(57)【要約】  本発明の実施形態は、選択的サンプル一掃および褐色細胞腫の指標としてのＨＩＬＩＣ化学をもたらす、弱カチオン抽出媒体を用いる、サンプル予備処理を最小限に止めた、ヒト血漿原液中のノルメタネフリン、メタネフリンおよび３−メトキシチラミンの決定を特徴とする。
2010527452.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
存在がカテコールアミン分泌性腫瘍を潜在的に示すものである、血漿中のノルメタネフリン、メタネフリンおよび３−メトキシチラミンから選択される化合物の群の少なくとも１つを検出する方法であって、
ａ．被験者から血漿サンプルを得る工程；
ｂ．ノルメタネフリン、メタネフリンおよび３−メトキシチラミンの少なくとも１つを弱カチオン交換樹脂で血漿タンパク質および構成物質から分離して少なくとも１つの保持されたノルメタネフリン、メタネフリンもしくは３−メトキシチラミンを形成する工程；
ｃ．少なくとも１つの保持されたノルメタネフリン、保持されたメタネフリンおよび保持された３−メトキシチラミンを酸移動相で弱カチオン交換樹脂から溶出して少なくとも１つのノルメタネフリン溶出物、メタネフリン溶出物および３−メトキシチラミン溶出物を形成する工程；
ｄ．少なくとも１つのノルメタネフリン溶出物、メタネフリン溶出物および３−メトキシチラミン溶出物をオンライン親水性相互作用液体クロマトグラフィーによって少なくとも１つの高純度ノルメタネフリン溶出物、高純度メタネフリン溶出物および高純度３−メトキシチラミン溶出物に分離し、前記高純度ノルメタネフリン溶出液、高純度メタネフリン溶出物および高純度３−メトキシチラミン溶出物はメタネフリンおよびノルメタネフリンからなる群の少なくとも１つの存在に対応する１以上のピークを示す工程；
ｅ．前記高純度ノルメタネフリンおよびメタネフリン溶出液を質量分析計に導入してノルメタネフリン、メタネフリンおよび３−メトキシチラミンからなる前記群の少なくとも１つの存在および量に関係する信号を生成し、前記存在および量はカテコールアミンを分泌する腫瘍の存在もしくは不在を示すものである工程、
を含む方法。
【請求項２】
内部標準を前記サンプルに添加する工程をさらに含む、請求項１の方法。
【請求項３】
前記内部標準がノルメタネフリン、メタネフリンおよび３−メトキシチラミンからなる群より選択される化合物の重水素化形態の少なくとも１つの既知量である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記弱カチオン交換樹脂が１以上の弱カチオン交換官能基を有する水湿潤性有機ポリマーである、請求項１の方法。
【請求項５】
前記有機ポリマーが少なくとも１つの親水性モノマーおよび少なくとも１つの疎水性モノマーから選択されるモノマーより誘導される、請求項４の方法。
【請求項６】
前記疎水性モノマーがジビニルベンゼンである、請求項５の方法。
【請求項７】
前記親水性モノマーがＮ−ビニルピロリドンおよびビニルピリジンからなるモノマーの対から選択される、請求項５の方法。
【請求項８】
前記弱カチオン交換基がカルボキシルである、請求項４の方法。
【請求項９】
非標識ノルメタネフリンレベルを前記サンプル中の重水素化ノルメタネフリン濃度と比較することによってカテコールアミンの前記血漿レベルを決定する、請求項３の方法。
【請求項１０】
非標識メタネフリンレベルを前記サンプル中の重水素化メタネフリン濃度と比較することによってカテコールアミンの前記血漿レベルを決定する、請求項３の方法。
【請求項１１】
前記質量分析計を正イオン化モードで稼働させる、請求項１の方法。
【請求項１２】
メタネフリンをプロトン化して質量対電荷１９８のイオンを形成する、請求項１１の方法。
【請求項１３】
前記ノルメタネフリンをプロトン化して質量対電荷１８４のイオンを形成する、請求項１１の方法。
【請求項１４】
３−メトキシチラミンをプロトン化して質量電荷比（ｍ／ｚ）１６８のイオンを形成する、請求項１１の方法。
【請求項１５】
前記メタネフリンが水を失って１８０の質量対電荷を有するイオンを形成する、請求項１２の方法。
【請求項１６】
前記ノルメタネフリンが水を失って１６６の質量対電荷を有するイオンを形成する、請求項１３の方法。
【請求項１７】
前記３−メトキシチラミンがアンモニウムを典型的に失って１５１の質量電荷比を有するイオンを形成する、請求項１４の方法。
【請求項１８】
前記質量分析計が衝突フラグメンテーションを用いてメタネフリンの１以上のイオンフラグメントを形成する、請求項１の方法。
【請求項１９】
メタネフリンの前記フラグメントが１４８の質量対電荷を有する、請求項１８の方法。
【請求項２０】
前記質量分析計が衝突フラグメンテーションを用いてノルメタネフリンの１以上のイオンフラグメントを形成する、請求項１の方法。
【請求項２１】
ノルメタネフリンの前記フラグメントが１３４の質量対電荷を有する、請求項２０の方法。
【請求項２２】
前記質量分析計が衝突フラグメンテーションを用いて３−メトキシチラミンの１以上のイオンフラグメントを形成する、請求項１の方法。
【請求項２３】
３−メトキシチラミンの前記フラグメントが１１９の質量電荷比を有する、請求項２２の方法。
【請求項２４】
約０．３ｎｍｏｌ毎リットルを上回るメタネフリンの濃度が褐色細胞腫を示唆する、請求項１の方法。
【請求項２５】
約１．２ｎｍｏｌ毎リットルを上回るノルメタネフリンの濃度が褐色細胞腫を示唆する、請求項１の方法。
【請求項２６】
約０．２ｎｍｏｌ毎リットルを上回る３−メトキシチラミンの濃度が褐色細胞腫を示唆する、請求項１の方法。
【請求項２７】
非標識３−メトキシチラミンレベルを前記サンプル中の重水素化３−メトキシチラミン濃度と比較することによってカテコールアミンの前記血漿レベルを決定する、請求項３の方法。
【請求項２８】
存在がカテコールアミン分泌性腫瘍を潜在的に示すものである、血漿中のノルメタネフリン、メタネフリンおよび３−メトキシチラミンから選択される化合物の群の少なくとも１つを検出するための装置であって、
ａ．ノルメタネフリン、メタネフリンおよび３−メトキシチラミンから選択される化合物の群の少なくとも１つを弱カチオン交換樹脂で血漿タンパク質および構成物質から分離して保持されたノルメタネフリン、保持されたメタネフリンおよび保持された３−メトキシチラミンの少なくとも１つを形成し、並びに保持されたノルメタネフリン、保持されたメタネフリンおよび保持された３−メトキシチラミンの少なくとも１つを酸移動相で弱カチオン交換樹脂から溶出してノルメタネフリン溶出物、メタネフリン溶出物および３−メトキシチラミン溶出物の少なくとも１つを形成するための分離および溶出手段であって、前記分離および溶出手段は１以上の血漿サンプルを１以上の被験者から受け取り、液体クロマトグラフ手段と液通し、および制御手段と通信状態にあり、前記分離および溶出手段はサンプル識別子信号を前記制御手段に送信する手段；
ｂ．ノルメタネフリン溶出物、メタネフリン溶出物および３−メトキシチラミン溶出物の少なくとも１つをオンライン親水性相互作用液体クロマトグラフィーによって少なくとも１つの高純度ノルメタネフリン溶出物、高純度メタネフリン溶出物および高純度３−メトキシチラミン溶出物に分離するための液体クロマトグラフ手段であって、前記少なくとも１つの高純度ノルメタネフリン溶出物、高純度メタネフリン溶出物および高純度３−メトキシチラミン溶出物はメタネフリン、ノルメタネフリンおよび３−メトキシチラミンからなる群の少なくとも１つの存在に対応する１以上のピークを示し、前記液体クロマトグラフ手段は質量分析計手段と液通し、および制御手段と通信状態にあり、前記液体クロマトグラフは前記少なくとも１つの高純度ノルメタネフリン溶出物、高純度メタネフリン溶出物および高純度３−メトキシチラミン溶出物を前記サンプル識別子信号と関連付けて維持する手段；
ｃ．前記少なくとも１つの高純度ノルメタネフリン溶出物、高純度メタネフリン溶出物および高純度３−メトキシチラミン溶出物を受けてノルメタネフリン、メタネフリンおよび３−メトキシチラミンからなる前記群の少なくとも１つの存在および量に関連する少なくとも１つの質量対電荷信号を生成するための質量分析計手段であって、前記質量分析計手段は制御手段と通信状態にある手段；
