(57)【要約】  ＬＲＲＫ２タンパク質キナーゼ活性を変調させることに有用であると予測される化合物を同定するための方法であって、（１）試験化合物が基質のＥｚｒｉｎ／Ｒａｄｉｘｉｎ／Ｍｏｅｓｉｎ（ＥＲＭ）ファミリーポリペプチド上のＬＲＲＫ２ポリペプチドのタンパク質キナーゼ活性を変調させるかどうかを決定する工程と、（２）前記ＬＲＲＫ２ポリペプチドのタンパク質キナーゼ活性を変調させる化合物を選択する工程とを含む方法が開示される。このような化合物は、パーキンソン病またはパーキンソン症候群の治療に有用でありうる。ＬＲＲＫ２の触媒活性フラグメントの同定には、ＧＴＰａｓｅ、ＣＯＲおよびキナーゼドメインならびにＷＤ４０様モチーフおよびＣ末端テールを必要とする。【選択図】図１５
2010523101.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＲＲＫ２タンパク質キナーゼ活性を変調させることに有用であると予測される化合物を同定するための方法であって、（１）試験化合物が基質のＥｚｒｉｎ／Ｒａｄｉｘｉｎ／Ｍｏｅｓｉｎ（ＥＲＭ）ファミリーポリペプチド上のＬＲＲＫ２ポリペプチドのタンパク質キナーゼ活性を変調させるかどうかを決定する工程と、（２）前記ＬＲＲＫ２ポリペプチドのタンパク質キナーゼ活性を変調させる化合物を選択する工程とを含む、方法。
【請求項２】
細胞内でのＥＲＭファミリーポリペプチドのリン酸化を変調させる、例えば阻害することに有用であると予測される化合物を同定するための方法であって、（１）試験化合物がＬＲＲＫ２ポリペプチドのタンパク質キナーゼ活性を変調させる、例えば阻害するかどうかを決定する工程と、（２）前記ＬＲＲＫ２ポリペプチドのタンパク質キナーゼ活性を変調させる、例えば阻害する化合物を選択する工程とを含む、方法。
【請求項３】
パーキンソン病（ＰＤ）もしくはパーキンソン症候群またはその他の神経変性状態を治療もしくは予防することに有用であると予測される化合物を同定するための方法であって、（１）試験化合物がＥＲＭファミリー（例えば、ｍｏｅｓｉｎ）ポリペプチドのリン酸化を変調させる、例えば阻害するかどうかを決定する工程と、（２）前記ＥＲＭファミリー（例えば、ｍｏｅｓｉｎ）ポリペプチドのリン酸化を変調させる、例えば阻害する化合物を選択する工程とを含む、方法。
【請求項４】
（１）試験化合物がＬＲＲＫ２ポリペプチドによるＥＲＭファミリー（例えば、ｍｏｅｓｉｎ）ポリペプチドのリン酸化を変調させる、例えば阻害するかどうかを決定する工程と、（２）前記ＬＲＲＫ２ポリペプチドによる前記ＥＲＭファミリー（例えば、ｍｏｅｓｉｎ）ポリペプチドのリン酸化を変調させる、例えば阻害する化合物を選択する工程とを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＬＲＲＫ２ポリペプチドは、野生型ヒトＬＲＲＫ２もしくはそのフラグメント、またはそれらのいずれかの融合体である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記フラグメントは、野生型ヒトＬＲＲＫ２の少なくとも残基１３２６−２５２７を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＬＲＲＫ２ポリペプチドは、野生型ヒトＬＲＲＫ２の自然発生突然変異を有するヒトＬＲＲＫ２、もしくはそのフラグメント、またはそれらのいずれかの融合体である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ヒトＬＲＲＫ２の自然発生突然変異は、パーキンソン病（ＰＤ）と関連する突然変異である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記突然変異は、野生型ヒトＬＲＲＫ２のナンバリングを使用すると、Ｇ２０１９Ｓである、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記突然変異は、野生型ヒトＬＲＲＫ２のナンバリングを使用すると、Ｒ１４４１Ｃ、Ｒ１４４１Ｇ、Ｙ１６９９Ｃ、Ｒ１９１４Ｈ、Ｉ２０１２Ｔ、Ｉ２０２０Ｔ、Ｔ２３５６Ｉ、Ｇ２３８５Ｒ、Ｋ５４４Ｅ、Ｐ７５５Ｌ、Ｒ７９３Ｍ、Ｑ９３０Ｒ、Ｓ９７３Ｎ、Ｒ１０６７Ｑ、Ｓ１０９６Ｃ、Ｉ１１２２Ｖ、Ｓ１２２８Ｔ、Ｉ１３７１Ｖ、Ｒ１４４１Ｈ、Ａ１４４２Ｐ、Ｒ１５１４Ｑ、Ｍ１８６９ＴまたはＧ２０１９Ｓである、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１１】
前記フラグメントは、ヒトＬＲＲＫ２の少なくとも残基１３２６−２５２７に対応する、請求項７から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＬＲＲＫ２ポリペプチドは、ＧＳＴ融合ポリペプチドである、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＬＲＲＫ２ポリペプチドは、ＧＳＴ−ＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７、Ｇ２０１９Ｓ］である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＬＲＲＫ２ポリペプチドおよび／またはＥＲＭファミリーポリペプチドは、組換えである、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＥＲＭファミリーポリペプチドは、ＥＲＭファミリーポリペプチド、例えばｍｏｅｓｉｎ、ｒａｄｉｘｉｎもしくはｅｚｒｉｎに由来するフラグメントであり、例えばｍｏｅｓｉｎのＴｈｒ５５８残基に対応する残基およびこの残基を含む周辺配列の少なくとも一部、例えばこの残基のＣ末端およびＮ末端の少なくとも２、３、４、５、６もしくは７残基、例えばポリペプチドＲＬＧＲＤＫＹＫＴＬＲＱＩＲＱもしくはＲＬＧＲＤＫＹＫＴＬＲＱＩＲＱＧＮＴＫＱＲ、または各々がＴ／Ｓ残基以外の残基の０、もしくは１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個までの保存的もしくは非保存的置換を備えるアミノ酸配列ＲＬＧＲＤＫＹＫ（Ｔ／Ｓ）ＬＲＱＩＲＱもしくはＲＬＧＲＤＫＹＫ（Ｔ／Ｓ）ＬＲＱＩＲＱＧＮＴＫＱＲを含む１００、８０、６０、５０、４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７もしくは１６アミノ酸未満のポリペプチドを含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ＬＲＲＫ２ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドおよびＥＲＭファミリーポリペプチドもしくはポリヌクレオチドを含む、精製された製剤またはパーツのキット。
【請求項１７】
組換えＬＲＲＫ２ポリヌクレオチドを含む、請求項１６に記載の製剤またはキット。
【請求項１８】
組換えＥＲＭファミリーポリヌクレオチドを含む、請求項１６または１７に記載の製剤またはパーツのキット。
【請求項１９】
ＬＲＲＫ２ポリペプチドおよびＥＲＭファミリーポリペプチドを発現できる組換え細胞。
【請求項２０】
組換えＬＲＲＫ２ポリヌクレオチドおよび組換えＥＲＭファミリーポリヌクレオチドを含む、請求項１９に記載の組換え細胞。
【請求項２１】
ＬＲＲＫ２ポリペプチドおよびＥＲＭファミリーポリペプチドを含む、請求項１９に記載の組換え細胞。
【請求項２２】
請求項１９から２１のいずれか一項に記載の細胞から前記製剤を精製する工程を含む、請求項１６から１８のいずれか一項に記載の製剤を製造するための方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法によって入手できる製剤。
【請求項２４】
基質ＥＲＭファミリーポリペプチドへのタンパク質キナーゼ活性を有する２，０００アミノ酸未満の切断ＬＲＲＫ２ポリペプチドであって、野生型ヒトＬＲＲＫ２の少なくともＧＴＰａｓｅドメイン、ＣＯＲドメイン、キナーゼドメイン、ＷＤ４０様モチーフおよびＣ末端テール残基、またはそれらの変異体もしくは自然発生突然変異体を含む、切断ＬＲＲＫ２ポリペプチド。
【請求項２５】
野生型ヒトＬＲＲＫ２の少なくとも残基１３２６−２５２７またはそれらの変異体もしくは自然発生突然変異体を含む、請求項２４に記載の切断ＬＲＲＫ２ポリペプチド。
【請求項２６】
ＬＲＲＫ２ポリペプチドであるＧＳＴ−ＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７、Ｇ２０１９Ｓ］またはＧＳＴ−ＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７］。
【請求項２７】
ＥＲＭファミリーポリペプチド、例えばｍｏｅｓｉｎ、ｒａｄｉｘｉｎもしくはｅｚｒｉｎに由来し得るフラグメントである基質ポリペプチドであって、ｍｏｅｓｉｎのＴｈｒ５５８残基に対応する残基およびこの残基を含む周辺配列の少なくとも一部、例えばこの残基のＣ末端およびＮ末端の少なくとも２、３、４、５、６もしくは７残基、例えばポリペプチドＲＬＧＲＤＫＹＫＴＬＲＱＩＲＱもしくはＲＬＧＲＤＫＹＫＴＬＲＱＩＲＱＧＮＴＫＱＲ、または各々がＴ／Ｓ残基以外の残基の０、もしくは１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個までの保存的もしくは非保存的置換を備えるアミノ酸配列ＲＬＧＲＤＫＹＫ（Ｔ／Ｓ）ＬＲＱＩＲＱもしくはＲＬＧＲＤＫＹＫ（Ｔ／Ｓ）ＬＲＱＩＲＱＧＮＴＫＱＲを含む１００、８０、６０、５０、４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７もしくは１６アミノ酸未満のポリペプチドを含む、基質ポリペプチド。
【請求項２８】
請求項２４から２６のいずれか一項に記載の切断ＬＲＲＫ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２９】
請求項２８に記載の基質ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３０】
ＥＲＭファミリーポリペプチドをリン酸化する方法であって、前記ＥＲＭファミリーポリペプチドは、ＬＲＲＫ２ポリペプチドによってリン酸化される方法。
【請求項３１】
ＥＲＭファミリーポリペプチドをリン酸化する方法におけるＬＲＲＫ２ポリペプチドの使用。
【請求項３２】
前記ＥＲＭファミリーポリペプチドは、全長ヒトｍｏｅｓｉｎのＴｈｒ５５８に対応するトレオニン残基上でリン酸化される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記化合物が全細胞、組織もしくは有機体中でのＥＲＭファミリーポリペプチドのリン酸化、または有機体におけるパーキンソン症候群もしくはパーキンソン病の特性を変調させるかどうかを評価する工程を含み、前記活性もしくは疾患特性を変調させる化合物が選択される、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
全細胞、組織もしくは有機体中で本化合物がＥＲＭファミリーポリペプチドの活性を変調させるかどうかを評価する工程をさらに含み、前記活性を変調させる化合物が選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記選択された化合物を合成する、精製する、および／または調製する工程をさらに含む、請求項１から１５、３３または３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
ＬＲＲＫ２ポリペプチドの活性もしくはＥＲＭファミリーポリペプチドのリン酸化を変調させる化合物を調製するための方法であって、１）請求項１から１５、３３または３４のいずれか一項に記載の方法を実施する工程と、２）前記選択された化合物を合成する、精製する、および／または調製する工程とを含む、方法。
【請求項３７】
ＬＲＲＫ２突然変異体、例えばパーキンソン病を有する患者において見いだされるＬＲＲＫ２突然変異体を特性付ける方法であって、前記ＬＲＲＫ２突然変異体が基質ＥＲＭファミリーポリペプチドをリン酸化する能力を評価する工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ロイシンリッチリピート・タンパク質キナーゼ−２（ＬＲＲＫ２）をコードする遺伝子内の相違する常染色体優性点突然変異は、ヒトに特発性パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ：ＰＤ）と識別できない臨床的所見を備える遅発性ＰＤ（ＯＭＩＭアクセッション番号６０９００７）を発症する素因を与えるという近年の発見［非特許文献１−４］によって関心が大きく高まってきた。現在までに実施された遺伝分析は、ＬＲＲＫ２における突然変異が相当頻回に発生し、家族性ＰＤの５〜１０％を占めるだけではなく、散発性ＰＤ症例のかなりの割合においても見いだされることを示している［非特許文献５、６］。ＬＲＲＫ２が細胞中においてどのように調節されるのか、その生理学的基質は何であるのか、そしてＬＲＲＫ２におけるどのような突然変異がＰＤを誘発するのか、またはＰＤのリスクを増大させるのかについては、ほとんど分かっていない。哺乳動物においては、ＬＲＲＫタンパク質キナーゼの２つのアイソフォームであるＬＲＲＫ１（２０３８残基）およびＬＲＲＫ２（２５２７残基）が存在する。それらは、Ｒｏｃｏとも呼ばれてきたタンパク質ファミリーに属している［非特許文献７］。これまでは、ＬＲＲＫ２における突然変異はＰＤと結び付けられてきたが、ＬＲＲＫ１における突然変異はＰＤと結び付けられていない。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質キナーゼのＬＲＲＫ／Ｒｏｃｏクラスは、最初は粘液変形菌であるＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ  ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ（細胞性粘菌）中において、それがタンパク質キナーゼを含む他のドメインを有するので他の小さなＧＴＰａｓｅドメインとは別個のＲａｓ／ＧＴＰａｓｅスーパーファミリーの異常なメンバーを含んでいる、ＧｂｐＣ（ｃＧＭＰ結合タンパク質Ｃ）と呼ばれるタンパク質であると特性付けられた［非特許文献７、８］。その後の研究は、ＧｂｐＣがＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍにおける化学走性および細胞極性を調節することを提案したが［非特許文献９］、この酵素のための生理学的基質は解明されていない。ＬＲＲＫ／Ｒｏｃｏタンパク質の明確な特徴は、それらがロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）モチーフ、複合体のＲａｓのＣ末端（ＣＯＲ：Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｏｆ  Ｒａｓ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｘ）ドメインと呼ばれている高アミノ酸保存の領域であるＲａｓ様の低分子量ＧＴＰａｓｅ、およびタンパク質キナーゼ触媒ドメインを有することにある［非特許文献７、１０］。ＬＲＲＫ２のタンパク質キナーゼドメインは、チロシン様セリン／トレオニンタンパク質キナーゼに属しており、先天性免疫シグナル伝達経路において重要な役割を果たすＲｈｏ相互作用タンパク質キナーゼ（ＲＩＰＫ）に極めて類似している［非特許文献１１］。その他のドメインもまた、ＬＲＲＫキナーゼの特定メンバー上で見いだされる。例えば、ＧｂｐＣは、哺乳動物ＬＲＲＫ１およびＬＲＲＫ２においては見いだされない追加のＤＥＰ、サイクリックＧＭＰ結合およびＲａｓ−ＧＥＦドメインを有している。ヒトＬＲＲＫ１はそのＮ末端で３つのアンキリンリピートを有しており、他方ＬＲＲＫ２にはこれらのドメインが欠如しているが、ＬＲＲＫ１においては見いだされないそのＣ末端に向けて配置されたＷＤ４０リピートを有している［非特許文献７］。
【０００３】
ヒトＬＲＲＫ２は、ロイシンリッチリピート（残基１０１０−１２８７）、低分子量ＧＴＰａｓｅドメイン（残基１３３５−１５０４）、ＣＯＲドメイン（残基１５１７−１８４３）、セリン／トレオニンタンパク質キナーゼドメイン（残基１８７５−２１３２）およびＷＤ４０リピートとの低類似性を有するモチーフ（２２３１−２２７６）からなる。現在までに、約２０個の単一アミノ酸置換突然変異が常染色体優性ＰＤと結び付けられており、これらは低分子量ＧＴＰａｓｅ、ＣＯＲ、タンパク質キナーゼおよびＷＤ４０ドメインの保存残基内または極めて近位において見いだされている［非特許文献３、４］。
【０００４】
ヨーロッパにおける家族性ＰＤの約６％および特発性ＰＤ症例の３％を占める最も優勢なＬＲＲＫ２の突然変異形は、キナーゼドメインのサブドメインであるＶＩＩ内の保存ＤＹＧ−Ｍｇ２＋結合モチーフ内に位置するＧｌｙ２０１９からＳｅｒ残基へのアミノ酸置換を含んでいる［非特許文献３］。近年の報告書は、この突然変異がＬＲＲＫ２の自己リン酸化ならびにそれがミエリン塩基性タンパク質をリン酸化する能力を中程度に約２〜３倍増強することを提案している［非特許文献１２、１３］。これらの所見は、ＬＲＲＫ２の過剰活性化がヒトにＰＤを発症する素因を与えることを提案しており、これはＬＲＲＫ２を阻害した薬物が、一部の形態のＰＤの発病を遅延させるため、または治療するためにさえ利用できることを意味している。ＬＲＲＫ２についての研究は、活性組換え酵素を発現させることの困難さおよび堅固な定量的アッセイの欠如によって妨げられてきた。
【０００５】
本明細書における以前に発行された文献の列挙または考察は、それらの文献が最新技術または共通する一般的知識の一部であることの承認であると必ずしも見なすべきではない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Paisan-Ruiz, C., Jain, S., Evans, E. W., Gilks, W. P., Simon, J., van der Brug, M., Lopez de Munain, A., Aparicio, S., Gil, A. M., Khan, N., Johnson, J., Martinez, J. R., Nicholl, D., Carrera, I. M., Pena, A. S., de Silva, R., Lees, A., Marti-Masso, J. F., Perez-Tur, J., Wood, N. W. and Singleton, A. B. (2004) Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease. Neuron 44, 595-600
【非特許文献２】Zimprich, A., Biskup, S., Leitner, P., Lichtner, P., Farrer, M., Lincoln, S., Kachergus, J., Hulihan, M., Uitti, R. J., Calne, D. B., Stoessl, A. J., Pfeiffer, R. F., Patenge, N., Carbajal, I. C., Vieregge, P., Asmus, F., Muller-Myhsok, B., Dickson, D. W., Meitinger, T., Strom, T. M., Wszolek, Z. K. and Gasser, T. (2004) Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology. Neuron 44, 601-607
【非特許文献３】Mata, I.F., Wedemeyer, W. J., Farrer, M. J., Taylor, J. P. and Gallo, K. A. (2006) LRRK2 in Parkinson's disease: protein domains and functional insights. Trends Neurosci 29, 286-293
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、活性組換えＬＲＲＫ２を発現させる方法を開発し、タンパク質キナーゼの生理学的基質について探索することを支援するために近年開発されてきたＫＥＳＴＲＥＬ（ＫｉｎａｓＥ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ＴＲａｃｋｉｎｇ  ａｎｄ  ＥＬｕｃｉｄａｔｉｏｎ（キナーゼ基質の追跡および解明））スクリーンにおいてこれを利用した（非特許文献［１４］において精査されている）。これは、ｍｏｅｓｉｎが変性させられると、以前に生理学的に重要なリン酸化部位であると特性付けられたＴｈｒ５５８でＬＲＲＫ２によって効率的にリン酸化される潜在的な生理学的基質であるという同定をもたらした。本発明者らは、これらの所見を利用してＬＲＲＫ２のための堅固な定量的アッセイを開発した。この方法を用いて、本発明者らは、ＰＤを有する患者において同定されたいくつかのＬＲＲＫ２突然変異がＬＲＲＫ２を活性化するのではなく、むしろ影響を及ぼさない、または実質的に阻害することを証明する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の第１態様は、ＬＲＲＫ２タンパク質キナーゼ活性を変調させることに有用であると予測される化合物を同定するための方法であって、（１）試験化合物が基質のＥｚｒｉｎ／Ｒａｄｉｘｉｎ／Ｍｏｅｓｉｎ（ＥＲＭ）ファミリーポリペプチド上のＬＲＲＫ２ポリペプチドのタンパク質キナーゼ活性を変調させるかどうかを決定する工程と、（２）前記ＬＲＲＫ２ポリペプチドのタンパク質キナーゼ活性を変調させる化合物を選択する工程とを含む方法を提供する。
【０００９】
スクリーニング法において変調／評価されるＬＲＲＫ２ポリペプチドのタンパク質キナーゼ活性は、ＥＲＭファミリーポリペプチドのリン酸化である。ＥＲＭファミリーポリペプチドのリン酸化は、下記および実施例において詳細に考察するように、ＥＲＭファミリーポリペプチドのリン酸化または変調を測定することによって評価することができる。例えば、ｍｏｅｓｉｎのリン酸化された（もしくはリン酸化されていない）リン酸化部位に対して特異的な抗体は、当業者には周知であるように、そのリン酸化部位のリン酸化を評価する際に使用することができる。また別の方法は、この教示およびタンパク質リン酸化を評価する多数の公知の方法に基づいて、当業者には明白である。
【００１０】
ＥＲＭファミリーポリペプチドのリン酸化は、ＥＲＭファミリーポリペプチドがアクチン（ａｃｔｉｎ）に結合する、または細胞膜もしくは膜成分、例えばＰｔｄｌｎｓ４，５Ｐ２もしくは膜結合性ポリペプチド、例えばＬ−セレクチン類、ＩＣＡＭ１２３もしくはＣＤ４４に結合する能力を評価する工程によって評価することもできる。例えば、ｍｏｅｓｉｎのＦＥＲＭドメインは、数種の原形質膜タンパク質［非特許文献１８、１９］ならびにＰｔｄｌｎｓ４，５Ｐ２と相互作用することが報告されている。例えば、ｍｏｅｓｉｎの最終３０残基は、Ｆ−アクチン結合部位を形成すると考察されている［非特許文献２０、２２］。そのような結合を評価する方法は当業者には周知であり、実施例は、例えば非特許文献１８、１９、２０、２１、２２、２４および２５のような本明細書で言及した参考文献においても提示されている。
【００１１】
