(57)【要約】本発明は、ＥｐｈＡ６の遺伝子機能を阻害したマウスの行動の調査に基づく。一態様において、本発明は、天然配列Ｅｐｈ受容体Ａ６（ＥｐｈＡ６）ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊と関連している表現型を同定する方法であって、この方法は、（ａ）天然配列ＥｐｈＡ６ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊をゲノム内に含む非ヒトトランスジェニック動物を提供する工程；（ｂ）該非ヒトトランスジェニック動物の生理学的特性を測定する工程；および（ｃ）測定された生理学的特性を、性別適合野生型動物のものと比較する工程であって、ここで、該野生型動物の生理学的特性と異なる該非ヒトトランスジェニック動物の生理学的特性は、該非ヒトトランスジェニック動物における遺伝子破壊に起因する表現型と同定される、工程を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然配列Ｅｐｈ受容体Ａ６（ＥｐｈＡ６）ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊と関連している表現型を同定する方法であって、該方法は：
（ａ）天然配列ＥｐｈＡ６ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊をゲノム内に含む非ヒトトランスジェニック動物を提供する工程；
（ｂ）該非ヒトトランスジェニック動物の生理学的特性を測定する工程；および
（ｃ）測定された該生理学的特性を、性別適合野生型動物のものと比較する工程を含み、ここで、該野生型動物の生理学的特性と異なる該非ヒトトランスジェニック動物の生理学的特性は、該非ヒトトランスジェニック動物における該遺伝子の破壊に起因する表現型と同定される、
方法。
【請求項２】
前記非ヒトトランスジェニック動物が、天然配列ＥｐｈＡ６ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊に対してヘテロ接合性である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
性別適合野生型同腹仔と比べたとき前記非ヒトトランスジェニック動物によって示される表現型が神経学的障害である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記神経学的障害が認知障害である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記認知障害が、痕跡恐怖条件付けパラダイムにおける障害と関連している、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記認知障害が、空間の学習または記憶における障害と関連している、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記認知障害が、文脈の学習または記憶に関する障害と関連している、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記認知障害が、アルツハイマー病、脳卒中、脳に対する外傷性損傷、疾患または損傷に起因する発作、学習障害および学習困難、ならびに脳性麻痺からなる群より選択される状態と関連している、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記発作が癲癇によって生じる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記天然配列ＥｐｈＡ６ポリペプチドがマウスＥｐｈＡ６である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記天然配列ＥｐｈＡ６ポリペプチドがヒトＥｐｈＡ６である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記天然配列ＥｐｈＡ６ポリペプチドが、マウスＥｐｈＡ６ポリペプチドＱ６２４１３  ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｑ６２４１３  ＮＩＤ：ハツカネズミ（マウス）ＥＰＨＲＩＮ  ＴＹＰＥ−Ａ  ＲＥＣＥＰＴＯＲ  ６  ＰＲＥＣＵＲＳＯＲ（ＥＣ  ２．７．１．１１２）（ＴＹＲＯＳＩＮＥ−ＰＲＯＴＥＩＮ  ＫＩＮＡＳＥ  ＲＥＣＥＰＴＯＲ  ＥＨＫ−２）（ＥＰＨ  ＨＯＭＯＬＯＧＹ  ＫＩＮＡＳＥ−２）またはヒトＥｐｈＡ６ポリ（ｐｏｌｙｅ）ペプチドＸＰ＿１１４９７３  ＰＲＥＤＩＣＴＥＤ：受容体型チロシンキナーゼに類似［ホモサピエンス］である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記天然配列ＥｐｈＡ６ポリペプチドが、配列番号１のヒトＰＲＯ３５４４４ポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ＥｐｈＡ６ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊をゲノム内に含む非ヒトトランスジェニック動物由来の単離細胞。
【請求項１５】
マウス細胞である、請求項１４に記載の単離細胞。
【請求項１６】
前記マウス細胞が胚性幹細胞である、請求項１５に記載の単離細胞。
【請求項１７】
前記非ヒトトランスジェニック動物が、性別適合野生型同腹仔と比較して少なくとも神経学的障害の表現型を示す、請求項１４に記載の単離細胞。
【請求項１８】
前記神経学的障害が認知障害である、請求項１７に記載の単離細胞。
【請求項１９】
前記認知障害が、痕跡恐怖条件付けパラダイムにおける障害と関連している、請求項１８に記載の単離細胞。
【請求項２０】
前記認知障害が、空間の学習または記憶における障害と関連している、請求項１９に記載の単離細胞。
【請求項２１】
前記認知障害が、文脈の学習または記憶に関する障害と関連している、請求項１９に記載の単離細胞。
【請求項２２】
前記認知障害が、アルツハイマー病、脳卒中、脳に対する外傷性損傷、疾患または損傷に起因する発作、学習障害および学習困難、ならびに脳性麻痺からなる群より選択される状態と関連している、請求項１９に記載の単離細胞。
【請求項２３】
前記発作が癲癇によって生じる、請求項２２に記載の単離細胞。
【請求項２４】
天然配列ＥｐｈＡ６ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊と関連している表現型をモジュレートする薬剤を同定する方法であって、
（ａ）天然配列ＥｐｈＡ６ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊をゲノム内に含む非ヒトトランスジェニック動物を提供する工程；
（ｂ）（ａ）の非ヒトトランスジェニック動物の生理学的特性を測定する工程；
（ｃ）（ｂ）の測定された生理学的特性を性別適合野生型動物のものと比較する工程であって、ここで、該野生型動物の生理学的特性と異なる該非ヒトトランスジェニック動物の生理学的特性は、該非ヒトトランスジェニック動物における遺伝子破壊に起因する表現型と同定される、工程；
（ｄ）試験薬剤を（ａ）の非ヒトトランスジェニック動物に投与する工程；および
（ｅ）該試験薬剤が、該非ヒトトランスジェニック動物における遺伝子破壊と関連している該同定された表現型をモジュレートしているか否かを判定する工程
を含む方法。
【請求項２５】
前記遺伝子破壊と関連している表現型が神経学的障害を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記神経学的障害が認知障害である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記認知障害が、痕跡恐怖条件付けパラダイムにおける障害と関連している、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記認知障害が、空間の学習または記憶における障害と関連している、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記認知障害が、文脈の学習または記憶に関する障害と関連している、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記認知障害が、アルツハイマー病、脳卒中、脳に対する外傷性損傷、疾患または損傷に起因する発作、学習障害および学習困難、ならびに脳性麻痺からなる群より選択される状態と関連している、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記発作が癲癇によって生じる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記天然配列ＥｐｈＡ６ポリペプチドがマウスＥｐｈＡ６である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３３】
前記天然配列ＥｐｈＡ６ポリペプチドがヒトＥｐｈＡ６である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３４】
前記天然配列ＥｐｈＡ６ポリペプチドが、マウスＥｐｈＡ６ポリペプチドＱ６２４１３  ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｑ６２４１３  ＮＩＤ：ハツカネズミ（マウス）ＥＰＨＲＩＮ  ＴＹＰＥ−Ａ  ＲＥＣＥＰＴＯＲ  ６  ＰＲＥＣＵＲＳＯＲ（ＥＣ  ２．７．１．１１２）（ＴＹＲＯＳＩＮＥ−ＰＲＯＴＥＩＮ  ＫＩＮＡＳＥ  ＲＥＣＥＰＴＯＲ  ＥＨＫ−２）（ＥＰＨ  ＨＯＭＯＬＯＧＹ  ＫＩＮＡＳＥ−２）またはヒトＥｐｈＡ６  ポリペプチドＸＰ＿１１４９７３  ＰＲＥＤＩＣＴＥＤ：受容体型チロシンキナーゼに類似［ホモサピエンス］である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３５】
前記天然配列ＥｐｈＡ６ポリペプチドが、配列番号１のヒトＰＲＯ３５４４４ポリペプチドである、請求項２４に記載の方法。
【請求項３６】
請求項２４に記載の方法によって同定される薬剤。
【請求項３７】
ＥｐｈＡ６ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストである、請求項３６に記載の薬剤。
【請求項３８】
前記アゴニストが抗ＥｐｈＡ６抗体である、請求項３７に記載の薬剤。
【請求項３９】
治療用薬剤である、請求項３６に記載の薬剤。
【請求項４０】
ＥｐｈＡ６ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊と関連している状態に影響を及ぼす能力を有する治療用薬剤を評価する方法であって、
（ａ）ＥｐｈＡ６ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊をゲノム内に含む非ヒトトランスジェニック動物を提供する工程；
（ｂ）（ａ）の非ヒトトランスジェニック動物の生理学的特性を測定する工程；
（ｃ）（ｂ）の測定された生理学的特性を性別適合野生型動物のものと比較する工程であって、ここで、該野生型動物の生理学的特性と異なる該非ヒトトランスジェニック動物の生理学的特性は、該非ヒトトランスジェニック動物における遺伝子破壊に起因する状態と同定される、工程；
（ｄ）試験薬剤を（ａ）の非ヒトトランスジェニック動物に投与する工程；および
（ｅ）該非ヒトトランスジェニック動物における遺伝子破壊と関連している該同定された状態に対する該試験薬剤の効果を評価する工程
を含む方法。
【請求項４１】
前記状態が神経学的障害である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記神経学的障害が認知（ｃｏｎｇｎｉｔｉｖｅ）障害である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記認知障害が、痕跡恐怖条件付けパラダイムにおける障害と関連している、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記認知障害が、空間の学習または記憶における障害と関連している、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記認知障害が、文脈の学習または記憶に関する障害と関連している、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
前記認知障害が、アルツハイマー病、脳卒中、脳に対する外傷性損傷、疾患または損傷に起因する発作、学習障害および学習困難、ならびに脳性麻痺からなる群より選択される状態と関連している、請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
前記発作が癲癇によって生じる、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
請求項４０に記載の方法によって同定される治療用薬剤。
【請求項４９】
ＥｐｈＡ６ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストである、請求項４８に記載の治療用薬剤。
【請求項５０】
前記アゴニストが抗ＥｐｈＡ６抗体である、請求項４９に記載の治療用薬剤。
【請求項５１】
請求項４８に記載の治療用薬剤を含む医薬組成物。
【請求項５２】
ＥｐｈＡ６ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊と関連している神経学的障害を処置または予防または改善する方法であって、かかる処置を必要とする、既に該障害を有しているかもしれない被験体、または該障害を有する傾向を有し得る被験体、または該障害が予防されるべきであり得る被験体に、治療有効量の請求項４９に記載の治療用薬剤またはそのアゴニストを投与し、それにより該障害を有効に処置または予防または改善することを含む方法。
【請求項５３】
前記神経学的障害が認知障害である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記認知障害が、痕跡恐怖条件付けパラダイムにおける障害と関連している、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記認知障害が、空間の学習または記憶における障害と関連している、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記認知障害が、文脈の学習または記憶に関する障害と関連している、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
前記認知障害が、アルツハイマー病、脳卒中、脳に対する外傷性損傷、疾患または損傷に起因する発作、学習障害および学習困難、ならびに脳性麻痺からなる群より選択される状態と関連している、請求項５３に記載の方法。
【請求項５８】
前記発作が癲癇によって生じる、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
空間の学習または記憶の欠陥を診断する方法であって、被験体由来の試料を提供する工程であって、該試料はそのヒトの海馬由来のＥｐｈＡ６遺伝子産物を含む、工程；および該試料中のＥｐｈＡ６遺伝子産物の発現レベルを測定する工程を含み、該試料中の発現レベルが、正常なヒトの海馬由来のＥｐｈＡ６遺伝子産物を含む試料のレベルより低い場合、該ヒトが空間の学習または記憶に欠陥を有することを示す、方法。
【請求項６０】
前記ＥｐｈＡ６遺伝子産物がＥｐｈＡ６  ｍＲＮＡである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記ＥｐｈＡ６遺伝子産物がＥｐｈＡ６ポリペプチドである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
文脈の学習または記憶の欠陥を診断する方法であって、被験体由来の試料を提供する工程であって、該試料はそのヒトの海馬由来のＥｐｈＡ６遺伝子産物を含む、工程；および該試料中のＥｐｈＡ６遺伝子産物の発現レベルを測定する工程を含み、該試料中の発現レベルが、正常なヒトの海馬由来のＥｐｈＡ６遺伝子産物を含む試料のレベルより低い場合、該ヒトが文脈の学習または記憶に欠陥を有することを示す、方法。
【請求項６３】
前記ＥｐｈＡ６遺伝子産物がＥｐｈＡ６  ｍＲＮＡである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記ＥｐｈＡ６遺伝子産物がＥｐｈＡ６ポリペプチドである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
哺乳動物被験体における神経学的障害の処置のための方法であって、該哺乳動物被験体に有効量のＥｐｈＡ６−イムノアドヘシンを投与することを含む、方法。
【請求項６６】
前記神経学的障害が認知障害である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記認知障害が、痕跡恐怖条件付けパラダイムにおける障害と関連している、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記認知障害が、空間の学習または記憶における障害と関連している、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
前記認知障害が、文脈の学習または記憶に関する障害と関連している、請求項６６に記載の方法。
【請求項７０】
前記認知障害が、アルツハイマー病、脳卒中、脳に対する外傷性損傷、疾患または損傷に起因する発作、学習障害および学習困難、ならびに脳性麻痺からなる群より選択される状態と関連している、請求項６６に記載の方法。
【請求項７１】
前記発作が癲癇によって生じる、請求項７０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、エフリン受容体Ａ６（ＥｐｈＡ６）遺伝子の破壊と関連している記憶と学習の障害、ならびにＥｐｈＡ６受容体およびそのアゴニストのさまざまな使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
エフリン受容体（Ｅｐｈ）は、その活性が、エフリンとして知られるリガンド相互作用とのモジュレートされ得る受容体型チロシンキナーゼである。Ｅｐｈ受容体ファミリーは、さらに、２つのクラス、ＥｐｈＡおよびＥｐｈＢに分けられる（例えば，非特許文献１を参照のこと）。ＥｐｈＡ受容体は、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー型タンパク質であるエフリン−Ａリガンドと相互作用する。Ｅｐｈ受容体は、神経伸張経路の発達に関与していることが報告されている（非特許文献１）。ＥｐｈＡ６は、鋤鼻神経の伸張に特に重要である可能性がある（非特許文献２）。
【０００３】
ＥｐｈＡ６は、他のＥｐｈ受容体と比べて、脳内で強く発現されることが報告されている（非特許文献３）。特に、海馬、皮質の種々の領域、および網膜において高発現である（非特許文献４；非特許文献５）。いくつかのＥｐｈ受容体およびエフリンの機能が調査されており、いくつかの研究は、生体脳全体および海馬におけるその活性、特に、学習と記憶過程に着目したものである（非特許文献６；非特許文献７；非特許文献１に概説）。特に、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、ＥｐｈＡ４およびＥｐｈＡ５は、学習と記憶に関与する過程および受容体に対して効果を有することが報告されている。ＥｐｈＡ６の遺伝子機能阻害に起因する表現型は報告されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ＆  Ｓｏｒｉａｎｏ，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｒｅｖ．（２００５）４９（２）：２１１−２６
【非特許文献２】Ｋｎｏｌｌら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（２００１）１２８（６）：８９５−９０６
【非特許文献３】Ｈａｆｎｅｒら，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．（２００４）５０（３）：４９０−９
【非特許文献４】Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（１９９３）８，３２７７−３２８８
【非特許文献５】Ｌｅｅら，ＤＮＡ  ＆  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９６）１５：８１７−８２５
【非特許文献６】Ｍｕｒａｉ  ＆  Ｐａｓｑｕａｌｅ，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．（２００３）１１６：２８２３−３２
【非特許文献７】Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  ＆  Ｐａｓｑｕａｌｅ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．（２００４）１４（３）：２８８−９６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、少なくとも一部は、ＥｐｈＡ６の遺伝子機能を阻害したマウスの行動の調査に基づく。
【０００６】
一態様において、本発明は、天然配列Ｅｐｈ受容体Ａ６（ＥｐｈＡ６）ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊と関連している表現型を同定する方法であって、
（ａ）天然配列ＥｐｈＡ６ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊をゲノム内に含む非ヒトトランスジェニック動物を提供する工程；
（ｂ）該非ヒトトランスジェニック動物の生理学的特性を測定する工程；および
（ｃ）測定された生理学的特性を、性別適合野生型動物のものと比較する工程であって、ここで、該野生型動物の生理学的特性と異なる該非ヒトトランスジェニック動物の生理学的特性は、該非ヒトトランスジェニック動物における遺伝子破壊に起因する表現型と同定される、工程
を含む方法に関する。
【０００７】
別の態様において、本発明は、ＥｐｈＡ６ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊をゲノム内に含む非ヒトトランスジェニック動物由来の単離細胞に関する。
【０００８】
また別の態様において、本発明は、天然配列ＥｐｈＡ６ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊と関連している表現型をモジュレートする薬剤を同定する方法であって、
（ａ）天然配列ＥｐｈＡ６ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊をゲノム内に含む非ヒトトランスジェニック動物を提供する工程；
（ｂ）（ａ）の非ヒトトランスジェニック動物の生理学的特性を測定する工程；
（ｃ）（ｂ）の測定された生理学的特性を性別適合野生型動物のものと比較する工程、ここで、該野生型動物の生理学的特性と異なる該非ヒトトランスジェニック動物の生理学的特性は、該非ヒトトランスジェニック動物における遺伝子破壊に起因する表現型と同定される；
（ｄ）試験薬剤を（ａ）の非ヒトトランスジェニック動物に投与する工程；および
（ｅ）該試験薬剤が、該非ヒトトランスジェニック動物における遺伝子破壊と関連していると同定された表現型をモジュレートしているか否かを判定する工程
を含む方法に関する。
【０００９】
さらなる態様において、本発明は、前述の方法によって同定される薬剤に関する。
【００１０】
なおさらなる態様において、本発明は、ＥｐｈＡ６ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊と関連している状態に影響を及ぼす能力を有する治療用薬剤を評価する方法であって、
（ａ）ＥｐｈＡ６ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊をゲノム内に含む非ヒトトランスジェニック動物を提供する工程；
（ｂ）（ａ）の非ヒトトランスジェニック動物の生理学的特性を測定する工程；
（ｃ）（ｂ）の測定された生理学的特性を性別適合野生型動物のものと比較する工程、ここで、該野生型動物の生理学的特性と異なる該非ヒトトランスジェニック動物の生理学的特性は、該非ヒトトランスジェニック動物における遺伝子破壊に起因する状態と同定される；
（ｄ）試験薬剤を（ａ）の非ヒトトランスジェニック動物に投与する工程；および
（ｅ）該非ヒトトランスジェニック動物における遺伝子破壊と関連していると同定された状態に対する該試験薬剤の効果を評価する工程
を含む方法に関する。
【００１１】
本発明は、さらに、前述の方法によって同定される治療用薬剤、およびかかる治療用薬剤を含む医薬組成物に関する。
【００１２】
別の態様において、本発明は、ＥｐｈＡ６ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊と関連している神経学的障害処置または予防または改善する方法であって、かかる処置を必要とする既に該障害を有しているかもしれない被験体、または該障害を有する傾向を有し得る被験体、または該障害が予防されるべきであり得る被験体に、治療有効量の上記の治療用薬剤またはそのアゴニストを投与し、それにより前記障害を有効に処置または予防または改善することを含む方法に関する。
【００１３】
また、本発明は、空間の学習または記憶の欠陥を診断する方法であって、被験体の海馬由来のＥｐｈＡ６遺伝子産物を含む試料を提供する工程；および該試料中のＥｐｈＡ６遺伝子産物の発現レベルを測定する工程を含み、該試料中の発現レベルが、正常なヒトの海馬由来のＥｐｈＡ６遺伝子産物を含む試料のレベルより低い場合、該被験体が空間の学習または記憶に障害があることを示す方法に関する。
【００１４】
別の態様において、本発明は、文脈の学習または記憶の障害を診断する方法であって、被験体の海馬由来のＥｐｈＡ６遺伝子産物を含む試料を提供する工程；および該試料中のＥｐｈＡ６遺伝子産物の発現レベルを測定する工程を含み、該試料中の発現レベルが、正常なヒトの海馬由来のＥｐｈＡ６遺伝子産物を含む試料のレベルより低い場合、該被験体が文脈の学習または記憶に障害があることを示す方法に関する。
【００１５】
また別の態様において、本発明は、哺乳動物被験体における神経学的障害の処置のための方法であって、前記哺乳動物被験体に有効量のＥｐｈＡ６−イムノアドヘシンを投与することを含む方法に関する。
【００１６】
すべての態様において、神経学的障害は、好ましくは認知障害、例えば、痕跡恐怖条件付けパラダイム（ｔｒａｃｅ  ｆｅａｒ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｐａｒａｄｉｇｍ）における障害と関連している障害であり得る。
【００１７】
認知障害に包含される具体例は、空間および／または文脈の学習および／または記憶における障害と関連している障害である。具体的な認知障害としては、例えば、アルツハイマー病、脳卒中、脳に対する外傷性損傷、疾患または損傷に起因する発作、学習障害（ｌｅａｒｎｉｎｇ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）および学習困難（ｌｅａｒｎｉｎｇ  ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ）、ならびに脳性麻痺が挙げられる。
【００１８】
天然配列ＥｐｈＡ６ポリペプチドは、例えばマウスまたはヒトＥｐｈＡ６、例えば、マウスＥｐｈＡ６ポリペプチドＱ６２４１３  ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｑ６２４１３  ＮＩＤ：ハツカネズミ（マウス）ＥＰＨＲＩＮ  ＴＹＰＥ−Ａ  ＲＥＣＥＰＴＯＲ  ６  ＰＲＥＣＵＲＳＯＲ（ＥＣ  ２．７．１．１１２）（ＴＹＲＯＳＩＮＥ−ＰＲＯＴＥＩＮ  ＫＩＮＡＳＥ  ＲＥＣＥＰＴＯＲ  ＥＨＫ−２）（ＥＰＨ  ＨＯＭＯＬＯＧＹ  ＫＩＮＡＳＥ−２）またはヒトＥｐｈＡ６  ポリペプチドＸＰ＿１１４９７３  ＰＲＥＤＩＣＴＥＤ：受容体型チロシンキナーゼに類似［ホモサピエンス］であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、エキソン１を欠失させてＥｐｈａ６ヌル（ｎｕｌｌ）動物を作出するための相同組換えの試験ストラテジーの図である（１Ａ）。Ｓｐｅ１で制限消化し、５’外部プローブとハイブリダイズさせたゲノムＤＮＡのサザンハイブリダイゼーションにより、７．５ｋｂに変異型バンドおよび９．８ｋｂにＷＴバンドを有する被標的化ＥＳ細胞クローンを同定（１Ｂ）。ヌル動物は、ＷＴ（Ｗ  １０２ｂｐ）、ホモ接合型（Ｍ  ２５１ｂｐ）、およびヘテロ接合型（Ｗ＋Ｍ）が同定される遺伝子特異的プライマーを用いて、テイルＤＮＡのＰＣＲ遺伝子型判定によって確認した（１Ｃ）。
【図２】図２（Ａ）は、痕跡条件付けアッセイにおいて得られた各音の終了後の１０秒間の痕跡間隔の音に応答したすくみの図である。図２（Ｂ）は、文脈試験（ｃｏｎｔｅｘｔ  ｔｅｓｔ）中のすくみ行動の図である。＊−ｐ＜０．０５（対応なしｔ検定）。
【図３】図３（Ａ）は、聴覚条件（ｃｕｅ）試験中の新たな文脈におけるＣＳ前のすくみの図である。図３（Ｂ）は、ＣＳ後のすくみの図である。図３（Ｃ）は、音の後（ＣＳ後）のすくみと音の前（ＣＳ前）のすくみの差の図である。＊−ｐ＜０．０５（対応なしｔ検定）。
【図４】図４（Ａ）は、ＭＷＭにおける隠れプラットフォーム訓練中の逃避潜伏時間（ｅｓｃａｐｅ  ｌａｔｅｎｃｙ）の図である。図４（Ｂ）は、ＭＷＭにおける隠れプラットフォーム訓練中の累積的な接近の図である。
【図５】図５（Ａ）は、精査試行２中の各四分円（ｑｕａｄｒａｎｔ）における消費時間の割合の図である。図５（Ｂ）は、精査試行２中のプラットフォームまでの平均接近距離の図である。＊−ｐ＜０．０５（対応なしｔ検定）。
【図６−１】図６は、天然配列ＰＲＯ３５４４４  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１）を示し、配列番号１は、本明細書において「ＤＮＡ２２２６５３」（ＵＮＱ６１１４）と表示するクローンである。
【図６−２】図６は、天然配列ＰＲＯ３５４４４  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１）を示し、配列番号１は、本明細書において「ＤＮＡ２２２６５３」（ＵＮＱ６１１４）と表示するクローンである。
【図７】図７は、図６に示す配列番号１のコード配列から誘導されるアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
詳細な説明
定義
この出願書類全体を通して用いる用語は、当業者にとって通常の意味を有すると解釈されたい。しかしながら、本出願人らは、以下の用語が記載のような具体的な定義を有すると解釈されることを所望する。
【００２１】
用語「ＰＲＯポリペプチド」および「ＰＲＯ」は、本明細書で用いる場合、およびすぐ後に番号指定が続く場合、種々のポリペプチドをいい、完全な指定（すなわち、ＰＲＯ／番号）は、本明細書に記載の具体的なポリペプチド配列をいう。用語「ＰＲＯ／番号ポリペプチド」および「ＰＲＯ／番号」は、天然配列のポリペプチドおよびポリペプチドバリアント（これは、本明細書においてさらに定義する）を包含し、用語「番号」は、本明細書で使用している実際の番号指定を示す。
【００２２】
用語「Ｅｐｈ受容体Ａ６」、「ＥｐｈＡ６」、「ＵＮＱ６１１４」および「ＰＲＯ３５４４４」は、本明細書において互換的に用い、任意の哺乳動物種の天然配列ＥｐｈＡ６ポリペプチドおよびそのバリアント（これは、本明細書においてさらに定義する）をいう。「Ｅｐｈ受容体Ａ６」、「ＥｐｈＡ６」、「ＵＮＱ６１１４」および「ＰＲＯ３５４４４」ポリペプチドは、さまざまな供給源（ヒト組織型などもしくは別の供給源）から単離されたものであってもよく、組換えおよび／または合成法によって調製されたものであってもよい。上記のように、記載の指定は、供給源または調製様式にかかわらず、それぞれの天然配列分子およびそのバリアントをいうために用いる。
【００２３】
用語「天然配列Ｅｐｈ受容体Ａ６」、「天然配列ＥｐｈＡ６」、「天然配列ＵＮＱ６１１４」および「天然配列ＰＲＯ３５４４４」は、互換的に用い、天然由来の対応ＥｐｈＡ６ポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含する。かかる天然ポリペプチドは、自然界から単離されたものであってもよく、組換えもしくは合成手段によって作製されたものであってもよい。用語「天然配列ＥｐｈＡ６」およびその同義語は、具体的には、特定のＥｐｈＡ６ポリペプチド（例えば、細胞外ドメイン配列）の天然に存在する切断型または分泌型形態、天然に存在するバリアント形態（例えば、あるいはまた、スプライシング形態）および該ポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子バリアントを包含する。添付の図面に示す完全長アミノ酸配列を含む成熟または完全長天然配列ポリペプチドである本明細書に開示したポリペプチド。天然配列ヒトＥｐｈＡ６（ＰＲＯ３５４４４）ポリペプチドの開始コドンおよび終止コドンを、図６（配列番号２）に太字フォントで示し、下線を施す。しかしながら、添付の図面に開示したＥｐｈＡ６ポリペプチドは、メチオニン残基で始まるように示し、本明細書において図面の１位のアミノ酸と指定しているが、図面の１位のアミノ酸の上流または下流いずれかに存在する他のメチオニン残基がＥｐｈＡ６ポリペプチドの出発アミノ酸残基として使用され得ることが想定され得、可能である。用語「天然配列ＥｐｈＡ６」およびその同義語は、具体的には、ＥｐｈＡ６ポリペプチドの以下のヒトおよびマウス配列、またはその天然に存在するバリアント：ＮＭ＿００７９３８  ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＮＭ＿００７９３８  ＮＩＤ：ｇｉ  ６６７９６６０  ｒｅｆ  ＮＭ＿００７９３８．１  ハツカネズミＥｐｈ受容体Ａ６（Ｅｐｈａ６）；タンパク質参照：Ｑ６２４１３  ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｑ６２４１３  ＮＩＤ：ハツカネズミ（マウス）．ＥＰＨＲＩＮ  ＴＹＰＥ−Ａ  ＲＥＣＥＰＴＯＲ  ６  ＰＲＥＣＵＲＳＯＲ（ＥＣ  ２．７．１．１１２）（ＴＹＲＯＳＩＮＥ−ＰＲＯＴＥＩＮ  ＫＩＮＡＳＥ  ＲＥＣＥＰＴＯＲ  ＥＨＫ−２）（ＥＰＨ  ＨＯＭＯＬＯＧＹ  ＫＩＮＡＳＥ−２）；ヒト遺伝子配列参照：ＸＭ＿１１４９７３  ＰＲＥＤＩＣＴＥＤ：ホモサピエンス  ＥｐｈＡ６（ＥＰＨＡ６）；ヒトタンパク質配列は参照：ＸＰ＿１１４９７３  ＰＲＥＤＩＣＴＥＤに相当する：受容体型チロシンキナーゼに類似［ホモサピエンス］、ならびに他の哺乳動物種のそのオルソログを包含する。
【００２４】
ＥｐｈＡ６ポリペプチドの「細胞外ドメイン」または「ＥＣＤ」は、本質的に膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインのないＥｐｈＡ６ポリペプチドの形態をいう。通常、ＥｐｈＡ６ポリペプチドＥＣＤは、１％未満のかかる膜貫通および／または細胞質ドメインを有し、好ましくは０．５％未満のかかるドメインを有する。本発明のＥｐｈＡ６ポリペプチドに関して同定される任意の膜貫通ドメインは、そのような型の疎水性のドメインの同定のために当該技術分野で常套的に使用されている基準に従って同定されることは理解されよう。膜貫通ドメインの正確な境界部は、種々であり得るが、たいていは、本明細書において最初に同定されたドメインのいずれかの末端側の約５アミノ酸以下までである。したがって、任意選択で、ＥｐｈＡ６ポリペプチドの細胞外ドメインは、本実施例または本明細書において同定された膜貫通ドメイン／細胞外ドメイン境界部のいずれかの末端側の約５以下のアミノ酸を含むものであり得、かかるポリペプチド（関連シグナルペプチドを有するもの、または有しないもの）およびこれをコードする核酸も本発明によって想定される。
