(57)【要約】  触媒デンプン脱分岐ドメイン及びデンプン結合ドメインを含むポリペプチドを開示する。デンプン結合ドメインポリペプチドは、デンプン結合ドメインを伴わない、同じ量の同じ触媒ユニットと比較して、生デンプン分解において改善された機能を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
デンプン脱分岐活性を有し、かつ触媒デンプン脱分岐ドメイン及びデンプン結合ドメインを含むアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項２】
前記触媒デンプン脱分岐ドメインとデンプン結合ドメインとを連結するリンカーをさらに含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記触媒デンプン脱分岐ドメインが、プルラナーゼ又はイソアミラーゼに由来する、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記触媒デンプン脱分岐ドメインが、バチルス・アシドプルリチカス（Bacillus acidopullulyticus）、バチルス・デラミフィカンス（B. deramificans）、クレブシエラ・ニューモニア（Klebsiella pneumonia）、クレブシエラ・アエロゲネス（K. aerogenes）又はパイロコッカス属（Pyrococcus sp.）から得られるプルラナーゼ；あるいはロドサームス・マリヌス（Rhodothermus marinus）、シュードモナス・アミロデラモサ（Pseudomonas amyloderamosa）、シュードモナス属ＳＭＰ１（Pseudomonas sp. SMP1）、フラボバクテリウム・オドラツム（Flavobacterium odoratum）、スルフォロブス・アシドカルダリウス（Sulfolobus acidocaldarius）又はスルフォロブス・ソルファタリクス（S. solfataricus）から得られるイソアミラーゼに由来する、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記プルラナーゼが、バチルス属の細菌に由来する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記プルラナーゼが、バチルス・アシドプルリチカス（B. acidopullulyticus）ｐｕｌＢもしくはｐｕｌＣ、又はこれらの変異体である、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記プルラナーゼがｐｕｌＢとｐｕｌＣのハイブリッドである、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記デンプン結合ドメインが、炭水化物結合モジュールファミリーのＣＢＭ−２０、ＣＢＭ−２１、ＣＢＭ−２５、ＣＢＭ−２６、ＣＢＭ−３４、ＣＢＭ−４１及びＣＢＭ−４５に属する、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記デンプン結合ドメインが、ＣＢＭ−２０ファミリーに属する、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記デンプン結合ドメインが、アノキシバチルス・コンタミナンス（Anoxybacillus contaminans）α−アミラーゼのデンプン結合ドメイン、又はサーモアナエロバクター属（Thermoanaerobacter sp.）ＣＧＴアーゼのデンプン結合ドメインである、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記リンカーが、１００以下のアミノ酸、好ましくは２〜５０のアミノ酸、より好ましくは２〜２５のアミノ酸、そして最も好ましくは５〜２０のアミノ酸から成る、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記リンカーがプロリンリッチである、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記リンカーが−ＰＥＰＴＰＥＰＮ−である、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項１５】
請求項１４に記載の核酸を含む組み換えベクター。
【請求項１６】
ｐＲＢ２１２である、請求項１５に記載の組み換えベクター。
【請求項１７】
請求項１４に記載の核酸又は請求項１５もしくは１６に記載のベクターを含む、組み換え宿主細胞。
【請求項１８】
非ゼラチン化デンプン及び水を請求項１〜１３のいずれか１項に記載のポリペプチドと共にインキュベートすることを含む、生デンプン分解のための方法。
【請求項１９】
以下のステップ：
ａ）生デンプンと水の混合物を提供するステップ；
ｂ）エンド型アミラーゼ又はエキソ型アミラーゼと一緒に、デンプン脱分岐活性を有するポリペプチドを添加するステップ；
ｃ）デンプンが分解するために有効な温度及び時間において、上記混合物をインキュベートするステップ、
を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記エキソ型アミラーゼがグルコアミラーゼを含む、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デンプン脱分岐活性を有するポリペプチド、及びデンプン加水分解、特に生デンプン加水分解におけるこれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
デンプンは多種多様な植物中で見られる天然の貯蔵炭水化物である。デンプン含有作物は世界中のほとんどの場所において重要な農作物である。デンプンを含む最も重要な作物としては、トウモロコシ、小麦、稲、大麦及びジャガイモが挙げられる。
【０００３】
デンプンの酵素分解は、醸造、グルコース又は高果糖シロップの生産、及び飲料用又は燃料用エタノールの生産といった多くの工業処理の一部である。
【０００４】
その天然状態において、デンプンは多くの酵素による分解に対して極めて耐性であり、このためデンプンの工業的な酵素分解は、伝統的に、デンプンをゼラチン化する加熱工程により開始され、これにより多くの酵素に対してより感受性を与える。ゼラチン化は高度な分解を満足するために一般的に必要とされるが、粘度を極めて増加させ、これは技術的な困難性を与える恐れにつながる。
【０００５】
エンド型酵素、例えばα−アミラーゼ；エキソ型酵素、例えばβ−アミラーゼ及びグルコアミラーゼ；ならびに脱分岐酵素、例えばプルラナーゼ及びイソアミラーゼの組み合わせはデンプンの酵素分解のために使用される。
【０００６】
WO 98/16633は、デンプン分解酵素、炭水化物結合ドメイン（ＣＢＤ）及びリンカーを含むハイブリッドを記載する。プルラナーゼは、デンプン分解酵素の一例として言及されている。唯一例示されているハイブリッドは、α−アミラーゼ、ＣＢＤ及びリンカーから成る。
【０００７】
EP 1200552 B1は、デンプン結合ドメイン（ＳＢＤ）を有するハイブリッドとして、デンプン変換タンパク質、例えばプルラナーゼの植物中の発現を開示する。該ハイブリッドは、これらが植物中でデンプン粒に限局し、これにより変換されたデンプンが産生されるという利点を有する。
【０００８】
Van Bueren et al. Biochemistry 2004, 43: 15633-15642 は、超好熱真正細菌サーモトガ・マリチマ（Thermotoga maritima）から単離されたプルラナーゼ活性を有する４つのモジュールタンパク質を記載する。この４つのモジュールの１つは、α−（１−４）結合グルカンに最も高い親和性を有する、新しい種類の炭水化物結合ドメインとして同定された。
【０００９】
N. Sauvonnet et al. 1995. J. Bact. 177 （18）: 5238-5246 には、細菌プルラナーゼに関する研究が開示されており、ここでより小さい挿入は許容されるが、より大きなタンパク質のＮ−又はＣ−末端に対する融合は、一般に有効に分泌できないことが発見されている。
【００１０】
WO 2005/096804 には、植物における発現のためのポリヌクレオチドが開示されている。該ポリヌクレオチドは、第１のポリペプチドと第２のペプチドを含む融合ポリペプチドをコードできる。第１のポリペプチドはプルラナーゼ活性を有しており、そして第２のペプチドはデンプン結合ドメイン由来のＮ−末端シグナル配列であってよい。
【発明の概要】
【００１１】
本発明者らは、デンプン結合ドメイン（ＳＢＤ）をデンプン脱分岐ドメインに加えることにより、より優れた生デンプン加水分解を得ることが可能となることを見出した。
【００１２】
したがって、本発明は、触媒デンプン脱分岐ドメイン、デンプン結合ドメイン（ＳＢＤ）、及び任意に、これらのドメインを連結するリンカーを含む融合ポリペプチド（ハイブリッドポリペプチド）を供する。該触媒デンプン脱分岐ドメインは、好ましくはプルラナーゼである。
【００１３】
本発明はまた、本発明の融合ポリペプチドの調製を供する。本発明はさらに、デンプン分解、特に生デンプン分解における触媒デンプン脱分岐ドメイン及びデンプン結合ドメインを含むポリペプチドの使用を供する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、プラスミドｐＫＫ２２３−３を示す。詳細は実施例に供される。
【図２】図２は、プラスミドｐＮＢＴ５１を示す。
【図３】図３は、プラスミドｐＮＢＴ５２を示す。
【図４】図４は、プラスミドｐＮＢＴ５３を示す。
【図５】図５は、プラスミドｐＮＢＴ５４を示す。
【図６】図６は、プラスミドｐＮＢＴ３５を示す。
【図７】図７は、プラスミドｐＮＢＴ３０を示す。
【図８】図８は、プラスミドｐＮＢＴ３１を示す。
【図９】図９は、プラスミドｐＮＢＴ３６を示す。
【図１０】図１０は、プラスミドｐＲＢ１６５を示す。
【図１１】図１１は、プラスミドｐＭＲＴ１３５を示す。
【図１２】図１２は、プラスミドｐＷＷｉ００６を示す。
【図１３】図１３は、プラスミドｐＭＤＴ１０５を示す。
【図１４】図１４は、プラスミドｐＭＤＴ１１４を示す。
【図１５】図１５は、プラスミドｐＭＢｉｎ１１５を示す。
【図１６】図１６は、プラスミドｐＲＢ２１２を示す。
【００１５】
定義
本発明において、ポリペプチドのドメインは、ポリペプチドのリマインダーの構造的及び／又は機能的な相違であるポリペプチドの一部を意味することを意図する。例えば、ポリペプチドはポリペプチドの触媒特性の原因である触媒ドメインを有することが知られており、その一方で第２ドメインは特定の構造成分に結合するための原因となりうる。天然のポリペプチドは１つだけのドメインから成るか、あるいは２つ以上のドメインを含みうる。典型的には、各々のドメインは、独立にポリペプチドのリマインダーの折りたたみ及び機能化を可能にする。
【００１６】
触媒ドメインは酵素の一部であってよく、あるいは完全な酵素であってもよい。
【００１７】
デンプン脱分岐酵素は、デンプンの脱分岐を触媒することができる酵素を意味する。
【００１８】
デンプンは、α−１，４結合を介して連結されるグルコシル残基から構成されるポリマーである。一般に、デンプンは、アミロース、α−１，４結合を介して連結されるグルコシル残基から成るポリマー、及びα−１，６−結合を介してほかのα−１，４結合グルコシル鎖に連結するα−１，４結合グルコシル鎖の分岐とのα−１，４結合を介して連結されるグルコシル残基から成るアミロペクチンから構成される。アミロペクチンを攻撃することができる脱分岐酵素は、イソアミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．６８）及びプルラナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．４１）を含む。
