(57)【要約】  本発明は、単離されたタンパク質−ＨＤＭ２結合部位ならびに単離されたタンパク質−プロテアソーム結合部位（ＥＤ（Ｘ）Ｙ配列）をコードする核酸およびアミノ酸双方の配列を提供する。さらなる一局面において、本発明は、関連する核酸、アミノ酸、ベクター、宿主細胞、製薬学的組成物および製品もまた提供する。本発明は、試験化合物がＨＤＭ２とプロテアソームの間の結合と相互作用するかどうかの決定方法、ならびに、とりわけ抗癌剤としての、なおより具体的には被験体における細胞増殖性障害を処置するための前記試験化合物を含んでなる製薬学的組成物をさらに提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＤＭ２のプロテアソームへの結合に影響を及ぼす化合物の同定方法。
【請求項２】
ａ）ＨＤＭ２タンパク質、関連タンパク質若しくはそれらのタンパク質結合フラグメントと試験されるべき化合物を接触させること、および
ｂ）前記化合物が、ユビキチン−プロテアソームタンパク質分解経路によるＨＤＭ２結合タンパク質のタンパク質分解に影響を及ぼすかどうかを決定すること
を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＨＤＭ２結合タンパク質がｐ５３である、請求項１若しくは２に記載の方法。
【請求項４】
ＨＤＭ２結合タンパク質がｐ５３以外である、請求項１若しくは２に記載の方法。
【請求項５】
ａ）プロテアソームサブユニット若しくはそのタンパク質結合フラグメントを、標識ＨＤＭ２、標識関連タンパク質若しくは標識したそれらのタンパク質結合フラグメントとともにインキュベートすること、
ｂ）試験化合物をインキュベーション混合物に添加すること、および
ｃ）プロテアソームサブユニット若しくはそのタンパク質結合フラグメントに結合された標識ＨＤＭ２、標識関連タンパク質若しくは標識したそれらのタンパク質結合フラグメントの量に対する該試験化合物の影響を測定すること
を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ａ）標識プロテアソームサブユニット若しくは標識したそのタンパク質結合フラグメントを、ＨＤＭ２、関連タンパク質若しくはそれらのタンパク質結合フラグメントとともにインキュベートすること、
ｂ）試験化合物をインキュベーション混合物に添加すること、および
ｃ）ＨＤＭ２、関連タンパク質若しくはそれらのタンパク質結合フラグメントに結合された標識プロテアソームサブユニット若しくは標識したそのタンパク質結合フラグメントの量に対する試験化合物の影響を測定すること
を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ａ）プロテアソームサブユニット若しくはそのタンパク質結合フラグメントを、ＨＤＭ２、関連タンパク質若しくはそれらのタンパク質結合フラグメントでプロービングすること、
ｂ）ＨＤＭ２、関連タンパク質若しくはそれらのタンパク質結合フラグメントと相互作用するプロテアソームサブユニット若しくはそのタンパク質結合フラグメント（または逆もまた真）の結合部位の接触原子を同定すること、
ｃ）（ｂ）で同定された原子と相互作用する試験化合物を設計し、および
ｄ）前記設計された試験化合物を、プロテアソームサブユニット、そのタンパク質結合フラグメント、ＨＤＭ２、関連タンパク質若しくはそれらのタンパク質結合フラグメントと接触して、ＨＤＭ２とプロテアソームの間の相互作用を調節する若しくはユビキチン−プロテアソームタンパク質分解を調節する前記化合物の能力を測定する
を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＨＤＭ２のタンパク質結合フラグメントが
ａ）アミノ酸配列、配列番号１１若しくは配列番号１２またはそれらのホモログであって、前記ホモログは配列番号１１若しくは配列番号１２に対する最低７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８若しくは９９％の同一性を有するか、
ｂ）ＨＤＭ２のアミノ酸２５２−２６４（配列番号１１）若しくは３８７−３９９（配列
番号１２）またはそれらのホモログであって、前記ホモログは配列番号１１若しくは配列番号１に対する最低７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８若しくは９９％の同一性を有するか、あるいは
ｃ）ＨＤＭ２（配列番号５）のアミノ酸２５７−２５９若しくは３９２−３９４またはそれらのホモログであって、前記ホモログは配列番号５に対する最低７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８若しくは９９％の配列同一性を有する、
を含んでなるポリペプチド配列の一群若しくはポリペプチド配列の一群のメンバーから選択される、請求項１ないし７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
プロテアソームユニットのタンパク質結合フラグメントが、
ａ）アミノ酸配列、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０若しくは配列番号１３またはそれらのホモログであって、前記ホモログは、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０若しくは配列番号１３のいずれか１種に対する最低７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８若しくは９９％の同一性を有するか、
ｂ）Ｓ６Ａのアミノ酸４１３−４２５（配列番号７）、Ｓ６Ｂのアミノ酸３５６−３６８（配列番号８）、Ｓ５Ａのアミノ酸３１８−３３１（配列番号９）、Ｓ２のアミノ酸４３２−４４４（配列番号１０）若しくはＳ４のアミノ酸４３１−４４０（配列番号１３）またはそれらのホモログであって、前記ホモログは、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０若しくは配列番号１３に対する最低７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８若しくは９９％の配列同一性を有するか、あるいは
ｃ）Ｓ６Ａ（配列番号１）のアミノ酸４１８−４２０、Ｓ６Ａ（配列番号２）のアミノ酸４１８−４２０、Ｓ６Ｂ（配列番号３）のアミノ酸３６１−３６３、Ｓ５Ａ（配列番号４）のアミノ酸３２３−３２６、Ｓ２（配列番号６）のアミノ酸４３７−４３９若しくはＳ４（配列番号１３）のアミノ酸４３６−４３９またはそれらのホモログであって、前記ホモログは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４若しくは配列番号６に対する最低７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８若しくは９９％の配列同一性を有する、
を含んでなるポリペプチド配列の一群若しくはポリペプチド配列の一群のメンバーから選択される、請求項１、５、６若しくは７のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
医薬品としての使用のための、請求項８に記載のＨＤＭ２のタンパク質結合フラグメント若しくは請求項９に記載のプロテアソームサブユニットのタンパク質結合フラグメント。
【請求項１１】
医薬品としての使用のための、
ａ）ヌクレオチド配列、配列番号１８若しくは配列番号１９またはそれらのホモログであって、前記ホモログは配列番号１８若しくは配列番号１９に対する最低７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８若しくは９９％の同一性を有するか、
ｂ）ＨＤＭ２のヌクレオチド配列１０５０−１０８８（配列番号１８）若しくは１４５５−１４９３（配列番号１９）またはそれらのホモログであって、前記ホモログは、配列番号１８若しくは配列番号１９に対する最低７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８若しくは９９％の同一性を有するか、あるいは
ｃ）配列番号１８若しくは配列番号１９のヌクレオチド配列１６−２４またはそれらのホモログであって、前記ホモログは配列番号２５に対する最低７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８若しくは９９％の配列同一性を有する、
を含んでなる、請求項８に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の一群若しくはヌクレオチド配列の一群のメンバー。
【請求項１２】
医薬品としての使用のための、
ａ）プロテアソームサブユニットＳ６ａ、Ｓ６ｂ、Ｓ５ａ、Ｓ４若しくはＳ２のＥＤ（Ｘ
）Ｙヌクレオチド配列またはそれらのホモログであって、前記ホモログは、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７若しくは配列番号２０に対する最低７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８若しくは９９％の同一性を有する。
ｂ）プロテアソームサブユニットＳ６ａ、Ｓ６ｂ、Ｓ５ａ、Ｓ４若しくはＳ２の配列番号２１のヌクレオチド配列１４３１−１４６９、配列番号２２の１１０３−１１４１、配列番号２３の１０１４−１０５５、配列番号２４の１３２７−１３６５若しくは配列番号２６の１３３９−１３７１またはそれらのホモログであって、前記ホモログは、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４若しくは配列番号１６に対する最低７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８若しくは９９％の同一性を有する。
ｃ）配列番号１４、配列番号１５若しくは配列番号１７のヌクレオチド配列１−３９、配列番号１６のヌクレオチド配列１−４２または配列番号２０のヌクレオチド配列１−３３あるいはそれらのホモログであって、前記ホモログは、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７若しくは配列番号２０に対する最低７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８若しくは９９％の配列同一性を有する。
ｄ）配列番号１４、配列番号１５若しくは配列番号１７のヌクレオチド配列１６−２４、配列番号１６若しくは配列番号２０のヌクレオチド配列１６−２７またはそれらのホモログであって、前記ホモログは、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７若しくは配列番号２０に対する最低７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８若しくは９９％の配列同一性を有する、
を含んでなる、請求項９に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の一群若しくはヌクレオチド配列の一群のメンバー。
【請求項１３】
癌および白血病の処置のための医薬品の製造のための、請求項７若しくは８に記載のポリペプチド配列または請求項１０若しくは１１に記載のヌクレオチド配列の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＤＭ２若しくは関連タンパク質のプロテアソームとの相互作用の特徴付け、および、この相互作用の破壊が例えばユビキチン（Ｕｂ）−プロテアソームタンパク質分解（ＵＰＳ）経路にどのように影響を及ぼし得るかに基づく。従って、単離されたタンパク質−ＨＤＭ２結合部位、ならびに単離されたタンパク質−プロテアソーム結合部位（ＥＤ（Ｘ）Ｙ配列およびそれらの対蹠物）をコードする核酸およびアミノ酸双方の配列を提供する。さらなる一局面において、本発明は、関連する核酸、アミノ酸、ベクター、宿主細胞、製薬学的組成物および製品もまた提供する。本発明は、試験化合物がＨＤＭ２とプロテアソームの間の結合と相互作用するかどうかの決定方法をさらに提供する。
【背景技術】
【０００２】
Ｈｄｍ２は、ｈｄｍ２遺伝子増幅、ならびにｐ１４ＡＲＦおよびＰＴＥＮのような上流の腫瘍抑制因子の欠失を包含する多様な機序により多数の癌患者で活性化されている重要な癌遺伝子である。Ｈｄｍ２は、骨肉腫、軟組織肉腫および神経膠腫を包含する数種の型の悪性病変で過剰発現されており、そして高レベルのｈｄｍ２は不良な予後を伴う（非特許文献１）。興味深いことに、ｈｄｍ２発現を増大するｈｄｍ２プロモーター中の単一ヌクレオチド多形が、ヒトでの遺伝性および散発性双方の癌における加速された腫瘍形成と関連している（非特許文献２）。
【０００３】
ＨＤＭ２は、細胞周期調節タンパク質と会合してそれらの活性および安定性を調節することにより腫瘍形成を促進する。ＨＤＭ２の基質の数は急速に拡大しており、重要な例は、腫瘍抑制因子ｐ５３ならびにそのファミリーメンバーｐ６３およびｐ７３、Ｅ２Ｆ１ならびにｐ２１ｗａｆ１，ｃｉｐ１を包含する（非特許文献３）。最も広範囲に研究されているのはｐ５３である。ＨＤＭ２はｐ５３タンパク質を結合かつユビキチン化し、それはプロテアソームによるｐ５３の迅速な分解をもたらす。ＨＤＭ２−ｐ５３複合体の分解の抑止は、ｐ５３安定化およびｐ５３の下流の遺伝子のその後の転写活性化を引き起こす（非特許文献４に総説されている）。ユビキチンリガーゼ機能に加え、ＨＤＭ２の他の活性もまた、ＨＤＭ２の中央ドメインでのリン酸化が抑止される場合にユビキチン化されたｐ５３の蓄積により明示されるとおり、ｐ５３分解に必要とされる（非特許文献５）。Ｓ４、Ｓ５ａ、Ｓ６ａおよびＳ６ｂのような２６Ｓプロテアソームの多様なサブユニットとのＨＤＭ２の会合（第３回Ｍｄｍ２ワークショップ、独国コンスタンスにおいて２００５年９月）が、この過程で重要な役割を演じているかもしれない。
【０００４】
ＨＤＭ２腫瘍形成の重要な役割と一致して、ｈｄｍ２癌遺伝子のアンタゴニストすなわちペプチドおよび小分子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで腫瘍細胞増殖、およびｉｎ  ｖｉｖｏで免疫不全マウスにおけるヒト異種移植片の増殖を阻害する（非特許文献６、７）。Ｈｄｍ２アンタゴニストは、機能的ｐ５３を欠く腫瘍細胞中で抗増殖効果をなお表しうる。これは、ＨＤＭ２タンパク質を、抗癌療法の開発のための魅力的な標的と位置づける。
【０００５】
腫瘍形成におけるＨＤＭ２の中心的役割を考えれば、ＨＤＭ２−プロテアソーム相互作用の調節が、癌の処置のための新たな化学療法剤の開発のための新規機序を提供し得ることが期待されるはずである。
【０００６】
例えばＨＤＭ２−プロテアソーム相互作用を妨害することが可能でかつ従って例えばＵＰＳ経路の破壊により細胞増殖性障害の処置で有用な化合物を同定することを可能にするタンパク質−ＨＤＭ２結合部位ならびにタンパク質−プロテアソーム結合部位（ＥＤ（Ｘ）Ｙ配列およびそれらの対蹠物）を特徴付けることが、本発明の一目的である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｃｏｒｄｏｎ−Ｃａｒｄｏ  Ｃ，Ｌａｔｒｅｓ  Ｅ，Ｄｒｏｂｎｊａｋ  Ｍ，Ｏｌｉｖａ  ＭＲ，Ｐｏｌｌａｃｋ  Ｄ，Ｗｏｏｄｒｕｆｆ  ＪＭ，Ｍａｒｅｃｈａｌ  Ｖ，Ｃｈｅｎ  Ｊ，Ｂｒｅｎｎａｎ  ＭＦとＬｅｖｉｎｅ  ＡＪ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｍｄｍ２  ａｎｄ  ｐ５３  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ａｄｕｌｔ  ｓｏｆｔ  ｔｉｓｓｕｅ  ｓａｒｃｏｍａｓ．（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４、７９４−９。
【非特許文献２】Ｂｏｎｄ  ＧＬ，Ｈｕ  ＷＷ，Ｂｏｎｄ  ＥＥ，Ｒｏｂｉｎｓ  Ｈ，Ｌｕｔｚｋｅｒ  ＳＧ，Ａｒｖａ  ＮＣ，Ｂａｒｇｏｎｅｔｔｉ  Ｊ，  Ｂａｒｔｅｌ  Ｆ，Ｔａｕｂｅｒｔ  Ｈ，Ｗｕｅｒｌ  Ｐ，Ｏｎｅｌ  Ｋ，Ｙｉｐ  Ｌ，Ｈｗａｎｇ  ＳＪ，Ｓｔｒｏｎｇ  ＬＣ，Ｌｏｚａｎｏ  ＧとＬｅｖｉｎｅ  ＡＪ．Ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＭＤＭ２  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｐ５３  ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｎｄ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ  ｔｕｍｏｒ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ．（２００４）Ｃｅｌｌ  １１９、５９１−６０２。
