(57)【要約】  本発明は、５プライムから３プライムの方向に配列される以下の隣接するエレメント；プロモーター、選択可能マーカー、候補ｍｉＲＮＡ標的配列を含む核酸セグメントを受け入れるためのクローニング部位、及びポリアデニル化シグナルを含む核酸であって、前記エレメントが、前記プロモーターによって誘導される転写物が前記選択可能マーカー、前記候補ｍｉＲＮＡ標的配列、及び前記ポリアデニル化シグナルをその順序で含むように配列される核酸に関する。適切には、ｍｉＲＮＡ試験配列は、３’ＵＴＲであり又は３’ＵＴＲに由来する。本発明はまた、ライブラリーを作製及びスクリーニングする方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
５プライムから３プライムの方向に配列される以下の隣接するエレメント
ａ）プロモーター、
ｂ）少なくとも２つの選択可能マーカー、
ｃ）候補調節性ＲＮＡ標的配列を含む核酸セグメントを受け入れるためのクローニング部位、及び
ｄ）ポリアデニル化シグナル
を含む核酸であって、
前記エレメントが、前記プロモーターによって誘導される転写物が前記少なくとも２つの選択可能マーカー、前記候補調節性ＲＮＡ標的配列、及び前記ポリアデニル化シグナルをその順序で含むように配列される核酸。
【請求項２】
候補調節性ＲＮＡ標的配列が、候補マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）標的配列である、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
選択可能マーカーとクローニング部位との間に位置する終止コドンをさらに含む、請求項１又は２に記載の核酸。
【請求項４】
終止コドンが、３つの前方のフレームのそれぞれにおける終止コドンを含む終止ボックスである、請求項３に記載の核酸。
【請求項５】
少なくとも１つの選択可能マーカーが、正の選択用である、請求項１〜４のいずれかに記載の核酸。
【請求項６】
少なくとも１つの選択可能マーカーが、負の選択用である、請求項１〜４のいずれかに記載の核酸。
【請求項７】
少なくとも２つの選択可能マーカーが、前記２つの選択可能マーカーを含む単一ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームとして提供される、請求項１〜６のいずれかに記載の核酸。
【請求項８】
選択可能マーカーが、正の選択用の１つのマーカー及び負の選択用の１つのマーカーを含む、請求項７に記載の核酸。
【請求項９】
選択可能マーカーが、ＨＳＶＴＫ／ＰＵＲＯ融合タンパク質を含む、請求項１〜８のいずれかに記載の核酸。
【請求項１０】
クローニング部位が、方向性クローニング部位である、請求項１〜９のいずれかに記載の核酸。
【請求項１１】
３プライム非翻訳領域（ＵＴＲ）又は３プライムＵＴＲ候補を含む核酸セグメントがクローニング部位の中に挿入されている、請求項１〜１０のいずれかに記載の核酸。
【請求項１２】
請求項１１に記載の核酸を複数含む３プライムＵＴＲライブラリー。
【請求項１３】
候補ｍｉＲＮＡ標的配列が、ｃＤＮＡによって含まれる、請求項１２に記載の３プライムＵＴＲライブラリー。
【請求項１４】
候補ｍｉＲＮＡ標的配列が、６ｋｂ未満である、請求項１２又は１３に記載の３プライムＵＴＲライブラリー。
【請求項１５】
候補ｍｉＲＮＡ標的配列が、約２ｋｂである、請求項１４に記載の３プライムＵＴＲライブラリー。
【請求項１６】
ｃＤＮＡが、脳ｃＤＮＡ又は急性骨髄性白血病細胞由来のｃＤＮＡである、請求項１２〜１５のいずれかに記載の３プライムＵＴＲライブラリー。
【請求項１７】
請求項１〜１１のいずれかに記載の核酸又は請求項１２〜１６のいずれかに記載のライブラリーを含む細胞。
【請求項１８】
請求項１２〜１６のいずれかに記載のライブラリーの少なくとも一部分を共にハーバリングする細胞の集団。
【請求項１９】
３プライムＵＴＲライブラリーを作製する方法であって、請求項１〜１１のいずれかに記載の核酸を提供するステップと、クローニング部位の中に３プライムＵＴＲ又は３プライムＵＴＲ候補を含む核酸を挿入するステップとを含む方法。
【請求項２０】
５プライムＵＴＲライブラリーを作製する方法であって、請求項１〜１１のいずれかに記載の核酸を提供するステップと、クローニング部位の中に５プライムＵＴＲ又は５プライムＵＴＲ候補を含む核酸を挿入するステップとを含む方法。
【請求項２１】
請求項１〜１１のいずれかに記載の核酸を含むベクター。
【請求項２２】
ｍｉＲＮＡ標的配列を同定する方法であって、
（ａ）候補ｍｉＲＮＡ標的配列を含む請求項１〜１１のいずれかに記載の核酸を宿主細胞の中に導入するステップと、
（ｂ）前記核酸の少なくとも１つの選択可能マーカーを発現する（１又は複数の）宿主細胞を選択するステップ、
（ｃ）（ｂ）の（１又は複数の）前記宿主細胞に、所望の少なくとも１つのｍｉＲＮＡを導入するステップと、
（ｄ）（ｃ）の細胞における前記核酸の少なくとも１つの選択可能マーカーの発現についてアッセイするステップと
を含み、
（ｃ）の細胞が、少なくとも１つの選択可能マーカーの発現を示さない場合、前記候補ｍｉＲＮＡ標的配列が、ｍｉＲＮＡ標的配列として同定される方法。
【請求項２３】
ｍｉＲＮＡ標的配列に対して活性なｍｉＲＮＡを同定する方法であって、
（ａ）前記ｍｉＲＮＡ標的配列を含む請求項１〜１１のいずれかに記載の核酸を宿主細胞の中に導入するステップと、
（ｂ）前記核酸の少なくとも１つの選択可能マーカーを発現する（１又は複数の）宿主細胞を選択するステップと、
（ｃ）（ｂ）の（１又は複数の）前記宿主細胞に、所望の少なくとも１つのｍｉＲＮＡを導入するステップと、
（ｄ）（ｃ）の細胞における前記核酸の少なくとも１つの選択可能マーカーの発現についてアッセイするステップと
を含み、
（ｃ）の細胞が、少なくとも１つの選択可能マーカーの発現を示さない場合、所望の前記ｍｉＲＮＡが、前記ｍｉＲＮＡ標的配列に対して活性なｍｉＲＮＡとして同定される方法。
【請求項２４】
ステップ（ｄ）が、少なくとも１つの選択可能マーカーを発現する細胞を選択することを含む、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
ステップ（ｄ）が、少なくとも１つの選択可能マーカーを発現しない細胞を選択することを含む、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２６】
調節性ＲＮＡの阻害剤を同定する方法であって、
（ａ）所望の少なくとも１つの調節性ＲＮＡを宿主細胞の中に導入するステップと、
（ｂ）候補ＲＮＡ標的配列を含む請求項１〜１１のいずれかに記載の核酸を前記宿主細胞の中に導入するステップと、
（ｃ）前記核酸の少なくとも１つの選択可能マーカーの発現を示さない（１又は複数の）宿主細胞を選択するステップと、
（ｄ）試験物質又は核酸を前記宿主細胞に導入するステップと、
（ｅ）（ｄ）の細胞における少なくとも１つの前記選択可能マーカーの発現についてアッセイするステップと
を含み、
（ｄ）の細胞が、少なくとも１つの選択可能マーカーの発現を示す場合、試験物質又は核酸が、前記調節性ＲＮＡを阻害するものとして同定される方法。
【請求項２７】
調節性ＲＮＡ標的配列を同定する方法であって、
（ａ）候補調節性ＲＮＡ標的配列を含む請求項１〜１１のいずれかに記載の核酸を宿主細胞の中に導入するステップと、
（ｂ）前記核酸の少なくとも１つの選択可能マーカーを発現する（１又は複数の）宿主細胞を選択するステップと、
（ｃ）（ｂ）の（１又は複数の）前記宿主細胞に、所望の少なくとも１つの調節性ＲＮＡを導入するステップと、
（ｄ）（ｃ）の細胞における前記核酸の少なくとも１つの選択可能マーカーの発現についてアッセイするステップと
を含み、
（ｃ）の細胞が、少なくとも１つの選択可能マーカーの発現を示さない場合、前記候補調節性ＲＮＡ標的配列が、調節性ＲＮＡ標的配列として同定される方法。
【請求項２８】
調節性ＲＮＡが、ｓｉＲＮＡであり、候補調節性ＲＮＡ標的配列が、候補ｓｉＲＮＡ標的配列である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
同定された標的配列と、所望の調節性ＲＮＡの既知の標的配列とを比較し、それによって、前記調節性ＲＮＡの新しい標的配列を同定するステップをさらに含む、請求項２７又は２８に記載の方法。
【請求項３０】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、及び配列番号７のうち１又は複数の核酸配列を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項３１】
添付の図に関連して本明細書において記載されている核酸又は方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ，microRNA）などの調節性ＲＮＡの機能分析、特に、３’非翻訳領域（ＵＴＲ，untranslated region）配列などの調節性ＲＮＡの標的の試験又はスクリーニングで使用するための核酸及びライブラリーなどの物質に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、多くの遺伝子の発現を調節する、新規なクラスの小型調節性ＲＮＡ分子として現在認識されている。それらは、血管新生、細胞接着、細胞増殖、生存を媒介し、かつ造血において重要な役割を果たすことが示されてきた。それらは、一次ＲＮＡ転写物（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）から生成され、この転写物が酵素ＤＲＯＳＨＡによって処理されて、約７０ｂｐの二本鎖になり、ＤＩＣＥＲによってさらに処理されて、約２２ｂｐのｍｉＲＮＡ二本鎖になる。２２ｂｐ二本鎖の一方の鎖は、ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）内の部位を標的とするＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ，RNA-induced silencing complex）と結合して、翻訳の阻止、ｍＲＮＡの切断、又は脱アデニル化の誘導をもたらす。ヒトにおいて、ＲＩＳＣ複合体は、標的ｍＲＮＡの３’ＵＴＲへの結合を通しての特異的な翻訳の阻害及びより程度は低いがｍＲＮＡ標的の分解を誘導することによって主に作用すると現在考えられている。
【０００３】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、２１〜２５ヌクレオチド長の成熟非コード小型ＲＮＡのファミリーである。それらは、タンパク質コード遺伝子の発現を負に調節する。ｍｉＲＮＡは、一次ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ，primary miRNA）前駆体転写物から連続的に処理され、転写後レベルで遺伝子発現を調節する。ｍｉＲＮＡの発現は、組織及び発達段階に高度に特異的であるが、これらの発現パターンがどのように調節されるかについてはほとんど知られていない。５４１個を超えるヒトｍｉＲＮＡ遺伝子が同定されているが、最近の生物情報学的アプローチは、その数が１，０００個に近いと予測している。現在の推定により、ヒトｍＲＮＡの約３分の１がｍｉＲＮＡ標的であるように思われることが示唆される。それらは、血管新生、細胞接着、細胞増殖、生存を媒介し、かつ造血及び癌において重要な役割を果たすことが示されてきた。
【０００４】
ｍｉＲＮＡとその標的の間の部分的な相同性並びにｍＲＮＡの分解ではなく翻訳の阻害により、標的の同定は、困難な作業となる。生物情報学的アルゴリズムは、「シード」配列に基づいたｍｉＲＮＡ標的の予測のために開発されてきた。主な４つのアルゴリズムは、標的対当たり１０１，０３１個のｍｉＲＮＡを予測する（平均してｍｉＲＮＡ当たり２００個の標的）。これらの対のわずか０．０１％（１２）が、４つのアルゴリズムすべてによって予測され、２．８％が３つのアルゴリズムによって、１５．４％が２つのアルゴリズムによって、及び８１．８％がわずか１つのアルゴリズムによって予測される。同定された４６５個のヒトｍｉＲＮＡのうち、わずか５７個が、８５個の遺伝子において１０３個の実験的に検証された標的部位を有する。
【０００５】
現在まで、多くのｍｉＲＮＡの役割及び特異的標的はほとんど知られていない。これは、主に、標的を同定するのが困難であることによるものである、というのは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ，short interfering RNA）とは違って、ｍｉＲＮＡの結合は、部分的に、標的との相同性によるものにすぎないからである。そのうえ、翻訳の阻害は、標的の発見のためのｍＲＮＡ発現アレイ研究を不可能にする。
【０００６】
ｍｉＲＮＡの機能に対するより優れた洞察力を得るために、多くの努力が、様々なアルゴリズムを使用するｍｉＲＮＡ標的の計算的同定に注がれてきた（たとえばmiRBase（Sanger institute社、http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/）、TargetScan（Whitehead Institute for Biomedical Research社、http://www.targetscan.org/）、及びPicTar（New York University、http://pictar.bio.nyu.edu/））。しかしながら、これらの予測の欠点は、それらが、それぞれ、実質的な数の偽陽性を生成することである。そのうえ、予測は、ほとんど、非常に少ない既知のｍｉＲＮＡ：標的相互作用から得られた知識、予測上、非対称性をほぼ確実にもたらす統計的に非常に小さなサンプルサイズに基づくものであるので、予測は、おそらく、固有に偏っている。
【０００７】
ｍｉＲＮＡ遺伝子調節についての先行技術による研究は、特に機能的研究に関する、標的の同定及び検証のために必要なツールを欠く。
【０００８】
ｓｉＲＮＡは、触媒効果を有することが知られており、ｍＲＮＡを分解することができる。結果的に、ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡを追加する前及びその後に、発現パターンアレイ分析を使用することによって研究することができる。しかしながら、多くのｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡの分解をもたらす触媒活性を有していないので、これらのタイプの分析は、ｍｉＲＮＡの研究に適用することができない。
【０００９】
先行技術におけるｍｉＲＮＡ機能についての他の理論は、それらがペプチドの伸長を予防するということである。このシナリオでは、ｍｉＲＮＡの挙動を分析するためにタンパク質産物を調べることが必要であると思われる。
【００１０】
ｍｉＲＮＡ検出のための先行技術は、ｍｉＲＮＡアレイに基づくものであった。これらは、ｍｉＲＮＡ自体の配列の知識を用いてしか生成することができない。そのうえ、これらの現象を研究するための試みは、特異的なｍｉＲＮＡに対するリアルタイムＰＣＲを使用してなされた。しかしながら、またしても、このタイプの分析は、正確なｍｉＲＮＡ配列を知ることに依存する。
【００１１】
ｍｉＲＮＡの機能に対するより優れた洞察力を得るために、多くの努力が、様々なアルゴリズムを使用するｍｉＲＮＡ標的の計算的同定に注がれてきた。しかしながら、これらの予測の欠点は、それらすべてが、実質的な数の偽陽性を生成することであり、それらは、ほとんど、少ない知られているｍｉＲＮＡ：標的相互作用から得られた知識に基づくものであるので、偏っている可能性がある。したがって、この分野において、候補ｍｉＲＮＡを見つけることは、計算的技術によって容易なものとなる。しかしながら、ｍｉＲＮＡを見つけるための計算的技術は、実際に、実験的に検証された少数のｍｉＲＮＡに固有に偏っているなどの欠点の影響を受ける。検証されたｍｉＲＮＡの数は、非常に少ないので、保存モチーフ又は保存ドメインを得ることができる検証されたｍｉＲＮＡ配列のプールは、相応して小さい。第１に、これは、少数の知られている配列の間のオーバーラップから候補ｍｉＲＮＡのより広範なプールを推定することを困難にする。第２に、大きな全体的なグループからの任意の統計的に小さなサンプルにおいて、固有の統計的な偏りが偶然にあるであろう。したがって、計算的予測が基づくｍｉＲＮＡの数は、非常に少ないので、大きな統計的な偏りが、予測において存在することはほぼ確実である。
【００１２】
そのうえ、４つの主要な予測アルゴリズムを考慮すると、ｍｉＲＮＡ／標的対のわずか０．０１％が、アルゴリズムのそれぞれによって予測される。実に、８０％を超える対が、わずか１つのアルゴリズムによって予測される。したがって、ｍｉＲＮＡ／標的対合の精密な同定又は検証は、当技術分野における問題となる。
【００１３】
この分野における基本的な問題点は、ｍｉＲＮＡに対する標的の発見である。ｍｉＲＮＡ標的が、ｍｉＲＮＡ配列自体に対して配列が必ずしも同一ではないことが知られているので、これはとりわけ困難となる。
【００１４】