ｄ．前記サンプル識別子信号および質量対電荷信号を受信し、前記質量対電荷信号を前記サンプル識別子信号に関連付け、前記質量対電荷信号を対照値と比較してカテコールアミンを分泌する腫瘍の存在もしくは不在を被験者に示唆するための制御手段、
を含む装置。
【請求項２９】
存在がカテコールアミン分泌性腫瘍を潜在的に示すものである、血漿中のノルメタネフリン、メタネフリンおよび３−メトキシチラミンから選択される化合物の群の少なくとも１つを検出するためのキットであって、化合物ノルメタネフリン、メタネフリンおよび３−メトキシチラミンの少なくとも１つ並びに血漿サンプルへの添加および質量分析計のキャリブレーションのための標準を形成するための取扱説明書を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府の支援に関する宣言
本発明は連邦政府の資金なしになされた。
【０００２】
本発明の実施形態は褐色細胞腫の診断のための血漿中のメタネフリンの検出に向けられる。
【背景技術】
【０００３】
褐色細胞腫は副腎髄質の腫瘍である。これらの腫瘍はカテコールアミンを産生し、これらは血流中に放出される。血流中で、これらのカテコールアミンは個人に高血圧を経験させて大いに苦しめる。高血圧は慢性的な状態もしくは腫瘍がこれらのカテコールアミンを放出する様式に対応する偶発的なものとして起こり得る。比較的希にではあるが、高血圧患者の治療に先立ち、褐色細胞腫の存在もしくは不在を診断することが望ましい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
褐色細胞腫の検出方法は扱いにくく、時間のかかるものであった。この方法は偽陽性および偽陰性の結果に悩まされてもいる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の実施形態は血漿中のノルメタネフリン、メタネフリンおよび３−メトキシチラミンのレベルを決定するための方法および装置に向けられる。「ノルメタネフリン」、「メタネフリン」および「３−メトキシチラミン」という用語はこのような化合物が当分野において知られるような通常の化学的な意味で用いられる。「血漿」という用語もこのような用語が当分野において知られるように用いられる。ノルメタネフリン、メタネフリンおよび３−メトキシチラミンはカテコールアミン代謝物である。この文書ではこのような化合物を指すのに「３−メトキシチラミン」という用語を用いる。血漿中のノルメタネフリン、メタネフリンおよび３−メトキシチラミンの存在および異常濃度はカテコールアミン分泌性腫瘍を潜在的に示すものである。
【０００６】
本発明の実施形態は、被験者から血漿を得る工程並びに、存在するのであれば、ノルメタネフリン、メタネフリンおよび３−メトキシチラミンを弱カチオン交換樹脂で血漿タンパク質および構成物質から分離して、存在するのであれば、保持されたノルメタネフリン、メタネフリンおよび３−メトキシチラミンの少なくとも１つを形成する工程を含む方法に向けられる。保持されたノルメタネフリン、メタネフリンおよび３−メトキシチラミンは弱カチオン交換樹脂から酸移動相で溶出して少なくとも１つのノルメタネフリン、メタネフリンおよび３−メトキシチラミン溶出物を形成する。ノルメタネフリン、メタネフリンおよび３−メトキシチラミン溶出物は、オンライン親水性相互作用液体クロマトグラフィーにより、少なくとも１つの高純度ノルメタネフリン、メタネフリンおよび３−メトキシチラミン溶出物に分離する。ノルメタネフリン、メタネフリンおよび３−メトキシチラミンからなる群の少なくとも１つの存在に対応する１以上のピークを示す高純度ノルメタネフリン、メタネフリンおよび３−メトキシチラミン溶出物を質量分析計に導入し、ノルメタネフリン、メタネフリンおよび３−メトキシチラミンからなる群の少なくとも１つの存在および量に関連する質量対電荷信号（ｍａｓｓ  ｔｏ  ｃｈａｒｇｅ  ｓｉｇｎａｌ）を生成する。ノルメタネフリン、メタネフリンおよび３−メトキシチラミンの群の少なくとも１つの存在および異常量はカテコールアミンを分泌する腫瘍の存在もしくは不在を示すものである。
【０００７】
好ましくは、弱カチオン交換樹脂は１以上の弱カチオン交換官能基を有する水湿潤性有機ポリマーである。好ましい有機ポリマーは、少なくとも１つの親水性モノマーおよび少なくとも１つの疎水性モノマーより選択されるモノマーから誘導される。限定なしの例として、好ましい疎水性モノマーの１つはジビニルベンゼンである。好ましい親水性モノマーにはＮ−ビニルピロリドンおよびビニルピリジンが含まれる。好ましい弱カチオン交換基の１つはカルボキシルである。
【０００８】
好ましくは、この方法は内部標準をサンプルに添加する工程をさらに含む。内部標準は、好ましくは、ノルメタネフリン、メタネフリンおよび３−メトキシチラミンを含む群の少なくとも１つの重水素化形態の少なくとも１つの公知量である。好ましくは、カテコールアミン代謝物の血漿レベルは、非標識ノルメタネフリンレベル、非標識メタネフリンレベルおよび非標識３−メトキシチラミンレベルをサンプル中の重水素化ノルメタネフリン、重水素化メタネフリンおよび重水素化３−メトキシチラミン濃度と比較することによって決定する。
【０００９】
好ましくは、質量分析計は正イオン化モードで作動させる。メタネフリンはプロトン化して質量対電荷１９８のイオンを形成する。ノルメタネフリンはプロトン化して質量対電荷１８４のイオンを形成する。３−メトキシチラミンはプロトン化して１６８の質量電荷比（ｍａｓｓ  ｔｏ  ｃｈａｒｇｅ  ｒａｔｉｏｎ）のイオンを形成する。メタネフリンは、典型的に、水を失って１８０の質量対電荷を有するイオンを形成する。ノルメタネフリンは、典型的に、水を失って１６６の質量対電荷を有するイオンを形成する。３−メトキシチラミンは、典型的に、アンモニアを失って１５１の質量電荷比を有するイオンを形成する。
【００１０】
好ましくは、質量分析計は衝突フラグメンテーションを用いて、１４８の質量対電荷を有するメタネフリンの１以上のイオンフラグメント、１３４の質量対電荷を有するノルメタネフリンの１以上のイオンフラグメントおよび１１９の質量電荷比を有する３−メトキシチラミンの１以上のイオンフラグメントを形成する。
【００１１】
質量分析計によって決定されるフラグメントもしくは分子全体の存在および濃度がサンプルに関係する。これらの濃度は比較された対照値である。約０．３ｎｍｏｌ毎リットルを上回るメタネフリンの濃度は褐色細胞腫を示唆する。約１．２ｎｍｏｌ毎リットルを上回るノルメタネフリンの濃度は褐色細胞腫を示唆する。約０．２ｎｍｏｌ毎リットルを上回る３−メトキシチラミンの濃度は褐色細胞腫を示唆する。
【００１２】
本発明のさらなる実施形態は、血漿中のノルメタネフリン、メタネフリンおよび３−メトキシチラミンを検出するための装置に向けられる。繰り返しになるが、ノルメタネフリン、メタネフリンおよび３−メトキシチラミンの存在および異常濃度はカテコールアミン分泌性腫瘍を潜在的に示すものである。
【００１３】
