(57)【要約】  本発明は、インビボ光学イメージングに好適な造影剤であって、例えば血漿タンパク質との非特異的結合が低減したペンタメチンシアニン色素のコンジュゲートを含む造影剤に関する。これは、スルホン酸置換基、特にスルホアルキル基の種類と位置の制御によって達成される。医薬組成物及びキット、並びにインビボイメージング法についても開示する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類の体のインビボ光学イメージングに好適な造影剤であって、次の式Ｉのコンジュゲートを含む造影剤。
［ＢＴＭ］−（Ｌ）ｎ−ＣｙＤ              （Ｉ）
式中、
ＢＴＭは生物学的ターゲティング部分であり、
ＣｙＤは式ＩＩのシアニン色素であり、
【化１】
2010527922.tif 000031
（式中、
Ｙ１及びＹ２は独立に−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ６−又は−ＣＲ７Ｒ８−であって、Ｙ１及びＹ２の少なくとも一方が−ＣＲ７Ｒ８−であるように選択され、
Ｒ１及びＲ２は独立にＨ、−ＳＯ３Ｍ１又はＲａであり（式中、Ｍ１はＨ又はＢｃであり、Ｂｃは生体適合性陽イオンである。）、
Ｒ３はＨ、Ｃ１〜５アルキル、Ｃ１〜６カルボキシアルキル又はＲａ基であり、
Ｒ４〜Ｒ６は独立にＣ１〜５アルキル、Ｃ１〜６カルボキシアルキル又はＲａであり、
Ｒ７はＨ又はＣ１〜３アルキルであり、
Ｒ８はＲａ又はＣ１〜６カルボキシアルキルであり、
ＲａはＣ１〜４スルホアルキルである。）、
Ｌは式−（Ａ）ｍ−の合成リンカー基であり（式中、各Ａは独立に−ＣＲ２−、−ＣＲ＝ＣＲ−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＣＲ２ＣＯ２−、−ＣＯ２ＣＲ２−、−ＮＲＣＯ−、−ＣＯＮＲ−、−ＮＲ（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ−、−ＮＲ（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ−、−ＳＯ２ＮＲ−、−ＮＲＳＯ２−、−ＣＲ２ＯＣＲ２−、−ＣＲ２ＳＣＲ２−、−ＣＲ２ＮＲＣＲ２−、Ｃ４〜８シクロヘテロアルキレン基、Ｃ４〜８シクロアルキレン基、Ｃ５〜１２アリーレン基若しくはＣ３〜１２ヘテロアリーレン基、アミノ酸、糖又は単分散ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成ブロックであって、各ＲはＨ、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ２〜４アルケニル、Ｃ２〜４アルキニル、Ｃ１〜４アルコキシアルキル又はＣ１〜４ヒドロキシアルキルから独立に選択され、ｍは１〜２０の整数である。）、
ｎは０又は１の整数であるが、ただし、
（ｉ）シアニン色素は１以上のＲａ基と、Ｒ１、Ｒ２及びＲａ基から合計３〜６個のスルホン酸置換基とを含むこと、
（ｉｉ）当該造影剤が蛍光消光剤を含まない
ことを条件とする。
【請求項２】
Ｒ３がＨである、請求項１記載の造影剤。
【請求項３】
Ｙ１及びＹ２が各々独立に−ＣＲ７Ｒ８−である、請求項１又は請求項２記載の造影剤。
【請求項４】
Ｒ７がＣＨ３である、請求項３記載の造影剤。
【請求項５】
ＣｙＤが、Ｒ１、Ｒ２及びＲａ基から選択される合計４個のスルホン酸置換基を有する、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の造影剤。
【請求項６】
Ｒａ基が独立に式−（ＣＨ２）ｋＳＯ３Ｍ１のものである（式中、Ｍ１は請求項１で定義した通りであり、ｋは１〜４の整数である。）、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の造影剤。
【請求項７】
ｋが３又は４である、請求項６記載の造影剤。
【請求項８】
Ｒ１＝Ｒ２＝ＳＯ３Ｍ１である、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の造影剤。
【請求項９】
ＳＯ３Ｍ１置換基がインドール／インドレニン環の５位にある、請求項８記載の造影剤。
【請求項１０】
ＣｙＤが式ＩＩＩのものである、請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の造影剤。
【化２】
2010527922.tif 000032
式中、
Ｒｂは独立にＲａ基又はＣ１〜６カルボキシアルキルであり、
Ｒ９〜Ｒ１２は独立にＣ１〜５アルキル又はＲｂ基であって、Ｒ９＝Ｒ１０＝Ｒｃ又はＲ１１＝Ｒ１２＝Ｒｃのいずれかとなるように選択され（式中、ＲｃはＣ１〜２アルキルである。）、
Ｒａ及びＭ１は請求項１で定義した通りである。
【請求項１１】
ＢＴＭが以下の（ｉ）〜（ｖ）から選択される、請求項１乃至請求項１０のいずれか１項記載の造影剤。
（ｉ）３〜１００アミノ酸長のペプチド、
（ｉｉ）酵素基質、酵素拮抗剤又は酵素阻害剤、
（ｉｉｉ）受容体結合性化合物、
（ｉｖ）オリゴヌクレオチド、
（ｖ）オリゴＤＮＡ又はオリゴＲＮＡ断片。
【請求項１２】
ＢＴＭが３〜１００アミノ酸長のペプチドである、請求項１１記載の造影剤。
【請求項１３】
式ＩＶａ又は式ＩＶｂのものである、請求項１２記載の造影剤。
［ＣｙＤ］−（Ｌ）ｎ−［ＢＴＭ］−Ｚ２      （ＩＶａ）
Ｚ１−［ＢＴＭ］−（Ｌ）ｎ−［ＣｙＤ］      （ＩＶｂ）
式中、
Ｚ１はＢＴＭペプチドのＮ末端に結合していて、Ｈ又はＭＩＧであり、
Ｚ２はＢＴＭペプチドのＣ末端に結合していて、ＯＨ、ＯＢｃ又はＭＩＧであり、
Ｂｃは請求項１で定義した通りであり、
ＭＩＧは、ＢＴＭペプチドの酵素代謝を阻害又は抑制する生体適合性の基である代謝阻害基である。
【請求項１４】
Ｚ１＝Ｚ２＝ＭＩＧである、請求項１３記載の造影剤。
【請求項１５】
請求項１乃至請求項１４のいずれか１項記載の造影剤を生体適合性担体と共に哺乳類への投与に適した形態で含む医薬組成物。
【請求項１６】
一人の患者に適した用量を有していて、適当なシリンジ又は容器で供給される、請求項１５記載の医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１５又は請求項１６記載の医薬組成物の調製用キットであって、生体適合性担体の無菌供給で再構成すれば溶解が起きて所望の医薬組成物が得られるように請求項１乃至請求項１４のいずれか１項記載の造影剤を無菌固体形態で含むキット。
【請求項１８】
前記無菌固体形態が凍結乾燥固体である、請求項１７記載のキット。
【請求項１９】
次の式Ｉａのコンジュゲート。
［ＢＴＭ］−（Ｌ）ｎ−ＣｙＤ              （Ｉ）
［ＢＴＭ］−（Ｌ）ｎ−ＣｙＤ              （Ｉａ）
式中、ＢＴＭ、Ｌ及びｎは請求項１で定義した通りであり、ＣｙＤは次の式ＩＩＩａのものである。
【化３】
2010527922.tif 000033
式中、
Ｒ９〜Ｒ１２は独立にＲｂ又はＲｃ基であって、Ｒ９＝Ｒ１０の１つがＲａ基で、その他が各々Ｒｃ基であるように選択され（式中、ＲｃはＣ１〜２アルキルである。）、
Ｒａ、Ｒｂ及びＭ１は請求項１０で定義した通りである。
【請求項２０】
請求項１９記載のコンジュゲートの調製に有用な、請求項１９に記載された式ＩＩＩａのシアニン色素。
【請求項２１】
Ｑａ基（式中、ＱａはＢＴＭとの結合に適した反応性官能基である。）をさらに含む、請求項２０記載のシアニン色素。
【請求項２２】
Ｒｂが独立に−（ＣＨ２）ｋＳＯ３Ｍ１である（式中、ｋは１〜４の整数である。）、請求項２０又は請求項２１記載のシアニン色素。
【請求項２３】
哺乳類の体のインビボ光学イメージング方法であって、請求項１乃至請求項１４のいずれか１項記載の造影剤或いは請求項１５又は請求項１６記載の医薬組成物のいずれかを用いてインビボでのＢＴＭの局在部位の画像を得ることを含む方法。
【請求項２４】
請求項１乃至請求項１４のいずれか１項記載の造影剤或いは請求項１５又は請求項１６記載の医薬組成物が哺乳類の身体に予め投与されている、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
（ｉ）哺乳類の体内の関心組織表面に励起光を照射する段階、
（ｉｉ）ＣｙＤの励起によって生じる造影剤からの蛍光を蛍光検出器を用いて検出する段階、
（ｉｉｉ）蛍光検出器で検出された光を適宜濾光して蛍光成分を分離する段階、及び
（ｉｖ）段階（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の蛍光から前記関心組織表面の画像を生成させる段階
を含む、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
段階（ｉ）の励起光が本質的に連続波（ＣＷ）である、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
（ａ）不均質組成を有する前記哺乳類の体の光散乱生体組織を、所定の経時的変動強度の光源からの光に露光して造影剤を励起する段階であって、組織が励起光を多重散乱させる段階、
（ｂ）前記露光に応答した組織からの多重散乱発光を検出する段階、
（ｃ）組織内の様々な位置での蛍光特性のレベルに各々対応する複数の値をプロセッサーで確定することによって、発光から組織全体の蛍光特性を定量化する段階であって、蛍光特性のレベルが組織の不均質組成に応じて変化する段階、及び
（ｄ）段階（ｃ）の値に従って組織の不均質組成のマッピングを行うことによって組織の画像を生成する段階
を含む、請求項２４記載の方法。
【請求項２８】
当該光学イメージング方法が蛍光内視鏡検査法を含む、請求項２３乃至請求項２７のいずれか１項記載の方法。
【請求項２９】
インビボ光学イメージングが、哺乳類の体の病勢進行の検出、ステージング、診断、モニタリング又は病気の治療のモニタリングを支援するために使用される、請求項２３乃至請求項２８のいずれか１項記載の方法。
【請求項３０】
哺乳類の体の病勢進行の検出、ステージング、診断、モニタリング又は病気の治療のモニタリングを行う方法であって、請求項２３乃至請求項２９のいずれか１項記載のインビボ光学イメージング法を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インビボ光学イメージングに好適な造影剤であって、例えば血漿タンパク質との非特異的結合が低減したペンタメチンシアニン色素のコンジュゲートを含む造影剤に関する。これは、スルホン酸置換基、特にスルホアルキル基の種類と位置の制御によって達成される。医薬組成物及びキット、並びにインビボイメージング法についても開示する。
【背景技術】
【０００２】
米国特許第６０８３４８５号及び対応特許には、オクタノール−水分配係数が２．０以下のシアニン色素を用いたインビボ近赤外（ＮＩＲ）光学イメージング法が開示されている。特定の細胞集団に結合するか、受容体に選択的に結合するか或いは組織又は腫瘍内に蓄積する分子量３０ｋＤａ以下の「生物学的検出単位」と上記色素とのコンジュゲートも開示されている。米国特許第６０８３４８５号の色素は、ポリリジン、デキストラン又はポリエチレングリコールのような高分子に結合させることもできる。具体的な色素−コンジュゲートは開示されていない。
【０００３】
国際公開第００／１６８１０号には、分子内に３個以上のスルホン酸基を有する式ＡのＮＩＲ蛍光造影剤が開示されている。
【０００４】
【化１】
2010527922.tif 000002
【０００５】
式中、
Ｒ１及びＲ２は同一又は異なるもので、各々置換又は非置換アルキルであり、
Ｚ１及びＺ２は各々置換又は非置換縮合ベンゾ環又は縮合ナフト環の形成に必要な非金属原子であり、
ｒは０、１又は２であり、
Ｌ１〜Ｌ７は同一又は異なるもので、各々置換又は非置換メチンであるが、ｒが２のときに２度現れるＬ６及びＬ７は同一でも異なるものでもよく、
Ｘ及びＹは同一又は異なるもので、各々式−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ＝ＣＨ−又は−Ｃ（Ｒ３Ｒ４）−の基である（式中、Ｒ３及びＲ４は同一又は異なるもので、各々置換又は非置換アルキルである。）。
【０００６】
国際公開第００／１６８１０号には、式Ａのｒが好ましくは１、つまり色素がヘプタメチンシアニン色素であること、及び分子内に３個以上のスルホン酸基を有する好ましい色素が式Ｂのベンズインドール色素であることが教示されている。
【０００７】
【化２】
2010527922.tif 000003
【０００８】
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｌ１〜Ｌ７、Ｘ及びＹは式Ａで定義した通りであり、Ｒ５〜Ｒ１６は同一又は異なるもので、幾つかの特定の化合物を除いて、各々Ｈ、スルホン酸基、カルボキシル基、ＯＨ、アルキル（スルホアルキル）アミノ基、ビス（スルホアルキル）アミノ基、スルホアルコキシ基、（スルホアルキル）スルホニル基又は（スルホアルキル）アミノスルホニル基である。
