(57)【要約】本発明は、レトロウイルスベクター粒子、アデノウイルスベクター粒子、アデノ随伴ウイルスベクター粒子、ヘルペスウイルスベクター粒子、および水疱性口内炎ウイルスＧタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）などによる偽型ウイルスを含む「標的化」ウイルスおよび非ウイルス粒子に、そしてビロソームまたは他のプロテオリポソーム遺伝子移入ベクターの一部としてウイルスタンパク質を含有する非ウイルスベクターに関連するものである。極めて高い力価を備えたウイルス粒子を含む、向病巣性（病気追求）標的化遺伝子送達系を提供する。特にウイルス粒子は、治療剤または診断剤を疾患部位、たとえば癌転移部位に特異的に送達するように操作される。有害副作用を低減させて癌などの疾患を効果的に治療するための個別化投薬レジメンも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象に少なくとも２×１０９コロニー形成単位／ミリリットル（ｃｆｕ／ｍｌ）の力価レトロウイルスベクターの治療的有効量を投与するステップを含み、前記レトロウイルスベクターが受容体結合領域を含む修飾ウイルスエンベロープタンパク質を含み、前記受容体結合領域が細胞外マトリクス成分に結合する結合領域を有する標的化ポリペプチドを含むように修飾されている、対象における露出された細胞外マトリクスに関連する疾患または障害の発生を予防する、その回帰／再発を治療または回避する方法。
【請求項２】
前記疾患または障害が癌、腫瘍、心血管疾患、慢性炎症、自己免疫疾患、関節リウマチ、狼瘡、糖尿病、乾癬、子宮内膜症、血管新生緑内障、肥満症、肝硬変、結合組織障害、コラーゲンの露出に関連する血管障害、新生内膜、血管病変、再狭窄、線維症、潰瘍性病変、炎症、レーザー損傷、角膜混濁、外科的損傷、関節炎、瘢痕、またはケロイドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記疾患または障害が癌または腫瘍の転移である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記疾患または障害が、乳癌、皮膚癌、骨癌、前立腺癌、肝臓癌、肺癌、脳腫瘍、子宮癌、喉頭癌、胆嚢癌、膵臓癌、直腸癌、副甲状腺癌、甲状腺癌、副腎癌、神経組織癌、頭頸部癌、結腸癌、胃癌、気管支癌、腎臓癌、基底細胞癌、潰瘍型と乳頭型の両方の扁平上皮癌、転移性皮膚癌、骨肉腫、ユーイング肉腫、細網細胞肉腫（ｖｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｃｅｌｌ  ｓａｒｃｏｍａ）、骨髄腫、巨細胞腫、小細胞肺腫瘍、胆石、膵島細胞腫瘍、原発性脳腫瘍、急性および慢性リンパ急性および顆粒球性腫瘍、毛様細胞腫瘍、腺腫、過形成、髄様癌、褐色細胞腫、粘膜神経腫、腸神経節神経腫、過形成性角膜神経腫瘍、マルファン症候群様体質腫瘍、ウィルムス腫瘍、精上皮腫、卵巣腫瘍、平滑筋腫瘍（ｌｅｉｏｍｙｏｍａｔｅｒ  ｔｕｍｏｒ）、子宮頸部異形成および上皮内癌、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、軟組織肉腫、線維肉腫、悪性カルチノイド、局所皮膚病変、菌状息肉腫、横紋筋肉腫、カポジ肉腫、骨原性および他の肉腫、悪性高カルシウム血症、腎細胞腫、真性多血球血症、腺癌、多形神経膠芽腫、白血病、リンパ腫、悪性黒色腫、類表皮癌、ならびに他の癌腫および肉腫から成る群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記疾患または障害が骨肉腫、肉腫、膵臓癌、乳癌、または結腸癌である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
対象に別の治療剤を投与するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記別の治療剤が前記レトロウイルスベクターと異なる化学療法剤または生物剤である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
対象がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記レトロウイルスベクターの投与後に、ヒトが前記レトロウイルスベクターと異なる化学療法剤または生物剤を摂取したときに、前記レトロウイルスの投与に関連する有害な副作用の低減を受ける、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記有害な副作用が脱毛症、抜け毛、薄毛または頭髪収縮（ｍｉｎｉａｔｕｒｉｚａｔｉｏｎ）、骨髄抑制、肝臓および腎臓機能の実質的な有害変化、悪心、嘔吐、粘膜炎、発疹および便秘から成る群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
レトロウイルスベクターの治療用的有効量が局所的に、静脈内に、動脈内に、結腸内に、気管内に、腹腔内に、鼻内に、血管内に、髄腔内に、頭蓋内に、骨髄内に、胸膜内に、皮内に、皮下に、筋肉内に、眼内に、骨内に、および／または滑液包内に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
レトロウイルスベクターの治療的有効量が静脈内注入によって対象に投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記標的化ポリペプチドがコラーゲン結合ドメインである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記コラーゲン結合ドメインがフォンウィルブランド因子のＤ２ドメインに由来するペプチドを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
フォンウィルブランド因子がウシフォンウィルブランド因子である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ペプチドがアミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ  Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｌａ（配列番号：１）を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ペプチドがアミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｌａ（配列番号：２）を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記修飾ウイルスエンベロープタンパク質が両栄養性である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記両栄養性修飾ウイルスエンベロープが４０７０Ａ両栄養性エンベロープタンパク質である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記４０７０Ａ両栄養性エンベロープタンパク質がコラーゲン結合ドメインを含む標的化ポリペプチドを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記標的化ポリペプチドが４０７０Ａ両栄養性エンベロープタンパク質のｇｐ７０部分に含有されている、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記レトロウイルスベクターがプロモータに作動的に連結された異種核酸配列を含み、前記配列が診断用または治療用ポリペプチドをコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記治療用ポリペプチドが癌抑制ポリペプチド、アポトーシス促進性ポリペプチド、チミジンキナーゼ、サイトカイン、および細胞破壊ポリペプチドから成る群より選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞破壊ポリペプチドがサイクリンＧ１のＮ末端欠失変異体である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
サイクリンＧ１の前記Ｎ末端欠失変異体がヒトサイクリンＧ１のおおよそアミノ酸４１から２４９までを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記サイトカインが顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記チミジンキナーゼが単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記レトロウイルスベクターが１．０×１０１０ｃｆｕから１．０×１０１２ｃｆｕまでの１日用量範囲で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
１日用量が５日連続で投与される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
１日用量が週２回投与される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
１日用量が週３回投与される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記レトロウイルスベクターが約１から５００ｍｌの量で投与される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記レトロウイルスベクターが１．０×１０１１ｃｆｕから１×１０１４ｃｆｕまでの１週用量範囲で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
レトロウイルスベクターの治療的有効量が４週間の治療と続く２週間の休止を含む治療サイクルとして投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
前記対象が客観的応答を示す場合に追加の治療サイクルが与えられる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記疾患が癌であり、前記客観的応答が臨床観察、放射線医学的結果、組織学的結果、免疫組織化学的結果および臨床化学的結果を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記臨床観察がカリパスまたは触診によって測定した腫瘍塊縮小、食欲増進、移動性、疼痛減少を含むパフォーマンスステータスの向上、または麻薬使用または酸素の減少を含む支持療法の必要性の低下を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記放射線医学的結果がＭＲＩ、ｘ線、ＣＴ、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴまたは超音波結果を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記組織学的結果がアポトーシス腫瘍または新生血管細胞のパーセンテージ上昇、壊死腫瘍または新生血管細胞のパーセンテージ上昇、先の結果または歴史的対照と比較した反応性線維症のパーセンテージ上昇を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記免疫組織化学結果が腫瘍浸潤リンパ球のパーセンテージ上昇あるいはサイトカイン導入遺伝子を発現している腫瘍細胞の出現またはパーセンテージ上昇を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
プロモータに作動的に連結された異種核酸配列を含むレトロウイルスベクターの治療的有効量を投与するステップをさらに含み、前記配列が別の治療用ポリペプチドをコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項４１】
前記別の治療用ポリペプチドがＧＭ−ＣＳＦである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ウイルス粒子が対象の露出コラーゲンの部位に蓄積する、請求項１に記載の方法。
【請求項４３】
前記露出コラーゲンの部位が腫瘍性病変、活発な血管新生領域、腫瘍性病変、血管損傷領域、外科的部位、炎症部位および組織破壊領域を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
癌細胞を含有する腫瘍（複数を含む）を有する対象を治療用ウイルス粒子で治療する方法であって：
ａ）ｉ）対象の腫瘍中に存在する癌細胞の数、または腫瘍中の腫瘍細胞の総数によって定義されるような対象の腫瘍負荷を決定することと；
ｉｉ）腫瘍負荷に治療用ウイルス粒子の生理的感染多重度（ｐＭＯＩ）を乗算することと；
ｉｉｉ）対象に投与される治療用ウイルス粒子の体積を得るために、得られた数値を治療用ウイルス粒子の力価で除算することと；
によって治療用ウイルス粒子の用量を決定するステップと；
ｂ）前記治療用ウイルス粒子の決定された用量を前記対象に投与するステップと；
ｃ）前記腫瘍（複数を含む）の、治療に対する応答を監視するステップと；
ｄ）ステップａ）〜ｃ）を腫瘍制御のために必要に応じて反復するステップと；
を含む方法。
【請求項４５】
前記レトロウイルスベクターが１．０×１０１０ｃｆｕ〜１．０×１０１２ｃｆｕの１日用量範囲で投与される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
１日用量が５日連続で投与される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
１日用量が週２回投与される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
１日用量が週３回投与される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記レトロウイルスベクターが約１から５００ｍｌの量で投与される、請求項４４に記載の方法。
【請求項５０】
前記レトロウイルスベクターが１×１０１１ｃｆｕから１×１０１４ｃｆｕまでの１週用量範囲で投与される、請求項４４に記載の方法。
【請求項５１】
レトロウイルスベクターの治療的有効量が４週間の治療と、続く２週間の休止とを含む治療サイクルとして投与される、請求項４４に記載の方法。
【請求項５２】
単位がミリリットルの前記治療用ウイルス粒子の用量が、次の一般式：
【数５】
2010509223.tif 000020
（式中、ｐＭＯＩは４から２５０までである）
に基づいて計算される、請求項４４に記載の方法。
【請求項５３】
ｐＭＯＩが約１００である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記腫瘍負荷が次の式：
（標的病変または腫瘍の最長直径の和（ｃｍ））×１×１０９癌細胞／ｃｍ
によって決定される、請求項４４に記載の方法。
【請求項５５】
前記標的病変または腫瘍がカリパスによって、または放射線撮像によって測定される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
放射線撮像がＭＲＩ、ＣＴ、ＰＥＴ、またはＳＰＥＣＴスキャンである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記治療用ウイルス粒子が局所的に、静脈内に、動脈内に、結腸内に、気管内に、腹腔内に、鼻内に、血管内に、髄腔内に、頭蓋内に、骨髄内に、胸膜内に、皮内に、皮下に、筋肉内に、眼内に、骨内に、および／または滑液包内に投与される、請求項４４に記載の方法。
【請求項５８】
前記治療用ウイルス粒子が静脈内注入によって対象に投与される、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記対象がヒトである、請求項４４に記載の方法。
【請求項５９】
前記癌が乳癌、皮膚癌、骨癌、前立腺癌、肝臓癌、肺癌、脳腫瘍、子宮癌、喉頭癌、胆嚢癌、膵臓癌、直腸癌、副甲状腺癌、甲状腺癌、副腎癌、神経組織癌、頭頸部癌、結腸癌、胃癌、気管支癌、腎臓癌、基底細胞癌、潰瘍型と乳頭型の両方の扁平上皮癌、転移性皮膚癌、骨肉腫、ユーイング肉腫、細網細胞肉腫（ｖｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｃｅｌｌ  ｓａｒｃｏｍａ）、骨髄腫、巨細胞腫、小細胞肺腫瘍、胆石、膵島細胞腫瘍、原発性脳腫瘍、急性および慢性リンパ球性および顆粒球性腫瘍、毛様細胞腫瘍、腺腫、過形成、髄様癌、褐色細胞腫、粘膜神経腫、腸神経節神経腫、過形成性角膜神経腫瘍、マルファン症候群様体質腫瘍、ウィルムス腫瘍、精上皮腫、卵巣腫瘍、平滑筋腫瘍（ｌｅｉｏｍｙｏｍａｔｅｒ  ｔｕｍｏｒ）、子宮頸部異形成および上皮内癌、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、軟組織肉腫、悪性カルチノイド、局所皮膚病変、菌状息肉腫、横紋筋肉腫、カポジ肉腫、骨原性および他の肉腫、悪性高カルシウム血症、腎細胞腫、真性多血球血症、腺癌、多形神経膠芽腫、白血病、リンパ腫、悪性黒色腫、および類表皮癌から成る群より選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項６０】
前記癌が骨肉腫、肉腫、膵臓癌、乳癌、または結腸癌である、請求項４４に記載の方法。
【請求項６１】
前記ウイルス粒子が対象の露出コラーゲンの領域に蓄積する、請求項４４に記載の方法。
【請求項６２】
前記露出コラーゲンの領域が腫瘍性病変、活発な血管新生領域、腫瘍性病変、血管損傷領域、外科的部位、炎症部位および組織破壊領域を含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記治療用ウイルス粒子が、コラーゲン結合ドメインを含有するように修飾されたエンベロープタンパク質を有し、前記癌に対する治療剤をコードするレトロウイルスベクターである、請求項４４に記載の方法。
【請求項６４】
前記監視様式が臨床観察、放射線医学的結果、組織学的結果、免疫組織化学的結果および臨床化学的結果から成る群より選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項６５】
前記臨床観察がカリパスまたは触診によって測定した腫瘍塊縮小、食欲増進、移動性を含むパフォーマンスステータスの向上、または麻薬使用または酸素の減少を含む支持療法の必要性の低下を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記放射線医学的結果がＭＲＩ、ｘ線、ＣＴ、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴまたは超音波を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
前記組織学的結果がアポトーシス腫瘍または新生血管細胞のパーセンテージ上昇、壊死腫瘍または新生血管細胞のパーセンテージ上昇、反応性線維症のパーセンテージ上昇を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６８】
前記免疫組織化学的結果が腫瘍浸潤リンパ球のパーセンテージ上昇あるいはサイトカイン導入遺伝子を発現している腫瘍細胞の出現またはパーセンテージ上昇を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６９】
前記レトロウイルスベクターが両栄養性である、請求項６３に記載の方法。
【請求項７０】
前記治療剤がサイクリンＧ１変異体である、請求項６３に記載の方法。
【請求項７１】
前記治療剤がＧＭ−ＣＳＦである、請求項６３に記載の方法。
【請求項７２】
腫瘍制御が腫瘍根絶、完全腫瘍応答、部分腫瘍応答、安定病態、および再発の予防を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項７３】
治療用ウイルス粒子投与の前に、治療用ウイルス粒子投与と同時に、または治療用ウイルス粒子投与に続いて、前記対象に化学治療剤、生物剤、または放射線療法を与えるステップをさらに含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項７４】
癌に対する別の治療剤をコードする追加の治療用ウイルス粒子の投与をさらに含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項７５】
追加のウイルス粒子が他のウイルス粒子の投与の前に、他のウイルス粒子の投与と同時に、または他のウイルス粒子の投与の後に投与される、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記別の治療剤がサイトカインまたはチミジンキナーゼである、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
前記サイトカイン遺伝子がＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−アルファ、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ガンマ；インターロイキン−１（ＩＬ１）、インターロイキン−ベータ（ＩＬ−ベータ）、インターロイキン−２（ＩＬ２）、インターロイキン−４（ＩＬ４）、インターロイキン−５（ＩＬ５）、インターロイキン−６（ＩＬ６）、インターロイキン−８（ＩＬ８）、インターロイキン−１０（ＩＬ１０）、インターロイキン−１２（ＩＬ１２）、インターロイキン−１３（ＩＬ１３）、インターロイキン−１４（ＩＬ１４）、インターロイキン−１５（ＩＬ１５）、インターロイキン−１６（ＩＬ１６）、インターロイキン−１８（ＩＬ１８）、インターロイキン−２３（ＩＬ２３）、およびインターロイキン−２４（ＩＬ２４）から成る群より選択される、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
レトロウイルスベクターであって：
ａ）産生細胞に：
ｉ）コラーゲン結合ドメインを含有するように修飾された４０７０Ａ両栄養性エンベロープタンパク質をコードする核酸配列であって、プロモータに作動的に連結された核酸配列を含む第１のプラスミドと；
ｉｉ）プロモータに作動的に連結され、ウイルスｇａｇ−ｐｏｌポリペプチドをコードする核酸配列と、
プロモータに作動的に連結され、産生細胞に薬物耐性を与えるポリペプチドをコードする核酸配列と、
ＳＶ４０複製起点と、
を含む、第２のプラスミドと；
ｉｉｉ）プロモータに作動可能に連結され、診断用または治療用ポリペプチドをコードする異種核酸配列と、
５’および３’長末端反復配列（ＬＴＲ）と、
ψレトロウイルスパッケージ配列と、
５’ＬＴＲの上流のＣＭＶプロモータと、
プロモータに作動可能に連結され、産生細胞の薬物耐性を与えるポリペプチドをコードする核酸配列と、
ＳＶ４０複製起点と、
を含み、前記産生細胞がＳＶ４０ラージＴ抗原を発現するヒト細胞である、第３のプラスミドと；
を一過性に形質移入するステップと；
ｂ）ａ）の産生細胞を、標的化送達ベクター産生および培養物の上清中への放出を可能にする条件下で培養するステップと；
ｃ）ウイルス粒子を収集するために上清を閉ループマニホールドシステム内に単離および導入するステップと；
ｄ）レトロウイルスベクターを収集するステップと；
を含む方法によって産生されるレトロウイルスベクター。
【請求項７９】
前記第１のプラスミドがＢｖ１／ｐＣＡＥＰプラスミドである、請求項７８に記載のベクター。
【請求項８０】
前記第１のプラスミドがｐＢ−ＲＶＥプラスミドである、請求項７８に記載のベクター。
【請求項８１】
前記第２のプラスミドがｐＣｇｐｎプラスミドである、請求項７８に記載のベクター。
【請求項８２】
前記第３のプラスミドがｐｄｎＧ１／ＵＢＥＲ−ＲＥＸプラスミドである、請求項７８に記載のベクター。
【請求項８３】
前記収集したレトロウイルス粒子が、約１×１０９から１×１０１４までのコロニー形成単位／ミリリットルのウイルス力価を示す、請求項７８に記載のベクター。
【請求項８４】
前記収集したレトロウイルス粒子が、少なくとも２×１０９コロニー形成単位／ミリリットルのウイルス力価を示す、請求項７８に記載のベクター。
【請求項８５】
前記収集したレトロウイルス粒子が、少なくとも５×１０９コロニー形成単位／ミリリットルのウイルス力価を示す、請求項７８に記載のベクター。
【請求項８６】
前記収集したレトロウイルス粒子が、２×１０９から１×１０１４までのコロニー形成単位／ミリリットルのウイルス力価を示す、請求項７８に記載のベクター。
【請求項８７】
前記収集したレトロウイルス粒子が、２×１０９から１×１０１３までのコロニー形成単位／ミリリットルのウイルス力価を示す、請求項７８に記載のベクター。
【請求項８８】
前記ウイルス粒子の直径が５０ｎｍから１５０ｎｍまでである、請求項７８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（相互参照）
本願は、２００６年３月１１日に出願された米国特許出願第１１／５５６，６６６号に対する優先権を主張する。米国特許出願第１１／５５６，６６６号は、２００４年４月２１日に出願された米国特許出願第１０／８２９，９２６号の一部において継続であり、米国特許出願第１０／８２９，９２６号は、２００３年４月２１日に出願された米国仮特許出願第６０／４６４，５７１号からの優先権を主張する。米国特許出願第１１／５５６，６６６号、同第１０／８２９，９２６号および米国仮特許出願第６０／４６４，５７１号は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
本発明は一般に、各種の疾患、障害または状態を治療するための方法および組成物に関するものである。さらに本発明は、治療的に有効なベクターを産生するための方法および系に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
すべての遺伝子療法プロトコルの約７０％が転移癌を治療することを目的としている。有効なプロトコルの大多数はサイトカインまたは腫瘍抗原の細胞ベース遺伝子移入による一部の形式の癌免疫療法を包含するが、残りのプロトコルはプロドラッグ、化学的予防剤、アンチセンス構築物、または腫瘍抑制遺伝子を担持する腫瘍崩壊性ウイルスまたはベクターの腫瘍内送達を包含する。しかし、有効な癌遺伝子療法の開発および展開を妨げてきた主な未解決の問題は、生体内での標的細胞への不十分な送達の問題、すなわち多くの直接治療手法を排除および妨害する問題である（非特許文献１）。この点で、向病巣性ターゲティングの出現は、癌遺伝子療法の新たなパラダイムを開始させる。転移部位での有効ベクター濃度を最適化するために、癌細胞自体ではなく、病巣の組織病理学を標的とすることによって、循環する遺伝子療法ベクターの安全性および有効性は前臨床試験で劇的に向上した（非特許文献２；非特許文献３）。（分裂細胞を選択的に形質導入する）マウス白血病ウイルスベースベクターの固有の特性と、殺腫瘍活性および抗血管新生活性を示す細胞周期制御遺伝子の戦略的特異性によってさらに強化されて（非特許文献４）、向病巣性ベクターの前臨床および臨床性能は、原発癌、遠隔癌、転移癌、および不顕性癌の生理学的調査および治療のための遺伝子薬の全身送達の可能性を確立する。
【０００４】
標的送達系を臨床現場で利用できるような、改良ベクター、改良ベクターを産生するための系、およびこのようなベクターを投与する治療レジメンが望ましい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｔｓｅｎｇ  ａｎｄ  Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎ．Ａｍ．１１：５３７−５６９，２００２
【非特許文献２】Ｇｏｒｄｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：３３４３−３３４７，２０００
【非特許文献３】Ｇｏｒｄｏｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１２：１９３−２０４，２００１
【非特許文献４】Ｇｏｒｄｏｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１２：１９３−２０４，２００１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示は、レトロウイルスベクター粒子、アデノウイルスベクター粒子、アデノ随伴ウイルスベクター粒子、ヘルペスウイルスベクター粒子、および水疱性口内炎ウイルスＧタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）などによる偽型ウイルスを含む「標的化」ウイルスおよび非ウイルス粒子に、そしてビロソームまたは他のプロテオリポソーム遺伝子移入ベクターの一部としてウイルスタンパク質を含有する非ウイルスベクターに関連するものである。
【０００７】
標的化ウイルス粒子の産生のための新規なレトロウイルス発現系と、粒子を産生するために一過性に形質移入されたヒト産生細胞の使用と、ウイルス粒子の大規模産生のための製造プロセスと、標的化ウイルスベクターを収集および貯蔵する方法も提供する。
【０００８】
一実施形態において、標的化送達ベクターを産生する方法を提供する。方法は、産生細胞に１）コラーゲン結合ドメインを含有するように修飾された４０７０Ａ両栄養性エンベロープタンパク質をコードする核酸配列を含む第１のプラスミドと；２）ｉ）プロモータに作動可能に連結され、ウイルスｇａｇ−ｐｏｌポリペプチドをコードする核酸配列と；ｉｉ）プロモータに作動可能に連結され、産生細胞に薬物耐性を与えるポリペプチドをコードする核酸配列と；ｉｉｉ）ＳＶ４０複製起点と；を含む第２のプラスミドと；３）ｉ）プロモータに作動可能に連結され、診断用または治療用ポリペプチドをコードする異種核酸配列と；ｉｉ）５’および３’長末端反復配列と；ｉｉｉ）ψレトロウイルスパッケージ配列；ｉｖ）５’ＬＴＲの上流のＣＭＶプロモータと；ｖ）プロモータに作動可能に連結され、産生細胞の薬物耐性を与えるポリペプチドをコードする核酸配列と；ｖｉ）ＳＶ４０複製起点と；を含む第３のプラスミドと；を一過性に形質移入するステップを含む。産生細胞は、ＳＶ４０ラージＴ抗原を発現するヒト細胞である。一態様において、産生細胞は２９３Ｔ細胞である。
【０００９】
方法は、形質移入された産生細胞を、標的化送達ベクターが培養物の上清中で産生される条件下で培養するステップと、ベクターを収集するために上清を閉ループマニホールドシステム内に単離および導入するステップとをさらに含む。例示的な閉ループマニホールドシステムを図１９Ａと図１９Ｂに示す。一実施形態において、標的化送達ベクターはウイルス粒子である。別の実施形態において、標的化送達ベクターは非ウイルス粒子である。
【００１０】
一態様において、第１のプラスミドはＢｖ１／ｐＣＡＥＰプラスミドであり、第２のプラスミドはｐＣｇｐｎプラスミドであり、第３のプラスミドはｐｄｎＧ１／Ｃ−ＲＥＸプラスミド、ｐｄｎＧ１／Ｃ−ＲＥＸ  ＩＩプラスミド、ｐｄｎＧ１／ＵＢＥＲ−ＲＥＸ  プラスミドである。
【００１１】
収集した粒子は一般に約１×１０７〜１×１０１１、１×１０８〜１×１０１１、１×１０９〜１×１０１１、５×１０８〜５×１０１０、２×１０９〜５×１０１０、３×１０９〜５×１０１０、４×１０９〜１×１０１０、５×１０９〜１×１０１０、３×１０９〜５×１０１１、少なくとも５×１０８、１×ｌ０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、８×１０９、１×１０１０、５×１０１０、または１×１０１１コロニー形成単位（ｃｆｕ）／ミリリットルのウイルス力価を示す。加えて、ウイルス粒子は一般に、直径約１０ｎｍ〜１０００ｎｍ、２０ｎｍ〜５００ｎｍ、５０ｎｍ〜３００ｎｍ、５０ｎｍ〜２００ｎｍ、または５０ｎｍ〜１５０ｎｍである。
【００１２】
一実施形態において、コラーゲン結合ドメインはフォンウィルブランド因子のＤ２ドメインに由来するペプチドを含む。一般に、フォンウィルブランド因子は哺乳類に由来する。ペプチドはアミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ  Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｌａ（配列番号：１）、またはＧｌｙ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ  Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｌａ（配列番号：８）を含む。
