(57)【要約】本発明は、アミロイド形成性ペプチド又はタンパク質の可溶性会合体を選択的に認識して切断する合成切断剤及びこの合成切断剤を用いてアミロイド形成性ペプチド又はタンパク質の可溶性会合体を選択的に切断する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミロイド形成性ペプチド又はタンパク質の可溶性会合体に選択的に作用する一般式（１）の切断剤:
（Ｒ）ｎ−（Ｌ）ｍ−Ｚ      （１）
（式中、Ｒは、Ａ、Ａ−（Ｙ）ｏ−（ＣＨ２）ｐ−（Ｙ）ｏ−Ａ、Ａ−（ＣＨ＝ＣＨ）−Ａ、Ａ−（Ｙ）ｏ−（ＣＨ２）ｐ−（Ｙ）ｏ−Ａ−（Ｙ）ｏ−（ＣＨ２）ｐ−（Ｙ）ｏ−Ａ、及びＡ−（Ｙ）ｏ−（ＣＨ２）ｐ−（Ｙ）ｏ−Ａ−（Ｙ）ｏ−（ＣＨ２）ｐ−（Ｙ）ｏ−Ａ−（Ｙ）ｏ−（ＣＨ２）ｐ−（Ｙ）ｏ−Ａからなる群から独立的に選択された標的認識部位であり、
Ａは独立して、Ｃ６−１４アリール、又は酸素、硫黄及び窒素からなる群から選択された一つ以上のヘテロ原子を有する５員〜１４員のヘテロアリールであり、
ここで、アリール又はヘテロアリールは、独立的にＣ１−１５アルキル、ヒドロキシ、Ｃ１−１５アルコキシ、Ｃ１−１５アルキルカルボニルオキシ、Ｃ１−１５アルキルスルホニルオキシ、アミノ、モノ−又はジ−Ｃ１−１５アルキルアミノ、Ｃ１−１５アルキルカルボニルアミノ、Ｃ１−１５アルキルスルホニルアミノ、Ｃ３−１５シクロアルキルアミノ、ホルミル、Ｃ１−１５アルキルカルボニル、カルボキシ、Ｃ１−１５アルキルオキシカルボニル、カルバモイル、モノ−又はジ−Ｃ１−１５アルキルカルバモイル、Ｃ１−１５アルキルスルファニルカルボニル、Ｃ１−１５アルキルスルファニルチオカルボニル、Ｃ１−１５アルコキシカルボニルオキシ、カルバモイルオキシ、モノ−又はジ−Ｃ１−１５アルキルカルバモイルオキシ、Ｃ１−１５アルキルスルファニルカルボニルオキシ、Ｃ１−１５アルコキシカルボニルアミノ、ウレイド、モノ又はジ又はトリ−Ｃ１−１５アルキルウレイド、Ｃ１−１５アルキルスルファニルカルボニルアミノ、メルカプト、Ｃ１−１５アルキルスルファニル、Ｃ１−１５アルキルジスルファニル、スルホ、Ｃ１−１５アルコキシスルホニル、スルファモイル、モノ−又はジ−Ｃ１−１５アルキルスルファモイル、トリ−Ｃ１−１５アルキルシラニル及びハロゲンからなる群から独立的に選択された一つ以上の置換基で置換されていてもよく；
ＹはＯ又はＮ−Ｚであり、ここで、Ｚは水素又はＣ１−９アルキルであり；
Ｌはリンカーであり；
Ｚは触媒部位として、金属イオン−リガンド複合体であり；
ｎは独立的に１〜６の整数であり；
ｍ及びｏは独立的に０又は１であり；
ｐは０〜５の整数である。）。
【請求項２】
Ａが下記式からなる群から選択され；
ｐが独立的に０、１又は２であることを特徴とする請求項１に記載の切断剤：
【化１】
2010507652.tif 000018
（式中、Ｘは独立的にＣ、Ｎ、ＮＨ、Ｏ及びＳからなる群から選択され、
ＡはＣ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、アミノ、モノ−又はジ−Ｃ１−１２アルキルアミノ、Ｃ１−６アルキルカルボニルアミノ、Ｃ１−６アルキルスルホニルアミノ、Ｃ５−１５シクロアルキルアミノ、Ｃ１−６アルキルカルボニル、カルバモイル、モノ−又はジ−Ｃ１−６アルキルカルバモイル、Ｃ１−６アルコキシカルボニルアミノ、ウレイド、モノ又はジ又はトリ−Ｃ１−６アルキルウレイド、Ｃ１−６アルキルスルファニルカルボニルアミノ、Ｃ１−６アルキルスルファニル、Ｃ１−６アルキルジスルファニル、スルファモイル、モノ−又はジ−Ｃ１−６アルキルスルファモイル、トリ−Ｃ１−１５アルキルシラニル及びハロゲンからなる群から独立的に選択された一つ以上の置換基で置換されていてもよい。）。
【請求項３】
Ａが下記式からなる群から選択されることを特徴とする請求項２に記載の切断剤：
【化２】
2010507652.tif 000019
（式中、ＸはＮＨ、Ｏ、又はＳであり、
ＡはＣ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、アミノ、モノ−又はジ−Ｃ１−８アルキルアミノ、Ｃ６−１２シクロアルキルアミノ、Ｃ１−４アルキルカルボニル及びハロゲンからなる群から独立的に選択された一つ以上の置換基で置換されていてもよい。）。
【請求項４】
リガンドが下記式からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の切断剤：
【化３】
2010507652.tif 000020
（式中、リガンド中の窒素原子は酸素、硫黄及びリン原子からなる群から選択された原子に置き換えられ；
リガンドはＣ６−１４アリール又は５員〜１４員のヘテロアリールと縮合でき；
リガンドはＣ１−１５アルキル、ヒドロキシ、Ｃ１−１５アルコキシ、Ｃ１−１５アルキルカルボニルオキシ、Ｃ１−１５アルキルスルホニルオキシ、アミノ、モノ−又はジ−Ｃ１−１５アルキルアミノ、Ｃ１−１５アルキルカルボニルアミノ、Ｃ１−１５アルキルスルホニルアミノ、ホルミル、Ｃ１−１５アルキルカルボニル、カルボキシ、Ｃ１−１５アルキルオキシカルボニル、カルバモイル、モノ−又はジ−Ｃ１−１５アルキルカルバモイル、Ｃ１−１５アルキルスルファニルカルボニル、Ｃ１−１５アルキルスルファニルチオカルボニル、Ｃ１−１５アルコキシカルボニルオキシ、カルバモイルオキシ、モノ−又はジ−Ｃ１−１５アルキルカルバモイルオキシ、Ｃ１−１５アルキルスルファニルカルボニルオキシ、Ｃ１−１５アルコキシカルボニルアミノ、ウレイド、モノ又はジ又はトリ−Ｃ１−１５アルキルウレイド、Ｃ１−１５アルキルスルファニルカルボニルアミノ、メルカプト、Ｃ１−１５アルキルスルファニル、Ｃ１−１５アルキルジスルファニル、スルホ、Ｃ１−１５アルコキシスルホニル、スルファモイル、モノ−又はジ−Ｃ１−１５アルキルスルファモイル、トリ−Ｃ１−１５アルキルシラニル及びハロゲンからなる群から独立的に選択された一つ以上の置換基で置換されていてもよい。）。
【請求項５】
リガンドが下記式からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の切断剤：
【化４】
2010507652.tif 000021
（式中、リガンドはＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルカルボニルオキシ及びハロゲンからなる群から独立的に選択された一つ以上の置換基で置換されていてもよい。）。
【請求項６】
金属イオンがＣｏＩＩＩ、ＣｕＩ、ＣｕＩＩ、ＣｅＩＶ、ＣｅＶ、ＣｒＩＩＩ、ＦｅＩＩ、ＦｅＩＩＩ、ＭｏＩＶ、ＮｉＩＩ、ＰｄＩＩ、ＰｔＩＩ、ＶＶ及びＺｒＩＶからなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の切断剤。
【請求項７】
金属イオンがＣｏＩＩＩ、ＣｕＩＩ又はＰｄＩＩであることを特徴とする請求項６に記載の切断剤。
【請求項８】
リンカー（Ｌ）は炭素、窒素、酸素、ケイ素、硫黄及びリンからなる群から独立的に選択された１〜３０個の元素を含む骨格で構成され、
骨格に含まれる原子はアルカン、アルケン、アルキン、カルボニル、チオカルボニル、アミン、エーテル、シリル、スルフィド、ジスルフィド、スルホニル、スルフィニル、ホスホリル、ホスフィニル、アミド、イミド、エステル及びチオエステルからなる群から独立的に選択された官能基の形態として存在し、
リンカーがＣ１−９アルキル、ヒドロキシ、Ｃ１−９アルコキシ、Ｃ１−９アルキルカルボニルオキシ、Ｃ１−９アルキルスルホニルオキシ、アミノ、モノ−又はジ−Ｃ１−９アルキルアミノ、Ｃ１−９アルキルカルボニルアミノ、Ｃ１−９アルキルスルホニルアミノ、ホルミル、Ｃ１−９アルキルカルボニル、カルボキシ、Ｃ１−９アルキルオキシカルボニル、カルバモイル、モノ−又はジ−Ｃ１−９アルキルカルバモイル、Ｃ１−９アルキルスルファニルカルボニル、Ｃ１−９アルキルスルファニルチオカルボニル、Ｃ１−９アルコキシカルボニルオキシ、カルバモイルオキシ、モノ−又はジ−Ｃ１−９アルキルカルバモイルオキシ、Ｃ１−９アルキルスルファニルカルボニルオキシ、Ｃ１−９アルコキシカルボニルアミノ、ウレイド、モノ又はジ又はトリ−Ｃ１−９アルキルウレイド、Ｃ１−９アルキルスルファニルカルボニルアミノ、メルカプト、Ｃ１−９アルキルスルファニル、Ｃ１−９アルキルジスルファニル、スルホ、Ｃ１−９アルコキシスルホニル、スルファモイル、モノ−又はジ−Ｃ１−９アルキルスルファモイル、トリ−Ｃ１−９アルキルシラニル及びハロゲンからなる群から独立的に選択された一つ以上の置換基で置換されていてもよいことを特徴とする請求項１に記載の切断剤。
【請求項９】
骨格を構成する原子数が１〜２０であり、
リンカーがＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、モノ−又はジ−Ｃ１−６アルキルアミノ、Ｃ１−６アルキルカルボニルアミノ、Ｃ１−６アルキルスルホニルアミノ、Ｃ１−６アルキルカルボニル、カルバモイル、モノ−又はジ−Ｃ１−６アルキルカルバモイル、Ｃ１−６アルコキシカルボニルアミノ、ウレイド、モノ又はジ又はトリ−Ｃ１−６アルキルウレイド、Ｃ１−６アルキルスルファニルカルボニルアミノ、Ｃ１−６アルキルスルファニル、Ｃ１−６アルキルジスルファニル、スルファモイル、モノ−又はジ−Ｃ１−６アルキルスルファモイル、トリ−Ｃ１−６アルキルシラニル及びハロゲンからなる群から独立的に選択される一つ以上の置換基で置換されていてもよいことを特徴とする請求項８に記載の切断剤。
【請求項１０】
一般式（１）の化合物の１つ以上のＲ、Ｌ及びＺが−（Ｌ）ｍ−（Ｒ）ｎによりさらに置換（ここで、Ｒ、Ｚ、Ｌ、ｍ及びｎは請求項１の定義と同義である）されることを特徴とする請求項１に記載の切断剤。
【請求項１１】
Ａβ４０又はＡβ４２のオリゴマーを切断することを特徴とする請求項１に記載の切断剤。
【請求項１２】
アミリンのオリゴマーを切断することを特徴とする請求項１に記載の切断剤。
【請求項１３】
α−シヌクレインのオリゴマーを切断することを特徴とする請求項１に記載の切断剤。
【請求項１４】
請求項１に記載の切断剤及び薬剤学的に許容される塩を含むアミロイド症を予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項１５】
アミロイド症がアルツハイマー病、第ＩＩ型糖尿病、パーキンソン病、海綿状脳症又はハンチントン病であることを特徴とする請求項１４に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミロイド形成性（amyloidogenic）ペプチド又はタンパク質の可溶性会合体（soluble assembly）に選択的に作用する切断剤及び切断方法に関する。本発明の切断剤は、アミロイド形成性ペプチド又はタンパク質の可溶性会合体を切断することによって、アミロイド形成性ペプチド又はタンパク質の生物学的な活性度を抑制する。
【背景技術】
【０００２】
アミロイド症（amyloidosis）とは、不溶性アミロイド（amyloids）タンパク質が臓器及び／又は組織で非正常的に蓄積された様々な状態をいい、疾患を引き起こしている（非特許文献１）。アミロイド症を引き起こすアミロイド形成性ペプチド又はタンパク質は、様々な種類が知られている（非特許文献２）。固有の構造と機能を有する様々なアミロイド形成性ペプチド又はタンパク質が形成したアミロイドは、繊維状と交差βシート構造を有する共通的な特徴を有している。
【０００３】
アミロイド形成性ペプチド又はタンパク質は、様々なオリゴマー及びプロトフィブリル（protofibrils）を含む可溶性会合体を形成した後、不溶性フィブリル（fibrils；原繊維）に転換される。今までに蓄積された実験的な証拠によると、アミロイド形成性ペプチド又はタンパク質の可溶性オリゴマーが、アミロイド症の主な原因と考えられている（非特許文献１）。アミロイドベータ（Ａβ）ペプチド、アミリン（amylin）、α−シヌクレイン（α-synuclein）、プリオン（prion）、ポリグルタミン（polyglutamine）のようなアミロイド形成性ペプチド又はタンパク質の可溶性オリゴマー形態は、それぞれアルツハイマー病（Alzheimer's disease）、ＩＩ型糖尿病、パーキンソン病（Parkinson's disease）、海綿状脳症（spongiform encepahlopathies）、ハンチントン病（Huntington's disease）を引き起こす可能性がある（非特許文献３）。
【０００４】
本発明において、アミロイド形成性ペプチド又はタンパク質の可溶性オリゴマーが有する化学的及び生物学的特性を、モデルとしてアルツハイマー病を用いて説明する。アルツハイマー病は老年性認知症の主な原因である。
【０００５】
アルツハイマー病は、神経細胞が漸進的に喪失されることを特徴とする退行性脳疾患である。アルツハイマー病患者の脳内でＡβペプチドからなる斑点（plaque）及び神経原繊維変化（ＮＦＴ）が脳内から見つかった（非特許文献４）。
【０００６】
Ａβペプチドは、アミロイド先駆タンパク質の逐次切断後、形成される。Ａβペプチドはβ−及びγ−セクレターゼ（secretase）の連続的作用によって生成され、これらセクレターゼは、主に、アミノ酸４０個又は４２個からなるオリゴペプチドを生成している（非特許文献５）。４０又は４２個のアミノ酸からなるＡβをＡβ４０又はＡβ４２とよく略称している。図１にＡβ４２のアミノ酸配列が示されている。Ａβ４２のアミノ酸配列からＣ−末端アミノ酸２個を除去すれば、Ａβ４２のアミノ酸配列になる。アミロイド堆積物の最も主な成分はＡβ４２であり、Ａβ４２はＡβ４０より集積されやすい。
【０００７】
アミロイドカスケード仮説（amyloid cascade hypothesis）は１９９２年に提案された（非特許文献６）。この仮説はＡＰＰの代謝異常（mismetabolism）によりＡＤ病因が誘発され、Ａβ４２の集積が順次的にこれを引き起こすと仮定した。Ａβ４２の生成量の増加による繊維状集積体の形成及び神経斑（neuritic plaque）の形成により、神経伝達物質の減少及びｔａｎｇｌｅ−ｂｅａｒｉｎｇ  ｎｅｕｒｏｎの死滅及び認知症を引き起こすシナプス連結の破壊を含む、更なる病理学的症状が触発され得る。
【０００８】
Ｋａｔｚｍａｎらは、アルツハイマー病患者らに対して認知症とアミロイド斑と間の相関関係がよくないことを報告した（非特許文献７、８）が、それにもかかわらず、最近までこの仮説が相当に支持されてきた。しかし、アルツハイマー病患者の脳内から可溶性Ａβ４２が見つけられた（非特許文献９）。また、Ｌｅｕらは、アルツハイマー病がアミロイド斑の量よりむしろ可溶性Ａβ４２の量に関係があると報告した（非特許文献１０、１１）。従って、可溶性Ａβ４２に対する関心が増加し、アミロイドカスケード仮説は修正された。
【０００９】
修正された仮説（非特許文献１２）によると、アルツハイマー病患者の脳内でシナプス機能障害が起きる理由は、不溶性のアミロイドフィブリルやＡβ単量体のためでなく、Ａβの可溶性オリゴマーに起因する。Ａβ４２（たとえば、１２量体）の可溶性オリゴマーがアルツハイマー病の神経毒性中間体として役割を果たすことを支持する様々な証拠が最近、追加的に報告されている（非特許文献１３、１４、１５、１６）。
【００１０】
Ａβ４２が会合する過程で、いくつかのオリゴマー、プロトフィブリルなどの可溶性会合体が、可逆的又は部分非可逆的に形成された後、不溶性フィブリルが非可逆的に形成された（非特許文献１６、１７、１８）。Ａβ４２の多様なオリゴマーは、それぞれ固有の構造を有している（非特許文献１９）。
【００１１】
Ａβ４２が引き起こす神経毒性を緩和する治療法を開発するために、脳内からＡβ４２のオリゴマーの除去を促進する方案を模索することができる。これを達成するために、Ｈａｒｄｙらは、ＡＰＰ（先駆タンパク質）からＡβの生成を抑制するため、β−及びγ−セクレターゼのいずれか一つの活性を阻害する方法を提案した（非特許文献１２）。Ａβ免疫剤を使用して、Ａβのオリゴマー化を抑制する方案も可能である（非特許文献２０、２１）。Ａβに対する親和度の高い小分子を用いてＡβのオリゴマー化を抑制することもできる（非特許文献２２）。
【００１２】
Ａβ分解酵素、例えば、エンドセリン転換酵素、インスリン分解酵素及びネプリライシン（neprilysin）を刺激することで、脳中Ａβ４２のオリゴマーの量を低減することができる（非特許文献２３）。
【００１３】
アルツハイマー病に関連したＡβ４２の可溶性オリゴマーについて説明したように、アミロイド症に対する治療方案として様々な戦略が採択されている（非特許文献２４）。この戦略の中には、アミロイド形成性ペプチド又はタンパク質自体を安定化させる方案、アミロイド形成性ペプチド又はタンパク質を先駆物質から生成する酵素の活性を抑制する方案、アミロイド形成性ペプチド又はタンパク質やその先駆物質の合成過程を調整する方案、繊維状集積体の形成を阻害する方案、繊維状集積体の先駆物質の蓄積を防止する方案などが含まれる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Bittan, G.; Fradinger, E. A.; Spring, S. M.; Teplow, D. B. Amyloid 2005, 12, 88
【非特許文献２】Kelly, J. F. Curr. Opin. Struct. Biol. 1996, 6, 11
【非特許文献３】Demuro, A. G.; Mina, E.; Kayed, R.; Milton, S.; Parker, I.; Glabe, C. G. J. Biol. Chem. 2005, 280, 17294
【非特許文献４】Selkoe, D. J. Physiol. Rev. 2001, 81, 741
【非特許文献５】Sambamurti, K.; Greig, N. H.; Lahiri, D. K. Neuromol. Med. 2002, 1, 1
【非特許文献６】Hardy, J. A.; Higgins, G. A. Science 1992, 256, 184
【非特許文献７】Katzman, R.; Terry, R.; De Teresa, R.; Brown, T.; Davies, P.; Fuld, P.; Renbing, X.; Peck, A. Ann. Neurol. 1988, 23, 138
【非特許文献８】Naslund, J.; Haroutunian, V.; Mohs, R.; Davis, K L.; Davies, P.; Greengard, P.; Buxbaum J. D. J. Am. Med. Ass. 2000, 283, 1571
【非特許文献９】Kuo, Y. M.; Emmerling, M. R.; Vigo-Pelfrey, C.; Kasunic, T. C.; Kirkpatrick, J. B.; Murdoch G. H.; Ball, M. J.; Roher, A. E. J. Biol. Chem. 1996, 271, 4077
【非特許文献１０】Lue, L. F.; Kuo, Y. M.; Roher, A. E.; Brachova, L.; Shen, Y.; Sue, L.; Beach, T.; Kurth, J. H.; Rydel, R. E.; Rogers, J. Am. J. Pathol. 1999, 155, 853
【非特許文献１１】McLean, C. A.; Cherny, R. A.; Fraser, F. W.; Fuller, S. J.; Smith, M. J.; Beyreuther, K.; Bush, A. I.; Masters, C. L. Ann. Neurol. 1999, 46, 860
【非特許文献１２】Hardy, J.; Selkoe, D. J. Science 2002, 297, 353
【非特許文献１３】Tanzi, R. E. Nature Neurosci. 2005, 8, 977
