(57)【要約】  本発明は、ＡＤＣＣ／ＣＤＣ活性を含む生物学的活性が向上した、免疫グロブリン部分（エフェクター機能部分）のＦｃ領域とのＦＧＦ受容体部分の可溶性断片又はドメイン（標的又は結合部分）の融合物を含む修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物、それらを含有する組成物及びこのような修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合分子を産生する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫グロブリンのＦｃ領域とのＦＧＦ受容体の可溶性断片又はドメインの融合物を含む、修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物（ここで、ＦＧＦ受容体部分の少なくとも５番目のＮ−グリコシル化部位が占有され、前記ＦＧＦ受容体部分のＮ−グリカンの最大で４５％がシアル基を有さない。）。
【請求項２】
さらに、ＦＧＦ受容体部分の、３番目、４番目、６番目及び７番目のＮ−グリコシル化部位が占有される、請求項１に記載の修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物。
【請求項３】
ＦＧＦ受容体部分の少なくとも７個のＮ−グリコシル化部位が占有される、請求項２に記載の修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物。
【請求項４】
ＦＧＦ受容体部分の全てのＮ−グリコシル化部位が占有される、請求項３に記載の修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物。
【請求項５】
ＦＧＦ受容体部分のＮ−グリカン１個あたりのシアル酸の平均数が０．９以上である、請求項１から請求項４の何れか一項に記載の修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物。
【請求項６】
ＦＧＦ受容体部分のＮ−グリカン１個あたりのシアル酸の平均数が１．２以上である、請求項５に記載の修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物。
【請求項７】
ＢｉａｃｏｒｅＴＭにより測定されるＦＧＦ２に対する前記融合物のＫＤ値が１から５ｎＭの間に含まれる、請求項１から請求項６の何れか一項に記載の修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物。
【請求項８】
ＢｉａｃｏｒｅＴＭにより測定されるＦＧＦ２に対する前記融合物のＫＤ値が約１．５ｎＭである、請求項７に記載の修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物。
【請求項９】
前記融合物がＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ活性を保持する、請求項１から請求項８の何れか一項に記載の修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物。
【請求項１０】
前記融合物のＮ−グリカンが６０−１００％フコシル化されている、請求項１から請求項９の何れか一項に記載の修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物。
【請求項１１】
前記修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物が、グリカン１分子あたり、３個のマンノース残基、平均１．５から３．０個のガラクトース残基、平均３．５から５個のＮ−アセチルグルコサミン残基及び平均０．６から１個のフコース残基を含む、請求項１から請求項１０の何れか一項に記載の修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物。
【請求項１２】
前記融合物のＮ−グリカンが０−６０％フコシル化されている、請求項１から請求項９の何れか一項に記載の修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物。
【請求項１３】
ＦＧＦ受容体がＦＧＦ受容体１（ＦＧＦＲ１）又はＦＧＦ受容体２（ＦＧＦＲ２）の中から選択される、請求項１から請求項１２の何れか一項に記載の修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物。
【請求項１４】
ＦＧＦ受容体が、ＦＧＦ受容体１アイソタイプＩＩＩｃ及びＦＧＦ受容体２アイソタイプＩＩＩｃの中から選択される、請求項１から請求項１３の何れか一項に記載の修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物。
【請求項１５】
ＦＧＦ受容体可溶性ドメインが、配列番号４で示される配列又は配列番号４と少なくとも９５％の同一性を有する配列を有する、請求項１から請求項１４の何れか一項に記載の修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物。
【請求項１６】
Ｆｃ部分が、配列番号６で示される配列又は配列番号６と少なくとも９５％の同一性を有する配列を有する、請求項１から請求項１５の何れか一項に記載の修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物。
【請求項１７】
前記修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物が少なくとも３アミノ酸残基のリンカー配列をさらに含む、請求項１から請求項１６の何れか一項に記載の修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物。
【請求項１８】
リンカー配列がＳＡＬ（Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ）である、請求項１７に記載の修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物。
【請求項１９】
修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物が、配列番号２で示されるポリペプチド配列又は配列番号２と少なくとも９５％の同一性を有する配列を有する、請求項１から請求項１８の何れか一項に記載の修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物。
【請求項２０】
修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物が、配列番号８のシグナルペプチドをさらに含む、請求項１から請求項１９の何れか一項に記載の修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物。
【請求項２１】
請求項１から請求項２０の何れか一項に記載の修飾融合ＦＧＦ受容体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２２】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項２１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２３】
請求項２１及び請求項２２の何れか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２４】
請求項２３に記載のベクターを含む細胞。
【請求項２５】
薬剤としての、請求項１から請求項２０の何れか一項に記載の修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物
【請求項２６】
請求項１から請求項２０の何れか一項に記載の修飾融合ＦＧＦ受容体を含む、医薬組成物。
【請求項２７】
前記組成物がさらなる治療薬を含有する、請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
前記さらなる治療薬が抗血管形成薬又は化学療法剤である、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
前記抗血管形成薬が、腫瘍壊死因子又は、酸性もしくは塩基性繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、組織因子（ＴＦ）、プロテインＣ、プロテインＳ、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）又はＨＥＲ２受容体のアンタゴニストである、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
前記化学療法剤が、抗微小管薬；白金配位錯体；アルキル化剤；抗生物質；トポイソメラーゼＩＩ阻害剤；代謝拮抗物質；トポイソメラーゼＩ阻害剤；ホルモン及びホルモン類似体；シグナル伝達経路阻害剤；非受容体チロシンキナーゼ血管形成阻害剤；免疫療法剤； プロアポトーシス剤；及び細胞周期シグナル伝達阻害剤の群から選択される、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
前記化学療法剤がタキソール及びタキソテールの群から選択される、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
癌を治療するための薬剤の調製のための、請求項１から請求項２０の何れか一項に記載の修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物の使用。
【請求項３３】
同じ又は異なる組成物の製造におけるさらなる治療薬の使用を含む、請求項３２に記載の使用。
【請求項３４】
前記さらなる治療薬が抗血管形成薬又は化学療法剤である、請求項３３に記載の使用。
【請求項３５】
前記抗血管形成薬が、腫瘍壊死因子又は、酸性もしくは塩基性繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、組織因子（ＴＦ）、プロテインＣ、プロテインＳ、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）又はＨＥＲ２受容体のアンタゴニストである、請求項３４に記載の使用。
【請求項３６】
前記化学療法剤が、抗微小管薬；白金配位錯体；アルキル化剤；抗生物質；トポイソメラーゼＩＩ阻害剤；代謝拮抗物質；トポイソメラーゼＩ阻害剤；ホルモン及びホルモン類似体；シグナル伝達経路阻害剤；非受容体チロシンキナーゼ血管形成阻害剤；免疫療法剤； プロアポトーシス剤；及び細胞周期シグナル伝達阻害剤の群から選択される、請求項３４に記載の使用。
【請求項３７】
前記化学療法剤がタキソール及びタキソテールの群から選択される、請求項３４に記載の使用。
【請求項３８】
前記癌が、癌腫（膀胱癌、乳癌、結腸癌、頭頸部癌、腎臓癌（腎細胞癌を含む。）、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、子宮頸部癌、甲状腺癌及び皮膚癌（扁平上皮癌）を含む。）；リンパ系の血液腫瘍（白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫を含む。）；骨髄系の血液腫瘍（急性及び慢性骨髄性白血病及び前骨髄球性白血病を含む。）；間葉由来の腫瘍（線維肉腫及び横紋筋肉腫を含む。）；その他の腫瘍（メラノーマ、精上皮腫、奇形癌腫、神経芽種及び神経膠腫を含む。）；中枢及び末梢神経系の腫瘍（星状細胞腫、神経芽種、神経膠腫及び神経鞘腫を含む。）；間葉由来の腫瘍（線維肉腫、横紋筋肉腫及び骨肉腫を含む。）；及びその他の腫瘍（メラノーマ、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、精上皮腫、濾胞性甲状腺腫及び奇形癌腫を含む。）の群から選択される、請求項３２に記載の使用。
【請求項３９】
前記癌が、メラノーマ、白血病、腎臓癌、結腸癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、膀胱癌、乳癌及び頭頸部癌の群から選択される、請求項３８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野及び導入
本発明は、生物学的活性が向上した、免疫グロブリンのＦｃ領域とのＦＧＦ受容体の可溶性断片又はドメインの融合物を含む、修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物、それらを含有する組成物及びこのような修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物分子を作製する方法に関する。特に、修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物は、抗血管形成活性及び抗腫瘍抗体依存性の細胞介在性細胞傷害活性、即ちＡＤＣＣ（抗体依存性細胞性細胞傷害）及び／又はＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）が向上しており、従って、癌、転移性腫瘍の治療において、及び対象において腫瘍増殖を低下させるために、有用である。本発明は、さらに、腫瘍成長を阻害する方法及び、以下に限定されないが、乳癌、メラノーマ、白血病、脳転移、腎臓癌、原発性メラノーマ、原発性結腸癌、原発性膀胱癌、小児血管腫、卵巣癌、前立腺癌及び肺癌を含む病的状態の治療又は予防のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景及び関連性
血管形成、即ち既存の血管からの新血管の形成は、内皮細胞増殖、移動、基底膜分解及び新血管編成の複雑な協調を含む（Ｊｉら、１９９８、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１２：１７３１−１７３８）。局所的な制御不能な血管成長因子の放出及び／又は天然の血管形成阻害剤の産生の変化（結果として血管形成バランスが変化する。）（Ｈａｎａｈａｎら、１９９６、Ｃｅｌｌ．８６：３５３−６４）は、腫瘍血管新生中及び血管形成に依存する疾患において起こる制御不能な細胞増殖に関与する（Ｆｏｌｋｍａｎ、１９９５、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１：２７−３１）。
【０００３】
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）ファミリーのメンバー、アンジオポエチン、形質転換増殖因子−α及び−β（ＴＧＦ−α及び−β）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン、ケモカイン及び繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリーのメンバーを含め、血管形成の多数の天然誘導因子が同定されている。これらの強力な血管形成因子は腫瘍組織により過剰発現されることが多い（Ｐｒｅｓｔａ、２００５、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ＆  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  Ｒｅｖｉｅｗｓ．１６：１５９−１７８；Ｇｒｏｓｅ、２００５、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ＆  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  Ｒｅｖｉｅｗｓ．１６：１７９−１８６）。実際に、ＦＧＦ及びとりわけＦＧＦ２は、メラノーマ（Ｈａｌａｂａｎ、１９９６、Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２３：６７３−８１；Ｈａｎａｄａ、２００１、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：５５１１−５５１６）、白血病（Ｋｒｅｊｃｉら、２００１  Ｌｅｕｋｅｍｉａ．１５：２２８−３７、Ｂｉｅｋｅｒら、２００３、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：７２４１−７２４６）、腎臓癌（Ｈａｎａｄａ、２００１、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：５５１１−５５１６）、結腸癌（Ｔａｓｓｉ、２００６、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６６：１１９１−１１９８）、卵巣癌（Ｗｈｉｔｗｏｒｔｈら、２００５、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１１：４２８２−４２８８、Ｇａｎら、２００６、Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．２３：１３２４−３１）、前立腺癌（Ａｉｇｎｅｒら、２００２  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２１：５７３３−４２；Ｋｗａｂｉ−Ａｄｄｏら、２００４、Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｌａｔ  Ｃａｎｃｅｒ．１１：７０９−２４）及び肺癌（Ｔａｋａｎａｍｉら、１９９６、Ｐａｔｈｏｌ  Ｒｅｓ  Ｐｒａｃｔ．１９２：１１１３−２０；Ｖｏｌｍら、１９９７、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１７：９９−１０３；Ｂｒａｔｔｓｔｒｏｍら、１９９８、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１８：１１２３−１１２７）を含む多数のヒトの癌で過剰発現される。さらに、ＦＧＦ２過剰発現は、膀胱癌、乳癌、頭頸部癌を含むある種の癌において化学耐性と相関し得る（Ｇａｎら、２００６、Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．２３：１３２４−３１）。ＦＧＦファミリーメンバーに関して、腫瘍細胞により分泌されるＦＧＦは細胞表面のグリコサミノグリカン側鎖及びマトリクスプロテオグリカンに対して親和性を有するので、これらの分泌ＦＧＦは、おそらく、ＦＧＦの蓄積場所を形成する腫瘍細胞付近に隔絶されると考えられる。これによって、特に、ＦＧＦが、安定して発現され容易に接近可能である標的分子を必要とする活性分子を移動させるための良好なストラテジーに対応するようになる。
