(57)【要約】本発明はエンドシアリンとエンドシアリンリガンドとの相互作用を阻害する方法を提供する。該阻害は、細胞表面に発現されたエンドシアリンとフィブロネクチン及びコラーゲンの様なリガンドとの相互作用を、ＦＢ５としても知られた抗エンドシアリン抗体Ｍ４を使ってブロックすることにより達成される。
2010523592.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンドシアリン発現細胞とエンドシアリンリガンドとの相互作用を阻害する方法であって、前記エンドシアリン発現細胞とエンドシアリンに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片とを接触させることを含み、そこでは、前記抗体又は抗原結合断片と該エンドシアリン発現細胞の表面上に発現されるエンドシアリンとの結合が、前記エンドシアリン発現細胞と前記エンドシアリンリガンドとの相互作用を阻害する方法。
【請求項２】
請求項１の方法において、該エンドシアリンリガンドがコラーゲン又はフィブロネクチンである方法。
【請求項３】
請求項１の方法において、前記抗体又は抗原結合断片がマウスエンドシアリンに結合しない方法。
【請求項４】
請求項１の方法において、エンドシアリンに対する前記抗体又は抗原結合断片の親和性が約１ｘ１０−７Ｍ未満である方法。
【請求項５】
請求項１の方法において、前記抗体又は抗原結合断片がキメラ抗体又は抗原結合断片である方法。
【請求項６】
請求項１の方法において、前記抗体又は抗原結合断片がヒト化抗体又は抗原結合断片である方法。
【請求項７】
請求項１の方法において、該抗体又は抗原結合断片は、配列ＩＤ番号２８のＣＤＲ1、配列ＩＤ番号３０のＣＤＲ２、及び配列ＩＤ番号３２のＣＤＲ３を含む重鎖並びに、配列ＩＤ番号１３のＣＤＲ1、配列ＩＤ番号１５のＣＤＲ２、及び配列ＩＤ番号１７のＣＤＲ３を含む軽鎖を含む方法。
【請求項８】
請求項７の方法において、該抗体又は抗原結合断片は、配列ＩＤ番号３４の可変ドメインを含む重鎖及び配列ＩＤ番号１９の可変ドメインを含む軽鎖を含む方法。
【請求項９】
請求項８の方法において、該抗体又は抗原結合断片は、配列ＩＤ番号２２又は２６のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列ＩＤ番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む方法。
【請求項１０】
請求項１の方法において、該抗体又は抗原結合断片は、ＡＴＣＣアクセス番号ＰＴＡ−７５５４又はＡＴＣＣアクセス番号＿＿＿＿＿＿を有する細胞によって生産された抗体の特性を含む方法。
【請求項１１】
請求項１の方法において、前記エンドシアリン発現細胞と前記エンドシアリンリガンドとの相互作用を阻害することが、該エンドシアリン発現細胞の遊走を阻害する方法。
【請求項１２】
請求項１の方法において、前記エンドシアリン発現細胞と前記エンドシアリンリガンドとの相互作用を阻害することが、マトリックスメタロプロテアーゼの活性化を阻害する方法。
【請求項１３】
請求項１２の方法において、該マトリックスメタロプロテアーゼがＭＭＰ−９である方法。
【請求項１４】
請求項１の方法において、前記エンドシアリン発現細胞と前記エンドシアリンリガンドとの相互作用を阻害することが、マトリックスメタロプロテアーゼの発現を阻害する方法。
【請求項１５】
請求項１４の方法において、該マトリックスメタロプロテアーゼがＭＭＰ−９である方法。
【請求項１６】
請求項１の方法において、前記エンドシアリン発現細胞と前記エンドシアリンリガンドとの相互作用を阻害することが、インテグリンβ１、β２、又はβ３の活性化を阻害する方法。
【請求項１７】
請求項１の方法において、前記エンドシアリン発現細胞が哺乳類細胞である方法。
【請求項１８】
請求項１の方法において、前記エンドシアリン発現細胞が腫瘍性の細胞である方法。
【請求項１９】
被検体中の新血管形成を阻害する方法であって、エンドシアリンに特異的に結合する治療的に有効量の抗体又は抗原結合断片を該被検体に投与することを含み、そこでは、前記抗体又は抗原結合断片が細胞表面上に発現されたエンドシアリンとエンドシアリンリガンドとの相互作用を阻害し、及び前記細胞の表面上に発現されたエンドシアリンと前記エンドシアリンリガンドとの前記相互作用を阻害することが該被検体中の組織、器官、又は腫瘍の新血管形成を阻害する方法。
【請求項２０】
請求項１９の方法において、該リガンドがコラーゲン又はフィブロネクチンである方法。
【請求項２１】
請求項１９の方法において、前記抗体又は抗原結合断片がマウスエンドシアリンに結合しない方法。
【請求項２２】
請求項１９の方法において、エンドシアリンに対する前記抗体又は抗原結合断片の親和性が約１ｘ１０−７Ｍ未満である方法。
【請求項２３】
請求項１９の方法において、前記抗体又は抗原結合断片がキメラ抗体又は抗原結合断片である方法。
【請求項２４】
請求項１９の方法において、前記抗体又は抗原結合断片がヒト化抗体又は抗原結合断片である方法。
【請求項２５】
請求項１９の方法において、該抗体又は抗原結合断片は、配列ＩＤ番号２８のＣＤＲ1、配列ＩＤ番号３０のＣＤＲ２、及び配列ＩＤ番号３２のＣＤＲ３を含む重鎖並びに、配列ＩＤ番号１３のＣＤＲ1、配列ＩＤ番号１５のＣＤＲ２、及び配列ＩＤ番号１７のＣＤＲ３を含む軽鎖を含む方法。
【請求項２６】
請求項２５の方法において、該抗体又は抗原結合断片は、配列ＩＤ番号３４の可変ドメインを含む重鎖及び配列ＩＤ番号１９の可変ドメインを含む軽鎖を含む方法。
【請求項２７】
請求項２６の方法において、該抗体又は抗原結合断片は、配列ＩＤ番号２２又は２６のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列ＩＤ番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む方法。
【請求項２８】
請求項１９の方法において、該抗体又は抗原結合断片は、ＡＴＣＣアクセス番号ＰＴＡ−７５５４又はＡＴＣＣアクセス番号＿＿＿＿＿＿を有する細胞によって生産された抗体の特性を含む方法。
【請求項２９】
請求項１９の方法において、前記細胞の表面上に発現されたエンドシアリンと前記エンドシアリンリガンドとの前記相互作用を阻害することが、該細胞の遊走を阻害する方法。
【請求項３０】
請求項１９の方法において、前記細胞の表面上に発現されたエンドシアリンと前記エンドシアリンリガンドとの前記相互作用を阻害することが、マトリックスメタロプロテアーゼの活性化を阻害する方法。
【請求項３１】
請求項３０の方法において、該マトリックスメタロプロテアーゼがＭＭＰ−９である方法。
【請求項３２】
請求項１９の方法において、前記細胞の表面上に発現されたエンドシアリンと前記エンドシアリンリガンドとの前記相互作用を阻害することが、マトリックスメタロプロテアーゼの発現を阻害する方法。
【請求項３３】
請求項３２の方法において、該マトリックスメタロプロテアーゼがＭＭＰ−９である方法。
【請求項３４】
請求項１９の方法において、前記細胞の表面上に発現されたエンドシアリンと前記エンドシアリンリガンドとの前記相互作用を阻害することが、インテグリンβ１、β２、又はβ３の活性化を阻害する方法。
【請求項３５】
請求項１９の方法において、前記細胞が哺乳類細胞である方法。
【請求項３６】
請求項１９の方法において、前記細胞が腫瘍性の細胞である方法。
【請求項３７】
被検体中の血管新生を阻害する方法であって、エンドシアリンに特異的に結合する治療的に有効量の抗体又は抗原結合断片を該被検体に投与することを含み、そこでは、前記抗体又は抗原結合断片が細胞表面上に発現されたエンドシアリンとエンドシアリンリガンドとの相互作用を阻害し、及び前記細胞の表面上に発現されたエンドシアリンと前記エンドシアリンリガンドとの前記相互作用を阻害することが該被検体中の組織、器官、又は腫瘍の血管新生を阻害する方法。
【請求項３８】
請求項３７の方法において、該リガンドがコラーゲン又はフィブロネクチンである方法。
【請求項３９】
請求項３７の方法において、前記抗体又は抗原結合断片がマウスエンドシアリンに結合しない方法。
【請求項４０】
請求項３７の方法において、エンドシアリンに対する前記抗体又は抗原結合断片の親和性が約１ｘ１０−７Ｍ未満である方法。
【請求項４１】
請求項３７の方法において、前記抗体又は抗原結合断片がキメラ抗体又は抗原結合断片である方法。
【請求項４２】
請求項３７の方法において、前記抗体又は抗原結合断片がヒト化抗体又は抗原結合断片である方法。
【請求項４３】
請求項３７の方法において、該抗体又は抗原結合断片は、配列ＩＤ番号２８のＣＤＲ1、配列ＩＤ番号３０のＣＤＲ２、及び配列ＩＤ番号３２のＣＤＲ３を含む重鎖並びに、配列ＩＤ番号１３のＣＤＲ1、配列ＩＤ番号１５のＣＤＲ２、及び配列ＩＤ番号１７のＣＤＲ３を含む軽鎖を含む方法。
【請求項４４】
請求項４３の方法において、該抗体又は抗原結合断片は、配列ＩＤ番号３４の可変ドメインを含む重鎖及び配列ＩＤ番号１９の可変ドメインを含む軽鎖を含む方法。
【請求項４５】
請求項４４の方法において、該抗体又は抗原結合断片は、配列ＩＤ番号２２又は２６のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列ＩＤ番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む方法。
【請求項４６】
請求項３７の方法において、該抗体又は抗原結合断片は、ＡＴＣＣアクセス番号ＰＴＡ−７５５４又はＡＴＣＣアクセス番号＿＿＿＿＿＿を有する細胞によって生産された抗体の特性を含む方法。
【請求項４７】
請求項３７の方法において、前記細胞の表面上に発現されたエンドシアリンと前記エンドシアリンリガンドとの前記相互作用を阻害することが、該細胞の遊走を阻害する方法。
【請求項４８】
請求項３７の方法において、前記細胞の表面上に発現されたエンドシアリンと前記エンドシアリンリガンドとの前記相互作用を阻害することが、マトリックスメタロプロテアーゼの活性化を阻害する方法。
【請求項４９】
請求項４８の方法において、該マトリックスメタロプロテアーゼがＭＭＰ−９である方法。
【請求項５０】
請求項３７の方法において、前記細胞の表面上に発現されたエンドシアリンと前記エンドシアリンリガンドとの前記相互作用を阻害することが、マトリックスメタロプロテアーゼの発現を阻害する方法。
【請求項５１】
請求項５０の方法において、該マトリックスメタロプロテアーゼがＭＭＰ−９である方法。
【請求項５２】
請求項３７の方法において、前記細胞の表面上に発現されたエンドシアリンと前記エンドシアリンリガンドとの前記相互作用を阻害することが、インテグリンβ１、β２、又はβ３の活性化を阻害する方法。
【請求項５３】
請求項３７の方法において、前記細胞が哺乳類細胞である方法。
【請求項５４】
請求項３７の方法において、前記細胞が腫瘍性の細胞である方法。
【請求項５５】
エンドシアリン発現細胞とエンドシアリンリガンドとの相互作用を阻害する方法であって、前記エンドシアリンリガンドと前記エンドシアリンリガンドに特異的に結合する抗体又は抗原結合断片を接触させることを含み、従って、前記エンドシアリンリガンドと前記細胞の表面上に発現したエンドシアリンとの相互作用を妨害し、そこでは前記妨害が前記エンドシアリン発現細胞と前記エンドシアリンリガンドとの相互作用を阻害する方法。
【請求項５６】
請求項５５の方法において、前記エンドシアリンリガンドがコラーゲン又はフィブロネクチンである方法。
【請求項５７】
被検体中の新血管形成を阻害する方法であって、エンドシアリンリガンドに特異的に結合する治療的に有効量の抗体又は抗原結合断片を該被検体に投与することを含み、従って、該エンドシアリンリガンドとエンドシアリンとの相互作用を妨害し、及び該被検体中の組織、器官、又は腫瘍の新血管形成を阻害する方法。
【請求項５８】
請求項３８の方法において、前記エンドシアリンリガンドがコラーゲン又はフィブロネクチンである方法。
【請求項５９】
被検体中の血管新生を阻害する方法であって、エンドシアリンリガンドに特異的に結合する治療的に有効量の抗体又は抗原結合断片を該被検体に投与することを含み、従って、該エンドシアリンリガンドとエンドシアリンとの相互作用を妨害し、及び該被検体中の組織、器官、又は腫瘍の血管新生を阻害する方法。
【請求項６０】
請求項５９の方法において、前記エンドシアリンリガンドがコラーゲン又はフィブロネクチンである方法。
【請求項６１】
エンドシアリン発現細胞とエンドシアリンリガンドとの相互作用を阻害する方法であって、前記細胞の表面上に発現されるエンドシアリンを妨害することを含み、そこでは、前記妨害が前記細胞と前記リガンドとの相互作用を阻害する方法。
【請求項６２】
請求項６１の方法において、該エンドシアリンリガンドがコラーゲン又はフィブロネクチンである方法。
【請求項６３】
請求項６１の方法において、前記妨害が、前記細胞とエンドシアリンに特異的に結合する抗体又は抗原結合断片とを接触させることを含む方法。
【請求項６４】
請求項６１の方法において、前記妨害が、前記細胞とエンドシアリンの競合的阻害剤を接触させることを含む方法。
【請求項６５】
請求項６４の方法において、前記エンドシアリンの競合的阻害剤がコラーゲン又はフィブロネクチンのエンドシアリン結合断片を含む方法。
【請求項６６】
請求項６４の方法において、前記エンドシアリンの競合的阻害剤がフィブロネクチンの７０ｋＤａＮ末端断片、フィブロネクチンの４５ｋＤａゼラチン結合断片、又はフィブロネクチンの３０ｋＤａへパリン結合断片を含む方法。
【請求項６７】
エンドシアリン発現細胞とエンドシアリンリガンドとの相互作用を阻害する方法であって、
エンドシアリン発現細胞中でエンドシアリンの発現を阻害することを含み、そこでは、前記細胞中でエンドシアリンの発現を阻害することは前記細胞と前記リガンドとの相互作用を阻害する方法。
【請求項６８】
請求項６７の方法において、該リガンドはコラーゲン又はフィブロネクチンである方法。
【請求項６９】
請求項６７の方法において、前記エンドシアリン発現細胞は哺乳類細胞である方法。
【請求項７０】
請求項６７の方法において、前記エンドシアリン発現細胞中でエンドシアリンの発現を阻害することは、エンドシアリンをコードする遺伝子の発現と干渉する核酸分子を前記細胞中に導入することを含む方法。
【請求項７１】
請求項６７の方法において、前記エンドシアリン発現細胞と前記リガンドとの相互作用を阻害することは該細胞の遊走を阻害する方法。
【請求項７２】
請求項６７の方法において、前記エンドシアリン発現細胞と前記リガンドとの相互作用を阻害することはマトリックスメタロプロテアーゼの発現又は活性化を阻害する方法。
【請求項７３】
請求項７０の方法において、前記エンドシアリン発現細胞と前記リガンドとの相互作用を阻害することはインテグリンβ１、β２、又はβ３の活性化を阻害する方法。
【請求項７４】
エンドシアリンとエンドシアリンリガンドとの相互作用の作動薬又は拮抗薬を同定する方法であって、エンドシアリンと前記エンドシアリンリガンドとをテスト化合物の存在下及び非存在下で接触させ、並びにエンドシアリンと該リガンドとの相互作用を定量的に測定することを含み、そこでは、テスト化合物の存在下でエンドシアリンと前記リガンドとの相互作用のレベルが増加し又は減少することが、テスト化合物がエンドシアリンと前記リガンドとの相互作用のそれぞれ作動薬又は拮抗薬であることを示す方法。
【請求項７５】
請求項７４の方法において、該エンドシアリンは細胞膜、細胞膜断片、又は人工脂質二重膜に結合させられる方法。
【請求項７６】
請求項７５の方法において、該細胞膜、又は細胞膜断片は哺乳類細胞からである方法。
【請求項７７】
請求項７６の方法において、該哺乳類細胞はエンドシアリンを発現する安定細胞、又は安定細胞株である方法。
【請求項７８】
請求項７４の方法において、該リガンドはコラーゲン又はフィブロネクチンである方法。
【請求項７９】
請求項７４の方法において、該エンドシアリンは固相担体に結合させられる方法。
【請求項８０】
請求項７４の方法において、該リガンドは固相担体に結合させられる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は２００７年４月５日付け出願の米国特許仮出願第６０／９１０，３６２号及び２００７年１０月１５日付け出願の米国特許仮出願第６０／９８０，０２６号に対して優先権を主張するものであり、両出願はこの参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は一般的には免疫療法の分野に関する。より特異的には、本発明は血管新生及び細胞運動を含む細胞機能を阻害するために、エンドシアリンとその基質との相互作用を破壊するための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
特許、公開された出願、技術文献及び学術論文を含む様々な文献は、本明細書中で引用される。これらの引用文献は、完全に及びすべての目的のためこの参照により本明細書に組み込まれる。
【０００４】
血管新生は制御されたプロセスで新しい血管の形成に関与する。血管新生は正常な成長、胚発生、創傷治癒、及び他の生理的なプロセスに必要不可欠な役割を担う（Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ，  ４０７：２４２−８）。毛細血管が発生する中で、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質は増殖する血管内皮細胞とがん組織の構造的足場として働き、がん細胞の増殖を支援する。新規の血管新生は、がんを含むいくつかの疾病の状態に関与する。そこでは、新しい「胚様」血管（本願明細書では新血管形成と称する）は構造と機能に関して、正常な脈管構造と異なるように見える（Ｈａｎａｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｅｌｌ，１００：５７−７０）。多くのインビボとインビトロの研究は、血管新生の様々なモデルシステムを用いて、正常と疾患関連の脈管構造の間に生物学的差異があることを実証する。従って、新血管形成疾患の治療のために胚型、がん関連の血管内皮細胞の血管形成を選択的に阻害する新規な抗血管新生化合物の可能性が挙げられる。治療のためのこれらの機会を考慮すると、がん又は他の血管新生疾患関連の血管内皮細胞やストローマ細胞（線維芽細胞、周皮細胞など）の増殖や機能を特異的に阻害することができる潜在的標的の懸命な探索が進行中である。
【０００５】
そのような標的同定しようとして、がんストローマ細胞の表面抗原を同定すること及びがんストローマ細胞に発現する特異的タンパク質やＲＮＡを同定する戦略が練られてきた（Ｒｅｔｔｉｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１０８３２−６；Ｓｔ．Ｃｒｏｉｘ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２８９：１１９７−１２０２）。これらの戦略でがんストローマ細胞に特異的に発現するように見える細胞表面タンパク質が同定され、エンドシアリン（又は、がん血管内皮細胞マーカー１（ＴＥＭ１）又はＣＤ２４８）と称された。
【０００６】
正常と腫瘍性の組織における遺伝子発現パターンの検証によると、がん新生血管でエンドシアリンのｍＲＮＡ発現の上昇が示唆された（Ｓｔ．Ｃｒｏｉｘ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２８９：１１９７−１２０２）。同様のエンドシアリンの発現レベルはヒト結腸直腸がん（Ｒｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，１１：１２８３−１２８６）、乳がん組織（Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，  ２１：３１−３７）、及び組織球腫（Ｄｏｌｚｎｉｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎ．，５：１０）で記述された。ヒトエンドシアリン発現は、高い浸潤性の神経膠芽腫、未分化星状細胞腫、及びメラノーマを含む浸潤性細胞癌で観察されてきた（Ｂｒａｄｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．  Ｅｘｐ．  Ｎｅｕｒｏｌ．，  ６３：１２７４−１２８３；Ｈｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）  Ｊ．  Ｃｕｔａｎ．  Ｐａｔｈｏｌ，．３３：１４５−１５５）。
【０００７】
免疫組織化学の研究で抗体を使うことにより、悪性組織中の多くの新血管形成血管内皮細胞、線維芽細胞、及び/又は周皮細胞（Ｖｉｒｇｉｎｔｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，  １０：３５−４５）で、エンドシアリンの強い発現が見出された。一方、限定はされないがＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）、又はＨＭＶＥＣ（新生児皮膚微小血管内皮細胞）のような胚様血管内皮細胞培養由来の細胞株での発現は限定的である。エンドシアリンに結合することができる抗体、ポリペプチド又は非タンパク質リガンドの解析により、エンドシアリンがその基質に結合する能力を抑制し、及び／又は細胞うっ血や細胞死を誘導する細胞内活性を抑制する分子のサブセットを同定してきた。
【０００８】
Ｒｅｔｔｉｇ  ｅｔ  ａｌ．は、様々ながんの型で血管上の抗原を認識するモノクローナル抗体を記述した（Ｒｅｔｔｉｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１０８３２−６）。これらのうち一つはＦＢ５と表記され、ヒト胚線維芽細胞をマウスに免疫することで作製された。ＦＢ５は神経膠芽腫の細胞株ＬＡ１−５ｓ（米国特許ＮＯ．５，３４２，７５７）の細胞表面の約１００ｋＤａのタンパク質を認識する。ＦＢ５はエンドシアリンに結合するマウス抗体（ＩｇＧ１）で、様々な異なるがんの型に関連した血管内皮細胞を認識することが示されてきた。構造的評価ではエンドシアリンがＣ型レクチン様で、膜内在性タンパク質で５つの球状細胞外ドメインを含む（Ｃ型レクチンドメイン、一つのＳｕｓｈｉ／ｃｃｐ／ｓｃｒパターンと相同性のあるドメイン、３つのＥＧＦリピートを含む）と分類される。該タンパク質はムシン様領域と膜貫通セグメント、及び短い細胞質側末端を含んでいる。該タンパク質は糖タンパク質であるように見える。糖の解析によりエンドシアリンのコアタンパク質はＯ結合型糖鎖修飾を多く含むことが示されている（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６：４８５８８−４８５９５）。引き続く仕事により、マウスＦＢ５の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）をヒトＩｇＧ１骨格に組み入れることでＨＭＶＥＣ培養中のサブセット細胞と同様に悪性組織中の血管に結合するヒト化抗体を作製した。
【０００９】
Ｔｅｍ１ノックアウトマウスは正常に発生し正常な創傷治癒を示す。このことは、エンドシアリンが胎児発生又は創傷修復における新血管形成に必要ではないことを示唆している（Ｎａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，  １０３：３３５１−３３５６）。結腸直腸がん細胞がＴｅｍ１ノックアウトマウスの腹部に移植されると、しかしながら、エンドシアリンの発現の消失は、親動物と比べてがんの増殖、浸潤、及び転移の減少と相関していた。エンドシアリンの発現の消失により、エンドシアリンノックアウトマウス中でのヒトがんの異種移植の増殖、浸潤及び転移が減少することを示した（Ｎａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，  １０３：３３５１−３３５６）。さらに付け加えると、エンドシアリンの欠如は小さな未成熟の血管の増加と中程度から大きながんの血管の数の減少を導いた。