【００２５】
本明細書に開示した種々のＥｐｈＡ６ポリペプチドの「シグナルペプチド」のおよその位置を、本明細書および／または添付の図面に示す。しかしながら、シグナルペプチドのＣ末端境界部は、種々であり得るが、たいていは、本明細書において最初に同定されたシグナルペプチドＣ末端境界部のいずれかの末端側の約５アミノ酸以下までであり、シグナルペプチドのＣ末端境界部は、そのような型のアミノ酸配列エレメントの同定のために当該技術分野で常套的に使用されている基準に従って同定され得ることに留意されたい（例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎら，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：１−６（１９９７）およびｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１４：４６８３−４６９０（１９８６））。さらに、場合によっては、分泌されたポリペプチドからのシグナル配列の切断は完全に均一ではなく、１種類より多くの分泌種がもたされることも認識されよう。このような成熟ポリペプチドは、シグナルペプチドが、本明細書において同定されたシグナルペプチドのＣ末端境界部のいずれかの末端側の約５アミノ酸以下以内で切断され、該ポリヌクレオチドがこれをコードしている場合、本発明によって想定される。
【００２６】
「ＥｐｈＡ６バリアント」およびその同義語は、本明細書において規定するＥｐｈＡ６ポリペプチド、好ましくは活性なＥｐｈＡ６ポリペプチドであって、本明細書に開示した完全長天然配列ＥｐｈＡ６ポリペプチド配列と少なくとも約８０アミノ酸配列同一性％を有するもの、シグナルペプチドのない本明細書に開示したＥｐｈＡ６ポリペプチド配列、本明細書に開示したＥｐｈＡ６ポリペプチドの細胞外ドメイン（シグナルペプチドを有するもの、もしくは有しないもの）、または本明細書に開示した完全長ＥｐｈＡ６ポリペプチド配列の任意の他の断片（完全長ＥｐｈＡ６ポリペプチドの完全コード配列の一部分だけである核酸にコードされたものなど）を意味する。ＥｐｈＡ６ポリペプチドバリアントとしては、例えば、１つ以上のアミノ酸残基が該完全長天然アミノ酸配列のＮ-またはＣ末端において付加または欠失されたＥｐｈＡ６ポリペプチドが挙げられる。通常、ＥｐｈＡ６ポリペプチドバリアントは、本明細書に開示した完全長天然配列ＥｐｈＡ６ポリペプチド配列、シグナルペプチドのない本明細書に開示した天然配列ＥｐｈＡ６ポリペプチド配列、本明細書に開示した天然配列ＥｐｈＡ６ポリペプチドの細胞外ドメイン（シグナルペプチドを有するもの、もしくは有しないもの）、または完全長天然配列ＥｐｈＡ６ポリペプチド配列の任意の他の具体的に規定する断片と、少なくとも約８０アミノ酸配列同一性％を有する（ｗｉｌｌ  ｈａｖｅ  ｏｒ  ｗｉｌｌ  ｈａｖｅ）もの、あるいはまた少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９アミノ酸配列同一性％を有するものである。通常、ＥｐｈＡ６バリアントポリペプチドは、少なくとも約１０アミノ酸長である（ａｒｅ  ｏｒ  ａｒｅ）か、あるいはまた少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００アミノ酸長、またはそれ以上である。任意選択で、ＥｐｈＡ６バリアントポリペプチドは、天然ＥｐｈＡ６ポリペプチド配列と比較して１つ以下の同類アミノ酸置換を有するものであるか、あるいはまた、天然ＥｐｈＡ６ポリペプチド配列と比較して２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以下の同類アミノ酸置換を有するものである。好ましい実施形態において、ＥｐｈＡ６ポリペプチドバリアントは、天然配列ＥｐｈＡ６ポリペプチドの定性的生物学的活性を保持している。
【００２７】
「生物学的活性」は、ＥｐｈＡ６ポリペプチドおよびそのアゴニストとの関連において、学習および／または記憶過程、特に、空間および／または文脈の学習および／または記憶過程におけるかかる分子の関与をいう。
【００２８】
ＥｐｈＡ６ポリペプチドに関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列アラインメントおよびギャップ導入後、特定のＥｐｈＡ６ポリペプチド配列内のアミノ酸残基と同一である候補配列内のアミノ酸残基の割合と定義し、必要であれば最大配列同一性パーセントを得、同類置換はいずれも配列同一性とみなさない。アミノ酸配列同一性パーセントを求める目的のためのアラインメントは、当該技術分野の技能の範囲である種々の様式で、例えば、公共的に入手可能なコンピュータソフトウェア（ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなど）を用いて行なわれ得る。当業者は、アラインメントを測定するための適切なパラメータ、例えば、比較対象の配列の全長に関して最大アラインメントを得るために必要とされる任意のアルゴリズムを決定することができよう。しかしながら、本明細書での解釈上、アミノ酸配列同一性％の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を用いて得られ、その場合のＡＬＩＧＮ−２プログラムの全ソースコードを、以下の表１に示す。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．著作のものであり、以下の表１に示すソースコードは、ユーザー資料とともに米国著作権局（Ｕ．Ｓ．Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ  Ｏｆｆｉｃｅ）（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，２０５５９）にファイルされており、著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから公共的に入手可能なものであるか、または以下の表１に示したソースコードからコンパイルされ得るものである。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム、好ましくはｄｉｇｉｔａｌ  ＵＮＩＸ（登録商標）  Ｖ４．０Ｄにおける使用のためにコンパイルされたものであるのがよい。配列比較パラメータはすべてＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され、変更されない。
【００２９】
ＡＬＩＧＮ−２がアミノ酸配列比較のために使用される状況では、所与のアミノ酸配列Ｂに対する所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％（あるいはまた、これは、所与のアミノ酸配列Ｂに対して一定のアミノ酸配列同一性％を有する、または該同一性％を構成する所与のアミノ酸配列Ａと表現され得る）は、以下のようにして算出される：
１００×Ｘ／Ｙ分率
式中、Ｘは、ＡとＢのアラインメントプログラムである配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２によって同一マッチングとスコアリングされたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂのアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡのアミノ酸配列同一性％は、Ａに対するＢのアミノ酸配列同一性％と等しくないことは認識されよう。この方法を用いたアミノ酸配列同一性％の計算の一例として、表２と３に、「ＰＲＯ」と表示したアミノ酸配列に対する「比較タンパク質」と表示したアミノ酸配列のアミノ酸配列同一性％をどのようにして計算するかを示す。ここで、「ＰＲＯ」は、対象の仮想ＰＲＯポリペプチドのアミノ酸配列を表し、「比較タンパク質」は、対象の「ＰＲＯ」ポリペプチドと比較されるポリペプチドのアミノ酸配列を表し、「Ｘ」、「Ｙ」および「Ｚ」は各々、異なる仮想アミノ酸残基を表す。特に記載のない限り、本明細書で用いるアミノ酸配列同一性％の値はすべて、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを用いて、直前の段落に記載のようにして得られるものである。
【００３０】
「ＥｐｈＡ６バリアント核酸配列」およびその同義語は、本明細書において規定するＥｐｈＡ６ポリペプチド、好ましくは活性なＥｐｈＡ６ポリペプチドをコードする核酸分子であって、本明細書に開示した完全長天然配列ＥｐｈＡ６ポリペプチド配列、シグナルペプチドのない本明細書に開示した完全長天然配列ＥｐｈＡ６ポリペプチド配列、本明細書に開示したＥｐｈＡ６ポリペプチドの細胞外ドメイン（シグナルペプチドを有するもの、もしくは有しないもの）、または本明細書に開示した完全長ＥｐｈＡ６ポリペプチド配列の任意の他の断片（完全長ＥｐｈＡ６ポリペプチドの完全コード配列の一部分だけである核酸にコードされたものなど）をコードする核（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）酸配列と少なくとも約８０核酸配列同一性％を有する核酸分子を意味する。通常、ＥｐｈＡ６バリアントポリヌクレオチドは、少なくとも約８０核酸配列同一性％を有するもの、あるいはまた、本明細書に開示した完全長天然配列ＥｐｈＡ６ポリペプチド配列、シグナルペプチドのない本明細書に開示した完全長天然配列ＥｐｈＡ６ポリペプチド配列、本明細書に開示したＥｐｈＡ６ポリペプチドの細胞外ドメイン（シグナル配列を有するもの、もしくは有しないもの）、または本明細書に開示した完全長ＥｐｈＡ６ポリペプチド配列の任意の他の断片をコードする核酸配列と、少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９核酸配列同一性％を有するものである。バリアントは天然ヌクレオチド配列を包含しない。
【００３１】
通常、ＥｐｈＡ６バリアントポリヌクレオチドは、少なくとも約５ヌクレオチド長、あるいはまた少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０または１０００ヌクレオチド長であり、ここで、この状況における用語「約」は、参照ヌクレオチド配列の長さ±該参照ヌクレオチド配列の長さの１０％を意味する。
【００３２】
本明細書において同定されたＥｐｈＡ６コード核酸配列に関する「核酸配列同一性パーセント（％）」は、配列アラインメントおよびギャップ導入後、対象のＥｐｈＡ６核酸配列内のヌクレオチドと同一である候補配列内のヌクレオチドの割合と定義し、必要であれば、最大配列同一性パーセントを得る。核酸配列同一性パーセントを求める目的のためのアラインメントは、当該技術分野の技能の範囲である種々の様式で、例えば、公共的に入手可能なコンピュータソフトウェア（ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ  ｏｒ  Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなど）を用いて行なわれ得る。しかしながら、本明細書での解釈上、核酸配列同一性％の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を用いて得られ、その場合のＡＬＩＧＮ−２プログラムの全ソースコードを、以下の表１に示す。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．著作のものであり、以下の表１に示すソースコードは、ユーザー資料とともに米国著作権局（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，２０５５９）にファイルされており、著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから公共的に入手可能なものであるか、または以下の表１に示したソースコードからコンパイルされ得るものである。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム、好ましくはｄｉｇｉｔａｌ  ＵＮＩＸ（登録商標）  Ｖ４．０Ｄにおける使用のためにコンパイルされたものであるのがよい。配列比較パラメータはすべてＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され、変更されない。
【００３３】
ＡＬＩＧＮ−２が核酸配列比較のために使用される状況では、所与の核酸配列Ｄに対する所与の核酸配列Ｃの核酸配列同一性％（あるいはまた、これは、所与の核酸配列Ｄに対して一定の核酸配列同一性％を有する、または該同一性％を構成する所与の核酸配列Ｃと表現され得る）は、以下のようにして算出される：
１００×Ｗ／Ｚ分率
式中、Ｗは、ＣとＤのアラインメントプログラムである配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２によって同一マッチングとスコアリングされたヌクレオチドの数であり、Ｚは、Ｄのヌクレオチドの総数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと等しくない場合、Ｄに対するＣの核酸配列同一性％は、Ｃに対するＤの核酸配列同一性％と等しくないことは認識されよう。核酸配列同一性％の計算の一例として、表４と５に、「ＰＲＯ−ＤＮＡ」と表示した核酸配列に対する「比較ＤＮＡ」と表示した核酸配列の核酸配列同一性％をどのようにして計算するかを示す。ここで、「ＰＲＯ−ＤＮＡ」は対象の仮想ＰＲＯコード核酸配列を表し、「比較ＤＮＡ」は、対象の「ＰＲＯ−ＤＮＡ」核酸分子と比較される核酸分子のヌクレオチド配列を表し、「Ｎ」、「Ｌ」および「Ｖ」は各々、異なる仮想ヌクレオチドを表す。特に記載のない限り、本明細書で用いる核酸配列同一性％の値はすべて、ＡＬＩＧＮ−２  コンピュータプログラムを用いて、直前の段落に記載のようにして得られるものである。
【００３４】
本発明はまた、ＥｐｈＡ６ポリペプチドをコードする核酸分子であって、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で、本明細書に開示した完全長ＥｐｈＡ６ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にハイブリダイズできるＥｐｈＡ６バリアントポリヌクレオチドを提供する。ＥｐｈＡ６バリアントポリペプチドは、バリアントポリヌクレオチドにコードされたものであってもよい。
【００３５】
用語「完全長コード領域」は、ＥｐｈＡ６ポリペプチドをコードする核酸に関して用いる場合、本発明の完全長ＥｐｈＡ６ポリペプチドをコードするヌクレオチドの配列（これは、多くの場合、添付の図面において開始コドンと終止コドン（両端を含む）の間で示されるもの）をいう。用語「完全長コード領域」は、ＡＴＣＣ寄託核酸に関して用いる場合、ＡＴＣＣに寄託されたベクター内に挿入されたｃＤＮＡのＥｐｈＡ６ポリペプチドコード部分（多くの場合、添付の図面において開始コドンと終止コドン（両端を含む）の間で示されるもの）をいう。
【００３６】
「単離（された）」は、本明細書に開示した種々のポリペプチドを説明するために用いる場合、同定され、その天然環境の成分から分離および／または回収されたものであるポリペプチドを意味する。その天然環境の夾雑成分は、典型的には、該ポリペプチドの診断的または治療的使用を妨害することがあり得る物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質が挙げられ得る。本発明は、該ポリペプチドが（１）スピニングカップ配列決定装置の使用によって少なくとも１５残基のＮ末端もしくは内部アミノ酸配列が得られるのに十分な程度まで、（２）クマシーブルーもしくは好ましくは銀染色を用いて非還元もしくは還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥで均一になるまで精製されることを提供する。単離ポリペプチドは、ＥｐｈＡ６ポリペプチドの天然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイチュでのポリペプチドを包含する。しかしながら、通常、単離ポリペプチドは、少なくとも１回の精製工程によって調製されるものである。
【００３７】
「単離（された）」ＥｐｈＡ６ポリペプチドコード核酸または他のポリペプチドコード核酸は、同定されて、該ポリペプチドコード核酸の天然供給源中では通常会合している少なくとも１種類の夾雑核酸分子から分離された核酸分子である。単離ポリペプチドコード核酸分子は、自然界に見られる形態または状況以外のものである。したがって、単離ポリペプチドコード核酸分子は、天然細胞内に存在する場合の該ポリペプチドコード核酸分子とは識別される。しかしながら、単離ポリペプチドコード核酸分子は、通常、該ポリペプチドを発現する細胞であって、例えば、該核酸分子が天然細胞のものとは異なる染色体上の位置に存在する細胞内に含有されているポリペプチドコード核酸分子を包含する。
【００３８】
用語「制御配列」は、特定の宿主生物体内で、作動可能に連結されているコード配列が発現するのに必要なＤＮＡ配列をいう。原核生物に適した制御配列としては、例えば、プロモーター、任意選択でオペレーター配列、およびリボソーム結合部位が挙げられる。真核生物細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用することが知られている。
【００３９】
核酸は、別の核酸配列と機能的関係で配置されている場合、「作動可能に連結され」ている。例えば、プレ配列または分泌リーダー配列のＤＮＡがポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結されているとは、該ＤＮＡが該ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合であり、プロモーターまたはエンハンサーがコード配列に作動可能に連結されているとは、これらが該配列の転写に影響を及ぼす場合であり、あるいはリボソーム結合部位がコード配列に作動可能に連結されているとは、該部位が、翻訳を促進するように配置されている場合である。一般的に、「作動可能に連結されている」とは、連結されるＤＮＡ配列が隣接していること、および分泌リーダー配列の場合は、隣接し、かつリーディング相（ｐｈａｓｅ）内にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは隣接していなくてもよい。連結は、簡便な制限部位でのライゲーションによって行なわれ得る。かかる部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが慣用的実務に従って使用される。
【００４０】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって容易に決定可能であり、一般的には、プローブ長、洗浄温度、および塩濃度に依存性の
経験的計算値である。一般に、プローブが長いほど、適正なアニーリングのために高い温度が必要とされ、一方、プローブが短いほど、必要とされる温度は低い。ハイブリダイゼーションは、一般的に、変性ＤＮＡが、その融解温度より下の環境で相補鎖が存在する場合に再度アニーリングする能力に依存する。プローブとハイブリダイズ可能な配列間に所望される相同性の程度が高いほど、使用され得る相対温度は高い。その結果、相対温度が高いほど、反応条件がよりストリンジェントな傾向となり、一方、温度が低いほど、ストリンジェンシーが低い傾向となり得ることになる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーのさらなる詳細および説明については、Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，（１９９５）を参照のこと。
【００４１】
本明細書において定義する「ストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー条件」は、（１）洗浄に低イオン強度および高温、例えば、０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを５０℃で使用するもの；（２）ハイブリダイゼーション中、変性剤、例えば、ホルムアミド（例えば、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド）を、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）ならびに７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムとともに４２℃で使用するもの；または（３）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％硫酸デキストランを４２℃で、洗浄は、４２℃で０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）および５０％ホルムアミド、５５℃の後、０．１×ＳＳＣ、ＥＤＴＡ含有、５５℃の高ストリンジェンシー洗浄条件を使用するものによって特定され得る。
【００４２】
「中程度にストリンジェントな条件」は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９に記載のとおりに特定され得、上記のものより低いストリンジェンシーの洗浄溶液とハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度およびＳＤＳ％）の使用が挙げられる。中程度にストリンジェントな条件の一例は、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト液、１０％硫酸デキストラン、および２０ｍｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中、３７℃での一夜インキュベーション後、１×ＳＳＣ中、約３７〜５０℃でのフィルターの洗浄である。当業者には、例えばプローブ長などの要素に適応させる必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度などを調整するかが認識されよう。
【００４３】
用語「エピトープタグ化（された）」は、本明細書で用いる場合、「タグポリペプチド」に融合されたＥｐｈＡ６ポリペプチドを含むキメラポリペプチドをいう。タグポリペプチドは、抗体が作製され得るエピトープを提供するのに十分な残基を有するが、融合される該ポリペプチドの活性を妨害しないように十分短い。また、タグポリペプチドは、かなり特殊であるため、抗体は、実質的に他のエピトープと交差反応しない。好適なタグポリペプチドは、一般的には少なくとも６アミノ酸残基を有し、通常、約８〜５０アミノ酸残基（好ましくは、約１０〜２０アミノ酸残基）を有する。
【００４４】
「活性な」または「活性」は、本発明の解釈上、自然または天然に存在するＥｐｈＡ６ポリペプチドの生物学的および／または免疫学的活性を保持しているＥｐｈＡ６ポリペプチドの形態（１つまたは複数）をいい、ここで、「生物学的」活性は、自然または天然に存在するＥｐｈＡ６ポリペプチドによってもたらされる生物学的機能（阻害性または刺激性のいずれか）であって、自然または天然に存在するＥｐｈＡ６ポリペプチドが有する抗原エピトープに対する抗体の産生を誘導する能力以外のものをいい、「免疫学的」活性は、自然または天然に存在するＥｐｈＡ６ポリペプチドが有する抗原エピトープに対する抗体の産生を誘導する能力をいう。
【００４５】
用語「アンタゴニスト」は、最も広い意味［文法上の制限がない限り］で用い、本明細書に開示した天然配列ＥｐｈＡ６ポリペプチドの生物学的活性を一部もしくは完全にブロック、阻害または中和する任意の分子を包含する。同様に、用語「アゴニスト」は、最も広い意味［文法上の制限がない限り］で用い、本明細書に開示した天然ＥｐｈＡ６ポリペプチドの生物学的活性を模倣する任意の分子を包含する。好適なアゴニストまたはアンタゴニスト分子としては、具体的に、アゴニストまたはアンタゴニスト抗体または抗体断片、天然配列ＥｐｈＡ６ポリペプチド、ペプチドの断片またはアミノ酸配列バリアント、アンチセンスオリゴヌクレオチド、有機小分子などが挙げられる。ＥｐｈＡ６ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストの同定するための方法は、ＥｐｈＡ６ポリペプチドを候補アゴニストまたはアンタゴニスト分子と接触させること、および通常ＥｐｈＡ６ポリペプチドと関連している１つ以上の生物学的活性における検出可能な変化を測定することを含むものであり得る。
【００４６】
「処置すること」または「処置」または「緩和」は、治療的処置と予防的または抑制的手段の両方をいい、その目的は、対象の病的状態または障害を抑制または遅滞（減弱）させることである。処置を必要とする被験体は、既に該障害を有する被験体、または該障害を有する傾向を有し得る被験体、または該障害が予防されるべきであり得る被験体であり得る。
【００４７】
「慢性」投与は、急性様式とは対照的に、初期治療効果（活性）が長期間維持されるように連続様式での薬剤（１種類または複数種）の投与をいう。「断続的」投与は、中断せずに連続的に行なうのではなく、周期性の処置である。
【００４８】
処置目的のための「哺乳動物」は、哺乳動物に分類される任意の動物をいい、ヒト、齧歯類（ラットもしくはマウスなど）、飼育用および家畜用動物、ならびに動物園の動物、競技用動物、または愛玩動物（イヌ、ネコなど）、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギなどが挙げられる。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００４９】
１種類以上のさらなる治療用薬剤「との併用」投与は、同時（並行）および任意の順での逐次投与を包含する。
【００５０】
「担体」は、本明細書で用いる場合、使用される投薬量および濃度で、曝露対象の細胞または哺乳動物に対して無毒性の薬学的に許容され得る担体、賦形剤または安定剤を包含する。多くの場合、生理学的に許容され得る担体は水性ｐＨ緩衝溶液である。生理学的に許容され得る担体の例としては、バッファー（リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸など）；抗酸化剤（アスコルビン酸など）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなど）；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）；アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリシンなど）；単糖類、二糖類、および他の糖質（グルコース、マンノース、もしくはデキストリンなど）；キレート化剤（ＥＤＴＡなど）；糖アルコール（マンニトールもしくはソルビトールなど）；塩形成性対イオン（ナトリウムなど）；および／または非イオン系界面活性剤（ＴＷＥＥＮ（商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、やＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）など）が挙げられる。
【００５１】
「固相」により、本発明の抗体が付着し得る非水性マトリックスが意図される。本明細書に包含される固相の例としては、一部または全体がガラス（例えば、細孔性ガラス）、多糖類（例えば、アガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコールおよびシリコーンで形成されたものが挙げられる。状況に応じて、固相は、アッセイプレートのウェルを構成するものであってもよく、別の状況では、精製カラム（例えば、アフィニティークロマトグラフィーカラム）である。この用語はまた、個々の粒子の不連続固相（米国特許第４，２７５，１４９号に記載のものなど）を包含する。
【００５２】
「リポソーム」は、哺乳動物への薬物（ＥｐｈＡ６ポリペプチド、またはそのアゴニスト、アンタゴニストもしくは抗体など）の送達に有用な種々の型の脂質、リン脂質および／または界面活性剤で構成された小胞である。リポソームの成分は、一般的に、生体膜の脂質の整列と同様に二分子層を形成した状態で整列している。
【００５３】
「小分子」は、本明細書において約５００ダルトン未満の分子量を有するものと定義する。
【００５４】
本明細書に開示したＥｐｈＡ６ポリペプチド、抗ＥｐｈＡ６抗体、ＥｐｈＡ６結合オリゴペプチド、ＥｐｈＡ６結合有機分子またはそのアゴニストもしくはアンタゴニストの「有効量」は、具体的に記載した目的が実行されるのに十分な量である。「有効量」は、記載した目的に関して経験的に常套的な様式で決定され得る。
【００５５】
用語「治療有効量」は、被験体または哺乳動物の疾患または障害を「処置する」のに有効な抗ＥｐｈＡ６抗体、ＥｐｈＡ６ポリペプチド、ＥｐｈＡ６結合オリゴペプチド、ＥｐｈＡ６結合有機分子または他の薬物の量をいう。癌の場合、薬物の治療有効量により、癌細胞の数が低減；腫瘍サイズが縮小；末梢器官への癌細胞浸潤が抑止（すなわち、ある程度の遅延、好ましくは停止）；腫瘍転移が抑止（すなわち、ある程度の遅延、好ましくは停止）；腫瘍成長が抑止（ある程度）；および／または癌と関連している１つ以上の症状がある程度軽減され得る。本明細書における「処置すること」の定義を参照のこと。薬物は、既存の癌細胞が成長抑制および／または死滅される範囲で、細胞増殖抑制性および／または細胞傷害性であり得る。
【００５６】
語句「不安関連障害」は、不安、気分および物質乱用の障害をいい、これらに限定されないが、鬱、全般性不安障害、注意欠陥障害、睡眠障害、多動性障害、強迫性障害、統合失調症、認知障害、痛覚過敏および感覚障害が挙げられる。かかる障害としては、軽度から中等度の不安、一般的な状態による不安障害、特定不能な（ｎｏｔ  ｏｔｈｅｒｗｉｓｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｅｄ）不安障害、全般性不安障害、パニック発作、広場恐怖症を伴うパニック障害、広場恐怖症を伴わないパニック障害、心的外傷後ストレス障害、対人恐怖症、対人不安症、自閉症、特定の恐怖症、物質誘発性不安障害、急性アルコール禁断症状、強迫性障害、広場恐怖症、単極性障害、双極性障害Ｉ型もしくはＩＩ型、特定不能な双極性障害、循環病、鬱病性障害、大鬱病性障害、気分障害、物質誘発性気分障害、認知機能の向上、これらに限定されないが、アルツハイマー病、脳卒中もしくは脳に対する外傷性損傷と関連している認知機能の低下、疾患または損傷に起因する発作、例えば、これらに限定されないが、癲癇、学習障害／学習困難、脳性麻痺が挙げられる。また、不安障害は人格障害にも適用され得、これらに限定されないが、以下の型：妄想性、反社会的、回避性行動、境界性人格障害、依存性、ヒステリー性（ｈｉｓｔｒｏｎｉｃ）、自己愛性、強迫性、統合失調質性、および統合失調型が挙げられる。
【００５７】
用語「抗体」は、最も広い意味で用い、具体的には、所望の生物学的または免疫学的活性を示すものである限り、例えば、単独の抗ＥｐｈＡ６モノクローナル抗体（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、および中和抗体）、多エピトープ特異性を有する抗ＥｐｈＡ６抗体組成物、ポリクローナル抗体、単鎖抗ＥｐｈＡ６抗体、および抗ＥｐｈＡ６抗体の断片（下記参照）を包含する。用語「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、本明細書において抗体と互換的に用いる。
【００５８】
「単離（された）抗体」は、その天然環境の成分から同定および分離および／または回収されたものである。その天然環境の夾雑成分は、抗体の診断的または治療的使用を妨害することがあり得る物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質が挙げられ得る。本発明は、抗体が、（１）ローリー法で測定したときの抗体９５重量％超、最も好ましくは９９重量％超まで、（２）スピニングカップ配列決定装置の使用によって少なくとも１５残基のＮ末端もしくは内部アミノ酸配列が得られるのに十分な程度まで、（３）クマシーブルーもしくは好ましくは銀染色を用いて非還元もしくは還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥで均一になるまで精製されることを提供する。単離抗体は、抗体の天然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイチュでの抗体を包含する。しかしながら、通常、単離抗体は、少なくとも１回の精製工程によって調製されるものである。
【００５９】
基本の４鎖抗体ユニットは、２つの同一の軽（Ｌ）鎖と２つの同一の重（Ｈ）鎖で構成されたヘテロ四量体の糖タンパク質である（ＩｇＭ抗体は、基本のヘテロ四量体ユニットならびにＪ鎖と称されるさらなるポリペプチドの５鎖からなり、したがって、１０個の抗原結合部位を含み、一方、分泌型ＩｇＡ抗体は重合して２〜５個の基本の４鎖単位ならびにＪ鎖で構成された多価集合体を形成し得る）。ＩｇＧの場合、該４鎖単位は一般的に約１５０，０００ダルトンである。各Ｌ鎖はＨ鎖に、１つの共有結合性ジスルフィド結合によって連結されており、一方、２つのＨ鎖は互いに、Ｈ鎖アイソタイプに応じて１つ以上のジスルフィド結合によって連結されている。また、核Ｈ鎖とＬ鎖は、規則的に間隔のあいた鎖内ジスルフィド結合を有する。各Ｈ鎖はＮ末端に、可変ドメイン（ＶＨ）、続いてα鎖とγ鎖の各々に対して３つの定常ドメイン（ＣＨ）、およびμおよびεアイソタイプに対して４つのＣＨドメインを有する。各Ｌ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（ＶＬ）、続いて他端に定常ドメイン（ＣＬ）を有する。ＶＬはＶＨと並列しており、ＣＬは、重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）と並列している。特定のアミノ酸残基が軽鎖と重鎖の可変ドメイン間のインターフェースを形成していると考えられる。ＶＨとＶＬは、一緒に対合して単一の抗原結合部位を形成している。種々のクラスの抗体の構造および性質については、例えば，Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第８版，Ｄａｎｉｅｌ  Ｐ．Ｓｔｉｔｅｓ，Ａｂｂａ  Ｉ．ＴｅｒｒおよびＴｒｉｓｔｒａｍ  Ｇ．Ｐａｒｓｌｏｗ（編），Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ，１９９４，第７１頁および第６章を参照のこと。
【００６０】
任意の脊椎動物種由来のＬ鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパおよびラムダと称される２つの明白に異なる型の一方に割り当てられ得る。重鎖（ＣＨ）の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、異なるクラスまたはアイソタイプに割り当てられ得る。免疫グロブリンには、それぞれ、α、δ、ε、γおよびμと指定される重鎖を有する５つのクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在する。γおよびαクラスは、ＣＨの配列と機能の比較的軽微な違いに基づいて、さらにサブクラスに分けられ、例えば、ヒトは、以下のサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２を発現する。
