂ、１−１２５、１６１Ｈｏ、１８９Ｏｓｍ、１９２Ｉｒ、１５２Ｄｙ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２２３Ｒａ、２１９Ｒｎ、２１５Ｐｏ、２１１Ｂｉ、２２５Ａｃ、２２１Ｆｒ、２１７Ａｔ、２１３Ｂｉ、２５５Ｆｍおよびそれらの組合せを用いて製造することができる。さらに、ホウ素、ガドリニウムまたはウラニウム原子を用いることができ、ここで前記ホウ素原子は好ましくは１０Ｂであり、前記ガドリニウム原子は１５７Ｇｄであり、そして前記ウラニウム原子は２３５Ｕである。
【０２３５】
好ましくは、治療的放射性核種複合体は、２０〜１０，０００ｋｅＶのエネルギーを有する放射性核種を有する。放射性核種は、１０００ｋｅＶ未満のエネルギーを有するＡｕｇｅｒ放射体、２０〜５０００ｋｅＶのエネルギーを有するＰ放射体、または２０００〜１０，０００ｋｅＶのエネルギーを有するアルファまたは‘ａ’放射体であり得る。
【０２３６】
診断的放射性複合体は、ガンマ−、ベータ−または陽電子−放出同位体である放射性核種を含んでいてもよく、ここで前記放射性核種が２０〜１０，０００ｋｅＶのエネルギーを有する。放射性核種は１８Ｆ、５１Ｍｎ、５２ｍＭｎ、５２Ｆｅ、５５Ｃｏ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、８２ｍＲｂ、８３Ｓｒ、８６ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、ＩＩｎ、１２０ｉ、１２４ｉ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、６７ＣＵ、６７Ｇａ、７５Ｓｅ、９７Ｒｕ、９９ｍＴｃ、ＩｌｌＩｎ、１１４ｍＩｎ、１２３ｉ、１２５ｉ、１３１ｉ、１６９、１９７Ｈｇおよび２１’Ｔｌから成る群から選択され得る。
【０２３７】
さらなるタイプの診断的免疫複合体が意図される。本発明の抗体またはフラグメントは、光活性剤または造影剤である診断剤と結合していてもよい。光活性な化合物は、クロマジェンまたは染料のような化合物を含んでいてよい。造影剤は例えば常磁性イオンであってよく、ここで当該イオンはクロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）およびエルビウム（ＩＩＩ）から成る群から選択される金属を含む。造影剤はまた、Ｘ線技術またはコンピュータ断層撮影において用いられる放射的にオペークな化合物、例えばヨウ素、イリジウム、バリウム、ガリウムおよびタリウム化合物であってもよい。放射的にオペークな化合物は、バリウム、ジアトリゾエート、エチオン化油、ガリウムサイトレート、イオカルミン酸、イオセタミン酸、ヨーダミド、ヨージパミド、ヨードキサム酸、イオグラミド、イオヘキソール、イオパミドール、イオパン酸、イオプロセミン酸、イオセファム酸、イオセリン酸、イオスラミドメグルミン、イオセメト酸、イオタスル、イオテトリン酸、イオタラム酸、イオトロキシ酸、イオキサグリン酸、イオキソトリゾン酸、イポデート、メグルミン、メトリザミド、メトリゾエート、プロピルイオドン、およびタリウムクロライドから選択され得る。あるいは、診断用免疫複合体は、超音波強化剤、例えば本発明の抗体と複合化しているガス充填リポソームを含んでいてもよい。診断用免疫複合体は、様々な方法、例えば外科手術中、内視鏡下または血管内での腫瘍またはがん診断および検出方法のために使用することができるが、これらに限定されない。
【０２３８】
抗体と細胞毒性剤の複合体を、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えばジメチルアジピミデート  ＨＣＬ）、活性エステル（例えばジスクシンイミジルスベラート）、アルデヒド（例えばグルタレルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えばビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトリエン２，６−ジイソシアネート）、およびビス−活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を用いて製造することができる。例えば、リシン免疫毒素を、Vitetta et al. Science 238: 1098 (1987)に記載のとおりに製造することができる。炭素１４−標識化１−イソチオシアネートベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体に対する放射性核種の複合体についてのキレート剤の例である。WO94/11026参照。リンカーは、細胞における細胞毒性薬剤の放出を増加させる「切断リンカー」であり得る。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ感受性のリンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカー（Chari et al. Cancer Research 52: 127-131 (1992)）を使用することができる。薬剤はさらに、本発明の抗体と炭水化物基を介して結合していてもよい。
【０２３９】
あるいは、抗腫瘍細胞抗原抗体および細胞毒性剤を含む融合タンパク質を、例えば組換え技術またはペプチド合成によって製造することができる。
【０２４０】
さらに他の態様において、当該抗体は腫瘍前標的に有用な「受容体」（例えばストレプトアビジン）と結合することができ、ここで当該抗体−受容体複合体は、患者に投与し、その後当該環境から洗浄剤を用いて未結合複合体を除去し、そして細胞毒性剤（例えば放射性核種）と複合化した「リガンド」（例えばアビジン）を投与する。
【０２４１】
抗腫瘍細胞抗原抗体はさらに、標的細胞リソゾーム内のみで放出される細胞毒性分子と複合化することができる。例えば、薬剤モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）を、バリン−シトルリン結合（これは、タンパク質分解性リソゾーム酵素カテプシンＢで切断し、次に抗体複合体を内在化することによって切断される）を介して複合化することができる（例えば２００３年４月３日に公開されたWO03/026577参照）。あるいは、ＭＭＡＥは、切断基としてのヒドラゾン官能基を含む酸に不安定なリンカーを用いて抗体と結合することができる（例えば、２００２年１１月１１日に公開されたWO02/088172参照）。
【０２４２】
速やかに内在化することが上記抗体複合体について望ましいが、抗腫瘍活性が主としてＡＤＣＣによって介在される場合、ゆっくりと内在化した抗体が望まれる。「ゆっくりと内在化した抗体」は、顕著な時間、細胞表面に配置されたままである抗体を意味する。当業者は気付くであろうが、この特性は、治療を効果的なものとするために抗体−受容体複合体の内在化を実際に必要とする多くの治療適応に有利であると見なされる特性とは対照的である。この文脈において、顕著な時間は一般に、３時間、好ましくは６時間、より好ましくは１２時間、より好ましくは２４時間、３６時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、１４４時間、１６８時間またはそれ以上を超える。
【０２４３】
抗体の内在化は多様なアッセイにより評価することができる。例えば、ＦＺＤ１０でトランスフェクトした細胞系または表面でＦＺＤ１０を発現する細胞系（例えばＮＣＩ−Ｈ４６０細胞）を用いて、内在化に対する候補抗体結合の効果を評価することができる。細胞をヒトＩｇＧ１（コントロール抗体）または候補抗体と共に、氷上（内在化を阻止するための０．１％  ナトリウムアジドと共に）または３７℃（ナトリウムアジドなし）で、ある時間、好適には３時間、インキュベートする。冷染色バッファー（例えばＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋０．１％  ナトリウムアジド）で洗浄した後、細胞を、例えばヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣで３０分間、氷上で染色する。染色の程度を評価することができ；この例では幾何平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、例えばFACS Caliburによって記録することができる。他の好適なアッセイは当業者に知られている。
【０２４４】
組合せ療法
動物モデルにおいて有効である１種以上のＦＺＤ１０抗体を同定し、さらに２種以上の当該ＦＺＤ１０抗体を混合してさらに改善された抗がん効果を提供することがさらに有利であり得る。１種以上のＦＺＤ１０抗体を含む組成物を、がんを有するかまたはその素因を有する個人または哺乳類に投与することができる。ＦＺＤ１０抗体はまた、他の治療剤、例えば細胞毒性剤、あるいは常套のがん化学療法剤と共に投与することができる。２種の治療剤の同時投与は、薬剤がそれらの治療効果を発揮する時間が重複していれば、同じ時点で、または同じ経路で投与する必要はない。異なる日または週に投与される同時または逐次投与が意図される。
【０２４５】
本発明の方法は、１種の抗ＦＺＤ１０抗体、ならびに異なる抗体の組合せまたは「カクテル」の投与を意図する。かかる抗体カクテルは、異なるエフェクター機構を利用する抗体を含むか、または細胞毒性抗体と免疫エフェクター機能性に依存する抗体とを直接組み合わせる場合と同程度の利点を有し得る。かかる組合せ抗体は、相乗的治療効果を示し得る。
【０２４６】
細胞毒性剤は、細胞の融合を阻害または予防し、そして／または細胞の破壊を引き起こす物質を意味する。当該用語は、放射性同位体（例えばＩ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０およびＲｅ１８６）、化学療法剤、および毒素、例えば酵素的に活性な細菌、真菌、植物もしくは動物起源の毒素または合成毒素、あるいはそのフラグメントを含むことを意図する。非細胞毒性剤は、細胞の機能を阻害または防止しないおよび／または細胞の破壊を引き起こさない物質を意味する。非細胞毒性剤は、活性化して細胞毒性となり得る。非細胞毒性剤はビーズ、リポソーム、マトリックスまたは粒子を含んでいてもよい（例えば、米国特許公開公報2003/0028071および2003/0032995参照、これらを出典明示により本明細書の一部とする）。かかる薬剤は本発明の抗体と複合化、共役、結合または関連し得る。
【０２４７】
