(57)【要約】  ロイコトリエンＣ４シンターゼ（ＬＴＣ４Ｓ）の活性を調節することが期待される化合物を選択し又は設計する方法であって、ＬＴＣ４Ｓの触媒部位又は基質結合領域と相互作用することが予想される化合物を選択し又は設計する分子モデル化手段を使用する工程を含み、ここで、ＬＴＣ４Ｓの触媒部位又は基質結合領域の少なくとも一部の三次元構造が化合物の三次元構造と比較され、前記触媒部位又は基質結合領域と相互作用することが予想される化合物が選択される方法である。選択された化合物は、「ＧＳＨ基質結合キャビティ」（完全長ヒトＬＴＣ４Ｓの残基Ａｒｇ５１、Ａｒｇ３０、Ａｒｇ１０４、Ｇｌｎ５３、Ａｓｎ５５、Ｇｌｕ５８、Ｔｙｒ５９、Ｔｙｒ９３、Ｔｙｒ９７、Ｉｌｅ２７、Ｐｒｏ３７、Ｌｅｕ１０８又は均等な残基を含む残基によって形成される）；「親油性基質結合クレバス」（Ａｌａ２０、Ｌｅｕ２４、Ｉｌｅ２７、Ｔｙｒ５９、Ｔｒｐ１１６、Ａｌａ１１２、Ｌｅｕ１１５、Ｌｅｕ１０８、Ｔｙｒ１０９、Ｌｅｕ６２、Ｖａｌ１１９、Ｔｈｒ６６、Ｖａｌ１６及びＬｅｕ１７、又は均等な残基を含む残基によって形成される）；又は「触媒部位」（Ａｒｇ１０４又はＡｒｇ３１、又は均等な残基を含む残基によって形成される）と称される構造領域の少なくとも一部に結合することを予想することができる。【選択図】図４Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ロイコトリエンＣ４シンターゼ（ＬＴＣ４Ｓ）の活性を調節することが期待される化合物を選択し又は設計するための方法において、ＬＴＣ４Ｓの触媒部位又は基質結合領域と相互作用することが予想される化合物を選択し又は設計する分子モデル化手段を使用する工程を含み、ここで、ＬＴＣ４Ｓの触媒部位又は基質結合領域の少なくとも一部の三次元構造が化合物の三次元構造と比較され、前記触媒部位又は基質結合領域と相互作用することが予想される化合物が選択される方法。
【請求項２】
ＬＴＣ４Ｓの活性部位又は基質結合領域の少なくとも一部の三次元構造が、Ｎ末端ヘキサヒスチジンタグを含むＬＴＣ４Ｓポリペプチドに対して決定された三次元構造 (又はその一部) である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＬＴＣ４Ｓの活性部位又は基質結合領域の少なくとも一部の三次元構造が、ヒトＬＴＣ４Ｓポリペプチドに対して決定された三次元構造 (又はその一部) である請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＬＴＣ４Ｓの活性部位又は基質結合領域の少なくとも一部の三次元構造が、界面活性剤を含む母液溶液を使用して得ることができる結晶のＸ線解析により得ることができる三次元構造 (又はその一部)である請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
界面活性剤がドデシルマルトシド（ＤＤＭ）である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
母液溶液が、グルタチオン（ＧＳＨ）を含有する請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
ＬＴＣ４Ｓの活性部位又は基質結合領域の少なくとも一部の三次元構造が、表Ｉに示される構造座標（又はその一部分）によって表されるもの、又はそのような構造座標±２．０Å、１．５Å、１．０Å又は０．５Å未満のタンパク質骨格原子からの標準二乗偏差でモデル化された構造である請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
ＬＴＣ４Ｓの活性部位又は基質結合領域の少なくとも一部の三次元構造が、表ＩＩに示される構造座標（又はその一部分）によって表されるもの、又はそのような構造座標±２．０Å、１．５Å、１．０Å又は０．５Å未満のタンパク質骨格原子からの標準二乗偏差でモデル化された構造である請求項１から４又は６の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
選択された化合物が、「ＧＳＨ基質結合キャビティ」（完全長ヒトＬＴＣ４Ｓの残基Ａｒｇ５１、Ａｒｇ３０、Ａｒｇ１０４、Ｇｌｎ５３、Ａｓｎ５５、Ｇｌｕ５８、Ｔｙｒ５９、Ｔｙｒ９３、Ｔｙｒ９７、Ｉｌｅ２７、Ｐｒｏ３７、Ｌｅｕ１０８又は均等な残基を含む残基によって形成される）；「親油性基質結合クレバス」（Ａｌａ２０、Ｌｅｕ２４、Ｉｌｅ２７、Ｔｙｒ５９、Ｔｒｐ１１６、Ａｌａ１１２、Ｌｅｕ１１５、Ｌｅｕ１０８、Ｔｙｒ１０９、Ｌｅｕ６２、Ｖａｌ１１９、Ｔｈｒ６６、Ｖａｌ１６及びＬｅｕ１７、又は均等な残基を含む残基によって形成される）；又は「触媒部位」（Ａｒｇ１０４又はＡｒｇ３１、又は均等な残基を含む残基によって形成される）と称される構造領域の少なくとも一部をブロックし又はそれに結合することが予想される請求項１から９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
選択された化合物を合成し、精製し、及び／又は製剤化する工程を更に含む請求項１から９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
化合物がＬＴＣ４Ｓの活性を調節するかどうかを評価し、活性を調節する化合物を選択する工程を含む請求項１から１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
化合物が全細胞、組織又は生物中におけるＬＴＣ４シグナル伝達を調節するかどうかを評価し、活性を調節する化合物を選択する工程を含む請求項１から１１の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３】
化合物が全細胞、組織又は生物中におけるＬＴＣ４Ｓの活性を調節するかどうかを評価し、活性を調節する化合物を選択する工程を更に含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
選択された化合物を合成し、精製し、及び／又は製剤化する工程を更に含む請求項１０から１３の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ＬＴＣ４Ｓの活性を調節する化合物の製造方法であって、１）請求項１から１４の何れか一項に記載の方法を実施し、２）選択された化合物を合成し、精製し、及び／又は製剤化することを含む方法。
【請求項１６】
完全長ヒトＬＴＣ４ＳのＡｒｇ５１、Ａｒｇ３０、Ａｒｇ１０４、Ｇｌｎ５３、Ａｓｎ５５、Ｇｌｕ５８、Ｔｙｒ５９、Ｔｙｒ９３、Ｔｙｒ９７、Ｉｌｅ２７、Ｐｒｏ３７、Ｌｅｕ１０８、Ａｌａ２０、Ｌｅｕ２４、Ｉｌｅ２７、Ｔｙｒ５９、Ｔｒｐ１１６、Ａｌａ１１２、Ｌｅｕ１１５、Ｌｅｕ１０８、Ｔｙｒ１０９、Ｌｅｕ６２、Ｖａｌ１１９、Ｔｈｒ６６、Ｖａｌ１６及びＬｅｕ１７又はＡｒｇ３１に等価な一又は複数の残基が変異されている変異ＬＴＣ４Ｓポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１６に記載の変異ＬＴＣ４Ｓをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１８】
請求項１６に記載の変異ＬＴＣ４Ｓを発現させるのに適した請求項１７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
請求項１７又は１８に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項２０】
請求項１６に記載の変異ＬＴＣ４Ｓの製造方法であって、前記変異ＬＴＣ４Ｓを発現する請求項１９に記載の宿主細胞を培養し、前記変異ＬＴＣ４Ｓを単離することを含む方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法によって得ることができる変異ＬＴＣ４Ｓ。
【請求項２２】
ＬＴＣ４Ｓの活性を調節する化合物を同定し又は特徴付けする方法であって、請求項１６又は２１の何れかに記載の変異ＬＴＣ４Ｓの活性に対する化合物の効果、又はそれに対する化合物の結合能を決定する工程を含む方法。
【請求項２３】
請求項１６又は２１に記載の通りに変異されていないＬＴＣ４Ｓの活性に対する化合物の効果、又はそれに対する化合物の結合能を決定する工程を更に含む請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
（１）請求項１６又は２１に記載の変異ＬＴＣ４Ｓ、（２）請求項１６又は２１に記載されたように変異されていない対応するＬＴＣ４Ｓを含有するパーツのキット。
【請求項２５】
請求項１から３の何れか一項に記載のポリペプチドの三次元結晶形態。
【請求項２６】
空間群Ｆ２３に属し、及び／又は４８ＬＴＣ４Ｓ鎖を含む単位格子を有し、及び／又は金属イオンが配位した複数の隣接ヒスチジンタグ（例えば各ＬＴＣ４Ｓ三量体に対して３又は各単位格子に対して１２）を含む請求項２５に記載の結晶形態。
【請求項２７】
結晶形態が共結晶化分子を更に含む請求項２５又は２６に記載の三次元結晶形態。
【請求項２８】
共結晶化分子がＧＳＨ又はＤＤＭのような界面活性剤である請求項２７に記載の三次元結晶形態。
【請求項２９】
共結晶化分子がＬＴＣ４Ｓ活性を調節する請求項２７又は２８に記載の三次元結晶形態。
【請求項３０】
１）請求項１から３の何れか一項に記載のポリペプチドを提供し；２）請求項１から１４の何れか一項に記載の方法を使用して選択される化合物を提供し；３）請求項１から３の何れか一項に記載のポリペプチドと選択された化合物を含有する組成物で結晶化試験を実施することを含む、請求項２５から２９の何れか一項に記載の結晶形態を調製し又は調製を試みる方法。
【請求項３１】
ＬＴＣ４Ｓの活性部位又は基質結合領域（又はその一部）の結晶又は構造；又は試験化合物に結合したＬＴＣ４Ｓの活性部位又は基質結合領域（又はその一部）の結晶又は構造の生成における請求項１から３の何れか一項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項３２】
請求項１から３の何れか一項に記載のポリペプチドと選択された化合物を含有する組成物で結晶化試験を実施する工程を更に含む請求項１から１４の何れか一項に記載の方法。
【請求項３３】
標的ＬＴＣ４Ｓタンパク質又は他のＭＡＰＥＧファミリーメンバータンパク質又はそのホモ-又はヘテロ多量体（標的タンパク質）の三次元構造を予想する方法であって、標的タンパク質のアミノ酸配列の提示を、２．０Å、１．５Å、１．０Å又は０．５Å以下の標準二乗偏差だけ変動してもよい表Ｉ又はＩＩのＬＴＣ４Ｓのアミノ酸配列、又はその選択された座標と整列させ、アミノ酸配列の相同領域を一致させ；２．０Å、１．５Å、１．０Å又は０．５Å以下の標準二乗偏差だけ変動してもよい表Ｉ又はＩＩによって定義されたＬＴＣ４Ｓの対応領域、又はその選択された座標で前記標的タンパク質の一致した相同領域の構造をモデル化し；前記一致した相同領域の構造を実質的に保存する前記標的タンパク質に対するコンフォメーションを決定する工程を含む方法。
【請求項３４】
標的ＬＴＣ４Ｓタンパク質又は他のＭＡＰＥＧファミリーメンバータンパク質又はそのホモ-又はヘテロ多量体（標的タンパク質）の構造を得る方法であって、前記標的タンパク質の結晶を提供し；前記結晶のＸ線回折パターンを得、表Ｉ又はＩＩのＬＴＣ４Ｓ構造±２．０Å、１．５Å、１．０Å又は０．５Å未満のタンパク質の骨格原子からの標準二乗偏差、又はその選択された座標で前記標的タンパク質の構造をモデル化することによって、前記標的タンパク質の三次元原子座標構造を計算する工程を含む方法。
【請求項３５】
ＭＡＰＥＧファミリーメンバータンパク質又はそのホモ-又はヘテロ多量体の活性を調節することが予期される化合物を選択し又は設計する方法であって、ＭＡＰＥＧファミリーメンバータンパク質又はそのホモ-又はヘテロ多量体の触媒部位又は基質結合領域と相互作用することが予想される化合物を選択し又は設計する分子モデル化手段を使用する工程を含み、ここで、ＭＡＰＥＧファミリーメンバータンパク質又はそのホモ-又はヘテロ多量体の触媒部位又は基質結合領域の少なくとも一部の三次元構造を化合物の三次元構造と比較し、前記触媒部位又は基質結合領域と相互作用することが予想される化合物を選択し、ここで、ＭＡＰＥＧタンパク質又はそのホモ-又はヘテロ多量体の触媒部位又は基質結合領域の少なくとも一部の三次元構造が、請求項３３、３４又は４４に記載の方法によって予想され又は得られる三次元構造（又はその一部）である方法。
【請求項３６】
適合される分子構造がファルマコフォアモデルの形態である請求項１から１４又は３５の何れか一項に記載の方法。
【請求項３７】
合理的薬剤設計のコンピュータベースの方法において、（ａ）２．０Å、１．５Å、１．０Å又は０．５Å未満のタンパク質骨格原子の標準二乗偏差だけ変動してもよい表Ｉ又はＩＩで定義されたＬＴＣ４Ｓの座標又はその選択された座標を提供し；（ｂ）複数の分子断片の構造を提供し；（ｃ）分子断片の各々の構造を選択された座標に一致させ；（ｄ）分子断片を単一の分子に組み立てて候補調節因子分子を形成することを含む方法。
【請求項３８】
（ａ）分子断片又は調節因子分子を取得し又は合成し；（ｂ）分子断片又は調節因子分子をＬＴＣ４Ｓと接触させて、ＬＴＣ４Ｓと相互作用する分子断片又は調節因子分子の能力を決定する工程を更に含む請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ＬＴＣ４Ｓの三次元構造の提示を得る方法において、２．０Å、１．５Å、１．０Å又は０．５Å未満のタンパク質骨格原子の標準二乗偏差だけ変動してもよい表Ｉ又はＩＩのデータ又はその選択された座標を提供し、前記座標を表す三次元構造を構築することを含む方法。
【請求項４０】
構造が、（ａ）ワイヤ−フレームモデル；（ｂ）チキン−ワイヤモデル；（ｃ）ボール＆スティックモデル；（ｄ）空間充填モデル；（ｅ）スティックモデル；（ｆ）リボンモデル；（ｇ）スネークモデル；（ｈ）アローシリンダーモデル；（ｉ）電子密度マップ；（ｊ）分子表面モデルとして提示される請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
ＬＴＣ４Ｓ又は他のＭＡＰＥＧファミリーメンバータンパク質又はそのホモ-又はヘテロ多量体、ＬＴＣ４Ｓ又は他のＭＡＰＥＧファミリーメンバータンパク質又はそのホモ-又はヘテロ多量体と化合物との複合体と相互作用する化合物の構造を作成し及び／又はその最適化を実施するためのコンピュータシステムであって、（ａ）２．０Å、１．５Å、１．０Å又は０．５Å未満のタンパク質骨格原子の標準二乗偏差だけ変動してもよい表Ｉ又はＩＩのＬＴＣ４Ｓ座標データ又はその選択された座標であって、ＬＴＣ４Ｓの三次元構造を定める前記データ又はその前記選択された座標；（ｂ）２．０Å、１．５Å、１．０Å又は０．５Å未満のタンパク質骨格原子の標準二乗偏差だけ変動してもよい表Ｉ又はＩＩの座標データ又はその選択された座標に基づく標的の相同モデル化によって作成された標的ＭＡＰＥＧファミリーメンバータンパク質又はそのホモ-又はヘテロ多量体の原子座標データ；（ｃ）２．０Å、１．５Å、１．０Å又は０．５Å未満のタンパク質骨格原子の標準二乗偏差だけ変動してもよい表Ｉ又はＩＩの座標データ又はその選択された座標を参照してＸ線結晶学的データ又はＮＭＲデータを解釈することによって作成された標的ＭＡＰＥＧファミリーメンバータンパク質又はそのホモ-又はヘテロ多量体の原子座標データ；（ｄ）（ｂ）又は（ｃ）の原子座標データから誘導できる構造因子データ；及び（ｅ）２．０Å、１．５Å、１．０Å又は０．５Å未満のタンパク質骨格原子の標準二乗偏差だけ変動してもよい表Ｉ又はＩＩの原子座標データ又はその選択された座標の一又は複数を含むコンピュータ可読データを含むシステム。
【請求項４２】
前記原子座標データが、請求項９に列挙された残基によって提供される原子の少なくとも一つに対するものである請求項４１に記載のコンピュータシステム。
【請求項４３】
ロイコトリエンＣ４シンターゼ（ＬＴＣ４Ｓ）の活性を調節することが期待される化合物を選択し又は設計する方法であって、ＬＴＣ４Ｓのサブユニット相互作用領域と相互作用することが予想される化合物を選択し又は設計する分子モデル化手段を使用する工程を含み、ここで、ＬＴＣ４Ｓのサブユニット相互作用領域の少なくとも一部の三次元構造が化合物の三次元構造と比較され、前記基質相互作用領域と相互作用することが予想される化合物が選択される方法。
【請求項４４】
標的ＬＴＣ４Ｓタンパク質又は他のＭＡＰＥＧファミリーメンバータンパク質又はそのホモ-又はヘテロ多量体（標的タンパク質）の構造を得る方法であって、前記標的タンパク質の結晶を提供し；前記結晶の電子回折パターンを得；表Ｉ又はＩＩのＬＴＣ４Ｓ構造±２．０Å未満、好ましくは１．５Å、１．０Å又は０．５Å未満のタンパク質骨格原子からの標準二乗偏差、又はその選択された座標で前記標的タンパク質の構造をモデル化することによって、前記標的タンパク質の三次元原子座標構造を計算する工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
本発明はＬＴＣ４シンターゼのモジュレーターのスクリーニング方法に関する。ＬＴＣ４シンターゼの三次元構造の確定及びそれに基づく方法に関連する。
【０００２】