【００６１】
用語「可変」は、可変ドメインの一部のセグメントの配列が、抗体間で広く異なることをいう。Ｖドメインは、抗原結合を媒介し、特定の抗体のその特定の抗原に対する特異性を規定する。しかしながら、可変性は、１１０アミノ酸長の可変ドメイン全体にわたって均一に分布していない。そうではなく、Ｖ領域は、各々が９〜１２アミノ酸長の極めて可変性の「超可変領域」と称される短鎖領域によって分断されたフレームワーク領域（ＦＲ）と称される１５〜３０アミノ酸の比較的インバリアントな鎖からなる。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインは各々４つのＦＲを含み、該ＦＲは、たいていは３つの超可変領域に結合されたβ−シート構造であり、該領域はループを形成して該β−シート構造に結合しており、場合によってはその一部を構成している。各鎖の超可変領域は、ＦＲによって他方の鎖の超可変領域と近接して一緒に保持されており、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ．（１９９１）参照）。定常ドメインは、抗原への抗体の結合に直接的には関与していないが、種々のエフェクター機能（抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）への抗体の関与など）を示す。
【００６２】
用語「超可変領域」は、本明細書で用いる場合、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基をいう。超可変領域は、一般的に、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基（例えば、ＶＬのほぼ約２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）残基と、ＶＨのほぼ約１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３）残基；Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））および／または「超可変ループ」由来の残基（例えば、ＶＬの２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｌ３）残基と、ＶＨの２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）および９６〜１０１（Ｈ３）；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））を含む。
【００６３】
用語「モノクローナル抗体」は、本明細書で用いる場合、実質的に均質な抗体集団から得られる抗体をいう、すなわち、該集団を構成する個々の抗体は、微量に存在することがあり得る、考えられ得る天然変異以外は同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。さらに、種々の決定基（エピトープ）に対する種々の抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体が混入していない状態で合成され得るという点で好都合である。修飾語句「モノクローナル」は、任意の特定の方法による抗体の作製が必要であると解釈されないものとする。例えば、本発明において有用なモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ方法論（Ｋｏｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって最初に報告）によって調製され得るか、または細菌、真核生物の動物もしくは植物の細胞内での組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照）を用いて作製され得る。また、「モノクローナル抗体」は、ファージ抗体ライブラリーから、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載の手法を用いて単離されたものであり得る。
【００６４】
本明細書におけるモノクローナル抗体としては「キメラ」抗体が挙げられ、これは、重鎖および／または軽鎖の一部分が特定の種由来の抗体または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応配列と同一または相同であるとともに、該鎖（１つまたは複数）の残部が別の種由来の抗体または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応配列と同一または相同な抗体である。所望の生物学的活性を示す限り、かかる抗体の断片もまた、包含される（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４）参照）。本明細書において対象となるキメラ抗体は、非ヒト霊長類（例えば、旧世界ザル、類人猿など）に由来する可変ドメイン抗原結合配列と、ヒト定常領域配列とを含む「霊長類化」抗体を包含する。
【００６５】
「インタクトな」抗体は、抗原結合部位ならびにＣＬと、少なくとも重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含むものである。該定常ドメインは、天然配列定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列定常ドメイン）であってもよく、そのアミノ酸配列バリアントであってもよい。好ましくは、インタクトな抗体は、１つ以上のエフェクター機能を有するものである。
【００６６】
「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部分、好ましくはインタクトな抗体の抗原結合領域または可変領域を構成しているものである。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片；ダイアボディ；線状抗体（米国特許第５，６４１，８７０号、実施例２；Ｚａｐａｔａら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２［１９９５］参照）；単鎖抗体分子；ならびに抗体断片で形成された多重特異性抗体が挙げられる。
【００６７】
抗体のパパイン消化によって「Ｆａｂ」断片と称される２つの同一の抗原結合断片と、残余の「Ｆｃ」断片（この記号表示は、容易に結晶化する能力を反映している）とが生じる。Ｆａｂ断片は、完全なＬ鎖ならびにＨ鎖（ＶＨ）の可変領域ドメイン、および一方の重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）からなる。各Ｆａｂ断片は抗原結合に関して一価である、すなわち、単一の抗原結合部位を有する。抗体のペプシン処理では単一の大型Ｆ（ａｂ’）２断片が生じ、これは、ほぼ２つのジスルフィド連結Ｆａｂ断片に相当し、二価の抗原結合活性を有し、依然として抗原との架橋能を有している。Ｆａｂ’断片は、ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端にさらに数個の残基（例えば、抗体のヒンジ領域由来の１つ以上のシステイン）を有していることでＦａｂ断片と異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書において、定常ドメインのシステイン残基（１つまたは複数）が遊離チオール基を有するＦａｂ’の記号表示である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、最初は、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片対として作製された。抗体断片の他の化学的カップリングもまた知られている。
【００６８】
Ｆｃ断片は、ジスルフィドによって一緒に保持された両方のＨ鎖のカルボキシ末端部分を含む。抗体のエフェクター機能はＦｃ領域の配列によって決定され、また、該領域は、ある種の細胞型に見られるＦｃ受容体（ＦｃＲ）によって認識される部分である。
【００６９】
「Ｆｖ」は最小限の抗体断片であり、完全な抗原認識／結合部位を含む。この断片は、１つの重量可変領域ドメインと１つの軽鎖可変領域ドメインが非共有結合で強固に会合した二量体からなる。これらの２つのドメインのフォールディングによって６つの超可変ループ（Ｈ鎖とＬ鎖からそれぞれ３ループ）が生じ、該ループは、アミノ酸残基を抗原結合に寄与させ、抗体に対する抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（または、抗原に特異的な３つのＣＤＲだけを含むＦｖの半分）であっても、抗原を認識して結合する能力を有するが、完全な結合部位よりも親和性は低い。
【００７０】
「単鎖Ｆｖ」は、「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」とも略記され、ＶＨ抗体ドメインとＶＬ抗体ドメインが連結された単一のポリペプチド鎖で構成された抗体断片である。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドは、さらにＶＨドメインとＶＬメインの間にポリペプチドリンカーを含み、これにより、ｓＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することが可能となる。ｓＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，第１１３巻，ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，第２６９〜３１５頁（１９９４）；Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ  １９９５（後掲）を参照のこと。
【００７１】
用語「ダイアボディ」は、鎖内ではなく鎖間にＶドメイン対合をもたらし、二価断片、すなわち２つの抗原結合部位を有する断片が生じるようにＶＨドメインとＶＬメインの間に短鎖リンカー（約５〜１０残基）を有するｓＦｖ断片（先の段落参照）構築することによって作製される小型の抗体断片をいう。二重特異性ダイアボディは、２つの抗体のＶＨドメインとＶＬドメインが異なるポリペプチド鎖に存在している２つの「交差」ｓＦｖ断片のヘテロ二量体である。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）に、より十分に説明されている。
【００７２】
非ヒト（例えば、齧歯類）抗体の「ヒト化（された）」形態は、最小限の非ヒト抗体由来配列を含むキメラ抗体である。たいていは、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域由来の残基が、所望の抗体特異性、親和性および能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）（マウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類など）の超可変領域由来の残基で置き換えられたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基で置き換えられている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体には見られない残基を含むものであってもよい。このような修飾は、抗体性能をさらに上げるために行なわれる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全部を含み、このとき、超可変ループの全部または実質的に全部が、非ヒト免疫グロブリンのものに相当し、ＦＲの全部または実質的に全部が、ヒト免疫グロブリン配列のものに相当する。ヒト化抗体はまた、任意選択で、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）（典型的には、ヒト免疫グロブリンのもの）の少なくとも一部分を含む。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照のこと。
【００７３】
「種依存性抗体」（例えば、哺乳動物の抗ヒトＩｇＥ抗体）は、第１の哺乳動物種由来の抗原に対して、第２の哺乳動物種由来の該抗原のホモログよりも強い結合親和性を有する抗体である。通常、種依存性抗体は、ヒト抗原に「特異的に結合する」（すなわち、約１×１０−７Ｍ以下、好ましくは約１×１０−８以下、最も好ましくは約１×１０−９Ｍ以下の結合親和性（Ｋｄ）値を有する）が、第２の非ヒト哺乳動物種由来の抗原のホモログに対しては、ヒト抗原に対する結合親和性より少なくとも約５０倍、または少なくとも約５００倍、または少なくとも約１０００倍弱い結合親和性を有する。種依存性抗体は、上記の種々の型の抗体の任意のものであり得るが、好ましくはヒト化抗体またはヒト抗体である。
【００７４】
「ＥｐｈＡ６結合オリゴペプチド」は、本明細書に記載のＥｐｈＡ６ポリペプチドに結合する、好ましくは特異的に結合するオリゴペプチドである。ＥｐｈＡ６結合オリゴペプチドは、既知のオリゴペプチド合成方法論を用いて化学合成されたものであってもよく、組換え手法を用いて調製および精製したものであってもよい。ＥｐｈＡ６結合オリゴペプチドは、通常、少なくとも約５アミノ酸長であり、あるいはまた少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００アミノ酸長またはそれ以上であって、本明細書に記載のＥｐｈＡ６ポリペプチドに結合することができる、好ましくは特異的に結合することができるようなオリゴペプチドである。ＥｐｈＡ６結合オリゴペプチドは、必要以上に実験を行なうことなく、よく知られた手法を用いて同定され得る。この点に関して、ポリペプチド標的に特異的に結合することができるオリゴペプチドのオリゴペプチドライブラリーをスクリーニングするための手法は、当該技術分野でよく知られていることに留意されたい（例えば、米国特許第５，５５６，７６２号、同第５，７５０，３７３号、同第４，７０８，８７１号、同第４，８３３，０９２号、同第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５７１，６８９号、同第５，６６３，１４３号；ＰＣＴ公開公報番号ＷＯ８４／０３５０６およびＷＯ８４／０３５６４；Ｇｅｙｓｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１：３９９８−４００２（１９８４）；Ｇｅｙｓｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２：１７８−１８２（１９８５）；Ｇｅｙｓｅｎら，ｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ，１３０−１４９（１９８６）；Ｇｅｙｓｅｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１０２：２５９−２７４（１９８７）；Ｓｃｈｏｏｆｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４０：６１１−６１６（１９８８），Ｃｗｉｒｌａ，Ｓ．Ｅ．ら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６３７８；Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．ら（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：１０８３２；Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４；Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．ら（１９９１），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１；Ｋａｎｇ，Ａ．Ｓ．ら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：８３６３ならびにＳｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２：６６８を参照のこと）。
【００７５】
「ＥｐｈＡ６結合有機分子」は、本明細書に記載のＥｐｈＡ６ポリペプチドに結合する、好ましくは特異的に結合する本明細書において定義するオリゴペプチドまたは抗体以外の有機分子である。ＥｐｈＡ６結合有機分子は、既知の方法論を用いて同定および化学合成され得る（例えば、ＰＣＴ公開公報番号ＷＯ００／００８２３およびＷＯ００／３９５８５を参照のこと）。ＥｐｈＡ６結合有機分子は、通常、約２０００ダルトン未満のサイズ、あるいはまた、約１５００、７５０、５００、２５０または２００ダルトン未満のサイズであって、本明細書に記載のＥｐｈＡ６ポリペプチドに結合することができる、好ましくは特異的に結合することができるような有機分子であり、必要以上に実験を行なうことなく、よく知られた手法を用いて同定され得る。この点に関して、ポリペプチド標的に特異的に結合することができる分子の有機分子ライブラリーをスクリーニングするための手法は、当該技術分野でよく知られていることに留意されたい（例えば、ＰＣＴ公開公報番号ＷＯ００／００８２３およびＷＯ００／３９５８５を参照のこと）。
【００７６】
対象の抗原（例えば、腫瘍関連ポリペプチド抗原標的）に「結合する」抗体、オリゴペプチドまたは他の有機分子は、該抗原に、抗体、オリゴペプチドまたは他の有機分子が、好ましくは、該抗原を発現する細胞または組織の標的化において診断用薬剤および／または治療用薬剤として有用であり、他のタンパク質と有意に交差反応しないような十分な親和性で結合するものである。「非標的」タンパク質に対する抗体、オリゴペプチドまたは他の有機分子の結合の程度は、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）解析または放射性免疫沈降（ＲＩＡ）で測定したとき、特定の標的タンパク質に対する抗体、オリゴペプチドまたは他の有機分子の結合の約１０％未満である。標的分子に対する抗体、オリゴペプチドまたは他の有機分子の結合に関して、用語特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド標的上のエピトープに対する「特異的結合」または「特異的に結合する」または「特異的な」とは、非特異的相互作用とは測定可能に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、分子の結合を、対照分子（一般的には、結合活性をもたない類似した構造の分子）の結合と比較して測定することにより測定され得る。例えば、特異的結合は、標的と類似した対照分子（例えば、過剰の非標識標的）との競合によって測定され得る。この場合、プローブに対する標識標的の結合が過剰の非標識標的によって競合的に阻害されるなら、特異的結合が示される。用語特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド標的上のエピトープに対する「特異的結合」または「特異的に結合する」または「特異的な」は、本明細書で用いる場合、例えば、少なくとも約１０−４Ｍ、あるいはまた少なくとも約１０−５Ｍ、あるいはまた少なくとも約１０−６Ｍ、あるいはまた少なくとも約１０−７Ｍ、あるいはまた少なくとも約１０−８Ｍ、あるいはまた少なくとも約１０−９Ｍ、あるいはまた少なくとも約１０−１０Ｍ、あるいはまた少なくとも約１０−１１Ｍ、あるいはまた少なくとも約１０−１２Ｍ、またはそれより大きい標的に対するＫｄを有する分子によって示され得るものである。用語「特異的結合」は、分子が、特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド上のエピトープに、任意の他のポリペプチドまたはポリペプチドエピトープに実質的に結合することなく結合する場合の結合をいう。
【００７７】
抗体の「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域またはアミノ酸配列バリアントＦｃ領域）に起因する生物学的活性をいい、抗体アイソタイプによって異なる。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合および補体依存性細胞傷害性；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方調節；ならびにＢ細胞活性化が挙げられる。
【００７８】
「抗体依存性細胞傷害性」または「ＡＤＣＣ」は、ある種の細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合された分泌Ｉｇによって、このような細胞傷害性エフェクター細胞が抗原を有する標的細胞に特異的に結合し、続いて細胞毒によって標的細胞を死滅させることが可能になる細胞傷害性一形態をいう。該抗体は該細胞傷害性細胞を「武装」させ、かかる死滅に絶対的に必要である。ＡＤＣＣを媒介するための主要な細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩしか発現しないが、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血系細胞上のＦｃＲ発現は、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−９２（１９９１）の第４６４頁の表３にまとめられている。対象分子のＡＤＣＣ活性を評価するため、インビトロＡＤＣＣアッセイ（米国特許第５，５００，３６２号または同第５，８２１，３３７号に記載のものなど）が行なわれ得る。かかるアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。あるいはまたさらに、対象分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、動物モデル（ＣｌｙｎｅｓらＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されたものなど）において評価され得る。
【００７９】
「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を示す。好ましいＦｃＲは天然配列ヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体に結合するもの（γ受容体）であり、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩサブクラス（対立遺伝子バリアントを含む）の受容体、あるいはまた、これらの受容体のスプライシング形態が挙げられる。ＦｃγＲＩＩ受容体としては、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「抑制受容体」）が挙げられ、これらは、類似したアミノ酸配列を有するが、主に、その細胞質ドメインが異なる。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメイン内に免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。抑制受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメイン内に免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を含む（概説は、Ｍ．ｉｎ  Ｄａeｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３−２３４（１９９７）参照のこと）。ＦｃＲは、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−４９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌら，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２５−３４（１９９４）；およびｄｅ  Ｈａａｓら，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０−４１（１９９５）に概説されている。他のＦｃＲ（将来的に同定されるものを含む）も、本明細書における用語「ＦｃＲ」に包含される。また、該用語は新生児受容体ＦｃＲｎも包含し、これは、胎児への母体ＩｇＧの輸送を担う（Ｇｕｙｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）およびＫｉｍら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））。
【００８０】
「ヒトエフェクター細胞」は、１種類以上のＦｃＲを発現し、エフェクター機能を発揮する白血球である。好ましくは、該細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を発揮するものである。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞および好中球が挙げられ、ＰＢＭＣとＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞は、天然供給源、例えば血液から単離され得る。
【００８１】
「補体依存性細胞傷害性」または「ＣＤＣ」は、補体の存在下での標的細胞の溶解をいう。古典的補体経路の活性化は、補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）が、コグネイト抗原に結合している（適切なサブクラスの）抗体に結合することによって起始される。補体活性化を評価するためには、ＣＤＣアッセイ（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３（１９９６）に記載のもの）が行なわれ得る。
【００８２】
本明細書で用いる場合、用語「免疫接着体」は、異種タンパク質の結合特異性（「接着」）と、免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能を兼ね備えた抗体様分子を示す。構造的に、免疫接着体は、抗体の抗原認識／結合部位以外の所望の結合特異性を有する（すなわち、「異種」）アミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合体で構成されている。免疫接着体分子の接着部分は、典型的には、少なくとも受容体またはリガンドの結合部位を含む隣接アミノ酸配列である。免疫接着体の免疫グロブリン定常ドメイン配列は、任意の免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、もしくはＩｇＧ−４サブタイプ、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２）、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはＩｇＭなどから得られ得る。
【００８３】
文言「標識」は、本明細書で用いる場合、「標識」抗体が生成されるように抗体に直接または間接的にコンジュゲートされた検出可能な化合物または組成物をいう。標識は、それ自体が検出可能なものであってもよく（例えば、放射性同位体標識もしくは蛍光標識）、または酵素標識の場合は、基質化合物または組成物の検出可能な化学的改変を触媒するものであってもよい。
【００８４】
用語「添付文書」は、治療剤製品の市販パッケージに慣例的に含められる使用説明書をいうために用い、添付文書は、かかる治療剤製品の使用に関連する適応症、用法、投薬量、投与、禁忌および／または警告に関する情報を含む。
【００８５】
用語「遺伝子」は、（ａ）本明細書に開示したＤＮＡ配列の少なくとも１つを含む遺伝子；（ｂ）本明細書に開示したＤＮＡ配列にコードされるアミノ酸配列をコードする任意のＤＮＡ配列および／または；（ｃ）本明細書に開示したコード配列の相補配列にハイブリダイズする任意のＤＮＡ配列をいう。好ましくは、該用語は、コード配列ならびに非コード領域を包含し、好ましくは、通常の遺伝子発現に必要なあらゆる配列を包含する。
【００８６】
用語「遺伝子標的化」は、ゲノムＤＮＡの断片を哺乳動物細胞内に導入し、該断片を内在相同配列の位置に存在させて組み換えた場合に起こる相同組換えの一類型をいう。相同組換えによる遺伝子標的化では、特定のゲノム配列を特定設計の外来ＤＮＡで置き換えるために、組換えＤＮＡ手法が使用される。
【００８７】
用語「相同組換え」は、相同なヌクレオチド配列の部位における２つのＤＮＡ分子間または染色分体間のＤＮＡ断片の交換をいう。
【００８８】
用語「標的遺伝子」（あるいはまた、「標的遺伝子配列」または「標的ＤＮＡ配列」とも称する）は、相同組換えによって修飾される任意の核酸分子、ポリヌクレオチド、または遺伝子をいう。標的配列としては、インタクトな遺伝子、エキソンもしくはイントロン、調節配列または遺伝子間の任意の領域が挙げられる。標的遺伝子は、個体のゲノムＤＮＡ内の特定の遺伝子または遺伝子座の一部分を含むものであってもよい。
【００８９】
ＥｐｈＡ６遺伝子の「破壊」は、ゲノムＤＮＡの断片を内在相同配列の位置に存在させて組み換えた場合に起こり、このとき、該破壊は、天然遺伝子もしくはその一部分の欠失、または天然遺伝子における変異であるか、あるいは該破壊は、天然遺伝子の機能不活化である。あるいはまた、配列破壊は、遺伝子トラップベクター（すなわち、無作為に挿入された導入遺伝子を含有および発現する非ヒトトランスジェニック動物；例えば、２００２年８月２０日に発行された米国特許第６，４３６，７０７号参照）を用いた非特異的挿入的不活化によってもたらされ得る。このような配列破壊または修飾としては、挿入、ミスセンス、フレームシフト、欠失もしくは置換あるいはＤＮＡ配列の置き換え、またはその任意の組合せが挙げられ得る。挿入としては、遺伝子（動物、植物、真菌、昆虫、原核生物、またはウイルスの起源のものであり得る）全体の挿入が挙げられる。例えば、破壊によって、通常の遺伝子産物が、その産生が一部もしくは完全に抑制されることにより、または該通常の遺伝子産物の活性が向上することにより、改変され得る。好ましくは、破壊は、ＥｐｈＡ６遺伝子の有意な発現がないヌル破壊である。
【００９０】
用語「天然発現」は、ＥｐｈＡ６遺伝子にコードされた完全長ポリペプチドの、野生型マウスに存在する発現レベルの発現をいう。したがって、内在ＥｐｈＡ６遺伝子の「天然発現がない」破壊は、哺乳動物の単一の細胞、選択された細胞、または全細胞の内在ＥｐｈＡ６遺伝子にコードされたポリペプチドの少なくとも一部分の発現の一部または完全な低減をいう。
【００９１】
用語「ノックアウト」は、ＥｐｈＡ６遺伝子の破壊であって、天然遺伝子の機能不活化；天然遺伝子もしくはその一部分の欠失；または天然遺伝子における変異がもたらされる破壊をいう。
【００９２】
用語「ノックイン」は、マウスオルソログ（または他のマウス遺伝子）を、任意の特定のヒトＥｐｈＡ６コード遺伝子またはそのバリアントをコードするヒトｃＤＮＡで置き換えることをいう（すなわち、天然マウス遺伝子が天然ヒト遺伝子で置き換えられる破壊）。
【００９３】
用語「構築物」または「標的化構築物」は、標的組織、細胞株または動物内に導入するための人工的に構築されたＤＮＡセグメントをいう。典型的には、標的化構築物は、対象の特定の遺伝子または核酸配列、マーカー遺伝子および適切な制御配列を含む。本明細書に示すように、標的化構築物は、ＥｐｈＡ６標的化構築物を包含する。「ＥｐｈＡ６標的化構築物」としては、ＥｐｈＡ６遺伝子の少なくとも一部分に相同であり、かつ宿主細胞内でＥｐｈＡ６遺伝子の破壊をもたらすことができるＤＮＡ配列が挙げられる。
【００９４】
用語「トランスジェニック細胞」は、そのゲノム内に、遺伝子標的化方法によって完全または部分的に破壊、修飾、改変または交換されたＥｐｈＡ６遺伝子を含む細胞をいう。
【００９５】
用語「トランスジェニック動物」は、そのゲノム内に、本明細書に記載の方法または当該技術分野でよく知られた別の方法によって破壊あるいは修飾または変異された特定の遺伝子を含む動物をいう。好ましくは、非ヒトトランスジェニック動物は哺乳動物である。より好ましくは、哺乳動物は、ラットまたはマウスなどの齧歯類である。また、「トランスジェニック動物」は、ヘテロ接合型の動物（すなわち、１つの欠陥対立遺伝子と１つの野生型対立遺伝子）であってもよく、ホモ接合型の動物（すなわち、２つの欠陥対立遺伝子）であってもよい。胚は、動物の定義に含まれるとみなす。ただし、動物には、子宮内の胚または胎児（交配またはそれ以外のいずれも場合も、および胚が出生予定のもの、またはそうでないもののいずれも場合も）を含むものとする
本明細書で用いる場合、用語「選択的マーカー」および「位置選択マーカー」は、特定の細胞のみが一定の条件下で生存および／または成長することを可能にする産物をコードする遺伝子をいい、該特定の細胞は該遺伝子を担持している細胞である。例えば、導入されたネオマイシン耐性（Ｎｅｏｒ）遺伝子を発現する植物および動物の細胞は、化合物Ｇ４１８に耐性である。Ｎｅｏｒ遺伝子マーカーを担持していない細胞は、Ｇ４１８によって死滅する。他の陽性選択マーカーは、当業者にわかるか、またはその技能の範囲内である。
【００９６】
用語「モジュレートする」または「モジュレーション」は、本明細書で用いる場合、ＥｐｈＡ６遺伝子の機能、発現、活性、あるいはまたＥｐｈＡ６遺伝子と関連している表現型の減少、阻害、低減、改善、増大または向上をいう。
【００９７】
用語「改善する」または「改善」は、本明細書で用いる場合、状態、疾患、障害、または表現型、例えば、異常または症状の減少、低減または解消をいう。
【００９８】
用語「異常」は、ＥｐｈＡ６が関与している任意の疾患、障害、状態または表現型、例えば、病的状態および行動の観察結果をいう。
【００９９】
【表１−１】
2010527589.tif 000002
【０１００】
【表１−２】
2010527589.tif 000003
【０１０１】
【表１−３】
2010527589.tif 000004
【０１０２】
【表１−４】
2010527589.tif 000005
【０１０３】
【表１−５】
2010527589.tif 000006
【０１０４】
【表１−６】
2010527589.tif 000007
【０１０５】
【表１−７】
2010527589.tif 000008
【０１０６】
【表１−８】
2010527589.tif 000009
【０１０７】
【表１−９】
2010527589.tif 000010
【０１０８】
【表１−１０】
2010527589.tif 000011
【０１０９】
【表１−１１】
2010527589.tif 000012
【０１１０】
【表１−１２】
2010527589.tif 000013
【０１１１】
【表１−１３】
2010527589.tif 000014
【０１１２】
【表１−１４】
2010527589.tif 000015
【０１１３】
【表１−１５】
2010527589.tif 000016
【０１１４】
【表１−１６】
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【０１１５】
【表１−１７】
2010527589.tif 000018
【０１１６】
【表２】
2010527589.tif 000019
アミノ酸配列同一性％＝
（ＡＬＩＧＮ−２で測定したとき、２つのポリペプチド配列間で完全にマッチングしているアミノ酸残基の数）を、（ＰＲＯポリペプチドのアミノ酸残基の総数）で除算＝
５÷１５＝３３．３％
