(57)【要約】本発明は、Ｚ，Ｚ−ＦＰＰ合成酵素及びセスキテルペンＳＢ合成酵素を含む、ＳＢ型のセスキテルペン（アルファ−サンタレン、エピ−ベータ−サンタレン、シス−アルファ−ベルガモテン、トランス−アルファ−ベルガモテン、及びエンド−ベータ−ベルガモテン）及びその前駆体Ｚ，Ｚ−ファルネシル二リン酸（ＺＺ−ＦＰＰ）の生合成経路に関与する遺伝子、ならびに、ＳＢ型のセスキテルペン化合物を産生するためのその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＭＡＰ及びＩＰＰの供給源を有する細胞においてＺ，Ｚ−ＦＰＰからＳＢ型セスキテルペン又はその誘導体を産生するための方法であって、以下：
ａ）該細胞中への、ｚＦＰＳをコード化し、配列番号２と少なくとも８０%の同一性を伴う第１遺伝子を含む発現カセットを有するコンストラクト及びＳＢ合成酵素をコード化し、配列番号４と少なくとも８０%の同一性を伴う第２遺伝子を含む発現カセットを有するコンストラクトの導入；
ｂ）該第１遺伝子及び該第２遺伝子の発現のための適切な条件における形質転換細胞の培養；ならびに、
ｃ）場合により、該細胞中及び／又は培養液中に含まれるＳＢ型セスキテルペン又はその誘導体の回収
を含む、方法。
【請求項２】
Ｚ，Ｚ−ＦＰＰ合成酵素活性及び配列番号２と少なくとも８０%の同一性を伴う配列を有する単離又は組み換えタンパク質。
【請求項３】
その配列が配列番号２に対応することを特徴とする、請求項２記載のタンパク質。
【請求項４】
ＳＢ合成酵素活性を有し、及び、配列番号４と少なくとも８０%の同一性を伴う配列を有する単離又は組み換えタンパク質。
【請求項５】
請求項２から４記載のタンパク質をコード化するヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項６】
請求項５記載の核酸を含む発現カセット。
【請求項７】
請求項５記載の核酸又は請求項６記載の発現カセットを含むベクター。
【請求項８】
請求項５記載の核酸、請求項６記載の発現カセット、又は請求項７記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項９】
請求項５記載の核酸、請求項６記載の発現カセット、請求項７記載のベクター、又は請求項８記載の細胞を含む非ヒトトランスジェニック生物。
【請求項１０】
生物が植物の腺トリコームであり、好ましくはニコチアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）属又はソラナム（Ｓｏｌａｎｕｍ）属からであることを特徴とする、請求項９記載のトランスジェニック生物。
【請求項１１】
ＩＰＰ及びＤＭＡＰの供給源を有する細胞においてＩＰＰ及びＤＭＡＰからＺ，Ｚ−ファルネシル二リン酸（Ｚ，Ｚ−ＦＰＰ）又はその誘導体を産生するための方法であって、以下：
ａ）該細胞中への、請求項２又は３記載のタンパク質をコード化する核酸配列を伴う発現カセットを有するコンストラクトの導入；
ｂ）遺伝子の発現のための適切な条件における形質転換細胞の培養；ならびに、
ｃ）場合により、該細胞中及び／又は培養液中に含まれるその誘導体の回収
を含む、方法。
【請求項１２】
Ｚ，Ｚ−ＦＰＰ、アルファ−サンタレン、エピ−ベータ−サンタレン、アルファ−ベルガモテン、ベータ−ベルガモテン、及びエンド−ベータ−ベルガモテン、又は、アルファ−サンタロール、エピ−ベータ−サンタロール、アルファ−ベルガモトール、ベータ−ベルガモトール、及びＺ，Ｚ−ファルネソールなどのその誘導体を調製するための請求項２から４記載のタンパク質、請求項５記載の核酸、請求項８記載の宿主細胞、又は請求項９又は１０記載のトランスジェニック生物の使用。
【請求項１３】
ＳＢ型セスキテルペンの合成経路が、請求項２又は３記載のタンパク質をコード化する遺伝子もしくは請求項４記載のタンパク質をコード化する遺伝子、又は両方の遺伝子の不活化により遮断されることを特徴とする、細胞又は非ヒトトランスジェニック生物。
【請求項１４】
Ｓ．ハブロカイトと性的和合性のあるソラナム型の種において対応する遺伝子の遺伝子移入を制御するためにＳ．ハブロカイトと該種との間のゲノム多型を同定するための配列番号１又は配列番号３と少なくとも８０%の同一性を伴う核酸の全部又は一部を含む分子マーカーの使用。
【請求項１５】
分子マーカーが配列番号９及び１０に対応する核酸配列を含むことを特徴とする、請求項１４記載の使用。
【請求項１６】
プロトプラスト融合による、ソラナム・ハブロカイト（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）と性的和合性のない種における、ｚＦＰＳをコード化し、配列番号２と少なくとも８０%の同一性を伴うｚＦＰＳ遺伝子、及び、ＳＢ合成酵素をコード化し、配列番号４と少なくとも８０%の同一性を伴うＳＢＳ遺伝子の導入に存する方法。
【請求項１７】
ホスファターゼにより、請求項１１記載の方法に従い得られるＺ，Ｚ−ＦＰＰの脱リン酸化によりＺ，Ｚ−ファルネソールを産生するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セスキテルペンの混合物の合成に関与する２つの遺伝子ならびに細菌、酵母、動物細胞、及び植物などの生きた生物における該化合物を調製するためのそれらの使用に関する。
【０００２】
序論
テルペンは、細菌、カビ、動物、及び植物などの全ての生きた生物に存在する分子である。それらは生物界において天然産物の最大の分類を形成する。植物において、これらの分子はホルモン（ジベレリン、サイトカイニン、ブラシノステロイド、及びアブシシン酸）として、又は、光合成（カロチノイド、クロロフィル、プラストキノン、及びフィトール）、タンパク質プレニル化過程、及び膜構造（ステロール）に関与する化合物として、一次代謝において役割を果たす。しかし、二次代謝から生ずるテルペノイドは、分子のこの分類での構造的多様性の大部分を占める。いわゆる二次テルペノイド（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｔｅｒｐｅｎｏｉｄ）は、主に、例えば、植物に有益な昆虫の誘引（受粉及び植食性昆虫の捕食者）、病原体及び昆虫に対する防御、ならびに光酸化ストレスに対する保護などの環境相互作用において役割を果たす（Tholl, 2006）。
【０００３】
テルペンは複数の５炭素イソプレニル単位で構成される。含まれるイソプレニル単位の数に従って、テルペンは、モノテルペン（１０個の炭素原子又はＣ１０を伴う化合物）、セスキテルペン（Ｃ１５）、ジテルペン（Ｃ２０）、セスタテルペン（Ｃ２５）、トリテルペン（Ｃ３０）、テトラテルペン（Ｃ４０）などに分類される。全てのテルペンの普遍的な前駆体は、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）及びジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）である。２つの別々の経路が、ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰの形成をもたらす。１つのメバロン酸（ＭＥＶ）経路は真核細胞の細胞質中に位置しており、他方のメチル−エリトリトール（ＭＥＰ）経路は、それが葉緑体中に位置する一部の細菌及び植物においてのみ公知である（Rodriguez-Concepcion and Boronat, 2002）。これらの２つの経路における全ての階段及び階段の酵素をコード化する全ての遺伝子は、一定数の生物において公知である。
【０００４】
共通の前駆体であるＩＰＰ及びＤＭＡＰＰからのテルペン生合成の第一段階は、プレニル二リン酸合成酵素（又はプレニルトランスフェラーゼ）により実施され、それは、ホモアリル前駆体であるＩＰＰ及びアリル前駆体（ＤＭＡＰＰ、ゲラニル二リン酸、ファルネシル二リン酸、あるいはゲラニルゲラニル二リン酸）の縮合により、多様な長さのプレニル二リン酸鎖を生成する。プレニル二リン酸合成酵素の２つの主な分類が存在する：シス−プレニルトランスフェラーゼ又はＺ−プレニルトランスフェラーゼ及びトランス−プレニルトランスフェラーゼ又はＥ−プレニルトランスフェラーゼ。シス−プレニルトランスフェラーゼはシス−配置で二重結合の形成をもたらし、トランス−プレニルトランスフェラーゼはトランス配置で二重結合の形成をもたらす（Koyama, 1999）。例えば、トランス−ファルネシル二リン酸合成酵素、又はＥ−ＦＰＳ、によるＤＭＡＰＰへの２単位のＩＰＰの連続付加によって、Ｅ，Ｅ−ファルネシル二リン酸（Ｅ，Ｅ−ＦＰＰ、Ｃ１５）が生じる。鎖伸長反応は、二リン酸イオンの除去後のアリル型カチオンの形成により開始し、アリルプレニルを形成する。次に、１個のＩＰＰを加え、２番目の位置でプロトンが立体特異的に除去され、産物中に新しいＣ−Ｃ結合及び新しい二重結合を形成する。アリルプレニル二リン酸を伴うＩＰＰのこの立体特異的縮合の反復は、その鎖長及び立体化学が各々の酵素に特異的であるプレニル二リン酸の合成をもたらす。特に、終産産物の鎖長は大幅に変動し、Ｃ１０（ゲラニル二リン酸）から、数千の炭素原子で構成される天然ラテックスの前駆体であるポリプレニル二リン酸にまで及ぶ。
【０００５】
先に言及した通り、プレニルトランスフェラーゼは各々の伸長サイクル後に形成される二重結合の立体化学（Ｅ又はＺ）に基づき２つの異なる遺伝子系統に分けることができる（Poulter, 2006; Liang et al., 2002）。
【０００６】
今までに特性付けられたＥ−プレニルトランスフェラーゼは、Ｅ配置を有する短鎖プレニルリン酸（Ｃ１０からＣ５０）の合成をもたらす。例として、ゲラニル二リン酸合成酵素（ＧＰＳ）、ファルネシル二リン酸合成酵素（ＦＰＳ）、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素（ＧＧＰＳ）、オクタプレニル二リン酸合成酵素（ＯＰＳ）、ソラネシル二リン酸合成酵素（ＳＰＳ）、及びデカプレニル二リン酸合成酵素（ＤＰＳ）が挙げられ、それぞれ（Ｅ）−ＧＰＰ（Ｃ１０）、（Ｅ，Ｅ）−ＦＰＰ（Ｃ１５）、（Ｅ，Ｅ，Ｅ）−ＧＧＰＰ（Ｃ２０）、（Ｅ，Ｅ，Ｅ，Ｅ，Ｅ，Ｅ，Ｅ）−ＯＰＰ（Ｃ４０）、（Ｅ，Ｅ，Ｅ，Ｅ，Ｅ，Ｅ，Ｅ，Ｅ）−ＳＰＰ（Ｃ４５）、及び（Ｅ，Ｅ，Ｅ，Ｅ，Ｅ，Ｅ，Ｅ，Ｅ，Ｅ）−ＤＰＰ（Ｃ５０）の合成を触媒する。一般的に、（Ｅ，Ｅ）−ＦＰＰは、２０個を上回る炭素での鎖合成に関与するプレニルトランスフェラーゼの基質であることに注目すべきである。（Ｅ）−プレニルトランスフェラーゼをコード化する最初に特性付けされた遺伝子は、ラットのＦＰＳをコード化する遺伝子であった（Clarke et al., 1987）。Ｅ−プレニルトランスフェラーゼコード配列の配列整列によって、ＤＤＸＸＤ型の２つの保存モチーフが明らかにされている。ＦＰＳによるＸ線結晶構造解析（Tarshis et al., 1994）ならびに部位特異的変異誘発試験により初めて決定されたＥ−プレニルトランスフェラーゼの三次元構造によって、２つのＤＤＸＸＤモチーフが基質結合及び結果として得られる触媒活性に関与することが示された。最後に、第１のＤＤＸＸＤモチーフの上流に位置する少数の特定アミノ酸によって、合成されるイソプレニル鎖の長さが決定されることが示されている（Wang & Ohnuma, 1999）。
【０００７】
Ｚ−プレニルトランスフェラーゼをコード化する第１の遺伝子が、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）においてクローン化された（Shimizu et al., 1998）。この遺伝子はウンデカプレニルトランスフェラーゼ（ＵＰＳ）をコード化し、それはＥ−ＦＰＰを基質として使用し、Ｚ，Ｅ立体化学を伴う５５炭素プレニル二リン酸を形成する。この分子は、一部の細菌における細胞壁のペプチドグリカン生合成に関与する。シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）において特性付けされた相同配列が、１００から１３０個の炭素原子を有するＺ，Ｅ−イソプレニル二リン酸の合成に関与することが示された（Oh et al., 2000）。これらの酵素のアミノ酸配列分析によってＥ−プレニルトランスフェラーゼへの相同性は全く明らかにされなかった（Koyama, 1999）。特に、Ｚ−プレニルトランスフェラーゼは、アスパラギン酸に富むモチーフ（ＤＤＸＸＤ）を持たない。その全てが基質結合及びその触媒において多かれ少なかれ役割を果たす７つの保存領域が同定されている。今までに特性付けられている全てのＺ−プレニルトランスフェラーゼが、５５個の炭素より多い、又は、等しい鎖長を有するプレニル二リン酸を合成するが、基質としてＥ−ＧＰＰを使用して、Ｚ，Ｅ−ＦＰＰを形成するマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のＺ，Ｅ−ＦＰＳは例外である（Schulbach et al., 2000）。Ｍ．ルテウスのＵＰＳに関する最近の部位特異的変異誘発試験によって、合成されるイソプレニル鎖の伸長サイクル数において重要な役割を果たすいくつかのアミノ酸が同定された（Kharel et al., 2006）。
【０００８】