ロイコトリエンＣ４（ＬＴＣ４）シンターゼ（ＬＴＣ４Ｓ）は、炎症性及びアレルギー性疾患、特に気管支喘息の病態生理学に関与するパラクラインホルモンファミリーであるロイコトリエンの生合成における重要な酵素である（Samuelsson, B. Science 220, 568-75 (1983);及びLewis, R.A., Austen, K.F. & Soberman, R.J. N Engl J Med 323, 645-55 (1990)）。ロイコトリエンは、種々の免疫学的及び非免疫学的な刺激に応答して、好中球、好酸球性、好塩基、マストセル及びマクロファージを含む免疫応答細胞によって形成される。これらの脂質メディエーターは、ケモタキシンＬＴＢ４及び収縮刺激性システイニル−ロイコトリエン（ＬＴＣ４、ＬＴＤ４及びＬＴＥ４）によって例証される２つの主要なクラスに分けられる。ロイコトリエン生合成は、アラキドン酸を不安定なエポキシドＬＴＡ４（ロイコトリエン・カスケードにおける中心的な中間体）に変換する酵素５−リポキシゲナーゼ（５−ＬＯ）によって誘導される。ＬＴＡ４は次に、酵素ＬＴＡ４ヒドロラーゼによってＬＴＢ４に加水分解される、又は、ＬＴＣ４を形成するためにＧＳＨと接合され、この反応は特異的なＬＴＣ４Ｓによって触媒される。細胞活性化の間、ロイコトリエン生合成における全ての鍵酵素（ＬＴＡ４ヒドロラーゼ以外）は、核膜で構築される生合成複合体を形成し、このことはロイコトリエンが遺伝子調節又は細胞増殖に関連した未知の核内での機能を有することを示唆する（Serhan, C.N., Haeggstrom, J.Z. & Leslie, C.C. Faseb J 10, 1147-58 (1996)）
【０００３】
ロイコトリエンＣ４（ＬＴＣ４Ｓの天然産物）は、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ及びジペプチターゼによって、それぞれ産生ＬＴＤ４及びＬＴＥ４に切断され得る。並んで、これらの３つのロイコトリエンは、以前ヒト呼吸器においてｎＭ濃度のみで重大な効果を伴う強力な平滑筋収縮剤であるアナフィラキシーの遅反応性物質（ＳＲＳ−Ａ）として知られたものを構成しており、それは気管支収縮及び増加した漏出及び水腫形成を伴う微小循環を引き起こす（Samuelsson, B. Science 220, 568-75 (1983)）。したがって、システイニル−ロイコトリエン（ｃｙｓ−ＬＴ）は、炎症及びアレルギーの主要なメディエーターとして考えられており、腎炎、皮膚炎、花粉症及び特に喘息及び肺線維症を含む多くの疾病に関与している（Lewis, R.A., Austen, K.F. & Soberman, R.J. N Engl J Med 323, 645-55 (1990); Beller, T. C. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 101, 3047-52 (2004)）。さらに、炎症及び喘息におけるｃｙｓ−ＬＴの役割は、ｃｙｓ−ＬＴの生合成を阻害し、ｃｙｓ−ＬＴのレセプターのアンタゴニストである分子の治療上の可能性及び臨床用途によって十分に確証されている（Drazen, J. M., Israel, E. & O'Byrne, P. Treatment of asthma with drugs modifying the leukotriene pathway. N. Engl. J. Med. 340, 197-206 (1999)）。さらに、減少した炎症反応が、いくつかのロイコトリエン欠損動物モデルにおいて観察される（Chen, X.S., Sheller, J.R., Johnson, E.N. & Funk, C.D. Nature 372, 179-182 (1994); Griffiths, R.J., et al. Proc Natl Acad Sci U S A 92, 517-21 (1995);及びGriffiths, R.J., et al. J Exp Med 185, 1123-9 (1997)）。さらに、例えばリンパ球の特異的な一部の障害、サイトカインの生産及びＢリンパ球からの免疫グロブリンの解放によって、ＬＴＣ４は免疫反応を調整する（Payan, D.G., Missirian-Bastian, A. & Goetzl, E.J. Proc Natl Acad Sci U S A 81, 3501-5 (1984); Rola-Pleszczynski, M. & Lemaire, I. J Immunol 135, 3958-61 (1985);及びYamaoka, K.A., Claesson, H.E. & Rosen, A. J Immunol 143, 1996-2000 (1989)）。  
【０００４】
ＬＴＣ４Ｓは不安定であることが知られる、１８ｋＤａの内在性膜酵素であり、ＫＧ−１及びＴＨＰ−１細胞から見かけ上均一に精製された（Penrose, J. F. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 11603-11606 (1992); Nicholson, D. W. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2015-2019 (1993)）。酵素のクローニング及び分子の特徴付けにより、ＬＴＣ４Ｓ及びＦＬＡＰが相同タンパク質であることが予想外に明らかとなった（Lam, B. K., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 7663-7667 (1994); Welsch, D. J. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 9745-9749 (1994)）。更なる調査により、ＬＴＣ４Ｓがミクロソームのグルタチオン−Ｓ−転移酵素（ＭＧＳＴ）、特にＭＧＳＴ２及びＭＧＳＴ３にもかすかに関連があることが示され、ＬＴ代謝との機能的関連が確立された。したがって、ヒトＭＧＳＴ２及びＭＧＳＴ３はＬＴＣ４シンターゼ活性を有しており、最近の研究によりヒト臍静脈内皮細胞における主要な、もしそうでなければ唯一のＬＴＣ４生成酵素はＭＧＳＴ２であることが示され、このことはこの酵素が血管壁におけるＬＴＣ４の経細胞生合成において役割を有することを示している（Jakobsson, P.-J., et al. Prot. Sci. 8, 689-692 (1998)）。ＬＴＣ４Ｓに相同な他の酵素は、炎症、熱及び痛みの重要なメディエーターである基質ＰＧＥ２へのプロスタグランジンエンドペルオキシドの転換に触媒作用を及ぼすミクロソームのプロスタグランジン（ＰＧ）Ｅシンターゼ１型（ｍＰＧＥＳ−１）である（Jakobsson, P.J. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96,7220-7225 (1999)）。並んで、ＬＴＣ４Ｓ、ＦＬＡＰ、ＭＧＳＴ１、ＭＧＳＴ２、ＭＧＳＴ３及びミクロソームのプロスタグランジン（ＰＧ）Ｅ２シンターゼは、ＭＡＰＥＧ（エイコサノイド及びグルタチオン代謝における膜関連のタンパク質）と称される広範囲にわたるタンパク質スーパーファミリーに属する（Jakobsson, P.-J., et al. Prot. Sci. 8, 689-692 (1998)）。
【０００５】
現時点では、ＬＴＣ４Ｓ又はＭＡＰＥＧファミリーの他のメンバーについての詳細な構造情報は利用可能でない。大まかな構造情報は、Ｘ線結晶学と非常に異なり、原子分解能で構造を作成しない技術である電子顕微鏡法によって得られた。したがって、Schmidt-Krey等は、投影地図を算出可能なＬＴＣ４Ｓの２次元の結晶の生成について記載しており、四次構造（三量体）の画像及び膜貫通ヘリックスの基本的な相互関係を明らかにした（Structure 12, 2009-14 (2004)）。解毒作用を有する肝酵素ＭＧＳＴ−１の低解像度（３．２Å）構造も測定された（Holm et al (2006) J Mol Biol 360, 934-945.）しかしながら、よく認識されたニーズにもかかわらず、ＬＴＣ４Ｓの三次元構造は未だ開示されていない。
【０００６】
より具体的にはは、この種の測定を提示するために克服する必要がある課題が、手短に言うと以下のように説明される。更に以下に検討されるように、タンパク質分子の三次元構造を得るには２つの主要な問題が存在する。第１には、再生可能で、原子分解能（２．５Å以下）で回折する質の良い結晶を成長させることである。これは、少し記載するだけでも、例えばｐＨ、温度、バッファーの性質、沈澱剤の性質などの結晶成長に影響するパラメータの綿密かつ煩雑な調査を意味する。基質類似体又はインヒビターのようなリガンドの添加、又は他の分子の添加は、良好な結晶を得るのに重要であり得る。結晶化プロセスの物理的な背景はほとんど理解されておらず、このことから特定のタンパク質に対する適切な結晶化条件の検索が固有であり、創造力及び直観力が必要であり、試行錯誤によって決定されることを意味する。タンパク質の純度もまた結晶化の重要なパラメーターであり、適切な純度の程度を実現するのは難しい、又は不可能である。適切な結晶が得られる以前に、可能であるという保証はない。    
【０００７】
全てのこれらの課題を膜タンパク質、特に膜内在性タンパク質に対して成し遂げるのは極めて困難であることが強調されるべきであり、十分に純粋なものを多く得るのは困難である。また、膜タンパク質は疎水性で、凝集する傾向があり、結晶化プロセスを妨げる様々な界面活性剤によって、溶液中に保たれなければならない。  
【０００８】
第２の主な問題点は、Ｘ線回折法に内在する位相問題を克服することに関連している。この課題を解決しうるために、例えば水銀、金又は白金化合物などの適切な重元素基質でタンパク質を置換する必要がある。結晶は多くの場合これらの化合物での処理に耐えられず、適切な置換の検索は単純ではなく、非常に広範囲となり得る。他の選択肢は、セレノメチオニン（Ｓｅ−Ｍｅｔ）残基で全てのメチオニンを置換することである。この方法は、非標準条件下で大腸菌の特殊な系統における組換えタンパク質の産生を必要とし、Ｓｅ−Ｍｅｔを含有するタンパク質の新規の精製及び再結晶化が続く。  
【０００９】
Schmidt-Krey等が、ＬＴＣ４シンターゼの２次元の結晶の生成を報告したにもかかわらず（つまり、ＬＴＣ４シンターゼホモ三量体の単一の層又は１０未満の少数の層）、これらの結晶は酵素の三次元構造の測定及びＸ線結晶学に使用できないことに留意することが重要である。現在の技術を用たＸ線結晶学には、当業者に周知であるように、ＬＴＣ４シンターゼ・三量体の複数層の三次元結晶を得る必要がある。        
【００１０】
したがって、信頼性できるＬＴＣ４Ｓの三次元構造が確定すれば、例えばコンピューター・スクリーン上に分子の形状を視覚形態で表示可能とするので、上述した課題は解決され、例えばコンビナトリアルケミストリーと組み合わせて、ロイコトリエン・カスケードと関連している疾患において有用な新規の医薬の製造や、改変され有用な性質を持った新規な酵素変異体を作成するタンパク工学を目的とした理論的な構造ベースのドラッグデザインなどの全ての可能性が開かれる。
【００１１】
ＬＴＣ４Ｓは認識された重要な薬剤標的であるので、そのインヒビターが合成された（Hutchinson, J.H. et al J. Med. Chem. 38, 4538-4547 (1995); Gupta, N., Nicholson, D.W., Ford-Hutchinson, A.W. Can. J. Physiol. Pharmacol. 75, 1212-1219 (1997)）。ＬＴＣ４Ｓの三次元構造に関する利用可能な情報がないために、上記のように、先に述べたインヒビターのいずれも正確な構造に基づいて設計されなかった。したがって、ＬＴＣ４Ｓのより強力かつ選択的なインヒビター、及びより有利な製薬特性を示す改変された構造を設計するために、ＬＴＣ４Ｓの三次元構造を決定する分野においてニーズが存在する。
【００１２】
この明細書における先に公開された文献の列挙又は検討は、必ずしもその文献が先行技術の一部であるか又は一般的常識であることを自認したものと解してはならない。
【００１３】
我々はグルタチオン基質と複合体を形成せしめたＬＴＣ４Ｓを結晶化させ、その三次元構造を決定した。ＭＡＰＥＧファミリータンパク質メンバーの最初の高分解能の三次元構造であり、構造的基礎と触媒作用の分子機構の記述を可能にしている。また、構造情報は、酵素阻害剤の合理的設計を可能にし、臨床的に有用な抗炎症薬の開発につながりうる。
【００１４】
本発明の第一の態様は、ロイコトリエンＣ４シンターゼ（ＬＴＣ４Ｓ）の活性を調節することが期待される化合物を選択し又は設計するための方法を提供し、該方法は、ＬＴＣ４Ｓの触媒部位又は基質結合領域 (活性部位と共に)と相互作用することが予想される化合物を選択し又は設計する分子モデル化手段を使用する工程を含み、ここで、ＬＴＣ４Ｓの触媒部位又は基質結合領域の少なくとも一部の三次元構造が化合物の三次元構造と比較され、前記触媒部位又は基質結合領域と相互作用することが予想される化合物が選択される。
【００１５】
本発明は、表Ｉ又は表ＩＩの座標±２．０Å未満、好ましくは１．５Å、１．０Å又は０．５Å未満のタンパク質の骨格原子からの標準二乗偏差によって定まるＬＴＣ４Ｓ (タンパク質)の触媒部位又は基質結合領域の少なくとも一部の構造を提供し；
候補調節因子（モジュレーター）分子の構造を提供し；
候補調節因子分子の構造をタンパク質の構造に適合させることを含む、合理的薬剤設計のコンピュータベースの方法を提供する。
【００１６】
ＬＴＣ４Ｓなる用語には、Lam等(1994) Expression cloning of a cDNA for human leukotriene C4 synthase, an integral membrane protein conjugating reduced glutathione to leukotriene A4 PNAS 91, 7663-7667又はWelsch等(1994) Molecular cloning and expression of human leukotriene-C4 synthase PNAS 91, 9745-9749においてＬＴＣ４Ｓと命名されたポリペプチドが含まれる。ＬＴＣ４ＳはＥＣ番号４．４．１．２０を有している。ヒトＬＴＣ４Ｓポリペプチド配列を以下に提供する。ここで使用される「ＬＴＣ４Ｓ」なる用語は、このポリペプチド配列並びにその天然に生じる変異体を含む。更なる動物種はまたＬＴＣ４Ｓと均等なポリペプチドを有し、この用語の範囲に含まれる。好ましくは、ＬＴＣ４Ｓによって以下に示すＬＴＣ４Ｓポリペプチド又はそれに対して少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は９８％の同一性を有するポリペプチド配列を意味する。
..1 Met Lys Asp Glu Val Ala Leu Leu Ala Ala  .10
.11 Val Thr Leu Leu Gly Val Leu Leu Gln Ala  .20
.21 Tyr Phe Ser Leu Gln Val Ile Ser Ala Arg  .30
.31 Arg Ala Phe Arg Val Ser Pro Pro Leu Thr  .40
.41 Thr Gly Pro Pro Glu Phe Glu Arg Val Tyr  .50
.51 Arg Ala Gln Val Asn Cys Ser Glu Tyr Phe  .60
.61 Pro Leu Phe Leu Ala Thr Leu Trp Val Ala . .70
.71 Gly Ile Phe Phe His Glu Gly Ala Ala Ala  .80
.81 Leu Cys Gly Leu Val Tyr Leu Phe Ala Arg  .90
.91 Leu Arg Tyr Phe Gln Gly Tyr Ala Arg Ser  100
101 Ala Gln Leu Arg Leu Ala Pro Leu Tyr Ala  110
111 Ser Ala Arg Ala Leu Trp Leu Leu Val Ala  120
121 Leu Ala Ala Leu Gly Leu Leu Ala His Phe  130
131 Leu Pro Ala Ala Leu Arg Ala Ala Leu Leu  140
141 Gly Arg Leu Arg Thr Leu Leu Pro Trp Ala  150
【００１７】
ＬＴＣ４Ｓなる用語には、２０まで、１５まで、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１の保存的又は非保存的置換を持つヒト型と同じアミノ酸配列を有する任意の哺乳動物又は他のＬＴＣ４Ｓと称されるポリペプチドが含まれる。哺乳動物ＬＴＣ４Ｓのアミノ酸配列は約９０％の同一性である。よって、三次元構造もまた略同じ程度で同一であることが期待される。ＬＴＣ４Ｓなる用語は、当業者には直ぐに理解されるように、ＦＬＡＰ、ＭＧＳＴ−１、ＭＧＳＴ−２、ＭＧＳＴ−３又はＭＰＧＥＳ−１のようなＭＡＰＥＧファミリーの他のメンバーは包含しない。
【００１８】
スクリーニング法又はアッセイで使用されるポリペプチド又は構造に関して、該用語は、当業者には知られているように、活性部位を含むその断片及び融合体もまた含む。ＬＴＣ４Ｓは単一ドメイン酵素であるので、完全長ＬＴＣ４Ｓ配列の広範な部分が失われている断片は触媒活性を保持していないであろうと考えられる。しかしながら、 完全長ＬＴＣ４ＳのＣ末端アミノ酸（例えば、２０、１５、１０、５、４、３、２又は１のアミノ酸までのＣ末端）が失われている断片は触媒活性を保持していると考えられる。ＬＴＣ４Ｓの活性部位は２つの隣接モノマーからのアミノ酸からなる(表１及び２)ので、ＬＴＣ４Ｓそのままの単一ポリペプチドは酵素活性には十分ではない。よって、触媒活性を示すためには、ＬＴＣ４Ｓポリペプチドは、他のＬＴＣ４Ｓポリペプチド又は代替ポリペプチド、Lam BK等(1997) J. Biol. Chem. 272(21):13923-8)に記載されているような例えばＦＬＡＰポリペプチドと複合体を形成せしめなければならない。Lam等(1997)は、ＬＴＣ４ＳポリペプチドとＦＬＡＰポリペプチドの融合物及びＬＴＣＳの内部セグメントがＦＬＡＰの対応するセグメントで置き換えられた融合物に対する触媒活性を報告している。野生型ＬＴＣ４Ｓポリペプチドは自然に触媒的に活性な複合体に構築されると考えられる：ＬＴＣ４Ｓ断片又は融合物がこの能力を保持しているのが好ましい。
