(57)【要約】  一つ以上の植物から、抽出によって、生物活性な組成物を得る方法であって、ａ）粗製完全抽出物、または有効成分に富むフラクション、より具体的には無極性フラクションまたは極性フラクション、を得るために、所与の活性に関して選択した植物またはそれらの部分を別々に、一つ以上の溶媒で処理する工程と、ｂ）ＭＴＴ試験に対して代謝活性を示し、そしてその活性の、少なくとも一つの特異的な試験に対して生物活性を示す抽出物またはフラクションを選択する工程とを含む方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一つ以上の植物から、抽出によって、生物活性な組成物を得る方法であって、
ａ）粗製完全抽出物、または有効成分に富むフラクション、より具体的には無極性フラクションまたは極性フラクション、を得るために、所与の活性に関して選択した植物またはそれらの部分を別々に、一つ以上の溶媒で処理する工程と、
ｂ）ＭＴＴ試験に対して代謝活性を示し、そしてその活性の、少なくとも一つの特異的な試験に対して生物活性を示す抽出物またはフラクションを選択する工程と
を含む方法。
【請求項２】
請求項１に記載の工程ａ）およびｂ）以外に、工程ａ）および／または工程ｂ）のあとに実施される工程ｃ）を含み、かつその工程ｃ）が、前記抽出物または選択したフラクションを分析して、それらが含有する成分を決定し、そしてもし望めば、生物活性の本質を担う一つまたは複数の化合物を分離することを含む、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程ａ）において、植物または植物の部分が、粉砕、乾燥して得られる微粉末の形で使用されることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
植物の部分が、葉、皮、根、気生部分、果実および種子であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
工程ａ）が、一つ以上の抽出を含み、そしてそれらの抽出が、ＣＯ2または有機溶媒、具体的にはアルコール、シクロヘキサンまたはあらゆる無極性の溶媒、ジクロロメタンまたはクロロホルム、およびこれらの溶媒のいくつか、またはすべての溶媒で行われ、特定のフラクションを分離するためにこれらの溶媒を順次使用することが可能であることを特徴とする請求項１ないし４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
工程ｃ）に従うフラクションの分析がＨＰＬＣによって行われることを特徴とする請求項２ないし５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
工程ｂ）に従って行われる生物学的試験が、抗糖尿病活性、具体的にはインスリンの分泌に対する活性を決定する試験であることを特徴とする請求項１ないし６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか一項に記載の方法で得ることができる抽出物、フラクションが対象であることを特徴とする生物活性組成物。
【請求項９】
前記抽出物またはフラクションから分離可能な化合物が対象であることを特徴とする請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
次にあげる属および種：
Ｓｔｒｙｃｈｎｏｓ  ｍｙｒｔｏｉｄｅｓ，Ｏｂｅｔｉａ  ｒａｄｕｌａ，Ｔｒｅｍａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ，Ｓｃｌｅｒｏｃａｒｙａ  ｂｉｒｒｅａ，Ｖｏａｃａｎｇａ  ｔｈｏｕａｒｓ  ｉ  Ｍｏｒｉｎｇａ  ｏｌｅｉｆｅｒａ（＝Ｍｏｒｉｎｇａ  ｍｏｒｉｎｇａ，Ｍｏｒｉｎｇａ  ｐｔｅｒｙｇｏｓｐｅｒｍａ，Ｇｕｉｌａｎｄｉｎａ  ｍｏｒｉｎｇａ），Ａｇｒｉｍｏｎｉａ  ｅｕｐａｔｏｒｉａ，Ａｒｃｔｉｕｍ  ｍａｊｕｓ（＝Ｌａｐｐａ  ｍａｊｏｒ），Ａｌｃｈｅｍｉｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ，Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ，Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｍｙｒｔｉｌｌｕｓ，Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ  ｉｎｔｙｂｕｓ，Ｃｙｎａｒａ  ｓｃｏｌｙｍｕｓ，Ｇｅｒａｎｉｕｍ  ｒｏｂｅｒｔｉａｎｕｍ，Ｊｕｇｌａｎｓ  ｒｅｇｉａ，Ｋａｌａｎｃｈｏｅ  ｃｒｅｎａｔａ，Ｌｅｐｔｏｄｅｎｉａ  ｍａｄａｇａｓｃａｒｉｅｎｓｉｓ，Ｍｏｒｕｓ  ｎｉｇｒａ，Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ，Ｒｕｂｕｓ  ｆｒｕｃｔｉｃｏｓｕｓ，Ｓｐａｔｈｏｄｅａ  ｃａｍｐａｎｕｌａｔａの中から選択する植物から得ることが可能であることを特徴とする請求項８または９に記載の組成物。
【請求項１１】
次にあげる属：
Ｓｔｒｙｃｈｎｏｓ，Ｏｂｅｔｉａ，Ｔｒｅｍａ，Ｓｃｌｅｒｏｃａｒｙａ，Ｖｏａｃａｎｇａ，Ｍｏｒｉｎｇａ，Ａｇｒｉｍｏｎｉａ，Ａｒｃｔｉｕｍ，Ａｌｃｈｅｍｉｌｌａ，Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ，Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ，Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ，Ｃｙｎａｒａ，Ｇｅｒａｎｉｕｍ，Ｊｕｇｌａｎｓ，Ｋａｌａｎｃｈｏｅ，Ｌｅｐｔｏｄｅｎｉａ，Ｍｏｒｕｓ，Ｏｌｅａ，Ｒｕｂｕｓ，Ｓｐａｔｈｏｄｅａの中から選択する植物から得ることが可能であることを特徴とする請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
次にあげる科：
Ｌｏｇａｎｉａｃｅａｅ，Ｕｒｔｉｃａｃｅａｅ，Ｕｌｍａｃｅａｅ，Ａｎａｃａｒｄｉａｃｅａｅ，Ａｐｏｃｙｎａｃｅａｅ，Ｍｏｒｉｎｇａｃｅａｅ，Ｒｏｓａｃｅａｅ，Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ，Ｆａｂａｃｅａｅ，Ｅｒｉｃａｃｅａｅ，Ｇｅｒａｎｉａｃａｅａ，Ｊｕｇｌａｎｄａｃａｅａ，Ｃｒａｓｓｕｌａｃｅａｅ，Ｏｌｅａｃｅａｅ，Ｂｉｇｎｏｎｉａｃｅａの中から選択する植物から得ることが可能であることを特徴とする請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
Ｔｒｅｍａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ  Ｕｌｍａｃｅａｅ，Ｓｔｒｙｃｈｎｏｓ  ｍｙｒｔｏｉｄｅｓ  Ｌｏｇａｎｉａｃｅａｅ，Ｏｂｅｔｉａ  ｒａｄｕｌａ  Ｕｒｔｉｃａｃｅａｅ，Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｍｙｒｔｉｌｌｕｓ  Ｅｒｉｃａｃｅａｅ，Ｓｃｌｅｒｏｃａｒｙａ  ｂｉｒｒｅａ  Ａｎａｃａｒｄｉａｃｅａｅ，Ａｇｒｉｍｏｎｉａ  ｅｕｐａｔｏｒｉａ  Ｒｏｓａｃｅａｅ，Ａｌｃｈｅｍｉｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  Ｒｏｓａｃｅａｅ，およびＯｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ  Ｏｌｅａｃｅａｅから精製されたフラクションが対象である特徴とする請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
植物から得ることが可能な生成物、たとえば抽出物、フラクションおよび／または分子を、ＴＧＲ５の特異的アゴニストとして使用すること。
【請求項１５】
前記生成物が、植物の抽出物もしくはこれらの抽出物から得ることが可能なフラクション、またはこれらの抽出物もしくはフラクションから得ることが可能な分子であり、そして
−ＴＧＲ５の天然リガンド、たとえばリトコール酸（ＬＣＡ）のＣＥ50と等しいか、それより高いＣＥ50を示し、
−ＦＸＲ核内受容体を活性化せず、
