(57)【要約】  本発明の好気発酵工程および系は、感知および制御することを通して、発酵全体にわたってある特定の溶存酸素（ＤＯ）プロフィールを確立し、発酵工程を改善する。いくつかの実施形態において、ＤＯプロフィールは、発酵工程の間に、発酵培地中におけるＤＯレベルを微生物の遅延相から定常相に上昇および低下させる１サイクルに従ってよい。培地中のＤＯレベルを制御するための１つの例として、前記ＤＯレベルは、微生物の増殖相の間に、ある一定の最大制御レベルに上昇し、その後、およそ微生物の最大増殖速度となったときに低下し、およそ増殖が停止する時に、ある一定の最小制御レベルに到達してよい。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
好気発酵工程を行う方法であって；
ａ）発酵微生物および該微生物により発酵可能な基質を含む発酵培地を提供することと；
ｂ）初めに予め決められた最大標的値に溶存酸素（ＤＯ）レベルを上昇させ、続いて、微生物の増殖の間に、前記最大標的値からその後の発酵工程の完了まで維持される予め決められた最小標的値にＤＯレベルを低下させ始めることにより、発酵培地中のＤＯレベルを制御することと
を含む方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記最小標的値は、およそ微生物に対するＤＯの下限である方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記最大標的値は、およそ微生物に対するＤＯの上限である方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、前記最小標的値は、およそ微生物に対するＤＯの下限であり、前記最大標的値は、およそ微生物に対するＤＯの上限である方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、前記上昇および低下は、実質的に線形の速度で生じる方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、前記初期の上昇は、およそ微生物の指数関数的な増殖相が始まるときに開始する方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、前記低下の開始は、およそ微生物の最大増殖速度を伴う時間に生じる方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、前記初期の上昇は、およそ微生物の指数関数的な増殖相が始まる第１の時間に開始し、前記低下の開始は、およそ微生物の最大増殖速度を伴う第２の時間に生じる方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、前記ＤＯレベルの制御には、培地へのオキシダントの供給を制御することが含まれる方法
【請求項１０】
請求項１に記載の方法であって、前記ＤＯレベルの制御には、培地の撹拌を制御することが含まれる方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法であって、さらに、培地中のＤＯレベルをモニタリングすることおよび前記モニタリングからのフィードバックに基づいた制御を達成するためにＤＯレベルを調節することを含んでなる方法。
【請求項１２】
好気発酵工程を行う方法であって；
ａ）発酵微生物および該微生物により発酵可能な基質を含む発酵培地を提供することと；
ｂ）第１の時間に予め決められた最大標的値に到達するように溶存酸素（ＤＯ）レベルを上昇させ、該上昇は、微生物の指数関数的な増殖の開始により開始する所定の期間に渡って生じるように培地中のＤＯレベルを制御することと；
ｃ）第２の時間に予め決められた最小標的値に到達し、前記最大標的値から前記最小標的値への移行は微生物の増殖の間に開始するように、前記最大標的値からＤＯレベルを低下させることにより、培地中のＤＯレベルを制御することと；
ｄ）前記第２の時間に最小標的値に到達した後、発酵工程の終了までＤＯレベルを維持することと
を含んでなる方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、前記最大標的値から最小標的値への移行は前記第１の時間に開始する方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、ＤＯレベルを上昇させることによる培地中のＤＯレベルの制御の前には、積極的なＤＯレベルの制御を欠いている方法。
【請求項１５】
