(57)【要約】  本発明は好熱性のアラビノース異性化酵素及びそれを用いたタガトースの製造方法に関するものであって、より詳しくは、高温菌のゲオバチルス  ステアロサーモフィルスＤＳＭ２２（Geobacillus stearothermophilus DSM22）由来のアラビノース異性化酵素をコードする遺伝子、前記遺伝子を含む組換え発現ベクター、前記組換え発現ベクターで形質転換されたＧＲＡＳ（Generally Recognized As Safe）菌株から食品安全型好熱性のアラビノース異性化酵素を製造する方法及び前記酵素を用いてガラクトースからタガトースを製造する方法に関するものである。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＲＡＳ（Generally recognized as safe）微生物から発現された食品安全型好熱性のアラビノース異性化酵素。
【請求項２】
前記ＧＲＡＳ微生物はコリネバクテリウム（Corynebacterium）、バチルス（Bacillus）、ラクトバチルス（Lactobacillus）、ラクトコッカス（Lactococcus）及びイースト（Yeast）を含む食用可能な微生物であることを特徴とする請求項１に記載のアラビノース異性化酵素。
【請求項３】
前記ＧＲＡＳ微生物はコリネバクテリウム又はバチルスであることを特徴とする請求項２に記載のアラビノース異性化酵素。
【請求項４】
前記アラビノース異性化酵素はゲオバチルス  ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）由来であることを特徴とする請求項１に記載のアラビノース異性化酵素。
【請求項５】
請求項１に記載のアラビノース異性化酵素を用いてガラクトースからタガトースを製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は好熱性のアラビノース異性化酵素及びそれを用いたタガトースの製造方法に関するものであって、より詳しくは、高温菌のゲオバチルス  ステアロサーモフィルス  ＤＳＭ２２（Geobacillus stearothermophilus DSM22）由来のアラビノース異性化酵素をコードする遺伝子、前記遺伝子を含む組換え発現ベクター、前記組換え発現ベクターで形質転換されたＧＲＡＳ（Generally Recognized As Safe）菌株から食品安全型好熱性のアラビノース異性化酵素を製造する方法及び前記酵素を用いてガラクトースからタガトースを製造する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
最近、健康に対する関心が高くなってきており、砂糖が各種成人病を誘発させ得る主要因子の一つであることより、副作用の少ないタガトースが砂糖の代替品として開発されてきた。タガトースはガラクトースの異性体であり、フルクトースと類似の物理化学的な性質を有していると知られている。最近、タガトースは低カロリー天然糖であり、米国ＦＤＡからＧＲＡＳ（Generally Recognized As Safe）として認められて食品、飲料、健康食品、ダイエット添加物などに甘味料として使用を許可されている。
【０００３】
ＧＲＡＳ（Generally Recognized As Safe）は一般に安全であると認められる物質を示し、物質の意図された使用条件・目的下で科学的手続きと試験を通じて、経験と訓練を経た専門家によって判断される。ＧＲＡＳ制度は米国のみが有している独特な制度であって、安全性の高い（一定の使用条件下で）食品及び食品化学物質に適用されるが、その認識が米国内だけでなく国際的にも認識されているため今後の推移が注目される制度である。
【０００４】
タガトースを生産する方法としては、主にガラクトースに触媒を用いて異性化方法によって生産する化学的方法と、異性化酵素を用いて酵素的な方法で転換させる生物学的方法がある。化学的生産方法は経済性や収率の側面からは優秀であるが、高温高圧の化学工程を有して工程そのものが複雑であり、産業廃棄物を発生させる問題点を持っているから、環境にやさしい生物学的生産方法に対する要求が増加している。
