(57)【要約】活性化された化学発光基質からJ会合体色素などのエネルギー受容体色素へのエネルギー転移により生体分子を検出するための試薬、キットおよび方法を記載する。2010528294.tif 000019
2010528294.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面を有する支持体；
支持体表面上の化学発光増強物質；
支持体表面上のエネルギー受容体色素；および
支持体表面上の1つまたは複数の生体分子プローブ
を含む製造物品。
【請求項２】
エネルギー受容体色素がJ会合体色素である、請求項1記載の物品。
【請求項３】
化学発光増強物質が、正に荷電したオニウム基を含むカチオン性ホモポリマーまたはコポリマーである、請求項1記載の物品。
【請求項４】
化学発光増強物質が、ポリ(塩化ビニルベンジルジメチルベンジルアンモニウム)（BDMQ）、ポリ(塩化ビニルベンジルトリメチルアンモニウム)（TMQ）、ポリ(塩化ビニルベンジルトリブチルアンモニウム)（TBQ）、ポリ(塩化ビニルベンジルトリ(n-ペンチル)アンモニウム)（TPQ）、ポリ(塩化ビニルベンジルトリブチルホスホニウム)（TB）、ポリ(塩化ビニルベンジルトリオクチルホスホニウム)（TO）、前述の2つ以上、または前述の1つもしくは複数を含むコポリマーを含む、請求項3記載の物品。
【請求項５】
支持体が粒子である、請求項1記載の物品。
【請求項６】
支持体が、ラテックス、ポリスチレン、ナイロン、ポリアクリルアミド、またはポリ(スチレンジビニルベンゼン)ビーズを含む、請求項1記載の物品。
【請求項７】
J会合体色素がシアニン色素である、請求項2記載の物品。
【請求項８】
1つまたは複数の生体分子プローブが、抗体、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質、受容体、レクチン、またはアプタマーを含む、請求項1記載の物品。
【請求項９】
支持体がアニオン性表面を有し、化学発光増強物質が支持体表面上のカチオン性ホモポリマーまたはコポリマーであり、かつJ会合体色素が該カチオン性ホモポリマーまたはコポリマー上のアニオン性色素である、請求項2記載の物品。
【請求項１０】
アニオン性色素が下記の構造を有するアニオン性シアニン色素である、請求項9記載の物品：
2010528294.tif 000013
。
【請求項１１】
表面に結合した生体分子プローブの1つまたは複数が、分析物に結合することができるプローブ、または分析物があれば分析物に結合するプローブを含む、請求項1記載の物品；
化学発光基質；および
任意で、酵素標識生体分子または酵素標識分析物
を含む、試料中の分析物を検出するためのキット。
【請求項１２】
化学発光基質が、ジオキセタン、アクリジニウムエステル、アクリジニウムスルホンイミド、アクリダン、アクリダンエノールホスフェート、ルシフェリン、またはルミノールである、請求項11記載のキット。
【請求項１３】
化学発光基質が1,2-ジオキセタン基質である、請求項12記載のキット。
【請求項１４】
化学発光基質が下記の構造を有する、請求項13記載のキット：
2010528294.tif 000014
。
【請求項１５】
酵素標識が加水分解酵素である、請求項11記載のキット。
【請求項１６】
酵素標識が、アルカリ性ホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ、およびノイラミニダーゼからなる群より選択される、請求項11記載のキット。
【請求項１７】
表面に結合した生体分子プローブが抗体であり、かつ分析物が該抗体の抗原であり、かつ表面に結合した生体分子プローブに分析物が結合すると分析物に結合することができる酵素標識抗体を含む、請求項11記載のキット。
【請求項１８】
酵素標識生体分子または酵素標識分析物を含み、かつ酵素標識がアルカリ性ホスファターゼである、請求項14記載のキット。
【請求項１９】
表面に結合した1つまたは複数の生体分子プローブが、分析物に結合することができるプローブ、または分析物があれば分析物に結合するプローブを含む、請求項9記載の物品；
化学発光基質であって、活性化された化学発光基質がエネルギー受容体色素を励起して、そこからの放射を引き起こす、化学発光基質；および
任意で、酵素標識生体分子または酵素標識分析物
を含む、試料中の分析物を検出するためのキット。
【請求項２０】
アニオン性シアニン色素が下記の構造を有する、請求項19記載のキット：
2010528294.tif 000015
。
【請求項２１】
試料を請求項1記載の物品と接触させる段階であって、1つまたは複数の生体分子プローブが分析物に結合するプローブを含む、段階；
表面に結合したプローブに試料中の分析物を結合させる段階であって、（a）分析物が酵素であるか、（b）分析物が酵素で標識されているか、（c）支持体表面を、分析物に結合する酵素標識生体分子と接触させるか、または（d）分析物が非標識であり、かつ酵素標識分析物を試料に加えて、表面に結合したプローブへの結合について試料中の酵素標識分析物と非標識分析物を競合させる、段階；
支持体表面を酵素によって活性化される化学発光基質と接触させる段階であって、活性化された化学発光基質がエネルギー受容体色素を励起して、そこからの放射を引き起こす段階；および
エネルギー受容体色素からの放射を検出する段階
を含む、試料中の分析物を検出するための方法。
【請求項２２】
エネルギー受容体色素がJ会合体色素である、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
酵素または酵素標識が加水分解酵素である、請求項21記載の方法。
【請求項２４】
酵素または酵素標識が、アルカリ性ホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ、およびノイラミニダーゼからなる群より選択される、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
酵素または酵素標識が酸化酵素である、請求項21記載の方法。
【請求項２６】
表面に結合したプローブが抗体でありかつ分析物が該抗体の抗原であるか、または表面に結合したプローブが抗体の抗原でありかつ分析物が該抗原に対する抗体である、請求項21記載の方法。
【請求項２７】
試料中の分析物を支持体に結合したプローブに結合させた後に支持体表面を酵素標識生体分子に接触させ、かつ酵素標識生体分子が、分析物が支持体に結合したプローブに結合すると分析物に結合する抗体である、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
化学発光基質が、ジオキセタン、アクリジニウムエステル、アクリジニウムスルホンイミド、アクリダン、アクリダンエノールホスフェート、ルシフェリン、またはルミノールである、請求項21記載の方法。
【請求項２９】
化学発光基質が1,2-ジオキセタンである、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
化学発光基質が下記の構造を有する、請求項29記載の方法：
2010528294.tif 000016
。
【請求項３１】
酵素または酵素標識がアルカリ性ホスファターゼである、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
試料を請求項9記載の物品と接触させる段階であって、1つまたは複数の生体分子プローブが、分析物に結合するプローブを含む、段階；
表面に結合したプローブに試料中の分析物を結合させる段階であって、（a）分析物が酵素であるか、（b）分析物が酵素で標識されているか、（c）支持体表面を、分析物に結合する酵素標識生体分子と接触させるか、または（d）分析物が非標識であり、かつ酵素標識分析物を試料に加えて、表面に結合したプローブへの結合について試料中の酵素標識分析物と非標識分析物を競合させる、段階；
支持体表面を酵素によって活性化される化学発光基質と接触させる段階であって、活性化された化学発光基質がエネルギー受容体色素を励起して、そこからの放射を引き起こす、段階；および
エネルギー受容体色素からの放射を検出する段階
を含む、試料中の分析物を検出するための方法。
【請求項３３】
酵素または酵素標識が加水分解酵素である、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
酵素または酵素標識が、アルカリ性ホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ、およびノイラミニダーゼからなる群より選択される、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
表面に結合したプローブが抗体でありかつ分析物が該抗体の抗原であるか、または表面に結合したプローブが抗体の抗原でありかつ分析物が該抗原に対する抗体である、請求項32記載の方法。
【請求項３６】
表面に結合したプローブに試料中の分析物を結合させた後に支持体表面を酵素標識生体分子に接触させ、かつ酵素標識生体分子が、分析物が支持体に結合したプローブに結合すると分析物に結合する抗体である、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
化学発光基質が、ジオキセタン、アクリジニウムエステル、アクリジニウムスルホンイミド、アクリダン、アクリダンエノールホスフェート、ルシフェリン、またはルミノールである、請求項32記載の方法。
【請求項３８】
化学発光基質が1,2-ジオキセタンである、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
化学発光基質が下記の構造を有する、請求項38記載の方法：
2010528294.tif 000017
。
【請求項４０】
酵素または酵素標識がアルカリ性ホスファターゼである、請求項35記載の方法。
【請求項４１】
表面を有する支持体、支持体表面上のエネルギー受容体色素、および支持体表面上の1つまたは複数の生体分子プローブを含む製造物品であって、該1つまたは複数の生体分子プローブが、分析物に結合することができるかまたは分析物があれば分析物に結合する、製造物品；
化学発光基質；および
任意で、酵素標識生体分子または酵素標識分析物
を含む、試料中の分析物を検出するためのキット。
【請求項４２】
エネルギー受容体色素がJ会合体色素である、請求項41記載のキット。
【請求項４３】
支持体表面上の化学発光増強物質をさらに含む、請求項41記載のキット。
【請求項４４】
化学発光基質が、ジオキセタン、アクリジニウムエステル、アクリジニウムスルホンイミド、アクリダン、アクリダンエノールホスフェート、ルシフェリン、またはルミノールである、請求項41記載のキット。
【請求項４５】
化学発光基質が1,2-ジオキセタン基質である、請求項44記載のキット。
【請求項４６】
化学発光基質が下記の構造を有する、請求項45記載のキット：
2010528294.tif 000018
。
【請求項４７】
酵素標識生体分子または酵素標識分析物を含む、請求項41記載のキット。
【請求項４８】
酵素標識が加水分解酵素である、請求項47記載のキット。
【請求項４９】
