(57)【要約】  本発明は一般に、蛋白質や核酸を含む目標検体を含有するテストサンプルを分析するためのＳＡＷ共振器マイクロセンサに対する信号増幅方法に関する。本発明は、圧電性基板表面上に配置された反射器マイクロチャネルと複数の３次元インターデジタルトランスデューサ電極（ＩＤＴＥ）とを備えた、少なくとも１つの表面音響波共振器ユニットに関する。本発明は、更に、上記３次元マイクロチャンネル中の固体／液体体積比の変化に関する。液体／固体体積比におけるその変化は、テストサンプル中の目標検体濃度に相関して検出することが可能である。【選択図】図１
2010501067.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面音響波（ＳＡＷ）共振器ユニットであって、
（ａ）圧電性基板と、
（ｂ）少なくとも１つのインターデジタルトランスデューサ電極（ＩＤＴＥ）構造体と、
（ｃ）少なくとも１つの反射器構造体と、
を備え、
前記（ｂ）におけるＩＤＴＥ構造体内には３次元マイクロチャンネルが形成されており、前記（ｃ）における反射器構造体内には３次元マイクロチャンネルが形成されており、更に前記共振器ユニットが表面固定化された分子認識成分を含む、
共振器ユニット。
【請求項２】
前記固定化された分子認識成分は、更に、検体種を含む目標種と第２の分子認識成分とに結合される、請求項１に記載の共振器ユニット。
【請求項３】
前記第２の分子認識成分は酵素結合型抗体である、請求項２に記載の共振器ユニット。
【請求項４】
少なくとも２つの近接したＩＤＴＥは１０ｎｍから１ｍｉｃｒｏｎの間の高さを有し、該近接した電極間のマイクロチャンネルは１００ｎｍから１０ｍｉｃｒｏｎの間の幅を有する、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の共振器ユニット。
【請求項５】
少なくとも２つの近接した反射器は１０ｎｍから１ｍｉｃｒｏｎの間の高さを有し、近接した電極間のマイクロチャンネルは１００ｎｍから１０ｍｉｃｒｏｎの間の幅を有する、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の共振器ユニット。
【請求項６】
少なくとも２つの近接したＩＤＴＥ／反射器ジャンクションは１０ｎｍから１ｍｉｃｒｏｎの間の高さを有し、該近接した構造間のマイクロチャンネルは１００ｎｍから１０ｍｉｃｒｏｎの間の幅を有する、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の共振器ユニット。
【請求項７】
基質は、ジアミノベンジジン（ＤＡＰ）、アミノエチルカルバゾール（ＡＥＣ）、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、ないしは５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸塩（ＢＣＩＰ）／ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、を含む一群より選択される、
請求項１乃至６のいずれか１項に記載の共振器ユニット。
【請求項８】
追加の絶縁被膜を少なくとも１つ有する、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の共振器ユニット。
【請求項９】
検体種は、血液、血清、血漿、排泄物、脊髄中心液、及び尿からなる一群より選択される哺乳類流体サンプルより抽出される、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の共振器ユニット。
【請求項１０】
請求項１乃至９のいずれかに記載の表面音響波（ＳＡＷ）共振器ユニットを少なくとも１つ備えた、マイクロセンサ。
【請求項１１】
請求項１乃至９のいずれかに記載の表面音響波（ＳＡＷ）共振器ユニットのセットを少なくとも１つ備えた、請求項１０に記載のマイクロセンサ。
【請求項１２】
少なくとも１つの、固定化された分子認識成分を含まない参照表面音響波（ＳＡＷ）共振器ユニットを更に備えた、請求項１０又は１１に記載のマイクロセンサ。
【請求項１３】
固定化された分子認識成分を含まない参照表面音響波（ＳＡＷ）共振器ユニットのセットを少なくとも１つ備えた、請求項１２に記載のマイクロセンサ。
【請求項１４】
請求項１０乃至１３のいずれかに記載のマイクロセンサを備えた、目標検体を検出するための、手持ち型デバイス。
【請求項１５】
サンプル中の検体を検出するための方法であって、
（ａ）検体種を、請求項１乃至９のいずれかに記載された表面音響波（ＳＡＷ）共振器ユニットの表面に固定化された、少なくとも１つの第１の認識成分に接触させ、それにより、該検体と該第１の認識成分とを含む複合体を作成する段階と、
（ｂ）前記共振器ユニット上での前記検体の結合における質量増加を測定する段階と、
を含む、方法。
【請求項１６】
サンプル中の検体を検出するための方法であって、
（ａ）検体種を、請求項１乃至９のいずれかに記載された表面音響波（ＳＡＷ）共振器ユニットの表面に固定化された、少なくとも１つの第１の認識成分に接触させ、それにより、該検体と該第１の認識成分とを含む複合体を作成する段階と、
（ｂ）前記複合体を、酵素連結型の第２の認識成分に接触させる段階と、
（ｃ）前記共振器ユニットに対して基質を提供する段階であって、それにより、該基質は、（ｂ）における連結された酵素によって沈殿物へと変換される段階と、
（ｄ）前記沈殿物を、前記共振器ユニット上の堆積物上で測定する段階と、
を含む、方法。
【請求項１７】
前記検体は、トロポニンＩ、トロポニンＴ、ＢＮＰ、Ｈ−ＦＡＢＰ、アレルゲン、及びＩｇＥよりなる一群より選択される、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
サンプル中の目標検体の検出における信号を測定するための、請求項１０乃至１４のいずれかに記載されたマイクロセンサの使用。
【請求項１９】
前記目標検体は、トロポニンＩ、トロポニンＴ、ＢＮＰ、Ｈ−ＦＡＢＰ、アレルゲン、及びＩｇＥよりなる一群より選択される、請求項１４に記載のマイクロセンサの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は一般に、ＳＡＷ共振器ユニットと、そのユニットを備えた、テストサンプルを分析するために有用であるようなマイクロセンサとに関する。
【０００２】
本発明は、更に、圧電性基板表面上に配置された反射器チャネルと複数の３次元インターデジタルトランスデューサ電極（ＩＤＴＥ）とを備えた、表面音響波共振器ユニットに関する。
【０００３】
本発明は、更に、上記３次元マイクロチャンネル中の固体／液体体積比の変化に関する。液体／固体体積比におけるその変化は、テストサンプル中の目標検体濃度に相関して検出することが可能である。そのマイクロセンサは、多くの化学的、環境上、及び医学的用途に適用される。
【背景技術】
【０００４】
背景
例えば生物検体のような検体を高感度で検出することは、分析的検出方法における重要な課題であり続けている。検出方法においては、複数のサンプルを処理することがしばしば要求される。加えて、分析的検出方法は、簡単で、迅速で、そして再現可能であるべきである。このことは、例えば診断方法のような高度に専門的な方法及び試薬を利用することができない場合において、とりわけ重要である。
【０００５】
従来の生物学的分析方法には、具体的に幾つかの欠陥がある。例えば、混成プローブが放射性ラベルを含有するときには、オートラジオグラフィー、又は蛍光物質イメージ分析によって、又は、混成プローブが、例えばビオチンやジゴキシンのようなラベルを含有するときには密度計によって、一般的には核酸分子の混成が検出される。それから、そのラベルを、酵素共役抗体又は配位子によって認識することができる。最新の生体分子検出方法の多くは、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、又は蛋白質等の分子を修飾することを必要とするのであり、このことによって、現在の検出方法は高価で手間のかかるものとなっている。
【０００６】
