(57)【要約】  本発明は、一般的に、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に、そして特に、ＨＩＶ−１エンベロープ（Ｅｎｖ）免疫原に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ４結合部位突然変異またはスーパー抗原（ＳＡｇ）結合モチーフ突然変異を含むＨＩＶ−１エンベロープ（Ｅｎｖ）タンパク質を含む免疫原。
【請求項２】
前記Ｅｎｖタンパク質がｇｐ１４０を含む、請求項１記載の免疫原。
【請求項３】
ＣＤ４結合部位突然変異およびＳＡｇ結合モチーフ突然変異を含む、請求項１記載の免疫原。
【請求項４】
前記Ｅｎｖタンパク質が前記ＣＤ４結合部位突然変異を含み、そして前記免疫原がＣＤ４に結合しない、請求項１記載の免疫原。
【請求項５】
前記突然変異が３５８〜３６０位のアミノ酸の１以上にある、請求項２記載の免疫原。
【請求項６】
突然変異が３５８〜３６０位でアミノ酸配列ＡＰＡを生じる、請求項５記載の免疫原。
【請求項７】
前記Ｅｎｖタンパク質が前記ＳＡｇ結合モチーフ突然変異を含む、請求項１記載の免疫原。
【請求項８】
ＳＡｇ１モチーフの配列ＬＦＮがＡＡＡに突然変異し、そしてＳＡｇ２モチーフの配列ＩＫＱがＡＡＡに突然変異する、請求項７記載の免疫原。
【請求項９】
モノクローナル抗体２Ｆ５または４Ｅ１０が前記免疫原に結合する、請求項１記載の免疫原。
【請求項１０】
請求項１記載の前記免疫原およびキャリアーを含む、組成物。
【請求項１１】
請求項１記載の免疫原をコードする配列を含む、核酸構築物。
【請求項１２】
請求項１１記載の核酸およびキャリアーを含む、組成物。
【請求項１３】
哺乳動物において免疫応答を誘導する方法であって、前記哺乳動物に、前記誘導を達成するのに十分な量の請求項１記載の免疫原を投与する工程を含む、前記方法。
【請求項１４】
哺乳動物において免疫応答を誘導する方法であって、前記哺乳動物に、請求項１１記載の前記核酸を、前記配列が発現され、前記免疫原が産生され、そして前記誘導が達成されるような条件下で投与する工程を含む、前記方法。
【請求項１５】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１３または１４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００７年４月１３日出願の米国仮出願第６０／９０７，７１９号から優先権を請求し、該出願の全内容は、本明細書に援用される。
本発明は、米国衛生研究所によって授与される助成金番号ＡＩ０６７８５４のもとに米国政府の援助を受けて作成された。米国政府は、本発明において特定の権利を有する。
技術分野
本発明は、一般的に、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に、そして特に、ＨＩＶ−１エンベロープ（Ｅｎｖ）免疫原に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＩＶ−１感染における免疫応答において、定量的および定性的異常のいくぶんかは、Ｅｎｖスーパー抗原（ＳＡ）活性によって仲介されるｇｐ１６０の免疫抑制活性の存在のためである（Ｋａｒｒａｙら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９４（４）：１３５６−１３６０（１９９７））か、あるいはＴ細胞、マクロファージまたはＤＣ上のＣＤ４へのｇｐ１２０結合の免疫抑制効果による（Ｐａｎｔａｌｅｏら，  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３２８（５）：３２７−３３５（１９９３）、Ｖｉｎｇｅｒｈｏｅｔｓら，  Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １１１（１）：１２−１９（１９９８））可能性があると仮定されてきている。本発明は、少なくとも部分的に、この仮説を試験するように設計された研究から生じる。これらの研究には、広範中和抗体が結合可能であるエピトープを発現するＨＩＶ−１  Ｅｎｖの産生、およびこうしたＥｎｖがスーパー抗原活性を持たず、そして／またはこれらが免疫抑制方式で免疫細胞ＣＤ４に結合不能であるような突然変異が含まれた。本発明は、こうした突然変異エンベロープに、そして該エンベロープを用いて免疫応答を誘導する方法に関する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｋａｒｒａｙら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９４（４）：１３５６−１３６０（１９９７）
