(57)【要約】  本発明は、スクリーニングの新規なパラダイムを用いた、癌性疾患修飾抗体（ｃａｎｃｅｒｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）を作製する方法に関する。このプロセスにより、癌細胞の細胞傷害性を指標として抗癌抗体を分離することにより、治療目的及び診断目的のための抗癌抗体の作製が可能となる。この抗体は、癌のステージング及び診断の補助に、及び原発性腫瘍及び腫瘍転移の治療に用いることができる。この抗癌抗体は、毒素、酵素、放射性化合物、及び造血系細胞と結合することができる。
2010509245.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＤＡＣに１８０７０６−０３の受託番号で寄託されているハイブリドーマによって産生された、単離されたモノクローナル抗体。
【請求項２】
ＩＤＡＣに１８０７０６−０３の受託番号で寄託されているハイブリドーマによって産生された、単離されたモノクローナル抗体のヒト化抗体、又は該ヒト化抗体から作製された抗原結合断片。
【請求項３】
ＩＤＡＣに１８０７０６−０３の受託番号で寄託されているハイブリドーマによって産生された、単離されたモノクローナル抗体のキメラ抗体、又は該キメラ抗体から作製された抗原結合断片。
【請求項４】
ＩＤＡＣに１８０７０６−０３の受託番号で寄託されている、単離されたハイブリドーマ細胞系。
【請求項５】
ヒト腫瘍から選別された組織サンプル中の癌性細胞の抗体の誘導による細胞傷害性を開始する方法であって：
該ヒト腫瘍から組織サンプルを提供する工程と：
前記のＩＤＡＣに１８０７０６−０３の受託番号で寄託されているハイブリドーマによって産生された、単離されたモノクローナル抗体、前記のＩＤＡＣに１８０７０６−０３の受託番号で寄託されているハイブリドーマによって産生された、単離されたモノクローナル抗体のヒト化抗体、前記のＩＤＡＣに１８０７０６−０３の受託番号で寄託されているハイブリドーマによって産生された、単離されたモノクローナル抗体のキメラ抗体、又はそのＣＤＭＡＢを提供する工程であって、該ＣＤＭＡＢが、該単離されたモノクローナル抗体のその標的抗原への結合を競合的に阻害する能力を特徴とする、工程と；
該単離されたモノクローナル抗体、該ヒト化抗体、該キメラ抗体、又はそのＣＤＭＡＢを、該組織サンプルと接触させる工程と；
を含み、
ここで、該単離されたモノクローナル抗体、該ヒト化抗体、該キメラ抗体、又はそのＣＤＭＡＢと該組織サンプルとの結合が細胞傷害性を誘導する、方法。
【請求項６】
請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体のＣＤＭＡＢ。
【請求項７】
請求項２に記載のヒト化抗体のＣＤＭＡＢ。
【請求項８】
請求項３に記載のキメラ抗体のＣＤＭＡＢ。
【請求項９】
細胞傷害性部分、酵素、放射性化合物、及び造血系細胞から成る群より選択されるメンバーと結合した、請求項１、２、３、６、７、若しくは８のいずれか１項に記載の単離された抗体又はそのＣＤＭＡＢ。
【請求項１０】
哺乳類において、抗体の誘導による細胞傷害性に感受性のあるヒト腫瘍を治療する方法であって、ここで、該ヒト腫瘍が、前記のＩＤＡＣに１８０７０６−０３の受託番号で寄託されているハイブリドーマによって産生された、単離されたモノクローナル抗体、又はそのＣＤＭＡＢと特異的に結合する少なくとも１個の抗原エピトープを発現し、該ＣＤＭＡＢが、該単離されたモノクローナル抗体のその標的抗原への結合を競合的に阻害する能力を特徴とし、該哺乳類に、該モノクローナル抗体又は該そのＣＤＭＡＢを、該哺乳類の全腫瘍組織量が減少する結果となる効果量投与する工程を含む、方法。
【請求項１１】
前記の単離されたモノクローナル抗体が、細胞傷害性部分と結合する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記の細胞傷害性部分が、放射性同位元素である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記の単離されたモノクローナル抗体、又はそのＣＤＭＡＢが、補体を活性化する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記の単離されたモノクローナル抗体、又はそのＣＤＭＡＢが、抗体依存性細胞傷害性を媒介する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記の単離されたモノクローナル抗体が、ヒト化される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記の単離されたモノクローナル抗体が、キメラ化される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記のＩＤＡＣに１８０７０６−０３の受託番号で寄託されているハイブリドーマによって産生された、単離されたモノクローナル抗体と同じ１若しくは複数個のエピトープと特異的に結合することができるモノクローナル抗体。
【請求項１８】