請求項１２に記載の方法であって、前記最小標的値および最大標的値は、それぞれ、微生物に対するＤＯの下限および微生物に対するＤＯの上限である方法。
【請求項１６】
請求項１２に記載の方法であって、前記上昇および低下は線形の速度で生じる方法。
【請求項１７】
好気発酵工程を行う系であって；
ａ）発酵槽と；
ｂ）発酵槽内の培地における溶存酸素（ＤＯ）レベルを制御するために備えられた制御部であって、
i）最初に予め決められた最大標的値にＤＯレベルを上昇させることにより、培地中のＤＯレベルを上昇させる工程と；
ii）その後、前記最大標的値からその後発酵工程が完了するまで維持される予め決められた最小標的値にＤＯレベルを低下させる工程であって、前記低下は、微生物の増殖の間に開始する工程と
を含んでなる方法を実施するために、前記制御部からの出力信号を管理する制御指示を含む制御部と
を含んでなる系。
【請求項１８】
請求項１７に記載の系であって、さらに酸素源を含んでなり、前記制御部は、前記発酵槽に対する酸素源からの流れを制御するように構成された系。
【請求項１９】
請求項１７に記載の系であって、さらに、前記発酵槽中に備えられた撹拌器を含んでなり、前記制御部は、前記撹拌器の操作を制御するように構成された系。
【請求項２０】
請求項１７に記載の系であって、さらに、前記発酵槽内にＤＯ検出プローブを含んでなり、該プローブは、前記制御部に対してフィードバックシグナルを提供する系。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発酵は、例えば、食品、医薬、バイオテクノロジー、醸造および水処理の産業により利用される種々の発酵産物を産生するために使用される産業的な工程を意味する。バッチでの好気発酵は、酵母、細菌または他の好気性微生物を、該微生物により消費されて有用な産物を産生するための炭素含有基質と共に含む、反応容器または発酵槽中で起こる。発酵槽において維持される環境的な条件は、微生物の増殖を助ける。
【０００２】
好気発酵の間の発酵槽内の培地における溶存酸素（ＤＯ）の量は、生産性および基質収量に影響を及ぼす。ＤＯのレベルが低すぎる場合には微生物に対して好ましくないが、ＤＯのレベルが高すぎる場合には微生物の成長を阻害し得る。培地におけるＤＯの量は、特定の微生物発酵、ならびに発酵槽に供給される気体中の酸素の流速、圧力、および濃度に依存する。それ故、多くの発酵系は、培地中のＤＯおよびＤＯプロフィールに従って発酵槽に添加される酸素の制御量を測定する（前記ＤＯプロフィールは、発酵の間の酸素レベルにおける変化を意味する）。例えば、いくつかのアプローチは、発酵工程の間、一定のＤＯレベルを維持する。しかしながら、既知のＤＯプロフィールは、過剰または不十分な酸素レベルを結果として生じ、それ故、生産性および収量に対して有害に影響する。加えて、これらの非効率的なＤＯプロフィールは、供給される酸素を浪費する。浪費されるエネルギーおよび使用されない添加される反応物は、生産ユニットのコストを増大させ、発酵工程を不経済にする。
【０００３】
それ故、好気発酵条件下における微生物を用いた発酵に対する改善された方法および装置に対する必要性がある。
【発明の概要】
【０００４】
いくつかの実施形態において、好気発酵工程を行う方法には、発酵微生物および該微生物により発酵可能な基質を含む発酵培地を提供すること、ならびに始めにＤＯレベルを最大標的値に上昇させることにより培地中の溶存酸素（ＤＯ）レベルを制御し、その後、微生物の培養の間に、最大標的値からその後の発酵工程の発酵完了まで維持される最小標的値までＤＯレベルを低下させ始めることが含まれる。
【０００５】
いくつかの実施形態において、好気発酵工程を行う方法には、発酵微生物および該微生物により発酵可能な基質を含む発酵培地を提供すること、ならびに第１の時間に最大標的値に到達するようにＤＯレベルを上昇させることにより、培地中のＤＯレベルを制御することを含み、前記上昇は、微生物の指数関数的な増殖の開始と共に始まる期間に渡って生じる。前記方法は、さらに、前記最大標的値から第２の時間に最小標的値に到達するようにＤＯレベルを低下させることにより、培地中のＤＯレベルを制御することを含み、最大標的値から最小標的値への移行は、微生物の指数関数的な増殖のような増殖の間に開始する。前記方法は、さらに、前記第２の時間に最小標的値に到達した後、発酵工程の完了までＤＯレベルを実質的に維持することを含む。
【０００６】