【非特許文献２】Ｐａｎｔａｌｅｏら，  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３２８（５）：３２７−３３５（１９９３）
【非特許文献３】Ｖｉｎｇｅｒｈｏｅｔｓら，  Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １１１（１）：１２−１９（１９９８）
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、一般的に、ＨＩＶに、そしてより具体的には、免疫原性組成物、および該組成物を用いて、ＨＩＶに対する免疫応答を誘導する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】ＨＩＶ−１  ＪＲＦＬ  Ｅｎｖ、ならびにＣＤ４結合部位およびスーパー抗原モチーフに突然変異を含む突然変異体ＪＲＦＬ  Ｅｎｖの模式的構造。
【図２】ＨＩＶ−１  ＪＲＦＬ突然変異体ｇｐ１４０  Ｅｎｖのウェスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイ。
【図３】ＨＩＶ−１  ＪＲＦＬ突然変異体ｇｐ１４０  Ｅｎｖの表面プラズマ共鳴。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
本発明は、ＣＤ４結合部位、可変ループ、ＭＰＥＲ  ４Ｅ１０および２Ｆ５中和エピトープとともに、他の中和エピトープなどの多様な抗原性エピトープを含有するＨＩＶ−１エンベロープ（Ｅｎｖ）に関して、以下に例示される。今日まで免疫原として用いられているＨＩＶ−１  Ｅｎｖは、選択されたＨＩＶ−１初代単離体のみを中和する抗体を誘導する。広範中和抗体が作製不能な１つの理由が、ＳＡｇ活性およびまたはＣＤ４結合性免疫抑制活性によるという仮説を試験するため：１）ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ  ｇｐ１４０ＣＦオリゴマー上のＳＡｇ結合モチーフを除去し、そして２）ＨＩＶ  ＥｎｖオリゴマーのＣＤ４結合部位を破壊するための戦略を発展させた。
【０００７】
ＨＩＶ−１サブタイプＢ初代単離体ＪＲＦＬは、中和するのが比較的困難な単離体である２層（ｔｉｅｒ  ２）ウイルスであるが、それでも、このオリゴマー上によく発現されるＭＰＥＲ  ４Ｅ１０および２Ｆ５  ｇｐ４１広範中和エピトープ両方を有する（Ｌｉａｏら，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３５３：２６８−２８２（２００６））。ＪＲＦＬ  ｇｐ１４０  ＷＴ免疫原は、選択されたいくつかのサブタイプＢ単離体のみを中和するが、自己ＪＲＦＬ単離体を中和しない抗体を誘導した（Ｌｉａｏら，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３５３：２６８−２８２（２００６））。プロトタイプとしてＪＲＦＬ  Ｅｎｖ  １４０オリゴマーを用いて実験を行った（以下の実施例を参照されたい）。
【０００８】
ｐｃＤＮＡ３．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）を用いて、３つの突然変異体ＪＲＦＬ  ｇｐ１４０発現構築物を設計し、そして生成した（図１）。ＣＤ４結合部位が突然変異した組換えＪＲＦＬ  ｇｐ１４０（ＪＲＦＬΔＣＤ４ＢＳ）、ＳＡ結合モチーフの欠失を含むＪＲＦＬ  ｇｐ１４０（ＪＲＦＬΔＳＡｇ）、ならびにＣＤ４結合部位およびスーパー抗原モチーフ両方が突然変異したＪＲＦＬ  ｇｐ１４０（ＪＲＦＬΔＣＤ４ＢＳ−ＳＡｇ）を産生する、安定トランスフェクション２９３Ｔ細胞株が樹立されている。３つの組換えタンパク質すべてを発現させ、そしてレクチンカラムによって、安定トランスフェクション２９３Ｔ細胞株の上清から精製した（図２Ａ）。