ｍｉＲＮＡ作用を研究する又は定量化することを試みる先行技術は、Ambion Inc社のルシフェラーゼアッセイである。これは、標的のクローニング及び候補ｍｉＲＮＡとの組合せを含み、その後、Ambion社からのプラスミド：pMIR-REPORT（商標）、カタログ番号ＡＭ５７９５を使用する、任意の効果をも読み取るように設計されたルシフェラーゼアッセイが続く。第１に、十分に理解されるように、このタイプの分析を行ない得る前に、標的又は標的候補を知ることが典型的には必要である。第２に、スクリーニングタイプの設定において、所望の核酸を含むクローンをそれを含まないクローンから分離するための方法がないので、それぞれの個々のクローンは、別々に処置する必要がある。
【００１５】
ｍｉＲＮＡの効果を分析するための他の方法は、タンパク質発現パターンを研究するための２Ｄゲルの使用によるものである。このシナリオでは、様々なタンパク質の２Ｄ発現パターンは、ｍｉＲＮＡ処置と非ｍｉＲＮＡ処置の間で比較される。しかしながら、この技術の感度は非常に低い。おそらく、すべてのタンパク質が、このやや粗雑な方法によって検出されるとは限らない。実に、わずか約１０％の発現タンパク質しか、２Ｄゲルタイプタンパク質発現分析において現われないことが推定される。明らかに、このアプローチは、ｍｉＲＮＡ作用についての有意義な研究に十分に感応性ではない。
【００１６】
そのうえ、上記に述べられるように、ｍｉＲＮＡが、ｓｉＲＮＡと同じ方法で標的ＲＮＡを分解しないので、ｍＲＮＡレベルをモニターすることによってｍｉＲＮＡ作用を研究することもまたできない。
【００１７】
国際公開第２００４／０９７０４２号パンフレットは、ｓｉＲＮＡの選択方法を開示する。ｓｉＲＮＡは、それらの標的配列に対して１００％の同一性を示す。使用されるクローンは、転写物当たりわずか１つのマーカーを含む。方法は、クローニングされたｃＤＮＡに向けられたｓｉＲＮＡを選択するために使用される。
【００１８】
先行技術は、上記に述べた弱点の影響を受ける。そのうえ、先行技術において、既存の、ｍｉＲＮＡの分野における標的の発見のための機能アッセイはない。加えて、計算的モデルの限界を明らかにする例がある。たとえば、ＬＥＤ７は、線虫からのｍｉＲＮＡである。この遺伝子（「ｌｅｔｈａｌ  ７」として知られている）は、様々な遺伝子をノックアウトし、それが発現する細胞系統においてアポトーシスをもたらす。計算的モデルを適用して、ＬＥＤ７が結合するはずである、予測される配列を同定することは可能である。しかしながら、これらの予測される標的の多くは、ＬＥＤ７に全く結合しないことが実験的に示されている。対照的に、ＥＴＷＫ３遺伝子が研究されてきた。この研究の過程において、ｍｉＲ１４３と命名されたｍｉＲＮＡは、ＥＴＷＫ３の真の標的であることが証明された。しかしながら、ｍｉＲ１４３は、せいぜい上記に述べられる計算的モデルの一部によって予測されるが、それらのすべてによって予測されるわけではない。そのため、ｍｉＲＮＡが実際に結合しない標的を予測することに加えて、計算的モデルはまた、真のｍｉＲＮＡ対合をも予測しない。そのため、当技術分野におけるこれらの計算的システムは、それらと関連する多数の重大な問題及び欠点を有することを十分に理解することができる。
【００１９】
本発明は、先行技術と関連する問題を克服しようとするものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】国際公開第２００４／０９７０４２号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
本発明者らは、有利には、ｍｉＲＮＡ作用などの調節性ＲＮＡについての機能アッセイを可能にする新しい系を設計した。本発明は、有利には、３プライムＵＴＲ候補を挿入することができるクローニング系と選択可能な遺伝マーカーを組み合わせる。このように、正及び負の様式の両方における様々なｍｉＲＮＡの効果並びに特定のＲＮＡの発現を研究することが可能になる。基本的な概念は、研究されているＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ作用の候補３プライムＵＴＲ部位又は標的部位）が、正及び／又は負の選択可能マーカーのコード配列に直接的に連結されることである。したがって、有利には、１又は複数の選択可能マーカーに続くことによって、特定のｍｉＲＮＡ及びそれらのｍＲＮＡの効果の直接的な機能の読み取りを得ることができる。本発明は、この驚くべき発見に基づくものである。本発明の基本的な利点は、それが、タンパク質レベルでの機能の読み取りを提供することである。ｓｉＲＮＡなどのいくつかの調節性ＲＮＡは、標的ＲＮＡの切断をもたらし、これは、たとえばＲＮＡのレベル又は切断をモニターすることによってＲＮＡレベルでのアッセイを可能にするが、ｍｉＲＮＡなどの他の調節性ＲＮＡは、この効果をもたらさない。本明細書において記載されるようにタンパク質レベルでの効果をアッセイすることによって、多数の調節性ＲＮＡ型は、機能的に研究される可能性があり、これは、先行技術と比較して進歩となる。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
したがって、広範囲の態様において、本発明は、５プライムから３プライムの方向に配列される以下の隣接するエレメント； 
ａ）プロモーター、
ｂ）選択可能マーカー、
ｃ）候補調節性ＲＮＡ標的配列を含む核酸セグメントを受け入れるためのクローニング部位、及び
ｄ）ポリアデニル化シグナル
を含む核酸であって、
前記エレメントが、前記プロモーターによって誘導される転写物が前記選択可能マーカー、前記候補調節性ＲＮＡ標的配列、及び前記ポリアデニル化シグナルをその順序で含むように配列される核酸を提供する。
【００２３】
第１の態様において、本発明は、５プライムから３プライムの方向に配列される以下の隣接するエレメント； 
ａ）プロモーター、
ｂ）少なくとも２つの選択可能マーカー、
ｃ）候補調節性ＲＮＡ標的配列を含む核酸セグメントを受け入れるためのクローニング部位、及び
ｄ）ポリアデニル化シグナル
を含む核酸であって、
前記エレメントが、前記プロモーターによって誘導される転写物が前記少なくとも２つの選択可能マーカー、前記候補調節性ＲＮＡ標的配列、及び前記ポリアデニル化シグナルをその順序で含むように配列される核酸を提供する。
【００２４】
適切には、核酸は、ＤＮＡ、たとえばＤＮＡプラスミドを含む。核酸がＤＮＡを含む場合、ＲＮＡ標的配列、マイクロＲＮＡ、及び同様のものに対する言及は、慣習に従って理解されるものとする、つまり、それらは、特定されるヌクレオチド配列を定義し、核酸が、ＲＮＡ（又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド）であることを必ずしも必要とするものではないことが理解される。そのため、熟練した読者は、ヌクレオチド配列が、当技術分野において慣習的であるように、核酸の性質によって決められるような適切な位置にＴ又はＵを含むことを理解するであろう。
【００２５】
エレメントは、前記プロモーターによって誘導される転写物（単一の転写物）が、前記選択可能マーカー、前記候補調節性ＲＮＡ標的配列、及び前記ポリアデニル化シグナルをその順序で含むように、つまり、単一「融合」ＲＮＡ転写物として配列されることが重要な特徴である。無関係の適用で知られているプラスミドによって、この様式における転写物の融合は認められていない、たとえば、慣習的なｃＤＮＡライブラリーは、そのような融合転写物を誘導しない。これは、本発明の特有の利点となる。
【００２６】
適切には、前記候補調節性ＲＮＡ標的配列は、候補マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）標的配列又は候補低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）標的配列である。適切には、前記候補調節性ＲＮＡ標的配列は、候補マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）標的配列である。
【００２７】
本発明の核酸に関連して使用される用語「１又は複数の選択可能マーカー」は、当技術分野におけるその普通の意味を有し、適切には、ポリペプチド選択可能マーカー、つまり、選択可能な特性又は活性を付与するポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸を指す。
【００２８】
適切には、核酸は、さらに、前記選択可能マーカーと前記クローニング部位の間に位置する停止コドンを含む。適切には、前記終止コドンは、３つの前方のフレームのそれぞれにおける終止コドンを含む終止ボックスである。
【００２９】
（１又は複数の）選択可能マーカーは、正の選択用でもよい。
【００３０】
（１又は複数の）選択可能マーカーは、負の選択用でもよい。
【００３１】
適切には、核酸は、さらに、（ｅ）転写ターミネーターシグナルを含んでいてもよい。ポリアデニル化シグナルは、典型的には、本発明の哺乳動物への適用などのように、より高等な真核生物にとっては十分となるであろうが、本発明が、単細胞真核生物などの、より下等の真核生物又はそれどころか原核生物において適用される場合、転写ターミネーターは、ＲＮＡ転写の有利な特別なコントロールを提供する可能性があることが考えられる。
【００３２】
選択可能マーカーは、適切には、２つ以上の選択可能マーカー、適切には、２つの選択可能マーカーを含む。適切には、前記２つ以上の選択可能マーカーは、単一ポリペプチド又はオープンリーディングフレーム（つまり「融合タンパク質」）として提供される。したがって、適切には、前記２つの選択可能マーカーは、前記２つの選択可能マーカーを含む単一ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームとして提供される。適切には、前記選択可能マーカーは、正の選択用の少なくとも１つのマーカー及び負の選択用の少なくとも１つのマーカーを含む。適切には、前記選択可能マーカーは、ＨＳＶＴＫ／ＰＵＲＯ融合タンパク質である。
【００３３】
適切には、前記クローニング部位は、方向性クローニング部位である。
【００３４】
適切には、３プライムＵＴＲ又は３プライムＵＴＲ候補を含む核酸セグメントが前記クローニング部位の中に挿入されている。他の態様において、本発明は、複数の前記核酸を含む３プライムＵＴＲライブラリーを提供する。適切には、前記候補ｍｉＲＮＡ標的配列は、ｃＤＮＡによって含まれる。適切には、前記候補ｍｉＲＮＡ標的配列は、６ｋｂ未満である。適切には、前記候補ｍｉＲＮＡ標的配列は、約２ｋｂである。
【００３５】
適切には、前記ｃＤＮＡは、脳ｃＤＮＡ、精巣ｃＤＮＡ、又は急性骨髄性白血病細胞由来のｃＤＮＡである。
【００３６】
本発明はまた、上記に記載されている核酸を含む又は上記に記載されているライブラリーを含む１又は複数の細胞をも提供する。
【００３７】
他の態様において、本発明は、上記に記載されているライブラリーの少なくとも一部分を共にハーバリングする細胞の集団を提供する。
【００３８】
他の態様において、本発明は、３プライムＵＴＲライブラリーを作製する方法であって、上記に記載されている核酸を提供するステップと、前記クローニング部位の中に３プライムＵＴＲ又は候補３プライムＵＴＲを含む核酸を挿入するステップとを含む方法を提供する。
【００３９】
他の態様において、本発明は、５プライムＵＴＲライブラリーを作製する方法であって、上記に記載されている核酸を提供するステップと、前記クローニング部位の中に５プライムＵＴＲ又は５プライムＵＴＲ候補を含む核酸を挿入するステップとを含む方法を提供する。
【００４０】
他の態様において、本発明は、上記に記載されている核酸を含むベクターを提供する。ベクターは、プラスミドベクター、トランスポゾンベクター、ウイルスベクター若しくはレトロウイルスベクター、又は他のベクターなどの任意の核酸ベースのベクターであってもよい。適切には、ベクターは、プラスミドベクターである。ベクターは、適切には、宿主生物における増殖及び／又は増幅を可能にする「シャトル」エレメントを備えている。適切には、前記シャトルエレメントは、大腸菌（E.coli）細胞における増殖用であり、大腸菌複製開始点を含む。
【００４１】
他の態様において、本発明は、ｍｉＲＮＡ標的配列を同定する方法であって、
（ａ）候補ｍｉＲＮＡ標的配列を含む、上記に記載されている核酸を宿主細胞の中に導入するステップと、
（ｂ）前記核酸の少なくとも１つの選択可能マーカーを発現する（１又は複数の）宿主細胞を選択するステップと、
（ｃ）（ｂ）の（１又は複数の）前記宿主細胞に、所望の少なくとも１つのｍｉＲＮＡを導入するステップと、
（ｄ）（ｃ）の細胞における前記核酸の少なくとも１つの選択可能マーカーの発現についてアッセイするステップと
を含み、
（ｃ）の細胞が、少なくとも１つの選択可能マーカーの発現を示さない場合、候補ｍｉＲＮＡ標的配列が、ｍｉＲＮＡ標的配列として同定される方法を提供する。
【００４２】
他の態様において、本発明は、ｍｉＲＮＡ標的配列に対して活性なｍｉＲＮＡを同定する方法であって、
（ａ）前記ｍｉＲＮＡ標的配列を含む、上記に記載されている核酸を宿主細胞の中に導入するステップと、
（ｂ）前記核酸の少なくとも１つの選択可能マーカーを発現する（１又は複数の）宿主細胞を選択するステップと、
（ｃ）（ｂ）の（１又は複数の）前記宿主細胞に、所望の少なくとも１つのｍｉＲＮＡを導入するステップと、
（ｄ）（ｃ）の細胞における前記核酸の少なくとも１つの選択可能マーカーの発現についてアッセイするステップと
を含み、
（ｃ）の細胞が、少なくとも１つの選択可能マーカーの発現を示さない場合、所望のｍｉＲＮＡが、前記ｍｉＲＮＡ標的配列に対して活性なｍｉＲＮＡとして同定される方法を提供する。
【００４３】
ステップ（ｄ）は、少なくとも１つの選択可能マーカーを発現する細胞を選択するステップを含んでいてもよい。
【００４４】
ステップ（ｄ）は、少なくとも１つの選択可能マーカーを発現しない細胞を選択するステップを含んでいてもよい。
【００４５】
他の態様において、本発明は、調節性ＲＮＡの阻害剤を同定する方法であって、
（ａ）所望の少なくとも１つの調節性ＲＮＡを宿主細胞の中に導入するステップと、
（ｂ）候補ＲＮＡ標的配列を含む、上記に記載されている核酸を前記宿主細胞の中に導入するステップと、
（ｃ）前記核酸の少なくとも１つの選択可能マーカーの発現を示さない（１又は複数の）宿主細胞を選択するステップと、
（ｄ）試験物質又は核酸を前記宿主細胞に導入するステップと、
（ｅ）（ｄ）の細胞における少なくとも１つの前記選択可能マーカーの発現についてアッセイするステップと
を含み、
（ｄ）の細胞が、少なくとも１つの選択可能マーカーの発現を示す場合、試験物質又は核酸が、前記調節性ＲＮＡを阻害するものとして同定される方法を提供する。
【００４６】
他の態様において、本発明は、調節性ＲＮＡ標的配列を同定する方法であって、
（ａ）候補調節性ＲＮＡ標的配列を含む、上記に記載されている核酸を宿主細胞の中に導入するステップと、
（ｂ）前記核酸の少なくとも１つの選択可能マーカーを発現する（１又は複数の）宿主細胞を選択するステップと、
（ｃ）（ｂ）の（１又は複数の）前記宿主細胞に、所望の少なくとも１つの調節性ＲＮＡを導入するステップと、
（ｄ）（ｃ）の細胞における前記核酸の少なくとも１つの選択可能マーカーの発現についてアッセイするステップと
を含み、
（ｃ）の細胞が、少なくとも１つの選択可能マーカーの発現を示さない場合、候補調節性ＲＮＡ標的配列が、調節性ＲＮＡ標的配列として同定される方法を提供する。
【００４７】
適切には、前記調節性ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡであり、前記候補調節性ＲＮＡ標的配列は、候補ｓｉＲＮＡ標的配列である。
【００４８】
他の態様において、本発明は、同定された標的配列を、所望の調節性ＲＮＡの知られている標的配列と比較し、それによって、前記調節性ＲＮＡの新しい標的配列を同定するステップをさらに含む、上記に記載されている方法を提供する。
【００４９】
他の態様において、本発明は、上記に記載されている核酸であって、前記核酸は、１又は複数の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、又は配列番号７の核酸配列を含む核酸を提供する。
【００５０】
他の態様において、本発明は、上記に記載されている核酸であって、前記核酸は、プラスミドp3'UTR3、p3'UTRTKPuro、p3'UTRHyTK、又はp3'UTRTKzeoから選択される核酸を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
本発明は、有利には、マイクロＲＮＡ標的の発見及び検証のための機能アッセイを提供する。マイクロＲＮＡは、小型調節性ＲＮＡなどの調節性ＲＮＡの１つのクラスであることが理解されるであろう。他のクラスの小型調節性ＲＮＡもまた、本明細書において説明される実施形態において検討することができる。特に、小型干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、マイクロＲＮＡの代わりに用いることができる。ｍｉＲＮＡとｓｉＲＮＡの適用を両方組み合わせることもできる。便宜上、本発明は、調節性ＲＮＡとしてｍｉＲＮＡに対して最も多く言及して記載される。
【００５２】
「シード配列」という用語は、当技術分野においてよく知られており、典型的には、調節性ＲＮＡ（たとえばｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ）の５’端末を指す。これは、典型的には、調節性ＲＮＡの５’端末の６つ又は７つの塩基を指す。これらは、典型的には、標的配列に対して１００％一致する。
【００５３】
