(57)【要約】  本発明は免疫グロブリン鎖（または免疫グロブリンVLまたはCH1ドメイン）の凝集のインヒビターを提供する。好ましい実施形態において、インヒビターは、(a)免疫グロブリン軽鎖可変ドメインのFR1域のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列、またはアミノ酸残基12を含むその部分、(b)細菌のスーパー抗原プロテインLの免疫グロブリン結合ドメインのアミノ酸配列に対応するアミノ酸、またはその部分、および／または(c)連鎖球菌のプロテインG（SpG）の免疫グロブリン結合ドメインのアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列、またはその部分、または免疫グロブリン鎖、またはそのドメインの凝集を阻害する親ポリペプチドの能力を保持するその変異体、融合体または誘導体、または前記変異体の融合体もしくはその誘導体を含むかまたはそれらから成るポリペプチドを含むかまたはそれらから成る。本発明はさらに、抗体、フラグメント、融合体または誘導体の凝集物を形成する能力を少なくとも部分的に阻害するように軽鎖可変ドメインのFR1域が改変された（例えば、突然変異して）軽鎖可変ドメイン、または前記フラグメントの融合体または誘導体を含むことを特徴とする、非天然の抗体、またはその抗原結合フラグメント、融合体または誘導体を提供する。最も好ましくは、軽鎖可変ドメインはFR1域の位置12において天然アミノ酸（例えば、κ軽鎖のセリン）がプロリンにより置き換えられている。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫グロブリン鎖上のβエッジと結合する部位を含む、免疫グロブリン鎖の凝集のインヒビター。
【請求項２】
免疫グロブリン軽鎖もしくは免疫グロブリン軽鎖可変ドメインの凝集を阻害することができる非天然ポリペプチド、または、免疫グロブリン軽鎖もしくは免疫グロブリン軽鎖可変ドメインの凝集を阻害するポリペプチドの能力を保持する、かかるポリペプチドの変異体、融合体または誘導体、または前記変異体の融合体もしくはその誘導体を含むかまたはそれらから成る、請求項１に記載のインヒビター。
【請求項３】
ポリペプチド、またはその変異体、融合体もしくは誘導体が、免疫グロブリン軽鎖のFR1域または免疫グロブリン軽鎖可変ドメインの間のH結合形成を阻害することができる、請求項２に記載のインヒビター。
【請求項４】
ポリペプチド、またはその変異体、融合体もしくは誘導体が、免疫グロブリン軽鎖または免疫グロブリン軽鎖可変ドメインのFR1域のアミノ酸残基12もしくはその隣接アミノ酸残基にて結合することができる、請求項２または３に記載のインヒビター。
【請求項５】
ポリペプチドが
(a)免疫グロブリン軽鎖可変ドメインのFR1域のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列、またはアミノ酸残基12を含むその部分；および／または
(b)細菌のスーパー抗原プロテインLの免疫グロブリン結合ドメインのアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列、またはその部分、
または、免疫グロブリン軽鎖もしくは免疫グロブリン軽鎖可変ドメインの凝集を阻害するポリペプチドの能力を保持する、ポリペプチドの変異体、融合体または誘導体、または前記変異体の融合体もしくはその誘導体を含むかまたはそれらから成る、請求項４に記載のインヒビター。
【請求項６】
ポリペプチドが免疫グロブリン軽鎖可変ドメインのFR1域のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列、またはアミノ酸残基12を含むその部分を含むかまたはそれらから成る、請求項５に記載のインヒビター。
【請求項７】
ポリペプチドが免疫グロブリン軽鎖可変ドメインのFR1域からの少なくとも4隣接アミノ酸、例えば少なくとも5、6、7、8、9、10、12、14、16、18または20隣接アミノ酸に対応するアミノ酸配列を含むかまたはそれらから成る、請求項５または６に記載のインヒビター。
【請求項８】
ポリペプチドが免疫グロブリン軽鎖可変ドメインのFR1域からの位置5〜13、18、20、22および24のアミノ酸の配列に対応するアミノ酸配列を含む、請求項５〜７のいずれか１項に記載のインヒビター。
【請求項９】
免疫グロブリン軽鎖がヒト免疫グロブリン軽鎖である、先行する請求項のいずれか１項に記載のインヒビター。
【請求項１０】
免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列が生殖系列抗体遺伝子セグメントによりコードされる、先行する請求項のいずれか１項に記載のインヒビター。
【請求項１１】
免疫グロブリン軽鎖がκ軽鎖である、先行する請求項のいずれか１項に記載のインヒビター。
【請求項１２】
ポリペプチドがアミノ酸配列：
PSSLSA〔配列番号2〕
または、免疫グロブリン軽鎖もしくは免疫グロブリン軽鎖可変ドメインの凝集を阻害する親ポリペプチドの能力を保持するその変異体、融合体または誘導体、または前記変異体の融合体もしくはその誘導体を含むかまたはそれらから成る、先行する請求項のいずれか１項に記載のインヒビター。
【請求項１３】
ポリペプチド、変異体、融合体または誘導体はプロテインLと免疫グロブリン軽鎖または免疫グロブリン軽鎖可変ドメインとの結合を阻害することができる、請求項５に記載のインヒビター。
【請求項１４】
ポリペプチドがプロテインLの免疫グロブリン結合ドメインのアミノ酸配列、またはその部分に対応するアミノ酸配列を含むかまたはそれらから成る、請求項１３に記載のインヒビター。
【請求項１５】
ポリペプチドがプロテインLの免疫グロブリン結合ドメインからの少なくとも4隣接アミノ酸、例えば少なくとも5、6、7、8、9、10、12、14、16、18または20隣接アミノ酸に対応するアミノ酸配列を含むかまたはそれらから成る、請求項１４に記載のインヒビター。
【請求項１６】
ポリペプチドがアミノ酸配列：
QTAEF［配列番号3］および／または
QTATF［配列番号4］
または、免疫グロブリン軽鎖または免疫グロブリン軽鎖可変ドメインの凝集を阻害する親ポリペプチドの能力を保持するその変異体、融合体または誘導体、または前記変異体の融合体もしくはその誘導体を含むかまたはそれらから成る、請求項１５に記載のインヒビター。
【請求項１７】
免疫グロブリン重鎖もしくは免疫グロブリン重鎖CH1ドメインの凝集を阻害することができる非天然ポリペプチド、または、免疫グロブリン重鎖もしくは免疫グロブリン重鎖CH1ドメインの凝集を阻害するポリペプチドの能力を保持する、かかるポリペプチドの変異体、融合体または誘導体、または前記変異体の融合体もしくはその誘導体を含むかまたはそれらから成る、請求項１に記載のインヒビター。
【請求項１８】
ポリペプチド、またはその変異体、融合体もしくは誘導体が免疫グロブリン重鎖のCH1ドメインまたは免疫グロブリン重鎖CH1ドメインの間のH結合形成を阻害することができる、請求項１７に記載のインヒビター。
【請求項１９】
ポリペプチド、またはその変異体、融合体もしくは誘導体が免疫グロブリン重鎖のCH1ドメインのアミノ酸残基205〜218もしくはその隣接アミノ酸残基または免疫グロブリン重鎖CH1ドメインと結合することができる、請求項１７または１８に記載のインヒビター。
【請求項２０】
ポリペプチドが連鎖球菌のプロテインG（SpG）の免疫グロブリン結合ドメイン、またはその部分のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を含むかまたはそれらから成る、請求項１９に記載のインヒビター。
【請求項２１】
ポリペプチドがSpGの免疫グロブリン結合ドメインからの少なくとも4隣接アミノ酸、例えば少なくとも5、6、7、8、9,10、12、14、16、18または20の隣接アミノ酸に対応するアミノ酸配列を含むかまたはそれらから成る、請求項２０に記載のインヒビター。
【請求項２２】
ポリペプチドがアミノ酸配列：
TLKGETT    ［配列番号 5］
または、免疫グロブリン軽鎖または免疫グロブリン軽鎖可変ドメインの凝集を阻害する親ポリペプチドの能力を保持するその変異体、融合体または誘導体、または前記変異体の融合体もしくはその誘導体を含むかまたはそれらから成る、請求項２１に記載のインヒビター。
【請求項２３】
ポリペプチドは長さが30未満のアミノ酸、例えば、長さが20未満、15未満、14未満、13未満、12未満、11未満、10未満、9未満、8未満、7未満、または6未満のアミノ酸である、請求項２〜２２のいずれか１項に記載のインヒビター。
【請求項２４】
ポリペプチドは長さが2〜20のアミノ酸、例えば2〜10、4〜8、4〜6、または長さが正確に5または6アミノ酸である、請求項２〜２３のいずれか１項に記載のインヒビター。
【請求項２５】
ポリペプチドがL-アミノ酸を含むかまたはそれらから成る、請求項２〜２４のいずれか１項に記載のインヒビター。
【請求項２６】
１以上のアミノ酸が改変、置換または誘導体化されている、請求項２〜２５のいずれか１項に記載のインヒビター。
【請求項２７】
ポリペプチド、変異体、融合体または誘導体が直鎖である、請求項２〜２６のいずれか１項に記載のインヒビター。
【請求項２８】
ポリペプチド、変異体、融合体または誘導体が環状である、請求項２〜２７のいずれか１項に記載のインヒビター。
【請求項２９】
請求項２〜２８のいずれか１項に定義されたポリペプチドをコードする単離された核酸分子。
【請求項３０】
核酸分子がDNA分子である、請求項２９に記載の単離された核酸分子。
【請求項３１】
請求項２９または３０に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項３２】
ベクターが発現ベクターである、請求項３１に記載のベクター。
【請求項３３】
ベクターが真核細胞における複製に好適である、請求項３１または３２に記載のベクター。
【請求項３４】
ベクターが哺乳動物細胞における複製に好適である、請求項３３に記載のベクター。
【請求項３５】
ベクターがpTWIN、pShuttle、pUC18、pUC19、pBacPAK、pBR322、pBR329、pTrc99A、pKK223-3、pSVL、pMSG、pRS403〜406およびpRS413〜416からなる群より選択される、請求項３１〜３４のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項３６】
請求項２９もしくは３０に記載の核酸分子または請求項３１〜３５のいずれか１項に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３７】
細胞が真核細胞である、請求項３６に記載の宿主細胞。
【請求項３８】
細胞が哺乳動物細胞である、請求項３７に記載の宿主細胞。
【請求項３９】
細胞が大腸菌株DH5、RR1、ER2566、CHO細胞（例えば、CCL61）、NIH Swissマウス胎仔細胞（NIH/3T3）、COS-1細胞（例えば、CRL 1650および293）、Sf9細胞および酵母細胞株YPH499〜501からなる群より選択される、請求項３６〜３８のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項４０】
請求項３６〜３９のいずれか１項に記載の宿主細胞を培養してポリペプチドを発現させるステップ、およびそれからポリペプチドを単離するステップを含んでなる、請求項２〜２８のいずれか１項に記載のインヒビターを作る方法。
【請求項４１】
ポリペプチドの固相合成を含んでなる、請求項２〜２８のいずれか１項に記載のインヒビターを作る方法。
【請求項４２】
医学上または獣医学上許容される賦形剤、希釈剤または担体との混合物で、請求項１〜２８のいずれか１項に記載のインヒビターを含む医薬製剤。
【請求項４３】
医学に使用する、請求項１〜２８のいずれか１項に記載のインヒビターまたは請求項４２に記載の医薬製剤。
【請求項４４】
請求項１〜２８のいずれか１項に記載のインヒビター、またはその天然の等価物、または請求項４２に記載の医薬製剤の、免疫グロブリン鎖の凝集に関係する疾患または症状を治療するための医薬品の調製における使用。
【請求項４５】
免疫グロブリン鎖が免疫グロブリン軽鎖または免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり、インヒビターが請求項１〜１６または２３〜２８のいずれか１項に記載のインヒビターである、請求項４４に記載の使用。
【請求項４６】
免疫グロブリン鎖が免疫グロブリン重鎖または免疫グロブリン重鎖CH1ドメインであり、インヒビターが請求項１または１７〜２８に記載のインヒビターである、請求項４４に記載の使用。
【請求項４７】
免疫グロブリン鎖の原繊維形成に関係する疾患または症状を治療する医薬品の調製における、請求項４４〜４６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４８】
繊維がVκ繊維である、請求項４７における使用。
【請求項４９】
免疫グロブリン鎖の凝集に関係する疾患または症状が軽鎖沈着症（LCDD）、細菌感染、および過剰ヒスタミン産生により特徴付けられる疾患／症状からなる群より選択される、請求項４４〜４８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５０】
免疫グロブリン鎖の凝集に関係する疾患または症状が細菌感染である、請求項４９に記載の使用。
【請求項５１】
免疫グロブリン鎖の凝集に関係する疾患または症状が軽鎖沈着症である、請求項４９に記載の使用。
【請求項５２】
免疫グロブリン鎖の凝集を防止するために、請求項１〜２８のいずれか１項に記載のインヒビター、またはその天然の等価物、または請求項４２に記載の医薬製剤の使用。
【請求項５３】
免疫グロブリン鎖が免疫グロブリン軽鎖または免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり、インヒビターが請求項１〜１６または２３〜２８のいずれか１項に記載のインヒビターである、請求項５２に記載の使用。
【請求項５４】
免疫グロブリン鎖が免疫グロブリン重鎖または免疫グロブリン重鎖CH1ドメインであり、インヒビターが請求項１または１７〜２８のいずれか１項に記載のインヒビターである、請求項５２に記載の使用。
【請求項５５】
免疫グロブリン鎖における繊維形成を防止するための、請求項５２〜５４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５６】
繊維がVκ繊維である、請求項５５に記載の使用。
【請求項５７】
請求項１〜２８のいずれか１項に記載のインヒビター、またはその天然の等価物、または請求項４２に記載の医薬製剤の、細菌による感染を治療するための医薬品の調製における使用。
【請求項５８】
細菌がペプトストレプトコッカス（Peptostreptococcal）菌および連鎖球（Streptococcal）菌の細菌からなる群より選択される、請求項５７に記載の使用。
【請求項５９】
細菌がPeptostreptococcus magnusであり、インヒビターが請求項１３〜１６または２３〜２８のいずれか１項に記載のインヒビターである、請求項５８に記載の使用。
【請求項６０】
細菌が連鎖球菌であり、インヒビターが請求項１７〜２８のいずれか１項に記載のインヒビターである、請求項５８に記載の使用。
【請求項６１】
免疫グロブリン鎖の凝集を阻害できる薬剤による治療を必要とする患者を治療する方法であって、患者に請求項１〜２８のいずれか１項に記載のインヒビター、またはその天然の等価物、または請求項４２に記載の医薬製剤の有効な量を投与するステップを含んでなる前記方法。
【請求項６２】
免疫グロブリン鎖が免疫グロブリン軽鎖または免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり、インヒビターが請求項１〜１６または２３〜２８のいずれか１項に記載のインヒビターである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
免疫グロブリン鎖が免疫グロブリン重鎖または免疫グロブリン重鎖CH1ドメインであり、インヒビターが請求項１または１７〜２８のいずれか１項に記載のインヒビターである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
免疫グロブリン鎖の原繊維形成に関係する疾患または症状を治療するための、請求項６１〜６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
繊維がVκ繊維である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
軽鎖沈着症（LCDD）、細菌感染および過剰ヒスタミン産生により特徴付けられる疾患／症状からなる群より選択される免疫グロブリン鎖の凝集に関係する疾患または症状を治療するための、請求項６１〜６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
免疫グロブリン鎖の凝集に関係する疾患または症状が細菌感染である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
免疫グロブリン鎖の凝集に関係する疾患または症状が軽鎖沈着症である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
患者がヒトである、請求項６１〜６８のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７０】
細菌に感染した、または感染に感受性のある患者を治療する方法であって、患者に請求項１〜２８のいずれか１項に記載のインヒビター、またはその天然の等価物、または請求項４２に記載の医薬製剤の有効な量を投与するステップを含んでなる前記方法。
【請求項７１】
細菌がペプトストレプトコッカス菌および連鎖球菌からなる群より選択される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
細菌がPeptococcus magnusであり、インヒビター が請求項１３〜１６または２３〜２８のいずれか1項に記載のインヒビターである、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
細菌が連鎖球菌であり、インヒビターが請求項１７〜２８のいずれか1項に記載のインヒビターである、請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
さらに１以上の通常の抗菌薬を投与するステップを含んでなる、請求項７０〜７３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７５】
患者がヒトである、請求項７０〜７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】
抗体または抗原結合フラグメントまたはその誘導体をサンプルから単離または精製する方法であって、サンプルを請求項１〜２８のいずれか1項に記載のインヒビター、またはその天然の同等物と、抗体または抗原結合フラグメントまたはその誘導体（もしサンプル中に存在すれば）との結合が可能になる条件下で接触させるステップを含んでなる前記方法
【請求項７７】
サンプル中の抗体または抗原結合フラグメントまたはその誘導体の存在または非存在を検出する方法であって、サンプルを請求項１〜２８のいずれか1項に記載のインヒビターまたはその天然の同等物と、抗体または抗原結合フラグメントまたはその誘導体（もしサンプル中に存在すれば）との結合が可能になる条件下で接触させるステップを含んでなる前記方法。
【請求項７８】
インヒビターまたはその天然の同等物を固定する、請求項７６または７７に記載の方法。
【請求項７９】
インヒビターまたはその天然の同等物がクロマトグラフィカラムのアフィニティマトリックスを形成する、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
免疫グロブリン鎖の凝集を阻害できる薬物様化合物または薬物様化合物開発のためのリード化合物を同定する方法であって、免疫グロブリン鎖との結合に対して、請求項１〜２８のいずれか1項に記載のインヒビター、またはその天然の同等物と競合する能力について前記化合物を試験するステップを含んでなる前記方法。
【請求項８１】
免疫グロブリン鎖は免疫グロブリン軽鎖または免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり、インヒビターが請求項１〜１６または２３〜２８のいずれか１項に記載のインヒビターである、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
免疫グロブリン鎖は免疫グロブリン重鎖または免疫グロブリン重鎖CH1ドメインであり、インヒビターが請求項１または１７〜２８のいずれか１項に記載のインヒビターである、請求項８０に記載の方法。
【請求項８３】
プロテインLと免疫グロブリン軽鎖、または免疫グロブリン軽鎖可変ドメインとの結合を阻害することができる薬物様化合物または薬物様化合物開発のためのリード化合物を同定する方法であって、免疫グロブリン軽鎖、または免疫グロブリン軽鎖可変ドメインとの結合に対して、請求項１３〜１６または２３〜２８のいずれか１項に記載のインヒビター、またはその天然の同等物と競合する能力について前記化合物を試験するステップを含んでなる前記方法。
【請求項８４】
SpGと免疫グロブリン重鎖、または免疫グロブリン重鎖CH1ドメインとの結合を阻害することができる薬物様化合物または薬物様化合物開発のためのリード化合物を同定する方法であって、免疫グロブリン重鎖、または免疫グロブリン重鎖CH1ドメインとの結合に対して、請求項１または１７〜２８のいずれか１項に記載のインヒビター、またはその天然の同等物と競合する能力について前記化合物を試験するステップを含んでなる前記方法。
【請求項８５】
前記方法の結果を知的（インテリジェント）フォーマットに整理する、請求項８０または８４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８６】
前記結果を情報媒体に記録または保存する、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
さらに、同定した化合物を凝集および／または結合のインヒビターとして医薬製剤に製剤するステップを含んでなる、請求項８０〜８６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８８】
請求項８０〜８７のいずれか１項に記載の方法によって得ることができるかまたは得た化合物。
【請求項８９】
医学に使用する、請求項８８に記載の化合物。
【請求項９０】
免疫グロブリン鎖の凝集に関係する疾患または症状を治療するための医薬の調製における、請求項８８に記載の化合物の使用。
【請求項９１】
免疫グロブリン鎖が免疫グロブリン軽鎖または免疫グロブリン軽鎖可変ドメインである、請求項９０に記載の化合物の使用。
【請求項９２】
免疫グロブリン鎖が免疫グロブリン重鎖または免疫グロブリン重鎖CH1ドメインである、請求項９０に記載の化合物の使用。
【請求項９３】
免疫グロブリン鎖の凝集に関係する疾患または症状が軽鎖沈着症（LCDD）、細菌感染および過剰ヒスタミン産生により特徴付けられる疾患／症状からなる群より選択される、請求項９０〜９２のいずれか1項に記載の使用。
【請求項９４】
免疫グロブリン鎖の凝集を防止するための、請求項８８に記載の化合物の使用。
【請求項９５】
免疫グロブリン鎖が免疫グロブリン軽鎖または免疫グロブリン軽鎖可変ドメインである、請求項９４に記載の使用。
【請求項９６】
免疫グロブリン鎖が免疫グロブリン重鎖または免疫グロブリン重鎖CH1ドメインである、請求項９４に記載の使用。
【請求項９７】
免疫グロブリン鎖における繊維形成を防止するための、請求項９４〜９６のいずれか1項に記載の使用。
【請求項９８】
繊維がVκ繊維である、請求項９７に記載の使用。
【請求項９９】
細菌による感染を治療するための医薬品の調製における、請求項８８に記載の化合物の使用。
【請求項１００】
細菌がペプトストレプトコッカス菌および連鎖球菌からなる群より選択される、請求項９９に記載の使用。
【請求項１０１】
細菌がPeptostreptococcus magnusである、請求項１０１に記載の使用。
【請求項１０２】
細菌が連鎖球菌である、請求項１０１に記載の使用。
【請求項１０３】
軽鎖可変ドメインのFR1域が抗体、フラグメント、融合体または誘導体の凝集物を形成する能力を少なくとも部分的に阻害するように改変された軽鎖可変ドメイン、または前記フラグメントまたは誘導体の融合体を含む、非天然の抗体、またはその抗原結合フラグメント、融合体または誘導体。
【請求項１０４】
軽鎖可変ドメインがアミノ酸位置9、10、11、12、13または14の１以上で改変された、請求項１０３に記載の抗体、フラグメント、融合体または誘導体。
【請求項１０５】
軽鎖可変ドメインのFR1域の位置9、10、11、12、13または14の１以上の天然アミノ酸がプロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシンからなる群より選択されるアミノ酸によって置き換えられた、請求項１０３または１０４に記載の抗体、フラグメント、融合体または誘導体。
【請求項１０６】
軽鎖可変ドメインのFR1域の位置9、10、11、12、13または14の１以上の天然アミノ酸がプロリンによって置き換えられた、請求項１０３〜１０５のいずれか１項に記載の抗体、フラグメント、融合体または誘導体。
【請求項１０７】
軽鎖可変ドメインのFR1域の位置12の天然アミノ酸が置き換えられた、請求項１０３〜１０６のいずれか１項に記載の抗体、フラグメント、融合体または誘導体。
【請求項１０８】
キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、１本鎖抗体、二特異的抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖および／または軽鎖のホモ二量体およびヘテロ二量体、および抗原結合フラグメントならびに前記誘導体からなる群より選択される、請求項１０３〜１０７のいずれか１項に記載の抗体、フラグメント、融合体または誘導体。
【請求項１０９】
抗原結合フラグメントがFvフラグメント（例えば、１本鎖Fvおよびジスルフィド結合されたFv）、Fab様フラグメント（例えば、Fabフラグメント、Fab'フラグメントおよびF(ab)2フラグメント）、単一可変ドメイン（例えば、VH、VHHおよびVLドメイン）、および前記の改変バージョン（例えば、ポリエチレングリコールまたはその他の好適なポリマーの共有結合により改変された）からなる群より選択される、請求項１０３〜１０８のいずれか１項に記載の抗体、フラグメント、融合体または誘導体。
【請求項１１０】
抗原結合フラグメントまたはその誘導体がドメイン抗体である、請求項１０９に記載の抗体、フラグメント、融合体または誘導体。
【請求項１１１】
ドメイン抗体が多量体フォーマットである、請求項１１０に記載の抗体、フラグメント、融合体または誘導体。
【請求項１１２】
多量体フォーマットが二量体または三量体である、請求項１１０または１１１に記載の抗体、フラグメント、融合体または誘導体。
【請求項１１３】
多量体フォーマットの成分サブユニットの１つを除く全てがS12P突然変異を含む、請求項１１１または１１２に記載の抗体、フラグメント、融合体または誘導体。
【請求項１１４】
多量体フォーマットの成分サブユニットの１以上がS9Lおよび／またはS10P突然変異を含む、請求項１１２または１１３に記載の抗体、フラグメント、融合体または誘導体。
【請求項１１５】
さらに細胞傷害性または検出可能な部分を含む、請求項１０３〜１１４のいずれか１項に記載の抗体、フラグメント、融合体または誘導体。
【請求項１１６】
請求項１０３〜１１５のいずれか１項に記載の抗体、フラグメント、融合体またはその誘導体、またはその軽鎖をコードする単離された核酸分子。
【請求項１１７】
核酸分子がDNA分子である、請求項１１６に記載の単離された核酸分子。
【請求項１１８】
請求項１１６または１１７に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１１９】
ベクターが発現ベクターである、請求項１１８に記載のベクター。
【請求項１２０】
真核細胞における複製に好適である、請求項１１８または１１９に記載のベクター。
【請求項１２１】
哺乳動物細胞における複製に好適である、請求項１２０に記載のベクター。
【請求項１２２】
pTWIN、pShuttle、pUC18、pUC19、pBacPAK、pBR322、pBR329、pTrc99A、pKK223-3、pSVL、pMSG、pRS403〜406およびpRS413〜416からなる群より選択される、請求項１１８〜１２１のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１２３】
請求項116または117に記載の核酸分子または請求項118〜122に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１２４】
細胞が真核細胞である、請求項１２３に記載の宿主細胞。
【請求項１２５】
細胞が哺乳動物細胞である、請求項１２４に記載の宿主細胞。
【請求項１２６】