【０００４】
治療薬として様々な抗体に基づく生成物が現在使用されており、いくつかのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が現在、癌、炎症、感染性疾患及び心血管系疾患などの様々な治療領域で承認されている。これらのｍＡｂは、免疫系の動員を含む複数の機構により、腫瘍細胞の殺滅を誘導する（Ｈａｒｒｉｓ、２００４、Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ、５：２９２−３０２）。ｍＡｂのＦｃ部分は、２つの主要な機構（抗体依存性の細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ））を含むこれらの免疫介在性エフェクター機能に関与する。ＡＤＣＣは、ｍＡｂが最初にその抗原結合部位を介して腫瘍細胞上のその標的に結合した際に起こり、次いで、標的細胞を攻撃するエフェクター細胞（即ち、ＮＫ、好中球、マクロファージなど）上の特異的Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）によりＦｃ部分が認識される。ＣＤＣは、補体活性化部位の近辺で抗体被覆腫瘍細胞の表面上でＣ３ｂ形成に導くＣ１ｑにｍＡｂが結合する場合に、様々な補体タンパク質のカスケードが活性化されるプロセスである。Ｃ３ｂがあると、腫瘍細胞を溶解するために膜に挿入することができるＣ５−Ｃ９細胞膜傷害複合体の形成が制御される（Ｓｈａｒｋｅｙ、２００７、ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ、５６：２２６−２４３）。ｍＡｂのＡＤＣＣ刺激能はそれらのアイソタイプに依存する。ＩｇＧ１及びＩｇＧ３抗体はＦｃＲによく結合し、一方、ＩｇＧ４及びＩｇＧ２抗体は結合が弱い。ｍＡｂのＣＤＣ能もまたｍＡｂアイソタイプに依存する。ＩｇＧ３及び、それほどではないにせよＩｇＧ１は、古典的な補体カスケードを刺激するための最も有効なアイソタイプである。ＩｇＧ２  ｍＡｂは、補体カスケードを活性化することにおいて効率が低く、一方、ＩｇＧ４は補体カスケードを活性化できない（Ｓｔｒｏｍｅ、２００７、Ｔｈｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ、１２：１０８４−１０９５）。
【０００５】
抗体として、特異的標的化を示す結合部分及び、免疫系の動員により標的細胞の溶解を誘導することができるエフェクター部分を伴う二重機能性を有し得る融合タンパク質の使用は、これらの治療ストラテジーの１つの態様である。さらに、治療において有用であるために、この分子は、有利な薬物動態特性ＰＫを有する必要がある。Ｆｃ部分は、検出可能に、修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物の血清半減期を延長させ得るが、血清半減期がより長い融合タンパク質が依然として必要とされている。最後に、この融合タンパク質を薬物として使用しようとする場合、確実に、効率的に、及び適切な生産性でそれが産生されることが必要である。
【０００６】
従って、癌、転移性腫瘍の治療のための、及び対象において腫瘍成長を低下させるための、ＰＫ特性が向上し、効率的に産生され得る、ＦＧＦを標的とするＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ活性を有する融合タンパク質が必要とされている。
【０００７】
出願者は、今回、特定のグリカンプロファイルを有するように修飾可溶性ＦＧＦ受容体部分（結合又は標的化部分）とＦｃ部分（エフェクター機能部分）との間の可溶性融合タンパク質（ｓＦＧＦＲ−Ｆｃ）において、実際に、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ活性を含め、生物学的活性が実質的に向上しており、従って、制御不能な細胞増殖又は癌の処置に対して、有効な抗血管形成及び抗腫瘍薬としてこれが使用され得ることを発見した。これらの修飾可溶性融合タンパク質は、そのシアル化率ゆえに、有利なＰＫ特性を有し、そのグリコシル化パターンのために、適切な生産性及び最小限の凝集で産生され得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｊｉ他、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１２、１９９８年、ｐ．１７３１−１７３８
【非特許文献２】Ｈａｎａｈａｎ他、Ｃｅｌｌ．８６、１９９６年、ｐ．３５３−６４
【非特許文献３】Ｆｏｌｋｍａｎ、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１、１９９５、ｐ．２７−３１
【非特許文献４】Ｐｒｅｓｔａ、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ＆  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  Ｒｅｖｉｅｗｓ．１６、２００５年、ｐ．１５９−１７８
【非特許文献５】Ｇｒｏｓｅ、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ＆  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  Ｒｅｖｉｅｗｓ．１６、２００５年、ｐ．１７９−１８６
【非特許文献６】Ｈａｌａｂａｎ、Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２３、１９９６年、ｐ．６７３−８１
【非特許文献７】Ｈａｎａｄａ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１、２００１年、ｐ．５５１１−５５１６
【非特許文献８】Ｋｒｅｊｃｉ他、Ｌｅｕｋｅｍｉａ．１５、２００１年、ｐ．２２８−３７
【非特許文献９】Ｂｉｅｋｅｒ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３、２００３年、ｐ．７２４１−７２４６
【非特許文献１０】Ｈａｎａｄａ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１、２００１年、ｐ．５５１１−５５１６
【非特許文献１１】Ｔａｓｓｉ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６６、２００６年、ｐ．１１９１−１１９８
【非特許文献１２】Ｗｈｉｔｗｏｒｔｈ他、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１１、２００５年、ｐ．４２８２−４２８８
【非特許文献１３】Ｇａｎ他、Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．２３、２００６年、ｐ．１３２４−３１
【非特許文献１４】Ａｉｇｎｅｒ他、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２１、２００２年、ｐ．５７３３−４２
【非特許文献１５】Ｋｗａｂｉ−Ａｄｄｏ他、Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｌａｔ  Ｃａｎｃｅｒ．１１、２００４年、ｐ．７０９−２４
【非特許文献１６】Ｔａｋａｎａｍｉ他、Ｐａｔｈｏｌ  Ｒｅｓ  Ｐｒａｃｔ．１９２、１９９６年、ｐ．１１１３−２０
【非特許文献１７】Ｖｏｌｍ他、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１７、１９９７年、ｐ．９９−１０３
【非特許文献１８】Ｂｒａｔｔｓｔｒｏｍ他、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１８、１９９８年、ｐ．１１２３−１１２７
【非特許文献１９】Ｇａｎ他、Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．２３、２００６年、ｐ．１３２４−３１
【非特許文献２０】Ｈａｒｒｉｓ、Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ、５、２００４年、ｐ．２９２−３０２
【非特許文献２１】Ｓｈａｒｋｅｙ、ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ、５６、２００７年、ｐ．２２６−２４３
【非特許文献２２】Ｓｔｒｏｍｅ、Ｔｈｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ、１２、２００７年、ｐ．１０８４−１０９５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、本発明は、免疫グロブリンのＦｃ領域との、ＦＧＦ受容体の可溶性断片又はドメインの融合物を含む修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃに関する（ここで、ＦＧＦ受容体部分の少なくとも５番目のＮ−グリコシル化部位が占有され、ＦＧＦ受容体部分のＮ−グリカンの最大で４５％がシアル基を有さない。）。さらに、本発明のさらに好ましい実施形態によると、ＦＧＦ受容体部分の、３番目、４番目、６番目及び７番目のＮ−グリコシル化
部位が占有される。好ましくは、全てのＮ−グリコシル化部位が占有される。さらに好ましい実施形態において、本発明の融合物のＦＧＦ受容体部分におけるＮ−グリカン１個あたりのシアル酸の平均数は、少なくとも０．９；さらにより好ましくは、少なくとも１．２である。本発明による修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物の各Ｎ−グリカン分子は、平均１．５から３．０個のガラクトース残基、３．５から５個のＮ−アセチルグルコサミン及び０．６から１個のフコース残基において、３個のマンノース残基を有する。
【００１０】
本発明はまた、免疫グロブリンのＦｃ領域とのＦＧＦ受容体の可溶性断片又はドメインの融合物を含む修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物にも関し、この場合、全Ｎ−グリコシル化部位が占有され、ＦＧＦ受容体部分のＮ−グリカンの最大で４５％がシアル基を有さず、Ｆｃ領域のＮ−グリカンが６０から１００％フコシル化されている。
【００１１】
ある実施形態において、ＦＧＦ受容体の可溶性断片又はドメインは、ＦＧＦ受容体１（ｓＦＧＦＲ１）又はＦＧＦ受容体２（ｓＦＧＦＲ２）の可溶性又は細胞外ドメインである。別の実施形態において、ＦＧＦ受容体の可溶性断片又はドメインは、ＦＧＦ受容体１アイソタイプ又は変異型ＩＩＩｃ（ｓＦＧＦＲ１（ＩＩＩｃ））又はＦＧＦ受容体２アイソタイプＩＩＩｃ（ｓＦＧＦＲ２（ＩＩＩｃ））の可溶性又は細胞外ドメインである。
【００１２】
好ましい実施形態によると、修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物は、配列番号１で示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド又は配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる。さらに好ましい実施形態において、本発明の修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物は、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は配列番号２で示される配列と少なくとも９５％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する配列を有する。
【００１３】
本発明の修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物は、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ活性を有し、従って、癌などの疾患の治療に有用である。
【００１４】
本発明はまた、このような修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物を含む医薬組成物にも関する。
【００１５】
本発明はさらに、化学療法剤又は抗腫瘍及び／又は抗血管形成特性のあるバイオ治療薬との修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物の組み合わせに関する。
【００１６】
本発明の別の目的は、治療的有効量で本発明の修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物を対象に投与することを含む、癌の治療方法又は、腫瘍成長及び体積及び転移性腫瘍を予防するかもしくは緩和する方法である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】図１Ａ及びＢは、それぞれＳＩＡＴ６（ＳＴ３ＧＡＬ３）及びＢ４ＧＴ１（Ｂ４ＧＡＬＴ１）に対する発現ベクターのマップを示す。
【図１Ｂ】図１Ａ及びＢは、それぞれＳＩＡＴ６（ＳＴ３ＧＡＬ３）及びＢ４ＧＴ１（Ｂ４ＧＡＬＴ１）に対する発現ベクターのマップを示す。
【図２Ａ】図２Ａ及びＢは、ｐＸＬ４５５１からの発現のためのＢ４ＧＴ１（Ｂ４ＧＡＬＴ１）の核酸（配列番号９）及びアミノ酸（配列番号１０）配列を示す。
【図２Ｂ】図２Ａ及びＢは、ｐＸＬ４５５１からの発現のためのＢ４ＧＴ１（Ｂ４ＧＡＬＴ１）の核酸（配列番号９）及びアミノ酸（配列番号１０）配列を示す。
【図３Ａ】図３Ａ及びＢは、ｐＸＬ４５４４からの発現のためのＳＩＡＴ６（ＳＴ３ＧＡＬ３）の核酸（配列番号１１）及びアミノ酸（配列番号１２）配列を示す。
【図３Ｂ】図３Ａ及びＢは、ｐＸＬ４５４４からの発現のためのＳＩＡＴ６（ＳＴ３ＧＡＬ３）の核酸（配列番号１１）及びアミノ酸（配列番号１２）配列を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、ｐＸＬ４４１０、ｐＸＬ４４２９又はｐＸＬ４６３６からの発現のためのｓＦＧＦＲ２−Ｆｃの核酸配列に対応する（配列番号１）。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ｐＸＬ４４１０、ｐＸＬ４４２９又はｐＸＬ４６３６によりコードされるｓＦＧＦＲ２−Ｆｃのアミノ酸配列に対応する（Ｎ−グリコシル化部位を太字で示す。）（配列番号２）。
【図４Ｃ】図４ＣはｓＦＧＦＲ２のアミノ酸配列に対応する（配列番号４）。
【図４Ｄ】図４ＤはＦｃのアミノ酸配列に対応する（配列番号６）。
【図４Ｅ】図４Ｅはリンカーのアミノ酸配列に対応する。
【図４Ｆ】図４Ｆはシグナルペプチドのアミノ酸配列に対応する（配列番号８）。これは、インターロイキン−２に対して記載されるシグナルペプチドである。配列番号２により示される配列のこのペプチド上流の融合により、均一なＮ−末端アミノ酸配列を伴う分泌タンパク質が導かれることが観察された。
【図５】図５は、ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃ及びグルタミンシンテターゼをコードするｐＸＬ４６３６を構築するために使用されるストラテジーの概略図である。
【図６Ａ】図６Ａ及びＢは、ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃ及びＤＨＦＲに対する発現ベクターｐＸＬ４４２９及びネオマイシン耐性遺伝子をコードするｐＸＬ４４１７のマップを示す。
【図６Ｂ】図６Ａ及びＢは、ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃ及びＤＨＦＲに対する発現ベクターｐＸＬ４４２９及びネオマイシン耐性遺伝子をコードするｐＸＬ４４１７のマップを示す。
【図７】図７は、ｓＦＧＦＲ２  Ｎ−グリカン１個あたりのシアル酸の平均数と血中のｓＦＧＦＲ２−Ｆｃのクリアランスとの間の相関を示すグラフである−最適比率＞１．２、好ましい比率＞０．９。
【図８】図８は、ＰＮＧａｓｅ  Ｆの非存在下（−）又は存在下（＋）で温置したｓＦＧＦＲ２−Ｆｃの１μｇのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元条件）を示す。Ｍ：分子量マーカー。
【図９】図９は、ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃ二量体におけるＮ−グリカン位置及び付番を示す。付番は、位置Ｎ１がＡｓｎ８３に対応し、Ｎ２がＡｓｎ１２３に、Ｎ３がＡｓｎ２２８に、Ｎ４がＡｓｎ２４１に、Ｎ５がＡｓｎ２６５に、Ｎ６がＡｓｎ２９７に、Ｎ７がＡｓｎ３１８に、Ｎ８がＡｓｎ３３１に対応するように、ＦＧＦＲ２（ＦＧＦＲ２＿ＨＵＭＡＮ）のＮ末端アミノ酸配列から始まる。位置Ｎ２９７は、ヒトＦｃ（ＩｇＧ１）においてＡｓｎ位置に対応する。
【図１０】図１０は、７２時間までの時間にわたる、血中のタンパク質ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃ（四角）の消失動態を示すグラフである。
【図１１】図１１は、注射用量の％で表される、血漿及び肝臓中でのタンパク質ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃの回収量を示す。
【図１２】図１２は、第４０日までの治療後のＡ５４９腫瘍体積分析のグラフである（１００μｇ／マウス／投与：三角；３００μｇ／マウス／投与：四角；５００μｇ／マウス／投与：黒丸；ＰＢＳ対照：白丸）。
【図１３】図１３は、第４０日での治療後のＡ５４９腫瘍重量分析のグラフである。
【図１４】図１４は、第２２日までの治療後のＨ４６０腫瘍体積分析のグラフである（治療群：黒丸；ＰＢＳ対照群：白丸）。
【図１５】図１５は、第２２日までの治療後のＨ４６０腫瘍重量分析のグラフである。
【図１６】図１６は、Ｈ４６０及びＡ５４９腫瘍細胞でのｓＦＧＦＲ２−ＦｃのインビトロＡＤＣＣ活性の評価のグラフである。