ＥＲＭファミリーポリペプチドのリン酸化もしくは変調は、例えば細胞骨格パラメータを評価することによって細胞内で評価することもできる。１つの例では、Ｎａｋａｍｕｒａら、（１９９５）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７０（５２），３１３７７−３１３８５、「Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ  ５５８  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃａｒｂｏｘｙｌ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ａｃｔｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  Ｍｏｅｓｉｎ  ｂｙ  Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ」に記載されている血小板をベースとするアッセイを使用できる。血小板は、ｍｏｅｓｉｎを含有するがその他のファミリーメンバーであるｒａｄｉｘｉｎおよびｅｚｒｉｎは含有していないことが報告されている。セリン／トレオニンキナーゼ（スタウロスポリン）の非特異的阻害剤およびホスファターゼの阻害剤は、ｍｏｅｓｉｎのリン酸化に反対の作用を有することが見いだされたが、どちらも血小板が極度に長い糸状仮足を形成するがガラス上では広がらないことを誘導することが見いだされた。リン酸化ｍｏｅｓｉｎは、Ｆ−アクチンとともに細胞の中心に集中することが見いだされた。そこで、細胞の挙動（例えば細胞形状）もしくはｍｏｅｓｉｎおよび／またはアクチンの場所のいずれかを（当業者には明白であるように、適切なコントロールを用いて）使用すると、ＬＲＲＫ２ポリペプチドタンパク質キナーゼ活性に試験化合物が及ぼす作用を評価する（または詳細に評価する）ことができる。
【００１２】
本発明のまた別の態様は、細胞内でのＥＲＭファミリーポリペプチドのリン酸化を変調させる、例えば阻害することに有用であると予測される化合物を同定するための方法であって、（１）試験化合物がＬＲＲＫ２ポリペプチドのタンパク質キナーゼ活性を変調させる、例えば阻害するかどうかを決定する工程と、（２）前記ＬＲＲＫ２ポリペプチドのタンパク質キナーゼ活性を変調させる、例えば阻害する化合物を選択する工程とを含む方法を提供する。
【００１３】
本発明のまた別の態様は、パーキンソン病（ＰＤ）もしくはパーキンソン症候群（またはその他の神経変性状態）を治療もしくは予防することに有用であると予測される化合物を同定するための方法であって、（１）試験化合物がＥＲＭファミリー（例えば、ｍｏｅｓｉｎ）ポリペプチドのリン酸化を変調させる、例えば阻害するかどうかを決定する工程と、（２）前記ＥＲＭファミリー（例えば、ｍｏｅｓｉｎ）ポリペプチドのリン酸化を変調させる、例えば阻害する化合物を選択する工程とを含む方法を提供する。本方法は、（１）試験化合物がＬＲＲＫ２ポリペプチドによるＥＲＭファミリー（例えば、ｍｏｅｓｉｎ）ポリペプチドのリン酸化を変調させる、例えば阻害するかどうかを決定する工程と、（２）前記ＬＲＲＫ２ポリペプチドによる前記ＥＲＭファミリー（例えば、ｍｏｅｓｉｎ）ポリペプチドのリン酸化を変調させる、例えば阻害する化合物を選択する工程とを含んでいてよい。ＥＲＭファミリーポリペプチドのリン酸化を評価するための方法の例については上記で考察しており、上記で考察したように、リン酸化特異的抗体を利用する方法を含んでいる。
【００１４】
ＬＲＲＫ２ポリペプチドの活性は、上記で考察したように、適切なリン酸塩ドナーの存在下で、ＬＲＲＫ２ポリペプチドによるＥＲＭファミリーポリペプチドのリン酸化を測定する工程によって測定することができる。ＥＲＭファミリーポリペプチドのリン酸化を評価する方法の例は、上記に指示されている。
【００１５】
タンパク質キナーゼ活性は、特定の基質についてのＬＲＲＫ２ポリペプチドのＶｍａｘもしくはＫｍ（または両方）における変化によって増加または減少させることができる。例えば、活性は、増加したＶｍａｘまたは減少したＫｍによって増加させることができる。ＬＲＲＫ２ポリペプチドが活性化または不活性化させられているかどうかを決定するためには、ＶｍａｘもしくはＫｍのいずれかの数値を決定することが必ずしも必要ではないことは理解される。
【００１６】
活性は、所定の時間でリン酸化される基質の量として測定できる。このため活性の変化は、所定の時間でリン酸化される基質の量における変化として（例えば、単一濃度で）検出することができる。活性は、少なくとも２倍、好ましくは５、１０、１５、２０、２５、３０または５０倍、適切に増加または減少させられるのが好ましい。
【００１７】
例えば、化合物に曝露させる場合には（１）基質をＬＲＲＫ２ポリペプチドへ曝露させた後、（２）基質をＬＲＲＫ２ポリペプチドへ曝露させる前に、および／または（３）ＬＲＲＫ２ポリペプチドへ曝露させずに、基質の特性を測定する工程によって、基質の特性に化合物が及ぼす作用を決定するのが必要な場合があることは理解される。
【００１８】
タンパク質キナーゼ活性を変調させることには、タンパク質キナーゼ活性の阻害または増加が含まれる。
【００１９】
ポリペプチドのリン酸化が発生する可能性のある本発明の方法では、本発明の上記の態様について記載したように、適切なリン酸塩ドナーの存在が必要になる場合があることは理解される。適切なリン酸塩ドナーは、当業者には公知であり、例えば実施例において記載されたようにマグネシウム塩（ＭｇＡＴＰ）としてのＡＴＰを含む。
【００２０】
試験化合物がＬＲＲＫ２ポリペプチドとＥＲＭファミリーポリペプチドとの結合に及ぼす作用を評価するのが有用な場合がある。ポリペプチド：ポリペプチド相互作用を評価する方法は、当業者には周知である。
【００２１】
ＬＲＲＫ２および／またはＥＲＭファミリーポリペプチドは、例えば、ＬＲＲＫ２および／またはＥＲＭファミリーポリペプチドが自然に発現する細胞から精製することができるが、ＬＲＲＫ２およびＥＲＭファミリーポリペプチドのうちの少なくとも１つが組換え型であるのがより便宜的である可能性がある。
【００２２】
用語「ＥＲＭファミリーポリペプチド」は、上述したように、当業者には周知である。ＥＲＭファミリーメンバーには、上述したように、ｍｏｅｓｉｎ、ｅｚｒｉｎおよびｒａｄｉｘｉｎが含まれる。ｍｅｒｌｉｎは、また別のＥＲＭファミリーメンバーである。アッセイにおいて使用されるＥＲＭファミリーポリペプチドは、組換え型または非組換え型であってよい。ＥＲＭファミリーポリペプチドは、例えば、細菌によって発現する、または哺乳動物細胞によって発現する（例えば、実施例において記載したような）ＥＲＭファミリーポリペプチドであってよい。ＥＲＭファミリーポリペプチドは、天然型ＥＲＭファミリーメンバーのアミノ酸配列、例えば天然型のｍｏｅｓｉｎ、ｅｚｒｉｎ、ｒａｄｉｘｉｎまたはｍｅｒｌｉｎポリペプチドのアミノ酸配列を有していてよい、または（例えば、実施例１に記載したような）融合ポリペプチドであってよい、もしくはそれを含んでいてよい、またはＬＲＲＫ２ポリペプチド、例えば実施例１に記載したようなＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７］またはＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７、Ｇ２０１９Ｓ］によってリン酸化もしくは活性化される能力を保持する天然型ＥＲＭファミリーメンバーのフラグメントもしくは変異体であってよい。そこで、ＥＲＭファミリーポリペプチドは、全長野生型ヒトｍｏｅｓｉｎのトレオニン（Ｔｈｒ）５５８に対応する位置でのトレオニン（もしくはセリン）残基を保持するＥＲＭファミリーポリペプチドであるのが好ましい。ＥＲＭファミリーポリペプチドは、Ｔｈｒ５５８に対応する残基がトレオニンもしくはセリン以外の残基によって置換されている、例えばアラニンによって置換されている突然変異体ではないのが好ましい。ＥＲＭファミリーポリペプチドは、全長野生型ヒトｍｏｅｓｉｎのトレオニン５２６に対応する位置でのトレオニン（もしくはセリン）残基を保持するＥＲＭファミリーポリペプチドであってよい。ＥＲＭファミリーポリペプチドは、Ｔｈｒ５２６がトレオニンもしくはセリン以外の残基によって置換されている、例えばアラニンによって置換されている突然変異体ではなくてよい。ｍｏｅｓｉｎのＴｈｒ５５８残基およびこの残基を含む周辺配列の少なくとも一部に対応する残基、例えばこの残基のＣ末端およびＮ末端の少なくとも２、３、４、５、６もしくは７残基を含むＥＲＭファミリーポリペプチド、例えばｍｏｅｓｉｎ、ｒａｄｉｘｉｎもしくはｅｚｒｉｎに由来し得るフラグメントは、スクリーニング法において使用するために適切な基質である。ｍｏｅｓｉｎのＴｈｒ５２６残基およびこの残基を含む配列の少なくとも一部に対応する残基、例えばこの残基のＣ末端および／またはＮ末端の少なくとも２、３、４、５、６もしくは７残基を含むＥＲＭファミリーポリペプチド、例えばｍｏｅｓｉｎ、ｒａｄｉｘｉｎもしくはｅｚｒｉｎに由来し得るフラグメントは、スクリーニング法において使用するために適切な基質の可能性がある。ポリペプチドは、例えば、この残基を含む少なくとも８または９残基を、例えばこの残基のＮ末端の５−６残基およびこの残基のＣ末端の２もしくは３残基とともに有していてよい。
【００２３】
実施例および図面に示したように、ＬＲＲＫ２は、ｅｚｒｉｎ、ｒａｄｉｘｉｎ、ｍｏｅｓｉｎおよびｍｅｒｌｉｎ上の等価の残基をリン酸化し、これらのいずれか１つは、例えばスクリーニングアッセイにおいてＬＲＲＫ２のための基質として使用できよう。全てが同様にリン酸化されており、何が使用されたかに依存する有意差はないと考えられている。
【００２４】
ｍｏｅｓｉｎ、ｒａｄｉｘｉｎもしくはｅｚｒｉｎに由来し得る、ｍｏｅｓｉｎのＴｈｒ５５８に対応する残基を含む適切な基質は、ＲＬＧＲＤＫＹＫＴＬＲＱＩＲＱまたはＲＬＧＲＤＫＹＫＴＬＲＱＩＲＱＧＮＴＫＱＲである。ｍｏｅｓｉｎのＴｈｒ５５８に対応する残基には、下線が付けられている。
【００２５】
ＥＲＭファミリーポリペプチドは、各々Ｔ／Ｓ残基以外の残基の０もしくは１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個までの保存的もしくは非保存的置換を備えるアミノ酸配列ＲＬＧＲＤＫＹＫ（Ｔ／Ｓ）ＬＲＱＩＲＱまたはＲＬＧＲＤＫＹＫ（Ｔ／Ｓ）ＬＲＱＩＲＱＧＮＴＫＱＲを備える、１００、８０、６０、５０、４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７もしくは１６アミノ酸未満のポリペプチドであってよい。ＥＲＭファミリーポリペプチドは、さらにまた各々Ｔ／Ｓ残基以外の残基の０もしくは１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個までの保存的もしくは非保存的置換を備えるＴ／Ｓ残基を含むこの配列からの少なくとも７、８、９もしくは１０個のアミノ酸を含む１６アミノ酸未満のポリペプチドであってよい。ポリペプチド配列は、典型的には天然型ＥＲＭファミリーポリペプチド、例えば任意で残基（例えば、残基の１０、２０、３０、４０、５０もしくは６０％まで）の保存的もしくは非保存的置換を備える、ｍｏｅｓｉｎ、ｒａｄｉｘｉｎもしくはｅｚｒｉｎ、例えばヒトｍｏｅｓｉｎ、ｒａｄｉｘｉｎもしくはｅｚｒｉｎの配列に由来してよい。
【００２６】
図１９および２０に示したデータはさらに、Ｔｈｒ残基を取り囲む個別残基の相対重要性がＴｈｒ５５８と等価であることを示している。最も重要な残基はＴｙｒ５５６（−２位）であると思われ、＋２位での塩基性残基に対する顕著な優先性もまた認められた。そこで、１つの実施形態では、ポリペプチドはＴ／Ｓ残基に対して−２位でチロシン残基を、および／またはＴ／Ｓ残基に対して＋２位で塩基性残基（例えば、アルギニンまたはリシン）を有している。
【００２７】
より長い配列ＲＬＧＲＤＫＹＫ（Ｔ／Ｓ）ＬＲＱＩＲＱＧＮＴＫＱＲ（長鎖ＬＲＲＫｔｉｄｅと呼ばれる）は、より短い配列ＲＬＧＲＤＫＹＫ（Ｔ／Ｓ）ＬＲＱＩＲＱ（短鎖ＬＲＲＫｔｉｄｅ）に比較して５〜１０分の１の少ない量のペプチドの使用を許容すると考えられる。しかし、短鎖および長鎖ペプチド配列におけるコア認識モチーフは同一である。
【００２８】
ＬＲＲＫ２ポリペプチドによってそれをインビトロ（試験管内）でリン酸化させるためには、実施例１において考察するように、例えば、それがＦＥＲＭドメイン（例えばヒトｍｏｅｓｉｎの残基１−２９８）およびＣ末端テール領域（Ｃ−ＥＲＭＡＤドメイン、例えばヒトｍｏｅｓｉｎの残基４８９−５７５）の両方を含む場合は、ＥＲＭポリペプチドを変性させることが必要になり得る。したがって、ＥＲＭポリペプチドが機能的ＦＥＲＭドメインを含まないことが望ましいことがある。
【００２９】
ＮＣＢＩデータベースにおけるＥＲＭファミリーポリペプチドのためのアクセッション番号の例には、以下が含まれる：
ＡＡＢ０２８６４，Ｍ８６４５０（ブタｍｏｅｓｉｎ）
ＡＡＡ３９７２８，Ｍ８６３９０．１，ＮＰ＿０３４９６３，ＮＭ＿０１０８３３．２（ハツカネズミｍｏｅｓｉｎ）
ＮＰ＿００２４３５，ＮＭ＿００２４４４．２（ヒトｍｏｅｓｉｎ）
ＮＰ＿１１０４９０，ＮＭ＿０３０８６３．１（ドブネズミｍｏｅｓｉｎ）
ＮＰ＿００１０３９９４２，ＮＭ  ００１０４６４７７．１（ウシｍｏｅｓｉｎ）
ＮＰ＿０６２２３０，ＮＭ＿０１９３５７．１（ドブネズミｅｚｒｉｎ）
ＣＡＡ４３０８６，Ｘ６０６７１．１（ハツカネズミｅｚｒｉｎ）
Ｐ１５３１１（ヒトｅｚｒｉｎ）
ＮＰ＿００２８９７，ＮＭ＿００２９０６．３（ヒトｒａｄｉｘｉｎ）
ＮＰ＿０３３０６７，ＮＭ＿００９０４１（ハツカネズミｒａｄｉｘｉｎ）
ＮＰ＿００１００５８８９，ＮＭ＿００１００５８８９．２（ドブネズミｒａｄｉｘｉｎ）
ＮＰ＿００１００９５７６，ＮＭ＿００１００９５７６．１（ブタｒａｄｉｘｉｎ）
Ｐ３５２４０（ヒトｍｅｒｌｉｎ）
Ｐ４６６６２（ハツカネズミｍｅｒｌｉｎ）
Ｑ６３６４８（ドブネズミｍｅｒｌｉｎ）
【００３０】
哺乳動物および非哺乳動物ＥＲＭファミリーポリペプチド配列の極めて多数のまた別の例は、当業者には周知であるように、ＮＣＢＩ  Ｍｅｄｌｉｎｅ（商標）サービスからアクセス可能な配列データベースにおいて入手できる。
【００３１】
用語「ＬＲＲＫ２」は、上述したように、当業者には周知である。アッセイにおいて使用されるＬＲＲＫ２ポリペプチドは、組換え型または非組換え型であってよい。ＬＲＲＫ２ポリペプチドは、例えば細菌によって発現する、または（例えば、実施例において記載したような）哺乳動物細胞によって発現するＬＲＲＫ２ポリペプチドであってよい。基質ポリペプチド、例えばＥＲＭファミリーポリペプチドとともにＬＲＲＫ２ポリペプチドを発現させるのが適切な場合がある。ＬＲＲＫ２ポリペプチドは、天然型ＬＲＲＫ２のアミノ酸配列を有していてよい、または（例えば、実施例１に記載したような）融合ポリペプチドであってよい、もしくはそれを含んでいてよい、または例えば実施例１に記載したように、ＥＲＭファミリーポリペプチドもしくはミエリン塩基性タンパク質をリン酸化する能力を保持する、例えば全長ヒトｍｏｅｓｉｎのＴｈｒ５５８（もしくはＴｈｒ５２６）に対応する残基上の（実施例１に記載したように変性させた）ｍｏｅｓｉｎもしくはそのフラグメントをリン酸化する能力を保持する天然型ＬＲＲＫ２のフラグメントもしくは変異体であってよい。そこで、ＬＲＲＫ２ポリペプチドは、活性キナーゼドメインを保持するＬＲＲＫ２ポリペプチドである。触媒的に活性であるために、ＬＲＲＫ２ポリペプチドは、実施例１に記載したようにＧＴＰａｓｅドメイン、ＣＯＲドメイン、ＷＤ４０様モチーフおよびＣ末端テールに対応する領域を保持することもまた考察されている。ＬＲＲＫ２ポリペプチドは、全長ＬＲＲＫ２内に存在するロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）モチーフを含んでいない可能性がある。ＬＲＲＫ２ポリペプチドは、実施例１に記載したように、野生型ヒトＬＲＲＫ２、またはそのようなフラグメントのＧＳＴ融合の残基１３２６−２５２７を含んでいてよい、またはそれらからなってよい。上記に示した無傷キナーゼドメインおよびその他のドメインを含有するＬＲＲＫ２のフラグメントは有用な可能性があるが、ＬＲＲＫ２のその他の領域（例えば、ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）モチーフ）は有用ではない可能性がある。ＬＲＲＫ２のこの領域は、タンパク質キナーゼ活性を保持するために十分であるが、全長ＬＲＲＫ２より短く、活性形で発現させるのが容易である。本アッセイにおいて使用されるＬＲＲＫ２ポリペプチドは、実施例において記載されているようなｋｉｎａｓｅ−ｄｅａｄ型突然変異体（例えば、全長ヒトＬＲＲＫ２の残基Ｄ２０１７と等価の残基が、例えば、アラニンへ突然変異させられているＬＲＲＫ２）ではない。
【００３２】
そこで、ＬＲＲＫ２ポリペプチドは、野生型ヒトＬＲＲＫ２もしくはそのフラグメント、またはそれらのいずれかの融合体であってよい。フラグメントは、野生型ヒトＬＲＲＫ２の少なくとも残基１３２６−２５２７を含んでいてよい。Ｃ末端での切断は切断したＬＲＲＫ２ポリペプチドのタンパク質キナーゼ活性に有害な影響を及ぼし得るが、他方フラグメントのＮ末端での切断はより良好に忍容される可能性があると考えられる。そこで、切断ＬＲＲＫ２ポリペプチドのＮ末端は、または残基１３２６の後、例えば残基１３２６と約残基１３３６との間に存在する可能性がある。
【００３３】
ＬＲＲＫ２ポリペプチドは、野生型ヒトＬＲＲＫ２の自然発生突然変異を有するヒトＬＲＲＫ２、またはそのフラグメント、またはそれらのいずれかの融合体であってよい。そのフラグメントは、自然発生突然変異を有するヒトＬＲＲＫ２の少なくとも残基１３２６−２５２７を含んでいてよい。
【００３４】
ヒトＬＲＲＫ２の自然発生突然変異は、パーキンソン病（ＰＤ）と関連する突然変異であってよい。突然変異は、野生型ヒトＬＲＲＫ２のナンバリングを用いると、Ｇ２０１９Ｓであってよい。この突然変異は、実施例１において詳細に考察するように、ＬＲＲＫ２のタンパク質キナーゼ活性を増強すると考えられる。
【００３５】
突然変異は、野生型ヒトＬＲＲＫ２のナンバリングを用いると、またはＲ１４４１Ｃ、Ｒ１４４１Ｇ、Ｙ１６９９Ｃ、Ｒ１９１４Ｈ、Ｉ２０１２Ｔ、Ｉ２０２０Ｔ、もしくはＧ２３８５Ｒであってよい。突然変異Ｒ１４４１Ｃ、Ｒ１４４１Ｇ、Ｙ１６９９ＣもしくはＴ２３５６Ｉを備えるＬＲＲＫ２は、野生型ＬＲＲＫ２に類似するタンパク質キナーゼ活性を有すると考えられる。突然変異Ｒ１９１４ＨもしくはＩ２０１２Ｔを備えるＬＲＲＫ２は、ほぼ不活性であると考えられる。突然変異Ｉ２０２０Ｔを備えるＬＲＲＫ２は、野生型ＬＲＲＫ２と突然変異Ｒ１９１４ＨもしくはＩ２０１２Ｔを備えるＬＲＲＫ２との中間の活性を有すると考えられる。突然変異Ｇ２３８５Ｒを備えるＬＲＲＫ２もまた、ほぼ不活性であると考えられる。また別の突然変異体の活性は、図１７に示した。
【００３６】
１つより多いＬＲＲＫ２ポリペプチドに対して、例えば１つより多い突然変異ＬＲＲＫ２ポリペプチドに対して化合物を試験するのが有益な可能性がある。これは、設計および試験すべきまた別の化合物を決定するのに役立つことがある。
【００３７】
ＬＲＲＫ２ポリペプチドは、実施例１において考察するように、ＧＳＴ融合ポリペプチドであってよい。例えば、ＬＲＲＫ２ポリペプチドは、ＧＳＴ−ＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７、Ｇ２０１９Ｓ］であってよい。また別の融合部分もまた、当業者には周知であるように、使用できる。
【００３８】
必須ではないが、ＬＲＲＫ２ポリペプチドは、残基Ｔｈｒ５５８もしくはＴｈｒ５２６上の全長ヒトｍｏｅｓｉｎのリン酸化、またはそのような残基（例えば、上記で考察したような、例えばＲＬＧＲＤＫＹＫＴＬＲＱＩＲＱまたはＲＬＧＲＤＫＹＫＴＬＲＱＩＲＱＧＮＴＫＱＲ）を含むペプチド基質のリン酸化に関して全長ヒトＬＲＲＫ２の酵素活性の少なくとも３０％を有するのが特に好ましい。
【００３９】
ＬＲＲＫ２ポリペプチドが、残基Ｔｈｒ５５８もしくはＴｈｒ５２６上の全長ヒトｍｏｅｓｉｎのリン酸化、または上記で考察したようなそのような残基を含むペプチド基質のリン酸化に関して全長ヒトＬＲＲＫ２の酵素活性の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％およびより好ましくは少なくとも９０％を有すれば、より好ましい。
【００４０】
ＮＣＢＩデータベースにおける哺乳動物ＬＲＲＫ２配列のためのアクセッション番号の例には、以下が含まれる：
ＡＡＶ６３９７５．１  ｈｕｍａｎ
ＸＰ＿００１１６８４９４．１  Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ（チンパンジー）
ＸＰ＿６１５７６０．３  Ｂｏｓ  Ｔａｕｒｕｓ（ウシ）
ＸＰ＿５４３７３４．２  Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ（イヌ）
ＮＰ＿０８０００６．２  Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス）
ＸＰ＿２３５５８１．４  Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（ラット）
【００４１】
哺乳動物および非哺乳動物のＬＲＲＫ２ポリペプチド配列の極めて多数のまた別の例は、当業者には周知であるように、ＮＣＢＩ  Ｍｅｄｌｉｎｅ（商標）サービスからアクセス可能な配列データベースにおいて入手できる。
【００４２】
ポリペプチドの「変異体」には、本発明者らは、挿入、欠失および保存的もしくは非保存的いずれかの置換を含めている。詳細には、本発明者らは、そのような変化がタンパク質キナーゼ活性または適切にリン酸化されるべき能力を実質的には変化させないポリペプチドの変異体を含めている。当業者であれば、例えば様々な種からの、各ポリペプチドの例の配列の比較に基づいて、適切な変異体を容易に設計および試験することができる。当業者であれば、挿入もしくは欠失を行うことのできる場所、またはどの残基を適切に未変化で残すことができるのか、保存的置換によって置換することができるのか、または非保存的置換によって置換することができるのかを容易に決定できる。変異体ポリペプチドは、例えば実施例１に記載したように、容易に試験することができる。
【００４３】
「保存的置換」は、例えばＧｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；およびＰｈｅ、Ｔｙｒなどの意図された組み合わせである。
【００４４】
本明細書では、上記で規定した記号Ｚａａを除いて、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会の３文字もしくは１文字アミノ酸コードを使用する。特に、Ｘａａは、任意のアミノ酸を表す。少なくとも本明細書に規定したコンセンサス配列に対応するアミノ酸がＬ−アミノ酸であるのが好ましい。
【００４５】
ポリペプチド変異体が、関連ヒトポリペプチドのアミノ酸配列との少なくとも６５％の同一性、より好ましくは少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％もしくは７４％、さらにより好ましくは少なくとも７５％、なおさらにより好ましくは少なくとも８０％、一層好ましくは少なくとも８５％、さらに一層好ましくは少なくとも９０％の同一性、および最も好ましくは関連ヒトポリペプチドのアミノ酸配列との少なくとも９５％もしくは９７％の同一性を有するアミノ酸配列を有する場合は、特に好ましい。
【００４６】
さらに、タンパク質キナーゼ変異体が、ヒトポリペプチドの触媒ドメインのアミノ酸配列との少なくとも６５％の同一性、より好ましくは少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％もしくは７４％、さらにより好ましくは少なくとも７５％、なおさらにより好ましくは少なくとも８０％、一層好ましくは少なくとも８３もしくは８５％、さらに一層好ましくは少なくとも９０％の同一性、および最も好ましくは関連ヒトアミノ酸配列との少なくとも９５％もしくは９７％の同一性を有するアミノ酸配列を有する場合は、さらに好ましい。
【００４７】
タンパク質キナーゼ関連ポリペプチドの触媒ドメインは、例えば以下で記載する配列比較を使用して、当業者であれば容易に同定できることは理解される。タンパク質キナーゼは、Ｊｏｈｎｓｏｎら、（１９９６）Ｃｅｌｌ，８５，１４９−１５８およびＴａｙｌｏｒ  ＆  Ｒａｄｚｉｏ−Ａｎｄｚｅｌｍ（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２，３４５−３５５において記載されたように、保存された触媒性コアを示す。このコアは、概してアンチパラレルβシートを含む小さなＮ末端ローブ、および大部分がα−ヘリカルである大きなＣ末端ローブに折り畳まれる。