「３’ＵＴＲ」という用語は、文字どおり、３プライム非翻訳領域を意味する。これは、翻訳されず、たとえばｍｉＲＮＡによる翻訳調節の標的となることが多いｍＲＮＡの領域である。たとえばｍｉＲＮＡ標的配列が生成されたものである又は非ｍＲＮＡ源に由来するものである場合、ｍｉＲＮＡ標的配列は、３’ＵＴＲに由来するものではない可能性がある又は３’ＵＴＲであることが実験的に実証されるものではないので、この用語は、より広範囲の用語「ｍｉＲＮＡ標的配列」を用いて本明細書において使用されることが多い。典型的には、多くの又はすべてのｍｉＲＮＡ標的配列は３’ＵＴＲにおいて見つけられる。しかしながら、明らかに、ｍｉＲＮＡ標的配列は、他の位置に、たとえば全体としてゲノムに由来するものであってもよく、又はさらに、ｍｉＲＮＡ標的配列を含んでいる可能性があるライブラリー又はランダム配列若しくはセミランダム配列を生成することによって人工的に作り出すことができる。したがって、本発明は、一般的に、ｍｉＲＮＡ標的配列に適用され、便宜上、これらは、本明細書において３’ＵＴＲと称されることが多いが、前記標的配列又は候補標的配列は、実際に、実際の実験的に定義された３’ＵＴＲとは異なる１又は複数の源に由来してもよいことに留意しなければならない。適切には、ｍｉＲＮＡ標的配列は、３’ＵＴＲとする又は３’ＵＴＲに由来する。
【００５４】
「クローニング部位」という用語は、当技術分野におけるその普通の意味を有する。特に、それは、制限酵素又は同様の触媒による核酸の消化を可能にして、前記消化された部位の中への核酸の挿入を可能する核酸エレメント又は核酸配列を指す。クローニング部位の例は、多数の核酸制限酵素の認識部位を含む核酸配列を特徴として、それによって、単一のクローニング部位への代替のクローニング戦略を可能にする多重クローニング部位（「ＭＣＳ」，multiple cloning site）である。適切には、本発明のクローニング部位は、少なくとも１つの制限酵素、適切には、方向性クローニングを可能にする制限酵素、適切にはSfiIによって認識可能な核酸配列を含む。したがって、一実施形態において、クローニング部位は、単に、SfiI認識部位とする。
【００５５】
本発明に従って発現されることとなるポリペプチドのコード配列は、有利には、発現が起こる標的細胞（宿主細胞）に最適化されたコドンであってもよい。特に、適切には、選択可能マーカーは、選択が起こる細胞に最適化されたコドンとする。適切には、コドン最適化は、ヒト細胞のためのヒトの基準に対するものとする。
【００５６】
本発明の利点
ｍｉＲＮＡ作用を分析するための先行技術は、ルシフェラーゼの使用に基づくものである。ルシフェラーゼは、明度又は放出される光をモニターすることによってその活性を測定することができるタンパク質である。ルシフェラーゼは、正又は負の選択をできない。ルシフェラーゼベースの系を使用すると、特定のｍｉＲＮＡの効果をスクリーニングするのに、疑いもなく非常に労働集約的なものとなる。第１に、この技術が、３プライムＵＴＲ又は候補３プライムＵＴＲに適用されることになった場合、それぞれ、別々の処置において行なわれなければならないであろう。これには、４０〜１００，０００回もの別々の実験又は処置を伴い得る可能性がある。明らかに、これは、実行するのに非常に煩わしく、費用のかかる手順である。対照的に、本発明によれば、ｍｉＲＮＡ作用は、遺伝子選択技術を使用して評価することができる。これは、有利には、ある種の選択可能マーカーを発現する細胞を選択することを可能にし、ｍｉＲＮＡの効果（正であれ負であれ）を、任意の発光アッセイに頼らずに、直接的に遺伝的に選択することを可能にする。時間のかかる発光アッセイを回避することに加えて、本発明は、ある種のあらかじめ決められた遺伝子構築物を含む（又は発現する）細胞のみが選択手順後に生存するので、並行して多数の分析を扱うことができるといったさらなる利点がある。
【００５７】
この利点をよりよく理解するために、以下の例証を考慮されたい。第１に、本発明に従って、特定の遺伝子構築物を含む細胞は、正の選択の第１のステップにおいて選択することができる。これは、所望の核酸を含まない細胞の死滅をもたらす。したがって、すべての生存する細胞は、推論の結果として（選択によって）、所望の遺伝子構築物を含んでいるにちがいない。次いで、細胞のこの第１の正に選択された集団は、手順の第２のステップに進むことができる。手順の第２のステップにおいて、それらの細胞は、ｍｉＲＮＡを用いて処置され、ｍｉＲＮＡが所望のマーカーのタンパク質発現に影響を与えるそれらの細胞が選択される。したがって、この第２の選択ステップを実行することによって、研究されている特定のｍｉＲＮＡに対して応答性の遺伝子構築物を含むそれらの細胞は、遺伝的に単離される。
【００５８】
多数の選択的な手順によって細胞の集団を研究することができるのは本発明の利点である。実に、実際面では、単一の皿において、個々に異なる遺伝子構築物を含む細胞の集団を研究することができるのは本発明の利点である。もちろん、大きな集団の細胞を研究する場合又は便宜上、研究の構成に依存して、多数の皿が有利となる可能性があるが、基本的な利点は、多数の選択的な手順が、手順を通じて個々のクローンを別々に扱わなければならないのではなく、選択段階で、異なる遺伝子構築物を含む細胞を並行して扱うことを可能にすることである。このタイプの適用は、先行技術のルシフェラーゼベースの分析を用いると、明らかに可能ではない。この少なくとも１つの理由は、それらのルシフェラーゼ発現のある特徴においてのみ異なる同等の細胞から、特定のレベルのルシフェラーゼを発現する細胞を単離することが実現可能ではないということである。
【００５９】
選択可能マーカー
本発明の核酸はまた、選択可能マーカー遺伝子をも含む。選択可能マーカー遺伝子は、その遺伝子を運搬する細胞を、対応する選択物質の存在下において特異的に選択することを可能にする。選択可能マーカーは、正、負、又は二機能性のものとすることができる。正の選択マーカーは、マーカーを運搬する細胞の選択を可能にするのに対して、負の選択マーカーは、マーカーを運搬する細胞を選択的に排除することを可能にする。二機能性の選択可能マーカーは、選択可能マーカー遺伝子又は融合遺伝子を含有する細胞の正又は負の選択のいずれかのための手段を含有する（Schwartz et al Proc. Natl. Acad. Sci USA 88:10416-10420 (1991)を参照されたい）。
【００６０】
本発明の核酸及び技術における選択可能マーカーの使用は、本明細書において述べられるいくつかの利点をもたらす。そのような１つの利点は、それが、所望の遺伝子構築物を含む細胞の選択を可能にすることである。そのうえ、多数の選択可能マーカーの使用は、実施されることとなるより多くの複雑な選択方法を可能にすることができる。たとえば、２つの選択可能マーカーを使用することによって、ライブラリーの核酸を含む細胞の第１の集団を選択することができ、第２の選択可能マーカーは、ｍｉＲＮＡの追加に続いてＵＴＲを介して発現をダウンレギュレートするそれらの細胞を選択するために使用してもよい。
【００６１】
典型的には、選択可能マーカー遺伝子は、薬剤に対する耐性を付与する（たとえばプロドラッグコンバターゼ）又は宿主細胞における代謝的若しくは分解的欠損を補うであろう。たとえば、哺乳動物細胞と共に一般に使用される選択可能マーカーは、アデニンデアミナーゼ（ａｄａ，adenine deaminase）、ヒグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（Ｈｐｈ，hygromycin B phosphotransferase）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ，dihydrofolate reductase）、チミジンキナーゼ（ＴＫ，thymidine kinase）、チミジル酸キナーゼ（これはＡＺＴを変換する、またチミジンキナーゼよりも強力である可能性がある）、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ，glutamine synthetase）、アスパラギンシンテターゼの遺伝子、ネオマイシン（Ｇ４１８）、ピューロマイシン、ヒスチジノール、ゼオシン（ゼオシンは、ブレオマイシン及び／又はスレオマイシン（thleomycin）と置き換えてもよく、これらの耐性遺伝子は、３つすべてについて同じである；ゼオマイシンは、そのより低い費用により典型的には適している）、並びにブラスチシジンＳに対する耐性をコードする遺伝子を含む。
【００６２】
選択物質は、必要に応じてメーカーの推奨に従って使用される。参考として、ＺＥＯ選択は、約３週間かかり得る、またＰＵＲＯ選択は、約１週間かかり得る。選択可能マーカーの発現のレベルを含む濃度及び条件はすべて、必要性に従って選択時間を変更するために、熟練した従事者によって操作することができる。
【００６３】
選択可能マーカー遺伝子は、認識可能な細胞性の欠失を補完することができる任意の遺伝子であってもよい。したがって、たとえば、ＨＰＲＴ活性を欠く細胞を用いる場合、選択可能マーカー遺伝子配列としてＨＰＲＴの遺伝子を使用することができる可能性がある。したがって、この遺伝子は、突然変異細胞を選択する又はこの遺伝子産物を発現する細胞を「負に選択する」ためにその発現産物を使用することができる遺伝子の例である。他の例は、遺伝子を運搬する細胞に薬剤ピューロマイシンに対する耐性を付与する選択可能マーカー遺伝子ピューロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ（Ｐａｃ，puromycin N-acetyltransferase）の使用である。
【００６４】
哺乳動物発現系において使用される他の共通の選択可能マーカー遺伝子はチミジンキナーゼである。活性チミジンキナーゼ（ＴＫ）酵素を含有しない細胞は、チミジンを含有する培地において増殖することができないが、５−ブロムデオキシウリジン、６−チオグアニン、８−アザプリンなどのヌクレオシド類似体を含有する培地において増殖することができる。逆に、活性チミジンキナーゼを発現する細胞は、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン、及びグリシンを含有する培地（ＨＡＴＧ培地）において増殖することができるが、５−アザシチジンなどのヌクレオシド類似体を含有する培地において増殖することができない（Giphart-Gassler, M et al Mutat. Res. 214:223-232 (1989）、Sambrook et al, In: Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2ndEd, Cold Spring Harbour Laboratory Press, N.Y. (1989)）。選択可能マーカー遺伝子として活性単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ＴＫ，Herpes Simplex Virus Thymidine Kinase）を含有する細胞は、ガンシクロビル又は同様の作用物質の存在下において増殖することができない。明らかに、選択を実施するために使用される作用物質は、メーカーの指示に従って使用されるべきである。細胞への作用物質の追加の濃度又はモード／タイミングは、最も厳正な信頼できる選択を提供するために、使用される特定の構築物又は選択可能マーカーに最適化される必要がある可能性がある。この最適化は、十分に、当業者の能力の範囲内である。さらに、たとえば、最も高度に発現するクローンを選択するために、レベルが増強した所望の作用物質を用い、又は逆に、より低度に発現するクローンを選択するために、よりレベルが低いものを用いるレベルを分けた選択戦略を実践することができる可能性がある。そのような変更は、十分に、当業者の範囲内である。
【００６５】
さらに、より高い薬剤感受性を可能にする代謝酵素の突然変異体が作られている。たとえば、チミジル酸キナーゼＦ１０５Ｙは、ＡＺＴへの細胞の感受性を増加させる、これは、順番に、より少ないＡＺＴを使用することを可能にする可能性がある又はＡＺＴの所与の濃度でのより速い死滅を達成する可能性がある。Ｒ１６ＧＬＬ突然変異体もまた使用することができる。加えて、ＳＣ３９と命名された突然変異体ＨＳＶＴＫは、ガンシクロビル及び／又は同様の作用物質に著しくより感応性であることが示された（Blumental et al, Mol. Therapy, 2007）。したがって、知られている選択可能マーカーの突然変異体もまた、本明細書において説明される実施形態における適用を見出す。
【００６６】
したがって、負の選択用に、ＨＳＶＴＫ、チミジル酸キナーゼ（Ｆ１０５Ｙ又は他のものなど）を使用することができる。正の選択用に、ＰＵＲＯ、ＺＥＯ、ＨＹＧＲＯ、又はＮＥＯを使用することができる。適切には、本発明の融合物は、これらのグループからの１つの正のマーカー及び１つの負のマーカーを含む。適切には、融合物は、いずれかの順序としてもよい。実施例の部におけるものが最も好ましい。実に、これらは、例証されるように働くことがうまく示され、これは、他の文脈におけるそれらの挙動についての知識から想定されない可能性がある。
【００６７】
いくつかの融合物は、ＴＫ／ＺＥＯ（Cayla社製／Invitrogen社製）又はＨＹＧＲＯ／ＴＫ（Immunex社製）などのように、本発明より以前に存在している。これらは、遺伝子療法型の適用でのみ知られている、たとえば、処置が終わった後にベクターを受け取った細胞を死滅させる（つまり、自殺遺伝子として使用する）ことで知られている。初めて本明細書において開示される組合せ又は融合物は好ましい。いずれにせよ、本発明によって教示される調節性ＲＮＡへの融合は、以前に記載されておらず又は示唆されていない。
【００６８】
そのうえ、選択可能マーカーは、必ずしも細胞の死滅を伴う必要があるとは限らず、たとえば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）／ＰＵＲＯは、フローソート（flowsort）選択、つまりフローソート選択可能マーカーのために（他の蛍光体又は可視化可能なタンパク質のように）使用することができる。
【００６９】
特に適している組合せは、ＴＫ／ＰＵＲＯ、ｗｔＴｈｙｍ／ＰＵＲＯ、Ｒ１６ＧＬＬＴｈｙｍ／ＰＵＲＯ、Ｆ１０５ＹＴｈｙｍ／ＰＵＲＯ、Ｒ１６ＧＬＬ−Ｆ１０５ＹＴｈｙｍ／ＰＵＲＯ、Ｆ１０５ＹＴｈｙｍ／Ｚｅｏ、Ｚｅｏ／Ｆ１０５ＹＴｈｙｍ、ＧＦＰ／ＰＵＲＯを含む。
【００７０】
いくつかの実施形態において、単一の選択可能マーカーを用いる２重の選択可能な戦略を使用することができる可能性がある。この実施形態において、正及び負の選択の両方ができるように選択可能マーカーを選ぶことが必要であると思われる。たとえば、ＵＲＡ遺伝子によってコードされる代謝酵素は、ある種の真核生物系においてウラシルからの独立性をもたらすことができる。したがって、ＵＲＡ遺伝子を含む細胞は、ウラシルフリーの培地を使用して、正に選択することができる−ＵＲＡ遺伝子を含む細胞のみが、それら自体のウラシルを作製することによって増殖することができるであろう。この全く同じ遺伝子は、前駆体５−フルオロ−オロト酸（５−ＦＡ）を毒性代謝物質に変換することができる。したがって、ウラシル遺伝子を含む細胞は、増殖培地への５−ＦＡの包含によって選択することができる−ＵＲＡ遺伝子を含むそれらの細胞は、それを毒性代謝物質に変換し、選択手順によって取り除かれるであろう。したがって、この実施形態において、単一の選択可能マーカーは、実際に、正及び負の選択ステップを提供する。しかしながら、最も一般に、正及び負の選択ステップは、２つ以上の選択可能マーカーを用意することによってもたらされるであろう。
【００７１】
同様の様式において、シトシンデアミナーゼは、選択可能マーカーとして使用することができる。正常な哺乳動物細胞は、シトシンデアミナーゼを含有しない。シトシンデアミナーゼ遺伝子を発現する細胞は、比較的無毒性のプロドラッグ５−フルオロシトシンを高度に毒性の５−フルオロウラシルに代謝する。したがって、シトシンデアミナーゼは、選択可能マーカーとして使用することができ、したがって、異なる実施形態において５−フルオロシトシンを用いて処置した場合に負の選択を可能にする。
【００７２】
適切には、多数の選択可能マーカーは、本発明の核酸上の単一のオープンリーディングフレームにおいて融合物として提供される。
【００７３】
適切には、少なくとも２つの選択可能マーカーが使用される。適切には、３つの選択可能マーカーが使用される。適切には、４つの選択可能マーカーが使用され、又はさらに多くが使用される。
【００７４】
適切には、２つの選択可能マーカーが使用され、適切には、それらの２つの選択可能マーカーは融合される。「融合される」は、当技術分野におけるその普通の意味を有する、つまり、適切には、マーカーは、前記マーカーのそれぞれのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする単一のオープンリーディングフレームから発現してもよいことを意味する。したがって、「融合される」は、適切には、２つ以上の選択可能マーカーが単一ポリペプチドにおいて提供されることを意味する（又は前記２つ以上の選択可能マーカーを含む単一ポリペプチドをコードする単一の核酸若しくは転写物）。言いかえれば、マーカーのオープンリーディングフレームは、核酸レベルで「融合され」、「融合される」と表現される２つ（以上）のマーカーのそれぞれのアミノ酸配列を含む「融合タンパク質」の発現をもたらす。これは、有利には、２重の選択スクリーニング手順が後続することを可能にする、たとえば、遺伝子構築物の存在についての正の選択と、その後に続く、ｍｉＲＮＡの存在下において発現をダウンレギュレートしない細胞に対する負の選択が試験される。