ＰＮＧアーゼ消化での脱グリコシル化を伴いまたは伴わなず、ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０  ＭＡｂ  Ｔ８、ＪＲＦＬ突然変異体Ｅｎｖを用いたウェスタンブロット分析は、野生型ＪＲＦＬ  Ｅｎｖと比較した際、還元または非還元条件下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける見かけの移動パターンに相違を示さなかった（図２Ａ）。ＥＬＩＳＡアッセイによって、ＣＤ４結合部位またはＳＡモチーフいずれかでの突然変異は、ｇｐ１２０  ＭＡｂ  Ｔ８、ならびにＭＰＥＲ  ＭＡｂである２Ｆ５および４Ｅ１０が結合する能力を維持する一方、これらの突然変異体ＥｎｖがＣＤ４およびＣＤ４結合部位ＭＡｂ、１Ｂ１２に結合する能力を無効にすることが立証された（図２Ｂ）。ＪＲＦＬΔＳＡｇ突然変異体Ｅｎｖはまた、ＣＤ４ｉ  ＭＡｂ  Ａ３２に結合する能力も失った（図２Ｂ）。
【０００９】
表面プラズマ共鳴分析によって、ＪＲＦＬ  Ｅｎｖ突然変異体上の機能性および抗原性エピトープをさらに性質決定した（図３）。ＪＲＦＬΔＣＤ４ＢＳ  ＥｎｖがＨＩＶ  ｇｐ１２０  ＭＡｂ  Ｔ８に強く結合し、そして低レベルでＭＡｂ  Ａ３２に結合する（図３Ａ）ことが見出されているが、ＪＲＦＬΔＣＤ４ＢＳ  ＥｎｖへのＭＡｂ  １７Ｂの恒常的結合、または抗ｇｐ４１  ＭＡｂ  ７Ｂ２結合は観察されなかった。ＣＤ４結合接触点の１つでアミノ酸ＤＰＥをＡＰＡで置換すると、ＪＲＦＬΔＣＤ４ＢＳ  ＥｎｖがＣＤ４に結合する能力が完全に無効にされた（図３Ａ）。多様な抗ＨＩＶ−１  Ｖ３抗体もまた、ＪＲＦＬ  ｇｐ１４０  Ｅｎｖ（図３Ｂ、実線）とともに、ＪＲＦＬΔＣＤ４ＢＳ  ｇｐ１４０  Ｅｎｖ（図３Ｂ、破線）の両方に結合した。ＨＩＶ−１  ＭＰＥＲ  ｍＡｂである２Ｆ５および４Ｅ１０が、ＪＲＦＬ  ｇｐ１４０（図３Ｃ、実線）およびＪＲＦＬΔＣＤ４ＢＳ  ｇｐ１４０（図３Ｃ、破線）の両方に、匹敵するレベルで結合したため、ＨＩＶ−１  ＭＰＥＲ中和エピトープは保持されていた。しかし、ＪＲＦＬΔＣＤ４ＢＳ  ｇｐ１４０は、低アビディティーでＪＲＦＬ  ｇｐ１４０に結合する非中和性ネズミＭＰＥＲ  ＭＡｂ  ５Ａ９に結合せず、一方、ＪＲＦＬ  ｇｐ１４０（図３Ｄ、実線）およびＪＲＦＬΔＣＤ４ＢＳ  ｇｐ１４０（図３Ｄ、破線）の両方へのヒト・クラスターＩＩ  ＭＡｂ  ９８−６および１２６−６の強い結合が観察された。ＣＤ４結合部位およびＳＡモチーフ両方での突然変異を含むＪＲＦＬ  Ｅｎｖの機能特性および免疫原性特性の研究が進行中である。
【００１０】
本発明の１つの側面の免疫原は、可溶性型であるか、あるいは例えばトランス脂質（ｔｒａｎｓｌｉｐｉｄ）二重層エンベロープを含有する細胞小胞またはリポソーム中に係留されたかいずれかのエンベロープを含む。より天然のエンベロープを作製するため、天然三量体エンベロープ形成のため、脂質二重層中で配列を形成してもよい。あるいは、本発明は、ｇｐ１６０の形で、免疫原として使用可能である。
【００１１】
当該技術分野に周知の技術を用いて、本発明の免疫原を薬学的に許容されうるキャリアーおよび／またはアジュバント（ミョウバンまたはｏＣｐＧなど）とともに配合してもよい。本免疫原の適切な投与経路には、全身（例えば筋内または皮下）が含まれる。粘膜免疫系における免疫応答が求められる場合、別の経路を用いてもよい（例えば鼻内）。
【００１２】
本発明の免疫原を化学的に合成してもよいし、または周知の組換えＤＮＡ技術を用いて合成してもよい。本発明の免疫原をコードする核酸を、例えばコード配列を裸のＤＮＡとして投与するＤＮＡワクチンの構成要素として用いてもよいし、または例えば、免疫原をコードするミニ遺伝子が、ウイルスベクター中に存在してもよい。コード配列は、例えば、複製または非複製アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、弱毒化結核菌（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ベクター、カルメット・ゲラン桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ  Ｇｕｅｒｉｎ）（ＢＣＧ）ベクター、ワクシニアまたは修飾ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ベクター、別のポックスウイルスベクター、組換えポリオおよび他の腸管ウイルスベクター、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種細菌ベクター、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）種細菌ベクター、ベネズエラ・ウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）ベクター、セムリキ森林ウイルスベクター、またはタバコモザイクウイルスベクター中に存在してもよい。