【００１９】
イソアミラーゼは、アミロペクチンとβ−限界デキストリンにおけるα−１，６−Ｄ−グルコシド分岐結合を加水分解し、そしてプルランを攻撃するためのイソアミラーゼの不能力により、及びα−限界デキストリンにおける制限された作用により、プルラナーゼと区別することができる。アミロペクチンに対するアミラーゼの割合、該アミロペクチンにおける分岐の頻度、及び該分岐の平均の鎖長は、デンプン源に有意に依存して変化するが、これは本発明において考慮するほど重要ではない。したがって、デンプン脱分岐酵素は、アミロペクチンのα−１，６結合の分解を触媒し、これによりアミロペクチン構造から分岐を除去することができるポリペプチドである。
【００２０】
本発明において、「デンプン脱分岐酵素」の用語又は文法的に同等の表現は、２つのグルコース単位を接続するα−１，６−グルコース結合を分解することができる触媒活性を有する酵素又はタンパク質ドメインを意味することが意図される。したがって、該用語はプルラナーゼ又はイソアミラーゼとして記載される酵素に制限されない。
【００２１】
デンプン脱分岐酵素は、天然に見られるタンパク質、天然において見られるタンパク質の断片であってよく、あるいはこのようなタンパク質の変異体であってもよい。
【００２２】
変異体の用語は、少なくとも１つの改変、例えば置換、挿入又は欠失による天然タンパク質に直接又は間接的に由来するタンパク質であると理解される。タンパク質の変異体は、分子生物学における当業者に周知の技術を使用して調製することができ、確立されたハンドブック、例えば J. Sambrook, E. F. Fritsch, 及び T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York に記載されている。
【００２３】
触媒デンプン脱分岐ドメインは、デンプン脱分岐酵素の一部を意味することが意図され、この部分は完全な酵素の触媒活性に関与する。したがって、触媒デンプン脱分岐ドメインは、デンプン脱分岐酵素の全部又は一部であってよい。
【００２４】
炭水化物結合ドメインは、通常、非共有結合により、炭水化物と結合することができるタンパク質構造である。炭水化物結合ドメインは、多糖類、セルロース、キシラン又はデンプンを結合するドメインを含む。いくつかの炭水化物結合ドメインは文献中に記載されており、ファミリーに分類されている。ＣＢＭファミリーの分類については Boraston et al. （2004） Biochem. J. 382: 769-781 及び http://afrnb.cnrs- mrs.fr/CAZY/inclex.html を参照のこと。
【００２５】
デンプン結合ドメインは、デンプン、特に生デンプンに対する特異性を有する炭水化物結合ドメインである。デンプン結合ドメインは、ＣＢＭ−２０、ＣＢＭ−２１、ＣＢＭ−２５、ＣＢＭ−２６、ＣＢＭ−３４、ＣＢＭ−４１及びＣＢＭ−４５の少なくとも１つの炭水化物結合ドメインファミリーに見られる。
【００２６】
リンカーは、２つのドメインの活性を阻害することなく、触媒デンプン脱分岐ドメインを炭水化物結合ドメインから分離するタンパク質部分である。
【００２７】
本明細書において、デンプン分解は、デンプン形成デキストリンとグルコースの酵素的な脱重合として理解される。デンプン分解は、通常、α−１，４及びα１，６グルコシド結合を加水分解することができる酵素、例えばα−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ及びＣＧＴアーゼの組み合わせを使用して行われる。通常、デンプン分解は、少なくとも１つのエンド型アミラーゼ、例えばα−アミラーゼと、少なくとも１つのエキソ型アミラーゼ、例えばβ−アミラーゼ又はグルコアミラーゼ、ならびに任意的な脱分岐酵素、例えばプルラナーゼの組み合わせを使用して行われる。伝統的には、デンプン分解は、デンプン含有物質と水の混合物を加熱し、その後酵素を添加し、そして分解が完了するか、所望の程度に達するまで該混合物を適当な温度に保つことにより行われる。デンプン含有物質と水の混合物の最初の加熱により、デンプンはゼラチン化し、混合物の粘度を有意に増加させる。
【００２８】
本明細書において、生デンプンは、非ゼラチン化デンプンとして理解される。生デンプン分解は、デンプンのゼラチン化及びその後の実質的な粘度の増加を伴わずに行われるデンプン分解プロセスである。
【００２９】
発明の詳細な説明
本発明は、デンプン脱分岐触媒ドメイン及びデンプン結合ドメイン、ならびに任意的にこれらのドメインを接続するリンカー配列を含む融合ポリペプチドを供する。
【００３０】
デンプン脱分岐触媒ドメイン
デンプン脱分岐触媒ドメインは、原則として、デンプンの脱分岐を触媒することが可能ないずれかのドメインであってよい。デンプン脱分岐触媒ドメインは、好ましくはプルラナーゼに由来する。
【００３１】
脱分岐酵素は、主には細菌であるが、多様な生物、例えばバチルス属及びパイロコッカス属；ならびに植物、例えば大麦及び稲に由来することが記載されている。本発明においては、脱分岐酵素は細菌に由来し、例えばバチルス・アシドプルリチカス（Bacillus acidopullulyticus）、バチルス・デラミフィカンス（B. deramificans）、クレブシエラ・ニューモニア（Klebsiella pneumonia）、クレブシエラ・アエロゲネス（K. aerogenes）又はパイロコッカス属（Pyrococcus sp.）に由来するプルラナーゼ；あるいはロドサームス・マリヌス（Rhodothermus marinus）、シュードモナス・アミロデラモサ（Pseudomonas amyloderamosa）、シュードモナス属ＳＭＰ１（Pseudomonas sp. SMP1）、フラボバクテリウム・オドラツム（Flavobacterium odoratum）、スルフォロブス・アシドカルダリウス（Sulfolobus acidocaldarius）又はスルフォロブス・ソルファタリクス（S. solfataricus）に由来するイソアミラーゼが好ましい。
【００３２】
好ましくは、本発明の脱分岐酵素は、細菌、好ましくはバチルス属に由来するプルラナーゼである。
【００３３】
好ましい実施形態において、脱分岐酵素は、Ｂ・アシドプルリチカス（B. acidopullulyticus）に由来するプルラナーゼ、特には配列番号１４の１１〜８３７残基から成るｐｕｌＢ／Ｃハイブリッド（融合）である。これは、コード領域内のＢａｍ  ＨＩ部位のｐｕｌＢ遺伝子上流部分 （Kelly et al., 1994 FEMS Microbiol. Letters, 1 15: 97-106を参照のこと；参考として組み込まれている）及びコード領域内のＢａｍ  ＨＩ部位のＢ・アシドプルリチカス（B. acidopullulyticus）のｐｕｌＣ遺伝子下流部分から成る。
【００３４】
脱分岐酵素は、天然の酵素であってよく、あるいは脱分岐活性を依然として有する天然の酵素の変異体であってもよい。これに関して、変異体は、天然のポリペプチドと少なくとも１つのアミノ酸残基が異なるポリペプチドとして理解される。少なくとも１つが異なるアミノ酸は、１又は複数のアミノ酸残基の置換、挿入又は欠失、あるいはこれらの組み合わせの中から選択されてよい。このような変異体を調製するための方法は当業者に周知である。
【００３５】
ある実施形態において、脱分岐酵素は、WO 00/01796 又はWO 01/51620 に開示されるような変異体であり、これらは共に参考として本明細書に組み込まれている。
【００３６】
デンプン結合ドメイン（ＳＢＤ）
デンプン結合ドメイン（ＳＢＤ）は、原則としてデンプンと結合することができるいずれかのタンパク質ドメインであってよい。本明細書において、ＳＢＤは、好ましくは非ゼラチン化デンプンとして理解される生デンプンに結合することが可能である。
【００３７】
ＳＢＤは、炭水化物結合モジュールの認識されたグループに属してよく、あるいはほかの既知の炭水化物結合モジュールに類似しない独特の構造を有してもよい。いくつかの炭水化物結合モジュール（ＣＢＭ）は、文献において記載されており、また配列的及び構造的な類似性に基づくファミリーに分類されている。デンプン結合ドメインは、ＣＢＭ−２０、ＣＢＭ−２１、ＣＢＭ−２５、ＣＢＭ−２６、ＣＢＭ−３４、ＣＢＭ−４１及びＣＢＭ−４５の炭水化物結合ドメインファミリーに見られる。好ましくは、本発明のＳＢＤは、ＣＢＭ−２０ファミリーに属する。
【００３８】
ＣＢＭ−２０ファミリーに属するＳＢＤは、古細菌（archaebacteria）に由来する酵素中、例えばパイロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）ＤＳＭ  ３６３８（Uniprot ace. No. Q8U1 U7）に由来するＰＦ１１０８タンパク質中、；真正細菌（eubacteria）に由来する酵素中、例えばアノキシバチルス・コンタミナンス（Anoxybacillus contaminans）（バチルス・フラボサーマス（Bacillus flavothermus）として従来知られていた）に由来するα−アミラーゼタンパク質、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）に由来するα−アミラーゼ、及びバチルス・サーキュランスＡＭ７（Bacillus circulans AM7）に由来するα−アミラーゼ中；並びに真核生物（eukaryotes）に由来する酵素、例えばアスペルギルス・ニゲル（Aspergillus niger）に由来するグルコアミラーゼ中に見られる。
【００３９】
本発明のＣＢＭ−２０ファミリーに属するＳＢＤは、好ましくはバチルス（Bacillus）、ゲオバチルス（Geobacillus）、アノキシバチルス（Anoxybacillus）、パイロコッカス（Pyrococcus）又はアスペルギルス（Aspergillus）属に属する微生物に由来する。
【００４０】
ＣＢＭ−２０ファミリーに属するＳＢＤは、配列番号１５、及び配列番号１４の８３８〜９３６残基として示されている。前者は、サーモアナエロバクター属（Thermoanaerobacter sp）のＣＧＴアーゼに由来し（Joergensen et al （1997）, Biotechnol. Lett. 19:1027-1031）、そして後者は、アノキシバチルス・コンタミナンス（Anoxybacillus contaminans）のα−アミラーゼに由来する （WO 2006/066596）。
【００４１】
ＳＢＤは、天然のＳＢＤであってよく、あるいはデンプン結合活性を有する天然のＳＢＤの変異体であってもよい。これに関して、変異体は、天然のポリペプチドと少なくとも１つのアミノ酸残基が異なるポリペプチドとして理解される。少なくとも１つが異なるアミノ酸は、１又は複数のアミノ酸残基の置換、挿入又は欠失、あるいはこれらの組み合わせの中から選択されてよい。タンパク質、例えばＳＢＤの変異体を調製するための方法は、当業者に周知である。
【００４２】
リンカー
リンカーの重要な目的は、融合体のほかの部分によって融合体の１つのドメインの機能のいずれかの立体障害を防止するために、ＳＢＤから触媒ドメインを分離することである。リンカーは融合体の構築ストラテジーをもたらす１又は数個のアミノ酸から成ってよく、あるいはリンカーはより長いペプチドであってもよい。原則として、リンカーの長さに上限はないが、実質的な理由により、リンカーは約１００アミノ酸残基よりも長くないことが好ましい。したがって、本発明の好ましいリンカーは１〜１００のアミノ酸、好ましくは２〜５０のアミノ酸、より好ましくは２〜２５のアミノ酸、そして最も好ましくは５〜２０のアミノ酸である。