【非特許文献３】Ｚｈａｎｇ  ＺとＺｈａｎｇ  Ｒ．ｐ５３−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｍｄｍ２  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｌｅｖａｎｃｅ  ｔｏ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｓ；２００５；５：９−２０。
【非特許文献４】Ｂｒｏｏｋｓ  ＣＬとＧｕ  Ｗ．ｐ５３  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ：ｍｄｍ２  ａｎｄ  ｂｅｙｏｎｄ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  ２１、３０７−３１５．５。
【非特許文献５】Ｂｌａｔｔｎｅｒ  Ｃ，Ｈａｙ  Ｔ，Ｍｅｅｋ  Ｄ，Ｌａｎｅ  ＤＰ．Ｈｙｐｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｄｍ２  ａｕｇｍｅｎｔｓ  ｐ５３  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．（２００２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、２２、６１７０−６１８２。
【非特許文献６】Ｖａｓｓｉｌｅｖ  ＬＴ，Ｖｕ  ＢＴ，Ｇｒａｖｅｓ  Ｂ，Ｃａｒｖａｊａｌ  Ｄ，Ｐｏｄｌａｓｋｉ  Ｆ，Ｆｉｌｉｐｏｖｉｃ  Ｚ，Ｋｏｎｇ  Ｎ，Ｋａｍｍｌｏｔｔ  Ｕ，Ｌｕｋａｃｓ  Ｃ，Ｋｌｅｉｎ  Ｃ，Ｆｏｔｏｕｈｉ  Ｎ，Ｌｉｕ  ＥＡ．Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐ５３  Ｐａｔｈｗａｙ  ｂｙ  Ｓｍａｌｌ−Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ｏｆ  ＭＤＭ２．Ｓｃｉｅｎｃｅ；２００４；３０３：８４４−８４８。
【非特許文献７】Ｇｒａｓｂｅｒｇｅｒ  ＢＬ，Ｌｕ  Ｔ，Ｓｃｈｕｂｅｒｔ  Ｃ，Ｐａｒｋｓ  ＤＪ，Ｃａｒｖｅｒ  ＴＥ，Ｋｏｂｌｉｓｈ  ＨＫ，Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  ＭＤ，ＬａＦｒａｎｃｅ  ＬＶ，Ｍｉｌｋｉｅｗｉｃｚ  ＫＬ，Ｃａｌｖｏ  ＲＲ，Ｍａｇｕｉｒｅ  Ｄ，Ｌａｔｔａｎｚｅ  Ｊ，Ｆｒａｎｋｓ  ＣＦ，Ｚｈａｏ  Ｓ，Ｒａｍａｃｈａｎｄｒｅｎ  Ｋ，Ｂｙｌｅｂｙｌ  ＧＲ，Ｚｈａｎｇ  Ｍ，Ｍａｎｔｈｅｙ  ＣＬ，Ｐｅｔｒｅｌｌａ  ＥＣ，Ｐａｎｔｏｌｉａｎｏ  ＭＷ，Ｄｅｃｋｍａｎ，ＩＣ，Ｓｐｕｒｌｉｎｏ，ＪＣ，Ｍａｒｏｎｅｙ  ＡＣ，Ｔｏｍｅｚｕｋ  ＢＥ，Ｍｏｌｌｏｙ  ＣＪ，Ｂｏｎｅ  ＲＦ．Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｃｏｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅｄｉｏｎｅ  ＨＤＭ２  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ｔｈａｔ  Ａｃｔｉｖａｔｅ  ｐ５３  ｉｎ  Ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．；２００５；４８：９０９−１２
【発明の概要】
【０００８】
［発明の要約］
本発明は、ＨＤＭ２、関連タンパク質若しくはそれらのタンパク質結合フラグメント、ならびにタンパク質−プロテアソーム結合部位のタンパク質若しくは小分子との相互作用
、とりわけＳ２、Ｓ４、Ｓ５ａ、Ｓ６ａ若しくはＳ６ｂまたはそれらのフラグメントよりなる群から選択されるプロテアソームサブユニットを含んでなる相互作用を利用するアッセイを提供する。
【０００９】
該アッセイは、ＨＤＭ２、関連タンパク質若しくはそれらのタンパク質結合フラグメントの別のタンパク質、プロテアソーム若しくはプロテアソームサブユニットとの相互作用を試験化合物が変え得るかどうかを同定するのに有用である。該アッセイは、試験化合物がＵＰＳ経路のアゴニストであるかアンタゴニストであるかを決定するのにもまた有用である。上のアッセイは、ＨＤＭ２（配列番号５）、関連タンパク質若しくはそれらのタンパク質結合フラグメントの別のタンパク質、プロテアソーム若しくはプロテアソームサブユニットとの相互作用が、陽性若しくは陰性対照として評価されるか、または該試験化合物で得られる結果と比較される、競合、非競合および比較アッセイを包含する多様な形式で実施し得る。
【００１０】
別の局面において、本発明は、単離されたタンパク質−ＨＤＭ２結合部位ならびに単離されたタンパク質−プロテアソーム結合部位（ＥＤ（Ｘ）Ｙ配列）をコードする単離かつ精製されたポリペプチドおよびポリヌクレオチド分子、ならびに本発明のアッセイでの前記結合領域の使用に関する。
【００１１】
さらなる一態様において、本発明は、本発明により提供されるペプチド、ペプチド模倣物若しくはポリヌクレオチドを含んでなる製薬学的組成物、ならびに癌および乾癬のような増殖性状態を阻害するためのそれらの治療的使用に関する。本発明は、本発明のペプチド、ペプチド模倣物若しくはポリヌクレオチドの有効量を投与することによる、形質転換細胞を包含する細胞の異常増殖の阻害方法を提供する。細胞の異常増殖は正常な調節機構に依存しない細胞増殖（例えば接触阻害の喪失）を指す。これは、癌細胞の増殖停止、最終分化および／若しくはアポトーシスを引き起こすことにより直接、ならびに腫瘍の血管新生を阻害することによる間接的の双方の腫瘍増殖の阻害を包含する。
【００１２】
これおよび本発明のさらなる局面は下により詳細に論考されるであろう。
【００１３】
［発明の詳細な記述］
定義
別の方法で明示的に本明細書に提供されるところを除き、本出願で使用されるところの以下の用語のそれぞれは、下に示す意味を有する。
【００１４】
「ＭＤＭ２」としてもまた知られる「ＨＤＭ２」は「ｍｏｕｓｅ  ｄｏｕｂｌｅ  ｍｉｎｕｔｅ  ２ホモログ」（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔエントリＱ００９８７）を意味し、そしてヒトタンパク質に制限されないが、しかしマウスタンパク質（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔエントリＰ２３８０４）、イヌタンパク質（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔエントリＰ５６９５０）、ウマタンパク質（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔエントリＰ５６９５１）、ネコタンパク質（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔエントリＱ７ＹＲＺ８）のような関連タンパク質、またはヒト配列（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔエントリＱ００９８７）に対する最低７０、８０、９０、９５、９７若しくは９９％の配列同一性を有するタンパク質を包含する。ｐ５３結合タンパク質ＭＤＭ２としてもまた知られるＨＤＭ２は、元はＯｌｉｎｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ、（１９９２）；３５８：８０−８３）によりクローン化された。「関連タンパク質」で、ヒト配列（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔエントリＱ００９８７）に対する最低４０、６０若しくは６９％の配列同一性を有するタンパク質を意味している。
【００１５】
「プロテアソーム」はユビキチン化されたタンパク質の分解を標的とする大型の多サブユニット複合体を意味している。
【００１６】
「プロテアソームサブユニット」は、プロテアソームサブユニット６Ａ、Ｓ６Ａ若しくはＰＳＭＣ３；プロテアソームサブユニット６Ｂ、Ｓ６Ｂ若しくはＰＳＭＣ４；プロテアソームサブユニット５Ａ、Ｓ５Ａ若しくはＰＳＭＤ４；プロテアソームサブユニット２、Ｓ２若しくはＰＳＭＤ２；またはプロテアソームサブユニット４、Ｓ４若しくはＰＳＭＣ１を意味している。それはヒトタンパク質に制限されないが、しかしマウスＳ６Ａ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔエントリＱ８８６８５）、ラットＳ６Ａ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔエントリＱ６３５６９）、マウスＳ６Ｂ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔエントリＰ５４７７５）、ラットＳ６Ｂ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔエントリＱ６３５７０）、ウシＳ６Ｂ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔエントリＱ３Ｔ０３０）、マカクＳ６Ｂ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔエントリＱ４Ｒ７Ｌ３）、マウスＳ５Ａ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔエントリＱ３５２２６）、ウシＳ５Ａ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔエントリＱ５８ＤＡ０）、マウスＳ２（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔエントリＱ８ＶＤＭ４）、ウシＳ２（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔエントリＰ５６７０１）、マウスＳ４（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔエントリＰ６２１９２）、若しくはラットＳ４（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔエントリＰ６２１９３）のような関連タンパク質を包含する。それはまた、ヒト配列Ｓ６Ａ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔエントリＰ１７９８０）、Ｓ６Ｂ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔエントリＰ４３６８６）、Ｓ５Ａ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔエントリＰ５５０３６）、Ｓ２（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔエントリＱ１３２００）若しくはＳ４（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔエントリＰ６２１９１）に対する最低７０、８０、９０、９５、９７若しくは９９％の配列同一性を有するタンパク質も包含する。
【００１７】
「投与すること」は、当業者に既知の多様な方法および送達系のいずれかを使用して遂げられ若しくは実施される様式で送達することを意味している。投与することは、例えば、局所で、静脈内で、心周囲に、経口で、植込み物を介して、経粘膜で、経皮で、筋肉内で、皮下で、腹腔内で、くも膜下腔内で、リンパ内に、病変内で若しくは硬膜外で実施し得る。投与することは、例えば１回、複数回、および／または１若しくはそれ以上の延長された期間でもまた実施し得る。
【００１８】
「宿主細胞」は、限定されるものでないが細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞を挙げることができる。細菌細胞は、リン酸カルシウム沈殿、電気穿孔法および微小注入法のような当該技術分野で公知の方法によりトランスフェクトし得る。
【００１９】
「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は本明細書で互換性に使用され、そしてそれぞれデオキシリボヌクレオチドおよび／若しくはリボヌクレオチドのポリマーを指す。デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドは天然に存在し得るか、若しくはそれらの合成アナログであり得る。
【００２０】
「生理学的状態」という用語は、所定の細胞に関して、細胞の生化学的環境を通常構成するとみられる状態を意味している。細胞の生化学的環境は、細胞が通常曝露される数種若しくは全部のプロテアーゼを制限なしに包含する。こうした状態は、限定されるものでないがｉｎ  ｖｉｖｏ状態を挙げることができる。
【００２１】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は本明細書で互換性に使用され、そしてそれぞれアミノ酸残基のポリマーを意味している。アミノ酸残基は天然に存在し得るか、若しくはそれらの化学的アナログであり得る。ポリペプチド、ペプチドおよびタンパク質は、グリコシル化、脂質付加、硫酸化、水酸化およびＡＤＰ−リボシル化のような修飾もまた包含し得る。
【００２２】
「被験体」は、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、マウス若しくはラットのようなげっ歯類、シチメンチョウ、ニワトリおよび霊長類を制限なしに包含する哺乳動物若し
くは鳥類のようないかなる動物も意味している。好ましい態様において、被験体はヒトである。
【００２３】
「処置すること」は、被験体の疾患を排除すること、その経過を復帰させること、その進行を遅らせること、その症状を低下させること，若しくは別の方法で軽減することを制限なしに包含する。
【００２４】
「ベクター」は当該技術分野で既知のいかなる核酸ベクターも意味している。こうしたベクターは、限定されるものでないがプラスミドベクター、コスミドベクターおよびバクテリオファージベクターを挙げることができる。
【００２５】
本明細書で使用されるところの「化合物」は、いずれかの大きさの原子の有機若しくは無機集成体であり、そして小分子（約２５００ダルトン未満）若しくは大型分子、例えばペプチド、ポリペプチド、全タンパク質およびポリヌクレオチドを包含する。
【００２６】
「候補物質」および「試験化合物」という用語は互換性に使用され、そしてＨＤＭ２、関連タンパク質若しくはそれらのフラグメントのプロテアソーム、プロテアソームサブユニット若しくはそれらのフラグメントとの結合と相互作用すると考えられる物質を指す。本発明の方法を使用して検討し得る例示的候補物質は、限定されるものでないが、ペプチド、酵素、酵素基質、補助因子、糖、オリゴヌクレオチド、化合物小分子およびモノクローナル抗体を挙げることができる。
【００２７】
「調節する」は、野生型若しくは変異体のＨＤＭ２、プロテアソーム、プロテアソームサブユニット若しくは関連タンパク質のいずれかの若しくは全部の化学的および生物学的活性若しくは特性の増大、減少若しくは他の変化を意味している。
【００２８】
「相互作用する」は、分子間の「結合」相互作用を包含する分子間の検出可能な直接および間接的相互作用を意味している。相互作用は、例えば性質がタンパク質−タンパク質若しくはタンパク質−核酸であり得る。こうした相互作用は技術既知の手順、例えば酵母２ハイブリッドアッセイ、免疫沈降、ＳＰＡアッセイ若しくはフィルター結合アッセイを使用して検出し得る。
【００２９】
「プロテアソーム結合ドメイン」若しくは「プロテアソーム結合フラグメント」で、プロテアソーム若しくはプロテアソームサブユニットに結合し得るＨＤＭ２タンパク質若しくは関連タンパク質の部分を意味している。
【００３０】
「ＥＤ（Ｘ）Ｙ配列およびそれらの対蹠物」で、Ｈｄｍ２、Ｈｄｍ２関連タンパク質、プロテアソームおよびプロテアソームサブユニットに存在する下述されるところのポリペプチドならびにそれらのホモログおよびアナログ、ならびにこれらの配列が結合するそれらの対蹠物ポリペプチドを意味している。
【００３１】
本明細書で使用されるところの「単離された」は、問題のポリヌクレオチド、タンパク質およびポリペプチド若しくはそれらのそれぞれのフラグメントが、それらが当業者により操作され得るように（限定されるものでないが配列決定、制限消化、部位特異的突然変異誘発、および核酸フラグメントのための発現ベクターへのサブクローニング、ならびにポリクローナル抗体、モノクローナル抗体を生成する機会を提供する量のタンパク質若しくはタンパク質フラグメントを得ること、アミノ酸配列決定およびペプチド消化を挙げることができる）それらのｉｎ  ｖｉｖｏ環境から取り出されているという事実を指す。言い換えれば、「単離された」は、天然に存在する配列がその天然の細胞の情況から取り出されていることを意味している。従って、該配列は細胞を含まない溶液中にありうるか、
または異なる細胞環境若しくは核酸の情況に置かれることができる。従って、本明細書で特許請求される核酸は、全細胞若しくは細胞ライセート中、または部分的、実質的若しくは完全に精製された形態の不均質な物質として存在し得る。
【００３２】