コード配列はまた、例えばＣＭＶプロモーターなどの活性プロモーターを含むＤＮＡプラスミドとして発現されてもよい。また、他の生存ベクターを用いて、本発明の配列を発現してもよい。好ましくはヒト細胞における発現を最適化するコドンおよびプロモーターを用いて、免疫原をコードする核酸を細胞内に導入することによって、患者自身の細胞において、本発明の免疫原の発現を誘導してもよい。ＤＮＡワクチンを作製し、そして用いる方法の例は、米国特許第５，５８０，８５９号、第５，５８９，４６６号、および第５，７０３，０５５号に開示される。
【００１３】
本発明はさらに、免疫学的に有効な量の本発明の免疫原、または該免疫原をコードする核酸配列を、薬学的に許容されうる送達系中に含む組成物に関する。免疫不全ウイルス感染の予防および／または治療のために、該組成物を用いてもよい。アジュバント、乳化剤、薬学的に許容されうるキャリアー、またはワクチン組成物中でルーチンに提供される他の成分を用いて、本発明の組成物を配合してもよい。最適な配合物は、一般の当業者によって容易に設計可能であり、そしてこれには、即時放出および／または持続放出用の、そして全身免疫の誘導および／または局所粘膜免疫の誘導用の配合物が含まれてもよい（例えば配合物を鼻内投与用に設計してもよい）。皮下、鼻内、経口、筋内、または他の非経口もしくは経腸経路を含む、任意の好適な経路によって、本組成物を投与してもよい。単回用量または多数回用量として、免疫原を投与してもよい。最適免疫スケジュールは、一般の当業者によって容易に決定可能であり、そして患者、組成物および求める効果で多様でありうる。
【００１４】
本発明は、本発明の免疫原両方および／または該免疫原をコードする核酸および／または上述のベクター中のミニ遺伝子として発現される免疫原の直接の使用を意図する。例えば、免疫原をコードするミニ遺伝子を初回刺激および／またはブーストとして用いてもよい。
【００１５】
本発明の特定の側面は、以下の限定されない実施例により詳細に記載されうる。（米国出願第１０／５７２，６３８号もまた参照されたい。）
【実施例】
【００１６】
実施例１
ＣＤ４結合部位に突然変異を含むＪＲＦＬ  Ｅｎｖ  ｇｐ１４０ＣＦのクローニング
３５８〜３６０位のアミノ酸配列（ＤＰＥ）は、ＨＩＶ−１  ＥｎｖがＣＤ４に結合する際の接触点の１つであった（Ｋｗｏｎｇら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３９８：６４８−６５９（１９９８））。ＪＲＦＬ  Ｅｎｖ上のＣＤ４結合部位を突然変異させるため、ＰＣＲにおいて使用するための突然変異誘発プライマー２対を設計し、そして合成して（表１）、ＰＣＲによってＤＰＥコード配列をＡＰＡコード配列に変化させることによって、遺伝子配列中に突然変異を導入した。ＨＩＶ−１  ＪＲＦＬ  ｇｐ１４０ＣＦ遺伝子構築物（Ｌｉａｏら，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３５３：２６８−２８２（２００６））をＰＣＲ増幅におけるテンプレートとして用いて、ＪＲＦＬ  Ｅｎｖ突然変異体遺伝子を産生した。２セットの第一周期ＰＣＲを実行して、部位特異的突然変異を導入し、そしてＪＲＦＬ  １４０  ＤＮＡ断片の前半および後半を生成した。順方向プライマー（ＪＲＦＬ−Ｆ１）および逆方向プライマー（ＪＲＦＬ−ｍｕｔ１１６５）のプライマー対を用いることによって、前半ＪＲＦＬ  １４０  ＤＮＡ断片を増幅した。順方向プライマー（ＪＲＦＬ−ｍｕｔ１１４２）および逆方向プライマー（ＪＲＦＬ−Ｒ１９７８）のプライマー対を用いることによって、後半ＪＲＦＬ  １４０  ＤＮＡ断片を増幅した（表１）。これら２セットのＰＣＲから増幅された２つのＪＲＦＬ  ＤＮＡ断片（各１０ｎｇ）を第二周期のＰＣＲのテンプレートとして用い、ＪＲＦＬ−Ｆ１およびＪＲＦＬ−Ｒ１９７８のプライマー対を用いて、全長ＪＲＦＬ  １４０遺伝子を産生した。