【００４８】
２つのポリペプチド間の配列同一性率は、適切なコンピュータプログラム、例えばウィスコンシン大学遺伝的計算グループのＧＡＰプログラムを使用して決定することができ、同一性率はそれらの配列が最適にアラインメントさせられているポリペプチドに関連して計算されることは理解される。
【００４９】
アラインメントは、またはＣｌｕｓｔａｌ  Ｗプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９４）を用いて実施することができる。使用されるパラメータは、以下のとおりである：
Ｆａｓｔペアワイズアラインメントパラメータ：Ｋ−タプル（ワード）サイズ；１、ウィンドウサイズ；５、ギャップペナルティ；３、上方対角線の数；５。スコアリング法：ｘパーセント。
多重アラインメントパラメータ：ギャップオープンペナルティ：１０、ギャップ延長ペナルティ；０．０５。
スコアリングマトリックス：ＢＬＯＳＵＭ
【００５０】
アラインメントは、または実施例１において考察したように、プログラムＴ−Ｃｏｆｆｅｅ［非特許文献１９］、もしくはＥＭＢＯＳＳ［非特許文献２０］を用いて実施することができる。
【００５１】
例えば全長ヒトｍｏｅｓｉｎのＴｈｒ５５８に対応する（等価である）残基は、配列間のマッチを最大化できるような方法でポリペプチドの配列と全長ヒトｍｏｅｓｉｎの配列とのアラインメントによって同定することができる。アラインメントは、目視による検査、および／または適切なコンピュータプログラム、例えばポリペプチドの同一性率の計算もまた可能にするウィスコンシン大学遺伝的計算グループのＧＡＰプログラムの使用によって実施できる。アラインプログラム（Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９４）ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  ＩＩ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，ＡＭ  ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，ＨＧ  ｅｄｓ），  ｐｐ３６５−３８９，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｌｉｆｔｏｎ）。そこで、この方法で同定された残基は、「対応する残基」でもある。
【００５２】
（例えば）ｍｏｅｓｉｎの切断形またはアミノ酸の単純置換が発生している形態では、「対応する残基」を同定するのが容易であることは理解される。
【００５３】
スクリーンにおいて使用されるポリペプチドは、自然発生対立遺伝子変異体（スプライス変異体を含む）を含む、哺乳動物、好ましくはヒト（または農業において、または家畜もしくはペット動物として有用な種、例えばイヌ、ネコ、ウマ、ウシ）であることが好ましい。本スクリーンにおいて使用されるポリペプチドは、ＧＳＴ部分を含んでいてよい、または当業者には公知であるように、または実施例１に記載したように、ビオチン化さもなければ例えば６Ｈｉｓ、ＨＡ、ｍｙｃもしくはその他のエピトープタグを用い標識化されてよい。これは、ポリペプチドを精製および／または検出する際に有用なことがある。
【００５４】
本化合物の作用は、様々な濃度の本化合物の存在下で、例えば本化合物の非存在下および例えば約１００μＭ、３０μＭ、１０μＭ、３μＭ、１μＭ、０．１μＭ、０．０１μＭおよび／または０．００１μＭの濃度での存在下で、ＬＲＲＫ２ポリペプチドによる基質ポリペプチドのリン酸化の速度もしくは程度を比較することによって決定できる。
【００５５】
本発明の方法によって同定される化合物は、ＬＲＲＫ２ポリペプチドが様々な基質、例えばｍｏｅｓｉｎ、ｒａｄｉｘｉｎもしくはｅｚｒｉｎまたはペプチド基質ＲＬＧＲＤＫＹＫＴＬＲＱＩＲＱもしくはＲＬＧＲＤＫＹＫＴＬＲＱＩＲＱＧＮＴＫＱＲを様々な程度にリン酸化する能力を変調させることができる。そこで、必須ではないが、ｍｏｅｓｉｎの活性を変調させる際に使用するための化合物をスクリーニングする場合は、ｍｏｅｓｉｎもしくはそのフラグメントが基質として使用されるのが好ましい。同様に、必須ではないが、ｒａｄｉｘｉｎの活性を変調させる際に使用するための化合物をスクリーニングする場合は、ｒａｄｉｘｉｎもしくはそのフラグメントが基質として使用されるのが好ましい。ペプチド基質ＲＬＧＲＤＫＹＫＴＬＲＱＩＲＱは、ｍｏｅｓｉｎ、ｒａｄｉｘｉｎおよびｅｚｒｉｎの各々に存在する。
【００５６】
本方法は、例えば、ＬＲＲＫ２のタンパク質キナーゼ活性もしくはＬＲＲＫ２によるＥＲＭファミリーポリペプチドのリン酸化を変調させる、例えば阻害する化合物を同定することに有用である。ＬＲＲＫ２のタンパク質キナーゼ活性もしくはＬＲＲＫ２によるＥＲＭファミリーポリペプチドのリン酸化を変調させる、例えば阻害する化合物は、パーキンソン病（例えば、特発性パーキンソン病もしくは遅発性パーキンソン病）またはパーキンソン症候群の治療において有用な可能性がある。
【００５７】
ＥＲＭファミリーポリペプチド、例えばｍｏｅｓｉｎのリン酸化を変調させる、例えば阻害する化合物は、他の神経変性状態においても有用な可能性がある。
【００５８】
本化合物は、ＬＲＲＫ２ポリペプチドとＥＲＭファミリーポリペプチドとの間の接触領域もしくはその近くに結合する化合物であってよい、または他の領域に結合し、例えばその複合体を安定化（もしくは不安定化）させる、またはその形成を促進（もしくは阻害）する立体配座変化もしくはアロステリック変化を誘導する化合物であってよい。本化合物は、アロステリック作用によってＬＲＲＫ２ポリペプチドのタンパク質キナーゼ活性を増加させられるように、ＬＲＲＫ２ポリペプチドもしくはＥＲＭポリペプチドへ結合することができる。このアロステリック作用は、ＬＲＲＫ２ポリペプチド活性の自然調節に含まれているアロステリック作用であってよい。
【００５９】
本方法において同定される化合物は、それ自体が薬物として有用な場合がある、またはより有効な化合物の設計および合成のための主導化合物を表す場合がある。
【００６０】
本化合物は、薬物様化合物または化合物を同定する上記の方法各々のための薬物様化合物を開発するための主導化合物であってよい。前記方法は、当業者には周知であるように、医薬化合物もしくは薬物の開発におけるスクリーニングアッセイとして有用な可能性があることは理解される。
【００６１】
用語「薬物様化合物」は、当業者には周知であり、例えば医薬品中の有効成分として、医学において使用するために適合させることのできる特性を有する化合物の意味を含むことができる。そこで、例えば、薬物様化合物は、有機化学の技術によって、余り好ましくはないが分子生物学もしくは生物化学の技術によって合成できる分子であってよく、好ましくは５，０００ダルトン未満であってよい低分子である。薬物様化合物は、さらに特定の１つ以上のタンパク質との選択的相互作用の特徴を示すことがあり、生体内利用可能であってよい、および／または細胞膜を透過できてよいが、これらの特徴は必須ではないことは理解される。
【００６２】
用語「主導化合物」は、同様に当業者には周知であり、その化合物が、それ自体は（例えば、その意図される標的に対して効力が極めて弱い、その作用において非選択的である、不安定である、合成するのが困難である、または不良なバイオアベイラビリティを有するために）薬物として使用するためには適合しないが、より望ましい特性を有する可能性がある他の化合物を設計するための出発点を提供できるという意味を含むことができる。
【００６３】
タンパク質キナーゼのインビボ（生体内）の活性を変調できる化合物を同定するのが望ましいことは理解される。そこで、本方法において使用される試薬および条件は、例えばＬＲＲＫ２ポリペプチドとＥＲＭファミリーポリペプチド、例えばｍｏｅｓｉｎ、ｒａｄｉｘｉｎもしくはｅｚｒｉｎポリペプチドとの間の相互作用は、ヒトＬＲＲＫ２とヒトＥＲＭファミリーポリペプチド、例えばｍｏｅｓｉｎ、ｒａｄｉｘｉｎもしくはｅｚｒｉｎポリペプチドとの間の相互作用と実質的に同一であるように選択されることは理解される。本化合物がＬＲＲＫ２ポリペプチドに結合できること、またはＥＲＭファミリーポリペプチドに結合できることは理解される。
【００６４】
化合物がタンパク質キナーゼ、例えばＬＲＲＫ２ポリペプチドのタンパク質キナーゼ活性を変調させる能力を測定できる本アッセイおよびその他のアッセイのスクリーニング法において試験される化合物は、例えばコンピュータ技術を使用して、分子モデリング技術を用いて選択および／または設計（修飾を含む）されている化合物であってよい（がそのような化合物である必要はない）。選択もしくは設計された化合物は、（既に合成されていない場合は）合成することができ、それがＬＲＲＫ２ポリペプチドに及ぼす作用、例えばタンパク質キナーゼ活性に及ぼす作用について試験することができる。本化合物は、本発明のスクリーニング法において試験できる。
【００６５】
試験される化合物は、タンパク質キナーゼの活性を変調させる可能性が高いと既に考えられる化合物であってよい、またはタンパク質キナーゼの活性を変調させる可能性が高いことを根拠に選択されていない化合物であってよい。そこで、試験される化合物は、一般に、選択されていない化合物バンクの少なくとも一部を形成する化合物であってよい、または例えばタンパク質キナーゼの活性を変調させる可能性が高いと考えられることを根拠に事前に選択された化合物バンクのような、事前に選択された化合物バンクの少なくとも一部を形成する化合物であってよい。
【００６６】
高スループット作動が可能であるスクリーニングアッセイは、特に好ましいことが理解される。例えば、ｍｏｅｓｉｎリン酸化部位の１つに基づく基質ペプチドを使用する、例えばペプチドのリン酸化形には結合するが未リン酸化形には結合しない（またはその逆もある）抗体を使用するアッセイが適合する可能性がある。例には、セルベースアッセイおよびタンパク質−タンパク質結合アッセイを含むことができる。また別の例は、同様に当業者には周知であるＳＰＡベース（シンチレーション近接アッセイ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）システムである。例えば、シンチラントおよび基質ポリペプチド、例えば上記で考察したようなＥＲＭファミリーペプチド基質を含むビーズを調製できる。ビーズは、３２Ｐ−もしくは３３Ｐ−γ標識化ＡＴＰを含むサンプル、ＬＲＲＫ２ポリペプチドおよび試験化合物と混合されてよい。便宜的には、これは９６ウエルフォーマット中で実施される。プレートは次に、３２Ｐもしくは３３Ｐ  ＳＰＡアッセイのための公知のパラメータを用いて、適切なシンチレーションカウンタを使用して計数される。シンチラントに近接する、すなわちビーズに結合している基質に結合している３２Ｐもしくは３３Ｐだけが検出される。そのようなアッセイの、例えば基質ポリペプチドが抗体もしくは抗体フラグメントへの結合によってシンチラントビーズ上に固定化されるような変形もまた使用できる。高スループットのタンパク質キナーゼ活性アッセイは当業者には周知であり、本明細書に提供した情報を参照すると、ＬＲＲＫ２ポリペプチドによるＥＲＭポリペプチドのリン酸化に容易に適合させることができる。
【００６７】
本スクリーニング法は、化合物が全細胞、組織もしくは有機体中でのＥＲＭファミリーポリペプチド、例えばｍｏｅｓｉｎのリン酸化（または他のパラメータ、例えばアクチン結合もしくは膜成分結合または上記で考察したような細胞特性）を変調させるかどうかを評価する工程と、リン酸化（もしくは他のパラメータ）を変調させる化合物を選択する工程とをさらに含むことができる。化合物は、上記で考察したように、パーキンソン病と結び付けられたＬＲＲＫ２突然変異を有する、またはさもなければＬＲＲＫ２を過剰発現する全細胞、組織もしくは有機体中で試験することができる。化合物は、例えば、ニューロン細胞系において試験することができる。そこで、本化合物がＥＲＭファミリーポリペプチド、例えばｍｏｅｓｉｎのリン酸化に及ぼす作用は、ニューロン細胞系において評価することができる。
【００６８】
当業者には明白であるように、化合物が他のタンパク質キナーゼに及ぼす作用を評価することが望ましい場合がある。例えば、ＬＲＲＫ２阻害剤とＲＯＣＫ阻害剤とを識別するために、化合物が他のタンパク質キナーゼの基質、例えばＲｏｃｋＩＩの基質のリン酸化に及ぼす作用を評価することが望ましい場合がある。例えば、図２０および２２において示し、それらの説明文で考察したように、ＬＲＲＫ２とＲｏｃｋ−ＩＩの基質優先性は相違する。一例として、ＬＲＲＫ２はＭＹＰＴをリン酸化しないが、Ｒｏｃｋ−ＩＩはＭＹＰＴをリン酸化する。
【００６９】
表１．ｒｈｏ関連キナーゼ（Ｒｏｃｋ）の公知の基質。公知のＲｏｃｋ基質リン酸化部位を示している、Ｋａｎｇら、（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ８９，ｐ．３９−４７  ２００７）から採用した表。ｍｅｒｌｉｎは、ｍｏｅｓｉｎのＴ５５８と類似であるが変性した部位を備えるｅｚｒｉｎ、ｒａｄｉｘｉｎ、ｍｏｅｓｉｎ（ＥＲＭ）関連タンパク質である。
【００７０】
【表１】
2010523101.tif 000003
【００７１】
このスクリーニング法は、全細胞、組織もしくは有機体中で本化合物がＬＲＲＫ２の活性を変調させるかどうかを評価する工程と、選択された活性を変調させる化合物を選択する工程とをさらに含むことができる。
【００７２】
本明細書に記載したスクリーニング法を用いて同定された化合物をさらに試験するために適切な可能性があるＰＤモデル、バイオマーカーおよび評価技術に関して、擁護／反論する情報は、例えば、当業者が利用できる情報の代表的なものである以下のリンクで見いだすことができる。
【００７３】
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｉｎｄｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ａｂｏｕｔ＿ｎｉｎｄｓ／ｐｌａｎｓ／ｎｉｈｐａｒｋｉｎｓｏｎｓ＿ａｇｅｎｄａ．ｈｔｍ＃Ｍｏｄｅｌｓ
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｃｉｅｎｃｅｄａｉｌｙ．ｃｏｍ／ｒｅｌｅａｓｅｓ／２００６／０７／０６０７２９１３４６５３．ｈｔｍ（ミトコンドリア障害を備えるマウスモデル）
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｃｉｅｎｃｅｄａｉｌｙ．ｃｏｍ／ｒｅｌｅａｓｅｓ／２００４／１０／０４１００５０７４８４６．ｈｔｍ（胚幹細胞モデル）
ｈｔｔｐ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ＿ｄｉｓｅａｓｅ
【００７４】
ＰＤ動物モデルには、６−ヒドロキシドーパミン処置齧歯類およびＭＰＴＰ処置霊長類が含まれる。どちらもドーパミン作動性脳細胞（および一部の他のタイプ）の中毒性破壊に基づいており、通例は、若齢の、その他の点では健常な動物を使用する。これらのモデルはパーキンソン病の一部の重要な特徴を再生するために、それらは出現しつつある新規療法を試験するために有用であると考えられる。
【００７５】
化合物は、当業者には周知であるように、さらに他の試験、例えば毒物学試験もしくは代謝試験にかけることもできる。
【００７６】
本発明のスクリーニング法は、選択された化合物を合成する、精製する、および／または調製する工程をさらにまた含むことができる。
【００７７】
本発明は、ＬＲＲＫ２の活性またはＥＲＭポリペプチドのリン酸化を変調させる化合物を調製する方法であって、１）本発明の適切なスクリーニング法を実施する工程と、２）前記選択された化合物を合成する、精製する、および／または調製する工程とを含む方法をさらに提供する。
【００７８】
本化合物は、医薬的使用のために、例えば、動物またはヒトにおけるインビボ試験において使用するために調製されてよい。
【００７９】
本発明のまた別の態様は、本発明のスクリーニング法によって同定された、または同定可能な化合物である。
【００８０】
本発明のさらにまた別の態様は、医学において使用するための本発明の化合物である。本発明のさらにまた別の態様は、パーキンソン病（例えば、特発性パーキンソン病もしくは遅発性パーキンソン病）またはパーキンソン症候群を治療するための本発明の化合物である。
【００８１】
本化合物は、任意の適切な方法で、希釈液および担体の標準の無菌非発熱性製剤中で、通常は非経口、例えば静脈内、腹腔内、皮下もしくは筋肉内もしくは膀胱内投与することができる。本化合物は、局所投与することもまたできる。本化合物は、局所的方法で、例えば注射によって投与することもできる。治療は、単回投与またはある期間にわたる複数回の投与から構成されてよい。本化合物は、パーキンソン病もしくはパーキンソン症候群を有する、またはそのリスク状態にある患者を治療することに有用な可能性がある。
【００８２】
本発明の化合物は、単独で投与することが可能であるが、１つ以上の許容される担体とともに医薬製剤として提示されることが好ましい。担体は、本発明の化合物と適合性であり、その受容者にとって有害ではないという意味において「許容可能」でなければならない。典型的には、担体は、無菌および発熱物質無含有である水または食塩水である。
【００８３】
そこで、本発明は、本発明のスクリーニング法によって同定された、もしくは同定可能である化合物と医薬上許容される担体とを含む医薬組成物をさらに提供する。
【００８４】
本組成物は、パーキンソン病もしくはパーキンソン症候群または適切に他の神経変性状態を治療することに有用であるまた別の化合物をさらに含んでいてよい、またはそれとともに投与されてよい。
【００８５】
本発明のまた別の態様は、（例えば、上記で考察したような）ＬＲＲＫ２ポリペプチドもしくはポリヌクレオチド（すなわち、ＬＲＲＫ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）および（例えば、上記で考察したような）ＥＲＭファミリーポリペプチドもしくはポリヌクレオチド（すなわち、ＥＲＭファミリーポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）を含む、精製された製剤またはパーツのキットを提供する。本製剤またはキットは、例えば、組換えＬＲＲＫ２ポリヌクレオチドおよび組換えＥＲＭファミリーポリヌクレオチドを含んでいてよい。また別の例として、本製剤またはキットは、またはＬＲＲＫ２および、ＥＲＭファミリーポリペプチド、例えばｍｏｅｓｉｎ、ｒａｄｉｘｉｎもしくはｅｚｒｉｎに由来し得るフラグメントであり、ｍｏｅｓｉｎのＴｈｒ５５８残基に対応する残基およびこの残基を含む周辺配列の少なくとも一部、例えばこの残基のＣ末端およびＮ末端の少なくとも２、３、４、５、６もしくは７残基、例えばポリペプチドＲＬＧＲＤＫＹＫＴＬＲＱＩＲＱもしくはＲＬＧＲＤＫＹＫＴＬＲＱＩＲＱＧＮＴＫＱＲ、または各々が上記で考察したＴ／Ｓ残基以外の残基の０、もしくは１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個までの保存的もしくは非保存的置換を備えるアミノ酸配列ＲＬＧＲＤＫＹＫ（Ｔ／Ｓ）ＬＲＱＩＲＱもしくはＲＬＧＲＤＫＹＫ（Ｔ／Ｓ）ＬＲＱＩＲＱＧＮＴＫＱＲを含む１００、８０、６０、５０、４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７もしくは１６アミノ酸未満のポリペプチドを含んでいてよい。
【００８６】
本製剤またはキットは、本発明の第１、第２または第３態様のアッセイにおいて有用な可能性がある。
【００８７】
本キットは、特異的結合パートナー、典型的にはリン酸化状態感受性方法でｍｏｅｓｉｎ（例えばヒトｍｏｅｓｉｎ）のＴｈｒ５５８もしくはＴｈｒ５２６を含むエピトープまたはまた別のＥＲＭポリペプチドの対応する部分、例えばｒａｄｉｘｉｎもしくはｅｚｒｉｎへ結合する抗体をさらに含んでいてよい。「リン酸化状態感受性方法における結合」には、特異的結合パートナーが、リン酸化可能な部分上でリン酸化されるとそのエピトープ（もしくはそのエピトープを含むＥＲＭファミリーポリペプチド）に結合することができるが、それがそのエピトープのリン酸化可能な部分上でリン酸化されていない場合は、そのエピトープ（もしくはそのエピトープを含むＥＲＭファミリーポリペプチド）に結合することができないという意味が含まれている。そこで、特異的結合パートナーは、リン酸化および非リン酸化ＥＲＭファミリーポリペプチドに対するアフィニティにおいて、少なくとも５倍、好ましくは１０、２０、５０、１００、２００、５００、１，０００、２，０００もしくは５，０００倍の相違を有するのが好ましい。実際に、当分野において公知である方法を用いて調製、および精製／選択された特異的結合パートナー（例えば、国際公開第０３／０８７４００号パンフレットを参照されたい。例えば、リン酸化ペプチドアフィニティカラムおよび非リン酸化ペプチドアフィニティカラムを用いて精製されるアフィニティ）は、必要とされる結合のアフィニティおよび特異性を有すると予想されている。
【００８８】
用語「抗体」には、合成抗体ならびに、抗原結合部位を保持する全抗体のフラグメントおよび（例えば、上記で考察したような）変異体が含まれる。抗体は、モノクローナル抗体であってよいが、さらにまたポリクローナル抗体製剤、それらの１つ以上の部分（例えば、ＦａｂフラグメントもしくはＦ（ａｂ’）２）または合成抗体もしくはそれらのパーツであってよい。Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖおよびｄＡｂ抗体フラグメントは全部を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現させて分泌させることができるので、大量の前記フラグメントの容易な生産が可能である。用語「ＳｃＦｖ分子」は、ＶＨおよびＶＬパートナードメインが柔軟性オリゴペプチドによって連結されている分子を意味する。ＩｇＧクラスの抗体が好ましい。
【００８９】
選択された抗原にとって適切なモノクローナル抗体は、上述したように修飾された、例えば、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」，Ｈ．Ｚｏｌａ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８）および「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，ＪＧＲ  Ｈｕｒｒｅｌｌ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９８２）に開示された技術のような公知の技術によって調製されてよい。二重特異性抗体は、細胞融合、一価フラグメントの最連結、または全抗体の化学的架橋結合によって調製することができる。二重特異性抗体を調製する方法は、Ｃｏｒｖａｌｅｎら、（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２４，１２７−１３２および１３３−１３７および１３８−１４３に開示されている。
【００９０】
それらの特異的結合部位を保持する抗体フラグメントの合成に関係する技術についての一般的概論は、Ｗｉｎｔｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３４９，２９３−２９９の中に見いだすことができる。
【００９１】
「精製（された）」は、製剤が、それが形成されている物質の存在下で他の成分から、例えば組換え細胞の他の成分から少なくとも部分的に分離されていることを意味する。使用できる精製方法の例は、実施例に記載されている。
【００９２】
