(57)【要約】【課題】ポリペプチドおよび蛋白質の化学合成のための方法および中間体を提供する。【解決手段】本発明はポリペプチドおよび蛋白質の化学合成のための方法および中間体、さらにとりわけ、Ｎ−末端Ｎ−メチル−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を含むペプチドフラグメントとＣ−末端チオエステルを有する別のペプチドフラグメントを化学的に連結して、自発的に再配列してアミド結合を形成するβ（ベータ）−（メチルアミノ）−チオエステル中間体を生み出すための方法および中間体に関する。その上、本発明はポリペプチドおよび蛋白質のＮ−メチル−チアゾリジンをＮ−メチル−システインに変換する方法に関する。本発明はまた、ペプチド−酸フルオリドからペプチド−チオエステルを合成する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
チオエステル部分を有する第１分子と酸化されていないスルフヒドリル部分を有するＮ−（Ｃ１−Ｃ５）−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）残基を有する第２分子間にアミド結合を形成するための方法であって、以下のステップ：
（ａ）第１分子のチオエステル部分を第２分子のＮ−（Ｃ１−Ｃ５）−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）残基の酸化されていないスルフヒドリル部分と反応させて、第１分子と第２分子をβ（ベータ）−（Ｃ１−Ｃ５アミノ）−チオエステルリンケージによりつなぐ中間体を生み出すこと；および
（ｂ）中間体のβ（ベータ）−（Ｃ１−Ｃ５アミノ）−チオエステルリンケージを分子内で再配列させ、第１分子と第２分子をつなぐアミド結合を形成させること
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記Ｎ−（Ｃ１−Ｃ５）−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）残基がＮ−メチル−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）残基であり、そして前記β（ベータ）−（Ｃ１−Ｃ５アミノ）−チオエステルリンケージがβ（ベータ）−（メチルアミノ）−チオエステルリンケージである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記の第１分子および第２分子が、ペプチドフラグメント、ポリペプチド、ペプチドミメティックおよび蛋白質を含む群から独立して選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記の反応ステップおよび再配列ステップが液相または固相中で起こる、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記反応ステップが少なくとも１つのチオール触媒の存在下で起こる、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記チオール触媒が、チオフェノール、１−チオ−２−ニトロフェノール、２−チオ−安息香酸、２−チオ−ピリジン、４−チオ−２−ピリジンカルボン酸、４−チオ−２−ニトロピリジン、４−メルカプトフェニル酢酸、２−メルカプトエタンスルホン酸、３−メルカプト−１−プロパンスルホン酸、および２，３−ジメルカプトプロパンスルホン酸からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
（ａ）チオエステルを有する第１分子部分；
（ｂ）Ｎ−（Ｃ１−Ｃ５）−システイン残基（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を有する第２分子部分；および
（ｃ）チオエステルとＮ−（Ｃ１−Ｃ５）−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）をつなぐβ（ベータ）−（Ｃ１−Ｃ５アミノ）−チオエステルリンケージ
を含む、分子中間体。
【請求項８】
前記β（ベータ）−（Ｃ１−Ｃ５アミノ）−チオエステルリンケージが自発的に分子内で再配列し、前記の第１分子部分と第２分子部分をつなぐアミド結合を形成する、請求項７に記載の分子中間体。
【請求項９】
前記Ｎ−（Ｃ１−Ｃ５）−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）残基がＮ−メチル−システイン残基（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）であり、そして前記β（ベータ）−（Ｃ１−Ｃ５アミノ）−チオエステルリンケージがβ（ベータ）−（メチルアミノ）−チオエステルリンケージである、請求項７に挙げた方法。
【請求項１０】
前記β（ベータ）−（メチルアミノ）−チオエステルリンケージが自発的に分子内で再配列し、前記の第１分子部分と第２分子部分をつなぐアミド結合を形成する、請求項９に記載の分子中間体。
【請求項１１】
２つのペプチドフラグメントの連結によってポリペプチドまたは蛋白質を合成するための方法であって、以下のステップ：
（ａ）Ｎ−末端Ｎ−（Ｃ１−Ｃ５）−チアゾリジンを含む第１ペプチドフラグメントのＣ−末端チオエステルと第２ペプチドフラグメントのＮ−末端Ｎ−（Ｃ１−Ｃ５）−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の連結によりアミド結合を形成すること；および
（ｂ）酸性条件下で求核試薬により連結生成物を処理し、Ｎ−末端Ｎ−（Ｃ１−Ｃ５）−チアゾリジン残基をＮ−末端Ｎ−（Ｃ１−Ｃ５）−システイン残基（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）に変換すること
を含む、前記方法。
【請求項１２】
前記求核試薬がＯ−アルキルヒドロキシルアミンである、請求項１１に挙げた方法。
【請求項１３】
前記Ｏ−アルキルヒドロキシルアミンがＯ−メチルヒドロキシルアミンである、請求項１２に挙げた方法。