【０００９】
国際公開第００／１６８１０号のＬ１〜Ｌ７のポリメチン鎖は、好ましくは式Ｃのものである。
【００１０】
【化３】
2010527922.tif 000004
【００１１】
式中、Ｚ３は五又は六員環の形成に必要な非金属原子であり、ＡはＨ又は一価の基である。
【００１２】
国際公開第００／１６８１０号には、優れた水溶性のためスルホン酸基の数は好ましくは４以上であるが、合成の容易さの点では総数が１０以下、好ましくは８以下とすべきことが教示されている。国際公開第００／１６８１０号には、スルホン酸基の好ましい位置が以下の通り教示されている。
式Ａ：Ｒ１、Ｒ２、Ｚ１及び／又はＺ２の位置、
式Ｂ：Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ１１及び／又はＲ１３の位置、
式Ｃ：アルキレンのような二価基を介した位置Ａ。
【００１３】
国際公開第０１／４３７８１号には、上記の式Ａのｒ＝１に相当する７個のメチン炭素を有するシアニン色素（ヘプタメチン又はＣｙ７色素）が開示されている。国際公開第０１／４３７８１号の色素は４〜６個のスルホン酸置換基を有している。
【００１４】
Ｌｉｃｈａ  ｅｔ  ａｌ［Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．，７２（３），３９２−３９８（２０００）］には、１個以上の親水性グルカミド又はグルコサミド置換基を有するシアニン色素はその親色素に比べて血漿タンパク結合（ＰＰＢ）が低減すると報告されている。かかる置換を１つから２つにすると、ＰＰＢがさらに一段と低下すると記載されている。親水性置換基は色素の光物理的性質を改善し、腫瘍と正常組織との間のコントラストが増幅されるように薬物動態を変化させるとも記載されている。
【００１５】
米国特許第６９７７３０５号（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）には、次式の化合物が記載されている。
【００１６】
【化４】
2010527922.tif 000005
【００１７】
式中、
Ｒ２及びＲ１２は独立にアルキル又はスルホアルキルであり、
Ｒ３はカルボキシアルキルであり、
Ｒ４Ｒ１３及びＲ１４は独立にアルキルであり、
Ｒ６〜Ｒ９及びＲ１６〜Ｒ１９は独立にＨ又はスルホであり、
ｎは１、２又は３である。
【００１８】
上記色素の活性化エステルも開示されている。これと関連する米国特許第６９７４８７３号には、上記色素を用いて生物学的試料を染色する方法、並びに上記色素のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを用いて、タンパク質、ペプチド又は核酸高分子との色素−コンジュゲートを形成する方法が開示されている。
【００１９】
国際公開第２００５／０４４９２３号には、生物材料の標識及び検出に適した色素が開示されている。色素は、式Ｄのトリメチン、ペンタメチン及びヘプタメチンシアニン色素（つまりｎ＝１、２又は３）である。
【００２０】
【化５】
2010527922.tif 000006
【００２１】
式中、
Ｒ１及びＲ２はＣ１〜６アルキル、非置換又はスルホン酸若しくは−（ＣＨ２）ｋ−Ｗで置換されたベンジルであり（式中、Ｗはスルホン酸又はホスホン酸であり、ｋは１〜１０の整数である。）、
Ｒ３〜Ｒ６はＨ、ＳＯ３Ｈ又は−Ｅ−Ｆであり（式中、Ｅは単結合又はＣ、Ｎ及びＯから選択される１〜２０個の連結原子の鎖を有するスペーサー基であり、Ｆは標的結合基である。）、
Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３及びＲ１４はＣ１〜６アルキル又は−（ＣＨ２）ｋ−Ｗであり、
Ｚ１及びＺ２は独立に単環式又は二環式芳香系の完成に必要な炭素原子であるが、
（ｉ）Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３及びＲ１４の１つ以上が独立に−（ＣＨ２）ｋ−Ｗであること、
（ｉｉ）Ｒ１〜Ｒ７の１つ以上が−Ｅ−Ｆであること
を条件とする。
【００２２】
国際公開第２００５／０４４９２３号の標的結合基（Ｆ）は、標的成分（例えばタンパク質、ペプチド、核酸又は炭水化物）の官能基と反応するように設計される。国際公開第２００５／０４４９２３号には、インドリニウム環の３位（つまりＲ１１又はＲ１２）に結合した１又は好ましくは複数の水溶性基が存在していると、色素−色素相互作用、特に色素が核酸、タンパク質、抗体などの成分に結合しているときの色素−色素相互作用を低減させ、色素同士の重なりに起因する蛍光強度の損失の低減に役立つことが教示されている。国際公開第２００５／０４４９２３号には、Ｗが好ましくはスルホン酸であること、及び２個以上の−（ＣＨ２）ｋ−Ｗ基が存在すべきであり、好ましくはＲ１１／Ｒ１２基の一方とＲ１３／Ｒ１４基の一方が−（ＣＨ２）ｋ−Ｗであって、他方が好ましくは−ＣＨ３であるように選択することが教示されている。国際公開第２００５／０４４９２３号には、Ｗが好ましくはスルホン酸であり、ｋが好ましくは３又は４であることが教示されている。追加の実施形態として、国際公開第２００５／０４４９２３号には、色素が好ましくは３〜５個のスルホン酸基で置換されること、かかる色素を生物学的標的分子の標識に使用すると色素−色素凝集による蛍光の損失が低減することが教示されている。国際公開第２００５／０４４９２３号には、生物学的分子を式Ｄの色素で標識する方法が開示されている。国際公開第２００５／０４４９２３号は、インビトロ色素用途に関するものであり、インビボ用途については何ら記載されていない。
【００２３】
国際公開第２００５／１２３７６８号には、血管新生のインビボ光学イメージングのための、シアニン色素（カルバシアニン、オキサシアニン、チアシアニン又はアザシアニンである。）とＲＧＤ型ペプチドとのコンジュゲートが開示されている。国際公開第２００５／１２３７６８号のシアニン色素は、好ましくはペンタメチン又はヘプタメチン色素であり、好ましくは０、１又は２個のスルホン酸置換基を有する。従来技術のシアニン色素よりもスルホン酸基の数を減少させると、血漿タンパク結合（ＰＰＢ）が低減し、ひいてはインビボでの非特異的取込みが減少すると記載されている。国際公開第２００５／１２３７６８号の例５には、１、２及び４個のスルホン酸基を有するペンタメチンシアニン色素のコンジュゲートのＰＰＢに関するデータが記載されている。ＰＰＢは、スルホン酸基の数に伴って増大するとの知見が得られている（ＰＰＢはそれぞれ１７％、２１％及び４５％）。
【００２４】
Ｂｕｌｌｏｋ  ｅｔ  ａｌ［Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４６（１３），４０５５−４０６５（２００７）］には、エフェクターカスパーゼ認識配列（ＤＥＶＤテトラペプチド）を（ｉ）膜トランスポーターペプチド（Ｔａｔペプチド）、（ｉｉ）近赤外消光剤（ＱＳＹ２１）及び（ｉｉｉ）シアニン色素フルオロフォアＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（商標）６４７と結合させたアポトーシスプローブＴｃａｐＱ５４７が開示されている。インタクトなプローブは、ＱＳＹ２１の消光のためほとんど蛍光を呈さない。カスパーゼによってカスパーゼ活性部位で開裂されると、コンジュゲートのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（商標）６４７は消光剤とは異なる分子に存在するようになるので、開裂ペプチドは蛍光を示す。この報文には、分離されたインタクト細胞及びインビボ動物モデルの両方での研究が記載されている。
【００２５】
Ｓｔｒｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ［Ｅｕｒ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｎｅｔｗ．，１７，４９−５９（２００６）］には、ケモカインタンパク質をその配列の特定の位置でＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（商標）６４７で修飾したものが開示されている。インビトロでの細胞染色の特異性が検討されており、これらの化合物がインタクト細胞でのケモカイン受容体アッセイに有用である可能性があると示唆されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２６】
【特許文献１】米国特許第６０８３４８５号明細書
【特許文献２】国際公開第００／１６８１０号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０１／４３７８１号パンフレット
【特許文献４】米国特許第６９７７３０５号明細書
【特許文献５】米国特許第６９７４８７３号明細書
【特許文献６】国際公開第２００５／０４４９２３号パンフレット
【特許文献７】国際公開第２００５／１２３７６８号パンフレット
【非特許文献】
【００２７】
【非特許文献１】Licha et al, Photochem. Photobiol., 72(3), 392-398 (2000)
【非特許文献２】Bullok et al, Biochem., 46(13), 4055-4065 (2007)
【非特許文献３】Strong et al, Eur. Cytokine Netw., 17, 49-59 (2006)
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２８】
本発明は、インビボ光学イメージングに好適な造影剤であって、特定のスルホン化パターンを有し、生物学的ターゲティング部分（ＢＴＭ）と結合した特定のクラスのペンタメチンシアニン色素を含む造影剤を提供する。本発明者らは、ペンタメチン色素では、スルホアルキル基が血漿タンパク結合（ＰＰＢ）の減少に重要な役割を有することを見出した。これは、非特異的結合の抑制に役立つので、インビボ及びインビトロ用途のいずれにおいても重要である。これは、本質的に二次元的（つまり「平坦」）なアリールスルホン化色素（例えばＣｙ５及びＣｙ５．５）とは対照的に、このような修飾色素の三次元的性状つまり「嵩高い」性状に起因すると考えられる。
【００２９】
本発明者らは、同じ系列のペンタメチンシアニン色素においてさえ、生物学的ターゲティング分子（例えばＲＧＤペプチド）と結合させると、生物学的特性、特に非特異的結合の点で大きなバラツキがみられるという知見を得た。これは、インビボでの不要なバックグラウンド取込みの一因となり、画像コントラストが低下するとともに、バックグラウンドクリアランスが遅くなって撮像前の遅延が必要となる。さらに、従来技術では認識されていないが、コラーゲン（哺乳類の体内に広く分布している。）との非特異的結合が大きく変動する。本発明は、インビボイメージングに好ましい特性を有するペンタメチンシアニン色素の特定の部分集合を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】化合物１、２、４及び６で得られた平均腫瘍部強度を平均筋肉部強度で除した比として定義される標的／バックグラウンド比（ＴＢＲ）を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
第１の態様では、本発明は、哺乳類の体のインビボ光学イメージングに好適な造影剤であって、式Ｉのコンジュゲートを含む造影剤を提供する。
【００３２】
［ＢＴＭ］−（Ｌ）ｎ−ＣｙＤ              （Ｉ）
式中、
ＢＴＭは生物学的ターゲティング分子であり、
ＣｙＤは式ＩＩのシアニン色素であり、
【００３３】
【化６】
2010527922.tif 000007
【００３４】
（式中、
Ｙ１及びＹ２は独立に−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ６−又は−ＣＲ７Ｒ８−であって、Ｙ１及びＹ２の少なくとも一方が−ＣＲ７Ｒ８−であるように選択され、
Ｒ１及びＲ２は独立にＨ、−ＳＯ３Ｍ１又はＲａであり（式中、Ｍ１はＨ又はＢｃであり、Ｂｃは生体適合性陽イオンである。）、
Ｒ３はＨ、Ｃ１〜５アルキル、Ｃ１〜６カルボキシアルキル又はＲａ基であり、
Ｒ４〜Ｒ６は独立にＣ１〜５アルキル、Ｃ１〜６カルボキシアルキル又はＲａであり、
Ｒ７はＣ１〜３アルキルであり、
Ｒ８はＲａ又はＣ１〜６カルボキシアルキルであり、
ＲａはＣ１〜４スルホアルキルである。）、