いくつかの実施形態によると、好気発酵工程を行うための系は、発酵槽および発酵槽内の培地中におけるＤＯレベルを制御するように構成された制御部を含み、前記制御部は、始めにＤＯレベルを上昇させることにより培地中のＤＯレベルを増大させること、およびその後、前記最大標的値から発酵工程の完了まで維持される最小標的値にＤＯレベルを低下させることを含む方法を行うために、前記制御部からの出力信号を管理する制御指示を含み、前記低下は、微生物の増殖の間に開始する。
【０００７】
本発明の本質および目的のさらなる理解のために、付属の図面と共に以下の発明の詳細な説明を参照すべきであり、同様の要素は、同じまたは類似の参照番号が与えられる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、非定常のＤＯプロフィールを確立するために、発酵槽内に含まれる培地中の溶存酸素（ＤＯ）レベルを制御する発酵系を示し、本発明の実施形態と一致する。
【図２】図２は、結果に基づいて、培地中のＤＯレベルの制御を変化させるために確認された発酵時間を用いた例示的な発酵工程の結果のグラフを示し、本発明の実施形態と一致する。
【図３】図３は、本発明の実施形態に従った、非定常のＤＯプロフィールの一例に対するプロットを示す。
【図４】図４は、本発明の実施形態に従った、非定常のＤＯプロフィールで好気性微生物の発酵工程を行う方法のフローチャートを示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
実施形態は、一般的に、感知および制御することを通して、発酵工程を改善するために発酵全体にわたってある特定の溶存酸素（ＤＯ）プロフィールを確立する、バッチ式の発酵工程および系のような好気発酵工程に関する。ここで述べられる技術は、いくつかの産業的な発酵工程に及び、例えば、食品、医薬、バイオテクノロジー、醸造および水処理産業に利用される。発酵工程は、酵母、細菌または他の好気性微生物を該微生物により消費され、有用な産物を作り出すための炭素含有基質と共に含む反応容器または発酵槽において起こる。いくつかの実施形態において、ＤＯプロフィールは、発酵工程の間に、微生物の遅延（lag）相から定常相に、発酵培地中のＤＯレベルを増加させ減少させる１サイクルに従ってよい。培地中のＤＯレベルを制御する１つの例として、ＤＯレベルは、微生物の増殖相の間に最大許容ＤＯまで増大してよく、通常、微生物の抑制点と定義され、およそそのとき微生物の最大増殖速度となり、およそ微生物の増殖が停止する時に、ＤＯレベルは微生物のＤＯ下限（ＤＯ limitation）まで低下する。
【００１０】
図１は、１以上の非定常ＤＯプロフィールを確立するために、発酵槽１００内に含まれる培地１０２中のＤＯレベルを制御する発酵系１００を示す。系１００は、発酵槽１０４に連結されたＯ２供給１０６およびある一定の非定常ＤＯプロフィールを達成するために系１００の側面を制御する制御部１０８を含む。この目的のために、制御部１０８は、１以上の非定常ＤＯプロフィールを用いてプログラムされるか、またはプログラム可能である。制御部１０８は、汎用のコンピュータ（例えば、オペレーティングシステムの制御下におけるワークステーション機能）またはプログラマブル論理制御装置（ＰＬＣ）のような特定用途のプログラム可能な装置であってよい。制御部１０８の出力１１０は、Ｏ２供給１０６と発酵槽１０４との間に配置されたバルブ１１２を動作させる制御信号を伝達し、バルブ１１２を通る流速を制御する。Ｏ２供給１０６は、空気、純粋な酸素または酸素に富んだ空気のような気体の形態であってよい酸素を含有する。バルブ１１２を通る流速を増大または減少させることにより、それぞれ、発酵槽１０４に供給される酸素の量を増大または減少させ、ここで述べるようにＤＯレベルを制御する。
【００１１】
いくつかの実施形態において、制御部１０８の出力１１０は、さらに、発酵槽１０４内に備えられた撹拌器１１４の操作を制御してよい。例えば、撹拌器１１４は、速度が制御部１０８からの信号により制御されることにより管理されるモーターにより動かされ、培地１０２を機械的にかき回す回転子を定義してもよい。培地１０２の撹拌は、ＤＯレベルを上昇させ、撹拌の操作の程度は前記ＤＯプロフィールを得る助けとして利用され得る。
【００１２】
制御部１０８は、発酵槽１０４内で、ＤＯプローブ１１６からのフィードバックを利用する。ＤＯプローブ１１６は、培地１０２中のＤＯレベルを測定し、制御部１０８によるＤＯレベルの適切な制御を達成する。制御部１０８は、発酵工程の間の選択された非定常ＤＯプロフィールを達成するために、ＤＯレベルを制御する。制御部１０８は、それ故、ここで述べられ、図４に示すような方法を実行するための指示でコードされたコンピュータ読み取り可能な実体的な記憶媒体を有するコンピュータを含んでよい。制御部１０８に発酵工程の動力学を入力することにより、さらに、制御部が、ここでの教示に基づく適切な制御アルゴリズムを利用して、非定常ＤＯプロフィールを計算することが可能になる。