【００１０】
新血管形成は多くの疾病状態と関連がある。がんでは、新血管形成は腫瘍に血液を供給するために重要であると信じられている。非腫瘍学のがん又は網膜症及び黄斑変性症のような悪性疾患では、制御されていない新血管形成は失明を引き起こす（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ−Ｂｅｒｋａ（２００４）Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．，１０：３３３１−４８；Ｄａｓ  ａｎｄ  ＭｃＧｕｉｒｅ（２００３）Ｐｒｏｇ．Ｒｅｔｉｎ．Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．，２２:７２１−４８）。さらに、炎症性疾患において新血管形成の役割を同定したいくつかの報告がある（Ｐａｌｅｏｌｏｇ  ａｎｄ  Ｍｉｏｔｌａ  （１９９８）  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，２（４）：２９５−３０７）。胚様血管内皮細胞及び前駆細胞、同様にこれらの疾患状態に関連した血管内皮細胞関連細胞（周皮細胞、線維芽細胞など）において分子パスウェイをよりよく理解する方法は、新規な薬剤を開発してこれらの疾患を治療するよう導くだろう。逆に、新血管形成は創傷治癒に関連する（Ｇａｌｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．，  １６４：１９３５−４７）。創傷治癒で血管形成を促進する分子パスウェイの同定は、外傷、やけど及び感染と関連した創傷治療を亢進するこれらのプロセスを助長する薬剤や因子を同定する能力を提供することができる。
【００１１】
効果的な抗血管新生及び血管新生促進療法の難しい問題は、新血管形成と関連した細胞プロセスを活性化するのに重要な分子及び関連パスウェイの生物学的プロセスの本質が定義されていないことである（Ｂａｇｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６３：５８６６−７３）。既知のパスウェイを制御する分子やその機能を同定し明らかにする能力は、がん、炎症、眼疾患、循環器疾患、及び創傷治癒のような新血管形成関連疾患において刺激性又は阻害性の活性をもつ効果的な化合物の単離へと導くことができる。分子に基づくアッセイによりこれらの化合物を単離し研究する能力は、正常な成体組織での血管に関与する成体様血管内皮細胞と対照的に、新血管形成に関与する細胞の正常な生物活性を特異的に抑制し又は刺激する効果を評価するのにさらなる有用性を提供するであろう（Ａｓａｈａｒａ  ａｎｄ  Ｋａｗａｍｏｔｏ（２００４）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２８７：Ｃ５７２−９）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明はエンドシアリン発現細胞とエンドシアリンリガンドとの相互作用を阻害する方法を特徴とする。
【００１３】
一つの側面として、前記方法は遺伝学的レベルでエンドシアリン発現細胞中でのエンドシアリンの発現を阻害することを含む。エンドシアリンリガンドはコラーゲンやフィブロネクチンの様な細胞外マトリックスタンパク質でもあり得る。いくつかの実施形態では、該リガンドはコラーゲンＩ又はコラーゲンＩＶである。好ましい実施形態では、該細胞は哺乳類細胞である。遺伝学的レベルでのエンドシアリン発現制御は、アンチセンス核酸分子、二重鎖ＲＮＡ、リボザイム、ハンマーヘッド型リボザイム、デコイオリゴヌクレオチド、およびそれと類似するものなど先行技術にある適切な任意の方法で達成され得る。エンドシアリンの発現制御はエンドシアリン遺伝子をノックアウトすることによっても達成され得る。
【００１４】
他の側面では、該方法はエンドシアリン発現細胞の細胞表面に発現するエンドシアリンを物理的に妨害し、従って、該細胞とエンドシアリンリガンドとの相互作用を阻害することを含む。エンドシアリンリガンドはコラーゲン（例えばコラーゲンＩ又はコラーゲンＩＶ）又はフィブロネクチンのような細胞外マトリックスタンパク質であり得る。
【００１５】
細胞表面のエンドシアリンの阻害は、低分子阻害剤、ポリペプチド阻害剤、エンドシアリンに特異的に結合する抗体、エンドシアリンリガンドに特異的に結合する抗体、及びそれと類似するものなど先行技術にある適切な任意の方法で達成され得る。いくつかの実施形態では、競合的阻害剤が、エンドシアリン又はエンドシアリン発現細胞とエンドシアリンリガンドとの相互作用を阻害するために使用される。いくつかの実施形態では、該競合的阻害剤はエンドシアリンのリガンド、エンドシアリンリガンドのエンドシアリン結合断片、例えばコラーゲンやフィブロネクチンのエンドシアリン結合断片であろう。好ましい競合的阻害剤はコラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ又はフィブロネクチンのエンドシアリン結合断片である。最も好ましい競合的阻害剤はフィブロネクチンの７０ｋＤａＮ末端断片、フィブロネクチンの４５ｋＤａゼラチン結合断片、及びフィブロネクチンの３０ｋＤａへパリン結合断片である。
【００１６】
適した抗体はキメラ抗体、ヒト化抗体、完全なヒト抗体、抗原に特異的に結合する抗原結合断片、及びそれに類似するものであり得る。いくつかの実施形態では、抗原への抗体の親和性は、好ましくは約１ｘ１０−７Ｍ未満であり、より好ましくは約１ｘ１０−８Ｍ未満であり、さらにより好ましくは約１ｘ１０−９Ｍ未満であり、そして最も好ましくは約１ｘ１０−１０Ｍ未満である。いくつかのより好ましい実施形態では、該抗体はエンドシアリン抗体又はエンドシアリンを特異的に認識する抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、該抗体又は抗原結合断片は、それぞれ配列ＩＤ番号２８，３０，及び３２のＣＤＲ1、ＣＤＲ２，及びＣＤＲ３を含む重鎖及び、それぞれ配列ＩＤ番号１３，１５，及び１７のＣＤＲ1、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、該抗体又は抗原結合断片は、配列ＩＤ番号３４の可変領域を含む重鎖及び、配列ＩＤ番号１９の可変領域を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では該抗体又は抗原結合断片は、配列ＩＤ番号２２又は２６のアミノ酸配列を含む重鎖及び、配列ＩＤ番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み得る。Ｍ４及びＭ４．1抗体はヒトエンドシアリンに対するヒト化抗体である。Ｍ４及びＭ４．1抗体は軽鎖の配列を共有しているが、配列ＩＤ番号２４の４２９番残基に対応して配列ＩＤ番号２０の４２９番残基であるように重鎖が１アミノ酸異なっている。該アミノ酸の変化は配列ＩＤ番号２３の１２８６番のヌクレオチドに対応して配列ＩＤ番号１９の１２８６番のヌクレオチドに１ヌクレオチド置換の結果である。いくつかの実施形態では、本発明と一致して使用される抗体は、ＡＴＣＣアクセス番号ＰＴＡ−７７５４又はＡＴＣＣアクセス番号＿＿＿＿＿＿を有する細胞により生産される。
【００１７】
エンドシアリンとエンドシアリンのリガンドとの相互作用の阻害は、正常な相互作用によってもたらされるパスウェイ、カスケード、及び下流の効果に影響を与え得る。例えば、エンドシアリン発現細胞とエンドシアリンリガンドとの相互作用を妨害し又は阻害することは、インテグリンの活性化、マトリックスメタロプロテアーゼの活性化、及び／又はマトリックスメタロプロテアーゼの発現を阻害し得る。細胞運動が阻害され得る。最も好ましくは血管新生、新血管形成が阻害される。
【００１８】
いくつかの実施形態では、エンドシアリン発現細胞とそのリガンドとの相互作用の阻害は、インテグリンβ１、β２又はβ３の活性化を阻害する。いくつかの実施形態では、エンドシアリン発現細胞とそのリガンドとの相互作用の阻害は、細胞遊走を阻害する。いくつかの実施形態では、エンドシアリン発現細胞とそのリガンドとの相互作用の阻害は、マトリックスメタロプロテアーゼの活性化と発現を阻害し得る。好ましい実施形態では、マトリックスメタロプロテアーゼはＭＭＰ−９である。
【００１９】
本発明は、血管新生と新血管形成を阻害する方法を特徴とする。該方法はインビトロ及びインビボで血管新生と新血管形成を阻害することを含む。いくつかの側面では、該方法は被検体に、エンドシアリンに特異的に結合する抗体又は抗原結合断片を、又は細胞表面に発現するエンドシアリンを妨害することで細胞とエンドシアリンのリガンドとの相互作用が阻害される組成物を、治療的に有効量投与することを含む。この阻害が、該組成物を投与した被検体中の組織、器官、又は腫瘍の血管新生及び／又は新血管形成を抑制する。エンドシアリンリガンドは、コラーゲン（例えばコラーゲンＩ又はコラーゲンＩＶ）又はフィブロネクチンのような細胞外マトリックスタンパク質であり得る。該組成物は細胞表面のエンドシアリンとエンドシアリンリガンドの少なくとも一つとの相互作用を物理的に妨害し得る任意の分子、ここに記載されたもの及び本願明細書中に例示されたものを含み得る。そのような分子の例は、限定はされないが、低分子阻害剤、ポリペプチド阻害剤、エンドシアリンに特異的に結合する抗体、エンドシアリンリガンドに特異的に結合する抗体、抗原結合断片及び、それに類似するものを含む。適した抗体はキメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、抗体断片、及びそれに類似するものであり得る。
【００２０】
また、特徴とするのは、エンドシアリンとエンドシアリンリガンドとの相互作用を増強する（作動薬）又は減少させる（拮抗薬）薬剤の同定のためのアッセイと方法である。そのような拮抗薬を同定する方法の一面では、該方法はエンドシアリンとテスト化合物を接触させて、エンドシアリンとテスト化合物複合体を形成させ、エンドシアリンとテスト化合物複合体をエンドシアリンリガンドと接触させ、定量的にエンドシアリンとそのリガンドとの結合をテスト化合物の存在下及び非存在下で測定することを含む。そこでは、テスト化合物の存在下でエンドシアリンとそのリガンドとの相互作用のレベルが減少することは、テスト化合物がエンドシアリンとそのリガンドとの相互作用する拮抗薬であることを示す。一つの実施形態では、エンドシアリンとエンドシアリンリガンドとの相互作用の作動薬又は拮抗薬を同定する方法は、エンドシアリンとそのリガンドとをテスト化合物の存在下及び非存在下で接触させ、定量的にエンドシアリンとそのリガンドとの相互作用を測定することを含む。そこでは、テスト化合物の存在下でエンドシアリンとそのリガンドとの相互作用のレベルが増加し又は減少することが、テスト化合物がエンドシアリンとそのリガンドとの相互作用のそれぞれ作動薬又は拮抗薬であることを示す。本発明のアッセイでは、エンドシアリンは細胞膜、細胞膜断片、人工脂質二重膜又は固相担体に結合し得る。いくつかの側面では、該リガンドは固相担体に結合し得る。エンドシアリンリガンドはコラーゲン又はフィブロネクチンの様な細胞外マトリックスタンパク質であり得る。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の方法と他の側面に関連する様々な用語は本明細書と特許請求の範囲の全体にわたり使用される。そのような用語は他に記述されない限り技術において通常な意味で用いられる。他の特に定義した用語は本明細書中で与えられた定義と矛盾しないように解釈される。
【００２２】
本発明は特定の方法、試薬、化合物、組成物、又は生物系に制限されることはなく、当然ながら変更されることは理解されるものとする。また、本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態のみを説明する目的で使用されるものであり、限定する意図はないこともまた理解される。
【００２３】
本明細書および添付の請求項に用いられる、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、その内容が明らかに別のことを示していない限り、複数の言及を含む。従って、例えば「ａ ｃｅｌｌ（細胞）」の言及は２若しくはそれ以上の細胞の組み合わせなどを含む。
【００２４】
本明細書に列挙した各範囲は、本明細書に含まれる特定の数字だけでなく、範囲内のすべての組み合わせ及びサブコンビネーションを含む。
【００２５】
本明細書に用いるとおり、「約」という用語は、量、一時的な期間など、測定可能な値を指す場合、特定の値からの±２０％又は±１０％、より好ましくは±５％、さらに好ましくは±１％、まださらに好ましくは±０．１％のばらつきを含むことを意味し、そのようなばらつきは開示された方法を実施する上で適応する。
【００２６】
「エンドシアリン特異的アッセイ」（ＥＳＡ）は、エンドシアリンの発現と生物学的活性を直接又は間接的に攪乱させることができる化合物を同定するために用いられるアッセイを称する。そしてそれは、エンドシアリン発現細胞又はエンドシアリンとＥＭＰｓとの、エンドシアリンを介した若しくはインテグリンを媒介するメカニズムを介して変更された直接又は間接の結合を生じ、そして、特に限定されないがマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰｓ）及び／又は細胞増殖と生存の様な細胞内在性のパスウェイを修飾する。
【００２７】
「ポリヌクレオチド」、同意語として「核酸」又は「核酸分子」と称するが、これらは任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシヌクレオチドを指し、それらは非修飾のＲＮＡ又はＤＮＡあるいは修飾されたＲＮＡ又はＤＮＡでもあり得る。「ポリヌクレオチド」は、限定はされないが、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖と二本鎖領域が混ざったＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、及び一本鎖と二本鎖領域が混ざったＲＮＡ、一本鎖又はより典型的には二本鎖もしくは一本鎖と二本鎖領域が混ざったＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子を含む。さらに、「ポリヌクレオチド」はＲＮＡ又はＤＮＡもしくはＲＮＡ及びＤＮＡの両者を含む三本鎖領域を指す。ポリヌクレオチドの用語は一以上の修飾された塩基を含むＤＮＡｓ又はＲＮＡｓ、安定性又は他の理由で骨格が修飾されたＤＮＡｓ又はＲＮＡｓをもまた含む。「修飾された」塩基は、例えば、トリチル化された塩基及びイノシンのような普通でない塩基を含む。様々な修飾がＤＮＡとＲＮＡにされ得る。従って「ポリヌクレオチド」は典型的に自然界に見出されるような化学的に、酵素学的に、代謝的に修飾された形態を包含し、ウイルスや細胞に特徴的なＤＮＡとＲＮＡの化学的な形態をまた包含する。「ポリヌクレオチド」は比較的短い核酸鎖、しばしばオリゴヌクレオチドと称するものも包含する。
【００２８】
「ベクター」はプラスミド、ファージ、コスミド又はウイルスのようなレプリコンであって、別の核酸セグメントが作動的に挿入されて該セグメントの複製と発現をもたらす。
【００２９】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は本明細書で同義的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。前記用語は、１または複数のアミノ酸残基が対応する天然型アミノ酸の人工化学的ミメティックであるアミノ酸ポリマー、および天然型アミノ酸ポリマーおよび非天然型アミノ酸ポリマーにも当てはまる。本発明のポリペプチドには、保存的修飾変異体を含む。当業者であれば、コード化配列中の単一アミノ酸または少ない割合のアミノ酸を変更、付加、または欠失させる核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列の置換、欠失、または付加は「保存的修飾変異体」であり、前記変化により、アミノ酸が化学的に類似のアミノ酸と置換されることが認識される。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表は当該分野で周知である。そのような保存的修飾変異体は、本発明の多型変異体、種間相同体、および対立遺伝子に追加され、これらを除外しない。
【００３０】
核酸分子の「発現する」、「発現された」、又は「発現」の用語は、遺伝子産物の生合成のことを指す。前記用語は遺伝子のＲＮＡへの転写を含む。例えば、限定されるものではないが、アンチセンス核酸又は干渉核酸のような制御的遺伝子はアンチセンスＲＮＡ若しくはＲＮＡｉ又はｓｈＲＮＡとして転写されることで発現され得る。前記用語はまた、ＲＮＡが一または複数のポリペプチドに翻訳されることを含み、任意の天然型転写後及び翻訳後修飾を含む。
【００３１】
細胞は、ＤＮＡが細胞内に導入された時に、外来性又は異種のＤＮＡの様な核酸により「形質転換」又は「トランスフェクト」される。形質転換されるＤＮＡは、細胞のゲノムに組み込まれる（共有結合性に結合）かもしれないし、又はないかもしれない。原核生物、酵母、哺乳類細胞中では、例えば、形質転換されるＤＮＡはプラスミドのようなエピソームの要素として維持される。真核細胞に関しては、安定に形質転換した細胞、又は「安定細胞」は、形質転換したＤＮＡが染色体に組み込まれて、染色体の複製によって娘細胞へと遺伝していく細胞である。この安定性は、真核細胞が形質転換したＤＮＡを含む娘細胞の集団からなる細胞株又はクローンを樹立する能力により示される。「クローン」は単一細胞又は有糸分裂による共通の先祖に由来する細胞集団である。細胞株は多数世代に渡りインビトロで安定的に成長することができるプライマリー細胞のクローンである。
【００３２】
本明細書中で用いられる「テスト化合物」は、任意の精製された分子、実質的に精製された分子、化合物の混合物の一つ又は複数の成分である分子、本発明の方法で用いられる得る任意の他の物質をもつ化合物の混合物を指す。テスト化合物は、有機又は無機の化学物質若しくは生体分子、及び任意の断片、類似体、相同体、複合物、並びにその派生物であり得る。「生体分子」はタンパク質、ポリペプチド、核酸、脂質、単糖、多糖、及び任意の断片、類似体、相同体、複合物、並びにその派生物を含む。テスト化合物は天然又は合成起源で、天然由来の原料から単離又は精製され得、若しくは新規に合成され得るものである。テスト化合物は、構造又は組成に関して定義され得、若しくは定義され得ない。該化合物は、構造の知られていない単離された生成物、いくつかの既知の生成物の混合物、又は一つ又は複数の化合物を含む定義されていない組成物であり得る。定義されていない組成物の例は細胞及び組織の抽出物、原核生物、真核生物及び古細菌が培養される成長培地、発酵ブロス、タンパク質発現ライブラリー、並びにその類似物などを含む。
【００３３】
「ノックダウン」は、一つ又は複数の遺伝子の発現が減少する細胞や生命体を指す。当業者であれば理解されるように、ノックダウンは、少なくとも発現の約５０％減少を示し、好ましくは少なくとも発現の約６７％減少を示し、より好ましくは少なくとも発現の約７５％減少を示す。より高い減少が可能であり、ノックダウンは、少なくとも発現の約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより多くの減少を示す。
【００３４】
「阻害する」又は「阻害」もしくは「干渉する」は、遺伝子、遺伝子産物（例えばポリペプチド）、又は標的のパスウェイの生物学的活性若しくは発現を、縮小させ、減少させ、ブロックし、阻止し、遅らせ、抑制し、不活性化し、脱感作し、停止し、ダウンレギュレートすることを意味する。いくつかの本発明の好ましい実施形態では、タンパク質又は標的のパスウェイ、例えばエンドシアリン又は細胞遊走パスウェイの発現若しくは生物活性の阻害は、約５０％から約９９％より大きな減少（阻害又はダウンレギュレーション）を指し、より具体的には約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより多くの減少を示す。阻害は直接的、つまり標的の分子又はパスウェイそのものに作用するかもしれないし、又は間接的、つまり標的の分子やパスウェイに影響を与える分子やパスウェイに作用するかもしれない。
【００３５】
「リコンビナント」が例えば細胞、核酸、タンパク質、又はベクターに関して使用された場合、細胞、核酸、タンパク質、又はベクターが異種の核酸又はタンパク質を導入することで修飾されたこと、若しくは、天然の核酸又はタンパク質が変更されたこと、あるいは細胞がそのように修飾された細胞に由来することを指す。従って、例えば、リコンビナント細胞は、天然型の（非リコンビナント）細胞中に見出せない遺伝子を発現し、又は、別の面では異常に発現した天然型の遺伝子を、その発現下又はまったく発現していない状態で発現する。
【００３６】
「有効量」及び「治療的に有効量」の用語は本明細書中で同意義に用いられ、本明細書中に記載されるように抗体、抗原結合断片または組成物の、限定はされないが、開示され記載され本明細書中に例示された生物学的結果のような特異的生物学的結果を達成するのに有効な量を指す。そのような結果は、限定はされないが、技術に適した任意の方法により特定される、血管新生又は新血管形成と関連した疾患の治療を含む。
【００３７】
本明細書中で使用される「計測する」又は「測定する」の用語は任意の定性的又は定量的測定を指す。
【００３８】
「エンドシアリンリガンド」は、エンドシアリンに結合し、相互作用し、刺激し、及び／又は発現を変更する任意の化学物質、生体分子、複合体又は類似物、相同体、若しくはその派生物を指す。
【００３９】
記載されない限り、「被検体」又は「患者」は同意義に用いられ、人間の患者及びヒトでない霊長類の様な哺乳類、並びにウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス及び他の動物のような実験動物を指す。従って、本明細書中で使用される「被検体」又は「患者」は、本発明の組成物が投与され得る任意の哺乳類患者又は被検体を意味する。
【００４０】
「血管新生」は新しい血管の形成を指す。
【００４１】
「新血管形成」は、正常では血管を含まない（複数の）組織や（複数の）器官に新しい血管が病的に増殖すること、もしくは特異的組織や器官に正常と違ったタイプ又は量の血管が病的に増殖することを指す。
【００４２】
「エピトープ」は抗体結合部位として働く抗原の免疫学的決定因子を指す。本明細書中で使用される「立体構造的エピトープ」という用語は、アミノ酸の連続的系列よりも抗原のアミノ酸間の空間的関連により形成された不連続のエピトープを指す。
【００４３】
「単離された」という用語は自然状態から「人間の手により」変更されたことを意味する。もし分子又は組成物が自然界にあるなら、本来の環境から変化し又は取り除かれた若しくはその両方であるなら「単離された」とされる。例えば、生存している植物や動物に天然に存在するポリヌクレオチド又はポリペプチドは「単離され」ていない。しかし、天然の状態の共存する物質から分離された同じポリヌクレオチド又はポリペプチドは「単離された」と本明細書中で前記用語が用いられる。
【００４４】
核酸とアミノ酸配列に関して「実質的に同一」とは、２以上の配列の間で少なくとも約６５％同一であることを意味する。好ましくは、前記用語は２以上の配列の間で少なくとも約７０％同一であることを指し、より好ましくは少なくとも約７５％同一であること、より好ましくは少なくとも約８０％同一であること、より好ましくは少なくとも約８５％同一であること、より好ましくは少なくとも約９０％同一であること、より好ましくは少なくとも約９１％同一であること、より好ましくは少なくとも約９２％同一であること、より好ましくは少なくとも約９３％同一であること、より好ましくは少なくとも約９４％同一であること、より好ましくは少なくとも約９５％同一であること、より好ましくは少なくとも約９６％同一であること、より好ましくは少なくとも約９７％同一であること、より好ましくは少なくとも約９８％同一であること、及びより好ましくは少なくとも約９９％又はそれ以上同一であることを指す。