ポリヌクレオチドは、それが環境汚染物質から精製される場合に「精製された」とみなされる。従って、細胞から単離されたポリヌクレオチドは、標準的方法により細胞成分から精製される場合に実質的に精製されているとみなされる一方、化学合成される核酸配列はその化学的前駆体から精製されている場合に実質的に精製されているとみなされる。「実質的に純粋な」タンパク質若しくは核酸は、典型的にサンプルの最低８５％を含むことができ、より大きいパーセンテージが好ましい。タンパク質若しくは核酸分子の純度の測定方法は、ポリアクリルアミド若しくはアガロースのようなマトリックス中で調製物を電気泳動することによる。純度は染色後の単一バンドの出現により明示される。他の純度評価方法は、クロマトグラフィー、質量分析および分析的遠心分離を包含する。
【００３３】
本明細書で使用されるところの「相補的」若しくは「相補性」という用語は、水素結合により会合して二本鎖核酸分子を形成するプリンおよびピリミジンヌクレオチドの能力を指す。以下の塩基対すなわちグアニンおよびシトシン；アデニンおよびチミン；ならびにアデニンおよびウラシルが相補性により関係する。本明細書で使用されるところの「相補的」は、前記分子の長さ全体にわたり２種の一本鎖核酸分子を含んでなる実質的に全部の塩基対に前述の関係が当てはまることを意味している。「部分的に相補的」は、２種の一本鎖核酸分子の一方が、該分子の一方の一部分が一本鎖のまま留まるような他者より長さが短い、前述の関係を指す。
【００３４】
本明細書で使用されるところの「ハイブリダイゼーション」という用語は、一本鎖核酸分子がヌクレオチド塩基対形成により相補鎖と結合する過程を指す。
【００３５】
「ストリンジェンシー」という用語はハイブリダイゼーション条件を指す。高ストリンジェンシー条件は非相同塩基対形成を嫌う。低ストリンジェンシー条件は反対の効果を有する。ストリンジェンシーは例えば温度および塩濃度により変えることができる。「ストリンジェンシー条件」は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、Ｄｅｎｈａｒｄｔ液、１０％デキストラン硫酸および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含んでなる溶液中４２℃で一夜インキュベーション、次いで０．１×ＳＳＣ中約６５℃でフィルターを洗浄することを指す。さらなる適するハイブリダイゼーション条件を実施例に記述する。
【００３６】
「ベクター」という用語は、宿主細胞による外因性ＤＮＡの複製および／若しくは適切な発現のため宿主細胞中にＤＮＡを移入するのに有用である外因性ＤＮＡのいかなる担体も指す。
【００３７】
本記述を通じて、分子生物学技術の情況で使用される場合の「標準的方法」、「標準的プロトコル」および「標準的手順」という用語は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、編者Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９９４、若しくはＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．とＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー  １９８９のような通常の実験室手引書に見出されるプロトコルおよび手順として理解されるべきである。
【００３８】
本発明の態様
ＨＤＭ２タンパク質、関連タンパク質およびそれらのタンパク質結合フラグメント
本発明はＨＤＭ２のタンパク質結合フラグメントをコードする単離されたポリペプチド分子を提供し、前記フラグメントは、親タンパク質中で連続である最低１０アミノ酸を含んでなるが、しかし親タンパク質中で連続である最低１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、６０、８０、１００、１５０、２００、２５０、３００若しくは３５０アミノ酸を望ましくは含有することができ、また、前記フラグメントは、限定されるものでないがＨＤＭ２タンパク質、プロテアソーム若しくはプロテアソームサブユニットの別の部分を挙げることができる他のタンパク質を結合することが可能である。
【００３９】
本発明は、親タンパク質中で連続である最低１０アミノ酸を含んでなるが、しかし親タンパク質中で連続である最低１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、６０、８０、１００、１５０、２００、２５０、３００若しくは３５０アミノ酸を望ましくは含有しうる、ＨＤＭ２関連タンパク質のタンパク質結合フラグメントをコードする単離されたポリペプチド分子をさらに提供し、そして前記フラグメントは他のタンパク質を結合することが可能である。
【００４０】
特定の一態様において、前記タンパク質結合フラグメントは、
ａ）ＨＤＭ２（配列番号５）のＮ末端ドメイン、
ｂ）ＨＤＭ２（配列番号５）のアミノ酸０−２００、
ｃ）ＨＤＭ２（配列番号５）の中央ドメイン、
ｄ）ＨＤＭ２（配列番号５）のアミノ酸２００−４００、
ｅ）ＨＤＭ２（配列番号５）のアミノ酸２００−３００、若しくは
ｆ）ＨＤＭ２（配列番号５）のアミノ酸３００−４００
を含んでなるポリペプチド配列の一群若しくはポリペプチド配列の一群のメンバーから選択される。
【００４１】
より特定の一態様において、前記タンパク質結合フラグメントは、
ａ）１若しくは２個のＥＤＹ配列（配列番号１１若しくは配列番号１２）またはそれらのホモログであって、前記ホモログは配列番号１１若しくは配列番号１２に対する最低７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８若しくは９９％の同一性を有するか、
ｂ）ＨＤＭ２のアミノ酸配列２５２−２６４（配列番号１１）若しくは３８７−３９９（配列番号１２）またはそれらのホモログであって、前記ホモログは配列番号１１若しくは配列番号１２に対する最低７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８若しくは９９％の同一性を有するか、あるいは
ｃ）ＨＤＭ２（配列番号５）のアミノ酸２５７−２５９若しくは３９２−３９４またはそれらのホモログであって、前記ホモログは、配列番号５に対する最低７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８若しくは９９％の配列同一性を有する、
を含んでなるポリペプチド配列の一群若しくはポリペプチド配列の一群のメンバーから選択される。
【００４２】
なおさらなる特定の一態様において、前記タンパク質結合フラグメントは、
ａ）１若しくは２個のＥＤＹ配列（配列番号１１若しくは配列番号１２）またはそれらのホモログであって、前記ホモログは配列番号１１若しくは配列番号１２に対する最低７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８若しくは９９％の同一性を有するか、
ｂ）ＨＤＭ２のアミノ酸２５２−２６４（配列番号１１）若しくは３８７−３９９（配列番号１２）またはそれらのホモログであって、前記ホモログは配列番号１１若しくは配列番号１２に対する最低７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８若しくは９９％の同一性を有するか、あるいは、
ｃ）ＨＤＭ２（配列番号５）のアミノ酸２５７−２５９若しくは３９２−３９４またはそ
れらのホモログであって、前記ホモログは配列番号５に対する最低７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８若しくは９９％の配列同一性を有する、
よりなるポリペプチド配列の一群若しくはポリペプチド配列の一群のメンバーから選択される。
【００４３】
本発明は前記ＨＤＭ２フラグメントをコードする単離された核酸をさらに提供し、前記フラグメントは上で定義されたところのタンパク質結合ドメインを最小にコードするとみられる。該核酸はＲＮＡ、若しくはｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを包含するＤＮＡ、とりわけＤＮＡであり得る。
【００４４】
特定の一態様において、前記核酸配列は、
ａ）ＨＤＭ２（配列番号２５）のＮ末端ドメイン、
ｂ）ＨＤＭ２（配列番号２５）のヌクレオチド配列０−６００、
ｃ）ＨＤＭ２（配列番号２５）の中央ドメイン、
ｄ）ＨＤＭ２（配列番号２５）のヌクレオチド配列６００−１６００、
ｅ）ＨＤＭ２（配列番号２５）のヌクレオチド配列６００−１１００、
ｆ）ＨＤＭ２（配列番号２５）のヌクレオチド配列１１００−１６００
を含んでなるヌクレオチド配列の一群若しくはヌクレオチド配列の一群のメンバーから選択される。
【００４５】
より特定の一態様において、前記核酸配列は、
ａ）１若しくは２個のＥＤＹヌクレオチド配列（配列番号１８若しくは配列番号１９）またはそれらのホモログであって、前記ホモログは配列番号１８若しくは配列番号１９に対する最低７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８若しくは９９％の同一性を有するか、
ｂ）ＨＤＭ２のヌクレオチド配列１０５０−１０８８（配列番号１８）若しくは１４５５−１４９３（配列番号１９）またはそれらのホモログであって、前記ホモログは配列番号１８若しくは配列番号１９に対する最低７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８若しくは９９％の同一性を有するか、あるいは、
ｃ）配列番号１８若しくは配列番号１９のヌクレオチド配列１６−２４またはそれらのホモログであって、前記ホモログは配列番号２５に対する最低７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８若しくは９９％の配列同一性を有する、
を含んでなるヌクレオチド配列の一群若しくはヌクレオチド配列の一群のメンバーから選択される。
【００４６】
なおさらなる特定の一態様において、前記核酸配列は、
ａ）１若しくは２個のＥＤＹヌクレオチド配列（配列番号１８若しくは配列番号１９）またはそれらのホモログであって、前記ホモログは配列番号１８若しくは配列番号１９に対する最低７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８若しくは９９％の同一性を有するか、
ｂ）ＨＤＭ２のヌクレオチド配列１０５０−１０８８（配列番号１８）若しくは１４５５−１４９３（配列番号１９）またはそれらのホモログであって、前記ホモログは配列番号１８若しくは配列番号１９に対する最低７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８若しくは９９％の同一性を有するか、あるいは
ｃ）配列番号１８若しくは配列番号１９のヌクレオチド配列１６−２４またはそれらのホモログであって、前記ホモログは配列番号２５に対する最低７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８若しくは９９％の配列同一性を有する、
よりなるヌクレオチド配列の一群若しくはヌクレオチド配列の一群のメンバーから選択される。
【００４７】
ＨＤＭ２内の結合フラグメントの同一性および特徴付けを考えれば、
（ａ）上述されたポリヌクレオチドに相補的である核酸分子；
（ｂ）上のポリヌクレオチドの最低１５の連続する塩基を含んでなる核酸分子；
（ｃ）上述されたポリヌクレオチド分子にストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸分子；若しくは
（ｄ）上述されたポリヌクレオチドのいずれかのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に遺伝暗号の結果として縮重されるヌクレオチド配列を含んでなるＨＤＭ２のタンパク質結合フラグメントをコードする核酸分子
よりなる群若しくは群のメンバーから選択される単離かつ精製された核酸分子を提供することもまた本発明の一目的である。
【００４８】
本発明は、上で定義されたところの単離された核酸分子を含んでなるベクター、ならびにこうしたベクターで安定に形質転換されている宿主細胞もまた提供する。従って、特定の一態様において、前記ベクターは、ｐＧＬ３ｌｕｃ、ｐＢＬＣＡＴ５（ＬＭＢＰ  ２４５１）、ｐＧＭＣＳＦｌａｃＺ（ＬＭＢＰ  ２９７９）、ｐＥＧＦＰ若しくはｐＳＥＡＰｂａｓｉｃ（ＤＭＢ  ３１１５）のような発現ベクターであり、ＬＭＢＰおよびＤＭＢ番号はベルギー微生物共同コレクション（Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｃｏ−ｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｓ）のこれらの発現ベクターの受託番号を指す。本発明のベクターを内部に持つ宿主細胞もまた本発明に包含される。こうした宿主細胞は、原核生物細胞、単細胞真核生物細胞、若しくは多細胞生物体由来の細胞であり得る。宿主細胞は、従って、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞のような細菌細胞；サッカロミセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）若しくはピキア  パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）のような酵母細胞、またはＨＥＫ２９３細胞のような哺乳動物細胞であり得る。宿主細胞へのベクターの導入を遂げるのに使用される方法は、組換えＤＮＡ法になじみのある当業者に公知の標準的方法である。
【００４９】
従って、さらなる一態様において、本発明は、ＨＤＭ２、関連タンパク質若しくはそれらのタンパク質結合フラグメントの別のタンパク質、プロテアソーム、プロテアソームサブユニット若しくはそれらのタンパク質結合フラグメントとの相互作用を利用するアッセイ若しくは精製方法における、ＨＤＭ２、関連タンパク質若しくはそれらのタンパク質結合フラグメントをコードする単離かつ精製されたポリペプチドの使用に関する。
【００５０】
とりわけ、本発明は、上述された単離かつ精製されたポリペプチドの本発明のアッセイ若しくは方法における使用を包含する。
【００５１】
さらなる一態様において、本発明は、ＨＤＭ２、関連タンパク質若しくはそれらのタンパク質結合フラグメントをコードする上述された単離かつ精製された核酸分子に関し、前記核酸分子は、医薬品としての使用のためＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ若しくはゲノムＤＮＡのいずれかである。
【００５２】
当業者は、遺伝暗号の縮重の結果、ヌクレオチド塩基対の多数の「サイレント」置換を、コードされるアミノ酸（１種若しくは複数）若しくはタンパク質産物の同一性を変えることなく、配列番号１８若しくは配列番号１９と同定される配列または前記配列の上で同定されたフラグメントに導入し得ることを認識するであろう。全部のこうした置換は本発明の範囲内にあることを意図している。
プロテアソーム、プロテアソームサブユニットおよびそれらのタンパク質結合フラグメント。
【００５３】
本発明は、プロテアソーム若しくはプロテアソームサブユニットのタンパク質結合領域
をコードする単離されたポリペプチド分子を提供し、前記フラグメントは親タンパク質中で連続である最低１０アミノ酸を含んでなるが、しかし親タンパク質中で連続である最低１１、１２、１３、１４，１５、２０、３０、４０、６０、８０、１００、１５０、２００、２５０、３００若しくは３５０アミノ酸を望ましくは含有することができ、また、前記フラグメントは例えばＨＤＭ２若しくはそのプロテアソーム結合フラグメントのようなタンパク質を結合することが可能である。
【００５４】
特定の一態様において、プロテアソーム若しくはプロテアソームサブユニットの前記タンパク質結合フラグメントは、限定されるものでないがプロテアソームサブユニットＳ６Ａ、Ｓ６Ｂ、Ｓ５Ａ、Ｓ２若しくはＳ４またはそれらのホモログに存在するタンパク質結合フラグメントを挙げることができるポリペプチド配列の一群若しくはポリペプチド配列の一群のメンバーから選択され、前記ホモログは、配列番号１，配列番号２、配列番号３、配列番号４若しくは配列番号６に対する最低７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８若しくは９９％の同一性を有する。
【００５５】
より特定の一態様において、前記タンパク質結合フラグメントは、
ａ）アミノ酸配列、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０若しくは配列番号１３またはそれらのホモログであって、前記ホモログは、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０若しくは配列番号１３のいずれか１種に対する最低７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８若しくは９９％の同一性を有するか、