−メタボリックシンドロームのマウスモデルにおいて、脂肪食によって誘発される体重増加の減少と前記モデルの副睾丸皮下脂肪の質量減少とをもたらし、
−耐糖性の向上をもたらす、
ことを特徴とする、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
植物が、Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ，Ａｌｃｈｅｍｉｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ，Ｊｕｇｌａｎｓ  ｒｅｇｉａ，Ａｇｒｉｍｏｎｉａ  ｅｕｐａｔｏｒｉａ，Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｍｙｒｔｉｌｌｕｓ，およびＯｂｅｔｉａ  ｒａｄｕｌａを含む群から選択されることを特徴とする請求項１４または１５に記載の使用。
【請求項１７】
分子が５環系トリテルペンを含むことを特徴とする請求項１４ないし１６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１８】
分子がオレアナン型５環系トリテルペン、たとえばオレアノール酸を含むことを特徴とする請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
分子がウルサン型５環系トリテルペン、たとえばコロソール酸を含むことを特徴とする請求項１７に記載の使用。
【請求項２０】
分子がルパン型５環系トリテルペンを含むことを特徴とする請求項１７に記載の使用。
【請求項２１】
医薬組成物が、請求項８ないし１３のいずれか一項に記載する少なくとも一つの組成物または請求項１４ないし２０のいずれか一項に記載するアゴニスト、の有効量と、医薬的に許容される賦形剤とを含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項２２】
組成物が、経口、経局所または注射による投与のためにガレヌス製剤の形で提供されることを特徴とする請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
医薬組成物が、経口投与するために錠剤、タブレット剤、カプセル剤、顆粒剤、滴剤、シロップ剤、アルコール性シロップ剤の形で提供されるか、またはエアロゾルの形で提供されることを特徴とする請求項２１に記載の組成物。
【請求項２４】
医薬組成物が、局所投与するためにガレヌス製剤、たとえば乳剤、クリーム、ローション、油剤、またはパッチなどの形で提供されることを特徴とする請求項２１に記載の組成物。
【請求項２５】
注射によって投与するため、医薬組成物が、無菌液または滅菌可能な溶液、あるいはさらに懸濁液またはエマルションから調製される、静脈、皮下または筋肉内注射液の形で提供されることを特徴とする請求項２１に記載の組成物。
【請求項２６】
糖尿病治療のため、医薬組成物が、請求項８ないし１３のいずれか一項に記載する少なくとも一つの組成物または請求項１４ないし２０のいずれか一項に記載するアゴニスト、の有効量と、医薬的に許容される賦形剤と、を含むことを特徴とする組成物。
【請求項２７】
代謝障害、肥満および／またはそれらと関連する疾患、たとえばＸ症候群（メタボリックシンドローム）、２型糖尿病、を予防および／または治療するためのヒトまたは動物用薬剤を製造するために、請求項１４ないし２０のいずれか一項に記載のアゴニストを使用すること。
【請求項２８】
前記抽出物またはフラクションまたはコロソール酸が、２型糖尿病、肥満および／またはメタボリックシンドロームを予防および／または治療するために使用されることを特徴とする請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
前記抽出物またはフラクションまたはオレアノール酸が、肥満または糖尿病、具体的には２型糖尿病、および／またはメタボリックシンドロームを予防および／または治療するために使用されることを特徴とする請求項２７に記載の使用。
【請求項３０】
使用可能な不活性の賦形剤と一緒に、薬効のある食品に応用するため、ヒトおよび動物用サプリメントが、請求項８ないし１３のいずれか一項に記載する組成物の少なくとも一つ、または請求項１４ないし２０のいずれか一項に記載するアゴニスト、の有効量を含むことを特徴とする、ヒトおよび動物用サプリメント。
【請求項３１】
サプリメントが、ガム、散剤、錠剤、ゼラチンカプセル、カプセル、浸剤、煎剤の摂取可能な形で供給されることを特徴とする請求項２７に記載のサプリメント。
【請求項３２】
サプリメントが、食品製造時または食品包装時に添加されるか、あるいはすでに前記生成物と一緒に配合した調合品の使用時に添加されて、所望の補給を可能にすることを特徴とする請求項３１または３２に記載のサプリメント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は植物から得ることが可能な新規生物活性組成物に関する。さらに、所与の活性の視点から選択された植物から抽出してこれらの組成物を得る方法にも関する。さらに、代謝および／またはエネルギー収支の乱れ、いわゆる代謝疾患が原因で発症するヒトまたは動物の病気、とりわけ２型糖尿病を治療するために、これらの組成物を生物学的に応用することにも関する。
【背景技術】
【０００２】
ここ３０年の間に、先進国では運動不足と栄養の過剰摂取とによって、肥満の発生率が爆発的に高まっている。肥満は、別の代謝症候群または疾患、たとえばＸ症候群、インスリン耐性、および２型糖尿病などを発症するリスクを高める。世界の糖尿病患者数は約２億人にまで達し、その約９０％が２型糖尿病を患っている。この数字は今後２５年の間に倍増して、世界の人口の５％を超えるものと推定されている。
【０００３】
糖尿病患者は脳および心臓の血管に合併症を発症するリスクが２倍ないし４倍高い。糖尿病患者は、大きな血管に関するこれらの問題に加えて、さらに微小血管が関係するいくつかの合併症、すなわち網膜疾患、神経疾患、および腎疾患を発症する。病気が１０年経過すると糖尿病患者の３分の１は、これらの合併症に冒されるが、運動および、特に、栄養の補給を含む適切な食餌療法と、薬物療法とを取り入れることにより、大幅に軽減することができる。
【０００４】
代謝疾患の治療に使用できる薬物としては、さまざまな種類のものが存在するが、代謝を構成する過程のいずれか一つに作用する点では共通している。しかしそうであっても、代謝疾患の症候が多様であるということは、とりもなおさず複数の薬物治療が行われることを意味し、そのことは、健常な身体にとって高いコストを払わなければならないばかりでなく、薬物間相互作用による副作用のリスクも高める。治療手段が多数存在しているにもかかわらず、代謝疾患に対する医学的な必要性がきわめて高い理由は、この点にある。
【０００５】
代謝疾患に罹っている患者は、３０年間、いや４０年間にわたってその疾患が進行するのを見ることになる。その間、患者は病状を実感することなく、代謝疾患に罹っている大半の患者は、しばしば副作用の原因であるいくつかの薬剤を組み合わせた治療に頼らざるを得ないほど悪化している。
【０００６】
加えて、糖尿病の治療に現在使用されている製品は、真に満足できるようなものではなく、依然と解消されないさまざまな副作用が、その使用を制限している。現在開発が進められている新規薬剤や上市を目前にひかえた製品にもやはり副作用が認められており、さらに満足できる効果的な製品の開発が急がれている。
【０００７】
このような理由で、当研究者は、  特に、合成化合物とは対照的に、自然産物と考えられる植物由来の生成物を基礎にした別の解決方法に特別な関心を持ちながら、この領域の研究をつづけている。その結果、植物を基礎にした薬剤および／または植物由来の薬剤を発見すると同時に、植物を基礎にしたサプリメントの確認にも成功した。事実、特定の植物を基礎にしたサプリメントをとりいれた適切な食餌療法を組み合わせることで、代謝疾患、特に肥満および糖尿病の進行を防止できることを明らかにした。
【０００８】
世界的なレベルで見ると、約１２００種類の植物が代謝疾患、特に２型糖尿病に対して有効であるとされている。しかしほとんどの場合、無毒であるという確証はなされていないし、これらの植物が含有する有効成分も同定されていない、そしてその植物がどのような治療クラスに属しているかを決定し、仮に新しい治療クラスに属するとした場合、それがどのようなクラスかを明らかにするための薬理学的研究も行われていないし、これらの有効成分を技術的経済的に最適な条件で得ることができる抽出方法についても全く記載されていない。