イソプレニル二リン酸は、酵素分類、テルペン合成酵素の基質であり、それはＣ１０（モノテルペン）、Ｃ１５（セスキテルペン）、Ｃ２０（ジテルペン）、及びＣ３０（トリテルペン）中の基本環状骨格又はアシルテルペン骨格の形成を触媒する（Cane 1999; McMillan and Beale, 1999; Wise and Croteau, 1999）。これらの酵素の反応多様性は、天然において見いだされる環状テルペン骨格の多様性の基礎となる。ファルネシル二リン酸の４つの立体異性体が、分子の２及び６番目の位置の二重結合の立体化学的配置に従って理論的に可能である（Ｅ，Ｅ、Ｚ，Ｅ、Ｅ，Ｚ、又はＺ，Ｚ）。しかし、今までに、遺伝子が特性付けされた全てのセスキテルペン合成酵素で、基質としてＥ，Ｅ−ＦＰＰが使用される。これは、例えば、タバコの５−エピ−アリストロチェン合成酵素（Facchini & Chappell, 1992）、グランドモミ（Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）の（Ｅ）−アルファ−ビサボレン合成酵素（Bohlmann et al., 1998）、チコリのゲルマクレンＡ合成酵素（Bouwmeester et al., 2002）、クソニンジン（Ａｎｎｕａｌ  Ｗｏｒｍｗｏｏｄ）のアモルファ−４，ＩＩ−ジエン合成酵素（Wallaart et al., 2001）、トマトのゲルマクレンＣ合成酵素（Colby et al., 1998）、クソニンジンのカリオフィレン合成酵素（Cai et al., 2002）、及びオレンジのバレンセン合成酵素（Sharon-Asa et al., 2003）の例である。それにもかかわらず、最近の研究では、１４のセスキテルペンの混合物の合成を触媒するトウモロコシセスキテルペン合成酵素（ｔｐｓ４）がＥ，Ｅ−ＦＰＰ及びＺ，Ｅ−ＦＰＰを受け取り（Kollner et al., 2006）、それによってセスキテルペン合成酵素がＥ，Ｅ−ＦＰＰ以外の異性体を基質として使用できることが示されたと報告された。しかし、今までにクローン化されたセスキテルペン合成酵素のいずれもＺ，Ｚ−ＦＰＰを使用しない。
【０００９】
ソラナム・ハブロカイト（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）（以前はリコペルシコン・ヒルスタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）として公知）のＶＩ型腺毛（ｇｌａｎｄｕｌａｒ  ｔｒｉｃｈｏｍｅ）は、２つの異なる分類に属する大量のセスキテルペンオレフィンを分泌する。クラスＩは特にゲルマクレンＢを含み、クラスＩＩはとりわけアルファ−サンタレン及びアルファ−ベルガモテンを含む。栽培トマトの遺伝子型（リコペルシコン・エスクレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）＝ソラナム・リコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ））と野生型トマトの遺伝子型（リコペルシコン・ヒルスタム＝ソラナム・ハブロカイト）の間の分離比分析によって、これらの２つの異なるセスキテルペンクラスの生合成が、２つの異なる染色体にマップされる２つの異なる遺伝子座（Ｓｓｔ１Ａ及びＳｓｔ２）により制御されることが示された（van der Hoeven et al., 2000）。Ｓｓｔ１Ａ遺伝子座は第６染色体上に位置し、この遺伝子座の遺伝子はクラスＩセスキテルペンの蓄積に関与する。第８染色体上に位置するＳ．ハブロカイトのＳｓｔ２対立遺伝子は、アルファ−サンタレン、また、シス−アルファ−ベルガモテン、トランス−アルファ−ベルガモテン、エピ−ベータ−サンタレン、及びベータ−ベルガモテン、ならびに他の未同定の微量化合物などのクラスＩＩセスキテルペンの蓄積を制御する。Ｓｓｔ１Ａ遺伝子座の遺伝子のコード配列が同定されているのに対して（van der Hoeven et al., 2000）、これはＳｓｔ２遺伝子座の遺伝子には該当しない。
【００１０】
発明の概要
本発明は、アルファ−サンタレン、エピ−ベータ−サンタレン、シス−アルファ−ベルガモテン、トランス−アルファ−ベルガモテン、及びエンド−ベータ−ベルガモテンで主に構成されるセスキテルペンの混合物ならびにそれらの前駆体Ｚ，Ｚ−ファルネシル二リン酸（Ｚ，Ｚ−ＦＰＰ）の合成に関与する２つの遺伝子、及び、細菌、酵母、動物細胞、及び植物などの生きた生物において該化合物を調製するためのその使用に関する。
【００１１】
より具体的には、本発明は、本文の残りの部分において（サンタレン及びベルガモテンでの）ＳＢ型セスキテルペンと呼ばれるクラスＩＩのＳ．ハブロカイトのセスキテルペン（とりわけ、アルファ−サンタレン、エピ−ベータ−サンタレン、シス−アルファ−ベルガモテン、トランス−アルファ−ベルガモテン、及びエンド−ベータ−ベルガモテン）の合成に関与するＳ．ハブロカイトの２つの遺伝子の同定及び特性付けについて記載する。第１の遺伝子はＺ，Ｚ−ファルネシル二リン酸合成酵素をコード化し、第２は、基質としてＺ，Ｚ−ファルネシル二リン酸を使用する複数産物のセスキテルペン合成酵素をコード化する。対応する組み換えタンパク質の産生は、インビトロで得られるセスキテルペンプロファイルが、トマトＳｓｔ２遺伝子座により制御されるものと同一であることを明らかにした。
【００１２】
本発明は、一方で、ＩＰＰ及びＤＭＡＰからのＺ，Ｚ−ＦＰＰ、ならびに、Ｚ，Ｚ−ＦＰＰからのアルファ−サンタレン、エピ−ベータ−サンタレン、シス−アルファ−ベルガモテン、トランス−アルファ−ベルガモテン、及びエンド−ベータ−ベルガモテンで主に構成されるセスキテルペンの混合物の生合成に関与する酵素活性、ならびに、該活性に関与するペプチド配列及び該ペプチド配列をコード化する核酸配列に関する。本発明は、さらに、該化合物又はその誘導体を産生するための該酵素活性を使用した方法に関する。
【００１３】
本発明は、従って、ＩＰＰ及びＤＭＡＰの供給源を有する細胞において、Ｚ，Ｚ−ＦＰＰから、アルファ−サンタレン、エピ−ベータ−サンタレン、シス−アルファ−ベルガモテン、トランス−アルファ−ベルガモテン、及びエンド−ベータ−ベルガモテンで主に構成されるセスキテルペンの混合物を産生するための方法に関し、以下：
ａ）該細胞中への、本発明のＺ，Ｚ−ＦＰＳをコード化する第１遺伝子を含む発現カセットを有するコンストラクト及び本発明のＳＢＳと命名されたセスキテルペン合成酵素をコード化する第２遺伝子を含む発現カセットを有するコンストラクトの導入；
ｂ）該第１遺伝子及び該第２遺伝子の発現のための適切な条件における形質転換細胞の培養；ならびに、
ｃ）場合により、該細胞中及び／又は培養液中に含まれるＺ，Ｚ−ＦＰＰ又はＳＢＳ酵素のセスキテルペン産物又はその誘導体の回収
を含む。
【００１４】
本発明は、Ｚ，Ｚ−ＦＰＳ活性を有する単離又は組み換えタンパク質に関する。該タンパク質は、好ましくは、配列番号２と少なくとも８０%の同一性を伴う配列を有する。本発明は、また、そのようなタンパク質をコード化するヌクレオチド配列、又はストリンジェントな条件においてそれにハイブリダイズできる配列を含む核酸に関する。
【００１５】
本発明は、また、ＳＢ合成酵素型活性を有し、配列番号４と少なくとも８０%の同一性を伴う配列を有する単離又は組み換えタンパク質に関する。本発明は、また、そのようなタンパク質をコード化するヌクレオチド配列、又はストリンジェントな条件においてそれにハイブリダイズできる配列を含む核酸に関する。
【００１６】
本発明は、本発明の核酸を含む発現カセット、本発明の発現カセット又は核酸を含むベクター、本発明のベクター、発現カセット、又は核酸を含む宿主細胞、及び本発明の細胞、ベクター、発現カセット、又は核酸を含む非ヒトトランスジェニック生物に関する。
【００１７】
本発明は、また、ＩＰＰ及びＤＭＡＰの供給源を有する細胞において、ＩＰＰ及びＤＭＡＰから、Ｚ，Ｚ−ファルネシル二リン酸（Ｚ，Ｚ−ＦＰＰ）又はその誘導体を産生するための方法に関し、以下：
ａ）該細胞中への、本発明のＺ，Ｚ−ＦＰＳをコード化する核酸配列を伴う発現カセットを有するコンストラクトの導入；
ｂ）遺伝子の発現のための適切な条件における形質転換細胞の培養；ならびに、
ｃ）場合により、該細胞中及び／又は培養液中に含まれるその誘導体の回収
を含む。
【００１８】
本発明は、Ｚ，Ｚ−ＦＰＰ、又は、アルファ−サンタレン、エピ−ベータ−サンタレン、シス−アルファ−ベルガモテン、トランス−アルファ−ベルガモテン、及びエンド−ベータ−ベルガモテンなどのＳＢ型セスキテルペン、又は、アルファ−サンタロール、エピ−ベータ−サンタロール、シス−アルファ−ベルガモトール、トランス−アルファ−ベルガモトール、及びベータ−ベルガモトールなどのその誘導体を調製するための本発明のタンパク質、核酸、宿主細胞、又はトランスジェニック生物の使用に関する。
【００１９】
本発明は、クラスＩＩセスキテルペンの合成経路が、本発明のＺ，Ｚ−ＦＰＳをコード化する遺伝子もしくは本発明のＳＢ合成酵素をコード化する遺伝子のいずれか、あるいは両方の遺伝子の不活化により遮断されることを特徴とする、細胞又は非ヒトトランスジェニック生物に関する。
【００２０】
本発明は、また、対応するゲノム配列を他の種又は品種の栽培トマト（ソラナム・リコペルシカム）中に導入可能にする分子マーカーの同定のための核酸の使用に関する。本発明に関連して、ヌクレオチド配列の配列番号１及び２又はその変異体を、他の種又は品種の栽培トマト中への該配列の遺伝子導入のための分子マーカーとして使用することもできる。
【００２１】
このように、本発明は、Ｓ．ハブロカイトと性的和合性のあるソラナム型の種中に対応する遺伝子を導入するためにＳ．ハブロカイトと該種との間のゲノム多型を同定するための配列番号１又は配列番号３と少なくとも８０%の同一性を伴う核酸の全部又は一部を含む分子マーカーに関する。本発明は、また、プロトプラストによる、ソラナム・ハブロカイトと性的和合性のない種中へのｚＦＰＳ遺伝子及びＳＢＳ遺伝子の導入である方法に関する。
【００２２】
本発明は、また、ホスファターゼによるＺ，Ｚ−ＦＰＰの脱リン酸化によるＺ，Ｚ−ファルネソールを産生するための方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ＦＰＰの可能な立体異性体。ＦＰＰの全ての立体異性体はＩＰＰ及びＤＭＡＰＰから生合成される。今までに、多くの生物において特性付けされているＥ，Ｅ−ファルネシル二リン酸合成酵素（１）、及びマイコバクテリウム・ツベルクローシス−のＺ，Ｅ−ファルネシル二リン酸合成酵素（２）（Schulbach et al., 2000）だけが公知であった。（３）：本発明のトマトＺ，Ｚ−ファルネシル二リン酸合成酵素；（４）：Ｅ，Ｚ−ファルネシル二リン酸合成酵素：この活性を有する酵素はまだ記載されていない。
【図２Ａ】Ｓｈ−ｚＦＰＳ及びＳｈ−ＳＢＳ導入遺伝子を保有するＴ−ＤＮＡの図面。ｋｍ：カナマイシン耐性遺伝子；３５Ｓ：  ＣａＭＶ  ３５Ｓ遺伝子プロモーター。ＣＢＴＳ−ｔｅｒ：ＣＢＴＳターミネーター遺伝子；ｅＣＢＴＳ１．０：ＣａＭＶ３５プロモーターのエンハンサーに融合したＣＢＴＳ遺伝子の１kbプロモーター。Ｓｈ−ｚＦＰＳ：トマトｚＦＰＳ（Ｓ．ハブロカイト  ＬＡ１７７７）をコード化する遺伝子のコーディングフレーム；Ｓｈ−ＳＢＳ：トマトＳＢ合成酵素（Ｓ．ハブロカイト  ＬＡ１７７７）をコード化する遺伝子のコーディングフレーム；ＬＢ：Ｔ−ＤＮＡの左ボーダー；ＲＢ：  Ｔ−  ＤＮＡ右ボーダー；３５Ｓ−ｔｅｒ：ＣａＭＶ３５遺伝子ターミネーター；ｎｏｓ−ｔｅｒ：アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ターミネーターのノパリン合成酵素遺伝子。図２：ｐＬＩＢＲＯ６バイナリーベクターのＴ−ＤＮＡ断片；図２Ｂ：ｐＬＩＢＲＯ６５バイナリーベクターのＴ−ＤＮＡ断片。
【図２Ｂ】Ｓｈ−ｚＦＰＳ及びＳｈ−ＳＢＳ導入遺伝子を保有するＴ−ＤＮＡの図面。ｋｍ：カナマイシン耐性遺伝子；３５Ｓ：  ＣａＭＶ  ３５Ｓ遺伝子プロモーター。ＣＢＴＳ−  ｔｅｒ：ＣＢＴＳターミネーター遺伝子；ｅＣＢＴＳ１．０：遺伝子がＣａＭＶ３５プロモーターのエンハンサーに融合したＣＢＴＳ遺伝子の１kbプロモーター。Ｓｈ−ｚＦＰＳ：トマトｚＦＰＳ（Ｓ．ハブロカイト  ＬＡ１７７７）をコード化する遺伝子のコーディングフレーム；Ｓｈ−ＳＢＳ：トマトＳＢ合成酵素（Ｓ．ハブロカイト  ＬＡ１７７７）をコード化する遺伝子のコーディングフレーム；ＬＢ：Ｔ−ＤＮＡの左ボーダー；ＲＢ：  Ｔ−  ＤＮＡ右ボーダー；３５Ｓ−ｔｅｒ：ＣａＭＶ３５遺伝子ターミネーター；ｎｏｓ−ｔｅｒ：アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ターミネーターのノパリン合成酵素遺伝子。図２：ｐＬＩＢＲＯ６バイナリーベクターのＴ−ＤＮＡ断片；図２Ｂ：ｐＬＩＢＲＯ６５バイナリーベクターのＴ−ＤＮＡ断片。
【図３Ａ】トランスジェニックタバコ葉におけるＳｈ−ＳＢＳ導入遺伝子発現分析。発現は、蛍光プローブ（（登録商標）ＴＡＱ−ＭＡＮ，ＡＢＩ）を使用したリアルタイム定量的ＰＣＲにより決定する。１つのプローブがＳｈ−ＳＢＳ導入遺伝子に特異的であり、他はタバコアクチン遺伝子（対照遺伝子）に特異的である。縦軸の値は、Ｓｈ−ＳＢＳプローブで得られた値とアクチンプローブで得られた値との力価の２つの比率（２ＳＢＳ／２アクチン）を表す。この比率は、Ｓｈ−ＳＢＳ導入遺伝子発現とアクチンのそれとの比率を表す。横軸の値はトランスジェニック系統の数を示唆する。図３Ａ：Ｓｈ−ｚＦＰＳ及びＳｈ−ＳＢＳ導入遺伝子を組み込んだトランスジェニックタバコ系統（ｐＬＩＢＲＯ−０６４）。図３Ｂ：Ｓｈ−ＳＢＳ導入遺伝子のみを組み込んだトランスジェニックタバコ系統（ｐＬＩＢＲＯ−０６５）。
【図３Ｂ】トランスジェニックタバコ葉におけるＳｈ−ＳＢＳ導入遺伝子発現分析。発現は、蛍光プローブ（（登録商標）ＴＡＱ−ＭＡＮ，ＡＢＩ）を使用したリアルタイム定量的ＰＣＲにより決定する。１つのプローブがＳｈ−ＳＢＳ導入遺伝子に特異的であり、他はタバコアクチン遺伝子（対照遺伝子）に特異的である。縦軸の値は、Ｓｈ−ＳＢＳプローブで得られた値とアクチンプローブで得られた値との力価の２つの比率（２ＳＢＳ／２アクチン）を表す。この比率は、Ｓｈ−ＳＢＳ導入遺伝子発現とアクチンのそれとの比率を表す。横軸の値はトランスジェニック系統の数を示唆する。図３Ａ：Ｓｈ−ｚＦＰＳ及びＳｈ−ＳＢＳ導入遺伝子を組み込んだトランスジェニックタバコ系統（ｐＬＩＢＲＯ−０６４）。図３Ｂ：Ｓｈ−ＳＢＳ導入遺伝子のみを組み込んだトランスジェニックタバコ系統（ｐＬＩＢＲＯ−０６５）。