常套のがん化学療法剤は、以下のものを含むが、これらに限定されない：アルキル化剤、例えばカルボプラチンおよびシスプラチン；窒素マスタードアルキル化剤；ニトロソウレアアルキル化剤、例えばカルムスチン（ＢＣＮＵ）；代謝拮抗剤、例えばメトトレキセート；フォリン酸；プリンアナログ代謝拮抗剤、メルカプトプリン；ピリミジンアナログ代謝拮抗剤、例えばフルオロウラシル（５−ＦＵ）およびゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））；ホルモン性抗新生物剤、例えばゴセレリン、ロイプロリド、およびタモキシフェン；天然抗新生物剤、例えばアルデスロイキン、インターロイキン−２、ドセタキセル、エトポシド（ＶＰ−１６）、インターフェロンアルファ、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、およびトレチノイン（ＡＴＲＡ）；抗生物質性天然抗新生物剤、例えばブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ダウノマイシンおよびミトマイシン、例えばミトマイシンＣ；およびビンカアルカロイド天然抗新生物剤、例えばビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン；ヒドロキシウレア；アセグラトン、アドリアマイシン、イフォスファミド、エノシタビン、エピチオスタノール、アクラルビシン、アクシタビン、ニムスチン、プロカルバジンヒドロクロライド、カルボクオン、カルボプラチン、カルモフール、クロモマイシンＡ３、抗腫瘍多糖類、抗腫瘍血小板因子、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘｉｎ（登録商標））、シゾフィラン、シタラビン（シトシンアラビノシド）、デカルバジン、チオイノシンアナログ、例えばアウリスタチン、ＣＰＴ−１１（イリノテカン）、ミトザントロン、ビノレルビン、テニポシド、アミノプテリン、カルミノマイシン、エスペラミシン（例えば米国特許第4,675,187号参照）、ネオカルジノスタチン、ＯＫ−４３２、ブレオマイシン、フルツロン、ブロキシウリジン、ブスルファン、ホンバン、ペプロマイシン、ベスタチン（Ｕｂｅｎｉｍｅｘ（登録商標））、インターフェロン−β、メピチオスタン、ミトブロニトール、メルファラン、ラミニンペプチド、レンチナン、カワラタケ（Coriolus versicolor）抽出物、テガフール／ウラシル、エストラムスチン（エストロゲン／メクロレタミン）。
【０２４８】
さらに、常套のがん治療剤には、下記のものが含まれる：ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ガンシクロビル；抗生物質、ロイプロリド；メペリジン；ジドブジン（ＡＺＴ）；変異体およびアナログを含むインターロイキン１〜１８；インターフェロンまたはサイトカイン、例えばインターフェロンα、β、γホルモン、例えば黄体化ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）およびアナログ、ならびにゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）；成長因子、例えば形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、成長ホルモン放出因子（ＧＨＲＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞成長因子ホモログ因子（ＦＧＦＨＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、およｂインシュリン成長因子（ＩＧＦ）；腫瘍壊死因子−α＆β（ＴＮＦ−α＆β）；侵襲阻害因子−２（ＩＩＦ−２）；骨形成タンパク質１−７（ＢＭＰ１−７）；ソマトスタチン；チモシン−α−１；γ−グロブリン；スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）；補体因子；抗血管新生因子；抗原物質；およびプロドラッグ。
【０２４９】
プロドラッグは、親薬剤と比較して腫瘍細胞に毒性が低いかまたは存在しない薬学的に活性な物質の前駆体または誘導体形態であって、酵素的に活性なまたはより活性な親形態に活性化または変換され得るものを意味する。例えば、Wilman, “Prodrugs in Cancer Chemotherapy” Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986)およびStella et al., “Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery,” Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985)参照。プロドラッグには、リン酸含有プロドラッグ、チオリン酸含有プロドラッグ、硫酸含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ−アミノ酸修飾プロドラッグ、糖化プロドラッグ、βラクタム含有プロドラッグ、所望により置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ、５−フルオロシトシンおよび他の５−フルオロウリジンを含むがこれらに限定されず、これらはより活性な細胞毒性有利薬剤に変換することができる。本発明において使用するためのプロドラッグ形態に誘導化することができる細胞毒性薬剤の例には、上記化学療法剤が含まれるが、これらに限定されない。
【０２５０】
WO2005/044294（その全体について出典明示により本明細書の一部とする）は、抗体のＡＤＣＣ−介在性抗腫瘍活性を改善するために、ＩＬ−２をがん様細胞（例えばＣＤ４０）をにおいて発現している抗原と結合する抗体と組み合わせて投与することができると開示しているモノクローナル抗体ＡＤＣＣ活性は好中球および単球／マクロファージ集団由来の活性に起因し得る。例えば、Hernandez-Ilizaliturri et al. (2003) Clin. Cancer Res. 9 (16, Pt 1): 5866-5873；およびUchida et al. (2004) J. Exp. Med. 199 (12): 1659-1669)参照。ＩＬ−２はこれらの細胞集団を活性化すると知られているため、本発明の１つの態様は、アンタゴニスト抗ＦＺＤ１０抗体と、抗体のＡＤＣＣ−介在性抗腫瘍活性を上昇させ得るＩＬ−２またはその生物学的に活性な変異体の組合せ療法を提供する。
【０２５１】
オリゴヌクレオチド
いくつかの態様において、ＦＺＤ１０調節剤はオリゴヌクレオチドである。いくつかの態様において、当該オリゴヌクレオチドはアンチセンスまたはＲＮＡｉオリゴヌクレオチドである。いくつかの態様において、当該オリゴヌクレオチドはＦＺＤ１０の領域、ドメイン、部分またはセグメントをコード化するヌクレオチドに相補的である。いくつかの態様において、当該オリゴヌクレオチドは約５〜約１００ヌクレオチド、約１０〜約５０ヌクレオチド、約１２〜約３５、および約１８〜約２５ヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、当該オリゴヌクレオチドはＦＺＤ１０遺伝子の領域、ドメインまたはセグメントと少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％相同である。いくつかの態様において、ＦＺＤ１０遺伝子の少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０または１００連続ヌクレオチドにわたって実質的な配列相同性を有する。いくつかの態様において、ＦＺＤ１０遺伝子の全長にわたって実質的な配列相同性を有する。いくつかの態様において、当該オリゴヌクレオチドは中度またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸分子と結合する。
【０２５２】
いくつかの態様において、ＦＺＤ１０調節剤は配列番号３−２２から成る群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドである。
【表２】
2010509368.tif 000003
【０２５３】
いくつかの態様において、ＦＺＤ１０調節剤は二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子であり、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）によって作用する。いくつかの態様において、当該ｄｓＲＮＡの一本の鎖は、ＦＺＤ１０遺伝子の領域、部分、ドメインまたはセグメントの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％相同である。いくつかの態様において、ＦＺＤ１０遺伝子の少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、または１０００連続ヌクレオチドにわたって実質的な配列相同性を有する。いくつかの態様において、ＦＺＤ１０遺伝子の全長にわたって実質的な配列相同性を有する。
【０２５４】
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において用いる。この配列はゲノム配列またはｃＤＮＡ配列に基づき（またはそれらから設計され）、そして特定の細胞または組織中の同一、類似または相補的ＤＮＡまたはＲＮＡを増幅、確認またはその存在を検出するために用いることができる。オリゴヌクレオチドはまた、遺伝子の発現を調節するために使用することができる。かかるオリゴヌクレオチド調節剤はＤＮＡ配列の一部を含み、そして少なくとも約１０ヌクレオチドから約５００ヌクレオチドまでを含む。いくつかの態様において、当該オリゴヌクレオチドは約１０ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド〜約３０ヌクレオチド、および約２０ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドを化学的に合成することができ、プローブとして使用することもできる。いくつかの態様において、当該オリゴヌクレオチド調節剤は一本鎖である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチド調節剤は、二本鎖である少なくとも１つの部分を含む。いくつかの態様において、当該オリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。いくつかの態様において、当該オリゴヌクレオチドはＲＮＡ干渉オリゴヌクレオチド（ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）である。
【０２５５】
小分子
いくつかの態様において、ＦＺＤ１０調節剤は小分子である。本明細書において使用するとき、「小分子」なる用語は、約１０キロダルトン未満である分子量を有する有機または無機非ポリマー性化合物を意味する。小分子の例には、ペプチド、オリゴヌクレオチド、有機化合物、無機化合物等が含まれる。いくつかの態様において、前記小分子は約９、約８、約７、約６、約５、約４、約３、約２または約１キロダルトン未満である分子量を有する。
【０２５６】
模倣物
いくつかの態様において、ＦＺＤ１０調節剤は模倣物である。本明細書において使用するとき、「模倣物」なる用語は、ペプチドの活性を模倣する化合物を意味するものとして使用する。模倣物は非ペプチドであるが、非ペプチド結合により結合したアミノ酸を含んでいてもよい。１９９７年６月１０日に発行された米国特許第5,637,677号およびその特許出願（出典明示により本明細書の一部とする）は、模倣物の製造についての詳細な説明が含まれている。簡潔には、ＦＺＤ１０受容体の３次元構造と特異的に相互作用するペプチドの３次元構造を、ペプチドではない分子によって複製する。いくつかの態様において、当該ＦＺＤ１０模倣物はＦＺＤ１０受容体の模倣物またはＦＺＤ１０受容体のリガンドの模倣物である。
【０２５７】
可溶性受容体
