(57)【要約】閉鎖環境において、生物学的分析を実行するためのデバイス、容器、及び方法を提供する。例示的な生物学的分析としては、高密度核酸増幅及び検出、並びにイムノＰＣＲがあげられる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
閉鎖系において、試料に対して複数の反応を実行するための容器であって
試料を受け取るためのチャネル、
各々１又はそれ以上の試薬を含み、流動的にチャネルに連結されている複数の高密度反応ウェル、及び
高密度反応ゾーンへの試料の導入に際して、高密度反応ウェル間の交差混入を最小限にするバリア層
を含む高密度反応ゾーンを含む、前記容器。
【請求項２】
高密度反応ウェルに対して加圧して、複数の各ウェル中に試料の部分を密封することができる可動層を含む、請求項１記載の容器。
【請求項３】
試料が流体であり、かつ、バリア層が反応ウェルあたり１又はそれ以上の穿孔がある穿孔層であり、前記穿孔は、力の存在下で流体試料が通過できるほど大きいが、力の非存在下では流体試料が実質的に通過させないほど小さい、請求項１記載の容器。
【請求項４】
力が各高密度反応ウェルにおいて真空である、請求項３記載の容器。
【請求項５】
バリア層が、試薬を条件的に放出する化学的バリアである、請求項１記載の容器。
【請求項６】
試薬が各ウェルにおいて乾燥して提供され、かつ、化学的バリアが比較的緩慢に溶解し、かつ、試薬の再水和を遅らせる、請求項５記載の容器。
【請求項７】
化学層が保存温度では固形又はゲルである物質であるが、サーマルサイクリング温度では液体である、請求項５記載の容器。
【請求項８】
複数の高密度反応ウェルが、少なくとも５０の高密度反応ウェルを含む、請求項１記載の容器。
【請求項９】
複数の高密度反応ウェルが、少なくとも１２０の高密度反応ウェルを含む、請求項１記載の容器。
【請求項１０】
複数の高密度反応ウェルが、少なくとも４００の高密度反応ウェルを含む、請求項１記載の容器。
【請求項１１】
試薬がＰＣＲプライマー対を含む、請求項１記載の容器。
【請求項１２】
１のウェルが、対照核酸及び対照核酸を増幅するように設定されたプライマー対を含有し、かつ、少なくとも１の他のウェルが、同じプライマーを含有するが対照核酸を含有しない、請求項１１記載の容器。
【請求項１３】
対照核酸が合成核酸である、請求項１２記載の容器。
【請求項１４】
複数の高密度反応ウェルの各々がＰＣＲプライマーの異なる対を含有する、請求項１記載の容器。
【請求項１５】
試料を容器内に導入するための試料注入ポート、
試料注入ポートに流動的に連結されている、試料中に存在する細胞又は胞子を溶解するように設定された細胞溶解ゾーン、
細胞溶解ゾーンに流動的に連結されている、核酸を精製するように設定された核酸調製ゾーン、及び
核酸調製ゾーン及び高密度反応ゾーンに流動的に連結されており、試料の第１段階増幅のために設定された第１段階反応ブリスターを含む、第１段階反応ゾーン
をさらに含む、請求項１４記載の容器。
【請求項１６】
試料中の核酸を増幅する方法であって、以下の：
高密度反応ゾーンがある容器を提供する工程であり、前記高密度反応ゾーンは以下の：
試料を受け取るためのチャネル、
各々１対のＰＣＲプライマーを含み、流動的にチャネルに連結されている複数の高密度反応ウェル、及び
高密度反応ゾーンへの試料の導入に際して、高密度反応ウェル間のＰＣＲプライマー対の交差混入を最小限にするバリア層
を含み；
チャネルを介して高密度反応ゾーン内に試料を注入する工程；
各高密度反応ウェルに試料の部分を導入する工程；
高密度反応ウェル中の試料の部分を密封する工程；並びに、
高密度反応ゾーンをサーマルサイクリングするする工程；
を含む、前記方法。
【請求項１７】
バリア層が反応ウェルあたり１又はそれ以上の穿孔がある穿孔層であり、前記穿孔は、力の存在下で流体試料が通過できるほど大きいが、力の非存在下では流体試料が実質的に通過させないほど小さい；
力が各反応ウェルに提供される真空であり；かつ、
試料の部分が穿孔を通じて各反応ウェル内に導入される；
請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
バリア層が、試薬を条件的に放出する化学的バリアであり、かつ、
化学的バリアから試薬が放出される前に、試料の部分が各反応ウェル内に密封される、
請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
試料中の核酸を検出する方法であって、以下の：
容器を提供する工程であって、前記容器には以下の：
フレキシブルな第１段階増幅ブリスターを含む複数の流動的に連結された反応チャンバー、並びに複数の第２段階ウェル及び交差混入を防止するためのバリア層を含む高密度アレイであって、各第２段階ウェルが試料中に存在しうる異なる標的核酸を増幅するように設定されたプライマー対を含有する、前記高密度アレイ、並びに
容器外部からのみ反応ブリスターへアクセスできるように、反応チャンバーに流動的に連結された１又はそれ以上の密封可能ポート
があり；
第１の密封可能ポートを介して容器内に試料を注入する工程で、かつ、試料注入の後に第１のポートを密封する工程；
標的を増幅するように設定された複数のプライマー対を含むＰＣＲ反応成分と、試料中の核酸とを混合する工程；
第１段階増幅ブリスター中で核酸をサーマルサイクリングする工程で、第１段階増幅混合物を生成する工程；
第２段階ウェル各々に、第１段階増幅混合物の部分を移動させる工程；
各第２段階ウェル内に、第１段階増幅混合物の各部分を密封する工程；
第２段階反応チャンバー中で核酸をサーマルサイクリングする工程で、第２段階増幅産物を生成する工程；かつ、
どの第２段階反応チャンバーが第２段階増幅産物を含有するかを検出する工程；
を含む、前記方法。
【請求項２０】
それぞれの各標的について、第２段階プライマー対が、その対応する第１段階プライマー対内で入れ子になっている（ｎｅｓｔｅｄ）、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
第１段階サーマルサイクリング工程が対数期に到達する前に終結し、かつ、第２段階サーマルサイクリング工程が対数期に進行する、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
移動工程が、第１段階増幅ブリスターに加圧して、第１段階増幅混合物を第１段階増幅ブリスターの外に出して第２段階増幅チャンバー内に入れる工程を含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２３】
検出工程が、第２段階反応チャンバー中の蛍光色素からの蛍光放出を検出する工程を含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２４】
高密度アレイが、複数の別の第２段階ウェルを含み、前記別の第２段階ウェルの１つが、対照核酸及び対照核酸を増幅するように設定されたプライマー対を含有し、かつ、少なくとも１の他の別のウェルは、同じプライマーを含有するが対照核酸を含有しない、請求項１９記載の方法。
【請求項２５】
対照核酸が合成核酸である、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
検出工程の後に、第２段階増幅ウェルが開封され、かつ、第２段階増幅ウェルの全ての内容物が混合される、請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
第２段階増幅ウェルの内容物が、他の反応チャンバーの内容物と混合される、請求項２６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の所有権
本発明は、米国国立衛生研究所により付与された助成金番号Ｕ０１ＡＩ０６１６１１号及びＲ４３ＡＩ０６３６９５号で、政府の援助を得て行われた。政府は本発明において、特定の権利がある。
【背景技術】
【０００２】
米国、カナダ、及び西欧では、感染性疾患はヒト死亡率のおよそ７％を占める一方、発展途上地域では、感染性疾患はヒト死亡率の４０％以上を占める。感染性疾患は、多様な臨床的徴候を招く。一般的な明白な徴候には、熱、肺炎、髄膜炎、下痢、及び血液含有下痢がある。身体的徴候により、何らかの病原体が示唆され、そして他のものが病原因子としては排除される一方、多様な潜在的原因因子が残り、そして明白に診断するには、しばしば、多様なアッセイを行わなければならない。病原体を診断するための伝統的な微生物学技術は、数日又は数週間かかる場合もあり、適当な治療過程が遅れる場合がある。
【０００３】
近年、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が感染性因子の迅速な診断のために選択される方法となっている。ＰＣＲは、感染性疾患を診断する、迅速、高感度、かつ特異的なツールでありうる。診断の主な手段としてＰＣＲを用いる際、多様な原因生物が存在する可能性があり、かつ病理標本のいくつかは、存在する生物が低レベルである点で困難である。大部分が陰性であると予想される場合に、各々の可能性のある原因生物に関して１つずつ、大規模な一連のＰＣＲアッセイを実行するのは非現実的な場合がある。病原体核酸が低濃度であり、かつ適当な反応鋳型を収集するために多量の試料が必要な場合、問題は悪化する。可能性のある原因因子全てについてアッセイするのが不適当な試料がある場合がある。解決法は、単一の反応で、多数の標的について同時に試料をアッセイする「多重ＰＣＲ」を行うことである。多重ＰＣＲはいくつかの系では価値があることが証明されているが、高レベル多重反応の安定性に欠き、かつ多数の産物の明確な分析が困難である。当該問題を解決するため、その後、アッセイを多数の二次ＰＣＲに分割してもよい。初代産物内で二次反応を入れ子にする（ｎｅｓｔｉｎｇ）と安定性が高まる。しかし、この他の処理は高価である場合もあり、かつ、混入又は他の問題が生じうる。
【０００４】
同様に、イムノＰＣＲ（「ｉＰＣＲ」）は、非常に多様な抗原の高感度検出のための潜在能力がある。しかし、ｉＰＣＲには伝統的ＥＬＩＳＡ技術が適用されており、ｉＰＣＲは、ＰＣＲに基づく検出法を用いる場合に問題となる混入の問題がおこる場合がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、生物学的分析において、混入の多様な問題に取り組む。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
したがって、生物を含む多数の生物学的物質に関して同時にアッセイする迅速高感度アッセイを提供する。内蔵系は、内蔵形式の安価な使い捨てプラスチックパウチを例示的に使用し、例として混入を最小限にして、そして頑強な増幅を提供しつつ、入れ子ＰＣＲ及び他の手段が生物分子を同定するのを可能にする。
【０００７】
したがって、本発明の１の側面では、閉鎖系において、試料に対して２段階増幅を実行するための容器を提供し、該容器は、試料の第１段階増幅のために設定された第１段階反応ブリスターを含む第１段階反応ゾーン、第１段階反応ブリスターに流動的に連結された他のリザーバー、試料に他の流体を提供するように設定された他のリザーバー、及び第１段階反応ゾーンに流動的に連結された第２段階反応ゾーンを含み、該第２段階反応ゾーンは複数の第２段階反応チャンバーを含み、各第２段階反応チャンバーは試料の他の増幅のために設定されたプライマー対を含む。１の例示的例では、第１段階反応ゾーンは第１段階ＰＣＲ増幅ゾーンである。別の例示的な例では、第１段階反応ゾーンはイムノＰＣＲのための抗原結合ゾーンであり、この中で、試料中に存在する抗原が認識され、そして特定の核酸セグメントと会合し、そして第２段階反応ゾーンは核酸増幅ゾーンである。さらに別の例示的な例では、容器はさらに、試料中に位置する細胞又は胞子を溶解するための粒子を含む細胞溶解ゾーン、及び核酸を精製するための成分を含む核酸調製ゾーンをさらに含む。例として、ブリスターは、個々のブリスターに加圧するとブリスターが崩壊して、内容物がブリスターから押し出されるような、フレキシブルな材料を含む。
【０００８】
本発明の別の側面では、複数のチャネルを介して流動的に連結されている複数のブリスターを有するフレキシブルな部分、及び複数のリザーバーであって、各リザーバーが反応成分を含有し、各リザーバーが複数のブリスターの少なくとも１つに流動的に連結されている、前記リザーバー、及び試料を受け取るように設定され、複数のブリスターの１つに流動的に連結されている密封可能ポートを含む容器を提供する。１の例示的な態様では、反応成分は乾燥型であり、容器はさらに、複数のリザーバーの各々に流動的に連結された第２の密封可能ポートを含み、該ポートは反応成分を再水和するための水を受け取るよう設定されている。
【０００９】
本発明の他の側面では、試料中の細胞を溶解するための方法であって、細胞溶解ブリスターを含むフレキシブルな容器を提供し、細胞を細胞溶解ブリスター内に導入し、ブリスターに力を適用して粒子及び試料を移動させて、高速衝撃を生じて溶解物を生じる工程を含む、前記方法を提供する。
【００１０】
本発明のさらに別の側面では、核酸の存在に関して試料を分析するためのデバイスを提供し、該デバイスは、その中に本発明の容器、容器の多様なブリスターに対応して位置し、各々、容器の対応するブリスターに加圧するように設定された複数のアクチュエーター、ブリスターの１の内容物をサーマルサイクリングするように設定された第１のヒーター／クーラーデバイス、及び第２段階チャンバーをサーマルサイクリングするための第２のヒーター／クーラーを受け取るように設定されている。
【００１１】
本発明のさらに別の側面では、方法を提供する。１の例示的な方法では、核酸を増幅する。別の例示的な方法では、イムノＰＣＲを用いて抗原を検出する。
【００１２】
本発明の他の側面では、チャネル、チャネルに流動的に連結され各々１又はそれ以上の試薬を含む、複数の高密度反応ウェル、及び高密度反応ゾーンへの試料の導入に際して、高密度反応ウェル間の交差混入を最小限にするバリア層を含む、高密度反応ゾーンを提供する。バリア層は、物理的層、例示的には、穿孔を通じて試料を移動させる力が存在しない場合は、穿孔を通じる流れを最小限にする穿孔層であってもよい。あるいは、バリアは、ウェルが密封されうるまで、ウェル中に試薬を維持する化学的バリアであってもよい。
【００１３】
本発明の他の特徴は、現在知覚されるような、本発明を実行する最適な様式を例示する好ましい態様の以下の詳細な説明を考慮すれば、当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本発明の１の態様によるフレキシブルパウチを示す。
【図２】図２は、図１記載のフレキシブルパウチの細胞溶解ゾーンの態様を示し、図２ａは、図２に示す細胞溶解ゾーンに対応するブラダーの部分の態様を示し、図２ｂは、別のボルテックス機構を有する、図１記載のフレキシブルパウチの細胞溶解ゾーンの態様を示す。
【図３】図３は、図１記載のフレキシブルパウチの核酸調製ゾーンの態様を示す。
【図４】図４は、図１記載のフレキシブルパウチの第１段階増幅ゾーンの態様を示す。
【図５】図５は、パウチの別の態様を示している以外、図１同様であり、図５ａは、図５のパウチの装備の断面図であり、図５ｂは、図５のパウチの部分の拡大図である。
【図６】図６は、パウチの別の代替態様の斜視図であり、図６ａは、図６のパウチの装備の断面図である。
【図７】図７は、図６のパウチと共に用いるための例示的なブラダー構成要素を示す。
【図８】図８は、図６のパウチを含む、図６のパウチと共に用いるための装置の分解斜視図である。
【図９】図９は、図７のブラダー構成要素を含む、図８の装置の部分的断面図を示し、図６のパウチを影に示す。
【図１０】図１０は、図６のピンチバルブ及びパウチ用の多様なブラダーを含む、図８の装置の部分的断面図を示す。
【図１１】図１１は、ＥＬＩＳＡ及びイムノＰＣＲのスキームを示し、二次抗体（Ａ）；捕捉抗体（Ｃ）；酵素（Ｅ）；レポーター抗体（Ｒ）；二重官能性結合部分（Ｓ）及び抗原（Ｔ）である。
【図１２】図１２は、イムノＰＣＲ用に設定されたパウチを示している以外、図６同様である。
【図１３】図１３は、ＰＣＲ及びイムノＰＣＲの両方のために設定されたパウチを示している以外、図６同様である。
【図１４】図１４は、図５のパウチ中で溶解して増幅した試料の第２段階増幅由来の増幅曲線を示す。
【表１】
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【図１５】図１５は、第２段階高密度アレイを有するパウチを示している以外、図６同様であり、図１５ａは、図８の装置の構成要素の修飾を示す。図１５のパウチと共に用いるように設定されたモーターを含めて、支持体メンバーが提供されている。
【図１６】図１６は、図１５の第２段階高密度アレイの分解斜視図である。
【図１７】図１７は、第２段階高密度アレイの構築中を示す、図１５の第２段階高密度アレイの底面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書記載の内蔵型核酸分析パウチを用いて、多様な生物学的物質、例として抗原及び核酸配列の存在を、例として単一閉鎖系において、試料をアッセイすることができる。１の態様では、パウチを用いて、多数の病原体をアッセイする。例として、場合によっては使い捨てパウチ中で、核酸調製、一次大量多重ＰＣＲ、一次増幅産物の希釈、及び二次ＰＣＲを含み、リアルタイム検出及び／又は融解曲線分析等の増幅後分析に及ぶ、多様な工程を実行してもよい。しかし、病原体検出は、１の例示的な使用にすぎず、他の核酸分析、又は、ペプチド、毒素、及び小分子を含むがこれらに限定されない他の物質の検出にパウチを用いてもよいことが理解される。さらに、本発明のパウチでは、多様な工程を実行できるが、特定の用途のために１又はそれ以上の工程を省いてもよく、そしてパウチ設定はそれにより改変できることが理解される。
【００１６】
ＰＣＲは、本明細書の実施例で用いられる増幅法であるが、プライマーを用いる任意の増幅法が適当でありうることが理解される。適当な方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；鎖置換増幅（ＳＤＡ）；核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）；カスケードローリングサークル増幅（ｃａｓｃａｄｅ  ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＣＲＣＡ）；ＤＮＡのループ仲介等温増幅（ＬＡＭＰ）；核酸の等温及びキメラプライマー開始増幅（ＩＣＡＮ）；標的に基づくヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）；転写仲介増幅（ＴＭＡ）等があげられる。したがって、用語ＰＣＲを用いる場合、他の代替増幅法が含まれることを理解すべきである。それによりプロトコルを調製する必要がありうることが理解される。
【００１７】
図１は、例示的な内蔵核酸分析パウチ１０を示す。パウチ１０には、細胞溶解ゾーン２０、核酸調製ゾーン４０、第１段階増幅ゾーン６０、及び第２段階増幅ゾーン８０がある。核酸を含有する試料を試料注入ポート１２を介してパウチ１０内に導入する。パウチ１０は、多様なチャネル及び多様なサイズのブリスターを含み、試料が系を通じて流動するように配置されている。試料は多様なゾーンを通過することによりプロセシングされる。
【００１８】
試料プロセシングは、パウチ１０内に位置する多様なブリスター中で起こる。プロセシングゾーン内及び当該ゾーン間で試料を移動させるための多様なチャネルが提供される一方、試料に流体及び試薬を送達するか、又は当該流体及び試薬を試料から除去するための他のチャネルを提供する。パウチ１０内の液体は、以下に記載するように、例として圧、例として空気圧によりブリスター間を移動するが、パウチ内で物質を移動させる他の方法が意図される。
【００１９】
例として、パウチ１０は、押出、プラズマ蒸着、及びラミネート加工を含む当該技術分野で公知の任意のプロセスで作製できる、ポリエステル、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリメチルメタクリレート、並びに当該混合物等の二層のフレキシブルプラスチックフィルム又は他のフレキシブルな材料で形成されるが他の容器を用いてもよい。金属ホイル又はアルミニウムラミネート加工を伴うプラスチックもまた用いてよい。共に密封してブリスター及びチャネルを形成できる他のバリア材料が当該技術分野で公知である。プラスチックフィルムを用いる場合、例として熱密封等で、層を共に結合させてもよい。例として、物質には低核酸結合能がある。
【００２０】
蛍光モニターを用いる態様に関しては、作動波長で、吸光度及び自己蛍光が適当に低いプラスチックフィルムが好ましい。当該材料は、異なるプラスチック、異なる可塑化剤、及び混成比、並びに異なるフィルム厚を試すことにより同定できる。アルミニウム又は他のホイルラミネート加工を伴うプラスチックに関しては、蛍光検出デバイスにより読み取られるパウチ部分を、ホイルなしにしてもよい。例えば、パウチ１０の第２段階増幅ゾーン８０のブリスター８２中で蛍光をモニターする場合、ブリスター８２の一方又は両方の層を、ホイルなしにしてもよい。ＰＣＲの例では、約０．００４８インチ（０．１２１９ｍｍ）厚のポリエステル（Ｍｙｌａｒ、Ｄｕｐｏｎｔ、デラウェア州ウィルミントン）及び０．００１〜０．００３インチ（０．０２５〜０．０７６ｍｍ）厚のポリプロピレンフィルムで構成されるフィルムラミネートがよく機能する。例として、パウチ１０は、入射光のおよそ８０％〜９０％を透過できる透明材料で作製される。
【００２１】
例示的な態様では、ブリスター及びチャネルに対して、圧、例として空気圧を適用することにより、ブリスター間で物質を移動させる。したがって、空気圧を用いる態様では、パウチ材料は、例として、空気圧が所望の効果を奏することができる程度に十分にフレキシブルである。用語「フレキシブル」は、本明細書でパウチの材料の物理的性質を記載するのに用いられる。用語「フレキシブル」は、亀裂、破壊、ひび割れ等なく、本明細書で用いる空気圧レベルで容易に変形できるものと定義される。例えば、Ｓａｒａｎ（商標）ラップ及びＺｉｐｌｏｃ（登録商標）バッグ等の薄いプラスチックシート、並びにアルミニウムホイル等の薄い金属ホイルはフレキシブルである。しかし、空気圧を用いる態様でさえも、フレキシブルでなければならないのはブリスター及びチャネルの特定の領域のみである。さらに、ブリスター及びチャネルが容易に変形できれば、フレキシブルでなければならないのはブリスター及びチャネルの１の側面のみである。パウチ１０の他の領域は、剛性材料で作製されていてもよいし、又は剛性材料で補強されていてもよい。
【００２２】