【００４５】
エンドシアリンがフィブロネクチン又はコラーゲンを含む細胞外マトリックスタンパク質と特異的に相互作用することが、本発明と一致して発見された。前記相互作用が細胞遊走を促進し、及びさらに血管新生を促進し亢進することも発見されてきた。これらの観察に加えてさらに、エンドシアリンと細胞外マトリックスタンパク質の相互作用を乱すことは細胞遊走を抑制させ及び血管新生を抑制することが発見されてきた。従って、本発明はエンドシアリンとエンドシアリンリガンドとの相互作用を阻害する方法を特徴とする。
【００４６】
一面において、本発明はエンドシアリン発現細胞に発現されるエンドシアリンとエンドシアリンリガンドとの相互作用を阻害する方法を特徴とする、いくつかの好ましい実施形態では、該方法は細胞でのエンドシアリンの発現を阻害することを含む。エンドシアリンの発現を阻害することは遺伝子レベル又はタンパク質レベルで起こり得る。例えば、エンドシアリンの発現を阻害することは、エンドシアリンをコードするＤＮＡをターゲットとし又はエンドシアリン遺伝子のｍＲＮＡ転写産物をターゲットすることを含み得る。
【００４７】
遺伝子制御の方法は既知であり先行技術で容易に実行され、本発明の方法の中ですべて使用に適している。例えば、エンドシアリン（例えば、配列ＩＤ番号１、３、又は５）をコードするトランスジーンを発現するように特異的に操作された細胞中では、該トランスジーンは誘導性プロモーターの制御下に配置され得る。本発明で使用されるのに適した誘導性プロモーターは当業者に知られている。
【００４８】
いくつかの好ましい実施形態では、エンドシアリンをコードする遺伝子は、様々な他の転写後ジーンサイレンシング（ＲＮＡサイレンシング）技術を使用することで阻害され得る。ＲＮＡサイレンシングは、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を小さな２１−２８ヌクレオチドの断片にＲＮａｓｅＨベースの酵素（「ダイサー」又は「ダイサー様」）により加工することに関与する。該切断産物は、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）又はｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）であるが、配列特異的様式で遺伝子発現を制御するタンパク質エフェクター複合体に取り込まれる。
【００４９】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって媒介される転写後ジーンサイレンシングのメカニズムであり、アンチセンス及びリボザイムベースのアプローチとは異なっている（Ｊａｉｎ，  Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ（２００４）５：２３９−４２参照。ＲＮＡi及びｓｉＲＮＡのレビュー）。ＲＮＡ干渉は、細胞中又はヒトのような動物中で、細胞を形質転換したり又は、エンドシアリンをコードする遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし標的遺伝子の発現を減弱する核酸（例えばｄｓＲＮＡ）を動物に投与することで、エンドシアリンの発現を阻害する方法に有益である。ＲＮＡ干渉はエンドシアリン遺伝子の一つ又は複数の領域を標的とする複数の配列を含むｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡを提供する。二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子（ｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ）は、様々な種類の細胞中でｍＲＮＡの配列特異的分解を指揮すると考えられている。それは、第一にＲＮａｓｅＩＩＩ様のＤＩＣＥＲ（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ４０９：３６３−３６６）と称する酵素により，二つの２１ｎｔの鎖、つまり其々が５’のリン酸基及び３’ヒドロキシル基を持ち、他方の鎖と完全に相補的な１９ｎｔ領域を含み、従って２ｎｔの３’オーバーハングで隣接された１９ｎｔの二重鎖の領域をもつ鎖を含む小さなｄｓＲＮＡにプロセスされる。ＲＮＡｉはこのように、典型的には約１９ヌクレオチドの二重鎖に１−２ヌクレオチドの３’オーバーハングが其々の鎖についていて、全体の長さが約２１及び２３ヌクレオチドである低分子干渉ＲＮＡｓ（ｓｉＲＮＡ）により媒介される。哺乳類細胞では約３０ヌクレオチドより長いｄｓＲＮＡは、典型的にはインターフェロン反応を介した非特異的ｍＲＮＡの分解を誘導する。しかしながら、哺乳類細胞でｓｉＲＮＡが存在することは、インターフェロン反応を誘導すること以外では、配列特異的ジーンサイレンシングを生じる。
【００５０】
ウイルスベクター又はＤＮＡベクターは、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードし、それは細胞の細胞質中で低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）へと加工される。一般的に低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、好ましくは約１９塩基対の長さであるＲＮＡ二重鎖を含み、選択的にさらに一つ又は二つの一本鎖オーバーハング又はループを含む。一つのｓｉＲＮＡは、両者がハイブリダイズした二つのＲＮＡ鎖を含み得、又は代わりに自己ハイブリダイズする部分を含んだ一本鎖ＲＮＡを含み得る。ｓｉＲＮＡｓは、リン酸基及び／又はヒドロキシル基を含み得る一つ又は複数の自由な鎖の末端を含み得る。ｓｉＲＮＡｓは標的転写産物とストリンジェントな条件でハイブリダイズする部分を典型的に含む。
ｓｉＲＮＡの一つの鎖（又はｓｉＲＮＡの自己ハイブリダイズする部分）は標的転写産物の領域と典型的に完全に相補的であり、ｓｉＲＮＡは標的転写産物と一つのミスマッチもなしにハイブリダイズすることを意味する。完全な相補性が達成されない本発明のある実施形態では、任意のミスマッチはｓｉＲＮＡの末端又はその近傍に位置していることが一般に好まれる。
【００５１】
ｓｉＲＮＡは、トランスフェクション、エレクトロポレーション、カチオン性リポソームを媒介するトランスフェクション、又はマイクロインジェクションの様な方法で哺乳類細胞に導入された場合、もしくは様々なプラスミドベースの任意の方法で細胞に発現された場合、遺伝子発現をダウンレギュレートすることが示されてきた。ｓｉＲＮＡを用いたＲＮＡ干渉は、以下の文献で概説されている。例えば、Ｔｕｓｃｈｌ（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４４６−８、Ｙｕ  Ｊ−Ｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，  ９９：６０４７−５２、Ｓｕｉ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，  ９９：５５１５−２０、Ｐａｄｄｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ．，１６：９４８−５８、Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２９６：５５０−３，２００２、Ｍｉｙａｇａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０：４９７−５００、及びＰａｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０：５０５−８。前記文献や他の文献に記載されるように、ｓｉＲＮＡは２つの其々の核酸鎖からなり、又はヘアピン（ステムループ）構造を形成することができる自己相補的な領域を持つ一本鎖からなり得る。構造、長さ、ミスマッチの数、ループの大きさ、オーバーハングにあるヌクレオチドの同一性などの多くの変異体は、ｓｉＲＮＡが引き起こす効果的なジーンサイレンシングで一致している。任意の理論に拘束されることを望んではいないが、様々な異なる前駆体を細胞中でプロセスすること（例えば、ＤＩＣＥＲによって）で、効果的にジーンサイレンシングを媒介することができるｓｉＲＮＡの生産を生じると考えられている。一般的にイントロンよりもエクソンを標的にすることが好まれる。また、標的転写産物の３’部分中の領域と相補的な配列を選択することも好ましい。一般的に、異なるヌクレオチドがおよそ等モルの割合で含まれる配列を選択し、及び一つの残基が複数回反復される配列を避けることが好まれる。
【００５２】
ｓｉＲＮＡはこのように、約１９ヌクレオチドの二重鎖の領域に１−２ヌクレオチドの３’オーバーハングが其々の鎖についていて、全体の長さが約２１及び２３ヌクレオチドの間であるＲＮＡ分子を含み得る。本明細書中で使用されるように、ｓｉＲＮＡはまた、インビボでプロセスされて前記分子を生成する様々なＲＮＡ構造を含む。前記構造は、２つの相補的な配列がお互いにハイブリダイズしてステム、ループ、及び選択的にオーバーハング、好ましくは３’オーバーハングを形成することを含有するＲＮＡ鎖を含む。好ましくは、該ステムは約１９ｂｐの長さで、該ループは約１−２０、より好ましくは約４−１０、及び最も好ましくは約６−８ｎｔの長さであり、及び／又は該オーバーハングは約１−２０、より好ましくは約２−１５ｎｔの長さである。本発明のある実施形態では、該ステムは最少１９ヌクレオチドの長さで、最大約２９ヌクレオチドの長さでもあり得る。４ヌクレオチド又はそれより大きいループは、それより短いループよりも立体障害の影響を受ける可能性が高くないので、従って好ましいといえよう。該オーバーハングは５’リン酸基と３’ヒドロキシル基を含む。該オーバーハングは複数のＵ残基、例えば１から５の間のＵ残基を含む必要はないが、含んでもよい。前記の典型的なｓｉＲＮＡは、標的であるｍＲＮＡの分解を引き起こし、従って、タンパク質生成の速度を減少させる。典型的なパスウェイにより機能するｓｉＲＮＡｓに加えて、鋳型転写産物の３’ＵＴＲに結合するある種のｓｉＲＮＡは、鋳型転写産物でコードされるタンパク質の発現を、典型的なＲＮＡ干渉と異なるが関連するメカニズムで、例えば安定性を減少させるよりは転写産物の翻訳を減少させることにより阻害しうる。そのようなＲＮＡはマイクロＲＮＡs（ｍｉＲＮＡｓ）と称し、典型的には約２０から２６ヌクレオチドの長さであり、例えば２２ｎｔの長さである。それらは、小分子ＲＮＡs（ｓｔＲＮＡｓ）またはｍＲＮＡ前駆体で、典型的には約７０ｎｔの長さで約４−１５ｎｔのループを持つとして知られているより大きな前駆体に由来する（Ｇｒｉｓｈｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｅｌｌ，１０６：２３−４、Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３：８３４−８、Ｋｅｔｔｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１５：２６５４−９）。この型の内在性のＲＮＡsは哺乳類を含む様々な生物で同定され、転写後ジーンサイレンシングのこのメカニズムが広範なものであろうことを示唆している（Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９４：８５３−８，２００１、Ｐａｓｑｕｉｎｅｌｌｉ（２００２）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎ．，１８：１７１−３）。マイクロＲＮＡｓは哺乳類細胞で標的部位を含む標的転写産物の翻訳を阻止することが示されている（Ｚｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，９：１３２７−３３）。
【００５３】
３’ＵＴＲ中（又は標的転写産物のどこか）に結合し翻訳を阻害する天然型の又は人工の（ヒトにより設計された）ｍＲＮＡのようなｓｉＲＮＡｓは、ｓｉＲＮＡ／鋳型二重鎖中のたくさんのミスマッチを許容し得、特に該二重鎖の中心領域にあるミスマッチを許容するだろう。事実、いくつかのミスマッチは、インビトロで翻訳を阻害することが示されてきたｍＲＮＡと同様に天然型のｓｔＲＮＡがしばしばそのようなミスマッチを示すように、望ましくまたは必要とされるだろうという証拠がある。例えば、標的の転写産物とハイブリダイズする場合、そのようなｓｉＲＮＡはミスマッチの領域により分離された二つの完全に相補的な配列をしばしば含む。様々な構造が可能である。例えば、該ｍＲＮＡは一致しない（ミスマッチ）の複数の領域を含み得る。一致しない（ミスマッチ）の領域は、ある意味では対称的である必要はなく、標的とｍＲＮＡの両者は対になっていないヌクレオチドを含む。典型的には、完全な相補的な配列は少なくとも５ヌクレオチドの長さで、例えば６、７、それ以上のヌクレオチドの長さであり、一方ミスマッチの領域は例えば、１、２、３，４ヌクレオチドの長さである。
【００５４】
ｓｉＲＮＡ及びｍＲＮＡ前駆体を模倣するように設計されたヘアピン構造は細胞内でプロセスされて標的の転写産物の発現を減少し又は阻害することができる分子になる（ＭｃＭａｎｕｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）ＲＮＡ  ８：８４２−５０）。前記ヘアピン構造は２つのＲＮＡ鎖が１９ｂｐの二重鎖を形成することからなる典型的なｓｉＲＮＡｓに基づいているが、クラスＩ又はクラスＩＩヘアピンと分類される。クラスＩヘアピンは、アンチセンスｓｉＲＮＡ（つまり阻害することが望まれる標的転写産物と相補的な鎖）の５’又は３’末端のループを取り込むが、その他では典型的なｓｉＲＮＡｓと同一である。クラスＩＩヘアピンは、１９ｎｔ二重鎖の領域とその二重鎖のアンチセンス鎖の３’又は５’のいずれかの末端のループとさらにステムでの一つ又は複数のヌクレオチドのミスマッチを含むｍＲＮＡ前駆体に似ている。前記分子は細胞内でサイレンシングを媒介する小さなＲＮＡ二重鎖構造に加工される。それらは、天然型ｍＲＮＡｓ及びｓｉＲＮＡｓがそうであると考えられるように、翻訳抑制よりは標的ｍＲＮＡの分解を通して機能するように思われる。
【００５５】
このように、二重鎖構造を含むＲＮＡ分子の多様な型が様々なメカニズムでサイレンシングを媒介することができることは明白である。本発明の目的のために、任意のそのようなＲＮＡは、その一部分が標的転写産物に結合し、分解を引き起こすこと、翻訳を阻害すること、又は他の手段で発現を減少させるものであるが、ｓｉＲＮＡと考えられる。そして、そのようなｓｉＲＮＡ（つまり該ＲＮＡの前駆体として働く）を生成する任意の構造は本発明を実行するのに有益である。
【００５６】
本発明で用いられるＲＮＡ干渉のさらなる方法は低分子ヘアピンＲＮＡs（ｓｈＲＮＡ）の使用である。特に望まれるｓｉＲＮＡの配列をコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドはトランスフェクション又はウイルスを介した感染により、標的細胞に運ばれる。細胞の中にいったん入ると、該ＤＮＡ配列は継続的にＲＮＡ分子に転写され、自分自身に折り重なり、分子内の塩基対合を介してヘアピン構造を形成する。前記ヘアピン構造は細胞で加工されてトランスフェクトされたｓｉＲＮＡと同等なものになり、細胞により標的タンパク質のＲＮＡｉを媒介するものとして用いられる。ｓｈＲＮＡの使用はｓｉＲＮＡのトランスフェクションにおけるよりも前者がタンパク質の発現の安定した長期の阻害を導く点で利点がある。トランスフェクトされたｓｉＲＮＡｓによるタンパク質発現の阻害は、数日よりも長い期間起こらない一過性の現象である。いくつかの場合では、このことは好ましく及び望まれるものであろう。より長い期間タンパク質発現の阻害が必要な場合、ｓｈＲＮＡを介した阻害が好まれる。ｓｈＲＮＡの使用は特に好まれる。典型的には、ｓｉＲＮＡをコードするベクターは、プロモーター、「センス」方向のサイレンスされる標的遺伝子の配列、スペーサー、標的遺伝子配列のアンチセンス、及びターミネーターを含むコンストラクトである。
【００５７】
エンドシアリンの発現の阻害は、また、先行技術に知られ容易に実行される他の方法でも達成され得る。例えば、アンチセンス核酸が用いられる。アンチセンスＲＮＡ転写産物は同一細胞中の任意の他のＲＮＡ転写産物の一部又は全体に相補的な塩基配列を持つ。前記転写産物は、ＲＮＡスプライシングの修飾、ＲＮＡ輸送の修飾、及びｍＲＮＡの翻訳の修飾を含む様々なメカニズムで遺伝子発現を修飾することが示されてきた（Ｄｅｎｈａｒｄｔ（１９９２）Ａｎｎ．ＮＹＡｃａｄ．Ｓｃｉ．，６６０：７０−６，１９９２、Ｎｅｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１８：４１９−２３、及びＢａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１４８９：３−１８）。従って、本発明のある実施形態では、細胞中でのエンドシアリンの阻害は該細胞内でアンチセンス核酸分子を発現することで達成される。
【００５８】
アンチセンス核酸は一般的に一本鎖の核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾されたＤＮＡ，又は修飾されたＲＮＡ）で、標的核酸（例えばｍＲＮＡ転写産物）の一部と相補的であり、従って、標的に結合して二重鎖を形成する。典型的には、それらは、１５から３５ヌクレオチドの長さの範囲のオリゴヌクレオチドで、１０から約５０ヌクレオチドの長さの範囲でもあり得る。結合は典型的にはエンドシアリンをコードする遺伝子のような標的核酸の機能を減少させ又は阻害する。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドはゲノムＤＮＡに結合して転写を阻止し、ｍＲＮＡに結合して翻訳を阻害し、及び／又は核酸の分解を導き得る。エンドシアリンの発現の阻害は、エンドシアリンタンパク質をコードするｍＲＮＡの配列と相補的な配列を含むアンチセンス核酸又はペプチド核酸の投与により達成され得る。アンチセンス技術とその応用は当業者にはよく知られ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ（ｅｄ．）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２０００，Ｖｏｌｕｍｅｓ  ３１３  ａｎｄ  ３１４，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、及び、その文書中で引用される文献に記載される。また、Ｃｒｏｏｋｅ（ｅｄ．）“ＡＮＴＩＳＥＮＳＥ  ＤＲＵＧ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ，ＳＴＲＡＴＥＧＩＥＳ，ＡＮＤＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ”（第一版）Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ及びその文書中で引用される文献も参照される。
【００５９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは細胞内にある任意のＲＮＡ転写産物の一部に相補的な塩基配列で合成される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡスプライシングの修飾、ＲＮＡ輸送の修飾、及びｍＲＮＡの翻訳の修飾を含む様々なメカニズムで遺伝子発現を修飾することができる。安定性、毒性、組織分布、並びに細胞への取り込み及び結合親和性を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドの様々な特性は、以下の化学的修飾により変更されるだろう。（ｉ）ホスホジエステル骨格の置換（例えば、ペプチド核酸、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、及びホスホロアミド酸オリゴヌクレオチド）。（ｉｉ）糖塩基の修飾（例えば、２’−Ｏ−プロピルリボース及び２’−メトキシエトキシリボース）。及び（ｉｉｉ）ヌクレオシドの修飾（例えば、Ｃ−５プロピニルＵ、Ｃ−５チアゾールＵ，及びフェノキサジンＣ）。（Ｗａｇｎｅｒ（１９９５）Ｎａｔ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１：１１１６−８、Ｖａｒｇａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｉｍｍｕｎ．Ｌｅｔｔ．，６９：２１７−２４、Ｎｅｉｌｓｅｎ（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１０：７１−５、及びＷｏｏｌｆ（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８：１７６３−９）。
【００６０】
エンドシアリンの発現の阻害は、リボザイムの使用によっても達成される。リボザイム又はデオキシリボザイムと称されるある種の核酸分子はＲＮＡ分子の配列特異的切断を触媒することが示されている。切断部位は、ターゲットのＲＮＡ中のヌクレオチドを有するＲＮＡ又はＤＮＡ酵素中の相補的なヌクレオチドの対合によって決定される。このように、ＲＮＡ及びＤＮＡ酵素は任意のＲＮＡ分子を切断し、従って分解の速度を増加させるように設計される（Ｃｏｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）ＥＭＢＯ  Ｊ．，８：８６１−６、及びＵｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，  １：５２７−３３）。ハンマーヘッド型リボザイムはまた、遺伝子制御に日常的に使用される（Ｌｙｎｇｓｔａｄａａｓ（２００１）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｒａｌ  Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，１２：４６９−７８）。
【００６１】
本発明の好ましい面では、本発明の方法でターゲットされた細胞は、ｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡのような転写をサイレンシングする核酸で特異的に形質転換され、又は、細胞が阻害的な核酸分子を発現するような核酸をコードするベクターで形質転換され得る。細胞の形質転換はここに記載されたもの及び本明細書中で例示されたものを含む先行技術中で適した任意の方法により実行される。
【００６２】
デコイオリゴヌクレオチドもまたエンドシアリンをコードする遺伝子の発現を制御するのに適している。最近の臨床治験はデコイオリゴヌクレオチドが病原性のタンパク質を隔離する能力を試験した。デコイオリゴヌクレオチドは一般的に細胞を通過することができるエンハンサー要素を含み、いったん細胞に入ると、該デコイオリゴヌクレオチドは配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質に結合して転写に干渉する（Ｆｉｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２４：５６３−７０、Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｉｎ  Ｖｉｖｏ，１６：４５−８、Ｔｏｍｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｅｘｐ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．，５：４２９−３４）。