いくつかの態様において、ＦＺＤ１０調節剤は可溶性受容体である。本明細書において使用するとき、「可溶性受容体」なる用語は、実質的に膜ドメインを含まないか、または崩壊した膜ドメインを有するFrizzled受容体、好ましくはＦＺＤ１０受容体を意味する。
【０２５８】
デコイ受容体
いくつかの態様において、ＦＺＤ１０調節剤はＦＺＤ１０受容体の少なくとも部分を含むデコイ受容体である。いくつかの態様において、当該デコイ受容体はＦＺＤ１０リガンドについて天然ＦＺＤ１０と競合する。いくつかの態様において、当該デコイ受容体は定量、定性および／または可視化を促進するために標識化する。他の態様において、デコイ受容体はさらに、デコイ受容体およびまたはデコイ受容体−ＦＺＤ１０複合体の単離および／または分離を促進するための基を含む。いくつかの態様において、当該デコイ受容体は、、ＦＺＤ１０受容体リガンドとの結合によって、（天然ＦＺＤ１０受容体と比較して）影響するシグナルの増加を引き起こす。いくつかの態様において、当該デコイ受容体はＦＺＤ１０リガンドを捕捉し、シグナル伝達ＦＺＤ１０受容体との相互作用を防ぐことによって機能する非シグナル伝達分子である。いくつかの態様において、当該デコイ受容体は抗体または抗体フラグメントと縮合したＦＺＤ１０の少なくとも部分を含む。
【０２５９】
がんを処置／予防する方法
本発明は、対象におけるがんまたはがんの症状を処置および／または予防する方法であって、当該対象に治療上有効量の１種以上のＦＺＤ１０調節剤を投与することを含む方法を提供する。いくつかの態様において、がんはＦＺＤ１０の過剰発現に関連したがんである。いくつかの態様において、がんは大腸がん、卵巣がん、肺がんまたは子宮がんである。いくつかの態様において、対象はがんを有すると、またはがんの素因を有すると診断されている。
【０２６０】
がんの症状は当業者に周知であり、疼痛、死亡、体重減少、衰弱、食欲不振、血便、吐き気、嘔吐、肝臓転移、肺転移、骨転移、腹部膨満、腫張、腹腔内体液、膣出血、便秘症、腹部膨満、大腸の穿孔、急性腹膜炎（感染、熱、疼痛）、吐血、嚥下困難等を含むが、これらに限定されない。
【０２６１】
さらなる態様において、本発明の予防的または治療的処置方法は、ＦＺＤ１０調節剤、例えば抗ＦＺＤ１０抗体または阻害ポリヌクレオチドでの治療に応答性である可能性のある対象を、当該ＦＺＤ１０調節剤で対象を処置する前に同定する方法を含む。応答性の対象を同定する方法は、当該対象由来の腫瘍細胞におけるＬＲＰ５の発現レベルおよび／またはリン酸化状態を検出することを含み、ここで増加したＬＲＰ５の発現またはリン酸化がＦＺＤ１０抗体またはｓｉＲＮＡ治療に応答性である可能性と相関し得る。ＬＲＰ５状態を検出することに代えて、またはそれに加えて、応答性の対象を、当該対象由来の腫瘍細胞におけるＦＺＤ１０の発現レベルを検出することによって同定することができ、ここで増加したＦＺＤ１０の発現がＦＺＤ１０抗体またはｓｉＲＮＡ治療に応答性である可能性と相関し得る。対象由来の組織サンプルにおけるタンパク質の発現レベルを、ＬＲＰ５またはＦＺＤ１０に特異的な抗体を用いた免疫組織化学、ｍＲＮＡの相対的レベルを検出するＰＣＲを含む多くの異なる方法においてアッセイすることができる。免疫組織化学は、組織サンプルをタンパク質に特異的な抗体（例えばポリクローナルまたはモノクローナル）と接触させ、そしてサンプルに対する抗体の相対的結合を検出することを含む。核酸利用方法は、サンプルから核酸を抽出および増幅し、増幅した核酸を当該タンパク質をコードする遺伝子に特異的なプローブまたはプライマーと接触させ、そして増幅した核酸に対するプローブまたはプライマーのハイブリダイゼーションを検出することを含む。関連する態様において、上記プローブまたはプライマーを標識化する。ＬＲＰ５のリン酸化状態を、ＬＲＰ６のスレオニン（Theorine）１４７９、セリン１４９０およびスレオニン１４９３と相同なリンアミノ酸残基であるＬＲＰ５のスレオニン１４９２、セリン１５０３およびスレオニン１５０６に対してリン特異的な抗体によって検出することができる。これらのＬＲＰ６に特異的な残基は、β−カテニン介在正順経路のＷＮＴリガンド介在活性化によってリン酸化されることが示された（Zeng et al., Nature. 2005 Dec 8;438(7069):873-7; Davidson et al., Nature. 2005 Dec 8;438(7069):867-72.）。ＬＲＰ６と交叉反応するかかるリン特異的抗体の使用によって、ＬＲＰ５のリン酸化状態を検出するのに十分であり得る。ＬＲＰ５に特異的な抗体を用いてＬＲＰ５とＬＲＰ６間を区別することも、望まれ得る。
【０２６２】
関連する態様において、ＦＺＤ１０調節剤での対象の処置を、処置の開始後、例えば１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月または月１回もしくは年４回、年２回または年１回の間隔で、当該対象由来の組織サンプルにおけるＬＲＰ５および／またはＦＺＤ１０の発現レベル、またはＬＲＰ５のリン酸化状態を検出することによって、モニターする。かかるモニタリングは所望により、予後を予測するために使用することができ、ここで減少したＬＲＰ５および／またはＦＺＤ１０の発現または減少したＬＲＰ５のリン酸化状態は改善された予後に関連している。
【０２６３】
調節化合物の治療上有効量は、医学者に周知の方法によって実験的に決定することができ、そして特に、患者の年齢、状態の重症度および望まれる最終的な医薬製剤に依存する。本発明の調節剤の投与は例えば、吸入もしくは座薬によって、または粘膜組織に、例えば膣、直腸、尿道、頬側および舌下組織に洗浄することによって、経口的に、局所的に、鼻腔内に、腹腔内に、非経腸的に、静脈内に、リンパ管内に、腫瘍内に、筋肉内に、傷口内に、動脈内に、皮下に、眼内に、滑液内に、径上皮的に、および経皮的に行うことができる。好ましい態様において、当該阻害剤を洗浄によって、経口的に、または動脈内に投与する。他の好適な導入方法には、再充填可能または生分解性デバイス、および遅延もしくは徐放ポリマーデバイスも含まれ得る。上記の通り、本発明の治療組成物はまた、他の既知の抗がん剤または他の既知の抗骨疾患処置レジメンとのコンビナトリアル治療の一部として投与することができる。
【０２６４】
本発明はさらに、患者のＦＺＤ１０関連生物学的活性を調節する方法を提供する。当該方法は、前記患者に１種以上のＦＺＤ１０生物学的活性を調節するのに有効な量のＦＺＤ１０調節剤を投与することを含む。ＦＺＤ１０生物学的活性を測定するための適切なアッセイは本明細書に記載されている。
【０２６５】
本発明はまた、必要とする患者におけるがん細胞増殖を阻害する方法であって、当該患者に治療上有効量の１種以上のＦＺＤ１０調節剤を投与することを含む方法を提供する。ＦＺＤ１０関連細胞増殖を測定するための適切なアッセイは、当業者に既知である。
【０２６６】
本発明はさらに、必要とする患者におけるがんを阻害する方法を提供する。当該方法は、患者がＦＺＤ１０治療の候補であるかを本明細書に記載のとおりに決定し、そして当該患者がＦＺＤ１０治療の候補であれば、治療上有効量の１種以上のＦＺＤ１０調節剤を当該患者に投与することを含む。患者がＦＺＤ１０治療の候補でなければ、当該患者を常套のがん処置で処置する。
【０２６７】
本発明はまた、患者における２種以上の細胞の相互作用を阻害する方法であって、当該患者に治療上有効量のＦＺＤ１０調節剤を投与することを含む方法を提供する。ＦＺＤ１０関連細胞相互作用を測定するための適切なアッセイは、当業者に既知である。
【０２６８】
本発明はまた、患者におけるがんの１種以上の症状を調節する方法であって、当該患者に治療上有効量の本明細書に記載のＦＺＤ１０組成物を投与することを含む方法を提供する。
【０２６９】
本発明はさらに、必要とする患者におけるアンカレッジ独立細胞増殖を阻害する方法であって、当該患者に治療上有効量のＦＺＤ１０調節剤を投与することを含む方法を提供する。ＦＺＤ１０関連アンカレッジ独立細胞増殖を測定するための適切なアッセイは、実施例に記載されている。
【０２７０】
本発明はまた、必要とする患者におけるがん細胞の遊走を阻害する方法であって、当該患者に治療上有効量のＦＺＤ１０調節剤を投与することを含む方法を提供する。ＦＺＤ１０関連細胞遊走を測定するための適切なアッセイは、当業者に既知である。
【０２７１】
本発明はさらに、必要とする患者におけるがん細胞の接着を阻害する方法であって、当該患者に治療上有効量のＦＺＤ１０調節剤を投与することを含む方法を提供する。ＦＺＤ１０関連細胞接着を測定するための適切なアッセイは、当業者に既知である。
【０２７２】
本発明はまた、がん、がん転移を発症する素因を有するか、または転移を有したことがあり、したがって再発もしくは再発症の可能性がある患者を予防的に処置する方法を提供する。当該方法は、例えばがんのまたは転移性腫瘍の家族歴を有するか、またはがん転移の遺伝的素因を示す高リスクな個体において特に有用である。いくつかの態様において、前記腫瘍はＦＺＤ１０関連腫瘍である。さらに当該方法は、外科的切除によって除去したか、または常套のがん処置で処置したＦＺＤ１０関連腫瘍を有していた患者において、ＦＺＤ１０関連腫瘍の再発を予防するのに有用である。
【０２７３】
本発明はまた、がん進行を阻害するおよび／またはがん退縮を惹起する方法であって、患者に治療上有効量のＦＺＤ１０調節剤を投与することを含む方法を提供する。
【０２７４】
いくつかの態様において、抗がん処置を必要とする患者を、抗体、小分子、模倣物、可溶性受容体、デコイ受容体またはオリゴヌクレオチド調節剤と、化学療法および／または放射線療法との組合せで処置する。例えば、抗体、小分子、模倣物、可溶性受容体、デコイ受容体またはオリゴヌクレオチド調節剤の投与後に、当該患者は治療上有効量の抗がん放射線照射で処置することもできる。いくつかの態様において、化学療法処置は、抗体、小分子、模倣物、可溶性受容体、デコイ受容体またはオリゴヌクレオチド調節剤との組合せにおいて提供される。いくつかの態様において、抗体、小分子、模倣物、可溶性受容体、デコイ受容体またはオリゴヌクレオチド調節剤を、化学療法または放射線療法との組合せで投与する。
【０２７５】
処置方法は、患者に１種以上のＦＺＤ１０調節剤の１回または複数回投与量を投与することを含む。いくつかの態様において、ＦＺＤ１０調節剤を滅菌、ピロゲンを含まない、薬学的に許容される担体または希釈剤との組合せにおいてＦＺＤ１０調節剤を含む注射用医薬組成物として投与する。
【０２７６】
いくつかの態様において、本発明の治療レジメンは、外科手術、放射線治療、ホルモンアブレーションおよび／または化学療法を含むが、これらに限定されない常套の処置レジメンと共に使用される。本発明のＦＺＤ１０調節剤の投与は、常套のがん処置の前、同時または後に行うことができる。
【０２７７】
いくつかの態様において、２種以上の異なるＦＺＤ１０調節剤を患者に投与することができる。
【０２７８】
いくつかの態様において、患者に投与するＦＺＤ１０調節剤の量は、Dishevelledリン酸化を阻害するのに有効である。いくつかの態様において、患者に投与するＦＺＤ１０調節剤の量は、ｃ−Ｊｕｎリン酸化を阻害するのに有効である。いくつかの態様において、患者に投与するＦＺＤ１０調節剤の量は、β−カテニンリン酸化を誘導するのに有効である。いくつかの態様において、患者に投与するＦＺＤ１０調節剤の量は、がん進行の阻害および／またはがん退縮の惹起に有効である。
【０２７９】
臨床的局面