【非特許文献１４】Snyder, E. M.; Nong, Y.; Almeida, C. G.; Paul, P.; Moran, T.; Choi, E. Y.; Nairn, A. C.; Salter, M. W.; Lombroso, P. J.; Gouras, G. K.; Greengard, P. Nature Neurosci. 2005, 8, 1051
【非特許文献１５】Barghorn, S.; Nimmrich, V.; Striebinger, A.; Krantz, C.; Keller, P.; Janson, B.; Bahr, M.; Schmidt, M.; Bitner, R. S.; Harlan, J.; Barlow, E.; Ebert, R.; Hillen. H. J. Neurochem. 2005, 95, 834
【非特許文献１６】Lesne S.; Koh, M. T.; Kotilinek, L.; Kayed, R.; Glabe, C. G.; Yang, A.; Gallagher, M.; Ashe, K. H. Nature 2006, 440, 352
【非特許文献１７】Bitan, G.; Kirkitadze, M. D.; Lomakin, A.; Vollers, S. S.; Benedek, G. B.; Teplow, D. B. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003, 100, 330
【非特許文献１８】Moss, M. A.; Nichols, M. R.; Reed, D. K.; Hoh, J. H.; Rosenberry, T. L. Mol. Pharmacol. 2003, 64, 1160
【非特許文献１９】Urbanic, B.; Cruz, L.; Yun, S.; Buldyrev, S. V.; Bitan, G.; Teplow, D. B.; Stanley. H. E. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004, 101, 17345
【非特許文献２０】Schenk, D.; Barbour, R.; Dunn, W.; Gordon, G.; Grajeda, H.; Guido, T.; Hu, K.; Huang, J.; Johnson-Wood, K.; Khan, K.; Kholodenko, D.; Lee, M.; Liao, Z.; Lieberburg, I.; Motter, R.; Mutter, L.; Soriano, F.; Shopp, G.; Vasquez, N.; Vandevert, C.; Walker, S.; Wogulis, M.; Yednock, T.; Games, D.; Seubert, P. Nature 1999, 400, 173
【非特許文献２１】DeMattos, R. B.; Bales, K. R.; Cummins, D. J.; Dodart, J.-C.; Paul, S. M.; Holtzman. D. M. Proc Natl. Acad. U.S.A. 2001, 98, 8850
【非特許文献２２】Cohen, T.; Frydman-Marom, A.; Rechter, M.; Gazit, E. Biocemistry 2006, 45, 4727
【非特許文献２３】Choi, D. S.; Wang, D.; Yu, G. Q.; Zhu, G.; Kharazia, V. N.; Paredes, J. P.; Chang, W. S.; Deitchman, J. K.; Mucke, L.; Messing, R. O. Proc Natl. Acad. Sci. 2006, 103, 8215
【非特許文献２４】Dobson, C. M. Science 2004, 304, 1259
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明者らは、アミロイド形成性ペプチド又はタンパク質の可溶性会合体を切断して可溶性オリゴマーの量を低減する方法を着眼した。アミロイド形成性ペプチド又はタンパク質の可溶性会合体に対して選択的に作用する合成切断分子（以下、‘切断剤’称する）は、アミロイド形成性ペプチド又はタンパク質の可溶性会合体を除去するための人工酵素である。本発明者らは、このような特性を有する切断剤を見つけるために、鋭意研究を行った。本発明者らは、アミロイド形成性ペプチド又はタンパク質の可溶性会合体を選択的に認識する認識部位とペプチド結合を切断する反応部位とを連結することによって、切断剤を見つけ出した。本発明者らは、この切断剤を用いることによって、アミロイド形成性ペプチド又はタンパク質の可溶性オリゴマーの量を低減する本発明の目的を效果的に達成できることを確認し、本発明を完成した。
【００１６】
従って、本発明は、アミロイド形成性ペプチド又はタンパク質の可溶性会合体を除去する切断剤の提供を目的とする。
【００１７】
また、本発明は,上記切断剤及び薬剤学的に許容される担体を含むアミロイド症の予防又は治療用医薬組成物の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、アミロイド形成性ペプチド又はタンパク質の可溶性会合体を選択的に切断する一般式（１）の切断剤に関する：
（Ｒ）ｎ−（Ｌ）ｍ−Ｚ    （１）
（式中、Ｒは、Ａ、Ａ−（Ｙ）ｏ−（ＣＨ２）ｐ−（Ｙ）ｏ−Ａ、Ａ−（ＣＨ＝ＣＨ）−Ａ、Ａ−（Ｙ）ｏ−（ＣＨ２）ｐ−（Ｙ）ｏ−Ａ−（Ｙ）ｏ−（ＣＨ２）ｐ−（Ｙ）ｏ−Ａ、及びＡ−（Ｙ）ｏ−（ＣＨ２）ｐ−（Ｙ）ｏ−Ａ−（Ｙ）ｏ−（ＣＨ２）ｐ−（Ｙ）ｏ−Ａ−（Ｙ）ｏ−（ＣＨ２）ｐ−（Ｙ）ｏ−Ａからなる群から独立的に選択された標的認識部位であり、
Ａは独立して、Ｃ６−１４アリール、又は酸素、硫黄及び窒素からなる群から選択された一つ以上のヘテロ原子を有する５員〜１４員のヘテロアリールであり、
ここで、アリール又はヘテロアリールは、独立的にＣ１−１５アルキル、ヒドロキシ、Ｃ１−１５アルコキシ、Ｃ１−１５アルキルカルボニルオキシ、Ｃ１−１５アルキルスルホニルオキシ、アミノ、モノ−又はジ−Ｃ１−１５アルキルアミノ、Ｃ１−１５アルキルカルボニルアミノ、Ｃ１−１５アルキルスルホニルアミノ、Ｃ３−１５シクロアルキルアミノ、ホルミル、Ｃ１−１５アルキルカルボニル、カルボキシ、Ｃ１−１５アルキルオキシカルボニル、カルバモイル、モノ−又はジ−Ｃ１−１５アルキルカルバモイル、Ｃ１−１５アルキルスルファニルカルボニル、Ｃ１−１５アルキルスルファニルチオカルボニル、Ｃ１−１５アルコキシカルボニルオキシ、カルバモイルオキシ、モノ−又はジ−Ｃ１−１５アルキルカルバモイルオキシ、Ｃ１−１５アルキルスルファニルカルボニルオキシ、Ｃ１−１５アルコキシカルボニルアミノ、ウレイド、モノ又はジ又はトリ−Ｃ１−１５アルキルウレイド、Ｃ１−１５アルキルスルファニルカルボニルアミノ、メルカプト、Ｃ１−１５アルキルスルファニル、Ｃ１−１５アルキルジスルファニル、スルホ、Ｃ１−１５アルコキシスルホニル、スルファモイル、モノ−又はジ−Ｃ１−１５アルキルスルファモイル、トリ−Ｃ１−１５アルキルシラニル及びハロゲンからなる群から独立的に選択された一つ以上の置換基で置換されていてもよく；
ＹはＯ又はＮ−Ｚであり、ここで、Ｚは水素又はＣ１−９アルキルであり；
Ｌはリンカーであり；
Ｚは触媒部位として、金属イオン−リガンド複合体であり；
ｎは独立的に１〜６の整数であり；
ｍ及びｏは独立的に０又は１であり；
ｐは０〜５の整数である。）。
【発明の効果】
【００１９】
本発明に係る切断剤はアミロイド形成性ペプチド又はタンパク質の可溶性会合体を認識する標的認識部位と特にペプチド結合を切断する切断活性を有する触媒部位とからなる。従って、アミロイド形成性ペプチド又はタンパク質の可溶性会合体を選択的に認識する能力とペプチド結合を切断する能力とを有している。その結果、本発明の切断剤は、様々な種類のバイオ分子が存在する状況下でアミロイド形成性ペプチド又はタンパク質の可溶性オリゴマーの生物学的活性を選択的に阻害する効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】Ａβ４２のアミノ酸配列を示す図である。
【図２】アミロイド形成性ペプチド又はタンパク質の可溶性会合体と不溶性会合体との生成過程を概略的に示す図である。
【図３】切断剤の作用によってアミロイド形成性ペプチド又はタンパク質の可溶性会合体と不溶性会合体の量が低減される過程を概略的に示す図である。
【図４】本発明の実施例１で切断剤Ａの合成過程を概略的に示す図である。
【図５】Ａβ４０（○）及びＡβ４２（●）（初期濃度４．０μＭ）がｐＨ７．５０及び３７℃で一定時間予備反応させた後、カットオフ分子量１００００の膜を通過させ、ろ過される部分（fraction）の量を示すグラフである（各データ点は少なくとも５回実験した数値の平均値である）。
【図６】実施例１の切断剤Ａ（３．０μＭ）をｐＨ７．５０及び３７℃で３６時間Ａβ４０（４．０μＭ）と反応させた後、生成された生成物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量を示すスペクトルである。
【図７】実施例１の切断剤Ａ（１．０μＭ）をｐＨ７．５０及び３７℃でＡβ４２（４．０μＭ）と３６時間反応させた後、生成された生成物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量を示すスペクトルである。
【図８】実施例１の切断剤Ａの濃度（Ｃｏ）を変えながら、ｐＨ７.５０及び３７℃でＡβ４０（○）及びＡβ４２（●）（４．０μＭ）と３６時間反応させた後に、測定した切断収率がｌｏｇＣｏ／Ｍに依存する傾向を示すグラフである。
【図９】Ａβ４０（灰色の棒）又はＡβ４２(黒色の棒)（４．０μＭ）をｐＨ７．５０及び３７℃で反応させた後、実施例１の切断剤Ａ（３．０μＭ）を加え、３６時間切断される反応収率が反応時間に依存する傾向を示すグラフである。
【図１０】ｐＨ７．５０及び３７℃で、Ａβ４０（○）及びＡβ４２（●）（４．０μＭ）が実施例１の切断剤Åによって切断される収率が切断反応時間に依存する傾向を示すグラフである。
【図１１】Ａｍ（初期濃度４．０μＭ）がｐＨ７．５０溶液及び３７℃で一定時間反応させた後、カットオフ分子量１００００の膜を通過させ、ろ過される部分（fraction）の量を示すグラフである。
【図１２】実施例１の切断剤Ａ（３．２μＭ）をｐＨ７．５０及び３７℃で３６時間Ａｍ（４．０μＭ）と反応させた後、ＨＰＬＣで精製した生成物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルである。
【図１３】実施例１の切断剤Ａの濃度（Ｃｏ）を変えながら、ｐＨ７．５０及び３７℃でＡｍ（４．０μＭ）と３６時間反応させた後に、測定した切断収率がｌｏｇＣｏ／Ｍに依存することを示す図である。
【図１４】Ｓｙｎ（初期濃度７０μＭ）がｐＨ７．５０溶液及び３７℃で一定時間反応させた後、０．２２μｍミリポアフィルタ（Millipore Millex-GV4MM）を通過してろ過される部分（fraction）の量を示すグラフである。
【図１５】実施例１の切断剤Ａの濃度（Ｃｏ）を変えながら、ｐＨ７．５０及び３７℃でＳｙｎ（７０μＭ）と３日間反応させた後に、測定した切断収率がｌｏｇＣｏ／Ｍに依存する傾向を示すグラフである。
【図１６】本発明の実施例２で切断剤Ｂの合成過程を概略的に示す図である。
【図１７】実施例２の切断剤Ｂ（３．０μＭ）をｐＨ７．５０及び３７℃でＡβ４０（４．０μＭ）と３６時間反応させた後、生成された生成物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルである。
【図１８】実施例２の切断剤Ｂ（０．５０μＭ）をｐＨ７．５０及び３７℃でＡβ４２（４．０μＭ）と３６時間反応させた後、生成された生成物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルである。
【図１９】実施例２の切断剤Ｂの濃度（Ｃｏ）を変えながら、ｐＨ７.５０及び３７℃でＡβ４０（○）又はＡβ４２（●）（４．０μＭ）と３６時間反応させた後に、測定した切断収率がｌｏｇＣｏ／Ｍに依存する傾向を示すグラフである。
【図２０】実施例２の切断剤Ｂ（１．０μＭ）をｐＨ７．５０及び３７℃でＡｍ（４．０μＭ）と３６時間反応させた後、ＨＰＬＣで精製した生成物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルである。
【図２１】実施例２の切断剤Ｂの濃度（Ｃｏ）を変えながら、ｐＨ７．５０及び３７℃でＡｍ（４．０μＭ）と３６時間反応させた後に、測定した切断収率がｌｏｇＣｏ／Ｍに依存する傾向を示すグラフである。
【図２２】ｐＨ７．５０及び３７℃でＡｍ（４．０μＭ）を予備反応させた後、実施例２の切断剤Ｂ（１．０μＭ）によって、３６時間切断される反応の収率が反応時間に依存する傾向を示すグラフである。
【図２３】ｐＨ７．５０及び３７℃でＡｍ（４．０μＭ）が実施例２の切断剤Ｂ（１．０μＭ）によって切断される収率が切断反応時間に依存する傾向を示すグラフである。
【図２４】実施例２の切断剤Ｂの濃度（Ｃｏ）を変えながら、ｐＨ７．５０及び３７℃でＳｙｎ（７０μＭ）と３日間反応させた後に、測定した切断収率がｌｏｇＣｏ／Ｍに依存する傾向を示すグラフである。
【図２５】本発明の実施例３で切断剤Ｃの合成過程を概略的に示す図である。
【図２６】実施例３の切断剤Ｃ（１．００μＭ）をｐＨ７．５０及び３７℃でＡβ４２（４．０μＭ）と３６時間反応させた後、生成された生成物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルである。
【図２７】実施例３の切断剤Ｃの濃度（Ｃｏ）を変えながら、ｐＨ７．５０及び３７℃でＡβ４０（○）又はＡβ４２（●）（４．０μＭ）と３６時間反応させた後に、測定した切断収率がｌｏｇＣｏ／Ｍに依存する傾向を示すグラフである。
【図２８】実施例３の切断剤Ｃ（３．２μＭ）をｐＨ７．５０及び３７℃でＡｍ（４．０μＭ）と３６時間反応させた後、ＨＰＬＣで精製した生成物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルである。
【図２９】実施例３の切断剤Ｃの濃度（Ｃｏ）を変えながら、ｐＨ７．５０及び３７℃でＡｍ（４．０μＭ）と３６時間反応させた後に、測定した切断収率がｌｏｇＣｏ／Ｍに依存する傾向を示すグラフである。
【図３０】本発明の実施例４で切断剤Ｄの合成過程を概略的に示す図である。
【図３１】実施例４の切断剤Ｄ（１．００μＭ）をｐＨ７．５０及び３７℃でＡβ４２（４．０μＭ）と３６時間反応させた後に、生成された生成物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルである。
【図３２】実施例４の切断剤Ｄの濃度（Ｃｏ）を変えながら、ｐＨ７．５０及び３７℃でＡβ４０（○）又はＡβ４２（●）（４．０μＭ）と３６時間反応させた後に、測定した切断収率がｌｏｇＣｏ／Ｍに依存する傾向を示すグラフである。
【図３３】実施例４の切断剤Ｄ（０．３８μＭ）をｐＨ７．５０及び３７℃でＡｍ（４．０μＭ）と３６時間反応させた後、ＨＰＬＣで精製した生成物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルである。
【図３４】実施例４の切断剤Ｄの濃度（Ｃｏ）を変えながら、ｐＨ７．５０及び３７℃でＡｍ（４．０μＭ）と３６時間反応させた後に、測定した切断収率がｌｏｇＣｏ／Ｍに依存する傾向を示すグラフである。
【図３５】本発明の実施例５で切断剤Ｅの合成過程を概略的に示す図面である。
【図３６】実施例５の切断剤Ｅ（０．８９μＭ）をｐＨ７．５０及び３７℃でＡｍ（４．０μＭ）と３６時間反応させた後に、ＨＰＬＣで精製した生成物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルである。
【図３７】実施例５の切断剤Ｅの濃度（Ｃｏ）を変えながら、ｐＨ７．５０及び３７℃でＡｍ（４．０μＭ）と３６時間反応させた後に、測定した切断収率がｌｏｇＣｏ／Ｍに依存する傾向を示すグラフである。
【図３８】本発明の実施例６で切断剤Ｆの合成過程を概略的に示す図である。
【図３９】実施例６の切断剤Ｆ（１．６μＭ）をｐＨ７．５０及び３７℃でＡｍ（４．０μＭ）と３６時間反応させた後に、ＨＰＬＣで精製した生成物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルである。
【図４０】実施例６の切断剤Ｆの濃度（Ｃｏ）を変えながら、ｐＨ７．５０及び３７℃でＡｍ（４．０μＭ）と３６時間反応させた後、測定した切断収率がｌｏｇＣｏ／Ｍに依存する傾向を示したグラフである。
【図４１】本発明の実施例７で切断剤Ｇの合成過程を概略的に示す図である。
【図４２】実施例７の切断剤Ｇ（０．８９μＭ）をｐＨ７．５０及び３７℃でＡｍ（４．０μＭ）と３６時間反応させた後に、ＨＰＬＣで精製した生成物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルである。
【図４３】実施例７の切断剤Ｇの濃度（Ｃｏ）を変えながら、ｐＨ７．５０及び３７℃でＡｍ（４．０μＭ）と３６時間反応させた後に、測定した切断収率がｌｏｇＣｏ／Ｍに依存する傾向を示すグラフである。
【図４４】本発明の実施例８で切断剤Ｈの合成過程を概略的に示す図である。
【図４５】実施例８の切断剤Ｈ（７．１μＭ）をｐＨ７．５０及び３７℃でＡｍ（４．０μＭ）と３６時間反応させた後に、ＨＰＬＣで精製した生成物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルである。
【図４６】実施例８の切断剤Ｈの濃度（Ｃｏ）を変えながら、ｐＨ７．５０及び３７℃でＡｍ（４．０μＭ）と３６時間反応させた後に、測定した切断収率がｌｏｇＣｏ／Ｍに依存する傾向を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明に係る切断剤を具体的に説明する。
【００２２】
Ａβ４２のオリゴマー化及びフィブリル形成過程で説明されたように、アミロイド形成性ペプチド又はタンパク質の会合過程には、様々な可溶性オリゴマー及びプロトフィブリルが可逆的又は部分非可逆的に形成され、フィブリルが非可逆的に形成される（非特許文献１７）。プロトフィブリルは、可溶性又は不溶性ポリマーと見なされ得る （非特許文献１８： Hull, R.; Westermark, G. T.; Westermark, P.; Kahn, S. J. Clin. Endicrinol. Metab. 204, 89, 3629）。従って、アミロイド形成性ペプチド又はタンパク質の一つ以上の可溶性会合体を様々な可溶性会合体から除去すれば、アミロイド形成性ペプチド又はタンパク質の可溶性会合体の全量が低減され、フィブリル形成が抑制される。
【００２３】
効果的な切断剤は、酵素の触媒作用原理を摸倣することによって得ることができる。酵素反応において、基質は酵素と複合体を形成し、酵素は結合された基質を製品に変換する。酵素−基質複合体の形成を通して、基質に対する酵素の触媒官能基の有効モル濃度は大きく増加し、非常に速い反応速度をもたらす。
【００２４】
本発明に係る一般式（１）の切断剤は人工酵素である。
【００２５】
本発明の切断剤は、アミロイド形成性ペプチド又はタンパク質の可溶性会合体を認識する標的認識部位を有しているので、一つ以上の可溶性会合体と選択的に結合しうる。標的認識部位が可溶性会合体と結合された後、本発明に係る切断剤の触媒部位が可溶性会合体内のペプチド結合を切断する。
【００２６】