【図１７Ａ】図１７は、第４１日までの、３種類のマウス系統、即ちＳＣＩＤ（図１７Ａ）、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ（図１７Ｂ）及びＳＣＩＤ／ｂｇ（図１７Ｃ）に移植した場合のＡ５４９腫瘍体積分析のグラフを示す（ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃ  １００μｇ／マウス／投与：菱型；ＰＢＳ対照：白丸）。
【図１７Ｂ】図１７は、第４１日までの、３種類のマウス系統、即ちＳＣＩＤ（図１７Ａ）、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ（図１７Ｂ）及びＳＣＩＤ／ｂｇ（図１７Ｃ）に移植した場合のＡ５４９腫瘍体積分析のグラフを示す（ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃ  １００μｇ／マウス／投与：菱型；ＰＢＳ対照：白丸）。
【図１７Ｃ】図１７は、第４１日までの、３種類のマウス系統、即ちＳＣＩＤ（図１７Ａ）、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ（図１７Ｂ）及びＳＣＩＤ／ｂｇ（図１７Ｃ）に移植した場合のＡ５４９腫瘍体積分析のグラフを示す（ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃ  １００μｇ／マウス／投与：菱型；ＰＢＳ対照：白丸）。
【図１８Ａ】図１８は、第２２日までの、３種類のマウス系統、即ちＳＣＩＤ（図１８Ａ）、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ（図１８Ｂ）及びＳＣＩＤ／ｂｇ（図１８Ｃ）に移植した場合のＨ４６０腫瘍体積分析のグラフを示す（ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃ  １００μｇ／マウス／投与：菱型；ＰＢＳ対照：白丸）。
【図１８Ｂ】図１８は、第２２日までの、３種類のマウス系統、即ちＳＣＩＤ（図１８Ａ）、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ（図１８Ｂ）及びＳＣＩＤ／ｂｇ（図１８Ｃ）に移植した場合のＨ４６０腫瘍体積分析のグラフを示す（ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃ  １００μｇ／マウス／投与：菱型；ＰＢＳ対照：白丸）。
【図１８Ｃ】図１８は、第２２日までの、３種類のマウス系統、即ちＳＣＩＤ（図１８Ａ）、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ（図１８Ｂ）及びＳＣＩＤ／ｂｇ（図１８Ｃ）に移植した場合のＨ４６０腫瘍体積分析のグラフを示す（ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃ  １００μｇ／マウス／投与：菱型；ＰＢＳ対照：白丸）。
【図１９Ａ】図１９Ａは、ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃ（ＦｃにおいてＡ２６５）をコードするプラスミドのマップを示す。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃ（ＦｃにおいてＡ２６５）のタンパク質配列を示す（配列番号１４）。位置３９２はＦｃドメインにおける突然変異の位置であり（Ａｓｐ２６５Ａｌａ）、太字で表す。
【図２０】図２０は、第２３日までのヌードマウス系統に移植した場合のＨ４６０腫瘍体積分析を示すグラフである（白丸：ＰＢＳ対照；菱型：ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃ  ５００μｇ／マウス／投与；白四角：ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃ（Ａ２６５Ｆｃ）５００μｇ／マウス／投与）。＊＊：対照に対してｐ＜０．０１、Ａｎｏｖａ  ＆  Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ事後検定）。
【００１８】
詳細な説明
本開示を通じて、出願者らは、学術論文、特許文献、刊行物、ウェブページ、データベースにおいて利用可能な配列情報及びその他の情報源を参照する。当業者は、本発明の態様を形成し、使用するための、情報のあらゆる引用源の全内容を使用することができる。それぞれ及び全ての情報の引用源は、具体的に、その全体において本明細書中に参照により組み込まれる。これらの引用源の一部が、許容され必要とされるように、この文書に含まれ得る。しかし、この開示中で具体的に定義され説明されるあらゆる用語又は句の意味は、引用源の何れの内容によっても変更され得ない。続く記述及び実施例は、単に本発明の範囲及び本開示の内容の典型例である。当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく、下記で列挙される実施例に対する多くの変更を考案し、構築することができる。
【００１９】
本発明は、ＦＧＦ受容体のドメインを含む可溶性タンパク質融合物に関する。本発明は、全般的に、ＦＧＦ受容体断片、ドメイン及び特に可溶性又は細胞外ドメインを包含する。ＦＧＦ受容体の細胞外ドメインは、免疫グロブリンＦｃ単位などの適切な融合パートナーに連結される。従って、最も広い意味において、本発明の修飾可溶性ＦＧＦ受容体融合物は、ＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ）タンパク質、断片、ドメイン、細胞外ドメイン、可溶性ドメイン及び融合パートナー、特にＦｃ領域融合パートナーに連結されたこれらの何れかであり得る。
【００２０】
出願者らは、免疫グロブリンのＦｃ領域とのＦＧＦ受容体の可溶性ドメインの融合物を含む修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物（最大で４５％のＮ−グリカンがシアル基を持たない。）が有利な特性を有することを見出した。本発明の修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物のシアル化パターンの長所には、薬物動態プロファイルがより良好であること及びインビボでの切断に対する耐性の向上が含まれる。
【００２１】
通常、Ｎ−グリカンは、特異的なアスパラギン（Ａｓｎ）残基を通じて翻訳時に連結される。コンセンサス配列、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ここで、ＸはＰｒｏを除く何らかのアミノ酸である。）は必須であるが、局所的な二次構造が付加を決定し得るという点において十分ではない（Ｊｅｆｆｅｒｉｓら、２００６、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２４：１２４１）。いくつかの因子がＮ−グリコシル化部位の非占有の原因となると考えられている（Ｊｏｎｅｓら、２００５、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １７２６：１２１）。本発明の可溶性ＦＧＦ受容体内にいくつかのＮ−グリコシル化部位が存在する。例えば、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃの細胞外ドメインに８個のＮ−グリコシル化部位がある（図９参照）。Ｎ−グリカンは、Ａｓｎに連結される保存的オリゴ糖コアを含有する。このコアは、３個のマンノース（Ｍａｎ）及び２個のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）単糖残基から構成される。さらなるＧｌｃＮＡｃは通常、α６Ｍａｎ又はα３Ｍａｎにβ１，２−結合により結合し、一方、Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃα２，６）、ガラクトース（Ｇａｌβ１，４）、フコース（Ｆｕｃα１，６）及び分枝ＧｌｃＮＡｃ（β１，４）は存在しても存在しなくてもよい（Ｊｅｆｆｅｒｉｓら、２００６、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２４：１２４１）。
【００２２】
出願者らは、ＦＧＦＲ部分のＮ末端から５番目のＮ−グリコシル化部位でのＮ−グリカンの存在により、実験の実施例で示されるように、生産性及び低凝集性に対して有利な特性が与えられることを示した。特に、この特定の位置でグリコシル化がない場合、凝集が高まる一方で生産性が劇的に低下する。さらに、このＮ−グリカンの存在がＦＧＦ結合に必要であることが分かった。
【００２３】
従って、本発明は、免疫グロブリンのＦｃ領域とのＦＧＦ受容体の可溶性ドメインの融合物を含む修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物（ここで、ＦＧＦ受容体部分の少なくとも５番目のＮ−グリコシル化部位が占有され、該ＦＧＦ受容体部分の最大で４５％のＮ−グリカンがシアル基を有さない。）に関する。
【００２４】
本発明のさらなる実施形態によると、ＦＧＦ受容体部分の、３番目、４番目、６番目及び７番目のＮ−グリコシル化部位が占有される。ＦＧＦ受容体部分のＮ−グリコシル化部位の少なくとも７個がグリコシル化される場合、本発明の融合物は、生産性及び低凝集性に関してさらにより良好な特性を有する。従って、別の態様において、本発明は、免疫グロブリンのＦｃ領域とのＦＧＦ受容体の可溶性断片又はドメインの融合物（ここで、少なくとも７個のＮ−グリコシル化部位が占有され、ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物の部分のＮ−グリカンの最大で４５％がシアル基を有さない。）に関する。本発明の具体的な実施形態において、全てのＮ−グリコシル化部位が占有される。
【００２５】
別の態様において、本発明の修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物は、ＦＧＦ受容体部分のＮ−グリカン１個あたりのシアル酸の平均数が少なくとも０．９であり、即ち、この数は０．９又は０．９を上回るあらゆる値であり得る。好ましい実施形態において、本発明の修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物は、Ｎ−グリカン１個あたりのシアル酸の平均数が少なくとも１．２である。このような比率は、出願者らによって、本発明の可溶性ＦＧＦ受容体融合物の血中での最大濃度（これは、Ｆｃ分子に対して見出される血中最適濃度に匹敵する。）を確保することが分かった。
【００２６】
本発明は、さらに、免疫グロブリンのＦｃ領域とのＦＧＦ受容体の可溶性断片又はドメインの融合物を含む修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物（ここで、全てのＮ−グリコシル化部位が占有され、ＦＧＦ受容体部分のＮ−グリカンの最大で４５％がシアル基を持たず、Ｆｃ領域のＮ−グリカンがフコシル化されない。）に関する。別の実施形態において、本発明の修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物は部分的にフコシル化され、例えば０から６０％フコシル化される。さらに別の実施形態において、本発明の修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物は完全にフコシル化される。好ましい実施形態において、本発明の修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物は６０から１００％フコシル化される。さらに好ましい実施形態において、本発明による修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物の各Ｎ−グリカン分子は、グリカン１分子あたり、３個のマンノース残基及び平均１．５から３．０個ガラクトース残基、３．５から５個のＮ−アセチルグルコサミン及び０．６から１個のフコース残基をさらに含む。
【００２７】
本発明によると、修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物は、高い親和性でＦＧＦリガンドに結合する。例えば、前記融合物は、ＢｉａｃｏｒｅＴＭにより測定した場合に１から５ｎＭの間に含まれるＫＤ値でＦＧＦ２に結合する。本発明の好ましい実施形態において、ＢｉａｃｏｒｅＴＭにより測定されたＦＧＦ２に対する前記融合物のＫＤ値は約１．５ｎＭである。
【００２８】
上述のこのような修飾融合物は、強力で治療的に有効な腫瘍成長の阻害剤として有用である。実際に、出願者らは、本発明の修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物がインビボで腫瘍成長を阻害できることを明らかにした。さらに、本発明の修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物は、インビトロ及びインビボの両方でＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ反応を惹起することができる。効果的なＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ介在分子として、これらの化合物は、ＦＧＦを過剰発現する癌性腫瘍を治療するために特に有用である。
【００２９】
ＦＧＦＲ化合物に対して使用されるＦＧＦＲ配列、ＦＧＦＲの全長又は断片、合成ＦＧＦＲ配列、細胞外ドメイン、可溶性ドメイン又はこれらの融合物は、何らかの利用可能又は既知の配列から選択することができる。ＦＧＦＲは、受容体のチロシンキナーゼファミリー及び免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパー遺伝子ファミリーに属する。この受容体の膜貫通型において、チロシンキナーゼドメインは細胞内であり、Ｉｇ様ドメインは細胞外である。膜貫通型及び分泌型の両者ともＦＧＦに結合する。２又は３個の細胞外免疫グロブリン（Ｉｇ）−様ループ（ＩｇＩ−ＩｇＩＩＩ）及び１個の細胞内チロシンキナーゼドメインの共通構造を有するＦＧＦＲをコードする少なくとも４個の遺伝子がある。細胞外領域をコードするエクソンから、オルタナティブスプライシング産物も知られており、その結果、複数の受容体型が得られる。３番目のＩｇ−様ループにより、少なくとも３個の受容体変異型が導かれ、ループＩＩＩの後半をコードする２個のエクソン（ＩＩＩｂ及びＩＩＩｃ）のオルタナティブスプライシングにより２個の膜貫通型が産生される。例えば、ＦＧＦＲ１の可溶性型（ＩＩＩａ）を産生させるために、エクソンＩＩＩｂ及びＩＩＩｃに先行する選択的ポリアデニル化部位を使用する。ヒト及びマウスにおいて、ＦＧＦＲ１のＩｇＩＩＩａスプライス変異型は、明らかに疎水性膜貫通ドメインを持たず、従って、受容体の分泌型又は可溶型であり得るタンパク質をコードする。ＦＧＦＲ化合物は、ＦＧＦＲ１（ＮＣＢＩ、ＮＰ＿０７５５９８におけるタンパク質遺伝子座）；ＦＧＦＲ２（ＮＣＢＩ、ＮＰ＿０００１３２におけるタンパク質遺伝子座）；ＦＧＦＲ３（ＮＣＢＩ、Ｐ２２６０７におけるタンパク質遺伝子座）；及びＦＧＦＲ４（ＮＣＢＩ、ＮＰ＿００２００２におけるタンパク質遺伝子座）（Ｋｉｅｆｅｒら、１９９１、Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ５：１１５−１２７）からの配列も利用し得る。
【００３０】
細胞外ドメインを含むＦＧＦ受容体の可溶型もまた、米国特許第５，２８８，８５５号；同第６，６５６，７２８号；ＷＯ９１／００９１６；ＷＯ９２／００９９９；ＷＯ００／４６３８０；ＷＯ２００５／０１６９６６；ＷＯ２００５／１１３２９５；ＷＯ２００６／１１３２７７；ＷＯ２００７／０１４１２３；及び欧州特許第５２９  ０７６号でも考察されている。本明細書中で使用する場合、ＦＧＦＲ断片、ドメイン又は可溶性もしくは細胞外ドメインは、そのネイティブ型において細胞外であるか又は天然の分泌型の全て又は一部からなるＦＧＦＲの断片を含み得る。さらに、本発明において使用する場合、ＦＧＦＲ配列は、具体的に記載され又は列挙されるものであり得、記載又は示されるポリペプチド配列の全長にわたり、約９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％又は９０％のアミノ酸配列同一性を有するか、又は、本発明のＦＧＦＲ配列をコードする核酸に対するポリペプチドコード領域にわたり、約９５％、９０％、８５％、８０％又は７５％の核酸配列同一性を有するものであり得る。断片又はドメインはまた、これらのさらなるアミノ酸又は領域が、本発明において記載されるように使用しようとするＦＧＦＲ化合物の能力を妨害又は顕著に低下させない限り、さらなるアミノ酸又はＦＧＦＲのその他の領域も含み得る。基本的にＦＧＦＲドメイン又は断片からなるポリペプチド又は融合タンパク質は、哺乳動物細胞において発現され、ＦＧＦに結合する能力が維持される限り、場合によっては、さらに、細胞増殖を低下させるか又は血管形成を減少させる能力が維持される限り、その他のアミノ酸を含有し得る。
【００３１】
ある実施形態において、ＦＧＦ受容体の可溶性断片又はドメインは、ＦＧＦ受容体１（ｓＦＧＦＲ１）又はＦＧＦ受容体２（ｓＦＧＦＲ２）の可溶性又は細胞外ドメインである。
【００３２】
選択されるＦＧＦＲ１及びＦＧＦＲ２の断片は、１以上の次の突然変異：１−７個のアミノ酸のＮ末端欠失；又はＮ末端置換；ループ１配列の欠失；酸性ボックス配列の欠失を有し得る。以下に限定されないが、オリゴヌクレオチド媒介（又は部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発及び先に調製された突然変異又は関心のある分子の非突然変異型のカセット突然変異誘発を含む当技術分野で公知の様々な方法によって、アミノ酸配列突然変異をコードするポリヌクレオチドを調製することができる（例えばＫｕｎｋｅｌ、１９８５、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８２：４８８を参照）。
【００３３】
別の実施形態において、ＦＧＦ受容体の可溶性断片又はドメインは、ＦＧＦ受容体１アイソタイプＩＩＩｃ（ｓＦＧＦＲ１（ＩＩＩｃ））及びＦＧＦ受容体２アイソタイプＩＩＩｃ（ｓＦＧＦＲ２（ＩＩＩｃ））の可溶性又は細胞外ドメインである。