細胞が大腸菌株DH5、RR1、ER2566、CHO細胞（例えば、CCL61）、NIH Swissマウス胎仔細胞（NIH/3T3）、COS-1細胞（例えば、CRL1650および293）、Sf9細胞および酵母細胞株YPH499〜501からなる群より選択される、請求項１２３〜１２５のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項１２７】
請求項１０３〜１１５のいずれか1項に記載の抗体、またはフラグメントまたはその誘導体 を作る方法であって、請求項１２３〜１２５のいずれか1項に記載の宿主細胞を培養してポリペプチドを発現させるステップ、およびそれからポリペプチドを単離するステップを含んでなる前記方法。
【請求項１２８】
請求項１０３〜１１５のいずれか１項に記載の抗体、またはそのフラグメントまたは誘導体と、医学上もしくは獣医学上許容される賦形剤、希釈剤または担体との混合物を含む医薬製剤。
【請求項１２９】
医学に使用するための、請求項１０３〜１１５のいずれか１項に記載の抗体、またはそのフラグメントまたは誘導体、または請求項１２４に記載の医薬製剤。
【請求項１３０】
抗体、または軽鎖可変ドメインを含むその抗原結合フラグメント、融合体または誘導体、または前記フラグメントまたは誘導体の融合体の（水溶液中の）溶解度を改善する方法であって、軽鎖可変ドメインのFR1域を改変して、少なくとも部分的に、その凝集物を形成する能力を阻害するステップを含んでなる前記方法。
【請求項１３１】
軽鎖可変ドメインをアミノ酸位置9、10、11、12、13または14の１以上において改変するステップを含んでなる、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３２】
軽鎖可変ドメインのFR1域の位置9、10、11、12、13または14の１以上の天然アミノ酸を、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニンからなる群より選択されるアミノ酸によって置き換えるステップを含んでなる、請求項１３０または１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
軽鎖可変ドメインのFR1域の位置9、10、11、12、13または14の１以上の天然アミノ酸をプロリンによって置き換える、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３４】
軽鎖可変ドメインのFR1域の位置12の天然アミノ酸を改変する、請求項１３０〜１３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３５】
抗体、フラグメント融合体または誘導体がキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、１本鎖抗体、二特異的抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖および／または軽鎖のホモ二量体およびヘテロ二量体、および抗原結合フラグメントおよび前記誘導体からなる群より選択される、請求項１３０〜１３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３６】
抗体、フラグメント融合体または誘導体がFvフラグメント、１本鎖Fvフラグメント、ジスルフィド結合されたFvフラグメント、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')2フラグメント、ダイアボディ、免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えば、ヒトVH、およびヒトVL、VHH）および前記の改変バージョン（例えば、ポリエチレングリコールまたは他の好適なポリマーの共有結合により改変された）からなる群より選択される、請求項１３０〜１３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３７】
抗原結合フラグメントまたはその誘導体がドメイン抗体である、請求項１３６に記載の方法。
【請求項１３８】
実質的に、例を参照して本明細書に以上記載したインヒビター。
【請求項１３９】
実質的に、例を参照して本明細書に以上記載した、請求項１〜２８のいずれか１項に記載のインヒビターの使用。
【請求項１４０】
実質的に、例を参照して本明細書に以上記載した、抗体、フラグメントまたは誘導体。
【請求項１４１】
実質的に、例を参照して本明細書に以上記載した、請求項１０３〜１１５のいずれか１項に記載の抗体、フラグメントまたは誘導体の使用。
【請求項１４２】
EGFRに対して結合特異性を有するリガンドであって、EGFRに対して結合特異性をもつ少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含みかつ前記ドメインがアミノ酸位置12においてセリンのプロリンへの突然変異を含有する前記リガンド。
【請求項１４３】
さらに血清アルブミンに対して結合特異性をもつ免疫グロブリン単一可変ドメインも含む、請求項１４２に記載のリガンドを含むインライン融合タンパク質。
【請求項１４４】
EGFRに対して結合特異性をもつドメインがDOM16-39-618(S12P)-TVA-DOM7h-14と少なくとも約85％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１４３に記載のインライン融合タンパク質。
【請求項１４５】
TNF-αに対して結合特異性を有するリガンドであって、TNF-αに対して結合特異性をもつ少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含みかつ前記ドメインがアミノ酸位置12においてセリンのプロリンへの突然変異を含有する前記リガンド。
【請求項１４６】
さらに血清アルブミンに対して結合特異性をもつ免疫グロブリン単一可変ドメインも含む、請求項１４５に記載のリガンドを含むインライン融合タンパク質。
【請求項１４７】
PEP1-5-19(S12P)-TVA-DOM7h-8と少なくとも約85％アミノ酸配列同一性を有する、請求項１４６に記載のインライン融合タンパク質。
【請求項１４８】
IL-1に対して結合特異性を有するリガンドであって、IL-1に対して結合特異性をもつ少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含みかつ前記ドメインがアミノ酸位置12においてセリンのプロリンへの突然変異を含有する前記リガンド。
【請求項１４９】
さらに血清アルブミンに対して結合特異性をもつ免疫グロブリン単一可変ドメインも含む、請求項１４８に記載のリガンドを含むインライン融合タンパク質。
【請求項１５０】
DOM4-130-54(S12P)-TVAAPS-DOM7h-8；DOM4-130-54(S12P)-TVAAPS-DOM7h-2；DOM4-130-54(S12P)-TVAAPS-DOM7h-10；DOM4-130-93(S12P)-TVAAPS-DOM7h-8；DOM4-130-54(S12P)-TVAAPS-DOM7h-22；DOM4-130-54(S12P)-TVAAPS-DOM7R-31からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約85％アミノ酸配列同一性を有する、請求項１４９に記載のインライン融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、凝集を阻害する目的で改変された非天然免疫グロブリン、ならびにその抗原結合フラグメントおよび誘導体に関する。ある好ましい実施形態において、本発明は、改善された溶解度特性をもつ免疫グロブリン単一可変ドメインおよび抗体の精製に利用できるペプチド誘導体を提供する。本発明はさらに、免疫グロブリン鎖および免疫グロブリンドメインの凝集を阻害できる薬剤、特にポリペプチドに関する。一実施形態においては、かかる薬剤を、軽鎖凝集、例えば軽鎖沈着症により特徴付けられる疾患の治療および予防処置に用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
通常可溶性のタンパク質が規則正しい無分枝の原繊維および／または不規則な無定形のクランプなどの不溶性構造への凝集は、アミロイド症および軽鎖沈着症（LCDD）などの多数の疾患に関係する基礎病理である（Falk et al., 1997, N. Engl. J. Med. 337:898-909）。タンパク質凝集の証明事象は通常、可溶性タンパク質の２次および／または３次構造が高度に規則正しいパラ結晶アレイ（または原繊維）および／または不規則な無定形の構造に自己アセンブリーしがちになる変化である。例えば、in vivoでアミロイド原繊維の成分として臨床的に同定されているタンパク質は20種以上存在し、それにはアミロイド前駆体タンパク質、膵島アミロイドポリペプチド、α-シヌクレイン、トランスサイレチン、免疫グロブリン軽鎖、ポリグルタミン反復配列、およびプリオンタンパク質が含まれる。かかるタンパク質の凝集は、アルツハイマーII型糖尿病、パーキンソン病、家族性多発性神経障害、軽鎖沈着症、軽鎖関連アミロイド症、ハンチントン病、および海綿状脳障害などの疾患と密接に関係がある。
【０００３】
タンパク質凝集疾患を発症するリスクは40代の年齢を越えたヒトで著しく増加する。実際、加齢はおそらくタンパク質凝集およびアミロイド疾患の発症と進行に対する最も有意なリスク因子であり、例外として、しばしばもっと早い発症年齢を示す家族型がある。さらに、アミロイド前駆体タンパク質などの疾患で凝集するタンパク質のアミノ酸配列の置換をもたらす突然変異は、早期発症アミロイド疾患の統計的リスクを大幅に高くする。生活様式が改善されてヒトの平均余命は大きく増加しているので、高齢者集団のサイズは増加し続けており、タンパク質凝集疾患の進行を停止しうる治療薬を見出すことが絶対に必要である。LCDDおよびアミロイド症などのタンパク質凝集疾患の多くは現在不治の疾患であるが、ある特定の療法は細胞傷害薬を用いて前駆体タンパク質の生産を停止することにより一過的に疾患の進行を遅延させる。
【０００４】
免疫グロブリン構造
ほとんどの哺乳動物の免疫グロブリン（例えば抗体）の基本構造は、ジスルフィド結合により接続された４つのポリペプチド鎖；２つの軽鎖と２つの重鎖から成る糖タンパク質（MW≒150,000ダルトン）である（図1Aを参照）。それぞれの軽鎖はほぼ25,000ダルトンの分子量を有し、２つのドメイン、１つの可変ドメイン（VL）および１つの定常ドメイン（CL）を有する。２つの型の軽鎖、ラムダ（λ）およびカッパ（κ）が存在する。ヒトでは、軽鎖の60％がλであって40％がκであるが、マウスでは、軽鎖の95％がκであって5％がλである。単一の抗体分子はλ軽鎖またはκ軽鎖のどちらかを含有するが、決して両方を含有しない。
【０００５】
それぞれの重鎖はほぼ50,000ダルトンの分子量を有し、定常域と可変域から成る。重鎖と軽鎖は、類似するが同一でないアミノ酸配列の基を含む多数の相同セクションを含有する。これらの相同ユニットは約110アミノ酸から成り、免疫グロブリンドメインと呼ばれる。重鎖は１つの可変ドメイン（VH）および３つまたは４つの定常ドメイン（抗体クラスまたはアイソタイプに応じてCH1、CH2、CH3、およびCH4）のどちらかを含有する。CH1とCH2ドメインの間の領域はヒンジ域と呼ばれ、Y型抗体分子の２つのFabアームの間にフレキシビリティを持たせ、開閉して２つの抗原性決定基との結合に適応させる。
【０００６】
重鎖はまた、抗体分子の機能活性を決定する役割も果たす。５つの抗体クラス（IgG、IgA、IgM、IgEおよびIgD）が存在し、それぞれその重鎖γ、α、μ、εおよびδにより区別される。IgD、IgEおよびIgG抗体クラスはそれぞれ単一の構造ユニットで構成されているが、IgA抗体は１つまたは２つのユニットのどちらかを含有しうるし、IgM抗体は５つのジスルフィド連結構造ユニットから構成される。IgG抗体はさらに、４つのサブクラスに分割される（しばしば、アイソタイプと呼ばれる）が、その命名法は抗体を産生する種に応じて若干異なる。
【０００７】
免疫グロブリン軽鎖と重鎖の可変ドメイン内には、３つの超可変域（または相補性決定域、CDR）および４つのフレームワーク域が配置され、それらの中のアミノ酸配列は比較的保存されている（図１参照）。
【０００８】
共通の構造的特徴は、その間に緊密にパックされた疎水性アミノ酸側鎖をもつ、ジスルフィド結合により接続された逆平行βストランドの２つの広いシートが存在することである。この繰り返される構造モチーフは免疫グロブリンフォールドと呼ばれる。Cドメインは１つのシート内に３つのβストランドと並置されたシート内に４つのβストランドを含有する一方、Vドメインは、シートの１つに２つの余分のβストランドの追加があることを除いて類似している。
【０００９】
免疫グロブリン特異性を決定する超可変域、またはCDRは、２つのβシートのエッジのループ中に位置する。このようにして免疫グロブリンフォールドは、超可変ループのほとんど無限の変化を可能にする保存されたフレームワークとして機能する。
【００１０】
軽鎖構造および凝集の研究
多数のグループが、アミノ酸置換が軽鎖ドメインの熱力学的安定性に与える影響を研究してきた。変異体残基がドメインの安定に与える結果を評価すると、フォールディング安定性の低下とアミロイド原繊維形成傾向の増加との間に良い相関が示された。実際、組換え軽鎖VLドメインの変異分析によって、その置換が不可避的に原繊維形成傾向の増加をもたらすドメイン内の重要な残基が同定された。Hurleら（1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91：5446-5450）は、アミロイド形成軽鎖のなかで非常に高頻度で起こるVLドメインのアミノ酸置換を同定した。彼らはこれらの置換のほとんどが、軽鎖ドメインの構造的完全性を維持するために極めて重要な位置で起こることを見出した。例えば、λ軽鎖置換G57E、G68D、L78TおよびA84T、およびκ軽鎖置換のR61Nは全てフレームワーク域で起こる。これらの変異体は、それぞれの親の、患者由来のタンパク質配列より熱力学的安定性が低い。
【００１１】
別の研究では、Raffenら（1999, Prot. Sci. 8：509-517）は、アミロイド形成性軽鎖由来の２つの組換え体κ4軽鎖可変ドメイン（VL）の熱力学的安定性を良性軽鎖由来のVLの熱力学的安定性と比較した。アミロイド形成性VLは良性VLより安定性が有意に低かった。さらに、アミロイド形成性VLだけがin vitro原繊維形成アッセイにおける生理学的条件下で原繊維を形成した。部位特異的突然変異誘発を用いて個々のアミノ酸置換の結果を試験し、アミロイド形成性VLがフォールディング安定性と原繊維形成性の速度に影響することを見出した。当然のこととして、脱安定化する突然変異だけが原繊維形成をin vitroで誘導した。これらの結果は、原繊維を形成しない良性VLの構造的または配列特異的な特徴は、当にフォールディング安定性の増加にあることを示唆した。部位特異的な変異体CDR1からのN28FおよびK30T、CDR3からのY96PおよびY96Q、および２つの変異体L15PおよびP40Lは原繊維を形成する傾向の増加を示す。これらの研究は、VLβ-ドメイン構造が相補性決定域（CDR）を含むいくつもの部位で不安定化する突然変異に脆弱であり、可変ドメイン安定性の消失が原繊維形成の主要な駆動力であることを示す。
【００１２】
軽鎖病
抗体免疫グロブリン可変ドメインは、とりわけ、最も集中して研究されたβタンパク質構造である。これらのドメイン構造は高度に保存されていて、いくつかの規定された特徴を有する（Richardson, J. S. & Richardson, D. C. (2002) Proc Natl Acad Sci U S A 99:2754-9、およびSiepen, J. A., Radford, S. E. & Westhead, D. R. (2003) Protein Sci 12:2348-59を参照）。ある特定の軽鎖サブセットは、in vitroとin vivoの両方で凝集する傾向があり、その場合、これらは臨床的に重要な障害：軽鎖沈着症およびALアミロイド症に関係する。κサブタイプは特に凝集しがちであり、典型的にはVλより安定であるという事実にも関らず、LCDDの症例の＞85％に関わる（Denoroy et al., 1994, Immunol. Lett. 42, 63-6）。抗体ドメインについて、in vitroで多数の研究がなされており、極度のpHと温度条件下の長いインキュベーションは部分的アンフォールディングと凝集をもたらしうることを示す（Souillac et al., 2003, Biochemistry 42, 8094-104）。
【００１３】
軽鎖沈着症（LCDD）は複数器官においてモノクローナル、無定形、非コンゴレッド親和性軽鎖の沈着であって、超ミクロ構造を試験すると典型的には原繊維状構造を示さない。
【００１４】
LCDDは複数器官に関わる軽鎖の浸潤である。腎不全、タンパク尿症、およびネフローゼ症候を含む腎疾患はLCDDの主要徴候である。多くの症例が多発性骨髄腫またはリンパ球増殖性疾患に関係しているが、患者の50％は新生物形質細胞増殖の確証を有しない。
【００１５】
現行治療薬と薬物設計手法
前駆体タンパク質のアベイラビリティを低下する手法が、免疫グロブリン軽鎖の凝集に関係する疾患および症状の治療における一次治療標的になっている。かかる手法の１つは、異常増殖中の、前駆体タンパク質を合成する形質細胞のクローンを標的化し、骨髄移植によりそのクローンを根絶することに関わる。
【００１６】
軽鎖に関連する凝集疾患を治療するためのさらに最近の手法は、(i)抗血管形成薬の慣用化学療法との併用、ならびに(ii)能動的および受動的免疫療法に関わる。例えば、循環中のイディオタイプ陽性リンパ球を、成熟B細胞に対する抗CD20細胞傷害性抗体などの抗体を用いて、免疫療法のために標的化できることが示されている。イディオタイプワクチン接種などの他の免疫療法手法も研究されている。
【００１７】
カルコン、フラボノイドおよびビフラボノイドのハイスループットスクリーニングによっても、組換え抗体可変ドメインにより原繊維形成を阻害できる化合物が同定された（Lin et al., 2001, Amyloid 8:182-193）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Falkら, 1997, N. Engl. J. Med. 337:898-909
【非特許文献２】Hurleら, Proc. Natl. Acad. Sci. 91：5446-5450, （1994）
【非特許文献３】Raffenら, Prot. Sci. 8：509-517, （1999）
【非特許文献４】Richardson, J. S. & Richardson, D. C. (2002) Proc Natl Acad Sci U S A 99:2754-9
【非特許文献５】Siepen, J. A., Radford, S. E. & Westhead, D. R. (2003) Protein Sci 12:2348-59
【非特許文献６】Denoroyら, 1994, Immunol. Lett. 42, 63-6
【非特許文献７】Souillacら, 2003, Biochemistry 42, 8094-104
【非特許文献８】Linら, 2001, Amyloid 8:182-193
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
従って、本発明は、貯蔵中に低い凝集性向を有する遺伝子操作した抗体鎖および可変ドメインを提供し、そうして貯蔵安定性のある医薬組成物の可能性を提供することを追及する。本発明はさらに、免疫グロブリン鎖の凝集、特に免疫グロブリン軽鎖またはVL凝集を阻害する新しい薬剤と方法を提供することを追及する。かかる薬剤は、LCDDおよび関係症状を含むいくつもの障害の治療および／または予防に有用である。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
広い意味における本発明は、免疫グロブリン鎖（および特に免疫グロブリン可変ドメイン）の凝集のインヒビターであって、免疫グロブリン鎖のβエッジ（すなわちβストランドの曝された主鎖骨格）と結合する部位を含む前記インヒビターに関する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】免疫グロブリン構造を示す図である。(A)IgG分子の基本構造の模式図であって、成分の重鎖と軽鎖およびそれらのドメインを示す。(B)免疫グロブリン軽鎖可変ドメインの模式図であって、そのフレームワークと超可変（CDR）配列を示す。
【図２】Vκドメインの模式図を示す図である。主鎖水素結合は、Vκ配列の中での保存が注目される。ストランドA内にストランドスイッチが見られ、ここで残基3〜7はストランドBと、残基9〜13はストランドGと水素結合を作る。
【図３】VD9原繊維の電子顕微鏡写真を示す図である。アミロイド様原繊維の凝集物が観察され、個々の原繊維の大きさはほぼ7nm巾および60〜180nm長さである。
【図４】コンゴレッドで染色したVD9繊維（A、B）と対照のex vivo AAアミロイド原繊維（B、D）との比較を示す図である。イメージは直線偏光白色光（A、C）および交差偏光（円偏光振動方向N-S；B、D）で撮影し、同一の光と色設定のもとで捕捉した。VD9凝集物をコンゴレッドにより染色したが、ある画分だけがアップル-グリーン二色性を示した（B）。半結晶外観の乾燥懸濁物が緩衝塩により生成し、コンゴレッドの結果に影響を与えなかった。
【図５】15量体VD9繊維構造を示す図である。VD9は集合して生来の構造化モノマーの反復15分子繊維を形成する。(A)単一VD9ドメインを表すそれぞれ着色したオブジェクト（オレンジまたはコムギ色）をもつ非対称ユニットのリボン表現。非対称ユニットは末端が末端と詰め合わされて連続左回転らせん状繊維を作る。(B)βストランドは繊維軸に対して主に45°で詰まっている。(C)サブユニット間の相互作用が逆平行にパックされたモノマーを横切る延長βシートを作る。(D)VD9繊維は６つのドメインにより取り囲まれた中空コアを有する。
【図６】VD9構造からの２つの連続ドメイン上の、重ね合わされたプロテインL：Fab複合体を示す図である。プロテインL（PpL；P. magnus、PDBコード1HEZ（28）由来）複合体はオレンジ色であり、VD9はコムギ色である。２つの構造中のそれぞれのドメインの配向は非常に類似していて、PpLからのシートは最初のVD9ドメインの内部シートと広く整合する。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
従って、一実施形態においては、免疫グロブリン鎖のFR1域または免疫グロブリン鎖可変ドメインと結合する結合部位を含み、それにより免疫グロブリン軽鎖または可変ドメインの凝集を阻害するインヒビターが提供される。好ましくは、インヒビターはアミノ酸位置12にてまたは隣接してFR1域と結合し、それにより免疫グロブリン軽鎖または軽鎖可変ドメインの凝集を阻害する。
【００２３】
アミノ酸位置12に「隣接して」とは、本発明のポリペプチドが、免疫グロブリン軽鎖または軽鎖可変ドメインの凝集を阻害するために十分近い位置でアミノ酸位置12と結合することを意味する。
【００２４】
従って、位置12と結合する代わりに、本発明のインヒビターは、第２の軽鎖または可変ドメインと第１の軽鎖または可変ドメインの位置12との結合を防止するように、軽鎖または可変ドメインと（好ましくはそのFR1域にて）結合してもよい。例えば、インヒビターは免疫グロブリン軽鎖または軽鎖可変ドメインのFR1域のアミノ酸位置9、10、11、12および／または13の任意の１以上にて結合してもよい。従って、一実施形態において、インヒビターはアミノ酸位置9および／または10にてまたは隣接して結合する。
【００２５】
さらなる実施形態において、インヒビターは、軽鎖または可変ドメインのFR1配列と同一である配列を含むポリペプチドと、免疫グロブリン軽鎖もしくは免疫グロブリン軽鎖可変ドメインの位置12との結合を競合する。競合は、任意の好適なアッセイ、FACSまたは表面プラズモン共鳴（SPR）により評価することができる（Cullen et al., 1987-88, Biosensors 3(4):211-25を参照）。
【００２６】
当業者は、インヒビターが単離されたポリペプチドまたは小分子であってもよいことを理解しうる。
【００２７】
好ましくは、しかし、インヒビターは単離されたポリペプチドを含むかまたはそれらから成る。
【００２８】
例えば、単離されたポリペプチドは抗体および抗体フラグメントからなる群より選択されてもよい。好ましい抗体および抗体フラグメントはモノクローナル抗体、Fvフラグメント、１本鎖Fvフラグメント、ジスルフィド結合されたFvフラグメント、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')2フラグメント、ダイアボディおよび免疫グロブリン単一可変ドメインである。
【００２９】
「免疫グロブリン単一可変ドメイン」とは、本発明者らは、他のVドメインとは独立し、標的、抗原またはエピトープと特異的に結合する抗体可変域（VH、VHH、VL）を含める。しかし、本明細書で使用するこの用語、免疫グロブリン単一可変ドメインは、他の可変域または可変ドメインと共に、あるフォーマット（例えば、ヘテロ多量体）で存在してもよく、ここで、他の領域またはドメインは、単一免疫グロブリン可変ドメインによる抗原結合を必要としない（すなわち、免疫グロブリン単一可変ドメインは、さらなる可変ドメインとは独立して、抗原と結合する）。「ドメイン抗体」または「dAb」は、本明細書で使用する用語「免疫グロブリン単一可変ドメイン」ポリペプチドと同じものである。本明細書で使用する免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドは、哺乳動物、好ましくはヒトの免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドを意味するが、またげっ歯類またはラクダ科のものも含む（例えば、WO 00/29004に開示された通り）。
【００３０】
本明細書に使用する「ラクダ科」dAbは、ラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダ、およびグアナコを含む種由来の免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドであり、天然に軽鎖を欠く重鎖抗体（VHH）を含む。類似のdAbはコモリザメ（nurse shark）などの他の種から１本鎖抗体として得ることができる。
【００３１】
例示の免疫グロブリン可変ドメインは、WO 03/002609、WO 2004/101790、WO 200/5035572、WO 2004/061026、WO 2004/003019、WO 2004/058821、WO 94/04678、WO 97/49805、WO 99/23221、WO 99/37681、WO 00/24884、WO 00/43507、WO 00/65067、WO 01/40310、WO 03/035694、WO 03/053531、WO 03/054015、WO 03/05527、WO 2004/015425、WO 2004/041862、WO 2004/041863、WO 2004/041865、WO 2004/062551、WO 2005/044858およびEP 1 134 231に開示されている。
【００３２】
一実施形態において、ポリペプチドはスーパー抗原の可変ドメイン結合域を含む。
【００３３】
他の実施形態において、ポリペプチドは非Igタンパク質スカフォールドを含む。好適なスカフォールドは、例えば、SpA（例えば、US 5,831,012を参照）などの天然の細菌受容体、フィブロネクチンおよびアフィボディ（affibodies）に基づくもの（例えば、WO 98/58965を参照）、アビマー（avimer）、リポカリン（lipocallin）およびCTLA4、（van den Beuken et al., J. Mol. Biol. 310：591-601 (2001)に記載）、ならびに、例えば、細菌GroELの環構造または他のシャペロンポリペプチドに基づくWO 00/69907 （Medical Research Council）に記載のスカフォールドにより提供される。
【００３４】
アフィボディ（Affibody(登録商標)）親和性リガンドは、小さい単純なタンパク質であって、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）由来のプロテインAのIgG結合ドメインの１つのスカフォールドに基づく３つのへリックス束から構成される。このスカフォールドは親和性リガンドとして優れた特徴を有し、任意の標的タンパク質と高親和性で結合するように設計することができる。ドメインは58アミノ酸から成り、そのうちの13アミノ酸を無作為化して、多数のリガンド変異体をもつアフィボディ(登録商標)ライブラリーが作製される。従って、ライブラリーは、同一の骨格と可変性の表面結合特性をもつ多数のタンパク質リガンドから成る。
【００３５】
アフィボディ(登録商標)ライブラリーは、Nord K. et al （1995） Protein Eng. 8：601：608）、特に同著の例１に記載の通りアセンブルすることができる。
【００３６】
アフィボディ(登録商標)ライブラリーはまた、Affibody AB（Box 20137 SE-161 02 Bromma、Sweden）から市販されている。