【０００９】
このように、これらの植物の効果について詳細な科学的知識が不足していることが、治療への応用を妨げる原因になっている。さらに、ヨーロッパ指令２００２／４６／ＣＥのフランス版として、サプリメントに関する新しい法令２００６−３５２が発効して以来、最近この分野を取り締まる法の枠が強化されたため、これらの化学的情報がないと、薬効のある食品（ｎｕｔｒａｃｅｕｔｉｑｕｅ）として使用することさえむずかしくなっている。
【００１０】
発明者は、正確な化学的データを入手することと、元の活性物質を開発することとを考慮して、植物由来の組成物の、代謝活性に対する効果をミトコンドリアレベルで評価する方法を開発した。最近の研究によって、特にミトコンドリアレベルにおける代謝活性自体の低下が、代謝疾患の進行、特に２型糖尿病の発症過程の中で、早期に観察される主要な乱れの一つであることが明らかにされている［Ｐｅｔｅｒｓｅｎら］。
【００１１】
第一のアプローチに従い、発明者は、合成由来または天然由来の所与の生成物が示す細胞毒性を評価するために広く用いられているＭＴＴ試験（２，３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）（Ｍｏｓｍａｎｎ）が、植物から活性組成物を選択するのに非常に有益な手段となりうることを確認した。
【００１２】
この試験は、ミトコンドリア中に含まれている脱水素酵素が、溶液状態で黄色の分子であるＭＴＴを、溶液状態で青色を示すフォルマザンの結晶に変換する能力を有することに基づいている。この試験は、所与の生成物で処理したあとにミトコンドリア中に含まれる脱水素酵素の活性を測定することを可能にし、それゆえ、ミトコンドリアによって作られるＡＴＰの量、すなわち細胞ミトコンドリアレベルで代謝活性を表すＡＴＰの定量を可能にする。
【００１３】
さらに、本発明者は、選ばれた植物の抽出物、フラクションおよび化合物の細胞毒性を測定することだけにとどまらず、独創的な方法でこれらの抽出物、フラクション、および化合物が代謝活性を増進する能力を測定するために、ＭＴＴ試験を使って、代謝活性に影響を及ぼす力に対して最初の化合物をスクリーニングする方法をも開発した。
【００１４】
さらに、本発明者の探求は、ミトコンドリアの機能に影響を及ぼす生物学的標的ＴＧＲ５を特異的に認識する植物由来の生成物の研究に向けられた。受容体ＴＧＲ５はＧタンパク質共役受容体（以下ＲＣＰＧと略す）のファミリーに属する。胆汁酸によって活性化される最初の膜受容体が対象となる。ＴＧＲ５は胆汁酸の特定の内分泌機能を媒介するメディエーターであると記載されている。
【００１５】
本発明者は、ＴＧＲ５発現ベクターおよびレポータープラスミド（たとえばルシフェラーゼに対してコードする遺伝子として）で確実にトランスフェクションしたＣＨＯ細胞株を使用し、そのＣＨＯ細胞を、植物から得ることができる抽出物および／またはフラクションで処理するか、またはこれらの抽出物またはフラクションから得ることができる分子で処理すると、対照試料に比べて、ＴＧＲ５の活性が高まることを認めた。「発明の詳細な説明」および「特許請求項」では、これらの抽出物、フラクションおよび分子は、包括的に、「組成物」または「生成物」という用語で示される。
【００１６】
本発明に従い、生物学的標的としてＴＧＲ５を使用すれば、代謝に対する効果のレベルで特異性の高い生成物を入手することが可能になる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
したがって、本発明は、食餌療法を併用しながら、代謝疾患を予防し治療するために有用な新規組成物を得るための、信頼性が高く、かつ実施が容易な方法を提供することに関する。
【００１８】
さらに、本発明は、このような組成物を新規生成物として提供することに加え、代謝疾患の治療および予防を目的とした、植物由来の薬剤もしくはサプリメント、または植物性活性物質を製造するために組成物の性質を活用することにも関する。
【００１９】
本発明は、特にＴＧＲ５のアゴニスト生成物を提供することに関し、そしてヒトおよび動物に対して、特に治療薬、食品、薬効のある食品の分野に、そして広く、代謝障害が関係する疾患、トラブルおおび症候群を予防し治療するために、これらの生成物を応用することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
第一の実施態様によれば、本発明は、
ａ）所与の活性に関して選択した植物またはそれらの植物の部分を一つ以上の溶媒で別々に処理して、完全抽出物または有効成分に富むフラクション、より具体的には無極性フラクションおよび極性フラクション、を得る工程と、
ｂ）ＭＴＴ試験に対して代謝活性を示し、そしてその活性の、少なくとも一つの特異的試験に対して生物活性を示す抽出物またはフラクションを選択する工程とを含む、
ことを特徴とする、一つ以上の植物から、抽出によって生物活性な組成物を得る方法に関する。
【００２１】
この方法は、前記工程ａ）およびｂ）以外に、工程ａ）および／または工程ｂ）のあとに実施される工程ｃ）を含み、かつその工程ｃ）が、前記抽出物または選択した前記フラクションを分析して、それらが含有する成分を決定し、そしてもし望めば、生物活性の本質を担う一つまたは複数の有効成分を分離、精製することを含むことが有利である。この分析は、さらに具体的には、ＨＰＬＣのプロファイルによって行われる。
【００２２】
活性化合物の同定および分離に対するこの措置は、医薬品開発および薬効のある食品開発の視点から見ると、この種の化合物を合成によって得ることに見通しを与えるものである。
【００２３】
工程ａ）において、植物または植物の部分は、粉砕乾燥したものを微粉末の形で使用するのが好ましい。
【００２４】
特に対象となるのは、葉、皮、根、気生部分、果実、種子などである。
【００２５】
工程ａ）には、一般に、一回以上の抽出が含まれ、それらの抽出は、超臨界ＣＯ2または有機溶媒、特にアルコール系溶媒（とりわけエタノールまたはメタノール）、シクロヘキサン、または別の無極性溶媒（石油エーテル、ヘプタン）、ジクロロメタン、またはクロロホルムによって行われるが、特定のフラクションを分離するには、これらの複数の溶媒、またはこれらのすべての溶媒を順次使用することができる。
【００２６】
工程ｂ）に従い、生物学的効果は認められているが、それらの特性を決定する手段がないため有効に利用することができない植物に対してＭＴＴ試験を適用し、これを使用すれば、本発明以前には全く同定されていなかった抽出物およびフラクションを明らかにすることが可能となることは、注目に値しよう。
【００２７】
前記方法によって得られる組成物および生成物、抽出物、フラクション、化合物、および分子は新規であり、その意味で、本発明の範囲内に入る。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、本発明による植物抽出物のＨＰＬＣプロファイルを示す説明図である。
【図２】図２は、本発明による植物抽出物のＨＰＬＣプロファイルを示す説明図である。
【図３】図３は、本発明による植物抽出物のＨＰＬＣプロファイルを示す説明図である。
【図４】図４は、本発明による植物抽出物のＨＰＬＣプロファイルを示す説明図である。
【図５】図５は、本発明による植物抽出物のＨＰＬＣプロファイルを示す説明図である。
【図６】図６は、本発明による植物抽出物のＨＰＬＣプロファイルを示す説明図である。
【図７】図７は、本発明による植物抽出物のＨＰＬＣプロファイルを示す説明図である。
【図８】図８は、本発明による植物抽出物のＨＰＬＣプロファイルを示す説明図である。
【図９】図９は、本発明による植物抽出物のＭＴＴ試験の結果を示す説明図である。
【図１０】図１０は、ＴＧＲ５受容体の活性に対するＯｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａフラクションの効果を示す説明図である。
【図１１】図１１は、ＴＧＲ５に対して活性なＯｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａフラクションのＨＰＬＣプロファイルを示す説明図である。
