(57)【要約】  肺癌の羅患率を決定するため、肺癌の可能性のある患者の治療管理、及び肺腫瘍の分子病期分類、のための方法及びキットを提供する。この方法は、患者から得た試料におけるバイオマーカー群の各構成物量の測定を含み、そのバイオマーカー群はα−１−抗トリプシン、癌胎児抗原、扁平上皮細胞癌抗原、レチノール結合タンパク質、トランスフェリン、及びハプトグロビンの中、少なくとも２種のタンパク質を含み、及びこの方法はまた、バイオマーカー群中の各バイオマーカー量の測定結果に基づく、肺癌の羅患率がより高い群又はより低い群への患者の区分けを含む。  【選択図】    なし
2010528265.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者を、肺癌の羅患率がより高い群又はより低い群に区分けするための方法であって、
ａ）患者から得た試料中のバイオマーカー群の各構成物量を測定する段階であって、該バイオマーカー群が、α−１−抗トリプシン、癌胎児抗原、扁平上皮細胞癌抗原、レチノール結合タンパク質、トランスフェリン、及びハプトグロビンの中の少なくとも２種のタンパク質から成る段階、及び
ｂ）該バイオマーカー群中の各バイオマーカー構成物量の測定量に基づいて、該患者を肺癌の羅患率がより高い群又はより低い群に区分けする段階、
から成る方法。
【請求項２】
前記バイオマーカー群が、α−１−抗トリプシン、癌胎児抗原、扁平上皮細胞癌抗原、レチノール結合タンパク質、トランスフェリン、及びハプトグロビンの中の少なくとも３種のタンパク質から成る請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記バイオマーカー群が、α−１−抗トリプシン、癌胎児抗原、扁平上皮細胞癌抗原、レチノール結合タンパク質、トランスフェリン、及びハプトグロビンの中の少なくとも４種のタンパク質から成る請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記バイオマーカー群が、少なくともα−１−抗トリプシン、癌胎児抗原、扁平上皮細胞癌抗原、及びレチノール結合タンパク質から成る請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記バイオマーカー群が、少なくともα−１−抗トリプシン、癌胎児抗原、扁平上皮細胞癌抗原、レチノール結合タンパク質、トランスフェリン、及びハプトグロビンから成る請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記バイオマーカー群中の各バイオマーカーの測定量に対して予め決められたアルゴリズムを適用する段階、及びこのアルゴリズムの結果を、肺癌の羅患率がより高い群又はより低い群に患者を区分けするために使用する段階を含む請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記アルゴリズムが、決定樹木解析法である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記アルゴリズムが、分類回帰樹木法（ＣＡＲＴ）解析である請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記試料が、血清試料である請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記患者が、ヒト患者である請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
肺癌の可能性を持つ患者の治療を管理するための方法であって、
ａ）患者から得た試料中のバイオマーカー群の各構成物量を測定する段階であって、該バイオマーカー群が、α−１−抗トリプシン、癌胎児抗原、扁平上皮細胞癌抗原、レチノール結合タンパク質、トランスフェリン、及びハプトグロビンの中の少なくとも２種のタンパク質から成る段階、
ｂ）該バイオマーカー群中の各バイオマーカー構成物量の測定量に基づいて、該患者を肺癌の羅患率がより高い群又はより低い群に区分けする段階、及び
ｃ）患者を区分けした群に基づいて、肺癌の可能性を持つ患者の治療を管理する段階、
から成る方法。
【請求項１２】
肺腫瘍又は肺腫瘍と疑われる疾患の分子病期分類のための方法であって、
ａ）肺腫瘍又は肺腫瘍と疑われる疾患をかかえる患者から得た試料中のバイオマーカー群の各構成物量を測定する段階であって、該バイオマーカー群が、α−１−抗トリプシン、癌胎児抗原、扁平上皮細胞癌抗原、レチノール結合タンパク質、トランスフェリン、及びハプトグロビンの中の少なくとも２種のタンパク質から成る段階、
ｂ）該バイオマーカー群中の各バイオマーカー構成物量の測定量に基づいて、該患者を肺腫瘍又は肺腫瘍と疑われる疾患のある病期の羅患率がより高い群又はより低い群に区分けする段階、及び
ｃ）患者を区分けした群に基づいて、肺腫瘍又は肺腫瘍と疑われる疾患の分子病期分類を決定する段階、
から成る方法。
【請求項１３】
患者を肺癌のリスクの高い群に区分けするための方法であって、
ａ）患者から得た試料中のバイオマーカー群の各構成物量を測定する段階であって、該バイオマーカー群が、α−１−抗トリプシン、癌胎児抗原、扁平上皮細胞癌抗原、レチノール結合タンパク質、トランスフェリン、及びハプトグロビンの中の少なくとも２種のタンパク質から成る段階、及び
ｂ）該バイオマーカー群中の各バイオマーカー構成物量の測定量に基づいて、該患者を肺癌のリスクの高い群に区分けする段階、
から成る方法。
【請求項１４】
患者から得た試料中のバイオマーカー群の各構成物量の測定量に基づいて、患者の肺癌羅患の可能性を測定するためのキットであって、
ｉ）該バイオマーカー群中の各バイオマーカーに特異的な検出分子であって、該バイオマーカー群が、α−１−抗トリプシン、癌胎児抗原、扁平上皮細胞癌抗原、レチノール結合タンパク質、トランスフェリン、及びハプトグロビンの中の少なくとも２種のタンパク質から成る検出分子、及び
ｉｉ）バイオマーカー群の各構成物量を測定し、肺癌の羅患率を決定するための説明書、
から成るキット。
【請求項１５】
前記検出分子が、結合した検出可能原子団を含む請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
前記バイオマーカー群中のタンパク質バイオマーカーに特異的な前記検出分子が、固体支持体に固定化されている請求項１４に記載のキット。
【請求項１７】
前記検出分子が、前記バイオマーカー群中の各タンパク質バイオマーカーに特異的な抗体から成る請求項１４に記載のキット。
【請求項１８】
前記タンパク質バイオマーカーに特異的な抗体の各々に対する特異的二次抗体を含み、該特異的二次抗体が検出可能原子団に結合している請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
前記バイオマーカー群中のバイオマーカーに特異的な検出分子の各々に特異的な結合パートナーを含み、各特異的結合パートナーが検出可能原子団と結合している請求項１４に記載のキット。
【請求項２０】
前記検出可能原子団が、放射標識、蛍光標識及び酵素標識から成る群から選択される請求項１５、１８又は１９に記載のキット。
【請求項２１】
緩衝試薬、タンパク質安定化試薬、酵素基質、バックグランド減少試薬、対照試薬、検出を行うための装置、及び解析及び結果提示のために必要なソフトウェアのうちの１又は２以上を含む請求項１４に記載のキット。
【請求項２２】
前記試料がヒト患者から得られた血清試料である請求項１４に記載のキット。
【請求項２３】
前記バイオマーカーが、α−１−抗トリプシン、癌胎児抗原、扁平上皮細胞癌抗原、レチノール結合タンパク質、トランスフェリン、及びハプトグロビンの中の少なくとも３種のタンパク質から成る請求項１４に記載のキット。
【請求項２４】
前記バイオマーカーが、α−１−抗トリプシン、癌胎児抗原、扁平上皮細胞癌抗原、レチノール結合タンパク質、トランスフェリン、及びハプトグロビンの中の少なくとも４種のタンパク質から成る請求項１４に記載のキット。
【請求項２５】
前記バイオマーカーが、少なくともα−１−抗トリプシン、癌胎児抗原、扁平上皮細胞癌抗原、及びレチノール結合タンパク質から成る請求項１４に記載のキット。
【請求項２６】
前記バイオマーカーが、少なくともα−１−抗トリプシン、癌胎児抗原、扁平上皮細胞癌抗原、レチノール結合タンパク質、トランスフェリン、及びハプトグロビンから成る請求項１４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この特許出願は、２００７年８月１６日に出願された発明の名称が"肺癌早期発見のための諸血清バイオマーカー"である米国仮出願第６０／９６５，０５３号、及び２００７年５月１８日に出願された発明の名称が"肺癌検出のための諸新血清マーカー"である米国仮出願第６０／９３０，８８６号の優先権を主張するものであり、本明細書は両者全体を参考文献として取り込む。