【００３７】
アビマーはヒト血清タンパク質のファミリーの組換えに由来する。アビマーは、それぞれ特別な標的部位と結合するように設計されたモジュール結合ドメインから構成される単一のタンパク質鎖である。アビマーは単一タンパク質標的上の部位とおよび／または複数タンパク質標的上の部位と同時に結合することができる。複数点付着またはアビディティとして公知のように、この結合機構は、細胞および分子が体内で相互作用する経路を模倣し、アンタゴニストおよびアゴニストの作製を支援して複数の機能と強力な活性をもつ薬物を生じる。
【００３８】
アビマーライブラリーは本明細書に参照により組み入れられるWO 2004/044011、特に99頁の実施例６、および例えば米国特許出願（公開）第2005/0053973号、第2005/0089932号、第2005/0164301号に従って作製することができる。
【００３９】
アビマーライブラリーはまた、Avidia Inc.（Mountain View, California, USA）から市販されている。
【００４０】
従って、本発明の第１の態様は、免疫グロブリン軽鎖もしくは免疫グロブリン軽鎖可変ドメインの凝集を阻害できる非天然ポリペプチド、または、免疫グロブリン軽鎖もしくは免疫グロブリン軽鎖可変ドメインの凝集を阻害するポリペプチドの能力を保持する、かかるポリペプチドの変異体、融合体または誘導体、または前記変異体の融合体もしくはその誘導体を含むかまたはそれらから成るインヒビターを提供する。
【００４１】
インヒビター（例えば、ポリペプチド）が免疫グロブリン軽鎖のFR1域または免疫グロブリン軽鎖可変ドメインの間のH結合形成を阻害できることは有利である。
【００４２】
ある好ましい実施形態において、非天然ポリペプチドは：
(a)免疫グロブリン軽鎖可変ドメインのFR1域のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列、またはそのアミノ酸残基12（Kabat番号系を用いて付与）を含む部分；および／または
(b)細菌のスーパー抗原プロテインLの免疫グロブリン結合ドメインのアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列、またはその部分、
または免疫グロブリン軽鎖もしくは免疫グロブリン軽鎖可変ドメインの凝集を阻害するポリペプチドの能力を保持するかかるポリペプチドの変異体、融合体または誘導体、または前記変異体の融合体もしくはその誘導体を含むかまたはそれらから成る。
【００４３】
免疫グロブリン軽鎖もしくは軽鎖可変ドメインの「凝集」とは、フォールディング状態、部分的アンフォールディング状態および／またはアンフォールディング状態における軽鎖もしくは軽鎖可変ドメインの間の相互作用を意味する。かかる凝集は増大して規則正しい（原繊維の）または不規則な無定形構造を有する大きな会合タンパク質の塊を形成しうる。好ましくは、凝集はフォールディング状態の免疫グロブリン軽鎖または軽鎖可変ドメインから成る。
【００４４】
免疫グロブリン軽鎖の凝集と、得られる原繊維または無定形の構造の形成とは、当技術分野で周知の技法、例えば、電子顕微鏡、ヒト血清アミロイドP成分（SAP）の結合、およびコンゴレッド染色（偏光下で、明緑色に見える）により測定することができる。VκまたはVλ軽鎖に対する抗体による特異的染色によりALが確認される。免疫グロブリン軽鎖の凝集を測定する好ましい方法は実施例に記載されている。
【００４５】
免疫グロブリン軽鎖または軽鎖可変ドメインの凝集を「阻害することができる」とは、本発明のポリペプチドを免疫グロブリン鎖またはドメインを含むサンプルまたは調製物に加えると、本発明のポリペプチドの非存在のもとでの凝集形成（原繊維および／または無定形の構造）と比較して、凝集（原繊維および／または無定形の）の形成を低下させ得ることを意味する。好ましくは、タンパク質凝集の形成を、少なくとも20％、例えば少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、そして最も好ましくは100％（すなわち、完全な阻害）だけ低下させる。
【００４６】
当業者は、本発明のポリペプチドは、好ましくは、免疫グロブリン鎖もしくはドメインの凝集を生理学的条件のもとで（例えば、in vivoで）阻害できることを理解するであろう。
【００４７】
ある好ましい実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチド、変異体、融合体または誘導体は、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインのFR1域、またはアミノ酸残基12を含むその部分のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を含むかまたはそれらから成る。
【００４８】
ポリペプチド、変異体、融合体または誘導体は、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインのFR1域からの少なくとも4隣接アミノ酸、例えば少なくとも4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18または20隣接アミノ酸に対応するアミノ酸配列を含むかまたはそれらから成ると有利である。
【００４９】
最も好ましくは、ポリペプチド、変異体、融合体または誘導体は、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインのFR1域からの位置9〜12のアミノ酸の配列、すなわち、SSLS［配列番号1］に対応するアミノ酸配列を含むかまたはそれらから成る。例えば、ポリペプチド、変異体、融合体または誘導体は、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインのFR1域からの位置5〜13、18、20、22および24のアミノ酸を含んでもよい。
【００５０】
免疫グロブリン軽鎖は任意の哺乳動物源由来であってもよい。免疫グロブリン軽鎖がヒト免疫グロブリン軽鎖であると有利である。例えば、免疫グロブリン軽鎖は生殖系列抗体遺伝子セグメント、例えば、DPK1、DPK2、DPK3、DPK4、DPK5、DPK6、DPK7、DPK8、DPK9、DPK10、DPK12、DPK13、DPK15、DPK16、DPK18、DPK19、DPK20、DPK21、DPK22、DPK23、DPK24、DPK25、DPK26またはDPK28免疫グロブリン遺伝子セグメントによりコードされていてもよい。所望であれば、フレームワークはさらに、ヒト生殖系列Jk1、Jk2、Jk3、Jk4、またはJk5免疫グロブリン遺伝子セグメントによりコードされたフレームワークアミノ酸配列を含んでもよい。
【００５１】
好ましくは、免疫グロブリン軽鎖はκ軽鎖である。
【００５２】
免疫グロブリン軽鎖がヒト免疫グロブリン軽鎖であることは好都合である。
【００５３】
フレームワークはVHフレームワーク、例えば、ヒト生殖系列DP4、DP7、DP8、DP9、DP10、DP31、DP33、DP38、DP45、DP46、DP47、DP49、DP50、DP51、DP53、DP54、DP65、DP66、DP67、DP68またはDP69の免疫グロブリン遺伝子セグメントによりコードされたフレームワークアミノ酸配列を含むフレームワークであってもよい。所望であれば、VHフレームワークはさらに、ヒト生殖系列JH1、JH2、JH3、JH4、JH4b、JH5およびJH6免疫グロブリン遺伝子セグメントよりコードされたフレームワークアミノ酸配列を含んでもよい。
【００５４】
ある特定の実施形態において、免疫グロブリン鎖は、ヒト生殖系列抗体遺伝子セグメントによりコードされた対応するフレームワーク域のアミノ酸配列と同じものであるか、または、ヒト生殖系列抗体遺伝子セグメントによりコードされた前記対応するフレームワーク域のアミノ酸配列と比較して、前記フレームワーク域の１以上のアミノ酸配列がまとめて5アミノ酸以下の相違を含むものであるアミノ酸配列を有する、１以上のフレームワーク（FR）域を含む。
【００５５】
ある特定の実施形態において、免疫グロブリン鎖のFR1、FR2、FR3およびFR4のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列抗体遺伝子セグメントによりコードされた対応するフレームワーク域のアミノ酸配列と同じものであるか、または、ヒト生殖系列抗体遺伝子セグメントによりコードされた対応するフレームワーク域のアミノ酸配列と比較して、FR1、FR2、FR3およびFR4のアミノ酸配列がまとめて10アミノ酸以下の相違を含有する。
【００５６】
ある好ましい実施形態において、本発明の第１の態様のポリペプチド、変異体、融合体または誘導体は次のアミノ酸配列：
PSSLSA〔配列番号2〕
または、免疫グロブリン軽鎖もしくは免疫グロブリン軽鎖可変ドメインの凝集を阻害する親ポリペプチドの能力を保持するその変異体、融合体または誘導体、または前記変異体の融合体もしくはその誘導体を含むかまたはそれらから成る。
【００５７】
本発明は、軽鎖凝集と密接に関わる軽鎖可変ドメイン第１フレームワーク域（FR1）の限局された領域の同定から派生するものである。理論に縛られることを欲しないものの、本発明のポリペプチドは、FRI域内のポリペプチド骨格のH結合を形成する能力を妨害することにより軽鎖またはVLの凝集を阻害すると考えられる。本発明のインヒビターは、FR1域内のこの限局域に競合して結合し、その軽鎖が他の軽鎖またはVLと結合する（そして原繊維または無定形のクランプを形成する）のを防止することにより、軽鎖またはVLの凝集を阻害すると考えられる。これは、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインのFR1域のアミノ酸配列、またはアミノ酸残基12（Kabat番号系を用いて付与）を含むその部分に実質的に対応する（すなわち実質的に同一である）アミノ酸配列を含むポリペプチドを用いることにより達成することができる。
【００５８】
FR1域内の前記部位は軽鎖と細菌スーパー抗原プロテインLの免疫グロブリン結合ドメイン（Peptostreptococcus magnusプロテインLはPpLとしても知られる）との結合に関わる。「スーパー抗原」は、大部分が毒素の形態で細菌に発現され、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーとこれらの分子の外側の通常のリガンド結合部位と相互作用する抗原である。ブドウ球菌のエンテロトキシンはT細胞受容体と相互作用し、CD4＋T細胞を刺激する効果を有する。抗体に対するスーパー抗原としては、IgG定常域と結合する分子プロテインG（Bjorck and Kronvall (1984) J. Immunol, 133: 969；Reis et al. (1984) J. Immunol., 132: 3091）、IgG定常域およびVHドメインと結合するプロテインA（Forsgren and Sjoquist (1966) J. Immunol., 97: 822）ならびにVLドメインと結合するプロテインL（Bjorck (1988) J. Immunol., 140: 1994）が挙げられる。
【００５９】
「プロテインL」とは、Peptostreptococcus magnus由来のおよび4〜5個の高度に相同性の連続細胞外ドメインを有するプロテインL（ここで反復数は菌株に依存し、例えばNCBI受託番号AAA25612およびAAA67503に記載のタンパク質）を含める。
【００６０】
プロテインLは4〜5個の高度に相同性の連続細胞外ドメイン（「B」反復配列としても公知である）を含有する複数ドメインタンパク質であり、前記の数は菌株に依存する。定義した配列QTAEF［配列番号3］は、単離されたドメインとFab 2A2との構造複合体由来のプロテインLドメインのVκ1と相互作用するストランドに対応する（pdb 1HEZ；Graille, M. et al., 2001, Structure 9, 679-687およびGraille, M. et al., 2002, J. Biol. Chem. 277, 47500-47506を参照）。第５のドメインは5残基配列QTATF［配列番号4］を有する（Kastern et al., 1992, J. Biol. Chem 267, 12820-12825を参照）。
【００６１】
それ故に、プロテインLと免疫グロブリン軽鎖または免疫グロブリン軽鎖可変ドメインとの結合を阻害できるポリペプチド、変異体、融合体または誘導体も軽鎖凝集を阻害するために用いることができる。従って、ポリペプチドは、細菌のスーパー抗原プロテインL、またはその部分の免疫グロブリン結合ドメインに対応するアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、ポリペプチドは、プロテインLの免疫グロブリン結合ドメインからの少なくとも4連続アミノ酸、例えば少なくとも5、6、7、8、9、10、12、14、16、18または20連続アミノ酸に対応するアミノ酸配列を含むかまたはそれらから成るものであってもよい。
【００６２】
本発明の第１の態様のさらなる好ましい実施形態において、ポリペプチドは、アミノ酸配列
QTAEF［配列番号3］および／または
QTATF［配列番号4］
あるいは免疫グロブリン軽鎖または免疫グロブリン軽鎖可変ドメインの凝集を阻害する親ポリペプチドの能力を保持する変異体、融合体またはその誘導体、あるいは前記変異体またはその誘導体の融合体を含むかまたはそれらから成る。
【００６３】
当業者はアミノ酸残基の番号は菌株に依存することを理解するであろう。例えば、Graille. et al., 2002, J. Biol. Chem. 277, 47500-47506は、Bドメインのアラインメントとそれらの番号の詳細を提供し、FR1との相互作用に関わる残基を記載し、水素結合を形成する残基のリストを掲げている（残基36、38、40および53；その表１を参照されたい）。Grailleらの番号を採用すると、QTAEF［配列番号3］ドメインはアミノ酸35〜39に対応する。この界面と相互作用するアミノ酸残基は残基24、34〜40、49、53および56である。構造としては、主な接触はストランドβ2からである一方、さらなる相互作用はストランドβ1とαへリックスからである。αへリックスと接続した逆平行βストランドβ1およびβ2はこのドメインの残基20〜60を含み、もしN-末端の全体が含まれれば（すなわち、残基1〜60）、恐らくもっと大きいと思われる。
【００６４】
以上に示したように、軽鎖凝集に関わるFR1域内のアミノ酸残基はまた、軽鎖と細菌のスーパー抗原プロテインLの免疫グロブリン結合ドメインとの結合に関わる。従って、本発明のポリペプチド、変異体、融合体または誘導体もプロテインLと免疫グロブリン軽鎖、または軽鎖可変ドメインとの結合を阻害することができるであろう。
【００６５】
連鎖球菌のプロテインG（SpGとも呼ぶ）は、プロテインLおよびVLドメインとの相互作用に類似する相互作用を介して、免疫グロブリン重鎖のCH1域の一部位と結合する免疫グロブリン結合ドメインを含有すると考えられる。プロテインLおよびプロテインGとFab結合様式との間の構造的集合は、Graille et al., 2002, J. Biol. Chem. 277, 47500-47506に実証されている。SpG結合ドメインのフォールドはPpL由来のフォールドと密接に関係し、２対の逆平行βストランドとシートの頂上の１つのαへリックスにより形成されるβシートから成る。SpGとCH1の相互作用は、PpLとVLの相互作用と多くの特徴を共有する。SpGとPpLのそれぞれのドメインのβ2ストランドは相互作用に関わり、このストランドはβジッパー相互作用によりFabのβシートを拡大する。この相互作用は、SpG-CH1界面における５つの主鎖／主鎖水素結合に関わるが、PpL-VLにおいては３つの水素結合だけに関わる。
【００６６】
「SpG」とは、連鎖球菌のプロテインG、例えば、連鎖球菌株G148由来の連鎖球菌グループタンパク質Gを含める（Nygren et al., (1988) J. Mol. Recognit., 1:69-74；Nilsson et al., (1994) Eur. J. Biochem., 224:103-108；Guss, B. et al, 1987 EMBO J. 5:1567-1575；Olsson, A. et al., 1987 Eur. J. Biochem. 168:319-324；US 5,831,012；EP 0 739 353、およびEP 0 486 525）。
【００６７】
従って、本発明の第１の態様の代わりの実施形態においては、免疫グロブリン重鎖もしくは免疫グロブリン重鎖CH1ドメインの凝集を阻害することができる非天然のポリペプチド、または、免疫グロブリン重鎖もしくは免疫グロブリン重鎖CH1ドメインの凝集を阻害するポリペプチドの能力を保持するかかるポリペプチドの変異体、融合体または誘導体、または前記変異体の融合体もしくはその誘導体を含むかまたはそれらから成るインヒビターを提供する。
【００６８】
用語「凝集」および「阻害」は免疫グロブリン重鎖と重鎖定常ドメインとの関係において、免疫グロブリン軽鎖と軽鎖可変ドメインの関係において先に定義した使用と一致した方式で解釈されるものとする。
【００６９】
ポリペプチド、またはその変異体、融合体もしくは誘導体が免疫グロブリン重鎖のCH1ドメインまたは免疫グロブリン重鎖CH1ドメインの間のH結合形成を阻害できることは好都合である。
【００７０】
例えば、ポリペプチド、またはその変異体、融合体もしくは誘導体は、免疫グロブリン重鎖のCH1ドメインのアミノ酸残基205〜218にてまたはそれらに隣接して、または免疫グロブリン重鎖CH1ドメインと結合できるものであってもよい。
【００７１】
SpGとCH1相互作用は、CH1ドメインの最後のβストランド（ストランドG；マウスIgG1の残基209〜216、表１参照）からプロテインGの第２のβストランド（β2）（IgG結合ドメインIIIの残基16〜22、DerrickおよびWigleyによる番号48、49）へ拡がる一連の水素結合を介して安定化される。
【表１】
2010508016.tif 000002
【００７２】
CH1とSpG間の複合体の構造においては、主鎖／主鎖水素結合がそれぞれ、マウスCH1ドメインの212、214および216に対応する位置（表１、太字）とプロテインGの第三Bドメインの位置、20、18および16（本明細書では以後、B3ドメインと呼ぶ）の間に形成される。構造中の20、18および16と記した残基は、配列のNCBI受託番号CAA27638の残基343、341および339を意味する。このタンパク質は３つのIgG結合Bドメインを有する。
【００７３】
好ましくは、ポリペプチドは、SpGの免疫グロブリン結合ドメイン、またはその部分のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を含むかまたはそれらから成る。
【００７４】
より好ましくは、ポリペプチドは、SpGの免疫グロブリン結合ドメインからの少なくとも4つの隣接アミノ酸、例えば少なくとも5、6、7、8、9、10、12、14、16、18または20隣接アミノ酸に対応するアミノ酸配列を含むかまたはそれらから成る。
【００７５】
最も好ましくは、ポリペプチドは、アミノ酸配列：
TLKGETT［配列番号5］
または、免疫グロブリン軽鎖または免疫グロブリン軽鎖可変ドメインの凝集を阻害する親ポリペプチドの能力を保持するその変異体、融合体または誘導体、または前記変異体の融合体もしくはその誘導体を含むかまたはそれらから成る。
【００７６】
この配列は、DerrickおよびWigley（48、49）が示したβ2ストランドの残基16〜22を表す。太字の残基がCH1 BストランドGと主鎖/主鎖H結合を形成する。
【００７７】
連鎖球菌プロテインG配列は、NCBI受託番号CAA27638、EMBL受託番号 X04015.1；およびpdb受託番号1IGCをもつFabフラグメントとの複合体中のB3ドメインの構造の一例として見出すことができる。
【００７８】
IgG結合に関わる各Bドメインの保存された配列（太字）をもつ連鎖球菌プロテインG配列（NCBI受託番号 CAA27638）を次に示す：
2010508016.tif 000003
【００７９】
本発明の第１の態様のインヒビターは様々な長さのポリペプチドを含むかまたはそれらから成ってもよいことを当業者は理解するであろう。好ましくは、しかし、ポリペプチドは長さが30未満のアミノ酸、例えば、長さが20未満、15未満、14未満、13未満、12未満、11未満、10未満、9未満、8未満、7未満、または6未満のアミノ酸である。例えば、ポリペプチドは、長さが2〜20アミノ酸の間、例えば2〜10アミノ酸の間、4〜8アミノ酸の間、4〜6アミノ酸の間、または長さが正確に5または6アミノ酸であってもよい。
【００８０】
当業者はさらに、本発明の第１の態様のポリペプチドの上記定義は天然のまたはそうではなくて公知の免疫グロブリン軽鎖、プロテインLまたはSpGを包含することを意図しないことを理解するであろう。しかし、かかる天然のまたはそうではなくて公知のポリペプチドの使用は下記の、本発明の他の態様に包含される。
【００８１】
本発明のポリペプチド実施形態を表す化学式において、具体的に示してないが、アミノおよびカルボキシ末端基は、特に断らない限り、生理学的pH値にあると仮定しうる形態であると解釈しうる。従って、規定しなくてもまた示さなくても、N末端NH3＋およびC末端COO-は生理学的pHで存在すると解釈される。本明細書で使用するポリペプチド表記法においては、標準の用法と慣習に従い、分子の左端はアミノ末端であり、右端はカルボキシ末端である。非生理学的pH値で形成される塩基および酸の付加塩も本発明のポリペプチドに含まれる。
【００８２】
本発明で使用する用語「アミノ酸」としては、標準の20種の遺伝的にコードされるアミノ酸およびその対応する「D」型の立体異性体（天然の「L」型と比較して）、ωアミノ酸、その他の天然アミノ酸、非通常アミノ酸（例えば、α,α-二置換アミノ酸、N-アルキルアミノ酸など）および化学的に誘導体化されたアミノ酸（下記参照）が挙げられる。
【００８３】
アミノ酸を、「アラニン」または「Ala」または「A」のように、具体的に挙げる場合、この用語は、特に明白に断らない限り、L-アラニンとD-アラニンの両方を意味する。他の非通常アミノ酸も、所望の特性をそのポリペプチドが保持する限り、本発明のポリペプチドとして好適な成分でありうる。示したペプチドについては、それぞれのコードされたアミノ酸残基を、適宜、通常アミノ酸の慣用名に対応する単文字表記により表現する。
【００８４】
好ましくは、ポリペプチドはL-アミノ酸を含むか、から成る。
【００８５】
当業者は、本発明の第１の態様は定義したポリペプチドの変異体、融合体および誘導体、ならびに前記変異体の融合体または誘導体を、かかる変異体、融合体および誘導体が軽鎖凝集を阻害する能力を保持することを条件として、包含することを理解するであろう。
【００８６】
変異体は、組換えポリヌクレオチドを用いる当業者に周知のタンパク質エンジニアリングおよび部位特異的突然変異誘発を利用して作製することができる（例えば、Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 3rd edition, Sambrook & Russell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照）。
【００８７】
前記ポリペプチドの「融合体」には任意の他のポリペプチドと融合したポリペプチドを含める。例えば、前記ポリペプチドは、前記ポリペプチドの精製を容易にするためにグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）またはプロテインAなどのポリペプチドと融合することができる。かかる融合体の例は当業者に周知である。同様に、前記ポリペプチドは、His6などのオリゴヒスチジンタグと、または周知のMycタグエピトープなどの抗体により認識されるエピトープと融合してもよい。前記ポリペプチドの変異体または誘導体との融合体も本発明の範囲に含まれる。軽鎖凝集阻害などの所望の特性を保持する融合体（または変異体もしくはその誘導体）が好ましいことは理解されるであろう。
【００８８】
もし融合体が本明細書に記載の方法およびスクリーニングアッセイに使用するのに好適であれば、これも特に好ましい。
【００８９】
例えば、融合体は、所望の特性を前記本発明のポリペプチドに与えるさらなる部分を含んでもよい；例えば、前記部分はポリペプチドを検出または単離するのに、またはポリペプチドの細胞取り込みを促進するために有用であってもよい。その部分は、例えば、ビオチン部分、放射性部分、蛍光部分、例えば小フルオロフォアまたは緑色蛍光タンパク質（GFP）フルオロフォア、ならびに当業者に公知のものであってもよい。その部分は、免疫原性のタグ、例えば当業者に公知のMycタグであってもよく、または、当業者に公知のポリペプチドの細胞取込みを促進することができる親油性分子またはポリペプチドドメインであってもよい。
【００９０】
ポリペプチドの「変異体」とは、保存的なまたは非保存的な両方の挿入体、欠失体および置換体を含める。特に本発明者らは、かかる変化が同ポリペプチドの活性を実質的に変えることのないポリペプチドの変異体を含める。特に本発明者らは、かかる変化が同ポリペプチドによる軽鎖凝集の阻害を実質的に変えることのないポリペプチドの変異体を含める。
【００９１】
特に好ましいのは、ポリペプチド変異体が、先に与えたアミノ酸配列と少なくとも75％、より好ましくは少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、そして最も好ましくは先に記載のアミノ酸配列（すなわち、プロテインLの免疫グロブリン軽鎖のFR1域または免疫グロブリン結合ドメイン）と100％同一性のある、アミノ酸配列を有することである。
【００９２】
ヒト、マウス、およびラクダフレームワーク生殖系列配列の例は、Kabat et al. (eds), 1991, Sequences of Protein of Immunological Interest. 5th ed National institutes of Health, Bethesda, MDに開示されている。
【００９３】
２つのポリペプチドの間の％配列同一性は、好適なコンピュータープログラム、例えばWisconsin大学遺伝計算機グループ（the University of Wisconsin Genetic Computing Group）のGAPプログラムを用いて決定することができ、％同一性は配列を好適にアラインメントしたポリペプチドと比較して計算されることは理解されよう。
【００９４】
アラインメントは、あるいは、Clustal Wプログラム（Thompson et al., 1994, Nuc. Acid Res. 22:4673-4680に記載）を用いて行うことができる。
【００９５】
使用するパラメーターは次の通りでありうる：
迅速ペアワイズアラインメントパラメーター（Fast pairwise alignment parameters）：K-tuple(word) size＝1、window size＝5、gap penalty＝3、top diagonalsの数＝5。スコアリング方法：x パーセント。
【００９６】
多重アラインメントパラメーター（Multiple alignment parameters）：gap open penalty＝10、gap extension penalty＝0.05。
【００９７】
スコアリングマトリックス：BLOSUM。
【００９８】
あるいは、BESTFITプログラムを用いて局所配列アラインメントを決定してもよい。
【００９９】
好適な変異体は、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6に記載の核酸ハイブリダイゼーション方法論により同定することができる。
【０１００】
上記参考文献には水性および非水性の方法が記載されていて、どちらを使用してもよい。本明細書で意味する具体的なハイブリダイゼーション条件は、次の通りである：(1)低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件：6 X 塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（SSC）、約45℃でのインキュベーション、続いて、0.2 X SSC、0.1％ SDS、少なくとも50℃（洗浄温度は低ストリンジェンシー条件では55℃に増加してもよい）での２回の洗浄；(2)中ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件：6 X SSC、約45℃でのインキュベーション、続いて、0.2 X SSC、0.1％ SDS、60℃での１回以上の洗浄；(3)高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件：6 X SSC 、約45℃でのインキュベーション、続いて、0.2 X SSC、0.1％ SDS、65℃での１回以上の洗浄；および好ましくは、(4)非常に高いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件：0.5Mリン酸ナトリウム、7％ SDS、65℃でのインキュベーション、続いて、0.2 X SSC、1％ SDS、65℃での１回以上の洗浄。
【０１０１】
好ましくは、好適な変異体ポリペプチドをコードする核酸分子を高ストリンジェンシー条件(3)、または非常に高いストリンジェンシー条件(4)を用いて同定する。
