(57)【要約】  本発明は、特定の試薬での、アネキシンＡ３（ＡＮＸＡ３）及び／又はＡＮＸＡ３に対する自己抗体を含む前立腺癌の診断方法に関する。該方法は、良性の前癌から悪性の状態までの分化を可能にする。さらに、該方法は、予後の関連を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料を、アネキシンＡ３の細胞内分布に関して分析する、癌の診断方法。
【請求項２】
前記癌が、尿生殖器及び／又は胃腸管の癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該癌が、上皮癌である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
該癌が、前立腺癌である、請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
試薬が、抗体である、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１から５までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
組織化学的方法である、請求項１から６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記試料が、組織試料、特に生検材料である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記のアネキシンＡ３の細胞内分布を、上皮細胞において、特に前立腺上皮細胞において測定する、請求項１から８までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
（ｉ）良性状態、
（ｉｉ）前癌状態、及び
（ｉｉｉ）悪性状態
から選択される疾病段階の鑑別診断を含む、請求項１から９までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも１つのさらなるマーカーを測定する、請求項１から１０までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記のさらなるマーカーが、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）及び／又は前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
アネキシンＡ３に対する自己抗体をさらに測定する、請求項１から１２までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
癌、特に前立腺癌の診断方法であって、その際、試料、例えば組織又は体液試料を、アネキシンＡ３の存在、量及び／又は細胞内分布に関して、並びにアネキシンＡ３に対する自己免疫反応に関して分析し、その際、該自己免疫反応は、有利には、アネキシンＡ３及び／又はプロスタソーム／エキソソームに対する自己抗体の存在によって、又はＡＮＸＡ３陽性の制御性Ｔ細胞の存在によって特徴付けられる、診断方法。
【請求項１５】
癌、有利には前立腺癌の診断方法であって、その際試料を、アネキシンＡ３に対する自己抗体の存在及び／又は量に関して、及び場合により制御性Ｔ細胞の存在及び／又は量に関して分析する、診断方法。
【請求項１６】
アネキシンＡ３の不在が、特に手術後の進行の高いリスクを有する、前立腺癌の侵襲性の亜群を示す、請求項１から１５までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
進行性前立腺癌の中間のリスクを有するように分類させた、被験者の層別化方法であって、その際、該被験者からの試料を、アネキシンＡ３の存在及び／又は量に関して分析する方法。
【請求項１８】
（ｉ）アネキシンＡ３を測定するための試薬、並びに
（ｉｉ）アネキシンＡ３に対する自己抗体を測定するための試薬及び／又は制御性Ｔ細胞を測定するための試薬
を含む、癌の診断のための試験試薬。
【請求項１９】
前立腺癌の診断のための、請求項１８に記載の試薬。
【請求項２０】
アネキシンＡ３に対する自己抗体を測定するための試薬を含む、前立腺癌の診断のための試験試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の試薬での、アネキシンＡ３（ＡＮＸＡ３）及び／又はＡＮＸＡ３に対する自己抗体の測定を含む前立腺癌の診断方法に関する。該方法は、良性、前癌及び悪性の状態までの分化を可能にする。さらに、該方法は、予後の関連を有する。
【０００２】