この発明は、肺癌検出におけるバイオマーカーの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
肺癌は依然として重要な世界的公衆衛生問題であり続けている。非浸襲的画像化法の進歩により、肺癌検出能は改善されたが、治療上の選択の余地が限られているために、７５％以上の肺癌患者が進行段階の病期分類に分類されている（１）。臨床的病期分類Ｉの肺癌にある患者でさえ、５年生存率が最善で６０％であることは、全ての病期分類Ｉの患者の大多数が診察時に未検出の転移性疾病を有することを意味する（１）。これらの統計により、早期発見方法の改善及び腫瘍のより正確な分子病期分類法の必要性が強調される。
【０００３】
肺癌は、他の悪性腫瘍より多い癌死の原因である。診断能力及び治療の進歩にも拘わらず、肺癌死亡率は過去数十年間顕著に変わっていない。化学療法及び放射線療法を含む治療上の選択肢が殆ど治癒的でない場合、多くの患者にとって手術不可能な疾病のままである。胸部Ｘ線写真及び喀痰細胞診による肺癌スクリーニングは、この疾患で死亡する患者数を減少させることを示すことに失敗している（１６）。
【０００４】
低線量スパイラルＣＴを用いた最近の試行により、小さな腫瘍を発見することができることが明らかになっているが、これがスクリーニングプログラムの最終目標である肺癌死亡率を減少させることを示す研究はない（１７）。これらの試みもまた、肺癌に対する単独の早期発見法としての画像化に関して多くの困難な課題があることを示している。
【０００５】
第１に、高い危険度を有する個人（即ち、喫煙者や元喫煙者）はＣＴ検査を受けることが推奨されてきた（２，１８）。しかし、少数の人々のみが現在のところ肺癌進行の高危険度にあると分類されており、またこれらの癌の幾つかは、不活発な表現形質を持つことがある；即ち過剰診断バイアスがある（３，１７，１９，２０）。従って、スクリーニングを受ける適切な集団を決定することは未解決のままである。第２に、ＣＴスクリーニング試行において無病誤診が高いことは、多数の人々が追跡検査を受けることを示す。より煩わしいことには、幾つかのＣＴスクリーニング試行において、切除した小結節の３０％までが良性である。従って、多くの人々が、手術の過程で疾病及び死亡の可能性がある不必要な開胸術を受けている（３）。未確定の病変を評価する幾つかの方法が示唆されているが、これらの患者を取り扱う適切な方法についての証拠に基づく合意は得られてない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、腫瘍の早期発見及び分子病期分類を提供する研究方法が必要であるが、未対処のままである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、肺癌羅患率を決定し、肺癌の可能性のある患者の治療を取り扱い、及び肺癌を分子病期分類するための方法及びキットを提供する。
幾つかの実施態様において、患者を、肺癌の羅患率がより高い群又はより低い群に区分けするための方法であって、ａ）患者から得た試料中のバイオマーカー群（バイオマーカーパネル）の各構成物量を測定する段階であって、このバイオマーカー群が、α−１−抗トリプシン、癌胎児抗原、扁平上皮細胞癌抗原、レチノール結合タンパク質、トランスフェリン、及びハプトグロビンの中の少なくとも２種のタンパク質から成る段階、及びｂ）このバイオマーカー群中の各バイオマーカー構成物量の測定量に基づいて、この患者を肺癌の羅患率がより高い群又はより低い群に区分けする段階、から成る方法が提供される。幾つかの実施態様において、試料は血清試料である。幾つかの実施態様において、患者はヒト患者である。
【０００８】
幾つかの実施態様において、このバイオマーカー群は、α−１−抗トリプシン、癌胎児抗原、扁平上皮細胞癌抗原、レチノール結合タンパク質、トランスフェリン、及びハプトグロビンの中の少なくとも３種のタンパク質から成る。幾つかの実施態様において、このバイオマーカー群は、α−１−抗トリプシン、癌胎児抗原、扁平上皮細胞癌抗原、レチノール結合タンパク質、トランスフェリン、及びハプトグロビンの中の少なくとも４種のタンパク質から成る。幾つかの実施態様において、このバイオマーカー群は、少なくともα−１−抗トリプシン、癌胎児抗原、扁平上皮細胞癌抗原、及びレチノール結合タンパク質から成る。幾つかの実施態様において、このバイオマーカー群は、少なくともα−１−抗トリプシン、癌胎児抗原、扁平上皮細胞癌抗原、レチノール結合タンパク質、トランスフェリン、及びハプトグロビンから成る。
【０００９】
幾つかの実施態様において、この方法は、このバイオマーカー群中の各バイオマーカーの測定量に対して予め決められたアルゴリズムを適用する段階、及びこのアルゴリズムの結果を、肺癌の羅患率がより高い群又はより低い群に患者を区分けするために使用する段階を含む。幾つかの実施態様において、このアルゴリズムは、決定樹木解析法である。幾つかの実施多様において、このアルゴリズムは、分類回帰樹木法（ＣＡＲＴ）である。
【００１０】
幾つかの実施態様において、肺癌の可能性を持つ患者の治療を管理するための方法であって、ａ）患者から得た試料中のバイオマーカー群の各構成物量を測定する段階であって、このバイオマーカー群が、α−１−抗トリプシン、癌胎児抗原、扁平上皮細胞癌抗原、レチノール結合タンパク質、トランスフェリン、及びハプトグロビンの中の少なくとも２種のタンパク質から成る段階、ｂ）このバイオマーカー群中の各バイオマーカー構成物量の測定量に基づいて、この患者を肺癌の羅患率がより高い群又はより低い群に区分けする段階、及びｃ）患者を区分けした群に基づいて、肺癌の可能性を持つ患者の治療を管理する段階、から成る方法が提供される。
【００１１】
幾つかの実施態様において、肺腫瘍又は肺腫瘍と疑われる疾患の分子病期分類のための方法であって、ａ）肺腫瘍又は肺腫瘍と疑われる疾患をかかえる患者から得た試料中のバイオマーカー群の各構成物量を測定する段階であって、このバイオマーカー群が、α−１−抗トリプシン、癌胎児抗原、扁平上皮細胞癌抗原、レチノール結合タンパク質、トランスフェリン、及びハプトグロビンの中の少なくとも２種のタンパク質から成る段階、ｂ）このバイオマーカー群中の各バイオマーカー構成物量の測定量に基づいて、この患者を肺腫瘍又は肺腫瘍と疑われる疾患のある病期の羅患率がより高い群又はより低い群に区分けする段階、及びｃ）患者を区分けした群に基づいて、肺腫瘍又は肺腫瘍と疑われる疾患の分子病期分類を決定する段階、から成る方法が提供される。
【００１２】
幾つかの実施態様において、患者を肺癌のリスクの高い群に区分けするための方法であって、ａ）患者から得た試料中のバイオマーカー群の各構成物量を測定する段階であって、このバイオマーカー群が、α−１−抗トリプシン、癌胎児抗原、扁平上皮細胞癌抗原、レチノール結合タンパク質、トランスフェリン、及びハプトグロビンの中の少なくとも２種のタンパク質から成る段階、及びｂ）このバイオマーカー群中の各バイオマーカー構成物量の測定量に基づいて、この患者を肺癌のリスクの高い群に区分けする段階、から成る方法が提供される。
【００１３】
幾つかの実施態様において、患者から得た試料中のバイオマーカー群の各構成物量の測定量に基づいて、患者の肺癌羅患の可能性を測定するためのキットであって、ｉ）このバイオマーカー群中の各バイオマーカーに特異的な検出分子であって、このバイオマーカー群が、α−１−抗トリプシン、癌胎児抗原、扁平上皮細胞癌抗原、レチノール結合タンパク質、トランスフェリン、及びハプトグロビンの中の少なくとも２種のタンパク質から成る検出分子、及びｉｉ）バイオマーカー群の各構成物量を測定し、肺癌の羅患率を決定するための説明書、から成るキットが提供される。幾つかの実施態様において、試料はヒト患者から得た血清試料である。
【００１４】
このキットの幾つかの実施態様において、この検出分子は、結合した検出可能原子団を含む。幾つかの実施態様において、この検出分子は固体支持体に固定化されている。幾つかの実施態様において、このバイオマーカー群中の各タンパク質バイオマーカーに特異的な抗体から成る。幾つかの実施態様において、このキットは、このタンパク質バイオマーカーに特異的な抗体の各々に対する特異的二次抗体を含み、この特異的二次抗体が検出可能原子団に結合している。幾つかの実施態様において、このキットは、このバイオマーカー群中のバイオマーカーに特異的な検出分子の各々に特異的な結合パートナーを含み、各特異的結合パートナーは検出可能原子団と結合している。幾つかの実施態様において、この検出可能原子団は、放射標識、蛍光標識及び酵素標識から成る群から選択される。幾つかの実施態様において、このキットは、緩衝試薬、タンパク質安定化試薬、酵素基質、バックグランド減少試薬、対照試薬、検出を行うための装置、及び解析及び結果提示のために必要なソフトウェアのうちの１又は２以上を含む。
【００１５】
