(57)【要約】本発明はＴＨ２媒介炎症症状の治療組成物に関する。本組成物は、非霊長類ＴＳＬＰあるいはそのフラグメントから成るワクチンであり、過剰なＴＨ２によって媒介される炎症症状を発症したヒトの治療のためのワクチンとして用いられる。ヒト以外の哺乳動物におけるＴＨ２媒介炎症症状の治療のためには、ワクチン注射の対象となる動物種のＴＳＬＰが抗原として用いられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト以外の霊長類あるいは他のヒト以外の哺乳動物から得られたＴＳＬＰまたはその少なくとも１個のフラグメントと、薬学的に許容されるアジュバントから成るワクチン。
【請求項２】
元の形状または多重結合された形状でＴＳＬＰの少なくとも１個のフラグメントが担体分子へ結合されていることを特徴とする請求項１項記載のワクチン。
【請求項３】
前記ＴＳＬＰが、ヒト以外の霊長類、すなわち犬、猫、あるいは馬から得られるＴＳＬＰであることを特徴とする請求項１項または２項記載のワクチン。
【請求項４】
ＴＳＬＰワクチンの医薬品としての使用。
【請求項５】
ｃＤＮＡ、またはＴＳＬＰのゲノムシーケンス、またはＴＳＬＰの５を越えるアミノ酸をエンコードする部分をクローンとして発生させること、この発生させたクローンを適当なベクター中へ連結させること、該ベクターを真核あるいは原核ホスト細胞へ転換させて融合タンパク質を生成させること、ＴＳＬＰの全シーケンスあるいはその部分を元の形態のＴＳＬＰ、突然変異させたＴＳＬＰ、あるいは多重結合されたＴＳＬＰ中へ含ませること、及び得られた融合タンパク質を精製し、及び任意であるが適当なアジュバントと混合させること、の各工程から成ることを特徴とする、請求項１項記載のワクチンの調製方法。
【請求項６】
治療対象となる動物種（あるいは近縁な動物種）から得られるＴＳＬＰの全体あるいは一部から成る融合タンパク質及び外来担体タンパク質の、医薬品として用いるワクチン製造への利用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サイトカインＴＳＬＰ（胸腺ストローマリンフォポイエチン）をターゲットとすることによる、ＴＨ２媒介炎症症状の緩和方法、あるいは該炎症の誘発抑制方法に関する。本発明は、概して哺乳動物に用いられるワクチンに関するものであるが、本発明の好ましい実施態様は、ヒト、犬、猫、または馬に用いられるワクチンに関する。以下において、ヒト、猫、馬、あるいは犬用ワクチンに言及しながら本発明について概括的に説明する。
【背景技術】
【０００２】
過去数１０年間において、免疫系機能不全によって生ずる数種疾患が現代医療における主要な課題となっている。このような疾患の一つとしてアレルギー疾患がある。ヒトにおけるアレルギーは過去２０〜３０年間においては殆ど流行病的であり、中でも著しい疾患はアトピーあるいは免疫グロブリン（ＩｇＥ）媒介アレルギーである。アレルギーは、犬、猫、馬などの多くの飼育動物にとっても同様に重大な疾患である。しかしながら、これら飼育動物に関し、ＩｇＥの関与に関する報告はあまり為されていない。ヒトの場合における一般的なアトピー性アレルギーとしては、毛皮アレルギー、枯草熱、ホコリダニアレルギー、昆虫毒アレルギー、外因性喘息、及び多種に亘る食品アレルギーがある。さらに、飼育動物の多くは同種のアレルゲンを原因としてアレルギーを起こしている。全人類人口のほぼ３０％がアレルギーを患っていると推定されている。
【０００３】
アレルギー疾患は免疫系の機能不全によって発症される。種々病原体に対する正常な免疫反応を調節する数種のサイトカインは、アレルギー疾患の過程においても直接関与していると考えられる。サイトカイン、あるいはヒトの免疫系の調節に重要な働きをもつ成長及び分化因子は、疾患介入の潜在的ターゲットとされるものである。
【０００４】
動物薬分野における特に困難な問題の一つとして犬の重篤なアトピー性皮膚炎がある。獣医を訪ねる飼い主のほぼ５０％は主としてこのようなアトピー性皮膚炎を原因とする皮膚病を抱えた者である。他方ヒトの場合、医療的に特に困難とされる病状は重篤な喘息である。極めて重篤なケースにおいては、既存のいかなる治療法によっても十分な臨床効果は得られない。犬の場合、重篤なアトピー性皮膚炎に罹患した状況においては、多くの犬は殺されざるを得ない。ここに一つのまだ対処されていない医学的な大きなニーズがある。
【０００５】