【００１３】
別の実施形態において、ペプチドは、４０７０Ａ両栄養性エンベロープタンパク質のｇｐ７０部分に含有される。
【００１４】
別の実施形態において、治療用ポリペプチドは、サイクリンＧ１、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、またはチミジンキナーゼのＮ末端欠失突然変異体である。
【００１５】
本明細書で開示した標的化送達ベクターは一般に、診断用または治療用ポリペプチドをコードする核酸配列を含有する。本明細書の他の部分でさらに詳細に説明するように、本発明の例示的な治療用タンパク質およびポリペプチドとしては、決してこれに限定されるわけではないが、自殺タンパク質、アポトーシス誘導タンパク質、サイトカイン、インターロイキン、およびＴＮＦファミリタンパク質の類のタンパク質およびポリペプチドが挙げられる。例示的な診断用タンパク質またはペプチドの例としてはたとえば、緑色蛍光タンパク質およびルシフェラーゼが挙げられる。
【００１６】
本発明の標的化遺伝子送達系は、露出された細胞外マトリクス成分、たとえばコラーゲン（たとえばＩ型コラーゲンおよびＩＶ型コラーゲン）、ラミニン、フィブロネクチン、エラスチン、グリコサミノグリカン、プロテオグリカンまたはＲＧＤ配列を持つ組織を選択的に標的化するために使用される。本発明のベクター粒子を感染または形質導入することができる組織中の細胞としては、これに限定されるわけではないが、結合組織の内皮細胞、腫瘍細胞、軟骨細胞、線維芽細胞および線維弾性細胞；骨における骨細胞および骨芽細胞；脈管構造の内皮細胞および平滑筋細胞；消化管および呼吸管の上皮細胞および上皮下細胞；線維症肝の血管細胞、結合組織細胞、および肝細胞、ならびに炎症組織の修復単核および顆粒球浸潤が挙げられる。
【００１７】
本発明のベクター粒子によって予防または治療できる疾患または障害としては、これに限定されるわけではないが、露出された細胞外マトリクス成分に関連する疾患または障害が挙げられる。このような疾患または障害としては、これに限定されるわけではないが、細胞の異常または制御不能な増殖および／または異常血管新生を特徴とする、またはそれに関連する病状が挙げられる。異常細胞増殖および／または血管新生を含む病状としてはたとえば、癌（たとえば固形腫瘍および血液腫瘍、特に転移癌）、心血管疾患（たとえばアテローム性動脈硬化および再狭窄）、慢性炎症（関節リウマチ、クローン病）、糖尿病（糖尿病性網膜症）、乾癬、子宮内膜症、血管新生緑内障および肥満性心血管疾患；肝硬変；結合組織障害（靭帯、腱、および軟骨に関連するものを含む）；コラーゲン露出に関連する血管障害が挙げられる。ベクター粒子は、新生内膜形成に関連する増殖応答および線維応答を制限することに加えて、内皮細胞機能を回復して、血栓症に効果のある治療用遺伝子を送達するために使用できる。ベクター粒子は、血管病変；再狭窄；肝臓および肺線維症などの線維症；潰瘍性病変；炎症領域；レーザー損傷の部位、たとえば眼；角膜混濁；手術部位；関節炎；瘢痕；およびケロイドを予防または治療するのに利用することもできる。ベクター粒子は創傷治癒にも利用できる。
【００１８】
特にベクター粒子は、原発性または続発性のどちらかの悪性および非悪性腫瘍を含む腫瘍、血液障害の予防または治療に、そして癌または腫瘍の転移の予防または治療に利用できる。出願人はいずれの理論的推論に限定する意図はないが、腫瘍は正常な組織または器官を浸潤するときに、細胞外マトリクス成分の露出をもたらすコラゲナーゼまたはメタロプロテイナーゼなどの酵素を分泌する。ベクター粒子をこのような露出された細胞外マトリクス成分へ標的化することによって、ベクター粒子は腫瘍に隣接している露出されたマトリクス成分に濃縮されるようになり、それによりベクター粒子は次に腫瘍細胞に感染する。このような腫瘍としては、これに限定されるわけではないが、癌腫、肉腫、たとえば乳癌、皮膚癌、骨癌、前立腺癌、肝臓癌、肺癌、脳腫瘍、喉頭癌、胆嚢癌、膵臓癌、直腸癌、副甲状腺癌、甲状腺癌、副腎癌、神経組織癌、頭頸部癌、結腸癌、胃癌、気管支癌、腎臓癌、基底細胞癌、潰瘍型と乳頭型の両方の扁平上皮癌、転移性皮膚癌、骨肉腫、ユーイング肉腫、細網細胞肉腫（ｖｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｃｅｌｌ  ｓａｒｃｏｍａ）、骨髄腫、巨細胞腫、小細胞肺腫瘍、胆石、膵島細胞腫瘍、原発性脳腫瘍、急性および慢性リンパ急性および顆粒球性腫瘍、毛様細胞腫瘍、腺腫、過形成、髄様癌、褐色細胞腫、粘膜神経腫、腸神経節神経腫、過形成性角膜神経腫瘍、マルファン症候群様体質腫瘍、ウィルムス腫瘍、精上皮腫、卵巣腫瘍、平滑筋腫瘍（ｌｅｉｏｍｙｏｍａｔｅｒ  ｔｕｍｏｒ）、子宮頸部異形成および上皮内癌、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、軟組織肉腫、線維肉腫、悪性カルチノイド、局所皮膚病変、菌状息肉腫、横紋筋肉腫、カポジ肉腫、骨原性および他の肉腫、悪性高カルシウム血症、腎細胞腫、真性多血球血症、腺癌、多形神経膠芽腫、白血病、リンパ腫、悪性黒色腫、類表皮癌、ならびに他の癌腫および肉腫が挙げられる。
【００１９】
血液障害としては、血液細胞の異形成変化を引き起こすことがある血液細胞の異常増殖および各種の白血病などの血液悪性腫瘍が挙げられる。血液障害の例としては、これに限定されるわけではないが、急性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、および鎌状赤血球性貧血が挙げられる。
【００２０】
一実施形態において、対象において露出された細胞外マトリクス成分に関連する疾患または障害を発症するリスクを予防または低減する方法が提供される。該方法は、対象に本発明の標的化ベクターを投与するステップを含む。
【００２１】
別の実施形態において、癌を有する対象における癌の転移を抑制する方法が提供される。該方法は、対象に本発明の標的化ベクターを投与するステップを含む。
【００２２】
別の実施形態において、露出された細胞外マトリクス成分に関連する疾患または障害を有する対象を治療する方法が提供される。該方法は、対象に本発明の標的化ベクターを投与するステップを含む。該方法は場合により、標的化ベクター投与の前に、標的化ベクター投与と同時に、または標的化ベクター投与に続いて、対象に化学治療剤および生物剤などの別の治療剤を投与するステップ、または放射線、外科手術および熱分解などの他の療法と組み合せて対象を治療するステップを含むことがある。
【００２３】
化学治療剤の例としては、これに限定されるわけではないが、アルキル化剤、たとえばチオテパおよびシクロホスファミド（シトキサン（商標））；アルキルスルホナート、たとえばブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン；アジリジン、たとえばベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、およびウレドーパ；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびトリメチロールメラミンを含む、エチレンイミンおよびメチラメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅｓ）；アセトゲニン（特にブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトセシン（合成類似トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビセレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（関節クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体ＫＷ−２１８９およびＣＢＩ−ＴＭＩを含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンジスタチン；窒素マスタード、たとえばクロランブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベムビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソ尿素、たとえばカルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン；抗生物質、たとえばエンジイン抗体（たとえばカリケアマイシン、特にカリケアマイシンガンマＩＩおよびカリケアマイシンｐｈｉＩ１、たとえばＡｇｎｅｗ，Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：１８３−１８６（１９９４）を参照；ジネマイシンＡを含む、ジネマイシン；ビスホスホネート、たとえばクロドロネート；エスペラマイシン；同様にネオカルチノスタチン発色団および関連色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン（商標））（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、ミトマイシン、たとえばミトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗物質、たとえばメトトレキセートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸類似体、たとえばデモプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトトレキサート；プリン類似体、たとえばフルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類似体、たとえばアンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン；アンドロゲン、たとえばカルステロン、ドロモスタノロンプロピオナート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎剤、たとえばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補給剤、たとえばフロリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エドラトレキセート；デフォファミン；デメコルチン；ジアジコン；エルホルニチン；エリプチニウムアセテート；エポシロン；エトグルシド；ガリウムニトレート；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；メイタンシノイド、たとえばメイタンシンおよびアンサマイトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリニック酸；２−エチルヒドラジン；プロカルバジン；ＰＳＫ（商標）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテシン（特にＴ−２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡおよびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオペタ；タキソイド、たとえばパクリタキセル（タキソール（商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｅｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，プリンストン、ニュージャージー州）およびドセタキセル（タキソテール（商標）．，Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロランブシル；ゲムシタビン（ジェムザール（商標））；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；プラチナ類似体、たとえばシスプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトロキサントロン；バンクリスチン；ビノレルビン（ナベルビン（商標））；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ；イバンドロナート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害物質ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド、たとえばレチノイン酸；カペシタビン；および上のいずれかの製薬的に許容される塩、酸または誘導体が挙げられる。「化学治療剤」の定義には、腫瘍に対するホルモン作用を調節または抑制するように作用する抗ホルモン剤、たとえばタモキシフェン（ノルバデックス（商標）を含む）、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストンおよびトレミフェン（ファレストン（商標）を含む、抗エストロゲンおよび選択的エストロゲン受容体調節物質（ＳＥＲＭ）；副腎でのエストロゲン産生を調節する、酵素アロマターゼの阻害物質、たとえば４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、メゲストロールアセテート���メゲース（商標））、エキセメスタン、フォルメスタン、ファドロゾール、ボロゾール（リビゾール（商標））、レトロゾール（フェマーラ（商標））、およびアナストロゾール（アリミデックス（商標））；および抗アンドロゲン、たとえばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリン；ならびに上のいずれかの製薬的に許容される塩、酸または誘導体も含まれる。
【００２４】
詳細な実施形態において、標的化ベクターと組み合された治療剤は、チロシンキナーゼ阻害物質、たとえばＺＤ１８３９（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ  Ｋ．Ｋ．のイレッサ（商標））；ＩＭＣ−Ｃ２２５またはセツキシマブ（エルビタックス（商標））；トラスツズマブ（ヘルセプチン（商標））；イマチニブメシレート（グリベック（商標）、以前のＳＴＩ−５７１）；およびソラフェニブ（ネクサバール（商標））である。
【００２５】
生物剤は治療用抗体、たとえばリツキシマブ（リツキサン（商標））；アレムツズマブ（キャンパス（商標））；およびゲムツズマブゾガマイシン（Ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ  ｚｏｇａｍｉｃｉｎ）（マイロターグ（商標））でもよい。
【００２６】
標的化ベクターを使用して本発明を実施することによって、治療されている対象、特にヒト対象については、疾患が予防または緩和されているだけでなく、本発明の標的化療法が脱毛症または抜け毛、骨髄抑制、肝臓および腎臓機能の著しい変化、悪心および嘔吐、粘膜炎、発疹または便秘などを含む、化学療法および生物療法などの他の種類の療法と一般に関連付けられる副作用を大きく低減または除去するので、生活の質も改善されている。
【００２７】
実施形態の変形において、該方法は、対象に本明細書に記載するウイルス粒子を接触させるステップを含む第１相プロトコルを含み、そこでは対象にｉ）１〜約６日間連続して対象に投与された、約１×１０９〜６×１０９単位／日の第１のウイルス粒子用量レベル；ｉｉ）１〜約３日間連続して第１のウイルス投薬後に対象に投与された、約７×１０９〜約１×１０１０単位／日の第２のウイルス粒子用量レベル、ｉｉｉ）１〜約３日間連続して第２のウイルス投薬後に対象に投与された、約１×１０１０〜約５×１０１０単位／日のウイルス粒子用量レベルで接触させる。該方法はさらに、対象に本明細書で記載したように産生されたウイルス粒子を接触させるステップを含む第２相プロトコルを含み、そこでは対象に１〜約１５日間連続して、第１相プロトコル後に投与された、約１×１０９〜約５×１０１０単位／日のウイルス粒子用量レベルで接触させる。
【００２８】
変形にしたがって、該方法は場合により、第１相プロトコルおよび第２相プロトコルの前に、第１相プロトコルおよび第２相プロトコルと同時に、または第１相プロトコルおよび第２相プロトコルに続いて、化学治療剤を対象に投与するステップを含む。第１のウイルス粒子用量レベルは、約４×１０９〜５×１０９単位／日が可能である。第２のウイルス粒子用量レベルは、約９×１０９〜１×１０１０単位／日でもよい。第３のウイルス粒子用量レベルは、約１×１０１０〜２×１０１０単位／日が可能である。
【００２９】
本明細書で開示する標的化送達ベクターは局所的に、静脈内に、動脈内に、結腸内に、気管内に、腹腔内に、鼻内に、血管内に、髄腔内に、頭蓋内に、骨髄内に、胸膜内に、皮内に、皮下に、筋肉内に、眼内に、骨内に、および／または滑液包内に投与できる。
【００３０】
別の実施形態において、プラスミドはプロモータに機能的に連結された多重クローニング部位を含み、プロモータは異種核酸配列；５’および３’長末端反復配列；ψレトロウイルスパッケージ配列；５’ＬＴＲの上流に位置するＣＭＶプロモータ；プロモータに作動可能に連結され、プラスミドを含有する産生細胞に対する薬物耐性を与えるポリペプチドをコードする核酸配列と；ＳＶ４０複製起点の発現を補助する。例示的なプラスミドとしては、ｐＣ−ＲＥＸ  ＩＩ、ｐＣ−ＲＥＸおよびｐＵＢＥＲ−ＲＥＸが挙げられる。例示的なさらなる誘導体としては、治療用または診断用ポリペプチドをコードする異種核酸配列を含有する誘導体が挙げられる。
【００３１】
他の実施形態において、標的化送達ベクターの産生のためのキットが提供される。キットは一般に、たとえばウイルス粒子の産生のための、本明細書で開示したプラスミドを含有する容器を含む。このようなキットは、プラスミドを形質移入するのに適した産生細胞と、産生細胞にプラスミドを一過性に形質移入するための説明書とをさらに含むことができる。説明書は、標的化送達ベクターを産生させる条件下で形質移入された産生細胞を培養するための方法をさらに含むことができる。たとえば標的化ウイルス粒子の産生のためのキットは、Ｂｖ１／ｐＣＡＥＰプラスミド、ｐＣｇｐｎプラスミド、およびｐｄｎＧ１／Ｃ−ＲＥＸプラスミド、ｐｄｎＧ１／Ｃ−ＲＥＸＩＩプラスミド、またはｐｄｎＧ１／ＵＢＥＲ−ＲＥＸプラスミドを含有する容器を含むことができる。このようなキットは、２９３Ｔ細胞と、細胞にプラスミドを一過性に形質移入するための、そして標的化ウイルス粒子を産生させる条件下で形質移入細胞を培養するための説明書をさらに含むことができる。
【００３２】
別の実施形態において、腫瘍性障害を治療するキットが提供される。該キットは、製薬的に許容される担体中に本明細書に記載した方法によって産生されたウイルス粒子を含有する容器と、ウイルス粒子を対象に投与するための説明書とを含む。投与は、表１に示した例示的な治療プロトコルに従うことができる。
【００３３】
別の実施形態において、遺伝子療法事業を運営する方法が提供される。該方法は、標的化送達ベクターを産生させるステップと、適切な培地中でベクター粒子を採取および懸濁させて、懸濁液を貯蔵することによってベクターのバンクを確立するステップを含む。該方法は、粒子と、粒子の使用説明書とを、その必要がある対象（患者）への投与のために、医師または医療提供者に供給するステップをさらに含む。このようなベクターの使用説明書は、表１に示した例示的な治療レジメンを含むことができる。該方法は場合により、患者または患者の保険提供者に請求することを含む。
【００３４】
なお別の実施形態において、本明細書で開示したキットを医師または医療提供者に供給するステップを含む遺伝子療法事業を運営する方法が提供される。
【００３５】
なお別の実施形態において、癌細胞を含有する１つまたは複数の腫瘍を有する対象を治療用ウイルス粒子によって治療する方法が提供される。該方法はａ）ｉ）対象の腫瘍中に存在する癌細胞の数、または腫瘍中の腫瘍細胞の総数によって定義されるような対象の腫瘍負荷を決定することと；ｉｉ）腫瘍負荷に治療用ウイルス粒子の生理的感染多重度（ｐＭＯＩ）を乗算することと；ｉｉｉ）対象に投与される治療用ウイルス粒子の体積を得るために、得られた数値を治療用ウイルス粒子の力価で除算することと；によって治療用ウイルス粒子の用量を決定するステップと、ｂ）治療用ウイルス粒子の決定された用量を対象に投与するステップとを含む。
【００３６】
実施形態により、対象は、１〜５日間、または１〜約６日間連続して、決定された１日当たりの治療用ウイルス粒子の用量で治療用ウイルス粒子によって治療される。場合により、対象は、月曜日、水曜日、および金曜日に連続して、決定された１日当たりの治療用ウイルス粒子の用量で治療用ウイルス粒子によって治療される。対象は１〜２日間休止させてもよく、その１〜２日間は治療サイクルを構成する。対象は２〜８治療サイクルの間、好ましくは３〜４サイクルの間、治療することができる。
【００３７】
また実施形態により、単位がミリリットルの治療用ウイルス粒子の用量は、次の一般式に基づいて計算できる：
【００３８】
【数１】
2010509223.tif 000002
式中、ｐＭＯＩは４〜２５０、好ましくは１００である。
【００３９】
また実施形態により、該方法はさらに次のステップ：対象が治療用ウイルス粒子の決定された用量で治療された後に、対象の腫瘍負荷を決定するステップと；治療用ウイルス粒子の用量を再計算するステップと；治療用ウイルス粒子を再計算された用量で対象に投与するステップとをさらに含む。
【００４０】
また実施形態により、腫瘍負荷は次の式：（標的病変または腫瘍の最長直径の和（ｃｍ））×１×１０９癌細胞／ｃｍによって決定される。標的病変または腫瘍は、カリパスによって、または放射線撮像、たとえばＭＲＩ、ＣＴ、ＰＥＴ、またはＳＰＥＣＴスキャンによって測定できる。
【００４１】
また実施形態により、治療用ウイルス粒子は局所的に、静脈内に、動脈内に、結腸内に、気管内に、腹腔内に、鼻内に、血管内に、髄腔内に、頭蓋内に、骨髄内に、胸膜内に、皮内に、皮下に、筋肉内に、眼内に、骨内に、および／または滑液包内に投与される。好ましくは、治療用ウイルス粒子は静脈内注入によって対象に投与される。
【００４２】
また実施形態により、対象は哺乳類、好ましくはヒトである。
【００４３】
また実施形態により、癌は、乳癌、皮膚癌、骨癌、前立腺癌、肝臓癌、肺癌、脳腫瘍、子宮癌、喉頭癌、胆嚢癌、膵臓癌、直腸癌、副甲状腺癌、甲状腺癌、副腎癌、神経組織癌、頭頸部癌、結腸癌、胃癌、気管支癌、腎臓癌、基底細胞癌、潰瘍型と乳頭型の両方の扁平上皮癌、転移性皮膚癌、骨肉腫、ユーイング肉腫、細網細胞肉腫（ｖｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｃｅｌｌ  ｓａｒｃｏｍａ）、骨髄腫、巨細胞腫、小細胞肺腫瘍、胆石、膵島細胞腫瘍、原発性脳腫瘍、急性および慢性リンパ急性および顆粒球性腫瘍、毛様細胞腫瘍、腺腫、過形成、髄様癌、褐色細胞腫、粘膜神経腫、腸神経節神経腫、過形成性角膜神経腫瘍、マルファン症候群様体質腫瘍、ウィルムス腫瘍、精上皮腫、卵巣腫瘍、平滑筋腫瘍（ｌｅｉｏｍｙｏｍａｔｅｒ  ｔｕｍｏｒ）、子宮頸部異形成および上皮内癌、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、軟組織肉腫、悪性カルチノイド、局所皮膚病変、菌状息肉腫、横紋筋肉腫、カポジ肉腫、骨原性および他の肉腫、悪性高カルシウム血症、腎細胞腫、真性多血球血症、腺癌、多形神経膠芽腫、白血病、リンパ腫、悪性黒色腫、類表皮癌から成る群より選択される。癌は好ましくは、骨肉腫、肉腫、膵臓癌、乳癌、または結腸癌である。
【００４４】
また実施形態により、治療用ウイルス粒子は本明細書で開示した本発明のウイルスベクター、たとえばコラーゲン結合ドメインを含有するように修飾されたエンベロープタンパク質を有するレトロウイルス（好ましくは両栄養性）ベクターであり、癌に対する治療剤（たとえばサイクリンＧ１の細胞破壊突然変異体）をコードする
また実施形態により、該方法は次のステップ：治療用ウイルス粒子投与の前に、治療用ウイルス粒子投与と同時に、または治療用ウイルス粒子投与に続いて、対象に化学治療剤、生物剤、または放射線療法を投与するステップをさらに含むことができる。
【００４５】
本発明のこれらおよび他の態様、実施形態、目的および特徴は、その最良の実施形態と同様に、本発明の以下の詳細な説明が添付図面と併せて読まれるときにより十分に認識されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１Ａは、手術台の範囲内の膵臓の領域における大きい円形再発腫瘍（Ｔ；カッコ内の領域）および転移を示す肥大した傍大動脈リンパ節（Ｎ）を表す、治療サイクル＃１完了の１日後の患者＃１からの代表的なＭＲＩを示す。図１Ｂは、腫瘍塊の４０〜５０％を含む大きい中央壊死領域（ｎｅｃ）を持つ再発腫瘍（Ｔ；カッコ内の領域）の形状の不規則性と、傍大動脈リンパ節転移（Ｎ）の大きさの著しい縮小を表す、治療サイクル＃２完了の４日後の患者＃１からの追跡ＭＲＩを示す
【図１Ｃ】図１Ｃは、Ｒｅｘｉｎ−Ｇが患者＃１のＣＡ１９−９血清レベルの低下を誘発することを表すグラフである。垂直軸にプロットした血清ＣＡ１９−９レベル（Ｕ／ｍｌ）は、水平軸にプロットした時間（日）の関数として表される。各治療サイクルの開始は矢印で表す。
【図２】図２Ａは、上腸間膜静脈（ＳＭＶ）および上腸間膜動脈（ＳＭＡ）に侵入する膵頭部（Ｔ）の領域における６．０ｃｍ３の塊を示している、治療サイクル＃１の開始時に得た患者＃２からの代表的な腹部ＣＴスキャンを与える。図２Ｂは、膵臓腫瘍塊（Ｔ）のサイズが縮小して上腸間膜血管（ＳＭＶおよびＳＭＡ）から消失したことを示す、治療サイクル＃２完了の２日後の患者＃２からの追跡腹部ＣＴスキャンを与える。各治療サイクルの開始は矢印で表す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、Ｒｅｘｉｎ−Ｇが患者＃２における原発性腫瘍成長を停止させることを示すグラフである。Ｒｅｘｉｎ−Ｇによる連続治療によって、腫瘍サイズの段階的縮小が認められた。式：幅２×長さ×０．５２（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、Ｃｅｌｌ  ８８，２７７，１９９７）を使用して得て、垂直軸にプロットした腫瘍体積（ｃｍ３）は、水平軸にプロットした時間の関数として表される。各治療サイクルの開始は矢印で表す。
【図３】図３Ａは、Ｒｅｘｉｎ−Ｇとゲムシタビンが転移膵臓癌を持つ患者＃３において腫瘍退縮を誘発することを示唆するデータを示す。原発性腫瘍の腫瘍体積（ｃｍ３）をＹ軸にプロットして、時間（日）の関数として表す。Ｒｅｘｉｎ−Ｇ注入の開始は矢印で表す。図３Ｂは、Ｒｅｘｉｎ−Ｇとゲムシタビンが転移膵臓癌を持つ患者＃３において腫瘍退縮を誘発することを示唆するデータを示す。原発性腫瘍の門脈節をＹ軸にプロットして、時間（日）の関数として表す。Ｒｅｘｉｎ−Ｇ注入の開始は矢印で表す。図３Ｃは、Ｒｅｘｉｎ−Ｇとゲムシタビンが転移膵臓癌を持つ患者＃３において腫瘍退縮を誘発することを示唆するデータを示す。肝結節の数をＹ軸にプロットして、時間（日）の関数として表す。Ｒｅｘｉｎ−Ｇ注入の開始は矢印で表す。
【図４】図４Ａは、患者＃１について、Ｒｅｘｉｎ−Ｇ注入の時間を水平軸にプロットするのに対して、ｍｍＨｇで表す収縮期血圧を垂直軸にプロットする。図４Ｂは、患者＃１について、Ｒｅｘｉｎ−Ｇ注入の時間を水平軸にプロットするのに対して、１分間当たりの脈拍数を垂直軸にプロットする。図４Ｃは、患者＃１について、Ｒｅｘｉｎ−Ｇ注入の時間を水平軸にプロットするのに対して、１分間当たりの呼吸数を垂直軸にプロットする。
【図５】図５Ａは、Ｘ軸にプロットした治療日数の関数として表された、Ｙ軸にプロットした患者＃１のヘモグロビン（グラム％）、白血球数および血小板数を示すデータを表す。図５Ｂは、Ｒｅｘｉｎ−Ｇが患者＃１の肝機能に有害影響を持たないことを示すデータを表す。Ｙ軸にプロットしたＡＳＴ（Ｕ／Ｌ）、ＡＬＴ（Ｕ／Ｌ）、およびビリルビン（ｍｇ％）は、Ｘ軸にプロットした治療日数の関数として表される。図５Ｃは、Ｘ軸にプロットした治療日数の関数として表される、Ｙ軸にプロットした患者＃１の血液尿素窒素（ｍｇ％）、クレアチニン（ｍｇ％）およびカリウム（ｍｍｏｌ／Ｌ）レベルを表す。用量レベルＩ（４．５×１０９ｃｆｕ／用量）を６日連続で投与して、２日間の休止期間を置いて、続いて用量レベルＩＩ（９×１０９ｃｆｕ／用量）で２日間、次に用量レベルＩＩＩ（１．４×１０１０ｃｆｕ／用量）で２日間投与した。
【図６】Ｒｅｘｉｎ−Ｇの用量増加が患者＃２の血行動態機能に有害影響を及ぼさなかったことを表すデータを与える。各用量レベルについて、水平軸にプロットした注入時間の関数として、収縮期血圧（ｍｍＨｇ）と、脈拍数／分、呼吸数／分が垂直軸にプロットされる。
【図７】図７Ａは、Ｘ軸にプロットした治療日数の関数として表された、Ｙ軸にプロットした患者＃２のヘモグロビン（グラム％）、白血球数および血小板数を示す。図７Ｂは、Ｒｅｘｉｎ−Ｇが患者＃２の肝機能に有害影響を持たないことを示すデータを表す。Ｙ軸にプロットしたＡＳＴ（Ｕ／Ｌ）、ＡＬＴ（Ｕ／Ｌ）、およびビリルビン（ｍｇ％）は、Ｘ軸にプロットした治療日数の関数として表される。図７Ｃは、Ｘ軸にプロットした治療日数の関数として表される、Ｙ軸にプロットした患者＃２の血液尿素窒素（ｍｇ％）、クレアチニン（ｍｇ％）およびカリウム（ｍｍｏｌ／Ｌ）レベルを表す。用量レベルＩ（４．５×１０９ｃｆｕ／用量）を５日連続で投与して、続いて用量レベルＩＩ（９×１０９ｃｆｕ／用量）で３日間、次に用量レベルＩＩＩ（１．４×１０１０ｃｆｕ／用量）で２日間投与した。
【図８】図８Ａは、Ｘ軸にプロットした治療日数の関数として表された、Ｙ軸にプロットした患者＃３のヘモグロビン（グラム％）、白血球数および血小板数を示す。図８Ｂは、Ｒｅｘｉｎ−Ｇが患者＃３の肝機能に有害影響を持たないことを示すデータを表す。Ｙ軸にプロットしたＡＳＴ（Ｕ／Ｌ）、ＡＬＴ（Ｕ／Ｌ）、およびビリルビン（ｍｇ％）は、Ｘ軸にプロットした治療日数の関数として表される。図８Ｃは、Ｒｅｘｉｎ−Ｇが患者＃３の腎機能に有害影響を持たないことを示すデータを表す。Ｙ軸にプロットした血液尿素窒素（ｍｇ％）、クレアチニン（ｍｇ％）およびカリウム（ｍｍｏｌ／Ｌ）レベルは、Ｘ軸にプロットした治療日数の関数として表される。用量レベルＩ（４．５×１０９ｃｆｕ／用量）を６日間連続して投与した。
【図９】Ｒｅｘｉｎ−Ｇナノ粒子のサイズ測定を表す。Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＭＡ０２０３８  Ｕ．Ｓ．Ａ．）を使用して、ベクターサンプルは動的光散乱（ＤＬＳ）をバッチモードで使用して解析し、流体力学半径（ｒｈ）として分子サイズを決定した。Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｄｅｃｏｎｖｏｌｖｅソフトウェアを使用して、ＤＬＳデータからの各種のサイズ集団を数学的に決定した。３つのＲｅｘｉｎ−Ｇ臨床ロットの平均粒径はそれぞれ９５、１０５および９５ｎｍであり、検出可能なウイルス凝集はない。
【図１０】ＧＴＩ発現ベクターＧｌｎＸＳｖＮａの高感染力価（ＨＩＴ）バージョンを表す。ｐＲＶ１０９プラスミドは強力なＣＭＶプロモータを与える。得られたｐＲＥＸ発現ベクターは、ＳＶ４０ラージＴ抗原（２９３Ｔ）を発現する産生細胞系におけるエピソーム複製およびプラスミド救出のためのＳＶ４０  ｏｒｉ、すなわち大腸菌における選択および維持のためのアンピシリン耐性遺伝子、そしてベクター力価を決定するためにＳＶ４０  ｅ．ｐ．によって駆動されるネオマイシン耐性遺伝子を有する。興味のある遺伝子は、ＮｏｔＩおよびＳａｌＩオーバーハングを持つＰＣＲ生成物として最初にクローニングされる。増幅された断片はＤＮＡ配列解析によって検証され、各断片をｐＧ１ＸｓｖＮａ（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｉｎｃ．）内へクローニングして、次にこのプラスミドのＫｐｎＩ断片を切除して、続いての線状化（ＫｐｎＩ消化）ｐＲＶ１０９プラスミドと連結することによって、レトロウイルス発現ベクターｐＲＥＸ中へ挿入されて、各ＨＩＴ／ｐＲＥＸベクターを得る。