【０００５】
このような生物学的生産方法としてはアルドース（aldose）またはアルドースの誘導体をケトース（ketose）またはケトースの誘導体に酵素的な方法によって転換させる方法が当業界によく知られている。ガラクトースからタガトースへのアラビノース異性化酵素（arabinose isomerase）を用いた異性化反応は熱力学的に高い反応温度で比例的に高い転換率を有する反応である。従って異性化酵素を用いたタガトースへの生物学的転換の産業への応用には、高温で安定した酵素の開発とこれを用いたタガトースの生産法が重要技術であると言える。高温菌由来のアラビノース異性化酵素の探索を通じて、産業化が可能である高温適合性異性化酵素の開発及びこれを用いた異性化工程の開発が各研究チームによって進められてきた。
【０００６】
韓国内では東洋製菓でアラビノース異性化酵素を用いた酵素異性化法を開発した。この方法に従い、東洋製菓は大腸菌由来のアラビノース異性化酵素の遺伝子を組換え技術を用いて大腸菌で大量発現し、この組換え異性化酵素は３０℃において２４時間反応させたとき、ガラクトースからタガトースへの転換率が２５％で、熱安定性及び転換収率が低かった（特許文献１）。呉徳根教授チーム（世宗大学校）はゲオバチルス  ステアロサーモフィルス由来のアラビノース異性化酵素を大腸菌で組換え技術を用いて大量発現し、これを固定化してガラクトースのタガトースへの高温異性化工程を提案した。東洋製菓は温泉地域からスクリーニングした高温性微生物ライブラリーから高温性異性化酵素を分離し組換え大腸菌を宿主として活性型で発現してガラクトースの高温異性化工程に用いた。類似例として、(株)ケビゼンはゲオバチルス  ジニトリフィカンス  ＤＢＧ−Ａ１（Geobacillus dinitrificans DBG-A1）由来の高温異性化酵素を大腸菌で生産し、これを用いて固定化方法でタガトースを生産する技術を開発した。
【０００７】
ゲオバチルス微生物由来の異性化酵素の発現レベルは産業に利用するにはその蛋白質の発現量が少ない。従って、現在までの高温菌由来のアラビノース異性化酵素を用いたタガトースの生産技術は組換え大腸菌で大量発現された組換え酵素或いはこれを含む宿主を用いたガラクトースからタガトースへの異性化反応工程の開発のみに留まっている。しかし、このような組換え大腸菌を用いたタガトースの生物工学的生産は食品安全性の側面から実質的に食品素材としてのタガトース生産に不適合である。食品添加物としてのタガトース生産には、産業的大量生産に適したＧＲＡＳ微生物宿主で発現されたアラビノース異性化酵素及びその大量生産が不可欠である。
【０００８】
組換え酵素を生産するために産業的に使用できるＧＲＡＳ微生物はバチルス属、コリネバクテリウム属、ラクトバチルス属などの食用可能な微生物から選択することができる。この中でバチルスとコリネバクテリウム属は、産業的に使用するための遺伝子操作及び大量培養に容易な菌株特性を有するのみならず、多様な条件で高い安全性を有する菌株である。実質的に組換え酵素生産用宿主としては、ＧＲＡＳ微生物ではバチルス属及びコリネバクテリウム属が有用に使用される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】韓国特許出願第1999-16118号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者らはＧＲＡＳ微生物のバチルス属及びコリネバクテリウム属菌株から高温菌のゲオバチルス属由来のアラビノース異性化酵素を活性型で発現し、このように発現された食品安全型組換え酵素を用いて高濃度のガラクトースからタガトースへの異性化反応技術を完成した。
【００１１】
本発明の目的はＧＲＡＳ微生物から好熱性微生物由来のアラビノース異性化酵素を活性型で発現し、これを用いてガラクトース異性化反応を行うことによって食品安全性が付与されたタガトースを生産する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記の目的を達成するために、本発明は高温菌のゲオバチルス  ステアロサーモフィルス由来の好熱性のアラビノース異性化酵素遺伝子をＧＲＡＳ微生物に挿入して食品安全型組換え酵素を生産し、これを用いてガラクトースからタガトースを連続生産することができることを確認した。