【００４３】
リンカーの正確な配列は重要ではないが、リンカーの配列は、リンカーがいずれかの剛構造（rigid structure）を導入しないように選択することが好ましい。リンカーのアミノ酸組成は、好ましくは、親水性残基リッチであるように選択される。また、プロリン残基は、リンカーのいずれかの二次構造を分裂させる能力を有することから有利となりうる。
【００４４】
好ましい実施形態において、リンカーはプロリンリッチリンカーである。プロリンリッチリンカーは、少なくとも２０％の残基、好ましくは２５〜２５％の残基がプロリン残基であるリンカーを意味することを意図する。
【００４５】
本発明のプロリンリッチリンカーの好ましい例は、−ＰＥＰＴＰＥＰＮ−（配列番号１）である。
【００４６】
特に好ましい実施形態において、本発明の融合体は配列番号１４の成熟部分から成る。これは、コード領域内のＢａｍＨＩ部位のｐｕｌＢ遺伝子上流部分（Kelly et al., 上記を参照のこと）及びコード領域内のＢａｍＨＩ部位のＢ・アシドプルリチカス（B. acidopullulyticus）のｐｕｌＣ遺伝子下流の部分から成るｐｕｌＢ／Ｃ遺伝子ハイブリッド（融合）の発現により作成されるｐｕｌＢ／Ｃハイブリッド（融合）、Ａ・コンタミナンス（A. contaminans）α−アミラーゼ、又はサーモアナエロバクター属（Thermoanaerobacter sp.）ＣＧＴアーゼ由来のＳＢＤ、及びリンカー−ＰＥＰＴＰＥＰＮ−（配列番号１）を含む。
【００４７】
本発明の融合体は、本発明の融合体をコードする核酸を提供し、該核酸を、特に選択された宿主細胞に適合する適当なプロモーター及び適当な制御配列を有する適当な発現ベクターに挿入し、宿主細胞を該発現ベクターで形質転換し、該形質転換した宿主細胞を、融合体の発現を促進する適当な成長培地中で培養し、その後、該融合体を回収することにより慣習的に産生される。組み換えポリペプチド、例えば本発明の融合体を発現するための技術、発現ベクター、宿主細胞等は、当業界において簡単に入手できるものであり、そして例えば Sambrook et al. op. cit に記載される周知の方法を使用して本発明の融合体を産生するための適当な条件を選択することは、平均的な当業者の範疇にある。
【００４８】
組み換え発現ベクター
ほかの観点において、本発明は本発明の融合体をコードする核酸を含む組み換え発現ベクターに関する。
【００４９】
本発明の組み換え発現ベクターは、組み換えＤＮＡ手順において慣習的行うことができるいずれかの発現ベクターであってよく、ベクターの選択は、導入される宿主細胞にしばしば依存する。したがって、ベクターは、自発的に複製ベクター、すなわち、染色体外部として存在し、染色体複製と独立する複製、例えばプラスミドとして存在するベクターであってよい。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入される場合、宿主細胞ゲノムと、部分的又は全体的に一体化し、そして一体化された染色体と一緒に複製されるものあってよい。発現ベクターはプラスミド又はウイルスＤＮＡであってよく、あるいはその両方の要素を含有してもよい。
【００５０】
本発明の発現ベクターにおいて、融合をコードするＤＮＡ配列は、好ましくはＤＮＡの転写に必要な追加的なセグメント、特に１又は複数のプロモーター及びターミネーター領域と作動可能的に連結される。「作動可能的に連結される」の用語は、該セグメントが、これらの意図される目的に合わせて機能するように配置されたセグメントを意味する。例えば転写は、プロモーターにおいて開始され、酵素をコードするＤＮＡ配列を介して進行する。
【００５１】
プロモーターは、選択された宿主細胞において転写活性を示すいずれかのＤＮＡ配列であってよく、そして該宿主細胞と同種又は異種のタンパク質をコードする遺伝子に由来してよい。
【００５２】
細菌宿主細胞において使用するための適当なプロモーターの例は、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）マルトジェニック・アミラーゼ遺伝子、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）α−アミラーゼ遺伝子、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）α−アミラーゼ遺伝子、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）アルカリプロテアーゼ遺伝子、又はバチルス・プミルス（Bacillus pumilus）キシロシダーゼ遺伝子のプロモーター、あるいはファージラムダＰＲ又はＰＬプロモーター、あるいは大腸菌（E. coli）ｌａｃ、ｔｒｐ、もしくはｔａｃプロモーターを含む。
【００５３】
また、本発明の酵素をコードするＤＮＡ配列は、必要な場合には、適当なターミネーターと任意に連結することができる。
【００５４】
本発明の組み換え発現ベクターは、さらに問題の宿主細胞中でベクターを複製することを可能にするＤＮＡ配列を含んでよい。
【００５５】
本発明の発現ベクターはまた、選択マーカー、例えば宿主細胞における欠陥を補完する遺伝子、又は例えばカナマイシン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、テトラサイクリン、スペクチノマイシンなどの抗生物質に対する耐性、あるいは重金属又は除草剤に対する耐性をコードする遺伝子含んでよい。
【００５６】
該酵素を宿主細胞の分泌経路に向けるために、分泌シグナル配列（リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列としても知られる）を組み替えベクター中に供することができる。分泌シグナル配列は正しいリーディング・フレームにおいて酵素をコードするＤＮＡ配列に連結される。分泌シグナル配列は、一般に該酵素をコードするＤＮＡ配列に対して５’に位置している。該分泌シグナル配列は該酵素に通常関連してよく、あるいは、ほかの分泌されたタンパク質をコードする遺伝子に由来してよい。
【００５７】
本発明の酵素をコードするＤＮＡ配列、プロモーター、及び任意的なターミネーター及び／又は分泌シグナル配列をそれぞれ連結するため、又は適当なＰＣＲ増幅スキームによりこれらの配列を構築するため、そしてこれらを複製や一体化に必要な情報を含有する適当なベクターに導入するために使用される手順は、当業界に周知である（例えばSambrook et al., op.cit.を参照のこと）。
【００５８】
生デンプン分解
さらなる観点において、本発明は、触媒デンプン脱分岐ドメイン及びデンプン結合ドメインを含むポリペプチドを使用する、生デンプンを分解するための方法に関する。本発明者らは、驚くべきことに、デンプン結合ドメインを伴わずに同じ触媒デンプン脱分岐ドメインを含むポリペプチドを使用する場合と比較して、触媒デンプン脱分岐ドメイン及びデンプン結合ドメインを含むポリペプチドを使用することによって、より有効な生デンプン分解を達成できることを見出した。
【００５９】
触媒デンプン脱分岐ドメイン及びデンプン結合ドメインを含むポリペプチドは、天然の酵素であってよく、あるいは本発明の融合体であってもよい。好ましくは、触媒デンプン脱分岐ドメイン及びデンプン結合ドメインを含むポリペプチドは、本発明の融合体であり、よりさらに好ましくは、触媒プルラナーゼドメイン及びデンプン結合ドメインを含む融合ポリペプチドである。
【００６０】
典型的には、生デンプンを分解するための方法は以下の工程を含む：
ａ）生デンプンと水の混合物を提供するステップ；
ｂ）触媒デンプン脱分岐ドメインとデンプン結合ドメインを含む少なくとも１つのポリペプチド、少なくとも１つのエンド型アミラーゼ、及び少なくとも１つのエキソ型アミラーゼを添加するステップ；
ｃ）該混合物を、所望の程度の分解を得るために適当な温度及び十分な時間においてインキュベートするステップ。
【００６１】
工程ａ）において、上記混合物は、ＰＨ調節化合物、無機塩等をさらに含んでよい。生デンプンは、いずれかの生デンプンであってもよいが、好ましくは該デンプンは、穀類デンプン、例えばトウモロコシ、小麦、大麦、ソルガム等に由来するデンプンである。
【００６２】
触媒デンプン脱分岐ドメイン及びデンプン結合ドメインを含むポリペプチドは、天然のポリペプチドであってよく、あるいは本発明の融合体であってもよい。
【００６３】
エンド型アミラーゼは、好ましくは微生物源、特には糸状菌又は酵母菌、又は細菌に由来するα−アミラーゼから選択される。多数のα−アミラーゼが当業界において知られており、そして本発明の生デンプンを分解する方法に適当なα−アミラーゼを選択することは当業者の能力の範囲内である。適当なα−アミラーゼの例としては、アクレモニウム（Acremonium）、アルカリゲネス（Alcaligenes）種、特にアルカリゲネス・レイタス（Alcaligenes latus）、アスペルギルス（Aspergillus）種、特にアルペルギルス・カワチイ（Aspergillus kawachii）及びアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）、バチルス（Bacillus）種、特にバチルスバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・ポリミクサ（Bacillus polymyxa）、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）及びバチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）、デスルフロコッカス（Desulfurococcus）種、特にデスルフロコッカス・ムコサス（Desulfurococcus mucosus）、フェルビドバクテリウム（Fervidobacterium）種、ラクトバチルス（Lactobacillus）種、ミクロコッカス（Micrococcus）種、シュードモナス（Pseudomonas）種、特にシュードモナス・アミロデラモサ（Pseudomonas amyloderamosa）、パイロコッカス（Pyrococcus）種、特にパイロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）及びパイロコッカス・ウォエセイ（Pyrococcus woesei）、ピロジクチウム（Pyrodictium）種、スルホロブス（Sulfolobus）種、スタフィロサーマス（Staphylothermus）種、又はサーモコッカス属（Thermococcus sp.）種に由来するα−アミラーゼを挙げることができる。
【００６４】
エキソ型アミラーゼは、好ましくはグルコアミラーゼ、例えばアスペルギルス・ニゲル（Aspergillus niger）、アスペルギルス・アワモリ（A. awamori）、アスペルギルス・カワチイ（A. kawachii）、タラロマイセス・エメルソニイ（Talaromyces emersonii）、トラメテス・シングラタ（Trametes cingulata）又はアセリア・ロフシイ（Athelia rolfsii）に由来するグルコアミラーゼである。
【００６５】
α−アミラーゼ及び／又はグルコアミラーゼは（ａ）天然の酵素であってよく、あるいは周知の組み替えＤＮＡ技術方法を使用して改変した変異酵素であってもよい。
【００６６】
好ましい実施形態において、生デンプン分解は、燃料エタノールを調製するための過程の一部である。
【００６７】
本発明者により意図されるほかの使用は、洗剤組成物、デンプン液化もしくは糖化、又は織物湯通し（textile desizing）における本発明の融合体の使用を含む。