この装置は、ノルメタネフリン、メタネフリンおよび３−メトキシチラミンの群の少なくとも１つを弱カチオン交換樹脂で血漿タンパク質および構成物質から分離して保持されたノルメタネフリン、メタネフリンおよび３−メトキシチラミンの群の少なくとも１つを形成し、並びに保持されたノルメタネフリン、メタネフリンおよび３−メトキシチラミンを酸移動相で弱カチオン交換樹脂から溶出してノルメタネフリン、メタネフリンおよび３−メトキシチラミン溶出物の群の少なくとも１つを形成するための分離および溶出手段を含む。分離および溶出手段は１以上の血漿サンプルを１以上の被験者から受けるものであり、液体クロマトグラフィー手段と液通する。分離および溶出手段は制御手段と通信状態にあり、サンプル識別子（ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）信号を送信する。この装置は、ノルメタネフリン、メタネフリンおよび３−メトキシチラミン溶出物の群の少なくとも１つをオンライン親水性相互作用液体クロマトグラフィーによって高純度ノルメタネフリン、メタネフリンおよび３−メトキシチラミン溶出物を含む群の少なくとも１つに分離するための液体クロマトグラフ手段をさらに含む。高純度ノルメタネフリン、メタネフリンおよび３−メトキシチラミン溶出物はメタネフリン、ノルメタネフリンおよび３−メトキシチラミンからなる群の少なくとも１つの存在に対応する１以上のピークを示す。液体クロマトグラフ手段は質量分析計手段と液通し、制御手段と通信状態にある。液体クロマトグラフは高純度ノルメタネフリン、メタネフリンおよび３−メトキシチラミン溶出物をサンプル識別子信号と関連付けて維持する。この装置は、高純度ノルメタネフリン、メタネフリンおよび３−メトキシチラミン溶出物の少なくとも１つを受けてノルメタネフリン、メタネフリンおよび３−メトキシチラミンからなる群の少なくとも１つの存在および量に関連する少なくとも１つの質量対電荷信号を生成するための質量分析計手段をさらに含む。質量分析計手段は制御手段と通信状態にある。この装置は、サンプル識別子信号および質量対電荷信号を受信し、質量対電荷信号をサンプル識別子信号に関連付けるための制御手段をさらに含む。制御手段は質量対電荷信号を対照値と比較してカテコールアミンを分泌する腫瘍の存在もしくは不在を被験者に示唆する。
【００１４】
分離および溶出手段は、本発明の脈絡においては、非常に異なる保持特性を有する化合物の分離に用いられるサンプル調製システムを指す。液体クロマトグラフ手段は分析レベルで分離が可能な分離システムを指す。質量分析計手段は質量分析計のあらゆる形態、例えば、例として、イオントラップ・シングル質量分析計、二連および三連四重極質量分析計並びに飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析計を指す。本明細書で用いられる場合、「液通」という用語は流体を受容もしくは移送するように配管されていることを指し、内外への流体の注入を包含する。「通信」状態という用語は、ワイヤ、光ファイバもしくはワイヤレス無線通信によりデータもしくは指示もしくは命令を電磁気的、光学的様式で受信もしくは送信する信号の伝達を指す。
【００１５】
本発明のさらなる実施形態は、メタネフリン、ノルメタネフリンおよび３−メトキシチラミンから選択される、血漿中の天然カテコールアミンの代謝物の群の少なくとも１つの分析を実施するためのキットに向けられる。このキットは、分析を実施するための質量分析計の標準およびキャリブレータをこれらの使用に適する取扱説明書と共に含む。このキットは、好ましくは、提供される試薬および物質に適する包装および封入物を有する。
【００１６】
これらの、および他の特徴および利点は、図を閲覧し、以下の詳細な説明を読むことで明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の特徴を具現する機器の模式図を示す。
【図２】本発明の特徴を具現するキットを示す。
【図３Ａ】質量分析測定によって得られるノルメタネフリンの生成物イオンスペクトルを示す。
【図３Ｂ】質量分析測定によって得られるメタネフリンの生成物イオンスペクトルを示す。
【図４Ａ】メタネフリンを添加した血漿サンプルを注入することによって得られるキャリブレーション線を示す。
【図４Ｂ】ノルメタネフリンを添加した血漿サンプルを注入することによって得られるキャリブレーション線を示す。
【図５Ａ】０．１６ｎｍｏｌ／Ｌメタネフリンおよびｄ３−メタネフリン約１ｎｍｏｌ／Ｌを含有する血漿サンプルの多反応監視クロマトグラムを示す。
【図５Ｂ】０．１６ｎｍｏｌ／Ｌメタネフリンおよびｄ３−メタネフリン約１ｎｍｏｌ／Ｌを含有する血漿サンプルの多反応監視クロマトグラムを示す。
【図５Ｃ】０．３８ｎｍｏｌ／Ｌノルメタネフリンおよび３−ノルメタネフリン約１ｎｍｏｌ／Ｌを含有する血漿サンプルの多反応監視クロマトグラムを示す。
【図５Ｄ】０．３８ｎｍｏｌ／Ｌノルメタネフリンおよび３−ノルメタネフリン約１ｎｍｏｌ／Ｌを含有する血漿サンプルの多反応監視クロマトグラムを示す。
【図６Ａ】健康であると推察される患者から得られる血漿サンプルの小セット（ｎ＝１０２）からのメタネフリンの参照範囲を示す。
【図６Ｂ】健康であると考えられる患者から得られる血漿サンプルの小セット（ｎ＝１０２）からのノルメタネフリンの参照範囲を示す。
【図７Ａ】液体クロマトグラフィーおよびＭＲＭモードのＭＳ／ＭＳによる、遊離血漿メタネフリン、ノルメタネフリンおよび３−メトキシチラミン並びにこれらの重水素化内部標準のクロマトグラムを示す。
【図７Ｂ】液体クロマトグラフィーおよびＭＲＭモードのＭＳ／ＭＳによる、遊離血漿メタネフリン、ノルメタネフリンおよび３−メトキシチラミン並びにこれらの重水素化内部標準のクロマトグラムを示す。
【図７Ｃ】液体クロマトグラフィーおよびＭＲＭモードのＭＳ／ＭＳによる、遊離血漿メタネフリン、ノルメタネフリンおよび３−メトキシチラミン並びにこれらの重水素化内部標準のクロマトグラムを示す。
【図７Ｄ】液体クロマトグラフィーおよびＭＲＭモードのＭＳ／ＭＳによる、遊離血漿メタネフリン、ノルメタネフリンおよび３−メトキシチラミン並びにこれらの重水素化内部標準のクロマトグラムを示す。
【図７Ｅ】液体クロマトグラフィーおよびＭＲＭモードのＭＳ／ＭＳによる、遊離血漿メタネフリン、ノルメタネフリンおよび３−メトキシチラミン並びにこれらの重水素化内部標準のクロマトグラムを示す。
【図７Ｆ】液体クロマトグラフィーおよびＭＲＭモードのＭＳ／ＭＳによる、遊離血漿メタネフリン、ノルメタネフリンおよび３−メトキシチラミン並びにこれらの重水素化内部標準のクロマトグラムを示す。
【図７Ｇ】液体クロマトグラフィーおよびＭＲＭモードのＭＳ／ＭＳによる、遊離血漿メタネフリン、ノルメタネフリンおよび３−メトキシチラミン並びにこれらの重水素化内部標準のクロマトグラムを示す。
【図７Ｈ】液体クロマトグラフィーおよびＭＲＭモードのＭＳ／ＭＳによる、遊離血漿メタネフリン、ノルメタネフリンおよび３−メトキシチラミン並びにこれらの重水素化内部標準のクロマトグラムを示す。
【図７Ｉ】液体クロマトグラフィーおよびＭＲＭモードのＭＳ／ＭＳによる、遊離血漿メタネフリン、ノルメタネフリンおよび３−メトキシチラミン並びにこれらの重水素化内部標準のクロマトグラムを示す。
【図７Ｊ】液体クロマトグラフィーおよびＭＲＭモードのＭＳ／ＭＳによる、遊離血漿メタネフリン、ノルメタネフリンおよび３−メトキシチラミン並びにこれらの重水素化内部標準のクロマトグラムを示す。
【図７Ｋ】液体クロマトグラフィーおよびＭＲＭモードのＭＳ／ＭＳによる、遊離血漿メタネフリン、ノルメタネフリンおよび３−メトキシチラミン並びにこれらの重水素化内部標準のクロマトグラムを示す。
【図７Ｌ】液体クロマトグラフィーおよびＭＲＭモードのＭＳ／ＭＳによる、遊離血漿メタネフリン、ノルメタネフリンおよび３−メトキシチラミン並びにこれらの重水素化内部標準のクロマトグラムを示す。
【図８Ａ】１２０名の個人からの参照サンプル中の分画血漿遊離メタネフリンの分布をｎｍｏｌ毎リットルで示す。
【図８Ｂ】１２０名の個人からの参照サンプル中の分画血漿遊離ノルメタネフリンの分布をｎｍｏｌ毎リットルで示す。
【図８Ｃ】１２０名の個人からの参照サンプル中の分画血漿遊離３−メトキシチラミンの分布をｎｍｏｌ毎リットルで示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の実施形態を、血漿中のノルメタネフリン、メタネフリンおよび３−メトキシチラミンから選択される化合物の群の少なくとも１つを検出するための方法および装置並びに血漿中のノルメタネフリン、メタネフリンおよび３−メトキシチラミンから選択される化合物の群の少なくとも１つを検出するためのキットに関して説明する。これらの装置、キットおよび方法は血漿中のノルメタネフリン、メタネフリンおよび３−メトキシチラミンから選択される化合物の群の少なくとも１つの存在および異常濃度の検出についての有用性を有する。血漿中のノルメタネフリン、メタネフリンおよび３−メトキシチラミンの異常増加はカテコールアミン分泌性腫瘍を潜在的に示すものである。当業者は、褐色細胞腫およびカテコールアミン分泌性腫瘍に関連する他の疾患状態の診断に対する本発明の実施形態の診断上の有用性を認める。
【００１９】