【図１２】図１２は、Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ抽出物、ＴＧＲ５に対して活性な成分、オレアノール酸のＮＭＲスペクトルを示す説明図である。
【図１３】図１３は、ＴＧＲ５受容体の活性に対するＡｌｃｈｅｍｉｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓフラクションの効果を示す説明図である。
【図１４】図１４は、ＴＧＲ５に対して活性なＡｌｃｈｅｍｉｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓフラクションのＨＰＬＣプロファイルを示す説明図である。
【図１５】図１５は、Ａｌｃｈｅｍｉｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ抽出物、ＴＧＲ５に対する活性成分、コロソール酸のＮＭＲスペクトルを示す説明図である。
【図１６】図１６は、ＴＧＲ５受容体の活性に対するＪｕｇｌａｎｓ  ｒｅｇｉａフラクションの効果を示す説明図である。
【図１７】図１７は、ＴＧＲ５に対して活性なＪｕｇｌａｎｓ  ｒｅｇｉａフラクションのＨＰＬＣプロファイルを示す説明図である。
【図１８】図１８は、ＴＧＲ５受容体の活性に対するＡｇｒｉｍｏｎｉａ  ｅｕｐａｔｏｒｉａフラクションの効果を示す説明図である。
【図１９】図１９は、ＴＧＲ５に対して活性なＡｇｒｉｍｏｎｉａ  ｅｕｐａｔｏｒｉａフラクションのＨＰＬＣプロファイルを示す説明図である。
【図２０】図２０は、ＴＧＲ５受容体の活性に対するＶａｃｃｉｎｉｕｍ  ｍｙｒｔｉｌｌｕｓフラクションの効果を示す説明図である。
【図２１】図２１は、ＴＧＲ５に対して活性なＶａｃｃｉｎｉｕｍ  ｍｙｒｔｉｌｌｕｓフラクションのＨＰＬＣプロファイルを示す説明図である。
【図２２】図２２は、ＴＧＲ５受容体の活性に対するＯｂｅｔｉａ  ｒａｄｕｌａフラクションの効果を示す説明図である。
【図２３】図２３は、ＴＧＲ５に対して活性なＯｂｅｔｉａ  ｒａｄｕｌａフラクションのＨＰＬＣプロファイルを示す説明図である。
【図２４】図２４は、脂肪食を与えられたマウスに対するブドウ糖負荷試験（ＩＰＧＴＴ）に対するオレアノール酸（ＯＡ）、コロソール酸（ＡＶＡ）、およびＴＧＲ５に対して活性なＪｕｇｌａｎｓ  ｒｅｇｉａ（ＪＲＬ）フラクションの効果を示す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下では、抗糖尿活性を有し、特に２型糖尿病の予防と治療に有用な組成物の取得に、本発明を適用することにより、本発明を詳細に説明する。
【００３０】
この目的の中では、前記工程ｂ）に従って行われる生物学的試験は、抗糖尿活性、具体的にはインスリンの分泌を決定する方法である。
【００３１】
上で述べた点から好ましい組成物および生成物は、次にあげる属および種：Ｓｔｒｙｃｈｎｏｓ  ｍｙｒｔｏｉｄｅｓ，Ｏｂｅｔｉａ  ｒａｄｕｌａ，Ｔｒｅｍａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ，Ｓｃｌｅｒｏｃａｒｙａ  ｂｉｒｒｅａ，Ｖｏａｃａｎｇａ  ｔｈｏｕａｒｓｉｉ  Ｍｏｒｉｎｇａ  ｏｌｅｉｆｅｒａ（＝Ｍｏｒｉｎｇａ  ｍｏｒｉｎｇａ，Ｍｏｒｉｎｇａ  ｐｔｅｒｙｇｏｓｐｅｒｍａ，Ｇｕｉｌａｎｄｉｎａ  ｍｏｒｉｎｇａ），  Ａｇｒｉｍｏｎｉａ  ｅｕｐａｔｏｒｉａ，Ａｒｃｔｉｕｍ  ｍａｊｕｓ＝Ｌａｐｐａ  ｍａｊｏｒ，Ａｌｃｈｅｍｉｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ，Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ，Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｍｙｒｔｉｌｌｕｓ，Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ  ｉｎｔｙｂｕｓ，Ｃｙｎａｒａ  ｓｃｏｌｙｍｕｓ，Ｇｅｒａｎｉｕｍ  ｒｏｂｅｒｔｉａｎｕｍ，Ｊｕｇｌａｎｓ  ｒｅｇｉａ，Ｋａｌａｎｃｈｏｅ  ｃｒｅｎａｔａ，Ｌｅｐｔｏｄｅｎｉａ  ｍａｄａｇａｓｃａｒｉｅｎｓｉｓ，Ｍｏｒｕｓ  ｎｉｇｒａ，Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ，Ｒｕｂｕｓ  ｆｒｕｃｔｉｃｏｓｕｓ，Ｓｐａｔｈｏｄｅａ  ｃａｍｐａｎｕｌａｔａの中から選択される植物から得ることが可能である。
【００３２】
有利な組成物および生成物は、次にあげる属：Ｓｔｒｙｃｈｎｏｓ，ｂｅｔｉａ，Ｔｒｅｍａ，Ｓｃｌｅｒｏｃａｒｙａ，Ｖｏａｃａｎｇａ，Ｍｏｒｉｎｇａ，Ａｇｒｉｍｏｎｉａ，Ａｒｃｔｉｕｍ，Ａｌｃｈｅｍｉｌｌａ，Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ，Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ，Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ，Ｃｙｎａｒａ，Ｇｅｒａｎｉｕｍ，Ｊｕｇｌａｎｓ，Ｋａｌａｎｃｈｏｅ，Ｌｅｐｔｏｄｅｎｉａ，Ｍｏｒｕｓ，Ｏｌｅａ，Ｒｕｂｕｓ，Ｓｐａｔｈｏｄｅａの中から選択される植物から得ることが可能であることを特徴とするものである。
【００３３】
特に好ましい組成物および生成物は、次にあげる科：Ｌｏｇａｎｉａｃｅａｅ，Ｕｒｔｉｃａｃｅａｅ，Ｕｌｍａｃｅａｅ，Ａｎａｃａｒｄｉａｃｅａｅ，Ａｐｏｃｙｎａｃｅａｅ，Ｍｏｒｉｎｇａｃｅａｅ，Ｒｏｓａｃｅａｅ，Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ，Ｆａｂａｃｅａｅ，Ｅｒｉｃａｃｅａｅ，Ｇｅｒａｎｉａｃａｅａ，Ｊｕｇｌａｎｄａｃａｅａ，Ｃｒａｓｓｕｌａｃｅａｅ，Ｏｌｅａｃｅａｅ，Ｂｉｇｎｏｎｉａｃｅａの中から選択される植物から得ることが可能である。
【００３４】
特に好ましい別の組成物は：Ｔｒｅｍａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ  Ｕｌｍａｃｅａｅ，Ｓｔｒｙｃｈｎｏｓ  ｍｙｒｔｏｉｄｅｓ  Ｌｏｇａｎｉａｃｅａｅ，Ｏｂｅｔｉａ  ｒａｄｕｌａ  Ｕｒｔｉｃａｃｅａｅ，Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｍｙｒｔｉｌｌｕｓ  Ｅｒｉｃａｃｅａｅ，Ｓｃｌｅｒｏｃａｒｙａ  ｂｉｒｒｅａ  Ａｎａｃａｒｄｉａｃｅａｅ，Ａｇｒｉｍｏｎｉａ  ｅｕｐａｔｏｒｉａ  Ｒｏｓａｃｅａｅ，Ａｌｃｈｅｍｉｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  Ｒｏｓａｃｅａｅ，およびＯｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ  Ｏｌｅａｃｅａｅのフラクション（それらのＨＰＬＣプロファイルは図１〜図８にそれぞれ示す）、およびこれらのフラクションに由来する生物活性化合物である。
【００３５】
別の実施態様によれば、本発明は、これらの植物から得ることが可能な生成物、たとえば抽出物、フラクション、および／または分子を、特にＴＧＲ５の特異的アゴニストとして使用することに関する。
【００３６】
前記生成物の作用機構の解明が、具体的な応用の開発を可能にしてくれることを考えると、それを基礎にした本発明のこの態様が、いかに独創的であるかが推し量ることができる。
【００３７】
本発明に従う使用において機能を発揮する生成物は、ＴＧＲ５のアゴニストであることが知られている胆汁酸とは異なる化学構造をしていること、ＣＥ50が、ＴＧＲ５の天然リガンドである、たとえばリトコール酸（ＬＣＡ）のそれより大きいか等しいこと、および核内受容体であるＦＸＲを活性化しないこと、を特徴とする生物活性生成物である。加えて、これらの生成物は、メタボリックシンドロームのマウスモデルに対して、脂肪性食物によって引き起こされる体重増加の緩和をもたらし、さらに、同マウスモデルに対して、副睾丸皮下脂肪の質量減少ももたらす。また、これらの生成物は耐糖能の改善をももたらす。
【００３８】
この特異的な効果によって、肥満、メタボリックシンドローム（またはＸ症候群）または２型糖尿病などの病気を予防し、あるいはこれらの病気に罹った患者を治療するのに特に好適であることが明らかになる。