ｂ）Ｓ６Ａのアミノ酸４１３−４２５（配列番号７）、Ｓ６Ｂのアミノ酸３５６−３６８（配列番号８）、Ｓ５Ａのアミノ酸３１８−３３１（配列番号９）、Ｓ２のアミノ酸４３２−４４４（配列番号１０）若しくはＳ４のアミノ酸４３１−４４０（配列番号１３）またはそれらのホモログであって、前記ホモログは、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０若しくは配列番号１３に対する最低７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８若しくは９９％の配列同一性を有するか、あるいは
ｃ）Ｓ６Ａ（配列番号１）のアミノ酸４１８−４２０、Ｓ６Ａ（配列番号２）のアミノ酸４１８−４２０、Ｓ６Ｂ（配列番号３）のアミノ酸３６１−３６３、Ｓ５Ａ（配列番号４）のアミノ酸３２３−３２６、Ｓ２（配列番号６）のアミノ酸４３７−４３９若しくはＳ４（配列番号１３）のアミノ酸４３６−４３９またはそれらのホモログであって、前記ホモログは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４若しくは配列番号６に対する最低７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８若しくは９９％の配列同一性を有する、
を含んでなるポリペプチド配列の一群若しくはポリペプチド配列の一群のメンバーから選択される。
【００５６】
なおさらなる特定の一態様において、前記タンパク質結合フラグメントは、
ａ）アミノ酸配列、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０若しくは配列番号１３またはそれらのホモログであって、前記ホモログは、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０若しくは配列番号１３のいずれか１種に対する最低７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８若しくは９９％の同一性を有するか、
ｂ）Ｓ６Ａのアミノ酸４１３−４２５（配列番号７）、Ｓ６Ｂのアミノ酸３５６−３６８（配列番号８）、Ｓ５Ａのアミノ酸３１８−３３１（配列番号９）、Ｓ２のアミノ酸４３２−４４４（配列番号１０）若しくはＳ４のアミノ酸４３１−４４０（配列番号１３）またはそれらのホモログであって、前記ホモログは、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０若しくは配列番号１３に対する最低７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８若しくは９９％の配列同一性を有するか、あるいは
ｃ）Ｓ６Ａの（配列番号１）アミノ酸４１８−４２０、Ｓ６Ａ（配列番号２）のアミノ酸４１８−４２０、Ｓ６Ｂ（配列番号３）のアミノ酸３６１−３６３、Ｓ５Ａ（配列番号４）のアミノ酸３２３−３２６、Ｓ２（配列番号６）のアミノ酸４３７−４３９若しくはＳ
４（配列番号１３）のアミノ酸４３６−４３９またはそれらのホモログであって、前記ホモログは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４若しくは配列番号６に対する最低７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８若しくは９９％の配列同一性を有する、
よりなるポリペプチド配列の一群若しくはポリペプチド配列の一群のメンバーから選択される。
【００５７】
本発明は、上で定義されたところのタンパク質結合ドメインをコードする単離された核酸をさらに提供する。該核酸はＲＮＡ、若しくはｃＤＮＡおよびゲノムを包含するＤＮＡ、とりわけＤＮＡであり得、そしてさらなる一態様において、プロテアソームサブユニットからのタンパク質結合ドメインおよびＨＤＭ２結合ドメインをコードする核酸配列から選択される。
【００５８】
特定の一態様において、単離された核酸分子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４若しくは配列番号６よりなる群から選択されるアミノ酸配列よりなるプロテアソームサブユニットＳ６ａ、Ｓ６ｂ、Ｓ５ａ、Ｓ４若しくはＳ２に存在する結合フラグメントをコードする。より特定の一態様において、前記単離された核酸は、Ｓ６Ａのアミノ酸４１３−４２５（配列番号７）、Ｓ６Ｂのアミノ酸３５６−３６８（配列番号８）、Ｓ５Ａのアミノ酸３１８−３３１（配列番号９）、Ｓ２のアミノ酸４３２−４４４（配列番号１０）若しくはＳ４のアミノ酸４３１−４４０（配列番号１３）またはそれらのホモログ（前記ホモログは、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０若しくは配列番号１３に対する最低７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８若しくは９９％の配列同一性を有し）、あるいは前述の核酸配列のいずれかに対する最低７０、８０、９０、９５、９７、若しくは９８％の配列同一性を有する核酸配列よりなるタンパク質結合領域を含んでなるフラグメントをコードする。
【００５９】
より特定の一態様において、前記核酸配列は、
ａ）プロテアソームサブユニットＳ６ａ、Ｓ６ｂ、Ｓ５ａ、Ｓ４若しくはＳ２のＥＤＹヌクレオチド配列であって、前記ホモログは、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７若しくは配列番号２０に対する最低７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８若しくは９９％の同一性を有する。
ｂ）プロテアソームサブユニットＳ６ａ、Ｓ６ｂ、Ｓ５ａ、Ｓ４若しくはＳ２の配列番号２１のヌクレオチド配列１４３１−１４６９、配列番号２２の１１０３−１１４１、配列番号２３の１０１４−１０５５、配列番号２４の１３２７−１３６５、若しくは配列番号２６の１３３９−１３７１またはそれらのホモログであって、前記ホモログは、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４若しくは配列番号１６に対する最低７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８若しくは９９％の同一性を有する。
ｃ）配列番号１４、配列番号１５若しくは配列番号１７のヌクレオチド配列１−３９、配列番号１６のヌクレオチド配列１−４２、または配列番号２０のヌクレオチド配列１−３３あるいはそれらのホモログであって、前記ホモログは、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７若しくは配列番号２０に対する最低７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８若しくは９９％の配列同一性を有する。
ｄ）配列番号１４、配列番号１５若しくは配列番号１７のヌクレオチド配列１６−２４、配列番号１６若しくは配列番号２０のヌクレオチド配列１６−２７またはそれらのホモログであって、前記ホモログは、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７若しくは配列番号２０に対する最低７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８若しくは９９％の配列同一性を有する
を含んでなるヌクレオチド配列の一群若しくはヌクレオチド配列の一群のメンバーから選択される。
【００６０】
なおさらなる特定の一態様において、前記核酸配列は、
ａ）プロテアソームサブユニットＳ６ａ、Ｓ６ｂ、Ｓ５ａ、Ｓ４若しくはＳ２のＥＤＹヌクレオチド配列であって、前記ホモログは、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７若しくは配列番号２０に対する最低７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８若しくは９９％の同一性を有する。
ｂ）プロテアソームサブユニットＳ６ａ、Ｓ６ｂ、Ｓ５ａ、Ｓ４若しくはＳ２の配列番号２１のヌクレオチド配列１４３１−１４６９、配列番号２２の１１０３−１１４１、配列番号２３の１０１４−１０５５、配列番号２４の１３２７−１３６５若しくは配列番号２６の１３３９−１３７１またはそれらのホモログであって、前記ホモログは、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４若しくは配列番号１６に対する最低７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８若しくは９９％の同一性を有する。
ｃ）配列番号１４、配列番号１５若しくは配列番号１７のヌクレオチド配列１−３９、配列番号１６のヌクレオチド配列１−４２または配列番号２０のヌクレオチド配列１−３３、あるいはそれらのホモログであって、前記ホモログは、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７若しくは配列番号２０に対する最低７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８若しくは９９％の配列同一性を有する。
ｄ）配列番号１４、配列番号１５若しくは配列番号１７のヌクレオチド配列１６−２４、配列番号１６若しくは配列番号２０のヌクレオチド配列１６−２７またはそれらのホモログであって、前記ホモログは、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７若しくは配列番号２０に対する最低７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８若しくは９９％の配列同一性を有する、
よりなるヌクレオチド配列の一群若しくはヌクレオチド配列の一群のメンバーから選択される。
【００６１】
プロテアソームのコンセンサス結合領域の同一性および特徴付けを考えれば、
ａ）上のポリヌクレオチドに相補的である核酸分子；
ｂ）上のポリヌクレオチドの最低１５の連続する塩基を含んでなる核酸分子；
ｃ）上のポリヌクレオチド分子に緊縮条件下でハイブリダイズする核酸分子；若しくは
ｄ）遺伝暗号の結果として上のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に縮重されるヌクレオチド配列を含んでなる、プロテアソームサブユニットのタンパク質結合領域をコードする核酸分子およびそれらの対蹠物
よりなる群から選択される単離かつ精製された核酸分子を提供することもまた本発明の一目的である。
【００６２】
本発明は、上で定義されたところの単離された核酸分子を含んでなるベクター、ならびにこうしたベクターで安定に形質転換されている宿主細胞もまた提供する。従って、特定の一態様において、前記ベクターは、ｐＧＬ３ｌｕｃ、ｐＢＬＣＡＴ５（ＬＭＢＰ  ２４５１）、ｐＧＭＣＳＦｌａｃＺ（ＬＭＢＰ  ２９７９）、ｐＥＧＦＰ若しくはｐＳＥＡＰｂａｓｉｃ（ＤＭＢ  ３１１５）のような発現ベクターであり、ＬＭＢＰおよびＤＭＢ番号はベルギー微生物共同コレクション（Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｃｏ−ｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｓ）のこれらの発現ベクターの受託番号を指す。本発明のベクターを内部に持つ宿主細胞もまた本発明に包含される。こうした宿主細胞は、原核生物細胞、単細胞真核生物細胞、若しくは多細胞生物体由来の細胞であり得る。宿主細胞は、従って、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞のような細菌細胞；サッカロミセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）若しくはピキア  パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）のような酵母細胞、またはＨＥＫ２９３細胞のような哺乳動物細胞であり得る。宿主細胞へのベクターの導入を遂げるのに使用される方法は、組換えＤＮＡ法になじみのある当業者に公知の標準的方法である。
【００６３】
従って、さらなる一態様において、本発明は、ＨＤＭ２および関連タンパク質のプロテアソーム、プロテアソームサブユニット若しくはそれらのタンパク質結合フラグメントとの相互作用を利用するアッセイにおける、プロテアソーム、プロテアソームサブユニット若しくはそれらのタンパク質結合フラグメントをコードする単離かつ精製されたポリペプチドの使用に関する。
【００６４】
とりわけ、本発明は、プロテアソーム、プロテアソームサブユニット若しくはそれらのタンパク質結合フラグメントをコードする上述された単離かつ精製されたポリペプチドの本発明のアッセイでの使用を包含する。
【００６５】
医薬品としての使用のための、プロテアソームサブユニット、タンパク質結合フラグメント若しくはＨＤＭ２結合フラグメントをコードする上述された単離かつ精製されたポリペプチドおよび核酸分子を提供することもまた、本発明の一態様である。
【００６６】
当業者は、遺伝暗号の縮重の結果、ヌクレオチド塩基対の多数の「サイレント」置換を、コードされるアミノ酸（１種若しくは複数）若しくはタンパク質産物の同一性を変えることなく、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７若しくは配列番号２０と同定される配列または前記配列の上で同定されたフラグメントに導入し得ることを認識するであろう。全部のこうした置換は本発明の範囲内にあることを意図している。
【００６７】
核酸およびポリペプチド配列の同一性パーセントは、問い合わせ配列と参照配列を比較する商業的に入手可能なアルゴリズムを使用して計算し得る。以下のプログラム（国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）により提供される）すなわちＢＬＡＳＴ、ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴＮおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを使用して相同性／同一性を決定することができ、これらはデフォルトのパラメータとともに使用しうる。
【００６８】
アルゴリズムＧＡＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、ウィスコンシン州マディソン）は、一致の数を最大にしかつギャップの数を最少にする、２種の完全な配列を整列すためのＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈのアルゴリズムを使用する。一般に、デフォルトのパラメータを使用し、ｇａｐ  ｃｒｅａｔｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ＝１２およびｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ＝４である。
【００６９】
核酸配列若しくはその一部分と問い合わせ配列の間の最良の全体的一致の別の決定方法は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．、６；２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムの使用である。該プログラムは包括的配列アライメントを提供する。前記包括的配列アライメントの結果は同一性パーセントである。同一性パーセントを計算するためのＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢ検索で使用される適するパラメータは、Ｍａｔｒｉｘ＝Ｕｎｉｔａｒｙ、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝４、Ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝３０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ  Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ  Ｓｉｚｅ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝０．０５およびＷｉｎｄｏｗ  Ｓｉｚｅ＝５００若しくはヌクレオチド塩基での問い合わせ配列長さのいずれか短い方である。アミノ酸アライメントの同一性および類似性パーセントを計算するのに適するパラメータは、Ｍａｔｒｉｘ＝ＰＡＭ  １５０、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝２０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ  Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ  Ｓｉｚｅ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝０．０５およびＷｉｎｄｏｗ  Ｓｉｚｅ＝５００若しくはヌクレオチド塩基での問い合わせ配列長さのいずれか短い方である。