例として、パウチ１０用にプラスチックフィルムを用いる。金属、例としてアルミニウムのシート、又は他の適当な材料を圧延するか又は別の方式で切断して、盛り上がった表面パターンがあるダイスを生成する。例として１９５℃の作動温度で制御された、空気圧プレス（例としてＡ−５３０２−ＰＤＳ、Ｊａｎｅｓｖｉｌｌｅ  Ｔｏｏｌ  Ｉｎｃ．、ウィスコンシン州ミルトン）に適合させる場合、空気圧プレスは印刷機のように機能し、ダイスがフィルムに接触している箇所のみ、プラスチックフィルムの密封表面を融解する。パウチ１０が形成されるにつれて、ＰＣＲプライマー（例としてフィルム上にスポッティングして乾燥させたもの）、抗原結合性支持体、磁気ビーズ、及びケイ酸ジルコニウムビーズ等の多様な構成要素を多様なブリスター内部に密封してもよい。集合的に又は別に、密封前に試料プロセシング用の試薬をフィルム上にスポッティングしてもよい。１の態様では、ポリメラーゼ及びプライマーとは別に、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）をフィルム上にスポッティングして、反応が水性試料により水和されるまで、ポリメラーゼの活性を本質的に排除する。水性試料が水和前に加熱されると、これは真のホットスタートＰＣＲのための条件を生成して高価な化学的ホットスタート成分の必要性を軽減するか又は排除する。この別のスポッティングを、図５ｂについて、以下にさらに記載するが、当該スポッティングを、本明細書に記載する任意の態様で用いてよいことが理解される。
【００２３】
空気圧を用いてパウチ１０内の材料を移動させる場合、１の態様では「ブラダー」を用いてもよい。その一部を図２ａに示すブラダー・アセンブリー７１０は、パウチ作製と類似のプロセスで製造できるが、ブラダー・アセンブリー７１０中の個々のブリスターには、ブラダー・アセンブリー７１０内の個々のブラダーが圧縮ガス供給源により加圧できる、空気圧装備（例として装備７２４ａ）が含まれる。ブラダー・アセンブリーは圧縮ガスに供され、ブラダー・アセンブリーは、多数回用いるため、パウチよりも堅牢であるか又は厚い材料で作製されてもよい。あるいは、ブラダーは、ガスケット、シール、バルブ、及びピストンで共に固定された一連のプレートから形成されてもよい。その他の配置は本発明の範囲内である。
【００２４】
パウチ１０を装置内に置く場合、空気圧ブラダー・アセンブリー７１０は、パウチ１０の１の面に対して押しつけられ、特定のブラダーが膨張すると、圧により液体がパウチ１０中の対応するブリスターから外に押し出される。パウチ１０のブリスターの多くに対応する空気圧ブラダーに加えて、ブラダー・アセンブリーには、パウチ１０の多様なチャネルに対応する、ブラダー又は空気圧駆動ピストン等の他の空気圧アクチュエーターがあってもよい。活性化された場合、当該他の空気圧アクチュエーターは、対応するチャネルをピンチオフし、閉鎖するピンチバルブを形成する。パウチ１０の特定のブリスター内に液体を閉じ込めるため、ピンチバルブ空気圧アクチュエーターを、ブリスターに出入りするチャネル上で膨張させ、それにより、アクチュエーターは、チャネルをつまんで閉鎖するピンチバルブとして機能する。例として、異なるブリスター中の２体積の液体を混合するため、連結チャネルを密封するピンチバルブ空気圧アクチュエーターを減圧し、そしてブリスター上の空気圧ブリスターを交互に加圧し、ブリスターを連結しているチャネルを通じて、液体を往復させて、中の液体を混合する。ピンチバルブ空気圧アクチュエーターは、多様な形状及びサイズであってもよく、そして一度に１つより多いチャネルをピンチオフするように設定されてもよい。こうした例示的なピンチバルブを、全ての注入ポートを閉鎖するのに用いうるピンチバルブ１６として、図１に例示する。空気圧アクチュエーターは本明細書で記載されるが、リニアステップモーター、モーター駆動性カム、空気、水又は電磁力により駆動される剛性パドル、ローラー、ロッカーアーム、及びある場合、コックト・スプリング（ｃｏｃｋｅｄ  ｓｐｒｉｎｇ）等の多様な電気機械的アクチュエーターを含めて、パウチに加圧する他の方法が意図されることが理解される。さらに、チャネル軸に垂直に加圧することに加えて、可逆的に又は不可逆的にチャネルを閉鎖する、多様な方法がある。これらには、チャネルを覆うバッグをねじること、熱密封、アクチュエーターの回転、並びにバタフライバルブ及びボールバルブ等の、チャネル内に密封された多様な物理的バルブが含まれる。さらに、小さいペルチェ素子又は他の温度制御因子をチャネルに隣接して配置して、液体を凍結するのに十分な温度で設定して、効果的にシールを形成してもよい。また、図１の設計は、自動化装置用に適応し、ブリスター及びチャネル各々の上に位置するアクチュエーター要素を特徴とするが、アクチュエーターが固定されたままでもよく、試料破壊、核酸捕捉、第１及び第２段階ＰＣＲ、並びにイムノアッセイ及びイムノＰＣＲ等のパウチの他の適用を含む、いくつかのプロセシング・ステーション用に、少数のアクチュエーターを用いうるように、パウチを一次元又は二次元で移行させてよいこともまた意図される。チャネル及びブリスターに対して作用するローラーは、パウチをステーション間で平行移動させる設定で、特に有用であることが証明できる。したがって、現在開示する態様では、空気圧アクチュエーターを用いるが、用語「空気圧アクチュエーター」を本明細書で用いる場合、パウチ及び装置の設定に応じて、他のアクチュエーター及���加圧する他の方法を用いてよいことが理解される。
【００２５】
図１に関して、核酸抽出及び多重ＰＣＲ用に設定された、例示的な試料パウチ１０を提供する。試料は、装備９０中の試料注入ポート１２を介して、パウチ１０に入る。インジェクターポート１２は、壊れやすいシール、一方向バルブ、又は他の進入ポートでもよい。パウチ１０内部からの真空を用いて、試料をパウチ１０内に引き入れてもよいし、シリンジ又は他の圧力を用いて、試料をパウチ１０内に押し込んでもよいし、あるいはインジェクターポート１２を介して、パウチ１０内に試料を導入する他の手段を用いてもよい。試料は、チャネル１４を介して、試料中の細胞を溶解する細胞溶解ゾーン２０の三葉ブリスター２２に移動する。試料が三葉ブリスター２２に進入した時点で、ピンチバルブ１６を閉鎖する。すでに閉鎖していてもよいピンチバルブ３６と共に、ピンチバルブ１６の閉鎖は、三葉ブリスター２２中で試料を密封する。細胞溶解は全ての試料で必要ではないことが理解される。当該試料に関しては、細胞溶解ゾーンを省いてもよいし、又は試料を直接次のゾーンに移動させてもよい。しかし、多くの試料では、細胞溶解が必要である。１の態様では、ビーズミリングを用いて細胞を溶解する。
【００２６】
ケイ酸ジルコニウム（ＺＳ）ビーズ３４等の溶解粒子の存在下で試料を振盪するか又はボルテックスすることによるビーズミリングは、溶解物を形成する有効な方法である。本明細書の「溶解する」、「溶解」、及び「溶解物」等の用語は、細胞の破裂に限定されず、当該用語には、ウイルス等の非細胞粒子の破壊が含まれることが理解される。図２は、収束流が高速ビーズ衝撃を生成して溶解物を生成する、細胞溶解ゾーン２０の１の態様を示す。例として、三葉ブリスター２２の２つのより下方の葉２４、２６はチャネル３０を介して連結され、より上方の葉２８は、チャネル３０の反対側３１で、より下方の葉２４、２６と連結される。図２ａは、パウチ１０の細胞溶解ゾーン２０と接触するブラダー・アセンブリー７１０の対応する部分を示す。パウチ１０を装置中に入れると、パウチ１０上の各葉２４、２６、２８に隣接するのは、ブラダー・アセンブリー７１０中の対応する空気圧ブラダー７２４、７２６、７２８である。用語「隣接する」は、パウチ中のブリスター又はチャネル及びそれに対応する空気圧アクチュエーター間の関係を示す場合、パウチが装置内に配置された場合のブリスター又はチャネル及び対応する空気圧アクチュエーター間の関係を示す。１の態様では、より下方の葉２４、２６に隣接する２つのより下方の空気圧ブラダー７２４、７２６の空気圧装備７２４ａ、７２６ａが、共に配管される。空気圧装備７２４ａ、７２６ａ、及びより上方の葉２８に隣接するより上方の空気圧ブラダー７２８の空気圧装備７２８ａは、二重作用空気圧シリンダーを駆動するように設定された電気的に作動されるバルブの反対側に配管される。このように設定されると、圧はより上方の空気圧ブラダー７２８及び２つのより下方の空気圧ブラダー７２４、７２６の間で交互になる。バルブが往復するよう切り替えられると、パウチ１０中の液体がより下方の葉２４、２６及びより上方の葉２８の間で、チャネル３０中の狭いネクサス３２を通じて駆動される。２つのより下方の葉２４、２６は、同時に加圧されるため、流れは収束し、そしてより上方の葉２８内に撃ち込まれる。葉の幾何学に応じて、ネクサス３２でのビーズ３４の衝突速度は、少なくとも約１２ｍ／秒であり、溶解を生じる高衝撃衝突を提供しうる。例示的な三葉系により、細胞破壊が優れ、構造的に頑強になる一方、サイズ及び空気ガス消費は最小限になる。ＺＳビーズを溶解粒子として用いるが、この選択は単なる例示であり、他の材料及び他の形状の粒子を用いてもよいことが理解される。細胞溶解ゾーン２０の他の設定も本発明の範囲内であることもまた理解される。
【００２７】
三葉ブリスターを細胞溶解に用いるが、他の多葉設定が本発明の範囲内にあることが理解される。例えば、四葉ブリスター、例としてクローバーの葉のパターンのものを用いてもよく、反対のブリスターを同時に加圧し、溶解粒子を互いに向かって押し出し、そして次いで、他の２つの葉に角度を変えて、次いでこれらを共に加圧してもよい。当該四葉ブリスターは、両方向に高速衝撃する利点があるであろう。さらに、一葉ブリスターを用いてもよいことが意図され、ここで、溶解粒子は、一葉ブリスターの１の部分から他の部分に迅速に移動する。例えば、空気圧アクチュエーターを用いて、一葉ブリスターの領域を閉鎖し、残りの領域中に多葉ブリスターを一時的に形成してもよい。デバイスの葉に作用する、モーター、空気、水、又は電磁的に駆動されるパドル等の他の作動法もまた用いてもよい。例として、より上方の及びより下方の葉間に再循環手段が提供され、そしてアクチュエーターが蠕動ポンプ作用を提供する場合、ローラー又は回転パドルを用いて、図２のネクサス３２で流体を共に駆動してもよい。他の設定が本発明の範囲内である。
【００２８】
多葉ブリスターを一時的に形成することなく、一葉溶解ブリスター内で、溶解を達成するために十分に迅速に試料及び溶解粒子を移動させることもできる。図２ｂに示す１の当該代替態様では、電気モーター１９に取り付けられた回転ブレード又はパドル２１でパウチに衝撃を与えてボルテックスを達成してもよい。ブレード２１は、溶解ブリスターでパウチに衝撃を与えてもよく、又は溶解ブリスター近傍、例として溶解ブリスターに隣接するエッジ１７で、パウチに衝撃を与えてもよい。当該態様では、溶解ブリスターは、１又はそれ以上のブリスターを含んでもよい。図１５は、１の当該溶解ブリスター５２２を含む態様を示す。図１５ａは、ブレード２１を含むビーズ攪拌モーター１９を示し、これは図８に示す装置８００の第２の支持体メンバー８０４の第１の側面８１１上に備え付けてもよい。しかし、モーター１９は、装置８００の第１の支持体メンバー８０２上又は他の表面上に備え付けてもよい。
【００２９】
図２ａはまた、空気圧装備７１６ａを含む空気圧ブラダー７１６、及び空気圧装備７３６ａを含む空気圧ブラダー７３６も示す。パウチ１０がブラダー・アセンブリー７１０と接触して配置されると、ブラダー７１６はチャネル１２と一致し、ピンチバルブ１６が完成する。同様に、ブラダー７３６はチャネル３８と一致し、ピンチバルブ３６が完成する。空気圧ブラダー７１６及び７３６を作動させると、ピンチバルブ１６及び３６が開放されそして閉鎖されうる。細胞溶解ゾーンに隣接するブラダー・アセンブリー７１０の一部しか示していないが、ブラダー・アセンブリー７１０は、パウチ１０の残りのゾーン全体の流体の移動を制御する空気圧ブリスターに類似の配置を提供することが理解される。
【００３０】
他の先行技術装置で、密封されたフレキシブルな容器内のＰＣＲを解説する。例えば、本明細書に援用される、米国特許第６，６４５，７５８号及び第６，７８０，６１７号、並びに同時係属米国特許出願第１０／４７８，４５３号を参照されたい。しかし、密封されたＰＣＲ容器内に細胞溶解を含めると、特に、試験しようとする試料がバイオハザードを含有しうる場合は、使用の容易さ及び安全性が改善されうる。本明細書に例示する態様では、細胞溶解由来の、並びに他の全ての工程由来の廃棄物は、密封されたパウチ内に残る。しかし、他の試験のため、パウチ内容物を取り除いてもよいことが理解される。
【００３１】
細胞が溶解した時点で、ピンチバルブ３６を開放して、そして図３で最適に見られるように、チャネル３８を通じて溶解物を核酸調製ゾーン４０に移動させ、その後、ピンチバルブ３６を閉鎖し、核酸調製ゾーン４０中で試料を密封する。図３に例示する態様では、核酸の精製は、ビーズミリングされた材料を用いて、シリカに基づく磁気ビーズ５６へのアフィニティー結合を用いて、ビーズをエタノールで洗浄し、核酸を水又は他の流体で溶出して、細胞溶解物から核酸を精製する。核酸抽出に必要な個々の成分は、例として、ブリスター４４、４６、４８中に存し、これらは、試薬混合を可能にするチャネル４５、４７、４９により連結される。溶解物は、チャネル３８からブリスター４４に進入する。ブリスター４４に、磁気ビーズ５６及び適当な結合緩衝液、例として１−２−３（商標）試料調製キット（Ｉｄａｈｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ユタ州ソルトレークシティー）等の高塩緩衝液を提供してもよいし、ブリスター４４に連結された１又はそれ以上のチャネルを通じて、当該成分のどちらか又は両方を続いて提供してもよい。核酸をビーズ５６上で捕捉し、次いでピンチバルブ５３を開放し、そしてブリスター４４及び５８に対して交互に穏やかに加圧して溶解物及びビーズ５６を混合し、次いで、例としてブラダー・アセンブリー７１０上の対応する空気圧ブラダーにより提供される空気圧により、ブリスター５８に移動させてもよい。ブリスター５８に隣接する装置中に位置する引き込み式の磁石５０により、ブリスター５８中で磁気ビーズ５６を捕捉し、そして廃棄物を廃棄物リザーバーに移動させてもよいし、又はブリスター５８に加圧することにより、ブリスター４４に戻してもよい。次いで、ピンチバルブ５３を閉鎖する。ピンチバルブ５５の解除に際して、ブリスター４６から提供される、エタノール、イソプロパノール、あるいは他の有機又は無機洗浄溶液で、磁気ビーズ５６を洗浄する。場合によっては、磁石５０を引っ込めて、ブリスター４６及び５８に交互に加圧して、ビーズを洗浄させることができる。磁石５０により、ブリスター５８中にビーズ５６をもう一度捕捉し、そして溶解物の非核酸部分をビーズ５６から洗い流し、ブリスター４６にまた移動させ、そしてピンチバルブ５５により確保してもよいし、又は別のチャネルを介して廃棄物リザーバーに洗い流してもよい。磁気ビーズを洗浄した時点で、ピンチバルブ５７を開放し、ブリスター４８から水（例として緩衝水）又は別の核酸溶離剤を放出する。再び、磁石５０を引っ込めて、例としてブリスター４８及び５８に交互に加圧して、水及びビーズ５６を最大に混合することができる。ビーズ５６を収集するため、磁石５０を再び配備する。ピンチバルブ５９を解除して、チャネル５２を介して、溶出した核酸を第１段階増幅ゾーン６０に移動させる。次いで、ピンチバルブ５９を閉鎖し、こうして第１段階増幅ゾーン６０中で試料を確保する。
【００３２】
図３に示し、かつ上記のような、核酸調製ゾーン４０の設定は、単なる例示であり、多様な他の設定が本開示の範囲内でありうることが理解される。
【００３３】
本明細書で用いるエタノール、水、及び他の流体を、多様な方式でブリスターに提供してもよい。首が多様なピンチバルブ又は壊れやすい部分によりピンチオフできるブリスター中に流体を保存してもよく、試料調製順序の適当な時期にこれを開放してもよい。あるいは、図５中のパウチ１１０に示すように、パウチ中のリザーバー中に、又は図６のパウチ２１０に関して説明した装備中に、流体を保存して、必要に応じて、チャネルを介して移動させてもよい。さらに別の態様では、特にエタノール注入ポート４１、８８及びプランジャー６７、６８、６９に関して、図１に示すように、外部供給源から流体を導入してもよい。例として、プランジャー６７、６８、６９を、例としてより剛性の材料の、装備９０内に挿入してもよく、本明細書に援用される米国特許出願第１０／５１２，２５５号で、プランジャーを活性化させた場合に、正確に体積を測定した流体を提供してもよい。測定した体積は、各プランジャーで同じでも又は異なってもよい。最後に、さらに別の態様では、１又はそれ以上のブリスター中に保存される流体の測定された体積をパウチに提供してもよく、ここで流体はブリスター内に含有され、例としてブリスター内の小さい密封されたパウチ中で提供され、ブリスター内にブリスターを有効に形成する。適当な時点で、次いで、例として空気圧で密封されたパウチを破裂させて流体をパウチのブリスター内に放出してもよい。装置はまた、流体の通過が一方向バルブで厳密に制御されて、実行中に装置に混入するのを防ぐという条件で、装置及び装備又はパウチ材料間の直接の液体接触を通じて、試薬のいくつか又は全てを提供するように設定されてもよい。さらに、混入ＤＮＡがパウチから拡散するのを防ぐため、場合によっては、パウチ又はその装備が操作後に密封されるのが望ましいであろう。シリンジポンプ等、求めに応じて試薬を提供し、そして有刺装備又はｏリングシール等、装備又はパウチと一時的に流体接触させる多様な手段が公知である。特定の適用で必要により指示されうるように、本明細書で記載のいかなるパウチの態様と共に、流体を適当なブリスターに導入するいかなる方法を用いてもよいことが理解される。
【００３４】
上記のように、入れ子ＰＣＲは、２段階で実行される標的増幅を含む。第１段階では、例としてゲノム又は逆転写鋳型から標的を増幅する。望ましい場合、第１段階増幅をプラトー期前に終結させてもよい。第２段階反応では、第１段階単位複製配列を希釈してもよく、そして二次増幅は同じプライマーを用いるか、又は例として第１段階産物のプライマーに対して内部でハイブリダイズする入れ子プライマーを用いる。入れ子ＰＣＲの利点としては：ａ）最初の反応産物が均質かつ特異的な鋳型を形成し、二次反応で高忠実度が保証され、第１段階反応の効率が比較的低くても、頑強な第２段階反応を補助するのに適した鋳型を生成する；ｂ）異なる入れ子プライマーを用いて元来の増幅鋳型（例としてゲノムＤＮＡ又は逆転写産物）は、二次増幅で有意性が排除される程度まで希釈されうるため、第１段階反応由来の非特異的産物は、第２段階反応と有意に干渉しない；かつｃ）入れ子ＰＣＲは反応多重化がより高次となりうる。第１段階反応には、いくつかの固有の増幅産物のプライマーが含まれうる。次いで、第２段階反応で当該産物を同定する。しかし、第１段階多重性及び第２段階単一性は単なる例示であり、他の設定ができることが理解される。例えば、第１段階は単一対のプライマーを用いて多様な異なる関連単位複製配列を増幅でき、第２段階を用いて、例として融解曲線分析を用いて、単位複製配列間の相違を標的化することもできる。
【００３５】
図１では、核酸試料はチャネル５２を介して、第１段階増幅ゾーン６０に進入してブリスター６１に送達される。ポリメラーゼ（例としてＴａｑポリメラーゼ）、ｄＮＴＰ、及びプライマー、例として多重増幅のための複数のプライマー対を含むＰＣＲ混合物を、ブリスター６１中に提供してもよいし、上記の多様な手段を介して、ブリスター６１内に導入してもよい。あるいはパウチ１０を組み立てる際に、乾燥した試薬をブリスター６１の位置上にスポッティングしてもよく、図１に示すように、例としてプランジャー６８を介して、ブリスター６１に水又は緩衝液を導入してもよい。図４に最適に見られるように、試料はここで、ピンチバルブ５９及び７２により、ブリスター６１中で確保され、例として、装置中に位置し、ブリスター６１と接触するよう設定される熱ブロック又はペルチェ素子により、２以上の温度間でサーマルサイクリングされる。しかし、当該技術分野で公知の、ブリスター６１内に含有される試料を加熱して冷却する他の手段が、本発明の範囲内であることが理解される。サーマルサイクリングのための別の加熱／冷却デバイスの非限定の例としては、ブラダー内の空気循環ブリスターがあるものが含まれ、ブリスター６１に隣接する空気圧ブリスター中の空気が２以上の温度間で周期処理されるか；あるいは本明細書に援用される米国特許出願第１０／４７８，４５３号のような複数の空気圧を例として用いて、あるいはパウチ１０を軸上で平行移動させるか、又はパウチ１０に回転レイアウトを提供し、パウチ１０をスピンさせて、固定した温度の熱ゾーン間で内容物を移動させることにより、試料をブリスター６１内の温度ゾーンに移動させる。
【００３６】
病原体由来の核酸は、かなりの量の宿主核酸と同時に単離される場合がある。当該宿主由来核酸は、プライマーと相互作用して、不要な産物を増幅する場合があり、当該産物は、プライマー、ｄＮＴＰ、及びポリメラーゼ活性を除去して、望ましい産物の供給源を潜在的に枯渇させてしまう。病原性生物由来の核酸は、一般的に存在量が少なく、不要な産物は潜在的な問題である。ゾーン６０の第１段階反応における周期数を最適化して、特異的産物を最大化して非特異的産物を最小限にしてもよい。最適周期数は、約１０〜約３０周期であり、例として約１５〜約２０周期であると予期されるが、特定の標的、宿主、及びプライマー配列に応じて、周期数は多様でありうることが理解される。
【００３７】
第１段階多重増幅後、二次反応部位への流動性輸送の前に、例として不完全ＰＣＲマスターミックス中で、第１段階増幅産物を希釈する。
【００３８】
図４は、３の工程で試料を希釈するための例示的な態様を示す。第１の工程で、ピンチバルブ７２を開放し、試料は、上記のように、ブリスター６２由来の等体積の水又は緩衝液と試料をブリスター６１中で混合して、２倍希釈を経て、ブリスター６２、並びにブリスター６４及び６６に提供される。ブリスター６１、６２間で体積を往復して圧搾すると、完全な混合が提供される。上記のように、ブラダー７１０中で提供され、ブリスター６１、６２に隣接して位置する空気圧ブラダーにより、混合を提供してもよい。空気圧ブラダーを交互に加圧して、液体を往復させてもよい。混合中、ピンチバルブ７４は、隣接するブリスター内への液体の流入を防止する。混合終了時、希釈試料の体積を領域７０中に捕捉し、ピンチバルブ７２を閉鎖し、希釈された試料を領域７０中に密封する。ピンチバルブ７４を開放し、ブリスター６３、６４のいずれか又は両方の中で提供される水又は緩衝液により試料をさらに希釈する。上記のように、ブリスター６３、６４間で体積を往復して圧搾して、混合を提供する。続いて、ピンチバルブ７４を閉鎖し、他の希釈された体積の試料を領域７１中で密封する。最終希釈は、例として、上記のように混合しながらブリスター６５、６６のいずれか又は両方で提供された緩衝液又は水を用いることにより、起こる。例として、この最終希釈は、流体としての不完全ＰＣＲマスターミックス（例えばプライマー以外の全てのＰＣＲ試薬を含有する）を用いて行われる。場合によっては、第２段階増幅前のブリスター６６の内容物を加熱すると、高価な抗体又は酵素を必要とせずに、ホットスタート増幅の利点が提供されうる。しかし、水又は他の緩衝液を最終希釈のために用い、他のＰＣＲ成分が第２段階増幅ゾーン８０中で提供されてもよいことが理解される。例示的な態様は３つの希釈段階を用いるが、適当なレベルの希釈を提供するために、任意の数の希釈段階を用いてもよいことが理解される。領域７０及び７１中に捕捉される試料の体積を調製して希釈量を調節してもよいこともまた理解され、領域７０及び７１に捕捉される試料の量が小さければ小さいほど、希釈量は大きく、又はピンチバルブ７２及び７４及び／又はピンチバルブ７４及び７６を反復して開放しそして閉鎖することにより、領域７０及び／又は領域７１に捕捉される他のアリコットを用いて、希釈量を減少させてもよい。約１０−２〜約１０−５希釈は、多くの適用に適していると予期される。