【００６８】
本発明は、実証的な目的のために供される以下の例によりさらに説明されるが、制限することを意図するものではない。
【００６９】
実験
培地
バチルス株をＴＢＡＢプレート（Difco Tryptose Blood Agar Base （BD Diagnostics, Franklin Lakes, NJ, USA）又はＬＢ寒天プレート（１０ｇ／ｌのトリプトン、５ｇ／ｌの酵母抽出物、５ｇ／ｌのＮａＣｌ、１５ｇ／ｌのバクト寒天）において、あるいはＶＹ液体培地（２５ｇ／ｌの仔牛抽出液（veal infusion）（BD Diagnostics, Franklin Lakes, NJ, USA）、５ｇ／ｌの酵母抽出物）中で成長させた。必要な場合には、濾過滅菌抗生物質を、１２０μｇ／ｍｌのスペクチノマイシン；６μｇ／ｍｌのネオマイシン；５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールの濃度において、オートクレーブ後培地に添加した。
大腸菌（E. coli）株を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン（濾過滅菌、オートクレーブ後添加）を補完したＬＢ液体培地（１０ｇ／ｌのトリプトン、５ｇ／ｌの酵母抽出物、５ｇ／ｌのＮａＣｌ）又はＬＢ寒天（ＬＢ培地及び１５ｇ／ｌのバクト寒天）又は２Ｘ  ＹＴ寒天（１６ｇ／ｌのトリプトン、１０ｇ／ｌの酵母抽出物、５ｇ／ｌのＮａＣｌ、１５ｇ／ｌのバクト寒天）において成長させた。
【００７０】
バチルス宿主株
バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）１６８Δ４は、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）型株１６８（BGSC 1A1 , Bacillus Genetic Stock Center, Columbus, OH）に由来し、ｓｐｏｌｌＡＣ、ａｐｒＥ、ｎｐｒＥ、及びａｍｙＥ遺伝子における欠失を有する。これらの４遺伝子の欠失は、基本的にバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）Ａ１６４Δ５について記載されるとおりに行い、これは米国特許第5,891,701号に詳しく記載される。
【００７１】
バチルス・サブチリス（B. subtilis）Ａ１６４Δ１０は、小さな細胞外プロテアーゼ遺伝子ｗｐｒＡ、ｂｐｒ、ｖｐｒ、ｍｐｒ、及びｅｐｒにおける欠失を伴うＡ１６４Δ５株である（Connelly et al., 2004, J. Bacteriol. 186: 4159- 4167）。
【００７２】
プラスミド及びゲノムＤＮＡ単離
プラスミドＤＮＡは、QIAprep 8 Miniprep Kit（QIAGEN, Valencia, CA, USA）を使用して、あるいはBioRobot 9600（QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA）を使用して、あるいはQIAGEN Plasmid Midi Kit（QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA）を使用して、各々の製造業者によって提供された手順に従い、大腸菌（E. coli）形質転換細胞から単離した。
【００７３】
ゲノムＤＮＡは、Pitcher et al., 1989, Lett. Appl. Microbiol. 8: 151-156の手順に従い、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）宿主から単離した。
【００７４】
大腸菌（E. coli）及びＢ・スブチリス（B. subtilis）のための形質転換方法
Ｂ・スブチリス株は、AnagnostopolousとSpizizen の手順（J. Bacteriol. 81 : 741-746）に従い形質転換した。大腸菌ＳＵＲＥ細胞（Stratagene Corporation, La JoIIa, CA, USA）、ＤＨ５α細胞（GibcoBRL, Gaithersburg, MD, USA）、及びＯｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０細胞（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞（Stratagene Corporation, La JoIIa, CA, USA）は、各々の製造業者により提供された手順に従い形質転換した。
【００７５】
ＰＣＲ
ＰＣＲは、上述した製造業者の取扱説明書に従い行った。増幅反応物（５０μｌ）は、１×ＰＣＲバッファーＩＩ（Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）、３．０ｍＭのＭｇＣｌ2、２００μＭの各々のｄＮＴＰ、０．５μＭの各々のプライマー、０．２５ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、及び約５０〜１００ｎｇのプラスミドＤＮＡ又は約２００ｎｇのゲノムＤＮＡから構成された。反応は、９５℃において２分間を１サイクル；９５℃、５５℃及び７２℃において各々２分間を３０サイクル；そして７２℃において３分間を１サイクルでプログラムされた RoboCycler（登録商標）40 Temperature Cycler（Stratagene, La JoIIa, CA, USA）において行った。
【００７６】
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列決定は、Applied Biosystems Model 3130X Genetic Analyzer（Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）を使用して、染色ターミネーター・ケミストリー（Giesecke et al., 1992, Journal of Virol. Methods 38: 47-60）を用いて行った。
【００７７】
プルラン・アズール (pullulan-azure) 及びＡＺＣＬ−プルランオーバーレイ
寒天プレート上のバチルス株のプルラナーゼ活性を、プルラン・アズール（Sigma, St. Louis, MO, USA）又はＡＺＣＬ−プルラン（Megazymes International Ireland Ltd., Bray, Ireland）を含有する寒天オーバーレイを使用して検出した。０．５％プルラン・アズール又は０．１％ＡＺＣＬ−プルランを含有する１００ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）中の１％寒天の層を、寒天プレート上のコロニー上に注ぎ、その後５０℃でインキュベートした。プルラナーゼ活性は、コロニーを取り囲むプルラン・アズールにおける透明帯の形成により検出した。
【００７８】
酵素活性：
グルコアミラーゼ活性（ＡＧＵ）
ノボ・グルコアミラーゼユニット(Novo Glucoamylase Unit)（ＡＧＵ）は、３７℃、ｐＨ４．３において１分あたり１マイクロモルのマルトースを加水分解する酵素の量として定義した。
【００７９】
該活性は、Boehringer Mannheim, 124036からのGlucose GOD-Perid キットの使用後に改変した方法（AEL-SM-0131, Novozymesからの要求により入手できる）によりＡＧＵ／ｍｌとして測定する。標準：ＡＭＧ標準、バッチ７−１１９５、１９５ＡＧＵ／ｍｌ。３７５μｌの基質（５０ｍＭの酢酸ナトリウム中１％マルトース、ｐＨ４．３）を３７℃で５分間インキュベートする。酢酸ナトリウム中に希釈した２５μｌの酵素を添加する。反応は、１００μｌの０．２５Ｍ  ＮａＯＨを添加することにより１０分後に終了する。２０μｌを９６ウェルマイクロタイタープレートに移し、そして２００μｌのＧＯＤペリド溶液（124036, Boehringer Mannheim）を添加する。室温で３０分後、６５０ｎｍにおいて吸光度を測定し、そして活性をＡＭＧ標準からＡＧＵ／ｍｌにおいて計算する。この分析方法をより詳細に説明するフォルダ（ＡＥＬ−ＳＭ−０１３１）は、Novozymes A/S, Denmarkからの要求により入手でき、これは参考により本明細書に組み込まれている。
【００８０】
プルラナーゼ活性（ニュー・プルラナーゼ・ユニット・ノボ（New Pullulanase Unit Novo)、ＮＰＵＮ）
プルラナーゼ活性は、プルラン基質に対して測定することができる。プルランは、１，６−α−結合により結合されるマルトトリオシル単位（maltotriosyl unit）から本質的に成る直線状のＤ−グルコースポリマーである。エンド型プルラナーゼは、任意に１，６−α−結合を加水分解し、マルトトリオース、６３−α−マルトトリオシル−マルトトリオース、６３−α−（６３−α−マルトトリオシル−マルトトリオシル）−マルトトリオースを遊離する。
【００８１】
１ニュー・プルラナーゼ・ユニット・ノボ（ＮＰＵＮ）は、エンド型プルラナーゼ活性の単位であり、Novozymes A/S Promozyme D 標準に対して測定される。標準条件は４０℃、ｐＨ４．５で３０分間の反応時間であり、基質として０．７％レッド・プルラン（Red-pullulan)を伴う。赤色の基質の分解生成物の量は、５１０ｎｍにおいて写真分光学的に測定され、これは試料中のエンド型プルラナーゼ活性に比例する。この分析方法をより詳細に説明するフォルダ（ＥＢ−ＳＭ．０４２０．０２／０１）は、Novozymes A/S, Denmarkからの要求により入手でき、これは参考により本明細書に組み込まれている。
【００８２】
標準条件下において、１ＮＰＵＮは、１分あたりに２．８６マイクロモルのグルコースに相当する還元力を伴う還元炭水化物を遊離させる酵素の量と同等である。
【００８３】
媒体
【００８４】
【表１】
2010518814.tif 000002
【００８５】
【表２】
2010518814.tif 000003
【００８６】
【表３】
2010518814.tif 000004
【００８７】
【表４】
2010518814.tif 000005
【００８８】
Ｊ６：ツベルミン（Tubermine）ジャガイモタンパク質加水分解物
１０Ｌにするために、１２Ｌの発酵槽に５Ｌの水道水、０．７５ｋｇのツベルミンを添加する。
水を添加して８Ｌにし、完全に懸濁するように攪拌する（５００ｒｐｍ）。
５５℃まで加熱を開始する。
５５℃になったら、４Ｎ  ＮａＯＨを添加し、ｐＨ７．００にする。
ｐＨ＝６．２０において、粘度が増加する。
ｐＨ＝７．００において、７２．９ｇのアルカラーゼ（Alcalase）２．４を添加する。
４  ＨＲ加水分解
水で９Ｌまで満たす。
５ＨＲの合計において、３００ｒｐｍまで攪拌を下げる。
滴定を止める。
１０Ｌまで水を添加する。
【実施例】
【００８９】
例１：ｐＮＢＴ３６の構築
ｐＮＢＴ３６は、クロラムフェニコール選択を用いて２つのａｍｙ  Ｅ断片を介する二重相同組み換えにより、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）染色体のａｍｙ  Ｅ座位において発現カセットの挿入を許容する、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）のａｍｙ  Ｅ遺伝子の断片を有するｐＤＧ２６８ＭＣＳΔＰamyQ(sc)／ＰcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶである。ｐＮＢＴ３６の構築を以下に説明する。