このキットの幾つかの実施態様において、このバイオマーカーは、α−１−抗トリプシン、癌胎児抗原、扁平上皮細胞癌抗原、レチノール結合タンパク質、トランスフェリン、及びハプトグロビンの中の少なくとも３種のタンパク質から成る。幾つかの実施態様において、このバイオマーカーは、このバイオマーカーは、α−１−抗トリプシン、癌胎児抗原、扁平上皮細胞癌抗原、レチノール結合タンパク質、トランスフェリン、及びハプトグロビンの中の少なくとも４種のタンパク質から成る。幾つかの実施態様において、このバイオマーカーは、少なくともα−１−抗トリプシン、癌胎児抗原、扁平上皮細胞癌抗原、及びレチノール結合タンパク質から成る。幾つかの実施態様において、このバイオマーカーは、少なくともα−１−抗トリプシン、癌胎児抗原、扁平上皮細胞癌抗原、レチノール結合タンパク質、トランスフェリン、及びハプトグロビンから成る。
【００１６】
従って、本発明の目的は、肺癌を検出する新しい方法を提供することである。この目的及び他の目的は、本明細書に開示した発明により、全体的に又は部分的に達成される。
本明細書に開示した発明の目的、他の目的、及び利点は、以下の記載、図、及び実施例により明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】肺癌を有するヒト群（クラス１）又は肺癌を有しないヒト群（クラス２）から得た１００血清試料の練習用セットについての分類回帰樹木法（ＣＡＲＴ）の解析結果を示す。この解析は、４種のタンパク質バイオマーカー（即ち、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、レチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）、扁平上皮細胞癌抗原（ＳＣＣ）及びα−１−抗トリプシン（ＡＡＴ））を選択して用いた、７種のターミナルノード（末端節）の結果である。図１において、クラス１試料は、順方向スラッシュ斜線で表され、またクラス２試料は、逆方向スラッシュ斜線で表される。全体として、この樹木解析は、４４／５０（８８％）の肺癌血清及び４１／５０（８２％）の非癌血清を正しく分類した（感度８９．３％、特異性８４．７％）。全肺癌症例の６８％（３４／５０）は、ターミナルノード４、５及び７に仕分けられるが、他方対照例の６％（３／５０）だけが、これらのノード（節）に仕分けられた。従って、もしある患者がこれらのターミナルノードの一つに区分けされるならば、この患者は９２％（３４／３７）の羅患率で肺癌を有する。
【図２】血清のテストセットの分類回帰樹木法（ＣＡＲＴ）解析に由来する７ターミナルノードの各々における病期分類（図２Ａ）及びタイプ（図２Ｂ）による癌の割合を示す棒グラフである。肺癌の新診断を受けた４９人の患者群と、年齢及び性をマッチさせた４８人の対照群の血清試料から得た、ブラインドされ、独立した、バイオマーカーデーターのセットについて、図１由来の樹木解析を行った。図２Ａ及び図２Ｂの両者に於いて、ｙ軸に表された割合（％）は、それぞれ、７ターミナルノードの各々に示される特定の病期分類及び組織型の全癌の割合を示す。図２Ａに示すように、病期分類Ｉ患者の６２％（１０／１６）、病期分類ＩＩ患者の６６％（２／３）、病期分類ＩＩＩ患者の６３％（１２／１９）及び病期分類ＩＶ患者の１００％（１１／１１）は肺癌ノードに正確に区分けされた。図２Ａにおいて、病期分類Ｉは、白抜きボックスで表され；病期分類ＩＩは順方向スラッシュ斜線で表され；病期分類ＩＩＩは逆方向スラッシュ斜線で表され；また病期分類ＩＶは黒ボックスで表される。図２Ｂにターミナルノードに従う組織型の分布を表わす。図２Ｂにおいて、アデノカルシノーマは白抜きボックスで表され；ＢＡＣは順方向スラッシュ斜線で表され；扁平細胞は逆方向スラッシュ斜線で表され；ＳＣＬＣは黒ボックスで表され；ＮＳＣＬＣは点描として表される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本明細書で開示した発明に従い、腫瘍の検出、できれば早期検出及び分子病期分類のために、方法及び組成物が提供される。バイオマーカー群は、肺癌検出のために提供される。本明細書に提供されたバイオマーカーは、高リスク患者を特徴付けることができ、また未確定の肺結節を持つどの患者が肺癌を有するか示唆することができる。このバイオマーカーは、診断能力を促進し、画像調査を補完し、また癌検出のための臨床的利点を有する。
他に規定しなければ本明細書で用いる全ての技術及び科学用語は、本明細書に記載の発明が属する、通常の当業者により一般的に理解できる用語と同じ意味を持つ。全ての出版物、特許出願、特許、本明細書に述べる他の参照文献は、その全体が本明細書に取り込まれる。
【００１９】
Ｉ．定義
以下の用語は、当業者に良く理解されていると信じられるが、以下の定義を、本明細書に開示した発明を説明する上で役立てるために述べる。
長年にわたる特許法の慣例に従い、用語"ａ"及び"ａｎ"は、クレイムを含む本明細書で用いる際、"１又は２以上"を意味する。
他に指示しない限り、本明細書及びクレイムで用いる、含有物、反応条件、及びその他の量を表す全ての数は、全ての場合において、用語"約"により修飾されうると理解される。従って、もし反対に指示しない限り、本明細書及び付帯のクレイムに示されるパラメーターの数字範囲は、本明細書に開示した発明により求められて得られた好ましい特徴により変わることができる近似値である。
【００２０】
"アミノ酸配列"並びに"ペプチド"、"ポリペプチド"及び"タンパク質"等の用語は本明細書で区別無く用いられ、またこのアミノ酸配列が前記タンパク質分子と結合した完全な、天然のアミノ酸配列（即ち、自然に存在するタンパク質に見出される諸アミノ酸のみ含む配列）に制限されることを意味しない。本明細書に開示した発明のタンパク質及びタンパク質断片は、組み換え法により作成可能であり、又は天然に存在する原料から分離可能である。タンパク質断片は何れかのサイズであることができて、例えば、４アミノ酸残基から全アミノ酸配列マイナス１アミノ酸のサイズ範囲が可能である。
【００２１】
用語"抗体"は、所定のタンパク質に十分特異的に結合する何れかの抗体断片を含む。
成句"検出分子"は、本明細書では、最も広い意味で用いられ、バイオマーカー群の構成物の一つに十分特異的に結合する何れかの分子を含み、バイオマーカー群中の他の構成物の存在下又は非存在下に、特定のバイオマーカー構成物の検出を可能にする。検出が可能とは、特定のバイオマーカー構成物の存在又は非存在を測定することを意味することができて、幾つかの実施態様において、特定のバイオマーカーの量を測定することを意味することができる。検出分子は、抗体及び抗体断片を含んでもよい。
【００２２】
本明細書で用いるように、用語"試料"は、その最も広い意味で用いられる。ある意味では、生物原料からの試料を含むことを意味する。生物試料は、動物（ヒトを含む）から得ることができ、また流体、固体、組織、及び気体を含む。生物試料は血漿、血清等々の血液産物を含む。
【００２３】
本明細書で用いられる、成句"各検出分子に対する特異的結合パートナー"は、十分な特異性を持って１種の検出分子と結合する何れかの分子を含み、バイオマーカー群の他の構成物のための検出分子の存在又は非存在下で特定の検出分子の検出を可能にする。例えば、幾つかの実施態様において、特異的結合パートナーは、一次抗体である検出分子を認識する二次抗体であることができる。幾つかの実施態様において、例えば、検出分子上のビオチン基のような、検出分子上の原子団に、特異的結合パートナーは特異的に結合する分子であることができる。
【００２４】
本明細書で用いるように用語"患者"は、ヒト、ヒト以外の霊長類、齧歯類等々を含み、これらに限られない何れかの動物（例えば、哺乳動物）を表し、これらは特定の治療の被験者である。用語"サブジェクト（患者）"及び"ペイシャント（患者）"は、本明細書では、互換性を持って使われ、ヒト患者に対する参照文献に制限されない。
【００２５】
本明細書で用いるように、用語"肺癌に羅患したと疑われる患者"は、肺癌の１又は２以上の徴候を示す、又は検診で肺癌とされた（例えば、定期健康診断）患者を示す。肺癌を疑われた患者は、また１又は２以上の危険因子を有することができる。一般的に、肺癌に羅患したと疑われた患者は、癌の検診を受けてこなかった。しかし、"肺癌に羅患したと疑われる患者"は、初診（例えば、未確定の肺結節を示すＣＴスキャン）を受けたが、どの病期分類の癌が分からない人を含んでもよい。この用語は更に、一度肺癌に罹った人々（例えば、再発の人々）も含む。
本明細書で用いるように、用語"癌のリスクを持つ患者"は肺癌羅患に対する１又は２以上の危険因子を持つ患者を示す。
【００２６】
ＩＩ．代表的実施態様
本明細書で開示した発明は、肺癌の検出、できれば早期の肺癌検出、及び腫瘍の分子病期分類に有用な血清バイオマーカー群を提供する。幾つかの態様において、本明細書に提供された血清バイオマーカーのこのバイオマーカー群は、ＣＴスクリーニング単独による腫瘍の早期発見のある限界に対処する。