【００１９】
該構造は、典型的には（しかし必ずしもそうではない）ＬＴＣ４Ｓ活性を保持するＬＴＣ４Ｓポリペプチドの構造（又は構造の一部分）である。例えば、三量体又は二量体の形態の場合、ＬＴＣ４Ｓポリペプチドは典型的にはグルタチオンをロイコトリエンＡ４に結合せしめうる。あるいは又は加えて、ＬＴＣ４Ｓポリペプチドは脂肪酸ヒドロペルオキシダーゼ活性を保持していることが好ましい。
【００２０】
次は、ＬＴＣ４Ｓの作用を調節する、例えば阻害する化合物の能力を評価する際に使用できるアッセイの例である。該アッセイでは、ＬＴＣ４シンターゼが、基質ＬＴＡ４メチルエステルがＬＴＣ４メチルエステルに転換される反応を触媒する。精製された組換えヒトＬＴＣ４シンターゼ（例えば酵母中で発現される）を２５ｍＭのＴｒｉｓ−バッファー（ｐＨ７．８）に溶解させ、−２０℃で保存する。該アッセイは、５ｍＭのグルタチオン（ＧＳＨ）を補填したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）中で実施される。反応は、アセトニトリル／ＭｅＯＨ／酢酸（５０／５０／１）の添加により終了せしめられる。該アッセイは９６ウェルプレート中で室温で実施される。生成したＬＴＣ４メチルエステルの分析は、逆相ＨＰＬＣ（Ｏｎｙｘ ＭｏｎｏｌｉｔｈｉｃのＣ１８カラムを利用するＷａｔｅｒｓ２７９５）で実施される。移動相は、ｐＨがＮＨ３でｐＨ５．６まで調節された１％の酢酸を有するアセトニトリル／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（３２．５／３０／３７．５）からなり、吸光度は、Ｗａｔｅｒｓ２４８７ＵＶ検出器を用いて２８０ｎｍで測定される。
【００２１】
次のものを各ウェルに連続して添加する：
１．  ５０μｌのアッセイバッファー、５ｍＭのＧＳＨを含むＰＢＳ。
２．  ＤＭＳＯ中の０．５μｌの試験化合物。
３．  ＰＢＳ中の２μｌのＬＴＣ４シンターゼ。この溶液中の全タンパク質濃度は０．０２５ｍｇ／ｍｌである。プレートを室温で１０分間インキュベートする。
４．  ０．５μｌのＬＴＡ４メチルエステル。プレートを室温で１分間インキュベートする。
５．  ５０μｌの停止液。
８０μｌのインキュベーション混合物をＨＰＬＣで分析する。
【００２２】
あるいは、脂肪酸ヒドロペルオキシダーゼ活性のアッセイを使用することができる。例えば、２５０ｐｍｏｌのヒドロペルオキシド（１３−ＨＰＯＤ、又は５−ＨＰＥＴＥ）と共に１．５ｍＭのＧＳＨを含む５０μｌの０．１ＭのＫ−ホスフェート（ｐＨ７．５）中で室温にて１０分間、０．１−０．２μｇのＬＴＣ４Ｓをインキュベートする。１５０μｌの停止液（ＭｅＣＮ：Ｈ２Ｏ：ＨＯＡｃ，５０：２５：０．２，ｖ／ｖ）を添加して反応を終了させる。ＭｅＣＮ：Ｈ２Ｏ：ＨＯＡｃ，６０：４０：０．１，ｖ／ｖからなる移動相及び２３５ｎｍに設定したＵＶ検出器を使用して、上述のようにして、ＲＰ−ＨＰＬＣによってヒドロペルオキシドの転換を分析する。
当業者にはよく知られているように、これらのアッセイ又は代替アッセイについて変形態様を使用することができる。
【００２３】
我々は、Ｎ末端ヘキサヒスチジンタグを有するＬＴＣ４ＳがＬＴＣ４Ｓの構造を決定するために特に有益であることを見出した。この融合ポリペプチドは、例えばＬＴＣ４Ｓ活性及び有益な溶解性及び安定特性を有しており、これが、例えばＸ線結晶学法によって分析することができる結晶の形成のような構造研究にそれを特に適したものにする。異なったタイプのタグ又は異なった長さのヒスチジンタグ（例えばペンタヒスチジンタグ又はセプタヒスチジンタグ）を有する融合ポリペプチドは尚も有用でありうるが、ヘキサヒスチジンタグを有する融合ポリペプチドと同じほどには有用ではないようであると思われる。ヘキサヒスチジンタグのサイズ及び金属イオン座標特性がＬＴＣ４Ｓの良好に回折する結晶を形成するのに特に有益であると考えられる。ヘキサヒスチジンタグは、例えばニッケル又はコバルトイオンのような二価金属イオンを配位させると考えられる。結晶は、金属イオンに配位した一を越えるＬＴＣ４Ｓ三量体からの隣接するヘキサヒスチジンタグを含むと考えられる。従って、構造は、Ｎ末端ヘキサヒスチジンタグを有するＬＴＣ４Ｓに対して決定されたものでありうる。
【００２４】
その構造は、実施例１に記載された方法によって決定可能なもの、例えば、界面活性剤を含む母液溶液を使用して得ることができる結晶のＸ線解析によって得ることができる構造であることが特に好ましい。適切な界面活性剤の例はドデシルマルトシド（ＤＤＭ）である。他の適切な界面活性剤の例は次のものを含む：
【００２５】
ＣＹＭＡＬ(登録商標)−４
４−シクロヘキシル−１−ブチル−β−Ｄ−マルトシド１
ＣＡＳ番号：１８１１３５−５７−９
ＣＹＭＡＬ(登録商標)−５
５−シクロヘキシル−１−ペンチル−β−Ｄ−マルトシド１
式分子量：４９４．５  Ｃ２３Ｈ４２Ｏ１１
ｎ−ノニル−(登録商標)−Ｄ−マルトピラノシド，ＡＮＡＧＲＡＤＥ(登録商標)
ｎ−ノニル−(登録商標)−Ｄ−マルトシド  
ＣＡＳ番号：１０６４０２−０５−５
【００２６】
ｎ−デシル−(登録商標)−Ｄ−マルトピラノシド，ＡＮＡＧＲＡＤＥ(登録商標)
ｎ−デシル−β−Ｄ−マルトシド
（低アルファ）
ＣＡＳ番号：８２４９４−０９−５
式分子量：４８２．６  Ｃ２２Ｈ４２Ｏ１１
【００２７】
ｎ−ウンデシル−(登録商標)−Ｄ−マルトピラノシド，ＡＮＡＧＲＡＤＥ(登録商標)
ｎ−ウンデシル−β−マルトシド（低アルファ）
ＣＡＳ番号：２５３６７８−６７−０
ｎ−オクチル−(登録商標)−Ｄ−グルコピラノシド，ＡＮＡＧＲＡＤＥ(登録商標)
ｎ−オクチル−(登録商標)−Ｄ−グルコシド
ＣＡＳ番号：２９８３６−２６−８
式分子量：２９２．４  Ｃ１４Ｈ２８Ｏ６
【００２８】
結晶化及びＸ線解析の更に好ましい詳細は実施例１に記載する。
構造が、表Ｉ（グルタチオン；ＧＳＨの不存在下で決定した構造）又はＩＩ（ＧＳＨの存在下で決定した構造）に示される構造座標によって表されるもの、又は例えばタンパク質の骨格原子からの標準二乗偏差が２．０Å未満、好ましくは１．５Å、１．０又は０．５Å未満であるそのような構造又は座標に基づくか又はそれからモデル化された構造であることが特に好ましい。
本出願は、その基質の一つのグルタチオンと複合体を形成したヒトＬＴＣ４Ｓを定める座標を例示するリスト、並びに脂質基質ロイコトリエンＡ４（ＬＴＡ４）に対して結合部位を定める界面活性剤分子を提供する。触媒作用におけるその役割に基づいて、グルタチオン及び界面活性剤に支配される二つの結合部位がＬＴＣ４Ｓの活性部位を定め、所望の性質を有する分子の設計のためのテンプレートとして使用することができる。そのような設計のための方法は以下に更に詳細に検討する。本発明による構造座標は、請求の範囲の直前に表ＩからＩＩとして「Ｘ線データ」と標記された別のセクションとして本明細書に含められる。これらはＬＴＣ４Ｓ単量体及び配位分子に対する座標である。表Ｉにおいて、原子番号１から原子番号１２６３が複合体のＬＴＣ４Ｓ部分を定める。表ＩＩにおいて、原子番号１から原子番号１１９５がＬＴＣ４Ｓに関する一方、原子番号１２３３から１２５２がグルタチオンに関係する。ＬＴＣ４Ｓに関する原子番号は２つの表において異なっているが、これは、第一の表にはより多くの可視できる残基があるためである；テイル部はＸ線構造では必ずしも可視できるとは限らない。ホモ三量体（又は二量体）内の活性部位は、ホモ三量体内の二つの隣接するサブユニットからの残基によって形成される。その決定の際に使用する条件は以下の実験セクションに詳細に記載する。
【００２９】
当業者には分かるように、かかる座標は、通常、例えば熱運動及び結晶充填における僅かな差のため、ある程度の変動を示す。よって、タンパク質及び他の分子に関して表ＩからＩＩへのここでの言及は、同じ装置及び方法の使用によって決定される、同一条件下で分子のコンフォメーションを定める座標を示すことを単に意図している。
【００３０】
構造は、ＬＴＣ４Ｓとの既知の又は潜在的な相互作用物質又はＬＴＣ４Ｓ活性の調節因子(以下で更に検討する)の存在下での結晶化後に決定されるものでありうる。構造は、例えばグルタチオン（ＧＳＨ）の不存在下又はＧＳＨの存在下で決定可能なものでありうる。双方の実施例を実施例１に提供する。我々は、ＬＴＣ４ＳがＧＳＨの存在下で結晶化することを見出した。あるいは、ＧＳＨは最初の結晶化中にはあり得ず、ついで結晶が形成された後に結晶中に浸漬される。
【００３１】
例えば、構造は、既知のＬＴＣ４Ｓ阻害剤、例えばＧＳＨ結合部位に結合すると信じられている阻害剤；又はＬＴＡ４結合部位に結合すると信じられている阻害剤、例えばシステイニル−ロイコトリエン類、ＬＴＣ４、ＬＴＤ４、又はＬＴＥ４、５−リポキシゲナーゼ阻害剤チオピラノール［２，３，４−ｃ，ｄ］インドール類及びＬ−６９９．３３３、ＦＬＡＰ阻害剤ＭＫ８８６、又はＣｙｓＬＴレセプターアンタゴニストＭｏｎｔｅｌｕｋａｓｔの存在下で結晶化後に決定されるものでありうる。共結晶は、実施例１において検討されるように、ＧＳＨ基質結合キャビティに位置させられたＧＳＨをそれぞれ移すことができる阻害剤；又は親油性基質結合クレバスに位置させられた界面活性剤；又は活性部位の触媒部に対して形成されうる。脂質基質及びＧＳＨは活性部位に対して異なった親和性を有している。よって、共結晶は、１００μＭ未満、例えば１０μＭ未満又は１μＭ未満（例えば基質としてＬＴＡ４／ＧＳＨを使用して測定）のＩＣ５０を有する資質結合部位を標的とした化合物を形成しうる一方、ＧＳＨ結合部位を標的とした化合物は、１０ｍＭ未満、例えば１ｍＭ未満又は１００μＭ未満（例えばＬＴＡ４／ＧＳＨを基質として測定）のＩＣ５０を有しうる。結晶化条件のある種の変更（例えば異なる母液）が異なった分子での共結晶化に必要とされうることは理解されるであろう。ここに提供された情報から出発して、それぞれの場合に適した結晶化条件を調査する技術は当業者にはよく知られている。一実施態様では、共結晶化は、ポリペプチドの結晶、例えば実施例１に設定されたようにして得られた結晶への共結晶化分子の拡散によって実施されうる。これは「浸漬」手順と称されうる。実施例１で検討されるように、活性部位に位置したＧＳＨ又は界面活性剤がある場合、拡散／浸漬による共結晶化は達成するのが容易であり得、例えば１０μＭ未満、例えば１μＭ未満又は１００ｎＭ未満のＩＣ５０の低濃度の阻害剤を必要としうる。
【００３２】
ＬＴＣ４Ｓに対して低親和性、例えばミリモル濃度範囲のＩＣ５０の分子を用いての共結晶化がまた可能であり有用でありうると考えられる。例えば、共結晶化は活性部位だけの部分と相互作用すると考えられる小分子（「断片」）を用いると有用でありうる。これらの小分子は、ＬＴＣ４Ｓ阻害剤活性に対して低いＩＣ５０を有する大きな分子を設計／構築する際の分子として有用でありうる。
【００３３】
本発明の更なる態様は、本発明の先の態様の何れか一つに関連して定義されたＬＴＣ４Ｓポリペプチド（すなわち、多層、例えば１０層、好ましくは１００層以上のＬＴＣ４Ｓホモ三量体）、例えばＮ末端ヘキサヒスチジンタグを有する完全長ヒトＬＴＣ４Ｓからなるポリペプチドの三次元結晶形態を提供する。三次元結晶形態は空間群Ｆ２３に属しうる。実施例１において更に検討されるように（例えば各ＬＴＣ４Ｓ三量体に対して３、又は各単位格子に対して１２）、単位格子は４８のＬＴＣ４Ｓ鎖を含み、及び／又は金属イオンが配位された複数の隣接するヒスチジンタグを有しうる。「三次元結晶形態」なる用語は当業者にはよく知られており、上掲のSchmidt-Krey等(1994)に記載されたもののような二次元（つまり、単一又は約１０層までのＬＴＣ４Ｓホモ三量体）結晶形態を包含しない。
【００３４】
結晶形態は、共結晶化分子、例えばＧＳＨ又は界面活性剤又は他の既知の又は潜在的なＬＴＣ４Ｓとの相互作用物質又はＬＴＣ４Ｓ活性調節因子、又はそのＬＴＣ４Ｓに対する性質が知られていない試験化合物（例えば活性部位の一部のみと相互作用すると考えられる小分子）を更に含みうる。例えば、共結晶化分子、例えば試験化合物は、ＬＴＣ４Ｓ又は他のＭＡＰＥＧファミリーメンバー活性を調節することが知られている分子であり得；又はＬＴＣ４模倣物又はＬＴＡ４模倣物、又はＬＴＣ４レセプターアゴニスト又はアンタゴニスト；又は脂肪酸ヒドロペルオキシド又はその模倣物、又は他の脂肪族化合物でありうる(Thoren S及びJakobsson PJ, Eur. J. Biochem. (2000) 267(21):6428-34；Schroder O等, Biochem. Biophys. Res Commun.. (2003), 312(2):271-6.）。既知のＬＴＣ４レセプターはＣｙｓＬＴ１、ＣｙｓＬＴ２及びＧＰＲ−１７を含む(Ciana P等 EMBO J (2006), 25(19):4615-27)。例えば、共結晶化分子は、１００μＭ未満、典型的には１０μＭ、１μＭ又は１００ｎＭ未満のＩＣ５０をＬＴＣ４Ｓに対して持つ化合物でありうる。共結晶化分子は、以下に更に検討されるように、本発明のスクリーニング／設計方法によって同定される化合物でありうる。共結晶化分子は、活性部位の一部とのみ相互作用し、ミリモル濃度範囲のＩＣ５０を持つと考えられる小分子でありうる。
【００３５】
本発明の更なる態様は、従って本発明の結晶化形態を調製するための、又は本発明の結晶形態を調製する試みのための方法であって、１）本発明の先の態様の何れかに関連して定義されたＬＴＣ４Ｓポリペプチドを提供し；２）本発明の選択／設計方法を使用して選択された（必ずではないが典型的には１００μＭ、１０μＭ、１μＭ又は１００ｎＭ未満のＬＴＣ４Ｓ ＩＣ５０を持つ）化合物を提供し；３）ポリペプチドと選択化合物を含有する組成物での結晶化試験を実施することを含む方法を提供する。
【００３６】
本発明の更なる態様は、ＬＴＣ４Ｓの三次元結晶又は活性部位又は基質結合領域（又はその何れかの少なくとも一部）の構造；又は試験化合物に結合したＬＴＣ４Ｓの三次元結晶又は活性部位又は基質結合領域（またはその何れかの少なくとも一部）の構造の作成における、本発明の先の態様の何れかに関連して定義されたポリペプチドの使用を提供する。試験化合物に対する優先性は上に示した通りである。
【００３７】
結晶化形態は、例えば実施例１に記載されたものと同様な技術を使用して、当業者によく知られているように、Ｘ線回折データ及び構造を得るのに有用でありうる。例えばここに記載されたようなＬＴＣ４Ｓに対して決定された構造は、例えば実施例１に記載されたような、構造解析及び洗練において使用されうる。
【００３８】
かかる共結晶化及び共結晶化分子から決定された構造は、分子モデルの際に、また相互作用に重要なポリペプチドと化合物の特徴を決定する際に有用でありうる。これは更なる試験化合物を設計し又は選択するのに有用でありうる。
【００３９】
一実施態様では、モデル化された分子は、「ＧＳＨ基質結合キャビティ」（完全長ヒトＬＴＣ４Ｓの残基Ａｒｇ５１、Ａｒｇ３０、Ａｒｇ１０４、Ｇｌｎ５３、Ａｓｎ５５、Ｇｌｕ５８、Ｔｙｒ５９、Ｔｙｒ９３、Ｔｙｒ９７、Ｉｌｅ２７、Ｐｒｏ３７、Ｌｅｕ１０８又は他のＬＴＣ４Ｓポリペプチドの等価な残基を含む残基によって形成されると思われる）；「親油性基質結合クレバス」（Ａｌａ２０、Ｌｅｕ２４、Ｉｌｅ２７、Ｔｙｒ５９、Ｔｒｐ１１６、Ａｌａ１１２、Ｌｅｕ１１５、Ｌｅｕ１０８、Ｔｙｒ１０９、Ｌｅｕ６２、Ｖａｌ１１９、Ｔｈｒ６６、Ｖａｌ１６及びＬｅｕ１７、又は他のＬＴＣ４Ｓポリペプチドの均等な残基を含む残基によって形成される）；又は「触媒部位」（Ａｒｇ１０４又はＡｒｇ３１、又は他のＬＴＣ４Ｓポリペプチドの均等な残基を含む残基）と呼ばれる構造領域に結合することが予想されるのが好ましい。従って、該方法は、化合物の構造を、上述の領域（又はその領域と相互作用する領域）の一又は複数の構造と比較することを含みうる。
【００４０】
（表１：グルタチオン結合キャビティに並ぶ残基）
2010527246.tif 000003
表１において、Ａｒｇ５１、Ａｓｎ５５、Ｇｌｕ５８、Ｔｙｒ５９、Ｔｙｒ９３、Ｔｙｒ９７、Ａｒｇ１０４、Ａｒｇ３０、及び  Ｇｌｎ５３は、ＭＡＰＥＧファミリーメンバーの間で高度に保存されたアミノ酸である。
【００４１】
この部位において、ＧＳＨは、一つの単量体からのヘリックス１及び２と隣接する単量体からの３及び４の間の界面の極性ポケット中に深く結合している。ＧＳＨ分子は活性部位を構成する両単量体からの残基に対して極性の相互作用をなす。ＧＳＨのカルボキシレート部分は、結合ポケットのベースにＡｒｇ５１’及びＡｒｇ３０に対する塩架橋を形成し、ＧＳＨを効果的に屈曲させそのチオール基を膜界面に向け、そこでＡｒｇ１０４’と相互作用する。ＧＳＨに対する更なる極性相互作用は、Ｇｌｎ５３、Ａｓｎ５５’、Ｇｌｕ５８’、Ｔｙｒ５９’、Ｔｙｒ９３’及びＴｙｒ９７’によって形成される。幾つかの非極性相互作用がまた形成され（Ｉｌｅ２７、Ｐｒｏ３７及びＬｅｕ１０８’）、ＧＳＨのその結合ポケットへの最適な適合をもたらす。
【００４２】
（表２：ロイコトリエン結合部位におけるアミノ酸）
2010527246.tif 000004
本アミノ酸は、ＬＴＡ４の良好な模倣物である界面活性剤ＤＤＭの脂肪族側鎖に結合する部位を定める。
【００４３】
ここで、Ｔｒｐ１１６はポケットの屋根部を形成し、Ｔｙｒ５９、Ａｌａ２０、及びＬｅｕ６２は床部及び側壁を形成する一方、Ｌｅｕ１１５は、タンパク質中へのＬＴＡ４のω端の更なる侵入を制限する底部をつくる。ＬＴＡ４の反対の端部では、カルボキシル基が広い断面の基質結合間隙に位置している。
【００４４】
（表３：ＬＴＣ４Ｓの触媒ドメイン）
2010527246.tif 000005
上記の表１−３において、ＬＴＣ４Ｓのアミノ酸配列の番号付けは開始Ｍｅｔで開始し、よって配列番号１における番号付けと同一である。表１−３に列挙された残基は、相同な酵素、つまりＭＡＰＥＧファミリーの他のメンバーに対して共通の活性部位を形成すると思われる。
