(57)【要約】  本発明は、O-グリカン組成物(例えばムチン)を、ヒト患者のような対象へ投与する段階を含む、炎症性腸障害(例えばクローン病もしくは潰瘍性大腸炎)または胃腸の腫瘍(例えば結腸直腸癌)のための予防的アプローチおよび治療を提供する。加えて本発明は、コア1-由来またはコア3-由来のO-グリカンを合成することができないトランスジェニックマウスも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
O-グリカン組成物をそれを必要とする対象へ投与する段階を含む、炎症性腸疾患の発症を予防または治療する方法。
【請求項２】
炎症性腸疾患が、潰瘍性大腸炎である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
炎症性腸疾患が、クローン病である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
O-グリカン組成物が、ムチン組成物を含む、請求項1記載の方法。
【請求項５】
ムチン組成物が、Muc1、Muc2、Muc3、Muc4、Muc5AC、Muc6、またはMuc13の1種または複数種を含む、請求項4記載の方法。
【請求項６】
第二の治療的組成物を対象へ投与する段階を更に含む、請求項1記載の方法。
【請求項７】
第二の治療的組成物が、抗炎症薬または抗生物質である、請求項6記載の方法。
【請求項８】
O-グリカン組成物が、胃において放出されるように製剤化される、請求項1記載の方法。
【請求項９】
O-グリカン組成物が、小腸において放出されるように製剤化される、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
O-グリカン組成物が、回腸、空腸または十二指腸において放出されるように製剤化される、請求項8載の方法。
【請求項１１】
O-グリカン組成物が、大腸において放出されるように製剤化される、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
O-グリカン組成物が、盲腸、上行結腸、横行結腸、下行結腸、S状結腸または直腸において放出されるように製剤化される、請求項9記載の方法。
【請求項１３】
対象が、哺乳動物である、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
対象が、ヒトである、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
ムチン組成物が、哺乳動物から得られたムチンを含む、請求項4記載の方法。
【請求項１６】
ムチンが、遠心分離により精製される、請求項14記載の方法。
【請求項１７】
ムチンが、DNAse、RNAse、プロテアーゼおよびリパーゼにより処理される、請求項14記載の方法。
【請求項１８】
ムチンが、クロマトグラフィーにより更に精製される、請求項15記載の方法。
【請求項１９】
ムチンが、胃または結腸に由来する、請求項14記載の方法。
【請求項２０】
ムチンが、ヒトムチンである、請求項14記載の方法。
【請求項２１】
ムチンが、非ヒトムチンである、請求項14記載の方法。
【請求項２２】
ムチンが、哺乳動物の発現系において組換えにより発現される、請求項4記載の方法。
【請求項２３】
Lox P部位の側方に位置する機能性T-シンターゼ遺伝子を持つ、トランスジェニックマウス。
【請求項２４】
腸上皮細胞においてあらゆる機能性T-シンターゼ遺伝子を欠いている、トランスジェニックマウス。
【請求項２５】
腸上皮細胞において1つの機能性および1つの非機能性T-シンターゼ遺伝子を有する、トランスジェニックマウス。
【請求項２６】
あらゆる機能性コア3β1,3-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ遺伝子を欠いている、トランスジェニックマウス。
【請求項２７】
1つの機能性および1つの非機能性コア3β1,3-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ遺伝子を有する、トランスジェニックマウス。
【請求項２８】
腸上皮細胞においてあらゆる機能性T-シンターゼ遺伝子、およびコア3β1,3-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ遺伝子を欠いている、トランスジェニックマウス。
【請求項２９】
腸上皮細胞において1つの機能性および1つの非機能性T-シンターゼ遺伝子、ならびに1つの機能性および1つの非機能性コア3β1,3-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ遺伝子を有する、トランスジェニックマウス。
【請求項３０】
O-グリカン組成物を、それを必要とする対象へ投与する段階を含む、結腸直腸腫瘍の発症を予防する方法。
【請求項３１】
結腸直腸腫瘍が、結腸直腸腺腫性ポリープである、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
結腸直腸腫瘍が、結腸直腸腺腫である、請求項30記載の方法。
【請求項３３】
結腸直腸腫瘍が、結腸直腸癌である、請求項30記載の方法。
【請求項３４】
O-グリカン組成物が、ムチン組成物を含む、請求項30記載の方法。
【請求項３５】
ムチン組成物が、Muc1、Muc2、Muc3、Muc4、Muc5AC、Muc6、またはMuc13の1種または複数種を含む、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
第二の療法を対象へ施与する段階を更に含む、請求項30記載の方法。
【請求項３７】
第二の抗癌療法が、抗炎症薬または抗生物質である、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
O-グリカン組成物が、大腸において放出されるように製剤化される、請求項30記載の方法。
【請求項３９】
O-グリカン組成物が、盲腸、胃、上行結腸、横行結腸、下行結腸、S状結腸または直腸において放出されるように製剤化される、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
対象が、哺乳動物である、請求項30記載の方法。
【請求項４１】
対象が、ヒトである、請求項30記載の方法。
【請求項４２】
ムチン組成物が、哺乳動物から得られたムチンを含む、請求項34記載の方法。
【請求項４３】
ムチンが、遠心分離により精製される、請求項42記載の方法。
【請求項４４】
ムチンが、DNAse、RNAse、プロテアーゼおよびリパーゼにより処理される、請求項42記載の方法。
【請求項４５】
ムチンが、クロマトグラフィーにより更に精製される、請求項44記載の方法。
【請求項４６】
ムチンが、胃または結腸に由来する、請求項42記載の方法。
【請求項４７】
ムチンが、ヒトムチンである、請求項42記載の方法。
【請求項４８】
ムチンが、非ヒトムチンである、請求項42記載の方法。
【請求項４９】
ムチンが、哺乳動物の発現系において組換えにより発現される、請求項42記載の方法。
【請求項５０】
薬学的に許容される緩衝剤、希釈剤または賦形剤中に分散されたO-グリカン組成物を含有する、薬学的組成物。
【請求項５１】
O-グリカン組成物が、ムチン組成物を含む、請求項50記載の組成物。
【請求項５２】
ムチン組成物が、Muc1、Muc2、Muc3、Muc4、Muc5AC、Muc6、またはMuc13の1種または複数種を含む、請求項50記載の組成物。
【請求項５３】
小腸において放出されるように製剤化される、請求項50記載の組成物。
【請求項５４】
回腸、空腸または十二指腸において放出されるように製剤化される、請求項53記載の組成物。
【請求項５５】
大腸において放出されるように製剤化される、請求項50記載の組成物。
【請求項５６】
盲腸、上行結腸、横行結腸、下行結腸、S状結腸または直腸において放出されるように製剤化される、請求項54記載の組成物。
【請求項５７】
胃において放出されるように製剤化される、請求項50記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2006年4月5日に出願された米国特許仮出願第60/789,499号に対する優先権の恩典を請求するものであり、この仮出願全体の内容は、本明細書に参照として組入れられている。
【０００２】
米国政府は、米国立衛生研究所グラント番号P20-RRO18758に従い、本発明に権利を有する。
【０００３】
1. 発明の分野
本発明は概して、糖鎖生物学および医薬の分野に関する。より詳細に述べると、これは、炎症性腸疾患(例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎)または胃腸の腫瘍を予防または治療するための、O-グリカン組成物(例えばムチン)の使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
2. 関連技術の説明
潰瘍性大腸炎は、炎症性腸疾患(IBD)の一般型である。これは、遺伝的に易罹患性の宿主における結腸の微生物叢と粘膜の免疫細胞の間の異常な相互作用から生じる免疫-媒介型障害として一般に認められる(Sartor, 2003(非特許文献1)；Podolsky, 2002(非特許文献2)；Elsonら, 2003(非特許文献3))。粘膜の免疫異常の性質は依然不明であり、この相互作用がどのようにして発症するかは、よくわかっていない。加えて潰瘍性大腸炎の治療のために現在市販されている薬物は全て、副作用を有し、かつこれらの中で本疾患を治癒することができるものはない。加えてIBDは、結腸直腸癌のリスク上昇に関連している(Dixonら, 2006(非特許文献4))。
【０００５】
変化された腸のO-グリカン発現が、IBDおよび結腸直腸癌の患者において長い間認められてきたが、これらの疾患の病因におけるこの変化の役割は不明である(Corfieldら, 2001(非特許文献5)；Rhodes, 1997(非特許文献6)；PodolskyおよびIsselbacher, 1984(非特許文献7))。従って、これらの病態の発症においてO-グリカンが果たす役割を更に理解する必要性が存在する。
【０００６】
【非特許文献１】Sartor, 2003
【非特許文献２】Podolsky, 2002
【非特許文献３】Elsonら, 2003
【非特許文献４】Dixonら, 2006
【非特許文献５】Corfieldら, 2001
【非特許文献６】Rhodes, 1997
【非特許文献７】PodolskyおよびIsselbacher, 1984
【発明の開示】
【０００７】
発明の概要
本発明は、O-グリカン組成物(例えばムチン)を対象(例えばヒト患者)へ投与する段階を含む、IBDを治療する方法を提供することにより、先行技術の欠陥を克服する。加えて本発明は、O-グリカン組成物(例えばムチン)を、ヒト患者のような対象へ投与する段階を含む、胃腸癌(例えば結腸直腸癌)を予防および治療する方法も提供する。
【０００８】