音響波センサ技術は、検出物質における幅広い応用性を示した。音響波センサは、音響波を発生させ、そして観測することにより、物質を検出する。音響波が物質の表面を通って伝播するとき、又は物質表面上を伝播する時には、伝播経路の特性に対する如何なる変化も、波の速度、及び／又は振幅に影響する。センサにおける、振幅、周波数、及び／又は位相特性を測定し、対応する物理量に相関付けることが可能である。
【０００７】
幾つかの、異なったタイプの音響波デバイスが開発されているが、しかしながらその全ては、水溶性サンプル又は生体サンプルの測定において、わずかな成功しか収めていない。バルク音響波（ＢＡＷ）は、媒体を通じて伝播する。最も一般に使われているＢＡＷデバイスは、厚みすべりモード（ＴＳＭ）共振器である。最も一般的なタイプは、石英結晶マイクロバランス、及び、せん断水平音響プレートモード（ＳＨ−ＡＰＭ）センサである。反対に、基板の表面上を伝播する波は、表面波として知られている。最も広く用いられている表面波デバイスは、表面音響波センサ、及びせん断水平表面音響波（ＳＨ−ＳＡＷ）センサであって、それは表面横断波（ＳＴＷ）センサとしても知られている。全ての音響波センサは、気体、又は真空の環境において機能するであろう。しかしながら、それらのうちで、液体と接触している場合において効率よく動作するものは殆どない。
【０００８】
液体検出のための、公知の音響センサにおいて、せん断水平ＳＡＷの特殊な型であるラブ波のセンサは、最も高い感度を有する。ラブ波センサを作成するため、ＳＨ−ＳＡＷデバイス上には、せん断水平波のエネルギーがその被膜に集中するような、誘電性導波被膜が取り付けられる。その後、その導波被膜上には生体認識被膜が取り付けられ、完全な生体センサを形成する。ポリマーラブ導波被膜を用い、１１０ＭＨｚ  ＹＺ−ｃｕｔ  ＳＨ−ＳＡＷを使っての、ｎｇ／ｍｌの濃度範囲における抗ヤギＩｇＧの検出が成功している（非特許文献１）。
【０００９】
異なったＳＡＷセンサの間での比較については、最近説明がなされている（非特許文献２）。ＧｉｚｅｌｉとＬｏｗｅとは、１．９２ｍｇ／ｃｍ2の感度を有する１２４ＭＨｚ  ラブ波センサを説明している。生体化合物の検出にＳＡＷセンサを用いることは、例えば、特許文献１，２，及び３において報告されている。その各々は、参照により、その全てがここへと組み入れられている。
【００１０】
伝播波の垂直成分が液体−空気障壁によって抑制されるので、従来のＳＡＷデバイスを液体検出のために選択することは芳しいものではない。液体中で機能するような音響波センサの１つとしては、せん断水平ＳＡＷセンサがある。圧電性結晶物質の切断部（カット）を適切に回転させれば、波は水平に、そして液体表面に平行に、伝播する。これにより損失は飛躍的に減少するのであり、液体が伝播媒体と接触するようになったときに、ＳＨ−ＳＡＷセンサが生体センサとして動作することが可能となる。例えば生体分子のような、溶液検体の検出における多くの取り組みは、音響波と固体／液体界面の性質との間の相互作用を定めることや、ＧＨｚ範囲で動作するような高周波数ＳＡＷデバイスを設計することに集中していた。
【００１１】
本発明は、ＳＡＷデバイスが液体中で生体分子を含むような検体を測定できないことについての解決手段を与える。
【００１２】
免疫測定においてＳＡＷデバイスを用いることは、過去に説明されている。これらのデバイスは、２つの電極間に挟まれた単一の結晶ウエハで構成される。電極には、石英結晶をその共振周波数でドライブする外部の発振器回路へと、これらデバイスを接続するための手段が備えられている。この周波数は、結晶の質量や、その結晶の電極領域に閉じ込められた、あらゆる層の質量に依存する。すなわち、電極表面上、又はそれら電極上のあらゆる層中の質量の変化によって、周波数が変わる。一般には、これらデバイスにおける、その共振周波数の変化を、質量変化の総計と相関付けることが可能である。
【００１３】
１９８０年１２月２日にＲｉｃｅに対して交付された、米国特許第４，２３５，９８３号（特許文献４）においては、抗体の特定サブクラスを決定するための方法が開示されている。その方法は、決定されるべき抗体に対する抗原に固有な２次元表面に結合された、圧電発振器を利用する。抗原被膜された発振器は、未知量の抗体を含有する溶液に曝される。溶液中の抗体が発振器上の抗原に加えられた後、発振器は、いわゆるサンドイッチ物質に曝され、それは決定されている抗体の固有サブクラスと選択的に結合する。発振器の周波数は、サンドイッチ物質に曝される前後の乾燥した状態において測定される。周波数の変化は、２次元発振器表面に結合された抗体サブクラスの量に関連する。標準曲線を参照することにより、溶液中の抗体サブクラスの量を決定することができる。
【００１４】
Ｒｏｅｄｅｒｅｒ等は、圧電性石英結晶を用いた、その場での免疫測定、特に表面音響波デバイスを開示している。ヤギ抗ヒトＩｇＧは、２次元石英結晶表面上で、カップリング媒体を用いて固定化されていた。圧電性結晶は、それから電気発振器回路内に置かれ、抗原ヒトＩｇＧの検出のためにテストされた。検出は、吸着による表面質量の変化が結晶の共振周波数のシフトとして反映されるという事実に基づくものであった。その方法は感度に乏しく、そして検出限界も芳しいものではないと、その著者らは結論付けている。その著者らはまた、検出されるべき抗原は高分子量のものでなくてはならず、この方法論によって低分子量検体を直接検出することは不可能であるとも結論付けている（非特許文献３）。
【００１５】
Ｎｇｅｈ−Ｎｇｗａｉｎｂｉ等は、気相中のパラチオン分析に用いられるようなパラチオンに対する抗体で被膜された圧電性石英結晶を使用することを述べている。被膜された抗体が、気相中の直接反応によりパラチオンと結合する時、結果として生じる結晶についての質量変化は、農薬の濃度に比例した周波数シフトを生み出す（非特許文献４）。
【００１６】
１９９１年３月１２日にＷａｒｄに対して交付された、米国特許第４，９９９，２８４号（特許文献５）においては、石英結晶マイクロバランス分析を用いた方法が開示されている。そこにおいては、検体の、石英結晶マイクロバランス（ＱＣＭ）上、又は近傍表面への結合が、酵素を含む複合体によって検出される。その酵素は、基板における質量変化をもたらして、故に共振周波数のシフトをもたらすような、ＱＣＭの２次元表面上への堆積、又は、それとの反応が可能な生成物への変換に対する触媒作用を及ぼす能力を有している。しかしながら、周波数は、抗ＡＰＳ還元酵素抗体を用いた検体ＡＰＳ還元酵素の０．２４ｎｇ／ｍｌの濃度において３０分間で４０６Ｈｚ変化するのみであり、０．００２ｎｇ／ｍｌ（２ｐｇ／ｍｌ）の濃度において、３０分間で６．３Ｈｚ変化するのみであった。２次元ＱＣＭ表面に異なった修飾を用いて、その著者は、０．０２５ｎｇ／ｍｌ（２５ｐｇ／ｍｌ）の検体濃度において３０分間で２２Ｈｚの変化を得ることに成功している。この結果は、検出／ノイズレベル以下でなければ、非常に低い（ｐｇ／ｍｌ範囲の）濃度において、差分Ｈｚ変化は下がるということを示唆している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】米国特許第５，４７８，７５６号
【特許文献２】国際公開第９２０１９３１号
【特許文献３】国際公開第０３０１９９８１号
【特許文献４】米国特許第４，２３５，９８３号
【特許文献５】米国特許第４，９９９，２８４号
【特許文献６】米国特許出願第第２００６００２４８１３号
【特許文献７】米国特許第５，１３０，２５７号
【特許文献８】米国特許第５，２８３，０３７号
【特許文献９】米国特許第５，３０６，６４４号
【特許文献１０】米国特許第５，８４６，７０８号
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Ｅ．Ｇｉｚｅｌｉ  ｅｔ  ａｌ．  １９９７．  “Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ａ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ  Ｌｉｐｉｄ  Ｌａｙｅｒ：  Ａ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ａｃｏｕｓｔｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒ，”  Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ，  Ｖｏｌ．  ６９：４８０８−４８１３