いくつかの態様において、本発明の方法および組成物は、大腸がん、卵巣がん、肺細胞がん、および子宮がんにおいて特に有用である。いくつかの態様において、当該方法および組成物は、例えば肺転移を含むがん転移を処置および／または診断において有用である。
【０２８０】
医薬組成物
本発明はまた、１種以上の本明細書に記載のＦＺＤ１０調節剤および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【０２８１】
いくつかの態様において、当該医薬組成物を注射液として、液体溶液または懸濁液として製造し；注射前に液体ビークル中の溶液または懸濁液とるのに適した固体形態も製造することができる。リポソームは薬学的に許容される担体の定義に含まれる。薬学的に許容される塩、例えば鉱酸塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩等；および有機酸の塩、例えば酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩等も、医薬組成物中に存在していてよい。薬学的に許容される賦形剤の全議論は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (1995) Alfonso Gennaro, Lippincott, Williams, & Wilkinsで入手可能である。
【０２８２】
ＦＺＤ１０を検出する方法
本発明はまた、ＦＺＤ１０を検出する方法を提供する。いくつかの態様において、ＦＺＤ１０は患者または患者サンプル中に存在する。いくつかの態様において、当該方法は、患者に１種以上のＦＺＤ１０調節剤を含む組成物を投与し、そして患者における造影剤の局在化を検出することを含む。いくつかの態様において、前記患者サンプルはがん細胞を含む。いくつかの態様において、前記ＦＺＤ１０調節剤は造影剤と結合しているか、または検出可能なように標識化されている。いくつかの態様において、前記ＦＺＤ１０調節剤は造影剤と複合化された抗ＦＺＤ１０抗体であり、そして患者に投与して１個以上の腫瘍を検出するか、またはＦＺＤ１０治療に対する患者の受容性を決定する。前記標識化抗体は、細胞上の高密度の受容体と結合し、それによって腫瘍細胞に蓄積する。標準的な造影技術を用いて、腫瘍の位置を検出することができる。
【０２８３】
本発明はまた、ＦＺＤ１０を発現しているかまたは過剰発現している細胞または腫瘍を造影／検出する方法であって、ＦＺＤ１０調節剤を含む組成物をサンプルと接触させ、そしてサンプル中のＦＺＤ１０調節剤の存在を検出することを含む方法を提供する。いくつかの態様において、前記サンプルは患者サンプルである。いくつかの態様において、患者サンプルはがん細胞を含む。いくつかの態様において、前記ＦＺＤ１０調節剤は造影剤と結合しているか、または検出可能なように標識化されている。
【０２８４】
本発明はまた、患者、細胞またはサンプル中に存在するＦＺＤ１０の量を定量する方法を提供する。当該方法は、１種以上の抗体、プローブまたは小分子を患者またはサンプルに投与して、当該サンプル中に存在するＦＺＤ１０の量を検出することを含む。いくつかの態様において、当該抗体、プローブまたは小分子は、造影剤と結合しているか、または検出可能なように標識化されている。かかる情報は、例えば腫瘍がＦＺＤ１０に関連しているか否か、そしてしたがって、特定の処置を使用するべきか避けるべきかを示す。いくつかの態様において、当該技術分野において周知の標準的な方法を用いて、腫瘍細胞を含むと考えられるサンプルを得て、そして標識化抗体、プローブ、オリゴヌクレオチドおよび小分子と接触させること。未結合の標識化抗体、プローブ、オリゴヌクレオチドまたは小分子を除去した後、前記細胞と結合した標識化抗体、ペプチド、オリゴヌクレオチドまたは模倣物の量を、あるいは未結合として除去された抗体、ペプチド、オリゴヌクレオチドまたは模倣物の量を測定する。当該情報は、存在するＦＺＤ１０の量と直接関係する。
【０２８５】
造影を、当業者に周知の方法を用いて行うことができる。例えばラジオシンチグラフィー、核磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）またはコンピュータ断層撮影（ＣＴスキャン）によって造影を行うことができる。造影剤に最も一般的に使用される放射標識は、放射活性ヨウ素またはインジウムを含む。ＣＴスキャンによる造影は、鉄キレートのような重金属を用いることができる。ＭＲＩスキャンは、ガドリニウムまたはマンガンのキレートを用いることができる。さらに、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）は、酸素、窒素、鉄、炭素またはガリウムの陽電子放出を用いることができる。
【０２８６】
検出方法は当業者に周知である。例えば、ポリヌクレオチドを検出する方法は、ＰＣＲ、Northernブロッティング、Southern ブロッティング、ＲＮＡ保護、およびＤＮＡハイブリダイゼーション（インサイチュハイブリダイゼーションを含む）を含むが、これらに限定されない。ポリペプチドを検出する方法は、Westernブロッティング、ＥＬＩＳＡ、酵素活性アッセイ、スロットブロッティング、ペプチド質量フィンガープリント、電気泳動、免疫化学および免疫組織化学を含むが、これらに限定されない。検出方法の他の例には、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、化学発光イムノアッセイ、フルオロイムノアッセイ、時間分解フルオロイムノアッセイ（ＴＲ  ＦＩＡ）、２色蛍光顕微鏡観察、または免疫クロマトグラフアッセイ（ＩＣＡ）（全て当業者に周知である）をふくむが、これらに限定されない。本発明のいくつかの好ましい態様において、ポリヌクレオチド発現を、ＰＣＲ方法論を用いて検出し、そしてポリペプチド生産をＥＬＩＳＡ技術を用いて検出する。
【０２８７】
ＦＺＤ１０治療に対する受容性を検出する方法
本発明はまた、ＦＺＤ１０治療に対する患者の受容性を測定するための方法を提供する。当該方法は、患者または患者サンプルにおけるＦＺＤ１０発現の証拠の有無を検出することを含む。患者またはサンプルにおけるＦＺＤ１０発現の証拠の存在は、ＦＺＤ１０治療に受容性である患者の指標である。患者または患者サンプルにおけるＦＺＤ１０発現の証拠の不在は、ＦＺＤ１０治療の候補ではない患者の指標である。
【０２８８】
いくつかの態様において、当該治療方法は、まずＦＺＤ１０治療に受容性である患者を同定することを含み、これは必要とする患者に、造影剤と結合または検出可能なように標識化したＦＺＤ１０抗体、プローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドを投与し、そして当該患者における遺伝子または遺伝子産物の証拠の有無を検出することを含む。患者におけるＦＺＤ１０発現、とりわけＦＺＤ１０過剰発現の証拠の存在は、ＦＺＤ１０治療の候補である患者の指標であり、そして患者におけるＦＺＤ１０発現の証拠の不在は、ＦＺＤ１０治療の候補ではない患者の指標である。いくつかの態様において、当該治療方法はさらに、当該患者がＦＺＤ１０治療の候補であるとき、当該患者に１種以上のＦＺＤ１０調節剤を投与し、当該患者がＦＺＤ１０治療の候補ではないとき、当該患者を常套のがん処置で処置することを含む。
【０２８９】
スクリーニング方法
本発明はまた、抗がん剤をスクリーニングする方法を提供する。当該方法は、ＦＺＤ１０を発現する細胞を候補化合物と接触させ、そしてＦＺＤ１０関連生物学的活性が調節されるかを測定することを含む。いくつかの態様において、Dishevelledのリン酸化の減少、ｃ−Ｊｕｎのリン酸化の減少、およびβ−カテニンのリン酸化の増加ががん阻害剤の指標である。いくつかの態様において、ＦＺＤ１０発現の阻害ががん阻害剤の指標である。
【０２９０】
本発明はさらに、がん阻害剤を同定する方法を提供する。当該方法は、ＦＺＤ１０を発現している細胞を候補化合物およびＦＺＤ１０リガンドと接触させ、そしてＦＺＤ１０関連生物学的活性が調節されるかを測定することを含む。いくつかの態様において、Dishevelledのリン酸化の減少、ｃ−Ｊｕｎのリン酸化の減少、およびβ−カテニンのリン酸化の増加ががん阻害剤の指標である。いくつかの態様において、ＦＺＤ１０発現の阻害ががん阻害剤の指標である。
【０２９１】
いくつかの態様において、本発明は、例えば推定される調節剤をDishevelledのリン酸化の減少能、ｃ−Ｊｕｎのリン酸化の減少能、およびβ−カテニンのリン酸化の増加能についてスクリーニングすることによる、抗がん剤、とりわけ抗転移性がん薬剤をスクリーニングする方法を提供する。
【０２９２】
キット
いくつかの態様において、本発明はＦＺＤ１０過剰発現に関連した遺伝子または遺伝子産物を造影および／または検出するためのキットを提供する。本発明のキットは、検出用抗体、小分子、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド調節剤、可溶性受容体、デコイ受容体、模倣物またはプローブならびに本発明の方法を行うための指示書を含む。所望により、キットは下記の１個以上も含む：対照（ポジティブおよび／またはネガティブ）、対照のための容器、ポジティブまたはネガティブな結果の代表的な例の写真または描写。
【０２９３】
本明細書に記載の特許、特許出願、GenBank 受託番号および公報の各々は、その全体について、参照により本明細書の一部とする。
【０２９４】
本発明の様々な修飾が、本明細書に記載のものに加えて、上記記載の観点から当業者に明らかであろう。かかる修飾も添付の特許請求の範囲に含まれることが意図される。本発明はさらに、下記実施例において詳述され、これは説明の目的のためであり、本発明の範囲を限定することを意図しない。
【実施例】
【０２９５】
実施例
実施例１：肺がん、卵巣がん、子宮がんおよび大腸がんにおけるＦＺＤ１０の上方制御
Frizzled 10ｍＲＮＡの代表であるヌクレオチド配列のセット（プローブセット）をポリヌクレオチドアレイ（Affymetrix, Santa Clara, CA）でアレイしたヌクレオチド配列から選択し、そしてこれを用いて様々な腫瘍または健常組織サンプルにおけるｍＲＮＡの相対的発現レベルをスクリーニングした。目的の細胞系または組織から単離したｍＲＮＡのｃＤＮＡフラグメントを製造し、常套の方法に従って標識化し、そして製造業者の指示に従ってポリヌクレオチドをアレイしてハイブリダイズさせた。様々ながん様組織サンプルおよび正常組織サンプルのｍＲＮＡをアッセイした。
【０２９６】
図１はＦＺＤ１０を用いて分析したがん様および正常組織のマイクロアレイ分析（affy U133 プラス 2 チップ）の代表図を示す。正常およびがん様組織タイプは水平軸に沿って並べられている。がん様組織は、例えば‘ｃ’、例えば“c_breast_duct”とラベルしており、これは乳がん組織サンプルを意味し、そして同様に、正常組織は‘ｎ’で示す。組織タイプはさらに、知られていれば、組織のタイプおよびサブタイプでラベルされている。例えば、“c_breast_duct”は乳管に局在した乳がん由来のがん様組織である。サブタイプが外科的除去によっても明らかではないかまたは知られていないとき、ラベルは‘特定されていない’という‘ns’と表記する。垂直軸の各スポットは、１人の患者由来の組織サンプルを意味し、垂直軸上の各スポットの高さ（ｌｏｇ２に基づく）はプローブセットの相対的発現レベルを意味する。黒丸は直線検出範囲の発現レベルを有するサンプルを意味する。白丸は、遺伝子がプローブセットの検出限界未満であるサンプルにおける遺伝子発現の上限を意味する。白四角は、プローブセットが飽和したサンプルにおける遺伝子発現の下限を意味する。（簡潔には、分析を行う前に、各プローブセットを大きな、様々なサンプルのセット間でその構成プローブの動態を分析することによってキャリブレーションした。このキャリブレーションによって、各プローブの相対的感受性を決定し、そしてプローブセット応答がプローブ間で直線である強度範囲を決定する。この範囲未満の強度は「検出されず」と称し、上のものは「飽和」と称される。サンプル間でのハイブリダイゼーションおよびラベリング効率の差のため、キャリブレーションの適用後に本発明者らは各チップを正規化する。これによって、サンプル間で異なる遺伝子発現についての範囲の上限および下限が生じる）