【００７５】
したがって、適切には、単一の「融合」ポリペプチドとして提供される２つ以上の選択可能マーカーをコードする１又は複数の核酸は、２つの選択可能マーカーをコードするオープンリーディングフレームの部分の中間にいかなる終止コドンをも有していない。
【００７６】
適切には、選択可能マーカー融合物は、ＴＫ／ＰＵＲＯ、ＴＫ／ＨＹＧＲＯ、又はＴＫ／ＺＥＯの組合せから選択される。列挙された選択可能マーカー融合物は、典型的には、逆にすることができる、たとえば、ＨＹＧＲＯ／ＴＫ又はＴＫ／ＨＹＧＲＯは、同等に有効である可能性があり、それぞれ、「ＨＹＧＲＯ／ＴＫ」又は「ＴＫ／ＨＹＧＲＯ」に対する言及によって包含されることが理解されるはずである。任意のさらなるガイダンスが必要とされている場合には、適切には、既定として、融合物は、書かれるとおりとする、たとえば、ＨＹＧＲＯ／ＴＫは、文脈が他に示さない限り、Ｎ末端−ＨＹＧＲＯ−ＴＫ−Ｃ末端を意味する。最も適切には、選択可能マーカーは、ＴＫ／ＰＵＲＯ融合物とする。これは、ピューロマイシンが非常に強力であるといった利点を有する。これは、おそらく、最も優れた選択可能マーカーである。ピューロマイシンはタンパク質合成を遮断する。これは、形質移入細胞の純粋な集団が、実験室条件下で約１週間で選択されることを可能にする。
【００７７】
ヒグロマイシンもまた、非常に強力な選択可能マーカーである。ヒグロマイシンは、その作用強度においてピューロマイシンと同等である。
【００７８】
ゼオマイシンは、挿入剤である。ゼオマイシンは、ピューロマイシン又はヒグロマイシンと比較して作用のモードが遅い。これは、ある種の状況において有利となる可能性がある。
【００７９】
したがって、適切には、選択可能マーカーは、ＨＳＶＴＫタンパク質及びＰＵＲＯタンパク質の融合物とする。適切には、前記融合物は配列番号１を含み、適切には、前記融合物は配列番号１からなる。
【００８０】
他のプロドラッグコンバターゼは、ＨＳＶＴＫの代わりに使用することができる、たとえば、ベータ−グルコシダーゼ又は本明細書において言及される、特に、上記に言及されている他のもの（選択可能マーカー遺伝子）。
【００８１】
広範囲の実施形態において、ビーズ選択などの、細胞を選択するための他の方法は、細胞表面上のＬＮＧＦＲなどのマーカーの存在又は不在のための使用することができる可能性がある。
【００８２】
プロモーター
本発明の核酸は、たとえば選択可能マーカー遺伝子をコードするコード配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む。「作動可能に連結された」という用語は、記載される構成成分が、それらが、それらの意図される様式において機能することを可能にする関係にあることを意味する。コード配列に作動可能に連結されたプロモーターは、コード配列の発現が、プロモーターが活性している状態において達成されるように位置する。
【００８３】
「プロモーター」という用語は、遺伝子の転写をコントロールするポリヌクレオチド配列又はそれが作動可能に連結された配列を指す。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ結合及び転写開始のためのシグナルを含む。プロモーターという用語は、当技術分野においてよく知られており、最小限のプロモーターから上流エレメント及びエンハンサーを含むプロモーターまでの、サイズ及び複雑性の範囲のポリヌクレオチド配列を包含する。
【００８４】
プロモーターは、必ずしもではないが、通常、コード配列の上流に位置し、プロモーターは、その発現を調節する。そのうえ、プロモーターを含む調節性エレメントは、通常、遺伝子の転写の開始部位の２ｋｂ以内に位置する。
【００８５】
当業者は、特定の有用なプロモーターの選択が、適切な細胞株及びコード配列を発現するように使用されることとなる発現ベクターの他の様々なパラメーターに依存することを理解するであろう。様々な異なる源からの構成的プロモーター、誘導性プロモーター、及び抑制性プロモーターを含む多くのプロモーターは当技術分野においてよく知られており、ＧｅｎＢａｎｋなどのデータベースにおいて同定することができ、たとえばＡＴＣＣ及び他の民間又は個人の供給源などの保管所からのクローニングされたポリヌクレオチドとして又はその範囲内で入手可能である。
【００８６】
本発明の核酸における使用に適しているプロモーターは、哺乳動物遺伝子、微生物遺伝子、ウイルス遺伝子、又は昆虫遺伝子に由来するものを含む。一般に使用される哺乳動物細胞プロモーター配列は、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０，simian virus 40）、及びサイトメガロウイルスに由来する。単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター（ＨＳＶｔｋ，herpes simplex virus thymidine kinase）などの最小限のプロモーターもまた使用することができる。ベータアクチンプロモーターなどの哺乳動物プロモーターもまた本発明の核酸における使用に適している。宿主細胞又は関連する種からのプロモーターもまた適している可能性がある。
【００８７】
構成的サイトメガロウイルス前初期プロモーターは、哺乳動物細胞において高レベルの遺伝子発現を得るために使用することができる。そのようなプロモーターは、広く入手可能であり、たとえばStratagene社（たとえばpCMV-Script（登録商標） Vector）から得ることができる。他の構成的プロモーター、ＳＶ４０エンハンサー／プロモーター（後期ＳＶ４０プロモーター又は初期ＳＶ４０プロモーターを含む）は、当技術分野において一般に使用されており、哺乳動物細胞において適度に高レベルの遺伝子発現を可能にする。
【００８８】
プロモーターが誘導性であることもまた有利である可能性がある。誘導性プロモーターを用いると、プロモーターの活性はシグナルに応じて増加又は減少する。たとえば、テトラサイクリンオペレーター配列（ｔｅｔＯ，tetracycline operator）を含有するテトラサイクリン（ｔｅｔ，tetracycline）プロモーターは、テトラサイクリン調節性トランス活性化因子タンパク質（ｔＴＡ，tetracycline-regulated transactivator）によって誘導することができる。ｔｅｔＯへのｔＴＡの結合は、ｔｅｔの存在下において阻害される。Tet-On and Tet-Off Gene Expression Systems（Clontech社製）は、オン（恒常的にオフであるが、テトラサイクリンを用いて誘導される）又はオフ（恒常的にオンであるが、テトラサイクリン若しくはドキシサイクリンを用いて抑制される）のモードにおいて組み換えタンパク質発現を維持するために、テトラサイクリン応答性エレメントを使用する。ｊｕｎプロモーター、ｆｏｓプロモーター、並びにメタロチオネインプロモーター及び熱ショックプロモーターを含む他の適している誘導性プロモーターの詳細については、Sambrook et al, In: Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2ndEd, Cold Spring Harbour Laboratory Press, N.Y. (1989)及びGossen et al Curr Opi Biotech 5:516-520 (1994)において見出すことができる。
【００８９】
加えて、これらのプロモーターのうちのいずれも、さらなる調節配列、たとえばコード配列に作動可能に連結されたエンハンサー配列の追加によって改変することができる。エンハンサーは、転写を増加させるようにプロモーターに作用するシス作用性ＤＮＡエレメントである。エンハンサーは、プロモーターのみを用いて得られる発現のレベルを増加させるためにプロモーターと協力して機能することが必要である可能性がある。作動可能に連結されたエンハンサーは、コード配列の上流、コード配列内、又はコード配列の下流に位置することができ、プロモーターから相当な距離となる可能性がある。
【００９０】
転写ターミネーター
本発明の核酸はまた、転写ターミネーターを含んでいてもよい。「転写ターミネーター」は、ＲＮＡポリメラーゼに転写を終了させるように転写される、所望の遺伝子の３’端末に普通表わされるヌクレオチド配列又は配列のひと続きを指す。
【００９１】
別々の遺伝エレメントにポリアデニル化シグナルがあり、これは、一次転写物の３’−端末へのポリアデニル化配列の追加を促進する。ポリアデニル化シグナル配列は、下流の配列を加えて切断の部位から約１０〜３０ヌクレオチド上流に位置する配列AATAAAを含む。ポリアデニル化シグナルは、転写ターミネーター（存在する場合）の非常に近くに位置してもよく、又はある状況においてそれとさらにオーバーラップしていてもよい。
【００９２】
一般的に、多くの転写ターミネーターは、終了部位及び終了部位に付された非鋳型ＤＮＡ鎖におけるＴ−残基の配列に先行するＧＣリッチ配列を含む。ＲＮＡポリメラーゼは、ＧＣリッチ配列を横断して、ｍＲＮＡ内で安定した塩基対ステムアンドループ構造を形成することができるｍＲＮＡを生成する。次いで、転写は、通常、Ｔ−残基が、ウリジル酸残基を主として含む配列で終わるＲＮＡをもたらす、ステムアンドループ構造のすぐ下流で終了する（Brennan and Geiduschek, 1983, Nucleic Acids Res. 11:4157）。
【００９３】
ターミネーター配列の例は、ウシ成長ホルモン遺伝子由来のものである。このターミネーターエレメントはまた、ポリアデニル化シグナルをも提供する可能性がある。ターミネーター配列はまた、ZAP Express（登録商標） Vector System（Stratagene社）及びpCMV-V5-His6（Clontech Laboratories社（Palo Alto、Califから入手可能）などのように、十分に知られている民間の供給業者から得ることができる。哺乳動物発現系において活性なターミネーターは、文献に記載されており、当業者によって容易に得られる。
【００９４】
形質移入／形質導入
「細胞形質移入」は、外来性核酸の細胞への導入を指す。化学的な形質移入方法（リポソーム媒介性、非リポソーム脂質、デンドリマー）、物理的な送達方法（エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、熱ショック）、並びにウイルスベースの遺伝子移入（レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、及びレンチウイルス）を含む、ＤＮＡ及びＲＮＡを細胞の中に導入するためのいくつかの方法がある。選択の方法は、通常、細胞型及びクローニングアプリケーションに依存し、また、代替の方法は、当業者らに十分に知られている。そのような方法は、Davis et al, Basic Methods In Molecular Biology (1986)などの多くの標準的な実験室マニュアルにおいて記載されている。
【００９５】
形質移入された遺伝物質は、細胞において一時的に又は持続的に発現することができる。一時的な形質移入において、ＤＮＡは移動し、細胞に存在するが、核酸は、宿主細胞染色体の中に統合しない。典型的には、一時的な形質移入は、形質移入の２４〜７２時間後に導入されたＲＮＡの及び形質移入の４８〜９６時間後に導入されたＤＮＡの高度な発現レベルをもたらす。安定した形質移入は、染色体ＤＮＡへのＤＮＡベクターの統合によって達成され、細胞のゲノムにおいて持続的に発現する。
【００９６】
Lipofectinamine 2000、エレクトロポレーション、又は形質導入の他の形態などの市販で入手可能なリポソームを使用する形質移入は使用することができる。そのうえ、所望のマイクロＲＮＡなどの核酸は、ウイルス発現プラスミド又は非ウイルス発現プラスミドの中にクローニングすることができ、これらは、次いで、感染（ウイルスベクター）又は形質移入（非ウイルス）によって導入することができる。これは、細胞の安定した形質導入をもたらすであろう。そのような詳細については共通しており、当業者に十分に知られている。特に、そのような技術は、Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel, F. M. et al. (1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.)においてのように実行することができる。
【００９７】
外来性核酸を用いて細胞を形質移入するための化学的な手段は、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム、又は人工リポソームの使用を含む。ＤＥＡＥ−デキストランは、負に荷電した核酸と結合する陽イオン性ポリマーである。ＤＮＡ／ポリマー複合体におけるポリマーによって与えられる過剰な正の荷電により、複合体が、負に荷電した細胞膜とより密接に結合するようになることを可能にする。細胞による複合体の続いて起こる取り込みはエンドサイトーシスによるものと考えられる。この方法は、一時的な発現のための細胞の中への核酸の送達に成功している。ポリブレン、ポリエチレンイミン、及びデンドリマーを含む他の合成陽イオン性ポリマーは、細胞の中への核酸の移入のために使用することができる。
【００９８】
リン酸カルシウム共沈法を使用する形質移入は、様々な細胞型の一時的又は安定した形質移入のために使用することができる。この方法は、形質移入されることとなる核酸を塩化カルシウムと混合すること、これを、コントロールした様式において緩衝生理食塩水／リン酸溶液に追加すること、及び混合物を室温でインキュベートすることを含む。このステップにより、培養細胞上に分散する沈澱物が生成される。核酸を含む沈澱物は、エンドサイトーシス又はファゴサイトーシスを介して細胞によって取り込まれる。これは、たとえばJ R Rayner and T J Gonda （"A simple and efficient procedure for generating stable expression libraries by cDNA cloning in a retroviral vector." Mol Cell Biol. 1994 February; 14(2): 880-887）において教示されるように、哺乳動物細胞で大規模に達成された。
【００９９】
人工リポソームを使用する形質移入は、宿主細胞における外来性核酸の一時的又は長期的な発現を得るために使用することができる。この方法はまた、リン酸カルシウム又はＤＥＡＥ−デキストランに調和しないある種の細胞型を形質移入するのに役に立つ可能性がある。
【０１００】
リポソームは、細胞膜と実際に融合して、細胞の中に核酸を放出することができる小型の膜結合性の物質である。生理的ｐＨで全体的に正味の正の荷電を有する脂質は、人工リポソームを使用する形質移入法のために開発されたリポソームの最も共通する合成脂質成分である。陽イオン性脂質は、Ｌ−ジオレオイルフホスファチジル−エタノールアミン（ＤＯＰＥ，L-dioleoylphosphatidyl-ethanoloamine）などの中性脂質と混合されることが多い。脂質分子の陽イオン性部分は、負に荷電した核酸と結合して、リポソーム／核酸複合体において核酸の圧縮をもたらす。エンドサイトーシスに続いて、複合体は、エンドソーム中に現われ、後に核中に現われる。哺乳動物細胞への核酸の送達のために陽イオン性脂質を使用する形質移入試薬は、広く入手可能であり、たとえばPromega社から得ることができる（TransFast（商標）Transfection Reagent）。
【０１０１】
さらなる利点
ｍｉＲＮＡの機能の研究における選択可能マーカーの使用は、以前に開示されていない。上記に述べられるように、この分野における分析は、ルシフェラーゼなどの定量化できるマーカーの使用に典型的には限られている。特定のｍｉＲＮＡのタンパク質発現に対する効果を定量化しようとする際に、ルシフェラーゼは特に魅力的である。これは、発光の直接的に比較可能な測定を異なる処置にわたって行ない、比較することを可能にする。際立って対照的に、選択可能マーカーは、より二元性の基本原理の上に作動する。選択可能マーカーの基本の概念は、マーカーを含む細胞は、生存させることができ、マーカーを有していない（又はマーカーを発現しない）細胞は、排除することができることである。したがって、ｍｉＲＮＡ分析の分野における選択可能マーカーの使用は、経験にそぐわないと考えられ得る。加えて、ルシフェラーゼの先行技術使用と比較して、選択可能マーカーの使用は、情報の損失に当たる。これは、上記に述べられるように、ルシフェラーゼは、処置の間の発現レベルの定量化及び比較に非常によく適合し、この情報は、めったに、選択可能マーカーを使用して入手可能ではなく又は測定されないからである。したがって、本発明の方法及び物質は、先行技術に関して経験にそぐわないと考えられ得る。明らかに、非常に密接に比較発現レベルに基づくｍｉＲＮＡ分析などの分野において、広範囲の直接的な比例的な測定及びなされることとなるタンパク質発現に関する推測を可能にする系の背景から単に二元性の分析を可能にする系に切り替える考えは、すぐに捨てられると思われる。演繹的に、これは、そのような分析から有用に抽出することができる情報に関して、後退していると確実に思われるであろう。しかしながら、本明細書において実証されるように、ｍｉＲＮＡの機能の分析において、特に前記ｍｉＲＮＡの標的の同定に遺伝子選択技術を用いることは実際に驚くほど有用である。