【請求項１４】
前記酸性条件がｐＨ２．０〜ｐＨ６．０の範囲にある、請求項１１、１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
所望するポリペプチドまたは蛋白質が形成されるまで前記のステップ（ａ）およびステップ（ｂ）が反復されうる、請求項１１、１２、１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
遊離Ｎ−末端Ｎ−（Ｃ１−Ｃ５）−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を含むポリペプチドを合成するための方法であって、以下のステップ：
（ａ）固相または液相中にＮ−末端Ｎ−（Ｃ１−Ｃ５）−チアゾリジン残基を含むポリペプチドを合成すること；および
（ｂ）酸性条件下で求核試薬によりポリペプチドを処理し、Ｎ−末端Ｎ−（Ｃ１−Ｃ５）−チアゾリジン残基を遊離Ｎ−末端Ｎ−（Ｃ１−Ｃ５）−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）残基に変換すること
を含む、前記方法。
【請求項１７】
前記求核試薬がＯ−アルキルヒドロキシルアミンである、請求項１６に挙げた方法。
【請求項１８】
前記Ｏ−アルキルヒドロキシルアミンがＯ−メチルヒドロキシルアミンである、請求項１４に挙げた方法。
【請求項１９】
以下のステップ：
（ａ）Ｌ−チアゾリジン−４−カルボン酸を酸の存在下でアルデヒドにより処理すること；および
（ｂ）生成物を精製すること
を含む、Ｎ−（Ｃ１−Ｃ５）−チアゾリジン−カルボン酸を合成するための方法。
【請求項２０】
前記アルデヒドがホルムアルデヒドである、請求項１９に挙げた方法。
【請求項２１】
前記酸がギ酸である、請求項１９または２０に挙げた方法。
【請求項２２】
以下のステップ：
（ａ）Ｎ−末端アミノ基が保護基によって保護され、そしてＣ−末端カルボン酸官能基が遊離しているペプチドを合成すること；
（ｂ）Ｎ−末端アミノ基が保護基によって保護され、そしてＣ−末端カルボン酸官能基が遊離しているペプチドを、Ｎ−末端アミノ基が保護基によって保護され、そしてＣ−末端官能基が酸フルオリドであるペプチドに変換すること；
（ｃ）Ｎ−末端アミノ基が保護基によって保護され、そしてＣ−末端官能基が酸フルオリドであるペプチドを、Ｎ−末端アミノ基が保護基によって保護され、そしてＣ−末端官能基がチオエステルであるペプチドに変換すること；および
（ｄ）Ｎ−末端アミノ基が保護基によって保護され、そしてＣ−末端官能基がチオエステルであるペプチドを脱保護し、Ｃ−末端にチオエステル官能基を含む遊離ペプチドを生み出すこと
を含む、ポリペプチドチオエステルを合成するための方法。
【請求項２３】
以下のステップ：
（ａ）側鎖官能基およびＮ−末端アミノ基が保護基によって保護され、そしてＣ−末端カルボン酸官能基が遊離しているペプチドを合成すること；
（ｂ）側鎖官能基およびＮ−末端アミノ基が保護基によって保護され、そしてＣ−末端カルボン酸官能基が遊離しているペプチドを、側鎖官能基およびＮ−末端アミノ基が保護基によって保護され、そしてＣ−末端官能基が酸フルオリドであるペプチドに変換すること；
（ｃ）側鎖官能基およびＮ−末端アミノ基が保護基によって保護され、そしてＣ−末端官能基が酸フルオリドであるペプチドを、側鎖官能基およびＮ−末端アミノ基が保護基によって保護され、そしてＣ−末端官能基がチオエステルであるペプチドに変換すること；および
（ｄ）側鎖官能基およびＮ−末端アミノ基が保護基によって保護され、そしてＣ−末端官能基がチオエステルであるペプチドを脱保護し、Ｃ−末端にチオエステル官能基を含む遊離ペプチドを生み出すこと
を含む、ポリペプチドチオエステルを合成するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はポリペプチドおよび蛋白質の化学合成のための方法および中間体、さらにとりわけ、Ｎ−末端Ｎ−メチル−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を含むペプチドフラグメントをＣ−末端チオエステルを有する別のペプチドフラグメントと化学的に連結して、自発的に再配列してアミド結合を形成するβ（ベータ）−（メチルアミノ）−チオエステル中間体を生み出すための方法および中間体に関する。その上、本発明はポリペプチドおよび蛋白質のＮ−メチル−チアゾリジンをＮ−メチル−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）に変換する方法に関する。本発明はまた、ペプチド−酸フルオリドからペプチド−チオエステルを合成する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛋白質を化学的に合成するためのいくつかの技術が開発されている。たとえば、Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｊ．Ｍ．ら，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，２版，１９８４）およびＢｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．ら，Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９８４）を参照されたい。それらの中で、ネイティブの化学的連結がネイティブの蛋白質を化学的に生み出すための最も有用な方法の１つであることが証明されている。しかし、ネイティブの化学的連結はシステイン残基を有するポリペプチドおよび蛋白質の合成に適しているだけであり、かかるシステイン残基は最終標的ポリペプチドおよび蛋白質を形成するためにペプチドフラグメントを連結するための接続点として使用することができる。
【０００３】