酵素標識が、アルカリ性ホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ、およびノイラミニダーゼからなる群より選択される、請求項48記載のキット。
【請求項５０】
表面に結合したプローブが抗体でありかつ分析物が該抗体の抗原であるか、または表面に結合したプローブが抗体の抗原でありかつ分析物が該抗原に対する抗体である、請求項47記載のキット。
【請求項５１】
分析物が支持体表面上のプローブに結合すると分析物に結合する酵素標識生体分子、または支持体に結合したプローブへの結合について試料中の非標識分析物と競合する酵素標識分析物を含み、酵素標識がアルカリ性ホスファターゼ標識である、請求項46記載のキット。
【請求項５２】
表面を有する支持体、支持体表面上の第一の化学発光増強物質、支持体表面上の第一のエネルギー受容体色素、および支持体表面上の第一の生体分子プローブを含む第一の製造物品を試料と接触させる段階であって、第一の生体分子プローブが第一の分析物に結合することができる、段階；
表面を有する支持体、支持体表面上の第二の化学発光増強物質、支持体表面上の第二のエネルギー受容体色素、および支持体表面上の第二の生体分子プローブを含む第二の製造物品を試料と接触させる段階であって、第二の生体分子プローブが第二の分析物に結合することができる、段階；
試料中の第一の分析物を第一のプローブに結合させる段階であって、（a）第一の分析物が第一の酵素であるか、（b）第一の分析物が第一の酵素で標識されているか、（c）第一の製造物品の支持体表面を、第一の酵素で標識されかつ支持体表面上の第一の分析物に結合する生体分子と接触させるか、または（d）第一の分析物が非標識であり、かつ第一の酵素で標識された第一の分析物を試料に加えて、第一の製造物品の第一の生体分子プローブへの結合について試料中の酵素標識された第一の分析物と非標識の第一の分析物を競合させる、段階；
試料中の第二の分析物を第二のプローブに結合させる段階であって、（a）第二の分析物が第二の酵素であるか、（b）第二の分析物が第二の酵素で標識されているか、（c）第二の製造物品の第二の支持体表面を、第二の酵素で標識されかつ支持体表面上の第二の分析物に結合する生体分子と接触させるか、または（d）第二の分析物が非標識であり、かつ第二の酵素で標識された第二の分析物を試料に加えて、第二の製造物品の第二の生体分子プローブへの結合について試料中の酵素標識された第二の分析物と非標識の第二の分析物を競合させる、段階；
第一の製造物品を第一の酵素によって活性化される第一の化学発光基質と接触させ、かつ第二の製造物品を第二の酵素によって活性化される第二の化学発光基質と接触させる段階であって、活性化された第一の化学発光基質が、第一のエネルギー受容体色素を励起して、そこからの放射を引き起こし、活性化された第二の化学発光基質が、第二のエネルギー受容体色素を励起して、そこからの放射を引き起こす、段階；および
第一のエネルギー受容体色素からの放射を検出し、かつ第二のエネルギー受容体色素からの放射を検出する段階であって、第一のエネルギー受容体色素からの放射が第二のエネルギー受容体色素からの放射と識別可能である、段階
を含む、試料中の複数の分析物を検出するための方法。
【請求項５３】
第一および第二の化学発光基質が同じでも異なっていてもよい、請求項52記載の方法。
【請求項５４】
第一および第二の化学発光増強物質が同じでも異なっていてもよい、請求項52記載の方法。
【請求項５５】
第一および第二の製造物品を試料と同時または逐次に接触させる、請求項52記載の方法。
【請求項５６】
第一および第二の製造物品を第一および第二の化学発光基質と同時または逐次に接触させる、請求項52記載の方法。
【請求項５７】
第一のエネルギー受容体色素からの放射および第二のエネルギー受容体色素からの放射を同時または逐次に検出する、請求項52記載の方法。
【請求項５８】
表面を有する第一の支持体、支持体表面上の第一の化学発光増強物質、支持体表面上の第一のエネルギー受容体色素、および支持体表面上の第一の生体分子プローブを含む第一の製造物品であって、第一の生体分子プローブが、第一の分析物に結合することができるかまたは第一の分析物があれば第一の分析物に結合する第一のプローブを含む、第一の製造物品；
表面を有する支持体、支持体表面上の第二の化学発光増強物質、支持体表面上の第二のエネルギー受容体色素、および支持体表面上の第二の生体分子プローブを含む第二の製造物品であって、第二の生体分子プローブが、第二の分析物に結合することができるかまたは第二の分析物があれば第二の分析物に結合する第一のプローブを含む、第二の製造物品；
第一の化学発光基質であって、活性化された第一の化学発光基質が第一のエネルギー受容体色素を励起して、そこからの放射を引き起こす、第一の化学発光基質；
第二の化学発光基質であって、活性化された第二の化学発光基質が第二のエネルギー受容体色素を励起して、そこからの放射を引き起こし、第一のエネルギー受容体色素からの放射が第二のエネルギー受容体色素からの放射と識別可能である、第二の化学発光基質；
任意で、第一の酵素標識生体分子、または第一の酵素で標識された第一の分析物；
任意で、第二の酵素標識生体分子、または第二の酵素で標識された第二の分析物
を含む、試料中の複数の分析物を検出するためのキット。
【請求項５９】
第一および第二の化学発光基質が同じでも異なっていてもよい、請求項58記載のキット。
【請求項６０】
第一および第二の化学発光増強物質が同じでも異なっていてもよい、請求項58記載のキット。
【請求項６１】
エネルギー受容体色素が蛍光色素である、請求項1記載の物品。
【請求項６２】
エネルギー受容体色素が、ナフタレン、アントラセン、ピレン、ビフェニル、アクリジン、クマリン、キサンテン、フタロシアニン、スチルベン、フラン、オキサゾール、オキサジアゾール、およびベンゾチアゾールからなる群より選択される芳香族化合物である、請求項1記載の物品。
【請求項６３】
エネルギー受容体色素からの発光放射の検出に干渉する光放射を遮蔽または消光する、支持体表面上の分子フィルターをさらに含む、請求項1記載の物品。
【請求項６４】
分子フィルターがヘモグロビンまたは消光色素である、請求項63記載の物品。
【請求項６５】
エネルギー受容体色素からの発光放射の検出に干渉する光放射を遮蔽または消光する分子フィルターをさらに含む、請求項11記載のキット。
【請求項６６】
化学発光基質が活性化されるとエネルギー受容体色素を励起して、そこからの発光放射を引き起こし、かつ分子フィルターがエネルギー受容体色素からの発光放射の検出に干渉する発光放射を遮蔽または消光する、請求項65記載のキット。
【請求項６７】
エネルギー受容体色素からの放射の検出中に、分子フィルターが支持体表面上にあり、該分子フィルターがエネルギー受容体色素からの発光放射の検出に干渉する光放射を遮蔽または消光する、請求項21記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2007年5月23日提出の米国特許仮出願第60/924,640号の恩典を主張し、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本明細書において用いる項の表題は構成のためにすぎず、本明細書に記載の内容をいかなる様式でも限定すると解釈されるべきではない。
【０００３】
分野
本出願は、一般には、試料中の生体分子を検出するための試薬、キットおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
序論
生物検定法の需要家は、単純で少ない段階（例えば、分離段階なし）、すなわち結果を得るための少ない労力と短時間を好んで、不均一検定法の代わりに均一検定様式をどんどん採用しつつある。
【０００５】
本明細書に記載するとおり、高感度の均一生物検定法を支持体表面上で行うことができ、ここで局在化酵素回転が支持体上の受容体色素層（例えば、J会合体色素）の局在化化学励起を生じ、これは近傍の捕捉分析物の検出に相関する。チップ様式および溶液検定法における化学発光均一酵素標識生物検定法のための高感度生物検定支持体として、支持体組立品を用いることができる。この検定設計は、異なる支持体組立品の混合物にも適応して、均一検定様式の複数の検定を提供することができる。発光シグナルの波長を自己蛍光バンドからシフトし、化学励起からシグナルを開始することが可能であれば、より低いバックグラウンド、シグナルノイズ比の増大、ダイナミックレンジの増大、検出感度の増大、および著しく単純化された機器読み出しを提供することができる。
【発明の概要】
【０００６】
概要
下記を含む製造物品を提供する；
表面を有する支持体；
支持体表面上の化学発光増強物質；
支持体表面上のエネルギー受容体色素；および
支持体表面上の1つまたは複数の生体分子プローブ。
【０００７】
試料中の分析物を検出するためのキットであって、下記を含むキットも提供する：
1つまたは複数の生体分子プローブが、分析物に結合することができるプローブ、または分析物があれば分析物に結合するプローブを含む、前述の製造物品；
化学発光基質；および
任意で、酵素標識生体分子または酵素標識分析物。酵素標識生体分子は、分析物が表面に結合したプローブに結合すると、分析物に結合することができる。酵素標識分析物は、表面に結合したプローブへの結合について、試料中の非標識分析物と競合することができる。
【０００８】
試料中の分析物を検出するための方法であって、下記の段階を含む方法も提供する：
試料を前述の製造物品と接触させる段階であって、1つまたは複数の生体分子プローブが分析物に結合することができるプローブを含む、段階；
試料中の分析物をプローブに結合させる段階であって、（a）分析物が酵素であるか、（b）分析物が酵素で標識されているか、（c）支持体表面を、分析物に結合する酵素標識生体分子と接触させるか、または（d）分析物が非標識であり、酵素標識分析物を試料に加えて、プローブへの結合について試料中の酵素標識分析物を非標識分析物と競合させる、段階；
支持体表面を酵素によって活性化される化学発光基質と接触させ、ここで活性化された化学発光基質はエネルギー受容体色素を励起して、そこからの放射を引き起こす段階；および
エネルギー受容体色素からの放射を検出する段階。
【０００９】
試料中の分析物を検出するためのキットであって、下記を含むキットも提供する：
表面を有する支持体、支持体表面上のエネルギー受容体色素、および支持体表面上の1つまたは複数の生体分子プローブを含む製造物品であって、1つまたは複数の生体分子プローブが、分析物に結合することができるかまたは分析物があれば分析物に結合する1つまたは複数の生体分子プローブを含む、製造物品；
化学発光基質；および
任意で、酵素標識生体分子または酵素標識分析物。酵素標識生体分子は、分析物が表面に結合したプローブに結合すると、分析物に結合することができる。酵素標識分析物は、表面に結合したプローブへの結合について、試料中の非標識分析物と競合することができる。
【００１０】
試料中の分析物を検出するための方法であって、下記の段階を含む方法も提供する：