本製剤は、実質的に純粋であってよい。「実質的に純粋」は、前記ポリペプチドが他のタンパク質を実質的に含んでいないことを意味する。そこで、本発明者らは、前記ポリペプチドとして少なくとも２、３、４、５、１０、１５、２０もしくは３０重量％のタンパク質含量を含む任意の組成物を含めており、好ましくは少なくとも５０重量％、より好ましくは少なくとも７０重量％、さらにより好ましくは少なくとも９０重量％および最も好ましくは少なくとも９５重量％のタンパク質含量が前記ポリペプチドである。
【００９３】
そこで、本発明は、前記ポリペプチドおよび汚染物質を含む組成物をさらに含むが、このとき前記汚染物質は前記組成物の９６、９５、９４、９０、８５、８０もしくは７０重量％未満、好ましくは前記組成物の５０重量％未満、より好ましくは前記組成物の３０重量％未満、さらにより好ましくは前記組成物の１０重量％未満および最も好ましくは前記組成物の５重量％未満を含んでいる。
【００９４】
本発明は、さらに他の構成成分とエックスビボ（生体外）で結合された場合に実質的に純粋な前記ポリペプチドを含んでいるが、前記他の構成成分は前記ポリペプチドが見いだされる細胞内で見いだされる構成成分の全部ではない。
【００９５】
本発明のまた別の態様は、ＬＲＲＫ２ポリペプチドおよびＥＲＭファミリーポリペプチドを発現することのできる組換え細胞を提供する。本細胞は、組換えＬＲＲＫ２ポリヌクレオチドおよび組換えＥＲＭファミリーポリヌクレオチドを含んでいてよい。本細胞は、前記ポリペプチドをコードする内生配列から、例えば転写アクチベータの配列特異的ターゲティング技術を使用して、ＬＲＲＫ２ポリペプチドおよび／またはＥＲＭファミリーポリペプチドを過剰発現できる可能性がある。そこで、本細胞は、そのように修飾されていない細胞に比較して、ＬＲＲＫ２ポリペプチドおよびＥＲＭファミリーポリペプチドの少なくとも一方の増加した発現を導くことが意図される方法で修飾することができる。本細胞は、原核細胞または真核細胞であってよい。例えば、本細胞は、真核細胞、例えば昆虫、酵母もしくは哺乳動物細胞、例えばヒト細胞であってよい。適切な細胞の例は、実施例の項において記載する。
【００９６】
組換え核酸は、好ましくはコードされたポリペプチドを発現させるために適合する。組換え核酸は、発現ベクターの形態であってよい。所定のポリペプチドを発現させるために適合する組換えポリヌクレオチドは、当業者には周知であり、例は実施例１において記載する。
【００９７】
本発明のまた別の態様は、ＬＲＲＫ２ポリペプチドおよびＥＲＭファミリーポリペプチドを含む組換え細胞を提供する。本細胞は、組換えＬＲＲＫ２ポリペプチドおよび組換えＥＲＭファミリーポリペプチドを含んでいてよい。本細胞は、本発明の先行態様による細胞であってよい。本細胞は、ＬＲＲＫ２ポリペプチドを過剰発現させるため、または組換えＬＲＲＫ２ポリペプチドを発現させるために修飾されていない等価細胞より少なくとも１．１、１．２、１．５、２、３、５、１０もしくは２０倍多いＬＲＲＫ２ポリペプチド（および／またはＥＲＭファミリーポリペプチド）を含んでいてよい。
【００９８】
「発現させるために適合する」は、本ポリヌクレオチドが、ポリペプチド、例えばＲＮＡを形成するために翻訳されることのできる、または本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（好ましくはＤＮＡである）が発現のために適正な方向および正確なリーディングフレーム内で、例えばプラスミドなどの発現ベクター内に挿入されているポリヌクレオチドであることを意味する。本ポリヌクレオチドは、任意の所望の宿主によって認識される適切な転写および翻訳調節制御ヌクレオチド配列に連結されてよい。そのような調節は、発現ベクター内に組み込むことができる。
【００９９】
哺乳動物細胞／真核細胞内での複製のために適切なベクターの特性は、当業者には周知であり、例については以下で提供する。ベクターは、原核細胞および真核細胞の両方における複製のために適合する可能性があることは理解される。
【０１００】
例えば相補的付着性末端を介してポリヌクレオチドを、詳細にはＤＮＡをベクターへ機能的に連結させるために、様々な方法が開発されてきた。適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹに記載されている。
【０１０１】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを修飾するために望ましい方法は、Ｓａｉｋｉら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９，４８７−４９１によって開示されたポリメラーゼ連鎖反応を使用する方法である。本方法は、例えば適切な制限部位での組換え技術によって、ＤＮＡを適切なベクター内へ導入するために使用でき、または、当技術分野において公知である他の有用な方法でＤＮＡを修飾するために使用できる。
【０１０２】
この方法では、酵素的に増幅させられるＤＮＡはそれら自体が増幅されたＤＮＡ内に組み込まれるようになる２つの特異的プライマーに挟まれる。前記特異的プライマーは、当技術分野において公知の方法を用いて発現ベクター内へクローニングするために使用できる制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含有していてよい。
【０１０３】
ＤＮＡ（またはレトロウイルスベクターの場合には、ＲＮＡ）は、次に本発明の化合物を含むポリペプチドを生成するために適切な宿主内で発現させられる。そこで、本発明の化合物を構成するポリペプチドをコードするＤＮＡは、公知の技術によって、本明細書に含まれる教示に照らして適切に修飾して、発現ベクターを構築するために使用することができ、発現ベクターは、次に本発明のポリペプチドの発現および製造のために適切な宿主細胞を形質転換させるために使用される。そのような技術には、１９８４年４月３日にＲｕｔｔｅｒらへ発行された米国特許第４，４４０，８５９号明細書、１９８５年７月２３日にＷｅｉｓｓｍａｎへ発行された第４，５３０，９０１号明細書、１９８６年４月１５日にＣｒｏｗｌへ発行された第４，５８２，８００号明細書、１９８７年６月３０日にＭａｒｋらへ発行された第４，６７７，０６３号明細書、１９８７年７月７日にＧｏｅｄｄｅｌへ発行された第４，６７８，７５１号明細書、１９８７年１１月３日にＩｔａｋｕｒａらへ発行された第４，７０４，３６２号明細書、１９８７年１２月１日にＭｕｒｒａｙへ発行された第４，７１０，４６３号明細書、１９８８年７月１２日にＴｏｏｌｅ，Ｊｒ．らへ発行された第４，７５７，００６号明細書、１９８８年８月２３日にＧｏｅｄｄｅｌらへ発行された第４，７６６，０７５号明細書および１９８９年３月７日にＳｔａｌｋｅｒへ発行された第４，８１０，６４８号明細書に開示されたものが含まれ、前記特許は全てが参照して本明細書に組み込まれる。
【０１０４】
ポリペプチドをコードするＤＮＡ（またはレトロウイルスベクターの場合には、ＲＮＡ）は、適切な宿主内へ導入するための極めて様々な他のＤＮＡ配列に結合させることができる。コンパニオンＤＮＡは、宿主の性質、宿主内へのＤＮＡの導入方法、およびエピソームの保持もしくは統合が望ましいかどうかに左右される。
【０１０５】
一般に、ＤＮＡは、例えばプラスミドなどの発現ベクター内に、発現のために適正な方向および正確なリーディングフレーム内に挿入される。必要であれば、ＤＮＡは、所望の宿主によって認識される適切な転写および翻訳調節制御ヌクレオチド配列に連結されてよいが、そのような調節は、一般には発現ベクター内で利用できる。ベクターは、次に標準技術によって宿主内へ導入される。一般に、これらの宿主の全部はベクターによって形質転換されない。このため、形質転換された宿主細胞を選択することが必要である。１つの選択技術は、発現ベクター内に、例えば抗生物質耐性などの形質転換細胞における選択可能な形質をコードするＤＮＡ配列を、任意の必要な調節エレメントとともに組み込む工程を含んでいる。または、そのような選択可能な形質のための遺伝子は、所望の宿主細胞を同時形質転換させるために使用されるまた別のベクターであってよい。
【０１０６】
本発明の組換えＤＮＡによって形質転換されている宿主細胞は、ポリペプチドの発現を許容するために本明細書に開示した教示に照らすと、当業者には公知である十分な時間および適切な条件下で次に培養され、前記ポリペプチドはその後回収できる。
【０１０７】
細菌（例えば大腸菌および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、酵母（例えばサッカロミセスセレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、糸状菌（例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ））、植物細胞、動物細胞および昆虫細胞を含む多数の発現系が公知である。
【０１０８】
ベクターには、原核細胞中で増殖させるための、およびそのベクターが他の非原核細胞タイプにおける発現において使用される場合であっても、例えばＣｏｌＥ１  ｏｒｉなどの原核細胞レプリコンが含まれる。ベクターには、それを用いて形質転換された例えば大腸菌などの細菌宿主細胞中での遺伝子の発現（転写および翻訳）を指示できる、例えば原核細胞プロモータなどの適切なプロモータをさらに含むことができる。
【０１０９】
プロモータは、ＲＮＡポリメラーゼの結合および転写の発生を許容するＤＮＡ配列によって形成された発現調節エレメントである。典型的な細菌宿主と適合するプロモータ配列は、典型的には、本発明のＤＮＡセグメントを挿入するための便宜的な制限部位を含有するプラスミドベクター内に提供される。
【０１１０】
典型的な原核細胞ベクタープラスミドは、Ｂｉｏｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（米国カリフォルニア州リッチモンド）から入手できるｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２およびｐＢＲ３２９ならびにＰｈａｒｍａｃｉａ社（米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）から入手できるｐＴｒｃ９９ＡおよびｐＫＫ２２３−３である。
【０１１１】
典型的な哺乳動物細胞ベクタープラスミドは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社（米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）から入手できるｐＳＶＬである。このベクターは、クローン化された遺伝子の発現を促進するためのＳＶ４０後期プロモータを使用するが、この発現の最高レベルは例えばＣＯＳ−１細胞などのＴ抗原産生細胞中で見いだされる。
【０１１２】
誘導性哺乳動物発現ベクターの例は、同様にＰｈａｒｍａｃｉａ社から入手できるｐＭＳＧである。このベクターは、クローン化された遺伝子の発現を促進するためにマウス乳腺腫瘍ウイルスの長い末端反復配列のグルココルチコイド誘導性プロモータを使用する。
【０１１３】
有用な酵母プラスミドベクターはｐＲＳ４０３−４０６およびｐＲＳ４１３−４１６であり、一般にはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社（米国カリフォルニア州９２０３７、ラ・ホーヤ）から入手できる。プラスミドｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５およびｐＲＳ４０６は、酵母統合プラスミド（ＹＩｐ）であり、酵母選択的マーカーＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２およびＵＲＡ３を組み込んでいる。プラスミドｐＲＳ４１３−４１６は、酵母セントロメアプラスミド（ＹＣｐ）である。
【０１１４】
宿主細胞は、原核細胞または真核細胞のいずれであってもよい。細菌細胞は好ましい原核宿主細胞であり、典型的には大腸菌の菌株、例えばＢｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（米国メリーランド州ベテスダ）から入手できる大腸菌株ＤＨ５、および米国メリーランド州ロックビルに所在のアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から入手できるＲＲ１（ＡＴＣＣ番号３１３４３）である。好ましい真核宿主細胞には、酵母、昆虫および哺乳動物細胞、好ましくはマウス、ラット、サルもしくはヒト線維芽細胞系由来細胞などの脊椎動物細胞が含まれる。酵母宿主細胞には、一般にはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社（米国カリフォルニア州９２０３７、ラ・ホーヤ）から入手できる、ＹＰＨ４９９、ＹＰＨ５００およびＹＰＨ５０１が含まれる。好ましい哺乳動物宿主細胞には、ヒト胚腎臓２９３細胞（実施例１を参照されたい）、ＣＣＬ６１としてＡＴＣＣから入手できるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＲＬ１６５８としてＡＴＣＣから入手できるＮＩＨ  Ｓｗｉｓｓマウス胚細胞ＮＩＨ／３Ｔ３、およびＣＲＬ１６５０としてＡＴＣＣから入手できるサル腎臓由来ＣＯＳ−１細胞が含まれる。好ましい昆虫細胞は、バキュロウイルス発現ベクターを用いてトランスフェクトできるＳｆ９細胞である。
【０１１５】
ＤＮＡ構築体を用いた適切な細胞宿主の形質転換は、典型的には使用されるベクターのタイプに依存する周知の方法によって遂行される。原核宿主細胞の形質転換に関しては、例えば、Ｃｏｈｅｎら、（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９，２１１０およびＳａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照されたい。酵母細胞の形質転換は、Ｓｈｅｒｍａｎら、（１９８６）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹに記載されている。Ｂｅｇｇｓ（１９７８）Ｎａｔｕｒｅ  ２７５，１０４−１０９の方法もまた有用である。脊椎動物細胞に関して、そのような細胞をトランスフェクトすることに有用な試薬、例えばリン酸カルシウムおよびＤＥＡＥ−デキストランもしくはリポソーム製剤は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、またはＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（米国メリーランド州２０８７７ゲーサーズバーグ）から入手できる。
【０１１６】
エレクトロポレーションは、細胞を形質転換および／またはトランスフェクトするためにも有用であり、当技術分野において酵母細胞、細菌細胞、昆虫細胞および脊椎動物細胞を形質転換させるために周知である。
【０１１７】
例えば、多数の細菌種は、参照して本明細書に組み込まれるＬｕｃｈａｎｓｋｙら、（１９８８）Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２，６３７−６４６に記載された方法によって形質転換させることができる。最大数の形質転換体は、２５：ＦＤで１ｃｍ当たり６２５０Ｖを用いて２．５Ｘ  ＰＥＢ中に懸濁させたＤＮＡ細胞混合物のエレクトロポレーション後に一貫して回収される。
【０１１８】
エレクトロポレーションによって酵母を形質転換させるための方法は、Ｂｅｃｋｅｒ  ＆  Ｇｕａｒｅｎｔｅ（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９４，１８２に開示されている。
【０１１９】
形質転換に成功した細胞、即ち本発明のＤＮＡ構築体を含有する細胞は、周知の技術によって同定することができる。例えば、本発明の発現構築体の導入の結果として生じる細胞は、本発明のポリペプチドを生成するために増殖させることができる。細胞を収穫して溶解させ、それらのＤＮＡ含量は例えばＳｏｕｔｈｅｒｎ（１９７５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８，５０３またはＢｅｒｅｎｔら、（１９８５）Ｂｉｏｔｅｃｈ．３，２０８によって記載された方法などの方法を用いてＤＮＡの存在について試験することができる。
【０１２０】
組換えＤＮＡの存在について直接的にアッセイすることに加えて、形質転換の成功は、組換えＤＮＡがタンパク質の発現を指示できる場合は、周知の免疫学的方法によって確認することができる。例えば、発現ベクターを用いて形質転換に成功した細胞は、適切な抗原性を提示するタンパク質を生成する。形質転換されたことが疑われる細胞のサンプルは、適切な抗体を使用して、収穫してタンパク質についてアッセイされる。
【０１２１】
そこで、形質転換された宿主細胞自体に加えて、本発明は、栄養培地中のそれらの細胞の培養、好ましくはモノクローナル（クローン的に均質な）培養、またはモノクローナル培養に由来する培養をさらに企図している。
【０１２２】
本発明の製剤を作製するための本発明の方法また別の態様は、本発明によって細胞から製剤を精製する工程を含んでいる。宿主細胞を培養し、組換えタンパク質を単離する方法は、当技術分野において周知である。適切な精製技術の例は、実施例の項において記載する。例えば、本製剤の１つ以上の構成成分は、当業者には周知であり、実施例の項において記載したように、アフィニティ試薬を使用して精製を支援できるように標識することができる。例えば実施例の項において記載したように、クロマトグラフィ技術もまた使用できる。
【０１２３】
本発明のまた別の態様は、本発明の先行態様の方法によって入手される、または入手可能な製剤を提供する。本製剤は、例えば、標識化ＬＲＲＫ２ポリペプチドおよびＥＲＭファミリーポリペプチドを含んでいてよい。
【０１２４】
本発明の第１、第２もしくは第３態様の方法は、本発明の製剤、または上記で指摘した方法によって入手される、または入手可能な製剤もしくは複合体の形態にある、または本発明の細胞中のＬＲＲＫ２ポリペプチドおよびＥＲＭファミリーポリペプチドを用いて実施することができる。
【０１２５】
上記のポリペプチドは、当技術分野において周知の、ならびに以下および実施例１において記載する方法によって、例えば分子生物学的方法もしくは自動化学ペプチド合成方法を用いて作製できる。
【０１２６】
ペプチドミメティック化合物もまた有用な可能性があることは、理解される。そこで、「ポリペプチド」もしくは「ペプチド」には、本発明者らは、アミノ酸残基がペプチド（−ＣＯ−ＮＨ−）結合によって結合されている分子だけではなく、ペプチド結合が無効にされる分子もまた含めている。そのようなレトローインバーソペプチドミメティックは、例えば参照して本明細書に組み込まれるＭｅｚｉｅｒｅら、（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９，３２３０−３２３７に記載された方法のような、当技術分野において公知の方法を用いて作製することができる。このアプローチは、バックボーンを含むが側鎖の方向は含んでいない変化を含有する疑似ペプチドを作製する工程を含んでいる。Ｍｅｚｉｅｒｅら、（１９９７）は、少なくともＭＨＣクラスＩＩおよびＴヘルパー細胞応答に対して、これらの疑似ペプチドが有用であることを示している。ＣＯ−ＮＨペプチド結合の代わりにＮＨ−ＣＯ結合を含有するレトロ−インバース（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｅ）型ペプチドは、タンパク質分解に対してはるかに大きい耐性を示す。
【０１２７】
同様に、ペプチド結合は、アミノ酸残基のＣＩ原子間の間隔を保持する適切なリンカー部分が使用されることを前提にともに分配させることができる。特に、リンカー部分が同一電荷分布を実質的に有しており、実質的にペプチド結合として同一平面性を有すれば好ましい。
【０１２８】
本ペプチドは、エキソ型タンパク質分解性消化に対する感受性を低下させるのに役立つように、便宜的にはそのＮ末端またはＣ末端で遮断できることは理解される。
【０１２９】
そこで、ＬＲＲＫ２、またはより好ましくは、ＥＲＭファミリーポリペプチドはペプチドミメティック化合物であってよいことは理解される。
【０１３０】
ＬＲＲＫ２ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドおよびＥＲＭファミリーポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを含む本発明のパーツのキットは、例えば、本発明の第１、第２もしくは第３態様のスクリーニング法において有用な可能性がある製剤もしくは複合体を形成するために有用な可能性がある。組換えポリヌクレオチドは、（例えば、上記で考察したような）発現ベクター内にあってよい、または（所望性は低いが）インビトロ発現のために有用な可能性がある。ＥＲＭファミリーポリペプチドは、上記で考察したように、ヒトｍｏｅｓｉｎの残基Ｔｈｒ５５８を含むペプチドであってよい。
【０１３１】
本発明のまた別の態様は、基質ＥＲＭファミリーポリペプチド（例えば、上記で考察したようなヒトｍｏｅｓｉｎの残基Ｔｈｒ５５８を含むペプチド）へタンパク質キナーゼ活性を有する２，０００アミノ酸未満の切断ＬＲＲＫ２ポリペプチドであって、野生型ヒトＬＲＲＫ２の少なくともＧＴＰａｓｅドメイン、ＣＯＲドメイン、キナーゼドメイン、ＷＤ４０様モチーフおよびＣ末端テール残基またはそれらの変異体もしくは自然発生突然変異体を含む、切断ＬＲＲＫ２ポリペプチドを提供する。切断ＬＲＲＫ２ポリペプチドは、ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）モチーフを含んでいない可能性がある。切断ＬＲＲＫ２ポリペプチドは、野生型ヒトＬＲＲＫ２の少なくとも残基１３２６−２５２７またはそれらの変異体もしくは自然発生突然変異体を含んでいてよい、またはそれらからなってよい。上述したように、Ｃ末端での切断は切断したＬＲＲＫ２ポリペプチドのタンパク質キナーゼ活性に有害な影響を及ぼすが、他方フラグメントのＮ末端での切断はより良好に忍容される可能性があると考えられる。そこで、切断ＬＲＲＫ２ポリペプチドのＮ末端は、または残基１３２６の後、例えば残基１３２６と約残基１３３６との間に存在する可能性がある。
【０１３２】
そこで、本発明のポリペプチドの例は、ＬＲＲＫ２ポリペプチドであるＧＳＴ−ＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７、Ｇ２０１９Ｓ］またはＧＳＴ−ＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７］である。
【０１３３】
本発明のまた別の態様は、ＥＲＭファミリーポリペプチド、例えばｍｏｅｓｉｎ、ｒａｄｉｘｉｎもしくはｅｚｒｉｎに由来し得るフラグメントであって、ｍｏｅｓｉｎのＴｈｒ５５８残基に対応する残基およびこの残基を含む周辺配列の少なくとも一部、例えばこの残基のＣ末端およびＮ末端の少なくとも２、３、４、５、６もしくは７残基を含む基質ポリペプチド、例えばポリペプチドＲＬＧＲＤＫＹＫＴＬＲＱＩＲＱもしくはＲＬＧＲＤＫＹＫＴＬＲＱＩＲＱＧＮＴＫＱＲ、または各々が上記で考察したＴ／Ｓ残基以外の残基の０、もしくは１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個までの保存的もしくは非保存的置換を備えるアミノ酸配列ＲＬＧＲＤＫＹＫ（Ｔ／Ｓ）ＬＲＱＩＲＱもしくはＲＬＧＲＤＫＹＫ（Ｔ／Ｓ）ＬＲＱＩＲＱＧＮＴＫＱＲを含む１００、８０、６０、５０、４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７もしくは１６アミノ酸未満のポリペプチドを提供する。
【０１３４】
本基質ポリペプチドは、各々がＴ／Ｓ残基以外の残基の０もしくは１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個までの保存的もしくは非保存的置換を備えるアミノ酸配列ＲＬＧＲＤＫＹＫ（Ｔ／Ｓ）ＬＲＱＩＲＱまたはＲＬＧＲＤＫＹＫ（Ｔ／Ｓ）ＬＲＱＩＲＱＧＮＴＫＱＲからなってよい。
【０１３５】