改善された化学的および生物学的特性を有するポリペプチドならびに蛋白質類似体および誘導性を作り出すために、ポリペプチドおよび蛋白質の内側の特定の部位への非天然アミノ酸残基の組み込みが時には必要である。そのような類似体および誘導体は改善された化学的安定性、改善された酵素的安定性、ｉｎ  ｖｉｖｏでの作用期間延長、および亢進した生物学的活性を有することができる。そのような非天然アミノ酸の１クラスはＮ−メチルアミノ酸である。Ｎ−メチルアミノ酸はペプチド骨格に構造的束縛を負わせ、水素結合部位を遮断し、そして潜在的にペプチド結合を酵素的開裂から保護することができる（たとえば、Ｈａｖｉｖ，Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９９３，３６：３６３−３６９；Ｆａｉｌｉｅ，Ｄ．Ｐ．ら，Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９９５，２：６５４−６８６；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｓ．Ｍ．，ら，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．Ｒｅｓ．，１９９５，３５：２０−３２；およびＳｃｈｍｉｄｔ，Ｒ．，ら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．，１９９５，４６：４７−５５を参照されたい）。Ｎ−メチルシステイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）は非天然アミノ酸のこのクラスの１メンバーである。生物学的にいっそう活性で、酵素的にいっそう安定な蛋白質類似体および誘導体を生み出すために、蛋白質の内側のいずれか所望する位置にＮ−メチル−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）残基を組み込むための新規な化学的方法を開発する必要性が存在する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１】図１は本発明の一側面に従ったアミド結合を形成するための合成スキームを示す図である。
【図２】図２は本発明の一側面に従ったポリペプチドおよび蛋白質の化学的合成中にＮ−メチル−チアゾリジン型でＮ−末端Ｎ−メチル−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を保護するための合成スキームを示す図である。
【図３】図３は保護されたペプチド−酸からペプチド−チオエステルを合成するための合成スキームを示す図である。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は２つの分子間にアミド結合を形成する方法に関し、そのような分子は蛋白質、ポリペプチド、ペプチドミメティック、ポリマー、またはそのいずれかの組み合わせでありうる。これらの２つの分子間で、一方の−“第１”−分子は末端ＨＮ−メチル−システイン（または単に、“Ｎ−メチル−システイン”（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）残基を含み、他方の−“第２”−分子はチオエステル官能基を含む。図１に示すように、反応中、２つの分子は初めにβ（ベータ）−（メチルアミノ）−チオエステルリンケージを介してつながり、その後β（ベータ）−（メチルアミノ）−チオエステルリンケージは分子内再配列により自発的に最終アミド結合に変換する。生じた最終生成物は新規に形成されたアミド結合を介してつながる２つの分子の部分を含む。
【０００６】
本発明の別の側面は液相または固相中で実行される連結反応に関する。反応媒体はチオール触媒を含んでいてもよい。そのようなチオール触媒には、チオフェノール、１−チオ−２−ニトロフェノール、２−チオ−安息香酸、２−チオ−ピリジン、４−チオ−２−ピリジンカルボン酸、４−チオ−２−ニトロピリジン、４−メルカプトフェニル酢酸、２−メルカプトエタンスルホン酸、３−メルカプト−１−プロパンスルホン酸、および２，３−ジメルカプトプロパンスルホン酸が挙げられるがそれらに限定されない。
【０００７】
本発明の別の側面はＮ−メチル−チアゾリジンからＮ−メチル−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）への変換に関する。この段階的な連結では、Ｎ−末端Ｎ−メチル−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）とＣ−末端チオエステルを持つペプチドフラグメントが必要である。しかし、Ｂｏｃ−化学のベンジルならびにＦｍｏｃ−化学のトリチルおよびｔ−ブチルのような慣用のチオ−保護基を使用して、Ｎ−末端Ｎ−メチル−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）のスルフヒドリル基を保護することはできない。これは、最終開裂ステップ中、そのような慣用の保護基が除去され、遊離スルフヒドリル基が生み出されて、それがＣ−末端チオエステルと反応して所望しない生成物を形成することになるという事実のためである。
【０００８】
この問題を検討するために、図２に示すように、本発明はポリペプチドおよび蛋白質の化学合成中にＮ−メチル−チアゾリジン型でＮ−末端Ｎ−メチル−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を保護するための方法を提供する。Ｎ−メチル−チアゾリジンは開裂ステップ中、元のままの状態であり、Ｎ−末端Ｎ−メチル−チアゾリジンおよびＣ−末端チオエステルを含むペプチド中間体が生み出されることになる。この中間体はＣ−末端チオエステルを含む別のペプチドフラグメントとの連結反応において使用されることになる。連結反応の後にだけ、生成物中のＮ−メチル−チアゾリジンは酸性条件下で求核試薬を使用することによってＮ−メチル−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）に変換され、ここで該求核試薬はＯ−アルキルヒドロキシルアミンであり、さらに具体的には該Ｏ−アルキルヒドロキシルアミンはＯ−メチルヒドロキシルアミンであり、そして酸性条件はｐＨ２．０〜ｐＨ６．０の範囲である。生じたＮ−末端Ｎ−メチル−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）残基を有する、より大きなペプチドフラグメントをその後の連結ステップに使用して、さらにより大きなポリペプチドまたは蛋白質を生み出すことができる。