本発明者らは、数年間に亘って、ヒト及び飼育動物におけるＩｇＥ媒介アレルギーに対して可能な治療方法、及びＩｇＥに対するワクチン接種（注射）について研究してきた（文献１〜５参照）。しかしながら、犬のようにＩｇＥレベルが例外的に高い場合には、この治療方法には明らかな限界があった（文献６参照）。このような限界は主として高濃度の循環性ＩｇＥによって引き起こされる強い耐薬性作用によるものである。さらに、大量のターゲット分子が除去されなければならない場合には、良好な臨床効果を得ることは困難である。それゆえ、犬の場合においては、ＩｇＥに対するワクチン接種によって我々の目標を達成することはほぼ不可能であることが分かった（文献６）。そこで新たな革新的方法の開発が必要とされる。本発明では、上記問題に対する一つの可能な解決策、すなわちヒトの免疫性を調節する重要なサイトカインの一種である胸腺ストローマリンフォポイエチン（ＴＳＬＰ）に対するワクチン接種（注射）を提供する。
【０００６】
ＴＳＬＰ（胸腺ストローマリンフォポイエチン）はアレルギー炎症のマスタースイッチとなることが説明されている（文献７）。ＴＳＬＰは、ヒトにおいて、主として上皮細胞及びマスト細胞によって生成されるＩＬ−７様サイトカインである。このサイトカインはｍＤＣを刺激し、投薬処理を受けたことのないＣＤ４＋細胞のＴＨ２型エフェクター細胞への分化を促進する［文献７参照］。これらＴＨ２細胞によってアレルギー助長サイトカインＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３及びＴＮＦ−αが生成されるが、ＩＬ−１０及びＩＦＮ−γは生成されない（文献８）。最近では、ＴＳＬＰによって活性化されたＤＣがＴＨ２感作だけでなく、アレルギー疾患におけるＴＨ２中枢記憶細胞の維持及び分極化にも重要な役割を果たしていることが見出されている（文献９）。アトピー性皮膚炎の病変部分中の角化細胞によって高レベルのＴＳＬＰが発現されること、及びこの角化細胞がアトピー性皮膚炎進行中における主要サイトカインであることが示されている（文献８）。皮膚中に過剰のＴＳＬＰを発現するように遺伝子操作されたマウスもアトピー性皮膚炎を発症し、このマウスでは循環型ＴＨ２細胞の劇的な増加と血清ＩｇＥの上昇が起こる（文献１０）。しかしながら、ＴＳＬＰは末梢組織だけではなく、ヒト胸腺中のハッサル小体によっても発現される。この場合において、ＴＳＬＰは胸腺ＤＣの命令に関与して高親和性自己反応型Ｔ細胞をＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋調節Ｔ細胞へと変換させる。そのレセプターに関し、異種二量体ＴＳＬＰレセプターは骨髄樹状細胞（ｍＤＣ）のみによって排他的に発現されるようである。
【０００７】
ＴＳＬＰはＴＨ２媒介炎症症状の主要調節因子の一つであるとみられ、そのため治療介入にとって極めて重要なターゲットとなる可能性がある（文献１１）。以下に、ＴＳＬＰをターゲットとすることにより過剰なＴＨ２媒介炎症症状を緩和することを目的としたワクチン接種方法（注射）について説明する。このワクチン接種方法は、ヒトにおける重篤な喘息の治療と、犬のアトピー性皮膚炎の治療において新たな重要ステップとなり得るものである。
これまでに、ヒトＴＳＬＰの活性をブロックするモノクローナル抗体及び水溶性レセプターの利用について記載した特許出願が為されている。これらＴＳＬＰをターゲットとする治療方法は、患者の余命の全期間に亘って２〜４週間ごとに高度に精製された組換え型タンパク質を注射することに依存するものである。本願記載のワクチンの場合、組換え型タンパク質の注射に対する依存度が従来技術よりもかなり少なっている点、おそらくモノクローナルあるいは水溶性レセプターを用いた治療に必要とされる量に比べて１０，０００倍程度まで少なくなっている点において大幅に改善されている。このワクチンは殆どの場合１年間に１〜４回投与を受けるだけで良いが、それに対して上述したモノクローナルあるいは水溶性レセプターの場合はもっと頻繁に投与を受ける必要がある。ヒト以外の霊長類のシーケンスを用いることによりヒトにおいて生ずるワクチン免疫力が増大する可能性もある。ワクチン以外の治療方法を行う場合には、注射された組換え型タンパク質の効果を大きく減ずるタンパク質に対する免疫反応が引き出されないように、変化の加えられていないＴＳＬＰ（ヒトタンパク質）が用いられるべきである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Hellman L. 「新アレルギーワクチン処理後におけるアレルゲン感受性の低下」, Eur J Immunol 1994; 24(2): 415-20.