【００１３】
本発明を詳しく説明すると次の通りである。
【００１４】
本発明のＧＲＡＳ（Generally recognized as safe）微生物は望ましくはバチルス属及びコリネバクテリウム属を含み、さらに望ましくはコリネバクテリウム  グルタミカム  ＫＣＴＣ１３０３２（Corynebacterium glutamicum KCTC 13032）及び枯草菌１６８（Bacillus subtilis 168）が利用される。
【００１５】
本発明のアラビノース異性化酵素の遺伝子は、望ましくは高温菌由来のものであり、さらに望ましくは高温菌のゲオバチルス  ステアロサーモフィルス  ＤＳＭ２２（Geobacillus stearothermophilus DSM22）由来のものである。
【００１６】
本発明のアラビノース異性化酵素の遺伝子は従来知られた突然変異誘発法、例えば、方向性進化法（Directed evolution）及び部位特異的突然変異法などによって当業者により容易に修飾されることができる。従って、任意に選ばれるＧＲＡＳ宿主に一定程度、例えば７０％以上、望ましくは８０％以上、さらに望ましくは９０％以上の相同性を有している宿主細胞、その宿主で活性型で発現される組換え酵素及びこれを含む宿主細胞はすべて本発明の範囲に含まれるものと解釈されなければならない。
【００１７】
本発明は本発明のアラビノース異性化酵素をコードする遺伝子が含まれているベクターを提供する。本発明のベクターは典型的にクローニングのためのベクターまたは発現のためのベクターとして構築されることができる。本発明のベクターは特別に限定されるものではなく、当業界に知られた任意のベクターを使用することができる。
【００１８】
本発明のベクターは好熱性の異性化酵素を活性型で発現するためにバチルス及びコリネバクテリウムで活性を有するプロモータを使用した。
【００１９】
前記コリネバクテリウムでの遺伝子発現のためのプロモータ配列は大腸菌や枯草菌などのような他の産業微生物とは異なって一般的な構造が知られていない。ここで、産業的によく用いられるコリネバクテリウム由来であり、大腸菌でも発現可能な強力なプロモータが開発された。tacプロモータは従来最も強力なプロモータ活性を有するものの一つとして広く知られていた。tacプロモータとは大腸菌のトリプトファンオペロンプロモータの−３５領域から得られた配列と大腸菌の乳糖オペロンプロモータの−１０領域から得られた配列を融合して得られたプロモータを意味する。本発明に使用されたＣＪ−１で構成されたプロモータはコリネバクテリウム属バクテリア細胞でtacプロモータより効率的に遺伝子を発現させるということが確認された（韓国特許公開番号10-2006-0068505）。
【００２０】
また、本発明に使用されたバチルスプロモータはバチルス属微生物のみならず一般的にラクトバチルス、ビフィドバクテリウムなどの乳酸菌型微生物でもプロモータ活性を有する。コリネバクテリウムプロモータもコリネバクテリウム属微生物のみならずエシェリキア属バクテリア及び大腸菌細胞でもプロモータ活性を有する。特に、本研究で使用されたプロモータはエシェリキア属バクテリア細胞でもtacプロモータに比べて２倍以上最も強力なプロモータ活性を有する。
【００２１】
本発明は前記ベクターでバチルス及びコリネバクテリウムを形質転換して製造された組換え菌株を培養して、これから食品安全型に発現されたアラビノース異性化酵素を提供する。宿主細胞の培養は選ばれる宿主細胞によって従来知られた任意の培養培地及び培養条件を使用してなされる。
【００２２】
本発明の前記組換えアラビノース異性化酵素を用いてガラクトースを基質として使用してタガトースを製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ゲオバチルス  ステアロサーモフィルス  ＤＳＭ２２菌株から由来した好熱性のアラビノース異性化酵素をコードする遺伝子を含む組換え発現ベクターpHT01-GSAIの製造過程を示す図面である。