Ｌは式−（Ａ）ｍ−の合成リンカー基であり（式中、各Ａは独立に−ＣＲ２−、−ＣＲ＝ＣＲ−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＣＲ２ＣＯ２−、−ＣＯ２ＣＲ２−、−ＮＲＣＯ−、−ＣＯＮＲ−、−ＮＲ（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ−、−ＮＲ（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ−、−ＳＯ２ＮＲ−、−ＮＲＳＯ２−、−ＣＲ２ＯＣＲ２−、−ＣＲ２ＳＣＲ２−、−ＣＲ２ＮＲＣＲ２−、Ｃ４〜８シクロヘテロアルキレン基、Ｃ４〜８シクロアルキレン基、Ｃ５〜１２アリーレン基若しくはＣ３〜１２ヘテロアリーレン基、アミノ酸、糖又は単分散ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成ブロックであって、各ＲはＨ、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ２〜４アルケニル、Ｃ２〜４アルキニル、Ｃ１〜４アルコキシアルキル又はＣ１〜４ヒドロキシアルキルから独立に選択され、ｍは１〜２０の整数である。）、
ｎは０又は１の整数であるが、ただし、
（ｉ）上記シアニン色素が１以上のＲａ基と、Ｒ１、Ｒ２及びＲａ基から合計３〜６個のスルホン酸置換基とを含むこと、
（ｉｉ）当該造影剤が蛍光消光剤を含まない
ことを条件とする。
【００３５】
「造影剤」という用語は、哺乳類の全身（つまり無傷な身体）の関心領域のインビボ光学イメージングに適した化合物を意味する。好ましくは、哺乳類はヒトの患者である。イメージングは、侵襲的（例えば、手術中検査又は内視鏡検査）であっても、非侵襲的であってもよい。イメージングは、適宜、生検（例えば内視鏡機器の鉗子口を通しての生検など）又は腫瘍切除（例えば手術中の腫瘍マージン同定による腫瘍切除）を容易にするために使用することができる。
【００３６】
式Ｉのコンジュゲートはインビボイメージングに適しているが、インビトロ用途（例えば生物学的試料中のＢＴＭの定量アッセイ又は組織試料中のＢＴＭの可視化）も有する。好ましくは、造影剤はインビボイメージングに用いられる。
【００３７】
「スルホン酸置換基」という用語は、式−ＳＯ３Ｍ１の置換基を意味する（式中、Ｍ１はＨ又はＢｃであり、Ｂｃは生体適合性陽イオンである。）。−ＳＯ３Ｍ１置換基は炭素原子に共有結合し、炭素原子はアリール（例えばＲ１又はＲ２基）又はアルキル（すなわちＲａ基）である。「生体適合性陽イオン」（Ｂｃ）という用語は、イオン化し負に荷電した基（ここではスルホン酸基）と塩を形成する正に荷電した対イオンであって、正に荷電した対イオンが無毒性で、哺乳類の身体、特に人体への投与に適しているものを意味する。好適な生体適合性陽イオンの例としては、アルカリ金属のナトリウム又はカリウム、アルカリ土類金属のカルシウム及びマグネシウム、並びにアンモニウムイオンが挙げられる。好ましい生体適合性陽イオンはナトリウム及びカリウムであり、最も好ましくはナトリウムである。
【００３８】
「蛍光消光剤」という用語は、消光剤とＣｙＤの両方に結合したＢＴＭの蛍光が最小の蛍光をもつようにＣｙＤの蛍光を抑制する部分を意味する。消光剤分子は、当技術分野で公知である［Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３３５，１７−２９（２００６）及びＢｕｌｌｏｋ  ｅｔ  ａｌ（上述）］。本発明の造影剤コンジュゲートはＣｙＤの存在のため既に蛍光性であり、消光剤からＣｙＤを分離するための代謝活性化を必要としない。このことは、例えば消光剤とＣｙＤ又は消光剤とＢＴＭ又は消光剤とリンカー基の間の相互作用に起因する立体障害又はコンフォメーション変化などのため、インビボで生物学的認識部位と相互作用するＢＴＭの能力に影響を与えかねない追加の分子にＢＴＭが結合していないという利点を有する。さらに、消光剤が必要とされると、ＢＴＭは生物学的標的の基質（つまり酵素で開裂されるもの）又は結合時に大きなコンフォメーション変化を起こすものに限定される。消光剤を有していないので、使用できるＢＴＭの種類が増え、診断できる病態の範囲が広がる。消光剤に起因する潜在的な毒性の問題についても、考慮する必要がなくなる。
【００３９】
「生物学的ターゲティング部分」（ＢＴＭ）という用語は、投与後に哺乳類の身体の特定部位に取込まれるか又は局在化する化合物を意味する。かかる部位は、例えば、特定の病態に関連したものであってもよいし、器官又は代謝プロセスがどのように機能しているかの指標となるであってもよい。生物学的ターゲティング部分は、３〜１００アミノ酸長のペプチド、ペプチド類似体、ペプトイド若しくはペプチド模倣体（これらは線状ペプチドでも環状ペプチドであってもよい）又はこれらの組合せ、或いは酵素基質、酵素拮抗剤又は酵素阻害剤、合成受容体結合性化合物、オリゴヌクレオチド或いはオリゴＤＮＡ又はオリゴＲＮＡ断片を含む。
【００４０】
「ペプチド」という用語は、ペプチド結合（つまり、あるアミノ酸のアミンと別のアミノ酸のカルボキシルとを連結するアミド結合）で２以上のアミノ酸（以下で定義）が連結した化合物を意味する。「ペプチド模倣体」又は「模倣体」という用語は、ペプチド又はタンパク質の生物活性を模倣しているが、化学的性状がペプチドではない、つまりペプチド結合（アミノ酸間のアミド結合）を含まない生物活性化合物をいう。本明細書では、ペプチド模倣体という用語は広義に用いられ、性状が完全にペプチドでない分子（例えば、プソイドペプチド、セミペプチド及びペプトイド）を包含する。「ペプチド類似体」という用語は、以下で説明する１以上のアミノ酸類似体を含むペプチドをいう。“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ”，Ｍ．Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ  Ｅ２２ｃ，Ｔｈｉｅｍｅ参照。
【００４１】
「アミノ酸」という用語は、Ｌアミノ酸又はＤアミノ酸、アミノ酸類似体又はアミノ酸模倣体を意味し、天然のものでも純然たる合成品であってもよく、光学的に純粋つまり単一の鏡像異性体（従ってキラルなもの）であってもよいし、鏡像異性体の混合物であってもよい。本明細書では、アミノ酸の慣用三文字又は一文字略号を用いる。好ましくは、本発明のアミノ酸は光学的に純粋である。「アミノ酸模倣体」という用語は、天然アミノ酸のアイソスター（等価体）である合成類似体、つまり天然化合物の立体及び電子構造を模倣して設計されたものを意味する。かかるアイソスターは当業者に周知であり、特に限定されないが、デプシペプチド、レトロインベルソペプチド、チオアミド、シクロアルカン又は１，５−二置換テトラゾールが挙げられる［Ｍ．Ｇｏｏｄｍａｎ，  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２４，１３７（１９８５）参照］。
【００４２】
好適な酵素の基質、拮抗剤又は阻害剤には、グルコース及びグルコース類似体（例えば、フルオロデオキシグルコース）、脂肪酸、或いはエラスターゼ、アンジオテンシンＩＩ又はメタロプロテイナーゼ阻害剤がある。好ましい非ペプチド系アンジオテンシンＩＩ拮抗剤はロサルタンである。好適な合成受容体結合性化合物には、エストラジオール、エストロゲン、プロゲスチン、プロゲステロンその他のステロイドホルモン、ドーパミンＤ−１又はＤ−２受容体或いはトロパンのようなドーパミン輸送体のリガンド、並びにセロトニン受容体のリガンドがある。
【００４３】
式ＩＩのシアニン色素（ＣｙＤ）は、緑色乃至近赤外波長（５００〜１２００ｎｍ、好ましくは６００〜１０００ｎｍ）の光を用いた光学イメージング法で直接又は間接的に検出できる蛍光色素又は発色団である。好ましくは、ＣｙＤは蛍光特性を有する。
【００４４】
式Ｉのリンカー基−（Ａ）ｍ−の役割の１つは、ＣｙＤをＢＴＭの活性部位から遠ざけることである。これは、ＣｙＤが比較的嵩高く、不都合な立体的相互作用が起こり得るので特に重要である。これは、ＣｙＤがそれ自体で活性部位から遠ざかる自由度をもつようにするための柔軟性（例えば単純なアルキル鎖）及び／又はＣｙＤを活性部位から遠ざけるシクロアルキル系もしくはアリール系スペーサーのような剛直性の組合せによって達成することができる。リンカー基の性状は、造影剤の体内分布を変更することにも利用できる。例えばエーテル基をリンカーに導入すると、血漿タンパク結合を最小限に抑制するのに役立つ。−（Ａ）ｍ−がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成ブロック又は１〜１０アミノ酸残基のペプチド鎖からなる場合、リンカー基はインビボでの造影剤の薬物動態及び血中クリアランス速度を変える機能をもつ。かかる「バイオモディファイアー」リンカー基は、バックグラウンド組織（例えば、筋肉又は肝臓）及び／又は血液からの造影剤のクリアランスを促進して、バックグラウンド干渉の低減により診断用画像を向上させる。バイオモディファイアーリンカー基は、特定の排出経路（例えば、肝臓経由ではなく腎臓経由の排出）を優勢にするためにも使用できる。
【００４５】
「糖」という用語は、単糖類、二糖類又は三糖類を意味する。好適な糖には、グルコース、ガラクトース、マルトース、マンノース及びラクトースがある。糖は、アミノ酸とのカップリングを容易にするため適宜官能化してもよい。例えば、アミノ酸のグルコサミン誘導体を、ペプチド結合を介して他のアミノ酸に結合させてもよい。アスパラギンのグルコサミン誘導体（ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ社から市販）はその一例である。
【００４６】
【化７】
2010527922.tif 000008
【００４７】
式Ｉは、−（Ｌ）ｎ［ＣｙＤ］部分がＢＴＭの適当な位置に結合できることを示している。−（Ｌ）ｎ［ＣｙＤ］部分の適当な位置は、インビボでの活性部位との結合に関与する部分から離れた位置として選択される。式Ｉの［ＢＴＭ］−（Ｌ）ｎ−部分は、式ＩＩのＣｙＤの適当な位置に結合させればよい。［ＢＴＭ］−（Ｌ）ｎ−部分は、既存の置換基（例えばＲ１〜Ｒ８基のいずれか）に取って代わるか或いはＣｙＤの既存の置換基と共有結合する。［ＢＴＭ］−（Ｌ）ｎ−部分は、好ましくはＣｙＤのカルボキシアルキル置換基を介して結合する。
【００４８】
好ましい特徴
造影剤の分子量は好適には３００００ダルトン以下である。好ましくは、分子量は１０００ダルトン〜２００００ダルトン、最も好ましくは２０００ダルトン〜１８０００ダルトンの範囲内であり、２５００ダルトン〜１６０００ダルトンが特に好ましい。
【００４９】
ＢＴＭは合成されたものでも、天然のものでもよいが、好ましくは合成である。「合成」という用語はその通常の意味を有し、天然のもの（例えば哺乳類の体）から単離したものではなく、人工のものを意味する。かかる化合物は、その製造及び不純物プロファイルを完全に制御できるという利点を有する。従って、天然のモノクローナル抗体及びその断片は、本明細書で用いる用語「合成」の範疇に属さない。
【００５０】
ＢＴＭは、好ましくは３〜１００アミノ酸長のペプチド、酵素基質、酵素拮抗剤又は酵素阻害剤から選択される。ＢＴＭは最も好ましくは３〜１００アミノ酸長のペプチド又はペプチド類似体である。ＢＴＭがペプチドであるときは、好ましくは４〜３０アミノ酸長のペプチド、最も好ましくは５〜２８アミノ酸長のペプチドである。
【００５１】
式ＩＩにおいて、Ｙ１及びＹ２は好ましくは独立に−ＣＲ７Ｒ８−である。式ＩＩにおいて、Ｒ３は好ましくはＨ又はＲａ基、最も好ましくはＨである。Ｒ７は好ましくはＣＨ３である。
【００５２】
式Ｉの［ＢＴＭ］−（Ｌ）ｎ−部分は、好ましくは式ＩＩのＣｙＤのＲ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７又はＲ８、さらに好ましくはＲ３、Ｒ４又はＲ５、最も好ましくはＲ４又はＲ５の位置に結合する。ＢＴＭがＲ３位で結合していると、
（ｉ）スルホアルキル基（Ｒａ）を配置するための追加の好ましい部位が利用できる、
（ｉｉ）色素の嵩高さが増して、ＰＰＢの低減に役立つ
という利点を有する。
【００５３】
シアニン色素（ＣｙＤ）は、好ましくはＲ１、Ｒ２及びＲａ基から選択される合計４個のスルホン酸置換基を有する。２つのＲａ基は好ましくはＹ２、Ｒ３、Ｒ４又はＲ５に位置し、最も好ましくはＲ５に位置しているとともにＹ２＝−ＣＲ７Ｒａ又はＲ４＝Ｒａのいずれかである。式ＩＩにおいて、Ｒａ基は好ましくは式−（ＣＨ２）ｋＳＯ３Ｍ１のものである。式中、Ｍ１はＨ又はＢｃであり、ｋは１〜４の整数であり、Ｂｃは（上記で定義した通りの）生体適合性陽イオンである。ｋは好ましくは３又は４である。
【００５４】
式ＩＩにおいて、Ｒ１及びＲ２は好ましくは共にＳＯ３Ｍ１である。Ｒ１及びＲ２が共にＳＯ３Ｍ１である場合、ＳＯ３Ｍ１置換基は好ましくはインドール／インドレニン環の５位に存在する。
【００５５】
特に好ましい色素は式ＩＩＩのものである。
【００５６】
【化８】
2010527922.tif 000009