本発明のまた別の態様は、本発明の切断ＬＲＲＫ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【０１３６】
本発明のまた別の態様は、本発明の基質ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【０１３７】
本ポリヌクレオチドは、哺乳動物／真核細胞におけるポリペプチドの複製および／または発現のために適合するベクターであってよい。本発明のさらにまた別の態様は、本発明のポリペプチドを発現させるために適合する組換えポリヌクレオチドである。
【０１３８】
本ポリヌクレオチドもしくは組換えポリヌクレオチドは、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、好ましくはＤＮＡであってよい。本ポリヌクレオチドは、コーディング配列内にイントロンを含有していてよい、または含有していなくてよい。好ましくは、ポリヌクレオチドはｃＤＮＡである、またはｃＤＮＡを含んでいる。
【０１３９】
本発明のまた別の態様は、ＥＲＭファミリーポリペプチドをリン酸化する方法を提供し、このときＥＲＭファミリーポリペプチドは、ＬＲＲＫ２ポリペプチドによってリン酸化される。本方法によってリン酸化されるＥＲＭファミリーポリペプチドは、部分的または完全に脱リン酸化されたＥＲＭファミリーポリペプチドであってよい。
【０１４０】
本発明のまた別の態様は、ＥＲＭファミリーポリペプチドをリン酸化する方法におけるＬＲＲＫ２ポリペプチドの使用を提供する。ＥＲＭファミリーポリペプチドは、好ましくは全長ヒトｍｏｅｓｉｎのＴｈｒ５５８に対応するトレオニン残基上でリン酸化されてよいが、さらにまたは代替として、全長ヒトｍｏｅｓｉｎのＴｈｒ５２６に対応するトレオニン残基上でリン酸化されてもよい。
【０１４１】
ＥＲＭファミリーポリペプチドが既にリン酸化されている場合は、さらなるリン酸化は可能ではないことは理解される。さらに、細胞から単離されたＥＲＭファミリーポリペプチド（内生もしくは組換えポリペプチドとしてのいずれか）は、そのリン酸化状態に関して不均質である可能性があることは理解される。例えば、ＥＲＭファミリーポリペプチドの完全リン酸化、完全脱リン酸化および／または部分的リン酸化分子は、単一細胞または細胞群／細胞培養中に存在する場合がある。
【０１４２】
本発明のまた別の態様は、ＬＲＲＫ２突然変異体、例えばパーキンソン病を有する患者において見いだされるＬＲＲＫ２突然変異体を特性付ける方法であって、前記ＬＲＲＫ２突然変異体が基質ＥＲＭファミリーポリペプチドをリン酸化する能力を評価する工程を含む方法を提供する。本方法は、ＥＲＭファミリーポリペプチドに対するＬＲＲＫ２突然変異体のＫｍおよび／またはＶｍａｘを決定する工程を含んでいてよい。そのような特性付けは、パーキンソン病もしくはパーキンソン症候群の基礎にある機序を調査することに有用な可能性がある。
【０１４３】
本明細書で言及する全ての文献は、参照して本明細書に組み込まれる。
【０１４４】
以下では、本発明を下記の非限定的な図面および実施例を参照することによって、より詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】ＫＥＳＴＲＥＬスクリーンのための活性ＬＲＲＫ２フラグメントの生成。（上方パネル）ヒトＬＲＲＫ２（アクセッション番号ＡＡＶ６３９７５）に対応する残基の予測される機能的ドメインおよびナンバリングを示している、ＬＲＲＫ２のドメイン構造の略図。略語：ＬＲＲ（ロイシンリッチリピート）；ＣＯＲ（Ｒａｓ保存モチーフのＣ末端）；ＫＤ（セリン／トレオニンタンパク質キナーゼドメイン）。２９３細胞は、指示した形態のＧＳＴ−ＬＲＲＫ２をコードする構築体を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの３６時間後、ＬＲＲＫ２キナーゼをアフィニティ精製し、ポリアクリルアミドゲル上でのエレクトロフォレーシスによって分析し、相対タンパク質レベルを定量するためにコロイダルブルーを用いて染色した。ＧＳＴ−ＬＲＲＫ２は、ポリアクリルアミドゲル上でのエレクトロフォレーシスおよびその後のＭＢＰまたはＬＲＲＫ２に対応するコロイダルブルー染色バンドのオートラジオグラフィの後に、ＭＢＰのリン酸化およびＬＲＲＫ２の自己リン酸化を測定することによってアッセイした。＊は、ＧＳＴ−ＬＲＲＫ２製剤を汚染するタンパク質を示している。３回の個別実験において類似の結果が得られた。
【図２】ＬＲＲＫ２［Ｇ２０１９Ｓ］ＫＥＳＴＲＥＬスクリーン。（Ａ〜Ｄ）ラット脳から抽出し、ヘパリン−セファロースに結合しなかったタンパク質（図９）を、指示したカラム上で連続的にクロマトグラフィにかけた。特定の画分は、「材料および方法」の項で記載したようにＧＳＴ−ＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７、Ｇ２０１９Ｓ］および［γ３２Ｐ］−ＡＴＰの存在下（＋）または非存在下（−）でリン酸化した。基質のリン酸化は、サンプルのポリアクリルアミド・エレクトロフォレーシスおよびオートラジオグラフィの後に分析した。リン酸化された基質としてのｍｏｅｓｉｎおよびクレアチンキナーゼの同一性は、図３に確定されている。
【図３】ｍｏｅｓｉｎのＬＲＲＫ２基質としての同定。Ｓｕｐｅｒｄｅｘに先行してＳｏｕｒｃｅ−Ｑ内で一層精製されたヘパリン−セファロースと相互作用させた６２ｋＤａの基質（ＣＲＭＰ２）を含有するＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムの画分１０〜１５（図１０）、６８ｋＤａの基質（ｍｏｅｓｉｎ）を含有するＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムの画分１２〜１５（図２）、および４３ｋＤａの基質（クレアチンキナーゼ）を含有するＱカラムの画分１１は、ＶｉｖａＳｃｉｅｎｃｅスピンフィルタを用いて濃縮させた。これらのサンプルは、「材料および方法」の項で記載したようにＧＳＴ−ＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７、Ｇ２０１９Ｓ］および［γ３２Ｐ］−ＡＴＰの存在下（＋）または非存在下（−）でリン酸化した。基質のリン酸化は、サンプルのポリアクリルアミド・エレクトロフォレーシスおよびオートラジオグラフィの後に分析した。全サンプルは同一ゲル上でランさせたが、データを単純化するために、表示したバンドはカットしともに貼り付けた。黒色の線は、ゲルがどこでカットされたかを示している。ＬＲＲＫ２によってリン酸化したコロイダルブルー染色バンド（＊で表示した）は、ゲルから切除し、トリプシンを用いてゲル内で消化し、それらの同一性はトリプシンペプチド質量スペクトルフィンガープリントによって決定した。Ｍａｓｃｏｔスコアでは、＞６３の数値が有意であると見なされる（Ｐ＜０．０５）。
【図４】ＬＲＲＫ２によってリン酸化されるｍｏｅｓｉｎ上の残基の同定。（Ａ）ｍｏｅｓｉｎを発現した大腸菌は、指示した時間にわたりＧＳＴ−ＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７、Ｇ２０１９Ｓ］および［γ３２Ｐ］−ＡＴＰを用いたリン酸化に先行して、６５０℃で１５分間にわたりインキュベートした。ｍｏｅｓｉｎタンパク質のリン酸化は、ポリアクリルアミドゲル上でのエレクトロフォレーシスおよびその後のｍｏｅｓｉｎに対応するコロイダルブルー染色バンドのオートラジオグラフィの後に決定した。３回の個別実験において、類似の結果が得られた。（Ｂ）ＧＳＴ−ＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７、Ｇ２０１９Ｓ］を４０分間にわたり用いたリン酸化後の３２Ｐ標識ｍｏｅｓｉｎは、トリプシンを用いて消化し、Ｃ１８カラム上でクロマトグラフィにかけた。主要３２Ｐ標識トリプシンペプチド（Ｐ１）、ペプチド（Ｐ２）およびペプチド（Ｐ３）を含有する画分が示されたが、クロマトグラフィの他の画分では他の主要３２Ｐ標識ペプチドは観察されなかった。（Ｃ）指示したペプチドを固相シーケンシングにかけ、Ｅｄｍａｎ分解の各サイクル後に放出された３２Ｐ放射能を測定した。（Ｄ）ペプチドはさらにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦ質量分析法および予測アミノ酸配列によって分析し、（ｐ）によって表示したリン酸化部位を各ペプチドの実測質量および理論質量とともに示した。（Ｅ）ｍｏｅｓｉｎの指示した野生型および突然変異形がＧＳＴ−ＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７、Ｇ２０１９Ｓ］を用いて３０分間にわたりリン酸化されたことを除いて、（Ａ）と同様。２回の個別実験において、類似の結果が得られた。
【図５】ＬＲＲＫ２によるｍｏｅｓｉｎのリン酸化についての分析。（Ａ）ＧＳＴ−ｍｏｅｓｉｎ（１μＭ）を発現した大腸菌は、指示した温度で１５分間にわたりインキュベートし、その後に３０℃でＧＳＴ−ＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７、Ｇ２０１９Ｓ］（上方パネル）またはＲＯＣＫ−ＩＩ（下方パネル）を用いてリン酸化した。ｍｏｅｓｉｎタンパク質のリン酸化は、ポリアクリルアミドゲル上でのエレクトロフォレーシスおよびその後のｍｏｅｓｉｎに対応するコロイダルブルー染色バンドのオートラジオグラフィの後に決定した。（ＢおよびＣ）ｍｏｅｓｉｎの指示した野生型および切断形（全部が濃度１μＭ）は、活性ＧＳＴ−ＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７、Ｇ２０１９Ｓ］またはキナーゼ不活性（ＫＩ）ＧＳＴ−ＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７、Ｄ２０１７Ａ］またはＲＯＣＫＩＩのいずれかを用いたリン酸化の前に、７０℃で１５分間にわたりインキュベートする工程によって「熱変性」させた以外は、（Ａ）と同様。２回の個別実験において、類似の結果が得られた。ゲルバンドの上方の数値は、熱変性させられていないＭＢＰ（Ｂ）またはｍｏｅｓｉｎ［５００−５７７］（Ｃ）に比較した相対リン酸化を示している。（Ｄ）ＧＳＴ−ｅｚｒｉｎおよびＧＳＴ−ｒａｄｉｘｉｎを発現した大腸菌の全長野生型および指示した突然変異体のＧＳＴ−ＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７、Ｇ２０１９Ｓ］によるリン酸化について分析した以外は、上記と同様。
【図６】ＬＲＲＫ２のためのペプチド基質の生成。（Ａ）２９３細胞は、指示した形態の活性およびキナーゼ不活性（ＫＩ、Ｄ２０１７Ａ）ＧＳＴ−ＬＲＲＫ２をコードする構築体を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの３６時間後、ＬＲＲＫ２キナーゼをアフィニティ精製し、ポリアクリルアミドゲル上でのエレクトロフォレーシスによって分析し、相対タンパク質レベルを定量するためにコロイダルブルーを用いて染色した。ＧＳＴ−ＬＲＲＫ２は、「材料および方法」の項で記載したように、３００μＭでのＬＲＲＫｔｉｄｅペプチド（ＲＬＧＲＤＫＹＫＴＬＲＱＩＲＱ）のリン酸化を測定することによってアッセイした。キナーゼ触媒アッセイの結果は、３回ずつ実施したアッセイの平均触媒活性度±ＳＤとして表示した。表示した結果は、２〜３回の独立実験の代表値である。（Ｂ）ＶｍａｘおよびＫｍ酵素パラメータの計算を可能にするためにＬＲＲＫｔｉｄｅの濃度を変化させたこと以外は、（Ａ）と同様。
【図７】ＰＤ病のＬＲＲＫ２突然変異体の分析。本発明者らが分析したＬＲＲＫ２にＰＤを誘発する９つの突然変異の場所を示している略図（略語は図１と同様）。（Ｂ）ＧＳＴ−ＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７］の非突然変異形および指示した突然変異形を２９３細胞において発現させ、グルタチオン−セファロース上でアフィニティ精製した。２．０μｇの各製剤は、ポリアクリルアミドゲル上でのエレクトロフォレーシスによって分析し、相対タンパク質レベルを定量するためにコロイダルブルーを用いて染色した。各製剤は、自己リン酸化ならびにＭＢＰ、ｍｏｅｓｉｎ［５００−５７７］およびＬＲＲＫｔｉｄｅペプチドのリン酸化を測定することによってアッセイした。ＬＲＲＫｔｉｄｅリン酸化についてのデータは、３回ずつ実施したアッセイの平均比活性度（精製ＧＳＴ−ＬＲＲＫ２製剤内の全タンパク質１ｍｇ当たりの単位数）±ＳＤとして表示した。表示した結果は、２〜３回の独立実験の代表値である。略語：ＷＴ、野生型；ＫＩ、キナーゼ不活性（Ｄ２０１７Ａ）ＬＲＲＫ２。
【図８】ＬＲＲＫ２活性を調節する際の非キナーゼドメインの役割。（Ａ）（上方パネル）ヒトＬＲＲＫ２残基（アクセッション番号ＡＡＶ６３９７５）に対応する残基の予測される機能的ドメインおよびナンバリングを示している、ＬＲＲＫ２のドメイン構造の略図。略語は、図１と同様である。ＧＳＴ−ＬＲＲＫ２の野生型および指示したフラグメントを２９３細胞において発現させ、グルタチオン−セファロース上でアフィニティ精製した。１．０μｇの各製剤は、相対タンパク質レベルを定量するためにポリアクリルアミドゲル上でのエレクトロフォレーシスによって分析し、抗ＧＳＴ抗体を用いて免疫ブロッティングしたポリアクリルアミドゲル上でのエレクトロフォレーシスによって分析した。各製剤は、さらに自己リン酸化ならびにＭＢＰ、ｍｏｅｓｉｎ［５００−５７７］およびＬＲＲＫｔｉｄｅのリン酸化を測定することによってアッセイした。ＬＲＲＫｔｉｄｅアッセイについてのデータは、３回ずつ実施したアッセイの平均比活性度（精製ＧＳＴ−ＬＲＲＫ２製剤内の全タンパク質１ｍｇ当たりの単位数）±ＳＤとして表示した。（Ｂ）ＧＳＴ−ＬＲＲＫ２［１３２７−２５２７、Ｇ２０１９Ｓ］の指示したＣ末端点突然変異および小さなＣ末端切断が及ぼす作用がＬＲＲＫｔｉｄｅ基質を用いて分析された以外は、（Ａ）と同様。表示した結果は、２〜３回の独立実験の代表値である。略語：ＷＴ、野生型；ＫＩ、キナーゼ不活性（Ｄ２０１７Ａ）ＬＲＲＫ２。
【図９】２９３細胞におけるＧＳＴ  ＬＲＲＫ２の形態の発現。（上方パネル）ヒトＬＲＲＫ２残基（アクセッション番号ＡＡＶ６３９７５）に対応する残基の予測される機能的ドメインおよびナンバリングを示している、ＬＲＲＫ２のドメイン構造の略図。略語：ＬＲＲ（ロイシンリッチリピート）；ＣＯＲ（Ｒａｓ保存モチーフのＣ末端）；ＫＤ（セリン／トレオニンタンパク質キナーゼドメイン）。２９３細胞は、指示した形態のＧＳＴ−ＬＲＲＫ２をコードする構築体を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの３６時間後、ＬＲＲＫ２キナーゼをアフィニティ精製し、ポリアクリルアミドゲル上でのエレクトロフォレーシスによって分析し、相対タンパク質レベルを定量するためにコロイダルブルーを用いて染色した。ＧＳＴ−ＬＲＲＫ２は、ポリアクリルアミドゲル上でのエレクトロフォレーシスに続いてＬＲＲＫ２の自己リン酸化を測定することによってアッセイした。
【図１０】ＬＲＲＫ２［Ｇ２０１９Ｓ］ＫＥＳＴＲＥＬスクリーン。ラット脳から抽出したタンパク質を６０％硫酸アンモニウムで沈降させ、脱塩させ、ヘパリン−セファロースカラム上でクロマトグラフィにかけた。指示した画分のアリコートは、「材料および方法」の項で記載したように、変性させ、次にＧＳＴ−ＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７、Ｇ２０１９Ｓ］およびＭｎ−［γ３２Ｐ］−ＡＴＰの存在下（＋）または非存在下（−）でリン酸化した。基質のリン酸化は、サンプルのポリアクリルアミド・エレクトロフォレーシスおよびオートラジオグラフィの後に分析した。リン酸化した基質としてのＣＲＭＰ２およびクレアチンキナーゼの同一性は、図３に確定されている。
【図１１】ＬＲＲＫ２によるＭＢＰのリン酸化についての分析。（Ａ）ｍｏｅｓｉｎをリン酸化するために使用した同一条件下で４０分間にわたるＧＳＴ−ＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７、Ｇ２０１９Ｓ］を用いたリン酸化後の３２Ｐ標識ＭＢＰ（図４Ｂ）。これは、１モルのＭＢＰ当たり０．０１モルの３２Ｐにしかリン酸化されなかった。リン酸化されたＭＢＰは、トリプシンを用いて消化し、Ｃ１８カラム上でクロマトグラフィにかけた。主要３２Ｐ標識トリプシンペプチド（Ｐ１−Ｐ５）を含有する画分を示した。クロマトグラフィの他の画分においては、他の主要３２Ｐ標識ペプチドは観察されなかった。（Ｂ）指示したペプチドを固相シーケンシングにかけ、Ｅｄｍａｎ分解の各サイクル後に放出された３２Ｐ放射能を測定した。（Ｃ）ペプチドは、さらにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦ質量分析法および予測アミノ酸配列によって分析し、（ｐ）によって表示したリン酸化部位を各ペプチドの実測質量および理論質量とともに示した。
【図１２】ＬＲＲＫ２上の自己リン酸化部位の分析。（Ａ）ＧＳＴ−ＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７］の活性およびキナーゼ不活性（ＫＩ）形の指示した形態を１００μＭ  ＡＴＰの存在下で４０分間にわたりインキュベートした。サンプルはポリアクリルアミド上でのエレクトロフォレーシスにかけ、ＧＳＴ−ＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７］に対応するクーマジー（ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）染色バンドを切除し、トリプシンを用いて消化した。ホスホペプチドは、併用ＬＣ−ＭＳおよびＭＳ／ＭＳ分析によって同定した。図面は、ＧＳＴ−ＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７］（ブルー）、ＫＩ−ＧＳＴ−ＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７、Ｄ２０１７Ａ］（グリーン）、ＧＳＴ−ＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７、Ｇ２０１９Ｓ］（レッド）に由来するホスホペプチドについてのシグナル強度（ｃｐｓ、１秒間当たりに検出されたイオン数）対イオン分布（ｍ／ｚ）を示している。本発明者らが質量分析法によって同定することのできたリン酸化ペプチドには、標識Ｐａ〜Ｐｆがマーキングされている。ペプチド内のリン酸化の正確な部位が決定できなかった場合は、これは表の中で「？」を付けて指示されている。
【図１３】ＬＲＲＫ２上の自己リン酸化部位の突然変異は活性に影響を及ぼさない。ＧＳＴ−ＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７］の非突然変異部位および指示した自己リン酸化部位突然変異体を２９３細胞において発現させ、グルタチオン−セファロース上でアフィニティ精製した。これらは、ポリアクリルアミドゲル上でのエレクトロフォレーシスによって分析し、相対タンパク質レベルを定量するためにコロイダルブルーを用いて染色した。各製剤は、ＬＲＲＫｔｉｄｅペプチドに向けての活性を測定することによってアッセイした。データは、３回ずつ実施したアッセイの平均触媒活性度±ＳＤとして表示した。
【図１４】ヒトＥＲＭファミリーポリペプチド配列のアラインメント。
【図１５】ＬＲＲＫ２によるｍｏｅｓｉｎのリン酸化についての分析。（Ａ）ｅｚｒｉｎ、ｒａｄｉｘｉｎおよびｍｅｒｌｉｎのＣ末端領域の配列アラインメント。星印は、ｍｏｅｓｉｎ上のＴｈｒ５５５と等価のＴｈｒ残基を示している。ブラックおよびグレーの影を付けた残基は、各々同一および同種の残基を表す。（Ｂ）全長ＧＳＴ−ｍｏｅｓｉｎ、ＧＳＴ−ｅｚｒｉｎ、ＧＳＴ−ｒａｄｉｘｉｎまたはＧＳＴ−ｍｏｅｓｉｎ［５００−５７７］のＣ末端フラグメント（Ｃ’  Ｍｏｅｓｉｎ）を発現した大腸菌は、氷上（−）に放置するか、または７０℃（＋）で１５分間にわたりインキュベートし、その後にＧＳＴ−ＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７、Ｇ２０１９Ｓ］を用いてリン酸化した。ＥＲＭタンパク質のリン酸化は、ポリアクリルアミドゲル上でのエレクトロフォレーシス、およびその後のｍｏｅｓｉｎ（右のパネル）に対応するコロイダルブルー染色バンドのオートラジオグラフィ（左のパネル）の後に決定した。
【図１６】ｍｏｅｓｉｎ上の主要ＬＲＲＫ２リン酸化ペプチドについてのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦ分析。図４Ａに示した実験に由来するペプチドＰ２は、マトリックスとしての５０％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸中の５ｍｇ／ｍＬのα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸を用いてレフレクタモードのＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４７００プロテオミクス分析装置上で分析した。このペプチドからのＨ３ＰＯ４の消失は、ｙ７（−９８）＋イオンの存在によって示される。９８Ｄａの類似の特性損失は、図４Ａに示したＰ１およびＰ３ペプチドの分析上で観察された。
【図１７】ＬＲＲＫ２のキナーゼ不活性にＰＤ関連突然変異が及ぼす作用についての分析。ＬＲＲＫ２のフラグエピトープ標識化した全長野生型（ＷＴ）、ｋｉｎａｓｅ  ｄｅａｄ型（ＫＤ）および突然変異型ｃＤＮＡ対立遺伝子を２９２細胞中で発現させ、モノクローナルＭ２抗ＦＬＡＧアガロース樹脂を用いるイムノアフィニティクロマトグラフィによって精製した。免疫複合体は、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰの存在下で、ＬＲＲＫｔｉｄｅに対してアッセイした。比活性度は、ＬＲＲＫ２の量について修正した、ＬＲＲＫｔｉｄｅ内に組み込んだ３２Ｐのｃｐｍであり、これはＬＩＣＯＲによる免疫ブロット定量法によって決定した。Ｇ２０１９Ｓ突然変異は、活性のほぼ２倍の増加を生じさせるが、他方Ａ１４４２Ｐ、Ｒ１９４１Ｈ、Ｉ２０１２Ｔ、Ｉ２０２０ＴおよびＧ２３８５Ｒは活性の減少を生じさせる。
【図１８】ＬＲＲＫ２のための基質としての、ｍｏｅｓｉｎ、ｒａｄｉｘｉｎ、ｅｚｒｉｎおよびｍｅｒｌｉｎの評価。ＥＲＭタンパク質のカルボキシ末端は、ｍｅｒｌｉｎとともに、細菌中でのＧＳＴ融合体として生成した。生成されたフラグメントおよび突然変異は、以下のとおりであった：ｍｏｅｓｉｎアミノ酸５００−末端、野生型およびＴ５５８Ａ；ｅｚｒｉｎアミノ酸５０５−末端、野生型およびＴ５６７Ａ；ｒａｄｉｘｉｎアミノ酸５０３−末端、野生型およびＴ６６４Ａ；ならびにｍｅｒｌｉｎ５１４−末端、野生型およびＴ５６７Ａ。ＬＲＲＫ２およびＲｏｃｋがこれらのタンパク質を修飾する能力は、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰの存在下でのインビトロキナーゼ反応によって決定した。組換えＧＳＴ−ＬＲＲＫ２  １３２６−末端は、（Ｊａｌｅｅｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ２００７，４０５（２）：３０７−１７）に記載されたように調製した。Ｒｏｃｋは、昆虫細胞から精製した構成的に活性なフラグメント、アミノ酸２−５４３である。反応生成物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマジーブルー染色（ＣＢ）、さらにその後のオートラジオグラフィ（３２Ｐ）によって評価した。ＬＲＲＫ２は全ＥＲＭタンパク質および特にｍｅｒｌｉｎ上の類似のＴ５５８部位を容易に修飾するが、これはｍｅｒｌｉｎがＬＲＲＫ２のための新規なインビトロ基質であることを示している。ＲｏｃｋはさらにまたＴ５５８部位および類似のＥＲＭ残基上のＥＲＭタンパク質を修飾するが、Ｒｏｃｋは、Ｔ５６７上ではｍｅｒｌｉｎをリン酸化しないので、これはＲｏｃｋがＬＲＲＫ２とは相違する基質決定因子を示すことを指示している。