以前の示差定量タンパク質発現の研究において、ＡＮＸＡ３が、前立腺癌と極めて関係があることを示した（１）。しかしながら、ヒト前立腺におけるＡＮＸＡ３の役割及び生物学については、殆ど知られていない。これまでは、ＡＮＸＡ３が、放出された小さな小胞が上皮の多様性を形成する、いわゆるエキソソームの一部であり（２）、該エキソソームが、先天性免疫系の制御における完全に理解されていない役割を有し（３）、かつそれらが、ごく最近発見された抗腫瘍活性を有する（４）ことを示している。最近の報告は、前立腺からのエキソソームである、いわゆるプロスタソーム（ｐｒｏｓｔａｓｏｍｅ）に対する前立腺癌患者における自己免疫（５）を示している。
【０００３】
前立腺癌及び尿路の他の上皮癌の治療又は診断のためのタンパク質バイオマーカーは、ＵＳ ２００５ １３０ ８７６号、ＷＯ ０３ ０８６ ４６１号、ＷＯ ２００５ ０７８ １２４号、ＥＰ ０５ ０１１ ０４２．８号及びＥＰ ０５ ０２６ ０９２．６号において記載されている。これらの文献の内容は、参照をもって本明細書に組み込まれたものとする。
【０００４】
ＵＳ ６０／８１２，０８９号及びＵＳ ６０／８５９，４８９号は、癌の診断を開示しており、その際試料は、非常に特異的なモノクローナル抗体で、アネキシンＡ３の存在及び／又は量に関して分析される。これらの文献の内容は、参照をもって本明細書に組み込まれたものとする。
【０００５】
ＡＮＸＡ３は、前立腺癌のためのマーカーとして公知であるが、良性、前癌及び悪性の状態までの分化の診断のための改良された方法を要求する。
【０００６】
現在の研究の目的の一つは、良性の前立腺上皮、高グレードの前立腺上皮内腫瘍（ＨＧＰＩＮ）及び前立腺癌の上皮構成要素におけるＡＮＸＡ３の発現及び局在化を研究すること、並びに前立腺の悪性転換の過程における分化及び局在化の変化を理解することであった。
【０００７】
本発明によって、良性の前立腺組織における抗ＡＮＸＡ３染色は、強く、かつ先端部である一方で、癌においては、弱く、かつより基底部であることを見出している。１９００より多い症例に関する組織アレイ研究は、良性、前癌及び悪性の前立腺組織におけるＡＮＸＡ３発現の種々のパターンが、予後の関連を有し、かつ機械論の理解を提供することを示している。
【０００８】
進行癌において、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）のための対比染色と共存する、非上皮性散在性細胞におけるＡＮＸＡ３の存在が観察された。さらに、ＡＮＸＡ３に対する自己抗体の存在を、癌患者において検出することができた。それらのＡＮＸＡ３に対する自己抗体は、癌細胞の酸化ストレス下で、おそらく誘発される。これは、エキソソームによるＡＮＸＡ３の放出が、癌細胞が前立腺癌患者におけるＡＮＸＡ３を含有するプロスタソームに対する自己免疫を誘発することによって置き換えようとする防御機構を構成することの証明を提供する。従って、Ｔｒｅｇｓのシグナリングが、ＡＮＸＡ３エキソソーム及び／又は癌細胞によって調整されてよい。さらに、プロスタソーム／エキソソームに対する自己免疫抗体は、ＡＮＸＡ３−陽性Ｔ細胞によって誘発／制御されてよい。
【０００９】
これらを一緒に考えると、良性前立腺肥大（ＢＰＨ）中の前立腺の細胞外構成要素へのＡＮＸＡ３の放出が、癌に対する防御機構を構成し、かつ癌性組織が、ＡＮＸＡ３に対する自己免疫抗体の誘導によって、及び制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）を含む機構によって、最終的にはこの放出を弱めることを強く示している。種々のＡＮＸＡ３染色パターンは、初めて、Ｇｌｅａｓｏｎスコア、ｐＴ−ステージ及びＰＳＡによって層別化した患者の中間リスク群におけるＰＳＡ無増悪生存期間を予想する可能性も提供する。
【００１０】
最初の観点において、本発明は、癌、有利には前立腺癌の診断方法に関し、その際組織試料は、アネキシンＡ３の細胞内分布に関して分析される。
【００１１】
他の観点において、本発明は、癌、特に前立腺癌の診断方法に関し、その際試料、例えば組織又は体液試料は、アネキシンＡ３の存在、量及び／又は細胞内分布に関して、並びにアネキシンＡ３に対する自己免疫反応に関して分析され、その際該自己免疫反応は、有利には、アネキシンＡ３に対する自己抗体の存在によって、及び／又は制御性Ｔ細胞の存在によって特徴付けられる。
【００１２】
本発明の他の観点は、癌、有利には前立腺癌の診断方法に関し、その際試料は、アネキシンＡ３に対する自己抗体の存在及び／又は量に関して、及び場合により制御性Ｔ細胞の存在及び／又は量に関して分析される。
【００１３】