Ａβ４２のために提案されるように、アミロイド形成性ペプチド又はタンパク質の様々な種類の可溶性会合体と不溶性フィブリルの生成過程を図２に示した （非特許文献１７）。図２において、長方形中に含まれたものは可溶性会合体を示す。可溶性会合体は可溶性オリゴマー及び可溶性プロトフィブリルを含む。可溶性プロトフィブリルは非常に大きな可溶性オリゴマーと見なされ得る。プロトフィブリルとフィブリルなどの大きな会合体がそれらより小さいものへの転換は遅く、大きな会合体の形成は非可逆又は部分的に非可逆と見なされ得る。一部のアミロイド形成性ペプチド又はタンパク質の場合、フィブリル形成が可逆であり、フィブリとモノマーとが平衡関係にあることが提案されている（Wetzel, R. Acc. Chem. Res. 2006, 39, 671）。図２に示されるように、切断を通じて一種類の会合体の濃度を低減することは、切断された会合体に容易に転換され得る他の会合体の濃度を低減することができる。
【００２７】
本発明に係る切断剤は、図２の長方形に示された一つ以上の種と結合した後、アミロイド形成性ペプチド又はタンパク質のペプチド結合を切断して、所期の機能を達成する。切断剤の標的認識部位と可溶性会合体との複合体形成を通じて、切断剤の触媒部位はアミロイド形成性ペプチド又はタンパク質のペプチド結合に近接に位置する。触媒部位の攻撃によって、アミロイド形成性ペプチド又はタンパク質が效果的に切断される。
【００２８】
切断剤と標的と間の反応は酵素反応に適用されるＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ式と同様の反応式１として要約される：
反応式１
【化１】
2010507652.tif 000002
【００２９】
ＣｏＩＩＩ複合体の様々な誘導体に対して知られたように、切断剤が触媒として作用し、ペプチド結合を加水分解する場合、切断剤は標的切断後に、再生される（Jeon, J. W.; Son, S. J.; Yoo, C. E.; Hong, I. S.; Song, J. B.; Suh, J. Org. Lett. 2002, 4, 4155: Chae, P. S.; Kim, M.; Jeung, C.; Lee, S. D.; Park, H.; Lee, S.; Suh, J. J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 2396）。
【００３０】
図２と反応式１の内容を結合して作成した図３には、切断剤の作用によって、アミロイド形成性ペプチド又はタンパク質の可溶性会合体と不溶性会合体の量を低減する工程が示されている。図３において、（ＡＰ）ａｓｓ−ｍは切断された会合体を表す。（ＡＰ）ａｓｓ−ｍが本発明の切断剤によって切断され、（ＡＰ）ａｓｓ−ｍの濃度が低減されたとき、（ＡＰ）ａｓｓ−ｍに容易に転換され得る他の会合体の濃度も低減された。しかし、（ＡＰ）ａｓｓ−ｍに容易に転換されないプロトフィブリル又はフィブリルを含む会合体の量は效果的に低減されない。その代わりに、（ＡＰ）ａｓｓ−ｍの濃度の低減によって、（ＡＰ）ａｓｓ−ｍからプロトフィブリル又はフィブリルの形成速度が低下される。
【００３１】
標的認識部位 
効果的な切断剤は、切断剤の非常に低い濃度で、アミロイド形成性ペプチド又はタンパク質の可溶性会合体と複合体を形成する必要がある。従って、本発明に係る切断剤は可溶性会合体と選択的で、且つ強く結合しうる標的認識部位からなっている。
【００３２】
アミロイド形成性ペプチド又はタンパク質の芳香族側鎖間の相互作用は会合体形成に重要な役割を有している（Cohen, T.; Frydman-Marom, A.; Rechter, M.; Gazit, E. Biochemistry 2006, 45, 4727）。Ｋａｙｅｄらは多様な種類のアミロイド形成性ペプチド又はタンパク質の可溶性オリゴマーが共通の形態依存構造を有していることを報告した（Kayed, R.; Head, E.; Thompson, J. L.; McIntire, T. M.; Milton, S. C.; Cotman, C. W.; Glabe, C. G. Science 2003, 300, 486）。
【００３３】
従って、芳香族鎖によって形成された微細領域に対して高い親和度を有する有機基は、制限がなく、本発明に係る標的認識部位として使用することができる。
【００３４】
好ましくは、本発明に係る標的認識部位は、Ａ、Ａ−（Ｙ）ｏ−（ＣＨ２）ｐ−（Ｙ）ｏ−Ａ、Ａ−（ＣＨ＝ＣＨ）−Ａ、Ａ−（Ｙ）ｏ−（ＣＨ２）ｐ−（Ｙ）ｏ−Ａ−（Ｙ）ｏ−（ＣＨ２）ｐ−（Ｙ）ｏ−Ａ及びＡ−（Ｙ）ｏ−（ＣＨ２）ｐ−（Ｙ）ｏ−Ａ−（Ｙ）ｏ−（ＣＨ２）ｐ−（Ｙ）ｏ−Ａ−（Ｏ）ｏ−（ＣＨ２）ｐ−（Ｙ）ｏ−Ａからなる群から選択される。
【００３５】
ここで、Ａはそれぞれ独立して、Ｃ６−１４アリール、又は酸素、硫黄及び窒素からなる群から選択された一つ以上のヘテロ原子を含有する５員〜１４員のヘテロアリールを表す。
【００３６】
好ましくは、Ａは下記式の化合物からなる群から選択され；
【化２】
2010507652.tif 000003
式中、Ｘはそれぞれ独立して、Ｃ、Ｎ、ＮＨ、Ｏ及びＳからなる群から選択される。
【００３７】
より好ましくは、Ａは下記式からなる群から選択され；
【化３】
2010507652.tif 000004
式中、ＸはそれぞれＮＨ、Ｏ、又はＳである。
ここで、Ａはそれぞれ、Ｃ１−１５アルキル、ヒドロキシ、Ｃ１−１５アルコキシ、Ｃ１−１５アルキルカルボニルオキシ、Ｃ１−１５アルキルスルホニルオキシ、アミノ、モノ−又はジ−Ｃ１−１５アルキルアミノ、Ｃ１−１５アルキルカルボニルアミノ、Ｃ１−１５アルキルスルホニルアミノ、Ｃ３−１５シクロアルキルアミノ、ホルミル、Ｃ１−１５アルキルカルボニル、カルボキシ、Ｃ１−１５アルキルオキシカルボニル、カルバモイル、モノ−又はジ−Ｃ１−１５アルキルカルバモイル、Ｃ１−１５アルキルスルファニルカルボニル、Ｃ１−１５アルキルスルファニルチオカルボニル、Ｃ１−１５アルコキシカルボニルオキシ、カルバモイルオキシ、モノ−又はジ−Ｃ１−１５アルキルカルバモイルオキシ、Ｃ１−１５アルキルスルファニルカルボニルオキシ、Ｃ１−１５アルコキシカルボニルアミノ、ウレイド、モノ又はジ又はトリ−Ｃ１−１５アルキルウレイド、Ｃ１−１５アルキルスルファニルカルボニルアミノ、メルカプト、Ｃ１−１５アルキルスルファニル、Ｃ１−１５アルキルジスルファニル、スルホ、Ｃ１−１５アルコキシスルホニル、スルファモイル、モノ−又はジ−Ｃ１−１５アルキルスルファモイル、トリ−Ｃ１−１５アルキルシラニル及びハロゲンからなる群から独立的に選択された一つ以上の置換基で置換されていてもよい。
【００３８】
好ましくは、ＡはＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、アミノ、モノ−又はジ−Ｃ１−１２アルキルアミノ、Ｃ１−６アルキルカルボニルアミノ、Ｃ１−６アルキルスルホニルアミノ、Ｃ６−１５シクロアルキルアミノ、Ｃ１−６アルキルカルボニル、カルバモイル、モノ−又はジ−Ｃ１−６アルキルカルバモイル、Ｃ１−６アルコキシカルボニルアミノ、ウレイド、モノ又はジ又はトリ−Ｃ１−６アルキルウレイド、Ｃ１−６アルキルスルファニルカルボニルアミノ、Ｃ１−６アルキルスルファニル、Ｃ１−６アルキルジスルファニル、スルファモイル、モノ−又はジ−Ｃ１−６アルキルスルファモイル、トリ−Ｃ１−６アルキルシラニル及びハロゲンからなる群から独立的に選択された一つ以上の置換基で置換されていてもよい。
【００３９】
より好ましくは、ＡはＣ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、アミノ、モノ−又はジ−Ｃ１−８アルキルアミノ、Ｃ６−１２シクロアルキルアミノ、Ｃ１−４アルキルカルボニル及びハロゲンからなる群から独立的に選択された一つ以上の置換基で置換されていてもよい。
ここで、ＹはＯ又はＮ−Ｚであり、
ＺはＣ１−９アルキル、好ましくはＣ１−４アルキルである。
ここで、ｐは独立的に０〜５の整数、好ましくは０〜２の整数である。
ここで、ｏは独立的に０又は１である。
【００４０】
本発明に係る切断剤は、標的認識部位を１〜６個、好ましくは１〜４個、より好ましくは１又は２個含む。
【００４１】
触媒部位
金属イオン中の一部は、有機官能基又は別の金属イオンの助力なしにペプチド結合を加水分解する反応で触媒活性を示している（Suh, J. Acc. Chem. Res. 1992, 25, 273: Suh, J. Acc. Chem. Res. 2003, 36, 562）。
【００４２】
金属イオンは、ペプチド加水分解反応において、触媒活性に基づいて本発明に係る触媒部位の核心要素として活用できる。
【００４３】
本発明に係る触媒部位は金属イオン−リガンド複合体で構成されている。上記標的認識部位を介して、本発明に係る切断剤がアミロイド形成性ペプチド又はタンパク質の可溶性会合体と結合することによって、切断剤の触媒部位と標的分子の切断部位と間の有効濃度が大いに増加される。従って、本発明の切断剤は標的分子のペプチド結合を效果的に切断することができる。
【００４４】
ペプチド又はタンパク質を切断する能力を有する多数の金属イオンが公知されている。好ましくは、本発明に係る触媒部位に使用される金属イオンは、ＣｏＩＩＩ、ＣｕＩ、ＣｕＩＩ、ＣｅＩＶ、ＣｅＶ、ＣｒＩＩＩ、ＦｅＩＩ、ＦｅＩＩＩ、ＭｏＩＶ、ＮｉＩＩ、ＰｄＩＩ、ＰｔＩＩ、ＶＶ及びＺｒＩＶからなる群から選択される。より好ましくは、ＣｏＩＩＩ、ＣｕＩＩ又はＰｄＩＩである。最も好ましくは、ＣｏＩＩＩである。
【００４５】
また、本発明者らはアミロイド形成性ペプチド又はタンパク質の可溶性オリゴマーを選択的に切断することで、これらの生物学的活性を阻害するためには触媒部位のリガンドを特定構造に限定することが重要であることを見出した。
【００４６】
本発明の触媒部位に使用されるリガンドは下記化合物からなる群から選択される：
【化４】
2010507652.tif 000005
式中、リガンドに含まれるそれぞれの窒素原子は酸素、硫黄及びリン原子からなる群から選択された原子で代替でき；
リガンドはＣ６−１４アリール又は５員〜１４員のヘテロアリールと縮合されていてもよい。
【００４７】
好ましくは、触媒部位に使用されるリガンドは下記式からなる群から選択される：
【化５】
2010507652.tif 000006
【００４８】
より好ましくは、リガンドは１２個の原子からなる環であり、下記式からなる群から選択される：
【化６】
2010507652.tif 000007
ここで、リガンドはＣ１−１５アルキル、ヒドロキシ、Ｃ１−１５アルコキシ、Ｃ１−１５アルキルカルボニルオキシ、Ｃ１−１５アルキルスルホニルオキシ、アミノ、モノ−又はジ−Ｃ１−１５アルキルアミノ、Ｃ１−１５アルキルカルボニルアミノ、Ｃ１−１５アルキルスルホニルアミノ、ホルミル、Ｃ１−１５アルキルカルボニル、カルボキシ、Ｃ１−１５アルキルオキシカルボニル、カルバモイル、モノ−又はジ−Ｃ１−１５アルキルカルバモイル、Ｃ１−１５アルキルスルファニルカルボニル、Ｃ１−１５アルキルスルファニルチオカルボニル、Ｃ１−１５アルコキシカルボニルオキシ、カルバモイルオキシ、モノ−又はジ−Ｃ１−１５アルキルカルバモイルオキシ、Ｃ１−１５アルキルスルファニルカルボニルオキシ、Ｃ１−１５アルコキシカルボニルアミノ、ウレイド、モノ又はジ又はトリ−Ｃ１−１５アルキルウレイド、Ｃ１−１５アルキルスルファニルカルボニルアミノ、メルカプト、Ｃ１−１５アルキルスルファニル、Ｃ１−１５アルキルジスルファニル、スルホ、Ｃ１−１５アルコキシスルホニル、スルファモイル、モノ−又はジ−Ｃ１−１５アルキルスルファモイル、トリ−Ｃ１−１５アルキルシラニル及びハロゲンからなる群から独立的に選択された一つ以上の置換基で置換されていてもよい。
【００４９】
好ましくは、リガンドはＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルカルボニルオキシ及びハロゲンからなる群から独立的に選択された一つ以上の置換基で置換されていてもよい。
【００５０】
より好ましくは、リガンドはＣ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシ及びハロゲンからなる群から独立的に選択された一つ以上の置換基で置換されていてもよい。
【００５１】
リンカー
本発明の切断剤において、標的認識部位（Ｒ）はリンカーを通じて連結されているか、または触媒部位（Ｚ）に直接連結される。
【００５２】
リンカーによる標的認識部位及び触媒部位の結合態様は、リンカーを通じてそれぞれ１個の標的認識部位と触媒部位と間の連結する形式、２つ以上の標的認識部位が別途のリンカーを通じて触媒部位に連結される並列形式、２つ以上の標的認識部位が分岐構造を有する一個のリンカーを通じて触媒部位に連結される並列形式、２つ以上の標的認識部位が１個のリンカーを通じて互いに連結され、一つの認識部が別途のリンカーを通じて触媒部位に連結される直列形式を含む。又は、切断剤は複数の数の標的認識部位を触媒部位に連結するために、上記リストされた連結態様を結合することによって切断剤を構成することができる：
【化７】
2010507652.tif 000008
式中、
【化８】
2010507652.tif 000009
はリンカーを表し、
Ｒは標的認識部位を表し、
Ｚは触媒部位を表す。
【００５３】
リンカーは標的認識部位と触媒部位と間を直接連結するか、又は二つの標的認識部位間を連結する主鎖、及び主鎖に任意に付着された置換基を含む。
【００５４】
標的認識部位が標的タンパク質に結合した後、触媒部位は標的タンパク質内のペプチド結合中の一つ以上を切断する。タンパク質上の切断部位と触媒部位と間の有効濃度を増加させることによって、触媒部位の反応性を増進される。有効濃度を調節する効果的な方法は、切断剤中に含まれた標的認識部位と触媒部位と間の相対的な位置を調節することである。リンカーの長さと形状は相対的な位置を調節するために用いられていてもよい。
【００５５】
本発明のリンカーは、標的認識部位及び触媒部位を連結するのに用いられる。本発明のリンカーは、炭素、窒素、酸素、ケイ素、硫黄及びリンからなる群から独立的に選択された一つ以上の原子を含む骨格からなる。骨格を構成する原子の数は１〜３０であり、好ましくは１〜２０であり、より好ましくは１〜１５である。リンカーの骨格に含まれた原子は、アルカン、アルケン、アルキン、カルボニル、チオカルボニル、アミン、エーテル、シリル、スルフィド、ジスルフィド、スルホニル、スルフィニル、ホスホリル、ホスフィニル、アミド、イミド、エステル及びチオエステルからなる群から独立的に選択された官能基の構成員として存在する。
【００５６】
リンカーは、Ｃ１−９アルキル、ヒドロキシ、Ｃ１−９アルコキシ、Ｃ１−９アルキルカルボニルオキシ、Ｃ１−９アルキルスルホニルオキシ、アミノ、モノ−又はジ−Ｃ１−９アルキルアミノ、Ｃ１−９アルキルカルボニルアミノ、Ｃ１−９アルキルスルホニルアミノ、ホルミル、Ｃ１−９アルキルカルボニル、カルボキシ、Ｃ１−９アルキルオキシカルボニル、カルバモイル、モノ−又はジ−Ｃ１−９アルキルカルバモイル、Ｃ１−９アルキルスルファニルカルボニル、Ｃ１−９アルキルスルファニルチオカルボニル、Ｃ１−９アルコキシカルボニルオキシ、カルバモイルオキシ、モノ−又はジ−Ｃ１−９アルキルカルバモイルオキシ、Ｃ１−９アルキルスルファニルカルボニルオキシ、Ｃ１−９アルコキシカルボニルアミノ、ウレイド、モノ又はジ又はトリ−Ｃ１−９アルキルウレイド、Ｃ１−９アルキルスルファニルカルボニルアミノ、メルカプト、Ｃ１−９アルキルスルファニル、Ｃ１−９アルキルジスルファニル、スルホ、Ｃ１−９アルコキシスルホニル、スルファモイル、モノ−又はジ−Ｃ１−９アルキルスルファモイル、トリ−Ｃ１−９アルキルシラニル及びハロゲンからなる群から独立的に選択された一つ以上の置換基で置換されていてもよい。
【００５７】
好ましくは、リンカーは、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、モノ−又はジ−Ｃ１−６アルキルアミノ、Ｃ１−６アルキルカルボニルアミノ、Ｃ１−６アルキルスルホニルアミノ、Ｃ１−６アルキルカルボニル、カルバモイル、モノ−又はジ−Ｃ１−６アルキルカルバモイル、Ｃ１−６アルコキシカルボニルアミノ、ウレイド、モノ又はジ又はトリ−Ｃ１−６アルキルウレイド、Ｃ１−６アルキルスルファニルカルボニルアミノ、Ｃ１−６アルキルスルファニル、Ｃ１−６アルキルジスルファニル、スルファモイル、モノ−又はジ−Ｃ１−６アルキルスルファモイル、トリ−Ｃ１−６アルキルシラニル及びハロゲンからなる群から独立的に選択された一つ以上の置換基で置換されていてもよい。
【００５８】
より好ましくは、リンカーは、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、モノ−又はジ−Ｃ１−４アルキルアミノ、Ｃ１−４アルキルカルボニルアミノ、Ｃ１−４アルキルスルホニルアミノ、Ｃ１−４アルキルカルボニル、カルバモイル、モノ−又はジ−Ｃ１−４アルキルカルバモイル、Ｃ１−４アルコキシカルボニルアミノ、ウレイド、モノ又はジ又はトリ−Ｃ１−４アルキルウレイド、Ｃ１−４アルキルスルファニルカルボニルアミノ、Ｃ１−４アルキルスルファニル、Ｃ１−４アルキルジスルファニル、スルファモイル、モノ−又はジ−Ｃ１−４アルキルスルファモイル、トリ−Ｃ１−４アルキルシラニル及びハロゲンからなる群から独立的に選択された一つ以上の置換基で置換されていてもよい。
【００５９】
本発明が属する技術分野で熟練した者であれば、上記定義の中で、様々な標的タンパク質及び合成触媒に対する切断部位及び触媒部位間の有効濃度を調節するのに適したリンカーの構造を選択するための組み合わせ化学的実験方法を考案することができるはずである。
【００６０】
本発明の切断剤は、アミロイド形成性ペプチド又はタンパク質の可溶性会合体に含まれた芳香性微細構造と切断剤の標的認識部位に含まれた芳香族構成成分と間の相互作用を活用して標的を認識する。従って、芳香性微細構造を含む可溶性会合体である限り、可溶性会合体を形成するために、種々の種類のアミロイド形成性ペプチド又はタンパク質が使用されるかは重要ではない。即ち、１種類のアミロイド形成性ペプチド又はタンパク質によって形成された可溶性会合体だけでなく、２種類以上のアミロイド形成性ペプチド又はタンパク質によって形成された可溶性会合体を、本発明の切断剤のための標的にすることができる。
【００６１】
また、可溶性会合体の形成過程で、他の種類のバイオ分子が会合体内に組み込まれ得る。これらのバイオ分子が会合体内に共存するときでも、本発明の会合体はまだ切断剤の標的でありうる。
【００６２】
本発明の切断剤は、一つのアミロイド症に関連したペプチド又はタンパク質の可溶性会合体を選択的に切断することができるか、又は２つ以上のアミロイド症に関連したペプチド又はタンパク質の可溶性会合体を切断することができる。
【００６３】
本発明の切断剤は、下記オリゴマーに制限されないが、特に下記オリゴマーの切断に効果的である。
【００６４】
（１）アルツハイマー病に関連したＡβ４０及びＡβ４２のオリゴマー
Ａβ４０及びＡβ４２は、図２に示されるように、自体会合によって様々なオリゴマー、プロトフィブリル及びフィブリルを形成する。Ａβ４２の集積はＡβ４０のそれより速い。従って、Ａβ４２単量体の濃度が数μＭ以上高い場合、Ａβ４２は数分内にオリゴマー化される。その後、数時間内に、溶液中又は固体表面上で０．１μｍより小さいプロトフィブリルに変換される（Kowalewski, T.; Holtzman, D. M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999, 96, 3688: Bitan, G.; Kirkitadze, M. D.; Lomakin, A.; Vollers, S. S.; Benedek, G. B.; Teplow, D. B. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003, 100, 330）。Ａβ４０は二量体、三量体、四量体などを平衡工程で形成し、Ａβ４２は五量体と六量体を主に形成することと知られている（非特許文献１７）。最近には、Ａβ４２は単量体が大きなオリゴマーと混合物として存在し、Ａβ４０は単量体が二量体と平衡関係にあると報告されている（Hepler, R. W.; Grimm, K. M.; Nahas, D. D.; Breese, R.; Dodson, E. C.; Acton, P.; Keller, P. M.; Yeager, M.; Wang, H.; Shughrue, P.; Kinney, G.; Joyce, J. G. Biochemistry 2006, 45, 15157-15167）。