【非特許文献２】Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｅｎｓｏｒｓ，  Ｅｄｓ．  Ｅｌｅｃｔｒａ  Ｇｉｚｅｌｉ  ａｎｄ  Ｃｈｒｉｓｔｏｆｆｅｒ  Ｒ．  Ｌｏｗｅ  （２００２）
【非特許文献３】Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｖｏｌ．  ５５，  （１９８３）
【非特許文献４】Ｊ．Ｍａｔ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  Ｖｏｌ．  １０８，  ｐｐ．  ５４４４−５４４７  （１９８６）
【非特許文献５】Ｆ．Ｊｏｓｅ，ｅｔ．ａｌ．  “Ｇｕｉｄｅｄ  Ｓｈｅａｒ  Ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ａｃｏｕｓｔｉｃ  Ｗａｖｅ  Ｓｅｎｓｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄｓ，”  Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２００１，  ７３，  ５９３７
【非特許文献６】Ｗ．Ｗｅｌｓｃｈ，  ｅｔ．  ａｌ．，  “Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ａｃｏｕｓｔｉｃ  Ｗａｖｅ  Ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒ，”  Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  １９９６，  ６８，  ２０００−２００４
【非特許文献７】Ｍ．Ｒａｐｐ，ｅｔ．ａｌ．  “Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｌｙ  Ａｖａｉｌａｂｌｅ  ＬＯＷ−ＬＯＳＳ  ＳＡＷ  ｄｅｖｉｃｅｓ  ｔｏｗａｒｄｓ  ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｗａｔｅｒ”  １９９５  ＩＥＥＥ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，  Ｎｏｖ．  ７−１０，  １９９５，  Ｓｅａｔｔｌｅ，  Ｗａｓｈ
【非特許文献８】Ｎ．  Ｂａｒｉｅ，ｅｔ．ａｌ，  “Ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｂｏｕｎｄ  ｓｅｎｓｉｎｇ  ｌａｙｅｒｓ  ｏｎ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｃｏｕｓｔｉｃ  ｗａｖｅ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ，”  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ＆  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  １６  （２００１）  ９７９
【非特許文献９】Ｋ．  Ｖｉｊａｙａｍｏｈａｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．  “Ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ  ａｓ  ａ  ｔｕｎａｂｌｅ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ＆  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  １７  （２００２）  １−１２
【非特許文献１０】Ｇｅｏｒｇｅ  Ｍ．  Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  “Ａｒｒａｙ  ｏｆ  Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  Ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ  ｆｏｒ  ｓｔｕｄｉｎｇ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ．”  Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ２００２，  ７４，  １８０５−１８１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
質量変化が抗原抗体間での免疫学的反応に起因するような圧電性ベース免疫測定は、一般に、２次元センサ表面が用いられるような状況下では、感度が乏しく、そして検出限界が芳しくはないものとなってしまう可能性がある。したがって、当該技術において、分子認識成分、及びその目標検体の間での反応を増幅し、より鋭敏な分析をもたらすことが可能であるような、圧電性ベースの特異な結合分析が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
発明の開示
本発明者は、驚くべきことに、３次元構造を備えた表面音響波（ＳＡＷ）共振器ユニットを用いるＳＡＷセンサ技術と分子認識分子との組み合わせを用いて検体種を検出することが可能であることを発見した。
【００２１】
その結果として、本発明は第１の態様において、
表面音響波（ＳＡＷ）共振器ユニットであって、
（ａ）圧電性基板と、
（ｂ）少なくとも１つのインターデジタルトランスデューサ電極（ＩＤＴＥ）構造体と、
（ｃ）少なくとも１つの反射器構造体と、
を備え、
（ｂ）におけるＩＤＴＥ構造体内には３次元マイクロチャンネルが形成されており、（ｃ）における反射器構造体内には３次元マイクロチャンネルが形成されており、更に共振器ユニットが表面固定化された分子認識成分を含む、
共振器ユニット、に関する。
【００２２】
第２の態様において、本発明は、上述のとおりの表面音響波（ＳＡＷ）共振器ユニットを少なくとも１つ備えたマイクロセンサに関する。
【００２３】
第３の態様において、本発明は、上記マイクロセンサを備えた目標検体を検出するための手持ち型デバイスに関する。
【００２４】
第４の態様において、本発明は、
サンプル中の検体を検出するための方法であって、
（ａ）検体種を酵素連結型の第２の認識成分に接触させ、それにより、検体と酵素連結型認識成分とを含む複合体を作成する段階と、
（ｂ）複合体を、少なくとも１つの、上記表面音響波（ＳＡＷ）共振器ユニットの表面に固定化された第１の認識成分に接触させる段階と、
（ｃ）上記（ｂ）の共振器ユニットに対して基質を提供する段階であって、その基質は、（ａ）における連結された酵素によって沈殿物へと変換される段階と、
（ｄ）沈殿物を、共振器ユニット上の堆積物上で測定する段階と、
を含む、方法に関する。
【００２５】
第５の態様において、本発明は、
サンプル中の検体を検出するための方法であって、
（ａ）検体種を、少なくとも１つの、上記表面音響波（ＳＡＷ）共振器ユニットの表面に固定化された第１の認識成分に接触させ、それにより、検体と第１の認識成分とを含む複合体を作成する段階と、
（ｂ）複合体を、酵素連結型の第２の認識成分に接触させる段階と、
（ｃ）共振器ユニットに対して基質を提供する段階であって、それにより、その基質は、（ｂ）における連結された酵素によって沈殿物へと変換される段階と、
（ｄ）沈殿物を、共振器ユニット上の堆積物上で測定する段階と、
を含む、方法に関する。
【００２６】
第６の態様において、本発明は、サンプル中の目標検体の検出における信号を測定するための、上記に従ったマイクロセンサの使用に関する。
【００２７】
