(57)【要約】水中油型エマルジョン中のスクアレン含有量の測定は、生産中の問題を調べる方法として使用することができる。特に、スクアレン内容物の液滴は、濾過に問題が生じたことを示唆できることが明らかになった。最終ロット中のスクアレン含有量を試験することは、フィルターの特性を調査することより容易であり、したがってスクアレン検定によって、水中油型エマルジョンの品質管理が簡易になる。一実施形態において、本発明は、スクアレンを含む水中油型エマルジョンアジュバントの品質管理試験方法を提供し、この方法はアジュバントの実際のスクアレン含有量と標準スクアレン含有量を比較する工程を含む。実際のスクアレン含有量が標準含有量と異なる場合、生産の失敗が起こっており、したがってアジュバントは品質管理試験に不合格となる。しかし、実際の含有量が許容される場合、アジュバントは品質管理試験に合格し、ワクチン製造に使用することができる。
2010509202.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水中油型エマルジョンアジュバントを製造するための方法であって、（ｉ）既知量の水性担体、界面活性剤、およびスクアレンを使用して、サブミクロン水中油型エマルジョンを調製する工程と、（ｉｉ）該エマルジョンを濾過滅菌に供し、無菌化されたエマルジョンを準備する工程と、（ｉｉｉ）該無菌化されたエマルジョンのスクアレン含有量を測定する工程とを含む、方法。
【請求項２】
前記プロセスが、（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で測定された前記スクアレン含有量を工程（ｉ）で既知の前記スクアレン含有量と比較する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｉｖ）における比較によって、前記スクアレン含有量が工程（ｉ）と工程（ｉｉｉ）の間で著しく変化したことが明らかになった場合、前記アジュバントが受け入れられない、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｉｉｉ）において測定された前記含有量が、工程（ｉ）で既知の前記含有量と±１０％を超えて異なる場合、前記アジュバントが受け入れられない、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｉ）で既知の前記スクアレン含有量が２体積％〜８体積％のスクアレン濃度である、請求項２または３または４に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｉ）で既知の前記スクアレン含有量が４体積％〜６体積％のスクアレン濃度である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
水中油型エマルジョンアジュバントの品質管理試験方法であって、該アジュバントはスクアレンを含み、かつ該方法は、該アジュバントの実際のスクアレン含有量を標準スクアレン含有量と比較する工程を含む、方法。
【請求項８】
前記アジュバントが許容されるスクアレン含有量を有する場合、抗原と混合される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記抗原がインフルエンザ抗原である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
スクアレンを含む水中油型エマルジョンアジュバントを含むワクチンの品質管理試験方法であって、該方法は、（ｉ）該アジュバントの実際のスクアレン含有量を標準スクアレン含有量と比較する工程と、該実際のスクアレン含有量が許容される場合、（ｉｉ）該アジュバントと抗原を混合することによって該ワクチンを調製する工程とを含む、方法。
【請求項１１】
前記標準スクアレン含有量が２体積％〜８体積％のスクアレン濃度である、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記標準スクアレン含有量が４体積％〜６体積％のスクアレン濃度である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記実際の含有量が前記標準含有量と±１０％を超えて異なる場合、前記アジュバントが受け入れられない、請求項９から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
（ｉ）インフルエンザウイルス抗原および（ｉｉ）スクアレンを含む水中油型エマルジョンアジュバントを混合する工程を含む方法であって、該方法は、（ａ）該混合工程の前の該アジュバント中、および／または（ｂ）該混合工程後の該抗原−アジュバント混合物中のスクアレン含有量が測定される工程も含む、方法。
【請求項１５】
（ａ）または（ｂ）において測定された前記スクアレン含有量が、生産の失敗を調べるために標準スクアレン含有量（単数または複数）と比較される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記標準スクアレン含有量が２体積％〜８体積％のスクアレン濃度である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記標準スクアレン含有量が４体積％〜６体積％のスクアレン濃度である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記実際の含有量が前記標準含有量と±１０％を超えて異なる場合、前記アジュバントが受け入れられない、請求項１５から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
スクアレン含有量が（ａ）と（ｂ）とにおいて測定される、請求項１４から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
スクアレン含有量が（ａ）において測定されるが、（ｂ）において測定されない、請求項１４から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
スクアレン含有量が（ｂ）において測定されるが、（ａ）において測定されない、請求項１４から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記エマルジョンが、スクアレン、Ｔｗｅｅｎ  ８０、およびＳｐａｎ  ８５を含むサブミクロンエマルジョンである、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記エマルジョンが、スクアレン、トコフェロール、およびＴｗｅｅｎ  ８０のエマルジョンである、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記エマルジョンが、スクアレン、トコフェロール、およびＴｒｉｔｏｎ洗浄剤のエマルジョンである、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記エマルジョンが、スクアレン、ポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン性界面活性剤、および疎水性非イオン性界面活性剤を含むエマルジョンである、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書に引用された文献はすべて、参照によりその全体が組み込まれる。
【０００２】
本発明は、ワクチンアジュバント製造、および特にスクアレンを含有する水中油型エマルジョンアジュバントの品質管理検定の分野である。
【背景技術】
【０００３】
「ＭＦ５９」と呼ばれるワクチンアジュバント［１−３］（特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）は、スクアレン、Ｔｗｅｅｎ  ８０、およびＳｐａｎ  ８５のサブミクロン水中油型エマルジョンである。これは、クエン酸塩イオン類、例えば１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝剤も含んでよい。エマルジョンの組成（体積）は、約５％のスクアレン、約０．５％のポリソルベート８０、および約０．５％のＳｐａｎ  ８５とすることができる。アジュバントは、参考文献４の１０章および参考文献５の１２章にさらに詳細に記載されている。ＭＦ５９中の油滴は、０．２μｍのフィルターで無菌化濾過するのに十分な程度に小さい。