【０１１７】
【表３】
2010527589.tif 000020
アミノ酸配列同一性％＝
（ＡＬＩＧＮ−２で測定したとき、２つのポリペプチド配列間で完全にマッチングしているアミノ酸残基の数）を、（ＰＲＯポリペプチドのアミノ酸残基の総数）で除算＝
５÷１０＝５０％
【０１１８】
【表４】
2010527589.tif 000021
核酸配列同一性％＝
（ＡＬＩＧＮ−２で測定したとき、２つの核酸配列間で完全にマッチングしているヌクレオチドの数）を、（ＰＲＯ−ＤＮＡ核酸配列の総数ヌクレオチド）で除算＝
６÷１４＝４２．９％
【０１１９】
【表５】
2010527589.tif 000022
核酸配列同一性％＝
（ＡＬＩＧＮ−２で測定したとき、２つの核酸配列間で完全にマッチングしているヌクレオチドの数）を、（ＰＲＯ−ＤＮＡ核酸配列の総数ヌクレオチド）で除算＝
４÷１２＝３３．３％  。
【０１２０】
ＩＩ．本発明の組成物および方法
Ａ．完全長ＥｐｈＡ６ポリペプチド
本発明は、ＥｐｈＡ６ポリペプチドをコードする新たに同定および単離されたヌクレオチド配列を提供する。特に、以下の実施例にさらに詳細に開示するように、種々のＥｐｈＡ６ポリペプチドをコードするｃＤＮＡが同定および単離された。別々の発現ラウンドで産生されたタンパク質には、異なるＰＲＯ番号を付与することがあり得るが、ＵＮＱ番号は、任意の所与のＤＮＡおよびコードタンパク質に特殊であり、変更しないことに留意されたい。しかしながら、便宜上、本明細書では、ＰＲＯの前述の定義に含まれる本明細書に開示した完全長天然核酸分子にコードされたタンパク質ならびにあらゆるさらなる天然ホモログおよびバリアントを、その起源または調製様式にかかわらず、「ＰＲＯ／番号」で記載する。
【０１２１】
以下の実施例に開示するように、種々のｃＤＮＡクローンをＡＴＣＣに寄託した。該クローンの実際のヌクレオチド配列は、当業者により、寄託されたクローンを、当該技術分野の常套的な方法を用いて配列決定することによって容易に決定され得る。推定アミノ酸配列は、常套的な技術を用いてヌクレオチド配列から決定され得る。本明細書に記載のＥｐｈＡ６ポリペプチドおよびコード核酸に関して、本出願人らは、当時入手可能な配列情報で最良に同定可能なリーディングフレームであると考えられるものを同定した。
【０１２２】
Ｂ．ＥｐｈＡ６ポリペプチドバリアント
本明細書に記載の完全長天然配列ＥｐｈＡ６ポリペプチドに加え、ＥｐｈＡ６バリアントが作製され得ることが想定される。ＥｐｈＡ６バリアントは、ＥｐｈＡ６  ＤＮＡに適切なヌクレオチド変更を導入すること、および／または所望のＥｐｈＡ６ポリペプチドの合成によって作製され得る。当業者には、アミノ酸変更によって、ＥｐｈＡ６ポリペプチドの翻訳後プロセッシングが改変され得ること（グリコシル化部位の数もしくは位置の変化、または膜固定特性の改変など）が認識されよう。
【０１２３】
本明細書に記載の天然完全長配列ＥｐｈＡ６ポリペプチドまたはＥｐｈＡ６ポリペプチドの種々のドメインにおいて、例えば、例えば米国特許第５，３６４，９３４号に示された同類（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）および非同類変異のための任意の手法および指針を用いて変異を行なうことができる。変異は、天然配列ＥｐｈＡ６ポリペプチドと比べたとき、ＥｐｈＡ６ポリペプチドのアミノ酸配列の変化をもたらすＥｐｈＡ６ポリペプチドをコードする１つ以上のコドンの置換、欠失または挿入であり得る。任意選択で、変異は、ＥｐｈＡ６ポリペプチドの１つ以上のドメインで少なくとも１つのアミノ酸が任意の他のアミノ酸で置換されることによるものである。どのアミノ酸残基が、所望の活性に悪影響を及ぼすことなく挿入、置換または欠失され得るかの決定における手引きは、ＥｐｈＡ６ポリペプチドの配列を相同な既知タンパク質分子のものと比較し、および高相同性の領域内のアミノ酸配列の変化の数を最小限にすることにより見いだされ得る。アミノ酸置換は、１つのアミノ酸を、類似した構造的および／または化学的性質を有する別のアミノ酸で置き換えた（例えば、ロイシンをセリンで置き換える）結果、すなわち、同類アミノ酸置換であり得る。挿入または欠失は、任意選択で、約１〜５アミノ酸の範囲内であり得る。許容される変異は、配列内へのアミノ酸の挿入、欠失または置換を体系的に行ない、得られたバリアントを、完全長または成熟天然配列によって示される活性について試験することにより判定され得る。
【０１２４】
ＥｐｈＡ６ポリペプチド断片を本明細書において提供する。かかる断片は、例えば、完全長天然タンパク質と比較したとき、Ｎ末端またはＣ末端が切断されたものであってもよく、内部残基を欠いたものであってもよい。一部の断片は、ＥｐｈＡ６ポリペプチドの所望の生物学的活性に必須ではないアミノ酸残基を欠いたものである。
【０１２５】
ＥｐｈＡ６断片は、いくつかの慣用的な手法のいずれかによって作製され得る。所望のペプチド断片は化学合成されたものであってもよい。択一的なアプローチは、ＥｐｈＡ６断片を、酵素的消化によって、例えば、そのタンパク質を、タンパク質を特定のアミノ酸残基で規定される部位で切断することがわかっている酵素で処理することにより、またはそのＤＮＡを適当な制限酵素で消化し、所望の断片を単離することにより作製することを含むものである。また別の適当な手法は、所望のポリペプチド断片をコードするＤＮＡ断片を単離し、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅することを伴うものである。ＤＮＡ断片の所望の末端を規定するオリゴヌクレオチドが、ＰＣＲの５’および３’プライマーに使用される。好ましくは、ＥｐｈＡ６ポリペプチド断片は、本明細書に開示した天然ＥｐｈＡ６ポリペプチドと少なくとも１つの生物学的および／または免疫学的活性を共有するものである。
【０１２６】
対象の同類置換を表６に、好ましい置換という見出しで示す。かかる置換によって生物学的活性の変化がもたらされる場合、好ましくは、表６に例示的な置換に記載した、またはアミノ酸クラスに関してさらに後述するより実質的な変更を導入し、産物をスクリーニングする。
【０１２７】
【表６】
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ＥｐｈＡ６ポリペプチドの機能または免疫学的実体における実質的な修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド主鎖の構造（例えば、シートもしくはらせん形コンホメーションとしての）、（ｂ）標的部位の分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のかさの維持に対する効果が有意に異なる置換を選択することにより行なわれる。天然に存在する残基は、共通する側鎖の性質に基づいて分類される。
【０１２８】
アミノ酸は、その側鎖の性質の類似性に従って分類され得る（Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第２版，ｐｐ．７３−７５，Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７５））。
【０１２９】
（１）無極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）
（２）非電荷極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）
（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）
（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）
あるいはまた、天然に存在する残基は、共通する側鎖の性質に基づいて分類され得る。
【０１３０】
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ
（５）鎖の向きに影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ
非同類置換は、これらのクラスの１つの構成員を別のクラスに交換することを伴う。また、かかる被置換残基を同類置換部位内に導入してもよく、より好ましくは残りの（非同類）部位に導入するのがよい。
【０１３１】
該変異は、当該技術分野で知られた方法、例えば、オリゴヌクレオチド媒介型（部位特異的）変異誘発、アラニンスキャニング、およびＰＣＲ変異誘発などを用いて行われ得る。部位特異的変異誘発［Ｃａｒｔｅｒら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３：４３３１（１９８６）；Ｚｏｌｌｅｒら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１０：６４８７（１９８７）］、カセット変異誘発［Ｗｅｌｌｓら，Ｇｅｎｅ，３４：３１５（１９８５）］、制限選択変異誘発［Ｗｅｌｌｓら，Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ  ＳｅｒＡ，３１７：４１５（１９８６）］または他の既知の手法を、クローニングしたＤＮＡに対して行い、ＥｐｈＡ６バリアントＤＮＡを作製することができる。
【０１３２】
また、スキャンアミノ酸解析を用いても、隣接配列に沿って１つ以上のアミノ酸を同定することができる。中でも、好ましいスキャンアミノ酸は、比較的小分子の中性アミノ酸である。かかるアミノ酸としては、アラニン、グリシン、セリン、およびシステインが挙げられる。アラニンは、β−炭素を超える（ｂｅｙｏｎｄ）側鎖を排除し、バリアントの主鎖コンホメーションをあまり改変させないため、典型的には、この群の中で好ましいスキャンアミノ酸である［ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５（１９８９）］。また、アラニンは、最も一般的なアミノ酸であるため、典型的には好ましい。さらに、これは、内部位置と露出位置の両方に高頻度に見られる。［Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５０：１（１９７６）］。アラニン置換によって十分な量のバリアントが得られない場合は、同配体アミノ酸が使用され得る。
【０１３３】
Ｃ．ＥｐｈＡ６ポリペプチドの修飾
ＥｐｈＡ６ポリペプチドの共有結合性修飾は、本発明の範囲に含まれる。共有結合性修飾の型の一例は、ＥｐｈＡ６ポリペプチドの被標的化アミノ酸残基を、ＥｐｈＡ６ポリペプチドの選択された側鎖またはＮ-もしくはＣ−末端の残基と反応する能力を有する有機誘導体化剤と反応させることを含むものである。二官能性の薬剤による誘導体化は、例えば、ＥｐｈＡ６ポリペプチドを、抗ＥｐｈＡ６抗体の精製方法における使用のために水不溶性の支持体マトリックスまたは表面に架橋させるのに（および逆の場合も）有用である。一般的に使用される架橋剤としては、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル、ホモ二官能性のイミドエステル、例えば、ジスクシンイミジルエステル（３，３’−ジチオビス（プロピオン酸スクシンイミジル）など）、二官能性マレイミド（ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなど）、およびメチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートなどの薬剤が挙げられる。
【０１３４】
他の修飾としては、グルタミニルおよびアスパラギニル残基のそれぞれ対応するグルタミルおよびアスパルチル残基への脱アミド化、プロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリルまたはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化［Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ．７９−８６（１９８３）］、Ｎ末端アミンのアセチル化、または任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
【０１３５】
本発明の範囲に含まれるＥｐｈＡ６ポリペプチドの共有結合性修飾の別の型は、該ポリペプチドの天然グリコシル化パターンを改変させることを含むものである。「天然グリコシル化パターンを改変させる」とは、本明細書での解釈上、天然配列ＥｐｈＡ６ポリペプチドに見られる１つ以上の糖質部分を欠失させること（基礎となるグリコシル化部位の除去あるいは化学的および／または酵素的手段によるグリコシル化の欠失のいずれかによって）、および／または天然配列ＥｐｈＡ６ポリペプチドには存在しない１つ以上のグリコシル化部位を付加することを意味することが意図される。また、該語句は、天然タンパク質のグリコシル化の定性的変化（存在する種々の糖質部分の性質および割合の変化を含む）を包含する。
【０１３６】
ＥｐｈＡ６ポリペプチドへのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を改変させることによって行なわれ得る。該改変は、例えば、天然配列ＥｐｈＡ６（Ｏ−結合グリコシル化部位）への１つ以上のセリンまたはトレオニン残基の付加または置換によって行なわれ得る。ＥｐｈＡ６アミノ酸配列は、任意選択で、ＤＮＡレベルでの変更によって、特に、ＥｐｈＡ６ポリペプチドをコードするＤＮＡの予め選択した塩基を、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンがもたらされるように変異させることにより改変され得る。
【０１３７】
ＥｐｈＡ６ポリペプチドの糖質部分の数を増加させる別の手段は、該ポリペプチドへのグリコシドの化学的または酵素的カップリングによるものである。かかる方法は、当該技術分野において、例えば、ＷＯ８７／０５３３０（１９８７年９月１１日公開）ならびにＡｐｌｉｎおよびＷｒｉｓｔｏｎ，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐｐ．２５９−３０６（１９８１）に報告されている。
【０１３８】
ＥｐｈＡ６ポリペプチド上に存在する糖質部分の除去は、化学的もしくは酵素的に、またはグリコシル化の標的に供されるアミノ酸残基をコードするコドンの変異置換によって行なわれ得る。化学的脱グリコシル化手法は、当該技術分野で知られており、例えば、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２５９：５２（１９８７）およびＥｄｇｅら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１８：１３１（１９８１）に報告されている。ポリペプチド上の糖質部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１３８：３５０（１９８７）に記載のようなさまざまなエンド−およびエキソ−グリコシダーゼの使用によって行なわれ得る。
【０１３９】
別の型のＥｐｈＡ６ポリペプチドの共有結合性修飾は、ＥｐｈＡ６ポリペプチドを、さまざまな非タンパク質性ポリマーの１つ、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンに、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１９２号または同第４，１７９，３３７号に示された様式で連結させることを含むものである。
【０１４０】
また、本発明のＥｐｈＡ６ポリペプチドは、別の異種ポリペプチドまたはアミノ酸配列に融合されたＥｐｈＡ６ポリペプチドを含むキメラ分子が形成される様式で修飾され得る。
【０１４１】
かかるキメラ分子は、ＥｐｈＡ６ポリペプチドと、抗タグ抗体が選択的に結合し得るエピトープを提供するタグポリペプチドとの融合体を含む。該エピトープタグは、一般的に、ＥｐｈＡ６ポリペプチドのアミノ−またはカルボキシル−末端に配置される。ＥｐｈＡ６ポリペプチドのかかるエピトープタグ化形態の存在は、該タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出され得る。また、エピトープタグを提供することにより、ＥｐｈＡ６ポリペプチドが、抗タグ抗体を用いたアフィニティ精製または該エピトープタグに結合する別の型の親和性マトリックスによって容易に精製されることが可能になる。種々のタグポリペプチドおよびそれらのそれぞれの抗体は、当該技術分野でよく知られている。例としては、ポリヒスチジン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ）またはポリヒスチジン−グリシン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグ；ｆｌｕ  ＨＡタグポリペプチドおよびその抗体１２ＣＡ５［Ｆｉｅｌｄら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８：２１５９−２１６５（１９８８）］；ｃ−ｍｙｃタグおよびこれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７および９Ｅ１０抗体［Ｅｖａｎら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒおよびＣｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５：３６１０−３６１６（１９８５）］；ならびに単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグおよびその抗体［Ｐａｂｏｒｓｋｙら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３（６）：５４７−５５３（１９９０）］が挙げられる。他のタグポリペプチドとしては、Ｆｌａｇペプチド［Ｈｏｐｐら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：１２０４−１２１０（１９８８）］；ＫＴ３エピトープペプチド［Ｍａｒｔｉｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５：１９２−１９４（１９９２）］；α−チューブリンエピトープペプチド［Ｓｋｉｎｎｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：１５１６３−１５１６６（１９９１）］；およびＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ［Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６３９３−６３９７（１９９０）］が挙げられる。
【０１４２】
該キメラ分子は、ＥｐｈＡ６ポリペプチドと免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの特定の領域との融合体を含むものであってもよい。二価形態のキメラ分子（「イムノアドヘシン」とも称される）では、かかる融合体は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域とのものであり得る。Ｉｇ融合体は、好ましくは、Ｉｇ分子内の少なくとも１つの可変領域の代わりに、ＥｐｈＡ６ポリペプチドの可溶性（膜貫通ドメイン欠失または不活化）形態の置換を含むものである。本発明の特に好ましい態様では、免疫グロブリン融合体は、ＩｇＧ１分子のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３、またはヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合体の作製については、米国特許第５，４２８，１３０号（１９９５年６月２７日発行）もまた参照のこと。
【０１４３】
Ｄ．ＥｐｈＡ６ポリペプチドの作製
以下の説明は、主に、ＥｐｈＡ６核酸を含有するベクターで形質転換またはトランスフェクトされた細胞を培養することによるＥｐｈＡ６ポリペプチドの作製に関する。もちろん、当該技術分野でよく知られた択一的な方法を用いてＥｐｈＡ６ポリペプチドが作製され得ることが想定される。例えば、ＥｐｈＡ６配列またはその一部分は、固相手法を用いて直接ペプチド合成により作製され得る［例えば、Ｓｔｅｗａｒｔら，Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ（１９６９）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９−２１５４（１９６３）参照］。インビトロタンパク質合成は、手作業的手法を用いて、または自動化によって行なわれ得る。自動合成は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて製造業者の使用説明書を用いて行なわれ得る。ＥｐｈＡ６ポリペプチドの種々の一部分を別々に化学合成し、化学的または酵素的方法を用いて結合し、完全長ＥｐｈＡ６ポリペプチドを得てもよい。
【０１４４】
１．ＥｐｈＡ６ポリペプチドをコードするＤＮＡの単離
ＥｐｈＡ６ポリペプチドをコードするＤＮＡは、ＥｐｈＡ６  ｍＲＮＡを有し、これを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から作製されたｃＤＮＡライブラリーから得られ得る。したがって、ヒトＥｐｈＡ６  ＤＮＡは、本実施例に記載のものなどのヒト組織から作製されたｃＤＮＡライブラリーから簡便に得られ得る。また、ＥｐｈＡ６コード遺伝子は、ゲノムライブラリーから、または既知の合成手順（例えば、自動核酸合成）によって得られ得る。
【０１４５】
ライブラリーは、目的の遺伝子またはそれにコードされたタンパク質が同定される設計されたプローブ（ＥｐｈＡ６ポリペプチドに対する抗体または少なくとも約２０〜８０塩基のオリゴヌクレオチドなど）を用いてスクリーニングされ得る。選択されたプローブを用いたｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーのスクリーニングは、標準的な手順、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）などに記載のものを用いて行なわれ得る。ＥｐｈＡ６をコードする遺伝子を単離するための択一的な手段は、ＰＣＲ方法論の使用である［Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前掲）；Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈら，ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９５）］。
【０１４６】
以下の実施例に、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのための手法を記載する。プローブとして選択されるオリゴヌクレオチド配列は、十分な長さであり、偽陽性が最小限となる十分に明確なものであるのがよい。該オリゴヌクレオチドは、好ましくは、スクリーニング対象のライブラリー内のＤＮＡにハイブリダイゼーションすると検出されるように標識される。標識方法は、当該技術分野でよく知られており、放射性標識（３２Ｐ標識ＡＴＰなど）、ビオチン化または酵素標識の使用が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件（例えば、中等度ストリンジェンシーおよび高ストリンジェンシー）は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前掲）に示されている。
【０１４７】
かかるライブラリースクリーニング法で同定された配列は、寄託された他の既知配列や公共データベース（ＧｅｎＢａｎｋなど）または他の私有の配列データベースで入手可能な他の既知配列と比較およびアラインメントされ得る。分子の規定領域内または完全長配列全体における配列同一性（アミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルのいずれか）は、当該技術分野で知られた方法および本明細書に記載の方法を用いて測定され得る。
【０１４８】
タンパク質コード配列を有する核酸は、選択したｃＤＮＡまたはゲノムのライブラリーを、本明細書に初めて開示した推定アミノ酸配列を用いて、および必要であれば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前掲）に記載の慣用的なプライマー伸長手順を用いてスクリーニングして前駆体を検出し、ｃＤＮＡに逆転写されなかったものであり得るｍＲＮＡの中間体を処理することにより得られ得る。
【０１４９】
２．宿主細胞の選択および形質転換
宿主細胞は、ＥｐｈＡ６ポリペプチド産生のための本明細書に記載の発現ベクターまたはクローニングベクターでトランスフェクトまたは形質転換し、慣用的な栄養培地（プロモーター誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために適宜改変）中で培養する。培養条件、例えば、培地、温度、ｐＨなどは、当業者が必要以上に実験を行なうことなく選択可能である。一般に、細胞培養物の生産性を最大限にするための原理、プロトコル、および実施手法は、Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｍ．Ｂｕｔｌｅｒ編（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９９１）およびＳａｍｂｒｏｏｋら（前掲）を見るとよい。
【０１５０】
真核生物細胞のトランスフェクションおよび原核生物細胞の形質転換の方法は、当業者にわかり、例えば、ＣａＣｌ２、ＣａＰＯ４、リポソーム媒介型およびエレクトロポレーションである。使用される宿主細胞に応じて、形質転換は、かかる細胞に適切な標準的な手法を用いて行なわれる。塩化カルシウムを用いるカルシウム処理（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前掲）に記載）、またはエレクトロポレーションは、一般的に、原核生物に使用される。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓによる感染は、ある種の植物細胞の形質転換に使用される（Ｓｈａｗら，Ｇｅｎｅ，２３：３１５（１９８３）およびＷＯ８９／０５８５９（１９８９年６月２９日公開）に記載）。かかる細胞壁のない哺乳動物細胞では、Ｇｒａｈａｍおよびｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６−４５７（１９７８）のリン酸カルシウム沈殿法が使用され得る。哺乳動物細胞宿主系のトランスフェクションの一般的な態様は、米国特許第４，３９９，２１６号に記載されている。酵母の形質転換は、典型的には、Ｖａｎ  Ｓｏｌｉｎｇｅｎら，Ｊ．Ｂａｃｔ．，１３０：９４６（１９７７）およびＨｓｉａｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），７６：３８２９（１９７９）の方法に従って行なわれる。しかしながら、細胞内にＤＮＡを導入するための他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、インタクトな細胞との細菌プロトプラスト融合、またはポリカチオン（例えば、ポリブレン、ポリオルニチン）などもまた使用され得る。哺乳動物細胞の形質転換のための種々の手法については、Ｋｅｏｗｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８５：５２７−５３７（１９９０）およびＭａｎｓｏｕｒら，Ｎａｔｕｒｅ，３３６：３４８−３５２（１９８８）を参照のこと。
【０１５１】
本明細書のベクター内のＤＮＡのクローニングまたは発現のための好適な宿主細胞としては、原核生物、酵母、または高等真核生物細胞が挙げられる。好適な原核生物としては、これらに限定されないが、真正細菌、例えば、グラム陰性またはグラム陽性菌、例えば、腸内細菌科（大腸菌など）が挙げられる。種々の大腸菌株、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ  ３１，４４６）；大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ  ３１，５３７）；大腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ  ２７，３２５）およびＫ５  ７７２（ＡＴＣＣ  ５３，６３５）などが公共的に入手可能である。他の適当な原核生物宿主細胞としては、腸内細菌科、例えば、エシェリキア属（例えば、大腸菌）、エンテロバクター属、エルウィニア属、クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ属（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア属（例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）、および赤痢菌属、ならびにバチルス属（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓなど（例えば、ＤＤ  ２６６，７１０（１９８９年４月１２日）に開示されたＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ４１Ｐ））、シュードモナス属（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａなど）、およびストレプトミセス属が挙げられる。これらの例は限定ではなく例示である。Ｗ３１１０菌株は、組換えＤＮＡ作製醗酵に一般的な宿主株であるため、特に好ましい宿主または親宿主の一例である。好ましくは、宿主細胞は、最小限量のタンパク質分解性酵素を分泌するものである。例えば、Ｗ３１１０菌株は、宿主に内在性のタンパク質をコードする遺伝子において遺伝子変異が起こるように修飾され得、かかる宿主の例としては、大腸菌Ｗ３１１０株１Ａ２（これは、完全な遺伝子型ｔｏｎＡを有する；大腸菌Ｗ３１１０株９Ｅ４（これは、完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３を有する）；大腸菌Ｗ３１１０株２７Ｃ７（ＡＴＣＣ  ５５，２４４）（これは、完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｋａｎｒを有する）；大腸菌Ｗ３１１０株３７Ｄ６（これは、完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｒｂｓ７  ｉｌｖＧ  ｋａｎｒを有する）；大腸菌Ｗ３１１０株４０Ｂ４（これは、非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失変異を有する株３７Ｄ６である）；および変異型ペリプラズムプロテアーゼを有する大腸菌株（米国特許第４，９４６，７８３号（１９９０年８月７日発行）に開示）が挙げられる。あるいはまた、インビトロクローニング法、例えば、ＰＣＲまたは他の核酸ポリメラーゼ反応が好適である。
【０１５２】
原核生物に加え、糸状菌または酵母などの真核生物微生物は、ＥｐｈＡ６コードベクターの好適なクローニングまたは発現用宿主である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、一般的に使用されている下等真核生物宿主微生物である。他のものとしては、分裂酵母（ＢｅａｃｈおよびＮｕｒｓｅ，Ｎａｔｕｒｅ，２９０：１４０［１９８１］；ＥＰ１３９，３８３（１９８５年５月２日公開））；クリベロミセス属宿主（米国特許第４，９４３，５２９号；Ｆｌｅｅｒら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：９６８−９７５（１９９１））、例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ（ＭＷ９８−８Ｃ，ＣＢＳ６８３，ＣＢＳ４５７４；Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５４（２）：７３７−７４２［１９８３］），Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ  １２，４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ  １６，０４５），Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ  ２４，１７８）、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ（ＡＴＣＣ  ５６，５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（ＡＴＣＣ  ３６，９０６；Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：１３５（１９９０））、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓおよびＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ；ｙａｒｒｏｗｉａ（ＥＰ４０２，２２６）など；ピキア属  ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＥＰ１８３，０７０；Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａら，Ｊ．Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２８：２６５−２７８［１９８８］）；カンジダ属；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ（ＥＰ２４４，２３４）；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ（Ｃａｓｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：５２５９−５２６３［１９７９］）；シュワニオマイセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ（ＥＰ３９４，５３８（１９９０年１０月３１日公開））など；ならびに糸状菌、例えば、アカパンカビ属、ペニシリウム属、トリポクラジウム属（ＷＯ９１／００３５７（１９９１年１月１０日公開））など、およびアスペルギルス属宿主（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ（Ｂａｌｌａｎｃｅら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１１２：２８４−２８９［１９８３］；Ｔｉｌｂｕｒｎら，Ｇｅｎｅ，２６：２０５−２２１［１９８３］；Ｙｅｌｔｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：１４７０−１４７４［１９８４］）およびＡ．ｎｉｇｅｒ（ＫｅｌｌｙおよびＨｙｎｅｓ，ＥＭＢＯ  Ｊ．，４：４７５−４７９［１９８５］）など）が挙げられる。メチロトローフ酵母は、本明細書において好適であり、これらに限定されないが、ハンゼヌラ属、カンジダ属、クロエケラ属、ピキア属、サッカロミセス属、トルロプシス属、およびロドトルラ属からなる属から選択されるメタノール上で増殖可能な酵母が挙げられる。このクラスの酵母の例示である具体的な種の一覧は、Ｃ．Ａｎｔｈｏｎｙ，Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｓ，２６９（１９８２）を見るとよい。