【０００９】
本発明の別の側面はペプチド−酸フルオリドからペプチド−チオエステルを合成する方法に関する。
Ｎ−（Ｃ１−Ｃ５）−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、Ｎ−（Ｃ１−Ｃ５）−チアゾリジン、β（ベータ）−（Ｃ１−Ｃ５アミノ）−チオエステルなどを含む別の反応物および中間体が使用されてもよいことは当業者に容易に明らかであろう。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の化合物中に存在するある種のアミノ酸は以下のように表すことができ、以下のように本明細書に表される：
ＡｌａまたはＡはアラニンであり、
ＡｒｇまたはＲはアルギニンであり、
ＡｓｎまたはＮはアスパラギンであり、
ＡｓｐまたはＤはアスパラギン酸であり、
ＣｙｓまたはＣはシステインであり、
ＧｌｎまたはＱはグルタミンであり、
ＧｌｕまたはＥはグルタミン酸であり、
ＧｌｙまたはＧはグリシンであり、
ＨｉｓまたはＨはヒスチジンであり、
ＩｌｅまたはＩはイソロイシンであり、
ＬｅｕまたはＬはロイシンであり、
ＬｙｓまたはＫはリシンであり、
ＭｅｔまたはＭはメチオニンであり、
Ｎｌｅはノルロイシンであり、
ＰｈｅまたはＦはフェニルアラニンであり、
ＰｒｏまたはＰはプロリンであり、
ＳｅｒまたはＳはセリンであり、
ＴｈｒまたはＴはトレオニンであり、
ＴｒｐまたはＷはトリプトファンであり、
ＴｙｒまたはＹはチロシンであり、そして
ＶａｌまたはＶはバリンである。
【００１１】
本明細書で使用されるある種の他の略語は以下のように定義される：
Ｂｏｃはｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルであり、
Ｂｚｌはベンジルであり、
ＤＣＭはジクロロメタンであり、
ＤＩＣはＮ，Ｎ−ジイソプロピルカルボジイミドであり、
ＤＩＥＡはジイソプロピルエチルアミンであり、
Ｄｍａｂは４−｛Ｎ−（１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロへキシリデン）−３−メチルブチル）−アミノ｝ベンジルであり、
ＤＭＡＰは４−（ジメチルアミノ）ピリジンであり、
ＤＭＦはジメチルホルムアミドであり、
ＤＮＰは２，４−ジニトロフェニルであり、
Ｆｍｏｃはフルオレニルメチルオキシカルボニルであり、
ＨＢＴＵは２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートであり、
ｃＨｅｘはシクロヘキシルであり、
ＨＯＡｔはＯ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートであり、
ＨＯＢｔは１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾールであり、
Ｍｍｔは４−メトキシトリチルであり、
ＮＭはＮ−メチルピロリドンであり、
Ｐｂｆは２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニルであり、
Ｐｈはフェニルであり、
ｔＢｕまたはｔ−ブチルはｔｅｒｔ−ブチルであり、
ＴＩＳはトリイソプロピルシランであり、
ＴＯＳはトシルであり、
Ｔｒｔはトリチルであり、
ＴＦＡはトリフルオロ酢酸であり、
ＴＦＦＨはテトラメチルフルオロホルアミジニウムヘキサフルオロホスフェートであり、そして
Ｚはベンジルオキシカルボニルである。
【００１２】
本開示におけるアミノ酸のすべての略語（たとえば、Ａｌａ）は−ＮＨ−Ｃ（Ｒ）（Ｒ′）−ＣＯ−の構造を表し、式中ＲおよびＲ′はそれぞれ独立して水素またはアミノ酸の側鎖（たとえば、Ａｌａの場合Ｒ＝ＣＨ３およびＲ′＝Ｈ）であり、あるいはＲとＲ′が一緒になって環系を形成してもよい。
【００１３】
お互いに等価である用語、“Ｎ−メチル−システイン”（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、“ＮＭｅ−Ｃｙｓ”、“Ｎ−ＭｅＣｙｓ”または“ＮＭｅＣｙｓ”によって意味するものは：
【００１４】
【化１】
2010537984.tif 000002
【００１５】
であり、そしてそれはＬ−またはＤ−コンフィギュレーションでありうる。
お互いに等価である用語“Ｎ−（Ｃ１−Ｃ５）−システイン”または“Ｎ−（Ｃ１−Ｃ５）−Ｃｙｓ”（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）によって意味するものは：
【００１６】
【化２】
2010537984.tif 000003
【００１７】
であり、式中ｔは０〜４までの整数であり、そしてそれはＬ−またはＤ−コンフィギュレーションでありうる。
お互いに等価である用語“Ｎ−メチル−チアゾリジン”、“ＮＭｅ−Ｔｈｚ”、“Ｎ−ＭｅＴｈｚ”または“ＮＭｅＴｈｚ”によって意味するものは：
【００１８】
【化３】
2010537984.tif 000004
【００１９】
であり、そしてそれはＬ−またはＤ−コンフィギュレーションでありうる。
“Ｎ−（Ｃ１−Ｃ５）−チアゾリジン”によって意味するものは：
【００２０】
【化４】
2010537984.tif 000005
【００２１】
であり、式中ｔは０〜４までの整数であり、そしてそれはＬ−またはＤ−コンフィギュレーションでありうる。
“β（ベータ）−（メチルアミノ）−チオエステル”によって意味するものは：
【００２２】
【化５】
2010537984.tif 000006
【００２３】
であり、
“β（ベータ）−（Ｃ１−Ｃ５アミノ）−チオエステル”によって意味するものは：
【００２４】
【化６】
2010537984.tif 000007
【００２５】
であり、式中ｔは０〜４の整数である。
“Ｓ−Ｐｈ”によって意味するものは：
【００２６】