さらに本発明の他の観点は、発達中の前立腺癌の中間リスクを有するように分類されている被験者の層別化のための方法に関し、その際該被験者からの試料は、アネキシンＡ３の存在、局在化及び／又は量に関して分析される。
【００１４】
さらに本発明の他の観点は、（ｉ）アネキシンＡ３を測定するための試薬、並びに（ｉｉ）アネキシンＡ３に対する自己抗体を測定するための試薬及び／又は制御性Ｔ細胞を測定するための試薬を含む、癌、特に前立腺癌の診断のための試験試薬である。
【００１５】
さらに本発明の他の観点は、アネキシンＡ３に対する自己抗体を測定するための試薬を含む、前立腺癌の診断のための試験試薬である。
【００１６】
本発明によって診断されてよい癌は、有利には、尿生殖及び／又は胃腸管の癌、例えば前立腺、膀胱、腎臓、尿道、卵巣、子宮又は大腸の癌である。特に、該癌は上皮癌である。特に好ましい一実施態様において、該癌は、前立腺癌である。
【００１７】
好ましい一実施態様において、本発明は、疾病段階及び／又は予後評価の鑑別診断を含む。例えば、本発明は、
（ｉ）良性状態、特に良性の前立腺の状態、例えば良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、線維症及び慢性前立腺炎、
（ｉｉ）前癌状態、例えば高グレード前立腺上皮内腫瘍（ＨＧＰＩＮ）を含む種々の段階の前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ−１−３）、並びに／又は
（ｉｉｉ）悪性状態、例えば前立腺癌、特にＧｌｅａｓｏｎスコア及び／又はｐＴ段階によって示される進行状態における進行前立腺癌
から選択される疾病段階の鑑別診断を可能にする。
【００１８】
より有利には、本発明は、一方では良性又は前癌状態、及び他方で悪性状態の鑑別診断を可能にする。
【００１９】
好ましい一実施態様において、ＡＮＸＡ３の存在、量及び／又は分布は、体液又は組織試料であってよい、試料において測定される。より有利には、該試料は、前立腺組織からの組織試料、例えば組織切片又は生検材料である。他の一実施態様において、ＡＮＸＡ３の細胞内分布／局在化は、試料において測定されてよく、その際該試料は、例えば前立腺組織からの組織試料、有利には組織切片又は生検材料である。有利には、ＡＮＸＡ３の細胞内局在化は、上皮細胞において、特に前立腺上皮細胞において測定される。存在、量及び細胞内局在化は、シグナル組織試料に対して、又は種々の試料、例えば同一の被験者からの体液試料及び組織試料に対して測定されてよいことに注意すべきである。
【００２０】
例えば組織試料の強い染色に対応する、試料における多量のＡＮＸＡ３は、主に良性状態に関して示している。例えば組織試料の弱い／中程度の染色に対応する、中程度の／低い量のＡＮＸＡ３は、前癌状態に関して、又は初期／初期−中間段階の悪性状態に対して示している。試料におけるＡＮＸＡ３の不在は、悪性状態に関して、主に進行段階における、例えば中間又は最終段階における悪性状態に関して示している。さらに、試料におけるＡＮＸＡ３の不在は、特に手術、例えば根治的前立腺切除術後の進行の高いリスクを有する、前立腺癌の侵襲性亜群に関して示している。
【００２１】
ＡＮＸＡ３の先端部の細胞内局在化、特に先端部に局在化された小胞、例えばエキソソーム及び／又はプロスタトソーム（ｐｒｏｓｔａｔｏｓｏｍｅ）におけるＡＮＸＡ３の存在は、主に良性又は前癌状態に関して示している。ＡＮＸＡ３の散在性の細胞内局在化は、特に先端部に局在化された小胞の不在との組合せで、悪性状態に関して示している。
【００２２】
ＡＮＸＡ３に対する自己免疫反応の存在、例えばＡＮＸＡ３に対する自己抗体の存在及び／又は強いＡＮＸＡ３−陽性（しかし細胞内にあり、先端部ではない）制御性Ｔ細胞の存在は、主に、悪性状態に関して、特に進行状態における悪性状態に関して示している。
【００２３】
本発明は、試料におけるポリペプチド又は細胞の測定を含む。有利には、この測定は、免疫学的方法を含み、その際測定される構成要素の存在、量及び／又は局在化は、免疫学的試験試薬を使用する。
【００２４】
試料におけるＡＮＸＡ３を測定するための試薬は、有利には、ＡＮＸＡ３に特異的である抗体、例えばポリクローナル又はモノクローナル抗体である。ＵＳ ６０／８１２，０８９号及びＵＳ ６０／８５９，４８９号において記載されている非常に特異的なモノクローナル抗体が特に好ましく、参照をもって本明細書に組み込まれたものとする。
【００２５】
試料におけるＡＮＸＡ３自己抗体を測定するための試薬は、有利には、自己抗体によって認識されるエピトープを含むそれらのＡＮＸＡ３ポリペプチド又は断片である。より有利には、ＡＮＸＡ３ポリペプチドは、組換えＡＮＸＡ３ポリペプチドである。