【００９０】
プラスミドｐＮＢＴ５１。プラスミドｐＮＢＴ１０（ｐＤＧ２６８ＭＣＳ−ＰｒcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶ；米国特許第6,255,076号）を製造業者の取扱説明書に従い大腸菌宿主ＤＨ５αから単離し、そしてＣｌａ  Ｉ及びＳｃａ  Ｉで消化した。Ｃｌａ  Ｉ末端は、クレノウ断片（Klenow fragment）（New England Biolabs, Inc., Beverly, MA, ＵＳＡ）及びｄＮＴＰを使用して、製造業者の取扱説明書に従い平滑末端化した。消化したプラスミドを、ＴＢＥ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓベース−５０ｍＭ  ホウ酸−１ｍＭ  ＥＤＴＡ二ナトリウム）緩衝液を用いて０．８％アガロース電気泳動により分析し、そして約６６１５ｂｐのベクター断片を、QIAquick Gel Extraction Kit （QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA）を使用して精製した。プラスミドｐＯＳ４３０１（Bacillus Genetic Stock Center, Ohio State University, Columbus, OH, USA）をＳａｌ  Ｉ及びＳｃａ  Ｉで消化し、そして上述のとおり、クレノウ断片及びｄＮＴＰを使用して、Ｓａｌ  Ｉ末端を平滑末端化した。消化したプラスミドをＴＢＥ緩衝液を用いて０．８％アガロース電気泳動により分析し、そして大腸菌ｒｒｎＢ転写ターミネーターを有する約８４０ｂｐの断片をQIAquick Gel Extraction Kitを使用して精製した。同じ８４０ｂｐのＳａｌ  Ｉ／Ｓｃａ  Ｉ断片は、ベクターｐＫＫ２２３−３（GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA）から単離することができた（図１）。ｐＮＢＴ１０ベクター断片とターミネーターを有する断片を、製造業者の取扱説明書に従い、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA）により結合させ、そして大腸菌ＤＨ５αを製造業者の取扱説明書に従い、該連結物で形質転換し、３７℃における２Ｘ  ＹＴアンピシリンプレート上でアンピシリン耐性を選択する。生じたプラスミドをｐＮＢＴ５１（ｐＤＧ２６８−ＰcryiiiA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶΔ）と命名した（図２）。
【００９１】
プラスミドｐＮＢＴ５２。プラスミドｐＮＢＴ５１（ｐＤＧ２６８−ＰcryiiiA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶΔ）をＳｆｉ  Ｉで消化し、そしてその末端を、Ｔ４  ポリメラーゼ（Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA）及び２５μＭの各々のｄＮＴＰと共に１１℃で２０分間インキュベートすることにより平滑末端化し、その後、７５℃で１０分間インキュベートすることにより該ポリメラーゼを熱不活性化した。その後平滑末端化プラスミドをＤｒａ  ＩＩＩで消化し、そしてＴＢＥ緩衝液を用いて０．８％アガロース電気泳動により分析し、そして約５９２０ｂｐのベクター断片をQIAquick Gel Extraction Kitを使用して精製した。プラスミドｐＮＢＴ２０（ｐＤＧ２６８ＭＣＳ−ＰamyQ(sc)／ＳＡＶ；米国特許第6,255,076号）をＤｒａ  ＩＩＩ及びＥｃｌ  １３６ＩＩで消化し、そしてショートコンセンサスａｍｙＱプロモーター（ＰamyQ(sc)）を有する約１６４１ｂｐの断片をQIAquick Gel Extraction Kitを使用して精製した。上述のとおり、ｐＮＢＴ５１ベクター断片とＰamyQ(sc)断片を結合させ、そして上述のとおり、大腸菌ＤＨ５αを該連結物で形質転換し、３７℃における２Ｘ  ＹＴアンピシリンプレート上でアンピシリン耐性を選択する。プラスミドＤＮＡをいくつかの形質転換体から単離し、Ｓｐｈ  Ｉで消化し、そしてＴＢＥ緩衝液を用いて０．８％アガロース電気泳動により分析した。約４８７３ｂｐ及び２６８８ｂｐの期待された制限酵素断片を有する１つのプラスミドをｐＮＢＴ５２（ｐＤＧ２６８−ＰamyQ(sc)／ＰcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶΔ）と命名した（図３）。
【００９２】
プラスミドｐＮＢＴ５３。プラスミドｐＮＢＴ６（ｐＨＰ１３ａｍｐ−ＳＡＶ；米国特許第6,255,076号）をＳｆｉ  Ｉ及びＳａｃ  Ｉで消化し、そしてＴＢＥ緩衝液を用いて０．８％アガロース電気泳動により分析し、そして約６４３８ｂｐのベクター断片をQIAquick Gel Extraction Kitを使用して精製した。プラスミドｐＮＢＴ５２（ｐＤＧ２６８−ＰamyQ(sc)／ＰcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶΔ）をＳｆｉ  Ｉ及びＳａｃ  Ｉで消化し、そしてＴＢＥ緩衝液を用いて０．８％アガロース電気泳動により分析し、そしてＰamyQ(sc)／ＰcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂタンデムプロモーターを有する約７２７ｂｐの断片をQIAquick Gel Extraction Kitを使用して精製した。上述のとおり、ｐＮＢＴ６ベクター断片とＰamyQ(sc)／ＰcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ断片を結合し、そして上述のとおり、大腸菌ＤＨ５α細胞を該連結物で形質転換し、３７℃における２Ｘ  ＹＴアンピシリンプレート上でアンピシリン耐性を選択する。いくつかの形質転換体からＤＮＡプラスミドを単離し、Ｐｖｕ  ＩＩで消化し、そしてＴＢＥ緩衝液を用いて０．８％アガロース電気泳動により分析した。約４９０３ｂｐ、１３２０ｂｐ、及び９４２ｂｐの期待された制限酵素断片を有する１つのプラスミドを、ｐＮＢＴ５３（ｐＨＰ１３ａｍｐ−ＰamyQ(sc)／ＰｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶ）と命名した（図４）。
【００９３】
プラスミドｐＮＢＴ５４。プラスミドｐＮＢＴ１（ｐＤＧ２６８ＭＣＳ；米国特許第6,255,076号）をＳｆｉ  Ｉ及びＢａｍ  ＨＩで消化し、そしてＴＢＥ緩衝液を用いて０．８％アガロース電気泳動により分析し、そして約６０４０ｂｐのベクター断片をQIAquick Gel Extraction Kitを使用して精製した。プラスミドｐＮＢＴ５３（ｐＨＰ１３ａｍｐ−ＰamyQ(sc)/ＰcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶ）をＳｆｉ  Ｉ及びＢａｍ  ＨＩで消化し、そしてＴＢＥ緩衝液を用いて０．８％アガロース電気泳動により分析し、そしてＰamyQ(sc)/ＰcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶカセットを有する約１９５３ｂｐの断片をQIAquick Gel Extraction Kitを使用して精製した。上述のとおり、ｐＮＢＴ１ベクター断片とＰamyQ(sc)／ＰcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶ断片を結合させ、そして上述のとおり、大腸菌ＤＨ５α細胞を該連結物で形質転換し、３７℃における２Ｘ  ＹＴアンピシリンプレート上でアンピシリン耐性を選択する。いくつかの形質転換体からプラスミドＤＮＡを単離し、Ｓｆｉ  Ｉ及びＢａｍ  ＨＩで同時に消化し、その後ＴＢＥ緩衝液を用いて０．８％アガロース電気泳動を使用して分析した。約６０４０ｂｐ及び１９５３ｂｐの期待された制限酵素断片を有する１つのプラスミドを、ｐＮＢＴ５４（ｐＤＧ２６８ＭＣＳ−ＰamyQ(sc)／ＰcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶ）と命名した（図５）。
【００９４】
プラスミドｐＮＢＴ３５。プラスミドｐＮＢＴ２（ｐＤＧ２６８ＭＣＳΔ−ＰｒcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶ；米国特許第6,255,076号）をＳｆｉ  Ｉ及びＢａｍ  ＨＩで消化し、そしてＴＢＥ緩衝液を用いて０．８％アガロース電気泳動により分析し、そして約５３９４ｂｐのベクター断片をQIAquick Gel Extraction Kitを使用して精製した。プラスミドｐＮＢＴ５４（ｐＤＧ２６８ＭＣＳ−ＰamyQ(sc)／ＰcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶ）をＳｆｉ  Ｉ及びＢａｍ  ＨＩで消化し、そしてＴＢＥ緩衝液を用いて０．８％アガロース電気泳動により分析し、そしてＰamyQ(sc)／ＰcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶカセットを有する約１９５３ｂｐの断片をQIAquick Gel Extraction Kitを使用して精製した。上述のとおり、ｐＮＢＴ２ベクター断片とＰamyQ(sc)／ＰcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶ断片を結合させ、そして上述のとおり、大腸菌ＤＨ５α細胞を該連結物で形質転換し、３７℃における２Ｘ  ＹＴアンピシリンプレート上でアンピシリン耐性を選択する。いくつかの形質転換体からプラスミドＤＮＡを単離し、Ｎｃｏ  Ｉで消化し、そしてＴＢＥ緩衝液を用いて０．８％アガロース電気泳動を使用して分析した。約５４９２ｂｐ及び１８５５ｂｐの期待された制限酵素断片を有する１つのプラスミドをｐＮＢＴ３５（ｐＤＧ２６８ＭＣＳΔ−ＰamyQ(sc)／ＰcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶ）と命名した（図６）。
【００９５】
プラスミドｐＮＢＴ３０。プラスミドｐＮＢＴ３０は、ａｍｙＬ遺伝子プロモーターのａｍｙＬ４１９９変異体のＰＣＲクローンを含有するように構築した（米国特許第6,100,063号）。バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）ＳＪ１９０４ゲノムＤＮＡを単離した。ａｍｙＬ４１９９プロモーター（Ｐamyl4199）遺伝子を、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）ＳＪ１９０４ゲノムＤＮＡから、プライマー９５０８７２及び９９１１５１（配列番号２及び３）を使用して、ＰＣＲにより増幅した。プライマー９５０８７２は、Ｓｆｉ  Ｉ制限部位を含み、そしてプライマー９９１１５は、Ｓａｃ  Ｉ制限部位及びＰamyl4199の変異ヌクレオチドを含んでいる。
【００９６】
このＰＣＲは上記の製造業者の推奨に従い行った。これにより生じた約６２５ｂｐのＰＣＲ産物は、TOPO TA Cloning （登録商標） Kit （Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）を使用してベクターｐＣＲ２．１中でクローニングし、そして製造業者の取扱説明書に従い、One Shot （登録商標） TOP10 Chemically Competent 大腸菌細胞に形質転換した。プラスミドＤＮＡをいくつかの形質転換体から単離し、そしてＥｃｏ  ＲＩによる消化、その後のＴＢＥ緩衝液を用いた０．８％アガロース電気泳動により、クローン化ＰＣＲ断片の存在を分析した。約３９１３ｂｐ及び６４０ｂｐの期待された制限酵素断片を有する１つのプラスミドを、ｐＮＢＴ３０（ｐＣＲ２．１−ａｍｙＬ４１９９）と命名した（図７）。クローン化ＰＣＲ断片のＤＮＡ配列はＤＮＡ配列決定により確認した。