【０２９７】
DecisionSiteソフトウェア（Spotfire, Somerville, MA）および社内開発したPipeline Pilot （SciTegic, San Diego, CA）プロトコルを用いて、図１に示す図を作成した。当該結果は、様々な正常組織タイプにおける発現と比較して、矢印で示した強調された腫瘍指標において、ＦＺＤ１０発現の増加を示す。患者数、次にがんと正常サンプル間の相対的発現を示す表を示す。当該結果は様々な正常組織タイプにおける発現と比較して、卵巣がん、肺がんおよび子宮がん組織におけるＦＺＤ１０ｍＲＮＡの発現の増加を示す。
【０２９８】
図２において、ｍＲＮＡをレーザ捕獲微小解剖（ＬＣＭ）大腸がん組織から単離し、そしてｍＲＮＡを各正常細胞（ＲＳＭ＝レファレンス・スタンダードミックス）または各組織サンプル内のがん細胞に隣接する正常細胞のプールと比較した。サンプルをAffymetrix（登録商標） GeneChips（登録商標） U133A & B （Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA）でのオリゴヌクレオチドアレイ分析によって試験した。Ｙ軸は相対的生発現レベルである。患者数、次にがんと正常サンプル間の相対的発現を示す表を示す。（“％ＧＥ２Ｘ”および“＞＝２Ｘ”は２倍の上方制御を意味し；“％ＬＥ．５Ｘ”および“＜＝２ｘ”は２倍の下方制御を意味する）。当該結果は、各正常組織または隣接正常細胞と比較して、大腸がん患者のサブセットにおいてＦＺＤ１０が上方制御されることを示している。
【０２９９】
実施例２：  原発性大腸がん、肺がんおよび卵巣がん患者サンプルの定量的ＲＴ−ＰＣＲ
原発性腫瘍サンプルのＲＴ−ＰＣＲ分析は、４つの主要工程に分けられる：１）一次正常および主要組織からＲＮＡ精製；２）実時間定量ＰＣＲのために、精製組織ＲＮＡから第一の標準ｃＤＮＡの製造；３）３８４ウェル反応にあわせたABI PRISM 7900HT Sequence Detection Systemを用いた遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲセットアップ；４）がんにおいて異なって発現する（上方制御）遺伝子を同定するための統計的方法によるＲＴ−ＰＣＲデータ分析。
【０３００】
Qiagen RNeasyミニキット CAT#74106を用いて、組織サンプルは典型的には約ＲＮＡ３０μｇが得られ、そして溶出バッファー１５０μｌを用いるとき、典型的には最終濃度約２００ｎｇ／μｌとなった。ＲＮＡを抽出した後、Molecular ProbesのRibogreen定量試薬を用いて、製造業者のプロトコルに従ってＲＮＡの収率および濃度を測定した。抽出したＲＮＡの完全性（Integrity）をＥｔＢｒ染色アガロースゲルで評価して、２８Ｓおよび１８Ｓバンドが等しい強度を有するかを決定した。抽出したＲＮＡの完全性をまた、製造業者のプロトコルに従って、Agilent 2100を用いて評価した。Agilent Bioanalyzer / “Lab-On-A-Chip”はＲＮＡサンプルの電気泳動法を生じるマイクロ粒体システムである。１８Ｓおよび２８Ｓバンドの比およびベースラインの滑らかさを観察して、ＲＮＡ分解のレベルの測定を行うことができる。２８Ｓ：１８Ｓ比１未満のサンプルを廃棄する。
【０３０１】
ＲＮＡサンプルはまた、ＲＴ−ＰＣＲで試験して、抽出中のゲノムＤＮＡ汚染のレベルを測定した。ＲＮＡをｃＤＮＡ合成についてアレイした。一般に、最低１０個の正常および２０個の腫瘍を、各腫瘍タイプについてアッセイした。使用したプライマーは下記のとおりであった：ＳＧＰ７５８（フォワード配列；ctggtcatgcgcagggt；（配列番号２３）；リバース配列；ctcaccggcttcgtgctc（配列番号：２４）；プローブ配列ggcagcatggacgtcaacgcg；（配列番号：２５））をＦＺＤ１０について用いた。
【０３０２】
正常および腫瘍サンプルの両方での標的遺伝子の発現レベルを、定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて、ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System （Applied Biosystems, California）を用いて測定した。当該方法は、リファレンス（正規化）ハウスキーパー遺伝子（Pre-Developed TaqMan（登録商標） Assay Reagents Gene Expression Quantification Protocol, Applied Biosystems, 2001）と比較した、標的テンプレートの初期コピー数の定量に基づく。各ＰＣＲサイクルによるＤＮＡ生成物の蓄積は、複製効率および初期テンプレート濃度に関連する。したがって、標的および正規化の両方の増幅効率は同じでなければならない。開始テンプレートコピー数およびＤＮＡ増幅効率に依存する閾値サイクル（ＣＴ）は、ＰＣＲ産物増加が指数的であるＰＣＲサイクルである。各アッセイを４回行う；したがって、４つのＣＴ値があるサンプルにおける標的遺伝子について得られる。
【０３０３】
同時に、ハウスキーパー遺伝子のグループの発現レベルも同じ方法で測定した。４連での異常値を検出し、元の４連での標準偏差と比較して残りの３連の標準偏差が３０％以下であるとき、これを除外する。各腫瘍タイプにおいて試験したアイソフォームの存在率（prevalence）も測定した。結果を図３に示す。簡潔には、原発腫瘍の定量的ＰＣＲデータ（最低１０個の正常＆２０個の腫瘍サンプルのパネル）は、ＦＺＤ１０が肺がん患者サンプルの４２％、卵巣がん患者サンプルの３０％、そして大腸がん患者サンプルの３６％において過剰発現していることが示された。
【０３０４】
実施例３：異なるがん細胞系におけるＦＺＤ１０の表面発現
異なるがん細胞系におけるＦＺＤ１０の表面発現を、下記の通りにアッセイした。がん細胞系におけるＦＺＤ１０の表面発現を、GUAVA Express SystemsおよびGUAVA 96-PCA装置（Hayward, CA）の分析によって測定した。がん細胞系をＦＺＤ１０ｍＲＮＡ発現について、実施例２に記載の方法を用いた定量的ＲＴ−ＰＣＲで評価した。ＦＺＤ１０ｍＲＮＡ発現細胞（ＳＷ６２０、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＤＯＶ１３）および非発現細胞（ＨＣＴ１１６、Ａ５４９およびＳＫＯＶ３）である選択した大腸がん、肺がんおよび卵巣がん細胞系を８０−９０％コンフルエンスに増殖させ、そしてGUAVA-96 Express Systemを用いたフローサイトメトリー分析のために収穫した。９６ウェル丸底プレートを染色バッファー（１×ＰＢＳ、２％  ＢＳＡ、０．０５％  ナトリウムアジド）５０μｌ／ウェルで２０分間室温で予めブロックした。細胞を分注する前に染色バッファーをプレートから除去した。適切な体積の細胞を各細胞系について１５ｍｌコニカルチューブに移し、洗浄し、そして５×１０４細胞／１００μｌの濃度に染色バッファーで希釈した。各細胞系について、希釈細胞１００μｌを各ウェルに、３連サンプルについて、予めブロックした９６ウェル丸底プレートに分注した。１次抗体インキュベーションの直後に、細胞をＦＺＤ１０に対するポリクローナル抗体（濃度１０μｇ／ｍｌ）または対照抗体、例えば免疫前ウサギＩｇＧ  ５０μｌで３０分間、氷上で染色し、染色した細胞を洗浄バッファー（１×ＰＢＳ、０．０５％  ナトリウムアジド）２００μｌで２回洗浄した。２次抗体インキュベーションの直後に、細胞を２次抗体、ヤギ（Ｆａｂ’２）抗ウサギＩｇＧ−ＰＥ複合体で３０分間、氷上で染色し、染色した細胞を洗浄バッファー（１×ＰＢＳ、０．０５％  ナトリウムアジド）２００μｌで２回洗浄した。染色した細胞を有する９６ウェルプレートを、Guava-96 PCA装置およびGuava Express Systems （Hayward, CA）を用いて、製造業者のプロトコルに従って分析して、ＰＥ−複合化２次抗体によって放出される蛍光シグナルに基づく各がん細胞系のＦＺＤ１０の相対的表面発現を測定した。
【０３０５】
図４に示した結果は、GUAVA Express Systemsから出力されたデータの代表である。当該グラフは対数スケールでの蛍光シグナルに対する細胞数でプロットする。ＦＺＤ１０のタンパク質表面発現は、大腸がん細胞系ＳＷ６２０、肺がん細胞系ＮＣＩ−Ｈ４６０において検出され、そして卵巣がん細胞系ＤＯＶ１３で表面発現が検出可能であったが、ネガティブコントロールとして免疫前ウサギＩｇＧと比較したとき、細胞系ＨＣＴ１１６、Ａ５４９およびＳＫＯＶ３ではそうでなかった。当該データは、定量的ＰＣＲアッセイに基づくこれらのがん細胞系におけるＦＺＤ１０ｍＲＮＡのレベルと一致している。
【０３０６】
実施例４：ｓｉＲＮＡはＦＺＤ１０の表面発現を減少させる
ＦＺＤ１０を様々なレベルで発現する様々な細胞系（Ｈ４６０肺がん、ＥＫＶＸ非小細胞性肺癌、ＮＣＩ−Ｈ２１２６肺がん、ＳＷ６２０大腸がんおよびＣｏｌｏ３２０ＤＭ大腸がん）およびＦＺＤ１０を発現しない２種の細胞系（ＭＣＦ７乳がんおよびＡ５４９肺がん）由来の細胞を、下記の通りＦＺＤ１０ｓｉＲＮＡ介在性ノックダウンの効果についてアッセイした。異なる細胞系は異なるｓｉＲＮＡトランスフェクション条件を有し得る。Ｈ４６０（図５）について、細胞をトランスフェクションの前日に、培地１０ｍｌ中で１０ｃｍ皿に、６００，０００細胞／ウェルで播種した。プレートを３７℃で一晩（Ｏ／Ｎ）インキュベートした。翌日、培地を除去し、完全培地３ｍｌを加えた。エッペンドルフチューブで、OptiMem  １．２ｍｌをｓｉＲＮＡ  ２５０ｐｍｏｌと混合した。セパレートチューブ（separate tube）で、OptiMem  １．２ｍｌを用いてDhamarfect-1脂質試薬（Dharmacon, Lafayette, CO）２５μｌを希釈した。希釈した脂質を希釈したｓｉＲＮＡと混合し、室温で２５分間、複合体を形成させ、そして次に細胞に滴下した。細胞培地中ｓｉＲＮＡの最終濃度は５０ｎＭであった。細胞をｓｉＲＮＡと、４時間から一晩、３７℃でインキュベートし、そして完全培地で置換した。実施例３で確立した方法に従ってＲＮＡ／ＦＺＤ１０表面発現レベルをモニターするために、２４−７２時間で細胞を収穫した。ＥＫＶＸ細胞について、播種した細胞密度は１，０００，０００細胞／１０ｃｍ皿であり、Dharmafect-2脂質（Dharmacon, Lafayette, CO）５μｌ／トランスフェクションを用いた。ＮＣＩ−Ｈ２１２６について、播種した細胞密度は７５０，０００細胞／１０ｃｍ皿であり、Dharmafect-1脂質（Dharmacon, Lafayette, CO）１５μｌ／トランスフェクションを用いた。ＳＷ６２０について、播種した細胞密度は１，２００，０００１０ｃｍ皿であり、Lipofectamine-RNAiMAX （Invitrogen, Carlsbad, CA）脂質１５μｌ／トランスフェクションを用いた。Ｃｏｌｏ３２０ＤＭについて、播種した細胞密度は１，０００，０００細胞／１０ｃｍ皿であり、Dharmafect-2 脂質（Dharmacon, Lafayette, CO）１５μｌ／トランスフェクションを用いた。全ｓｉＲＮＡを全細胞タイプにおいて濃度５０ｎＭでトランスフェクトした。