【化７】
2010537984.tif 000008
【００２７】
である。
【実施例】
【００２８】
本発明の異なる特徴をさらに説明するために実施例が以下に提供される。実施例はまた、本発明を実施するための有用な方法論を説明する。これらの実施例は主張された本発明を限定しない。
【００２９】
本発明で使用されるペプチドフラグメントは標準固相ペプチド合成によって調製することができる（たとえば、Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｊ．Ｍ．ら，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，２版．１９８４）を参照されたい）。
【００３０】
実施例１：ＨＮ−ＭｅＣｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）の調製
【００３１】
【化８】
2010537984.tif 000009
【００３２】
表題ペプチドは手動ペプチドシンセサイザーで合成した。Ｒｉｎｋ  ａｍｉｄｅ  
ＭＢＨＡレジン（２１１ｍｇ、１５２マイクロモル、０．７２ｍｍｏｌｅ／ｇ）（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）が使用された。Ｆｍｏｃアミノ酸が以下の側鎖保護と共に使用された：Ｆｍｏｃ−Ｎ−ＭｅＣｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（Ｔｒｉｍｅｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｌｏｄｚ，Ｐｏｌａｎｄ；（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１））、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ；（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）），およびＦｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ；（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３））。Ｆｍｏｃ基はジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中２５％ピペリジンによる１０分間、２回の処理により除去された。それぞれのカップリングステップでは、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）中のＦｍｏｃアミノ酸（４等量）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）（４等量）、およびジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）（４等量）が使用された。以下の反応サイクルが使用された：（１）ＤＭＦによる洗浄；（２）２０分間のＤＭＦ中２５％ピペリジンによるＦｍｏｃ保護基の除去；（３）ＤＭＦによる洗浄；および（４）６０分間の予め活性化されたＦｍｏｃアミノ酸とのカップリング。Ｆｍｏｃ−Ｎ−ＭｅＣｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（１．１等量；（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１））はＮＭＰ中のＨＯＢｔ（１．１等量）およびＤＩＣ（１．１等量）を使用して１２時間カップリングさせた。このカップリングは次にＮＭＰ中のＦｍｏｃ−Ｎ−ＭｅＣｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（０．５等量；（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１））、テトラメチルフルオロホルムアミジニウムヘキサフルオロホスフェート（ＴＦＦＨ）（０．５等量）、およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（１．０等量）を使用して１時間繰り返された。シンセサイザーでの最終サイクル中に、Ｆｍｏｃは脱保護された。生じたレジンはＤＭＦ、ジクロロメタン（ＤＣＭ）およびメタノール（ＭｅＯＨ）で洗浄し、真空下で乾燥させた。
【００３３】
生じた保護されたペプチド−レジンは脱保護し、８％トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）／トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（２ｍｌ）で２時間開裂させた。レジンは濾過し、ＴＦＡ（２ｍｌ）およびＤＣＭ（２ｍｌ）で洗浄した。濾液は窒素流下で１ｍｌ未満に濃縮し、それを冷ジエチルエーテル（５ｍｌ）に注いだ。形成された沈殿物は遠心分離し、集めた。ペレットは５０％水性アセトニトリル溶液に溶解し、凍結乾燥させた。
【００３４】
この粗生成物は水性アセトニトリルに溶かし、Ｌｕｎａ  ５μＣ８（２）カラム（１００ｘ２０ｍｍ）を使用する逆相プレパラティブＨＰＬＣで精製した。カラムは１００％Ａおよび０％Ｂから８０％Ａおよび２０％Ｂまでの直線グラジエントで３０分間溶出し、ここでＡは水中０．１％ＴＦＡであり、Ｂはアセトニトリル中０．１％ＴＦＡであった。画分はアナリティカルＨＰＬＣによりチェックした。純粋な生成物を含むものを合わせ、凍結乾燥し、乾固させた。化合物の純度は約９９％であった。最終生成物５１．２ｍｇが得られた。ＥＳＩ−ＭＳ分析は分子量４０９．３を示した（計算した分子量４０９．６と一致）。
【００３５】
実施例２：Ｈ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓ−Ｐｈ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）の調製
【００３６】
【化９】
2010537984.tif 000010
