(57)【要約】食道癌は消化管の癌として世界で３番目に多く、癌関連死の死因として第７位を占める。最もよく見られる食道癌のタイプは、扁平上皮癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）および腺癌である。扁平上皮癌は、食道の内側を覆う扁平細胞に発症する。腺癌は食道の粘膜に発症し、バレット食道と呼ばれる状態に関係している。本発明は、ある種のマイクロＲＮＡのレベルまたは遺伝子の状態に基づき食道癌の診断および分類ならびに食道癌の個体の生存の予後を行うための方法および組成物を提供する。さらに、本発明は、ｍｉＲＮＡのレベルを低下させる薬を含む組成物および生存を改善するためのその使用も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体の食道癌の診断方法であって、ａ）前記個体の癌の疑いがある食道組織サンプルにおける少なくとも１種のｍｉＲＮＡのレベルを判定すること、およびｂ）前記ｍｉＲＮＡのレベルを参照レベルと比較することを含み、前記ｍｉＲＮＡのレベルの特徴的な変化から食道癌が示唆され、ただし、前記ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−２９ｂ、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２ｓ、ｍｉＲ−１８２ａｓ、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−１２９−１、ｍｉＲ−１５およびｍｉＲ−１６ではない、方法。
【請求項２】
前記食道癌は、食道扁平上皮癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１種のｍｉＲＮＡは、図１に示すｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記個体の図１に示す少なくとも３種のｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログのレベルを参照レベルと比較することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記個体の図１に示す少なくとも１０種のｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログのレベルを参照レベルと比較することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ｍｉＲＮＡの少なくとも１つは、配列番号１〜１４のｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログからなる群から選択され、配列番号１〜１４のｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログの少なくとも１つのレベルの実質的な上昇から食道癌が示唆される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ｍｉＲＮＡの少なくとも１つは、配列番号１５〜３８のｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログからなる群から選択され、配列番号１５〜３８のｍｉＲＮＡの少なくとも１つまたはそれに対応するホモログのレベルの実質的な低下から食道癌が示唆される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ｍｉＲＮＡの少なくとも１つは配列番号１〜１４のｍｉＲＮＡからなる群から選択され、かつ前記ｍｉＲＮＡの少なくとも１つは配列番号１５〜３８のｍｉＲＮＡからなる群から選択され、配列番号１〜１４のｍｉＲＮＡの少なくとも１つのレベルの実質的な上昇および配列番号１５〜３８のｍｉＲＮＡの少なくとも１つのレベルの実質的な低下から食道癌が示唆される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
図１のすべてのｍｉＲＮＡのレベルが判定され、配列番号１〜１４のｍｉＲＮＡのレベルの実質的な上昇および配列番号１５〜３８のｍｉＲＮＡのレベルの実質的な低下から食道癌が示唆される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ｍｉＲＮＡのレベルは、マイクロアレイ解析により判定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ｍｉＲＮＡのレベルは、前記マイクロアレイ上の前記ｍｉＲＮＡのハイブリダイゼーションシグナルに基づき判定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ｍｉＲＮＡのレベルは、前記マイクロアレイ上の前記ｍｉＲＮＡのハイブリダイゼーションシグナルと参照サンプルのハイブリダイゼーションシグナルとの比に基づき判定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記ｍｉＲＮＡのレベルは、ノーザンブロット解析、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションおよび定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応のいずれかにより判定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ｍｉＲＮＡのレベルは、リンパ節サンプル、血液、血清または食道組織スワブのいずれか由来の前記ｍｉＲＮＡのレベルに基づき判定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
個体の食道癌を診断する方法であって、個体の癌の疑いがある食道組織サンプル中のｍｉＲＮＡに対応する少なくとも１個のｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子の状態を解析することを含み、対照サンプル中の前記対応するｍｉＲＮＡ遺伝子と比較した、前記遺伝子の状態の特徴的な変化から食道癌が示唆され、ただし、前記ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−２９ｂ、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２ｓ、ｍｉＲ−１８２ａｓ、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−１２９−１、ｍｉＲ−１５およびｍｉＲ−１６ではない、方法。
【請求項１６】
前記遺伝子の状態の変化は、前記ｍｉＲＮＡ遺伝子の欠失または増幅に基づき判定される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記遺伝子の状態の変化は、前記ｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子コピー数の変化に基づき判定される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
食道癌を診断するシステムであって、前記システムは複数のプローブを含み、前記プローブはそれぞれサンプル中の異なるｍｉＲＮＡを検出することができ、かつ前記プローブの少なくとも約５０％は図１に示すｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログを検出することができる、システム。
【請求項１９】
食道癌を診断するシステムの使用であって、前記システムは複数のプローブを含み、前記プローブはそれぞれサンプル中の異なるｍｉＲＮＡ（またはそれに対応するｍｉＲＮＡの遺伝子の状態）を検出することができ、前記プローブの少なくとも約５０％は図１に示すｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログを検出することができ、かつ図１に示す前記ｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログの少なくとも１つのレベルの特徴的な変化から食道（ｅｓｏｐｈａｇｒｅａｌ）癌が示唆される、システムの使用。
【請求項２０】
食道癌を診断するシステムを製造するためのプローブの使用であって、前記プローブはそれぞれサンプル中の異なるｍｉＲＮＡを検出することができ、かつ前記プローブの少なくとも約５０％は図１に示すｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログを検出することができる、プローブの使用。
【請求項２１】
食道患者を分類する方法であって、個体の食道癌組織における少なくとも１種のｍｉＲＮＡのレベルまたはそれに対応するｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子の状態を判定することを含み、前記ｍｉＲＮＡのレベルまたはそれに対応するｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子の状態が前記食道患者の分類の根拠として用いられる、方法。
【請求項２２】
図２ａに示すｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログのレベルが判定され、かつ前記ｍｉＲＮＡのレベルが前記個体の食道癌の分化度を判定する根拠として用いられる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
少なくとも１種のｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３５、ｈｓａ−ｍｉＲ−２５、ｈｓａ−１３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ａもしくはｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｄまたはそれに対応するホモログである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ｍｉＲＮＡのレベルは、ノーザンブロット解析、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションおよび定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応のいずれかにより判定される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記ｍｉＲＮＡのレベルは、リンパ節、血液、血清または食道組織スワブのいずれか由来の前記ｍｉＲＮＡのレベルに基づき判定される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
食道癌患者を分類するシステムであって、前記システムは複数のプローブを含み、前記プローブはそれぞれサンプル中の異なるｍｉＲＮＡを検出することができ、かつ前記プローブの少なくとも約５０％は表２に示すｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログを検出することができる、システム。
【請求項２７】
食道癌の個体を分類するシステムの使用であって、前記システムは１つまたは複数のプローブを含み、前記プローブはそれぞれサンプル中の異なるｍｉＲＮＡを検出することができ、かつ前記プローブの少なくとも約５０％は表２に示すｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログを検出することができる、システムの使用。
【請求項２８】
食道癌の個体を分類するシステムを製造するためのプローブの使用であって、前記プローブはそれぞれサンプル中の異なるｍｉＲＮＡ（またはそれに対応するｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子の状態）を検出することができ、かつ前記プローブの少なくとも約５０％は表２に示すｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログを検出することができる、プローブの使用。
【請求項２９】
食道癌の個体の生存の予後を判定する方法であって、（ａ）前記個体由来の食道癌組織サンプル中の少なくとも１種のｍｉＲＮＡのレベルを判定すること、および（ｂ）前記サンプル中の前記ｍｉＲＮＡのレベルを閾値レベルと比較することを含み、閾値レベルと比較して前記ｍｉＲＮＡのレベルは前記個体の生存と相関または逆相関する、方法。
【請求項３０】
少なくとも１種のｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７もしくはｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂまたはそれに対応するホモログである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
食道癌の個体の生存の予後を判定する方法であって、少なくとも１個のｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子の状態を解析することを含み、対照サンプルの変化と比較した遺伝子の状態の変化から前記個体の生存率（ｓｕｒｖｉｖａｌ）の高低が示唆される、方法。
【請求項３２】
少なくとも１個のｍｉＲＮＡ遺伝子は、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７もしくはｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂまたはそれに対応するホモログの遺伝子に対応する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記生存は、全生存である、請求項２９〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
前記生存は、無病生存である、請求項２９〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
前記個体の適切な処置期間を判定することをさらに含む、請求項２９〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
前記ｍｉＲＮＡのレベルは、ノーザンブロット解析、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションおよび定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応のいずれかにより判定される、請求項２９〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
前記ｍｉＲＮＡのレベルは、リンパ節サンプル、血清、血液または食道組織スワブのいずれか由来の前記ｍｉＲＮＡのレベルに基づき判定される、請求項２９〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
食道癌の個体の生存の予後を判定する１つまたは複数のプローブの使用であって、前記プローブは前記サンプル中のｍｉＲＮＡを検出することができ、かつ前記閾値レベルと比較して前記ｍｉＲＮＡのレベルは前記個体の生存と相関または逆相関する、プローブの使用。
【請求項３９】
少なくとも１種のｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７もしくはｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂまたはそれに対応するホモログである、請求項２９〜３２のいずれかに記載の使用。
【請求項４０】
食道癌の個体の生存の予後を判定する薬（またはシステム）を製造するための１つまたは複数のプローブの使用であって、前記プローブは前記サンプル中のｍｉＲＮＡを検出することができ、かつ前記閾値レベルと比較して前記ｍｉＲＮＡのレベルは前記個体の生存と相関または逆相関する、プローブの使用。
【請求項４１】
少なくとも１種のｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７もしくはｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂまたはそれに対応するホモログである、請求項４０に記載の使用。
【請求項４２】
食道癌の個体の生存を改善する方法であって、ｍｉＲＮＡのレベルを低下させる薬を前記個体に有効量で投与することを含み、前記閾値レベルと比較して前記ｍｉＲＮＡのレベルは前記個体の生存と逆相関する、方法。
【請求項４３】
少なくとも１種のｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７もしくはｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂまたはそれに対応するホモログである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記薬はアンチセンスＲＮＡである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記薬はｓｉＲＮＡである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
少なくとも２種のｍｉＲＮＡのレベルを低下させる１種または複数種の薬を前記個体に有効量で投与することを含み、少なくとも１種のｍｉＲＮＡはｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂまたはそれに対応するホモログである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂまたはそれに対応するホモログのレベルを低下させる１種または複数種の薬を前記個体に有効量で投与することを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
食道癌の個体の生存を改善する薬物を製造するための、ｍｉＲＮＡレベルを低下させる薬の使用であって、前記閾値レベルと比較して前記ｍｉＲＮＡレベルは前記個体の生存と逆相関する、薬の使用。
【請求項４９】
少なくとも１種のｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂまたはそれに対応するホモログである、請求項４８に記載の使用。
【請求項５０】
前記薬はアンチセンスＲＮＡである、請求項４８に記載の使用。
【請求項５１】
前記薬はｓｉＲＮＡである、請求項４８に記載の使用。
【請求項５２】
ｍｉＲＮＡのレベルを低下させる薬および薬学的に許容されるキャリアを含み、少なくとも１種のｍｉＲＮＡはｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂまたはそれに対応するホモログである、医薬組成物。
【請求項５３】
前記薬はアンチセンスＲＮＡである、請求項５２に記載の医薬組成物。
【請求項５４】
前記薬はｓｉＲＮＡである、請求項５２に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、マイクロＲＮＡのレベルに基づく疾患（食道癌など）の診断の方法ならびに患者の生存の予後および改善の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
食道癌は消化管の癌として世界で３番目に多く、癌関連死の死因として第７位を占める。最もよく見られる食道癌のタイプは、扁平上皮癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）および腺癌である。扁平上皮癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）は、食道の内側を覆う扁平細胞に発症する。腺癌は食道の粘膜に発症し、バレット食道と呼ばれる状態に関係している。
【０００３】
食道扁平上皮癌は、前浸潤性の異形成から浸潤性扁平上皮癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）への進行について十分に解明されており、病期が進むと転移する場合が多い（Ｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆａｍ．Ｃａｎｃｅｒ．２００６  Ｍａｙ  ２５；［Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ］）。食道癌では、多くの遺伝子で発現が変化することが確認されている。たとえば、化成から異形成、癌への進展、さらに潜在的な転移拡大にはＣＯＸ−２およびＶＥＧＦ（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）が関係している（Ｌｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００６，６６：７１１１−７１１８；Ｖａｌｌｂｏｈｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ａｒｃｈ  Ｓｕｒｇ．２００６，１４１：４７６−４８１；Ｆａｍ．Ｃａｎｃｅｒ．２００６  Ｍａｙ  ２５，［Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ］；Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｓｕｒｇ．２００６，１０：１０１６−１０２２；Ｓｏｍａ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２００６，１１９：７７１−７８２）。
【０００４】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、約２２ヌクレオチド長の低分子非コード一本鎖ＲＮＡで、部分配列相同性または完全な配列相同性により、標的ｍＲＮＡ分子の３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ：ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）と相互作用する場合がある（Ｂａｒｔｅｌ，Ｃｅｌｌ  ２００４，１１６：２８１−２９７）。ｍｉＲＮＡとその標的ｍＲＮＡとの相互作用により、ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳は阻止される。その標的とｍｉＲＮＡが完全に一致すると、場合によってはｍＲＮＡの分解が起こることもある。ｍｉＲＮＡは、細胞分化、細胞増殖および細胞死など、様々な細胞プロセスに関係していると考えられている（Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２００５，３３：１２９０−７；Ｊｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ，ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ．２００４，２：ｅ３６３）。ヒトゲノムには１，０００ものｍｉＲＮＡが存在すると推定されている（Ｚａｍｏｒｅ  ａｎｄ  Ｈａｌｅｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００５，３０９：１５１９−１５２４）。３分の１と多くのヒトｍＲＮＡがｍｉＲＮＡの標的になり得ると推定されている（Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  ２００５，１１５：７８７−７９８）。ヒトｍｉＲＮＡのＲＮＡエディティングに関する最近の知見から、制御標的のレパートリーがかなり大きいことが示唆されている（Ｂｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２００６，７：Ｒ２７）。