表面を有する支持体、支持体表面上の第一の化学発光増強物質、支持体表面上の第一のエネルギー受容体色素、および支持体表面上の第一の生体分子プローブを含む第一の製造物品を試料と接触させる段階であって、第一の生体分子プローブが第一の分析物に結合することができる、段階；
表面を有する支持体、支持体表面上の第二の化学発光増強物質、支持体表面上の第二のエネルギー受容体色素、および支持体表面上の第二の生体分子プローブを含む第二の製造物品を試料と接触させる段階であって、第二の生体分子プローブが第二の分析物に結合することができる、段階；
試料中の第一の分析物を第一の生体分子プローブに結合させる段階であって、（a）第一の分析物が第一の酵素であるか、（b）第一の分析物が第一の酵素で標識されているか、（c）第一の製造物品の支持体表面を、第一の酵素で標識されかつ第一の分析物に結合する生体分子と接触させるか、または（d）第一の分析物は非標識であり、第一の酵素で標識された第一の分析物を試料に加えて、第一の生体分子プローブへの結合について試料中の酵素標識された第一の分析物を非標識の第一の分析物と競合させる、段階；
試料中の第二の分析物を第二の生体分子プローブに結合させる段階であって、（a）第二の分析物が第二の酵素であるか、（b）第二の分析物が第二の酵素で標識されているか、（c）第二の製造物品の支持体表面を、第二の酵素で標識されかつ第二の分析物に結合する生体分子と接触させるか、または（d）第二の分析物が非標識であり、第二の酵素で標識された第二の分析物を試料に加えて、第二の生体分子プローブへの結合について試料中の酵素標識された第二の分析物を非標識の第二の分析物と競合させる、段階；
第一の製造物品を第一の酵素によって活性化される第一の化学発光基質と接触させ、ここで活性化された第一の化学発光基質は第一のエネルギー受容体色素を励起して、そこからの放射を引き起こし、かつ第二の製造物品を第二の酵素によって活性化される第二の化学発光基質と接触させ、ここで活性化された第二の化学発光基質は第二のエネルギー受容体色素を励起して、そこからの放射を引き起こす段階；および
第一のエネルギー受容体色素からの放射を検出し、かつ第二のエネルギー受容体色素からの放射を検出する段階であって、第一のエネルギー受容体色素からの放射は第二のエネルギー受容体色素からの放射と識別可能である、段階。
【００１１】
試料中の複数の分析物を検出するためのキットであって、下記を含むキットも提供する：
下記を含む第一の製造物品：表面を有する第一の支持体、支持体表面上の第一の化学発光増強物質、支持体表面上の第一のエネルギー受容体色素、および支持体表面上の第一の生体分子プローブであって、第一の分析物に結合することができるか、または第一の分析物があれば第一の分析物に結合する第一の生体分子プローブ；
下記を含む第二の製造物品：表面を有する支持体、支持体表面上の第二の化学発光増強物質、支持体表面上の第二のエネルギー受容体色素、および支持体表面上の第二の生体分子プローブであって、第二の分析物に結合することができるか、または第二の分析物があれば第二の分析物に結合する第二の生体分子プローブ；
第一の化学発光基質、ここで活性化された第一の化学発光基質は第一のエネルギー受容体色素を励起して、そこからの放射を引き起こす；
第二の化学発光基質、ここで活性化された第二の化学発光基質は第二のエネルギー受容体色素を励起して、そこからの放射を引き起こし、ここで第一のエネルギー受容体色素からの放射は第二のエネルギー受容体色素からの放射と識別可能である；
任意で、第一の酵素標識生体分子または第一の酵素で標識された第一の分析物；
任意で、第二の酵素標識生体分子または第二の酵素で標識された第二の分析物。
【００１２】
本発明の教示のこれらおよび他の特徴が本明細書において示される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
当業者であれば、以下に記載する図面は例示のためにすぎないことを理解するであろう。図面はいかなる様式でも本発明の教示の範囲を限定する意図はない。
【図１】図1は、アルカリ性ホスファターゼで標識されたIgG抗体の検定法を示す概略図であり、ここで化学発光増強剤（すなわち、TPQ）、アニオン性シアニン色素および生体分子プローブ（すなわち、プロテインA）を含み、プローブに結合したアルカリ性ホスファターゼ標識IgG抗体を有するPOROS(登録商標)-A支持体は、化学発光基質の化学励起を生じて、支持体上のJ会合体シアニン色素からの狭帯域放射を引き起こす。
【図２】図2は、化学発光増強剤（すなわち、TPQ）、J会合体色素および生体分子プローブ（すなわち、プロテインA）を含み、プローブに結合したウサギcAMP抗体を有するPOROS(登録商標)-A支持体を有する構築物の概略図である。
【図３】図3は、図2の構築物を用いての競合検定法を示す概略図であり、ここで試料に加えたアルカリ性ホスファターゼ標識cAMPは支持体表面上のプロテインA生体分子プローブに結合したウサギcAMP抗体への結合について試料中のcAMPと競合する。
【図４】図4は、1：50希釈のPOROS(登録商標)構築物上のcAMP抗体およびcAMP-アルカリ性ホスファターゼ結合体40μlを用いての、図3に示す均一cAMP検定法の標準曲線を示すグラフである。
【図５】図5は、図2の構築物を用いての、均一cAMP-AP検定法のエネルギー転移（ET）スペクトルである。
【図６】図6は、表面、化学発光増強剤（すなわち、TPQ）、アニオン性シアニン色素（例えば、J会合体色素）、試料中の分析物を捕捉するための生体分子プローブ（すなわち、捕捉抗体）および支持体に結合した分析物に結合することができる酵素標識抗体を含む支持体を用いての、サンドイッチ検定法を示す概略図である。図6に示すとおり、ジオキセタン基質の酵素回転は、分解して光を生じる活性化された化学発光基質を生じ、これは、エネルギー転移（ET）を通じてシアニン色素からの蛍光を生じる。
【図７】図7は、多重、均一検定法を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
様々な態様の説明
本明細書を説明するために、下記の定義を適用し、適当な場合はいつでも、単数形で用いられる用語は複数形も含み、逆も同様である。以下に示す任意の定義が、参照により本明細書に組み入れられる任意の文書を含む任意の他の文書におけるその用語の用法と矛盾する場合、反対の意味が明らかに意図される（例えば、その用語が元々用いられている文書を説明する）以外は、本明細書およびその関連する特許請求の範囲を説明するために以下に示す定義が常に支配することになる。本明細書における「または」の使用は、そうではないと記載されているか、または「および/または」の使用が明らかに不適当である場合以外は、「および/または」を意味する。本明細書における「一つの（a）」の使用は、そうではないと記載されているか、または「1つまたは複数の」の使用が明らかに不適当である場合以外は、「1つまたは複数の」を意味する。「含む（comprise）」、「含む（comprises）」、「含む（comprising）」、「含む（include）」、「含む（includes）」、および「含む（including）」の使用は交換可能で、限定する意図はない。さらに、1つまたは複数の態様の記載が「含む（comprising）」なる用語を使用する場合、当業者であれば、いくつかの特定の場合には、その態様を「から基本的になる」および/または「からなる」なる言葉を用いて代わりに記載しうることを理解するであろう。
【００１５】
本明細書において用いられる、エネルギー受容体色素とは、供与体（例えば、化学励起供与体）からエネルギー転移（ET）によりエネルギーを受容し、エネルギーを放射（例えば、発光）に変換することができる分子である。受容体色素の例示的クラスはJ会合体色素である。
【００１６】
本明細書において用いられる、化学励起供与体とは、活性化されて（例えば、酵素による活性化により）、その初期の基底エネルギー状態から励起状態の断片を設置することができる分子である。断片は基底状態のエネルギーレベルに戻る際に、その励起状態エネルギーを受容体分子に転移することができる。
【００１７】
本明細書において用いられる、分子フィルターとは、検出されるシグナルに干渉する光放射を遮蔽する（または消光する）分子である。分子フィルターの非限定例は、＜600nmの光放射を遮蔽するヘモグロビンおよび消光色素である。シグナルに干渉する光放射の例は自己蛍光（例えば、生体物質からの高エネルギー、青色バックグラウンド放射）である。
【００１８】
本明細書において用いられる、J会合体色素とは、その分子が会合して、単量体色素種に比べて赤色シフトし、放射帯域幅が狭い蛍光放射を有する会合体を形成する色素である。例えば、特定のシアニン色素のJ会合は、蛍光放射を著しく赤色シフトさせ（すなわち、単量体の530〜550nmからJ会合体の590〜620nm）、放射帯域幅を約15nm（fwhm）まで狭くすることができる。J会合体色素は下記に開示されている：T. Kobayashi (ed.), ''J-Aggregates'', World Scientific Publishing Co., 1996; Whitten et al., ''Stabilization of the Aggregation of Cyanine Dyes at the Molecular and Nanoscopic Level,'' Langmuir, 2000, 16, 9042-9048; Mishra et al., ''Cyanines During the 1990s: A Review'', Chem. Rev. 2000, 100, 1973-2011; およびvon Berlepsch et al., ''Effect of alcohols on J-aggregation of a carbocyanine dye,'' Langmuir 2002, 7699-7705。
【００１９】
J会合体シアニン色素の一般構造を以下に示す：
2010528294.tif 000003
式中、X＝COO-またはSO3-、mは0〜9の整数であり、かつnは1〜9の整数である。これらの色素は文献に記載されており、市販されている（例えば、FEW Chemicals, Wolfen, Germany）。
【００２０】
本明細書において用いられる、供与体と受容体部分との間のエネルギーの転移は、エネルギー転移セットの密接に関連する部分の衝突による、または共鳴エネルギー転移（RET）などの非放射プロセスによるなどの、任意のエネルギー転移（ET）プロセスによって起こりうる。本出願におけるエネルギー転移へのいかなる言及も、これらのメカニズム的に異なる現象のすべてを含むことが理解されるべきである。エネルギー転移は記載されたことがない、またはまだ完全には理解されていないメカニズムによっても起こりうることが理解されるべきである。エネルギー転移は、複数のエネルギー転移プロセスによって同時および/または逐次に起こりえ、検出可能なシグナルは複数のエネルギー転移プロセスの活性の尺度でありうることも理解されるべきである。したがって、エネルギー転移のメカニズムは本発明を限定するものではない。
【００２１】