【０１０２】
方向性クローニング戦略が使用されるのは本発明の利点である。好ましい実施形態において、SfiIクローニングが使用される。これは、まれな切断制限酵素である。SfiIは、８塩基対認識配列を切断する。そのうえ、SfiIは、２つの切断端末で対称性の突出を残して切断する。これは、有利には、SfiI消化に続く方向性クローニング戦略を可能にする。これらの技術は、米国特許第５，５９５，８９５号明細書においてなどのように先行技術において開示され、これは、参照によって本明細書において組み込まれる。明らかに、本発明は、BstXIクローニングなどの、核酸構築物における使用に適している任意の方向性クローニング系を包含する。方向性クローニングのために使用される１又は複数の制限酵素は、BstXIであってもよい。これはまた、米国特許第５，５９５，８９５号明細書において記載される。SfiI方向性クローニングは、その単純性により好ましい。SfiIクローニングを使用するというさらなる利点は、８塩基対認識配列がゲノムにおいて比較的まれであるということである。たとえば、Spe I又はHind IIIなどのより頻繁な切断制限酵素が使用される場合、それらが、クローニング作業の間に標的配列を消化してしまう、相応してより高い危険性があり、この危険性は、８塩基対認識配列などのより長い認識配列の使用により低下する。
【０１０３】
他の分野における発現ベクターとは対照的に、本発明の核酸は、選択可能マーカーに続く終止コドンを特徴とすることが好ましい。この実施形態において、選択可能マーカーが核酸によってコードされるポリペプチドである場合、前記選択可能マーカーポリペプチドの翻訳は終止コドンで終了する。したがって、３プライムＵＴＲ又は３プライムＵＴＲの候補として本発明の核酸中に存在する任意の配列が任意のポリペプチドをコードするかどうかは本発明の作業に影響を与えるはずがない。実に、３プライムＵＴＲ又は候補３プライムＵＴＲ中に存在する任意のそのようなコード配列が、理想的に、選択可能マーカーのポリペプチドに融合されないであろうといったことは本発明の利点である可能性がある。したがって、選択可能マーカーポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームの直後に存在する１又は複数の終止コドン（適切には終止ボックス）は、任意のさらなる下流の核酸配列の翻訳を予防する又は少なくとも妨げるといった利点を有する。
【０１０４】
終止ボックスは、当技術分野において一般に知られている遺伝エレメントである。手短に言えば、終止ボックスは、少なくとも３つの終止コドンを含み、これらは、終止ボックスの５プライム端末と３プライム端末の間で、終止コドンが、３つの可能性のある前方のリーディングフレームのそれぞれにおいて提供されるように、オーバーラップ又は非オーバーラップの構成において配列する。終止コドンは、オーバーラップしていてもよく、又はそれらは、１、２、４、５、又はそれ以上のヌクレオチドによって分離されるなどのように、少数のヌクレオチドによって分離されていてもよい。明らかに、終止コドンは、３、６、９、又は３で割り切れる任意の他の数のヌクレオチドによって分離されることは考えられない、なぜなら、この様式で配列させた終止コドンは、異なるリーディングフレームにおいて提示されないと思われるからである。しかしながら、それはもちろん述べられるべきである。フレームにおける２つ以上の終止コドンはまた、たとえば読み過ごしに対して警戒するためにも有用であり、したがって、たとえば、必要に応じて反復終止コドン若しくは重複終止コドン又は終止ボックスを使用して、適している実施形態において用いることができる。そのような詳細については、当業者に十分に知られている。
【０１０５】
ｃＤＮＡライブラリー
適切には、３プライムＵＴＲ又は候補３プライムＵＴＲは、ｃＤＮＡライブラリーに由来する。適切には、ｃＤＮＡは、哺乳動物ｃＤＮＡとする。適切には、ｃＤＮＡは、所望の組織又は疾患由来である。たとえば、ｃＤＮＡは、脳由来であってもよい。これは、最も多様なｃＤＮＡを提示する組織であるという利点を有する。このように、ｃＤＮＡは、単一の組織から調製することができるが、できるだけ多くの異なる遺伝子を表わす最大限の可能性を有する。他の実施形態において、ｃＤＮＡは、所望の疾患由来であってもよい。そのような疾患の例は、急性骨髄性白血病である。この実施形態において、適切には、ｃＤＮＡはすべて、急性骨髄性白血病細胞に由来する。これは、おそらく選ばれた疾患に関連性があるであろう３プライムＵＴＲ又は候補３プライムＵＴＲを提示するという利点を有する。
【０１０６】
原則として、３プライムＵＴＲ又は候補３プライムＵＴＲは、任意の適している遺伝子源に由来してもよい。ｃＤＮＡライブラリーは、ｃＤＮＡライブラリーから、候補３プライムＵＴＲのうちの３プライムＵＴＲに到達するための特に好都合な供給源である。所望のＵＴＲの供給源としてｃＤＮＡを使用することはいくつかの利点を有する。第１に、ｃＤＮＡライブラリーは、たとえば単独で又はランダムヘキサマーと組み合わせて選択されるオリゴｄＴであってもよい。これは、３プライム端末でライブラリーを最も厳正にする効果を有し、この端末は、ポリＡテイルに隣接する。調整のためのそれらの方法により、ｃＤＮＡライブラリーは、特に最も長いｃＤＮＡ転写物について、５プライム端末で不十分に表わされる傾向を有する。しかしながら、ｃＤＮＡライブラリーの３プライム端末は、典型的には、最も無傷で多様な配列により、最もよく表わされているので、これは、３プライムＵＴＲ又は候補３プライムＵＴＲの供給源として、ｃＤＮＡライブラリーの使用に対して最小限の影響（たとえあったとしても）しか有していないであろう。
【０１０７】
もちろん、遺伝子の５プライムＵＴＲ内にも又は他の位置にも存在するｍｉＲＮＡ標的部位がある可能性がある。そのため、オリゴｄＴ及びランダムヘキサマーの組合せの使用は、有利には、そのように生成されたｃＤＮＡライブラリーによって候補ｍｉＲＮＡ標的部位のより広い保証範囲を可能にする。
【０１０８】
ｃＤＮＡライブラリーは、伝統的に、コードされたポリペプチドの研究のために使用されるので、そのような物質を、多様なＵＴＲ又は候補ＵＴＲの供給源として使用することができることはそれ自体驚くべきことである。
【０１０９】
任意選択で、候補３’ＵＴＲは、サイズを選択することができる。これは、全体的な核酸のサイズを最適化するという利点を有する。これは、３’ＵＴＲが由来する所望の生物又は組織における３’ＵＴＲの最も共通するサイズの知識に基づいて、できるだけ多くの無傷の３’ＵＴＲを含む可能性を最大限に高めることを可能にするというさらなる利点を有する。
【０１１０】
宿主細胞
本発明のアッセイは、有利には、宿主細胞において（又は上で）実行される。適切には、これらは真核細胞である。適切には、これらは、多細胞生物からの細胞である。適切には、細胞は、昆虫又は脊椎動物由来である。細胞が脊椎動物由来である場合、適切には、それらは哺乳動物細胞である。適切には、細胞は、研究しているｍｉＲＮＡ又は３’ＵＴＲと「同起源」とする、適切には、細胞は、研究しているｍｉＲＮＡ及び３’ＵＴＲの両方と同起源とする。同起源であることは、同じ生物に由来することを意味する。これは、たとえばｍｉＲＮＡを処理するための又はｍＲＮＡを翻訳するための細胞処理機構が、共通しており、そのため、ｍｉＲＮＡ−３’ＵＴＲの機能を研究する又は試験するための、生物学的に最も適切な条件を提供するといった利点を有する。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、研究しているｍｉＲＮＡ及び／又は３’ＵＴＲの供給源と異なることが望ましい。そのような適用の１つの例は、研究下の標的配列（たとえば３’ＵＴＲ又は候補３’ＵＴＲ）に干渉する可能性がある又はそれと相互作用する可能性がある内在性ｍｉＲＮＡがある場合である。この実施形態において、ｍｉＲＮＡ及び／又は標的配列が由来する（１又は複数の）生物と異なる生物由来である細胞又は細胞株を使用することは望ましい可能性がある。たとえば、ヒトｍｉＲＮＡを研究する場合、Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞を使用することは望ましい可能性がある。この様式において、自然発生のｍｉＲＮＡ又は内在性ｍｉＲＮＡによる、研究又はスクリーニングの「干渉」又は複雑化を回避することができる可能性がある。１又は複数の標的配列を有する核酸を１又は複数の細胞の中に導入し、１又は複数の選択可能マーカーの発現について試験することによって、内在性干渉ｍｉＲＮＡが、所望の細胞又は細胞株中にあるかどうかを試験することはもちろん容易である。所望のｍｉＲＮＡの追加又は導入がない状態においてさえ発現が見られない場合、これは、自然発生のｍｉＲＮＡ又は内在性ｍｉＲＮＡが、選択可能マーカーの発現を予防している又はダウンレギュレートしていることを示している可能性がある。そのような観察は、有意義な研究又はスクリーニングが試みられる前に、たとえば、外来性ｍｉＲＮＡの非存在下における１又は複数の選択可能マーカー遺伝子の信頼できる発現のための条件が確立されるまで代替の細胞又は細胞株を試験することによって、この問題を検討する必要があることを示すものである。本明細書において提供されるガイダンスを考慮すれば、これは、明らかに、熟練した操作者にとってルーチン的な事項である。
【０１１２】
適切には、宿主細胞は、ｍｉＲＮＡ処理のために及びタンパク質発現のために少なくとも必要な装置を含有する。なおまた、これは、本発明の１又は複数の核酸を導入することによって及び上記に述べたマーカー遺伝子発現をモニターすることによって容易に試験される。
【０１１３】
適している細胞は、ＮＩＨ  ３Ｔ３マウス線維芽細胞などの３Ｔ３細胞（これらの細胞は、ＭＩＲ１０ａ及びＭＩＲ１３０を発現するが）；ヒトＨＬ６０又はＪｕｒｋａｔ細胞（これらは、有利には、有意なＭＩＲ１０ａ又はＭＩＲ１３０を発現しない）；ヒトＨｅＬａ細胞（これらは、有利には、非常に低いＭＩＲ１０ａ及びＭＩＲ１３０を発現する）；Ｃｏｓ細胞（これらは、有利には、容易に形質移入することができる）を含む。
【０１１４】
ＮＩＨ３Ｔ３細胞及びＨｅＬａ細胞は、容易に形質移入することができるという付加的な利点を有する。
【０１１５】
最も適切には、細胞は、ＭＣＦ７細胞とする。
【０１１６】
ライブラリー又はスクリーニングの構成において、細胞株は、それらのｍｉＲＮＡが、使用される宿主細胞中で内因的に発現される場合、ＵＴＲが、スクリーニング／選択の第１のラウンドを通過しないという意味で、「セルフクリーニング」と見なすことができる。
【０１１７】
特に適しているのは、実施例の部において示される細胞又は細胞株である。
【０１１８】
さらなる適用
マイクロＲＮＡは、分化、血管新生、細胞接着、細胞増殖、生存などの多くの生物学的プロセスにおいて役割を果たし、造血において重要な役割を果たす。それらはまた癌において重要な役割を果たすことが示された。そのため、本発明は、有利には、産業の多くの異なる分野において適用することができる。
【０１１９】
発明者らは、１つの手順において特異的なマイクロＲＮＡに対する多数の標的を同定することができる、マイクロＲＮＡ標的の同定のために開発された機能アッセイを記載する。これは、マイクロＲＮＡ研究の拡大しつつある分野にわたって適用を見出す。
【０１２０】
選択手順の適合は、有利には、多様な生物からのｍｉＲＮＡ及び／又はｍｉＲＮＡ標的に関連して、本発明を使用可能にすることができる。さらに、マイクロＲＮＡ標的の同定は、マイクロＲＮＡが重要な役割を果たす癌などの疾患において重要である。同定された標的は、小分子開発のための新規な標的（たとえばＢＣＲ／ＡＢＬ、ｇｌｉｖｅｃ、及びその他のもの）を提供する可能性がある。
【０１２１】
加えて、本発明は、たとえば図２において示されるように、ＨＳＶＴＫ／ｐｕｒｏの後ろのＵＴＲをクローニングするための１又は複数の新しいプラスミドを提供する。
【０１２２】
本発明はまた、１又は複数の新規な選択可能マーカー融合物を提供する。
【０１２３】
遺伝子の５プライムＵＴＲ内にも存在するｍｉＲＮＡ標的部位がある可能性がある。そのため、オリゴｄＴ及びランダムヘキサマーの組合せの使用は、有利には、オリゴｄＴのみの使用と比較して、ｃＤＮＡライブラリーによって標的部位のより広い保証範囲を可能にする。
【０１２４】
調節性ＲＮＡの調節因子
特異的なマイクロＲＮＡに対する標的を使用すると、この系は、このマイクロＲＮＡの調節因子を同定するために使用することができる。選択可能マーカー（ＴＫｐｕｒｏ融合物など）に連結された標的配列（たとえば標的ＵＴＲ）及びマイクロＲＮＡを発現する細胞の集団は、ガンシクロビル耐性及びピューロマイシン感応性となるであろう。次いで、物質又はｃＤＮＡライブラリーが、これらの細胞に導入され、ピューロマイシン中で選択される場合、発明者らは、このマイクロＲＮＡ発現を調節する遺伝子、つまり、ｍｉＲＮＡ作用を予防し又は阻害し、そのため、選択可能マーカー発現（遺伝子又は物質の非存在下において抑制される）を可能にする又は増加させる遺伝子又は物質を同定することができる。
【０１２５】
言いかえれば、この系は、マイクロＲＮＡなどの調節性ＲＮＡを調節する遺伝子、化学物質、小分子又は他の実体を研究する又はスクリーニングするために使用することができる。たとえば、ｍｉｒＸが、標的Ｙを調節する場合、ｍｉｒＸ発現をダウンレギュレートする実体又は処置を同定するために、物質又は遺伝子（たとえばｃＤＮＡライブラリー又は小分子ライブラリー）は細胞に導入されると思われる。ｍｉｒＸのダウンレギュレーションは、ｐｕｒｏＴＫなどの選択可能マーカーの発現をもたらし、これらの細胞にピューロマイシン耐性を付与するであろう。試験実体がｃＤＮＡである場合、導入されたｃＤＮＡの同定は、ｍｉｒＸの発現及び／又は機能を調節する１又は複数の遺伝子を明らかにするであろう。実体が小分子である場合、そのような小分子ライブラリーは、有利には、当技術分野において十分に知られているように、単一の実験又は多数の化合物のプールにおいて適用することができ、有利には、たとえばロボットサンプルハンドリングの使用によって自動化されることが多い。
【０１２６】
オフ標的スクリーニング
ｓｉＲＮＡ分子などの多くの調節性ＲＮＡは、臨床治験に向けて又は臨床治験において開発下にある。本発明の実施形態は、ｓｉＲＮＡのオフ標的効果について、これらのｓｉＲＮＡ分子をスクリーニングするために使用することができる。これは、重要な付加的な産業上の適用であり、この系の有用性である。
【０１２７】
これらの実施形態において、系は、小型干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）などの調節性ＲＮＡのオフ標的効果を研究するために使用することができる。多くのｓｉＲＮＡ分子は、癌における癌遺伝子（たとえばＢＣＬ２）及び／又は他の遺伝子疾患に関連する突然変異遺伝子などの遺伝子のノックダウンについて臨床治験において開発下にある。個々のｓｉＲＮＡに関する問題は、シード配列（ｓｉＲＮＡ又はマイクロＲＮＡの５’端末のヘキサマー配列）によるオフ標的効果である。意図される標的以外で、ヒトゲノムにおいて不在であるシード配列を有していないｓｉＲＮＡを設計することは非実用的である。これは、単に、ヒトゲノムのサイズ及びそのような短い配列（たとえば６量体）がゲノムにおいて唯一である可能性による。このシード配列は、ヒトゲノムにおいて何百回も生じることが予想されると思われる。１又は複数のオフ標的シード配列を有するｓｉＲＮＡは、これらの不適切な又はオフ標的部位で、マイクロＲＮＡとして作用することができる可能性がある（ｓｉＲＮＡに関する１００％の相同性の代わりに標的との部分的な相同性のみ）。本明細書において記載された系は、可能性のあるオフ標的効果について提唱されるｓｉＲＮＡ分子を試験するために使用することができる可能性がある。適切には、完全長ｃＤＮＡライブラリーは、本発明の核酸における候補調節性ＲＮＡ標的配列の供給源として使用することができる可能性がある。これは、切断型ｃＤＮＡ又は他の供給源と比較して、すべての可能性のあるシード配列を網羅する可能性が高いという利点を有するが、もちろん、それらは、望まれる場合、同等に使用することができる。
【０１２８】
本発明は、ここでは、実施例として記載される。これらの実施例は、例示的であることが意図され、添付された請求項を限定することを意図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１】本発明の１又は複数の方法を示す図である。
【図２】本発明の核酸を示す図である。
【図３】本発明の核酸を示す図である。
【図４】本発明の核酸を示す図である。
【図５】本発明の核酸を示す図である。
【図６】発現のルシフェラーゼ／ＭＡＦＢ  ＵＴＲダウンレギュレーションの棒グラフ及びＭＡＦＢタンパク質発現の写真を示す図である。
【図７】ＧＣＶ感受性１０日目の棒グラフを示す図である。
【図８】ＧＣＶ感受性１０日目の棒グラフを示す図である。
【図９】ｍｉｒ−１０ａ  ｍｉｒ−１３０ａの発現の棒グラフを示す図である。
【図１０】ＴＫＺＥＯガンシクロビル７日目の棒グラフを示す図である。
【図１１】ＴＫＺＥＯガンシクロビル１３日目の棒グラフを示す図である。