【０００５】
癌の発生および進展において様々なｍｉＲＮＡ種が重要な役割を果たしていることを示唆する証拠が増えている（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）。ｍｉＲＮＡ遺伝子は、癌において修飾を受けるゲノム部位、脆弱部位（ＦＲＡ：ｆｒａｇｉｌｅ  ｓｉｔｅ）などの領域、切断点部位および領域、ゲノム増幅の微小領域ならびにヘテロ接合性消失の微小領域と関連して発見されることが多いことから（非特許文献５；非特許文献６）、癌に見られる一部のｍｉＲＮＡの発現が変化するのは、根底にあるゲノム不安定性によることが窺われる。
【０００６】
癌組織におけるｍｉＲＮＡの発現は、マイクロアレイ（Ｂａｂａｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ  ２００４，１０：１８１３−９；Ｂａｒａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２００４，１４：２４８６−９４；Ｃａｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００４，１０１：１１７５５−１１７６０；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００４，１０１：９７４０−４；Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００４，１：１５５−６１；Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００４，１：４７−５３；Ｃｉａｆｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００５，３３４：１３５１−１３５８；Ｓｈｉｎｇａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ  ２００５，１１：１４６１−１４７０）、マイクロビーズのハイブリダイゼーション（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２００５，４３５：８３４−８３８）およびＲＴ  ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）（Ｂａｎｄｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００６，５：２９）により検査されている。ｍｉＲＮＡの発現の変化は、慢性リンパ球白血病（Ｃａｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００４，１０１：１１７５５−１１７６０）、結腸癌（Ｂａｎｄｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００６，５：２９）、膠芽細胞腫（Ｃｉａｆｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００５，３３４：１３５１−１３５８）および乳癌（Ｉｏｒｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００５，６５：７０６５−７０７０）など多くの癌で確認されている。最近では、保存された癌組織生検標本が、ホルマリン保存パラフィン包埋組織（ＦＰＰＥ：ｆｏｒｍａｌｉｎ  ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ  ｐａｒａｆｆｉｎ  ｅｍｂｅｄｄｅｄ）（Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ  ２００６，１２：１８７−１９１）、凍結保存組織（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ２００５，４３５：８３４−８３８）またはその両方（Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ２００５，４３５：８２８−８３３）として保存されるか、あるいは保存形式が不明なもの（Ｖｏｌｉｎｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００６，１０３：２２５７−２２６１；Ｙａｎａｉｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２００６，９：１８９−１９８）もあるが、癌におけるｍｉＲＮＡプロファイルの解析に用いられ成功している。
【０００７】
本明細書に言及される刊行物、特許、特許出願および公開された特許出願の開示内容についてはすべて、参照によってその全体を本明細書に援用する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ２００５，４３５：８３４−８３８
【非特許文献２】Ｖｏｌｉｎｉａ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００６，１０３：２２５７−２２６１
【非特許文献３】Ｗｙｎｔｅｒ，Ｍｅｄ．Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ．２００６，６６：６１２−３５
【非特許文献４】Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００６，３４８：２２９−２３７
【非特許文献５】Ｃａｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００２，９９：１５５２４−１５５２９
【非特許文献６】Ｃａｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００４，１０１：２９９９−３００４
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、ｍｉＲＮＡのレベルまたは対応するｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子の状態に基づく癌の診断および予後、特に食道癌の診断および予後のための方法および組成物を提供する。また、癌、特に食道癌の診断および予後のための、ｍｉＲＮＡまたは対応する遺伝子の遺伝子の状態を検出するプローブの使用も提供する。
【００１０】
これに伴い、本発明は、個体の癌を診断する方法であって、ａ）個体由来のサンプル中の少なくとも１種のｍｉＲＮＡのレベルを判定すること、およびｂ）ｍｉＲＮＡのレベルを参照レベルと比較することを含み、ｍｉＲＮＡのレベルの特徴的な変化から癌が示唆される、方法を提供する。
【００１１】
一態様では、個体の食道癌を診断する方法であって、ａ）個体の癌の疑いがある食道組織サンプル中の少なくとも１種のｍｉＲＮＡ（図１に示す少なくとも１種のｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログなど）のレベルを判定すること、およびｂ）ｍｉＲＮＡのレベルを参照レベルと比較することを含み、ｍｉＲＮＡのレベルの特徴的な変化から、食道癌が示唆される、方法を提供する。いくつかの実施形態では、癌は、食道扁平上皮癌である。いくつかの実施形態では、癌は、食道腺癌である。
【００１２】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−２９ｂ、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８２ａ、ｍｉＲ−１８３およびｍｉＲ−１２９−１ではない。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１５およびｍｉＲ−１６ではない。
【００１３】
いくつかの実施形態では、配列番号１〜１４のｍｉＲＮＡの少なくとも１つ（少なくとも２、５、１０、１４のいずれかなど）またはそれに対応するホモログのレベルを判定し、測定したｍｉＲＮＡの少なくとも１つのレベルの実質的な上昇から食道癌が示唆される。いくつかの実施形態では、配列番号１５〜３８のｍｉＲＮＡの少なくとも１つ（少なくとも２、５、１０、１５、２０、２４のいずれかなど）またはそれに対応するホモログのレベルを判定し、測定したｍｉＲＮＡの少なくとも１つのレベルの実質的な低下から食道癌が示唆される。いくつかの実施形態では、配列番号１〜１４のｍｉＲＮＡの少なくとも１つ（少なくとも２、５、１０、１４のいずれかなど）またはそれに対応するホモログおよび配列番号１５〜３８のｍｉＲＮＡの少なくとも１つ（少なくとも２、５、１０、１５、２０、２４のいずれかなど）またはそれに対応するホモログのレベルを判定し、図１の番号１〜１４のｍｉＲＮＡの少なくとも１つまたはそれに対応するホモログのレベルの実質的な上昇および番号１５〜３８のｍｉＲＮＡの少なくとも１つまたはそれに対応するホモログのレベルの実質的な低下から食道癌が示唆される。
【００１４】
いくつかの実施形態では、マイクロアレイ解析によりｍｉＲＮＡのレベルを判定する。いくつかの実施形態では、マイクロアレイ上のｍｉＲＮＡのハイブリダイゼーションシグナルに基づきｍｉＲＮＡのレベルを判定する。いくつかの実施形態では、マイクロアレイ上のｍｉＲＮＡに対するハイブリダイゼーションシグナルと参照サンプルのそれとの比に基づきｍｉＲＮＡのレベルを判定する。いくつかの実施形態では、ノーザンブロット解析、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションおよび定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応のいずれかによりｍｉＲＮＡのレベルを判定する。
【００１５】
いくつかの実施形態では、個体の食道癌を診断する方法であって、個体の癌の疑いがある食道組織サンプル中の少なくとも１個のｍｉＲＮＡ遺伝子（図１に示すｍｉＲＮＡに対応する少なくとも１個のｍｉＲＮＡ遺伝子またはそれに対応するホモログなど）の遺伝子の状態を解析することを含み、対照サンプル中の対応するｍｉＲＮＡ遺伝子と比較した遺伝子の状態の特徴的な変化から食道癌が示唆される、方法を提供する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ遺伝子の欠失または増幅に基づき遺伝子の状態の変化を判定する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子コピー数の変化に基づき遺伝子の状態の変化を判定する。
【００１６】
いくつかの実施形態では、サンプル中の図１に示す少なくとも１つのｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログのレベル（または対応するｍｉＲＮＡの遺伝子の状態）を判定するシステム（マイクロアレイなど）であって、システムは複数のプローブを含み、各プローブは食道組織サンプル中の異なるｍｉＲＮＡ（または対応するｍｉＲＮＡの遺伝子の状態）を検出することができ、かつプローブの少なくとも約１５％（たとえば、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％のいずれかなど）は図１に示すｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログ（または対応するｍｉＲＮＡの遺伝子の状態）を検出することができる、システムを提供する。いくつかの実施形態では、食道癌を診断するシステム（マイクロアレイなど）であって、システムは複数のプローブを含み、各プローブはサンプル中の異なるｍｉＲＮＡ（または対応するｍｉＲＮＡの遺伝子の状態）を検出することができ、かつプローブの少なくとも約１５％（たとえば、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％のいずれかなど）は図１に示すｍｉＲＮＡ（または対応するｍｉＲＮＡの遺伝子の状態）を検出することができる、システムを提供する。
【００１７】
いくつかの実施形態では、食道癌を診断するシステムの使用であって、システムは少なくとも１種（たとえば、少なくとも２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５および４０のいずれかなど）のプローブ（オリゴヌクレオチドなど）を含み、各プローブは図１に示す異なるｍｉＲＮＡのレベル（または対応するｍｉＲＮＡの遺伝子の状態）を検出し、図１に示すｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログの少なくとも１つのレベル（または対応するｍｉＲＮＡの遺伝子の状態）の特徴的な変化から食道癌が示唆される、システムの使用を提供する。いくつかの実施形態では、食道癌を診断するシステム（マイクロアレイなど）の使用であって、システムは複数のプローブを含み、各プローブはサンプル中の異なるｍｉＲＮＡ（または対応するｍｉＲＮＡの遺伝子の状態）を検出することができ、プローブの少なくとも約１５％（たとえば、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％のいずれかなど）は図１に示すｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログ（または対応するｍｉＲＮＡの遺伝子の状態）を検出することができ、かつ図１に示すｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログの少なくとも１つのレベル（または対応するｍｉＲＮＡの遺伝子の状態）の特徴的な変化から食道癌が示唆される、システムの使用を提供する。
【００１８】
また、本明細書に記載のシステムの製造のため、ｍｉＲＮＡを検出するプローブの使用も提供する。いくつかの実施形態では、個体の食道癌を診断するシステムを製造するための、１つまたは複数のプローブ（オリゴヌクレオチドなど）の使用であって、各プローブは図１に示すｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログのレベル（または対応するｍｉＲＮＡの遺伝子の状態）を判定することができる、プローブの使用を提供する。いくつかの実施形態では、食道癌を診断するシステム（マイクロアレイなど）を製造するためのプローブ（オリゴヌクレオチドなど）の使用であって、各プローブはサンプル中の異なるｍｉＲＮＡ（または対応するｍｉＲＮＡの遺伝子の状態）を検出することができ、かつプローブの少なくとも約１５％（たとえば、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％のいずれかなど）は図１に示すｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログ（または対応するｍｉＲＮＡの遺伝子の状態）を検出することができる、プローブの使用を提供する。
【００１９】
別の態様では、たとえば、分化度、腫瘍病期および病理学的分類に基づき食道患者を分類する方法を提供する。いくつかの実施形態では、食道患者を分類する方法（たとえば、分化度の判定、腫瘍病期の判定および食道患者の病理学的分類）であって、個体の食道癌組織における少なくとも１種のｍｉＲＮＡレベル（表２に示すｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログなど）または対応するｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子の状態を判定することを含み、ｍｉＲＮＡのレベル（または対応するｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子の状態）を食道患者の分類の根拠として用いる、方法を提供する。
【００２０】
いくつかの実施形態では、個体の食道癌の分化度を判定する方法であって、個体の食道癌組織における図２ａに示すｍｉＲＮＡのレベルまたはそれに対応するホモログを判定することを含み、ｍｉＲＮＡのレベルを個体の食道癌の分化度を測定する根拠として用いる、方法を提供する。いくつかの実施形態では、少なくとも１種のｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３５またはそれに対応するホモログである。いくつかの実施形態では、少なくとも１種のｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−２５またはそれに対応するホモログである。いくつかの実施形態では、少なくとも１種のｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−１３０ｂまたはそれに対応するホモログである。いくつかの実施形態では、少なくとも１種のｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ａである。いくつかの実施形態では、少なくとも１種のｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｄまたはそれに対応するホモログである。
【００２１】
いくつかの実施形態では、サンプル中の表２に示す少なくとも１種のｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログのレベル（または対応するｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子の状態）を判定するシステム（マイクロアレイなど）であって、システムは複数のプローブを含み、各プローブはサンプル中の異なるｍｉＲＮＡ（または対応するｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子の状態）を検出することができ、かつプローブの少なくとも約１５％（たとえば、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％のいずれかなど）は表２に示すｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログ（または対応するｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子の状態）を検出することができる、システムを提供する。いくつかの実施形態では、食道癌患者を分類するシステム（マイクロアレイなど）であって、システムは複数のプローブを含み、各プローブはサンプル中の異なるｍｉＲＮＡ（または対応するｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子の状態）を検出することができ、かつプローブの少なくとも約１５％（たとえば、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％のいずれかなど）は、表２に示すｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログ（または対応するｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子の状態）を検出することができる、システムを提供する。
【００２２】
いくつかの実施形態では、食道癌の個体を分類するシステムの使用であって、システムは１つまたは複数のプローブを含み、かつ各プローブは表２に示すｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログのレベル（または対応するｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子の状態）を判定することができる、システムの使用を提供する。いくつかの実施形態では、食道癌の個体を分類するシステムの使用であって、システムは１つまたは複数のプローブを含み、各プローブはサンプル中の異なるｍｉＲＮＡを検出することができ、かつ少なくともプローブの約５０％は、表２に示すｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログを検出することができる、システムの使用を提供する。
【００２３】
いくつかの実施形態では、食道癌の個体を分類するシステムを製造するための、１つまたは複数のプローブの使用であって、各プローブは表２に示すｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログのレベル（または対応するｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子の状態）を判定することができる、プローブの使用を提供する。いくつかの実施形態では、食道癌の個体を分類するシステム（マイクロアレイなど）を製造するためのプローブの使用であって、各プローブはサンプル中の異なるｍｉＲＮＡ（または対応するｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子の状態）を検出することができ、かつプローブの少なくとも約１５％（たとえば、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％のいずれかなど）は表２に示すｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログ（または対応するｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子の状態）を検出することができる、プローブの使用を提供する。
【００２４】
いくつかの実施形態では、このシステムは、食道癌の個体における食道癌の分化度の判定に有用である。いくつかの実施形態では、このシステムは、食道扁平上皮癌の個体の病理学的分類に有用である。いくつかの実施形態では、このシステムは、食道癌の個体の腫瘍病期の判定に有用である。
【００２５】
別の態様では、本発明は、たとえば、食道癌の個体の生存の予後を判定する方法など、食道癌患者の予後を診断する方法を提供する。いくつかの実施形態では、食道癌の個体の生存の予後を判定する方法であって、（ａ）個体由来の食道癌組織サンプル中の少なくとも１種のｍｉＲＮＡのレベルを判定すること、および（ｂ）該サンプル中のｍｉＲＮＡのレベルを閾値レベルと比較することを含み、閾値レベルと比較してｍｉＲＮＡのレベルが個体の生存と相関または逆相関する、方法を提供する。いくつかの実施形態では、食道癌の個体の生存の予後を判定する方法であって、少なくとも１個のｍｉＲＮＡ遺伝子（ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７およびｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂのいずれかに対応するｍｉＲＮＡ遺伝子など）の遺伝子の状態を解析することを含み、対照サンプルの変化と比較した遺伝子の状態の変化から個体の生存率（ｓｕｒｖｉｖａｌ）の高低が示唆される、方法を提供する。
【００２６】
いくつかの実施形態では、少なくとも１種のｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７もしくはｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂまたはそれに対応するホモログである。いくつかの実施形態では、少なくとも１種のｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３である。いくつかの実施形態では、少なくとも１種のｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７である。いくつかの実施形態では、少なくとも１種のｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂである。いくつかの実施形態では、生存は全生存である。いくつかの実施形態では、生存は無病生存である。いくつかの実施形態では、個体は、初期の食道癌である。いくつかの実施形態では、本方法は、個体に対して適切な処置期間を判定することをさらに含む。
【００２７】