しばしば、エネルギー転移は単一の供与体部分および単一の受容体部分の作動によって起こるであろうが、これは限定的なものではない。供与体および受容体部分は、1つまたは複数の受容体部分が1つまたは複数の供与体部分から転移したエネルギーを受容するように作動することができる。いったん化学励起のエネルギーが第一の受容体に転移されると、次いでエネルギーは第二の受容体に転移されることができ、続く供与体から受容体へのエネルギーのカスケードによって以下同様であり、ここで各エネルギー受容体は次のエネルギー転移事象のエネルギー供与体であることが理解されるべきである。
【００２２】
本明細書において用いられる、「支持体」は、「固体支持体」、「固体担体」、「固相」、「表面」、「膜」または「樹脂」などの用語と交換可能である。すべての「支持体」は少なくとも1つの表面を含む。表面は平面、実質的に平面、または非平面でありうる。
【００２３】
支持体は、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシ、およびポリアクリルアミドなどの有機ポリマー、ならびに前述の任意のもののコポリマーおよびグラフトからなりうる。いくつかの他の例示的支持体物質には、ラテックス、ポリスチレン、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）、ポリ2フッ化ビニリデン（PVDF）、ナイロン、ポリアクリルアミド、またはポリ(スチレンジビニルベンゼン)（例えば、POROS(登録商標)）ビーズが含まれるが、それらに限定されるわけではない。支持体はガラス、シリカまたは制御多孔性ガラス（CPG）などの無機物であってもよい。支持体の形状はビーズ、球体、粒子、顆粒、ゲルまたは膜の形でありうる。適当な支持体のいくつかの非限定例には、微小粒子、ナノ粒子、クロマトグラフィ支持体、膜またはマイクロウェル表面が含まれるが、それらに限定されるわけではない。支持体は多孔性または非多孔性でありえ、膨潤または非膨潤特性を有しうる。支持体は剛性または柔軟でありうる。支持体はウェルの形、くぼみ（depression）もしくは他の容器、器、特徴または位置に形成することができる。複数の支持体を、試薬の自動化送達のため、または検出法および/もしくは検出機器によって対処可能な、様々な位置の配列に形成することができる。
【００２４】
支持体は荷電、中性、疎水性または親水性表面を有することができる。いくつかの態様に従い、荷電支持体表面は、例えば、逐次組み立てまたは逆荷電有機分子によって生成された、高分子電解質多層（PEM）コーティングのための支持体として機能することができる。高分子電解質多層コーティングは、Decher et al., eds., ''Multilayer Thin Films: Sequential Assembly of Nanocomposite Materials'', Wiley-VCH, (2003); Harris et al., ''Synthesis of Passivating, Nylon-Like Coatings Through Cross-Linking of Ultrathin Polyelectrolyte Films,'' J. Am. Chem. Soc., 1999, 121:1978-1979; および米国特許出願公報第2002-053514 A1に開示されている。例えば、ポリスチレンビーズを疎水性吸着を用いて「コーティング」することができる。支持体を電荷相互作用、疎水性相互作用またはこれらの効果の組み合わせを用いてコーティングすることもできる。支持体自体が化学発光増強剤（例えば、ナイロン）であってもよい。特定の場合において、化学発光増強が可能な構築物を形成するために、支持体表面を直接誘導体化してもよい。例えば、化学発光増強のために誘導体化された支持体は、メリフィールド樹脂（すなわち、ジビニルベンゼンで架橋されたスチレンとクロロメチルスチレンとのコポリマーによるポリスチレン樹脂）上のクロロメチル基の部分的4級化によって調製することができる。
【００２５】
本明細書において用いられる、「支持体に結合した」とは、支持体の表面に共有結合された化合物または支持体の表面にきわめて接近して保持されている化合物を意味する。化合物は、例えば、1）表面またはその中に配置された化合物との静電相互作用により；2）表面またはその中に配置された化合物との疎水性相互作用により；または3）その組み合わせにより、支持体の表面にきわめて接近して保持することができる。化合物は、支持体の表面を覆うポリマー層（例えば、コーティング）における包括によって、支持体の表面にきわめて接近して保持することができる（例えば、米国特許第5,071,909号）。きわめて接近してとは、1）いくつかの態様において、表面の約200Å以内；2）いくつかの態様において、表面の約150Å以内；3）いくつかの態様において、表面の約75Å以内；または4）いくつかの態様において、表面の約50Å以内を意味する。
【００２６】
前述のとおり、化学発光増強物質、エネルギー受容体色素および1つまたは複数の生体分子プローブは、いくつかの態様に従い、支持体の「表面上」にある。「表面上」とは、これらの成分が表面に物理的に接触しているか、またはそうではなく支持体の表面にきわめて接近して保持されていることを意味する。きわめて接近してとは、1）いくつかの態様において、表面の約200Å以内；2）いくつかの態様において、表面の約150Å以内；3）いくつかの態様において、表面の約75Å以内；または4）いくつかの態様において、表面の約50Å以内を意味する。支持体の表面がエネルギー受容体色素および/または化学発光増強物質でコーティングされている場合などの、いくつかの態様において、「表面」とは、成分が表面にきわめて接近して保持されているかどうかを調べるための、コーティングおよびバルク溶液によって画定された界面を意味することになる。いくつかの態様において、「表面」とは、成分が表面にきわめて接近して保持されているかどうかを調べるための、支持体の表面を意味する。
【００２７】
いくつかの態様において、成分は支持体表面に直接または間接的（例えば、表面を覆う介在層への結合により）に結合することができる。結合は化学的（例えば、イオンまたは共有結合）もしくは物理的またはそのいくつかの組み合わせでありうる。例えば、化学発光増強物質を支持体表面上にコーティングすることができ、得られた構築物を続いてエネルギー受容体色素でコーティングすることができる。または、エネルギー受容体色素を支持体表面上にコーティングすることができ、得られた構築物を続いて化学発光増強物質でコーティングすることができる。
【００２８】
いくつかの態様において、成分を表面にきわめて接近して保持することができる（これは物理的保持の例である）。例えば、成分が他の化合物との反応に利用可能であるが、バルク溶液中に自由に漏れ出さないように、成分を薄いポリマー網目に包括することができる（米国特許第5,071,909参照）。
【００２９】
前述のとおり、本発明は、支持体上での高感度の均一生物検定法を提供し、ここで局在化酵素回転が受容体色素の局在化化学励起を生じ、これは分析物捕捉（すなわち、分析物の存在および/または量の評価）に相関しうる。得られる増強され、波長シフトした発光シグナルは、バルク溶液中の非特異的で、増強されておらず、シフトしていないシグナルから容易に識別される。
【００３０】
本明細書に記載の検定法は、より一般化され、単純化された検定プラットフォームを提供する。支持体を組み込むことにより、分析物の捕捉が起こる表面が、バルク溶液中の非特異的発光シグナルとは異なる発光検出シグナルを生じる微小環境を提供するように設計された特徴が得られる。受容体色素、発光増強剤、および分析物捕捉物質を有する支持体の組み合わせにより、分析物捕捉に相関させることができ（同定および/または定量のため）、非特異的発光と識別可能な発光検出シグナルの生成が可能となる。この検定法は、酵素標識を用いてシグナル増幅を提供することができるため、高感度である。表面で標識された分析物を捕捉した後（酵素標識分析物による競合様式、または酵素標識検出物質によるサンドイッチ様式のいずれか）、支持体表面近くの化学発光基質の酵素による活性化が、分析物捕捉に関連するエネルギー転移（ET）シグナル生成を開始する。捕捉事象近くの酵素により活性化された化学発光基質のバルク溶液へのいかなる損失も、ETシグナルと識別可能な非特異的シグナルを生じる。検定組立品を含む支持体上の捕捉事象に関連する酵素標識から起こる放射と、バルク溶液中の非関連、非特異的酵素活性から起こる放射との間の量子収量に差があるため、過剰の非複合酵素標識試薬を支持体から分離または洗浄する必要はない。非特異的光放射をさらに減らすために、ヘモグロビンまたは消光色素などの分子フィルターをバルク溶液中または固体支持体上で用いることができる。波長シフトした増強シグナルは分析物捕捉事象と比例しうる。より複雑な機器設計（例えば、波長特異的フィルターの包含）により、非複合酵素活性からの高エネルギーシグナルの完全な除去が起こりうる。しかし、実際には、これは一般に必要ではないであろう。
【００３１】
支持体上の受容体色素層、化学発光増強剤層、および捕捉物質の組み合わせは、均一様式において分別シグナル生成を促進するだけでなく、多重均一検定設計を可能にもする。例えば、均一様式において、検定は下記を含むことができる：1）受容体色素A、化学発光増強剤、および捕捉物質Aでコーティングされた支持体A；2）受容体色素B、化学発光増強剤、および捕捉物質Bでコーティングされた支持体B；ならびに3）受容体色素C、化学発光増強剤、および捕捉物質Cでコーティングされた支持体C、など。多重、均一検定法を図7に示す。多重、均一検定様式において、化学発光増強剤および/または化学発光基質はそれぞれ、最適な酵素-基質-増強剤の組み合わせに応じて、同じでも異なっていてもよい。受容体色素Aからの発光は受容体色素Bと識別可能であり、これらはいずれも受容体色素Cと識別可能であり、以下同様である。これは測定する受容体色素からのシグナルであるため、多重検定法において同じまたは異なる化学発光増強剤および/または化学発光基質を用いるかどうかは無関係である。
【００３２】
いくつかの態様において、支持体上で実施することになる均一検定法は、J会合体シアニン色素の受容体色素層、ポリマーオニウム化学発光増強剤、加水分解酵素標識、および化学発光ジオキセタン基質を組み込むことができる。支持体上の酵素標識分析物の捕捉はJ会合体色素層の局在化化学励起を生じる。
【００３３】