【図１９】組換えタンパク質におけるＬＲＲＫ２リン酸化部位決定因子の解明。Ａ．左のパネルに示したようにｍｏｅｓｉｎの５００−末端のＴ５２６Ａは特定部位突然変異誘発を受けたが、このときリン酸化部位の−８位から＋８位のアミノ酸はＡｌａに変換された。右のパネルでは、ｍｏｅｓｉｎの５００−末端のＴ５２６Ａは特定部位突然変異誘発を受けたが、このときｍｏｅｓｉｎの指示された残基は指示された残基と置換された。これらのタンパク質は、ＬＲＲＫ２およびＲＯＣＫとのインビトロキナーゼ反応を受け、反応生成物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマジーブルー染色（ＣＢ）、さらにその後のオートラジオグラフィ（３２Ｐ）によって評価された。Ｂ．ｍｏｅｓｉｎのＴ５５８リン酸化部位を取り囲んでいる残基の配列は、指示したナンバリングおよび残基位置を備えて示されている。
【図２０】ペプチドにおけるＬＲＲＫ２リン酸化部位決定因子の解明。Ｒｏｃｋに比較したＬＲＲＫｔｉｄｅのＬＲＲＫ２認識を指示するアミノ酸決定因子を詳細に試験するために、個別ペプチドを合成したが、このときＬＲＲＫｔｉｄｅの残基−６から＋５は、Ａｌａ、３ＡおよびＣと置換した。さらにペプチドを合成したが、このとき残基はさらに図１９Ｂ〜Ｄに指示した残基へ変換した。Ｔｈｒ５５８部位の＋７から＋１２の残基を伴う、より長いＬＲＲＫｔｉｄｅ（長鎖）をＬＲＲＫｔｉｄｅと比較した。ペプチドの濃度依存性リン酸化は、ＬＲＲＫ２（ＡおよびＢ）およびＲｏｃｋ（ＣおよびＤ）の両方について監視した。−６位  Ｇｌｙ５５２からＡｌａへの置換は、ＬＲＲＫ２およびＲｏｃｋによる組換えタンパク質基質の認識に中等度の作用を及ぼした。これは５５２Ａ変化を伴うペプチドのＬＲＲＫ２修飾についてと類似であったが、Ｒｏｃｋについては反応速度のより大きな減少が見られたので、マイナスの作用がより顕著であった。−５位  Ａｒｇ５５３からＡｌａへの置換は、ＬＲＲＫ２およびＲｏｃｋの両方について組換えタンパク質ならびにペプチドの修飾を減少させた。−４位  組換えタンパク質データは、−４位での酸性残基がＬＲＲＫ２およびＲｏｃｋによって嫌われることを示しているが、これはこの残基がＡｌａへ変化した場合のシグナルの増加によって証明された。ＬＲＲＫ２については、この位置で負電荷を除去するプラスの作用は、ペプチドリン酸化によってアッセイした場合は余り顕著ではなかった；しかし、Ｒｏｃｋについては、このペプチドについての反応速度の上昇によって示されたように明白である。−３位  組換えタンパク質データは、−３位での塩基性残基（Ｋ５５５）はＬＲＲＫ２によっては余り好まれないことを示しているが、これはこの残基がＡｌａへ変化した場合のシグナルの増加によって証明された。しかし、Ｒｏｃｋについては、この位置での塩基性残基は、ＡｌａまたはＧｌｕ酸への突然変異がリン酸化を遮断するので好ましいと思われる。Ｐｒｏ残基は、ＬＲＲＫ２およびＲｏｃｋの両方についてこの位置で極めて良好に忍容される。Ｋ５５５Ａペプチドの増強された修飾はＬＲＲＫ２を用いた場合は見られず、５５５での塩基性残基に対するＲｏｃｋ優先性は反応速度の減少によって明白である。−２位  Ｔｙｒ５５６からＡｌａへの置換は組換えタンパク質のＬＲＲＫ２リン酸化をバックグラウンドレベル近くへ減少させ、Ｒｏｃｋによるリン酸化を顕著に減少させる。さらに、Ｔｙｒ５５６からＰｒｏ、ＧｌｕまたはＡｒｇへの置換は、基質のＬＲＲＫ２認識の有害な作用をもたらす。これらの観察所見は全部が、置換がＬＲＲＫｔｉｄｅの状況において評価された場合に再現された。興味深いことに、Ｒｏｃｋについては、Ｔｙｒ５５６Ｐｒｏ突然変異体はＲｏｃｋによって弱度に修飾されるが、Ｔｙｒ５５６Ｇｌｕ置換の負電荷はＲｏｃｋによるリン酸化を完全に遮断する。これらの結果は、ペプチドリン酸化を用いても再現される。−２位、Ｔｙｒ５５６Ａｒｇでの塩基性電荷は、Ｒｏｃｋによるリン酸化における大きな増加を生じさせる。５５６Ｒペプチドは、野生型レベルと同様にリン酸化される。これらの結果は、−２位での疎水性残��がＬＲＲＫ２のために必要であること、そして塩基性電荷がＲｏｃｋによって最も好まれることを示している。−１位  Ｌｙｓ５５７からＡｌａへの置換は、ＬＲＲＫ２による修飾の減少およびＲｏｃｋによるリン酸化の完全な遮断を生じさせた。この作用は、Ｌｙｓ５５７がペプチド内で変化させられ、反応速度値が野生型についての反応速度の半分未満である場合により顕著であった。＋１位  組換えタンパク質では、Ｌｅｕ５５９からＡｌａ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、またはＴｙｒへの置換はＬＲＲＫ２によるリン酸化にほんのわずか、または全く作用を及ぼさないが、Ｌｅｕ５５９からＧｌｕへの変化は有害である。Ｌｅｕ５５９ＡｌａがＬＲＲＫｔｉｄｅの状況においてアッセイされる場合は、野生型の反応速度のほぼ半分への反応速度の減少が見られる。しかし、＋１位でのＬｅｕは、組換えタンパク質においてアッセイされた任意の突然変異またはこの位置でのＬＲＲＫｔｉｄｅはリン酸化を遮断するので、Ｒｏｃｋによる基質認識のためには極めて重要であると思われる。＋２位  ＬＲＲＫ２およびＲｏｃｋの両方について、この位置では塩基性残基が好ましい。Ａｒｇ５６０からＡｌａ、ＰｒｏまたはＧｌｕへの置換は、両方のキナーゼによるリン酸化を遮断する。Ａｒｇ５６０からＡｌａ、ＰｒｏまたはＧｌｕへの置換がＬＲＲＫｔｉｄｅの状況においてアッセイされる場合は、ＬＲＲＫ２はこのペプチドをリン酸化することができない。Ｒｏｃｋについては、Ａｒｇ５６０からＡｌａまたはＰｒｏへの置換は反応速度を減少させるが完全には減少させず、Ｐｒｏ置換はわずかに低いアフィニティを示す。＋３位  Ｇｌｎ５６１からＡｌａへの変化はＬＲＲＫ２またはＲｏｃｋが組換え基質を修飾する能力に些細な作用しか示さなかった。ＬＲＲＫ２については、この作用はペプチドリン酸化によってアッセイした場合にも最少であり、反応速度においてわずかな減少しか見られなかった。しかしＲｏｃｋについては、Ｇｌｎ５６１がＬＲＲＫｔｉｄｅにおいてＡｌａと置換された場合に反応速度における顕著な変化が生じた。＋４位  Ｉｌｅ５６２からＡｌａへの置換は、組換え基質ならびにペプチド基質の両方のＬＲＲＫ２リン酸化を減少させた。この置換は組換え基質のＲｏｃｋ修飾を増加させたが、ペプチド基質のリン酸化をわずかに減少させた。＋５位  Ａｒｇ５６３からＡｌａ、ＰｒｏまたはＧｌｕへの変化はＬＲＲＫ２の組換えタンパク質基質の認識に中等度の作用を及ぼす。しかし、Ｒｏｃｋは組換えタンパク質におけるＡｌａおよびＧｌｕの置換よりも強い忍容体であるが、Ｐｒｏの忍容体ではない。ＬＲＲＫｔｉｄｅにおけるＡｌａ置換は、Ｒｏｃについての反応速度に中等度の作用を引き出すが、ＬＲＲＫ２を用いた場合は反応速度の重度の減少が見られる。ＰｒｏおよびＧｌｕの置換５６３はこれらの変化を伴ってＲｏｃｋについてみられる反応速度の減少を伴って、ＬＲＲＫ２によるリン酸化を遮断する。＋６位  Ｇｌｎ５６４からＡｌａへの置換は、組換え基質のＬＲＲＫ２およびＲｏｃｋ両方の修飾を減少させる。＋７位  Ｇｌｙ５６４からＡｌａへの置換は、組換え基質のＬＲＲＫ２およびＲｏｃｋ両方の修飾をわずかに減少させる。＋８位  Ａｓｎ５６４からＡｌａへ��置換は、組換え基質のＬＲＲＫ２修飾をわずかに増加させ、組換え基質のＲｏｃｋリン酸化をわずかに減少させる。
【図２１】ＬＲＲＫ２は、カルボキシ末端伸長を伴うより長いＬＲＲＫｔｉｄｅに対する、より高度のアフィニティを示す。Ｔｈｒ５５８部位の＋７から＋１２の残基を伴うより長いＬＲＲＫｔｉｄｅを、ＬＲＲＫ２によるリン酸化によるＬＲＲＫｔｉｄｅと比較した。組換えｍｏｅｓｉｎにおける遠位＋位残基でのＡｌａ置換の分析は、ＬＲＲＫ２によるリン酸化におけるわずかな差を明らかにした。長いＬＲＲＫｔｉｄｅに対するＬＲＲＫ２アフィニティは、ＬＲＲＫｔｉｄｅのＬＲＲＫ２アフィニティの１０倍を超える。
【図２２】ＬＲＲＫ２は、ＭＹＰＴをリン酸化しない。組換えＧＳＴ−ＭＹＰＴおよび熱変性ＧＳＴ全長ｅｚｒｉｎに、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰの存在下でＲｏｃｋまたはＬＲＲＫ２の量を増加させながらインビトロキナーゼ反応を受けさせた。反応生成物は、ＭＹＰＴキナーゼ反応のためには全ＭＹＰＴおよびホスホ−ＭＹＰＴ  Ｔｈｒ８５０を用い、またはｅｚｒｉｎキナーゼ反応のためには全ＥＲＭおよびホスホ−ＥＲＭを用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、その後にクーマジーブルー染色およびオートラジオグラフィまたは免疫ブロット法によって分析した。公知のＭＹＰＴ  Ｒｏｃｋリン酸化部位は−２位ではＡｒｇおよび＋２位ではＧｌｙを含有している（表１）。ＬＲＲＫ２が−２位での疎水性残基および＋２位での塩基性残基を好む場合は、ＭＹＰＴがＬＲＲＫ２に対する不良な基質として機能するはずである。ＭＹＰＴは、突然変異誘発性試験データを支持して、ＬＲＲＫ２のためよりもＲｏｃｋのためにはるかに優れた基質である。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【０１４６】
ＬＲＲＫ２はＴｈｒ５５８でｍｏｅｓｉｎをリン酸化する；パーキンソン病突然変異体がキナーゼ活性に作用を及ぼす方法の特性解析。
【０１４７】
略語：ＧＳＴ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ；ＫＥＳＴＲＥＬ、キナーゼＥ基質の追跡および解明；ＬＲＲＫ２、ロイシンリピートリッチキナーゼ２；ＬＤＳ、ドデシル硫酸リチウム；ＭＢＰ、ミエリン塩基性タンパク質；ＣＲＭＰ２、ｃｏｌｌａｐｓｉｎ応答メディエータタンパク質２；ＣＯＲ、複合体のＲａｓのＣ末端；ＰＤ、パーキンソン病；ＧｂｐＣ、ｃＧＭＰ結合タンパク質Ｃ；ＲＩＰＫ、Ｒｈｏ相互作用タンパク質キナーゼ；およびＲＯＣＫ−ＩＩ、Ｒｈｏ関連キナーゼ２。
【０１４８】
要約。ヒトロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）遺伝子における常染色体優性突然変異は、遅発性パーキンソン病（ＰＤ）を誘発する。ＬＲＲＫ２は、タンパク質キナーゼドメインの他に、ロイシンリッチリピート、ＧＴＰａｓｅドメイン、ＣＯＲドメインおよびＷＤ４０モチーフを含有する、大きな約２８０ｋＤａの酵素である。これらのドメイン各々内での突然変異は、ＰＤと連結している。ＬＲＲＫ２がどのように調節されるのか、その生理学的基質は何であるか、そして突然変異がＬＲＲＫ２機能にどのように影響を及ぼすのかについては、ほとんど分かっていない。これまでＬＲＲＫ２活性は、自己リン酸化およびかなり緩徐に触媒されるミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）のリン酸化によってしか評価されてこなかった。本発明者らは、ＬＲＲＫ２の活性化ＰＤ突然変異体（Ｇ２０１９Ｓ）によってリン酸化されたタンパク質を同定するために、ラット脳抽出物中でＫＥＳＴＲＥＬスクリーンを企画した。これは、アクチン細胞骨格を原形質膜へ固定するｍｏｅｓｉｎと呼ばれるタンパク質は、以前に同定されたｍｏｅｓｉｎがアクチンに結合する能力を調節するインビボリン酸化部位であるＴｈｒ５５８でＬＲＲＫ２によって効率的にリン酸化されるという所見を導いた。ＬＲＲＫ２は、Ｔｈｒ５５８を含んでいたＬＲＲＫｔｉｄｅと呼ばれるペプチドもまたリン酸化した。本発明者らは、以前に報告されたＬＲＲＫ２の９つのＰＤ突然変異がキナーゼ活性にどのように影響を及ぼすのかを決定するためにこれらの所見を活用した。分析した突然変異のうちの１つだけ、つまりＧ２０１９Ｓだけがキナーゼ活性を刺激した。４つの突然変異（Ｒ１９４１Ｈ、Ｉ２０１２Ｔ、Ｉ２０２０ＴおよびＧ２３８５Ｒ）はＬＲＲＫ２キナーゼ活性を阻害したが、残り（Ｒ１４４１Ｃ、Ｒ１４４１Ｇ、Ｙ１６９９ＣおよびＴ２３５６Ｉ）は活性に影響を及ぼさなかった。このために、ＬＲＲＫ２突然変異がＰＤを誘導する方法は、以前に想像されたよりも複雑である可能性が高く、ＬＲＲＫ２キナーゼ活性の増加によってだけでは誘導されない。本発明者らはさらに、ＬＲＲＫ２の触媒活性度が最少であるフラグメントは、無傷ＧＴＰａｓｅ、ＣＯＲおよびキナーゼドメインならびにＷＤ４０モチーフおよびＣ末端テール（残基１３２６−２５２７を含む）を必要とすることも示している。本試験に提示した所見は、ＬＲＲＫ２キナーゼ活性の定量的測定のために有用であり、ＰＤを治療するためのＬＲＲＫ２を阻害する薬物についてスクリーニングするためにも活用できる。本発明者らは、突然変異体ＬＲＲＫ２によるｍｏｅｓｉｎリン酸化のダウンレギュレーションが、どのようにしてパーキンソン病におけるドーパミン作動性軸索末端の早期消失を引き起こすのかについても考察する。
【０１４９】
材料および方法。
【０１５０】
材料。プロテアーゼ阻害剤のカクテル錠は、Ｒｏｃｈｅ社から入手した。Ｐ８１ホスホセルロース紙は、Ｗｈａｔｍａｎ社から入手した。［γ３２Ｐ］−ＡＴＰおよび全タンパク質クロマトグラフィ媒質は、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社から購入した。ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から入手した。Ｐｒｅｃａｓｔ  ＳＤＳポリアクリルアミドＢｉｓ−ＴｒｉｓゲルはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から入手した；組織培養試薬は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から入手した。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐは、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から入手した。活性ラットＲＯＣＫＩＩ［残基２−５４３］は、シグナル伝導療法ユニット科（ダンディー大学）によってバキュロウイルス中で発現させられた。ＬＲＲＫｔｉｄｅペプチド（ＲＬＧＲＤＫＹＫＴＬＲＱＩＲＱ）は、ブリストル大学でＧｒａｈａｍ  Ｂｌｏｏｍｂｅｒｇ博士によって合成された。
【０１５１】
抗体。抗ＧＳＴは、ヒツジにおいてグルタチオンＳ−トランスフェラーゼタンパク質に対して立てられた。免疫ブロット法のために使用されるホースラディッシュペルオキシダーゼに結合した二次抗体をＰｉｅｒｃｅ社から入手した。
【０１５２】
一般的方法。組織培養、トランスフェクション、免疫ブロット法、制限酵素消化、ＤＮＡライゲーション、およびその他の組換えＤＮＡ方法は、標準プロトコールを用いて実施した。全突然変異誘発試験は、Ｑｕｉｃｋ−Ｃｈａｎｇｅ特定部位突然変異誘発法（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて実施した。トランスフェクションのために使用したＤＮＡ構築体は、Ｑｉａｇｅｎ社プラスミドＭｅｇａまたはＭａｘｉキットを製造業者のプロトコールにしたがって使用して、大腸菌ＤＨ５αから精製した。全ＤＮＡ構築体は、ダンディー大学ライフサイエンス学部シーケンシングサービス部門（英国スコットランド）によって、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製自動ＤＮＡシーケンサー上でＤＹＥｎａｍｉｃ  ＥＴターミネータ化学（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて実施されたＤＮＡシーケンシングによって検証された。
【０１５３】
バッファ。溶解用バッファは、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％（ｗ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、１ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム、１０ｍＭナトリウム−β−グリセロホスフェート、５０ｍＭフッ化ナトリウム、５ｍＭピロリン酸ナトリウム、０．２７Ｍスクロース、０．１％（ｖ／ｖ）の２−メルカプトエタノールおよび完全プロテイナーゼ阻害剤カクテル（１錠／５０ｍＬ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社）を含有していた。バッファＡは、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡおよび０．１％（ｖ／ｖ）の２−メルカプトエタノールを含有していた。抽出用バッファは、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５％（ｖ／ｖ）のグリセロール、１０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．０３％（ｖ／ｖ）のＢｒｉｊ−３５、完全プロテイナーゼ阻害剤カクテル（１錠／５０ｍＬ）を含有していた。サンプルバッファは、１容積％の２−メルカプトエタノールを含有する１×  ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＬＤＳサンプルバッファ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）であった。
【０１５４】
プラスミド。ＮＣＢＩアクセッション番号に対応するＬＲＲＫ２をコードする全長ｃＤＮＡクローン。ＡＡＶ６３９７５は、Ｍｉｃｈｅｌ  Ｇｏｅｄｅｒｔ博士（ケンブリッジ大学ＬＭＢ）のご厚意により寄贈された。本試験に利用されたＬＲＲＫ２遺伝子の全長およびフラグメントは、ＫＯＤポリメラーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を使用して、標準ＰＣＲ法にしたがって、ＬＲＲＫ２  ｃＤＮＡフラグメントから増幅させた。結果として生じるＰＣＲ産物は、Ｂａｍｈ１−Ｎｏｔ１フラグメントとして哺乳動物ｐＥＢＧ２ＴおよびｐＣＭＶ５発現ベクター内にサブクローニングされた。ヒトｍｏｅｓｉｎ（ＮＣＢＩアクセッション番号、ＮＰ＿００２４３５）の全長ならびにＣ末端フラグメントをコードするｃＤＮＡは、Ｇｅｎｅｓｅｒｖｉｃｅ社から発注されたＥＳＴ（ＩＭＡＧＥクローン、４９０８５８０）からＰＣＲによって増幅された。ＰＣＲ産物は、Ｎｏｔ１−Ｎｏｔ１フラグメントとして相違する発現ベクター内にライゲーションされた。
【０１５５】
ＧＳＴ−ＬＲＲＫ２の発現および精製。ＨＥＫ２９３細胞の典型的には１０〜１００個の１０ｃｍ径の培養皿を培養し、各培養皿はポリエチレンイミン法を使用して、ＬＲＲＫ２の野生型または相違する突然変異形をコードする５μｇのｐＥＢＧ−２Ｔ構築体を用いてトランスフェクトされた［非特許文献１５］。細胞は、さらに３６時間にわたり培養し、０．５ｍＬの氷冷溶解用バッファ中に溶解させ、溶解液をプールし、４℃で１０分間にわたり２６，０００×ｇで遠心した。ＧＳＴ融合タンパク質はグルタチオンセファロース（２９３細胞の培養皿１枚当たり１０μＬ）上でのアフィニティクロマトグラフィによって精製し、２０ｍＭグルタチオンおよび０．２７Ｍスクロースを含有するバッファＡ中で溶出させた。酵素は少量のアリコート中で急速冷凍し、−８０℃で保存した。
【０１５６】
ＬＲＲＫ２  ＫＥＳＴＲＥＬスクリーン。５０匹のラット由来の脳を細分化し、４容積の抽出用バッファを用いてホモジナイズした。不溶性物質は４℃で２０分間にわたり２８，０００×ｇでの遠心分離によって沈降させ、上清中のタンパク質は６０％（ｗ／ｖ）の硫酸アンモニウムとともに２時間にわたり攪拌することによって沈降した。沈降したタンパク質は２０分間にわたり２８，０００×ｇで遠心することによって採取し、抽出用バッファ中に再懸濁させ、３０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ６．９）、１０％（ｖ／ｖ）のグリセロール、１０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．０３％（ｖ／ｖ）のＢｒｉｊ−３５内へＳｅｐｈａｄｅｘ−Ｇ２５微粒子上でのクロマトグラフィによって脱塩し、ヘパリン−セファロース上で後者のバッファ中でクロマトグラフィにかけた。ヘパリンカラムの貫流は１Ｍ  ＮａＯＨを用いてｐＨ７．５へ滴定し、３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、１０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．０３％（ｖ／ｖ）のＢｒｉｊ−３５中で１Ｍ  ＮａＣｌへの１３６ｍＬ勾配を用いて展開させた８ｍＬのＳｏｕｒｃｅ  １５Ｑカラム上に装填した。全画分のアリコートは、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１０μｇ／ｍＬのロイペプチン、１ｍＭ  Ｐｅｆａｂｌｏｃ中に１０倍に希釈し、６５℃で１５分間にわたりインキュベートし、その後３ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１ＭＢｑ／ｍＬの［γ３２Ｐ］−ＡＴＰとともに、２μｇのＧＳＴ−ＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７、Ｇ２０１９Ｓ］（ＬＲＲＫ２酵素の純度は全タンパク質の２〜５％であると推定された）の非存在下または存在下で５分間にわたりインキュベーションした。反応は、ＳＤＳ−サンプルバッファの添加によって終了させ、ポリアクリルアミドゲル・エレクトロフォレーシスにかけ、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｐへ電気移動させた。膜を乾燥させ、オートラジオグラフィにかけた。全画分および試験アリコートは、−８０℃で冷凍した。Ｑ画分５および６を含有する基質は、３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．２）、１０％（ｖ／ｖ）のグリセロール、１０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．０３％（ｖ／ｖ）のＢｒｉｊ−３５中で５倍に希釈し、１ｍＬのＳｏｕｒｃｅ  １５  Ｑカラムへ装填した。このカラムは、１Ｍ  ＮａＣｌへの１０ｍＬ勾配を備える３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０％（ｖ／ｖ）のグリセロール、１０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．０３％（ｖ／ｖ）のＢｒｉｊ−３５中で展開させ、０．５ｍＬの画分を採取し、アリコートは上記と同様にＬＲＲＫ２を用いてスクリーニングした。Ｑ分画６および７を含有する基質を１２０ｍＬのＳｕｐｅｒｄｅｘ−２００カラムへ装填し、１．２ｍＬのアリコートを採取してスクリーニングした。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ画分１２〜１５を含有する基質をプールし、濃縮させ、２ｍＬのＶｉｖａＳｃｉｅｎｃｅシステム内での濾過によって脱塩した。４μｇのアリコートは変性させ、またはそのまま放置し、ＬＲＲＫ２の存在下または非存在下でのリン酸化によって基質の存在について試験した。サンプルは、ポリアクリルアミドゲル上でのエレクトロフォレーシスにかけ、��ロイダルブルーを用いて染色し、オートラジオグラフィによって分析した。基質シグナルに対応するタンパク質バンドを切除し、トリプシンを用いて消化し、質量分析フィンガープリント法によるタンパク質同定を受けさせた。
【０１５７】