【００３７】
クロロトリチルクロリドレジン（１．０ｇ、１．４９ｍｍｏｌｅ）（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）はＤＣＭ（１０ｍｌ）中のＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（４８７ｍｇ、１．６４ｍｍｏｌｅ；（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４））（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）およびＤＩＥＡ（７７０ｍｇ、５．９６ｍｍｏｌｅ）の溶液で１時間処理した。レジンは濾過し、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＤＩＥＡ１７：２：１（１０ｍｌ）で２回、ＤＣＭで３回、そしてＤＭＦで３回洗浄した。
【００３８】
Ｆｍｏｃ保護基は２５％ピペリジン／ＤＭＦ（１０ｍｌ）と共に１０分間および３０分間レジンを振盪することによって除去した。次にレジンはＤＭＦ（１０ｍｌ）で３回洗浄した。Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（２．７９ｇ、５．９５ｍｍｏｌｅ；（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２））（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）はＮＭＰ（１０ｍｌ）中のＨＯＢｔ（５．９５ｍｍｏｌ）およびＤＩＣ（５．９５ｍｍｏｌ）と共に１時間振盪することによって、生じたペプチドレジンにカップリングさせた。
【００３９】
脱保護および洗浄手順は上記のように反復した。Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ（１．５８ｇ、５．９５ｍｍｏｌｅ；（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３））（Ｂａｃｈｅｍ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）はＮＭＰ（１０ｍｌ）中のＨＯＢｔ（５．９５ｍｍｏｌ）およびＤＩＣ（５．９５ｍｍｏｌ）と共に１時間振盪することによってペプチドレジンにカップリングさせた。
【００４０】
レジンはＤＭＦで３回、ＤＣＭで３回、その後ＭｅＯＨで３回洗浄した。レジンは真空下で乾燥させた。
保護されたペプチドはＤＣＭ中１．０％ＴＦＡ１０ｍｌと共に２分間レジンを振盪することによりレジンから開裂させた。レジンは濾過し、濾液はＭｅＯＨ中、１０％ピリジン２ｍｌに注いだ。溶媒を真空下で除去した後、残渣はＤＣＭに溶解し、飽和ＮａＣｌで２回、そして１Ｍ硫酸水素ナトリウムで３回洗浄した。ＤＣＭ溶液は硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒は真空下で除去し、１２０ｍｇの白色固体を得た。
【００４１】
この保護されたペプチド（１２０ｍｇ、２１８マイクロモル）はＤＣＭ（５ｍｌ）中のＴＦＦＨ（２１８マイクロモル）およびＤＩＥＡ（４３６マイクロモル）で処理した。生じた酸フルオリドはチオフェノール（２１８マイクロモル）で処理し、チオエステルを形成させた。２時間後、９：１  ＤＣＭ／ＭｅＯＨで溶出した薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は反応が完了したことを示した。反応混合物はＤＣＭ（１０ｍｌ）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム（５ｍｌ）で３回洗浄した。この溶液は硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒は真空下で除去した。生じた白色固体は１３０ｍｇの重さであった。
【００４２】
このＤＣＭ２ｍｌ中の保護されたペプチドはＴＦＡ２ｍｌの添加により脱保護された。２時間後、溶媒を１ｍｌに濃縮し、ペプチドを１４ｍｌの冷ジエチルエーテルの添加により沈殿させた。生じた懸濁液は遠心分離し，デカンテーションした。ペレットは水に溶かし、Ｌｕｎａ  ５μＣ８（２）カラム（１００ｘ２０ｍｍ）を使用して逆相プレパラティブＨＰＬＣで精製した。カラムは１００％Ａおよび０％Ｂから６０％Ａおよび４０％Ｂまでの直線グラジエントで３０分間溶出し、ここでＡは水中０．１％ＴＦＡであり、Ｂはアセトニトリル中０．１％ＴＦＡであった。画分はアナリティカルＨＰＬＣによりチェックした。純粋な生成物を含むものは合わせて凍結乾燥し、乾固させた。最終生成物７６．６ｍｇが得られた。ＥＳＩ−ＭＳ分析は分子量４４２．３を示した（計算した分子量４４２．５８と一致）。
【００４３】
実施例３：Ｈ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｎ−ＭｅＣｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）の調製
Ｈ−Ｎ−ＭｅＣｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ２（実施例１、５．０ｍｇ、１２．２マイクロモル；（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５））は２００ｍＭ、ｐＨ８．５ホスフェート／６Ｍグアニジンバッファー（０．５ｍｌ）に溶かした。それにｔｒｉｓ（カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）（０．０４２ｍｌの４０ｍｇ／ｍｌ溶液、ｐＨは７に調整）を添加した。生じた溶液にＨ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓ−Ｐｈ（実施例２、３．４ｍｇ、７．６マイクロモル；（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６））を添加した。４０分後、次に７５分後に、１ｍｇの付加的なＨ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓ−Ｐｈ（２．２マイクロモル；（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６））を添加した。反応混合物は室温で２０時間放置した。その後別の１．０ｍｇのＨ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓ−Ｐｈ（２．２マイクロモル；（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６））を添加した。ＬＣ−ＭＳ分析は２３時間後に連結反応が完了し、以下の構造：