【００６５】
Ａβ４０及びＡβ４２の集積工程は、実験条件に敏感である（Hepler, R. W.; Grimm, K. M.; Nahas, D. D.; Breese, R.; Dodson, E. C.; Acton, P.; Keller, P. M.; Yeager, M.; Wang, H.; Shughrue, P.; Kinney, G.; Joyce, J. G. Biochemistry 2006, 45, 15157-15167）。
【００６６】
現段階では、アミロイド形成性ペプチド又はタンパク質により形成された様々な種類のオリゴマー中、どんな種類のオリゴマーが本発明の切断剤により切断されるのかは明らかでない。しかし、標的オリゴマーの濃度が切断剤による切断することによって低くなるとき、この標的オリゴマーと平衡関係にある別のオリゴマーの濃度も低減される。従って、また、該当アミロイド症の原因になるオリゴマーの量も低減される。
【００６７】
実施例で示されるように、切断剤中の幾つかは、様々な種類のアミロイド形成性ペプチド又はタンパク質のオリゴマーを切断する能力を有している。
【００６８】
本発明の実施例１では、切断剤ＡがＡβ４２だけでなくＡβ４０のオリゴマーを切断している。Ａβ４０は、主にβ−アミロイド先駆タンパク質のタンパク分解の切断によって生成される。Ａβ４０は様々な生理的な機能を担当しているので、Ａβ４０を大幅に切断すれば、その正常機能を阻害される。しかし、アルツハイマー病患者の脳にはＡβ４０の量が、正常の高齢者の水準のそれよりも３０〜４０倍高い（非特許文献１０）。従って、Ａβ４２の切断過程で、Ａβ４０が一部分切断されても、アルツハイマー病患者での副作用を引き起こさないこともあり得る。
【００６９】
Ａβ４２のオリゴマーに対抗して作られた抗体が、Ａβ４２オリゴマーだけでなくＡβ４０オリゴマー、及びα−シヌクレイン、アミリン、ポリグルタミン、リゾチーム、インスリン、プリオンペプチド１０６−１２６などの、他のアミロイド形成性タンパク質又はペプチドのオリゴマーを認識することができる（Kayed, R.; Head, E.; Thompson, J. L.; McIntire, T. M.; Milton, S. C.; Cotman, C. W.; Glabe, C. G. Science 2003, 300, 486-489）。異なる種類の水溶性アミロイドオリゴマーは共通の形態−依存構造を有し、単一薬で異なる種類のアミロイド症を治療する可能性があるという考察が示唆された。
【００７０】
実施例で提示される切断剤の一部は、２種類以上のアミロイド形成性ペプチド又はタンパク質のゴマーを切断する能力を示しているが、これは抗体研究の結果に一致している。
【００７１】
（２）２型糖尿病に関連したアミリンのオリゴマー
２型糖尿病を引き起こす原因の中の一つとして、アミリン（Ａｍ：ヒト膵島アミロイドポリペプチド）のオリゴマーが報告されている（Janson, J.; Ashley, R. H.; Harrison, D.; McIntyre, S.; Butler, P. C. Diabetes 1999, 48, 491-498: Kayed, R.; Head, E.; Thompson, J. L.; McIntire, T. M.; Milton, S. C; Cotman, C. W.; Glabe, C. G. Science 2003, 300, 486-489: Kayed, R.; Sokolov, Y.; Edmonds, B.; McIntire, T. M.; Milton, S. C.; Hall, J. E.; Glabe, C. G. J. Biol. Chem. 2004, 279, 46363-46366:Meier, J. J.; Kayed, R.; Lin, C.-Y.; Gurlo, T.; Haataja, L.; Jayasinghe, S.; Langen, R.; Glabe, C. G.; Butler, P. C. Am. J. Endicrinol. Metab. 2006, 291, E1317-E1324: Ritzel, R. A.; Meier, J. J.; Lin, C.-Y.; Veldhuis, J. D.; Butler, P. C. Diabetes 2007, 56, 65-71: Lin, C. Y.; Gurlo, T.; Kayed, R.; Butler, A. E.; Haataja, L.; Glabe, C. G.; Butler, P. C. Diabetes 2007, 56, 1324-1332）。Ａｍは３７個のアミノ酸残基からなる環状オリゴペプチドであり、自体会合によってアミロイドを形成することが可能である。
【００７２】
実施例で示されるように、本発明の切断剤はＡｍのオリゴマーを切断する。Ａｍの様々なオリゴマー中でどのオリゴマーが本発明の切断剤によって切断されるかは明らかではない。しかし、標的と平衡関係にある他のオリゴマーの濃度は、標的オリゴマーの濃度の低減に従って減少する。従って、２型糖尿病の原因になるオリゴマーの量が低減される。
【００７３】
（３）パーキソン病気に関連したα−シヌクレインのオリゴマー
α−シヌクレインのオリゴマーがパーキソン病気を引き起こす原因の一つでとして報告されている（Giasson, B. I.; Murry, I. V. J.; Trojanowski, J. Q.; Lee, V. M. J. Biol. Chem. 2001, 276, 2380-2386: Vladimir N.; Nversky, N.; Li, J.; Fink, A. L. J. Biol. Chem. 2001, 276, 10737-10744）。α−シヌクレイン（Ｓｙｎ）は、１４０個のアミノ酸からなるタンパク質であり、自体会合によってアミロイドを形成することが可能である。
【００７４】
医薬組成物
本発明の切断剤は、アミロイド形成性ペプチド又はタンパク質によって形成された可溶性会合体を切断し、可溶性会合体の生物学的活性を阻害して、アミロイド症の予防又は治療する。本発明は、一般式（１）の切断剤及び薬剤学的に許容される塩を含む、アミロイド症を予防又は治療するための医薬組成物に関する。アミロイド症は、アルツハイマー病、２型糖尿病、パーキンソン病、海綿状脳症又はハンチントン病を含むが、これらに制限されない。
【００７５】
本発明の切断剤を患者に投与する方法及び時期は、患者の体重、性、健康状態、食餌、疾患の重症度、患者が服用している他の薬により異なる。
【００７６】
本発明の切断剤は切断剤の標的によって決定されたどんな経路でも投与することができる。従って、本発明の切断剤は静脈、経口、鼻腔、皮下、腹腔、後腹膜、直腸内などに投与することができる。しかし、静脈、経口及び鼻腔内投与が好ましい。
【００７７】
注射用製剤、例えば、滅菌注射用水性又は油性懸濁液は、該分野の公知技術によって適した分散剤、湿潤剤又は懸濁剤を使用して製造できる。
【００７８】
上記製剤を製造するために、水、リンガー液及び等張性ＮａＣｌ溶液が使用され、滅菌固定油が通例的に溶媒又は懸濁媒体として使用され得る。モノ−、ジ−グリセリドを含む無刺激性固定油も使用でき、オレイン酸のような脂肪酸も注射用製剤で使用することができる。
【００７９】
また、本発明の切断剤は、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤及び顆粒剤などを含む経口剤で製剤化できる。しかし、錠剤及びカプセル剤は腸溶性錠剤又は丸剤が好ましい。
【００８０】
固体投与製剤は、本発明の一般式（１）の切断剤をスクロース、ラクトース、でんぷんなどの不活性希釈剤、及びステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、崩壊剤及び結合剤のような薬剤学的に許容される担体と混合することによって製造することができる。
【００８１】
（実施例）
以下、本発明を実施例を通してより詳細に説明する。しかし、下記実施例は本発明を例示することを意図しており、いかなる方法でも本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例１】
【００８２】
切断剤Ａを図４に示した経路に従って合成した。
【化９】
2010507652.tif 000010
【００８３】
式（１ａ）の化合物の合成
４−アミノメチル−安息香酸（１．０ｇ、６．８ｍｍｏｌ）及び２−アミノフェノール（０．６９ｇ、７．４ｍｍｏｌ）をポリリン酸（１０ｇ）と混合し、窒素雰囲気下で１．５時間 １７０℃に加熱した。反応混合物を室温に冷却し、１０％Ｋ２ＣＯ３水溶液に注いだ。沈澱物を減圧下でろ過した。沈澱物をアセトン−水で再結晶し、続いて、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）−水中の活性木炭で処理して４−ベンゾオキサゾール−２−イル−ベンジルアミン（１ａ）を得た。
Rf 0.65 (EtOAc/ヘキサン 1:2); 1H NMR (CDCl3): δ 8.20 (d, 2 H), 7.76 (dd, 1 H), 7.66 (dd, 1 H), 7.55 (d, 2 H), 7.41 (m, 2 H), 3.90 (s, 2 H); MS (MALDI-TOF) m/z 225.33 (M+H)+, C14H13N2O1に対する計算値225.09。
【００８４】
式（１ｃ）の化合物の合成
塩化シアヌル（１ｂ）（０．２０ｇ、１．１ｍｍｏｌ）、式（１ａ）の化合物（０．２０ｇ、０．９０ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、０．３８ｍＬ、２．７ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５０ｍＬ）中で一緒に混合し、混合物を氷浴中で４時間攪拌した。混合物を蒸発させて得られた残渣をカラムクロマトグラフィーで精製して（４−ベンゾオキサゾール−２−イル−ベンジル）−（４，６−ジクロロ−［１，３，５］トリアジン−２−イル）−アミン（１ｃ）を得た。
Rf 0.7 (EtOAc/ヘキサン 1:4); 1H NMR (CDCl3): δ 8.13 (d, 2 H), 7.70 (d, 1 H), 7.51 (d, 1 H), 7.40 (d, 2 H), 7.27 (d, 2 H), 4.58 (d, 2 H); 13C NMR (300 CDCl3): δ 171.26, 170.17, 166.04, 162.43, 150.72, 141.96, 139.84, 128.161, 128.09, 126.96, 125.34, 124.73, 120.06, 110.65, 76.60, 45.05; MS (MALDI-TOF) m/z 372.28 (M+H)+, C17H12Cl2N5Oに対する計算値372.03。
【００８５】
式（１ｄ）〜（１ｆ）の樹脂の合成
式（１ｃ）の化合物（５５ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（１．５ｍＬ）に、ＰＳ−チオフェノール樹脂（Argonaut Technologies社製、５０ｍｇ、０．０７４ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（０．１０ｍＬ、０．７４ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を６５℃に加熱し、一晩放置した。ろ過後、生成された樹脂をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、塩化メチレン（ＭＣ）、ＭｅＯＨ及びＭＣで洗浄し、窒素ガス下で乾燥して式（１ｄ）の樹脂を得た。
【００８６】
Ｎ−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ；１ｍＬ）中の式（１ｄ）の樹脂の懸濁液に、ｎ−ブタノール（１ｍＬ）及びブチルアミン（４９μＬ、０．５８ｍｍｏｌ）を加え、続いて、ＤＩＥＡ（１２０μＬ、０．８７ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を１２０℃で８時間加熱した。ろ過後、樹脂をＤＭＦ、ＭＣ、ＭｅＯＨ及びＭＣで洗浄し、窒素ガス下で乾燥して式（１ｅ）の樹脂を得た。
【００８７】
式（１ｅ）の樹脂に、１，４−ジオキサン（１．８ｍＬ）及び水性１Ｎ  ＮａＯＨ（１６０μＬ）中のｍ−クロロペルオキシ安息香酸（ｍ−ＣＰＢＡ；１３０ｍｇ、０．７４ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で４時間攪拌した。ろ過後、生成された樹脂を１，４−ジオキサン及びＭＣで洗浄し、窒素ガス下で乾燥して式（１ｆ）の樹脂を得た。
【００８８】
式（１ｈ）の化合物の合成
アセトニトリル（１．５ｍＬ）中の式（１ｆ）の樹脂の懸濁液に、ＰＳ−ＤＩＥＡ樹脂（Argonaut Technologies社製、３０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）と式（１ｇ）の化合物（P. S. Chae, M. Kim, C. Jeung, S. D. Lee, H. Park, S. Lee, J. Suh, J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 2396-2397）（３９ｍｇ、０．０７４ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を８０℃で８時間加熱した。混合物をろ過し、樹脂をＭＣ（１ｍＬ×３回）で洗浄した。合わせたろ液と洗浄液を真空蒸発させ、残渣をカラムクロマトグラフィーで精製して１０−｛３−［４−（４−ベンゾオキサゾール−２−イル−ベンジルアミノ）−６−ブチルアミノ−［１，３，５］トリアジン−２−イルアミノ］−プロピル｝−１，４，７，１０−テトラアザ−シクロドデカン−１，４，７−トリカルボン酸トリ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル(１ｈ)を得た。
Rf 0.5 (EAのみ); 1H NMR (CDCl3): δ 8.13 (d, 2H), 7.70 (d, 1H), 7.51 (d, 1H), 7.40 (d, 2H), 7.27 (d, 2H), 4.58 (d, 2H), 3.8-3.2(br, 14H), 2.5 (br, 6H), 2.1 (br, 2H), 1.63 (br, 2H), 1.5-1.3 (m, 31H), 0.9-0.8 (dd 3H); 13C NMR (CDCl3): δ 164.89, 161.91, 154.33, 149.67, 142.56, 141.06, 126.72, 124.82, 124.01, 123.53, 118.89, 109.53, 78.51, 78.31, 75.58, 53.92, 52.91, 48.92, 48.08, 43.31, 39.35, 37.97, 30.86, 28.67, 27.65, 19.03, 13.10; MS (MALDI-TOF) m/z 902.99 (M+H)+, C47H72N11O7に対する計算値902.55。
【００８９】
実施例で樹脂を用いるトリアジン誘導体の合成は、本明細書で特に引用されない限り、参考文献（Khersonsky, S. M.; Chang, Y. T. J. Comb. Chem. 2004, 6, 474）に従う。
【００９０】
式（１ｉ）の化合物及び切断剤Ａの合成
式（１ｈ）の化合物（５ｍｇ）をＭＣ（５０ｍＬ）中の５０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で５時間処理し、混合物にジエチルエーテル（１ｍＬ）を加えた。沈澱物を遠心分離で分離し、ジエチルエーテルで数回洗浄し、窒素ガス下で乾燥してＮ−（４−ベンゾオキサゾール−２−イル−ベンジル）−Ｎ’−ブチル−Ｎ’’−[３−（１，４，７，１０−テトラアザ−シクロドデク−１−シル）−プロピル]−［１，３，５］トリアジン−２，４，６−トリアミン（１ｉ）のＴＦＡ塩を得た。式（１ｉ）の化合物のＴＦＡ塩を用いてＮＭＲ及びＭＳを評価した：
1H NMR (CDCl3): δ 8.17 (d, 2 H), 7.73 (d, 1 H), 7.55 (d, 1H), 7.43 (d, 2H), 7.33 (d, 2H), 4.42 (br, 2H), 3.4-3.0 (br, 14H), 2.85 (br, 6H), 2.62 (br, 2H), 1.68 (br, 2H), 1.36-1.23 (m, 4H), 0.9-0.8 (dd 3H); 13C NMR (CDCl3): δ 164.89, 162.67, 150.62, 141.76, 127.80, 126.12, 125.30, 124.73, 119.83, 110.65, 76.60, 51, 48.90, 44.87, 42.80, 42.32, 38.07, 30.89, 29.70, 23.71, 19.83, 14.07; MS (MALDI-TOF) MS (MALDI-TOF) m/z 602.73. (M+H)+, C32H48N11Oに対する計算値602.40; HRMS m/z 602.4043。(M+H)+, C32H48N11Oに対する計算値602.4038。
【００９１】
式（１ｉ）の化合物のＴＦＡ塩を、約５ｍｇ／５０μＬの濃度でメタノールに溶かして得られた溶液に、５〜７当量のＬｉＯＨを加え、続いて、ＣｏＣｌ２・Ｈ２Ｏの当量を参照文献（Kim, M. G.; Kim, M.-s.; Lee, S. D.; Suh, J. J. Inorg. Biol. Chem. 2006, 11. 867）に従って加えて、相応するＣｏＩＩ複合体を製造した。複合体を空気中で一日攪拌してＣｏＩＩ複合体をＣｏＩＩＩ複合体に酸化させた。
【００９２】
ＣｏＩＩからＣｏＩＩＩへの酸化は濃紫色の出現を伴っている。ＨＰＬＣを使用して５４５ｎｍで検出することによってＣｏＩＩＩ複合体を分離し、蒸発させて個体を得た。固体を０．１Ｍ  ＮａＯＨ溶液に溶かし、３７℃で１時間放置した。溶液をＨＣｌでｐＨ６〜８に中和し、室温で数日放置して切断剤Ａの原液を得た。ＩＣＰを使用してコバルト含量を測定し、該溶液中の切断剤の濃度を測定した。
【００９３】
切断剤Ａの活性試験
（１）アルツハイマー病に関連したＡβ４０及びＡβ４２のオリゴマーの切断
以下の各実施例で特に断らない限り、各々の切断剤の活性試験は３７℃及びｐＨ７．５０（０．０５０Ｍリン酸）でエッペンドルフチューブ中で実施した。
【００９４】
Ａβ４０及びＡβ４２のモノマーと小さなオリゴマーの量の低減に関する定量的な情報を収集するために、下記のろ過実験を実施した。
【００９５】
初期反応段階でＡβ４０又はＡβ４２のモノマー形態を発生させるために、ｐＨ７．５０の反応媒体に露出させる前に、Ａβ４０又はＡβ４２をＮａＯＨで処理した（Fezoui, Y.; Hartley, D. M.; Harper, J. D.; Khurana, R.; Walsh, D. M.; Condron, M. M.; Selkoe, D. J.; Lansbury, P.T. Jr.; Fink, A. L.; Teplow, D. B. Amyloid 2000, 7, 166-178）。自体会合体をｐＨ７．５０及び３７℃で多様な時間培養した後、カットオフＭＷ１００００の膜を通過するＡβ４０（○）又はＡβ４２（●）（初期濃度：４．０μＭ）のフラクションを測定した結果を図５に示した。この結果によれば、大部分（＞８０％）のＡβ４２（ＭＷ  ４５１４）がｐＨ７．５０媒体に露出された直後に、膜を通過している。およそ１０分かかる膜ろ過中、膜を通過できない大きなオリゴマーが生成されることもあり得る。従って、ほとんどのＡβ４２が膜を通過したものと思われる。