【０１０２】
本発明の第１の態様のポリペプチド、変異体、融合体または誘導体は、改変されたまたは誘導体化された１以上のアミノ酸を含んでもよい。
【０１０３】
１以上のアミノ酸の化学誘導体は、官能性側鎖基との反応によって作製することができる。かかる誘導体化された分子には、例えば、遊離アミノ基が誘導体化されてアミン塩酸塩、p-トルエンスルホニル基、カルボキシベンゾキシ基、t-ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基を形成した分子が含まれる。遊離カルボキシル基を誘導体化して塩、メチルおよびエチルエステルまたは他のタイプのエステルおよびヒドラジドを形成することができる。遊離ヒドロキシル基を誘導体化してO-アシルまたはO-アルキル誘導体を形成することができる。また、化学誘導体として、20種の標準アミノ酸の天然アミノ酸誘導体を含有するペプチドも含まれる。例えば：4-ヒドロキシプロリンをプロリンと置換することができ；5-ヒドロキシリシンをリシンと置換することができ；3-メチルヒスチジンをヒスチジンと置換することができ；ホモセリンをセリンと置換することができ；オルニチンをリシンと置換することができる。誘導体にはまた、必要な活性が維持される限り、１以上の付加または欠失を含有するペプチドも含まれる。その他の含まれる改変には、アミド化、アミノ末端アシル化（例えば、アセチル化またはチオグリコール酸アミド化）、末端カルボキシルアミド化（例えば、アンモニアまたはメチルアミンによる）、および同様な末端改変が含まれる。
【０１０４】
さらに当業者は、ペプチドミメチック化合物も有用であることを理解するであろう。従って、「ポリペプチド」には、軽鎖凝集を阻害することができるペプチドミメチック化合物を含める。用語「ペプチドミメチック」は、治療薬としての特別なペプチドのコンフォメーションおよび所望される特性を模倣する化合物を意味する。
【０１０５】
例えば、本発明のポリペプチドは、アミノ酸残基がペプチド（-CO-NH-）連鎖により接続されている分子だけではなく、ペプチド結合が逆転している分子も含む。かかるretro-inversoペプチドミメチックは、当技術分野で公知の方法、例えば、Meziere et al. (1997) J. Immunol. 159, 3230-3237に記載された方法を用いて作ることができる。この手法は、骨格に関わる変化を有し、かつ側鎖のオリエンテーションに関わる変化を有しないシュードペプチドを作ることに関わる。CO-NHペプチド結合の代わりにNH-CO結合を含有するretro-inverseペプチドはタンパク質分解に対する耐性がさらに高い。あるいは、本発明のポリペプチドは、１以上のアミノ酸残基が通常のアミド連鎖の代わりに-y(CH2NH)-結合で連結しているペプチドミメチック化合物であってもよい。
【０１０６】
さらなる代わりの実施形態において、アミノ酸残基の炭素原子間の間隔を保持する適当なリンカー部分を用いることを条件として、ペプチド結合が全く無しで済ますこともでき；もしそのリンカー部分がペプチド結合と実質的に同じ電荷分布および実質的に同じ平面性を有すれば特に好ましい。
【０１０７】
ポリペプチドをそのNまたはC末端でブロックして、外タンパク質分解性消化に対する感受性の低下を助けると好都合であることは理解されるであろう。
【０１０８】
D-アミノ酸およびN-メチルアミノ酸などのコードされないまたは改変された様々なアミノ酸も、哺乳動物のペプチドを改変するために利用されている。さらに、推定される生物活性コンフォメーションを、環化またはラクタムの組込みまたは他のタイプの架橋などの共有結合による改変により安定化してもよく、例えば、Veber et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:2636；およびThursell et al., 1983, Biochem. Biophys. Res. Comm. 111:166を参照されたい。
【０１０９】
多数の合成計画のなかの１つの共通テーマは、いくつかの環状部分をペプチド系フレームワーク中に導入することにあった。環状部分はペプチド構造のコンフォメーション空間を制限し、これはしばしば特別な生物学的受容体に対するペプチドの親和性の増加をもたらすからである。この計画により付加される利点は、環状部分のペプチドへの導入がまた、細胞のペプチダーゼに対する感受性の低下をもたらしうることである。
【０１１０】
従って、本発明の好ましいポリペプチドは、末端システインアミノ酸を含む。かかるポリペプチドは末端システインアミノ酸中のメルカプチド基のジスルフィド結合形成によりヘテロデチック（heterodetic）環で、または末端アミノ酸間のアミドペプチド結合形成によりホモデチック（homodetic）環で存在しうる。以上に示したように、小ペプチドをジスルフィドまたはアミド結合を介してNおよびC末端システイン間を環化することにより、直鎖ペプチドでしばしば観察される親和性と半減期の問題を、タンパク質分解を低減しかつ構造の硬直性を増加してより高親和性の化合物を得ることにより回避することができる。ジスルフィド結合により環化したポリペプチドは遊離アミノおよびカルボキシ末端を有してなおタンパク質分解性分解に感受性がある一方、N-末端アミンとC-末端カルボキシルとの間でアミド結合形成により環化したペプチドはもはや遊離アミノまたはカルボキシ末端を持たない。このように、本発明のペプチドはC-N結合またはジスルフィド結合のどちらによって連結してもよい。
【０１１１】
本発明は決してペプチドの環化方法に限定されるものでなく、任意の好適な合成方法により達成しうる環状構造のペプチドを包含する。従って、ヘテロデクチック連鎖は、限定されるものでないが、ジスルフィド、アルキレンまたはスルフィド架橋を介する形成も含みうる。ジスルフィド、スルフィドおよびアルキレン架橋を含む環状ホモデチックペプチドおよび環状ヘテロデチックペプチドの合成方法は、US 5,643,872に開示されている。その他の環化方法の例は、US 6,008,058に考察されかつ開示されている。環状ペプチドはまた、II'型β-ターンジペプチドの組込みによって調製することもできる （Doyle et al., 1996, Int J Pept Protein Res. 47(6):427-36）。
【０１１２】
環状の安定化ペプチドミメチック化合物を合成するさらなる手法は閉環メタセシス（RCM）である。この方法は、ペプチド前駆体を合成しかつそれをRCM触媒と接触させてコンフォメーションの制限されたペプチドを得るステップに関わる。好適なペプチド前駆体は２以上の不飽和C-C結合を含有する。この方法は固相ペプチド合成技法を用いて行うことができる。この実施形態においては、固体支持体に固定された前駆体をRCM触媒と接触させ、その生成物を次いで固体支持体から切断してコンフォメーションの制限されたペプチドを得る。
【０１１３】
D. H. Rich, Protease Inhibitors, Barrett and Selveson, eds., Elsevier (1986)に開示された他の手法は、酵素インヒビター設計における遷移状態類似体の概念を応用してペプチド模倣体を設計することにある。例えば、スタチンの二級アルコールがペプシン基質の切断可能なアミド結合の四面体遷移状態を模倣することは公知である。
【０１１４】
総括すると、末端改変は周知のようにプロテイナーゼによる感受性を低下させるのに有用であり、従って、溶液、特にプロテアーゼが存在しうる生物体液中のペプチドの半減期を延長する。ポリペプチド環化も、環化により形成される安定構造の故にかつ環状ペプチドについて観察される生物学的活性の視点で、有用な改変であって好ましい。
【０１１５】
従って、本発明の第１の態様の一実施形態において、ポリペプチドは環状である。しかし、代わりの好ましい実施形態において、ポリペプチドは直鎖である。
【０１１６】
本発明にはまた、本発明のポリペプチドの製薬上許容される酸または塩基の付加塩を含む組成物も含まれる。本発明に有用な上記塩基化合物の製薬上許容される酸付加塩を調製するために使用される酸は、無毒の酸付加塩、すなわち、薬理学的に許容されるアニオンを含有する塩、なかでも、例えば、塩酸塩、臭化水素塩、ヨウ化水素塩、硝酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、酒石酸水素塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、サッカラート、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、p-トルエンスルホン酸塩およびパモエート［すなわち、1,1'-メチレン-bis-(2-ヒドロキシ-3ナフトエ酸塩)］塩を形成する酸である。
【０１１７】
製薬上許容される塩基付加塩を用いて本発明による化合物の製薬上許容される塩型を調製してもよい。
【０１１８】
酸性の性質である本発明の化合物の製薬上許容される塩基付加塩を調製するための試薬として使用できる化学塩基は、かかる化合物の無毒の塩基付加塩を形成する塩基である。かかる無毒の塩基付加塩としては、限定されるものでないが、かかる薬理学的に許容されるカチオン、なかでも、例えば、アルカリ金属カチオン（例えば、カリウムおよびナトリウム）およびアルカリ土類金属カチオン（例えば、カルシウムおよびマグネシウム）、アンモニウムまたはN-メチルグルカミン（またはメグルミン）のような水溶性アミン付加塩、および低級アルカノールアンモニウム、ならびにその他の製薬上許容される有機アミン類の塩基付加塩が挙げられる。
【０１１９】
本発明のポリペプチドを貯蔵のために冷凍乾燥し、使用前に好適な担体に入れて再構成してもよい。任意の好適な凍結乾燥方法（例えば、スプレー乾燥、ケーキ乾燥）および／または再構成技法を使うことができる。当業者は、凍結乾燥および再構成が様々な程度の抗体活性低下を導きうる（例えば、通常の免疫グロブリンにおいて、IgM抗体はIgG抗体より活性低下が大きくなる傾向がある）こと、それを補償するために使用レベルを上方調節しなければならないことを理解するであろう。凍結乾燥したポリペプチドは、再水和したときに、（凍結乾燥前の）その活性が約20％以下、または約25％以下、または約30％以下、または約35％以下、または約40％以下、または約45％以下、または約50％以下しか低下しないことが好ましい。
【０１２０】
本発明のポリペプチドは単量体の形でまたはそのホモもしくはヘテロ多量体（例えば、二量体、三量体、四量体、五量体など）の形で存在しうることを当業者は理解するであろう。
【０１２１】
本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様によって先に定義されたポリペプチド、変異体、融合体または誘導体をコードする単離された核酸分子を提供する。
【０１２２】
従って、単離された核酸分子は本発明のポリペプチドインヒビターを発現するのに好適である。「発現するのに好適な」とは、核酸分子が翻訳されてポリペプチドを形成することができるポリヌクレオチド、例えばRNAであること、または本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（好ましくはDNA）がプラスミドなどの発現ベクター中に、発現のための好適な方向でかつ正しいリーディングフレームに挿入されていることを意味する。ポリヌクレオチドを、任意の所望の宿主により認識される適当な転写および翻訳の調節および制御ヌクレオチド配列と連結させてもよく；かかる制御配列を発現ベクターに組込んでもよい。
【０１２３】
本発明の核酸分子はDNAまたはRNAであってもよく、好ましくはDNAである。
【０１２４】
核酸分子（またはポリヌクレオチド）を好適な宿主で発現させて本発明のポリペプチドを産生させることができる。従って、本明細書に含まれる教示の視点で適当に修正した公知の技法によって、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いて発現ベクターを構築し、次いでこれを利用して適当な宿主細胞を形質転換し、本発明のポリペプチドを発現し産生することができる（例えば、前掲のSambrook & Russellに記載の通り）。
【０１２５】
本発明のポリペプチドをコードする核酸分子を、様々な他のポリヌクレオチド配列と接続して適当な宿主中に導入することができる。同伴ポリヌクレオチドは、宿主の性質、ポリヌクレオチドの宿主中への導入方式およびエピソーム維持か組込みのどちらが望ましいかに依存しうる。
【０１２６】
一般に、核酸分子は、プラスミドなどの発現ベクター中に、発現のために適当な方向でかつ正しいリーディングフレームに挿入される。もし必要であれば、核酸分子を所望の宿主により認識される適当な転写および翻訳の調節制御ヌクレオチド配列に連結してもよいが、かかる制御配列は一般的に発現ベクターにおいて利用しうる。ベクターを次いで標準技法を介して宿主中に導入する。一般的に全ての宿主がベクターにより形質転換しうるのではない。それ故に、形質転換する宿主細胞を選択する必要があろう。１つの選択技法は、任意の必要な制御配列と共に、形質転換される細胞の選択可能な形質、例えば抗生物質耐性をコードするポリヌクレオチド配列を、発現ベクター中に組み込むことに関わる。あるいは、かかる選択可能な形質に対する遺伝子を他のベクター上において、これを用いて所望の宿主細胞を同時形質転換してもよい。
【０１２７】
本発明の組換え核酸分子により形質転換した宿主細胞を次いで、本明細書に開示した教示の視点で、ポリペプチドの発現を可能にする十分な時間および当業者に周知の適当な条件のもとで培養し、これを次いで回収することができる。
【０１２８】
多数の発現系が公知であり、それには、細菌（例えば大腸菌E. Coli
および枯草菌Bacillus subtilis）、酵母（例えば、Saccharomyces cerevisiae）、糸状真菌（例えば、Aspergillus）、植物細胞、動物細胞および昆虫細胞が含まれる。
【０１２９】
ベクターは典型的には原核生物中での伝播のためのColE1 oriなどの原核生物のレプリコン（たとえ他の非原核生物細胞型での発現に使うベクターであっても）を含む。ベクターはまた、形質転換に利用する大腸菌などの細菌宿主細胞内の遺伝子の発現（転写および翻訳）を指令できる、原核生物プロモーターなどの適当なプロモーターを含んでもよい。例示の細菌宿主と適合しうるプロモーター配列は、典型的には、本発明のポリヌクレオチドを挿入するために好都合な制限酵素切断部位を含有するプラスミドベクターに入れて提供される。
【０１３０】
典型的な原核生物のベクタープラスミドは、Biorad Laboratories、（Richmond、CA、USA）から入手しうるpUC18、pUC19、pBR322およびpBR329、ならびにPharmacia（Piscataway、NJ、USA）から入手しうるpTrc99AおよびpKK223-3である。
【０１３１】
典型的な哺乳動物の細胞ベクタープラスミドは、Pharmacia（Piscataway、NJ、USA）から入手しうるpSVLである。このベクターは、SV40後期プロモーターを用いてクローニングした遺伝子の発現を駆動し、最高の発現レベルはCOS-1細胞などのT抗原産生細胞において見られる。
【０１３２】
誘導しうる哺乳動物発現ベクターの例は、Pharmaciaからも入手しうるpMSGである。このベクターは、マウス乳房腫瘍ウイルス長末端反復配列のグルココルチコイド誘導プロモーターを用いてクローニングした遺伝子の発現を駆動する。
【０１３３】
有用な酵母プラスミドベクターは、pRS403〜406およびpRS413〜416であり、一般にStratagene Cloning Systems（La Jolla、CA 92037、USA）から入手しうる。プラスミドpRS403、pRS404、pRS405およびpRS406は酵母組込みプラスミド（YIp）であり、酵母選択マーカーHIS3、TRP1、LEU2およびURA3を取り込んでいる。プラスミドpRS413〜416は酵母動原体プラスミド（YCp）である。
【０１３４】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドベクター構築物を用いて形質転換した宿主細胞にも関する。宿主細胞は原核生物または真核生物のどちらであってもよい。細菌細胞が好ましい原核生物宿主細胞であって、典型的には大腸菌株、例えば、Bethesda Research Laboratories Inc.（Bethesda、MD、USA）から入手しうる大腸菌株DH5、およびAmerican Type Culture Collection （ATCC）（Rockville、MD、USA）（No ATCC 31343）から入手しうるRR1などである。好ましい真核生物の宿主細胞には、酵母、昆虫および哺乳動物の細胞、好ましくは脊椎動物細胞、例えば、マウス、ラット、サルまたはヒトの繊維芽細胞および腎細胞株由来の細胞が含まれる。酵母宿主細胞には、一般にStratagene Cloning Systems（La Jolla、CA 92037、USA）から入手しうるYPH499、YPH500およびYPH501が含まれる。好ましい哺乳動物の宿主細胞には、ATCCからCCL 61として入手しうるチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、ATCCからCRL 1658として入手しうるNIH Swissマウス胎仔細胞NIH/3T3、ATCCからCRL 1650として入手しうるサル腎臓由来のCOS-1細胞およびヒト胎児腎細胞である293細胞が含まれる。好ましい昆虫細胞は、バキュロウイルス発現ベクターを用いてトランスフェクトできるSf9細胞である。
【０１３５】
本発明の核酸分子による適当な細胞宿主の形質転換は、典型的には使用するベクターの型に依存する周知の方法により実施される。原核生物の宿主細胞の形質転換については、例えば、Sambrook & Russell（前掲）を参照されたい。酵母細胞の形質転換は、多数の総括に記載されている（例えば、Gietz & Woods (2001) Biotechniques 30：816-228を参照）。脊椎動物細胞の関係でかかる細胞をトランスフェクトするために有用な試薬、例えば、リン酸カルシウムおよびDEAE-デキストランまたはリポソーム製剤は、Stratagene Cloning Systems、またはLife Technologies Inc.（Gaithersburg、MD 20877、USA）から入手しうる。
【０１３６】
エレクトロポレーションも細胞を形質転換および／またはトランスフェクトするのに有用であり、酵母細胞、細菌細胞、昆虫細胞および脊椎動物細胞を形質転換する技術分野において周知である。例えば、多数の細菌種は、Luchansky et al. (1988) Mol. Microbiol. 2:637-646に記載の方法により形質転換することができる。エレクトロポレーションにより酵母を形質転換する方法は、Becker & Guarente (1990) Methods Enzymol. 194:182に開示されている。
【０１３７】
首尾よく形質転換された細胞、すなわち、本発明の核酸分子を含有する細胞は周知の技法により同定することができる。例えば、本発明の発現構築物の導入により得られる細胞を増殖して本発明のポリペプチドを産生することができる。細胞を収穫し、溶解し、そのDNA含量を、Sambrook & Russell（前掲）などに記載の方法を用いて、DNAの存在について試験することができる。あるいは、上清中のタンパク質の存在は抗体を用いて検出することができる。
【０１３８】
組換え体DNAの存在について直接試験することだけでなく、組換え体DNAがタンパク質の発現を指令することができる場合、形質転換の成功を周知の免疫学的方法により確証することができる。例えば、発現ベクターによって首尾よく形質転換された細胞は適当な抗原性を示すタンパク質を産生する。形質転換されているか疑わしい細胞のサンプルを収穫し、好適な抗体を用いてタンパク質について試験する。
【０１３９】
従って、本発明の第３の態様は、本発明の第２の態様による核酸分子を含むベクターを提供する。ある好ましい実施形態において、ベクターは発現ベクターである。
【０１４０】
ベクターが哺乳動物細胞などの真核細胞における複製に好適であると有利である。
【０１４１】
好ましいベクターは、pBudCE4.1pTWIN、pShuttle、pUC18、pUC19、pBacPAK、pBR322、pBR329、pTrc99A、pKK223-3、pSVL、pMSG、pRS403〜406、pRS413〜416およびpPicZαからなる群より選択することができる。
【０１４２】
本発明の第４の態様は、本発明の第２の態様による核酸分子または本発明の第３の態様によるベクターを含む宿主細胞を提供する。細胞が真核細胞、例えば哺乳動物の細胞であることは好都合である。
【０１４３】
好ましくは、宿主細胞は大腸菌菌株DH5、RR1、ER2566、CHO細胞（例えば、CCL61）、NIH Swissマウス胎仔細胞（NIH/3T3）、COS-1細胞（例えば、CRL 1650および293）、Sf9細胞および酵母細胞株YPH499〜501、またはKM71HなどのPichia pastorisからなる群より選択される。
【０１４４】
形質転換された宿主細胞自体だけでなく、本発明はまた、栄養培地に含まれたこれらの細胞の培養、好ましくはモノクローナル（クローン的に均質な）培養、またはモノクローナル培養由来の培養を意図する。
【０１４５】
本発明の第５の態様は、本発明の第１の態様に記載のポリペプチドインヒビターを作る方法であって、本発明の第４の態様に記載の宿主細胞を培養してポリペプチドを発現させ、それからポリペプチドを単離するステップを含んでなる前記方法を提供する。宿主細胞を培養し、組換えタンパク質を単離する方法は当技術分野で周知である。
【０１４６】
本発明の第６の態様は、本発明の第１の態様に記載のポリペプチドインヒビターを作る方法であって、ポリペプチドの固相合成を含んでなる前記方法を提供する。例えば、ポリペプチドは、Solid-Phase Peptide Synthesis (1997) Fields, Abelson & Simon (Eds), Academic Press (ISBN: 0-12-182190-0)に記載の通り合成することができる。
【０１４７】
本発明の第７の態様は、本発明の第１の態様によるインヒビターと医学上または獣医学上許容される賦形剤、希釈剤または担体との混合物を含む、医薬製剤を提供する。
【０１４８】
本明細書で使用する「医薬製剤」は、本発明による治療上有効な製剤を意味する。
【０１４９】
本明細書で使用する「治療上有効な量」、または「有効量」、または「治療上有効な」は、所与の症状および投与レジメンについて治療効果を提供する量を意味する。これは、所要の添加剤および希釈剤、すなわち、担体または投与ビヒクルに関連して所望の治療効果を生じるよう計算した活性物質の予め定めた量である。さらに、これは、宿主の臨床的に有意な活性、機能および応答の不足を減する、最も好ましくは防止するために十分な量を意味することを意図する。あるいは、治療上有効な量は、臨床上有意な宿主の症状の改善を生じるために十分である。当業者は理解するように、化合物の量はその具体的活性に応じて変わりうる。好適な投与量は、所要の希釈剤と連携して所望の治療効果を生じるように計算した予め定めた活性組成物の量を含有しうる。本発明の組成物を製造する方法およびその使用においては、活性成分の治療上有効な量を提供する。治療上有効な量は、当技術分野で周知のように、通常の医学または獣医学の従事者が、年齢、体重、性別、症状、複合症、他の疾患などの患者の特徴に基づいて決定することができる。
【０１５０】
従って、ある好ましい実施形態において、本発明は、次の１以上を（少なくとも部分的に）阻害するために有効な本発明のインヒビターの量を含む医薬製剤を提供する：
（a）免疫グロブリン軽鎖または重鎖（VLまたはCH1ドメインを含む）の凝集；
（b）PpLと免疫グロブリン軽鎖および／または免疫グロブリン軽鎖可変ドメインとの結合；および／または
（c）SpGと免疫グロブリン重鎖および／または免疫グロブリン重鎖CH1ドメインとの結合。
【０１５１】
本発明のインヒビターは、一般的に投与の意図する経路および標準医薬実務との関係で選択された好適な製薬の賦形希釈剤または担体と混合して投与しうることを当業者は理解するであろう（例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995, Ed. Alfonso Gennaro, Mack Publishing Company, Pennsylvania, USAを参照）。好適な投与経路を以下に考察するが、それには局所、静脈内、経口、経肺、経鼻、経耳、経眼、膀胱およびCNS送達が含まれる。
【０１５２】
例えば、本発明のポリペプチドインヒビターおよび医薬製剤は、ミクロスフェアなどの注入可能な持続放出薬物送達系を用いて送達することができる。これらを、具体的には注入頻度を少なくするように設計する。かかる系の一例は、ニュートロピン（Nutropin）デポーであって、これは組換えヒト成長ホルモン（rhGH）を生物分解性のミクロスフェアにカプセル封入したもので、注入するとrhGHを持続期間にわたって徐々に放出する。
【０１５３】
あるいは、本発明のインヒビターおよび医薬製剤を手術により移植するデバイスにより投与して、薬物を所要の部位へ直接放出することができる。
【０１５４】
エレクトロポレーション療法（EPT）システムも、ポリペプチドなどのインヒビターを投与するために使うことができる。パルス電場を細胞に送達するデバイスは細胞膜の薬物に対する透過性を増加し、細胞内薬物送達の著しい増加をもたらす。
【０１５５】
インヒビターはまた、エレクトロインコーポレーション（EI）により送達することもできる。EIは、皮膚表面上の直径30ミクロン以下の小粒子がエレクトロポレーションに使われるのと同じかまたは類似の電気パルスを受けたときに起こる。EIにおいて、これらの粒子は角質層を通って皮膚のさらに深い層内に駆動される。粒子は薬物もしくは遺伝子を充填されるかまたはコートされていてもよく、または単純に「弾丸」として作用し、皮膚に薬物が貫入できる孔を開けてもよい。
【０１５６】
インヒビター送達の代わりの方法は、感熱性のReGel注入可能な媒質である。体温より低いと、ReGelは注入可能な液体である一方、体温ではただちにゲル貯蔵所を形成して徐々に浸食されて公知の安全な生物分解性ポリマーに溶解する。活性薬はバイオポリマーとして時間をかけて送達される。
【０１５７】
インヒビターはまた、経口で送達することもできる。ポリペプチドを送達するかかる系の１つは、体内のビタミンB12を経口摂取する自然のプロセスを利用して、タンパク質とポリペプチドを同時送達する。ビタミンB12摂取系に載せることにより、タンパク質またはポリペプチドを腸壁に移動されることができる。複合体のビタミンB12部分の内因子（IF）に対する有意な親和性と複合体の薬物部分の有意な生物活性との両方を保持する、ビタミンB12類似体と薬物との間の複合体を作製する。
【０１５８】
好ましくは、本発明の医薬製剤は、活性成分の１日用量または単位、１日サブ用量またはその適当な画分を含有する単位投与製剤である。
【０１５９】
本発明のインヒビターおよび医薬製剤は、通常、経口でまたは非経口で、活性成分を含む医薬製剤の形態で、任意に、無毒の有機もしくは無機酸または塩基の付加塩の形態で、製薬上許容される投与剤形で投与される。障害および治療する患者、ならびに投与経路に応じて、組成物は様々な用量で投与することができる。
【０１６０】
ヒトの療法においては、本発明のインヒビターを単独で投与してもよいが、一般には、意図する投与経路および標準の医薬実施要領の関係で選択した好適な医薬品、賦形剤、希釈剤または担体と混合して投与しうる。
【０１６１】
例えば、インヒビター、例えば、本発明のポリペプチドは、経口、頬側または舌下に、錠剤、カプセル、卵形剤、エリキシル剤、溶液または懸濁液の形態で、投与することができ、それらは香料または着色剤を含有し、即時型、遅延型または制御放出型で施用してもよい。本発明の化合物はまた、空洞内注入経由で投与することもできる。
【０１６２】
かかる錠剤は、賦形剤、例えば、微結晶セルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、二塩基性リン酸カルシウムおよびグリシン；崩壊剤、例えば、デンプン（好ましくはトウモロコシ、ジャガイモまたはタピオカデンプン）、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウムおよびある特定の複雑なケイ酸塩；および造粒バインダー、例えば、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピル-メチルセルロース（HPMC）、ヒドロキシプロピルセルロース（HPC）、スクロース、ゼラチンおよびアカシアを含有してもよい。さらに潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリルおよびタルクを含んでもよい。
【０１６３】
類似したタイプの固体組成物をゼラチンカプセル中のフィラーとして使うこともできる。この関係の好ましい賦形剤には、ラクトース、デンプン、セルロース、乳糖または高分子量ポリエチレングリコールが含まれる。水性懸濁液および／またはエリキシル剤については、本発明の化合物を様々な甘味剤もしくは香料、着色物質もしくは染料と、乳濁化剤および／もしくは懸濁化剤と、ならびに水、エタノール、プロピレングリコールおよびグリセリン、ならびにそれらの組合わせなどの希釈剤と組合わせることができる。