また、本明細書は、ｍｉＲＮＡのレベル（または対応するｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子の状態）を検出することができるプローブまたは生存の予後を判定する１つまたは複数のプローブを含むシステムの使用も提供する。たとえば、いくつかの実施形態では、食道癌の個体の生存の予後を判定する１つまたは複数のプローブ（または１つまたは複数のプローブを含むシステム）の使用であって、プローブはサンプル中のｍｉＲＮＡを検出することができ、かつ閾値レベルと比較してｍｉＲＮＡのレベルは該個体の生存と相関または逆相関する、プローブの使用を提供する。いくつかの実施形態では、食道癌の個体の生存の予後を判定する１つまたは複数のプローブの使用であって、閾値レベルと比較してｍｉＲＮＡのレベルは該個体の生存と逆相関し、かつ少なくとも１種のｍｉＲＮＡはｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７もしくはｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂまたはそれに対応するホモログである、プローブの使用を提供する。
【００２８】
いくつかの実施形態では、食道癌の個体の生存の予後を判定する薬（またはシステム）を製造するための、１つまたは複数のプローブの使用であって、プローブはサンプル中のｍｉＲＮＡを検出することができ、かつ閾値レベルと比較してｍｉＲＮＡのレベルは該個体の生存と相関または逆相関する、プローブの使用を提供する。いくつかの実施形態では、食道癌の個体の生存の予後を判定する薬（またはシステム）を製造するための、１つまたは複数のプローブの使用であって、閾値レベルと比較してｍｉＲＮＡのレベルは該個体の生存と逆相関し、かつ少なくとも１種のｍｉＲＮＡはｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７もしくはｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂまたはそれに対応するホモログである、プローブの使用を提供する。いくつかの実施形態では、少なくとも１種のｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７またはｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂである。
【００２９】
また、本明細書は、食道癌の個体の生存を改善する方法も提供する。いくつかの実施形態では、食道癌の個体の生存を改善する方法であって、ｍｉＲＮＡのレベルを低下させる薬を有効量で個体に投与することを含み、閾値レベルと比較してｍｉＲＮＡのレベルは該個体の生存と逆相関する、方法を提供する。いくつかの実施形態では、食道癌の個体の生存を改善する薬物を製造するための、ｍｉＲＮＡのレベルを低下させる薬の使用であって、閾値レベルと比較してｍｉＲＮＡのレベルは該個体の生存と逆相関する、薬の使用を提供する。
【００３０】
いくつかの実施形態では、食道癌の個体の生存を改善する方法であって、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂおよびこれらに対応するホモログからなる群から選択されるｍｉＲＮＡのレベルを低下させる薬を有効量で個体に投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、食道癌の個体の生存を改善する薬物を製造するための薬の使用であって、薬はｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂおよびこれらに対応するホモログからなる群から選択されるｍｉＲＮＡのレベルを低下させる、薬の使用を提供する。いくつかの実施形態では、薬（単数または複数）は、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７およびｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂからなる群から選択される少なくとも２種のｍｉＲＮＡのレベルを低下させる。いくつかの実施形態では、薬（単数または複数）は、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７およびｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂのレベルを低下させる。
【００３１】
いくつかの実施形態では、少なくとも１種のｍｉＲＮＡのレベルを低下させる薬および薬学的に許容されるキャリアを含む医薬組成物であって、少なくとも１種のｍｉＲＮＡはｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７もしくはｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂまたはそれに対応するホモログである、医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、少なくとも１種のｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３である。いくつかの実施形態では、少なくとも１種のｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７である。いくつかの実施形態では、少なくとも１種のｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂである。いくつかの実施形態では、薬は、二本鎖ＲＮＡ（低分子または小分子干渉ＲＮＡ、すなわち「ｓｉＲＮＡ」など）、アンチセンス（ａｎｔｉｓｅｎｓｅｓ）核酸またはリボザイムなどの酵素ＲＮＡ分子である。
【００３２】
さらに、本発明は、本明細書に記載の方法のためのキットも提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１−１】食道癌患者においてレベルが変化したｍｉＲＮＡを示す。
【図１−２】食道癌患者においてレベルが変化したｍｉＲＮＡを示す。
【図２ａ】分化度が異なる食道癌患者においてレベルが変化したｍｉＲＮＡを示す。
【図２ｂ−１】キノコ状の食道扁平上皮癌と髄様型の食道扁平上皮癌でレベルが変化したｍｉＲＮＡを示す。
【図２ｂ−２】キノコ状の食道扁平上皮癌と髄様型の食道扁平上皮癌でレベルが変化したｍｉＲＮＡを示す。
【図２ｃ】腫瘍病期が異なる食道癌（Ｎ０／Ｎ１）においてレベルが変化したｍｉＲＮＡを示す。
【図３】そのレベルが食道癌の生存率と相関するｍｉＲＮＡを示す。
【図４】マイクロアレイの有意性解析（ＳＡＭ）で選択されたｍｉＲＮＡ発現の階層的クラスタリングを示す。凍結食道癌組織とパラ癌食道組織で発現が異なるｍｉＲＮＡは４０あり、食道組織由来の３１対のサンプルの４０のｍｉＲＮＡプロファイルをクラスタリングした。サンプルは列方向、ｍｉＲＮＡは行方向である。＃を付けたサンプルは、「誤って分類された」ものである。
【図５】新鮮な組織と凍結組織のｍｉＲＮＡ発現プロファイルの比較を示す。新鮮な組織の５対のテストサンプルでｍｉＲＮＡプロファイルを確認した。ＳＶＭ法を用いて１０個のテストサンプルを確認したところ、その１０個が正確に分類された。＃を付けたトレーニングサンプルは、「誤って分類された」ものである。
【図６】食道癌患者のカプランマイヤー生存曲線を示す。図５Ａはｈｓａ−ｍｉＲ−１０３の低発現（ｎ＝１５）が食道癌患者の高い全生存率と相関し、かつｈｓａ−ｍｉＲ−１０３の高発現（ｎ＝１６）が食道癌患者の低い全生存率と相関することを示す。図５Ｂはｈｓａ−ｍｉＲ−１０７の低発現（ｎ＝１４）が食道癌患者の高い全生存率と相関し、かつｈｓａ−ｍｉＲ−１０７の高発現（ｎ＝１７）が食道癌患者の低い全生存率と相関することを示す。図Ｃはｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂの低発現（ｎ＝１７）が食道癌患者の高い全生存率と相関し、かつｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂの高発現（ｎ＝１４）が食道癌患者の低い全生存率と相関することを示す。図Ｄはｈｓａ−ｍｉＲ−１０３の低発現（ｎ＝１５）が食道癌患者の高い無病生存率と相関し、かつｈｓａ−ｍｉＲ−１０３の高発現（ｎ＝１６）が食道癌患者の低い無病生存率と相関することを示す。図Ｅはｈｓａ−ｍｉＲ−１０７の低発現（ｎ＝１４）が食道癌患者の高い無病生存率と相関し、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７の高発現（ｎ＝１７）が食道癌患者の低い無病生存率と相関することを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明の一部は、３１対の凍結保存された正常または癌食道組織サンプルのセットを用いたゲノムワイドなｍｉＲＮＡ発現プロファイリングに関する我々の研究に基づく。具体的には、ＤＮＡオリゴヌクレオチドマイクロアレイを用いて、癌サンプルのｍｉＲＮＡの発現を対応する非癌サンプルと比較した。癌サンプルでは、対応する非癌サンプルと比較して４０のｍｉＲＮＡが過剰発現あるいは過小発現することが確認された。また、ある種のｍｉＲＮＡのレベルは病状によって異なることも確認された。さらに、３種のｍｉＲＮＡのレベルが食道癌患者の全生存率および無病生存率と相関することも見出された。
【００３５】
これを踏まえて、本発明は、ｍｉＲＮＡのレベルまたは対応するｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子の状態に基づく疾患の診断および予後（癌の診断および予後、特に癌の診断および予後など）のための方法および組成物を提供する。
【００３６】
一態様では、ある種のｍｉＲＮＡのレベルに基づき疾患（たとえば、食道癌のような癌など）を診断する方法および組成物を提供する。
【００３７】
別の態様では、ある種のｍｉＲＮＡのレベルに基づく病理学的形態、分化度および腫瘍病期から癌患者、特に食道癌患者を分類する方法および組成物を提供する。
【００３８】
別の態様では、ｍｉＲＮＡのレベルに基づき癌、特に食道癌の個体の生存の予後を判定する方法および組成物を提供する。また、食道癌患者の生存を改善する方法およびそうした方法のための医薬組成物も提供する。
【００３９】
一態様では、疾患の診断を目的としてＲＴ−ＰＣＲ法によりｍｉＲＮＡのレベルを判定する方法を提供する。
【００４０】
さらに、本発明は、本明細書に記載の方法に有用なシステムおよびキットも提供する。
【００４１】
本明細書で使用する場合、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、他に記載がない限り単数を意味しても複数を意味してもよい（すなわち、１つを意味しても２つ以上を意味してもよい）。
【００４２】
本明細書で使用する場合、「個体」とは、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、一層好ましくはヒトをいう。哺乳動物として、家畜、競技用動物、ペット、霊長類、マウスおよびラットが挙げられるが、これに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、個体はヒトである。いくつかの実施形態では、個体は、食道癌の研究に用いる動物モデルである。個体がヒトではない場合、ｍｉＲＮＡは、本明細書に示すヒトｍｉＲＮＡに対応するホモログまたはオルソログを指すことが理解されよう。
【００４３】
いくつかの実施形態では、個体は雄である。いくつかの実施形態では、個体は雌である。いくつかの実施形態では、個体は、食道癌の病理学的表現型をまったく示さない。いくつかの実施形態では、個体には食道癌の家族歴がある。
【００４４】
本明細書に記載の「食道組織サンプル」は、食道由来の組織サンプルをいう。いくつかの実施形態では、組織サンプルは新鮮なサンプルである。いくつかの実施形態では、組織サンプルは凍結サンプルである。いくつかの実施形態では、組織サンプルは保存されている。いくつかの実施形態では、組織サンプルはホルマリン保存されている。いくつかの実施形態では、組織サンプルはパラフィン包埋されている。下記のように、特定の方法に合わせて組織を全部使用してもよいし、当該技術分野において公知の様々な方法に従いサンプルを小片、細胞凝集体または個々の細胞に切り離してもよい。
【００４５】
食道癌には、食道扁平上皮癌または食道腺癌があるが、これに限定されるものではない。
【００４６】
癌、特に食道癌を診断するための方法および組成物
一態様では、本発明は、個体の疾患（癌など）を診断する方法であって、ａ）個体のサンプル中の少なくとも１種のｍｉＲＮＡのレベルを判定すること、およびｂ）ｍｉＲＮＡのレベルを参照レベルと比較することを含み、ｍｉＲＮＡのレベルの特徴的な変化から疾患（癌など）が示唆される、方法を提供する。
【００４７】
本発明で診断できる好適な疾患には、癌（たとえば、肺癌、乳房癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、結腸直腸癌、膵臓癌、白血病、リンパ腫、腎臓癌、膀胱癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、精巣癌など）。循環器疾患（たとえば、冠動脈心疾患、高血圧、アテローム性動脈硬化症）。加齢に伴う疾患（たとえば、パーキンソン病、アルツハイマー病、糖尿病）があるが、これに限定されるものではない。
【００４８】
一態様では、本発明は、個体の食道癌を診断する方法であって、ａ）個体の癌の疑いがある食道組織サンプル中の少なくとも１種のｍｉＲＮＡ（図１に示す少なくとも１種のｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログなど）のレベルを判定すること、およびｂ）ｍｉＲＮＡのレベルを参照レベルと比較することを含み、ｍｉＲＮＡのレベルの特徴的な変化から食道癌が示唆される、方法を提供する。
【００４９】
いくつかの実施形態では、個体の食道癌を診断する方法であって、ａ）個体由来の癌の疑いがある食道組織サンプル中の少なくとも１種のｍｉＲＮＡのレベル（図１に示す少なくとも１種のｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログなど）を参照レベルと比較すること、およびｂ）少なくとも１種のｍｉＲＮＡのレベルの特徴的な変化に基づき個体が食道癌であるかどうかを判定することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、個体から食道組織サンプルを得るステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、この方法は、組織サンプルからｍｉＲＮＡを単離することをさらに含む。
【００５０】
いくつかの実施形態では、個体の食道癌を診断するための情報を提供する方法であって、ａ）個体の癌の疑いがある食道組織サンプル中の図１に示す少なくとも１つのｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログレベルを判定すること、およびｂ）食道癌の診断のためｍｉＲＮＡのレベルに関する情報を提供することを含み、ｍｉＲＮＡのレベルを食道癌を診断する根拠として用い、かつ少なくとも１種のｍｉＲＮＡのレベルの特徴的な変化から食道癌が示唆される、方法を提供する。
【００５１】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−２９ｂ、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２＊、ｍｉＲ−１８２ａ＊、ｍｉＲ−１８３およびｍｉＲ−１２９−１ではない。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１５およびｍｉＲ−１６ではない。
【００５２】
いくつかの実施形態では、配列番号１〜１４のｍｉＲＮＡの少なくとも１つ（少なくとも２、５、１０、１４のいずれかなど）のレベルを判定し、測定したｍｉＲＮＡの少なくとも１つのレベルの実質的な上昇から食道癌が示唆される。いくつかの実施形態では、配列番号１５〜３８のｍｉＲＮＡの少なくとも１つ（少なくとも２、５、１０、１５、２０、２４のいずれかなど）のレベルを判定し、測定したｍｉＲＮＡの少なくとも１つのレベルの実質的な低下から食道癌が示唆される。いくつかの実施形態では、配列番号１〜１４のｍｉＲＮＡの少なくとも１つ（少なくとも２、５、１０、１４のいずれかなど）のレベルおよび配列番号１５〜３８のｍｉＲＮＡの少なくとも１つ（少なくとも２、５、１０、１５、２０、２４のいずれかなど）のレベルを判定し、図１の番号１〜１４のｍｉＲＮＡの少なくとも１つのレベルの実質的な上昇および番号１５〜３８のｍｉＲＮＡの少なくとも１つのレベルの実質的な低下から食道癌が示唆される。
【００５３】
いくつかの実施形態では、図１に示すすべてのｍｉＲＮＡのレベルを判定し、配列番号１〜１４のｍｉＲＮＡの少なくとも１つのレベルの実質的な上昇および配列番号１５〜３８のｍｉＲＮＡの少なくとも１つのレベルの実質的な低下から食道癌が示唆される。いくつかの実施形態では、配列番号１〜１４のｍｉＲＮＡの少なくとも２つのレベルの実質的な上昇および配列番号１５〜３８のｍｉＲＮＡの少なくとも２つのレベルの実質的な低下から食道癌が示唆される。いくつかの実施形態では、配列番号１〜１４のｍｉＲＮＡのレベルの実質的な上昇および配列番号１５〜３８のｍｉＲＮＡのレベルの実質的な低下から食道癌が示唆される。
【００５４】
また、組織サンプル中のｍｉＲＮＡのレベルには、ｍｉＲＮＡの遺伝子の状態の変化を反映させもよい。たとえば、ｍｉＲＮＡ遺伝子の欠失もしくは増幅またはｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子コピー数の変化による遺伝子の状態を反映させても構わない。
【００５５】
そこで、いくつかの実施形態では、個体の食道癌を診断する方法であって、個体の癌の疑いがある食道組織サンプル中の少なくとも１個のｍｉＲＮＡ遺伝子（図１に示すｍｉＲＮＡに対応する少なくとも１個のｍｉＲＮＡ遺伝子など）の遺伝子の状態を解析することを含み、対照サンプル中の対応するｍｉＲＮＡ遺伝子と比較した遺伝子の状態の特徴的な変化から食道癌が示唆される、方法を提供する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ遺伝子の欠失または増幅に基づき遺伝子の状態の変化を判定する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子コピー数の変化に基づき遺伝子の状態の変化を判定する。
【００５６】
いくつかの実施形態では、個体の食道癌を診断する方法であって、欠失または増幅について個体由来の癌の疑いがある食道組織サンプル中の図１に示す少なくとも１種のｍｉＲＮＡに対応する少なくとも１個のｍｉＲＮＡ遺伝子を解析することを含み、そのｍｉＲＮＡ遺伝子に、対照サンプル中の対応するｍｉＲＮＡ遺伝子と比較して欠失または増幅があることから食道癌が示唆される、方法を提供する。たとえば、いくつかの実施形態では、この方法は、増幅について配列番号１〜１４の少なくとも１種のｍｉＲＮＡに対応する少なくとも１個のｍｉＲＮＡ遺伝子を解析することを含み、そのｍｉＲＮＡ遺伝子に、対照サンプル中の対応するｍｉＲＮＡ遺伝子と比較して増幅があることから食道癌が示唆される。いくつかの実施形態では、この方法は、欠失について配列番号１５〜３８の少なくとも１種のｍｉＲＮＡに対応する少なくとも１個のｍｉＲＮＡ遺伝子を解析することを含み、そのｍｉＲＮＡ遺伝子に、対照サンプル中の対応するｍｉＲＮＡ遺伝子と比較して欠失があるから食道癌が示唆される。いくつかの実施形態では、この方法は、個体から癌の疑いがある食道組織サンプルを得るステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、この方法は、食道組織サンプルからＤＮＡを単離するステップをさらに含む。
【００５７】
いくつかの実施形態では、個体の食道癌を診断する方法であって、個体由来の癌の疑いがある食道組織サンプル中の図１に示すｍｉＲＮＡの少なくとも１つに対応する少なくとも１個のｍｉＲＮＡ遺伝子またはそれに対応するホモログの遺伝子コピー数を判定することを含み、体細胞染色体または雌の性染色体上にあるｍｉＲＮＡ遺伝子の２以外および雄の性染色体上にあるｍｉＲＮＡ遺伝子の１以外のコピー数から食道癌が示唆される、方法を提供する。たとえば、いくつかの実施形態では、この方法は、個体由来のサンプル中の配列番号１〜１４のｍｉＲＮＡの少なくとも１つに対応する少なくとも１個のｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子コピー数を判定することを含み、体細胞染色体または雌の性染色体上にあるｍｉＲＮＡ遺伝子の３以上、あるいは雄の性染色体上にあるｍｉＲＮＡ遺伝子の２以上のコピー数から食道癌が示唆される。いくつかの実施形態では、この方法は、個体由来のサンプル中の配列番号１５〜３８のｍｉＲＮＡの少なくとも１つに対応する少なくとも１個のｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子コピー数を判定することを含み、体細胞染色体または雌の性染色体上にあるｍｉＲＮＡ遺伝子の２未満または雄の性染色体上にあるｍｉＲＮＡ遺伝子の１未満のコピー数から食道癌が示唆される。いくつかの実施形態では、この方法は、個体から癌の疑いがある食道組織サンプルを得るステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、この方法は、食道組織サンプルからＤＮＡを単離するステップをさらに含む。
【００５８】
また、本明細書に記載のｍｉＲＮＡは、食道組織サンプル中の少なくとも１種または複数種のｍｉＲＮＡのレベルまたは個体の食道組織サンプル中の少なくとも１種または複数種のｍｉＲＮＡの遺伝子の状態に基づく食道癌患者の分類、食道癌の発症リスクの予測、食道癌患者の腫瘍進行のモニタリングおよび食道癌患者の処置のモニタリングの１つまたは複数に有用である。
【００５９】
また、本明細書は、図１に示すｍｉＲＮＡを検出できるプローブ（オリゴヌクレオチドなど）を含むシステム（マイクロアレイなど）および図１に示すマイクロＲＮＡに対応するｍｉＲＮＡ遺伝子またはそれに対応するホモログの遺伝子の状態を判定できるプローブを含むシステム（マイクロアレイなど）も提供する。こうしたシステムは、図１に示すｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログのレベルの判定および食道癌の診断に有用である。以下の考察の一部はｍｉＲＮＡを検出するシステムに着目しているが、その説明がｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子の状態を対象としたシステムにも同様に当てはまることを当業者であれば容易に理解できる。
【００６０】
したがって、いくつかの実施形態では、サンプル中の図１に示す少なくとも１つのｍｉＲＮＡレベル（または対応するｍｉＲＮＡの遺伝子の状態）を判定するシステム（マイクロアレイなど）であって、システムは複数のプローブを含み、各プローブは食道組織サンプル中の異なるｍｉＲＮＡ（または対応するｍｉＲＮＡの遺伝子の状態）を検出することができ、かつプローブの少なくとも約１５％（たとえば、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％のいずれかなど）は図１に示すｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログ（または対応するｍｉＲＮＡの遺伝子の状態）を検出することができる、システムを提供する。いくつかの実施形態では、食道癌を診断するシステム（マイクロアレイなど）であって、システムは複数のプローブを含み、各プローブはサンプル中の異なるｍｉＲＮＡ（または対応するｍｉＲＮＡの遺伝子の状態）を検出することができ、かつプローブの少なくとも約１５％（たとえば、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％のいずれかなど）は、図１に示すｍｉＲＮＡ（または対応するｍｉＲＮＡの遺伝子の状態）を検出することができる、システムを提供する。いくつかの実施形態では、食道癌を診断するシステム（マイクロアレイなど）であって、少なくとも１種（たとえば、少なくとも２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５および４０のいずれかなど）のプローブを含み（たとえば、本質的にそれからなり）、各プローブは図１に示す異なるｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログのレベル（または対応するｍｉＲＮＡの遺伝子の状態）を検出する、システムを提供する。本明細書に提供するシステム（マイクロアレイなど）について以下にさらに詳細に説明する。