従って本発明に従い、O-グリカン組成物をそれらを必要とする対象へ投与する段階を含む、炎症性腸疾患の発症を予防または治療する方法が提供される。炎症性腸疾患は、潰瘍性大腸炎またはクローン病であり得る。O-グリカン組成物は、例えばMuc1、Muc2、Muc3、Muc4、Muc5AC、Muc6、またはMuc13の1種または複数種を含有するムチン組成物を含み得る。本方法は更に、該対象へ第二の治療的組成物、例えば抗炎症薬または抗生物質を投与する段階を含み得る。
【０００９】
O-グリカン組成物は、小腸において、例えば回腸、空腸または十二指腸において放出されるように製剤化することができる。それは、大腸において、例えば、盲腸、上行結腸、横行結腸、下行結腸、S状結腸または直腸において放出されるように製剤化することもできる。この対象は、哺乳動物、例えばヒトであってよい。ムチン組成物は、ヒトまたは非ヒトのいずれかの哺乳動物から得られたムチンを含有することができる。これらのムチンは、遠心分離により精製され、DNAse、RNAse、プロテアーゼおよびリパーゼにより処理されてよい。ムチンは更に、クロマトグラフィーにより精製されてもよい。ムチンは、胃または結腸に由来してもよい。あるいは、ムチンは、哺乳動物の発現システムにおいて組換えにより発現されてよい。
【００１０】
別の態様において、Lox P部位の側方に位置する機能性T-シンターゼ遺伝子を持つトランスジェニックマウスが提供される。更に別の態様において、腸上皮細胞のあらゆる機能性T-シンターゼ遺伝子を欠いているトランスジェニックマウスが提供される。尚更に別の態様において、腸上皮細胞に1つの機能性および1つの非機能性T-シンターゼ遺伝子を有するトランスジェニックマウスが提供される。更なる態様において、あらゆる機能性コア3β1,3-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ遺伝子を欠いているトランスジェニックマウスが提供される。より更なる態様において、1つの機能性および1つの非機能性コア3β1,3-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ遺伝子を有するトランスジェニックマウスが提供される。また尚更なる態様において、腸上皮細胞のあらゆる機能性T-シンターゼ遺伝子、およびあらゆる機能性コア3β1,3-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼを欠いているトランスジェニックマウスが提供される。更に別の態様において、腸上皮細胞の1つの機能性および1つの非機能性T-シンターゼ遺伝子、ならびに1つの機能性および1つの非機能性コア3β1,3-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ遺伝子を有するトランスジェニックマウスが提供される。
【００１１】
更に別の態様において、O-グリカン組成物をそれを必要とする対象へ投与する段階を含む、結腸直腸腫瘍の発症を予防する方法が提供される。結腸直腸腫瘍は、結腸直腸腺腫性ポリープ、結腸直腸腺腫、または結腸直腸癌であり得る。O-グリカン組成物は、ムチン組成物、例えば、Muc1、Muc2、Muc3、Muc4、Muc5AC、Muc6、またはMuc13を1種または複数種含むムチン組成物を含む。本方法は更に、該対象へ、抗炎症薬または抗生物質などの第二の療法を施与する段階を含む。
【００１２】
O-グリカン組成物は、小腸、例えば、回腸、空腸または十二指腸において放出されるように製剤化することができる。それは同じく、胃および大腸、例えば、盲腸、上行結腸、横行結腸、下行結腸、S状結腸または直腸において放出されるように製剤化することもできる。この対象は、哺乳動物、例えばヒトであってよい。ムチン組成物は、ヒトまたは非ヒトのいずれかの、哺乳動物から得られたムチンを含有することができる。 これらのムチンは、遠心分離により精製され、DNAse、RNAse、プロテアーゼおよびリパーゼにより処理されてよい。ムチンは更に、クロマトグラフィーにより精製されてもよい。これらのムチンは、胃または結腸に由来してもよい。あるいは、ムチンは、哺乳動物の発現システムにおいて組換えにより発現されてよい。
【００１３】
更に追加の態様において、薬学的に許容される緩衝剤、希釈剤または賦形剤中に分散された、O-グリカン組成物を含有する薬学的組成物が提供される。O-グリカン組成物は、ムチン組成物、例えば、Muc1、Muc2、Muc3、Muc4、Muc5AC、Muc6、またはMuc13を1種または複数種含有するムチン組成物を含むことができる。O-グリカン組成物は、胃または小腸、例えば回腸、空腸もしくは十二指腸において放出されるように製剤化することができる。それは同じく、大腸、例えば、盲腸、上行結腸、横行結腸、下行結腸、S状結腸または直腸において放出されるように製剤化することもできる。
【００１４】
本明細書に説明されたあらゆる方法または組成物は、本明細書に説明されたいずれか他の方法または組成物に関して実行することができることが企図されている。
【００１５】
単語「1つの(a)」または「1つの(an)」の使用は、特許請求の範囲および/または明細書において用語「含む」と組合せて使用される場合、「1つの(one)」を意味することができるが、これは「1つまたは複数(one or more)」、「少なくとも1つ」、および「1つまたは複数(one or more than one)」の意味とも一致する。
【００１６】
本明細書において考察されたあらゆる態様は、本発明のあらゆる方法または組成物に関して実行することができること、またはその逆の場合も同様であることが企図されている。更に本発明の組成物およびキットを、本発明の方法を実現するために使用することができる。
【００１７】
本出願を通じ、用語「約」は、値が、装置に関する固有誤差の変動、その値を決定するために使用される方法、または試験対象間に存在する変動を含むことを示すように使用される。
【００１８】
例証的態様の説明
O-グリカンは、消化管上皮に積層している腸粘液ゲル層の主要成分である。この層は、上皮細胞と一緒に、腸の微生物叢が腸管粘膜免疫細胞と遭遇するのをを防ぐように機能する、腸の障壁を構成している濃密な多糖-リッチなマトリックスである。この粘液層は、主にO-連結したオリゴ糖(O-グリカン)が結合することが多いセリンおよびトレオニンリッチな分子であるムチンからなる。ムチン質量の80％以上は、O-グリカンからなる。O-グリカンは、コア1およびコア3-由来のO-グリカンと称される2つの主要亜型を有し、これらの亜型の生合成は、特異的グリコシルトランスフェラーゼにより制御される。
【００１９】
炎症性腸疾患(IBD)、および胃腸癌の発症機序における、インビボでの腸の機能におけるO-グリカンの役割に取り組むために、本発明者らは、コア1-由来のO-グリカンが欠損しているマウス系統を確立した。本発明者らは、コア3-由来のO-グリカンが欠損している系統、および両方を欠損している系統も開発した。これらのマウス系統を使用することにより、本発明者らは、前述の病態に対する特異的寄与を確定し、更にはO-グリカンの対象への投与によりこれらの病態の症状を軽減することができた。
【００２０】
従って本発明は、ある特定のO-グリカンの機能の変化が、インビボにおいて重大な表現型をもたらし得ることを明らかにしている。本発明は、O-グリカン(例えばムチン)を対象(例えばヒト患者)へ投与する段階を含む、IBDを予防および治療するか、または胃腸癌(例えば結腸直腸癌)を予防する方法を提供する。
【００２１】
I. O-グリカン
複雑な構造および機能のO-グリコシド結合した糖鎖を伴う糖タンパク質が、癌細胞の分泌物中および細胞表面において認められる。O-グリカンの構造は、癌において普通でないかまたは異常であることが多く、癌細胞の表現型および生物学に大きく寄与している。O-グリコシル化経路における変化の機構の一部が、癌のモデルシステムにおいて決定されている。しかしO-グリカン生合成は、複雑なプロセスである。O-グリカンを合成するグリコシルトランスフェラーゼは、個々のメンバーが、組織特異的および増殖特異的様式で発現される関連酵素のファミリーとして存在するように見える。それらの癌における調節の研究は、癌性の形質転換とグリコシル化の間の関連を明らかにすることができ、これは腫瘍細胞の異常な生物学を理解しかつ制御するための助けとなり得る。癌の診断は、ある種のグリコシル化されたエピトープの出現を基にすることができ、かつそれらのグリカンにより癌細胞を攻撃する治療的手段がデザインされている。
【００２２】
A. ムチン
ムチンは、トレオニン、セリン、およびプロリンがリッチなタンデムリピートペプチドにO-グリコシド結合された、クラスター化されたオリゴ糖の含量が高い、高分子量の上皮性糖タンパク質である。2つの構造的および機能的に識別されるムチンのクラス、分泌型ゲル形成ムチン(MUC2、MUC5AC、MUC5B、およびMUC6)、および膜貫通型ムチン(MUC1、MUC3A、MUC3B、MUC4、MUC12、MUC17)が存在するが、しかし一部のMUC遺伝子の産物は、いずれのクラスにもうまく適合しない(MUC7、MUC8、MUC9、MUC13、MUC15、MUC16)。免疫学的に検出されたMUC1ムチンは、結腸癌において発現が増大し、これは予後不良に関連している。MUC2分泌型ゲル形成ムチンの発現は、一般に、結腸直腸腺癌において減少するが、しかしマイクロサテライト不安定性に関連した別の亜型の結腸癌である粘液性癌においては保存される。別の分泌型ゲル形成ムチンであるMUC5ACは、正常な胃粘膜の産物であり、これは正常な結腸には存在しないが、結腸直腸腺腫および結腸癌において頻繁に存在する。ムチンのO-グリコシド結合されたオリゴ糖は、コア型、骨格型、および末端構造に関して説明することができる。
【００２３】
B. O-グリカン薬学的調製物
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体中に溶解または分散された有効量のO-グリカンまたはムチンを含有する。語句「薬学的または薬理学的に許容される」とは、動物、例えばヒトなどに適宜投与される場合に、有害で、アレルギー性または他の悪い反応を生じない分子実体および組成物を意味する。少なくとも1種のO-グリカンまたは追加の活性成分を含有する薬学的組成物の調製物は、本明細書に参照として組入れられているRemington's Pharmaceutical Sciences、第18版、Mack Printing Company、1990年に例示されているように、本開示を踏まえて、当業者に公知である。更に、動物(例えばヒト)投与に関して、調製物は、FDAの生物学的基準部(Office of Biological Standards)により必要とされる無菌性、発熱性、全般的安全性および純度の基準に合致しなければならないことが理解される。
【００２４】
本明細書において使用されるように、「薬学的に許容される担体」は、当業者に公知であるように、任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤(例えば抗菌剤、抗真菌剤)、等張化剤、吸収遅延薬、塩、保存剤、薬物、薬物安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤、色素、そのような物質およびそれらの組合せを含む(例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、第18版、Mack Printing Company、1990年、1289-1329頁を参照することとし、これは本明細書に参照として組入れられている。)。任意の通常の担体が活性成分と不適合である限りを除き、治療的または薬学的組成物中でのその使用が企図される。