【０１６４】
本発明のインヒビターはまた、非経口で、例えば、静脈内、関節内、腹腔内、くも膜下腔内、脳室内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内または皮下に投与することもできるし、あるいは注入技法により投与することもできる。最良の使用法は、溶液を血液と等張にするために十分な他の物質、例えば、塩またはグルコースを含有する無菌水溶液の形態である。水溶液は、必要であれば、好適に緩衝化しなければならない（好ましくは3〜9のpH）。無菌条件下の好適な非経口製剤の調製は、当業者に周知の標準の製薬技法により容易に実施することができる。
【０１６５】
非経口投与用に好適な製剤としては、抗酸化剤、バッファー、静菌剤、および溶質（製剤を意図するレシピエントの血液と等張にする）を含有してもよい水性および非水性無菌注入溶液；ならびに懸濁化剤および粘稠剤を含んでもよい水性および非水性懸濁液が挙げられる。製剤は単位用量または多用量容器、例えば、封入したアンプルおよびバイアルに入れて提示してもよく、凍結乾燥状態で貯蔵して使用直前に無菌の液担体、例えば注入用水を加えることを必要としてもよい。用事調製の注入溶液および懸濁液は、先に記載した種類の無菌粉末、顆粒および錠剤から調製することができる。
【０１６６】
ヒト患者への経口および非経口投与については、本発明の化合物の１日投与量レベルは通常、単一または分割用量で、成人1人当たり1〜1000mg（すなわち、約0.015〜15mg/kg）であろう。
【０１６７】
従って、例えば、本発明のインヒビターの錠剤またはカプセルは、適宜、一度に単一、または２以上の投与について、1mg〜1000mgの活性化合物を含有しうる。いずれの事象においても、医師は、いずれかの個々の患者に最も好適でありうる実際の投与量を決定し、その量は特定の患者の年齢、体重および応答によって変わりうるであろう。前記投与量は単に平均的な場合の例である。勿論、もっと高いまたはもっと低い投与量範囲が有利である個々の場合があり、これらは本発明の範囲に含まれる。
【０１６８】
本発明のインヒビターはまた、鼻腔内にまたは吸入により投与することもでき、好都合なのは、乾燥粉末吸入器または加圧容器、ポンプ、スプレーまたは噴霧器からのエーロゾルスプレー送達の形態で、好適な噴霧剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、1,1,1,2-テトラフルオロエタン（HFA 134A3）もしくは1,1,1,2,3,3,3-ヘプタフルオロプロパン（HFA 227EA3）などのヒドロフルオロアルカン、二酸化炭素または他の好適なガスを利用して送達する。加圧エーロゾルの場合、投与量単位は、一定量を送達するバルブを提供することによって決定してもよい。加圧容器、ポンプ、スプレーまたは噴霧器は、例えば、エタノールと噴霧剤の混合液を溶媒として用いる活性化合物の溶液または懸濁液を含有してもよく、これはさらに、滑沢剤、例えば、ソルビタントリオレイン酸を含有してもよい。吸入器または吹送器で使用する（例えば、ゼラチンから作られた）カプセルおよびカートリッジは、本発明の化合物とラクトースまたはデンプンなどの好適な粉末基剤を含有するように製剤することができる。
【０１６９】
エーロゾルまたは乾燥粉末製剤は、好ましくは、それぞれの一定用量または「パフ」が本発明の化合物の少なくとも1mgを患者に送達するように手配される。エーロゾルの全体の日用量は患者毎に変わりうるのであって、単一用量または、通常はそれ以上、１日を通して分割した用量で投与することができる。
【０１７０】
あるいは、本発明のインヒビターは、坐剤または膣座薬の剤形で投与することができるし、または局所にローション、溶液、クリーム、軟膏または散布パウダーの剤形で施用することもできる。本発明の化合物はまた、経皮的に、例えば、皮膚パッチを用いて投与することもできる。これらはまた、眼の経路により投与することもできる。
【０１７１】
眼科に用いる場合、本発明のインヒビターは、等張のpH調節した無菌生理食塩水中の微粒化懸濁液として、または、好ましくは、等張のpH調節した無菌生理食塩水中の溶液として、任意に、塩化ベンジルアルコニウムなどの保存剤と組合わせて製剤することができる。あるいは、これらはワセリンなどの軟膏に入れて製剤することができる。
【０１７２】
皮膚へ局所的に施用する場合、本発明のインヒビターは、例えば、鉱油、液体ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックスおよび水の１以上との混合物に懸濁または溶解した活性化合物を含有する好適な軟膏として製剤することができる。あるいは、これらは、例えば、鉱油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリエチレングリコール、液体パラフィン、ポリソルベート60、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、2-オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水のうちの１以上の混合物に懸濁または溶解した好適なローションまたはクリームとして製剤することができる。
【０１７３】
一般的にヒトでは、本発明のインヒビターの経口または非経口投与が好ましい経路であり、最も好都合である。
【０１７４】
インヒビターまたはその製剤のかかる有効量は、単一ボーラス用量（すなわち、急性投与）または、より好ましくは、ある期間にわたる一連の用量（すなわち、慢性投与）として送達できることを当業者は理解するであろう。
【０１７５】
当業者はさらに、本発明のインヒビターおよび医薬製剤は医学および獣医学領域の両方で用途を有することを理解するであろう。従って、本発明のインヒビターは、ヒトと非ヒト動物（ウマ、イヌおよびネコなど）両方の治療に用いることができる。しかし好ましくは、患者はヒトである。
【０１７６】
獣医学用の場合、本発明のインヒビターは通常の獣医学の慣習に従って好適な許容される製剤で投与され、獣医師は特定の動物に対して最も適当でありうる投与レジメンおよび投与経路を決定するであろう。
【０１７７】
第８の態様においては、本発明の第１の態様によるインヒビターまたは本発明の第７の態様による医学に使用する医薬製剤が提供される。
【０１７８】
本発明の第９の態様は、免疫グロブリン鎖の凝集に関係する疾患または症状を治療する医薬品の調製における、本発明の第１の態様によるインヒビター、またはその天然の同等物、または本発明の第７の態様による医薬製剤の使用を提供する。
【０１７９】
「その天然の同等物」によって、本発明者らは、免疫グロブリン鎖（または免疫グロブリンVLまたはCH1ドメイン）の凝集を阻害し、本発明の第１の態様に関係して先に定義したインヒビターの特性を示す天然のまたはそうではなくて公知のタンパク質およびポリペプチドを含める。例えば、天然の同等体は配列番号1〜5のいずれか１以上によるアミノ酸配列を含みうる。
【０１８０】
ある好ましい実施形態において、免疫グロブリン鎖は免疫グロブリン軽鎖または免疫グロブリン軽鎖可変ドメインである。
【０１８１】
代わりの好ましい実施形態において、免疫グロブリン鎖は免疫グロブリン重鎖または免疫グロブリン重鎖ドメインである。
【０１８２】
従って、本発明のインヒビターおよび製剤は、免疫グロブリン鎖の原繊維形成に関係する疾患または症状を治療する医薬品の調製に用いることができる。例えば、原繊維形成には単一のcis-プロリンを有する免疫グロブリン鎖の領域が介在しうる。一実施形態においては、ファイバーはVκ鎖を含むかまたはそれらから成る。
【０１８３】
好ましくは、本発明のインヒビターおよび製剤を用いて次の症状または病状を患うかまたは患うリスクのある患者または被験体を治療することができる：
軽鎖沈着症（LCDD）、アミロイド疾患、細菌感染、および過剰なヒスタミン生産を特徴とする疾患/症状。
【０１８４】
より好ましくは、患者または被験体は軽鎖沈着症（LCDD）を患うかまたは患うリスクがある。
【０１８５】
あるいは、患者または被験体はアミロイド疾患を患うかまたは患うリスクがある。
【０１８６】
PpLは、色々な臨床標本中の細菌性膣疾患の病原性因子として記載されている（Kastern et al., 1990, Infect. Immun 58, 1217-22を参照）。いくつかの病原菌はIgG結合特性をもつ細胞表面タンパク質を提示して、宿主組織の浸潤およびコロニー形成中に利点を得る。PpLは、Fcε受容体に結合したIgEと架橋することにより、好塩基球および肥満細胞によるヒスタミン放出を誘発する（Patella et al., 1990, J. Immunol. 145, 3054-61；Genovese et al., 2000, Infect. Immun. 68, 5517-24を参照）。
【０１８７】
さらなる好ましい実施形態において、本発明は細菌感染を治療する医薬品の調製における、本発明の第１の態様によるインヒビター、またはその天然の同等物、または本発明の第７の態様による医薬製剤の使用を提供する。好ましくは、細菌はペプトストレプトコッカス（Peptostreptococcal）菌および連鎖球菌の細菌からなる群より選択される。
【０１８８】
従って、本発明は、（先に記載の）免疫グロブリン鎖の凝集を阻害できる薬剤による治療を必要とする患者を治療する方法であって、患者に、本発明の第１の態様によるインヒビター、またはその天然の同等物、または本発明の第７の態様による医薬製剤の有効量を投与することを含む前記方法を提供する。
【０１８９】
本発明はさらに、（先に記載の）細菌に感染したかまたは感染に感受性のある患者を治療する方法であって、患者に、本発明の第１の態様によるインヒビター、またはその天然の同等物、または本発明の第７の態様による医薬製剤の有効量を投与することを含む前記方法を提供する。
【０１９０】
「治療」および「治療する」により、本発明者らは患者の治療および予防的治療の両方を含める。用語「予防的」を用いて、患者もしくは被験体の症状 または 病状の尤度を防止するかまたは低下させる、本明細書に記載のインヒビターまたは製剤の使用を包含する。
【０１９１】
以上考察したように、本明細書では用語「有効な量」を用いて、治療する疾患または症状の好都合な変化（その変化が緩解、好都合な生理学的結果、治療する病状または症状の逆転または減弱、治療する疾患または症状に応じて起こる症状または病状の防止または尤度の低下であれ）を生じうる、本発明による化合物の濃度または量を記載する。本発明のポリペプチドを組合わせて使用する場合、それぞれのポリペプチドを有効な量だけ使用することができ、その場合、有効な量は相乗作用量を含んでもよい。
【０１９２】
本発明のインヒビターと製剤は、特別な疾患または症状を治療するための１以上の公知または慣用の薬剤と組合わせて同時投与できることを当業者は理解するであろう。「同時投与する」は、インヒビターならびに同時投与した化合物が、化合物を実際に投与した時（同時を含めて）に関係なく、患者の身体内に（例えば、血流中に）同時に見出されるように本発明のインヒビターを患者に投与することを意味する。
【０１９３】
例えば、患者がアミロイド疾患または症状を患っている場合、本発明のインヒビターまたは製剤を化学／放射線療法および／または末梢の血液幹細胞移植と組合わせて投与することができる。
【０１９４】
同様に患者が細菌に感染している場合、本発明のインヒビターまたは製剤を１以上の慣用の抗生物質薬と組合わせて投与することができる。
【０１９５】
本発明の第１０の態様はさらに、本発明の第１の態様によるインヒビター、またはその天然の同等物、または本発明の第７の態様による医薬製剤の、免疫グロブリン鎖凝集を防止するための使用を提供する。
【０１９６】
例えば、本発明の第１の態様によるポリペプチド、変異体、融合体または誘導体、または本発明の第７の態様による医薬製剤は、免疫グロブリンサンプル／調製物をin vitroで安定化させる添加剤として使用することができる。従って、本発明はさらに、かかる免疫グロブリンサンプル／調製物を包含する。
【０１９７】
本発明の第１１の態様は、抗体または抗原結合フラグメントまたはその誘導体をサンプルから単離または精製する方法であって、サンプルを本発明の第１の態様によるインヒビター、またはその天然の同等物と、抗体または抗原結合フラグメントまたはその誘導体（もしサンプル中に存在すれば）との結合が可能になる条件下で接触させるステップを含んでなる前記方法を提供する。いったん他の不純物が除去されると、次いで抗体または抗原結合フラグメントまたはその誘導体を、本発明の第１の態様によるインヒビターとの結合を破壊することにより回収することができる。
【０１９８】
本発明の第１２の態様は、サンプル中の抗体または抗原結合フラグメントまたはその誘導体の存在または非存在を検出する方法であって、サンプルを本発明の第１の態様によるインヒビター、またはその天然の同等物と、抗体または抗原結合フラグメントまたはその誘導体（もしサンプル中に存在すれば）との結合が可能になる条件下で接触させるステップを含んでなる前記方法を提供する。
【０１９９】
本発明の第１１および第１２の態様のある好ましい実施形態において、インヒビターは固定される。例えば、インヒビターはクロマトグラフィカラムのアフィニティマトリックスを形成してもよい。
【０２００】
目的のペプチド／タンパク質を共有結合させる支持体を提供するカラムの例には、Milliporeからの活性化ProSep （ProSep-5CHO および ProSep-9CHO）；BioRadからのAffi-Gelが含まれる。
【０２０１】
本発明の第１３の態様は、免疫グロブリン鎖の凝集を阻害できる薬物様化合物または薬物様化合物開発のためのリード化合物を同定する方法であって、免疫グロブリン鎖との結合に対して、本発明の第１の態様によるインヒビター、またはその天然の同等物と競合する能力について前記化合物を試験するステップを含んでなる前記方法を提供する。
【０２０２】
ある好ましい実施形態において、免疫グロブリン鎖は免疫グロブリン軽鎖または免疫グロブリン軽鎖可変ドメインである。
【０２０３】
代わりの好ましい実施形態において、免疫グロブリン鎖は免疫グロブリン重鎖または免疫グロブリン重鎖CH1ドメインである。
【０２０４】
免疫グロブリン鎖、またはそのドメインの凝集を阻害する候補化合物の能力は、競合結合アッセイ、例えば、アフィニティクロマトグラフィまたはBIAcoreにより評価することができる。候補化合物はポリペプチドまたは非ポリペプチド化合物であってもよい。軽鎖凝集の阻害は、試験化合物と本発明の第１のポリペプチド（または、例えば、ポリペプチドを置換することによって得た本発明の第２のポリペプチド）との免疫グロブリン軽鎖またはその可変ドメインに対する結合について競合する能力により、定量することができる。置換されたポリペプチドはいくつもの技法によりアッセイすることができる。例えば、放射標識したポリペプチドは市販の放射標識したアミノ酸前駆体を用いて合成することができる。3H、14Cまたは35Sにより放射標識したポリペプチドは、通常の液体シンチレーション技法により定量することができる。あるいは、蛍光標識したポリペプチドを合成することができる。例えば、リシンを重要でない位置に挿入し、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）により標識することができる。FITCだけでなく、ポリペプチドを任意の好適なフルオロフォアにより標識してもよい。１以上の本発明のポリペプチドのカルボキシフルオレセイン誘導体を調製することができる。あるいは、アミドペプチド連鎖により環化したポリペプチドは、チオシアネートなどの蛍光化合物と連結するのに利用することができる遊離スルフヒドリル基を有する。結合したポリペプチドを無結合のポリペプチドから分離し、置換されたポリペプチドを、当業者に公知の通常の技法により定量することができる。
【０２０５】
本発明のこの実施形態は、置換されたポリペプチドを定量するために用いた方法により限定されるものでなく、任意の好適な分析技法を使用できることは理解されるであろう。
【０２０６】
関係する本発明の態様は、PpLと免疫グロブリン軽鎖、または免疫グロブリン軽鎖可変ドメインとの結合を阻害できる薬物様化合物または薬物様化合物を開発するためのリード化合物を同定する方法であって、免疫グロブリン軽鎖もしくは免疫グロブリン軽鎖可変ドメインとの結合に対して、本発明の第１の態様によるインヒビター、またはその天然の同等物と競合する能力について前記化合物を試験するステップを含んでなる前記方法を提供する。
【０２０７】
さらなる本発明の関係する態様は、SpGと免疫グロブリン重鎖、または免疫グロブリン重鎖CH1ドメインとの結合を阻害できる薬物様化合物または薬物様化合物開発のためのリード化合物を同定する方法であって、免疫グロブリン重鎖もしくは免疫グロブリン重鎖CH1ドメインとの結合に対して、本発明の第１の態様によるインヒビター、またはその天然の同等物と競合する能力について前記化合物を試験するステップを含んでなる前記方法を提供する。
【０２０８】
化合物を同定するための上記の方法のそれぞれについて、候補化合物は薬物様化合物または薬物様化合物開発のためのリード化合物であってもよい。前記方法は、医薬品化合物または薬物の開発における当業者に周知のスクリーニングアッセイとして有用でありうることは理解されるであろう。
【０２０９】
用語「薬物様化合物」は当業者に周知であり、例えば、医薬品の活性成分として医学での使用に好適な特徴を有する化合物の意味を含みうる。従って、例えば、薬物様化合物は有機化学の技法により、（それより好ましくはないが）分子生物学または生化学の技法により合成できる分子であって、好ましくは、5000ダルトン未満の分子量である小分子であってもよい。薬物様化合物はさらに、１以上の特別なタンパク質と選択的に相互作用する特性を示してもよく、バイオアベイラビリティを有しおよび／または細胞膜を透過できてもよい、しかしこれらの特性は必須ではない。
【０２１０】
用語「リード化合物」は、同様に当業者に周知であり、その化合物が、それ自体は薬物としての使用に（例えば、それが単にその意図する標的に対して効力が弱い、その作用が非選択的である、不安定である、合成が困難である、またはバイオアベイラビリティが乏しいという理由で）不適であるものの、さらに所望の特徴を有しうる他の化合物を設計するための出発点を提供できるという意味を含みうる。
【０２１１】
前記化合物は、本発明のインヒビターと、免疫グロブリン軽鎖のFR1域との結合について競合できるポリペプチドでありうることは理解されるであろう。
【０２１２】
軽鎖凝集をin vivoで阻害できる化合物を同定することが所望されることはさらに理解されるであろう。従って、本発明の方法で使用する試薬および条件は、前記ポリペプチドと免疫グロブリン軽鎖との間の相互作用がin vivoで軽鎖間と実質的に同じになるように選択できることは理解されるであろう。
【０２１３】
本発明のスクリーニングアッセイで同定された「薬物様化合物」と「リード化合物」はさらなるスクリーニングで好適な試験が行われ、軽鎖沈着症を治療する上でのその潜在的有用性が決定される。
【０２１４】
本発明の第１３の態様のある好ましい実施形態において、本方法はさらに、こうして同定された化合物を製薬上許容される担体と混合するステップを含んでなる。
【０２１５】
本方法はまた、スクリーニングアッセイの結果を、例えば、情報媒体に記録または保存された、またはコンピューターで読取り可能なファイルとして保存された知的（インテリジェント）フォーマットで提供するステップも含んでなる。
【０２１６】
本発明はまた、本発明の第１３の態様による方法によって得ることができるまたは得た化合物、ならびに医学に使用するためのかかる化合物も提供する。
【０２１７】
以上に詳しく説明した通り、本発明のインヒビターは免疫グロブリン軽鎖のFR1域とアミノ酸位置12にて結合することができる。本発明者らは、このアミノ酸は凝集過程で免疫グロブリン軽鎖がお互いに結合する当にその部位であることを同定した。この結合部位を効果的にブロックすることにより、本発明のインヒビターは軽鎖凝集を阻害することができる。
【０２１８】
本発明がまた包含する、軽鎖凝集を阻害する代わりの計画は、免疫グロブリン軽鎖または可変ドメイン自体をFR1域の位置12またはその近くで改変して、他の軽鎖との結合部位としてもう機能できないようにすることである。
【０２１９】
従って、本発明の第１４の態様は、その軽鎖可変ドメインのFR1域が抗体、フラグメント、融合体または誘導体の凝集物を形成する能力を少なくとも部分的に阻害するように改変（例えば、突然変異）された、非天然の抗体、または軽鎖可変ドメインを含むその抗原結合フラグメント、融合体または誘導体、または前記フラグメントの融合体または誘導体を提供する。
【０２２０】
本発明の上記態様において、FR1ドメインが改変された抗体または軽鎖可変ドメインを含む抗原結合フラグメント、融合体または誘導体は、融合タンパク質の部分であって、例えば、その融合パートナーが、例えば、血清アルブミンと結合することにより血清半減期を延長する、さらなる抗体または軽鎖可変ドメインを含むその抗原結合フラグメント、融合体または誘導体であってもよい。
【０２２１】
本発明の上記態様において、軽鎖可変ドメインは、例えば、１以上のアミノ酸位置8〜22（Kabat系を用いて付与）で改変されていてもよい。
【０２２２】
好ましくは、免疫グロブリン可変ドメインまたは抗体は、異種特異的なポリペプチドと結合できるいずれの生物学的物質であってもよい標的と特異的に結合する。標的は、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、オリゴ核酸、糖、多糖、糖タンパク質であってもよい。例としては、限定されるものでないが、治療標的、診断標的、受容体、受容体リガンド、ウイルスのコートタンパク質、免疫系タンパク質、ホルモン、酵素、抗原、細胞シグナル伝達タンパク質、またはその断片が挙げられる。標的は、生来のタンパク質またはその断片、その相同配列、その機能的部分、または相同配列の機能的部分であってもよい。標的には、限定されるものでないが、IgE、腫瘍壊死因子α（TNF-α）、フォン・ビルブラント因子（vWF）、vWF A1またはA3 5ドメイン、gplb、gpla/llA、コラーゲンまたはその断片、またはその相同性配列の断片、インターフェロンγ（IFN-γ）、アミロイド-β（A-β）またはその断片、トランスフェリン受容体特異的リガンド-神経医薬品の融合タンパク質（その教示が本明細書に参照により組み入れられる米国特許第5,977,307号を参照）、脳毛細管内皮細胞受容体、トランスフェリン、トランスフェリン受容体（例えば、可溶トランスフェリン受容体）、インスリン、インスリン様増殖因子1（IGF 1）受容体、インスリン様増殖因子2（IGF 2）受容体、インスリン受容体、血液凝固因子X、αl-アンチトリプシンおよびHNF 1αが含まれる。血清半減期を延長する好適なポリペプチドとしてはまた、α-1糖タンパク質（オロソムコイド；AAG）、α-1抗キモトリプシン（ACT）、α-1ミクログロブリン（タンパク質HC；AIM）、抗トロンビンIII（AT III）、アポリポプロテインA-1（Apo A-1）、アポリポプロテインB（Apo B）、セルロプラスミン（Cp）、補体成分C3（C3）、補体成分C4（C4）、C1エステラーゼインヒビター（C1 INH）、C反応性タンパク質（CRP）、フェリチン（FER）、ヘモペキシン（HPX）、リポタンパク質(a)（Lp(a)）、マンノース結合タンパク質（MBP）、ミオグロビン（Myo）、プレアルブミン（トランスサイレチン；PAL）、レチノール-結合タンパク質（RBP）、およびリウマチ因子（RF）コラーゲン、ラミニン、インテグリンおよびフィブロネクチン、血漿タンパク質［例えば、フィブリン、α-2マクログロブリン、血清アルブミン、フィブリノーゲン（例えば、フィブリノーゲンA、フィブリノーゲンB）、血清アミロイドプロテインA、ハプトグロビン、プロフィリン、ユビキチン、ウテログロブリンおよびα-2-ミクログロブリン）、酵素および酵素インヒビター（例えば、プラスミノーゲン、リゾチーム、シスタチンC、α-1-アンチトリプシンおよび膵臓トリプシンインヒビター）、免疫グロブリンタンパク質（例えば、IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、免疫グロブリン軽鎖（κ／λ）などの免疫系タンパク質］、輸送タンパク質（例えば、レチノール結合タンパク質、α-1ミクログロブリン）、デフェンシン（例えば、β-デフェンシン1、好中球デフェンシン1、好中球デフェンシン2および好中球デフェンシン3）、血液脳関門または神経組織で見出されるタンパク質、例えば、メラノコルチン受容体、ミエリン、アスコルビン酸輸送体など、腎臓に局在するタンパク質（例えば、ポリシスチン、IV型コラーゲン、有機アニオン輸送体Kl、Heymann抗原）、肝臓に局在するタンパク質（例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ、G250）、肺に局在するタンパク質（例えば、IgAと結合する分泌性成分）、心臓に局在するタンパク質（例えば、拡張型心筋症に関係するHSP 27）、皮膚に局在するタンパク質（例えば、ケラチン）、骨特異的タンパク質［例えば、骨原性活性を示すタンパク質のトランスフォーミング増殖因子βスーパーファミリーのサブセットである形態形成性タンパク質（BMP）（例えば、BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8）］、腫瘍特異的タンパク質（例えば、 栄養芽細胞抗原、ハーセプチン受容体、パラプレギン受容体、カテプシン（例えば、肝臓 および 脾臓に見出されるカテプシンB））、疾患特異的タンパク質、例えば、活性化T細胞上でのみ発現される抗原、すなわち、LAG-3（リンパ球活性化遺伝子）、オステオプロテグリンリガンド（OPGL；Nature 402、304-309 (1999)を参照）、OX40（活性化T細胞上で発現され、ヒトT細胞白血病ウイルスI型（HTLV-I）を産生する細胞で特異的に上方調節されるTNF受容体ファミリーの一メンバー；Immunol. 165 (1)：263-70 (2000)を参照）、メタロプロテアーゼ（関節炎/癌に関連して）、例えば、CG6512ショウジョウバエ、ヒトパラプレギン、ヒトFtsH、ヒトAFG3L2、マウスftsH；および血管形成増殖因子、例えば、酸性繊維芽細胞増殖因子（FGF-1）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（FGF-2）、血管内皮増殖因子／血管透過性因子（VEGF/VPF）、トランスフォーミング増殖因子-α（TGF-α）、腫瘍壊死因子-α（TNF-α）、アンジオゲニン、インターロイキン-3（IL-3）、インターロイキン-8（IL-8）、血小板由来の内皮増殖因子（PD-ECGF）、胎盤増殖因子（P1GF）、ミッドカイン血小板由来増殖因子-BB（PDGF）、およびフラクタルカイン、熱ショックタンパク質（HSP）などのストレスタンパク質が挙げられる。HSPは通常、細胞内に見出される。HSPが細胞外に見出されるときは、細胞が死んだかその含量が溢流したことの指標となる。この非プログラム細胞死（壊死）は、外傷、疾患または傷害の結果として、細胞外HSPが免疫系からの応答を誘発するときに起こる。細胞外HSPとの結合は本発明の成分の疾患部位への局在化をもたらし、Fc輸送に関わるタンパク質には、例えば、Brambell受容体（FcRBとしても知られる）が含まれる。このFc受容体は２つの機能を有し、その両方とも送達に役立つ可能性がある。前記機能とは、(1)親から子への胎盤を横切るIgGの輸送と(2)IgGを分解から保護してその血清半減期を延長することである。受容体はIgGをエンドソームからリサイクルすると考えられる。（Holliger et al., Nat Biotechnol 15(7)：632-6 (1997)を参照されたい）。細胞表面タンパク質、例えばCD抗原、サイトカイン受容体（例えば、インターロイキン受容体、ケモカイン受容体）、接着分子または共刺激性分子。例えば、ポリペプチド薬は、サイトカイン、増殖因子、サイトカイン受容体、増殖因子受容体および他の標的リガンドと結合することができ、それらとしては、限定されるものでないが：ApoE、Apo-SAA、BDNF、カルジオトロフィン-1、CEA、CD40、CD40リガンド、CD56、CD38、CD138、EGF、EGF受容体、ENA-78、エオタキシン（Eotaxin）、エオタキシン-2（Eotaxin-2）、エキソダス-2（Exodus-2）、FAP-α、FGF-酸性、FGF-塩基性、繊維芽細胞増殖因子-10、FLT3リガンド、フラクタルカイン（CX3C）、GDNF、G-CSF、GM-CSF、GF-β1、ヒト血清アルブミン、インスリ��、IGF-I、IGF-II、IL-1α、IL-1β、IL-1受容体、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8（72 a.a.）、IL-8（77 a.a.）、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18（IGIF）、インヒビンα、インヒビンβ、IP-10、ケラチノサイト増殖因子-2（KGF-2）、KGF、レプチン、LIF、リンフォタクチン（Lymphotactin）、ミューラー（Mullerian）阻害物質、単球コロニー阻害因子、単球誘引タンパク質、M-CSF、MDC （67 a.a.）、MDC（69 a.a.）、MCP-1（MCAF）、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MDC（67 a.a.）、MDC（69 a.a.）、MIG、MIP-1α、MIP-1β、MIP-3α、MIP-3β、MIP-4、骨髄前駆体インヒビター因子-1（MPIF-1）、NAP-2、ニュールツリン（Neurturin）、神経成長因子、β-NGF、NT-3、NT-4、オンコスタチンM、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PF-4、RANTES、SDF1α、SDF1β、SCF、SCGF、幹細胞因子（SCF）、TARC、TGF-α、TGF-β、TGF-β2、TGF-β3、腫瘍壊死因子（TNF）、TNF-α、TNF-β、TNF受容体I、TNF受容体II、TNIL-1、TPO、VEGF、VEGF A、VEGF B、VEGF C、VEGF D、VEGF受容体1、VEGF受容体2、VEGF受容体3、GCP-2、GRO/MGSA、GRO-β、GRO-γ、HCC1、1-309、HER 1、HER 2、HER 3およびHER 4、TACE認識部位、TNF BP-IおよびTNF BP-II、また、ホルモン、例えば、下垂体ホルモン（PTH）、副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）、レニン、黄体形成ホルモン-放出ホルモン（LHRH）、性腺刺激ホルモン-放出ホルモン（GnRH）、黄体形成ホルモン（LH）、卵胞刺激ホルモン（FSH）、アルドステロン、などが挙げられる。好適な薬物としてはまた、ケラチノサイト増殖因子、インターフェロン（例えば、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IFN-ω）、エリスロポエチン（EPO）、プロテアーゼ、エラスターゼ、LHRH類似体、アゴニストおよびアンタゴニスト、κオピオイド受容体アゴニスト（例えば、ダイノルフィンA）などのオピオイド受容体アゴニスト、カルシトニンおよびカルシトニン類似体、抗利尿ホルモン（バソプレッシン）、オキシトシンアンタゴニスト、血管作動性腸ペプチド、トロンビンインヒビター、界面活性剤およびカタツムリ毒液（例えば、ジコノチド）、ならびに、表５または表６に開示したいずれかの標的（添付資料に記載の組合わせで、異なる組合わせで、または個々にのどれで）が挙げられる。以上のリストは徹底したものでないことは理解されよう。