【００６３】
エンドシアリン発現の遺伝学的制御はエンドシアリンをコードする遺伝子のノックダウンにより達成される。当業者であれば理解されるように、エンドシアリン遺伝子の（興味のある任意の生物からの）配列は、例えば配列ＩＤ番号１、３、又は５は、エンドシアリン遺伝子の発現をノックダウンする核酸分子及びベクターを作製するのに使用され得る。前記配列に関して考慮すると、配列ＩＤ番号１、３、又は５に由来する制御的で特に阻害的な配列をコードする核酸分子は、配列ＩＤ番号１、３、又は５の対立遺伝子変異体、相同体及び自然変異体を含む。前記変異体及び相同体がヌクレオチドの配列で数種の違いを保持することを期待されているので、本発明は少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、又は７０％、より好ましくは少なくとも約７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、又は８０％、さらにより好ましくは８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、及びさらにより好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、及び最も好ましくは９６％、９７％、９８％、及び９９％またはそれ以上の配列ＩＤ番号１、３、又は５由来の任意のノックダウン核酸と相同性をもつ単離されたヌクレオチドを提供する。異なる生物中で前記制御配列をコードする遺伝子の中に存在するであろう自然の配列変異があるので、当業者は、ノックダウンポリヌクレオチドのユニークな性質をそれでも維持する一方、このレベルの変異を見出すことを期待される。従って、前記変異体及び相同体はお互いに実質的に同一であると考えられ、本発明の範囲に含まれる。
【００６４】
ノックダウン核酸分子は二つの一般的な方法で調整され得る。（１）適切なヌクレオチド三リン酸から合成され得る（２）生物原料から単離され得る。両者の方法は先行技術によく知られたプロトコルを利用する。
【００６５】
エンドシアリンの全長の核酸配列、例えば配列ＩＤ番号１、３、及び５のようなヌクレオチド配列情報を利用することで、オリゴヌクレオチド合成により本発明の単離された核酸分子の調製を可能にする。合成されるオリゴヌクレオチドはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３８Ａ  ＤＮＡ合成装置又は類似の機器で使用されるホスホアマダイト法により調製され得る。結果として生じるコンストラクトは高機能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のような先行技術で知られた方法により精製される。そのように作製された合成ＤＮＡ分子はクローン化され適切なベクターで増幅され得る。
【００６６】
ノックダウン核酸は任意の便利なクローニングベクター中でＤＮＡとして保持され得る。いくつかの好ましい面では、クローンはプラスミドのクローニング又は発現ベクター中で保持され、どちらも適切な原核生物又は真核生物宿主細胞中で増殖され得る。
【００６７】
ノックダウン核酸分子は、一本鎖、二本鎖、又は三本鎖でもあるｃＤＮＡ，ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ及びその断片を含む。このように、本発明は、本発明の核酸分子の少なくとも一つの配列、特に配列ＩＤ番号１、３、又は５とハイブリダイズすることができる配列を有するオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡのセンス又はアンチセンス鎖）を提供する。前記オリゴヌクレオチドはエンドシアリンをコードする遺伝子を検出するための、若しくは、ｍＲＮＡが翻訳されてタンパク質になるその時又は以前に、エンドシアリンをコードする遺伝子の発現の正又は負の制御のためのプローブとして有益である。オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドがアッセイのプローブとして利用される方法は、特に限定はされないが、（１）インサイツハイブリダイゼーション（２）サザンハイブリダイゼーション（３）ノーザンハイブリダイゼーション（４）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）のような様々な増幅反応を含む。
【００６８】
本発明に一致して特徴的なのは、センスとアンチセンスの方向のエンドシアリン又は相同体、類似体、又はその変異体の発現を阻害する制御配列をコードするポリヌクレオチドを含む、若しくは細胞又は組織特異的なプロモーター及び／又は他の制御配列の制御下にあるコンストラクトを含む、トランスジェニックな宿主細胞を生産するベクター及びキットである。前記ベクターはエンドシアリンの発現を修飾し及び好ましくは阻害するのに適している。
【００６９】
適した宿主細胞は、限定はされないが、エンドシアリンを発現する植物細胞、バクテリア細胞、酵母及び他の真菌細胞、昆虫細胞、並びに哺乳類細胞を含む。該細胞は、腫瘍性に形質転換され得る。より好ましくはヒト細胞である。
【００７０】
多種多様な前記宿主細胞を形質転換するベクターは当業者には周知である。それらは、限定はされないが、プラスミド、ファジミド、コスミド、バキュロウイルス、バックミド、バクテリア人工染色体（ＢＡＣｓ），酵母人工染色体（ＹＡＣｓ）、又は他のバクテリア、酵母、ウイルスベクターを含む。
【００７１】
制御配列のコードする領域は強力な恒常的プロモーター、例えば、以下の遺伝子のプロモーターの下流に配置される。ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、アデノシンデアミナーゼ、ピルベートキナーゼ、ベータアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン、及び他のものである。さらに、多くのウイルスのプロモーターが真核細胞で恒常的に機能し、本発明に使用するのに適している。前記ウイルスプロモーターは、限定はされないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ＳＶ４０の初期及び後期プロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、マローニー白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、エプステインバーウイルス（ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、及びその他レトロウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲｓ）、及び単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターを含む。他のプロモーターは当業者に周知である。一つの実施形態では、制御配列のコードする領域は、誘導プロモーターの下流に配置されている。誘導プロモーターは、メタロチオニンプロモーター、テトラサイクリン誘導プロモーター、ドキシサイクリン誘導プロモーター、タンパク質キナーゼＲ２’，５’−オリゴアデニレート合成酵素、Ｍｘ遺伝子、ＡＤＡＲ１及びそれに類似するもののような一つ又は複数のインターフェロン刺激反応要素（ＩＳＲＥ）を含むプロモーターを含む。他の適した誘導プロモーターは当業者に周知であろう。
【００７２】
ノックダウンベクターが、制御核酸配列で様々なエンドシアリン発現細胞を形質転換するのに使用される。様々な技術が、外部の遺伝子を細胞中に導入するための先行技術中で知られていて、本発明の様々な実施形態と一致して本発明の方法を実行する目的で、リコンビナント細胞を作製するのに使用されるだろう。使用される技術は、異種の遺伝子配列を宿主細胞に安定的に移動するために提供され、該異種の遺伝子配列は細胞の子孫によって遺伝され及び発現可能であり、受容細胞の必要な発生と生理学的機能が乱されない。使用される技術は、限定はされないが、染色体移動（例えば、細胞融合、染色体を媒介する遺伝子移動、マイクロ細胞を媒介する遺伝子移動）、物理的方法（例えば、トランスフェクション、スフェロプラスト融合、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソーム担体）、ウイルスベクター移動（例えば、リコンビナントＤＮＡウイルス、リコンビナントＲＮＡウイルス）、及びそれに類似するもの（Ｃｌｉｎｅ（１９８５）Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．，２９：６９−９２に記載）を含む。
【００７３】
エンドシアリンの発現が阻害されるノックダウン細胞は、「転写後ジーンサイレンシング」により輸送タンパク質をコードするｍＲＮＡの翻訳を阻害することで作製され得る。ダウンレギュレーションの標的とされる種からの遺伝子、又はその断片は、コードされるタンパク質の生産を制御するために利用されるだろう。全長のアンチセンス分子がこの目的のために使用され得る。代わりに、翻訳に重要なｍＲＮＡの特異的な領域を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドが使用されるだろう。アンチセンス分子が、転写によりアンチセンスＲＮＡ配列を生産するＤＮＡコンストラクトで細胞を形質転換することにより、シンサイツで提供されるだろう。前記コンストラクトは全長又は部分的なアンチセンスの配列を生産するように設計され得る。前記ジーンサイレンシング効果は、トランスジェニックに遺伝子をコードする配列のセンス及びアンチセンスＲＮＡの両者を過剰生産することで多量のｄｓＲＮＡが生産され、増強され得る（例えば、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９５：１３９５９−６４を参照）。この点で、少なくとも一つのイントロンの部分又は全体に対応する配列を含むｄｓＲＮＡが特に効果的であることが見出されてきた。一つの実施形態では、コードする配列のアンチセンス鎖の一部又は全体がトランスジーンにより発現された。他の実施形態では、一つのエンドシアリンをコードする配列の一部又は全部がハイブリダイズするセンス及びアンチセンス鎖がトランスジェニックに発現された。
【００７４】
標的とされる又は他に本発明の方法中で使用される細胞は、天然にエンドシアリンを発現するエンドシアリン発現細胞又はエンドシアリンを発現するリコンビナントプラスミドをトランスフェクトした細胞を含む。本発明のプライマリーエンドシアリン発現細胞は、組織から単離され、若しくは、限定はされないがプライマリー及び培養された線維芽細胞と同様にＨＵＶＥＣ又はＨＭＶＥＣのような供給メーカーから販売されている血管内皮細胞を購入され得る。本発明のトランスフェクトされた細胞は、任意の既知の昆虫発現細胞株、例えばＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞を含む。発現細胞株は酵母細胞株でもあり得、例えば、出芽酵母及び分裂酵母である。発現細胞はまた、哺乳類細胞でもあり得、例えば、チャイニーズハムスター卵巣、ベビーハムスター腎臓細胞、ヒト胎児腎臓株２９３、正常イヌ腎臓細胞株、正常ネコ腎臓細胞株、サル腎臓細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、ＣＯＳ細胞、非腫瘍性マウス筋芽細胞Ｇ８細胞、線維芽細胞株、ミエローマ細胞株、マウスＮＩＨ／３Ｔ３細胞、ＬＭＴＫ細胞、マウスセルトリ細胞、ヒト子宮頚癌細胞、バッファローラット肝臓細胞、ヒト肺細胞、ヒト肝臓細胞、マウス乳癌細胞、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞及びＦＳ４細胞である。
【００７５】
エンドシアリンの発現を阻害することはエンドシアリンと任意のエンドシアリンリガンドとの相互作用を阻害する。エンドシアリンリガンドはフィブロネクチン及びコラーゲンのような細胞外マトリックスタンパク質を含む。
【００７６】
本発明と一致して特徴的なのは、エンドシアリン発現細胞により発現されるエンドシアリンとエンドシアリンリガンドとの相互作用を阻害する方法であり、細胞によりエンドシアリンの発現をブロック又は妨害することを含む。このように、例えば、物理的障害が発現されたエンドシアリンとエンドシアリンリガンドとの相互作用を阻害し、妨害し、又は邪魔するのに役立つ。任意の化学物質又は生体分子が前記相互作用を妨害するのに貢献し得る。例えば、エンドシアリンに特異的に結合する又は、代わりにエンドシアリンリガンドに特異的に結合する小分子、ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片が前記方法に使用され得る。
【００７７】
いくつかの好ましい実施形態では、エンドシアリン発現細胞とエンドシアリンリガンドとの相互作用を阻害することはエンドシアリンリガンドと発現されたエンドシアリンとの結合を阻害することを含む。例えば、エンドシアリンとそのリガンドとの相互作用は、分子障害で邪魔され、ブロックされ、妨害され、又は他に妨げられる。このように、リガンドによる細胞へのアクセスが、邪魔され、阻害され、ブロックされ、妨害され、妨げられ又は防止される。エンドシアリンの妨害は、化学物質又は生体分子のような先行技術中で適した任意の方法で引き起こされ得る。
【００７８】
例えば、本発明の方法で使用するのに適した化学物質は、限定はされないが、アミノ酸構造、ステロイド、サイクリックヌクレオチド、アントラセン、重金属、キニロン、テルペン、フェノール類、グリコシド、アルキロイド、脂質、又はその混合物などエンドシアリン発現細胞に生物学的効果を与えることができるものを含む。化学物質は化学合成で製造されるか、生体触媒に由来するか、又は、体液に由来し得る。化学物質はヒト、非ヒト哺乳類、植物、酵母、真菌及び／又は原核生物の原料に由来し得る。
【００７９】
いくつかの実施形態では、競合的阻害剤が、エンドシアリン又はエンドシアリン発現細胞とエンドシアリンリガンドとの相互作用を阻害するのに用いられる。「競合的阻害剤」は該リガンドとエンドシアリンへの結合部位において競合する。いくつかの実施形態では、該競合的阻害剤はエンドシアリンリガンドであり、例えばコラーゲン（例えばコラーゲンＩ又はＩＶ）、フィブロネクチン、又はそのエンドシアリン結合断片である。最も好ましい競合的阻害剤はフィブロネクチンの７０ｋＤａＮ末端断片、フィブロネクチンの４５ｋＤａゼラチン結合断片、及びフィブロネクチンの３０ｋＤａへパリン結合断片である。
【００８０】
非常に好ましい実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、発現されたエンドシアリンとエンドシアリンリガンドとの相互作用を妨害するために使用される。該抗体又は抗原結合断片はエンドシアリンのエピトープに特異的であり、又はエンドシアリンリガンドのエピトープに特異的であり得る。エンドシアリンに特異的な抗体及びその抗原結合断片がより好まれる。フィブロネクチン、コラーゲン、その他類似物のようなリガンドに対する抗体は商業的に入手できる。
【００８１】
適した抗体はポリクローナル又はモノクローナルであり、エンドシアリン又はエンドシアリンリガンドに対して特異性を保持する抗体の派生物又は断片であり得る。該抗体は抗体の５つのクラスの任意であり得る。つまり、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭアイソタイプである。適した抗体はまた、ＩｇＹアイソタイプを含み、一般に、ニワトリや七面鳥の血清及び、ニワトリや七面鳥の卵黄に見出される。
【００８２】
抗体派生物及び抗原結合断片は、本発明の方法で使用するのに適しており、そのような派生物は、元の抗体分子の抗原結合特異性を保持する完全な抗体の一部を含む。例えば、派生物は少なくとも一つの可変領域（重鎖又は軽鎖の可変領域のいずれか）を含み得る。適した抗体の派生物及び断片の例は、限定はされないが、複数のエピトープの特異性を持つ抗体、二重特異性抗体、二特異性抗体及び一本鎖分子であり、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２，Ｆｄ、Ｆａｂｃ、及びＦｖ分子、一本鎖（Ｓｃ）抗体、個々の抗体軽鎖、個々の抗体重鎖、抗体鎖と他の分子のキメラ融合体、重鎖のモノマー又はダイマー、軽鎖のモノマー又はダイマー、一つの重鎖と一つの軽鎖からなるダイマー、及びそれに類似するものを含む。任意の抗体のアイソタイプが抗体派生物及び断片を生産するのに使用され得る。抗体派生物及び断片は組換えで生産され得る。
【００８３】
本発明の方法で使用されるのに適した抗体は、任意の種に由来するものであり得る。例えば、該抗体はマウス、ラット、ヤギ、ウマ、ブタ、ウシ、ニワトリ、ウサギ、ロバ、ヒト、及びそれに類似するものであり得る。治療方法での使用又はヒトへの投与のためには、非ヒト由来の抗体は、ヒト患者に投与する際に抗原性が低くなるように構造的に変更され得る。
【００８４】
このように、本発明のいくつかの実施形態では、本発明の方法中で使用される抗体はキメラ抗体である。キメラ抗体及びそれを生産する方法は先行技術に周知で確立されたものである。例えば、キメラ抗体はヒトＦｃ又は他のそのような構造ドメインを有するマウスの抗原結合ドメインを含み得る。
【００８５】
いくつかの実施形態では、抗体はヒト化抗体である。ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリン由来の配列を最小限含む、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はその断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２又は抗体の他の抗原結合配列）であり得る。大部分では、ヒト化抗体はヒトの免疫グロブリン（受容抗体）であり、受容体の相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基は、望ましい特異性、親和性、及び能力を持ったマウス、ラット、又はウサギのような非ヒト種（供給抗体）のＣＤＲの残基に置き換わる。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＷＲ）の残基は対応する非ヒトの残基で置き換わる。さらに、ヒト化抗体は、受容抗体中にも輸入されたＣＤＲ又はフレームワーク配列にも見つからない残基を含み得る。前記修飾は抗体の性能をさらに洗練し及び最適化するためになされる。一般的にはヒト化抗体は、実質的に全ての、少なくとも一つ、及び典型的には２つの可変領域を含み、そこでは、全ての又は実質的に全てのＣＤＲ領域は非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、及び全ての又は実質的に全てのＦＷＲ領域は、ヒトの免疫グロブリンの配列のものである。ヒト化抗体は最適にはまた、典型的にはヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常部（Ｆｃ）の一部を少なくとも含む。さらに詳細には、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５、Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−９、Ｐｒｅｓｔａ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−６を参照。
【００８６】
本発明の好ましい面では、該抗体は完全にヒトのものである。このことは、該抗体はもっぱらヒト起源であり、又は、他にヒト型の抗体と同一のアミノ酸配列からなることを意味している。
【００８７】
本発明の抗体は、例えば治療や診断に適用するため、様々な化学物質又は生体分子の成分でラベルされ又は他には抱合され得る。該成分は細胞傷害性のものであり得、例えば、バクテリア毒素、ウイルス毒素、放射性同位体、及びそれに類似するものである。該成分は検出できるラベルであり得、例えば、蛍光ラベル、放射能ラベル、ビオチン、及びそれに類似するものである。さらなる成分は、限定はされないが、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、及びアミド化を含む。本発明の方法に有益な抗体は、既知の保護／ブロック基、タンパク質切断、細胞リガンド又は他のタンパク質に結合するもの、及びそれに類似するものにそれ自身誘導体化するものであり得る。
【００８８】
当業者は、抗体の特異性は主に６つのＣＤＲ領域、特に重鎖のＣＤＲ３によって決定されると認識する（Ｋａｌａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３２：５３５−４１、Ｍｏｒｅａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７５：２６９−９４、及びＣｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−１７）。抗体のフレームワーク領域は、しかしながら、抗原―抗体相互作用に役割を果たし（Ｐａｎｋａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：３０８０−４）、特にＣＤＲのループの立体構造に役割を果たし得る（Ｆｏｏｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２４：４８７−９９）。このように本発明の方法で使用されるのに適した抗体は、エンドシアリン又はエンドシアリンリガンドに抗体の特異性を与える、Ｈ又はＬ鎖ＣＤＲ又はＦＷＲ領域の任意の組み合わせを含み得る。
【００８９】
いくつかの実施形態では、本発明はエンドシアリンに特異的に結合する単離されたヒト抗体及びその抗原結合断片の使用を意図する。いくつかの実施形態では、適した抗体又は抗原結合断片は、それぞれ配列ＩＤ番号２８、３０、及び３２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖、並びに配列ＩＤ番号１３、１５、及び１７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む軽鎖を含み得る。いくつかの実施形態では、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、それぞれ配列ＩＤ番号２７、２９、及び３１のヌクレオチド配列によりコードされる。いくつかの実施形態では、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、それぞれ配列ＩＤ番号１２、１４、及び１６のヌクレオチド配列によりコードされる。いくつかの実施形態では、該抗体又は抗原結合断片は配列ＩＤ番号３４の可変ドメインを含む重鎖及び配列ＩＤ番号１９の可変ドメインを含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、重鎖の可変ドメインは配列ＩＤ番号３３のヌクレオチド配列でコードされている。いくつかの実施形態では、軽鎖の可変ドメインは配列ＩＤ番号１８のヌクレオチド配列でコードされている。いくつかの実施形態では、該抗体又は抗原結合断片は、配列ＩＤ番号２２又は２６のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列ＩＤ番号１１のアミノ酸を含む軽鎖を含み得る。いくつかの実施形態では、重鎖は配列ＩＤ番号２１又は２５のヌクレオチド配列でコードされており、及び軽鎖は配列ＩＤ番号１０のヌクレオチド配列でコードされている。いくつかの実施形態では、該抗体又は抗原結合断片は配列ＩＤ番号２０又は２４を含む重鎖及び配列ＩＤ番号９を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、該抗体は配列ＩＤ番号８又は２３の核酸配列によりコードされる重鎖を含む。抗体と抗原結合断片は配列ＩＤ番号７を含む核酸配列によりコードされる軽鎖を含み得る。