本発明は、テストサンプル溶液中における目標検体の存在を検出するためのマイクロセンサであって、少なくとも１つの、しかしながら好ましくは２以上の表面音響波（ＳＡＷ）共振器ユニットを備え、その各々は、圧電性基板と、上記基板表面上の反射器と複数のインターデジタルトランスデューサ電極（ＩＤＴＥ）とを備え、上記電極と反射器との間には３次元マイクロチャンネルが形成されており、上記ＳＡＷ共振器ユニットは、上記ＩＤＴＥ構造体と反射器構造体との間に形成されたマイクロチャンネル内に固定化された少なくとも１つの分子認識成分を含み、テストサンプル中の目標検体を、少なくとも１つの分子認識成分と反応させ、第２の酵素結合型分子認識成分、又は酵素結合型検体と、更に反応させ、上記電極と反射器構造体との間に形成されたマイクロチャンネル中に堆積する不溶性の沈殿物へと変換され、それによって上記マイクロチャンネルにおける固体／液体体積比を減少させるような基質と、更に反応させ、上記マイクロチャンネルにおける上記固体／液体体積比変化は周波数または位相の信号変化をもたらすような、マイクロセンサに関する。
【００２８】
ＳＡＷ共振器センサタイプに対して、ＩＤＴＥと反射器構造体との間の３次元マイクロチャンネル中における生体膜の剛性変化は、併せて、設定に依存しつつＳＡＷ共振器ユニットの周波数を増加又は減少させる。ヒドロゲル技術を用いたこの現象は、こことは別に、本発明と同一の発明者による米国特許出願第２００６００２４８１３号（特許文献６）において、説明されている。
【００２９】
本発明は、サンプル溶液中における目標検体の存在を検出するためのマイクロセンサへと向けられている。マイクロセンサは、センサ表面上に３次元マイクロチャンネル構造を有する、ＳＡＷ共振器センサを備える。マイクロチャンネル構造は、目標検体を結合させることができる、固定化された分子認識成分を、更に備える。マイクロチャンネル内で、目標検体は更に、第２の酵素結合型分子認識成分、又は酵素結合型目標検体と反応し、更に、上記電極と反射器構造体との間に形成されたマイクロチャンネル中に堆積する不溶性の沈殿物へと変換され、それによって上記マイクロチャンネルにおける固体／液体体積比を減少させるような基質と、反応するのであり、上記マイクロチャンネルにおける上記固体／液体体積比変化は、周波数または位相の信号変化をもたらす。
【００３０】
マイクロセンサは、また、参照表面音響波共振器マイクロチャンネル構造を備えていてもよい。完全な実施形態において、参照マイクロチャンネルは、分子認識成分を含有しない。代わりに、その参照をもって、目標検体を含まないサンプル溶液の測定をなすことが可能となる。センサマイクロチャンネルと参照マイクロチャンネルの信号の間での差により、目標検体の存在が決定される。
【００３１】
分子認識成分における非制限的な例としては、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ＰＮＡ及びＬＮＡ分子のような核酸類似体、蛋白質、ペプチド、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥを含む抗体、酵素、酵素補助因子、酵素基質、酵素阻害薬、レセプター、配位子、キナーゼ、プロテインＡ、ポリウラシル（Ｐｏｌｙ  Ｕ）、ポリアデニン（Ｐｏｌｙ  Ａ）、ポリリジン、トリアジン色素、ボロン酸、チオール、ヘパリン、多糖類、クマシー・ブルー、アズールＡ、金属結合ペプチド、砂糖、炭水化物、キレート剤、原核細胞、及び真核細胞が含まれる。
【００３２】
目標検体における非制限的な例としては、核酸、蛋白質、ペプチド、抗体、酵素、炭水化物、化学化合物、及びガスが含まれる。別の典型的な目標検体としては、トロポニンＩ、トロポニンＴ、アレルゲン、又はＩｇＥのような免疫グロブリンが含まれる。特定の適用において、目標検体は、２以上の分子認識成分を結びつけることができる。
【００３３】
本発明は、また、サンプル溶液中の目標検体を検出するための方法へと向けられている。分子認識成分は、表面音響波センサの表面上に配置されたマイクロチャンネル内に固定化されている。センサは、サンプル中の検体における認識成分への結合を促進するような条件下で、サンプルと接触している。表面音響波における周波数又は位相シフトの変化が、その後に検出される。その変化により、サンプル中に検体の存在することが決定される。
【００３４】
ＳＡＷ共振器ユニットの振幅は、少なくとも１つの分子認識成分がテストサンプル中の目標検体と反応するために最適な条件へと調整されるべきである、ということが述べられている。振幅が大きすぎる場合、分子認識成分／検体の相互作用のために最適ではない条件に起因して、整合しない結果を得る可能性がある。
【００３５】
テストサンプル中の検体を検出するための方法は、テストサンプル中の検体を、第１の認識成分、及び、酵素結合型検体についての第２の酵素結合型認識成分と反応させる段階と、基質を加える段階であって、その基質は上記結合された酵素によって不溶性の沈殿物へと変換される段階と、を含み、上記２つの段階はＳＡＷ共振器ユニットから分離された反応容器内で実行され、得られた上記不溶性の沈殿物は、能動的に上記ＳＡＷ共振器ユニットへと輸送され、そこにおいて上記電極と反射器構造体との間に形成されたＳＡＷマイクロチャンネルと接触しているものが、上記マイクロチャンネルにおける固体／液体体積比を減少させ、上記マイクロチャンネルにおける上記固体／液体体積比の変化は、周波数又は位相の信号変化をもたらし、上記信号変化が検体固有信号を生じさせる。
【００３６】
目標検体を、任意のサンプル内で検出することが可能である。典型的なサンプルとしては、血液、血清、血漿、腹水、排泄物、脊髄中心液、尿、スミア、唾液が含まれる。この方法を、診断目的のために用いることが可能である。
【００３７】
図面を参照しながら、本発明を、以下に詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、参照番号１及び２によって一般的に指示される、２つのＳＡＷ共振器ユニットを図解している。各々のＳＡＷ共振器ユニットは、１つのＩＤＴＥ部分（７，８）と、２つの反射器部分（９，１０）と、からなる。マイクロチャンネル（４，５）は、ＩＤＴＥ（３，６）の間に配置される。同一のマイクロチャンネルは、反射器構造体の間にも配置される（１５，１６）。全体としてのＳＡＷ共振器ユニット（１）３次元表面上には分子認識成分が固定化される（３，１７）一方、ＳＡＷ共振器ユニット（２）上には分子認識成分が存在しない。反応層（１１）は、検体と第２の酵素連結型分子認識成分と基質とを表す。基質が不溶性の沈殿物へと変換する時、マイクロチャンネル（１６）における固体／液体体積比変化に起因して、反射器構造体（１２，１３）間のマイクロチャンネルスペース（１６）が減少する。併せて、幾つかの理由により、ＳＡＷ共振器ユニット（１）におけるＩＤＴＥ間のマイクロチャンネルが減少する。ＳＡＷ共振器ユニット（２）上の構造（１４，１８）間において、マイクロチャンネル（１５）の固体／液体体積比に変化は見られない。
【図２】図２は、同じ基板上の２つのＳＡＷ共振器ユニット（１，２）を図解しており、それ以外は図１と同一である。
【図３】図３は、例１において更に説明される、用量反応曲線を図解している。
【図４】図４は、図１の（９）において図解される反射器構造体のＡＦＭ像を示している。数字１は、基板を表している。数字２は、反射器構造体を表している。数字３と４とは、反射器構造体間マイクロチャンネルの寸法を表している。
【図５】図５は、図４において示されるＡＦＭ像からの計算スキームを示している。ここでは、ＩＤＴＥと反射器との構造の寸法について、幾つかの例が示されている。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
発明の詳細な説明
定義
本件において用いられる「結合イベント」とは、ＳＡＷセンサの３次元マイクロチャンネル構造表面内に固定化された分子認識成分に、目標検体を結合させることを意味する。
【００４０】
図面を参照することによって、本発明を理解できるのであり、そこにおいて同様の参照数字は同様の要素を指示するために用いられる。
【００４１】