【０１５３】
グリコシル化ＥｐｈＡ６ポリペプチドの発現に好適な宿主細胞は、多細胞生物体に由来するものである。無脊椎動物細胞の例としては、昆虫細胞（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｓｆ９など）、ならびに植物細胞が挙げられる。有用な哺乳動物宿主細胞株の例としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびＣＯＳ細胞が挙げられる。より具体的な例としては、ＳＶ４０で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１細胞株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胚性腎細胞株（２９３または２９３細胞，浮遊培養での培養のためにサブクローニング，Ｇｒａｈａｍら，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９（１９７７））；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３−２５１（１９８０））；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２，ＨＢ  ８０６５）；およびマウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）が挙げられる。適切な宿主細胞の選択は、当該技術分野の技能の範囲を考える。
【０１５４】
３．複製可能なベクターの選択および使用
ＥｐｈＡ６ポリペプチドをコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）は、クローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のために複製可能なベクター内に挿入され得る。種々のベクターが公共的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、またはファージの形態であり得る。適切な核酸配列が、さまざまな手順によってベクター内に挿入され得る。一般に、ＤＮＡは、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位（１つまたは複数）内に、当該技術分野で知られた手法を用いて挿入される。ベクター成分には、一般的に、これらに限定されないが、シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列の１つ以上が含まれる。これらの成分の１つ以上を含有する適当なベクターの構築には、当業者にわかる標準的なライゲーション手法が使用される。
【０１５５】
ＥｐｈＡ６ポリペプチドは、組換えにより直接的だけでなく、異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても作製され得、該異種ポリペプチドは、シグナル配列または成熟タンパク質もしくはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドであり得る。一般に、シグナル配列は、ベクターの一成分であってもよく、ベクター内に挿入されたＥｐｈＡ６コードＤＮＡの一部分であってもよい。シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、または熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダー配列の群から選択される原核生物系シグナル配列であり得る。酵母内の分泌では、シグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー配列、α因子リーダー配列（例えば、サッカロミセス属およびクリベロミセス属、α−因子リーダー配列、後者は米国特許第５，０１０，１８２号に記載）、または酸ホスファターゼリーダー配列、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ  グルコアミラーゼリーダー配列（ＥＰ３６２，１７９（１９９０年４月４日公開））、またはＷＯ９０／１３６４６（１９９０年１１月１５日公開）に記載のシグナルであり得る。哺乳動物細胞内の発現では、哺乳動物系シグナル配列、例えば、同じ種または関連種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列、ならびにウイルス系分泌リーダー配列などがタンパク質の分泌の指令に使用され得る。
【０１５６】
発現ベクターおよびクローニングベクターはともに、ベクターが１種類以上の選択された宿主細胞内で複製するのを可能にする核酸配列を含有する。かかる配列は、さまざまな細菌、酵母、およびウイルスに関するものがよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２の複製起点は、ほとんどのグラム陰性菌に適しており、２μプラスミド起点は酵母に適しており、種々のウイルス複製起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ）が、哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。
【０１５７】
発現ベクターおよびクローニングベクターは、典型的には、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質もしくは他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、もしくはテトラサイクリンに対する耐性を付与する（ｂ）栄養要求欠乏を補足する、または（ｃ）複合培地から得られ得ない重要な栄養素を補給する（例えば、バチルス属の場合は、Ｄ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）タンパク質をコードするものである。
【０１５８】
哺乳動物細胞に適した選択可能マーカーの一例は、ＥｐｈＡ６コード核酸の取込みに対してコンピテントな細胞の同定を可能にするもの、例えば、ＤＨＦＲまたはチミジンキナーゼなどである。野生型ＤＨＦＲが使用される場合に適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性が欠損したＣＨＯ細胞株であり、これは、Ｕｒｌａｕｂら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６（１９８０）に記載のようにして調製および増殖を行なう。酵母における使用に適した選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７内に存在するｔｒｐ１遺伝子である［Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら，Ｎａｔｕｒｅ，２８２：３９（１９７９）；Ｋｉｎｇｓｍａｎら，Ｇｅｎｅ，７：１４１（１９７９）；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒら，Ｇｅｎｅ，１０：１５７（１９８０）］。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中での増殖能が欠損した酵母の変異型株、例えば、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．４４０７６またはＰＥＰ４−１に対する選択マーカーを提供する［Ｊｏｎｅｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、８５：１２（１９７７）］。
【０１５９】
発現ベクターおよびクローニングベクターは、通常、ＥｐｈＡ６コード核酸配列に作動可能に連結され、ｍＲＮＡ合成を指令するプロモーターを含む。さまざまな潜在宿主細胞によって認識されるプロモーターは十分わかるであろう。原核生物宿主での使用に適したプロモーターとしては、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系［Ｃｈａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ，２７５：６１５（１９７８）；Ｇｏｅｄｄｅｌら，Ｎａｔｕｒｅ，２８１：５４４（１９７９）］、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系［Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，８：４０５７（１９８０）；ＥＰ３６，７７６］、およびハイブリッドプロモーター（ｔａｃプロモーターなど）［ｄｅＢｏｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０：２１−２５（１９８３）］が挙げられる。また、細菌系における使用のためのプロモーターは、ＥｐｈＡ６ポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結されたシャイン−ダルガノ（Ｓ．Ｄ．）配列を含む。
【０１６０】
酵母宿主での使用のための適当なプロモーター配列の例としては、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ［Ｈｉｔｚｅｍａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５５：２０７３（１９８０）］または他の解糖酵素［Ｈｅｓｓら，Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇ．，７：１４９（１９６８）；Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１７：４９００（１９７８）］、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼなどのプロモーターが挙げられる。
【０１６１】
培養条件によって制御される転写のさらなる利点を有する誘導プロモーターである他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連している分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ならびにマルトースおよびガラクトース利用を担う酵素プロモーター領域である。酵母発現における使用に適したベクターおよびプロモーターは、ＥＰ７３，６５７にさらに記載されている。
【０１６２】
哺乳動物宿主細胞におけるベクターからのＥｐｈＡ６転写は、例えば、ウイルス（ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス（ＵＫ２，２１１，５０４（１９８９年７月５日公開））、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）など）のゲノムから得られるプロモーターによって、異種哺乳動物系プロモーター、例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーター、および熱ショックプロモーターによって制御される。ただし、かかるプロモーターは宿主細胞系と適合性であるものとする。
【０１６３】
高等真核生物によるＥｐｈＡ６ポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、エンハンサー配列をベクター内に挿入することにより増大され得る。エンハンサーは、通常、約１０〜３００ｂｐのシス作用性のＤＮＡエレメントであり、プロモーターが転写を増大させるように作用する。現在、哺乳動物系遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトタンパク質、およびインスリン）の多くのエンハンサー配列が知られている。しかしながら、典型的には、真核生物細胞ウイルス由来のエンハンサーが使用される。例としては、複製起点の後期側（１００〜２７０ｂｐ）のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。エンハンサーは、ベクター内にＥｐｈＡ６  コード配列に対して５’または３’位でスプライシングされたものであってもよいが、好ましくはプロモーターから５’の部位に存在させる。
【０１６４】
真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物体由来の有核細胞）において使用される発現ベクターはまた、転写の終結およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。かかる配列は、一般的に、真核生物またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’（場合によっては３’）非翻訳領域から利用可能である。このような領域は、ＥｐｈＡ６ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分のポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
【０１６５】
組換え脊椎動物細胞培養物におけるＥｐｈＡ６ポリペプチドの合成への適合に適したさらに他の方法、ベクター、および宿主細胞は、Ｇｅｔｈｉｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ，２９３：６２０−６２５（１９８１）；Ｍａｎｔｅｉら，Ｎａｔｕｒｅ，２８１：４０−４６（１９７９）；ＥＰ１１７，０６０；およびＥＰ１１７，０５８に記載されている。
【０１６６】
４．遺伝子の増幅／発現の検出
遺伝子の増幅および／または発現は、試料中で直接、例えば、慣用的なサザンブロッティング、ノザンブロッティング（ｍＲＮＡの転写の定量のため）［Ｔｈｏｍａｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：５２０１−５２０５（１９８０）］、ドットブロッティング（ＤＮＡ解析）、またはインサイチュハイブリダイゼーションにより、適切に標識されたプローブを使用し、本明細書に提供した配列に基づいて測定され得る。あるいはまた、特定の二本鎖、例えば、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖またはＤＮＡ−タンパク質二本鎖を認識し得る抗体が使用され得る。また、該抗体を標識してアッセイを行なってもよく、その場合、二本鎖を表面に結合させ、該表面上で二本鎖が形成されると、該二本鎖に結合した抗体の存在が検出され得るようにする。
【０１６７】
あるいはまた、遺伝子発現は、免疫学的方法（細胞または組織切片の免疫組織化学的染色など）および細胞培養物または体液のアッセイなどによって測定され得、遺伝子産物の発現を直接定量する。免疫組織化学的染色および／または試料液のアッセイに有用な抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルのいずれかであり得、任意の哺乳動物において調製され得る。簡便には、該抗体は、天然配列ＥｐｈＡ６ポリペプチドに対して、または本明細書に提供したＤＮＡ配列に基づいた合成ペプチドに対して、またはＥｐｈＡ６  ＤＮＡに融合させ、かつ特定の抗体エピトープをコードした外来配列に対して調製され得る。
【０１６８】
５．ポリペプチドの精製
ＥｐｈＡ６ポリペプチド形態は、培養培地または宿主細胞ライセートから回収され得る。膜結合型の場合は、適当なデタージェント溶液（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００）を用いて、または酵素的切断によって膜から放出させ得る。ＥｐｈＡ６ポリペプチドの発現に用いられる細胞は、種々の物理的または化学的手段、例えば、凍結−解凍サイクル、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤などによって破壊させ得る。
【０１６９】
組換え細胞タンパク質またはポリペプチドからＥｐｈＡ６ポリペプチドを精製することが望ましい場合もあり得る。以下の手順は、例示的な好適な精製手順である：イオン交換カラムでの分別；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカまたはカチオン交換樹脂（ＤＥＡＥなど）上でのクロマトグラフィー；等電点電気泳動；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；ゲル濾過（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５を使用）；プロテインＡセファロースカラムによる夾雑物（ＩｇＧなど）の除去；および金属キレートカラム（エピトープタグ化形態のＥｐｈＡ６ポリペプチドを結合）。種々のタンパク質精製方法が使用され得、かかる方法は、当該技術分野で知られており、例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８２（１９９０）；Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２）に報告されている。選択される精製工程（１回または複数回）は、例えば、使用される作製方法の性質および作製される具体的なＥｐｈＡ６ポリペプチドに依存する。
【０１７０】
Ｅ．ＥｐｈＡ６ポリペプチドの使用
ＥｐｈＡ６ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（またはその相補配列）は、分子生物学の技術分野において種々の適用用途を有し、染色体および遺伝子マッピングならびにアンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡの作製におけるハイブリダイゼーションプローブとしての使用が挙げられる。また、ＥｐｈＡ６核酸は、本明細書に記載の組換え手法によるＥｐｈＡ６ポリペプチドの調製に有用である。
【０１７１】
完全長天然配列ＥｐｈＡ６遺伝子またはその一部分は、完全長ＥｐｈＡ６  ｃＤＮＡを単離するため、および本明細書に開示した天然ＥｐｈＡ６配列と所望の配列同一性を有するさらに他のｃＤＮＡ（例えば、他の種に由来するＥｐｈＡ６ポリペプチドまたはＥｐｈＡ６ポリペプチドの天然に存在するバリアントをコードするもの）を単離するためのｃＤＮＡライブラリー用のハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。任意選択で、該プローブの長さは約２０〜約５０塩基である。ハイブリダイゼーションプローブは、完全長天然ヌクレオチド配列の少なくとも一部新規な領域に由来するものであり得、該領域は、必要以上に実験を行なうことなく決定されるもの、またはゲノム配列に由来するものであり得、天然配列ＥｐｈＡ６のプロモーター、エンハンサーエレメントおよびイントロンが挙げられる。一例として、スクリーニング法は、選択した約４０塩基のプローブを合成するための既知のＤＮＡ配列を用いて、ＥｐｈＡ６遺伝子のコード領域を単離することを含むものである。ハイブリダイゼーションプローブは、さまざまな標識、例えば、放射性ヌクレオチド（３２Ｐもしくは３５Ｓなど）、または酵素標識（アビジン／ビオチンカップリング系によってプローブにカップリングさせたアルカリホスファターゼなど）によって標識され得る。本発明のＥｐｈＡ６遺伝子のものに相補的な配列を有する標識プローブは、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングするために使用され得、かかるライブラリーのどの構成員に該プローブがハイブリダイズするかが測定される。ハイブリダイゼーション手法を、以下の実施例においてさらに詳細に記載する。
【０１７２】
本出願書類に開示した任意のＥＳＴ配列は、本明細書に開示した方法を用いてプローブとして同様に使用され得る。
【０１７３】
ＥｐｈＡ６核酸の他の有用な断片としては、標的ＥｐｈＡ６  ｍＲＮＡ（センス）またはＥｐｈＡ６  ＤＮＡ（アンチセンス）配列に結合することができる単鎖核酸配列（ＲＮＡもしくはＤＮＡのいずれか）を含むアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。本発明によるアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、ＥｐｈＡ６  ＤＮＡのコード領域の断片を含む。かかる断片は、一般的に、少なくとも約１４ヌクレオチド、好ましくは約１４〜３０ヌクレオチドを含む。所与のタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づいてアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドが誘導できることは、例えば、ＳｔｅｉｎおよびＣｏｈｅｎ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８：２６５９，１９８８）ならびにｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒｏｌら（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８，１９８８）に報告されている。
【０１７４】
標的核酸配列へのアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドの結合により二本鎖の形成がもたらされ、これにより、標的配列の転写または翻訳が、いくつかの手段（例えば、二本鎖の分解増強、転写または翻訳の早期終結）の１つ、または他の手段によってブロックされる。したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチドはＥｐｈＡ６の発現をブロックするために使用され得る。アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、さらに、修飾糖ホスホジエステル主鎖（または他の糖鎖結合（ＷＯ９１／０６６２９に記載のものなど））を有するオリゴヌクレオチドを含み、ここで、かかる糖鎖結合は内在性ヌクレアーゼに抵抗性である。抵抗性糖鎖結合を有するかかるオリゴヌクレオチドは、インビボで安定である（すなわち、酵素的分解に耐えることができる）が、標的ヌクレオチド配列に結合できる配列特異性を保持している。
【０１７５】
センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例としては、有機部分に共有結合されたオリゴヌクレオチド（ＷＯ９０／１００４８に記載のものなど）、および標的核酸配列に対する該オリゴヌクレオチドの親和性を増大させる他の部分（ポリ（Ｌ−リシン）など）が挙げられる。なおさらには、インターカレート剤（エリプチシンなど）、およびアルキル化剤または金属錯体をセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させて、標的ヌクレオチド配列に対するアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドの結合特異性を修飾してもよい。
【０１７６】
アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、標的核酸配列を含む細胞内に、任意の遺伝子導入方法（例えば、ＣａＰＯ４媒介型ＤＮＡトランスフェクション、エレクトロポレーションなど）によって、または遺伝子導入ベクター（エプスタイン−バーウイルスなど）を用いることによって導入され得る。好ましい手順において、アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、適当なレトロウイルスベクター内に挿入される。標的核酸配列を含む細胞は、組換えレトロウイルスベクターとインビボまたはエキソビボのいずれいかで接触させる。好適なレトロウイルスベクターとしては、限定されないが、マウスレトロウイルスＭ−ＭｕＬＶ由来のもの、Ｎ２（Ｍ−ＭｕＬＶ由来のレトロウイルス）、またはＤＣＴ５Ａ、ＤＣＴ５ＢおよびＤＣＴ５Ｃ二重コピーベクターで指定され（ＷＯ９０／１３６４１参照）が挙げられる。
【０１７７】
また、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ヌクレオチド配列を含む細胞内に、ＷＯ９１／０４７５３に記載のようなリガンド結合分子とのコンジュゲートの形成によって導入され得る。好適なリガンド結合分子としては、限定されないが、細胞表面受容体、増殖因子、他のサイトカイン、または細胞表面受容体に結合する他のリガンドが挙げられる。好ましくは、リガンド結合分子のコンジュゲーションは、リガンド結合分子がその対応する分子もしくは受容体に結合する能力を実質的に妨害しないもの、またはセンスもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチドあるいはそのコンジュゲート型が細胞内に進入するのをブロックしないものである。
【０１７８】
あるいはまた、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的核酸配列を含む細胞内に、ＷＯ９０／１０４４８に記載のようなオリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成によって導入され得る。センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質複合体は、好ましくは、細胞内で内在性リパーゼによって解離されるものである。
【０１７９】
アンチセンスまたはセンスＲＮＡまたはＤＮＡ分子は、一般的に、少なくとも約５塩基長、約１０塩基長、約１５塩基長、約２０塩基長、約２５塩基長、約３０塩基長、約３５塩基長、約４０塩基長、約４５塩基長、約５０塩基長、約５５塩基長、約６０塩基長、約６５塩基長、約７０塩基長、約７５塩基長、約８０塩基長、約８５塩基長、約９０塩基長、約９５塩基長、約１００塩基長、またはそれ以上である。
【０１８０】
また、ＰＣＲ手法では、プローブを用いて近縁ＥｐｈＡ６コード配列同定のための配列プールが作製され得る。
【０１８１】
ＥｐｈＡ６ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列はまた、ＥｐｈＡ６ポリペプチドをコードする遺伝子をマッピングするため、および遺伝性障害を有する個体の遺伝的解析ためのハイブリダイゼーションプローブを構築するために使用され得る。本明細書に提供したヌクレオチド配列は、染色体および染色体の特定領域に、既知の手法、例えば、インサイチュハイブリダイゼーション、既知染色体マーカーに対する連鎖解析、およびライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニングなどを用いてマッピングされ得る。
【０１８２】
ＥｐｈＡ６のコード配列は、別のタンパク質（ＥｐｈＡ６が受容体である）に結合するタンパク質をコードするため、ＥｐｈＡ６ポリペプチドは、該結合相互作用に関与するその他のタンパク質または分子を同定するためのアッセイにおいて使用され得る。かかる方法によって、該受容体／リガンド結合相互作用のインヒビターが同定され得る。また、かかる結合相互作用に関与するタンパク質は、該結合相互作用のペプチドまたは小分子のインヒビターまたはアゴニストについてスクリーニングするために使用され得る。受容体ＥｐｈＡ６は、相関するリガンド（１つまたは複数）を単離するために使用され得る。スクリーニングアッセイは、天然ＥｐｈＡ６ポリペプチドの生物学的活性を模倣するリード化合物が見い出されるように設計され得る。かかるスクリーニングアッセイは、化学物質ライブラリーのハイスループットスクリーニングに適し小分子薬物候補の同定に特に適したものとなるアッセイを含む。想定される小分子としては、合成の有機または無機化合物が挙げられる。該アッセイは、さまざまな形式で、例えば、当該技術分野において十分特性評価されたタンパク質−タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイおよび細胞系アッセイにて行なわれ得る。
【０１８３】
また、ＥｐｈＡ６ポリペプチドまたはその修飾形態をコードする核酸は、トランスジェニック動物または「ノックアウト」動物のいずれかを作出するために使用され得、該動物は、さらに、治療上有用な試薬の開発およびスクリーニングに有用である。トランスジェニック動物（例えば、マウスまたはラット）は、導入遺伝子を含む細胞を有する動物であり、該導入遺伝子は、該動物または該動物の出生前（例えば、胚段階）にその祖先に導入されたものである。導入遺伝子は、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノム内に組み込まれるＤＮＡである。本発明は、確立された手法に従ってＥｐｈＡ６ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡをクローニングするために使用され得るＥｐｈＡ６ポリペプチドをコードするｃＤＮＡと、ＥｐｈＡ６ポリペプチドをコードするＤＮＡを発現する細胞を含むトランスジェニック動物を作出するのに使用されるゲノム配列とを提供する。当該技術分野で知られた任意の手法を用いて標的遺伝子である導入遺伝子が動物に導入され、トランスジェニック動物の創始系が作出され得る。かかる手法としては、限定されないが、前核マイクロインジェクション（米国特許第４，８７３，１９１号、同第４，７３６，８６６号および同第４，８７０，００９号）；生殖細胞系内へのレトロウイルス媒介型遺伝子導入（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｕｔｔｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ、８２：６１４８−６１５２（１９８５））；胚性幹細胞における遺伝子標的化（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，Ｃｅｌｌ，５６：３１３−３２１（１９８９））；遺伝子トラップベクターを用いた非特異的挿入不活化（米国特許第６，４３６，７０７号）；胚のエレクトロポレーション（Ｌｏ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３：１８０３−１８１４（１９８３））；および精子媒介型遺伝子導入（Ｌａｖｉｔｒａｎｏら，Ｃｅｌｌ，５７：７１７−７２３（１９８９））；などが挙げられる。典型的には、特定の細胞が、組織特異的エンハンサーを伴ってＥｐｈＡ６導入遺伝子組込みに標的化され得る。胚段階で動物の生殖細胞系に導入されたＥｐｈＡ６ポリペプチドコード導入遺伝子コピーを含むトランスジェニック動物を用いて、ＥｐｈＡ６ポリペプチドをコードするＤＮＡの発現増大の効果が検討され得る。かかる動物は、例えば、該ＤＮＡの過剰発現と関連している病的状態からの保護を付与すると考えられる試薬の試験動物として使用され得る。本発明のこの一面によれば、動物を該試薬で処置し、該導入遺伝子を有する未処置動物と比較したときの該病的状態の発生の低減は、病的状態に対する治療的介入の可能性を示し得る。あるいはまた、ＥｐｈＡ６ポリペプチドの非ヒトホモログは、ＥｐｈＡ６「ノックアウト」動物を構築するために使用され得、該動物は、ＥｐｈＡ６ポリペプチドをコードする内在性の遺伝子と、該動物の胚性幹細胞内に導入されたＥｐｈＡ６ポリペプチドコード改変ゲノムＤＮＡとの相同組換えの結果としてのＥｐｈＡ６タンパク質コード欠陥または改変遺伝子を有する。好ましくは、ノックアウト動物は哺乳動物である。より好ましくは、哺乳動物は、ラットまたはマウスなどの齧歯類である。例えば、ＥｐｈＡ６ポリペプチドをコードするｃＤＮＡは��確立された手法に従ってＥｐｈＡ６ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡをクローニングするために使用され得る。ＥｐｈＡ６ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡは、一部分が、欠失したものであってよく、別の遺伝子、例えば、組込みをモニターするために使用され得る選択可能マーカーをコードする遺伝子で置き換えられたものであってもよい。典型的には、数キロ塩基の未改変フランキングＤＮＡ（５’および３’の両末端）をベクターに含める［例えば、相同組換えベクターの説明については、ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ，５１：５０３（１９８７）を参照のこと］。ベクターを胚性幹細胞株内に導入し（例えば、エレクトロポレーションによって）、導入ＤＮＡが内在ＤＮＡと相同組換えされた細胞を選択する［例えば、Ｌｉら，Ｃｅｌｌ，６９：９１５（１９９２）参照］。次いで、選択した細胞を、動物（例えば、マウスまたはラット）の胚盤胞内に注射し、凝集キメラを形成させる［例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ，ｉｎ  Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編（ＩＲＬ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８７），ｐｐ．１１３−１５２参照］。次いで、キメラ胚を適当な偽妊娠雌養育動物に移植し、および胚を出生まで至らせ、「ノックアウト」動物を作出する。相同組換えＤＮＡを生殖細胞内に有する子孫は、標準的な手法によって確認され得、全細胞が相同組換えＤＮＡを有する動物を繁殖させるために使用され得る。ノックアウト動物は、例えば、ある種の病的状態に対する防御能力、およびＥｐｈＡ６ポリペプチドをコードする遺伝子の非存在による病的状態の発生を特徴とするものである。
【０１８４】
また、ノックアウトマウスは、遺伝子機能および薬物標的に対する医薬有用性の知得、ならびに所与の標的と関連している予測どおりの副作用の可能性の測定において高度に情報提供性のあるものであり得る。遺伝子機能および生理学機能は、マウスとヒトとで非常によく保存されている。これは、両者がともに哺乳動物であり、類似した数の遺伝子を含み、該遺伝子が種間で高度に保存されているためである。最近、例えば、マウスの第１６染色体上の遺伝子の９８％がヒトオルソログを有することが文書で十分に立証された（Ｍｕｒａｌら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：１６６１−７１（２００２））。
【０１８５】
胚性幹（ＥＳ）細胞における遺伝子標的化によって、ヒト疾患と関連している多くの遺伝子にヌル変異を有するマウスの構築が可能となったが、遺伝性疾患のすべてがヌル変異に起因する訳ではない。マウス遺伝子座を破壊して変異を有するヒト相対遺伝子を導入する遺伝子置換（ノックイン）方法を確立することにより、ヒト疾患の有益なマウスモデルが設計され得る。続いて、ヒトタンパク質を標的化するインビボ薬物試験が行なわれ得る（Ｋｉｔａｍｏｔｏら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２２２：７４２−４７（１９９６））。
【０１８６】
また、ＥｐｈＡ６ポリペプチドをコードする核酸は、遺伝子療法において使用され得る。遺伝子療法の適用では、例えば、欠陥遺伝子と置き換えて、治療上有効な遺伝子産物のインビボ合成を行なわせるために遺伝子を細胞内に導入する。「遺伝子療法」は、単独処置によって持続性効果を達成する従来の遺伝子療法と、治療上有効なＤＮＡまたはｍＲＮＡの単回または反復投与を伴う遺伝子療法剤の投与の両方を包含する。アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡは、ある種の遺伝子の発現をインビボでブロックするための治療用薬剤として使用され得る。既に、短鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞内に輸送され得、細胞膜による取込みが限定的なため細胞内濃度が低いにもかかわらず、該細胞内でインヒビターとして作用することが示されている（Ｚａｍｅｃｎｉｋら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：４１４３−４１４６［１９８６］）。該オリゴヌクレオチドは、その取込みが向上するように、例えば、負電荷を有するホスホジエステル基を無電荷の基で置換することにより修飾してもよい。