【図２】ゲオバチルス  ステアロサーモフィルス  ＤＳＭ２２菌株から由来した好熱性のアラビノース異性化酵素をコードする遺伝子を含む組換え発現ベクターpCJ-1-GSAIの製造過程を示す図面である。
【図３】組換えバチルス宿主細胞から生成された好熱性のアラビノース異性化酵素の活性を測定した結果を示す図面である。Ａは宿主細胞（枯草菌１６８）培養液から得られた粗酵素液の活性測定値であり、Ｂはアラビノース異性化酵素遺伝子を有するシャトルベクターを含む組換えバチルス宿主細胞（GSAIB-1）培養液から得られた粗酵素液の活性測定値を示す。
【図４】組換え菌株のGSAIB-1の発現最適条件及び酵素活性最適条件を実験した結果を示すグラフである。
【図５】組換え菌株のGSAIC-1の最適化培地での菌体生育結果を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下、本発明を実施例を通じてより詳しく説明する。しかし、これら実施例は本発明を例示的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限られるものではない。
【００２５】
本発明の実施例では高度好熱性の微生物のゲオバチルス  ステアロサーモフィルス  ＤＳＭ２２（Geobacillus stearothermophilus DSM22）由来の好熱性のアラビノース異性化酵素（arabinose isomerase）をコードする遺伝子を大腸菌−コリネバクテリウムシャトルベクターのｐＣＪ−１（韓国特許公開番号10-2006-0068505）及び大腸菌−バチルスシャトルベクターのｐＨＴ１０（Mo Bi Tech., Goettingen, Germany）に挿入してそれぞれ最終的に宿主のコリネバクテリウム  グルタミカム  ＫＣＴＣ１３０３２（Corynebacterium glutamicum KCTC13032）及び枯草菌１６８（Bacillus subtilis 168）から前記蛋白質を大量発現した。収得された組換え菌株のコリネバクテリウム  グルタミカム  ＧＳＡＩＣ−１及び枯草菌ＧＳＡＩＢ−１をそれぞれ培養して培養各段階で細胞抽出物を得、タガトース生産活性を測定して各培養時期別に生産される活性型組換え蛋白質の量を測定した。このように最適発現された培養結果物は細胞破砕、熱処理、イオン交換樹脂及びゲルクロマトグラフィなどを通じて分離精製し、蛋白質活性測定を通じてタガトース生産活性があることを確認した。
【実施例１】
【００２６】
アラビノース異性化酵素のクローニング
【００２７】
ゲオバチルス  ステアロサーモフィルス  ＤＳＭ２２を好気条件で培養した後、この菌体を８,０００xgで１０分間遠心分離して収得した。前記収得した菌体から細胞培養ＤＮＡミディキット（Cell culture DNA Midi Kit：Qiagen, U.S.A.）を使用してゲノミックＤＮＡを抽出した。前記ゲノミックＤＮＡからそれぞれXba1とBamH1制限酵素切断塩基配列が導入された5'−TCTAGAATGATGCTGTCATTACGTCCTTATGAATTTTG−3'（配列番号１）及び5'−TCTAGATTACCGCCCCCGCCAAAACACTTCGTTCC−3'（配列番号２）のオリゴヌクレオチドをプライマーで使用して重合連鎖反応（Polymerase Chain Reaction; PCR）を行った。ゲオバチルス  ステアロサーモフィルス由来のアラビノース異性化酵素遺伝子を含む１４９４bpサイズのＤＮＡを増幅してＰＣＲ産物１を収得した。再度前記ゲノミックＤＮＡからＰＣＲを行った。プライマーとしてEcoRVとPstI制限酵素切断塩基配列が導入されたオリゴヌクレオチド5'−CCCGATATCATGCTGTCATTACGTCCTTATG−3'（配列番号３）と5'−TGCACTGCAGTTACCGCCCCCGCCAAAACAC−3'（配列番号４）を用いた。