図１を参照すると、参照数字１及び２によって一般的に指示される、２つのＳＡＷ共振器ユニットからなるマイクロセンサが示されている。各々のＳＡＷ共振器ユニットは、１つのＩＤＴＥ部分（７，８）と、２つの反射器部分（９，１０）と、からなる。マイクロチャンネル（４，５）は、ＩＤＴＥ（３，６）の間に配置される。同一のマイクロチャンネルは、反射器構造体（１５，１６）の間にも配置される。全体としてのＳＡＷ共振器ユニット（１）３次元表面上には分子認識成分が固定化される（３，１７）一方、ＳＡＷ共振器ユニット（２）上には分子認識成分が存在しない。反応層（１１）は、検体と第２の酵素連結型分子認識成分と基質とを表す。基質が不溶性の沈殿物へと変換する時、マイクロチャンネル（１６）における固体／液体体積比変化に起因して、反射器構造体（１２，１３）間のマイクロチャンネルスペース（１６）が減少する。併せて、幾つかの理由により、ＳＡＷ共振器ユニット（１）におけるＩＤＴＥ間のマイクロチャンネルが減少する。ＳＡＷ共振器ユニット（２）上の構造（１４，１８）間において、マイクロチャンネル（１５）の固体／液体体積比に変化は見られない。
【００４２】
マイクロチャンネル（１６）中に堆積することが可能な不溶性生成物を生み出すことが可能である、酵素／基質システムの例としては、アルカリホスファターゼや、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸塩（ＢＣＩＰ）がある。酵素的に触媒作用を受けるＢＣＩＰの加水分解により不溶性のダイマーが生み出され、ダイマーはマイクロチャンネル内に沈殿する。ガラクトース、グルコース、脂肪酸、脂肪酸エステル、アミノ酸のような、加水分解により開裂可能な官能基によって一部が置き換えられたリン酸塩を含む、類似した他の基質を、それらの補酵素と共に用いることが可能である。
【００４３】
他の酵素／基質システムとしては、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）又はミエロペルオキシダーゼ等のペルオキシダーゼ酵素と、ベンジジン（ｂｅｎｚｉｄｅｎｅ）、ベンジジン二塩酸塩、ジアミノベンジジン、ｏ−トルイジン（ｏ−ｔｏｌｉｄｅｎｅ）、ｏ−ジアニシジン、及び、テトラメチルベンジジン、カルバゾール、特に３−アミノ−９−エチルカルバゾールのうちの１つを含むものがある（それらは全て、ペルオキシダーゼとの反応で沈殿物を形成するということが報告されている。）。併せて、アルファヒドロキシ酸オキシダーゼ、アルデヒドオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、及びキサンチンオキシダーゼ、のようなオキシダーゼを、フェナジンメトサルフェート−ニトロブルテトラゾリウム混合物のような、酸化しやすい基質システムと共に用いることが可能である。
【００４４】
図２を参照すると、この図２は同じ基板上の２つのＳＡＷ共振器ユニット（１，２）を図解しており、それ以外は図１と同一である。
【００４５】
図３を参照する。この図３は、例１において更に説明される。
【００４６】
図４は、図１の（９）において図解される反射器構造体のＡＦＭ像を描写している。数字１は、基板を表している。数字２は、反射器構造体を表している。数字３と４とは、反射器構造体間マイクロチャンネルの寸法を表している。
【００４７】
図５は、図４において示されるＡＦＭ像からの計算スキームを描写している。
ここにおいては、反射器とＩＤＴＥとの構造の寸法について、幾つかの例が示されている。
【００４８】
表面音響波センサ
本発明において開示されるマイクロセンサには、少なくとも１つの表面音響波センサが含まれる。表面音響波センサは、圧電層、又は圧電性基板と、入力及び出力トランスデューサとを備える。表面音響波は圧電層内で発生し、インターデジタル化された電極によって検出される。以下で更に詳細に説明されるとおり、表面音響波センサの表面を変える結合イベントは、伝播している表面音響波における性質の変化として、検出可能である。表面音響波センサは、米国特許第５，１３０，２５７号（特許文献７）、同５，２８３，０３７号（特許文献８）、及び同５，３０６，６４４号（特許文献９）、そして非特許文献５及び６によって説明されている。その各々は、参照により、その全てがここに明示的に組み入れられている。
【００４９】
圧電性基板を通っての、又はその上での波伝播モードによって、音響波デバイスを説明する。音響波は、主にその速度と変位方向とによって区別される。物質と境界条件とに依存して、多くの組み合わせを考えることができる。各々のセンサにおけるインターデジタルトランスデューサ電極（ＩＤＴＥ）は、基板を変位させ、ひいては音響波を形成するために必要である電場を与える。その波は基板を通って伝播し、対向する電極のＩＤＴＥにおいて、変換され電場へと戻される。横波、又はせん断波は、波伝播方向に垂直な粒子変位を有するのであって、粒子変位が検出表面に対して平行又は垂直となるよう、偏波させることが可能である。せん断水平な波動運動は、検出表面に対して平行に偏波した横の変位を意味する。せん断垂直な運動は、その表面に垂直な横変位を示す。
【００５０】
本件において用いられる「表面音響波センサ」又は「表面音響波デバイス」とは、実質的には上述されたとおりの方法で動作するような、あらゆるデバイスを意味するものである。幾つかの実施形態において、「表面音響波センサ」とは、表面変位が伝播方向に垂直であってデバイス表面に平行であるような表面横断波デバイスと、表面変位の少なくとも一部分がデバイス表面に垂直であるような表面音響波センサと、の両方に言及するものである。表面横断波デバイスは、一般には流体中において、より良い感度を有するのであるが、表面変位の一部が、そのデバイス表面に垂直である場合においても、また十分な感度を得ることが可能であるということが、示されている。例えば、非特許文献７及び８等を参照されたい。それら全ては、参照により、その全てがここに明示的に組み入れられている。
【００５１】
センサは、フォトリソグラフィー過程によって作成される。製造は、圧電性基板を慎重に研磨し、洗浄することから始まる。その後、金やアルミニウムのような金属を、基板上に一様に堆積させる。デバイスはフォトレジストでスピンコートされ、焼いて固められる。その後、最終デバイス上で金属化されるべき領域に対応する不透明な領域を有するマスクを通して、ＵＶ光に曝される。その曝される領域は、現像液を用いてその領域を除去することを可能とするような、化学変化を起こす。最後に、残っているフォトレジストが除去される。デバイス上に残っている金属のパターンは、インターデジタルトランスデューサ（ＩＤＴ）、又はインターデジタル電極（ＩＤＥ）と呼ばれる。ＩＤＴの長さ、幅、位置、及び厚さを変えることにより、センサの性能を最大化することが可能である。
【００５２】
有意なバックグラウンド信号を含むサンプルの分子認識においては、しばしば信号を増幅することが必要となる。本発明者は、公知の分子法が、例えば結合された酵素のような増幅要素を備えた第２の認識成分が含まれるようにして、共振ユニットに対し、及び本発明に従った方法に対し適用可能であることを発見した。ＳＡＷセンサは、酵素によって開裂された基質の沈殿におけるセンサ表面の質量増加に対して、非常に効率よく応答した。したがって、好ましい態様において、共振器ユニットは更に、検体への結合後に第２の分子認識成分を含む。この第２の分子認識成分は、酵素連結型抗体であることが好ましい。
結合された酵素は、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、又は西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）であることが好ましい。
【００５３】
検体と分子認識要素との間の結合において変わる信号に関して最良の結果を得るために、共振器ユニットは、１０ｎｍから１ｍｉｃｒｏｎの間の高さを有し、それらの間のマイクロチャンネルが１００ｎｍから１０ｍｉｃｒｏｎの間の幅を有するような、少なくとも２つの近接したＩＤＴＥを備えるべきである。
【００５４】
検体と分子認識要素との間の結合において変わる信号に関して最良の結果を得るために、共振器ユニットは、１０ｎｍから１ｍｉｃｒｏｎの間の高さを有し、それらの間のマイクロチャンネルが１００ｎｍから１０ｍｉｃｒｏｎの間の幅を有するような、少なくとも２つの近接した反射器を備えるべきである。
【００５５】
検体と分子認識要素との間の結合において変わる信号に関して最良の結果を得るために、共振器ユニットは、１０ｎｍから１ｍｉｃｒｏｎの間の高さを有し、それら隣接構造間のマイクロチャンネルが１００ｎｍから１０ｍｉｃｒｏｎの間の幅を有するような、少なくとも２つの近接したＩＤＴＥ／反射器ジャンクションを備えるべきである。