【００４５】
ＬＴＣ４Ｓの活性部位又は基質結合領域の少なくとも一部の三次元構造が、全てが上で定義した通りの「ＧＳＨ基質結合キャビティ」；「親油性基質結合クレバス」；及び／又は「触媒部位」又は相互作用領域の少なくとも一部の三次元構造であり、ＬＴＣ４Ｓの上記「ＧＳＨ基質結合キャビティ」；「親油性基質結合クレバス」；及び／又は「触媒部位」又は相互作用領域と相互作用することが予想される化合物が選択されるのが好ましい。あるいは、化合物は、例えば基質分子の結合又は触媒部位へのその接近性に干渉するようにＬＴＣ４Ｓの「ＧＳＨ基質結合キャビティ」；「親油性基質結合クレバス」；及び／又は「触媒部位」又は相互作用領域ではない前記ＬＴＣ４Ｓポリペプチドの一部に結合しうる。また更なる例では、化合物は、アロステリック効果により前記ポリペプチドの活性を減少させるようにＬＴＣ４Ｓの一部に結合しうる。このアロステリック効果は、ＬＴＣ４Ｓの活性の自然の調節に関与するアロステリック効果でありうる。
【００４６】
化合物は、ホモ三量体のサブユニット間の相互作用に関連するＬＴＣ４Ｓの一部に結合しうる。サブユニット間の相互作用に関連すると考えられる残基を次の表に示す。サブユニットはサブユニットＡ、Ｂ及びＣとして示し、ＡとＢ及びＡとＣの相互作用を示す。
【００４７】
（表４）
2010527246.tif 000006
2010527246.tif 000007
2010527246.tif 000008
2010527246.tif 000009
【００４８】
よって、本発明の更なる態様は、ロイコトリエンＣ４シンターゼ（ＬＴＣ４Ｓ）の活性を調節することが期待される化合物を選択し又は設計する方法であって、分子モデル化手段を使用して、ＬＴＣ４Ｓのサブユニット相互作用領域と相互作用することが予想される化合物を選択し又は設計する工程を含み、ここで、ＬＴＣ４Ｓのサブユニット相互作用領域の少なくとも一部の三次元構造が、化合物の三次元構造と比較され、前記基質相互作用領域と相互作用することが予想される化合物が選択される方法を提供する。サブユニット相互作用領域に関与する残基は先の表４に示している。
【００４９】
ある化合物は、ＬＴＣ４Ｓの一を越える部分、例えばＬＴＣ４Ｓ活性部位の一を越える部分と相互作用することが予想される成分部分を有しうることが理解される。例えば、ある化合物は、上で検討したように、ＬＴＣ４ＳのＧＳＨ基質結合キャビティと相互作用する成分部分と、ＬＴＣ４Ｓの異なった部分、例えば「親油性基質結合クレバス」；及び／又は「触媒部位」、つまり活性部位の他の部分と相互作用する他の成分部分を有しうる。更なる試験のための化合物は、ＬＴＣ４Ｓの異なった部分、例えばＬＴＣ４Ｓ活性部位の異なった部分に結合することが予想される成分部分（個別では非常に小さい場合がありうる）から「構築」されうる。
三次元構造は、例えばコンピュータスクリーン上で、二次元形態でコンピュータによって表示されうる。比較は、かかる二次元表示装置を使用して実施することができる。
【００５０】
次のものは分子モデル化技術に関する：Blundell等(1996) Stucture-based drug design Nature 384, 23-26；Bohm (1996) Computational tools for structure-based ligand design Prog Biophys Mol Biol 66(3), 197-210；Cohen等(1990) J Med Chem 33, 883-894；Navia等 (1992) Curr Opin Struct Biol 2, 202-210。
【００５１】
例えば次のコンピュータプログラムが本発明のこの態様の方法を実施する際に有用でありうる：ＧＲＩＤ(Goodford (1985) J Med Chem 28, 849-857；Molecular Discovery, Pinner, UKから入手可能)；ＭＯＥ (Chemical Computing Group, Montreal, Quebec, Canada)；ＡＵＴＯＤＯＣＫ (Goodsell等(1990) Proteins: Structure, Function and Genetics 8, 195-202；Scripps Research Institute, La Jolla, CA, USAから入手可能)；ＤＯＣＫ (Kuntz等 (1982) J Mol Biol 161, 269-288；University of California, San Francisco, CAから入手可能)；ＬＵＤＩ (Bohm (1992) J Comp Aid Molec Design 6, 61-78；Accelrys, San Diego, CA, USAから入手可能)；Ｓｙｂｙｌ (Tripos Associates, St Louis, MO, USA)；Ｇａｕｓｓｉａｎ ０３、例えば改訂版Ｄ(Gaussian, Inc., Pittsburgh, PA, USA)；ＡＭＢＥＲ(University of California at San Francisco, San Francisco, CA, USA)；ＱＵＡＮＴＡ (Accelrys, San Diego, CA, USA)；及びＩｎｓｉｇｈｔ ＩＩ(Accelrys, San Diego, CA, USA)。プログラムは、例えば、Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｇｒａｐｈｉｃｓ(商標)、ＩＢＭ ＲＩＳＣ／６０００(商標)、又はＲｅｄ Ｈａｔ Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ Ｌｉｎｕｘワークステーションで実行することができる。
【００５２】
例えば実施例２に記載されたように、又はＵｎｉｔｙ(Tripos Associates, St Louis, MO, USA)又はＣｈｅｍＦｉｎｄｅｒ (CambridgeSoft, Cambridge, MA, USA)のようなプログラムを使用する新しいリガンドの部分構造サーチを経由して、幾つかのインシリコ法を用いることができる。天然リガンド（ＬＴＡ４又はＧＳＨ）又はＬＴＣ４Ｓに結合可能なその部分の基本的構造を取り出し（又は予想し）、その様々な構造的特徴（例えば疎水性及び荷電体）をプログラムに入力し、この部分構造を含む化学物質について化学会社のカタログの集合を検索する。例えば、ＧＳＨの末端の構造は、ＧＳＨ結合ポケット又は触媒部位と相互作用しうる化合物を検索する際に有用でありうる一方、ＬＴＡ４の構造、例えばその長さは、親油性基質結合クレバスと相互作用する化合物の検索に有用でありうる。
【００５３】
ついで、例えば大きすぎるか又は立体的又は電荷障害を有するために、触媒部位の一部、例えばＧＳＨ基質結合キャビティ（又は上で検討した他の部分）と相互作用し得ない基について、これらの化合物を、コンピュータを使用するか又は眼によって検索し、それを破棄する。残りの化学物質をＰＲＯＤＲＧサーバーに入力し、これら化学物質に対するトポロジー／座標をつくる。これらの化学物質を構造としてモデル化し、それから、ＧＳＨ基質結合キャビティ／親油性基質結合クレバス／触媒部位／相互作用領域におそらくは結合可能な化学物質を選択する。ＰＲＯＤＲＧプログラムの更なる詳細はｈｔｔｐ：／／ｄａｖａｐｃ１．ｂｉｏｃｈ．ｄｕｎｄｅｅ．ａｃ．ｕｋ／ｐｒｏｇｒａｍｓ／ｐｒｏｄｒｇ／ｐｒｏｄｒｇ．ｈｔｍｌにおいて入手可能である。
【００５４】
代替法は、ＧＲＯＭＯＳ／ＭＯＬ２／ＷＨＡＴＩＦトポロジー及び水素原子位置を小分子ＰＤＢファイルから作成するツールであるＰＲＯＤＲＧを使用することである。天然リガンドから出発し、当業者は、タンパク質座標及びリガンド骨格座標を固定したままで、リガンド上の各部位の全ての可能な基を、様々な新しい基を用いて、コンピュータによって変化させることができる。ついで、結果について、障害、反発、誘引をスクリーニングすることができる。
【００５５】
出発化合物は、ＬＴＣ４Ｓ酵素活性(例えば基質としてＬＴＡ４を使用)に対する効果をスクリーニングすることによって最初に選択し；ついで構造と比較し；更なる化合物の設計のための基礎として使用し；これをついで、以下に更に検討されるようにして、更なるモデル化及び／又は合成及び評価によって試験することができる。
ついで、選択された化合物を注文し又は合成し、ＬＴＣ４Ｓに結合し及び／又はＬＴＣ４Ｓ活性を調節する一又は複数の能力について評価する。化合物はＬＴＣ４Ｓポリペプチドで結晶化させ、任意の複合体の構造を決定することができる。
【００５６】
本発明の方法は、上述のように、コンピュータモデル化を使用して選択された化合物を提供し、合成し、精製し、及び／又は製剤化し；該化合物がＬＴＣ４Ｓの活性を調節するかどうかを評価する工程を更に含みうる。該化合物は、薬学的使用のため、例えば動物又はヒトにおけるインビボ治験に使用するために、処方されうる。
よって、本発明は、ＬＴＣ４Ｓ阻害剤の構造ベースの設計方法を提供する。かかる方法は、強い特異的な結合特性を有する有利な阻害剤を合成するためのテンプレートとして、例えば本座標、又は好ましくは選択された領域を定める座標を使用することに基づく。より詳細には、かかる方法は、単独で又はコンビナトリアルケミストリーと組み合わせて、一般的な有機合成を最初に使用することができ、ここで、合成の生成物の構造を、酵素及び阻害剤の結晶化サイクルによって更に洗練し、他の化学合成を続け、その生成物を再び精製等する。
【００５７】
ＬＴＣ４Ｓの活性を調節する化合物を選択することができる。例えば、ＬＴＣ４Ｓの活性を増加させる化合物を選択することができ、又はＬＴＣ４Ｓの活性を減少させる化合物を選択することができる。それぞれのタイプの化合物が有用でありうる（又はそのような化合物が更なる研究又は化合物設計のための出発点である）状況を以下に示す。
【００５８】
ＬＴＡ４（５Ｓ，５，６−オキシド−７，９−ｔｒａｎｓ−１１，１４−ｃｉｓエイコサテトラエン酸）に対するＬＴＣ４Ｓの活性を調節する化合物の能力を評価することができる。かかる評価はまたマイクロタイタープレート形式又は高スループットスクリーニングに適した他の形式で実施することもできる。評価は、当業者によく知られ、以下に記載される酵素アッセイ技術を使用して実施することができる。このようなアッセイで使用されるＬＴＣ４Ｓポリペプチドは、上で検討したように、ＬＴＣ４Ｓ活性を保持しているＬＴＣ４Ｓポリペプチドでありうる。例えば、当業者には明らかなように、完全長ヒトＬＴＣ４Ｓを含んでなるか又はヒトＬＴＣ４Ｓの断片、例えばＣ末端の２０、１０、５、４、３、２又は１までのアミノ酸を欠く断片を含んでなるポリペプチドを使用することができる。任意のそのようなコンピテントな断片は、活性部位が二つの隣接するサブユニットからの残基からなるので、活性な二量体又は三量体を形成するために相補的断片と一緒に存在していなければならない：そのような二量体又は三量体への構築は自然に生じるが、タンパク質工学における標準的技術を使用して、それらをまたリンカーによって連結してもよい。
【００５９】
ＬＴＣ４Ｓの作用を調節する、例えば阻害する化合物の能力を評価する際に使用することができるアッセイの例は上に記載している。
あるいは、ＬＴＣ４Ｓの脂肪酸ヒドロペルオキシダーゼ活性を調節する化合物の能力を測定することができる。適切なアッセイの例は上に記載している。
【００６０】
ＬＴＣ４Ｓの活性部位に結合する化合物はＬＴＣ４ＳのＬＴＣ４Ｓ活性（例えばＬＴＡ４に対する作用によって評価される）を調節することが予期される一方、ＬＴＣ４Ｓの他の活性又は性質、例えばサブユニット相互作用又は他のポリペプチド（例えば他のＭＡＰＥＧファミリーメンバー、例えばＦＬＡＰ）との相互作用、リン酸化(Gupta N等 FEBS Lett. (1999) 449(1):66-70)、又は二価陽イオンの効果(Nicholson DW等 Eur. J. Biochem. (1992) 209(2):725-34)、又は分子内相互作用又は他のＬＴＣ４Ｓ又はＦＬＡＰ単量体又は二量体との相互作用(Mandal AK等 Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2004) 101(17):6587-92)が調節されうることはありうる。
【００６１】
上で指摘したように、選択され又は設計された化合物は、合成され（まだ合成されていない場合）又は精製され、ＬＴＣ４Ｓ（又はＬＴＣ４Ｓ活性を有する断片、変異体又は融合物）に対するその効果、例えばＬＴＣ４Ｓ活性に対するその効果について試験されうる。化合物は、ＬＴＣ４Ｓポリペプチド又はＬＴＣ４Ｓが存在している細胞又は組織に対するその効果についてのインビトロスクリーニングで試験することができる。細胞又は組織は、内因性ＬＴＣ４Ｓを含み得、及び／又は外因性ＬＴＣ４Ｓ（ＬＴＣ４Ｓをコードする内因性核酸の操作の結果として発現されるＬＴＣ４Ｓを含む)を含みうる。化合物は、トランスジェニック動物又は組織を使用してもよいエキソビボ又はインビボスクリーニングで試験することができる。該化合物はまた、例えばＬＴＣ４Ｓ遺伝子の一又は複数のコピーのノックアウト又はノックダウンのためにＬＴＣ４Ｓを含まない（又は低減量のＬＴＣ４Ｓを含む）細胞、組織又は生物において比較のために試験することもできる。適切な試験は当業者には明らかであり、例には炎症の動物又はエキソビボモデルにおける効果の評価が含まれる。適切なモデルの例には、ザイモサン誘導腹膜炎及びアレルギー性喘息モデルとしての卵白アルブミン感作マウスが含まれる。化合物は、例えばヒト末梢血又はヒト臍帯血で、又はヒト末梢血又はヒト臍帯血から単離された細胞、例えば白血球、例えば好中球、好酸球、又は肥満細胞での炎症のヒトエキソビボモデルにおいて試験することができる。
【００６２】
当業者にはよく知られているように、化合物に例えば毒性試験又は代謝試験のような他の試験をまた施してもよい。
親油性基質結合クレバスに結合する化合物は、例えば肥満細胞のような細胞においてＬＴＣ４Ｓ産物に対するレセプター、つまりＬＴＣ４レセプターにまた結合することができる化合物でありうる。ＬＴＣ４レセプターの例にはＣｙｓＬＴ１、ＣｙｓＬＴ２及びＧＰＲ−１７が含まれる。よって、かかる化合物は、ＬＴＣ４アンタゴニスト又はアゴニストとして有用でありうる。適切な試験をまた実施してその通りであるかどうかを決定することができる。
【００６３】
ＬＴＣ４Ｓは、上で参照したＬＴＣ４Ｓ配列のアミノ酸配列からなるポリペプチド又はその天然に生じるアレル変異体からなるポリペプチドであることが好ましい。天然に生じるアレル変異体は哺乳動物、好ましくはヒトであることが好ましい。ＬＴＣ４Ｓは融合ポリペプチド、例えば上で検討したような、Ｎ末端ヘキサヒスチジンタグ又はＦＬＡＰとのものでありうる。
【００６４】
ＬＴＣ４Ｓの変異体又は断片又は誘導体又は融合物、又は変異体又は断片又は誘導体の融合物は、ＬＴＡ４のグルタチオンコンジュゲーションに対して完全長ヒトＬＴＣ４Ｓの酵素活性の少なくとも３０％を有していることが必須ではないが特に好ましい。前記ＬＴＣ４Ｓの変異体又は断片又は誘導体又は融合物、又は変異体又は断片又は誘導体の融合物は、ＬＴＡ４のグルタチオンコンジュゲーションに対してＬＴＣ４Ｓの酵素活性の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％を有していることがより好ましい。しかし、酵素活性を欠く変異体又は融合物又は誘導体又は断片は、例えば他のポリペプチドと相互作用することによって尚も有用でありうる。よって、酵素活性を欠く変異体又は融合物又は誘導体又は断片は、結合アッセイで有用であり得、これは、例えば、本発明の変異ＬＴＣ４Ｓと化合物の相互作用の調節が測定される本発明の方法において使用することができる。
【００６５】
ポリペプチドの「変異体」には、保存的であれ非保存的であれ、挿入、欠失及び置換が含まれる。特に、そのような変化が前記ポリペプチドの活性、例えば上述したＬＴＣ４ＳのＬＴＣ４Ｓ活性を実質的に変化させないポリペプチドの変異体が含まれる。
「保存的置換」には、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；及びＰｈｅ、Ｔｙｒのような組合せが意図される。
【００６６】
ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会の一及び三文字アミノ酸コードがここで使用される。特に、Ｘａａは任意のアミノ酸を表す。Ｘａａは天然に生じるアミノ酸を表すのが好ましい。アミノ酸はＬ−アミノ酸であることが好ましい。
ＬＴＣ４Ｓ変異体は、上で参照されるＬＴＣ４Ｓのアミノ酸配列(例えば上掲のLam等(1994))と少なくとも６５％の同一性、より好ましくは少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％又は７４％、更になお好ましくは少なくとも７５％、また更により好ましくは少なくとも８０％、更になお好ましくは少なくとも８５％、更になお好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％又は９７％の上述のアミノ酸配列との同一性を有しているアミノ酸配列を有している。
【００６７】
２つのポリペプチド間のパーセント配列同一性は、適切なコンピュータプログラム、例えばウイスコンシン大学遺伝子計算グループのＧＡＰプログラムを使用して決定することができ、パーセント同一性が、配列が最適に整列されたポリペプチドに関して計算されることが理解される。
整列は、別法では、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラム(Thompson等(1994) Nucl Acid Res 22, 4673-4680)を使用して実施することができる。使用されるパラメータは次の通りでありうる：