【００３９】
二次ＰＣＲ反応の成功は、多重第１段階反応で生成される鋳型に依存する。一般的には、高純度のＤＮＡを用いてＰＣＲを行う。フェノール抽出又は商業的ＤＮＡ抽出キット等の方法で高純度のＤＮＡが提供される。パウチ１０を通じてプロセシングされる試料は、純粋でない調製を相殺するように適応させなければならない。ＰＣＲは、生物学的試料の成分で阻害される可能性もあり、潜在的に障害となる。例として、ホットスタートＰＣＲ、より高濃度のｔａｑポリメラーゼ酵素、ＭｇＣｌ２濃度の調製、プライマー濃度の調製、及びアジュバント（ＤＭＳＯ、ＴＭＳＯ、又はグリセロール）の添加は、場合によっては、低純度の核酸を相殺するのに用いてよい。純度の問題は、第１段階増幅で問題になりうるが、第２段階増幅でもまた、類似の調製を提供できることが理解される。
【００４０】
例示的な態様では、パウチの第１段階ＰＣＲ部分のブリスター及びチャネル中に、少量の増幅試料を保持して、希釈及び第２段階試料の調製が達成されるが、当該プロセスはまた、他の方式でも実行できることが理解される。１のこうした例示的な例では、予め増幅した試料を、メンバー中の小さい空洞中に捕捉してもよく、例としてメンバーを平行移動させるか又は回転させると、固定された体積の試料を、第１段階から第２段階ＰＣＲ試薬に移動させることができる。予め増幅された試料の１マイクロリットルの部分を、１００マイクロリットルの新鮮なＰＣＲ試薬と混合すると、濃度が１００倍低下するであろう。この希釈は単なる例示であり、他の体積及び希釈レベルができることが理解される。当該アプローチは、第１段階増幅産物を剛性装備内に押し込み、図１のプランジャー６８又は６９の１つと接触させることにより達成できる。当該態様では、プランジャーは、試料のほんのわずかを、隣接する希釈緩衝液又は第２段階ＰＣＲ緩衝液と接触させるよう、設定されるであろう。同様に、段階間のシールを維持しながら、そして増幅された試料を剛性装備９０内に含有して、スライディング要素を用いて、少量の第１段階増幅産物を第２段階反応混合物と接触させてもよい。
【００４１】
第１段階ＰＣＲ及び希釈の後に、チャネル７８は、二次入れ子ＰＣＲのため、複数の低体積ブリスター８２に試料を移す。１の例示的な態様では、入ってくる水性材料により、第２段階ブリスター中で提供される乾燥プライマーを再懸濁して、反応混合物を完成させる。場合によっては、二重鎖核酸の検出に用いるＬＣＧｒｅｅｎ（登録商標）Ｐｌｕｓ（Ｉｄａｈｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ユタ州ソルトレークシティー）等の蛍光色素を各ブリスター中で提供してもよいし、又は連続希釈終了時に提供される不完全ＰＣＲマスターミックスに添加してもよいが、ＬＣＧｒｅｅｎ（登録商標）Ｐｌｕｓは単なる例示であり、当該技術分野に公知の他の色素が利用できることが理解される。他の任意の態様では、各特異的単位複製配列用に設定された乾燥蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブを、各乾燥プライマーと共に、各第２段階ブリスター中で提供してもよい。さらに、パウチ１０は、混入を減少させるため、全ての反応及び操作を含有するよう設計されているが、ある状況では、各ブリスター８２から増幅産物を除去して、他の分析を行うことが望ましい場合もある。当該技術分野で公知のように、第２段階単位複製配列を検出するための他の手段が本発明の範囲内である。試料をブリスター８２に移した時点で、ピンチバルブ８４及び８６を活性化して、ブリスター８２を閉鎖する。各ブリスター８２は、ここで、特定の標的の増幅に必要な全ての試薬を含有する。例として、各ブリスターは、固有のプライマー対を含有してもよく、又は複数のブリスター８２が同じプライマーを含有し、いくつかの複製増幅を提供してもよい。
【００４２】
本明細書に開示する態様は、第２段階増幅のためのブリスターを使用し、ブリスターは、フレキシブルな部分の残りと同じか又は類似のプラスチックフィルムで形成されることに注目されたい。しかし、多くの態様では、第２段階ブリスターの内容物は、第２段階ブリスターから除去されることはなく、つまり、第２段階反応はフレキシブルなブリスター中で行う必要はない。ブリスターに流動的に連結された複数の剛性、半剛性、又はフレキシブルなチャンバー中で、第２段階反応を行ってもよいことが理解される。チャンバーを連結するフレキシブルなチャネルに対して加圧して、本例のようにチャンバーを密封してもよく、あるいは例として熱密封又は一方向バルブを用いて、他の方式で密封してもよい。本明細書に記載の多様な態様には、廃棄物収集のためにのみ提供されるブリスターが含まれる。廃棄物は除去されないため、剛性、半剛性、又はフレキシブルなチャンバー中で、廃棄物を収集してもよい。
【００４３】
第１段階増幅で用いたものと同一のプライマーを用いて、第２段階増幅を行うことが本発明の範囲内である（米国特許第６，６０５，４５１号を参照されたい）。しかし、第２段階反応では、第１及び第２段階プライマー結合部位間に重複がないか又は重複が最小限であるように、第１段階産物の内部にあるようなプライマーがあることが好都合な場合がある。第１段階産物を希釈すると、元来の鋳型ＤＮＡ及び第１段階試薬の第２段階反応における関与を大部分排除できる。さらに、例として、第１段階で用いるものよりＴｍが高い第２段階プライマーを用いて、入れ子増幅を増強してもよい。有意なヘアピン、ヘテロ／ホモ二量体及び不要なハイブリダイゼーションを回避するように、プライマーを設計してもよい。第２段階プライマーは、入れ子形式のため、単一工程でゲノムＤＮＡから標的を増幅するのに用いるプライマーよりも、有害な相互作用には極めて寛容である。場合によっては、第２段階増幅でホットスタートを用いる。
【００４４】
当該技術分野で公知であるように、例としてｄｓＤＮＡ結合色素として、又は蛍光プローブの一部として、蛍光色素が第２段階増幅に含まれる場合、提供される光学を用いて、１又はそれ以上の試料の増幅をモニターしてもよい。場合によっては、増幅曲線の形状分析を提供して各試料が陽性であるか又は陰性であるかを判定してもよい。試料を判定する例示的な方法は、本明細書に援用される米国特許第６，７３０，５０１号に記載されている。あるいは、交差閾値（ｃｒｏｓｓｉｎｇ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）を用いる方法を用いてもよい。外部、また装置内部にコンピュータを提供してもよいし、方法を実行し、第２段階増幅の存在又は非存在に基づいて試料を陽性又は陰性と判定するようにコンピュータを設定してもよいし、コンピュータは、標準曲線に対して、又は実行内の他の増幅曲線に対して、増幅曲線の特徴的なパラメーター（交差閾値等）を比較することにより、出発鋳型濃度に関する定量的情報を提供してもよい。しかし、当該技術分野で公知の他の方法を用いて、各試料を判定してもよいことは理解される。蛍光情報に対して他の分析を実行してもよい。１の非限定の例は、単位複製配列の適当な融解特性（例えばＴｍ、融解プロフィール形状）を示す、融解曲線分析の使用である。全てのブリスター８２の画像を一度に捕捉するように、提供される光学を設定してもよいし、又は各個々のブリスターに関して、個々の光学を提供してもよい。他の設定が本発明の範囲内にある。
【００４５】
図５は、代替パウチ１１０を示す。この態様では、装備１９０を介して、多様な試薬をパウチ１１０内に装填する。図５ａは、複数のプランジャー１６８の１つを含む装備１９０の断面図を示す。図５ａは図５の態様に示すような進入チャネル１１５ａを通じた断面図を示し、１２の進入チャネルが存在し（進入チャネル１１５ａ〜１１５ｌ）、その各々が装備１９０中で用いるためのそれ自体のプランジャー１６８があってもよいが、この特定の設定では、進入チャネル１１５ｃ、１１５ｆ、及び１１５ｉは使用されないことが理解される。１２の進入チャネルを有する設定は単なる例示であり、そして任意の数の進入チャネル及び関連するプランジャーを用いてよいことが理解される。例示的な態様では、装備１９０の任意の真空ポート１４２が、装備１９０の第１の表面１９４を通じて形成されて、チャンバー１９２と連絡する。任意の真空ポート１４２を、真空又は真空チャンバー（未提示）と連絡するために提供して、パウチ１１０内から空気を吸い取って、パウチ１１０のチャンバー１９２並びに多様なブリスター及びチャンバー内に真空を生成してもよい。次いで、プランジャー１６８をチャンバー１９２内に十分に深く挿入して、真空ポート１４２を密封してもよい。例として、所定量の真空下でチャンバー１９２を提供して、使用に際して、チャンバー１９２内に所望量の体積の液体を引き入れる。チャンバー１９２の調製に関する他の情報は、本明細書ですでに援用されている米国特許出願第１０／５１２，２５５号に見いだされうる。
【００４６】
例示的な装備１９０には、装備１９０の第２の表面１９５中に形成される注入ポート１４１がさらに含まれる。例として、プランジャー１６８を十分に深く挿入して真空ポート１４２を密封する一方、注入ポート１４１を介して、チャンバー１９２へなおアクセスできるように、注入ポート１４１は、図５ａに示すように、真空ポート１４２よりも、パウチ１１０のプラスチックフィルムにより近く配置する。示すように、プラスチックフィルム部分１１７の第２の表面１１９は、チャンバー１９２及び取り巻く大気間の、注入ポート１４１を経由した連絡を防ぐように、貫通可能シール１３９を提供する。しかし、第２の表面１１９は、場合によっては、注入ポート１４１まで伸びていなくてもよく、多様な他のシールを用いてもよい。さらに、シールのために別の位置、例えば装備１９０の第１の表面１９４上が望ましい場合、注入ポート１４１は、装備１９０上のその位置へのチャネルを含んでもよい。本明細書ですでに援用されている米国特許出願第１０／５１２，２５５号は、シールが注入ポートから離れて位置しており、そしてシールがチャネルを介してチャンバーに連結されている、多様な設定を示す。やはり米国特許出願第１０／５１２，２５５号は、チャネルが単一のシールを多数のチャンバーに連結する、多様な設定を開示する。シール位置並びに多数のチャンバーへの単一注入ポートの接続の変形は、本発明の範囲内である。場合によって、シール１３９は脆弱でもよく、そしてカニューレ（未提示）の挿入の際に破壊されて、カニューレ内から流体試料がチャンバー１９２内に吸引されるか又は押し入れられてもよい。
【００４７】
パウチ・アセンブリー１１０の例示的なプランジャー１６８は、筒形状であり、そしてチャンバー１９２内に圧入されるように、直径は約５ｍｍである。プランジャー１６８には、第１の末端部分１７３及び反対の第２の末端部分１７５が含まれる。図５ａに示されるように、プランジャー１６８のノッチ１６９が、第２の末端部分１７５中で形成される。用いる際、第２の末端部分１７５をチャンバー１９２内に一部挿入し、そしてノッチ１６９を注入ポート１４１と並列させて、プランジャー１６８が十分に深く挿入されて、そうでなければ注入ポート１４１を遮断する場合であっても、流体試料がチャンバー１９２内に吸引されるか又は注入されてもよい。
【００４８】
例として、先端にカニューレを取り付けた（ｃａｎｎｕｌａｔｅｄ）シリンジを含む容器（未提示）中に流体を入れて、これを注入ポート１４１内に挿入して、中のシール１３９を穿刺してもよい。空気を抜いて真空にしたパウチ・アセンブリー１１０を用いる際、シール１３９を穿刺すると、周囲空気圧に比較して、チャンバー１９２内が陰圧であるため、流体が容器から抜き取られる。次いで、流体はポート１４１を通過して、チャンバー１９２を満たす。この時点で、流体は通常、パウチ１１０のプラスチックフィルム部分１１７内には流れ込まない。最後に、プランジャー１６８をチャンバー１９２内に挿入して、プランジャー１６８の第２の末端部分１７５がチャンバー１９２の底１９１にアプローチして、測定された量の試薬又は試料をプラスチックフィルム部分１１７内に押し込むようにする。示すように、プランジャー１６８は、完全に挿入した際、第２の末端部分１７５がチャンバー１９２の底１９１と完全に触れあわないように設定される。残りの空間は、泡を捕捉して、それによりプラスチックフィルム部分１１７に進入する泡の数を減少させるのに有用である。しかし、いくつかの態様では、プランジャー１６８を完全に挿入した際、第２の末端部分１７５が底１９１と触れあうことが望ましい場合もある。図５に示す態様では、進入チャネル１１５ａ、１１５ｂ、１１５ｄ、１１５ｅ、１１５ｇ、１１５ｈ、１１５ｊ、１１５ｋ、及び１１５ｌは、全て反応ゾーン又はリザーバー・ブリスターにつながる。進入チャネル１１５ａと関連するプランジャーを完全に挿入すると、試料が三葉ブリスター１２２内に押し込まれ、進入チャネル１１５ｂと関連するプランジャーを完全に挿入すると、試薬がリザーバー・ブリスター１０１内に押し込まれ、進入チャネル１１５ｄと関連するプランジャーを完全に挿入すると、試薬がリザーバー・ブリスター１０２内に押し込まれ、進入チャネル１１５ｅと関連するプランジャーを完全に挿入すると、試薬がリザーバー・ブリスター１０３内に押し込まれ、進入チャネル１１５ｇと関連するプランジャーを完全に挿入すると、試薬がリザーバー・ブリスター１０４内に押し込まれ、進入チャネル１１５ｈと関連するプランジャーを完全に挿入すると、試薬がリザーバー・ブリスター１０５内に押し込まれ、進入チャネル１１５ｊと関連するプランジャーを完全に挿入すると、試薬がリザーバー・ブリスター１０６内に押し込まれ、進入チャネル１１５ｋと関連するプランジャーを完全に挿入すると、試薬がリザーバー・ブリスター１０７内に押し込まれ、そして進入チャネル１１５ｌと関連するプランジャーを完全に挿入すると、試薬がリザーバー・ブリスター１０８内に押し込まれる。
【００４９】
図５ａに示す態様に例示するように、ノッチ１６９を含むプランジャー設計を用いる場合、ノッチ１６９をオフセットし、そして注入ポート１４１をチャンバー１９２との連絡から閉鎖して、内容物を中に密封するように、プランジャー１６８を回転させてもよい。これは、取り巻く大気への注入ポート１４１を通じた流体のいかなる潜在的な逆流も最小限にするよう作用し、これは、プランジャーの完全な挿入の遅延が望ましい場合に特に有用である。プランジャー１６８に関してノッチ１６９が示され、そして前記のとおり、流体試料をチャンバー１９２内に分配した直後に、例えばチャンバー１９２の底に向かうプランジャー１６８の押圧、熱密封、一方向バルブ、又は自己密封ポート等の他の手段により、注入ポート１４１を閉鎖することは本開示の範囲内である。熱密封を密封法として用いる場合、装置内にパウチを挿入した際に、全てのチャンバーが熱密封されるように、シールバーを装置中に含めてもよい。
【００５０】
例示的な方法では、使用者は、進入チャネル１１５ａと関連する注入ポート１４１内に試料を注入して水を多様な他の注入ポート内に注入する。水は、進入チャネル１１５ｂ、１１５ｄ、１１５ｅ、１１５ｇ、１１５ｈ、１１５ｊ、１１５ｋ、及び１１５ｌの各々に関連するチャンバー１９２内で、先に凍結乾燥されていた試薬を再水和する。以下の図６に示すように、１の単一のシールを通じて水を注入して、次いで、チャネルを介してチャンバー各々へ分配してもよいし、又は水を各チャンバーに独立に注入してもよい。あるいは、水を注入して乾燥試薬を再水和するのでなく、溶解試薬、核酸抽出試薬、及びＰＣＲ試薬等の湿った試薬を、装備１９０の適当なチャンバー１９２内に注入してもよい。
【００５１】
進入チャネル１１５ａと関連するプランジャー１６８の活性化に際して、チャネル１１４を介して、試料を三葉ブリスター１２２内に直接押し入れる。使用者はまた、残りのプランジャー１６８を押し込んで、装備１９０中のチャンバー１９２各々から内容物を出し、そして１０８を通じてリザーバー・ブリスター１０１内に入れてもよい。この時点で、パウチ１１０は、プロセシングのために装置内に装填される。図８に示す装置８００は、図６のパウチ２１０のために設定されているが、装置８００のブラダーの設定を修飾すると、装置８００がパウチ１１０及び５１０又は他の設定のパウチと共に用いるのに適したものになることが理解される。
【００５２】
１の例示的な例では、プランジャー１６８の押圧に際して、リザーバー・ブリスター１０１は、ここで、イソプロパノール中のＤＮＡ結合磁気ビーズを含有し、リザーバー・ブリスター１０２は、ここで、第１の洗浄溶液を含有し、リザーバー・ブリスター１０３は、ここで、第２の洗浄溶液を含有し、リザーバー・ブリスター１０４は、ここで、核酸溶出緩衝液を含有し、リザーバー・ブリスター１０５は、ここで、多重化第１段階プライマーを含む第１段階ＰＣＲ試薬を含有し、リザーバー・ブリスター１０６は、ここで、プライマーを含まない第２段階ＰＣＲ試薬を含有し、リザーバー・ブリスター１０７は、ここで、プライマーを含まずそして鋳型を含まない陰性対照ＰＣＲ試薬を含有し、そしてリザーバー・ブリスター１０８は、ここで、鋳型を含む陽性対照ＰＣＲ試薬を含有する。しかし、当該試薬は単なる例示であり、そして所望の反応及び最適化条件に応じて、他の試薬を用いてもよいことが理解される。
【００５３】
パウチ１１０が装置８００内に入り、試料が三葉ブリスター１２２に移動した時点で、試料をＺＳ又はセラミックビーズ等の溶解粒子と共に攪拌することにより、試料を破壊に供してもよい。溶解粒子を三葉ブリスター１２２中で提供してもよいし、又は試料と共に三葉ブリスター１２２内に注入してもよい。図５の三葉ブリスター１２２は図１の三葉ブリスター２２とほぼ同じ方式で操作され、２つのより下方の葉１２４、１２６を共に加圧し、そしてより上方の葉１２８及びより下方の葉１２４、１２６の間で交互に加圧する。しかし、例示するように、より下方の葉１２４、１２６は、より下方の葉２４、２６よりもはるかに丸く、チャネル１３０へビーズがスムーズに流動でき、ネクサス３２で三角流分離装置が存在しなくても高速衝突しうる。三葉ブリスター２２でのように、図５の三葉ブリスター１２２により、試料中の微生物、細胞、及びウイルス粒子は有効に溶解又は破壊される。幅が約３〜４ｍｍ、例として約３．５ｍｍであるチャネル１３０は、溶解中、比較的ビーズが含まれず、高速衝突を提供するのに有効であることが見出されている。
【００５４】
溶解後、リザーバー・ブリスター１０１上に位置するブラダーを加圧することにより、チャネル１３８を介して、より上方の葉１２８内に核酸結合性磁気ビーズを注入する。例として溶解中より穏やかに、三葉ブリスター１２２の内容物と磁気ビーズを混合し、溶液を、例として約１分間インキュベーションすると、核酸はビーズに結合しうる。
【００５５】
次いで、チャネル１４３を介して「図８」のブリスター１４４内に溶液をポンピングし、ここで例として空気圧的に駆動されて装置中に収納される引き込み式磁石によりビーズが捕捉される。ビーズ捕捉プロセスは、ビーズミリング器具１２２の全ての葉１２４、１２６、及び１２８を加圧して始まる。これは、１２２の液体内容物の多くを、チャネル１４３を通じて、ブリスター１４４内に押し入れる。磁石をブリスター１４４のより下方の部分１４４ｂと接触させ、試料を数秒間インキュベーションして、磁石が溶液からビーズを捕捉することができ、次いでブリスター１２２に隣接するブラダーを減圧し、ブリスター部分１４４ａ及び１４４ｂに隣接するブラダーを加圧して液体をブリスター１２２内に戻す。全てのビーズが１回の通過で捕捉されないため、このプロセスを最大１０回反復して、実質的に全てのビーズをブリスター１４４中に捕捉してもよい。次いで、液体をブリスター１４４の外に押し出し、磁気ビーズ及び捕捉された核酸のみを残して後の２回の洗浄で洗浄試薬をブリスター１４４内に導入する（それぞれ、チャネル１４５及び１４７を介して、リザーバー・ブリスター１０２及び１０３から）。各洗浄中、洗浄試薬を含有するリザーバー・ブリスター上に位置するブラダーを加圧し、内容物をブリスター１４４内に押し入れる。磁石を引っ込め、ブリスター１４４の各葉１４４ａ及び１４４ｂを覆う２つのブラダー各々を交互に加圧することにより、磁気ビーズを含有するペレットを破壊する。より上方の葉１４４ａを圧縮すると、液体内容物がより下方の葉１４４ｂ内に押し入れられ、より下方の葉１４４ｂを圧縮すると、内容物がより上方の葉１４４ａ内に押し入れられる。ブリスター１４４中の溶液をより上方の葉１４４ａ及びより下方の葉１４４ｂ間で攪拌することにより、磁気ビーズから不純物が有効に洗い流される。ビーズのペレットが乱されないままにしておく不適当な攪拌、及びビーズ表面から核酸を洗い流し、洗浄試薬と共に失う過剰な攪拌の間で、バランスを維持する。各洗浄周期後、ブリスター１４４において、磁石により磁気ビーズを捕捉し、洗浄試薬を、例として三葉ブリスター１２２内に押し入れ、このブリスターはここで廃棄物貯蔵所として働く。しかし、使用したリザーバー・ブリスターもまた、廃棄物貯蔵所として働くこともでき、また他のブリスターが特に廃棄物貯蔵所として提供されてもよいことが理解される。
【００５６】
次いで、チャネル１４９を介して、リザーバー・ブリスター１０４由来の核酸溶出緩衝液をブリスター１４４内に注入し、試料をもう一度攪拌し、磁石を用いて磁気ビーズを再捕捉する。ブリスター１４４中の流体混合物には元来の試料由来の核酸が含まれる。ブリスター１４４に加圧すると、核酸試料がチャネル１５２を介して第１段階ＰＣＲブリスター１６１に移動し、試料は多数のプライマーセットを含有する第１段階ＰＣＲマスターミックスと混合され、このＰＣＲマスターミックスは、チャネル１６２を介してリザーバー・ブリスター１０５から提供される。望ましい場合、試料及び／又は第１段階ＰＣＲマスターミックスを混合前に加熱してホットスタートの利点をもたらしてもよい。場合によっては、第１段階ＰＣＲの前に、ＲＮＡ標的の逆転写のための成分を提供してもよい。あるいは、ＲＴ酵素、例として熱安定性ＲＴ酵素を第１段階ＰＣＲマスターミックス中で提供して、ＲＮＡ標的を同時逆転写させてもよい。本明細書に開示する任意の態様では、第１段階ＰＣＲ混合物中にＲＴ酵素が存在していてもよいことが理解される。以下に見られるように、図５のパウチ１１０は、最大１０のプライマーセット用に設定されるが、設定を改変してもよく、任意の数のプライマーセットを用いてよいことが理解される。ブリスター１６１上に位置するブラダーを低圧で加圧して、ブリスター１６１の内容物を、ブリスター１６１の他方の側面上の加熱／冷却素子、例としてペルチェ素子と密接に接触させるようにする。ブリスター１６１上の加圧は、加熱／冷却素子との接触が確実に優れる程度に十分でなければならないが、流体がブリスター１６１から押し出されないように、十分に穏やかでなければならない。加熱／冷却素子を、例として約６０℃〜約９５℃の間で、温度周期処理する。例として、約１５〜２０周期、温度周期処理を行って、存在する１又はそれ以上の核酸標的の増幅を生じる。又は例として、プラトー期前に温度周期処理を停止して対数期中に又は対数期前であってさえ、停止できる。１の例では、検出の最低レベルに到達せずに、試料中の所望の単位複製配列を単に濃縮することが望ましい場合もある。本明細書に援用される米国特許第６，６０５，４５１号を参照されたい。