【００２５】
本発明の化合物は、固体、液体またはエアロゾル形で投与されるかどうか、ならびに注射のような投与経路のために滅菌されることが必要かどうかに応じ、様々な種類の担体を含有してよい。本発明は、経口または経直腸的に投与することができるが、当業者に公知であるように、気管支内、鼻腔内、皮下、経粘膜、局所的、吸入(例えばエアロゾル吸入)、注射、注入、点滴、標的細胞の直接的、カテーテルを介した、洗浄によるもしくは他の方法による局所的灌流浴、または前述のもののいずれかの組合せにより投与することもできる(例えばRemington's Pharmaceutical Sciences、第18版、Mack Printing Company、1990年を参照することとし、これは本明細書に参照として組入れられている。)。
【００２６】
患者へ投与される本発明の組成物の実際の用量は、体重、状態の重症度、治療される疾患の種類、前もってまたは同時に使用される治療的介入、患者の特発性疾患および投与経路などの、身体的および生理的要因により決定することができる。投与に責任のある医師が、いずれにしても、組成物中の活性成分の濃度および個々の対象に関する好適な投与量を決定する。
【００２７】
いずれの場合においても、本組成物は、1種または複数の成分の酸化を遅延するために、様々な抗酸化剤を含有してよい。加えて微生物の作用の防止は、非限定的にパラベン(例えばメチルパラベン、プロピルパラベン)、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールまたはそれらの組合せを含む、様々な抗菌剤および抗真菌剤のような保存剤によりもたらされ得る。
【００２８】
本発明の化合物は、遊離塩基形、中性形または塩形で、組成物に製剤化され得る。薬学的に許容される塩は、酸付加塩、例えばタンパク質性組成物の遊離アミノ基により形成されたもの、または例えば塩酸もしくはリン酸のような無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸もしくはマンデル酸のような有機酸により形成されたものを含む。遊離のカルボキシル基により形成された塩は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムもしくは水酸化第二鉄などの無機塩基；またはイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジンもしくはプロカインのような有機塩基に由来することもできる。
【００２９】
本組成物が液体形である態様において、担体は、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど)、脂質(例えば、トリグリセリド、植物油、リポソーム)およびそれらの組合せを含むが、これらに限定されるものではない、溶媒または分散媒であることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングを使用することにより；例えば液体ポリオールもしくは脂質のような担体中に分散することにより、必要な粒子径を維持することにより；例えばヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤を使用することにより；または、そのような方法の組合せにより、維持することができる。多くの場合、例えば、砂糖、塩化ナトリウムまたはそれらの組合せのような、等張化剤を含有することが好ましい。
【００３０】
特定の態様において、本発明のO-グリカン組成物は、経口摂取のような経路による投与のために調製される。これらの態様において、固形組成物は、例えば、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤(例えばゼラチン硬または軟カプセルシェル)、遅延放出カプセル剤、徐放型製剤、口腔内組成物、トローチ剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウエハー剤、またはそれらの組合せを含むことができる。経口組成物は、食事の食品に直接混和されてよい。経口投与のための好ましい担体は、不活性希釈剤、吸収可能な食用担体またはそれらの組合せを含む。本発明の別の局面において、経口組成物は、シロップ剤またはエリキシル剤として調製されてよい。シロップ剤またはエリキシル剤は、例えば少なくとも1種の活性物質、甘味剤、保存剤、香味剤、色素、保存剤、またはそれらの組合せを含有してよい。
【００３１】
ある具体的態様において、経口組成物は、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、香味剤、およびそれらの組合せを1種または複数種含有してよい。ある態様において、組成物は、下記の1種または複数種を含有してよい：例えば、トラガカントガム、アカシア、トウモロコシデンプン、ゼラチンもしくはそれらの組合せなどの、結合剤；例えば、リン酸二カルシウム、マンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムもしくはそれらの組合せなどの、賦形剤；例えば、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸もしくはそれらの組合せなどの、崩壊剤；例えば、ステアリン酸マグネシウムなどの、滑沢剤；例えば、ショ糖、乳糖、サッカリンもしくはそれらの組合せなどの、甘味剤；例えば、ペパーミント、冬緑樹油、チェリー香料、オレンジ香料などの、香味剤；または、前述のものの組合せ。単位剤型がカプセル剤である場合、これは、前述の種類の材料に加え、液体担体のような担体を含有することができる。様々な他の材料が、コーティングとして、またはそうでなければ剤型の物理的形状を修飾するために存在してよい。例えば錠剤、丸剤、またはカプセル剤は、セラック、砂糖または両方によりコーティングされてよい。
【００３２】
他の投与様式に適した追加の製剤は、坐剤を含む。坐剤は、通常は直腸への挿入のために投薬される、様々な重量および形状の固形剤形である。挿入後、坐剤は腔内で軟化、溶融または溶解する。一般に坐剤のための従来の担体は、例えばポリアルキレングリコール、トリグリセリドまたはそれらの組合せを含んでよい。ある態様において、坐剤は、例えば、活性成分を約0.5％〜約10％、好ましくは約1％〜約2％の範囲含有する混合物から形成されてよい。
【００３３】
滅菌注射液は、必要ならば先に列挙された様々な他の成分を伴う好適な溶媒中に必要量の活性化合物を混和し、引き続き濾過滅菌することにより調製される。一般に分散剤は、様々な滅菌された活性成分の、基本の分散媒および/または他の成分を含有する無菌のビヒクルへの混和により調製される。無菌の注射用の溶液、懸濁液または乳液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製法は、活性成分に加え追加の所望の成分の予め濾過滅菌された液体媒体からそれらの粉末を生じる、真空乾燥または凍結乾燥技術である。液体媒体は、必要ならば好適に緩衝剤で処理されなければならず、および液体希釈剤は最初に、十分な生理食塩水またはグルコースにより注射前に等張とされなければならない。直接注射用の高濃度の組成物の調製物も企図され、ここで溶媒としてのDMSOの使用は、小さい領域への活性物質の極めて迅速な浸透、高濃度の送達を生じることが予測される。
【００３４】
本組成物は、製造および貯蔵の条件下で安定し、かつ細菌および真菌のような微生物の混入作用に対し保護されなければならない。エンドトキシン混入は、例えば、0.5ng/mgタンパク質未満のように、安全なレベルに最小限に維持されなければならないことは理解されるであろう。
【００３５】
C. O-グリカンの生成および精製
本発明のO-グリカンは、動物から精製されるか、または組換えO-グリカンが作出され、任意に精製されてよい。ある態様において、組換えヒトO-グリカンが、細胞において発現され、その後精製されてもよい(例えば、遠心分離および/またはクロマトグラフィーを使用)。
【００３６】
一般に、精製のために、本発明者らは、改変を加えた、新鮮なブタの胃または結腸からのムチンの精製に関する公開された方法に従う。Xiaら、(2005)；Festeら、(1990)。簡単に述べると、内容物の除去および水による簡単な洗浄の後、ブタの胃または結腸の粘膜層(上皮および粘液を含む)を、こすりとることにより取り除く。この粘膜材料を、氷冷した水(粘膜〜1：水1、最終スラリー)中でホモジナイズし、遠心し、不溶性デブリを除く。上清中の可溶性ムチンを、100mM HClによりpH5.0に調節することにより沈殿し、その後遠心分離(10,000×g, 4℃, 10分間)する。ペレットを再溶解し、100mM NaOHによりpH7.2に調節し、次にメタノール：クロロホルム(1:1v/v)中で2回抽出し、その後2回目の遠心分離を行う。中間相を収集し、透析し(12〜14,000MWCO)、引き続きヘパリナム由来のヘパリナーゼII(0.075U/ml, Sigma)、コンドロイチナーゼABC(0.015U/ml, Sigma)、DNase(75U/ml, Invitrogen)、RNase(0.01mg/ml, Invitrogen)、およびプロテイナーゼK(0.25U/ml, 65℃でO/N, Sigma)により順次処理する。これらの処理は、混入している脂質、ポリペプチド、およびヌクレオチドを除去する。次にムチンを、等張緩衝液(50mMトリス, 100mM NaCl, pH7.4)中のサイズ排除クロマトグラフィー(Sephacryl HR-S-200, Pharmacia)により、空隙容量＞200kDaの画分として収集する。この空隙容量画分を、透析し、凍結乾燥し、秤量し、かつ-80℃で貯蔵する。精製されたムチンの量は、PASにより染色される、3％スタッキングゲルおよび4％分離ゲルを使用するSDS-PAGEにより検証する。タンパク質は、BCAキット(Pierce)を用いて測定する。
【００３７】
D. O-グリカン変種
ムチン(例えば、Muc1、Muc2、Muc3、Muc4、Muc5AC、Muc6、および/またはMuc13)の構造には修飾および/または変更を行うことができるので、本発明は、本発明の予防的および治癒的局面に対して、なお実質的活性を維持するムチンおよび他のO-グリカン組成物の変化を企図している。
【００３８】
1. 改変されたポリヌクレオチドおよびポリペプチド
生物学的機能同等物は、異なる配列を含むが、同時に「野生型」または標準タンパク質をコードする能力を保持するように操作されているポリヌクレオチドを含んでよい。これは、遺伝暗号の縮重、すなわち同じアミノ酸をコードしている複数のコドンの存在により実現することができる。一つの例において、当業者は、ポリヌクレオチドのタンパク質をコードする能力を損なうことなく、制限酵素認識配列をポリヌクレオチドへ導入することを意図することができる。