【０００４】
ヒトに投与するためのアジュバントである（例えば、ＦＬＵＡＤ（商標）ワクチンに含まれる）ので、ワクチンの品質管理は特に重要であり、ロット間変動は狭い範囲内に制御されなければならない。ＭＦ５９にとって重要なパラメータとしては、エマルジョン中の平均液滴サイズ、汚染微生物数、ｐＨ、視覚的外観、およびその材料の分解生成物または一般的汚染物質の存在が挙げられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第９０／１４８３７号パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ＰｏｄｄａおよびＤｅｌ  Ｇｉｕｄｉｃｅ、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ（２００１）２：１９７−２０３
【非特許文献２】Ｐｏｄｄａ、Ｖａｃｃｉｎｅ（２００１）１９：２６７３−２６８０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、ＭＦ５９などの水中油型エマルジョンアジュバントの品質管理検定をさらに進め改善することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の開示
ここで、ＭＦ５９アジュバントの各ロット中のスクアレン含有量の測定を、生産中の問題を調べる方法として使用できることが明らかになった。特に、スクアレン内容物中の液滴は、濾過に問題が生じたことを示唆し得ることが明らかになった。最終ロット中のスクアレン含有量を試験することは、特にフィルターがＧＭＰ条件下で維持されている装置の一部分である場合フィルターの特性を調査することより容易であり、したがってスクアレン検定によって、水中油型エマルジョンの品質管理が簡易になる。
【０００９】
したがって、本発明は、水中油型エマルジョンアジュバントの品質管理試験方法であって、このアジュバントはスクアレンを含み、かつこの方法はアジュバントの実際のスクアレン含有量と標準スクアレン含有量を比較する工程を含む方法を提供する。実際のスクアレン含有量が標準含有量と異なる場合、生産の失敗が起こっており、したがってアジュバントは品質管理試験に不合格となる。しかし、実際の含有量が許容される場合、アジュバントは品質管理試験に合格し、ワクチン製造に使用することができる。
【００１０】
本発明は、水中油型エマルジョンアジュバントを製造するプロセスであって、（ｉ）既知量の水性担体、界面活性剤、およびスクアレンを使用して、サブミクロン水中油型エマルジョンを調製する工程と、（ｉｉ）エマルジョンを濾過滅菌にかけて、無菌化されたエマルジョンを準備する工程と、（ｉｉｉ）無菌化されたエマルジョンのスクアレン含有量を測定する工程とを含むプロセスも提供する。工程（ｉｉｉ）で測定されたスクアレン含有量と、工程（ｉ）から既知のスクアレン含有量を比較することができる。この比較によって、スクアレン含有量が著しく変化したことが明らかである場合、生産の失敗が起こっており、したがってアジュバントは品質管理試験に不合格となる。
【００１１】
患者に投与する前に、エマルジョンアジュバントは、通常、抗原と混合される。混合は、使用時に即時に行ってもよく（この場合、抗原およびアジュバントは別々に包装されている）、またはワクチン製造中、充填する前に行うことができる。前者の状況では、品質管理試験はアジュバント自体について行う。後者の状況では、品質管理試験は抗原と混合する前のアジュバント、および／またはアジュバント−抗原の混合物について行うことができる。
【００１２】
したがって、本発明は、スクアレンを含む水中油型エマルジョンアジュバントを含むワクチンの品質管理試験方法であって、この方法は、（ｉ）アジュバントの実際のスクアレン含有量と標準スクアレン含有量を比較する工程と、実際のスクアレン含有量が許容される場合、（ｉｉ）アジュバントと抗原を混合することによってワクチンを調製する工程とを含む方法も提供する。工程（ｉｉ）は、アジュバントおよび抗原を、使用時に混合することができるように別々に包装することを含んでもよく、あるいはアジュバントおよび抗原を充填前または充填中に混合することを含んでもよい。
【００１３】
同様に、本発明は、抗原、およびスクアレンを含む水中油型エマルジョンアジュバントを含むワクチンの品質管理試験方法であって、この方法は、ワクチンの実際のスクアレン含有量と標準スクアレン含有量を比較する工程を含む方法を提供する。実際のスクアレン含有量が標準含有量と異なる場合、生産の失敗が起こっており、したがってワクチンは品質管理試験に不合格となる。しかし、実際の含有量が許容される場合、ワクチンは品質管理試験に合格し、販売および／または分配用に放出することができる。
【００１４】
本発明は、インフルエンザウイルスワクチン類の製造中に特に有用であり、したがって本発明は、（ｉ）インフルエンザウイルス抗原と（ｉｉ）スクアレンを含む水中油型エマルジョンアジュバントを混合する工程を含む方法であって、この方法は、（ａ）混合工程前のアジュバント中のスクアレン含有量、および／または（ｂ）混合工程後の抗原−アジュバントの混合物中のスクアレン含有量が測定される工程も含む方法を提供する。前述のように、生産の失敗を調べるために、測定されたスクアレン含有量と標準スクアレン含有量を比較することができる。
【００１５】
試験方法
本発明の方法は、スクアレンを含む水中油型エマルジョンアジュバントを用いて使用され、（ｉ）アジュバント自体、および／または（ｉｉ）アジュバントを抗原と混合して含むワクチン組成物のスクアレン含有量を測定することを含む。
【００１６】
様々なスクアレン検定が当技術分野で知られている。例えば、参考文献６は、スクアレンの比色定量試験を開示する。参考文献７は、遊離脂肪酸類、遊離ステロール類、およびアシルグリセリン分子種の存在下でのスクアレンの定量化のための高温ガスクロマトグラフィー・フレームイオン化検出方法を開示する。参考文献８は、検出限界が１０億分の１４０である、紫外検出高速液体クロマトグラフィーを用いた有効な検定を開示する。参考文献９は、スクアレンの定量分析における超臨界流体クロマトグラフィーの使用を開示する。参考文献１０は、スクアレンを検定するためのレーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析方法を開示する。参考文献１１は、スクアレン含有量を検定するための超臨界ＣＯ２抽出によるガスクロマトグラフィー−質量分析および高速液体クロマトグラフィーの使用を開示する。参考文献１２は、シリル化した後に不鹸化材料のガスクロマトグラフ分析を含む直接方法による、スクアレン、α−トコフェロール、およびステロール類の定量化のための簡易でかつ信頼性のある手順を開示する。参考文献１３は、不鹸化材料が、シリカゲルカラムの順相ＨＰＬＣでヘキサン／プロパノール−２／水からなる移動相を使用して分画され、溶離液を２１５ｎｍでモニターし、このようにして回収された炭化水素分画中のスクアレンを、分析カラムでヘキサンを使用して溶離させて定量する手順を開示する。直接および間接検定を使用することができる。例えば、スクアレンを、最初に低温ケン化にかけ、続いてヘキサン抽出物のガスクロマトグラフィー−質量分析にかけてもよい。
【００１７】
アジュバントまたは抗原のスクアレン含有量が測定されると、それは標準スクアレン含有量と比較される。標準スクアレン含有量は、当該アジュバントで、患者に投与するのに許容されることが知られている量であり得る。これは、アジュバントを調製するのに使用されたスクアレンの量であり、それによってスクアレンの最終量と出発量を比較することが可能になり得る。
【００１８】