数字１１によって一般的に示される、血漿中のノルメタネフリン、メタネフリンおよび３−メトキシチラミンから選択される化合物の群の少なくとも１つを検出するための装置が図１に示される。この装置は以下の主要機素を含む。即ち、分離および溶出手段１３、液体クロマトグラフ手段１５、質量分析計手段１７並びに制御手段１９である。
【００２０】
分離および溶出手段１３は、ノルメタネフリン、メタネフリンおよび３−メトキシチラミンを各々他者から、並びに血漿タンパク質および構成物質から分離するためのものである。分離および溶出手段は、シリンジ２３によって模式的に示されるように、患者から得られる１以上のサンプルを受ける。サンプルは血液サンプルとして得、遠心によって処理して血球を血漿から分離する。
【００２１】
好ましくは、サンプルは、標識ノルメタネフリン、標識メタネフリンおよび標識３−メトキシチラミン既知量を含有する標準希釈溶液で希釈する。好ましい標識ノルメタネフリン、メタネフリンおよび３−メトキシチラミンは重水素化ノルメタネフリン、重水素化メタネフリンおよび重水素化３−メトキシチラミンであり、これらは内部標準としての役割を果たす。標識ノルメタネフリン、標識メタネフリンおよび標識３−メトキシチラミンは、質量分析計手段１７による非標識ノルメタネフリン、非標識メタネフリンおよび非標識３−メトキシチラミンの定量を可能にする。
【００２２】
希釈した血漿サンプルは、円形トレー２５におけるネスティング（ｎｅｓｔｉｎｇ）として示されるバイアルまたは抽出カートリッジ［図示せず］またはマルチウェルプレートのトレー［図示せず］に入れる。抽出カートリッジおよびマルチウェルプレートは当分野において周知である。サンプルは、光学的もしくは電子的手段、例えば、バーコード、磁気ストライプもしくはメモリーチップによってバイアルまたはウェルもしくはトレー位置を患者に結びつけることができるように索引を作成し、制御手段１９に入力する。
【００２３】
血漿は分離および溶出手段内の弱カチオン交換樹脂を強制通過させ、存在するのであれば、少なくとも１つの保持されたノルメタネフリン、メタネフリンおよび３−メトキシチラミンを形成する。弱カチオン交換樹脂はカートリッジカラム、バイアルもしくはマルチウェルプレート内または分離および溶出手段内の分離カラム内に保持される。図示されるように、バイアルは分離および溶出手段１３内に支持され、アリコートが引き出されてカラム２７に導入される。
【００２４】
カラム２７、カートリッジカラム、バイアルもしくはマルチウェルプレートには弱カチオン交換樹脂を充填する。好ましくは、弱カチオン交換樹脂は、この媒体を湿潤および再湿潤させることを可能にする水湿潤性である。好ましい樹脂は有機ポリマー組成物を有する水湿潤性弱カチオン交換樹脂である。好ましい有機ポリマーは少なくとも１つの親水性モノマーおよび少なくとも１つの疎水性モノマーから選択されるモノマーから誘導される。限定なしの例として、好ましい疎水性モノマーの１つはジビニルベンゼンである。好ましい親水性モノマーにはＮ−ビニルピロリドンおよびビニルピリジンが含まれる。好ましい弱カチオン交換基の１つはカルボキシルである。好ましいポリマー組成物はＯＡＳＩＳ（登録商標）ＷＣＸ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、マサチューセッツ州、ＵＳＡ）の商品名で販売される。
【００２５】
分離および溶出手段１３は、好ましくは、サンプル処理のためのオンライン固相抽出システムである。これらのシステムは幾つかの製造供給元から入手可能であり、例えば、Ｓｐａｒｋ  Ｈｏｌｌａｎｄ（Ｅｍｍｅｎ、オランダ）によって販売されるＳｙｍｂｉｏｓｉｓ（登録商標）Ｐｈａｒｍａ  Ｓｙｓｔｅｍがある。分離および溶出手段１３は制御手段１９と通信状態にあり、液体クロマトグラフ手段１５と液通する。
【００２６】
制御手段１９は索引データを分離および溶出手段１３から受信し、下流構成要素からのデータをサンプルを引き出した個々の被験者に遡って関連付けることを可能にする。制御手段１９はコンピュータ型装置、例えば、装置１１に組み込まれたコンピュータ処理ユニット（ＣＰＵ）または、適切なソフトウェア制御を備えるメインフレームコンピュータ、ポータブル、デスクトップ、ラップトップもしくはサーバ型コンピュータを限定なしの例として含む、コンピュータである。コンピュータは多数の製造供給元、例えば、ＵＳＡ、カリフォルニア州、ＣｕｐｅｒｔｉｎｏのＡｐｐｌｅ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ，ＩｎｃもしくはＵＳＡ、テキサス州、ＨｏｕｓｔｏｎのＤｅｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって販売されている。好ましいソフトウェアシステムには、Ｓｐａｒｋ  Ｈｏｌｌａｎｄから入手可能なＳｐａｒｋｌｉｎｋ  ｖ．３．０およびＷａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能なＭａｓｓＬｙｎｘ  ｖ．４．０が含まれる。
【００２７】
分離および溶出手段は酸移動相の源［図示せず］と液通する。ノルメタネフリン、メタネフリンおよび３−メトキシチラミンの少なくとも１つは、存在するのであれば、カラム２７に保持され、他の血漿構成物質は廃棄物［図示せず］に導かれる。制御手段は、カラム２７を通して酸移動相を汲み上げ、ノルメタネフリン、メタネフリンおよび３−メトキシチラミン溶出物の少なくとも１つを、このような化合物がサンプル中に元来存在するのであれば形成するように、分離および溶出手段１３に指示する。
【００２８】
ノルメタネフリン、メタネフリンおよび／もしくは３−メトキシチラミン溶出物は液体クロマトグラフ手段１５に導入される。液体クロマトグラフ手段１５は、ノルメタネフリン、メタネフリンおよび３−メトキシチラミン溶出物をオンライン親水性相互作用液体クロマトグラフィーによって少なくとも１つの高純度ノルメタネフリン溶出物、高純度メタネフリン溶出物および高純度３−メトキシチラミン溶出物にそれぞれ分離するためのものである。液体クロマトグラフ手段１５は幾つかの製造供給元から入手可能であり、例えば、Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能なＡＬＬＩＡＮＣＥ（登録商標）分離モジュールおよびＡＣＱＵＩＴＹ（登録商標）分離モジュール並びにＡｇｉｌｅｎｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、カリフォルニア州、ＵＳＡ）から入手可能な１１００  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｓｙｓｔｅｍがある。
【００２９】
本明細書で用いられる場合、「オンライン」という用語は、分離が高速クロマトグラフィーによって行われることを意味する。親水性相互作用クロマトグラフィーは、親水性を高めるため、疎水性もしくはほとんど有機物の移動相を中性親水性固定相を横切って通過させ、溶液中の化合物を溶出させることによって化合物を分離する分離技術である。
【００３０】
液体クロマトグラフィー手段１５は親水性相互作用クロマトグラフィーを行う微細カラム２９を有する。微細カラム２９は幾つかの製造供給元から入手可能であり、好ましいカラム２９は、シリカ粒子が充填された、Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能なＡＴＬＡＮＴＩＳ（登録商標）Ｂｒａｎｄカラムである。好ましいカラムは３ミクロン粒子を有し、２．１ｍｍ×５０ｍｍである。しかしながら、異なる粒子サイズおよびカラム径を有するカラムを容易に代用することもできる。
【００３１】
高純度ノルメタネフリン溶出物、高純度メタネフリン溶出物および高純度３−メトキシチラミン溶出物はそれぞれメタネフリン、ノルメタネフリンおよび３−メトキシチラミンからなる群の少なくとも１つの存在に対応する１以上のピークを示す。液体クロマトグラフ手段１５は質量分析計手段１７と液通し、制御手段１９と通信状態にある。液体クロマトグラフ手段１７は、高純度ノルメタネフリン溶出物、高純度メタネフリン溶出物および高純度３−メトキシチラミン溶出物をそれぞれ、制御手段１９がデータとして維持するサンプル識別子信号と関連付けて維持する。