ゲオバチルス  ステアロサーモフィルス由来のアラビノース異性化酵素遺伝子を含む１５１２bpサイズのＤＮＡを増幅することによりＰＣＲ産物２を得た。前記二つの増幅された遺伝子がコードしているアラビノース異性化酵素を大量発現するために、保有しているバチルス属由来のシャトルベクターpHT01及びコリネバクテリウム属由来のシャトルベクターpCJ-1を使用した。シャトルベクターpCJ-1は大腸菌DH5alphaに形質転換して２００４年１１月６日付で国際寄託機関の韓国微生物保存センターに寄託した遺伝子源（受託番号KCCM-10611）を使用し、シャトルベクターpHT01は分譲受けた遺伝子源（Mo Bi Tech Co., PBS001）を使用した（表１）。
【００２８】
【表１】
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【００２９】
制限酵素Xba1及びBamH1で切断したシャトルベクターpHT01に制限酵素Xba1及びBamH1で切断された前記ＰＣＲ産物１を挿入して組換え発現ベクターpHT01−GSAIを製作した（図１参照）。また、制限酵素EcoRV及びPstIで切断したシャトルベクターpCJ-1に制限酵素EcoRV及びPstIで切断された前記ＰＣＲ産物２を挿入して組換え発現ベクターpCJ-1−GSAIを製作した（図２参照）。組換え発現ベクターpHT01−GSAI及びpCJ-1−GSAIでコリネバクテリウム  グルタミカム  ＫＣＴＣ１３０３２（Corynebacterium glutamicum KCTC 13032）及び枯草菌１６８（Geobacillus stearothermophilus 168）をそれぞれ形質転換させて組換え菌株を製造した後、これをそれぞれ「コリネバクテリウム  グルタミカム  GSAIC-1」及び「枯草菌GSAIB-1」と命名し、それを2006年10月18日付けで韓国ソウル特別市西大門区弘済１洞３６１−２２１番地に所在する国際寄託機関の韓国種菌協会付設韓国微生物保存センター（Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM）にそれぞれ受託番号KCCM10789P及びKCCM10788Pで寄託した。
【実施例２】
【００３０】
バチルスで組換えのアラビノース異性化酵素の発現
【００３１】
前記実施例１から製造された組換え菌株枯草菌GSAIB-1（受託番号KCCM10788P）を２０μｇ/ml濃度のクロラムフェニコール（Chloramphenicol）を含むＬＢ培地（Bacto-trypton 10g/L、Bacto-yeast extract 5g/L、NaCl 10g/L）に接種し、３７℃で１２時間、２３０rpmの速度で振とう撹拌培養して前培養液を得た。このように得られた前培養液を０.１％濃度で同一成分の本培養液に接種した後、O.D.600＝１に至るまで３７℃で２３０rpmの速度で振とう撹拌培養して組換えのアラビノース異性化酵素の発現を誘導した。発現されたアラビノース異性化酵素の活性を測定するために、培養液を１２,０００xgで１０分間遠心分離して菌体を回収した後、５０mM Tris-HCl（pH8.2）バッファー溶液に再懸濁し、これを超音波処理（170Watt、2分当たり1秒おきに氷冷却）で細胞を破砕処理した後、１２,０００xgで１２分間遠心分離して上澄液を粗酵素液として使用してガラクトース異性化反応を行った。
【００３２】
ガラクトース異性化反応は基質として１００mMのガラクトース２５μｌと、粗酵素液を１００μｌを混合して、６０℃で１時間反応させて行った。ガラクトース異性化反応の活性測定は４０mMのガラクトースを基質として含む１００μｌの粗酵素液と１mlの反応バッファー溶液（５０mM Tris-HCl、pH７.０）を混合して６５℃で２０分間反応させて行った。この際、反応液内に最終濃度５mMの塩化マグネシウム（MgCl2）と最終濃度１mMの塩化マンガン（MnCl2）をそれぞれ添加して使用した。