標準含有量は、様々な形で準備することができる。例えば、正のアジュバント対照試料と被検アジュバントを、それらのスクアレン含有量を比較することができるように並行して検定することができる。代替として、正の対照を被検アジュバントの前または後に分析して、比較のための値を準備することができる。別の代替として、標準含有量は、先の分析に基づく絶対値とすることができる。しかし、すべての場合において、この方法は、試験されるアジュバントのスクアレン含有量が、品質管理の目的で許容されるどうかを明らかにする。測定されたスクアレン含有量が標準含有量と異なる場合、この差は生産の失敗を示唆する。
【００１９】
標準含有量は、絶対量または濃度であってもよく、あるいは例えば界面活性剤含有量または抗原含量に比べて測定された相対量であってもよい。絶対量または濃度がより一般的である。
【００２０】
標準含有量は、正確な値であってもよく、または範囲であってもよい。例えば、それは、許容される偏差（百分率）、例えば±１０％、±５％などの絶対量であってもよい。次いで、測定された含有量を標準含有量の範囲と比較することができ、範囲外である場合、検定に不合格となる。水中油型エマルジョンアジュバントの典型的な標準スクアレン絶対含有量は、例えば４０〜４５ｍｇ／ｍｌ（例えば、４３ｍｇ／ｍｌ）、３６〜４２ｍｇ／ｍｌ（例えば、３９ｍｇ／ｍｌ）、２０〜２５ｍｇ／ｍｌ（例えば、２１．５ｍｇ／ｍｌ）、１８〜２１ｍｇ／ｍｌ（例えば、１９．５ｍｇ／ｍｌ）などとすることができる。
【００２１】
通常の統計基準によれば、スクアレン含有量は、典型的には実験偏差の影響を最小限に抑えるためにいくつかの試料について測定される。したがって、本発明は、標準含有量と突き合わせて平均値を比較するものとすることができる。
【００２２】
詳細に後述するように、抗原と混合する前のアジュバント、抗原／アジュバントの混合物、充填する前のバルク材料、バルクから抽出された充填後の材料などについてスクアレン検定を行うことができる。
【００２３】
アジュバント
本発明の方法は、水中油型エマルジョンアジュバントを用いて使用される。アジュバントは、不飽和テルペノイド油（Ｃ３０Ｈ５０；［（ＣＨ３）２Ｃ［＝ＣＨＣＨ２ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）］２＝ＣＨＣＨ２−］２；２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエン；ＣＡＳ  ＲＮ  ７６８３−６４−９）であるスクアレンを含む。
【００２４】
アジュバントは、スクアレンに加えて他の油類も含んでよい。好ましくは、さらなる油類はいずれも、生分解性（代謝可能）でかつ生体適合性である。アジュバントは、動物源（魚など）または植物源からの油類などの油類も含んでよい。植物油の供給源としては、堅果類、種子類、および穀物類が挙げられる。堅果油類の例としては、最も一般に入手可能な落花生油、ダイズ油、ココナッツ油、およびオリーブ油が挙げられる。例えば、ホホバ豆から得られたホホバ油を使用することができる。種子油類としては、サフラワー油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ種子油などが挙げられる。穀物群においては、トウモロコシ油が最も容易に入手可能であるが、小麦、オート麦類、ライ麦、米、テフ、ライ小麦など他のシリアル穀物の油も使用することができる。種子油類には天然に存在しないグリセロールおよび１，２−プロパンジオールの６〜１０個の炭素の脂肪酸エステル類は、堅果油類および種子油類を出発物とする適切な材料の加水分解、分別、およびエステル化によって調製してもよい。哺乳類の乳からの油脂類は代謝可能であり、したがって本発明に実施で使用してもよい。動物源から純粋な油類を得るのに必要な分別、精製、ケン化、および他の手段の手順は、当技術分野でよく知られている。大部分の魚類は、容易に回収することができる代謝可能な油類を含有する。本明細書で使用することができる魚油類の数例としては、例えばタラ肝油、サメ肝油類、および鯨蝋などの鯨油が挙げられる。いくつかの分枝鎖油類は、炭素５個のイソプレン単位で生化学的に合成され、テルペノイド類と総称され、それにはスクアレンが含まれる。スクアレンの飽和類似体であるスクアランも使用することができる。スクアレンおよびスクアランを含めて、魚油類は、商業供給業者から容易に入手可能であり、または当技術分野で知られている方法で得ることができる。他の好ましい油類はトコフェロール類である。組成物がトコフェロールを含む場合、α、β、γ、δ、ε、またはζトコフェロール類のいずれかを使用することができるが、α−トコフェロール類が好ましい。トコフェロールは、いくつかの形、例えば様々な塩および／または異性体とすることができる。塩としては、コハク酸塩、酢酸塩、ニコチン酸塩などの有機塩が挙げられる。Ｄ−α−トコフェロールおよびＤＬ−α−トコフェロールは両方とも、使用することができる。好ましいα−トコフェロールはＤＬ−α−トコフェロールである。このトコフェロールの塩を使用する場合、好ましい塩はコハク酸塩である。
【００２５】
スクアレン（および場合によっては、さらに１種または複数の他の油類）の存在に加えて、エマルジョンには、水相および界面活性剤が含まれる。界面活性剤は、好ましくは生分解性（代謝可能）でかつ生体適合性である。界面活性剤はその「ＨＬＢ」（親水／親油バランス）で分類することができる。本発明の好ましい界面活性剤は、ＨＬＢが少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、より好ましくは少なくとも１６である。本発明は、界面活性剤を用いて使用することができ、これらの界面活性剤としては、ポリオキシエチレンソルビタンエステル類界面活性剤（よくＴｗｅｅｎ類と呼ばれる）、特にポリソルベート２０およびポリソルベート８０；線状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマー類など、ＤＯＷＦＡＸ（商標）という販売名で販売されているエチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）、および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー類；エトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の繰返し数が変わり得るオクトキシノール類、特にオクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が重要である；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；ホスファチジルコリン（レシチン）などのリン脂質；トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ  ３０）など、ラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、およびオレイルアルコールに由来するポリオキシエチレン脂肪エーテル類（Ｂｒｉｊ界面活性剤と呼ばれる）；ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル；ならびにソルビタントリオレアート（Ｓｐａｎ  ８５）およびソルビタンモノラウラートなどのソルビタンエステル類（よくＳＰＡＮ類と呼ばれる）が挙げられるが、これらに限定されない。エマルジョン中に含むための好ましい界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ  ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート）、Ｓｐａｎ  ８５（ソルビタントリオレアート）、レシチン、およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である。
【００２６】
界面活性剤の混合物、例えばＴｗｅｅｎ  ８０／Ｓｐａｎ  ８５の混合物またはＴｗｅｅｎ  ８０／Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の混合物を使用することができる。ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（Ｔｗｅｅｎ  ８０）などのポリオキシエチレンソルビタンエステルとｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）などのオクトキシノールの組合せも適している。別の有用な組合せは、ラウレス９にポリオキシエチレンソルビタンエステル、および／またはオクトキシノールを加えたものを含む。