【００３２】
質量分析計手段１７は高純度ノルメタネフリン、高純度メタネフリン溶出物および／もしくは高純度３−メトキシチラミン溶出物を受け取り、ノルメタネフリン、メタネフリンおよび３−メトキシチラミンからなる前記群の少なくとも１つの存在および量に関係する少なくとも１つの質量対電荷信号を生成する。質量分析計手段１７は制御手段１９と通信状態にある。質量分析計手段１７は質量分析計のあらゆる形態、例えば、例として、イオントラップ・シングル質量分析計、二連および三連四重極質量分析計、飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析計である。好ましい質量分析計手段１７はＷａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎが販売するＱＵＡＴＴＲＯ  ＭＩＣＲＯ（登録商標）タンデム型質量分析計である。
【００３３】
制御手段１９はサンプル識別子信号および質量対電荷信号を受信し、質量対電荷信号を前記サンプル識別子信号に関連付ける。制御手段は質量対電荷信号を対照値と比較してカテコールアミンを分泌する腫瘍の存在もしくは不在を被験者に示唆し、これらの結果をスクリーンディスプレイ、プリンタ出力またはオペレータへの他の光学的もしくは音響的伝達によって記録および表示する。
【００３４】
好ましくは、分離および溶出手段１３は内部標準を受け取り、この内部標準は、装置１１による同定および定量化を容易にするため、分析に先立ち、もしくはこれと同時に、液体クロマトグラフ手段１５および質量分析計手段１７によって処理され、導入される。内部標準は、好ましくは、ノルメタネフリン、メタネフリンおよび／もしくは３−メトキシチラミンの重水素化形態の少なくとも１つの既知量である。
【００３５】
好ましくは、カテコールアミンの血漿レベルは、非標識ノルメタネフリンレベル、非標識メタネフリンレベルおよび非標識３−メトキシチラミンレベルをサンプル中の対応する重水素化ノルメタネフリン、重水素化メタネフリンおよび重水素化３−メトキシチラミン濃度と比較することによって決定する。
【００３６】
好ましくは、質量分析計は正イオン化モードで作動させる。メタネフリンはプロトン化して１９８の質量対電荷のイオンを形成する。ノルメタネフリンはプロトン化して１８４の質量対電荷のイオンを形成する。３−メトキシチラミンはプロトン化して１６８の質量電荷比のイオンを形成する。メタネフリンは、典型的に、水を失って１８０の質量対電荷を有するイオンを形成する。ノルメタネフリンは、典型的に、水を失って１６６の質量対電荷を有するイオンを形成する。３−メトキシチラミンは、典型的に、アンモニアを失って１５１の質量電荷比を有するイオンを形成する。
【００３７】
好ましくは、質量分析計は衝突フラグメンテーションを用いて、１４８の質量対電荷を有するメタネフリンの１以上のイオンフラグメント、および１３４の質量対電荷を有するノルメタネフリンの１以上のイオンフラグメント、および１１９の質量電荷比を有する３−メトキシチラミンの１以上のイオンフラグメントを形成する。
【００３８】
質量分析計によって決定されるフラグメントもしくは分子全体の存在および濃度がサンプルに関係する。これらの濃度は制御手段１９もしくはオペレータによって比較された対照値である。約０．３ｎｍｏｌ毎リットルを上回るメタネフリンの濃度は褐色細胞腫を示唆する。約１．２ｎｍｏｌ毎リットルを上回るノルメタネフリンの濃度は褐色細胞腫を示唆する。約０．２ｎｍｏｌ毎リットルを上回る３−メトキシチラミンの濃度は褐色細胞腫を示唆する。
【００３９】
ここで図２を見ると、数字５１によって一般に示される、メタネフリン  ノルメタネフリンおよび３−メトキシチラミンから選択される血漿中の天然カテコールアミンの代謝物の群の少なくとも１つの分析を実施するためのキットが示される。このキットは装置１１用の内部標準および試薬を含む。
【００４０】
キット５１は、メタネフリン、ノルメタネフリンをそれぞれ収容する、１以上のバイアルもしくは容器１３ａ、１３ｂおよび１３ｃを有する。これらの化合物は、標識もしくは非標識形態にあるノルメタネフリン、メタネフリンおよび３−メトキシチラミンの既知量を含有するキャリブレーション溶液の形成に用いられる。キット５１は、好ましくは、カラム２７および微細カラム２９を有する。好ましくは、キット５１は分析を行うための取扱説明書を有する。このキットは、好ましくは、適切な包装、例えば、箱５５を有する。
【００４１】
方法に向けられた本発明の実施形態を以下の実施例に関して説明する。
【実施例１】
【００４２】
患者サンプル
６名の健常ボランティアからの血漿サンプルがＭｅｄｅｖａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、ＵＫ）によって提供され、これらをアッセイの性能特性の評価およびキャリブレータの調整に用いた。さらに１０２の血漿サンプルをメタネフリンおよびノルメタネフリンの参照範囲の予備調査において用いた。これらは健康と推察される患者から収集し、ＵＭＣ  Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ（Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ、オランダ）によって提供されたものである。
【００４３】
標準、キャリブレータおよび品質管理
ノルメタネフリンおよびメタネフリンはＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｌｔｄ（Ｐｏｏｌｅ、ＵＫ）からＤ，Ｌ−メタネフリン．ＨＣｌおよびＤ，Ｌ−ノルメタネフリン．ＨＣｌとして購入した。重水素化内部標準α，α，β−ｄ３−メタネフリン．ＨＣｌおよびα，α，β−ｄ３−ノルメタネフリン．ＨＣｌは、それぞれ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅｓ  Ｉｎｃ．（Ａｎｄｏｖｅｒ、ＭＡ、ＵＳＡ）およびＭｅｄｉｃａｌ  Ｉｓｏｔｏｐｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｐｅｌｈａｍ、ＮＨ、ＵＳＡ）から購入した。
【００４４】
キャリブレータは、１ｍＬ血漿サンプルに、十分な混合に先立って０．１Ｍ  ＨＣｌ中に作製されたノルメタネフリンおよびメタネフリン（１０μＬ）を添加することによって調製した。ＱＣサンプルは、キャリブレータの調製に用いられるものとは無関係であるＭおよびＮＭの原液を用いて、同様の様式で調製した。
【００４５】
質量分析
Ｚ  ＳＰＲＡＹイオン源を有するＱｕａｔｔｒｏマイクロタンデム型質量分光計をすべての分析に用いた（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、ＵＫ）。この機器は正イオン化モードで稼働させ、Ｓｙｍｂｉｏｓｉｓ（登録商標）Ｐｈａｒｍａ（Ｓｐａｒｋ  Ｈｏｌｌａｎｄ、Ｅｍｍｅｎ、オランダ）オンライン固相抽出−液体クロマトグラフィーシステムに直接連結させた。ＭＳシステムの制御およびデータ取得はＭａｓｓＬｙｎｘ  ｖ４．０ソフトウェアをＱｕａｎＬｙｎｘ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｍａｎａｇｅｒによる自動データ処理と共に用いて行った。Ｓｙｍｂｉｏｓｉｓシステムの制御はＳｐａｒｋＬｉｎｋ  ｖ３．０ソフトウェアを用いて行った。
【００４６】
正イオン化モードにおいては、ノルメタネフリンおよびメタネフリンをプロトン化して、それぞれ、ｍ／ｚ１９８およびｍ／ｚ１８４の［Ｍ＋Ｈ］＋の形態のイオンを生成する。これらのイオンは水１０の容易な喪失を生じることが公知であり、イオン源の条件は［Ｍ＋Ｈ−Ｈ２Ｏ］＋の形態のこれらの生じるイオン（Ｍ＝ｍ／ｚ１８０；ＮＭ＝ｍ／ｚ１６６）に対して最適化する。衝突誘起解離（ＣＩＤ）で、これらの前駆体イオンは、図３ａおよび３ｂにおいて最もよく分かるように、ＭおよびＮＭメタネフリンおよびノルメタネフリンに対して、それぞれ、ｍ／ｚ１４８およびｍ／ｚ１３４の特徴的な生成物イオンを生成した。
【００４７】