【図１１Ａ】図１１Ａは、ｐＣ−ＲＥＸプラスミドの制限マップを表す。プラスミドをＧ１ＸＳｖＮａ（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｉｎｃ．）より得て、その中へＣＭＶ、すなわちプロモータエンハンサを５’ＬＴＲ上流の唯一のＳａｃＩＩ部位にクローニングした。診断または治療用ポリペプチドをコードする異種核酸配列（ＨＳ）はＮｏｔ  １制限部位とＳａｌ  １制限部位の間に含むことができる。ｎｅｏ遺伝子はＳＶ４０  ｅ．ｐ．によってその入れ子状ｏｒｉによって駆動される。得られたｐＣ−ＲＥＸプラスミドは、２９３Ｔ細胞中での高力価ベクター産生のために設計された。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、ｐｄｎＧ１／Ｃ−ＲＥＸプラスミドの制限マップを表す。プラスミドは、Ｎｏｔ１およびＳａｌ１オーバーハングを含めるためにＰＣＲによって調製された２０９ａａ（６３０ｂｐ）ドミナントネガティブ変異体ｄｎＧ１（４７２−１０９８ｎｔ；４１−２４９ａａ；アクセション番号Ｕ４７４１３）をコードする核酸配列を含有することを除いて、図１１Ａに示したｐＣ−ＲＥＸプラスミドと同じである。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、ｐｄｎＧ１／Ｃ−ＲＥＸの制限消化を表す。
【図１２】図１２Ａは、Ｂｖ１／ｐＣＡＥＰプラスミドの制限マップを表す。ＣＡＥＰ（Ｐ＝Ｐｓｔ  １）は、成熟ｇｐ７０ポリペプチドのａａ６と７の間の、ＣＡＥ両栄養性エンベロープタンパク質（４０７０Ａ）のＮ末端付近での唯一のＰｓｔ１部位の付加によって作製した。Ｂｖ１は、ｖＷＦに由来し、戦略的に重要なリンカーに隣接され、ＰＣＡＥＰのＰｓｔ１部位内へインフレームコード配列として挿入された、コラーゲン結合デカペプチドである。図１２Ｂは、Ｂｖ１／ｐＣＡＥＰの制限消化を表す。
【図１３】図１３Ａは、ｐＣｇｐｎプラスミドの制限マップを表す。本プラスミドは、ＣＭＶ即時型初期プロモータエンハンサによって駆動されたＭｏＭｕＬｖ  ｇａｇ−ｐｏｌをコードする。ＥｃｏＲ  １クローニング部位に隣接されたｇａｇ−ｐｏｌコード配列は、クローン３ＰＯからｐＧａｇ−ｐｏｌ−ｇｐｔとして得られた（Ｍｏａｒｋｏｗｉｔｚら、１９８８）。ベクター主鎖はｐｃＤＮＡ３．１＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。ポリアデニル化シグナルおよびウシ成長ホルモンからの転写終結配列は、ＲＮＡ安定性を向上させる。ＳＶ４０  ｏｒｉはｅ．ｐ．と共に、ＳＶ４０ラージＴ抗原を発現する細胞系におけるエピソーム複製の特色を成す。図１３Ｂは、ｐＣｇｐｎの制限消化を表す。
【図１４】新規ｐＣ−ＲＥＸＩＩ（すなわちＥＰＥＩＵＳ−ＲＥＸ）プラスミドのマップを表す。
【図１５】治療用サイトカイン遺伝子ＩＬ−２が挿入された新規ｐＣ−ＲＥＸＩＩ（すなわちＥＰＥＩＵＳ−ＲＥＸ）プラスミドのマップを表す。
【図１６】治療用サイトカイン遺伝子ＧＭ−ＣＳＦが挿入された新規ｐＣ−ＲＥＸＩＩ（すなわちＥＰＥＩＵＳ−ＲＥＸ）プラスミドのマップを表す。
【図１７】図１７Ａ〜Ｇは、ｐＣ−ＲＥＸＩＩのＭＣＳ部位を利用するＨＳｔｋ（レポーター）遺伝子の近位側の複雑な一連の補助プロモータを表す。
【図１７Ｈ】図１７Ｈは、図１７Ａ〜Ｇに示した補助プロモータからの腫瘍細胞における差次的遺伝子発現のウェスタンブロットを表す。
【図１８】ｐＩＲＥＳからのＣＭＶプロモータ配列の核酸配列を表す。
【図１９Ａ】図１９Ａは、標的化ベクターを産生するための閉ループマニホールドシステムを表す。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、閉ループマニホールドシステムの構成要素に関する情報を提供する。
【図２０】図２０Ａは、標的化レトロウイルスベクターエンベロープ構築物（Ｅｐｅｉｕｓ−ＢＶ１）：成熟タンパク質（ＣＡＥ−Ｐ）のＮ末端付近での唯一の制限部位の付加によって修飾され；コラーゲン結合モチーフ（ＧＨＶＧＷＲＥＰＳＦＭＡＬＳＡＡ）を呈するように操作され；すべての上流（５’）および下流（３’）ウイルス配列を除去するためにＰＣＲによって再産生された、最小両栄養性ｅｎｖ（４０７０Ａ）を担持する、強化ＣＭＶ発現プラスミドである、新規ｐＢ−ＲＶＥプラスミドのマップを表す。プラスミド主鎖（ｐｈＣＭＶ１）は、ＳＶ４０ラージＴ抗原（２９３Ｔ）を発現するベクター産生細胞においてエピソーム複製を可能にするＳＶ４０プロモータ／エンハンサに加えて、ｅｎｖの発現を推進するための最適化ＣＭＶプロモータ／エンハンサ／イントロンを供給する。ポジティブ選択はカナマイシン耐性遺伝子によって供給される。図２０Ｂは、ｐＢ−ＲＶＥの制限消化を表す。
【図２１】図２１Ａは、新規なｐｄｎＧ１／ＵＢＥＲ−ＲＥＸプラスミドのマップを表す。本プラスミドは、２０９ａａ（６３０ｂｐ）ドミナントネガティブ変異体ｄｎＧ１（４７２−１０９８ｎｔ；４１−２４９ａａ；アクセション番号Ｕ４７４１３）をコードする。プラスミドをＧ１ＸＳｖＮａ（ＧＴＩ）より得て、その中へＣＭＶ、すなわちプロモータエンハンサを５’ＬＴＲ上流の唯一のＳａｃＩＩ部位にクローニングした。残留ｇａｇ配列の４８７ｂｐを除去して（Ｄ）ＲＣＲの可能性を低下させて、９７ｂｐスプライス受容部位（ＥＳＡ）をｄｎＧ１の上流に添加した。ｄｎＧ１コード配列（ｎｔ  ４７２−１０９８と停止コドン＝１１０１）は、ＮｏｔＩおよびＳａｌＩオーバーハングを含めてＰＣＲによって作製した。ｎｅｏ遺伝子はＳＶ４０  ｅ．ｐ．遺伝子によりその入れ子状ｏｒｉによって駆動される。ｐｄｎＧ１／ＵＢＥＲ−ＲＥＸプラスミドは、２９３Ｔ細胞中での高力価ベクター産生のために設計された。図２１Ｂは、ｐｄｎＧ１／ＵＢＥＲ−ＲＥＸの制限消化を表す。
【図２２】図２２Ａは、野生種モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）エンベロープスプライス受容部位（ＥＳＡ）のマップを表す。図２２Ｂは、ｐＵＢＥＲ−ＲＥＸエンベロープスプライス受容部位（ＥＳＡ）のマップを表す。
【図２３】図２３Ａは、Ｃ−ＲＥＸプラスミドの概略図を示す。図２３Ｂは、ＵＢＥＲ−ＲＥＸプラスミドの概略図を示す。
【図２４】ステージＩＶ膵臓癌の患者（患者Ａ３）からの外科的に切除した肝臓切片で観察されたような、転移腫瘍結節における静脈内Ｒｅｘｉｎ−Ｇ（商標）誘発壊死および線維症を表す。（Ａ）生検肝臓における腫瘍結節の代表的なヘマトキシリン−エオシン染色組織切片；ｔ＝腫瘍細胞；ｎ＝壊死；ｆ＝線維症。（Ｂ）同じ腫瘍結節の組織切片のトリクローム染色。青色染色物質は、線維性領域におけるコラーゲンタンパク質の存在を示す。
【図２５】膵臓癌の患者（患者Ａ３）に見られる、転移腫瘍結節における静脈内Ｒｅｘｉｎ−Ｇ（商標）誘発顕性アポトーシスを表す。（Ａ〜Ｄ）タネル陽性アポトーシス核（褐色染色物質）の測定可能な発生を示す、生検肝臓からの腫瘍結節の代表的な免疫染色組織切片。
【図２６】Ｒｅｘｉｎ−Ｇ（商標）治療した膵臓癌患者（患者Ａ３）から切除した転移腫瘍結節における腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の免疫組織化学的キャラクタリゼーションを表す。生検肝臓内の残留腫瘍結節の代表的な組織切片は、免疫反応性ＴおよびＢ細胞の機能補体による著しいＴＩＬ浸潤を示す。左上から時計周りに：ヘルパーＴ細胞（ｃｄ４＋）、キラーＴ細胞（ｃｄ８＋）、Ｂ細胞（ｃｄ２０＋）、単球／マクロファージ（ｃｄ４５＋）、樹状細胞（ｃｄ３５＋）、およびナチュラルキラー細胞（ｃｄ５６＋）。細胞性免疫および体液性免疫と関連して機能するＴＩＬの組織の存在（すなわち遊走）は免疫担当宿主における癌免疫化の可能性を示唆することに注意する。
【図２７】悪性黒色腫患者（患者Ｂ４）の癌リンパ節における静脈内Ｒｅｘｉｎ−Ｇ（商標）誘発壊死、アポトーシス、および線維症を表す。Ａ）周囲（ｔ）に生腫瘍細胞の縁を備えた、癌細胞の広範囲にわたる壊死（ｎ）、アポトーシス（矢印によって示す）および線維症（ｆ）を示す、鼠径リンパ節のＨ＆Ｅ染色組織切片；（Ｂ）濃縮または断片化核を持つ小細胞によって表されたアポトーシスを受けている多数の細胞を示す、Ａの切片の高倍率（１００×）；（Ｃ）金色がかった黄色のヘモジデリン沈着マクロファージを示す、Ａの高倍率（１００×）；（Ｄ）免疫反応性ＣＤ３５＋樹状細胞による著しい浸潤を示す鼠径リンパ節の代表的な組織切片、（Ｅ）ＣＤ６８＋マクロファージおよび（Ｆ）ＣＤ８＋キラーＴ細胞。
【図２８】喉頭の扁平上皮癌の患者（患者Ｂ６）における腫瘍縮退の証拠を表す。Ｒｅｘｉｎ−Ｇ（商標）治療の前（上パネル）および後（下パネル）に得た頸部領域のＭＲＩ画像。上気道の連続切片の直径の測定は、治療前（白色矢印によって示す）に得た切片と比較したときに、Ｒｅｘｉｎ−Ｇ（商標）の反復注入後に上気道直径の劇的な（〜３００％）の増大を示している。気道の開通性の増大は、周囲腫瘍塊の縮退、そして音声能力の回復に相当する。
【図２９】非常に大きい腫瘍負荷を示す膵臓癌患者（患者Ｃ１）で見られる肝臓転移病巣の数および質に対するＲｅｘｉｎ−Ｇ（商標）注入の効果を示す。Ｒｅｘｉｎ−Ｇ（商標）の算出した（パリティー解析）用量集中注入による、（Ａ）治療前および（Ｂ）治療後に得た腹部ＭＲＩ。画像の左上象限における多数の低密度腫瘍結節（カッコ内）の完全な根絶はもちろんのこと、確立された肝臓小結節の嚢胞への変換（黒色矢印）にも注意する。次の肥大肝嚢胞（白色矢印）の吸引と、続いての細胞学的解析によって、治療後の吸引液中に癌細胞が完全に存在しないことを確認した。
【図３０】化学療法難治性骨肉腫患者の連続ＣＴ−ＰＥＴ画像を表す。Ｒｅｘｉｎ−Ｇの抗腫瘍活性は、治療１ヵ月後の病変への１８ＦＤＧ取り込みの減少と治療２ヵ月後の石灰化病変の増大によって証明される。
【図３１】第２の治療サイクル後に新たな病変がないことによって証明される、Ｒｅｘｉｎ−Ｇ治療後の化学療法難治性転移骨肉腫の患者における腫瘍進行速度の低下を表す。
【図３２】Ｒｅｘｉｎ−Ｇ治療後の化学療法難治性転移骨肉腫の患者の標的病変における１８ＦＤＧ取り込みのＳＵＶｍａｘの漸減を表す。
【図３３】ハウンズフィールド単位の増加によって証明される、Ｒｅｘｉｎ−Ｇ治療後の化学療法難治性転移骨肉腫の患者の癌性病変における石灰化の増大を表す。
【図３４】難治性ステージＩＶ膵臓癌患者の原発性膵臓腫瘍内での広範囲の壊死および局所ＧＭ−ＣＳＦ産生を表す。（Ａ）原発性膵臓腫瘍のＨ＆Ｅ染色組織切片は、癌細胞の広範囲の（〜９５％）壊死（ｎ）を反応性線維症（ｆ）と共に示し、周囲には生腫瘍細胞の変性（ｄｅｇ）縁およびオルガノイド構造が見える。（ＢおよびＣ）（Ａ）で見られた切片の線維症領域、壊死領域、および変性領域のより高い倍率。（Ｄ）ＧＭ−ＣＳＦ導入遺伝子の免疫染色が、この手術不能の原発性腫瘍内に残存する免疫反応性ＧＭ−ＣＳＦ分泌腫瘍細胞（矢印）の小型のクラスタを同定する。（Ｅ）生存する残留腫瘍細胞内の免疫反応性ＧＭ−ＣＳＦタンパク質を示すＤのより高い倍率（黒く染色された物質によって示される）；（Ｆ）著しい免疫浸潤のある領域の精密な検査は、壊死腫瘍細胞（矢印によって表される）中および単核細胞浸潤（ｉｍ）を伴う腫瘍細胞片の断片中でのＧＭ−ＣＳＦ陽性を示している。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
本発明の好ましい実施形態を本明細書で提示および説明するが、このような実施形態が単なる例示として与えられていることが当業者には明らかになるであろう。本発明から逸脱することなく、当業者には今や多くの変形、変更、および代替が思い浮かぶであろう。本明細書に記載する本発明の実施形態の各種の代案が本発明の実施に利用できることが理解されるべきである。以下の請求項が本発明の範囲を定義することと、これらの請求項およびその均等物の範囲内の方法および構造は請求項に含まれることとが意図される。
【００４８】
標的化送達系は、レトロウイルスベクターまたは他のいずれのウイルスまたは非ウイルスベクター、タンパク質または薬物を病態範囲に選択的に標的化して（すなわち向病巣性標的化）、血管（Ｈａｌｌら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，８：２１８３−９２，１９９７；Ｈａｌｌら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，１１：９８３−９３，２０００）または癌性病巣（Ｇｏｒｄｏｎら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １２：１９３−２０４，２００１；Ｇｏｒｄｏｎら、Ｃｕｒｉｅｌ  ＤＴ，Ｄｏｕｇｌａｓ  ＪＴ，ｅｄｓ．Ｖｅｃｔｏｒ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ：Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．２９３−３２０，２００２）、活発な血管新生の領域、および組織損傷または炎症領域への、生体内での高い効率の優先的遺伝子送達を可能にする。
定義
別途定義しない限り、本明細書で使用するすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書全体を通じて言及するすべての特許、特許出願、公開出願および公報、Ｇｅｎｂａｎｋ配列、ウェブサイトおよび他の公開資料は、別途記載しない限り、その全体が参照により組み入れられている。本明細書の用語に複数の定義がある場合には、本節の定義が優先する。ＵＲＬあるいは他の識別子またはアドレスが引用される場合、このような識別子は変更されることがあり、インターネット上の詳細な情報は移り変わることがあるが、同等の情報がインターネットによる検索によって見いだされることが理解される。それらの引用はこのような情報の入手可能性と公への普及を証明している。
【００４９】
本明細書で使用するように、「核酸」は、少なくとも２つの共有結合されたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似サブユニットを含有するポリヌクレオチドを指す。核酸は、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）、あるいはＤＮＡまたはＲＮＡの類似物質であることが可能である。ヌクレオチド類似物質は市販されており、このようなヌクレオチド類似物質を含有するポリヌクレオチドを作製する方法は公知である（Ｌｉｎら（１９９４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：５２２０−５２３４；Ｊｅｌｌｉｎｅｋら、（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４：１１３６３−１１３７２；Ｐａｇｒａｔｉｓら、（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：６８−７３）。核酸は１本鎖、２本鎖、またはその混合物である場合がある。本明細書では、別途規定しない限り、核酸は２本鎖であり、または文脈からそのことが明らかである。
【００５０】
本明細書で使用するように、ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、プラスミドならびに修飾ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似物質を含むＤＮＡを含む、あらゆる種類および範囲のＤＮＡ分子を含むものである。
【００５１】
本明細書で使用するように、ヌクレオチドは、ヌクレオチド１リン酸、２リン酸、および３リン酸を含む。ヌクレオチドは、これに限定されるわけではないが、ホスホロチオアートヌクレオチドおよびジアザプリンヌクレオチドおよび他のヌクレオチド類似物質などの修飾ヌクレオチドも含む。
【００５２】
本明細書で使用するように、「対象」という用語は、大型ＤＮＡ分子が導入できる動物、植物、昆虫、および鳥類を指す。ヒト、霊長類、げっ歯類、ウシ、ブタ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、マウス、ラット、モルモット、ネコ、イヌ、ウマ、ニワトリおよびその他を含む、哺乳類および鳥類などの高等生物も含まれる。
【００５３】
本明細書で使用するように、「対象に投与する」とは、１つ以上の送達薬剤および／または大型核酸分子を一緒にまたは個別に、対象内に存在する標的細胞が薬剤および／または大型核酸分子と最終的に接触するように、対象内に導入される、または対象に塗布される手順である。
【００５４】
本明細書で使用するように、「標的化送達ベクター」または「標的化送達ビヒクル」は、外来性核酸分子を担持して、標的細胞または組織まで搬送するウイルス粒子および非ウイルス粒子の両方を指す。ウイルスビヒクルとしては、これに限定されるわけではないが、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルスが挙げられる。非ウイルスビヒクルとしては、これに限定されるわけではないが、微粒子、ナノ粒子、ビロソームおよびリポソームが挙げられる。「標的化された」は本明細書で使用するように、送達ビヒクルと結合されて、ビヒクルを細胞または組織へ標的化するリガンドの使用を指す。リガンドとしては、これに限定されるわけではないが、抗体、受容体およびコラーゲン結合ドメインが挙げられる。
【００５５】
本明細書で使用するように、「伝達」と互換的に使用される「送達」は、外来核酸分子が細胞内に位置するように細胞内へ移入されるプロセスを指す。核酸の送達は、核酸の発現とは別個のプロセスである。
【００５６】
本明細書で使用するように、「多重クローニング部位（ＭＣＳ）」は、複数の制限酵素部位を含有するプラスミド内の核酸領域であり、そのいずれもベクターを消化するために標準組み換え技術と併せて使用することができる。「制限酵素消化」は、核酸分子内の特異的位置のみで機能する酵素による核酸分子の触媒的切断を指す。これらの制限酵素の多くは市販されている。このような酵素の使用は当業者に広く理解されている。ベクターはＭＣＳ内で切断する制限酵素を使用して頻繁に線形化または断片化されて、外来配列がベクターに連結できるようにする。  本明細書で使用するように、「複製起点」（「ｏｒｉ」と呼ばれることが多い）は、複製が開始される特異的核酸配列である。あるいは宿主細胞が酵母である場合、自己複製配列（ＡＲＳ）が利用できる。
【００５７】
本明細書で使用するように、「選択可能またはスクリーニング可能なマーカー」は、発現ベクターを含有する細胞の容易な同定を可能にする、細胞に対する識別可能な変化を与える。一般に、選択可能なマーカーは、選択を可能にする特性を与えるマーカーである。正の選択可能なマーカーは、マーカーの存在がその選択を可能にするマーカーであるが、負の選択可能なマーカーは、その存在がその選択を防止するマーカーである。正の選択可能なマーカーの例は、薬物耐性マーカーである。
【００５８】
通常、薬物選択マーカーの包含は、形質転換体のクローニングや同定を補助し、たとえばネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシンおよびヒスチジノールに耐性を与える遺伝子が有用な選択可能なマーカーである。条件の実現に基づいて形質転換体の識別を可能にする表現型を与えるマーカーに加えて、熱量分析を基礎とするＧＦＰなどのスクリーニング可能なマーカーを含む他の種類のマーカーも検討される。あるいは、スクリーン可能な酵素、たとえば単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）も利用できる。当業者は、おそらくＦＡＣＳ解析と併せて免疫学的マーカーを利用する方法も知っているであろう。使用されるマーカーは、遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現することが可能である限り、重要であると考えられない。選択可能およびスクリーニング可能なマーカーのさらなる例は、当業者に周知である。
【００５９】
「形質移入」という用語は、外来ＤＮＡの細胞による取り込みを指すために使用される。細胞は、外来ＤＮＡが細胞膜の内側に導入されているときに「形質移入」されている。いくつかの形質移入技法が当分野で一般に公知である。たとえばＧｒａｈａｍら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６（１９７３）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８９）；Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６）；Ｃｈｕら、Ｇｅｎｅ  １３：１９７（１９８１）を参照。このような技法を使用して、１つ以上の外来ＤＮＡ部分、たとえばヌクレオチド組み込みベクターおよび他の核酸分子を適切な宿主細胞内に導入することができる。該用語は、化学的、電気的、およびウイルス媒介形質移入手順を捉えている。
【００６０】
本明細書で使用するように、「発現」は、核酸がペプチドに翻訳される、またはＲＮＡ内に転写されて、これがたとえばペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に翻訳されることが可能であるプロセスを指す。核酸がゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は適切な真核宿主細胞または生物が選択されるならばｍＲＮＡのスプライシングを含むことができる。宿主細胞中で発現される異種核酸では、異種核酸が最初に細胞中に送達されて、次に細胞内に入ったら、最終的に核に存在しなければならない。
【００６１】
本明細書で使用するように、「対象に印加する」は、対象中に存在する標的細胞が超音波又は電気エネルギーなどのエネルギーによって最終的に接触される手順である。印加は、エネルギーを印加することができるいずれかのプロセスによる。
【００６２】
「宿主細胞」という用語はたとえば、標的化送達ベクターを産生するために複数の構築物のレシピエントとして使用可能である、または使用されている微生物、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳類細胞を示す。該用語は、形質移入された元の細胞の子孫を含む。それゆえ「宿主細胞」は本明細書で使用するように、一般に、外来ＤＮＡ配列が形質移入されている細胞を指す。単一の親細胞の子孫は自然の、偶発的、または計画的な変異のために、元の親と形態が、あるいはゲノムまたは全ＤＮＡ補体が必ずしも完全に同一でないかもしれないことが理解されるであろう。
【００６３】
本明細書で使用するように、「遺伝子療法」は、療法または診断が要求される障害または状態を持つ哺乳類、特にヒトのある細胞、標的細胞への異種ＤＮＡの移入を含む。ＤＮＡは、異種ＤＮＡが発現されて、それによりコードされた治療用産物が産生されるような方式で、選択した標的細胞中に導入される。あるいは、異種ＤＮＡはある方式で治療用産物をコードするＤＮＡの発現を媒介することが可能であり、異種ＤＮＡはある方式で治療用産物の発現を直接または間接的に媒介するペプチドまたはＲＮＡなどの産物をコードすることが可能である。遺伝子療法は、遺伝子産物をコードする核酸を送達して、欠陥遺伝子を置き換えるために、または核酸が導入される哺乳類または細胞によって産生された遺伝子産物を補助するためにも使用できる。導入された核酸は、哺乳類宿主において通常は産生されない、あるいは治療的有効量で、または治療的に有用なときに産生されない治療化合物、たとえばその成長因子阻害物質、あるいは腫瘍壊死因子またはその阻害物質、たとえばその受容体をコードすることができる。治療用産物をコードする異種ＤＮＡは、産物またはその発現を向上またはそうでなければ改変させるために、罹患した宿主の細胞内への導入前に修飾することができる。
【００６４】
本明細書で使用するように、「異種核酸配列」は通例、それが発現される細胞によって生体内で通常は産生されないＲＮＡおよびタンパク質をコードする、あるいは転写、翻訳、または他の調節可能な生化学プロセスに影響を及ぼすことによって外来ＤＮＡの発現を改変させる媒介物を媒介またはコードするＤＮＡである。異種核酸配列は外来ＤＮＡと呼ばれることもある。当業者がＤＮＡが発現される細胞に対して異種または外来であると認識または考慮するであろういずれのＤＮＡも、本発明書では異種ＤＮＡに含まれる。異種ＤＮＡの例としては、これに限定されるわけではないが、追跡可能なマーカータンパク質、たとえば薬物耐性を与えるタンパク質をコードするＤＮＡ、治療的有効物質、たとえば抗癌剤、酵素およびホルモンをコードするＤＮＡ、ならびに他の種類のタンパク質、たとえば抗体をコードするＤＮＡが挙げられる。異種ＤＮＡによってコードされた抗体は、異種ＤＮＡが導入された細胞の表面で分泌または発現されることが可能である。
プラスミド
本明細書で開示するプラスミドは、治療および診断手順での使用のための標的化送達ベクターを形質移入および産生するために使用される。一般に、このようなプラスミドは、本明細書で開示する標的化ベクターの、ウイルス性または非ウイルス性の構成成分をコードする核酸配列を供給する。このようなプラスミドとしては、たとえばコラーゲン結合ドメインを含有するように修飾された４０７０Ａ両栄養性エンベロープタンパク質をコードする核酸配列が挙げられる。さらなるプラスミドとしては、プロモータに作動可能に連結された核酸配列が挙げられる。配列は一般に、ウイルスｇａｇ−ｐｏｌポリペプチドをコードする。プラスミドはプロモータに作動的に連結された核酸配列をさらに含み、配列は産生細胞に薬物耐性を与えるポリペプチドをコードする。複製起点も含まれる。さらなるプラスミドは、診断用または治療用ポリペプチドをコードする異種核酸配列、５’および３’長末端反復配列；ψレトロウイルスパッケージ配列、５’ＬＴＲの上流のＣＭＶプロモータ、プロモータに作動可能に連結された核酸配列、およびＳＶ４０複製起点を含むことができる。
【００６５】
異種核酸配列は一般に、診断用または治療用ポリペプチドをコードする。詳細な実施形態において、治療用ポリペプチドまたはタンパク質は、それ自体が、または他の化合物の存在下で細胞死を引き起こす「自殺タンパク質」である。このような自殺タンパク質の代表的な例は、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼである。さらなる例としては、水痘帯状疱疹ウイルスのチミジンキナーゼ、細菌遺伝子シトシンデアミナーゼ（５−フルオロシトシンを毒性の強い化合物５−フルオロウラシルに変換する）、ｐ４５０オキシドレダクターゼ、カルボキシペプチダーゼＧ２、ベータグルクロニダーゼ、ペニシリン−Ｖ−アミダーゼ、ペニシリン−Ｇ−アミダーゼ、ベータラクタマーゼ、ニトロレダクターゼ、カルボキシペプチダーゼＡ、リナマラーゼ（ベータグルコシダーゼとも呼ばれる）、大腸菌ｇｐｔ遺伝子、および大腸菌Ｄｅｏ遺伝子が挙げられるが、他も当分野で公知である。一部の実施形態において、自殺タンパク質はプロドラッグを毒性化合物に変換する。本明細書で使用するように、「プロドラッグ」は、毒性産物に変換できる、すなわち腫瘍細胞に対して毒性である、本発明の方法で有用ないずれの化合物も意味する。プロドラッグは、自殺タンパク質によって毒性産物に変換される。このようなプロドラッグの代表的な例としては：チミジンキナーゼに対するガンシクロビル、アシクロビル、およびＦＩＡＵ  （１−（２−デオキシ−２−フルオロ−ベータ−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−ヨードウラシル）；オキシドレダクターゼに対するイホスファミド；ＶＺＶ−ＴＫに対する６−メトキシプリンアラビノシド；シトシンデアミナーゼに対する５−フルオロシトシン；ベータグルクロニダーゼに対するドキソルビシン；ニトロレダクターゼに対するＣＢ１９５４およびニトロフラゾン；ならびにカルボキシペプチダーゼＡに対するＮ−（シアノアセチル）−Ｌ−フェニルアラニンまたはＮ−（３−シクロプロピオニル）−Ｌ−フェニルアラニンが挙げられる。プロドラッグは、当業者によってただちに投与することができる。当業者は、プロドラッグの投与のための最も適切な用量および経路をただちに決定できるであろう。
【００６６】
一部の実施形態において、治療用タンパク質またはポリペプチドは癌抑制物質、たとえばｐ５３またはＲｂであり、あるいはこのようなタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸である。もちろん当業者には、広範囲にわたるこのような癌抑制物質あるいは癌抑制物質および／それらをコードする核酸を得る方法は公知である。
【００６７】
治療用タンパク質またはポリペプチドの他の例としては、アポトーシス促進性治療用タンパク質またはポリペプチド、たとえばｐ１５、ｐ１６、またはｐ２１．ｓｕｐ．ＷＡＦ−１が挙げられる。
【００６８】
サイトカイン、およびサイトカインをコードする核酸も治療用タンパク質またはポリペプチドとして使用できる。例としては：ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）；ＴＮＦ−アルファ（腫瘍壊死因子アルファ）；これに限定されるわけではないが、ＩＦＮ−アルファおよびＩＦＮ−ガンマを含むインターフェロン；ならびにこれに限定されるわけではないが、インターロイキン−１（ＩＬ１）、インターロイキン−ベータ（ＩＬ−ベータ）、インターロイキン−２（ＩＬ２）、インターロイキン−４（ＩＬ４）、インターロイキン−５（ＩＬ５）、インターロイキン−６（ＩＬ６）、インターロイキン−８（ＩＬ８）、インターロイキン−１０（ＩＬ１０）、インターロイキン−１２（ＩＬ１２）、インターロイキン−１３（ＩＬ１３）、インターロイキン−１４（ＩＬ１４）、インターロイキン−１５（ＩＬ１５）、インターロイキン−１６（ＩＬ１６）、インターロイキン−１８（ＩＬ１８）、インターロイキン−２３（ＩＬ２３）、インターロイキン−２４（ＩＬ２４）を含むインターロイキンが挙げられるが、他の実施形態も当分野で公知である。
【００６９】
細胞破壊遺伝子の追加の例としては、これに限定されるわけではないが、変異サイクリンＧ１遺伝子が挙げられる。一例として、細胞破壊遺伝子はサイクリンＧ１タンパク質のドミナントネガティブ変異体でもよい（たとえばＷＯ／０１／６４８７０）。
【００７０】
以前に、レトロウイルスベクター（ＲＶ）構築物は一般に、１つはレトロウイルスＬＴＲ、パッケージ配列、および興味のある各遺伝子（複数を含む）を含有して；もう１つのレトロウイルスベクターは強力なプロモータ（たとえばＣＭＶ）はもちろんのこと、外来機能性配列の宿主も含有する、２つの別個のレトロウイルス（ＲＶ）プラスミドのクローニングおよび融合によって産生された。本明細書で開示するｐＣ−ＲＥＸＩＩ（ｅ−ＲＥＸ）ベクターは、実験遺伝子（複数を含む）の定方向クローニングを促進するために、１次プラスミド中の独自のクローニング部位のセットの挿入を含有する改良されたプラスミドを指す。強力なプロモータ（たとえばＣＭＶ）はレシピエントの産生細胞内で産生されたＲＮＡメッセージの量を増加させるためにプラスミド主鎖において利用されるが、遺伝子に隣接したレトロウイルスＬＴＲの外側に位置するので、それ自体はレトロウイルス粒子中にパッケージされない。
【００７１】
したがってヒトへの使用がＦＤＡによって以前に承認されたＧ１ｘＳｖＮａベクター内の戦略的部位内に（ＰＣＲによって得られた）強力なＣＭＶプロモータを含む、改良されたプラスミドが設計され、それゆえ以前に報告されたベクターのプラスミドのサイズと配列の問題を取り除いた。この流線形の構築物はｐＣ−ＲＥＸと呼ばれた。ＰＣ−ＲＥＸは一連の独自のクローニング部位（ｐＣ−ＲＥＸＩＩのＭＣＳを参照、図１４）を含むようにさらに修飾されて、複数の遺伝子の定方向クローンニングおよび／または挿入はもちろんのこと、補助機能ドメインの定方向クローンニングおよび／または挿入も可能にした。それゆえ新たなプラスミドは、ｐＣ−ＲＥＸおよびｐＣ−ＲＥＸＩＩ（ＥＰＥＩＵＳ−ＲＥＸまたはｅＲＥＸ）と呼ばれる。ｐＣ−ＲＥＸプラスミドの設計（図１１Ａを参照）は、直接並べて比較すると、ｐＨＩＴ−１１２／ｐＲＥＸの設計よりも優れていた。新たなプラスミド設計は、各種の治療的に有効なポリペプチドのコード配列を含むようにさらに修飾された。一例において、ドミナントネガティブサイクリンＧ１（ｄｎＧ１）（図１１Ｂを参照）は治療用遺伝子に含まれていた。トリパタイトウイルス粒子（ｅｎｖ、ｇａｇ−ｐｏｌ、およびｄｎＧ１遺伝子ベクター構築物）は、臨床試験の報文で集合的にＲＥＸＩＮ−ＧＴＭと呼ばれている。それゆえＲＥＸＩＮ−Ｇは、標的化注射用ウイルス粒子にパッケージされ、キャプシド形成され、エンベロープされた標的化送達ベクターｄｎＧ１／Ｃ−ＲＥＸを表す。
【００７２】