【図１２】ＡＺＴ感受性７日目の棒グラフを示す図である。
【図１３】一時的な（上）及び安定した（下）、ＭＣＦ７細胞からのＭｉｒ１０ａ及びｍｉｒ１３０ａの発現を示す図である。
【図１４】本発明の代表的な脳ＵＴＲライブラリーの写真を示す図である。
【図１５Ａ】サイズを選択したｃＤＮＡを示す図である。
【図１５Ｂ】Sfi I消化したクローニングライブラリーを示す図である。
【図１６】ライブラリーのＰＣＲ分析を示す図である。
【実施例１】
【０１３０】
核酸
核酸は、５プライムから３プライムの方向に配列される以下の隣接するエレメントを含んで構築される；プロモーター；選択可能マーカー；候補ｍｉＲＮＡ標的配列を含む核酸セグメントを受け入れるためのクローニング部位；及びポリアデニル化シグナル。
【０１３１】
エレメントは、前記プロモーターによって誘導される転写物が、前記選択可能マーカー、前記候補ｍｉＲＮＡ標的配列、及び前記ポリアデニル化シグナルをその順序で含むように配列される。
【実施例２】
【０１３２】
２重選択可能マーカー
本明細書において説明されるように、選択可能マーカーは、本発明の基本的な部分である。ある実施形態において、選択可能マーカーは、有利には、１つを超える活性を含んでいてもよい。この実施例は、１つを超える活性を有する選択可能マーカーの生成を実証する。この実施例において、これは、２つの異なる個々の選択可能マーカーのＯＲＦの単一の核酸セグメントの中への融合によって達成される。これは、有利には、２つの異なるポリペプチドドメインを含み、それぞれ、その特異的な（選択可能な）活性を有する単一ポリペプチドの生成をもたらす。
【０１３３】
この実施例において、使用される２つの個々のマーカーはＨＳＶＴＫ及びＰＵＲＯである。これらは、ＴＫ／ＰＵＲＯ２重選択可能マーカーを形成するために融合される。
【０１３４】
ＨＳＶＴＫ及びＰＵＲＯのオープンリーディングフレームは研究されている。適している融合点は、それらの活性が融合産物において保持される可能性を最大限にするためにポリペプチド産物の性質を考慮して選択される。この段階で、２つのポリペプチドの間の接合個所でリンカー（たとえばリンカー領域又は「つなぎ鎖」又は他のそのような接合部）を含むかどうか、決定することができる。注意はまた、本発明における融合物の手順又は使用に干渉する可能性がある１又は複数の制限酵素認識部位の核酸配列をスキャンするなどの実用的な事項にも払われる（たとえば、本発明の最終的な核酸において、ＵＴＲ挿入のために使用されることが意図されるSfiI、BstXI、又は他の制限酵素部位は、有利には、この段階で排除されるべきである）。そのような部位の排除は、部位特異的突然変異誘発又は同様の技術によって適切に達成することができる。
【０１３５】
次いで、核酸配列は、必要に応じて生成され、接合される。これは、当技術分野において知られている任意の適している手段によるものとすることができる。たとえば、これは、共に融合物を形成するための異なるエレメントの制限酵素消化及びライゲーションによるものであってもよい（要求に応じて、任意の中間断片の選択的充填又は平滑端末化を含む）。その代わりに、これは、必要に応じて、望まれる断片のＰＣＲ増幅及びその後に続くクローニング／ライゲーションによって達成することができる。その代わりに、設計された完全な核酸配列は、たとえば化学合成によって完全形態で直接的に合成することができる。
【０１３６】
この実施例において、Ｈｙｇｒｏ／ＴＫ融合物が生成される。この融合物は、配列番号３において示される配列を有する。
【実施例３】
【０１３７】
ＨＳＶＴＫ／ＰＵＲＯ２重選択可能マーカー
この実施例において、２つの選択可能マーカーは、活性／ポリペプチドの両方を含む単一の翻訳産物を生成するために融合される。
【０１３８】
この実施例において、使用される２つの個々のマーカーはＨＳＶＴＫ及びＰＵＲＯである。これらは、ＴＫ／ＰＵＲＯ２重選択可能マーカーを形成するために融合される。
【０１３９】
ＨＳＶＴＫ及びＰＵＲＯのオープンリーディングフレームは研究されている。次いで、マーカーは、実施例２において記載されるように融合される。
【０１４０】
結果として生じる選択可能マーカーは配列番号１において示される。これは、２重選択可能マーカーである。これは、本発明によればＴＫ−ＰＵＲＯ融合物である。
【実施例４】
【０１４１】
２重選択可能マーカーを有する核酸
この実施例において、２つの選択可能マーカーは、本発明の核酸の中に組み込まれる。
【０１４２】
この実施例において、ＨＳＶＴＫ／ｐｕｒｏを有する核酸は、選択可能マーカーとして生成される。
【０１４３】
２つの選択可能マーカーは、実施例３におけるように、活性／ポリペプチドの両方を含む単一の翻訳産物を生成するために融合される。
【０１４４】
次いで、２重選択可能マーカーをコードするこのヌクレオチド配列は、プロモーターの後に（つまり下流又は３’）かつ３’ＵＴＲ挿入の部位の前に（つまり上流又は５’）本発明の核酸の中に導入される。
【実施例５】
【０１４５】
３’ＵＴＲライブラリー
３’ＵＴＲライブラリーは本発明に従って生成される。
【０１４６】
３プライムＵＴＲライブラリーは、実施例１において記載されるなどのように、上記に記載されるように核酸を提供し、前記クローニング部位の中に候補ｍｉＲＮＡ標的配列を含む核酸を挿入することによって作製される。この実施例において、候補ｍｉＲＮＡ標的配列は、３プライムＵＴＲ又は候補３プライムＵＴＲである。
【０１４７】
より詳細には、３’ＵＴＲ又は３’ＵＴＲ候補が挿入される核酸は、実施例４の核酸によって含まれる。具体的には、核酸は、プラスミドｐ３’ＵＴＲ３によって含まれる（図２を参照されたい）。
【０１４８】
この実施例において、３’ＵＴＲ又は３’ＵＴＲ候補を有する核酸セグメントはｃＤＮＡである又はそれに由来する。この特定の実施例において、ｃＤＮＡは脳に由来する。脳は、任意の他の器官と比較して、最も多くの唯一の転写物を有する。これは、有利には、最大限の多様性を有するライブラリーの生成を可能にする。明らかに、任意の組織からのｃＤＮＡを使用することができ、又は実に、異なる組織からのｃＤＮＡの混合物を、多様性を最大限にするために使用することができる。
【０１４９】
発明者らは、オリゴｄＴプライムヒト脳ｃＤＮＡライブラリーを使用する（上記に述べられるように、脳は、最も多くの異なるｍＲＮＡを発現する）。このｃＤＮＡライブラリーにおいて、ｃＤＮＡは、異なる３’突出（GGCCNNNNNGGCC）を有する２つのSfiI部位の中に一方向性にクローニングされている。
【０１５０】
平均して、ヒト３’ＵＴＲは、約１０００ヌクレオチド長である。そのため、ライブラリーは、SfiIを用いて消化し、サイズを選択してもよい、つまり、１５００ｂｐ未満の画分は、大多数の３’ＵＴＲの捕獲を確実にするために単離される。次いで、このｃＤＮＡは、ＴＫｐｕｒｏの下流に、ｐ３’ＵＴＲベクターのSfiI部位の中に一方向性にクローニングされる。
【０１５１】
したがって、本発明による３’ＵＴＲライブラリーは生成される。
【実施例６】
【０１５２】
ＡＭＬライブラリー
実施例５の技術は、疾患特異的３’ＵＴＲライブラリーの構築に適用される。
【０１５３】
３’ＵＴＲ（３’ＵＴＲ候補）は、ｃＤＮＡライブラリーに由来する。この実施例において、そのライブラリーは、急性骨髄性白血病細胞に由来する。
【０１５４】
ｃＤＮＡは、サイズを選択することができる。この実施例において、それらは、約１５００ヌクレオチドの最大限のサイズを用いてサイズを選択される。
【０１５５】
次いで、このｃＤＮＡは、ＴＫｐｕｒｏの下流に、ｐ３’ＵＴＲベクターのSfiI部位の中に一方向性にクローニングされる。
【０１５６】
したがって、本発明による３’ＵＴＲライブラリーは生成される。
【実施例７】
【０１５７】
細胞ベースのライブラリー
プラスミドライブラリーは、上記の実施例５又は実施例６に従って生成され、宿主細胞の中に大規模で導入される。この実施例において、細胞は、非ヒト細胞であり、細胞の中へのライブラリーの導入は、Mourtada et al 2005 （Mourtada-Maarabouni M, Kirkham L, Farzaneh F, Williams GT. Functional expression cloning reveals a central role for the receptor for activated protein kinase C 1 (RACK1) in T cell apoptosis. J Leukoc Biol. 2005.2:503）において記載されるように実行される。
【０１５８】
次いで、プラスミドライブラリーを含有する細胞は、プラスミドライブラリーを取り込んだ細胞のみが増殖することができるように、ピューロマイシンの存在下において選択される。
【０１５９】
次いで、細胞は、収集物の多様性を維持しながら拡張する。次いで、拡張した細胞はプールされる。次いで、プールされた拡張した細胞の一定分量は、たとえば液体窒素における−１９６℃での凍結及び保管によって将来の使用のために維持される。
【０１６０】
必要とされる場合、細胞は、解凍し、スクリーニング／分析における使用のために培養に戻される。ピューロマイシン選択は、標的プラスミドを含む細胞のみが維持されることを確実にするためにいかなる時も適用することができる。この様式におけるプラスミドライブラリーを含む細胞の収集物は、本発明に従って細胞ベースのライブラリーと見なされる。
【実施例８】
【０１６１】
スクリーニング
本発明は、ｍｉＲＮＡ遺伝子調節における、標的の同定及び検証のツール及び方法を提供する。たとえばライブラリースクリーニングによる、ｍｉＲＮＡ標的の同定のための機能アッセイもまた提供される。
【０１６２】
選択研究（スクリーニング研究）
この実施例において、発明者らは、３’ＵＴＲへのｍｉＲＮＡの結合によるタンパク質ダウンレギュレーションの同定のための新規な選択アプローチを適用する。このために、本発明者らは、発現した場合にピューロマイシン耐性及びガンシクロビル感受性を細胞に付与するＨＳＶＴＫ／Ｐｕｒｏ融合遺伝子の下流にクローニングされた３’ＵＴＲを利用する。３’ＵＴＲへのｍｉＲＮＡの結合による翻訳のダウンレギュレーションは、これらの細胞をピューロマイシン感受性及びガンシクロビル耐性に変換する（概要としての図１を参照されたい）。
【０１６３】
このアプローチを実証するために、本発明者らは、ｐ３’ＵＴＲのSfiI部位の中に、ＴＫｐｕｒｏの下流に、検証されたｍｉＲＮＡ標的部位並びにＨＯＸＡ１遺伝子及びＭＡＦＢ遺伝子の完全長３’ＵＴＲをクローニングした（図２を参照されたい）。ＨＯＸＡ１及びＭＡＦＢは、それぞれ、ｍｉＲＮＡ  ｍｉｒ−１０ａ及びｍｉｒ−１３０ａとの知られている相互作用を有する（Garzon R, Pichiorri F, Palumbo T, et al. MicroRNA fingerprints during human megakaryocytopoiesis. PNAS 2006;103:5078-5083）。
【０１６４】
マウス細胞又は昆虫細胞は、ｐ３’ＵＴＲ発現プラスミドを用いて形質移入し、ピューロマイシン中で選択し、形質移入細胞の集団を得る。
【０１６５】
次いで、前駆体ｍｉＲＮＡ（ｍｉｒ−１０ａ、ｍｉｒ−１３０ａ；Ambion社製）及びスクランブルしたコントロールＲＮＡオリゴを形質移入し、細胞は、ガンシクロビルの存在下において拡張させて、ｍｉＲＮＡがＴＫｐｕｒｏタンパク質発現をダウンレギュレートし、これらの細胞をガンシクロビル耐性に変換したクローンを単離する。
【０１６６】
生存する細胞は、クローニングし、ＨＯＸＡ１及びＭＡＦＢの標的部位又はＵＴＲの存在は、ＰＣＲ及び配列決定によって検証する。
【０１６７】
ｍｉＲＮＡの存在下におけるＴＫｐｕｒｏの発現レベルは、市販で入手可能な抗体（Insight Biotechnology社製）を使用して、ＨＳＶＴＫのウエスタンブロットによって調査することができる。
【０１６８】
ライブラリースクリーニング
プラスミドライブラリーは、上記の実施例５に従って生成され、宿主細胞の中に大規模で導入される。この実施例において、細胞は、非ヒト細胞であり、細胞の中へのライブラリーの導入は、Mourtada et al 2005 （Mourtada-Maarabouni M, Kirkham L, Farzaneh F, Williams GT. Functional expression cloning reveals a central role for the receptor for activated protein kinase C 1 (RACK1) in T cell apoptosis. J Leukoc Biol. 2005.2:503）において記載されるように実行される。
【０１６９】
ピューロマイシン選択に続いて、所望のｍｉＲＮＡ及び／又は１又は複数のコントロールが導入される。この実施例において、ｍｉｒ−１０ａ、ｍｉｒ−１３０ａ、又はスクランブルオリゴが導入される。
【０１７０】
Lipofectinamine 2000、エレクトロポレーション、又は形質導入の他の形態などの市販で入手可能なリポソームを使用する形質移入が使用される。
【０１７１】
次いで、発明者らは、ガンシクロビルの存在下において、ライブラリー含有細胞を増殖させ、これらのクローンにおいて、ＨＯＸＡ１又はＭＡＦＢの３’ＵＴＲの存在について耐性クローンを試験する。
【０１７２】
この手順はまた、ｍｉｒ−１０ａ及びｍｉｒ−１３０ａに対する多くの他の標的をも同定する。これらは、これらのクローンにおけるＴＫ／ｐｕｒｏ発現のウエスタンブロット分析によって検証される。このライブラリースクリーニング技術は、したがって、既知及び今までのところ未同定のｍｉＲＮＡの両方の同定及び標的検証のための非常に価値のあるツールであることが示される。
【実施例９】
【０１７３】
オフ標的スクリーニング
この実施例において、肝臓癌に関連する遺伝子をノックダウンするためのｓｉＲＮＡは所望の調節性ＲＮＡである。適切には、これは、インビボで特異的に肝臓を標的とすることができる。
【０１７４】
この調節性ＲＮＡのオフ標的効果を調査するために、ＴＫｐｕｒｏなどの選択可能マーカーと連結させた脳又は肝臓の３’ＵＴＲライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーが、上記に記載されるように試験される。
【０１７５】
調査下におけるｓｉＲＮＡが細胞に導入される。
【０１７６】
ガンシクロビル耐性コロニーからの標的候補配列は、次いで、ＰＣＲし、配列決定する。意図される標的遺伝子Ｘ以外の遺伝子が回収される場合、これは、調節性ＲＮＡのオフ標的効果を示す。次いで、これらは、必要に応じて評価する又はさらに研究することができる。
【０１７７】
これらの結果は、ｓｉＲＮＡなどの異なる調節性ＲＮＡを用いて進む又はそれを設計するための決定を助ける。
【実施例１０】
【０１７８】
例示的なライブラリースクリーニング
Ａ）発明者らは、２０％のＭＡＦＢＵＴＲを混ぜたＵＴＲライブラリーをＭＣＦ７及びＭＣＦ７ｍｉｒ１３０Ａに形質移入した。それらはゼオシン中で選択し、コントロールはすべて死滅し、多くのコロニーが得られる。ｍｉｒ１３０Ａは、形質移入ＭＣＦ７細胞の中に導入し、次いで、ピューロマイシン中で選択し（７〜１０日）、次いで、ガンシクロビル中で選択する。次いで、クローンは配列決定する。
【０１７９】
Ｂ）加えて、２回目の形質移入を、ＭＣＦ７及びｍｉｒ１３０Ａを発現するＭＣＦ７ｍｉｒ１３０Ａに行なった。ＭＣＦ７は、当然、ｍｉｒ１３０Ａを発現しないので、ゼオシン選択の後に、回収されたクローンは、クローンの約２０％においてＭＡＦＢＵＴＲを含有しているはずである。しかしながら、ＭＣＦ７ｍｉｒ１３０Ａにおいて、ＭＡＦＢＵＴＲが発現停止するはずであり、これは、ゼオシン耐性の損失をもたらす。ＭＣＦ７ｍｉｒ１３０Ａへのこの第２の形質移入から、ゼオシン選択の後に回収したクローンは、全く又はほとんどＭＡＦＢＵＴＲ挿入断片を有していないはずである。
【０１８０】
次いで、ＤＮＡは、両方の形質移入からの細胞の混合集団から単離し、ＵＴＲ挿入断片をＰＣＲする（混合集団）。これらの挿入断片は、ＴＡクローニングベクターの中にクローニングし、個々のクローンは、９６ウェル構成における配列決定に回す。それぞれの形質移入からの約４８のクローンが配列決定される。
【０１８１】
次いで、発明者らは、ＭＡＦＢＵＴＲがどれくらい多く、ＭＣＦ７及びＭＣＦ７ｍｉｒ１３０Ａの形質移入からのクローンにおいて存在するかを数える。したがって、手順の原理は実証される。
【０１８２】
同時に、この手順に続いて、同様にＧＣＶ選択を行なうことができる。
【実施例１１】
【０１８３】
さらなるライブラリースクリーニング
発明者らは、ＭＣＦ７細胞及びＭＣＦ７（ｍｉｒ１３０）細胞を形質移入した。ＭＣＦ７は、ｍｉｒ１３０を発現せず、ＭＣＦ７（ｍｉｒ１３０）において、発明者らはｍｉｒ１３０を導入し、発明者らは、ｑＰＣＲによってｍｉｒ１３０の発現を検証した。
【０１８４】
小規模実験（それぞれ、１０枚のプレート）において、発明者らは、ｐ３’ＴＫｚｅｏベクター中に、クローニングしたライブラリーを導入した。ライブラリーは、ｍｉｒ１３０に対する標的である２０％のＭＡＦＢ  ＵＴＲと混ぜた。
【０１８５】
両方の細胞株は、１ｍｇ／ｍｌゼオシン中で選択し、これにより、それぞれの細胞株につき２００〜３００のコロニーがもたらされた。ＭＣＦ７においてｍｉｒ１３０が存在しないので、ＭＡＦＢ  ＵＴＲは、ダウンレギュレートされないはずである。ＭＡＦＢＵＴＲのダウンレギュレーションは、ＴＫｚｅｏタンパク質の不在をもたらすはずであり、これは、ゼオシン中でのこれらの細胞の死をもたらすはずである。ＭＣＦ７（ｍｉｒ１３０）において、ＭＡＦＢＵＴＲは、ダウンレギュレートされるはずであり、これは、ＭＡＦＢＵＴＲを含有する細胞の死をもたすはずである。