【００３４】
好ましい実施形態には、配列番号３の配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる、及び／又は配列番号４のアミノ酸配列又は配列番号４と少なくとも９５％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列を有する、ＦＧＦ受容体２アイソタイプの可溶性断片もしくはドメイン又は変異型ＩＩＩｃが含まれる。
【００３５】
この最後に実施形態によると、本発明の修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物（ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃ）は、有利に、その天然リガンドＦＧＦ２に対して高い親和性を有するか又は１から５ｎＭの間に含まれ、より正確には約１．５ｎＭというナノモーラーオーダーの高いＫＤ値を有する。
【００３６】
免疫グロブリンドメインの具体例には、以下に限定されないが、免疫グロブリン分子のＦｃ領域；免疫グロブリン分子のヒンジ領域；免疫グロブリン分子のＣＨ１領域；免疫グロブリン分子のＣＨ２領域；免疫グロブリン分子のＣＨ３領域；免疫グロブリン分子のＣＨ４領域；及び免疫グロブリン分子の軽鎖及びこれらの何れかのヒト化変異体が含まれる。これらの領域に対する配列もまた当業者にとって利用可能である（例えばＨｕｃｋら、１９８６、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：１７７９参照）。
【００３７】
明細書及び特許請求の範囲において使用する場合、「免疫グロブリンＦｃ領域又はＦｃ」は、免疫グロブリン重鎖定常領域のカルボキシル末端部分を意味する。Ｆｃ領域は、免疫グロブリンの生物学的機能の決定において特に重要であり、これらの生物学的機能はエフェクター機能と呼ばれる。当技術分野で公知のように、免疫グロブリンサブクラスの重鎖は、４又は５個のドメインを含み：ＩｇＭ及びＩｇＥは５個の重鎖ドメインを有し、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＧは４個の重鎖ドメインを有する。ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＧのＦｃ領域はヒンジ−ＣＨ２−−ＣＨ３ドメインの二量体であり、ＩｇＭ及びＩｇＥにおいて、これは、ヒンジ−ＣＨ２−−ＣＨ３−−ＣＨ４ドメインの二量体である。さらに、ＩｇＭ及びＩｇＥのＣＨ３ドメインはＩｇＧのＣＨ２ドメイン及びＩｇＭのＣＨ４ドメインと構造的に同等であり、ＩｇＥはＩｇＧのＣＨ３ドメインのホモログである（Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ編、１９９３、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照）。既知のＦｃ領域の何れも、本発明の修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物におけるＦｃ領域として有用である。
【００３８】
ある実施形態において、ヒト白血球から調製したＲＮＡ及び適切な５’及び３’プライマーを用いて逆転写及びＰＣＲによってヒトＩｇＧ（Ｆｃγ）のＦｃ領域をコードする遺伝子を得る。得られたＤＮＡ断片は、ＩｇＧのヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインの完全配列を含有し、当技術分野で公知のように、ある一定のアミノ酸が置換されている変異体を作製するために鋳型として使用することができる。任意の制限酵素を含むペプチドリンカーをコードするプライマーは、ＰＣＲプロセスに組み込まれ得る。保持ベクター（ｈｏｌｄｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒ）に得られたＤＮＡ断片を挿入し、ＤＮＡ配列決定により確認する。
【００３９】
好ましくは、ヒンジ領域、ＣＨ１領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリンガンマ−１のＦｃ領域を使用する。さらに、免疫グロブリンガンマ−１のＦｃ領域は、ＣＨ１欠失−Ｆｃ又はＣＨ２欠失−Ｆｃであり得、ヒンジ領域及びＣＨ３領域の一部を含む（ここで、ＣＨ１及び／又はＣＨ２領域は欠失している。）。ＣＨ２欠失−Ｆｃは、Ｇｉｌｌｉｅｓら（１９９０、Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、１：４７）により記載されている。
【００４０】
最も好ましくは、ＩｇＧ１のＦｃ領域は、配列番号５の配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる配列及び／又は配列番号６で示されるアミノ酸配列又は配列番号６と少なくとも９５％の同一性のある配列を含む。しかし、免疫グロブリン、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭのその他のクラスからのＦｃ領域もまたＦｃ領域として有用である。
【００４１】
さらに、定常ドメインの１以上が欠失しているこれらのＦｃ領域の欠失コンストラクトを調製し得る。当業者は、周知の分子生物学的技術を用いて、このような欠失コンストラクトを調製し得る。さらに、使用されるＦｃ領域は、配列番号６で示されるものと約９９％又は約９８％又は約９５％又は約９０％又は約８５％又は約８０％又は約７５％のアミノ酸同一性を有するものであり得る。
【００４２】
個々に又は何らかの組合せで選択され得るか又は使用され得る配列番号６と比較した場合の具体的な突然変異は、最初の２０個のＮ末端アミノ酸内のＣｙｓの１個の欠失又は置換；配列番号６の位置５でのＣｙｓの欠失；又は位置５のＣｙｓの置換である。選択されるＦｃ領域配列は、検出可能に、修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物の血清半減期を延長させ得る。
【００４３】
本発明の修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物はヒンジを含み得るか、又は可溶性受容体部分とＦｃ領域との間でスペーサー領域を使用し得る（Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、１９９７、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、９：１９５−２００）。例として、約２０以下のアミノ酸長のフレキシブルペプチドリンカーが挙げられる。より好ましくは、ペプチドリンカーは少なくとも３個のアミノ酸長であり得、及び／又は次のアミノ酸：グリシン、セリン、アラニン及びスレオニンの２以上を含むペプチドリンカーであり得る。好ましい実施形態において、ペプチドリンカーはプロテアーゼ切断部位を含まない。最も好ましいリンカーはＳＡＬ（Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ）である。
【００４４】
本発明はまた、本発明による修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物をコードするポリヌクレオチドの構築ならびに、適切な宿主細胞に導入された際に修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物を発現することができるベクターも提供する。好ましい実施形態によると、修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１の配列又は配列番号１と少なくとも８０％の同一性を共有する配列を有する。本明細書中で使用する場合、「ベクター」は、関心のあるヌクレオチド配列を含み、宿主細胞に組み込まれ得る何らかの核酸を意味し、場合によってはコードされるタンパク質又はポリペプチドを発現すると理解されたい。ベクターには線状の核酸、プラスミド、ファージミド、コスミドなど（全て当業者の知識内）が含まれる。ＦＧＦＲ又は本発明の融合化合物をコードするポリヌクレオチドならびにこれらの核酸を含有するベクター及びこれらのベクターが導入されている宿主細胞も、本発明の範囲に具体的に組み込まれる。
【００４５】
最も好ましくは、本発明の融合分子は、ヒト免疫グロブリンγ１遺伝子のＦｃγ１領域にＣ末端で融合されるＦＧＦＲの細胞外ドメインを含むＤＮＡによりコードされる。免疫グロブリンγ１遺伝子のＦｃγ１領域は、ヒンジドメイン及びＣＨ３ドメインの少なくとも一部又はヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。本発明によるキメラポリペプチド分子をコードするＤＮＡは、そのゲノム形態又はそのｃＤＮＡ形態であり得る。小胞体の膜を横断してタンパク質の輸送を効率的に開始するためにシグナルペプチドを使用し得る。シグナル配列は、当技術分野で特徴がよく分かっており、１６から３０個のアミノ酸残基を通常は含有することが知られているが、その他のサイズも可能である。ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ（１９８６、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１４：４６８３）によりシグナルペプチド配列の詳細な考察が与えられる。好ましい実施形態によると、シグナルペプチドは、当技術分野で公知のように、インターロイキン−２シグナルペプチド（配列番号８）から取られる。出願者らは、ＦＧＦＲの細胞外ドメインへのこのペプチドの融合によって、均一なＮ末端アミノ酸配列を有する分泌タンパク質がもたらされる（この場合は、内在性ＦＧＦＲシグナルペプチドは使用されない。）ことを観察した。
【００４６】
適切な転写及び翻訳調節配列の制御下に置かれた本発明の修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物のコード配列を含有する発現ベクターは、当技術分野で公知のように、組み換えＤＮＡ技術により構築され得る。当業者にとって公知の何らかの技術によって、このような発現ベクターを宿主細胞に導入する。次に、当業者にとって公知の何らかの技術を用いて、修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物又はその断片を産生させるために、得られたベクター含有細胞を増殖させる。
【００４７】
本発明によると、修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物分子を発現させるために、様々な発現系を使用し得る。ある態様において、このような発現系は、関心のあるコード配列が産生され、続いて精製され得るビヒクルを意味するだけでなく、適切なヌクレオチドコード配列が一時的に遺伝子移入された場合に、インシトゥで本発明の修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物分子を発現し得る細胞も意味する。組み換え修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物分子の発現に対して、特に完全な組み換え修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物分子の発現に対して、哺乳動物細胞が一般的に使用される。例えば、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要初期中間体遺伝子プロモーターエレメントを有するものなどの発現シグナルを含有するベクターと組み合わせた、ＨＥＫ２９３又はＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞は、本発明の修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物を発現するための有効な系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら、１９８６、Ｇｅｎｅ  ４５：１０１；Ｃｏｃｋｅｔｔら、１９９０、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：２）。
【００４８】
さらに、挿入配列の発現を調節するか又は望ましい具体的な方式で遺伝子産物を修飾及びプロセシングする宿主細胞を選択する。タンパク質産物のこのような修飾（例えばグリコシル化）及びプロセシングはタンパク質の機能に重要であり得る。様々な宿主細胞は、タンパク質及び遺伝子産物の翻訳後プロセシング及び修飾のための特性及び特異的な機構を有する。適切な細胞株又は宿主系は、発現される関心のある修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物の正確な修飾及びプロセシングを確保するように選択される。ゆえに、一次転写産物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化のための細胞機構を保持する真核宿主細胞を使用し得る。このような哺乳動物宿主細胞には、以下に限定されないが、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３、３Ｔ３又は骨髄腫細胞が含まれる。本発明のタンパク質を発現するベクターを含む２以上の発現ベクターをこの宿主細胞に同時遺伝子移入し得る。例えば、上述のように、修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物ポリペプチドをコードする第一のベクター及びグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする第二のベクターを宿主細胞に遺伝子移入することができる。あるいは、第二のベクターは、グリコシルトランスフェラーゼに対して低分子干渉ＲＮＡを発現し得る。
【００４９】
長期にわたる組み換えタンパク質の高収率産生のために、安定発現が好ましい。本発明のある実施形態において、修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物分子を安定に発現する細胞株を作製し得る。ウイルス由来の複製起点を含有する発現ベクターを使用するのではなく、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位及び当業者にとって公知のその他の適切な配列を含む適切な発現調節エレメント及び選択可能マーカーの制御下で、ＤＮＡで宿主細胞を形質転換する。外来ＤＮＡの導入後、栄養富化培地中で１から２日間、改変細胞を増殖させ得、次いで選択培地に移す。組み換えプラスミド上の選択可能マーカーは選択に対する耐性を与え、これにより、細胞の染色体にプラスミドを安定して統合し、細胞株に拡大することが可能になる。
【００５０】
本発明に従い、以下に限定されないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、１９７７、Ｃｅｌｌ  １１：２２３）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａら、１９９２、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ４８：２０２）、メチオニンスルホキシミドの存在下でのグルタメートシンターゼ選択（Ａｄｖ  Ｄｅｌ  Ｒｅｖ、２００６、５８：６７１及びＬｏｎｚａ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ．のウェブサイト又は文献）及びそれぞれｔｋ、ｈｇｐｒｔ又はａｐｒｔ細胞におけるアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら、１９８０、Ｃｅｌｌ  ２２：８１７）遺伝子を含む多くの選択系を使用し得る。また、次の遺伝子：メトトレキセートに対する耐性を与えるｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒら、１９８０、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７７：３５７）；ミコフェノール酸に対する耐性を与えるｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎら、１９８１、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７８：２０７２）；アミノグリコシド、Ｇ−４１８に対する耐性を与えるｎｅｏ（Ｗｕら、１９９１、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７）；及びハイグロマイシンに対する耐性を与えるｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、１９８４、Ｇｅｎｅ  ３０：１４７）に対する選択の基礎として、代謝拮抗物質耐性も使用し得る。所望の組み換えクローンを選択するために、組み換えＤＮＡ技術の技術分野で公知の方法を通常は適用し得、このような方法が例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９３）に記載されている。ベクター増幅により、修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物分子の発現レベルを向上させることができる。修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物を発現するベクター系におけるマーカーが増幅可能である場合、培養中に存在する阻害剤のレベルの上昇によってマーカー遺伝子のコピー数が増加する。増幅領域が本発明の修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物をコードする遺伝子に連結されるので、この修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物の産生も向上する（Ｃｒｏｕｓｅら、１９８３、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ３：２５７）。
【００５１】