【００５７】
式中、
Ｒｂは独立にＲａ基又はＣ１〜６カルボキシアルキルであり、
Ｒ９〜Ｒ１２は独立にＣ１〜５アルキル又はＲｂ基であって、Ｒ９＝Ｒ１０＝Ｒｃ又はＲ１１＝Ｒ１２＝Ｒｃのいずれかとなるように選択され（式中、ＲｃはＣ１〜２アルキルである。）、
Ｒａ及びＭ１は式ＩＩで定義した通りである。
【００５８】
式ＩＩＩのＲａ基は、好ましくは独立に−（ＣＨ２）ｋＳＯ３Ｍ１である（式中、ｋは１〜４の整数であり、ｋは好ましくは３又は４である。）。好ましくは、式ＩＩＩの色素はＢＴＭとの共有結合を容易にするためのＣ１〜６カルボキシアルキル置換基を有する。
【００５９】
式ＩＩＩの好ましい色素は、Ｒ９〜Ｒ１２のいずれかがＲｂ基で、残りが各々Ｒｃ基、最も好ましくは各々ＣＨ３であるように選択される。式ＩＩＩの特に好ましい色素は式ＩＩＩａのものであって、Ｒ９〜Ｒ１２のいずれかがＲａ基であり、残りは各々Ｒｃ基、最も好ましくはＣＨ３である。好ましい式ＩＩＩａの色素は、Ｒｂ基の１つがＣ１〜６カルボキシアルキルとなるように選択される。
【００６０】
最も好ましい式ＩＩＩ及びＩＩＩａの色素の具体例はそれぞれＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（商標）６４７及びＣｙ５＊＊であり、Ｃｙ５＊＊が理想的である。
【００６１】
【化９】
2010527922.tif 000010
【００６２】
ＢＴＭがペプチドである場合、かかるペプチドとして好ましいものには以下のものがある。
・ソマトスタチン、オクトレオチド及び類似体、
・ＳＴ受容体に結合するペプチド（ＳＴとは大腸菌その他の微生物で産生される耐熱性毒素をいう。）、
・ラミニン断片、例えばＹＩＧＳＲ、ＰＤＳＧＲ、ＩＫＶＡＶ、ＬＲＥ及びＫＣＱＡＧＴＦＡＬＲＧＤＰＱＧ、
・白血球蓄積のターゲティング部位用のＮ−ホルミルペプチド、
・血小板第４因子（ＰＦ４）及びその断片、
・ＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）含有ペプチド、これは例えば血管新生をターゲティングすることができる［Ｒ．Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９７  Ｊｕｎ；１５（６）：５４２−６］、［Ｅ．Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．１９９７  Ｍａｙ；５１（５）：１４１３−７］、
・α２−抗プラスミン、フィブロネクチン又はβ−カゼイン、フィブリノーゲン又はトロンボスポンジンのペプチド断片。α２−抗プラスミン、フィブロネクチン又はβ−カゼイン、フィブリノーゲン又はトロンボスポンジンのアミノ酸配列は、以下の参考文献に記載されている。α２−アンチプラスミン前駆体［Ｍ．Ｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１０２，１０３３，（１９８７）］、β−カゼイン［Ｌ．Ｈａｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ，１３９，１９３，（１９９４）］、フィブロネクチン［Ａ．Ｇｕｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２０７，１４５，（１９９６）］、トロンボスポンジン−１前駆体［Ｖ．Ｄｉｘｉｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８３，５４４９，（１９８６）］、Ｒ．Ｆ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５３，１９５，（１９８４）、
・アンジオテンシンＩＩ：Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（Ｅ．Ｃ．Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９７９，Ｖｏｌ２２，９，１０３８−１０４４）、［Ｓａｒ，Ｉｌｅ］アンジオテンシンＩＩ：Ｓａｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ（Ｒ．Ｋ．Ｔｕｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９７２，１７７，１２０３）のようなアンジオテンシンの基質又は阻害剤であるペプチド、
・アンジオテンシンＩ：Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ。
【００６３】
ＢＴＭがペプチドである場合、ペプチドの一端又は両端、好ましくは両端は代謝阻害基（ＭＩＧ）に結合している。ペプチドの両端をこうして保護しておくことはインビボイメージング用途では重要である。さもないと、急速な代謝が予想され、ＢＴＭペプチドの選択的な結合親和性が失われるからである。「代謝阻害基」（ＭＩＧ）という用語は、酵素（特にカルボキシペプチダーゼのようなペプチダーゼ）を阻害又は抑制し、ＢＴＭペプチドのアミノ末端又はカルボキシ末端での代謝を阻害又は抑制する生体適合性基を意味する。かかる基はインビボ用途では特に重要であり、当業者には周知であって、ペプチドアミン末端に対しては、好適には、Ｎ−アシル化基−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＲＧから選択されるか（式中、アシル基−（Ｃ＝Ｏ）ＲＧはＣ１〜６アルキル、Ｃ３〜１０アリール基から選択されるＲＧを有する。）、或いはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成ブロックを含む。好適なＰＥＧ基については、リンカー基（Ｌ）に関して以下で説明する。かかるＰＥＧ基として好ましいのは、式Ｂｉｏ１又はＢｉｏ２（後記）のバイオモディファイアーである。好ましいアミノ末端ＭＩＧ基は、アセチル、ベンジルオキシカルボニル又はトリフルオロアセチルであり、最も好ましくはアセチルである。
【００６４】
ペプチドカルボキシル末端に適した代謝阻害基としては、カルボキサミド、ｔｅｒｔ−ブチルエステル、ベンジルエステル、シクロヘキシルエステル、アミノアルコール又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成ブロックが挙げられる。ＢＴＭペプチドのカルボキシ末端アミノ酸残基に好適なＭＩＧ基は、アミノ酸残基の末端アミンがＣ１〜４アルキル基、好ましくはメチル基でＮ−アルキル化されているものである。好ましいＭＩＧ基はカルボキサミド又はＰＥＧであり、最も好ましい基はカルボキサミドである。
【００６５】
一方又は両方のペプチド末端がＭＩＧ基で保護される場合、−（Ｌ）ｎ［ＣｙＤ］部分は適宜ＭＩＧ基に結合していてもよい。好ましくは、少なくとも一方のペプチド末端はＭＩＧ基を有しておらず、その位置で−（Ｌ）ｎ［ＣｙＤ］部分が結合して式ＩＶａ又はＩＶｂの化合物を与えるようにする。
【００６６】
［ＣｙＤ］−（Ｌ）ｎ−［ＢＴＭ］−Ｚ２      （ＩＶａ）
Ｚ１−［ＢＴＭ］−（Ｌ）ｎ−［ＣｙＤ］      （ＩＶｂ）
式中、
Ｚ１はＢＴＭペプチドのＮ末端に結合していて、Ｈ又はＭＩＧであり、
Ｚ２はＢＴＭペプチドのＣ末端に結合していて、ＯＨ、ＯＢｃ又はＭＩＧであり、
Ｂｃは（上記で定義した通りの）生体適合性陽イオンである。
【００６７】
式ＩＶａ及びＩＶｂにおいて、Ｚ１及びＺ２は好ましくは独立にＭＩＧである。Ｚ１及びＺ２に対して好ましいＭＩＧ基は、ペプチド末端について上述した通りである。ＢＴＭペプチドの代謝の阻害はいずれのペプチド末端でも、−（Ｌ）ｎ［ＣｙＤ］部分を同様に結合することによっても達成できるが、−（Ｌ）ｎ［ＣｙＤ］自体は本発明のＭＩＧの定義には属さない。
【００６８】
ＢＴＭペプチドは、適宜、ＣｙＤの結合に適した側鎖を有するアミノ酸残基であって、リンカー基（Ｌ）のアミノ酸残基の一部をなす１以上の追加のアミノ酸残基を含んでいてもよい。かかるアミノ酸残基として好適なものとして、アミン官能化ＣｙＤ色素との結合のためのＡｓｐ又はＧｌｕ残基、又はカルボキシ官能化若しくは活性エステル官能化ＣｙＤ色素との結合のためのＬｙｓ残基が挙げられる。ＣｙＤを結合させるための追加のアミノ酸残基は好適にはＢＴＭペプチドの結合領域から離れて位置しており、好ましくはＣ末端又はＮ末端のいずれかに位置す。好ましくは、結合用のアミノ酸残基はＬｙｓ残基である。
【００６９】
合成リンカー基（Ｌ）が存在する場合、合成リンカー基は好ましくは［ＢＴＭ］及びＣｙＤとの結合を容易にする末端官能基を含む。このような基（Ｑａ）として適しているものについては、第５の態様（後記）で説明する。Ｌが、１〜１０アミノ酸残基のペプチド鎖を含む場合、アミノ酸残基は好ましくはグリシン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はセリンから選択される。ＬがＰＥＧ部分を含む場合、Ｌは好ましくは式Ｂｉｏ１又はＢｉｏ２の単分散ＰＥＧ様構造のオリゴマー化から誘導される単位を含む。
【００７０】
【化１０】
2010527922.tif 000011
【００７１】
式Ｂｉｏ１の１７−アミノ−５−オキソ−６−アザ−３，９，１２，１５−テトラオキサヘプタデカン酸。式中、ｐは１〜１０の整数である。或いは、式Ｂｉｏ２のプロピオン酸誘導体に基づくＰＥＧ様構造も使用できる。
【００７２】
【化１１】
2010527922.tif 000012
【００７３】
式中、ｐは式Ｂｉｏ１で定義した通りであり、ｑは３〜１５の整数である。式Ｂｉｏ２において、ｐは好ましくは１又は２であり、ｑは好ましくは５〜１２である。
【００７４】
リンカー基がＰＥＧ又はペプチド鎖を含まない場合、好ましいＬ基は原子数２〜１０、最も好ましくは原子数２〜５の−（Ａ）ｍ−部分を構成する結合原子の骨格鎖を有し、原子数２又は３原子のものが特に好ましい。２原子からなる最小リンカー基骨格鎖は、不都合な相互作用が最小限に抑制されるほどＣｙＤが十分に隔てられるという利点を付与する。
【００７５】
ＢＴＭペプチドが市販されていなければ、Ｐ．Ｌｌｏｙｄ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｆ．Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ  ａｎｄ  Ｅ．Ｇｉｒａｌｄ；Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７に記載の固相ペプチド合成法で合成できる。
【００７６】
造影剤は以下の通り製造することができる。
【００７７】
ＢＴＭとＣｙＤとの結合を容易にするため、好適にはＣｙＤに反応性官能基（Ｑａ）を結合させておく。Ｑａ基はＢＴＭの相補性官能基と反応するように設計され、ＣｙＤとＢＴＭの間で共有結合を形成する。ＢＴＭの相補性官能基は、ＢＴＭに固有の部分であってもよいし、当技術分野で公知の二官能基による誘導体化で導入してもよい。表１に、反応性基とその相補性対応物の具体例を示す。
【００７８】
【表１】
2010527922.tif 000013
【００７９】
「活性化エステル」又は「活性エステル」という用語は、カルボン酸のエステル誘導体であって、良好な脱離基であり、アミンのような求核試薬との反応が容易になるように設計されたものをいう。好適な活性エステルの例は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、ペンタフルオロフェノール、ペンタフルオロチオフェノール、ｐ−ニトロフェノール及びヒドロキシベンゾトリアゾールである。好ましい活性エステルは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド又はペンタフルオロフェノールエステルである。
【００８０】
タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物などのＢＴＭに存在する官能基の例としては、ヒドロキシ、アミノ、スルフヒドリル、カルボニル（アルデヒド及びケトンを含む）及びチオホスフェートが挙げられる。好適なＱａ基は、カルボキシル、活性化エステル、イソチオシアネート、マレイミド、ハロハセトアミド、ヒドラジド、ビニルスルホン、ジクロロトリアジン及びホスホルアミダイトから選択し得る。好ましくは、Ｑａはカルボン酸の活性化エステル、イソチオシアネート、マレイミド又はハロアセトアミドである。
【００８１】
相補性基がアミン又はヒドロキシルである場合、Ｑａは好ましくは活性化エステルであり、好ましいエステルは上述の通りである。好ましいＣｙＤ上の置換基は、５−カルボキシペンチル基の活性化エステルである。相補性基がチオールである場合、Ｑａは好ましくはマレイミド又はヨードアセトアミド基である。
【００８２】