【００７０】
本発明のタンパク質およびペプチドは全部の可能な保存的アミノ酸変化を包含し、「保存的アミノ酸変化」は、ある種のアミノ酸の技術に認識される置換可能性に基づく、親分子の生物学的活性に影響を及ぼさない親受容体タンパク質若しくはペプチド中の１個若しくはそれ以上のアミノ酸残基の置換を指す（例えばＭ．Ｄａｙｈｏｆｆ、Ｉｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｖｏｌ．５、Ｓｕｐｐ．３、３４５−３５２ページ、１９７８を参照されたい）。
【００７１】
当業者は、本発明のポリペプチド、すなわちＨＤＭ２タンパク質、関連タンパク質、それらのタンパク質結合フラグメント、プロテアソーム、プロテアソームサブユニットおよびそれらのタンパク質結合フラグメントを、例えばハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅若しくは新規ＤＮＡ合成を包含する複数の組換えＤＮＡ技術により得ることができることを認識するであろう（例えば、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓら  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、第１４章（１９８９）を参照されたい）。
【００７２】
本発明のペプチドおよび誘導体は、十分に確立された標準的な液相若しくは好ましくは固相ペプチド合成法に従って容易に製造し得、それらの一般的記述は広範に入手可能であるか、または、それらは液相法、若しくは固相、液相および溶液化学のいずれかの組み合わせにより溶液中で製造しうる。
【００７３】
本発明のポリペプチドは、例えばコーディング核酸からの発現による産生後に単離かつ／若しくは精製（例えば抗体を使用して）しうる。
【００７４】
単離かつ／若しくは精製されたポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、最低１種の付加的な成分を包含しうる組成物、例えば製薬学的に許容できる賦形剤、ベヒクル若しくは担体を包含する製薬学的組成物の製剤で使用しうる。
【００７５】
本発明のポリペプチドは、免疫原として、若しくは、そうでなければ特定の抗体を得ることにおいて使用しうる。抗体はポリペプチドの精製および他の操作、診断スクリーニングならびに治療の情況で有用である。本発明のポリペプチドに対する抗体は、有利には当該技術分野で既知である技術により製造しうる。例えば、ポリクローナル抗体は、マウスのような宿主動物に増殖因子若しくはそのエピトープを接種すること、および免疫血清を回収することにより製造しうる。モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  Ｒ．とＭｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ．、Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６、４９５−４９７により記述されたような既知技術により製造しうる。
【００７６】
アッセイ
本発明のアッセイは、生物学的活性若しくは結合タンパク質についての化合物のスクリーニングの技術分野で公知の多くの形式で設計し得る。
【００７７】
本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、１種若しくはそれ以上の疾患状態、とりわけ上で挙げられた疾患を包含する１種若しくはそれ以上の生物学的機能を司る。従って、例えばＵＰＳ経路を妨害する化合物を同定するためのスクリーニング方法を考案することが望ましい。
【００７８】
本発明のアッセイは、有利には、ＨＤＭ２とプロテアソーム、プロテアソームサブユニットおよびそれらの結合フラグメントの間の相互作用の破壊が例えばユビキチン化されたタンパク質の下流での標的を定めた分解に影響を及ぼすという事実を活用する。
【００７９】
さらに、本発明は、ＨＤＭ２、関連タンパク質若しくはそれらのタンパク質結合フラグメントに特異的に結合する化合物の同定方法を包含し、前記化合物は、ＨＤＭ２、関連タンパク質若しくはそれらのタンパク質結合フラグメントと別のタンパク質、プロテアソーム若しくはそのサブユニットの間の相互作用に影響を及ぼす。
【００８０】
ＨＤＭ２、関連タンパク質若しくはそれらのタンパク質結合フラグメントへの化合物の結合は、アミノ酸の単純な直線的伸長のみを必要とし得るか、例えば改変された（例えばリン酸化若しくは水酸化）またはコンホメーション的に感受性のモチーフを含み得るか、あるいは該タンパク質に沿って特定の方法で分布されている数種のアミノ酸配列を必要とし得る。
【００８１】
本発明の第一の方法は、ＨＤＭ２、関連タンパク質若しくはそれらのタンパク質結合フラグメントの化合物との相互作用がＨｄｍ２結合タンパク質をタンパク質分解に対し保護する最低１段階を該アッセイが組み込むため、当該技術分野で記述されたものと異なる。より具体的には、該化合物はＵＰＳ経路によるタンパク質分解に対しＨｄｍ２結合タンパク質を保護する。
【００８２】
従って、本発明は、プロテアソーム、プロテアソームサブユニット若しくはそれらのタンパク質結合フラグメントへのＨｄｍ２、関連タンパク質若しくはそれらのタンパク質結合フラグメントの結合に影響を及ぼす化合物の同定方法を提供し、前記方法は
ａ）試験されるべき化合物を、ＨＤＭ２タンパク質若しくは関連タンパク質またはそれらのタンパク質結合フラグメントと接触させること、および
ｂ）前記化合物が、ユビキチン−プロテアソームタンパク質分解経路によるＨｄｍ２結合タンパク質のタンパク質分解に影響を及ぼすかどうか決定すること
を含んでなる。
【００８３】
本発明の一態様において、ＨＤＭ２結合タンパク質のタンパク質分解は、細胞、細胞ライセート、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＵＰＳ系若しくはｉｎ  ｖｉｖｏ系で遂げることができる。
【００８４】
別の態様において、Ｈｄｍ２結合タンパク質はｐ５３である。
【００８５】
別の態様において、Ｈｄｍ２結合タンパク質はｐ５３以外である。
【００８６】
本発明の第二の方法は、ポリペプチドと直接若しくは間接的に会合した標識によって、ポリペプチド、または該ポリペプチドを持つ細胞若しくは膜、またはそれらの融合タンパク質への候補化合物の結合を単純に測定しうる。それらのアッセイは、それらがＥＤ（Ｘ）Ｙ配列若しくはそれらの対蹠物を適用するために当該技術と異なる。
【００８７】
従って、一態様において、該スクリーニング方法は、標識ＨＤＭ２、標識関連タンパク質若しくは標識したそれらのフラグメントを含んでなり、前記標識は、プロテアソームサブユニット若しくはそのタンパク質結合フラグメントに結合されたＨＤＭ２、関連タンパク質若しくはそれらのタンパク質結合フラグメントの量に対する試験化合物の影響を測定するのに使用する。
【００８８】
従って、本発明は、プロテアソーム、プロテアソームサブユニット若しくはそれらのタンパク質結合フラグメントへのＨｄｍ２、関連タンパク質若しくはそれらのタンパク質結合フラグメントの結合に影響を及ぼす化合物の同定方法を提供し、前記方法は
ａ）プロテアソームサブユニット若しくはそのタンパク質結合フラグメントを、標識ＨＤＭ２、標識関連タンパク質若しくは標識したそれらのタンパク質結合フラグメントととも
にインキュベートすること、
ｂ）試験化合物をインキュベーション混合物に添加すること、および
ｃ）プロテアソームサブユニット若しくはそのタンパク質結合フラグメントに結合された標識ＨＤＭ２、標識関連タンパク質若しくは標識したそれらのタンパク質結合フラグメントの量に対する試験化合物の影響を測定すること
を含んでなる。
【００８９】
あるいは、該スクリーニング方法は標識プロテアソームサブユニット若しくは標識したそのタンパク質結合フラグメントを含んでなり、前記標識は、プロテアソームサブユニット若しくはそのタンパク質結合フラグメントに結合されたＨＤＭ２、関連タンパク質若しくはそれらのタンパク質結合フラグメントの量に対する試験化合物の影響を測定するのに使用する。
【００９０】
従って、本発明は、Ｈｄｍ２、関連タンパク質若しくはそれらのタンパク質結合フラグメントのプロテアソーム、プロテアソームサブユニット若しくはそれらのタンパク質結合フラグメントへの結合に影響を及ぼす化合物の同定方法を提供し、前記方法は
ａ）標識プロテアソームサブユニット若しくは標識したそのタンパク質結合フラグメントを、ＨＤＭ２、関連タンパク質若しくはそれらのタンパク質結合フラグメントとともにインキュベートすること、
ｂ）試験化合物を該インキュベーション混合物に添加すること、および
ｃ）ＨＤＭ２、関連タンパク質若しくはそれらのタンパク質結合フラグメントに結合された、標識プロテアソームサブユニット若しくは標識したそのタンパク質結合フラグメントの量に対する試験化合物の影響を測定すること
を含んでなる。
【００９１】
可能な結合アッセイの例は、下の実施例で提供されるところの免疫沈降アッセイ、若しくはＢｉａｃｏｒｅ装置により活用される表面プラズモン共鳴効果の使用（Ｍａｌｍｑｖｉｓｔ  Ｍ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｔｒａｎｓ．１９９９  Ｆｅｂ；２７（２）：３３５−４０）である。後者において、本発明のポリペプチドのＦＬＡＧ標識若しくはＨｉｓ標識バージョンをＢｉａｃｏｒｅのバイオセンサーチップに結合し得、そして、化合物の存在および非存在下で結合パートナーの結合を検査して結合部位の競合相手を同定し得る。例えば、一態様において、上で定義されたところのプロテアソームサブユニットをＦｌａｇ標識を使用してＢｉａｃｏｒｅチップに固定することができ、そして化合物の存在および非存在下でタンパク質若しくはそのフラグメントの結合を検査して結合部位の競合相手を同定することができる。あるいは、上で定義されたところのプロテアソームのＨＤＭ２結合フラグメント若しくはそのホモログをＦｌａｇ標識を使用してＢｉａｃｏｒｅチップに固定することができ、そして化合物の存在および非存在下でＨＤＭ２若しくはそのプロテアソーム結合フラグメントの結合を検査して結合部位の競合相手を同定することができる。
【００９２】
本発明のポリペプチドの標識は、放射標識リガンドの結合および競合相手による該結合部位のこうした放射リガンドの置換を検出するための慣習的フィルター結合アッセイ（例えばＢｒａｎｄｅｌフィルターアッセイ装置を使用する）若しくはハイスループットのシンチレーション近接型結合アッセイ（ＳＰＡおよびＣｙｔｏｓｔａｒ−Ｔフラッシュプレート技術；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で前記分子を固定するのにもまた有用である。放射活性は、９６、３８４、１５３６マイクロタイターウェル形式から迅速測定を行うことが可能なＰａｃｋａｒｄ  Ｔｏｐｃｏｕｎｔ若しくは類似の装置で測定し得る。ＳＰＡ／Ｃｙｔｏｓｔａｒ−Ｔ技術はハイスループットスクリーニングの影響をとりわけ受けやすく、そして従ってこの技術は標準的リガンドを置換することが可能な化合物についてのスクリーニングとして使用するのに適する。
【００９３】
さらに、これらのスクリーニング方法は、酵素の酵素活性に適切な検出系を使用して、前記酵素の活性化若しくは阻害により生成されるシグナルを候補化合物がもたらすかどうかを試験しうる。酵素活性は一般に、プロセシングに際して測定可能なシグナルを提供する適切な基質を使用して評価する。
【００９４】
化合物は、多様な供給源、例えば細胞、細胞を含まない調製物、化学物質ライブラリーおよび天然産物の混合物から同定しうる。そのように同定されるこうしたアゴニスト若しくはアンタゴニストは、場合によっては受容体ポリペプチドの天然の若しくは修飾ペプチド、リガンド、酵素などでありうるか；またはそれらの構造若しくは機能の模倣物でありうる（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １（２）：第５章（１９９１）を参照されたい）。
【００９５】
本発明の一態様において、ＨＤＭ２、関連タンパク質若しくはそれらのタンパク質結合フラグメントのプロテアソーム、プロテアソームサブユニット若しくはそれらのタンパク質結合フラグメントへの結合に影響を及ぼす化合物は、ペプチド、より具体的には上述されたポリペプチドの１種、若しくは前記ペプチドの融合タンパク質である。
【００９６】
さらなる一局面において、本発明は、溶質（ｓｏｌｕｔｅ）支持体に固定した本発明のペプチド若しくはペプチド模倣物と細胞画分を接触させること、およびそれから結合パートナーを溶離することを含んでなる、タンパク質例えばＨＤＭ２結合タンパク質若しくは関連タンパク質、プロテアソームサブユニットまたはプロテアソーム結合タンパク質を含有する細胞画分からのそれらの単離方法を提供する。
【００９７】
本発明の別の態様において、プロテアソーム、プロテアソームサブユニット若しくはそれらのタンパク質結合フラグメントへのＨＤＭ２、関連タンパク質若しくはそれらのタンパク質結合フラグメントの結合に影響を及ぼす化合物は、小分子、より具体的には化合物ＪＮＪ  ＃１である。
【００９８】
ＥＤ（Ｘ）Ｙ配列の発見を、
ａ）ＨＤＭ２、関連タンパク質若しくはそれらのタンパク質結合フラグメントでプロテアソームサブユニット若しくはそのタンパク質結合フラグメントをプロービングすること、ｂ）ＨＤＭ２、関連タンパク質若しくはそれらのタンパク質結合フラグメントと相互作用するプロテアソームサブユニット若しくはそのタンパク質結合フラグメント（または逆もまた真）の結合部位の接触原子を同定すること、
ｃ）（ｂ）で同定された原子と相互作用する試験化合物を設計すること、および
ｄ）前記設計された試験化合物を、プロテアソームサブユニット、そのタンパク質結合フラグメント、ＨＤＭ２、関連タンパク質若しくはそれらのタンパク質結合フラグメントと接触させて、ＨＤＭ２とプロテアソームの間の相互作用を調節する、若しくはユビキチン−プロテアソームタンパク質分解を調節する前記化合物の能力を測定すること
により、プロテアソームサブユニットへのＨＤＭ２若しくは関連タンパク質の間の結合のアンタゴニストの構造に基づくすなわち合理的な設計方法でもまた使用しうることが、当業者により容易に認識されるであろう。
【００９９】
受容体および酵素のコンホメーションのモデルを創製かつ利用するのに適切なハードウェアおよびソフトウェア双方を包含する分子モデル化技術が当該技術分野で既知である。
【０１００】
多数のコンピュータプログラムが、本明細書に記述される方法での潜在的に相互作用する化合物のコンピュータモデル化、モデル構築、ならびにコンピュータでの同定、選択および評価の過程に利用可能でありかつ適する。これらは、例えば、ＧＲＩＤ（英国オック
スフォード大学から入手可能）、ＭＣＳＳ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴから入手可能）、ＡＵＴＯＤＯＣＫ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒｏｕｐから入手可能）、ＦＬＥＸ  Ｘ（Ｔｒｉｐｏｓ、ミズーリ州セントルイスから入手可能）、ＤＯＣＫ（カリフォルニア大学、カリフォルニア州サンフランシスコから入手可能）、ＣＡＶＥＡＴ（カリフォルニア大学バークレー校から入手可能）、ＨＯＯＫ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴから入手可能）、ならびにＭＡＣＣＳ−３Ｄ（ＭＤＬ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州サンレアンドロから入手可能）、ＵＮＩＴＹ（Ｔｒｉｐｏｓ、ミズーリ州セントルイスから入手可能）およびＣＡＴＡＬＹＳＴ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴから入手可能）のような３Ｄデータベースシステムを包含する。潜在的候補物質は、ＬＵＤＩ（Ｂｉｏｓｙｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州サンディエゴから入手可能）、ＬＥＧＥＮＤ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴから入手可能）およびＬＥＡＰＦＲＯＧ（Ｔｒｉｐｏｓ、ミズーリ州セントルイスから入手可能）のようなソフトウェアパッケージを使用してコンピュータで「新規」にもまた設計しうる。化合物の変形エネルギーおよび静電反発は、ＧＡＵＳＳＩＡＮ  ９２、ＡＭＢＥＲ、ＱＵＡＮＴＡ／ＣＨＡＲＭＭおよびＩＮＳＩＧＨＴ  ＩＩ／ＤＩＳＣＯＶＥＲのようなプログラムを使用して解析しうる。これらのコンピュータ評価およびモデル化技術は、例えばＳｉｌｉｃｏｎ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ、Ｓｕｎ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓおよび他者から入手可能なワークステーションを包含するいずれかの適するハードウェアで実施しうる。これらのモデル化技術、方法、ハードウェアおよびソフトウェアパッケージは代表的なものであり、そして包括的一覧であることを意図していない。当該技術分野で既知の他のモデル化技術もまた本発明により使用しうる。例えばＮ．Ｃ．Ｃｏｈｅｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）を参照されたい。