【００９６】
Ａβ４２の二量体と三量体は単量体よりはるかに少なく形成されることが当業界でよく知られている（Bitan, G.; Kirkitadze, M. D.; Lomakin, A.; Vollers, S. S.; Benedek, G. B.; Teplow, D. B. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003, 100, 330; Hepler, R. W.; Grimm, K. M.; Nahas, D. D.; Breese, R.; Dodson, E. C.; Acton, P.; Keller, P. M.; Yeager, M.; Wang, H.; Shughrue, P.; Kinney, G.; Joyce, J. G. Biochemistry 2006, 45, 15157-15167））。従って、Ａβ４２は反応初期には大部分単量体として存在する。３時間又は３６時間後、Ａβ４２の約２／３又は９０％が、それぞれ、膜を通過できない大きな会合体に変えられた。しかし、Ａβ４０の場合には、反応初期には９０％以上が膜を通過し、２４時間後には５０％が膜を通過した。
【００９７】
Ａβ４０又はＡβ４２（４．０μＭ）を切断剤Ａと反応させて得られたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを図６と図７にそれぞれ示した。これらの図に示されたように、Ａβ４０及びＡβ４２は切断剤Ａによって切断された。Ａβ１−２０及びＡβ１−２１は切断生成物に含まれている（本実施例において、Ａβ切断はＡβ４２のアミノ酸配列によって命名され、ｍ／ｚ値が表示されたピークに該当する切断生成物の構造はＭＡＬＤＩ  ＬＩＦＴ−ＴＯＦ／ＴＯＦ  ＭＳで確認された）。
【００９８】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳのピークの強度が相対濃度とは関係がないので、強いＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳピークを示すことなく、一部のオリゴペプチド断片が相当量で存在していてもよい。
【００９９】
実施例で特に断らない限り、切断反応は切断剤を含有する溶液にＡβ４０又はＡβ４２を加えて開始し、切断収率は下記工程を通して評価した。
【０１００】
切断反応によって形成された生成物溶液をカットオフ分子量１００００の膜を通して通過させてＡβ４０又はＡβ４２の集積体を除去した。その後、ＨＰＬＣを使用して切断生成物を分離し、切断生成物の総量を測定した。アルカリ加水分解によって切断生成物をアミノ酸に分解し、その後、アミノ酸の総量をフルオレスカミンで測定して切断生成物の総量を決定した。切断生成物の量を最初に加えられたＡβ４０又はＡβ４２の量と比較して切断収率を計算した。
【０１０１】
切断剤Ａの濃度を多様に変化させながら、Ａβ４０又はＡβ４２（４．０μＭ）及び３７℃、ｐＨ７．５０で３６時間反応させて測定した切断収率を図８に示した。本実施例において、Ａβ４０又はＡβ４２の切断収率は、４〜６個の異なる反応混合物を使用して測定した平均値である。各切断収率の相対標準偏差（％ＲＳＤ）は５〜１５％である。
【０１０２】
Ａβ４０又はＡβ４２は切断剤Ａと反応する前に、自体会合のための一定期間緩衝液で反応させた。切断収率を再び測定し、その結果を図９に示した。
【０１０３】
切断反応の進行に対する情報を得るために、Ａβ４０又はＡβ４２を３７℃、ｐＨ７．５０で切断剤Ａと一定時間反応させて切断収率を測定し、その結果を図１０に要約した。
【０１０４】
図９の結果によると、Ａβ４２の２４時間予備反応後、切断剤Ａが反応混合物に加えられるとき、プロトフィブリル又はフィブリルの形成をもたらすＡβ４２の高分子化によって切断は殆ど観察されなかった。Ａβ４２を３〜６時間予備反応させた後に、切断剤Ａが反応混合物に加えられるとき、切断収率は、予備反応無しで切断剤Ａを最初に加えて得たものより、それほど少なくなかった。これは、最初の３〜６時間の間にＡβ４２単量体の量のかなりの低減を示す図５の結果と対照的である。これらの結果は、Ａβ４２単量体、プロトフィブリル、あるいはフィブリルではなく、オリゴマーが切断剤Ａによって切断されたことを表している。
【０１０５】
Ａβ４０を２４時間予備反応させた後、切断剤Ａの追加は、かなりのペプチド切断をもたらし、長時間の予備反応は切断収率を減少させる。これは、Ａβ４２と比較してＡβ４０の場合、プロトフィブリル又はフィブリル形成速度の低下と一致している。さらに、それは、Ａβ４０のプロトフィブリル又はフィブリルは切断剤Ａによって切断されていないことを明らかにしている。切断剤ＡによるＡβ４０の切断収率は、予備反応によって大幅に減少されないので、Ａβ４０単量体はろ過実験の結果を考慮して、断片の主要ソースではない。
【０１０６】
高い切断剤濃度で得られた切断剤Ａの切断収率の上限線は約３０％である。Ａβ４２オリゴマーが短命の中間体として存在して、切断剤によるＡβ４２オリゴマーの切断はオリゴマーの高分子化反応と競争関係にある。切断剤によるＡβ４２の切断はオリゴマーの濃度に対して１次反応であるので、切断剤濃度が固定される限り、切断による標的オリゴマーの半減期はペプチドの濃度によって影響されない。
【０１０７】
オリゴマーのポリマー化反応はペプチド濃度において少なくとも２次以上であるので、半減期はペプチドの濃度を減少させることによって増大される。Ａβ４２の総濃度はアルツハイマー病患者の脳で１ｎＭよりはるかに低くなる（Lue, L. F.; Kuo, Y. M.; Roher, A. E.; Brachova, L.; Shen, Y.; Sue, L.; Beach, T.; Kurth, J. H.; Rydel, R. E.; Rogers, J. Am. J. Pathol. 1999, 155, 853-862）。
【０１０８】
本実施例において、Ａβ４２の濃度が４．０μＭのとき、反応収率は１００ｎＭの切断剤濃度でも切断反応が発生した。Ａβ４２の濃度が生体内レベルまで低くなったとき、１００ｎＭより遥かに低い切断剤濃度でも重要な切断がかなり進むことになる。
【０１０９】
（２）２型糖尿病に関連したアミリンのオリゴマーの切断
ｐＨ７．５０及び３７℃で多様な時間反応させた後、カットオフ分子量１００００の膜を通過するＡｍのフラクションを図１１に示した。Ａｍとその二量体又は三量体のような小さなオリゴマーは上記膜を通過することができる。フィルタを通過するＡｍの量は数時間内に半分以下に減少された。
【０１１０】
Ａｍ（４．０μＭ）を切断剤Ａと反応させた後、ＨＰＬＣで精製した生成物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを図１２に示した。本実施例と以下の実施例において、Ａｍのための切断生成物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルは下記に記述された方法によってＨＰＬＣで精製後に測定した。
【０１１１】
図１２に示したように、Ａｍは切断剤Ａによって切断される。上記切断生成物はＡｍ２０−３７及びＡｍ１９−３７（Ａｍ断片はＡｍのアミノ酸配列によって命名され、ｍ／ｚ値が表示されたピークに該当する切断生成物の構造は、ＭＡＬＤＩ  ＬＩＦＴ−ＴＯＦ／ＴＯＦ  ＭＳによって確認された）を含有している。
【０１１２】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳのピーク強度が相対濃度とは関係がないので、強いＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳピークを示すことなく、一部のオリゴペプチド断片は相当な濃度で存在していてもよい。
【０１１３】
本実施例で特に断らない限り、Ａｍの切断反応は、切断剤を含有する溶液にＡｍを加えることによって開始し、切断収率は下記工程を通して評価した。切断反応から生成された生成物溶液を膜（カットオフ分子量＝１００００）を通して通過させてＡｍの集積体を除去し、その後、ＨＰＬＣを使用して切断生成物を分離した。切断生成物の総量を測定した。切断生成物をアルカリ加水分解によってアミノ酸に変換し、アミノ酸の総量を、フルオレスカミンを用いて測定して、切断生成物の量を決定した。切断収率は切断生成物の量をＡｍの最初量と比較することによって計算した。
【０１１４】
切断剤Ａの濃度を多様に変化させながら、３７℃、ｐＨ７.５０でＡｍ（４．０μＭ）と３６時間反応させた後に測定した切断収率を図１３に示した。本実施例において、Ａｍの切断収率は４〜６個の異なる反応混合物を用いて測定した平均値である。各切断収率の相対標準偏差は５〜１５％である。
【０１１５】
（３）パーキソン病気に関連したα−シヌクレインのオリゴマーの切断
本実施例において、若干変形させたα−シヌクレイン（Ｓｙｎ）類似体を基質として使用して遺伝子組換えによってα−シヌクレイン（Ｓｙｎ）を得た。ニッケルキレート法で精製を促進するために、Ｃ−末端に、ヒスチジン標識（ＬＥＨＨＨＨＨＨ）が付着された。転写過程で干渉を避けるために、５−位のアミノ酸残基としてメチオニンの代わりにロイシンを導入した。
【０１１６】
Ｓｙｎが自体会合によって大きな会合体を形成する速度に対する情報を得るために、ｐＨ７．５０及び３７℃で一定時間反応（培養）中の自体会合後の０．２２ｍｍミリポアフィルタを通過するＳｙｎの量を測定し、その結果を図１４に要約した。相当量のＳｙｎが反応容器に吸着されるか、又は上記フィルタを通して通過することができないプロトフィブリル又はフィブリルが、数日内に形成されることが分かる。
【０１１７】
前後関係で別途明らかにしない限り、Ｓｙｎの切断反応は切断剤の溶液にＳｙｎを加えることによって開始される。切断収率は下記方法によって計算した。
【０１１８】
切断反応によって形成された生成物溶液をカットオフ分子量１００００の膜を通過させ、Ｓｙｎ及びその会合体を除去した。その後、ＨＰＬＣを使用して切断生成物を分離し、切断生成物の総量を評価した。アルカリ加水分解を通して切断生成物をアミノ酸に分解させた。続いて、アミノ酸の総量をフルオレスカミンで評価して切断生成物の総量を定量した。切断収率は切断生成物の量を最初に加えられたＳｙｎの量と比較して計算した。
【０１１９】
切断剤Ａの濃度を多様に変えながら、Ｓｙｎ（７０μＭ）を３７℃、ｐＨ７．５０で３日間反応させることによって測定された切断収率を図１５に示した。本実施例において、切断収率は４〜６個の異なる反応溶液を使用して測定した平均値である。本実施例で使用されるＳｙｎの分子量が約１５０００であるので、Ｓｙｎの切断によって形成された一部のタンパク質断片は大きすぎて、カットオフ分子量１００００の膜を通過できなくなる。過小評価のこの可能な理由を勘案すれば、図１５にまとめられた切断収率はかなり大きくなる。
【０１２０】
（４）対照ペプチド又はタンパク質との反応
切断剤Ａに対して、下記の対照実験を実施した。この対照実験に使用したペプチド又はタンパク質はアミロイドを形成しない。この対照実験は、切断剤Ａが実施例の条件下でそのようなペプチド又はタンパク質を切断しなかったことを確認するために行われた。スクランブル配列（ＫＶＫＧＬＩＤＧＡＨＩＧＤＬＶＹＥＦＭＤＳＮＳＡＩＦＲＥＧＶＧＡＧＨＶＨＶＡＱＶＥＦ、ＡＩＡＥＧＤＳＨＶＬＫＥＧＡＹＭＥＩＦＤＶＱＧＨＶＦＧＧＫＩＦＲＶＶＤＬＧＳＨＮＶＡ）（４．０μＭ）とＡβ４２と同じ４２個のアミノ酸を有する２種スクランブルＡβ４２は、３７℃、ｐＨ７．５０で３６時間、切断剤Ａ（３．０μＭ）との反応によって切断されなかった。
【０１２１】
ウマ心臓ミオグロビン、ウシ血清γ−グロブリン、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、卵白リゾチーム、卵白オボアルブミン、ウシ膵臓インスリン（それぞれ２〜７μＭ）を３７℃、ｐＨ７．５０で３６時間切断剤Ａ（５．０μＭ）と反応させたとき、切断反応は観察されなかった。
【０１２２】
切断剤Ａの認識部位が除去されたとき、Ａβ４０、Ａβ４２、Ａｍ及びＳｙｎのオリゴマーを切断する切断剤Ａの能力が喪失されているか否かを確認するために、シクレンのＣｏＩＩＩ複合体（２０μＭ）を３７℃、ｐＨ７．５０で３６時間、Ａβ４０（４．０μＭ）、Ａβ４２（４．０μＭ）、Ａｍ（４．０μＭ）又はＳｙｎ（７０μＭ）と反応させた。切断反応は観察されなかった。
【実施例２】
【０１２３】
切断剤Ｂを図１６の経路に従って合成した。
【化１０】
2010507652.tif 000011
【０１２４】
式（２ａ）の化合物の合成
ジメチルスルホキシドシード（１０ｍＬ）中の２−アミノチオフェノール（１．３ｇ、１０ｍｍｏｌ）とＮ−メチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−４−アミノベンズアルデヒド（１．８ｇ、１０ｍｍｏｌ）との混合物を１．５時間１７０℃に加熱した。室温に冷却後、反応混合物を水に注いだ。生成された混合物を酢酸エチル（５０ｍＬ×２回）で抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒の蒸発によって得られた残渣をアセトニトリルで再結晶して、２−［（４−ベンゾチアゾール−２−イル−フェニル）−メチル−アミノ］−エタノール（２ａ）を黄色固体として得た。
Rf 0.20 (EA/ヘキサン 1:1); 1H NMR (CDCl3): δ 7.97 (d, 1 H), 7.95 (d, 2 H), 7.85 (d, 1 H), 7.45 (t, 1 H), 7.32 (t, 1 H), 6.81 (d, 2 H), 3.88 (t, 2 H), 3.60 (t, 2 H), 1.80 (br s, 3 H); 13C NMR (CDCl3): δ 154.09, 151.61, 134.38, 129.03, 126.10, 124.34, 122.23, 121.67, 111.96, 77.02, 60.19, 54.66, 39.03; MS (MALDI-TOF) 285.35 m/z (M+H)+, C16H17NOSに対する計算値285.10。
【０１２５】
式（２ｂ）と（２ｃ）の化合物の合成
アセトニトリル（１００ｍＬ）中の式（１ｇ）の化合物（２．９ｇ，５ｍｍｏｌ）の攪拌された溶液に、Ｎ−α−Ｃｂｚ−Ｌ−アラニン（１．２ｇ、５ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（２．９ｍＬ、１７ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物に、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ；２．１ｇ、５．５ｍｍｏｌ）を加え、混合物を１時間攪拌した。溶液を蒸発させて得られた残渣をＥＡ（１００ｍＬ）に溶かした。この酢酸エチル溶液を５％クエン酸水溶液（５０ｍＬ）、５％Ｎａ２ＣＯ３水溶液（５０ｍＬ）及び塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を蒸発させ、カラムクロマトグラフィーで１０−［（Ｓ）−３−（２−ベンジルオキシカルボニルアミノ−プロピオニルアミノ）−プロピル］−１，４，７，１０−テトラアザ−シクロドデカン−１，４，７−トリカルボン酸トリ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（２ｂ）を無色油として得た。
Rf 0.2 (EA/ヘキサン 1:1). 1H NMR (CDCl3): δ 7.30 (s, 5H), 5.02 (s, 2), 3.50-3.10 (br, 15H) 2.60-2.30 (br, 6H), 1.57-1.49 (br, 2H), 1.39-1.36 (m, 27H), 1.18 (s, 3H); 13C NMR (CDCl3): δ 171.58, 154.82, 154.79, 154.22, 135.42, 127.55, 78.49, 65.71, 53.42, 49.56, 48.92, 47.57, 47.18, 46.53, 45.25, 37.68, 29.92, 27.64, 18.32; MS (MALDI-TOF) m/z 735.88 (M+H)+, C37H63N6O9に対する計算値735.46。
【０１２６】
ＥｔＯＨ（８０ｍＬ）中の式（２ｂ）の化合物（２．０ｇ、２．７ｍｍｏｌ）と１０％Ｐｄ／Ｃ（１．０ｇ）の懸濁液を１気圧水素下で２４時間攪拌した。触媒をセライトでろ過し、溶媒を蒸発させて、１０−［（Ｓ）−３−（２−ベンジルオキシカルボニルアミノ−プロピオニルアミノ）−プロピル］−１，４，７，１０−テトラアザ−シクロドデカン−１，４，７−トリカルボン酸トリ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（２ｃ）を固体として得た。
1H NMR (CDCl3): δ 7.49 (s, 1H), 3.63-3.18 (br, 15H), 2.72-2.52 (br, 6H), 1.88-1.75 (br, 2H), 1.73-1.60 (m, 2H), 1.50-1.40 (m, 27H), 1.40-1.30 (d, 3H); 13C NMR (CDCl3): δ 171.98, 155.03, 154.69, 154.25, 78.57, 78.42, 78.28, 53.60, 52.95, 49.72, 49.01, 47.80, 47.07, 46.54, 46.18, 37.56, 29.92, 27.64, 22.99; MS (MALDI-TOF) 601.58 m/z (M+H)+, C29H57N6O7に対する計算値601.42。
【０１２７】
式（２ｄ）の化合物の合成
式（１ｂ）の化合物（０．２０ｇ、１．１ｍｍｏｌ）、式（２ａ）の化合物（０．２０ｇ、０．７０ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（０．３８ｍＬ、２．７ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５０ｍＬ）中で一緒に混合し、混合物を室温で８時間攪拌した。溶媒を蒸発して得られた残渣をカラムクロマトグラフィーで分離して、（４−ベンゾチアゾール−２−イル−フェニル）−［２−（４，６−ジクロロ−［１，３，５］トリアジン−２−イルオキシ）−エチル］−メチル−アミン（２ｄ）を得た。
Rf 0.7 (EA/ヘキサン 1:4); 1H NMR (CDCl3): δ 7.97 (t, 3H), 7.85 (d, 1H), 7.45 (t, 1H), 7.36 (t, 1H), 6.78 (d, 2H), 4.67 (t, 2H), 3.84 (t, 2H), 3.12 (br, 3H); 13C NMR (CDCl3): δ 172.53, 171.84, 168.15, 155.13, 151.39, 135.02, 129.21, 126.27, 124.59, 122.66, 122.46, 121.74, 112.14, 67.78, 50.58, 38.89; MS (MALDI-TOF) m/z 432.29 (M+H)+, C19H16Cl2N5OSに対する計算値432.04。
【０１２８】
式（２ｅ）〜（２ｇ）の樹脂の合成