【００９０】
本発明と一致して使用される抗体を生産する抗体生産細胞は、Ａｍｅｒ．Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔ．Ｃｏｌｌ．（１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ  ２０１１０−２２０９）に２００６年４月２４日及び２００８年３月１１日に設置され、それぞれアクセス番号ＰＴＡ−７５５４及び＿＿＿＿＿を割り当てられた。
【００９１】
重鎖と軽鎖及びそれらをコードする遺伝子に存在するであろう天然の配列変異のため、当業者は、本発明の抗体がもつユニークな結合特性（例えば特異性及び親和性）を維持しながら、それをコードするアミノ酸配列又はその遺伝子の中にある程度の変異を見出すことが期待されるだろう。そのような期待は一部では遺伝コードの縮重によるもので、コードされたタンパク質の性質をかなり変更することなしに、保存されたアミノ酸配列変異においての既知の進化的成功と同様である。従って、そのような変異体及び相同体はお互いに実質的に同一であると考えられ、本発明の範囲に含まれる。
【００９２】
本明細書中で記載される抗体の生物学的特性（例えば、結合親和性又は免疫エフェクター活性）を保持する、一つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失、付加、又は交換を有する変異体は本発明で使用されることを意図している。当業者は、一つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失、付加、又は交換を有する変異体を作製することができる。そのような変異体は、例えば、（ａ）一つ又は複数のアミノ酸残基が保存された又は非保存のアミノ酸と置換されている変異体、（ｂ）一つ又は複数のアミノ酸がポリペプチドに付加し又は欠失している変異体、（ｃ）一つ又は複数のアミノ酸が置換基を含む変異体、（ｄ）融合パートナー、タンパク質標識、又は他の化学的成分のように他のペプチド又はポリペプチドとポリペプチドが融合し、抗体のエピトープ、ポリヒスチジン、ビオチン成分及びそれに類似するものなどのそのポリペプチドに有益な特性を付与し得る変異体を含み得る。本発明の抗体は、保存された又は非保存の位置のいずれかで、一つの種からのアミノ酸残基が別の種のそれに対応する残基に置換された変異体を含み得る。他の実施形態では、非保存の位置のアミノ酸残基が保存された又は非保存の残基と置換される。遺伝学的（抑制、欠失、変異など）、化学的、酵素学的技術を含む前記変異体を得る技術は当業者に周知である。
【００９３】
本発明は、前記記載のアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を有する抗体、又はその抗原結合断片を意図する。例えば、前記抗体又は抗原結合断片は、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３がそれぞれ配列ＩＤ番号２８、３０、及び３２と少なくとも９０％同一で、並びに／又は軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３がそれぞれ配列ＩＤ番号１３、１５、及び１７と少なくとも９０％同一であるものを含み得る。いくつかの実施形態では、前記抗体又は抗原結合断片は、重鎖の可変ドメインが配列ＩＤ番号３４と少なくとも９０％同一で、及び／又は軽鎖の可変ドメインが配列ＩＤ番号１９と少なくとも９０％同一であるものを含み得る。いくつかの実施形態では、前記抗体又は抗原結合断片は、重鎖が配列ＩＤ番号２２又は２６と少なくとも９０％同一で、及び／又は軽鎖が配列ＩＤ番号１１と少なくとも９０％同一であるものを含み得る。いくつかの実施形態では、前記抗体又は抗原結合断片は、重鎖が配列ＩＤ番号２０又は２４と少なくとも９０％同一で、及び／又は軽鎖が配列ＩＤ番号９と少なくとも９０％同一であるものを含み得る。例えば、抗体Ｍ４及びＭ４．１はヒトエンドシアリンに対するヒト化抗体である。抗体Ｍ４及びＭ４．１は軽鎖を共有しているが、それらは以下に示される重鎖が一アミノ酸配列で異なっている。例えば配列ＩＤ番号２４の４２９番残基に対して配列ＩＤ番号２０の４２９番残基である。本発明はさらに、エンドシアリンが抗体Ｍ４又はＭ４．１に結合するのと競合する抗体又はその抗原結合断片を意図する。本発明はさらに抗体Ｍ４又はＭ４．１とエンドシアリンの同じエピトープに結合する抗体又はその抗原結合断片を意図する。
【００９４】
本発明の方法で使用されるのに適した抗体は、エンドシアリン又はエンドシアリンリガンドのような標的抗原に対する結合親和性を持ち、それは解離定数（ＫＤ）が１ｘ１０−２Ｍ未満である。いくつかの実施形態ではＫＤは１ｘ１０−３Ｍ未満である。他の実施形態では、ＫＤは１ｘ１０−４Ｍ未満である。いくつかの実施形態では、ＫＤは１ｘ１０−５Ｍ未満である。まだ他の実施形態では、ＫＤは１ｘ１０−６Ｍ未満である。他の実施形態では、ＫＤは１ｘ１０−７Ｍ未満である。他の実施形態では、ＫＤは１ｘ１０−８Ｍ未満である。他の実施形態では、ＫＤは１ｘ１０−９Ｍ未満である。他の実施形態では、ＫＤは１ｘ１０−１０Ｍ未満である。まだ他の実施形態では、ＫＤは１ｘ１０−１１Ｍ未満である。いくつかの実施形態では、ＫＤは１ｘ１０−１２Ｍ未満である。他の実施形態では、ＫＤは１ｘ１０−１３Ｍ未満である。他の実施形態では、ＫＤは１ｘ１０−１４Ｍ未満である。まだ他の実施形態では、ＫＤは１ｘ１０−１５Ｍ未満である。
【００９５】
エンドシアリンに結合する抗体の特異性及び／又は親和性は、抗体産生細胞に導入されたＰＭＳ１、ＰＭＳ２、ＰＭＳ２−１３４、ＰＭＳＲ２、ＰＭＳＲ３、ＭＬＨ１、ＭＬＨ２、ＭＬＨ３、ＭＬＨ４、ＭＬＨ５、ＭＬＨ６、ＰＭＳＬ９、ＭＳＨ１、及びＭＳＨ２のようなミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブアレルを使用することで、該抗体を産生する細胞の定向進化によって選択的に最適化され得る。該ドミナントネガティブ変異体を含む細胞はトランスフェクトされていないコントロールの細胞に比べて、超可変及びより高率で変異を蓄積するだろう。変異した細胞のプールは、抗体又は結合タンパク質のより高い親和性／特異性を作り出すクローン、又は抗体又は結合タンパク質のより高い力価を生産する、若しくはある種の条件で単純に早くよく増殖するクローンがスクリーニングされ得る。ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブアレルを使用した超可変細胞の作製技術は米国特許番号６，１４６，８９４に記載されている。代わりに、ミスマッチ修復は、ＷＯ０２／０５４８５６に記載されるミスマッチ修復の化学物質阻害剤を使うことで阻害され得る。ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブアレル又はミスマッチ修復の化学物質阻害剤を使って抗体を機能向上させる技術は、クローン化された免疫グロブリン又はタンパク質遺伝子をも発現する哺乳類、酵母、植物、原核生物発現細胞に適用され得る。ドミナントネガティブアレル又は低分子を発現する細胞は、ドミナントネガティブアレルがもし誘導的なら遮断され細胞から除去されることで、一方低分子化学物質は成長培地から除去され結果として遺伝学的に再び安定であり及びもはや異常に高率で変異を蓄積しない細胞になることで「治癒」され得る。
【００９６】
エンドシアリンの発現を阻害することは、エンドシアリンと任意のエンドシアリンリガンドとの相互作用を阻害する。エンドシアリンリガンドはフィブロネクチン及びコラーゲンの様な細胞外マトリックスタンパク質を含む。コラーゲンＩ及びコラーゲンＩＶがより好まれる。
【００９７】
エンドシアリンとエンドシアリンリガンドとの相互作用を阻害することは、前記相互作用の結果アップレギュレート又あるいは活性化されるパスウェイ及びカスケードを阻害する。例えば、エンドシアリンとエンドシアリンリガンドの相互作用は、インテグリンの様な接着分子の発現及び／又は活性化を促進し得、細胞外マトリックス又は他の細胞への細胞接着を媒介し、及び細胞のシグナルパスウェイを媒介し、その他のことも含み得る。
【００９８】
インテグリンはα（アルファ）とβ（ベータ）サブユニットの２つの異なる鎖を含有するヘテロダイマーとして存在する。そこには、約１８α及び８βの特性づけられたサブユニットがある。さらに、多くのインテグリンサブユニットは異なるスプライシングによる変異体として存在する。アルファとベータインテグリンサブユニットの様々な組み合わせは、２４を超えるユニークな活性型インテグリン複合体を生じる（Ｈｙｎｅｓ（２００２）Ｃｅｌｌ，１１０：６７３）。インテグリンのサブユニットは細胞膜を貫通し、一般的に約４０−７０アミノ酸の短い細胞質ドメインを含む。細胞膜の外側では、アルファとベータ鎖は約２３ｎｍの長さで、お互いに緊密に近接して位置する。其々のインテグリン鎖のアミノ末端はお互いに５ｎｍに隣接し、ＥＭＰ相互作用のリガンド結合領域を形成する。インテグリンはいくつかの判断基準で分類される。フォンウイルブランド因子中のＡドメインに類似する構造モチーフを持つので、α鎖のサブセットはアルファＡドメインと呼ばれるアミノ末端近くに挿入された構造要素を持つために、アルファ鎖はそのように分類される。このドメインを有するインテグリンはコラーゲンに結合するか（インテグリン複合体α１β１及びα２β１）又は、β２ファミリーのインテグリンを含む前記複合体を有する細胞間接着分子として機能する。インテグリンの２つの主要な機能は、細胞の細胞外マトリックスへの接着及びＥＭＰ−インテグリンの細胞への結合を介するシグナル伝達である。さらに、インテグリンは他の広範囲の生物学的活性にも関与する。例えば、免疫巡回及び細胞遊走のための細胞間接触に関与する細胞への結合と同様に、アデノウイルス、エコーウイルス、ハンタウイルス、口蹄疫ウイルスの様なウイルスとの結合に関与する。インテグリンは、細胞内でＥＭＰｓ（インテグリン複合体に依存する）と細胞骨格を共役する。いくつかのインテグリンリガンドが同定されてきた。より共通するリガンドはフィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン、及びラミニンである。インテグリン、ＥＭＰと細胞内のマイクロフィラメントとの相互作用は、タリン、パキシリン、及びアルファアクチニンを含む足場タンパク質を介して結びつけられる。これらの相互作用がＦＡＫ（接着斑キナーゼ）及びＳｒｃキナーゼファミリーメンバーの様なキナーゼを制御し、ｐ１３０ＣＡＳの様な基質をリン酸化し、従ってＣｒｋの様なシグナルアダプターをリクルートしてパスウェイの活性化、細胞の増殖及び／又は生存を含む細胞反応を媒介する。前記インテグリン関連の機能の任意は、エンドシアリン活性の機能としてインテグリンの活性をモニターし、本発明の薬剤又は効果的なエンドシアリンを標的とする分子の同定をするアッセイのためのスクリーニングアッセイとして構築され得る。さらに、本明細書中に開示される発明を考慮すると、エンドシアリン発現細胞中においてエンドシアリンに対する薬剤でインテグリンを標的とすることは、インテグリンを介したウイルス感染及び他の病態を抑制する幅広い機会を有する。
【００９９】
このようにエンドシアリンとエンドシアリンリガンドとの相互作用を阻害することは、エンドシアリン発現細胞上のインテグリン分子の発現及び／又は活性化を阻害する。いくつかの好ましい実施形態では、インテグリンβ１、β２、又はβ３の発現又は活性化が該阻害により抑制される。
【０１００】
エンドシアリンリガンドとエンドシアリンの相互作用を阻害することで発現及び／又は活性化が影響を受ける他の分子及びパスウェイは、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰｓ）を含む。ＭＭＰｓは、他の事の中で、細胞外マトリックスタンパク質、細胞表面受容体及びそれに類似するものの分解に役割を担う亜鉛依存的プロテアーゼである。ＭＭＰｓは、細胞遊走、増殖、血管新生、他の事象に役割を担う。ＭＭＰ酵素ファミリーは、その活性部位中に共通する亜鉛結合モチーフ（ＨＥｘｘＨｘｘＧｘｘＨ）及び活性部位に引き続く保存されたメチオニンを有する。ＭＭＰｓは、お互いの相同性、基質特異性、及び部分的には細胞局在により分類される。それらは広くは４つのクラスにグループ化される。それは、コラーゲナーゼ、ストロメライシン、ゼラチナーゼ、及び膜型ＭＭＰｓ（ＭＴ−ＭＭＰｓ）である。コラーゲナーゼ型ＭＭＰｓは、三重鎖線維状コラーゲンを異なる断片に分解することができる。前記コラーゲンは骨と軟骨の主要な構成成分であり、このクラスのＭＭＰsはそれらを分解できるただ一つの既知の哺乳類酵素である。それらは、ＭＭＰ-1（間質性のコラーゲナーゼ）、ＭＭＰ−８（好中球コラーゲナーゼ）、ＭＭＰ−１３（コラーゲナーゼ３）、及びＭＭＰ−１８である。ストロメライシン型ＭＭＰ酵素は、ＥＭＰsを切断する広範な能力を示すが、三重鎖線維状コラーゲンを切断しえない。このクラスはＭＭＰ−３（ストロメライシン１）、ＭＭＰ−１０（ストロメライシン２）、ＭＭＰ−１１（ストロメライシン３）、ＭＭＰ−１２（マクロファージメタロプロテアーゼ）、ＭＭＰ−１９（ＲＡＳＩ−１、又はストロメライシン４と称する）、及びＭＭＰ−２０（エナメライシン）、ＭＭＰ−２２（Ｃ−ＭＭＰ）、及びＭＭＰ−２７を含む。ゼラチナーゼ型ＭＭＰｓはＩＶ型コラーゲン及びゼラチンを分解し、触媒ドメイン中に挿入された付加的なドメインの存在により区別される。このゼラチン結合領域は亜鉛結合モチーフの直前に位置し、触媒ドメインの構造を乱さない別の折りたたみユニットを形成する。このクラスは、ＭＭＰ−２（７２ｋＤａゼラチナーゼ、ゼラチナーゼ―Ａ）、ＭＭＰ９（９２ｋＤａゼラチナーゼ、ゼラチナーゼ―Ｂ）を含む。最後に、膜結合ＭＭＰｓは、細胞外膜に付着したものである。それらは、以下のものを含む。ＩＩ型膜貫通システインアレイＭＭＰ−２３、グリコシルフォスファチジルイノシトール付着ＭＭＰｓ１７及び２５（それぞれＭＴ４−ＭＭＰ及びＭＴ６−ＭＭＰ）、Ｉ型膜貫通ＭＭＰｓ１４、１５、１６、２４（それぞれＭＴ１−ＭＭＰ、ＭＴ２−ＭＭＰ、ＭＴ３−ＭＭＰ、及びＭＴ５−ＭＭＰ）。前記ＭＭＰsの全ては、プロペプチド中のフューリン切断部位を有し、その特徴はＭＭＰ−１１によっても共有される。
【０１０１】
このように、エンドシアリンとエンドシアリンリガンドとの相互作用を阻害することは、エンドシアリン発現細胞上のＭＭＰｓの発現及び／又は活性化を阻害する。いくつかの好ましい実施形態では、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、又はＭＭＰ−１８の発現又は活性化が該阻害により抑制される。
【０１０２】
任意の特定の理論又は作動メカニズムに拘束されるよう意図するものではないが、エンドシアリンは血管新生、特に新血管形成及びがんの様な疾患において、直接的又は間接的に機能すると信じられている。従って、エンドシアリン又はエンドシアリン発現細胞がエンドシアリンリガンドに結合するのを妨害すること、又は、エンドシアリンを介したインテグリンの活性化、ＭＭＰｓの発現及び／又は細胞の増殖と生存を妨害することは、新血管形成疾患と関連する血管形成を抑制することができる。
【０１０３】
従って、本発明は血管新生を阻害する方法をも特徴とする。該方法はインビトロ又はインビボで実行され得る。一つの面では、血管新生を阻害する方法は、細胞の表面に発現されたエンドシアリンを妨害する治療的に有効量の組成物を被検体に投与することを含む。そこでは、前記妨害は、前記細胞とエンドシアリンリガンドが相互作用するのを阻害し、及びそこでは、前記細胞と前記リガンドとの前記相互作用を阻害することは、被検体中の組織、器官、又は腫瘍の血管新生を阻害する。
【０１０４】
他の面では、血管新生を阻害する方法は、細胞、培養細胞、組織、器官と、細胞表面に発現されたエンドシアリンを妨害する組成物とを接触させることを含み、そこでは、前記妨害は前記細胞とエンドシアリンリガンドとの相互作用を阻害し、及びそこでは、前記細胞と前記リガンドとの前記相互作用を阻害することは前記細胞、培養細胞、組織、器官の血管新生を阻害する。
【０１０５】
いくつかの好ましい実施形態では、該組成物は本明細書中に記載される少なくとも一つの競合的阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、該競合的阻害剤はエンドシアリンリガンド、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、又はそのエンドシアリン結合断片である。好ましい競合的阻害剤はコラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ又はフィブロネクチンの断片である。最も好ましい競合的阻害剤はフィブロネクチンの７０ｋＤａＮ末端断片、フィブロネクチンの４５ｋＤａゼラチン結合断片、及びフィブロネクチンの３０ｋＤａへパリン結合断片である。
【０１０６】
好ましい実施形態では、該組成物はエンドシアリンに特異的に結合する少なくとも一つの抗体を含む。そのような抗体は好ましくはエンドシアリンに対する親和性が約１ｘ１０−７Ｍ未満であり、より好ましくは約１ｘ１０−８Ｍ未満であり、より好ましくは約１ｘ１０−９Ｍ未満であり、より好ましくは約１ｘ１０−１０Ｍ未満である。エンドシアリンに特異的に結合する抗体は、その特性が本明細書中に記載され及び例証された抗体を含み得る。例えば、いくつかの好ましい面では、エンドシアリンに特異的に結合する抗体は、それぞれ配列ＩＤ番号２８、３０、及び３２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖、及びそれぞれ配列ＩＤ番号１３、１５、及び１７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３はそれぞれ配列ＩＤ番号２７、２９、及び３１のヌクレオチド配列によりコードされる。いくつかの実施形態では、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３はそれぞれ配列ＩＤ番号１２、１４、及び１６のヌクレオチド配列によりコードされる。いくつかの実施形態では、該抗体は配列ＩＤ番号３４の可変ドメインを含む重鎖及び配列ＩＤ番号１９の可変ドメインを含む軽鎖を含み得る。いくつかの実施形態では、重鎖の可変ドメインは配列ＩＤ番号３３のヌクレオチド配列によりコードされる。いくつかの実施形態では、軽鎖の可変ドメインは配列ＩＤ番号１８のヌクレオチド配列によりコードされる。いくつかの実施形態では、該抗体は配列ＩＤ番号２２又は２６のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列ＩＤ番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み得る。いくつかの実施形態では、重鎖は配列ＩＤ番号２１又は２５のヌクレオチド配列によりコードされており、及び軽鎖は配列ＩＤ番号１０のヌクレオチド配列によりコードされている。いくつかの実施形態では、該抗体は配列ＩＤ番号２０又は２４を含む重鎖及び配列ＩＤ番号９を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、該抗体は配列ＩＤ番号８又は２３の核酸配列によりコードされる重鎖を含む。抗体は、配列ＩＤ番号７を含む核酸配列によりコードされる軽鎖を含み得る。本発明に一致して使用され得る抗体を生産する抗体生産細胞はＡｍｅr.Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔ．  Ｃｏｌｌ．（１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  Ｖｉｒｇｉｎｉａ  ２０１１０−２２０９）に２００６年４月２４日及び２００８年３月１１日に設置され、それぞれアクセス番号ＰＴＡ−７７５４及び＿＿＿＿＿＿を割り当てられた。該抗体は本明細書に記載されるようにポリクローナル、モノクローナル、抗原結合断片、キメラ、ヒト化、完全ヒト及びそれに類似するものであり得る。
【０１０７】
エンドシアリンの発現を阻害することは、エンドシアリンとエンドシアリンリガンドの任意との相互作用を阻害する。エンドシアリンのリガンドはフィブロネクチン及びコラーゲンの様な細胞外マトリックスタンパク質を含む。
【０１０８】
本発明はまた、新血管形成を阻害する方法も特徴とする。該方法は、インビトロ又はインビボで実行され得る。一つの面では、新血管形成を阻害する方法は、細胞表面に発現されるエンドシアリンを妨害する治療的に有効量の組成物を被検体に投与することを含み、そこでは、前記妨害は前記細胞とエンドシアリンリガンドとの相互作用を阻害し、及びそこでは前記細胞と前記リガンドとの前記相互作用を阻害することは被検体中の組織、器官、腫瘍の新血管形成を阻害する。
【０１０９】
別の面では、新血管形成を阻害する方法は、細胞、培養細胞、組織、又は器官と細胞表面上に発現したエンドシアリンを妨害する組成物を接触させ、そこでは、前記妨害が前記細胞とエンドシアリンリガンドとの相互作用を阻害し、及びそこでは前記細胞と前記リガンドとの前記相互作用を阻害することは前記細胞、培養細胞、組織、又は器官の新血管形成を阻害する。
【０１１０】
いくつかの好ましい実施形態では、該組成物は本明細書中に記載される少なくとも一つの競合的阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、該競合的阻害剤はエンドシアリンリガンド、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、又はそのエンドシアリン結合断片である。好ましい競合的阻害剤はコラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、又はフィブロネクチンの断片である。最も好ましい競合的阻害剤はフィブロネクチンの７０ｋＤａＮ末端断片、フィブロネクチンの４５ｋＤａゼラチン結合断片、及びフィブロネクチンの３０ｋＤａへパリン結合断片である。
【０１１１】
好ましい実施形態では、該組成物はエンドシアリンに特異的に結合する少なくとも一つの抗体を含む。そのような抗体は好ましくはエンドシアリンに対する親和性が約１ｘ１０−７Ｍ未満であり、より好ましくは約１ｘ１０−８Ｍ未満であり、より好ましくは約１ｘ１０−９Ｍ未満であり、より好ましくは約１ｘ１０−１０Ｍ未満である。エンドシアリンに特異的に結合する抗体は、その特性が本明細書中に記載され及び例証された抗体を含み得る。例えば、いくつかの好ましい側面では、エンドシアリンに特異的に結合する抗体は、それぞれ配列ＩＤ番号２８、３０、及び３２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖、及びそれぞれ配列ＩＤ番号１３、１５、及び１７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３はそれぞれ配列ＩＤ番号２７、２９、及び３１のヌクレオチド配列によりコードされる。いくつかの実施形態では、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３はそれぞれ配列ＩＤ番号１２、１４、及び１６のヌクレオチド配列によりコードされる。いくつかの実施形態では、該抗体は配列ＩＤ番号３４の可変ドメインを含む重鎖及び配列ＩＤ番号１９の可変ドメインを含む軽鎖を含み得る。いくつかの実施形態では、重鎖の可変ドメインは配列ＩＤ番号３３のヌクレオチド配列によりコードされる。いくつかの実施形態では、軽鎖の可変ドメインは配列ＩＤ番号１８のヌクレオチド配列によりコードされる。いくつかの実施形態では、該抗体は配列ＩＤ番号２２又は２６のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列ＩＤ番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み得る。いくつかの実施形態では、重鎖は配列ＩＤ番号２１又は２５のヌクレオチド配列によりコードされており、及び軽鎖は配列ＩＤ番号１０のヌクレオチド配列によりコードされている。いくつかの実施形態では、該抗体は配列ＩＤ番号２０又は２４を含む重鎖及び配列ＩＤ番号９を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、該抗体は配列ＩＤ番号８又は２３の核酸配列によりコードされる重鎖を含む。抗体は、配列ＩＤ番号７を含む核酸配列によりコードされる軽鎖を含み得る。本発明に一致して使用され得る抗体を生産する抗体生産細胞はＡｍｅr.Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔ．  Ｃｏｌｌ．（１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  Ｖｉｒｇｉｎｉａ  ２０１１０−２２０９）に２００６年４月２４日及び２００８年３月１１日に設置され、それぞれアクセス番号ＰＴＡ−７７５４及び＿＿＿＿＿＿を割り当てられた。該抗体は本明細書に記載されるようにポリクローナル、モノクローナル、抗原結合断片、キメラ、ヒト化、完全ヒト及びそれに類似するものであり得る。