【００２７】
バイオマーカーの考え方は、全身疾患としての癌の生物的特徴に基づく。悪性度の進行に伴い、癌は、成長及び転移に要求されるタンパク質を分泌し、細胞を循環させる。宿主は、全身的に免疫防御を開始するばかりではなく、組織構造の変化、及び原発細胞の微少環境に脈管構造を誘導して対応する。このことは、腫瘍内部にマクロファージ、組織球、及びリンパ球のような炎症細胞の移動を伴う生得的及び適応応答、及び自己抗体の産生を含めることができる（２１〜２４）。従って、腫瘍発現タンパク質及び、もし定義できるとすると、宿主応答タンパク質は、臨床的スクリーニングのための癌のプロフィールを開発するために有用であることができる。
【００２８】
肺癌は、不均一疾患であるので、幅広い臨床的表現形質をカバーするマーカーのバイオマーカー群が必要とされる。トランスフェリン、レチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）、及びハプトグロビンは、２次元示差ゲル電気泳動（２Ｄ−ＤＩＧＥ）実験から、またα−１−抗トリプシン（ＡＡＴ）はマトリクス補助レーザー離脱／イオン化−飛行時間質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）実験により同定された（実施例１参照）。この群のバイオマーカーは、２種のタンパク質、癌胎児抗原（ＣＥＡ）及び扁平上皮細胞癌抗原（ＳＣＣ）で補足され、これらの血清中の濃度は肺癌状態により変化することが知られているが、単独の診断検定又は様々な他のタンパク質との組合せ診断検定では、不充分な感度及び特異性を有する（１１、１４、１５）（実施例１参照）。
【００２９】
最初、７種のタンパク質を検定した。練習用セットの分類回帰樹木法（ＣＡＲＴ）により、特に４種のマーカー（ＣＥＡ、ＲＢＰ、ＳＣＣ、及びＡＡＴ）は、癌患者の８８％及び癌を持たない患者の８２％を正確に分類するに十分であることが分かった（実施例４〜５参照）。分類回帰樹木法（ＣＡＲＴ）解析により作られた分類スキームにより、各患者（彼又は彼女）があてはまるターミナルノード（末端節）に基づいて、各患者は、悪性疾患の羅患率に区分けされる。図１を参照。練習用セットにおいて、もしある患者が３種のターミナルノードの一つ（図１のノード（節）４、５又は７）にあてはまるならば、この患者が肺癌に羅患する確率は９２％である。研究の検証段階において、分類樹は、７１．４％の肺癌患者、及び６６．６％の非癌対照患者を正しく分類した（実施例６参照）。繰り返すが、図１のノード４、５及び７は、肺癌の代表的な予想スキームを提供する：全肺癌症例の５７％はこれらのノードに仕分けられ、他方対照例の６％だけが、これらのノードに仕分けられた。もしある患者がこれらのターミナルノードの一つに区分けされたら、患者は９０％の確率で肺癌に罹っている。
【００３０】
本明細書に開示したタンパク質マーカーは、組み合わせると、肺癌の早期発見及び腫瘍の分子病期分類のための重要な臨床的有用性を提供する。従って、幾つかの実施態様において、肺癌の羅患率がより高い又はより低い群に患者を区分けするために、幾つかの方法を提供する。幾つかの実施態様において、この方法は、患者血清試料中のバイオマーカー群の各々の濃度測定を含み、ここで、バイオマーカー群は、α−１−抗トリプシン、癌胎児抗原、扁平上皮細胞癌抗原、レチノール結合タンパク質、トランスフェリン、及びハプトグロビンの中、少なくとの２種のタンパク質を含み、またこの方法は、バイオマーカー群中の各バイオマーカー量の上記測定に基づく、肺癌の羅患率より高い又はより低い群への患者の区分けを含む。
【００３１】
幾つかの実施態様において、肺癌のリスクの高い群に患者を区分けするための方法を提供する。この方法は、患者血清試料中のバイオマーカー群の各々の濃度測定を含むことができて、ここでバイオマーカー群は、α−１−抗トリプシン、癌胎児抗原、扁平上皮細胞癌抗原、レチノール結合タンパク質、トランスフェリン、又はハプトグロビンの中、少なくとの２種のタンパク質を含み、またこの方法は、バイオマーカー群中の各バイオマーカー量の上記測定に基づく、肺癌のリスクの高い群への患者の区分けが含まれる。
【００３２】
幾つかの実施態様において、肺癌の可能性のある患者の治療を管理するための方法を提供する。この方法は、患者血清試料中のバイオマーカー群の各々の濃度測定を含み、ここで、バイオマーカー群は、α−１−抗トリプシン、癌胎児抗原、扁平上皮細胞癌抗原、レチノール結合タンパク質、トランスフェリン、及びハプトグロビンの中、少なくとの２種のタンパク質を含み、またこの方法は、バイオマーカー群中の各バイオマーカー量の上記測定に基づく、肺癌の羅患率がより高い又はより低い群への患者の区分け、及び患者が区分された群に基づく肺癌の可能性のある患者の治療の管理を含む。
【００３３】
幾つかの実施態様において、腫瘍又は腫瘍と疑われる疾患の分子病期分類のための方法を提供する。この方法は、腫瘍又は腫瘍と疑われる疾患を有する患者血清試料中のバイオマーカー群の各々の濃度測定を含み、ここで、バイオマーカー群は、α−１−抗トリプシン、癌胎児抗原、扁平上皮細胞癌抗原、レチノール結合タンパク質、トランスフェリン、又はハプトグロビンの中、少なくとの２種のタンパク質を含み、またこの方法は、バイオマーカー群中の各バイオマーカー量の上記測定に基づく、肺腫瘍又は肺腫瘍と疑われる疾患のある病期の羅患率がよりより高い群又はより低い群への患者の区分け；及び患者が区分された群に基づく、腫瘍又は腫瘍と疑われる疾患の病期分類の決定を含む。
【００３４】
本明細書で開示したバイオマーカー群各々の濃度は様々な動物組織で測定することができる。幾つかの実施態様において、このバイオマーカーは動物組織又は体液中で検出できる。幾つかの実施態様において、このバイオマーカーは、血漿、血清、全血、粘液、及び／又は尿を含む体液において検出できる。特別な実施態様において、このバイオマーカーは血清中において検出できる。
【００３５】
幾つかの実施態様において、本明細書で開示した方法は、各バイオマーカー量の統計的解析を含んでもよい。統計解析は、バイオマーカー量に対して所与のアルゴリズム適用を含んでもよい。アルゴリズムの結果は、肺癌羅患率がより高い又はより低い群への患者の区分けに適用することができる。
【００３６】
本明細書に開示した方法において、様々なアルゴリズムを使用することができる。使用したアルゴリズムは、本明細書の実施例に記載したアルゴリズムに制限されず、本明細書を閲覧した当業者にとって自明であるアルゴリズムを含む。幾つかの実施態様において、使用したアルゴリズムは、決定樹木解析法であってもよい。幾つかの実施態様において、使用するアルゴリズムは、分類回帰樹木法（ＣＡＲＴ）解析であってもよい。
【００３７】
バイオマーカー群の各々の濃度は、本明細書に開示した方法により測定できる。幾つかの実施態様において、バイオマーカー群は、α−１−抗トリプシン、癌胎児抗原、扁平上皮細胞癌抗原、レチノール結合タンパク質、トランスフェリン、及びハプトグロビンの中、少なくとも３種のタンパク質を含んでもよい。幾つかの実施態様において、バイオマーカー群は、α−１−抗トリプシン、癌胎児抗原、扁平上皮細胞癌抗原及びレチノール結合タンパク質、トランスフェリン、又はハプトグロビンの中の少なくとも４種のタンパク質を含んでもよい。幾つかの実施態様において、バイオマーカー群は、少なくとも、α−１−抗トリプシン、癌胎児抗原、扁平上皮細胞癌抗原、及びレチノール結合タンパク質のタンパク質を含んでもよい。幾つかの実施態様において、バイオマーカー群は、少なくとも、α−１−抗トリプシン、癌胎児抗原、扁平上皮細胞癌抗原、レチノール結合タンパク質、トランスフェリン、及びハプトグロビンのタンパク質を含んでもよい。
【００３８】
本明細書に開示した発明は、上記バイオマーカー群に制限されない。肺癌又は肺癌の進行に相関する何れかのマーカーも、本明細書に提供されたバイオマーカー群に含めることができて、また本明細書で開示した発明の有効範囲内である。本明細書に開示した方法を用いるために適切な更なる肺癌バイオマーカーを同定するために、以下の実施例に記載した方法を含むがこれに限られない、何れかの方法を用いることができる。例えば、当業者には既知の、方法を用いて、肺癌において上向又は下向制御されていると知られている、又は同定されているバイオマーカーを用いることができる。追加のバイオマーカーとして、１又は２以上のポリペプチド、小分子代謝物、脂質及び塩基配列を含んでもよい。バイオマーカー群に含まれるマーカーは、以下の実施例に記載した方法を含むがこれらに限定されない全ての適切な方法を用いて、予測値をスクリーニングして選択することができる。
【００３９】