【非特許文献２】Hellman L. 「IgEに対するワクチンは可能か?」, Adv Exp Med Biol 1996; 409: 337-42.
【非特許文献３】Hellman L, Carlsson M. 「アレルギーワクチン、開発のレビュー」、Clin Immunotherapeutics 1996; 6(2): 130-42.
【非特許文献４】Hellman L. 「アレルギーに対するワクチン」、In: Perlmann P, Wigzell H編、Handbook of Experimental Pharmacology, Vol 133, Vaccines. Berlin, Springer-Verlag, 1999: 499-526.
【非特許文献５】Vernersson M, Ledin A, Johansson J, Hellman L. 「IgEに対する治療抗体反応の誘導」、Faseb J 2002; 16(8): 875-7.
【非特許文献６】Ledin A, Bergvall K, Salmon-Hillbertz N, Hansson H, Andersson G, Hedhammar A, et al, 「例外的に高いプラズマIgEレベルをもつ動物種としての犬におけるIgEに対する治療抗体反応の誘導」、Vaccine 2006; 24, 66-74.
【非特許文献７】Liu YJ. 「胸腺ストローマリンフォポイエチン：アレルギー性炎症のマスタースイッチ」、J Exp Med 2006; 203(2): 269-73.
【非特許文献８】Soumelis V, Reche PA, Kanzler H, Yuan W, Edward G, Homey B, et al. 「ＴＳＬＰ生成によるヒト上皮細胞トリガー樹状細胞媒介アレルギー炎症」、Nat Immunol 2002; 3(7): 673-80.
【非特許文献９】Wang YH, Ito T, Wang YH, Homey B, Watanabe N, Martin R, et al. 「胸腺ストローマリンフォポイエチン媒介樹状細胞によるヒトＴＨ２中枢記憶Ｔ細胞の維持及び分極化」、Immunity 2006; 24(6): 827-38.
【非特許文献１０】Yoo J, Omori M, Gyarmati D, Zhou B, Aye T, Brewer A, et al. 「特に皮膚中に誘導可能な胸腺ストローマリンフォポイエチン転換遺伝子を発現させるマウス自発性アトピー性皮膚炎」、J Exp Med 2005; 202(4): 541-9.