【００２７】
界面活性剤の好ましい量（重量％）は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル類（Ｔｗｅｅｎ  ８０など）０．０１％〜１％、特に約０．１％；オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール類（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、またはＴｒｉｔｏｎシリーズの他の洗浄剤など）０．００１％〜０．１％、特に０．００５％〜０．０２％；ポリオキシエチレンエーテル類（ラウレス９など）０．１％〜２０％、好ましくは０．１％〜１０％、特に０．１％〜１％、または約０．５％である。
【００２８】
エマルジョンの水相は、好ましくは緩衝生理食塩水、例えばリン酸緩衝生理食塩水である。
【００２９】
エマルジョン中の油滴は、典型的には直径１μｍ未満（平均）である。サブミクロン直径は、微小流動化装置を用いて容易に実現することができ、安定なエマルジョンをもたらす。２２０ｎｍ未満のサイズの液滴は、濾過滅菌にかけることができるので特に好ましい。液滴数の少なくとも８０％が直径５０〜２００ｎｍの範囲であるエマルジョンが特に有用である。
【００３０】
スクアレンを含有し、かつ本発明の方法で試験することができる特定の水中油型エマルジョンアジュバントとしては、下記が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
・スクアレン、Ｔｗｅｅｎ  ８０、およびＳｐａｎ  ８５のサブミクロンエマルジョン。エマルジョンの組成（体積）は、約５％のスクアレン、約０．５％のポリソルベート８０、および約０．５％のＳｐａｎ  ８５とすることができる。重量で表すと、これらの量は、４．３％のスクアレン、０．５％のポリソルベート８０、および０．４８％のＳｐａｎ  ８５となる。このアジュバントは「ＭＦ５９」と呼ばれる。ＭＦ５９エマルジョンは、クエン酸塩イオン類、例えば１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝剤を含むことが有利である。
【００３２】
・スクアレン、トコフェロール、およびＴｗｅｅｎ  ８０のエマルジョン。このエマルジョンは、リン酸緩衝生理食塩水を含んでもよい。これは、Ｓｐａｎ  ８５（例えば、１％）および／またはレシチンも含んでよい。これらのエマルジョンは、２％〜１０％のスクアレン、２％〜１０％のトコフェロール、および０．３％〜３％のＴｗｅｅｎ  ８０を有してもよく、かつスクアレン：トコフェロールの重量比は≦１であることが、より安定なエマルジョンをもたらすので好ましい。スクアレンとＴｗｅｅｎ  ８０は、約５：２の体積比で存在してもよい。このような１つのエマルジョンは、Ｔｗｅｅｎ  ８０をＰＢＳに溶解して、２％溶液を得、次いでこの溶液９０ｍｌを（５ｇのＤＬ−α−トコフェロールおよび５ｍｌのスクアレン）の混合物と混合し、次いでこの混合物を微小流動化することによって作製することができる。得られたエマルジョンは、例えば平均直径１００ｎｍ〜２５０ｎｍ、好ましくは約１８０ｎｍのサブミクロン油滴を有してもよい。このエマルジョンは、３ｄ−ＭＰＬおよび／またはサポニン（例えば、ＱＳ２１）も含んでよい。
【００３３】
・スクアレン、トコフェロール、およびＴｒｉｔｏｎ洗浄剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）のエマルジョン。このエマルジョンは、３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ（「３ｄ−ＭＰＬ」）も含んでよい。このエマルジョンは、リン酸塩緩衝剤を含有してもよい。
【００３４】
・スクアレン、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８ブロックコポリマー、卵ホスファチジルコリン、グリセロール、およびトコフェロールを含むエマルジョン［１４］。
【００３５】
・スクアレン、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０）、Ｔｒｉｔｏｎ洗浄剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、およびトコフェロール（例えばコハク酸α−トコフェロール）を含むエマルジョン。このエマルジョンは、これらの３成分を約７５：１１：１０の質量比（例えば、７５０μｇ／ｍｌのポリソルベート８０、１１０μｇ／ｍｌのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、および１００μｇ／ｍｌのコハク酸α−トコフェロール）で含んでもよく、かつこれらの濃度は、抗原由来のこれらの成分のあらゆる寄与を含むはずである。このエマルジョンは、３ｄ−ＭＰＬも含んでよい。このエマルジョンは、ＱＳ２１などのサポニンも含んでよい。水相は、リン酸塩緩衝剤を含有してもよい。
【００３６】
・スクアレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン性界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレン（１２）セトステアリルエーテル）、および疎水性非イオン性界面活性剤（例えば、ソルビタンモノオレアートまたは「Ｓｐａｎ  ８０」などのソルビタンエステルまたはマンニドエステル）を含むエマルジョン。このエマルジョンは、好ましくは熱可逆性であり、かつ／または油滴の少なくとも９０体積％が２００ｎｍ未満のサイズである［１５］。このエマルジョンは、アルジトール；凍結保護剤（例えば、ドデシルマルトシドおよび／またはスクロースなどの糖）；および／またはアルキルポリグリコシドの１種または複数も含んでよい。これは、化学構造に糖環が含まれないものなどのＴＬＲ４アゴニストも含んでよい［１６］。このようなエマルジョンを凍結乾燥してもよい。
【００３７】
・スクアレン、ポロキサマー１０５、およびＡｂｉｌ−Ｃａｒｅのエマルジョン［１７］。アジュバントを含むワクチン類中のこれらの成分の最終濃度（重量）は、５％のスクアレン、４％のポロキサマー１０５（プルロニックポリオール）、および２％のＡｂｉｌ−Ｃａｒｅ  ８５（ビス−ＰＥＧ／ＰＰＧ−１６／１６  ＰＥＧ／ＰＰＧ−１６／１６ジメチコン；トリ（カプリル／カプリン酸）グリセリル）である。
【００３８】
抗原
水中油型エマルジョンアジュバントを、（例えば、患者に別に投与された抗原にアジュバント効果を与えるために）単独で患者に投与することが可能であるが、アジュバントと抗原を投与する前に混合することがより一般的である。この混合は、分配されたワクチン製品がすぐに投与できるように製造中に行ってもよく、または使用時に行うことができる。
【００３９】
様々な抗原は、水中油型エマルジョンを用いて使用することができ、これらの抗原としては、ウイルス表面タンパク質などのウイルス抗原；タンパク質および／または糖抗原などの細菌抗原；真菌性抗原；寄生虫抗原；ならびに腫瘍抗原が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４０】
本発明は、インフルエンザウイルス、ＨＩＶ、鉤虫、Ｂ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス、狂犬病、呼吸器合胞体ウイルス、サイトメガロウイルス、黄色ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、クラミジア、ＳＡＲＳコロナウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、肺炎連鎖球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、エプスタイン・バーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）、ヒトパピローマウイルスなどに対するワクチン類で特に有用である。