シアニン色素を生物学的分子に結合する一般的方法は、Ｌｉｃｈａ  ｅｔ  ａｌ［Ｔｏｐｉｃｓ  Ｃｕｒｒ．Ｃｈｅｍ．，２２２，１−２９（２００２）；Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．，５７，１０８７−１１０８（２００５）］に記載されている。本発明で使用するためのペプチド、タンパク質及びオリゴヌクレオチド基質は末端部位又は１以上の内部部位で標識してもよい。蛍光色素標識試薬を用いるタンパク質標識の総説及び例については、“Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ，ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ”，Ｇａｒｍａｎ，Ａ．Ｊ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７、“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”，Ａｓｌａｍ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｎｔ，Ａ．，Ｍａｃｍｉｌｌａｎ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｌｔｄ，（１９９８）を参照されたい。合成ペプチドで部位特異的標識を得るのに利用できるプロトコルについては、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）を参照されたい。
【００８３】
好ましくは、造影剤の製造法は、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかを含む。
（ｉ）ＢＴＭのアミン官能基と式Ｙ１−（Ｌ）ｎ−［ＣｙＤ］の化合物との反応、又は
（ｉｉ）ＢＴＭのカルボン酸又は活性化エステル官能基と式Ｙ２−（Ｌ）ｎ−［ＣｙＤ］の化合物との反応、
（ｉｉｉ）ＢＴＭのチオール基と式Ｙ３−（Ｌ）ｎ−［ＣｙＤ］の化合物との反応
式中、ＢＴＭ、ＭＩＧ、Ｌ、ｎ及びＣｙＤは上記で定義した通りであり、
Ｙ１はカルボン酸、活性化エステル、イソチオシアネート又はチオシアネート基であり、
Ｙ２はアミン基であり、
Ｙ３はマレイミド基である。
【００８４】
Ｙ２は、好ましくは第一又は第二アミン基であり、最も好ましくは第一アミン基である。段階（ｉｉｉ）で、ＢＴＭのチオール基は好ましくはシステイン残基に由来するものである。
【００８５】
段階（ｉ）〜（ｉｉｉ）において、ＢＴＭは、化学反応が選択的に所望の部位でしか起こらないように適切な保護基で保護されたＣｙＤ誘導体と潜在的に反応し得る他の官能基を適宜有していてもよい。
「保護基」という用語は、望ましくない化学反応は阻止又は抑制するが、残りの分子を変質させない程度の穏和な条件下で官能基から脱離させることのできる十分な反応性をもつように設計された基を意味する。脱保護後に所望の生成物が得られる。アミン保護基は当業者に周知であり、好適にはＢｏｃ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルの略）、Ｆｍｏｃ（フルオレニルメトキシカルボニルの略）、トリフルオロアセチル、アリルオキシカルボニル、Ｄｄｅ［すなわち１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシリデン）エチル］又はＮｐｙｓ（すなわち３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル）から選択される。好適なチオール保護基は、Ｔｒｔ（トリチル）、Ａｃｍ（アセトアミドメチル）、ｔ−Ｂｕ（ｔｅｒｔ−ブチル）、ｔｅｒｔ−ブチルチオ、メトキシベンジル、メチルベンジル又はＮｐｙｓ（３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル）である。その他の保護基の使用については、‘Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ’，Ｔｈｅｏｄｏｒａ  Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐｅｔｅｒ  Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９１）に記載されている。好ましいアミン保護基はＢｏｃ及びＦｍｏｃであり、最も好ましくはＢｏｃである。好ましいチオール保護基はＴｒｔ及びＡｃｍである。
【００８６】
ペプチドとの結合に適した官能化シアニン色素（ＣｙＤ）は、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、Ａｔｔｏ−Ｔｅｃ社、Ｄｙｏｍｉｃｓ社、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社などから市販されている。かかる色素の大半はＮＨＳエステルとして入手できる。ヒドラジド、マレイミド又はスクシンイミジルエステル基で官能化されたＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（商標）６４７は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社から市販されている。Ｒ３位がカルボキシル又はマレイミド基で官能化されたＣｙＤは、欧州特許出願公開第１８１６４７５号に記載されたものと同様の方法で調製できる。
【００８７】
光学レポーター色素をアミノ酸及びペプチドに結合する方法は、Ｌｉｃｈａ（上記参照）並びにＦｌａｎａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ［Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，８，７５１−７５６（１９９７）］、Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ，［Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，１３，６０５−６１０（２００２）］及びＺａｈｅｅｒ［Ｍｏｌ．Ｉｍａｇｉｎｇ，１（４），３５４−３６４（２００２）］に記載されている。リンカー基（Ｌ）をＢＴＭに結合する方法では、色素単独の場合（上記参照）と同様の化学反応が用いられ、当技術分野で公知である。
【００８８】
式ＩＩＩの色素については、以下の第５の態様で説明する。
【００８９】
第２の態様では、本発明は、第１の態様の造影剤を生体適合性担体と共に哺乳類への投与に適した形態で含む医薬組成物を提供する。
【００９０】
「生体適合性担体」とは、造影剤を懸濁又は溶解できる流体、特に液体であって、組成物が生理学的に認容できるもの、つまり毒性も耐え難い不快感も伴わずに哺乳類の身体に投与することができるようなものである。生体適合性担体は好適には注射可能な担体液であり、例えば、発熱物質を含まない注射用の滅菌水、食塩液のような水溶液（これは注射用の最終製剤が等張性となるように調整するのに都合がよい）、１種以上の張度調節物質（例えば血漿陽イオンと生体適合性対イオンとの塩）、糖（例えばグルコース又はスクロース）、糖アルコール（例えばソルビトール又はマンニトール）、グリコール（例えばグリセロール）その他の非イオン性ポリオール材料（例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコールなど）の水溶液である。好ましくは、生体適合性担体は発熱物質を含まない注射用水又は等張食塩水である。
【００９１】
造影剤と生体適合性担体は、各々、無菌健全性及び／又は放射能の安全性並びに適宜、不活性ヘッドスペースガス（例えば窒素又はアルゴン）を維持することができ、しかも、シリンジ又はカニューレで溶液の添加及び吸引もできる密封容器を備える適当なバイアル又は容器に入れて供給される。かかる容器として好ましいのはセプタムシールバイアルであり、気密蓋をオーバーシール（通例アルミニウム製）でクリンプしたものである。蓋は、無菌状態を維持したまま皮下注射針で一回又は複数回穿刺するのに適したもの（例えばクリンプオン式セプタムシール蓋）である。かかる容器は、所望により（例えば、ヘッドスペースガスの交換又は溶液の脱気などのための）真空に蓋が耐えることができるとともに、酸素や水蒸気のような外部雰囲気ガスを侵入させずに減圧する際などの圧力変化にも耐えるという追加の利点も有する。
【００９２】
好ましい多用量用容器は、複数回分の用量を収容した単一バルクバイアル（例えば容積１０〜３０ｃｍ３のもの）からなり、臨床症状に応じて製剤の有効期間中様々な時間間隔で単一用量を臨床グレードのシリンジに吸引することができる。プレフィルドシリンジは単一用量つまり「単位用量」を収容するように設計され、そのため好ましくは使い捨て又はその他臨床用に適したシリンジである。本発明の医薬組成物は好ましくは一人の患者に適した用量を有していて、適当なシリンジ又は容器で供給される
医薬組成物は、適宜、抗菌保存剤、ｐＨ調節剤、充填剤、安定剤又は浸透圧調整剤のような追加の賦形剤を含んでいてもよい。「抗菌保存剤」という用語は、細菌、酵母又はカビなどの有害微生物の増殖を阻害する薬剤を意味する。抗菌保存剤は、使用量に応じてある程度の殺菌作用を示すこともある。本発明の抗菌保存剤の主な役割は、医薬組成物での微生物の増殖を阻害することである。ただし、抗菌保存剤は、投与前に医薬組成物の調製に用いられるキットの１以上の成分における有害微生物の増殖の防止にも適宜使用できる。適当な抗菌保存剤としては、パラベン類、すなわちメチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン又はこれらの混合物、ベンジルアルコール、フェノール、クレゾール、セトリミド及びチオメルサールが挙げられる。好ましい抗菌保存剤はパラベン類である。
【００９３】
「ｐＨ調節剤」という用語は、組成物のｐＨが、ヒト又は哺乳類への投与に関する許容範囲（約ｐＨ４．０〜１０．５）内に収まるようにするのに有用な化合物又は複数の化合物の混合物を意味する。かかる適当なｐＨ調節剤としては、トリシン、リン酸塩又はＴＲＩＳ（すなわちトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）のような薬学的に許容される緩衝剤、並びに炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム又はこれらの混合物などの薬学的に許容される塩基が挙げられる。組成物をキットの形態で用いる場合、キットのユーザーが多段階法の一部としてｐＨを調節できるようにｐＨ調節剤を適宜別のバイアル又は容器で提供してもよい。
【００９４】
「充填剤」という用語は、製造及び凍結乾燥時の材料の取扱いを容易にする薬学的に許容される増量剤を意味する。適当な充填剤としては、塩化ナトリウムのような無機塩並びに水溶性糖類又は糖アルコール、例えばスクロース、マルトース、マンニトール又はトレハロースが挙げられる。
【００９５】
第２の態様の医薬組成物は、所望の非発熱性無菌製品が得られるように、無菌製造（クリーンルーム）条件下で調製し得る。主要成分、特に関連試薬並びに機器のうち造影剤と接する部材（例えばバイアル）は無菌であるのが好ましい。部品及び試薬は、無菌濾過、並びにγ線照射、オートクレーブ処理、乾熱又は化学的処理（例えばエチレンオキサイドでの処理）などでの最終滅菌を始めとする当技術分野で公知の方法で滅菌できる。実施しなければならない操作の数を最小限にするため、幾つかの成分を予め滅菌しておくのが好ましい。ただし、用心のため、医薬組成物の調製における最終段階として１回以上の滅菌濾過段階を含めておくのが好ましい。
【００９６】
第２の態様の医薬組成物は、好ましくは以下の第３の態様に関して説明するキットから調製される。
【００９７】
第３の態様では、本発明は、第２の態様の医薬組成物の調製用キットであって、第２の態様の生体適合性担体の無菌供給で再構成すれば溶解が起きて所望の医薬組成物が得られるように第１の態様の造影剤を無菌固体形態で含むキットを提供する。
【００９８】
この場合、造影剤、さらに上述の他の任意成分としての賦形剤を凍結乾燥粉末として、適当なバイアル又は容器に入れて供給することができる。これらは、所望の生体適合性担体で再構成すれば、哺乳類への投与にすぐに使用できる無菌で非発熱性の形態の医薬組成物が得られるように設計される。
【００９９】
造影剤の好ましい無菌固体形態は凍結乾燥固体である。無菌固体形態は、好ましくは医薬組成物に関して上記で説明した通りの医薬用グレードの容器に入れて供給される。キットを凍結乾燥する場合、配合物は、適宜、糖類（好ましくはマンニトール、マルトース及びトリシン）から選択される凍結保護剤を含んでいてもよい。
【０１００】
第４の態様では、本発明は式Ｉａのコンジュゲートを提供する。