【０１８６】
結論として；ゼオシン中での選択の後のＭＣＦ７細胞において、クローンの約２０％は、ＭＡＦＢＵＴＲを含有するはずであるが、ＭＣＦ７（ｍｉｒ１３０）において、その割合ははるかに低いはずである。これを調査するために、発明者らは、内在性ＭＡＦＢではなく、ライブラリー中に存在するＭＡＦＢＵＴＲ  ＤＮＡのみを増幅するであろうプライマーを設計した。結果を図１６に提示する。２つの異なる細胞の間でＭＡＦＢＵＴＲ  ＤＮＡの量において約１０×の差異があり、これは、手順の正当性を明らかに示す。
【０１８７】
発明者らはまた、２つの細胞中に存在する完全なＵＴＲをＰＣＲ増幅し、プラスミド中でこれらのＰＣＲ産物をクローニングした。それぞれの細胞からの２４のクローンは配列決定に回す。ＭＡＦＢ含有クローンの数において４分の１の低下がなおある。
注釈：これは過小評価である可能性がある。理論によって拘束されることを望むものではないが、プラスミドのプレップが同等にきれいではない可能性がある。混ぜるために使用したＭＡＦＢＵＴＲは、Ｓｉｇｍａ（商標）からのｍａｘｉｐｒｅｐ（商標）であり、ライブラリープレップは、ｑｉａｇｅｎ（商標）からのｇｉｇａｐｒｅｐ（商標）であった。ｓｉｇｍａ（商標）プレップは、よりきれいであり、より多くの形質移入細胞をもたらす可能性がある。明らかに、これは、当技術分野において知られている任意の適している技術に従ってライブラリープレップをきれいにすることによって熟練した従事者によって最適化される可能性がある。
【０１８８】
そのうえ、発明者らは、ライブラリーを含有するＭＣＦ７細胞の中に、ＭＡＦＢｕｔｒに対するｍｉｒ  １０、ｍｉｒ  １３０、及び低分子ペアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をここでは導入した。これらの細胞は、ゼオシン選択の下に置かれ、これにより、ｍｉｒ１０を発現する細胞からのではなくｍｉｒ１３０又はｓｈＲＮＡを発現する細胞からのＭＡＦＢＵＴＲを取り除くはずである。別々の実験において、これらの細胞は、ガンシクロビル選択の下に置くことができ、これにより、ｍｉｒ１０を発現する細胞からのではなくｍｉｒ１３０又はｓｈＲＮＡを発現する細胞からのＭＡＦＢＵＴＲを救済するはずである。
【実施例１２】
【０１８９】
機能アッセイ
選択は、慣習的なスクリーニング（非ヒットは、なくなる又は選び出されるのではなく存在したままである）よりも強力である。したがって、発明者らは、以下のように選択ベースのスクリーニングを用いた：
薬剤選択
正の／負の選択
選択可能マーカー（たとえばｐｕｒｏ、ｈｙｇｒｏ、ｚｅｏ、又は他の適しているもの）のプロドラッグコンバターゼ（たとえばＨＳＶｔｋ−ＧＣＶ、シトシンデアミナーゼ−５ＦＣ、チミジル酸キナーゼ−ＡＺＴ、又は他の適しているもの）との融合タンパク質
スクリーニング及びＦＡＣＳソートのためのＧＦＰ−ｐｕｒｏ融合物
【実施例１３】
【０１９０】
３’ＵＴＲライブラリー
ライブラリーは下記に従って構築する：
３’ＵＴＲの中央値の長さは１ｋＢである
出発物質：脳ｃＤＮＡライブラリー
オリゴｄＴプライム：多くの挿入断片は、少なくとも部分的な３’ＵＴＲを含有する
異なるSfi I部位を使用して一方向性にクローニング
サイズ選択２．５ｋＢを超える
【実施例１４】
【０１９１】
スクリーニング
ＨｏｘＡ１及びＭＡＦＢは、ｍｉｒ１０ａ及びｍｉｒ１３０によってそれぞれダウンレギュレートされる。
ｐｏｓ／ｎｅｇ選択ベクター並びにルシフェラーゼベクターの中にクローニングされたＨｏｘＡ１及びＭＡＦＢのＵＴＲ並びに予測される標的部位。
ＭＡＦＢは、ｍｉＲ−１３０ａの標的である（図６を参照されたい）；ｍｉｒ１０ａによるＨＯＸＡ１のダウンレギュレーションもまた確立された。
ＧＣＶ感受性１０日目は図７及び８に示す。
ｍｉｒ−１０ａ  ｍｉｒ−１３０ａの発現は図９に示す。
ＴＫＺＥＯガンシクロビル「７日目」は、図１０に、「１３日目」は図１１に示す。
ＡＺＴ感受性７日目は図１２に示す。
一時的な（上）及び安定した（下）、ＭＣＦ７細胞からのＭｉｒ１０ａ及びｍｉｒ１３０ａの発現は図１３に示す。
【実施例１５】
【０１９２】
ライブラリーの詳細な製造
ライブラリーは以下のように製造される：
サイズ選択し、Sfi I消化したｃＤＮＡ  ２．５Ｋｂを超える
ＴＫｚｅｏ  Sfi Iにおいてクローニング
１５μｌライゲーション  １μｇ  ＴＫｚｅｏ＋２００ｎｇライブラリー形質転換１．０μｌ
１０００μｌから１μｌ及び１０μｌを平板培養
１μｌから５００を超えるコロニー
５００×１０００×１５＝７５０万
５０ミニプレップ  ５０の異なる挿入断片
収集±６００．０００の独立したクローン
Ｇｉｇａプレップから７．５ｍｇ
本発明による代表的な脳ＵＴＲライブラリーは図１４に示す。
サイズ選択したｃＤＮＡ及びSfi I消化したクローニングライブラリーは図１５Ａ及び１５Ｂにそれぞれ示す。ライブラリーは、２０％のＭＡＦＢ−ＵＴＲプラスミドと混ぜた。
【０１９３】
選択スクリーニング：
ＭＣＦ７細胞及びｍｉｒ１３０Ａを発現するＭＣＦ７細胞の中に形質移入。
形質移入細胞はゼオシンを用いて選択した
（約２０００コロニー）。
ゲノムＤＮＡは、単離し、プラスミドＭＡＦＢ−ＵＴＲの量は、ＭＣＦ７＋ライブラリー及びＭＣＦ７  ｍｉｒ１３０Ａ＋ライブラリー中に存在するＵＴＲのｑＰＣＲＰＣＲ並びに個々のクローンの配列決定のためのＴｏｐｏ  ＴＡクローニングによって決定した。
ＭＡＦＢに対するｍｉｒ１０Ａ、ｍｉｒ１３０Ａ、及びｓｈＲＮＡを用いて形質移入したＭＣＦ７＋ライブラリー＋２０％ＭＡＦＢ。
ゼオシン中での選択（ＭＡＦＢの低下）。
ガンシクロビル中での選択（ＭＡＦＢ豊富化並びにｍｉｒ１０Ａ及びｍｉｒ１３０Ａの標的の同定）。
【０１９４】
上記の明細書において言及される刊行物はすべて、参照によって本明細書において組み込まれる。記載される態様及び本発明の実施形態の様々な修飾及び変更は、本発明の範囲から逸脱することなく当業者らに明白となるであろう。本発明は、特定の好ましい実施形態に関連して記載されているが、主張される本発明が、そのような特定の実施形態に不当に限定されるべきでないことが理解されるはずである。実に、当業者らに明白な、本発明を実行するために記載されるモードの様々な修飾は、以下の請求項の範囲内であることが意図される。
【０１９５】
配列番号１
ＴＫ−ＰＵＲＯ融合物の核酸配列
ATGGCCTCGTACCCCGGCCATCAACACGCGTCTGCGTTCGACCAGGCTGCGCGTTCTCGCGGCCATAGCAACCGACGTACGGCGTTGCGCCCTCGCCGGCAGCAAGAAGCCACGGAAGTCCGCCCGGAGCAGAAAATGCCCACGCTACTGCGGGTTTATATAGACGGTCCCCACGGGATGGGGAAAACCACCACCACGCAACTGCTGGTGGCCCTGGGTTCGCGCGACGATATCGTCTACGTACCCGAGCCGATGACTTACTGGCGGGTGCTGGGGGCTTCCGAGACAATCGCGAACATCTACACCACACAACACCGCCTCGACCAGGGTGAGATATCGGCCGGGGACGCGGCGGTGGTAATGACAAGCGCCCAGATAACAATGGGCATGCCTTATGCCGTGACCGACGCCGTTCTGGCTCCTCATATCGGGGGGGAGGCTGGGAGCTCACATGCCCCGCCCCCGGCCCTCACCCTCATCTTCGACCGCCATCCCATCGCCGCCCTCCTGTGCTACCCGGCCGCGCGGTACCTTATGGGCAGCATGACCCCCCAGGCCGTGCTGGCGTTCGTGGCCCTCATCCCGCCGACCTTGCCCGGCACCAACATCGTGCTTGGGGCCCTTCCGGAGGACAGACACATCGACCGCCTGGCCAAACGCCAGCGCCCCGGCGAGCGGCTGGACCTGGCTATGCTGGCTGCGATTCGCCGCGTTTACGGGCTACTTGCCAATACGGTGCGGTATCTGCAGTGCGGCGGGTCGTGGCGGGAGGACTGGGGACAGCTTTCGGGGACGGCCGTGCCGCCCCAGGGTGCCGAGCCCCAGAGCAACGCGGGCCCACGACCCCATATCGGGGACACGTTATTTACCCTGTTTCGGGCCCCCGAGTTGCTGGCCCCCAACGGCGACCTGTATAACGTGTTTGCCTGGGCCTTGACGTCTTGGCCCAAACGCCTCCGTTCCATGCACGTCTTTATCCTGGATTACGACCAATCGCCCGCCGGCTGCCGGGACGCCCTGCTGCAACTTACCTCCGGGATGGTCCAGACCCACGTCACCACCCCCGGCTCCATACCGACGATATGCGACCTGGCGCGCACGTTTGCCCGAGAAATGAAGCTTACCATGACCGAGTACAAGCCCACGGTGCGCCTCGCCACCCGCGACGACGTCCCCAGGGCCGTACGCACCCTCGCCGCCGCGTTCGCCGACTACCCCGCCACGCGCCACACCGTCGATCCGGACCGCCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCTCACGCGCGTCGGGCTCGACATCGGCAAGGTGTGGGTCGCGGACGACGGCGCCGCGGTGGCGGTCTGGACCACGCCGGAGAGCGTCGAAGCGGGGGCGGTGTTCGCCGAGATCGGCCCGCGCATGGCCGAGTTGAGCGGTTCCCGGCTGGCCGCGCAGCAACAGATGGAAGGCCTCCTGGCGCCGCACCGGCCCAAGGAGCCCGCGTGGTTCCTGGCCACCGTCGGCGTCTCGCCCGACCACCAGGGCAAGGGTCTGGGCAGCGCCGTCGTGCTCCCCGGAGTGGAGGCGGCCGAGCGCGCCGGGGTGCCCGCCTTCCTGGAGACCTCCGCGCCCCGCAACCTCCCCTTCTACGAGCGGCTCGGCTTCACCGTCACCGCCGACGTCGAGGTGCCCGAAGGACCGCGCACCTGGTGCATGACCCGCAAGCCCGGTGCCTGA
配列番号２
プラスミドバックボーンの核酸配列
GCTAGCATCGATAAGAATTCCGGATCCTTAGGCCATTAAGGCCGGCCGCCTCGGCCCACTTCGTGGGGTACCGAGCTCGAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGTGGCCGAGGAGCAGGACTGACACGTGCTACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCGACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTCGACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTG
配列番号３
Ｈｙｇｒｏ／ＴＫ融合物の核酸配列
ATGGGTAAAAAGCCTGAACTCACCGCGACGTCTGTCGAGAAGTTTCTGATCGAAAAGTTCGACAGCGTCTCCGACCTGATGCAGCTCTCGGAGGGCGAAGAATCTCGTGCTTTCAGCTTCGATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCTGCGGGTAAATAGCTGCGCCGATGGTTTCTACAAAGATCGTTATGTTTATCGGCACTTTGCATCGGCCGCGCTCCCGATTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGGAATTCAGCGAGAGCCTGACCTATTGCATCTCCCGCCGTGCACAGGGTGTCACGTTGCAAGACCTGCCTGAAACCGAACTGCCCGCTGTTCTGCAGCCGGTCGCGGAGGCCATGGATGCGATCGCTGCGGCCGATCTTAGCCAGACGAGCGGGTTCGGCCCATTCGGACCGCAAGGAATCGGTCAATACACTACATGGCGTGATTTCATATGCGCGATTGCTGATCCCCATGTGTATCACTGGCAAACTGTGATGGACGACACCGTCAGTGCGTCCGTCGCGCAGGCTCTCGATGAGCTGATGCTTTGGGCCGAGGACTGCCCCGAAGTCCGGCACCTCGTGCACGCGGATTTCGGCTCCAACAATGTCCTGACGGACAATGGCCGCATAACAGCGGTCATTGACTGGAGCGAGGCGATGTTCGGGGATTCCCAATACGAGGTCGCCAACATCTTCTTCTGGAGGCCGTGGTTGGCTTGTATGGAGCAGCAGACGCGCTACTTCGAGCGGAGGCATCCGGAGCTTGCAGGATCGCCGCGGCTCCGGGCGTATATGCTCCGCATTGGTCTTGACCAACTCTATCAGAGCTTGGTTGACGGCAATTTCGATGATGCAGCTTGGGCGCAGGGTCGATGCGACGCAATCGTCCGATCCGGAGCCGGGACTGTCGGGCGTACACAAATCGCCCGCAGAAGCGCGGCCGTCTGGACCGATGGCTGTGTAGAAGTCGCGTCTGCGTTCGACCAGGCTGCGCGTTCTCGCGGCCATAGCAACCGACGTACGGCGTTGCGCCCTCGCCGGCAGCAAGAAGCCACGGAAGTCCGCCCGGAGCAGAAAATGCCCACGCTACTGCGGGTTTATATAGACGGTCCCCACGGGATGGGGAAAACCACCACCACGCAACTGCTGGTGGCCCTGGGTTCGCGCGACGATATCGTCTACGTACCCGAGCCGATGACTTACTGGCGGGTGCTGGGGGCTTCCGAGACAATCGCGAACATCTACACCACACAACACCGCCTCGACCAGGGTGAGATATCGGCCGGGGACGCGGCGGTGGTAATGACAAGCGCCCAGATAACAATGGGCATGCCTTATGCCGTGACCGACGCCGTTCTGGCTCCTCATATCGGGGGGGAGGCTGGGAGCTCACATGCCCCGCCCCCGGCCCTCACCCTCATCTTCGACCGCCATCCCATCGCCGCCCTCCTGTGCTACCCGGCCGCGCGGTACCTTATGGGCAGCATGACCCCCCAGGCCGTGCTGGCGTTCGTGGCCCTCATCCCGCCGACCTTGCCCGGCACCAACATCGTGCTTGGGGCCCTTCCGGAGGACAGACACATCGACCGCCTGGCCAAACGCCAGCGCCCCGGCGAGCGGCTGGACCTGGCTATGCTGGCTGCGATTCGCCGCGTTTACGGGCTACTTGCCAATACGGTGCGGTATCTGCAGTGCGGCGGGTCGTGGCGGGAGGACTGGGGACAGCTTTCGGGGACGGCCGTGCCGCCCCAGGGTGCCGAGCCCCAGAGCAACGCGGGCCCACGACCCCATATCGGGGACACGTTATTTACCCTGTTTCGGGCCCCCGAGTTGCTGGCCCCCAACGGCGACCTGTATAACGTGTTTGCCTGGGCCTTGACGTCTTGGCCCAAACGCCTCCGTTCCATGCACGTCTTTATCCTGGATTACGACCAATCGCCCGCCGGCTGCCGGGACGCCCTGCTGCAACTTACCTCCGGGATGGTCCAGACCCACGTCACCACCCCCGGCTCCATACCGACGATATGCGACCTGGCGCGCACGTTTGCCCGAGAAATGAAGCTTCGATAA
配列番号４
ＴＫｚｅｏ融合物の核酸配列