上記の実施態様から明らかなように、本明細書に開示した方法及び組成物は、肺癌、肺癌の早期発見、及び肺癌の可能性がある、又は肺癌であると知られている患者の治療管理に対して患者を区分けするために有用である。例えば、幾つかの実施態様において、バイオマーカー群は、患者を画像診断、又は肺癌を検出する他の既知の方法前に患者を区分けして、患者の肺癌のリスクが高いか、又はより高いかを決めるために有用である。このようにして、高リスク臨床プロフィール、及び肺癌の可能性が高い又はより高いことを示すバイオマーカー群からの試験結果の両者を持つ患者のみを、ＣＴスキャンを受けるために送ることができる。癌の可能性が低いと示唆される患者は、通常の追跡検査の間に、血清バイオマーカー群を用いて再検査を受けることができる。
【００４０】
幾つかの実施態様において、本明細書で提供する血清バイオマーカー群は、画像調査において未確定の肺結節が検知された場合、スクリーニング試験で検知された、又は他の徴候のために行われたものであろうと、利用できる。肺癌の低リスクを示すバイオマーカー群からの検査結果を持つ患者は、ターミナルノード検査結果の危険率により指示された時間間隔で画像調査を受けることができる。高リスク臨床プロファイル及び悪性病変の高リスクと関係するターミナルノードの両者を持つ患者は、即刻の治療を必要すると決定できる。実施例５〜６に記載した研究に於いて、肺癌患者の６０％以上は、９０％以上の癌羅患率を持って３種の悪性ターミナルノードの一つにふるい分けられる（図１及び表２参照）。これらの患者に対して、ポジトロン発光断層撮影（ＰＥＴ）走査を行うことができ、その後他の臨床因子によって、手術又は生検を行う。
【００４１】
本開示を閲覧した当業者には自明であろうが、バイオマーカー群の各濃度を測定するためには、全ての適切な方法を用いることができる。例えば、バイオマーカー検知の方法は、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、液体クロマトグラフィー／質量分析器（ＬＣ−ＭＳ）、ガスクロマトグラフィー／質量分析（ＧＣ−ＭＳ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、磁気共鳴画像化法（ＭＲＩ）、フーリエ変換赤外（ＦＴ−ＩＲ）分光、及び誘導結合プラズマ質量分析器（ＩＣＰ−ＭＳ）を含む。更に以下の事柄が理解される、即ち質量分析技術は、磁気セクター及び二重焦点機器、透過型四重極子機器、四重極イオントラップ機器、飛行時間機器（ＴＯＦ）、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴機器（ＦＴ−ＭＳ）及びマトリクス補助レーザー離脱／イオン化飛行時間質量分析器（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）の使用を含むが、これらに制限されない。
【００４２】
幾つかの実施態様において、タンパク質バイオマーカーは、ゲル電気泳動、免疫組織化学、及び抗体結合の様な、当業者に既知の技術を用いて検出することができる。所定のポリペプチドに対する抗体作成方法は、当業者に既知である。本明細書に開示した発明のタンパク質バイオマーカーに対する抗体は、タンパク質バイオマーカーを適切に認識する限り、何れかのモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であることができる。幾つかの実施態様において、従来からの何れかの抗体又は抗血清作製法でもこれに従い、タンパク質バイオマーカーを免疫源として用いて、抗体を作成する。本明細書に開示した発明は、モノクローナル及びポリクローナル抗体の両者の使用を提供する。更に、本明細書に免疫源として用いるタンパク質は、何れかの特定の免疫源に制限されない。例えば、本明細書に開示した発明のタンパク質バイオマーカーの断片は、免疫源として使用できる。この断片は、タンパク質をコードする遺伝子断片の発現、タンパク質の酵素的加工、化学合成等々を含むが、これらに制限されない、何れかの方法を使っても得ることができる。
【００４３】
本明細書に開示した発明の抗体は、タンパク質バイオマーカーの検出に用いることができる。例えば、抗体結合は、当業者に既知の技術（例えば、放射性免疫検定法、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、"サンドイッチ"免疫検定法、免疫放射分析法、ゲル内拡散沈降反応、免疫拡散検定法、ｉｎ  ｓｉｔｕ免疫検定法（例えば、金コロイド、酵素、又は放射性同位元素標識）、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集検定法（例えば、ゲル凝集検定法、血液凝集反応検定他）、補体結合検定法、免疫蛍光検定法、プロテインＡ検定法、及び免疫電気泳動検定法等により検出される。免疫検定法の一例は、米国特許５，５９９，６７７及び５，６７２，４８０に記載されており、両者は本明細書の参考文献として取り込まれている。本開示を一覧して、当業者は、本明細書に開示した発明の方法を実行する上で有用な、無数の特異的免疫検定形式及びその変形物に精通しているであろう。
【００４４】
本明細書に開示した発明の幾つかの実施態様において、患者の試料中のバイオマーカー群の各構成物量の測定に基づいた、患者が肺癌に罹る確率を決定するためのキットが提供され、このキットは、ｉ）バイオマーカー群中の各バイオマーカーに特異的な検出分子を含み、ここで、このバイオマーカーは、α−１−抗トリプシン、癌胎児抗原、扁平上皮細胞癌抗原、レチノール結合タンパク質、トランスフェリン、及びハプトグロビンから選択した少なくとも２種のタンパク質を含み、またこのキットは、ｉｉ）バイオマーカー群の各構成物量測定、及び肺癌羅患率決定のための説明書を含む。本明細書で用いる成句"検出分子"は最も広い意味で用いられ、バイオマーカー群の一構成物に十分特異性を持って結合する何れかの分子を含み、バイオマーカー群中の他の構成物の存在下又は非存在下で特定のバイオマーカー構成物の検出を可能にする。検出を可能にするとは、特定のバイオマーカー構成物の存在又は非存在を決定することを意味することができて、幾つかの実施態様において、特定のバイオマーカーの量を決定することを意味することができる。検出分子は、抗体及び抗体断片を含んでもよい。幾つかの実施態様において、検出分子は、結合した検出可能原子団を含む。幾つかの実施態様において、検出分子は、バイオマーカー群中のタンパク質バイオマーカーの各々に特異的な抗体を含む。
【００４５】
検出可能シグナルを作り出す方法は、本開示を一覧した当業者に自明のように、既知の技術に従い、放射活性標識（例えば、３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光標識、酵素標識（例えば、西洋わさびパーオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ）、蛍光標識（例えば、フルオレセイン）等々の使用を含む。免疫検定における結合を検出のために、多くの方法が既知技術であり、本開示した発明の範囲内である。
【００４６】
幾つかの実施態様において、例えば、検出分子がバイオマーカー群の構成物に特異的な一次抗体であり、また検出が一次抗体上の標識を用いる場合、直接検出法が提供される。幾つかの実施態様において、特異的な結合パートナーの検出分子への結合を検出する、間接法により検出分子を検出することができる。この特異的結合パートナーは、検出分子に十分特異的に結合して、バイオマーカー群の他の構成物の存在又は非存在下に、特定の検出分子を検出できる何れかの分子であるこができる。幾つかの実施態様において、検出分子は一次抗体であり、この一次抗体を、二次抗体又は一次抗体に対する反応物又は他の特異的結合パートナーの結合を検出することにより検出することができる。例えば、幾つかの実施態様において、特異的結合パートナーは、一次抗体である検出分子を認識する二次抗体であることができる。幾つかの実施態様において、特異的結合パートナーは、例えば、検出分子上のビオチン基のような検出分子上の原子団に特異的に結合する分子であることができる。幾つかの実施態様において、結合パートナーは、標識されている。幾つかの実施態様において、結合パートナーは、標識された二次抗体である。
【００４７】
例えば、幾つかの実施態様において、間接的検出方法は、非標識一次抗体である検出分子、及び標識化した二次抗体である結合パートナーを含む。この方法は、一次抗体上の異なる抗原性部位と反応する１以上の二次抗体によるシグナル増幅により直接検出法よりも感度が高い。幾つかの実施態様において、間接検出法は免疫蛍光法であり、ここで二次抗体はＦＩＴＣ、ローダミン又はテキサスレッドの様な蛍光性色素で標識することができる。幾つかの実施態様において、間接的検出方法は、免疫酵素法であり、ここで二次抗体はパーオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、又はグルコースオキシダーゼ等の酵素により標識化できる。
【００４８】