【００５７】
次いで、チャネル１５２を介してブリスター１４４内に試料の大部分を戻し、少量（例として約１〜５％）の増幅試料のみをブリスター１６１中に残してチャネル１６３を介してリザーバー・ブリスター１０６から第２段階ＰＣＲマスターミックスを提供することにより、増幅された試料を場合によっては希釈する。例としてブリスター１０６及び１６１間でチャネル１６３を介して往復して移動させて試料を完全に混合する。望ましい場合、第２段階増幅前に、伸長温度より高く、例として少なくとも６０℃に反応混合物を加熱してもよい。次いで、チャネル１６５を通じて、第２段階増幅ゾーン１８０中央の低体積ブリスター１８２のアレイ内に試料を押し入れる。１０の例示的な低体積ブリスター１８２には各々、異なるプライマー対が含まれてもよく、このプライマー対は、第１段階増幅のプライマー対の１つと本質的に同じであるか、又はより短い単位複製配列を増幅するため、第１段階プライマー対内の「入れ子」であるか、いずれかである。プライマーは、ここで試料により水和されて増幅混合物が完成する。各々リザーバー・ブリスター１０７及び１０８の内容物を加圧し、チャネル１６６を介してリザーバー・ブリスター１０７から標的ＤＮＡを含まずに、又はチャネル１６７を介してリザーバー・ブリスター１０８から対照ＤＮＡを含んでのいずれかで、ＰＣＲマスターミックスを押し入れることにより、陽性及び陰性対照試料もまた導入する。例示するように、陽性対照ブリスター１８３及び陰性対照ブリスター１８１が各々５つあり、これらを２倍に多重化して、１０の異なる第２段階増幅反応に必要な対照を提供してもよい。この設定は単なる例示であり、そして任意の数の第２段階ブリスターを提供してもよいことが理解される。
【００５８】
例として、第２段階増幅に用いられるＰＣＲマスターミックスはプライマーがないが、そうでなければ完全である。しかし、「不完全」ＰＣＲマスターミックスは、他のＰＣＲ成分がなくてもよい。１の例では、第２段階ＰＣＲマスターミックスは、水又は緩衝液のみであり、これを次いで、場合によっては希釈された第１段階ＰＣＲ増幅産物と混合する。全ての残りの成分が予め提供されている小体積のＰＣＲ反応ブリスターに、この混合物を移動させる。望ましい場合、全ての残りの成分を共に混合し、そして小体積ＰＣＲ反応ブリスター内に、単一の混合物としてスポッティングしてもよい。あるいは、図５ｂに例示するように、各成分を小体積ＰＣＲ反応ブリスター１８２の別個の領域上にスポッティングしてもよい。図５ｂに示すように、４つの領域が存在し、例としてｄＮＴＰが領域１８２ａにスポッティングされ、プライマーが１８２ｂにスポッティングされ、ポリメラーゼが１８２ｃにスポッティングされ、マグネシウム化合物が１８２ｄにスポッティングされる。成分を別個にスポッティングし、成分を再水和する前に試料混合物を加熱すると非特異的な反応が最小限になりうる。成分の任意の組み合わせをこの方式でスポッティングしてもよく、ブリスターの１又はそれ以上の領域内に成分をスポッティングするこの方法は、本発明の任意の態様で用いてよいことが理解される。
【００５９】
小体積ＰＣＲ反応ブリスター１８１、１８２、及び１８３につながるチャネル１６５、１６６、及び１６７が密封され、空気圧ブラダーは、サーマルサイクリングのために、加熱／冷却素子、例としてペルチェ素子に向かってアレイを穏やかに加圧する。周期処理パラメーターは、独立に、第２段階サーマルサイクリングのためにセットされてもよい。例として、アレイ上に、励起供給源、例として青い光（４５０〜４９０ｎｍ）の焦点を合わせて、生じる蛍光発光、例として５１０ｎｍを超える蛍光発光を画像化することにより、反応をモニターする。
【００６０】
上記例では、ピンチバルブは説明されていない。しかし、試料がブリスターの１つに含められることが望ましい場合、特定のブリスターに出入りするチャネル上に位置する空気圧アクチュエーターが加圧され、ピンチバルブが生成されてチャネルが閉鎖されることが理解される。逆に、試料をブリスターの１つから移動させることが望ましい場合、適当な空気圧アクチュエーターを減圧して、チャネルを通じて試料を流動させる。
【００６１】
図５で前記のパウチには、試薬リザーバー・ブリスター１０１〜１０８が含まれ、使用者は、例として装置内へのパウチ１１０の挿入前に、パウチ１１０のプラスチックフィルム部分１１７中の試薬リザーバー・ブリスター１０１〜１０８内に、装備１９０から試薬を注入する。異なる温度で、多様なブリスターの内容物を維持する機能があることを含め、図５の試薬リザーバー・ブリスターの使用には利点があるが、不都合な点もまたいくつかある。操作者は、装備１９０からリザーバー・ブリスター１０１〜１０８に試薬を移動させるのに関与し、これはしばしば機械の外で、したがって活性化されたピンチバルブを伴わずに行われるため、時に、試薬がリザーバー・ブリスターから作業中のブリスターに漏出しうる。リザーバー・ブリスター中の試薬は、調製及び装填の間、暴露される。これらが加圧されるか、圧搾されるか、又は軽くぶつけられた場合であっても、試薬は利用可能なチャネルを通じて漏出しうる。試薬がかなり喪失する場合、反応は完全に失敗するかもしれない。さらに、操作中、リザーバー・ブリスター１０１〜１０８から押し出される試薬の量は、ある程度変動する場合もあり、結果が一貫されない。装備１９０への試薬導入及び装備１９０から試薬リザーバー・ブリスター１０１〜１０８への試薬の移動を自動化すると、当該問題の多くが解決され、これは本発明の範囲内である。
【００６２】
図６のパウチ２１０は、直接注入アプローチを用いることにより、異なる方式で、当該問題の多くに対処し、装置自体がプランジャー２６８を、例として空気圧ピストンを介して移動させて試薬が必要になるにつれて、多様な作業ブリスター内に試薬を押し入れる。図６の態様では、図５のリザーバー・ブリスター１０１〜１０８中に試薬を保存せず、試薬を装備２９０の多様なチャンバー２９２内に導入して、必要になるまでそこで維持する。適当な時点でピストン２６８を空気圧操作して、測定量の試薬を適当な反応ブリスターに導入する。上記問題の多くへの対処に加え、パウチ２１０はるかによりコンパクトな形状で、より小さい装置設計が可能になり、パウチ２１０のチャネルはより短く、流体流動により優れ、チャネル中の試薬喪失が最小限になる。
【００６３】
図６の１の例示的な態様では、試験しようとする試料（１００μｌ）及び溶解緩衝液（２００μｌ）を含む３００μｌの混合物を、注入ポート２４１ａ内に注入する。シール２３９ｂを介して、装備２９０内に水もまた注入し、チャネル２９３（影に示す）を介して、各々、チャンバー２９２ｂ〜２９２ｌ中に乾燥型で予め提供されていた最大１１の異なる試薬を水和する。当該試薬は、例として、凍結乾燥ＰＣＲ試薬、ＤＮＡ抽出試薬、洗浄溶液、イムノアッセイ試薬、又は他の化学実体を含んでもよい。図６の例に関して、試薬は、核酸抽出、第１段階多重ＰＣＲ、多重反応の希釈、及び第２段階ＰＣＲ試薬の調製、並びに対照反応のためのものであってもよい。図６に示す態様では、注入する必要があるのは、ポート２４１ａ中の試料及びポート２４１ｂ中の水のみである。
【００６４】
図６に示すように、シール２９３ｂを介して注入された水は、チャネル２９３を介して多様なチャンバーに分配される。この態様では、試料及び水をパウチ２１０に注入しさえすればよい。しかし、水を独立に各チャンバー２９２内に注入してもよいことが理解される。さらに、多様なチャンバー２９２中に乾燥試薬を提供し、水の注入に際して水和するのでなく、特定の湿った試薬を各チャンバー内に注入してもよいことが理解される。さらに、１又はそれ以上のチャンバー２９２に水のみを提供してもよく、必要な試薬を適当な反応ブリスター中で乾燥して提供してもよいことが理解される。特定の反応に必要であることにより指示されるような上記の多様な組み合わせが本発明の範囲内である。
【００６５】
図６に見られるように、装備２９０の底面２９７上に、所望による突起２１３を提供する。示すように、突起２１３は、各進入チャネル２１５内に位置する。しかし、他の設定ができる。突起２１３は、進入チャネル２１５を開放しておくように補助し、プランジャー２６８を押圧した場合に、進入チャネル２１５をピンチオフする方式で底面２９７が別の平らな表面とかみ合うのを防ぎ、これにより、プランジャー２６８の活性化の際に逆流を防ぐ一助となる。当該突起は、本発明の多様な任意のパウチ上で用いてよい。
【００６６】
水をパウチ内に注入して、装備中の多数のチャンバーで多数の乾燥試薬を水和する態様では、注入ポート及び多くのチャンバー間のチャネルを閉鎖する手段が望ましい。チャネルが閉鎖されないと、各プランジャーを活性化した際に各チャンバーの内容物のある程度がチャネルに戻る場合もあり、これが潜在的に隣のチャンバーに混入し、そしてチャンバー中に含有されてそしてチャンバーから送達される体積が改変する。このチャネルを閉鎖するいくつかの方法が用いられてきており、これには、上記ノッチ付きプランジャー２６８を回転させること、及びチャネルに渡ってプラスチックフィルムを熱密封し、それによりチャネルを永久に閉鎖すること、及びピンチバルブとしてチャネルに加圧することがあげられる。他の閉鎖もまた使用でき、例えば装備内に構築されたバルブ、例えば一方向バルブがある。
【００６７】
流体がチャンバー２９２内に装填されてパウチ２１０が装置内に装填された後、プランジャー２６８ａを、例として空気圧ピストンの活性化により押圧し、チャネル２１４を経由した三葉ブリスター２２０内に入る試料のバランスを取らせる。図１及び５に示す態様と同様に、三葉ブリスター２２０の葉２２４、２２６、及び２２８を、図７〜９に示すブラダー・アセンブリー８１０の作用ブラダー８２４、８２６、及び８２８を介して連続して圧縮し、葉間の狭いネクサス２３２を通じて液体を押し入れ、高速衝突を駆動し、試料を剪断し、例として硬くて開けにくい胞子、細菌、及び真菌由来の核酸を含めて、核酸を遊離させる。細胞溶解は、適当な期間、例えば０．５〜１０分間続ける。
【００６８】
細胞が適当に溶解された時点で、プランジャー２６８ｂを活性化し、チャネル２３６を介して、チャンバー２９２ｂ中に保存された核酸結合性磁気ビーズを三葉ブリスター２２０のより上方の葉２２８内に注入する。試料を磁気ビーズと混合し、混合物を適当な期間、例としておよそ１０秒間〜１０分間インキュベーションする。
【００６９】
ブラダー８２６の作用により、チャネル２３８を通じてブリスター２４４内に試料及びビーズの混合物を押し入れ、次いでブラダー８４４の作用によりブリスター２４６内に押し入れ、ここで図８に示すブリスター２４５に隣接する装置８００中に位置する引き込み式磁石８５０が、溶液から磁気ビーズを捕捉し、ブリスター２４６の内部表面に対してペレットを形成する。次いで、ブリスター２４６上に位置する空気圧ブラダー８４６が、ブリスター２４６から液体を押し出し、そしてブリスター２４４を通じて、そしてブリスター２２２に戻し、該ブリスターはここで、廃棄物貯蔵所として用いられる。しかし、図５で上記したように、他の廃棄物貯蔵所が本発明の範囲内である。プランジャー２６８ｃ、２６８ｄ、及び２６８ｅの１つを活性化して、チャネル２４５を介してブリスター２４４に、そして次いでチャネル２４３を介してブリスター２４６に洗浄溶液を提供してもよい。場合によっては、磁石８５０を引っ込めて、そしてブラダー８４４及び８４６を交互に加圧して、チャネル２４３を介してブリスター２４４及び２４６からビーズを往復して移動させて、磁気ビーズを洗浄する。磁気ビーズを洗浄した時点で、磁石８５０を活性化して、ブリスター２４６中で磁気ビーズを再捕捉し、次いで、洗浄溶液をブリスター２２２に移動させる。このプロセスを必要に応じて反復して、核酸結合性磁気ビーズから溶解緩衝液及び試料破片を洗浄する。例として、チャンバー２９２ｃ、２９２ｄ、及び２９２ｅ中の洗浄試薬を各々１回用いて、３回の洗浄を行う。しかし、洗浄がより多くても少なくても本発明の範囲内であることが理解される。より多くの洗浄が望ましい場合、より多くのチャンバー２９２を提供してもよい。あるいは、各チャンバー２９２は、より多くの体積の流体を保持してもよく、プランジャーの活性化が、各活性化に際して、チャンバーから体積の一部のみを押し出してもよい。
【００７０】
洗浄後、チャンバー２９２ｆ中に保存される溶出緩衝液は、チャネル２４７を介して、ブリスター２４８に移動し、磁石は引っ込められる。チャネル２５２を介して溶液をブリスター２４６及び２４８の間で循環させ、ブリスター２４６中で磁気ビーズのペレットを破壊し、捕捉された核酸がビーズから解離して、溶液中に流れうる。磁石８５０をもう一度活性化して、ブリスター２４６中で磁気ビーズを捕捉し、溶出した核酸溶液をブリスター２４８内に押し入れる。
【００７１】
プランジャー２６８ｈを押圧し、そしてチャンバー２９２ｈ由来の第１段階ＰＣＲマスターミックスをブリスター２４８中の核酸試料と混合する。場合によっては、ブラダー８４８及び８６４を交互に活性化させて、チャネル２５３を介して２４８及び２６４の間で混合物を移動させて混合物を混合する。数周期混合した後、溶液はブリスター２６４中に含まれ、ここで第１段階多重ＰＣＲを行う。望ましい場合、例として第１段階ＰＣＲマスターミックスをブリスター２６４内に移動させて、又はブリスター２４８に隣接するヒーターを提供して、第１段階ＰＣＲマスターミックスを予熱する間、混合前に、試料をブリスター２４６中に保持する。上記のように、予熱することにより、ホットスタートＰＣＲの利点がもたらされる。図８に例示する装置８００は、試料を加熱して冷却するペルチェに基づく熱サイクラー８８６及び８８８を特徴とする。しかし、上記のように、他のヒーター／クーラーデバイスを用いてよいことが理解される。場合によっては、熱サイクラー８８６がブリスター２４８及び２６４両方を加熱しそして冷却するように配置して、ブリスター２４８及び２６４の間の混合を温度周期処理中継続してもよい。当該混合は、いくつかの態様では、第１段階ＰＣＲ反応を改善することが見出されている。また、２以上の異なるブリスター中で温度を変化させて、エネルギー消費を最小にし、サーマルサイクリング速度を最大にすることにより、サーマルサイクリングを達成してもよい。例えば、ブリスター２４８中で温度を９５℃に、そしてブリスター２６４中で６５℃に維持してもよく、当該ブリスター間で試料を移動させると、熱が試料にそして試料から効率的に移動し、サーマルサイクリングが迅速でそして正確になりうる。温度周期処理は、例として、１５〜２０周期行われるが、上記のように、適用に応じて、他のレベルの増幅が望ましい場合もある。以下のように、第２段階の増幅ゾーン２８０は、１８の第２段階反応で、増幅を検出するように設定される。したがって、ブリスター２６４中で、ＰＣＲ反応において、１８の異なるプライマー対が含まれてもよい。
【００７２】
別のホットスタート法では、ブリスターの１つ、例としてブリスター２６４中で提供されたプライマーを含めて、パウチ２１０を製造する。１の態様では、プライマーを別個に凍結乾燥して、次いで、製造中に、脆弱なペレットとしてブリスター２６４内に導入する。第１段階ＰＣＲ前に、例として試料をブリスター２４６から溶出させ、ブリスター２６４に押し込んで、プライマーペレットを再水和する。ブリスター２４８及び２６４に隣接して位置するペルチェ８８６を４８℃に加熱し、ＰＣＲマスターミックスをブリスター２４８に押し込む。例として１０秒間保持して、この間、２つのブリスターが４８℃に到達した後、ブリスター２４８及び２６４の間の混合を開始する。したがって、成分が別個に４８℃に到達するまで、酵素及びｄＮＴＰがブリスター２４８中に残り、試料及びプライマーの大部分はブリスター２６４中に残る。しかし、４８℃を選択したのは、第１段階増幅、及び５０℃まで活性であるＡＭＶを用いたＲＴを同時に行う場合に用いるためであることが理解される。ＲＴが必要でない場合、又はより熱安定性が高いＲＴ酵素を用いる場合、プライマー融点又は特定の第１段階増幅プロトコル中の他の要因に応じて、２つのブリスター２４８及び２６４の一方又は両方を５８℃まで、又はさらにより高温で加熱してもよい。このホットスタート法を本発明の任意の態様で用いてよいことが理解される。
【００７３】
別の態様では、第１段階ＰＣＲ反応の複雑性を軽減するため、ブリスター２４８を２以上のブリスターに分割してもよい。多重反応の非特異的産物の数は、混合物中のプライマー数の二乗（又は場合によってはより高次の指数）に増加する一方、アッセイ感度の軽減は投入試料量の線形関数である。したがって、例えば、第１段階ＰＣＲを２つの反応に分けて、各々、この態様の単一反応の体積の半分とすると、感度は２倍低下するが、非特異的反応の量及び複雑性は、ほぼ１／４であろう。ブリスター２４８をより多くのブリスターに分割する場合、ブリスター２６４を、ブリスター２４８の数と等しい数のブリスターに分割してもよい。各ブリスター２４８は、各チャネル２５３を介して、各ブリスター２６４に連結される。各ブリスター２６４には、全てのプライマーサブセットを含むペレットを提供する。各ブリスター２４８にわたりブリスター２４６由来の試料を分割し、各ブリスター２４８を全ての他のものから密封して、上記のように、ブリスター２４８及び２６４の各対を用いてサーマルサイクリングが進行する。サーマルサイクリング後、試料を再びブリスター２６６内で合わせてもよいし、又は個々に第２段階ブリスターの別個のセットに送ってもよい。
【００７４】
第１段階ＰＣＲが所望の周期数で進行した後、図５の態様に関して上記のように、大部分の試料をブリスター２４８に戻し、少量を残して、チャンバー２９２ｉから第２段階ＰＣＲマスターミックスを添加して、試料を希釈してもよい。あるいは、チャネル２４９を介して、２９２ｉ由来の希釈緩衝液をブリスター２６６に移動させて、次いで、流体をブリスター２６４及び２６６間で往復して移動させて、ブリスター２６４中で増幅試料と混合してもよい。混合後、ブリスター２６４中に残った希釈試料の一部を、三葉ブリスター２２２に押し出すが、このブリスターは廃棄物貯蔵所である。望ましい場合、チャンバー２９２ｊ及び２９２ｋ由来の希釈緩衝液を用いて次いでチャンバー２９２ｇから第２段階ＰＣＲマスターミックスをいくつか又は全ての希釈された増幅試料に添加して、希釈を数回反復してもよい。希釈工程数を改変、あるいは希釈緩衝液又は第２段階ＰＣＲマスターミックスと混合する前に廃棄する試料の割合を改変すれば、希釈レベルを調節できることが理解される。望ましい場合、試料及び第２段階ＰＣＲマスターミックスの当該混合物を、第２段階増幅用の第２段階ブリスター２８２に移動させる前に、ブリスター２６４中で予熱してもよい。上記のように、予熱すると、第２段階ＰＣＲ混合物で、ホットスタート成分（酵素、化学薬品、又は別のもの）が必要でなくなれうる。
【００７５】
例示的な第２段階ＰＣＲマスターミックスは、プライマー対がなく不完全であり、１８の各第２段階ブリスター２８２は、特異的ＰＣＲプライマー対を予め装填している。望ましい場合、第２段階ＰＣＲマスターミックスは他の反応成分がなくてもよく、次いで、当該成分がまた、第２段階ブリスター２８２中に予め装填されていてもよい。前記例と共に上記のように、各プライマー対は、第１段階ＰＣＲプライマー対と同一であってもよいし、又は第１段階プライマー対内で入れ子であってもよい。ブリスター２６４から第２段階ブリスターに試料が移動すると、ＰＣＲ反応混合物が完成する。チャンバー２９２ｌ由来の対照試料もまた、チャネル２６７を介して対照ブリスター２８３に移動する。対照試料は、所望のとおり陽性又は陰性対照であってもよい。例として、各パウチは、プロセス中の各工程の操作を認証し、陽性結果が、先に増幅された核酸の自己混入の結果でないことを立証する、対照反応を含有するであろう。しかし、これは、多くのプロトコルにおいて、特に非常に多重化された反応に関しては実際的でない。適当な対照を提供する１の例示的な方法は、パン酵母等の種を試料にスパイク処理する工程を伴う。他の核酸と共に、酵母から核酸が抽出される。第１及び第２段階ＰＣＲ反応は、酵母ゲノムからＤＮＡ及び／又はＲＮＡ標的を増幅する。例として、イントロンにわたるプライマー配列を準備して、スプライシングされたプレｍＲＮＡ由来のｍＲＮＡ配列を用いて、ＲＮＡ特異的標的配列を生成してもよい。参照標準に対して酵母コピー数を定量的に分析すると、系の各成分が機能するということを実質的に認証できる。多くの第２段階アッセイ各々に関する陰性対照反応にはさらに問題がある。平行又は別個の実行のいずれかで、対照反応を実行することが望ましい場合もある。
【００７６】
ブラダー・アセンブリー８１０のブラダー８８２を活性化すると各第２段階ブリスター２８２、２８３内に試料が密封され、ブラダー８８０を活性化すると第２段階ブリスター２８２、２８３が穏やかに加圧され、第２段階ブリスター２８２、２８３がヒーター／クーラーデバイスと接触する。第２段階増幅ゾーン２８０上にあるウィンドウ８４７は、ＰＣＲ中及び反応産物のＤＮＡ融解曲線分析中のアレイで蛍光モニターすることができる。
【００７７】
図６のパウチ２１０は、密封されない領域２５５及び密封されない領域２５６等、いくつかの密封されない領域があることが注目される。当該密封されない領域は、この例示的な態様では、いかなる反応にも関与しないブリスターを形成する。むしろ、当該密封されない領域は、作業ブリスター及びチャネル間に空間を提供する。いくつかの製造プロセスにおいて、全ての使用されない空間中で密封されるパウチに比較した際、２５５及び２５６等の密封されない領域が提供された場合、おそらくフィルム材料中で問題となるしわが減少することにより、ときに、漏出が軽減することが見出されている。当該密封されない領域は、場合によっては、任意のパウチ態様上に提供されてもよい。
【００７８】
図８は、パウチ２１０と共に用いうる例示的な器具８００を示す。装置８００には、ケーシングの壁を形成できるか又はケーシング内にマウントできる支持体メンバー８０２が含まれる。装置８００にはまた、支持体メンバー８０２に対して場合によっては移動でき、パウチ２１０を挿入及び抜き取りできる、第２の支持体メンバー８０４も含まれる。移動可能支持体メンバー８０４をトラック上にマウントしてもよいし、又は多様な方式のいずれで、支持体メンバー８０２に対して移動させてもよい。例として、パウチ２１０を装置８００内に挿入すると、ふた８０５はパウチ２１０上に適合する。別の態様では、支持体メンバー８０２及び８０４両方を固定してもよく、他の機械的手段により、又は空気圧により、パウチ２１０を適所に保持してもよい。
【００７９】