【００４１】
・インフルエンザウイルス抗原。これらは、生ウイルスまたは不活化ウイルスの形をとってもよい。不活化ウイルスが使用される場合、ワクチンは、全ウイルス粒子、スプリットウイルス粒子、または精製表面抗原を含んでもよい（ヘマグルチニンを含み、かつ通常はノイラミニダーゼも含む）。インフルエンザ抗原は、ビロソーム類の形で存在することもできる［１８］。抗原は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、および／またはＨ１６から選択された任意のヘマグルチニンサブタイプを有してもよい。ワクチンは、インフルエンザＡウイルスおよび／またはインフルエンザＢウイルスを含めて１種または複数（例えば、１種、２種、３種、４種、またはそれ以上）のインフルエンザウイルス株からの抗原（単数または複数）を含んでもよい。インフルエンザウイルスは、リアソータント株であってもよく、逆遺伝学技術で得られたものでもよい［例えば、１９〜２３］。したがって、ウイルスは、Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルスからの１種または複数のＲＮＡセグメントを含んでもよい（典型的には、Ａ／ＰＲ／８／３４から６種のセグメントを含み、ＨＡセグメントおよびＮセグメントは、ワクチン株によるものであり、すなわち６：２のリアソータントである）。抗原の供給源として使用されるウイルスは、卵（例えば、有胚ニワトリ卵）でまたは細胞培養物で増殖させることができる。細胞培養物が使用される場合、細胞基質は、典型的にはＭＤＣＫ；ＣＨＯ；２９３Ｔ；ＢＨＫ；Ｖｅｒｏ；ＭＲＣ−５；ＰＥＲ．Ｃ６；ＷＩ−３８などの哺乳類細胞株である。インフルエンザウイルスを増殖させるための好ましい哺乳類細胞株としては、メイディン・ダービー（Ｍａｄｉｎ  Ｄａｒｂｙ）イヌ腎臓由来のＭＤＣＫ細胞［２４〜２７］；アフリカミドリザル（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ａｅｔｈｉｏｐｓ）腎臓由来のベロ（Ｖｅｒｏ）細胞［２８〜３０］；またはヒト胚網膜芽細胞由来のＰＥＲ．Ｃ６細胞［３１］が挙げられる。これらの細胞株は、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＡＴＣＣ）コレクション［３２］、Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ［３３］、またはＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）から広く入手可能である。例えば、ＡＴＣＣは、カタログ番号ＣＣＬ−８１、ＣＣＬ−８１．２、ＣＲＬ−１５８６、およびＣＲＬ−１５８７で様々な異なるベロ細胞を供給し、カタログ番号ＣＣＬ−３４でＭＤＣＫ細胞を供給する。ＰＥＲ．Ｃ６は、ＥＣＡＣＣから寄託番号９６０２２９４０で入手可能である。哺乳類細胞株の好ましくない代替物として、ウイルスは、アヒル（例えば、アヒル網膜）またはニワトリ、例えばニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）などに由来する細胞株を含めて、トリ細胞株［例えば、参考文献３４〜３６］で増殖させることができる。ウイルスを哺乳類細胞株で増殖させた場合、組成物は、卵タンパク質（例えば、オバルブミンおよびオボムコイド）およびニワトリＤＮＡを含まず、それによってアレルゲン性（ａｌｌｅｒｇｅｎｉｃｉｔｙ）を低減することが有利である。
【００４２】
・ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２を含めて、ヒト免疫不全ウイルス。抗原は、典型的にはエンベロープ抗原である。
【００４３】
・Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原。この抗原は、例えばサッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母で発現した後に組換えＤＮＡ法で得られることが好ましい。本来のウイルスＨＢｓＡｇと異なり、酵母で発現させた組換え抗原は、非グリコシル化されている。これは、リン脂質類を含む脂質マトリックスを含めて、実質的に球状な粒子（平均直径約２０ｎｍ）の形とすることができる。本来のＨＢｓＡｇ粒子と異なり、酵母で発現させた粒子は、ホスファチジルイノシトールを含む可能性がある。ＨＢｓＡｇは、ａｙｗ１、ａｙｗ２、ａｙｗ３、ａｙｗ４、ａｙｒ、ａｄｗ２、ａｄｗ４、ａｄｒｑ−、およびａｄｒｑ＋というサブタイプのいずれかによるものとすることができる。
【００４４】
・特にイヌ類に見られる鉤虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ  ｃａｎｉｎｕｍ）。この抗原は、組換えＡｃ−ＭＴＰ−１（アスタシン様メタロプロテアーゼ）および／またはアスパラギン酸ヘモグロビナーゼ（Ａｃ−ＡＰＲ−１）とすることができ、バキュロウイルス／昆虫細胞系で分泌タンパク質として発現される可能性がある［３７，３８］。
【００４５】
・単純ヘルペスウイルス抗原（ＨＳＶ）。本発明での使用に好ましいＨＳＶ抗原は膜糖タンパク質ｇＤである。ＨＳＶ−２株からのｇＤ（「ｇＤ２」抗原）を使用することが好ましい。組成物は、Ｃ末端膜アンカー領域が欠失したｇＤの形、例えば天然タンパク質の１〜３０６アミノ酸を含み、アパラギン（ａｐａｒａｇｉｎｅ）およびグルタミンをＣ末端に付加させた切断型ｇＤを使用することができる［３９］。この形のタンパク質は、切断されて成熟２８３アミノ酸タンパク質を生じるシグナルペプチドを含む。アンカーの欠失によって、タンパク質を可溶型で調製させることができる。
【００４６】
・ヒトパピローマウイルス抗原（ＨＰＶ）。本発明での使用に好ましいＨＰＶ抗原は、集合してウイルス様粒子（ＶＬＰ）と公知の構造を形成することができるＬ１カプシドタンパク質である。ＶＬＰは、酵母細胞（例えば、酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））または昆虫細胞（例えば、ツマジロクサヨトウ（Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）などのスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）細胞またはショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞）におけるＬ１の組換え発現によって産生することができる。酵母細胞では、プラスミドベクターがＬ１遺伝子（単数または複数）を保持することができ、昆虫細胞では、バキュロウイルスベクターがＬ１遺伝子（単数または複数）を保持することができる。より好ましくは、組成物は、ＨＰＶ−１６株とＨＰＶ−１８株の両方からのＬ１  ＶＬＰを含む。この２価の組合せは極めて有効であることがわかっている［４０］。ＨＰＶ−１６株およびＨＰＶ−１８株に加えて、ＨＰＶ−６株およびＨＰＶ−１１株からのＬ１  ＶＬＰを含むことも可能である。発癌性ＨＰＶ株の使用も可能である。ワクチンは、ＨＰＶ株あたり、２０〜６０μｇ／ｍｌ（例えば、約４０μｇ／ｍｌ）のＬ１を含み得る。
【００４７】
・炭疽菌抗原。炭疽は、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）によって引き起こされる。適当な炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）抗原は、Ａ成分（致死因子（ＬＦ）および浮腫因子（ＥＦ））を含み、これらは両方とも、感染防御抗原（ＰＡ）と公知の共通のＢ成分を共有することができる。抗原は、場合によっては解毒されていてもよい。さらに詳細は、参考文献４１〜４３で見ることができる］。
【００４８】
・癌抗原。種々の腫瘍特異抗原が知られている。本発明は、肺癌、黒色腫、乳癌、前立腺癌などに対して免疫療法反応を導き出す抗原を用いて使用してもよい。