Ｒｅｘｉｎ−Ｇ産生で使用される系などの一過性プラスミド同時形質移入系における複製可能なレトロウイルスの発生は、マウスベースレトロウイルスエンベロープ構築物、パッケージ構築物ｇａｇ  ｐｏｌ、およびレトロウイルスベクターがそれ自体のプロモータによって駆動された別々のプラスミド中で発現されるので、起こりそうもない。さらにヒト産生細胞がビリオンを産生するために使用される。ヒト細胞は、Ｒｅｘｉｎ−Ｇで使用されたマウスベースレトロウイルスベクターと組み換えすることができる内在性マウス配列を持たない。複製可能なレトロウイルス産生の可能性をさらに低下させるために、Ｒｅｘｉｎ−Ｇの産生に対して近年、改良が行われた。プラスミドｄｎＧ１／Ｃ−ＲＥＸは、各ｇａｇ−ｐｏｌ構築物に含有された５’ＤＮＡ配列と潜在的に重複する残留ｇａｇ−ｐｏｌ配列を含有する。したがって親ｄｎＧ１／Ｃ−ＲＥＸプラスミドから４８７塩基対が除去されて、９７塩基対スプライス受容部位の挿入が続いて、ｐｄｎＧ１／ＵＢＥＲ−ＲＥＸが生じた（図２１Ａ）。
【００７３】
標的リガンドは本明細書で開示するプラスミドに含まれる。一般に、標的リガンドは、標的ポリペプチドがアミノ酸残基６および７の間に挿入される修飾両栄養性ＣＡＥエンベロープポリペプチドなどでのように、プラスミドの核酸配列によってコードされたレトロウイルスエンベロープの未変性（すなわち未修飾）受容体結合領域の２つの連続して番号付けされたアミノ酸残基の間に挿入される。ポリペプチドは、モロニーマウス白血病ウイルスの両栄養性エンベロープ中に含まれるｇｐ７０として公知のタンパク質の一部である。一般に、標的ポリペプチドは、これに限定されるわけではないが、コラーゲン（コラーゲンＩ型およびコラーゲンＩＶ型を含む）、ラミニン、フィブロネクチン、エラスチン、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、およびフィブロネクチンに結合する配列、たとえばアルギニン−グリシン−アスパラギン酸、またはＲＧＤ、配列を含む、細胞外マトリクス成分に結合する結合領域を含む。標的ポリペプチド内に含まれることができる結合領域としては、これに限定されるわけではないが、フォンウィルブランド因子またはその誘導体内の機能ドメインであるポリペプチドドメインが挙げられ、このようなポリペプチドドメインはコラーゲンに結合する。一実施形態において、結合領域は次の構造式：Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒを有するポリペプチドである。
標的化ベクターを産生する方法
本開示はレトロウイルスベクター粒子、アデノウイルスベクター粒子、アデノ随伴ウイルスベクター粒子、ヘルペスウイルスベクター粒子、偽型ウイルス、および修飾、または標的化ウイルス表面タンパク質を有する非ウイルスベクター、たとえば標的化ウイルスエンベロープポリペプチドを含むウイルスおよび非ウイルスベクター粒子に関し、このような修飾ウイルス表面タンパク質、たとえば修飾ウイルスエンベロープポリペプチドとしては、コラーゲンなどの細胞外マトリクス成分に結合する結合領域を含む標的化ポリペプチドを含む。標的化ポリペプチドは、ウイルス表面タンパク質の２つの連続するアミノ酸残基の間に配置することができるか、またはウイルス表面タンパク質から除去されたアミノ酸残基を置換することができる。
【００７４】
遺伝子療法を達成するために最も頻繁に使用される送達系の１つは、ウイルスベクター、最も一般的にはアデノウイルスおよびレトロウイルスベクターを含む。例示的なウイルスベースビヒクルとしては、これに限定されるわけではながい、組み換えレトロウイルス（たとえばＷＯ９０／０７９３６；ＷＯ９４／０３６２２；ＷＯ９３／２５６９８；ＷＯ９３／２５２３４；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，２１９，７４０；ＷＯ９３／１１２３０；ＷＯ９３／１０２１８；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，７７７，１２７；ＧＢ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．２，２００，６５１；ＥＰ  ０  ３４５  ２４２；およびＷＯ９１／０２８０５）、アルファウイルスベースベクター（たとえばシンドビスウイルスベクター、セムリキ森林熱ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４７）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７３；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４６）およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２３；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５０；ＡＴＣＣ  ＶＲ  １２４９；ＡＴＣＣ  ＶＲ−５３２））、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（たとえばＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９３／０３７６９；ＷＯ９３／１９１９１；ＷＯ９４／２８９３８；ＷＯ９５／１１９８４およびＷＯ９５／００６５５を参照）が挙げられる。Ｃｕｒｉｅｌ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．（１９９２）３：１４７に記載されているような死滅アデノウイルスに結合されたＤＮＡの投与も利用できる。
【００７５】
遺伝子送達を目的として、標的細胞に対して未変性であるウイルスから、または標的細胞に対して未変性でないウイルスからウイルス粒子を発生させることができる。一般に、未変性ウイルスベクターよりも未変性でないウイルスベクターを使用することが望ましい。未変性ウイルスベクターは標的細胞に対して天然の親和性を有することがあり、このようなウイルスは、標的細胞でより大きい増殖の可能性を有するので、より大きな危険をもたらしている。この点で、ヒト細胞での増殖のために天然に設計されていない動物ウイルスベクターは、ヒト細胞への遺伝子送達に有用でありうる。しかし、遺伝子送達での使用のためにこのような動物ウイルスベクターの十分な収量を得るには、未変性動物パッケージング細胞における産生を実施する必要がある。しかしこの方法で産生されたウイルスベクターは通常、ヒト細胞に向性を与えることができるエンベロープの一部またはキャプシドの一部のどちらかとしての、いずれかの成分が不足している。たとえば非ヒトウイルスベクター、たとえばＭＭＬＶなどのエコトロピックマウス（マウス、ｍｕｒｉｎｅ）レトロウイルスは、マウスパッケージング細胞系に導入される。ヒト細胞向性に必要な別の成分も供給されねばならない。
【００７６】
一般に、ウイルスベクター（ヘルパーウイルスなし）の増殖はパッケージング細胞において進行し、パッケージング細胞では、ウイルス核酸をコードする細胞ゲノムおよび核酸に安定して組み込まれた成分をパッケージングするための核酸配列がこのような細胞に導入される。現在入手できるパッケージング系統は、遺伝子療法用途のためのヒト細胞を形質導入するために十分な力価の産生クローンを生じ、ヒト臨床試験の開始に至っている。しかしこれらの系統が不十分である２つの分野がある。
【００７７】
第一に、特定の用途のための適切なレトロウイルスベクターの設計は、複数のベクター配置の構築および試験を必要とする。たとえばＢｅｌｍｏｎｔら、Ｍｏｌｅｃ．ａｎｄ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８（１２）：５１１６−５１２５（１９８８）は、最高の力価の産生株を産生することと、最適な発現を与えることの両方が可能であるベクターを同定するために、１６レトロウイルスベクターから安定な産生系統を構築した。調査した配置の一部としては：（１）ＬＴＲ駆動発現対内部プロモータ；（２）ウイルスまたは細胞遺伝子に由来する内部プロモータの選択；（３）選択可能マーカーが構築物に包含されていたかどうかが挙げられる。安定な産生系統を生成する必要なしに、迅速な高力価ウイルスの産生を可能にするパッケージング系は、複数の構築物に由来する高力価産生クローンの同定に必要な約２ヶ月を短縮できるという点で、非常に好都合であるだろう。
【００７８】
第２に、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞と比較して、高力価両栄養性レトロウイルス産生株を用いた哺乳類体細胞の初代培養物の感染効率はかなり異なっている。マウス筋芽細胞（Ｄｈａｗａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１５０９−１５１２（１９９１）またはラット毛細管内皮細胞（Ｙａｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８１０１−８１０５（１９９１））の形質導入効率は、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞の形質導入効率とほぼ等しいことが示されたが、イヌ肝細胞の形質導入効率（Ａｒｍｅｎｔａｎｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：６１４１−６１４５（１９９０））は、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞で見られた形質導入効率のわずか２５％であった。原発性ヒト腫瘍浸潤リンパ球（「ＴＩＬ」）、末梢血リンパ球から単離したヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞、ならびに霊長類長期再構築造血幹細胞は、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞と比較して低い形質導入効率の極端な例を表す。精製ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、安定した産生クローンからの上清によって１回で６％〜９％のレベルまで感染することが報告されている（Ｍｏｒｅｃｋｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３２：３４２−３５２（１９９１））。レトロウイルスベクターがｎｅｏＲ遺伝子を含有する場合、Ｇ４１８での選択によって形質導入細胞が高度に濃縮された集団を入手することができる。しかし選択可能マーカー発現は、造血幹細胞中での生体内における長期遺伝子発現に対して悪影響を有することが示されている（Ａｐｐｅｒｌｙら、Ｂｌｏｏｄ  ７８：３１０−３１７（１９９１））。
【００７９】
これらの制限を克服するために、新規な一過性形質移入パッケージング系が提供される。レトロウイルスベクター設計の改良は：（１）従来技術を表す面倒なプラスミドクローニングおよび融合手順の置き換え、（２）規制当局（すなわちＦＤＡ）認可を得る観点から試薬を損なうであろう、親構築物における過度の融合および変異を回避する単一で直接のプラスミド構築物の供給、（３）得られたレトロウイルスベクター中の冗長、無効および／または望ましくない配列の除去、（４）レトロベクター中への治療用遺伝子構築物の選択および定方向クローニングのより高い柔軟性、（５）レトロウイルスベクター内の各種の補助ドメインの分子クローニングの促進、（６）ベクター産生細胞との関連で親プラスミドの性能を明らかに向上させて、それゆえレトロウイルスベクター産物の得られた効力を向上させる、戦略的修飾の導入、（７）プラスミド産生が生物学的発光の「低コピー、低収率」試薬から中間収率の試薬まで増加される程度までの、レトロウイルスベクター構築物の全体のサイズの著しい縮小、を可能にする。まとめると、これらの修飾は、現在使用されているレトロウイルスベクターの長所（ベクター安全性、遺伝子取り込みおよび遺伝子発現に関して）を保持して、同時にヒト遺伝子療法のための有望なレトロウイルスベクターの構築、確認、製造、および性能における著しい改良をもたらしている。このことは、ＴＤＳの第２の成分がＣ−ＲＥＸベクターと呼ばれる高性能レトロウイルス発現ベクターを含むことを表す。
【００８０】
一過性形質移入は、パッケージング細胞法に勝る多数の利点を有する。この点で、一過性形質移入は、安定なベクター産生細胞系統を生成するのに必要なより長い時間を回避し、ベクターゲノムまたはレトロウイルスパッケージング成分が細胞に対して毒性である場合に使用される。ベクターゲノムが毒性遺伝子または宿主細胞の複製を妨害する遺伝子、たとえば細胞周期の阻害物質またはアポトーシスを誘発する遺伝子をコードする場合、安定なベクター産生細胞系統を生成することが困難なことがあるが、細胞が死ぬ前に一過性形質移入を使用してベクターを産生することができる。また細胞系統は、安定なベクター産生細胞系統から得られたレベルに匹敵するベクター力価レベルを産生する一過性形質移入を使用して開発されてきた（Ｐｅａｒら、１９９３，ＰＮＡＳ  ９０：８３９２−８３９６）。
【００８１】
高いバルク力価および生物活性を備えた細胞破壊遺伝子を担持するレトロウイルスベクターストックの大規模産生のための高効率製造プロセスが提供される。その製造プロセスは、一過性に形質移入された２９３Ｔ産生細胞の使用；産生細胞スケールアップの操作方法；および高忠実度で細胞破壊遺伝子発現を維持するレトロウイルスベクターを生成する一過性形質移入手順について説明する。
【００８２】
別の実施形態において、臨床レトロウイルスベクター産生のための完全確認（ｆｕｌｌｙ  ｖａｌｉｄａｔｅｄ）２９３Ｔ（ＳＶ４０ラージＴによって形質転換されたヒト胎児由来腎臓細胞）マスター細胞バンクが提供される。２９３Ｔ細胞は実験室で使用するために少量の中〜高力価ベクターストックを生成したが、これらの産生細胞は、臨床ベクターストックの大規模産生に有用であることが以前には示されていない。Ｕ．Ｓ．ＦＤＡは、臨床生成物に未処置発癌遺伝子を移入できるベクターの使用を厳しく規制および制限している。製造プロセスは、ベクター効力の損失を一切生じない、ベクター採取および収集の最終ステップにおけるＤＮＡ分解の方法を含む。別の実施形態において、１０９ｃｆｕ／ｍｌに接近する臨床ベクター産物の一貫した生成のためにレトロウイルスベクターストックを濃縮する方法が提供される。臨床産物の最終調合物は、高力価臨床ベクターストックの採取、収集および貯蔵のための、化学的に定義された無血清溶液より成る。
【００８３】
別の実施形態において、無菌性の維持、品質管理試料のサンプリングおよび容易な最終充填のための閉ループマニホールドシステムを使用する臨床ベクターの収集の方法が提供される。閉ループマニホールドアセンブリ（図１９Ａおよび１９Ｂを参照）は、臨床産物の収集、すなわちサンプリング、採取、濃縮および最終充填中の無菌性の維持に必要な仕様を満足するように設計されており、市販製品として入手できない。本明細書で開示するウイルス粒子の採取、濃縮および貯蔵のための閉ループマニホールドアセンブリは、エチルビニル酢酸（ＥＶＡ）の流体接触層と、エチルビニルアルコール（ＥＶＯＨ）の気体バリアと、ＥＶＡの外層より成る３層同時押出フィルムであるＳｔｅｄｉｍ  ７１フィルムより成る、フレックスボーイバッグおよびマニホールドシステムを備えている。総フィルム厚は３００ｍｍである。ＥＶＡは不活性非ＰＶＣベースフィルムであり、可塑剤の添加を必要とせず、それにより抽出可能物を最小限に抑えている。Ｓｔｅｍは広範な生体適合性試験を実施して、本製品のＦＤＡによるドラッグマスターファイルを確立した。フィルムおよびポートチューブはＵＳＰクラスＶＩ要件を満足している。バッグのカスタマイズはすべてＳｔｅｄｉｍのクラス１０，０００管理製造環境で行われる。使用するフィルム、管材料およびすべての部品は４５ｋＧｙまでのガンマ適合性である。ガンマ照射は最低曝露２５ｋＧｙから最大４５ｋＧｙまでで実施される。Ｓｔｅｄｉｍおよびその契約滅菌業者から製品適合証明書が提供される。
【００８４】
臨床ベクターは、−８０℃にて５００ｍｌクリオバッグ中に１５０ｍｌの体積で貯蔵した。完全確認産物は、１ミリリットル当たり３×１０７コロニー形成単位（単位）のウイルス力価、ヒト乳癌細胞、結腸癌細胞および膵臓癌細胞中で６５〜７０％成長阻害活性の生物学的効力、ウイルス凝集のない１００ｎｍまでの均一な粒径、無処置発癌細胞が存在しないことを示す５５０ｂｐ未満の残留ＤＮＡ、検出不能のＥ１ＡまたはＳＶ４０ラージＴ抗原、およびダンハツカネズミおよびヒト２９３細胞での５回継代において検出不能な複製可能なレトロウイルス（ＰＣＲ）を示した。産物はエンドトキシンレベル＜０．３ＥＵ／ｍｌの無菌性であり、産生最終細胞はマイコプラズマおよび他の偶性ウイルスを含まない。
【００８５】
新たなｐＢ−ＲＶＥおよびｐｄｎＧ１／ＵＢＥＲ−ＲＥＸプラスミドを使用して産生されたＲｅｘｉｎ−Ｇは、−７０±１０℃にて１５０ｍｌプラスチック製クリオバッグ内に２０〜４０ｍｌの体積で貯蔵した。臨床ロットの力価は０．５〜５．０×１０ｅ９単位（Ｕ）／ｍｌの範囲であり、各ロットは複製可能なレトロウイルス（ＲＣＲ）を含まないことと、必要な純度、生物学的効力、無菌性、ヒトにおける全身使用のための全体的な安全性を備えることが確認された。
【００８６】
ウイルスエンベロープは、これに限定されるわけではないが、フィブロネクチンに結合する、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸、すなわちＲＧＤ配列と、またフィブロネクチンに結合する配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐを有するポリペプチドを含む標的リガンドを含む。結合領域に加えて、標的ポリペプチドは、結合領域のＮ末端および／またはＣ末端に位置する１つ以上のアミノ酸残基のリンカー配列をさらに含むことがあり、それによりこのようなリンカーは修飾エンベロープポリペプチドの、回転柔軟性を向上させる、および／または立体障害を最小限に抑える。ポリヌクレオチドは、当業者に公知の遺伝子組み換え技法によって構築できる。
【００８７】
それゆえ本発明によって作製された標的化送達ベクターは、それに結合された標的部位におけるベクター蓄積を促進するリガンド、すなわち標的特異性リガンドを含有する。リガンドは化学的部分、たとえば分子、官能基、またはその断片であり、選択した標的と特異的反応性であるが、他の標的とはあまり反応性ではなく、それゆえ標的化送達ベクターに、治療用または診断用ポリペプチドをコードする核酸を選択した標的付近の細胞中へ選択的に移入させる利点を与える。「反応性」であるとは、細胞または組織に対する結合親和性を有すること、あるいは細胞中へ内部移行することができるという意味であり、結合親和性は当分野で公知のいずれの手段によっても、たとえばＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、免疫細胞化学、表面プラスモン共鳴などのいずれの標準試験管内アッセイによっても検出できる。通常、リガンドは、特定の分子部分であるエピトープ、たとえば分子、官能基、あるいは細胞または組織と結合した細胞複合体に結合して、２つの構成要素の結合対を形成する。結合対において、いずれの構成要素もリガンドであることが可能であるが、残りの構成要素はエピトープであることが認識される。このような結合対は当分野で周知である。例示的な結合対は、抗体−抗原、ホルモン−受容体、酵素−基質、栄養素（たとえばビタミン）−輸送タンパク質、成長因子−成長因子受容体、炭水化物−レクチン、および相補配列を有する２つのポリヌクレオチドである。リガンドの断片はリガンドと見なすことが可能であり、本発明では断片が適切な細胞表面エピトープに結合する能力を保持する限り使用できる。好ましくは、リガンドは免疫グロブリンの抗原結合配列を含むタンパク質およびペプチドである。さらに好ましくは、リガンドはＦｃ配列が欠損した抗原結合抗体断片である。このような好ましいリガンドは、免疫グロブリンのＦａｂ断片、免疫グロブリンのＦ（ａｂ）２断片、Ｆｖ抗体断片、または単鎖Ｆｖ抗体断片である。これらの断片は、酵素的に誘導することができるか、または組み換えにより産生することができる。その機能的態様において、リガンドは好ましくは、内部移行可能なリガンド、すなわちたとえばエンドサイトーシスのプロセスによって選択した細胞により内部移行されるリガンドである。同様に、置換または他の改変を持つが、エピトープ結合能力を保持するリガンドを使用できる。リガンドは、病的細胞、たとえば悪性細胞または感染性因子を認識するために好都合に選択される。露出されたコラーゲンに結合するリガンドはたとえば、悪性組織を含む対象の領域にベクターを標的化することができる。一般に、体の別の領域に転移した細胞は、健康な細胞を浸潤および破壊することによってそうする。この浸潤は、本明細書で提供されるベクターによって標的化することができる露出されたコラーゲンで起こる。
【００８８】
ベクターを標的化するために使用できるリガンドのさらなる群は、多くの腫瘍にて細胞表面で過剰発現されるチロシンキナーゼ成長因子受容体と結合対を形成するリガンドである。代表的なチロシンキナーゼ成長因子は、ＶＥＧＦ受容体、ＦＧＦ受容体、ＰＤＧＦ受容体、ＩＧＦ受容体、ＥＧＦ受容体、ＴＧＦ−アルファ受容体、ＴＧＦ−ベータ受容体、ＨＢ−ＥＧＦ受容体、ＥｒｂＢ２受容体、ＥｒｂＢ３受容体、およびＥｒｂＢ４受容体である。ＥＦＧ受容体ｖＩＩＩおよびＥｒｂＢ２（ＨＥｒ２）受容体がＩＮＳＥＲＴＳを使用する癌治療の状況で特に好ましいのは、これらの受容体が、正常細胞では少ないが、悪性細胞に対してより特異的であるためである。あるいは、リガンドは、有用な遺伝子の導入による遺伝子補正または遺伝子改変が必要な細胞、たとえば：肝臓細胞、上皮細胞、遺伝子欠損生物における内分泌細胞、試験管内胎児性細胞、胚細胞、幹細胞、生殖細胞、ハイブリッド細胞、植物細胞、または工業プロセスで使用されるいずれの細胞をも認識するために選択される。
【００８９】
リガンドは、当分野で利用可能ないずれの方法によっても、ウイルス粒子の表面で発現することができるか、または非ウイルス粒子に結合することができる。結合は、吸着または複合体形成によってなどの、共有または非共有結合であることが可能である。結合は好ましくは、共有または非共有結合を形成するリガンドに共役可能であり、「アンカー」と呼ばれる親油性分子部分を含む。アンカーは、脂質ミセル、二重層、および他の凝縮相などの親油性環境への親和性を有し、それによりリガンドを脂質−核酸微粒子に結合させる。親油性アンカーを介したリガンド結合の方法は当分野で公知である（たとえばＦ．Ｓｃｈｕｂｅｒ，“Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄ−ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｔｏ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ”を参照、ｉｎ：Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ａｓ  Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｂａｓｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，ｅｄ．ｂｙ  Ｊ．Ｒ．Ｐｈｉｌｉｐｐｏｔ  ａｎｄ  Ｆ．Ｓｃｈｕｂｅｒ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９５，ｐ．２１−３７）。
【００９０】
本明細書で開示する標的化送達ベクターがウイルスおよび非ウイルス粒子を含むことが認識されている。非ウイルス粒子は、脂質二重層中に完全または部分構築ウイルス粒子を含む、カプセル化核タンパク質を含む。脂質二重層中にウイルスをカプセル化する方法は当分野で公知である。方法としては、脂質二重層封入ベシクル（リポソーム）への受動封入、およびリポソームによるビリオンのインキュベーション（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，９６２，４２９；Ｆａｓｂｅｎｄｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：６４７９−６４８９；Ｈｏｄｇｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓｏｌａｉｍａｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：３３９−３４２（１９９６））が挙げられる。理論に縛られることなく、我々は、ビリオン表面に露出された酸性タンパク質が標的化送達ベクターのカチオン性脂質／カチオン性ポリマー成分との複合体形成のための界面を提供して、中性脂質成分による二重層形成のための「足場」として作用することを仮定する。例示的なウイルスの種類は、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルスおよびバクテリオファージである。
【００９１】
たとえばカチオン性リポソームおよびポリカチオンを含む、微粒子またはナノ粒子などの非ウイルス送達系は、送達系の代わりの方法を提供して、本開示に含まれる。
【００９２】
非ウイルス送達系の例としては、たとえばＷｈｅｅｌｅｒら、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．５，９７６，５６７および５，９８１，５０１が挙げられる。これらの特許は、プラスミドの水溶液にカチオン性および非カチオン性脂質を含有する有機溶液を接触させることによる、血清安定性プラスミド−脂質粒子の調製を開示している。Ｔｈｉｅｒｒｙら、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，０９６，３３５は、全体的にアニオン性の生物活性物質、カチオン性構成要素およびアニオン性構成要素を含む複合体の調製を開示する。Ａｌｌｅｎ  ａｎｄ  Ｓｔｕａｒｔ，ＰＣＴ／ＵＳ９８／１２９３７（ＷＯ９８／５８６３０）は、カチオン性脂質の可溶化に適した脂質溶媒中でポリヌクレオチド−カチオン性脂質粒子を形成することと、粒子を含有する溶媒に中性ベシクル形成脂質を添加することと、脂質溶媒を蒸発させてポリヌクレオチドが中に捕捉されたリポソームを形成することとを開示している。Ａｌｌｅｎ  ａｎｄ  Ｓｔｕａｒｔ，Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，１２０，７９８は、第１のたとえば水性溶媒にポリヌクレオチドを溶解させることによってポリヌクレオチド−脂質微粒子を形成することと、前記第１溶媒と混合できない第２のたとえば有機溶媒に脂質を溶解させることと、単層の生成をもたらすために第３の溶媒を添加することと、２つの液相の生成をもたらすために第１および第２の溶媒の量をさらに添加することとを開示している。Ｂａｌｌｙら、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，７０５，３８５、およびＺｈａｎｇら、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，１１０，７４５は、脂質−核酸混合物を生成するために核酸に非カチオン性脂質およびカチオン性脂質を含有する溶液を接触させることによって、脂質−核酸粒子を調製する方法を開示している。Ｍａｕｒｅｒら、ＰＣＴ／ＣＡ００／００８４３（ＷＯ０１／０６５７４）は、予備形成された脂質ベシクル、荷電治療剤、および不安定化剤を混合して、ベシクルを不安定化するが、破壊はしない不安定化溶媒中でその混合物を生成することと、次に脱安定化剤を除去することとを含む、荷電治療剤の完全液体カプセル化治療剤粒子を調製する方法を開示している。
【００９３】
粒子形成成分（「ＰＦＣ」）は通例、場合によりカチオン性脂質以外のＰＦＣと組み合された、脂質、たとえばカチオン性脂質を含む。カチオン性脂質は、分子が約３〜約１０のｐＨの範囲において、好ましくは約４〜約９の生理学的ｐＨ範囲において正味の陽イオン電荷を産生する電離をすることができる脂質である。このようなカチオン性脂質はたとえば、１本の炭化水素鎖を有するカチオン性両親媒性物質などのカチオン性洗剤を含む。特許および科学文献は、核酸形質移入促進特性を有する多数のカチオン性脂質について記載している。これらの形質移入促進カチオン性脂質としては、たとえば：１，２−ジオレイルオキシ−３−（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニオ）プロパンクロライド、ＤＯＴＭＡ（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，８９７，３５５）；ＤＯＳＰＡ（Ｈａｗｌｅｙ−Ｎｅｌｓｏｎら、Ｆｏｃｕｓ  １５（３）：７３（１９９３）を参照）；Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−アンモニウムブロミド、すなわちＤＤＡＢ（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，２７９，８３３）；１，２−ジオレイルオキシ−３−（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニオ）プロパンクロライド−ＤＯＴＡＰ（Ｓｔａｍａｔａｔｏｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７：３９１７−３９２５（１９８８））；グリセロールベース脂質（Ｌｅｖｅｎｔｉｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０２３：１２４（１９９０）を参照；アルギニル−ＰＥ（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，９８０，９３５）；リジニル−ＰＥ（Ｐｕｙａｌら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２８：６９７（１９９５））、リポポリアミン（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，１７１，６７８）およびコレステロールベース脂質（ＷＯ９３／０５１６２，Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，２８３，１８５）；ＣＨＩＭ  （１−（３−コレステリル）−オキシカルボニル−アミノメチルイミダゾール；などが挙げられる。形質移入のためのカチオン性脂質は、たとえばＢｅｈｒ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５：３８２−３８９（１９９４）で総説されている。好ましいカチオン性脂質は、ＤＤＡＢ、ＣＨＩＭ、またはその組合せである。カチオン性洗剤であるカチオン性脂質の例としては、（Ｃ１２〜Ｃ１８）−アルキル−および（Ｃ１２〜Ｃ１８）−アルケニル−トリメチルアンモニウム塩、Ｎ−（Ｃ１２〜Ｃ１８）−アルキル−およびＮ−（Ｃ１２〜Ｃ１８）−アルケニル−ピリジニウム塩などが挙げられる。
【００９４】
本明細書により形成された標的化送達ベクターのサイズは、約４０〜約１５００ｎｍの範囲に、好ましくは約５０〜５００ｎｍの範囲に、最も好ましくは約２０〜１５０ｎｍの範囲にある。本サイズ選択は、標的化送達ベクターが体に投与されて血管から悪性腫瘍などの罹患組織中へ浸透して、その中へ治療用核酸を移入させるときに、標的化送達ベクターを好都合に補助する。たとえば動的光散乱法によって測定されるようなそのサイズが試験管内細胞培地または血漿などの細胞外生体液の存在下で実質的に増大しないということも、標的化送達ベクターの特徴的で好都合な特性である。
【００９５】
あるいはＣｕｌｖｅｒら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６，１５５０−１５５２に記載されているように、レトロウイルスを産生する細胞を腫瘍中に注射することができる。このように導入されたレトロウイルス産生細胞は操作されて、ウイルスベクター粒子などの標的化送達ベクターを能動的に産生するので、ベクターの連続産生がインサイチューで腫瘍塊内にて行われた。それゆえ増殖する腫瘍細胞は、レトロウイルスベクター産生細胞と混合されれば、生体内でうまく形質導入することができる。
治療方法