幾つかの実施態様において、免疫検定法はタンパク質バイオマーカー群の各構成物に対して特異的な抗体、及び検出可能シグナルを作り出す方法を含んでもよい。幾つかの実施態様において、この抗体を、既知技術に従って、支持体（ビーズ、プレート、又はスライドのような）上に固定化することができて、また液相の検査試料と接触させることができる。この支持体は、その後この液相から分離できて、支持相又は液相について、タンパク質バイオマーカーの存在に関わる、検出可能シグナルを吟味することができる。
【００４９】
本明細書で開示の発明は、バイオマーカー群の各構成物を検出するためのキットを含む。幾つかの実施態様において、このキットは、バイオマーカー群中のタンパク質バイオマーカーに特異的な、抗体のような検出分子、上記のような検出可能なシグナルを作り出すために必要な試薬、及び緩衝液を含む。幾つかの実施態様において、このキットは、全ての対照、検定を行うための説明書を含めた検出検定法を行うために必要な全ての構成物、及び結果を解析し、提示するために必要な何れかのソフトウェアーを含んでもよい。
【００５０】
本明細書に開示した発明の方法を行うための検出キットは多くのやり方で作成できる。幾つかの実施態様において、検出キットは、固体支持体に固定化されたバイオマーカー群中のタンパク質バイオマーカーに特異的に結合する抗体又は抗体断片である検出分子；及び検出可能な原子団に結合した一次抗体又は抗体断片に特異的な二次抗体又は抗体断片を含んでもよい。幾つかの実施態様において、本開示を一覧した当業者には自明なように、このキットはまた、検出可能な原子団が部分（例えば、酵素基質）である他の検出可能シグナル生成システム（必要な場合）；緩衝試薬及びタンパク質安定化試薬のような補助的試薬；試験において妨害となるバックグランドを減少させる試薬；対照試薬；試験を行う機器、等々を含んでもよい。
【００５１】
幾つかの実施態様において、この検出キットは、バイオマーカー群中の各タンパク質バイオマーカーに対して特異的な抗体又は抗体断片、及び検出可能な原子団と結合した各抗体に対する特異的結合パートナーを含んでもよい。上記の補助試薬も同様に含めることができる。試験キットは、試験を行うためにシート又は印刷した取扱説明書と共に、一般的には全てのグループを単一の容器に何れかの適切な仕方で梱包できる。
【００５２】
幾つかの実施態様において、バイオマーカー群のための検出検定法は、自動化できる。免疫検定法の自動化法は、米国特許5,885,530, 4,981,785, 6,159,750, 及び 5,358,691に記載され、これらは本明細書において、参考文献として取り込まれている。幾つかの実施態様において、結果の解析及び提示もまた自動化できる。このようにして、臨床医は、何れかの適切な方法又は道具を用いて、試験結果を利用できる。従って、幾つかの実施態様において、臨床医は、生のデータを理解する必要が無く、データは、最も有用な形で臨床医に直接に提示される。その後、臨床医は、直ちにその情報を利用して、患者の治療を最適化できる。本明細書に開示した発明は、検査を行なった実験室、情報提供者、医療作業者及び患者との間で、情報の受領、加工、伝達できる何れかの方法を提供する。
【実施例】
【００５３】
以下、代表的実施態様が示されている、添付した実施例を参照して、以下に本明細書で開示した発明をより詳細に記載する。しかし、本明細書に開示した発明は、異なった形で実施することは可能であり、本明細書に書かれた実施態様に制限して構成したものではない。むしろ、これらの実施態様は、本開示が十分で、完全であるように提供されたものであり、当業者に実施態様の範囲を完全に伝えるであろう。
【００５４】
実施例１
バイオマーカー群の候補の選択
異なる物理化学的特徴を有するタンパク質のグループを特定するために、２つの異なる方法を用いて、肺癌羅患又は非羅患患者の示差的に発現した血清タンパク質を検出した。肺癌羅患患者と、年齢と性を合わせた肺癌非羅患対照群との間で、示差的に発現する血清タンパク質を強調するために２種の異なる方法を用いた。この方法は、２次元示差電気泳動（２Ｄ−ＤＩＧＥ）とマトリクス補助レーザー離脱／イオン化飛行時間質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）である。全血清をＤｕｋｅ大学試験審査委員会（ＩＲＢ）により承認されたプロトコールに従って収集し、また全患者は説明された承諾（インフォームドコンセント）書類を提出した。
【００５５】
２Ｄ−ＤＩＧＥ：  ２Ｄ−ＤＩＧＥ試験のために、新たに非小細胞癌（ＮＳＣＬＣ）と診断された１０人の患者から得た血清タンパク質を、非癌の１０人の集団から得た血清タンパク質と比較した。２Ｄ−ＤＩＧＥ解析の前に、新たに非小細胞癌（ＮＳＣＬＣ）と診断された１０人の患者群及び非癌の１０人の対照群から得た血清試料（各１０μｌ）から、製造者の取扱説明書に従い、VivaPure SEPPRO混合６キット(VIVASCIENCE, Edgewood, NewYork, USA）を用いて６種の多量のタンパク質を取り出した。取り出した血清試料を、8 M ウレア、2 Mチオウレア、20 mM Tris-HCl、pH 8.5、及び 4% (w/v) CHAPSを含む緩衝液で稀釈し、タンパク質をＣｙ３又はＣｙ５で標識した。色素標識効率は、ランダムに決めた５癌患者及び５対照血清をＣｙ３に対して規格化し、また残りの５癌患者及び５非癌血清をＣｙ５に対して規格化した。２０個の除去した血清試料の各々を等量含むプール内部標準をＣｙ２で標識した。その後、全３試料から得た等量のタンパク質（癌、対照、プール各１５０μｇ）を混合して、１次元目に対してｐＨ  ３〜１０の１３ｃｍＩＰＧストリップ(AMERSHAM BIOSCIENCES, Piscataway, New Jersey, USA）、及び２次元目に対して１２％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲルを用いた２Ｄ−ゲル電気泳動にかけた。
【００５６】
このゲルは、各ＣｙＤｙｅｓ（染料）に対して特異的な３種の励起及び発光波長を用いて、TYPHOON 9400 Variable Mode Imager(Amersham）上で、画像化した。全てのゲルを、ＤＥＣＹＤＥＲ５．０(Amersham)ソフトウェアを用いて解析した。ＩＰＧストリップ及び染料フロントにより生ずる周辺のゲルアーチファクトを排除するために、ゲル画像をクロッピング（刈り込み）した後、DECYDER Difference In-gel Analysis（示差ゲル内解析）ソフトウェアを用いて、ゲル内解析を行った。各ゲル内で約２０００個のスポットを自動検出し、手動で選択したフィルター排除パラメーターを用いて、これらのスポットにフィルターをかけた。フィルターを通した各々のゲルのスポット地図を保存し、ゲル間マッチング及び統計解析のために、BIOLOGICAL VARIATION 解析ソフトウェアに取り込んだ。癌と対照血清間のスポット強度の差を計数するために、独立したスチューデントＴ−テストを用いて、０．１以下のＴ−スコアを持つタンパク質スポットを削除し、タンパク質同定のために、ＵＮＣ−Ｄｕｋｅプロテオミクスセンター（Chapel Hill, North Carolina）に提出した。
【００５７】
ＤＩＧＥゲルの解析により、２群間で少なくとも１．５倍（ｐ＜０．０５）濃度差のある、４種のタンパク質（トランスフェリン、フィブリノゲンβ鎖、レチノール結合タンパク質（ＲＢＰ），及びハプトグロビン）が明らかとなった（表１参照）。フィブリノゲンβ鎖は、凝集に関与することと急性期タンパク質としての性質により、肺癌の存在に無関係に血清中の濃度に影響を与えるようであるので、バイオマーカー群としての使用から除外した（６）。
【００５８】
表１：２Ｄ−ＤＩＧＥにより同定されたタンパク質
【表１】
2010528265.tif 000003
【００５９】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：TOF型マトリックス支援レーザー脱離イオン化法質量分析（MALDI-TOF MS）試験のために、１８人のＮＳＣＬＣ患者群および１８人の対照群からの血清試料を、各試料を２０本のチューブに分画するROTOFOR  セル(Bio-Rad, Hercules, California, USA)を用いて、最初、液相等電点電気泳動(IEF)に掛けた。その後、各分画をMALDI-TOF MSにより解析した。ＩＥＦの前に、蒸溜した、脱イオン水（ＤＤ水）に対して、一晩の透析(7000MWCO)により、各血清試料２ｍｌから塩を排除し、その後不溶物を除くために、遠心した。透析した血清を、１８ｍｌのＤＤ水で稀釈し、担体両性電解質（ｐＨ範囲３〜１０）を最終濃度２％（ｗ／ｖ）になるように加えた。製造者の取扱説明書に従い、ＲOTOFOR PREP IEF セル(Bio-Rad)を用いて、１２Ｗ定電圧下で等電点電気泳動を行った。ROTOFOR運転の終了時に、２０分画（各０．５〜１．５ｍｌ；平均タンパク質濃度〜１．５ｍｇ／ｍｌ）をミクロ遠心チューブに移し、使用時まで−８０℃で貯蔵した。