【図４Ａ】ファルネソール標準物質（異性体の混合物）上で混合した（Ｚ，Ｚ）−ファルネソールのＧＣ／ＭＳプロファイル。図４Ａ：灰色のクロマトグラム（ｍ／ｚ：６９）はＳｈ−ｚＦＰＳ−６Ｈｉｓ組み換えタンパク質で、インビトロで得られた産物に対応する。Ｓｈ−ＦＰＳ−６ＨｉｓをＤＭＡＰＰ及びＩＰＰと共にインキュベートした。イソプレニル二リン酸産物はアルコール中で脱リン酸化し、液体クロマトグラフィーにより精製した。ピーク１はＺ，Ｚ−ファルネソールに対応する。黒色のクロマトグラム（ｍ／ｚ：６９）は、（Ｚ，Ｅ）−、（Ｅ，Ｚ）−、及び（Ｅ，Ｅ）−ファルネソール異性体（Ｆｌｕｋａ）の混合物で構成されるファルネソール標準物質に対応する。ピーク２は（Ｚ，Ｅ）−及び（Ｅ，Ｚ）−ファルネソールの混合物に対応し、ピーク３は（Ｅ，Ｅ）−ファルネソールに対応する。図４Ｂ：ピーク１に対応する（Ｚ，Ｚ）−ファルネソールの質量スペクトル。図４Ｃ：ピーク２に対応する（Ｚ，Ｅ）−及び（Ｅ，Ｚ）−ファルネソール（混合物）の質量スペクトル。図４Ｄ：ピーク３に対応する（Ｅ，Ｅ）−ファルネソールの質量スペクトル。
【図４Ｂ】ファルネソール標準物質（異性体の混合物）上で混合した（Ｚ，Ｚ）−ファルネソールのＧＣ／ＭＳプロファイル。図４Ａ：灰色のクロマトグラム（ｍ／ｚ：６９）はＳｈ−ｚＦＰＳ−６Ｈｉｓ組み換えタンパク質で、インビトロで得られた産物に対応する。Ｓｈ−ＦＰＳ−６ＨｉｓをＤＭＡＰＰ及びＩＰＰと共にインキュベートした。イソプレニル二リン酸産物はアルコール中で脱リン酸化し、液体クロマトグラフィーにより精製した。ピーク１はＺ，Ｚ−ファルネソールに対応する。黒色のクロマトグラム（ｍ／ｚ：６９）は、（Ｚ，Ｅ）−、（Ｅ，Ｚ）−、及び（Ｅ，Ｅ）−ファルネソール異性体（Ｆｌｕｋａ）の混合物で構成されるファルネソール標準物質に対応する。ピーク２は（Ｚ，Ｅ）−及び（Ｅ，Ｚ）−ファルネソールの混合物に対応し、ピーク３は（Ｅ，Ｅ）−ファルネソールに対応する。図４Ｂ：ピーク１に対応する（Ｚ，Ｚ）−ファルネソールの質量スペクトル。図４Ｃ：ピーク２に対応する（Ｚ，Ｅ）−及び（Ｅ，Ｚ）−ファルネソール（混合物）の質量スペクトル。図４Ｄ：ピーク３に対応する（Ｅ，Ｅ）−ファルネソールの質量スペクトル。
【図４Ｃ】ファルネソール標準物質（異性体の混合物）上で混合した（Ｚ，Ｚ）−ファルネソールのＧＣ／ＭＳプロファイル。図４Ａ：灰色のクロマトグラム（ｍ／ｚ：６９）はＳｈ−ｚＦＰＳ−６Ｈｉｓ組み換えタンパク質で、インビトロで得られた産物に対応する。Ｓｈ−ＦＰＳ−６ＨｉｓをＤＭＡＰＰ及びＩＰＰと共にインキュベートした。イソプレニル二リン酸産物はアルコール中で脱リン酸化し、液体クロマトグラフィーにより精製した。ピーク１はＺ，Ｚ−ファルネソールに対応する。黒色のクロマトグラム（ｍ／ｚ：６９）は、（Ｚ，Ｅ）−、（Ｅ，Ｚ）−、及び（Ｅ，Ｅ）−ファルネソール異性体（Ｆｌｕｋａ）の混合物で構成されるファルネソール標準物質に対応する。ピーク２は（Ｚ，Ｅ）−及び（Ｅ，Ｚ）−ファルネソールの混合物に対応し、ピーク３は（Ｅ，Ｅ）−ファルネソールに対応する。図４Ｂ：ピーク１に対応する（Ｚ，Ｚ）−ファルネソールの質量スペクトル。図４Ｃ：ピーク２に対応する（Ｚ，Ｅ）−及び（Ｅ，Ｚ）−ファルネソール（混合物）の質量スペクトル。図４Ｄ：ピーク３に対応する（Ｅ，Ｅ）−ファルネソールの質量スペクトル。
【図４Ｄ】ファルネソール標準物質（異性体の混合物）上で混合した（Ｚ，Ｚ）−ファルネソールのＧＣ／ＭＳプロファイル。図４Ａ：灰色のクロマトグラム（ｍ／ｚ：６９）はＳｈ−ｚＦＰＳ−６Ｈｉｓ組み換えタンパク質で、インビトロで得られた産物に対応する。Ｓｈ−ＦＰＳ−６ＨｉｓをＤＭＡＰＰ及びＩＰＰと共にインキュベートした。イソプレニル二リン酸産物はアルコール中で脱リン酸化し、液体クロマトグラフィーにより精製した。ピーク１はＺ，Ｚ−ファルネソールに対応する。黒色のクロマトグラム（ｍ／ｚ：６９）は、（Ｚ，Ｅ）−、（Ｅ，Ｚ）−、及び（Ｅ，Ｅ）−ファルネソール異性体（Ｆｌｕｋａ）の混合物で構成されるファルネソール標準物質に対応する。ピーク２は（Ｚ，Ｅ）−及び（Ｅ，Ｚ）−ファルネソールの混合物に対応し、ピーク３は（Ｅ，Ｅ）−ファルネソールに対応する。図４Ｂ：ピーク１に対応する（Ｚ，Ｚ）−ファルネソールの質量スペクトル。図４Ｃ：ピーク２に対応する（Ｚ，Ｅ）−及び（Ｅ，Ｚ）−ファルネソール（混合物）の質量スペクトル。図４Ｄ：ピーク３に対応する（Ｅ，Ｅ）−ファルネソールの質量スペクトル。
【図５Ａ】Ｓｈ−ｚＦＰＳ−６Ｈｉｓ及びＳｈ−ＳＢＳ−６Ｈｉｓ組み換えタンパク質で実施したインビトロ活性テストのＧＣ／ＭＳプロファイル。２つの組み換え酵素Ｓｈ−ｚＦＰＳ−６Ｈｉｓ及びＳｈＳＢＳ−６ＨｉｓをＩＰＰ及びＤＭＡＰＰと共にインキュベートした。反応混合物はペンタンで抽出し、ＧＣ／ＭＳにより分析した。図５Ａ：Ｓｈ−ｚＦＰＳ及びＳｈ−ＳＢＳで、インビトロで得られた産物のクロマトグラム。ピーク２は主産物であり、アルファ−サンタレンに対応する。１、シス−アルファ−ベルガモテン；２、アルファ−サンタレン；３、トランス−アルファ−ベルガモテン；４、エピ−ベータ−サンタレン；５、エンド−ベータ−ベルガモテン。図５Ｂ：ピーク２（左）に対応する質量スペクトル及びアルファ−サンタレン構造（右）。
【図５Ｂ】Ｓｈ−ｚＦＰＳ−６Ｈｉｓ及びＳｈ−ＳＢＳ−６Ｈｉｓ組み換えタンパク質で実施したインビトロ活性テストのＧＣ／ＭＳプロファイル。２つの組み換え酵素Ｓｈ−ｚＦＰＳ−６Ｈｉｓ及びＳｈＳＢＳ−６ＨｉｓをＩＰＰ及びＤＭＡＰＰと共にインキュベートした。反応混合物はペンタンで抽出し、ＧＣ／ＭＳにより分析した。図５Ａ：Ｓｈ−ｚＦＰＳ及びＳｈ−ＳＢＳで、インビトロで得られた産物のクロマトグラム。ピーク２は主産物であり、アルファ−サンタレンに対応する。１、シス−アルファ−ベルガモテン；２、アルファ−サンタレン；３、トランス−アルファ−ベルガモテン；４、エピ−ベータ−サンタレン；５、エンド−ベータ−ベルガモテン。図５Ｂ：ピーク２（左）に対応する質量スペクトル及びアルファ−サンタレン構造（右）。
【図６】組み換え酵素Ｓｈ−ｚＦＰＳ−６Ｈｉｓ及びＳｈ−ＳＢＳ−６Ｈｉｓで、インビトロで得られた産物及びＴＡ５１７同質遺伝子組み換えトマト系統の浸出物での混合ＧＣプロファイル。追跡は抽出したｍ／ｚ９４イオンに対応する。灰色：ＳｈｚＦＰＳ及びＳｈ−ＫＳによりインビトロで産生したオレフィン。ブラック：ＴＡ５１７同質遺伝子系統の浸出物。１、シス−アルファ−ベルガモテン；２、アルファ−サンタレン；３、トランス−アルファ−ベルガモテン；４、エピ−ベータ−サンタレン；５、エンド−ベータ−ベルガモテン。
【図７Ａ】Ｓｈ−ｚＦＰＳ及びＳｈ−ＳＢＳ導入遺伝子を持つトランスジェニック植物（＃３８７７）により放出される揮発性分子のＧＣ／ＭＳプロファイル。トランスジェニック植物＃３８７７を培養チェンバー中の制御空気中で２４時間栽培した。植物により放出された揮発性分子をＳｕｐｅｒ（登録商標）Ｑマトリクス（Ａｌｌｔｅｃｈ）上に捕捉し、ＧＣ／ＭＳにより分析した。クロマトグラム（７Ａ）はＳＢ型セスキテルペンに特徴的な識別特性を伴ういくつかのピークを示す。ピークは、それらの保持時間及び質量スペクトルをＴＡ５１７系統（７Ｂ）のそれと比較することにより同定した。１、シス−アルファ−ベルガモテン；２、アルファ−サンタレン；３、トランス−アルファ−ベルガモテン；４、エピ−ベータ−サンタレン；５、エンド−ベータ−ベルガモテン。
【図７Ｂ】Ｓｈ−ｚＦＰＳ及びＳｈ−ＳＢＳ導入遺伝子を持つトランスジェニック植物（＃３８７７）により放出される揮発性分子のＧＣ／ＭＳプロファイル。トランスジェニック植物＃３８７７を培養チェンバー中の制御空気中で２４時間栽培した。植物により放出された揮発性分子をＳｕｐｅｒ（登録商標）Ｑマトリクス（Ａｌｌｔｅｃｈ）上に捕捉し、ＧＣ／ＭＳにより分析した。クロマトグラム（７Ａ）はＳＢ型セスキテルペンに特徴的な識別特性を伴ういくつかのピークを示す。ピークは、それらの保持時間及び質量スペクトルをＴＡ５１７系統（７Ｂ）のそれと比較することにより同定した。１、シス−アルファ−ベルガモテン；２、アルファ−サンタレン；３、トランス−アルファ−ベルガモテン；４、エピ−ベータ−サンタレン；５、エンド−ベータ−ベルガモテン。
【図８】Ｓ．リコペルシカム（Ｓｌ）とＳ．ハブロカイト（Ｓｈ）の間のｚＦＰＳ遺伝子多型：完全ｚＦＰＳ遺伝子をＳ．リコペルシカム、Ｓ．ハブロカイト、及びＴＡ５１７のゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅した。０．８%アガロースゲル上でのＰＣＲ産物の分離によって３本のバンドＡ、Ｂ、Ｃが同定され、それぞれのサイズは約３，０００、２，５００、及び２，０００ヌクレオチドであった。バンドＢに対応するＰＣＲ産物はＳ．ｈゲノムに特異的であり、本明細書において記載するｚＦＰＳ遺伝子に対応する。kb：キロベース。
【００２４】
略語及び定義
ｍＲＮＡ：メッセンジャーＲＮＡ
ＤＮＡ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ：ｍＲＮＡの逆転写により産生した相補的ＤＮＡ
ＣａＭＶ：カリフラワーモザイクウイルス
ＤＭＡＰＰ：ジメチルアリル二リン酸
ＣＢＴ−ｏｌ：センブラトリエン（ｃｅｍｂｒａｔｒｉｅｎ）−オール
ＣＢＴＳ：センブラトリエン−オール合成酵素
ＧＰＰ：ゲラニル二リン酸
ＦＰＰ：ファルネシル二リン酸
ＧＣ：ガスクロマトグラフィー
ＧＧＰＰ：ゲラニルゲラニル二リン酸
ｉｈｐＲＮＡｉ：干渉イントロンヘアピンＲＮＡ
ＩＰＰ：イソペンテニル二リン酸
ＭＳ：質量分析法
ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応
ＲＡＣＥ：ｃＤＮＡ末端の迅速増幅
Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｖ：普遍的な命名法に従ったアミノ酸の標準的暗号
www3.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Utils/wprintgc.cgi?mode=t
Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｂ、Ｄ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｗ、Ｙ：普遍的な命名法に従った塩基の標準的暗号
www3.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Utils/wprintgc.cgi?mode=t
ＲＦＬＰ：制限断片長多型
【００２５】
「Ｚ，Ｚ−ファルネシル二リン酸合成酵素」又はｚＦＰＳは、本明細書において使用する通り、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）及びジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰ）からＺ，Ｚ−ファルネシル二リン酸［（２Ｚ，６Ｚ）−ファルネシル二リン酸又はシス−，シス−ＦＰＰ］を産生できる酵素を指す。「Ｚ，Ｚ−ＦＰＳ活性」は、本明細書において使用する通り、ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰからのＺ，Ｚ−ファルネシル二リン酸の産生を指す。Ｚ，Ｚ−ＦＰＳ活性は、Ｚ，Ｚ−ファルネシル二リン酸の形成を測定することにより評価できる。
【００２６】
「ＳＢ合成酵素」又はＳＢＳは、本明細書において使用する通り、Ｚ，Ｚ−ＦＰＰからアルファ−サンタレン、エピ−ベータ−サンタレン、シス−アルファ−ベルガモテン、トランス−アルファ−ベルガモテン、及びエンドベータ−ベルガモテンで主に構成されるセスキテルペンの混合物を産生できる酵素を指す。「ＳＢ型活性」はＺ，Ｚ−ファルネシル二リン酸からのＳＢ型セスキテルペンの産生を指す。ＳＢ型活性は、１又は複数のＳＢ型セスキテルペンの形成を測定することにより評価できる。ＳＢ型活性の測定例を実施例において記載する。
【００２７】
「ＳＢ型セスキテルペン」は、本明細書において使用する通り、アルファ−サンタレン、エピ−ベータ−サンタレン、シス−アルファ−ベルガモテン、トランス−アルファ−ベルガモテン、及びエンド−ベータ−ベルガモテンで主に構成されるセスキテルペンの混合物を指す。
【００２８】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」：一般的に、所与のサイズ及び配列のポリヌクレオチドでの、ストリンジェントな条件は、同じ反応混合物中で該ポリヌクレオチドとその相補体により形成されたハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）を５℃から１０℃下回る温度で作業することにより得られる。所与のポリヌクレオチドでのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、問題のポリヌクレオチドのサイズ及び塩基組成ならびにハイブリダイゼーション混合物の組成（特に、ｐＨ及びイオン強度）に従って、当業者が決定できる。ハイストリンジェントな条件は、６５℃の０．２  ｘ  ＳＳＣバッファーでの洗浄段階を含む。
【００２９】
上に記載するストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、特に、“Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor; Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. CSH, N.Y. USA”、又は、その最新の再版の１つである“Ausubel et al., Eds., 1995, Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, N.Y.）”において記載される当業者に公知の関連教示に従って、より大きな、又は、より小さなポリヌクレオチドについて、当業者が適応できる。