本発明の標的化ベクターは、変異体サイクリンＧポリペプチドなどの治療剤をコードする核酸を送達する遺伝子療法プロトコルの一環として使用することもできる。それゆえ本発明の別の態様は、転移腫瘍性障害に関連する細胞タイプを含む対象の領域への治療剤の生体内または試験管内形質移入のための発現ベクターを特徴とする。本明細書で提供される標的化ベクターは、遺伝子療法用のベクターとしての使用を目的としている。変異体サイクリンＧポリペプチドおよび核酸分子は、他の標的化ベクター中の相当する遺伝子を置き換えるために使用できる。あるいは本明細書で開示した標的化ベクター（たとえばコラーゲン結合ドメインを含む標的化ベクター）は、いずれの治療剤（たとえばチミジンキナーゼ）もコードする核酸を含有することができる。腫瘍性障害を治療するのに有用な治療剤が興味深い。
【００９６】
本研究は、生体内ヒト臨床試験から生成されたデータを提供する。それにもかかわらず、本明細書で開示する標的化ベクターの追加の毒性および治療有効性は、ＬＤＳ５０（集合の５０％が致死する用量）およびＥＤ５０（集合の５０％に治療的に有効な用量）を決定するための、細胞培養物または実験動物での標準製薬的手順によって決定することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０で表すことができる。大きい治療指数を示す用量が好ましい。本発明において、未処置細胞への損傷を最小限に抑えて、副作用を低減するために送達部位が治療部位を標的にするように設計されているので、通常は副作用効果を示す用量を使用することができる。
【００９７】
ヒト臨床試験から得たデータ（下を参照）は、本発明の標的化ベクターが生体内で腫瘍性障害の進行を抑制することを証明している。表１のデータは、このようなベクターの患者への投与のための治療レジメンを提供する。加えて、別の形の標的化ベクター（たとえば代わりの標的機構または代わりの治療剤）を使用する細胞培養アッセイおよび動物試験から得たデータは、ヒトでの使用のための投薬量の範囲を調合するのに使用できる。投薬量は好ましくは、毒性をほとんどまたは全く持たない、ＥＤ５０を含む循環濃度範囲内にある。投薬量は、採用した投薬形および利用する投薬経路に応じてこの範囲内で変化することがある。治療的有効用量は、最初に細胞培養アッセイから概算することができる。用量は、細胞培養で決定されたようにＩＣ５０（すなわち最大半量感染または最大半量阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するために動物モデルにて調合することができる。このような情報は、ヒトでの有用な用量をより正確に決定するために使用できる。血漿中のレベルは、たとえば高速液体クロマトグラフィーによって測定できる。
【００９８】
標的化送達ベクターを含有する製薬組成物は、ベクターの選択された量を１つ以上の生理学的に許容される担体または賦形剤と混合することによっていずれの従来の方式でも調合することができる。たとえば標的化送達ベクターは、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）などの担体に懸濁させてもよい。活性化合物は、いずれの適切な経路によっても、たとえば経口的に、非経口的に、静脈内に、皮内に、皮下に、または局所的に、液体、半液体または固体形で投与することが可能であり、各投与経路に適切な方式で調合される。好ましい投与様式としては、経口および非経口投与様式が挙げられる。
【００９９】
標的化送達ベクターならびに生理学的に許容される塩および溶媒和物は、吸入または吹送（口または鼻のどちらかを通じて）による投与のために、あるいは経口、頬側投与、非経口または経直腸投与のために調合することができる。吸入による投与では、標的化送達ベクターは、加圧パックまたはネブライザからのエアゾールスプレー提示の形で、適切な噴霧剤、たとえばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素および他の適切なガスの使用によって送達することができる。加圧エアゾールの場合、投薬単位は、計量された量を送達するための弁を設けることによって決定できる。吸入器または吹入器で使用するための、治療用化合物とラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末ベースとの粉末ミックスを含有する、たとえばゼラチンのカプセルまたはカートリッジを調合することができる。
【０１００】
経口投与の場合、製薬組成物は、製薬的に許容される賦形剤、たとえば結合剤（たとえばアルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（たとえばラクトース、微結晶性セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（たとえばステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（たとえばジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）；あるいは湿潤剤（たとえばラウリル硫酸ナトリウム）を用いて従来の手段によって調製された、たとえば錠剤またはカプセル剤の形を取ることが可能である。錠剤は、当分野で周知の方法によってコーティングできる。経口投与のための液体調製物は、たとえば液剤、シロップ剤または懸濁剤の形を取ることが可能であるか、またはそれらは使用前に水または他の適切なビヒクルによって構成するための乾燥製品として提供することができる。このような液体調製物は、製薬的に許容される添加剤、たとえば懸濁化剤（たとえばソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素添加食用脂）；乳化剤（たとえばレシチンまたはアラビアゴム）；非水性ビヒクル（たとえばアーモンド油、油状エステル、エチルアルコールまたは分画植物油）；および保存料（たとえばメチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾアートまたはソルビン酸）を用いて従来手段によって調製することができる。調製物は必要に応じて、緩衝塩、着香料、着色料、甘味料も含有することができる。
【０１０１】
経口投与用の調製物は活性化合物の制御放出をもたらすように適切に調合することができる。頬側投与の場合、組成物は従来方式で調合された錠剤または口内錠の形を取ることができる。
【０１０２】
標的化送達ベクターは、注入による、たとえばボーラス注入または持続注入による非経口投与用に調合することができる。注射用調合物は、添加された保存料を含む、たとえばアンプルまたは複数回用量容器での単位投薬形で提供することができる。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁剤、液剤または乳剤などの形を取ることが可能であり、懸濁化剤、安定剤および／または分散化剤などの調合用剤を含有することができる。あるいは活性成分は、使用前に適切なビヒクル、たとえば滅菌性の、発熱物質を含まない水によって構成するための粉末凍結乾燥形であってもよい。
【０１０３】
上述した調合物に加えて、標的化送達ベクターはデポー調製物としても調合することができる。このような長期作用調合物は、（たとえば皮下または筋肉内への）植え込みによって、または筋肉内注入によって投与することができる。それゆえたとえば治療用化合物は適切なポリマーまたは疎水性物質（たとえば適切な油中のエマルジョン）またはイオン交換樹脂を用いて、あるいは難溶性誘導体、たとえば難溶性塩として調合することができる。
【０１０４】
活性剤は、局所（ｌｏｃａｌ）または局所（ｔｏｐｉｃａｌ）使用のために、たとえばゲル、クリーム、およびローションの形での皮膚および粘膜、たとえば眼内への局所使用のために、そして目への使用のために、あるいは槽内または脊髄内使用のために調合することができる。このような液剤、特に眼科用途を目的とする液剤は、適切な塩を用いて、ｐＨ約５〜７の０．０１％〜１０％等張液剤として調合することができる。化合物は、たとえば吸入による局所使用のためのエアゾールとして調合することができる。
【０１０５】
薬物組成物中の活性化合物の濃度は、活性化合物の吸収、不活性化および排泄速度、投薬スケジュール、および投与量はもちろんのこと、当業者に公知の他の因子によっても変わるであろう。たとえば送達される量は、高血圧の症状を治療するのに十分である。
【０１０６】
組成物は所望ならば、活性成分を含有する１回以上の単位投薬形を含有することができるパックまたはディスペンサ器具で提供することができる。パックはたとえば、金属またはプラスチックフォイル、たとえばプリスターパックを含むことができる。パックまたはディスペンサ器具には、投与の説明書が付属していることがある。
【０１０７】
活性剤は、包装材、本明細書で提供される薬剤、および薬剤が提供される障害を示すラベルを含有する製品として包装することができる。
【０１０８】
サイトカイン遺伝子を含む標的化レトロウイルス粒子は、単独で、あるいは他の治療処置または活性剤と併せて投与することができる。たとえば、サイトカイン遺伝子を含む標的化レトロウイルス粒子は、細胞破壊遺伝子を含む標的化レトロウイルス粒子と共に投与できる。投与される細胞破壊遺伝子を含む標的化レトロウイルス粒子の量は、本明細書で上述したようなウイルス粒子の力価に基づいている。一例として、サイトカイン遺伝子を含む標的化レトロウイルス粒子が細胞破壊遺伝子を含む標的化レトロウイルスと併せて投与される場合、各ベクターのレトロウイルス粒子の力価は各ベクターが単独で使用される場合よりも低いことがある。サイトカイン遺伝子を含む標的化レトロウイルス粒子は、細胞破壊遺伝子を含む標的化レトロウイルスと同時に、または別に投与することができる。
【０１０９】
主題発明の方法は、標的化レトロウイルス粒子（たとえば、単独、または細胞破壊遺伝子を発現する標的化レトロウイルスベクターとの併用のどちらかの、サイトカインを発現する標的化レトロウイルスベクター）を１つ以上の他の活性剤と共に投与することによって癌を治療する方法にも関する。使用できる他の活性剤の例としては、これに限定されるわけではないが、化学治療剤、抗炎症剤、プロテアーゼ阻害物質、たとえばＨＩＶプロテアーゼ阻害物質、ヌクレオシド類似物質、たとえばＡＺＴが挙げられる。１つ以上の活性剤は、１つ以上の活性剤と同時にまたは別々に（たとえば標的化レトロウイルス粒子の投与前にまたは標的化レトロウイルス粒子の投与後に）投与することができる。当業者は、標的化レトロウイルス粒子が１つ以上の薬剤と同じ経路（たとえば標的化レトロウイルスベクターおよび薬剤がどちらも静脈内投与される）または別の経路（たとえば標的化レトロウイルスベクターが静脈内投与され、１つ以上の薬剤が経口投与される）のどちらかによって投与可能であることを認識するであろう。
【０１１０】
治療が必要な対象に投与される標的化レトロウイルス粒子の有効量または治療的有効量は、各種の方法で決定することができる。一例として、量は動物モデルでのウイルス力価または有効性に基づくことが可能である。あるいは臨床試験で使用したレジメンを一般ガイドラインとして使用することができる。１日用量は、単回用量で、または１日のさまざまな時間に数回に分けて投与することができる。最初に、より多くの投薬量が必要とされることがあり、最適初期応答が得られたときに経時的に減少させることができる。一例として、治療は数日、数週間、または数年継続できるか、または介在休止期間を置くことができる。投薬量は、個人が投与されている他の治療に従って変更することができる。しかし治療方法は、標的化レトロウイルス粒子の特定の濃度または範囲に決して限定されず、治療されている各個人および使用された各誘導体について変更することができる。
【０１１１】
当業者は、所与の個人に対する最大効果を達成するために、投薬量の個別化が必要かもしれないことを認識するであろう。当業者はさらに、治療されている個人に投与された投薬量が個人の年齢、疾患の重症度またはステージおよび治療過程に対する応答によって変わる場合があることも認識するであろう。当業者には、本明細書に記載された方法によって治療されている個人への適正な投薬量を決定するために評価する臨床パラメータが公知となるであろう。投薬量を決定するために評価することができる臨床パラメータとしては、これに限定されるわけではないが、腫瘍サイズ、特定の悪性腫瘍に関する臨床試験で使用された腫瘍マーカーのレベルの変更が挙げられる。このようなパラメータに基づいて、治療担当医師は、所与の個人に使用される治療的有効量を決定するであろう。このような療法は、必要な頻度で、治療担当医師が必要と判断した期間にわたって投与することができる。
【０１１２】
現在の試験では、癌患者に対する例示的なプロトコルが設計された。Ｒｅｘｉｎ−Ｇの静脈内注入による患者内用量増加レジメンを毎日、８〜１０日間にわたって投与した。本レジメンの完了の後に、毒性評価のための１週間の休止期間を続けた；その後、Ｒｅｘｉｎ−Ｇの最大許容用量を静脈内にさらに８〜１０日間にわたって投与した。患者が治療期間中にＲｅｘｉｎ−Ｇに関連するグレード３または４の有害事象を発症しなかった場合、Ｒｅｘｉｎ−Ｇの用量を次のように増加させた：
表１：治療レジメン
【０１１３】
【表１】
2010509223.tif 000003
最初の２名の患者で認められた安全性に基づいて、多数の肝臓転移があるステージＩＶＢ膵臓癌の第３の患者にＲｅｘｉｎ−Ｇによる最先端治療を６日間静脈内投与して、その後、Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅ  ＢＦＡＤによって承認された第２の臨床プロトコルでの１０００ｍｇ／ｍ２のゲムシタビンの投与を８週間続けた。
【０１１４】
改良ｐＢ−ＲＶＥおよびｐｄｎＧ１／ＵＢＥＲ−ＲＥＸプラスミドの使用により、Ｒｅｘｉｎ−Ｇ（商標）の非常に効力の高い調製物（１〜５×１０ｅ９Ｕ／ｍｌ）の調製が可能となった。このことは以前の製品の大きい注入体積および生じる投薬上の制限の問題を克服して、パリティー解析（Ｃａｌｃｕｌｕｓ  ｏｆ  Ｐａｒｉｔｙ）として定義された戦略的用量集中（ｄｏｓｅ−ｄｅｎｓｅ）レジメンの開発を可能する。癌療法では、治験剤の有効性に影響を及ぼす臨床因子は腫瘍負荷の程度である。多くの場合、腫瘍制御を得る前に用量制限毒性に到達するために、試験薬の安全限界はあまりに狭い。それゆえ、用量制限副作用または臓器損傷を誘発せずに、実際に腫瘍負荷に対処できる制癌剤の開発は、癌治療における重大な出来事および進歩に相当する。別の重要な問題は、適切な動力学的解決法を必要とする、癌増殖の本来の動力学である。腫瘍増殖の史上有名なモデルは今や、過度に単純化されて考えられているが（Ｈｅｉｔｊａｎ．（１９９１）Ｓｔａｔ．Ｍｅｄ．１０：１０７５−１０８８，Ｎｏｒｔｏｎ．（２００５）Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ  １０：３７０−３８１）、これらの単純化されたモデルは、今日まだ実施されている、すなわち薬物を組み合せて使用するための、そして薬物を等しい強度の等間隔のサイクルで使用するための、癌治療の標準の開発に大きな影響をおよぼした。腫瘍収縮が予後改善と相関しているという予測は確かに真実であるが、従来の薬物を十分長期に投与することが腫瘍根絶につながるという予測は誤っていることが判明した（Ｎｏｒｔｏｎ．（２００６）Ｏｎｃｏｌ．４：３６−３７）。Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｇｏｍｐｅｒｒｚによって説明され、Ｎｏｒｔｏｎ−Ｓｉｍｏｎモデルによって明確な形にされたより複雑な動力学の認識は、その予測において転移の力学および腫瘍負荷と転移可能性との間の定量的関係を考慮に入れている。それゆえより短い時間間隔で腫瘍退縮を引き起こす薬物の最適用量を強調して、コンビナトリアル手法よりもむしろ連続手法に好都合であった、用量集中化学療法の概念が出現した（（Ｎｏｒｔｏｎ．（２００６）Ｏｎｃｏｌ．４：３６−３７；Ｆｏｒｍｅｒ  ａｎｄ  Ｎｏｒｔｏｎ．（２００５）Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７：６４−６９）。結果として、いくつかの臨床試験は、薬物をより高密度で投与することが、癌細胞死滅を最適化するという点で著しい相違をもたらすという、裏付けになる証拠を与えた。
【０１１５】
標的化遺伝子送達のための向病巣性ナノ粒子の導入は、転移癌を独自の戦略的方式で治療することへの新たな定量的手法を可能にする。本明細書に記載するパリティー解析は、非常に短縮された期間で所与の腫瘍負荷に対処および適合しようとする新たなパラダイム；言い換えれば、全腫瘍負荷の最良推定量に定量的に基づく用量集中誘導レジメンとなる。パリティー解析は最初から、（ｉ）生理学的性能係数（φ）または生理学的感染多重度（Ｐ−ＭＯＩ）を計算できるようにするために、希釈、乱流、流れ、拡散バリア、濾過、不活性化、およびクリアランスを含む生理学的バリアが十分に相殺されるように、治療剤（この場合、Ｒｅｘｉｎ−Ｇ（商標））が十分に標的化されていることと、（ｉｉ）薬剤が制限的な用量制限毒性を与えないレベルで有効であることと、（ｉｉｉ）薬剤が容量過負荷を誘発せずに個別化用量の静脈内投与を可能にする十分に高い濃度で利用可能であることとを仮定している。細胞破壊サイクリンＧ１構築物の生理学的性能係数は４〜２５０で変化して、一部は薬物の力価に依存する（Ｇｏｒｄｏｎら（２０００）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：３３４３−３３４７）。各日に投与されるＲｅｘｉｎ−Ｇ（商標）の最適投薬量を計算するために、次の因子：（１）放射線撮像試験に基づく全腫瘍負荷、（２）標的癌細胞ごとに必要とされる誘導的遺伝子移入単位の多重性を規定する、系の生理学的性能係数（φ）、および（３）１ｍｌ当たりのコロニー形成単位（Ｕ）で表される、ベクターの力価に関して定義された薬物の正確な効力を考慮に入れた。１遺伝子移入単位は、１コロニー形成単位に相当する。パリティー解析は、投与された標的化ベクターの用量が新しい腫瘍負荷と同等である場合に、腫瘍制御が達成できることを予測している；なお全投薬量は、細網内皮系に生じた腫瘍残屑を排除する時間を与えながら、遅れを取り戻そうとする腫瘍増殖を防止するために、安全に可能であると思われるできるだけ短い期間で投与すべきである（Ｇｏｒｄｏｎら（２０００）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：３３４３−３３４７）。
パリティー解析の式：
初期腫瘍制御に必要な遺伝子療法薬の用量＝腫瘍負荷×ｐＭＯＩ／薬の効力
Ｒｅｘｉｎ−Ｇ治療に適用されるパリティー解析
腫瘍負荷が式［標的病変の最長直径の和（ｃｍ）］×［１×１０ｅ９癌細胞／ｃｍ］より得られる場合
φまたはｐＭＯＩが、前臨床試験および臨床試験から推定された経験的数である場合
Ｒｅｘｉｎ−Ｇでは、ｐＭＯＩは１００である
効力が薬物溶液１ｍｌ当たりのコロニー形成単位（Ｕ）の数である場合。
新たな構築物ｐＢ−ＲＶＥおよびｐｄｎＧ１／ＥＲＥＸを使用して産生したＲｅｘｉｎ−Ｇでは、効力は５×１０ｅ８〜５×１０ｅ９単位／ｍｌの範囲である。
例：転移膵臓癌患者のためのＲｅｘｉｎ−Ｇ用量の計算
患者が寸法２ｃｍ×２ｃｍの局所進行腫瘍と、３個が寸法１ｃｍ×１ｃｍであり、４個目が２ｃｍ×２ｃｍの寸法である４個の肝病変を有する場合
腫瘍負荷（膵臓、肝臓）＝（４ｃｍ＋（２ｃｍ＋２ｃｍ＋２ｃｍ＋４ｃｍ））×１×１０ｅ９細胞／ｃｍ＝１４×１０ｅ９癌細胞
Ｒｅｘｉｎ−Ｇの特定のロットが１×１０ｅ９Ｕ／ｍｌ効力を有する場合
【０１１６】
【数２】
2010509223.tif 000004
例：投与するためのＲｅｘｉｎ−Ｇクリオバッグの数の計算
注入に必要なＲｅｘｉｎ−Ｇクリオバッグの数を決定するために、Ｒｅｘｉｎ−Ｇ用量の総体積を使用したロットからのクリオバッグに含有されたＲｅｘｉｎ−Ｇの標準体積によって割る。Ｒｅｘｉｎ−Ｇは２０ｍｌまたは４０ｍｌ分割量のどちらかのクリオバッグで供給される。
【０１１７】
【数３】
2010509223.tif 000005
４０ｍｌ分割量として供給されたＲｅｘｉｎ−Ｇは、必要なバッグの数である：１４００ｍｌ／４０ｍｌ＝３５クリオバッグ
パリティー解析を使用して、各種の腫瘍負荷について３つの投薬スケジュールを得た（上を参照）。
【０１１８】
【化１】
2010509223.tif 000006
本解析による我々の予備臨床経験（試験Ｃを参照）は、それぞれ比較的大きい腫瘍負荷を持つ患者３名に限定されている；しかし標準化学療法が失敗した患者２名と標準化学療法を拒否した患者１名で見られた劇的な応答（１００％応答率）は、潜在的有用性および定量的手法のさらなる研究の差し迫った必要性の両方を強調している。
【０１１９】
標的化遺伝子療法を含む標的化療法の出現は、制癌剤に対する腫瘍応答が評価されている方法を変更している。癌療法の指導原理は、有望な化学療法剤から得られた治療的利益が、薬物候補によって誘発された重篤なまたは致死性の全身毒性のリスクを超えなければならいことであった。このためにＲｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｔｕｍｏｒｓ（ＲＥＣＩＳＴ）がＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＣＩ）、ベセズダ、メリーランド州、米国によって作成され、すべてではないにしても大半の学術機関によって、腫瘍応答評価のための世界標準（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｆｏｒ  ｔｕｍｏｒ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｓ）として採用されてきた（Ｔｈｅｒａｓｓｅら、（２０００）Ｊ．Ｎａｔ’ｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９２：２０５−２１６）。詳細には、客観的腫瘍応答（ＯＴＲ）は最近まで、固形腫瘍の癌療法を評価する際の成功する黄金率と見なされてきた。ＯＴＲは、標的病変のサイズの少なくとも３０％の縮小および／または転移病巣または非標的病変の完全な消失より成る。しかし癌の多くの生物応答修飾物質は実際に腫瘍の縮小と関連付けられていないが、無進行生存期間（ＰＦＳ）、および全生存期間（ＯＳ）を延長させることが示されてきた（Ａｂｅｌｏｆｆ，（２００６）Ｏｎｃｏｌ．Ｎｅｗｓ  Ｉｎｔ’ｌ．１５：２−１６）。それゆえ有効な生物剤への応答は生理学的なことが多く、ＲＥＣＩＳＴはもはや、生物療法に対する腫瘍応答の評価のための適切な標準ではないかもしれない。それゆえ代わりの代理エンドポイント、たとえば腫瘍における腫瘍密度（壊死の指数）、血流およびグルコース利用の測定値、および腫瘍応答の機構を評価するために使用される撮像方法の他の改良が求められている。
【０１２０】
したがって疾患過程を、提案された介入の初期の作用機構と同様に理解することは、所与の臨床エンドポイントに対する治療効果を予測する場合に重大な意味を持つ。Ｒｅｘｉｎ−Ｇ（商標）に対する腫瘍応答の場合、１次作用機構は増殖性腫瘍細胞および付随する新生血管系におけるアポトーシスの誘発であり、腫瘍内での壊死および嚢胞性変化が起きることが多い。これは腫瘍を飢餓状態にして、続いて腫瘍内で壊死を生じさせる腫瘍の血液供給の標的化妨害のためである。Ｒｅｘｉｎ−Ｇ（商標）治療患者の腫瘍において、アポトーシスが支配的特徴であり、腫瘍は追跡撮像試験では簡単に収縮して消失する。しかし壊死が目立つ特徴である腫瘍においては、壊死腫瘍および腫瘍の嚢胞性変換のために引き起こされた炎症反応のために、腫瘍のサイズがＲｅｘｉｎ−Ｇ（商標）治療後に実際には大きくなることがある。この場合、ＣＴスキャン、ＰＥＴスキャンまたはＭＲＩでの腫瘍結節のサイズの増大は必ずしも疾患進行を示すわけではない。したがって、Ｒｅｘｉｎ−Ｇ（商標）治療によって誘発された壊死嚢胞性変化の程度をより正確に判定するためには、または治療した疾患の組織学的品質を反映するさらなる同時評価が必要である。ＣＴスキャンでは、ハウンズフィールド単位（ＨＵ）での腫瘍密度測定が、腫瘍の壊死の程度の正確かつ再現性のある指数である。標的病変の段階的縮小（ＨＵでの減少）は正の治療効果を示す。ＰＥＴスキャンでは、標的病変における標準取り込み値（ＳＵＶ）の段階的低下は、腫瘍活性低下および正の治療効果を示す。生検腫瘍では、アポトーシス、壊死、反応性線維症および腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）は、正の治療効果を示す。
【０１２１】
骨肉腫の場合、好ましい腫瘍応答は、連続ＣＴスキャンによって証明されたような病巣における腫瘍壊死および石灰化増大と、連続ＰＥＴスキャンでの１８ＦＤＧのＳＵＶの段階的低下によって証明されたような病変におけるグルコース利用の低下によって示される。少なくとも１０％、２５％、５０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、または１０００％の、病変にて観察された石灰化の増大は、治療結果を評価するために、そしてさらなる治療過程を設計するために使用できる正の腫瘍破壊応答の証拠である。少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％の病変による１８ＦＤＧ利用の低下は、治療結果を評価するために、そしてさらなる治療過程を設計するためにまた使用できる正の腫瘍破壊応答の証拠である。
【０１２２】
用量制限毒性（ＤＬＴ）および最大許容用量（ＭＴＤ）の同定の進歩は、適応療法設計を用いた徹底的な臨床試験を加速させており、それにより、臨床有効性が観察され、すべての治療関連毒性が≦グレード１まで消散する場合に、患者は同じ治療サイクルで再治療することができる。あるいは、客観的な治療応答が認められなかったが、すべての治療関連毒性が≦グレード１まで消散する場合に、患者は次のより高い用量レベルまで進むことができる。どちらの機構も、患者の安全性を損なうことなく腫瘍制御を得る機会を増加させて、患者募集に関連する時間や費用を低減させる。
【０１２３】
腫瘍根絶をさらに促進して、癌生存を強化するために、疾患部位またはその付近に腫瘍標的化細胞破壊遺伝子発現ベクターを局在化させるように特に設計された補助移入戦略が開発された。疾患部位またはその付近へのサイトカイン遺伝子を担持する腫瘍標的発現ベクターの局在化は、発現されたサイトカインへの全身性曝露ではなく、局在化曝露を誘発することができる。このような局在化サイトカイン誘発免疫応答は、急性腫瘍破壊を補助して、インサイチュー癌ワクチン接種も提供して、免疫監視の改善および癌再発頻度の低下を生じる。このような腫瘍ワクチン接種プロトコルは、休眠脱落および転移癌細胞を、そして原発性腫瘍および腫瘍灌流リンパ節中の残留生存癌細胞をも標的化するのに有用でありうる。
【０１２４】
標的化送達のために開発中である１つのサイトカイン遺伝子は、Ｒｅｘｉｎ−Ｇと同じ向病巣性ナノ粒子にパッケージされたときにＲｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃと呼ばれる顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）である。使用できる他のサイトカインとしては、ＴＮＦ−アルファ（腫瘍壊死因子アルファ）；これに限定されるわけではないが、ＩＦＮ−アルファおよびＩＮＦ−ガンマを含むインターフェロン；ならびにこれに限定されるわけではないが、インターロイキン−１（ＩＬ１）、インターロイキン−ベータ（ＩＬ−ベータ）、インターロイキン−２（ＩＬ２）、インターロイキン−４（ＩＬ４）、インターロイキン−５（ＩＬ５）、インターロイキン−６（ＩＬ６）、インターロイキン−８（ＩＬ８）、インターロイキン−１０（ＩＬ１０）、インターロイキン−１２（ＩＬ１２）、インターロイキン−１３（ＩＬ１３）、インターロイキン−１４（ＩＬ１４）、インターロイキン−１５（ＩＬ１５）、インターロイキン−１６（ＩＬ１６）、インターロイキン−１８（ＩＬ１８）、インターロイキン−２３（ＩＬ２３）、インターロイキン−２４（ＩＬ２４）を含むインターロイキンが挙げられる。さらに１つより多いサイトカイン遺伝子は、腫瘍標的化発現ベクターによって送達することができる。たとえばＧＭ−ＣＳＦはＩＬ１と同時発現させることができる。
【０１２５】
サイトカイン遺伝子を担持する腫瘍標的化発現ベクターは、細胞破壊向病巣性ナノ粒子投与の前、投与と同時、または投与の後に投与することができる。患者が単剤として、または併用療法で投与されたＲｅｘｉｎ−Ｇによる著しい腫瘍縮小（および延命）を経験するまでＲｅｘｉｍｍｎｅ−Ｃ投与を保留すること、そして再発を未然に防ぐために主にＲｅｘｉｍｍｎｅ−Ｃに依存することが最も好ましいであろう。これに対して、腫瘍負荷に直接対処するためには、Ｒｅｘｉｎ−ＧおよびＲｅｘｉｍｍｎｅ−Ｃの相乗作用が必要かもしれない。このような場合、各時点の所望のエンドポイントの組織学的評価は、組織学的および放射線評価基準をさらに高度化することによって対処すべきである。
【０１２６】
細胞破壊およびサイトカイン遺伝子発現向病巣性ナノ粒子は、各種の順序で複数回投与することができる。たとえば細胞破壊遺伝子発現向病巣性ナノ粒子は最初に、続いてサイトカイン遺伝子発現向病巣性ナノ粒子が投与され、次に細胞破壊遺伝子発現向病巣性ナノ粒子の投与が続く。このような組み合せは、交互の個別投与、交互の治療サイクル、またはその組み合せとして行うことができる。最初にＲｅｘｉｎ−Ｇ、続いてＲｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃの、続いてＲｅｘｉｎ−Ｇの投与がＴｒｉ−Ｒｅｘプロトコルとして公知である。リンパ節、肝臓、肺および骨への広範な転移のある乳癌患者では、Ｔｒｉ−Ｒｅｘプロトコルは腫瘍生検でのすべての癌細胞を完全に根絶した。累積用量は、最初のＲｅｘｉｎ−Ｇ治療サイクルでは６×１０ｅ１１ｃｆｕ、Ｒｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ治療サイクルでは１×１０ｅ１０ｃｆｕ、２回目のＲｅｘｉｎ−Ｇ治療サイクルでは４×１０ｅ１１ｃｆｕであった。この治療プロトコルは、広範囲の壊死がある完全壊死腫瘍結節と、あるとしてもごくわずかの極悪の腫瘍細胞が残存した宿主単核細胞の著しい浸潤を引き起こした。免疫細胞浸潤物は、ＣＤ３５＋樹状細胞、ＣＤ８＋キラーＴ細胞、およびＣＤ１３８＋血漿Ｂ細胞の広範囲にわたる補体を示し、能動インサイチュー免疫化の証拠を示している。
【０１２７】
細胞破壊およびサイトカイン遺伝子発現向病巣性ナノ粒子の併用治療スケジュールを使用する柔軟な治療計画は、観察された臨床、放射線、組織学的、免疫組織化学、および臨床化学結果を考慮するように設計することができる。たとえばこれらの各種の測定基準の１つ、いくつかまたはすべてを使用して客観的で意味のある腫瘍応答が見られない場合、医師が活性化免疫細胞に腫瘍抗原を十分に曝露するために細胞破壊遺伝子発現向病巣性ナノ粒子のより高い累積用量が必要であると考えるならば、同じ累積用量のサイトカイン遺伝子発現向病巣性ナノ粒子ではなく、より高い用量の細胞破壊遺伝子発現向病巣性ナノ粒子を使用する別の治療サイクルを開始することができる。
【０１２８】
サイトカイン遺伝子発現向病巣性ナノ粒子の投与を伴う、または伴わない細胞破壊遺伝子発現向病巣性ナノ粒子の個別投与、複数回投与、または治療サイクルの有効性を測定する組織学的指標としては、変性腫瘍細胞と関連する明白な抗血管新生作用の焦点範囲、壊死および反応性線維症の大規模な範囲、ならびにアポトーシス構造の陽性タネル染色が挙げられる。有効性の免疫組織化学指標としては、腫瘍浸潤リンパ球、たとえばＣＤ４＋（Ｔｈ）、ＣＤ８＋（Ｔｃ）、ＣＤ６８＋（マクロファージ）、ＣＤ１３８＋（血漿Ｂ細胞）、ＣＤ３５＋（樹状）、ＣＤ２０＋（Ｂ細胞）、およびＣＤ４５＋（単球−マクロファージ）細胞の出現が挙げられる。サイトカイン導入遺伝子発現に、たとえばＧＭ−ＣＳＦに陽性の細胞の同定も、有効性のサインである。
【０１２９】
臨床化学結果としては、溶解性、分泌、または脱落腫瘍マーカー／抗原の観察された減少、たとえば前立腺特異性抗原（ＰＳＡ）またはＨＥＲ２／ｎｅｕ脱落抗原の血清レベルの低下が挙げられる。
【０１３０】
組織学および免疫組織化学評価のサンプル源としては、腫瘍、リンパ節および臓器生検または針生検および切除腫瘍、リンパ節また臓器が挙げられる。
【０１３１】
サイトカイン発現のより大規模な制御は、臨床オフスイッチがサイトカイン導入遺伝子分泌腫瘍細胞の集合全体をただちに除去する、経口プロドラッグ、たとえばガンシクロビルなどの使用によって利用可能であるように、構築物中への自殺遺伝子の包含によって達成することができる。Ｒｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ−ＴＮＴと呼ばれ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ遺伝子を含む、Ｒｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃの第２世代版が、この目標を満足するために最近生成された。術前に腫瘍体積および生存能を低減するために、Ｒｅｘｉｎ−Ｇなどの治療用ウイルス粒子による事前治療も使用することができる。このことは、前に切除できない腫瘍を外科的に除去できる腫瘍に変換して、また外科的切除縁中での脱落した生存癌細胞の発生率も低下させる際に特に有益であろう。