前記活性測定はシステイン−カルバゾール−硫酸法（cystein-carbazol-sulfuric acid method; Dische, Z., and E. Borenfreund., A New Spectrophotometric Method for the Detection and Determination of Keto Sugars and Trioses, J. Biol. Chem., 192:583-587, 1951）で測定した。粗酵素液内の蛋白質定量はブラッドフォード検定法（Bradford assay kit, Biorad, U.S.A.）を使用し、その結果、異性化酵素活性０.２０４５±０.００７８（mg-tagatose/mg-protein・h）でガラクトース異性化反応の産物であるタガトースが正常的に生成されることを確認することができた（図３）。
【００３３】
各培養液の組成による酵素発現最適化のために、一般的にバチルスの培養に使用されるＭＢ（Bacto-trypton 10g/L, Bacto-yeast extract 5g/L, NaCl 10g/L, Soytone 10g/L）及びＬＢ（Bacto-trypton 10g/L, Bacto-yeast extract 5g/L, NaCl 10g/L）培地を基本培地として培養最適化を実施した。組換え菌株ＧＳＡＩＢ−１を２０μｇ/ml濃度のクロラムフェニコールを含むＬＢ培地（Bacto-trypton 10g/L, Bacto-yeast extract 5g/L, NaCl 10g/L）培地に接種し、３７℃、２３０rpm振とう培養器（Shaking incubator）で１２時間培養した結果物を前培養物として使用し、ＬＢ培地にいろいろの炭素源（フルクトース、グルコース、コハク酸、ソルビトール、スクロース）１０g/L含めたそれぞれの培地とＭＢ培地（Bacto-trypton 10g/L, Bacto-yeast extract 5g/L, NaCl 10g/L, Soytone 10g/L）を本培養培地にして前培養物０.１％を接種してO.D.600＝１に至るまで３７℃、２３０rpm振とう培養器で培養して組換えのアラビノース異性化酵素の発現を誘導した。ＭＢ培地での酵素発現量はＬＢ培地における発現量に比べて約３０％程度少ないことを確認することができた。また、各種類別の炭素源添加時の蛋白質発現の様相を調べるために、産業的に利用可能な炭素源のグルコース、フルクトース、コハク酸、ソルビトール、スクロースなどを１０g/Lずつ添加したＬＢ培地で培養し、酵素発現量を測定した結果、コハク酸及びソルビトール添加時、酵素発現量が少量増加する結果が得られた（図４）。
【実施例３】
【００３４】
コリネバクテリウムで組換えアラビノース異性化酵素の発現
【００３５】
前記実施例１から製造された組換え菌株コリネバクテリウム  グルタミカムGSAIC-1（受託番号KCCM10789P）は１０μｇ/ml濃度のカナマイシンを含むＭＢ培地（Bacto-trypton 10g/L、Bacto-yeast extract 5g/L、Nacl 10g/L、Soytone 5g/L）に接種し、３０℃で２４時間２００rpmの速度で振とう撹拌培養して前培養液を得た。このように得られた前培養液を１％濃度で本培養液に接種した後、O.D.600＝０.１に至るまで３０℃で２００rpmの速度で振とう撹拌培養して組換えのアラビノース異性化酵素の発現を誘導した。発現されたアラビノース異性化酵素の活性を測定するために、培養液を８,０００xgで１０分間遠心分離して菌体を回収した後、５０mM Tris-HCl（pH７.０）バッファー溶液に再懸濁し、これを超音波処理で細胞を破砕処理した後、８,０００xgで１２分間遠心分離して上澄液を粗酵素液に使用してガラクトース異性化反応を行った。粗酵素液内の蛋白質定量はブラッドフォード検定法（Bradford assay kit, Biorad, U.S.A.）を使用し、その結果、異性化酵素活性１.３８７（mg-tagatose/mg-protein・h）でガラクトース異性化反応の産物であるタガトースが正常的に生成されることを確認することができた。
【００３６】