【００３９】
本発明によりＴＧＲ５アゴニストとして使用される生成物は、さらに特に、Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ，Ａｌｃｈｅｍｉｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ，Ｊｕｇｌａｎｓ  ｒｅｇｉａ，Ａｇｒｉｍｏｎｉａ  ｅｕｐａｔｏｒｉａ，Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｍｙｒｔｉｌｌｕｓ，およびＯｂｅｔｉａ  ｒａｄｕｌａを含む群から選択される植物から得ることが可能である。
【００４０】
ＴＧＲ５を活性化する効果を考慮して特に好ましい分子には５環系トリテルペンが含まれる。
【００４１】
その中でもオレアナン型５環系トリテルペン、たとえばオレアノール酸、ウルサン型５環系トリテルペン、たとえばコロソール酸、またはルパン型５環系トリテルペンがさらに重要である。
【００４２】
今のところ、オリーブの葉が示す抗高血圧および低血糖特性が、唯一オレウロペインによるものとされていることを考えれば、オレアノール酸の抗高血糖、抗高インスリン血効果と、肥満に対する効果とが明らかにされたことは、特に驚くべきことである。
【００４３】
本発明による前記ＴＧＲ５アゴニストは、毒性がきわめて低く、有害な副作用を起こさないため有利である。
【００４４】
従って、本発明は、広く、前記組成物および生成物、すなわち本発明の抽出物、フラクション、および化合物を有効利用することに関する。
【００４５】
かくして、第一の実施態様によれば、本発明は、有効量の、少なくとも一つの組成物または生成物と、医薬的に許容される賦形剤とを含むことを特徴とする、新規医薬組成物に関する。
【００４６】
本発明は、代謝が関係するトラブル／代謝症候群、その中でも特に肥満および／または関連する疾患、たとえばＸ症候群（メタボリックシンドローム）、２型糖尿病の予防および／または治療を目的とした薬剤の製造に、生物活性な前記組成物および生成物を使用することにも関する。
【００４７】
一つの実施態様において、本発明は、ウルサン型５環系トリテルペン、オレアナン型５環系トリテルペン、またはルパン型５環系トリテルペンを使用することに関する。
【００４８】
別の一つの実施態様において、本発明は、特に、２型糖尿病、肥満および／またはメタボリックシンドロームの予防および／または治療に、前記抽出物またはフラクション、またはコロソール酸を使用することに関する。
【００４９】
さらに別の一つの実施態様において、本発明は、肥満または糖尿病、特に２型糖尿病、および／またはメタボリックシンドロームの予防および／または治療に、前記抽出物またはフラクション、またはオレアノール酸を使用することに関する。
【００５０】
本発明の薬剤は、経口、局所、または注射による投与に対して、ガレノス製剤の形で供するのが有利である。
【００５１】
経口投与の場合、医薬組成物は、特に圧縮錠剤、錠剤、ゼラチンカプセル剤、顆粒剤、滴剤、シロップ剤、アルコール性シロップ剤の形で供される。
【００５２】
局所投与の場合、医薬組成物は、クリーム、乳剤、ローション、油剤またはパッチの形で供するのが有利である。
【００５３】
好適なガレノス配合剤にはエアロゾルが含まれる。
【００５４】
注射投与の場合、医薬組成物は、静脈、皮下または筋肉内注射が可能なアンプル入り注射液として供され、滅菌液または滅菌が可能な液、あるいはさらに懸濁液または乳剤から調製される。
【００５５】
剤形が異なる場合および毎日使用する場合の用量は、古典的な方法により、治療すべき効果のタイプによって定められる。
【００５６】
一例をあげれば、前記アゴニストをベースとする前記薬剤の場合は、０．１ｍｇないし５ｇ／日の割合で投与される。
【００５７】
抗高血糖、抗高インスリン血効果および体重増加に対する前記生成物の効果は、ダイエットの形で生かすのが有利である。
【００５８】
かくして、第二の実施態様によれば、本発明は、薬効のある食品に適用するために、たとえば有効量の、少なくとも一つの前記組成物または生成物と、賦形剤とを含むことを特徴とする、サプリメントに関する。
【００５９】
かくして、本発明は、特にヒト（成人または小児）または動物用サプリメントとして前記ＴＧＲ５のアゴニストを使用することに関する。
【００６０】
本発明のサプリメントは、食品を調製する間、またはそれを包装するときに加えるか、あるいはすでに前記生成物を配合しおわった調製品を使用するときに食品に加えて、所望の補給を行うことができる。
【００６１】
本発明のサプリメントは、服用可能な形、たとえばゼラチンカプセル、カプセル、注入液、ガム剤、散剤、圧縮錠剤、ゼラチンカプセル、煎薬などの形で供することもできるが、ここに挙げたものだけに限定されるものではない。
【００６２】
これまで述べてきたことを総括すると、本発明は代謝疾患を予防するためのもう一つの方法を提案するものである。なぜなら、天然由来のこれらの生成物はよりよい生活の質に関係しており、他方で、これらの生成物は、しばしば伝統的な薬局方の中で一世紀以上にわたって使用されつづけており、副作用は、知り尽くされているからである。
【実施例】
【００６３】
次に、本発明の詳細な実施方法を記述し、それによって本発明のその他の特徴および利点を説明する。ここにあげた実施例は、本発明を説明するためのものであって、これによって本発明の範囲が限定されるものではない。これらの実施例の中で行われる参照は以下のとおり：
−Ａ：図１〜図９、本発明による植物抽出物のＨＰＬＣプロファイル（図１から図８まで）およびＭＴＴ試験の結果（図９）を示す。
−Ｂ：図１０〜図２４、６種類の植物（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ，Ａｌｃｈｅｍｉｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ，Ｊｕｇｌａｎｓ  ｒｅｇｉａ，ｄ‘Ａｇｒｉｍｏｎｉａ  ｅｕｐａｔｏｒｉａ，Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｍｙｒｔｉｌｌｕｓ，Ｏｂｅｔｉａ  ｒａｄｕｌａ）の抽出物のフラクションに対して得られた結果を示す。
−図１０：ＴＧＲ５受容体の活性に対するＯｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａフラクションの効果
−図１１：ＴＧＲ５に対して活性なＯｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａフラクションのＨＰＬＣプロファイル
−図１２：Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ抽出物、ＴＧＲ５に対して活性な成分、オレアノール酸のＮＭＲスペクトル
−図１３：ＴＧＲ５受容体の活性に対するＡｌｃｈｅｍｉｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓフラクションの効果
−図１４：ＴＧＲ５に対して活性なＡｌｃｈｅｍｉｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓフラクションのＨＰＬＣプロファイル
−図１５：Ａｌｃｈｅｍｉｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ抽出物、ＴＧＲ５に対する活性成分、コロソール酸のＮＭＲスペクトル
−図１６：ＴＧＲ５受容体の活性に対するＪｕｇｌａｎｓ  ｒｅｇｉａフラクションの効果
−図１７：ＴＧＲ５に対して活性なＪｕｇｌａｎｓ  ｒｅｇｉａフラクションのＨＰＬＣプロファイル
−図１８：ＴＧＲ５受容体の活性に対するＡｇｒｉｍｏｎｉａ  ｅｕｐａｔｏｒｉａフラクションの効果
−図１９：ＴＧＲ５に対して活性なＡｇｒｉｍｏｎｉａ  ｅｕｐａｔｏｒｉａフラクションのＨＰＬＣプロファイル
−図２０：ＴＧＲ５受容体の活性に対するＶａｃｃｉｎｉｕｍ  ｍｙｒｔｉｌｌｕｓフラクションの効果
−図２１：ＴＧＲ５に対して活性なＶａｃｃｉｎｉｕｍ  ｍｙｒｔｉｌｌｕｓフラクションのＨＰＬＣプロファイル
−図２２：ＴＧＲ５受容体の活性に対するＯｂｅｔｉａ  ｒａｄｕｌａフラクションの効果
−図２３：ＴＧＲ５に対して活性なＯｂｅｔｉａ  ｒａｄｕｌａフラクションのＨＰＬＣプロファイル