【００５６】
分子認識成分は、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ＰＮＡ及びＬＮＡ分子のような核酸類似体、蛋白質、ペプチド、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥを含む抗体、酵素、酵素補助因子、酵素基質、酵素阻害薬、レセプター、配位子、キナーゼ、プロテインＡ、ポリウラシル（Ｐｏｌｙ  Ｕ）、ポリアデニン（Ｐｏｌｙ  Ａ）、ポリリジン、トリアジン色素、ボロン酸、チオール、ヘパリン、多糖類、クマシー・ブルー、アズールＡ、金属結合ペプチド、砂糖、炭水化物、キレート剤、原核細胞、及び真核細胞からなる一群より選択されることが好ましい。
【００５７】
共振器ユニットは、追加の絶縁被膜を少なくとも１つ有していることが好ましい。そのような追加の絶縁被膜を、例えばチタニウム、ＳｉＯ2、誘電体薄膜、石英、又は、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、ＳｉＯ2、アルミニウム（Ａｌ）で構成される（ただし、これらに限定されるわけではない）追加被膜を有する任意の種類の高分子材料、又は任意の種類の高分子材料により構成することができる。
【００５８】
圧電性基板は、石英（ＳｉＯ2）と、タンタル酸リチウム（ＬｉＴａＯ3）と、そこまで重要ではないものの、ニオブ酸リチウム（ＬｉＮｂＯ3）と、を含む一群から選択されることが好ましい。商業的可能性を有する他の物質としては、ガリウムヒ素（ＧａＡｓ）、炭化ケイ素（ＳｉＣ）、ランガサイト（ＬＧＳ）、酸化亜鉛（ＺｎＯ）、窒化アルミニウム（ＡｌＮ）、チタン酸ジルコン酸鉛（ＰＺＴ）、及びポリフッ化ビニリデン（ＰＶｄＦ）が含まれる。圧電性基板は、石英、ニオブ酸リチウム（ＬｉＮｂＯ3）、又は他の任意の圧電材料から作成することができる。
【００５９】
分子認識成分は、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ＰＮＡ及びＬＮＡ分子のような核酸類似体、蛋白質、ペプチド、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥを含む抗体、酵素、酵素補助因子、酵素基質、酵素阻害薬、レセプター、配位子、キナーゼ、プロテインＡ、ポリウラシル（Ｐｏｌｙ  Ｕ）、ポリアデニン（Ｐｏｌｙ  Ａ）、ポリリジン、トリアジン色素、ボロン酸、チオール、ヘパリン、多糖類、クマシー・ブルー、アズールＡ、金属結合ペプチド、砂糖、炭水化物、キレート剤、原核細胞、及び真核細胞からなる一群より選択される。
【００６０】
検体種は、血液、血清、血漿、排泄物、脊髄中心液、及び尿からなる一群より選択される、哺乳類流体サンプルより抽出することが好ましい。
【００６１】
本発明に従った共振器ユニットを、サンプルからの検体種を検出するために適したマイクロセンサ内で用いることができる。
【００６２】
マイクロセンサは、本発明に従った表面音響波（ＳＡＷ）共振器ユニットのセットを少なくとも１つ備えることが好ましい。
【００６３】
本発明の１実施形態において、そのセットユニットは同一の圧電性基板上に配置される。
【００６４】
本発明の１実施形態において、そのセットユニットは別々の圧電性基板上に配置される。
【００６５】
検体の量を計算するために用いることが可能であるような信号を得るためには、信号を参照（バックグラウンド）信号と比較せねばならない。したがって、好ましい実施形態においてマイクロセンサは、少なくとも１つの、固定化された分子認識成分を含まない参照表面音響波（ＳＡＷ）共振器ユニットを、更に備える。マイクロセンサは、固定化された分子認識成分を含まない表面音響波（ＳＡＷ）共振器ユニットのセットを、少なくとも１つ備えることが好ましい。
【００６６】
ＳＡＷセンサは、手持ち型デバイス内で用いるために適した技術をもたらす、小型センサである。したがって、本発明は更に、上述したとおりのマイクロセンサを備えた、目標検体を検出するための手持ち型デバイスに関する。
【００６７】
別の態様において、本発明は、サンプル中の検体を検出するための方法であって、
（ａ）検体種を、請求項１乃至９のいずれかに記載された表面音響波（ＳＡＷ）共振器ユニットの表面に固定化された、少なくとも１つの第１の認識成分に接触させ、それにより、検体と第１の認識成分とを含む複合体を作成する段階と、
（ｂ）共振器ユニット上での検体の結合における質量増加を測定する段階と、
を含む、方法に関する。
【００６８】
別の態様において、本発明は、サンプル中の検体を検出するための方法であって、
（ａ）検体種を、酵素連結型の第２の認識成分に接触させ、それにより、検体と酵素連結型認識成分とを含む複合体を作成する段階と、
（ｂ）複合体を、少なくとも１つの、本発明に従った表面音響波（ＳＡＷ）共振器ユニットの表面に固定化された第１の認識成分に接触させる段階と、
（ｃ）上記（ｂ）の共振器ユニットに対して基質を提供する段階であって、その基質は、（ａ）における連結された酵素によって沈殿物へと変換される段階と、
（ｄ）沈殿物を、共振器ユニット上の堆積物上で測定する段階と、
を含む、方法に関する。
【００６９】
別の態様において、本発明は、サンプル中の検体を検出するための方法であって、
（ａ）検体種を、本発明に従った表面音響波（ＳＡＷ）共振器ユニットの表面に固定化された、少なくとも１つの第１の認識成分に接触させ、それにより、検体と第１の認識成分とを含む複合体を作成する段階と、
（ｂ）複合体を、酵素連結型の第２の認識成分に接触させる段階と、
（ｃ）共振器ユニットに対して基質を提供する段階であって、それにより、その基質は、（ｂ）における連結された酵素によって沈殿物へと変換される段階と、
（ｄ）沈殿物を、共振器ユニット上の堆積物上で測定する段階と、
を含む、方法に関する。
【００７０】
別の態様において、本発明は、サンプル中の目標検体の検出における信号を測定するために、上述したとおりのマイクロセンサを使用することに関する。
【００７１】
検体は、トロポニンＩ、トロポニンＴ、ＢＮＰ、Ｈ−ＦＡＢＰ、アレルゲン、及びＩｇＥからなる一群より選択されることが好ましい。
【００７２】
入力及び出力トランスデューサ
入力及び出力トランスデューサは、インターデジタル化されたトランスデューサであることが好ましい。一般的には、２つのインターデジタルトランスデューサが存在する。入力及び出力トランスデューサの各々は、インターデジタル化されたパターンに配列された、２つの電極を備える。入力トランスデューサにおける２つの電極間に印加される電位差は、結果として圧電性基板内に表面音響波を発生させる。一般に、電極は任意の導電性物質を含んでいてよく、アルミニウムや金は好ましい。
【００７３】
電極は如何なる従来形状を有していてもよいが、支持体表面に沿った波の伝播方向を横断する細長い金属化領域として、フォトリソグラフィーにより表面上で堆積されることが好ましい。細長い金属化領域は、同じ桁の幅と間隔とを有することが好ましい。幅は、典型的には１〜４０ｍｉｃｒｏｎの間であって、好ましくは１０〜２０ｍｉｃｒｏｎの間である。特定の実施形態において、その幅は、１００ｎｍ，２００ｎｍ，３００ｎｍ，４００ｎｍ，５００ｎｍ，６００ｎｍ，７００ｎｍ，８００ｎｍ，９００ｎｍ，１ｍｉｃｒｏｎ，２ｍｉｃｒｏｎ，３ｍｉｃｒｏｎ，４ｍｉｃｒｏｎ，５ｍｉｃｒｏｎ，７．５ｍｉｃｒｏｎ，１０ｍｉｃｒｏｎ，１５ｍｉｃｒｏｎ，２０ｍｉｃｒｏｎ，２５ｍｉｃｒｏｎ，３０ｍｉｃｒｏｎ，３５ｍｉｃｒｏｎ，４０ｍｉｃｒｏｎ，４５ｍｉｃｒｏｎ，５０ｍｉｃｒｏｎ，６０ｍｉｃｒｏｎ，７０ｍｉｃｒｏｎ，８０ｍｉｃｒｏｎ，又は９０ｍｉｃｒｏｎであるか、またはそれらより大きい。別の実施形態において、電極間隔は、１００ｍｉｃｒｏｎ，９０ｍｉｃｒｏｎ，８０ｍｉｃｒｏｎ，７０ｍｉｃｒｏｎ，６０ｍｉｃｒｏｎ，５０ｍｉｃｒｏｎ，４５ｍｉｃｒｏｎ，４０ｍｉｃｒｏｎ，３５ｍｉｃｒｏｎ，３０ｍｉｃｒｏｎ，２５ｍｉｃｒｏｎ，２０ｍｉｃｒｏｎ，１５ｍｉｃｒｏｎ，１０ｍｉｃｒｏｎ，７．５ｍｉｃｒｏｎ，５ｍｉｃｒｏｎ，４ｍｉｃｒｏｎ，３ｍｉｃｒｏｎ，２ｍｉｃｒｏｎ，１ｍｉｃｒｏｎ，９００ｎｍ，８００ｎｍ，７００ｎｍ，６００ｎｍ，５００ｎｍ，４００ｎｍ，３００ｎｍ，２００ｎｍ，１００ｎｍ，又は７５ｎｍとするか、あるいはそれらより小さくすることができる。間隔は、デバイスの周波数と逆比例して変化することに、注意すべきである。