【００２６】
試料における制御性Ｔ細胞を測定するための試薬は、有利には、制御性Ｔ細胞のためのマーカー、例えばＣＤ２５もしくはＦｏｘｐ３又は他のかかるマーカーに対する抗体である。
【００２７】
本発明の方法は、自動装置に好適な試験形式を含む、免疫学的測定に好適なあらゆる試験形式において実施されてよい。いくつかの試験形式においては、ラベリング基、例えば視覚的マーカー、例えばラテックス又は金ビーズ、蛍光マーカー基、酵素マーカー基等を有する試薬を使用することが有利であってよい。試薬及びラベリング基の共役は、標準的な方法によって、例えば、試薬の反応性アミノ酸側基、例えばカルボキシ基、アミノ基及び／又はチオール基に対する、ラベリング基を用いた、例えば二官能性スペーサー分子を介した共有結合によって製造されてよい。
【００２８】
この試料は有利には、ヒト被験者から得られる。いくつかの実施態様において、前記の方法は、非侵襲性の診断方法であり、その際前記試料は、例えば尿試料、特に、圧搾液尿（ｅｘｐｒｉｍａｔｅ ｕｒｉｎｅ）試料又は糞便試料であってよい。所望される場合に、該試料は、前処理法、例えばゲル濾過にかけられてよい。さらに他の実施態様において、前記方法は、組織化学的方法であってよく、その際その試料は、組織試料、特に生検材料、例えばＴＵＲ−Ｐ（前立腺の経尿道的切除）からのパンチもしくは切開生検材料又は試料であってよい。組織化学的な手法において、細胞内又は細胞外ＡＮＸＡ３の選択的な測定は、試料内でのＡＮＸＡ３の局所化の測定によって実施されてよい。
【００２９】
好ましい一実施態様において、本発明は、ＡＮＸＡ３の半定量又は定量を含む。この半定量又は定量は、所定のカットオフ値に基づく試験結果の評価、及び評価の結果と疾病段階との相互関係を含んでよい。カットオフ値は、公知の方法による、健康な人及び／又は所定の疾病段階を有する人からの試料におけるＡＮＸＡ３の測定によって測定されてよい。さらに、試料におけるＡＮＸＡ３の量は、染色された組織試料の評価及び評価の結果と疾病段階との相互関係によって測定されてもよい。
【００３０】
本発明は、自己免疫反応、例えばＡＮＸＡ３に対する自己抗体及び／又は制御性Ｔ細胞の存在の測定にも関する。この測定は、個々に又はＡＮＸＡ３の測定との組合せで実施されてよい。自己抗体の存在は、悪性状態、特に進行段階における悪性状態に関して示している。自己抗体の測定は、場合により、制御性Ｔ細胞の測定と組み合わせられる。制御性Ｔ細胞の存在は、悪性状態、特に進行段階における悪性状態に関して示している。
【００３１】
前記の試料は、細胞外の及び細胞内のＡＮＸＡ３の別個の測定を可能にする分画化法にかけられてよい。例えば、該試料は、細胞ペレット及び上清を得るために遠心分離されてよく、その際細胞内アネキシンＡ３は、細胞ペレット中で測定され、かつ細胞外アネキシンＡ３は、上清中で測定される。特に好ましい一実施態様において、前記方法は、細胞外ＡＮＸＡ３の選択的測定を含む。さらに特に好ましい一実施態様において、前記方法は、細胞内ＡＮＸＡ３の選択的測定を含む。
【００３２】
本発明の方法は、他の癌マーカー、例えば癌マーカーの測定をさらに含んでよい。他のマーカーの測定は、同一試料中で実施されてよく、その際、ＡＮＸＡ３は、種々の試料、例えば血液、血清及び／又は血漿試料中で測定される。血液、血清又は血漿マーカー、特にカリクレインプロテアーゼファミリーの少なくとも１つのメンバー、例えば、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）及び／又は少なくとも１つの上皮細胞マーカー、特に前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）の測定が、特に好ましい。
【００３３】
本発明は、スクリーニング法であってよく、その際個人又は個人群は、癌、特に前立腺癌に関して試験される。一方で、前記方法は、診断評価又は治療追跡試験を含んでもよく、その際、癌、特に前立腺癌又はそれらの前駆段階に関して陽性を既に診断されている個人は、予後評価及び／又は治療調整モニタリングを受ける。
【００３４】