糖タンパク質のグリコシル化レベルに影響を与えるために、多くの因子が当業者にとって公知である。例えば、グリコシルトランスフェラーゼの発現を増加又は減少させることにより、修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物のグリコシル化プロファイルを変化させるために、改変哺乳動物宿主細胞を使用することができる。このような改変哺乳動物宿主細胞には、以下に限定されないが、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３、ＰＥＲ．Ｃ６、３Ｔ３、ＹＢ２／０及び骨髄腫細胞（Ｓｔａｎｌｅｙら、１９８６、Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ、２４９：５３３；Ｍｏｒｉら、２００６、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ９４：６８；Ｃｈｉｔｌａｒｕら、１９９８、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３３６：６４７；Ｕｍａｎａら、１９９９  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：１７６）が含まれる。バイオプロセス因子が糖タンパク質オリゴ糖生合成に影響を与えることも当業者にとって公知である（Ｇｏｏｃｈｅｅら、１９９４、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：５４６）。グルコース又はアンモニウムイオン濃度、ｐＨ、血清及びその他のバイオプロセス因子の影響（細胞増殖速度など）、培養時間などの細胞培養条件の影響もＮ−結合グリコシル化に影響を与える（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．３９：３２７（１９９３）；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．６８：３７０（２０００）；Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：７２０（１９９３）；Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：１３（１９９５）；Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２７２：３３３（１９９０））。さらに、宿主細胞及びバイオプロセス因子に対して、オリゴ糖プロセシングが、局所的糖タンパク質環境に懸垂している各Ｎ−グリコシル化部位での局所的環境により影響を受けることも知られている。部位ごとの相違は、ｔ−ＰＡで観察されたように大きいものであり得るか、又は、ＥＰＯの３個のＮ−グリコシル化部位に対して観察されたように、分枝及び末端プロセシングでのより小さな相違を含み得る（Ｇｏｏｃｈｅｅら、１９９１、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３４７）。
【００５２】
それが産生された後、免疫グロブリン分子の精製について当技術分野で公知の何らかの方法により、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、特にＦｃに対するプロテインＡ親和性によるクロマトグラフィーなど）、遠心、溶解度の差により又はタンパク質精製のための何らかのその他の標準的技術により、本発明の修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物を精製し得る。
【００５３】
基本的に以前に記載のように、精製した修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合タンパク質における、定量的シアル酸同定（Ｎ−Ｎ−アセチルノイラミン酸残基）、炭水化物組成分析及びＮ−グリカンの定量的オリゴ糖マッピングを行うことができる（Ｓａｄｄｉｃら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９４：２３−３６（２００２）及びＡｎｕｍｕｌａら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ８：６８５−６９４（１９９８））。
【００５４】
変更すべきところは変更して、何らかのその他の哺乳動物の発現可能又は生物学的に活性のある融合物に対して当業者によく知られている方法により、可溶性ＦＧＦ受容体ドメインを組み込む融合タンパク質を作製することができる。例えば、本発明のＦＧＦＲ化合物を設計し作製するために、ＩｇＧのＦｃ領域をサイトカイン及び可溶性受容体のドメインと組み合わせることが報告されている方法を適合させることができる（例えば、Ｃａｐｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３７：５２５−５３１（１９８９）；Ｃｈａｍｏｗら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１４：５２−６０（１９９６）；Ｕ．Ｓ．５，１１６，９６４号、同第５，３４９，０５３号及び同第５，５４１，０８７号参照）。適合させることができる受容体−Ｉｇ融合タンパク質のその他の例には、Ｕ．Ｓ．５，７２６，０４４号；同第５，７０７，６３２号；及び同第５，７５０，３７５号のものが含まれる。ＦＧＦ受容体細胞外ドメインは免疫グロブリン遺伝子ファミリーとかなりの程度の相同性を有し、ＦＧＦＲ細胞外ドメインはＩｇ−様セグメントを含有するので、Ｆｃ領域の使用は特に好ましい。ある例において、融合物は、ＩｇＧ  Ｆｃのヒンジ領域のシステイン残基を通じて連結されるホモ二量体タンパク質であり、その結果、ＩｇＧ分子と同様の性質を有する分子が得られる。Ｆｃ領域を使用することに対するある長所は、循環半減期が延長されることである。さらに、本発明の融合物は同様のアイソタイプのヒトＩｇＧと匹敵するインビボ薬物動態プロファイルを示すので、本発明の修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合タンパク質のグリコシル化修飾により、薬物動態特性が向上する。
【００５５】
本発明のさらなる実施形態は、ＦＧＦＲ断片又はドメイン、フレキシブルペプチドリンカー及びヒトＩｇＧ  Ｆｃ変異体を含む修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合タンパク質を作製するための方法を提供するが、この方法は、（ａ）ＣＨＯ由来細胞株を作製することと；（ｂ）組み換え融合タンパク質が発現されるような条件下でその細胞株を増殖させることと；（ｃ）段階（ｂ）からの発現タンパク質を精製することと、を含む。この場合、好ましくは、可溶性ＦＧＦ受容体とヒトＩｇＧ  Ｆｃ変異体との間に少なくとも約３アミノ酸を含むフレキシブルペプチドリンカーは、グリシン、セリン、アラニン及びスレオニンからなる群から選択される２以上のアミノ酸を含む。さらなる及び関連する実施形態において、リンカーペプチドは存在しないか又はわずか１個のアミノ酸長である。好ましい実施形態において、ペプチドリンカーはプロテアーゼ切断部位を含まない。最も好ましいリンカーはＳＡＬ（Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ）である。
【００５６】
好ましくは、本明細書中の実施例に記載のように、懸濁液状態において、ＣＨＯ細胞において、修飾可溶性ＦＧＦ受容体融合タンパク質を産生させる。
【００５７】
本明細書中の実施例で示されるように、本発明の修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物は、少なくともＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ反応の誘発を通じた抗腫瘍活性を有し、従って、転移性腫瘍及び癌などの疾患の治療において有用である。従って、本発明のある態様は、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ活性のある上述のような修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物に関する。
【００５８】
特に関心があるのは、ＡＤＣＣなどの細胞性細胞傷害エフェクター機能を媒介する能力が向上した、修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物である。その分子のＦｃ領域において１個又は複数の置換を行うことにより（従ってＦｃ受容体とのその相互作用が変化している。）、このようなタンパク質を得ることができる。このような突然変異を設計するための方法は、例えばＬａｚａｒら（２００６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０３（１１）：４００５−４０１０）及びＯｋａｚａｋｉら（２００４、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６（５）：１２３９−４９）において見出すことができる。ＷＯ０３／０７４６７９、ＷＯ２００４／０２９２０７、ＷＯ２００４／０９９２４９、ＷＯ２００６／０４７３５０、ＷＯ２００６／０１９４４７、ＷＯ２００６／１０５３３８、ＷＯ２００７／０４１６３５も参照のこと。改良された修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物の産生のために特に改変された細胞株を使用することもできる。特に、これらの株は、グリコシル化経路の制御が変化しており、その結果、フコシル化が乏しいか又は完全に脱フコシル化されている、修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物が得られる。このような細胞株及びこれらを改変するための方法は、例えば、Ｓｈｉｎｋａｗａら（２００３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（５）：３４６６−３４７３）、Ｆｅｒｒａｒａら（２００６、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１（８）：５０３２−５０３６；２００６、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９３（５）：８５１−６１）、ＥＰ１３３１２６６、ＥＰ１４９８４９０、ＥＰ１４９８４９１、ＥＰ１６７６９１０、ＥＰ１７９２９８７及びＷＯ９９／５４３４２において開示されている。
【００５９】
上述のような修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物の有効量を投与することを含む、対象において腫瘍成長を抑制する方法及び対象における転移の治療又は予防のための方法は本発明の態様である。従って、本発明は、薬剤としての上述のような修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物にも関する。本発明は、対象において腫瘍成長を治療又は抑制するための薬剤の調製のための上述のような修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物の使用にも関する。本発明の別の態様は、本発明の修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物の医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物は通常、本発明の修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物及び医薬的に許容可能な担体を含む。本明細書中で使用される場合、「医薬的に許容可能な担体」は、生理学的に適合する何らかの及び全ての、溶媒、緩衝液、塩溶液、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤などを含む。担体のタイプは、意図する投与経路に基づき選択することができる。様々な実施形態において、担体は、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所、経皮又は経口投与に適切である。医薬的に許容可能な担体には、滅菌水溶液又は分散液及び滅菌注射溶液又は分散液の即時調製用の滅菌粉末が含まれる。医薬的に活性のある物質に対する媒質及び物質の使用は当技術分野で周知である。本明細書中、以下で詳述するように、抗癌及び又は抗血管形成薬など、さらなる活性化合物を組成物に組み込むこともでき；特に、さらなる活性化合物は、抗血管形成薬、化学療法剤又は低分子量の薬剤であり得る。滅菌リンガー液２５０ｍＬ及び薬剤の組み合わせ１００ｍｇを含有するように、静脈内点滴のための一般的な医薬組成物を調製し得る。非経口投与可能な化合物を調製するための実際的方法は、当業者にとって公知であるか又は明らかであり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１７版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．（１９８５）及びその第１８版及び第１９版（これらは参照により本明細書中に組み込まれる。）においてより詳細に記載されている。
【００６０】
本発明の修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物はまた、インプラント及びマイクロカプセル封入送達系を含め、担体及び制御放出製剤とともに調製することもできる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸及びポリ乳酸ポリグリコール酸コポリマー（ＰＬＧ）など、生体分解性及び生体適合性ポリマーを使用することができる。このような製剤を調製するための多くの方法は一般に当業者にとって公知である。
【００６１】
組成物中の修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物は、好ましくは、有効量で処方される。「有効量」とは、ＦＧＦ及び／又はＦＧＦＲ活性の調節及びＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ反応の誘発など、所望の結果を達成するための、投与時及び必要な時間にわたる、有効な量を指す。「治療的有効量」とは、特定の疾患状態の治療コースに影響を与えるのに十分な量を意味する。治療的有効量はまた、その薬剤の何らかの毒性又は有害な影響を治療的に有益な効果が上回るものでもある。
【００６２】
治療的適応に対して、ヒトに対して、ボーラスとしてもしくは長時間にわたり連続点滴により静脈内に、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液嚢内、髄腔内、経口、局所又は吸入経路により、投与され得るものを含む、上記で考察したものなどの医薬的に許容可能な剤形で、哺乳動物、好ましくはヒトに、本発明の修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物を投与する。修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物はまた、局所ならびに全身的治療効果を得るために、腫瘍内、腫瘍周囲、病巣内又は病変部周囲経路によっても適切に投与される。腹腔内経路は、例えば卵巣腫瘍の治療において特に有用であると予想される。
【００６３】
最適反応を与えるために、投与計画を調節し得る。例えば、単回ボーラスを投与し得、数回に分けた用量を長時間にわたり投与し得るか、又は均等に用量を減少もしくは増加させ得る。対象において細胞増殖活性に影響を与えるために、対象に本発明の組成物を投与することができる。本明細書中で使用する場合、「対象」という用語は、ＦＧＦ依存性細胞増殖が存在する生物を含むものとし、具体的にはウサギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、サル、そのトランスジェニック種及びヒトなどの哺乳動物を含む生物が含まれる。
【００６４】
本発明の修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物及び医薬組成物は、次のもの：癌腫（膀胱癌、乳癌、結腸癌、頭頸部癌、腎臓癌（腎臓細胞癌を含む。）、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、子宮頸部癌、甲状腺癌及び皮膚癌（扁平上皮癌を含む）を含む。）；リンパ系の血液腫瘍（白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫を含む。）；骨髄系の血液腫瘍（急性及び慢性骨髄性白血病及び前骨髄球性白血病を含む。）；間葉由来の腫瘍（線維肉腫及び横紋筋肉腫を含む。）；その他の腫瘍（メラノーマ、精上皮腫、奇形癌腫、神経芽種及び神経膠腫を含む。）；中枢及び末梢神経系の腫瘍（星状細胞腫、神経芽種、神経膠腫及び神経鞘腫を含む。）；間葉由来の腫瘍（線維肉腫、横紋筋肉腫及び骨肉腫を含む。）；及びその他の腫瘍（メラノーマ、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、精上皮腫、濾胞性甲状腺腫及び奇形癌腫を含む。）及びＦＧＦ過剰発現により生じることがまだ確認されていないその他の癌を含む（がこれに限定されない。）様々な癌の治療又は予防において有用である。好ましい実施形態において、メラノーマ、白血病、腎臓癌、結腸癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、膀胱癌、乳癌又は頭頸部癌を治療するために、本発明の修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物を使用する。
【００６５】
従って、本発明は、対象において癌関連疾患を治療又は抑制するための薬剤の調製のための、上述の修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物の使用に関する。癌細胞増殖の結果起こる疾患及びプロセスを治療する方法及び癌の成長を治療又は抑制するための組成物を提供することは、本発明の態様又は目的である。本発明のさらに別の態様は、癌の調節のための遺伝子治療に有用な組成物及び方法を提供することである。特にメラノーマ、白血病、腎臓癌、結腸癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、膀胱癌、乳癌又は頭頸部癌の治療のために、本発明の方法を使用し得る。