【０１０１】
［ＢＴＭ］−（Ｌ）ｎ−ＣｙＤ              （Ｉａ）
式中、ＢＴＭ、Ｌ及びｎは第１の態様で定義した通りであり、ＣｙＤは式ＩＩＩａのものである。
【０１０２】
【化１２】
2010527922.tif 000014
【０１０３】
式中、
Ｒ９〜Ｒ１２は独立にＲｂ又はＲｃ基であり、Ｒ９＝Ｒ１０の１つがＲａ基で、その他が各々Ｒｃ基であるように選択され（式中、ＲｃはＣ１〜２アルキルである。）、
Ｒａ、Ｒｂ及びＭ１は式ＩＩＩで定義した通りである。
【０１０４】
コンジュゲートにおける式ＩＩＩａの好ましい実施形態は上述の通りである。
【０１０５】
第４の態様のコンジュゲートは、式ＩＩＩａの好ましいシアニン色素を有する造影剤及び医薬組成物のいずれの調製にも有用である。ＢＴＭ、Ｌ、ｎ及び式ＩＩＩａの色素の好ましい態様は、上述した通りである。コンジュゲートは、第１及び第５の態様に記載した通り調製できる。
【０１０６】
第５の態様では、本発明は第４の態様で定義した式ＩＩＩａのシアニン色素を提供する。第５の態様の色素は、式ＩＩＩａの好ましいシアニン色素を有するＢＴＭ−コンジュゲート、造影剤及び医薬組成物の調製に有用である。
【０１０７】
式ＩＩＩａのシアニン色素の好ましい態様は、上述した通りである。色素は、好ましくはＱａ基をさらに含んでいる（式中、ＱａはＢＴＭとの結合に適した反応性官能基である）。好適で好ましいＱａ基は上述した通りである。式ＩＩＩａの色素は、例３でＣｙ５＊＊について記載した通り調製できる。Ｑａ基（Ｑａは活性エステルである）が導入された色素は、例４に従って調製できる。
【０１０８】
第６の態様では、本発明は、哺乳類の体のインビボ光学イメージング法であって、第１の態様の造影剤又は第２の態様の医薬組成物のいずれかを用いてインビボでのＢＴＭ局在部位の画像を得ることを含む方法を提供する。
【０１０９】
「光学イメージング」という用語は、緑色乃至近赤外領域（波長５００〜１２００ｎｍ）の光との相互作用に基づいて、病気の検出、ステージング又は診断、病気進行の追跡或いは病気の治療の追跡のため、画像を形成する任意の方法を意味する。光学イメージングはさらに、いかなる装置も使用しない直接可視化から、各種スコープ、カテーテル及び光学イメージング装置（例えば、断層撮像用のコンピューター支援ハードウェア）のような装置の使用を伴うあらゆる方法を包含する。モダリティ及び測定技法としては、特に限定されないが、ルミネセンスイメージング、内視鏡検査、蛍光内視鏡検査、光学コヒーレンス断層撮影、透過率イメージング、時間分解透過率イメージング、共焦点イメージング、非線形顕微鏡検査、光音響イメージング、音響光学イメージング、分光分析、反射分光分析、干渉分析、コヒーレンス干渉分析、拡散光学断層撮影及び蛍光媒介拡散光学断層撮影（連続波、時間ドメイン及び周波数ドメインシステム）、並びに光散乱、吸光、偏光、ルミネセンス、蛍光寿命、量子収量及び消光の測定がある。これらの技術の詳細については、Ｔｕａｎ  Ｖｏ−Ｄｉｎｈ（ｅｄｉｔｏｒ）：“Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ”（２００３），ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  ＬＣＣ、Ｍｙｃｅｋ＆Ｐｏｇｕｅ（ｅｄｉｔｏｒｓ）：“Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ”（２００３），Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｓｐｌｉｎｔｅｒ＆Ｈｏｐｐｅｒ：“Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｏｐｔｉｃｓ”（２００７），ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  ＬＣＣに記載されている。
【０１１０】
緑色乃至近赤外領域の光は好適には５００〜１２００ｎｍ、好ましくは６００〜１０００ｎｍの波長のものである。光学イメージング法は、好ましくは蛍光内視鏡検査である。第６の態様の哺乳類の身体は好ましくは人体である。造影剤の好ましい実施形態は、第１の態様（上述）で説明した通りである。特に、用いるＣｙＤ色素が蛍光性であるのが好ましい。
【０１１１】
第６の態様の方法では、造影剤又は医薬組成物は、好ましくは哺乳類の身体に予め投与されている。「予め投与」とは、臨床医の関与の下で造影剤を例えば静脈内注射によって患者に投与する段階がイメージングに先立って既に実施されていることを意味する。この実施形態は、ＢＴＭが関与する哺乳類の身体の病態のインビボ画像診断用の診断薬を製造するための、第１の実施形態のコンジュゲートの使用を含む。
【０１１２】
第６の態様の好ましい光学イメージング法は、蛍光反射イメージング（ＦＲＩ）である。ＦＲＩでは、本発明の造影剤を診断すべき被験体に投与し、次いで被験体の組織表面に励起光（通常は連続波（ＣＷ）励起）を照射する。光は造影剤のＣｙＤ色素を励起する。励起光で生じる造影剤からの蛍光を、蛍光検出器を用いて検出する。戻り光を好ましくは濾光して蛍光成分を（単独で又は部分的に）分離する。蛍光から画像を形成する。通常、最小限の処理を実施し（寿命、量子収量などの光学パラメーターの計算にプロセッサーは使用しない）、画像は蛍光強度をマップする。造影剤は罹患部に集中して高い蛍光強度を生じるように設計される。こうして、蛍光強度画像で罹患部は陽性コントラストを生じる。画像は好ましくはリアルタイムイメージングが可能となるようにＣＣＤカメラ又はチップを用いて得られる。
【０１１３】
励起用波長は使用するＣｙＤ色素に応じて異なるが、本発明の色素では通例５００〜１２００ｎｍの範囲内にある。励起光を発生させるための機器は、レーザー（イオンレーザー、色素レーザー、半導体レーザーなど）、ハロゲン光源又はキセノン光源のような慣用の励起光源であればよい。最適な励起波長を得るため、適宜、各種光学フィルターを用いてもよい。
【０１１４】
好ましいＦＲＩ法は、以下の段階（ｉ）〜（ｉｖ）：
（ｉ）哺乳類の体内の関心組織表面に励起光を照射する段階、
（ｉｉ）ＣｙＤの励起によって生じる造影剤からの蛍光を蛍光検出器を用いて検出する段階、
（ｉｉｉ）蛍光検出器で検出された光を適宜濾光して蛍光成分を分離する段階、及び
（ｉｖ）段階（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の蛍光から前記関心組織表面の画像を生成させる段階
を含む。段階（ｉ）では、励起光は好ましくは本質的に連続波（ＣＷ）である。段階（ｉｉｉ）では、検出した光を好ましくは濾光する。特に好ましいＦＲＩ法は蛍光内視鏡検査である。
【０１１５】
第６の態様の別のイメージング法は、ＦＤＰＭ（周波数ドメイン光子移動）を用いる。これは、組織中での色素の検出深度が大きいことが重要となる連続波（ＣＷ）法［Ｓｅｖｉｃｋ−Ｍｕｒａｃａｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，６，６４２−６５０（２００２）］に比べて利点を有する。かかる周波数／時間ドメインイメージングには、画像化すべき病変の組織深度及び使用する機器の種類に応じて変調できる蛍光特性をＣｙＤが有していると有利である。
【０１１６】
ＦＤＰＭ法は以下の（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）不均質組成を有する前記哺乳類の体の光散乱生体組織を、所定の経時的変動強度の光源からの光に露光して造影剤を励起する段階であって、組織が励起光を多重散乱させる段階、
（ｂ）前記露光に応答した組織からの多重散乱発光を検出する段階、
（ｃ）組織内の様々な位置での蛍光特性のレベルに各々対応する複数の値をプロセッサーで確定することによって、発光から組織全体の蛍光特性を定量化する段階であって、蛍光特性のレベルが組織の不均質組成に応じて変化する段階、及び
（ｄ）段階（ｃ）の値に従って組織の不均質組成のマッピングを行うことによって組織の画像を生成する段階
を含む。
【０１１７】
段階（ｃ）の蛍光特性は、好ましくは造影剤の取込みに対応し、好ましくは造影剤を投与する前の組織の吸収係数及び散乱係数に対応する複数の量のマッピングをさらに含む。段階（ｃ）の蛍光特性は、好ましくは蛍光寿命、蛍光量子効率、蛍光収量及び造影剤取込みの１以上に対応する。蛍光特性は、好ましくは発光強度とは無関係であり、造影剤濃度とも無関係である。
【０１１８】
段階（ｃ）の定量は、好ましくは、（ｉ）値の推定値を設定し、（ii）推定値の関数として算出発光値を求め、（iii）算出発光値を検出段階の発光と比較して誤差を求め、（iv）誤差の関数として蛍光特性の修正推定値を得ることを含む。定量は、好ましくは組織の多重光散乱挙動をモデル化する数学的関係から値を求めることを含む。第１のオプションの方法は、好ましくは、蛍光特性のバラツキを検出することによってインビボでの組織の代謝特性をモニターすることをさらに含む。
【０１１９】
第６の態様の光学イメージングは、好ましくは哺乳類の体の病態の管理に役立てるために用いられる。「管理」という用語は、病勢進行の検出、ステージング、診断、モニタリング又は治療のモニタリングでの使用を意味する。病態は、好適には造影剤のＢＴＭが関与するものである。イメージング用途は、好ましくはカメラによる表面イメージング、内視鏡検査及び手術のガイダンスを含む。好適な光学イメージング法の詳細については、Ｓｅｖｉｃｋ−Ｍｕｒａｃａ  ｅｔ  ａｌ［Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，６，６４２−６５０（２００２）］の総説がある。
【０１２０】
他の態様では、本発明は哺乳類の体の病勢進行の検出、ステージング、診断、モニタリング又は病気の治療のモニタリングを行う方法であって、第６の態様のインビボ光学イメージング法を含む方法を提供する。
【実施例】
【０１２１】
本発明を、以下の非限定的な実施例で例示する。例１ａ及び２では、それぞれ化合物１及び３の合成を例示するが、いずれも本発明の技術的範囲に属さない関連色素の比較例である。例１ｂでは、対照ペプチド（スクランブルＲＧＤ）の色素コンジュゲートである化合物２の合成を例示する。例３では、本発明の好ましいＣｙＤであるシアニン色素Ｃｙ５＊＊の合成を例示する。例４では、Ｃｙ５＊＊の活性エステルの合成を例示する。例５では、Ｃｙ５＊＊のペプチドコンジュゲートである化合物４の合成を例示する。例６では、Ａｌｅｘａ６４７のペプチドコンジュゲートである化合物６の合成を例示する。例７では、化合物１〜８の血漿安定性データを提供する。化合物５及び７（血漿中で４時間インキュベートした後に残存する主ピークはそれぞれ４６％及び７０％）を除いて、すべてのコンジュゲートが十分な血漿安定性を示した。例８では、本発明の化合物のＰＰＢデータを提供する。最も高いＰＰＢは化合物３及び７で観察され、最も低いのは化合物４及び６であった。例９では、化合物１〜８のコラーゲン結合データを提供する。ほとんどの化合物は低濃度で高い結合を示したが、化合物４及び６は最も低いコラーゲン結合を示した。例１０では、化合物１〜８の結合アッセイデータを提供する。若干高いＫｉ値を示す化合物７と、化合物２（スクランブル陰性対照）を除いて、すべてｎＭ程度の同様のＫｉ値を示した。これから、シアニン色素が結合しているにもかかわらず、ＲＧＤペプチドの生物学的結合特性が保持されていて、一群のシアニン色素に当てはまることが分かる。例１１では、化合物１〜８のインビボイメージングデータを提供する。分析ソフトウェアでは、色素の単純な指数関数的ウォッシュアウトを仮定した。推定ウォッシュアウト時間は、特に皮膚及び筋肉の信号については過小評価され、不正確であることが認められた。これは、ＲＧＤがバックグラウンド組織のインテグリン及びおそらくはコラーゲンと結合することに起因し、見掛け上二重指数関数的ウォッシュアウト特性を与えるためと考えられる。腫瘍でのウォッシュイン及びウォッシュアウトが筋肉よりも遅いことは好ましいと考えられる。陰性対照（化合物２）は腫瘍及び参照組織で同様のキネティクスを示し、陽性化合物で観察された差異がターゲティングによるもので、灌流作用に起因するものではないことを示唆している。化合物６が最も好ましいイメージングキネティクスをもつと考えられた。
【０１２２】
【表２】
2010527922.tif 000015
【０１２３】
【表３】
2010527922.tif 000016
【０１２４】
略語
慣用の一文字又は三文字アミノ酸略号を使用する。
Ａｃｍ：  アセトアミドメチル
ＡＣＮ：  アセトニトリル
Ｂｏｃ：  ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル
ＤＭＦ：  Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ：  ジメチルスルホキシド