【００３０】
「異種」は、本明細書において使用する通り、遺伝子が遺伝子操作により細胞中に導入されていることを意味すると理解される。それはエピ−ソーム又は染色体の形で存在できる。遺伝子は、それが導入される細胞とは異なる供給源に由来してよい。一方、遺伝子は、また、それが導入される細胞と同じ種に由来してよく、しかし、それは天然ではないその環境のために異種と見なされる。例えば、遺伝子がその天然のプロモーターではないプロモーターの制御下にあり、遺伝子がその天然の位置とは異なる位置に導入されるため、その遺伝子は異種と呼ばれる。宿主細胞は、異種遺伝子の導入前に遺伝子の内因性コピーを含むこともあれば、又は、それは内因性コピーを含まないこともある。
【００３１】
本明細書において使用する通り、２つの核酸配列又はアミノ酸配列の間の「同一性パーセント」は、最良の配列整列後に得られる、比較する２つの配列の間で同一であるヌクレオチド又はアミノ酸残基のパーセンテージを指し、該パーセンテージは純粋に統計的であり、２つの配列の間の違いは無作為に、及び、それらの全長にわたり分布する。最良の配列整列又は最適な配列整列は、後に算出する、比較する２つの配列の間の同一性パーセントが最高である配列整列である。２つの核酸配列又はアミノ酸配列の間の配列比較は、従来、それらを最適に配列整列した後に該配列を比較することにより実施し、該比較はセグメントにより、又は、比較ウィンドウにより行い、配列類似性の局所領域を同定及び比較する。その他、手作業で、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ  （１９８１）(Ad. App. Math. 2: 482)の局所ホモロジーアルゴリズムを用いて、Ｎｅｄｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ  （１９７０）(J. Mol. Biol. 48: 443)の局所ホモロジーアルゴリズムを用いて、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ  （１９８８）(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444)のホモロジー検索法を用いて、コンピューターソフトウェアで実行する該アルゴリズム（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ；Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI）を用いて、配列を比較のために最適に整列できる。２つの核酸配列又はアミノ酸配列の間の同一性パーセントは、比較ウィンドウによりこれらの２つの最適に整列した配列を比較することにより決定でき、ここで、比較する核酸配列又はアミノ酸配列の領域は、これら２つの配列の間の最適な配列整列のための参照配列と比べて付加又は欠失を含みうる。同一性パーセントは、ヌクレオチド又はアミノ酸残基が２つの配列間で同じである同一位置の個数を決定し、同一位置の該個数を比較ウィンドウ中の位置の総個数により割り、結果に１００を掛けることにより算出し、これらの２つの配列間の同一性パーセントを得る。
【００３２】
発明の詳細な説明
本発明は、従って、多くのセスキテルペンの合成経路に関与する酵素をコード化する遺伝子について初めて記載する。特に、本発明は、ＳＢ型化合物と呼ばれ、Ｚ，Ｚ−ＦＰＰからのアルファ−サンタレン、エピ−ベータ−サンタレン、シス−アルファ−ベルガモテン、トランス−アルファ−ベルガモテン、及びエンド−ベータ−ベルガモテンで主に構成されるセスキテルペンの混合物の産生を可能にする複数の産物を伴うトマトのセスキテルペン合成酵素（ＳＢ合成酵素）の特性付けに関する。また、本発明は、さらに、ＩＰＰ及びＤＭＡＰからのＺ，Ｚ−ＦＰＰの産生を可能にするトマトのＺ，Ｚ−ファルネシル二リン酸合成酵素（ｚＦＰＳ）の特性付けに関する。これらの酵素を使用して、トランスジェニック生物又は組み換え微生物もしくは細胞においてインビトロ又はインビボで、ＳＢ型セスキテルペン又はＺ，Ｚ−ＦＰＰを産生できる。トランスジェニック生物、細菌、酵母、カビ、動物、昆虫、もしくは植物細胞などの細胞又は微生物、及びトランスジェニック動物又は植物を検討する。それらはＺ，Ｚ−ファルネソールなどのＺ，Ｚ−ＦＰＰに由来する化合物の産生も可能にする。本発明の方法は、特に微生物（細菌、酵母）におけるＺ，Ｚ−ＦＰＰ、及び分泌型の腺毛を保有する植物においてＳＢ型化合物を産生するために使用できる。ＳＢ型セスキテルペン混合物又はその誘導体の産生は、また、植物、例えばトマトにおいて、遺伝子消失技術により、又は、変異導入法により低減又は抑制することができる。また、本発明において同定した配列は、生物の他の種、特に植物において同じ活性を有する酵素をコード化する遺伝子を同定及び／又はクローン化するために有用である。最後に、多型分子的マーカーはｚＦＰＳ及びＳＢ合成酵素をコード化する核酸から同定でき、他の種又は様々な栽培トマト（ソラナム・リコペルシカム）中への対応する機能的ゲノム配列の導入をモニター可能にする。
【００３３】
Ｚ，Ｚ−ＦＰＰはセスキテルペン合成酵素の潜在的な基質であるが、しかし、現在それは市販されていない。今までに特性付けされたセスキテルペン合成酵素の大多数でＥ，Ｅ−ＦＰＰが使用されるが、市販Ｚ，Ｚ−ＦＰＰの欠如によって実験目的でのその使用が大きく制限されてきたことも明らかである。綿のカジネン合成酵素は、セスキテルペン合成酵素によるＺ，Ｚ−ＦＰＰの優先的な使用を記載する唯一の例である（Heinstein et al., 1970）。この場合、Ｚ，Ｚ−ＦＰＰは化学合成により産生され、本特許において記載するＺ，Ｚ−ＦＰＰ合成酵素は簡単で安価な様式で該分子を産生するための方法を提供する。
【００３４】
さらに、ＳＢ型セスキテルペンはアルファ−サンタレンを含み、それ自体がアルファ−サンタロールの直接の前駆体である。アルファ−サンタロールはビャクダン油の特徴的な構成成分の１つである。ビャクダン油は香料産業において高く評価され、その価格は、ビャクダンの乱獲のために、主にインドにおいて過去１０年にわたり急激に上昇している。この乱獲は天然ビャクダン資源の生存に脅威を及ぼす。アルファ−サンタロールは、単純なヒドロキシル化によりアルファ−サンタレンから入手できる。
【００３５】
本発明は、従って、ＤＭＡＰ及びＩＰＰＰの供給源を有する細胞においてＺ，Ｚ−ＦＰＰからＳＢ型セスキテルペン又はその誘導体を産生するための方法に関し、以下：
ａ）該細胞中への、本発明のｚＦＰＳをコード化する第１遺伝子を含む発現カセットを有するコンストラクト及び本発明のＳＢ合成酵素をコード化する第２遺伝子を含む発現カセットを有するコンストラクトの導入；
ｂ）該第１遺伝子及び該第２遺伝子の発現のための適切な条件における形質転換細胞の培養；ならびに、
ｃ）場合により、該細胞中及び／又は培養液中に含まれるＳＢ型セスキテルペン又はその誘導体の回収
を含む。
【００３６】
特定の態様において、産生したＳＢ型セスキテルペンは段階ｃ）において回収する。好ましい態様において、産生されるＳＢ型セスキテルペンは、アルファ−サンタレン、エピ−ベータ−サンタレン、アルファ−ベルガモテン、ベータ−ベルガモテン、及びエンド−ベータ−ベルガモテンから成る群より選択される。別の特定の態様において、産生したＳＢ型セスキテルペンは、アルファ−サンタロールなどの目的の他の化合物を得るための出発産物である。好ましい態様において、ＳＢ型セスキテルペン誘導体は、アルファ−サンタロール、エピ−ベータ−サンタロール、シス−アルファ−ベルガモトール、トランス−アルファ−ベルガモトール、及びエンド−ベータ−ベルガモトールから成る群より選択される。
【００３７】
特定の態様において、本発明は、ＤＭＡＰ及びＩＰＰＰの供給源を有する細胞においてＺ，Ｚ−ＦＰＰからＳＢ型セスキテルペン又はその誘導体を産生するための方法に関し、以下：
ａ）本発明のｚＦＰＳをコード化する第１異種遺伝子及び本発明のＳＢ合成酵素をコード化する第２異種遺伝子を含む組み換え細胞の提供；
ｂ）該第１遺伝子及び該第２遺伝子の発現のための適切な条件における該細胞の培養；ならびに、
ｃ）場合により、該細胞中及び／又は培養液中に含まれるＳＢ型セスキテルペン又はその誘導体の回収
を含む。
【００３８】
好ましい態様において、該細胞はＺ，Ｚ−ＦＰＰを産生する。別の態様において、Ｚ，Ｚ−ＦＰＰが細胞に供給される。
【００３９】
特定の態様において、２つの発現カセットは同じコンストラクトにより保有される。別の態様において、２つの発現カセットは２つの別々のコンストラクトにより保有される。
【００４０】
本発明は、Ｚ，Ｚ−ＦＰＰ合成酵素活性を有する単離又は組み換えタンパク質に関する。特に、本発明は、Ｚ，Ｚ−ＦＰＰ合成酵素活性を有し、配列番号２と少なくとも８０%、８５%、９０%、９５%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を伴う配列を有する単離又は組み換えポリペプチドに関する。好ましくは、ポリペプチドは、配列番号２と少なくとも９５%の同一性を伴う配列を有する。特定の態様において、ペプチドは、配列番号２の配列を含む、又は、それから成る。該ポリペプチドは、酵素の精製を容易にする追加配列、例えばいくつかの連続ヒスチジンアミノ酸を含むタグ配列を含んでもよい。
【００４１】
本発明は、また、Ｚ，Ｚ−ＦＰＰ合成酵素活性を有し、配列番号２と少なくとも８０%、８５%、９０%、９５%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を伴う配列又はストリンジェントな条件においてそれにハイブリダイズできる配列を有するポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む単離核酸に関する。核酸の例は、配列番号１と少なくとも８０%、８５%、９０%、９５%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を伴う配列又はその相補配列を含む、又は、それから成る核酸である。本発明は、ハイストリンジェンシーな条件において、Ｚ，Ｚ−ＦＰＰ合成酵素活性を有するポリペプチド及び配列番号２と少なくとも９５%又は９８%の同一性を伴う配列を有する該ポリペプチドをコード化する核酸にハイブリダイズできる単離核酸に関する。特定の態様において、核酸は配列番号１の配列を含む、又は、それから成る。本発明は、また、本発明の核酸を含む発現カセット、ベクター、宿主細胞、又はトランスジェニック生物に関する。
【００４２】
核酸は、ゲノムＤＮＡ、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、又は合成ＤＮＡでよい。核酸は、単鎖もしくは二重鎖又は２つの混合物でよい。本発明において、転写された核酸は好ましくはイントロン無しのｃＤＮＡである。転写された核酸は合成又は半合成の組み換え分子でよく、場合により増幅し、又は、ベクター中にクローン化し、化学修飾し、又は非天然塩基を含む。典型的に、それらは、当業者に周知の組み換え技術により合成した単離ＤＮＡ分子である。
【００４３】
本発明は、また、ＳＢ合成酵素活性を有し、配列番号４と少なくとも８０%、８５%、９０%、９５%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を伴う配列を有する単離又は組み換えポリペプチドに関する。特定の態様において、ポリペプチドは配列番号４の配列を含む、又は、それから成る。この場合において、本発明は、ＳＢ合成酵素活性を有し、配列番号４と少なくとも９５%の同一性を伴う配列を有する単離又は組み換えポリペプチドに関する。該ポリペプチドは、酵素の精製を容易にする追加配列、例えばいくつかの連続ヒスチジンアミノ酸を含むタグ配列を含んでもよい。
【００４４】
本発明は、また、ＳＢ合成酵素活性を有し、配列番号４と少なくとも８０%、８５%、９０%、９５%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を伴う配列又はストリンジェントな条件においてそれにハイブリダイズできる配列を有するポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む単離核酸に関する。そのような核酸の例は、配列番号３と少なくとも８０%、８５%、９０%、９５%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を伴う配列又はその相補配列を含む、又は、それから成る核酸である。本発明は、ハイストリンジェンシーな条件において、ＳＢ合成酵素活性を有するポリペプチド及び配列番号４と少なくとも９５%又は９８%の同一性を伴う配列を有する該ポリペプチドをコード化する核酸にハイブリダイズできる単離核酸に関する。特定の態様において、核酸は配列番号３の配列を含む、又は、それから成る。本発明は、また、本発明の核酸を含む発現カセット、ベクター、宿主細胞、又はトランスジェニック生物に関する。
【００４５】
本発明は、特に、ＳＢ合成酵素活性を有し、配列番号４と少なくとも８０%、８５%、９０%、９５%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を伴う配列を有するポリペプチドをコード化する異種配列を含む核酸及びＺ，Ｚ−ＦＰＰ合成酵素活性を有し、配列番号２と少なくとも８０%、８５%、９０%、９５%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を伴う配列を有するポリペプチドをコード化する異種配列を含む核酸を含むベクター、宿主細胞、又はトランスジェニック生物に関する。本発明の特定の態様において、トランスジェニック生物は、植物、特に植物トリコーム（ｐｌａｎｔ  ｔｒｉｃｈｏｍｅ）である。