ATGGCTTCGTACCCCGGCCATCAACACGCGTCTGCGTTCGACCAGGCTGCGCGTTCTCGCGGCCATAGCAACCGACGTACGGCGTTGCGCCCTCGCCGGCAGCAAGAAGCCACGGAAGTCCGCCCGGAGCAGAAAATGCCCACGCTACTGCGGGTTTATATAGACGGTCCCCACGGGATGGGGAAAACCACCACCACGCAACTGCTGGTGGCCCTGGGTTCGCGCGACGATATCGTCTACGTACCCGAGCCGATGACTTACTGGCGGGTGCTGGGGGCTTCCGAGACAATCGCGAACATCTACACCACACAACACCGCCTCGACCAGGGTGAGATATCGGCCGGGGACGCGGCGGTGGTAATGACAAGCGCCCAGATAACAATGGGCATGCCTTATGCCGTGACCGACGCCGTTCTGGCTCCTCATATCGGGGGGGAGGCTGGGAGCTCACATGCCCCGCCCCCGGCCCTCACCCTCATCTTCGACCGCCATCCCATCGCCGCCCTCCTGTGCTACCCGGCCGCGCGGTACCTTATGGGCAGCATGACCCCCCAGGCCGTGCTGGCGTTCGTGGCCCTCATCCCGCCGACCTTGCCCGGCACCAACATCGTGCTTGGGGCCCTTCCGGAGGACAGACACATCGACCGCCTGGCCAAACGCCAGCGCCCCGGCGAGCGGCTGGACCTGGCTATGCTGGCTGCGATTCGCCGCGTTTACGGGCTACTTGCCAATACGGTGCGGTATCTGCAGTGCGGCGGGTCGTGGCGGGAGGACTGGGGACAGCTTTCGGGGACGGCCGTGCCGCCCCAGGGTGCCGAGCCCCAGAGCAACGCGGGCCCACGACCCCATATCGGGGACACGTTATTTACCCTGTTTCGGGCCCCCGAGTTGCTGGCCCCCAACGGCGACCTGTATAACGTGTTTGCCTGGGCCTTGGACGTCTTGGCCAAACGCCTCCGTTCCATGCACGTCTTTATCCTGGATTACGACCAATCGCCCGCCGGCTGCCGGGACGCCCTGCTGCAACTTACCTCCGGGATGGTCCAGACCCACGTCACCACCCCCGGCTCCATACCGACGATATGCGACCTGGCGCGCACGTTTGCCCGAGAGATGATCAGCGGAGCTAATGGCGTCATGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTCCGGTGCTCACCGCGCGCGACGTCGCCGGAGCGGTCGAGTTCTGGACCGACCGGCTCGGGTTCTCCCGGGACTTCGTGGAGGACGACTTCGCCGGTGTGGTCCGGGACGACGTGACCCTGTTCATCAGCGCGGTCCAGGACCAGGTGGTGCCGGACAACACCCTGGCCTGGGTGTGGGTGCGCGGCCTGGACGAGCTGTACGCCGAGTGGTCGGAGGTCGTGTCCACGAACTTCCGGGACGCCTCCGGGCCGGCCATGACCGAGATCGGCGAGCAGCCGTGGGGGCGGGAGTTCGCCCTGCGCGACCCGGCCGGCAACTGCGTGCACTTCGTGGCCGAGGAGCAGGACTGA
配列番号５
ｐ３’ＨＹＴＫ
CCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTTGGCCACATGGGTAAAAAGCCTGAACTCACCGCGACGTCTGTCGAGAAGTTTCTGATCGAAAAGTTCGACAGCGTCTCCGACCTGATGCAGCTCTCGGAGGGCGAAGAATCTCGTGCTTTCAGCTTCGATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCTGCGGGTAAATAGCTGCGCCGATGGTTTCTACAAAGATCGTTATGTTTATCGGCACTTTGCATCGGCCGCGCTCCCGATTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGGAATTCAGCGAGAGCCTGACCTATTGCATCTCCCGCCGTGCACAGGGTGTCACGTTGCAAGACCTGCCTGAAACCGAACTGCCCGCTGTTCTGCAGCCGGTCGCGGAGGCCATGGATGCGATCGCTGCGGCCGATCTTAGCCAGACGAGCGGGTTCGGCCCATTCGGACCGCAAGGAATCGGTCAATACACTACATGGCGTGATTTCATATGCGCGATTGCTGATCCCCATGTGTATCACTGGCAAACTGTGATGGACGACACCGTCAGTGCGTCCGTCGCGCAGGCTCTCGATGAGCTGATGCTTTGGGCCGAGGACTGCCCCGAAGTCCGGCACCTCGTGCACGCGGATTTCGGCTCCAACAATGTCCTGACGGACAATGGCCGCATAACAGCGGTCATTGACTGGAGCGAGGCGATGTTCGGGGATTCCCAATACGAGGTCGCCAACATCTTCTTCTGGAGGCCGTGGTTGGCTTGTATGGAGCAGCAGACGCGCTACTTCGAGCGGAGGCATCCGGAGCTTGCAGGATCGCCGCGGCTCCGGGCGTATATGCTCCGCATTGGTCTTGACCAACTCTATCAGAGCTTGGTTGACGGCAATTTCGATGATGCAGCTTGGGCGCAGGGTCGATGCGACGCAATCGTCCGATCCGGAGCCGGGACTGTCGGGCGTACACAAATCGCCCGCAGAAGCGCGGCCGTCTGGACCGATGGCTGTGTAGAAGTCGCGTCTGCGTTCGACCAGGCTGCGCGTTCTCGCGGCCATAGCAACCGACGTACGGCGTTGCGCCCTCGCCGGCAGCAAGAAGCCACGGAAGTCCGCCCGGAGCAGAAAATGCCCACGCTACTGCGGGTTTATATAGACGGTCCCCACGGGATGGGGAAAACCACCACCACGCAACTGCTGGTGGCCCTGGGTTCGCGCGACGATATCGTCTACGTACCCGAGCCGATGACTTACTGGCGGGTGCTGGGGGCTTCCGAGACAATCGCGAACATCTACACCACACAACACCGCCTCGACCAGGGTGAGATATCGGCCGGGGACGCGGCGGTGGTAATGACAAGCGCCCAGATAACAATGGGCATGCCTTATGCCGTGACCGACGCCGTTCTGGCTCCTCATATCGGGGGGGAGGCTGGGAGCTCACATGCCCCGCCCCCGGCCCTCACCCTCATCTTCGACCGCCATCCCATCGCCGCCCTCCTGTGCTACCCGGCCGCGCGGTACCTTATGGGCAGCATGACCCCCCAGGCCGTGCTGGCGTTCGTGGCCCTCATCCCGCCGACCTTGCCCGGCACCAACATCGTGCTTGGGGCCCTTCCGGAGGACAGACACATCGACCGCCTGGCCAAACGCCAGCGCCCCGGCGAGCGGCTGGACCTGGCTATGCTGGCTGCGATTCGCCGCGTTTACGGGCTACTTGCCAATACGGTGCGGTATCTGCAGTGCGGCGGGTCGTGGCGGGAGGACTGGGGACAGCTTTCGGGGACGGCCGTGCCGCCCCAGGGTGCCGAGCCCCAGAGCAACGCGGGCCCACGACCCCATATCGGGGACACGTTATTTACCCTGTTTCGGGCCCCCGAGTTGCTGGCCCCCAACGGCGACCTGTATAACGTGTTTGCCTGGGCCTTGACGTCTTGGCCCAAACGCCTCCGTTCCATGCACGTCTTTATCCTGGATTACGACCAATCGCCCGCCGGCTGCCGGGACGCCCTGCTGCAACTTACCTCCGGGATGGTCCAGACCCACGTCACCACCCCCGGCTCCATACCGACGATATGCGACCTGGCGCGCACGTTTGCCCGAGAAATGAAGCTTCGATAAGAATTCCGGATCCTTAGGCCATTAAGGCCGGCCGCCTCGGCCCACTTCGTGGGGTACCGAGCTCGAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGTGGCCGAGGAGCAGGACTGACACGTGCTACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCGACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTCGACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAG
配列番号６
ｐ３’ＴＫＰＵＲ
GCTAGCTTATCGCATGGCCTCGTACCCCGGCCATCAACACGCGTCTGCGTTCGACCAGGCTGCGCGTTCTCGCGGCCATAGCAACCGACGTACGGCGTTGCGCCCTCGCCGGCAGCAAGAAGCCACGGAAGTCCGCCCGGAGCAGAAAATGCCCACGCTACTGCGGGTTTATATAGACGGTCCCCACGGGATGGGGAAAACCACCACCACGCAACTGCTGGTGGCCCTGGGTTCGCGCGACGATATCGTCTACGTACCCGAGCCGATGACTTACTGGCGGGTGCTGGGGGCTTCCGAGACAATCGCGAACATCTACACCACACAACACCGCCTCGACCAGGGTGAGATATCGGCCGGGGACGCGGCGGTGGTAATGACAAGCGCCCAGATAACAATGGGCATGCCTTATGCCGTGACCGACGCCGTTCTGGCTCCTCATATCGGGGGGGAGGCTGGGAGCTCACATGCCCCGCCCCCGGCCCTCACCCTCATCTTCGACCGCCATCCCATCGCCGCCCTCCTGTGCTACCCGGCCGCGCGGTACCTTATGGGCAGCATGACCCCCCAGGCCGTGCTGGCGTTCGTGGCCCTCATCCCGCCGACCTTGCCCGGCACCAACATCGTGCTTGGGGCCCTTCCGGAGGACAGACACATCGACCGCCTGGCCAAACGCCAGCGCCCCGGCGAGCGGCTGGACCTGGCTATGCTGGCTGCGATTCGCCGCGTTTACGGGCTACTTGCCAATACGGTGCGGTATCTGCAGTGCGGCGGGTCGTGGCGGGAGGACTGGGGACAGCTTTCGGGGACGGCCGTGCCGCCCCAGGGTGCCGAGCCCCAGAGCAACGCGGGCCCACGACCCCATATCGGGGACACGTTATTTACCCTGTTTCGGGCCCCCGAGTTGCTGGCCCCCAACGGCGACCTGTATAACGTGTTTGCCTGGGCCTTGACGTCTTGGCCCAAACGCCTCCGTTCCATGCACGTCTTTATCCTGGATTACGACCAATCGCCCGCCGGCTGCCGGGACGCCCTGCTGCAACTTACCTCCGGGATGGTCCAGACCCACGTCACCACCCCCGGCTCCATACCGACGATATGCGACCTGGCGCGCACGTTTGCCCGAGAAATGAAGCTTACCATGACCGAGTACAAGCCCACGGTGCGCCTCGCCACCCGCGACGACGTCCCCAGGGCCGTACGCACCCTCGCCGCCGCGTTCGCCGACTACCCCGCCACGCGCCACACCGTCGATCCGGACCGCCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCTCACGCGCGTCGGGCTCGACATCGGCAAGGTGTGGGTCGCGGACGACGGCGCCGCGGTGGCGGTCTGGACCACGCCGGAGAGCGTCGAAGCGGGGGCGGTGTTCGCCGAGATCGGCCCGCGCATGGCCGAGTTGAGCGGTTCCCGGCTGGCCGCGCAGCAACAGATGGAAGGCCTCCTGGCGCCGCACCGGCCCAAGGAGCCCGCGTGGTTCCTGGCCACCGTCGGCGTCTCGCCCGACCACCAGGGCAAGGGTCTGGGCAGCGCCGTCGTGCTCCCCGGAGTGGAGGCGGCCGAGCGCGCCGGGGTGCCCGCCTTCCTGGAGACCTCCGCGCCCCGCAACCTCCCCTTCTACGAGCGGCTCGGCTTCACCGTCACCGCCGACGTCGAGGTGCCCGAAGGACCGCGCACCTGGTGCATGACCCGCAAGCCCGGTGCCTGACGCCCGCCCCACGACCCGCAGCGCCCGACCGAAAGGAGCGCACGACCCCATGCATCGATAAGAATTCCGGATCCTTAGGCCATTAAGGCCGGCCGCCTCGGCCCACTTCGTGGGGTACCGAGCTCGAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGTGGCCGAGGAGCAGGACTGACACGTGCTACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCGACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTCGACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTG
配列番号７
ｐ３’ＴＫＺＥＯ
CATGGCTTCGTACCCCGGCCATCAACACGCGTCTGCGTTCGACCAGGCTGCGCGTTCTCGCGGCCATAGCAACCGACGTACGGCGTTGCGCCCTCGCCGGCAGCAAGAAGCCACGGAAGTCCGCCCGGAGCAGAAAATGCCCACGCTACTGCGGGTTTATATAGACGGTCCCCACGGGATGGGGAAAACCACCACCACGCAACTGCTGGTGGCCCTGGGTTCGCGCGACGATATCGTCTACGTACCCGAGCCGATGACTTACTGGCGGGTGCTGGGGGCTTCCGAGACAATCGCGAACATCTACACCACACAACACCGCCTCGACCAGGGTGAGATATCGGCCGGGGACGCGGCGGTGGTAATGACAAGCGCCCAGATAACAATGGGCATGCCTTATGCCGTGACCGACGCCGTTCTGGCTCCTCATATCGGGGGGGAGGCTGGGAGCTCACATGCCCCGCCCCCGGCCCTCACCCTCATCTTCGACCGCCATCCCATCGCCGCCCTCCTGTGCTACCCGGCCGCGCGGTACCTTATGGGCAGCATGACCCCCCAGGCCGTGCTGGCGTTCGTGGCCCTCATCCCGCCGACCTTGCCCGGCACCAACATCGTGCTTGGGGCCCTTCCGGAGGACAGACACATCGACCGCCTGGCCAAACGCCAGCGCCCCGGCGAGCGGCTGGACCTGGCTATGCTGGCTGCGATTCGCCGCGTTTACGGGCTACTTGCCAATACGGTGCGGTATCTGCAGTGCGGCGGGTCGTGGCGGGAGGACTGGGGACAGCTTTCGGGGACGGCCGTGCCGCCCCAGGGTGCCGAGCCCCAGAGCAACGCGGGCCCACGACCCCATATCGGGGACACGTTATTTACCCTGTTTCGGGCCCCCGAGTTGCTGGCCCCCAACGGCGACCTGTATAACGTGTTTGCCTGGGCCTTGGACGTCTTGGCCAAACGCCTCCGTTCCATGCACGTCTTTATCCTGGATTACGACCAATCGCCCGCCGGCTGCCGGGACGCCCTGCTGCAACTTACCTCCGGGATGGTCCAGACCCACGTCACCACCCCCGGCTCCATACCGACGATATGCGACCTGGCGCGCACGTTTGCCCGAGAGATGATCAGCGGAGCTAATGGCGTCATGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTCCGGTGCTCACCGCGCGCGACGTCGCCGGAGCGGTCGAGTTCTGGACCGACCGGCTCGGGTTCTCCCGGGACTTCGTGGAGGACGACTTCGCCGGTGTGGTCCGGGACGACGTGACCCTGTTCATCAGCGCGGTCCAGGACCAGGTGGTGCCGGACAACACCCTGGCCTGGGTGTGGGTGCGCGGCCTGGACGAGCTGTACGCCGAGTGGTCGGAGGTCGTGTCCACGAACTTCCGGGACGCCTCCGGGCCGGCCATGACCGAGATCGGCGAGCAGCCGTGGGGGCGGGAGTTCGCCCTGCGCGACCCGGCCGGCAACTGCGTGCACTTCGTGGCCGAGGAGCAGGACTGACCGACGCCGACCAACACCGCCGGTCCGACGGCGGCCCACGGGTCCCAGGGTCGACCTCGAGATCCTTAGGCCATTAAGGCCGGCCGCCTCGGCCCACTTCGTGGGGTACCGAGCTCGAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGTGGCCGAGGAGCAGGACTGACACGTGCTACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCGACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTCGACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCAAGCTTATCG
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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