【００３９】
別の例において、ポリヌクレオチドは、より顕著な変化を伴う生物学的機能同等物である(およびコードする)。ある種のアミノ酸は、例えば、抗体の抗原-結合領域、基質分子、受容体などの上の結合部位のような構造との相互作用的な結合能を目立って喪失することなく、タンパク質構造内の別のアミノ酸と置換され得る。この構造的変化はタンパク質のそのデザインされた機能を実行する能力を侵害するものではないので、いわゆる「保存的」変化は、タンパク質の生物学的活性を破壊しない。従って本発明者らにより、本発明の目標を依然満たしつつ、本明細書に開示された遺伝子の配列およびタンパク質において様々な変更を行い得ることが企図される。
【００４０】
機能同等物に関して、「生物学的機能同等物」のタンパク質および/またはポリヌクレオチドの定義における固有の概念は、分子を許容できるレベルで同等な生物学的活性を伴うよう維持しつつ、分子の規定された部分内に作製することができる変化の数には限界があるという概念であることは当業者には良く理解されている。従って生物学的機能同等物は、選択されたアミノ酸(またはコドン)は置換されてよいようなタンパク質(およびポリヌクレオチド)として本明細書において定義される。
【００４１】
一般に、分子の長さがより短いと、機能を維持しつつ分子内に作製することができる変化はより少ない。より長いドメインは、中位数の変化を有することができる。完全長タンパク質は、より大きい数の変化に最も耐えられるであろう。しかし、それらの構造に高度に依存するある特定の分子またはドメインは、ほどんどまたは全く修飾を許容しないことは理解されなければならない。
【００４２】
アミノ酸置換は一般に、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えばそれらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどを基にしている。アミノ酸側鎖置換基のサイズ、形状および/または種類の分析は、アルギニン、リシンおよび/もしくはヒスチジンは全て正帯電した残基であること；アラニン、グリシンおよび/もしくはセリンは全て類似したサイズであること；ならびに/または、フェニルアラニン、トリプトファンおよび/もしくはチロシンは全て全般的に類似した形状であることを明らかにしている。従ってこれらの考察を基に、アルギニン、リシンおよび/もしくはヒスチジン；アラニン、グリシンおよび/もしくはセリン；ならびに/または、フェニルアラニン、トリプトファンおよび/もしくはチロシン；は、本明細書において生物学的機能同等物として定義される。
【００４３】
より定量的な変化を実行するために、アミノ酸の疎水性親水性指標(hydropathic index)を考慮することができる。各アミノ酸は、それらの疎水特性および/または電荷特性を基に、疎水性親水性指標を割当てられており、それらは以下の通りである：イソロイシン(+4.5)；バリン(+4.2)；ロイシン(+3.8)；フェニルアラニン(+2.8)；システイン/シスチン(+2.5)；メチオニン(+1.9)；アラニン(+1.8)；グリシン(-0.4)；トレオニン(-0.7)；セリン(-0.8)；トリプトファン(-0.9)；チロシン(-1.3)；プロリン(-1.6)；ヒスチジン(-3.2)；グルタミン酸(-3.5)；グルタミン(-3.5)；アスパラギン酸(-3.5)；アスパラギン(-3.5)；リシン(-3.9)；および/または、アルギニン(-4.5)。
【００４４】
タンパク質に相互に作用する生物学的機能を付与する上でアミノ酸疎水性親水性指標の重要性は、当該技術分野において一般に理解されている(KyteおよびDoolittle, 1982、これは本明細書に参照として組入れられている)。ある種のアミノ酸は、類似した疎水性親水性指標および/もしくはスコアを有する他のアミノ酸と置き換えることができ、ならびに/または依然類似した生物学的活性を保持することは公知である。疎水性親水性指標を基にした変化を作製する上で、その疎水性親水性指標は±2以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±1以内であるものが特に好ましく、および/または±0.5以内であるものが尚更に特に好ましい。
【００４５】
本発明のある特定の態様におけるように、特にこれにより作出される生物学的機能性同等物のタンパク質および/またはペプチドが、免疫学的態様における使用が意図されている場合には、そのようなアミノ酸の置換は、親水性を基に効果的に行うことができることも同じく、当該技術分野において理解される。本明細書に参照として組入れられている米国特許第4,554,101号は、その隣接アミノ酸の親水性により決定される、タンパク質の最大部分平均親水性は、その免疫原性および/または抗原性と、すなわちタンパク質の生物学的特性と相関することを開示している。
【００４６】
米国特許第4,554,101号に詳述されるように、下記親水値が、アミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン(+3.0)；リシン(+3.0)；アスパラギン酸(+3.0±1)；グルタミン酸(+3.0±1)；セリン(+0.3)；アスパラギン(+0.2)；グルタミン(+0.2)；グリシン(0)；トレオニン(-0.4)；プロリン(-0.5±1)；アラニン(-0.5)；ヒスチジン(-0.5)；システイン(-1.0)；メチオニン(-1.3)；バリン(-1.5)；ロイシン(-1.8)；イソロイシン(-1.8)；チロシン(-2.3)；フェニルアラニン(-2.5)；トリプトファン(-3.4)。類似した親水値を基に変化を作製する上で、その親水値が±2以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±1以内のものが特に好ましく、および/または±0.5以内のものが尚更に特に好ましい。
【００４７】
2. 変更されたアミノ酸
本発明は、多くの局面において、好適なポリヌクレオチドの転写および翻訳による、インサイト(in cyto)でのペプチドおよびポリペプチドの合成に頼っている。これらのペプチドおよびポリペプチドは、20種の「天然」アミノ酸、およびそれらの翻訳後修飾を含む。しかしインビトロペプチド合成は、修飾されたおよび/または非天然(unusual)アミノ酸の使用を可能にする。ここで修飾されたおよび/または非天然のアミノ酸の非限定的例の表を、以下に提示する。
【００４８】
（表１）修飾されたおよび/または非天然のアミノ酸
2010501472.tif 000002
【００４９】
3. ミメティック
本発明者らは、先に考察された生物学的機能同等物に加え、構造的に類似した化合物は、本発明のペプチドまたはポリペプチドの重要な部分を模倣するために製剤化され得ることも企図している。このような化合物は、ペプチドミメティックと称されるが、これらは本発明のペプチドと同じ様式で使用することができ、従って機能同等物でもある。
【００５０】
タンパク質二次構造および三次構造の要素を模倣するある種のミメティックは、Johnsonらの論文(1993)に説明されている。ペプチドミメティックの使用の背後にある基礎となる根拠は、タンパク質のペプチド骨格は主に、抗体および/または抗原の分子相互作用のような分子相互作用を促進するように、アミノ酸側鎖を配向するように存在していることである。従ってペプチドミメティックは、天然の分子に類似した分子相互作用を可能にするようにデザインされている。
【００５１】
ペプチドミメティックの概念のいくつかの成功裡の適用は、高度に抗原性であることが公知である、タンパク質内のβ-ターンのミメティックに焦点を当てている。同様にポリペプチド内のβ-ターン構造は、本明細書において考察されたように、コンピュータ-ベースのアルゴリズムにより予測することができる。一旦そのターンの構成要素のアミノ酸が決定されると、そのアミノ酸側鎖の必須要素に類似した空間的配向を実現するようにミメティックを構築することができる。
【００５２】
別のアプローチは、巨大なタンパク質の結合部位を模倣する生物学的に活性のある高次構造を作出するための魅力的な構造鋳型として、小さいマルチジスルフィド-含有タンパク質に焦点を当てている(Vitaら, 1998)。ある毒素に進化的に保存されているように見える構造モチーフは、小さく(30〜40個のアミノ酸)、安定し、かつ突然変異に高度に許容性である。このモチーフは、3個のジスルフィドにより内部コアにおいて架橋されたβシートおよびαヘリックスにより構成される。
【００５３】
βIIターンは、環状L-ペンタペプチドおよびD-アミノ酸を伴うものを用いうまく模倣されている(Weisshoffら, 1999)。同じくJohannessonらの論文(1999)は、逆ターンを誘導する特性を伴う二環式トリペプチドを報告している。
【００５４】
特異的構造を作出する方法は、当該技術分野において開示されている。例えば、α-ヘリックスミメティックは、米国特許第5,446,128号、第5,710,245号、第5,840,833号および第5,859,184号に開示されている。これらの構造は、ペプチドまたはタンパク質をより熱に安定とし、同じくタンパク質分解に対する抵抗性を増大する。6-、7-、11-、12-、13-および14-員環構造が開示されている。
【００５５】
高次構造上制限されたβターンおよびβバルジを作出する方法は、例えば、米国特許第5,440,013号、第5,618,914号および第5,670,155号に開示されている。β-ターンは、対応する骨格の高次構造に変化を有することなく、変更された側鎖置換基を許容し、標準の合成手順によるペプチドへの組込みに適した末端を有する。他の種類のミメティックターンは、逆ターンおよびγターンを含む。逆ターンミメティックは、米国特許第5,475,085号および第5,929,237号に開示されており、かつγターンミメティックは、米国特許第5,672,681号および第5,674,976号に開示されている。
【００５６】
II. 炎症性腸疾患
本発明のO-グリカン化合物または組成物(例えばムチン)は、炎症性腸疾患を治療するために使用することができる。ある態様において、本発明により治療されるIBDは、潰瘍性大腸炎またはクローン病である。しかし本明細書において使用される用語「炎症性腸疾患」または「IBD」は、胃腸管の少なくとも一部の炎症により特徴付けられる疾患の広範な種類を説明する。IBD症状は、腸の炎症を含み、かつ腹部の痙攣および持続性の下痢を生じる。炎症性腸疾患は、潰瘍性大腸炎(UC)、クローン病(CD)、非定型大腸炎、慢性大腸炎、不連続または斑状疾患、回腸炎症、結腸外炎症、破裂した陰窩(crypt)に反応した肉芽腫性炎症、アフタ性潰瘍、経壁的炎症、微視的大腸炎、憩室炎および空置大腸炎を含む。
【００５７】
A. 潰瘍性大腸炎