式（２ｄ）の化合物（６２ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（１．５ｍＬ）に、ＰＳ−チオフェノール樹脂（Argonaut Technologies社製、５０ｍｇ、０．０７４ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（０．１０ｍＬ、０．７４ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を６５℃で一晩加熱した。ろ過後、生成された樹脂（２ｅ）をＤＭＦ、ＭＣ、ＭｅＯＨ及びＭＣ（それぞれ３ｍＬ×３回）で洗浄し、窒素ガス下で乾燥した。
【０１２９】
ＮＭＰ（１ｍＬ）中の式（２ｅ）の樹脂の懸濁液に、ｎ−ブタノール（１ｍＬ）、４−クロロベンジルアミン（７１μＬ、０．５８ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（１２０μＬ、０．８７ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を１２０℃で８時間加熱した。ろ過後、生成された樹脂（２ｆ）をＤＭＦ、ＭＣ、ＭｅＯＨ及びＭＣ（それぞれ３ｍＬ×３回）で洗浄し、窒素ガス下で乾燥した。
【０１３０】
１，４−ジオキサン（１．８ｍＬ）中のｍ−ＣＰＢＡ（１３０ｍｇ、０．７４ｍｍｏｌ）の溶液と１Ｎ  ＮａＯＨ水溶液（１６０μＬ）との混合物に、式（２ｆ）の樹脂を加えた。混合物を室温で４時間振盪した。ろ過後、生成された樹脂（２ｇ）を１，４−ジオキサン及びＭＣ（それぞれ３ｍＬ×３回）で洗浄し、窒素ガス下で乾燥した。
【０１３１】
式（２ｈ）及び（２ｉ）の化合物、並びに切断剤Ｂの合成
アセトニトリル（１．５ｍＬ）中の式（２ｇ）の樹脂の懸濁液に、ＰＳ−ＤＩＥＡ樹脂（Argonaut Technologies社製、３０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）と式（２ｃ）の化合物（３９ｍｇ、０．０７４ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を８０℃で８時間加熱した。混合物をろ過し、樹脂をＭＣ（１ｍＬ×３回）で洗浄した。合わせたろ液と洗浄液を真空内で蒸発させ、生成された残渣をカラムクロマトグラフィーで精製して、１０−｛３−［４−｛２−［（４−ベンゾチアゾール−２−イル−フェニル）−メチル−アミノ］−エトキシ｝−６−（４−クロロ−ベンジルアミノ）−｛１，３，５｝トリアジン−２−イルアミノ］−（Ｓ）−プロピオニルアミノ｝−プロピル）−１，４，７，１０テトラアザ−シクロドデカン−１，４，７−トリカルボン酸トリ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（２ｈ）を得た。
Rf 0.2 (EAのみ); 1H NMR (CDCl3): δ 8.13 (d, 2 H), 7.70 (d, 1 H), 7.51 (d, 1 H), 7.40 (d, 2 H), 7.27 (d, 2 H), 4.58 (d, 2 H), 3.8-3.2 (br, 12H), 2.5 (br, 6H), 2.1 (br, 2H), 1.63 (br, 4H), 1.5-1.3 (m, 31H), 0.9-0.8 (dd 3H); 13C NMR (CDCl3): δ 164.89, 161.91, 154.33, 149.67, 142.56, 141.06, 126.72, 124.82, 124.01, 123.53, 118.89, 109.53, 78.51, 78.31, 75.58, 53.92, 52.91, 48.92, 48.08, 43.31, 39.35, 37.97, 30.86, 28.67, 27.65, 19.03, 13.10; MS (MALDI-TOF) m/z 1102.59 (M+H)+,C55H78ClN12O8Sに対する計算値1102.54。
【０１３２】
実施例１の式（1ｈ）で化合物に対して記述しように、式（２ｈ）の化合物をＴＦＡで処理して、２−［４−｛２−［（４−ベンゾチアゾール−２−イル−フェニル）−メチル−アミノ］−エトキシ｝−６−（４−クロロ−ベンジルアミノ）−［１，３，５］トリアジン−２−イルアミノ］−Ｎ−［３−（１，４，７，１０−テトラアザ−シクロドデク−１−シル）−プロピル］−（Ｓ）−プロピオンアミド（２ｉ）のＴＦＡ塩を得た。式（２ｉ）の化合物のＴＦＡ塩を使用してＮＭＲ及びＭＳ特性を測定した。
1H NMR (CDCl3): δ 7.95 (s, 1H), 7.92-7.85 (q, 3H), 7.45 (t, 1H), 7.37-7.28 (m, 5H), 6.79 (t, 2H), 4.70-4.40 (br, 2H), 3.78 (br, 2H), 3.13-2.70 (br, 15H), 2.74 (s, 3H), 2.58-2.44 (br, 6H), 1.93 (m, 1H), 1.66-1.55(br, 2H), 1.44-1.19 (m, 5H); 13C NMR (CDCl3): δ 173.57, 169.69, 168.84, 163.26, 162.01, 155.42, 152.65, 138.23, 135.63, 132.63, 130.76, 130.52, 130.07, 127.63, 125.90, 123.26, 123.08, 122.51, 113.29, 69.08, 67.48, 52.18, 51.49, 50.44, 45.22, 43.73, 43.18, 39.98, 31.51, 24.91; MS (MALDI-TOF) m/z 801.57 (M+H)+, calcd for C40H54ClN12O2S 801.39; HRMS m/z 801.3907. (M+H)+, C40H54ClN12O2Sに対する計算値801.3896。
【０１３３】
切断剤Ｂの原液は、実施例１で切断剤Ａに対して記述したように、式（２ｉ）の化合物から得た。
【０１３４】
切断剤Ｂの活性試験
（１）アルツハイマー病に関連したＡβ４０及びＡβ４２のオリゴマーの切断
Ａβ４０又はＡβ４２（４．０μＭ）と切断剤Ｂとを反応させることによって得られたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルをそれぞれ図１７及び図１８に示した。図１７及び図１８に示されたように、Ａβ４０及びＡβ４２は切断剤Ｂを用いて切断され、Ａβ１−２０及びＡβ１−２１が切断生成物に含まれている。
【０１３５】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳのピーク強度が相対濃度とは関係がないので、強いＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳピークを示すことなく、一部のオリゴペプチド断片は相当量で存在していてもよい。
【０１３６】
切断剤Ｂの濃度を多様に変えながら、Ａβ４０又はＡβ４２（４．０μＭ）を３７℃、ｐＨ７．５０で３６時間反応させて測定した切断収率を図１９に示した。高い切断剤濃度で得られた切断剤ＢによるＡβ４０及びＡβ４２の切断のための切断収率の上限線は、それぞれ約１２％及び１７％である。
【０１３７】
Ａβ４２の濃度が４．０μＭのとき、切断剤Ｂ濃度３０〜５０ｎＭでも切断反応を観察できた。もし、Ａβ４２の濃度が生体内のレベルに低くなれば、重要な切断反応は、実施例１で説明したように、切断剤Ｂの濃度でさえ、３０〜５０ｎＭより遥かに低く起こることになる。
【０１３８】
（２）２型糖尿病に関連したアミリンのオリゴマーの切断
Ａｍ（４．０μＭ）と切断剤Ｂとの反応後、ＨＰＬＣで精製した切断生成物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを図２０に示した。上記スペクトルはＡｍが切断剤Ｂによって切断され、Ａｍ２０−３７、Ａｍ１９−３７及びＡｍ１７−３７が切断生成物に含まれていることを示している。
【０１３９】
切断剤Ｂの濃度を多様に変えながら、３７℃、ｐＨ７．５０で３６時間、Ａｍ（４．０μＭ）との反応後に、測定した切断収率を図２１に示した。切断剤Ｂ（１．０μＭ）との反応前に、多様な期間にわたってＡｍ（４．０μＭ）の予備反応後に、測定した切断収率を２２に示した。
【０１４０】
Ａｍを３６時間以上予備反応させた後、反応混合物に切断剤Ｂを加えたとき、プロトフィブリル又はフィブリルの形成の原因となるＡｍの高分子化によって、切断反応はほとんど起こらない。
【０１４１】
Ａｍを６時間予備反応させた後、反応混合物に切断剤Ｂを加えたとき、Ａｍの切断によって形成された生成物の量は、Ａｍの予備反応無しに、最初に加えた切断剤Ｂとの反応で得られた量よりそれほど少なくない。これは、図１１に示したＡｍ単量体及び小さなオリゴマーが、６時間の間に、かなり減少していることと対照的である。これらの結果はＡｍ単量体、プロトフィブリル及びフィブリルの代わりにＡｍ単量体が切断剤Ｂによって切断されたことを示している。
【０１４２】
切断反応の進行を調べるために、３７℃、ｐＨ７．５０で一定時間Ａｍと切断剤Ｂと反応させて測定した切断収率を図２３に要約した。図２３の結果は、たとえ反応時間を３６時間以上延ばしても、反応収率が増加しないことを明らかにしている。
【０１４３】
（３）パーキソン病気に関連したα−シヌクレインのオリゴマーの切断
切断剤Ｂの濃度を多様に変えながら、３７℃、ｐＨ７．５０で３日間 Ｓｙｎ（７０μＭ）と反応させて測定した切断収率を図２４に示した。
【０１４４】
本実施例で使用されたＳｙｎの分子量は約１５０００であるので、Ｓｙｎの切断により形成される一部のタンパク質断片が多すぎてカットオフ分子量１００００の膜を通して通過できなくなる。過小評価の可能な理由を勘案すれば、図２４にまとめられた切断収率はかなり大きくなる。
【０１４５】
（４）対照ペプチド又はタンパク質との反応
対照実験は実施例１と同様にして、切断剤Ｂのために実施した。対照実験の結果は、実施例１で得られたものと同様であった。
【実施例３】
【０１４６】
切断剤Ｃを図２５の経路に従って合成した。
【化１１】
2010507652.tif 000012
【０１４７】
式（３ａ）と（３ｂ）の樹脂の合成
ＮＭＰ（１ｍＬ）中の式（２ｅ）の樹脂（５０ｍｇ、０．０４６ｍｍｏｌ）の懸濁液に、ｎ−ブタノール（１ｍＬ）及びシクロドデシルアミン（６６μＬ、０．５１ｍｍｏｌ）を加え、続いて、ＤＩＥＡ（６３μＬ、０．３６ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を１２０℃で８時間加熱した。ろ過後、生成された樹脂（３ａ）をＤＭＦ、ＭＣ、ＭｅＯＨ及びＭＣ（それぞれ３ｍＬ×３回）で洗浄し、窒素ガス下で乾燥した。
【０１４８】
式（３ａ）の樹脂に、１，４−ジオキサン（１．８ｍＬ）中のｍ−ＣＰＢＡ（８０ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）の溶液と水性１Ｎ  ＮａＯＨ（９３μＬ）との混合物を加えた。混合物を室温で４時間振盪した。ろ過後、生成された樹脂（３ｂ）を１，４−ジオキサンとＭＣ（それぞれ３ｍＬ×３回）で洗浄し、窒素ガス下で乾燥した。
【０１４９】
式（３ｄ）及び（３ｅ）の化合物、並びに切断剤Ｃの合成
アセトニトリル（１．５ｍＬ）中の式（３ｂ）の樹脂の懸濁液に、ＰＳ−ＤＩＥＡ樹脂（Argonaut Technologies社製、１９ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ）と式（３ｃ）の化合物（２８ｍｇ、０．０４６ｍｍｏｌ）を加えた（P. S. Chae, M. Kim, C. Jeung, S. D. Lee, H. Park, S. Lee, J. Suh, J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 2396-2397）。反応混合物を８０℃で８時間加熱した。混合物をろ過し、樹脂をＭＣ（１ｍＬ×３回）で洗浄した。合わせたろ液と洗浄液を真空内で蒸発させ、残渣をカラムクロマトグラフィーで精製して、１０−｛３−［３−（４−｛２−［（４−ベンゾチアゾール−２−イル−フェニル）−メチル−アミノ］−エトキシ｝−６−シクロドデシルアミノ−［１，３，５］トリアジン−２−イルアミノ）−プロピオニルアミノ］−プロピル｝−１，４，７，１０−テトラアザ−シクロドデカン−１，４，７−トリカルボン酸トリ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（３ｄ）を得た。
Rf 0.3 (EAのみ); 1H NMR (CDCl3): δ 7.95 (t, 3H), 7.83 (d, 1H), 7.41 (t, 1H), 7.33 (br, 1H), 6.78 (m, 2H), 4.67 (br, 2H), 3.75 (br, 2H), 3.67 (br, 2H), 3.55-3.18 (br, 14H), 3.10 (s, 3H), 2.60 (br, 5H), 2.50 (br, 4H), 1.61-1.58 (br, 6H), 1.45-1.41 (m, 27H), 1.33 br, 18H); 13C NMR (CDCl3): δ 184.41, 173.21, 171.70, 169.97, 168.67, 156.28, 155.60, 155.24, 154.34, 150.84, 134.47, 129.75, 128.97, 125.99, 125.01, 124.21, 122.21, 121.35, 111.57, 111.46, 79.46, 62.94, 56.52, 55.11, 51.07, 49.97, 48.36, 47.41, 46.54, 40.92, 39.27, 36.76, 35.63, 29.69, 28.62, 23.50, 21.32; MS (MALDI-TOF) m/z 1144.02 (M+H)+, C60H95N12O8Sに対する計算値1143.70。
【０１５０】
実施例１の式（１ｈ）の化合物に対して記述したように、式（３ｄ）の化合物をＴＦＡで処理して、３−（４−｛２−［（４−ベンゾチアゾール−２−イル−フェニル）−メチル−アミノ］−エトキシ｝−６−シクロドデシルアミノ−［１，３，５］トリアジン−２−イルアミノ）−Ｎ−［３−（１，４，７，１０−テトラアザ−シクロドデク−１−シル）−プロピル］−プロパンアミド（３ｅ）のＴＦＡ塩を得た。式（３ｅ）の化合物のＴＦＡ塩を使用してＮＭＲ及びＭＳ特性を測定した。
1H NMR (CDCl3): δ 7.94 (br, 3H), 7.83 (d, 1H), 7.45 (br, 1H), 7.35 (br, 1H), 6.75 (d, 2H), 4.57 (br, 2H), 3.81 (br, 2H), 3.63 (br, 2H), 3.3-2.9 (br, 17H), 2.76 (br, 5H), 2.44 (br, 4H), 1.65-1.61 (br, 6H), 1.31 (br, 18H); 13C NMR (CDCl3): δ 188.78, 188.78, 172.02, 169.91, 169.79, 169.44, 157.24, 151.78, 133.60, 129.56, 126.89, 125.41, 125.16, 121.81, 120.57, 112.28, 112.02, 66.26, 65.57, 60.62, 50.69, 49.67, 48.68, 44.63, 42.51, 39.33, 39.16, 37.01, 30.20, 29.94, 23.82, 23.51, 21.48; MS (MALDI-TOF) m/z 843.79 (M+H)+, C45H71N12O2Sに対する計算値843.55; HRMS m/z 843.5547. (M+H)+, C45H71N12O2Sに対する計算値843.5538。
【０１５１】
切断剤Ｃの原液は、実施例１で切断剤Ａに対して記述したように、式（３ｅ）の化合物から得た。
【０１５２】
切断剤Ｃの活性試験
（１）アルツハイマー病に関連したＡβ４０及びＡβ４２のオリゴマーの切断
切断剤Ｃ（０．１〜１０μＭ）を、３７℃、ｐＨ７．５０で３６時間、Ａβ４０（４．０ｍＭ）と反応させたとき、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳデータはＡβ４０の切断の少しの証拠も明らかにしていない。
【０１５３】
Ａβ４２（４．０μＭ）を切断剤Ｃと反応させて得られたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ質量スペクトルを図２６に示した。図２６に示されるように、Aβ４２は切断剤Ｃにより切断され、Ａβ１−２０が切断生成物に含まれている。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳピークの強度が相対濃度とは関係がないので、強いＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳピークを示すことなく、一部のオリゴペプチド断片は相当量で存在していてもよい。
【０１５４】
切断剤Ｃの濃度を多様に変えながら、３７℃、ｐＨ７．５０で３６時間、Ａβ４０又はＡβ４２（４．０μＭ）と反応させて測定した切断収率を図２７に示した。高い切断剤濃度で得られた切断剤ＣによりＡβ４２の切断のための切断収率の上限線は約１２％である。Ａβ４２の濃度が４．０μＭのとき、切断剤Ｃ濃度１００ｎＭでも切断反応を観察できた。もし、Ａβ４２の濃度が生体内のレベルに低くなれば、重要な切断反応は、実施例１に説明されたように、切断剤Ｃの濃度でさえ、１００ｎＭより遥かに低く起こることになる。
【０１５５】
（２）２型糖尿病に関連したアミリンのオリゴマーの切断
Ａｍ（４．０μＭ）を切断剤Ｃと反応させた後、ＨＰＬＣで精製した切断生成物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを図２８に示した。図２８に示されるように、アミリンは切断剤Ｃにより切断され、Ａｍ１７−３７が切断生成物に含まれている。
【０１５６】
切断剤Ｃの濃度を多様に変えながら、３７℃、ｐＨ７．５０で３６時間、Ａｍ（４．０μＭ）と反応させた後に、測定した切断収率を図２９に示した。
【０１５７】
（３）対照ペプチド又はタンパク質との反応
対照実験は実施例１と同様にして、切断剤Ｃのために実施した。対照実験の結果は、実施例１で得られたものと同様であった。
【実施例４】
【０１５８】
切断剤Ｄを図３０の経路に従って合成した。
【化１２】
2010507652.tif 000013
【０１５９】
式（４ａ）及び（４ｂ）の樹脂の合成
ＮＭＰ（１ｍＬ）中の式（２ｅ）の樹脂（５０ｍｇ、０．０４６ｍｍｏｌ）の懸濁液に、ｎ−ブタノール（１ｍＬ）及びシクロドデシルアミン（６６μＬ、０．５１ｍｍｏｌ）を加え、続いて、ＤＩＥＡ（６３μＬ、０．３６ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を１２０℃で８時間加熱した。ろ過後、生成された樹脂（４ａ）をＤＭＦ、ＭＣ、ＭｅＯＨ及びＭＣ（それぞれ３ｍＬ×３回）で洗浄し、窒素ガス下で乾燥した。
【０１６０】
式（４ａ）の樹脂に、１，４−ジオキサン（１．８ｍＬ）中のｍ−ＣＰＢＡ（８０ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）の溶液と水性１Ｎ  ＮａＯＨ（９３μＬ）との混合物を加えた。混合物を室温で４時間振盪した。ろ過後、生成された樹脂（４ｂ）を１，４−ジオキサンとＭＣ（それぞれ３ｍＬ×３回）で洗浄し、窒素ガス下で乾燥した。
【０１６１】
式（４ｃ）及び（４ｄ）の化合物、並びに切断剤Ｄの合成
アセトニトリル（１．５ｍＬ）中の式（４ｂ）の樹脂の懸濁液に、ＰＳ−ＤＩＥＡ樹脂（Argonaut Technologies社製、１９ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ）と式（３ｃ）の化合物（２８ｍｇ、０．０４６ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を８０℃で８時間加熱した。混合物をろ過し、樹脂をＭＣ（１ｍＬ×３回）で洗浄した。合わせたろ液と洗浄液を真空内で蒸発させ、残渣をカラムクロマトグラフィーで精製して、１０−｛３−［３−（４−｛２−［（４−ベンゾチアゾール−２−イル−フェニル）−メチル−アミノ］−エトキシ｝−６−（２−メチル−ベンジルアミノ）−［１，３，５］トリアジン−２−イルアミノ）−プロピオニルアミノ］−プロピル｝−１，４，７，１０−テトラアザ−シクロドデカン−１，４，７−トリカルボン酸トリ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（４ｃ）を得た。