【０１３２】
癌の家族暦がある、または公知の遺伝子異常／癌発症のリスクを向上させる変異体ＢＲＡＣ１遺伝子などの変異を持つ患者において、Ｒｅｘｉｎ−Ｇ、Ｒｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ、または２つの組み合せによる予防治療を使用して、明らかな疾患の発生を防止することができる。このことは、引き続き大型化するために必要とされる新生血管の補充を開始した癌細胞の微視的クラスタを破壊することによって、またはリンパ球を癌細胞の微視的クラスタに誘引して免疫系を教育することによって、または２つの組み合せによって引き起こすことができる。
【０１３３】
レトロウイルスの投与は、レシピエント中のベクター中和抗体の産生を誘発することができ、それによりさらなる治療を妨げる。（Ｈａｌｂｅｒｔら（２００６）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１７（４）：４４０−４４７）。しかしながら当分野では、中和抗体産生の誘発は、おおよそベクター投与時に与えた免疫抑制治療によって遮断することができる。このような免疫抑制治療としては、薬物（シクロホスファミド、ＦＫ５０６）、サイトカイン（インターフェロン−ガンマ、インターロイキン−１２）およびモノクローナル抗体（抗ＣＤ４、抗ｐｇｐ３９、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ）（Ｐｏｔｔｅｒ  ａｎｄ  Ｃｈａｎｇ，（１９９９）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７５：１５９−１７４）が挙げられる。さらに、中和抗体は体外免疫吸着（Ｎｉｌｓｓｏｎら、（１９９０）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８２（３）４４０−４４４）によって除去できる。中和抗体は、より高用量のベクターの投与によって生体内で消耗させることができる。Ｒｅｘｉｎ−Ｇは低い免疫原性を有し、現在までにベクター中和抗体は６ヶ月間の追跡期間にわたって患者の血清中で検出されていない。
キット
本明細書に記載した方法で使用するための組成物を含むキットまたは薬物送達系も提供される。標的化レトロウイルス粒子の投与に必要とされる不可欠な物質および試薬すべてをキット内に集めることができる（たとえばパッケージング細胞構築物または細胞系統、サイトカイン発現ベクター）。キットの構成要素は、上記のような各種の調合物で供給することができる。１つ以上の標的化レトロウイルス粒子は、１つ以上の薬剤（たとえば化学療法剤）を用いて単一の製薬的に許容される組成物または別個の製薬的に許容される組成物に調合することができる。
【０１３４】
これらのキットまたは薬物送達系の成分は、乾燥または凍結乾燥形で提供することもできる。試薬または成分が乾燥形として提供されるとき、再構成は、別の容器手段で提供することも可能である一般に適切な溶媒の添加による。本発明のキットは、標的化レトロウイルス粒子の投薬量および／または投与情報に関する説明書も含むことができる。本発明のキットまたは薬物送達系は通例、所望のバイアルが中に保持されているたとえば射出またはブロー成形プラスチック容器などの、市販用に厳重に閉じ込められたバイアルを含有する手段も含むであろう。容器の数または種類とは無関係に、キットは、対象の体内での最終的な複合組成物の注入／投与または配置を補助するための器具を含むことができるか、または器具と共に包装することができる。このような器具は、アプリケータ、吸入器、注射器、ピペット、鉗子、計量スプーン、点眼器またはこのようないずれの医療用に承認された送達ビヒクルでもよい。
【０１３５】
別の実施形態において、遺伝子療法事業を運営する方法が提供される。該方法は、標的化送達ベクターを産生させるステップと、適切な培地中でウイルスベクターを採取および懸濁させて、懸濁液を貯蔵することによってベクターのバンクを確立するステップを含む。該方法は、粒子と、粒子の使用説明書とを、その必要がある対象（患者）への投与のために、医師または医療提供者に供給するステップをさらに含む。このようなベクターの使用説明書は、表１に示した例示的な治療レジメンを含むことができる。該方法は場合により、患者または患者の保険提供者に請求することを含む。
【０１３６】
なお別の実施形態において、本明細書で開示したキットを医師または医療提供者に供給するステップを含む遺伝子療法事業を運営する方法が提供される。
【０１３７】
以下の実施例は、例示する目的のためだけに含まれており、本発明の範囲を制限するものではない。例示された具体的な方法は、他の種を用いて実施できる。実施例は、一般的なプロセスを例示することを目的としている。
【実施例】
【０１３８】
膵臓癌は、米国の癌による死亡の４番目に多い原因であり、すべての癌の中で最も致命的である。膵臓癌の完全な外科的切除がこの疾患にとって唯一の有効な治療を提供する。不都合なことに、このような「治療的」手術は膵臓癌患者の１０〜１５％のみで可能であり、通例、これらの個人では黄疸が主症状である。切除不能な膵臓癌の患者の中央生存期間は３〜６ヶ月である。それゆえ進行膵臓癌の管理は一般に、症状の緩和に向けられる。外部ビーム放射は寿命を延長させるように思えないが、腫瘍サイズの十分な縮小は疼痛の軽減をもたらすことがある。
【０１３９】
外部ビーム放射へのフルオロウラシル（５−ＦＵ）による化学療法の追加は、これらの患者（１８）の生存期間を延長している。最近、デオキシシチジン類似物質であるゲムシタビンは、進行膵臓癌患者の生活の質を改善したことを示しているが、生存期間は８〜１０週間延長されただけである。
【０１４０】
外科的切除は、米国の癌による死亡の２番目に多い原因である直腸結腸癌患者に対する主な治療様式でもある。さらなる化学療法および放射線治療は、早期ステージ疾患の患者（７）における直腸結腸癌の再発を低減するのに役立ってきた（７）。しかし局所進行腫瘍に対するこのような治療の効果は、満足度が低い（８）。現在、外科的切除によって治療された直腸結腸癌患者の５年生存率は、ステージＩで約９０％、ステージＩＩで７０％、ステージＩＩＩで５０％、そしてステージＩＶでは５％未満である。結腸癌の化学療法は、特にはダウンステージにさえ拡張できる、なお有用な緩和選択肢であるが、結腸癌患者の大多数は、標準治療からの利益を１８ヶ月以内に使い果たしてしまう。その上、標的化「生物療法」が膵臓癌と結腸癌の両方のための将来の臨床開発の面で最大の将来性を持つという、主要な臨床腫瘍学者の間での合意があると思われる。
（実施例１）
構築物
プラスミドｐＢｖ１／ＣＡＥＰは、コラーゲン結合機能の完全な獲得を含むように修飾された４０７０Ａ両栄養性エンベロープタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号：Ｍ３３４６９）のコード配列を含有する（Ｈａｌｌら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，８：２１８３−２１９２，１９９７）。親発現プラスミドｐＣＡＥ（Ｍｏｒｇａｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６７：４７１２−４７２１，１９６７）は、ＵＳＣ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓより提供された。本ｐＣＡＥプラスミドは、アミノ酸６および７のコード配列間の成熟タンパク質（ｐＣＡＥＰ）のＮ末端付近でのＰｓｔＩ部位（ｇｅｔ  ｇｃａ  ｇｇａ、アミノ酸ＡＡＧをコード）の挿入によって修飾される。ウシフォンウィルブランド因子のＤ２ドメインに由来する最小コラーゲン結合ジペプチド（太字）であるアミノ酸ＧＨＶＧＷＲＥＰＳＦＭＡＬＳＡＡをコードして（Ｈａｌｌら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１１：９８３−９９３，２０００）、戦略的に重要なリンカーに隣接された（下線）、合成オリゴヌクレオチド２本鎖（ｇｇａ  ｃａｔ  ｇｔａ  ｇｇａ  ｔｇｇ  ａｇａ  ｇａａ  ｃｃａ  ｔｃａ  ｔｔｃ  ａｔｇ  ｇｃｔ  ｃｔｇ  ｔｃａ  ｇｃｔ  ｇｃａは、この独自のＰｓｔＩ部位中にクローニングされて、ｐＢｖ１／ＣＡＥＰを産生した。
【０１４１】
２９３Ｔ産生細胞におけるキメラエンベロープタンパク質の発現は、強力なＣＭＶ、すなわちプロモータによって駆動される。キメラエンベロープは正しく処理され、レトロウイルス粒子中に安定して包含されて、測定可能なほど感染力価を失うことなく機能獲得表現型を示す。コラーゲン結合ドメインの正しい配向はＤＮＡ配列解析によって確認され、プラスミド品質管理は、プラスミドを線状化して、コラーゲン結合ドメインを放出する制限消化ＰｓｔＩによって確認された。
【０１４２】
元のプラスミドｐＢｖ１／ＣＡＥＰに対するさらなる改良を行って、Ｒｅｘｉｎ−Ｇ（商標）生成中に複製可能なレトロウイルス（ＲＣＲ）を生成する可能性を低下させた。ベクターｐＢｖ１／ＣＡＥＰは、モロニーエンベロープＡＴＧ開始コドンの上流の未翻訳配列の３８塩基対を含有する。本ベクターは、モロニーエンベロープ停止コドンの下流の未翻訳配列の７６塩基対も含有する。これらの未翻訳配列のどちらも（３８＋７６＝１１４塩基対）は、ＡＴＧ開始コドンからＴＧＡ停止コドンまでのモロニーエンベロープ読み取り枠配列のみを増幅するために、ポリメラーゼ連鎖反応技法を使用することによって排除した。次のプライマーのセットを使用した：
【０１４３】
【数４】
2010509223.tif 000007
ｐＢｖ１／ＣＡＥＰをＰＣＲ反応の鋳型として使用して、独自のフォンウィルブランドコラーゲン結合部位（ＧＨＶＧＷＲＥＰＳＦＭＡＬＳＡＡ）が新たな読み取り枠のみのエンベロープＰＣＲ生成物中に正しく複製されるようにする。適正な２０３７ｂｐ対ＰＣＲ生成物が産生され、ｐＣＲ２クローニングベクター中へ結合され、配列決定されて、予想配列の１００％配列適合性を確保する。この適性に塩基配列決定されたモロニーエンベロープ読み取り枠のみの遺伝子をｐＣＲ２プラスミド主鎖から切除して、超高度発現プラスミドｐＨＣＭＶ形Ｇｅｎｅｌａｎｔｉｓ（以前のＧｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）中にサブクローニングして、新たなプラスミドｐＢ−ＲＶＥを産生した。
【０１４４】
本プラスミドをいくつかの各種の力価アッセイで試験すると、その強度が上昇して、同じ力価を達成するために、ｐＣｇｐｎおよびｐＥ−ＲＥＸに加えての２９３Ｔ細胞中への形質移入においてその量の５分の１〜３分の１を使用することが今や最適であることを見出した。このことは、ｐＢ−ＲＶＥプラスミドが機能性エンベロープタンパク質の産生にあたって、相当するｐＢＶ１／ＣＡＥＰよりも３〜５倍強力であることを意味している。しかし通常量のｐＢＶ１／ＣＡＥＰと同量のｐＢ−ＲＶＥプラスミドが使用される場合、はるかに低い力価が生じるであろう。この結果は、最高力価のための最適比を得るために、完全な一連のプラスミド比試験を実施することの重要性を強調している。一部の状況では、３つのプラスミド成分遺伝子のいずれか１つの過剰発現が、構築および処理の間にウイルス部分の繊細なバランスを混乱させて、より低い力価で認められるような阻害効果を引き起こす可能性がある。我々はｐＢＶ１／ＣＡＥＰの５分の１〜３分の１のｐＢ−ＲＶＥを使用することにして、ＧＭＰレトロウイルス産生の間に、同様の高い力価を達成し、本プラスミドによるそのようにはるかに少ないプラスミドを使用するによる利点を得た。この高レベルの発現効果はおそらく、エンベロープ遺伝子がＣＭＶイントロンと直列になっているＣＭＶプロモータエンハンサから発現されるという事実のためである。  併用は、ｐＢＶ１／ＣＡＥＰプラスミドの場合と同様にＣＭＶプロモータから単に発現された場合よりも、３〜５倍強いことが公表されている。
【０１４５】
プラスミドｐＣｇｐｎは、最初にプロウイルスクローン３ＰＯからｐＧａｇ−ｐｏｌ−ｇｐｔとして由来して（Ｍａｒｋｏｗｉｔｚら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６２：１１２０−１１２４，１９８８）、ψパッケージングシグナルの１３４塩基対欠損およびｅｎｖコード配列の切断を示す、ＭｏＭｕＬＶ  ｇａｇ−ｐｏｌコード配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号３３１９３４）を含有する。構築物は、５’ＥｃｏＲＩ部位がＧａｇの上流のＸｍａＩＩＩ部位に相当して、３’ＥｃｏＲＩ部位がｅｎｖ内のＳｃａｌ部位に隣接して付加されたｐＣｇｐ内のＥｃｏＲＩ断片として提供された。ＥｃｏＲＩ断片をｐＣｇｐから切除して、独自のＥｃｏＲＩクローニング部位にてｐｃＤＮＡ３．１＋発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に結合させた。
【０１４６】
正しい配向はＳａｌＩを用いた制限消化によって確認し、挿入はＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いた消化によってさらにキャラクタリゼーションした。ｇａｇ−ｐｏｌ挿入の５’および３’配列はどちらも、Ｔ７プロモータ結合（Ｓ１）およびｐｃＤＮＡ３．１／ＢＧＨリバースプライミング部位（ＡＳ１）をそれぞれ利用するＤＮＡ配列解析によって確認した。ｐＣｇｐｎと呼ばれる、得られたプラスミドは、強力ＣＭＶプロモータによって駆動されたｇａｇ−ｐｏｌポリタンパク質およびＳＶ４０初期プロモータによって駆動されたネオマイシン耐性遺伝子をコードする。本プラスミドでのＳＶ４０  ｏｒｉの存在は、ＳＶ４０ラージＴ抗原を発現する細胞系統（すなわち２９３Ｔ産生細胞）でのエピソーム複製を可能にする。
【０１４７】
以下でドミナントネガティブサイクリンＧ１構築物（ｄｎＧ１）を含有するｐｄｎＧ１／Ｃ−ＲＥＸレトロウイルス発現ベクターを担持しているプラスミドの構築について説明する。プラスミドは高い感染力価のベクターの産生のために、一過性形質移入プロトコルによって増強される。ヒトサイクリンＧ１（ＣＹＣＧ１，Ｗｕら、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，１：７０５−１１，１９９４；アクセション番号Ｕ４７４１３）のａａ４１−２４９をコードするｃＤＮＡ配列（４７２−１０９８および停止コドン）は、ＮｏｔＩ／ＳａｌＩオーバーハングを含む全長サイクリンＧ１鋳型からＰＣＲによって生成した。Ｎ末端欠失変異体構築物を最初にＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングして、ＮｏｔＩ／ＳａｌＩ消化および精製挿入物のＮｏｔＩ／ＳａｌＩ消化ｐＧｌＸＳｖＮａレトロウイルス発現ベクター（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｉｎｃ．）への結合を続けて、５’および３’長末端反復（ＬＴＲ）配列ならびにψレトロウイルスパッケージング配列を完備したｐｄｎＧ１ＳｖＮａベクターを産生した。
【０１４８】
ＣＭＶ、すなわちプロモータ−エンハンサは、ＰＣＲによってＣＭＶ駆動ｐＩＲＥＳ鋳型（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から、ＳａｃＩＩオーバーハングを含めて作製して、５’ＬＴＲの上流のｐｄｎＧ１ＳｖＮａの独自のＳａｃＩＩ部位中にクローニングした。ベクター力価の決定を容易にするネオマイシン耐性遺伝子は、その入れ子になったｏｒｉを用いてＳｖ４０ｅ．ｐ．により駆動される。Ｓｖ４０  ｏｒｉに加えて、強力ＣＭＶプロモータの包含は、ラージＴ抗原を発現する２９３Ｔ細胞中での高力価レトロウイルスベクター産生を容易にする（Ｓｏｎｅｏｋａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２３：６２８−６３３，１９９５）。ＣＭＶプロモータの正しい配向および配列は、ｄｎＧ１コード配列と同様に、制限消化およびＤＮＡ配列解析によって確認した。プラスミド同一性および品質管理は、ＳａｃＩＩ（７５０ｂｐ  ＣＭＶプロモータを放出する）およびＢｇｌＩＩ（ｄｎＧ１構築物内の独自の部位で切断する）を用いた消化によって確認する。
【０１４９】
ｐｄｎＧ１／Ｃ−ＲＥＸおよびｐＢＶ１−ＣＡＥＰを使用する複数のＧＭＰレトロウイルス産生は、安全でＲＣＲを含まないことが判明している。第４および第５世代ＭＬＶベースレトロウイルスベクターおよびベクター産生方法；すなわちスプリットゲノム設計は、標準ＧＭＰ条件下でＲＣＲを生成せずに、一貫した産生品質を生じている（Ｓｈｅｒｉｄａｎら、２０００；Ｍｅｒｔｅｎ，２００４）。しかし我々は、他者と同様に、利用可能なベクター構築物がすべて、各ｇａｇ−ｐｏｌプラスミド構築物中に含有された５’ＤＮＡ配列と潜在的に重複するかなりの数の残存ｇａｇ−ｐｏｌ配列を含有することと（Ｙｕら、２０００）；ベクター産生がより多くの細胞数および対応するプラスミド濃度を用いる商業用の量へ最終的にスケールアップされるときに、これらのかなりの重複範囲が問題となるかもしれないこととを認めている。
【０１５０】
これらの検討事項を念頭に置いて、我々は制限消化およびＰＣＲクローニングによって親ｐｄｎＧ１／Ｃ−ＲＥＸベクターから残存ｇａｇ−ｐｏｌ配列の４８７塩基対を除去すること（ｐｄｎＧ１／Ｃ−ΔＲＥＸ）を決定して、パッケージング（力価）および遺伝子発現（効力）に関して有害なものを相殺するように作用する合成９７ｂｐエンベロープスプライス受容部位（ＥＳＡ）の挿入を続けた（Ｌａｚｏら、（１９８７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１（６）：２０３８−４１）（図２２）。このように得られたｐｄｎＧ１／Ｃ−ＲＥＸの安全性の修飾はｐｄｎＧ１／ＵＢＥＲ−ＲＥＸの生成を生じさせ、ｐｄｎＧ１／ＵＢＥＲ−ＲＥＸは、ＧＡＧの４８７塩基対を含まない全く同じ導入遺伝子（ｄｎＧ１およびｎｅｏ）をコードおよび発現して、Ｒｅｘｉｎ−Ｇの産生における前のプラスミドをここで置き換える。Ｃ−ＲＥＸおよびＣ−ＲＥＸＩＩプラスミドと、ＵＢＥＲ−ＲＥＸプラスミドと間の図による比較を図２３に示す。
【０１５１】
正確な比での、高度に制限および最適化された製造条件下でのｐＢ−ＲＶＥ、ｐＣｇｐｎ、ｐｄｎＧ１／ＵＢＥＲプラスミドの併用は、ＲＣＲを含まない臨床ベクター生成物と、これまで報告された最高の未濃縮ＧＭＰ最終生成物レトロウイルス力価、＞５×１０９Ｃｆｕ／ｍＬを生じる。
（実施例２）
ＲＥＸＩＮ−Ｇ
最終生成物Ｍｘ−ｄｎＧ１（ＲＥＸＩＮ−Ｇ（商標））は、ハイブリッドＬＴＲ／ＣＭＶプロモータの制御下でＮ末端欠失変異体ヒトサイクリンＧ１構築物をコードするマトリクス（コラーゲン）標的化レトロウイルスベクターである。ベクターは、ＳＶ４０初期プロモータによって駆動されるネオマイシン耐性遺伝子も含有する。
【０１５２】
Ｍｘ−ｄｎＧ１ベクターは、十分に確認されたマスターセルバンクからの２９３Ｔ（ＳＶ４０ラージＴ抗原によって形質転換されたヒト胎児由来２９３細胞）細胞の３プラスミドを用いて、一過性形質移入によって産生される。
【０１５３】
形質移入系の構成要素としては、ＣＭＶ即時型初期プロモータによって駆動されたａ．ａ．４１〜２４９をコードするヒトサイクリンＧ１遺伝子の欠失変異体を含有するｐｄｎＧ１／Ｃ−ＲＥＸ治療用プラスミド構築物、パッケージング配列、および内部ＳＶ４０初期プロモータの制御下の細菌ネオマイシン耐性遺伝子が挙げられる。切断サイクリンＧ１遺伝子を最初にＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングして、ＮｏｔＩ／ＳａｌＩ消化および精製挿入物のＮｏｔＩ／ＳａｌＩ消化ｐＧｌＸＳｖＮａレトロウイルス発現ベクター（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｉｎｃ．により提供、ゲティスバーグ、メリーランド州）への結合を続けて、５’および３’ＬＴＲ配列ならびにψ配列を完備したｐｄｎＧ１ＳｖＮａベクターを産生した。ＣＭＶ、すなわちプロモータ−エンハンサは、ＰＣＲによってＣＭＶ駆動ｐＩＲＥＳ鋳型（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から、ＳａｃＩＩオーバーハングを含めて作製して、５’ＬＴＲの上流のｐｄｎＧ１ＳｖＮａの独自のＳａｃＩＩ部位中にクローニングした。
【０１５４】
プラスミドｐｄｎＧ１／Ｃ−ＲＥＸの使用は、元のｐｄｎＧ１／Ｃ−ＲＥＸに見出されたＧＡＧの４８７塩基対を含まない全く同じ導入遺伝子（ｄｎＧ１およびｎｅｏ）をコードおよび発現する次世代プラスミドのｐｄｎＧ１／ＵＢＥＲ−ＲＥＸによって置き換えられた。
【０１５５】
系はさらに、ＣＭＶ駆動修飾両栄養性４０７０Ａエンベロープタンパク質を含有するＭｘ（Ｂｖ１／ｐＣＡＥＰ）エンベローププラスミドをさらに含み、コラーゲン含有ペプチドは４０７０ＡエンベロープのＮ末端領域のａ．ａ．６および７の間の組み換えＰｓｔＩ部位中に挿入される。
【０１５６】
Ｍｘ（Ｂｖ１／ｐＣＡＥＰ）エンベローププラスミドの使用は、未変性未翻訳（ＵＴＲ）配列と潜在的に重複する外来レトロウイルス配列の１１４ｂｐを除去する改質プラスミドであるｐＢ−ＲＶＥによって置き換えられる。
【０１５７】
系は、ＣＭＶ即時型初期プロモータによって駆動されたＭＬＶ  ｇａｇ−ｐｏｌ要素を含有するｐＣｇｐｎプラスミドも含む。ｐＣｇｐｎプラスミドは、ｐＧａｇ−ｐｏｌ−ｇｐｔとしてのクローン３ＰＯに由来する。ベクター主鎖はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎによるｐｃＤＮＡ３．１＋である。ポリアデニル化シグナルおよびウシ成長ホルモンからの転写終結配列は、ＲＮＡ安定性を向上させる。ＳＶ４０  ｏｒｉはｅ．ｐ．と共に、ＳＶ４０標的Ｔ抗原を発現する細胞系統におけるエピソーム複製およびベクターレスキューの特色を成す。
【０１５８】
プラスミドは制限エンドヌクレアーゼ消化によって解析されており、細胞系統は１リットル当たり４グラムのグルコース、１リットル当たり３グラムの重炭酸ナトリウム、および１０％ガンマ照射ウシ胎仔血清（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ）を添加したＤＭＥＭベースより成る。血清は米国の供給源より入手して、ＵＳＤＡ規則に従ってウシウイルスがないことを検査した。レトロウイルス粒子の出芽は、酪酸ナトリウムを用いた誘発によって強化される。得られたウイルス粒子は、上清を０．４５ミクロンフィルターに通過させることのみによって処理されるか、または接線流／ダイアフィルトレーション法を使用して濃縮される。ウイルス粒子は、外見がＣ型レトロウイルスである。レトロウイルス粒子は採取されて、９５％  ＤＭＥＭ培地および１．２％ヒト血清アルブミンの溶液中に懸濁される。本調合物を５００ｍｌクリオバッグ中に１５０ｍｌの分割量で貯蔵して、使用するまで−７０〜−８６℃で凍結保存する。
【０１５９】
ｐＢ−ＲＶＥおよびｐｄｎＧｌ／ＵＢＥＲ−ＲＥＸプラスミドによって産生されたＲｅｘｉｎ−Ｇ（商標）では、治療用ナノ粒子の産生、懸濁および収集は、滅菌閉ループ系を使用する連続浄化、濾過およびクリオバッグ中への最終充填によって処理される、専売培地の最終調合物中でウシ血清の非存在下にて実施される。平均粒径１００ナノメートルの得られたＣ型レトロウイルス粒子はすべてのウイルス遺伝子を欠いており、完全に複製欠損性である。臨床ロットの力価は３×１０ｅ７〜５×１０ｅ９コロニー形成単位（Ｕ）／ｍｌの範囲であり、各ロットは必要な純度および生物学的効力について確認されている。
【０１６０】
患者への投与のためのＭｘ−ｄｎＧ１ベクターの作製は、ベクターを３７℃の８０％エタノール浴中のベクターバッグ内で解凍することより成る。各ベクターバッグは患者への注入１時間前に解凍され、パルモザイム（１０Ｕ／ｍｌ）で処理して、１〜３時間内にただちに注入する。
【０１６１】
改良ｐＢ−ＲＶＥおよびｐｄｎＧ１／ＵＢＥＲ−ＲＥＸによって産生された処理済み臨床グレードＲｅｘｉｎ−Ｇ（商標）はクリオバッグ中で密封されて、出荷前に−７０±１０℃の冷凍庫で貯蔵する。Ｒｅｘｉｎ−Ｇ（商標）ベクターを含有する確認および発表（ｒｅｌｅａｓｅｄ）されたクリオバッグの各ロットは、ドライアイスに載せて臨床現場まで出荷されて、そこでベクターは使用するまで−７０±１０℃の冷凍庫で貯蔵される。静脈内注入の１５分前に、ベクターを３２〜３７℃水浴で急速回答して、ただちに注入するか、あるいはただちに使用するために専用トレーまたはクーラー内の氷に載せて病室または臨床現場へ搬送する。患者は、Ｒｅｘｉｎ−Ｇ（商標）の注入を末梢静脈、中心静脈ライン、または肝動脈を介して投与される。臨床試験Ａ、ＢおよびＣ（下）に記載されているように、各種のレジメンが使用された；しかし８ｍｌ／ｋｇ／用量の最大体積が１日１回投与される。Ｒｅｘｉｎ−Ｇ（商標）の各バッグは４ｍｌ／分の速度で１０〜３０分間で注入される。
（実施例３）
Ｍｘ−ｄｎＧ１ベクターの治療効力
Ｍｘ−ｄｎＧ１が試験管内で癌細胞増殖を阻害する、および肝転移のヌードマウスモデルでの生体内での腫瘍成長を停止する有効性を試験した。膵臓起源のヒト未分化癌細胞系統は、転移癌の原型として選択された。これらの癌細胞におけるレトロウイルス形質導入効率は優れており、感染多重度（それぞれ４および２５０）に応じて２６％〜８５％の範囲である。治療用遺伝子の選択では、各種のサイクリンＧ１構築物を担持するベクターを使用して形質導入細胞中で細胞増殖試験を実施した。標準条件下で、Ｍｘ−ｄｎＧ１ベクターは、ｄｎＧ１タンパク質を表す、２０ｋＤａの領域における免疫反応性サイクリンＧ１の出現と同時に、一貫して最大の抗増殖効果を示す。これらの結果に基づいて、次の生体内有効性試験のためにＭｘ−ｄｎＧ１ベクターを選択した。
【０１６２】
Ｍｘ−ｄｎＧ１の生体内での性能を評価するために、所定の位置に１４日間保持された留置カテーテルを介した７×１０５ヒト膵臓癌細胞の門脈への注入によって、肝転移のヌードマウスモデルを確立した。Ｍｘ−ｄｎＧ１（ＲＥＸＩＮ−Ｇ（商標）；力価：９．５×１０８ｃｆｕ／ｍｌ）またはＰＢＳ食塩水対照のどちらか２００ｍｌ／日より成る、ベクターの注入を３日後に、合計９日間にわたって開始した。ベクター注入完了の１日後にマウスを殺処分した。
【０１６３】
ＰＢＳまたは低用量Ｍｘ−ｄｎＧ１のどちらかで処置したマウスからの転移腫瘍病巣の組織学的および免疫細胞化学的評価を実施して、Ｏｐｔｉｍａｓ撮像システムによって評価した。ヒトサイクリンＧ１タンパク質は、ＰＢＳ処置動物における、そしてＭｘ−ｄｎＧ１ベクター処置動物の残存腫瘍病巣におけるサイクリンＧ１核免疫反応性の向上（褐色染色物質）によって証明されるように、転移腫瘍病巣で高度に発現された。対照動物からの肝臓切片の組織学的検査は血管新生および間質形成の付随領域を持つ実質的な腫瘍病巣を明らかにした；上皮成分はサイトケラチンに対して陽性に染色され、関連する腫瘍間質／内皮細胞はビメンチンおよびＦＬＫ受容体に対して陽性に染色された。これに対して、低用量Ｍｘ−ｄｎＧ１処置動物中の腫瘍病巣の平均サイズは、ＰＢＳ対照と比較して有意に縮小され（ｐ＝０．００１）、同時に、ＰＢＳ対照群と比較してアポトーシス核の密度の病巣での上昇を明らかにした。さらにＰＡＳ＋、ＣＤ６８＋およびヘモシデリン担持マクロファージによる浸潤がＭｘ−ｄｎＧ１処置動物の残存腫瘍病巣で観察されて、変性腫瘍細胞および腫瘍残屑の肝臓細網内皮系による能動クリアランスを示唆した。総合すれば、これらの発見は、細胞破壊細胞周期制御遺伝子を担持する標的化注入可能レトロウイルスベクターの生体内での抗腫瘍有効性を証明して、転移癌に対する標的化注入可能ベクターの開発における決定的な進歩を表している。
【０１６４】
ヌードマウスの皮下ヒト膵臓癌モデルでは、我々は、Ｍｘ−ｄｎＧ１の静脈内（ＩＶ）注入が遺伝子送達を向上させて、非標的化ＣＡＥ−ｄｎＧ１ベクター（ｐ＝０．０１４）、マーカー遺伝子を担持する対照マトリクス標的化ベクター（Ｍｘ−ｎＢｇ；ｐ＝．００４）およびＰＢＳ対照（ｐ＝．００１）と比較したときに、皮下腫瘍の成長を停止させることを証明した。腫瘍結節のベクター浸透および形質導入の向上（３５．７＋標準偏差１．４％）は、関連する全身毒性のない治療有効性と相関していた。ＰＢＳプラセボ、非標的化ＣＡＥ−ｄｎＧ１ベクターおよびＭｘ−ｄｎＧ１ベクターによって処置したマウスで、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存試験も実施した。Ｔａｒｏｎｅログランク検定を使用すると、３つすべての群を同時に比較するための全体のｐ値は０．００３であり、０．００４のレベルに対して有意である傾向を有し、腫瘍成長の長期制御の確率が非標的化ＣＡＥ−ｄｎＧ１ベクターまたはＰＢＳプラセボによってよりも、標的化Ｍｘ−ｄｎＧ１ベクターによって著しく大きいことが示された。総合すれば、本試験は、末梢静脈注入によって分散されたＭｘ−ｄｎＧ１が（ｉ）１時間以内に血管新生腫瘍血管系に蓄積して、（ｉｉ）腫瘍細胞を高レベルの有効性で形質導入し、（ｉｉｉ）測定可能な毒性を誘発せずに治療用遺伝子送達および長期有効性を向上させたことを証明している。
（実施例４）
薬理学／毒物学試験
細胞外マトリクス成分（たとえばコラーゲン）を標的とするペプチドを包含するマトリクス標的化注入可能レトロウイルスベクターは、生体内での治療用遺伝子送達を促進することが証明されている。２つの癌マウスモデルと、細胞破壊／細胞分裂阻害ドミナントネガティブサイクリンＧ１構築物（Ｍｘ−ｄｎＧ１およびＭｘＶ−ｄｎＧ１と呼ばれる）を担持する２つのマトリクス標的化ＭＬＶベースレトロウイルスベクターを使用して、追加のデータを示す。Ｍｘ−ｄｎＧ１およびＭｘＶ−ｄｎＧ１はどちらも、病変領域を標的とするマトリクス（コラーゲン）標的モチーフを提示する両栄養性４０７０Ａ  ＭＬＶベースレトロウイルスベクターである。２つのベクター間の唯一の相違は、ＭｘＶ−ｄｎＧ１が水疱性口内炎ウイルスＧタンパク質によってシュードタイプ化されていることである。
【０１６５】
皮下ヒト癌異種移植モデルにおいて、１×１０７ヒトＭｉａＰａｃａ２膵臓癌細胞（転移消化器癌のプロトタイプ）をヌードマウスの側腹部に皮下移植した。６日後、Ｍｘ−ｄｎＧ１ベクター２００μｌを、１または２回の１０日間処置サイクルで  尾静脈中に毎日、直接注入した（全ベクター用量：それぞれ５．６×１０７［ｎ＝６］または１．６×１０８ｃｆｕ［ｎ＝４］）。肝転移のヌードマウスモデルでは、７×１０５ＭｉａＰａｃａ２細胞を、所定の位置に１０〜１４日間保持された留置カテーテルによって門脈を通じて注入した。ＭｘＶ−ｄｎＧ１ベクター２００ｍｌを毎日１０分間かけて、腫瘍細胞注入３日後から開始して６または９日間にわたって注入した（全ベクター用量：それぞれ４．８×１０６［ｎ＝３］または１．１×１０９ｃｆｕ用量［ｎ＝４］）。生体内分布試験では、マウスゲノムＤＮＡバックグラウンドへのＳＶ４０およびネオマイシン（Ｎｅｏ）遺伝子配列を含有するＧ１ＸＳｖＮａベースベクターを検出するためのＴａｑＭａｎ（商標）ベースアッセイが開発された（Ａｌｔｈｅａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）。アッセイは、蛍光標識プローブがＳＶ４０遺伝子の３’部分およびネオマイシンホスホトランスフェラーゼ耐性（Ｎｅｏｒ）遺伝子の５’部分を重複させる、９５ｎｔ単位複製配列（Ｇ１ＸＳｖＮａプラスミドベクターのｎｔｓ．１７７９−１８７４）を検出する。
【０１６６】
Ｍｘ−ｄｎＧ１またはＭｘＶ−ｄｎＧ１ベクターのどちらでも、ベクター関連の死亡率または罹患率は見られなかった。低レベルの正のシグナルが、低用量および高用量ベクター処置動物の両方の肝臓、肺および脾臓で検出された。ベクター処置動物の精巣、脳または心臓ではＰＣＲシグナルは検出されなかった。病理組織学的検査によって、留置カテーテルを備え、抗生物質の予防的投与なしの２匹の動物において門脈静脈炎、限局性心筋炎を伴う腎盂腎炎が明らかになった。Ｍｘ−ｄｎＧ１またはＭｘＶ−ｄｎＧ１処置マウスの非標的臓器では他の病状は認められなかった。血清化学特性によって、ＰＢＳ対照と比較してＭｘ−ｄｎＧ１処置動物のＡＬＴおよびＡＳＴの穏やかな上昇が明らかになった。しかしレベルはマウスの正常限度内であった。７週間の追跡期間内に、ベクター処置動物の血清中でベクター中和抗体は検出されなかった。
【０１６７】