【０１１２】
エンドシアリンの発現を阻害することはエンドシアリンとエンドシアリンリガンドの任意との相互作用を阻害する。エンドシアリンリガンドはフィブロネクチン、例えばヒトフィブロネクチン（配列ＩＤ番号３５）及びコラーゲンの様な細胞外マトリックスタンパク質を含む。
【０１１３】
本発明はまた、エンドシアリンとエンドシアリンのリガンドとの相互作用の作動薬及び拮抗薬を同定するアッセイ及び方法を特徴とする。いくつかの実施形態では、該方法は、エンドシアリンとテスト化合物とを接触させ、エンドシアリン―テスト化合物複合体をエンドシアリンリガンドと接触させ、及びテスト化合物の存在下及び非存在下でエンドシアリンと該リガンドとの相互作用を定量的に測定することを含む。テスト化合物の存在下でエンドシアリンとリガンドとの相互作用のレベルの増加又は減少することは、該テスト化合物がエンドシアリンと該リガンドとの相互作用のそれぞれ作動薬又は拮抗薬であることを示す。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、該方法は、エンドシアリン発現細胞とテスト化合物を接触させ、エンドシアリン発現細胞とエンドシアリンリガンドとを接触させ、及び、テスト化合物の存在下及び非存在下で細胞上のインテグリンβ１、β２、又はβ３の様なインテグリン分子の発現又は活性化を定量的に測定することを含む。テスト化合物の存在下で細胞上のインテグリン分子の発現又は活性化のレベルの増加又は減少することは、該テスト化合物がエンドシアリンと前記リガンドとの相互作用のそれぞれ作動薬又は拮抗薬であることを示す。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、該方法は、エンドシアリン発現細胞とテスト化合物を接触させ、エンドシアリン発現細胞とエンドシアリンリガンドとを接触させ、及び、テスト化合物の存在下及び非存在下で細胞上のＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、又はＭＭＰ−１８の様なＭＭＰｓの発現又は活性化を定量的に測定することを含む。テスト化合物の存在下で細胞上のＭＭＰ分子の発現又は活性化のレベルの増加又は減少することは、該テスト化合物がエンドシアリンと前記リガンドとの相互作用のそれぞれ作動薬又は拮抗薬であることを示す。
【０１１６】
発明のアッセイ中では、エンドシアリンは細胞膜、好ましくは哺乳類細胞膜、細胞膜断片、人工脂質二重膜又は、適した固相担体に結合され得る。エンドシアリンリガンドは、限定はされないがフィブロネクチン又はコラーゲンを含む細胞外マトリックスタンパク質であり得る。
【０１１７】
エンドシアリン又はエンドシアリン発現細胞、つまりエンドシアリンと潜在的に相互作用することに対する潜在的生物学的活性を有するテスト化合物を作製する一つの戦略は、限定はされないが、ファージのコートペプチドを生産するファージライブラリーをスクリーニングすることに関与する。それは、エンドシアリンとエンドシアリンリガンドとの相互作用を阻害するように潜在的に働くライブラリー中のポリペプチドを同定するためにスクリーニングされ得ることに関与する。
【０１１８】
以下の実施例は、本発明をより詳細に記述するために提供される。それらは、本発明を限定するものではなく説明する意図である。
【実施例１】
【０１１９】
悪性組織上のエンドシアリン発現の免疫組織化学的解析。
エンドシアリン発現細胞を検出するための抗体の使用により悪性組織の免疫組織化学が示された。抗エンドシアリン又は正常ＩｇＧ抗体は、新鮮に凍結されたヒト結腸直腸癌組織に、二つの濃度（０．５μｇ／ｍＬ及び２．５μｇ／ｍＬ）で適用された。リン酸緩衝食塩水[ＰＢＳ（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．２）]＋１％ウシ血清アルブミンが一次抗体の希釈剤として用いられた。組織はＴｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ(R)Ｏ．Ｃ．Ｔ．培地に埋め込まれ、ドライアイス上で凍結され、−７０℃以下に封されたプラスチック袋中に保管された。組織は約５μｍで切片化され室温のアセトン中で１０分間固定された。スライドは染色まで−７０℃以下で保管された。染色の直前にスライドは１０％中性緩衝ホルマリン中で１０秒間固定された。
【０１２０】
凍結切片はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ[０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．２]）中で２度リンスされた。内在性のペルオキシダーゼは、スライドをＤａｋｏ  ＥｎＶｉｓｉｏｎＴＭキット中に提供されるペルオキシダーゼ溶液で５分間インキュベートすることでブロックされ、ＰＢＳ（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．２）で２度リンスされる。次に、スライドは非特異的結合を減少させるようにデザインされたタンパク質ブロックで２０分間処置された。該タンパク質ブロックは以下のように調製される。ＰＢＳ（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．２）、０．５％カゼイン、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、及び１．５％正常ヤギ血清。プロテインブロックに引き続き、一次抗体（被検物質Ｍ４、ネガティブコントロール抗体、又は無[アッセイのコントロールとして緩衝液だけ]）が室温で一時間アプライされた。次に、スライドはＰＢＳ（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．２）を用いて２度リンスされ、Ｄａｋｏ  ＥｎＶｉｓｉｏｎＴＭキットで供給されるペルオキシダーゼで標識されたヤギ抗ＩｇＧポリマーで３０分処置され（ＥｎＶｉｓｉｏｎＴＭポリマーは製造元の推奨する濃度で使用され）、ＰＢＳ（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．２）で２度リンスされ、Ｄａｋｏ  ＥｎＶｉｓｉｏｎＴＭキットで供給される発色基質（ＤＡＢ）溶液で８分間処置される。全てのスライドは水でリンスされ、ヘマトキシリンで対比染色され、脱水され、解釈のためカバースリップで封入された。ここに示されるように、腫瘍の血管（図１Ａ）はエンドシアリンに陽性であり、一方連続切片を染めたアイソタイプコントロール抗体は陰性（図１Ｂ）であった。
【実施例２】
【０１２１】
健常組織上でのエンドシアリン発現の免疫組織学的解析。
エンドシアリン発現細胞を検出するための抗体の使用により正常組織の免疫組織化学が示された。手短には、正常組織検体がクリオスタットで切片化され、上記されたようにエンドシアリンの発現を解析された。正常組織は、腫瘍の血管に観察されたように強く又は同種のものでないようにエンドシアリンを発現した、非常に少ない数の線維芽細胞／樹状様細胞を含む（図２Ａ及びＢ）。これらの細胞は、新血管形成の効果を研究するのに有益であり、細胞増殖、分化、遊走、又は署名照合のプロフィールを研究するために遺伝子発現用に単離され得る。それらは、以下にリスト化されたものと同様に当業者に知られた方法を使って、インビボ、エキソビボ、又はインビトロで研究され得る。
【実施例３】
【０１２２】
エンドシアリン発現細胞の単離と濃縮。
エンドシアリンに結合することができるタンパク質が、血管内皮細胞又は線維芽細胞様エンドシアリン発現細胞を濃縮するために効果的な方法として役立つことを実証するために、ヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣｓ）がエンドシアリンに結合できる抗体を使って選別され、５−１０％のエンドシアリン発現細胞を含む最初のプールからエンドシアリン発現細胞の濃縮された集団を単離された。以下の方法又は特異的試薬に拘束されることを望んではいないが、この実施例はエンドシアリン発現細胞を単離出来るエンドシアリン抗体の使用を示す。
【０１２３】
手短には、９６ウエルプレートは無菌状態でヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃγを用いてコートされた。次に、２０μｇ／ｍｌのヒト抗エンドシアリン抗体Ｍ４がプレートに加えられ、３つのウエル（Ａ、Ｂ、Ｃ）は抗体を入れないコントロールとしてあり、そして４℃で１時間インキュベートされた。ＨＭＶＥＣｓは、細胞膜への任意のダメージを避けるためにトリプシンよりＤＰＢＳ／ＥＤＴＡで１０ｃｍペトリ皿培養から回収され、従って、エンドシアリン細胞の細胞表面のタンパク質は無傷である。プールされた細胞は、任意の非結合の抗エンドシアリン抗体を吸引し洗い流した後に、２つの異なる濃度、１００，０００細胞／ウエル又は５０，０００細胞／ウエルのいずれかで蒔いて培養された。細胞は４℃で１時間プレート中にインキュベートされた。プレートはそれからＤＰＢＳ／ＦＢＳで４回洗浄された（コントロールウエルのＡ、Ｂ、及びＣがそのウエル中に細胞がなくなるまで）。５０，０００細胞／ウエルのプレートはほとんど細胞がなかったが、一方１００，０００細胞／ウエルのウエルは、プレートに接着した多数の細胞を含んでいた。細胞はそれから適切な成長培地で３日間インキュベートされた。コントロールのＢ及びＣのウエルが１００，０００細胞／ウエルのプレートから免疫染色のため選ばれた。カルセイン、ＡＭ染料が細胞を染めてニコン(R)Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＳ１００蛍光顕微鏡を使って可視化するのに用いられた。ポジティブに選別された培養細胞は、増殖及び下記する均一なエンドシアリンの発現のためのさらなる解析のために増やされた。
【０１２４】
エンドシアリン発現細胞を単離する能力をさらに測定するために、ＨＭＶＥＣ細胞を選別し及びＨＭＶＥＣ培養細胞を選別しない抗エンドシアリン抗体は、蛍光標識されたエンドシアリン抗体又は蛍光標識されたα―β１−インテグリン抗体をコントロールとして使用する免疫染色のために調製された。期待されたように、選別された及び選別されていない培養細胞から９０％より多くの細胞がα―β１−インテグリンに対して陽性に染色された（図に示されていない）。選別された細胞から９０％より多くの細胞がエンドシアリンに陽性に染色される一方、選別されていないＨＭＶＥＣ培養細胞では、たったの５−７％の細胞しかエンドシアリンに陽性に染色されなかった。これらのデータは抗体の様なエンドシアリン結合タンパク質を使って生きたエンドシアリン発現細胞を単離及び濃縮する能力を実証する。
【０１２５】
図３に示されるように、選別された培養細胞は、選別されていない元の培養細胞に比べて、エンドシアリン陽性細胞がよりずっと高くなっている。それは、抗エンドシアリン抗体を介してその後蛍光標識された二次抗体で処理して、免疫染色することで測定される。それぞれのフィールドの細胞数は、光学顕微鏡で測定された。
【実施例４】
【０１２６】
細胞外マトリックスタンパク質とエンドシアリンの相互作用。
ＴＥＭ１及びＦｃ−ＴＥＭ１発現プラスミドの構築。
ＬＡ１−５ＳゲノムＤＮＡから、ＴＥＭ１のオープンリーディングフレーム（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦ２７９１４２）のアミノ酸１−６８５を示すＤＮＡ断片が、ＰＣＲを使用することによって増幅された。生じた増幅産物はＥｃｏＲＩ及びＸｂａIで消化し、ｐＥＦ６−Ｖ５−ＨｉｓＡ（インビトロジェン）に連結された。Ｆｃ−ＴＥＭ−１を作製するために、ＴＥＭ１の細胞外領域が単量体のマウスＩｇＧ２ｂＦｃγドメインに融合され、その派生物であるｐＥＦ６−ＥＫ−Ｍｍ−ＩｇＧ２ｂ−Ｆｃγ―ＮＤベクターに連結される。該ベクターはエンテロキナーゼ認識領域（ＤＤＤＤ）に引き続いて修飾されたマウスＩｇＧ２ｂＦＣγ（ＣＨ３を通してヒンジされる）ドメインを含む。二量体化を防ぐため、重鎖間ジスルフィド結合に原因がある４つのシステイン残基はセリンに変更された。結果として生じた、単量体の分泌型融合タンパク質はＴＥＭ１細胞外ドメインの全長とマウスＩｇＧ２ｂＦＣγからなる。全てのプラスミド配列の完全性はベックマン(R)ＤＴＣＳケミストリー（ベックマンコールター、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）を使用して確認された。生データはＣＥＱ８０００ＤＮＡシークエンサーを用いて得られ、ＶｅｃｔｏｒＮＴＩ(R)ソフトウエア（インビトロジェン）を使用して解析された。
【０１２７】
Ｆｃ−ＴＥＭ−１の精製
ＣＨＯ−ＴＥＭ１−Ｆｃγ細胞は、２ｍＭＬ−グルタミン、１ｘペニシリン／ストレプトマイシン、６ｇ／Ｌダイズ加水分解物及び２．２ｇ／Ｌ炭酸水素ナトリウム（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充したＩＳ−ＣＨＯ−ＣＤ培地（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎｔａ  Ａｎａ、ＣＡ）中で２５Ｌスケールにおいて培養された。その培養は、培養の生存性が５０−７０％になるまで、Ｃｅｌｌｂａｇ５０(R)（ＧＥ  ヘルスケア、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を装着したＷＡＶＥ２０／５０ＥＨプラットフォーム上で行われた。細胞外の条件培地は、保持容器に０．５Ｌの培養液が残るまで、０．２μｍの中空繊維カートリッジ（ＧＥ  ヘルスケア）を装着したＦｌｅｘｓｔａｎｄ(R)ベンチトップパイロット中空繊維システム（ＧＥ  ヘルスケア）を使って濾過された。この時点で、濃縮された細胞塊は、４Ｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、２０ｍＭカリウムリン酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌｐＨ７．２）で洗浄され、残存した細胞外溶液を回収した。該４Ｌの洗浄液は濾過された原料とともにプールされた。濾過された培養上清は、それから１２倍濃縮（２９Ｌから２．５Ｌへ）された。Ｐｒｅｐ／Ｓｃａｌｅ(R)ホルダー（ミリポア、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）中でＰｒｅｐ／Ｓｃａｌｅ(R)Ｓｐｉｒａｌ  Ｗｏｕｎｄ２．５ｆｔ２  １００ｋ限外濾過カートリッジセットを使って、入口圧力２０ＰＳＩでペリスタポンプにより駆動され、及び再循環速度が約４００ｍｌ／ｍｉｎである。生じた濃縮原料は０．２μｍの膜を備えたボトルトップフィルター（Ｎａｌｇｅｎｅ）で滅菌濾過された。ＴＥＭ１−ＦｃγはプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーで捕獲され、１０ｘ１００ｍｍＰｒｏＳｅｐ−ｖＡ(R)（ミリポア）カラムを通し、５カラム量の溶出溶液（１００ｍＭクエン酸／１０ｍＭ酢酸ｐＨ３．０）を加えることで溶出された。溶出された溶液はＱＡ溶液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ８．０）で透析され、さらに、イオン交換クロマトグラフィーで５ｍｌＨｉＴｒａｐ(R)Ｑ−ＦＦカラム（ＧＥ  ヘルスケア）を通して精製された。結合タンパク質は、１５％ＱＢ溶液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、１Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ８．０）で洗浄し、引き続いて３５％ＱＢ溶液を使って結合したＦｃ−ＴＥＭ１を溶出した。溶出したタンパク質は、１００ｋＤａＭＷＣＯ膜（ミリポア）を装着したモデル８４００ポジティブプレッシャー限外濾過モジュール（ミリポア）で限外濾過することで濃縮し、約５ｍｌの最終容量になった。濃縮されたＦｃ−ＴＥＭ−１は、調製用の分子ふるいクロマトグラフィーでＳｅｐｈａｃｒｙｌ(R)Ｓ−３００ＨＲ２６ｘ６０カラム（ＧＥ  ヘルスケア）を通して精製され、ＰＢＳで平衡化された。精製されたＦｃ−ＴＥＭ−１を含む画分はプールされ、１００ｋＤａＭＷＣＯ膜を使った限外濾過により０．１−１ｍｇ／ｍＬの名目上の範囲に濃縮され、−８０℃で一回に使う分量ごとに貯蔵された。
【０１２８】
精製されたＦｃ−ＴＥＭ−１（２．９μｇ）は４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（インビトロジェン、Ｉｎｃ．）上にロードされ、ＭＯＰＳランニングバッファー（５０ｍＭ  ＭＯＰＳ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、３．５ｍＭ  ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ７．７）で４０分間電気泳動された。染色のため、ゲルは固定液（５０％  メタノール、１０％酢酸）中で１５分間固定され、脱イオン水で１０分間２回洗浄し、ＧｅｌＣｏｄｅ  Ｂｌｕｅ  ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｌｕｅ染色（Ｐｉｅｒｃｅ）を使って少なくとも１時間染色された。該ゲルは脱イオン水で何回も洗浄することにより脱染色された。
【０１２９】
フィブロネクチン（ＦＮ）、コラーゲンＩ（Ｃｏｌ  Ｉ）、コラーゲンＩＶ（Ｃｏｌ  ＩＶ）、ラミ二ン（ＬＮ）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）、ビトロネクチン（ＶＮ）、又はゼラチン（Ｇｅl）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｌ．）でプレコートされた９６ウエルプレートがＦｃ−ＴＥＭ−１の結合を評価するために使用された。ＴＥＭ１のＣｏｌＩ，ＣｏｌＩＶ及びＦＮへの結合は、ヒト血漿から精製したタンパク質中の混合物を追跡するためではない。なぜなら、抗Ｃｏｌ抗体ＥＬＩＳＡによってＣｏｌI又はＣｏｌＩＶがＦＮ中に検出されず、ＦＮがＣｏｌ中にも検出されないからである（データは示されない）。全てのプレートは、Ｆｃ−ＴＥＭ−１融合タンパク質、つまりＮ末端リーダー配列及び細胞外ドメイン全体をマウスのガンマ重鎖に融合することで作製された可溶性エンドシアリンを添加する前に２時間アッセイバッファー（ＰＢＳ中に０．５％ＢＳＡ、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０）でブロックされた。１時間室温でインキュベートしたのち、プレートは洗浄され、ＨＲＰ標識されたヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を１時間加えられた。カラー現像は、ＳｕｒｅＢｌｕｅＴＭＴＭＢペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を使って評価された。ＢＳＡとヒトアイソタイプコントロール抗体の両者がネガティブコントロールとして使用された。Ｆｃ−ＴＥＭ−１はＢＳＡに結合せず、ヒトアイソタイプはＥＣＭタンパク質の任意に結合しなかった（データは示されない）。
【０１３０】
図４Ａで示されるように、Ｆｃ−ＴＥＭ−１は、容量依存的にフィブロネクチン並びにコラーゲンＩ及びＩＶに結合し、一方、容量範囲の全体に渡り、ＬＮ又はＶＮには結合しなかった。興味深いことに、Ｆｃ−ＴＥＭ１はコラーゲンに結合する一方、ゼラチン（熱変成したコラーゲン）への結合は検出されなかった。テストされた４つのマウスアイソタイプＩｇＧ抗体はＥＣＭタンパク質の任意に結合しなかった。このことは、該相互作用がＦｃ−ＴＥＭ１融合タンパク質のマウスＦｃ骨格によって媒介される可能性を除外する（データは示されない）。マウスガンマ重鎖及びエンドシアリンのレクチンドメインのみを含む融合タンパク質は、またＦＮへ結合する（データは示されない）。
【０１３１】
Ｆｃ−ＴＥＭ１とＥＣＭタンパク質相互作用の選択性を確認するために、Ｆｃ−ＴＥＭ１は、異なる精製蛋白質でコートされたＥＬＩＳＡプレートにアプライされた。抗原特異的ＥＬＩＳＡｓは、ＴＰ  Ｉｍｍｕｎｏｍｉｎｉ  ＥＬＩＳＡプレートを、４℃オーバーナイトで炭酸水素コーティングバッファー（ｐＨ９．６）（Ｓｉｇｍａ）に溶解した以下のものでコートすることで行われた。１μｇ／ｍｌＳＴＥＢ（ブドウ球菌エンテロトキシンＢワクチン）、２μｇ／ｍｌウシガンマグロブリン、ほとんど全てのメラノーマ細胞に発現される２μｇ／ｍｌの癌関連９０ｋＤ糖タンパク質抗原（ＴＡ９０）、２μｇ／ｍｌ鶏卵リゾチーム、１：５００希釈の破傷風トキソイド、１％ＢＳＡ、０．２μｇ／ｍｌヒトメソテリン、２μｇ／ｍｌオボアルブミン（ＯＶＡ）、１μｇ／ｍｌヒトＧＭ−ＣＳＦ，２μｇ／ｍｌヤギＩｇＧ、２μｇ／ｍｌマウスＩｇＧである。プレートは室温で２時間１ｘアッセイバッファーとともにブロックされ洗浄バッファー（０．５％ＴＷＥＥＮ−２０を含む）で３回洗浄し、ＥＬＩＳＡが上記のように実行された。図４Ｂに示されるように、Ｆｃ−ＴＥＭ１は、ポジティブコントロールとして使用された抗マウスＦｃを除いて、テストされた任意のタンパク質に結合しなかった。
【実施例５】
【０１３２】
ヒト血漿フィブロネクチンへのＴＥＭ１結合の阻害。
９６ウエルプレートがフィブロネクチン（ＦＮ）でプレコートされ、抗ＴＥＭ−１抗体によるＦｃ−ＴＥＭ−１の媒介する接着を阻害する能力がＥＬＩＳＡにより評価された。手短には、融合タンパク質を添加する前２時間の間、ＦＮコートされたプレートはアッセイバッファー（ＰＢＳ中に０．５％ＢＳＡ，０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０）でブロックされた。Ｆｃ−ＴＥＭ−１は、Ｍ４抗体（米国特許公開番号２００６０２３９９１１中にＥＳ１として記載されたヒト化抗エンドシアリン抗体）、ヒトアイソタイプ（ＨｕＩｇＧ）、又はウサギで作製された抗ＴＥＭ−１抗体（ＲｂｔＴＥＭ１）と共に４℃で１時間プレインキュベートされた。Ｍ４は、非ヒト霊長類を除いて、エンドシアリンの種間の相同体に結合しない。Ｍ４の結合エピトープはエンドシアリンの細胞外レクチンドメインにマップされた。タンパク質／抗体複合体はＦＮコートプレートに加えられ、室温で１時間接着させられた。その時点で、プレートは洗浄され、ＨＲＰ標識されたヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）が１時間加えられた。カラー現像は、ＳｕｒｅＢｌｕｅＴＭＴＭＢペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を使って評価された。図６に示されるように、Ｍ４は、フィブロネクチンへのＦｃ−ＴＥＭ１結合を抑制した。一方、非特異的コントロール（ＨｕＩｇＧ）は結合を抑制しなかった。ＲｂｔＴＥＭ１は、また、フィブロネクチンへのＦｃ−ＴＥＭ１結合を抑制した（データは示されない）。