この化学発光均一検定法はいくつかの利点を有する。例えば、化学励起により開始されたJ会合体色素発光はノイズを減らし、外部励起光源を必要とせず、かつ任意のジオキセタン分解ならびに生体および細胞物質に関連する典型的な自己蛍光帯域幅によって生成されるシグナル以上に著しく赤色シフトしたシグナルを提供することができる。エネルギー転移（ET）受容体としてのJ会合体色素の使用は、著しく赤色シフトした検出シグナルを提供する。したがって、比率測定データ収集は必要ない。加えて、溶液中で起こりうる非増強、非特異的ジオキセタン分解に比べての、分析物捕捉部位における支持体上のETシグナルの優先的増強は、比率測定の必要をさらに低減する。非特異的光放射をさらに減らすために、ヘモグロビンまたは消光色素などの分子フィルターをバルク溶液中または固体支持体上で用いることができる。市販の光度計での全光測定としての検定シグナル検出は、初期のETに基づく生物検定法において記載された特注の二重光電子増倍管（PMT）光度計での煩わしい比率測定を回避する｛例えば、Patel et al., ''Chemiluminescence Energy Transfer: A New Technique Applicable to the Study of Ligand-Ligand Interactions in Living Systems'', Analyt. Biochem. 129:162-169 (1983); Patel et al., ''Homogeneous Immunoassay Based On Chemiluminescence Energy Transfer'', Clin. Chem. 29/9, 1604-1608 (1983); Williams et al., ''A Homogeneous Assay For Biotin Based On Chemiluminescence Energy Transfer'', Analyt. Biochem., 155 :249-255(1986)参照｝。直接の化学発光基質標識の代わりに酵素標識を用いて、検出シグナルを増幅し、検出感度の限界を高めることもできる。例えば、本明細書に記載の検定法は3桁のダイナミックレンジを示すことができ、検定法の最適化は一般のET均一検定設計における分析物検出感度をさらに高めることができる（図4および実施例B参照）。
【００３４】
本明細書に記載の検定システムは、活性化された化学発光基質（すなわち、化学的に励起された状態の供与体）から色素受容体（例えば、蛍光受容体色素および/またはJ会合体色素）へのエネルギー転移（ET）による支持体表面上に存在する（例えば、捕捉された）分析物の検出を可能にする。色素受容体の波長シフトした放射特性は、典型的な生体分子または細胞のバックグラウンド蛍光から赤色シフトした別々の検出シグナルを提供する生物検定システムの設計を可能にする。特定の例は、自己蛍光から著しく赤色シフトした、先鋭で狭い別々の検出シグナルを提供する、J会合体色素の使用である。
【００３５】
一般の検定設計は、最適な分析物シグナルの生成および判別のために支持体表面の電荷環境を調整する、任意の化学発光酵素基質（例えば、ジオキセタン、アクリジニウムエステル、アクリジニウムスルホンイミド、アクリダン、アクリダンエノールホスフェート、ルシフェリンおよびルミノール）および化学発光表面シグナル増強剤を適応させることができる。例えば、検定システムは化学発光増強ポリマーおよび色素でコーティングした支持体を含むことができ、ここで支持体は分析物の捕捉に適した1つまたは複数の表面に結合した生体分子プローブを含む。分析物が捕捉されると、この事象は、例えば、酵素標識または酵素分析物によって生じる、化学励起ジオキセタン断片からの化学発光シグナルにより検出することができる。所望のシグナルが波長シフトし、増強され、支持体の「表面上」の受容体色素から発出するような、捕捉された分析物により生じる化学発光シグナルは非特異的シグナルから容易に識別可能である。これは、波長シフトしておらず、増強されず、かつバルク溶液から発出する非特異的シグナルに匹敵する。検定法を捕捉分析物を同定および/または定量するために用いることができる。
【００３６】
生物検定システムは、エネルギー転移モードで約460nmから590nmの波長の化学励起を用いて、赤色シフトした受容体色素放射を生じることができる。約610nmの波長のJ会合体色素放射を生じるための約460nmの波長の化学励起の例は約150nmのストークスシフトを生じる。この大きいストークスシフトはシグナル検出および定量の単純化を可能にし、ここでシグナル定量は市販の光度計での全光測定として行うことができ、特注の光度計での二重フィルター読み取りまたは二重光電子増倍管（PMT）読み取りを必要とせず、比率測定データへの変換を必要としない。全光読み取りとしての単純化されたデータ収集は、表面に結合した（すなわち、捕捉された）分析物に対応するシグナルを優先的に増強することによりさらに促進される。
【００３７】
化学発光増強物質は、極性媒質（すなわち、溶媒としての水、または水と、メタノール、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどの他のほとんど、または完全に極性物質との混合物からなる媒質）中で化学発光基質の酵素による活性化によって引き起こされる光放射断片のためにプロトン供与性が低下した疎水性微小環境を提供しうる、水適合性の合成または天然物質でありうる。化学発光増強物質は光放射断片からの化学発光放射の環境による消光を防止しうるため、微小環境の正確な性質に応じて、化学発光シグナル、および/または化学発光シグナルノイズ比は化学発光増強物質存在下で高くなりうる。加えて、化学発光増強物質の存在は酵素反応が起こる部位からの化学発光基質の酵素による活性化によって引き起こされる光放射断片の拡散を最小化しうるため、シグナルは実質的水性環境だけよりも空間的に分解されうる。
【００３８】
化学発光増強物質は、疎水性領域を有する高分子球状タンパク質でありうる。球状タンパク質は、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）ゲル電気泳動で定量して、約1,000から約800,000ダルトン、好ましくは40,000から約100,000ダルトンの範囲の分子量を有しうる。例示的球状タンパク質には、ウシ血清アルブミン（BSA）およびヒト血清アルブミン（HAS）などの哺乳動物血清アルブミンならびに哺乳動物免疫グロブリンG（IgG）、免疫グロブリンE（IgE）、プロテインA、およびアビジンが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００３９】
化学発光増強物質は合成高分子物質（例えば、オリゴマーまたはポリマー化学発光増強物質）でありうる。例示的合成高分子化学発光増強物質には、水溶性または水適合性、溶媒可溶性ポリマーオニウム塩が含まれる。このクラスの様々なポリマーが先行技術において、拡散転写写真システムにおける媒染剤、または画像受信層として用いられている。オニウム官能基はポリマーの主鎖中（イオネン）または主鎖の側鎖上にあってもよい。正に荷電したオニウム官能基は通常は窒素、リン、または硫黄に基づいているが、任意の正に荷電した基を用いてもよい。任意のこれらのポリマーを高分子化学発光増強物質として用いてもよい。この大きいクラスの物質の例は、下記の式を有するポリ(ビニルベンジル4級アンモニウム塩)である：
2010528294.tif 000004
上式中、各基、R1、R2およびR3はそれぞれ独立に下記を表す：
1から20（両端を含む）の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖無置換アルキルまたはアルケニル基（例えば、メチル、エチル、n-ブチル、t-ブチル、セチルなど）；
1つまたは複数のヒドロキシ、アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ、ベンジルオキシ、またはポリエチレンオキシ）、アリールオキシ（例えば、フェノキシ）、アミノもしくは置換アミノ（例えば、アセトアミドまたはコレステリルオキシカルボニルアミド）、またはハロゲンもしくはフルオロアルカンもしくはフルオロアリール（例えば、ヘプタフルオロブチル）基で置換された、1から20（両端を含む）の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖アルキル基；
3から12（両端を含む）の環炭素原子を有する無置換モノシクロアルキル基（例えば、シクロヘキシルまたはシクロオクチル）；
1つまたは複数のアルキル、アルコキシ、ハロアキル（haloakyl）、または縮合ベンゾ基（例えば、ジメチルシクロヘキシルまたはテトラヒドロナフチル）で置換された、3から12（両端を含む）の環炭素原子を有する置換モノシクロアルキル基（例えば、ジメチルシクロヘキシルまたはテトラヒドロナフチル）；
それぞれ5から12（両端を含む）の炭素原子を有し、無置換または1つもしくは複数のアルキル、アルコキシもしくはアリール基で置換された、複数の縮合環を有するポリシクロアルキル（例えば、1-アダマンチルまたは3-フェニル-1-アダマンチル）；
少なくとも1つの環および合計6から20（両端を含む）の炭素原子を有し、無置換または1つもしくは複数のアルキル、アリール、ハロゲン、フルオロアルキルもしくはフルオロアリール基で置換された、アリール、アルカリール、またはアラルキル基（例えば、フェニル、ナフチル、ペンタフルオロフェニル、エチルフェニル、ベンジル、クロロもしくはフルオロベンジルまたはフェニルベンジル）；
【００４０】
前述のR基（すなわち、R1、R2またはR3基）の少なくとも2つは、それらが結合している4級原子と一緒になって、3から5（両端を含む）の炭素原子、および1から3（両端を含む）のヘテロ原子を有する、飽和または不飽和、無置換または置換、窒素含有、窒素および酸素含有、または窒素および硫黄含有環を形成することができ、これらはベンゾ環状、例えば、1-ピリジニウム、1-(3-アルキルもしくはアラルキル)イミダゾリウム、モルホリニウム、アルキルもしくはアシルピペリジニウム、ベンゾキサゾリウム、ベンゾチアゾリウム、またはベンズイミダゾリウム基でありうる。
【００４１】
記号X-はアニオン対イオンを表し、これには単独または組み合わせで、ハロゲンイオン（例えば、塩素イオンまたは臭素イオン）、硫酸イオン、アルキルスルホン酸イオン（例えば、メタンスルホン酸イオン）、トリフレートイオン、アリールスルホン酸イオン（例えば、p-トルエンスルホン酸イオン）、過塩素酸イオン、アルカン酸イオン（例えば、酢酸イオン）、アリールカルボン酸イオン、または蛍光対イオン（例えば、フルオレセインまたはフルオレセイン誘導体）、9,10-ジフェニルアントラセンスルホン酸イオン、もしくはスルホローダミン誘導体などの部分が含まれうる。
【００４２】
記号nは、ポリ(ビニルベンジル)4級アンモニウム塩の分子量が低角度光散乱（LALLS）技術によりもとめて約8,000から1,000,000以上の範囲となるような、数を表しうる。
【００４３】
化学発光増強物質として用いることができる他の例示的ポリマーオニウム塩には、下記の式に示すホスホニウムまたはスルホニウムポリマーが含まれ、ここで基、R、X-およびnの定義は前述のとおりである。
2010528294.tif 000005
。
【００４４】
さらに、複数の異なる側鎖オニウム基を含むコポリマーも、化学発光増強物質として用いてもよい。これらはランダムまたはブロックコポリマーであってもよく、当技術分野において公知の方法を用いて合成することができる。これらのコポリマーは下記の式IVまたは式Vに示す反復単位の組み合わせを含むことができる：
2010528294.tif 000006
上式中、Mは窒素、またはリンでありうる。R1、R2およびR3基のそれぞれ、ならびに各X-は前述の定義のとおりである。式IVにおいて、側鎖オニウム部分の1つにおけるM、R1、R2またはR3置換基の1つまたは複数は他の側鎖オニウム部分における対応する置換基とは異なる。記号、xおよびyは、コポリマーを構成する個々のモノマーのモル分率を表す。したがって、記号、xおよびyは個別に0.01から0.99まで変動してもよく、xおよびyの和は1に等しい。