【００６１】
また、本明細書に記載の食道癌を診断するシステムの使用も提供する。たとえば、いくつかの実施形態では、癌を診断するシステムの使用であって、システムは少なくとも１種（たとえば、少なくとも２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５および４０のいずれかなど）のプローブ（オリゴヌクレオチドなど）を含み、各プローブは図１に示す異なるｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログのレベル（または対応するｍｉＲＮＡの遺伝子の状態）を検出し、かつ図１に示すｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログの少なくとも１つのレベル（または対応するｍｉＲＮＡの遺伝子の状態）の特徴的な変化から食道癌が示唆される、システムの使用を提供する。いくつかの実施形態では、食道癌を診断するシステム（マイクロアレイなど）の使用であって、システムは複数のプローブを含み、各プローブはサンプル中の異なるｍｉＲＮＡ（または対応するｍｉＲＮＡの遺伝子の状態）を検出することができ、プローブの少なくとも約１５％（たとえば、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％のいずれかなど）は図１に示すｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログ（または対応するｍｉＲＮＡの遺伝子の状態）を検出することができ、かつ図１に示すｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログの少なくとも１つのレベル（または対応するｍｉＲＮＡの遺伝子の状態）の特徴的な変化から食道（ｅｓｏｐｈａｇｒｅａｌ）癌が示唆される、システムの使用を提供する。
【００６２】
また、本明細書に記載のシステムを製造するための、ｍｉＲＮＡを検出するプローブの使用も提供する。いくつかの実施形態では、個体の食道癌を診断するシステムを製造するための、１つまたは複数のプローブ（オリゴヌクレオチドなど）の使用であって、各プローブは図１に示すｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログのレベル（または対応するｍｉＲＮＡの遺伝子の状態）を判定することができる、プローブの使用を提供する。いくつかの実施形態では、食道癌を診断するシステム（マイクロアレイなど）を製造するためのプローブ（オリゴヌクレオチドなど）の使用であって、各プローブはサンプル中の異なるｍｉＲＮＡ（または対応するｍｉＲＮＡの遺伝子の状態）を検出することができ、かつプローブの少なくとも約１５％（たとえば、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％のいずれかなど）は図１に示すｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログ（または対応するｍｉＲＮＡの遺伝子の状態）を検出することができる、プローブの使用を提供する。
【００６３】
食道癌を診断するためのｍｉＲＮＡ
本発明は、そのレベルが食道癌と相関する４０のｍｉＲＮＡを同定する。これらのｍｉＲＮＡを表２および図１に示す。また、図１は、ｍｉＲＮＡの名称、配列および染色体上の位置も示す。ｍｉＲＮＡに関する情報は通常、ｈｔｔｐ：／／ｍｉＲＮＡ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／で確認できる。Ｇｒｉｆｆｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００６，Ｖｏｌ．３４，Ｄｅｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅを参照されたい。食道癌の診断方法は、図１に示すｍｉＲＮＡのいずれかのレベルに基づいても、遺伝子の状態に基づいてもよい。本明細書に記載のシステムを用いて、図１に示すｍｉＲＮＡの１つまたは複数のレベルを判定し、図１に示すｍｉＲＮＡの１つまたは複数のレベルに基づき食道癌を診断してもよい。
【００６４】
本明細書に記載の方法の実施に許容できる感度および特異性のレベルを単一のｍｉＲＮＡで達成することもできるが、本明細書に記載の方法の有効性（感度および／または特異性など）は、少なくとも２種のｍｉＲＮＡを用いる場合に向上するのが一般的である。たとえば、いくつかの実施形態では、図１に示す少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５または３８種のｍｉＲＮＡを用いる。
【００６５】
いくつかの実施形態では、配列番号１〜１４のｍｉＲＮＡの少なくとも２つ（少なくとも３、５、１０またはそれ以上のいずれかなど）のレベルまたは遺伝子の状態を判定する。いくつかの実施形態では、配列番号１５〜３８のｍｉＲＮＡの少なくとも２つ（少なくとも３、５、１０、１５、２０またはそれ以上のいずれかなど）のレベルまたは遺伝子の状態を判定する。いくつかの実施形態では、配列番号１〜１４のｍｉＲＮＡから選択されるｍｉＲＮＡの少なくとも１つおよび配列番号１５〜３８のｍｉＲＮＡから選択されるｍｉＲＮＡの少なくとも１つのレベルまたは遺伝子の状態を判定する。いくつかの実施形態では、配列番号１〜１４のｍｉＲＮＡから選択されるｍｉＲＮＡの少なくとも２つ（少なくとも３、５、１０またはそれ以上のいずれかなど）のレベルまたは遺伝子の状態および配列番号１５〜３８のｍｉＲＮＡの少なくとも２つ（少なくとも３、５、１０、１５、２０またはそれ以上のいずれかなど）のレベルを判定する。いくつかの実施形態では、図１に示すすべてのｍｉＲＮＡのレベルまたは遺伝子の状態を判定する。
【００６６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍｉＲＮＡに対応するホモログのレベルを判定する。本明細書に記載のｍｉＲＮＡに「対応するホモログ」とは、対応する本明細書に記載のｍｉＲＮＡに対する配列同一性が少なくとも約５０％（たとえば、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％のいずれかなど）配列同一性であるｍｉＲＮＡをいう。たとえば、配列番号１のｍｉＲＮＡに対応するホモログは、配列番号１に対する配列同一性が少なくとも約５０％（たとえば、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％のいずれかなど）配列同一性である。
【００６７】
たとえば、参照配列（配列番号１など）と少なくとも約９５％同一であるｍｉＲＮＡ配列は、参照配列の各１００ヌクレオチドにつきｍｉＲＮＡ配列が最大５つの点変異を含む場合を除いてｍｉＲＮＡ配列が参照配列と同一であることを意図する。こうした最大５つの変異は、参照配列のヌクレオチドの中で個々に散在するか、あるいは参照配列内に１つまたは複数の群として散在した欠失、置換、付加でもよく、配列のどこにあってもよい。
【００６８】
ｍｉＲＮＡのレベルに基づく食道癌の診断方法
いくつかの実施形態では、食道癌の診断方法は、ｍｉＲＮＡのレベルに基づく。
【００６９】
本明細書で使用する場合、「レベル」という語は、ｍｉＲＮＡ分子またはその前駆体の蓄積の量または比をいう。この語を用いて、サンプル中のｍｉＲＮＡの絶対量（たとえば、ハイブリダイゼーションシグナルの強度によって表される）またはｍｉＲＮＡの量と対照の量の比（たとえば、サンプルのハイブリダイゼーションシグナルと対照のそれの比によって表される）を指してもよい。対照は、食道癌組織サンプル中でレベルが変化しない同じサンプル由来の別のｍｉＲＮＡでもよいし、別のサンプル（同じ個体由来の非癌性組織サンプルまたは食道癌でない別の個体由来の組織サンプルなど）由来の同じｍｉＲＮＡでもよい。
【００７０】
ｍｉＲＮＡ分子の「前駆体」または「ｍｉＲＮＡ前駆体」とは、プロセシングを受けていないｍｉＲＮＡ遺伝子転写物をいい、一般に約７０ヌクレオチド長のＲＮＡ転写物を含む。ｍｉＲＮＡ前駆体は、ＲＮアーゼ（ダイサー、アルゴノート（Ａｒｇｏｎａｕｔ）またはＲＮアーゼＩＩＩなど）により消化処理されて通常１９〜２５ヌクレオチド長の活性ｍｉＲＮＡ分子になるのが一般的である。
【００７１】
「食道組織サンプル中のｍｉＲＮＡのレベル」とは、組織サンプル中のｍｉＲＮＡのレベルをいう。食道組織サンプル中のｍｉＲＮＡのレベルについては、ほとんどの場合、食道組織サンプル中のｍｉＲＮＡのレベルの測定に直接基づき判定するが、リンパ節サンプル（近位リンパ節またはリンパ液など）、血清、血液または痰など他の近位の生物学的液体材料中のｍｉＲＮＡのレベルで表す（したがって、それに基づく）場合があることも考えられる。いくつかの実施形態では、リンパ節サンプル（リンパ節切片または穿刺吸引液など）中のｍｉＲＮＡのレベルに基づきｍｉＲＮＡのレベルを判定する。いくつかの実施形態では、血液または血清中のｍｉＲＮＡのレベルに基づきｍｉＲＮＡのレベルを判定する。いくつかの実施形態では、食道組織スワブ中のｍｉＲＮＡのレベルに基づきｍｉＲＮＡのレベルを判定する。いくつかの実施形態では、超音波内視鏡下でのサンプリング手順で採取したサンプルのｍｉＲＮＡのレベルに基づきｍｉＲＮＡのレベルを判定する（たとえば、ＲＴ−ＰＣＲ解析による）。超音波内視鏡下穿刺吸引法（ＦＮＡ：ｆｉｎｅ−ｎｅｅｄｌｅ  ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ）は、手術をせずに縦隔リンパ節をサンプリングするためほとんど侵襲性のない手法であり、より詳細な分子マーカー解析が可能になる。食道癌組織以外のサンプル中のｍｉＲＮＡのレベルの判定結果を互いに一緒にあるいは相互の関連で用いてもよい。たとえば、まず血清からｍｉＲＮＡのレベルを判定し、次に所属リンパ節のｍｉＲＮＡのフォローアップ解析を行ってもよい。こうした多段階解析により追加情報が得られ、診断の機密性が高まる場合がある。
【００７２】
ｍｉＲＮＡのレベルを様々な段階で判定することができる。たとえば、ｍｉＲＮＡのレベルを、手術の直前、手術中、手術後、腫瘍処置の前、腫瘍処置の最中または腫瘍処置の後に判定してもよい。いくつかの実施形態では、綿棒で採取した組織サンプル（特に食道組織サンプル）中のｍｉＲＮＡのレベルに基づきｍｉＲＮＡのレベルを判定する。
【００７３】
ｍｉＲＮＡのレベルの判定方法は、当該技術分野において公知である。たとえば、ｍｉＲＮＡのレベルを、ノーザンブロット、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ＲＴ−ＰＣＲおよびマイクロアレイで判定することができる。こうした方法は、当該技術分野において公知である。たとえば、Ｅｉｎａｔ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００６，３４２：１３９−１５７；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．２００６，２０：２２０２−２２０７を参照されたい。
【００７４】
例示的な一方法によれば、全細胞ＲＮＡについては、核酸抽出緩衝液の存在下で均質化し、続いて遠心分離により細胞から精製してもよい。核酸を沈殿させ、ＤＮＡをＤｎアーゼで処理し沈殿させて除去する。次にＲＮＡ分子を標準的な技法に従いアグロースゲル上で電気泳動を行い分離し、たとえば、いわゆる「ノーザン」ブロッティング技法でニトロセルロースフィルターにトランスファーする。次にＲＮＡを加熱してフィルターに固定化する。特定のＲＮＡの検出および定量については、対象のＲＮＡと相補的で適切に標識されたＤＮＡまたはＲＮＡプローブを用いて行う。ｍｉＲＮＡとのプローブハイブリダイゼーションをオートラジオグラフィーにより検出するには、ハイブリダイズしたフィルターを写真フィルムに密着させて行えばよい。ハイブリダイズしたフィルターを密着させた写真フィルムを濃度スキャニングすると、ＲＮＡ転写物のレベルを正確に測定できる。あるいは、たとえば、ホスホイメージャーを用いてハイブリダイゼーションブロットのコンピューター画像によりＲＮＡ転写物のレベルを定量してもよい。
【００７５】
ＲＮＡ転写物のレベルについては、ノーザンおよび他のＲＮＡブロッティングハイブリダイゼーション技法だけでなく、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション手法に従っても行うことができる。この手法では、細胞または組織全体を顕微鏡カバースリップ上に塗布し、細胞または組織の核酸量を放射性標識または別の方法で標識したプローブ（ｃＲＮＡプローブなど）を含む溶液でブローブする。
【００７６】
さらに、ｍｉＲＮＡ転写物を逆転写してからポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）で増幅させてｍｉＲＮＡのレベルを判定してもよい。たとえば、同じサンプル中に存在する「ハウスキーピング」遺伝子のｍＲＮＡのレベルのような内部標準と比較してｍｉＲＮＡのレベルを定量することができる。内部標準として用いるのに好適な「ハウスキーピング」遺伝子には、ミオシンまたはグリセルアルデヒデス−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ：ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅｓ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）またはｈｕｍａｎ  Ｕ６がある。定量的ＲＴ−ＰＣＲおよびその変形形態の方法は、当業者によく知られている。ＲＴ−ＰＣＲ実験の例示的プライマーを表１に示す。ある程度初期の癌のｍｉＲＮＡを検出する際は、古典的な組織切片法および染色法よりもｍｉＲＮＡのリアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）解析の方が感度が高い場合もあり得る。本明細書に提供するｍｉＲＮＡのレベル判定のためのｑＲＴ−ＰＣＲは、食道癌の診断、分類および予後に適した高感度かつ特異的なツールであるかもしれない。一態様では、本発明は、ＲＴ−ＰＣＲにより個体（たとえば、癌のような疾患のある個体など）のサンプル中のｍｉＲＮＡのレベルを判定する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ｑＲＴ−ＰＣＲによりｍｉＲＮＡのレベルを判定する。
【００７７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のマイクロアレイなどのマイクロアレイを用いてｍｉＲＮＡのレベルを判定する。
【００７８】
上記の１つまたは複数の方法に適した核酸プローブについては、当該技術分野において周知の方法を用いて遺伝子組換え技術により作製するか、化学的に合成することができる。さらに、ハイブリダイゼーションプローブについては、たとえば、放射性同位元素、蛍光タグ、レポーター酵素、ビオチンおよび他のリガンドなど、検出可能な様々な標識により標識してもよい。こうした検出可能な標識を、たとえば、分光光度検出に適した、熱量測定または光度測定の指示物質とさらに結合してもよい。こうしたプローブの標識方法および検出方法は、当該技術分野において公知である。
【００７９】
サンプル中のｍｉＲＮＡの検出に有用な核酸プローブを、当業者が判定しやすい様々なストリンジェント条件下でハイブリダイズさせてもよい。当業者は、特定のアッセイに合わせてストリンジェント条件を変えて個々のサンプル中の特定のｍｉＲＮＡの検出を容易に最適化することができる。
【００８０】
一般に、ハイブリッドの安定性は、イオン濃度および温度によって決まる。通常、比較的低ストリンジェント条件下でハイブリダイゼーション反応を行い、続いてストリンジェント条件を変えて、より高ストリンジェンシーで洗浄する。中ストリンジェントなハイブリダイゼーションとは、プローブなどの核酸分子が相補的核酸分子に結合できる条件をいう。ハイブリダイズした核酸分子の同一性は通常、たとえば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％同一性のいずれかなど、少なくとも６０％である。中ストリンジェント条件は、５０％ホルムアミド、５×デンハルト（Ｄｅｎｈａｒｔ’ｓ）溶液、５×ＳＳＰＥ（ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ，ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ＥＤＴＡ）、０．２％ＳＤＳ（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）中で４２℃にてハイブリダイズし、続いて０．２×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳで４２℃にて洗浄するのと同等な条件である。高ストリンジェント条件については、たとえば、５０％ホルムアミド、５×デンハルト（Ｄｅｎｈａｒｔ’ｓ）溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中で４２℃にてハイブリダイズし、続いて０．１×ＳＳＰＥおよび０．１％ＳＤＳで６５℃にて洗浄することにより得られる。
【００８１】
低ストリンジェントなハイブリダイゼーションとは、１０％ホルムアミド、５×デンハルト（Ｄｅｎｈａｒｔ’ｓ）溶液、６×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中で２２℃にてハイブリダイズし、続いて１×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳで３７℃にて洗浄するのと同等な条件をいう。デンハルト（Ｄｅｎｈａｒｔ’ｓ）溶液は、１％フィコール、１％ポリビニルピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｏｌｉｄｏｎｅ）および１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ：ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）を含む。２０×ＳＳＰＥ（塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、エチレンジアミド四酢酸（ＥＤＴＡ：ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｄｉａｍｉｄｅ  ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ））は、３Ｍの塩化ナトリウム、０．２Ｍのリン酸ナトリウムおよび０．０２５Ｍ（ＥＤＴＡ）を含む。他の好適な中ストリンジェントおよび高ストリンジェントなハイブリダイゼーション緩衝液および条件は当業者によく知られており、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；ａｎｄ  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ，１９９９）に記載されている。
【００８２】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡのレベルを個体から複数の時点で取得する。こうした「連続」サンプリングは、食道癌の個体における食道癌の進行のモニタリングに関する本発明の態様に適している。年２回、年１回、２年に１回またはより低い頻度など、所望の任意のスケジュールで連続サンプリングを行ってよい。新たなサンプルを測定するたびに測定レベルと参照レベルの比較を行ってもよいし、解析頻度が低い場合、レベルに関する各データを保管しておいてもよい。
【００８３】
本明細書に記載の方法では、参照レベルは通常、個々のｍｉＲＮＡに対して「正常」と思われるレベルである。いくつかの実施形態では、参照レベルは、同じ個体由来の非癌性食道組織中のｍｉＲＮＡのレベルに基づく。いくつかの実施形態では、参照レベルは、食道癌でない個体のレベルに基づく。いくつかの実施形態では、参照レベルは、食道癌でない集団から取得したレベルの平均に基づく。いくつかの実施形態では、参照レベルを、検査対象サンプルを含むサンプルプールから得る。参照レベルについては、事前に設定しておいてもよいし、検査対象サンプルと同時に判定してもよい。
【００８４】
本明細書で使用する場合、「参照」値は、絶対値、相対値、上限または下限のある値、ある範囲の値、平均値、中央値、平均（ｍｅａｎ）値、または特定の対照値もしくはベースライン値と比較した値であってもよい。
【００８５】
参照値との比較については、図１に示す１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５または３８種のｍｉＲＮＡの少なくともいずれかまたはそれに対応するホモログを対象に行ってもよい。ｍｉＲＮＡのレベルと参照レベルの比較プロセスについては、目的のｍｉＲＮＡの測定値のタイプに適した任意の簡便なやり方で行うことができる。たとえば、ｍｉＲＮＡのハイブリダイゼーションシグナルをｍｉＲＮＡのレベルの指標として用いる場合、ハイブリダイゼーションシグナルの強度を目視比較してレベルを定性的に比較してもよい。定量測定の場合、数値データの調査、データの表示内容の調査（たとえば、棒グラフまたは線グラフなどのグラフ表示の調査）して比較を行ってもよい。比較プロセスは、手作業（方法の実行者による目視検査など）でもよいし、自動化されていてもよい。
【００８６】
いくつかの実施形態では、測定レベルと参照レベルの差の大きさ（測定レベルと参照レベルの差が「何倍か」またはその百分率を比較するなど）を判定して比較を行う。本明細書で使用する場合、「差が何倍」という語句は、ｍｉＲＮＡについて測定値と参照値の差の大きさを数値で表す。
【００８７】
ｍｉＲＮＡのレベルの「特徴的な変化」は単に、参照レベルと比較した個体のｍｉＲＮＡレベルの実質的な低下または実質的な上昇であってもよい。本明細書で用いる「実質的な上昇」とは、ｍｉＲＮＡのレベルが、たとえば、少なくとも６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％またはそれ以上のいずれかなど少なくとも約５％上昇することをいう。同様に、本明細書で用いる「実質的な低下」とは、ｍｉＲＮＡのレベルが、たとえば、少なくとも６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％またはそれ以上のいずれかなど少なくとも約５％低下することをいう。
【００８８】
図１は、例示的な一方法における図示したｍｉＲＮＡの変化の概要を示す。ｍｉＲＮＡのレベルの特徴的な変化を食道癌の診断の根拠として用いる。たとえば、いくつかの実施形態では、配列番号１〜１４のｍｉＲＮＡの少なくとも１つのレベルを判定した際、測定したｍｉＲＮＡの少なくとも１つのレベルの実質的な上昇から食道癌が示唆される。いくつかの実施形態では、配列番号１５〜３８のｍｉＲＮＡの少なくとも１つを判定した際、測定したｍｉＲＮＡの少なくとも１つのレベルの実質的な低下から食道癌が示唆される。いくつかの実施形態では、配列番号１〜１４のｍｉＲＮＡの少なくとも１つおよび配列番号１５〜３８のｍｉＲＮＡの少なくとも１つを判定した際、図１の番号１〜１４のｍｉＲＮＡの少なくとも１つのレベルの実質的な上昇および番号１５〜３８のｍｉＲＮＡの少なくとも１つのレベルの実質的な低下から食道癌が示唆される。