これらの実験からの情報を用いて、表１に示されるＭＳ法を、０．０７秒の滞留時間を用いるＭＲＭモードでのノルメタネフリンおよびメタネフリン並びにこれらの重水素化類似体の監視に用いた。
【００４８】
【表１】
2010527452.tif 000003
【００４９】
オンライン固相抽出
サンプル体積：４０μＬ（ＩＳ水溶液での血漿の１：１希釈液）
カートリッジ：Ｗａｔｅｒｓ  １０ｍｍ×１ｍｍ  Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＷＣＸ
溶媒和：１ｍＬアセトニトリル  ５ｍＬ／分
平衡化：１ｍＬ水  ５ｍＬ／分
サンプルローディング：１ｍＬ水  ２ｍＬ／分
洗浄１：１ｍＬ水  ５ｍＬ／分
洗浄２：１ｍＬアセトニトリル  ５ｍＬ／分
溶出持続時間：ＬＣ移動相で２分
合計抽出時間：バルブ洗浄を含めて２分５５秒
合計サイクル時間：サンプルあたり７分４０秒
液体クロマトグラフィー条件
カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ２．１ｍｍ×５０ｍｍ  ＨＩＬＩＣ；３μｍ
移動相Ａ：アセトニトリル
移動相Ｂ：１００ｍＭ  ギ酸アンモニア＠ｐＨ３
【００５０】
【表２】
2010527452.tif 000004
【００５１】
結果
キャリブレーション線は、図４ａおよび４ｂにおいて最もよく分かるように、ノルメタネフリンおよびメタネフリンについて＞０．９９９の相関係数で試験した範囲にわたって直線であった。
【００５２】
ＭおよびＮＭの定量化の下限（信号対雑音比≧１０）は、図５ａ、５ｂ、５ｃおよび５ｄにおいて最もよく分かるように、それぞれ０．０４および０．１６ｎｍｏｌ／Ｌであった。
【００５３】
ＭおよびＮＭの抽出回収率は、Ｓｙｍｂｉｏｓｉｓ（登録商標）Ｐｈａｒｍａシステムの自動Ｍｅｔｈｏｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ機能を用いて、≧９０％であることが見出された。
【００５４】
アッセイ内変動はＱＣサンプルをＭおよびＮＭについて３つのレベルで用いて算出した。これはすべてのレベルで＜６％であることが見出された（表２）。
【００５５】
【表３】
2010527452.tif 000005
【００５６】
アッセイ間変動は３レベルのＱＣサンプル（ｎ＝１０）および数回のアッセイにわたる患者サンプルからの結果（ｎ＝７）を用いて算出した。両者の場合において、アッセイ間精度は≦１５％であることが見出された（表３）。
【００５７】
【表４】
2010527452.tif 000006
【００５８】
ＭおよびＮＭノルメタネフリンおよびメタネフリンの参照間隔の暫定的な見積もりは、健康であると推測された１０２名の患者のサンプル分析に基づくものであった。参照間隔は、図６ａおよび６ｂにおいて最もよく分かるように、患者サンプル中に見出されるＭおよびＮＭノルメタネフリンおよびメタネフリンの平均濃度±２標準偏差を用いて算出した。
【００５９】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳに連結されているオンライン固相抽出技術の使用は、感度、選択性が改善され、サンプルの取扱が大幅に減少したＰＦＭアッセイをもたらすことが示されている。重水素化内部標準を含有する水での血漿サンプルの単純な希釈とこれに続く遠心が退屈なオフライン抽出法に置き換わる。
【００６０】
高選択性抽出プロセスは弱カチオン交換（ＷＣＸ）媒体を用いて達成する。伝統的に、強塩基は強カチオン交換（ＳＣＸ）媒体を用いて抽出し、そこでは塩基は中和によって溶出しなければならない。四級アミンの場合、これはしばしば不可能であり、より一般的には、塩基性分析物の安定性が損なわれる。Ｗａｔｅｒｓ  Ｏａｓｉｓ（商標）ＷＣＸ媒体を用いると、強塩基はｐＨ＞５でカートリッジ内のカルボキシルイオン交換体に結合し、関心分析物を溶出することなしにカートリッジを水および１００％アセトニトリルで洗浄することが可能となる。その後、クロマトグラフィー法において酸性移動相を用いることを許容することにより、カートリッジの溶出を行う。
【００６１】
極性塩基の分析へのＨＩＬＩＣ化学の使用は、エレクロトスプレーイオン化を用いるときに伝統的な逆相法よりも高い感度を有する、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイをもたらす。関心分析物は高濃度の有機溶媒（約７５％）で溶出し、脱溶媒和プロセスはより効率的である。
【００６２】
アッセイの妥当性の暫定的な指標として、患者サンプル（ｎ＝１０２）の小群におけるＭおよびＮＭノルメタネフリンおよびメタネフリンレベルを仮参照間隔の算出に用いた（図６ａおよび６ｂ）。ＭおよびＮＭについて、それぞれ、０．０５から０．４７ｎｍｏｌ／Ｌおよび０．１２から１．１ｎｍｏｌ／Ｌの参照範囲を示唆する、従来の研究１０におけるものに非常に一致することが見出された。検体収集策、特に、血液サンプルを得るときの患者の位置がＭおよびＮＭノルメタネフリンおよびメタネフリンレベルに対する重要な因果関係を有し得ることに注意すべきである。
【００６３】
ＳＰＡＲＫ  ＳＹＭＢＩＯＳＩＳ（登録商標）ｐｈａｒｍａシステムおよびｗａｔｅｒｓ  ＱＵＡＴＴＲＯ  ＭＩＣＲＯ（商標）を用いる、サンプル予備処理を最小限に止めたヒト血漿原液中のノルメタネフリンおよびメタネフリンの決定を示した。Ｗａｔｅｒ  Ｏａｓｉｓ（商標）ＷＣＸ抽出媒体の使用は複合マトリックス中の高度に塩基性の分析物に選択的なサンプル一掃をもたらすのに用いることができる。ｗａｔｅｒｓ  ＨＩＬＩＣ化学と共に用いられるＷＡＴＥＲＳ  ＱＵＡＴＴＲＯ  ＭＩＣＲＯ（商標）は高極性塩基性分析物低レベルの高感度分析法をもたらし得る。
【実施例２】
【００６４】
この実施例ではメタネフリンに対して「ＭＮ」、ノルメタネフリンに対して「ＮＭＮ」および３−メトキシチラミンに対して「３−ＭＴ」の略語を用いる。
【００６５】
材料および方法
試薬
ＨＰＬＣ級アセトニトリルおよびメタノールはＲａｔｈｂｕｒｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｌｔｄ（Ｗａｌｋｅｒｂｕｒｎ、スコットランド）から入手した；リン酸アンモニウム９９．９９５＋％および二ナトリウムＥＤＴＡはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｌｔｄ（Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ、ドイツ）から購入した。ギ酸９８から１００％超純粋はＢＤＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｕｐｐｌｉｅｓ（Ｐｏｏｌｅ、ＵＫ）から供給された；オルト−リン酸９５％（ｐ．ａ．）、２−プロパノール（ｐ．ａ．）およびメタ亜硫酸水素ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ５）はすべてＭｅｒｃｋ  ＫＧａＡ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）から購入した。水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）および塩酸は自家製造であった。Ｂａｒｎｓｔｅａｄ  ｓｙｓｔｅｍから入手した試薬級水を全体を通して用いた。
【００６６】
Ｄ，Ｌ−メタネフリン．ＨＣｌ、Ｄ，Ｌ−ノルメタネフリン．ＨＣｌおよびＤ，Ｌ−３−メトキシチラミン．ＨＣｌはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｌｔｄ（Ｐｏｏｌｅ、ＵＫ）から購入した。重水素化内部標準α，α，β−ｄ３−メタネフリン．ＨＣｌおよびα，α，β，β−ｄ４−３−メトキシチラミン．ＨＣｌはＣａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅｓ  Ｉｎｃ．（Ａｎｄｏｖｅｒ、ＭＡ）から購入した；α，α，β−ｄ３−ノルメタネフリン．ＨＣｌはＭｅｄｉｃａｌ  Ｉｓｏｔｏｐｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｐｅｌｈａｍ、ＮＨ）から購入した。