１単位の高忠実度ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カリフォルニア州カールスバッド）、および各５０ｐｍｏｌプライマーを用いて、総体積５０：ｌ中で、すべてのＰＣＲを行った。ＰＣＲ熱サイクリング条件は以下の通りであった：１周期の９４℃１分間；２５周期の９４℃３０秒間の変性工程、５５℃３０秒間のアニーリング工程、６８℃２分間の伸長工程；および１周期の６８℃５分間のさらなる伸長。生じた全長ＪＲＦＬ  １４０  ＤＮＡ断片をＰＣＲ精製カラム（Ｑｉａｇｅｎ）で精製し、そして制限酵素ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩで酵素消化し、そして次いで、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ部位を介して、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（−）／Ｈｙｇｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏ、カリフォルニア州）にクローニングした。ＣＤ４ＢＳが突然変異したＪＲＦＬの生じたＤＮＡクローン（ｐＪＲＦＬΔＣＤ４ＢＳ）を遺伝子構築物の全長のＤＮＡ配列決定によって検証した。
【００１７】
【表１】
2010523146.tif 000002
【００１８】
スーパー抗原（ＳＡｇ）モチーフに突然変異を含むＪＲＦＬ  Ｅｎｖ  ｇｐ１４０ＣＦのクローニング。スーパー抗原結合部位は、ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０の２つの領域由来のタンパク質配列によって形成される。コアモチーフは、Ｖ４可変領域およびＣ４定常ドメイン隣接アミノ末端領域に渡る不連続エピトープである。３５８〜３６０位のアミノ酸配列（ＡＰＡ）は、ＨＩＶ−１  ＥｎｖがＣＤ４に結合する際の接触点の１つであった（Ｋａｒｒａｙら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９４（４）：１３５６−１３６０（１９９７））。スーパー抗原結合部位を破壊するため、プライマー対（表１、ＪＲＦＬ−Ｆ１１２８およびＪＲＦＬ−Ｒ１２３７）を設計して、ＳＡｇ１領域のＬＦＮコード配列をＡＡＡコード配列に変化させ、そしてＳＡｇ２領域のＩＫＱコード配列をＡＡＡコード配列に変化させた（図１）。ＨＩＶ−１  ＪＲＦＬ  ｇｐ１４０ＣＦ遺伝子構築物（Ｌｉａｏら，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３５３：２６８−２８２（２００６））をＰＣＲ増幅におけるテンプレートとして用いて、ＪＲＦＬ  Ｅｎｖ突然変異体遺伝子を産生した。２セットの第一周期ＰＣＲを実行して、部位特異的突然変異を導入し、そしてＪＲＦＬ  １４０  ＤＮＡ断片の前半および後半を生成した。順方向プライマー（ＪＲＦＬ−Ｆ１）および逆方向プライマー（ＪＲＦＬ−ｍｕｔ−Ｒ１２３７）のプライマー対を用いることによって、前半ＪＲＦＬ  １４０  ＤＮＡ断片を増幅した。順方向プライマー（ＪＲＦＬ−ｍｕｔ  Ｆ１１２８）および逆方向プライマー（ＪＲＦＬ−Ｒ１９７８）のプライマー対を用いることによって、後半ＪＲＦＬ  １４０  ＤＮＡ断片を増幅した（表１）。これら２セットのＰＣＲから増幅された２つのＪＲＦＬ  ＤＮＡ断片（各１０ｎｇ）を第二周期のＰＣＲのテンプレートとして用い、ＪＲＦＬ−Ｆ１およびＪＲＦＬ−Ｒ１９７８のプライマー対を用いて、全長ＪＲＦＬ  １４０遺伝子を産生した。１単位の高忠実度ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カリフォルニア州カールスバッド）、および各５０ｐｍｏｌプライマーを用いて、総体積５０μｌ中で、すべてのＰＣＲを行った。ＰＣＲ熱サイクリング条件は以下の通りであった：１周期の９４℃１分間；２５周期の９４℃３０秒間の変性工程、５５℃３０秒間のアニーリング工程、６８℃２分間の伸長工程；および１周期の６８℃５分間のさらなる伸長。生じた全長ＪＲＦＬ  １４０  ＤＮＡ断片をＰＣＲ精製カラム（Ｑｉａｇｅｎ）で精製し、そして制限酵素ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩで酵素消化し、そして次いで、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ部位を介して、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（−）／Ｈｙｇｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏ、カリフォルニア州）にクローニングした。スーパー抗原結合領域が突然変異したＪＲＦＬの生じたＤＮＡクローン（ｐＪＲＦＬΔＳＡｇ）を遺伝子構築物の全長のＤＮＡ配列決定によって検証した。