【非特許文献１１】Huston DP, Liu YJ. 「胸腺ストローマケンフォポイエチン：アレルギー及び喘息の潜在的治療ターゲット」、Curr Allergy Asth ma Rep 2006; 6(5): 372-6.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は過剰なＴＨ２型免疫によって生ずる種々の炎症症状を治療するための簡便かつコスト効率的方法を提供することを目的とする。ＴＳＬＰ（またはＴＳＬＰの一部）及び外来担体タンパク質から成る融合タンパク質を含んで成るワクチンを用いる治療により、遊離ＴＳＬＰレベルが低下し、それによってサイトカインの過剰放出によって引き起こされる症状が緩和される。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的は、本発明に従って提供される、（ヒトに用いられる場合には）ヒト以外の霊長類から得られるＴＳＬＰの全アミノ酸シーケンス、あるいは前記アミノ酸シーケンスの５を越えるのアミノ酸から成るセグメントをその元の形態あるいは多重結合された形態中にもつタンパク質が含まれるワクチンによって達成される。飼育動物に対して処理する場合には、上記ワクチンに代え、ワクチン化対象動物種から得られるＴＳＬＰシーケンスが用いられる。前記タンパク質は、任意であるがアジュバントを含有させることにより、１または２以上の異種担体タンパク質へ任意に結合させることが可能である。ワクチン抗原中に用いられるＴＳＬＰ分子は、そのレセプターへの結合をブロックするため、１または数か所に突然変異を起こすことによって変更可能である。これにより、ホスト中へ注射された時にはタンパク質にＴＳＬＰ活性はないが、生来のＴＳＬＰと反応する抗体を誘導するタンパク質の能力は猶維持される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】チンパンジーＴＳＬＰのヌクレオチド及び対応アミノ酸シーケンスを示した図である。
【発明を実施するための手段】
【００１２】
能動免疫、つまりワクチン接種（注射）を行うことによりホスト中に抗ＴＳＬＰ抗体が生成される。修飾ＴＳＬＰ分子をホスト体内へ摂種（注射）することにより、ホスト免疫系によってそれ自身のＴＳＬＰに対するポリクローナル抗体反応が引き起こされ、それによって潜在的に過剰なＴＳＬＰ生成の影響に対する下方調節が行われる。ホストの免疫系が、修飾された自己タンパク質が非自己タンパク質であると認識するように抗体を変化させることが最も重要である。それを達成するためには、非自己アミノ酸部分をＴＳＬＰへ、あるいは処理対象となる動物種から得られたＴＳＬＰの特定部分へ共有結合させることが必要である。これにより、前記非自己部分内にあるペプチドによって潜在的に自己反応性であるＢ細胞の働きを助ける非耐性型Ｔ細胞が誘引あるいは活性化される。
自己タンパク質を修飾するためには少なくとも４つの方法がある。一つは、非自己タンパク質と、原核あるいは真核発現系中にある自己ＴＳＬＰの全フラグメントまたは５を越えるのアミノ酸から成るフラグメントとの間に融合タンパク質を生成することである。次いで、まず図１の犬及びヒトＴＳＬＰによって例示されるＴＳＬＰの開放読み取り枠が、細菌、カビあるいは真核融合タンパク質ベクター中へクローンとして発生される。次いで所望される融合タンパク質を生成するため、この融合タンパク質構造体は哺乳動物あるいは原核ホスト中へトランスフェクションされる。この場合、融合対象物は、１０個のアミノ酸ないし数百ｋＤの大きさから成る何らかの非自己タンパク質であることができる。しかしながら、自己タンパク質とほぼ同じ大きさをもつ融合対象物を用いることが一般的に好ましい。
【００１３】
あるいは上記に代わる2つ目の方法として、外来ペプチドの両側上へ自己ＴＳＬＰシーケンスをもつ融合タンパク質を生ずるようにＴＳＬＰ構造中へ免疫優性ペプチドを挿入することも可能である。
【００１４】
３つ目の方法として、哺乳動物ホスト、あるいは原核ホストまたはホスト細胞株中において非修飾ＴＳＬｐを生成し、次いで化学結合によって担体タンパク質へ共有結合させることも可能である。
【００１５】
４つ目の方法として、若干好ましさには欠けるが、ＴＳＬＰシーケンスの特定部分を合成ペプチドとして生成し、次いでこれらのペプチドを化学結合によって外来担体分子へ結合させる方法がある。この４つ目の方法によれば、通常、患者への注射後に、生来の適切に折り畳まれたタンパク質に対して低い結合活性を示し、従って臨床効果も低い抗体反応が引き起こされる。
【００１６】
製造後、次いでワクチン抗原は精製され、発熱物質含量及び起こり得る他混入物質含量の検査が行われる。自己エピトープに対する十分に強い免疫反応を得るため、任意であるが、次いでワクチン抗原は患者へ注射される前にアジュバントと混合される。患者への投与後、ワクチンによってワクチン抗原に対する免疫反応が誘導される。ワクチン抗原中に自己エピトープが存在するため、このタンパク質によってターゲット分子、この場合ではＴＳＬＰに対する抗体反応も誘導され、それによって患者体内に存在するこのタンパク質レベルが減じられる。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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