【００４９】
本発明は、ウイルス表面抗原および異種抗原を含むハイブリッドタンパク質または融合タンパク質に基づく抗原でも有用である。例えば、ＨＢｓＡｇ配列を異種抗原に融合させて、集合して粒子を構築するＨＢｓＡｇの能力を利用することが知られている。例えば、参考文献４４によって、ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０をＨＢｓＡｇに融合させて、自発的に集合して本来のＨＢｓＡｇ粒子に似ている粒子を構築するタンパク質を得ることが報告されている。この手法は、マラリアワクチン類にも使用されてきた。参考文献４５によって、マラリアｇｐ１９０抗原の６１ａａまでのエピトープをＨＢｓＡｇ配列に挿入したこと、および発現したハイブリッド粒子は動物において抗ｇｐ１９０免疫応答を導き出し得ることが報告されている。参考文献４６によって、ＨＢｓＡｇを含む融合タンパク質として発現したスポロゾイト周囲タンパク質の４ｍｅｒ配列の１６個繰返しを有するタンパク質が報告されている。参考文献４７によって、ＨＢｓＡｇに融合させたＰｆｓ１６から構成されるウイルス様粒子の酵母における産生が報告されている。参考文献４８は、スポロゾイト周囲タンパク質がＨＢｓＡｇに融合しているハイブリッド抗原を開示する。参考文献４９は、Ｐ．ｖｉｖａｘのメロゾイト表面タンパク質１のＣ末端領域の融合物が、２０〜４５ｎｍサイズの免疫原性粒子を形成したことを開示する。したがって、マラリア抗原を自己集合性粒子の形で提示するのにＨＢｓＡｇを使用することは、当技術分野でよく知られている。したがって、本発明は、ウイルス表面抗原および異種抗原を含むハイブリッド抗原を用いて使用することができる。特に、ウイルス表面抗原がＨＢｓＡｇである場合、異種抗原は、ＨＩＶ、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ）、または卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ）によるものとすることができる。ＨＢｓＡｇハイブリッドを作製するのに適当なＨＩＶ抗原としては、エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０またはその抗原断片が挙げられる［４４］。ＨＢｓＡｇハイブリッドを作製するのに適当な熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）抗原は、スポロゾイト周囲表面抗原（「ＣＳＰ」）のサブユニットをベースとすることがあり、例えばそのＮＡＮＰモチーフの３個〜２０個繰返しを含んでもよく、かつ／またはＣＳＰのＣ末端領域を含んでもよい（しかし、典型的にはＣ末端の最終の１２個のアミノ酸を含まない）。例えば、本発明は、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のＮＦ５４または７Ｇ８単離物からのＣＳＰのＣ末端の大部分（ＮＡＮＰの１９個繰返し、およびアミノ酸３６７〜３９０にＴ細胞エピトープ領域を含むアミノ酸２１０〜３９８）を含み、ＨＢｓＡｇのｐｒｅＳ２部分の４個のアミノ酸によってＨＢｓＡｇのＮ末端に融合された「ＲＴＳ」として既知である抗原を使用してもよい。したがって、ＲＴＳの配列は、（ｉ）Ｎ末端メチオニン残基；（ｉｉ）Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｐｒｏ；（ｉｉｉ）熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）７Ｇ８からのＣＳタ��パク質のアミノ酸２１０〜３９８または熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）ＮＦ５４からのＣＳタンパク質のアミノ酸２０７〜３９５に対応する１８９個のアミノ酸；（ｉｖ）ＡｒｇまたはＧｌｙ；（ｖ）Ｂ型肝炎Ｐｒｅ−Ｓ２タンパク質からのＰｒｏ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ；および（ｖｉ）ＨＢｓＡｇを含むことができる。
【００５０】
ワクチン
本発明の方法で試験したエマルジョンアジュバントを使用して、ワクチン類を製造することができる。前述のように、混合およびエマルジョンおよび抗原は使用時に即時に行ってもよく、またはワクチン製造中に行うことができる。本発明の方法を、両方のタイプのワクチンを作製するときに適用することができる。予め混合されたワクチンでは、本方法は、アジュバントを抗原と混合する前に、アジュバントに行うことができ、かつ／または混合した後行うことができ、次いで品質管理試験に合格するワクチンを販売および／または分配用に放出することができる。即時混合向けの形で供給されたワクチンでは、本方法は、抗原を共に含むキットにアジュバントを包装する前にアジュバントに行う。
【００５１】
したがって、アジュバントを試験する本発明の方法は、アジュバントを抗原と混合する別のプロセス工程を含んでもよい。代替策として、本方法は、アジュバントを、抗原成分と共に含むキット成分としてキットに包装する別の工程を含んでもよい。これらの別の工程は、通常アジュバントが品質管理試験に合格した場合のみ行われる。
【００５２】
本発明の方法は、通常、小試料のバルクアジュバントまたは混合ワクチンに行われる。品質管理はこの試料に行われ、試料が品質管理試験に合格した場合のみ、バルクが各用量に包装される。したがって、本発明の方法は、バルクアジュバントから試料を抽出する工程と、その試料を上述されたように試験する工程と、次いで試料が試験に合格した場合、そのバルクを抗原のバルク混合物と混合する工程とを含んでもよい。次いで、単位用量の混合バルクを抽出し、販売および／または分配用に包装することができる。
【００５３】
代替実施形態において、本発明の方法は、バルクアジュバントから試料を抽出する工程と、その試料を上述されたように試験する工程と、次いで試料が試験に合格した場合、バルクアジュバントから単位用量を抽出して、単位用量の抗原と混合する工程とを含んでもよい。
【００５４】
別の代替実施形態において、本発明の方法は、バルクアジュバントから試料を抽出する工程と、その試料を上述されたように試験する工程と、次いで、試料が試験に合格した場合、バルクアジュバントから単位用量を抽出して、上述されたように即時使用向けのキット成分として包装する工程とを含んでもよい。
【００５５】
別の代替実施形態において、本発明の方法は、抗原およびアジュバントのバルク混合物から試料を抽出する工程と、その試料を上述されたように試験する工程と、次いで試料が試験に合格した場合、バルク混合物から単位用量を抽出して、包装する工程とを含んでもよい。
【００５６】
インフルエンザワクチン類では、単位用量のワクチンは、典型的にはヘマグルチニン（ＨＡ）含有量を典型的にはＳＲＩＤで測定して、参照することにより標準化される。現存するワクチン類は、典型的には約１５μｇのＨＡ／株を含むが、特にアジュバントを使用する場合には、より少ない用量を使用することができる。１／２（すなわち、７．５μｇのＨＡ／株）、１／４、および１／８などの分割用量は、より多い用量（例えば、３倍または９倍用量［５２，５３］）が使用されたように使用されてきた［５０，５１］。したがって、ワクチン類は、０．１〜１５０μｇのＨＡ／インフルエンザ株、好ましくは０．１〜５０μｇ、例えば０．１〜２０μｇ、０．１〜１５μｇ、０．１〜１０μｇ、０．１〜７．５μｇ、０．５〜５μｇなどを含んでもよい。具体的な用量としては、例えば約１５、約１０、約７．５、約５、約３．８、約１．９、約１．５／株などが挙げられる。
【００５７】