特に好ましい一実施態様において、本発明は、あらゆる診断評価における、特に治療調整のための高価なツールである、疾患の進行の予後評価に関する。予後評価は、単独又は他のマーカー、例えばＰＳＡとの組合せでの、ＡＮＸＡ３の測定に基づいてよい。例えば、組織学的評価によって、及び／又はＰＳＡ又は他の癌マーカーの測定レベルによって、患者は、低いリスク群（例えばＰＳＡレベル≦１０ｎｇ／ｍｌ）、中間のリスク群（例えばＰＳＡレベル＞１０及び＜２０ｎｇ／ｍｌ）、並びに高いリスク群（例えばＰＳＡレベル≧２０ｎｇ／ｍｌ）で分類されてよい。これらの患者群におけるＡＮＸＡ３の測定は、特に中間のリスク群であると分類されている患者において、他の価値のある情報を導いてよい。これらの中間のリスク患者が、ＡＮＸＡ３陽性である場合に、無ＰＳＡ生存率が、ＡＮＸＡ３に関して陰性であると測定されている患者におけるよりも有意に高くなる。従って、本発明は、個々の患者群のための他のリスクの層別化を可能にする。有利には、場合により中間のリスク群であると分類されている群における患者は、ＡＮＸＡ３の測定の結果に基づいて分類されてよい。ＡＮＸＡ３陽性である患者は、低いリスク群であると分類されてよく、かつＡＮＸＡ３陰性である（及び場合によりＡＮＸＡ３に対して自己免疫反応を有する）患者は、高いリスク群であると分類される。
【００３５】
さらに、本発明は、以下の図及び実施例により、より詳細に説明されるものである。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】ＡＮＸＡ３染色強度の相違及び局在化を示す図。
【図２】ＡＮＸＡ３染色の結果の概要を示す図。
【図３】種々の患者群における無ＰＳＡ生存時間とＡＮＸＡ３染色との関連を示す図。
【図４】無ＰＳＡ生存時間とＡＮＸＡ３状態との関連を示す図。
【図５】前立腺癌患者からの血清における自己抗体の存在を示す図。
【００３７】
図１は、良性の前立腺肥大試料（１Ａ）、中間Ｇｌｅａｓｏｎスコアを有する前立腺癌組織からの試料（１Ｂ）、及びＡＮＸＡ３陽性散在細胞を有する進行癌の組織断片（１Ｃ）における、ＡＮＸＡ３染色強度及び局在化の相違を示す。このタイプの細胞は、ＣＤ３（一般的なＴ細胞マーカー、１Ｄ）、並びに制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）のための特異的マーカーのＣＤ２５（１Ｅ）、及びＴｒｅｇｓのための他の特異的マーカーのＦｏｘｐ３（１Ｆ）に関する陽性も染色する。
【００３８】
図２は、それぞれの状態（良性状態、前癌状態ＰＩＮ及び悪性状態、すなわちＧｌｅａｓｏｎスコア（ＧＳ）によって分類された癌）から依存しているＡＮＸＡ３染色の結果（陰性、弱い、中程度、強い）の概要を示す：最も高い染色強度は、良性上皮において見出された。
（ａ）脱分化を増加することでＰＩＮ及び癌腫において増加された染色強度
（ｂ）先端ＡＮＸＡ３染色が、癌の重症度の増加と反比例して関連される。前立腺の悪性転換の種々の段階での双方のパラメータの相互関係は、ρ値＜０．００１で、非常に有意である。ＡＮＸＡ３、アネキシンＡ３；ＰＩＮ、前立腺上皮内腫瘍。
【００３９】
図３は、種々の患者群における無ＰＳＡ生存時間とＡＮＸＡ３染色との関連を示す。
（ａ）予後に関連のある亜群に分類することができる、先端部対散在性である染色パターンに関するＡＮＸＡ３陽性腫瘍のサブ分析
（ｂ）リスク群分類によるＰＳＡ無増悪生存率
（ｃ）最も大きいコホート（ｎ＝９６９）を示す中間のリスク群の、高い及び低いリスクの亜群（ρ＝０．０００１）への分類を可能にしたＡＮＸＡ３状態（陰性対陽性）による二段層化。ＡＮＸＡ３、アネキシンＡ３；ＰＳＡ、前立腺特異的抗原。
【００４０】
図４は、無ＰＳＡ生存時間とＡＮＸＡ３状態との関連を示す。陰性ＡＮＸＡ３染色状態は、無ＰＳＡ生存と著しく関連する。（ｂ）Ｇｌｅａｓｏｎグレード、（ｃ）ｐＴ段階、及び（ｄ）手術前ＰＳＡ（ｎｇ／ｍｌ）による無ＰＳＡ生存率。ＡＮＸＡ３、アネキシンＡ３；ＰＳＡ、前立腺特異的抗原。
【００４１】
図５は、前立腺癌患者からの血清における自己抗体の存在を示す。
【００４２】
実施例
１．材料及び方法
１．１ 抗体
この研究において、次の抗体を使用した：
Ｃｌｏｎｅ ｔｇｃ７ ＰｒｏＶＩＩ５Ｃ５（ＤＳＭ ＡＣＣ２７８０）、モノクローナル、２，４ｍｇ／ｍｌ；標的タンパク質ＡＮＸＡ３に対する。
【００４３】
１．２ 組織
３０００より多い組織試料を含有する既存の前立腺癌ＴＭＡを分析した。その組成物の詳細な説明を、結果の項目において提供する。
【００４４】
１．３ 免疫組織化学（ＩＨＣ）
ホルマリン固定組織におけるアネキシンＡ３の検出に好適なＩＨＣプロトコルを開発した。詳細なプロトコルを以下で示す。
【００４５】
ＡＮＥＸＡ３免疫染色（ＩＨＣ）プロトコル
スライド作成
・キシレン（ＧＦＳ  ２×５分キシレン）中でＴＭＡを少なくとも１時間脱パラフィン化する
・下降エタノール系列中で蒸留水に近づくまで再水和する
・ＰＢＳ緩衝液中で５分すすぐ
前処理（エピトープ検索）
・酢酸ｐＨ２中で５分間スライドを加圧殺菌する
・ＰＢＳ緩衝液中で５分すすぐ
ペルオキシダーゼ阻害
・１％Ｈ2Ｏ2／メタノール中で１０分間インキュベートする
・ＰＢＳ緩衝液中で２×５分すすぐ