大腸菌中でのヒトｍｏｅｓｉｎの発現および精製。ヒトｍｏｅｓｉｎの野生型および突然変異形をコードするｐＧＥＸ発現構築体を大腸菌ＢＬ２１細胞内へ形質転換させ、１リットルの培養物は６００ｎｍでの吸光度が０．８になるまで１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬｕｒｉａブロス中で３７℃で増殖させた。タンパク質発現の誘導は、１００μＭイソプロピル−β−Ｄ−ガラクトシドを加えることによって実施し、細胞はさらに１６時間にわたり２６℃で培養した。細胞は遠心分離によって単離し、１５ｍＬの氷冷溶解用バッファ中に再懸濁させ、１ラウンドの凍結／解凍において溶解させ、その後にＤＮＡをフラグメント化する超音波処理を実施した。溶解液は４℃で３０分間にわたり２６，０００×ｇで遠心し、組換えタンパク質は０．２ｍＬのグルタチオン−セファロース上でアフィニティ精製し、２０ｍＭグルタチオンおよび０．２７Ｍスクロースを含有する０．４ｍＬのバッファＡ中に溶出させた。
【０１５８】
Ｇ２０１９Ｓ  ＬＲＲＫ２によりリン酸化されたｍｏｅｓｉｎ上の部位のマッピング。ｍｏｅｓｉｎ（４μｇ）は６５℃で１５分間にわたり処理し、次に全反応容積５０μＬ中に１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１００μＭ  ［γ３２Ｐ］−ＡＴＰ（１０，０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）を含有するバッファＡ中の１．５μｇのＧＳＴ−ＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７、Ｇ２０１９Ｓ］とともに３０℃でインキュベートした。この反応は、ＬＤＳ−１０ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）の最終濃度が１％（ｗ／ｖ）となるようにサンプルバッファを加えることによって４０分後に終了させ、サンプルを１分間にわたり１００℃で加熱し、氷上で冷却した。４−ビニルピリジンを５０ｍＭの濃度となるように加え、サンプルはシステイン残基をアルキル化するために室温で３０分間にわたり攪拌プラットフォーム上に放置した。サンプルはＢｉｓＴｒｉｓ  ４〜１２％のポリアクリルアミドゲル上でのエレクトロフォレーシスを受けさせ、これをコロイダルブルーで染色し、次にオートラジオグラフィにかけた。リン酸化されたｍｏｅｓｉｎバンドを切除し、細片に切断し、１ｍＬの以下の：水、水とアセトニトリルの１：１混合液、０．１Ｍ重炭酸アンモニウム、０．２Ｍ重炭酸アンモニウムおよびアセトニトリルの１：１混合液および最後にアセトニトリルを用いて１５分間にわたり振動プラットフォーム上で連続的に洗浄した。ゲルピースは、ｓｐｅｅｄｉ−ｖａｃによって乾燥させ、０．１ｍＬの５０ｍＭ重炭酸アンモニウム、１μｇの質量分析法用トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を含有する０．１％（ｗ／ｖ）のｎ−オクチル−グルコシド中でインキュベートした。１６時間後、０．１ｍＬのアセトニトリルを加え、この混合液を攪拌プラットフォーム上で１０分間にわたりインキュベートした。上清を除去し、ゲルピースを０．３ｍＬの５０ｍＭ重炭酸アンモニウム、および０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸中でさらに１０分間にわたり洗浄した。＞９０％の３２Ｐ放射能を含有する結合上清は、０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸水溶液中で平衡させたＶｙｄａｃ  ２１８ＴＰ５２１５  Ｃ１８カラム（Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  Ｇｒｏｕｐ社、カリフォルニア州ヘスペリア）上でクロマトグラフィにかけた。カラムは、０．２ｍＬ／分の流速で線形アセトニトリル勾配（対角線）を用いて展開させ、０．１ｍＬの画分を採取した。ホスホペプチドは、Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｅｌｅｃｔ樹脂（Ｓｉｇｍａ社）上での固定化金属キレートアフィニティクロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）によってさらに精製した。
【０１５９】
ホスホペプチド配列分析。単離したホスホペプチドは、マトリックスとして５μｇ／ｍＬのαシアノ桂皮酸を使用してＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４７００プロテオミクス分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦ）上で分析した。スペクトルはレフレクトロンモードおよび線形モードの両方で取得し、ホスホペプチドの配列は選択された質量についてＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ＭＳを実施することによって確証した。親ホスホペプチドからのリン酸（Ｍ−９８Ｄａ）の特徴的な消失ならびにホスホセリンについてのデヒドロアラニン（Ｍ−６９ｋＤａ）またはホスホトレオニンについてのデヒドロアミノ酪酸（−８３）の自然消失を使用して、リン酸化部位の位置を指定した。全３２Ｐ標識ペプチドのリン酸化の部位は、以前に記載されたように［非特許文献１６］、Ｓｅｑｕｅｌｏｎ−ＡＡ膜（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ社）に結合させたペプチドのＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４９４Ｃシークェネータ上での固相Ｅｄｍａｎ分解によって決定した。
【０１６０】
基質としてｍｏｅｓｉｎまたはＭＢＰを使用するＬＲＲＫ２のアッセイ。アッセイは、０．５〜０．７μｇの野生型もしくは突然変異形いずれかのＬＲＲＫ２、１μＭ  ｍｏｅｓｉｎ（アッセイ前に氷上に放置されていた、または６５℃で１５分間にわたりインキュベートされていた、全長もしくは指示した突然変異体）または１μＭミエリン塩基性タンパク質、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および０．１ｍＭ［γ３２Ｐ］−ＡＴＰ（３００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）を含有する総容量２５μＬのバッファＡ中でセットアップした。３０分間にわたり３０℃でインキュベートした後、反応はＬＤＳ−サンプルバッファの添加によって停止させた。ｍｏｅｓｉｎもしくはＭＢＰ基質中へのリン酸塩の組込みならびにＬＲＲＫ２自己リン酸化は、４〜１２％のポリアクリルアミドゲル上でのサンプルのエレクトロフォレーシスおよび乾燥させたクーマジーブルー染色ゲルのオートラジオグラフィ後に決定した。リン酸化された基質もまたゲルから切除し、Ｃｈｅｒｅｎｋｏｖ計数によって３２Ｐの取り込みを定量した。
【０１６１】
基質としてＬＲＲＫｔｉｄｅを使用するＬＲＲＫ２のアッセイ。アッセイは、３００μＭもしくは指示した濃度のＬＲＲＫｔｉｄｅ（ＲＬＧＲＤＫＹＫＴＬＲＱＩＲＱ）ペプチド基質の存在下で、０．５〜０．７μｇの野生型もしくは突然変異形いずれかのＬＲＲＫ２、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および０．１ｍＭ［γ３２Ｐ］−ＡＴＰ（３００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）を含有する総容量５０μＬのバッファＡ中でセットアップした。３０℃での３０分間にわたるインキュベーション後に、反応は４０μＬの反応混合物をＰ８１ホスホセルロース紙上に適用することによって終了させ、ＬＲＲＫｔｉｄｅのリン酸化は、５０ｍＭリン酸中でのＰ８１ホスホセルロースの洗浄およびＣｈｅｒｅｎｋｏｖ計数後に定量した。１単位（Ｕ）のＬＲＲＫ２活性は、１ｎｍｏｌの３２ＰのＬＲＲＫｔｉｄｅ内への組込みを触媒する酵素の量であると規定した。ＫｍおよびＶｍａｘパラメータは、様々な濃度のＬＲＲＫｔｉｄｅを使用して、上述したアッセイを実施することによって決定した。ＫｍおよびＶｍａｘパラメータは、Ｇｒａｐｈ−Ｐａｄプリズムプログラムを使用して計算した。
【０１６２】
免疫ブロッティング。サンプルは７０℃のサンプルバッファ中で５分間加熱し、ポリアクリルアミドゲル・エレクトロフォレーシスを受けさせ、ニトロセルロース膜へ移した。膜は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０％（ｗ／ｖ）のスキムミルクを含有する０．２％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ（ＴＢＳＴバッファ）中で３０分間にわたりブロックした。膜は、５％（ｗ／ｖ）のスキムミルクを含有する４℃のＴＢＳＴバッファ中で１６時間にわたり１μｇ／ｍＬの抗ＧＳＴ抗体を用いてプローブした。検出は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ抱合二次抗体および増強した化学発光試薬を用いて実施した。
【０１６３】
ＬＲＲＫ２自己リン酸化部位の同定。１０μｇの指示された形態の精製ＧＳＴ−ＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７］は、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および０．１ｍＭ  ＡＴＰを含有する総容量５０μＬのバッファＡ中で６０分間にわたりインキュベートした。反応は、サンプルバッファの添加によって終了させ、４〜１２％のポリアクリルアミドゲル上でのエレクトロフォレーシスにかけ、これをコロイダルブルークーマジーを用いて染色した。ＧＳＴ−ＬＲＲＫ２バンドをゲルから切除し、０．１Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３および５０％のアセトニトリル／５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３を用いて洗浄した。タンパク質は次に６５℃で４５分間にわたり０．１Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３中の１０ｍＭ  ＤＴＴを用いて還元させ、室温で３０分間にわたり５０ｍＭヨードアセトアミドの添加によってアルキル化した。ゲルピースは０．１Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３および５０％（ｖ／ｖ）のアセトニトリル／５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３中で洗浄し、乾燥させ、３０℃で１６時間にわたり５μｇ／ｍＬのトリプシンを含有する２５ｍＭ重炭酸トリエチルアンモニウムとともにインキュベートした。リン酸化部位を同定するために、ペプチドはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４０００  Ｑ−ＴＲＡＰ上でのＬＣ−ＭＳによって分析した。Ｃｅｌｅｒａ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）ヒトデータベースを含む数種のデータベースは、Ｍａｓｃｏｔ検索アルゴリズム（ｗｗｗ．ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ）を用いて検索した。
【０１６４】
結果。
【０１６５】
ＫＥＳＴＲＥＬにおいて使用するためのＬＲＲＫ２の活性フラグメントの発現。ＫＥＳＴＲＥＬスクリーンのためのタンパク質キナーゼの起源として、本発明者らは２９３細胞中でＬＲＲＫ２のＧＳＴ−融合体を発現させた。グルタチオン−セファロース上でのアフィニティ精製後に、全長ＬＲＲＫ２の発現レベルは低かったが、残基１３２６−２５２７を含んでおり、ロイシンリッチリピートが欠如しているが、依然としてＧＴＰａｓｅ、ＣＯＲ、キナーゼ、ＷＤ４０およびＣ末端テールを含有するＬＲＲＫ２フラグメントの発現レベルは有意に高かった（図９）。ＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７］フラグメントは、マグネシウムおよび［γ３２Ｐ］−ＡＴＰとともにインキュベートした場合に自己リン酸化し、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）を弱度にではあるがリン酸化した（図１）。Ｍｇ２＋結合Ａｓｐ残基が突然変異させられたＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７、Ｄ２０１７Ａ］の触媒的に不活性な突然変異体は、並行反応において自己リン酸化またはＭＢＰをリン酸化することができなかった（図１）。本発明者らは、「はじめに」の項で言及した共通ＰＤ突然変異体ＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７、Ｇ２０１９Ｓ］は、以前の研究と一致して非突然変異ＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７］と比較して約３倍高いレベルの自己リン酸化およびＭＢＰリン酸化を示すこともまた見いだしたが、これはこの突然変異がＬＲＲＫ２活性を刺激することを示している［非特許文献１２、１３］。
【０１６６】
ＬＲＲＫ２  ＫＥＳＴＲＥＬスクリーン。ＬＲＲＫ２によってリン酸化される脳中のタンパク質について検索するために、５０例のラット脳に由来する抽出物を６０％（ｗ／ｖ）の硫酸アンモニウムを用いて沈降させ、脱塩し、ヘパリン−セファロース上でクロマトグラフィにかけ（図１０）、その後にｐＨ７．５でのＳｏｕｒｃｅ−Ｑ（図２Ａ）およびｐＨ８．２でのＳｏｕｒｃｅ−Ｑ（図２Ｂ）および最後にＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ゲル濾過（図２Ｃ）にかけた。各カラム画分のアリコートを反応バッファ中で希釈し、タンパク質をリン酸化する可能性がある、したがってそうしないとＫＥＳＴＲＥＬ分析を妨害し得るバックグラウンドレベルのリン酸化を減少させる可能性がある内生タンパク質キナーゼを不活性化するために、６５℃で１５分間にわたりインキュベートした［非特許文献１７］。各画分は、次に「材料および方法」の項で記載したようにＧＳＴ−ＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７］またはＧＳＴ−ＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７、Ｇ２０１９Ｓ］および［γ３２Ｐ］−ＡＴＰの存在下または非存在下でインキュベートした。精製された非突然変異ＧＳＴ−ＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７］を利用すると、任意のラット脳タンパク質の有意なリン酸化は検出されなかった（データは示していない）。より活性なＧＳＴ−ＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７、Ｇ２０１９Ｓ］突然変異体を配置すると、３つのタンパク質がリン酸化されることが観察された（図２および図１０）。これらのタンパク質を精製し、ポリアクリルアミドゲル上でのエレクトロフォレーシスにかけ、各製剤においてＬＲＲＫ２によってリン酸化されたクーマジーブルー染色したバンドの同一性は、トリプシンペプチド質量スペクトル法のフィンガープリント法によって確定した（図３）。これは、ＬＲＲＫ２によってリン酸化されたタンパク質は、ｃｏｌｌａｐｓｉｎ応答メディエータタンパク質２（ＣＲＭＰ２）、クレアチンキナーゼおよびｍｏｅｓｉｎであることを解明した。ＣＲＭＰ２およびクレアチンキナーゼは、ｍｏｅｓｉｎにおけるよりも脳抽出物中においては５０〜１００倍以上豊富であることが観察された（ＡＫデータは示していない）。ＬＲＲＫ２によるこれらのタンパク質の相対リン酸化を試験するために、類似量の精製されたＣＲＭＰ２、クレアチンキナーゼおよびｍｏｅｓｉｎタンパク質をこれらの条件下でＧＳＴ−ＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７、Ｇ２０１９Ｓ］によりリン酸化すると、ｍｏｅｓｉｎはＣＲＭＰ２またはクレアチンキナーゼに比較して顕著に大きな程度にリン酸化された（図３）。ＣＲＭＰ２およびクレアチンキナーゼは高度に豊富なタンパク質であり、ＬＲＲＫ２によってｍｏｅｓｉｎよりはるかに低効率でリン酸化されたので、本発明者らはＬＲＲＫ２によるｍｏｅｓｉｎのリン酸化を試験することに焦点を当てた。
【０１６７】
ＬＲＲＫ２によりリン酸化されたｍｏｅｓｉｎ中でのリン酸化残基のマッピング。本発明者らは、ＫＥＳＴＲＥＬスクリーンにおいて実施したように６５℃で１５分間にわたりインキュベートされていた大腸菌中で発現した組換えヒトＧＳＴ−ｍｏｅｓｉｎが、１モルのｍｏｅｓｉｎ当たり約０．１モルのリン酸塩の最大化学量論比へ時間依存性方法でＬＲＲＫ２によってリン酸化されることを見いだした（図４Ａ）。本発明者らは、より高い化学量論比へｍｏｅｓｉｎをリン酸化することができなかったが、これは有意な比率の組換え酵素がリン酸化できない立体配座にある可能性を示していた。ＬＲＲＫ２を用いてリン酸化された３２Ｐ−ｍｏｅｓｉｎはトリプシンを用いて消化し、３２Ｐ標識ホスホペプチドを単離するためにＣ１８カラム上でクロマトグラフィにかけた。これは２つの主要ピーク（Ｐ１およびＰ２）および１つの小さなピーク（Ｐ３）を明らかにした（図４Ｂ）。Ｐ１およびＰ２の固相Ｅｄｍａｎシーケンシング（図４Ｃ）および質量分析法（図４Ｄ）は、Ｔｈｒ５５８でリン酸化されたペプチドとＴｈｒ５２６でリン酸化されたペプチドとしてのＰ３との同一性を確定した。本発明者らは次に、ｍｏｅｓｉｎにおけるＴｈｒ５２６およびＴｈｒ５５８の突然変異が、ＧＳＴ−ＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７、Ｇ２０１９Ｓ］によるリン酸化にどのような影響を及ぼしたのかについて評価した。Ｔｈｒ５２６の突然変異はＬＲＲＫ２によるｍｏｅｓｉｎのリン酸化を中等度に減少させたが、他方Ｔｈｒ５５８の突然変異はｍｏｅｓｉｎのリン酸化を実質的に無効にしたので（図４Ｅ）、これはＴｈｒ５５８がリン酸化の主要部位であることを示していた。Ｔｈｒ５２６およびＴｈｒ５５８残基の両方が突然変異した場合は、ｍｏｅｓｉｎのリン酸化は観察されなかった。
【０１６８】
ＬＲＲＫ２によるｍｏｅｓｉｎのリン酸化についての詳細な分析。ｍｏｅｓｉｎは、アクチン細胞骨格を原形質膜へ固定するために機能するタンパク質のｅｚｒｉｎ／ｒａｄｉｘｉｎ／ｍｏｅｓｉｎ（ＥＲＭ）ファミリーのメンバーであり、膜構造および組織化を調節することに重要な役割を果たす［非特許文献１８、１９］。ｍｏｅｓｉｎは、数種の原形質膜タンパク質［非特許文献１８、１９］ならびにホスホイノシチド４，５ビスホスフェート（Ｐｔｄｌｎｓ４，５Ｐ２）と相互作用するバンドＦｏｕｒ−ｐｏｉｎｔ−ｏｎｅ／ｅｚｒｉｎ／ｒａｄｉｘｉｎ／ｍｏｅｓｉｎ（ＦＥＲＭ）ドメイン（残基１−２９８）からなる。ｍｏｅｓｉｎ上のＦＥＲＭドメインにはα−ヘリカルドメイン（残基２９８−４６０）、柔軟性リンカー領域（残基４６０−４８９）および保存されたＣ末端テール（Ｃ−ＥＲＭＡＤドメインとも呼ばれる、残基４８９−５７５）が続く。Ｔｈｒ５５８を含むｍｏｅｓｉｎの最終３０アミノ酸は、Ｆ−アクチン結合部位を形成する［非特許文献２０、２２］。ｍｏｅｓｉｎおよびその他のＥＲＭタンパク質は、少なくとも２つの立体配座状態、つまり膜およびＦ−アクチンに結合することのできる活性「開放」形および、アクチン結合部位が遮蔽されているのでアクチン細胞骨格を原形質膜へ連結させることのできない不活性もしくは不活発な「閉鎖」形で存在する。ｍｏｅｓｉｎの閉鎖状態の構造は、ｍｏｅｓｉｎのＦＥＲＭドメインおよびＣ末端テールが相互作用することを明らかにするが、他方開放形ではＦＥＲＭおよびＣ末端ドメインは解離している［非特許文献２３］。Ｔｈｒ５５８でのｍｏｅｓｉｎのリン酸化は、膜タンパク質および場合によってはＰｔｄｌｎｓ（４，５）Ｐ２に結合するＦＥＲＭドメインと連動して、Ｃ末端テールのＦＥＲＭドメインからの解離を促進し、ｍｏｅｓｉｎがＦ−アクチンに結合することを可能にする［非特許文献２４、２５］。Ｔｈｒ５５８でのｍｏｅｓｉｎをリン酸化するキナーゼ類は確実には確定されていないが、一部の候補には、インビトロおよび細胞中で過剰発現させた場合にＥＲＭタンパク質のＣ末端テールをリン酸化するＲｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）が含まれる［非特許文献２６−２８］。
【０１６９】
以前の報告書は、細菌によって発現したｍｏｅｓｉｎのＣ末端テールが全長ｍｏｅｓｉｎタンパク質よりはるかに高度にＲＯＣＫによってリン酸化されることを見いだした［非特許文献２６、２８］。これはおそらく、ｍｏｅｓｉｎが大腸菌で発現した場合に、Ｔｈｒ５５８がリン酸化のために接近可能ではない閉鎖した立体配座にあるからであると思われる。本発明者らは、ＫＥＳＴＲＥＬスクリーンにおいては、リン酸化に先行してｍｏｅｓｉｎを６５℃でインキュベートする工程がＴｈｒ５５８を露出させる立体配座変化を誘導したのではないかと推測した。これを調査するために、本発明者らは、大腸菌中で発現したｍｏｅｓｉｎを加熱することが、並行反応においてＬＲＲＫ２（図５Ａ）ならびにＲＯＣＫ−ＩＩ（図５Ｂ）によるリン酸化にどのように影響を及ぼすかについて試験した。驚くべきことに、本発明者らは、ＬＲＲＫ２もＲＯＣＫ−ＩＩも少なくとも６０℃の温度でプレインキュベートされていなかったｍｏｅｓｉｎをリン酸化することができないことを見いだした（図５Ａ）。これとは対照的に、ＦＥＲＭドメインが欠如するｍｏｅｓｉｎのフラグメントは、リン酸化に先行する熱処理の非存在下においてＬＲＲＫ２（図５Ｃ）またはＲＯＣＫ−ＩＩ（図５Ｄ）によってリン酸化することができた。使用した条件下では、ｍｏｅｓｉｎ［４００−５７７］Ｃ末端フラグメントは、全長ＧＳＴ−ｍｏｅｓｉｎより約２倍高度にリン酸化された（図５Ｂ）。
【０１７０】
ＬＲＲＫ２についてのペプチドベースの基質アッセイの同定。本発明者らは次に、ＬＲＲＫ２がｍｏｅｓｉｎのＴｈｒ５５８（ＲＬＧＲＤＫＹＫＴＬＲＱＩＲＱ）（式中、下線の引かれたＴｈｒ残基はＴｈｒ５５８と等価である）を含む短鎖ペプチド基質をリン酸化できるかどうかについて調査した。本発明者らは、ＧＳＴ−ＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７、Ｇ２０１９Ｓ］がこのペプチドを、キナーゼ不活性ＧＳＴ−ＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７、Ｄ２０１７Ａ］がこのペプチドをリン酸化できなかった条件下で、非突然変異ＧＳＴ−ＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７］より約３倍高い初期速度でリン酸化することを見いだした（図６Ａ）。このペプチドはＬＲＲＫｔｉｄｅと名付けられ、非突然変異ＧＳＴ−ＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７］およびＧＳＴ−ＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７、Ｇ２０１９Ｓ］の両方によって、類似の約２００μＭのＫｍでリン酸化された（図６Ｂ）。ＧＳＴ−ＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７、Ｇ２０１９Ｓ］によるＬＲＲＫｔｉｄｅのリン酸化のＶｍａｘは、非突然変異ＧＳＴ−ＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７］によるＶｍａｘより約２．５倍高かった（図６Ｂ）。ＧＳＴ−ＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７、Ｇ２０１９Ｓ］は１０Ｕ／ｍｇのＶｍａｘを有しており、この製剤中の酵素の純度は約５％であると推定されたが、これはＬＲＲＫ２［Ｇ２０１９Ｓ］酵素の純粋製剤が２００Ｕ／ｍｇの比活性度でＬＲＲＫｔｉｄｅをリン酸化することを示唆しており、これは好ましい基質をリン酸化する相当に活性なキナーゼにとってまずまずの速度である。