【００７４】
特定の実施形態において、電極の高さは電極の幅と同じである。他の実施形態において、電極の高さは、例えば、１０ｎｍ，２０ｎｍ，３０ｎｍ，４０ｎｍ，５０ｎｍ，７５ｎｍ，１００ｎｍ，２００ｎｍ，３００ｎｍ，４００ｎｍ，５００ｎｍ，６００ｎｍ，７００ｎｍ，８００ｎｍ，又は９００ｎｍであるか、又はそれらよりも大きい。別の実施形態において、電極間隔の深さは、１ｍｉｃｒｏｎ，９００ｎｍ，８００ｎｍ，７００ｎｍ，６００ｎｍ，５００ｎｍ，４００ｎｍ，３００ｎｍ，２００ｎｍ，１００ｎｍ，７５ｎｍ，５０ｎｍ，４０ｎｍ，３０ｎｍ，又は２０ｎｍであるか、あるいはそれらよりも小さいものとすることができる。
【００７５】
ある代替的実施形態において、存在するインターデジタルトランスデューサは１つである。この実施形態においては、単一のインターデジタルトランスデューサが入力及び出力トランスデューサの両方としての役目を果たす。入力及び出力トランスデューサの両方として振舞う単一のインターデジタルトランスデューサを採用する実施形態において、ＳＡＷセンサ内部で１以上の共振を起こすよう、一般的には反射器構造体が備えられる。反射器構造体は、例えば薄膜格子であってよい。格子は、アルミニウム、又は別の導電性物質を含んでいてよい。発生した共鳴は、例えば単一のトランスデューサにおいて消散した出力を測定することにより、検出可能である。薄型構造内での１以上の結合イベントによりこれら共振は変化するのであり、これにより結合イベントを検出することが可能となる。この実施形態に従ったセンサと技術とは、ここにおいて参照により組み入れられている米国特許第５，８４６，７０８号（特許文献１０）において、一般的に説明されている。後述のとおり、１つだけのインターデジタルトランスデューサを備えたＳＡＷセンサを採用する実施形態においては、別の電子機器、及び／または回路を同じように利用することができる。
【００７６】
分子認識分子を、自己組織化した単分子層へと直接加えることができる。例えば、金のＩＤＴＥを採用した場合、当該技術分野において公知であり、例えば、その両方が参照によりここに組み入れられている非特許文献９及び１０等において説明されているように、自己組織化した単分子層を用いて、ＤＮＡの５’上のＳＨ基を用いて、ＤＮＡプローブ分子を加えることが可能である。
【００７７】
本発明は、更に、
（１）サンプル中の検体を検出するための方法であって、
（ａ）サンプル中の検体を、第１の認識成分及び第２の酵素結合型認識成分と反応させる段階と、
（ｂ）基質を加える段階であって、その基質は上記結合された酵素によって沈殿物へと変換される段階と、
を含み、
（ｃ）上記段階（ａ）及び（ｂ）は測定チャンバから分離された反応容器内で実行され、段階（ｂ）において得られる沈殿物は、能動的に測定チャンバへと輸送され、そこにおいてＳＡＷセンサ表面と接触しているものが検体固有信号を生じさせる、
方法に関する。
【００７８】
本発明の更なる実施形態は、以下のとおりである。
【００７９】
（２）上記（１）及び／又は後続の実施形態のうちいずれか１つに従う方法であって、第１の認識成分は検体を反応容器内で表面に固定化させる、方法。
【００８０】
（３）上記（１）及び／又は後続の実施形態のうちいずれか１つに従う方法であって、上記表面は反応容器の裏地であるか、又は、容器空洞内に含まれる物質の表面であるか、又はそれらの組み合わせであってよい、方法。
【００８１】
（４）上記（１）及び／又は後続の実施形態のうちいずれか１つに従う方法であって、認識成分は、蛋白質、蛋白質類似体、変性蛋白質、核酸、核酸類似体、及び変性核酸を含む一群から選択される、方法。
【００８２】
（５）上記（１）及び／又は後続の実施形態のうちいずれか１つに従う方法であって、蛋白質は、抗体、抗体フラグメント、変性抗体、レセプター分子、及び配位子分子を含む一群から選択される、方法。
【００８３】
（６）上記（１）及び／又は後続の実施形態のうちいずれか１つに従う方法であって、酵素は、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）及び西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を含む一群から選択される、方法。
【００８４】
（７）上記（１）及び／又は後続の実施形態のうちいずれか１つに従う方法であって、基質は、ジアミノベンジジン（ＤＡＰ）、アミノエチルカルバゾール（ＡＥＣ）、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、又は５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸塩（ＢＣＩＰ）／ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）を含む一群から選択される、方法。
【００８５】
本発明は、更に、
（８）上記（１）及び／又は後続の実施形態のうちいずれか１つの方法に従ってサンプル中の検体を検出するためのデバイスであって、
（ａ）注入口と排出口とを有する反応容器であって、酵素変換によって検体固有の沈殿物がその中に生じる反応容器を備え、
（ｂ）上記反応容器は、注入口と排出口とを有しＳＡＷセンサを備えた測定チャンバに繋がれており、
（ｃ）液流は、上記沈殿物を、反応容器から測定チャンバへと能動的に輸送しており、そして上記沈殿物はＳＡＷセンサ表面と接触し、検体固有信号を生じさせる、
デバイスに関する。
【００８６】
本発明の更なる実施形態は、以下のとおりである。
【００８７】
（９）上記（８）及び／又は後続の実施形態のうちいずれか１つに従うデバイスであって、更に流量調整装置へと繋がれており、上記調整装置は、反応容器の前に配置されたポンプシステム、測定チャンバの後ろに配置された吸引システム、又はその両方である、デバイス。
【００８８】
（１０）上記（８）及び／又は後続の実施形態のうちいずれか１つに従うデバイスであって、上記反応容器は、チューブ、チュービングシステム、チャンバ及び接続されたチャンバのシステム、を含む一群より選択される、デバイス。
【００８９】
（１１）上記（８）及び／又は後続の実施形態のうちいずれか１つに従うデバイスであって、反応容器システム内に保持された、ビーズ及びゲルを含む一群より選択される物質を更に備えた、デバイス。
【００９０】
（１２）上記（８）及び／又は後続の実施形態のうちいずれか１つに従うデバイスであって、反応容器システムは、フィルター及びグリッドを含む一群より選択される１以上の材料を更に備えた、デバイス。
【００９１】
（１３）上記（８）及び／又は後続の実施形態のうちいずれか１つに従うデバイスであって、ＳＡＷセンサはＳＡＷフィルタユニットタイプである、デバイス。
【００９２】
例
以下の非制限的な例は、上記説明された発明を使用する方法を、より完全に説明するために役立つ。これらの例は、決して本発明の範囲を制限するものではなく、むしろ例証目的のために与えられているということを、理解すべきである。
【００９３】
例１−抗マウスＩｇＧ／抗ＨＦＡＢＰ  ｍＡｂ−ＡＬＰの分析
手順は、図１に示されるモードに従って実行された。
【００９４】
２つのＳＡＷ共振器ユニット（図１の１及び２）を備えたマイクロセンサを用いた。３次元表面を有するＳＡＷ共振器ユニット（図１の１）は、２０ｎｍの金で被覆されていた。３次元表面を有する同一のＳＡＷ共振器ユニット（図１の２）は、ＳＩＯ2で被覆されていた。図１の１におけるＳＡＷ共振器の金表面は、１００ｕｇ／ｍｌのヤギ抗マウスＩｇＧを用いてインキュベートされ、一方で図１の２におけるＳＡＷ共振器のＳＩＯ2表面は、１００ｕｇ／ｍｌのヤギＩｇＧを用いてインキュベートされた。
【００９５】