前述のように、変化した腸のO-グリカン発現が、潰瘍性大腸炎のようなIBD患者において認められるが、この変化のこれらの疾患の病因における役割は不明である(Rhodes, 1996；1997；PodolskyおよびFournier, 1988)。潰瘍性大腸炎は、大腸に限定して、炎症および潰瘍と称されるびらんを引き起こす疾患である。この炎症は通常直腸および結腸の下位部に生じるが、これは結腸全体に影響を及ぼし得る。潰瘍性大腸炎は稀に、終末回腸と称される末端区域以外の小腸に影響を及ぼす。潰瘍性大腸炎は、大腸炎または直腸炎とも称される。この炎症は、頻繁に結腸を空にし、下痢を引き起こす。潰瘍は、炎症が結腸の裏層の細胞を殺傷する部位に形成され；潰瘍は出血し、膿を生成する。
【００５８】
潰瘍性大腸炎は、あらゆる年齢のヒトにおいて生じるが、15〜30歳の間に最も良く発症し、50〜70歳の間は頻度が減る。小児および青年は、時々、本疾患を発症する。潰瘍性大腸炎は、男性および女性を同等に冒し、一部の家系特有であるように見える。潰瘍性大腸炎を引き起こすものに関する理論は多いが、証明されたものはない。最も良く知られている理論は、腸壁で進行性炎症を引き起こすことによる、体の免疫系のウイルスまたは細菌との反応である。潰瘍性大腸炎のヒトは、免疫系の異常があるが、医師はこれらの異常が、本疾患の原因または結果であるかどうかはわからない。潰瘍性大腸炎は、感情的苦痛またはある種の食物または食品に対する感受性によって引き起こされることはないが、一部のヒトにおいてはこれらの要因が症状の引き金となることがある。
【００５９】
潰瘍性大腸炎の最も一般的は症状は、腹痛および出血性下痢である。患者は、疲労、体重減少、食欲減退、直腸出血、ならびに体液および栄養の喪失を経験することもある。患者の約半分は軽度の症状を有する。他の患者は、発熱、出血性下痢、悪心、および重度の腹部の痙攣に苦しめられる。潰瘍性大腸炎は、関節炎、眼の炎症、肝疾患(肝炎、肝硬変、および原発性硬化性胆管炎)、骨粗鬆症、皮膚発疹、および貧血などの問題も引き起こすことがある。問題が結腸の外側で生じる理由は、確実にはわかっていない。科学者は、これらの合併症は、免疫系が、体の他の部分で炎症の引き起こす場合に生じるであろうと考えている。これらの問題点の一部は、大腸炎が治療された時点で消失する。
【００６０】
詳細な身体試験および一連の検査が、潰瘍性大腸炎の診断には必要であろう。血液検査は、貧血をチェックするために行われ、これは結腸または直腸における出血を示唆する。血液検査はまた、高い白血球数を明らかにし、これは体内のどこかの炎症の徴候である。糞便試料を試験することにより、医師は、結腸または直腸の出血または感染症を検出することができる。医師は、結腸鏡検査またはS状結腸鏡検査を行うことができる。いずれの検査についても、医師は、コンピュータおよびTVモニターに接続された長い柔軟なライトのついたチューブである内視鏡を、肛門に挿入し、結腸および直腸の内側を観察する。医師は、結腸壁のあらゆる炎症、出血、または潰瘍を見ることができる。この検査時に医師は、結腸の裏層から組織試料を採取し顕微鏡で検査することを含む生検を行ってもよい。結腸のバリウム浣腸x-線撮影も、必要であることがある。この手順は、結腸をチョークのような(chalky)白色溶液であるバリウムで満たすことを含む。バリウムは、x-線フィルムで白色に写り、そこに存在し得る潰瘍または他の異常を含む、結腸の明確な像を、医師にもたらす。
【００６１】
潰瘍性大腸炎の治療は、疾患の重篤度によって決まる。ほとんどのヒトは、薬物療法により治療される。重症症例において、患者は、罹患した結腸を切除するための手術が必要となることがある。手術は、潰瘍性大腸炎の唯一のケアである。その症状がある種の食物により引き起こされる一部のヒトは、濃い味付けの食物、生の果実および野菜、または乳糖(ラクトース)のような自身の腸を不調にする食物を避けることにより、症状を管理することができる。個々のヒトは、異なる潰瘍性大腸炎を経験し、そのため治療は各個人に合わせられる。精神的および生理学的支援が重要である。一部のヒトは、数ヶ月または数年さえ続く寛解期間−症状が消失する期間−を有する。しかしほとんどの患者の症状は、最終的には回復する。この疾患の変化するパターンは、いつ治療が役立ったかを常に判断することができないことを意味する。一部の潰瘍性大腸炎のヒトには、状態をモニタリングするための定期的な医師の訪問による、しばらくの間の医学的ケアが必要である。
【００６２】
治療の目標は、寛解の誘導および維持であり、潰瘍性大腸炎のヒトの生活の質の改善である。いくつかの種類の薬物が利用可能である：
・アミノサリチル酸−5-アミノサリチル酸(5-ASA)を含有する薬物は、炎症の管理を補助する。スルファサラジンは、スルファピリジンおよび5-ASAの組合せであり、寛解を誘導および維持するために使用される。スルファピリジン成分は、抗炎症性5-ASAを腸へ運搬する。しかしスルファピリジンは、悪心、吐気、胸焼け、下痢、および頭痛を含むような副作用につながることがある。オルサラジン、メサラミンおよびバルサラジドのような他の5-ASA薬は、異なる担体を有し、より少ない副作用を供し、スルファサラジンを摂取することができないヒトに使用することができる。5-ASAは、結腸の炎症の位置に応じて、経口的、浣腸によるか、または坐剤で投与される。軽度または中等度の潰瘍性大腸炎のほとんどのヒトは、最初にこの群の薬物で治療される。
・コルチコステロイド−プレドニソンおよびヒドロコルチゾンなども、炎症を軽減する。これらは、中等度から重度の潰瘍性大腸炎のヒト、または5-ASA薬物に反応しないヒトに使用することができる。ステロイドとしても公知であるコルチコステロイドは、炎症の位置に応じて、経口的、静脈内、浣腸によるか、または坐剤で投与することができる。これらの薬物は、体重増加、座瘡、顔の毛、高血圧、気分変動、および感染症リスクの上昇などの副作用を引き起こし得る。この理由のために、これらは長期間使用は推奨されない。
・免疫モジュレーター−アザチオプリンおよび6-メルカプト-プリン(6-MP)などは、免疫系に作用することにより炎症を軽減する。これらは、5-ASAもしくはコルチコステロイドに反応しない患者、またはコルチコステロイドに依存する患者に使用される。しかし免疫モジュレーターは、緩徐に作用し、かつ完全な便益が認められるまでに最大6ヶ月を要することがある。これらの薬物を摂取している患者は、膵炎および肝炎、低下した白血球数、ならびに感染症リスクの上昇を含む合併症についてモニタリングされる。シクロスポリンAは、静脈内コルチコステロイドに反応しないヒトにおいて活動期の重度の潰瘍性大腸炎を治療するために、6-MPまたはアザチオプリンと共に使用することができる。
【００６３】
その他の薬物を、患者をリラックスさせるか、または疼痛、下痢もしくは感染症を緩和するために、投与することができる。
【００６４】
場合によっては、症状は、ヒトが入院しなければならないのに十分なほど重症である。例えば、ヒトは、重度の出血または脱水を引き起こすような重度の下痢を有することがある。このような症例において、医師は、下痢、ならびに血液、体液およびミネラル塩の喪失を停止するように努力する。患者は、特別食、静脈を介した栄養補給、薬物療法、時には手術を必要とすることがある。
【００６５】
潰瘍性大腸炎患者の約25〜40％は、大量出血、重度の疾患、結腸の破裂または癌のリスクのために、最終的にはその結腸を摘出しなければない。時には医師は、内科的治療が失敗した場合またはコルチコステロイドもしくは他の薬物の副作用が患者の健康を脅かす場合に、結腸摘出を推奨する。結腸および直腸を摘出する手術は、直腸結腸切除術として公知であるが、これは以下の1つに従う：
・回腸造瘻術。これは、外科医が、腹部にストーマと称される小さい開口部を作成し、これを回腸と称される小腸の末端と吻合する。排泄物は、小腸を通って移動し、ストーマを通り体から排出される。このストーマは、ほぼクォーターサイズであり、通常胴回り近くの腹部の下位右側部分に配置される。排泄物を収集するために、開口部の上にパウチを装着し、患者は必要に応じパウチを空にする。
・回腸肛門吻合または貫通手術。これは、肛門部分を保存するので、患者は正常な腸運動を持つことができる。この手術において、外科医は、結腸の罹患部および直腸の内側を摘出し、直腸の外側筋肉を残す。次に外科医は、回腸を直腸および肛門の内側に吻合し、パウチを作成する。排泄物はパウチ内に貯められ、通常の様式で肛門を通過する。腸運動は、より頻繁になり、本手技以前よりもより水様になる。パウチの炎症(回腸嚢炎)は、可能性のある合併症である。
【００６６】
全ての手術が各人に適切なわけではない。どの手術を行うかは、疾患の重症度および患者の必要性、予期およびライフスタイルによって決まる。その決断に直面したヒトは、主治医、結腸手術患者の経験のある看護師(人工肛門の療法士)、および他の結腸手術患者に相談することにより、できる限り多くの情報を得るべきである。患者支援組織は、患者に支援グループおよび他の情報源を示すことができる。
【００６７】
ほとんどの潰瘍性大腸炎の患者には、手術は全く不要である。しかし手術が必要になり始めると、患者の一部は、術後に大腸炎が治癒し、ほとんどのヒトは通常の活動的生活を続けることができることを知り、安堵する。
【００６８】
B. クローン病
潰瘍性大腸炎のように、O-グリカンは、別の胃-腸管の炎症疾患であるクローン病において役割を果たすことが示唆されている。クローン病は、腸の炎症ならびに腸の狭窄およびフィステルの発症により特徴付けられ；これらの症状にニューロパシーが随伴することが多い。クローン病の病因の一つの仮説は、恐らく遺伝的易罹患性および環境因子(例えば喫煙)、細菌および食物抗原を含む腸管由来の抗原への免疫系の曝露から生じる、腸粘膜障壁の欠損である(例えば、Soderholmら, 1999；Hollanderら, 1986；Hollander, 1992)。別の仮説としては、パラ結核菌(Mycobacterium paratuberculosis)、リステリア菌(Listeria monocytogenes)、異常な大腸菌(Escherichia coli)またはパラミクソウイルスなどの病原体による持続性の腸感染症は、免疫応答を刺激するか；あるいは、症状は、正常な腸の微生物叢ならびにそれらが産生する代謝産物および毒素のような遍在性の抗原に対する無調節の免疫応答から生じる(Sartor, 1997)。血清中のIgAおよびIgG抗-出芽酵母(Sacccharomyces cerevisiae)抗体(ASCA)の存在は、小児クローン病について高度に診断に役立つことが認められた(Ruemmeleら, 1998；Hoffenbergら, 1999)。
【００６９】
クローン病に対する診断および治療のツールを開発する最近の努力は、サイトカインの中心的役割に焦点を当てている(Schreiber, 1998；van HogezandおよびVerspaget, 1998)。サイトカインは、細胞と細胞の相互作用、細胞間情報伝達、または他の細胞の挙動に特異的作用を有する、小型の分泌タンパク質または因子(5〜20kD)である。サイトカインは、リンパ球、特にTH1およびTH2リンパ球、単球、腸のマクロファージ、顆粒球、上皮細胞、および線維芽細胞により産生される(RoglerおよびAndus, 1998；GalleyおよびWebster, 1996において概説)。一部のサイトカインは、炎症促進性であり(例えば、TNF-α、IL-1(αおよびβ)、IL-6、IL-8、IL-12、または白血病阻止因子(LIF))；他のものは、抗炎症性である(例えば、IL-1受容体アンタゴニスト、IL-4、IL-10、IL-11、およびTGF-β)。しかし、ある特定の炎症条件下でのそれらの作用においては、重複および機能の冗長性が存在し得る。