【０２２３】
本発明の第１４の態様のある好ましい実施形態においては、軽鎖可変ドメインを、アミノ酸位置9、10、11、12、13または14（Kabat系を用いて付与）の１以上で改変する。例えば、軽鎖可変ドメインのFR1域の位置9、10、11、12、13または14の１以上の天然アミノ酸を、可変ドメインのFR1域内のポリペプチド骨格の、例えば、他の軽鎖可変ドメインとH結合を形成する能力を阻害するアミノ酸により置き換えることができる。可変ドメインのFR1域内のポリペプチド骨格のH結合を形成する能力を阻害するアミノ酸は、大きいおよび／またはバルキーなアミノ酸残基、例えばトリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、プロリンでありうる。
好ましくは、軽鎖可変ドメインのFR1域の位置9、10、11、12、13または14の１以上の天然アミノ酸を、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシンからなる群より選択されるアミノ酸によって置き換える。
【０２２４】
より好ましくは、軽鎖可変ドメインのFR1域の位置9、10、11、12、13または14の１以上の天然アミノ酸をプロリンによって置き換える。
【０２２５】
最も好ましくは、軽鎖可変ドメインを、FR1域の位置12で、例えば、天然アミノ酸（典型的には、κ軽鎖のセリン）をプロリンに置き換えることにより改変する。従って、好ましい突然変異はS12Pである。
【０２２６】
FR1域に行う改変はまた、他の手段により、例えば、アミノ酸の１以上を非天然アミノ酸または模倣物により置き換えることによって行うことができることを当業者は理解するであろう。さらに、FR1域を、化学的手段またはPEG基の使用などの結合または会合を妨げる大きい化合物の付加により改変することもできる。
【０２２７】
本発明の第１４の態様の抗体、フラグメント、融合体または誘導体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体（ここで少なくとも１つのアミノ酸は天然のヒト抗体と比較して突然変異している）、１本鎖抗体、二特異的抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖および／または軽鎖のホモ二量体およびヘテロ二量体、ならびに抗原結合フラグメントおよび前記誘導体を含むかまたはから成ってもよいことを当業者は理解するであろう。
【０２２８】
同様に、軽鎖可変ドメインを含む抗原結合フラグメントは、Fvフラグメント（例えば、１本鎖Fvおよびジスルフィド結合Fv）、Fab様フラグメント（例えば、Fabフラグメント、Fab'フラグメントおよびF(ab)2フラグメント）、モノマーの単一可変ドメイン（ドメイン抗体；dAb、例えば、VH、VHHおよびVLドメイン）および二重特異的フォーマット［例えば、dAb-リンカー-dAb］）、および前記の改変バージョン（例えば、ポリエチレングリコールまたは他の好適なポリマーの共有結合付着により改変された）からなる群より選択してもよいことは理解されるであろう。
【０２２９】
好ましくは、抗原結合フラグメントはドメイン抗体（１本鎖または多量体フォーマットのどちらかの）である。
【０２３０】
従って、一実施形態においては、成分Vκサブユニットの１以上のFR1域が少なくとも部分的に、Vκ多量体の凝集物を形成する能力を阻害するように（例えば、アミノ酸位置9、10、11、12および／または13にて）改変されているVκ多量体（二量体および三量体などのホモオリゴマー）を提供する。かかる改変は、より容易に精製を達成することを可能にし、および／または溶解度特性の改善に導く。例えば、多量体フォーマットのドメイン抗体鎖の１つを除く全てにS12P突然変異を組み込んでいる、または代わりに、多量体フォーマットのドメイン抗体鎖の１以上にS9Lおよび／またはS10P突然変異を組み込んでいるVκ多量体を提供することができる。
【０２３１】
さらなる好ましい実施形態において、本発明の第１４の態様の抗体、フラグメント、融合体または誘導体は、細胞傷害性または検出可能な部分を含んでもよい。例えば、抗体、フラグメント、融合体または誘導体は放射性または蛍光部分を含んでもよい。
【０２３２】
本明細書で使用する用語「細胞傷害性」および「検出可能な」部分は、それぞれ細胞傷害性または検出可能な化学種の生成に直接または間接に関わる単一の原子および分子を意味する。かかる部分を、本発明の抗体、フラグメント、融合体または誘導体に連結するかまたは組み込んでまたは分離して使ってもよく、またこれらの原子または分子を単独でまたはさらなる試薬と一緒に使ってもよい。好適な細胞傷害性または検出可能な部分は医薬品化学では周知であり、またこれらの部分とポリペプチドおよびタンパク質との連結は当技術分野で周知である。細胞傷害性または検出可能な部分の例としては、限定されるものでないが、放射性同位元素（例えば、3H、14C、35S、123I、125I、131I、99Tc、111In、90Y、188Re）、放射性核種（例えば、11C、18F、64Cu）、蛍光標識（例えば、FITC、ローダミン、ランタニド蛍光体、カルボシアニン）、酵素標識（例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光基、ビオチニル基、二次レポーターにより認識される予め決められたポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー・ペア配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）が挙げられる。いくつかの実施形態においては、標識を様々な長さのスペーサーアームにより結合して潜在的な立体障害を減ずる。
【０２３３】
本発明はまた、本発明の第１４の態様の抗体、フラグメント、融合体または誘導体を産生する方法も提供する。
【０２３４】
従って、本発明のさらなる態様は、
（a）本発明の第１４の態様の抗体、フラグメント、融合体または誘導体をコードする単離された核酸分子（例えば、DNA分子）；
（b）かかる核酸分子を含むベクター（例えば、発現ベクター）；および
（c）かかる核酸分子またはベクターを含む宿主細胞を提供する。
【０２３５】
例示の好ましいベクターおよび宿主細胞は、本発明の第２の態様に関係して先に記載されている。
【０２３６】
本発明のさらなる態様は、本発明の第１４の態様の抗体、フラグメント、融合体または誘導体を作製する方法であって、抗体、フラグメント、融合体または誘導体を発現する宿主細胞を培養するステップ、およびそれから得られるポリペプチドを単離するステップを含んでなる前記方法を提供する。
【０２３７】
抗体および抗体フラグメントを作製する方法は当技術分野で周知である。例えば、抗体は、抗体分子のin vivo産生の誘導、免疫グロブリンライブラリーのスクリーニング（Orlandi. et al, 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86：3833-3837； Winter et al., 1991、Nature 349：293-299）、または培養における細胞株によるモノクローナル抗体分子の作製を利用する、いくつかの方法の任意の１つを経由して作製することができる。これらの方法としては、限定されるものでないが、ハイブリドーマ技法、ヒトB細胞ハイブリドーマ技法、およびエプスタイン・バーウイルス（EBV）ハイブリドーマ技法（Kohler et al., 1975. Nature 256:4950497；Kozbor et al., 1985. J. Immunol. Methods 81:31-42；Cote et al., 1983. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030；Cole et al., 1984. Mol. Cell. Biol. 62:109-120）が挙げられる。
【０２３８】
選択した抗原に対する好適なモノクローナル抗体は、公知の技法、例えば、“Monoclonal Antibodies: A manual of techniques”, H Zola （CRC Press, 1988）、および“Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications”, J G R Hurrell (CRC Press, 1982)に開示された技法により調製することができる。
【０２３９】
抗体フラグメントは、当技術分野で周知の方法を用いて得ることができる（例えば、Harlow & Lane, 1988, “Antibody： A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, New Yorkを参照されたい）。例えば、本発明による抗体フラグメントは、抗体のタンパク質分解性加水分解により、または断片をコードするDNAの大腸菌または哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養または他のタンパク質発現系）における発現により調製することができる。あるいは、抗体フラグメントは、通常の方法による全抗体のペプシンまたはパパイン消化によって得ることができる。
【０２４０】
当業者は、ヒト療法または診断用にヒト化抗体が好ましいことを理解するであろう。非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化型は、遺伝子操作で作られた最小限の非ヒト抗体由来の部分を有するキメラ抗体または抗体フラグメントであることが好ましい。ヒト化抗体は、ヒト抗体（レシピエント抗体）の相補性決定領域を、所望の機能を有するマウス、ラットまたはウサギの非ヒト種（ドナー抗体）の相補性決定領域由来の残基により置き換えた抗体を含む。いくつかの事例では、ヒト抗体のFvフレームワーク残基を対応する非ヒト残基により置き換える。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体にもまたはインポートした相補性決定域またはフレームワーク配列にも存在しない残基を含んでもよい。一般に、ヒト化抗体は少なくとも１つ、２つまたは典型的には４つの可変ドメインの全てを実質的に含み、これらの可変ドメインにおいて、相補性決定域の全てまたは実質的に全ては非ヒト抗体のそれに対応し、かつフレームワーク域の全てまたは実質的に全ては関連するヒトコンセンサス配列のそれに対応する。最適なヒト化抗体はまた、典型的にはヒト抗体由来のFc域のような抗体定常域の少なくとも部分も含む（例えば、Jones et al., 1986. Nature 321:522-525；Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-329；Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596を参照）。
【０２４１】
非ヒト抗体をヒト化する方法は当技術分野で周知である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入された１以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基（しばしばインポート残基と呼ばれる）は、典型的にはインポート可変ドメインから取り込まれる。ヒト化は本質的に、記載のように（例えば、Jones et al., 1986, Nature 321:522-525；Reichmann et al., 1988. Nature 332:323-327；Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536l；US 4,816,567を参照）、ヒト相補性決定域を対応するげっ歯類相補性決定域と置換することにより行うことができる。従って、かかるヒト化抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少なく、非ヒト種由来の対応する配列により置換されているキメラ抗体である。実際、ヒト化抗体は、いくつかの相補性決定域残基と恐らくはいくつかのフレームワーク残基がげっ歯類抗体の類似部位からの残基により置換されたヒト抗体である。
【０２４２】
ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーを含む当技術分野で公知の様々な技法を用いて同定することができる（例えば、Hoogenboom & Winter, 1991, J. Mol. Biol. 227:381；Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581；Cole et al., 1985, In: Monoclonal antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pp. 77；Boerner et al., 1991. J. Immunol. 147:86-95を参照）。
【０２４３】
本発明のさらなる態様は、本発明の第１４の態様の抗体、フラグメント、融合体または誘導体と医学上または獣医学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体との混合物を含む医薬製剤を提供する。例示の好ましい医薬製剤は本発明の第７の態様において先に記載した。
【０２４４】
本発明のなおさらなる態様は、医学に使用するための本発明の第１４の態様の抗体、フラグメント、融合体または誘導体またはその医薬製剤を提供する。任意の公知の抗体に基づく治療薬を本明細書の教示に従って改変し、少なくとも部分的に、免疫グロブリン軽鎖凝集を阻害できることを当業者は理解するであろう。
【０２４５】
本発明はさらに、抗体、または軽鎖可変ドメインを含むその抗原結合フラグメント、融合体または誘導体、または前記フラグメントまたは誘導体の融合体の（水溶液中の）溶解度を改善する方法であって、軽鎖可変ドメインの軽鎖FR1域を改変して（例えば、突然変異して）、少なくとも部分的に、その凝集物を形成する能力を阻害するステップを含んでなる前記方法を提供する。
【０２４６】
ある好ましい実施形態においては、軽鎖可変ドメインをアミノ酸位置9、10、11、12、13または14（Kabat系を用いて付与）の１以上において改変する。例えば、軽鎖可変ドメインのFR1域の位置9、10、11、12、13または14の１以上の天然アミノ酸を、可変ドメインのFR1域内のポリペプチド骨格の、例えば、他の軽鎖可変ドメインとH結合を形成する能力を阻害するアミノ酸によって置き換えることができる。
【０２４７】
好ましくは、軽鎖可変ドメインのFR1域の位置9、10、11、12、13または14の１以上で、天然アミノ酸をプロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシンからなる群より選択されるアミノ酸によって置き換える。より好ましくは、軽鎖可変ドメインのFR1域の位置9、10、11、12、13または14の１以上で天然アミノ酸をプロリンによって置き換える。最も好ましくは、軽鎖可変ドメインをFR1域の位置12で、例えば、天然アミノ酸（典型的には、κ軽鎖のセリン）をプロリンによって置き換えることにより改変する。
【０２４８】
本発明はさらに、抗体、または重鎖CH1ドメインを含むその抗原結合フラグメント、融合体または誘導体、または前記フラグメントまたは誘導体の融合体の（水溶液中の）溶解度を改善する方法であって、CH1ドメインを改変して（例えば、突然変異して）、少なくとも部分的に、その凝集物を形成する能力を阻害するステップを含んでなる前記方法を提供する。
【０２４９】
ある好ましい実施形態においては、CH1ドメインをアミノ酸位置205〜218の１以上で改変する。より好ましくは、CH1ドメインを位置212、214または216の１以上で改変する。
【０２５０】
ポリペプチドの溶解度を測定する方法は当技術分野で周知であり、タンパク質が吸収しない波長、例えば、410nmにおける散乱による吸収後に、サンプルを取り出してゲル上で泳動させ、定量し、サンプルを取り出し、SEC（サイズ排除クロマトグラフィ）により、EMによりおよび分析遠心分離により分析するステップを含んでなる。
【０２５１】
好ましくは、抗体、または抗原結合フラグメント、融合体または誘導体の溶解度は、少なくとも10％、例えば、少なくとも20％、30％、40％、50％、75％、100％以上改善される。
【０２５２】
前記方法を用いてキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体（ここで、少なくとも１つのアミノ酸は天然のヒト抗体と比較して突然変異している）、１本鎖抗体、二特異的抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖および／または軽鎖のホモ二量体およびヘテロ二量体、ならびに前記の抗原結合フラグメントおよび誘導体からなる群より選択されるの抗体、フラグメント、融合体または誘導体の溶解度を改善できることを当業者は理解するであろう。
【０２５３】
同様に、軽鎖可変ドメインを含む抗原結合フラグメントを、Fvフラグメント（例えば、１本鎖Fvおよびジスルフィド結合したFv）、Fab様フラグメント（例えば、Fabフラグメント、Fab'フラグメントおよびF(ab)2フラグメント）、モノマーおよび二重フォーマット〔例えば、dAb-linker-dAb〕の単一可変ドメイン（すなわち、ドメイン抗体；dAb、例えば、VH、VHHおよびVLドメイン）、および前記の改変バージョン（例えば、ポリエチレングリコールまたは他の安定なポリマーの共有結合付着により改変した）からなる群より選択できることは理解するであろう。dAbはヒト、ラクダ、マウス、またはコモリザメ（nurse shark）由来であってもよい。
【０２５４】
好ましくは、抗原結合フラグメントはドメイン抗体である。
【０２５５】
本発明の好ましい様態を、次の限定されるものでない実施例において、次の図面を参照して説明する。
【実施例】
【０２５６】
（実施例１）  総括
曝されたβ-ストランドは非特異的なβジッパー相互作用を媒介して次々にオリゴマー化と凝集に導きうるので、フォールド不安定性の潜在源である。これを避けるために、βシートタンパク質は欲しないエッジ相互作用を防止する一揃えの「ネガティブ設計」を進化させた（1、2）。歴史的に、タンパク質凝集の焦点の多くは部分的にアンフォールドした中間体に向けられてきた。しかし、今日のトポロジーの広汎性、例えば、サンドイッチ、バレルおよびプロペラならびにそれらの成分のネガティブ設計エレメントは、生来の構造の凝集が全生物にとって重要な問題であることを意味している（1）。
【０２５７】
抗体免疫グロブリン可変ドメインはβタンパク質構造のなかでも最も重点的に研究されている。これらのドメイン構造は高度に保存されていくつかの古典的「ネガティブ設計」の特徴を有するが、それでもある特定の軽鎖サブセットはin vitroおよびin vivoの両方で凝集する傾向があり、これが臨床的に重要な障害：軽鎖沈着症（LCDD）に関係している（3、4）。κサブタイプは特に凝集する傾向があり、典型的にはVλより安定であるという事実にも関らず（6）、LCDDの症例の＞85％に関わっている（5）。抗体ドメインについてin vitroで多数の研究が行われ、極度のpHと温度の条件下での長いインキュベーションは部分的アンフォールディングと凝集を導き得ることが示されている（7）。逆に、生来の構造エレメントの凝集についてはあまり知られていない。最近、本発明者らは、VHドメインのVHVL界面における単一の点突然変異が表面の親水性を増加し、その結果、溶解度および凝集耐性を共に増加することを実証した（8）。Vκ'は高安定性を有するので、本発明者らは、生来の状態がin vivoで凝集と病原性沈着を引き起こすかどうかに疑問をもった。
【０２５８】
Vκドメインは、密接にパックされて平滑なβバレルを生じる２つの逆平行βシートから成る典型的な免疫グロブリンフォールドを有する（図２）。バレルの１つの末端は可変ループCDR2により、S形状にねじれて、5-ストランド内側シート上のストランドC'と3-ストランド外側シート上のストランドDの両方をキャップするように形成される。バレルの他の末端において、N末端ストランドAは「シートスイッチ」デバイスを使ってそれぞれのシートからの２つのエッジストランド（外側シート上のBおよび内側シート上のG；図２）を保護する。ストランドAは最初Bと対合し、その後、絶対的に保存された位置8のcis-プロリンが急激に捻れて、該ストランドをストランドGとパックする反対のシートへスイッチする。その捻れ（kink）の前に、可変ループCDR3の末端とFR4の開始部分はストランドA4-7を保護するが、捻れの後、A9〜12 の骨格は保護されない。本発明者らは、ストランドA9〜12が溶液中のVκ VD9のオリゴマー化と凝集の誘因であることを発見した。
【０２５９】
これらの例において、ストランドスイッチがVκ軽鎖のFR1 βストランド（A9〜12）を構造的に曝したままにし、凝集をしやすくすることが示された。本発明者らは、A9〜12β-ジッパー相互作用が反復15らせん状繊維のアセンブリーに介在する、凝集し易いVκ1、VD9の結晶構造を提案するものである。点突然変異または５量体ペプチドとの競合のどちらかによって相互作用を破壊すると、溶液中のVD9の凝集が阻害され、劇的にその溶解度が増加する。細菌スーパー抗原プロテインLは、κサブタイプにおいてだけ前記A9〜12残基と結合する。このサブタイプの特質は、軽鎖沈着症の特徴であり、症例の＞85％においてκが介在している。κサブタイプとλサブタイプの構造を比較すると、これらは二者択一の、高度に保存されたストランドスイッチ設計を有し、κにおいて、より長くかつより曝されたA9〜12エッジストランドをもたらす。本発明者らは、A9〜12 βエッジがVκスカフォールドの病原体免疫回避と自己凝集の両方にとってアキレス踵（唯一の弱点）であるという確証を提供する。
【０２６０】
材料と方法
タンパク質発現と精製
生殖系列VD9をpET12aベクター中にサブクローニングし、大腸菌BL21(DE3)pLysS細胞（Novagen、MerckBiosciences、Nottingham）で発現させた。発現物上清を0.2μmフィルターを通過させ、VD9をプロテインLアガロース（Sigma-Aldrich Co Ltd、Dorset）で精製した。次いで、このタンパク質を0.15M NaClを含有する20mM Hepes pH 7.4中に透析し、さらにSuperdex G75（Amersham Biosciences UK Ltd、Bucks）で精製した。プロテインLと結合しない変異体S12PはHi-Trap SPカラム（Amersham Biosciences）を使いイオン交換クロマトグラフィにより精製した。
【０２６１】
繊維動力学と阻害アッセイ
繊維は、pH4の0.5Mクエン酸バッファー中に0.4mMタンパク質を含有する200μl反応容積で成長させた。反応液を、37℃にてEppendorf型サーモミキサー内で、10秒間1400rpmで振とうして次いで50秒間休むサイクルによってインキュベートした。アリコート（10μl）を時間間隔をおいて採取し、90μlの65μMチオフラビンT（ThT）を含むPBSに加えた。蛍光を25℃でSpectramax GeminiXS蛍光プレートリーダーを用いて励起445nmおよび発光484nm（10nmバンド巾）にて測定した。繊維は典型的にはクエン酸バッファー単独に対する50と比較して、10,000ユニットの蛍光シグナルを与えた。ペプチド阻害および変異体アッセイについては、サンプルを3日間インキュベートし、その時点で≦5％野生型VD9のシグナルは繊維を形成しないとみなした。Southampton Polypeptides Ltd.が合成したペプチドを10mM HEPES pH7.0に再懸濁し、希釈液（10μl）を前記の通りThTに加えた。
【０２６２】
電子顕微鏡
VD9繊維を前記の通り調製し、グロー放電した炭素コート銅グリッド（300メッシュ；Agar Scientific, Essex）上に吸収させた。グリッドを脱イオン水によって洗浄し、2％酢酸ウラニルを用いてネガティブ染色した。サンプルを、120kVで操作中のTecnai 12透過型電子顕微鏡（FEI UK Ltd, Cambridge）を用いて試験した。
【０２６３】
コンゴレッド染色
実験は本質的に記載の通り実施した（24）。VD9繊維を、ヒトAA、ALysおよびAb2mアミロイド組織から抽出したアミロイド原繊維、またはin vitroでAb1-42ペプチドから（F. Hoffmann-La Roche、Basel、Switzerland）およびウシ・ホスファチジルイノシトール3'-キナーゼ（PI3-SH3）のp85αサブユニットのSH3ドメインから（25）形成したアミロイド原繊維と共に並行して分析したが、これらは全て、コンゴレッドによる染色後に典型的な赤-緑二色性を与えた（VD9繊維についてはごく僅かあったが）。全実験は独立して少なくとも３回繰り返した。
【０２６４】
SAP結合アッセイ
実験は本質的に記載の通り実施した（26）。VD9繊維との結合を、先に記載した公知のアミロイド原繊維と比較した。対照インキュベーションを20mM EDTAの存在のもとで実施し、原繊維の非存在のもとで得たバックグラウンド計数値を全ての結果から差し引いた。３つの独立した実験は一致した結果を与えた。
【０２６５】
円二色性
PBS中の5μM VD9の25℃および85℃におけるCD測定値を235nmにて記録した。アンフォールディング曲線は２つの状態があると仮定し、記載（27）の通り、アミノ酸残基１つ当たり12calのΔCp寄与（28）を用いてフィットさせ、TmおよびΔGN-Uを得た。
【０２６６】
構造決定
VD9の結晶を蒸気拡散により0.1Mクエン酸、pH 4.0、2M NaCl中で成長させ、100Kにて凍結した。データはRigaku回転陽極X線源で、Mar345イメージプレート回折計を用いて採取した。データMOSFLMでインデックスを付し、SCALAで重み付けをした（29）。15分子についての分子置換溶液を、モデル1HEZを用いてPHASERで見出した（30）。最初のモデルをREFMACで洗練させて、0.24の最終Rfactorおよび0.29のRfreeを得た（表３を参照）。この結果は、分子置換法により解明した最大コピー数を表す。
【０２６７】
結果と考察
VD9は、繊維成長を持続する条件と類似の条件下で結晶しうるので、本発明者らはその構造をX線結晶学により解明した（詳しくは表３を参照）。非対称ユニットまたは最小反復オリゴマーは15個の分子から成り、密にパックされた左回りへリックスにアセンブルされている（図5A）。これらの15分子らせん状オリゴマーはそれ自体末端が末端に積み重なって連続繊維を作る。１ターン毎に6個のVD9分子があり、それぞれ60°だけ回転し、ほぼ35Åのピッチ（または1個のVD9ドメイン）を与える（図5D）。全てのVD9分子は生来フォールドしていて、へリックス下方に逆平行にパックされ、隣接コピーは繊維軸に直交して２倍回転対称性で関係付けられる（図5A、B）。繊維の中心部は中空であり、20Å直径の満水ナノチューブから成る（図5D）。繊維の全体直径はほぼ70Åであり、これは、溶液中で成長した繊維の直径と著しく一致し、電子顕微鏡で可視化される。その構造はまた、古典的アミロイド繊維と多くの形態学的類似点を有する。中心部の満水ナノチューブおよび１ターン当たり６個のドメインは、包埋されたAL繊維の断面中の電子顕微鏡で観察される電子密度の低い中心部周りに配置された4〜6個のプロトフィラメントと一致する（7）。その構造はほとんど逆平行βシートから専ら成り、シートは曝されたエッジストランドにより一緒にジッパー締めされている（図5C）。