【０１０１】
本発明の一態様において、プロテアソーム結合ドメインの三次元構造を、Ｓ５ａプロテアソームサブユニットの原子座標（タンパク質データベースＩＥＵＬ）±１０Å以下、好ましくは５Å以下の前記アミノ酸のバックボーン原子の標準偏差を使用して生成する。
【０１０２】
本スクリーニングにおいては、結合部位へのこうした化合物の適合の質を形状相補性若しくは推定相互作用エネルギー（Ｍｅｎｇ，Ｅ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｃｏｍａ．Ｃｈｅｍ  １３：５０５−５２４（１９９２））のいずれによっても判断しうる。
【０１０３】
他の分子モデル化技術もまた本発明により使用しうる。例えば、Ｃｏｈｅｎ，Ｎ．Ｃ．ら、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３３：８８２−８９４（１９９０）を参照されたい。Ｎａｖｉａ，Ｍ．Ａ．とＭ．Ａ．Ｍｕｒｃｋｏ、”Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ”、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２、ｐｐ．２０２−２１０（１９９２）もまた参照されたい。
【０１０４】
化合物が上の方法により一旦設計若しくは選択されれば、その化合物がプロテアソーム結合ドメイン若しくはタンパク質結合ドメインと結合若しくは相互作用しうる親和性を、コンピュータ評価および／若しくは該化合物を合成した後に生物学的活性を試験することにより試験かつ最適化しうる。阻害剤若しくは化合物は、全体的結合エネルギーが同様である１以上のコンホメーションでプロテアソーム結合ドメイン若しくはタンパク質結合ドメインと相互作用しうる。それらの場合、結合の変形エネルギーは、遊離化合物のエネルギーと、プロテアソーム結合ドメイン若しくはタンパク質結合ドメインに該化合物が結合する場合に観察されるコンホメーションの平均エネルギーの間の差違であると解釈される
べきである。
【０１０５】
プロテアソーム結合ドメイン若しくはタンパク質結合ドメインと結合若しくは会合するとして設計若しくは選択された化合物を、その結合された状態でそれが好ましくは結合ドメインとの反発する静電相互作用を欠くことができるようにさらにコンピュータで最適化しうる。こうした非相補的（例えば静電）相互作用は反発する電荷−電荷、双極子−双極子および電荷−双極子相互作用を包含する。とりわけ、阻害剤が結合されている場合の阻害剤とプロテアソーム結合ドメイン若しくはタンパク質結合ドメインの間の全静電相互作用の総和は、好ましくは結合のエンタルピーに対し中立の若しくは好ましい寄与をなす。弱結合化合物はＳＡＲを決定するようにこれらの方法によってもまた設計することができる。例えば米国特許出願第６０／２７５，６２９号；同第６０／３３１，２３５号；同第６０／３７９，６１７号；および同第１０／０９７，２４９号明細書を参照されたい。
【０１０６】
特定のコンピュータソフトウェアが化合物の変形エネルギーおよび静電相互作用を評価するために当該技術分野で利用可能である。こうした用途のため設計されたプログラムの例は、Ｇａｕｓｓｉａｎ  ９２、ｒｅｖｉｓｉｏｎ  Ｃ（Ｍ．Ｊ．Ｆｒｉｓｃｈ、Ｇａｕｓｓｉａｎ，Ｉｎｃ．、ペンシルベニア州ピッツバーグ、著作権（ＣＯＰＹＲＧＴ）１９９２）；ＡＭＢＥＲ、ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．０（Ｐ．Ａ．Ｋｏｌｌｍａｎ、カリフォルニア大学サンフランシスコ校、著作権１９９４）；ＱＵＡＮＴＡ／ＣＨＡＲＭＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州バーリントン、著作権１９９４）；およびＩｎｓｉｇｈｔ  ＩＩ／Ｄｉｓｃｏｖｅｒ（Ｂｉｏｓｙｓｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴ、著作権１９９４）を包含する。他のハードウェアシステムおよびソフトウェアパッケージが当業者に既知であろう。
【０１０７】
プロテアソーム結合ドメイン若しくはタンパク質結合ドメインと会合する化合物が上述されたとおり一旦最適に選択若しくは設計されていれば、その後、その結合特性を改良若しくは改変するためにその原子若しくは側基のいくつかで置換を行いうる。一般に最初の置換は保存的である。すなわち置換基は元の基とほぼ同一の大きさ、形状、疎水性および電荷を有することができる。もちろん、コンホメーションを変えることが当該技術分野で既知の成分を回避しうることが理解されるべきである。こうした置換化合物をその後、上に詳述された同一のコンピュータの方法により、プロテアソーム結合ドメイン若しくはタンパク質結合ドメインへの適合の効力について解析しうる。
【０１０８】
本発明は本明細書に記述されるポリペプチドのペプチド模倣物もまた提供する。ペプチドアナログは、鋳型ペプチドの特性に類似の特性をもつ非ペプチド薬物として製薬業界で一般に使用されている。これらの型の非ペプチド化合物は「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｍｅｔｉｃｓ）」若しくは「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）」と命名され（Ｆａｕｃｈｅｒｅ（１９８６）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．１５：２９；ＶｅｂｅｒとＦｒｅｉｄｉｎｇｅｒ（１９８５）ＴＩＮＳ  ｐ．３９２；およびＥｖａｎｓら（１９８７）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９）、そしてコンピュータ化分子モデル化の助けを借りて通常開発される。治療上有用なペプチドに構造的に類似であるペプチド模倣物を、同等の治療若しくは予防効果を生じるのに使用しうる。
【０１０９】
本発明は、本明細書に記述される配列および／若しくは構造座標を含有するシステム、とりわけコンピュータに基づくシステムをさらに提供する。こうしたシステムは、プロテアソーム結合ドメイン若しくはタンパク質結合ドメインの構造決定および合理的ドラッグデザインを行うよう設計されている。コンピュータに基づくシステムは、上に詳述されたコンピュータの方法のいずれかで本発明の配列および／若しくは構造座標を解析するのに使用されるハードウェア手段、ソフトウェア手段およびデータ記憶手段を指す。本発明の
コンピュータに基づくシステムの最小ハードウェア手段は、中央処理装置（ＣＰＵ）、入力手段、出力手段およびデータ記憶手段を含んでなる。当業者は、現在入手可能なコンピュータに基づくシステムのどれが本発明での使用に適するかを容易に認識し得る。
【０１１０】
従って、本明細書に記述される構造座標を含有するコンピュータ可読データ記憶媒体を提供することが本発明の一目的である。本明細書で使用されるところの「コンピュータ可読データ記憶媒体」は、コンピュータにより直接読み込み若しくはアクセスされ得るいかなる媒体も指す。こうした媒体は、限定されるものでないが、フロッピーディスク、ハードディスク記憶媒体および磁気テープのような磁気記憶媒体；光ディスク若しくはＣＤ−ＲＯＭのような光記憶媒体；ＲＡＭおよびＲＯＭのような電子記憶媒体；ならびに磁気／光記憶媒体のようなこれらの範疇の混成物を挙げることができる。
【０１１１】
治療的使用
一般に、本発明のポリペプチド（ＥＤ（Ｘ）Ｙ配列およびそれらの対蹠物）ならびにポリヌクレオチドを、上および下で挙げられるような疾患のため治療および予防目的上使用しうる。
【０１１２】
従って、本発明は、医薬品として、および腫瘍の増殖を阻害する処置での使用のための、ポリペプチド、ペプチド、ペプチド模倣物、プロテアソームサブユニット、それらのタンパク質結合フラグメント、ＨＤＭ２、関連タンパク質、それらのタンパク質結合フラグメント、およびポリヌクレオチドから選択される群の１若しくはそれ以上のメンバーの使用に関する。
【０１１３】
従って、本発明は、癌および白血病の処置のための医薬品の製造のための上述されたポリペプチドおよびポリヌクレオチドの使用に関する。
【０１１４】
本発明は、医薬品としての、および腫瘍の増殖を阻害する処置での使用のための、前記ポリペプチドおよび前記ポリヌクレオチドの使用にさらに関する。
【０１１５】
阻害されうる腫瘍の例は、限定されるものでないが、肺癌（例えば腺癌、および非小細胞肺癌を包含する）、膵癌（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）（例えば、膵内分泌腫瘍のような例えば膵癌（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ））、結腸癌（例えば、結腸腺癌および結腸腺腫のような例えば結腸直腸癌）、進行疾患を包含する前立腺癌、リンパ系列の造血器腫瘍（例えば急性リンパ球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫）、骨髄性白血病（例えば急性骨髄性白血病（ＡＭＬ））、甲状腺濾胞癌、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、間葉起源の腫瘍（例えば線維肉腫および横紋筋肉腫）、骨髄腫、奇形癌腫、神経芽腫、神経膠腫、皮膚の良性腫瘍（例えば角化棘細胞腫）、乳癌（例えば進行乳癌）、腎癌、卵巣癌、膀胱癌および表皮癌を挙げることができる。
【０１１６】
従って、さらなる一局面において、本発明は、ＵＰＳ活性を調節するのに有効な量の、製薬学的に許容できる担体と場合によっては組合せの、限定されるものでないがＥＤ（Ｘ）Ｙ配列、それらのタンパク質対蹠物、および前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挙げることができる上述されたところのＵＰＳ調節化合物の治療上有効量を哺乳動物被験体に投与することを含んでなる、ＵＰＳ活性に関する医学的状態の予防、処置若しくは軽減方法を提供する。こうした担体は、限定されるものでないが、生理的食塩水、緩衝生理的食塩水、右旋糖、水、グリセロール、エタノールおよびそれらの組合せを挙げることができる。本発明は、本発明の前述の組成物の成分の１種若しくはそれ以上で満たされた１個若しくはそれ以上の容器を含んでなる製薬学的パックおよびキットにさらに関する。本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、単独で、若しくは治療的化合物のような他の化合物と組合せで使用しうる。
【０１１７】
化合物若しくは組成物は例えば全身若しくは経口投与による投与経路に適合させることができる。全身投与の好ましい形態は、典型的には静脈内注入による注入を包含する。皮下、筋肉内若しくは腹腔内のような他の注入経路を使用し得る。全身投与のための代替手段は、胆汁酸塩若しくはフシジン酸または他の洗剤のような浸透剤を使用する経粘膜および経皮投与を包含する。加えて、本発明のポリペプチド若しくは他の化合物を腸若しくは被包化製剤で処方し得る場合は経口投与もまた可能でありうる。これらの化合物の投与は、貼付剤、軟膏剤、パスタ剤、ゲル剤などの形態で局所および／若しくは限局性でもまたありうる。
【０１１８】
投与されるべき化合物、組成物若しくは製剤は、いずれにしても、処置されている被験体の症状を軽減するのに有効な量の有効成分（１種若しくは複数）の量を含有することができる。
【０１１９】
本化合物の正確な投薬量および投与頻度は、当業者に公知であるとおり、使用される特定の化合物、処置されている特定の状態、処置されている状態の重症度、特定の患者の齢、重量、性、食餌、投与時刻および全身的健康状態、投与様式、ならびに該個体が服用しているかもしれない他の医薬品に依存する。さらに、有効１日量は、処置される被験体の応答に依存して、かつ／若しくは本発明の化合物を処方する内科医の評価に依存して、減少若しくは増大しうる。
【０１２０】
０．２５ないし９５％の範囲の有効成分を含有し、残りは非毒性担体から構成される投薬形態物若しくは組成物を製造しうる。投与様式に依存して、製薬学的組成物は、好ましくは０．０５から９９重量％まで、より好ましくは０．１から７０重量％までの有効成分、および１から９９．９５重量％まで、より好ましくは３０から９９．９重量％までの製薬学的に許容できる担体を含むことができ、全部のパーセンテージは総組成物に基づく。
【０１２１】
経口投与のためには、製薬学的に許容できる非毒性組成物は、例えば製薬学的等級のマンニトール、乳糖、セルロース、セルロース誘導体、クロスカルメロースナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｃｒｏｓｓｃａｒｍｅｌｌｏｓｅ）、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石、ブドウ糖、ショ糖、マグネシウム、炭酸塩、などのような通常使用される賦形剤のいずれかの組み込みにより形成される。こうした組成物は溶液、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放製剤などの形態をとる。こうした組成物は１％〜９５％の有効成分、より好ましくは２〜５０％、最も好ましくは５〜８％を含有しうる。
【０１２２】
非経口投与は、皮下、筋肉内若しくは静脈内いずれかでの注入を一般に特徴とする。注射剤は慣習的形態で、液体の溶液若しくは懸濁液、注入の前の液体中の溶液若しくは懸濁剤に適する固体の形態、または乳剤のいずれかとして製造し得る。適する賦形剤は、例えば水、生理的食塩水、右旋糖、グリセロール、エタノールなどである。加えて、所望の場合は、投与されるべき製薬学的組成物は、少量の例えば酢酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミン、酢酸トリエタノールアミンナトリウム（ｔｒｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ  ｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）などのような、湿潤若しくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤などのような非毒性の補助物質もまた含有しうる。
【０１２３】
こうした非経口組成物に含有される有効成分のパーセンテージは、それらの特定の性質ならびに化合物の活性および被験体の必要性に高度に依存する。しかしながら、溶液中０．１％ないし１０％の有効成分のパーセンテージが使用可能であり、そして組成物が上のパーセンテージにその後希釈されることができる固体である場合にはより高いことができる。好ましくは、組成物は溶液中に０．２〜２％の有効成分を含むことができる。
【０１２４】
最後に、本発明は、（ａ）製薬学的剤が本発明のアッセイを使用して同定され、かつ（ｂ）包装が被験体の細胞増殖性障害を処置するための該剤の使用を示すラベルを含んでなる、包装および製薬学的剤を含んでなる製品を提供する。とりわけ抗癌薬として。
【０１２５】
本発明は後に続く実験の詳細への参照によりより良好に理解されるであろうが、しかし、当業者は、これらはその後に続く請求の範囲により完全に記述されるところの本発明の具体的説明にすぎないことを容易に認識するであろう。加えて、本出願を通じて多様な刊行物が引用される。これらの刊行物の開示は、本発明が関する従来技術をより完全に記述するために本出願に引用することによりここに組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】ＪＮＪ−＃１はＨＤＭ２に結合する。ＧＳＴ−ＨＤＭ２、ＧＳＴ−ＨＤＭＸを１０μＭのＪＮＪ−＃１若しくは対照のためＤＭＳＯとともにインキュベートした。その後４０ｎｇのトリプシンを添加し、そして混合物を氷上で１５分間インキュベートした。サンプルを１２若しくは１５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより分離しかつＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐメンブレンにブロットした。ＨＤＭ２抗体４Ｂ２、ＳＭＰ１４およびＣ１８とともにメンブレンをインキュベートすることによりＨＤＭ２を検出した。ウエスタンブロットをＥＣＬにより発色した。
【図２】ＪＮＪ−＃１によるＨＤＭ２のタンパク質分解の阻害の用量依存性。ＧＳＴ−ＨＤＭ２を、示される用量のＪＮＪ−＃１、または対照のためのＤＭＳＯ、１０μＭの活性および不活性ｎｕｔｌｉｎ若しくはＭＧ１３２とともにインキュベートした。４０ｎｇのトリプシンを添加し、そして混合物を氷上で１５分間インキュベートした。サンプルを１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離しかつＩｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｐメンブレンにブロットした。メンブレンを抗ＨＤＭ２抗体４Ｂ２とともにインキュベートした。ウエスタンブロットをＥＣＬにより発色した。