−図２４：脂肪食を与えられたマウスに対するブドウ糖負荷試験（ＩＰＧＴＴ）に対するオレアノール酸（ＯＡ）、コロソール酸（ＡＶＡ）、およびＴＧＲ５に対して活性なＪｕｇｌａｎｓ  ｒｅｇｉａ（ＪＲＬ）フラクションの効果
実施例Ａ
材料および方法
植物
【００６４】
抽出にかける微粉末を得るため、乾燥した植物の部分（葉、根など）を粉砕する。
抽出−精製
【００６５】
極性溶媒または無極性溶媒を使用し、前記粉末を濾過または浸出または超音波照射して抽出する。溶媒として、シクロヘキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトン、酢酸エチル、ブタノール、エタノール、メタノール、水、またはこれらの異なる溶媒の混合物を使用することができる。抽出物は２ないし１０％の収率で得られる。抽出物は減圧下で蒸発乾固させる。次に、液−液抽出を行うか、溶媒の極性を上げながら順次抽出してフラクションに分ける。特に、吸着クロマトグラフィ、排除クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、または分別結晶化によってフラクションに分ければ純粋な化合物を得ることができる。
クロマトグラフィ分析
【００６６】
抽出物、濃縮フラクション、大まかに精製したフラクション、または純粋な化合物を逆相カラム高圧クロマトグラフィ（ＲＰ−ＣＬＨＰ）にかけて分析する。固定相としては、特に粒径が５ないし１０のＣ8またはＣ18グラフトシリカが使用される。溶離液としては、特に、メタノールまたはアセトニトリルを加えた酸性水（ｐＨ３）が使用される。グラジエントを使用し少なくとも６０分かけて９８％酸性水から０％酸性水まで変化させる。
ＭＴＴ試験
【００６７】
この試験に使用した膵臓の形質転換ＩＮＳ１細胞株は、ヨーロッパ糖尿病センター（Ｈａｕｔｅｐｉｅｒｒｅ、フランス）から提供されたものである。細胞を９６穴プレートに３・１０3／穴の密度で播種し、ウシ胎児血清を添加した（１０％）ＲＰＭＩ  １６４０培地で培養する。その細胞を各植物抽出物（２００μｇ／ｍｌ）で２４時間処理し、つづいてＭＴＴ試験にかける：ＭＴＴ（２  ３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）はテトラゾリウム塩の形をしており、培地で希釈すると黄色溶液を与える。テトラゾリウム環は、培地中で、生細胞の活性なミトコンドリア脱水素酵素によってのみ切断され、紫色の不溶性ホルマザンに変換される。死細胞はこの変化を引き起こすことができない。ＭＴＴ溶液（最終濃度０．５ｍｇ／ｍｌ）を細胞に添加し、４時間インキュベーションする。つづいて、生成したホルマザンの結晶を吸引しないように注意しながら、培地を吸引し、結晶をＤＭＳＯ  １００μｌに溶解する。溶解した物質を分光光度法によって測定し、生成した色素の濃度に比例する光学密度を得る。分光光度計のバックグラウンドノイズを消去したのち、各穴の光学密度を５４０〜６３０で測定する。結果は対照試料（ＤＭＳＯのみ）に対するパーセンテージで表示する。
インスリン分泌試験
【００６８】
ブタ膵臓のランゲルハンス島はヨーロッパ糖尿病センター（Ｈａｕｔｅｐｉｅｒｒｅ，フランス）から入手する。２４穴プレートにランゲルハンス島細胞を１００個／穴の密度で播種し、ウシ胎児血清を添加した（１０％）ＲＰＭＩ  １６４０培地で培養する。細胞を各植物の抽出物（２００μｇ／ｍｌ）で６０分間処理したのち、Ｅｌｉｓａキット（Ｍｅｒｃｏｄｉａ）により、メーカーの説明書に従ってインスリン分泌量を測定する。結果は対照試料（ＤＭＳＯのみ）に対するパーセンテージで表示する。
実施例１Ａ：代謝活性に対する選ばれた植物の効果の検討
【００６９】
ＩＮＳ１細胞を、エタノール、メタノールまたはジクロロメタンで抽出して得られた植物抽出物２００μｇ／ｍｌで２４時間処理した。ＭＴＴ変換率を計算して抽出物の効果を対照試料に対するパーセンテージで表示した。
【００７０】
得られた結果を表１に示す：エタノール抽出物（全面抽出）、メタノール抽出物（極性化合物に富む）およびジクロロメタン抽出物（無極性化合物に富む）。表の中のＥｔＯＨ＝エタノールフラクション；ＭｅＯＨ＝メタノールフラクション；ＤＣＭ＝ジクロロメタンフラクション。
【００７１】
【表１】
2010509390.tif 000002
これらの結果を検査すると、選ばれたすべての植物が細胞の代謝活性に対して有効であることが証明される。
実施例２Ａ：ＨＰＬＣのプロファイル
【００７２】
生物活性に関して抽出物のクロマトグラフパターンを得るため、活性なフラクションをＲＰ−ＨＰＬＣにかける。図１〜図８はＴｒｅｍａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ，Ｓｔｒｙｃｈｎｏｓ  ｍｙｒｔｏｉｄｅｓ，Ｏｂｅｔｉａ  ｒａｄｕｌａ，Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｍｙｒｔｉｌｌｕｓ，Ｓｃｌｅｒｏｃａｒｙａ  ｂｉｒｒｅａ，Ａｇｒｉｍｏｎｉａ  ｅｕｐａｔｏｒｉａ，Ａｌｃｈｅｍｉｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓおよびＯｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａのエタノールフラクションをそれぞれＲＰ−ＨＰＬＣにかけて得られたプロファイルである。
【００７３】
次に、フラクションをセミ分取ＲＰ−ＨＰＬＣで精製し、それから有効成分を確認、同定するためＭＴＴ試験にかけた。この試験を行うため、ＩＮＳ１細胞を植物抽出物１００，２００，４００または８００μｇ／ｍｌで２４時間処理した。Ｔｒｅｍａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓで得られた結果の一例を図９に示す。図の中で使用されている略号の意味は次のとおりである：ＴＣ：ブランク細胞のみ；ＤＭＳＯ：ブランク細胞のみ＋溶媒（ＤＭＳＯ）；Ａ−Ｊ：セミ分取ＲＰ−ＨＰＬＣにかけたのち得られたフラクション（フラクションの詳細は図１を参照）。５６０ｎｍで光学密度を測定して得られた転化率を示す。
実施例３Ａ：インスリンの分泌に対する、選ばれた植物の抽出物の効果
【００７４】
２型糖尿病の治療に対しては４つの抗糖尿病治療クラスがある。それらの中で、スルホニル尿素は米国において２型糖尿病治療の灯台的な薬剤である。スルホニル尿素は膵臓のインスリン分泌を促進し、その面から高血糖を予防する。選ばれた植物は細胞の代謝に対して活性なので、その活性物質が４つの治療クラスのいずれか１つ、とりわけスルホニル尿素に属するか否かを決定するため、ブタＬａｎｇｈｅｒａｎｓ島に対するインスリン分泌試験によって、これらの抽出物の活性を確認した。
【００７５】
ブタＬａｎｇｈｅｒａｎｓ島を植物の抽出物２００μｇ／ｍｌで６０分間処理した。インスリンの分泌をＥＬＩＳＡ試験によって測定し、抽出物の効果は対照試料に対するパーセンテージで表示する。
【００７６】
結果を次表２に示す。この表でＥｔＯＨ、ＭｅＯＨおよびＤＣＭは、それぞれエタノール抽出物（全面抽出）、メタノール抽出物（極性化合物に富む）およびジクロロメタン抽出物（無極性化合物に富む）を意味する。
【００７７】
【表２】
2010509390.tif 000003
実施例Ｂ
生成物および方法
生成物
【００７８】
オレアノール酸はＥｘｔｒａｓｙｎｔｈｅｓｅ社（Ｇｅｎａｙ、フランス）の製品、そしてオレウロペインおよびリトコール酸はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（Ｓａｉｎｔ−Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ、フランス）の製品である。
植物からの抽出
【００７９】
エタノール抽出に対しては、空気中で乾燥し粉砕したオリーブ（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ  Ｌ．  Ｏｌｅａｃｅａｅ、  ＰｈｙｔｏＥｓｔ、フランス）の葉１０ｇを８０％エタノール水溶液に室温で３時間浸漬して徹底的に抽出する。つづいて混合物を吸引濾過し、濾液を減圧濃縮する。
【００８０】