【００６０】
マトリクスとして４５％（ｖ／ｖ）アセトニトリル及び０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡに溶かしたシナピン酸(SA; Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri, USA)飽和溶液を用いた、従来型の乾燥粒子プロトコールを用いて、ＩＥＦ−分画した血清のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ解析を行った。ＳＡは結晶型を得て、更なる精製を加えずに用いた。各ＲＯＴＯＦＯＲ分画１μｌを５μｌＳＡマトリクス溶液に稀釈して、得られた１．２μｌ混合物をＭＡＬＤＩ試料台の上に置いた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析の外部校正を、別個であるが類似した既知分子量のタンパク質についてのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ試験で定義された前もってセットされた、校正式によって行なった。
【００６１】
全てのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ質量分析を、窒素レーザー（３３７ｎｍ）を用いた線型モードで、Voyager DEPRO Biospectrometry  Workstation (PerSeptive Biosystem, Framingham, Massachusetts, USA)上で行なった。質量スペクトルを、加速電圧２５ＫＶ及び４７５ｎｓの遅延時間を用いた陽イオンモードで集めた。グリッド電圧、ガイドワイアー電圧及び低質量ゲートを、それぞれ、９４．０％、０．１５％及び１０００．０  ｍ／ｚにセットした。
【００６２】
各試料の２０分画の各々から得られたスペクトルを、組み合わせて３６個の複合スペクトル作成した（７）。対照スペクトルと比較して、ＮＳＣＬＣスペクトルは、対照血清と比べてＮＳＣＬＣ血清に示差的に表された、ｍ／ｚ５０４３０に統計的に有意なピークが見られた。このタンパク質を、部分精製、２Ｄ−ゲル電気泳動及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦペプチド質量フィンガープリンティング及びＭＳ／ＭＳ配列決定により、α−１−抗トリプシン（ＡＡＴ）と同定した。ＡＡＴは肺癌の検出及び病因と関係している（８、９）。
【００６３】
２種の良く研究されたバイオマーカーである、癌胎児抗原（ＣＥＡ）及び扁平上皮細胞癌抗原（ＳＣＣ）もまた、バイオマーカー群に含めた。これらのバイオマーカーのいずれも、肺癌診断又は治療追跡調査において、それ自体有効と示されてこなかった（１０、１１）。
【００６４】
実施例２
患者試料
全ての血清試料をＩＲＢ−承認保管所から選択した。試料は、全て同様に集められ、加工され、保管されたものである。血清試料は、肺癌と新しく診断され、以前治療を受けてない、９９人の一連の患者から選択した。血清を最初の診断時に、患者から採取した。更に、９８個の血清試料を、年齢と性別を合わせた、同じ時期に同じ一般的大学診療に見かける対照非癌患者から採取した。患者の統計学的データ及び臨床的プロフィールを表２に示す。癌及び対照群の各々から得た５０個の血清試料を用いて一つのモデルを開発し、このモデルを癌群から４９血清試料、及び対照群から４８血清試料を用いて検証した。過去の医療履歴、投薬、診断時の病期分類、組織型及び結果を含む臨床データについては、血清を試験のために提供した各患者が入手可能である。
【００６５】
表２：患者統計及び臨床的プロフィール
【表２】
2010528265.tif 000004
【００６６】
実施例３
バイオマーカー検定
バイオマーカー群を形成する全てのタンパク質（即ち、トランスフェリン、ＲＢＰ、ハプトグロビン、ＡＡＴ、ＣＥＡ及びＳＣＣ）の血清濃度は、市場で入手可能な酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡｓ）を用いて、製造者の取扱説明書に従い（表３参照）、練習用セット及びテストセット中の全ての試料において測定した。各バイオマーカーの検定は、凍結融解サイクルの違いや日々可変性の他の原因によるデータのブレを除くために、練習用及びテストセットの両者に対して同時に行った。
【００６７】
表３：バイオマーカー群ＥＬＩＳＡｓ
【表３】
2010528265.tif 000005
【００６８】
実施例４
データ解析
分類回帰樹木法（ＣＡＲＴ）と呼ばれる樹木構造データ解析技法は、バイオマーカー群内のタンパク質の血清濃度に基づいて肺癌羅患と非肺癌患者とを分類するために使われている（１２、１３）。このＣＡＲＴソフトウェア(Salford Systems, San Diego, California, USA)は、均一分割を好む１０倍のクロス検証を持つＧｉｎｉ分割アルゴリズムを用い、また５以下の観測値を持つノード（節）の分割を許可しないであろう。このＣＡＲＴモデルは、初診の際血清を採取された肺癌を羅患した（それ以前の治療は受けてない）５０人の一連の患者、及び年齢及び性別を合わせた癌でない５０人の患者から得たＥＬＩＳＡ血清データを用いて開発したものである（実施例２参照）。これら１００試料が、練習用データセットを構成した。このモデルは、各試料を肺癌又は非肺癌羅患の確率と関連したターミナルノード（末端節）に仕分けした。
【００６９】
実施例５
４血清マーカーのバイオマーカー群を練習用セットに選択
この試験の目的は、その血清中の濃度が肺癌の早期発見に用いることができるであろうタンパク質のバイオマーカー群を同定することなので、ＣＡＲＴモデルを、肺癌羅患又は非羅患の患者から得た１００血清試料を分類するために練習として使用した。この練習用セットにおいて、ＣＡＲＴ解析は、ＣＥＡ、ＲＢＰ、ＳＣＣ及びＡＡＴを、７種ターミナルノードを持つバイオマーカー群として同定した（図１参照）。全体として、この樹木解析は、４４／５０（８８％）の肺癌血清及び４１／５０（８２％）の非肺癌血清を正しく分類した（感度８９．３％、特異性８４．７％）。ターミナルノード４、５及び７において、６８％（３４／５０）が肺癌症例と仕分けされ、他方６％（３／５０）が対照例に仕分けされた。従って、もしある患者がこれらのターミナルノードの一つに区分けされたら、肺癌羅患確率は９２％（３４／３７）であった。７種ターミナルノードの各々に対する肺癌羅患率を表４に示す。
【００７０】
表４：分類回帰樹木法（ＣＡＲＴ）解析による患者の分類
【表４】
2010528265.tif 000006
【００７１】
実施例６
４血清マーカーのバイオマーカー群のテストセットによる検証
真の診断結果を知ることなしに、新しく肺癌と診断された患者から得た４９人分の血清試料と年齢及び性別を合わせた対照群から得た４８人分の血清試料とから成る９７人分の患者のバイオマーカーデータの独立したセットについて（実施例２参照）、図１と同じ樹木解析をテストした。各試料は、練習用セットの解析由来の悪性疾患羅患率と関係する、ターミナルノードに区分された。
樹木解析は、３５／４９（７１．４％）の肺癌血清及び３２／４８（６６．７％）の非肺癌対照血清を正しく分類した（感度７７．８％、特異性７５．４％）。ターミナルノード４、５及び７では（図１）、５７％（２８／４９）が肺癌に仕分けられ、他方６％（３／４８）のみが対照例に仕分けられた。もし、患者が、これらのノードの一つに区分けされると、この患者は９０％（２７／３０）の確率で肺癌に羅患する。７種のターミナルノードの各々に対する肺癌羅患率を表４に示す。
図２Ａに示すように、病期分類Ｉ患者の６２％（１０／１６）、病期分類ＩＩ患者の６６％（２／３）、病期分類ＩＩＩ患者の６３％（１２／１９）の及び病期分類ＩＶ患者の１００％（１１／１１）が肺癌ノードに正しく区分けられた。ターミナルノードによる組織型の分布を、図２Ｂに示す。
【００７２】
テストセットによる正しい分類率は、練習用セットにおけるものより低いが、テストセットにおいて、個々のノードの血清を分類することができる能力は変化する。表４に示したように、ノード１、５及び７は、練習用セットと比べてテストセットにおいて同等によく、又はより良く機能した。総合して、これら３種のノードは、テストセットにおける２０／２４（８３％）の非肺癌血清及び２１／２５（８４％）の癌血清を正しく分類した。ノード２、３、４び５は、練習用セットで良く機能し、テストセットでは３５〜７０％の正しい分類率を示した。練習用及びテストセットの両者において観察された最も正確なノードは、癌胎児抗原（ＣＥＡ）濃度のみ、又はレチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）との組合せで決定された。これら２種のバイオマーカーは、本明細書で開示した肺癌血清診断テストの幾つかの実施態様の基礎として役立つことができる。