【００４５】
モノマーの1つがエチレン不飽和オニウムモノマーであり、その他は電荷中性であるコポリマーまたはブロックコポリマーも、化学発光増強物質として用いることができる。酵素により活性化された1,2-ジオキセタンなどの、化学発光種からの光放射の増強を提供しうるこれらおよび他の高分子は、米国特許第5,145,772号および第5,827,650号において見いだすことができる。これらの特許はいずれも、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００４６】
ジカチオン界面活性剤も化学発光増強物質として用いることができる。これらのジカチオン界面活性剤は下記の式で表すことができる：
X-(R4)3A+CH2 - [リンク] - CH2A+(R5)3X-
式中：
各Aはリンおよび窒素原子からなる群より独立に選択され；
X-はアニオン対イオンであり；
R4およびR5はそれぞれ、R4およびR5が同じでも異なっていてもよいような、1から20の炭素原子を含む無置換および置換アルキルおよびアラルキル基からなる群より独立に選択され；かつ
[リンク]は4から20の炭素原子を含むジアルキレンアリール、アリール、アルキレン、アルケニレンおよびアルキニレン基からなる群より選択される炭素鎖である。化学発光増強剤として用いることができるジカチオン界面活性剤は米国特許第5,451,347号に記載されており、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００４７】
他の水溶性オリゴマー、ホモポリマーおよびコポリマー物質を、前述のポリマーに加えて、またはその代わりに、増強剤物質として用いることができ、それには下記が含まれる：
ポリ-N-ビニルオキサゾリジノン；
ポリビニルカーバメート（例えば、ポリビニルプロピレンカーバメート）；
ポリヒドロキシアクリレートおよびメタクリレート［例えば、ポリ(β-ヒドロキシエチル)メタクリレートおよびポリエチレングリコールモノメタクリレート］；
アルキル化またはアラルキル化剤によって4級化された、アミン含有オリゴマー（例えば、Jeffamine）；
合成ポリペプチド（例えば、ポリリジンまたはフェニルアラニン）；
ポリビニルアルキルエーテル（例えば、ポリビニルメチルエーテル）；
ポリ酸およびその塩［例えば、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリビニル安息香酸、ポリエチレンスルホン酸、ポリアクリルアミドメチルプロパンスルホン酸、ポリマレイン酸およびポリ(N-ビニルスクシンアミド酸)］；
アンモニアまたは環式もしくは非環式1級もしくは2級アミンから誘導される、ポリアクリルアミドおよびポリメタクリルアミド；
ポリビニルアルコールおよび酢酸ビニル、エチレンなどとのポリビニルアルコールコポリマー；
複素環窒素原子が前述の式IのR1、R2およびR3について定義した基に結合している、ポリ2-、3-または4-ビニルピリジニウム塩；
ポリビニルアルキルピロリジノン（例えば、ポリビニルメチルピロリジノン）；
ポリビニルアルキルオキサゾリドン（例えば、ポリビニルメチルオキサゾリドン）；
分枝ポリエチレンイミン、アシル化分枝ポリエチレンイミン、またはアルキルもしくはアラルキル基でさらに4級化されたアシル化分枝ポリエチレンイミン；
アンモニアまたは環式もしくは非環式1級もしくは2級アミンから誘導される、ポリN-ビニルアミン、およびその4級塩；
ポリビニルピペリジン；あるいは
正に荷電した窒素原子上の他の置換基が前述の式Iで定義したR1、R2およびR3基のいずれであってもよい、ポリアクリロイル、ポリメタクリロイル、もしくは4-ビニルベンゾイルアミンイミドまたはポリビニルベンジルアミンイミド。
【００４８】
前述のオリゴマーまたはポリマー化学発光増強物質は、式Iのポリ(ビニルベンジル4級アンモニウム塩)について前述した範囲内の分子量を有しうる。
【００４９】
正に荷電した水溶性または水適合性、溶媒可溶性低分子オニウム塩も、支持体上の化学発光シグナルを増強するための化学発光増強物質として用いることができる。低分子オニウム塩は、窒素、リンまたは硫黄上の正に荷電したオニウム基を有することもでき、または構造内に任意の他の正に荷電した基を含むこともできる。対イオンには、単独または組み合わせのいずれかで、ハロゲンイオン（例えば、塩素イオンまたは臭素イオン）、硫酸イオン、アルキルスルホン酸イオン（例えば、メタンスルホン酸イオン）、トリフレートイオン、アリールスルホン酸イオン（例えば、p-トルエンスルホン酸イオン）、過塩素酸イオン、アルカン酸イオン（例えば、酢酸イオン）、アリールカルボン酸イオン、または蛍光対イオンなどの部分が含まれうる。
【００５０】
前述のポリマーの化学発光増強効果は、米国特許第5,547,836号に記載の化学発光増強添加物の使用によって調節することができる。化学発光増強添加物は、化学発光増強物質の支持体表面への適用前または適用後に、支持体表面に適用することができる。または、化学発光増強添加物を化学発光増強物質と混合し、得られる混合物を支持体表面に適用することもできる。
【００５１】
化学発光増強添加物は、化学発光増強物質の疎水性領域を形成する能力を改善することができ、この領域でジオキセタンオキシアニオンおよび得られる放射体が捕捉されて、水非存在下での分解および化学発光を可能にし、したがって、それにより引き起こされる消光反応を低減することができる。増強添加物は、任意の多様な化合物から得ることができる。例示的増強添加物には、界面活性剤（例えば、洗剤）、負に荷電した塩および溶媒が含まれる。界面活性剤は化学発光増強物質の比較的安定な疎水性領域を形成する能力を改善することができる。界面活性剤はカチオン性、アニオン性、両性イオン性または中性であってもよい。溶液に加えた場合に、増強物質の活性ジオキセタン種を捕捉する能力を改善すると思われ、またいかなる場合にも、化学発光シグナルのさらなる増強を引き起こす、増強添加物のもう一つのクラスには、負に荷電した塩が含まれる。非常に低濃度でも活性な増強添加物の第三のクラスは疎水性溶媒であり、これにはアルコールが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００５２】
増強添加物の第四の有効なクラスは、ポリ(2-エチル-Z-オキサゾリン)（PolyOx）などの非4級水溶性ポリマーである。これらのポリマーはそれ自体ではバックグラウンドノイズを高めることなく、化学発光シグナルの限られた増強を誘導しうるが、非4級水溶性ポリマーをポリマー性4級オニウム塩増強物質と共に用いると、マイクロアレイなどの支持体上の化学発光シグナルを改善することができる。
【００５３】
化学発光シグナルおよびシグナルノイズ比（S/N）のさらなる改善は、1つまたは複数の増強物質（例えば、球状タンパク質、合成オニウムまたは非オニウムポリマーまたはコポリマー）と、1つまたは複数の増強添加物とを独立に組み合わせることにより得ることができる。
【００５４】
化学発光増強ポリマーは、下記の構造を有するTPQポリマーでありうる。
2010528294.tif 000007
他の例示的化学発光増強ポリマーには、
ポリ(塩化ビニルベンジルジメチルベンジルアンモニウム)（BDMQ）、
ポリ(塩化ビニルベンジルトリメチルアンモニウム)（TMQ）、
ポリ(塩化ビニルベンジルトリブチルアンモニウム)（TBQ）、
ポリ(塩化ビニルベンジルトリブチルホスホニウム)（TB）、ポリ(塩化ビニルベンジルトリオクチルホスホニウム)（TO）およびそのコポリマーが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００５５】
受容体色素は、化学発光基質の励起状態に比べて、その一重項励起状態のために低いエネルギーを有する、任意の蛍光化合物から選択することができる。化学発光基質から受容体色素への共鳴エネルギー転移は赤色シフトした放射を引き起こす。受容体色素の例には下記が含まれるが、それらに限定されるわけではない：蛍光色素；ナフタレン、アントラセン、ピレン、ビフェニルを含む芳香族化合物；アクリジン；クマリン；キサンテン；フタロシアニン、スチルベン；フラン、オキサゾール、オキサジアゾール；およびベンゾチアゾール。エネルギー受容体色素として用いることができる例示的色素は、米国特許第6,028,190号；第6,335,440 B1号；第6,849,745 B2号；および第7,169,939 B2号にも開示されている。
【００５６】
色素は、支持体表面上でJ会合体を形成することができる色素から選択することができる（例えば、シアニン）。支持体表面上でJ会合体を形成する色素の能力により、均一化学発光検定設計が可能となる。J会合体色素は、非常に特徴的な狭帯域（例えば、15〜20nm fwhm）、ならびにモノマー色素放射（例えば、約530nm）、ジオキセタン放射（例えば、約460nmから590nm）、および生体分子または細胞バックグラウンド発光（例えば、約350nm）から著しく赤色シフトした（例えば、約80〜250nm）放射を示す。
【００５７】
シアニン色素はアニオン性シアニン色素でありうる。アニオン性シアニン色素は下記の構造を有しうる：
2010528294.tif 000008
。
【００５８】
支持体は、カチオン性化学発光増強物質 (例えば、正に荷電したオニウム基を有するカチオン性ホモポリマーまたはコポリマー）でコーティングされた、負に荷電した表面を有しうる。支持体が負に荷電した表面を有する場合、負に荷電した表面をカチオン性化学発光増強物質でコーティングすることができる。次いで、得られる構築物をアニオン性受容体色素でコーティングすることができる。または、支持体が正に荷電した表面を有する場合、表面をアニオン性受容体色素と、続いてカチオン性化学発光増強物質でコーティングすることができる。支持体上のコーティング色素および増強剤層の順序、ならびに色素および増強剤の物理的特性（すなわち、電荷および/または疎水性）は、支持体表面上の色素および増強剤の有効な多層コーティングを得るために変動することができる。
【００５９】
いくつかの態様において、受容体色素および化学発光増強剤を単層中に混合するか、または支持体と統合することができる。化学発光増強剤および色素を含む例示的調合物は、米国特許第5,145,772号に開示されている。いくつかの態様において、受容体色素および/または化学発光増強剤をポリマー網目に包括することができる。化学発光増強剤がポリマーである場合、増強剤を調合して、表面上の薄いコーティングを形成し、受容体色素または受容体色素の改変版を包括することができる。例えば、受容体色素標識したペプチドをポリマー化学発光増強剤を含む層に包括することができる。ペプチドを包括する方法は米国特許第5,071,909号に開示されている。例えば、色素をポリペプチドに連結することができ、得られる構築物を米国特許第5,071,909号に開示される方法を用いて包括することができる。
【００６０】