【００８９】
いくつかの実施形態では、図１に示すすべてのｍｉＲＮＡのレベルを判定し、配列番号１〜１４のｍｉＲＮＡの少なくとも１つのレベルの実質的な上昇および配列番号１５〜３８のｍｉＲＮＡの少なくとも１つのレベルの実質的な低下から食道癌が示唆される。いくつかの実施形態では、配列番号１〜１４のｍｉＲＮＡの少なくとも２つのレベルの実質的な上昇および配列番号１５〜３８のｍｉＲＮＡの少なくとも２つのレベルの実質的な低下から食道癌が示唆される。
【００９０】
そのような実施形態において、複数のｍｉＲＮＡを用いてもｍｉＲＮＡのレベルが一様に食道癌の診断を暗示または示唆さない場合、「過半数」により暗示または示唆されれば、それをアッセイの結果と考えてもよい。たとえば、この方法では、５種のｍｉＲＮＡを用いて、そのうち３種が食道癌を暗示／示唆する場合、その結果は、個体に対して食道癌の診断を暗示または示唆すると考えてもよい。しかしながら、いくつかの実施形態では、食道癌の診断には、少なくとも１種または複数種の特定のｍｉＲＮＡの特徴的な変化が必要とされる。たとえば、ｍｉＲＮＡの１つがｈｓａ−ｍｉＲ−１６であるとき、いくつかの実施形態では、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６レベルの実質的な上昇が食道癌の診断に必須な場合がある。
【００９１】
ｍｉＲＮＡの遺伝子の状態に基づく診断方法
いくつかの実施形態では、個体のサンプル中の図１に示す少なくとも１つのｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログの遺伝子の状態に基づき食道癌を診断する方法を提供する。
【００９２】
いくつかの実施形態では、欠失または増幅についてサンプル中の少なくとも１個のｍｉＲＮＡ遺伝子を解析して遺伝子の状態を評価し、対照サンプル中のｍｉＲＮＡと比較してｍｉＲＮＡ遺伝子において欠失または増幅が検出されると、個体での食道癌の存在が示唆される。
【００９３】
食道癌の疑いがある個体の食道組織サンプル由来の細胞の遺伝子の構造または配列を判定し、この構造または配列と対照サンプル由来の細胞の遺伝子の構造または配列とを比較してｍｉＲＮＡ遺伝子の欠失または増幅を検出してもよい。本方法の実施に際しては、遺伝子の構造または配列の変化を検出するのに好適であればどのような技法を用いてもよい。たとえば、ｍｉＲＮＡ配列に特異的な核酸プローブを用いて被検体由来のゲノムＤＮＡのサザンブロットハイブリダイゼーションにより、ｍｉＲＮＡ遺伝子における欠失および増幅の存在を検出しても構わない。また、配列解析および一本鎖ＤＮＡ高次構造多型を用いてもよい。
【００９４】
さらに、ｍｉＲＮＡ遺伝子のフラグメントをポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）で増幅させ、増幅させたフラグメントをシーケンシングまたは電気泳動で解析し、個体のＤＮＡサンプル由来の増幅フラグメントの配列または長さが対照ＤＮＡサンプルのそれと異なるかどうか判定して、ｍｉＲＮＡ遺伝子の欠失または増幅を検出してもよい。さらに、ｍｉＲＮＡ遺伝子に密接に連鎖した染色体マーカーの欠失を検出することでｍｉＲＮＡ遺伝子の欠失を同定しても構わない。
【００９５】
また、サンプル中の少なくとも１個のｍｉＲＮＡの遺伝子コピー数を測定することで個体の細胞におけるｍｉＲＮＡ遺伝子の状態を評価してもよく、体細胞染色体および雌の性染色体上のｍｉＲＮＡ遺伝子の２以外または雄の性染色体上のｍｉＲＮＡ遺伝子の１以外の遺伝子コピー数から個体における食道（ｅｓｏｐｈａｇｒｅａｌ）癌の存在が示唆される。
【００９６】
本方法の実施に際しては、サザンブロット法およびＰＣＲ増幅法など、遺伝子コピー数の検出に好適な任意の技法を用いてよい。食道組織サンプル中のｍｉＲＮＡ遺伝子のコピー数を判定する代替方法は、ｍｉＲＮＡまたは遺伝子クラスターの多くが染色体マーカーまたは他の遺伝子に密接に連鎖することに基づく。ｍｉＲＮＡ遺伝子に密接に連鎖したマーカーまたは遺伝子がヘテロ接合である個体でｍｉＲＮＡ遺伝子のコピーが消失していることは、密接に連鎖したマーカーまたは遺伝子のヘテロ接合性の消失から推測することができる。染色体マーカーのヘテロ接合性の消失を判定する方法は、当該技術分野の技術の範囲内にある。
【００９７】
「対照サンプル」は、食道癌でない個体由来の組織サンプルでもよい。あるいは、対照サンプルは、個体の集団由来の組織サンプルの集合体であってもよい。
【００９８】
図１に示す１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５または３８種のｍｉＲＮＡの少なくともいずれかまたはそれに対応するホモログについて遺伝子の状態を判定してもよい。そうした実施形態において、複数のｍｉＲＮＡの遺伝子の状態を用いても一様に食道癌の診断が暗示または示唆されない場合、「過半数」により暗示または示唆されれば、それをアッセイの結果と考えてもよい。たとえば、この方法では、５種のｍｉＲＮＡを用いて、そのうち３種が食道癌を暗示／示唆する場合、その結果は、個体に対して食道癌の診断を暗示または示唆すると考えてもよい。しかしながら、いくつかの実施形態では、食道癌の診断には、少なくとも１種または複数種の特定のｍｉＲＮＡの特徴的な変化が必要とされる。
【００９９】
様々な技法を用いてｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子の状態を判定することができる。そうした技法として、たとえば、マイクロアレイ上の対立遺伝子特異的プライマー伸長法、ＰＣＲ／ＬＤＲユニバーサルアレイ法、マイクロスフェアベースの一塩基鎖伸長法、配列タグ分子反転プローブ法およびコンビナトリアルなハイブリダイゼーションによる配列決定法が挙げられる。
【０１００】
食道癌患者の分類方法
別の態様では、たとえば、分化度、腫瘍病期および病理学的分類に基づき食道患者を分類する方法を提供する。いくつかの実施形態では、食道患者を分類する方法（たとえば、分化度の判定、腫瘍病期の判定および食道患者の病理学的分類）であって、個体の食道癌組織における少なくとも１種のｍｉＲＮＡレベル（表２に示すｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログなど）または対応するｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子の状態を判定することを含み、ｍｉＲＮＡのレベル（または対応するｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子の状態）を食道患者の分類の根拠として用いる、方法を提供する。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、個体の食道癌の分化度を判定する方法であって、個体の食道癌組織中の図２ａに示す少なくとも１種のｍｉＲＮＡのレベル（または対応するｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子の状態）を判定することを含み、ｍｉＲＮＡのレベル（または対応するｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子の状態）を個体の食道癌の分化度を判定する根拠として用いる、方法を提供する。たとえば、検査対象のｍｉＲＮＡのレベルに基づき個体の分化度を高分化、中分化および低分化と判定してもよい。ｍｉＲＮＡのレベル（または対応するｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子の状態）と分化度の相関関係については、たとえば、当該技術分野において公知の方法に基づき様々な分化度に分類されている食道癌サンプル集団のｍｉＲＮＡのレベル（または対応するｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子の状態）を解析することで判定してもよい。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡはｈｓａ−ｍｉＲ−２５、ｈｓａ−１３０ｂ。およびｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ａのいずれか１つもしくは複数またはそれに対応するホモログであり、食道癌サンプル中のｍｉＲＮＡのレベルは、分化度と逆相関する。すなわち、サンプル中のｍｉＲＮＡのレベルが低いと分化度が高くなる一方、サンプル中のｍｉＲＮＡのレベルが高いと、分化度が低くなる関係にある。いくつかの実施形態では、少なくとも１種のｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３５である。いくつかの実施形態では、少なくとも１種のｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−２５である。いくつかの実施形態では、少なくとも１種のｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−１３０ｂである。いくつかの実施形態では、少なくとも１種のｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ａである。いくつかの実施形態では、少なくとも１種のｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｄである。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、食道扁平上皮癌の個体の病理学的分類方法であって、個体の食道癌組織における図２ｂに示す少なくとも１種のｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログのレベル（または対応するｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子の状態）を判定することを含み、ｍｉＲＮＡのレベル（または対応するｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子の状態）を個体の病理学的分類の根拠として用いる、方法を提供する。たとえば、検査対象のｍｉＲＮＡのレベルによって、個体をキノコ状の食道扁平上皮癌または髄様型の食道扁平上皮癌と判定してもよい。たとえば、当該技術分野において公知の方法で病理学的に分類されているサンプル集団のｍｉＲＮＡのレベル（または対応するｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子の状態）を解析して、ｍｉＲＮＡのレベル（または対応するｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子の状態）と癌の種々の病理学的形態との相関関係を設定してもよい。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、食道癌の個体の腫瘍病期を判定する方法であって、個体の食道癌組織における図２ｃに示す少なくとも１種のｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログのレベル（または対応するｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子の状態）を判定することを含み、ｍｉＲＮＡのレベル（または対応するｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子の状態）を個体の腫瘍病期の判定の根拠として用いる、方法を提供する。たとえば、ｍｉＲＮＡのレベル（または対応するｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子の状態）に基づき個体の腫瘍を病期Ｉ、病期ＩＩまたは病期ＩＩＩであると判定してもよい。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡのレベル（または対応するｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子の状態）に基づき個体の腫瘍を病期Ｔ１、Ｔ２またはＴ３であると判定する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡのレベル（または対応するｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子の状態）に基づき個体を病期Ｎ０および病期Ｎ１であると判定する。たとえば、当該技術分野において公知の方法で種々の腫瘍の病期に分類されているサンプル集団のｍｉＲＮＡのレベル（または対応するｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子の状態）を解析して、ｍｉＲＮＡのレベル（または対応するｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子の状態）と種々の腫瘍の病期との相関関係を設定してもよい。
【０１０５】
また、本明細書は、表２に示すｍｉＲＮＡ（たとえば、図２ａ、図２ｂおよび図２ｃのいずれかに示すｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログなど）を検出できるプローブを含むシステム（マイクロアレイなど）および表２に示すｍｉＲＮＡに対応するｍｉＲＮＡ遺伝子またはそれに対応するホモログの遺伝子の状態を判定するシステムも提供する。これらのシステムは、表２に示すｍｉＲＮＡのレベル（または対応するｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子の状態）および食道癌患者の分類の判定に有用である。したがって、いくつかの実施形態では、サンプル中の表２に示す少なくとも１種のｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログのレベル（または対応するｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子の状態）を判定するシステム（マイクロアレイなど）であって、システムは複数のプローブを含み、各プローブはサンプル中の異なるｍｉＲＮＡ（または対応するｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子の状態）を検出することができ、かつプローブの少なくとも約１５％（たとえば、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％のいずれかなど）は、表２に示すｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログ（または対応するｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子の状態）を検出することができる、システムを提供する。いくつかの実施形態では、食道癌患者を分類するシステム（マイクロアレイなど）であって、システムは複数のプローブを含み、各プローブはサンプル中の異なるｍｉＲＮＡ（または対応するｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子の状態）を検出することができ、かつプローブの少なくとも約１５％（たとえば、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％のいずれかなど）は、表２に示すｍｉＲＮＡ（または対応するｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子の状態）を検出することができる、システムを提供する。いくつかの実施形態では、食道癌の個体を分類するシステム（マイクロアレイなど）であって、少なくとも約２、５、１０、２０、３０または４０種のプローブのいずれかを含み（たとえば、本質的にそれからなり、あるいは、それからなり）、各プローブは表２に示すｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログ（または対応するｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子の状態）を検出することができる、システムを提供する。
【０１０６】
また、食道患者を分類するための、本明細書に提供するシステムの使用も提供する。たとえば、いくつかの実施形態では、食道癌の個体を分類するシステムの使用であって、システムは１つまたは複数のプローブを含み、かつ各プローブは表２に示すｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログのレベル（または対応するｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子の状態）を判定することができる、システムの使用を提供する。いくつかの実施形態では、食道癌の個体における食道癌の分化度を判定するシステムの使用であって、システムは１つまたは複数のプローブを含み、各プローブは図２ａに示すｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログのレベル（または対応するｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子の状態）を判定することができる、システムの使用を提供する。いくつかの実施形態では、食道扁平上皮癌の個体を病理学的に分類するシステムの使用であって、システムは１つまたは複数のプローブを含み、各プローブは図２ｂに示すｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログのレベル（または対応するｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子の状態）を判定することができる、システムの使用を提供する。いくつかの実施形態では、食道癌の個体の腫瘍病期を判定するシステムの使用であって、システムは１つまたは複数のプローブを含み、各プローブは図２ｃに示すｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログのレベル（または対応するｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子の状態）を判定することができる、システムの使用を提供する。
【０１０７】
さらに、本明細書に記載のシステムを製造するための、ｍｉＲＮＡを検出する（または対応するｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子の状態を判定する）プローブの使用も提供する。いくつかの実施形態では、食道癌の個体を分類するシステムを製造するための、１つまたは複数のプローブの使用であって、各プローブは表２に示すｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログのレベル（または対応するｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子の状態）を判定することができる、プローブの使用を提供する。いくつかの実施形態では、食道癌の個体を分類するシステム（マイクロアレイなど）を製造するためのプローブの使用であって、各プローブはサンプル中の異なるｍｉＲＮＡ（または対応するｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子の状態）を検出することができ、かつプローブの少なくとも約１５％（たとえば、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％のいずれかなど）は、表２に示すｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログ（または対応するｍｉＲＮＡの遺伝子の状態）を検出することができる、プローブの使用を提供する。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、食道癌の個体における食道癌の分化度を判定するシステムを製造するための、１つまたは複数のプローブの使用であって、各プローブは図２ａに示すｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログのレベル（または対応するｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子の状態）を判定することができる、プローブの使用を提供する。いくつかの実施形態では、食道扁平上皮癌の個体を病理学的に分類するシステムを製造するための、１つまたは複数のプローブの使用であって、各プローブは図２ｂに示すｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログのレベル（または対応するｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子の状態）を判定することができる、プローブの使用を提供する。いくつかの実施形態では、食道癌の個体の腫瘍病期を判定するシステムを製造するための、１つまたは複数のプローブの使用であって、各プローブは図２ｃに示すｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログのレベル（または対応するｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子の状態）を判定することができる、プローブの使用を提供する。
【０１０９】
食道癌患者の生存の予後および改善のための方法および組成物