抗体インキュベーション
・一次抗体（ＡＮＸＡ３）１：８１００（０．３μｇ／ｍｌ）をＰＢＳ中で希釈する
・組織／ＴＭＡ断片を希釈された抗体１００〜２００μｌで覆う
・２時間３０℃で湿室でインキュベートする
・ＴＲＩＳ−ＰＢＳ緩衝液（１：１０）中で２×５分すすぐ
・ＨＲＰ共役二次抗体（ＥｎＶｉｓｉｏｎ ＤＡＫＯ Ｋ４００３、抗ウサギ）を３０分間３０℃で適用する
・ＴＲＩＳ−ＰＢＳ緩衝液中で２×５分すすぐ
色原体
・スライドを１０分間ＤＡＢ−色原体（Ｌｉｑｕｉｄ ＤＡＢ ＤＡＫＯ Ｃｏｄｅ Ｎｏ．：Ｋ ３４６７）で、室温で覆う
・スライドをＰＢＳ緩衝液で完全に洗浄する
・１分秒間ヘマトキシリン（Ｈａｒｒｉｓ Ｈａｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ＨＴＸ ３１０００、Ｍｅｄｉｔｅ ＧｍｂＨ）で対比染色する
・水ですすぐ
・ＨＣｌ−エタノールブルー中で５分間、水増加エタノール系列で識別する
・キシレンで覆う。
【００４６】
１．４ ＨＣｌスコアリング
ある病理学者が、全ての染色を評価した。バージョンａ）それぞれの組織試料及び抗体に関して、膜染色強度を、４段階の尺度（０、１、２、３）における目視検査によって判定した。さらに、腫瘍細胞の染色陰性の断片を、４段階尺度（＜２０％、＞＝２０＜４０％、＞＝４０−＜９０％、＞９０％）で判定した。最終ＩＨＣスコアを、それらの２つのパラメータから確立した。
【００４７】
スコアの定義
【表１】
2010523990.tif 000002
確実な統計的分析のために、癌を、陰性（陰性）又は陽性（弱い、中程度、強い）として分類した。
【００４８】
１．５ データファイルの記載
この研究において生じた全てのデータを、データファイルで要約し、フィールド記述は以下である：
【表２】
2010523990.tif 000003
【００４９】
１．６ 統計
カイ二乗検定を使用して、種々の腫瘍サブセット間のＡＮＸＡ３発現の相違の確率を算出した。カプラン−マイヤー（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ）プロットを算出して、患者の予後に対するＡＮＸＡ３発現の影響に対処した。多変量分析のために、Ｃｏｘ回帰分析を実施した。
【００５０】
２．結果
１６７９の根治的前立腺切除術誘導検体の癌のコアを含む組織マイクロアレイの分析に基づいて、ＡＮＸＡ３に対する特異的抗体での免疫細胞化学からの典型的な画像（図１）は、良性前立腺肥大の典型的な検体（１Ａ）、中間Ｇｌｅａｓｏｎスコアを有する前立腺癌組織（１Ｂ）、及び進行癌（１Ｃ）におけるＡＮＸＡ３染色強度及び局在化の相違を示す。さらに、１３５の良性及び１２５の新生物発生前の病巣（高グレードＰＩＮ）のセットを分析した。
【００５１】
一般的に、ＡＮＸＡ３染色は、主に細胞質であり、かつ細胞質及び膜境界／小胞模様を有する細胞内分化を示した。良性腺上皮において、顕著な細胞及び核ＡＮＸＡ３染色が見られた。さらに、染色を、細胞の先端部で濃縮され、先端部で強調された細胞質染色パターンをもたらす、小さな細胞質小胞において見出した。細胞の先端部で、ＡＮＸＡ３陽性小胞の形成を、線管中への離出分泌法に対応して頻繁に観察した。
【００５２】
良性の分泌細胞及びＨＧＰＩＮ病巣は、先端部で強調された細胞質染色でほとんど陽性を均一に染色した。しかしながら、ＨＧＰＩＮにおいて、染色強度は、著しく低減した（ｐ＜０．０００１）。癌染色強度において、さらに著しい低減（２７％、ｐ＜０．０００１での陰性染色を含む）、及び先端部で強調された原形質染色パターンから散在性の原形質染色への明瞭な移行を観察した（ｐ＜０．０００１）。これらの結果の要約を、図２において示す。
【００５３】
陰性ＡＮＸＡ３染色を、ＰＳＡ（ｐ＝０．２９）ではなく、ｐＴ段階及びＧｌｅａｓｏｎスコア（ｐ＜０．０００１）と関連させた。カプラン−マイヤー分析は、著しく低減されたＰＳＡ無増悪生存期間を明らかにした（ｐ＜０．０００１、ログランク検定）。多変量分析において、陰性ＡＮＸＡ３染色は、独立した予後予測であることを示された（ＨＲ１．２０、ｐ＝０．００２）。詳細は、第１表及び第２表において提供される。
【００５４】
抗体染色による進行癌における散在シグナル細胞の他の分析は、それらの細胞が、主にＴ細胞（１Ｄ）及びより詳述すれば制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）であることを示した。それというのも、それらは、ＣＤ２５（１Ｅ）及びＦｏｘｐ３（１Ｆ）を示すからである（６）。Ｔｒｅｇｓは、最近、腫瘍特異的寛容に寄与することが報告されている（７）。
【００５５】