例として、ブラダー・アセンブリー８１０及び空気圧バルブ・アセンブリー８０８を移動可能メンバー８０２上にマウントする一方、ヒーター８８６及び８８８を支持体メンバー８０２上にマウントする。しかし、この配置は単なる例示であり、そして他の配置もできることが理解される。ブラダー・アセンブリー８１０及び空気圧バルブ・アセンブリー８０８を移動可能支持体メンバー８０４上にマウントした際、空気圧アクチュエーターがパウチ２１０と接触して配置されるように、当該空気圧アクチュエーターをパウチ２１０に向かって移動させてもよい。パウチ２１０を装置８００内に挿入して移動可能支持体メンバー８０４を支持体メンバー８０２に向かって移動させると、パウチ２１０の多様なブリスターは、ブラダー・アセンブリー８１０及び空気圧バルブ・アセンブリー８０８の多様な空気圧ピストンに隣接した位置になるため、空気圧アクチュエーターを活性化すると、パウチ２１０の１又はそれ以上のブリスターから液体を押し出しうるか、又はパウチ２１０の１又はそれ以上のチャネルを持つピンチバルブを形成しうるようになる。パウチ２１０のブリスター及びチャネル並びにブラダー・アセンブリー８１０の空気圧アクチュエーター及び空気圧バルブ・アセンブリー８０８間の関係は、図９及び１０で、以下により詳細に記載される。
【００８０】
各空気圧アクチュエーターには、１又はそれ以上の空気圧装備がある。例えば、ブラダー・アセンブリー８１０のブラダー８２４には空気圧装備８２４ａがあり、空気圧ピストン８４３には関連する空気圧装備８４３ａがある。例示的な態様では、ブラダー・アセンブリー８１０の各空気圧装備は、通路８１６を通じて、移動可能支持体メンバー８０４中に伸長し、ここでホース８７８が、バルブ８９９を介して、各空気圧装備を圧縮空気供給源８９５に連結する。例示的な態様では、通路８１６は、圧縮空気供給源８９５へのアクセスを提供するだけでなく、通路はまた、ブラダー・アセンブリー８１０の多様な構成要素を並列させる一助となり、ブラダーは、パウチ２１０のブリスターと適当に並列する。
【００８１】
同様に、空気圧バルブ・アセンブリー８０８もまた、移動可能支持体メンバー８０４上にマウントされるが、他の設定もできることが理解される。例示的な態様では、空気圧バルブ・アセンブリー８０８上のピン８５８を、移動可能支持体メンバー８０４上のマウント開口部８５９中にマウントして通路８１６を通じて、空気圧ピストン８４３、８５２、８５３、及び８６２は、移動可能支持体メンバー８０４中に伸長して、パウチ２１０に接触する。例示するように、ブラダー・アセンブリーは、移動可能支持体メンバー８０４の第１の側面８１１上にマウントされる一方、空気圧バルブ・アセンブリー８０８は、移動可能支持体メンバー８０４の第２の側面８１２上にマウントされる。しかし、空気圧ピストン８４３、８５２、８５３、及び８６２は、通路８１６を通じて伸長するため、空気圧バルブ・アセンブリー８０８の空気圧ピストン及びブラダー・アセンブリー８１０の空気圧ブラダーは、共に働いて、パウチ２１０に必要な空気圧アクチュエーターを提供する。
【００８２】
上記のように、ブラダー・アセンブリー８１０及び空気圧バルブ・アセンブリー８０８の空気圧アクチュエーターの各々には関連空気圧装備がある。図８には、いくつかのホース８７８しか示していないが、ホース８７８を介して、各空気圧装備が圧縮ガス供給源８９５に連結されていることが理解される。圧縮ガス供給源８９５は、圧縮装置であってもよいし、又は圧縮ガス供給源８９５は、二酸化炭素シリンダー等の圧縮ガスシリンダーであってもよい。圧縮ガスシリンダーは、携帯性が望ましい場合、特に有用である。他の圧縮ガス供給源が本発明の範囲内である。
【００８３】
装置８１０のいくつかの他の構成要素もまた、圧縮ガス供給源８９５に連結されている。支持体メンバー８０２の第１の側面８１３上にマウントされている磁石８５０が例として配備され、そしてホース８７８を経由した圧縮ガス供給源８９５からのガスを用いて引き込まれるが、磁石８５０を移動させる他の方法が当該技術分野で公知である。磁石８５０は、支持体メンバー８０２中の凹所８５１中にある。凹所８５１が支持体メンバー８０２を通じた通路となり、こうして磁石８５０がパウチ２１０のブリスター２４６と接触できることが理解される。しかし、磁石８５０を配備した場合に、磁石８５０がブリスター２４６で十分な磁場を提供する程度に近接であり、かつ、磁石８５０を引っ込めた場合、磁石８５０がブリスター２４６中に存在するいかなる磁気ビーズにも有意に影響を及ぼさない限り、支持体メンバー８０２の材料に応じて、凹所８５１は、支持体メンバー８０２を通じて最後まで伸長しなくてよいことが理解される。磁石８５０の引き込みに言及するが、電磁石を用いてもよく、電磁石を通じた電気の流れを調節することにより、電磁石を活性化し、かつ不活性化してもよい。したがって、本明細書は、磁石を引き抜くか又は引っ込めることを記載するが、当該用語は、磁場を撤回する他の方法を取り込むように十分に広いことが理解される。空気圧連結は、空気圧ホース又は空気圧マニホールドであって、必要なホース又はバルブの数を減少させてもよいことが理解される。
【００８４】
支持体８０２上にマウントされている、空気圧ピストンアレイ８６９の多様な空気圧ピストン８６８もまた、ホース８７８を介して、圧縮ガス供給源８９５に連結されている。空気圧ピストン８６８を圧縮ガス供給源８９５に連結する２つのホース８７８のみが示されているが、空気圧ピストン８６８の各々が圧縮ガス供給源８９５に連結されていることが理解される。１２の空気圧ピストン８６８が示される。パウチ２１０が装置８００内に挿入されると、１２の空気圧ピストン８６８が配置されて、パウチ２１０の各１２のプランジャー２６８を活性化する。空気圧ピストン８６８が活性化される際に、ふた８０５が装備２９０を適所に保持するように、ふた８０５がパウチ２１０上を閉鎖すると、ふた８０５上のリップ８０６が装備２９０の支持を提供する。装備２９０の他の支持が本発明の範囲内にあることが理解される。
【００８５】
加熱／冷却デバイス対、例としてペルチェヒーターを支持体８０２の第２の側面８１４上にマウントする。第１段階ヒーター８８６は、第１段階ＰＣＲのため、ブリスター２６４の内容物を加熱し、そして冷却するよう位置する。第２段階ヒーター８８８は、第２段階ＰＣＲのため、パウチ２１０の第２段階ブリスター２８２及び２８３の内容物を加熱して冷却するよう位置する。しかし、当該ヒーターはまた、他の加熱目的にも使用でき、特定の適用に適当であるように、他のヒーターを含んでもよいことが理解される。
【００８６】
望ましい場合、試料を実際に特定のブリスター内に押し入れるかどうかに関して、フィードバックを提供するため、装置８００中にフィードバック機構（未提示）を含めてもよい。例示的なフィードバック機構には、温度又は圧センサー、あるいは特に蛍光又は着色色素が含まれる場合、光学検出装置が含まれる。当該フィードバック機構は、例として、支持体メンバー８０２又は８０４のいずれか上にマウントされていてもよい。例えば、圧センサーをブリスター２６４の位置に隣接する支持体８０２上にマウントしてもよい。試料が仮にブリスター２６４に移動する場合、圧センサーが押圧されたならば、試料プロセシングを持続しうる。しかし、圧センサーが押圧されなければ、試料プロセシングは停止するか、又はエラーメッセージがスクリーン８９２上に示される場合がある。ブリスターの任意の組み合わせ又は全てが、フィードバック機構をもち、パウチを通じた試料の適当な移動に関してフィードバックを提供してもよい。
【００８７】
蛍光検出が望ましい場合、光学アレイ８９０を提供してもよい。図８に示すように、光学アレイ８９０には、光源８９８、例としてフィルター処理されたＬＥＤ光源、フィルター処理された白色光、又はレーザー照射、及びカメラ８９６が含まれる。移動可能支持体８０４を通じたウィンドウ８４７は、光学アレイ８９０に、パウチ２１０の第２段階増幅ゾーン２８０へのアクセスを提供する。カメラ８９６には、例として、各々、パウチ２１０中の第２段階ブリスター２８２、８２３に対応する、複数の光検出装置がある。あるいは、カメラ８９６は、第２段階ブリスター２８２、２８３の全てを含有する画像を撮ってもよく、そしてその画像を第２段階ブリスター２８２、２８３の各々に対応する別個のフィールドに分けてもよい。設定に応じて、光学アレイ８９０は固定されていてもよいし、又は光学アレイ８９０は、１又はそれ以上のモーターに取り付けられた移動装置上に置かれて、そして各個々の第２段階ブリスター２８２、２８３からのシグナルを得るよう移動してもよい。他の配置もできることが理解される。
【００８８】
示すように、コンピュータ８９４は、圧縮空気供給源８９５のバルブ８９９を制御して装置８００の空気力学の全てを制御する。コンピュータ８９４はまた、ヒーター８８６及び８８８、並びに光学アレイ８９０も制御する。当該構成要素は各々、電気的に、例としてケーブル８９１を介して連結されるが、他の物理的又はワイヤレス連結が本発明の範囲内である。コンピュータ８９４は装置８９０内に収納されていてもよいし、又は装置８９０の外部であってもよいことが理解される。さらに、コンピュータ８９４には、構成要素のいくつか又は全てを制御する内蔵型回路基板が含まれていてもよく、そしてまた、光学アレイからデータを受け取り、そしてディスプレイするデスクトップ又はラップトップＰＣ等の外部コンピュータも含まれてもよい。情報、及び温度、周期数等の変数をインプットするためのキーを含むインターフェース８９３、例としてキーボードインターフェースが提供されてもよい。例として、ディスプレイ８９２もまた提供される。ディスプレイ８９２は、例えば、ＬＥＤ、ＬＣＤ、又は他の当該ディスプレイであってもよい。
【００８９】
図９は、装置８００の作動中のブラダー・アセンブリー８１０及びパウチ２１０の間の関係を示す。ブラダー・アセンブリーは、サブアセンブリー８１５、８１７、８１８、８１９、及び８２２を含む。ブラダー・サブアセンブリー８１５のブラダー８０９は大きいため、ブラダー・サブアセンブリー８１５には、例として２つの空気圧装備８１５ａ及び８１５ｂがある。ブラダー８０９は、チャンバー２９２（図６に示すようなもの）をパウチ２１０のプラスチックフィルム部分２１７から閉鎖するのに用いられる。１のプランジャー２６８を押圧すると、空気圧装備８１５ａ及び８１５ｂの一方又は両方が、ブラダー８０９を収縮できる。チャンバー２９２の１つから流体が通過した後、ブラダー８０９を再加圧し、チャンバー２１４、２３６、２４５、２４７、及び２４９を密封する。例示的なブラダー・サブアセンブリー８１５には、１のブラダー８０９しかないが、他の設定、例としてチャネル２１４、２３６、２４５、２４７、及び２４９の各々が、それ自体の関連するブラダー又は空気圧ピストンをもつ設定できることが理解される。ブラダー・サブアセンブリー８２２は、例として、３つのブラダー８２４、８２６、及び８２８を含む。上記のように、ブラダー８２４、８２４、及び８２８は、細胞溶解のため、三葉ブリスター２２２を駆動する。例示するように、ブラダー８２４、８２６、及び８２８は、対応するブリスター２２４、２２６、２２８よりわずかに大きい。膨張すると、ブラダー表面が幾分ドーム状になり、そしてわずかに大きいサイズのブラダーが、対応するブリスターの全表面上によく接触でき、圧がより均一になり及びブリスターの排気がより優れることが見出されてきている。しかし、いくつかの状況では、個々のブリスターの完全な排気は望ましい場合も不要な場合もあり、大きさがより大きいか又はより小さいブラダーを用いて、排気されるブリスター体積を制御してもよい。ブラダー・サブアセンブリー８１７には４つのブラダーがある。ブラダー８３６は、チャネル２３６のピンチバルブとして機能する一方、ブラダー８４４、８４８、及び８６６は、それぞれ、ブリスター２４４、２４８、及び２６６に対して加圧するよう設定される。ブラダー・サブアセンブリー８１８には、２つのブラダー８４６及び８６４があり、これらはそれぞれ、ブリスター２４６及び２６４に対して加圧するよう設定される。最後に、ブラダー・サブアセンブリー８１９は、第２段階増幅ゾーン２８０を制御する。ブラダー８６５は、チャネル２６５及び２６７のピンチバルブとして作用する一方、ブラダー８８２は、第２段階ブリスター２８２及び２８３に穏やかに加圧し、第２段階ブリスターをヒーター８８８と緊密に接触させる。ブラダー・アセンブリー８１０は５つのサブアセンブリーと共に提供されるが、この設定は単なる例示であり、任意の数のサブアセンブリーを用いてもよいし、又はブラダー・アセンブリー８１０が単一の完全なアセンブリーとして提供されてもよいことが理解される。
【００９０】
図１０は、同様に、装置８００の作動中の空気圧バルブ・アセンブリー８０８及びパウチ２１０間の関係を示す。空気圧バルブ・アセンブリー８０８には、ブラダーではなく、４つの空気圧ピストン８４２、８５２、８５３、及び８６２がある。当該空気圧ピストン８４２、８５２、８５３、及び８６２は、各々圧縮空気により駆動され、チャネル２４２、２５２、２５３、及び２６２に加圧する。ピストンの直径はかなり狭いため、ブラダー・サブアセンブリー８１７及びブラダー・サブアセンブリー８１８の間に適合して、チャネル２４２、２５２、２５３、及び２６２のためのピンチバルブを提供し、チャネル２４２、２５２、２５３、及び２６２をかなり短くしうる。しかし、望ましい場合、空気圧ピストン８４２、８５２、８５３、及び８６２をブラダーで置き換えてもよく、これらはブラダー・アセンブリー８１０に含まれて、空気圧バルブ・アセンブリー８０８を不要としてもよい。ブラダー及び空気圧ピストンの任意の組み合わせが本発明の範囲内であることが理解される。当該技術分野で公知のように、パウチ２１０のチャネル及びブリスターに対して加圧する他の方法が本発明の範囲内であることもまた理解される。
【００９１】
図１５は、図６のパウチ２１０と類似のパウチ５１０を示す。進入チャネル５１５ａ〜５１５ｌを含む装備５９０は、進入チャネル２１５ａ〜２１５ｌを含む装備２９０と類似である。各チャネル５３８、５４３、５５２、５５３、５６２、及び５６５を含むブリスター５４４、５４６、５４８、５６４、及び５６６は、パウチ２１０の各チャネル２３８、２４３、２５２、２５３、２６２、及び２６５を含むブリスター２４４、２４６、２４８、２６４、及び２６６と類似である。パウチ２１０のチャネル２４５、２４７、及び２４９は、パウチ５１０上のチャネル５４５ａ〜ｃ、５４７ａ〜ｂ、及び５４８ａ〜ｃとして幾分再設定されており；５１０の各チャネルは、パウチ２１０上の対応するチャネルよりわずかに短い。しかし、チャネル設定は単なる例示であり、そして多様なチャネル設定が本発明の範囲内であることが理解される。
【００９２】
図１５のパウチ５１０及び図６のパウチ２１０の間には２つの主な相違がある。第１に三葉ブリスター２２２が溶解ブリスター５２２に置き換わっている。溶解ブリスター５２２は、図２ｂに示すような、電気モーター１９に取り付けられた回転ブレード又はパドル２１を用いた固着（ｉｍｐａｃｔｉｏｎ）によるボルテックスのために設定されている。この溶解法は、空気圧ピストンの交互の圧に依存しないため、一葉のブリスターのみが示される。溶解ブリスター５２２は、単一の葉しかないため、両チャネル５１４及び５３６は、溶解ブリスター５２２の単一の葉につながる。溶解ブリスター５２２は、本明細書記載のパウチ態様のいずれでも用いてよいことが理解される。溶解アセンブリー８１０が、例として、ブラダー・サブアセンブリー８２２のブラダー８２４、８２６、及び８２８を、ブリスター５２２用に設定された単一のブラダーで置き換えるように修飾されてもよいことがさらに理解される。逆に、上記の多様な他の態様に記載される三葉ブリスターを、パウチ５１０中で用いてもよい。溶解ブリスター５２２は、例として溶解ブリスター５２２の外表面に、接着剤又はラミネート加工を用いて取り付けられた、所望の補強パッチ５２３と共に提供されてもよい。補強パッチ５２３は、パドル２１による反復接触のためにパウチ５１０が裂けるのを最小限にするよう補助する。図１５ａは、第２の支持体メンバー８０４上に取り付けられた電気モーター、例としてＭａｂｕｃｈｉ  ＲＣ−２８０ＳＡ−２８６５  ＤＣモーター（日本・千葉）を示す。１の例示的な態様では、モーターは、５，０００〜２５，０００ｒｐｍで、他の例として１０，０００〜２０，０００ｒｐｍで、そしてさらに他の例として、およそ１５，０００〜１８，０００ｒｐｍで回転する。Ｍａｂｕｃｈｉモーターに関しては、７．２Ｖが溶解に十分なｒｐｍを提供することが見出された。しかし、ブレード２１がパウチ５１０に衝撃を与えている場合は、実際の速度はそれよりも遅い場合もあることが理解される。用いるモーター及びパドルに応じて、溶解のために他の電圧及び速度を用いてもよい。場合によっては、制御された小体積の空気を、溶解ブリスター５２２に隣接するブラダー内で提供してもよい。いくつかの態様では、隣接するブラダーに１又はそれ以上の小体積の空気を部分的に充填すると、溶解プロセス中に溶解ブリスターを配置し、そして支持するのを補助することが見出されている。あるいは他の構造、例として剛性の又は適合したガスケット又は溶解ブリスター５２２周囲の他の残りの構造を用いて、溶解中にパウチ５１０を拘束してもよい。
【００９３】
図１５のパウチ５１０及び図６のパウチ２１０の間の第２の主な相違は、第２段階増幅ゾーン２８０のブリスター２８１、２８２、及び２８３が、第２段階増幅ゾーン５８０では、高密度アレイ５８１により置き換えられていることである。高密度アレイ５８１は、複数の第２段階ウェル５８２、例として５０以上、そしてさらに他の例として１２０以上のウェルを含む。より多くの第２段階ウェル５８２、例として約２００、約４００、又はさらに約５００以上のウェルを含む態様が本発明の範囲内である。他の設定もまた、本発明の範囲内である。ウェル５８２をより小さくすることによるか、高密度アレイ５８１をより大きくすることによるか、又はその組み合わせにより、別の第２段階ウェル５８２を付加してもよい。第２段階ＰＣＲに関しては、各ウェルがプライマー対を含有してもよい。１又はそれ以上のウェルを陽性又は陰性対照のために用いてもよいことが理解される。
【００９４】
ブリスター５６６中の希釈された第１段階増幅産物をウェルに充填する際、ウェル間の交差混入が大きな問題となりうる。交差混入は、パウチ２１０においては、図９に例示される、チャネル２６５の別個のブランチを通じて各第２段階ブリスターを充填し、次いでブラダー８８２で密封して制御された。流体がブリスター５８４のいくつか又は全てを充填されていてもよい高密度アレイ５８１を用いると、ウェル間の交差混入もまた制御しなければならない。１の態様では、第２段階ＰＣＲプライマーを共有的に又は非共有的に、各ウェルの内部表面に結合させてＰＣＲチップと類似に機能させてもよい。しかし、多くの態様では、ＰＣＲプライマーをウェルに束縛することなく、ウェル間の交差混入を制御することが望ましい。ウェル間の交差混入の制御は、高密度アレイ５８１の第１の表面５８１ａに流動させることにより、ブリスター５６６からの流れをウェル５８２に移動させる態様では、困難な場合もある。
【００９５】
第２段階増幅ゾーン５８０の装填を成功させるためのいくつかの望ましい特徴がある。第１に、ブリスター５６６からの流体が、実質的に同じレベルまで、実質的に全てのウェル５８２を充填することが望ましい。充填されていないウェルは偽陰性シグナルを生じるであろう。第２に、ウェル５８２を充填するプロセスは、ウェル中のプライマーの漏出を起こさないことが望ましい。１のウェルからのプライマーの喪失は、当該ウェルでのＰＣＲ反応の効率を限定する場合もあり、近接するウェルを汚染させうる。第３に、ウェル５８２が充填され、ＰＣＲが開始された後、ウェルが互いから完全に密封されることが望ましい。単位複製配列が１のウェルから漏出し、別のウェル内に進入すると、第１のウェル中のシグナルが低下し、第２のウェル中のシグナルが上昇し、潜在的に、第１のウェル中では偽陰性を、第２のウェル中では偽陽性を導きうる。さらに、特定の種類の対照に関しては、１のウェルで生成された単位複製配列が、さらに増幅されうる別のウェルに進入しないことが重要である。
【００９６】
この問題に対する解決法には、バリア層の使用が含まれる。１の例では、バリア層は、ウェルを迅速に装填し、かつ、バルク流体から迅速に密封しうるために提供される、物理的バリアである。別の例では、化学的及び物理的バリアの組み合わせを用い、ウェルを密封するのに物理的バリアを用い、次いで、化学的バリアが、例えば加熱、遅延放出、又は酵素消化により、ウェル溶液内にオリゴヌクレオチドプライマーを条件的に放出する。ウェルからの試薬の放出を制御するのに、ウェルの深さ又は各ウェルへのチャネルの長さもまた用いうる。高密度アレイ５８１を装填するための他の手段を用いうる。
【００９７】
図１５〜１７は、物理的バリアを用いた、第２段階５８０の例示的な態様である。パウチ５１０の第１の層５１８及び第２の層５１９の間に挟まれて、ウェル５８２を含む高密度アレイ５８１がある。図１６に最適に見られるように、穿孔５８６を含む穿孔層５８５が高密度アレイ５８１の１の側面上に提供されて、物理的バリアとして作用し、第２の層５８７が、高密度アレイ５８１の反対の側面上に提供されて、ウェル５８２の底を形成する。例として、穿孔層５８５及び第２の層５８７は、高密度アレイ５８１に対して、例として熱密封により密封されるプラスチックフィルムであるが、密封の他の方法もまた用いてよいことが理解される。高密度アレイ５８１用に用いられる材料、並びに穿孔層５８５及び第２の層５８７用に用いられる材料は、互いに、密封法と、そして用いる化学反応と適合しなければならないこともまた理解される。ＰＣＲ用に用いる場合、高密度アレイ５８１用に使用でき、かつ熱密封できる適合するプラスチックの例は、ＰＥ、ＰＰ、Ｍｏｎｐｒｅｎｅ（登録商標）、及び他のブロックコポリマー・エラストマーである。検出化学反応で蛍光色素を用いる場合、高密度アレイ５８１に関しては、黒又は他の比較的蛍光不透過性である材料から形成されて、１のウェル５８２から隣のウェルへのシグナル流出を最小限にし、層５８５及び５８７の少なくとも１つに関しては、比較的蛍光透過性であることが望ましい場合もある。穿孔層５８５及び第２の層５８７に関しては、ＰＥ、ＰＰ及びＤｕｐｏｎｔ  Ｓｕｒｌｙｎ（登録商標）等の熱密封プラスチック層を用いた、Ｍｙｌａｒ（登録商標）又はＰＥＴ等の強いエンジニアリングプラスチックのラミネート加工を用いてよい。接着剤に基づく系に関しては、ＰＥＴ又はポリカーボネート等の剛性のエンジニアリングプラスチックを用いて、高密度アレイ５８１を形成してもよく、次いで、ＰＣＲ適合性プラスチックのフィルムを穿孔層５８５及び第２の層５８７として用いる。１の例示的な態様では、高密度アレイ５８１は黒いＰＥで形成され、高密度アレイ５８１に熱密封される穿孔層５８５及び第２の層５８７には混成ポリエチレン／ＰＥＴラミネート（又はＸｅｒｏｘ（登録商標）ＰＮ１０４７０２ホットラミネート加工パウチ材料）が用いられ、そしてパウチ５１０の第１及び第２の層５１８、５１９には混成ポリプロピレン／ＰＥＴが用いられる。
【００９８】