【００６６】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、酸性又は塩基性繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）の血管形成活性を阻害するか又は中和することができるアンタゴニスト、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）又は肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、組織因子、プロテインＣ又はプロテインＳの凝集活性を阻害又は中和することができるアンタゴニスト（ＷＯ９１／０１７５３参照）、ＨＥＲ２受容体に結合することができる抗体などのアンタゴニスト（ＵＳ５，７７２，９９７参照）又は１以上の従来の治療薬、例えば、アルキル化剤、葉酸アンタゴニスト、核酸代謝の代謝拮抗剤、抗生物質、ピリミジン類似体、５−フルオロウラシル、シスプラチン、プリンヌクレオシド、アミン、アミノ酸、トリアゾールヌクレオシド又はコルチコステロイドなどの、これらの目的に有効である別の薬剤と連続して又は組み合わせて前記融合物を投与することにより、疾患を予防又は治療することにおける修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物の有効性が向上し得る。
【００６７】
本発明の別の態様において、例えばタキソール（パクリタキセル）又はタキソテール（ドセタキセル）などの化学療法剤の治療的有効量の投与と本投与を組み合わせる。
【００６８】
化学療法剤には、何ら限定されることなく、ジテルペノイド及びビンカアルカロイドなどの抗微小管薬；白金配位錯体；ナイトロジェンマスタード、オキサザホスホリン、アルキルスルホネート、ニトロソウレア及びトリアゼンなどのアルキル化剤；アントラサイクリン、アクチノマイシン及びブレオマイシンなどの抗生物質；エピポドフィロトキシンなどのトポイソメラーゼＩＩ阻害剤；プリン及びピリミジン類似体及び抗葉酸剤化合物などの代謝拮抗物質；カンプトセシンなどのトポイソメラーゼＩ阻害剤；ホルモン及びホルモン類似体；シグナル伝達経路阻害剤；非受容体チロシンキナーゼ血管形成阻害剤；免疫療法剤；プロアポトーシス剤；及び細胞周期シグナル伝達阻害剤が含まれる。さらに、別の抗癌治療、抗血管形成薬又は化学療法剤又は放射線療法と、本発明の方法を組み合わせることができる。好ましい例は、ドセタキセル又はタキソテールである。その他の例には、ゲムシタビン、シスプラチン・ジテルペノイド及びビンカアルカロイド、パクリタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン及びビノレルビン、カルボプラチン、シクロホスファミド、メルファラン及びクロラムブシル、ブスルファン、カルムスチン、ダカルバジン、シクロホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、カルムスチン、ダカルバジン、抗新生物薬（以下に限定されないが、ダクチノマイシンなどのアクチノマイシン、ダウノルビシン及びドキソルビシンなどのアンスロサイクリン、ブレオマイシン、エピポドフィロトキシン、エトポシド及びテニポシドを含む。）；代謝拮抗物質新生物薬、５−フルオロウラシル、メトトレキセート、シタラビン、メカプトプリン、チオグアニン、カンプトテシン、イリノテカンＨＣｌ及びトポテカンＨＣｌが含まれる。
【００６９】
様々な異なる化学療法剤又は抗癌ポリペプチドを選択することもできる。ｗｗｗ．ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ及びｗｗｗ．ｄｒｕｇｓ．ｃｏｍ．などの情報源には、選択することができるポリペプチド及び薬剤に対する参考文献が含まれる。
【００７０】
このようなその他の薬剤、例えば抗血管形成薬又は化学療法剤が、投与される組成物中に存在し得るか、又は個別に投与され得る。本発明のある態様において、同時に、個別に又は長時間にわたり連続的に、の何れかで、その他の有効成分とともに本投与を行う。投与を同時に行う場合、単一の医薬組成物中で２種類の有効成分を組み合わせ得、これには、錠剤又はゲルカプセルなどの２種類の組成物が含まれる。一方、２種類の有効成分が、同時に投与されるにせよしないにせよ、個別の医薬組成物中に存在し得る。この目的に対して、この組み合わせは、一方で上述のような修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物を、他方で第二の有効成分、上述のような修飾可溶性ＦＧＦ受容体Ｆｃ融合物を含むキットの形態であり得、この第二の有効成分は別個の区画中にあり、同時に、個別に又は長時間にわたり連続的に、投与されるものである。
【００７１】
化学療法、タンパク質療法（即ち、抗体又は組み換えタンパク質などの治療薬を用いて）、遺伝子治療、放射線療法、免疫療法、外科的介入又はこれらの組み合わせと組み合わせて、特に癌の治療のために、本発明による組み合わせを投与することができる。上述のように、その他の治療ストラテジーに関してアジュバント療法のように、長期治療が同様に可能である。
【００７２】
続く実施例は、本発明の範囲及びこの開示の内容の単なる典型例である。当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく、下記で列挙される実施例に対する多くの変更を考案し、構築することができる。
【００７３】
実施例
【実施例１】
【００７４】
高シアル酸含量及び低血中クリアランスのｓＦＧＦＲ２−ＦｃのＨＥＫ２９３での産生
ヒトα−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｂ４ＧＴ１）（配列番号９）又はヒトβ−２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ＳＩＡＴ６）（配列番号１１）をコードするｃＤＮＡをクローンコレクション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から得て、ＣＭＶプロモーターから発現が起動される哺乳動物発現ベクターｐＸＬ４２１４にクローニングした。タンパク質融合ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃをクローニングし、ｐＸＬ４４１０を作製するためにも同じ発現ベクターを使用した。Ｂ４ＧＴ１をコードするプラスミドｐＸＬ４５５１、ＳＩＡＴ６をコードするｐＸＬ４５４４及び修飾可溶性ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ−Ｆｃ融合物（本明細書中でｓＦＧＦＲ２−Ｆｃと呼ばれる。）をコードするｐＸＬ４４１０のマップを図１及び５で示し、ならびに、Ｂ４ＧＴ１（図２）、ＳＩＡＴ６（図３）及びｓＦＧＦＲ２−Ｆｃ（図４Ａ及びＢ）の核酸及び対応するアミノ酸配列を示す。ＪＥＴ  ＰＥＩ（Ｑ−Ｂｉｏｇｅｎ）と複合体形成される、ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃ、Ｂ４ＧＴ１又はＳＩＡＴ６をコードする１から３個の発現プラスミドの一時的遺伝子移入により、接着ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）においてｓＦＧＦＲ２−Ｆｃを産生させた。プラスミド率は、ｐＸＬ４４１０／ｐＸＬ４５４４／ｐＸＬ４５５１に対して９０／５／５であった。最適な生産性及びｓＦＧＦＲ２−Ｆｃポリペプチドの品質を確保するために、プラスミド率を最適化しなければならない。遺伝子移入から８日後に分泌タンパク質を回収し、遠心した。１００ｍＭグリシン／ＨＣｌ  ｐＨ２．７でのカラムからの溶出後、プロテインＧセファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）におけるアフィニティークロマトグラフィーによって、タンパク質を精製した。ＰＢＳ中でｓＦＧＦＲ２−Ｆｃタンパク質を調合し、０．２２μｍでろ過した。ｍｉｃｒｏＢＣアッセイ（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ）により、タンパク質濃度を調べた。
【００７５】
基本的に以前に記載されているように（Ｓａｄｄｉｃら、２００２、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９４：２３−３６及びＡｎｕｍｕｌａら、１９９８、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ８：６８５−６９４）、ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃ精製タンパク質における、定量的シアル酸同定、炭水化物組成分析及びＮ−グリカンの定量的オリゴ糖マッピングを行った。最初に、ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃの穏やかな加水分解後、シアル酸残基を放出させ、オルト−フェニレンジアミンで蛍光標識し、逆相ＨＰＬＣにより分離した。蛍光検出（励起、２３０ｎＭ；発光、４２５ｎＭ）により、個々のピークを検出し、同定し、Ｎ−アセチルノイラミン及びＮ−グリコリルノイラミン酸標準物質と比較することにより定量した。次に、個々の単糖を放出させるためにｓＦＧＦＲ２−Ｆｃ試料を酸加水分解した後、炭化水素組成を調べた。加水分解後、アントラニル酸で単糖（中性及びアミノ糖）を誘導体化し、次に、逆相ＨＰＬＣにより分離し、蛍光検出（励起、３６０ｎＭ；発光、４２５ｎＭ）により検出した。個々のピークを同定し、単糖標準物質と比較することにより定量した。第三に、ＰＮＧａｓｅ  Ｆでオリゴ糖を酵素的に放出させ、アントラニル酸で蛍光標識し、その後、Ａｓａｈｉｐａｋ−ＮＨ２Ｐ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）カラムにおいて順相陰イオン交換ＨＰＬＣによりシアル酸残基のそれらの数に従い、分離した。蛍光検出（励起、３６０ｎＭ；発光、４２５ｎＭ）により、標識したグリカンを検出し、定量した。ＦＧＦＲ２−ＦｃのモルあたりのＮ−グリカンのモル及びパパインによるＦｃの放出後に得られたＦｃモルあたりのＮ−グリカンのモルの総量に基づき、ＦＧＦＲ２ドメイン中のＮ−グリカン１個あたりのシアル酸の平均数を計算した。
【００７６】
Ｓｗｉｓｓ  Ｎｕｄｅマウス（Ｃｇａｒｋｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）の尾部に、精製ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃタンパク質を注射した。タンパク質のバッチあたり、全部で３匹のマウスを使用した。ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃの５００μｇの注射から６時間後、血液を回収し、血漿を得て、抗ヒトＦＧＦＲ２モノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）及び抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ結合ポリクローナル抗体（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてサンドイッチ法を使用してＥＬＩＳＡによりＦＧＦＲ２−Ｆｃ濃度を求めた（３回測定で２種類の希釈で２回分析）。対照実験において、ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃの注射１時間前に、フェチュイン及びアシオロフェチュインでマウスを前処理した。
【００７７】
表１は、様々なｓＦＧＦＲ２−Ｆｃバッチの産生の条件、Ｎ−グリカンプロファイル及び各バッチの単糖組成及びマウスでの静脈内注射から６時間後のｓＦＧＦＲ２−Ｆｃの血漿濃度をまとめる。
【００７８】
【表１】
2010510801.tif 000002
【００７９】
ヒトα−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ又はヒトβ−２，３−シアリルトランスフェラーゼとの融合タンパク質の一時的同時発現によって、ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡにおいて産生されるｓＦＧＦＲ２−Ｆｃ融合タンパク質のシアル化パターンの改良が示された。非シアル化グリカンの％が２倍減少し、タンパク質のモルあたりの総シアル酸含量が２倍増加し、Ｎ−グリカン１個あたりのシアル酸平均数が２．５倍増加したことにより、シアル化状態の大きな改善が明らかになった。注目すべきことに、単糖含量に影響はなかった（表１参照）。
【００８０】
シアル化Ｎ−グリカンのこの２．５倍の増加は、ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃの薬物動態パラメータが顕著に向上したことと正の相関がある。特に、血漿中に存在するｓＦＧＦＲ２−Ｆｃの１００倍の増加は、マウスでのｉｖ注射から６時間後に測定した。
【００８１】
フェチュインでの前処理と比較して、アシアロフェチュインでマウスを前処理した場合、薬物動態もまた１００倍向上した。フェチュインは結合しないが、アシアロフェチュインは、肝臓のアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）に結合することが知られている（Ｗｅｂｓｔｅｒら、２００３、Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ  ３３：９４５）。
【００８２】
まとめると、これらの結果からＮ−グリカンからの露出された末端ガラクトース残基を介したアシアロ糖タンパク質受容体への特異的結合がｓＦＧＦＲ２−Ｆｃのクリアランスに関与し、一方でｓＦＧＦＲ２−ＦｃにおけるＮ−グリカン１個あたり１個のシアル酸の存在によってこのクリアランスが顕著に低下したことが示された。
【実施例２】
【００８３】
最適の薬物動態に対する、ＦＧＦＲ２  Ｎ−グリカン１個あたりのシアル酸残基の平均数が１．２を超えるｓＦＧＦＲ２−Ｆｃタンパク質を発現するＣＨＯ安定クローンのスクリーニング
グルタミンシンテターゼ選択マーカーをコードするプラスミドｐＥＥ１４．４（Ｌｏｎｚａ）及びｓＦＧＦＲ２−ＦｃをコードするｃＤＮＡ配列を含有するプラスミドｐＸＬ４４１０から、ＣＨＯ細胞でのｓＦＧＦＲ２−Ｆｃの安定発現のための哺乳動物発現プラスミドｐＸＬ４６３６を作製した（図５）。供給者により推奨されるように、ＡＭＡＸＡ細胞株Ｎｕｃｌｅｏｆａｃｔｏｒキットを使用してヌクレオフェクチンにより、ＣＨＯ  Ｋ１細胞にプラスミドｐＸＬ４６３６を導入した。遺伝子移入した細胞を選択培地に移し、細胞増幅後、７種類の最もよい産生ＣＨＯ／ＧＳセミクローン（ＳＣ＃９、１１、２６、５８、１１２、１１８、１７０）を精製ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃ分子のシアル酸含量についてスクリーニングした。クローニング及び拡大産生のために、最高シアル酸含量の２種類のセミクローン（ＳＣ＃１１及び１１８）を選択し；特にＳＣ＃１１８からのクローンをさらにＧＣ１１１として記載した。
【００８４】
セミクローン全てから産生されたｓＦＧＦＲ２−Ｆｃ分子のシアル酸含量が高いにもかかわらず、これらによって同じ薬物動態は得られなかった。興味深いことに、２種類のセミクローン（ＳＣ＃１１及び１１８）から、最大シアル酸含量のｓＦＧＦＲ２−Ｆｃにより、表２に記載のように、マウスでのｉｖ注射６時間後の血中のｓＦＧＦＲ２−Ｆｃ濃度が最大になったことが観察された。２種類のクローン（ＳＣ＃９及び１７０）から、最低シアル酸含量のｓＦＧＦＲ２−Ｆｃで、マウスにおけるｉｖ注射６時間後の血中ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃ濃度が最低になった。
【００８５】
【表２】
2010510801.tif 000003
【００８６】
ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃの高シアル化Ｎ−グリカンに基づくクローンのスクリーニングにより、ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃの最適薬物動態パラメーターが予測される。
【実施例３】
【００８７】
ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃ  Ｎ−グリカン１個あたりのシアル酸の平均数と血中ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃクリアランスとの間の相関
実施例２に記載の実験と同様のその他の実験において、適切な哺乳動物発現プラスミドｐＸＬ４４２９及びプラスミドｐＸＬ４４１７を使用して、ＤＨＦＲ選択及び増幅系を用いて、ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃを発現する安定ＣＨＯ／ＤＨＦＲクローンを作製した（図６）。ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃ分子あたりのシアル酸含量についてこれらのＣＨＯ−ＤＨＦＲクローンもまたスクリーニングし、これらのクローンにより産生されるｓＦＧＦＲ２−Ｆｃのクリアランスもアッセイした。
【００８８】
ＦＧＦＲ２−ＦｃのモルあたりのＮ−グリカンのモル及びパパインによるＦｃの放出後に得られたＦｃモルあたりのＮ−グリカンのモルの総量に基づき、ＦＧＦＲ２ドメイン中のＮ−グリカン１個あたりのシアル酸の平均数を計算した。図７で示される結果から、Ｆｃ分子に対して見られる血中の最適濃度と比較した場合、ＦＧＦＲ２  Ｎ−グリカン１個あたりのシアル酸残基の比が１．２を超えることにより、血中の最適ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃ濃度が確保されたことが示された。選択されたクローンのみがこの最適比率を達成した。
【００８９】
従って、ＦＧＦＲ２  Ｎ−グリカン１個あたりのシアル酸残基の比によってクローンをスクリーニングすることにより、当業者は、血中のｓＦＧＦＲ２−Ｆｃの低クリアランスを予測することが可能になる。