【００９７】
プラスミドｐＮＢＴ３１。プラスミドｐＮＢＴ３（ｐＤＧ２６８ＭＣＳΔｎｅｏ−ＰｒcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶ；米国特許第6,255,076号）をＳｆｉ  Ｉ及びＳａｃ  Ｉで消化し、そしてＴＢＥ緩衝液を用いて０．８％アガロース電気泳動により分析し、そして約７９３１ｂｐのベクター断片をQIAquick Gel Extraction Kitを使用して精製した。プラスミドｐＮＢＴ３０（ｐＣＲ２．１−ａｍｙＬ４１９９）をＳｆｉ  Ｉ及びＳａｃ  Ｉで消化し、ＴＢＥ緩衝液を用いて０．８％アガロース電気泳動により分析し、そしてＰamyl4199を有する約６１２ｂｐの断片をQIAquick Gel Extraction Kitを使用して精製した。上述のとおり、ｐＮＢＴ３断片とＰamyl4199断片を結合させ、そして製造業者の取扱説明書に従い、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞を該連結物で形質転換し、３７℃における２Ｘ  ＹＴアンピシリンプレート上でアンピシリン耐性を選択する。いくつかの形質転換体からプラスミドＤＮＡを単離し、Ｎｃｏ  Ｉで消化し、そしてＴＢＥ緩衝液を用いて０．８％アガロース電気泳動を使用して分析した。約６８０２ｂｐ及び１７４１ｂｐの期待された制限酵素断片を有する１つのプラスミドをｐＮＢＴ３１（ｐＤＧ２６８ＭＣＳΔｎｅｏ−ＰamyL4199／ＰｒcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶ）と命名した（図８）。
【００９８】
プラスミドｐＮＢＴ３６。プラスミドｐＮＢＴ３５（ｐＤＧ２６８ＭＣＳΔ−ＰamyQ(sc)／ＰcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶ）をＳｆｉ  Ｉで消化し、そして上述のとおり、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ及びｄＮＴＰを使用して、その末端を平滑末端化した。その後、この平滑末端化プラスミドをＤｒａ  ＩＩＩで消化し、そしてＴＢＥ緩衝液を用いて０．８％アガロース電気泳動により分析した。約５８０８ｂｐのベクター断片をQIAquick Gel Extraction Kitを使用して精製した。プラスミドｐＮＢＴ３１（ｐＤＧ２６８ＭＣＳΔｎｅｏ−ＰamyL4199／ＰｒcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶ）をＤｒａ  ＩＩＩ及びＥｃｌ  １３６ＩＩで消化し、ＴＢＥ緩衝液を用いて０．８％アガロース電気泳動により分析し、そしてＰamyL4199を有する約２１５０ｂｐの断片をQIAquick Gel Extraction Kitを使用して精製した。上述のとおり、ｐＮＢＴ３５ベクター断片とＰamyL4199断片を結合させ、そして製造業者の取扱説明書に従い、大腸菌ＳＵＲＥ細胞を該連結物で形質転換し、３７℃における２Ｘ  ＹＴアンピシリンプレート上でアンピシリン耐性を選択する。いくつかの形質転換体からプラスミドＤＮＡを単離し、Ｎｃｏ  Ｉで消化し、そしてＴＢＥ緩衝液を用いて０．８％アガロース電気泳動を使用して分析した。約５４９２ｂｐ及び２４６６ｂｐの期待された制限酵素断片を有する１つのプラスミドを、ｐＮＢＴ３６（ｐＤＧ２６８ＭＣＳΔ−ＰamyL4199／ＰamyQ(sc)／ＰcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶ）と命名した（図９）。以下において、プロモーターＰamyL4199／ＰamyQ(sc)／ＰcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂはトリプル・タンデムプロモーターと称する。
【００９９】
例２：ｐＲＢ１６５の構築
プラスミドｐＲＢ１６５は、上述のとり、スペクチノマイシン耐性遺伝子のＰＣＲクローンを含有するように構築された、ｐＲＢ１６２（２つのｐｅｌ断片を介する二重相同組換えによりバチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）染色体のｐｅｌ座位において発現カセットの挿入を許容するバチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）ペクチン酸リアーゼ（ｐｅｌ）遺伝子の断片を有するプラスミド（ｐＤＧ２６８ＭＣＳ−ＰamyQ(sc)、米国出願公報第20030175902号）である。
【０１００】
プラスミドｐＣＲ２．１−ｓｐｃ。スペクチノマイシン耐性遺伝子を、プラスミドｐＳＪ５２１８（米国特許第6,808,896号）ＤＮＡから、プライマー９９４０７９及び９９４１０３（配列番号４及び５）を使用して、ＰＣＲにより増幅した。プライマー９９４０７９はＳａｌ  Ｉ制限部位を含み、そしてプライマー９９４１０３はＳｆｉ  Ｉ制限部位を含む。
【０１０１】
上記ＰＣＲは上述のとおり製造業者の推奨に従い行った。ＰＣＲは、上述のとおり、RoboCycler （登録商標） 40 Temperature Cycler において行った。
【０１０２】
生じた約１１６５ｂｐのＰＣＲ産物は、TOPO TA Cloning （登録商標） Kitを使用してベクターｐＣＲ２．１中でクローニングし、そして製造業者の取扱説明書に従い、One Shot （登録商標） TOP10 Chemically Competent 大腸菌細胞に形質転換した。プラスミドＤＮＡをいくつかの形質転換体から単離し、そしてＥｃｏ  ＲＩによる消化、その後のＴＢＥ緩衝液を用いた０．８％アガロース電気泳動により、クローン化ＰＣＲ断片の存在を分析した。約３９１３ｂｐ及び１１８３ｂｐの期待された制限酵素断片を有する１つのプラスミドをｐＣＲ２．１−ｓｐｃと命名した。スペクチノマイシン遺伝子のＤＮＡ配列はＤＮＡ配列決定により確認した。
【０１０３】
プラスミドｐＲＢ１６５。プラスミドｐＲＢ１６２（ｐｅｌ３’及びｐｅｌ５’を有するｐＤＧ２６８ＭＣＳ−ＰamyQ(sc)）をＳｆｉ  Ｉ及びＳａｌ  Ｉで消化し、ＴＢＥ緩衝液を用いて０．８％アガロース電気泳動により分析し、そして約４５４１ｂｐのベクター断片をQIAquick Gel Extraction Kitを使用して精製した。プラスミドｐＣＲ２．１／ｓｐｃをＳｆｉ  Ｉ及びＳａｌ  Ｉで消化し、そしてｓｐｃ遺伝子を有する約１１５３ｂｐの断片をQIAquick Gel Extraction Kitを使用して精製した。上述のとおり、ｐＲＢ１６２断片とｓｐｃ遺伝子断片を結合させ、そして製造業者の取扱説明書に従い、大腸菌ＳＵＲＥ細胞を該連結物で形質転換し、３７℃における２Ｘ  ＹＴアンピシリンプレート上でアンピシリン耐性を選択する。いくつかの形質転換体からプラスミドＤＮＡを単離し、Ｂａｍ  ＨＩで消化し、そしてＴＢＥ緩衝液を用いて０．８％アガロース電気泳動を使用して分析した。約１３２９ｂｐ及び４３６５ｂｐの期待された制限酵素断片を有する１つのプラスミドを、ｐＲＢ１６５（ｐｅｌ３’及びｐｅｌ５’を有するｐＤＧ２６８ＭＣＳ−ＰamyQ(sc)）と命名した（図１０）。
【０１０４】
例３：ｐＭＲＴ１３５の構築
プラスミドｐＭＲＴ１３５。プラスミドｐＮＢＴ３６（ｐＤＧ２６８Δ−ＰａｍｙＬ４１９９／ＰａｍｙＱ（ｓｃ）／ＰｃｒｙＩＩＩＡ／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶ）をＳｆｉ  Ｉ及びＳａｃ  Ｉで消化し、そしてトリプル・タンデムプロモーターを有する約１３３７ｂｐの断片をQIAquick Gel Extraction Kitを使用して精製した。プラスミドｐＲＢ１６５（ｐｅｌ３’、ｐｅｌ５’及びｓｐｃを有するｐＤＧ２６８Δｎｅｏ−ＰａｍｙＱ（ｓｃ））をＳｆｉ  Ｉ及びＳａｃ  Ｉで消化し、ＴＢＥ緩衝液を用いて０．８％アガロース電気泳動により分析し、そして約５５９１ｂｐのベクター断片をQIAquick Gel Extraction Kitを使用して精製した。上述のとおり、ｐＲＢ１６５ベクター断片とトリプル・タンデムプロモーター断片を結合させ、そして製造業者の取扱説明書に従い、大腸菌ＳＵＲＥ細胞を該連結物で形質転換し、３７℃における２Ｘ  ＹＴアンピシリンプレート上でアンピシリン耐性を選択する。いくつかの形質転換体からプラスミドＤＮＡを単離し、Ｓｆｉ  Ｉ及びＳａｃ  Ｉで消化し、そしてＴＢＥ緩衝液を用いて０．８％アガロース電気泳動を使用して分析した。約５５９１ｂｐ及び１３３７ｂｐの期待された制限酵素断片を有する１つのプラスミドをｐＭＲＴ１３５（ｐｅｌ３’、ｐｅｌ５’、及びｓｐｃを有するｐＤＧ２６８Δｎｅｏ−トリプル・タンデムプロモーター）と命名した（図１１）。
【０１０５】
例４：ｐＭＤＴ１０５の構築
プラスミドｐＭＤＴ１１４。プラスミドｐＭＤＴ１１４（図１４）は、ｐＭＲＴ０７５の約５３５８ｂｐのＳａｃ  Ｉ／Ｎｏｔ  Ｉベクター断片（米国特許出願公報第20050221446号）、ｐＭＤＴ１０５約２６２２ｂｐのＳａｃ  Ｉ／Ｍｌｕ  Ｉ断片（ａｐｒＨリボソーム結合部位及びｐｕｌＢ／Ｃコード領域を有する）、及びｐＷＷｉ００６の約７０ｂｐのＭｌｕＩ／ＮｏｔＩ断片（ａｐｒＨ転写ターミネーターを有する）から成る。プラスミドｓｐＭＤＴ１０５及びｐＷＷｉ００６の構築を以下に説明する。
【０１０６】
プラスミドｐＷＷｉ００６。ｐＷＷｉ００６は、ｐＮＢＴ１８（ｐＤＧ２６８ＭＣＳΔｎｅｏ−ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶ；米国特許第5,955,310号）のＢａｍ  ＨＩ部位を消去することにより構築した。プラスミドｐＮＢＴ１８をＢａｍ  ＨＩで消化し、そして製造業者の取扱説明書に従いＴ４  ＤＮＡポリメラーゼを使用して平滑末端化した。その後ｐＮＢＴ１８ベクター断片を、製造業者の取扱説明書に従い、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを使用して自己結合させ、そして製造業者の取扱説明書に従い、大腸菌ＤＨ５αを該連結物で形質転換し、３７℃における２Ｘ  ＹＴアンピシリンプレート上でアンピシリン耐性を選択する。生じたプラスミドをｐＷＷｉ００６と命名した（図１２）。
【０１０７】
プラスミドｐＭＤＴ１０５。プラスミドｐＭＤＴ１０５は、ｐＣＲ２．１ベクター中に挿入されたａｐｒＨリボソーム結合部位及びｐｕｌＢ／Ｃコード領域を含み、そして以下のとおり構築された。
【０１０８】
バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）ＰＬ２５４５は、染色体的に組み込まれたｐｕｌＢ／Ｃ遺伝子ハイブリド（融合体）のコピーを含有する。ｐｕｌＢ／Ｃ遺伝子は、コード領域内のＢａｍ  ＨＩ部位のバチルス・アシドプルリチカス（Bacillus acidopullulyticus）２９４−１６（Kellyら、上記）の上流のｐｕｌＢ遺伝子の部分、及びコード領域内のＢａｍ  ＨＩ部位のバチルス・アシドプルリチカス（Bacillus acidopullulyticus）２４６−４９下流のｐｕｌＣ遺伝子の部分を含む。
【０１０９】