ジクロロメタンおよびメタノールによる抽出に対しては、自動ソクスレー抽出器（２０５５  Ａｖｅｎｔｉ  Ｓｏｘｔｅｘ、  Ｆｏｓｓ  Ｔｅｃａｔｏｒ）を使用して、粉砕した植物材料（１０〜２０ｇ）をシクロヘキサン（１００ｍＬ）、ジクロロメタン（１００ｍＬ）およびメタノール（１００ｍＬ）で順次抽出する。
【００８１】
このプロトコルによれば、３つのタイプ抽出物を得ることができ、各抽出物中には親油性のきわめて高い無極性および極性の植物成分が濃縮されている。
【００８２】
溶媒を減圧下に蒸発させて除去し、残留物はそれぞれ重さを秤ったのち、使用するまで冷凍庫に保存する。
ＨＰＬＣによる分析
【００８３】
各抽出物の分析プロファイルを得るため、残留物（５ｍｇ／ｍＬ）のメタノール溶液をＨＰＬＣ分析（Ｖａｒｉａｎ  Ｐｒｏ  Ｓｔａｒ）にかけ、検出にはＤＡＤ検出器（Ｖａｒｉａｎ）を、そしてカラムには逆相カラム（Ｎｕｃｌｅｏｄｕｒ  １００−１０−Ｃ１８，２５０／４，６，Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を使用する。
【００８４】
溶離には、アセトニトリルと、酸性にした水（０．１％トリフルオロ酢酸）との混合物を使用する。
【００８５】
分析条件：流量は１ｍＬ／分とし、グラジエント条件は次のとおり：Ｈ2Ｏ／ＣＨ3ＣＮ（２０：８０）で３０分間、ＣＨ3ＣＮ（１００％）で５分間、そしてＨ2Ｏ／ＣＨ3ＣＮ（２０：８０）で５分間。ＬＣ／ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００ＳＬ）による分析では、検出波長を２５４ｎｍとし、２００〜５００ｎｍの波長範囲でＰＤＡを記録する。分析は、エレクトロスプレイによるイオン化（ＥＳＩ）のインターフェイスにＡＰＣＩ（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｌａｙｅｒ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（応用層プロトコル制御情報））を連結して、ネガティブモードで行う。
ＮＭＲ分析
【００８６】
1Ｈの分析には３００ＭＨｚのＤＰＸ３００型ＮＭＲ分析装置を使用する。化学シフトはδ値（ｐｐｍ）で表示し、ピリジン−ｄ5Ｃ5Ｄ5Ｎの溶媒ピーク７．５８を基準にする。
ルシフェラーゼ試験によるＴＧＲ５活性の定量
【００８７】
チャイニーズハムスターの卵巣細胞（ＣＨＯ）はＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，  Ｖｉｒｇｉｎｉｅ）から入手し、ウシ胎児血清（ＳＶＦ）１０％（ｖ／ｖ）、非必須アミノ酸１００μＭ（ＡＡＮＥ）、ペニシリン１００単位／ｍＬおよびストレプトマイシン硫酸塩１００μｇ／ｍＬを添加したα最少必須培養液（α−ＭＥＭ）に保存する。
【００８８】
ＴＧＲ５の活性を定量するため、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を使用し、ＴＧＲ５発現ベクタープラスミド（ｐＣＭＶＳＰＯＲＴ６／ＴＧＲ５）３．８μｇ、発現がｃＡＭＰ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔ（ＣＲＥ，ｐＣＲＥ−Ｌｕｃ）によって制御されるルシフェラーゼレポータープラスミド３．８μｇ、およびネオマイシン抵抗性遺伝子発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１（＋））０．４μｇで、ＣＨＯ細胞をトランスフェクトして得られる安定細胞株を使用する。トランスフェクトされた細胞はＧ４１８硫酸塩４００μｇ／ｍＬで選び出し、９６穴プレートで各クローンをそれぞれ独立に培養する。ＴＧＲ５を発現するＣＨＯ細胞をリトコール酸（ＬＣＡ）または植物抽出物１０μＭで処理し、それからルシフェラーゼの定量にかける［Ｐｉｃａｒｄら］。ルミネセンスは、Ｃｅｎｔｒｏ  ＸＳ３  ＬＢ９６０（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、  Ｂａｄ  Ｗｉｌｄｂａｄ、ドイツ）で測定する。
ルシフェラーゼによるＦＸＲの定量
【００８９】
植物抽出物のＦＸＲ活性を評価するには、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を使用し、各穴にｈＦＸＲ発現ベクタープラスミド（ｐＣＭＸ−ｈＦＸＲ）２５ｎｇ、マウス（ｍ）のαレキシノイド受容体（ＲＸＲα）発現ベクタープラスミド（ｐＣＭＸ−ｍＲＸＲα）２５ｎｇ、ルシフェラーゼレポーター（ｐＥｃＲＥｘ７−Ｌｕｃ）、および内部標準として使用するｐＣＭＶβ５０ｎｇを加え、ＣＯＳ１細胞（ＡＴＣＣ）にトランスフェクトする。
【００９０】
トランスフェクションから約１８時間が経過したら、細胞と、濃度が異なる各抽出物とを新しいＭＥＭ（またはＤＭＥＭ）で５時間インキュベートする。この処理が終わったら細胞を溶解し、前記Ｐｉｃａｒｄらの方法に従って、規格化ルシフェラーゼ活性を決定する。
動物および給餌方法
【００９１】
Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから入手した６週齢のオスのＣ５７ＢＬ／６ラットを使用する。
【００９２】
糖質に富むバランスのとれた普通食（ＳＡＦＥ，Ｄ０４）および脂質に富む食餌（６０％Ｋｃａｌ  Ｆａｔ，  Ｄ１２４９２）は、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ社（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ニュージャージ）から入手する。
【００９３】
マウスは、４ないし５頭ずつをケージに入れ、安定した温度で、昼と夜をそれぞれ１２時間とするサイクルで、食餌と水が自由に摂取できる状態に置かれる。マウスは、バランスの取れた普通食（ｎ＝５）の食餌条件か、脂質に富む食餌条件（ｎ＝３２）で１０週間飼育される。脂質に富む食餌条件で１０週間飼育されるマウスは８頭ずつ４つのグループに分けられ、一つのグループは脂質だけに富む食餌条件で飼育され、別の一つのグループには、オレアノール酸が１００ｍｇ／ｋｇ／日の割合で添加された同じ食餌が与えられ（全試験期間にわたって食餌の吸収量を測定し、安定した量が維持されるように化合物の量を調節する）、さらに別の一つのグループには、コロソール酸が１００ｍｇ／ｋｇ／日の割合で添加された同じ食餌が与えられ、最後に残ったグループにはＪｕｇｌａｎｓ  ｒｅｇｉａの活性フラクションが１００ｍｇ／ｋｇ／日の割合で添加された同じ食餌が与えられる。体重および食餌の吸収量を２日につき１日決定する。この実験は倫理規定に従って行われる。
ブドウ糖負荷試験
【００９４】
この試験は１０時間絶食状態に置いたマウスに対して行われる。血糖は携帯型グルコメーターで監視する（Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ  Ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ４、Ｂａｙｅｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）。この試験は、ブドウ糖を２ｇ／（ｋｇ体重）含む滅菌液を腹腔内に注射することにより行う。０、１５、３０、４５、６０、９０、１２０、１５０および１８０分の時点で尾部静脈から血液を採取し、血糖値を評価する。
実施例１Ｂ：  Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ由来ＴＧＲ５アゴニストの同定
・Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａの葉からの抽出
エタノールによる全面抽出物、ＤＣＭ（ジクロロメタン）抽出物およびＭｅＯＨ（メタノール）抽出物
【００９５】
ＣＨＯ−ＴＧＲ５細胞のルシフェラーゼ試験において、ＴＧＲ５の活性化がＬＣＡ（正のブランクとして使用）で観察されるのと類似する完全抽出物を最初に選択した。
【００９６】
疎水性分子に富む抽出物（ＤＣＭによる抽出）または親水性分子に富む抽出物（ＭｅＯＨ）の試験を行いながら、有効成分の分離を探索する。Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａの場合、活性の大部分がＤＣＭ抽出物中に存在する。
疎水性抽出物の分画
【００９７】