【実施例６】
【０１３３】
エンドシアリンはフィブロネクチンへの接着を媒介する。
エンドシアリンを安定に発現するＣＨＯ−ＴＥＭ１細胞（Ｍ４抗体を使ったＦＡＣＳにより確認された。データは示されない）が作製された。ＣＨＯ−Ｋ１細胞は、Ｌ−グルタミン、１％最小限必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、及び１０％熱非働化したＦＢＳ（インビトロジェン、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を添加したＲＰＭＩ中で維持された。ＣＨＯ−Ｋ１細胞（３Ｅ６）（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）は、０．４ｍｍのエレクトロポレーションキュベット中で、１０μｇの直線化ＤＮＡと共にエレクトロポレートされた。ジーンパルサー（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使って１７０Ｖ／１０００μＦのパルスが送達された。エレクトロポレートされた細胞は２４時間回復され、その後ブラストサイジン（５μｇ／ｍｌ）抵抗クローンが選択された。エンドシアリンの発現はＦＡＣＳで確認され、細胞は高発現のものが選別された。
【０１３４】
細胞（１．５ｘ１０５細胞／ウエル）は洗浄され、Ｍｇ２＋／Ｃａ２＋を含むＰＢＳ中に懸濁され、フィブロネクチンでコートされた９６穴プレートに４重に加えられ、１時間接着させられた。表示されるように、細胞は、アッセイの始まる前１時間、Ｍ４抗体（１００μｇ／ｍＬ）又はヒトアイソタイプ（ＩｇＧ）でプレインキュベートされた。細胞が接着させられた後、プレートはＰＢＳで５回洗浄され、生存性がＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ(R)（プロメガ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使って測定された。図９Ｂは、エンドシアリンの過剰発現がフィブロネクチンへの細胞結合を増加させ、非特異的ＩｇＧの様なコントロールと比べ、Ｍ４抗体の様なエンドシアリンの阻害剤によりブロックされることを示す。
【実施例７】
【０１３５】
フィブロネクチン及びフィブロネクチン断片へのエンドシアリン結合。
フィブロネクチンはタンパク質のＣ末端にジスルフィド架橋で共有結合的に連結された二量体として存在する大きな糖タンパク質複合体である（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５６：７２７７−７２８１、Ｗｉｅｒｚｂｉｃｋａ−Ｐａｔｙｎｏｗｓｋｉ＆Ｓｃｈｗａｒｚｂａｕｅｒ（２００３）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．，１１６：３２６９−３２７６、Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ＆Ｍｏｓｈｅｒ（１９９８）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．，１８：１３６３−１３７０）。酵素分解又は選択的スプライシングのいずれかに由来するフィブロネクチン断片は、ある種の疾患状態に関連するか、及び別々の生物学的機能を保持することが報告されてきた（Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ＆Ｍｏｓｈｅｒ（１９９８）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．，１８：１３６３−１３７０、Ｌａｂａｔ−Ｒｏｂｅｒｔ（２００２）Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．，１２：１８７−１９５、Ｈｏｍａｎｄｂｅｒｇ（１９９９）Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ．，４：Ｄ７１３−７３０）。
【０１３６】
Ｆｃ−ＴＥＭ−１が異なるフィブロネクチン断片に結合する能力が評価された。等モル量のタンパク質がコーティングバッファー（５０ｍＭ  炭酸―炭酸水素、ｐＨ９．４）に希釈され、ＥＬＩＳＡプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−ｏｎｅ、Ｍｏｎｒｏｅ、ＮＣ）に加えられ、４℃でオーバーナイトインキュベートされた。全てのプレートは、Ｆｃ−ＴＥＭ−１の添加前２時間の間アッセイバッファー（ＰＢＳ中に、０．５％ＢＳＡ、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０）でブロックされた。室温で１時間インキュベーションすることに引き続いて、プレートは洗浄され、ＨＲＰ標識されたヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）が１時間加えられた。カラー現像は、ＳｕｒｅＢｌｕｅＴＭＴＭＢペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を使って評価された。コートされたフィブロネクチンタンパク質の完全性を評価するために、フィブロネクチンに対するウサギポリクローナル抗体（ＦＮ  Ａｂ）が、全てのＦＮ断片が認識され均一にコートされていることを検出するために使用された。
【０１３７】
全長のヒト血漿精製フィブロネクチン及び１２０ｋＤａ細胞接着ＦＮ断片は、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｌ．（Ｔｅｍｕｃｕｌａ、ＣＡ）から購入された。タンパク質分解の３０ｋＤａ、４５ｋＤａ、７０ｋＤａ断片はシグマ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から、組換えヒトフィブロネクチン断片２及び４（それぞれＦＮ２及びＦＮ４）はＲ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から購入された。
【０１３８】
図７Ａで示されるように、Ｆｃ−ＴＥＭ１はフィブロネクチンのアミノ末端７０ｋＤａ断片、及びそのタンパク質分解産物（４５ｋＤａ及び３０ｋＤａ断片）に結合する。結合の程度は異なる断片の間で変わるが、ＦＮ全長で見られるよりは小さい。対照的に、Ｆｃ−ＴＥＭ１は１２０ｋＤａＦＮ断片若しくは組換え断片ＦＮ２又はＦＮ４に結合しない。この結合の欠如は、不均一なコーティング又は分解によるものではないようだ。なぜなら全てのＦＮ断片は抗ＦＮポリクローナル抗体により強く検出されるからだ。これは、ＦＮドメインが７０ｋＤａアミノ末端部分中でエンドシアリン残基と相互作用することに関与する証拠である。７０ｋＤａ断片をさらに消化することで結合能力が減少することは、Ｆｃ−ＴＥＭ１がタンパク質分解部位に非常に近接した部分に位置する領域に結合すること又はＴＥＭ１がさらなる消化の後に変更されるＦＮのアミノ末端中にある立体構造依存的エピトープを認識することを示すかどうかを決定するために、Ｆｃ−ＴＥＭ１がＦＮタンパク質の還元した型に結合する能力が検討された。抗ＦＮ抗体は、還元型のＦＮを認識できる一方、このことは等価のコーティングを示しているが、Ｆｃ−ＴＥＭ１の結合は図７Ｂに示すように完全に喪失している。ＦＮ全体と似ているように、抗エンドシアリン抗体Ｍ４は、Ｆｃ−ＴＥＭ１の７０ｋＤａ断片への結合を容量依存的に阻止する（図７Ｃ）。一方、アイソタイプコントロール抗体は、影響がなかった（図７Ｄ）。これらの結果は、Ｆｃ−ＴＥＭ１が、さらなるタンパク質分解により障害されるＦＮのアミノ末端中に位置する立体構造依存的エピトープを認識することを示している。
【実施例８】
【０１３９】
細胞表面のフィブロネクチンとエンドシアリンとの会合。
エンドシアリンを安定に発現するＣＨＯ−ＴＥＭ１細胞（Ｍ４抗体を使ったＦＡＣＳにより確認された。データは示されない）が作製された。ＣＨＯ−Ｋ１細胞は、Ｌ−グルタミン、１％最小限必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、及び１０％熱非働化したＦＢＳ（インビトロジェン、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を添加したＲＰＭＩ中で維持された。ＣＨＯ−Ｋ１細胞（３Ｅ６）（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）は、０．４ｍｍのエレクトロポレーションキュベット中で、１０μｇの直線化ＤＮＡと共にエレクトロポレートされた。ジーンパルサー（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使って１７０Ｖ／１０００μＦのパルスが送達された。エレクトロポレートされた細胞は２４時間回復され、その後ブラストサイジン（５μｇ／ｍｌ）抵抗クローンが選択された。エンドシアリンの発現はＦＡＣＳで確認され、細胞は高発現のものが選別された。
【０１４０】
細胞表面のＦＮのレベルが親株であるＣＨＯ−Ｋ１及びＣＨＯ−ＴＥＭ１細胞でポリクローナル抗ＦＮ抗体を使用してフローサイトメトリにより調べられた。細胞は細胞解離バッファー（インビトロジェン、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中に回収され、洗浄され、及び氷冷ＰＢＳ＋１％ＦＢＳに懸濁された。細胞は、一次抗体Ｍ４（１０μｇ／ｍｌ）と共に氷上で１時間インキュベートされ、洗浄され、そしてＦＩＴＣを抱合したヤギ抗ヒト二次抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）とインキュベートし、そしてＥＡＳＹＣＹＴＥ  フローサイトメーター（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）で解析された。ＣＨＯ−Ｋ１細胞に比べＣＨＯ−ＴＥＭ１細胞で１５−２０％高いレベルの細胞表面ＦＮが常に観察された（データは示されない）。細胞表面ＦＮとエンドシアリンとの会合が調べられた。
【０１４１】
抗ＦＮ抗体を使って、ＦＮがＣＨＯ−Ｋ１及びＣＨＯ−ＴＥＭ１の両者のライセートから免疫沈降され、引き続いて同じ抗体又は抗ＴＥＭ１抗体を使ってウエスタンブロットされた。細胞（１０Ｅ７）は、完全ミニプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を補充した放射性免疫沈降法（ＲＩＰＡ）バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１％  ＮＰ−４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  ドデシル硫酸ナトリウム[ＳＤＳ]）で溶解され、そして、細片を除去するために１５分間１３，０００ｒｐｍで遠心分離された。プロテインＧセファロース６ファーストフロービーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）がＰＢＳで３回洗浄され、抗ＦＮ抗体（１μｇ）が４℃で緩やかに振とうされることで捕獲された。サンプルあたり等量のタンパク質が非結合のプロテインＧを加えることでプレクリアーされた。２時間のインキュベートの後、プロテインＧは除去され、上澄み溶液は抗体―セファロース複合体を加えられ、４℃でオーバーナイトインキュベートされた。ＲＩＰＡバッファーで何度も洗浄したのち、結合したタンパク質は５％β―メルカプトエタノールを含むＮｕＰＡＧＥ(R)ＬＤＳサンプルバッファー（インビトロジェン）中で１０分間沸騰させることで除去された。タンパク質は４−１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（インビトロジェン）で、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて分離され、ＰＶＤＦ膜にトランスファーされた。免疫ブロットがフィブロネクチンに対する（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）又はエンドシアリンに対する（Ｍｏｒｐｈｏｔｅｋ，Ｉｎｃ、Ｅｘｔｏｎ、ＰＡ）特異的なウサギポリクローナル抗体を用いて行われ、ヤギ抗ウサギＨＲＰ抱合した抗体で検出され、そして、ＳＵＰＥＲＳＩＧＮＡＬウエストピコ化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使って可視化された。可溶化Ｆｃ−ＴＥＭ１の完全性と純度もまたウエスタンブロットを用いてモニターされた。タンパク質（５μｇ）は、５％β−メルカプトエタノールを含む４ｘＮＵＰＡＧＥ  ＬＤＳサンプルバッファー（インビトロジェン）中で５分間沸騰され、ＮＵＰＡＧＥ４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（インビトロジェン）で電気泳動され、そして、ＰＶＤＦ膜にトランスファーされ、上記のように免疫ブロットが実行された。
【０１４２】
ＦＮはＣＨＯ−ＴＥＭ１ライセートからエンドシアリンを免疫沈降することができることが見出された（データは示されない）。対照的に、ＦＮをプルダウンしない正常ＩｇＧを用いて免疫沈降した細胞ライセート中では、エンドシアリンは検出されなかった（データは示されない）。少なくとも２つの異なるやり方は（ＥＬＩＳＡ及び共免疫沈降法）ＦＮとエンドシアリンの相互作用の強い証拠を提供する。似たような結果が、エンドシアリンを異所的に発現するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を使って得られている（データは示されない）。
【実施例９】
【０１４３】
ＭＡＴＲＩＧＥＬ上に培養されたエンドシアリン発現細胞はクモの巣状の構造を形成する。
プラスチックの表面で培養された親株であるＣＨＯ−Ｋ１とＣＨＯ−ＴＥＭ１細胞の間には増殖又は生存に差は観察できなかったが、これらの細胞をＭＡＴＲＩＧＥＬ上で培養する場合劇的に異なる形態が観察された。親株であるＣＨＯ−Ｋ１細胞は２日の培養の後に最小限の突起を有する単離された細胞クラスターに成長するが（図８、上のパネル）、一方ＣＨＯ−ＴＥＭ１細胞は、クモの巣状のネットワークを形成するクラスターへと成長した（図８、左下のパネル）。さらに、該クラスター中のＣＨＯ−ＴＥＭ１細胞は他のクラスターへと延びた突起を示す（図８、右下のパネル）。時間がたつと、ＣＨＯ−Ｋ１細胞ではなくＣＨＯ−ＴＥＭ１細胞がお互いに近接して動き、より大きなクラスターを形成した（データは示されない）。
【実施例１０】
【０１４４】
エンドシアリンの発現は、フィブロネクチン及びフィブロネクチンの７０ｋＤ又は３０ｋＤのＮ末端への細胞接着を増加させる。
ＦＮ断片への接着を評価するため、等モル量のタンパク質断片がオーバーナイトでプレコートされ、そして１０ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡを含むＰＢＳで２時間ブロックされた。ＭＡＴＲＩＧＥＬはポジティブコントロールとして働く。細胞解離バッファー中に回収されたＣＨＯ−Ｋ１又はＣＨＯ−ＴＥＭ１細胞（１．５ｘ１０５細胞／ウエル）は洗浄され、Ｍｇ２＋／Ｃａ２＋を含むＰＢＳに懸濁され、ＥＣＭ細胞接着アレイキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に４重に加えられるか、又はＦＮ、ＬＮ、Ｇｅｌ、ＣｏｌＩが個々にコートされたプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に蒔いて培養され、１時間接着させられた。インキュベーションに引き続いて、各々のウエルはＰＢＳで５回洗浄され、生存性がＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ(R)を用いて測定された。表示されるように、細胞はアッセイのスタート前１時間抗体とプレインキュベートされた。図９Ａに示されるように、接着したＣＨＯ−ＴＥＭ１細胞の数は、ＦＮでコートしたウエル中で、親株のＣＨＯ−Ｋ１細胞の数より６倍高かった。ラミニン又はビトロネクチンでコートした表面上でのＣＨＯ−Ｋ１とＣＨＯ−ＴＥＭ１の間では、接着の有意な差は観察されなかった。一方、コラーゲンとテネイシンに対する接着は、任意の価値ある差を評価するには弱すぎた（図９Ａ）。Ｍ４抗体でＣＨＯ−ＴＥＭ１細胞を前処理することで、ＴＥＭ１−ＦＮ依存性細胞接着が５０％減少し、一方ＩｇＧコントロール抗体は影響がなかった(図９Ｂ)。Ｍ４抗体処理は親株のＣＨＯ−Ｋ１細胞のＦＮ依存性、エンドシアリン非依存性の細胞接着（ベースラインの接着）に影響を与えなかった。
【０１４５】
プレートは等モル量のＦＮ全長、ＦＮタンパク質分解断片、及びＭＡＴＲＩＧＥＬでプレコートされた。ＣＨＯ−ＴＥＭ１細胞は親株のＣＨＯ−Ｋ１細胞に比べてＦＮ、７０ｋＤａ及び３０ｋＤａ断片に対して３から５倍増加の接着を示すが、一方４５ｋＤａ又はＦｎ２断片に対しては有意な接着が見られなかった。ＣＨＯ−ＴＥＭ１細胞は、ＣＨＯ−Ｋ１に比べて５倍よくＭＡＴＲＩＧＥＬに結合した（図９Ｃ）。これらの結果は、エンドシアリンが細胞外マトリックスへの細胞の結合を向上させ、及びＦＮのアミノ末端がこれらの相互作用に関与することを示す。
【実施例１１】
【０１４６】
エンドシアリンはコラーゲンＩに結合しＭ４はこの結合を阻害する。
コラーゲンＩでプレコートされた９６穴プレートがＦｃ−ＴＥＭ−１結合をブロックするＭ４の能力を評価するために使用された。示された濃度（μｇ／ｍＬ）でのタンパク質の添加の前２時間の間、プレートはアッセイバッファー（ＰＢＳ中に０．５％ＢＳＡ、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０）でブロックされた。Ｆｃ−ＴＥＭ−１は、４℃で１時間Ｍ４抗体又はヒトアイソタイプ抗体（ヒトＩｇＧ)とともにプレインキュベートされた。タンパク質／抗体複合体はそれからＣｏｌＩでコートされたプレートに添加され室温で１時間接着させられた。そして、プレートは洗浄され、ＨＲＰで標識されたヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）が１時間加えられた。カラー現像は、ＳｕｒｅＢｌｕｅＴＭＴＭＢペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を使って評価された。図１０に示されるように、エンドシアリンの過剰発現はＣｏｌＩへの細胞結合を増加させ、非特異的ＩｇＧの様なコントロールと対照的にＭ４の様なエンドシアリンの阻害剤によってブロックされ得る。ＲｂｔＴＥＭ１は、また、ＣｏｌＩへのＦｃ−ＴＥＭ１結合を抑制する（データは示されない）。
【実施例１２】
【０１４７】
エンドシアリンはコラーゲンへの細胞接着を増加させる。
ＣＨＯ−Ｋ１又はＣＨＯ−ＴＥＭ１細胞（１．５ｘ１０５細胞／ウエル）は洗浄され、Ｍｇ２＋／Ｃａ２＋を含むＰＢＳ中に懸濁され、コラーゲンＩでコートされた９６穴プレートに４重に加えられ、示された時間の間接着させられた。該細胞が接着させられたのち、プレートはＰＢＳで５回洗浄され、生存性がＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ(R)を使って測定された。図１１で示されるように、エンドシアリンの過剰発現がＣｏｌＩへの細胞結合を増加させる。
【実施例１３】
【０１４８】
細胞遊走アッセイ。
ＢＤバイオコート癌浸潤システムＴＭ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びヒトフィブロネクチン細胞培養インサート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）がＴＥＭ１を介する細胞遊走を評価するために使用された。細胞は非酵素的細胞解離バッファーで回収され、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充された成長培地中で４Ｅ５細胞／ｍｌの濃度に希釈され、そして、５００μｌの細胞懸濁液が膜の挿入された上部のチャンバーに加えられた。濃度勾配を作るために、２０％ＦＢＳを含む成長培地が下部のチャンバーに加えられた。細胞は４８時間インキュベートされ、その後、インサートが除去され、コートされた膜を通して遊走した細胞がＣＥＬＬＴＩＴＥＲ−ＧＬＯ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使って計測された。細胞は、図１２での記載に示されるように抗体で前処理されて、遊走は、抗体の継続的な存在下で評価された。ＭＡＴＲＩＧＥＬ上での管の形成を調べるために、細胞（８Ｅ４細胞／ウエル）はＭＡＴＲＩＧＥＬ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）でコートした９６穴プレートに加えられ、オーバーナイトインキュベートされ、２００−４００ｘの拡大率で写真撮影された。
【０１４９】
図１２Ａで示されるように、ＣＨＯ−Ｋ１細胞は中程度の細胞遊走を示したが、一方、ＣＨＯ−ＴＥＭ１細胞は１０倍以上の亢進した遊走を示した。コントロールのＩｇＧではなく、Ｍ４抗体処理がＣＨＯ−ＴＥＭ１細胞の遊走を消失させた。似たような結果が、ＦＮでコートしたトランスウエルチャンバーを使った遊走実験で観察された(図１２Ｂ）。
【実施例１４】
【０１５０】
エンドシアリンはＭＭＰ−９の活性を増加させる。
エンドシアリン、ＭＭＰ−２及びＣＯＬＩＶは、初期の血管新生工程の指の様な突起に特徴づけられる組織領域に共局在することが示されてきた（Ｖｉｒｇｉｎｔｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，１０：３５−４５）ＭＭＰ活性を評価するために、細胞は６穴プレートに蒔かれ４８時間血清を欠乏させた。細胞培養上清が回収され、任意の細片を除去するために４℃で遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１５分）により濾過された。等量のタンパク質が、製造元のプロトコルに従って、非還元条件でゼラチン及びカゼインザイモグラフィー（インビトロジェン）に供された。ポジティブコントロールのヒトＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）は、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の移動を示すのに使用され、ＣＨＯＫ１及びＣＨＯ−ＴＥＭ−１上清の参照として使用された。図１３に示されるように、ＭＭＰ−９の活性が、親株であるＣＨＯ−Ｋ１細胞と比べてＣＨＯ−ＴＥＭ１細胞で有意に上昇していた。向上したＭＭＰ−９活性は、ＭＭＰ特異的ＥＬＩＳＡにより測定されるように、ＣＨＯ−ＴＥＭ１細胞の培養上清中の増加したＭＭＰ−９タンパク質の分泌と相関した（データは示されない）。これらのデータは、誘導されたＭＭＰ−９の分泌が、本明細書中で示されたＭＡＴＲＩＧＥＬ及びＦＮ−コートトランスウエルを介したＣＨＯ−ＴＥＭ１細胞の向上した細胞遊走能力に寄与することを示す。
【実施例１５】
【０１５１】
エンドシアリンはβインテグリンの活性を増加する。