高速対整列パラメータ：Ｋ組(ワード)サイズ；１、ウインドウサイズ；５、ギャップペナツティ；３、トップダイアゴナル数；５。スコアリング法：ｘパーセント。
多重整列パラメータ：ギャップオープンペナルティ；１０、ギャップエキステンションペナルティ；０．０５。スコアリングマトリックス：ＢＬＯＳＵＭ。
【００６８】
Ａｒｇ１０４又はＡｒｇ３１；及び／又はＡｒｇ５１、Ａｒｇ３０、Ａｒｇ１０４、Ｇｌｎ５３、Ａｓｎ５５、Ｇｌｕ５８、Ｔｙｒ５９、Ｔｙｒ９３、Ｔｙｒ９７、Ｉｌｅ２７、Ｐｒｏ３７、Ｌｅｕ１０８（ＧＳＨ基質結合キャビティ残基）；及び場合によってはまたＡｌａ２０、Ｌｅｕ２４、Ｉｌｅ２７、Ｔｙｒ５９、Ｔｒｐ１１６、Ａｌａ１１２、Ｌｅｕ１１５、Ｌｅｕ１０８、Ｔｙｒ１０９、Ｌｅｕ６２、Ｖａｌ１１９、Ｔｈｒ６６、Ｖａｌ１６及びＬｅｕ１７（親油性基質結合クレバス残基）と等価である同一又は保存された残基を有していることが好ましい。残基が同一であるか又は保存されていることが望ましい他の残基は、上の表１、２、３又は４に列挙された他の残基を含む。
【００６９】
本発明の更なる態様は、完全長ヒトＬＴＣ４ＳのＡｒｇ５１、Ａｒｇ３０、Ａｒｇ１０４、Ｇｌｎ５３、Ａｓｎ５５、Ｇｌｕ５８、Ｔｙｒ５９、Ｔｙｒ９３、Ｔｙｒ９７、Ｉｌｅ２７、Ｐｒｏ３７、Ｌｅｕ１０８、Ａｌａ２０、Ｌｅｕ２４、Ｉｌｅ２７、Ｔｙｒ５９、Ｔｒｐ１１６、Ａｌａ１１２、Ｌｅｕ１１５、Ｌｅｕ１０８、Ｔｙｒ１０９、Ｌｅｕ６２、Ｖａｌ１１９、Ｔｈｒ６６、Ｖａｌ１６及びＬｅｕ１７又はＡｒｇ３１に等価な一又は複数の残基が変異されている変異ＬＴＣ４Ｓポリペプチドを提供する。
【００７０】
本発明は、変異形態が次の表５−７（ここで、アミノ酸は一文字コードで与えられている）に定義された変異の一又は複数を含むＬＴＣ４Ｓの変異形態に関する。よって、Ｒ５１Ｇ／Ａ／Ｖ／Ｌ／Ｉ／Ｓ／Ｔ／Ｄ／Ｅ／Ｎ／Ｑ／Ｈ／Ｋ／Ｐ／Ｃ／Ｍ／Ｆ／Ｙ／Ｗは、、ＬＴＣ４Ｓ番号付けスキームを使用して残基アルギニン５１がアラニン、バリン、ロイシン等々に修飾されることを示している。
（表５：活性部位における変異（ＧＳＨ結合部位））
2010527246.tif 000010
（表６：活性部位における変異（ＬＴＡ４結合部位））
2010527246.tif 000011
【００７１】
より詳細には、この実施態様は、少なくとも２つの変異アミノ酸、又は上述の変異配列の何れか一、又は配列番号（５）１−９，６（１−５）からなる群から選択される何れかの別個の一アミノ酸変異を含む変異に関する。
変異ＬＴＣ４ＳはＬＴＣ４Ｓのどこで興味あるポリペプチド又は化合物が相互作用するかを決定するのに有用でありうる。例えば、変異及び未変異ＬＴＣ４Ｓに結合するか、又はＬＴＣ４Ｓの活性を調節する化合物（ポリペプチドを含む）の能力を測定し、比較することができる。
【００７２】
本発明の更なる態様は、本発明の変異ＬＴＣ４Ｓポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明のまた更なる態様は、本発明の変異ＬＴＣ４Ｓを発現するのに適した組換えポリヌクレオチドを提供する。本発明のまた更なる態様は、本発明のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。
本発明の更なる態様は、本発明の変異ＬＴＣ４Ｓを作製する方法を提供し、該方法は、前記変異ＬＴＣ４Ｓを発現する本発明の宿主細胞を培養し、前記変異ＬＴＣ４Ｓを単離することを含む。
【００７３】
本発明の更なる態様は、上記方法によって得ることができる変異ＬＴＣ４Ｓを提供する。
本発明のこれらの態様の例は、当業者によって常套的な方法を使用して調製することができる。
例えば、上記変異ＬＴＣ４Ｓは、例えば分子生物学の方法又は自動化学ペプチド合成法を使用して、当該分野でよく知られている方法によって作製することができる。
【００７４】
ペプチド模倣化合物もまた有用でありうることが理解される。よって、「ポリペプチド」又は「ペプチド」では、アミノ酸残基がペプチド（−ＣＯ−ＮＨ−）結合によって結合される分子ばかりでなく、ペプチド結合が逆にされる分子もまた含む。ペプチド模倣化合物を設計し作製する方法は当業者に知られている。
本発明は、ＬＴＣ４Ｓの活性を調節する化合物を同定し又は特徴付ける方法であって、本発明の前記変異ＬＴＣ４ＳのＬＴＣ４Ｓ活性、又はそれに結合する化合物の能力に対する化合物の効果を決定する工程を含む方法を更に提供する。
【００７５】
本方法は、前記残基において変異していないＬＴＣ４ＳのＬＴＣ４Ｓ活性、又はそれに結合する化合物の能力に対する化合物の効果を決定することを更に含みうる。
例えば、当業者には明らかであるように、化合物が予想通りに結合していることを確認等するために、野生型(未変異型) ＬＴＣ４Ｓ及び残基（例えばコンピュータモデル化研究から試験化合物が相互作用することが予想される残基）が変異している変異ＬＴＣ４Ｓに対する化合物の効果を比較することは有用でありうる。
ＬＴＣ４Ｓ又は変異ＬＴＣ４Ｓが、実施例１に記載されるように、例えば精製又は結晶化を助けるためにタグ、例えばヘキサヒスチジンタグを含む融合タンパク質でありうることは理解されるであろう。
【００７６】
本発明の更なる態様は、（１）本発明の変異ＬＴＣ４Ｓと（２）そのように変異されていない対応のＬＴＣ４Ｓを含む本発明の先の態様に係る方法を実施するのに有用なパーツのキットを提供する。
化合物（これはポリペプチドでありうる）との相互作用又は結合に関する前記ＬＴＣ４Ｓポリペプチドの能力は、以下で更に検討するように、タンパク質／タンパク質相互作用又は他の化合物／タンパク質相互作用を検出／測定する任意の方法によって測定することができる。適切な方法には、例えば酵母ツーハイブリッド相互作用、同時精製、ＥＬＩＳＡ、共免疫沈降及び表面プラズモン共鳴法のような方法が含まれる。よって、ＬＴＣ４Ｓポリペプチドは、ＬＴＣ４Ｓポリペプチドと化合物又はポリペプチドの間で相互作用がＥＬＩＳＡ、共免疫沈降及び表面プラズモン共鳴法又は酵母ツーハイブリッド相互作用又は同時精製法によって検出される場合には、ポリペプチド又は他の化合物に結合し、又は相互作用することができると考えられうる。相互作用は表面プラズモン共鳴法を使用して検出することができることが好ましい。表面プラズモン共鳴法は当業者にはよく知られている。技術は例えば、O'Shannessy DJ Determination of kinetic rate and equilibrium binding constants for macromolecular interactions: a critique of the surface plasmon resonance literature. Curr Opin Biotechnol. 1994 Feb;5(1):65-71；Fivash M, Towler EM, Fisher RJ BIAcore for macromolecular interaction.Curr Opin Biotechnol. 1998 Feb;9(1):97-101；Malmqvist M BIACORE: an affinity biosensor system for characterization of biomolecular interactions. Biochem Soc Trans. 1999 Feb;27(2):335-40に記載されている。
【００７７】
ＬＴＣ４ＳのＬＴＣ４Ｓ活性に対する化合物の効果を、上に示したように、評価することができる。ＬＴＣ４ＳのＬＴＣ４Ｓ活性を減少させる化合物を選択することができる。よって、かかる化合物は、例えばＬＴＣ４、ＬＴＤ４又はＬＴＥ４の形成が阻害され又は減少させられることが必要とされる症状の治療において、あるいはＣｙｓ−ＬＴレセプター（例えばＣｙｓ−ＬＴ１又はＣｙｓ−ＬＴ２）の活性化が阻害され又は減弱されることが必要とされる場合に有用でありうる。本発明の化合物はまたミクロソームグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＭＧＳＴｓ）、例えばＭＧＳＴ−Ｉ、ＭＧＳＴ−ＩＩ及び／又はＭＧＳＴ−ＩＩＩを阻害し、よってＬＴＤ４、ＬＴＥ４又は、特にＬＴＣ４の形成を阻害し又は減少させうる。
【００７８】
よって、かかる化合物は、ロイコトリエン（例えばＬＴＣ４）の生産（つまり、合成及び／又は生合成）の阻害から恩恵を受けうる疾患、例えば呼吸器疾患及び／又は炎症の治療に有用であることが期待される。当業者によく知られているように、かかる疾患及び／又は炎症の治療のための化合物の適合性を評価するために更なる試験を実施することができる。
【００７９】
「炎症」という用語は、上で述べたもののような身体外傷、感染、慢性疾患によって誘発されうる局所的又は全身性保護反応、及び／又は外部刺激に対する化学的及び／又は生理学的反応（例えばアレルギー反応の一部として）によって特徴付けられる任意の症状を含むと当業者に理解される。有害な薬剤と傷ついた組織の双方を破壊、希釈又は隔離する作用をするあらゆるそのような応答は、例えば発熱、腫れ、痛み、発赤、血管拡張及び／又は血流増加、白血球の罹患領域への侵入、機能喪失及び／又は炎症症状に伴うことが知られている任意の他の徴候に顕れうる。
【００８０】
よって、「炎症」という用語は、任意の炎症疾患、障害又は症状自体、それを伴う炎症要素を持つ任意の症状、及び／又はとりわけ急性、慢性、潰瘍、特異性、アレルギー性及び壊死性炎症、及び当業者に知られている炎症の他の形態を含む、徴候として炎症を特徴とする任意の症状を含むものとまた理解される。よって、その用語はまた本発明の目的に対して炎症痛、疼痛一般及び／又は発熱を含む。
【００８１】
従って、かかる化合物は、アレルギー性疾患、喘息、小児喘鳴、慢性閉塞性肺疾患、気管支肺異形成症、嚢胞性線維症、間質性肺疾患（例えば、サルコイドーシス、肺線維症、強皮症肺疾患、及び通常型間質性肺炎）、耳鼻咽喉科疾患（例えば、鼻炎、鼻ポリープ及び中耳炎）、眼科疾患（例えば、結膜炎及び巨大乳頭結膜炎）、皮膚疾患（例えば、乾癬、皮膚炎、及び湿疹）、リウマチ疾患（例えば、関節リウマチ、関節症、乾癬性関節炎、変形性関節症、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症）、脈管炎（例えばヘノッホ・シェーンライン紫斑病、レフラー症候群及び川崎病）、循環器疾患（例えばアテローム性動脈硬化症）、消化器疾患（例えば、消化器系における好酸球性疾患、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、結腸炎、腹腔及び胃出血）、泌尿器疾患（例えば、糸球体腎炎、間質性膀胱炎、腎炎、腎症、ネフローゼ症候群、肝腎障害症候群、及び腎臓毒性）、中枢神経系疾患（例えば、脳虚血、脊髄損傷、偏頭痛、多発性硬化症、及び睡眠呼吸障害)、内分泌疾患（例えば自己免疫甲状腺炎、糖尿病関連炎症）、蕁麻疹、アナフィラキシー、血管性浮腫、クワシオルコル浮腫、月経困難症、火傷誘発酸化損傷、多発外傷、疼痛、毒性オイル症候群、内毒素性ショック、敗血症、細菌感染症（例えば、ヘリコバクター・ピロリ、緑膿菌又はシゲラ・ディゼンテリエ）、真菌感染症（例えば、外陰膣カンジダ症)、ウイルス感染症（例えば、肝炎、髄膜炎、パラインフルエンザ及び呼吸器合胞体ウイルス）、鎌状赤血球貧血、好酸球増多症候群、及び悪性腫瘍（例えば、ホジキンリンパ腫、白血病（例えば、好酸球性白血病及び慢性骨髄性白血病）、肥満細胞症、真性多血症、及び卵巣癌）の治療に有用でありうる。特に、本発明の化合物は、アレルギー性疾患、喘息、鼻炎、結膜炎、ＣＯＰＤ、嚢胞性線維症、皮膚炎、蕁麻疹、好酸球性胃腸病、炎症性腸疾患、関節リウマチ、変形性関節症及び疼痛を治療する際に有用でありうる。
かかる化合物は上述の症状の治癒的及び／又は予防的処置に対して有用でありうる。
【００８２】
ＬＴＣ４ＳのＬＴＣ４シンターゼ活性を増加させる化合物は、ＬＴＣ４、ＬＴＤ４及び／又はＬＴＥ４の生産の亢進が有用である状況、例えば免疫応答障害の患者における免疫応答を向上させる際に有用でありうる。
本発明は、ＬＴＣ４ＳのＬＴＣ４Ｓ活性を調節し、例えば向上させ又は阻害するのに有用でありうる薬剤を同定する試みに使用されるスクリーニングアッセイを提供すると理解される。該方法で同定される化合物はそれ自体薬剤として有用であり得、又はそれらはより効能のある化合物の設計と合成のためのリード化合物となりうる。
該化合物は、化合物を同定する上記各方法に対する薬物様化合物の開発のための薬物様化合物又はリード化合物でありうる。前記方法は、当業者によく知られているように、薬学的化合物の開発におけるスクリーニングアッセイとして有用でありうるものと理解される。
【００８３】
「薬物様化合物」という用語は、当業者によく知られており、医薬品としての使用にそれを適するものにする特性、例えば、医薬品における有効成分としての特性を有する化合物の意味を含みうる。よって、例えば、薬物様化合物は、有機化学の技術によるか、それより好ましくはないが、分子生物学又は生化学の技術により合成されうる分子であり得、５０００ダルトン未満、より好ましくは１０００、７５０又は５００ダルトン未満でありうる。薬物様化合物は、特定のタンパク質又はタンパク質群との選択的相互作用の特徴を更に示し、生物学的に利用可能であり、及び／又は細胞膜を貫通可能であってもよいが、これらの特徴は必須ではないことは理解されるであろう。
【００８４】
「リード化合物」という用語は、同様に当業者によく知られており、それ自体薬物としての使用に適さない（例えば、その所期の標的に対して弱い効力を示すに過ぎず、その作用が非選択的で、不安定で、合成が困難であり又は不十分な生物学的利用能を有する）が、その化合物がより望ましい特性を有しうる他の化合物の設計の出発点を与えるものであるという意味を含みうる。
【００８５】
ＬＴＣ４Ｓの活性をインビボで調節しうる化合物を同定することが望ましいことが理解される。よって、該方法において使用される試薬及び条件は、例えばＬＴＣ４Ｓと基質との間の相互作用がヒトＬＴＣ４Ｓと天然に生じる基質（例えば、ＬＴＡ４）との間の作用と同様であるように選択されうる。当業者にはよく知られているように、アッセイの簡便さ又はＬＴＣ４Ｓに対する効果の特異性が最適化されうる幾つかの場合では、異なったアッセイ系を化合物の評価に使用することができる一方、他の場合では、例えば全細胞における化合物の効果を評価することによって、インビボ関連性を最適化できる。
該アッセイ又はＬＴＣ４ＳのＬＴＣ４Ｓ活性を調節する化合物の能力が測定されうる他のアッセイのスクリーニング方法で試験される化合物は、例えばコンピュータ技術を使用し、分子モデル化技術を使用して選択され及び／又は設計（修飾を含む）された化合物でありうる。
【００８６】
本発明はまた関連タンパク質（以下では標的タンパク質と称される）のホモロジーモデリングのための手段を提供する。「ホモロジーモデリング」とは、表ＩからＩＩの座標データの操作に基づいて、Ｘ線結晶学的データか構造のコンピュータ支援デノボ予測の何れかに基づく関連ＭＡＰＥＧファミリーメンバー構造の予測を意味する。
「ホモロジーモデリング」は、その構造が添付の実施例において決定されているヒトＴＣ４Ｓタンパク質に関連している標的ＭＡＰＥＧタンパク質まで拡張される。それはまたＬＴＣ４Ｓ変異体まで拡張される。
【００８７】
一般に、該方法は、アミノ酸配列を比較することにより、表Ｉ又はＩＩのＬＴＣ４Ｓタンパク質のアミノ酸配列を標的ＭＡＰＥＧファミリーメンバータンパク質と比較することを含む。ついで、配列中のアミノ酸を比較し、相同である（「対応領域」と称される）アミノ酸のグループが一緒にグループ化される。この方法はポリペプチドの保存領域を同定し、アミノ酸挿入又は欠失を明らかにする。ＬＴＣ４Ｓから得られた構造情報に鑑みたＭＡＰＥＧファミリー配列の整列は実施例１で検討し、整列を図６に示す。
アミノ酸配列間のホモロジーは、別法では又は加えて、上で検討したように、商業的に利用可能なアルゴリズムを使用して決定することができる。既知の構造及び未知の構造のポリペプチドのアミノ酸配列をひとたび整列させると、既知の構造のポリペプチドのコンピュータ表示中の保存アミノ酸の構造を、標的タンパク質の対応アミノ酸に移す。例えば、既知の構造のアミノ酸配列中のチロシンを、標的タンパク質のアミノ酸配列中の対応する相同アミノ酸であるフェニルアラニンによって置き換えられうる。
【００８８】
非保存領域に位置するアミノ酸の構造は、標準的なペプチド幾何学を使用することによって又は分子シミュレーション技術、例えば分子力学によって手作業で決定されうる。該プロセスの最終工程は、分子力学及び／又はエネルギー極小化を使用して全体構造を精密にすることによって達成することができる。
かかるホモロジーモデリングは、当業者によく知られている技術である（例えばGreer, Science, Vol. 228, (1985), 1055、及びBlundell等, Eur.J. Biochem, Vol. 172, (1988), 513を参照のこと）。これらの文献に記載されている技術、並びに当該分野で一般的に利用できる他のホモロジーモデリング技術を、本発明を実施する際に使用することができる。
【００８９】
よって、本発明の更なる態様は、標的ＬＴＣ４Ｓタンパク質又は他のＭＡＰＥＧファミリーメンバータンパク質又はそのホモ-又はヘテロ多量体（標的タンパク質）の三次元構造を予想する方法であって、標的タンパク質のアミノ酸配列の提示を、２．０Å以下、好ましくは１．５Å、１．０Å又は０．５Å未満の標準二乗偏差だけ変動してもよい表Ｉ又はＩＩのＬＴＣ４Ｓのアミノ酸配列、又はその選択された座標と整列させ、アミノ酸配列の相同領域を一致させ；２．０Å、１．５Å、１．０Å又は０．５Å以下の標準二乗偏差だけ変動してもよい表Ｉ又はＩＩによって定義されたＬＴＣ４Ｓ構造の対応領域、又はその選択された座標で前記標的タンパク質の一致した相同領域の構造をモデル化し；前記一致した相同領域の構造を実質的に保存する前記標的タンパク質に対するコンフォメーションを決定する工程を含む方法を提供する。