抽出物の疎水性フラクションの分画は、分取逆相ＨＰＬＣまたは薄層クロマトグラフィを使って追跡される。１から１０までの番号を付けた１０個のフラクションを分取し、１．５，５，１５および５０μｇ／ｍＬの各量に対して、ＣＨＯ−ＴＧＲ５におけるルシフェラーゼ活性を、ＬＣＡおよびオレウロペインのルシフェラーゼ活性を比較対照として測定する。
【００９８】
図１０が示すように、活性が見られるのはフラクション６〜９のみである。オレウロペインの場合、１．５から５０μｇ／ｍＬまでの範囲で、ＴＧＲ５に対してアゴニストとしての効果が全く見られない。これらのデータは、Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａのＤＣＭ抽出物に含まれる活性分子が、オレウロペインとは異なっていることを示している。
・フラクション７の活性分子
【００９９】
驚くべきことに、活性なフラクション７は高い純度を示す。ＵＶによる検出では保持時間が２１．９分の主要ピークしか現れない（図１１）。フラクション７のＬＣ／ＭＳ分析から、４５５．３ｇ／ｍｏｌにこの分子の分子量を確認することができる。この分析はネガティブモードで行われ、そのことはこの分子が水素プロトンを欠いていることを意味する。したがって、４５６ないし４５７ｇ／ｍｏｌ付近に検出される主要ピークから真の分子量が推定される。フラクション７の同定はＮＭＲで分析することによって最終的な決着を見る（図１２）。得られたスペクトルはトリテルペノイド型分子の特徴を示す。ＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳおよびＮＭＲ分析データと、オリーブの葉のすでに記載されているトリテルペンに関して使用できるデータとを組み合わせると、フラクション７の分子はオレアノール酸と結論される。この同定は、ＨＰＬＣ分析で市販の比較試料（Ｅｘｔｒａｓｙｎｔｈｅｓｅ、Ｇｅｎａｙ、フランス）と一緒に注入することによっても確認されるし、得られたＮＭＲスペクトルと、すでに報告されているオレアノール酸のＮＭＲスペクトル［Ｓｅｅｂａｃｈｅｒら］とを比較することによっても確認される。ヒトＴＧＲ５ルシフェラーゼ活性試験で得られたＣＥ50値、１．４２μＭは、ＴＧＲ５の天然リガンドであるＬＣＡに対して得られたＣＥ50値、０．８９μＭと比較可能な値である。
・ＴＧＲ５に対するオレアノール酸の選択性の研究
【０１００】
次に、オレアノール酸の生物活性を説明する中で胆汁酸核内受容体の可能性を完全に排除するため、ＦＸＲ依存性レポーター遺伝子（ルシフェラーゼ）を定量し、オレアノール酸がＦＸＲを活性化するか否かを決定する。得られた結果は、オレアノール酸がＦＸＲを活性化しないことを裏づけており、このトリテルペンがＴＧＲ５の選択的アゴニストであって、ＴＧＲ５とＦＸＲとを同時に活性化する胆汁酸とは全く異なっていることを示している。
実施例２Ｂ：Ａｌｃｈｅｍｉｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓから得られるＴＧＲ５アゴニストの同定
【０１０１】
Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａの場合と同様に操作し、抽出物およびフラクションを調製する。
【０１０２】
ＤＣＭ抽出物のフラクションに対して得られた結果を図１３に示す。
【０１０３】
ＴＧＲ５試験でフラクション９がきわめて強い反応を示すことが確認される。
【０１０４】
このフラクションのＨＰＬＣプロファイルを図１４に示す。
【０１０５】
図１５はフラクション９に含まれる活性分子、コロソール酸のＮＭＲスペクトルである。
実施例３Ｂ：Ｊｕｇｌａｎｓ  ｒｅｇｉａから得られるＴＧＲ５アゴニストの同定
【０１０６】
Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａに関する実施例１の記載と同様に操作する。
【０１０７】
ＤＣＭ抽出物のフラクションに対して得られた結果を図１６に示す。この図から、フラクション７，８および９が強い活性を示すことがわかる。これらのフラクションを一つに合わせたもののＨＰＬＣプロファイルを図１７に示す。
実施例４Ｂ：Ａｇｒｉｍｏｎｉａ  ｅｕｐａｔｏｒｉａから得られるＴＧＲ５アゴニストの同定
【０１０８】
Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａに関する実施例１の記載と同様に操作する。
【０１０９】
ＤＣＭ抽出物の８個のフラクションに対して得られた結果を図１８に示す。この図から、フラクション４が強い活性を示すことがわかる。これらのフラクションのＨＰＬＣプロファイルを図１９に示す。
実施例５Ｂ：Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｍｖｒｔｉｌｌｕｓから得られるＴＧＲ５アゴニストの同定
【０１１０】
実施例１の記載と同様に操作する。
【０１１１】
ＤＣＭ抽出物の９個のフラクションについて得られた結果を図２０に示す。この図からフラクション３、５、６、７、および８が、ＬＣＡのそれより高い活性を示し、その中でもフラクション６が特に高い活性を示す。
【０１１２】
このフラクションのＨＰＬＣプロファイルを図２１に示す。
実施例６Ｂ：Ｏｂｅｔｉａ  ｒａｄｕｌａから得られるＴＧＲ５アゴニストの同定
【０１１３】
実施例１の記載と同様に操作する。
【０１１４】
ＤＣＭ抽出物の８個のフラクションについて得られた結果を図２２に示す。この図からフラクション３、４および６がＬＣＡより高い活性を示し、その中でもフラクション６が特に高い活性を示す。
【０１１５】
このフラクションのＨＰＬＣプロファイルを図２３に示す。
実施例７Ｂ：脂肪食ラットの耐糖能に対する植物抽出物活性フラクションの効果
【０１１６】
メタボリックシンドロームのマウスモデル、すなわち脂肪食を与えられたマウスを用いて、本発明による植物抽出物活性フラクションの効果を評価した。植物抽出物による治療を始める前の１０週間にわたって、バランスのとれた普通食か、脂肪に富む食餌をＣ５７ＢＬ／６マウスに与える。この期間中に脂肪食を与えられたマウスは、エネルギー供給の類似の増加に伴って、５０％の体重増加を示す。
【０１１７】
Ｏｌｅａ（ＯＡ）、Ａｌｃｈｅｍｉｌｌａ（ＡＶＡ）およびＪｕｇｌａｎｓ（ＪＲＬ）のフラクションによる治療の期間が終わる時点（１４日）で、下表３に示す臨床パラメーターが得られる。
【０１１８】
【表３】
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体重増加を抑制する傾向が認められると同時に、副睾丸の皮下脂肪の質量減少も観察され、活性フラクションがエネルギー代謝に影響を及ぼすことが示唆される。
【０１１９】
これらの実験では、治療開始前の１０週間の間、脂肪に富む食餌が続けられることを測ることになる。したがって、この実験は体重の過大な増加およびインスリン抵抗性を防止するというより、むしろ矯正する能力を対象とする。
【０１２０】
図２４の結果は、これらのフラクションが、脂肪食を与えられたマウスの代謝ホメオスタシスを改善する能力を持つことを示す。特に、脂肪に富む食餌モデルに誘発され、前糖尿病効果を引き起こすインスリン抵抗性が矯正される：実際に、本発明の活性フラクションで１４日間治療したあとで、腹腔内を通して高血糖症を引き起こす実験（ＩＰＧＴＴ）を行う。ＩＰＧＴＴの前の平均血糖値は、普通食群、脂肪に富む食餌群、脂肪＋オレアノール酸に富む食餌群、脂質＋コロソール酸に富む食餌群、および脂質およびＪＲＬに富む食餌群で、それぞれ１０３±７、１５４±５、１４４±１８、１４１±２、および１５９±３ｍｇ／ｄＬである。ＩＰＧＴＴ曲線は、脂肪に富む食餌を摂取すると、耐糖能の低下とインスリン抵抗性とが誘発されることをはっきりと示している（図２４）。マウスを植物の活性フラクションで治療すると、この耐糖能は部分的に矯正される。
【０１２１】
このように、本発明は特異性の高い強力なＴＧＲ５アゴニストを提供し、そして、得られた結果は、それらの分子が、純粋なフラクションおよび／または富むフラクションであることに応じて、強い活性を示すことを証明している。
【０１２２】
[参照文献]
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【国際調査報告】
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