【００６７】
原液およびサンプル
原液は０．１ｍｏｌ／Ｌ  ＨＣｌ中に調製した。原液は連続的に希釈し、キャリブレータ並びに添加によりプールされた血漿において低、中および高品質対照サンプルを形成するのに用いた。キャリブレータの濃度範囲はすべての分析物について生理学的レベル（０から１ｎｍｏｌ／Ｌ）から約２０ｎｍｏｌ／Ｌまでであった。健常対照者および褐色細胞腫が確認された患者（尿分画メタネフリンに日常的に用いられるＧＣ−ＭＳ法および病理報告による確証）からの血漿サンプルは、オランダ、ＧｒｏｎｉｎｇｅｎのＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｒｏｔｉｎｇｅｎ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＵＭＣＧ）に由来するものであった。血液サンプルは、患者を座位にして静脈穿刺により、Ｋ２ＥＤＴＡ溶液を抗凝血剤として収容する１０ｍＬ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ  Ｔｕｂｅｓ（Ｂｅｃｔｏｎ  ａｎｄ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）内に収集した。遠心後、得られた血漿を、１５０ｍｇ  Ｎａ２Ｓ２Ｏ５を保存剤として収容するガラス管に移した。サンプルは分析まで−２０℃で保存した。
【００６８】
分析に先立ち、血漿サンプルのアリコート（５００μＬ）を１００μＬ内部標準原液（希釈酸中に４．９５ｎｍｏｌ／Ｌ）と混合し、４００μＬ水で希釈した。サンプルバイアルをオートサンプラに入れ、各サンプル１００μＬ（血漿５０μＬに等価）を注入した。
【００６９】
分析および定量
計測器具。Ｓｐａｒｋ  Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｓｙｍｂｉｏｓｉｓ（登録商標）（Ｓｐａｒｋ  Ｈｏｌｌａｎｄ、Ｅｍｍｅｎ、オランダ）オンライン固相抽出システムをすべての分析に用いた。このシステムは温度制御オートサンプラ（温度は１０℃に維持される。）、ＳＰＥ制御器ユニット（自動カートリッジ交換器；ＡＣＥ）、溶媒送達ユニット（２台の高圧ディスペンサ）およびＨＰＬＣポンプからなる。ＡＣＥモジュールは２つの連結可能な６方向バルブおよびＳＰＥカートリッジ交換モジュールを含んでいた。高圧ディスペンサはＳＰＥカートリッジに状態調節、平衡化、サンプル適用および洗浄用の溶媒をもたらす。用いられる一体型ＨＰＬＣポンプは二元高圧勾配ポンプであった。
【００７０】
Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＷＣＸ（弱カチオン交換）１０ｍｍ×１ｍｍ  ＳＰＥカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）をサンプル抽出に用いた。ＨＰＬＣはＡｔｌａｎｔｉｓ  ＨＩＬＩＣ  Ｓｉｌｉｃａカラム（粒子サイズ３μｍ；２．１ｍｍ  Ｉ．Ｄ．×５０ｍｍ；Ｗａｔｅｒｓ）を用いて行った。カラムの温度はＭｉｓｔｒａｌ  Ｃｏｌｕｍｎ  Ｏｖｅｎ（Ｓｐａｒｋ  Ｈｏｌｌａｎｄ）で制御した。検出は、正エレクトロスプレーイオン化モードで稼働するＺ  Ｓｐｒａｙ（登録商標）イオン源を備えるＱｕａｔｔｒｏ（登録商標）Ｐｒｅｍｉｅｒタンデム型質量分析計（Ｗａｔｅｒｓ）で行った。システム操作およびデータ取得のすべての状況はＭａｓｓＬｙｎｘ  ｖ４．１ソフトウェアをＱｕａｎＬｙｎｘ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｍａｎａｇｅｒを用いる自動データ処理と共に用いて制御した。
【００７１】
オンライン−ＳＰＥ。オンラインＳＰＥはＫｅｍａら（１７）によって記載されるものに類似する方法に従って行った。Ｓｙｍｂｉｏｓｉｓ（登録商標）システムは、一連のプログラム可能な所定作業（その最中にＳＰＥカートリッジが装着され、洗浄され、溶出される。）を通して自動的に進行するように設計した。分析物は分析カラム上で直接希釈し、表４において指定される。
【００７２】
【表５】
2010527452.tif 000007
【００７３】
第１工程において、ＳＰＥカートリッジは状態調節および平衡化のために左クランプに自動的に装着された。これに続いて、水をローディング溶媒として用いてサンプルが抽出カートリッジ上に渡され、洗浄溶媒が適用された。次に、抽出カートリッジが、カートリッジにクロマトグラフィー移動相を２分間通過させることによって分析物を分析カラム上に直接溶出するため、右クランプに自動的に移送された。溶出の後、分析カラムでのクロマトグラフィー分離が生じ、カートリッジを収容する右クランプがフラッシュされた。次の血漿サンプルの処理が平行して行われた。
【００７４】
液体クロマトグラフィー。ギ酸でｐＨ３．０に調整した水中の１００ｍｍｏｌ／Ｌギ酸アンモニウム（溶離液Ａ）およびアセトニトリル（溶離液Ｂ）からなる二元勾配系。勾配溶出は以下の溶出プログラムに従って行った。０から６分、５％Ａ、９５％Ｂ；６から７分  ２０％Ａ、８０％Ｂ；７から８分  ２０％Ａ、８０％Ｂ；８から９分  ５％Ａ、９５％Ｂ；９から１０分  ５％Ａ、９５％Ｂで再平衡化。適用される勾配は直線であった；流速は０．４００ｍｌ／分であった。カラム温度は２０℃で保持した。
【００７５】
質量分析。正イオン化モードにおいて、ＭＮ、ＮＭＮおよび３−ＭＴはプロトン化されて［Ｍ＋Ｈ］＋の形態でイオンを生成する。これらのイオンはイオン源内で水の容易な喪失を受けることが公知である。源条件はこれらの［Ｍ＋Ｈ−Ｈ２Ｏ］＋の形態の生じるイオンに対して最適化した。ＭＮ：ｍ／ｚ１８０；ＮＭＮ：ｍ／ｚ１６６および３−ＭＴ：ｍ／ｚ１５１）。衝突誘起解離（ＣＩＤ）で、これらの前駆体イオンは、それぞれ、ｍ／ｚ１４８、ｍ／ｚ１３４およびｍ／ｚ９１の特徴的な生成物イオンを生成した。４０ｍｓの滞留時間および１０ｍｓのチャンネル間遅延を用いて多反応監視（ＭＲＭ）法を開発した。
【００７６】
品質管理および方法の妥当性
選択性。サンプルＭＮ、ＮＭＮおよび３−ＭＴピークの同定は、キャリブレータの添加（標準添加）の後の化合物特異的質量スペクトルの分析によって検証した。
【００７７】
検出限界。血漿について、ＭＮ、ＮＭＮおよび３−ＭＴを含有する連続希釈サンプルを注入することによって検出限界（ＬＯＤ）および定量限界（ＬＯＱ）を決定した。ＬＯＤは３の信号対雑音比を生じる注入量と定義した。ＬＯＱは１０の信号対雑音比を生じる注入量と定義した。新規ＳＰＥカートリッジで行った連続分析間の持ち越しのパーセンテージは、ブランクおよびメタネフリン高濃度を含む血漿サンプルを交互に注入することによって見積もった。
【００７８】
直線性および精度。分析物ピーク面積の内部標準ピーク面積に対する比を８つの濃度のメタネフリンに対して、ＭＮについては０．２６から１８．２１ｎｍｏｌ／Ｌ、ＮＭＮについては０．８２から１８．２１ｎｍｏｌ／Ｌ、および３−ＭＴについては０．５８から１９．９３ｎｍｏｌ／Ｌの範囲でプロットした。異なる７日に新たなキャリブレーション線を作成して測定した。線はＥｘｃｅｌソフトウェアにより最小二乗直線回帰を用いて算出した。Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＬＳＩ；以前はＮＣＣＬＳ）ＥＰ−６Ｐプロトコルをこの方法の直線性の試験に適用した。アッセイの希釈直線性は添加血漿サンプルを水で連続希釈することによって２回行った。アッセイ内およびアッセイ間変動は、メタネフリンを低、中および高濃度（それぞれ、ＭＮについては０．２６、１．５５および１１．５７ｎｍｏｌ／Ｌ；ＮＭＮについては０．８２、１．８２および２１．３１ｎｍｏｌ／Ｌ、３−ＭＴについては０．５８、１．４１および６．１６ｎｍｏｌ／Ｌ）で含む３つのプールされたサンプルを用いることによって決定した。アッセイ内精度は一続きで測定された６回の反復測定から得た。アッセイ間精度は３週間にわたって異なる６日で評価した。
【００７９】