【００７０】
クローン病の活動性症例において、上昇した濃度のTNF-αおよびIL-6は、血液循環中に分泌され、ならびにTNF-α、IL-1、IL-6、およびIL-8は、粘膜細胞により過剰に局所的に産生される(同上；Funakoshiら, 1998)。これらのサイトカインは、骨形成、造血、ならびに肝臓、甲状腺および神経精神の機能を含む生理系に広範囲に渡る作用を有し得る。同じく炎症促進性IL-1βに有利な、IL-1β/IL-1ra比の不均衡が、クローン病患者において認められる(RoglerおよびAndus, 1998；Saikiら, 1998；Dionneら, 1998；しかしKuboyama, 1998を参照)。1つの研究は、糞便試料中のサイトカインプロファイルは、クローン病の有用な診断ツールであることを示唆している(Saikiら, 1998)。
【００７１】
5-アミノサリチル酸(例えばメサラミン)またはコルチコステロイドのような抗炎症薬が典型的には処方されるが、常に有効ではない(Botomanら, 1998において概説)。シクロスポリンによる免疫抑制は、コルチコステロイドに抵抗性の患者または不耐性の患者に時には有用である(Brynskovら, 1989)。クローン病において、無調節な免疫応答は、細胞-媒介型免疫病理に偏っている(Murch, 1998)。しかしシクロスポリン、タクロリムスおよびメサラミンのような免疫抑制薬が、コルチコステロイド-抵抗性のクローン病症例を治療するために使用され、様々な成果をあげている(Brynskovら, 1989；Fellermanら, 1998)。しかしながら外科的修復が、最終的に患者の90％において必要であり；50％が、結腸切除を受ける(Leiperら, 1998；Makowiecら, 1998)。術後の再発率は高く、50％が5年以内に更なる手術を必要とする(Leiperら, 1998；Besnardら, 1998)。他の療法は、様々なサイトカインのアンタゴニスト(例えばIL-1ra)、インヒビター(例えばIL-1β転換酵素および抗酸化薬)、および抗-サイトカイン抗体の使用である(RoglerおよびAndus, 1998；van HogezandおよびVerspaget, 1998；Reimundら, 1998；Lugeringら, 1998；McAlindonら, 1998)。TNF-αに対するモノクローナル抗体が、クローン病の治療において試みられ、一部成功している(Targanら, 1997；Stackら, 1997；van Dullemenら, 1995)。
【００７２】
クローン病を治療する別のアプローチは、炎症反応を引き起こすことがある細菌コミュニティの少なくとも部分的根絶、およびそれの非病原性コミュニティとの置き換えに焦点を当てている。例えば米国特許第5,599,795号は、ヒト患者においてクローン病を予防および治療する方法を開示している。それらの方法は、存在する叢を死滅させるための少なくとも1種の抗生物質および少なくとも1種の抗真菌薬による腸管の殺菌、ならびにそれらの正常なヒトから採取された、様々な選び出された良く特徴付けられた細菌による置き換えに関する。Borodyは、洗浄による存在する腸の微生物叢の少なくとも部分的な除去、および疾患-スクリーニングしたヒトドナー由来の糞便接種物によるかまたはバクテロイデス属菌(Bacteroides)種および大腸菌種を含む組成物により導入された新たな細菌コミュニティによる置き換えにより、クローン病を治療する方法を示している(米国特許第5,443,826号)。しかし、診断および/または治療の対象になり得るクローン病の原因はわかっていない。
【００７３】
III. 胃腸癌
状況証拠から、O-グリカンが、胃腸癌において役割を果たしている可能性のあることが示唆される。本発明者らは、驚くべきことに、O-グリカンはそれら自身、そのような癌の阻害を示すことを発見した。従って本発明のO-グリカン化合物(例えばムチン)は、ここでは結腸直腸癌のような胃腸癌の予防および治療のために推奨される。本発明により予防または治療され得る胃腸癌は、結腸直腸癌(例えば、結腸直腸腺腫、結腸直腸癌、または結腸直腸腺腫様ポリープ)、胃癌、大腸または小腸の癌、および食道癌を含む。ある態様において、本発明を用い予防または治療される胃腸癌は、結腸直腸癌である。
【００７４】
結腸直腸癌は、結腸または直腸において始まる癌に関して使用される用語である。結腸癌および直腸癌は、GI(胃腸)系とも称される消化系において始まる。これは、食物が処理され、エネルギーを作成しかつ体から廃棄物を除去する場所である。結腸直腸癌は、主に年齢50歳以上の男性および女性を冒す。男性に関して、結腸直腸癌は、前立腺癌および肺癌に続く第3位の頻度の癌である。女性に関して、結腸直腸癌は、乳癌および肺癌に続く第3位の頻度の癌である。
【００７５】
結腸の様々な領域で始まる癌は、異なる症状を引き起こすことがある。ほとんどの症例において、結腸癌および直腸癌は、数年にわたりゆっくり発生する。これらの癌のほとんどは、組織の結腸または直腸の中心部への成長である、ポリープとして始まる。腺腫として知られているポリープ型は、癌性となり始める可能性がある。早期のポリープの除去は、それが癌となり始めることを防ぐことができる。結腸癌および直腸癌の95％以上は、腺癌である。結腸および直腸の内側を裏打ちする細胞の癌が存在する。いくつかの他の、より稀な結腸および直腸の腫瘍の型が存在する。
【００７６】
従って本発明は、癌の予防、阻害または治療のためのO-グリカン組成物の使用に関する。本発明の水性組成物は、癌の症状を阻害、予防または軽減するO-グリカン組成物の有効量を有する。そのような組成物は一般に、薬学的に許容される担体、希釈剤または水性媒体中に溶解または分散される。1日おき、1日1回、1日2回、1日3回を含む様々な投与様式が企図されている。胃腸癌の発症リスクのある個体については、慢性的長期投与も企図される。一般に、経口投与が選択経路であるが、静脈内または筋肉内注射も利用することができる。
【００７７】
予防に関して、潰瘍性大腸炎の患者には、結腸直腸癌のリスクが増大するように見え、従って予防的/防御的投与を受けるクラスを構成する。いくつかの因子が、IBD患者における結腸直腸癌のより高いリスクと関連していることが示唆されている。罹患期間の延長は、一般にリスク因子として受け入れられており、潰瘍性大腸炎が8年未満存在する場合に、結腸直腸癌が診断されることは稀である。発症年齢は、結腸直腸癌発症のリスクと関連することが示唆されている。結腸直腸癌の家族歴も、リスク因子であり；結腸直腸癌の一等親血縁者を持つ潰瘍性大腸炎およびクローン病の患者は、結腸直腸癌の発症に関して、各々2.5および3.7の相対リスクを有し、ならびに一等親血縁者が50歳以前に結腸直腸癌と診断された場合、相対リスクは9.2である。
【００７８】
ほとんどの研究において、潰瘍性大腸炎の程度も、結腸直腸癌発症のリスク因子である。直腸炎の患者における結腸直腸癌のリスクに関する発生率は1.7であり、直腸を超えて広がるが右結腸曲には及ばない疾患の患者については2.8であり、ならびに右結腸曲を超えた疾患を有する患者については14.8であることが報告されている。
【００７９】
IV. 併用療法
O-グリカン化合物または組成物(例えばムチン)は、癌(例えば結腸直腸癌)または炎症性腸疾患を治療するために別の薬剤と組合せて投与されてよい。薬剤を組合せることにより、単剤療法に関連した毒性(もしあれば)を増強することなく、相加作用を実現することができる。加えて、相加作用を超える作用(「相乗作用」)を認めることが可能である。従って併用療法は、新規の治療的投薬計画を開発する一般的方法である。
【００８０】
O-グリカン治療は、数分から数週間の範囲の間隔で、他方の薬剤に先行して、それと同時におよび/またはそれに続けて行われる。O-グリカン治療および他の薬剤が、細胞、組織または生物に個別に適用される態様において、その結果O-グリカン治療および薬剤がなお、細胞、組織または生物に対し有利に組み合わせられた作用を発揮することができるように、各送達の時点の間で多くの時間が費やされないことを確実にすることが一般的であろう。例えば、そのような場合には、細胞、組織または生物を、2、3、4種またはそれ以上のモダリティで、実質的に同時に(すなわち約1分以内に)、O-グリカン治療に接触させることができることが企図される。別の局面において、1種または複数の薬剤は、O-グリカン治療の投与の前および/または後に、実質的に同時、約1分、約5分、約10分、約20分、約30分、約45分、約60分、約2時間、約3時間、約4時間、約5時間、約6時間、約7時間、約8時間、約9時間、約10時間、約11時間、約12時間、約13時間、約14時間、約15時間、約16時間、約17時間、約18時間、約19時間、約20時間、約21時間、約22時間、約22時間、約23時間、約24時間、約25時間、約26時間、約27時間、約28時間、約29時間、約30時間、約31時間、約32時間、約33時間、約34時間、約35時間、約36時間、約37時間、約38時間、約39時間、約40時間、約41時間、約42時間、約43時間、約44時間、約45時間、約46時間、約47時間、約48時間、約1日、約2日、約3日、約4日、約5日、約6日、約7日、約8日、約9日、約10日、約11日、約12日、約13日、約14日、約15日、約16日、約17日、約18日、約19日、約20日、約21日、約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7または約8週間またはそれ以上、およびその中で誘導可能な任意の範囲以内で、投与されてよい。
【００８１】
O-グリカン治療および1種または複数の薬剤の様々な併用投薬計画を、使用することができる。そのような組合せの非限定的例を以下に示すが、ここでO-グリカン治療は「A」であり、薬剤は「B」である：
2010501472.tif 000003
【００８２】
A. IBD併用療法
本発明のO-グリカン療法は、IBDの治療のために使用される他の療法と一緒に使用することができる。従ってO-グリカン(例えばムチン)を、以下に考察されるような、IBDの治療に使用される別の薬剤と組合せて使用してよい。
【００８３】
従来的には、IBDの治療に対し段階的アプローチが使用される。アミノサリチル酸/NSAIDおよび対症療法的薬剤は、第一選択の治療と考えられる。次に、特に肛門周囲疾患または炎症性腫瘤を有するクローン病患者においては、抗生物質頼る。コルチコステロイドは、次の防御線であり、他の抗炎症薬よりも著しく大きい副作用を有する。コルチコステロイドが望ましい結果をもたらさない場合は、免疫調節薬を使用することができる。前述のいずれかの範疇の薬物は、一緒に使用することができる。いくつかの具体例を以下に示す。
【００８４】
アミノサリチル酸
アミノサリチル酸は、アスピリンファミリーの抗炎症薬である。米国においては使用のために入手可能な5種のアミノサリチル酸調製物が存在する：スルファサラジン(Azulfidine)、メサラミン(Asacol, Pentasa)、オルサラジン(Dipentum)、およびバルサラジド(Colazal)。これらの薬物は、経口または経直腸(浣腸、坐薬製剤)のいずれかで投与することができる。