【００９０】
好ましくは、該方法はコンピュータモデル化を使用して実施される。
ＭＡＰＥＧファミリーメンバーは、ＦＬＡＰ、ＭＧＳＴ１、ＭＧＳＴ２、ＭＧＳＴ３、ＭＰＧＥＳ−１又はＬＴＣ４Ｓタンパク質でありうる。典型的には、ＭＡＰＥＧファミリーメンバーの構造は、未知であるか又は低分解能、例えば２．５Å未満の分解能でのみ知られている。予想される構造は、上に記載したように、例えば、ＦＬＡＰポリペプチドとのＬＴＣ４Ｓポリペプチドのヘテロ多量体（ヘテロ二量体）又はＬＴＣＳの内部セグメントがＦＬＡＰの対応するセグメントで置き換えられている融合物に対して予想される構造でありうる。
【００９１】
本発明の更なる態様は、標的ＬＴＣ４Ｓタンパク質又は他のＭＡＰＥＧファミリーメンバータンパク質又はそのホモ-又はヘテロ多量体（標的タンパク質）の構造を得る方法であって、前記標的タンパク質の結晶を提供し；前記結晶のＸ線回折パターンを得、表Ｉ又はＩＩのＬＴＣ４Ｓ構造±２．０Å未満、好ましくは１．５Å、１．０Å又は０．５Å未満のタンパク質の骨格原子からの標準二乗偏差、又はその選択された座標で前記標的タンパク質の構造をモデル化することによって、前記標的タンパク質の三次元原子座標構造を計算する工程を含む方法を提供する。
よって、本ＬＴＣ４Ｓ構造は、関連ポリペプチドからＸ線回折データを解釈するのに有用でありうる。
【００９２】
本発明の更なる態様では、ここで提供されるＬＴＣ４Ｓの３Ｄ構造は、２Ｄ結晶から構造を作成するために電子結晶学的データを解釈するために使用することができる。本発明の更なる態様は、標的ＬＴＣ４Ｓタンパク質又は他のＭＡＰＥＧファミリーメンバータンパク質又はそのホモ-又はヘテロ多量体（標的タンパク質）の構造を得る方法であって、前記標的タンパク質の結晶を提供し；前記結晶の電子回折パターンを得；表Ｉ又はＩＩのＬＴＣ４Ｓ構造±２．０Å未満、好ましくは１．５Å、１．０Å又は０．５Å未満のタンパク質骨格原子からの標準二乗偏差、又はその選択された座標で前記標的タンパク質の構造をモデル化することによって、前記標的タンパク質の三次元原子座標構造を計算する工程を含む方法を提供する。結晶は２Ｄ結晶でありうる。
【００９３】
本発明の更なる態様は、ＭＡＰＥＧファミリーメンバータンパク質又はそのホモ-又はヘテロ多量体の活性を調節することが予期される化合物を選択し又は設計する方法であって、ＭＡＰＥＧファミリーメンバータンパク質又はそのホモ-又はヘテロ多量体の触媒部位又は基質結合領域と相互作用することが予想される化合物を選択し又は設計する分子モデル化手段を使用する工程を含み、ここで、ＭＡＰＥＧファミリーメンバータンパク質又はそのホモ-又はヘテロ多量体の触媒部位又は基質結合領域の少なくとも一部の三次元構造を化合物の三次元構造と比較し、前記触媒部位又は基質結合領域と相互作用することが予想される化合物を選択し、ここで、ＭＡＰＥＧタンパク質又はそのホモ-又はヘテロ多量体の触媒部位又は基質結合領域の少なくとも一部の三次元構造が、本発明の先の３通りの態様に係る方法によって予想され又は得られる三次元構造（又はその一部）である方法を提供する。
【００９４】
化合物を選択し又は設計するための本発明の方法において、適合される分子構造がファルマコフォアモデルの形態でありうる。
本発明の更なる態様は、合理的薬剤設計のコンピュータベースの方法において、（ａ）２．０Å、１．５Å、１．０Å又は０．５Å未満のタンパク質骨格原子の標準二乗偏差だけ変動してもよい表Ｉ又はＩＩで定義されたＬＴＣ４Ｓの座標又はその選択された座標を提供し；（ｂ）複数の分子断片の構造を提供し；（ｃ）分子断片の各々の構造を選択された座標に一致させ；（ｄ）分子断片を単一の分子に組み立てて候補調節因子分子を形成することを含む方法を提供する。
【００９５】
該方法は、（ａ）分子断片又は調節因子分子を取得し又は合成し；（ｂ）分子断片又は調節因子分子をＬＴＣ４Ｓと接触させて、ＬＴＣ４Ｓと相互作用する分子断片又は調節因子分子の能力を決定する工程を更に含みうる。
【００９６】
選択された座標は、活性部位を定める座標、例えば上で検討されたような基質結合領域又は触媒部位でありうる。断片は、例えば活性部位の異なった部分に適合され得、ついで当業者によく知られている技術を使用して一緒に組み立てられ得る。例えば、Hajduk及びGreer (2007) Nature Reviews Drug Discovery 6, 211-219を参照のこと。
【００９７】
本発明の更なる態様は、ＬＴＣ４Ｓの三次元構造の提示を得る方法であって、２．０Å、１．５Å、１．０Å又は０．５Å未満のタンパク質骨格原子の標準二乗偏差だけ変動してもよい表Ｉ又はＩＩのデータ又はその選択された座標を提供し、前記座標を表す三次元構造を構築することを含む方法を提供する。
【００９８】
該構造は、例えば（ａ）ワイヤ−フレームモデル；（ｂ）チキン−ワイヤモデル；（ｃ）ボール＆スティックモデル；（ｄ）空間充填モデル；（ｅ）スティックモデル；（ｆ）リボンモデル；（ｇ）スネークモデル；（ｈ）アローシリンダーモデル；（ｉ）電子密度マップ；（ｊ）分子表面モデルとして提示されうる。
【００９９】
本発明の更なる態様は、ＬＴＣ４Ｓ又は他のＭＡＰＥＧファミリーメンバータンパク質又はそのホモ-又はヘテロ多量体、ＬＴＣ４Ｓ又は他のＭＡＰＥＧファミリーメンバータンパク質又はそのホモ-又はヘテロ多量体と化合物との複合体と相互作用する化合物の構造を作成し及び／又は化合物の最適化を実施するためのコンピュータ可読の格納媒体又はコンピュータシステムであって、（ａ）２．０Å、１．５Å、１．０Å又は０．５Å未満のタンパク質骨格原子の標準二乗偏差だけ変動してもよい表Ｉ又はＩＩのＬＴＣ４Ｓ座標データ又はその選択された座標であって、ＬＴＣ４Ｓの三次元構造を定める前記データ又はその前記選択された座標；（ｂ）２．０Å、１．５Å、１．０Å又は０．５Å未満のタンパク質骨格原子の標準二乗偏差だけ変動してもよい表Ｉ又はＩＩの座標データ又はその選択された座標に基づく標的の相同モデル化によって作成された標的ＭＡＰＥＧファミリーメンバータンパク質又はそのホモ-又はヘテロ多量体の原子座標データ；（ｃ）２．０Å、１．５Å、１．０Å又は０．５Å未満のタンパク質骨格原子の標準二乗偏差だけ変動してもよい表Ｉ又はＩＩの座標データ又はその選択された座標を参照してＸ線結晶学的データ又はＮＭＲデータを解釈することによって作成された標的ＭＡＰＥＧファミリーメンバータンパク質又はそのホモ-又はヘテロ多量体の原子座標データ；（ｄ）（ｂ）又は（ｃ）の原子座標データから誘導できる構造因子データ；及び（ｅ）２．０Å、１．５Å、１．０Å又は０．５Å未満のタンパク質骨格原子の標準二乗偏差だけ変動してもよい表Ｉ又はＩＩの原子座標データ又はその選択された座標の一又は複数を含む格納媒体又はコンピュータ可読データを含むシステムを提供する。
かかるコンピュータシステムは本発明の選択又は設計方法を実施するのに有用でありうる。
【０１００】
「コンピュータ可読格納媒体」なる用語は当業者にはよく知られており、コンピュータによって直接読むことができアクセスできる任意の媒体又は媒体群を含む。かかる媒体には、限定されるものではないが、磁気格納媒体、例えばフロッピーディスク（登録商標）、ハードディスク格納媒体及び磁気テープ；光学格納媒体、例えば光学ディスク又はＣＤ−ＲＯＭ；電気格納媒体、例えばＲＡＭ及びＲＯＭ；及びこれらのカテゴリーの混成品、例えば磁気／光学格納媒体が含まれる。
【０１０１】
「コンピュータシステム」なる用語はまた当業者にはよく知られており、本発明の原子座標データを解析するために使用されるハードウェア手段、ソフトウェア手段及びデータ格納手段を含む。本発明のコンピュータベースのシステムの最小のハードウェア手段は、典型的には中央演算装置（ＣＰＵ）、ワーキングメモリー及びデータ格納手段、及び例えば入力手段、出力手段等々を含む。モニターをまた設けて構造データを可視化することができる。データ格納手段はＲＡＭ又は本発明のコンピュータ可読媒体にアクセスするための手段でありうる。かかるシステムの例は、シリコン・グラフィックス社から入手可能なマイクロコンピュータワークステーション及びサン・マイクロシステムズ製Ｕｎｉｘベース、Ｌｉｎｕｘベース、ウインドウズＮＴ又はＩＢＭのＯＳ／２オペレーティングシステムである。本発明の方法は、例えばインターネットを使用して、本発明の原子座標データに遠隔からアクセスすることによって実施してもよいことが理解される。
【０１０２】
ここで言及される全ての文献は出典明示によってここに援用する。
以下、本発明を次の非限定的な図面及び実施例を参照して更に詳細に説明する。以下と本明細書の先の部分に与えた全ての文献は出典明示によってここに援用する。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】ロイコトリエン生合成におけるキー酵素及び中間体。
【図２Ａ】ＬＴＣ４シンターゼの全体構造。ａ）左側：ヘリックス１からヘリックス５を示すリボン描画でのＬＴＣ４シンターゼプロモータの正面図。最後の残基（ＧＳＨ−複合体構造中の最後の４つ）を除くＬＴＣ４シンターゼポリペプチド全体は、電子密度マップにおいてトレース可能である。右側：ホモ三量体。結合したグルタチオンは、ボール＆スティック描画において活性部位の位置を示す。おおよその膜の位置は黒い線で示している。
【図２Ｂ】ｂ）三量体のサイトゾル図で、３つの活性部位の位置を示し、ループ１は各結合ポケットを覆っている。グルタチオンはモデル化した界面活性剤と共にボール＆スティック描画で示す。
【図３】基質−及び脂質−タンパク質相互作用。ａ）三量体タンパク質の表面描画。タンパク質表面を裏打ちする炭素鎖のボール＆スティック描画を含む。界面活性剤分子が示され、下方に、結合したグルタチオンが垣間見られる。ｂ）ａ）に示したＬＴＣ４シンターゼのサイトゾル側からの断面で、ＧＳＨの極性結合ポケットと脂肪族補助基質が結合する間隙を明らかにしている。破線の結合は界面活性剤分子の第二ピラノシドの部分的な占有を強調している。
【図４Ａ】グルタチオン結合。ａ）ボール＆スティック描画で示した結合グルタチオンの電子密度マップ（２ＦＯ−ＦＣ，３σで輪郭描画し、精密化前にアポ構造とフェーズ化）。よって、相互作用側鎖を標識する。グルタチオンに対する化学結合は破線で示す。配位した水分子は球として示す。
【図４Ｂ】ｂ）アポ及びグルタチオン結合構造における活性部位の重ね合わせ。グルタチオンはスティック描画で示し、アポ構造からのサルフェート分子を示す。
【図５】疎水性結合クレバス及び提案された基質結合と触媒作用の概略機構。ａ）相互作用し境界にくる残基をスティックとして示して、２つの単量体間の界面を示す。球はシステイニル硫黄が位置している領域を示す。結合した界面活性剤はボール＆スティックモデルとして示す。ｂ）ａ）に対して反時計回りに９０°回転させた基質結合領域の側面図。明確にするために、Ｔｒｐ１１６’クレバスを持つ単量体のみを示す。取り除いた単量体は、疎水性残基を脂質結合間隙に、極性残基をグルタチオンに寄与させる。ｃ）提案された基質結合及びコンジュゲーションの概略図。
【図６】ＭＡＰＥＧファミリーの配列アラインメント。マウス（ｍ）、ラット（ｒ）、ウシ（ｃ）及びニワトリ（ｃｈ）由来の他のＭＡＰＥＧメンバーに整列化させたヒト（ｈ）ＬＴＣ４Ｓの一次配列。大文字のＧは構造中のＧＳＨに結合している残基を示す。これらの残基の保存を強調している。ヘリックスは対応するヘリックス番号を用いて示している。
【図７】ＬＴＣ４シンターゼによって触媒される反応の概略図。左側のＬＴＡ４とグルタチオンが非可逆反応で結合されてＬＴＣ４を形成する。
【図８】金属配位及び結晶充填。ａ）一つの金属の一つの三量体による完全な配位とヘキサ−ヒスチジンタグによる３つの金属（ドット）の部分的配位を示す核周囲図。ｂ）ａ）に示されるＮ末端を配位する十二量体当たり全８金属の金属クラスターによって主に支配されている結晶対称。
【図９】グルタチオン結合。ボール＆スティック描画で示した結合グルタチオンに対する電子密度マップ（２ＦＯ−ＦＣ，３σで輪郭描画し、精密化前にアポ構造とフェーズ化）を示す活性部位の立体図。よって、相互作用側鎖を単量体によって着色し、標識する。グルタチオンに対する化学結合は破線で示す。
【図１０】タンパク質リガンド相互作用の概略図。破線として結合長及び相互作用を示すグルタチオン及び相互作用残基のＬＩＧＰＬＯＴ。暗い破線はＡｒｇ１０４’とシステイニル硫黄の間の相互作用を示す。
【実施例】
【０１０４】
実施例１：ＬＴＣ４Ｓの結晶化及び構造決定
（材料及び方法）
イミダゾール、トリス・ベース、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、トリトンＸ−１００、デオキシコール酸ナトリウム、Ｓ−へキシルグルタチオンアガロース、プロベネシド、還元グルタチオン（ＧＳＨ）及び２‐メルカプトエタノールは、Ｓｉｇｍａから得られた。ドデシル・マルトシドは、Ａｎａｔｒａｃｅから得られた。
【０１０５】
ヒトＬＴＣ４Ｓは、酵母のヘキサ−ヒスチジン構築物として発現された。膜からの抽出は、トリトンＸ−１００及びトリトン−ＤＯＣ混合液を用いて行われた。タンパク質は２つのアフィニティークロマトグラフィ・ステップを用いて精製され、ゲル濾過によって最終精製され、界面活性剤をｎ−ドデシル−Ｄ−マルトシドに交換可能とした。
【０１０６】
（クローニング及びプラスミド構造）
ヒトＬＴＣ４ＳｃＤＮＡ（I.M.A.G.E. cDNA clone 5277851, MRC geneservice, Cambridge, UK）は、ｐＰＩＣＺＡ（Invitrogen）にサブクローニングされた。Ｈｉｓ６タグをコード化するＮ末端配列を追加された両方のｃＤＮＡ及びベクターはＰＣＲで増幅され、その産物はＣａＣｌ２−コンピテント大腸菌（ＴＯＰ１０、Invitrogen）に同時形質転換され、断片を再び結合するために大腸菌の内因性のリコンビナーゼ活性を利用した。結果として生じるプラスミド（ｐＰＩＣＺ−ｈｉｓＬＴＣ４Ｓ）のタンパク質コード化部分は、ＤＮＡ塩基配列決定によって確認された。
【０１０７】
（タンパク質発現及び精製）
発現ベクターはＰｉｃｈｉａ  ＥａｓｙＣｏｍｐ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎキット（Invitrogen）を用いて、Ｐ．  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＫＭ７１Ｈ細胞に形質転換された。組換え細胞は、バッフルフラスコにおいてグリセロール（Invitrogen）が入った２．５Ｌの最少酵母培地で２７℃で培養された。ＯＤ６００が８−１０に達した場合、細胞は０．５％メタノールが入った０．５Ｌの最少酵母培地中に再懸濁された。細胞は、７２時間後、遠心（２５００ｘｇ、７分）により採取され、５０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ７．８、１００ｍＭＫＣｌ及び１０％グリセロール中に再懸濁された。細胞は、ガラスビーズ（０．５ｍｍ）でホモジナイズされ、スラリーはナイロンネットフィルター（１８０μｍ、Millipore）で濾過され、遠心分離された（１５００ｘｇ、１０分）。上清中の膜に結合したタンパク質は、氷上で１時間撹拌しながらトリトンＸ−１００（１％、ｖ／ｖ）及びデオキシコール酸ナトリウム（０．５％、ｗ／ｖ）を用いて可溶化された。遠心（１００００ｘｇ、１０分）の後、上清に１０ｍＭイミダゾールを追加し、Ｎｉ−セファロースＦａｓｔ  Ｆｌｏｗ（GE Healthcare）にロードされた。カラムは、２０ｍＭイミダゾール及び０．１ＭＮａＣｌを追加されたバッファＡ（２５ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ７．８、１０％グリセロール、０．１％トリトンＸ−１００及び５ｍＭ２‐メルカプトエタノール）で洗浄され、続いて４０ｍＭイミダゾール及び０．５Ｍ  ＮａＣｌを含有するバッファＡで洗浄した。ＬＴＣ４シンターゼは、バッファＡの３００ｍＭイミダゾール、０．５ＭＮａＣｌ及び０．１ｍＭＧＳＨで溶出された。
【０１０８】
精製の最終ステップは、３ｍＬのＳ−へキシルグルタチオンアガロースで充填されるカラムで行われた。カラムは０．５Ｍ  ＮａＣｌ及び０．１ｍＭ  ＧＳＨを追加されたバッファＡで洗浄された。純粋なＬＴＣ４シンターゼは、２５ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ７．８、０．１％トリトンＸ−１００、３０ｍＭプロベネシド、５ｍＭ２−メルカプトエタノール及び０．１ｍＭＧＳＨで溶出された。精製されたタンパク質は、−２０℃で凍結保存されるか、又は０．０３％ｗ／ｖＤＤＭ（ｗ／ｖ）、２０ｍＭトリスｐＨ８．０、３００ｍＭＮａＣｌ及び０，５ｍＭＴＣＥＰで平衡化されたＳｕｐｅｒｄｅｘ２００  １６／６０（GE Healthcare）上でバッファー交換ステップにおいて更に直接ポリッシュされた。ＬＴＣ４シンターゼを含む画分は、限外濾過によって３．１ｍｇ／ｍｌに濃縮された。
【０１０９】
（結晶化）
結晶は、シッティングドロップ蒸気拡散技術を用いて、３．１ｍｇ／ｍｌの膜タンパク質溶液から４℃又は２０℃のいずれかで成長させた。結晶は通常は３−４日間後に見られ、およそ７日間後に最適のサイズに到達した。
【０１１０】
２０ｍＭトリスｐＨ８．０、３００ｍＭＮａＣｌ、０．０３％（ｗ／ｖ）ＤＤＭを含むタンパク質溶液は、天然タンパク質には２００ｍＭＮａＣｌ、１００ｍＭＮａカコジラートｐＨ６．５、２ＭＡｍｍｏｎｉｕｍ  Ｓｕｌｐｈａｔｅ（ＡｍＳＯ４）；ＧＳＨ誘導体には２％ＰＥＧ４００、１００ｍＭＨＥＰＥＳ  Ｎａ、ｐＨ７．５、２ＭＡｍＳＯ４、又は重原子浸漬には１００ｍＭビス−トリスｐＨ５．５、２ＭＡｍＳＯ４のいずれかを含むリザーバー溶液と１：１で混合した。後者では、結晶は２０℃で成長させ、２．５ｍＭＰｔＣＮ４中で２時間浸漬し、人工母液において溶解した。  
【０１１１】