【０１８７】
バイアブル細胞内への核酸の導入には、さまざまな手法が利用可能である。手法は、核酸が培養細胞にインビトロで導入されるのか、または意図される宿主の細胞内にインビボで導入されるのかによって異なる。インビトロでの哺乳動物細胞内への核酸導入に適した手法としては、リポソームの使用、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法などが挙げられる。現時点で好ましいインビボ遺伝子導入手法としては、ウイルスの（典型的には、レトロウイルス）ベクターでのトランスフェクション、およびウイルスコートタンパク質−リポソーム媒介型トランスフェクション（Ｄｚａｕら，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１，２０５−２１０［１９９３］）が挙げられる。状況によっては、核酸供給源に、標的細胞を標的化する薬剤、例えば、細胞表面膜タンパク質または標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上の受容体に対するリガンドなどを提供することが望ましい。リポソームが使用される場合、エンドサイトーシスと関連している細胞表面膜タンパク質にタンパク質が、標的化および／または取込みの助長のために使用され得、例えば、特定の細胞型に向性のキャプシドタンパク質またはその断片、サイクルにおいてインターナリゼーションを受けるタンパク質に対する抗体、細胞内局在を標的化し細胞内半減期を向上させるタンパク質などである。受容体媒介型エンドサイトーシスの手法は、例えば、Ｗｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２，４４２９−４４３２（１９８７）；およびＷａｇｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７，３４１０−３４１４（１９９０）に記載されている。遺伝子の作製および遺伝子療法のプロトコルの概説については、Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６，８０８−８１３（１９９２）を参照のこと。
【０１８８】
本明細書に記載のＥｐｈＡ６ポリペプチドはまた、タンパク質の電気泳動目的の分子量マーカーとしても使用され得、その単離核酸配列は、該マーカーの組換え発現に使用され得る。
【０１８９】
本明細書に記載のＥｐｈＡ６ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸分子は、染色体の同定に有用である。この点に関して、実際の配列データに基づいて染色体をマーキングする現在利用可能な試薬が比較的少ないため、新たな染色体マーカーを同定する必要性が依然として存在する。本発明のＥｐｈＡ６核酸分子は、各々が染色体マーカーとして使用され得る。
【０１９０】
本発明のＥｐｈＡ６ポリペプチドおよび核酸分子はまた、組織型分類のために診断的に使用され得、ここで、本発明のＥｐｈＡ６ポリペプチドは、ある組織において別の組織と比較して、好ましくは疾患組織において同じ組織型の正常組織と比較して識別的に発現され得る。ＥｐｈＡ６核酸分子には、ＰＣＲ、ノザン解析、サザン解析およびウエスタン解析用のプローブを作製するための用途が見い出される。
【０１９１】
また、本明細書に記載のＥｐｈＡ６ポリペプチドは、治療用薬剤として使用され得る。本発明のＥｐｈＡ６は、医薬として有用な組成物を調製するための既知の方法に従って製剤化され得、この場合、そのＥｐｈＡ６製剤は、薬学的に許容され得る担体ビヒクルと混合して合わされたものである。治療用製剤は、保存のため、所望の程度の純度を有する活性成分を、任意選択の生理学的に許容され得る担体、賦形剤または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  第１６版，Ｏｓｏｌ、Ａ．編（１９８０））と混合することにより、凍結乾燥製剤または水性液剤の形態で調製される。許容され得る担体、賦形剤または安定剤は、使用される投薬量および濃度でレシピエントに対して無毒性のものであり、バッファー（リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸など）；抗酸化剤（アスコルビン酸など）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリンなど）；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリシンなど）；単糖類、二糖類および他の糖質（グルコース、マンノース、もしくはデキストリンなど）；キレート化剤（ＥＤＴＡなど）；糖アルコール（マンニトールもしくはソルビトールなど）；塩形成性対イオン（ナトリウムなど）；および／または非イオン系界面活性剤（ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）もしくはＰＥＧなど）が挙げられる。
【０１９２】
インビボ投与に使用される製剤は、滅菌されたものでなければならない。これは、凍結乾燥と再構成の前または後に滅菌濾過膜に通す濾過によって容易になされる。
【０１９３】
本明細書における治療用組成物は、一般的に、滅菌供給口を有する容器内、例えば、皮下注射針が貫通可能なストッパーを有する静注液バッグまたはバイアル内に入れられる。
【０１９４】
投与経路は、既知の方法によるもの、例えば、静脈内、腹腔内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内もしくは病変内経路、経表面投与、または徐放系による注射または注入である。
【０１９５】
本発明の医薬組成物の投薬量および所望薬物濃度は、想定される具体的な使用に応じて異なり得る。適切な投薬量または投与経路の決定は、十分、当業者である医師の技能の範囲である。動物実験により、ヒトの治療に対する有効用量の決定のための信頼性のある手引きが得られる。有効用量の種間調整は、Ｍｏｒｄｅｎｔｉ、Ｊ．およびＣｈａｐｐｅｌｌ，Ｗ．“Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ  ｓｃａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ”．Ｉｎ  Ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｙａｃｏｂｉら編，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８９，ｐｐ．４２−９６に規定された原則に従って行なわれ得る。
【０１９６】
ＥｐｈＡ６ポリペプチドまたはそのアゴニストもしくはアンタゴニストのインビボ投与が使用される場合、通常の投薬量は、投与経路に応じて約１０ｎｇ／ｋｇ〜１００ｍｇまで／ｋｇ哺乳動物体重／日またはそれ以上、好ましくは約１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日で種々であり得る。具体的な投薬量および送達方法に関する手引きは、文献に示されている。例えば、米国特許第４，６５７，７６０号；同第５，２０６，３４４号；または同第５，２２５，２１２号を参照のこと。処置化合物および障害が異なれば有効な製剤も異なること、および例えば、ある器官または組織を標的とする投与は、別の器官または組織に対するものと異なる様式の送達が必要とされ得ることが予測される。
【０１９７】
ＥｐｈＡ６ポリペプチドの投与が必要とされる任意の疾患または障害の処置に適した放出特性を有する製剤にて、ＥｐｈＡ６ポリペプチドの徐放投与が所望される場合、徐放ＥｐｈＡ６ポリペプチドのマイクロカプセル化が想定される。組換えタンパク質のマイクロカプセル化は、ヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）、インターフェロン−（ｒｈＩＦＮ−）、インターロイキン−２、およびＭＮ  ｒｇｐ１２０で成功裡に行なわれている。Ｊｏｈｎｓｏｎら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，２：７９５−７９９（１９９６）；Ｙａｓｕｄａ，Ｂｉｏｍｅｄ．Ｔｈｅｒ．，２７：１２２１−１２２３（１９９３）；Ｈｏｒａら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：７５５−７５８（１９９０）；Ｃｌｅｌａｎｄ，“Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｏｌｙｌａｃｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｄｅ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，”  ｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＰｏｗｅｌｌおよびＮｅｗｍａｎ編，（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９５），ｐｐ．４３９−４６２；ＷＯ９７／０３６９２，ＷＯ９６／４００７２，ＷＯ９６／０７３９９；ならびに米国特許第５，６５４，０１０号。
【０１９８】
これらのタンパク質の徐放製剤は、その生体適合性と広範囲の生分解性のためポリ−乳酸−コグリコール酸（ＰＬＧＡ）ポリマーを用いて開発された。ＰＬＧＡの分解生成物である乳酸とグリコール酸は、ヒト体内で速やかに排出され得る。さらに、このポリマーの分解可能性は、その分子量と組成によって数ヶ月から数年まで調整され得る。Ｌｅｗｉｓ，“Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔｓ  ｆｒｏｍ  ｌａｃｔｉｄｅ／ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｅｒ，”ｉｎ：Ｍ．ＣｈａｓｉｎおよびＲ．Ｌａｎｇｅｒ（編）、Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９０），ｐｐ．１−４１。
【０１９９】
本発明は、ＥｐｈＡ６ポリペプチドを模倣するもの（アゴニスト）、またはＥｐｈＡ６ポリペプチドの効果を妨げるもの（アンタゴニスト）を同定するための化合物のスクリーニング方法を包含する。ＥｐｈＡ６ポリペプチドを模倣するアゴニストは、ＥｐｈＡ６ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊をゲノム内に含む非ヒトトランスジェニック動物での所見に基づいて負の表現型が観察される場合、特に治療的に有益である。したがって、ＥｐｈＡ６遺伝子の場合、マウスにおけるＥｐｈＡ６の遺伝子機能阻害により、特に、学習と記憶の試験において行動欠陥がもたらされた。実施例２に記載するように、痕跡条件付け訓練パラダイムを使用し、ＥｐｈＡ６が欠損したマウスは、野生型マウスほど強く課題を習得しなかった。２４時間後、同じ文脈で試験すると、ノックアウトマウスは野生型マウスほど多くすくみを示さず、これは、訓練文脈の結果の記憶の低下を示す。また、異なる文脈で条件刺激に対する応答性について試験すると、ノックアウトマウスは、同様に野生型マウスよりも反応が不十分であった。モリスの水迷路課題の隠れプラットフォームフェーズでは、ノックアウトマウスは、野生型マウスと同じ上達レベルに達しなかった。また、ノックアウトマウスは、第２回の精査試行中も反応が不十分であった。しかしながら、ノックアウトマウスは、ＷＴマウスと同じくらい容易に隠れプラットフォームの新たな位置を学習した。このような特定の欠陥は、ＥｐｈＡ６が、空間条件および文脈条件を用いた学習の基礎となる神経回路に関与していることを示す。したがって、ＥｐｈＡ６およびＥｐｈＡ６アゴニストには、ＥｐｈＡ６機能障害と関連している学習および／または記憶の障害、特に、空間および／または文脈の学習および／または記憶における障害の予防と処置における有用性が見い出される。
【０２００】
ＥｐｈＡ６ポリペプチドに対するアゴニストの効果は、例えば、既知の負のノックアウト表現型を改善するために、ＥｐｈＡ６アゴニストを非ヒトトランスジェニックマウスに投与することによって評価され得る。したがって、まず対象のＥｐｈＡ６遺伝子をノックアウトし、ＥｐｈＡ６遺伝子のノックアウトまたは破壊の結果得られた表現型が観察され得る。次いでその後、ＥｐｈＡ６ポリペプチドに対するアゴニストを非ヒトトランスジェニックマウスに投与することにより、ＥｐｈＡ６ポリペプチドに対するアゴニストの有効性が評価され得る。有効なアゴニストは、ノックアウト動物で最初に観察された負の表現型効果を改善することが予測される。
【０２０１】
また、本明細書に開示した分子の診断的および治療的使用は、以下に開示および記載する陽性機能アッセイヒットに基づいたものであってもよい。
【０２０２】
Ｆ．抗ＥｐｈＡ６抗体
本発明は、抗ＥｐｈＡ６抗体を提供し、該抗体には、本明細書において治療用および／または診断用薬剤としての用途が見い出され得る。例示的な抗体としては、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性、およびヘテロコンジュゲート抗体、例えば、アゴニスト抗体が挙げられる。
【０２０３】
１．ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、好ましくは、動物において関連抗原とアジュバントの反復皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射によって生成させる。これは、関連抗原（特に、合成ペプチドが使用される場合）を、免疫処置する種において免疫原性であるタンパク質にコンジュゲートさせるのに有用であり得る。例えば、抗原は、スカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、またはダイズトリプシンインヒビターに、二官能性の薬剤または誘導体化剤を用いて、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基によりコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基により）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、またはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、ＲおよびＲ１は、異なるアルキル基である）を用いてコンジュゲートさせ得る。
【０２０４】
動物は、抗原、免疫原性コンジュゲートまたは誘導体に対して、例えば、１００μｇまたは５μｇの該タンパク質またはコンジュゲート（それぞれ、ウサギまたはマウスに対して）を、３容量のフロイント完全アジュバントと合わせ、この溶液を多数の部位に皮内注射することにより免疫処置される。１ヶ月後、動物に、該ペプチドまたはコンジュゲート最初の量の１／５〜１／１０をフロイント完全アジュバント中にて、多数の部位に皮内注射することにより追加免疫刺激する。７〜１４日後、動物から採血し、血清を抗体価についてアッセイする。動物には、抗体価が安定するまで追加免疫刺激する。また、コンジュゲートは、組換え細胞培養物中でタンパク質融合体としても作製され得る。また、免疫応答を増強させるため、ミョウバンなどの凝集剤が好適に使用される。
【０２０５】
２．モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）に最初に報告）を用いて作製され得るか、または組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）によって作製され得る。
【０２０６】
ハイブリドーマ法では、マウスまたは他の適切な宿主動物（ハムスターなど）を上記のようにして免疫処置し、免疫処置に用いるタンパク質に特異的に結合する抗体を産生する、または該抗体の産生能を有するリンパ球を誘発させる。あるいはまた、リンパ球をインビトロで免疫処置してもよい。免疫処置後、リンパ球を単離し、次いで、ポリエチレングリコールなどの適当な融合剤を用いて骨髄腫細胞株と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。
【０２０７】
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を適当な培養培地に播種して培養する。該培地は、好ましくは、融合していない親骨髄腫細胞（融合パートナーとも称する）の増殖または生存を阻害する１種類以上の物質を含むものである。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠損している場合、ハイブリドーマのための選択培養培地は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含むもの（ＨＡＴ培地）であり、該物質は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を抑制するものである。
【０２０８】
好ましい融合パートナー骨髄腫細胞は、選択した抗体産生細胞に効率的に融合し、該細胞による抗体の安定な高レベル産生を支持し、かつ、非融合親細胞に選択的な選択培地に対して感受性のものである。好ましい骨髄腫細胞株は、マウス骨髄腫細胞株（Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＵＳＡから入手可能なＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍に由来するものなど）、ならびにＳＰ−２および誘導体（例えば、Ｘ６３−Ａｇ８−６５３細胞、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ，ＵＳＡから入手可能）である。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株もまた、ヒトモノクローナル抗体の産生について報告されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；およびＢｒｏｄｅｕｒら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７））。
【０２０９】
ハイブリドーマ細胞を培養している培養培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈殿またはインビトロ結合アッセイ（ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）もしくは酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）など）によって測定される。
【０２１０】
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Ｍｕｎｓｏｎら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）に記載のスキャッチャード解析によって測定され得る。
【０２１１】
所望の特異性、親和性、および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定されたら、クローンを、限界希釈手順によってサブクローニングし、標準的な方法によって培養してもよい（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。この目的に好適な培養培地としては、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。また、ハイブリドーマ細胞を、例えば、該細胞をマウスにｉ．ｐ．注射することにより動物において腹水中の腫瘍としてインビボで増殖させてもよい。
【０２１２】
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、培養培地、腹水液または血清から慣用的な抗体精製手順によって、例えば、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、プロテインＡもしくはプロテインＧ−セファロースを使用）またはイオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析などによって適切に分離される。
【０２１３】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、慣用的な手順を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子に対して特異的結合能を有するオリゴヌクレオチドプローブの使用によって）容易に単離され、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、かかるＤＮＡの好ましい供給源として供される。単離されたら、該ＤＮＡは、発現ベクター内に配置され得、次いで、これを、通常は抗体タンパク質を産生しない宿主細胞（大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞など）にトランスフェクトし、組換え宿主細胞内でのモノクローナル抗体の合成を得る。細菌内での抗体コードＤＮＡの組換え発現に関する概説論文としては、Ｓｋｅｒｒａら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５：２５６−２６２（１９９３）およびＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ．１３０：１５１−１８８（１９９２）が挙げられる。
【０２１４】
モノクローナル抗体または抗体断片は、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４（１９９０）に記載の手法を用いて作製された抗体ファージライブラリーから単離したものであってもよい。Ｃｌａｃｋｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）には、それぞれ、ファージライブラリーを用いたマウス抗体およびヒト抗体の単離が記載されている。その後の刊行物には、非常に大きなファージライブラリーを構築するためのストラテジーとして、鎖シャッフリング（Ｍａｒｋｓら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：７７９−７８３（１９９２））、ならびにコンビナトリアル感染およびインビボ組換えによる高親和性（ｎＭ範囲）のヒト抗体の産生が記載されている（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２１：２２６５−２２６６（１９９３））。したがって、これらの手法は、モノクローナル抗体の単離のための従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ手法に対する実行可能な択一法である。
【０２１５】
抗体をコードするＤＮＡは、キメラまたは融合抗体ポリペプチドが産生されるように、例えば、ヒト重鎖と軽鎖の定常ドメイン（ＣＨとＣＬ）配列を相同なマウス配列に置換すること（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１（１９８４））、または免疫グロブリンコード配列を、非免疫グロブリンポリペプチド（異種ポリペプチド）のコード配列の全部もしくは一部と融合させることにより修飾してもよい。非免疫グロブリンポリペプチド配列は、抗体の定常ドメインが置換されたものであってもよく、抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインが置換されたものであってもよく、抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位と、異なる抗原に対する特異性を有する別の抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体が作出される。
【０２１６】
３．ヒト抗体およびヒト化抗体
本発明の抗ＥｐｈＡ６抗体には、さらに、ヒト化抗体またはヒト抗体が包含され得る。非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含むキメラの免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはその断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、あるいは抗体の他の抗原結合部分配列など）である。ヒト化抗体としては、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）が挙げられ、これは、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、所望の特異性、親和性および能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）（マウス、ラットまたはウサギなど）のＣＤＲ由来の残基で置き換えられたものである。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基で置き換えられている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも輸入（ｉｍｐｏｒｔ）ＣＤＲ配列またはフレームワーク配列にも見られない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全部を含み、このとき、ＣＤＲ領域の全部または実質的に全部が、非ヒト免疫グロブリンのものに相当し、ＦＲ領域の全部または実質的に全部が、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）（典型的には、ヒト免疫グロブリンのもの）の少なくとも一部分を含むものである［Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２）］。
【０２１７】
非ヒト抗体のヒト化方法は、当該技術分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体は、非ヒト供給源から導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。このような非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合「輸入」、残基と称され、典型的には、「輸入」可変ドメインから採用される。ヒト化は、本質的に、Ｗｉｎｔｅｒら［Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４−１５３６（１９８８）］の方法に従って、齧歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列を対応するヒト抗体の配列で置き換えることによって行なわれ得る。したがって、かかる「ヒト化」抗体はキメラ抗体であり（米国特許第４，８１６，５６７号）、実質的にはインタクトに満たないヒト可変ドメインが、非ヒト種由来の対応配列で置き換えられたものである。実際、ヒト化抗体は、典型的には、一部のＣＤＲ残基および場合によっては一部のＦＲ残基が、齧歯類抗体の相似部位由来の残基で置き換えられたヒト抗体である。
【０２１８】
ヒト化抗体の作製に使用するヒト可変ドメイン（軽鎖および重鎖ともに）の選択は、該抗体がヒト治療用途が目的とされる場合、抗原性およびＨＡＭＡ応答（ヒト抗マウス抗体）を低減するために非常に重要である。いわゆる「ベストフィット（ｂｅｓｔ−ｆｉｔ）」法によれば、齧歯類抗体の可変ドメインの配列を、ヒト可変ドメインの既知配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。齧歯類のものに最も近いヒトＶドメイン配列を同定し、その内部のヒトフレームワーク領域（ＦＲ）をヒト化抗体に許容する（ｉｔ  ａｃｃｅｐｔｅｄ）（Ｓｉｍｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１（１９８７））。別の方法では、特定のサブグループの軽鎖または重鎖のすべてのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワーク領域が使用される。同じフレームワークが、いくつかの異なるヒト化抗体に使用されることがあり得る（Ｃａｒｔｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３（１９９３））。
【０２１９】
さらに、抗原に対する高結合親和性および他の好都合な生物学的性質を保持した抗体をヒト化することが重要である。この目的を達成するため、好ましい方法によれば、ヒト化抗体は、親配列とヒト化配列の３次元モデルを用いた、親配列と種々の理論的ヒト化産物の解析プロセスによって調製されるものである。３次元免疫グロブリンモデルは一般的に利用可能であり、当業者は熟知している。選択した候補免疫グロブリン配列の推定３次元コンホメーション構造を図示および表示するコンピュータプログラムが利用可能である。このような表示の検討により、候補免疫グロブリン配列の機能発揮における残基の考えられ得る役割の解析、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の解析が可能となる。このようにして、ＦＲ残基がレシピエント配列と輸入配列から選択され、結合され得、その結果、標的抗原（１種類または複数種）に対する親和性の増大などの所望の抗体特性が得られる。一般に、超可変領域残基は、抗原結合への影響に直接かつ最も実質的に関与している。
【０２２０】
種々の形態のヒト化抗ＥｐｈＡ６抗体が想定される。例えば、ヒト化抗体はＦａｂなどの抗体断片であり得、これは、任意選択で、イムノコンジュゲートを作製するために１種類以上の細胞傷害剤とコンジュゲートさせる。あるいはまた、ヒト化抗体は、インタクトな抗体（インタクトなＩｇＧ１抗体など）であり得る。
【０２２１】
ヒト化に対する択一法として、ヒト抗体が作製され得る。例えば、現在、免疫処置すると、内因性の免疫グロブリン産生なしで、十分なヒト抗体レパートリーを産生できるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を作出することが可能である。例えば、キメラ生殖細胞系変異型マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合型欠失により、内因性の抗体産生の完全な阻害がもたらされることが報告されている。ヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイを、かかる生殖細胞系変異型マウスに導入することにより、抗原刺激すると、ヒト抗体の産生がもたらされる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．７：３３（１９９３）；米国特許第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，５９１，６６９号（すべて、ＧｅｎＰｈａｒｍ）；同第５，５４５，８０７号；およびＷＯ９７／１７８５２を参照のこと。
【０２２２】
あるいはまた、ファージディスプレイ手法（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５３［１９９０］）を使用し、非免疫処置ドナー由来の免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体および抗体断片を作製することができる。この手法によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子をインフレームで、糸状バクテリオファージ（Ｍ１３またはｆｄなど）のマイナーまたはメジャーいずれかのコートタンパク質遺伝子にクローニングし、機能性抗体断片としてファージ粒子の表面上にディスプレイさせる。該糸状粒子はファージゲノムの単鎖ＤＮＡコピーを含むため、抗体の機能的性質に基づく選択により、該性質を示す抗体をコードする遺伝子もまた選択される。したがって、該ファージは、Ｂ細胞の一部の性質を模倣する。ファージディスプレイは、さまざまな形式で行なわれ得、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋｅｖｉｎ  Ｓ．およびＣｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ  Ｊ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：５６４−５７１（１９９３）に概説されている。いくつかのＶ遺伝子セグメント供給源が、ファージディスプレイに使用され得る。Ｃｌａｃｋｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）では、免疫処置マウスの脾臓由来のＶ遺伝子の小さなランダムコンビナトリアルライブラリーから、抗オキサゾロン抗体のさまざまなアレイが単離された。本質的に、Ｍａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）、またはＧｒｉｆｆｉｔｈら，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５−７３４（１９９３）に記載の手法に従い、非免疫処置ヒトドナー由来のＶ遺伝子のレパートリーが構築され得、さまざまな抗原（自己抗原を含む）のアレイに対する抗体が単離され得る。米国特許第５，５６５，３３２号および同第５，５７３，９０５号もまた参照のこと。
【０２２３】
上記のように、ヒト抗体もまた、インビトロで活性化Ｂ細胞によって作製され得る（米国特許第５，５６７，６１０号および同第５，２２９，２７５号参照）。
【０２２４】
４．抗体断片
ある種の状況では、完全体の抗体よりも抗体断片の使用に利点がある。断片のサイズが小さいほど速やかなクリアランスが許容され、充実性腫瘍への到達の改善がもたらされ得る。
【０２２５】
抗体断片の作製のための種々の手法が開発されている。従来より、このような断片は、インタクトな抗体のタンパク質分解性消化によって得ていた（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：１０７−１１７（１９９２）；およびＢｒｅｎｎａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：８１（１９８５）を参照のこと）。しかしながら、このような断片は、現在、組換え宿主細胞によって直接産生させることができる。Ｆａｂ、ＦｖおよびＳｃＦｖ抗体断片はすべて、大腸菌において発現させ、分泌させることができ、したがって、これらの断片を大量に容易に作製することが可能である。抗体断片は、上記の抗体ファージライブラリーから単離したものであってもよい。あるいはまた、Ｆａｂ’−ＳＨ断片を大腸菌から直接回収して化学的にカップリングさせ、Ｆ（ａｂ’）２断片を形成してもよい（Ｃａｒｔｅｒら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２））。別のアプローチによれば、Ｆ（ａｂ’）２断片は、組換え宿主細胞培養物から直接単離され得る。サルベージ（ｓａｌｖａｇｅ）受容体結合エピトープ残基を含むインビボ半減期が増大したＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片が、米国特許第５，８６９，０４６号に記載されている。抗体断片の作製のための他の手法は、当業者に自明であろう。一般的に好ましい抗体は単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。ＷＯ９３／１６１８５；米国特許第５，５７１，８９４号；および米国特許第５，５８７，４５８号参照。ＦｖとｓＦｖは、定常領域のないインタクトな結合部位を有する唯一の種であり、したがって、これらは、インビボ使用の際の非特異的結合の低減に適している。ｓＦｖ融合タンパク質は、エフェクタータンパク質がｓＦｖのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかに存在する融合体が得られるように構築され得る。Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ編、前掲）参照。また、抗体断片は、例えば、米国特許第５，６４１，８７０号などに記載のような「線状抗体」であり得る。かかる線状抗体断片は、単一特異性または二重特異性であり得る。