【００８５】
NSAID
非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)は、プロスタグランジン産生を阻害することにより作用する。非限定的例は、イブプロフェン、ケトプロフェン、ピロキシカム、ナプロキセン、ナプロキセンナトリウム、スリンダク、アスピリン、サブサリチル酸コリン、ジフルニサル、オキサプロジン、ジクロフェナクナトリウム遅延放出剤、ジクロフェナクカリウム即時放出剤、エトドラク、ケトロラク、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、インドメタシン、フェナム酸塩、メクロフェナメイト、メフェナム酸、ナブメトン、オキシカム、ピロキシカム、サルサラート、トルメチン、およびサリチル酸マグネシウムを含む。
【００８６】
コルチコステロイド
コルチコステロイドは、強力で即時作用する抗炎症薬である。IBDにおけるそれらの使用は、急性再発についてのみである。コルチコステロイドは、疾患の位置および重症度に応じて、様々な経路により投与されてよく；これらは、病院内で静脈内に(メチルプレドニゾロン、ヒドロコルチゾン)、経口的に(プレドニソン、プレドニソロン、ブデソニド、デキサメタゾン)、または経直腸的に(浣腸、坐剤、泡調製物)投与されてよい。コルチコステロイドは、症状の迅速な緩和に加え炎症の著しい軽減を提供する傾向があるが、それらの副作用のためにそれらの使用は制限される(特に長期使用)。
【００８７】
免疫修飾剤
免疫修飾剤は、6-メルカプトプリン(6-MP、プリネトール)およびアザチオプリン(Imuran)を含む。免疫修飾剤は、リンパ球(白血球型)数の減少を引き起こすことにより、作用することができる。これらは、アミノサリチル酸およびコルチコステロイドが、効果がないかまたは部分的にのみ有効であるかのいずれかの場合に使用されることが多い。これらは、一部の患者のコルチコステロイドへの依存を軽減または排除する上で有用である。免疫修飾剤は、難治性潰瘍性大腸炎の患者の一部において寛解を維持することの一助となることも判明し得る。
【００８８】
抗-TNF薬
インフリキシマブ(Remicade)は、抗-TNF薬であり、TNFに結合し、これにより組織へのその作用を阻害することにより作用する。これは、標準の薬物療法に対し不適切な反応を有する中等度から重度のクローン病のヒトの治療に関してFDAにより承認されている。そのようなヒトにおいて、反応率80％および寛解率50％が報告されている。
【００８９】
抗生物質
メトロニダゾールおよびシプロフロキサシンは、IBDのヒトにおいて最も一般的に使用される抗生物質である。抗生物質は、潰瘍性大腸炎ヒトにおいて控えめに使用され、その理由はこれらは抗生物質に関連した偽膜性大腸炎の発症リスクが増大するからである。クローン病のヒトにおいて、抗生物質は、合併症(肛門周囲疾患、フィステル、炎症性腫瘤)の治療に使用される。
【００９０】
対症療法
症状緩和のために、下痢止め薬、抗痙攣薬、および酸抑制薬も提供することができる。
【００９１】
B. 癌の併用療法
別の態様において、本発明は、胃腸癌の発症を予防もしくは遅延するか、またはそれらの症状を軽減するために使用することができる。癌の発症を防止するために使用することができるいくつかの薬剤が存在するが、非ステロイド系抗炎症薬(ペロキシカム(peroxicam)、スリンダク、アスピリン)は、結腸直腸癌に関して予防的作用を有することが示唆されている。同じく高度の繊維を組み込んだ食事、果実および野菜も、結腸直腸癌のリスクの低下に関連している。
【００９２】
V. 実施例
下記実施例は、本発明の好ましい態様を明らかにするために含まれる。下記実施例において明らかにされた技術は、本発明の実践において良く機能するよう本発明者らにより発見された技術を代表するものであり、従ってその実践に関する好ましい様式を構成しているとみなすことができることは、当業者により理解されなければならない。しかし当業者は、本開示を考慮し、開示された具体的態様において多くの変更を行うことができ、かつ本発明の精神および範囲から逸脱することなく、類似したまたは同様の結果を依然得ることができることを理解するはずである。
【００９３】
実施例1−コア3-由来のO-グリカン欠損マウスは、野生型(WT)同腹子と比べ、DSS誘導型大腸炎にはるかに易罹患性である
コア3-由来のO-グリカン欠損マウスは、野生型同腹子と比べ、DSS誘導型大腸炎にはるかに易罹患性である。
コア3-由来のO-グリカンの形成に重要な酵素であるC3GnTは、腸上皮、特に結腸組織において大部分発現される(Iwaiら, 2002、データは示さず)。腸の機能におけるコア3-由来のO-グリカンの役割を試験するために、本発明者らは、図2Aおよび2Bに図示したように通常のC3GnT遺伝子-欠損マウス系統(C3GnT-/-)を確立した。C3GnTの発現パターンを同定するために、内在性C3GnTプロモーター領域の直ぐ後ろにlac Zリポーターを組み込んだ(図2A)。RT-PCRおよび酵素アッセイは、組織抽出物中のC3GnT mRNA転写および酵素活性は、C3GnT-/-マウスにおいて排除されたことを明らかにした(図2Cおよび2D)。様々なC3GnT-/-組織のlac Z染色は、C3GnTの発現が腸に限定されることを確認した(図2E)。
【００９４】
C3GnT-/-マウスを開発し、通常のように交配した。複数の臓器の肉眼での形態学的試験および組織学的試験は、WTおよびC3GnT-/-マウスの間に認知できる差異が存在しないことを明らかにした(図3A)。しかし腸組織の過ヨウ素酸−シッフ法(PAS)および抗-マウスMuc2ペプチド抗体染色は、糖部分および主要な腸のムチンであるMuc2の発現は、C3GnT-/-結腸組織において著しく低下したことを明らかにした(図3Bおよび3C)。変更されたグリコシル化の結果を調べるために、本発明者らは、6週齢のC3GnT-/-雄およびWT雄を、飲料水中の2％DSS(分子量40kDa、INC Biomedicals Inc.)に7日間、引き続きDSSを含まない水に4日間曝露した(Stevcevaら, 2001)。これらの実験条件は、C3GnT-/-マウスにおいて、WTと比べ、はるかに重症型の大腸炎、はるかに大きく重篤な体重減少、下痢および便への出血を誘導した(図4A、データは示さず)。この炎症は、結腸、特に遠位結腸領域に限定され、小腸は著しく冒されることはなかった(図4B)。これらの実験は、腸の機能におけるコア3-由来のO-グリカンの意義を明らかにしている。
【００９５】
腸のコア1-由来のO-グリカンを欠損したマウスは自然発症的潰瘍性大腸炎を発症する。
コア1-由来のO-グリカンは、O-グリカンの主要型であり、多くの組織において発現される(Varkiら, 1999)。特に腸組織におけるコア1-由来のO-グリカンの役割を評価するために、本発明者らは、コア1-由来のO-グリカン生合成の重要な酵素であるT-シンターゼの腸上皮細胞-特異的欠損を伴うマウス系統を確立した(Epi T-syn-/-)。この系統は、よく確立されたCre/loxPシステムを用いて作出した。
【００９６】
本発明者らは最初に、T-syn遺伝子がloxP部位の側方に位置したマウスを開発した(T-synflox/floxマウス、データは示さず)。Epi T-syn-/-マウスを作出するために、T-synflox/floxマウスを、Villinプロモーター(VillinCre Mice, Jackson Laboratories)の制御下で、特異的に腸上皮細胞においてCreリコンビナーゼを発現しているトランスジェニック系統と交配した(図5Aおよび5B)。Epi T-syn-/-マウスは、予想されるメンデル比で出生し、誕生時に表現型欠損を示さなかった。RT-PCRによるT-syn転写産物の特徴決定は、loxPが導入された(floxed)のT-syn遺伝子のVillinCre-媒介したインビボ欠失は、単離された上皮細胞において完了したことを示した(図5C)。インビボ欠失の特異性を決定するために、本発明者らは、Epi T-syn-/-腸の組織断片を、Tn抗原に対するモノクローナル抗体(mAb)でプロービングした。WT組織は、Tn抗原を発現しないことが予想された。特異的VillinCre媒介欠失は、コア1-由来のO-グリカンの合成を根絶すること、およびEpi T-syn-/-マウスの腸上皮細胞において専らTn抗原を露出することが予想された。予想されたように、抗-Tn mAbによる免疫化学染色は、WT腸組織を標識しなかった。対照的に、抗-Tn mAbは、Epi T-syn-/-腸上皮細胞を標識したが、これらのマウスの他の細胞型は標識しなかった(図5D)。これらの知見は、VillinCre媒介欠失の特異性を証明している。
【００９７】
5週齢未満の若いEpi T-syn-/-マウスは、同腹子対照から識別不可能であった。しかし6週目の始めに、Epi T-syn-/-マウスの約20％は下痢を示し、ならびに12週目に、全てのEpi T-syn-/-マウスは下痢し、および一部は時折血便を有した。明白な体重減少が、雄のEpi T-syn-/-マウスにおいて、8週目までに明らかになった(図6A)。Epi T-syn-/-マウスの約15％は、直腸脱を有し(図6B)、本疾患の重症度は、時間が経つにつれて進行した。Epi T-syn-/-マウスの結腸、特に遠位結腸および直腸は、拡張しかつ肥厚した壁を有した(図6C)。実際に、この領域は常に疾患を示し、かつ常に最も重篤に罹患した。肥大した腸間膜リンパ節(MLN)は一般的であった(図6D)。鏡検は、心臓、肝臓、胃、脾臓および胸腺などの主な臓器においては異常がないことを示した。しかし、Epi T-syn-/-結腸は、上皮潰瘍形成、炎症細胞浸潤、杯細胞喪失、上皮過形成、および時には陰窩微小膿瘍により特徴付けられる、著しい炎症を示した(図6Eおよび6F)。
【００９８】
PASおよびMuc2染色は、Epi T-syn-/-マウスは、糖類、特に粘液層およびMuc2染色を有意に減少したことを明らかにした(図7Aおよび7B)。更に、Epi T-syn-/-結腸粘膜のHPLC分析は、WT結腸粘膜と比べ、O-グリカンの量および多様性の劇的低下を示した(図7C)。従ってO-グリカンの喪失は、Epi T-syn-/-マウスにおける大腸炎の病理と相関している。
【００９９】
コア1および3-由来のO-グリカンの両方が欠損したマウスは、自然発症的でありかつ早期に発症する重度の潰瘍性大腸炎を示す。
コア1およびコア3-由来のO-グリカンは、腸粘液の主要グリカン成分である(Corfieldら, 2001；Varkiら, 1999)。それらの役割を研究するために、本発明者らは、コア3-由来のO-グリカンに加え、腸のコア1-由来のO-グリカンを欠損しているマウス(DKO)を確立した。DKOマウスは、Epi T-syn-/-マウスとC3GnT-/-マウスの異種交配により作出した(図8A)。DKO結腸組織における抗-Tn mAbによる免疫組織化学染色、結腸組織抽出物のTn-特異性レクチンHPAによるウェスタンブロットは、DKO結腸組織におけるTn抗原発現を明らかにしたが、WT組織においては明らかにしなかった(図8Bおよび8C)。シアリダーゼ処理は、Tn染色パターンを有意に変更せず、このことはTn抗原のほとんどは、シアル酸によりキャップされないことを示唆している(図8C)。PASによる染色は、DKO結腸組織における糖類の劇的低下を確認した(図8D)。DKO組織内にPASの弱い残存する染色が認められ、これはTn抗原の染色を反映している。DKO組織における低下したMuc2染色は、O-グリカンの非存在は、このムチン発現に影響を及ぼすことを示している(図8E)。