ｐｕｌＢ／Ｃリボソーム結合部位及びコード領域を含む約２６２４ｂｐの断片は、プライマー９９８５４２及び９９８５４３（配列番号６及び７）を使用して、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）ＰＬ２５４５のゲノムDNAからＰＣＲにより増幅した。プライマー９９８５４２はＳａｃ  Ｉ制限部位及びバチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）アルカリ性プロテアーゼ遺伝子ａｐｒＨのリボソーム結合部位を含み、そしてｐｕｌＢの天然ＧＴＧ開始コドンをＡＴＧコドンに変換する。プライマー９９８５４３はＭｌｕ  Ｉ制限部位を含む。
【０１１０】
これにより生じた約２６２４ｂｐのＰＣＲ産物は、TOPO TA Cloning （登録商標） KitｐＣＲ２．１中でクローニングし、そして製造業者の取扱説明書に従い、One Shot （登録商標） TOP10 Chemically Competent 大腸菌細胞に形質転換した。いくつかの形質転換体由来のプラスミドＤＮＡを精製し、そしてクローン化したＰＣＲ断片のＤＮＡ配列をＤＮＡ配列決定により決定した。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼによる組み込みエラーのために、配列決定した各々のプラスミドはｐｕｌＢ／Ｃについて期待された配列に対して少なくとも１つの配列相違（sequence discrepancy）を有した。ｐｕｌＢ／Ｃ内に１つのヌクレオチド相違を有するプラスミドをｐＭＤＴ１０３と命名した。この相違はｐｕｌＢ遺伝子の断片を使用して以下のとおり修正した。
【０１１１】
ｐｕｌＢリボソーム結合部位及びコード領域を含む約２６２４ｂｐの断片を、上述のプライマー９９８５４２及び９９８５４３を使用して、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）ＤＮ１４００（Kellyら、上記）のゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅した。
【０１１２】
上記ＰＣＲは、上述のとおり、製造業者の取扱説明書に従い行った。
【０１１３】
これにより生じた約２６２４ｂｐのＰＣＲ産物は、TOPO TA Cloning （登録商標） KitｐＣＲ２．１中でクローニングし、そして製造業者の取扱説明書に従い、One Shot （登録商標） TOP10 Chemically Competent 大腸菌細胞に形質転換した。いくつかの形質転換体由来のプラスミドＤＮＡを精製し、そしてＥｃｏ  ＲＩで消化し、その後ＴＢＥ緩衝液を用いる０．８％アガロース電気泳動により、クローン化したＰＣＲ断片の存在について試験した。約３９１３ｂｐ及び２６４２ｂｐのＥｃｏ  ＲＩ断片を有する１つのプラスミドをｐＭＤＴ１０２と命名した。
【０１１４】
プラスミドｐＭＤＴ１０２をＢｂｒ  ＰＩ及びＮｓｉ  Ｉで消化し、そしてＴＢＥ緩衝液を用いて０．８％アガロース電気泳動により分析し、そして約４９１５ｂｐのベクター断片を QIAquick Gel Extraction Kit （QIAGENInc., Valencia, CA, USA）を使用して精製した。プラスミドｐＭＤＴ１０３をＢｂｒ  ＰＩ及びＮｓｉ  Ｉで消化し、そしてＴＢＥ緩衝液を用いて０．８％アガロース電気泳動により分析し、そしてｐｕｌＢ／Ｃコード領域の下流部分を有する約１６４０ｂｐｂの断片を、QIAquick Gel Extraction Kitを使用して精製した。上述のとおり、ｐＭＤＴ１０２ベクター断片とｐｕｌＢ／Ｃ断片を結合させ、そして製造業者の取扱説明書に従い、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞を該連結物で形質転換し、３７℃における２Ｘ  ＹＴアンピシリンプレート上でアンピシリン耐性を選択する。いくつかの形質転換体からプラスミドＤＮＡを単離し、ＢｂｒＰＩ及びＮｓｉＩで消化し、そしてＴＢＥ緩衝液を用いて０．８％アガロース電気泳動を使用して分析した。約４９１５ｂｐ及び１６４０ｂｐの期待された制限酵素断片を有する１つのプラスミドをｐＭＤＴ１０５と命名した（図１３）。
【０１１５】
例５：ｐＭＢｉｎ１１５の構築
プラスミドｐＭＢｉｎ１１５。プラスミドｐＭＤＴ１１４をＳａｃ  Ｉ及びＮｏｔ  Ｉで消化し、ＴＢＥ緩衝液を用いて０．８％アガロース電気泳動により分析し、そしてｐｕｌＢ／Ｃ遺伝子を有する約２６８４ｂｐの断片をQIAquick Gel Extraction Kitを使用して精製した。プラスミドｐＭＲＴ１３５（ｐｅｌ３’、ｐｅｌ５’及びｓｐｃｐを有するＤＧ２６８Δｎｅｏ−トリプル・タンデムプロモーター）をＳａｃ  Ｉ及びＮｏｔ  Ｉで消化し、ＴＢＥ緩衝液を用いて０．８％アガロース電気泳動により分析し、そして約６９０９ｂｐのベクター断片をQIAquick Gel Extraction Kitを使用して精製した。ｐＭＲＴ１３５ベクター断片とｐｕｌＢ／Ｃ断片を上述のとおり結合させ、そして製造業者の取扱説明書に従い、大腸菌ＳＵＲＥ細胞を該連結物で形質転換し、３７℃における２Ｘ  ＹＴアンピシリンプレート上でアンピシリン耐性を選択する。いくつかの形質転換体からプラスミドＤＮＡを単離し、ＴＢＥ緩衝液を用いて０．８％アガロース電気泳動によりｐｕｌＢ／Ｃ挿入の存在を分析した。１つのプラスミドをｐＭＢｉｎ１１５（ｐｅｌ３’、ｐｅｌ５’及びｓｐｃｐを有するｐＤＧ２６８Δｎｅｏ−トリプル・タンデムプロモーター／ｐｕｌＢ／Ｃ）と命名した（図１５）。
【０１１６】
例６：Ｂ・スブチリス（B. subtilis）におけるｐｕｌＢ／Ｃ−リンカー−ＡＭＹ  １０４８  ＣＢＭのクローニング及び発現のためのｐＲＢ２１２の構築
プラスミドｐＲＢ２１２は、トリプル・タンデムプロモーター、ａｐｒＨリボソーム結合部位、バチルス・アシドプルリチカス（Bacillus acidopullulyticus）プルラナーゼ（ｐｕｌＢ／Ｃ）コード領域、プロリンリッチリンカー（−ＰＥＰＴＰＥＰＮ−）、アノキシバチルス・コンタミナンス（A. contaminans）α−アミラーゼＣＢＭ（ＡＭＹ１０４８  ＣＢＭ）（ＣＢＭ２０ファミリー）及びａｐｒＨターミネーターを含む発現カセットを含有する大腸菌レプリコンである。バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）ペクチン酸リアーゼ（ｐｅｌ）の両側には遺伝子発現カセット及びｓｐｃ遺伝子が配置されており、２つのｐｅｌ断片を介する二重騒動組み換えにより、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）染色体のｐｅｌ座位において発現カセット及びｓｐｃ遺伝子の挿入を許容する。ｐＲＢ２１２の構築を以下に説明する。
【０１１７】
プラスミドｐＲＢ２１０。プロリンリッチリンカー（−ＰＥＰＴＰＥＰＮ−）及びｐｕｌＢ／ＣのＡＭＹ  １０４８  ＣＢＭ下流を導入するためにＡ  ＳＯＥ（重複伸展によるスプライシング）ストラテジーを考案した。このＡ  ＳＯＥストラテジーは、ｐｕｌＢ／Ｃの停止コドンを除去し、そしてｐｕｌＢ／Ｃの３’末端において該リンカーとＡＭＹ  １０４８  ＣＢＭの挿入を許容する。
【０１１８】
上流断片：
上流断片（ｐｕｌＢ／Ｃの３’末端）を、下流断片の５’末端に相同的なオーバーハングを含むプライマーを使用して、ＭＢｉｎ１１５からＰＣＲ増幅した。プライマー９９９４４８及び０６０１７９（配列番号８及び９）を、５７１ｂｐの上流断片のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅のために合成した。下流断片を増幅するために使用される０６０１８０プライマーの５’末端を補完するために、０６０１７９のヌクレオチド１〜１０を添加した。これらのプライマーは、ｐｕｌＢ／Ｃの停止コドンを含むことなく、ｐｕｌＢ／Ｃの３’末端のＰＣＲ増幅を許容する。
【０１１９】
上記ＰＣＲは、上述の条件下において行った。
【０１２０】
下流断片：
下流断片（アノキシバチルス・コンタミナンス（A. contaminans）ＡＭＹ  １０４８  ＣＢＭ（ＣＢＭ２０ファミリー））を、−ＰＥＰＴＰＥＰＴＮ−（配列番号１）リンカー及びｐｕｌＢ／Ｃの３’末端に相同的なオーバーハングを含むプライマーを使用して、ＡＭＹ  １０４８（WO 2006/066596 A2 の配列番号１）のクローン遺伝子からＰＣＲ増幅した。５４２ｂｐの下流断片のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅のためにプライマー０６０１８０及び９９９４５１（配列番号１０及び１１）を合成した。リンカー−ＰＥＰＴＰＥＰＮ−（配列番号１）及び上流断片を増幅するために使用した０６０１７９の５’末端の相補配列を導入するために、０６０１８０のヌクレオチド１〜２４を添加した。０６０１８０のヌクレオチド１〜１０は、上流断片と下流断片の重複領域を表す。
【０１２１】
上記ＰＣＲは、上述の条件下において行った。
【０１２２】
上記の上流断片と下流断片の鋳型として使用し、全長断片をＰＣＲ増幅した。該ＰＣＲは、上述の条件下において、プライマーペア９９９４４８／９９９４５１を使用して行った。
【０１２３】
このＳＯＥは、５６１ｂｐの３’−ｐｕｌＢ／Ｃ、２４ｂｐのリンカー、及び５１８ｂｐのＡＭＹ１０４８ＣＢＭと下流配列を含む配列を含有する１１０３ｂｐの断片を提供した。
【０１２４】
これにより生じた約１１０３ｂｐのＰＣＲ産物をゲル精製し、そして配列決定のためのTOPO （登録商標） TA PCR Cloning Kit を使用してベクターｐＣＲ２．１中でクローニングし、そして製造業者の取扱説明書に従い、One Shot （登録商標） TOP10 Chemically Competent 大腸菌細胞に形質転換した。１つの形質転換体からプラスミドＤＮＡを単離し、そしてＥｃｏ  ＲＩで消化し、そしてＴＢＥ緩衝液を用いて０．８％アガロース電気泳動を行い、約３９３１ｂｐ及び１１２１ｂｐの期待した断片を産生した。クローンＰＣＲ断片のＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列決定により確認した。このプラスミドはｐＲＢ２１０と命名した。ｐＣＲ２．１においてクローニングした完全ＤＮＡ配列である３’−ｐｕｌＢ／Ｃ−リンカー−ＡＭＹ  １０４８  ＣＢＭは配列番号１２に示される。
【０１２５】
プラスミドＲＢ２１２．プラスミドｐＲＢ２１０（ｐＣＲ２．１−３’−ｐｕｌＢ／Ｃ−リンカー−ＡＭＹ  １０４８  ＣＢＭ）をＢｓｔｘＸＩＩ及びＭＩｕＩで消化し、ＴＢＥ緩衝液を用いて０．８％アガロース電気泳動により分析し、そして３’−ｐｕｌＢ／Ｃ−リンカー−ＡＭＹ  １０４８  ＣＢＭを有する約４０２ｂｐの断片を QIAquick Gel Extraction Kitを使用して精製した。プラスミドｐＭＢｉｎ１１５（ｐｅｌ３’、ｐｅｌ５’及びｓｐｃを有するｐＤＧ２６８Δｎｅｏ−トリプル・タンデムプロモーター／ｐｕｌＢ／Ｃ）をＢｓｔｘＸ  ＩＩ及びＭｌｕ  Ｉで消化し、ＴＢＥ緩衝液を用いて０．８％アガロース電気泳動により分析し、そして約９４４２ｂｐのベクター断片をQIAquick Gel Extraction Kitを使用して精製した。ｐＭＢｉｎ１１５ベクター断片と３’−ｐｕｌＢ／Ｃ−リンカー−ＡＭＹ１０４８  ＣＢＭ断片を上述のとおり結合させ、そして大腸菌ＳＵＲＥ細胞を該連結物で上述のとおり形質転換し、３７℃における２Ｘ  ＹＴアンピシリンプレート上でアンピシリン耐性を選択する。製造業者の取扱説明書に従いQIAGENロボットを使用していくつかの形質転換体からプラスミドＤＮＡを精製し、そして０．５Ｘ  ＴＢＥ緩衝液を用いて０．８％アガロースゲルにおいてＢａｍ  ＨＩ消化により分析した。所望の断片（４６３８ｂｐ、２９５４ｂｐ、及び２３２２ｂｐ）を含有することが同定されたプラスミドをｐＲＢ２１２と命名した（図１６）。このクローニングストラテジーは、ｐｕｌＢ／ＣとａｐｒＨターミネーターに続く停止コドンの間に該リンカーとＡＭＹ  １０４８  ＣＢＭを置いた。このプラスミドにおけるｐｕｌＢ／Ｃ−リンカー−ＡＭＹ１０４８  ＣＢＭコード領域は、ＤＮＡ配列決定によりエラーがないことが確認された。