したがって、全体的にみて、本発明は、混合ワクチン類を調製するとき、またはすぐに混合することができる抗原およびアジュバントを含むキットを調製するとき使用することができる。混合が製造中に行われる場合、混合されるバルク抗原およびアジュバントの体積は、典型的には１リットルを超え、例えば≧５リットル、≧１０リットル、≧２０リットル、≧５０リットルなどである。混合が使用時に行われる場合、混合される体積は、典型的には１ミリリットルより少なく、例えば≦０．６ｍｌ、≦０．５ｍｌ、≦０．４ｍｌ、≦０．３ｍｌ、≦０．２ｍｌなどである。両方の場合において、実質的に等しい体積のエマルジョンおよび抗原溶液、すなわち実質的に１：１（例えば、１．１：１〜１：１．１、好ましくは１．０５：１〜１：１．０５、より好ましくは１．０２５：１〜１：１．０２５）が混合されるのが通常である。しかし、いくつかの実施形態において、過剰のアジュバントまたは過剰の抗原を使用してもよい。過剰体積の一成分を使用する場合、過剰は一般に少なくとも１．５：１、例えば≧２：１、≧２．５：１、≧３：１、≧４：１、≧５：１などである。
【００５８】
抗原およびアジュバントは、別々の成分としてキット内に提供される場合、キット内で互いに物理的に離れており、この分離は様々な方式で実現することができる。例えば、これらの成分は、バイアルなど別々の容器に存在してもよい。次いで、２本のバイアルの内容物は、例えば一方のバイアルの内容物を取り出し、それを他方のバイアルに加えることによって、または両方のバイアルの内容物を別々に取り出し、それらを第３の容器中で混合することによって、必要に応じて混合することができる。
【００５９】
好ましい配置では、キット成分の一方は注射器中にあり、他方はバイアルなどの容器中にある。注射器を（例えば、針を付けて）使用して、その内容物を混合用の第２の容器に挿入することができ、次いで混合物を注射器に引き出すことができる。次いで、典型的には新しい無菌針を介して、注射器の混合内容物を患者に投与することができる。一成分を注射器に充填することによって、患者に投与するのに別の注射器を使用する必要がなくなる。
【００６０】
別の好ましい配置では、２つのキット成分は共に、同じ注射器、例えばデュアルチャンバー注射器、具体的には参考文献５４〜６１などに開示される注射器に別々に保持される。注射器を作動させるとき（例えば、患者に投与中）、２つのチャンバーの内容物が混合される。この配置によって、使用時に別の混合工程が必要でなくなる。
【００６１】
様々なキット成分の内容物は、一般にすべて水性の形である。いくつかの配置では、一方の成分（典型的には、エマルジョン成分ではなく抗原成分）は乾燥した形（例えば、凍結乾燥した形）であり、他の成分は水性の形である。乾燥成分を再活性化し、患者に投与するための水性組成物を生じるために、２つの成分を混合することができる。凍結乾燥成分は、典型的には注射器ではなくバイアル内に配置される。乾燥した成分は、ラクトース、スクロース、またはマンニトール、およびそれらの混合物、例えばラクトース／スクロース混合物、スクロース／マンニトール混合物などの安定剤を含んでもよい。可能な一配置は、プレフィルド注射器中の水性エマルジョン成分、およびバイアル中の凍結乾燥した抗原成分を使用する。
【００６２】
ワクチン類がアジュバントおよび抗原に加えて成分を含む場合、これらのさらなる成分は、これらの２つのキット成分の１つに含めてもよく、または第３のキット成分の一部分であってもよい。
【００６３】
本発明の混合ワクチン類または個々のキット成分のための適当な容器としては、バイアルおよびディスポーザブル注射器が挙げられる。これらの容器は無菌であるべきである。
【００６４】
組成物／成分がバイアル中に配置される場合、バイアルは、好ましくはガラスまたはプラスチック材料で作製される。好ましくは、組成物をバイアルに加える前にバイアルを無菌化する。ラテックス感受性の患者の問題を回避するために、ラテックスを含まない栓でバイアルを密閉することが好ましく、かつすべての包装材料中にラテックスがないことが好ましい。バイアルは、単回用量のワクチンを含んでもよく、または１回を超える用量（「複数回用量」バイアル）、例えば１０回用量を含んでもよい。好ましいバイアルは、無色ガラスで作製される。
【００６５】
バイアルは、プレフィルド注射器をキャップに挿入することができるように適合されたキャップ（例えば、ルアーロック）を有することができ、注射器の内容物をバイアルに押し出すことができ（例えば、その中の凍結乾燥材料を再構築するため）、バイアルの内容物を注射器に引き戻すことができる。注射器をバイアルから取り外した後、次いで針を取り付け、組成物を患者に投与することができる。キャップは、好ましくはキャップにアクセスすることができる前にシールまたはカバーを取り除かなければならないようにシールまたはカバー内部に配置される。
【００６６】
組成物／成分が注射器に充填されている場合、注射器には、通常針が取り付けられているわけではないが、注射器と別に針を供給して、組み立て、使用してもよい。安全針が好ましい。１インチ２３ゲージ、１インチ２５ゲージ、および５／８インチ２５ゲージの針が典型的である。注射器には、記録を取ることが容易になるように、ロット番号、インフルエンザシーズン、および内容物の使用期限が印刷されていることがある剥離式ラベルが備えられていてもよい。注射器のプランジャーは、プランジャーが吸引中に偶発的に取り外されないように栓を有することが好ましい。注射器は、ラテックスゴムキャップおよび／またはプランジャーを有することができる。ディスポーザブル注射器には、単回用量のワクチンが入っている。注射器は、一般に針を取り付ける前に先端を密閉するように先端キャップを有し、先端キャップはブチルゴムで作製されていることが好ましい。注射器および針を別々に包装する場合、針はブチルゴムシールドで固定されることが好ましい。好ましい注射器は、商標名「Ｔｉｐ−Ｌｏｋ」（商標）で上市されているものである。
【００６７】
容器には、半用量体積を示すように印を付けて、例えば小児への送達を容易にすることができる。例えば、０．５ｍｌの用量を含む注射器は、０．２５ｍｌの体積を示す印を有してもよい。
【００６８】
ガラス容器（例えば、注射器またはバイアル）を使用する場合、ソーダ石灰ガラスではなくホウケイ酸ガラスで作製された容器を使用することが好ましい。
【００６９】
キットまたは組成物は、ワクチンの詳細、例えば投与するための指示書、ワクチン内の抗原の詳細などを含めて、パンフレットと共に（例えば、同じ箱に）包装してもよい。指示書には、例えばワクチン投与後のアナフィラキシー反応などに備えてアドレナリン溶液を容易に利用可能にしておくようにという警告も含まれることがある。
【００７０】
医薬組成物
本発明の方法を使用して作製された組成物は、医薬として許容される。これらは、抗原およびアジュバントに加えて、成分を含んでもよく、例えば典型的には１種または複数の医薬用担体（単数または複数）および／または賦形剤（単数または複数）を含む。このような成分について徹底した考察は、参考文献６２で見られる。
【００７１】
組成物は、チオメルサールまたは２−フェノキシエタノールなどの保存剤を含んでもよい。しかし、ワクチンは、水銀材料を実質的に含まない（すなわち、５μｇ／ｍｌ未満）、例えばチオメルサールを含まないことが好ましい［６３，６４］。水銀を含有しないワクチン類がより好ましい。
【００７２】
張度を制御するには、ナトリウム塩などの生理的塩を含むことが好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、１ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌで存在することができる。存在してもよい他の塩としては、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム二水和物、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどが挙げられる。
【００７３】
組成物は、一般にオスモル濃度が２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、好ましくは２４０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇであり、より好ましくは２９０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内に入る。オスモル濃度は、ワクチン投与によって引き起こされた疼痛に影響を与えないことが以前に報告された［６５］が、それにもかかわらずオスモル濃度をこの範囲にしておくことが好ましい。
【００７４】