【実施例４】
【００９０】
ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列
プラスミドｐＸＬ４４１０又はｐＸＬ４６３６又はｐＸＬ４４２９（図５及び６）によりコードされるタンパク質ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃは、ヒトＩｇＧ１配列由来のＦｃ断片との可溶性ＦＧＦＲ２ヒト配列の融合タンパク質である。
【００９１】
ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃをコードするポリヌクレオチドの配列は配列番号１及び図４Ａで示される。同様に、ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃタンパク質の全長アミノ酸配列は、図４Ｂの配列番号２で示される。位置１から３５０からのアミノ酸はＦＧＦＲ２ＩＩＩｃアイソタイプに対応し（図４Ｃ配列番号４参照）、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ（ＦＧＦＲ２＿ＨＵＭＡＮ）に記載の位置２７から３７６からのアミノ酸である。位置３５４から５８４のアミノ酸は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ（ＩＧＨＧ１＿ＨＵＭＡＮ）に記載のような位置９９から３２９のＩｇＧ１のアミノ酸であり；図４Ｄ及び配列番号６を参照のこと。位置３５１から３５３のアミノ酸は、合成リンカーのアミノ酸：ＳＡＬ（Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｌｅｕ）である。図４Ｅ参照。
【実施例５】
【００９２】
ＣＨＯ安定クローンＧＣ１１１において産生されるｓＦＧＦＲ２−Ｆｃの規定されたＮ−グリカン含量
ｓＦＧＦＲ２  Ｎ−グリカン１個あたりのシアル酸残基の比率が１．２を超えるようにｓＦＧＦＲ２−Ｆｃを産生させるために条件を最適化した。この実施例は、この条件を達成するための条件を提供する。
【００９３】
１００μＭ  ＭＳＸ及び１ｘＧＳサプリメントを添加したＣＤ−ＣＨＯタンパク質不含培地４．４Ｌを満たした５−Ｌ  Ｃｅｌｌｉｇｅｎバイオリアクター（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ）に、最初の細胞密度がクローンＧＣ１１１の３．５ｘ１０５個の細胞／ｍＬになるように播種し、３７℃で培養した。酸素、窒素、空気及び二酸化炭素の混合物又は純粋酸素を用いてスパージャー通気を使用し、溶解酸素を空気飽和度３０％に維持した。培地中で、二酸化炭素の添加及び１Ｍ重炭酸ナトリウムの注入によりｐＨを７．２に維持した。Ｃｅｌｌ  Ｌｉｆｔ  Ｉｍｐｅｌｌｅｒを用いて、使用した撹拌速度は１１０ｒｐｍであった。２−３ｇ／Ｌの標的レベルにグルコースを維持するために、フィード溶液（４５０ｇ／Ｌグルコース）を連続的に供給した。残存グルコース濃度が２．５ｇ／Ｌになった第５日に供給を開始した。連続栄養供給は、グルコース消費速度に等しい栄養供給速度で、予想される細胞増殖及びグルコース消費に基づいた。毎日のオフライン制御後、パルス添加により、１−３ｍｍｏｌ／Ｌにグルタミン酸濃度を維持した。細胞カウント、生存能及び代謝産物（グルコース、乳酸、グルタミン、アンモニア及びグルタミン酸）に対して及び産生期中の産物濃度について、細胞培養を監視した。細胞生存能が５５％に低下したときに培養を停止し、培養採取物を回収した。細胞培養採取物を透明化し、アフィニティークロマトグラフィー（ＰｒｏｓｅｐｖＡ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）及び２回のイオン交換クロマトグラフィー段階によりｓＦＧＦＲ２−Ｆｃを精製し、次いでろ過滅菌し、さらなる分析及びインビボ試験前にリン酸緩衝食塩水中で保存した。
【００９４】
非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から得られたｓＦＧＦＲ２−Ｆｃの見かけの分子量は１８０ｋＤａであった。これは、ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃホモ二量体のアミノ酸配列に基づいて計算される１３０ｋＤａの理論的分子量とは異なっていた。見かけの分子量と計算分子量との間のこの大きな差は、Ｎ−グリカン約３０％がさらに存在することによるものであった（表３参照）。実際に、ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ、Ｒｏｃｈｅ）によるｓＦＧＦＲ２−Ｆｃの消化及びそれに続く非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析において、脱グリコシル化ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃの分子量は約１６０ｋＤａであった（図７）。実施例１に記載のようにｓＦＧＦＲ２−Ｆｃの炭水化物組成及びＮ−グリカンプロファイルを分析し、表３で報告した。
【００９５】
【表３】
2010510801.tif 000004
【００９６】
表２で得られた結果と比較して、最適条件でクローンＧＣ１１１から産生されたｓＦＧＦＲ２−Ｆｃは、標準的条件下で産生されたクローンＧＣ１１１の親であるセミクローンＳＣ＃１１８から産生されたｓＦＧＦＲ２−Ｆｃよりもシアル化Ｎ−グリカンが多かった。例えば、非シアル化種の％が４３％から３０％に低下した。
【００９７】
ＦＧＦＲ２−ＦｃのモルあたりのＮ−グリカンのモル数及びパパインによるＦｃの放出後に得られるＦｃモルあたりのＮ−グリカンのモル数の総量に基づき、ＦＧＦＲ２あたり７個のＮ−グリカンがあることが測定により分かった。従って、ＦＧＦＲ２ドメインの殆どの部位が殆ど全て完全に占有されている。
【実施例６】
【００９８】
ＦＧＦ親和性及び生産性に重要なＮ−グリコシル化部位
ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃ融合タンパク質には、ＦＧＦＲ２ドメインに８個のＮ−グリコシル化部位があり、Ｆｃドメインに１個ある（Ｎ−グリカン位置Ｎ１からＮ８の定義については図８及び表５参照）。Ｉｇ−様ドメイン１を既に持たないＦＧＦＲ２−Ｆｃの２種類の変異体であるタンパク質４４９３及び４５６５が産生された。４４９３は、生産性及びＦＧＦ−２又はヘパリンへの結合に関して、ｐＸＬ４６３６由来の野生型ＦＧＦＲ２−Ｆｃと同様の特性を示した。一方、ｓＦＧＦＲ２ドメインの全てのグリコシル化部位で突然変異が起こっている（ＮからＱ置換）４５６５は、突然変異の生産性が５０倍を超えて低下したので、特性を調べることができなかった（表４参照）。
【００９９】
【表４】
2010510801.tif 000005
＊＊Ｇａｍｓｊａｅｇｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２００５年４月７日／ＢＪ２００５０１５６により記載のように、「構造変化を伴う２段階反応」モデルを使用して、ＢｉａｃｏｒｅＴＭ機器においてＦＧＦ−２に対する結合を調べた。簡潔に述べると、「バルク効果」領域を除き、全体的センサーグラム（ｓｅｎｓｏｇｒａｍ）において積分を行った。濃度範囲は、１から８ｎＭの間を選択した。同時ｋａ／ｋｄカイネティクス法により、次の等式を想定する２つのｋａ及び２つのｋｄの測定が可能となる：
【０１００】
【数１】
2010510801.tif 000006
次の式から解離定数ＫＤを計算した：
【０１０１】
【数２】
2010510801.tif 000007
【０１０２】
報告されている２つの競合モデル（Ｍｏｈａｍｍａｄｉからの対称ツーエンドモデル（ｔｗｏ−ｅｎｄ  ｍｏｄｅｌ）及びＰｅｌｌｅｇｒｉｎｉからの非対称モデル）によると、部位Ｎ３からＮ７は、ＦＧＦ１又はＦＧＦＲ２ｃの何れかのアミノ酸残基と相互作用し得る可能性があり、及び／又はヘパリンと相互作用し得、一方、部位Ｎ８は、全ての結晶構造において相互作用に関与しないと思われる（Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｉら、２０００、Ｎａｔｕｒｅ  ４０７：１０２９；Ｉｂｒａｈｉｍｉら、２００５  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２５：６７１）。
【０１０３】
上記情報に基づき、顕著な生産性を得るために、対応するＡｓｎからＧｌｎへの置換により及び位置Ｎ８を変化させずに維持することにより、位置Ｎ３からＮ７のＮ−グリコシル化部位を研究することは有意義であった。２レベルの一部実施要因実験により、ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃの物理化学的特性におけるＮ−グリカンの位置による影響を統計学的に評価した。５種類の変数（位置Ｎ３からＮ７のグリコシル化部位占有）を選択し、１６種類の独立構築物を調べた。記載のように（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｅｒｓ、Ｇ．Ｂｏｘ編、Ｗｉｌｌｅｙ、１９７８）、実験的２５−１一部実施計画（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ）及びデータ分析を行った。
【０１０４】
一部実施要因計画
４４９３及びプラスレベル（Ｎ）又はマイナスレベル（Ｑ）の何れかであり得る５種類の変数（Ｎ３からＮ７）を用いた２レベルでの要因計画に基づき、部位特異的Ｎ−グリコシル化変異体を設計した。この計画は、１６種類のコンストラクトを伴う一部計画であり（２５−１、即ち分解能Ｖ計画）、これにより主効果及び２因子交互作用の同定が可能になるが、３因子交互作用と２因子交互作用が交絡する。
【０１０５】
位置Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６又はＮ７でのＮからＱへの置換（しかし、位置Ｎ８及びＦｃドメインのＮ−グリコシル化部位は変化せずに維持）を行うための、一連のＰＣＲ及びクローニングにより、この１６種類のプラスミドコンストラクトを得た。これらのタンパク質変異体は、４４９３と、表５で列挙する２又は４個の点突然変異が異なるだけである。
【０１０６】
【表５】
2010510801.tif 000008
【０１０７】
設計したこの１６種類のコンストラクトを小規模産生について試験した。２種類の変異体（４５７２及び４５７４）は、産生が非常に低かった（約２ｍｇ／Ｌ）。残りの１４種類のコンストラクトは、リットル規模で産生され、妥当な産物回収率で標準的条件下で平行して精製された。次に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ゲルろ過、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭによりこれらを分析した。統計学的一部実施要因分解能−２５−１ＤＯＥにより、結果を解析した。
【０１０８】
生産性
Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７でのＮ−グリコシル化は生産性に積極的な貢献があった。試験した全ての位置（即ちＮ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６及びＮ７）に対して同様の定量的効果があり、２因子相互作用の有意な効果はなかった。
【０１０９】
【表６】
2010510801.tif 000009
【０１１０】
凝集
精製調製物中の高分子種の％（ＨＭＷ；％）を定量するために、ゲルろ過（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２０００）により、精製タンパク質を分析した。４５８７に対して８０．２％ＨＭＷという最大値（最悪例）が得られ、産生され得なかった２種類のコンストラクト（４５７２及び４５７４）に対するＤＯＥ分析においてこれを使用した（１４種類のコンストラクトから得られたＨＭＷ値の平均％もまた比較のために使用した（同様の結論を与える。））。位置Ｎ５での及びそれほどではないにせよ位置Ｎ６でのＮ−グリコシル化がある場合、ＨＭＷ種の出現は少なかった。Ｎ５−Ｎ６相互作用は、凝集において同様の効果を示した。
【０１１１】
【表７】
2010510801.tif 000010
【０１１２】
ＦＧＦ−２に対する結合
各コンストラクトに対して、ＢｉａｃｏｒｅＴＭを用いてＦＧＦ−２に対する結合親和性を調べた。測定可能な親和性を示すコンストラクトに対して、０．４９から２．３１ｎＭの間の解離定数（ＫＤ）値を得た。ＦＧＦ−２に結合しなかったか又は産生され得なかったコンストラクトの場合、ＤＯＥ分析に対して１０ｎＭの値を使用した。位置Ｎ５及びそれほどではないにせよ位置Ｎ６及びＮ３でのＮ−グリコシル化は、ＦＧＦ−２への結合に対して正の効果があった。相互作用Ｎ３−Ｎ６及びＮ４−Ｎ７が結合に対して負の影響があった一方で、相互作用Ｎ３−Ｎ５及びＮ５−Ｎ６は結合に対して有意に正の効果があった。
【０１１３】
【表８】
2010510801.tif 000011
【０１１４】
この分解能−Ｖ  ２５−１Ｄ．Ｏ．Ｅ．により、位置Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７においてＮ−グリコシル化が生産性において正の貢献があり；位置Ｎ５＞＞Ｎ６及びＮ３においてＦＧＦ−２への結合において正の影響があり；全ての位置、特にＮ５＞Ｎ６において、高分子量の分子の出現が少なかったことが明らかになった。
【０１１５】
従って、Ｎ−グリカン占有は位置Ｎ５で必須であり、それぞれ位置Ｎ３、Ｍ４、Ｎ６及びＮ７（ＦＧＦＲ２＿ＨＵＭＡＮ（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ）においてそれぞれ位置２６５、２２８、２４１、２９７及び３１８）で推奨される。
【実施例７】
【０１１６】
ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃ融合タンパク質の薬物動態
実施例７において、ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃは、ｓＦＧＦＲ２  Ｎ−グリカン１個あたりのシアル酸の平均数が１．３である、アミノ酸配列、配列番号２に対応する融合タンパク質である。時間点あたり３匹のマウスの尾静脈に本融合タンパク質５００μｇを注射した。本産物の注射後様々な時間点で採血し、図１０は、血漿及び肝臓中のタンパク質濃度を示す。図１１は、注射した用量の％で表される、血漿及び肝臓中の早期の時間点でのタンパク質回収量を示す。
【０１１７】
非コンパートメント解析を用いて薬物動態パラメータを計算した。対数線形最終相の最良適合を与えた最後の６つのデータ点を用いて、排出半減期を計算した（表９）。
【０１１８】
【表９】
2010510801.tif 000012
【０１１９】
静脈内投与後、ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃは、排出半減期が長く（ほぼ３日間）、全身クリアランスが低下した、好ましい薬物動態プロファイルを示した。分布容積は限られており、全身水分体積よりも少なく、このことから、組織分布が制限されることが示唆される。７２時間において、ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃ血漿濃度は非常に高い濃度に留まり、クリアランスも良好である。ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃの薬物動態パラメータは、治療薬としてのこの融合タンパク質の使用に非常によく適合する。実施例において示されるような効果において、マウスでの静脈内注射後の血漿濃度は実質的に高く、注射から７２時間後、クリアランスは非常に低いままである。重要なこととして、インビボでのｓＦＧＦＲ２−Ｆｃ切断の反応速度もまた非常に低いが、これは、ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃが部分的に切断されるだけであり（１８時間後で４０％）、全長分子濃度が７２時間まで変化しなかったからである。
【０１２０】
従って、配列番号２で列挙されるような、ｓＦＧＦＲ２  Ｎ−グリカン１個あたりのシアル酸の平均数が１．３である融合分子は、排出半減期が長く（ほぼ３日間）、全身クリアランスが満足いくものである、好ましい薬物動態プロファイルを示した。
【実施例８】
【０１２１】
Ａ５４９皮下腫瘍モデルにおけるｓＦＧＦＲ２−Ｆｃ融合タンパク質の有効性
この実施例において、ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃは、ｓＦＧＦＲ２  Ｎ−グリカン１個あたりのシアル酸の平均数が１．３であるアミノ酸配列  配列番号２に対応する融合タンパク質である。
【０１２２】
Ａ５４９皮下腫瘍モデル
Ａ５４９細胞株は、ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃの有効性を評価するための腫瘍細胞株として見なされた。インビトロで、出願者らにより、この細胞株がＦＧＦ２を発現すること、また、ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃがこれらの細胞の自己分泌増殖を無効にし得ることも示された。皮下Ａ５４９腫瘍モデルは、出願者により、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおいて確立された。さらに、インビボでこの腫瘍はＦＧＦ２を発現する。
【０１２３】
この実験において、Ａ５４９腫瘍成長モデルにおいてｓＦＧＦＲ２−Ｆｃ分子の有効性を評価した。週に２回、産物を皮下注射した。様々な用量、即ち、ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃの２５、１５及び５ｍｇ／ｋｇを評価した。
【０１２４】
腫瘍体積の全体的分析後、ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃでの３つの処置群の腫瘍進展は、ＰＢＳでの処置群の腫瘍進展と統計学的に差があった。ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃは、週に２回の５ｍｇ／ｋｇの用量で、このモデルにおいて腫瘍成長に有効である。