【００４４】
【化１０】
2010537984.tif 000011
【００４５】
に示すようなＨ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｎ−ＭｅＣｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）の生成物を得たことを示した。
生じた溶液はＬｕｎａ  ５μＣ８（２）カラム（１００ｘ２０ｍｍ）を使用して逆相ＨＰＬＣで精製した。カラムは、２３５ｎｍでモニターしながら１００％バッファーＡ（水中０．１％ＴＦＡ）および０％バッファーＢ（アセトニトリル中０．１％ＴＦＡ）から６０％バッファーＡおよび４０％バッファーＢまでの直線グラジエントで３０分かけて溶出した。最終生成物６．８ｍｇを得た。ＥＳＩ−ＭＳ分析は分子量７４１．３を示した（計算した分子量７４１．９６と一致）。
【００４６】
実施例４：Ｎ−メチル−チアゾリジン−４−カルボン酸（すなわち、Ｎ−ＭｅＴｈｚ−ＯＨ）の合成
【００４７】
【化１１】
2010537984.tif 000012
【００４８】
３７％ホルムアルデヒド（２２．５ｍｌ）および９６％ギ酸（３９．３ｍｌ）の混合物中のＬ−チアゾリジン−４−カルボン酸（１３．３ｇ）は８０℃に加熱した。１時間後にＣＯ２発生は終了した。大部分の溶媒が除去されるまで加熱を続けた。残渣はメタノールに溶かし、ロータリーエバポレーターで３回留去した。濃縮した塩酸１当量を添加し、生じた塩はメタノールおよびエチルエーテルから再結晶化させた。収量１７．０ｇ（９２％）。
【００４９】
実施例５：Ｎ−メチル−チアゾリジン−４−カルボン酸−リシン−グリシン−フェニルチオエステル（すなわちＮ−ＭｅＴｈｚ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓ−Ｐｈ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）の調製
【００５０】
【化１２】
2010537984.tif 000013
【００５１】
クロロトリチルクロリドレジン（７１４ｍｇ、１．０ｍｍｏｌｅ）（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）はＤＣＭ（９ｍｌ）中のＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（５９５ｍｇ、２．０ｍｍｏｌｅ；（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４））（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）およびＤＩＥＡ（５１７ｍｇ、４．０ｍｍｏｌｅ）の溶液で２時間処理した。レジンは濾過し、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＤＩＥＡ  １７：２：１（１０ｍｌ）で２回、ＤＣＭで３回、そしてＤＭＦで３回洗浄した。
【００５２】
Ｆｍｏｃ保護基は上記のように、２５％ピペリジン／ＤＭＦ（１０ｍｌ）と共に１０分間および３０分間レジンを振盪することによって除去した。レジンはＤＭＦ（１０ｍｌ）で３回洗浄した。Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（１．８７ｇ、４．０ｍｍｏｌｅ；（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２））（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）はＮＭＰ（１５ｍｌ）中のＨＯＢｔ（４．０ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（８．０ｍｍｏｌｅ）およびＨＢＴＵ（４．０ｍｍｏｌ）と共に１時間振盪することによって、生じた遊離アミンレジンにカップリングさせた。
【００５３】
脱保護および洗浄手順は上記のように反復した。Ｎ−メチル−チアゾリジン−４−カルボン酸（Ｎ−ＭｅＴｈｚ−ＯＨ）（実施例４、７３０ｍｇ、４．０ｍｍｏｌｅ）はＮＭＰ（１５ｍｌ）中のＨＯＢｔ（４．０ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（８．０ｍｍｏｌｅ）およびＨＢＴＵ（４．０ｍｍｏｌ）と共に１時間振盪することによって、生じたペプチドレジンにカップリングさせた。
【００５４】
レジンはＤＭＦで３回、ＤＣＭで３回、その後ＭｅＯＨで３回洗浄した。レジンは真空下で乾燥させた。
保護されたペプチドは酢酸（ＨＯＡｃ）／トリフルオロエタノール／ＤＣＭ  ２：２：６（１０ｍｌ）と共に２時間レジンを振盪することによりレジンから開裂させた。レジンは濾過し、開裂溶液（１０ｍｌ）で洗浄した。濾液は合わせて濃縮した。残渣は水に溶かし、その後凍結乾燥させた。
【００５５】
生じた粘性オイルは５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭで溶出するシリカゲルフラッシュカラム（Ｂｉｏｔａｇｅ  １．２Ｘ１５ｃｍ）で精製した。画分はプールし、溶媒は真空下で除去し、保護されたペプチド２０１ｍｇを得た。
【００５６】