【図３】ＪＮＪ−＃１はｐ５３および下流のエフェクターを誘導する。Ｕ−８７  ＭＧ神経膠芽腫細胞を示される濃度のＪＮＪ−＃１とともに２４時間インキュベートした。ＪＮＪ−＃１は５ｍＭストック溶液としてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、そしてその後組織培地で希釈して示される最終濃度をもたらした。全細胞ライセートを調製し、そしてドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ／ＰＡＧＥ）により分析した。タンパク質発現は特異的抗体を使用して検出した。アクチンタンパク質レベルは等しい負荷の対照として示した。
【図４】ＪＮＪ−＃１はＨＤＭ２−ｐ５３会合を高める。ＪＡＲ絨毛癌細胞を、示される濃度のＪＮＪ−＃１、Ｎｕｔｌｉｎ−３、若しくはＮｕｔｌｉｎ−３の不活性鏡像異性体とともに１．５時間インキュベートした。ＨＤＭ２／ｐ５３複合体を細胞ライセートから共免疫沈降し、そして方法の節で示されるところの特異的抗体を使用してタンパク質発現を検出した。免疫沈降されたＨＤＭ２タンパク質はＳＭＰ−１４抗体（ｓｃ−９６５）を使用して示し、また、ｐ５３タンパク質はウエスタンブロット分析で明記されるとおり示した。
【図５】ＪＮＪ−＃１は細胞中のｐ５３ユビキチン化を阻害しない。Ｕ２ＯＳ細胞をＨｉｓ標識ユビキチンでトランスフェクトし、そして１０μＭのＪＮＪ−＃１若しくはＮｕｔｌｉｎ−３とともに２時間インキュベートした。インキュベーション後、ユビキチン化されたタンパク質をＮｉ２＋−アガロースへの吸着により精製しかつＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ｐ５３はウエスタンブロッティングにより検出した。（ＴＣＬ：総細胞ライセート）
【図６】ＨＤＭ２およびプロテアソームの相互作用の阻害の用量依存性。ＧＳＴ−ＨＤＭ２を細菌中で発現させた。１００ｎｇのタンパク質を、示された用量のＪＮＪ−＃１の存在下若しくは対照のためのＤＭＳＯの存在下でプロテアソームとともにインキュベートした。入力対照のため、１０μｌの混合物を１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより分離しかつＩｍｍｏｂｉｌｏｎメンブレンにブロットした。ＨＤＭ２を抗ＨＤＭ２抗体Ｃ１８で免疫沈降しかつ１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに負荷した。タンパク質をＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐメンブレンにブロットした。メンブレンの上部を抗ＨＤＭ２抗体４Ｂ２と、下部をプロテオソームサブユニットＳ８に向けられた抗体とハイブリダイズさせた。ウエスタンブロットをＥＣＬにより発色した。
【図７】ＪＮＪ−＃１は生存細胞中でのプロテアソームとのＨＤＭ２の会合を予防する。Ａ）２９３Ｔ細胞を、１０μＭのｎｕｔｌｉｎ若しくはＪＮＪ−＃１または対照のためのＤＭＳＯとともに１．５時間インキュベートした。細胞を溶解し、そしてＣ１８抗体を使用してＨＤＭ２を免疫沈降した。免疫沈降物を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより分離しかつＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐメンブレンにブロットした。発現対照のため、５０μｇの総細胞ライセート（ＴＣＬ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離しかつＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐメンブレンにブロットした。双方のメンブレンをＳ６ｂおよびＨＤＭ２に向けられた抗体とハイブリダイズさせた。ウエスタンブロットをＥＣＬにより発色した。Ｂ）２９３Ｔ細胞をＭｙｃ−ＭＤＭ２でトランスフェクトした。トランスフェクション３６時間後に１０μＭのＪＮＪ−＃１  ＤＭＳＯ、対照のためを添加した。細胞を１．５時間後に溶解し、そしてＭＤＭ２を抗Ｍｙｃ抗体９Ｅ１０で免疫沈降しかつＡ部に記述されるとおり処理した。
【図８】ＪＮＪ−＃１はｉｎ  ｖｉｔｒｏでｐ５３分解を予防する。バキュロウイルスで発現させたｐ５３およびＭＤＭ２を精製し、そしてユビキチン；Ｅ１およびＥ２酵素、２６Ｓプロテアソーム、ならびに示される場合は示される用量のＪＮＪ−＃１または対照のためのＤＭＳＯ、１０μＭの活性および不活性ｎｕｔｌｉｎ若しくはＭＧ１３２ともに５時間インキュベートした。混合物を１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより分離しかつＩｍｍｏｂｉｌｏｎメンブレンにブロットした。メンブレンを抗ｐ５３抗体ＤＯ−１とハイブリダイズさせた。ウエスタンブロットをＥＣＬにより発色した。
【図９】多様なプロテアソームサブユニットおよびＨＤＭ２のＥＤ（Ｘ）Ｙモチーフを含有する配列のアライメント。
【図１０】ＨＤＭ２は２６ＳプロテアソームのＳ６ｂタンパク質のＥＤＹ配列と結合する。バキュロウイルスから発現させた１００ｎｇのＭＤＭ２を、Ｓ６ｂタンパク質のＥＤＹ配列を含有するＧＳＴ融合タンパク質１００ｎｇとともにインキュベートした。サンプルの１０％を入力対照（入力）のため１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに負荷した。残存するライセートにグルタチオン−セファロースを添加し、ＧＳＴ融合タンパク質を遠心分離により収集し、１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに負荷しかつＩｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｐブロッティングメンブレンに転写した。メンブレンをＭＤＭ２およびＧＳＴに対する抗体とハイブリダイズさせた（プルダウン）。
【図１１】ＥＤＹ配列の過剰発現はｐ５３分解を予防する。Ａ）Ｈ１２９９細胞を、ｐ５３およびチオレドキシンをコードするｃＤＮＡ（レーン１）、ｐ５３、チオレドキシンおよびＭＤＭ２をコードするｃＤＮＡ（レーン２）、ｐ５３、挿入されたＥＤＹモチーフを含有するＳ６ｂタンパク質からの配列を伴うチオレドキシンおよびＭＤＭ２をコードするｃＤＮＡ（レーン３）、若しくはｐ５３、挿入されたＥＤＹモチーフを含有するＨＤＭ２タンパク質からの配列を伴うチオレドキシンおよびＭＤＭ２をコードするｃＤＮＡ（レーン４）でトランスフェクトした。Ｂ）Ｕ２ＯＳ細胞を、チオレドキシンをコードするｃＤＮＡ（レーン１）、挿入されたＥＤＹモチーフを含有するＨＤＭ２タンパク質からの配列を伴うチオレドキシンをコードするｃＤＮＡ（レーン２）、若しくは挿入されたＥＤＹモチーフを含有するＳ６ｂタンパク質からの配列を伴うチオレドキシンをコードするｃＤＮＡ（レーン３）でトランスフェクトした。細胞をトランスフェクション４８時間後に溶解し、そしてｐ５３タンパク質濃度（および負荷対照のためのＰＣＮＡ濃度）をウエスタンブロッティングにより決定した。
【図１２】多様なプロテアソームサブユニットおよびＨＤＭ２のＥＤ（Ｘ）Ｙモチ―フを含有する完全なタンパク質配列ならびにＥＤ（Ｘ）Ｙモチーフのポリヌクレオチド配列。
【図１３】ＨＤＭ２の中央ドメインはＭＤＭ２のＳ６ｂとの会合を低下させる。２９３細胞を、Ｖ５標識Ｓ６ｂをコードするプラスミドと一緒に、Ｍｙｃ標識野生型（ｗｔ）、若しくは示される欠失を内部に持つ変異体ＭＤＭ２をコードするプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクション２４時間後に細胞を溶解し、そしてプロテインＡアガロースに結合した抗体９Ｅ１０を使用してＭＤＭ２を沈降させた。ビーズを洗浄しかつ１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに負荷した。タンパク質をＩｍｍｏｂｉｌｏｎｅメンブレンに転写し、そしてＭＤＭ２およびＳ６ｂの存在についてプロービングした（ＩＰ：ａ−Ｍｙｃ）。ＴＣＬ：５０μｇの細胞タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎｅメンブレンにブロットし、そしてＳ６ｂおよび負荷対照のためのＰＣＮＡについてプロービングした。
【実施例】
【０１２７】
実験
材料および方法
プラスミド
Ｍｙｃ−ＭＤＭ２をコードするプラスミドｐＤＷＭ６５９、ならびにプラスミドｐｃＤＮＡ３−Ｍｄｍ２およびｐｃＤＮＡ３−ｐ５３は以前に記述されている（Ｂｌａｔｔｎｅｒら、２００２）。完全長ＧＳＴ−ＨＤＭ２、ＧＳＴ−ＨＤＭ２フラグメントＧＳＴ−ＨＤＭ２−１−２０６、ＧＳＴ−ＨＤＭ２−２９３−４９３、ＧＳＴ−Ｓ６ｂ−ＥＤＹペプチドおよびＧＳＴ−ＨＤＭ２−ＥＤＹペプチドは、適切な制限部位を含有するプライマーを使用するＰＣＲによりそれぞれの配列を増幅することにより創製した。ＧＳＴ−ＨＤＭ２−１００−２００はＡｂｎｏｖａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ−カタログ番号Ｈ００００４１９３−Ｑ０１で注文した。ＰＣＲ断片をＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化しそしてｐＧｅｘ−４Ｔ−２ベクターにクローン化した。ＧＳＴ−ＨｄｍＸは、鋳型としての逆転写したＲＮＡおよび適切な制限部位をコードするプライマーを使用するＰＣＲによりＨｄｍＸを増幅することにより創製した。該ＰＣＲフラグメントをｐＧＥＸ−４Ｔ−２ベクターに連結した。タンパク質の発現および精製はｐＧＥＸ−４Ｔ−２ベクターの供給元（Ａｍｅｒｓｈａｍ）の推奨に従って実施した。Ｅ１を発現するバキュロウイルスおよびＵｂｃＨ５のプラスミドはＭａｒｔｉｎ  Ｓｃｈｅｆｆｎｅｒ、コンスタンスにより恵与された。Ｆｌａｇ−Ｍｄｍ２およびＦｌａｇ−ｐ５３をコードするバキュロウイルスは以前に記述されている（Ｂｒｉｇｎｏｎｅら、２００４）。
【０１２８】
抗体
以下の抗体を使用した。すなわち、抗ｍｙｃ抗体９Ｅ１０（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、抗増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）モノクローナル抗体ＰＣ１０（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、抗Ｓ８抗体クローンＰ４５−１１０（Ｂｉｏｍｏｌ）、抗Ｓ６ｂウサギポリクローナル抗体（Ｂｉｏｍｏｌ）、抗ＨＤＭ２抗体Ｃ１８、ＳＭＰ１４（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）および４Ｂ２（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ｐ５３抗体ＤＯ−１（Ｓａｎｔａ
Ｃｒｕｚ）、ならびにＨＲＰ結合抗マウス（Ｐ０１６１）および抗ウサギ（Ｐ０４４８）抗体（ＤＡＫＯ）ならびにＴｒｕｅ−ｂｌｏｔ抗ウサギ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ
ｓ）。Ｖ５に向けられたＨＲＰ結合抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および抗ＧＳＴ抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）。
【０１２９】
細胞株およびそれらの処理
２９３Ｔ、Ｈ１２９９およびＵ２ＯＳ細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）および１００単位／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地中、加湿雰囲気で３７℃かつ５％  ＣＯ２で培養した。Ｈ１２９９および２９３Ｔ細胞はリン酸カルシウムにより一過性にトランスフェクトし、Ｕ２ＯＳ細胞は製造元の推奨に従いｊｅｔＰＥＩ（Ｂｉｏｍｏｌ）でトランスフェクトした。
【０１３０】
免疫沈降およびウエスタンブロッティング
細胞を氷冷リン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、そしてＮＰ−４０緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス  ｐＨ８、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％  ＮＰ−４０、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル）で溶解した。タンパク質抽出物を１３０００ｇで４℃で１５分間の遠心分離により澄明にし、そしてタンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄの方法により測定した。プロテインＡアガロース（Ｐｉｅｒｃｅ）に予め結合した９Ｅ１０抗ｍｙｃ抗体３μｌを３００μｇのライセートに添加し、そして混合物を回転ホイール上４℃で２時間インキュベートした。アガロースをＮＰ−４０溶解緩衝液で３回洗浄し、そして１×ＳＤＳサンプル緩衝液（２％ドデシル硫酸ナトリウム、０．０８Ｍトリス  ｐＨ６．８、１０％グリセロール、２％β−メルカプトエタノール、０．００１％ブロモフェノールブルー）に再懸濁した。
【０１３１】
ウエスタンブロッティングのため、５０μｇのタンパク質を等容量の２×ＳＤＳサンプル緩衝液と混合し、熱変性しかつＳＤＳ−１０％  ＰＡＧＥゲルに負荷した。タンパク質をＩｍｍｏｂｉｌｉｎ−Ｐブロッティングメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転写した。免疫検出を記述された（Ｂｌａｔｔｎｅｒら、２００２）とおり実施した。
【０１３２】
共免疫沈降
細胞からのＨＤＭ２およびｐ５３の共免疫沈降：
ＪＡＲ絨毛癌細胞を３．６×１０６細胞／プレートで１０ｃｍ皿に播種し、そして、示された濃度のＪＮＪ−＃１、Ｎｕｔｌｉｎ−３若しくはＮｕｔｌｉｎ−３の不活性鏡像異性体とともに翌日に１．５時間インキュベートした。
【０１３３】
細胞を氷冷リン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、そしてＴｒｉｔｏｎ−Ｘ緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス  ｐＨ７．２、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）で溶解した。タンパク質抽出物を超音波処理し（ＨＤＭ２／ｐ５３  ｃｏＩＰのため）、１３０００ｇで４℃で１５分間の遠心分離により澄明にし、そしてタンパク質濃度をＢＣＡ／Ｐｉｅｒｃｅの方法により測定した。ライセート（１ｍｇ）を、２０μｌのマウスＩｇＧ血清および３０μｌのプロテインＡアガロースを添加すること、ならびに該混合物を回転ホイール上４℃で２時間インキュベートすることにより、予め澄明にした。その後、１０μｌの２Ａ  １０抗ＨＤＭ２抗体を澄明にしたライセートに添加しかつ２時間回転し、そして次に３０μｌのプロテインＡアガロースを添加し、次いで追加の１６時間４℃で回転した。免疫沈降物をＣｏ−ＩＰ洗浄緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５％グリセロール）を使用して３回洗浄した。免疫沈降させたＨＤＭ２タンパク質はＳＭＰ−１４抗体（ｓｃ−９６５）を使用して示し、また、ｐ５３タンパク質はウエスタンブロット分析で明記されるとおり示した。
【０１３４】
細胞からのＨＤＭ２およびプロテアソームの共免疫沈降：
細胞を氷冷リン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、そしてＮＰ−４０緩衝液
（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス  ｐＨ８、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％  ＮＰ−４０、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル）で溶解した。タンパク質抽出物を１３０００ｇで４℃で１５分間の遠心分離により澄明にし、そしてタンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄの方法により測定した。プロテインＡアガロース（Ｐｉｅｒｃｅ）に予め結合した９Ｅ１０抗ｍｙｃ若しくは抗ＨＤＭ２抗体３μｌを１ｍｇのライセートに添加し、そして該混合物を回転ホイール上４℃で１．５時間インキュベートした。アガロースをＮＰ−４０溶解緩衝液で３回洗浄した。４０μｌの１×ＳＤＳサンプル緩衝液（２％ドデシル硫酸ナトリウム、０．０８Ｍトリス  ｐＨ６．８、１０％グリセロール、２％β−メルカプトエタノール、０．００１％ブロモフェノールブルー）を添加し、そしてＳＤＳ−１０％  ＰＡＧＥゲルに負荷する前にサンプルを熱変性させた。タンパク質をＩｍｍｏｂｉｌｉｎ−Ｐブロッティングメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転写した。免疫検出を記述された（Ｂｌａｔｔｎｅｒら、２００２）とおり実施した。