穿孔５８６はウェル５８２と並列することが理解される。穿孔５８６は十分に小さく、何らかの力なしには、流体が穿孔５８６を通じて容易には流動しないこともまた理解される。例示的な穿孔は、０．００１〜０．１ｍｍ、他の例として０．００５〜０．０２ｍｍ、そして他の例として約０．０１ｍｍである。例示的な態様では、流体がブリスター５６６から受け入れられると、真空が穿孔５８６を通じて各ウェル５８２内に流体を引き入れるように、第２段階増幅ゾーン５８０は真空下で提供される。ウェル５８２が充填された時点で、流体をウェル５８２内に又はウェル５８２の外に移動させる力はもはや存在しない。次いで、第２段階増幅ゾーン５８０に隣接したブラダー（未提示であるが、ブラダー８８０／８８２の位置と類似）を活性化して、高密度アレイ５８１に対して第１の層５１８を押しつけて、そしてウェル５８２内に流体を密封してもよい。ウェル５８２を密封するのにパウチ５１０の第１の層５１８が用いられるが、穿孔層５８５及び第１の層５１０の間に所望による密封層が提供されてもよいことが理解される。
【００９９】
１の例示的な態様では、第２段階増幅ゾーン５８０を以下のように調製してもよい。プラスチックシート（例として０．１〜１ｍｍ厚）中にウェル５８２のアレイをパンチするか、モールドするか、又は別の方式で形成することにより、高密度アレイ５８１を調製してもよい。ウェルは、所望の任意の規則正しい又は不規則なアレイを形成してもよく、そして例として０．０５μｌ〜２０μｌ、そして他の例として０．１μｌ〜４μｌの体積を有してもよい。次いで、層５８５又は５８７の一方を高密度アレイ５８１の第１の表面５８１ａに、例として熱又は接着剤によりラミネート加工する。図１７に示すように、穿孔層５８５を第１の表面５８１ａに適用する。次いで、試薬５８９、例としてＰＣＲプライマー対等の固有のアレイの化学反応の要素をピペッティングにより手動で、又は自動的に（例としてピン・スポッター等のｘ／ｙ位置決定可能スポッター、ドットマトリックス・プリンター、小体積自動的ピペッター、又は微量流体ミクロ接触スポッターを用いる）のいずれかで、ウェル内にスポッティングする。試薬５８９を各ウェル５８２中で乾燥させた後、層５８５又は５８７の第２のものをアレイ５８１の第２の表面５８１ｂに適用する。小直径針のアレイを用いて、層５８５を穿孔して、穿孔５８６を形成する。層５８５をアレイ５８１に固定する前又は後のいずれに穿孔５８６を形成してもよい。穿孔前又は後に層５８５、あるいは層５８７のいずれかに対してスポッティングを行ってもよいことが理解される。予め穿孔された穴があるアレイにスポッティングすると、実質的に漏出を示さず、穿孔に用いる針が、スポッティングされた試薬に触れることによる混入がないという利点が提供される。あるいは、漏出の可能性を最小限にし、スポッティングされた試薬をアレイ中の最も遠い位置に配置するため、試薬５８９を第２の層５８７上にスポッティングし、アレイ５８１を層５８５で密封し、そして次いで層５８５を穿孔することが望ましい場合もある。例示的な例では、ＧｅＳｉＭＡ０６０−３２４Ｎａｎｏ−Ｐｌｏｔｔｅｒ２．１／Ｅ（Ｇｒｏｓｓｅｒｋｍａｎｎｓｄｏｒｆ、ドイツ）を用いて、試薬を第２の層５８７上にスポッティングする。当該スポッターを用いると、多数のアレイに同時にスポッティングできる。
【０１００】
スポッティングし、そして穿孔した時点で、アレイ５８１をパウチ５１０の層５１８及び５１９内部に入れ、そして例として熱密封、接着剤の使用、超音波溶接、機械的閉鎖、又はブリスター５８４内のパウチ５１０内部にアレイ５８１を被包する他の手段のいずれかにより、適所に密封する。ブリスター５８４が、チャネル５６５を介して、ブリスター５６６に流動的に連結され、そして液体がチャネル５６５からブリスター５８４内に、そして穿孔５８６上に流動できることが理解される。１の例示的な例では、ブリスター５８４が形成された場合、空気が抜けられるよう留意する。これは、第２段階増幅ゾーン５８０に隣接する第１の層５１８の内部表面を「ワッフル処理」して、わずかに盛り上がった風合いのパターンでフィルム材料をインプリントすることにより達成できる。これにより、空気及び液体が、穿孔層５８５の表面に沿って通過でき、液体がウェル５８２の全てに到達してこれらを充填することができる。次いで、パウチ５１０を真空チャンバー内部に入れて排気する。例として、圧がおよそ０．３ミリバールに達したら、真空チャンバー内部の空気圧シリンダーが作動して、プランジャーを装備５９０内に駆動してチャネル５６７を密封し、それにより密封したパウチ内部のアレイ、及び真空チャンバーから経路を遮断する。複数の他のプランジャーもまた、装備５９０内に駆動されて、多様な進入チャネル５１５を密封する。真空チャンバーからパウチを取り除き、そして真空バッグ中での長期保存のためにパッケージングしてもよい。
【０１０１】
パウチ５１０は、パウチ２１０と同様の方式で用いてよい。アレイ５８１は真空中でパッケージングされるため、液体をブリスター５６６から第２段階増幅ゾーン５８０に移動させると、穿孔５８６を通じて液体試料が抜き取られてウェル５８２内に入る。空気圧ブラダーがアレイ上に膨張することにより過剰な液体が排除され、上記のように、例としてアレイの１の側面に対して押しつけられたペルチェ素子を加熱しそして冷却することにより、サーマルサイクリングが達成される。
【０１０２】
上記のように、穿孔層５８５を多様な適当な物理的又は化学的バリアにより置き換えてもよい。化学的バリアを用いる１の例示的な態様では、穿孔層５８５が省かれ、試薬５８９は、比較的緩慢に溶解する緩衝液中で、ウェル５８２内にスポッティングされる。例として、適当な濃度で、ＰＥＧ、Ｆｉｃｏｌｌ又はポリソルベート２０等のポリマー、あるいはスクロース、トレハロース又はマンニトール等の糖を含有する試薬５８９は第２段階ＰＣＲ反応に適合し、単に水又はＴｒｉｓ／ＥＤＴＡ中でスポッティングされたプライマーで緩慢に溶解できる。上記のように、当該緩衝液の１の中でスポッティングされたプライマーをウェル５８２内で風乾してもよい（当該態様では、第２の層５８７がスポッティング用の高密度アレイ５８１に固定されることが理解される）。酵素試薬（例えばＰＣＲにおいて用いる酵素及び緩衝剤）の凍結乾燥において、当該同じポリマーを用いて、安定化された酵素を含有するオープンマトリックスを形成してもよい。したがって、当該緩衝液中でスポッティングされたプライマーをウェル５８２中の適所で凍結乾燥して、風乾よりもより遅いが、潜在的により完全な再水和を導いてもよい。パウチ５１０を用いる場合、ブリスター５６６由来の流体は、真空又は圧によりウェル内に駆動されて、そしてプライマーミックスを溶解させ始める。適当に緩慢に溶解する緩衝剤を選択することにより、第２段階増幅ゾーン５８０に隣接するブラダーが作動し、いかなる実質的な交差混入も生じる前に、各ウェル５８２の内容物が密封される。
【０１０３】
別の態様は、第２段階増幅ゾーン５８０を所定の温度より高温で加熱されるまで、溶解しないマトリックスを用いる。当該マトリックスの１の例は、ＧｅｎｅＰｕｒｅＬｏｗＭｅｌｔアガロース（ＩＳＣＢｉｏｅｘｐｒｅｓｓ）等の低融点アガロースである。１の例では、このアガロースの１．５％溶液は、６５℃で融解し、２４〜２８℃でゲル化する。スポッティング前に、試薬５８９を、例として５０℃に温めて、すでに融解している当該アガロースと混合し、次いで、小体積（例として１００〜５００ｎｌ）中で、ウェル５８２内にスポッティングしてもよい。スポッティング中に混合物を液体のまま維持するため、アガロースの融点より高温で加熱されたキャビネット中でこれを行う必要がありうる。あるいは、融解せずにアガロースの薄い溶液をピペッティングでありうる。アガロース／試薬混合物をスポッティングした後、高密度アレイ５８１を乾燥させる。これは単純な風乾であってもよいし、又はプライマー−アガロース混合物は、試薬が凍結乾燥できるように、上に列挙する糖及びポリマーを含有してもよい。パウチ５１０をＰＣＲに用いる場合、ブリスター５６６由来の流体が高密度アレイ５８１内に移動する際、第２段階増幅ゾーン５８０を例として５５℃に加熱してもよい。この温度ではアガロースは融解せず、プライマーは溶液内に放出されない。高密度アレイ５８１が充填された時点で、対応するブラダーが膨張してウェルを密封する。第１のＰＣＲ周期の第１の変性工程において、温度が６５℃より上昇すると、プライマーを含有するアガロースが融解して、プライマーをマスターミックス内に放出する。例として、サーマルサイクリングは６０℃（又はアガロースの他の融点）未満にはならないため、アガロースはサーマルサイクリング中にはゲル化しない。さらに、図８の例示的な装置８００において、反復される温度周期処理は、パウチの１の側面上に位置するヒーター８８８により駆動される。ウェル５８２中のＰＣＲ溶液に、しばしば温度勾配があり、これが対流によるプライマーの混合を促進することが予期される。類似の態様では、ワックスもまた用いてよい。
【０１０４】
他の態様では、プライマーをウェル５８１に条件的に結合させてもよく、ウェル５８１が充填された後、続いて溶液内にプライマーが放出される。プライマーをどのようにプラスチック支持体に付着させるかに応じて、熱（例としてＰＣＲ反応の最初の周期中）、光（例としてウィンドウ８４７を通じた照射）、化学薬品（例えば熱を伴うジチオスレイトールは、プライマーをウェルに連結するのに用いうるジスルフィド結合を還元する）、又は酵素（例えば組織プラスミノーゲンアクチベーター等の部位特異的プロテアーゼを用いて、プライマーを支持体に付着させる適当なペプチドリンカーを切断できる）を用いて、プライマーを切断できる。
【０１０５】
さらに別の態様では、増幅の後に、第２段階増幅ゾーン５８０内にＤＮアーゼを注入して、混入のいかなる潜在的なリスクも最小限にしてもよい。
【０１０６】
本明細書にＰＣＲで用いるための第２段階増幅ゾーン５８０が記載されていることが理解される。しかし、パウチ５１０及び第２段階増幅ゾーン５８０に関する他の使用も、本発明の範囲内である。さらに、第２段階増幅ゾーン５８０を、核酸抽出及び第１段階増幅ゾーンを伴い又は伴わずに用いてもよいことが理解される。最後に、第２段階増幅ゾーン５８０を、本明細書記載の任意のパウチ態様と共に用いてもよいことが理解される。
【実施例】
【０１０７】
実施例１：入れ子多重ＰＣＲ
装置８００に類似であるが、パウチ１１０用に設定された装置上、図５のパウチ１１０中で、反応セットを実行した。細胞溶解及び２段階核酸増幅の有効性を示すため、対数期のＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｉｅ）及びＳ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）の生存培養物各５０μｌを、健康なドナー由来の１００μｌの鼻咽頭吸引物試料と混合して試料を形成し、次いで２００μｌの溶解緩衝液（６ＭグアニジンＨＣｌ、１５％ＴｒｉｔｏｎＸ１００、３Ｍ酢酸ナトリウム）と混合した。次いで、溶解緩衝液中の４００μｌの試料のうち３００μｌをパウチ１１０のチャンバー１９２ａ内に注入した。
【０１０８】
三葉ブリスター１２２中に密封された０．２５ｇのＺＳビーズを含めてパウチ１１０を製造した。以下に記載の第２段階プライマーもまた、パウチ１１０の製造中にブリスター１８１及び１８２中にスポッティングした。パウチ１１０に以下のように装填した：
１１５ａ  上記の試料及び溶解緩衝液
１１５ｂ  溶解緩衝液中の磁気ビーズ
１１５ｄ〜ｅ  洗浄緩衝液（１０ｍＭクエン酸ナトリウム）
１１５ｇ  溶出緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）
１１５ｈ  第１段階ＰＣＲ緩衝液：
０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ
０．３μＭ  各プライマー：
Ｓｃ１：Ｓ．セレビシエのＲＮＡ及びＭＥＸ６７ｐに結合するＹＲＡ１核タンパク質の一部を増幅するように設定されたプライマー。ｃＤＮＡ（Ｍ−ＭＬＶにより逆転写されたｍＲＮＡ）の増幅が１８０ｂｐ単位複製配列を生じるよう、イントロンにわたり増幅するようにプライマーを設定する；
Ｓｃ２：Ｓ．セレビシエのＭＲＫ１グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ−３）相同体のｃＤＮＡの１２１ｂｐ領域を増幅するように設定されたプライマー；
Ｓｃ３：Ｓ．セレビシエのＲＵＢ１ユビキチン様タンパク質のｃＤＮＡの２１３ｂｐ領域を増幅するように設定されたプライマー；
Ｓｐ１：Ｓ．ポンベのｓｕｃ１−サイクリン依存性プロテインキナーゼ制御サブユニットのｃＤＮＡの２００ｂｐ領域を増幅するように設定されたプライマー；
Ｓｐ２：Ｓ．ポンベのｓｅｃ１４細胞質因子ファミリーのｃＤＮＡの１８０ｂｐ領域を増幅するように設定されたプライマー；
３ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含むＰＣＲ緩衝液（ＢＳＡ不含）
５０単位  Ｍ−ＭＬＶ
４．５単位  Ｔａｑ：抗体
１００単位  ＲＮＡｓｅＯｕｔ
１１５ｊ〜ｋ  第２段階ＰＣＲ緩衝液
０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ
１ＸＬＣ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）Ｐｌｕｓ（Ｉｄａｈｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）
２ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含むＰＣＲ緩衝液（ＢＳＡを含む）、
４．５単位  Ｔａｑ
１１５ｌ  第１段階単位複製配列の試料を含む第２段階ＰＣＲ緩衝液。
【０１０９】
製造中、第２段階ブリスター１８１及び１８２に、入れ子の第２段階プライマーをスポッティングした。第２段階ＰＣＲ緩衝液で再水和した時点で、約０．３μＭの最終濃度を生じる量で、各ブリスターに１のプライマー対をスポッティングした。第２段階入れ子プライマーは以下の通りである：
Ｓｃ１：Ｓｃ１ｃＤＮＡ第１段階単位複製配列の８０ｂｐ断片を増幅するように設定されたプライマー；
Ｓｃ２：Ｓｃ１ｃＤＮＡ第１段階単位複製配列の１２１ｂｐ断片を増幅するように設定されたプライマー；
Ｓｃ３：Ｓｃ１ｃＤＮＡ第１段階単位複製配列の９３ｂｐ部分を増幅するように設定されたプライマー；
Ｓｐ１：Ｓｃ１ｃＤＮＡ第１段階単位複製配列の９９ｂｐ部分を増幅するように設定されたプライマー；
Ｓｐ２：Ｓｃ１ｃＤＮＡ第１段階単位複製配列の９６ｂｐ部分を増幅するように設定されたプライマー；
いかなる標的でも、第１段階及び第２段階プライマー対間には重複はなかった。各第２段階増幅が２つ組で実行され、各２つ組が陰性対照を含むように、各対のプライマーを陰性対照ブリスター１８１及び２つの第２段階ブリスター１８２内にスポッティングした。
【０１１０】
装填後、進入チャネル１１５ａと関連するプランジャーの活性化は、試料を三葉ブリスター１２２に移動させ、進入チャネル１１５ｂと関連するプランジャーの活性化は、磁気ビーズをリザーバー１０１に移動させ、進入チャネル１１５ｄ〜ｅと関連するプランジャーの活性化は、洗浄緩衝液をリザーバー１０２及び１０３に移動させ、進入チャネル１１５ｇと関連するプランジャーの活性化は、溶出緩衝液をリザーバー１０４に移動させ、進入チャネル１１５ｈと関連するプランジャーの活性化は、第１段階ＰＣＲ緩衝液をリザーバー１０５に移動させ、進入チャネル１１５ｊ〜ｋと関連するプランジャーの活性化は、第２段階ＰＣＲ緩衝液をリザーバー１０６及び１０７に移動させ、進入チャネル１１５ｌと関連するプランジャーの活性化は、陽性対照（先に調製した第１段階単位複製配列の試料を含む第２段階ＰＣＲ緩衝液）をリザーバー１０８に移動させた。本実施例では、装置内へのパウチ１１０の装填前に、進入チャネル１１５ａ及び１１５ｂに関連するプランジャーを押圧した。実行中、全ての他のプランジャーを装置中で連続して押圧し、必要に応じて、流体をリザーバー１０２〜１０８に移動させた。
【０１１１】
パウチ１１０を装置内に入れた時点で、上記のようにＺＳビーズの存在下で攪拌を１０分間行った。細胞溶解が完了した時点で、リザーバー１０１を圧迫し、リザーバー１０１由来の核酸結合性磁気ビーズを三葉ブリスター１２２内に押し込み、ここでビーズを穏やかに混合し、５分間インキュベーションした。
【０１１２】
次いで、試料−ビーズ混合物をブリスター１４４に移動させ、磁石の活性化により磁気ビーズを捕捉した。磁石を配備した時点で、ブリスター１４４に隣接するブラダーに加圧して、流体を三葉ブリスター１２２に戻した。次いで、リザーバー１０２及び１０３由来の洗浄溶液を用いて、捕捉したビーズを上記のように洗浄した。洗浄後、磁石の活性化によりブリスター１４４中にビーズをもう一度捕捉し、リザーバー１０４に保存された溶出緩衝液をブリスター１４４に移動させ、ここで２分間インキュベーションした後、次いで、上記のように、ビーズから溶出した核酸をブリスター１６１に移動させた。
【０１１３】
ブリスター１６１中、核酸試料をリザーバー１０５由来の第１段階ＰＣＲマスターミックスと混合する。次いで、試料を４０℃で１０分間（この間、Ｍ−ＭＬＶがｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換する）、次いで９４℃で２分間（Ｍ−ＭＬＶを不活性化し、そしてｔａｑから抗体を除去するため）保持した。サーマルサイクリングは、次いで、９４℃１０秒間及び６５℃２０秒間の２０周期である。
【０１１４】
第１段階増幅の後に、リザーバー１０６由来の第２段階ＰＣＲマスターミックスを用いて、試料をおよそ１００倍希釈する。次いで、上記のように、第２段階プライマーを予めスポッティングしておいたブリスター１８２に試料を移動させる。第２段階ＰＣＲ緩衝液をリザーバー１８１から陰性対照ブリスター１８１に移動させ、そして陽性対照混合物をリザーバー１０８からブリスター１８３に移動させた。試料を９４℃で３０秒間変性させ、次いで９４℃５秒間及び６９℃２０秒間の４５周期、増幅させた。
【０１１５】
図１３に見られうるように、全ての標的単位複製配列及び陽性対照は増幅を示し、一方、陰性対照はいずれも増幅を示さなかった。各試料を複製して実行した。複製は各々、類似の増幅を示した（データ未提示）。
【０１１６】
Ｓ．セレビシエ及びＳ．ポンベ・標的は単なる例示であり、そして他の標的が本発明の範囲内であることが理解される。
【０１１７】
実施例２：高密度ＰＣＲ
上記実施例は図５のパウチ１１０を用いる。パウチ１１０には、５つの陰性対照ブリスター１８１、５つの陽性対照ブリスター１８３、及び１０の低体積試料ブリスター１８２がある。図６のパウチ２１０は、低体積試料ブリスター２８２の数を１８に増加させた。しかし、図１５に示すパウチ５１０の高密度アレイ５８１には、１２０以上の第２段階ウェル５８２があってもよい。第２段階反応数のこの増加は、パウチ及びその装置のサイズを増加させずに、広範なセットの潜在的な診断及びヒト同定に適用できる。多様な例を本明細書に記載する。
【０１１８】
１の例では、一般的な呼吸器ウイルスに関する標準的な商業的免疫蛍光アッセイは、アデノウイルス、ＰＩＶ１、ＰＩＶ２、ＰＩＶ３、ＲＳＶ、インフルエンザＡ、及びインフルエンザＢの７のウイルスを検出できることが公知である。より完全な組には、例として、コロナウイルス、ヒト・メタニューモウイルス、ＢＯＣＡウイルス、ライノウイルス及び非ＨＲＶエンテロウイルスの他の５つのウイルスに関するアッセイが含まれる。アデノウイルス又はＨＲＶ等の非常に可変性のウイルスに関しては、ウイルス系譜の枝全てを標的とする多数のプライマーを用いることが望ましい（例としてそれぞれ４つの外部及び４つの内部プライマーセット）。他のウイルス、例えばコロナウイルスに関しては、１の季節から他の季節で変化しない４つの別個の系譜（２２９Ｅ、ＮＬ６３、ＯＣ４３、ＨＫＵ１）があるが、これらは、別個のプライマーセットを要するほど十分に分岐している。例示的な完全呼吸器ウイルス組はまた、ＳＡＲＳコロナウイルス、おそらく鳥インフルエンザＨＡ及びＮサブタイプ、並びにおそらく他のものも標的とするであろう。最後に、呼吸器ウイルスのいくつかは、非常に高い配列変動率を示すため、当該ウイルス各々に関して、１より多い入れ子ＰＣＲアッセイを生成して、それによりプライマー下での配列変動による偽陰性結果の機会を最小限にすることが有益であろう。本明細書に記載するプライマーセットの全てが含まれる場合、当該呼吸器ウイルス組には、第２段階増幅において、８０以上の特異的単位複製配列がありうる。高密度アレイ５８１は、単一パウチ５１０中で当該組を容易に収容しうる。
【０１１９】
パウチ５１０の高密度アレイ５８１の第２の適用は、感染患者から単離された多剤耐性細菌の同一性及び抗生物質耐性スペクトルを決定することである。現在の方法は、生物を培養し、個々の薬剤耐性プロフィールを実験的に試験するために数日かかる。結果を受け入れるための間、医師はしばしば、広域スペクトル抗生物質を投与し、これにより多剤耐性細菌が増加する。抗生物質耐性の遺伝子決定要因（抗生物質耐性遺伝子自体）を検出するためのＰＣＲプライマーが開発されている。しかし、当該遺伝子のいくつかには非常に多数の変異体があるため、耐性プロフィールを完全に決定するには、多数の単位複製配列が必要である。Ｈｕｊｅｒらは、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）単離体に存在する耐性遺伝子を同定するための６２のＰＣＲアッセイ組を記載する。ここでも、高密度アレイ５８１は、単一パウチ中で当該組を容易に収容しうる。
【０１２０】
高密度アレイの有用性の第３の例は、例としてヒトの遺骸の法医学的同定及び実父確定試験のための、ヒト同定分野における。ヒト同定における市場の大部分では、短いタンデムリピート配列（ＳＴＲ）を分析する系が優位を占める。この分析は、一般的に、大きさにより、例えばキャピラリー電気泳動を用いて、リピートを分離しなければならなかった。この目的に用いられる特殊化された実験室装置は、一般的に野外携帯用ではなかった。同定試験のために一塩基多型（ＳＮＰ）を用いることにますます関心が高まっているが、これはＳＮＰを同定するために多くの技術セットがあり、これらのうちいくつかは野外使用に受け入れられるためである。Ｓａｎｃｈｅｚらは、集合的に、個体が偶然マッチする可能性を非常に低くする（少なくとも５．０ｘ１０−１９の平均マッチ可能性）、５２のよく性質決定されたＳＮＰを公表している。実際、各遺伝子座を正確に型決定するには、各ＳＮＰに関して２つの単位複製配列を要しうる（例えばＺｈｏｕらを参照されたい）。したがって、１０４の第２段階ウェル５８２を持つ１のパウチ５１０は、５２のＳＮＰ遺伝子座の全てで完全に個体を型決定することができる。
【０１２１】
異なる診断適用由来のアッセイを１のパウチ内で組み合わせることにより得られる、コスト及びワークフロー上の利点があることが理解される。例えば、完全呼吸器ウイルス組を、細菌同定組と組み合わせてもよい。組み合わせるパウチのタイプがより少ないため、当該組み合わせは製造を単純化しうる。クリニック中でストックする必要がある特殊なタイプのパウチがより少ないため、これらはまた、エンドユーザーの作業を単純化しうるし、また、特定の臨床試料に対して、誤ったパウチを用いる機会が軽減する。いくつかの適用に関して、当該利点は、より多い数のプライマー対を有するパウチを製造するコスト増を相殺しうる。したがって、１００以上の第２段階ウェル５８２を含む１のパウチ５１０を用いて、多数のアッセイ組を収容しうる。