Ｆｍｏｃ：  ９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＣｌ：  塩酸
ＨＰＬＣ：  高速液体クロマトグラフィー
ＨＳＰｙＵ：  Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチレンウロニウムヘキサフルオロホスフェート
Ｉｌｅ：  イソロイシン
ＬＣ−ＭＳ：  液体クロマトグラフィー質量分析
ＮＨＳ：  Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド
ＮＭＭ：  Ｎ−メチルモルホリン
ＮＭＰ：  １−メチル−２−ピロリジノン
Ｐｂｆ：  ２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル
ＰＢＳ：  リン酸塩緩衝食塩水
ＰＰＢ：  血漿タンパク結合
ＴＦＡ：  トリフルオロ酢酸
Ｔｒｔ：  トリチル
ＴＳＴＵ：  Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート
例１ａ：ＲＧＤ−［Ｃｙ５（２）］色素コンジュゲート（化合物１、比較例）の合成
【０１２５】
【化１３】
2010527922.tif 000017
【０１２６】
ＲＧＤペプチド（国際公開第２００５／１２３７６８号参照、２４ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）を固体として、Ｃｙ５（２）モノＮＨＳ−エステル（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社カタログ番号ＰＡ１５１０４、７．５ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２ｍｌ）溶液に添加し、次いでＮＭＭ（０．０１ｍｌ、０．０９ｍｍｏｌ）を添加した。反応は遮光下で一晩進行させた。ＤＭＦを減圧下で蒸発させ、粗生成物を逆相分取クロマトグラフィー（Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８カラム，２１８ＴＰ１０２２；溶媒Ａ＝水／０．１％ＴＦＡ、溶媒Ｂ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ、６０分間１０〜３０％Ｂの勾配、流量１０ｍｌ／分、２５４ｎｍで検出）で精製し、６．６ｍｇ（３７％）の純粋標品（分析ＨＰＬＣ：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８カラム、００Ｇ−４２５２−Ｅ０；溶媒Ａ＝水／０．１％ＴＦＡ、溶媒Ｂ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ、２０分間１５〜３５％Ｂの勾配、流量１．０ｍｌ／分；保持時間１９．５分、２１４ｎｍ及び２５４ｎｍで検出）を得た。質量分析法でさらに特性決定を行い、ｍ／ｚ値９４９．１［ＭＨ２＋］を得た。
【０１２７】
例１ｂ：ｎｅｇ−ＲＧＤ−［Ｃｙ５（２）］色素コンジュゲート（化合物２、比較例）の合成
【０１２８】
【化１４】
2010527922.tif 000018
【０１２９】
ペプチド配列Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｃｙｓを含有するｎｅｇ−ＲＧＤペプチドは、ＲＤＧペプチドについて記載された方法（国際公開第２００５／１２３７６８号参照）で調製した。
【０１３０】
ｎｅｇ−ＲＧＤ−［Ｃｙ５（２）］色素コンジュゲートは例１に記載の通り調製した。粗生成物を、逆相分取クロマトグラフィー（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ５μ  Ｃ１８（２）２５０×２１．２０ｍｍ；溶媒Ａ＝水／０．１ＴＦＡ、溶媒Ｂ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ、４０分間２０〜３０％Ｂの勾配、流量１０ｍｌ／分、２１４ｎｍで検出）で精製し、４．１ｍｇの標記化合物（分析ＨＰＬＣ：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ３μ  Ｃ１８（２）２０×２ｍｍ；溶媒Ａ＝水／０．１％ＴＦＡ、溶媒Ｂ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ、２０分間１０〜４０％Ｂの勾配、流量１．０ｍｌ／分、保持時間３．２３分、２１４ｎｍ及び２５４ｎｍで検出）を得た。質量分析法でさらに特性決定を行い、ｍ／ｚ値１８９５．６［Ｍ＋］を得た。
【０１３１】
例２：ＲＧＤ−Ｃｙ５（１））色素コンジュゲート（化合物３、比較例）の合成
【０１３２】
【化１５】
2010527922.tif 000019
【０１３３】
Ｃｙ５（１）をＤＭＦ（２ｍｌ）中のＴＳＴＵ（２．１ｍｇ、０．００７６ｍｍｏｌ）及びＮＭＭ（０．００９ｍｌ、０．０８ｍｍｏｌ）で１時間処理することによってＣｙ５（１）のＮＨＳ−エステル（４．５ｍｇ、０．００８ｍｍｏｌ）を形成した。次いで、溶液をＲＧＤペプチド（例１、２０ｍｇ、０．０１６ｍｍｏｌ）に添加し、反応を遮光下で一晩進行させた。ＤＭＦを減圧下で蒸発させ、粗生成物を逆相分取クロマトグラフィー（Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８カラム，２１８ＴＰ１０２２；溶媒Ａ＝水／０．１％ＴＦＡ、溶媒Ｂ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ、６０分間２０〜４０％Ｂの勾配、流量１０ｍｌ／分、２５４ｎｍで検出）で精製し、４．９ｍｇ（３４％）の純粋標品（分析ＨＰＬＣ：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８カラム、００Ｇ−４２５２−Ｅ０；溶媒Ａ＝水／０．１％ＴＦＡ、溶媒Ｂ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ、２０分間２５〜４５％Ｂの勾配、流量１．０ｍｌ／分、保持時間１５．２分、２１４ｎｍ及び２５４ｎｍで検出）を得た。質量分析法でさらに特性決定を行い、ｍ／ｚ値９０２．１［ＭＨ２＋］を得た。
【０１３４】
例３：シアニン色素２−｛（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）−５−［１−（５−カルボキシペンチル）−３，３−ジメチル−５−スルホ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン］ペンタ−１，３−ジエニル｝−３−メチル−１，３−ビス（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホネート（Ｃｙ５＊＊）の合成
【０１３５】
【化１６】
2010527922.tif 000020
【０１３６】
（３ａ）５−メチル−６−オキソヘプタン−１−スルホン酸
【０１３７】
【化１７】
2010527922.tif 000021
【０１３８】
ＤＭＦ（２５ｍｌ）中の２−メチルアセト酢酸エチル（５０ｇ）を、ＤＭＦ（１００ｍｌ）中の水素化ナトリウム（鉱油中６０％ＮａＨ１２．０ｇ）の懸濁液に、氷浴で冷却しながら１時間滴下した（内部温度０〜４℃）。この混合物を４５分間撹拌しながら室温まで温めてから、再度冷却した。次いで、１，４−ブタンスルトン（４５ｇ）のＤＭＦ（２５ｍｌ）溶液を１５分間滴下した。最終混合物を６０℃で１８時間加熱した。溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、残渣を水とジエチルエーテルとの間で分配させた。水層を回収し、新鮮なジエチルエーテルで洗浄し、ロータリーエバポレーターにかけて粘着性の泡状物を得た。この中間体を水（１００ｍｌ）に溶解させ、水酸化ナトリウム（１７．８ｇ）を１５分間にわたって撹拌しながら添加した。混合物を９０℃で１８時間加熱した。冷却した反応混合物を、濃塩酸（約４０ｍｌ）の添加によって約ｐＨ２に調節した。溶液をロータリーエバポレーターにかけ、真空下で乾燥させた。黄色固体を、２％塩酸を含有するエタノールで洗浄した（３×１５０ｍｌ）。エタノール溶液を濾過し、ロータリーエバポレーターにかけ、真空下で乾燥させて黄色固体を得た。収量７０ｇ。
【０１３９】
（３ｂ）２，３−ジメチル−３−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドール−５−スルホン酸二カリウム塩
【０１４０】
【化１８】
2010527922.tif 000022
【０１４１】
４−ヒドラジノベンゼンスルホン酸（４０ｇ）と５−メチル−６−オキソヘプタン−１−スルホン酸（３ａ、６０ｇ）と酢酸（５００ｍｌ）を混合し、６時間加熱還流した。溶媒を濾過し、ロータリーエバポレーターにかけ、真空下で乾燥させた。固体をメタノール（１Ｌ）に溶解させた。これに、２Ｍの水酸化カリウムメタノール溶液（３００ｍｌ）を添加した。混合物を３時間撹拌し、次いでロータリーエバポレーターを用いて溶媒の体積を５０％減少させた。得られた沈殿を濾過し、メタノールで洗浄し、真空下で乾燥させた。収量６０ｇ。ＭＳ（ＬＣＭＳ）：ＭＨ＋３６２。精密質量：実測値３６２．０７２９。ＭＨ＋＝Ｃ１４Ｈ２０ＮＯ６Ｓ２の所要ｍ／ｚ３６２．０７３２（−０．８ｐｐｍ）。
【０１４２】
（３ｃ）２，３−ジメチル−１，３−ビス（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホネート二カリウム塩
【０１４３】
【化１９】
2010527922.tif 000023
【０１４４】
２，３−ジメチル−３−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドール−５−スルホン酸（３ｂ、６０ｇ）を、１，４ブタンスルトン（１８０ｇ）及びテトラメチレンスルホン（１４６ｍｌ）と１４０℃で１６時間加熱した。得られた赤色固体をジエチルエーテルで洗浄し、粉末に粉砕し、真空下で乾燥させた。収量６０ｇ。
【０１４５】
（３ｄ）ＴＦＡ塩としてのＣｙ５＊＊
１−（５’−カルボキシペンチル）−２，３，３−トリメチル−インドレニウムブロミド５−スルホン酸Ｋ＋塩（２．７ｇ）、マロンアルデヒドビス（フェニルイミン）一塩酸塩（９６０ｍｇ）、無水酢酸（３６ｍｌ）及び酢酸（１８ｍｌ）を１２０℃で１時間加熱して暗赤褐色溶液を得た。反応混合物を室温まで冷却した。２，３−ジメチル−１，３−ビス（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホネート（３ｃ、８．１ｇ）及び酢酸カリウム（４．５ｇ）を混合物に添加し、室温で１８時間撹拌した。得られた青色溶液を、酢酸エチルを用いて沈澱させ、真空下で乾燥させた。粗製色素を、液体クロマトグラフィー（ＲＰＣ１８、水＋０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ＋０．１％ＴＦＡの勾配）で精製した。主な色素ピークを含む画分を回収し、プールし、真空下で蒸発させて標記色素２ｇを得た。紫外／可視（水＋０．１％ＴＦＡ）：６５０ｎｍ。ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）：ＭＨ＋８８７．１。ＭＨ＋＝Ｃ３８Ｈ５０Ｎ２Ｏ１４Ｓ４の所要ｍ／ｚ８８７．１。
【０１４６】
例４：２−［（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）−５−（１−｛６−［（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ］−６−オキソヘキシル｝−３，３−ジメチル−５−スルホ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン）ペンタ−１，３−ジエニル］−３−メチル−１，３−ビス（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホネートジイソプロピルエチルアミン塩（Ｃｙ５＊＊のＮＨＳエステル）の合成
【０１４７】
【化２０】
2010527922.tif 000024
【０１４８】
Ｃｙ５＊＊（例３、１０ｍｇ）を、無水ＤＭＳＯ（３ｍｌ）中に溶解し、これにＨＳＰｙＵ（２０ｍｇ）及びＮ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン（８０μｌ）を添加した。得られた溶液を３時間混合し、ＴＬＣ（ＲＰＣ１８、水／ＭｅＣＮ）で反応が完結したことを確認した。色素を酢酸エチル／ジエチルエーテル中で沈澱させるて単離し、濾過し、酢酸エチルで洗浄し、真空下で乾燥させた。紫外／可視（水）６５０ｎｍ。ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）：ＭＨ＋９８３．５。ＭＨ＋＝Ｃ４２Ｈ５３Ｎ３Ｏ１６Ｓ４の所要ｍ／ｚ９８４．１６。