インテグリン（例えば、α４β１、α５β１）は、ＦＮ依存的な細胞接着を媒介するよく特徴づけられた受容体である（Ｗｉｅｒｚｂｉｃｋａ−Ｐａｔｙｎｏｗｓｋｉ＆Ｓｃｈｗａｒｚｂａｕｅｒ  ２００３、Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ＆Ｍｏｓｈｅｒ  １９９８）。さらに、同定されていない細胞受容体が、ＦＮのＮ末端７０ｋＤａ領域に結合すること（ＭｃＫｅｏｗｎ−Ｌｏｎｇｏ＆Ｍｏｓｈｅｒ（１９８３）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，９７：４６６−４７２）及びＦＮ−インテグリン及びＦＮ−ＦＮ相互作用が関与する可溶性ＦＮの隠れたインテグリン結合サイト（ＲＧＤモチーフ）を露出させることが必要なこと（Ｔｏｍａｓｉｎｉ−Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌ．，２５：２８２−２９３，ＭｃＫｅｏｗｎ−Ｌｏｎｇｏ＆Ｍｏｓｈｅｒ（１９８５）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１００：３６４−３７４）が機能的に記載されてきた。本明細書中でエンドシアリンは、Ｎ末端７０ｋＤａＦＮ領域と相互作用し、ＦＮ依存的な細胞接着を向上する新規受容体として同定された。これらのインビトロの細胞システム中で測定された亢進したＦＮ結合は、エンドシアリンとインテグリンとの連続的な相互作用の結果であり得るだろう。
【０１５２】
ヒト胎児腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞は、エンドシアリンとモックのｃＤＮＡを発現するベクターでトランスフェクトされた。細胞は、細胞表面エンドシアリン（２９３ＴＥＭ１）を発現することが確認された。一方、モックをトランスフェクトされた細胞は発現していなかった。細胞は、Ｍ４抗体の存在下でインテグリンの発現と活性がアップレギュレートする能力があるかをテストされた。図１４Ｂはエンドシアリンの過剰発現がコントロール細胞と比較してインテグリンβ１の活性を増加することを示している。図１４Ａは細胞表面のインテグリンβ１の発現が変化のないことを示している。エンドシアリン阻害剤Ｍ４で処理した細胞は、細胞表面のレベルには全く影響がないが、インテグリンの活性が抑えられる(図１４Ｂ)。任意の一つの理論に拘束されることを望むわけではないが、エンドシアリンと可溶性ＦＮのＮ末端７０ｋＤａ断片との相互作用は、ＦＮがインテグリンに結合する多量体高親和性形態への組み立てを開始するのに関与するかもしれない。
【実施例１６】
【０１５３】
Ｍ４．１はマウスＴＥＭ−１でなく非還元型ヒトＴＥＭ−１を認識する。
ＣＨＯ−ＴＥＭ１細胞、マウス２Ｈ１１細胞、親株であるＣＨＯ−Ｋ１細胞、マウスＮＳ０細胞及びマウスＭＳ１細胞は、完全ＲＰＭＩ１６４０（ＲＰＭＩ１６４０、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、Ｌ−グルタミン、及びＦＢＳ、インビトロジェン  Ｃｏｒｐ．）中で培養された。ヒトプライマリー周皮細胞は、周皮細胞培地（５００ｍｌの基本培地（Ｃａｔ＃１２０１）、１０ｍｌ（２％）のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｃａｔ番号００２５）、５ｍｌの周皮細胞成長サプリメント（ＰＧＳ、Ｃａｔ番号１２５２）及び５ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Ｐ／Ｓ、Ｃａｔ番号０５０３）、インビトロジェン  Ｃｏｒｐ．）で培養された。細胞は、加湿されたインキュベーター中で３７℃、５％ＣＯ２で培養された。細胞は、ＴｒｙｐＬＥＴＭＳｅｌｅｃｔ（インビトロジェン  Ｃｏｒｐ．、カタログ番号１２５６３−０１１）ではがされ、洗浄され、数を数えられた。細胞は、プロテアーゼ阻害剤を含むＲＩＰＡ溶解バッファー中２ｘ１０７細胞で溶解され、１０分間氷上でインキュベートされた。不可溶の物質は１０，０００Ｇ、４℃１０分間でペレットされ、上清は新しいチューブにトランスファーされた。一定分量は、等量の２ｘタンパク質ローディングバッファーに１０％２−メルカプトエタノール（還元剤）を入れて又は入れずに混ぜられた。１５μｌ（１．５ｘ１０５細胞）のライセートが１５ウエル４−１２％Ｂｉｓ／ＴｒｉｓＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードされ、３０分間２００ＶでＭＥＳランニングバッファー中電気泳動された。ゲルはＰＶＤＦに電気ブロットされ、５％ミルク−ＴＢＳＴ（５％  Ｍ−ＴＢＳＴ）中でロックされながら室温１時間ブロックされた。Ｍ４．１ブロットは、５％Ｍ−ＴＢＳＴ中３．３μｇ／ｍＬの濃度、４℃オーバーナイトでＭ４．１によりプローブされた。
【０１５４】
ウサギ抗ｔｅｍ−１ポリクローナル抗体ブロットは、５％Ｍ−ＴＢＳＴ中、４℃オーバーナイトで抗体の１：３００希釈（４．５ｍｇ／ｍｌ、ストックロット番号ＮＢ４８７−７６）によりプローブされた。Ｍ４抗体の様にＭ４．1抗体は、ヒトエンドシアリンに対するヒト化抗体である。膜は室温中、３０ｍＬのＴＢＳＴで５回５分の間洗浄された。ＨＲＰ抱合したヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋L）（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ、１ｍｇ／ｍＬストック）は、二次抗体として５％Ｍ−ＴＢＳＴ中に１：２０，０００希釈し、室温で３０分間Ｍ４．1ブロットをプローブされた。ＨＲＰ抱合したヤギ抗ウサギ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体は室温で３０分間ポリクローナル抗ＴＥＭ−１ブロットをブロットするのに使用された。膜は室温中、３０ｍＬのＴＢＳＴで５回５分の間洗浄された。シグナルは、マニュアル通りフェムトウエスタンブロット検出システム（Ｐｉｅｒｃｅ）を使って化学発光により検出された。
【０１５５】
図１５に図示するように、Ｍ４．１はＣＨＯ−ＴＥＭ−１細胞及びヒトプライマリー周皮細胞の非還元型ヒトＴＥＭ−１を認識し、マウス２Ｈ１１細胞のマウスＴＥＭ−１（配列ＩＤ番号２）を認識しない(図１５)。ヒトＴＥＭ−１に対するウサギポリクローナル（ｒａｂＰＡｂＴＥＭ−１）は、ＣＨＯ−ＴＥＭ−１細胞とヒト周皮細胞中のヒトＴＥＭ−１を認識し、また、マウス２Ｈ１１細胞中のマウスＴＥＭ−１も認識する。Ｍ４．１又はｒａｂＰＡｂ  ＴＥＭ−１のどちらも、親株であるＣＨＯ−Ｋ１細胞又はマウスＮＳ０及びＭＳ１細胞のライセートと、これらの細胞でＴＥＭ−１発現が欠如しているため反応しない。ｒａｂＰＡｂ  ＴＥＭ−１だけが、非還元のＴＥＭ−１と比べてより少ない程度に減少して還元したヒトＴＥＭ−１と反応する。
【０１５６】
本発明は上記に記載及び例示される実施形態に限定されることはなく、付加された請求項の範囲で変更及び修正されるものを含み得る。
【図面の簡単な説明】
【０１５７】
図１Ａ及び１Ｂは、悪性組織でのエンドシアリン陽性細胞の免疫組織化学的解析を示す。腫瘍は直腸結腸癌の患者から単離され、液体窒素で急速冷凍された。サンプルは薄くセクションされ抗エンドシアリン又はアイソタイプコントロール抗体で染色された。示されるように、腫瘍の血管が(図１Ａ)エンドシアリンで陽性に染色され、一方連続切片を染色したアイソタイプコントロール抗体は陰性であった（図１Ｂ）。
【０１５８】
図２Ａ及び２Ｂは正常組織のエンドシアリン陽性細胞の免疫組織化学的解析を示す。正常組織がバイオプシーにより患者から単離され、液体窒素中で急速冷凍された。サンプルは薄くセクションされ抗エンドシアリン又はアイソタイプコントロール抗体で染色された。示されるように、正常組織は少ない数のＥＰＣｓ（矢印、図２Ａ）を含み、一方連続切片を染色したアイソタイプコントロール抗体は陰性であった(図２Ｂ)。テストされた多くの正常組織は、インサイツ又は抗体染色で測定されて少ない数のＥＰＣsを有していた。
【０１５９】
図３はプライマリー血管内皮細胞の培養細胞からエンドシアリン陽性細胞の単離を示す。ＨＭＶＥＣ細胞培養はパンニングによりＥＰＣｓを濃縮された。エンドシアリンでパンニングされた細胞培養はＨＭＶＥＣの親株培養とエンドシアリン発現細胞の割合を比較された。示されるように、抗エンドシアリン抗体により免疫染色され蛍光を抱合した二次抗体で引き続くことで測定されることで、パンニングされていない親株の培養に比べて、パンニングされた培養はエンドシアリン陽性細胞をよりずっと高い数有していた。それぞれのフィールドの細胞数は光学顕微鏡で測定された。
【０１６０】
図４は組換えエンドシアリン（Ｆｃ−ＴＥＭ１）が細胞外マトリックスタンパク質（ＥＭＰｓ）に結合することを示す。ＥＬＩＳＡプレートは、ＥＭＰフィブロネクチン（ＦＮ）、コラーゲン（ＣＯＬ、コラーゲンＩ型（ＣＯＬＩ）及びコラーゲンＩＶ型（ＣＯＬＩＶ）を含む）、ビトロネクチン、ラミニン、又はゼラチン（Ｇｅｌ）でプレコートされ、増加する濃度で精製Ｆｃ−ＴＥＭ１タンパク質を加える前にＥＬＩＳＡアッセイバッファーでブロックされた。２時間インキュベーションすることに引き続いて、プレートは洗浄され、標準的なＥＬＩＳＡ条件を用いて、Ｆｃテイルに特異的なＨＲＰ結合したヤギ抗マウス二次抗体を使って結合をアッセイされた。プレートは洗浄され、現像され、そして、ＯＤ４５０ｎｍでプレートリーダーを使って定量された。図４Ａに示されるように、Ｆｃ−ＴＥＭ１はＦＮ及びＣＯＬに強く結合し、一方ＬＭ、ＶＮ、又はＧｅｌとは弱い結合が観察された。図４Ｂでは、ＥＬＩＳＡプレートは、オーバーナイトで以下の抗原でプレコートされた。ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＴＥＢ）、オボアルブミン（ＯＶＡ）、ウシガンマグロブリン（ＢＧＧ）、ほとんど全てのメラノーマ細胞に発現される癌関連９０ｋＤ糖タンパク質抗原（ＴＡ９０）、鶏卵リゾチーム（ＨＥＬ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、１％ＢＳＡ、ヒトメソテリン、ヒトＧＭ−ＣＳＦ、ヤギＩｇＧ、及びマウスＩｇＧ。Ｆｃ−ＴＥＭ１は増加する量（５、１０、５０μｇ／ｍｌ）で加えられ２時間接着させられた。プレートはそれから洗浄され、ＨＲＰ抱合したヤギ抗マウス抗体が、結合したＦｃ−ＴＥＭ１を検出するために加えられた。
【０１６１】
図５はエンドシアリンに対するフィブロネクチン（ＦＮ）結合ドメインのマッピングを示す。フィブロネクチン（ＦＮ）に由来する、タンパク質分解及び組換え断片がＴＥＭ−１結合を支持する能力を評価された。評価されたＦＮ断片は以下のものを含む。Ｎ末端７０ｋＤａ断片（Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔ．番号Ｆ０２８７）（フィブロネクチンのカセプシンＤ消化により得られた）、３０ｋＤａへパリン結合断片（Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔ．番号Ｆ９９１１）、４５ｋＤａゼラチン結合断片（Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔ．番号Ｆ０１６２）（両者は７０ｋＤａ断片のトリプシン消化により得られた）、細胞接着ドメインを含む１２０ｋＤａ断片（「１２０ｋＤａ断片」）、及び２つの組換え断片、最初の７つのＦＮIII型ドメインを含むＦｎ２、及び鎖間のジスルフィド結合の部位とα４β１インテグリンの結合ドメインを含むＦｎ４。ＦＮ構造の図説は、Ｗｉｅｒｚｂｉｃｋａ−Ｐａｔｙｎｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．，１１６：３２６９−７６から引用した。
【０１６２】
図６は、阻害剤の存在下でのＦｃ−ＴＥＭ１のＥＭＰ及びフィブロネクチンへの結合を示す。Ｍ４はヒトエンドシアリンに対するヒト化抗体であり、ｒｂｔＴＥＭ１はヒトエンドシアリンに対するウサギ抗体である。アッセイは、抗体がＦｃ−ＴＥＭ１がＦＮに結合するのを邪魔し又はブロックする能力を測定するために加えられるのを除いては、図４に記載されるように行われた。この図に示されるように、Ｍ４はＦｃ−ＴＥＭ１がＦＮに結合するのを阻害することができる、一方非特異的コントロール（ＨｕＩｇＧ）は阻害しなかった。
【０１６３】
図７はＥＭＰ断片へのエンドシアリンの結合及びエンドシアリン−ＥＭＰ阻害化合物によるその結合の阻害を示す。フィブロネクチン断片は図５に図説された。図７ＡはネイティブＦＮに由来するタンパク質断片への結合を示す。図７Ｂは変性されたＦＮに由来するタンパク質断片への結合を示す。図７Ａ及び７Ｂでは、ＦＮ断片が示された濃度でＥＬＩＳＡプレートにコートされた。抗ＦＮポリクローナル抗体が、それ引き続きＨＲＰ抱合したヤギ抗ウサギ二次抗体を添加して、完全な結合タンパク質を検出するのに使用された。Ｆｃ−ＴＥＭ１（１．２５μｇ／ｍｌ）が加えられ、２時間結合させられた。プレートはそれから洗浄され、ＨＲＰ抱合ヤギ抗マウス抗体が結合したＦｃ−ＴＥＭ１を検出するために加えられた。図７Ｂ中の斜線のバー（Ｆｃ−ＴＥＭ１ネイティブ）は、変性していないＦＮに対するＦｃ−ＴＥＭ１の結合を表している。示されるように、エンドシアリンはフィブロネクチンのＮ末端領域に結合し、ＦＮ−２、ＦＮ−４、又は１２０ｋＤａ断片には少し又は全く結合が検出されなかった。フィブロネクチンに対するポリクローナル抗体は全ての断片に結合した。図７Ｃ及び７ＤはＦＮの７０ｋＤａ断片に対してのＦｃ−ＴＥＭ１の結合を示し、及びエンドシアリン―ＥＭＰ阻害化合物による該相互作用の阻害を示す。ＦＮ全長と７０ｋＤａＦＮタンパク質は、両者ともに約１５ｎｍｏｌ／ウエルの固定した濃度でＥＬＩＳＡプレート上にコートされた。Ｆｃ−ＴＥＭ１（１．２５μｇ／ｍｌ）は、抗エンドシアリン抗体Ｍ４又はアイソタイプコントロールＩｇＧの増加する量と共に１時間４℃でプレインキュベートされた。Ｆｃ−ＴＥＭ１／Ｍ４（図７Ｃ）又はＦｃ−ＴＥＭ１／ＩｇＧ（図７Ｄ）複合体は、ＦＮ−及び７０ｋＤａでコートされたウエルに加えられ、室温で２時間インキュベートされた。結合したＦｃ−ＴＥＭ１タンパク質は、ＨＲＰ抱合したヤギ抗マウス二次抗体を加えることで検出された。
【０１６４】
図８はＭＡＴＲＩＧＥＬ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の商品名で販売されているゼラチン様タンパク質混合物上での、エンドシアリン発現による細胞形態の変化を図示している。ＣＨＯ−Ｋ１又はＣＨＯ−ＴＥＭ１のいずれかの８Ｅ４細胞は、ＭＡＴＲＩＧＥＬでコートされた９６穴プレートに蒔かれ、３７℃でインキュベートされた。オーバーナイトインキュベートした後、細胞は管形成を巨視的に観察するために写真を撮られた。
【０１６５】
図９はＥＭＰ断片へのエンドシアリンが媒介する細胞結合を示す。ＣＨＯ細胞は、エンドシアリン又はモックｃＤＮＡを発現するベクターでトランスフェクトされた。細胞は細胞表面上のエンドシアリン（ＣＨＯＴＥＭ１）を発現するのが確認された。一方、モック（ＣＨＯＫ１）をトランスフェクトされた細胞は発現していなかった。図９Ａでは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、様々なＥＣＭタンパク質を含むプレコートされた９６穴プレートに加えられた。細胞は３７℃、１時間接着させられ、ウエルは緩く結合した細胞を除去するため、何度も洗浄された。接着した細胞の数はＣＥＬＬＴＩＴＥＲ−ＧＬＯ発光細胞生存性アッセイを使用して測定された。省略として：Ｃｏｌ、コラーゲン；ＦＮ、フィブロネクチン；ＬＮ、ラミニン；ＴＮ、テネイシン；ＶＮ、ビトロネクチン；Ｎｅｇ、ウシ血清アルブミン。図９Ｂでは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、エンドシアリン又はモックｃＤＮＡを発現するベクターでトランスフェクトされた。細胞は細胞表面上のエンドシアリン（ＣＨＯＴＥＭ１）を発現するのがＦＡＣＳ解析で確認された。一方、モック（ＣＨＯＫ１）をトランスフェクトされた細胞は発現していなかった。細胞は、単独で、又はエンドシアリン抗体Ｍ４又はコントロールＩｇＧと組み合わせて、ＥＭＰフィブロネクチンに結合する能力をテストされた。図９Ｂは抗エンドシアリン抗体Ｍ４が、ＦＮへのエンドシアリンを介する細胞接着を減少させることを示している。細胞（１．５Ｅ５）は、４℃で１時間、Ｍ４抗体（１００μｇ／ｍｌ）又はＩｇＧアイソタイプコントロール抗体（１００μｇ／ｍｌ）とともにプレインキュベートされた。図９Ｃでは、細胞は、ＦＮ全長又はフィブロネクチン断片と結合する能力をテストされた。図９Ａに示されるように、ＦＮでコートされたウエル中で接着したＣＨＯ−ＴＥＭ１細胞の数は、親株であるＣＨＯ−Ｋ１細胞の数より６倍高かった。ラミニン又はビトロネクチンでコートされた表面上では、ＣＨＯ−Ｋ１とＣＨＯ−ＴＥＭ１との間で接着に有意な差は観察されなかった。一方、コラーゲンとテネイシンへの接着は任意の価値ある差異を評価するのには弱すぎた(図９Ａ)。Ｍ４抗体でＣＨＯ−ＴＥＭ１細胞を前処理することは、ＴＥＭ１−ＦＮ依存性細胞接着を５０％減少させたが、ＩｇＧコントロール抗体は全く影響がなかった(図９Ｂ)。Ｍ４抗体は親株であるＣＨＯ−Ｋ１細胞のＦＮ依存性、エンドシアリン非依存性細胞接着（ベースライン接着）に影響を与えなかった。ＣＨＯ−ＴＥＭ１細胞は、親株であるＣＨＯ−Ｋ１細胞に比べて、ＦＮ、７０ｋＤａ及び３０ｋＤａ断片に対して３−５倍接着が増加することを示していたが、４５ｋＤａ又はＦｎ２断片に対しては、有意な接着は見られなかった。ＣＨＯ−ＴＥＭ１はＣＨＯ−Ｋ１より５倍よくＭＡＴＲＩＧＥＬに結合した(図９Ｃ)。
【０１６６】
図１０はエンドシアリン−ＥＭＰコラーゲン阻害化合物の同定を示す。ＣＨＯ細胞はエンドシアリン又はモックｃＤＮＡを発現するベクターでトランスフェクトされた。細胞は細胞表面上のエンドシアリン（ＣＨＯＴＥＭ１）を発現するのが確認された。一方、モック（ＣＨＯＫ１）をトランスフェクトされた細胞は発現していなかった。細胞は、単独で、又はエンドシアリン抗体Ｍ４又はコントロールＩｇＧと組み合わせて、ＥＭＰコラーゲンＩ型（ＣＯＬＩ）に結合する能力をテストされた。示されるように、エンドシアリンの過剰発現はＣＯＬＩへ細胞結合が増加した。それは、コントロール分子（ＩｇＧ）と比較して、Ｍ４の様なエンドシアリンの阻害剤でブロックされ得る。ＲｂｔＴＥＭ１はまたＣＯＬＩへのＦｃ−ＴＥＭ１結合を抑制した（データは示されない）。
【０１６７】
図１１はＥＭＰコラーゲンへのエンドシアリンを介した細胞結合を示す。ＣＨＯ細胞はエンドシアリン又はモックｃＤＮＡを発現するベクターでトランスフェクトされた。細胞は細胞表面上のエンドシアリン（ＣＨＯＴＥＭ１）を発現するのが確認された。一方、モック（ＣＨＯＫ１）をトランスフェクトされた細胞は発現していなかった。細胞は、それからＥＭＰコラーゲンＩ型へ結合する能力をテストされた。示されるように、エンドシアリンの過剰発現によりＣＯＬＩへの細胞結合が増加した。
【０１６８】
図１２はエンドシアリンによる細胞遊走の媒介及び抗エンドシアリン抗体Ｍ４によるその阻害を示す。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（図１２Ａ）、又はＦＮ(図１２Ｂ)でコートした膜を通してのＣＨＯ−ＴＥＭ１及びＣＨＯ−Ｋ１細胞の遊走をＭ４が阻害する能力を測定した。細胞は上部チャンバーに加えられ、３７℃で４８時間遊走させられた。該膜が除去され、遊走した細胞の数が、ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ−ＧＬＯ発光細胞生存性アッセイを使用して測定された。表示されるように、細胞は、実験の期間中Ｍ４又はＩｇＧアイソタイプコントロールで処置された。図１２Ａに示されるように、ＣＨＯ−Ｋ１細胞は、中程度の細胞遊走を示したが、一方ＣＨＯ−ＴＥＭ１細胞は＞１０倍の亢進した遊走を示した。コントロールＩｇＧでなくＭ４抗体処理がＣＨＯ−ＴＥＭ１細胞遊走を消失させた。似たような結果が、ＦＮでコートしたトランスウエルチャンバーを使った遊走実験で観察された(図１２Ｂ)。
【０１６９】
図１３は細胞パスウェイのエンドシアリンによる増強を示す。ＣＨＯ細胞はエンドシアリン又はモックｃＤＮＡを発現するベクターでトランスフェクトされた。細胞は細胞表面上のエンドシアリン（ＣＨＯＴＥＭ１）を発現するのが確認された。一方、モック（ＣＨＯＫ１）をトランスフェクトされた細胞は発現していなかった。細胞は、細胞パスウェイをアップレギュレートする能力をテストされた。一つのそのようなパスウェイはＭＭＰ９パスウェイで、細胞遊走に役割を担っている。示されるように、エンドシアリンの過剰発現は、コントロールの細胞と対照的に、ＭＭＰ−９活性が増加している。
【０１７０】
図１４は、βインテグリンの活性化上のエンドシアリンの阻害の効果について示している。ヒト胎児腎臓２９３(ＨＥＫ２９３)細胞は、エンドシアリン又はモックｃＤＮＡを発現するベクターでトランスフェクトされた。細胞は細胞表面上のエンドシアリン（２９３ＴＥＭ１）を発現するのが確認された。一方、モック（２９３Ｔ）をトランスフェクトされた細胞は発現していなかった。細胞は、細胞パスウェイをアップレギュレートする能力をテストされた。一つのそのようなパスウェイはインテグリンパスウェイで、細胞遊走に役割を担っている。示されるように、エンドシアリンの過剰発現は、コントロールの細胞と対照的に、インテグリンβ１活性が増加している(図１４Ｂ)。一方、細胞表面β１発現への直接の影響は変化がなかった（図１４Ａ）。エンドシアリン阻害剤Ｍ４での細胞の処理は、細胞表面レベルへの影響は見られないが、インテグリン活性の抑制を生じた(図１４Ｂ)。これらのデータは、エンドシアリン発現細胞中でインテグリンの機能を抑制するためにエンドシアリンの阻害剤を使用する能力を示している。
【０１７１】
図１５は、抗体Ｍ４．1がＣＨＯ−ＴＥＭ１細胞及びヒトプライマリー周皮細胞中で非還元型のヒトＴＥＭ−１を認識するが、マウス２Ｈ１１細胞中のマウスＴＥＭ−１を認識しないことを図説している。ヒトＴＥＭ−１に対するウサギポリクローナル（ｒａｂＰＡｂ  ＴＥＭ−１）は、ＣＨＯ−ＴＥＭ１細胞及びヒト周皮細胞中でヒトＴＥＭ−１を認識するが、マウス２Ｈ１１細胞中のマウスＴＥＭ−１をも認識する。Ｍ４．１又はｒａｂＰＡｂ  ＴＥＭ−１は、ＴＥＭ−１発現が欠如しているために、親株であるＣＨＯ−Ｋ１細胞又はマウスＮＳ０及びＭＳ１細胞のライセートに反応を示さない。ｒａｂＰＡｂ  ＴＥＭ−１だけが、非還元のＴＥＭ−１に比べるとより少ない程度に減少して、還元型ヒトＴＥＭ−１と反応する。
【図１Ａ】
2010523592.tif 000003
【図１Ｂ】
2010523592.tif 000004
【図２Ａ】
2010523592.tif 000005
【図２Ｂ】
2010523592.tif 000006
【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2010523592.tif 000009
【図５】
2010523592.tif 000010
【図６】
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【図７Ａ】
2010523592.tif 000012
【図７Ｂ】
2010523592.tif 000013
【図７Ｃ】
2010523592.tif 000014
【図７Ｄ】
2010523592.tif 000015
【図８】
2010523592.tif 000016
【図９Ａ】
2010523592.tif 000017
【図９Ｂ】
2010523592.tif 000018
【図９Ｃ】
2010523592.tif 000019
【図１０】
2010523592.tif 000020
【図１１】
2010523592.tif 000021
【図１２Ａ】
2010523592.tif 000022
【図１２Ｂ】
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【図１３】
2010523592.tif 000024
【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2010523592.tif 000029
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