【０１２５】
実験計画
第０日に、２００μＬ中の５．１０６  Ａ５４９細胞をＢａｌｂ／ｃヌードマウスに皮下注射した。同じ日の細胞注入後、ブロックあたり、体重に基づいて４群で４匹ずつ、マウスを無作為に分けた。細胞注入の翌日、無作為化後、治療を開始した。３９日間、週に２回：月曜日及び金曜日に、５００、３００又は１００μｇ／マウス／投与で（それぞれ、２５、１５及び５ｍｇ／ｋｇに相当する。）各群に皮下投与した。
【０１２６】
結果
腫瘍体積分析
図１２で示されるように、第４０日まで腫瘍体積を分析した。１００μｇ群（三角）、３００μｇ（四角）及び５００μｇ／マウス／投与（黒丸）は、ＰＢＳ群（白丸）と統計学的に差があった。発明者らは、ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃが２５、１５及び５ｍｇ／ｋｇの用量で腫瘍成長を低下させたと結論付けた。
【０１２７】
第４０日の腫瘍重量
図１３で示されるように、腫瘍を回収し、実験の最後に重量測定した。１００μｇ、３００μｇ及び５００μｇ／マウス／投与の群は、ＰＢＳ群と統計学的に差があった。発明者らは、本発明によるｓＦＧＦＲ２−Ｆｃが２５、１５及び５ｍｇ／ｋｇの用量で腫瘍重量を低下させたと結論付けた。
【０１２８】
ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃ＿１００、ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃ＿３００及びｓＦＧＦＲ２−Ｆｃ＿５００群の腫瘍成長の進展は、ＰＢＳでの治療群の進展と統計学的に差があった。ｓＦＧＦＲ２  Ｎ−グリカン１個あたりのシアル酸の平均数が１．３である本発明によるｓＦＧＦＲ２−Ｆｃ融合タンパク質（アミノ酸配列配列番号２）は、５ｍｇ／ｋｇの用量で実質的に腫瘍成長を低下させることができる。
【実施例９】
【０１２９】
Ｈ４６０皮下腫瘍モデルにおけるｓＦＧＦＲ２−Ｆｃ融合タンパク質の有効性
実施例９において、ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃは、ｓＦＧＦＲ２  Ｎ−グリカン１個あたりのシアル酸の平均数が１．６であるアミノ酸配列  配列番号２に対応する融合タンパク質である。
【０１３０】
Ｈ４６０皮下腫瘍モデル
Ｈ４６０細胞株は、ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃの有効性を評価するための腫瘍細胞株として見なされた。この細胞株はＦＧＦ２を発現することがインビトロで示されている。この実験において、腫瘍成長において、ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃの有効性を評価した。週に２回、２５ｍｇ／ｋｇの用量で産物を皮下注射した。腫瘍体積進展の全体的分析後、ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃは腫瘍成長を低下させた。
【０１３１】
実験計画
第０日に、２００μＬ中の５．１０６  Ｈ４６０細胞をＢａｌｂ／ｃヌードマウスの右側腹部に皮下注射した。細胞注入後、細胞接種日（第０日）に、測定体重によってマウスを無作為に分け、治療群に割り振る。
【０１３２】
週に２回（月曜日及び金曜日）、連続３週間、治療薬を皮下注射（２００μＬ）により投与した。治療薬への細胞の曝露を最大にするために、細胞接種後、第１日に最初の投与を行った。
【０１３３】
結果
腫瘍体積分析
図１４は、第２２日までの腫瘍体積分析を示す。発明者らは、ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃが実質的に腫瘍成長を低下させたと結論付けた。
【０１３４】
腫瘍重量分析
図１５は、第２２日の腫瘍重量分析を示す。発明者らは、ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃが腫瘍重量を実質的に減少させたと結論付けた。
【０１３５】
ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃ群の腫瘍成長の進展は、ＰＢＳ処置群の進展とは統計学的に差があった。発明者らは、ｓＦＧＦＲ２  Ｎ−グリカン１個あたりのシアル酸の平均数が１．６である本発明による融合タンパク質（アミノ酸配列  配列番号２）が、２５ｍｇ／ｋｇの用量で実質的にＨ４６０腫瘍成長を低下させることができると明確に結論付けた。
【実施例１０】
【０１３６】
Ａ５４９及びＨ４６０細胞株におけるｓＦＧＦＲ２−Ｆｃ融合タンパク質のインビトロＡＤＣＣ活性の評価
この実施例において、ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃは、ｓＦＧＦＲ２  Ｎ−グリカン１個あたりのシアル酸の平均数が１．６を超えるアミノ酸配列  配列番号２に対応する融合タンパク質である。両方の選択モデルＨ４６０及びＡ５４９腫瘍細胞において、ｓＦＧＦＲ２−ＦｃがインビトロＡＤＣＣ活性を媒介する能力を評価した（実施例８及び９参照）。
【０１３７】
実験計画
ＦＧＦ２の５００ｎｇ／ｍＬ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）及びｓＦＧＦＲ２−Ｆｃの２μｇ／ｍＬ又は対照ヒトＩｇＧ１（Ｓｉｇｍａ）とともに、ＰＢＳ２％ＢＳＡ中の腫瘍細胞（Ａ５４９及びＨ４６０）（１００万個／ｍＬ）を４℃で３０分間温置した。ＲＰＭＩ  １％ＦＢＳ中で腫瘍細胞を希釈し、５０００個の細胞／ウェルで９６ウェルプレート中で温置した。ＮＫ／腫瘍細胞の比が２０／１及び６／１となるように、精製ＮＫを添加した。３７℃で４時間プレートを温置し、次いで、遠心し、上清中で乳酸デヒドロゲナーゼを滴定した（キット  ＲＯＣＨＥ）。ｔｒｉｔｏｎＸ１００  ０．２％を用いて１００％溶解した。特異的なｓＦＧＦＲ２−Ｆｃ誘導性ＡＤＣＣを製造者により求められるようにして計算した。
【０１３８】
結果
図１６で述べられる結果は、２０／１（ＮＫ／腫瘍細胞）の条件で２５％に近いＡ５４９及びＨ４６０腫瘍細胞両方において、ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃ存在下で、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）介在性の腫瘍細胞溶解を示し、このことから、ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃがこれらの腫瘍細胞においてＡＤＣＣ効果を媒介できることが示唆される。
【実施例１１】
【０１３９】
Ａ５４９皮下腫瘍モデルにおけるｓＦＧＦＲ２−Ｆｃ融合タンパク質のインビボＡＤＣＣ及びＣＤＣ活性の評価
この実施例において、ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃは、ｓＦＧＦＲ２  Ｎ−グリカン１個あたりのシアル酸の平均数が１．６を超えるアミノ酸配列  配列番号２に対応する融合タンパク質である。
【０１４０】
Ａ５４９皮下腫瘍モデル
Ａ５４９細胞株はｓＦＧＦＲ２−Ｆｃの有効性を評価するための腫瘍細胞株として見なされたが、これは、これらの細胞がインビボで高レベルのＦＧＦ２を発現し、インビトロｓＦＧＦＲ２−Ｆｃ介在性ＡＤＣＣに感受性があったからである。
【０１４１】
マウス系統
ｓＦＧＦＲ２−ＦｃがインビボＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ活性を媒介する能力を評価するために、３種類の様々なマウス系統（ＳＣＩＤ、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ及びＳＣＩＤ／ｂｇマウス）を選択した。ＳＣＩＤマウスはＮＫ及び補体機能を維持し、ＡＤＣＣ及びＣＤＣ反応を引き起こすことができ、陽性対照として選択された。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスは、ＮＫ機能も補体活性を刺激する能力もなく、ＡＤＣＣもＣＤＣ活性も引き起こすことができなかった。ＳＣＩＤ／ｂｇマウスは、ＮＫ機能がなく、ＡＤＣＣ活性を引き起こすことができなかった。
【０１４２】
この実験において、３種類の様々なマウス系統の皮下に移植されたＡ５４９腫瘍においてｓＦＧＦＲ２−Ｆｃ分子系統の有効性を評価した。全試験コース中、５ｍｇ／ｋｇの用量で週に２回、ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃを皮下注射した。
【０１４３】
実験計画
既に記載のように、ＳＣＩＤ、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ及びＳＣＩＤ／ｂｇマウスの皮下にＡ５４９を移植した（実施例８参照）。連続６週間、皮下注射により、週に２回、治療薬を投与した。試験コース中、体重及び腫瘍体積を週に２回測定した。
【０１４４】
結果
図１７で示されるように、３つの実験において第４１日まで、腫瘍体積を分析した。ＳＣＩＤマウスにおいて、５ｍｇ／ｋｇのｓＦＧＦＲ２−Ｆｃで処置した群（菱型）は対照群（白丸）と統計学的に差があり、３９％の腫瘍抑制を示した（１００−（治療群体積／対照群体積ｘ１００）として計算）。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいて、５ｍｇ／ｋｇでのｓＦＧＦＲ２−Ｆｃは活性を示さなかった。ＳＣＩＤ／ｂｇマウスにおいて、５ｍｇ／ｋｇのｓＦＧＦＲ２−Ｆｃは、一部その活性を回復した（腫瘍抑制＝１８％）。これらの結果によると、ＣＤＣ及びＡＤＣＣ機能は、ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃの有効性に関与した。
【実施例１２】
【０１４５】
Ｈ４６０皮下腫瘍モデルにおけるｓＦＧＦＲ２−Ｆｃ融合タンパク質のインビボＡＤＣＣ及びＣＤＣ活性の評価
この実施例において、ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃは、ｓＦＧＦＲ２  Ｎ−グリカン１個あたりのシアル酸の平均数が１．６を超えるアミノ酸配列  配列番号２に対応する融合タンパク質である。
【０１４６】
Ｈ４６０皮下腫瘍モデル
Ｈ４６０細胞株はｓＦＧＦＲ２−Ｆｃの有効性を評価するための腫瘍細胞株として見なされ、これらの細胞はインビボで高レベルのＦＧＦ２を発現し、インビトロのｓＦＧＦＲ２−Ｆｃ介在性ＡＤＣＣに感受性があった。
【０１４７】
マウス系統
ｓＦＧＦＲ２−ＦｃがＨ４６０においてインビボＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ活性を媒介する能力を評価するために、実施例１１で既に記載のように、様々な免疫機能を有する３種類のマウス系統（ＳＣＩＤ、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ及びＳＣＩＤ／ｂｇマウス）を選択した。
【０１４８】
この実験において、３種類の様々なマウス系統の皮下に移植されたＨ４６０腫瘍において、ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃ分子の有効性を評価した。全試験コース中、２５ｍｇ／ｋｇの用量で週に２回、ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃを皮下注射した。
【０１４９】
実験計画
既に記載のように、ＳＣＩＤ、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ及びＳＣＩＤ／ｂｇマウスの皮下にＨ４６０を移植した（実施例９参照）。連続３週間、皮下注射により、週に２回、治療薬を投与した。試験コース中、体重及び腫瘍体積を週に２回測定した。
【０１５０】
結果
図１８で示されるように、３つの実験において第２２日まで腫瘍体積を分析した。ＳＣＩＤマウスにおいて、２５ｍｇ／ｋｇのｓＦＧＦＲ２−Ｆｃで処置した群（菱型）は対照群（白丸）と統計学的に差があり、２９％の腫瘍抑制を示した。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいて、５ｍｇ／ｋｇのｓＦＧＦＲ２−Ｆｃは、活性喪失を示し、腫瘍抑制は１４％であった。ＳＣＩＤ／ｂｇマウスにおいて、５ｍｇ／ｋｇのｓＦＧＦＲ２−Ｆｃは、その活性を完全に回復した（腫瘍抑制＝３２％）。これらの実験において、Ａ５４９腫瘍モデルで観察されるように（実施例１１参照）、ＣＤＣ及びＡＤＣＣ機能はｓＦＧＦＲ２−Ｆｃ有効性に関与した。
【実施例１３】
【０１５１】
Ｈ４６０皮下腫瘍モデルにおける、ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃ（Ａ２６５Ｆｃ）と比較した、ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃのインビボ有効性の評価
Ｓｈｉｅｌｄｓらは、全てのＦｃγＲ受容体への結合を低下させ、抗体依存性細胞傷害が非常に低くなる、（Ａ２６５Ｆｃ）と呼ばれるヒトＩｇＧ１のＦｃドメインにおける点突然変異Ａｓｐ２６５Ａｌａを記載した（２００１  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１）。プラスミドｐＸＬ４５４７のｓＦＧＦＲ２−ＦｃコードＤＮＡ配列のＦｃドメインにこの点突然変異を導入し（図１９）、その結果、配列番号１３で表されるポリヌクレオチド配列が得られた。実施例３に記載のように、適切な哺乳動物発現プラスミドｐＸＬ４５４７及びプラスミドｐＸＬ４４１７を用い、ＤＨＦＲ選択及び増幅系を使用して、ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃを発現する安定なＣＨＯ／ＤＨＦＲクローン（Ａ２６５Ｆｃ）（配列番号１４）を作製した。次にタンパク質ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃ（Ａ２６５Ｆｃ）を産生させ、インビボ実験のために精製した。そのグリカン含量が、実施例３又は５で産生されるｓＦＧＦＲ２−Ｆｃに対して見られるグリカン含量と同様であったことを確認した。
【０１５２】
【表１０】
2010510801.tif 000013
【０１５３】
４６０皮下腫瘍モデル
Ｈ４６０細胞株は、ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃの有効性を評価するための腫瘍細胞株として見なされ、これらの細胞はインビボで高レベルのＦＧＦ２を発現し、インビトロｓＦＧＦＲ２−Ｆｃ介在性ＡＤＣＣに感受性があった。
【０１５４】
この実験において、ヌードマウスに皮下移植されたＨ４６０腫瘍において、ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃ分子及び修飾ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃ（Ａ２６５Ｆｃ）分子の有効性を評価した。
【０１５５】
実験計画
既に記載のように、Ｂａｌｂ／Ｃマウスの皮下にＨ４６０を移植した（実施例９参照）。全試験コース中、週に２回、治療薬を投与した。試験コース中、体重及び腫瘍体積を週に２回測定した。
【０１５６】
結果
図２０で示されるように、第２３日まで腫瘍体積を分析した。２５ｍｇ／ｋｇのｓＦＧＦＲ２−Ｆｃによる治療群（菱型）は、対照群（白丸）と統計学的に差があり、５０％の腫瘍抑制を示した。２５ｍｇ／ｋｇの修飾ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃ（Ａ２６５Ｆｃ）は、活性を喪失しており、腫瘍抑制はわずか２５％（ＮＳ）であった。ｓＦＧＦＲ２−Ｆｃ（Ａ２６５Ｆｃ）のＦｃ内の突然変異により、活性低下が誘導された。
【０１５７】
この修飾は、抗体依存性の細胞傷害を抑制することが示されたので、実施例１３は、ＡＤＣＣを含む機構によりｓＦＧＦＲ２−Ｆｃがインビボで作用した間接的な証拠を提供する。
【図１Ａ】
2010510801.tif 000014
【図１Ｂ】
2010510801.tif 000015
【図２Ａ】
2010510801.tif 000016
【図２Ｂ】
2010510801.tif 000017
【図３Ａ】
2010510801.tif 000018
【図３Ｂ】
2010510801.tif 000019
【図４Ａ】
2010510801.tif 000020
【図４Ｂ】
2010510801.tif 000021
【図４Ｃ】
2010510801.tif 000022
【図４Ｄ】
2010510801.tif 000023
【図４Ｅ】
2010510801.tif 000024
【図４Ｆ】
2010510801.tif 000025
【図５】
2010510801.tif 000026
【図６Ａ】
2010510801.tif 000027
【図６Ｂ】
2010510801.tif 000028
【図７】
2010510801.tif 000029
【図８】
2010510801.tif 000030
【図９】
2010510801.tif 000031
【図１０】
2010510801.tif 000032
【図１１】
2010510801.tif 000033
【図１２】
2010510801.tif 000034
【図１３】
2010510801.tif 000035
【図１４】
2010510801.tif 000036
【図１５】
2010510801.tif 000037
【図１６】
2010510801.tif 000038
【図１７Ａ】
2010510801.tif 000039
【図１７Ｂ】
2010510801.tif 000040
【図１７Ｃ】
2010510801.tif 000041
【図１８Ａ】
2010510801.tif 000042
【図１８Ｂ】
2010510801.tif 000043
【図１８Ｃ】
2010510801.tif 000044
【図１９Ａ】
2010510801.tif 000045
【図１９Ｂ】
2010510801.tif 000046
【図２０】
2010510801.tif 000047
【配列表】
2010510801000001.app
【国際調査報告】
2010510801.tif 000048
2010510801.tif 000049
2010510801.tif 000050