この保護されたペプチド（１００ｍｇ、２３１マイクロモル）はＤＣＭ（５ｍｌ）中のＴＦＦＨ（２３１マイクロモル）およびＤＩＥＡ（４６２マイクロモル）で処理した。生じた酸フルオリドはチオフェノール（２３１マイクロモル）で処理し、チオエステルを形成させた。反応混合物はＤＣＭ（１０ｍｌ）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム（５ｍｌ）で３回洗浄した。この溶液は硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒は真空下で除去した。ＤＣＭ２ｍｌ中のこの保護されたペプチドはＴＦＡ２ｍｌの添加により脱保護された。１時間後、溶媒を濃縮し、エーテルの添加によりペプチドを沈殿させた。生じた懸濁液は遠心分離し，デカンテーションした。ペレットは水に溶かし、凍結乾燥させ、白色固体を得た。最終生成物４５．９ｍｇを得た。
【００５７】
ＥＳＩ−ＭＳにより４２５．０質量単位でＭ＋１イオンが検出された。計算した分子量は４２４．６質量単位である。
実施例６．Ｎ−ＭｅＴｈｚ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＭｅＣｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）の調製
Ｎ−ＭｅＴｈｚ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓ−Ｐｈ（実施例５、１．２ｍｇ、２．８３マイクロモル；（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８））およびＨ−Ｎ−ＭｅＣｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ２（実施例１、１．２ｍｇ、２．８３マイクロモル；（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５））は２００ｍＭ  ｐＨ８．５ホスフェート／６Ｍグアニジンバッファー（０．２ｍｌ）に溶かした。ｔｒｉｓ（カルボキシエチル）ホスフィン塩酸（ＴＣＥＰ）（０．０４２ｍｌの４０ｍｇ／ｍＬ溶液、ｐＨは７に調整）をこの溶液に添加した。反応混合物は室温で４時間放置した。ＬＣ−ＭＳ分析は連結が４時間で完了したことを示し、そして生成物は以下の構造：
【００５８】
【化１３】
2010537984.tif 000014
【００５９】
によって示すような、Ｎ−ＭｅＴｈｚ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＭｅＣｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）であった。
実施例７：Ｎ−ＭｅＣｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＭｅＣｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）の調製
【００６０】
【化１４】
2010537984.tif 000015
【００６１】
２００ｍＭ  ｐＨ８．５ホスフェート／６Ｍグアニジンバッファー（０．２ｍｌ）中のＮ−ＭｅＴｈｚ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＭｅＣｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ２（実施例６、２．０ｍｇ、２．８３マイクロモル；（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９））に０．２ＭメトキシアミンＨＣｌを添加し、ｐＨを４．０に調整した。反応はＬＣ−ＭＳを使用することによってモニターした。反応は２時間で完了した。反応溶液は−２０℃で一晩保存した。
【００６２】
実施例８：Ｎ−ＭｅＴｈｚ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｎ−ＭｅＣｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＭｅＣｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）の調製
解凍した、実施例７で得られた反応混合物のｐＨは２Ｎ  ＮａＯＨを添加することによって８に調整した。それにＮ−ＭｅＴｈｚ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓ−Ｐｈ（実施例５、１．２ｍｇ、２．８３マイクロモル；（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８））を添加した。連結はＬＣ−ＭＳによってモニターした。反応は３時間で完了した。
【００６３】
生じた溶液は２２０ｎｍでモニターしながら、１００％バッファーＡ（水中０．１％ＴＦＡ）および０％バッファーＢ（アセトニトリル中０．１％ＴＦＡ）から５０％バッファーＡおよび５０％バッファーＢで溶出する逆相ＨＰＬＣ（Ｌｕｎａ  ５μＣ８（２）１００ｘ４．６ｍｍカラム）で１５分間かけて精製した。ＥＳＩ−ＭＳにより１０２６．６質量単位でＭ＋１イオンが検出された。Ｎ−ＭｅＴｈｚ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｎ−ＭｅＣｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＭｅＣｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）の計算した分子量は１０２６．４質量単位である。
【図１】
2010537984.tif 000016
【図２】
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【図３】
2010537984.tif 000018
【配列表】
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【国際調査報告】
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