別の態様では、本発明は、たとえば、食道癌の個体の生存の予後を判定する方法など、食道癌患者の予後を診断する方法を提供する。本発明の予後の方法は、食道癌の個体に対する適切な処置期間の判定に有用である。たとえば、生存の可能性を判定することで、より保存的治療アプローチを取るべきか、それともより根治的な治療アプローチを取るべきか、あるいは、処置方式を組み合わせるべきかどうかの判定に貢献できる。さらに、こうした予後は、生存を改善する薬（本明細書に記載の薬など）が必要および／または有効であるかどうかの判定の一助になる可能性がある。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、食道癌の個体の生存の予後を判定する方法であって、（ａ）個体由来の食道癌組織サンプル中の少なくとも１種のｍｉＲＮＡのレベルを判定すること、および（ｂ）該サンプル中のｍｉＲＮＡのレベルを閾値レベルと比較することを含み、閾値レベルと比較してｍｉＲＮＡのレベルが個体の生存と相関または逆相関する、方法を提供する。本明細書で使用する場合、「相関する」とは、閾値レベルと比較してｍｉＲＮＡレベルが低い場合、食道癌の個体の生存率が低いことが示唆され、その逆も同様であることをいう。本明細書で使用する場合、「逆相関する」とは、閾値レベルと比較してｍｉＲＮＡレベルが高い場合、高い生存率が示唆され、その逆も同様であることをいう。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、少なくとも１種のｍｉＲＮＡは、ＰＰＰ６Ｃ、ＳＡＴＢ２、ＣＨＳＴ１１、ＣＲＥＬＤ１、ＥＳＲＲＡ、ＭＴＭＲ４、ＲＮＦ１２５；ＳＹＮＪ１、ＴＡＦ５、ＹＷＨＡＨ、ＺＹＸ、ＣＨＳＴ１１、ＫＩＡＡ１０３３、ＴＧＦＢＲ３、ＳＮＲＫ、ＲＮＦ１２５、ＡＸＩＮ２、ＣＡＰＺＡ２、ＳＹＮＪ１、ＤＬＬ１、ＹＷＨＡＨ、ＭＴＭＲ４、ＰＰＰ６Ｃ、ＣＡＭＫＶおよびＴＡＦ５、ＰＰＰ１ＣＢ、ＰＯＵ４Ｆ２、ＭＹＨ１、ＭＹＨ２、ＴＯＰ２Ｂ、ＳＴＸ１７、ＧＢＡＳ、ＭＹＨ４、ＣＰＳＦ４、ＥＩＦ４ＥＢＰ３、ＬＨＸ４、ＣＬＫ３、ＣＡＰＮ６、ＫＩＡＡ１６２２、ＡＵＨ、ＰＰＩＦ、ＫＣＮＫ３、ＩＬ６Ｒ、ＣＳＮＫ２Ａ２、ＺＮＦ５７９、ＮＲＧＮ、ＣＵＬ３、ＣＩＢ２、ＺＢＴＢ２６、ＧＰＢＰ１、ＴＭＥＭ１６Ｄ、ＨＯＸＡ１、ＣＡＭＴＡ１、ＭＣＭ３ＡＰ、ＭＰＰＥＤ２、ＨＯＯＫ２、ＰＬＡＵ、ＭＣＦＤ２、ＢＬＣＡＰ、ＤＨＸ１５、ＦＢＮ１、ＮＣＯＡ６、ＳＮＲＰＣ、ＣＣＫ、ＳＦＲＳ１５、ＴＭＯＤ１、ＧＰＲＣ５Ｂ、ＺＮＦ４０３、ＤＣＵＮ１Ｄ５、ＺＮＦ４２３およびＧＰＲ６４からなる群から選択される標的遺伝子を制御するｍｉＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡの少なくとも１種は、ＰＰＰ６Ｃ、ＳＡＴＢ２、ＣＨＳＴＩ１１、ＣＲＥＬＤ１、ＥＳＲＲＡ、ＭＴＭＲ４、ＲＮＦ１２５；ＳＹＮＪ１、ＴＡＦ５、ＹＷＨＡＨおよびＺＹＸからなる群から選択される標的遺伝子を制御するｍｉＲＮＡである。いくつかの実施形態では、少なくとも１種のｍｉＲＮＡは、ＣＨＳＴ１１、ＫＩＡＡ１０３３、ＴＧＦＢＲ３、ＳＮＲＫ、ＲＮＦ１２５、ＡＸＩＮ２、ＣＡＰＺＡ２、ＳＹＮＪ１、ＤＬＬ１、ＹＷＨＡＨ、ＭＴＭＲ４、ＰＰＰ６Ｃ、ＣＡＭＫＶおよびＴＡＦ５からなる群から選択される標的遺伝子を制御するｍｉＲＮＡである。いくつかの実施形態では、少なくとも１種のｍｉＲＮＡは、ＰＰＰ１ＣＢ、ＰＯＵ４Ｆ２、ＭＹＨ１、ＭＹＨ２、ＴＯＰ２Ｂ、ＳＴＸ１７、ＧＢＡＳ、ＭＹＨ４、ＣＰＳＦ４、ＥＩＦ４ＥＢＰ３、ＬＨＸ４、ＣＬＫ３、ＣＡＰＮ６、ＫＩＡＡ１６２２、ＡＵＨ、ＰＰＩＦ、ＫＣＮＫ３、ＩＬ６Ｒ、ＣＳＮＫ２Ａ２、ＺＮＦ５７９、ＮＲＧＮ、ＣＵＬ３、ＣＩＢ２、ＺＢＴＢ２６、ＧＰＢＰ１、ＴＭＥＭ１６Ｄ、ＨＯＸＡ１、ＣＡＭＴＡ１、ＭＣＭ３ＡＰ、ＭＰＰＥＤ２、ＨＯＯＫ２、ＰＬＡＵ、ＭＣＦＤ２、ＢＬＣＡＰ、ＤＨＸ１５、ＦＢＮ１、ＮＣＯＡ６、ＳＮＲＰＣ、ＣＣＫ、ＳＦＲＳ１５、ＴＭＯＤ１、ＧＰＲＣ５Ｂ、ＺＮＦ４０３、ＤＣＵＮ１Ｄ５、ＺＮＦ４２３およびＧＰＲ６４からなる群から選択される標的遺伝子を制御するｍｉＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡに対応する遺伝子は、５番染色体、１０番染色体および９番染色体のいずれかに位置している。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、図３に示すｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログのいずれかである。いくつかの実施形態では、少なくとも１種のｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３である。いくつかの実施形態では、少なくとも１種のｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７である。いくつかの実施形態では、少なくとも１種のｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂである。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、食道癌の個体の生存の予後を判定する方法であって、（ａ）個体由来の食道癌組織サンプル中の少なくとも１種のｍｉＲＮＡのレベルを判定すること、および（ｂ）該サンプル中のｍｉＲＮＡのレベルを閾値レベルと比較することを含み、閾値レベルと比較してｍｉＲＮＡのレベルは該個体の生存と逆相関し、かつ少なくとも１種のｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７もしくはｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂまたはそれに対応するホモログである、方法を提供する。いくつかの実施形態では、少なくとも１種のｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３である。いくつかの実施形態では、少なくとも１種のｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７である。いくつかの実施形態では、少なくとも１種のｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂである。
【０１１３】
また、本明細書に記載のｍｉＲＮＡのレベルは、ｍｉＲＮＡ（本明細書に記載のｍｉＲＮＡなど）の遺伝子の状態の変化を反映してもよい。いくつかの実施形態では、食道癌の個体の生存の予後を判定する方法であって、少なくとも１個のｍｉＲＮＡ遺伝子（ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７およびｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂのいずれかに対応するｍｉＲＮＡ遺伝子またはそれに対応するホモログなど）の遺伝子の状態を解析することを含み、対照サンプルの変化と比較した遺伝子の状態の変化から個体の生存率（ｓｕｒｖｉｖａｌ）の高低が示唆される、方法を提供する。たとえば、いくつかの実施形態では、食道癌の個体の生存の予後を判定する方法であって、増幅についてｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７およびｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂのいずれかに対応する少なくとも１個のｍｉＲＮＡ遺伝子を解析することを含み、そのｍｉＲＮＡ遺伝子の、対照サンプル中の対応するｍｉＲＮＡ遺伝子に対する増幅が個体の低生存率と相関する、方法を提供する。いくつかの実施形態では、食道癌の個体の生存の予後を判定する方法であって、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７およびｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂのいずれかに対応する少なくとも１個のｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子コピー数を判定することを含み、コピー数が３以上であることから、個体の低生存率示唆される、方法を提供する。
【０１１４】
また、本明細書は、ｍｉＲＮＡのレベル（または対応するｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子の状態）を検出することができるプローブまたは生存の予後を判定する１つまたは複数のプローブを含むシステムの使用も提供する。たとえば、いくつかの実施形態では、食道癌の個体の生存の予後を判定する１つまたは複数のプローブ（または１つまたは複数のプローブを含むシステム）の使用であって、プローブはサンプル中のｍｉＲＮＡを検出することができ、かつ閾値レベルと比較してｍｉＲＮＡのレベルは該個体の生存と相関または逆相関する、プローブの使用を提供する。いくつかの実施形態では、食道癌の個体の生存の予後を判定する１つまたは複数のプローブの使用であって、閾値レベルと比較してｍｉＲＮＡのレベルは該個体の生存と逆相関し、かつ少なくとも１種のｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７もしくはｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂまたはそれに対応するホモログである、プローブの使用を提供する。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、食道癌の個体の生存の予後を判定する薬を製造するための、１つまたは複数のプローブの使用（またはシステム）であって、プローブはサンプル中のｍｉＲＮＡを検出することができ、かつ閾値レベルと比較してｍｉＲＮＡのレベルは該個体の生存と相関または逆相関する、プローブの使用を提供する。いくつかの実施形態では、食道癌の個体の生存の予後を判定する薬（またはシステム）を製造するための、１つまたは複数のプローブの使用であって、閾値レベルと比較してｍｉＲＮＡのレベルは該個体の生存と逆相関し、かつ少なくとも１種のｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７もしくはｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂまたはそれに対応するホモログである、プローブの使用を提供する。
【０１１６】
さらに、本発明は、食道癌の個体の生存を改善する方法も提供する。いくつかの実施形態では、食道癌の個体の生存を改善する方法であって、ｍｉＲＮＡのレベルを低下させる薬を有効量で個体に投与することを含み、閾値レベルと比較してｍｉＲＮＡのレベルは該個体の生存と逆相関する、方法を提供する。いくつかの実施形態では、食道癌の個体の生存を改善する薬物を製造するための、ｍｉＲＮＡのレベルを低下させる薬の使用であって、閾値レベルと比較してｍｉＲＮＡのレベルは該個体の生存と逆相関する、薬の使用を提供する。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、食道癌の個体の生存を改善する方法であって、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂおよびこれらに対応するホモログからなる群から選択されるｍｉＲＮＡのレベルを低下させる薬を有効量で個体に投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、食道癌の個体の生存を改善する薬物を製造するための薬の使用であって、薬はｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂおよびこれらに対応するホモログからなる群から選択されるｍｉＲＮＡのレベルを低下させる、薬の使用を提供する。
【０１１８】
本明細書に記載の方法は、薬の投与前に（たとえば、本明細書に記載の方法により）個体の生存の予後を判定するステップをさらに含んでもよい。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、複数のｍｉＲＮＡのレベルを低下させる。これを実現するには、たとえば、２種以上のｍｉＲＮＡのレベルを低下させる薬を用いてもよい。あるいは、２種以上のｍｉＲＮＡのレベルを低下させるため、２種以上の薬を用いる。たとえば、いくつかの実施形態では、食道癌の個体の生存を改善する方法であって、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂおよびこれらに対応するホモログからなる群から選択される少なくとも２種のｍｉＲＮＡのレベルを低下させる１種または複数種の薬を有効量で個体に投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、食道癌の個体の生存を改善する薬物を製造するための、１種または複数種の薬の使用であって、薬はｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂおよびこれらに対応するホモログからなる群から選択される少なくとも２種のｍｉＲＮＡのレベルを低下させる、薬の使用を提供する。いくつかの実施形態では、食道癌の個体の生存を改善する方法であって、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７およびｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂのレベルを低下させる１種または複数種の薬を有効量で個体に投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、食道癌の個体の生存を改善する薬物を製造するための、１種または複数種の薬の使用であって、薬はｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７およびｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂのレベルを低下させる、薬の使用を提供する。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡのレベルを低下させる薬および薬学的に許容されるキャリアを含む医薬組成物であって、少なくとも１種のｍｉＲＮＡはｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７またはｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂである、医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、少なくとも１種のｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３である。いくつかの実施形態では、少なくとも１種のｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７である。いくつかの実施形態では、少なくとも１種のｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂである。いくつかの実施形態では、薬は、二本鎖ＲＮＡ（低分子または小分子干渉ＲＮＡ、すなわち「ｓｉＲＮＡ」など）、アンチセンス（ａｎｔｉｓｅｎｓｅｓ）核酸またはリボザイムなどの酵素ＲＮＡ分子である。生存を改善する方法および組成物については、以下にさらに詳細に説明する。
【０１２１】
本明細書に記載の生存は、無病生存でも全生存でもよい。本明細書で使用する場合、「無病生存」という語は、腫瘍の再発および／または進展がないこと、および診断後に個体がたどる経過、たとえば、腫瘍が再発しない状態で個体が生存していることをいう。「全生存」という語句は、個体に腫瘍が再発するかどうかにかかわらず診断後に個体がたどる経過をいう。
【０１２２】
生存についての予後の判定
本明細書に記載のある種の方法および使用では、閾値レベルと比較したｍｉＲＮＡのレベルに基づき生存の予後を判定する。
【０１２３】
閾値レベルについては、複数の方法で判定してもよいが、ただし、得られた閾値レベルは、ｍｉＲＮＡのレベルが閾値レベルを上回る第１の患者群に、ｍｉＲＮＡのレベルが閾値レベルを下回る第２の患者群の生存率と異なる生存率を正確に与えることが条件となる。
【０１２４】
たとえば、非癌性の食道癌組織サンプルのｍｉＲＮＡのレベルにより、閾値レベルを判定してもよい。また、食道癌の個体の集団におけるｍｉＲＮＡのレベルを解析して閾値レベルを判定しても構わない。これを達成するには、たとえば、検査した個体のコホート全体をグラフ化して、ｍｉＲＮＡのレベルを第１の軸に示し、個体の生存率を第２の軸に示し、ヒストグラム解析を行ってもよい。ｍｉＲＮＡのレベルが同一または類似しているコホートのサブセット集団を同定して２種以上の別の個体群を判定してもよい。その後、これらの異なる群を最も明確に区別するｍｉＲＮＡのレベルに基づき、閾値レベルの判定を行うことができる。たとえば、いくつかの実施形態では、閾値レベルは、生存率が高い群のｍｉＲＮＡの平均レベルと生存率が低い群のｍｉＲＮＡの平均レベルとの平均（ｍｅａｎ）値に基づいてもよい。さらに、閾値レベルは、２種以上のｍｉＲＮＡのレベルで表しても構わない。２種以上のｍｉＲＮＡを、たとえば、各ｍｉＲＮＡのレベル値の比で表しても構わない。
【０１２５】
閾値レベルは、あらゆる食道癌の個体に等しく適用できる単一の数字でも、個体の個々のサブ集団によって異なる単一の数字でもよい。たとえば、高齢男性の閾値レベルは、若年男性と異なるかもしれないし、女性の閾値レベルは、男性と異なるかもしれない。さらに、閾値レベルは、個体ごとに判定するレベルであってもよい。たとえば、閾値レベルは、食道癌組織のｍｉＲＮＡと同じ個体内の非癌性組織におけるｍｉＲＮＡのレベルとの特定の比であっても構わない。
【０１２６】
閾値レベルにより、閾値レベル未満を呈する食道癌患者と閾値レベル超を呈する患者の生存の可能性が見分けられるかどうか確認するには、単変量または多変量解析を用いてもよい。こうした方法は、１つまたは複数の変数と、ある結果が相関する可能性を判定する。具体的には、この方法は、癌患者のｍｉＲＮＡのレベルと無病生存または全生存とが相関する可能性を判定する。これらの解析を行うには、当業者によく知られた複数の方法のいずれか１つを用いればよい。単変量解析の例として、カプランマイヤー法またはコックス比例ハザード回帰モデルが挙げられる。
【０１２７】
たとえば、ヒストグラム解析により閾値レベルを集団に基づき判定する場合、ｍｉＲＮＡのレベルが異なる２つ以上の患者群を判定するのに十分な規模の患者コホートを用いて行えばよい。一般に、こうしたコホートは、たとえば、少なくとも約５０、７５、１００、１２５、１５０または２００例の患者のいずれかなど、少なくとも患者２５例で構成される。同様に、決定した閾値レベルを確認する場合も、たとえば、少なくとも約５０、７５、１００、１２５、１５０または２００例の患者のいずれかなど、少なくとも患者２５例で構成してもよい。
【０１２８】
さらに、単一の閾値レベルで２つの患者群を分けてもよいが、複数の閾値が存在し、それにより複数の集団を分けてもよい。たとえば、２つの閾値を用いてｍｉＲＮＡが高レベルの第１の患者群と、ｍｉＲＮＡが中レベルの第２の患者群およびｍｉＲＮＡが低レベルの第３の患者群とに分けてもよい。閾値レベルの数は、患者の無病生存または全生存の可能性をその患者のｍｉＲＮＡのレベルの関数として表した実線などの曲線を規定できるようであればよい。こうした曲線は、患者の無病生存または全生存の可能性がその患者のｍｉＲＮＡのレベルに比例する、「連続的な」ｍｉＲＮＡのレベルを意味する。こうした曲線で２つ以上のｍｉＲＮＡのレベルを表示してもよい。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、癌患者の生存の予後を判定する本発明の方法においてｍｉＲＮＡ（本明細書に記載のｍｉＲＮＡなど）を相互に組み合わせてもよい。２種以上のｍｉＲＮＡを組み合わせて用いると、予後の判定における予後の有意性または信頼性が高まる可能性がある。
【０１３０】
さらに、ｍｉＲＮＡのレベルを病理学的指標（たとえば、年齢、腫瘍の大きさ、腫瘍組織型、臨床病期、家族歴および同種のもの）など、食道癌患者の無病生存または全生存の可能性を示す指標として統計学的に有意であることが確認されている別の変数と併用してもよい。たとえば、癌の臨床病期は、無病生存または全生存の統計学的に有意な指標であり、癌の臨床病期によって閾値レベルが変化することがある。このため、ｍｉＲＮＡの閾値レベルは、食道癌の無病生存または全生存を示す統計学的に有意な別の指標に応じて変化してもよい。
【０１３１】
例示的な一方法では、カプランマイヤー解析を用いて生存率とｍｉＲＮＡレベルの相関を判定する。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、本方法は、（ａ）個体由来の食道癌組織における少なくとも１種のｍｉＲＮＡのレベルを判定すること、（ｂ）その個体を食道癌の第１の個体群または第２の個体群のどちらかに属するものとして分類することを含み、ｍｉＲＮＡのレベルが低い第１の個体群をｍｉＲＮＡのレベルが高い第２の個体群と比較して生存の可能性が高いと判定し、かつ少なくとも１種のｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７またはｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂである。
【０１３３】
患者サンプル中の１種または複数種のｍｉＲＮＡのレベルを判定して閾値レベルと比較した後、患者を一定の可能性の無病生存または全生存の群に分類する。次いで、その患者の無病生存または全生存の可能性を、その群内の各患者の無病生存または全生存の可能性に基づき評価する。
【０１３４】
たとえば、あるサンプルをｍｉＲＮＡのレベルが低いと判定することがある。その場合、この患者は、ｍｉＲＮＡのレベルが低い患者群に分類されるであろう。高レベルのｍｉＲＮＡを示す患者群の無病生存または全生存の可能性が高いことができる確立されているため、この癌患者は、無病生存または全生存の可能性が高いと考えられるであろう。
【０１３５】
本明細書に記載の方法は、個体に適切な処置期間を判定するステップをさらに含んでもよい。当業者であれば、初期の癌に罹患している癌患者の生存の予後指標がより後期の癌に罹患している癌患者のそれと異なる場合があることを理解するであろう。たとえば、病期Ｉの癌患者の予後では、癌の成長および／または転移が持続する可能性が着目されることがある一方、病期ＩＶの癌患者の予後では、癌処置の治療方法の好ましい有効性が着目されることがある。それ故、適切な処置期間の判定には、これらの変数を考慮に入れることになる。
【０１３６】
生存を改善する方法および組成物
また、図３に示すｍｉＲＮＡなど、ある種のｍｉＲＮＡのレベルを低下させる薬を用いて食道癌患者の生存を改善する方法も提供する。
【０１３７】
本発明の方法では、ｍｉＲＮＡのレベルを低下できるのであれば、どのような薬を用いてもよい。ｍｉＲＮＡ遺伝子の発現の阻害に好適な薬には、二本鎖ＲＮＡ（低分子または小分子干渉ＲＮＡ、すなわち「ｓｉＲＮＡ」など）、アンチセンス核酸、リボザイムなどの酵素ＲＮＡ分子、小分子化合物およびタンパク質があるが、これに限定されるものではない。これらの薬については単独で用いてもよいし、他の薬（本明細書に記載の他の薬など）と組み合わせて用いてもよい。薬は、直接的（ｍｉＲＮＡの発現または機能の阻害など）または間接的（対応するｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子の状態に作用するなど）にｍｉＲＮＡのレベルを低下させることができる。
【０１３８】
たとえば、少なくとも一部のｍｉＲＮＡ遺伝子産物との配列相同性が、たとえば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％のいずれかなど、少なくとも７０％である単離された二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）分子を用いてｍｉＲＮＡ遺伝子のＲＮＡ干渉を誘導することで、一定のｍｉＲＮＡ遺伝子の発現を阻害することができる。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、「低分子または小分子干渉ＲＮＡ」すなわち「ｓｉＲＮＡ」である。
【０１３９】
本方法に有用なｓｉＲＮＡは、たとえば、約１２〜２８、１４〜２６、１６〜２４または１８〜２２ヌクレオチドのいずれかなど、約１０〜３０ヌクレオチドの低分子二本鎖ＲＮＡであってもよい。このｓｉＲＮＡは、標準的なワトソン−クリック塩基対相互作用により共にアニーリングしたセンスＲＮＡ鎖と相補的アンチセンスＲＮＡ鎖を含む。センス鎖は、標的ｍｉＲＮＡ内に含まれる核酸配列と実質的に同一の核酸配列を含む。ｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、相補的な２本の一本鎖ＲＮＡ分子であってもよいし、２つの相補的部分が塩基対を形成し、一本鎖「ヘアピン」領域で共有結合している単一の分子であってもよい。
【０１４０】
ｓｉＲＮＡは、１個または複数個のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または変化により天然ＲＮＡと異なってもよい。そうした変化として、ｓｉＲＮＡの末端（単数または複数）もしくはｓｉＲＮＡ内部の１個または複数個のヌクレオチドなどへの非ヌクレオチド材料の付加またはｓｉＲＮＡにヌクレアーゼ消化に対する抵抗性を持たせる修飾またはｓｉＲＮＡの１個または複数個のヌクレオチドとデオキシヌクレオチドとの置換が挙げられる。また、いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡの１本または両方の鎖は、３’オーバーハングを含んでもよい。ｓｉＲＮＡについては、化学的に作製しても生物学的に作製してもよいし、以下にさらに説明するように、組換えプラスミドまたはウイルスベクターから発現させても構わない。
【０１４１】