【００１３】
図２は、系１００により得られる代表的な発酵工程の結果のグラフであり、時間に対して細胞量をプロットした曲線２００により示される。直線２０２は、曲線２００に沿った最も高い勾配に対応し、それ故、発酵工程の間の最大増殖速度、培地１０２中の微生物が最も速く増殖する場合を表す。非定常ＤＯプロフィールを適用しないで行われる予備的な発酵実験で、曲線２００を得るための細胞増殖速度を決定してよい。例えば、光吸収は細胞数に比例するため、曲線２００は、細胞量を決定するために、ある一定時間において培地１０２からサンプルを摂取し、サンプルの光学的な密度を測定することにより予備的な発酵実験で得られてよい。さらに、推定された、または最初の非定常ＤＯプロフィールを適用する先行するバッチ発酵からの繰り返しは、予備的な発酵実験を提供してよい。
【００１４】
遅延相２０３、指数関数的な増殖相２０４および定常相２０５は、発酵工程の初めから終わりに渡って生じ、曲線２００により表される。ＤＯレベルの上昇または低下の速度を選択された値に調節することにより、培地１０２中のＤＯレベルを制御し、第１、第２および第３の時間ｔ０、ｔ１、ｔ２が生じる。曲線２００は、非定常ＤＯプロフィールに沿った制御変化を定義するために使用される時間ｔ０、ｔ１、ｔ２の選択を可能にする。第１の時間ｔ０は、大体、増殖相２０４が開始する時に生じる。いくつかの実施形態において、前記第１の時間ｔ０は、ｘ軸と直線２０２との交点に対応し、時間を表し、交点は、第１の時間ｔ０が割り当てられる時間における特別な点を特定する。第２の時間ｔ１は、遅延相２０３と定常相２０５との中間の増殖相２０４の間に生じる。いくつかの実施形態において、第２の時間ｔ１は、最大増殖速度が生じるときに対応する。第３の時間ｔ２は、増殖相２０４のほぼ終わりに生じ、増殖速度が停止するか、または定常相２０５に到達する。１つの実施形態において、最大増殖速度（第２の時間ｔ１）および増殖速度の停止（第３の時間ｔ２）は、曲線２００の微分により決定されてよい。
【００１５】
図３は、非定常ＤＯプロフィール３００の一例についてのプロットを示す。遅延相２０３の間、消費される酸素を補充するＯ２供給１０６からの酸素の注入がないため、飽和状態からのＤＯレベルの自然な低下が生じる。ＤＯレベルの自然な低下は、酸素の注入が開始される第１の時間ｔ０まで続く。第１の時間ｔ０において、制御部１０８は、バルブ１１２を動作させ、および／または撹拌器１１４を操作し、時間をかけてＤＯレベルを微生物に対する既知のまたは予め実験的に決定されたＤＯの上限（ＤＯ inhibition）のような最大標的値３０１に上昇させる。制御部１０８の操作は自動であり、第２の時間ｔ１に最大標的値３０１に到達するように、第１の時間ｔ０からのＤＯレベルの増大が確立されるように機能してよい。いくつかの実施形態において、最大標的値３０１は、任意の最大値を意味するか、または、フラッディング（flooding）のような安全上または操作上の必要条件のように、系１００の物理的な状態により定義されてよい。
【００１６】
第２の時間ｔ１に達すると、制御部１０８は、制御基準を変化させ、ＤＯレベルを最大標的値３０１から発酵工程の完了まで維持される最小標的値３０２（例えば、既知の、または微生物に対して実験的に予め決定された任意の最小値またはＤＯ限界）に低下させ始める。制御部１０８は、第３の時間ｔ２に最小標的値３０２に到達するように第２の時間ｔ１からの低下速度を確立する。定常相２０５において最小標的値３０２にＤＯレベルが維持されると、微生物はもはや増殖しないため、Ｏ２を消耗することなく微生物の死滅を回避する。
【００１７】
ＤＯプロフィール３００は、遅延相２０３から定常相２０５まで培地１０２中でＤＯレベルを上昇および低下させる１サイクルに従う。前記サイクルは、発酵工程の間のある一定の時間にＤＯプロフィール３００が到達する標的値３０１、３０２を設定する。ＤＯプロフィール３００がそれぞれ第２および第３の時間ｔ１、ｔ２に最大および最小標的値３０１、３０２に到達し、増殖相２０４の間の第２の時間ｔ１から第３の時間ｔ２において下降する傾向が始まる限り、ＤＯプロフィール３００は、標的値３０１、３０２への直接的または間接的な経路に従ってよい。直線的な上昇および下降の勾配は、第１の時間ｔ０と第２の時間ｔ１との間および第２の時間ｔ１と第３の時間ｔ２との間でそれぞれＤＯプロフィールに沿って示されるが、２次または３次曲線のような他の形成された勾配は、時間ｔ０、ｔ１、ｔ２に対応する位置の間でＤＯプロフィール３００を形成してよい。例えば、ＤＯレベルにおける変化の速度（制御部１０８により制御される）は、一定（図３に示すように）または変化してよい（例えば、速度は初期に増大し、その後第２の時間に到達するまで段階的に低下する）。それ故、前記レベルにおける変化は、時間間隔（例えばｔ０からｔ１）の間の与えられた移行に対して、直線的もしくは非直線的または両方の組み合わせであってよい。