【００１９】
ＣＤ４ＢＳおよびスーパー抗原（ＳＡｇ）モチーフ両方に突然変異を含むＪＲＦＬ  Ｅｎｖ  ｇｐ１４０ＣＦのクローニング。ＣＤ４ＢＳおよびスーパー抗原結合部位の両方を破壊するため、ＨＩＶ−１  ＪＲＦＬΔＣＤ４ＳＡｇ  ＤＮＡ構築物をＰＣＲ増幅においてテンプレートとして用いて、ＪＲＦＬ  Ｅｎｖ突然変異体遺伝子を産生した。２セットの第一周期ＰＣＲを実行して、部位特異的突然変異を導入し、そしてＪＲＦＬ  １４０  ＤＮＡ断片の前半および後半を生成した。順方向プライマー（ＪＲＦＬ−Ｆ１）および逆方向プライマー（ＪＲＦＬ−ｍｕｔ１２３７）のプライマー対を用いることによって、前半ＪＲＦＬ  １４０  ＤＮＡ断片を増幅した。順方向プライマー（ＪＲＦＬ−ｍｕｔＦ１１２８）および逆方向プライマー（ＪＲＦＬ−Ｒ１９７８）のプライマー対を用いることによって、後半ＪＲＦＬ  １４０  ＤＮＡ断片を増幅した（表１）。これら２セットのＰＣＲから増幅された２つのＪＲＦＬ  ＤＮＡ断片（各１０ｎｇ）を第二周期のＰＣＲのテンプレートとして用い、ＪＲＦＬ−Ｆ１およびＪＲＦＬ−Ｒ１９７８のプライマー対を用いて、全長ＪＲＦＬ  １４０遺伝子を産生した。１単位の高忠実度ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カリフォルニア州カールスバッド）、および各５０ｐｍｏｌプライマーを用いて、総体積５０μｌ中で、すべてのＰＣＲを行った。ＰＣＲ熱サイクリング条件は以下の通りであった：１周期の９４℃１分間；２５周期の９４℃３０秒間の変性工程、５５℃３０秒間のアニーリング工程、６８℃２分間の伸長工程；および１周期の６８℃５分間のさらなる伸長。生じた全長ＪＲＦＬ  １４０  ＤＮＡ断片をＰＣＲ精製カラム（Ｑｉａｇｅｎ）で精製し、そして制限酵素ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩで酵素消化し、そして次いで、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ部位を介して、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（−）／Ｈｙｇｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏ、カリフォルニア州）にクローニングした。ＣＤ４ＢＳが突然変異したＪＲＦＬの生じたＤＮＡクローン（ｐＪＲＦＬΔＣＤ４ＢＳ−ＳＡｇ）を遺伝子構築物の全長のＤＮＡ配列決定によって検証した。
【００２０】
安定細胞株の生成および発現：突然変異体ＪＲＦＬ  Ｅｎｖを発現させるための安定トランスフェクション細胞株を樹立するため、ヒト細胞株２９３Ｔを用いた。組織培養プレート中の２９３Ｔ細胞をｐＪＲＦＬΔＣＤ４ＢＳ、ｐＪＲＦＬΔＣＤＢＳ−ＳＡｇ、またはｐＪＲＦＬΔＣＤ４ＢＳ−ＳＡｇプラスミドのいずれかでトランスフェクションした。２０％ウシ胎児血清およびハイグロマイシン（２００μｇ／ｍｌ）を含有する培地中で、ハイグロマイシンに耐性である安定トランスフェクション２９３Ｔ細胞クローンを選択した。ハイグロマイシン圧（２００μｇ／ｍｌ）のもとで、単一コロニーを選択する限界希釈によって、ハイグロマイシン耐性クローンをさらにクローニングした。ＪＲＦＬΔＣＤ４ＢＳ、ＪＲＦＬΔＣＤＢＳ−ＳＡｇ、またはＪＲＦＬΔＣＤ４ＢＳ−ＳＡｇ遺伝子構築物を発現する個々の細胞株が正しいことを、ＤＮＡ配列決定によって確認した。
【００２１】
上記に引用するすべての文書および他の情報供給源は、その全体が本明細書に援用される。
【図１】
2010523146.tif 000003
【図２】
2010523146.tif 000004
【図３】
2010523146.tif 000005
【国際調査報告】
2010523146.tif 000006
2010523146.tif 000007
2010523146.tif 000008