回収率。メタネフリンを血漿に低、中および高濃度で添加することによって平均相対回収率を見積もった。回収率は、直列に配置される２つのカートリッジを用いて、これらのサンプルの６回の反復測定で測定した。
【００８０】
安定性。添加メタネフリン・サンプル（低、中および高）を異なる保存状態の後に３回測定した。第１セットは直ちにアッセイし、参照点として役立てた；他のセットは１０℃（オートサンプラ温度）および４℃で１６時間、２４時間、４８時間および７日並びに室温で２４時間保存した。残りのサンプルは−２０℃で凍結させ、１から３回の凍結−解凍サイクルの後に安定性を調べた。
【００８１】
生物学的変動、参照値および患者サンプル。生物学的日内および日間変動は、座位にある１０名の健常人（男性５名、女性５名、年齢範囲２０から５６歳、中央値年齢３５．０）から、連続する５日に１日に５回、それぞれ得た血漿を分析することによって決定した。メタネフリン参照間隔は、ＰＲＥＶＥＮＤ研究（１９；２０）の最中に、座位にある健常対照者（男性６３名、女性５７名、年齢範囲３６から８１歳、中央値年齢５４．５）から引き出した１２０の血漿サンプルの分析に基づくものであった。両研究は本発明者らの施設の医学倫理委員会によって認可され、ヘルシンキ宣言の指針に従って実施された。すべての参加者にはインフォームド・コンセントの書面が渡された。参照間隔はＣＬＳＩによって推奨されるＥＰ  Ｅｖａｌｕａｔｏｒ（２１）を用いて算出した。
【００８２】
この方法の診断上の価値を説明するため、組織学的に立証された褐色細胞腫を有する１０名の患者からの血漿サンプルを分析した。
【００８３】
結果
品質管理および方法の妥当性
クロマトグラフィーおよび選択性。抽出を含む合計サンプル分析時間は１１分である。質量分析計が親に加えて娘イオンを高い分析特異性で監視するため、メタネフリンの完全な時間のかかるクロマトグラフィー分離は必要ではなく、重水素化内部標準を用いることができる。ＭＲＭでのＸＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって得られるクロマトグラムを図７に示す。化合物の素性は特異的質量スペクトルによって確認した。図７ＡからＣにおける質量クロマトグラムは健常対照者におけるＭＮ、ＮＭＮおよび３−ＭＴ並びにそれぞれの重水素化内部標準に対する応答を示し、一方、図７ＤからＦは組織学的に立証された褐色細胞腫を有する患者からの応答が高まったクロマトグラムを示す。すべての褐色細胞腫患者の血漿遊離３−ＭＴレベルが増加しているわけではない。健常対照者からのクロマトグラムを褐色細胞腫患者のものと比較することで、患者サンプルにおけるＭＮ（それぞれ、ピーク面積３６０９および１７０３４）およびＮＭＮ濃度（ピーク面積１０８２および９９１５０）の顕著な増加が明らかである。健常対照者においては、ＭＮおよびＮＭＮの両者が少ないが定量可能な量で存在する。
【００８４】
検出限界。ＬＯＤは、ＭＮについて０．０５ｎｍｏｌ／Ｌ、ＮＭＮについて０．０５ｎｍｏｌ／Ｌ、および３−ＭＴについて０．０７ｎｍｏｌ／Ｌであった。（１０の信号対ノイズ比の）定量限界は、それぞれ、０．１０、０．１０および０．１５ｎｍｏｌ／Ｌであった。
【００８５】
カートリッジは、この方法に追加の洗浄工程を適用することにより、新規もしくは再利用ＳＰＥカートリッジで行われる連続分析の間に観察される持ち越しなしに、数回再利用することが可能であった。
【００８６】
直線性および精度。血漿キャリブレーション曲線および対照サンプルは患者サンプルのあらゆるバッチで実施した。直線性は０から２０ｎｍｏｌ／Ｌのキャリブレーション範囲にわたって優秀であり、３つすべての化合物について対応する相関係数（Ｒ２）は一貫して＞０．９９であった。血漿キャリブレーション曲線は日間でＲ２＞０．９９で再現可能であった。低、中および高濃度の添加され、プールされた血漿の平均分析的アッセイ内およびアッセイ間反復性および再現性を表５に示す。
【００８７】
【表６】
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【００８８】
アッセイ内ＣＶ（ｎ＝６）は２．０から２．９％（ＭＮ）、２．０から４．７％（ＮＭＮ）および２．１から３．７％（３−ＭＴ）であった。アッセイ間ＣＶ（ｎ＝６）は１．６から９．４％（ＭＮ）、２．４から８．９％（ＮＭＮ）および３．５から１３．５％（３−ＭＴ）であった。再現性、確度および精度は、匹敵する結果（データは示さず）をもたらす、水性キャリブレーション曲線と同じ方法で測定した。キャリブレーション範囲を超える高メタネフリン濃度を有する血漿サンプルは１００倍まで希釈することができる。
【００８９】
回収率。回収率は９４．４から９９．６％（ＭＮ）、７４．５から９９．１％（ＮＭＮ）および８１．４から９８．５％（３−ＭＴ）の範囲であり、これらが低、中および高濃度レベルについて表６に示される。
【００９０】
【表７】
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【００９１】
安定性。メタネフリンは１０℃もしくは４℃で７日まで保存したヒト血漿中で安定であった。室温では、血漿メタネフリンは２４時間まで安定であった。１、２もしくは３回の凍結−解凍サイクルが施されている血漿中では測定された濃度に変化は観察されなかった。安定性データ（ｎ＝３）は示されていない。
【００９２】
生物学的変動、参照値および患者サンプル。生物学的日内および日間ＣＶ（ｎ＝１０）は、表２に示されるように、それぞれ、９．４および８．４％（ＭＮ）、１５．２％および１３．４％（ＮＭＮ）並びに４４．９％および２３．２％（３−ＭＴ）であった。１２０の参照値の分布は、図８ａ、８ｂおよび８ｃに示されるように、３種類のメタネフリンすべてで右シフトする。従って、参照間隔は、ＣＬＳＩ  Ｃ２８−Ａ２（２２）に従い、ＥＰエバリュエータ（ｅｖａｌｕａｔｏｒ）を用いて変形パラメータ様式（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ  ｍａｎｎｅｒ）で算出した。参照間隔は０．０７から０．３３ｎｍｏｌ／Ｌ（ＭＮ）、０．２３から１．０７ｎｍｏｌ／Ｌ（ＮＭＮ）および＜０．１７ｎｍｏｌ／Ｌ（３−ＭＴ）であった。ＸＬＣ−ＭＳ／ＭＳで測定した、組織学的に立証された褐色細胞腫を有する１０名の患者の上昇した血漿遊離ＮＭＮおよび／もしくはＭＮ濃度は０．１１から１７．９３（平均７．２６）ｎｍｏｌ／Ｌ（ＭＮ）および４．０５から７０．１０（平均２５．８４）ｎｍｏｌ／Ｌ（ＮＭＮ）の範囲であった。
【００９３】
このように、本発明者らは血漿遊離メタネフリンを測定するための方法および装置を説明している。これらの方法および装置は高スループットで正確、精確および線形である。これは、短い分析時間のために大サンプル系列の測定を可能にしながら、分析的変動並びにサンプル調製時間および経費に関してオフライン法を上回る利点を提供する。さらに、この方法は、ＸＬＣ−ＭＳ／ＭＳおよびナノモル濃度範囲での測定を用いることにより、高い感度および特異性を有する。
【００９４】
本発明者らは、本発明の好ましい実施形態を、このような実施形態が本明細書での教示から逸脱することなしに修正および変更が可能であるという理解を伴って、詳細に説明している。従って、本発明は詳細そのものに限定されるべきではなく、以下の特許請求の範囲の主題およびこれらの等価物が包含されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図７Ｈ】
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【図７Ｉ】
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【図７Ｊ】
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【図７Ｋ】
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【図７Ｌ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【国際調査報告】
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