【００１８】
例えば、図３には、ある一定速度で直線的に上昇するＤＯレベルが示されている。しかしながら、ＤＯレベルが上昇する一定速度は、異なる実施例に対しては異なってよいと解される。さらに、図３は、前記レベルの直線的な上昇（すなわち固定された速度での上昇）を示すが、前記レベルが上昇する速度は、種々の時間の間（例えば、第１の時間ｔ０と第２の時間ｔ１の間）で変化してよいとも考えられる。例えば、前記速度は、第１の時間ｔ０において初めに増大してよく、その後、前記速度は第２の時間ｔ１に到達するまで段階的に低下してよい。
【００１９】
ＤＯプロフィール３００は、最も必要な場合、ＤＯレベルに対する最大値を微生物の最も速い増殖と一致するように設定することにより、酸素の導入および利用の正の効果を改善する。その後、ＤＯレベルの低下は、発酵工程の最後において、培地１０２中で使用されない酸素を消費することを妨げることにより、酸素の導入および利用の正の効果を付加的に改善する。定常相２０５を導く増殖相２０４の間、酸素添加速度は、連続的に増大する代わりに、微生物の増殖に対して害を与えることなく低下する。細胞の濃度は、生産性を阻害しないように十分な酸素レベルを必要とする増殖の指標を提供しないため、ＤＯプロフィール３００は、酸素のようなオキシダントの浪費を妨げるために、細胞の量に依存せずにＤＯレベルを制御することを示す。発酵工程を通してＤＯレベルを一定に維持することに対して、非定常のＤＯプロフィール３００は、Ｏ２供給１０６の出力から培地１０２へ酸素が移動しない可能性を高めることまたは発酵工程の終わりにおいて酸素が余らないようにすることの結果として、必要な場合に微生物が利用可能な全酸素を制限すること、さらに酸素を浪費しないようにすることにより、系１００の生産性に貢献する。
【００２０】
図４は、非定常ＤＯプロフィールで発酵工程を行う方法のフローチャートを示す。発酵工程は、好気性微生物および発酵の間に該微生物により消費されるための炭素含有基質を含む培地を提供することにより、最初のステップ４０２から開始する。ＤＯを増大させるステップ４０４は、上述したような選択されたプロフィールの基準に従って培地中のＤＯレベルを上昇させるために、酸素の出力および／または培地の撹拌を操作することを含む。ＤＯレベルの上昇は、第１の時間に最大標的値に到達させるために、微生物の指数関数的な増殖の初期の部分に渡る少なくとも一定期間に渡って生じる。次に、さらなる操作は、ＤＯ低下ステップ４０６において、第２の時間に最小標的値に到達するように最大標的値からＤＯレベルを低下させる。前記低下は、微生物の指数関数的な増殖のような増殖の間に開始する。最後のステップ４０８において、第２の時間に最小標的値に到達した後、発酵工程の終了までＤＯレベルが維持される。
【００２１】
上述した基準に基づく制御部１０８の操作は、系１００の収率および生産性の両方を改善する。制御部１０８により、発酵槽１０４に対するＯ２供給１０６からの流れを、例えばＤＯプロフィール３００を達成するように操作することは、培地１０２中のある一定量の基質に対して産生される産物または細胞の量を改善する。基質の消費量に対して産生される細胞数を改善することに加えて、系１００を用いて達成される生産性は、単位時間当たりに培養される細胞または産物の数を結果として改善する。
【００２２】
本発明を実施するために好ましい方法および装置について述べられている。本発明の本質および範囲から離れることなく、上述した実施形態に対して多くの変化および修飾がなされてよいことは、当業者に理解され、自明であろう。上述したものは、説明のためのみに使用され、組み合わされた方法および装置の他の実施形態は、以下の請求の範囲に定義された本発明の真の範囲を逸脱することなく使用されてよい。
【図１】
2010527579.tif 000003
【図２】
2010527579.tif 000004
【図３】
2010527579.tif 000005
【図４】
2010527579.tif 000006
【国際調査報告】
2010527579.tif 000007
2010527579.tif 000008
2010527579.tif 000009