【０２６８】
その構造は２つのインターフェースで安定化される。第１インターフェースは、CDRループおよび隣接部からの６つのチロシン残基の「ヘリングボーン」型パッキングにより形成される。第２インターフェースは、隣接モノマーからの逆平行FR1 βエッジストランドとの会合により形成され、分子間の８個のストランドのβシートを作る。FR1ストランドは、残基9〜12間の６個の結合（SSLS）に関わる古典的βジッパー主鎖水素結合ネットワークを介して相互作用する。類似の相互作用はBence-Jonesタンパク質BREの結晶パッキング（8）と全ヒト軽鎖の＞60％を認識する細菌のスーパー抗原プロテインL（9）との結合に見られる。従って、FR1は構造的および機能的の両方で曝され、ジッパー相互作用の「ホットスポット」である。さらなるジッパーの後ろに相互作用があり、それには、Val19およびPro8（小さい疎水性コアを作製する）およびThr20の側鎖を含むパッキング相互作用、およびSer7からThr20およびThr22への水素結合が含まれる。これらの相互作用は一緒に、790Åの大きい溶媒の排除された界面を作製する。
【０２６９】
曝されたA9〜12βエッジ界面はまた、VκドメインのPeptostreptococcus magnusタンパク質、プロテインL（PpL）との相互作用にも見出される。プロテインLは混合αβタンパク質であり、ヒトVκドメインにA9〜12とのβジッパー相互作用を介して結合する。本発明者らは、溶解したプロテインL：Fv複合体からの軽鎖をVD9へリックスからの分子の１つに重ね合わせた。注目すべきことに、こうすると、プロテインLの４つのβストランドと、へリックスの次のVκD分子の最初の４つのβストランドは密接なアラインメントに配置される。実際、プロテインLとVD9は同じA9〜12残基（図6AおよびB）をもつ同一の水素結合を利用する。水素結合の距離と角度は、それぞれ、0.2Åおよび6°未満だけ偏向している。これらの間の唯一の相違は、VκD構造がペプチドの位置12の酸素と位置9の窒素（プロテインLの位置9、ストランドβ2位置835と構造的に等価の位置にあり、窒素は内側を指向している）間にさらなる推定水素結合を有することである。一緒に、これらの結果はA9〜12が構造的に曝されかつ機能的相互作用の「ホットスポット」の両方であることを説明する（39、40）。
【０２７０】
凝集におけるA9〜12βエッジの役割を究明するために、本発明者らは、界面を突然変異させるかまたは保護することの効果を試験した。最初に、いくつものプロリン突然変異を、A9〜12に導入してβジッパー形成を破壊した。変異体S10PはなおプロテインLと結合して繊維を形成する一方、変異体S12PはプロテインLと結合することも凝集物を形成することもなかった（表４）。この単一の変異体S12Pはまた、溶解度および発現の実質的な増加を与えた。これらの観察は、凝集に介在するストランドの役割と完全に一致する。第２に、本発明者らは、プロテインLまたは「ジッパー」ペプチドの付加が自己凝集を阻害するかどうかを試験した。四量体プロテインLは、ThT蛍光による検出ではVD9の原繊維形成性を阻害しなかったが沈降を生じ、おそらくこれは多価相互作用によると思われた。しかし、プロテインL（PL：QTAEF）の相互作用ストランドに対応する合成「ジッパー」ペプチドは、原繊維形成性を阻止した（0.1mM VD9に対して＞10倍モル過剰PLペプチド）。「ジッパー」相互作用を防止する中央プロリンをもつ「非ジッパー」対照ペプチド（H5：SSPSA）の付加は、類似の条件下で効果がなかった。本発明者らは、A9〜12ジッパー相互作用が液中の溶液中のVD9凝集の核であると結論する。
【０２７１】
結晶構造における第２の界面は、全ての３つのループ由来のCDR残基に関わる。この界面の中心は、芳香族環のπ-πまたはエッジ-プレーン積み重ねを可能にする、パラレルに配置されたそれぞれの分子上の位置32、49および92の６つのチロシン残基のヘリングボーン形式パッキングにより形成される。チロシン32および92のOH基はまた、向かい合うアスパラギンおよびグルタミン側鎖との水素結合が可能なように配向されている。このようにして、Tyr32AはAsn34Bと、Tyr92AはGln55Bと相互作用する。さらなる相互作用は、平面側鎖のTyr92とAsp49の間などの「ヘリングボーン」チロシンとの疎水性積み重ねに関わる。モデルアミロイド形成ペプチドの研究において、疎水性残基、特に芳香族は原繊維形成性を非常に促進することが示されている（41）。12量体アミロイド形成性ペプチドの構造について、最近、Makinらは、フェニルアラニン側鎖のπ-πスタッキングが原繊維アセンブリーの重要な成分であることを見出した（42）。Deretらはまた、非アミロイド形成性軽鎖よりもむしろアミロイド形成性軽鎖により高い頻度を観察した（43）。本発明者らは一連のアラニン突然変異を位置32、34、55および92に作って、溶液中の凝集に介在するこの界面の役割を試験したが、A9〜12の突然変異とは対照的に、単に限られた効果しか観察されなかった（表３）。CDRループがin vivoで凝集傾向に影響を与え、従って潜在的凝集界面を提供しうるという確証は存在するが（44）、この場合、その効果は小さいと思われる。
【０２７２】
LCDDを特徴付ける軽鎖沈着の主な特徴は、これらがVλよりもVκのドメインサブタイプから成ることである。本発明者らはVκとVλのドメインの間のストランドスイッチを比較して、この傾向を説明することができるかを確認した。２つのドメインは高度に相同的であり、＜1Åのフレームワークr.m.s.dで重なる。しかし、両者は明らかにFR1のストランドスイッチの設計に相違がある。κドメインは位置8のcis-プロリンを介してストランドスイッチを行う（図２）が、ほとんどのλ鎖はこの位置にtrans-プロリンと位置9にさらなるtrans-プロリンを有する。２つのtrans-プロリンにより誘導される捻れはκのように鋭くはないが、ストランドスイッチを達成するには十分である。２つの設計（Vκの単一のcis-プロリンとVλの２つのtrans-プロリンとを対比して）の間の重要な相違は、Vλの位置9の余分なプロリンは、A9〜12 ストランドを丁度３つの残基（A10-12）に短縮すると共に、それを平面環を介してキャップすることにある。これらの変化は、生来の状態のストランドとフォールディング中間体とのジッパー相互作用の尤度を低下させるに違いない。Trans-cis異性化はしばしば、タンパク質フォールディングの律速段階となり、Vκにおけるcis-プロリンの存在は、そのフォールディング速度を遅くし、凝集脱却経路（off-pathway aggregation）を増加しうる。実際、Vκの残基8および95のプロリンのtrans-cis異性化は律速であることが示されている（45）。
【０２７３】
もしλ鎖の代わりのストランドスイッチ配列が凝集に対する感受性を低下するとすれば、Vκ配列が（特に、本発明者らが示したように）単一の点突然変異で十分に凝集を防止するように維持されているのか疑問が生じる。可能性のある説明は、Spadaらが行った、熱力学的安定性のために最適な軽鎖ストランドスイッチ配列を決定するin vitro放出実験から誘導することができる（46）。かれらの研究では、２つのライブラリー：１つのκ様ライブラリー（ここではプロリン8および隣接残基を無作為化した）および１つのλ様ライブラリー（位置7に単一の残基欠失をもつ）を作製した。ライブラリーを組合わせて一緒に選択した場合、Vκ配列が対応するVλ配列よりも急速に強化された。それぞれのタイプのクローンの生物物理的分析は、これはVκ配列がかなりより安定である故であることを示した。著者らはまた、Vκ配列はより安定であるが、発現中に有意に凝集する傾向があり、より不溶性物質を生じることも記している。
【０２７４】
Vκストランドスイッチの保存についてのさらなる仮説は、これが病原体認識に影響を与えうることである。ポリクローナル抗体応答はしばしば個々の成分抗体よりも、抗原の中和化において有効であることが長く知られている。VκA9〜12配列はポリクローナル応答の抗体間のエッジ-エッジ相互作用を容易にするので、反応の結合活性を増加しうる。Calareseらは最近、可変ドメインが異常な四次構造を採用しうることを示した。これらの場合、抗HIV-1抗体は重鎖ドメイン交換を行って反復糖鎖エピトープと結合する（47）。
【０２７５】
βエッジがタンパク質凝集の中心的役割を果たすと永く仮定されてきたが、現存データは主として部分的に無構造のタンパク質またはペプチドに限られている（42、14）。これは、βタンパク質トポロジーが生来の状態の凝集に対する保護の重要性を明らかに説明するという事実にも関らずである（10）。本明細書において本発明者らが初めて示すのは、凝集しがちな免疫グロブリンκ軽鎖ドメイン（βバレルフォールド）の生来の状態で有する傷が、βエッジストランドを曝して凝集させるということである。逆説的に、この同じエッジストランド（A9〜12）は、免疫グロブリンバレルの１つの末端を保護するように設計されたストランドスイッチの部分を形成する。本発明者らは、κとλのサブタイプの間のこのストランドスイッチ設計における重大な相異が、in vivoでの軽鎖の凝集がVκにほとんど限られる理由を説明すると提案する。最後に、凝集に対する感受性を有するにもかかわらず、Vκストランドスイッチが保存されるのは、これが補償する利点を与えうることを示唆する。
【０２７６】
自己凝集と細菌による免疫回避において中心的役割を果たすFR1は明らかに軽鎖スカフォールド内の「アキレスの踵」である。それ故に、この配列が、とりわけ本発明者らがここで示すように、単一の突然変異が保護性であることを持続するのは驚きである。かかる突然変異は生殖系列内に存在し；κIIはプロテインL結合を防止する位置12にプロリンを有する。さらに、κIIはin vivoで凝集に耐性を有するようであって；臨床ALアミロイド症は主にサブタイプI、IIIおよびIVに関わる（19、20）一方、κIIは単一のAL患者においてのみ報じられ（21）、この特別なモノクローナルタンパク質は他のアミロイド形成性置換を含有していたのであろう。FR1の保存についての他の可能な説明は、これが選択上の利点を提供することである。例えば、FR1相互作用は抗体がポリクローナル応答から多量化するのを可能にし、結合活性（avidity）を介して親和性（affinity）を有意に増加する。相乗的結合がヒト絨毛膜性腺刺激ホルモン（22）およびボツリヌス毒素（23）などの単量体抗原に対して示され、その場合、組合わされた親和性は両者の合計より相当に大きくなる。
【０２７７】
FR1は、軽鎖凝集およびアミロイド原繊維形成のための新規の界面であることを示す。一般的意味で、このことは、タンパク質凝集に生来曝された構造のβエッジが介在しうることおよびこの生来の状態を標的化する薬物を用いて沈着症の発症を阻止することが可能であることを実証する。
【０２７８】
（実施例２）  (S12P)突然変異を含有する抗EGFR dAbインライン融合体
抗EGFR dAb（呼称DOM16-39-618(S12P)）と抗血清アルブミンdAb（呼称DOM7 dAb）とを融合したドメイン抗体（dAb）から成る、インライン融合タンパク質（ILFS）を構築した。DOM16-39-618は、セリンのプロリンへの突然変異を位置12に含有する。この突然変異の存在は、インライン融合タンパク質とプロテインLとの結合を停止しかつ軽鎖凝集も阻止することを見出した。その融合体を構成する部分を、融合タンパク質内でアミノ末端からカルボキシ末端に向けて現れる順に、表７に掲げる。従って、融合タンパク質の構造は、この表を左から右へ読むことによって理解することができる。表に提示した最初の融合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端に向けて、DOM16-39-618 (S12P)-Linker-DOM7H-14の構造を有する。これらのdAbの配列情報はWO 2007/066106に開示されていて、この開示は参照により本発明の開示に明示的に組み入れられる。
【０２７９】
（実施例３）  (S12P)突然変異を含有する抗TNFα dAbインライン融合体
抗TNFαdAb（呼称PEP1-5-19(S12P)）と抗血清アルブミンdAb（呼称DOM7h-8dAb）との融合体であるドメイン抗体（dAb）から成るインライン融合タンパク質を構築した。PEP1-5-19は、セリンのプロリンへの突然変異を位置12に含有する。
【０２８０】
このインライン融合体の呼称はPEP1-5-19(S12P)-TVA-DOM7h-8とする。
【０２８１】
個々のdAbを作製し、それらを個々に改変した後にSOE-PCRにより一緒に融合した。
【０２８２】
SOE-PCR：２つのDNA断片を制限酵素消化なしでPCR（重複延長PCR（またはSOE-PCR）によりスプライスする）により一緒に融合した。それぞれの断片の3'プライマーは、他の断片上の3'配列と重複するように設計した。２つの断片のPCR産物を等モル濃度で混合し、外側プライマーを用いてPCR増幅することにより、融合DNAを産生する。
【０２８３】
第１のdAdのS12P突然変異を修正するために、SAL1制限酵素切断部位も付加するプライマー1294（下記配列）を用いた。リンカー配列（TVAだけからTVAAへTVAAPSへ向かう；下記参照）をdAb間のリンカーとして用いた。配列はVκのCκドメインに向けての天然の延長であり、ILFの免疫事象を最小化する１つの非天然ペプチド結合だけを導入する。
【０２８４】
インライン融合体が申し分なく発現され（Pichia p.により、発酵槽および振とうフラスコ内で）、その効力は生物学的細胞アッセイで評価して良いことが見出された（表８）。
【０２８５】
（実施例４）  (S12P)突然変異を含有する、抗IL-1dAbインライン融合体
抗IL-1dAb（DOM4 dAb）と抗血清アルブミンdAb（DOM7h dAb）との融合体であるドメイン抗体（dAb）から成る、６種類のインライン融合タンパク質を次の通り構築した。Dom4 dAbは、セリンのプロリンへの突然変異を位置12に含有する。
【０２８６】
これらの抗IL-1インライン融合体の呼称は次の通りとする：
DOM4-130-54(S12P)-TVAAPS-DOM7h-8；
DOM4-130-54(S12P)-TVAAPS-DOM7h-2；
DOM4-130-54(S12P)-TVAAPS-DOM7h-10；
DOM4-130-93(S12P)-TVAAPS-DOM7h-8；
DOM4-130-54(S12P)-TVAAPS-DOM7h-22；
DOM4-130-54(S12P)-TVAAPS-DOM7r-31。
【０２８７】
個々のdAbを作製し、個々に改変した後にこれらをSOE-PCRにより一緒に融合した。
【０２８８】
SOE-PCR：  ２つのDNA断片を制限酵素消化なしのPCR（重複延長PCR（またはSOE-PCR）により切断する）により一緒に融合した。それぞれの断片の3'プライマーは、他の断片上の3'配列と重複するように設計した。２つの断片のPCR産物を等モル濃度で混合し、外側プライマーを用いてPCR増幅することにより、融合DNAを産生する。
【０２８９】
第１のdAdのS12P突然変異を修正するために、SAL1制限酵素切断部位も付加するプライマー 1294（下記配列）を用いた。リンカー配列（単独TVAからTVAAへTVAAPSへ向かう；下記）をdAb間のリンカーとして用いた。配列はVκのCκドメインに向けての天然の延長であり、ILFの免疫学的事象を最小化する１つの非天然ペプチド結合だけを導入する。
【０２９０】
インライン融合体が申し分なく発現され（Pichia p.により、発酵槽および振とうフラスコ内で）、その効力は生物学的細胞アッセイで評価して良いことが見出された（表９）。
【０２９１】
プライマー1294配列：
CACGCGTCGACGgatattcagatgactcagagcccaagcagcctgcccgcgtccgtcggtgat
TVAAPSリンカー配列：
ACCGTCGCTGCTCCA
【表２】
2010508016.tif 000004
【０２９２】
結果は、原繊維の非存在（＜1％）のもとでの結合に対して補正した後、結合した125I-SAP数のパーセントとして表わした。それぞれの結果は２つの複製値の平均である。
【表３】
2010508016.tif 000005
【表４】
2010508016.tif 000006
【表５】
2010508016.tif 000007
【０２９３】
2010508016.tif 000008
【０２９４】
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【０２９５】
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【０２９６】
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【０２９７】
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【０２９８】
2010508016.tif 000013
【０２９９】
2010508016.tif 000014
【０３００】
2010508016.tif 000015
【表６】
2010508016.tif 000016
【０３０１】
2010508016.tif 000017
【表７】
2010508016.tif 000018
【表８】
2010508016.tif 000019
【表９】
2010508016.tif 000020
【０３０２】
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【図１】
2010508016.tif 000021
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図７ｄ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年7月28日(2009.7.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
【課題を解決するための手段】
広い意味における本発明は、免疫グロブリン鎖（および特に免疫グロブリン可変ドメイン）の凝集のインヒビターであって、免疫グロブリン鎖のβエッジ（すなわちβストランドの曝された主鎖骨格）と結合する部位を含む前記インヒビターに関する。すなわち、本発明は、以下のとおりである。
（１）  免疫グロブリン鎖上のβエッジと結合する部位を含む、免疫グロブリン鎖の凝集のインヒビター。
（２）  免疫グロブリン軽鎖もしくは免疫グロブリン軽鎖可変ドメインの凝集を阻害することができる非天然ポリペプチド、または、免疫グロブリン軽鎖もしくは免疫グロブリン軽鎖可変ドメインの凝集を阻害するポリペプチドの能力を保持する、かかるポリペプチドの変異体、融合体または誘導体、または前記変異体の融合体もしくはその誘導体を含むかまたはそれらから成る、（１）のインヒビター。
（３）  ポリペプチド、またはその変異体、融合体もしくは誘導体が、免疫グロブリン軽鎖のFR1域または免疫グロブリン軽鎖可変ドメインの間のH結合形成を阻害することができる、（２）のインヒビター。
（４）  ポリペプチド、またはその変異体、融合体もしくは誘導体が、免疫グロブリン軽鎖または免疫グロブリン軽鎖可変ドメインのFR1域のアミノ酸残基12もしくはその隣接アミノ酸残基にて結合することができる、（２）または（３）のインヒビター。
（５）  ポリペプチドが
(a)免疫グロブリン軽鎖可変ドメインのFR1域のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列、またはアミノ酸残基12を含むその部分；および／または
(b)細菌のスーパー抗原プロテインLの免疫グロブリン結合ドメインのアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列、またはその部分、
または、免疫グロブリン軽鎖もしくは免疫グロブリン軽鎖可変ドメインの凝集を阻害するポリペプチドの能力を保持する、ポリペプチドの変異体、融合体または誘導体、または前記変異体の融合体もしくはその誘導体を含むかまたはそれらから成る、（４）のインヒビター。
（６）  ポリペプチドが免疫グロブリン軽鎖可変ドメインのFR1域のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列、またはアミノ酸残基12を含むその部分を含むかまたはそれらから成る、（５）のインヒビター。
（７）  ポリペプチドが免疫グロブリン軽鎖可変ドメインのFR1域からの少なくとも4隣接アミノ酸、例えば少なくとも5、6、7、8、9、10、12、14、16、18または20隣接アミノ酸に対応するアミノ酸配列を含むかまたはそれらから成る、（５）または（６）のインヒビター。
（８）  ポリペプチドが免疫グロブリン軽鎖可変ドメインのFR1域からの位置5〜13、18、20、22および24のアミノ酸の配列に対応するアミノ酸配列を含む、（５）〜（７）のいずれかのインヒビター。
（９）  免疫グロブリン軽鎖がヒト免疫グロブリン軽鎖である、上記いずれかのインヒビター。
（１０）  免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列が生殖系列抗体遺伝子セグメントによりコードされる、上記いずれかのインヒビター。
（１１）  免疫グロブリン軽鎖がκ軽鎖である、上記いずれかのインヒビター。
（１２）  ポリペプチドがアミノ酸配列：
PSSLSA〔配列番号2〕
または、免疫グロブリン軽鎖もしくは免疫グロブリン軽鎖可変ドメインの凝集を阻害する親ポリペプチドの能力を保持するその変異体、融合体または誘導体、または前記変異体の融合体もしくはその誘導体を含むかまたはそれらから成る、上記いずれかのインヒビター。
（１３）  ポリペプチド、変異体、融合体または誘導体はプロテインLと免疫グロブリン軽鎖または免疫グロブリン軽鎖可変ドメインとの結合を阻害することができる、（５）のインヒビター。
（１４）  ポリペプチドがプロテインLの免疫グロブリン結合ドメインのアミノ酸配列、またはその部分に対応するアミノ酸配列を含むかまたはそれらから成る、（１３）のインヒビター。
（１５）  ポリペプチドがプロテインLの免疫グロブリン結合ドメインからの少なくとも4隣接アミノ酸、例えば少なくとも5、6、7、8、9、10、12、14、16、18または20隣接アミノ酸に対応するアミノ酸配列を含むかまたはそれらから成る、（１４）のインヒビター。
（１６）  ポリペプチドがアミノ酸配列：
QTAEF［配列番号3］および／または
QTATF［配列番号4］
または、免疫グロブリン軽鎖または免疫グロブリン軽鎖可変ドメインの凝集を阻害する親ポリペプチドの能力を保持するその変異体、融合体または誘導体、または前記変異体の融合体もしくはその誘導体を含むかまたはそれらから成る、（１５）のインヒビター。
（１７）  免疫グロブリン重鎖もしくは免疫グロブリン重鎖CH1ドメインの凝集を阻害することができる非天然ポリペプチド、または、免疫グロブリン重鎖もしくは免疫グロブリン重鎖CH1ドメインの凝集を阻害するポリペプチドの能力を保持する、かかるポリペプチドの変異体、融合体または誘導体、または前記変異体の融合体もしくはその誘導体を含むかまたはそれらから成る、（１）のインヒビター。
（１８）  ポリペプチド、またはその変異体、融合体もしくは誘導体が免疫グロブリン重鎖のCH1ドメインまたは免疫グロブリン重鎖CH1ドメインの間のH結合形成を阻害することができる、（１７）のインヒビター。
（１９）  ポリペプチド、またはその変異体、融合体もしくは誘導体が免疫グロブリン重鎖のCH1ドメインのアミノ酸残基205〜218もしくはその隣接アミノ酸残基または免疫グロブリン重鎖CH1ドメインと結合することができる、（１７）または（１８）のインヒビター。
（２０）  ポリペプチドが連鎖球菌のプロテインG（SpG）の免疫グロブリン結合ドメイン、またはその部分のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を含むかまたはそれらから成る、（１９）のインヒビター。
（２１）  ポリペプチドがSpGの免疫グロブリン結合ドメインからの少なくとも4隣接アミノ酸、例えば少なくとも5、6、7、8、9,10、12、14、16、18または20の隣接アミノ酸に対応するアミノ酸配列を含むかまたはそれらから成る、（２０）のインヒビター。
（２２）  ポリペプチドがアミノ酸配列：
TLKGETT    ［配列番号 5］
または、免疫グロブリン軽鎖または免疫グロブリン軽鎖可変ドメインの凝集を阻害する親ポリペプチドの能力を保持するその変異体、融合体または誘導体、または前記変異体の融合体もしくはその誘導体を含むかまたはそれらから成る、（２１）のインヒビター。
（２３）  ポリペプチドは長さが30未満のアミノ酸、例えば、長さが20未満、15未満、14未満、13未満、12未満、11未満、10未満、9未満、8未満、7未満、または6未満のアミノ酸である、（２）〜（２２）のいずれかのインヒビター。
（２４）  ポリペプチドは長さが2〜20のアミノ酸、例えば2〜10、4〜8、4〜6、または長さが正確に5または6アミノ酸である、（２）〜（２３）のいずれかのインヒビター。
（２５）  ポリペプチドがL-アミノ酸を含むかまたはそれらから成る、（２）〜（２４）のいずれかのインヒビター。
（２６）  １以上のアミノ酸が改変、置換または誘導体化されている、（２）〜（２５）のいずれかのインヒビター。
（２７）  ポリペプチド、変異体、融合体または誘導体が直鎖である、（２）〜（２６）のいずれかのインヒビター。
（２８）  ポリペプチド、変異体、融合体または誘導体が環状である、（２）〜（２７）のいずれかのインヒビター。
（２９）  （２）〜（２８）のいずれかに定義されたポリペプチドをコードする単離された核酸分子。
（３０）  核酸分子がDNA分子である、（２９）の単離された核酸分子。
（３１）  （２９）または（３０）の核酸分子を含むベクター。
（３２）  ベクターが発現ベクターである、（３１）のベクター。
（３３）  ベクターが真核細胞における複製に好適である、（３１）または（３２）のベクター。
（３４）  ベクターが哺乳動物細胞における複製に好適である、（３３）のベクター。
（３５）  ベクターがpTWIN、pShuttle、pUC18、pUC19、pBacPAK、pBR322、pBR329、pTrc99A、pKK223-3、pSVL、pMSG、pRS403〜406およびpRS413〜416からなる群より選択される、（３１）〜（３４）のいずれかのベクター。
（３６）  （２９）もしくは（３０）の核酸分子または（３１）〜（３５）のいずれかのベクターを含む宿主細胞。
（３７）  細胞が真核細胞である、（３６）の宿主細胞。
（３８）  細胞が哺乳動物細胞である、（３７）の宿主細胞。
（３９）  細胞が大腸菌株DH5、RR1、ER2566、CHO細胞（例えば、CCL61）、NIH Swissマウス胎仔細胞（NIH/3T3）、COS-1細胞（例えば、CRL 1650および293）、Sf9細胞および酵母細胞株YPH499〜501からなる群より選択される、（３６）〜（３８）のいずれかの宿主細胞。
（４０）  （３６）〜（３９）のいずれかの宿主細胞を培養してポリペプチドを発現させるステップ、およびそれからポリペプチドを単離するステップを含んでなる、（２）〜（２８）のいずれかのインヒビターを作る方法。
（４１）  ポリペプチドの固相合成を含んでなる、（２）〜（２８）のいずれかに記載のインヒビターを作る方法。
（４２）  医学上または獣医学上許容される賦形剤、希釈剤または担体との混合物で、（１）〜（２８）のいずれかのインヒビターを含む医薬製剤。
（４３）  医学に使用する、（１）〜（２８）のいずれかのインヒビターまたは（４２）の医薬製剤
（４４）  （１）〜（２８）のいずれかのインヒビター、またはその天然の等価物、または（４２）の医薬製剤の、免疫グロブリン鎖の凝集に関係する疾患または症状を治療するための医薬品の調製における使用。
（４５）  免疫グロブリン鎖が免疫グロブリン軽鎖または免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり、インヒビターが（１）〜（１６）または（２３）〜（２８）のいずれかのインヒビターである、（４４）の使用。
（４６）  免疫グロブリン鎖が免疫グロブリン重鎖または免疫グロブリン重鎖CH1ドメインであり、インヒビターが（１）または（１７）〜（２８）のインヒビターである、（４４）の使用。
（４７）  免疫グロブリン鎖の原繊維形成に関係する疾患または症状を治療する医薬品の調製における、（４４）〜（４６）のいずれかの使用。
（４８）  繊維がVκ繊維である、（４７）の使用。
（４９）  免疫グロブリン鎖の凝集に関係する疾患または症状が軽鎖沈着症（LCDD）、細菌感染、および過剰ヒスタミン産生により特徴付けられる疾患／症状からなる群より選択される、（４４）〜（４８）のいずれかの使用。
（５０）  免疫グロブリン鎖の凝集に関係する疾患または症状が細菌感染である、（４９）の使用。
（５１）  免疫グロブリン鎖の凝集に関係する疾患または症状が軽鎖沈着症である、（４９）の使用。
（５２）  免疫グロブリン鎖の凝集を防止するために、（１）〜（２８）のいずれかのインヒビター、またはその天然の等価物、または（４２）の医薬製剤の使用。