また、アンチセンス核酸により個々のｍｉＲＮＡの発現を阻害してもよい。本明細書で使用する場合、「アンチセンス核酸」とは、ＲＮＡ−ＲＮＡまたはＲＮＡ−ＤＮＡ相互作用を用いて標的ＲＮＡに結合し標的ＲＮＡの活性を変化させる核酸分子をいう。本方法に用いるのに好適なアンチセンス核酸は、ｍｉＲＮＡの連続する核酸配列と相補的な核酸配列を含むのが一般的な一本鎖核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）およびＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）など）である。いくつかの実施形態では、アンチセンス核酸は、ｍｉＲＮＡの連続する核酸配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％のいずれかで相補的な核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、アンチセンス核酸は、たとえば、約１２〜２８、１４〜２６、１６〜２４または１８〜２２ヌクレオチドのいずれかなど、約１０〜３０ヌクレオチドである。
【０１４２】
また、アンチセンス核酸は、標的特異性、ヌクレアーゼ耐性、送達性またはこの分子の有効性に関連する他の特性を高めるべく、核酸骨格または糖および塩基部分（またはその等価物）の修飾を含んでもよい。こうした修飾には、コレステロール部分、アクリジンなどの二本鎖インターカレーターまたは１つまたは複数のヌクレアーゼ耐性基の付加がある。
【０１４３】
アンチセンス核酸については、化学的に作製しても生物学的に作製してもよいし、以下にさらに説明するように、組換えプラスミドまたはウイルスベクターから発現させても構わない。
【０１４４】
また、酵素的核酸により個々のｍｉＲＮＡ遺伝子の発現を阻害してもよい。本明細書で使用する場合、「酵素的核酸」とは、ｍｉＲＮＡの連続する核酸配列と相補的な基質結合領域を含み、かつｍｉＲＮＡを特異的に切断することができる核酸をいう。いくつかの実施形態では、酵素的核酸の結合領域は、ｍｉＲＮＡの連続する核酸配列と、たとえば、７５〜１００％、または９５〜１００％など、５０〜１００％相補的である。また、酵素的核酸は、塩基、糖および／またはリン酸基の修飾を含んでも構わない。本方法に使用する例示的な酵素的核酸として、リボザイムがある。
【０１４５】
酵素的核酸については、化学的に作製しても生物学的に作製してもよいし、以下にさらに説明するように、組換えプラスミドまたはウイルスベクターから発現させても構わない。
【０１４６】
核酸分子を癌細胞などの細胞に導入するには、種々の方法が当該技術分野において公知である。そうした方法として、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウムによるトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストランによるトランスフェクション、微小粒子銃、コロイド分散系（巨大分子複合体、ビーズ、水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセルおよびリポソームなど）による送達、および抗体、グラマシジンＳ、人工ウイルスエンベロープまたはＴＡＴなどの他の細胞内キャリアとのコンジュゲートが挙げられる。
【０１４７】
また、核酸薬については、当該技術分野において公知の好適なベクターを用いてインビトロまたはインビボで哺乳動物細胞に送達してもよい。核酸の哺乳動物細胞への送達に好適なベクターとして、ウイルスベクターおよびプラスミドベクターなどの非ウイルスベクターが挙げられる。こうしたベクターは、アンチセンスＲＮＡまたはｓｉＲＮＡなどの薬を治療量で与えるのに有用である。
【０１４８】
ウイルスを用いた系には、比較的高レベルの異種核酸を様々な細胞に導入できるという利点がある。核酸の導入に好適なウイルスベクターとして、たとえば、単純ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、サイトメガロウイルスベクター、モロニーマウス白血病ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターが挙げられる。さらに、他のウイルス由来のエンベロープタンパク質または表面抗原でベクターをシュードタイプ化することでバイタル（ｖｉｔａｌ）ベクターの指向性を改変してもよい。たとえば、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ：ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）狂犬病、エボラ、モコラおよび同種のもの由来の表面タンパク質でＡＡＶ（ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ）ベクターをシュードタイプ化することができる。
【０１４９】
さらに、アンチセンスＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの発現を制御できるように、刺激または分子を付加して様々な誘導性プロモーターまたはエンハンサーのいずれかを本発明の核酸またはベクターに加えてもよい。こうした誘導性の系として、たとえば、テトラサイクリン誘導系、重金属により誘導されるメタロチオネイン（ｍｅｔａｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ）プロモーター、エクジソン応答性の昆虫ステロイドホルモンまたは関連するムリステロンなどのステロイド、糖質コルチコイドおよびエストロゲンなどのステロイドにより誘導されるマウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ：ｍｏｕｓｅ  ｍａｍｍａｒｙ  ｔｕｍｏｒ  ｖｉｒｕｓ）ならびに温度変化により誘導させるヒートショートプロモーターが挙げられる。
【０１５０】
薬については、薬の量がｍｉＲＮＡのレベルを低下させるのに十分であれば、有効量とする。いくつかの実施形態では、薬は、ｍｉＲＮＡのレベルと閾値レベルの差で見て約１０％、２０％、３０％、４０％または５０％のいずれかｍｉＲＮＡのレベルを低下させる。薬（核酸薬など）の例示的な量には、０．１〜３０００ｍｇ／ｋｇ体重、１０〜２０００ｍｇ／ｋｇ体重、５０〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、１００〜５００ｍｇ／ｋｇ体重があるが、これに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、薬（核酸薬のいずれかなど）の量は、２０〜３００ｍｇ／グラム腫瘍塊、５０〜２００ｍｇ／グラム腫瘍塊および１００〜１５０ｍｇ／グラム腫瘍塊のいずれかなど、約１０〜５００ｍｇ／グラム腫瘍塊である。
【０１５１】
当業者であれば、個体への薬の投与の適切な投与計画を容易に判定できる。薬の例示的な投与回数として、少なくとも約３週に１回、２週に１回、週１回、週２回、週３回、週４回、週５回、週６回または１日１回のいずれかがあるが、これに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、それぞれの投与間隔は、約６日未満、５日未満、４日未満、３日未満、２日未満または１日未満のいずれかなど、約１週間未満である。いくつかの実施形態では、それぞれの投与間隔は一定である。たとえば、１日１回、２日ごと、３日ごと、４日ごと、５日ごとまたは毎週投与を行ってもよい。いくつかの実施形態では、１日２回、１日３回あるいはさらに頻繁に投与を行ってもよい。
【０１５２】
約１ヶ月から約３年など、薬の投与を長期間にわたって行ってもよい。たとえば、投与計画は、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１８、２４、３０および３６ヶ月のいずれかなどの一定期間にわたっても構わない。いくつかの実施形態では、投与スケジュールに中断を設けない。いくつかの実施形態では、それぞれの投与間隔は、約１週間以下である。
【０１５３】
本明細書に記載の組成物については、以下に限定されるものではないが、静脈内、腹腔内、眼内、動脈内、肺内、経口、膀胱内、筋肉内、気管内、皮下、眼内、髄膜内、経皮、経胸膜、動脈内、局所、吸入（噴霧としてなど）、経粘膜的（鼻粘膜経由など）、皮下、経皮、消化管、関節内、大槽内、脳室内、直腸（すなわち、坐剤による）、経膣（すなわち、ペッサリーによる）、頭蓋内、尿道内、肝内および腫瘍内など、当該技術分野の任意の経路で個体に投与してよい。いくつかの実施形態では、組成物を全身投与する。いくつかの実施形態では、組成物を局所投与する。
【０１５４】
また、本明細書は、ｍｉＲＮＡのレベルを低下させる薬および薬学的に許容されるキャリアを含む医薬組成物も提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂおよびこれらに対応するホモログからなる群から選択されるｍｉＲＮＡのレベルを低下させる薬を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１種のｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３である。いくつかの実施形態では、少なくとも１種のｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７である。いくつかの実施形態では、少なくとも１種のｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂである。いくつかの実施形態では、薬は、ｓｉＲＮＡである。いくつかの実施形態では、薬は、アンチセンスＲＮＡである。いくつかの実施形態では、薬は、リボザイムである。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は無菌である。いくつかの実施形態では、医薬組成物はパイロジェンフリー（ｐｙｒｏｇｅｎｅ−ｆｒｅｅ）である。
【０１５６】
好適な薬学的に許容されるキャリアとして、たとえば、水、緩衝水、生理食塩水、０．４％食塩水、０．３％グリシンおよびヒアルロン酸が挙げられる。また、医薬組成物は、従来の医薬品賦形剤および／または添加剤を含んでもよい。好適な医薬品賦形剤には、安定剤、酸化防止剤、重量オスモル濃度調整剤、緩衝剤およびｐＨ調整剤がある。好適な添加剤として、たとえば、生理学的に生体適合性の緩衝剤（トロメタミンヒドロクロリドなど）、キレート剤（たとえば、ＤＴＰＡ：ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉａｍｉｎｅ  ｐｅｎｔａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄまたはＤＴＰＡ−ビスアミドなど）またはカルシウムキレート錯体（たとえば、カルシウムＤＴＰＡ、ＣａＮａＤＴＰＡ−ビスアミドなど）またはカルシウム塩もしくはナトリウム塩（たとえば、塩化カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウムまたは乳酸カルシウム）が挙げられる。また、本発明の医薬組成物を液状で使用できるようにパッケージしてもよいし、凍結乾燥させてもよい。
【０１５７】
本発明の固形医薬組成物では、たとえば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムおよび同種のものなど、従来の薬学的に許容される無毒性固形キャリアを用いてもよい。
【０１５８】
ｍｉＲＮＡのレベルを検出し、および／またはｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子の状態を判定するシステム
本発明は、食道癌患者において特徴的な変化を示すｍｉＲＮＡレベルを検出する様々なシステムを提供する。また、ｍｉＲＮＡの遺伝子の状態を判定するシステムも提供する。このシステムについては、上記のように、たとえば、食道癌の診断、食道癌患者の分類および食道癌患者の生存の予後についての判定など、様々な目的で用いることができる。
【０１５９】
本明細書に記載のシステムは、ｍｉＲＮＡを検出し、および／またはｍｉＲＮＡの遺伝子の状態を判定するプローブを含む。以下の考察はｍｉＲＮＡを検出できるシステムに着目しているが、その説明のある種の態様を、遺伝子の欠失、増幅および／またはｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子コピー数の変化（まとめてｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子の状態という）を判定できるプローブを含むシステムにも同様に適用できることは当業者であれば容易に理解できる。
【０１６０】
たとえば、いくつかの実施形態では、複数のプローブを含むシステムであって、各プローブはサンプル中の異なるｍｉＲＮＡを検出することができ、かつプローブの少なくとも約１５％（たとえば、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％のいずれかなど）は、図１、表２または図３に示すｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログを検出することができる、システムを提供する。いくつかの実施形態では、システムは、少なくとも約２、５、１０、２０、３０、４０または５０種のプローブのいずれかを含み（たとえば、本質的にそれからなり、あるいは、それからなり）、各プローブは図１、表２または図３に示すｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログを検出することができる。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、複数のプローブを含むシステムであって、各プローブはサンプル中の異なるｍｉＲＮＡを検出することができ、かつプローブの少なくとも約１５％（たとえば、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％のいずれかなど）は、図１に示すｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログを検出することができる、システムを提供する。いくつかの実施形態では、システムは、少なくとも約２、５、１０、２０、３０または４０種のプローブのいずれかを含み（たとえば、本質的にそれからなり、あるいは、それからなり）、各プローブは図１に示すｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログを検出することができる。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、複数のプローブを含むシステムであって、各プローブはサンプル中の異なるｍｉＲＮＡを検出することができ、かつプローブの少なくとも約１５％（たとえば、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％のいずれかなど）は、表２に示すｍｉＲＮＡ（たとえば、図２ａ、図２ｂおよび図２ｃに示す任意のｍｉＲＮＡなど）を検出することができる、システムを提供する。いくつかの実施形態では、システムは、少なくとも約２、５、１０、２０、３０または４０種のプローブのいずれかを含み（たとえば、本質的にそれからなり、あるいは、それからなり）、各プローブは表２に示すｍｉＲＮＡ（たとえば、図２ａ、図２ｂおよび図２ｃに示す任意のｍｉＲＮＡなど）またはそれに対応するホモログを検出することができる。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、複数のプローブを含むシステムであって、各プローブはサンプル中の異なるｍｉＲＮＡを検出することができ、かつプローブの少なくとも約１５％（たとえば、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％のいずれかなど）は、図３に示すｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログを検出することができる、システムを提供する。いくつかの実施形態では、システムは、少なくとも約１、２、３、６、９、１２、１５、１８または２１種のプローブのいずれかを含み（たとえば、本質的にそれからなり、あるいは、それからなり）、各プローブは図３に示すｍｉＲＮＡを検出することができる。
【０１６４】
本明細書に記載のシステムは、同じｍｉＲＮＡを検出する２つ以上のプローブを含んでもよい。たとえば、いくつかの実施形態では、システムがマイクロアレイの場合、プローブは、マイクロアレイ中に複数の（２、３、４、５、６、７またはそれ以上のいずれかなど）コピーが存在してもよい。いくつかの実施形態では、システムは、同じｍｉＲＮＡを検出する異なるプローブを含む。たとえば、これらのプローブは、ｍｉＲＮＡの異なる（重複または非重複）領域に結合してもよい。
【０１６５】
ｍｉＲＮＡのレベルを判定できるのであれば、どのようなプローブを用いても構わない。いくつかの実施形態では、プローブはオリゴヌクレオチドである。ｍｉＲＮＡの検出にあっては、ある種の配列の変化を容認できることが理解されよう。したがって、オリゴヌクレオチドの配列（またはその相補配列）は、本明細書に記載のｍｉＲＮＡのそれと若干異なってもよい。こうした配列の変化は、ｍｉＲＮＡのレベルを判定するオリゴヌクレオチドの性能に大きな影響を与えない配列の変化であることを当業者であれば理解する。たとえば、これらのオリゴヌクレオチド分子のホモログおよび変異体は、標準方法により整列させると比較的高度の配列同一性を持つ。本明細書に記載のｍｉＲＮＡの配列に対する、本発明が包含するオリゴヌクレオチド配列の配列同一性は、たとえば、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上のいずれかなど、少なくとも４０％である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡを検出する部分および別の部分を含む。こうした他の部分を用いて、たとえば、オリゴヌクレオチドを基板に結合させる。いくつかの実施形態では、かかる他の部分は、相補配列部分と基板表面との間の距離を長くする非特異的配列（ポリＴなど）を含む。
【０１６６】
本明細書に記載のシステムのオリゴヌクレオチドは、たとえば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、これらの組み合わせおよび／またはこれらの修飾体を含む。さらに、このオリゴヌクレオチドは、修飾オリゴヌクレオチド骨格を含んでもよい。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、本明細書に記載のｍｉＲＮＡの全部または一部と相補的または同一の少なくとも約９、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上の連続オリゴヌクレオチドのいずれかを含む。１つのオリゴヌクレオチドは、こうした相補配列を２つ以上含んでもよい。いくつかの実施形態では、オリゴヌセオチドを基板に結合させるため、オリゴヌクレオチドの５’または３’末端に反応基（アミンなど）が結合している。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、システムは、プローブマイクロアレイである。本明細書で使用する場合、「マイクロアレイ」および「アレイ」は同義であり、特徴が未確定の場合が多い生化学的サンプル（標的）が（ハイブリダイゼーションなどにより）結合すると推定される部位のアレイ、好ましくは規則正しいアレイ表面を含む。いくつかの実施形態では、マイクロアレイとは、異なるオリゴヌクレオチドプローブを基板上の決められた位置に固定化したものをいう。
【０１６８】
たとえば、いくつかの実施形態では、複数のプローブを含むマイクロアレイであって、各プローブはサンプル中の異なるｍｉＲＮＡを検出することができ、かつプローブの少なくとも約１５％（たとえば、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％のいずれかなど）は図１、表２または図３に示すｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログを検出することができる、マイクロアレイを提供する。いくつかの実施形態では、複数のプローブを含むマイクロアレイであって、各プローブはサンプル中の異なるｍｉＲＮＡを検出することができ、かつプローブの少なくとも約１５％（たとえば、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％のいずれかなど）は、図１に示すｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログを検出することができる、マイクロアレイを提供する。いくつかの実施形態では、複数のプローブを含むマイクロアレイであって、各プローブはサンプル中の異なるｍｉＲＮＡを検出することができ、かつプローブの少なくとも約１５％（たとえば、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％のいずれかなど）は、表２に示すｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログを検出することができる、マイクロアレイを提供する。いくつかの実施形態では、複数のプローブを含むマイクロアレイであって、各プローブはサンプル中の異なるｍｉＲＮＡを検出することができ、かつプローブの少なくとも約１５％（たとえば、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％のいずれかなど）は、図３に示すｍｉＲＮＡまたはそれに対応するホモログを検出することができる、マイクロアレイを提供する。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示するｍｉＲＮＡに対応するｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子の状態を判定するマイクロアレイを提供する。遺伝子の状態を判定するマイクロアレイは、当該技術分野において公知である。たとえば、このシステムは、遺伝子の状態を判定する配列タグ付き分子反転プローブを含んでもよい。
【０１７０】
アレイについては、紙、ガラス、プラスチック（ポリプロピレン、ナイロン、ポリスチレンなど）、ポリアクリルアミド、ニトロセルロース、ケイ素、光ファイバーまたは他の任意の好適な固体または半固体支持体などの材料で製造され、平面（ガラス板、シリコンチップなど）形状または三次元（ピン、ファイバー、ビーズ、粒子、マイクロタイターウェル、キャピラリーなど）形状になった基板上に形成してもよい。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、プローブは、オリゴヌクレオチドである。アレイを形成するオリゴヌクレオチドについては、以下に限定されるものではないが、（ｉ）フォトリソグラフィー法を用いたｉｎ  ｓｉｔｕ合成（高密度オリゴヌクレオチドアレイなど）；（ｉｉ）中から低密度でのガラス、ナイロンまたはニトロセルロースへのスポッティング／プリンティング；（ｉｉｉ）マスキングおよび（ｉｖ）ナイロンまたはニトロセルロースハイブリダイゼーション膜へのドットブロッティングなど、どのようなやり方で基板に結合させてもよい。また、磁性ビーズを用いて、あるいは、マイクロタイターウェル中またはキャピラリー中などの流体相においてアンカーとハイブリダイズしてオリゴヌクレオチドを非共有結合的に基板に固定化してもよい。
【０１７２】