ＡＮＸＡ３陽性癌の分析に関して、それらはＧｌｅａｓｏｎスコア（ｐ＝０．０４）に対して相関があるが、しかし期待値に反して、高グレードの癌は、強度に染色された癌の最大の割合（３５．６％）を示し、かつ弱く染色された癌の割合は、低い及び高いグレードの癌（３５．６％対３６．３％）においてほとんど同一であった。染色強度は、ＰＳＡレベル（ｐ＝０．００２９）とも関係があった。ＡＮＸＡ３に関してより強度に染色された癌は、ＰＳＡカテゴリー≧２０ｎｇ／ｍｌ（４１．１％）で最も頻繁に見出され、ＡＮＸＡ３に関する弱い染色は、ＰＳＡカテゴリー２０ｎｇ／ｍｌ未満で最も頻繁に見出された。局所的進行癌において低減された染色強度の傾向があったが、しかしながら、これは、統計的相違に達しない（ｐ＝０．０６３０）。
【００５６】
ＰＳＡ経過観察は、１３１７人の患者において可能であった。生化学的再発を、２回の連続測定で、ＰＳＡ＞＝０．１ｎｇ／ｍｌとして定義した。３５４人の患者は、ＰＳＡ再発を生じた。全ての経過観察にわたる中央値は、３３ヶ月であり、再発しない患者の経過観察の中央値は、３９ヶ月であった。ＡＮＸＡ３−単変量分析の実施は、ＡＮＸＡ３に関する陰性染色が、ＡＮＸＡ３陽性腫瘍と比較して有意に低減させた無ＰＳＡ生存期間と関連した（ｐ＜０．０００１）ことを示すことができた。染色パターンに関するＡＮＸＡ３陽性腫瘍のサブ分析を、さらにこの群の患者を２つの予後に関係のある亜群に分類することが可能であった。予後は、それらの先端染色された相当品と比較して、散在性の上皮染色を有するＡＮＸＡ３陽性腫瘍において著しく悪かった（ログランク試験ｐ＝０．００１３、図３Ａ）。
【００５７】
ＡＮＸＡ３状態が、十分に確立された古典的予後パラメータＰＳＡ、Ｇｌｅａｓｏｎグレード及びｐＴ段階の併用に関連する予後を有するかどうかをさらに調査するために、３つのリスク群へコホートを分けた。ＰＳＡによって、患者のグレード及び段階を、低い、中間の、及び高い進行のリスクで分類した。進行の低いリスクにおいて、手術前のＰＳＡは、１０ｎｇ／ｍｌ以下であり、前立腺切除検体のＧｌｅａｓｏｎスコアは、６以下であり、かつ癌は、制限された。進行の高いリスクにおいて、手術前のＰＳＡは、２０ｎｇ／ｍｌより多く、前立腺切除検体のＧｌｅａｓｏｎスコアは、７以上であり、かつ腫瘍段階は、≧ｐＴ３であった。低くも高くもないものは、中間リスク群に割り当てた。
【００５８】
図３Ｂにおいて見られるように、リスクの分類区分は、著しく異なる進行のリスクを示した（ｐ＜０．０００１）。ＡＮＸＡ３状態（陰性対陽性）による二段層化を、最も大きいコホート（ｎ＝９２２）を示す中間のリスク群の、高い及び低いリスクの亜群への分類を可能にした（ｐ＝０．０００１）。低い又は高いリスク群において定義されることができた亜群はなかった（第３表）。中間リスクのカプラン−マイヤー分析は、ＡＮＡ３陰性患者に関する著しく低減されたＰＳＡ ＰＦＳも示した（図３Ｃ）。
【００５９】
ＡＮＸＡ３に関する陰性染色を、ＡＮＸＡ３陽性腫瘍と比較して、著しく低減された無ＰＳＡ生存時間と関連させた（ρ＜０．０００１、図４Ａ）。しかしながら、染色スコア（弱い対中程度対強い）に関するＡＮＸＡ３陽性癌の層別化は、予後関連亜群を示すことに失敗した（ログランク試験、ρ＝０．６４２、データは示されていない）。ＡＮＸＡ３染色（陰性対陽性）に加えて、単変量分析は、確立された予後因子Ｇｌｅａｓｏｎスコア、ｐＴ段階、及び手術前ＰＳＡ血清レベルに関する予後の有意性も示した（ｐ＜０．０００１、図４Ｂ〜Ｄ）。
【００６０】
癌患者における抗ＡＮＸＡ３自己免疫の可能性を、サンドイッチＥＬＩＳＡにおける組換えＡＮＸＡ３に対する免疫反応に関する患者の血清のスクリーニングよって試験することを行った。コントロールは、ホスホセリン被覆を有する及び有さない、ＡＮＸＡ５、ＭＣＶ、Ａｎａを含んだ。実際に、いくつかの前立腺癌患者において非常に高く特異的な抗ＡＮＸＡ３滴定濃度が見られた。図４において示されているように、それらの患者の１人のポリクローナル血清は、対応するモノクローナル抗ＡＮＸＡ３抗体での染色と比較して、組換えＡＮＸＡ３、前立腺癌細胞系（ＰＣ３細胞）からの天然ＡＮＸＡ３を染色する。この患者の全血からＢ細胞を分離すること、及び特異的モノクローナル抗体、組換えＡＮＸＡ３及びポジティブコントロールとしてＰＣ３細胞抽出物を使用することで、Ｂ細胞クローンを産出する対応する抗ＡＮＸＡ３抗体を分離及び培養して、そして、ヒトモノクローナル抗ＡＮＸＡ３抗体を生じることができた。対応するウェスタンブロットを、図５において示す。
【００６１】
３．考察