【０３０７】
使用したＦＺＤ１０特異的ｓｉＲＮＡは下記のものであった：CHIR317.1.4またはFZD10-1：GCACAAGTGCAAAATGAAC   配列番号２６； CHIR317.2.2 またはFZD10-2： AGCAGGTGTGCAGCCGTAGGTTAAA   配列番号２７；  ネガティブコントロールｓｉＲＮＡ、Ambion（CHIR317.1.4またはNC-1）の化学とマッチしたSilencer Negativeコントロール＃２（Ambion, Cat#4637）を購入し、全ｓｉＲＮＡ実験に用いた。ネガティブコントロールｓｉＲＮＡ、Invitrogen Stealth siRNA（CHIR317.2.2またはNC-2）の化学とマッチしたInvitrogen Stealth RNAi Negativeコントロール培地ＧＣ二本鎖（Invitrogen, Cat# 12935-300）を購入し、全ｓｉＲＮＡ実験に用いた。CHIR109.2.4またはEg5-1：GGGAGCAAAUGAACCUGAUTT 配列番号２８をポジティブコントロールとして、Ambionのマッチした化学と共に全ての機能性試験において用いた。CHIR109.1.2 またはEg5-2： UCCAAACUGGAUCGUAAGAAGGCAG−配列番号２９をポジティブコントロールとして、Invitrogen Stealth RNAiのマッチした化学と共に全ての機能性試験において用いた。
【０３０８】
ｍＲＮＡ発現をｓｉＲＮＡトランスフェクションの２４時間後に、逆転写共役ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって測定した。ｓｉＲＮＡトランスフェクトサンプル各々のｍＲＮＡを抽出し、実施例２に記載の方法によって定量した。全サンプルを半定量ＲＴ−ＰＣＲ（ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）、Applied Biosystems, Foster City, CA）によって比較した。２つのプライマーセットを試験したところ、同様の結果であった（ “ABTP 500/501”のプライマーセットの結果を図５に示す）。FZD10-1 ｓｉＲＮＡは、ネガティブコントロール−１と比較してＦＺＤ１０  ｍＲＮＡを６６％ノックダウンし、FZD10-2  ｓｉＲＮＡはネガティブコントロール−２と比較してＦＺＤ１０  ｍＲＮＡを７７％ノックダウンした。相対的発現を全サンプルのＨＰＲＴ遺伝子発現によって正規化した。当該結果は、両ｓｉＲＮＡが、Ｈ４６０において２４時間時点で、ｍＲＮＡレベルを少なくとも６０％ノックダウンすることを示している。
【０３０９】
ＮＣＩ−Ｈ４６０細胞のｓｉＲＮＡトランスフェクション後のＦＺＤ１０の表面発現を、上記実施例３に記載のとおりに測定した。図５は免疫前ウサギＩｇＧ抗体ネガティブコントロールと比較した表面染色細胞の割合の代表図である。トランスフェクト細胞を３つの異なる時点（トランスフェクション後２４、４８および７２時間）で回収して、ＮＣＩ−Ｈ４６０細胞のＦＺＤ１０の表面発現のｓｉＲＮＡ介在性ノックダウンの動力学をモニターした。ＮＣ−１  ｓｉＲＮＡトランスフェクトサンプルのＦＺＤ１０表面発現割合を、FZD10-1 ｓｉＲＮＡトランスフェクトサンプルによる表面発現の減少の％を比較するための１００％と任意に設定した。同様に、ＮＣ−２  ｓｉＲＮＡトランスフェクトサンプルのＦＺＤ１０表面発現の割合を、FZD10-2 ｓｉＲＮＡトランスフェクトサンプルによる表面発現の減少の％を比較するための１００％と任意に設定した。Ｍｏｃｋ未トランスフェクトサンプルをＮＣ−１と比較した。FZD10-1 ｓｉＲＮＡは４８および７２時間の時点でよりはっきりとＦＺＤ１０の表面発現を減少させ、そしてFZD10-2 ｓｉＲＮＡはまた４８および７２時間の時点で最も強いＦＺＤ１０表面発現のノックダウンを示したが、FZD10-2 ｓｉＲＮＡトランスフェクトサンプルの表面発現の少なくとも２０％が残っていたため、FZD10-1 ｓｉＲＮＡと比較して強力なノックダウンではなかったという結果が示された。図５はまた、各トランスフェクトサンプルで検出されたシグナルの量を示すための７２時間時点での各サンプルのヒストグラムデータを示している。全体として、ＲＴ−ＰＣＲおよびGUAVA Express分析のいずれもが、両ｓｉＲＮＡによるＦＺＤ１０表面発現の減少およびFZD10-1がFZD10-2よりも有効であることが示された。
【０３１０】
Cell titer glow（ＡＴＰ測定； Promega）アッセイを用いて、アンカレッジ独立細胞増殖を測定した。ｓｉＲＮＡトランスフェクションの２４時間後、細胞を９６ウェルプレートに細胞タイプに基づいて１０００−５０００細胞／ウェルで播種し、ＮＣＩ−Ｈ４６０については１６００細胞／ウェルを播種した。トランスフェクション後様々な時点（２４時間、４８時間、７２時間、９６時間）で；細胞を溶解し、cell titer growを用いて、製造業者の指示に従ってアッセイした。cell titer glow アッセイの結果は、相対的細胞数に比例する蛍光が得られる。図６および図７に示すとおり、アンカレッジ独立細胞増殖の減少は、Ｅｇ５に対する対照抗増殖性ｓｉＲＮＡ（Ｅｇ５−１およびＥｇ５−２）と比較して、ＮＣＩ−Ｈ４６０肺がん細胞およびＥＫＶＸ肺がん細胞において、FZD10-1およびFZD10-2両ｓｉＲＮＡによって観察された。増殖は、２つの異なるｓｉＲＮＡ合成化学の２つのネガティブコントロール（ＮＣ−１＆ＮＣ−２）によって阻害されなかった。これらの結果は、ＮＣＩ−Ｈ４６０およびＥＫＶＸ肺がん細胞系のノックダウンが増殖を阻害することを示した。
【０３１１】
Caspase 3/7 Glow （Promega # G8090）アッセイを用いて、がん細胞系におけるｓｉＲＮＡ  トランスフェクションによって誘導されるアポトーシスを測定した。ｓｉＲＮＡトランスフェクションの２４時間後に、細胞を９６ウェルプレートに細胞タイプに基づいて１０００−５０００細胞／ウェルで播種し、ＮＣＩ−Ｈ４６０では１６００細胞／ウェルを播種した。トランスフェクション後様々な時点（４８時間＆７２時間）で、細胞を溶解し、Cell titre blue 生存率アッセイ（Promega #G8080）を用いて、製造業者の指示に従ってアッセイした。cell titer blue アッセイの結果は、相対的細胞数に比例する蛍光が得られる。プレートリーダーによって蛍光シグナルを記録して、同じ９６ウェルプレートを用いてカスパーゼ３／７活性を、同じ体積のカスパーゼ３／７ Glow試薬と１時間暗所でインキュベートして測定した。蛍光シグナルをプレートリーダーによって、製造業者の指示に従って測定し、Cell titre Blueアッセイを用いて予め記録した生存率シグナルで正規化してデータを分析した。高い正規化シグナルは、カスパーゼ３／７活性の増加を示し、そしてアポトーシスの指標である。図６および図７に示すとおり、カスパーゼ３／７活性の増加はＥｇ５に対する対照ｓｉＲＮＡ（Ｅｇ５−１およびＥｇ５−２）と比較して、ＮＣＩ−Ｈ４６０肺がん細胞およびＥＫＶＸ肺がん細胞において、FZD10-1およびFZD10-2両ｓｉＲＮＡによって観察された。カスパーゼ３／７活性は２つの異なるｓｉＲＮＡ合成化学の２つのネガティブコントロール（ＮＣ−１＆ＮＣ−２）によって誘導されなかった。これらの結果は、ＮＣＩ−Ｈ４６０およびＥＫＶＸ肺がん細胞系のＦＺＤ１０のノックダウンによって、カスパーゼ３／７活性誘導メカニズムを介してアポトーシスが誘導されることを示した。
【０３１２】
軟寒天アッセイを用いて、アンカレッジ独立細胞増殖を測定した。軟寒天アッセイは、第１に非組織培養処理プレートをＰｏｌｙ−ＨＥＭＡでコーティングして細胞がプレートに接着することを防止することによって行う。非トランスフェクト細胞をトリプシンを用いて収穫し、そして培地で２回洗浄した。血球計を用いて細胞を計測し、培地で１０４細胞／ｍｌに再懸濁した。アリコート５０μｌをｐｏｌｙＨＥＭＡ被覆９６ウェルプレートに入れ、トランスフェクトした。
【０３１３】
トランスフェクションの翌日、細胞をトリプシン処理し、再懸濁し、計測した。細胞を約１０００細胞／１００μｌ／ウェルに希釈し、深いウェルブロック（最大体積＝１ｍｌ／ウェル、３連、標準位置に従う）に移した。細胞を２つのプレートに播種した：アッセイのために Corning #7007 Ultra Low Adherent U-plate 、および播種効率チェックのためにCorning # 3799 。Seaplaque GTG Agarose３％をマイクロウェーブオーブン中で約１分間加熱して融解させた。十分融解したとき、約１０ｍｌを予め温めた５０ｍｌポリプロピレンチューブ（Falcon # 35-2070）に注ぎ、そして６０℃ヒートブロックで少なくとも１０分間インキュベートした。完全培地約１８．６ｍｌを５０ｍｌポリプロピレンチューブに加え、そして約３７℃で水浴中でインキュベートした。Multimek（商標）ピペッターを用いてアガロースを、９６ウェルプレートの細胞にアガロースを分配した。温めた培地約１８．６ｍｌをアガロース１０ｍｌに注ぎ、ゆっくりと反転させて十分に混合した。プレートを約４℃で２０−３０分間インキュベートして、アガロースを速やかに固化させた。アガロースが固化した後、完全培地１００μｌを細胞に加えた。０日目の播種効率を測定するため、 Alamar Blue 約２５μｌ／ウェルを加え、一晩３７℃でインキュベートした。１８−２４時間後、プレートを５３０ｅｘ／５９０ｅｍでTECANプレートリーダーで読み込んだ。アッセイプレートを３７℃で７日間インキュベートした後、Alamar Blue（２５μｌ／ウェル）で現像した。
【０３１４】
ＮＣＩ−Ｈ４６０細胞についての典型的な増殖、アポトーシスおよび軟寒天アッセイの結果を図６に示し、これはFZD10-1およびFZD10-2両ｓｉＲＮＡが増殖を阻害し（アンカレッジ依存および独立の両方）、そしてこの細胞系のアポトーシスを誘導することができると示している。
【０３１５】
ＦＺＤ１０ノックダウンの機能的結果はまた、肺がん細胞系ＮＣＩ−Ｈ４６０におけるＰＡＲＰ切断に対するｓｉＲＮＡの効果を試験することによって試験した。ＰＡＲＰ切断はアポトーシスのメディエーターであるカスパーゼの活性化の指標である。ｓｉＲＮＡと適切なポジティブおよびネガティブコントロールでトランスフェクトした細胞を収穫し、４８時間および７２時間でＲＩＰＡバッファーに溶解させた。次に、細胞溶解物をWesternブロットで、ローディングコントロールとしてＰＡＲＰおよびβ−チューブリンの発現およびプロセッシングについて分析した。ＰＡＲＰ切断は７２時間時点でより強いシグナルを伴ってポジティブコントロール（Ｅｇ５−１およびＥｇ５−２）において増加した。ＦＺＤ１０に対するｓｉＲＮＡのトランスフェクション（ＦＺＤ１０−１＆ＦＺＤ１０−２）はまた、弱いＰＡＲＰ切断生成物を生じさせたが、ネガティブコントロールトランスフェクト（ＮＣ−１＆ＮＣ−２）サンプルではそうでなかった。図６に示すとおり、増殖阻害により効果的であるFZD10-1 ｓｉＲＮＡによって４８時間および７２時間の両時点でＰＡＲＰ切断が検出可能であったが、増殖阻害に効果が低いFZD10-2 ｓｉＲＮＡによってより遅い７２時間時点でのみＰＡＲＰ切断が検出可能であった。β−チューブリンの発現は等量のインプット細胞溶解物を示す全サンプルにわたって均一である。これらのデータは、ＦＺＤ１０のノックダウンによって誘導される増殖阻害がアポトーシス機構によるということを示唆した。