Rf 0.4 (EAのみ); 1H NMR (CDCl3): δ 7.96 (t, 3H), 7.83 (d, 1H), 7.43 (t, 1H), 7.32 (br, 1H), 7.15 (br, 4H), 6.77 (d, 2H), 4.53 (br, 4H), 3.75 (br, 2H), 3.66 (br, 2H), 3.5-3.1 (br, 14H), 3.09 (s, 3H), 2.58 (br, 4H), 2.49 (br, 4H), 2.32 (s, 3H), 1.60 (br, 2H), 1.46-1.41 (m, 27H); 13C NMR (CDCl3): δ 186.87, 179.99, 173.28, 171.18, 168.68, 155.26, 154.35, 150.86, 136.88, 136.10, 134.50, 130.27, 128.99, 127.27, 126.09, 126.01, 125.02, 124.24, 122.24, 121.45, 121.38, 111.55, 80.31, 79.51, 63.54, 56.56, 55.10, 54.95, 50.98, 49.95, 48.35, 47.65, 40.01, 39.03, 36.93, 29.71, 28.65, 19.10; MS (MALDI-TOF) m/z 1081.89 (M+H)+, C56H81N12O8Sに対する計算値1081.59。
【０１６２】
式（４ｃ）の化合物を、実施例１で式（１ｈ）の化合物に対して記述したように、ＴＦＡで処理して、３−（４−｛２−［（４−ベンゾチアゾール−２−イル−フェニル）−メチル−アミノ］−エトキシ｝−６−（２−メチル−ベンジルアミノ）−［１，３，５］トリアジン−２−イルアミノ）−Ｎ−［３−（１，４，７，１０−テトラアザ−シクロドデク−１−シル）−プロピル］−プロピオアミド（４ｄ）のＴＦＡ塩を得た。式（４ｄ）の化合物のＴＦＡ塩を使用してＮＭＲ及びＭＳ特性を測定した。
1H NMR (CDCl3): δ 7.96 (t, 3H), 7.85 (d, 1H), 7.49 (br, 1H), 7.37 (br, 1H), 7.15 (br, 4H), 6.80 (d, 2H), 4.56 (m, 4H), 3.58 (br, 2H), 3.3-2.8 (br, 17H), 2.33 (br, 8H), 2.31 (s, 3H), 1.48 (br, 2H); 13C NMR (CDCl3): δ 186.11, 180.06, 171.65, 169.85, 169.01, 151.51, 151.17, 136.08, 134.83, 132.77, 130.66, 129.65, 129.42, 127.99, 127.93, 127.82, 126.31, 126.13, 125.33, 121.76, 121.05, 112.09, 111.90, 66.12, 62.87, 53.89, 50.44, 49.72, 44.38, 44.22, 42.34, 42.09, 39.36, 36.63, 29.71, 19.07; MS (MALDI-TOF) m/z 781.73 (M+H)+, C41H57N12O2Sに対する計算値781.44; HRMS m/z 781.4457. (M+H)+, C41H57N12O2Sに対する計算値781.4443。
【０１６３】
切断剤Ｄの原液は、実施例１で切断剤Ａに対して記述したように、式（４ｄ）の化合物から得た。
【０１６４】
切断剤Ｄの活性試験
（１）アルツハイマー病に関連したＡβ４０及びＡβ４２のオリゴマーの切断
切断剤Ｄ（０．１〜１０μＭ）を、３７℃、ｐＨ７．５０で３６時間、Ａβ４０（４．０μＭ）と反応させたとき、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳデータはＡβ４０の切断の少しの証拠も明らかにしていない。
【０１６５】
Ａβ４２（４．０μＭ）を切断剤Ｄと反応させて得られたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ質量スペクトルを図３１に示した。図３１に示されるように、Ａβ４２は切断剤Ｄにより切断され、Ａβ１−２０が切断生成物に含まれている。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳピークの強度が相対濃度とは関係がないので、強いＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳピークを示すことなく、一部のオリゴペプチド断片は相当量で存在していてもよい。
【０１６６】
切断剤Ｄの濃度を多様に変えながら、３７℃、ｐＨ７．５０で３６時間、Ａβ４０又はＡβ４２（４．０μＭ）と反応させて測定した切断収率を図３２に示した。高い切断剤濃度で得られた切断剤ＤによりＡβ４２の切断のための切断収率の上限線は約１２％である。Ａβ４２の濃度が４．０μＭのとき、切断剤Ｄ濃度５０〜１００ｎＭでも切断反応を観察できた。もし、Ａβ４２の濃度が生体内のレベルに低くなれば、重要な切断反応は、実施例１に説明されたように、切断剤Ｄの濃度でさえ、５０〜１００ｎＭより遥かに低く起こることになる。
【０１６７】
（２）２型糖尿病に関連したアミリンのオリゴマーの切断
Ａｍ（４．０μＭ）を切断剤Ｄと反応させた後、ＨＰＬＣで精製した切断生成物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを図３３に示した。図３３に示されるように、Ａｍは切断剤Ｄにより切断され、Ａｍ１９−３７が切断生成物に含まれている。
【０１６８】
切断剤Ｄの濃度を多様に変えながら、３７℃、ｐＨ７．５０で３６時間、Ａｍ（４．０μＭ）と反応させた後に、測定した切断収率を図３４に示した。
【０１６９】
（３）対照ペプチド又はタンパク質との反応
対照実験は実施例１と同様にして、切断剤Ｄのために実施した。対照実験の結果は、実施例１で得られたものと同様であった。
【実施例５】
【０１７０】
切断剤Ｅを図３５の経路に従って合成した。
【化１３】
2010507652.tif 000014
【０１７１】
式（５ａ）と（５ｂ）樹脂の合成
ＮＭＰ（１ｍＬ）中の式（２ｅ）の樹脂（５５ｍｇ，０．１５ｍｍｏｌ）の懸濁液に、ｎ−ブタノール（１ｍＬ）及びブチルアミン（４９μＬ、０．５８ｍｍｏｌ）を加え、続いて、ＤＩＥＡ（１２０μＬ、０．８７ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を１２０℃で８時間加熱した。ろ過後、生成された樹脂（５ａ）をＤＭＦ、ＭＣ、ＭｅＯＨ及びＭＣ（それぞれ３ｍＬ×３回）で洗浄し、窒素ガス下で乾燥した。
【０１７２】
式（５ａ）の樹脂に、１，４−ジオキサン（１．８ｍＬ）中のｍ−ＣＰＢＡ（１３０ｍｇ、０．７４ｍｍｏｌ）の溶液と水性１Ｎ  ＮａＯＨ（１６０μＬ）との混合物に加えた。混合物を室温で４時間振盪した。ろ過後、生成された樹脂（５ｂ）を１，４−ジオキサンとＭＣ（それぞれ３ｍＬ×３回）で洗浄し、窒素ガス下で乾燥した。
【０１７３】
式（５ｃ）及び（５ｄ）の化合物、並びに切断剤Ｅの合成
アセトニトリル（１．５ｍＬ）中の式（５ｂ）の樹脂の懸濁液に、ＰＳ−ＤＩＥＡ樹脂（３０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）と式（１ｇ）の化合物（３９ｍｇ、０．０７４ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を８０℃で８時間加熱した。混合物をろ過し、樹脂をＭＣ（１ｍＬ×３回）で洗浄した。合わせたろ液と洗浄液を真空下で蒸発させ、残渣をカラムクロマトグラフィーで精製して、１０−［３−（４−｛２−［（４−ベンゾチアゾール−２−イル−フェニル）−メチル−アミノ］−エトキシ｝−６−ブチルアミノ−［１，３，５］トリアジン−２−イルアミノ）−プロピル］−１，４，７，１０−テトラアザ−シクロドデカン−１，４，７−トリカルボン酸トリ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（５ｃ）を得た。
Rf 0.2 (EA/ヘキサン 1:1); 1H NMR (CDCl3): δ 7.99 (t, 2H), 7.86 (d, 1H), 7.44 (t, 1H), 7.31 (t, 1H), 6.79 (d, 2H), 4.48 (t, 2H), 3.80 (t, 2H), 3.54-3.11 (br, 16H), 3.11 (s, 3H), 2.61 (br, 6H), 1.73 (m, 2H), 1.53 (m, 2H), 1.46-1.38 (br, 27H), 1.29 (m, 2H), 0.90 (t, 3H); 13C NMR (CDCl3): δ 170.47, 168.58, 167.25, 156.09, 155.69, 155.35, 154.43, 154.40, 150.92, 134.53, 128.97, 125.97, 124.19, 122.29, 121.56, 121.33, 111.57, 79.55, 79.34, 76.61, 62.54, 55.04, 54.16, 51.13, 50.02, 47.97, 40.52, 39.09, 31.75, 29.68, 28.66, 28.50, 24.93, 20.01, 13.79; MS (MALDI-TOF) m/z 962.33 (M+H)+, C49H75N11O7Sに対する計算値962.28。
【０１７４】
式（５ｃ）の化合物を実施例１の式（１ｈ）の化合物に記述されたように、ＴＦＡで処理して、６−｛２−［（４−ベンゾチアゾール−２−イル−フェニル）−メチル−アミノ］−エトキシ｝−Ｎ−ブチル−Ｎ'−［３−（１，４，７，１０−テトラアザ-シクロドデク−１−シル）−プロピル］−［１，３，５］トリアジン−２，４−ジアミン（５ｄ）のＴＦＡ塩を得た。式（５ｄ）の化合物のＴＦＡ塩を使用してＮＭＲ及びＭＳ特性を測定した。
1H NMR (MeOD): δ 7.90 (q, 4 H), 7.49 (t, 1 H), 7.37 (t, 1H), 6.85 (d, 2H), 4.73 (t, 2H), 3.89 (t, 2H), 3.2-3.0 (br, 12H), 2.98-2.86 (br, 4H), 2.84-2.75 (br, 4H), 2.68 (t, 3H), 1.76 (q, 2H), 1.52 (q, 2H), 1.31 (q, 2H), 0.89 (t, 3H); 13C NMR (CDCl3): δ 169.61, 161.13, 160.64, 160.32, 152.72, 151.72, 151.55, 133.49, 128.69, 128.64, 126.35, 124.67, 121.48, 120.93, 120.16, 118.24, 114.36, 111.84, 66.28, 49.98, 46.76, 44.31, 42.01, 41.86, 40.69, 38.95, 38.65, 37.84, 37.52, 30.51, 22.62, 19.55, 12.63; HRMS m/z 662.4073 (M+H)+, C34H52N11OSに対する計算値662.4077。
【０１７５】
式（５ｄ）の化合物のＴＦＡ塩を約３ｍｇ／５０μＬの濃度でメタノールに溶かして得られた溶液に、５〜７当量のＬｉＯＨを加え、続いて、ＣｏＣｌ２・Ｈ２Ｏの当量を加えて、式（５ｄ）の化合物のＣｏＩＩ複合体を製造した。複合体を空気中で一日攪拌してＣｏＩＩ複合体をＣｏＩＩＩ複合体に酸化させた。ＣｏＩＩからＣｏＩＩＩへの酸化は濃紫色の出現を伴っている。ＨＰＬＣを使用して５４５ｎｍで検出することによってＣｏＩＩＩ複合体を分離し、蒸発させて個体を得た。固体を水に溶かし、室温で数日間放置して切断剤Ｅの原液を得た。ＩＣＰでコバルト含量を測定してこの溶液に入っている切断剤の濃度を決定した。
【０１７６】
切断剤Ｅの活性試験
（１）２型糖尿病に関連したアミリンのオリゴマーの切断
Ａｍ（４．０μＭ）を切断剤Ｅと反応させた後、ＨＰＬＣで精製した切断生成物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを図３６に示した。図３６に示されるように、Ａｍは切断剤Ｅにより切断され、Ａｍ１７−３７とＡｍ１３−３７が切断生成物に含まれている。
【０１７７】
切断剤Ｅの濃度を多様に変えながら、３７℃、ｐＨ７．５０で３６時間、Ａｍ（４．０μＭ）と反応させた後に、測定した切断収率を図３７に示した。
【０１７８】
（２）対照ペプチド又はタンパク質との反応
対照実験は実施例１と同様にして、切断剤Ｅのために実施した。対照実験の結果は、実施例１で得られたものと同様であった。
【実施例６】
【０１７９】
切断剤Ｆを図３８の経路に従って合成した。
【化１４】
2010507652.tif 000015
【０１８０】
式（６ａ）と（６ｂ）の化合物の合成
アセトニトリル（１００ｍＬ）中の式１ｇの化合物（２．９ｇ、５．５．５ｍｍｏｌ）の攪拌された溶液に、Ｎ−α−Ｃｂｚ−Ｌ−ロイシン（０．８０ｇ、５ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（２．９ｍＬ、１７ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物に、ＨＢＴＵ（２．１ｇ、５．５ｍｍｏｌ）を加え、混合物を１時間攪拌した。溶液を蒸発させて得られた残渣をＥＡ（１００ｍＬ）に溶かした。ＥＡ溶液を５％クエン酸水溶液(５０ｍＬ)、５％  Ｎａ２ＣＯ３水溶液（５０ｍＬ）及び塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を蒸発させ、カラムクロマトグラフィーによって、１０−［（Ｒ）−３−（４−メチル−２−フェノキシカルボニルアミノ−ペンタノイルアミノ）−プロピル］−１，４，７，１０−テトラアザ−シクロドデカン−１，４，７−トリカルボン酸トリ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（６ａ）を無色油として得た。
Rf 0.5 (EA/ヘキサン 2:1); 1H NMR (CDCl3): δ 7.31-7.26 (br, 5H), 4.75-4.33 (br, 2H), 3.63-3.38 (br, 15H), 2.67-2.29 (br, 6H), 1.71-1.58 (m, 5H), 1.50-1.29 (br, 27H), 0.96-0.92 (t, 6H) MS (MALDI-TOF) m/z MS (MALDI-TOF) m/z 776.63 (M+H)+, C40H68N6O9に対する計算値776.50。
【０１８１】
ＥＡ（８０ｍＬ）中の式（６ａ）の化合物（１．８ｇ、２．７ｍｍｏｌ）と１０％Ｐｄ／Ｃ（１．０ｇ）との懸濁液を１気圧水素下で２４時間攪拌した。触媒をセルライトでろ過し、溶媒を蒸発させて、１０−［３−（２−アミノ−４−メチル−ペンタノイルアミノ）−プロピル］−１，４，７，１０−テトラアザ−シクロドデカン−１，４，７−トリカルボン酸トリ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（６ｂ）を固体として得た。
1H NMR (CDCl3): δ 7.72 (s, 1H), 4.60-4.20(br, 2H), 3.70-3.13 (br, 15H), 2.75-2.50 (br, 6H), 1.86-1.62 (m, 4H), 1.54-1.36 (m, 28H), 1.05-0.84 (t, 6H); 13C NMR (MeOD): δ 176.12, 156.31, 156.11, 155.91, 79.70, 54.16, 53.91, 53.18, 49.23, 46.84, 43.98, 37.53, 37.70, 27.70, 27.52, 24.51, 22.84, 22.02, 21.26; MS (MALDI-TOF) m/z 643.57 (M+H)+, C32H62N6O7に対する計算値643.47。
【０１８２】
式（６ｃ）と（６ｄ）樹脂の合成
ＮＭＰ（１ｍＬ）中の式（２ｅ）の樹脂（５５ｍｇ、０.１５ｍｍｏｌ）の懸濁液に、ｎ−ブタノール（１ｍＬ）及びピペリジン（５７μＬ、０．５８ｍｍｏｌ）を加え、続いて、ＤＩＥＡ（１２０μＬ、０．８７ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を１２０℃で８時間加熱した。ろ過後、生成された樹脂（６ｃ）をＤＭＦ、ＭＣ、ＭｅＯＨ及びＭＣ（それぞれ３ｍＬ×３回）で洗浄し、窒素ガス下で乾燥した。
【０１８３】
式（６ｃ）の樹脂に、１，４−ジオキサン（１．８ｍＬ）中のｍ−ＣＰＢＡ（１３０ｍｇ、０．７４ｍｍｏｌ）の溶液と水性１Ｎ  ＮａＯＨ（１６０μＬ）との混合物を加えた。混合物を室温で４時間振盪した。ろ過後、生成された樹脂（６ｄ）を１，４−ジオキサン及びＭＣ（それぞれ３ｍＬ×３回）で洗浄し、窒素ガス下で乾燥した。
【０１８４】
式（６ｅ）及び（６ｆ）の化合物、並びに切断剤Ｆの合成
アセトニトリル（１．５ｍＬ）中の式（６ｄ）の樹脂の懸濁液に、ＰＳ−ＤＩＥＡ樹脂（３０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）と式（６ｂ）化合物（４８ｍｇ、０．０７４ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を８０℃で８時間過熱した。混合物をろ過し、樹脂をＭＣ（１ｍＬ×３回）で洗浄した。合わせたろ液と洗浄液を真空内で蒸発させ、残渣をカラムクロマトグラフィーで精製して、１０−｛（Ｒ）−３−［２−（４−｛２−［（４−ベンゾチアゾール−２−イル−フェニル）−メチル−アミノ］−エトキシ｝−６−ピペリジン−１−イル−［１，３，５］トリアジン−２−イルアミノ）−４−メチル−ペンタノイルアミノ］−プロピル｝−１，４，７，１０−テトラアザ−シクロドデカン−１，４，７−トリカルボン酸トリ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（６ｅ）を得た。
Rf 0.2 (EA/ヘキサン 2:1); 1H NMR (CDCl3): δ 7.96 (q, 3H), 7.84 (d, 1H), 7.45 (t, 1H), 7.30 (t, 1H), 6.78 (d, 2H), 4.56-4.55 (br, 1H), 4.45 (t, 2H), 3.78 (t, 2H), 3.69-3.67 (br, 4H), 3.61-3.21(br, 14H), 3.11(s, 3H), 2.75-2.31(br, 6H), 1.72 (m, 1H), 1.72-1.50 (br, 10H), 1.49-1.29 (br, 27H), 0.93 (m, 6H); 13C NMR (CDCl3): δ 173.17, 170.46, 168.57, 166.78, 165.42, 156.13, 155.78, 155.30, 154.41, 150.89, 134.53, 129.00, 125.99, 124.23, 122.30, 121.60, 121.36, 111.56, 79.44, 76.61, 62.79, 54.88, 53.95, 51.10, 49.96, 49.15, 48.14, 44.46, 41.68, 39.10, 36.99, 29.69, 28.66, 28.51, 25.77, 24.87, 24.72, 24.46, 23.25, 21.80; MS (MALDI-TOF) m/z 1087.60 (M+H)+, C56H86N12O8Sに対する計算値1087.64。