上記の前臨床の結果は、ヒト膵臓癌の２つのヌードマウスモデルにおけるＭｘ−ｄｎＧ１の静脈内注入が隣接する正常組織に対する測定可能な損傷も、全身的な副作用も示さなかったことを確認する。静脈内注入による標的化遺伝子送達の方法は、複数の臨床に関連する利点を与える。静脈系への注入は、腫瘍の治療はもちろんのこと、潜在する腫瘍病巣の治療も可能にするであろう。分割する腫瘍細胞で見られるより高い分裂速度は、肝細胞および他の正常組織を残しながら腫瘍においてより高い形質導入効率をもたらすであろうことが考えられる。したがって我々は、標準化学療法に対して難治性である局所進行または転移膵臓癌および他の固形腫瘍の治療のための静脈内投与Ｍｘ−ｄｎＧ１ベクターを使用するヒト臨床研究プロトコルを提案する。
（実施例５）
臨床試験
本試験の目的は、（１）Ｒｅｘｉｎ−Ｇの連続静脈内注入の用量制限毒性および最大許容用量（安全性）を決定することと、（２）潜在的な抗腫瘍応答を評価することであった。プロコトルは、推定生存期間が少なくとも３ヶ月の末期癌患者に対して設計された。医療腫瘍学者により標準化学療法に対して難治性であると見なされたステージＩＶ膵臓癌患者３名に、Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅ  Ｂｕｒｅａｕ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇｓによって承認された、Ｒｅｘｉｎ−Ｇを使用する例外的使用プロトコルへの参加を求めた。Ｒｅｘｉｎ−Ｇの静脈内注入による患者内用量増加レジメンを毎日、８〜１０日間にわたって投与した。本レジメンの完了の後に、用量制限毒性のための１週間の評価期間を続けた；その後、Ｒｅｘｉｎ−Ｇの最大許容用量をさらに８〜１０日間にわたって静脈内投与した。患者が観察期間中にＲｅｘｉｎ−Ｇに関連するグレード３または４の有害事象を発症しなかった場合、Ｒｅｘｉｎ−Ｇの用量を表１（上）に示すように増加させた。
【０１６８】
腫瘍応答は、カリパスによって、または放射線撮像（ＭＲＩまたはＣＴスキャン）によって測定したように、式：幅２×長さ×０．５２を使用して、腫瘍体積の連続決定によって評価した。
【０１６９】
４７歳フィリピン人女性である患者＃１は、生検腫瘍組織の組織学的検査およびステージング試験によって、膵頭部の限局性腺癌を有することが診断された。患者＃１は、原発性腫瘍の完全切除を含むＷｈｉｐｐｌｅｓ外科処置を受けた。これに単剤ゲムシタビンを毎週７用量続けたが、許容できない毒性のために化学療法を中止した。数ヵ月後、追跡ＭＲＩは、鎖骨上リンパ節および腹部リンパ節の両方への転移拡散を伴う原発性腫瘍の再発を示した。臨床プロトコルに従って、患者は、１週間の中間休止期間が設けられた、２８日間にわたる２．１×１０ｅ１１単位の累積用量でのＲｅｘｉｎ−Ｇの１０日間治療サイクルを２回受けた。全身毒性の非存在下で、患者は、３×１０ｅ１１単位の総累積用量で、１０日間の治療サイクルをさらに受けた。
【０１７０】
２つの表面鎖骨上リンパ節のサイズを、カリパスを使用して手動で測定した。第２８日の腫瘍サイクル＃２の終わりまでに、それぞれ腫瘍サイズの３３％および６２％縮小に達する、鎖骨上リンパ節の腫瘍体積の段階的縮小が認められた（表２）。
【０１７１】
表２：患者＃１  鎖骨上リンパ節のカリパス測定
【０１７２】
【表２】
2010509223.tif 000008
追跡腹部ＭＲＩは、（ｉ）腫瘍転移の新たな領域がないことと、（ｉｉ）４０〜５０％の原発性腫瘍を含む、識別可能な中心壊死領域と、（ｉｉｉ）傍大動脈腹部リンパ節のサイズの著しい縮小とを明らかにした（図１Ａ〜Ｂ）。第５４日に、追跡ＭＲＩは、原発性腫瘍のサイズに中間変化がないことを示した。これらの発見と一致して、ＣＡ１９−９血清レベルの段階的低下（１２００Ｕ／ｍｌのピークから５８４Ｕ／ｍｌの低レベルへ）が認められ、第５４日におけるＣＡ１９−９レベルの５０％低下に相当した（図１Ｃ）。しかし第１０１日の追跡ＣＴは、原発性腫瘍および鎖骨上リンパ節のサイズに著しい増大を示さなかった。患者は、患者が毎週１０００ｍｇ／ｍ２のゲムシタビン投与に同意した第１７５日まで、さらなる化学療法を拒絶した。ＲＥＣＩＳＴ基準によって、患者＃１は、Ｒｅｘｉｎ−Ｇ注入開始から６．７５ヶ月、腫瘍再発時から１１ヶ月、そして初期診断時から２０ヶ月の追跡第１８９日に、進行病態で生存している。
【０１７３】
５６歳のフィリピン人女性の患者＃２は、胆汁ブラッシングの細胞学的検査によって、ステージＩＶＡの局所進行および切除不能な膵臓頭癌を有するとして診断された。試験開腹によって、腫瘍が門脈周囲で包囲され、上腸間膜動脈および静脈近くで浸潤されていることが明らかになった。患者＃２に、５−フルオロウラシルの外部ビーム放射線療法を投与して、単剤ゲムシタビンを毎週８用量と、続いての毎月の維持用量をさらに投与した。しかしＣＡ１９−９血清レベルの段階的上昇が認められ、追跡ＣＴスキャンによって腫瘍のサイズが増大したことを明らかになった（図２Ａ）。患者は、１．８×１０１１単位の総累積用量で、毎日の静脈内注入としてＲｅｘｉｎ−Ｇの治療サイクルを２回受けた。結果：連続腹部ＣＴスキャンによって、第２８日において腫瘍サイズの４７％縮小に相当する、Ｒｅｘｉｎ−Ｇ注入開始時の６．０ｃｍ３から治療終了時の３．２ｃｍ３までの腫瘍体積の著しい縮小が示された（図２Ａ〜Ｃ）。第１０３日の追跡ＣＴスキャンによって、腫瘍サイズの中間変化がないことが示され、その後、患者は毎月のゲムシタビンで維持された。ＲＥＣＩＳＴ基準によって、患者＃２は、Ｒｅｘｉｎ−Ｇ注入開始から５．５ヶ月、初期診断の１４ヵ月後の追跡第１５４日に、安定病態を伴って無症候で生存している。
【０１７４】
４７歳の中国人糖尿病男性の患者＃３は、ＣＴガイド肝臓生検によって確認されたように、肝臓および門脈リンパ節への多数の転移を伴う、ステージＩＶＢの膵臓の体部および尾部の腺癌を有するとして診断された。膵臓のステージＩＶＢ腺癌の迅速な致命的結果に基づいて、患者は、Ｒｅｘｉｎ−Ｇフロントラインを使用して、毎週のゲムシタビンを続ける第２の臨床プロトコルへの参加を求めた。Ｒｅｘｉｎ−Ｇの初回刺激用量を投与して、より良好な細胞破壊有効性のためにゲムシタビンを用いた化学療法に対して腫瘍を感作させた。患者に２．７×１０１０単位の単位の総累積用量で、６日間にわたって４．５×１０９の用量でＲｅｘｉｎ−Ｇの静脈内注入を毎日、続いてゲムシタビンの８週間の用量（１０００ｍｇ／ｍ２）を投与した。第６２日に、追跡腹部ＣＴスキャンによって、原発性腫瘍が７．０×４．２ｃｍ（腫瘍体積：６４．２ｃｍ３）ベースライン測定値から６．０×３．８ｃｍ（腫瘍体積：４５ｃｍ３）まで縮小したことが示された（図３Ａ）。さらに第６２日には、１８結節（ベースライン）から５結節への肝結節の数の劇的な減少（図３Ｃ）が、ベースラインの２．２×２ｃｍ（腫瘍体積：４．６ｃｍ３）から１×１ｃｍ（腫瘍体積：０．５２ｃｍ３）への最大肝結節の縮退と共に見られた（図３Ｂ）。ＲＥＣＩＳＴ基準によって、患者＃３は、Ｒｅｘｉｎ−Ｇ注入開始から４．７ヶ月、診断時の〜５ヵ月の追跡第１３３日に、安定病態を伴って生存している。
【０１７５】
表３は、患者３名の全体的な腫瘍応答の比較評価を示す。ＲＥＣＩＳＴ基準を使用すると、Ｒｅｘｉｎ−Ｇは、患者３名すべてで腫瘍成長の安定化を誘発した。
表３：ＲＥＣＩＳＴによる全体的な腫瘍応答の評価
【０１７６】
【表３】
2010509223.tif 000009
本試験では、Ｒｅｘｉｎ−Ｇの静脈内注入に対する腫瘍応答を評価するために２つの方法を使用した。２ｃｍより大きい標的病変の最長直径の和および比較ポイントとしてすべての非標的病変の消失対持続を測定するＮＣＩ−ＲＥＣＩＳＴ基準を使用すると、Ｒｅｘｉｎ−Ｇで治療した患者３名中３名（１００％）が、１００日（３ヶ月）を超えて腫瘍成長安定性を有していた（表３）。腫瘍体積測定による応答の評価（式：幅２×長さ×０．５２）（１６）によって、撮像試験（ＭＲＩまたはＣＴスキャン）およびカリパス測定によって証明されたように、患者３名中３名（１００％）におけるＲｅｘｉｎ−Ｇ誘発腫瘍縮退、すなわち患者＃１の転移リンパ節腫脹の３３〜６２％の縮退（表２）、患者＃２の原発性腫瘍の４７％の縮退（図２Ｃ）、ならびに患者＃３の原発性腫瘍の３０％の縮退、転移肝臓病巣の７２％（１３／１８）の根絶、および転移門脈節の８９％の縮退が明らかになった（図３）。さらに、安全性の評価により、用量制限毒性が３×１０１１単位の累積ベクター用量まで発生しないことが示され、より大きい治療有効性を達成するためにより多くのベクターを投与できることが指摘された。Ｒｅｘｉｎ−Ｇベクター注入は悪心または嘔吐、下痢、ニューロパシー、脱毛、血行動態の不安定化、骨髄抑制、肝臓または腎臓損傷に関連していなかった。
（実施例６）
臨床試験Ａ、局所進行および転移膵臓癌における第Ｉ／ＩＩ相、Ｒｅｘｉｎ−Ｇ（商標）
臨床試験Ａは、Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅ  Ｂｕｒｅａｕ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇｓ（ＢＦＡＤ）またはＵｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｆｏｏｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（ＦＤＡ）の承認、およびＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ  ｏｒ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（Ｇｏｒｄｏｎら、（２００４）Ｉｎｔ’ｌ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．２４：１７７−１８５）に従って、局所進行または転移膵臓癌へのＲｅｘｉｎ−Ｇ（商標）の静脈内注入を調査する第Ｉ／ＩＩ相または単回使用プロトコルを含む。試験の目的は、（１）Ｒｅｘｉｎ−Ｇ（商標）の毎日の静脈内注入の安全性／毒性を判定することと、（２）Ｒｅｘｉｎ−Ｇ（商標）の静脈内注入に対する潜在的な抗腫瘍応答を評価することとであった。プロコトルは、推定生存期間が少なくとも３ヶ月の患者に対して設計された。インフォームドコンセントが得られた後、局所進行切除不能または転移膵臓癌の患者６名をＲｅｘｉｎ−Ｇ（商標）の反復注入によって治療した。患者６名中５名で標準化学療法が失敗した；これらの患者は患者内用量増加プロトコルをフィリピンのマニラおよび／または米国、ニューヨーク州、ブルックリンで次のように完了した：第１〜２日：３．８×１０ｅ９単位；第３〜４日：７．５×１０ｅ９単位；第５〜６日：１．１×ｌ０ｅ１０単位；第７〜１０日：１．５×１０ｅ１０単位；休止１週間；第１８〜２７日：１．５×１０ｅ１０単位。患者２名に追加の１サイクルを投与し、患者１名に追加の７サイクルを投与した。切除不能ステージＩＶ膵臓癌を呈した６番目の患者には、６日間の静脈内Ｒｅｘｉｎ−Ｇ（商標）（３．８×１０ｅ９単位／日）、続いての８週間にわたる週１回のゲムシタビン（１０００ｍｇ／ｍ２）より成る、１次治療として併用療法を投与した。臨床試験Ａでは、Ｒｅｘｉｎ−Ｇ（商標）調製物は３×１０ｅ７単位／ｍｌの効力を有していた。
【０１７７】
有害事象は、ＮＩＨ  Ｃｏｍｍｏｎ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ（ＣＴＣＡＥ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２または３）（Ｃｏｍｍｏｎ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ．ＤＣＴＤ，ＮＣＩ，ＮＩＨ，ＤＨＨＳ，Ｍａｒｃｈ，１９９８．）に従ってグレーディングを行った。Ｒｅｘｉｎ−Ｇ（商標）の臨床有効性を評価するために、我々は、薬剤の一般的な細胞破壊および抗血管新生活性（Ｇｏｒｄｏｎら、（２０００）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：３３４３−３３４７，Ｇｏｒｄｏｎら、（２００１）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１２：１９３−２０４）はもちろんのこと、治療過程中の標的化ナノ粒子の生体内分布および生物学的利用能に影響を及ぼす向病巣性ナノ粒子の転移病変中への動的隔離（Ｇｏｒｄｏｎら、（２００１）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１２：１９３−２０４）も考慮した。ベクターは、腫瘍の侵襲性および血管新生の程度に応じて、ある癌性病変により容易に蓄積するので、特に腫瘍負荷の大きい患者では、残りの腫瘍結節に均一に分散されることは期待されない。このことは予想通りに混合腫瘍応答を誘発して、一部の腫瘍はサイズが縮小するかもしれないが、他の腫瘍結節はより大きくなることがある、および／または新たな病変が出現することがある。その後、腫瘍負荷全体の正常化または低下によって、向病巣性監視機能は、循環ナノ粒子を多少より均一に分散させるであろう。加えて、処置病変は最初に、壊死腫瘍によって誘発された炎症反応または嚢胞性変化のためにサイズが大きくなることがある。  したがってＲｅｘｉｎ−Ｇ（商標）治療に対する客観的な腫瘍応答の評価には、標準のＲｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｔｕｍｏｒｓ（ＲＥＣＩＳＴ；Ｔｈｅｒａｓｓｅら（２０００）Ｊ．Ｎａｔ’ｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９２：２０５−２１６）以外に、２つのさらなる尺度：すなわち（１）腫瘍体積概算のためのＯ’Ｒｅｉｌｌｙの式：Ｌ×Ｗ２×０．５２（２７  Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、（１９９７）Ｃｅｌｌ  ８８：２７７−２８５）、および（２）治療期間中の腫瘍における壊死または嚢胞性変化の誘発が使用された。それゆえ３０％以上の標的病変の腫瘍体積の減少、あるいは腫瘍内の壊死または嚢胞性変化の誘発は、治療の部分応答（ＰＲ）または正の効果と見なした。片側正確検定を使用して、Ｒｅｘｉｎ−Ｇ（商標）で治療した患者および歴史的対照のＰＲの相違の有意性を予想５％ＰＲで決定した。
【０１７８】
初期第Ｉ／ＩＩ相試験は、患者内用量増加プロトコルの安全性および潜在的有効性を検査する。表４に示すように、さまざまな程度の部分応答（ＰＲ）が、Ｒｅｘｉｎ−Ｇ（商標）で治療された患者６名のうち５名で認められたのに対して、残りの患者では安定病態が見られた。患者６名のうち３名（５０％）がＲＥＣＩＳＴまたは腫瘍体積測定によって腫瘍サイズの３０％以上の縮小を有し、患者６名のうち２名（３３％）が生検および／または追跡ＭＲＩ／ＣＡＴスキャンによって原発性腫瘍または転移小結節のどちらかの壊死を有していた。ＣＴスキャンによる、８個中６個の腫瘍結節が消失した特定の患者１名（Ａ３）のさらなる解析は、腫瘍生検によって促進され、生検肝臓の残存肝腫瘍中の多数の腫瘍浸潤リンパ球の観察と共に、前臨床試験で観察された（１８、１９）のと同様に、腫瘍結節内でのアポトーシス、壊死、および線維症の発生率上昇を明らかにした（図２０〜２２）。残存肝腫瘍を浸潤する免疫反応性ＴおよびＢリンパ球の存在（図２２）は、Ｒｅｘｉｎ−Ｇ（商標）が局所免疫応答を抑制しないことを示す。無進行生存は、患者６名中４名（６７％）で３ヶ月を超えた。化学療法耐性患者におけるＲｅｘｉｎ−Ｇ（商標）治療後の中央生存期間は１０ヶ月であり、診断後の中央生存期間は２５ヶ月であった。対照的に、１次薬剤としてゲムシタビンまたは５−ＦＵ（標準治療）のどちらかを投与した膵臓癌患者の報告された中央生存期間はそれぞれ、診断後５．６５ヶ月および４．４１ヶ月であった（Ｂｕｒｒｉｓら、（１９９７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１５：２４０３−２４１３）。片側正確検定を使用すると、Ｒｅｘｉｎ−Ｇ（商標）治療患者での部分応答の有意水準は、歴史的対照のＰＲ率と比較したときに＜０．０２５であった。これらの初期の発見は、比較的少数の患者で記録されているにもかかわらず、Ｒｅｘｉｎ−Ｇ（商標）が中程度の用量でも臨床的に有効であり、医療処置なしよりも明らかに優れており、進行または転移膵臓癌患者の治療のための単剤として使用されたときにゲムシタビンよりも優れているかもしれないことを示すのに十分である。
表４：臨床試験Ａの参加者の客観的腫瘍応答、無進行生存期間および全体の生存期間
【０１７９】
【表４】
2010509223.tif 000010
患者６名はすべて、関連する悪心または嘔吐、下痢、粘膜炎、抜け毛、またはニューロパシーを伴わずに、Ｒｅｘｉｎ−Ｇ（商標）注入を十分に耐容した。患者６名中３名（５０％）に疼痛の症状軽減があった。治験剤に関連する血行動態機能の著しい変化、骨髄抑制、肝臓、腎臓またはいずれの臓器の障害もなかった。治験剤に明確に関連していると考えられる唯一の有害事象は、患者６名中２名での全身性発疹および蕁麻疹（グレード１〜２）であり、おそらく関連していると考えられる有害事象は、患者６名中２名での悪寒および発熱であった（グレードＩ）。本試験で見られる限定された数の治療中に発生した有害事象は、このような増加用量で静脈内投与されたＲｅｘｉｎ−Ｇ（商標）が比較的安全な療法であることを示唆している。
（実施例７）
臨床試験Ｂ、各種の進行または転移固形腫瘍における第Ｉ／ＩＩ相Ｒｅｘｉｎ−Ｇ（商標）
臨床試験Ｂは、臨床試験Ａの拡張に相当する。Ｒｅｘｉｎ−Ｇ（商標）による初期臨床経験の有望な結果に基づいて、Ｒｅｘｉｎ−Ｇ（商標）のより高用量の安全性および潜在的有効性をさらに判定するために、標準化学療法に対して難治性であるすべての進行または転移固形腫瘍に臨床的適応を広げるために、そして治療スケジュールおよびプロトコルを調整して外来患者治療を可能にするために、第Ｉ／ＩＩ相試験を拡張した。本試験の目的は、（１）Ｒｅｘｉｎ−Ｇ（商標）の毎日の静脈内注入の安全性／毒性を判定することと、（２）Ｒｅｘｉｎ−Ｇ（商標）の静脈内注入に対する潜在的な抗腫瘍応答を評価することとであった。プロコトルは、推定生存期間が少なくとも３ヶ月の患者に対して設計された。インフォームドコンセントが得られた後に、外胚葉（黒色腫、１；喉頭扁平上皮癌、１）、中胚葉（平滑筋肉腫、１）または内胚葉（膵臓、２；乳房、２；子宮、１；結腸、２）のいずれかから生じる転移癌患者１０名、および化学療法を拒絶した、新たに診断された以前に未処置の転移膵臓癌患者（患者の総数＝１１）に、静脈内Ｒｅｘｉｎ−Ｇ（商標）を単剤として、次の治療スケジュール；第１〜５、８〜１２、１５〜１９、および２２〜２６日；月曜から金曜と週末の休止期間に従って、合計２０日間にわたり３．０×１０ｅ１０単位／日の用量で投与した。改善されたＧＭＰ製造およびバイオプロセスプロトコルによって、実質的により高い力価でのＲｅｘｉｎ−Ｇ（商標）の製造が可能となったので、臨床試験Ｂに使用した調製物は７×１０ｅ８単位／ｍｌのベクター効力を示した。
【０１８０】
有害事象は、ＮＩＨ  Ｃｏｍｍｏｎ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ（ＣＴＣＡＥ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２または３）（Ｃｏｍｍｏｎ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ．ＤＣＴＤ，ＮＣＩ，ＮＩＨ，ＤＨＨＳ，Ｍａｒｃｈ，１９９８．）に従ってグレーディングを行った。Ｒｅｘｉｎ−Ｇ（商標）の臨床有効性を評価するために、我々は、薬剤の一般的な細胞破壊および抗血管新生活性（Ｇｏｒｄｏｎら、（２０００）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：３３４３−３３４７，Ｇｏｒｄｏｎら、（２００１）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１２：１９３−２０４）はもちろんのこと、治療過程中の標的化ナノ粒子の生体内分布および生物学的利用能に影響を及ぼす向病巣性ナノ粒子の転移病変中への動的隔離（Ｇｏｒｄｏｎら、（２００１）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１２：１９３−２０４）も考慮した。ベクターは、腫瘍の侵襲性および血管新生の程度に応じて、ある癌性病変により容易に蓄積するので、特に腫瘍負荷の大きい患者では、残りの腫瘍結節に均一に分散されることは期待されない。このことは予想通りに混合腫瘍応答を誘発して、一部の腫瘍はサイズが縮小するかもしれないが、他の腫瘍結節はより大きくなることがある、および／または新たな病変が出現することがある。その後、腫瘍負荷全体の正常化または低下によって、向病巣性監視機能は、循環ナノ粒子を多少より均一に分散させるであろう。加えて、処置病変は最初に、壊死腫瘍によって誘発された炎症反応または嚢胞性変化のためにサイズが大きくなることがある。したがってＲｅｘｉｎ−Ｇ（商標）治療に対する客観的な腫瘍応答の評価には、標準のＲｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｔｕｍｏｒｓ（ＲＥＣＩＳＴ；Ｔｈｅｒａｓｓｅら（２０００）Ｊ．Ｎａｔ’ｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９２：２０５−２１６）以外に、２つのさらなる尺度：すなわち（１）腫瘍体積概算のためのＯ’Ｒｅｉｌｌｙの式：Ｌ×Ｗ２×０．５２（２７  Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、（１９９７）Ｃｅｌｌ  ８８：２７７−２８５）、および（２）治療期間中の腫瘍における壊死または嚢胞性変化の誘発が使用された。それゆえ３０％以上の標的病変の腫瘍体積の減少、あるいは腫瘍内の壊死または嚢胞性変化の誘発は、治療の部分応答（ＰＲ）または正の効果と見なした。
【０１８１】
本試験は、用量増加および臨床応用拡大によって初期第Ｉ／ＩＩ相膵臓癌プロトコルをすべての固形癌に拡張する。表５に示すように、患者１１名中７名（６４％）に、原発性腫瘍または転移小結節のどちらかのさまざまな程度の部分応答が認められた。患者１１名中５名（４５％）は生検またはＣＴスキャンのどちらかによって、原発性腫瘍および／または転移小結節の壊死およびアポトーシスを示し、患者１１名中５名（４５％）はＲＥＣＩＳＴまたは腫瘍体積測定により、原発性腫瘍または転移小結節の３０％を超える縮小を有していた。患者１１名中２名は安定病態を有し、非常に大きい腫瘍負荷を持つ１名の患者は混合腫瘍応答を有し、大きい腫瘍負荷（〜５０個までの肝結節）を持つ患者は進行病態を有した。
表５：臨床試験Ｂの参加者の客観的腫瘍応答、無進行生存および全体的生存
【０１８２】
【表５】
2010509223.tif 000011
Ｒｅｘｉｎ−Ｇ（商標）の反復注入による癌性リンパ節の段階的縮小は、膵臓癌患者で一貫して、子宮癌、結腸癌、乳癌および悪性黒色腫の患者で再度観察され、関連する薬物動力学の理解に関して注目すべきで有意義である。センチネルリンパ節（複数を含む）、すなわち癌が原発性腫瘍から広がると考えられる最初のリンパ節（複数を含む）が転移性疾患の発病、診断、および予定治療の我々の理解にとって非常に重要であることは周知であるが、局所リンパ節および遠位リンパ節中へのＲｅｘｉｎ−Ｇ（商標）の著しい浸透度は顕著かつ有望である（表４および５）。Ｒｅｘｉｎ−Ｇ（商標）中の向病巣性ナノ粒子が体中を循環するときにその生物活性を保持して、原発性および転移病変に蓄積するだけでなく、治療上の影響を伴ってリンパ節中にも流入するという発見の臨床上の重要性はいくら誇張しても誇張しすぎることはない。図２３に示すように、悪性黒色腫患者の鼠径部からの癌性リンパ節の外科生検は、実質的壊死（２３−Ａ）、広い面積の顕性アポトーシス（２３−Ｂ）、およびヘモジデリン沈着マクロファージ（２３−Ｃ）が腫瘍残屑を排除している帯域を示した。その上、免疫組織化学的染色によって、ＣＤ３５＋樹状細胞（２３−Ｄ）、ＣＤ６８＋マクロファージ（２３−Ｅ）、ＣＤ８＋キラーＴ細胞（２３−Ｆ）、およびＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞による著しい単核浸潤が明らかになった（図示せず）。向病巣性ナノ粒子の遺伝子送達機能（すなわち細胞破壊活性）がセンチネルリンパ節内の転移性疾患に浸透するときに活性なままであり、免疫系を破壊しないが、免疫系と協調して作用するように見えるという認識により、サイトカイン遺伝子を担持している本標的化遺伝子送達系を使用して、将来のインサイチューでの癌ワクチン接種の可能性が再確認される。
【０１８３】
喉頭扁平上皮癌の別の患者において、上気道の著しい再開通が頸部ＭＲＩによって証明され（図２４）、再開通は患者の声の回復と相関していた。無進行生存期間は、１ヶ月から５ヶ月超の範囲であった。中央生存時間はＲｅｘｉｎ−Ｇ（商標）治療開始時から６ヶ月超、診断から２４ヶ月超であった。患者１１名中８名（７２％）が、Ｒｅｘｉｎ−Ｇ（商標）による治療後に６〜１３ヶ月生存した／している。まとめると、Ｒｅｘｉｎ−Ｇ（商標）は広範囲の耐性腫瘍型において単剤活性を有するように思われる。さらに治療の簡潔さにもかかわらず、持続した治療的利益が患者の大半で観察されたことに注目する。
【０１８４】
患者１１名はすべて、関連する悪心または嘔吐、下痢、粘膜炎、抜け毛、またはニューロパシーを伴わずに、ベクター注入を十分に耐容した。１１名中８名（７３％）は疼痛の症状軽減、腫脹、拍動、嗄声、および疲労があった。治験剤に関連する血行動態機能の著しい変化、骨髄抑制、肝臓、腎臓またはいずれかの臓器の障害はなかった。治療に関連する有害事象がなかったことは、ベクター用量を増加させても、Ｒｅｘｉｎ−Ｇは比較的安全な療法であることをさらに示唆している。この時点で、用量制限毒性が存在しないことは、多様な異なる腫瘍型での単剤有効性の強制的適応（ｃｏｍｐｅｌｌｉｎｇ  ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｓ）と、より高い効力のＲｅｘｉｎ−Ｇ（商標）調合物が最近入手できるようになったことと併せて、臨床有効性の向上および治療プロトコルの最適化に焦点を合せて設計された臨床試験の進歩および規制認可を促した。
（実施例８）
臨床試験Ｃ、移転膵臓および結腸癌におけるＲｅｘｉｎ−Ｇ（商標）の利用範囲拡大（Ｅｘｐａｎｄｅｄ  Ａｃｃｅｓｓ）および「パリティー解析」
臨床検査Ｃは、フィリピンＢＦＡＤによって最近承認された暫定プログラムである、あらゆる固形癌に対するＲｅｘｉｎ−Ｇ（商標）の利用範囲拡大プログラムに参加した患者の小グループを含む。革新的プロトコルは、「追い上げ」腫瘍成長を防止または未然に防いで、それによりこの交絡パラメータを最小限に抑えるために、所与の患者の全腫瘍負荷にできるだけ速く、しかし安全に対処する（すなわち低減または根絶する）ように設計された。利用される推定全投薬量は、本明細書で「パリティー解析」と呼ぶ経験的計算によって決定した（量、または機能同等性においてと同様に、等式方法（ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｅｑｕａｌｉｔｙ）と呼ぶ）。基本式は、撮像試験から推定された全腫瘍負荷（１ｃｍ＝約１×１０ｅ９癌細胞）、標的ベクター系の経験的性能係数（φ）または生理学的感染多重度（Ｐ−ＭＯＩ、ウイルス学の点から）（非標的化ベクター系のＰ−ＭＯＩは本質的に無限である）、および臨床グレード調合物の効力（単位／ｍｌ）を考慮に入れる。腫瘍負荷は、１×１０ｅ９を乗算した腫瘍結節の最長直径（ｃｍ）の和として測定され、癌細胞の総数として表される。Ｒｅｘｉｎ−Ｇ（商標）に対する１００の「操作的に定義された」性能係数（φ）または生理学的ＭＯＩ（Ｐ−ＭＯＩ）は、広範囲にわたる前臨床試験で証明された標的化遺伝子送達系の形質導入効率向上の定量的実証と、初期臨床試験の厳しい試練で観察されたＲｅｘｉｎ−Ｇ（商標）の用量依存性能とに基づいていた。重要なことは、高効率Ｒｅｘｉｎ−Ｇ（商標）生成物の産生（〜１．０×１０ｅ９単位／ｍｌ）によって、Ｒｅｘｉｎ−Ｇ（ＴＭ）の計算された最適用量を容量過負荷のリスクなしに静脈内送達できるようになった。先駆的試験：Ｒｅｘｉｎ−Ｇ（ＴＭ）注入の最初の２０日間が完了した後、転移膵臓癌の患者２名および転移結腸癌の患者が（さらなるインフォームドコンセントによって）、それぞれ６週間（患者１名）および１６週間（患者２名）にわたって総用量〜２．５×１０ｅ１２まで、Ｒｅｘｉｎ−Ｇ（ＴＭ）静脈内注入の投与を継続することを選択した。これはＣＴスキャンまたはＭＲＩに基づいて患者の概算腫瘍負荷をおおよそ相関させるパリティー解析を提供する。
【０１８５】
有害事象は、ＮＩＨ  Ｃｏｍｍｏｎ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ（ＣＴＣＡＥ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２または３）（Ｃｏｍｍｏｎ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ．ＤＣＴＤ，ＮＣＩ，ＮＩＨ，ＤＨＨＳ，Ｍａｒｃｈ，１９９８．）に従ってグレーディングを行った。Ｒｅｘｉｎ−Ｇ（商標）の臨床有効性を評価するために、我々は、薬剤の一般的な細胞破壊および抗血管新生活性（Ｇｏｒｄｏｎら、（２０００）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：３３４３−３３４７，Ｇｏｒｄｏｎら、（２００１）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１２：１９３−２０４）はもちろんのこと、治療過程中の標的化ナノ粒子の生体内分布および生物学的利用能に影響を及ぼす向病巣性ナノ粒子の転移病変中への動的隔離（Ｇｏｒｄｏｎら、（２００１）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１２：１９３−２０４）も考慮した。ベクターは、腫瘍の侵襲性および血管新生の程度に応じて、ある癌性病変により容易に蓄積するので、特に腫瘍負荷の大きい患者では、残りの腫瘍結節に均一に分散されることは期待されない。このことは予想通りに混合腫瘍応答を誘発して、一部の腫瘍はサイズが縮小するかもしれないが、他の腫瘍結節はより大きくなることがある、および／または新たな病変が出現することがある。その後、腫瘍負荷全体の正常化または低下によって、向病巣性監視機能は、循環ナノ粒子を多少より均一に分散させるであろう。加えて、処置病変は最初に、壊死腫瘍によって誘発された炎症反応または嚢胞性変化のためにサイズが大きくなることがある。したがってＲｅｘｉｎ−Ｇ（商標）治療に対する客観的な腫瘍応答の評価には、標準のＲｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｔｕｍｏｒｓ（ＲＥＣＩＳＴ；Ｔｈｅｒａｓｓｅら（２０００）Ｊ．Ｎａｔ’ｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９２：２０５−２１６）以外に、２つのさらなる尺度：すなわち（１）腫瘍体積概算のためのＯ’Ｒｅｉｌｌｙの式：Ｌ×Ｗ２×０．５２（２７  Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、（１９９７）Ｃｅｌｌ  ８８：２７７−２８５）、および（２）治療期間中の腫瘍における壊死または嚢胞性変化の誘発が使用された。それゆえ３０％以上の標的病変の腫瘍体積の減少、あるいは腫瘍内の壊死または嚢胞性変化の誘発は、治療の部分応答（ＰＲ）または正の効果と見なした。
【０１８６】
本試験は、固形癌に対するＲｅｘｉｎ−Ｇ（商標）の利用範囲拡大プログラムでの最初の臨床経験報告となり、パリティー解析と呼ばれる革新的な個別化用量集中レジメンを紹介する。この予備的であるが重要な中間解析において、それぞれ広範な腫瘍負荷を持つ患者３名すべてに劇的な応答が認められた。１名の患者（Ｃ１）において、パリティー解析（または機能同等性）は追跡ＭＲＩで、切除不能膵臓腫瘍の液化壊死および嚢胞性変換ならびに転移肝結節の嚢胞性変換または消失のどちらかを引き起こす累積投薬量を概算した（図２５）。腫瘍結節の吸引は悪性細胞については陰性であった。ステージＩＶ結腸癌に罹患している第２の患者（Ｃ２）において、転移性疾患の大部分を縮小させるのには、規定のパリティー解析に接近しつつある累積投薬量が有効であった：画像解析によって、肝腫瘍結節で観察された８４％の壊死が証明された。第３の患者（Ｃ３）では、原発性膵臓腫瘍ならびに肺結節の数（肺結節２８個から１２個へ）およびサイズの低減がＣＴスキャンによって認められた。無進行生存期間および全体の生存期間は、２名の患者でのＲｅｘｉｎ−Ｇ（商標）治療後には６ヶ月を超えた。これらの発見により、パリティー解析が、所与の患者の腫瘍負荷に対処して、それにより最適導入レジメンを構成するＲｅｘｉｎ−Ｇ（商標）の総累積用量を決定するために使用できるという仮説を裏付ける予備的証拠が与えられる。