【０１２６】
例７：Ｂ．スブチリス（B. subtilis）におけるｐｕｌＢ／Ｃ−リンカー−ＡＭＹ  １０４８  ＣＢＭのクローニング及び発現
株ＲＢ２７２。上述のとおり、プラスミドｐＲＢ２１２を用いてＢ．スブチルス１６８Δ４をスペクチノマイシン耐性に変換した。組み込み体をネオマイシン感受性についてスクリーニングし、ｐｅｌ座位においてダブル・クロスオーバー統合（double-crossover integration)を示した。上述のとおり、プルラン・アズールオーバーレイ（及びＡＺＣＬ−プルランオーバーレイ）における透明帯の形成により、ｐｕｌＢ／Ｃ発現カセットの存在を確認した。このような組み込み体の１つをＲＢ２６８と命名した。ゲノムＤＮＡをバチルス・スブチリス（B. subtilis）ＲＢ２６８から単離した。
【０１２７】
細胞外タンパク質（例えば、ｐｕｌＣ−リンカー−ＣＢＭ）のプロセッシング及び分解を最小とするために、ｐｕｌＢ／Ｃ−リンカー−ＡＭＹ  １０４８  ＣＢＭの発現はプロテアーゼ欠損宿主中で生じさせた。その後、宿主をＲＢ２６８ゲノムＤＮＡで形質転換することによりトリプル・タンデムプロモーターｐｕｌＢ／Ｃ−リンカー−ＡＭＹ  １０４８  ＣＢＭ発現カセットをＢ．スブチルス産生宿主Ａ１６４Δ１０に移植し、スペクチノマイシン耐性にした。上述のとおり、ｐｕｌＢ／Ｃ発現カセットの存在はプルラン・アズールオーバーレイ（及びＡＺＣＬ−プルランオーバーレイ）における透明帯の形成により確認した。このような組み込み体の１つをＲＢ２７２と命名し、これは、Ａ１６４Δ１０のｐｅｌ座位において挿入されたトリプル・タンデムプロモーターｐｕｌＢ／Ｃ−リンカー−ＡＭＹ  １０４８  ＣＢＭ発現カセットを含有する。
【０１２８】
対照株ＲＢ２６５
対照株ＲＢ２６５は、ｐｅｌ染色体座位において１つのコピー中に統合されたトリプル・タンデムプロモーター、ａｐｒＨリボソーム結合部位、プルラナーゼ（ｐｕｌＢ／Ｃ）コード領域、及びａｐｒＨターミネーターを含有するＡ１６４Δ１０バチルス・スブチリス（B. subtilis）宿主である。
【０１２９】
Ｂ．スブチルスをスペクチノマイシン耐性に変換するために、ｐＭＢｉｎ１１５を使用した。組み換え体を、ネオマイシン感受性についてスクリーニングし、ｐｅｌ座位においてダブル・クロスオーバー統合を示した。上述のとおり、プルラン・アズールオーバーレイ（及びＡＺＣＬ−プルランオーバーレイ）における透明帯の形成により、ｐｕｌＢ／Ｃ発現カセットの存在を確認した。このような組み込み体の１つを１６８Δ４：：トリプル・タンデムプロモーター／ｐｕｌＢ／Ｃと命名した。
【０１３０】
その後、宿主を１６８Δ４：：トリプル・タンデムプロモーター／ｐｕｌＢ／ＣゲノムＤＮＡで形質転換することにより、トリプル・タンデムプロモーター−ｐｕｌＢ／Ｃ発現カセットをＢ．スブチルス産生宿主Ａ１６４Δ１０に移植し、スペクチノマイシン耐性にした（Connellyら、上記）。上述のとおり、ｐｕｌＢ／Ｃ発現カセットの存在はプルラン・アズールオーバーレイ（及びＡＺＣＬ−プルランオーバーレイ）における透明帯の形成により確認した。ＰＢ２７２により産生された透明帯は、ＡＭＹ  １０４８  ＣＢＭを伴わずにｐｕｌＢ／Ｃを内部に有する対照株ＲＢ２６５により産生された透明帯よりも僅かに小さかった。
【０１３１】
このような組み込み体の１つをＲＢ２６５と命名し、これは、Ａ１６４Δ１０のｐｅｌ座位において挿入されたトリプル・タンデムプロモーター／ｐｕｌＢ／Ｃ発現カセットを含有する。
【０１３２】
例８：Ｂ．スブチルスＡ１６４Δ１０におけるｐｕｌＢ／Ｃ−リンカー−ＡＭＹ  １０４８  ＣＢＭの発現のための発酵
実験室規模において、ＲＢ２６５及びＲＢ２２７２を以下のとおり試験した。
【０１３３】
種子繁殖
固体培地において種子を繁殖させ、そして振とうフラスコに移し、最終接種菌液（final inocula）を作成した。ＳＳＢ−４プレート上において、−８０℃の冷蔵ストックから株を筋付けした（streaked）。
【０１３４】
この後、プレートを３７℃で２０時間インキュベートし、その後さらに２０時間インキュベートするために他のＳＳＢ−４プレートに移した。その後、これらを５ｍｌのＭ９緩衝液と共に回収し、細菌懸濁液を作成した。その後、該Ｍ９懸濁液を６５０ｎｍで読取り、そして１００ｍｌのＰＲＫ５０調節振とうフラスコ中の接種体積を、式ｖ＝０．１／Ａｂｓ６５０を用いて測定した。振とうフラスコを３７℃、２５０ｒｐｍで２０時間インキュベートした。
【０１３５】
全ワーキング・ボリュームが１．０Ｌになるように１００ｍｌの適当な振とうフラスコ培養液をタンクに添加し、ＤＫプルラナーゼ培地を含有するタンクを接種した。プロセスコントロールは、手動及びＦｅｒｍＷｏｒｋｓ対照とデータ記録ソフトウェアを介して達成した（Jova Solutions, San Francisco, CA, USA）。
【０１３６】
タンクを、スクロース・フィードを伴うプロフィールに従い補い、そして４Ｎ  ＮＨ4ＯＨ／５Ｍ  Ｈ3ＰＯ4でｐＨを調整した。電子質量流装置を用いて、制御された速度においてタンクを圧縮空気でスパージした。発酵の間、手動で調節した目盛り付モーターコントローラーを介して攪拌を標準化した。１０℃のコールド・フィンガー及び電子ヒータープローブを使用して温度を制御した。
【０１３７】
発酵の間、ＦｅｒｍＷｏｒｋｓソフトウェアパッケージにおけるデータ・ロギング特性を使用してプロセスコントロールをモニターした。これらのデータは５分毎に転送した。
【０１３８】
ｐＨ高は、０時間において６．８であり、２０−２４−４８時間において６．２であった。ｐＨ低は、０−２０−２４−４８時間において５．９であった。空気プロフィールについての設定ポイントは２．２５L／ｍを保ち、そして温度プロフィールの設定ポイントは３７℃を保った。ＰＲＭプロフィールの設定ポイントは、０時間において７００、そして１−３−４８時間において１５００とした。フィードプロフィールの設定ポイントは、０時間において４．５ｇ／ｍであり、１５時間において２２．５ｇ／ｍであり、３０時間において２２．５８ｇ／ｍであり、そしてａ＜ｔ６０時間で１０．８ｇ／ｍであった。
【０１３９】
サンプリング
発酵の間の各時間におけるオンラインｐＨの検証のために、少量の試料を採取した。貯蔵／分析のための試料を約３、２４及び４８時間においてタンクから引き出した。アッセイ分析のために、２００μｌの全ブロスを９６ウェルプレートに満たし、そして−２０℃で凍結させた。後学のため、そして再アッセイの必要がある場合にそなえて、１ｍｌの全ブロスを各々２つの１．７ｍｌエッペンドルフ・チューブにピペッティングした。これらは、全ブロスライブラリーにおいて、−２０℃で保存した。タンパク質ゲル電気泳動のために更なるチューブのセットを用意した。
【０１４０】
例９：自動化プルラナーゼアッセイ
この方法は、Beckman Coulter Biomek NX （Beckman Coulter, Fullerton CA）と連動して使用する。培養液の上澄み液を約０．１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０（試料緩衝液）中に希釈した。試料緩衝液において２ＮＰＵＮ／ｍｌ濃度で出発し、そして０．０３１  ＮＰＵＮ／ｍｌ濃度で終了する２ホールド・ステップを使用してプルラナーゼ標準を希釈した。標準を含む全部で７５μｌの各希釈液を９６ウェルの平底プレート（アッセイプレート）中に移した。試料緩衝液中４０μｌの２．５％Ｒｅｄ−プルラン基質（Megazymes International Ireland Ltd., Wicklow, Ireland）を各ウェルに添加した。その後アッセイプレートを４０℃で１０分間インキュベートした。インキュベーションの完了において、１９０μｌのエタノール（９５％ｖ／ｖ）を各ウェルに添加し、その後周囲温度で１０分間インキュベートした。その後アッセイを３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。１５０μｌの上澄み液を除去し、そして新しい９６ウェルの平底プレートに置いた。その後、５１０ｎｍの吸光度を測定した。作成した標準曲線からの外挿により試料濃度を測定した。
【０１４１】
ＲＢ２７２とＲＢ２６５のおおまかなプルラナーゼ価は、１リットルあたり数グラムの範囲にあると推定された。
【０１４２】
例１０：ＲＢ２７２及びＲＢ２６５発酵試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
融合体の安定性を試験するために、製造業者の取扱説明書に従い、ＲＢ２７２とＲＢ２６５の発酵試料を７．５％Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Bio-Rad Laboratories, CA, USA）上を走らせた。かかる分析は、主なタンパク質生成物が、成熟したＰｕｌＢ／Ｃ（〜９１．７ｋＤＡ）及び融合ＰｕｌＢ／Ｃ−リンカー−ＡＭＹ１０４８ＣＢＭ（〜１０３ｋＤＡ）について予想されたサイズのものであることを示した。かかる分析は、株ＰＢ２７２が安定な融合体を産生することを確認するだけでなく、このような融合体の２４ｈにおける高い収率を確認するものである。
【０１４３】
例１１：粒状小麦デンプンのグルコースへの変換
本実施例は、グルコアミラーゼとの併用における、ＣＢＭ２０を伴う又は伴わないプルラナーゼを使用する粒状デンプンのグルコースへの変換を実証する。
【０１４４】
まず、継続的に攪拌しながら１０ｇの小麦デンプンを９０ｍｌの０．２Ｍ  酢酸ナトリウム  ｐＨ５．５に添加することにより、１０％小麦デンプンを伴うスラリーを作成した。
【０１４５】
以下の酵素を０時間において投与した（表１）。
【０１４６】
【表５】
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【０１４７】
上記酵素の添加後、デンプンスラリーを６０℃でインキュベートした。２５及び５０時間において、アリコートを除去し、溶液中のグルコースの量を測定した。グルコース含有量は、グルコース標準曲線に対する還元末端（reducing ends)を測定することにより決定した。
【０１４８】
その結果を以下の表２に示す。
【０１４９】
【表６】
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【０１５０】
例１２：粒状トウモロコシデンプンのグルコースへの変換
本実施例は、グルコアミラーゼとの併用における、ＣＢＭ２０を伴う又は伴わないプルラナーゼを使用する粒状デンプンのグルコースへの変換を実証する。
【０１５１】
まず、継続的に攪拌しながら３．６ｇのトウモロコシデンプンを１１２ｍｌの５０ｍＭ  酢酸ナトリウム、１ｍＭ  ＣａＣｌ2に添加することにより３．２％トウモロコシデンプンを伴うスラリーを作成した。ｐＨは酢酸で４．０に調節した。
【０１５２】
以下の酵素を０時間において投与した（表３）。
【０１５３】
【表７】
2010518814.tif 000008
【０１５４】
上記酵素の添加後、デンプンスラリーを３２℃の水浴中においた。２１及び４５時間において、アリコートを除去し、上述のとおり溶液中のグルコースの量を測定した。
【０１５５】
得られた結果を以下の表４に示す。
【０１５６】
【表８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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