【０１４９】
例５：ＲＧＤ−Ｃｙ５＊＊色素コンジュゲート（化合物４）の合成
【０１５０】
【化２１】
2010527922.tif 000025
【０１５１】
Ｃｙ５＊＊ＮＨＳエステル（２ｍｇ、例４）及びｓｙｍ−コリジン（２μＬ）をＮＭＰ（１ｍＬ）に溶解した溶液を、ＲＧＤペプチド（例１、６．４ｍｇ）及びｓｙｍ−コリジン（２μＬ）をＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解した溶液に滴下し、反応混合物を一晩撹拌した。次いで、混合物を１０％ＡＣＮ／水０．１％ＴＦＡ（６ｍＬ）で希釈し、生成物を分取ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ５μ  Ｃ１８（２）２５０×２１．２０ｍｍカラム；溶媒Ａ＝水／０．１％ＴＦＡ、溶媒Ｂ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ、４０分間１０〜２０％Ｂの勾配、流量１０ｍｌ／分、２１４ｎｍで検出）で精製し、２．３ｍｇ（７２％）の純粋標品（分析ＨＰＬＣ：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ３μ、Ｃ１８（２）２０×２ｍｍカラム；溶媒Ａ＝水／０．１％ＴＦＡ、溶媒Ｂ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ、５分間１０〜４０％Ｂの勾配、流量０．６ｍｌ／分、保持時間２．２８分、２１４ｎｍ及び２５４ｎｍで検出）を得た。質量分析法でさらに特性決定を行い、ｍ／ｚ値１０６４．５［ＭＨ２＋］を得た。
【０１５２】
例６：ＲＧＤ−Ａｌｅｘａ６４７色素コンジュゲート（化合物６）の合成
【０１５３】
【化２２】
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【０１５４】
Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７ＮＨＳエステル（２ｍｇ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ａ２０１０６）及びｓｙｍ−コリジン（３．２μＬ）をＮＭＰ（１．４ｍＬ）に溶解した溶液を、ＲＧＤペプチド（例１、１５ｍｇ）及びｓｙｍ−コリジン（３．２μＬ）をＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解した溶液に滴下し、反応混合物を一晩撹拌した。次いで、混合物を水／０．１％ＴＦＡ（６ｍＬ）で希釈し、生成物を分取ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ５μ  Ｃ１８（２）２５０×２１．２０ｍｍカラム；溶媒Ａ＝水／０．１％ＴＦＡ、溶媒Ｂ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ、４０分間１０〜２５％Ｂの勾配、流量１０ｍｌ／分、２１４ｎｍで検出）で精製し、２．７ｍｇ（５３％）の純粋標品（分析ＨＰＬＣ：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ３μ、Ｃ１８（２）２０×２ｍｍカラム；溶媒Ａ＝水／０．１％ＴＦＡ、溶媒Ｂ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ、５分間１０〜４０％Ｂの勾配、流量０．６ｍｌ／分、保持時間１．９９分、２１４ｎｍ及び２５４ｎｍで検出）を得た。質量分析法でさらに特性決定を行い、ｍ／ｚ値１０５０．４［ＭＨ２＋］を得た。
【０１５５】
例７：化合物１〜８の血漿安定性
マウス血漿（非滅菌）はＲｏｃｋｌａｎｄ社（米国ペンシルベニア州）から購入した。この血漿はヘパリンナトリウムで安定化されている。ＰＢＳ及び血漿中に物質をそれぞれ濃度０．１／０．２ｍｇ／ｍＬで溶解した。両ブランク試料（ペプチドなしの溶媒）及び血漿／ＰＢＳに溶解したペプチドを、３７℃で約４時間インキュベートした。インキュベート後、タンパク質をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社製フィルタインサートを備えた非滅菌Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ（商標）ＭＣ遠心チューブ（Ａｍｉｃｏｎ）を用いた限外濾過で除去した。上記フィルタのカットオフは３００００ＮＭＷＬであった。遠心前に、血漿試料は水で１：１に希釈した。試料は可視光検出を用いたＨＰＬＣで分析した。
【０１５６】
物質は、ＰＢＳ中に濃度０．１ｍｇ／ｍＬで溶解させた。超遠心試料の蛍光強度は、プレートリーダを備えたＦｌｕｏｒｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ（商標）ＦＬ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ社（フィンランド））を用いて測定した。励起波長は６４６ｎｍ、発光波長は６７８ｎｍであり、測定は２通りの異なる物質濃度（６．５μｇ／ｍＬ血漿及び２３μｇ／ｍＬ血漿）で実施した。
【０１５７】
本実験では、紫外−可視検出器を備えたＵｌｔｉｍａｔｅ  ３０００マイクロ液体クロマトグラフを用いた。溶液は強い青未を帯びており、６５０ｎｍで十分な吸収を示す。
【０１５８】
クロマトグラフィーは、Ｗａｔｅｒｓ社製のＸ−Ｔｅｒｒａ  ＲＰ１８カラム２．１×１５０ｍｍ（３．５μｍ粒子、アセトニトリル（ＡＣＮ）とリン酸塩緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．１）の勾配溶出、検出波長６５０ｎｍ、流速０．１ｍＬ／分、注入体積：５μＬ）を用いて実施した。勾配は緩衝液中２２％ＡＣＮで開始し、１２分間で５０％ＡＣＮに直線的に増加し、次いで勾配を２分間で急激に９０％ＡＣＮに直線的に増加し、次いで出発混合物に平衡化した。合計分析時間は２０分間であり、主ピークの保持時間は約９分であった。分解／不純物を主ピークの純度の変化として報告する。結果を表４に示す。
【０１５９】
【表４】
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【０１６０】
例８：化合物１〜８の蛍光偏光血漿タンパク結合アッセイ
化合物１〜８を、ヒト血漿及びアッセイ緩衝液（ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ）を用いる蛍光偏光タンパク質結合アッセイで試験した。４０μｌのペプチド（約５μＭ）を、４０μｌのＰＢＳ又はヒト血漿中でインキュベートした。Ｔｅｃａｎ  Ｓａｆｉｒｅプレートリーダ（Ｅｘ６３５／Ｅｍ６７８）で蛍光偏光を測定し、データは血漿添加時の偏光値の増加％として報告する。
【０１６１】
結果を表５に示す。
【０１６２】
【表５】
2010527922.tif 000028
【０１６３】
例９：化合物１〜８のコラーゲン結合アッセイ
市販のコラーゲンコート９６ウェルプレートを使用した（ＢＤ  Ｂｉｏｃｏａｔ商品コードＢＤＡＡ３５６６４９，Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（米国マサチューセッツ州ベッドフォード、ツー・オーク・パーク）。３０ｎＭ、１００ｎＭ又は３００ｎＭ（幾つかの事例では１０００ｎＭも含む）の各試験化合物から３通りのウェルを作り、プレートをプレートリーダで１分毎に振盪しながら３７℃で１時間インキュベートした＊。各ウェルの容量は２００μｌであった。インキュベートが終了したら、１５０μｌの上清を未処理９６ウェルプレートに移し、蛍光を励起６４６ｎｍ及び発光６７８ｎｍ波長で読み取った。
＊化合物３は、加熱室で５分毎に振盪しながら３７℃でインキュベートした（蓋付マイクロプレート）。
【０１６４】
結合度の計算には、上清からの蛍光を、初期濃度が同じ１５０μｌのアリコートの蛍光と比較した。いずれの場合も、３つのウェルからのメジアン値を使用した。結果を表６に示す。
【０１６５】
【表６】
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【０１６６】
例１０：化合物１〜８の競合アッセイ
αｖβ３受容体を発現する膜に対するＲＧＤ−ＣｙＤコンジュゲート（化合物１〜８）の親和性（Ｋｉ）を調べるため、１２５Ｉ−エキスタチンを用いた従来の競合アッセイを実施した。Ｋｉは、ヒト内皮細胞から調製した膜での受容体競合試験で求めた。αｖβ３を始めとする数種類のインテグリンを発現するヒト内皮腺癌細胞株ＥＡ−Ｈｙ９２６から膜を調製し、受容体源として用いた。αｖβ３を含めた数種類のインテグリンに対する公知の基質である１２５Ｉ−エキスタチンの競合的結合を、様々な濃度の非放射性化合物で実施した。結果を表７に示す。
【０１６７】
【表７】
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【０１６８】
例１１：化合物１〜８のインビボ試験
（ａ）動物モデル
本実験では、雌ＢＡＬＢｃ／Ａヌード（Ｂｏｍ）マウスを使用した。動物の使用については地元の倫理委員会の承認を得た。これらの動物は免疫無防備状態にあるので、ＨＥＰＡフィルタ濾過空気を供給する個別換気ケージ（ＩＶＣ，Ｓｃａｎｂｕｒ社製）に収容した。動物は、「Ｒａｔ  ａｎｄ  Ｍｏｕｓｅ  ｎｒ．３  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ」飼料（Ｓｃａｎｂｕｒ社）及びＨＣｌを１ｍＭモル濃度に添加して酸性化した水道水（ｐＨ３．０）を随時摂取できる状態にあった。撮像前の取扱い及びすべての手順に際して動物を保護するため、層状ＨＥＰＡフィルタ濾過空気の条件下で取り扱った。
【０１６９】
動物には、５日間以上の順化期間をおいてから、２箇所（肩及び左下腹部）にＨＴ−２９腫瘍細胞懸濁液を、体積１００μｌの注射当たり２．５〜３×１０６細胞の公称用量で皮下注射した。皮下注射は軽いガス麻酔下で実施した。腫瘍は２〜４週間増殖させた。
【０１７０】
光学イメージング中に固定しておくため、動物を同軸開口マスク中でキャリアガスとしての酸素と共にイソフルラン（通例１．５〜２％）で軽い外科手術レベルの麻酔状態に麻酔した。撮像時（最大３時間）に正常な体温を保つため、動物に電気毛布から外部熱を供給した。造影剤を投与するためのＶｅｎｆｌｏｎカテーテルを尾静脈に挿入した。各動物には造影剤を１回注射した。
【０１７１】
皮膚内のイメージングプローブからアーチファクトを除くため、撮像前に腫瘍及び筋肉の上の直径約３ｍｍの皮膚片を除去したが、その際動物は麻酔した。動物は実験終了後に頸椎脱臼により屠殺した。
【０１７２】
（ｂ）イメージングプロトコール
レーザーは、出力を安定化させるため実験開始の１５分以上前に電源を入れておいた。小さな白色プリンター用紙の束を撮像してフラットフィールド画像を得て、これを用いて照明の不均一性を補正した。動的イメージングのため、動物を温度４０℃の電気毛布（ＢｉｏＶｅｔ社）上の撮像用暗箱内に入れた。呼吸及び体温を用いて撮像中の麻酔深度を監視した。動物は１度に１回撮像した。すべての動物について、レーザ光源及び白色光源で注射前の画像を撮像した。いずれの光源についても、白色光画像を受信周波数で照明された画像にするため発光フィルタを置いた。
【０１７３】
試験物質をＶｅｎｆｌｏｎを介して静脈内注射し、０．２ｍｌの生理食塩水でフラッシュした。注射開始から３０秒毎に新たな画像１枚撮像して、時系列画像を得た。画像はローカル保存してからサーバに移した。
【０１７４】
画像分析は特注ＭＡＴＬＡＢソフトウェアで実施した。関心領域は、皮膚で覆われていない腫瘍及び筋肉の部分に設けた。第３の領域は、信号を損なう腫瘍又は腎臓組織が下に存在しない皮膚の部分に置いた。各領域内のピクセル値の平均信号を算出した。平均信号及びピクセル標準偏差を算出した。
【０１７５】
（ｃ）結果
例７〜１０のインビトロデータに基づいて、化合物１、２、４及び６で得られたインビボ結果を示す。腫瘍増強は、平均腫瘍部強度を平均筋肉部強度で除した比として定義される標的／バックグラウンド比（ＴＢＲ）として定量化される。
【０１７６】
化合物２（ｎｅｇ−ＲＧＤスクランブルペプチド）はＴＢＲが１．１４であった。化合物１［Ｃｙ５（２）−ＲＧＤ］のＴＢＲ比は１．４３であった。化合物４及び６は、それぞれＴＢＲ比が１．７２及び１．９８で、期待された改善を示している。結果を図１に示す。
【図１】
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【国際調査報告】
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