良性から悪性の前立腺上皮へ移行中のＡＮＸＡ３の局在化及び細胞内分布における一定変化、並びにその予後の意義は、前立腺組織の生物学におけるＡＮＸＡ３の重要な役割を示唆する。エキソソーム／プロスタソームにおけるタンパク質の報告された存在と一致して、前立腺の細胞外構成要素における分泌されたＡＮＸＡ３の存在（２）、及びこれらの小胞の提案された抗癌活性（４）は、ＡＮＸＡ３が、前立腺患者からの尿又はＰＣ３細胞抽出物における抗体で利用できるかどうかを試験することを導く。ＦＡＣＳ分析は、実際に、ＡＮＸＡ３が、潜在的に抗原性の表面タンパク質であることを示した（データは示されていない）。（ＡＮＸＡ３の診断値を評価する大量の臨床研究からの）癌及びＢＰＨ患者からの血清をスクリーニングすることで、小さいセットの癌患者の抗体を見出し、かつＢ細胞を生じる抗ＡＮＸＡ３抗体の対応するクローンを分離した。
【００６２】
早期の前立腺癌検出、ＰＳＡのための（８、９）、及び生検材料、又は完全な前立腺切除後の検体を使用したリスクアセスメントに関する困難な判断に関する（１０、１１）最新の標準バイオマーカーの不足の背景に対して、ＡＮＸＡ３は、総合診断タンパク質バイオマーカーの潜在性を示す。
【００６３】
ＡＮＸＡ３の重要な特徴の一つは、細胞内及び細胞外の分布並びに局在化が、前立腺癌の早期検出のための体液における安定な非侵襲性の検出を可能にするだけでなく、ＤＮＡ／ＲＮＡ分析（主に全体のＡＮＸＡ３の代用物のみを検出できる）で利用できない腫瘍生物学の重要な観点を反映することである。
【００６４】
結果は、より高次のＧｌｅａｓｏｎスコアの前立腺癌に対して、ＰＩＮによるＢＰＨからの前立腺の悪性転換中に徐々に失われる、有利にはエキソソーム／プロスタソームにおけるＢＰＨの前立腺上皮から選択されたＡＮＸＡ３の抗癌及び保護の役割と一致する。エキソソームＡＮＸＡ３の低減は、細胞外プロスタソームの表面抗原で意図された、制御性Ｔ細胞によって進行癌において誘発された自己免疫機構による。
【００６５】
初めて、中間リスク群における患者の多数の群を、さらに分布することができ、かつ経過観察の将来性、ＡＮＸＡ３を基礎とした前立腺癌の進行の予測に非常に関心のあるものであってよい。特定のこの前立腺癌におけるＡＮＸＡ３の分子の背景（１）、並びに癌の段階への前立腺悪性転換の免疫制御における役割、膜輸送、リンパ球遊走、細胞運動性及びシグナル変換におけるＡＮＸＡ３の役割（１２）、エキソソームにおける（２）及びプロスタソームにおける（１３）その存在を意図することは、特に関心がある。プロスタソームは、不活性免疫系を制御する（１４、１５）とみなされ、さらに最近、前立腺癌の種々の段階と関連づけされている（５、１６）。
【００６６】
組織と尿のＡＮＸＡ３の関連は、さらに、ＡＮＸＡ３の局在化及び放出の癌関連運動学を理解するのに役立つ。ここで促進された前立腺癌についてのマーカーとしてのＡＮＸＡ３の発見は、より一般的な合意を有すことが可能であり、それというのも２つのごく最近の報告が、逆に卵巣明細胞癌（１７）及び結腸直腸癌（１８、１９）に関する研究と同一の相互関係のあるマーカーとしてＡＮＸＡ３を見出したからである。それゆえ、ＡＮＸＡ３放出が、上皮腺癌のための、一般的な癌関連の役割を果たす仮説は、さらなる関心に値する。
【００６７】
前立腺癌における独立した予後因子であるＡＮＸＡ３のための陰性染色は、最も重要な研究の結果を表す。ＡＮＸＡ３のための陰性染色は、根治的前立腺切除術後の進行の高いリスクを有する前立腺癌の生物学的に侵襲性の亜群を特徴付ける。結論として、ＡＮＸＡ３は、標準の予後パラメータと組み合わせた場合に、個々の患者における予後のより正確な予測を提供し、かつ従って今後の患者の管理に起因することを示唆している、見込みのある候補組織のマーカーを表す。
【００６８】
表：
【表３】
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【００６９】
第１表：良性、前癌（ＰＩＮ）及び悪性の前立腺上皮におけるＡＮＸＡ染色
【表４】
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【００７０】
第２表：ＡＮＸＡ３染色と、ｐＴ段階、Ｇｌｅａｓｏｎスコア（ＧＳ）及びＰＳＡとの相互関係
【表５】
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【００７１】
第３表：ＡＮＸＡ３状態による生化学的再発率を示す進行のための低い、中間の及び高いリスクに患者を分類するリスク層別化
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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