【０２２６】
５．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、本明細書に記載のＥｐｈＡ６タンパク質の２つの異なるエピトープに結合するものであり得る。他のかかる抗体は、ＥｐｈＡ６結合部位と、別のタンパク質に対する結合部位とを併せ持つものであり得る。あるいはまた、抗ＥｐｈＡ６アームと、白血球上のトリガー分子、例えばＴ−細胞受容体分子（例えば、ＣＤ３）、またはＩｇＧのＦｃ受容体（ＦｃγＲ）（ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）など）などに結合するアームとが、細胞防御機構をＥｐｈＡ６発現細胞に集中および局在するように結合されたものであってもよい。また、二重特異性抗体は、細胞傷害剤をＥｐｈＡ６ポリペプチド発現細胞に局在化させるために使用され得る。このような抗体は、ＥｐｈＡ６結合アームと、細胞傷害剤（例えば、サポリン、抗インターフェロン−α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキサートまたは放射性同位体ハプテン）に結合するアームとを有する。二重特異性抗体は、完全長抗体または抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として作製され得る。
【０２２７】
ＷＯ９６／１６６７３には、二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体が記載されており、米国特許第５，８３７，２３４号には、二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＦｃγＲＩ抗体が開示されている。二重特異性抗ＥｒｂＢ２／Ｆｃα抗体は、ＷＯ９８／０２４６３に示されている。米国特許第５，８２１，３３７号には、二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＣＤ３抗体が教示されている。
【０２２８】
二重特異性抗体の作製方法は、当該技術分野で知られている。従来の完全長二重特異性抗体の作製は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖ペアの共発現に基づいたものであり、この場合、該２種類の鎖は異なる特異性を有する（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７−５３９（１９８３））。免疫グロブリン重鎖と軽鎖の組み合わせがランダムなため、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は１０種類の異なる抗体分子の潜在混合物を産生し、そのうち１種類のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、通常アフィニティークロマトグラフィー工程によって行なわれるが、かなり煩雑であり、産生物の収率は低い。同様の手順がＷＯ９３／０８８２９、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら，ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３６５５−３６５９（１９９１）に開示されている。
【０２２９】
別のアプローチによれば、所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインを、免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。好ましくは、該融合体は、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域の少なくとも一部分を含むＩｇ重鎖定常ドメインとのものである。該融合体の少なくとも１つに存在する軽鎖結合に必要な部位を含む第１重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体をコードするＤＮＡと、所望される場合は免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクター内に挿入し、適当な宿主細胞内でコトランスフェクトする。これにより、構築に不均等な比の３種類のポリペプチド鎖を用いて最適な収率の所望の二重特異性抗体を得る場合、３種類のポリペプチド断片の相互割合の調整においてより大きな柔軟性が得られる。しかしながら、同じ比率の少なくとも２種類のポリペプチド鎖の発現により高収率がもたらされる場合、または比率が所望の鎖の組合せの収率に有意な影響を及ぼさない場合は、３種類のポリペプチド鎖のうちの２種類または全種類のコード配列を単一の発現ベクター内に挿入することが可能である。
【０２３０】
本発明は、第１の結合特異性を一方のアームに、およびハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖ペア（第２の結合特異性を提供する）を他方のアームに有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖で構成された二重特異性抗体を提供する。この非対称構造により、二重特異性分子の片側のみに免疫グロブリン軽鎖が存在することが分離様式を提供するため、不要な免疫グロブリン鎖の組合せからの所望の二重特異性化合物の分離が助長されることがわかった。このアプローチはＷＯ９４／０４６９０に開示されている。二重特異性抗体の作製のさらなる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １２１：２１０（１９８６）を参照のこと。
【０２３１】
米国特許第５，７３１，１６８号に記載の別のアプローチによれば、１対の抗体分子間の界面を操作して、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体の割合を最大にすることができる。好ましい接触面は、ＣＨ３ドメインの少なくとも一部分を含む。この方法では、第１の抗体分子の接触面の１つ以上の小さいアミノ酸側鎖を、大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置き換える。大きなアミノ酸側鎖が小さなもの（例えば、アラニンまたはトレオニン）で置き換えられることにより、該大きな側鎖（１つまたは複数）と同一または類似したサイズの代償的「空洞」が第２の抗体分子の接触面上に作出される。これにより、他の望ましくない最終生成物（ホモ二量体など）よりもヘテロ二量体の収率が高くなるための機構がもたらされる。
【０２３２】
二重特異性抗体は、架橋型または「ヘテロコンジュゲート」抗体を包含する。例えば、ヘテロコンジュゲート内の抗体の一方はアビジンに、他方はビオチンにカップリングさせ得る。かかる抗体は、例えば、免疫系細胞を望ましくない細胞に標的化させるため（米国特許第４，６７６，９８０号）、ならびにＨＩＶ感染の処置のため（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／２００３７３、およびＥＰ０３０８９）に提案された。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の簡便な架橋方法を用いて作製され得る。好適な架橋剤は当該技術分野でよく知られており、いくつかの架橋手法とともに米国特許第４，６７６，９８０号に開示されている。
【０２３３】
また、抗体断片から二重特異性抗体を作製するための手法も文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体は化学結合を用いて作製することができる。Ｂｒｅｎｎａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１（１９８５）には、インタクトな抗体をタンパク質分解的に切断してＦ（ａｂ’）２断片を生成させる手順が記載されている。このような断片を、ジチオール錯化剤である亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元し、ビシナールジチオールを安定化させて分子間ジスルフィドの形成を抑制する。次いで、生成されたＦａｂ’断片をチオニトロ安息香酸（ＴＮＢ）誘導体に変換する。次いで、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の一方を、メルカプトエチルアミンで還元してＦａｂ’−チオールに再変換し、等モル量の他方のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合すると二重特異性抗体が形成される。作製された二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化ための薬剤として使用され得る。
【０２３４】
最近の進歩により、大腸菌からＦａｂ’−ＳＨ断片を直接回収することが容易になり、これを化学的にカップリングさせて二重特異性抗体を形成させることができる。Ｓｈａｌａｂｙら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７−２２５（１９９２）には、完全ヒト化二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の作製が記載されている。各Ｆａｂ’断片を別々に大腸菌から分泌させ、インビトロ指向型化学的カップリングに供して二重特異性抗体が形成された。このようにして形成された二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ２受容体を過剰発現する細胞および正常ヒトＴ細胞に結合し、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性を誘発することができるものであった。組換え細胞培養物から直接、二重特異性抗体断片を作製および単離するための種々の手法も報告されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを用いて作製された。Ｋｏｓｔｅｌｎｙら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドを、遺伝子融合によって２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結させた。抗体ホモ二量体をヒンジ領域で還元して単量体を形成させ、次いで、再度酸化すると抗体ヘテロ二量体が形成された。この方法はまた、抗体ホモ二量体の作製にも利用され得る。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）に記載の「ダイアボディ」手法は、二重特異性抗体断片作製のための択一的な機構を提供するものである。該断片は、ＶＨとＶＬがリンカーによって連結された構成であるが、このリンカーが短すぎて同じ鎖での該２つのドメイン間の対合が可能でない。したがって、１つの断片のＶＨドメインとＶＬドメインを別の断片の相補ＶＬおよびＶＨドメインと強制的に対合させ、それにより２つの抗原結合部位を形成させている。また、単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用による二重特異性抗体断片を作製するための別のストラテジーも報告されている。Ｇｒｕｂｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）参照。
【０２３５】
２より大きい価数を有する抗体も想定される。例えば、三重特異性抗体が作製され得る。Ｔｕｔｔら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。
【０２３６】
６．ヘテロコンジュゲート抗体
ヘテロコンジュゲート抗体もまた本発明の範囲に含まれる。ヘテロコンジュゲート抗体は、共有結合によって連結された２つの抗体で構成されている。かかる抗体は、例えば、免疫系細胞を望ましくない細胞に標的化させるため［米国特許第４，６７６，９８０号］、およびＨＩＶ感染の処置のため［ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／２００３７３；ＥＰ０３０８９］に提案された。該抗体は、既知の方法を用いて、タンパク質合成化学反応（例えば、架橋剤を伴うもの）にてインビトロで作製され得ることが想定される。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を用いて、またはチオエーテル結合を形成させることによって構築され得る。この目的に適した試薬の例としては、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデートおよび例えば、米国特許第４，６７６，９８０号に開示されたものが挙げられる。
【０２３７】
７．多価抗体
多価抗体は、該抗体が結合する抗原を発現する細胞によって、二価抗体よりも高速でインターナリゼーション（および／または  異化作用）を受けるものであり得る。本発明の抗体は、３つ以上の抗原結合部位を有する多価抗体（ＩｇＭクラス以外の）（例えば、四価抗体）であり得、該抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現によって容易に作製され得る。多価抗体は、二量体化ドメインと３つ以上の抗原結合部位で構成されたものであり得る。好ましい二量体化ドメインは、Ｆｃ領域またはヒンジ領域を含む（または該領域からなる）。この状況では、該抗体は、Ｆｃ領域と、該Ｆｃ領域のアミノ末端に３つ以上の抗原結合部位を含む。本明細書において好ましい多価抗体は、３〜約８個、好ましくは４つの抗原結合部位を含む（または該領域からなる）ものである。多価抗体は、少なくとも１つのポリペプチド鎖（好ましくは２つのポリペプチド鎖）を含み、該ポリペプチド鎖（１つまたは複数）は２つ以上の可変ドメインを含む。例えば、該ポリペプチド鎖（１つまたは複数）は、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−（Ｘ２）ｎ−Ｆｃを含むものであり得、式中、ＶＤ１は第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の可変ドメインであり、ＦｃはＦｃ領域のポリペプチド鎖の１つであり、Ｘ１およびＸ２はアミノ酸またはポリペプチドを表し、ｎは０または１である。例えば、該ポリペプチド鎖（１つまたは複数）は、ＶＨ−ＣＨ１−フレキシブルリンカー−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖；またはＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖を含むものであり得る。本明細書における多価抗体は、好ましくはさらに、少なくとも２つ（好ましくは４つ）の軽鎖可変ドメインポリペプチドを含むものである。本明細書における多価抗体は、例えば、約２〜約８個の軽鎖可変ドメインポリペプチドを含むものであり得る。本明細書において想定される軽鎖可変ドメインポリペプチドは、軽鎖可変ドメインを含み、任意選択で、さらにＣＬドメインを含む。
【０２３８】
８．エフェクター機能の操作
本発明の抗体を、例えば、抗体の抗原依存性細胞媒介型細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）が増強されるように、エフェクター機能に関して修飾することが望ましい場合があり得る。これは、抗体のＦｃ領域内に１つ以上のアミノ酸置換を導入することにより行なわれ得る。あるいはまたさらに、システイン残基（１つまたは複数）をＦｃ領域内に導入し、それにより、この領域における鎖間ジスルフィド結合の形成を可能にしてもよい。このようにして作製されたホモ二量体の抗体は、改善されたインターナリゼーション能および／または増大された補体媒介型細胞傷害性および抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を有するものであり得る。Ｃａｒｏｎら，Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１７６：１１９１−１１９５（１９９２）およびＳｈｏｐｅｓ，Ｂ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８−２９２２（１９９２）参照。増強された抗腫瘍活性を有するホモ二量体の抗体はまた、Ｗｏｌｆｆら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：２５６０−２５６５（１９９３）に記載のようなヘテロ二官能性の架橋体を用いて作製され得る。あるいはまた、二重Ｆｃ領域を有し、それにより補体溶解とＡＤＣＣ能力が増強され得る抗体が作出され得る。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ３：２１９−２３０（１９８９）参照。抗体の血清半減期を増大させるため、例えば、米国特許第５，７３９，２７７号に記載のように、サルベージ受容体結合エピトープを、抗体（特に、抗体断片）内に組み込んでもよい。本明細書で用いる場合、用語「サルベージ受容体結合エピトープ」は、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期の増大を担うＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープをいう。
【０２３９】
９．イムノコンジュゲート
本発明はまた、細胞傷害剤、例えば、化学療法剤、成長抑制剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物もしくは動物起源の酵素活性のある毒素またはその断片）、あるいは放射性同位体（すなわち、ラジオコンジュゲート（ｒａｄｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ））などにコンジュゲートさせた抗体を含むイムノコンジュゲートに関する。
【０２４０】
かかるイムノコンジュゲート作製に有用な化学療法剤は、先に記載している。使用され得る酵素活性のある毒素およびその断片としては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性の活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サルシン  、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）インヒビター、クルシン、クロチン、サパオナリア・オフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）インヒビター、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）、ならびにトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅ）が挙げられる。さまざまな放射性核種がラジオコンジュゲート抗体の作製に利用可能である。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、および１８６Ｒｅが挙げられる。抗体と細胞傷害剤のコンジュゲートは、さまざまな二官能性のタンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（アジプイミド酸ジメチルＨＣＬなど）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トルエン（ｔｏｌｙｅｎｅ）２，６−ジイソシアネートなど）、およびビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）などを用いて作製される。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３８：１０９８（１９８７）に記載のようにして調製され得る。炭素１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドと抗体とのコンジュゲーションのための例示的なキレート化剤である。ＷＯ９４／１１０２６参照。
【０２４１】
抗体と１つ以上の小分子毒素、例えば、カリチアマイシン、マイタンシノイド、トリコテシン、およびＣＣ１０６５、ならびに毒素活性を有するこれらの毒素の誘導体などとのコンジュゲートもまた本明細書において想定される。
【０２４２】
マイタンシンおよびマイタンシノイド
本発明は、１つ以上のマイタンシノイド分子にコンジュゲートさせた抗ＥｐｈＡ６抗体（完全長または断片）を提供する。
【０２４３】
マイタンシノイドは、チューブリンの重合を阻害することにより作用する有糸分裂（ｍｉｔｏｔｏｔｉｃ）阻害剤である。マイタンシンは、最初に、東アフリカの低木Ｍａｙｔｅｎｕｓ  ｓｅｒｒａｔａから単離された（米国特許第３，８９６，１１１号）。その後、ある種の微生物もまた、マイタンシノイド（マイタンシノールおよびＣ−３  マイタンシノールエステルなど）を産生することが見い出された（米国特許第４，１５１，０４２号）。合成マイタンシノールならびにその誘導体および類縁体は、例えば、米国特許第４，１３７，２３０；４，２４８，８７０；４，２５６，７４６；４，２６０，６０８；４，２６５，８１４；４，２９４，７５７；４，３０７，０１６；４，３０８，２６８；４，３０８，２６９；４，３０９，４２８；４，３１３，９４６；４，３１５，９２９；４，３１７，８２１；４，３２２，３４８；４，３３１，５９８；４，３６１，６５０；４，３６４，８６６；４，４２４，２１９；４，４５０，２５４；４，３６２，６６３および４，３７１，５３３（これらの開示内容は、引用により本明細書に明示的に組み込まれる）に開示されている。
【０２４４】
マイタンシノイド−抗体コンジュゲート
治療指数を改善する試みでは、腫瘍細胞抗原に特異的に結合する抗体へのマイタンシンおよびマイタンシノイドのコンジュゲーションが行なわれている。マイタンシノイドを含むイムノコンジュゲートおよびその治療用途は、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号、同第５，４１６，０６４号および欧州特許ＥＰ０４２５２３５Ｂ１（これらの開示内容は、引用により本明細書に明示的に組み込まれる）に開示されている。Ｌｉｕら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：８６１８−８６２３（１９９６）には、ヒト結腸直腸癌に対するモノクローナル抗体Ｃ２４２に連結されたＤＭ１と表示されたマイタンシノイドを含むイムノコンジュゲートが報告された。このコンジュゲートは、結腸癌培養細胞に対して高度に細胞傷害性であることが見い出され、インビボ腫瘍増殖アッセイにおいて抗腫瘍活性が示された。Ｃｈａｒｉら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７−１３１（１９９２）には、マイタンシノイドを、ヒト結腸癌細胞株上の抗原に結合するマウス抗体Ａ７にジスルフィドリンカーによってコンジュゲートさせた、またはＨＥＲ−２／ｎｅｕ癌遺伝子に結合する別のマウスモノクローナル抗体ＴＡ．１にコンジュゲートさせたイムノコンジュゲートが記載されている。ＴＡ．１−マイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｏｎｏｉｄ）コンジュゲートの細胞傷害性は、ヒト乳癌細胞株  ＳＫ−ＢＲ−３（これは、３×１０５ＨＥＲ−２表面抗原／細胞を発現する）においてインビトロで試験された。この薬物コンジュゲートでは、遊離のマイタンシノイド薬物と類似した程度の細胞傷害性が得られ、これは、抗体分子１つあたりのマイタンシノイド分子の数を増やすことにより増大され得た。Ａ７−マイタンシノイドコンジュゲートは、マウスにおいて低い全身細胞傷害性を示した。
【０２４５】
抗ＥｐｈＡ６抗体−マイタンシノイドコンジュゲート（イムノコンジュゲート）
抗ＥｐｈＡ６  抗体−マイタンシノイドコンジュゲートは、抗ＥｐｈＡ６抗体をマイタンシノイド分子に化学結合させることにより、抗体またはマイタンシノイド分子いずれかの生物学的活性を有意に減弱させることなく作製される。抗体分子１つあたり平均３〜４個のマイタンシノイド分子コンジュゲートさせると、抗体の機能または可溶性にマイナスの影響を及ぼすことなく、標的細胞の細胞傷害性の増強に有効であることが示されているが、毒素／抗体１分子であっても、裸の抗体を使用するよりも細胞傷害性が増強されることが予測され得る。マイタンシノイドは、当該技術分野でよく知られており、既知の手法によって合成され得るか、または天然供給源から単離され得る。好適なマイタンシノイドは、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号ならびに本明細書において上記の他の特許および非特許刊行物に開示されている。好ましいマイタンシノイドは、マイタンシノールおよびマイタンシノール分子の芳香族環または他の位置が修飾されたマイタンシノール類縁体（種々のマイタンシノールエステルなど）である。
【０２４６】
抗体−マイタンシノイドコンジュゲートを作製するための連結基は、当該技術分野で数多く知られており、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号またはＥＰ特許０４２５２３５Ｂ１、およびＣｈａｒｉら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７−１３１（１９９２）に開示されたものが挙げられる。該連結基としては、上記の特許に開示されているようなジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチダーゼ不安定性基、またはエステラーゼ不安定性基が挙げられ、ジスルフィドおよびチオエーテル基が好ましい。
【０２４７】
抗体とマイタンシノイドのコンジュゲートは、さまざまな二官能性のタンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（アジプイミド酸ジメチルＨＣＬなど）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トルエン２，６−ジイソシアネートなど）、およびビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）などを用いて作製され得る。特に好ましいカップリング剤としては、ジスルフィド結合をもたらすＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）（Ｃａｒｌｓｓｏｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１７３：７２３−７３７［１９７８］）およびＮ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）が挙げられる。
【０２４８】
リンカーは、結合の型に応じて、マイタンシノイド分子の種々の位置に結合され得る。例えば、エステル結合は、慣用的なカップリング手法を用いてヒドロキシル基との反応によって形成され得る。該反応は、ヒドロキシル基を有するＣ３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ１５位、およびヒドロキシル基を有するＣ２０位で行なわれ得る。該結合は、マイタンシノールまたはマイタンシノール類縁体のＣ３位で形成される。
【０２４９】
カリチアマイシン
対象の別のイムノコンジュゲートは、１つ以上のカリチアマイシン分子にコンジュゲートさせた抗ＥｐｈＡ６抗体を含むものである。カリチアマイシンファミリーの抗生物質は、ピコモル濃度以下で二本鎖ＤＮＡ破断をもたらすことができるものである。カリチアマイシンファミリーのコンジュゲートの作製については、米国特許第５，７１２，３７４号、同第５，７１４，５８６号、同第５，７３９，１１６号、同第５，７６７，２８５号、同第５，７７０，７０１号、同第５，７７０，７１０号、同第５，７７３，００１号、同第５，８７７，２９６号（すべて、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｙａｎａｍｉｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を参照のこと。使用され得るカリチアマイシンの構造類縁体としては、これらに限定されないが、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ−アセチル−γ１Ｉ、ＰＳＡＧおよびθＩ１（Ｈｉｎｍａｎら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：３３３６−３３４２（１９９３）、Ｌｏｄｅら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５８：２９２５−２９２８（１９９８）および前述のＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｙａｎａｍｉｄに対する米国特許）が挙げられる。該抗体をコンジュゲートさせ得る別の抗腫瘍薬は、葉酸代謝拮抗薬のＱＦＡである。カリチアマイシンおよびＱＦＡはともに、細胞内作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。したがって、抗体媒介型インターナリゼーションによるこれらの薬剤の細胞取込みによって、その細胞傷害性効果が大きく増強される。
【０２５０】
他の細胞傷害剤
本発明の抗ＥｐｈＡ６抗体にコンジュゲートさせ得る他の抗腫瘍剤としては、ＢＣＮＵ、ストレプトゾシン、ビンクリスチンおよび５−フルオロウラシル、集合的にＬＬ−Ｅ３３２８８複合体で知られる薬剤ファミリー（米国特許第５，０５３，３９４号、同第５，７７０，７１０号に記載）、ならびにエスペラミシン（米国特許第５，８７７，２９６号）が挙げられる。
【０２５１】
酵素活性を有する使用され得る毒素およびその断片としては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性の活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サルシン  、シナアブラギリタンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリインヒビター、クルシン、クロチン、サパオナリア・オフィシナリスインヒビター、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンならびにトリコテセンが挙げられる。例えば、ＷＯ９３／２１２３２（１９９３年１０月２８日公開）を参照のこと。
【０２５２】
本発明では、さらに、抗体と核酸分解活性を有する化合物（例えば、リボヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼ（デオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮａｓｅなど））とで形成されるイムノコンジュゲートが想定される。
【０２５３】
腫瘍の選択的破壊のためには、該抗体は、高度に放射性の原子を含むものであるのがよい。さまざまな放射性同位体がラジオコンジュゲート抗ＥｐｈＡ６抗体の作製に利用可能である。例としては、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２およびＬｕの放射性同位体が挙げられる。該コンジュゲートが診断用に使用される場合、シンチグラフィ試験用の放射性原子（例えば、ｔｃ９９ｍもしくはＩ１２３）、または核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像法（磁気共鳴画像法、ｍｒｉとしても知られる）用のスピン標識（ヨウ素−１２３（この場合も）、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガンもしくは鉄など）を含むものであり得る。
【０２５４】
放射性標識または他の標識も既知の様式で該コンジュゲートに組み込まれ得る。例えば、そのペプチドは、生合成されるものであってもよく、例えば、水素の代わりにフッ素−１９を含む適当なアミノ酸前駆体を用いて化学的アミノ酸合成によって合成されるものであってもよい。ｔｃ９９ｍまたはＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８およびＩｎ１１１などの標識は、システイン残基によってペプチド内に結合させ得る。イットリウム−９０は、
リシン残基によって結合させ得る。ＩＯＤＯＧＥＮ法（Ｆｒａｋｅｒら（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．８０：４９−５７を用いて、ヨウ素−１２３が組み込まれ得る。“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ”（Ｃｈａｔａｌ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９）には他の方法が詳細に記載されている。
【０２５５】
抗体と細胞傷害剤のコンジュゲートは、さまざまな二官能性のタンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（アジプイミド酸ジメチルＨＣＬなど）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トルエン２，６−ジイソシアネートなど）、およびビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）などを用いて作製され得る。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１０９８（１９８７）に記載のようにして調製され得る。炭素１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドと抗体のコンジュゲーションのための例示的なキレート化剤である。ＷＯ９４／１１０２６参照。リンカーは、細胞内での細胞傷害性薬の放出を助長する「切断可能なリンカー」であり得る。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７−１３１（１９９２）；米国特許第５，２０８，０２０号）が使用され得る。
【０２５６】
あるいはまた、抗ＥｐｈＡ６抗体と細胞傷害剤を含む融合タンパク質が、例えば、組換え手法またはペプチド合成によって作製され得る。ＤＮＡの全長には、コンジュゲートの２つの部分をコードするそれぞれの領域が、互いに隣接するか、またはリンカーペプチド（該コンジュゲートの所望の性質を破壊しないもの）をコードする領域によって分断されるかのいずれかで含まれ得る。