【０１７１】
ＬＲＲＫ２のＰＤ突然変異形の並行アッセイ。本試験で詳述したアッセイを利用して、本発明者らは次に、ＰＤに罹患しているヒトにおいて報告されているＬＲＲＫ２の９つの突然変異形の活性を比較した（非特許文献［３］において精査されている）。試験した突然変異は、ＧＴＰａｓｅドメイン（Ｒ１４４１Ｃ、Ｒ１４４１Ｇ）、ＣＯＲ領域（Ｙ１６９９Ｃ）、キナーゼドメイン（Ｒ１９１４Ｈ、Ｉ２０１２Ｔ、Ｇ２０１９Ｓ、Ｉ２０２０Ｔ）およびＷＤ４０リピート（Ｔ２３５６Ｉ、Ｇ２３８５Ｒ）の先にあるＣ末端テールの領域において見いだされた（図７Ａ）。本発明者らは、共通して観察されたＧ２０１９Ｓ突然変異だけがＬＲＲＫ２の自己リン酸化ならびにｍｏｅｓｉｎ、ＬＲＲＫｔｉｄｅおよびＭＢＰのリン酸化を有意に刺激することを見いだした（図７Ｂ）。４つの突然変異体（Ｒ１４４１Ｃ、Ｒ１４４１Ｇ、Ｙ１６９９ＣおよびＴ２３５６Ｉ）は、全アッセイにおいて非突然変異ＬＲＲＫ２として類似の活性を有していた（図７Ｂ）。キナーゼドメイン内の４つの突然変異中２つ（Ｒ１９１４Ｈ、Ｉ２０１２Ｔ）はほぼ不活性であり、これはコントロールとして使用されたキナーゼ不活性ＬＲＲＫ２［Ｄ２０１７Ａ］よりわずかに大きな活性しか示さなかった。第３のキナーゼドメイン突然変異体（Ｉ２０２０Ｔ）は、非突然変異ＬＲＲＫ２より有意に小さな活性を有していたが、Ｒ１９１４ＨおよびＩ２０１２Ｔ突然変異体よりは高い活性を有していた。興味深いことに、２つのＣ末端テールのＬＲＲＫ２突然変異中の１つ（Ｇ２３８５Ｒ）もまた、全アッセイにおいて極めて低い触媒活性を有していた（図７Ｂ）。
【０１７２】
タンパク質キナーゼ活性を保持するＬＲＲＫ２の最小フラグメントを規定する。本発明者らは、特定のドメインが欠如しているＬＲＲＫ２の全長形および突然変異形の活性を比較した。野生型全長ＬＲＲＫ２は、本試験の残りで利用したＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７］フラグメントと同様に、ｍｏｅｓｉｎ、ＬＲＲＫｔｉｄｅおよびＭＢＰ基質に対して類似の活性を有していた。一方のＧＴＰａｓｅドメイン（ＬＲＲＫ２［１５４１−２５２７］）またはＧＴＰａｓｅおよびＣＯＲドメイン（ＬＲＲＫ２［１８５６−２５２７］）の両方が欠如する突然変異体は、自己リン酸化を全く提示せず、いずれの基質もリン酸化しなかった。さらに、一方のＣ末端ＷＤ４０ドメイン（ＬＲＲＫ２［１３２６−２１４９］）または７つのＣ末端アミノ酸（［ＬＲＲＫ２［１３２６−２５２０］）だけが欠如するＬＲＲＫ２突然変異体もまた不活性であった。ＧＴＰａｓｅ、ＣＯＲ、ＷＤ４０およびＬＲＲＫ２のＣ末端領域がその活性のために必要であるという意見に一致して、キナーゼドメイン（ＬＲＲＫ２［１８５６−２１４５］）しか含まないＬＲＲＫ２のフラグメントにはあらゆるキナーゼ活性が欠如していた（図８）。
【０１７３】
図６〜８に示した試験では、同量のＧＳＴ精製タンパク質を各ゲル上に装填し、同量の全タンパク質を各アッセイにおいて使用した。使用した全ＬＲＲＫ２製剤は、同様に純粋であった。
【０１７４】
図７および８におけるキナーゼアッセイは、１μＭ  ＭＢＰおよび３００μＭ  ＬＲＲＫｔｉｄｅを用いて実施した。使用した条件下で、本発明者らは、ＭＢＰへは約３００〜１，０００ｃｐｍが組み込まれ、ＬＲＲＫｔｉｄｅ内へは典型的には１０〜２０倍高い数が組み込まれることを得た。これらのアッセイにおいて使用したＭＢＰおよびＬＲＲＫｔｉｄｅの濃度に３００倍の相違があるため、この実験から直接的にこれらの基質を直接比較するのは困難である。ＬＲＲＫｔｉｄｅペプチド基質の利点は、それがＭＢＰに比較してはるかに高濃度で配置でき、そして汚染している可能性のあるタンパク質キナーゼによってリン酸化される可能性が低いことにある。ＭＢＰもまた、図１１に示したように、ＬＲＲＫ２によって少なくとも１０の相違する部位で、低レベルでリン酸化される。
【０１７５】
ＬＲＲＫ２によってリン酸化されたＭＢＰ中のリン酸化残基のマッピング。本発明者らはさらに、ＬＲＲＫ２によってリン酸化されたＭＢＰ上の残基について試験した。本発明者らは、ＭＢＰがＧＳＴ−ＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７、Ｇ２０１９Ｓ］によって不良にリン酸化され、そしてタンパク質１モル当たりたった０．０１モルのリン酸塩の化学量論比でしかリン酸化されないことを見いだした。これらの条件下でリン酸化された３２Ｐ−ＭＢＰのトリプシン消化は、１０個を超える様々な３２Ｐ標識ペプチドを明らかにしたが（図１１）、これはＬＲＲＫ２がｍｏｅｓｉｎとは対照的に、ＭＢＰ上の多数の部位を、すべて極めて低い化学量論比でリン酸化していることを示唆している。質量分析法および固相シーケンシングを用いて、本発明者らはさらに、これらのリン酸化部位のうちの６つをＳｅｒ７、Ｔｈｒ１８、Ｔｈｒ６４、Ｔｈｒ９４、Ｔｈｒ９７、Ｔｈｒ１４８としてマッピングすることができた（図１１）。
【０１７６】
自己リン酸化のＬＲＲＫ２部位のマッピング。本発明者らはさらに、ＧＳＴ−ＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７］、ＧＳＴ−ＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７、Ｇ２０１９Ｓ］ならびに、これらの酵素とＭｇ−ＡＴＰとのインキュベーション後に観察された触媒的に不活性なＧＳＴ−ＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７、Ｄ２０１７Ａ］上の、自己リン酸化部位の質量分析法によるマッピングも実施した。触媒的に不活性なＬＲＲＫ２上ではホスホ−ペプチドは観察されなかったが、ＬＲＲＫ２の非突然変異形およびＧ２０１９Ｓ形は多数の部位で自己リン酸化した（図１２）。質量分析法分析によって、本発明者らは、５つのリン酸化ペプチドを同定することができたが、これらは全部がＧＴＰａｓｅドメイン内（残基１３３５−１５０４の間）に位置した（図１２）。主要自己リン酸化部位は、非突然変異ＧＳＴ−ＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７］上であり、これはＴｈｒ１５０３であった。この残基は、ＧＳＴ−ＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７、Ｇ２０１９Ｓ］上で２〜３倍高レベルでリン酸化された。Ｔｈｒ１４１０を含むその他は、より活性なＧＳＴ−ＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７、Ｇ２０１９Ｓ］突然変異体上でより高い化学量論比へリン酸化された（図１２）。本発明者らは、Ｔｈｒ１４１０およびＴｈｒ１５０３をＡｌａへ突然変異させたが、これはＬＲＲＫ２触媒活性度に影響を及ぼさないことを見いだした（図１３）。
【０１７７】
考察。
【０１７８】
本試験では、本発明者らは、脳におけるキナーゼ基質スクリーンのために残基１３２６−２５２７を含むＬＲＲＫ２の最も活性な突然変異体Ｇ２０１９Ｓの形態を使用し、ｍｏｅｓｉｎがこの酵素のための最も公知のタンパク質基質であると同定した。リン酸化部位Ｔｈｒ５５８を含むペプチドもまた、インビトロ基質において有用であった。この方法を使用して、本発明者らは、１セットの点突然変異体および欠失を比較することによって、そしてＰＤ患者において見いだされたＬＲＲＫ２の突然変異が酵素活性にどのように影響を及ぼすのかを確定することによって、ＬＲＲＫ２の触媒キナーゼ活性のための要件を分析することができた。本試験は、不良にしか特性付けられていないタンパク質キナーゼのための基質を見いだすための、ＫＥＳＴＲＥＬアプローチの有用性についてのまた別の例である。ｍｏｅｓｉｎがＬＲＲＫ２のための生理学的基質を含むかどうかを評価するためには、今後の研究が必要とされる。これを厳密に行うためには、ＬＲＲＫ２ノックアウト／ノックダウンマウスもしくは細胞においてＴｈｒ５５８でのｍｏｅｓｉｎのリン酸化を評価することが必須である。さらにまた、ｍｏｅｓｉｎをリン酸化する可能性を同様に有するＬＲＲＫ１の発現をノックアウト／ノックダウンすることもまた必要になる可能性がある。ｍｏｅｓｉｎ上のＴｈｒ５５８部位を取り囲む配列はｅｚｒｉｎおよびｒａｄｉｘｉｎにおけるものと同一であるので、ＬＲＲＫ２は、少なくともインビトロでは、これらのタンパク質もリン酸化することができる。
【０１７９】
ＥＲＭタンパク質がＬＲＲＫ２に対する生理学的基質を含むことが見いだされれば、これらが神経変性およびＰＤの発症において果たすと思われる役割を詳細に調査する必要がある。これに関連して、ｍｏｅｓｉｎおよびｒａｄｉｘｉｎは神経突起伸長の調節において重要な役割を果たすと見なされてきたが、これはこれらのタンパク質において欠損するニューロンが、成長円錐サイズの顕著な減少、半径方向横紋の消失、成長円錐の収縮、および成長円錐の中心領域を侵襲するアクチン線維の顕著な組織崩壊を示すためである［非特許文献２９］。近年の試験はさらに、活性化されたＧ２０１９Ｓ  ＬＲＲＫ２突然変異体の過剰発現が、神経突起の長さならびに一次ニューロン細胞培養およびラット黒質線条体経路の両方における枝分かれの進行性減少を誘導するが、他方ＬＲＲＫ２欠損症は神経突起の長さのおよび枝分かれの増加をもたらすことも証明している［非特許文献３０］。まとめると、これらのデータは、突然変異体ＬＲＲＫ２によるｍｏｅｓｉｎのリン酸化の調節不全は、パーキンソン病におけるドーパミン作動性軸索末端の早期消失の原因となる可能性があることを示唆している。ヒトにおいてはｍｅｒｌｉｎと呼ばれるｍｏｅｓｉｎに関連するタンパク質をコードする遺伝子における不活性化突然変異は、主として神経系に影響を及ぼす癌の形態である２型神経線維腫症を誘発する［非特許文献３１］。ｍｅｒｌｉｎのＣ末端テールにおけるＴｈｒ５５８と等価の残基をリン酸化するキナーゼ類の同一性に関してはほとんど分かっておらず、ＬＲＲＫ２がこの残基でｍｅｒｌｉｎをリン酸化できるかどうかを調査することは興味深い。
【０１８０】
本発明者らの試験結果は、最も一般的なＧ２０１９Ｓ  ＬＲＲＫ２  ＰＤ突然変異がキナーゼ活性を増強することを確証しており、これはＬＲＲＫ２活性が自己リン酸化およびＭＢＰのリン酸化によって評価された近年の２件の試験［非特許文献１２、１３］と一致する結論である。ＬＲＲＫｔｉｄｅを用いた本発明者らの動態学的分析もまた、基質結合Ｋｍアフィニティを増強することよりむしろ触媒的Ｖｍａｘ定数を増加させることによって、Ｇ２０１９Ｓの突然変異がＬＲＲＫ２活性を刺激することを示している。ＬＲＲＫ２触媒性ドメインを具体化させ、キナーゼ触媒ドメインのサブドメインＶＩＩ内のＭｇ２＋  Ａｓｐ残基の近くで保存されたＧｌｙ残基の置換がリン酸化の触媒効率をどのように刺激できるのかを決定できれば興味深い。５１８種のヒトキナーゼについての分析は、２つのタンパク質キナーゼ（ＴＳＳＫ１、ＢＵＢＲ１）、ならびに７つの予測された不活性疑似キナーゼ（ＫＳＲ２、ＳＴＬＫ６、ＲＳＫＬ１、ＳｇＫ０７１、Ｄｏｍａｉｎ２＿ＧＣＮ２、ＳｇＫ２６９、ＳｇＫ１９６）がそれらの触媒ドメインのサブドメインＶＩＩでＧｌｙからＳｅｒへの置換モチーフを有することを示している［非特許文献１１、３２］。ＴＳＳＫ１およびＢＵＢＲ１のサブドメインＶＩＩのＳｅｒ残基からＧｌｙへの突然変異がこれらのキナーゼの活性にどのような影響を及ぼすのかを確定できれば興味深い。そのようなアミノ酸置換を、これらの酵素の定常活性を増加させるための進化的機序として使用することは可能である。さらに、他のタンパク質キナーゼにおけるＧｌｙからＳｅｒへの突然変異の作用を調査することも興味深い。
【０１８１】
本発明者らのデータは、ＰＤ突然変異の全てがＬＲＲＫ２の活性を刺激する訳ではないことを示している。本発明者らは、４つのＰＤ突然変異Ｒ１４４１Ｃ、Ｒ１４４１Ｇ（ＧＴＰａｓｅドメイン内に位置する）、Ｙ１６９９Ｃ（ＣＯＲドメイン内に位置する）およびＴ２３５６Ｉ（Ｃ末端テールに位置する）は、ＬＲＲＫ２キナーゼ活性に有意な影響を及ぼさないことを見いだした。さらに、３つの突然変異Ｒ１９４１Ｈ、Ｉ２０１２Ｔ（キナーゼドメインに位置する）およびＧ２３８５Ｒ（Ｃ末端テールに位置する）は、ＬＲＲＫ２キナーゼ活性を顕著に阻害した。また別のＰＤ突然変異Ｉ２０２０Ｔ（Ｇｌｙ２０１９に隣接する残基内）は、ＬＲＲＫ２自己リン酸化ならびにＭＢＰおよびｍｏｅｓｉｎのリン酸化をＲ１９４１Ｈ、Ｉ２０１２ＴおよびＧ２３８５Ｒ突然変異より低い程度に減少させた。近年の報告書は、Ｙ１６９９Ｃ突然変異が野生型タンパク質に比較して約５０％増加した自己リン酸化を有することを示した［非特許文献３３］。本発明者らのデータは、この突然変異体がＧ２０１９Ｓ突然変異体より有意に活性が低い野生型タンパク質に比較して、ほんのわずかに大きい活性を有することを示す可能性がある（図７）。また別の報告書は、Ｉ２０２０Ｔ  ＬＲＲＫ２突然変異体が野生型ＬＲＲＫ２に比較して約４０％高いレベルへ自己リン酸化する能力があると判定したが［非特許文献３４］、これはこの突然変異体が低い活性しか有していないという本発明者らの所見とは対照的である。これについての理由は明白ではないが、特にこれらのアッセイが線形であることを確証するのは困難であり、タンパク質キナーゼの自己リン酸化はこの酵素の内因性活性と必ずしも比例しないので、自己リン酸化の測定は不確実である可能性がある。
【０１８２】
本発明者らがＬＲＲＫ２のＰＤ突然変異形を評価する際に得たこれらの結果は、全部の突然変異がタンパク質キナーゼ活性を増加させるＧ２０１９Ｓ突然変異と同一方法でそれらの作用を及ぼす訳ではないことを示している。突然変異の一部がそれらの作用をＬＲＲＫ２と調節結合パートナーとの細胞間相互作用を妨害することによって発揮する、および／またはＬＲＲＫ２細胞安定性もしくは所在位置を変化させることが考えられる。一部の突然変異がキナーゼ活性を減少させるという所見は、ＬＲＲＫ２の阻害がドーパミン性ニューロンの変性およびＰＤの発症をもたらす可能性も有する場合があることを指示している。これが事実であれば、これは、ＬＲＲＫ２阻害剤の治療有効性はＧ２０１９Ｓ  ＬＲＲＫ２突然変異の活性化を伴う患者の治療に限定できること、およびＬＲＲＫ２［Ｇ２０１９Ｓ］酵素を定常レベル未満に減少させることを誘発する疾患の活性を減少させない薬物の投与を利用することが必要とされることを示唆する。近年生成されたＬＲＲＫ２ノックアウトマウス［非特許文献３５］が老化するにつれて神経変性の徴候を発生するかどうかを試験することが重要である。
【０１８３】
本発明者らの研究は、この領域の７つのＣ末端残基の切断だけがＬＲＲＫ２活性を取り除くので、活性のためにはＬＲＲＫ２の無傷Ｃ末端テールが必要とされることも証明している。本発明者らはさらに、ＷＤ４０モチーフのＣ末端に位置するＧ２３８５Ｒ  ＰＤ突然変異がＬＲＲＫ２キナーゼ活性を不活性化することも見いだした。近年の研究は、特に中国人、台湾人の民族集団において優性であるこの突然変異が、ＰＤの原因となる突然変異よりむしろＰＤを発症させるリスクを増加させる多型を表す可能性があることを示唆している［非特許文献３６］。ＬＲＲＫ２のＣ末端領域は、ＷＤ４０モチーフとは相違して、任意の他の公知のタンパク質もしくは他の機能的ドメインとの相同性を有していない。まとめると、これらの観察所見は、ＬＲＲＫ２の全Ｃ末端領域がキナーゼ活性の調節に重要な役割を果たすことを示している。このドメインがＬＲＲＫ２を調節できる機序、およびこのドメインがキナーゼ活性を調節するために他の要素および／またはＬＲＲＫ２の他の領域と相互作用できるかどうかを調査するための詳細な分析が必要とされる。
【０１８４】
要約すると、本試験の結果は、タンパク質キナーゼ活性を保持するＬＲＲＫ２の最小フラグメントを規定し、さらにインビトロでは、ＬＲＲＫ２がＴｈｒ５５８でｍｏｅｓｉｎを効率的にリン酸化することも証明している。ｍｏｅｓｉｎがＬＲＲＫ２の生理学的基質を含むかどうかを確定するためにはさらなる研究が必要とされるが、本発明者らの所見は、ＬＲＲＫ２タンパク質キナーゼ活性を評価するためのより定量的および堅固な方法を提供することによって、ＬＲＲＫ２の機能的分析に役立つ。それらは、様々なＰＤ突然変異がＬＲＲＫ２活性にどのように影響を及ぼすかのより明確な特性付けもまた可能にし、ＰＤを治療するためのＬＲＲＫ２阻害剤についてのスクリーニングにおいて新薬発見プログラムを支援する。
【実施例２】
【０１８５】
ｅｚｒｉｎおよびｒａｄｉｘｉｎはｍｏｅｓｉｎのＴｈｒ５５８と等価の残基でＬＲＲＫ２によってリン酸化される。
【０１８６】
ｍｏｅｓｉｎにおけるリン酸化のＴｈｒ５５８部位を取り囲むアミノ酸配列は、ｅｚｒｉｎおよびｒａｄｉｘｉｎにおいて同一であり、これはこれらのタンパク質もまたＬＲＲＫ２によってリン酸化されることを示唆している。これを調査するために、本発明者らは、ＬＲＲＫ２が大腸菌中で発現させられていた全長ｅｚｒｉｎおよびｒａｄｉｘｉｎをリン酸化するかどうかについて試験した。全長ｍｏｅｓｉｎと同様に、ｅｚｒｉｎおよびｒａｄｉｘｉｎは、それらが７０℃で加熱された後にはＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７、Ｇ２０１９Ｓ］によってのみリン酸化された（図５Ｄおよび図１５）。ｅｚｒｉｎ（Ｔｈｒ５６７）およびｒａｄｉｘｉｎ（Ｔｈｒ５６４）におけるＴｈｒ５５８と等価の残基のＡｌａへの突然変異は、ＬＲＲＫ２によるこれらのタンパク質のリン酸化を強度に減少させ、これらが主要リン酸化部位であることを示した。使用した条件下では、ＧＳＴ−ｅｚｒｉｎはＬＲＲＫ２［１３２６−２５２７、Ｇ２０１９Ｓ］によってＧＳＴ−ｍｏｅｓｉｎおよびＧＳＴ−ｒａｄｉｘｉｎに比較して約２倍高度にリン酸化され、これは、これがＬＲＲＫ２酵素活性を評価するための最高のインビトロ基質を表すことを示唆している。
【実施例３】
【０１８７】
化合物をスクリーニングするために適切なアッセイフォーマット。
【０１８８】
当技術分野において公知のタンパク質キナーゼスクリーニングアッセイフォーマットは、ＬＲＲＫ２ポリペプチドの基質としてＥＳＭファミリーポリペプチドの同定を参照して適応させると使用できる。
【０１８９】
例えば、実施例１において使用した技術は、化合物をスクリーニングすることに使用できる。国際公開第０３／０８７４００号パンフレットに記載されたアッセイに類似するアッセイを使用できる。高スループット作動が可能なスクリーニングアッセイを使用できる。例えば、ＥＲＭファミリーポリペプチドリン酸化部位の１つに基づく基質ペプチドを使用する、例えばペプチドのリン酸化形には結合するが未リン酸化形には結合しない（またはその逆もある）抗体を使用するアッセイが適合する可能性がある。
【０１９０】
例えば、細胞容積応答に化合物が及ぼす作用を評価する場合は、セルベースアッセイを使用できる。
【０１９１】
タンパク質−タンパク質結合アッセイは、当業者には周知であるように、例えば表面プラズモン共鳴法に基づく技術またはチップベース結合アッセイを用いて使用できる。
【０１９２】
ＳＰＡベース（シンチレーション近接アッセイ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）アッセイは、当業者には周知であるように使用できる。例えば、シンチラントおよび基質ポリペプチド、例えば上記で考察したようなｍｏｅｓｉｎペプチド基質を含むビーズを調製できる。ビーズは、３２Ｐ−もしくは３３Ｐ−γ標識化ＡＴＰ、ＬＲＲＫ２ポリペプチドを含むサンプルおよび試験化合物と混合されてよい。便宜的には、これは９６ウエルフォーマット中で実施される。プレートは次に、３２Ｐもしくは３３Ｐ  ＳＰＡアッセイのための公知のパラメータを用いて、適切なシンチレーションカウンタを使用して計数される。シンチラントに近接する、すなわちビーズに結合している基質に結合している３２Ｐもしくは３３Ｐだけが検出される。そのようなアッセイの、例えば基質ポリペプチドが抗体もしくは抗体フラグメントへの結合によってシンチラントビーズ上に固定化されるような変法も、また使用できる。
【０１９３】
ＥＬＩＳＡフォーマットにある、小さな薬物様化合物ライブラリーをスクリーニングするために適切な非放射能アッセイを使用できる。
【０１９４】
抗ホスホ−ｍｏｅｓｉｎ５５８および抗ホスホ−ｍｏｅｓｉｎ５２６。抗ホスホペプチド抗体は、例えばウェスタンブロッティング法において使用するために、ヒツジにおいて立てることができる。それらは、ＥＬＩＳＡフォーマットで使用するために評価される。ｍｏｅｓｉｎまたはｍｏｅｓｉｎフラグメントのマイクロタイタープレートへの、例えばＧＳＴ−タグを介しての吸収もしくは捕捉による固定化は、ＬＲＲＫ２ポリペプチドがそれをリン酸化する能力には影響を及ぼさないと予想される。
【０１９５】
このアッセイは、ｍａｘｉｓｏｒｐ（Ｎｕｎｃ社）３８４透明プレート内で実施できる。ｍｏｅｓｉｎフラグメント（３０ｎｇ／ウエル）を４℃のＴｒｉｓ緩衝食塩水（ＴＢＳ）（ｐＨ７．４）中で一晩かけて被覆する。過剰な結合部位は室温で１時間かけて０．２％のＴｗｅｅｎ（ＴＢＳＴ）を含有するＴＢＳ中の５％のＢＳＡ液を用いてブロックし、次にＴＢＳＴを用いて３回洗浄する。反応バッファ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．０１％のＢＳＡ、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ）中の１５μＬのＬＲＲＫ２（１〜１，０００ｎｇ）をウエルに加え、１１％のＤＭＳＯ中に溶解させた２μＬの化合物を加え、３０分間にわたりインキュベートする。反応は、５μＬのＡＴＰ（１〜１，０００μＭ）／１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２の添加によって開始させ、室温で２５分間かけてインキュベートする。この反応は、２０μＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡの添加によって停止させる。プレートをＴＢＳＴで３回洗浄し、その後に２２μＬの抗ホスホｍｏｅｓｉｎ５５８抗体（２０μｇ／ｍＬのブロッキングペプチドを含有するＴＢＳＴ中で１：３７００倍に希釈する）を添加する。１時間後、プレートはＴＢＳＴで３回洗浄し、次に各ウエルに２２μＬの抗ヒツジ−ペルオキシダーゼ抱合体（１％のＢＳＡ／ＴＢＳＴ中で１：５０００に希釈）を加え、さらに１時間インキュベートする。最後にＴＢＳＴを用いて４回洗浄し、その後に２２μＬのペルオキシダーゼ基質、５０ｍＭ酢酸中の３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．０００９％のＨ２Ｏ２を加える。１５分間かけて発色させ、５μＬの１Ｍ  ＨＣｌの添加によって停止させる。プレートは、４５０ｎｍでの吸光度リーダーで読み取る。
【０１９６】
または、相違する色の検出を可能にする、市販されているペルオキシダーゼ基質を使用することができよう。例えば、４９２ｎｍで読み取られるオルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）または４０５ｎｍで読み取られるジアンモニウム２，２’−アジノ−ビス（３−エチル−ベンゾチアゾリン−６−スルホネート）。例えば１０−アセチル−３．７、ジヒドロキシフェノキサジンなどの蛍光基質またはルミネセンスのための光をベースとする基質を用いる、また別の検出技術もまた適用できる。
【０１９７】
本アッセイは、広範囲のＡＴＰ濃度（１〜１，０００μＭ）および１％のＤＭＳＯ（化合物貯蔵溶媒）に対して耐性であると考えられる。自己蛍光、消光もしくは吸光による化合物干渉は、数回の洗浄工程を含めて不均一であるので最小限に抑えられると考えられる。
【図２】
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【図３】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図８】
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【国際調査報告】
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