【０１８５】
式（６ｅ）の化合物を、実施例１で式（１ｈ）の化合物に対して記述したように、ＴＦＡで処理して、２−（（Ｓ）−４−{２−［（４−ベンゾチアゾール−２−イル−フェニル）−メチル−アミノ］−エトキシ}−６−ピペリジン−１−イル−［１，３，５］トリアジン−２−イルアミノ）−４-メチル−ペンタン酸［３−（１，４，７，１０−テトラアザ−シクロドデク−１−シル）−プロピル］−アミド（６ｆ）のＴＦＡ塩を得た。式（６ｆ）の化合物のＴＦＡ塩を使用してＮＭＲ及びＭＳ特性を測定した。
1H NMR (MeOD): δ 7.90 (q, 4H), 7.48 (t, 1H), 7.37 (t, 1H), 6.88 (d, 2H), 4.70-4.68 (br, 1H), 4.52 (t, 2H), 3.89 (t, 2H), 3.82-3.68 (br, 4H), 3.20-3.05 (br, 13H), 3.02-2.93 (br, 4H), 2.85-2.80 (br, 4H), 2.59 (t, 2H), 1.75-1.50 (br, 7H), 0.89 (t, 6H) ; 13C NMR (MeOD): δ 173.16, 169.35, 161.64, 161.45, 158.40, 157.85, 157.30, 153.47, 151.32, 133.84, 128.59, 126.14, 124.46, 121.35, 120.62, 116.53, 111.61, 65.65, 65.47, 53.59, 50.18, 50.01, 46.77, 45.25, 44.06, 42.06, 41.84, 41.09, 37.83, 36.60, 25.09, 24.54, 23.81, 21.90, 20.64, 14.04; HRMS m/z 787.4913 (M+H)+, C41H63N12O2Sに対する計算値787.4918。
【０１８６】
切断剤Ｆの原液は、実施例５で切断剤Ｅに対して記述したように、式（６ｆ）の化合物から得た。
【０１８７】
切断剤Ｆの活性試験
（１）２型糖尿病に関連したアミリンのオリゴマーの切断
Ａｍ（４．０μＭ）を切断剤Ｆと反応させた後、ＨＰＬＣで精製した切断生成物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを図３９に示した。図３９に示されるように、Ａｍは切断剤Ｅにより切断され、Ａｍ１９−３７とＡｍ１３−３７が切断生成物に含まれている。
【０１８８】
切断剤Ｆの濃度を多様に変えながら、３７℃、ｐＨ７．５０で３６時間、Ａｍ（４．０μＭ）と反応させた後に、測定した切断収率を図４０に示した。
【０１８９】
（２）対照ペプチド又はタンパク質との反応
対照実験は実施例１と同様にして、切断剤Ｆのために実施した。対照実験の結果は、実施例１で得られたものと同様であった。
【実施例７】
【０１９０】
切断剤Ｇを図４１の経路に従って合成した。
【化１５】
2010507652.tif 000016
【０１９１】
式（７ａ）と（７ｂ）樹脂の合成
ＮＭＰ（１ｍＬ）中の式（２ｅ）の樹脂（５５ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）の懸濁液に、ｎ−ブタノール（１ｍＬ）及びシクロドデシルアミン（７５μＬ、０．５８ｍｍｏｌ）を加え、続いて、ＤＩＥＡ（１２０μＬ、０．８７ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を１２０℃で８時間加熱した。ろ過後、生成された樹脂（７ａ）をＤＭＦ、ＭＣ、ＭｅＯＨ及びＭＣ（それぞれ３ｍＬ×３回）で洗浄し、窒素ガス下で乾燥した。
【０１９２】
式（７ａ）の樹脂に、１，４−ジオキサン（１．８ｍＬ）中のｍ−ＣＰＢＡ（１３０ｍｇ、０．７４ｍｍｏｌ）の溶液と水性１Ｎ  ＮａＯＨ（１６０μＬ）の混合物を加えた。混合物を室温で４時間振盪した。ろ過後、生成された樹脂（７ｂ）を１，４−ジオキサン及びＭＣ（それぞれ３ｍＬ×３回）で洗浄し、窒素ガス下で乾燥した。
【０１９３】
式（７ｃ）及び（７ｄ）の化合物、並びに切断剤Ｆの合成
アセトニトリル（１．５ｍＬ）中の式（７ｂ）の樹脂の懸濁液に、ＰＳ−ＤＩＥＡ樹脂（３０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）と式（６ｂ）の化合物（４８ｍｇ、０．０７４ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を８０℃で８時間過熱した。混合物をろ過し、樹脂をＭＣ（１ｍＬ×３回）で洗浄した。合わせたろ液と洗浄液を真空内で蒸発させ、残渣をカラムクロマトグラフィーで精製して、１０−｛（Ｒ）−３−［２−（４−｛２−［（４−ベンゾチアゾール−２−イル−フェニル−メチル−アミノ）−エトキシ］−６−シクロドデシルアミノ−［１，３，５］トリアジン−２−イルアミノ）−４−メチル−ペンタノイルアミノ｝−プロピル］−１，４，７，１０−テトラアザ−シクロドデカン−１，４，７−トリカルボン酸トリ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（７ｃ）を得た。
Rf 0.2 (EA/ヘキサン 2:1); 1H NMR (CDCl3): δ 7.96 (q, 3H), 7.84 (d, 1H), 7.43 (t, 1H), 7.30 (t, 1H), 6.77 (d, 2H), 4.47-4.41 (br, 3H), 4.14-4.04 (br, 1H), 3.77 (t, 2H), 3.68-21 (br, 14H), 3.12 (s, 3H), 2.75-2.34 (br, 6H), 1.72-1.55 (br, 5H), 1.52-1.40 (br, 27H), 1.38-1.28 (br, 22H), 0.87 (m, 6H); 13C NMR (CDCl3): δ 173.56, 170.42, 168.50, 166.90, 165.93, 156.07, 155.74, 155.26, 154.39, 150.91, 134.50, 128.97, 125.95, 124.20, 122.26, 121.62, 121.53, 121.32, 111.59, 111.49, 79.49, 79.34, 79.23, 76.73, 63.17, 63.06, 51.05, 49.87, 47.99, 47.55, 47.32, 39.21, 38.83, 30.58, 29.65, 28.64, 28.49, 25.00, 24.83, 24.10, 23.95, 23.73, 23.51, 23.32, 23.08, 22.15, 21.74, 21.17 ; MS (MALDI-TOF) m/z 1185.53 (M+H)+, C63H100N12O8Sに対する計算値1185.75。
【０１９４】
式（７ｃ）の化合物を、実施例１で式（１ｈ）の化合物に対して記述したように、ＴＦＡで処理して、２−（（Ｓ）−４−｛２−［（４−ベンゾチアゾール−２−イル−フェニル）−メチル−アミノ］−エトキシ｝−６−シクロドデシルアミノ−［１，３，５］トリアジン−２−イルアミノ）−４−メチル−ペンタン酸［３−（１，４，７，１０−テトラアザ−シクドデ−１−シル）−プロピル］−アミド（７ｄ）のＴＦＡ塩を得た。式（７ｄ）の化合物のＴＦＡ塩を使用してＮＭＲ及びＭＳ特性を測定した。
1H NMR (MeOD): δ 7.90 (q, 4H), 7.47 (t, 1H), 7.35 (t, 1H), 6.81 (d, 2H), 4.80-4.53 (br, 3H), 4.12-4.03 (br, 1H), 3.89 (t, 2H), 3.22-3.12 (br, 10H), 3.10-3.00 (br, 3H), 2.97-2.92 (br, 4H), 2.90-2.73 (br, 4H), 2.63 (t, 2H), 1.76-1.60 (br, 5H), 1.40-1.12 (br, 22H), 0.72 (t, 6H); 13C NMR (MeOD): δ 172.79, 169.50, 161.97, 161.41, 160.99, 159.38, 157.83, 157.28, 151.60, 133.48, 128.80, 126.32, 124.63, 121.45, 120.93, 116.52, 111.63, 66.45, 65.47, 53.76, 49.94, 46.79, 44.15, 41.96, 41.92, 37.52, 24.66, 23.61, 23.53, 23.37, 23.52, 23.10, 22.90, 22.10, 20.86, 20.46, 14.06; HRMS m/z 885.5991 (M+H)+, C48H77N12O2Sに対する計算値885.6013。
【０１９５】
切断剤Ｇの原液は、実施例５で切断剤Ｅに対して記述したように、式（７ｄ）の化合物から得た。
【０１９６】
切断剤Ｇの活性試験
（１）２型糖尿病に関連したアミリンのオリゴマーの切断
Ａｍ（４．０μＭ）を切断剤Ｇと反応させた後、ＨＰＬＣで精製した切断生成物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを図４２に示した。図４２に示されるように、Ａｍは切断剤Ｆにより切断され、Ａｍ２０−３７とＡｍ１７−３７が切断生成物に含まれている。
【０１９７】
切断剤Ｇの濃度を多様に変えながら、３７℃、ｐＨ７．５０で３６時間、Ａｍ（４．０μＭ）と反応させた後に、測定した切断収率を図４３に示した。
【０１９８】
（２）対照ペプチド又はタンパク質との反応
対照実験は実施例１と同様にして、切断剤Ｇのために実施した。対照実験の結果は、実施例１で得られたものと同様であった。
【実施例８】
【０１９９】
切断剤Ｈを図４４の経路に従って合成した。
【化１６】
2010507652.tif 000017
【０２００】
式（８ａ）と（８ｂ）の化合物の合成
アセトニトリル（１００ｍＬ）中の式（１ｇ）の化合物（２．９ｇ、５ｍｍｏｌ）の攪拌された溶液に、Ｎ−α−Ｃｂｚ−Ｌ−チロシン（１．１ｇ、５ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（２．９ｍＬ、１７ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物にＨＢＴＵ（２．１ｇ、５．５ｍｍｏｌ）を加え、混合物を１時間攪拌した。溶液を蒸発させて得られた残渣をＥＡ（１００ｍＬ）に溶かした。ＥＡ溶液を５％クエン酸水溶液（５０ｍＬ）、５％  Ｎａ２ＣＯ３水溶液（５０ｍＬ）及び塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を蒸発し、カラムクロマトグラフィーによって、１０−｛（Ｓ）−３−［３−（４−ヒドロキシ−フェニル）−２−フェノキシカルボニルアミノ−プロピオニルアミノ］−プロピル｝−１，４，７，１０−テトラアザ−シクロドデカン−１，４，７−トリカルボン酸トリ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（８ａ）を無色油として得た。
Rf 0.5 (EA/ヘキサン 3:1). 1H NMR (CDCl3): δ 7.42-7.23 (br, 5H), 7.07-6.85 (d, 2H), 6.77-6.62 (d, 2H), 4.60-4.13 (br, 4H), 3.77-2.92 (br, 16H), 2.69-2.54 (br, 4H), 2.50-2.37 (br, 2H), 1.65-1.31 (br, 29H); MS (MALDI-TOF) m/z 827.75 (M+H)+, C43H66N6O10に対する計算値827.04。
【０２０１】
ＥＡ（８０ｍＬ）中の式（８ａ）の化合物（２．０ｇ、２．７ｍｍｏｌ）と１０％Ｐｄ／Ｃ（１．０ｇ）との懸濁液を、１気圧水素下で２４時間攪拌した。触媒をセルライトでろ過し、溶媒を蒸発させて、１０−｛３−［（Ｒ）−２−アミノ−３−（４−ヒドロキシ−フェニル）−プロピオニルアミノ］−プロピル｝−１，４，７，１０−テトラアザ−シクロドデカン−１，４，７−トリカルボン酸トリ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（８ｂ）を固体として得た。
1H NMR (CDCl3): δ 7.2 (s, 1H), 7.05-6.97 (d, 2H), 6.81-6.72 (d, 2H), 3.65-3.58 (m, 1H), 3.53-3.20 (br, 14H), 3.12-3.00 (m, 2H), 2.75-2.48 (br, 8H), 1.76-1.64 (m, 2H), 1.54-1.38 (m, 27H); 13C NMR (CDCl3): δ 173.51, 155.91, 155.51, 130.40, 127.44, 115.62, 79.91, 79.65, 76.58, 56.12, 54.55, 49.76, 47.73, 39.63, 38.56, 37.13, 29.62, 28.61, 28.45, 24.23; MS (MALDI-TOF) m/z 692.84 (M+H)+, C35H60N6O8に対する計算値692.90。
【０２０２】
式（８ｃ）と（８ｄ）樹脂の合成
ＮＭＰ（１ｍＬ）中の式（２ｅ）の樹脂（５５ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）の懸濁液に、ｎ−ブタノール（１ｍＬ）及びジシクロヘキシルアミン（１１５μＬ、０．５８ｍｍｏｌ）を加え、続いて、ＤＩＥＡ（１２０μＬ、０．８７ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を１２０℃で８時間加熱した。ろ過後、生成された樹脂（８ｃ）をＤＭＦ、ＭＣ、ＭｅＯＨ及びＭＣ（それぞれ３ｍＬ×３回）で洗浄し、窒素ガス下で乾燥した。
【０２０３】
式（８ｃ）の樹脂に、１，４−ジオキサン（１．８ｍＬ）中のｍ−ＣＰＢＡ（１３０ｍｇ、０．７４ｍｍｏｌ）の溶液と水性１Ｎ  ＮａＯＨ（１６０μＬ）との混合物を加えた。混合物を室温で４時間振盪した。ろ過し、生成された樹脂（８ｄ）を１，４−ジオキサン及びＭＣ（それぞれ３ｍＬ×３回）で洗浄し、窒素ガス下で乾燥した。
【０２０４】
式（８ｅ）及び（８ｆ）の化合物、並びに切断剤Ｈの合成
アセトニトリル（１．５ｍＬ）中の式（８ｄ）の樹脂の懸濁液に、ＰＳ−ＤＩＥＡ樹脂（３０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）と式（８ｂ）の化合物（５１ｍｇ、０．０７４ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を８０℃で８時間加熱した。混合物をろ過し、樹脂をＭＣ（１ｍＬ×３回）で洗浄した。合わせたろ液と洗浄液を真空内で蒸発させ、残渣をカラムクロマトグラフィーで精製して、１０−｛（Ｓ）−３−［２−（４−｛２−［（４−ベンゾチアゾール−２−イル−フェニル）−メチル−アミノ］−エトキシ｝−６−ジシクロヘキシルアミノ−［１，３，５］トリアジン−２−イルアミノ）−３−（４−ヒドロキシ−フェニル）−プロピオニルアミノ］−プロピル｝−１，４，７，１０−テトラアザ−シクロドデカン−１，４，７−トリカルボン酸トリ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（８ｅ）を得た。
Rf 0.2 (EA:ヘキサン 1:4); 1H NMR (CDCl3): δ 7.87 (t, 3H), 7.73 (d, 2H), 7.35 (t, 2H), 7.20 (m, 2H), 6.75-6.48 (br, 4H), 4.45-4.41(m, 3H), 3.73-3.68(m, 2H), 3.62-3.08 (br, 18H), 3.05-2.65 (br, 6H), 2.19-2.17 (m, 2H), 1.93-1.85(m, 2H), 1.75-1.62 (br, 4H), 1.60-1.42 (br, 31H), 1.58-1.20 (br, 12H); 13C NMR (CDCl3): δ 169.55, 168.64, 165.09, 154.35, 151.53, 150.73, 135.81, 134.52, 129.04, 128.26, 125.53, 124.28, 122.30, 121.75, 121.38, 111.68, 76.71, 64.43, 64.24, 56.28, 56.16, 50.96, 47.21, 39.29, 34.24, 30.35, 29.99, 29.80, 29.72, 28.58, 28.46, 26.12, 25.58, 25.37, 21.22, 20.25, 20.18, 20.09; HRMS m/z 1232.7149 (M+H)+, C66H96N12O9Sに対する計算値1232.7144。
【０２０５】
式（８ｅ）の化合物を、実施例１で式（１ｈ）の化合物に対して記述しように、ＴＦＡで処理して、２−（４−｛（Ｓ）−２−［（４−ベンゾチアゾール−２−イル−フェニル）−メチル−アミノ］−エトキシ｝−６−ジシクロヘキシルアミノ−［１，３，５］トリアジン−２−イルアミノ）−３−（４−ヒドロキシ−フェニル）−Ｎ−［３−（１，４，７，１０−テトラアザ−シクロドデ−１−シル）−プロピル］−プロピオンアミド（８ｆ）のＴＦＡ塩を得た。式（８ｆ）の化合物のＴＦＡ塩を使用してＮＭＲ及びＭＳ特性を測定した。
1H NMR (CDCl3): δ 8.04 (t, 3H), 7.75 (d, 2H), 7.53 (t, 2H), 7.42 (m, 2H), 6.78-6.64 (br, 4H), 4.48-4.45 (m, 3H), 3.81-3.74 (m, 2H), 3.63-2.75 (br, 24H), 2.25-2.15 (m, 3H), 1.85-1.63 (br, 12H), 1.60-1.42 (br, 10H); 13C NMR (CDCl3): δ 169.55, 168.64, 164.59, 160.23, 153.72, 142.86, 130.91, 128.97, 128.26, 125.52, 122.10, 118.18, 117.51, 113.69, 79.80, 74.60, 73.43, 56.70, 56.53, 39.59, 34.22, 30.88, 30.47, 30.31, 29.56, 27.98, 25.25, 24.93, 21.19, 19.92; HRMS m/z 932.5573 (M+H)+, C51H72N12O3Sに対する計算値932.5571。
【０２０６】
切断剤Ｈの原液は、実施例５で切断剤Ｅに対して記述したように、式（８ｆ）の化合物から得た。
【０２０７】
切断剤Ｈの活性試験
（１）２型糖尿病に関連したアミリンのオリゴマーの切断
Ａｍ（４．０μＭ）を切断剤Ｈと反応させた後、ＨＰＬＣで精製した切断生成物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを図４５に示した。図４５に示されるように、Ａｍは切断剤Ｈにより切断され、Ａｍ１−１９が切断生成物に含まれている。
【０２０８】
切断剤Ｈの濃度を多様に変えながら、３７℃、ｐＨ７．５０で３６時間、Ａｍ（４．０μＭ）と反応させた後に、測定した切断収率を図４６に示した。
【０２０９】
（２）対照ペプチド又はタンパク質との反応
対照実験は実施例１と同様にして、切断剤Ｈのために実施した。対照実験の結果は、実施例１で得られたものと同様であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年5月18日(2009.5.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2010507652000001.app
【国際調査報告】
2010507652.tif 000068
2010507652.tif 000069