【０２５７】
本発明は、該抗体を、腫瘍予備標的化における利用のために「受容体」（ストレプトアビジンなど（ｓｕｃｈ））コンジュゲートさせ得ること、該抗体−受容体コンジュゲートを患者に投与した後、非結合コンジュゲートを循環系から清澄化剤を用いて除去し、次いで、細胞傷害剤（例えば、放射性ヌクレオチド）にコンジュゲートさせた「リガンド」（例えば、アビジン）を投与することを提供する。
【０２５８】
１０．イムノリポソーム
本明細書に開示した抗ＥｐｈＡ６抗体はまた、イムノリポソームとして製剤化され得る。「リポソーム」は、哺乳動物への薬物の送達に有用な種々の型の脂質、リン脂質および／または界面活性剤で構成された小胞である。リポソームの成分は、一般的に、生体膜の脂質の整列と同様に二分子層を形成した状態で整列している。該抗体を含むリポソームは、当該技術分野で知られた方法、例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：３６８８（１９８５）；  Ｈｗａｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ    Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４０３０（１９８０）；米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号；ならびにＷＯ９７／３８７３１（１９９７年１０月２３日公開）に記載の方法によって作製され得る。循環時間が向上したリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
【０２５９】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を使用し、逆相エバポレーション法によって作製され得る。リポソームは、所望の直径を有するリポソームが得られる規定の孔径のフィルターを通して押出成形される。本発明の抗体のＦａｂ’断片を、Ｍａｒｔｉｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：２８６−２８８（１９８２）に記載のリポソームに、ジスルフィド交換反応によってコンジュゲートさせることができる。任意選択で、該リポソームに化学療法剤を含める。Ｇａｂｉｚｏｎら，Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８１（１９）：１４８４（１９８９）参照。
【０２６０】
１１．抗体の医薬組成物
本明細書において同定されたＥｐｈＡ６ポリペプチド、ならびに本明細書において先に開示したスクリーニングアッセイによって同定された他の分子に特異的に結合する抗体は、種々の障害の処置のために、医薬組成物の形態で投与され得る。
【０２６１】
ＥｐｈＡ６ポリペプチドが細胞内に存在し、完全体の抗体がインヒビターとして使用される場合、インターナリゼーション抗体が好ましい。しかしながら、リポフェクションまたはリポソームもまた、細胞内への抗体または抗体断片の送達に使用され得る。抗体断片が使用される場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小の阻害性断片が好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に対しては、標的タンパク質配列に結合する能力を保持したペプチド分子が設計され得る。かかるペプチドは、化学合成および／または組換えＤＮＡ手法によって作製され得る。例えば、Ｍａｒａｓｃｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：７８８９−７８９３（１９９３）を参照のこと。また、本明細書における製剤は、処置対象の具体的な適応症に対する必要に応じて、１種類より多くの活性化合物（好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するもの）を含むものであってもよい。あるいはまたさらに、該組成物は、その機能を増強する薬剤、例えば、細胞傷害剤、サイトカイン、化学療法剤、または成長抑制剤などを含むものであり得る。かかる分子は、意図される目的に有効な量の組合せで好適に存在させる。
【０２６２】
また、活性成分を、例えば、コアセルベーション手法または界面重合によって作製されるマイクロカプセル（それぞれ、例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル）、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）あるいはマイクロエマルジョンに封入してもよい。かかる手法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（前掲）に開示されている。
【０２６３】
インビボ投与に使用される製剤は、滅菌されたものでなければならない。これは、滅菌濾過膜に通す濾過によって容易になされる。
【０２６４】
徐放調製物が調製され得る。徐放調製物の好適な例としては、該抗体を含む固形の疎水性のポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、該マトリックスは、成型体、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態である。徐放マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（メタクリル酸２−ヒドロキシエチル）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー（例えば、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）：乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドで構成された注射用マイクロスフィア）、ならびにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸などのポリマーは、１００日間を超えて分子の放出が可能であるが、ある種のヒドロゲルは、タンパク質を放出する期間が短い。カプセル封入抗体が体内に長期間維持されると、３７℃で湿分に曝露される結果、変性または凝集され、生物学的活性の低下および免疫原性に変化する可能性がもたらされる。関与する機構に応じて、安定化に関する合理的なストラテジーが考案され得る。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換による分子間Ｓ−Ｓ結合形成であることがわかっている場合、安定化は、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、含水率の制御、適切な添加剤の使用、および特定のポリマーマトリックス組成物の開発によって得られ得る。
【０２６５】
Ｇ．ＥｐｈＡ６抗体の使用
本発明のアゴニスト抗ＥｐｈＡ６抗体は、特に、ある種の神経学的障害、例えば、上記のようなＥｐｈＡ６機能障害と関連している学習および／または記憶の障害の予防および／または処置において、種々の治療的および／または診断的有用性を有する。
【０２６６】
また、抗ＥｐｈＡ６抗体は、ＥｐｈＡ６の診断用アッセイにおいて使用され得、例えば、特定の細胞、組織または血清中でのその発現（場合によっては、識別的発現）を検出する。当該技術分野で知られた種々の診断用アッセイ手法、例えば、競合的結合アッセイ、直接または間接的サンドイッチアッセイおよび免疫沈殿  アッセイ（不均一相または均一相のいずれかで実施）などが使用され得る［Ｚｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８７）ｐｐ．１４７−１５８］。診断用アッセイに使用される該抗体は、検出可能な部分で標識され得る。検出可能な部分は、直接または間接的のいずれかで検出可能なシグナルを生成できるものであるのがよい。例えば、検出可能な部分は、放射性同位体（３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、もしくは１２５Ｉなど）、蛍光化合物または化学発光化合物（フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、もしくはルシフェリンなど）、あるいは酵素（アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼもしくはホースラディッシュペルオキシダーゼなど）であり得る。抗体と検出可能な部分とのコンジュゲーションのための任意の当該技術分野で知られた方法、例えば、Ｈｕｎｔｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，１４４：９４５（１９６２）；  Ｄａｖｉｄら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３：１０１４（１９７４）；Ｐａｉｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，４０：２１９（１９８１）；およびＮｙｇｒｅｎ、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．，３０：４０７（１９８２）に記載の方法が使用され得る。
【０２６７】
また、抗ＥｐｈＡ６抗体は、組換え細胞培養物または天然供給源からのＥｐｈＡ６ポリペプチドのアフィニティ精製に有用である。この方法では、ＥｐｈＡ６ポリペプチドに対する抗体を、当該技術分野でよく知られた方法を用いて適当な支持体（Ｓｅｐｈａｄｅｘ樹脂または濾紙など（ｓｕｃｈ  ａ））に固定化する。次いで、固定化した抗体を、精製対象のＥｐｈＡ６ポリペプチドを含む試料と接触させ、その後支持体を、試料中のＥｐｈＡ６ポリペプチド（これは、固定化抗体に結合されている）以外の物質を実質的にすべて除去する適当な溶媒で洗浄する。最後に支持体を、ＥｐｈＡ６ポリペプチドを該抗体から放出させる別の適当な溶媒で洗浄する。
【０２６８】
本発明のさらなる詳細を、以下の非限定的な実施例に示す。
【実施例】
【０２６９】
実施例１
ＤＮＡ２２２６５３（ＵＮＱ６１１４）遺伝子破壊を含むマウスの作出および解析
Ａ．マウスの作出
このノックアウト実験では、ＰＲＯ３５４４４ポリペプチド（ＤＮＡ２２２６５３；ＵＮＱ６１１４と標示）をコードする遺伝子を破壊した。この試験に関する遺伝子の具体的な情報は、以下のとおりである：変異型マウス遺伝子は、ヌクレオチド参照：ＮＭ＿００７９３８  ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＮＭ＿００７９３８  ＮＩＤ：ｇｉ  ６６７９６６０  ｒｅｆ  ＮＭ＿００７９３８．１  ハツカネズミＥｐｈ受容体Ａ６（Ｅｐｈａ６）；タンパク質参照：Ｑ６２４１３  ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｑ６２４１３  ＮＩＤ：ハツカネズミ（マウス）に対応する。ＥＰＨＲＩＮ  ＴＹＰＥ−Ａ  ＲＥＣＥＰＴＯＲ  ６  ＰＲＥＣＵＲＳＯＲ（ＥＣ  ２．７．１．１１２）（ＴＹＲＯＳＩＮＥ−ＰＲＯＴＥＩＮ  ＫＩＮＡＳＥ  ＲＥＣＥＰＴＯＲ  ＥＨＫ−２）（ＥＰＨ  ＨＯＭＯＬＯＧＹ  ＫＩＮＡＳＥ−２）；ヒト遺伝子配列参照：ＸＭ＿１１４９７３  ＰＲＥＤＩＣＴＥＤ：ホモサピエンスＥｐｈＡ６（ＥＰＨＡ６）；ヒトタンパク質配列は、参照：ＸＰ＿１１４９７３  ＰＲＥＤＩＣＴＥＤ：受容体型チロシンキナーゼに類似［ホモサピエンス］に対応する。
【０２７０】
対象の遺伝子は、ヒトＥＰＨＡ６のオルソログであるマウスＥｐｈａ６（Ｅｐｈ受容体Ａ６）である。
別名としては、Ｅｈｋ２、Ｈｅｋ１２、ｍ−ｅｈｋ２、ＦＬＪ３５２４６、およびＤＫＦＺｐ４３４Ｃ１４１８が挙げられる。
【０２７１】
ＥＰＨＡ６は、受容体タンパク質チロシンキナーゼとしての機能を果たすＩ型内在性原形質膜タンパク質である。グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー型エフリン−Ａリガンド１〜５は、ＥＰＨＡ６を活性化し、アクチン細胞骨格を標的化するシグナル伝達応答に至ると思われる（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｃｙｔｏｌ  １９６：１７７−２４４（２０００））。ＥＰＨＡ６は、主に、内耳のらせん神経節のニューロン内および個々の脳領域のニューロン内で発現されるが、他の組織、例えば、精巣、卵巣、胸腺および脾臓などでも発現される（Ｌｅｅら，ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １５：８１７−２５（１９９６）；Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８：３２７７−８８（１９９３））。ＥＰＨＡ６は、発達またはリモデリング中のニューロン網および血管網の確立に役割を果たしていると思われる（ＹａｍａｇｕｃｈｉおよびＰａｓｑｕａｌｅ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  １４：２８８−９６（２００４）；Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｃｙｔｏｌ  １９６：１７７−２４４（２０００）；Ｎａｋａｍｏｔｏら，Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  １４：Ｒ１２１−３（２００４））。
【０２７２】
標的化型または遺伝子トラップ変異は、１２９ＳｖＥｖＢｒｄ由来胚性幹（ＥＳ）細胞株において生成させる。キメラマウスをＣ５７ＢＬ／６Ｊアルビノマウスと交配し、Ｆ１ヘテロ接合型動物を作出する。このような子孫を異種交配してＦ２野生型のヘテロ接合型およびホモ接合型の変異型子孫を作出する。稀な場合において、例えば、該キメラから得られたＦ１マウスが非常に少ない場合は、Ｆ１ヘテロ接合型マウスを１２９ＳｖＥｖＢｒｄ／Ｃ５７ハイブリッドマウスと交配させて別のヘテロ接合型動物を得、これを異種交配してＦ２マウスを作出する。レベルＩの表現型分類解析を、この世代のマウスにおいて行なう。
【０２７３】
【表７】
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Ｃｈｉ−Ｓｑ．＝０．６３  有意性＝０．７２９７８８９（ｈｏｍ／ｎ）＝０．２７  平均産子数＝８
変異情報
変異の型：相同組換え（標準的）
説明：遺伝子は、１８のエキソンからなり、開始コドンはエキソン１に存在する（ＮＣＢＩ受託ＮＭ＿００７９３８．１）。エキソン１を標的化した。
【０２７４】
１．野生型発現パネル：標的遺伝子の発現は、１３例の成体組織試料のうち脳、脊髄、目、腎臓、および心臓において検出された（ＲＴ−ＰＣＲによって試験）
２．ＱＣ発現：標的遺伝子の破壊は、サザンハイブリダイゼーション解析によって確認した。
【０２７５】
Ｂ．  表現型分類解析（破壊遺伝子：ＤＮＡ２２２６５３（ＵＮＱ６１１４）について
（ａ）全般的な表現型分類の概要
ヒトＥｐｈ受容体Ａ６（ＥＰＨＡ６）のオルソログをコードする遺伝子の変異により、（−／−）マウスにおいて、抑うつ様応答の減少、ホットプレート試験中の潜伏時間（ｌａｔｅｎｃｙ）の短縮、血小板数の増大、グルコース寛容減損、ならびに血清トリグリセリドおよびコレステロールレベルの増大によって示される免疫学的異常がもたらされた。雌（−／−）マウスもまた、平均総組織質量、総体脂肪、総脂肪質量の増大、ならびに骨塩量および骨密度測定値の増大を示した。遺伝子破壊はサザンブロットによって確認した。
【０２７６】
（ｂ）表現型分類解析：ＣＮＳ／神経学
神経学の領域において、本明細書では、神経学的障害および精神障害、例えば、鬱、全般性不安障害、注意欠陥多動性障害、強迫性障害、統合失調症、認知障害、痛覚過敏および感覚障害の処置のためのインビボ有効標的の同定に着目して解析した。神経学的障害としては、「不安障害」と定義されるカテゴリーが挙げられ、これには、限定されないが、軽度から中等度の不安、一般的な状態による不安障害、特定不能な不安障害、全般性不安障害、パニック発作、広場恐怖症を伴うパニック障害、広場恐怖症を伴わないパニック障害、心的外傷後ストレス障害、対人恐怖症、特定の恐怖症、物質誘発性不安障害、急性アルコール禁断症状、強迫性障害、広場恐怖症、双極性障害Ｉ型もしくはＩＩ型、特定不能な双極性障害、循環病、鬱病性障害、大鬱病性障害、気分障害、物質誘発性気分障害が含まれる。また、不安障害は人格障害にも適用され得、これらに限定されないが、以下の型：妄想性、反社会的、回避性行動、境界性人格障害、依存性、ヒステリー性、自己愛性、強迫性、統合失調質性、および統合失調型が挙げられる。
【０２７７】
行動のスクリーニングはすべて、野生型、ヘテロ接合型のおよびホモ接合型のマウスのコホートにおいて行なった。行動試験はすべて、実行可能性の低下によって早期試験が必要とされない限り、１２〜１６週齢の間で行なった。これらの試験には、不安、活性レベルおよび診査（ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ）を測定するためのオープンフィールド試験を含めた。
【０２７８】
機能観察総合評価（ＦＯＢ）試験−尾懸垂試験：ＦＯＢは、肉眼的感覚および運動欠陥を調べるために動物に適用される一連の状況である。肉眼的神経機能を評価するアーウィン神経系スクリーニングの試験のサブセットを使用する。一般には、短時間の触覚、聴覚および視覚刺激を動物に負荷し、正常に検出して応答する能力を調べる。このような簡単な試験にほぼ１０分間かけ、試験終了時にマウスをそのホームケージに戻す。
【０２７９】
（ｂ．１）尾懸垂試験：
尾懸垂試験は、齧歯類における抑うつ様行動のモデルとして開発された手順である。この特定の設定状況では、マウスを尾で６分間懸垂させ、それに応答してマウスは、この姿勢から逃れようとしてもがく。一定時間経つと、マウスのもがきは減少し、これを、学習型あきらめ（ｈｅｌｐｌｅｓｓｎｅｓｓ）パラダイムと解釈する。無効データを有する（すなわち、試験期間中、尾に這い上がった）動物は、解析から除外する。
【０２８０】
結果：
尾懸垂２：（−／−）マウスは、その（＋／＋）同腹仔および従来平均と比べ、メジアン無動時間の減少を示し、これは、変異型における抑うつ様応答の減少を示す。
【０２８１】
要約すると、尾懸垂試験により、軽度から中等度の不安、一般的な状態による不安、および／または  双極性障害；多動性；感覚障害；強迫性障害、統合失調症または妄想性人格と関連したものであり得る不安増大と関連している表現型が示された。したがって、ＰＲＯ３５４４４ポリペプチドまたはそのアゴニストは、かかる神経学的障害の処置に有用であり得る。
【０２８２】
（ｂ．２）ホットプレート試験
試験の説明：侵害受容に関するホットプレート試験は、各マウスを、囲いのある小型の５５℃のホットプレート上に配置することにより行なわれる。後肢応答（なめる、震える、または飛び上がる）までの潜伏時間を記録し、ホットプレート上での最大時間は３０秒間とする。各動物について１回試験する。
【０２８３】
結果：
変異型（−／−）マウスは、その性別適合（＋／＋）同腹仔対照と比べ、応答までの潜伏時間の縮小（例えば、感応度の差の増大）を示した。この結果は、侵害受容応答の向上を示す。
【０２８４】
実施例２
ＥｐｈＡ６  ノックアウトマウスにおける学習と記憶の障害
Ａ．材料および方法
（ａ）Ｅｐｈａ６欠損動物の作出
Ｅｐｈａ６（ＮＭ＿００７９３８）標的化ベクターを、λＫＯＳ系（ＷａｔｔｌｅｒらＢｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２６（６）：１１５０−６，１１５８，１１６０（１９９９））から構築した。酵母選択カセット（両側に遺伝子相同性の配列を有する）をＰＣＲによって作製し、エキソン１の両側の遺伝子特異的配列の酵母組換えによってゲノムクローン内に導入し、開始ＡＴＧの欠失をもたらした（図１Ａ）。Ｎｏｔ１線状標的化ベクターを、１２９Ｓｖ／Ｅｖｂｒｄ（ＬＥＸ２）胚性幹（ＥＳ）細胞内にエレクトロポレーションした。Ｇ４１８／ＦＩＡＵ耐性ＥＳ細胞クローンを、サザンブロットハイブリダイゼーションによって解析した。Ｅｐｈａ６欠失を確認するため、以下のプライマー；フォワード５’ＧＣＡＣＴＡＧＧＴＣＴＡＧＴＡＣＡＡＡＣ（配列番号３）およびリバース５’ＣＡＧＡＣＣＡＡＣＧＡＧＴＧＧＡＧ（配列番号４）を用いて作製された２２１ｂｐの５’外部ＰＣＲプローブ（図１Ｂ黒色バー）を、サザンハイブリダイゼーションに使用した。この外部プローブは、Ｓｐｅ１（Ｓ）消化ＷＴゲノムＤＮＡでは９．８ｋｂバンドで、および欠失変異型では７．５ｋｂバンドで標示された。
【０２８５】
被標的化ＥＳ細胞クローンを、Ｃ５７ＢＬ／６（アルビノ）胚盤胞内に注射し、得られたキメラをＣ５７ＢＬ／６（アルビノ）雌と交配した。本発明者らは、テイルＤＮＡを、以下のプライマー：フォワード５’ＧＴＣＡＣＧＴＣＴＣＣＡＡＣＣＡＡＧＧＴＡＡＧＧ（配列番号５）およびリバース５’ＡＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＧＧＡＣＡＡＡＧＴＴＡＣＣ（配列番号６）（これらにより１０２ｂｐ  ＷＴ（Ｗ）ＰＣＲ産物が増幅）を用いたＰＣＲ（図１Ｃ）によって遺伝子型分類し、変異型ＰＣＲ産物（Ｍ）は、フォワード５’ＧＣＡＧＣＧＣＡＴＣＧＣＣＴＴＣＴＡＴＣ（配列番号７）およびリバース５’ＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＡＧＴＧＴＧＧＣ（配列番号８）（これらにより２５１ｂｐアンプリコンが得られた）を用いて増幅した。ホモ接合型、ヘテロ接合型およびおよび同腹子ＷＴ対照は、予測されたメジアン比で得られた。
【０２８６】
（ｂ）被験体
すべての作業は、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅの規定、Ａｎｉｍａｌ  Ｗｅｌｆａｒｅ  Ａｃｔ、ならびにＬｅｘｉｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  Ｐｏｌｉｃｙ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  Ａｎｉｍａｌｓに従って行なった。実験はすべて、Ｌｅｘｉｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．の研究機関における動物の飼育と使用委員会（ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  ａｎｉｍａｌ  ｃａｒｅ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）で承認されたものであった。行動の試験すべてにおいて使用した動物は、混合型Ｃ５７／ＢＬ６／Ｊアルビノ×１２９ＳｖＥｖＢｒｄ（遺伝的背景：Ｌｅｘｉｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．の交配施設で交配）の雄および雌のＫＯおよびＷＴ同腹仔であった。マウスはすべてＬｅｘｉｃｏｎで維持し、試験時は１１〜１２週齢、体重２５〜３０ｇであった。これらを、標準的な明／暗サイクル下（午前７時から午後７時）、５匹の群で３０×２０×２０ｃｍのアクリル製ケージ内に収容し、水分と食餌は随意に摂取させた。
【０２８７】
（ｃ）痕跡恐怖条件付け
痕跡恐怖条件付けは、８つの条件付けチャンバ（Ｃｏｕｌｂｏｕｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ，ＵＳＡ）を用いて行なった。訓練日は、マウスを条件付けチャンバ内に入れ、試験環境に６０秒間馴化させた。次いで、音の発生による条件刺激（ＣＳ：１５秒間持続、８５ｄＢ  ３ｋＨｚ）を負荷した後、痕跡期間を１０秒間とし、次いで、無条件刺激（ＵＳ：フットショック、２秒間、０．３６ｍＡ）を与えた。マウスには５回の試行を与え、各試行間の間隔（ＩＴＩ）を１８０秒間とし、最終ショックの１分後、ホームケージに戻した。訓練中の動作を、各音（ＣＳ）の提示前の１分間の間に起こったすくみ（音の前のすくみ）、ＣＳの終了からＵＳ開始までの１０秒間（痕跡）中のすくみ（音に対するすくみ）、および各ＵＳ後から１分間に起こったすくみ（ショック後のすくみ）を調べることにより評価した。
【０２８８】
（ｄ）モリスの水迷路
この設定状況は、直径２メートルおよび深さ４０ｃｍの円形プール（Ａｃｃｕｓｃａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）と、ＷａｔｅｒＭａｚｅ  Ｖｉｄｅｏ  Ｔｒａｃｋｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｃｔｉｍｅｔｒｉｃｓ，Ｉｎｃ．）からなるものとした。プールに３０ｃｍの深さまで水を入れ、２４〜２６℃程度に維持した。避難用プラットフォームの可視性を隠蔽するため、無毒性の水系塗料の添加によって水を不透明にした。避難用プラットフォーム（円形、直径２０ｃｍ直径）は、四分円（Ｎ、Ｓ、Ｅ、またはＷ）の１つ（試験四分円と指定する）の中央部の水面下０．５ｃｍのところに配置した。各試行間では、マウスは、太陽灯の下で保持用ケージ内に保持した。３回の学習フェーズおよび２回の精査試行とした。第１フェーズは予備訓練フェーズとした。このフェーズ（可視性フェーズとしても知られる）では、局所的手掛り（シリンダー内に円錐管）をプラットフォーム上に配置してプラットフォームを可視性とした。迷路は、あらゆる迷路外手掛りを隠すため、カーテンで囲んだ。マウスをプール内で、四分円の１つ（プラットフォームを配置した四分円以外）の壁に向けて開放した。マウスがプラットフォーム上によじ登り、そこで１０秒間とどまったらすぐに試行を終了した。９０秒以内にプラットフォームを見つけることができなかったマウスは、実験者がプラットフォームまで誘導して１０秒間とどまらせた後、取り出して保持用ケージ内に戻した。このフェーズは、１日２回の試行を４日間行ない、各試行間の間隔を１５分間とした。次のフェーズは、隠し訓練フェーズとした。このフェーズでは、プラットフォームがわからないようにし、プールの周りのカーテンを外して迷路外の状況がわかるようにした。各試行後、可視性フェーズで記載したものと同じ手順を行なった。このフェーズは、１日あたり２回の試行を７日間とした。各試行で開放地点を変え、日によって開放地点の使用順序も変えた。累積的な接近をソフトウェアによって算出した。試行中、１秒あたりのプラットフォームまでの接近距離（間隔）をサンプリングし、訓練試行の１秒あたりの平均を算出し、次いで、訓練試行ごとの１秒間の平均の合計を使用した。それにより、プラットフォームまでの直線経路からの偏差の近似値が得られる。精査試行は、試行＃１１（第６日目の訓練）の前かつ最後の隠し訓練試行の２４時間後に行なった。精査試行では、プラットフォームをプールから除き、マウスをプール内に、訓練四分円と反対側の四分円の壁に向けて入れた。６０秒間の試行中の各四分円での消費時間の割合を記録した。また、精査試行では、精査試行全体におけるプラットフォームまでの平均接近距離もプラットフォームからの平均距離として算出した。マウスの作業記憶を評価するため、隠しフェーズの後に、２日間の逆転フェーズを行なった。逆転フェーズは、２日間の各日で、隠れプラットフォームの位置を訓練四分円と異なる四分円に変えて構成する。４回の訓練試行は、各々、逆転を伴って実行した。一部のマウスのみを逆転フェーズで試験した。ベースラインが同様となるように、最後の精査試行で見込み（ｃｈａｎｃｅ）を超える動作をし、前の位置を覚えていたことを示したマウスのみを、逆転フ���ーズ訓練に含めた。プラットフォームに到達するまでの時間、経路長および速度を、試行１回ごとに記録した。試行はすべて、ビデオカメラとＷａｔｅｒＭａｚｅソフトウェア（Ａｃｔｉｍｅｔｒｉｃｓ，Ｉｎｃ．）によって記録した。
【０２８９】
（ｅ）データ解析
Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａ  ７．０ソフトウェアパッケージ（ＳｔａｔＳｏｆｔ，Ｉｎｃ．）を用いて、群間の有意差を求めた。異なる試験のデータは、対応なし両側ｔ−検定またはＲＭ  ＡＮＯＶＡを用いて解析し、遺伝子型を主効果とし、試行を反復測定とした。
【０２９０】
Ｂ．結果
異なる態様の神経学的障害のモデルとして選択したＥＰＨＡ６  ＫＯおよびＷＴマウスを、一連の行動のアッセイにおいて試験した。オープンフィールド試験、逆スクリーニング、ストレス誘導性高体温、プラットフォーム試験（Ｐｏｇｏｒｅｌｏｖら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｍｅｔｈ  １６２（２００７）２２２−２２８に記載の試験の明：暗試験の変形型、プレパルス抑制、ホットプレート、ホルマリン足刺激、尾懸垂、および強制水泳アッセイ（データ示さず）で評価した場合、一般活動性、運動協調性、不安、音響に対する驚愕、感覚運動ゲーティング、痛覚感受性および抑うつ様行動において、この２つの遺伝子型の間に差はなかった。
【０２９１】
（ａ）痕跡恐怖条件付け
訓練
恐怖条件付けでは、ＷＴマウスにおいて、試行全体における訓練中のすくみ（ショック後のすくみ、音とショックの間の痕跡期間中のすくみ、および各音の前のすくみ）の消費時間が増大した、また、すくみは、ＫＯマウスにおいても増大したが、遺伝子型間で有意差がみられた。具体的には、音に対するすくみ（おそらく、痕跡手順の学習の具体的指標）は、ＫＯマウスにおいて低かった（図２Ａ）。ＲＭ  ＡＮＯＶＡにより、遺伝子型［Ｆ（１，３３）＝４．９、ｐ＜０．０５］および試行［Ｆ（４，１３２）＝４７．１３、ｐ＜０．０００１］の有意な効果が示された。遺伝子型と試行との相互作用は見られなかった。他の訓練測定値では、遺伝子型間に差は認められなかった。
【０２９２】
文脈試験
訓練の２４時間後に訓練文脈を与えると、ＷＴマウスは、試験セッション全体をとおして高レベルのすくみを示した。すくみは、文脈試験中、ＫＯマウスにおいて有意に少なかった（ｐ＜０．０５、ｔ−検定、図２Ｂ）。
【０２９３】
聴覚条件試験
訓練の４８時間後、新たな文脈を与えると、ＷＴマウスとＫＯマウスは、ＣＳ前のすくみ（音の発生前）において有意に異ならなかった。音を発生させると、両方遺伝子型において、すくみが増えた。ＣＳ後のすくみおよびＣＳすくみの差は、ＷＴマウスよりもＫＯにおいて有意に低かった（ｐ＜０．０５、ｔ−検定、図３Ａ−Ｃ）。
【０２９４】
（ｂ）モリスの水迷路
可視性プラットフォームフェーズ
可視性フェーズでは、ＷＴマウスおよびＫＯマウスともに、訓練課程全体において改善がみられ、可視性フェーズ訓練終了までに２０秒間をわずかに超える安定な動作に至った（データ示さず）。遺伝子型間に有意差はみられず、遺伝子型と試行の相互作用もみられなかった。試行の有意な効果がみられ［Ｆ（７，２４５）＝２２．８９、ｐ＜０．０００１］、これは、両方の遺伝子型のマウスが課題を学習し、試行において改善がみられたことを示す。１匹のＷＴおよび１匹のＫＯは可視性フェーズを学習せず、したがって隠し訓練フェーズから除外した。
【０２９５】
隠しプラットフォームフェーズ
図４Ａは、ＷＴマウスおよびＫＯマウスがともに課題を学習し、試行全体において、逃避潜伏時間の短縮を示したことを示す。ＡＮＯＶＡにより、逃避潜伏時間に対する遺伝子型［Ｆ（１，３３）＝８．４７、ｐ＜０．０１］および試行［Ｆ（１３，４２９）＝６．４、ｐ＜０．０００１］の有意な効果が示された。遺伝子型と試行の相互作用はみられなかった。この結果は、両方の遺伝子型が課題を学習したことを示すが、群間で動作において差がみられ、ＫＯマウスは、ＷＴと比べて動作障害（ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）を有した。隠れプラットフォームの位置の学習を示す別の測定値は、累積的な接近である（図４Ｂ）。Ｇａｌｌａｇｈｅｒらによれば、この測定値は訓練試行に有用である。Ｇａｌｌａｇｈｅｒの接近距離測定（Ｇａｌｌａｇｈｅｒ  Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  Ｍｅａｓｕｒｅ）の理論的根拠は、動物は、プラットフォームがどこにあるかを知らない場合であっても、広範囲の探索（ｓｗｅｅｐｉｎｇ  ｓｅａｒｃｈ）を用いるだけで、中程度に短い潜伏時間および経路長でプラットフォームに到達し得るということである。しかしながら、Ｇａｌｌａｇｈｅｒの測定値は、動物がどこにプラットフォームがあるかわかっている場合は小さく（良好）、プラットフォームの近くでの探索にほとんどの時間を費やす。遺伝子型の有意な効果［Ｆ（１，３３）＝６．６２、ｐ＜０．０５］、および試行の有意な効果［Ｆ（１３，４２９）＝１１．１３、ｐ＜０．０００１］がみられた。隠し訓練全体で、泳ぐ速度および移動距離で２つの遺伝子型間において差はみられず、遺伝子型と試行の相互作用もみられなかった。試行の有意な効果がみられた［Ｆ（１３，４２９）＝９．４７、ｐ＜０．０００１］。泳ぐ速度は、両方の遺伝子型のマウスにおいて、隠し訓練開始時の平均２２ｃｍ／秒から訓練終了時では１４ｃｍ／秒に減少した。
【０２９６】
精査試行
第１精査試行は、試行＃１１（隠し訓練フェーズの第６日目）の開始前に行なった。両方の遺伝子型のマウスは、訓練四分円の位置に対して見込みを超えるレベルの優先性を示し、訓練四分円での消費時間の割合においてＫＯとＷＴ間に差はみられなかった。さらに２日間の訓練後に行なった第２精査試行では、ＷＴマウスは、訓練四分円における消費時間の割合の高さ、およびプラットフォームまでの平均接近距離の短さに反映されているように、ＫＯと比べて有意に優れた動作を示した（図５ＡおよびＢ）。
【０２９７】
逆転フェーズ
プラットフォームの移動により、隠れプラットフォーム訓練の最終日に観察された平均時間と比べて、たどりつくまでの平均時間が増大した。しかしながら、ＭＷＭ手順のこのフェーズでは、遺伝子型間に差はみられなかった。ＷＴマウスおよびＫＯマウスはともに、各試験日において、プラットフォームの新しい位置を学習することができた。
【０２９８】
Ｃ．考察
ＥｐｈＡ６をコードする遺伝子の変異により、全般性の行動の変化はもたらされず、これらのマウスは、遺伝子機能阻害に起因する変化のさらなる試験に特に有用となる。痕跡恐怖条件付けパラダイムでは特異的で有意な障害が観察され、ＭＷＭアッセイでも空間記憶の障害が観察されたが、作業記憶では観察されなかった。このように全般性障害がないことは、空間および文脈学習における特異的障害と併せると、ＥｐｈＡ６が別々の行動ネットワークに関与していることを示す。ＥｐｈＡ６は、ＭＷＭにおいて痕跡条件付けおよび空間学習の取得に関与していることが十分わかっている海馬において強く発現される。したがって、この構造の変化が、ＥｐｈＡ６欠失の特異的行動の効果の原因である可能性がある。しかしながら、海馬は作業記憶にも関与しているため、ここに示した同じ効果が独立して存在するはずである。ＥｐｈＡ６は、学習と記憶に関与している回路の発達と機能に役割を果たしているＥｐｈＡ受容体およびＥｐｈＢ受容体の増えつつあるリストに加えられる。ＥｐｈＡ６の遺伝子機能阻害に起因する具体的な機能的変化および解剖学的変化が示されることにより、これらの行動プロセスに関する海馬および関連構造の役割の理解が高まるであろう。
【０２９９】
これらのデータは、ＥｐｈＡ６における変化が、認知障害を伴うヒト疾患に直接関与している可能性があることを示す。ヒト障害との遺伝的関連の調査により、特定の患者の症状の原因である機構を特定するための診断用ツールとしての直接的証拠がもたらされ得よう。また、ＥｐｈＡ６イムノアドヘシンも、ヒト認知障害の処置のための潜在的治療用薬剤として想定される。
【図２】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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