【００４６】
本発明は、また、ＳＢ合成酵素活性を有し、配列番号４と少なくとも８０%、８５%、９０%、９５%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を伴う配列を有するポリペプチドをコード化する異種配列を含む核酸を含むベクター、宿主細胞、又はトランスジェニック生物に関する。
【００４７】
本発明は、また、Ｚ，Ｚ−ＦＰＰ合成酵素活性を有し、好ましくは、配列番号２と少なくとも８０%、８５%、９０%、９５%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を伴う配列を有するポリペプチドをコード化する異種配列を含む核酸を含むベクター、宿主細胞、又はトランスジェニック生物に関する。
【００４８】
本発明は、ＩＰＰ及びＤＭＡＰからＳＢ型セスキテルペン混合物又はその誘導体を産生するための方法に関し、それは適切な条件においてＩＰＰ及びＤＭＡＰを、配列番号３と少なくとも８０%、８５%、９０%、９５%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を伴う精製又は組み換えＺ，Ｚ−ＦＰＰ合成酵素及び配列番号４と少なくとも８０%、８５%、９０%、９５%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を伴う精製又は組み換えＳＢ合成酵素と接触させること、及び、得られたＳＢ型セスキテルペン混合物又はその誘導体を回収することを含む。本発明は、ＩＰＰ及びＤＭＡＰからＳＢ型セスキテルペン混合物又はその誘導体を調製するための、配列番号２と少なくとも８０%、８５%、９０%、９５%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を伴う精製又は組み換えＺ，Ｚ−ＦＰＰ合成酵素及び配列番号４と少なくとも８０%、８５%、９０%、９５%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を伴う精製又は組み換えＳＢ合成酵素の使用に関する。
【００４９】
本発明は、ＩＰＰ及びＤＭＡＰからＺ，Ｚ−ＦＰＰ又はその誘導体を産生するための方法に関し、それは適切な条件においてＩＰＰ及びＤＭＡＰを、配列番号２と少なくとも８０%、８５%、９０%、９５%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を伴う精製又は組み換えＺ，Ｚ−ＦＰＰ合成酵素と接触させること、及び、得られたＺ，Ｚ−ＦＰＰ又はその誘導体を回収することを含む。場合により、方法は、得られたＺ，Ｚ−ＦＰＰとウシ腸アルカリホスファターゼとのインキュベーション、及び、Ｚ，Ｚ−ファルネソールの回収をさらに含む。本発明は、ＩＰＰ及びＤＭＡＰからＺ，Ｚ−ＦＰＰ又はその誘導体を調製するための、配列番号２と少なくとも８０%、８５%、９０%、９５%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を伴う精製又は組み換えＺ，Ｚ−ＦＰＰ合成酵素の使用に関する。
【００５０】
本発明は、Ｚ，Ｚ−ＦＰＰからクラスＩＩセスキテルペン又はその誘導体の混合物を産生するための方法に関し、それは適切な条件においてＺ，Ｚ−ＦＰＰを、配列番号４と少なくとも８０%、８５%、９０%、９５%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を伴う精製又は組み換えＳＢ合成酵素と接触させること、及び、得られたＳＢ型セスキテルペン混合物又はその誘導体を回収することを含む。本発明は、Ｚ，Ｚ−ＦＰＰからクラスＩＩセスキテルペン又はその誘導体の混合物を調製するための、配列番号４と少なくとも８０%、８５%、９０%、９５%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を伴う精製又は組み換えＳＢ合成酵素の使用に関する。
【００５１】
一般的に、発現カセットは、遺伝子転写及びタンパク質への翻訳に必要な全てのエレメントを含む。特に、それは、プロモーター、場合によりエンハンサー、転写ターミネーター、及び翻訳のためのエレメントを含む。
【００５２】
プロモーターは宿主細胞に適応させる。例えば、細胞が原核生物である場合、プロモーターは以下のプロモーターから成る群より選択できる：ＬａｃＩ、ＬａｃＺ、ｐＬａｃＴ、ｐｔａｃ、ｐＡＲＡ、ｐＢＡＤ、バクテリオファージＴ３又はＴ７のＲＮＡポリメラーゼプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、ラムダファージのＰＲ又はＰＬプロモーター。細胞が真核生物及び動物である場合、プロモーターは以下のプロモーターから成る群より選択できる：サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼプロモーター、サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期又は後期プロモーター、マウスメタロチオネイン−Ｌプロモーター、及び特定のレトロウイルスのＬＴＲ（末端反復配列）領域。一般的に、適切なプロモーターを選ぶために、当業者が“Sambrook and Russell (2000)”の研究、あるいは“Ausubel et al. (2006)”の研究において記載される方法を参照できることは有利である。
【００５３】
ベクターは、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、ウイルス、ＹＡＣ、ＢＡＣ、アグロバクテリウムｐＴｉプラスミドなどでよい。ベクターは、好ましくは、複製起点、複数のクローニング部位、及びマーカーから選択される１又は複数のエレメントを含みうる。マーカーは、検出可能シグナルを産生するレポーター遺伝子でありうる。検出可能シグナルは、蛍光シグナル、染色、光放出でありうる。マーカーは、従って、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＤｓＲｅｄ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、ルシフェラーゼなどでありうる。マーカーは、好ましくは、細胞に抗生物質耐性又は除草剤耐性を付与する選択マーカーである。例えば、遺伝子は、カナマイシン、ネオマイシンなどの耐性遺伝子でありうる。好ましい態様において、ベクターはプラスミドである。原核生物ベクターの例として、限定はされないが、以下が挙げられる：ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐｂｓ、ｐＤ１０、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６Ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＢＲ３２２、及びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＥＴ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、及びｐＱＥ−３０（ＱＩＡＧＥＮ）。真核生物ベクターの例として、限定はされないが、以下が挙げられる：ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＰＩＣＺ、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）Ｈｙｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＣＩ−ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。ウイルスベクターとして、限定はされないが、アデノウイルス、ＡＡＶ、ＨＳＶ、レンチウイルスなどが挙げられる。好ましくは、発現ベクターはプラスミド又はウイルスベクターである。
【００５４】
宿主細胞は原核生物、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、バシラス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、及びシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）又は真核生物でありうる。真核生物は、酵母（例えば、サッカロミセス・セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））もしくは糸状菌（例えば、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ））などの下等真核生物又は昆虫、哺乳動物、もしくは植物細胞などの高等真核生物でありうる。細胞は、哺乳動物細胞、例えばＣＯＳ、ＣＨＯ細胞（ＵＳ４，８８９，８０３；ＵＳ５，０４７，３３５）でありうる。特定の態様において、細胞は非ヒト及び非胚である。細胞は、例えば培養液中で単離できる。細胞は、生物、例えば非ヒトトランスジェニック動物又はトランスジェニック植物中に含まれてもよい。
【００５５】
本発明は、従って、ＩＰＰ及びＤＭＡＰの供給源を有する細胞においてＩＰＰ及びＤＭＡＰからＺ，Ｚ−ＦＰＰ又はその誘導体を産生するための方法に関し、以下：
ａ）該細胞中への、本発明のＺ，Ｚ−ＦＰＰ合成酵素をコード化する遺伝子を含む発現カセットを有するコンストラクトの導入；
ｂ）遺伝子の発現のための適切な条件における形質転換細胞の培養；ならびに、
ｃ）場合により、該細胞中及び／又は培養液中に含まれるＺ，Ｚ−ＦＰＰ又はその誘導体の回収
を含む。
【００５６】
特定の態様において、産生されたＺ，Ｚ−ＦＰＰは段階ｃ）において回収する。別の特定の態様において、産生されたＺ，Ｚ−ＦＰＰは、Ｚ，Ｚ−ファルネソールなどの目的の別の化合物を得るための出発産物である。例えば、Ｚ，Ｚ−ＦＰＰは、ホスファターゼによりＺ，Ｚ−ファルネソールに変換できる。このように、方法は、段階ａ）ホスファターゼをコード化する遺伝子を含む発現カセットを有するコンストラクトの導入をさらに含み、それによってＺ，Ｚ−ファルネソールを段階ｃ）において回収可能にする。本発明は、従って、ＩＰＰ及びＤＭＡＰの供給源を有し、本発明のＺ，Ｚ−ＦＰＰ合成酵素をコード化する異種遺伝子を含む組み換え細胞においてＩＰＰ及びＤＭＡＰからＺ，Ｚ−ＦＰＰ又はその誘導体を産生するための方法に関する。本発明は、このように、ＩＰＰＰ及びＤＭＡＰの供給源を有する組み換え細胞においてＺ，Ｚ−ＦＰＰを産生するための方法に関し、以下：
ａ）本発明のｚＦＰＳをコード化する異種遺伝子を含む組み換え細胞の提供；
ｂ）該遺伝子の発現のための適切な条件における細胞の培養；ならびに、
ｃ）場合により、該細胞中及び／又は培養液中に含まれるＺ，Ｚ−ＦＰＰ又はその誘導体の回収
を含む。
【００５７】
本発明は、従って、Ｚ，Ｚ−ＦＰＰの供給源を有する細胞においてＺ，Ｚ−ＦＰＰからＳＢ型セスキテルペン混合物又はその誘導体を産生するための方法に関し、以下：
ａ）該細胞中への、本発明のＳＢ合成酵素をコード化する遺伝子を含む発現カセットを有するコンストラクトの導入；
ｂ）遺伝子の発現のための適切な条件における形質転換細胞の培養；ならびに、
ｃ）場合により、該細胞中及び／又は培養液中に含まれるＳＢ型セスキテルペン混合物又はその誘導体の回収
を含む。
【００５８】
特定の態様において、産生されたＳＢ型セスキテルペン混合物は段階ｃ）において回収する。別の特定の態様において、産生されたＳＢ型セスキテルペン混合物は、アルファ−サンタロールなどの目的の別の化合物を得るための出発産物である。本発明は、従って、Ｚ，Ｚ−ＦＰＰの供給源を有し、本発明のＳＢ合成酵素をコード化する異種遺伝子を含む組み換え細胞においてＺ，Ｚ−ＦＰＰからＳＢ型セスキテルペン混合物又はその誘導体を産生するための方法に関する。本発明は、このように、Ｚ，Ｚ−ＦＰＰの供給源を有する組み換え細胞においてＺ，Ｚ−ＦＰＰからＳＢ型セスキテルペン又はその誘導体を産生するための方法に関し、以下：
ａ）本発明のＳＢ合成酵素をコード化する異種遺伝子を含む組み換え細胞の提供；
ｂ）該遺伝子の発現のための適切な条件における細胞の培養；ならびに、
ｃ）場合により、該細胞中及び／又は培養液中に含まれるＳＢ型セスキテルペン混合物又はその誘導体の回収
を含む。
【００５９】
細胞は、多細胞生物、例えば植物又は非ヒト動物の一部でもありうる。この場合において、本発明は、以下：
ａ）生物の細胞中への、本発明のＺ，Ｚ−ＦＰＰ合成酵素をコード化する第１遺伝子を含む発現カセットを有するコンストラクト及び本発明のＳＢ合成酵素をコード化する第２遺伝子を含む発現カセットを有するコンストラクトの導入；
ｂ）該細胞からの生物の再構成及び導入した２つの遺伝子を発現するトランスジェニック生物の選択
を含む多細胞生物を調製するための方法に関する。
【００６０】
一態様において、生物は非ヒト動物である。例えば、生物は、マウス、ラット、モルモット、ウサギなどでありうる。別の好ましい態様において、生物は、植物、好ましくは植物の腺トリコームである。
【００６１】
本発明は、従って、本発明のＺ，Ｚ−ＦＰＰ合成酵素及び本発明のＳＢ合成酵素を発現するトランスジェニック多細胞生物の提供ならびに該トランスジェニック生物におけるＳＢ型セスキテルペン混合物又はその誘導体の回収を含む、ＳＢ型セスキテルペン混合物を製造するための方法に関する。
【００６２】
この方法によって、そのような化合物を産生しない生物においてＳＢ型セスキテルペン混合物を産生し、又は、既にそれを産生する生物により産生されるＳＢ型セスキテルペン混合物の量を増加できる。