【０１００】
DKOマウスは、Epi T-syn-/-マウスのそれよりもはるかに重症である自然発症的潰瘍性大腸炎の早期発症型を発症した。DKOマウスは、誕生後3週目と早くに疾患を発症し(データは示さず)、本疾患の重症度は時間と共に進行し続けた(図9A-D)。Epi T-syn-/-マウス同様、炎症は、主に遠位結腸に限定され、これはヒト疾患に類似している。
【０１０１】
実施例2−ムチンの経口投与は、EPI T-SYN-/-マウスにおいて潰瘍性大腸炎を予防する 
外来性ムチン調製法
本発明者らは、公開された方法に従い、これに改変を加え、新鮮なブタの胃または結腸からムチンを精製した(Xiaら, 2005；Festeら, 1990)。簡単に述べると、ブタの胃または結腸の粘膜層(上皮および粘液を含む)を、内容物を除去し、水で簡単にすすいだ後、こすりとることにより取り除いた。粘膜物質を、氷冷した水中でホモジネートし(〜1部粘膜：1部水、最終スラリー)、遠心分離し、不溶性デブリを除去した。上清中の可溶性ムチンを、100mM HClを用いpH5.0に調節することにより沈殿させ、引き続き遠心分離した(10,000×g、4℃、10分間)。ペレットを、再度溶解し、100mM NaOHを用いpH7.2に調節し、その後メタノール：クロロホルム(1:1v/v)中で2回抽出し、その後2回目の遠心分離を行った。中間相を収集し、透析し(12〜14,000MWCO)、引き続きヘパリナム由来のヘパリナーゼII(0.075U/ml, Sigma)、コンドロイチナーゼABC(0.015U/ml, Sigma)、DNase(75U/ml, Invitrogen)、RNase(0.01mg/ml, Invitrogen)、およびプロテイナーゼK(0.25U/ml, 65℃でO/N, Sigma)で逐次処理した。これらの処理は、混入している脂質、ポリペプチド、およびヌクレオチドを除去する。その後ムチンを、空隙容量＞200kDa画分として、等張緩衝液(50mMトリス, 100mM NaCl, pH7.4)中のサイズ排除クロマトグラフィー(Sephacryl HR-S-200, Pharmacia)により収集した。この空隙容量画分を透析し、凍結乾燥し、秤量し、-80℃で貯蔵した。精製されたムチンの品質は、3％スタッキングゲルおよび4％分離ゲルを用いSDS-PAGEにより証明し、PASにより染色した。タンパク質は、BCAキット(Pierce)を用いて測定した。
【０１０２】
EPI T-SYN-/-マウスにおける外来性ムチンの経口投与
本発明者らの実験は、O-グリカン-欠損マウスは、Muc2染色の有意な低下、減少した腸の粘液ゲル層、および潰瘍性大腸炎の高い易罹患性を示すことを明らかにした。分泌型ムチンは腸の粘液ゲル層の主要成分であるので、このことは、外来性ムチンの投与は治療的であり得ることの理由である。従って本発明者らは、精製されたブタの胃ムチンの経口投与は、Epi T-syn-/-マウスにおいて潰瘍性大腸炎を予防するかどうかを試験した。Epi T-syn-/-マウスは、通常使用される水分補給源(a commonly used hydration source)であるNapa-Nectorにおいて50mgムチン/マウス/日で処置した。対照Epi T-syn-/-マウスは、Napa-Nectorのみで処置した。マウスは、4週齢で開始し、7週間処置した。処置したマウスは、未処置対照と比べ、大腸炎の重症度がはるかに低い型を発症した。予備的ではあるが、本実験は、O-グリカンの喪失は、粘液ゲル層の機能に主に作用し、および外来性ムチンは、潰瘍性大腸炎の治療に関して治療的価値の可能性があることを示唆している(図9A-D)。
【０１０３】
ムチン調製
本発明者らは、胃の反対側のブタ結腸から単離されたムチンは、より良い治療作用を生じるかどうかも調べた。先に説明された実験において、本発明者らは、ブタの胃ムチンを使用した。この作用物質は本発明者らのモデルにおいて大腸炎に対する予防的作用を示したが、ブタの結腸由来のムチンは、胃ムチンに比べ、大腸炎に対するより良い治療作用を有するかどうかを決定しようとした。従ってムチンを、新鮮なブタの結腸から精製した。簡単に述べると、内容物を除去し、水で簡単にすすいだ後、ブタの結腸の粘膜層(上皮および粘液を含む)を、かきとることにより取り除いた。粘膜物質を、氷冷した水中でホモジネートし(〜1部粘膜：1部水、最終スラリー)、遠心分離し、不溶性デブリを除去した。上清中の可溶性ムチンを、75％アルコールにより沈殿させ、引き続き遠心分離した(10,000×g、4℃、10分間)。ペレットを、再度溶解し、透析し、凍結乾燥し、秤量し、-80℃で貯蔵した。精製されたムチンの品質は、SDS-PAGEにより証明し、PASにより染色した(図10A-B)。
【０１０４】
C3GnT-/-/Epi T-syn-/-マウス(6週齢)を、3群に分けた(3匹マウス/群)。第1群には、Napa-Nectorと混合した精製したブタの結腸ムチンを、50mgムチン/マウス/日で摂取させた。第2群は、同量のアルブミン(ムチン重量の20％)を含有するNapa-Nectorで飼育した。予備的データは、ブタの結腸ムチンで処置したマウスは、対照よりもはるかに迅速に体重が増えたことを示した(図11)。予備的ではあるが、これらの実験は、O-グリカンの喪失は、主に粘液ゲル層の機能に作用し、外来性ムチンは、潰瘍性大腸炎に関して予防的および治療的価値の大きな可能性があることを示唆している。
【０１０５】
本明細書に開示されかつ請求された全ての組成物および方法は、本開示を考慮し、必要以上に実験することなく実行および達成することができる。本発明の組成物および方法は、好ましい態様に関して説明されているが、本発明の概念、精神および範囲から逸脱しない限りは、本明細書に説明された組成物および方法および工程、または方法の工程の順番を変更してよいことは当業者には明らかであろう。より詳細に述べると、化学的および生理的の両方で関連したある作用物質は、本明細書に説明された作用物質と置き換えてよく、同じまたは同様の結果が達成されることは明らかであろう。当業者に明らかであるそのような同様の置換および修飾は全て、添付された特許請求の範囲により規定される本発明の精神、範囲および概念内であると考えられる。
【０１０６】
参考文献
下記参考文献は、本明細書に説明されたものを補充する例証的手法または他の詳細を提供する範囲内で、具体的に本明細書に参照として組入れられている。
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【図面の簡単な説明】
【０１０７】
下記図面は、本明細書の一部を形成し、かつ本発明のある局面を更に明らかにするために含まれる。本発明は、本明細書に提示された具体的態様の詳細な説明と組合せて、これらの図面の1つまたは複数を参照し、より良く理解することができる。
【図１】このスキームは、O-グリカンコア構造の2つの主な型を示す。T-シンターゼは、コア1β1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼを指す。C3GnTは、コア3β1,3-Nアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼを指す。矢頭は、更なる分枝、伸長、フコシル化、シアル酸化および硫酸化の可能性のある経路を示す。
【図２】C3GnTの遺伝子を標的化することにより、コア3-由来のO-グリカンを欠くように操作されたマウス(C3GnT-/-)を示す。(図2A)遺伝子標的化戦略を示す。(図2B)サザンブロット遺伝子多型解析を示す。(図2C)RT-PCRは、C3GnT遺伝子産物の欠損を確認する。(図2D)酵素アッセイは、C3GnT-欠失組織におけるC3GnT活性の排除を示す。(図2E)LacZ染色は、C3GnT発現パターンを確認する。
【図３】(図3A-B)C3GnT-/-結腸は、低下した糖発現を示す。(図3C-D)DSS処置後7日目のC3GnT-/-およびWTマウスにおける、体重変化(図3C)およびHE染色結腸組織における炎症の変化(図3D)の比較を示す。
【図４】(図4A)DSSおよびAOM誘導型結腸直腸腫瘍により易罹患性のC3GnT-/-(*)を示す。(図4B)組織学検査は、インサイチュー腺癌を示している(矢頭)。
【図５】腸上皮細胞に特異的にT-シンターゼ遺伝子を欠失しているマウス(Epi T-syn-/-)の作出を示す。(図5A)Epi T-syn-/-マウスの作出戦略を示す。(図5B)尾組織から単離されたDNAのPCR(商標)遺伝子多型解析を示す。(図5C)T-syn mRNAは、T-syn-/-腸上皮細胞において完全に根絶された。(図5D)Epi T-syn-/-腸上皮は、Tn抗原について特異的に陽性染色されたが、WT腸上皮は染色されなかった。
【図６】(図6A)WTおよびEpi T-syn-/-雄の成長曲線を示す。(図6B)直腸脱を示したEpi T-syn-/-マウスを示す。(図6C)20-週齢のWTおよびEpi T-syn-/-マウス由来の大腸を示す。(図6D)Epi T-syn-/-マウス由来のMLNと、WT対照由来のMLNの比較を示す。(図6E-F)HE染色WTおよびEpi T-syn-/-遠位結腸切片を示す。
【図７】結腸切片のPASおよびMuc2染色の代表的画像を示す。
【図８】(図8A)Epi T-syn-/-およびC3GnT-/-二重ノックアウトマウス(DKO)作出のための交配戦略を示す。(図8B)抗-TN mAb染色を示す。(図8C)Tn-特異性レクチンHPAのウェスタンブロットを示す。β-アクチンを、負荷対照として使用した。(図8D-E)WTおよびDKO雄の成長曲線(図8D)および結腸組織学(図8E；6-週齢)を示す。
【図９】(図9A)ムチン処置または偽処置したEpi T-syn-/-マウスの成長曲線を示す。(図9B)組織学対照としてのHE染色WT結腸組織を示す。(図9C-D)ムチン処置または非処置の7週間後のEpi T-syn-/-マウスの代表的なHE染色結腸組織を示す。
【図１０】ムチンは、ブタ結腸の管腔表面層を収集し、引き続きアルコール沈殿することにより調製した。生成物は、SDS-PAGEゲル上を流した。(図9A)PAS染色は、グリカンを示す。(図9B)画分4のタンパク質混入を試験するためにクマシー染色し、これは最終生成物であり、実験に使用した。
【図１１】ブタ結腸ムチンによるムチン治療的試験を示す。大腸炎のWTまたはC3GnT-/--Epi Tsyn-/-マウス(各群3匹)を、ブタ結腸ムチンまたはアルブミン対照により処置した。体重の変化を、ベースラインと比較した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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