【０１３５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＨＤＭ２およびプロテアソームの共免疫沈降：
細菌中で発現させた１００ｎｇのＧＳＴ−Ｈｄｍ２および２μｌのプロテアソーム（ＵＳｂｉｏ）を、１５０μｌのＰＷＢ緩衝液（５０ｍＭトリス  ｐＨ７．５；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；１０％グリセロール；５ｍＭ  ＭｇＣｌ２；２ｍＭ  ＡＴＰ）中でＪＮＪ−＃１とプレインキュベートした。その後、ＨＤＭ２およびプロテアソームを合わせかつ室温で３０分間インキュベートした。２０μｌの混合物を入力対照のため採取し、そして２０μｌのプロテインＡアガロースに予め結合した３μｌの抗Ｃ１８を添加した。該混合物を回転ホイール上４℃で１．５時間インキュベートし、ＰＷＢ緩衝液で３回洗浄しかつ１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離した。
【０１３６】
ライセートのウエスタンブロッティング
Ｕ８７神経膠芽腫細胞を示された濃度のＪＮＪ−＃１とともに２４時間インキュベートした。全細胞ライセートを調製しかつＳＤＳ／ＰＡＧＥにより分析した。タンパク質のレベルは、ｐ５３（ＤＯ−１およびｐＡｂ１８０１、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、ｐ２１ｗａｆ１，ｃｉｐ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＨＤＭ２（２Ａ１０、ＯＰ１１５  Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、Ｅ２Ｆ１（ｓｃ−１９３、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、Ｒｂ（ｓｃ−１０２、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、ｐＲｂ＿Ｓｅｒ７８０（９３０７Ｌ、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）、抗ｐ７３（ａｂ２２０４５  Ａｂｃａｍ）、抗ｐ６３（ｓｃ−８４３１、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、サイクリンＣ１（ｓｃ−３２０、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、ＰＩＧ３（ＰＣ２６８、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、ＭＩＣ−１（ｓｃ−１０６０６、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）に対する特異的抗体を使用して検出した。アクチンタンパク質濃度（Ａｂ−１、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を等しい負荷の対照として示した。タンパク質−抗体複合体は、化学発光（Ｓｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ試薬、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）および蛍光（Ｏｄｙｓｓｅｙ）により、製造元の説明書に従って可視化した。
【０１３７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｐ５３分解アッセイ
Ｆｌａｇ−ＭＤＭ２／ｐ５３複合体を、供給元（Ｓｉｇｍａ）の推奨に従い、Ｆｌａｇ−アガロース精製キットによりＨｉｇｈ５昆虫細胞から精製した。
【０１３８】
３０μｌのユビキチン反応緩衝液（２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．４；１０ｍＭ  ＮａＣｌ；３ｍＭ  ＭｇＣｌ２；０．０５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００；０．５ｍＭ  ＤＴＴ）中の、昆虫細胞中で発現させた部分的に精製したＥ１酵素０．２μｌ、ＵｂｃＨ５を発現するＢＬ２１細胞の細菌ライセート２μｌ、２μｌのユビキチン（５μｇ／μｌ  Ｓｉｇｍａ）、５μｌの精製ＭＤＭ２／ｐ５３複合体、１μｌのＭｇ−ＡＴＰ（１００ｍＭ）。３０分の反応時間後にＪＮＪ−＃１を１０μＭの最終濃度まで添加しそして室温で５分間インキュベートした。１μｌの２６Ｓプロテアソーム（ＵＳｂｉｏ）および１μｌ
のＡＴＰ（１００ｍＭ）を添加し、そして反応を３７℃で２．５時間インキュベートした。１μｌのＡＴＰ（１００ｍＭ）を添加しかつ反応をさらなる２．５時間インキュベートした。等容量の２×サンプル緩衝液を添加し、反応を８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより分離し、そしてＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐメンブレンにブロットした。
【０１３９】
制限タンパク質分解
ＨｄｍＸ若しくはＨＤＭ２のフラグメントに融合した１００ｎｇのＧＳＴをＪＮＪ−＃１、活性若しくは不活性ｎｕｔｌｉｎ、対照のためのＭＧ１３２若しくはＤＭＳＯとともに５分間インキュベートした。その後４０ｎｇのトリプシンを添加し、そして混合物を氷上で１５分間インキュベートした。タンパク質分解を２×サンプル緩衝液の添加により停止した。サンプルを１２若しくは１５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに負荷し、そしてＨＤＭ２若しくはＨＤＭＸをウエスタンブロッティングにより検出した。
【０１４０】
結果
ＪＮＪ−＃１はＨＤＭ２に結合する。
【０１４１】
ＰＣＴ公開第ＷＯ２００６／０３２６３１号明細書でＨＤＭ２アンタゴニストであることが示された化合物の１種、ＪＮＪ−＃１のＨＤＭ２への結合を検討するため、われわれはタンパク質分解酵素トリプシンによるＨＤＭ２のタンパク質分解に対するその影響を測定した。われわれは従って、ＨＤＭ２のタンパク質分解が不完全であった（制限タンパク質分解）条件下で、ＧＳＴに融合した細菌で発現させたＨＤＭ２をＪＮＪ−＃１の存在若しくは非存在下にトリプシンとともにインキュベートした。
【０１４２】
図１に示されるとおり、ＪＮＪ−＃１は完全長ＨＤＭ２のタンパク質分解を強く低下したが、しかしＨＤＭ２の近接ホモログであるＨＤＭ２ファミリーメンバーＨＤＭＸのタンパク質分解はしなかった。
【０１４３】
ＪＮＪ−＃１は約１００ｎＭの用量でＨＤＭ２タンパク質分解を妨害する。
われわれは次に、ＨＤＭ２タンパク質分解の妨害に必要とされるＪＮＪ−＃１の用量を決定した。われわれは、ＧＳＴに融合した細菌に発現させたＨＤＭ２を、増大する濃度のＪＮＪ−＃１の存在下でトリプシンとともにインキュベートした。ＪＮＪ−＃１化合物の特異性を検討するため、われわれは活性および不活性ｎｕｔｌｉｎ、ならびにプロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２ともにもまたＧＳＴ−ＨＤＭ２をインキュベートした。図２にわれわれが示すとおり、ＨＤＭ２のタンパク質分解は約１００ｎＭの用量で既にＪＮＪ−＃１により阻害された。ＪＮＪ−＃１の用量を１μＭまで増大させることはＨＤＭ２のタンパク質分解をさらに低下し、そして３μＭではさらなる低下は観察されなかった。対照的に、１０μＭの用量の活性若しくは不活性ｎｕｔｌｉｎとのＧＳＴ−ＨＤＭ２のインキュベーションは、タンパク質分解に弱くのみ影響を及ぼし、そして１０μＭのＭＧ１３２とのＧＳＴ−ＨＤＭ２のインキュベーションは影響を有しなかった。
【０１４４】
ＪＮＪ−＃１は腫瘍細胞中でｐ５３を誘導しかつ下流のシグナル伝達を活性化する。
ＪＮＪ−＃１はｈＤＭ２を結合しかつそのコンホメーションを変えることが同定されている。ｐ５３およびＥ２Ｆ１のようなＨＤＭ２結合パートナーの発現ならびにそれらの下流のシグナル伝達分子にＪＮＪ−＃１が影響を及ぼすかどうかに関して、該化合物を最初に検討した。Ｕ−８７  ＭＧ神経膠芽腫細胞をＪＮＪ−＃１とともに２４時間インキュベートし、そして図３に示されるとおり、ＪＮＪ−＃１は１μＭで開始してｐ５３を誘導し、１０μＭまでさらに増大した。Ｓ期進行に不可欠であるＥ２Ｆ−１の発現は劇的に低下した。ｐ５３誘導と同時に、下流の遺伝子ｐ２１ｗａｆ１，ｃｉｐ１、ＭＩＣ−１およびＰＩＧ３の明瞭な増大が、１μＭで開始して２４時間のインキュベーション後に観察されたが、しかし１０μＭでその最大誘導に達した。またｐ５３により転写誘導されるＨｉｔ
ｓｅｌｆは対照条件下で検出可能でなかったが、しかし１ないし１０μＭでＪＮＪ−＃１により明瞭に誘導された。サイクリン依存性キナーゼ（ｃｄｋ）阻害剤ｐ２１ｗａｆ１，ｃｉｐ１の誘導は、Ｅ２Ｆ−１活性の阻止およびそれによりＧ１細胞周期停止をもたらす網膜芽腫（Ｒｂ）癌抑制タンパク質のｃｄｋ媒介性リン酸化の減少をもたらすことが期待される。図３に示されるとおり、実際に、Ｓｅｒ７８０−Ｒｂリン酸化の強い減少が１μＭで既に観察され、それはｐ２１ｗａｆ１，ｃｉｐ１誘導と平行する。
【０１４５】
ＪＮＪ−＃１はＪＡＲ絨毛癌細胞中でＨＤＭ２のｐ５３への結合を予防しない
ＪＮＪ−＃１はｈＤＭ２アンタゴニストと同定され、そしてｐ５３タンパク質レベルを誘導するため、われわれはその後、該化合物がｐ５３をＨＤＭ２から外してそれによりｐ５３分解を予防するかどうか検討した。この目的上、われわれは遺伝子増幅により高ＨＤＭ２発現レベルを有するＪＡＲ絨毛癌細胞を利用した。図４に具体的に示されるとおり、内因性ＨＤＭ２をＪＡＲ細胞から免疫沈降させた場合、結合されるｐ５３の量はＪＮＪ−＃１の存在下で増大した。ＨＤＭ２のＮ末端ポケットを結合することが既知である陽性対照ＨＤＭ２アンタゴニストＮｕｔｌｉｎ−３は、ｐ５３をＨＤＭ２タンパク質から効率的に外した一方、Ｎｕｔｌｉｎ−３の不活性鏡像異性体は影響を有しなかった。これらのデータは、ＪＮＪ−＃１が新規作用機序によりＨＤＭ２機能に影響を及ぼすことを示す。
【０１４６】
ＪＮＪ−＃１はＵ２ＯＳ細胞中でｐ５３ユビキチン化を阻害しない
ＪＮＪ−＃１はｐ５３の蓄積につながる。１つの非常にありそうな機序は、ＪＮＪ−＃１がＨＤＭ２ユビキチンリガーゼ活性に影響を及ぼすことによりｐ５３ユビキチン化を予防することであるとみられる。この選択肢を試験するため、われわれは該化合物の存在下で細胞ユビキチン化アッセイを実施した。図５に示されるとおり、ｐ５３のユビキチン化はＮｕｔｌｉｎ−３の存在下で強く低下された一方、それはＪＮＪ−＃１により全く影響されなかった。
【０１４７】
ＪＮＪ−＃１はＨＤＭ２のプロテアソームへの結合を用量依存的様式で予防する。
われわれは以前、ＨＤＭ２がプロテアソームと会合することを観察し、そして、われわれはこの相互作用がｐ５３分解に影響しうることを推測した。ＨＤＭ２のプロテアソームとの相互作用に対するＪＮＪ−＃１の影響を検討するため、われわれは、ＧＳＴに融合した細菌で発現させたＨＤＭ２およびプロテアソームを増大する用量のＪＮＪ−＃１とともにインキュベートした。われわれはその後、ＨＤＭ２の免疫沈降前にＨＤＭ２およびプロテアソームを混合しかつ該混合物を室温で３０分間インキュベートした。われわれは該複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、そしてＨＤＭ２と会合したプロテアソームの相対量をウエスタンブロッティングにより測定した。
【０１４８】
図６に示されるとおり、ＧＳＴ単独はＳ８サブユニットにより可視化されるとおりプロテアソームに弱くのみ結合した。われわれがアッセイにＨＤＭ２を包含した場合、有意により大量のプロテアソームがＧＳＴ単独とよりもＧＳＴ−ＨＤＭ２と共沈降した。約５０ｎＭの濃度のＪＮＪ−＃１の添加はこの会合に影響を及ぼさなかった。しかしながら、われわれがＪＮＪ−＃１の濃度を５００ｎＭに上げた場合、プロテアソームとのＨＤＭ２の会合は強く低下した。ＪＮＪ−＃１の用量を５μＭまで増大させることはＨＤＭ２のプロテアソームとの会合をさらに低下した。
【０１４９】
ＪＮＪ−＃１は細胞中でのＨＤＭ２のプロテアソームへの結合を予防する。
われわれは次に、ＪＮＪ−＃１が細胞中でＨＤＭ２のプロテアソームとの会合もまた予防したかどうかを決定した。われわれは、１０μＭのＪＮＪ−＃１、１０μＭのｎｕｔｌｉｎ若しくは対照のためのＤＭＳＯとともに細胞をインキュベートし、抗ＨＤＭ２抗体でＨＤＭ２を免疫沈降し、そして会合したＳ６ｂの相対量をウエスタンブロッティングにより測定した。プロテアソームサブユニットＳ６ｂはＪＮＪ−＃１の非存在下でＨＤＭ２と
共沈降した。しかしながら、１０μＭのＪＮＪ−＃１の存在下若しくはｎｕｔｌｉｎの存在下で、ＨＤＭ２のＳ６ｂとの会合はもはや検出可能でなかった（データは示されない）。該結果を確認するため、われわれは過剰発現させたＭｙｃ標識ＭＤＭ２を用いて実験を反復した。われわれは２９３Ｔ細胞でＭｙｃ−ＭＤＭ２をトランスフェクトした。トランスフェクション２４時間後に１０μＭのＪＮＪ−＃１若しくは対照のためのＤＭＳＯを細胞に添加した。１．５時間のインキュベーション時間後に抗Ｍｙｃ抗体９Ｅ１０を使用してＭｙｃ−ＭＤＭ２を沈降させた。会合するプロテアソームをウエスタンブロッティングにより測定した。内因性ＨＤＭ２と同様、プロテアソームはＭｙｃ標識ＭＤＭ２と共沈降した。ＪＮＪ−＃１は再度、該相互作用を完全に予防した（図７）。
【０１５０】
ＪＮＪ−＃１はｉｎ  ｖｉｔｒｏでｐ５３の分解を予防する。
ＪＮＪ−＃１の存在下でのプロテアソームとのＨＤＭ２の会合の低下がｐ５３分解に影響するかどうか決定するため、われわれはｉｎ  ｖｉｔｒｏ分解アッセイを使用した。われわれは、バキュロウイルス中で発現させたｐ５３およびＨＤＭ２をユビキチン、２６ＳプロテアソームならびにＥ１およびＥ２酵素と混合した。ＪＮＪ−＃１の非存在下でｐ５３は迅速に分解された。しかしながら、われわれが該反応をＪＮＪ−＃１の存在下で実施した場合、ｐ５３の分解は完全に廃止された（図８）。
【０１５１】
ＨＤＭ２／ＭＤＭ２はアミノ酸ＥＤＹを含んでなる配列モチーフを共有する
ＭＤＭ２上のプロテアソームとの相互作用部位を決定するため、われわれは、プロテアソームのＳ６ｂタンパク質をコードするプラスミドと一緒に一連のＭＤＭ２欠失変異体で２９３Ｔ細胞をトランスフェクトした。中央ドメインを欠くＭＤＭ２の１変異体とのＳ６ｂのコトランスフェクション後に、Ｍｄｍ２のＳ６ｂへの結合は野生型ＭＤＭ２のＳ６ｂへの結合に比較して有意に高められた（図１３）。この結果から、われわれは、中央ドメイン中の１配列モチーフがＭＤＭ２のプロテアソームへの結合を妨害すると結論付けた。従って、該中央ドメインは、プロテアソームともまた会合することが可能であるＭＤＭ２の配列に結合することによりＭＤＭ２のプロテアソームとの相互作用を低下させることができ、従って、配列モチーフがＭＤＭ２およびプロテアソームに共通であるべきである。こうした配列を探して、われわれはＭＤＭ２の中央ドメインをプロテアソームの数種のサブユニットと整列した。これにより、われわれは、ＭＤＭ２、および２６Ｓプロテアソームの数種のサブユニットに存在する３アミノ酸配列ＥＤＹモチーフを同定した（図９、図１２）。
【０１５２】
ＥＤＹモチーフを含有するペプチドはＭＤＭ２と会合する
われわれは、ＥＤＹ配列を包含するＳ６ｂタンパク質からのペプチドおよびバキュロウイルスから発現させたＭＤＭ２を含んでなるＧＳＴ融合タンパク質を使用するＧＳＴプルダウンアッセイを実施することにより、ＭＤＭ２がプロテアソームのＥＤＹモチーフと会合することが可能であるかどうか決定した。図１０にわれわれが示すとおり、驚くことに、ＭＤＭ２は、Ｓ６ｂ由来ペプチドを包含するＧＳＴ融合タンパク質と明瞭に会合したが、しかしＧＳＴ単独とはしなかった。
【０１５３】
ＨＤＭ２／ＭＤＭ２若しくはＳ６ｂのＥＤＹモチーフの過剰発現はｐ５３分解を妨害する
ＥＤＹモチーフがプロテアソームとのＨＤＭ２の会合を媒介している場合、ＥＤＹ配列を含有するペプチドはＨＤＭ２への結合についてプロテアソームと競合するはずである。さらに、プロテアソームとのＨＤＭ２の会合がｐ５３分解に重要である場合、ｐ５３はこうしたペプチドの過剰発現後に蓄積するはずである。図１１に、われわれはこれが実際に真実であることを示す。Ｓ６ｂ若しくはＨＤＭ２のＥＤＹモチーフを包含する配列をチオレドキシンタンパク質の外側ループで発現させたチオレドキシン挿入構築物をわれわれがＨ１２９９細胞にトランスフェクトした場合、ＭＤＭ２によるｐ５３分解は強く低下した。同様に、われわれがチオレドキシン挿入タンパク質をＵ２ＯＳ細胞で発現させた場合、
内因性ｐ５３の分解はほぼ完全に廃止された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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