第１の段階は、金で被膜された３次元ＳＡＷ表面上での、抗マウス抗体の吸着であった。これは、湿潤環境において２時間に亘り、ＰＢＳバッファ溶液中で１００ｕｇ／ｍＬ抗体を２ｕＬ用いての金／ＳＡＷ共振器ユニットの平衡により実行された。その後、両方のＳＡＷ共振器ユニットは、０．０５％のＴｗｅｅｎを含有するＰＢＳバッファを用いて３回洗浄された。この処置の後、２つのＳＡＷ共振器ユニット（図１の１及び２）は、湿潤環境において室温下で１時間に亘り、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡでインキュベートされた。その後、両方のＳＡＷ共振器ユニットは、ＴＢＳバッファ／０．０５％Ｔｗｅｅｎを用いて３回洗浄された。その後、２つのＳＡＷ共振器ユニット（図１の１及び２）は、１５分間に亘り、ＰＢＳバッファ中、アルカリホスファターゼ酵素（ＡＬＰ）でラベルされた多様な濃度のマウス抗体（抗ＨＦＡＢＰ  ｍＡｂ−ＡＬＰ）に曝された。ＴＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎを用いて３回洗浄された後、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（ＳＩＧＭＡ）が加えられ、ＳＡＷ共振器（図１の１）及びＳＡＷ共振器ユニット（図２の２）間での差分周波数が１０分後に測定された（実験Ｉ−ＶＩＩ）。
【００９６】
対照（実験  ＶＩＩＩ）−ヤギＩｇＧは、両方のＳＡＷ共振器ユニット（図１の１及び２）上でインキュベートされた。
【００９７】
その後、２つのＳＡＷ共振器ユニット（図１の１及び２）は、１５分間に亘り、ＰＢＳバッファ中、アルカリホスファターゼ酵素（ＡＬＰ）でラベルされた１００ｎｇ／ｍｌのマウス抗体（抗ＨＦＡＢＰ  ｍＡｂ−ＡＬＰ）に曝された。ＴＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎを用いて３回洗浄された後、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（ＳＩＧＭＡ）が加えられ、ＳＡＷ共振器（図１の１）及びＳＡＷ共振器ユニット（図２の２）間での差分周波数が１０分後に測定された（実験ＶＩＩＩ）。
【表１】
2010501067.tif 000003
【００９８】
表１からのデータを用いて、用量反応曲線（図３に示されている）が生成された。Ｒ値は１．００である。
【００９９】
例２−抗マウスＩｇＧ／抗ＨＦＡＢＰ  ｍＡｂ−２ＡＬＰの分析
例１におけるものと同様の分析手順であるが、しかしながら、感度を更に高めるために、抗マウスＩｇＧ／抗ＨＦＡＢＰ  ｍＡｂ−２ＡＬＰを検体（抗体ごとに２ＡＬＰ酵素でラベルされる）として用いた。
【表２】
2010501067.tif 000004
【図１】
2010501067.tif 000005
【図２】
2010501067.tif 000006
【図３】
2010501067.tif 000007
【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年4月23日(2009.4.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面音響波（ＳＡＷ）共振器ユニットであって、
（ａ）圧電性基板と、
（ｂ）少なくとも１つのインターデジタルトランスデューサ電極（ＩＤＴＥ）構造体と、
（ｃ）少なくとも１つの反射器構造体と、
を備え、
前記（ｂ）におけるＩＤＴＥ構造体内には３次元マイクロチャンネルが形成されており、前記（ｃ）における反射器構造体内には３次元マイクロチャンネルが形成されており、更に前記共振器ユニットが表面固定化された分子認識成分を含み、該固定化された分子認識成分は検体種と酵素結合型抗体とを含む目標種と結合することができる、
共振器ユニット。
【請求項２】
少なくとも２つの近接したＩＤＴＥは１０ｎｍから１ｍｉｃｒｏｎの間の高さを有し、該近接した電極間のマイクロチャンネルは１００ｎｍから１０ｍｉｃｒｏｎの間の幅を有する、請求項１に記載の共振器ユニット。
【請求項３】
少なくとも２つの近接した反射器は１０ｎｍから１ｍｉｃｒｏｎの間の高さを有し、近接した電極間のマイクロチャンネルは１００ｎｍから１０ｍｉｃｒｏｎの間の幅を有する、請求項１又は２に記載の共振器ユニット。
【請求項４】
少なくとも２つの近接したＩＤＴＥ／反射器ジャンクションは１０ｎｍから１ｍｉｃｒｏｎの間の高さを有し、該近接した構造間のマイクロチャンネルは１００ｎｍから１０ｍｉｃｒｏｎの間の幅を有する、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の共振器ユニット。
【請求項５】
基質は、ジアミノベンジジン（ＤＡＰ）、アミノエチルカルバゾール（ＡＥＣ）、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、ないしは５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸塩（ＢＣＩＰ）／ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、を含む一群より選択される、
請求項１乃至４のいずれか１項に記載の共振器ユニット。
【請求項６】
追加の絶縁被膜を少なくとも１つ有する、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の共振器ユニット。
【請求項７】
検体種は、血液、血清、血漿、排泄物、脊髄中心液、及び尿からなる一群より選択される哺乳類流体サンプルより抽出される、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の共振器ユニット。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれかに記載の表面音響波（ＳＡＷ）共振器ユニットを少なくとも１つ備えた、マイクロセンサ。
【請求項９】
請求項１乃至７のいずれかに記載の表面音響波（ＳＡＷ）共振器ユニットのセットを少なくとも１つ備えた、請求項８に記載のマイクロセンサ。
【請求項１０】
少なくとも１つの、固定化された分子認識成分を含まない参照表面音響波（ＳＡＷ）共振器ユニットを更に備えた、請求項８又は９に記載のマイクロセンサ。
【請求項１１】
固定化された分子認識成分を含まない参照表面音響波（ＳＡＷ）共振器ユニットのセットを少なくとも１つ備えた、請求項１０に記載のマイクロセンサ。
【請求項１２】
請求項８乃至１１のいずれかに記載のマイクロセンサを備えた、目標検体を検出するための、手持ち型デバイス。
【請求項１３】
サンプル中の検体を検出するための方法であって、
（ａ）検体種を、請求項１乃至７のいずれかに記載された表面音響波（ＳＡＷ）共振器ユニットの表面に固定化された、少なくとも１つの第１の認識成分に接触させ、それにより、該検体と該第１の認識成分とを含む複合体を作成する段階と、
（ｂ）前記複合体を、酵素連結型の第２の認識成分に接触させる段階と、
（ｃ）前記共振器ユニットに対して基質を提供する段階であって、それにより、該基質は、（ｂ）における連結された酵素によって沈殿物へと変換される段階と、
（ｄ）前記沈殿物を、前記共振器ユニット上の堆積物上で測定する段階と、
を含む、方法。
【請求項１４】
前記沈殿物は、前記ＳＡＷ共振器ユニットにおける前記電極と反射器構造体の間に形成されるマイクロチャンネル内に堆積し、それによって前記マイクロチャンネルにおける固体／液体体積比を減少させ、前記チャンネルにおける該固体／液体体積比の変化は、周波数、位相、又は振幅の信号変化をもたらす、
請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記検体は、トロポニンＩ、トロポニンＴ、ＢＮＰ、Ｈ−ＦＡＢＰ、アレルゲン、及びＩｇＥよりなる一群より選択される、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
サンプル中の目標検体の検出における信号を測定するための、請求項８乃至１１のいずれかに記載されたマイクロセンサの使用。
【請求項１７】
前記目標検体は、トロポニンＩ、トロポニンＴ、ＢＮＰ、Ｈ−ＦＡＢＰ、アレルゲン、及びＩｇＥよりなる一群より選択される、請求項８乃至１１のいずれかに記載のマイクロセンサの使用。
【国際調査報告】
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