（５３）  免疫グロブリン鎖が免疫グロブリン軽鎖または免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり、インヒビターが（１）〜（１６）または（２３）〜（２８）のいずれかのインヒビターである、（５２）の使用。
（５４）  免疫グロブリン鎖が免疫グロブリン重鎖または免疫グロブリン重鎖CH1ドメインであり、インヒビターが（１）または（１７）〜（２８）のいずれかのインヒビターである、（５２）の使用。
（５５）  免疫グロブリン鎖における繊維形成を防止するための、（５２）〜（５４）のいずれかの使用。
（５６）  繊維がVκ繊維である、（５５）の使用。
（５７）  （１）〜（２８）のいずれかのインヒビター、またはその天然の等価物、または（４２）の医薬製剤の、細菌による感染を治療するための医薬品の調製における使用。
（５８）  細菌がペプトストレプトコッカス（Peptostreptococcal）菌および連鎖球（Streptococcal）菌の細菌からなる群より選択される、（５７）の使用。
（５９）  細菌がPeptostreptococcus magnusであり、インヒビターが（１３）〜（１６）または（２３）〜（２８）のいずれかのインヒビターである、（５８）の使用。
（６０）  細菌が連鎖球菌であり、インヒビターが（１７）〜（２８）のいずれかのインヒビターである、（５８）の使用。
（６１）  免疫グロブリン鎖の凝集を阻害できる薬剤による治療を必要とする患者を治療する方法であって、患者に（１）〜（２８）のいずれかのインヒビター、またはその天然の等価物、または（４２）の医薬製剤の有効な量を投与するステップを含んでなる前記方法。
（６２）  免疫グロブリン鎖が免疫グロブリン軽鎖または免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり、インヒビターが（１）〜（１６）または（２３）〜（２８）のいずれかのインヒビターである、（６１）の方法。
（６３）  免疫グロブリン鎖が免疫グロブリン重鎖または免疫グロブリン重鎖CH1ドメインであり、インヒビターが（１）または（１７）〜（２８）のいずれかのインヒビターである、（６１）の方法。
（６４）  免疫グロブリン鎖の原繊維形成に関係する疾患または症状を治療するための、（６１）〜（６３）のいずれかの方法。
（６５）  繊維がVκ繊維である、（６４）の方法。
（６６）  軽鎖沈着症（LCDD）、細菌感染および過剰ヒスタミン産生により特徴付けられる疾患／症状からなる群より選択される免疫グロブリン鎖の凝集に関係する疾患または症状を治療するための、（６１）〜（６５）のいずれかの方法。
（６７）  免疫グロブリン鎖の凝集に関係する疾患または症状が細菌感染である、（６６）の方法。
（６８）  免疫グロブリン鎖の凝集に関係する疾患または症状が軽鎖沈着症である、（６６）の方法。
（６９）  患者がヒトである、（６１）〜（６８）のいずれかの方法。
（７０）  細菌に感染した、または感染に感受性のある患者を治療する方法であって、患者に（１）〜（２８）のいずれかのインヒビター、またはその天然の等価物、または（４２）の医薬製剤の有効な量を投与するステップを含んでなる前記方法。
（７１）  細菌がペプトストレプトコッカス菌および連鎖球菌からなる群より選択される、（７０）の方法。
（７２）
細菌がPeptococcus magnusであり、インヒビター が（１３）〜（１６）または（２３）〜（２８）のいずれかのインヒビターである、（７１）の方法。
（７３）  細菌が連鎖球菌であり、インヒビターが（１７）〜（２８）のいずれかのインヒビターである、（７１）の方法。
（７４）  さらに１以上の通常の抗菌薬を投与するステップを含んでなる、（７０）〜（７３）のいずれかの方法。
（７５）  患者がヒトである、（７０）〜（７４）のいずれかの方法。
（７６）  抗体または抗原結合フラグメントまたはその誘導体をサンプルから単離または精製する方法であって、サンプルを（１）〜（２８）のいずれかのインヒビター、またはその天然の同等物と、抗体または抗原結合フラグメントまたはその誘導体（もしサンプル中に存在すれば）との結合が可能になる条件下で接触させるステップを含んでなる前記方法。
（７７）  サンプル中の抗体または抗原結合フラグメントまたはその誘導体の存在または非存在を検出する方法であって、サンプルを（１）〜（２８）のいずれかのインヒビターまたはその天然の同等物と、抗体または抗原結合フラグメントまたはその誘導体（もしサンプル中に存在すれば）との結合が可能になる条件下で接触させるステップを含んでなる前記方法。
（７８）  インヒビターまたはその天然の同等物を固定する、（７６）または（７７）の方法。
（７９）  インヒビターまたはその天然の同等物がクロマトグラフィカラムのアフィニティマトリックスを形成する、（７８）の方法。
（８０）  免疫グロブリン鎖の凝集を阻害できる薬物様化合物または薬物様化合物開発のためのリード化合物を同定する方法であって、免疫グロブリン鎖との結合に対して、（１）〜（２８）のいずれかのインヒビター、またはその天然の同等物と競合する能力について前記化合物を試験するステップを含んでなる前記方法。
（８１）  免疫グロブリン鎖は免疫グロブリン軽鎖または免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり、インヒビターが（１）〜（１６）または（２３）〜（２８）のいずれかのインヒビターである、（８０）の方法。
（８２）  免疫グロブリン鎖は免疫グロブリン重鎖または免疫グロブリン重鎖CH1ドメインであり、インヒビターが（１）または（１７）〜（２８）のいずれかのインヒビターである、（８０）の方法。
（８３）  プロテインLと免疫グロブリン軽鎖、または免疫グロブリン軽鎖可変ドメインとの結合を阻害することができる薬物様化合物または薬物様化合物開発のためのリード化合物を同定する方法であって、免疫グロブリン軽鎖、または免疫グロブリン軽鎖可変ドメインとの結合に対して、（１３）〜（１６）または（２３）〜（２８）のいずれかのインヒビター、またはその天然の同等物と競合する能力について前記化合物を試験するステップを含んでなる前記方法。
（８４）  SpGと免疫グロブリン重鎖、または免疫グロブリン重鎖CH1ドメインとの結合を阻害することができる薬物様化合物または薬物様化合物開発のためのリード化合物を同定する方法であって、免疫グロブリン重鎖、または免疫グロブリン重鎖CH1ドメインとの結合に対して、（１）または（１７）〜（２８）のいずれかのインヒビター、またはその天然の同等物と競合する能力について前記化合物を試験するステップを含んでなる前記方法。
（８５）  前記方法の結果を知的（インテリジェント）フォーマットに整理する、（８０）または（８４）のいずれかの方法。
（８６）  前記結果を情報媒体に記録または保存する、（８５）の方法。
（８７）  さらに、同定した化合物を凝集および／または結合のインヒビターとして医薬製剤に製剤するステップを含んでなる、（８０）〜（８６）のいずれかの方法。
（８８）  （８０）〜（８７）のいずれかの方法によって得ることができるかまたは得た化合物。
（８９）  医学に使用する、（８８）の化合物。
（９０）  免疫グロブリン鎖の凝集に関係する疾患または症状を治療するための医薬の調製における、（８８）の化合物の使用。
（９１）  免疫グロブリン鎖が免疫グロブリン軽鎖または免疫グロブリン軽鎖可変ドメインである、（９０）の化合物の使用。
（９２）  免疫グロブリン鎖が免疫グロブリン重鎖または免疫グロブリン重鎖CH1ドメインである、（９０）の化合物の使用。
（９３）  免疫グロブリン鎖の凝集に関係する疾患または症状が軽鎖沈着症（LCDD）、細菌感染および過剰ヒスタミン産生により特徴付けられる疾患／症状からなる群より選択される、（９０）〜（９２）のいずれかの使用。
（９４）  免疫グロブリン鎖の凝集を防止するための、（８８）の化合物の使用。
（９５）  免疫グロブリン鎖が免疫グロブリン軽鎖または免疫グロブリン軽鎖可変ドメインである、（９４）の使用。
（９６）  免疫グロブリン鎖が免疫グロブリン重鎖または免疫グロブリン重鎖CH1ドメインである、（９４）の使用。
（９７）  免疫グロブリン鎖における繊維形成を防止するための、（９４）〜（９６）のいずれかの使用。
（９８）  繊維がVκ繊維である、（９７）の使用。
（９９）  細菌による感染を治療するための医薬品の調製における、（８８）の化合物の使用。
（１００）  細菌がペプトストレプトコッカス菌および連鎖球菌からなる群より選択される、（９９）の使用。
（１０１）  細菌がPeptostreptococcus magnusである、（１０１）の使用。
（１０２）  細菌が連鎖球菌である、（１０１）の使用。
（１０３）  軽鎖可変ドメインのFR1域が抗体、フラグメント、融合体または誘導体の凝集物を形成する能力を少なくとも部分的に阻害するように改変された軽鎖可変ドメイン、または前記フラグメントまたは誘導体の融合体を含む、非天然の抗体、またはその抗原結合フラグメント、融合体または誘導体。
（１０４）  軽鎖可変ドメインがアミノ酸位置9、10、11、12、13または14の１以上で改変された、（１０３）の抗体、フラグメント、融合体または誘導体。
（１０５）  軽鎖可変ドメインのFR1域の位置9、10、11、12、13または14の１以上の天然アミノ酸がプロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシンからなる群より選択されるアミノ酸によって置き換えられた、（１０３）または（１０４）の抗体、フラグメント、融合体または誘導体。
（１０６）  軽鎖可変ドメインのFR1域の位置9、10、11、12、13または14の１以上の天然アミノ酸がプロリンによって置き換えられた、（１０３）〜（１０５）のいずれかの抗体、フラグメント、融合体または誘導体。
（１０７）  軽鎖可変ドメインのFR1域の位置12の天然アミノ酸が置き換えられた、（１０３）〜（１０６）のいずれかの抗体、フラグメント、融合体または誘導体。
（１０８）  キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、１本鎖抗体、二特異的抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖および／または軽鎖のホモ二量体およびヘテロ二量体、および抗原結合フラグメントならびに前記誘導体からなる群より選択される、（１０３）〜（１０７）のいずれかの抗体、フラグメント、融合体または誘導体。
（１０９）  抗原結合フラグメントがFvフラグメント（例えば、１本鎖Fvおよびジスルフィド結合されたFv）、Fab様フラグメント（例えば、Fabフラグメント、Fab'フラグメントおよびF(ab)2フラグメント）、単一可変ドメイン（例えば、VH、VHHおよびVLドメイン）、および前記の改変バージョン（例えば、ポリエチレングリコールまたはその他の好適なポリマーの共有結合により改変された）からなる群より選択される、（１０３）〜（１０８）のいずれかの抗体、フラグメント、融合体または誘導体。
（１１０）  抗原結合フラグメントまたはその誘導体がドメイン抗体である、（１０９）の抗体、フラグメント、融合体または誘導体。
（１１１）  ドメイン抗体が多量体フォーマットである、（１１０）の抗体、フラグメント、融合体または誘導体。
（１１２）  多量体フォーマットが二量体または三量体である、（１１０）または（１１１）の抗体、フラグメント、融合体または誘導体。
（１１３）  多量体フォーマットの成分サブユニットの１つを除く全てがS12P突然変異を含む、（１１１）または（１１２）の抗体、フラグメント、融合体または誘導体。
（１１４）  多量体フォーマットの成分サブユニットの１以上がS9Lおよび／またはS10P突然変異を含む、（１１２）または（１１３）の抗体、フラグメント、融合体または誘導体。
（１１５）  さらに細胞傷害性または検出可能な部分を含む、（１０３）〜（１１４）のいずれかの抗体、フラグメント、融合体または誘導体。
（１１６）  （１０３）〜（１１５）のいずれかの抗体、フラグメント、融合体またはその誘導体、またはその軽鎖をコードする単離された核酸分子。
（１１７）  核酸分子がDNA分子である、（１１６）の単離された核酸分子。
（１１８）  （１１６）または（１１７）の核酸分子を含むベクター。
（１１９）  ベクターが発現ベクターである、（１１８）のベクター。
（１２０）  真核細胞における複製に好適である、（１１８）または（１１９）のベクター。
（１２１）  哺乳動物細胞における複製に好適である、（１２０）のベクター。
（１２２）  pTWIN、pShuttle、pUC18、pUC19、pBacPAK、pBR322、pBR329、pTrc99A、pKK223-3、pSVL、pMSG、pRS403〜406およびpRS413〜416からなる群より選択される、（１１８）〜（１２１）のいずれかのベクター。
（１２３）  （116）または（117）の核酸分子または（118）〜（122）のベクターを含む宿主細胞。
（１２４）  細胞が真核細胞である、（１２３）の宿主細胞。
（１２５）
細胞が哺乳動物細胞である、（１２４）の宿主細胞。
（１２６）  細胞が大腸菌株DH5、RR1、ER2566、CHO細胞（例えば、CCL61）、NIH Swissマウス胎仔細胞（NIH/3T3）、COS-1細胞（例えば、CRL1650および293）、Sf9細胞および酵母細胞株YPH499）〜（501からなる群より選択される、（１２３）〜（１２５）のいずれかの宿主細胞。
（１２７）  （１０３）〜（１１５）のいずれかの抗体、またはフラグメントまたはその誘導体 を作る方法であって、（１２３）〜（１２５）のいずれかの宿主細胞を培養してポリペプチドを発現させるステップ、およびそれからポリペプチドを単離するステップを含んでなる前記方法。
（１２８）  （１０３）〜（１１５）のいずれかの抗体、またはそのフラグメントまたは誘導体と、医学上もしくは獣医学上許容される賦形剤、希釈剤または担体との混合物を含む医薬製剤。
（１２９）  医学に使用するための、（１０３）〜（１１５）のいずれかの抗体、またはそのフラグメントまたは誘導体、または（１２４）の医薬製剤。
（１３０）  抗体、または軽鎖可変ドメインを含むその抗原結合フラグメント、融合体または誘導体、または前記フラグメントまたは誘導体の融合体の（水溶液中の）溶解度を改善する方法であって、軽鎖可変ドメインのFR1域を改変して、少なくとも部分的に、その凝集物を形成する能力を阻害するステップを含んでなる前記方法。
（１３１）  軽鎖可変ドメインをアミノ酸位置9、10、11、12、13または14の１以上において改変するステップを含んでなる、（１３０）の方法。
（１３２）  軽鎖可変ドメインのFR1域の位置9、10、11、12、13または14の１以上の天然アミノ酸を、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニンからなる群より選択されるアミノ酸によって置き換えるステップを含んでなる、（１３０）または（１３１）の方法。
（１３３）  軽鎖可変ドメインのFR1域の位置9、10、11、12、13または14の１以上の天然アミノ酸をプロリンによって置き換える、（１３２）の方法。
（１３４）  軽鎖可変ドメインのFR1域の位置12の天然アミノ酸を改変する、（１３０）〜（１３３）のいずれかの方法。
（１３５）  抗体、フラグメント融合体または誘導体がキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、１本鎖抗体、二特異的抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖および／または軽鎖のホモ二量体およびヘテロ二量体、および抗原結合フラグメントおよび前記誘導体からなる群より選択される、（１３０）〜（１３４）のいずれかの方法。
（１３６）  抗体、フラグメント融合体または誘導体がFvフラグメント、１本鎖Fvフラグメント、ジスルフィド結合されたFvフラグメント、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')2フラグメント、ダイアボディ、免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えば、ヒトVH、およびヒトVL、VHH）および前記の改変バージョン（例えば、ポリエチレングリコールまたは他の好適なポリマーの共有結合により改変された）からなる群より選択される、（１３０）〜（１３５）のいずれかの方法。
（１３７）  抗原結合フラグメントまたはその誘導体がドメイン抗体である、（１３６）の方法。
（１３８）  実質的に、例を参照して本明細書に以上記載したインヒビター。
（１３９）  実質的に、例を参照して本明細書に以上記載した、（１）〜（２８）のいずれかのインヒビターの使用。
（１４０）  実質的に、例を参照して本明細書に以上記載した、抗体、フラグメントまたは誘導体。
（１４１）  実質的に、例を参照して本明細書に以上記載した、（１０３）〜（１１５）のいずれかの抗体、フラグメントまたは誘導体の使用。
（１４２）  EGFRに対して結合特異性を有するリガンドであって、EGFRに対して結合特異性をもつ少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含みかつ前記ドメインがアミノ酸位置12においてセリンのプロリンへの突然変異を含有する前記リガンド。
（１４３）  さらに血清アルブミンに対して結合特異性をもつ免疫グロブリン単一可変ドメインも含む、（１４２）のリガンドを含むインライン融合タンパク質。
（１４４）  EGFRに対して結合特異性をもつドメインがDOM16-39-618(S12P)-TVA-DOM7h-14と少なくとも約85％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、（１４３）のインライン融合タンパク質。
（１４５）  TNF-αに対して結合特異性を有するリガンドであって、TNF-αに対して結合特異性をもつ少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含みかつ前記ドメインがアミノ酸位置12においてセリンのプロリンへの突然変異を含有する前記リガンド。
（１４６）  さらに血清アルブミンに対して結合特異性をもつ免疫グロブリン単一可変ドメインも含む、（１４５）のリガンドを含むインライン融合タンパク質。
（１４７）  PEP1-5-19(S12P)-TVA-DOM7h-8と少なくとも約85％アミノ酸配列同一性を有する、（１４６）のインライン融合タンパク質。
（１４８）  IL-1に対して結合特異性を有するリガンドであって、IL-1に対して結合特異性をもつ少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含みかつ前記ドメインがアミノ酸位置12においてセリンのプロリンへの突然変異を含有する前記リガンド。
（１４９）  さらに血清アルブミンに対して結合特異性をもつ免疫グロブリン単一可変ドメインも含む、（１４８）のリガンドを含むインライン融合タンパク質。
（１５０）  DOM4-130-54(S12P)-TVAAPS-DOM7h-8；DOM4-130-54(S12P)-TVAAPS-DOM7h-2；DOM4-130-54(S12P)-TVAAPS-DOM7h-10；DOM4-130-93(S12P)-TVAAPS-DOM7h-8；DOM4-130-54(S12P)-TVAAPS-DOM7h-22；DOM4-130-54(S12P)-TVAAPS-DOM7R-31からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約85％アミノ酸配列同一性を有する、（１４９）のインライン融合タンパク質。
【図面の簡単な説明】
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
軽鎖可変ドメインのFR1域が抗体、フラグメント、融合体または誘導体の凝集物を形成する能力を少なくとも部分的に阻害するように改変された軽鎖可変ドメイン、または前記フラグメントまたは誘導体の融合体を含む、非天然の抗体、またはその抗原結合フラグメント、融合体または誘導体。
【請求項２】
軽鎖可変ドメインがアミノ酸位置9、10、11、12、13または14の１以上で改変された、請求項１に記載の抗体、フラグメント、融合体または誘導体。
【請求項３】
軽鎖可変ドメインのFR1域の位置9、10、11、12、13または14の１以上の天然アミノ酸がプロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシンからなる群より選択されるアミノ酸によって置き換えられた、請求項１または２に記載の抗体、フラグメント、融合体または誘導体。
【請求項４】
軽鎖可変ドメインのFR1域の位置9、10、11、12、13または14の１以上の天然アミノ酸がプロリンによって置き換えられた、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体、フラグメント、融合体または誘導体。
【請求項５】
軽鎖可変ドメインのFR1域の位置12の天然アミノ酸が置き換えられた、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体、フラグメント、融合体または誘導体。
【請求項６】
キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、１本鎖抗体、二特異的抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖および／または軽鎖のホモ二量体およびヘテロ二量体、および抗原結合フラグメントならびに前記誘導体からなる群より選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体、フラグメント、融合体または誘導体。
【請求項７】
抗原結合フラグメントがFvフラグメント（例えば、１本鎖Fvおよびジスルフィド結合されたFv）、Fab様フラグメント（例えば、Fabフラグメント、Fab'フラグメントおよびF(ab)2フラグメント）、単一可変ドメイン（例えば、VH、VHHおよびVLドメイン）、および前記の改変バージョン（例えば、ポリエチレングリコールまたはその他の好適なポリマーの共有結合により改変された）からなる群より選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体、フラグメント、融合体または誘導体。
【請求項８】
抗原結合フラグメントまたはその誘導体がドメイン抗体である、請求項７に記載の抗体、フラグメント、融合体または誘導体。
【請求項９】
ドメイン抗体が多量体フォーマットである、請求項８に記載の抗体、フラグメント、融合体または誘導体。
【請求項１０】
多量体フォーマットが二量体または三量体である、請求項８または９に記載の抗体、フラグメント、融合体または誘導体。
【請求項１１】
多量体フォーマットの成分サブユニットの１つを除く全てがS12P突然変異を含む、請求項９または１０に記載の抗体、フラグメント、融合体または誘導体。
【請求項１２】
多量体フォーマットの成分サブユニットの１以上がS9Lおよび／またはS10P突然変異を含む、請求項１０または１１に記載の抗体、フラグメント、融合体または誘導体。
【請求項１３】
さらに細胞傷害性または検出可能な部分を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の抗体、フラグメント、融合体または誘導体。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体、フラグメント、融合体またはその誘導体、またはその軽鎖をコードする単離された核酸分子。
【請求項１５】
核酸分子がDNA分子である、請求項１４に記載の単離された核酸分子。
【請求項１６】
請求項１４または１５に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１７】
ベクターが発現ベクターである、請求項１６に記載のベクター。
【請求項１８】
真核細胞における複製に好適である、請求項１６または１７に記載のベクター。
【請求項１９】
哺乳動物細胞における複製に好適である、請求項１８に記載のベクター。
【請求項２０】
pTWIN、pShuttle、pUC18、pUC19、pBacPAK、pBR322、pBR329、pTrc99A、pKK223-3、pSVL、pMSG、pRS403〜406およびpRS413〜416からなる群より選択される、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項２１】
請求項１４または１５に記載の核酸分子または請求項１６〜２０に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２２】
細胞が真核細胞である、請求項２１に記載の宿主細胞。
【請求項２３】
細胞が哺乳動物細胞である、請求項２２に記載の宿主細胞。
【請求項２４】
細胞が大腸菌株DH5、RR1、ER2566、CHO細胞（例えば、CCL61）、NIH Swissマウス胎仔細胞（NIH/3T3）、COS-1細胞（例えば、CRL1650および293）、Sf9細胞および酵母細胞株YPH499〜501からなる群より選択される、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２５】
請求項１〜１３のいずれか1項に記載の抗体、またはフラグメントまたはその誘導体 を作る方法であって、請求項２１〜２４のいずれか1項に記載の宿主細胞を培養してポリペプチドを発現させるステップ、およびそれからポリペプチドを単離するステップを含んでなる前記方法。
【請求項２６】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体、またはそのフラグメントまたは誘導体と、医学上もしくは獣医学上許容される賦形剤、希釈剤または担体との混合物を含む医薬製剤。
【請求項２７】
医学に使用するための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体、またはそのフラグメントまたは誘導体、または請求項２６に記載の医薬製剤。
【請求項２８】
抗体、または軽鎖可変ドメインを含むその抗原結合フラグメント、融合体または誘導体、または前記フラグメントまたは誘導体の融合体の（水溶液中の）溶解度を改善する方法であって、軽鎖可変ドメインのFR1域を改変して、少なくとも部分的に、その凝集物を形成する能力を阻害するステップを含んでなる前記方法。
【請求項２９】
軽鎖可変ドメインをアミノ酸位置9、10、11、12、13または14の１以上において改変するステップを含んでなる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
軽鎖可変ドメインのFR1域の位置9、10、11、12、13または14の１以上の天然アミノ酸を、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニンからなる群より選択されるアミノ酸によって置き換えるステップを含んでなる、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
軽鎖可変ドメインのFR1域の位置9、10、11、12、13または14の１以上の天然アミノ酸をプロリンによって置き換える、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
軽鎖可変ドメインのFR1域の位置12の天然アミノ酸を改変する、請求項２８〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
抗体、フラグメント融合体または誘導体がキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、１本鎖抗体、二特異的抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖および／または軽鎖のホモ二量体およびヘテロ二量体、および抗原結合フラグメントおよび前記誘導体からなる群より選択される、請求項２８〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
抗体、フラグメント融合体または誘導体がFvフラグメント、１本鎖Fvフラグメント、ジスルフィド結合されたFvフラグメント、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')2フラグメント、ダイアボディ、免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えば、ヒトVH、およびヒトVL、VHH）および前記の改変バージョン（例えば、ポリエチレングリコールまたは他の好適なポリマーの共有結合により改変された）からなる群より選択される、請求項２８〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
抗原結合フラグメントまたはその誘導体がドメイン抗体である、請求項３４に記載の方法。
【国際調査報告】
2010508016.tif 000032
2010508016.tif 000033
2010508016.tif 000034
2010508016.tif 000035
2010508016.tif 000036
2010508016.tif 000037
2010508016.tif 000038