活性型で発現されることが確認された組換え菌株のコリネバクテリウム  GSAIC-1でのアラビノース異性化酵素の発現を最適化するために、組換え菌株を１０μｇ/ml濃度のカナマイシンを含むＭＢ培地（Bacto-trypton 10g/L, Bacto-yeast extract 5g/L, NaCl 10g/L, Soytone 5g/L）に初期濃度O.D.600＝０.６に接種して前培養液を得た。二種類の培養用基本培地でコリネバクテリウム菌株の生育を比較検討した。二種類の基本培地はＭＢ培地（Bacto-trypton 10g/L, Bacto-yeast extract 5g/L, NaCl 10g/L, Soytone 5g/L）及び変異培地（Bacto-trypton 10g/L, Bacto-yeast extract 5g/L, NaCl 2.5g/L, Beef extract 5g/L）である。それぞれ２５、３０、３７℃で培養温度別及びｐH別生育比較、基本炭素源のグルコースとスクロースのそれぞれ濃度別の添加生育比較及び静置及び好気条件における生育比較実験を行った。このように選定された多様な条件における生育結果及び酵素発現量を時間別に測定して組換えアラビノース異性化酵素の最適の大量発現条件を選定した（表２及び３）。
【００３７】
【表２】
2010510776.tif 000004
【００３８】
【表３】
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【００３９】
発現された組換えアラビノース異性化酵素の活性を測定するために、実施例２に記載した方法で酵素を処理し定量した。ＭＢ培地にスクロース２.５％を添加し、 好気条件において３０℃培養したとき、タガトースは、基本培養条件から得られた３１.６mU/mlに比べて１.８倍高い５７.０mU/mlの酵素活性を示した。これは、菌体の増殖に応じて比例的に活性が増加することを示唆している。前記最適化培地での菌体生育結果を図５に示した。
【実施例４】
【００４０】
組換えアラビノース異性化酵素の分離精製
【００４１】
前記実施例３から得られた最適の培養条件で組換え菌株の２Ｌ培養を行い、このようにして得られた培養液を８０００xgで１０分間遠心分離をして菌体を回収した後、５０mM Tris-HCl（pH７.０）バッファー溶液に再懸濁して蛋白質精製に使用した。前記細胞懸濁液は高圧細胞破砕器Ｔ−シリーズ４.０kW（T-series 4.0kW; Constant systems, UK）を用いて細胞を破砕した後、８０℃で２０分間熱処理を行い、１０,０００xgで１０分間遠心分離して組換え発現された好熱性のアラビノース異性化酵素を優先分離した。このようにして分離された組換え酵素液は分子量１０,０００で限外濾過（ultrafiltration; Sartorius, U.S.A.）を通じて濾過し、この際に得られた濾過液は次の実験に使用した。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
以上から詳細に説明したように、本発明は好熱性微生物のゲオバチルス属由来のアラビノース異性化酵素がＧＲＡＳ微生物であるコリネバクテリウム属菌株及びバチルス属菌株で安定的に発現されることを確認し、このように発現された活性型組換え酵素及びそれを用いて効率的固定化連続反応を行うタガトース製造方法を提供する。微生物酵素を用いた生物工学的食品素材の生産は製造工程中に使用される添加物の食品安全性が必須であり、本発明で完成された技術を通じてゲオバチルス属由来のアラビノース異性化酵素を食品安全型に発現して連続反応工程に適用できるから、実質的に産業化の可能性がある。
【図１】
2010510776.tif 000006
【図２】
2010510776.tif 000007
【図５】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
2010510776000001.xml
【国際調査報告】
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2010510776.tif 000013
2010510776.tif 000014