分子フィルターは検出されるシグナルに干渉する光放射を遮蔽または消光する任意の分子でありうる。分子フィルターの例には、ヘモグロビンならびにダブシル、DPX（Invitrogen #X1525）およびDNP C2アミン（Anaspec ＃81821）などの消光色素が含まれるが、それらに限定されるわけではない。検出されるシグナルに干渉する光放射を遮蔽または消光する任意の分子を用いることができる。
【００６１】
生体分子プローブは、抗体、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質、受容体、レクチンおよび/またはアプタマーであってもよく、またはこれらを含むこともできる。いくつかの態様において、生体分子プローブは、抗体、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質、受容体、レクチンおよび/またはアプタマーであるプローブを含む。
【００６２】
酵素分析物または酵素標識は、化学発光基質を活性化することができる任意の酵素でありうる。例は、セイヨウワサビペルオキシダーゼなどの酸化酵素、ならびにアルカリ性ホスファターゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼおよびノイラミニダーゼを含むが、それらに限定されるわけではない、加水分解酵素である。イムノアッセイの場合、分析物の捕捉後、捕捉事象をサンドイッチ検定法様式で検出抗体に結合した、または捕捉分析物に結合した、加水分解酵素標識で検出することができる。
【００６３】
化学発光基質としてジオキセタンを用いる場合、断片化を加水分解酵素の活性化によって開始することができる。この事象によって、化学発光基質のポテンシャルエネルギー（例えば、ジオキセタン基質の4員ペルオキシド環のポテンシャルエネルギー）が放出されて、アリールエステル断片を一重項励起状態へと励起する。一重項励起状態断片の基底状態への緩和はエネルギーを支持体表面上の隣接受容体色素（例えば、J会合体色素）に転移し、これは次いで発光することができる。エネルギー受容体がJ会合体色素である場合、放射は狭く、赤色シフトする。
【００６４】
前述のとおり、化学発光基質は1,2-ジオキセタン基質でありうる。例えば、1,2-ジオキセタン化学発光基質は、Applied Biosystemsから市販のCDP-Star(登録商標)でありうる。CDP-Star(登録商標)は2-クロロ-5-(4-メトキシスピロ{1,2-ジオキセタン-3,2'-(5'-クロロ)-トリシクロ[3.3.1.13,7]デカン}-4-イル)-1-フェニルリン酸2ナトリウムなる化学名および下記の化学構造を有する：
2010528294.tif 000009
1,2-ジオキセタン化学発光基質はCSPD(登録商標)でありえ、これもApplied Biosystemsから市販されている。CSPD(登録商標)は3-(4-メトキシスピロ{1,2-ジオキセタン-3,2'-(5'-クロロ)トリシクロ[3.3.1.13,7]デカン}-4-イル)-1-フェニルリン酸2ナトリウムなる化学名および下記の化学構造を有する：
2010528294.tif 000010
1,2-ジオキセタン化学発光基質はTFE-CDP-Star(登録商標)でありえ、これもApplied Biosystemsから市販されており、下記の化学構造を有する：
2010528294.tif 000011
前述の1,2-ジオキセタン化学発光基質は単なる例示であって、他の1,2-ジオキセタン基質を用いることもできる。
【００６５】
検定における分析物は、その分析物が特異的に結合することが公知の化合物（すなわち、プローブまたは生体分子プローブ）が存在する、任意の興味対象の分析物でありうる。例えば、分析物は酵素でありうる。または、分析物は酵素で標識された化合物、または分析物が支持体上のプローブに結合すると、分析物に結合する酵素標識生体分子でありうる。いくつかの態様において、分析物は非標識でありえ、支持体表面上の生体分子プローブへの結合について、試料に加えた酵素標識分析物と競合することができる。
【００６６】
酵素標識はアルカリ性ホスファターゼでありうる。化学発光基質はCSPD(登録商標)またはCDP-Star(登録商標)でありえ、かつ酵素標識はアルカリ性ホスファターゼでありうる。
【００６７】
試料中の複数の分析物を検出するための方法も提供する。この方法は、試料を、表面を有する支持体；支持体表面上の第一の化学発光増強物質；支持体表面上の第一のエネルギー受容体色素；および支持体に結合した第一の生体分子プローブであって、第一の分析物に結合することができる第一のプローブを含む生体分子プローブを含む、第一の製造物品と接触させる段階を含む。この方法に従い、第一のプローブは第一の分析物が試料中に存在する場合にその分析物に結合する。
【００６８】
この方法は、試料を、表面を有する支持体；支持体表面上の第二の化学発光増強物質；支持体表面上の第二のエネルギー受容体色素；および支持体に結合した第二の生体分子プローブであって、第二の分析物に結合することができる第二のプローブを含む生体分子プローブを含む、第二の製造物品と接触させる段階を含む。この方法に従い、第二のプローブは第二の分析物が試料中に存在する場合にその分析物に結合する。
【００６９】
次いで、試料中の第一および第二の分析物をそれぞれ第一および第二のプローブに結合させる。
【００７０】
酵素増幅を用いる検定法のために、下記の条件の1つを適用してもよい：（a）第一の分析物は第一の酵素である；（b）第一の分析物は第一の酵素で標識されている；（c）第一の製造物品の支持体表面を、第一の酵素で標識された（かつ第一の分析物が支持体表面上の第一のプローブに結合すると、第一の分析物に結合することができる）生体分子と接触させる；または（d）第一の分析物は非標識で、第一の酵素で標識された第一の分析物を試料に加えて、試料中の酵素標識された第一の分析物を第一の製造物品の第一のプローブへの結合について非標識の第一の分析物と競合させる。第二の分析物、第二の酵素、第二のプローブおよび第二の製造物品に関して、対応する条件を適用してもよい。
【００７１】
試料中の第一および第二の分析物をそれぞれ第一および第二のプローブに結合させた後、第一の製造物品を第一の酵素によって活性化される第一の化学発光基質と接触させる。活性化された第一の化学発光基質は第一のエネルギー受容体色素を励起して、そこからの放射を引き起こす。同様に、第二の製造物品を第二の酵素によって活性化される第二の化学発光基質と接触させる。活性化された第二の化学発光基質は第二のエネルギー受容体色素を励起して、そこからの放射を引き起こす。
【００７２】
次いで、第一のエネルギー受容体色素からの放射および第二のエネルギー受容体色素からの放射を検出する。第一のエネルギー受容体色素からの放射は第二のエネルギー受容体色素からの放射と識別可能である。
【００７３】
多重検定法において、第一および第二の化学発光基質は同じでも異なっていてもよい。第一および第二の化学発光増強物質も同じでも異なっていてもよい。加えて、第一および第二の製造物品を試料と同時または逐次に接触させることができる。第一および第二の製造物品を第一および第二の化学発光基質と同時または逐次に接触させることもできる。第一のエネルギー受容体色素からの放射および第二のエネルギー受容体色素からの放射を同時または逐次に検出することもできる。
【００７４】
酵素増幅を上に記載してきたが、化学発光標識を用いることもできる。特に、分析物を化学発光標識で標識することができる。または、支持体表面を、化学発光標識で標識され、分析物が支持体上のプローブに結合すると、分析物に結合する生体分子と接触させることもできる。さらなる代替法として、分析物は非標識でありえ、化学発光標識で標識された分析物を試料に加えた後、試料中の分析物をプローブに結合させ、それによりプローブへの結合について、非標識分析物と競合させることができる。次いで、化学発光標識を活性化することができる。活性化された化学発光標識から支持体上のエネルギー受容体色素へのエネルギー転移は発光を引き起こし、これを検出し、試料中の分析物の存在および/または量を評価するために用いることができる。
【００７５】
実施例
本発明の教示の局面は下記の実施例に照らせばさらに理解されると思われるが、これらの実施例はいかなる様式でも本発明の教示の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【００７６】
A.  IgG-AP検定法
いくつかの理由により、モデル生物検定試験のための支持体としてPOROS(登録商標)-Aを用いた。プロテインAでコーティングしたPOROS(登録商標)は全体に弱い負の表面電荷を示し、これはTPQなどのカチオン性ポリマー化学発光増強剤でのコーティングと、続くアニオン性シアニン色素でのコーティングを可能にする（例えば、図1に示すものなどの、POROS(登録商標)/TPQ/シアニン色素構築物を形成する）。POROS(登録商標)-HSも全体に負の電荷を有し、この上でJ会合を誘導するのが容易であるということに基づき、POROS(登録商標)-Aにコーティングしたアニオン性シアニン色素も支持体表面上でJ会合体を形成すると予想された。
【００７７】
プロテインAおよびIgG抗体の結合を、単にプロテインAおよびIgGを一緒にインキュベートして非常に緊密な複合体を形成することにより、1段階で行うことができる（Ka＝109M）（Akerstrom et al., ''A Physicochemical Study of Protein G, a Molecule with Unique Immunoglobulin G-Binding Properties,'' J. Biol. Chem., 1986, 261:10240-10247）。アルカリ性ホスファターゼで標識したIgG抗体をPOROS(登録商標)-A/TPQ/J会合体構築物を含む溶液中に導入する場合、分析物（アルカリ性ホスファターゼ）はJ会合体シアニンおよびTPQ増強剤でコーティングしたPOROS(登録商標)表面上に捕捉されることになる。次いで、分析物の検出は、J会合体色素表面の近く、または表面上で起こるシグナル生成の近接性（例えば、励起状態のジオキセタン断片によるJ会合体色素コーティングの化学励起）に基づく。J会合体シアニンコーティングへの効率的なエネルギー転移を得るために、化学励起したジオキセタン断片は、J会合体組立品から0から100オングストローム（すなわち、0〜10nm）以内の距離でありうる（Lakowicz, ''Principles of Fluorescence Spectroscopy'', 2nd ed., Kluwer Academic/Plenum Press, p. 388）。
【００７８】
図1に示すとおり、表面に捕捉されたアルカリ性ホスファターゼによって生じたジオキセタンCDP-Star(登録商標)の青色460nmエネルギー状態は、表面TPQ増強およびエネルギー転移を起こして、放射帯域幅が狭い、約600nmのJ会合体放射を生成する。460nmに中心がある青色化学発光シグナルが観察されることがあるが、これは水相におけるポリマー増強の欠如のため、最小となろう。均一検定法では、分析物の検出および定量のために赤色蛍光シグナル（590〜620nm）だけを測定しうる。シグナルはPOROS(登録商標)-A表面で起こっている事象に相関しうる。