組成物は、１種または複数の緩衝剤を含むことができる。典型的な緩衝剤としては、リン酸塩緩衝剤；Ｔｒｉｓ緩衝剤；ボラート緩衝剤；コハク酸塩緩衝剤；ヒスチジン緩衝剤；またはクエン酸塩緩衝剤が挙げられる。緩衝剤は、典型的には５ｍＭ〜２０ｍＭの範囲で含まれる。
【００７５】
組成物のｐＨは、一般に５．０〜８．１、さらに典型的には６．０〜８．０、例えば６．５〜７．５である。したがって、本発明のプロセスは、包装する前にバルクワクチンのｐＨを調整する工程を含むことができる。
【００７６】
組成物は、好ましくは無菌である。組成物は、好ましくは非発熱性であり、例えば＜１ＥＵ（エンドトキシン単位、標準尺度）／用量、好ましくは＜０．１ＥＵ／用量を含有する。組成物は、好ましくはグルテンを含まない。
【００７７】
組成物は、単回免疫用の材料を含んでもよく、または反復免疫用の材料を含んでもよい（すなわち、「複数回用量」キット）。保存剤を複数回用量の配置に含むことが好ましい。
【００７８】
ワクチン類は、典型的には約０．５ｍｌの投与量体積で投与されるが、半用量（すなわち、約０．２５ｍｌ）を小児に投与してもよい。
【００７９】
組成物およびキットは、好ましくは２℃〜８℃で貯蔵される。これらは凍結すべきではない。これらは、理想的には直射日光を避けるべきである。
【００８０】
治療方法およびワクチンの投与
本発明は、本発明の方法を使用して調製されたキットおよび組成物を提供する。これらはヒト患者への投与に適しており、本発明は、患者において免疫応答を高める方法であって、このような組成物を患者に投与する工程を含む方法を提供する。
【００８１】
本発明は、医薬品として使用するためのこれらのキットおよび組成物も提供する。
【００８２】
本発明は、患者において免疫応答を高めるための医薬品の製造における（ｉ）抗原の水性調製物；および（ｉｉ）本発明に従って試験された水中油型エマルジョンアジュバントの使用も提供する。
【００８３】
これらの方法および使用によって高められた免疫応答としては、一般に抗体応答、好ましくは防御抗体応答が挙げられる。
【００８４】
組成物は、様々な方式で投与することができる。最も好ましい免疫経路は、（例えば、腕または脚への）筋肉内注射によるが、他の利用可能な経路としては、皮下注射、鼻腔内［６６〜６８］、経口［６９］、皮内［７０，７１］、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）［７２］などが挙げられる。
【００８５】
本発明に従って調製されたワクチン類は、小児と成人を治療するために使用してもよい。患者は、１歳未満、１歳〜５歳、５歳〜１５歳、１５歳〜５５歳、または少なくとも５５歳であってもよい。患者は、高齢者（例えば、≧５０歳、好ましくは≧６５歳）、幼児（例えば、≦５歳）、入院患者、医療従事者、兵役および軍人、妊婦、慢性疾患患者、免疫不全患者、および海外旅行者であってもよい。しかし、ワクチン類は、これらの群だけに適しているわけではなく、ある集団でより全般的に使用してもよい。
【００８６】
治療は、単回投与計画または反復投与計画によるものとすることができる。反復投与は、一次免疫計画および／または追加免疫計画で使用してもよい。反復投与計画において、様々な用量は、同じまたは異なる経路、例えば非経口プライムおよび粘膜ブースト、粘膜プライムおよび非経口ブーストなどで投与してもよい。１回を超える用量（典型的には、２回用量）の投与は、特に免疫学的にナイーブな患者において有用である。反復投与は、典型的には少なくとも１週（例えば、約２週、約３週、約４週、約６週、約８週、約１２週、約１６週など）空けて投与する。
【００８７】
本発明のワクチン類は、他のワクチン類と実質的に同時（例えば、同じ医療相談または医療専門家への来診中）に患者に投与してもよい。
【００８８】
全般
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「なる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えばＸを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、Ｘのみからなることがあり、または追加の何かを含んでもよく、例えばＸ＋Ｙであってもよい。
【００８９】
「実質的に」という言葉は、「完全に」を除外せず、例えばＹを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まないことがある。必要に応じて、「実質的に」という言葉は、本発明の定義から省略してもよい。
【００９０】
数値ｘに関して「約」という用語は、例えばｘ±１０％を意味する。
【００９１】
具体的な記載のない限り、２つ以上の成分を混合する工程を含む方法では、特定の混合順序はいずれも必要でない。したがって、成分はいずれの順序でも混合することができる。３成分である場合、２成分を互いに混合することができ、次いで混合物を第３の成分などと混合してもよい。
【００９２】
細胞の培養で動物（特に、ウシの）材料が使用される場合、これらは、伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）、特にウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）を含まない供給源から入手すべきである。全体的にみて、完全に動物由来材料なしで、細胞を培養することが好ましい。
【００９３】
組成物の一部分として、化合物が身体に投与される場合、その化合物を代わりに適当なプロドラッグで置換してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】水中油型エマルジョンの種々のバッチのスクアレン含有量（ｍｇ／ｍｌ）を示した図である。許容されるスクアレン含有量からの３つの偏差は、Ａ、Ｂ、およびＣとして示される。
【発明を実施するための形態】
【００９５】
スクアレン、Ｓｐａｎ  ８５、Ｔｗｅｅｎ  ８０、水、およびクエン酸塩緩衝剤を混合することによって、ＭＦ５９アジュバントの個別ロット（それぞれ５０リットル）を調製した。成分を、所望の最終濃度が５％（体積）のスクアレン、０．５％（体積）のポリソルベート８０、０．５％（体積）のＳｐａｎ  ８５、および１０ｍＭ  クエン酸塩緩衝剤になる量で混合した。混合物を約７００バールで微小流動化し、および最終微小流動化混合物を０．２μｍのフィルターで濾過した。
【００９６】
これらのＭＦ５９ロット中の対象のスクアレン含有量は３９±３ｍｇ／ｍｌであった。図１は、１５０を超える種々の製造ロットのスクアレン含有量を示す。標的の分布範囲からの３つの偏差は明らかであり、Ａ〜Ｃと表示する。「Ａ」および「Ｂ」のロットについて、製造装置を調査したとき、相互作用チャンバー（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｃｈａｍｂｅｒ）の故障のためフィルターが詰まったことが明らかになり、これらのロットについて、液滴サイズが対象の上方レベルを超えて上昇することもわかった。「Ｃ」のロットについても、フィルターの詰まりが見られたが、このとき、原因は相互作用チャンバーに欠陥があったのではなく、不適切なフィルタータイプを使用していたことであった。
【００９７】
したがって、異常なスクアレンレベルは、フィルターを直接検査する必要なしに多様な濾過の問題を検出するのに適している。
【００９８】
本発明を例によって説明してきたにすぎず、本発明の範囲および趣旨内にととまりながら、修正を行ってもよいことが理解されよう。
【００９９】
参考文献（これらの内容は、参考として本明細書に援用される）
【０１００】
【化１】
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【０１０１】
【化２】
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【図１】
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【国際調査報告】
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