核酸をスライドガラスなどの固体基板に結合するには、当該技術分野において複数の技法が公知である。１つの方法は、アミン基、アミン基の誘導体または正電荷を持つ別の基など、固体基板に結合できる部分を含む修飾塩基またはアナログを、増幅した核酸に導入することである。次に、この増幅産物を、増幅産物にある反応基と共有結合を形成するアルデヒドまたは別の反応基でコーティングしたスライドガラスなどの固体基板と接触させると、増幅産物は、スライドガラスに共有結合する。増幅産物を含むマイクロアレイを、バイドット（Ｂｉｏｄｏｔ）（バイオドットインク（ＢｉｏＤｏｔ，Ｉｎｃ．）アーバイン（Ｉｒｖｉｎｅ），カリフォルニア州）スポッティング装置およびアルデヒドコーティングスライドガラス（ＣＥＬアソシエーツ（ＣＥＬ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ），ヒューストン，テキサス州）を用いて作製してもよい。増幅産物をアルデヒドコーティングスライドにスポットし、公開された手順に準じて処理しても構わない（Ｓｃｈｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９５）９３：１０６１４−１０６１９）。また、ロボットでアレイをガラス、ナイロン（Ｒａｍｓａｙ，Ｇ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９８），１６：４０−４４）、ポリプロピレン（Ｍａｔｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９５），２２４（１）：１１０−６）およびシリコーンスライド（Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ａ．ａｎｄ  Ｈｏｄｇｓｏｎ，Ｊ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９８），１６：２７−３１）にプリントしてもよい。アレイ構築に関する他のアプローチとして、電界内での微細なマイクロピペッティング（Ｍａｒｓｈａｌｌ  ａｎｄ  Ｈｏｄｇｓｏｎ，ｓｕｐｒａ）および正に帯電したコーティングプレートへのポリヌクレオチドの直接スポッティングが挙げられる。さらに、アミノプロピルケイ素の界面化学を用いた方法などの各方法も当該技術分野において公知であり、ｗｗｗ．ｃｍｔ．ｃｏｒｎｉｎｇ．ｃｏｍおよびｈｔｔｐ：／／ｃｍｇｍ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｐｂｒｏｗｎ／で公開されている。
【０１７３】
マイクロアレイを作製する１つの方法は、高密度ヌクレオチドアレイを作製するものである。ポリヌクレオチドの高速沈着については、いくつかの技法が知られている（Ｂｌａｎｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ＆  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，１１：６８７−６９０）。たとえば、マスキングよるなど他のマイクロアレイ作製法（Ｍａｓｋｏｓ  ａｎｄ  Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．（１９９２），２０：１６７９−１６８４）を用いてもよい。原則として、たとえば、上述のようなナイロンハイブリダイゼーション膜へのドットブロットなど、どのようなタイプのアレイを用いてもよい。しかしながら、当業者であれば理解するように、ハイブリダイゼーション量が少なくなるため、非常に小さなアレイが好まれる場合が多い。
【０１７４】
キット
さらに、本発明は、本明細書に記載の様々な方法のためのキットも提供する。
【０１７５】
たとえば、いくつかの実施形態は、本明細書に記載するようなｍｉＲＮＡのレベルを判定するシステム（マイクロアレイなど）を含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、アッセイを行うための追加試薬をさらに含む。キットは、本発明の方法を実施する好ましい方法を詳述した説明書またはユーザーマニュアルおよび／またはそうした説明書を取得できるインターネットサイトに関する言及をさらに含んでもよい。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、食道癌を診断するための、本明細書に記載のシステム（マイクロアレイなど）を含むキットを提供する。キットは、参照レベルの判定用の対照サンプル（単数または複数）および／または参照レベルの取得に関する情報をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載するような食道癌を診断するキットの使用説明書をさらに含んでもよい。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、食道癌の個体を分類するための、本明細書に記載のシステム（マイクロアレイなど）を含むキットを提供する。キットは、個体の分類用の対照サンプルおよび／または対照サンプルに関する情報をさらに含んでもよく、いくつかの実施形態では、個体の分類用のキットの使用説明書をさらに含んでもよい。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、食道癌の個体の生存の予後を判定するためのキットを提供する。こうしたキットは、たとえば、図３に示すｍｉＲＮＡなどのｍｉＲＮＡを検出するプローブを含んでもよい。いくつかの実施形態では、キットは、閾値レベルの判定用の対照サンプルおよび／または閾値レベルの取得に関する情報をさらに含む。いくつかの実施形態では、キットは、個体の生存についての予後を判定するためのキットの使用説明書をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態では、キットは、ｍｉＲＮＡのレベルを低下させる薬または生存を改善するそうした薬を含む医薬組成物をさらに含んでもよい。
【０１７９】
本明細書に記載のキットは、以下に限定されるものではないが、基質、標識、プライマー、ｍｉＲＮＡ標識用試薬、ｍｉＲＮＡ単離用試薬、ハイブリダイゼーションおよび検出用の陰性または陽性対照、チューブおよび／または他の付属物、組織サンプル採取用試薬、緩衝剤、ハイブリダイゼーションチャンバ−、カバースリップなどの試薬をさらに含んでもよく、さらに、たとえば、本明細書に記載するような統計学的方法を用いてｍｉＲＮＡのレベルおよび／またはｍｉＲＮＡのレベルの特徴的な変化を解析するソフトウェアパッケージおよび任意に編集データベースを評価するためのパスワードおよび／またはアカウント番号を含んでもよい。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、図３に示すｍｉＲＮＡのレベルを低下させる薬を含む医薬組成物と食道癌の個体の生存を改善する組成物の使用説明書とを含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、組成物を送達するベクターまたは他の薬をさらに含む。いくつかの実施形態では、キットは、医薬組成物の投与説明書をさらに含む。
【０１８１】
以下の実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【０１８２】
（実施例１）
この実施例は、ｍｉＲＮＡレベルの解析サンプルの調製を示す。
【０１８３】
患者およびサンプル
第１の食道扁平上皮癌組織および対応する隣接正常食道組織３１対をトレーニング群として用いた。これらの標本については、１９９９〜２００１年にインフォームドコンセントおよび同意を得て中国医学科学院（ＣＡＭＳ：Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）癌研究所・癌病院（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ａｎｄ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）の患者から取得した。組織サンプルはすべて、手術を受ける未処置の患者由来であり、液体窒素で急速凍結し、ｍｉＲＮＡの抽出まで−８０℃で保存（最低６年）しておいた。５対の症例由来の新鮮な組織（第２の独立したセット）を２００６年に同じ病院から収集して６ヶ月未満保存しおき、これを独立バリデーションデータセットとして用いた。切除した食道癌の周辺部分をパラフィン包埋、薄切りし、通常のＨ＆Ｅ（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  ａｎｄ  ｅｏｓｉｎ）染色した。この腫瘍細胞について病理学者が濃度を評価し、組織型を確認した。ＣＡＭＳ癌研究所・癌病院の追跡登録から追跡情報を得た。すべてのサンプルについて、臨床病理情報（年齢、性別、病態、分化、ＴＮＭ（ｔｕｍｏｒ  ｎｏｄｅ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）分類、腫瘍病期および手術後の生存期間）が入手可能であった。本研究は、ＣＡＭＳ癌研究所・癌病院の医療倫理委員会により承認された。
【０１８４】
ｍｉＲＮＡマイクロアレイの作製
全部で５０９の成熟ｍｉＲＮＡの配列を構築して我々のｍｉＲＮＡマイクロアレイデザインに組み込んだが、これら配列は、ｍｉＲＮＡ登録（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ；２００５年９月にアクセス）の成熟ｍｉＲＮＡをヒトで４３５（発表された参考資料（Ｘｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）からさらに予測される１２２のｍｉＲＮＡ配列を含む、ラットで１９６およびマウスで２６１含んでいた。さらに、既知のＲＮＡ配列と相同性がまったくない８個の小さいオリゴヌクレオチドを設計し、それに対応する合成ｍｉＲＮＡを、アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）社製のｍｉＲＮＡプローブ合成キット（カタログ番号１５５０，オースティン（Ａｕｓｔｉｎ），テキサス州）を用いてインビトロ転写で作製した。これらの合成ｍｉＲＮＡを、解析する前に内部対照として様々な量でヒトｍｉＲＮＡサンプルに加えた。
【０１８５】
ｍｉＲＮＡプローブ配列のすべてを、それに相同的な全長成熟ｍｉＲＮＡと完全に相補的になるように設計した。プローブがスライドガラス（キャピタルバイオコーポレーション（ＣａｐｉｔａｌＢｉｏ  Ｃｏｒｐ．））のアルデヒド修飾表面に固定しやすいように、プローブ配列を、５’アミノ修飾試薬（Ｃ６）により長さ４０ｎｔ（３’末端にｍｉＲＮＡプローブと５’末端に１９ｍｅｒのポリＴ）まで連結した。オリゴヌクレオチドプローブをＭＷＧバイオテクカンパニー（Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｃｏｍｐａｎｙ）で合成し、濃度４０μＭでＥａｓｙＡｒｒａｙ（商標）スポッティング溶液（キャピタルバイオコーポレーション）に溶解した。各プローブをＳｍａｒｔＡｒｒａｙ（商標）マイクロアレイヤー（キャピタルバイオコーポレーション）を用いて３回ずつプリントした。
【０１８６】
標的ＲＮＡの標識
全ＲＮＡをトリゾール試薬（インビトロジェン，カールズバッド，カリフォルニア州）で抽出し、アンビオン社製のｍｉＲＮＡ単離キットを用いて低分子量ＲＮＡを単離した。Ｔｈｏｍｓｏｎのプロトコル（Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）に従って、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ標識法を採用した。手短に言えば、４μｇの低分子量ＲＮＡを、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ（ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ），北京，中国）２ユニットを用いて５００ｎｇの５’−リン酸−シチジル−ウリジル−ｃｙ３−３’（ダーマコン，ラファイエット（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ），コロラド州）で標識した。４ｏＣで２時間標識反応を行った。標識したＲＮＡを０．３Ｍの酢酸ナトリウムおよび２．５容量のエタノールで沈殿させ、エタノールで洗浄し乾燥後、３×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳおよび１５％ホルムアミド含む１５μｌのハイブリダイゼーション緩衝液に再懸濁した。
【０１８７】
スライドハイブリダイゼーション
ＬｉｆｔｅｒＳｌｉｐＴＭ（エリー（Ｅｒｉｅ），ポーツマス，ニューハンプシャー州）というハイブリダイゼーションチャンバ−内でハイブリダイゼーションを行った。このチャンバーを三相タイリング撹拌機ＢｉｏＭｉｘｅｒＴＭ（キャピタルバイオ）に入れ、ハイブリダイゼーション緩衝液を連続的に混合した。こうすればハイブリダイゼーションがスライド表面全体にわたりより均一になり、エッジ効果を防ぐ。その効率については、我々のゲノムワイドなｍＲＮＡ発現プロファイリングで明らかにされている。ハイブリダイゼーションを４２ｏＣ水浴中で一晩行った。次に、このアレイを、０．２％ＳＤＳ、２×ＳＳＣ洗浄液（２つの洗浄液は連続緩衝液）で４２℃にて５分および０．２％ＳＳＣ洗浄液で室温にて５分洗浄した。アレイを共焦点ＬｕｘＳｃａｎＴＭスキャナーでスキャンし、その後、得られた画像をＬｕｘＳｃａｎＴＭ３．０ＴＭソフトウェア（２つともキャピタルバイオ社製）を用いて解析した。
【０１８８】
コンピューター解析
各ｍｉＲＮＡの複製スポットの平均値からバックグランドを除去し、補正してさらなる解析に供した。補正については、各チップの中間値による補正法および中間値のアレイを用いて行った。データを選別して、すべてのサンプル中で発現シグナルが８００未満の遺伝子を除去した。ｍｉＲＮＡの発現の変化をマイクロアレイの有意性解析（ＳＡＭ：Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）（ｗｗｗ−ｓｔａｔ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／〜ｔｉｂｓ／ＳＡＭ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌに掲載されている）で確認した。ＳＡＭは、すべての測定値の標準偏差と比較して発現の変化に基づき遺伝子ごとにスコアを算出する。平均法およびピアソン相関により階層的クラスタリングを行った。クロスバリデーションおよびテストセットの予測には、サポートベクターマシーンツールを用いた。
【０１８９】
最も有意なｍｉＲＮＡの予測標的を、一般に入手可能な４つのアルゴリズム、すなわち、ＭＩＲＡＮＤＡ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉＲＮＡ．ｏｒｇ／）、ＴＡＲＧＥＴＳＣＡＮ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ．ｏｒｇ／）、ＰＩＣＴＡＲ（ｈｔｔｐ：／／ｐｉｃｔａｒ．ｂｉｏ．ｎｙｕ．ｅｄｕ／）およびｍｉＲＢａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｍｉＲＮＡ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ／）を用いて解析した。偽陽性の数を減少させるため、プログラムの少なくとも３つが予測する推定標的遺伝子のみを許容した。カプランマイヤープロットを用いてｍｉＲＮＡ発現と診断から治療終了までの期間との任意の関連を確認した。
【０１９０】
表１．
リアルタイムＰＣＲ解析
ｍｉＲＮＡの発現プロファイルを検証するため、マイクロＲＮＡ特異的プライマーを用いて全細胞ＲＮＡをｑＲＴ−ＰＣＲに供した。逆転写酵素反応には、２．５ｎｇ／μｌの全ＲＮＡ、２５ｎＭのステムループＲＴプライマー、１×ＲＴ緩衝液、０．２５ｍＭずつのｄＮＴＰ、２００ＵのＭ−ＭＬＶ（Ｍｏｌｏｎｅｙ−ｍｕｒｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素および０．２５Ｕ／ｍｌのＲＮアーゼ阻害剤（インビトロジェン）を加えた。７．５ｍｌの反応物を、ＭＪリサーチ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）のＰＴＣ−２２５サーマルサイクラー内で１６℃で３０分間、４２℃で３０分間、８５℃で５分間インキュベートし、その後４℃に維持した。鋳型なし対照を含むすべての逆転写酵素反応を２回ずつ行った。リアルタイムＰＣＲには、製造者のプロトコルに従いＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  ＩキットおよびＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（どちらもロシュダイアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ），マンハイム（Ｍａｎｎｈｅｉｍ），ドイツ）を用いた。１０μｌのＰＣＲ溶液に１μｌのＲＴ産物、１×ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、１５ｎＭのフォワードプライマーおよび１５ｎＭのリバースプライマーを加えた。この反応物を９５℃で１０分間インキュベートし、続いて９５℃で１５秒、６０℃で３５秒および７２℃で３秒４０サイクルインキュベートした。鋳型なし対照を含むすべてのｑＲＴ−ＰＣＲ反応を２回ずつ行った。交点（ＣＰ：ｃｒｏｓｓｉｎｇ  ｐｏｉｎｔ）をサイクル数としてｍｉＲＮＡの相対的発現率を判定した。内因性対照としてヒトＵ６の遺伝子発現アッセイを用いた。結果をＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒソフトウェアバージョン３．５（ロシュダイアグノスティックス）を用いて解析した。融解曲線解析およびアガロースゲル電気泳動による確認を行い、リアルタイムＰＣＲ増幅産物を解析した。プライマー配列を表１に示す。
【０１９１】
【表１】
2010510769.tif 000002
（実施例２）
この実施例は、食道癌組織サンプル中のｍｉＲＮＡの発現の変化を示す。
【０１９２】
キノコ状と髄様型の扁平上皮癌、腫瘍の様々な病期分類および全コホートの対など、いくつかの群の対でｍｉＲＮＡの発現を比較した。最初に、すべての凍結サンプルから検出された１９１のｍｉＲＮＡの発現強度を比較した。個々の癌サンプルとパラ癌サンプルを平均法およびピアソン相関によりすべて比較検討した結果、任意のサンプル対の発現類似性に基づくサンプルの階層的クラスタリングが得られた。この最初のクラスタリングでは、癌サンプル１個およびパラ癌サンプル５個を除き、癌組織とパラ癌組織の６２個のサンプルが、２種類の群にうまく分かれた。
【０１９３】
各癌とそれに対応して対をなす非癌性組織をＳＡＭで比較したところ、４０のｍｉＲＮＡの発現プロファイルで２つの群間に統計学的な差があった。図１および図４を参照されたい。また、癌を様々な表現型分類および組織学的分類で比較して発現プロファイルを作成し、最後に、各癌とそれに対応して対をなす非癌性組織を比較した。我々は、様々な組織学的分類および癌の病期分類において発現が異なるｍｉＲＮＡを同定した（表２）。解析には２つの方法を用いたが、１つは癌組織のシグナル強度に直接基づき、もう１つは癌サンプルと、対をなすパラ癌サンプルのシグナル比に基づくものであった。概ね比で見るよりも直接のシグナル強度で見た方が同定されるｍｉＲＮＡ遺伝子はずっと多いが、注目すべきは、病理学的分類（キノコ状と髄様型）で５種の遺伝子（ｈｓａ−ｍｉＲ−３３５、−１８１ｄ、−２５、−７、−４９５）および食道（ｅｏｓｏｐｈａｇｕｓ）の癌の位置（上部と中部と下部）で２種の遺伝子（ｈｓａ−ｍｉＲ−２５、−１３０ｂ）が同定され、両方の分類法で複数のｍｉＲＮＡ遺伝子が同定されたことであった。
【０１９４】
【表２Ａ】
2010510769.tif 000003
【０１９５】
【表２Ｂ】
2010510769.tif 000004
【０１９６】
【表２Ｃ】
2010510769.tif 000005
独立した新鮮な食道癌組織セットを用いて、保存しておいた凍結組織のｍｉＲＮＡ発現プロファイルの確認を行った。５対の新鮮な組織セット（テスト）のｍｉＲＮＡ発現のマイクロアレイ解析を３１対の凍結保存組織セット（トレーニング）と直接比較した。それを図５に示す。１０個のテストサンプルをＳＶＭ法を用いて確認したところ、テストサンプルの８／１０が正確に分類された。２つの癌組織セットで検出されたｍｉＲＮＡを比較すると凍結保存された組織で１９１のｍｉＲＮＡが発現したのに対し、新鮮な組織で検出されたのは１６４であった。約１５５のｍｉＲＮＡが２つの腫瘍組織セットで共通して見出された。やはり注目すべきは、トレーニングサンプルとテストサンプルのどちらでも、同じ４０のｍｉＲＮＡが癌組織とパラ癌組織の間で発現が異なることが明らかになり、凍結保存された食道組織は新鮮な組織が示すレベルおよび比でｍｉＲＮＡを保持していることが示唆されたことであった。
【０１９７】
（実施例３）
この実施例は、ｍｉＲＮＡのレベルと食道癌患者の生存の相関関係を示す。
【０１９８】
生存期間が最初の診断から２０ヶ月よりも短いか長いかで最初のトレーニングセットである３１の患者サンプルを２つの群に分けた。それぞれ発現が異なるｍｉＲＮＡの強度を、各生存群のシグナルの平均値を求めて検査した。次に、これら２つの平均強度値の平均（ｍｅａｎ）をカプランマイヤー解析のシグナルの閾値強度として用いた。３種のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、−１０７、−２３ｂ）は、診断から９０ヶ月まで低発現の全生存期間の長さとの間で強い相関関係を示した。図３および図６大部分のｍｉＲＮＡは通常、その標的ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を下方制御するように機能することを考慮すれば、この相関関係からこれらのｍＲＮＡ標的（単数または複数）は、腫瘍抑制因子（単数または複数）としての機能を果たすことが示唆される。さらに興味深いことに、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂの発現レベルは、腫瘍病期分類Ｉ〜ＩＩＩに関連して同定されただけでなく、直接のシグナル強度によって同定されたことであった（表２）。さらに、患者の無病生存に関するカプランマイヤー解析でもやはり、低レベルの発現と無病生存期間の長さとが相関する２つのｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、−１０７）が同定された。
【０１９９】
マイクロアレイデータの確認をリアルタイムＰＣＲ解析で行った。ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３およびｈｓａ−ｍｉＲ−１０７についてリアルタイム解析およびマイクロアレイプロファイリングを行い、成熟ｍｉＲＮＡの量が食道癌患者の予後特性サインになるか判定した。
【０２００】
前述の発明について理解しやすいように図面および実施例によりある程度詳細に記載してきたが、いくつかの軽微な変形および変更を実施できることが当業者には明らかである。したがって、説明および実施例を本発明の範囲を限定するものとして解釈してはならない。
【図１−１】
2010510769.tif 000006
【図１−２】
2010510769.tif 000007
【図２ａ】
2010510769.tif 000008
【図２ｂ−１】
2010510769.tif 000009
【図２ｂ−２】
2010510769.tif 000010
【図２ｃ】
2010510769.tif 000011
【図３】
2010510769.tif 000012
【図４】
2010510769.tif 000013
【図５】
2010510769.tif 000014
【図６】
2010510769.tif 000015
【手続補正書】
【提出日】平成21年5月29日(2009.5.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2010510769000001.app
【国際調査報告】
2010510769.tif 000016
2010510769.tif 000017
2010510769.tif 000018
2010510769.tif 000019