【００７９】
POROS(登録商標)-A/TPQ/J会合体構築物を、分析物としてのアルカリ性ホスファターゼの均一検定法において用いた。アルカリ性ホスファターゼで標識したIgG抗体をPOROS(登録商標)-A/TPQ/J会合体構築物を含む溶液中に導入した後、分析物（アルカリ性ホスファターゼ）をJ会合体シアニンおよびTPQ増強剤でコーティングしたPOROS(登録商標)表面上のプロテインAによって捕捉した。分析物は、J会合体でコーティングした表面の近く、または表面上で起こるシグナル生成の近接性（例えば、励起状態のジオキセタン断片によるJ会合体コーティングの化学励起）に基づいて検出した。表面に捕捉されたアルカリ性ホスファターゼによって生じた青色460nmジオキセタンCDP-Star(登録商標)励起は、表面TPQ増強およびエネルギー転移を起こして、放射帯域幅が狭い、約600nmのJ会合体放射を生成した。非効率的なエネルギー転移から生じる任意の青色化学発光シグナル（460nm最大）は、水相ではポリマー増強されないため、最小化された。均一検定法では、分析物の検出および定量のために赤色蛍光シグナル（590〜620nm）だけを測定しうる。POROS(登録商標)-A表面上のJ会合体色素によって生成されるこのシグナルは、POROS(登録商標)-A表面で起こっている事象に相関する。
【００８０】
CDP-Star(登録商標)からPOROS(登録商標)-20A表面上に捕捉されたシアニンJ会合体へのエネルギー転移効率を、Carey Eclipse蛍光計で、96-マイクロタイタープレートからの赤/青シグナル強度比として測定した。各ウェルはBSA/PBS中のPOROS(登録商標)-20A/IgG-AP/TPQ色素構築物の一連の1：2希釈物10μlおよびpH9.5のAMP緩衝液中の0.4mM CDP-Star(登録商標)90μlの混合物を含んでいた。スペクトルおよびデータを下記の表にまとめている。
【表１】
2010528294.tif 000012
POROS(登録商標)20A/IgG-AP/TPQ/色素希釈物およびCDP-Star(登録商標)からの強度比
【００８１】
エネルギー転移効率は、597〜615nmの主なJ会合体放射シグナルの存在によって示されるとおり、エネルギー転移効率は良好であった。442〜447nmに残留するジオキセタン放射は低濃度希釈実験でのみ検出されたが、強度比はまだ高かった（受容体の1/64希釈でも赤：青強度比＝12）。
【００８２】
POROS(登録商標)-20A構築物表面上の分析物捕捉（IgG-アルカリ性ホスファターゼ）の相対検出曲線を得るために、一連の実験を行った。アルカリ性ホスファターゼの検出限界を、AMP緩衝液中の一連のウサギ抗マウスIgG-AP希釈物を、BSA/PBS中のPOROS(登録商標)20A/TPQ/アニオン性シアニン色素組立品およびpH9.5のAMP-CI緩衝液中の0.4mM CDP-Star(登録商標)の標準混合物とインキュベートすることによりもとめた。検出曲線をTurner Luminometerで、600nmの広帯域フィルターを用いて、または用いずに、全化学発光シグナルから生成した。
【００８３】
IgG-AP検出検定法のプロトコル
POROS(登録商標)構築物の調製
1.  0.15ml（約25mg）のPOROS(登録商標)-20Aスラリーをピペットで取り、0.85mlのH2Oに懸濁する。
2.  遠心分離して上清を廃棄する。
3.  ビーズを1mlのH2Oで3回洗浄する。
4.  ビーズを1mlのTPQ保存溶液（2mg/ml H2O）に懸濁する。
5.  プレート振盪機で60分間インキュベートする。
6.  上清を廃棄し、ビーズを1mlの水で2回と1mlの40％MeOH/H2Oで1回逐次洗浄する。
7.  ビーズを40％MeOH/H2Oに懸濁し、20μlの色素保存溶液（100mg/2ml MeOH）を加える。
8.  アルミホイルに包み、プレート振盪機で60分間インキュベートする。
9.  水溶液中で桃色乳濁液を生成する橙色上清を廃棄する。
10.  桃色のビーズを1mlのH2Oと1mlのBSA/PBSで3回逐次洗浄する。
11.  最終ビーズを1mlのBSA/PBSに懸濁し、冷蔵庫内の暗所で保存する。
【００８４】
IgG-AP結合体検定法
1.  一連の1：10 IgG-AP希釈物を調製する。
2.  10μlのPOROS(登録商標)構築物を試験管に入れる。
3.  10μlのIgG-AP希釈物を試験管に加える。
4.  混合物を室温で10分間インキュベートする。
5.  80μlの0.4mM COP-Star(登録商標)を加える。
6.  混合物を室温で30または60分間緩やかに振盪する。
7.  試験管を37℃でTurner光度計に設置し、ただちにシグナルを10分間収集する。
検出限界：IgG-APの1：1億希釈でS/N＞2（0.4mM CDP-Star(登録商標)60分間インキュベーション：読み出し用のフィルターはなし）
検出限界（S/N＞2）は、CDP-Star(登録商標)インキュベーション時間を2倍の60分にすることで、IgG-APの1：1000万から1：1億希釈まで10倍改善された。
【００８５】
B.  競合cAMP検定法
cAMPの競合均一検定法の支持体を提供するために、J会合体支持体構築物を用いた。図2に示すとおり、cAMP抗体をPOROS(登録商標)-A/TPQ/J会合体構築物上に層化した。POROS(登録商標)-A表面をTPQ増強剤およびJ会合体シアニン色素でコーティングした。図3に示すとおり、試料に加えた分析物（cAMP）およびcAMP-アルカリ性ホスファターゼ結合体はcAMP抗体による捕捉について競合した。cAMP-アルカリ性ホスファターゼのcAMP分析物との競合を、J会合体でコーティングした表面の近く、または表面上で起こるシグナル生成の近接性（例えば、励起状態のジオキセタン断片によるJ会合体コーティングの化学励起）に基づいて検出した。
【００８６】
図3に見られるとおり、表面に捕捉されたアルカリ性ホスファターゼによって生じた青色460nmジオキセタンCDP-Star(登録商標)励起は、表面TPQ増強およびエネルギー転移を起こして、放射帯域幅が狭い、約600nmのJ会合体放射を生成した。非効率的なエネルギー転移から生じる任意の青色化学発光シグナル（460nm最大）は、水相ではポリマー増強されないため、最小化された。図4は、POROS(登録商標)構築物上のcAMP抗体40μlおよびcAMP-アルカリ性ホスファターゼ結合体1：50希釈物を用いての、均一cAMP検定法の標準曲線を示すグラフであり、この図に示すとおり、cAMP分析物は0.1〜100ピコモル/ウェルの3桁にわたって検出された。
【００８７】
図5は、図2の構築物を用いての、均一cAMP-AP検定法のエネルギー転移（ET）スペクトルである。POROS(登録商標)-A/cAMP抗体/TPQ/J会合体構築物を0.1％BSAを含むPBS緩衝液240μlに懸濁し、10μlのcAMP-AP結合体（過剰）と共に室温で60分間インキュベートした。得られたスラリー20μLを96穴マイクロタイタープレートに入れ、pH9.5のAMP緩衝液中の0.4mM CDP-Star(登録商標)溶液80μlで処理した。37℃で30分間のインキュベーションの後、スペクトルをSpectraMax M2（Molecular Devices Corp.）で測定した。図5に見られるとおり、放射ピーク高の比（600nmの赤：460nmの青）は56：1よりも大きかった。
【００８８】
均一cAMP競合検定法のプロトコル
A.  cAMP構築物の調製
1.  0.3ml（約50mg）のPOROS(登録商標)-20Aスラリーをピペットで取り、0.7mlのPBSに懸濁する。
2.  遠心分離して上清を廃棄する。
3.  ビーズを1mlのPBSで4回洗浄する。
4.  ビーズを1mlのPBSに懸濁し、40μlのウサギcAMP抗体を加える。
5.  プレート振盪機で60分間インキュベートする。
6.  上清を廃棄し、ビーズを1mlのPBSで5回と1mlのH2Oで1回逐次洗浄する。
7.  ビーズを1mlのTPQ保存溶液（2mg/2ml H2O）に懸濁する。
8.  プレート振盪機で60分間インキュベートする。
9.  上清を廃棄し、ビーズを各1mlの水と20％MeOH/H2Oで次洗浄する。
10.  ビーズを20％MeOH/H2Oに懸濁し、30μlの色素保存溶液（100mg/2ml MeOH）を加える。
11.  アルミホイルに包み、プレート振盪機で60分間インキュベートする。
12.  水溶液中で桃色乳濁液を生成する橙色上清を廃棄する。
13.  桃色のビーズを1mlのH2O、1mlのBSA/PBSで3回、および1mlのトリス緩衝液（pH＝7.0）で2回逐次洗浄する。
14.  最終ビーズを1mlのトリス緩衝液に懸濁し、冷蔵庫内の暗所で保存する。
【００８９】
B.  cAMP競合検定法
1.  一連のcAMP標準溶液の1：10希釈物50μl/ウェルおよび希釈したcAMP-AP結合体25μl/ウェルを96穴マイクロタイタープレートのウェルに加え、プレート振盪機で10分間混合する。
2.  5μl/ウェルのPOROS(登録商標)cAMP構築物を加える。
3.  プレート振盪機で60分間インキュベートする。
4.  60μlの0.4mM CDP-Star(登録商標)を加え、プレート振盪機で10分間混合する。
5.  プレートを29℃で光度計TR 717に設置し、20および50分後にシグナルを測定する。
【００９０】
図6は、表面、化学発光増強剤（すなわち、TPQ）、アニオン性シアニン色素（例えば、J会合体色素）、試料中の分析物を捕捉するための生体分子プローブ（すなわち、捕捉抗体）および支持体に結合した分析物に結合することができる酵素標識抗体を含む支持体を用いての、サンドイッチ検定法を示す概略図である。図6に示すとおり、ジオキセタン基質の酵素回転は、分解して光を生じる活性化された化学発光基質を生じ、これは、エネルギー転移（ET）を通じてシアニン色素からの蛍光を生じる。
【００９１】
図7は、多重均一検定法を示す概略図である。図7に示すとおり、捕捉された第一の分析物（分析物1）を介して第一の支持体に結合した第一の酵素（酵素1）による化学発光供与体の活性化は化学励起供与体を生成し、これはエネルギー転移を通じて第一の支持体表面上の第一の色素（色素1）からの蛍光を生じる。図7に示すとおり、捕捉された第二の分析物（分析物2）を介して第二の支持体に結合した第二の酵素（酵素2）による化学発光供与体の活性化は化学励起供与体を生成し、これはエネルギー転移を通じて第二の支持体表面上の第二の色素（色素2）からの蛍光を生じる。第二の色素からの蛍光放射は第一の色素からの放射と識別することができる。したがって、試料中の複数の分析物を同時または逐次に検出することができる。
【００９２】
前述の明細は本発明の原理を教示し、実施例を例示のために提供しているが、当業者であれば、本開示を読むことにより、本発明の真の範囲から逸脱することなく形態および詳細において様々な変更を行いうることを理解するであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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