【０３１６】
ＦＺＤ１０を発現する細胞系の全てがＦＺＤ１０  ｓｉＲＮＡによって阻害され得るわけではない。ＦＺＤ１０を発現していない細胞系、例えばＭＣＦ７およびＡ５４９を同じｓｉＲＮＡのトランスフェクションによって試験したところ、機能的効果（増殖、軟寒天増殖およびアポトーシス）が観察されなかった。ＳＷ６２０（図８）およびＣｏｌｏ３２０ＤＭ（図９）のような、細胞表面でＦＺＤ１０を発現し、この発現をｓｉＲＮＡによって阻害することができる細胞系は、Ｅｇ５ポジティブコントロール（Ｅｇ５−１＆Ｅｇ５−２）によって良好な効果が示されたにもかかわらず、ｓｉＲＮＡトランスフェクション後に全く機能的効果を有さなかった。これらの大腸がん細胞系はＷＮＴシグナル伝達を仲介するＦＺＤ１０の細胞外要求をバイパスすることができるＡＰＣ変異を有し、そのためにｓｉＲＮＡ処置に応答しなかった。要するに、細胞増殖および生存についてのＦＺＤ１０の要求が状況依存的であると、これらのｓｉＲＮＡデータが示唆した。ＡＰＣにおけるβ−カテニン活性化変異または不活性化変異を有するこれらの細胞系は、ＦＺＤ１０アンタゴニストでの処置に感受性でない可能性がある。
【表３】
2010509368.tif 000004
【０３１７】
実施例５：抗ＦＺＤ１０  ＥＣＤ抗体製造
ウサギを免役するために使用するＦＺＤ１０抗原を、下記の通り製造および精製した。
【０３１８】
分泌されたＦＺＤ１０−ＥＣＤタンパク質を含むバキュロウイルス感染ＴＮ５細胞の増殖培地（１０Ｌを１．６Ｌに濃縮した）を、タンパク質精製のための出発物質として用いた。イミダゾールを最終濃度５ｍＭで上清に加えた。内毒素を含まないバッファーおよび装置を用いて、ＮｉバッファーＡ（ＰＢＳ  ｐＨ７．４／０．３５Ｍ  ＮａＣｌ／５ｍＭ  イミダゾール）で平衡した後、上清をNi HP （G.E.）カラム（高さ６ｃｍ×長さ２．６ｃｍ）にロードした。該カラムをバッファーＡでベースラインに洗浄し、タンパク質を１００％  ＮｉバッファーＢ（ＰＢＳ  ｐＨ７．４／０．３５Ｍ  ＮａＣｌ／５００ｍＭ  イミダゾール）への３０ＣＶグラジエントで溶出させた。アルギニンを最終濃度１００ｍＭでフラクションに加えた。ＦＺＤ１０を含むフラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥ減容化ゲルを用いて分析し、プールした。該プールをＳＰバッファーＡ（２５ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ５．７／０．１Ｍ  アルギニン）に対して透析して、最終伝導度８ｍＳ／ｃｍとした。透析プールを、ＳＰバッファーＡで平衡した５ｍｌ  SP Fast Flow Hi Trap カラム（G.E.）にロードした。該カラムをＳＰバッファーＡでベースラインに洗浄し、１００％  ＳＰバッファーＢ（２５ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ５．７／０．１Ｍ  アルギニン／５００ｍＭ  ＮａＣｌ）への３０ＣＶグラジエントで溶出させた。ＦＺＤ１０を含むフラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥ減容化ゲルを用いて分析し、プールした。該ＳＰプールをＮｉ２バッファーＡ（ＰＢＳ／０．３５Ｍ  ＮａＣｌ／５ｍＭ  イミダゾール／１００ｍＭ  アルギニン）で平衡した５ｍｌ  Ni HP Hi Trap （G.E.）カラムにロードした。該カラムをＮｉ２バッファーＡでベースラインに洗浄し、１００％  Ｎｉ２バッファーＢ（ＰＢＳ／０．３５Ｍ  ＮａＣｌ／５００ｍＭ  イミダゾール／１００ｍＭ  アルギニン）への２０ＣＶグラジエントで溶出させた。ＦＺＤ１０を含むフラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥ減容化ゲルを用いて分析し、プールした。該第２Ｎｉプールを、Ultrafree １５ｍｌ濃縮機（Millipore）を用いて最終体積１０ｍｌに濃縮した。当該濃縮物を、ＧＦＣバッファー（ＰＢＳ  ｐＨ７．４／１００ｍＭ  アルギニン）で平衡したSuperdex 75 26/60 Gel Filtrationカラム（G.E.）にロードした。ＦＺＤ１０を含むフラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥ減容化ゲルを用いて分析し、プールした。モノマーおよびダイマーを別個にプールし、モノマー物質を用いて抗体を製造した。モノマー物質はCoomassie ＳＤＳ−ＰＡＧＥで９５％純粋であり、内毒素レベルは０．３ＥＵ／ｍｇタンパク質未満であった。最終濃度は１．１ｍｇ／ｍｌであり、−８０℃で貯蔵した。
【０３１９】
ＦＺＤ１０タンパク質をウサギ血清アルブミン（ＲＳＡ）と、ｍ−マレイミド安息香酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）（Pierce, Rockford, Ill.）で複合化した。複合タンパク質での免疫化プロトコルを、標準的な方法に従って行った。最初に、免疫化の前にウサギの前出血を行った。第１の免疫化はFreund完全アジュバントおよび複合タンパク質５００μｇを含む。前の注射から４週間後に行った全ての続く免疫化は、同量のタンパク質を有するFreund不完全アジュバントを含む。出血を免疫化の７〜１０日後に行った。免疫後７７日目に、分析および精製のために出血を回収した。
【０３２０】
ウサギ抗ＦＺＤ１０−特異的抗体を下記の通り製造および精製した。ＮＨＳ活性化ＨＰ（G.E.カタログ# 10-0716-01）を用い、製造業者のプロトコルに従ってＦＺＤ１０抗原をＨＰ樹脂と共役させた。７７日目ウサギ血清を、バッファーＡ（７５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０）で平衡したＦＺＤ１０アフィニティーカラムにロードした。カラムをバッファーＡでベースラインに洗浄した。該抗体をバッファーＢ（１００ｍＭ  グリシン  ｐＨ２．７）で、Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０を含むフラクションに、最終濃度１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０で段階的に溶出させた。フラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、該抗体を含むフラクションをプールした。当該抗体がコントロール抗原、ＥＰＨＢ３またはＦＺＤ９と結合しないことがWesternブロット分析によって示された。
【０３２１】
タンパク質溶解物を異なる細胞系の細胞ペレットから、ＲＩＰＡバッファー（Teknova）で製造し、溶解物をアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、次に社内で精製した抗ＦＺＤ１０抗体（２種の異なる免疫化動物を代表するウサギＡおよびウサギＢ）を用いてWesternブロットに供した。細胞系はＦＺＤ１０を発現しない２９３Ｔヒト胚腎臓繊維芽細胞（ネガティブコントロール）；ポジティブコントロールとしてＦＺＤ１０哺乳類発現プラスミドで一時的にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞；定量的ＲＴ−ＰＣＲに基づいてＦＺＤ１０を発現していないヒト肺がん細胞系のシリーズ、ＮＣＩ−Ｈ６６１、ＮＣＩ−Ｈ１９１５、ＮＣＩ−Ｈ４４６；定量的ＲＴ−ＰＣＲに基づいてＦＺＤ１０を発現しているヒト肺がん細胞系のシリーズ、ＮＣＩ−Ｈ２１２６、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＥＫＶＸおよびＮＣＩ−Ｈ４６０；ヒト卵巣がん細胞系ＰＡＩ（図１０）を含む。
【０３２２】
ポジティブコントロール（ＦＺＤ１０トランスフェクト２９３Ｔ）細胞溶解物において、３つのバンド（〜６０ｋＤ、〜１２０ｋＤ＆〜１８０ｋＤ）が観察された。高分子量生成物の弱いバンド（１８０ｋＤａ）はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって完全に変性させることができなかったタンパク質のトリマー形態であり、１２０ｋＤａのバンドはＦＺＤ１０のダイマー形態であり得る。ウサギＡ抗ＦＺＤ１０抗体はＦＺＤ１０のモノマー形態に対してより強い優先度を有すると思われるが、様々な程度の強度を有するヒトがん細胞系全てにわたる少なくとも２つのバックグラウンドバンドも取り上げられた。ウサギＡ抗ＦＺＤ１０抗体はＦＺＤ９とも交叉反応し、これはこれらの他のバンドがＦＺＤ９または他の潜在的なＦＺＤファミリーのメンバーを意味し得ることを示唆している。ウサギＢ抗ＦＺＤ１０抗体は、ＦＺＤ１０のモノマーおよびダイマー形態に対して同等の優先度を有すると考えられるが、５０および３６ｋＤａで２つのバックグラウンドバンドも取り上げている。ウサギＢ抗ＦＺＤ１０抗体はＦＺＤ９と交叉反応しなかったため（最も近いホモログ）、これらの他のバンドはこの抗体によって認識される非特異的タンパク質である可能性があると示唆される。一般に、ＦＺＤ１０タンパク質発現は、実施例２に記載の方法を用いて測定した定量的ＲＴ−ＰＣＲ  Ｃｔレベルと一致する（表２）。Ｃｔ値はＰＣＲのサイクル数による検出の閾値を意味する。高いＣｔ値は、多数のサイクルがｃＤＮＡの検出のために必要であることを意味しており、したがって低いｍＲＮＡレベルの指標である。表２は、複数のヒト肺がん細胞系において顕著なレベルでＦＺＤ１０が発現していることを示している。
【表４】
2010509368.tif 000005
【０３２３】
実施例６：肺腫瘍マイクロアレイ（ＴＭＡ）および市販の多発性腫瘍ＴＭＡにおけるＦＺＤ１０の免疫組織化学的分析
【０３２４】
組織切片を脱パラフィン化し、抗原回復をVentana Discovery 装置（Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ）で行った。標準的な細胞コンディショニングを行い、細胞を６０分間、１次抗体と共にインキュベートした。ウサギ抗ヒトＦＺＤ１０  ＲｂＢｄ７７抗体（Chiron, Emeryville, CA）およびウサギＩｇＧ  Ｐｒｅｂｌｅｅｄ対照（Chiron, Emeryville, CA）を１０μｇ／ｍｌで用いた。Ventana Universal Secondary Reagent （Ventana Medical Systems, Inc.）、次にVentana DAB Map Kit （Ventana Medical Systems, Inc.）を検出に用いた。Ventana Hematoxylin および Bluing Reagents（Ventana Medical Systems, Inc.）を対比染色のために用い、切片を等級アルコールで脱水し、キシレンで洗浄し、合成マウント培地を用いてカバースリップした。