ＧＳＨ誘導体は、同量の６ｍＭＧＳＨを母液に溶解し、タンパク質と混合することにより得て、４℃で２４時間浸漬した。
【０１１２】
全ての結晶は、冷凍保護のために２５％グリセロールを追加した対応のリザーバ溶液に移され、液体窒素で急速冷凍された。
【０１１３】
全てのＸ線データは、欧州シンクロトロン放射光施設（ＥＳＲＦ）で、ビームラインＩＤ１４−４及びＩＤ２３−２について集められた。天然の結晶及びＧＳＨに浸漬された結晶の回折データは、Ｍｏｓｆｌｍ及びＳＣＡＬＡを用いて処理され、測定されたが、重原子ＭＡＤデータ・セットの処理及び測定のためにＸＤＳセットが用いられた。
【０１１４】
３つの高度に重複した３．２Åのデータセットは、結晶から集められるＸ線蛍光スペクトルに基づいて、ＰｔＬＩＩＩ端周辺で集められた。ＸＰＲＥＰ及びＳＨＥＬＸＥ２８のローカル・スケーリングにより正しいことが確認された後、一つのプラチナ・サイトはＳＨＥＬＸＤを用いてピークのデータセットにおいて観察される異常な相違に基づいて位置を決定した。望ましい実験的なＭＡＤ（多波長異常回折）相は、プログラムＳＨＡＲＰ２９を用いて得られ、それぞれ非中心性／中心性の反射として０．４１／０．２６の総合的な性能指数（ＦＯＭ、overall figure of merit）を生じた。これらの位相はＳＯＬＯＭＯＮ３０中の７５％溶媒含量を用いて更に改良され、０．８８の総合的な性能指数を生じた。
【０１１５】
モデルは、更にＣｏｏｔ３２を用いて構築され、より高い分解能のａｐｏ構造及びＧＳＨに結合された構造の、Ｐｈａｓｅｒ３３との分子置換のために用いられた。タンパク質モデルは、Ｃｏｏｔにおいて構築され、Ｒｅｆｍａｃ３４を用いてＲｗｏｒｋ／Ｒｆｒｅｅがａｐｏモデルは１７．６／２１．２％、ＧＳＨに結合された構造は１８．３／２２．０％まで改良された。全ての結晶は、８０％の溶媒含量を有する非対称の単位につき、一つの単量体を含む、近似のａ＝ｂ＝ｃ＝１７０Å及びα＝β＝γ＝９０°の格子寸法の空間群Ｆ２３から属した。  
【０１１６】
全ての画像は、ＬＩＧＰＬＯＴ３６で作製された図１０以外はＰｙｍｏｌ３５を用いて用意をされた。
（表８：データ収集、位相整合及び修正統計値）
2010527246.tif 000012
【０１１７】
（結果及び考察）
（ＬＴＣ４構築物及び膜相互作用）
我々は、それぞれ２．０及び２．１５Åの分解能でａｐｏ及びＧＳＨ複合型のヒトＬＴＣ４シンターゼの結晶構造を決定した。全てのＬＴＣ４Ｓポリペチドは、最後の残基（ＧＳＨ複合型構造では最後から４つ目）を除いて、電子密度地図においてトレースできる。さらに、精製のために用いられるＮ末端６−Ｈｉｓタグは、明らかに可視であり、８つの金属を配位結合させている１２の結晶学的に関連したヘキサ−ヒスチジン・タグ（図８）から成る固有の金属を配位結合させたクラスターを形成する。正しく並んだ界面活性剤又は脂質に由来する多くの伸長された密度が、地図において確認され、精製において用いられる界面活性剤ドデシル・マルトシド（ＤＤＭ）又は仮想の脂肪族鎖として結晶学的改良に導入された。この種の脂肪族鎖の顕著なクラスターが、ヘリックス５の高い疎水性を強調するヘリックス１、３及び５をパックし、前半はほとんどが疎水性の残基のから成る（図３ａ）。その天然の膜環境において、界面表面ヘリックスとして、ヘリックス５がわずかに脂質二重層に組み込まれるように方向を変えることは、もっともらしい。
【０１１８】
ＬＴＣ４Ｓは５つの長いα−ヘリックスから成る−最初の４つ（ヘリックス１−４）が膜貫通セグメントを形成するが、ヘリックス５は膜平面の外まで伸長する（図２）。結晶構造は緻密な三量体タンパク質を明らかにし、結晶学的三回軸は３つのサブユニットに関連する。３つのＴＭヘリックス接続ループのうちの２つは短く（ループ２及び３）、一方、ヘリックス１及び２に接続しているループ１はより長く、１１の残基によって構成される。ループ１は、隣接した単量体の上に折りたたまれており、三量体におけるサブユニット相互作用に寄与する（図２）。ヘリックス４及び５はターンを含む短いプロリンによって接続され、ヘリックス５はヘリックス４の延長と見られる。
【０１１９】
結合したＧＳＨによって同定されるＬＴＣ４Ｓの活性部位は、ループ１が配置される膜表面の近くの２つの隣接した単量体の境界に埋設される。それは、おそらく、タンパク質のこの部分が核の外膜の細胞質内側に面するということである。合成経路の前及び後の工程が膜のサイトゾル側で行われるので、基質と産物の解放及び送達が容易となる。結晶のコンタクトは、Ｃ末端のヘリックス、タンパク質の核周囲側のＮ末端６−Ｈｉｓタグ、更に、サイトゾル側のループ１及び３によって媒介される。結晶には２０％以下のみのタンパク質が含まれるが、高分解能で回折するのは希である。しかしながら、それは、高対称性空間群（Ｆ２３）及び内部結晶学的３２２の左右対称を含む興味深い６−Ｈｉｓ多核金属クラスターによって説明され得る。（図８）。
【０１２０】
電子密度地図は、結合した界面活性剤と脂質分子（図２ａ）に由来し得る多くの伸長された電子密度を明らかにする。ＧＳＨに浸漬した構造において、１つの仮説のＤＤＭ分子は、あるサブユニットのヘリックス１と隣接したサブユニットのヘリックス３との間に形成されるクレバスにおいて、結合したＧＳＨの近くにモデル化される（活性部位をマーク、下記参照）。ａｐｏ−ＬＴＣ４Ｓの構造では、２つのＤＤＭ分子がこの領域においてモデル化される。  
【０１２１】
大部分の付加的な脂肪族鎖は、ＴＭ領域の核周囲側の半分にも見られ、三量体構造の安定に重要と思われる三量体の中心に見られる一つの伸長鎖を含む。一般に、活性部位ポケットを含む分子の細胞質内側の半分は、より極性がある。酵素の細胞質ゾル側の半分における活性部位の位置は、ＬＴＣ４Ｓの補助基質を産生する５−ＬＯと一致しており、サイトゾルにおいて見いだされる。トポロジーは、ＬＴＣ４ＳのＳ２８をリン酸化することが知られているプロテインキナーゼＣ（Gupta N et al. FEBS Lett. (1999) 449(1): 66-70）がサイトゾルにおいて見いだされることとも一致している。  
【０１２２】
ＬＴＡ４Ｓの４−ヘリックスＴＭトポロジーは、ＬＴＣ４Ｓの低分解能電子回折画像によっても裏づけられる（Schmidt-Krey et al., 2004, supra）。４つのヘリックスＴＭ構造は、遠縁のＭＧＳＴ１の低分解能電子結晶学構造においても見られた（Holm et al 2006, supra）。
【０１２３】
（活性部位構造と基質結合）
ＬＴＣ４シンターゼの活性部位の位置は、明瞭に結合したＧＳＨによって明らかにされた。酵素の活性部位は、ループ１が位置する場所である、一つの単量体のヘリックス１及び２と隣接した単量体のヘリックス３及び４との間の膜表面の近くの隣接した２つの単量体の境界面に埋設している。おそらく、タンパク質のこの部分が核の外膜の細胞質内側に面しているということである。合成経路の前及び後の工程が膜のサイトゾル側で行われるので、基質と産物の解放及び送達が容易となる。ＧＳＨは、一つの単量体のヘリックス１及び２と隣接した単量体のヘリックス３及び４の間の境界面において極性のポケットの深部で馬蹄形のコンフォメーションをとる（図２ｂ、３ｂ）。ＧＳＨのカルボキシレート部分は基質タンパク質に面する一方、チオール基はＤＤＭ分子が結合した膜層に向けられている（図２ｂ）。極性相互作用は、活性部位を構成する両方のサブユニットの残基によって、ＧＳＨにおいて形成される（図４ａ，ｂ）。結合ポケットの基部において、Ａｒｇ５１’とＡｒｇ３０はＧＳＨの２つのカルボキシレートと塩橋を作り、効果的にＧＳＨを折り曲げて、Ａｒｇ１０４と相互作用し、結合したＤＤＭ分子の近くに位置する膜境界面にそのチオール基を向ける（図３ｂ、４ａ）。ＧＳＨへの付加的な極性相互作用は、Ｇｌｎ５３、Ａｓｎ５５’、Ｇｌｕ５８’、Ｔｙｒ５９’、Ｔｙｒ９３’及びＴｙｒ９７’により形成される。いくつか非極性相互作用もまた形成され（Ｉｌｅ２７、Ｐｒｏ３７、Ｌｅｕ  １０８’）、その結合ポケットへＧＳＨに望ましい適合を提供する。ＧＳＨ−結合の詳細な概要について、図１０を参照されたい。
【０１２４】
ＬＴＣ４Ｓの構造はＧＳＨを含まないａｐｏ型でも決定され、仮想の硫酸イオンはＧＳＨポケットにおいて見いだされる。ＧＳＨが結合したＬＴＣ４Ｓ構造とａｐｏ−ＬＴＣ４Ｓ構造との比較により、極性アミノ酸側鎖の局在調整のみがＧＳＨ結合により形成されることが明らかとなった（図４ｂ）。ＧＳＨと相互作用を示す疎水性の残基と芳香族の残基は２つの構造において非常に類似した位置に存在するのに対して、大部分の極性の残基はＧＳＨの結合でコンフォメーションを変える。ループ１は、少なくとも部分的に、その結合ポケットへのＧＳＨの接近をカバーするように見える（図２ｂ、４ｂ）。したがって、ループ１のフレキシビリティーは反応サイクルにおいて必要かもしれず、ＧＳＨの結合においてこのループの構造再配置と一致している（図４）。
【０１２５】
（親油性ＬＴＡ４基質の認識）
親油性基質との複合体の酵素の構造は珍しく、事実、その脂質基質と複合した膜内在性酵素又はその望ましい類似体の文献において、電子担体を除いて、直接の構造的情報は利用可能でない（http://blanco.biomol.uci.edu/Membrane_Proteins_xtal.html）。その共存基質ＬＴＡ４とＬＴＣ４Ｓの結晶学的研究は、化合物を含むエポキシドの寿命が短いため（〜１０秒）困難である。ＧＳＨ複合型ＬＴＣ４Ｓ構造において、疎水性分子は活性部位領域にすでに結合され、脂肪族鎖の長さ及びその頭部の見かけの構造に基づいて、この分子はＤＤＭと配置され、末端糖類の大部分は不規則である（図４ａ）。１２−炭素鎖と一番糖類は、しかしながら、電子密度において明確であり、ＬＴＡ４に重要な構造的類似点を有するように、この結合した界面活性剤が酵素へのＬＴＡ４の結合に対して望ましいモデルとして役立つかもしれないことを提唱する。脂肪族鎖が酵素脂質境界面上の細長いキャビティにおいて結合すると、この親油性化合物の結合形態は、ω−末端から数えて原子１５、ＧＳＨチオール基の上に位置しており、ＬＴＡ４がＬＴＡ４基質のＣ６の位置でＧＳＨと接合していることと一致している。ＬＴＡ４の提唱された結合キャニオンは、したがって、疎水性の残基により形成される狭く細長いクレバスによって構成される（図４ａ）。界面活性剤の疎水性のテイル部は、一つのサブユニットのＡｌａ２０、Ｌｅｕ  ２４、Ｉｌｅ２７と、隣接したサブユニットのＴｙｒ５９’、Ｔｒｐ１１６’、Ａｌａ１１２’、Ｌｅｕ１１５’、Ｌｅｕ１０８’及びＴｙｒ１０９’に覆われる。基質のω−末端の上に蓋を形成する場合、Ｔｒｐ１１６’は脂肪族鎖を配置する際に重要な役割を担う。Ｔｒｐ１１６’ポケットは、脂質のω−末端の位置を固定するための精巧な形態を構成し、ＧＳＨチオールでＬＴＡ４のＣ６の適切なポジショニングのために効果的に定規としての機能を果たす。ＧＳＨのないａｐｏ−ＬＴＣ４Ｓ構造において、ＤＤＭ分子はタンパク質のこの領域にも結合するが、ＧＳＨ複合型構造（図５ｂ）のＤＤＭと比較すると、界面活性剤分子はさらに脂質二重層中に移入される。この移動の効果は、ＬＴＡ４のＣ６に対応する界面活性剤の原子の位置が、ＧＳＨ構造においてＧＳＨチオールが位置するところから８Å以上のところに見出されるということである。さらに、ａｐｏ−ＬＴＣ４Ｓ構造における界面活性剤は、そのω−末端と共にＴｒｐ１１６ポケットに留めないが、その代わりにこの末端はポケットの外に位置する。これは、Ｔｒｐ１１６がＬＴＣ４Ｓの活性部位におけるＬＴＡ４の脂肪族鎖のアラインメントにおいて重要な役割を担うという事実の更なるサポートとなる。それは、おそらく活性部位の荷電群をカバーし、脂質と相互作用する表面を伸長することによって、結合ＧＳＨが適当な脂質結合クレバスの形成をアシストし、ＬＴＡ４がＬＴＣ４Ｓの活性部位の有効な結合形態となることをも示唆する。  
【０１２６】
ＧＳＨ結合反応を促進するために、ＧＳＨチオールの求核性は、酵素によって強化される可能性が高い。Ａｒｇ１０４は、その正電荷によりＧＳＨチオールのｐＫａシフトを促進するために理想的に配置され、η−窒素の一つは、ＧＳＨ硫黄（３．２Å）との極性相互作用を媒介し得る。かすかに関連したＭＧＳＴ−１２３に示唆されるように、この付加的な水素結合アクセプターの欠如に伴う異常に短い硫黄−窒素の距離により、酵素結合チオール基が結晶構造におけるアニオン性チオール酸であることが示唆される。ＧＳＨチオールは、ＬＴＡ４のオキシラン環のアリルＣ６への求核攻撃のためには良い位置に存在する３７。活性部位に位置している明らかな酸残基がなく、このことが基質のＣＯ基にプロトンを供給し得る。それは、おそらくしたがって、基質のオキシアニオンが酵素への水素結合することによって安定するということである。Ａｒｇ１０４は、基質のＣ５の予想される位置の近くに位置しており、したがって、基質のアニオンが安定することをアシストし得る。さらに、Ａｒｇ３１は基質の遠位側に位置しており、この構造においてフレキシブルであるにもかかわらず、この残基は基質アニオンの安定化をもアシストしているようである。結果として生じるＳＮ２機構のキラリティは、活性部位のエポキシドの有効な結合によって特徴付けられる。反応において、ＬＴＡ４のエポキシド酸素の６Ｓの立体化学がＬＴＣ４のグルタチオン部分の６Ｒ立体構造に完全に変わるように、エポキシドの開口部はキラルの逆転を起こす。
【０１２７】
図５ｃは、ＬＴＣ４シンターゼの基質結合及び産物生成の提唱された機構の模式的な概要を表す。提唱された結合スキームにおいて、ＧＳＨは、サイトゾルからその結合ポケットに入り、それにより前は脂質膜に存在していたＬＴＡ４の結合を可能にする。ＬＴＡ４への親水性の付加は、ＬＴＣ４がサイトゾルの外に移動することを可能にして、おそらくループ１のフレキシビリティに依存する。  
【０１２８】
ＬＴＣ４シンターゼの構造的情報、特にＴＭセグメントの位置と活性部位残基の位置の構造的情報は、ＭＡＰＥＧファミリーの構造ベースのアラインメントを可能にする（図６）。前の配列アラインメントは、ヒトＭＡＰＥＧメンバーの共通の進化の起源を示唆し、それは配列保存は低いが、２つの中心ＴＭ・セグメント、ヘリックス２及びヘリックス３において有意である１４。末端ＴＭセグメント、ヘリックス１及びヘリックス４の配列は、しかしながら、より分岐しており、明確な類似点はサブファミリーのみで見られる。構造ベースのアラインメントにおいて、ヘリックス１の起こりうるアラインメントによって、更なる保存がＭＡＰＥＧファミリーの活性部位領域に付加される。最初の３つのヘリックスのアラインメントは、大部分のＧＳＨを配位している残基が全てのＧＳＨ依存ＭＡＰＥＧメンバーにおいて保存されていることを強く裏づける（ＦＬＡＰ以外の全てのＭＡＰＥＧメンバーが、ＧＳＨ依存反応を触媒することは公知である）。これらのヘリックスからＧＳＨを配位している８つの極性残基のうち、５つはＧＳＨ依存酵素において完全に保存されているのに対して、残りの３つは主に保存的アミノ酸置換を有する。我々のヘリックス４のアラインメントは、より不確かなものである。ここで提唱される重要な触媒残基であるＡｒｇ１０４は、他のＧＳＨ依存ＭＡＰＥＧメンバーのヘリックス４のＮ末端に存在すると予測されるアルギニンと配置される。ＭＧＳＴ−１におけるこの潜在的触媒Ａｒｇ（Ａｒｇ１３０）の位置は、ＭＧＳＴ−１１９の低分解能構造と一致しているように見える。ＧＳＨを配位しているアミノ酸がＭＡＰＥＧファミリーにおいて高度に保存されるのに対して、提唱されたＬＴＡ４結合クレバスに並んでいる残基はそうでない。大部分の対応している残基が他のファミリーにおいて疎水性であるにもかかわらず、サイズ及び芳香組成は異なる。これは、どのようにＭＡＰＥＧメンバーが同じポケットにおける異なる脂質基質の結合を認識するために進化したか示しているのかもしれない。しかしながら、それは、例えばＭＧＳＴ−１が非常に非特異的進化したことなど、脂質認識が他のファミリーメンバーでは異なって起こることも示唆し得る。さらに、ＬＴＡ４の頭部の性質は酵素活性の損失なしに可変的であることが示された３８，３９。頭部への主要な特異性の欠如は、この領域のかなり広い分野で説明され得、カルボキシレートに異なる結合ポケットを供給しないということである（図３ａ、５ａ）。
【０１２９】
結論として、ＧＳＨの馬蹄形の結合形態は、ＧＳＨ依存ＭＡＰＥＧファミリーメンバーの全体にわたって保存され、潜在的に、ＧＳＨ活性化の構造的基礎が関連しているように見える。ＬＴＣ４シンターゼでは、位置１０４のアルギニンは、ＬＴＡ４エポキシドへの求核攻撃のＧＳＨチオール活性化における重要な役割を演じそうである。興味深いＬＴＣ４シンターゼの脂質結合ポケットが、ＬＴＡ４をＴｒｐ１１６クレバスによって活性部位に適合させ、ＧＳＨとの結合のために基質のＣ６を効果的に配置させる。脂質基質認識のこの原理が主に頭部の性質よりむしろ脂肪族の鎖長に基づくことは、もっともらしい。これは、他の膜内在性酵素における基質認識とも関連しているかもしれない。
【０１３０】
実施例２：コンピュータによる化合物スクリーニング
構造ベースのドラッグデザインは、最終的に疾患修飾剤（薬剤）となり得る分子を理論的に設計するために、ガイドとして既知の標的の三次元構造を利用する。標的の構造は、Ｘ線結晶学又は他の三次元構造決定方法から得られてもよい。
【０１３１】
好ましくは、結晶は、標的に対する推定上の薬剤の、関連する結合形態及び所望の相互作用を表す標的−リガンド複合体に含まれる。最も好適には、複合型リガンドが標的に対するリード化合物の複数の系列のメンバーとなるように、一連の標的−リガンド複合体は用意される。これは、一以上の所望の標的への特異性を改良するために、他の分子（例えば標的酵素と基質を共有する他の酵素）への結合を減少させるためのリガンド設計を含む。
【０１３２】
一つ以上の標的−リガンド複合体の三次元構造の試験は、リガンドの結合形態及びリガンドが存在する場合の標的の結合キャビティの理解を高めるであろう。この情報は、結合能を変調させる又は薬剤としての用途に好適な他の特徴を改善し得るリガンドへの改変のための仮説をたてるために、薬品化学又は計算機化学における一以上のツールによって利用することができる。  