【００７３】
参考文献
1. Mountain, C. F. Revisions in the International System for Staging Lung Cancer. Chest, 111: 1710-1717., 1997. 
2. Swensen, S. J., Jett, J. R., Hartman, T. E., Midthun, D. E., Mandrekar, S. J., Hillman, S. L., Sykes, A. M., Aughenbaugh, G. L., Bungum, A. O., and Allen, K. L. CT screening for lung cancer: five-year prospective experience. Radiology, 235: 259-265, 2005. 
3. Sone, S., Li, F., Yang, Z. G., Honda, T., Maruyama, Y., Takashima, S., Hasegawa, M., Kawakami, S., Kubo, K., Haniuda, M., and Yamanda, T. Results of three-year mass screening programme for lung cancer using mobile low-dose spiral computed tomography scanner. Br J Cancer, 84: 25-32, 2001. 
4. Manser, R., Dalton, A., Carter, R., Byrnes, G., Elwood, M., and Campbell, D. A. Cost-effectiveness analysis of screening for lung cancer with low dose spiral CT (computed tomography) in the Australian setting. Lung Cancer, 48: 171-185, 2005. 
5. Mahadevia, P. J., Fleisher, L. A., Frick, K. D., Eng, J., Goodman, S. N., and Powe, N. R. Lung cancer screening with helical computed tomography in older adult smokers: a decision and cost-effectiveness analysis. Jama, 289: 313-322, 2003. 
6. Gabay, C. and Kushner, I. Acute-phase proteins and other systemic responses to inflammation. N Engl J Med, 340: 448-454, 1999. 
7. Wang, M. Z., Howard, B., Campa, M. J., Patz, E. F., Jr., and Fitzgerald, M. C. Analysis of human serum proteins by liquid phase isoelectric focusing and matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry. Proteomics, 3: 1661-1666, 2003. 
8. Ljujic, M., Nikolic, A., Divac, A., Djordjevic, V., and Radojkovic, D. Screening of alpha-1-antitrypsin gene by denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). J Biochem Biophys Methods, 68: 167-173, 2006. 
9. Zelvyte, I., Wallmark, A., Piitulainen, E., Westin, U., and Janciauskiene, S. Increased plasma levels of serine proteinase inhibitors in lung cancer patients. Anticancer Res, 24: 241-247, 2004. 
13 10. Molina, R., Agusti, C., Mane, J. M., Filella, X., Jo, J., Joseph, J., Gimenez, N., Estape, J., and Ballesta, A. M. CYFRA 21-1 in lung cancer: comparison with CEA, CA 125, SCC and NSE serum levels. Int J Biol Markers, 9: 96-101, 1994. 
11. Schneider, J. Tumor markers in detection of lung cancer. Adv Clin Chem, 42: 1-41, 2006. 
12. Breiman, L., Friedman, J., Olshen, R., Stone, C. Classification and Regression Trees. Pacific Grove, CA: Wadsworth, 1984. 
13. Steinberg, D., Golovnya, M., and Tolliver, D. In: CART for Windows User Guide. San Diego, CA: Salford Systems, 2002. 
14. Tas, F., Aydiner, A., Topuz, E., Yasasever, V., Karadeniz, A., and Saip, P. Utility of the serum tumor markers: CYFRA 21.1, carcinoembryonic antigen (CEA), and squamous cell carcinoma antigen (SCC) in squamous cell lung cancer. J Exp Clin Cancer Res, 19: 477-481, 2000. 
15. Kulpa, J., Wojcik, E., Reinfuss, M., and Kolodziejski, L. Carcinoembryonic antigen, squamous cell carcinoma antigen, CYFRA 21-1, and neuron-specific enolase in squamous cell lung cancer patients. Clin Chem, 48: 1931-1937, 2002. 
16. Marcus, P. M., Bergstralh, E. J., Fagerstrom, R. M., Williams, D. E., Fontana, R., Taylor, W. F., and Prorok, P. C. Lung cancer mortality in the Mayo Lung Project: impact of extended follow-up. J Natl Cancer Inst, 92: 1308-1316, 2000. 
17. Bach, P. B., Jett, J. R., Pastorino, U., Tockman, M. S., Swensen, S. J., and Begg, C. B. Computed tomography screening and lung cancer outcomes. Jama, 297: 953-961, 2007. 
18. Henschke, C. I., Yankelevitz, D. F., Libby, D. M., Pasmantier, M. W., Smith, J. P., and Miettinen, O. S. Survival of patients with stage I lung cancer detected on CT screening. N Engl J Med, 355: 1763-1771, 2006. 
19. Patz, E. F., Jr., Goodman, P. C., and Bepler, G. Screening for lung cancer. N Engl J Med, 343: 1627-1633, 2000. 
20. Patz, E. F., Jr. Lung cancer screening, overdiagnosis bias, and reevaluation of the Mayo Lung Project. J Natl Cancer Inst, 98: 724-725, 2006. 
21. Petersen, R. P., Campa, M. J., Sperlazza, J., Conlon, D., Joshi, M. B., Harpole, D. H., Jr., and Patz, E. F., Jr. Tumor infiltrating Foxp3+ regulatory T-cells are associated with recurrence in pathologic stage I NSCLC patients. Cancer, 107: 2866-2872, 2006. 
22. Zhong, L., Coe, S. P., Stromberg, A. J., Khattar, N. H., Jett, J. R., and Hirschowitz, E. A. Profiling tumor-associated antibodies for early detection of non-small cell lung cancer. J Thorac Oncol, 1: 513-519, 2006. 
23. Welsh, T. J., Green, R. H., Richardson, D., Waller, D. A., O'Byrne, K. J., and Bradding, P. Macrophage and mast-cell invasion of tumor cell islets confers a marked survival advantage in non-small-cell lung cancer. J Clin Oncol, 23: 8959-8967, 2005. 
24. Condeelis, J. and Pollard, J. W. Macrophages: obligate partners for tumor cell migration, invasion, and metastasis. Cell, 124: 263-266, 2006. 
【００７４】
本明細書に開示した本発明の様々な詳細を、本発明の範囲から逸脱することなく、変更することが可能であることは理解されるであろう。更に、上記の記載は、本発明を説明するためのものであって、本発明を制限することを意図するものではない。
【図１】
2010528265.tif 000007
【図２Ａ】
2010528265.tif 000008
【図２Ｂ】
2010528265.tif 000009
【国際調査報告】
2010528265.tif 000010
2010528265.tif 000011
2010528265.tif 000012