【０１２２】
実施例３：プロセス制御
非常に多重化されたアッセイの制御は、特に、品質が試験あたりのコストと競合しなければならない臨床診断設定では問題が多い場合もある。単一の実行でアッセイできる診断標的の数が増加するため、パウチ５１０の高密度アレイ５８２では、潜在的に、この問題が高まる。多様な種類の制御を本明細書で記載する。
【０１２３】
例示的なプロセス制御には、試料をパウチ内に注入する前に、無傷の生物、例えばＲＮＡ標的を含有する生物を患者試料内に混合することが含まれる。当該標的は、無傷のＲＮＡバクテリオファージ（ＭＳ２又はＱβ）又は無傷の植物ＲＮＡウイルス（タバコモザイクウイルス）又は無傷の酵母中に存在するｍＲＮＡであってもよい。ＲＮＡ標的に特異的な外部プライマーが第１段階ＰＣＲ中に存在し、内部プライマーを含有するウェル５８２が高密度アレイ中に存在する。このウェル５８２中の増幅産物を検出すると、プロセスの全ての工程が正しく働いていることが確認される。正しい特異的産物が作製されたことを確認するために、第２段階後の増幅融解曲線もまた用いてよい。増幅曲線から決定される交差点（「Ｃｐ」）を用いて、試薬の完全性の定量的測定値を得ることもできる。例えば、Ｃｐを、異なる時点での同じロットの実行由来の他のパウチのものと比較してもよい。無傷の生物を用いる一方、溶解に関して試験することが重要でないならば、精製又は単離核酸を用いてもよいことが理解される。他の状況では、分析のより後の工程のみを試験する制御を用いることが望ましい場合もある。例えば、同族（ｃｏｇｎａｔｅ）プライマーを伴う、高密度アレイ中のウェル内への天然又は合成核酸鋳型のスパイキングを用いて、第２段階ＰＣＲ反応を試験してもよいし、そして第１段階ＰＣＲ増幅混合物において適当なプライマーと共に第１段階ＰＣＲ内に、及び第２段階増幅ゾーンのウェル５８２中に、核酸鋳型をスパイキングすると、第１及び第２段階ＰＣＲ反応が共に試験されるであろう。
【０１２４】
上記プロセス制御は、標的単位複製配列に特異的なプライマーの完全性を試験しない。特異的プライマーの完全性を試験する陽性対照の一例は、核酸、例として合成ＲＮＡの混合物を用いるが、これは、安定性及び可変性をさらに制御できる場合があり、当該配列が、混合物が特定のパウチ中に存在する各プライマーの核酸を含有する、環境的混入によっては存在しえないためである。診断設定において、患者試料を試験するのに用いたパウチの実行終了時に、この陽性対照を用いてもよい。混合物を、例として患者試料に用いたものと同じロットから、パウチに注入し、そして全ての標的単位複製配列が陽性結果を提供することにより、成功を定義する。陰性対照を同じ方式で行ってもよく；患者試料を試験するのに用いたパウチの実行終了時に、水又は緩衝液をパウチ内に注入し、そして全ての標的単位複製配列が陰性結果を提供することにより、成功を定義してもよい。
【０１２５】
診断研究室において、個々のワークフロー及びプロトコルを用いて、上記制御パウチを実行する前に、患者試料パウチ実行の数を決定してもよい。いかに頻繁に又は頻繁でなく制御パウチを実行するかにかかわらず、当該制御は、系全体で時間及びコストがかさむ。このため、対照をパウチに内在させることが有用である。高密度アレイ５８１の構造により、陰性対照に対する以下の新規アプローチをとれる。この例では、核酸、例として合成単位複製配列を、高密度アレイ５８１のウェル５８２ａの１つにスパイク処理する。この配列を増幅するプライマーをこのウェル５８２ａ内に、そしてアレイに渡って間隔を開けた２つの他のウェル５８２ｂ及び５８２ｃ内にスパイク処理する。例として、単位複製配列及びプライマーは人工的であり、用いるプライマーがいずれも、偶然、別の標的を増幅しないように設計される。
【０１２６】
きれいな混入されていないパウチ５１０を装置８００中で実行する場合、合成標的を含有するウェル５８２ａは単位複製配列を生じ、したがって陽性と判定されるであろう。対応するプライマーを含有する２つの他のウェル５８２ａ、５８２ｂは、試料中で何も増幅せず、したがって陰性と判定されるはずである。パウチ５１０をさらに、他の制御のために処理してもよい。例として、次いで、ヒーター８８８に対して高密度アレイを保持するブラダー８８０／８８２を減圧して、ウェル５８２の内容物を混合する。１の例示的な方法では、ウェル５８２の内容物を以下のように混合する：ヒーター８８８を用いて、高密度アレイの温度を緩衝液の沸点より上及び下に、短時間、周期処理する（例えば８５℃１０秒間、次いで１０５℃２０秒間の３周期）。高密度アレイ５８１のウェル５８２で生じた蒸気の泡は、ウェル５８２の内容物を第２段階増幅ゾーンブリスター５８０内に押し出すはずである。場合によっては、ブラダーを用いて、液体をパウチ５１０の一方の末端から他方の末端に移動させることにより、第２段階増幅ゾーン５８０の内容物を、パウチ５１０の残りの内容物と混合してもよい。当該工程の目的は、特異的混入制御単位複製配列を、パウチ全体のいかなる特異的標的単位複製配列とも共に混合することである。
【０１２７】
パウチがこの様式で実行された後、使用者が誤ってパウチを開けてしまった場合、特異的標的単位複製配列及び混入制御単位複製配列が放出されるであろう。微量の当該核酸が後のパウチ実行に混入した場合、合成単位複製配列に特異的なプライマーしか含まないウェル５８２ｂ、５８２ｃが陽性と判定されうるため、装置は、混入事象を検出できる。装置中のソフトウェアは使用者に警告し、実行の結果が疑わしいと注意喚起するであろう。
【０１２８】
混入を制御する別の方法は、実行終了時に、ＤＮＡ分解化学薬品又は酵素を添加して、第１及び第２段階ＰＣＲ反応のＤＮＡ産物の実質的に全てを破壊してもよい。例として、これは、第２段階アレイの内容物を局所沸点より高温で加熱し、増幅された試料をアレイ８５１のウェル５８２から抜き取って、加熱された液体を第１段階反応の希釈された内容物と混合し、ＤＮＡ分解物質のアリコットを、例として進入チャネル５１５ｋを通じて、混合物を冷却しながら又は冷却せずに添加して、ＰＣＲ反応中に産生されたＤＮＡの実質的に全てが破壊されるまで、ＤＮＡ分解反応をインキュベーションしうることにより、上記混入検出法と同様の方式で実行できる。当該技術分野に公知であるように、ＤＮアーゼ、酸、又は酸化剤を用いてこれを達成してもよい。
【０１２９】
本明細書記載の混入制御はいずれも、独立に又は任意の組み合わせで用いてよいことが理解される。
【０１３０】
実施例４：  ｉＰＣＲ
別の例では、本発明のパウチ及び装置をイムノＰＣＲ（ｉＰＣＲ）に用いてもよい。ｉＰＣＲはＥＬＩＳＡの抗体特異性とＰＣＲの感度及び多重能を組み合わせる。ｉＰＣＲは、診断及び毒素検出に適用されているが、おそらく、開放ＥＬＩＳＡ形式において、ＰＣＲ鋳型混入問題が深刻であるため、ｉＰＣＲの商業的適用が広く普及していない。本発明のパウチ形式は、封印された環境を提供するため、本発明のパウチは、ｉＰＣＲによく適している場合もある。
【０１３１】
伝統的なＥＬＩＳＡ検出スキームを図１１に示す（「ＥＬＩＳＡ」と示す）。１９９２年、Ｃａｎｔｏｒ及び同僚ら（本明細書に援用される、Ｓａｎｏ，Ｔ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９２．２５８（５０７９）：ｐ．１２０−２）は、基本的ＥＬＩＳＡ技術の修飾を記載し（図１１、捕捉抗体Ｃ−Ａｂを含まず、「イムノＰＣＲＩ」スキームに類似）、この中で、特異的シグナルを生じさせるために用いる酵素を、ストレプトアビジン−プロテインＡキメラ等の、二重官能性結合部分Ｓを通じて、レポーター抗体Ｒに間接的に付着された固有のＤＮＡ断片と置き換えている。続いて、このＤＮＡ断片をＰＣＲにより検出する。ＰＣＲ検出は、対応するＥＬＩＳＡアッセイを超えるイムノＰＣＲアッセイ感度を劇的に高めることもでき、感度の改善は、一般的に１０２〜１０４倍であることが知られる。定量的リアルタイムＰＣＲ法の進歩により、イムノＰＣＲの速度及び定量性が改善された。レポーター抗体（Ｒ−Ａｂ）をＤＮＡ鋳型タグに直接カップリングする（図１１、「イムノＰＣＲＩＩ」スキーム）と、アッセイ感度が１０２〜１０３倍さらに高まり、異なる抗体各々を異なるオリゴヌクレオチドでタグ付けし、したがって、各抗原を固有の増幅産物と会合させる、多重イムノＰＣＲアッセイを開発できる。
【０１３２】
当該利点は伝統的なＥＬＩＳＡに勝るにもかかわらず、ｉＰＣＲは、最初に報告されてから１３年間、商業的製品に広く採用されていない。これは、部分的に、いかなる開放試験管ＰＣＲ分析法にも内在性の、混入の危険のためである。先行技術のｉＰＣＲプロトコルは、ＥＬＩＳＡアッセイに由来し、多くの洗浄工程を要し、作業領域に増幅物質の混入の可能性が高まる。ワークフロー混入による偽陽性の有意なリスクが、診断評価におけるｉＰＣＲの回避の一因となっている。
【０１３３】
均質（すなわち「閉鎖試験管」）ＰＣＲアッセイが開発されるまで、単位複製配列混入問題のため、ヒト遺伝子状態又は感染性疾患の診断において、ＰＣＲ自体が広く普及して採用されるのが遅れていた。閉鎖試験管系でアッセイの読み取りできることにより、単位複製配列の広がりは大幅に抑えられた。同様に、閉鎖系形式が利用できるならば、ｉＰＣＲはより広く採用されうる。本系において、必要な試薬が全て提供されるパウチ内に、試料が注入される。抗原捕捉、洗浄、レポーター−抗体結合、洗浄、及びそれに続くＰＣＲ検出の工程がパウチ内で完全に実行できる。例として、核酸はパウチを決して離れず、そしてパウチと共に廃棄される。
【０１３４】
本発明のパウチのいずれをｉＰＣＲ用に適応させてもよい。例えば、図６のパウチ２１０を、例として以下のように適応させてもよい。チャンバー２９２ａ〜２９２ｌに以下の構成要素を充填する。例として未精製及び／又は未修飾抗原（例えば毒素）を含む試料を、注入ポート２４１ａからチャンバー２９２ａに注入する。磁気ビーズにコンジュゲート化された捕捉抗体（Ｃ−Ａｂ）をチャンバー２９２ｂ中で提供する。多数の標的を試験しようとする場合、多数の抗原に対する特異性を有する多数の捕捉抗体を用いてもよいことが理解される。所望による前洗浄緩衝液をチャンバー２９２ｃ中で提供する。オリゴヌクレオチド・鋳型にコンジュゲート化されたレポーター抗体（Ｒ−Ａｂ−ＤＮＡ）を、チャンバー２９２ｄ中で提供する。捕捉及びレポーター抗体は、モノクローナル又はポリクローナルであってもよいことが理解される。多数の抗原を検出しようとする場合、捕捉及びレポーター抗体は、ポリクローナル抗体のみ、モノクローナル抗体のみ、又は１の抗原に特異的なポリクローナル及び別の抗原に特異的なモノクローナルの任意の組み合わせを含有してもよい。レポーター抗体がポリクローナルである場合、そのセット中の多様な抗体間の特異性が多様である場合であっても、特定の抗原に特異性を有する全てのレポーター抗体は、１の特異的配列を有するオリゴヌクレオチド・鋳型とカップリングされることが理解される。オリゴヌクレオチドは二本鎖又は一本鎖であってもよい。多数のＲ−Ａｂ−ＤＮＡを提供して多数の抗原を検出してもよく、異なる抗体は各々、固有のオリゴヌクレオチドにコンジュゲート化されている。洗浄緩衝液をチャンバー２９２ｅ〜２９２ｈ中で提供する。上記第１段階ＰＣＲマスターミックスをチャンバー２９２ｉ中で提供する。希釈緩衝液をチャンバー２９２ｊ中で提供する。上記第２段階ＰＣＲマスターミックスをチャンバー２９２ｋ中で提供する。上記のように、試薬をチャンバー２９２ｂ〜２９２ｌ中で乾燥して提供してもよいし、シール２３９を通じた水の注入により使用前に再水和してもよく、又は各個々のチャンバー２９２への注入により、各試薬を湿った状態で提供してもよい。当該組み合わせが意図される。
【０１３５】
試料及び試薬を装填した時点で、パウチ２２０を装置８００内部に挿入する。次いで、プランジャー２６８ａを押圧し、試料を三葉ブリスター２２２に移動させる。プランジャー２６８ｂもまた押圧し、磁気ビーズにコンジュゲート化された捕捉抗体（図１１にＣとして示す）もまた、三葉ブリスター２２２に移動させる。ブラダー８２８からの圧力を、ブラダー８２４、８２６から交互に加圧して、試料及びＣ−Ａｂを混合する。混合が望ましいため、ブラダー８２４、８２６、８２８からの圧力は、溶解に関して上記で用いた圧力よりはかなり低くてもよい。例として、穏やかな混合が得られる。捕捉抗体が試料中の抗原Ｔに結合するのに十分な時間、例として約５分間、試料及びＣ−Ａｂをインキュベーションしうる（Ｃ−Ａｂ−Ｔ複合体を形成する）が、他のインキュベーション時間が望ましい場合もある。ｉＰＣＲに関しては、装置８００中に他のヒーターを含めて、インキュベーションを約３７℃に維持することが望ましい場合もある。
【０１３６】
試料中に存在する抗原が、捕捉のために十分にインキュベーションされた時点で、試料をブリスター２４６に移動させ、磁石８５０を配備して、捕捉抗体をブリスター２４６中で捕捉する。次いで、試料の未結合部分を三葉ブリスター２２２に戻すが、当該ブリスターは廃棄物リザーバーとして機能する。本明細書記載の実施例では、捕捉抗体を拘束するのに磁気ビーズが用いられるが、固体支持体、おそらくブリスターの内部表面への捕捉抗体の架橋さえ含む、他の捕捉機構を用いてよいことが理解される。
【０１３７】
望ましい場合、チャンバー２９２ｃ由来の前洗浄緩衝液を用いて、Ｃ−Ａｂ−Ｔ複合体を洗浄してもよい。チャネル２４５を介して前洗浄緩衝液をブリスター２４４内に移動させ、磁石を引っ込め、Ｃ−Ａｂ−Ｔ複合体を遊離させ、そしてブリスター２４４及び２４６間でビーズを穏やかに移動させる。次いで、磁石８５０の活性化により、ブリスター２４６中でビーズを再捕捉し、そして残りの流体を三葉ブリスター２２２に移動させる。この前洗浄は、バックグラウンド陰性シグナルを超える陽性シグナルの区別を改善することもできるが、当該相違は、有意でないと証明される場合もあると予期される。望ましい場合、他の前洗浄を実行してもよい。
【０１３８】
プランジャー２６８ｄを押圧し、オリゴヌクレオチド・鋳型にコンジュゲート化された１又はそれ以上のリポーター抗体Ｒ−Ａｂ（Ｒ−Ａｂ−ＤＮＡ、図１１のイムノＰＣＲＩＩスキームに核酸が付着したＲとして示される）を含有する混合物をブリスター２４６に移動させる。磁石を引っ込め、ブリスター２４４及び２４６間で移動させて混合物を穏やかに混合する。例として約５分であるが他のインキュベーション時間が望ましい場合もあるインキュベーションにより、図１１のイムノＰＣＲＩＩに例示されるような三元複合体Ｃ−Ａｂ−Ｔ−Ｒ−Ａｂ−ＤＮＡが形成されうる。磁石８５０の活性化により、ブリスター２４６中に三元複合体が捕捉され、残りの流体は、三葉ブリスター２２２に移動する。
【０１３９】
プランジャー２６８ｅを押圧し、そして洗浄緩衝液をチャンバー２９２ｅからブリスター２４６に移動させる。上記前洗浄におけるように磁気ビーズ−三元複合体を洗浄し、磁気ビーズ−三元複合体をブリスター２４６中で再捕捉し、残りの流体を三葉ブリスター２２２に移動させる。ブリスター２４４又はチャネル２４３中に存在しうる未結合Ｒ−Ａｂ−ＤＮＡ複合体を再導入することを回避するため、混合がブリスター２４６及び２４８の間であることを除いて、チャンバー２９２ｆ、２９２ｇ、及び２９２ｈ由来の洗浄緩衝液を用いて、洗浄を複数回反復する。この例示的な態様では、４回の洗浄が記載されるが、例として装備２９０中のチャンバーの数を改変し、又はチャンバーの体積を増加させ、各洗浄に関してチャンバー中の洗浄緩衝液の一部のみしか用いずに、任意の数の洗浄を用いてもよいことが理解される。全ての未結合Ｒ−Ａｂ−ＤＮＡ複合体全てを除去することは、多数回の洗浄を用いてさえ、非常に困難であることもまた理解される。さらに、試料中に存在しない抗原では、その抗原に特異的な未結合Ｒ−Ａｂ−ＤＮＡ又は非特異的に結合したＲ−Ａｂ−ＤＮＡ複合体がわずか数分子存在しても、増幅シグナルを生じうる。したがって、洗浄工程の理想的なゴールは、試料中に存在しない抗原に特異的な全てのＲ−Ａｂ−ＤＮＡ複合体を除去することであるが、１の例示的なゴールは、そのオリゴヌクレオチドに関する増幅曲線が遅延され、陽性試料の増幅曲線とは区別できるように、当該Ｒ−Ａｂ−ＤＮＡ複合体の十分な数を除去することである。例として、洗浄を多くすれば、より多くの未結合Ｒ−Ａｂ−ＤＮＡが除去され、検出限界がより低下するはずであるが、洗浄がより多ければ、磁石により捕捉されていない磁気ビーズの解離又は喪失を通じて、望ましい三元複合体を喪失するリスクがある。洗浄が完了した後、望ましい場合、ＰＣＲ前に、捕捉された三元複合体を加熱するか、又は酵素的に処理して（例として他のチャンバーを介して提供される、パパイン、プロテイナーゼＫ、又は他の適当な酵素を用いて）、ＤＮＡを遊離させる。当該処理は、第１段階ＰＣＲ効率を改善しうる。本明細書で記載するｉＰＣＲ例のいずれと共に、当該処理を用いてもよいことが理解される。
【０１４０】
洗浄が完了した時点で、プランジャー２６８ｉを押圧し、上記のように、第１段階ＰＣＲマスターミックスをブリスター２４６に移動させる。第１段階ＰＣＲマスターミックスは、全ての望ましい標的に関するプライマー対を含有する。磁石８５０を解除し、ブリスター２４６及び２４８間の所望による混合を用いて、三元複合体を再懸濁する。混合物をブリスター２６４に移動させ、上記のように第１段階サーマルサイクリングを行う。上記のように、複合体化オリゴヌクレオチドが十分なレベルまで増幅された時点で、チャンバー２９２ｊ中で提供される希釈緩衝液を用いて、増幅された混合物を場合によって希釈する。第１段階増幅混合物のある程度又は全てを、チャンバー２９２ｋから提供される第２段階ＰＣＲマスターミックスと混合してもよく、次いで、この混合物を１８の第２段階ブリスター２８２に移動させ、上記のように、第２段階プライマーを提供する。望ましい場合、第２段階ブリスター２８２の１つを陰性対照に用いてもよく、ここで陰性対照第２段階ブリスター２８２には、試料中に抗原がまったく存在しないが、Ｒ−Ａｂ−ＤＮＡがチャンバー２９２ｄから提供され、そして適当なプライマーが提供されることが知られる。多様な洗浄にもかかわらず、少量のこの特定のＲ−Ａｂ−ＤＮＡが第１段階ＰＣＲ中に存在する可能性もあり、したがって、少量の第１段階増幅産物がこの第２段階ブリスター２８２に提供されうると予期される。しかし、量は非常に少なく、そして交差点は陽性試料のものをはるかに超えて遅延するはずである。また、望ましい場合、第２段階ブリスターの１つを陽性対照に用いてもよく、ここで、試料には、そうでなければ試験されない（おそらくＣ−Ａｂビーズと共に含まれる）抗原がスパイク処理され、これはおそらく、対応するＲ−Ａｂ−ＤＮＡに結合し、そしてこれが次いで、第１段階ＰＣＲ中で増幅される。最後に、対照ブリスター２８３はこの例示的態様では用いられない。しかし、重要でない再設定を用いて、ブリスター２８３をブリスター２６６に連結してもよく、ブリスター２８３が６つの他の第２段階反応を提供してもよい。あるいは、特定の適用により望ましいように、ブリスター２８３を他の対照のために用いてもよい。
【０１４１】
上記のように、全ての未結合又は非特異的結合Ｒ−Ａｂ−ＤＮＡ複合体を除去することは困難であるため、陰性試料さえもある程度の増幅を示しうる。リアルタイム増幅分析は、閾値交差点の周期数（又は増幅の５０％に到達する際の周期数等の、同等の周期閾値測定値）の相違により、陽性が陰性から区別されうると予期される。
【０１４２】
多数の抗原に関して試験する場合であってさえ、第１段階多重増幅は、ｉＰＣＲでの検出に必要でない場合もあることが理解される。しかし、第１段階多重増幅により、感度はより高くなる。
【０１４３】
実施例５：ｉＰＣＲ特異的パウチを伴うｉＰＣＲ
上記実施例は、ｉＰＣＲのために図６のパウチ２１０を適応させる方法を例示する。しかし、図１２は、ｉＰＣＲ用に例として設定されたパウチ３１０を示す。装備３９０には、１５のチャンバー３９２及びプランジャー３６８がある以外、装備１９０及び２９０に類似である。各チャンバー３９２（例として試料を注入するチャンバー３９２ａ）には、それ自体の注入ポートがあってもよく、又はいくつかのチャンバーに連結チャネルがあってもよく、注入ポートを共有してもよい（例として各々洗浄緩衝液を含有する３９２ｅ〜３９２ｋ）。上記装備と同様、注入ポート及びチャネルの任意の組み合わせが本発明の範囲内である。パウチ３１０は１の主な点で図６のパウチ２１０と異なる。細胞溶解は、通常、ｉＰＣＲには必要でないため、三葉ブリスター２２２は、単一の巨大廃棄物リザーバー３２２により置き換えできる。ｉＰＣＲには多数の洗浄が望ましいため、廃棄物リザーバー３２２は、適用及び反応体積に応じて、多数の使用済み緩衝液を保持する程度に十分な体積、例えば２〜５ｍｌで提供される。装置８００は、パウチ３９０を収容するため、幾分再設定しなければならないことが理解される。
【０１４４】
装置内に挿入する前に、図１２のパウチ３９０は、例として、チャンバー３９２中に以下の構成要素があるであろう。試験する試料をチャンバー３９２ａ内に注入する。磁気ビーズにコンジュゲート化された捕捉抗体（Ｃ−Ａｂ）をチャンバー３９２ｂ中で提供する。場合によって前洗浄緩衝剤をチャンバー３９２ｃ中で提供する。各オリゴヌクレオチド・鋳型にコンジュゲート化されたレポーター抗体（Ｒ−Ａｂ−ＤＮＡ）をチャンバー３９２ｄ中で提供する。上記のように、異なる抗体各々が固有のオリゴヌクレオチドにコンジュゲート化されている、多数のＲ−Ａｂ−ＤＮＡを提供して多数の抗原を検出する。洗浄緩衝液をチャンバー３９２ｅ〜３９２ｋ中で提供する。第１段階ＰＣＲマスターミックスをチャンバー３９２ｌ中で提供する。希釈緩衝液をチャンバー３９２ｍ及び３９２ｎ中で提供する。第２段階ＰＣＲマスターミックスをチャンバー３９２ｏ中で提供する。
【０１４５】
最初に、プランジャー３６８ａ及び３６８ｂを押圧し、チャネル３４３を通じて試料及び捕捉抗体Ｃ−Ａｂをブリスター３４４内に入れる。例としてチャネル３４５を介してブリスター３４４及び３４６の間を移動させて、試料及びＣ−Ａｂを穏やかに混合し、上記のようにインキュベーションする。Ｃ−Ａｂ−Ｔ複合体を形成する程度の時間が経過した後、チャネル３３８を介して混合物をブリスター３４６に移動させ、ここで装置中に収納された磁石３５０を配備し、複合体化されたビーズを捕捉する。残った流体は、チャネル３３９を介して、廃棄物リザーバー３２２に移動する。場合によって、チャネル３４５を介してチャンバー３９２ｃ由来の前洗浄緩衝液をブリスター３４６に移動させ、磁石３５０を引っ込め、ブリスター３４４及び３４６の間で流体を移動させて、磁気ビーズを穏やかに洗浄する。磁石３５０を再び配備し、ビーズを再びブリスター３４６中に捕捉する。
【０１４６】