【００６３】
本発明は、従って、以下：
ａ）生物の細胞中への、本発明のＺ，Ｚ−ＦＰＰ合成酵素をコード化する遺伝子を含む発現カセットを有するコンストラクトの導入；
ｂ）該細胞からの生物の再構成及び導入した遺伝子を発現するトランスジェニック生物の選択
を含む多細胞生物を調製するための方法に関する。
【００６４】
本発明は、また、本発明のＺ，Ｚ−ＦＰＰ合成酵素を発現するトランスジェニック多細胞生物の提供及び該トランスジェニック生物における産生したＺ，Ｚ−ＦＰＰ又はその誘導体の回収を含む、Ｚ，Ｚ−ＦＰＰ又はその誘導体を産生するための方法に関する。
【００６５】
一態様において、生物は非ヒト動物である。例えば、生物は、マウス、ラット、モルモット、ウサギなどでありうる。別の好ましい態様において、生物は、植物、好ましくは腺トリコームを有する植物である。この方法によって、該化合物を産生しない生物においてＺ，Ｚ−ＦＰＰを産生し、又は、生物により産生されるＺ，Ｚ−ＦＰＰの量を増加できる。
【００６６】
本発明は、従って、以下：
ａ）生物の細胞中への、本発明のＳＢ合成酵素をコード化する遺伝子を含む発現カセットを有するコンストラクトの導入；
ｂ）該細胞からの生物の再構成及び導入した遺伝子を発現するトランスジェニック生物の選択
を含む多細胞生物を調製するための方法に関する。
【００６７】
本発明は、また、本発明のＳＢ合成酵素を発現するトランスジェニック多細胞生物の提供ならびに該トランスジェニック生物における産生されたＳＢ型セスキテルペン混合物又はその誘導体の回収を含む、ＳＢ型セスキテルペン混合物又はその誘導体を産生するための方法に関する。
一態様において、生物は非ヒト動物である。例えば、生物は、マウス、ラット、モルモット、ウサギなどでありうる。別の好ましい態様において、生物は、植物、好ましくは植物の分泌トリコームである。この方法によって、該化合物を産生しない生物によりＳＢ型セスキテルペン混合物を産生し、又は、生物により産生されるＳＢ型セスキテルペン混合物の量を増加できる。
【００６８】
特に、本発明は、腺トリコームを伴う科からの全ての植物、例えばキク科（ヒマワリなど）、ナス科（トマト、タバコ、ジャガイモ、コショウ、ナスなど）、アサ科（例、大麻（Ｃａｎｎａｂｉｓ  ｓａｔｉｖａ））、及びシソ科（ミント、バジル、ラベンダー、タイムなど）に適用可能である。本発明は、特に、例えば、ニコチアナ属、ソラナム属、カプシカム属、ペチュニア属、ダチュラ属、アトロパ属などからのナス科の植物、及び、特に、例えば栽培トマト（ソラナム・リコペルシカム）、野生トマトソラナム・ハブロカイト、栽培タバコ（ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ））、ウッドランドタバコ（ニコチアナ・シルベストリス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ））などのソラナム属及びニコチアナ属に適応する。非限定的な様式において、本発明は、以下の属からの植物に適用できる：ポプルス（Ｐｏｐｕｌｕｓ）属、ニコチアナ属、カンナビス（Ｃａｎｎａｂｉｓ）属、ファルビティス（Ｐｈａｒｂｉｔｉｓ）属、アプテリア（Ａｐｔｅｒｉａ）属、サイコトリア（Ｐｓｙｃｈｏｔｒｉａ）属、ヤマアイ属（Ｍｅｒｃｕｒｉａｌｉｓ）、キク属（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ）、ポリポディウム（Ｐｏｌｙｐｏｄｉｕｍ）属、ペラルゴニウム（Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ）属、ミゾホオズキ属（Ｍｉｍｕｌｕｓ）、マトリカリア（Ｍａｔｒｉｃａｒｉａ）属、モナルダ（Ｍｏｎａｒｄａ）属、ソラナム属、ノコギリソウ属（Ａｃｈｉｌｌｅａ）、パトリニア（Ｖａｌｅｒｉａｎａ）属、オシマム（Ｏｃｉｍｕｍ）属、メディカゴ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）属、アエスクルス（Ａｅｓｃｕｌｕｓ）属、プルンバゴ（Ｐｌｕｍｂａｇｏ）属、ギンシダ属（Ｐｉｔｙｒｏｇｒａｍｍａ）、ファセリア（Ｐｈａｃｅｌｉａ）属、アビセニア（Ａｖｉｃｅｎｎｉａ）属、タマリクス（Ｔａｍａｒｉｘ）属、フランケニア（Ｆｒａｎｋｅｎｉａ）属、リモニウム（Ｌｉｍｏｎｉｕｍ）属、フォエニクルム（Ｆｏｅｎｉｃｕｌｕｍ）属、ティムス（Ｔｈｙｍｕｓ）属、サルビア（Ｓａｌｖｉａ）属、カズラ（Ｋａｄｓｕｒａ）属、ベイエリア（Ｂｅｙｅｒｉａ）属、フムルス（Ｈｕｍｕｌｕｓ）属、メンタ（Ｍｅｎｔｈａ）属、アルテミシア（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ）属、ネプタ（Ｎｅｐｔａ）属、ゲラエア（Ｇｅｒａｅａ）属、ポゴステモン（Ｐｏｇｏｓｔｅｍｏｎ）属、マジョラム（Ｍａｊｏｒａｎａ）属、クレオメ（Ｃｌｅｏｍｅ）属、サントリソウ属（Ｃｎｉｃｕｓ）、パルセニウム（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ）属、リキノカルポス（Ｒｉｃｉｎｏｃａｒｐｏｓ）属、ヒメナエア（Ｈｙｍｅｎｎａｅａ）属、ラレア（Ｌａｒｒｅａ）属、プリムラ（Ｐｒｉｍｕｌａ）属、ファセリア（Ｐｈａｃｅｌｉａ）属、ドリオプテリス（Ｄｒｙｏｐｔｅｒｉｓ）属、プレクトランサス（Ｐｌｅｃｔｒａｎｔｈｕｓ）属、シプリペジウム（Ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍ）属、ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ）属、ダチュラ（Ｄａｔｕｒａ）属、ムクナ（Ｍｕｃｕｎａ）属、リシヌス（Ｒｉｃｉｎｕｓ）属、オトギリソウ属（Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ）、ハマジンチョウ属（Ｍｙｏｐｏｒｕｍ）、アカシア（Ａｃａｃｉａ）属、ディプロペルティス（Ｄｉｐｌｏｐｅｌｔｉｓ）属、ドドナエア（Ｄｏｄｏｎａｅａ）属、ハルガニア（Ｈａｌｇａｎｉａ）属、キアノステギア（Ｃｙａｎｏｓｔｅｇｉａ）属、プロスタンテラ（Ｐｒｏｓｔａｎｔｈｅｒａ）属、アンソサーシス−（Ａｎｔｈｏｃｅｒｃｉｓ）属、オレアリア（Ｏｌｅａｒｉａ）属、ビスカリア（Ｖｉｓｃａｒｉａ）属。好ましくは、植物は、キク科、アサ科、ナス科、又はシソ科からの植物である。より好ましい態様において、植物は、ソラナム属又はニコチアナ属に属し、好ましくはソラナム・エスクレンタム、ソラナム・ハブロカイト、ニコチアナ・タバカム、又はニコチアナ・シルベストリスである。
【００６９】
この態様において、遺伝子はプロモーターの制御下にあり、植物のトリコームにおいて、好ましくは特異的な発現を可能にする。そのようなプロモーターが存在し、当業者に公知である（Tissier et al., 2004）。
【００７０】
本発明において、「特異的」プロモーターは、主に所与の組織又は細胞群において活性なプロモーターを指す。他の組織又は細胞における残りの発現は、一般的に低く、完全には除外できないことが理解されるであろう。本発明の特定の特性は、腺トリコームの分泌細胞に特異的なプロモーターを構築して、植物の葉分泌物の組成物の改変を可能にし、及び、特にその中において本発明の遺伝子を発現させて、ＳＢ型セスキテルペン混合物の調製を可能にする能力に基づく。このように、Ｚ，Ｚ−ＦＰＰ、及びＳＢ型セスキテルペン混合物又はその誘導体は、特にトリコームの浸出物において、溶剤での抽出により、あるいは蒸留により、前記植物のトリコームから回収できる。
【００７１】
例えば、ＣＹＰ７１Ｄ１６遺伝子のＡＴＧの上流に位置する１８５２  ｂｐの調節配列が、タバコトリコームの分泌細胞において特異的にｕｉｄＡレポーター遺伝子の発現を方向付けることが示されている（出願ＵＳ２００３／０１０００５０  Ａ１，Wagner et al., 2003）。さらに、異なる種から抽出された、いくつかのプロモーター配列がタバコトリコームにおいて異種遺伝子の発現を方向付けできるとして同定されている。
【００７２】
【表１】
2010523099.tif 000002
【００７３】
本発明の好ましい態様において、カセットにおいて使用するプロモーターは、ニコチアナ・シルベストリス種の遺伝子ＮｓＴＰＳ−０２ａ、０２ｂ、０３、及び０４に由来し、ＣＹＣ−２と強い配列同一性を示す（ＣＢＴ−オールシクラーゼ；ＮＩＤ：ＡＦ４０１２３４）。前記プロモーターは、特許出願ＷＯ２００６０４０４７９（Tissier et al., 2004）においてより十分に記載されている。
【００７４】
好ましいターミネーター配列の内、ＮＯＳターミネーター（Bevan et al., 1983）及びヒストン遺伝子ターミネーター（ＥＰＯ  ６３３  ３１７）に言及できる。
【００７５】
特定の態様において、発現カセットは、発現を増加できる配列（「エンハンサー」）、例えばＣａＭＶ３５Ｓプロモーター及びオクトピン合成酵素遺伝子の特定のエレメントを含んでよい（ＵＳ  ５  ２９０  ９２４）。好ましくは、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターのエンハンサーエレメントを使用する。
【００７６】
本発明の１つ又は両方の遺伝子を有するコンストラクトの、種子又は植物を含む細胞又は植物組織中への導入は、エピ−ソーム又は染色体の形状を含む、当業者に公知の任意の方法により実施できる。植物の遺伝子組み換え技術は当技術分野において周知であり、例えば細菌アグロバクテリウム・ツメフアシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の使用、エレクトロポレーション、遺伝子銃技術、特にウイルスベクターによるトランスフェクション、及び当業者に公知の任意の他の方法を含む。
【００７７】
１つの共通に使用される方法は、細菌アグロバクテリウム・ツメフアシェンスの使用に基づき、主に、目的のコンストラクト（核酸、カセット、ベクターなど）を細菌Ａ・ツメフアシェンス中に導入し、次に形質転換した細菌を選んだ植物の葉片と接触させることに存する。発現カセットは、典型的に、ベクターとしてＴｉプラスミド（又はＴ−ＤＮＡ）を使用することにより細菌中に導入し、それは、例えばヒートショックにより、又は、エレクトロポレーションにより細菌中に移入できる。形質転換した細菌と葉片とのインキュベーションは、Ｔｉプラスミドの片細胞のゲノム中への移入をもたらす。これらは、場合により、適切な条件において栽培して、細胞が本発明のコンストラクトを含むトランスジェニック植物を再構成できる。Ａ．ツメフアシェンスの形質転換技術のさらなる詳細又は変法について、例えば“Horsch et al. (1985)”又は“Hooykaas and Schilperoort (1992)”を参照できる。
【００７８】
このように、特定の態様において、そのようにして構成した発現カセットをアグロバクテリウム・ツメフアシェンスによる植物細胞中への移入のためにアームを除去した（ｄｉｓａｒｍｅｄ）ＴｉプラスミドのトランスファーＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）の左ボーダーと右ボーダーの間に挿入する。Ｔ−ＤＮＡは、また、その発現が抗生物質又は除草剤に対する耐性を付与し、形質転換体の選択を可能にする遺伝子を含む。
【００７９】
ひとたび再生させれば、トランスジェニック植物は、トリコームにおいて本発明の遺伝子の異種発現又はＳＢ型セスキテルペン混合物、Ｚ，Ｚ−ＦＰＰ又はＺ，Ｚ−ファルネソールの産生についてテストできた。これは、葉浸出物の回収及び該浸出物中での目的の産物の存在についてのテストにより達成できる。植物により放出された揮発性化合物の分析によって、該化合物の同定も可能になる。これは、また、葉中及び、特にトリコーム細胞中での本発明の１又は複数の異種酵素の存在を分析することにより（例えば、特異的プライマー又はプローブでｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡを分析することにより）行える。植物は、場合により、選択、交配、処置などして、改善した発現レベルを有する植物を得ることができる。
【００８０】
本発明の別の目的は、また、上で定義したような核酸、発現カセット、又はベクターを含む植物又は種子に基づく。
【００８１】
本発明のさらなる目的は、Ｓ．ハブロカイトの対応するゲノム配列の他の性的和合性のある栽培トマト（Ｓ．リコペルシカム）の種又は品種中への導入を可能にする分子マーカーとしての本発明の核酸の使用に関する。実際に、前記マーカーは、Ｓ．ハブロカイトの対応するゲノム配列の他の性的和合性のある栽培トマト（Ｓ．リコペルシカム）の種又は品種中への導入を制御し、これにより、例えば、野生種と本発明の核酸の遺伝子移入が起こった栽培種の間での交配から産生された個体を同定及び選択することが可能になる。分子マーカーとしての本発明の核酸の使用は、当業者に公知の任意の技術により実施できる。例えば、一般的に使用される技術は、異なる制限酵素により切断される２つのゲノム間の、本発明の核酸との分子ハイブリダイゼーションによるバンド多型の同定（ＲＦＬＰ）に基づく。別の例は、比較するゲノムにおいて、本発明の核酸と相補的なプライマーから本発明の核酸の全て又は一部を増幅するためのＰＣＲの使用により多型を探索して、ＰＣＲ増幅後、２つのゲノム間のサイズ多型を同定することである。多型は、また、比較するゲノム間の異なるサイズの断片を産生する１又は複数の制限酵素による該ＰＣＲ産物の消化後に明らかにできる。
【００８２】
ひとたび多型が同定されると、この情報を使用して、例えば、Ｓ．ハブロカイトと本発明の核酸の遺伝子移入が望ましい様々なトマトの間の交配に由来するＦ２集団において個体を同定する。
【００８３】