【０１８７】
患者３名はすべて、関連する悪心または嘔吐、下痢、粘膜炎、抜け毛、またはニューロパシーを伴わずに、ベクター注入を十分に耐容した。治験剤に関連する血行動態機能の急性変化、骨髄抑制、肝臓、腎臓またはいずれかの臓器の障害はなかった。２名の患者は、おそらく次の壊死腫瘍中への出血に関連すると考えられる、赤血球輸血を必要とする貧血を発症した（グレード３）１名の患者は、おそらく治験剤に関連すると考えられる、血小板減少症の散発的症状発現を示した（グレード１〜２）。１名の患者は、Ｒｅｘｉｎ−Ｇ（商標）治療の３ヵ月後に、治験剤に起因しない急性劇症性表皮ブドウ球菌敗血症のために死亡した。この患者の検死結果によって、骨髄、心臓および脳で記録された正常な組織診断と共に、残存膵臓腫瘍のほぼ完全な壊死と、肝臓および腹腔腸間膜に残る転移腫瘍の７５〜９５％の壊死が示された。Ｒｅｘｉｎ−Ｇ（商標）投与に関連する全身毒性がないことは、転移癌の管理における有効性はもちろんのこと、他のＱＯＬ（生存の質）尺度に関しても、標準化学療法に勝るＲｅｘｉｎ−Ｇ（商標）の潜在的な利点を強調する。各症例において、全体的な腫瘍崩壊の程度は印象的であった。患者の腫瘍負荷を克服するために特別に調整されたＲｅｘｉｎ−Ｇ（商標）の用量集中レジメンがこのようなレベルの有効性を達成できるということの証明によって、最適な腫瘍根絶率を定義して、殺腫瘍後の創傷治癒に耐えている患者に対する支持療法を識別するために、パリティー解析をさらに改良する必要性が強調される。
（実施例９）
臨床試験Ｄ、標準化学療法に対して難治性である局所進行または転移膵臓癌のＲｅｘｉｎ−Ｇの第Ｉ相臨床試験
臨床試験Ｄでは、上の臨床試験Ａの患者６名で見られた初期臨床結果を確認するために、局所進行または転移膵臓癌患者１２名をＲｅｘｉｎ−Ｇの静脈内投与によって治療した。これらの初期患者は、免疫抑制または臓器損傷を示すことなく、累積用量１０ｅ１２ｃｆｕまでのＲｅｘｉｎ−Ｇ注入が反復して投与された。
【０１８８】
用量増加スキームに従って観察された用量制限毒性（ＤＬＴ）に基づいて最大許容用量（ＭＴＤ）を評価するために設計され、用量増加スキームでは、ＭＴＤは患者６名中最大１名がＤＬＴを経験する最高の安全許容用量として定義され、次に高い用量レベルでは患者６名中少なくとも２名がＤＬＴを経験する。血液有害事象は、ＮＣＩ  Ｃｏｍｍｏｎ  Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  Ａｄｖｅｒｓｅ  Ｅｖｅｎｔｓ  ｖ３．０により、少なくともおそらくＲｅｘｉｎ−Ｇに関連して、≧３のいずれかのグレードとして定義された。＜７２時間継続するグレード３ＡＮＣは除く。非血液有害事象は、ＮＣＩ  Ｃｏｍｍｏｎ  Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  Ａｄｖｅｒｓｅ  Ｅｖｅｎｔｓ  ｖ３．０により、少なくともおそらくＲｅｘｉｎ−Ｇに関連して、≧３のいずれかのグレードとして定義された。グレード≧３の悪心、嘔吐、または下痢は、患者が最大の支持療法を受けた場合にのみ用量制限的であると見なされた。脱毛症は用量制限的であると見なされなかった。
【０１８９】
患者は、３つの異なる用量レベルでＲｅｘｉｎ−Ｇを投与された。用量レベル１は、７．５×１０ｅ９ｃｆｕで第１〜７日および第１５〜２１日に治療を投与された３名の患者を有した。用量レベル２は、１．１×１０ｅ１０ｃｆｕで第１〜７日および第１５〜２１日に治療を投与された６名の患者を有した。用量レベル３は、３．０×１０ｅ１０ｃｆｕで第１〜５日、第８〜１２日、第１５〜１９日、および第２２〜２６日に治療を投与された３名の患者を有した。すべての患者は、体重１キログラム当たり８ｍｌの、最大用量当たり体積を投与された。
【０１９０】
用量レベル１では、３名の患者すべてがその治療過程を終了して、用量の１００％を投与された。いずれの患者も、治療中またはその１週間の観察中にＤＬＴを経験しなかった。用量レベル２において、４名の患者はＲｅｘｉｎ−Ｇの全用量を投与された。全用量を投与されなかった患者２名のうち、１名の患者は、おそらく治療に関連すると考えられるＡＳＴおよびＡＬＴのグレード３上昇のために、用量を調整された。しかし患者はアセトアミノフェン１０００ｍｇも毎日摂取していた。これらの上昇はＲｅｘｉｎ−Ｇおよびアセトアミノフェン中断の７２時間以内にグレードＩまで低下させて、Ｒｅｘｉｎ−Ｇ治療を完了させた。もう１人の患者は、グレード２アルカリホスファターゼ有害事象の発生のために治療を１日実施した。用量レベル３では、まだ毒性サマリーレポートは入手できないが、患者はＳＡＥおよびＤＬＴを経験しなかった。
【０１９１】
試験された用量レベルでのＲｅｘｉｎ−Ｇの安全性に次いで、静脈内注入後のウイルス粒子の薬理動態ならびに免疫応答誘発、組み換え事象（複製可能なレトロウイルス産生）誘起、および非標的組織へのベクター組み込みの可能性について試験した。ウイルス粒子の薬物動態のために、血液サンプルを患者１２名全員から第１日にベクター注入の０、５、３０、６０、１２０分および２４時間後の時点で採取した。ネオマイシン耐性（ｎｅｏｒ）遺伝子産物の発現に基づいて、Ｒｅｘｉｎ−Ｇベクター濃度（ウイルス力価）を決定および定量した。
【０１９２】
簡潔には、形質導入の１日前に１．５×１０４個のＨＴ１０８０（ヒト線維肉腫細胞）細胞を、１２ウェルプレートのそれぞれで平板培養した。培地は、８μｇ／ｍｌポリブレンを含むウイルス上清の連続希釈物０．５ｍｌを用いて、３２℃、５％  ＣＯ２にて静かに揺すりながら３時間半にわたってインキュベートした。新しい培地０．５ｍｌを培養物に添加して、次に３７℃、５％  ＣＯ２にて一晩維持した。ｎｅｏｒ遺伝子産物の発現のために、形質導入の２４時間後に開始するＧ４１８薬（５００μｇ／ｍｌ）を用いた処置によってＧ４１８耐性コロニーを選択した。メチレンブルーによって染色されたＧ４１８耐性コロニーの数を、Ｇ４１８薬で１３日間インキュベートした後に限界希釈によって定量した。ウイルス力価は、血清１ミリリットル当たりのコロニー形成単位の数（ｃｆｕ／ｍｌ）として表した。
【０１９３】
結果は、用量レベル１にて患者３名中３名で、用量レベル２にて患者６名中２名で、そして用量レベル３にて患者３名中２名で、Ｒｅｘｉｎ−Ｇ注入の５分後に得た血液サンプル中で、ｎｅｏｒ選択可能Ｒｅｘｉｎ−Ｇベクターは非常に低い（＜１×１０２ｃｆｕ／ｍｌ）が、検出可能であることを証明した。ベクターは、用量レベル１にて検出可能なベクターを有した患者３名中２名、レベル２にて患者６名中０名、用量レベル３にて患者６名中０名で３０分で減少した。３０分を超えた時点でベクターは回復されなかった。最小限のベクター回復は多くの因子による可能性があるが、この発見は、注入数分以内に発生することが公知される腫瘍中へのベクター生体内分布を示す可能性が高い。このことは、かなりの量の免疫反応性Ｒｅｘｉｎ−Ｇが静脈内注入後の数分以内に癌異種移植片に蓄積することが見いだされた前臨床試験の結果と一致する（Ｇｏｒｄｏｎら、２００１）。循環ベクターの腫瘍中へのこの迅速な分配は、活発な血管新生および／または腫瘍浸潤の領域に特徴的に露出された微視的な一連のコラーゲンタンパク質へ指定された、向病巣性（病気追求）ベクターの親和性または粘着性（血小板粘着のような）に起因する。したがって治療された患者の循環中のＲｅｘｉｎ−Ｇの短い生物学的半減期は、原発性および転移病変中への迅速な生体内分布に起因するのかもしれない。関与する機構とは無関係に、その注入３０分後以降に全身循環中に残存する循環Ｒｅｘｉｎ−Ｇは、存在するとしてもわずかである。
【０１９４】
抗ベクター抗体の存在についての試験を、患者１２名全員から注入前ならびに治療の４週間後（用量レベル１、２）および６週間後（用量レベル３）に得た血清サンプルに対して実施した。抗ベクター抗体の存在は、ウェスタンスロットブロット解析を使用してベクター中和アッセイを使用して試験した。ベクター中和抗体およびｇｐ７０ｅｎｖタンパク質に対する抗体は、用量レベルＩ〜ＩＩＩでＲｅｘｉｎ−Ｇによって治療した患者の血清中で検出されなかった。これらのデータは、Ｒｅｘｉｎ−Ｇの反復注入後にベクター中和抗体が検出されなかったマウスでの前臨床試験の結果を確認している。これらの発見は、潜在的な臨床有効性を失わずに反復静脈内投与を可能にするＲｅｘｉｎ−Ｇの低い免疫原性を肯定する。
【０１９５】
ＲＣＲの存在は、時間０（ベクター注入前）およびベクター注入開始の４週間後（用量レベル２）または６週間後（用量レベル３）のどちらかに患者７より得た末梢血リンパ球から抽出されたＤＮＡに対して実施した。アッセイは、ＰＣＲによって、Ｒｅｘｉｎ−Ｇレトロウイルスベクター中に存在する２００１ｂｐモロニーマウス白血病ウイルスエンベロープ（ＭｏＭＬＶ  Ｅｎｖ）遺伝子（４１１〜５７４ｂｐからの１６４ｂｐ断片）のごく一部の存在を検出するために設計された。試験した注入後サンプルはすべて、ＲＣＲに陰性であることが見出された。
【０１９６】
ベクターＤＮＡ組み込みの存在についての試験は、注入前、治療の１週間後、および４週間後（用量レベル１、２）；第５日および６週間後（用量レベル３）に患者９名より得た末梢血リンパ球から抽出したＤＮＡに対して実施した。末梢血リンパ球中のベクターＤＮＡ組み込みの試験は、白血球を赤血球および血清から分離するために患者の血液サンプルを遠心分離にかけることによって実施した。単離した白血球ＤＮＡにＮｅｏプライマーを使用してリアルタイムＰＣＲを受けさせて、ｄｎＧｌ−Ｅｒｅｘレトロウイルス中に存在する７９５ｂｐネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）遺伝子（３８２−４５６ｂｐからの７５ｂｐ）のごく一部を増幅させた。
【０１９７】
ベクターＤＮＡ配列は末梢血リンパ球ＤＮＡ中で検出されず、Ｒｅｘｉｎ−Ｇ処置マウス、ラット、およびウサギの肝臓および脾臓（ウイルス排除の臓器）を除くベクターＤＮＡが非標的臓器中で検出されなかった前臨床データを確認した。
【０１９８】
Ｒｅｘｉｎ−Ｇの静脈内投与後の抗腫瘍活性はＲＥＣＩＳＴによって評価した。用量レベル１を投与した患者３名すべてを第２８日くらいまで進行させた。患者６名中５名を、治療開始から約１ヶ月以内に進められる用量レベル２に登録した。他の患者はＲＥＣＩＳＴにより安定病態を有するとみなされたが、症状悪化に苦しんだ。用量レベル３を投与した患者３名すべてを第４２日の評価に進めた。
【０１９９】
ハウンズフィールド単位で測定したような腫瘍密度を使用して、Ｒｅｘｉｎ−Ｇの生物活性を測定した。レベル用量１の患者３名およびレベル２の患者６名のそれぞれで、ベースラインおよび第２８日におけるハウンズフィールド単位での、複数の病変の腫瘍密度のデータが入手できる（７名の患者で５つの病変、１名の患者で３つの病変、１名の患者で２つの病変）。これらのデータを２つの方法でまとめている。
【０２００】
表６は、各患者について、腫瘍密度になんらかの低下があった病変の割合はもちろんのこと、少なくとも１０％、１５％、および２０％の低下があった病変の割合も示している。病変の密度が低下する明らかな傾向がある；患者９名すべてが、偶然のみで予想されるよりも著しい、測定した病変におけるハウンズフィールド単位での正味の縮小を有していた（両側ｐ値＝０．００４）。しかし用量レベルの相違は強く示されていない；たとえば少なくとも２０％の縮小を示す病変の割合に関する用量レベルの比較では、両側ｐ値は０．４３であった（連続補正のあるＷｉｌｃｏｘｏｎ  ｒａｎｋ  ｓｕｍ検定）。
表６：腫瘍密度の低下を受けた各患者の病変の割合
【０２０１】
【表６】
2010509223.tif 000012
表７に、用量レベルによる、腫瘍密度低下の各種の条件；たとえば病変の少なくとも５０％における密度の何らかの低下を満足する患者の割合をまとめる。再び、用量レベルによる相違の明らかな証拠はない。
表７：複数の基準による、治療が有効な患者の割合
【０２０２】
【表７−１】
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【０２０３】
【表７−２】
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これらのデータは、部分応答（ＰＲ）のＣＨＯＩ基準を満足する癌細胞の数の減少および／あるいは腫瘍結節内の壊死または嚢胞性変換を示し、それによりＲｅｘｉｎ−Ｇの生物活性を満足する、ベースライン測定値と比較したＲｅｘｉｎ−Ｇ治療後の標的病変の腫瘍密度の著しい低下を証明している。
【０２０４】
用量レベル１の患者はすべて、３ヵ月半の中央生存期間で死に至る進行病態を有していた。用量レベル２の患者はすべて、２ヵ月半の中央生存期間で死に至る進行病態を有していた。用量レベル３では、患者１名が治療後に４ヶ月間生存した後に進行病態のために死亡して、残り２名は最終追跡以降はなお生存している。
【０２０５】
本試験は、用量レベル１、２、および３でのＲｅｘｉｎ−３の安全性を証明する最初の臨床試験Ａで達成された結果を確認する。さらに静脈内注入後のウイルス粒子の薬理動態は、投与５分後に血中で検出可能なわずかなウイルス粒子による迅速な腫瘍ターゲティングを示す。６週間の追跡期間中にウイルス粒子に対して誘起された免疫応答は認められず、反復治療サイクルを可能にするであろうベクターの低い免疫原性を示す。組み換え事象は見出されず、３−プラスミド形質移入系の、このような事象のリスクを劇的に低下させる能力を証明した。また非標的臓器へのベクター組み込みも見出されなかった。用量レベル１および２からの患者９名すべてが腫瘍密度の低下を証明して、Ｒｅｘｉｎ−Ｇの生物活性を示したが、２つの用量レベル間の腫瘍応答の相違は認められなかった。
（実施例１０）
転移骨肉腫における単剤Ｒｅｘｉｎ−Ｇ有効性の症例研究
２００３年１２月に右脛骨の骨肉腫と診断された１７歳男性は、シスプラチン、アドリアマイシンおよび高用量メトトレキセートによる術前化学療法と、続いての患肢救済処置を受けた。腫瘍の病理組織学的検査によって、術前化学療法に応答してわずか５０％の壊死が示された。術後に、男性はシスプラチンおよびアドリアマイシン×２、アドリアマイシンおよびイホスファミド×２を投与され、アドリアマイシンの累積用量を４００ｍｇ／ｍ２とした。化学療法は２００５年２月に完了した。２００６年３月に追跡ＣＴスキャンによって左側肺転移が示され、ＶＡＴＳ胸腔鏡下手術によって除去した。ＣＴスキャンおよびＰＥＴスキャンによって、手術部位に持続する病態が示された。２００６年の６月から１１月にかけて、男性に高用量のメトトレキセートおよびイホスファミドを投与して、次に２００６年１１月に開胸術を受けさせた。２００６年１２月の反復ＣＴスキャンによって進行肺転移が示され、標準化学療法の失敗が証明された。タキソテール、ジェムザールおよびアドリアマイシンによる救済療法を２００７年１月に開始したが、連続撮像は、男性の肺腫瘍のサイズおよび数が増えて、１ｃｍの大きさの１つの肺結節が２００７年４月までに最大病変のサイズが４．２ｃｍの１０個の肺結節となったことを証明した。
【０２０６】
正式なインフォームドコンセントが得られた後に、患者をＲｅｘｉｎ−Ｇの単回使用プロトコルに登録した。Ｒｅｘｉｎ−Ｇ治療の開始前に、先にＧｏｒｄｏｎら（２００６）によって記載されたパリティー解析を使用して、概算腫瘍負荷（全病変の最長直径の和に１×１０ｅ９癌細胞を乗算した和として定義される）に１００の経験的標的または生理学的係数（生理学的感染多重度、ｐＭＯＩ）を乗算することによって、累積ベクター用量を決定した。累積べクター用量は１．８×１０ｅ１２ｃｆｕレキシン−Ｇベクターと決定され、患者は疾患進行を停止させて、客観的腫瘍応答を誘発するために（用量当たり１×１０ｅ１１ｃｆｕでの）Ｒｅｘｉｎ−Ｇの１８〜２０回の注入が必要であろうことが予測された。
【０２０７】
週２回、４週間にわたって１×１０ｅ１１ｃｆｕとして静脈内投与され、２週間の休止期間が続くＲｅｘｉｎ−Ｇの第１サイクルによって、８×１０ｅ１１ｃｆｕの累積用量が生じた。連続ＰＥＴ−ＣＴスキャンを連続治療サイクルの前後に撮影した（図３０）。第１サイクル完了の１週間後に得られたＰＥＴ−ＣＴスキャンは、標的病変の総サイズの２８％の増大と、標的病変の総腫瘍密度の６％の低下と、４つの標的病変の総ＳＵＶｍａｘの３３％の低下とを、認められた３つの新たな小規模な肺病変と共に示した。代わりの治療選択肢がわずかであり、Ｒｅｘｉｎ−Ｇ注入に対する毒性が観察されないため、週２回、４週間にわたって１×１０ｅ１１ｃｆｕとして静脈内投与されたＲｅｘｉｎ−Ｇの追加の治療サイクルに対してＦＤＡ承認が得られ、累積用量を初期腫瘍負荷に基づいてＲｅｘｉｎ−Ｇの予想総用量に近い１．６×１０ｅ１２ｃｆｕとした。驚くべきことに、第２サイクル完了の２週間後に得られたＰＥＴ−ＣＴスキャンによって、新たな病変は示されず、標的病変の石灰化を示す総腫瘍密度の５３９％の低下と、４つの標的病変の総ＳＵＶｍａｘの４８％の低下とが示された。総腫瘍直径が増加したとしても、これは治験責任医師によって治療に対する正の部分応答として見なされた。
【０２０８】
正の腫瘍応答に基づいて、再発または転移化学療法難治性骨肉腫の第ＩＩ相臨床試験を開始した。ＰＥＴ撮像は腫瘍応答を判定するための最も情報価値のある撮像様式であるため、そしてＲＥＣＩＳＴ基準は腫瘍結節の進行中の修復石灰化のために腫瘍応答を正確に反映しないため、腫瘍応答を監視および報告するために、標準ＲＥＣＩＳＴ基準の使用の解除および国際ＰＥＴ基準によるその置換がＦＤＡから求められている。
（実施例１１）
適応試験設計を使用する高度第Ｉ／ＩＩ相臨床試験
再発または転移肉腫、乳癌または膵臓癌患者に対する、適応試験設計による３つの高度第Ｉ／ＩＩ相臨床試験が米国で同時に進行中である。試験の目的は３つある。１）静脈内（ＩＶ）注入として投与されたＲｅｘｉｎ−Ｇの用量制限毒性および最大許容用量を決定すること。２）静脈内Ｒｅｘｉｎ−Ｇが免疫応答、組み換え事象および非標的臓器での望ましくないベクター組み込みを誘発する可能性を評価すること。３）静脈内投与されたＲｅｘｉｎ−Ｇに対する抗腫瘍応答を同定すること。
【０２０９】
各試験は合計１５〜２４名の患者を登録するであろう。表８は、用量レベル０にてすでに進行中の治療による５つの計画された用量レベルを示す。
表８：Ｒｅｘｉｎ−Ｇの計画された用量レベル
【０２１０】
【表８】
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肉腫プロトコルの患者３名は用量レベル０（１×１０ｅ１１ｃｆｕ、週２回）で治療され、ＤＬＴなしで４２日間観察された。臨床有効性が観察され、すべての治療関連毒性が≦グレード１まで消失する場合、適応試験設計によって患者は同じ治療サイクルで再治療することが可能になる。あるいは、＜グレード１までの毒性の消失がある場合、患者は次のより高い用量レベルに進むことができる。用量レベル０肉腫患者は現在、用量レベル１で登録されている。これは腫瘍成長の制御を得て、安全性を脅かさずに客観的な腫瘍応答を誘発する機会を増加させるはずである。
【０２１１】
適応試験設計によって、治験責任医師に第１治療サイクルが完了した後に残存腫瘍の外科的減量または外科的切除を推奨させることもできる。残存腫瘍が病理組織学的試料において、またはＰＥＴ−ＣＴスキャンによって検出された場合、あるいは患者がグレード１以下の毒性を有する場合に、治療サイクルを再開することができる。
【０２１２】
３つの臨床試験すべてで、患者３名が用量レベルＩで登録されるであろう。用量レベルＩで患者３名中１名がＲｅｘｉｎ−Ｇに関連するまたはおそらく関連すると考えられる３または４有害事象（ＣＴＣＡＥ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．０）を発症する場合、ここで追加の患者３名が同じ用量レベルで登録されるであろう。最初の３名中少なくとも２名が、または用量レベルＩの患者６名中３名がＲｅｘｉｎ−Ｇに関連するまたはおそらく関連すると考えられる３または４有害事象を発症する場合、データについて食品医薬品局（ＦＤＡ）と議論が行われて、試験登録の継続または終了の決定がなされるまで、試験への自然増加は維持されるであろう。これらの用量制限毒性ルールはすべての用量レベルに適用される。
【０２１３】
次の用量レベルまでの用量増加は、患者３名が前の用量レベルで治療され、４２日間（６週間）観察されるまで行われないであろう。コホート内用量増加はないであろう。いずれの用量レベルにおいても、最初の３名の患者に生物活性の証拠がある場合には、最大６名の患者を登録することができる。生物活性に印象的な証拠があれば、用量増加は中止できる。補正を提出して、印象的な生物活性に基づく用量レベルをさらに増加させることができる。
【０２１４】
試験の１次エンドポイントは、患者のパフォーマンスステータス、毒性評価スコア、血液特性、および代謝特性によって定義されたＤＬＴおよびＭＴＤによって証明されたような臨床毒性である。２次エンドポイントは、Ｒｅｘｉｎ−Ｇが免疫応答、組み換え事象または非標的臓器での望ましくないベクター組み込みを誘発する可能性である。
【０２１５】
Ｒｅｘｉｎ−Ｇに対する客観的な腫瘍応答は、ＲＥＣＩＳＴ、ＣＨＯＩおよびＰＥＴによって測定する。現在までに、患者１０名が１×１０ｅ１１ｃｆｕの第１用量レベルで週２回、４週間にわたって治療されている（肉腫、ｎ＝６；乳癌、ｎ＝１；および膵臓癌、ｎ＝３）。腫瘍応答の４週間の評価が患者４名について入手可能であり、表９に示されている。
表９：Ｒｅｘｉｎ−Ｇの用量レベルで治療した患者４名の腫瘍応答
【０２１６】
【表９】
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表９は、肉腫プロトコルの患者３名中２名、そして膵臓癌プロトコルの患者１名がＲＥＣＩＳＴによって安定病態を有し、患者４名がＲｅｘｉｎ−Ｇ治療の４週間後にＰＥＴによる安定病態を有することを示す。Ｒｅｘｉｎ−Ｇ治療患者４名すべてが、標準化学療法の間にＣＴスキャンで証明された腫瘍進行を有していた。これらのデータは、Ｒｅｘｉｎ−ＧがＲＥＣＩＳＴによって患者４名中３名（７５％）の、基準によって患者４名中３名（７５％）の、そしてＰＥＴによって患者４名中４名（１００％）の腫瘍進行を停止させたことを示し、ＰＥＴスキャン撮像結果がＲｅｘｉｎ−Ｇ治療に対する早期指標として使用できることを指摘している。ＦＤＡ承認の第Ｉ／ＩＩ相プロトコルに従って、第１用量レベルでのＲｅｘｉｎ−Ｇの生物活性の表示により、さらに３名の患者が第１用量レベルでの肉腫プロトコルに登録されている。さらに、用量応答を評価して、各臨床的適応についてＲｅｘｉｎ−Ｇの最適生物学的用量および治療スケジュールを決定するために、肉腫および膵臓癌プロトコルのそれぞれで患者６名が各用量レベルにて登録されるであろう。
（実施例１２）
Ｒｅｘｉｎ−Ｇで治療した患者４９名の有効性および安全性のまとめ
累積された臨床的証拠は、Ｒｅｘｉｎ−Ｇが従来の化学療法と比較して独自の安全性を有することを証明している。著しい有害事象または毒性が生じることなく（表１１）、客観的な腫瘍応答が認められている（表１０）。
表１０：投与したＲｅｘｉｎ−Ｇ用量および腫瘍応答のまとめ
【０２１７】
【表１０】
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表１１：報告された副作用のまとめ
【０２１８】
【表１１】
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（実施例１３）
化学療法難治性再発または転移骨肉腫患者でのＲｅｘｉｎ−Ｇの第ＩＩ相臨床試験
ＰＥＴ−ＣＴ撮像試験の結果を使用して計算した概算腫瘍負荷に基づいて２つの異なるＲｅｘｉｎ−Ｇ用量レベルに、化学療法難治性再発または転移骨肉腫患者２０〜３０名が層別化されるであろう。概算腫瘍負荷は、標的病変の最長直径の和（ｃｍ）に１０ｅ９癌細胞を乗算することによって計算される。腫瘍負荷が１００億細胞未満である場合、患者は用量レベル１に割り当てられ、腫瘍負荷が１００億細胞を超える場合、患者は用量レベル２に割り当てられるであろう。表１２。
表１２：難治性再発または転移骨肉腫のＲｅｘｉｎ−Ｇ治療のための用量レベルおよび治療サイクル
【０２１９】
【表１２】
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治療サイクルは、４週間の治療と、続いての２週間の休止より成る６週間となる。＜グレードＩまでの毒性の消失がある患者は、反復サイクルを有することができる。ＰＥＴ−ＣＴは、最初の４サイクルでは６週間ごとに、その後は１２週間ごとに行う。１回以上の治療サイクルの後、治験責任医師は外科的減量または完全外科的切除を推奨することがある。組織病理学的検査またはＰＥＴ−ＣＴスキャンのどちらかによって残存疾患が存在する場合には、外科的切開が治癒しており、患者が＜グレードＩ毒性を有するならば、反復治療サイクルを手術４週間後に投与することができる。
【０２２０】
臨床試験の目的は、静脈内（ＩＶ）Ｒｅｘｉｎ−Ｇおよび全体の安全性を評価することである。臨床有効性は、腫瘍応答率、無進行生存期間および全体生存期間を含む。国際ＰＥＴ基準を使用して、腫瘍応答率をＣＲ、ＰＲまたはＳＤとして評価する。
【０２２１】
無進行生存期間は１ヶ月を超える生存であり、全体生存期間は６ヶ月以上の生存として定義される。静脈内投与Ｒｅｘｉｎ−Ｇの全体安全性は、パフォーマンスステータス、毒性評価スコア、血液特性、代謝特性、免疫応答、ＰＢＬへのベクター組み込みおよび組み換え事象によって測定されるであろう。
（実施例１４）
Ｒｅｘｉｎ−Ｇと、続いてのＲｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃとによって治療された進行転移膵臓癌患者の症例研究
放射線および化学療法が転移膵臓癌の肝臓への、そして肝臓内への拡散を制御できないときに、この重要臓器内の腫瘍負荷は非常に大きい割合まで成長することがあり、正常肝実質を巨大な腫瘍形成で置き換える。このようなときに、例外的使用およびインフォームドコンセントが組み合さって、致死的な腫瘍負荷を低減するためのより攻撃的なプロトコルの使用を促進する。図３４は、２８日間にわたるＲｅｘｉｎ−Ｇの連続注入（累積用量：２×１０ｅ１２ｃｆｕ）と、続いての６日間にわたるＲｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ（累積用量３×１０ｅ１０ｃｆｕ）によって治療した、難治性転移膵臓癌患者から得た剖検腫瘍検体中の原発性腫瘍の広範囲にわたる壊死を示す。一連の注入が耐容性良好であり、全体の腫瘍負荷が著しく低下されたが、患者は生育と大きい病変の即時の消失に失敗して、支持療法を必要とした。残念ながら患者は、劇症性大腸菌細菌性敗血症で治療の３ヵ月後に死亡し、敗血症はＲｅｘｉｎ−Ｇ介入とは無関係と見なされたが、より一般的な意味で切除後創傷治癒も問題に関連しているかもしれない。しかし腫瘍破壊の程度の組織学的検査は情報価値がある。図３４のパネルＡに見られ、パネルＢおよびＣで拡大されているように、死後の発見は、本膵臓腫瘍の〜９５％を含む莫大な量の壊死（ｎ）を、変性（ｄｅｇ）およびオルガノイド構造によって隣接された線維症（ｆ）の各種部位と共に示している。ＧＭ−ＣＳＦの免疫組織化学的染色によって、ＧＭ−ＣＳＦを発現する腫瘍細胞（パネルＥおよびＦ）が小さい島状（囲まれた部位、Ｅで拡大）に現れた（矢印）複数の部位が同定され、著しい免疫浸潤（ｉｍ）がＧＭ−ＣＳＦ分泌細胞の壊死断片と思われるものの付近に見える（パネルＦ）。本臨床症例研究は、３つの重要な課題：（ｉ）癌が回復不能臓器損傷を生じる前に、患者を早期に治療することの全体的な重要性、（ｉｉ）Ｒｅｘｉｎ−Ｇが極めて大きい腫瘍負荷に対応および適合する可能性、および（ｉｉｉ）Ｒｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃがその免疫刺激負荷量を用いて、腫瘍破壊のプロセスに関与する可能性を強調している。
【０２２２】
本発明の常法は、別途指摘しない限り、当分野の技術の範囲内である、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、遺伝子導入生物学、微生物学、組み換えＤＮＡ、および免疫学の従来技法を利用するであろう。このような技法は、文献に記載されている。たとえばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，ｅｄ．ｂｙ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９８９）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｄ．，１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ  ｅｄ．，１９８４）；Ｍｕｌｌｉｓら、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，６８３，１９５；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．  Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ  ｅｄｓ．，１９８７，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ＶｏＩｓ．１５４  ａｎｄ  １５５（Ｗｕらｅｄｓ．），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ．Ｎ．Ｙ．，１９８６）を参照。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2010509223.tif 000029
【図６】
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【図７】
2010509223.tif 000031
【図８】
2010509223.tif 000032
【図９】
2010509223.tif 000033
【図１０】
2010509223.tif 000034
【図１１Ａ】
2010509223.tif 000035
【図１１Ｂ】
2010509223.tif 000036
【図１１Ｃ】
2010509223.tif 000037
【図１２】
2010509223.tif 000038
【図１３】
2010509223.tif 000039
【図１４】
2010509223.tif 000040
【図１５】
2010509223.tif 000041
【図１６】
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【図１７】
2010509223.tif 000043
【図１７Ｈ】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
2010509223.tif 000046
【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
2010509223.tif 000050
【図２３】
2010509223.tif 000051
【図２４Ａ】
2010509223.tif 000052
【図２４Ｂ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
2010509223.tif 000055
【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２６】
2010509223.tif 000058
【図２７】
2010509223.tif 000059
【図２８】
2010509223.tif 000060
【図２９Ａ】
2010509223.tif 000061
【図２９Ｂ】
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【図３０】
2010509223.tif 000063
【図３１】
2010509223.tif 000064
【図３２】
2010509223.tif 000065
【図３３】
2010509223.tif 000066
【図３４】
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【配列表】
2010509223000001.app
【国際調査報告】
2010509223.tif 000068
2010509223.tif 000069