ＦＺＤ１０発現を、血管系および腫瘍上皮におけるＢＬ−２＋細胞質性発現である核破裂として観察した。全体的なＦＺＤ１０発現は弱く、腫瘍上皮において観察された。免疫前ＲｂＢｄ０は、複数の腫瘍要素における細胞質性の広範な発赤および炎症性細胞に対する応答性を示した。ＦＺＤ１０の発現はほとんどの肺がん要素、いくつかの大腸がん要素および卵巣がん要素において観察された。膀胱、食道、頸部、胸、甲状腺、胃、膵臓、皮膚、前立腺および直腸由来のがんも、下記表３および４に示すとおりＦＺＤ１０発現について評価した。
【表５】
2010509368.tif 000006
【表６】
2010509368.tif 000007
【表７】
2010509368.tif 000008
【表８】
2010509368.tif 000009
【表９】
2010509368.tif 000010
【０３２５】
実施例７：ＦＺＤ１０の過剰発現がDishievelledファミリーメンバーのリン酸化を誘導した。
ＦＺＤ１０、ＦＺＤ９、ＬＲＰ５、ＷＮＴ７ａおよびＷＮＴ７ｂのいずれかを発現している哺乳類発現ベクターで２９３Ｔ細胞をトランスフェクトした。細胞をトランスフェクション後２４時間で収穫し、該細胞をＲＩＰＡバッファー（Teknova）に溶解させて全細胞溶解物を製造した。Westernブロット分析を行って、様々なトランス遺伝子の発現を検出した。ＦＺＤ１０発現は抗ＦＺＤ１０  ＲｂＢＤ７７ウサギポリクローナル抗体によって検出した。ＦＺＤ９発現は、Ｒ＆Ｄシステム由来の抗ＦＺＤ９ヤギポリクローナル抗体によって検出した。ＬＲＰ５は、Santa Cruz由来の抗ＬＲＰ５抗体によって検出した。Ｗｎｔ７ａ−ＨＡおよびＷｎｔ７ｂ−ＨＡ発現は、Covance由来の抗ＨＡタグモノクローナル抗体によって検出した。これらのトランスフェクトした２９３Ｔ細胞溶解物中のＤｖｌ２およびＤｖｌ３のリン酸化状態を、全ての翻訳後修飾および未修飾Ｄｖｌ２およびＤｖｌ３タンパク質を認識する、Cell Signaling由来のウサギポリクローナル抗体によるＤｖｌ２およびＤｖｌ３の移動度シフトによって測定した。図１１はＤｖｌ２およびＤｖｌ３の両方の超リン酸化を引き起こすＦＺＤ９またはＦＺＤ１０の過剰発現を示す。この観察は報告されている細胞系におけるFrizzled過剰発現の影響と一致し、Ｄｖｌ２およびＤｖｌ３リン酸化状態をがん細胞系におけるＦＺＤ１０過剰発現の直接的結果として用いることができると示唆している。
【０３２６】
実施例８：ＦＺＤ１０のｓｉＲＮＡノックダウンによって、ヒト肺がん細胞系ＮＣＩ−Ｈ４６０においてDishievelledファミリーメンバーのリン酸化が減少した。
Ｄｖｌ２およびＤｖｌ３のリン酸化状態に対するFZD10-1およびFZD10-2 ｓｉＲＮＡによるＦＺＤ１０ノックダウンの影響をＮＣＩ−Ｈ４６０肺がん細胞系において試験した（図１１）。該細胞をｓｉＲＮＡおよび対応するネガティブコントロールと２４時間インキュベートし、そして細胞溶解物をWesternブロット分析によって分析した。抗ＦＺＤ１０抗体ＲｂＢｄ７７（Chiron, Emeryville, CA）を用いてＦＺＤ１０タンパク質の減少を検出した。Ｄｖｌ２およびＤｖｌ３のリン酸化状態を、全ての翻訳後修飾および未修飾Ｄｖｌ２およびＤｖｌ３タンパク質を認識する、抗Ｄｖｌ２および抗Ｄｖｌ３ウサギポリクローナル抗体（Cell Signaling）によって検出した。Ｄｖｌ２およびＤｖｌ３の遅い移動度種は、FZD10-1 ｓｉＲＮＡによってのみ２４時間で減少したが、ネガティブコントロールでは全く減少しなかった。FDZ10-2 ｓｉＲＮＡによる効果の低下は、FZD10-1 ｓｉＲＮＡと比較してこのｓｉＲＮＡの遅いノックダウン動力学に寄与し得る（実施例４）。このデータは、ＦＺＤ１０を過剰発現するがん細胞系、例えばＮＣＩ−Ｈ４６０におけるＤｖｌ２およびＤｖｌ３のリン酸化状態を、がん細胞系におけるＦＺＤ１０の機能的ノックアウトの標的調節バイオマーカーとして用いることができると示唆している。
【０３２７】
実施例９：配列
配列番号１    ＦＺＤ１０  ｎｔ配列
atgcagcgcccgggcccccgcctgtggctggtcctgcaggtgatgggctcgtgcgccgcc
atcagctccatggacatggagcgcccgggcgacggcaaatgccagcccatcgagatcccg
atgtgcaaggacatcggctacaacatgactcgtatgcccaacctgatgggccacgagaac
cagcgcgaggcagccatccagttgcacgagttcgcgccgctggtggagtacggctgccac
ggccacctccgcttcttcctgtgctcgctgtacgcgccgatgtgcaccgagcaggtctct
acccccatccccgcctgccgggtcatgtgcgagcaggcccggctcaagtgctccccgatt
atggagcagttcaacttcaagtggcccgactccctggactgccggaaactccccaacaag
aacgaccccaactacctgtgcatggaggcgcccaacaacggctcggacgagcccacccgg
ggctcgggcctgttcccgccgctgttccggccgcagcggccccacagcgcgcaggagcac
ccgctgaaggacgggggccccgggcgcggcggctgcgacaacccgggcaagttccaccac
gtggagaagagcgcgtcgtgcgcgccgctctgcacgcccggcgtggacgtgtactggagc
cgcgaggacaagcgcttcgcagtggtctggctggccatctgggcggtgctgtgcttcttc
tccagcgccttcaccgtgctcaccttcctcatcgacccggcccgcttccgctaccccgag
cgccccatcatcttcctctccatgtgctactgcgtctactccgtgggctacctcatccgc
ctcttcgccggcgccgagagcatcgcctgcgaccgggacagcggccagctctatgtcatc
caggagggactggagagcaccggctgcacgctggtcttcctggtcctctactacttcggc
atggccagctcgctgtggtgggtggtcctcacgctcacctggttcctggccgccggcaag
aagtggggccacgaggccatcgaagccaacagcagctacttccacctggcagcctgggcc
atcccggcggtgaagaccatcctgatcctggtcatgcgcagggtggcgggggacgagctc
accggggtctgctacgtgggcagcatggacgtcaacgcgctcaccggcttcgtgctcatt
cccctggcctgctacctggtcatcggcacgtccttcatcctctcgggcttcgtggccctg
ttccacatccggagggtgatgaagacgggcggcgagaacacggacaagctggagaagctc
atggtgcgtatcgggctcttctctgtgctgtacaccgtgccggccacctgtgtgatcgcc
tgctacttttacgaacgcctcaacatggattactggaagatcctggcggcgcagcacaag
tgcaaaatgaacaaccagactaaaacgctggactgcctgatggccgcctccatccccgcc
gtggagatcttcatggtgaagatctttatgctgctggtggtggggatcaccagcgggatg
tggatttggacctccaagactctgcagtcctggcagcaggtgtgcagccgtaggttaaag
aagaagagccggagaaaaccggccagcgtgatcaccagcggtgggatttacaaaaaagcc
cagcatccccagaaaactcaccacgggaaatatgagatccctgcccagtcgcccacctgc
gtgtga
配列番号２    ＦＺＤ１０  ａａ配列
mqrpgprlwlvlqvmgscaaissmdmerpgdgkcqpieipmckdigynmtrmpnlmghen
qreaaiqlhefaplveygchghlrfflcslyapmcteqvstpipacrvmceqarlkcspi
meqfnfkwpdsldcrklpnkndpnylcmeapnngsdeptrgsglfpplfrpqrphsaqeh
plkdggpgrggcdnpgkfhhveksascaplctpgvdvywsredkrfavvwlaiwavlcff
ssaftvltflidparfryperpiiflsmcycvysvgylirlfagaesiacdrdsgqlyvi
qeglestgctlvflvlyyfgmasslwwvvltltwflaagkkwgheaieanssyfhlaawa
ipavktililvmrrvagdeltgvcyvgsmdvnaltgfvliplacylvigtsfilsgf
fhirrvmktggentdkleklmvriglfsvlytvpatcviacyfyerlnmdywkilaaqhk
ckmnnqtktldclmaasipaveifmvkifmllvvgitsgmwiwtsktlqswqqvcsrrlk
kksrrkpasvitsggiykkaqhpqkthhgkyeipaqsptcv
【０３２８】
本発明を特定の態様についての記載によって説明してきたが、様々な変化をつけることができ、均等物が本発明の真の精神および範囲から離れることなく置換され得ることを、当業者によって理解されるべきである。さらに、多くの修正を行って具体的な状況、物質、物質の組成物、方法、方法工程または複数工程を、本発明の対象、精神および範囲に適用することができる。全てのかかる修飾は、本発明の範囲に含まれると意図される。
【図１】
2010509368.tif 000011
【図２】
2010509368.tif 000012
【図３】
2010509368.tif 000013
【図４】
2010509368.tif 000014
【図５】
2010509368.tif 000015
【図６】
2010509368.tif 000016
【図７】
2010509368.tif 000017
【図８】
2010509368.tif 000018
【図９】
2010509368.tif 000019
【図１０】
2010509368.tif 000020
【図１１】
2010509368.tif 000021
【配列表】
2010509368000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成21年6月1日(2009.6.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2010509368000001.app
【国際調査報告】
2010509368.tif 000031
2010509368.tif 000032
2010509368.tif 000033
2010509368.tif 000034
2010509368.tif 000035
2010509368.tif 000036