次にプランジャー３６８ｄを押圧し、核酸鋳型にコンジュゲート化されたレポーター抗体（Ｒ−Ａｂ−ＤＮＡ）をブリスター３４６に移動させ、磁石３５０を引っ込め、例としてチャネル３４５を介してブリスター３４４及び３４６間を移動させて、Ｃ−Ａｂ−Ｔ及びＲ−Ａｂ−ＤＮＡを穏やかに混合し、上記のようにインキュベーションする。三元複合体（Ｃ−Ａｂ−Ｔ−Ｒ−Ａｂ−ＤＮＡ）を形成後、磁石３５０を再び配備し、三元複合体をブリスター３４６中に捕捉し、残った流体を廃棄物ブリスター３２２に移動させる。
【０１４７】
次いで、前洗浄は上記のように、チャンバー３９２ｅ由来の洗浄緩衝液を用いて、三元複合体を洗浄する。磁石３５０を再び配備し、三元複合体をブリスター３４６中で捕捉し、残った流体を廃棄物ブリスター３２２に移動させる。チャンバー３９２ｆ〜３９２ｋ由来の洗浄緩衝液を用いて、洗浄を多様な回数反復する。こうして、図１２の例示的な態様では、７回の洗浄を完了する。しかし、上記のように、特定の適用に応じて、洗浄がより多いか又は少ない場合が望ましい場合もありうる。
【０１４８】
図１１に示すイムノＰＣＲＩＩスキームに例示するように、レポーター抗体を核酸鋳型に直接コンジュゲート化する。本明細書に論じる態様のいずれでも、直接及び間接共有及び非共有結合を含む、任意の多様な方法により、リポーター抗体を核酸鋳型に付着させてもよいことが理解される。また、図１１のイムノＰＣＲＩスキームに例示するように、例えば二次抗体の使用を通じるものを含めて、多様な機構を通じて、レポーター抗体を核酸に付着させてもよい。二次抗体又は他の間接的カップリング機構を用いる場合、他のポート及び他の洗浄工程を付加することが望ましい場合もある。
【０１４９】
次いで、上記のように、プランジャー３６８ｋの活性化により、第１段階ＰＣＲマスターミックスをブリスター３４６に配備し、磁石３５０をもう一度引っ込める。穏やかな混合が望ましい場合、チャネル３４７を介して、ブリスター３４６及び３６４の間で流体を移動させてもよい。先のようにブリスター３４６及び３４４の間で混合を行ってもよいが、例示的な態様では、ブリスター３４６及び３６４の間で混合を行う。これは、ブリスター３４４中に存在しうる未結合レポーター抗体複合体の再導入を低下させる一助となる。次いで、試料をブリスター３６４に移動させる。３６４上に位置するブラダーを穏やかに加圧して、ブリスター３６４がペルチェ素子等の加熱／冷却デバイスと接触するように移動させ、第１段階ＰＣＲに関して上記のように試料をサーマルサイクリングする。上記実施例では、上記のように第１段階ＰＣＲは現在記載されるｉＰＣＲでは不要でありえ、ブリスター３６４及びその関連ヒーターを省いてもよく、全ての洗浄を、例として、ブリスター３４４及び３４６間で混合して行ってもよい。第１段階ＰＣＲを省く場合、以下に記載の希釈もまた、省いてもよい。
【０１５０】
増幅された試料の大部分が廃棄物ブリスター３２２に移動し、ある程度の増幅された試料が、希釈されるためにブリスター３６４中に残る。ブリスター３２２のサイズを空間が制約するか又は他の懸念が制限される場合、残りの廃棄物を含有するのに、ブリスター３４４及び３４６を用いてもよいことが理解される。ブリスター３６６に移動していた少量の残りの増幅試料を、チャネル３４９を経由したチャンバー３９２ｍ由来の希釈緩衝液と混合する。チャネル３５５を介して、試料及び希釈緩衝液を、ブリスター３６４及び３６６間で穏やかに混合してもよい。他の希釈が望ましい場合、チャンバー３９２ｎ由来の希釈緩衝液を用いて希釈を反復してもよい。最後に、希釈試料のある程度を、廃棄物リザーバー３２２に移動させ、残った希釈試料をチャンバー３９２ｏ由来の第２段階ＰＣＲマスターミックスと混合する。混合後、試料を多様な低体積第２段階ブリスター３８２に移動させ、ここで上記のように第２段階プライマーを提供する。この設定において、先のｉＰＣＲ例では上記のように、ブリスター３８３を陰性対照用に用いてもよく、そしてブリスター３８４を陽性対照用に用いてもよい。先のｉＰＣＲ例では上記のように、第２段階ＰＣＲ及び分析を行う。
【０１５１】
実施例６  ＰＣＲ及びｉＰＣＲの組み合わせ
ある状況では、１の反応セットで、抗原及び核酸を試験することが望ましい場合もある。例えば、テロリストの攻撃は、多数の人々を殺すために多様な因子を使用しうる。攻撃に応戦する際、原因因子がウイルス、細菌、又は他の生物であるのか、あるいは原因因子が毒素であるのか不明な場合もある。本発明のパウチの閉鎖環境系は、当該使用によく適している。本明細書に開示する態様では、ＰＣＲ及びｉＰＣＲの両方を単一のパウチ内で行い、多様な生物学的及び抗原性因子を同時検出しうる。
【０１５２】
図１３は、図６のパウチ２１０に類似のパウチ４１０を示す。例示的なパウチ４１０には、パウチ２１０の全てのブリスターがあるが、ブリスター４３０、４３１、４３２、及び４３３もまた含む。パウチ４１０にはまた、２０の対応するプランジャー４６８と共に、２０のチャンバー４９２がある、より大きい装備４９０もある。上記のように、装備には、各チャンバーに関して別個の注入ポートが含まれてもよく、又は多様なチャンバーには連結チャネルがあってもよい。多様な組み合わせが本発明の範囲内である。パウチ４１０の装置は、ブリスター４３０、４３１、４３２、及び４３３、並びにチャネル４３６、４５７、４７３、４８６、４８７、及び４８８に他の空気圧アクチュエーターが、並びにブリスター４３３及び４３１にそれぞれ隣接する他の引き込み式磁石４５１及び４５４が必要であることを除いて、装置８００と類似である。
【０１５３】
例示的な態様では、チャンバーを以下のように装填する。ｉＰＣＲ洗浄緩衝液をチャンバー４９２ａ〜４９２ｅ及び４９２ｊ中で提供する。試験しようとする試料をチャンバー４９２ｆ内に注入する。磁気ビーズにコンジュゲート化された捕捉抗体（Ｃ−Ａｂ）をチャンバー４９２ｇ中で提供する。場合による前洗浄緩衝液をチャンバー４９２ｈ中で提供する。各オリゴヌクレオチド・鋳型にコンジュゲート化されたレポーター抗体（Ｒ−Ａｂ−ＤＮＡ）をチャンバー４９２ｉ中で提供する。細胞溶解緩衝液をチャンバー４９２ｋ中で提供する。核酸結合性磁気ビーズをチャンバー４９２ｌ中で提供する。核酸洗浄緩衝液をチャンバー４９２ｍ及び４９２ｎ中で提供する。核酸溶出緩衝液をチャンバー４９２ｏ中で提供する。第１段階ＰＣＲマスターミックスをチャンバー４９２ｐ中で提供する。希釈緩衝液をチャンバー４９２ｑ及び４９２ｒ中で提供する。第２段階ＰＣＲマスターミックスをチャンバー４９２ｓ中で提供する。図６に関して上に記載の対照をチャンバー４９２ｔ中で提供する。この配置は例であり、そして他の設定ができることが理解される。また、上記の他の実施例同様、当該構成要素の１又はそれ以上を、パウチ４１０の１又はそれ以上のブリスター中で乾燥させて提供してもよい。
【０１５４】
試料をチャンバー４９２ｆ内に装填し、そしてパウチ４１０を装置内に装填した時点で、プランジャー４６８ｆ及び４６８ｇを押圧し、チャネル４３６を通じて試料及びＣ−Ａｂをブリスター４３０に移動させる。ブリスター４３０及び４３１の間で穏やかに移動させて試料及び捕捉抗体を混合し、次いで、上記のようにインキュベーションして、Ｃ−Ａｂ−Ｔ複合体の形成を促進する。試料をブリスター４３１に移動させ、そして磁石４５４を活性化し、Ｃ−Ａｂ−Ｔ複合体を捕捉する。こうして、毒素又は他の標的化された抗原が、ここでブリスター４３１中に捕捉される。例示的な態様では、捕捉抗体とカップリングした磁気ビーズの磁気ビーズ部分の表面は、核酸結合性磁気ビーズの表面とは異なり、そして捕捉抗体にカップリングした磁気ビーズは、例として、核酸に結合しないように設定される。次いで、チャネル４７３を介して、残りの流体を三葉ブリスター４２２に移動させる。次いで、流体をプロセシングし、標的核酸の存在をアッセイしてもよい。試料のこの分割は、標的とされる抗原がＰＣＲ検出で標的とされる生物の表面抗原である場合、問題がある場合もある。当該状況においては、その生物に関する抗原検出及び核酸検出間で選択するか、又はＰＣＲ及びｉＰＣＲに関して別個のパウチを用いることが望ましい場合もある。あるいは、抗体捕捉前に、試料を溶解してもよい。例えば抗原の立体構造を変化させることにより、溶解が抗体捕捉に干渉するならば、試料を分割し、そして試料の部分のみを抗体捕捉前に溶解してもよい。Ｃ−Ａｂ−Ｔの前洗浄が望ましい場合、プランジャー４６８ｈを活性化して、チャンバー４９２ｈ由来の前洗浄緩衝液をブリスター４３１内に移動させる。磁石４５４を引っ込め、流体をブリスター４３０及び４３１間で混合し、磁石４５４をもう一度配備し、Ｃ−Ａｂ−Ｔ複合体をブリスター４３１中で捕捉する。ここで、捕捉後に残されていた細胞をおそらく含有する洗浄緩衝液を、残りの未捕捉物質と共に、三葉ブリスター４２２に移動させる。
【０１５５】
試料がここで、別個のプロセシングのため、２つの部分に分割されることが理解される。試料中に存在する抗原は、ここで、ブリスター４３１中のＣ−Ａｂ−Ｔ複合体中に捕捉される一方、試料中に存在する細胞、ウイルス、及び未結合核酸は、ここで、三葉ブリスター４２２中にあり、溶解される。両方が第１段階ＰＣＲのための準備ができるまで、試料の２つの部分を別個にプロセシングする。当該プロセスは任意の順序で又は同時に行ってもよい。しかし、本態様では、次いで三葉ブリスターが廃棄物リザーバーとして機能できるように、Ｃ−Ａｂ−Ｔ複合体の実質的なプロセシング前に、細胞溶解が行われなければならない。別個の廃棄物リザーバーを用いる場合、望ましいならば、Ｃ−Ａｂ−Ｔ複合体がプロセシングされた後に、細胞溶解を遅延させてもよい。
【０１５６】
チャネル４３６を介して、チャンバー４９２ｋ由来の溶解緩衝液を三葉ブリスター４２２内に移動させる。三葉ブリスター４２２のブリスターに隣接するブラダーを、図６に関して上記のように加圧し、高速衝突を駆動し、試料を剪断し、核酸を遊離させる。細胞が適当に溶解された時点で、プランジャー４６８ｌを活性化し、チャネル４３６を介して、チャンバー４９２ｌ中に保存された核酸結合性磁気ビーズを三葉ブリスター２２０内に注入する。試料を磁気ビーズと混合し、混合物がインキュベーションされうる。次いで、図６のパウチに関して上記のように、プロセシングを続ける。試料及びビーズの混合物を、チャネル４３８を通じてブリスター４４４内に押し込み、次いで、チャネル４４３を通じて、ブリスター４４６内に押し込み、ここで引き込み式磁石４５０が溶液から磁気ビーズを捕捉する。次いで、未捕捉の液体をブリスター４４６から押し出し、ブリスター４４４を通じて、ブリスター４２２内に戻し、これはここで、廃棄物貯蔵所として用いられる。プランジャー４６８ｍを活性化して、チャネル４４５を介してブリスター４４４に、次いで、チャネル４４７を介してブリスター４４６に洗浄溶液を提供してもよい。磁石４５０を引っ込め、ブリスター４４４及び４４６で、ビーズを往復して移動させて、磁気ビーズを洗浄する。磁気ビーズが洗浄された時点で、磁石４５０の活性化により、ブリスター４４６中で磁気ビーズを再捕捉し、次いで、洗浄溶液をブリスター４２２に移動させる。チャンバー４９２ｎ中の洗浄試薬を用いて、このプロセスを反復してもよい。しかし、洗浄がより多くても少なくても本発明の範囲内であることが理解される。洗浄後、チャネル４４７を介して、チャンバー４９２ｏ中に保存された溶出緩衝液をブリスター４４８に移動させ、磁石４５０を引っ込める。チャネル４５２を介して、ブリスター４４６及び４４８間で溶液を循環させ、ブリスター４４６中の磁気ビーズのペレットを破壊し、捕捉された核酸を溶液に入れうる。磁石４５０をもう一度活性化し、ブリスター２４６中で磁気ビーズを捕捉し、溶出された核酸溶液をブリスター４４８内に移動させる。
【０１５７】
ブリスター４３１に戻って、Ｃ−Ａｂ−Ｔ複合体をそこで捕捉する。プランジャー４６８ｉを押圧し、核酸鋳型にコンジュゲート化されたレポーター抗体（Ｒ−Ａｂ−ＤＮＡ）をブリスター４３０に導入し、磁石４５４を引っ込め、例として、チャネル４５７を介してブリスター４３０及び４３１間を移動させて、Ｃ−Ａｂ−Ｔ及びＲ−Ａｂ−ＤＮＡを穏やかに混合し、上記のようにインキュベーションする。三元複合体（Ｃ−Ａｂ−Ｔ−Ｒ−Ａｂ−ＤＮＡ）が形成された後、磁石４５４をもう一度配備し、ブリスター４３１中で三元複合体を捕捉して、残った流体をブリスター４２２に移動させ、このブリスターはここで、廃棄物リザーバーとして用いられる。
【０１５８】
次いで、前洗浄に関して上記のように、チャンバー４９２ｊ由来の洗浄緩衝液を用いて、三元複合体を洗浄する。磁石４５４を再び配備し、ブリスター４４６中で三元複合体を捕捉して、残った流体をブリスター４２２に移動させる。チャネル４８６を介して、チャンバー４９２ａ由来の他の洗浄緩衝液をブリスター４３２内に注入し、磁石４５４を引っ込め、ブリスター４３１及び４３２の流体を混合して三元複合体を再懸濁する。次いで、チャネル４８７を介して、流体をブリスター４３３に移動させ、磁石４５１の活性化により三元複合体をそこに捕捉する。次いで、ブリスター４３３及び４３２を通じて、廃棄物流体をブリスター４２２に戻す。チャンバー４９２ｂからブリスター４３２内に他の洗浄緩衝液を導入し、ブリスター４３２及び４３３間で混合することにより、洗浄を反復する。チャンバー４９２ｃ〜４９２ｅ由来の洗浄緩衝液を用いて、洗浄を多様な回数反復する。したがって、図１３の例示的な態様では、６回の洗浄が完了する。しかし、上記のように、特定の適用に応じて、洗浄がより多いか少ない方が望ましい場合もある。ブリスター４３２及び４３３を用いて、先の洗浄由来の混入を最小限にすることが理解される。望ましい場合、ブリスター４３２及び４３３を省いてもよく、そしてブリスター４３０及び４３１間で混合しながら、チャンバー４９２ａ〜４９２ｅ中に含有される洗浄緩衝液をブリスター４３０又は４３１のいずれかに直接提供してもよい。
【０１５９】
ここで、洗浄した抗体三元複合体をブリスター４３３中に捕捉し、ここで、溶出した核酸はブリスター４４８中にある。ＰＣＲを通じて、独立した反応で、第２段階ＰＣＲブリスターの別個のセットへと、抗体三元複合体及び溶出した核酸をプロセシングしてもよい。しかし、本態様では、抗体三元複合体及び溶出された核酸をＰＣＲ分析用に合わせる。全ての第１段階プライマーを含有する第１段階ＰＣＲマスターミックスを、チャンバー４９２ｐからブリスター４４８内に注入する。次いで、チャネル４５３を介して、核酸試料をブリスター４４８及び４６４間で混合する。ｉＰＣＲ成分のために第１段階ＰＣＲが望ましい場合、次いで、核酸試料をブリスター４３３に移動させ、磁石４５１を引っ込め、再度合わせた試料を例としてブリスター４３３及び４６４間で混合する。次いで、試料をブリスター４６４に移動させ、ここで上記のように試料をサーマルサイクリングする。次に、チャンバー４９２ｑ及び４９２ｒ由来の希釈緩衝液を用いて、増幅された試料を１回又は数回希釈してもよい。各希釈前に、チャネル４４７又はチャネル４８８のいずれかを介して、増幅された試料の大部分をブリスター４６４から除去する。希釈緩衝液の各添加時、チャネル４６２を介して、ブリスター４６４及び４６６間で試料を混合する。希釈後、上記例に記載のように、試料の全て又は一部をチャンバー４９２ｓ由来の第２段階ＰＣＲマスターミックスと混合する。
【０１６０】
次いで、チャネル４６５を介して、試料をブリスター４６６から第２段階増幅ゾーン４８０中のブリスター４８２に移動させる。ブリスター４８２は各々、プライマー対を含んで先に提供されており、いくつかのプライマー対は標的核酸に特異的だが、他のプライマー対は、レポーター抗体にコンジュゲート化されたオリゴヌクレオチドに特異的である。望ましい場合、上記のように、２つのブリスター４８２をｉＰＣＲ対照に充ててもよい。図６のブリスター２８３に関して上記のように、ＰＣＲ対照用にブリスター４８３を用いてもよい。１８のブリスター４８２が示されるが、任意の数のブリスター４８２を用いてよいことが理解される。図６に関して上記のように第２段階ＰＣＲ増幅が進行する。上記のように、ＰＣＲ分析は、増幅曲線、融解曲線又はその組み合わせを用いてもよく、一方、ｉＰＣＲ分析は、交差閾値を用いてもよいことが理解される。他の分析法が本発明の範囲内である。
参考文献
【０１６１】
【表２】
2010509918.tif 000004
【０１６２】
【表３】
2010509918.tif 000005
【０１６３】
【表４】
2010509918.tif 000006
【０１６４】
【表５】
2010509918.tif 000007
【０１６５】
本明細書でＰＣＲ及びｉＰＣＲに言及するが、本明細書に開示するデバイス及び方法は、当該技術分野で公知のように、他の核酸増幅又は他の生物学的プロセシング法、特に第１段階多重反応及び第２段階の個々の反応から利益を得る方法で用いるのに適する。例示的な限定されない第２段階反応には、アレル特異的プライマー伸張を含むプライマー伸張；１又はそれ以上のジデオキシヌクレオチドの取り込みによる終結を含む、伸長終結；蛍光又は非蛍光標識の取り込み；並びに非対称ＰＣＲ、アレル特異的ＰＣＲ、インベーダーアッセイ、及び他の等温増幅又は検出化学反応等の、反応混合物における成分又は成分比の変化を必要とする他の酵素反応が含まれる。
【０１６６】
本発明は、好ましい態様に関して詳細に記載されているが、以下の請求項に記載し、そして定義するような、本発明の範囲及び精神内の改変及び修飾が存在する。
【図１】
2010509918.tif 000008
【図２】
2010509918.tif 000009
【図２ａ】
2010509918.tif 000010
【図２ｂ】
2010509918.tif 000011
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図５ａ】
2010509918.tif 000015
【図５ｂ】
2010509918.tif 000016
【図６】
2010509918.tif 000017
【図６ａ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2010509918.tif 000022
【図１１】
2010509918.tif 000023
【図１２】
2010509918.tif 000024
【図１３】
2010509918.tif 000025
【図１４】
2010509918.tif 000026
【図１５】
2010509918.tif 000027
【図１５ａ】
2010509918.tif 000028
【図１６】
2010509918.tif 000029
【図１７】
2010509918.tif 000030
【手続補正書】
【提出日】平成21年7月16日(2009.7.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
閉鎖系において、試料に対して複数の反応を実行するための容器であって
試料を受け取るためのチャネル、
各々１又はそれ以上の試薬を含み、流動的にチャネルに連結されている複数の高密度反応ウェル、及び
高密度反応ゾーンへの試料の導入に際して、高密度反応ウェル間の交差混入を最小限にするバリア層
を含む高密度反応ゾーンを含む、前記容器。
【請求項２】
高密度反応ウェルに対して加圧して、複数の各ウェル中に試料の部分を密封することができる可動層を含む、請求項１記載の容器。
【請求項３】
試料が流体であり、かつ、バリア層が反応ウェルあたり１又はそれ以上の穿孔がある穿孔層であり、前記穿孔は、力の存在下で流体試料が通過できるほど大きいが、力の非存在下では流体試料を実質的に通過させないほど小さい、請求項１記載の容器。
【請求項４】
力が各高密度反応ウェルにおいて真空である、請求項３記載の容器。
【請求項５】
バリア層が、試薬を条件的に放出する化学的バリアである、請求項１記載の容器。
【請求項６】
複数の高密度反応ウェルが、少なくとも５０の高密度反応ウェルを含む、請求項１記載の容器。
【請求項７】
複数の高密度反応ウェルが、少なくとも１２０の高密度反応ウェルを含む、請求項１記載の容器。
【請求項８】
試薬がＰＣＲプライマー対を含む、請求項１の容器。
【請求項９】
１のウェルが、対照核酸及び対照核酸を増幅するように設定されたプライマー対を含有し、かつ、少なくとも１の他のウェルが、同じプライマーを含有するが対照核酸を含有しない、請求項１１記載の容器。
【請求項１０】
対照核酸が合成核酸である、請求項９の容器。
【請求項１１】
高密度反応ウェルの各セットがＰＣＲプライマーの異なる対を含有する、請求項１の容器。
【請求項１２】
試料を容器内に導入するための試料注入ポート、
試料注入ポートに流動的に連結されている、試料中に存在する細胞又は胞子を溶解するように設定された細胞溶解ゾーン、
細胞溶解ゾーンに流動的に連結されている、核酸を精製するように設定された核酸調製ゾーン、及び
核酸調製ゾーン及び高密度反応ゾーンに流動的に連結されており、試料の第１段階増幅のために設定された第１段階反応ブリスターを含む、第１段階反応ゾーン
をさらに含む、請求項１１記載の容器。
【請求項１３】
試料中の核酸を増幅する方法であって、以下の：
高密度反応ゾーンがある容器を提供する工程であり、前記高密度反応ゾーンは以下の：
試料を受け取るためのチャネル、
各々１対のＰＣＲプライマーを含み、流動的にチャネルに連結されている複数の高密度反応ウェル、及び
高密度反応ゾーンへの試料の導入に際して、高密度反応ウェル間のＰＣＲプライマー対の交差混入を最小限にするバリア層
を含み；
チャネルを介して高密度反応ゾーン内に試料を注入する工程；
各高密度反応ウェルに試料の部分を導入する工程；
高密度反応ウェル中の試料の部分を密封する工程；並びに、
高密度反応ゾーンをサーマルサイクリングするする工程；
を含む、前記方法。
【請求項１４】
バリア層が反応ウェルあたり１又はそれ以上の穿孔がある穿孔層であり、前記穿孔は、力の存在下で流体試料が通過できるほど大きいが、力の非存在下では流体試料を実質的に通過させないほど小さい；
力が各反応ウェルに提供される真空であり；かつ、
試料の部分が穿孔を通じて各反応ウェル内に導入される；
請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
容器が
フレキシブルな第一段階増幅ブリスターを含む複数の流動的に連結された反応チャンバー、及び容器外部から反応ブリスターへの唯一のアクセスを提供する、反応チャンバーに流動的に連結された１以上のシーリング可能ポート
をさらに含み、そして
高密度反応ゾーン内への試料の注入前に、
第一のシーリング可能ポートを経由して容器内に試料を注入し、そして試料注入に続いて第一のポートをシーリングする工程；
ターゲットを増幅するように設定された複数のプライマー対を含むＰＣＲ反応構成要素と、試料中の核酸を混合する工程；及び
第一段階増幅ブリスター中で核酸を熱周期処理して、第一段階増幅混合物を生成する工程；
をさらに含む、請求項１３の方法。
【請求項１６】
どの高密度反応ウェルが第二段階増幅産物を含有するかを検出する工程をさらに含む、請求項１５の方法。
【請求項１７】
複数の高密度反応ウェルが高密度アレイ中に形成され、高密度アレイ中のウェルの各々が第一の末端上でシーリングされ、かつ、バリア層が第二の反対の末端にある、請求項１の容器。
【請求項１８】
高密度アレイがプラスチック片から形成され、かつ、複数のウェルがプラスチック片中に形成される、請求項１７の容器。
【国際調査報告】
2010509918.tif 000031