【０１３３】
薬品化学のツール及び構造ベースのドラッグデザインの計算機化学は、分子モデリング、仮想スクリーニング及びドッキング、集約コンビナトリアルケミストリーライブラリー、デノボ・リガンド設計、三次元構造決定のための付加的な候補化合物へのガイド及び観察された構造活性相関の合理化を含むが、これに限定されるものではない。
【０１３４】
医薬の及び計算ツールの応用を通して方向付けられる、又は示唆される潜在的改変は、標的との特異的な相互作用を調節又は確立するためのリガンドの合成、重要でない、又は標的への所望の結合能を損なっていると考えられる群のリガンドからの除去、他の標的に対して相対特異性を調節するリガンドの改変及び標的への結合能へ許容できない効果を及ぼすことのない薬剤のような特性を改良するたまのリガンドの合成を含む。
【０１３５】
実施例において、酵素活性のスクリーニングにおいて阻害活性を有するとして同定された小分子化合物の構造は、Ｓｙｂｙｌ（Tripos Inc., 1699 South Hanley Rd., St. Louis, Missouri, 63144, USA）分子モデリング・ソフトウェアを用いてモデル化することができ、Ｃｏｏｔ（Emsley and Cowtan, Acta Crystallographica D, 2004, 60, 2126-2132）結晶学的モデル設定ソフトウェアを用いて酵素の活性部位領域において同一又は類似の分子のＸ線結晶構造と比較される。比較に基づいて、酵素の抑制を高める又は弱めるために、構造比較を基礎として、Ｓｙｂｙｌでモデル化された化合物に変化を起こすことができる。これらのモデルに基づく新規化合物は、合成され、酵素活性スクリーンにおける効果が測定される。おそらく、例えば異なるラウンドで分子／酵素の異なる部分又は化合物の異なる性質に焦点をあて、上記のようにこのプロセスを繰り返すことができる。
【０１３６】
（文献）
1. Samuelsson, B. Leukotrienes: Mediators of immediate hypersensitivity reactions and inflammation. Science 220, 568-575 (1983).
2. Funk, C. D. Prostaglandins and leukotrienes: Advances in eicosanoid biology. Science 294, 1871-1875 (2001).
3. Samuelsson, B., Dahlen, S.-E., Lindgren, J.-A., Rouzer, C. A. & Serhan, C. N. Leukotrienes and lipoxins: Structures, biosynthesis, and biological effects. Science
237, 1171-1176 (1987).
4. Hanna, C. J., Bach, M. K., Pare, P. D. & Schellenberg, R. R. Slow-Reacting Substances (Leukotrienes) Contract Human Airway and Pulmonary Vascular Smooth Muscle Invitro. Nature 290, 343-344 (1981).
5. Dahlen, S.-E., Hedqvist, P., Hammarstrom, S. & Samuelsson, B. Leukotrienes are potent constrictors of human bronchi. Nature 288, 484-486 (1980).
6. Dahlen, S.-E. 等 Leukotrienes promote plasma leakage and leukocyte adhesion in postcapillary venules: In vivo effects with relevance to the acute inflammatory response. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 3887-3891 (1981).
7. Weiss, J. W. 等 Bronchoconstrictor Effects of Leukotriene-C in Humans. Science 216, 196-198 (1982).
8. Smedegard, G. 等 Leukotriene-C4 Affects Pulmonary and Cardiovascular Dynamics in Monkey. Nature 295, 327-329 (1982).
9. Beller, T. C. 等 Cysteinyl leukotriene 1 receptor controls the severity of chronic pulmonary inflammation and fibrosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 3047-3052 (2004).
10. Robbiani, D. F. 等 The leukotriene C4 transporter MRP1 regulates CCL19 (MIP- 3beta, ELC)-dependent mobilization of dendritic cells to lymph nodes. Cell 103, 757- 68 (2000).
11. Drazen, J. F., Israel, E. & O'Byrne, P. Treatment of asthma with drugs modifying the leukotriene pathway. N. Engl. J. Med. 340, 197-206 (1999).
12. Lam, B. K. & Austen, K. F. Leukotriene C-4 synthase: a pivotal enzyme in cellular biosynthesis of the cysteinyl leukotrienes. Prostaglandins & Other Lipid Mediators 68-9, 511-520 (2002).
13. Penrose, J. F. 等 Purification of human leukotriene C4 synthase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 11603-11606 (1992).
14. Nicholson, D. W. 等 Purification to homogeneity and the N-terminal sequence of human leukotriene C4 synthase: A homodimeric glutathione S-transferase composed of 18-kDa subunits. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2015-2019 (1993).
15. Lam, B. K., Penrose, J. F., Freeman, G. J. & Austen, K. F. Expression cloning of a cDNA for human leukotriene C4 synthase, an integral membrane protein conjugating reduced glutathione to leukotriene A4. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91, 7663-7 (1994).
16. Welsch, D. J. 等 Molecular cloning end expression of human leukotriene C4
synthase. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91, 9745-9749 (1994).
17. Jakobsson, P. J., Morgenstern, R., Mancini, J., Ford-Hutchinson, A. & Persson, B. Common structural features of MAPEG -- a widespread superfamily of membrane associated proteins with highly divergent functions in eicosanoid and glutathione metabolism. Protein Sci. 8, 689-92. (1999).
18. Schmidt-Krey, I. 等 Human leukotriene C(4) synthase at 4.5 A resolution in
projection. Structure 12, 2009-14 (2004).
19. Holm, P. J. 等 Structural basis for detoxification and oxidative stress protection in membranes. J. Mol. Biol. 360, 934-945 (2006).
20. White, S. H. Membrane Proteins of Known 3D Structure. http://blanco.biomol.uci.edu/Membrane_Proteins_xtal.html (2007).
21. Morisseau, C. & Hammock, B. D. Epoxide hydrolases: Mechanisms, inhibitor
designs, and biological roles. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 45, 311-+ (2005).
22. Corey, E. J., Hopkins, P. B., Munroe, J. E., Marfat, A. & Hashimoto, S. Total
Synthesis of 6-Trans,10-Cis and (+/-)-6-Trans,8-Cis Isomers of Leukotriene-B. J. Am. Chem. Soc. 102, 7986-7987 (1980).
23. Morgenstern, R., Svensson, R., Bernat, B. A. & Armstrong, R. N. Kinetic analysis of the slow ionization of glutathione by microsomal glutathione transferase MGST1. Biochemistry (Mosc.) 40, 3378-3384 (2001).
24. Lam, B. K., Penrose, J. F., Xu, K. Y., Baldasaro, M. H. & Austen, K. F. Site-directed mutagenesis of human leukotriene C4 synthase. J. Biol. Chem. 272, 13923-13928 (1997).
25. Kojima, F., Kato, S. & Kawai, S. Prostaglandin E synthase in the pathophysiology of arthritis. Fundamental & Clinical Pharmacology 19, 255-261 (2005).
26. Mabuchi, T. 等 Membrane-associated prostaglandin E synthase-I is required for neuropathic pain. Neuroreport 15, 1395-1398 (2004).
27. Abramovitz, M. 等 5-lipoxygenase-activating protein stimulates the utilization of arachidonic acid by 5-lipoxygenase. Eur. J. Biochem. 215, 105-111 (1993).
28. Sheldrick, G. M. & Schneider, T. R. in Methods Enzymol. (ed. Sweet, C. W. C. J. a. R. M.) 319-343 (Academic Press, 1997).
29. de La Fortelle, E. & Bricogne, G. in Methods Enzymol. (ed. Charles W. Carter, J.) 472-494 (Academic Press, 1997).
30. Abrahams, J. P. & Leslie, A. G. W. Methods used in the structure determination of bovine mitochondrial F1 ATPase. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 52, 30-42 (1996).
31. Perrakis, A., Morris, R. & Lamzin, V. S. Automated protein model building combined with iterative structure refinement. Nat. Struct. Biol. 6, 458-463 (1999).
32. Emsley, P. & Cowtan, K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 60, 2126-2132 (2004).
33. McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Storoni, L. C. & Read, R. J. Likelihoodenhanced fast translation functions. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 61, 458-464 (2005).
34. Murshudov, G. N., Vagin, A. A. & Dodson, E. J. Refinement of Macromolecular Structures by the Maximum-Likelihood Method. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 53, 240-255 (1997).
35. DeLano, W. L. The PyMOL Molecular Graphics System. DeLano Scientific, Palo Alto, CA, USA. (2002).
36. Wallace, A. C., Laskowski, R. A. & Thornton, J. M. Ligplot - a Program to Generate Schematic Diagrams of Protein Ligand Interactions. Protein Eng. 8, 127-134 (1995).
37.  Corey, E. J. 等  Stereospecific total synthesis of a “Slow Reacting Substance” of anaphylaxis, leukotriene C4. J. Am. CHem Soc. 102, 1436-1439 (1980).
38. Izumi T. 等 Solubilization and partial purification of leukotriene C4 synthase from guinea-pig lung: a microsomal enzyme with high specificity towards 5,6-epoxide leukotriene A4. Biochim Biophys Acta. 959, 305-15 (1988).
39. Yoshimoto T, Soberman R J, Spur B, Austen K F. Properties of highly purified leukotriene C4 synthase of guinea pig lung. J Clin Invest. March; 81, 866-871 (1988).
【０１３７】
（Ｘ線データ）
表Ｉ−ＧＳＨなし
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【０１３８】
表ＩＩ−ＧＳＨ配位
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【図１】
2010527246.tif 000061
【図６】
2010527246.tif 000062
【図７】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
2010527246.tif 000067
【図４Ｂ】
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【図５】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2010527246.tif 000073
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