本発明の別の目的は、ｚＦＰＳ及びＳＢ合成酵素をコード化するＳ．ハブロカイトのゲノム配列の性的和合性のある種中への細胞、特にプロトプラストの融合による導入に関する。プロトプラスト質融合技術は当業者に公知であり（Zimmermann et al., 1981, Bates et al., 1983）、２つの融合種に属する染色体を含むハイブリッド細胞の作製を可能にする。融合中、２つの種の染色体又は染色体断片は除去される。本発明の遺伝子を含む染色体断片を保持したハイブリッド細胞は、次にｚＦＰＳをコード化する遺伝子（配列番号１）もしくはＳＢ合成酵素をコード化する遺伝子（配列番号２）に特異的なプライマー又は両方を一度に使用したＰＣＲにより選択できる。
【００８４】
本発明は、また、ＳＢ型セスキテルペン混合物の合成経路が、本発明のＺ，Ｚ−ＦＰＰ合成酵素をコード化する遺伝子もしくは本発明のＳＢ合成酵素をコード化する遺伝子のいずれか、又は両方の遺伝子の不活化により遮断されることを特徴とする、細胞又は非ヒトトランスジェニック生物に関する。前記遺伝子の発現は、当業者に公知の多くの利用可能な技術により遮断できる。遺伝子は、欠失、突然変異（例えば、メタンスルホン酸エチルでの化学的突然変異誘発により、又は、イオン化照射により）、又は中断（挿入突然変異誘発）できる。さらに、前記遺伝子の発現は、抑制性転写物の発現による遺伝子消失によっても遮断できる。抑制性転写物は、二本鎖ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、三重らせんを形成できるＲＮＡの形状であり、遮断する遺伝子の転写物と一定の相補性又は特異性を有するＲＮＡである。
【００８５】
本発明は、また、Ｚ，Ｚ−ＦＰＰ合成酵素をコード化する遺伝子の発現を低減又は抑制できる核酸に関する。実際に、二本鎖ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、三重らせんを形成できるＲＮＡの形状であり、Ｚ，Ｚ−ＦＰＰ合成酵素をコード化する遺伝子と一定の相補性又は特異性を有する抑制ＲＮＡは、本発明の教示に基づき調製できる。例えば、本発明は、配列番号１の少なくとも２１、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００個の連続ヌクレオチドを含むＺ，Ｚ−ＦＰＰ合成酵素をコード化する遺伝子又はそれに相補的な配列の抑制ＲＮＡに関する。同様に、本発明は、Ｚ，Ｚ−ＦＰＰ合成酵素をコード化する遺伝子の発現を抑制するための、配列番号１の少なくとも２１、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００個の連続ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド又はそれに相補的な配列の使用に関する。この酵素の抑制は、ＳＢ型セスキテルペン混合物の合成経路を停止又は減速させ、ＩＰＰ及びＤＭＡＰをＺ，Ｚ−ＦＰＰの供給を必要とする目的の別の合成経路で利用可能にするために有用でありうる。例えば、この酵素の抑制は、トマト葉の腺トリコーム細胞によるゲルマクレンＢの産生レベルにおける増加をもたらすことができる。本発明は、従って、Ｚ，Ｚ−ＦＰＰ合成酵素をコード化する遺伝子が不活化されたトランスジェニック生物又は細胞に関する。不活化は、ＲＮＡ干渉技術、遺伝子欠失、化学突然変異、又は相同組み換えによる不活化により達成できる。このように、Ｚ，Ｚ−ＦＰＰ又はＳＢ型セスキテルペン混合物の含量は、前記トランスジェニック生物又は細胞において低減できる。
【００８６】
さらに、本発明は、また、ＳＢ合成酵素をコード化する遺伝子の発現を低減又は抑制できる核酸に関する。確かに、二本鎖ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、三重らせんを形成できるＲＮＡの形状であり、ＳＢ合成酵素をコード化する遺伝子と一定の相補性又は特異性を有する抑制ＲＮＡは、本発明の教示に基づき調製できる。このように、本発明は、配列番号３の少なくとも２１、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００個の連続ヌクレオチドを含むＳＢ合成酵素をコード化する遺伝子の抑制ＲＮＡに関する。同様に、本発明は、ＳＢ合成酵素をコード化する遺伝子の発現を抑制するための、配列番号３の少なくとも２１、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００個の連続ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの使用に関する。この酵素の抑制は、ＳＢ型セスキテルペンの合成経路を停止させ、Ｚ，Ｚ−ＦＰＰを該化合物の供給を必要とする目的の別の合成経路で利用可能にする、例えばＺ，Ｚ−ＦＰＰ誘導体、例えばＺ，Ｚ−ファルネソール、又はＺ，Ｚ−ＦＰＰを基質として使用する合成酵素の産物である他のセスキテルペンを調製するために有用でありうる。
【００８７】
本発明は、従って、ＳＢ合成酵素をコード化する遺伝子が不活化されている細胞又はトランスジェニック生物に関する。不活化は、ＲＮＡ干渉技術、遺伝子欠失、化学突然変異、又は相同組み換えによる不活化により達成できる。このように、ＳＢ型セスキテルペン混合物の含量は、前記細胞又はトランスジェニック生物において低減できる。
【００８８】
本発明は、また、別の種に由来するＺ，Ｚ−ＦＰＰ合成酵素又はＳＢ合成酵素をコード化する他の遺伝子を同定又はクローン化するための方法に関し、ここで、配列番号１又は３の少なくとも１５、３０、５０、７５、１００、２００、又は３００個の連続ヌクレオチドを有するプローブを調製及び使用し、サンプル中の該プローブとハイブリダイズできるヌクレオチド配列を同定又は選択する。サンプルは、例えば、１又は複数の生物に由来するゲノム又はｃＤＮＡライブラリーでよい。方法は、同定又は選択した配列を特性付ける追加段階を含んでよい。この追加段階は、クローニング、及び／又はシークエンシング、及び／又は配列アラインメント、及び／又は酵素活性テストを含んでよい。
【００８９】
本発明の他の局面及び利点は、以下の実施例において明らかとなり、それらは説明の目的のために与えられ、限定しない。
【００９０】
実施例
トマト葉ｃＤＮＡ（Ｓ．ハブロカイト）の合成
ｍＲＮＡはトマト葉（ソラナム・ハブロカイト＝Ｌ．ヒルスタム  ＬＡ１７７７）から全ＲＮＡ抽出キット（RNeasy Minikit, Qiagen）を使用して抽出した。対応するｃＤＮＡは、逆転写酵素（Ｒｏｃｈｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．０３  ５３１  ３１７）を使用して、製造者が推奨する反応条件においてポリＴプライマーからの逆転写により合成する。
【００９１】
ソラナム・ハブロカイト・トマトからのＺ，Ｚ−ＦＰＰ合成酵素（Ｓｈ−ｚＦＰＳ）及びＳＢ合成酵素（Ｓｈ−ＳＢＳ）のためのコード配列のクローニング
２つの遺伝子Ｓｈ−ｚＦＰＳ及びＳｈ−ＳＢＳの完全コードヌクレオチド配列は、ＳＧＮウェブサイト（“ＳＯＬ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｎｅｔｗｏｒｋ”，http://www.sgn.cornell.edu/）で入手可能なＳ．ハブロカイトトマト葉トリコームのＥＳＴライブラリー（Van der Hoeven, et al., 2000、未発表）中の公的に入手可能な配列データからクローン化した。
【００９２】
Ｓｈ−ｚＦＰＳ（配列番号１）及びＳｈ−ＳＢＳ（配列番号３）の配列は、配列番号１についてはプライマー
【表２】
2010523099.tif 000003
を、配列番号３についてはプライマー
【表３】
2010523099.tif 000004
を使用してトマト葉ｃＤＮＡからＰＣＲにより得た。制限酵素部位（ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩ）をプライマーの５’末端に付加し、プロモーターの下流でのｃＤＮＡのクローニングを容易にした。ＰＣＲ増幅は、製造者により供給されるバッファーにおいて０．５単位のＴａｑポリメラーゼ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）で実施した。ＰＣＲ産物はＱｉａｑｕｉｃｋカラム（Ｑｉａｇｅｎ）で精製し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）でのライゲーションによりｐＧＥＭ−Ｔクローニングベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）中にクローン化した。予測配列を有するクローンは、挿入断片の完全シークエンシング後に選択した。
【００９３】
Ｓｈ−ｚＦＰＳヌクレオチド配列（配列番号１）は９１２塩基長であり、３０３個のアミノ酸（配列番号２）のタンパク質をコード化する。シス−型（Ｚ）−イソプレニル二リン酸合成酵素（シス−ＩＰＰＳ）、又は名ウンデカプレニル合成酵素（ＵＰＰＳ）の保存タンパク質ドメインを、コンピュータでのＣＣＤシス−テムにより同定した（NCBI, Marchler-Bauer A, Bryant SH (2004)）。Ｓｈ−ｚＦＰＳと類似のアミノ酸配列を、ＢｌａｓｔＰソフトウェアを使用したＳｗｉｓｓＰｒｏｔ及びＧｅｎＢａｎｋタンパク質データベースにおいて検索した（Altschul et al., 1997）。最高パーセントの同一性が、ウンデカプレニル二リン酸合成酵素とホモロジーを示すが、しかし、その機能が実証されていない植物配列で得られた（表１）。例えば、Ｓｈ−ｚＦＰＳは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ＢＡＡ９７３４５及びＡＡＯ６３３４９の推定ＵＰＰＳとそれぞれ４２%及び３９%の同一性を有する。Ｓｈ−ｚＦＰＳ配列がミクロコッカス・ツベルクロシス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（Ｏ５３４３４）のＺ，Ｅ−ＦＰＳと非常に低いパーセント（２４％）の同一性を有することも分かる。
【００９４】
【表４】
2010523099.tif 000005
表１：Ｓｈ−ｚＦＰＳ配列でのＳｗｉｓｓＰｒｏｔ及びＧｅｎＢａｎｋライブラリーに対するＢｌａｓｔＰ  ２．２．１３プログラム（Altschul et al., 1997）を使用したホモロジー検索により得られた最高パーセントの同一性（%同一性）を伴う配列
【００９５】
Ｓｈ−ＳＢＳヌクレオチド配列（配列番号３）は２３３４塩基長であり、７７７個のアミノ酸（配列番号４）のタンパク質をコード化する。保存テルペンシクラーゼタンパク質ドメインをＣＣＤシス−テム（NCBI, Marchler-Bauer A, Bryant SH (2004)）によりコンピュータで同定した。Ｓｈ−ＳＢＳと類似のアミノ酸配列を、ＢｌａｓｔＰソフトウェアを使用してＳｗｉｓｓＰｒｏｔ及びＧｅｎＢａｎｋタンパク質ライブラリーにおいて検索した（Altschul et al., 1997）。機能未知のタバコ配列（６０%同一性）を例外とし、最高のホモロジーが植物ジテルペン合成酵素で得られ（表２）、異なる植物（シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、セイヨウカボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｍａｘｉｍａ）、ステビア・レバウディアナ（Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）、オリザ・サティバ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ））のカウレン合成酵素をコード化する配列との同一性は約４０から４５%であった。Ｓｈ−ＳＢＳは、また、アビエタジエン合成酵素及びタキサジエン合成酵素などの機能未知のテルペン合成酵素ならびにアルファ−ビサボレン合成酵素とのより低いホモロジー（２６−３３%同一性）を有する。
【００９６】
【表５】
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表２：Ｓｈ−ＳＢＳ配列でのＳｗｉｓｓＰｒｏｔ及びＧｅｎＢａｎｋライブラリーに対するＢｌａｓｔＰ  ２．２．１３プログラム（Altschul et al., 1997）を使用したホモロジー検索により得られた最高パーセントの同一性（%同一性）を伴う配列
【００９７】
Ｓｈ−ｚＦＰＳ及びＳｈ−ＳＢＳ組み換えタンパク質の産生
Ｓｈ−ｚＦＰＳ及びＳｈ−ＳＢＳをコード化する核酸配列（それぞれ配列番号１及び３）を別々にｐＥＴ−３０ｂ発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）中に導入した。組み換えタンパク質の精製を可能にするために、これらの配列の終止コドンを欠失させて、Ｃ末端に６ヒスチジンテールを伴う融合タンパク質を作製した。そのようにして得られたＳｈｚＦＰＳ−ｐＥＴ３０ｂ及びＳｈ−ＳＢＳ−ｐＥＴ３０ｂベクターは、エレクトロポレーションにより、組み換えタンパク質の発現用に改変した大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に導入した。タンパク質を産生するために、大腸菌培養（５００ml）を３７℃で開始し、６００nmでの吸光度が０．５に達した。この段階で、培養温度を１６℃まで下げ、エタノール（１%V/V）を培地に加えた。１時間のインキュベーション後、ＩＰＴＧを１mM濃度で培地に加えて、組み換えタンパク質の発現を誘導した。培養物を次に１８時間インキュベートし、細胞を４℃で遠心することにより停止した。細胞沈殿物を２００mMリン酸バッファー中に再浮遊した。細胞をフレンチプレス（ΔＰ＝１９バール）で溶解させて、溶解物を１５，０００gで遠心した。可溶性タンパク質を含む上精をＰＤ１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で脱塩し、５０mMリン酸バッファー（ｐＨ７）で平衡化し、製造者の溶出プロトコルに厳密に従ってニッケル−ニトリロ三酢酸アフィニティ樹脂（Ｎｉ−ＮＴＡ，Ｑｉａｇｅｎ）上に添加した。最高量のＳｈ−ｚＦＰＳ−６Ｈｉｓ及びＳｈ−ＳＢＳ−６Ｈｉｓタンパク質を伴う画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより同定し、次に５０mM  ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．８，１００mM  ＫＣｌ）で平衡化したＰＤ１０カラムで脱塩した。粗タンパク質画分と比較して、約２０倍濃縮が２つのタンパク質について得られた。
【００９８】
Ｓｈ−ｚＦＰＳ及びＳｈ−ＳＢＳ組み換えタンパク質のインビトロ酵素活性テスト
活性テストは以下のバッファー中で実施した：５０mM  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．８）、１００mM  ＫＣｌ、７．５mM  ＭｇＣｌ２、５%(w/v)グリセロール、及び５mM  ＤＴＴ。活性テストでは、濃縮画分からの２５又は５０μgのタンパク質を３２℃で２時間基質ＩＰＰ、ＤＭＡＰＰ、ＧＰＰ、ＦＰＰ、ＧＧＰＰ（Ｓｉｇｍａ）と、単独又は併用で、各々６５μMの濃度でインキュベートした。
【００９９】
Ｓｈ−ｚＦＰＳ−６Ｈｉｓで実施したテストでは、反応産物を、２０単位のウシ腸アルカリホスファターゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）の３７℃で１時間の添加により脱リン酸化した。テルペンアルコールは、リン酸化産物であり、次にクロロホルム／メタノール／水混合物（０．５／１／０．４）で抽出した。水相及び有機相を水（０．５vol）及びクロロホルム（０．５vol）の添加により分離し、２，０００gで遠心した。有機層を回収し、窒素ガス流下で乾燥させ、ペンタン中に溶かし、質量分析を連結したガスクロマトグラフィー（ＧＣ−ＭＳ  ５９７３Ｎ，  Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により分析した。テルペンアルコールは、それらの質量スペクトルをＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＩＳＴ）のデータベースのものと比較し、及び、それらの保持時間をゲラニトール、ファルネソール、及びゲラニルゲラニオール参照標準物質（Ｆｌｕｋａ）のものと合わせることにより同定した。
【０１００】
Ｓｈ−ＳＢＳ−６Ｈｉｓで実施したテストでは、反応において産生したテルペンを反応混合物からペンタンで（３回）直接抽出した（容積対容積）。３つのペンタン抽出物をプールし、窒素ガス流下で濃縮し、ＧＣ−ＭＳにより分析した。産生したテルペンをＮＩＳＴデータベースの照合及びソラナム・ハブロカイト浸出物の抽出物でのクロマトグラムとの比較により同定した。
【０１０１】
Ｓｈ−ｚＦＰＳ−６Ｈｉｓ組み換えタンパク質を基質ＩＰＰ＋ＤＭＡＰＰ又はＩＰＰ＋ＧＰＰとインキュベートした（表１参照）。第１の組み合わせ（ＩＰＰ＋ＤＭＡＰＰ）のみが、脱リン酸化後、１５個の炭素原子（Ｃ１５）を伴う単一のテルペンアルコールの形成をもたらし、その質量スペクトルによって、ＮＩＳＴデータベース中の標準スペクトルとの比較により、それはファルネソールとして同定された（図４）。保持時間は、４つのファルネソール異性体（Ｅ，Ｅ−ファルネソール；Ｅ，Ｚ−ファルネソール；Ｚ，Ｅ−ファルネソール、及びＺ，Ｚ−ファルネソール）の混合物を含むファルネソール標準物質と比較した。Ｓｈ−ｚＦＰＳ−６Ｈｉｓにより産生したファルネソールは、Ｚ，Ｚ−ファルネソールのものと同一の保持時間を有した。
【０１０２】
Ｓｈ−ＳＢＳ−６Ｈｉｓ組み換えタンパク質を基質ＧＰＰ、ＦＰＰ、及びＧＧＰＰとインキュベートした。使用した基質を問わず、新しいテルペンは検出できず、酵素がトランス−アリル型基質では不活性であることを示唆する（表１）。
【０１０３】
【表６】
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＊：脱リン酸化後
表３：異なるイソプレン基質を伴うＳｈ−ｚＦＰＳ−６Ｈｉｓ及びＳｈ−ＳＢＳ−６Ｈｉｓ組み換えタンパク質で得られたインビトロ酵素活性テストのまとめ。Ａ、Ｚ，Ｚ−ファルネソール、Ｂ、アルファ−サンタレン；Ｃ、エピ−ベータ−サンタレン；Ｄ、エンド−ベータ−ベルガモテン；Ｅ、シス−アルファ−ベルガモテン；Ｆ、トランス−アルファ−ベルガモテン
【０１０４】
Ｓｈ−ｚＦＰＳ−６Ｈｉｓ及びＳｈ−ＳＢＳ−６Ｈｉｓ酵素を基質ＤＭＡＰＰ及びＩＰＰ又はＧＰＰ及びＩＰＰと一緒にインキュベートした。反応産物をホスファターゼで処置せず、ペンタンで抽出し、その中には全てのオレフィンが溶解できる。ＤＭＡＰＰ及びＩＰＰを基質として、抽出物のクロマトグラフ分析によっていくつかのテルペン化合物の存在が明らかになった（図５）。ＧＣプロファイルは、親のＳ．リコペルシカムとＳ．ハブロカイトから得られた準同質遺伝子系統であるＴＡ５１７トマト系統（Monforte and Tanksley, 2000）の浸出物のものと比較した。ＴＡ５１７系統は、クラスＩＩセスキテルペンの生合成に関与するＳ．ハブロカイトの遺伝子移入断片を含む（van der Hoeven et al., 2000）。２つのＧＣプロファイルは同一であり、組み換え酵素がトマト中に存在するものと厳密に同一である活性を有することが確認された（図６）。主成分（図５、ピーク２）は、その保持時間及び質量スペクトルをＴＡ５１７浸出物の抽出物のものと比較することによりアルファ−サンタレンとして同定された。量の多いものから、アルファ−サンタレン（ピーク４）、エンド−ベータ−ベルガモテン（ピーク５）、及びアルファ−ベルガモテン（ピーク１）も同定された。Ｓｈ−ＳＢＳ−６Ｈｉｓ酵素は、従って、その活性が複数の産物の形成をもたらす酵素である。
【０１０５】
Ｓｈ−ｚＦＰＳは、ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰに作用して、ファルネシル二リン酸型のリン酸化化合物を産生する酵素であると結論付けることができる。保持時間は（Ｚ，Ｚ）−ファルネソール標準物質と同一であり、ＳｈｚＦＰＳにより産生されるファルネシル二リン酸がＺ，Ｚ配置型により特徴付けられることを示唆する。Ｓｈ−ｚＦＰＳ−６Ｈｉｓが、ＩＰＰとの組み合わせで、Ｅ−ゲラニル二リン酸に不活性であるとの事実は、この分子がＳｈ−ｚＦＰＳ−６Ｈｉｓの中間体ではなく、１つのＤＭＡＰＰと１つのＩＰＰを組み合わせることにより少なくとも１つのＺ型結合を産生することを示唆する。Ｓｈ−ＳＢＳは、Ｓｈ−ｚＦＰＳにより産生されるファルネシル二リン酸化合物でのみ活性であるが、しかし、少なくとも４つの明確に同定されたセスキテルペンを産生し、主な１つはアルファ−サンタレンである。最後に、Ｃ末端での６ヒスチジンタグ及びスペーサーの存在は、元の植物の天然酵素と比較して、酵素活性に及ぼす効果を有さなかった（図３）。
【０１０６】
タバコにおけるＺ，Ｚ−ＦＰＰ合成酵素（Ｓｈ−ｚＦＰＳ）及びＳＢ合成酵素（Ｓｈ−ＳＢＳ）の発現
トリコーム特異的タバコプロモーター（eCBTS02, Tissier et al., 2004）をＳｈ−ｚＦＰＳ及びＳｈ−ＳＢＳのコード配列の上流にクローン化して、コンストラクトｅＣＢＴＳ１．０Ｓｈ−ｚＦＰＳ［＃１］及びｅＣＢＴＳ１．０−Ｓｈ−ＳＢＳ［＃２］を形成した。これらの２つのコンストラクトを、カナマイシン耐性遺伝子を含む、アグロバクテリウムによる形質転換用の同じバイナリーベクター中に導入し、ｐＬＩＢＲＯ−０６４バイナリーベクターを得た（図２Ａ）。コンストラクト＃２もｐＬＩＢＲＯ−０６５バイナリーベクター中に別々に導入した（図２Ｂ）。ベクターは、エレクトロポレーションによりアグロバクテリウム株ＬＢＡ４４０４中に導入した。異なるベクターを持つ株を使用して、葉片法（ｌｅａｆ  ｄｉｓｃ  ｍｅｔｈｏｄ）（Horsch et al., 1985）によるＮ．シルベストリスの遺伝子形質転換を実施した。
【０１０７】
導入遺伝子を保有するＴ−ＤＮＡを遺伝子形質転換により、ＣＢＴＳの発現がＲＮＡ干渉により抑制されたＮ．シルベストリスのトランスジェニック細胞系統（親系統ｉｈｐＣＢＴＳ）（Tissier et al., 2005）中に導入した。この系統において、葉中のＣＢＴジオール量は非常に低い。Ｎ．シルベストリスは野生タバコであり、トマトのものに対応するセスキテルペンを産生しない。約２５のカナマイシン耐性植物が、各々のコンストラクトについて得られた。各々の植物における導入遺伝子の存在を、葉ゲノムＤＮＡでのＰＣＲにより確認した。葉中での導入遺伝子の発現レベルは、タバコ葉からのｍＲＮＡでのリアルタイム定量的ＰＣＲにより確かめた。Ｓｈ−ＳＢＳ導入遺伝子の発現レベルを、タバコ葉において構成的に発現したアクチンのものと比較した。結果を図３において例示する。結果は、選択した系統が全て、アクチン遺伝子と比べて、ｐＬＩＢＲＯ−０６４コンストラクトでは１から５０まで、ｐＬＩＢＲＯ−０６５コンストラクトでは１から１０までの範囲の変動レベルで導入遺伝子を発現したことを示唆する。
【０１０８】
オレフィンセスキテルペンは揮発性分子であるため、植物により放出された揮発性分子は培養チェンバー中の制御空気中で分析した。空気サンプルを、オレフィンテルペンを吸収するＳｕｐｅｒＱ（登録商標）フィルター（Ａｌｔｅｃｈ）を含む誘導サーキット中に捕捉した。分子を次に１mlペンタンで溶出し、ＧＣ／ＭＳにより分析した。図７は、トランスジェニック植物により放出された揮発性分子のクロマトグラフプロファイルの例を図示する。それは、Ｓｈ−ｚＦＰＳ及びＳｈ−ＳＢＳ遺伝子を発現する系統＃３８７７は、このクラスのセスキテルペンに特徴的な分子イオンサイン９３、９４、１２１、及び２０４を伴ういくつかの新しいピークを含んだことを示す。クロマトグラフプロファイルを、天然でこれらの化合物を産生するＴＡ５１７トマト系統の浸出物で得られたものと比較した（図７）。２つのプロファイルは同一であり、各々のピークの質量スペクトルはＴＡ５１７系統のピークのものと同一であった。２つの導入遺伝子Ｓｈ−ｚＦＰＳ及びＳｈ−ＳＢＳを発現している植物が、アルファ−サンタレン、エピ−ベータ−サンタレン、シス−アルファ−ベルガモテン、トランス−アルファ−ベルガモテン、及びエンド−ベータ−ベルガモテンを産生したのに対し、Ｓｈ−ＳＢＳ遺伝子のみを組み込んだトランスジェニック系統はこれらの化合物のいずれも産生しなかった。これらの結果は、両方の遺伝子の存在がＳＢ型のセスキテルペンの合成に必要であることを示唆する。それらによって、組み換え酵素で、インビトロで得られたデータが確認される。結論として、Ｓｈ−ｚＦＰＳ及びＳｈ−ＳＢＳ遺伝子は、トマトのセスキテルペンの生合成に関与し、“van der Hoeven et al., 2000”により記載される遺伝子座ＳｓＴ２に位置する。
【０１０９】
Ｓ．リコペルシカムとＳ．ハブロカイトの間のｚＦＰＳ遺伝子多型
完全ｚＦＰＳ遺伝子は、以下のプライマーを使用して、Ｓ．リコペルシカム、Ｓ．ハブロカイト、及びＴＡＳ１７のゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅した：ＡＣＣＡＴＧＧＧＴＴＣＴＴＴＧＧＴＴＣＴＴＣＡＡＴＧＴＴＧＧＡ（配列番号９）及びＡＣＴＣＧＡＧＡＴＡＴＧＴＧＴＧＴＣＣＡＣＣＡＡＡＡＣＧＴＣＴＡＴＧ（配列番号１０）。２つの産物が２つのゲノムにおいて増幅され、２つのゲノム中に少なくとも２コピーの遺伝子が存在することを示唆する（図８）。約３０００ヌクレオチド（バンドＡ）のサイズを伴う２つの産物の１つは、２つのゲノムに共通である。第２の産物は、Ｓ．リコペルシカムにおいて約２０００ヌクレオチド（バンドＣ）及びＳ．ハブロカイトにおいて約２５００ヌクレオチド（バンドＢ）のサイズを有する。ＴＡ５１７系統のプロファイルは、Ｓ．ハブロカイトのものと同一である。これらの結果は、Ｓ．ハブロカイトに特異的な遺伝子ＢがＴＡ５１７系統中に導入されていることを示唆する。産物Ｂのシークエンシングによって、それが本明細書において記載するｚＦＰＳ遺伝子に対応することが確認された。この結果は、また、２つのゲノムの間に存在する多型をこの遺伝子について使用することによりＳ．ハブロカイトのｚＦＰＳ遺伝子をＳ．リコペルシカム中に導入できることを実証する。
【表７】
2010523099.tif 000008
2010523099.tif 000009
2010523099.tif 000010
2010523099.tif 000011
【図１】
2010523099.tif 000012
【図２Ａ】
2010523099.tif 000013
【図２Ｂ】
2010523099.tif 000014
【図３Ａ】
2010523099.tif 000015
【図３Ｂ】
2010523099.tif 000016
【図４Ａ】
2010523099.tif 000017
【図４Ｂ】
2010523099.tif 000018
【図４Ｃ】
2010523099.tif 000019
【図４Ｄ】
2010523099.tif 000020
【図５Ａ】
2010523099.tif 000021
【図５Ｂ】
2010523099.tif 000022
【図６】
2010523099.tif 000023
【図７Ａ】
2010523099.tif 000024
【図７Ｂ】
2010523099.tif 000025
【図８】
2010523099.tif 000026
【配列表】
2010523099000001.app
【国際調査報告】
2010523099.tif 000027
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