哺乳類のヒト腫瘍を治療する方法であって、ここで、該ヒト腫瘍が、前記のＩＤＡＣに１８０７０６−０３の受託番号で寄託されているハイブリドーマによって産生された、単離されたモノクローナル抗体、又はそのＣＤＭＡＢと特異的に結合する少なくとも１個の抗原エピトープを発現し、該ＣＤＭＡＢが、該単離されたモノクローナル抗体のその標的抗原への結合を競合的に阻害する能力を特徴とし、該哺乳類に、該モノクローナル抗体又はそのＣＤＭＡＢを、該哺乳類の全身腫瘍組織量が減少する結果となる効果量投与する工程を含む、方法。
【請求項１９】
前記の単離されたモノクローナル抗体が、細胞傷害性部分と結合する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記の細胞傷害性部分が、放射性同位元素である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記の単離されたモノクローナル抗体、又はそのＣＤＭＡＢが、補体を活性化する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記の単離されたモノクローナル抗体、又はそのＣＤＭＡＢが、抗体依存性細胞傷害性を媒介する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記の単離されたモノクローナル抗体が、ヒト化される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記の単離されたモノクローナル抗体が、キメラ化される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
哺乳類のヒト腫瘍を治療する方法であって、ここで、該ヒト腫瘍が、前記のＩＤＡＣに１８０７０６−０３の受託番号で寄託されているハイブリドーマによって産生された、単離されたモノクローナル抗体、又はそのＣＤＭＡＢと特異的に結合する少なくとも１個の抗原エピトープを発現し、該ＣＤＭＡＢが、該単離されたモノクローナル抗体のその標的抗原への結合を競合的に阻害する能力を特徴とし、該哺乳類に、該モノクローナル抗体又はそのＣＤＭＡＢを、少なくとも１種類の化学療法薬と組み合わせて、該哺乳類の全身腫瘍組織量が減少する結果となる効果量投与する工程を含む、方法。
【請求項２６】
前記の単離されたモノクローナル抗体が、細胞傷害性部分と結合する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記の細胞傷害性部分が、放射性同位元素である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記の単離されたモノクローナル抗体、又はそのＣＤＭＡＢが、補体を活性化する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記の単離されたモノクローナル抗体、又はそのＣＤＭＡＢが、抗体依存性細胞傷害性を媒介する、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記の単離されたモノクローナル抗体が、ヒト化される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記の単離されたモノクローナル抗体が、キメラ化される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
ＩＤＡＣ受託番号１８０７０６−０３を持つハイブリドーマ細胞系ＡＲ２７Ａ８０７．１４．１によって産生された、単離されたモノクローナル抗体、前記のＩＤＡＣに１８０７０６−０３の受託番号で寄託されているハイブリドーマによって産生された、単離されたモノクローナル抗体のヒト化抗体、又は前記のＩＤＡＣに１８０７０６−０３の受託番号で寄託されているハイブリドーマによって産生された、単離されたモノクローナル抗体のキメラ抗体によって特異的に結合される、ヒト腫瘍から選別された組織サンプル内の癌性細胞の存在を判定する結合アッセイであって：
該ヒト腫瘍から組織サンプルを提供する工程と；
ＩＤＡＣ受託番号１８０７０６−０３を持つハイブリドーマ細胞系ＡＲ２７Ａ８０７．１４．１によって産生された、単離されたモノクローナル抗体によって認識されるものと同じ１若しくは複数個のエピトープを認識する該単離されたモノクローナル抗体、該ヒト化抗体、該キメラ化抗体、又はそのＣＤＭＡＢの少なくとも１種類を提供する工程と；
該提供された抗体又はそのＣＤＭＡＢの少なくとも１種類を、該組織サンプルと接触させる工程と；
該提供された抗体又はそのＣＤＭＡＢの少なくとも１種類と該組織サンプルとの結合を測定する工程と；
を含み、
これによって、該組織サンプル中の該癌性細胞の存在が示される、結合アッセイ。
【請求項３３】
モノクローナル抗体のヒト全身腫瘍組織量を減少させるための使用であって、ここで、該ヒト腫瘍が、前記のＩＤＡＣに１８０７０６−０３の受託番号で寄託されているハイブリドーマによって産生された、単離されたモノクローナル抗体又はそのＣＤＭＡＢと特異的に結合する少なくとも１個の抗原エピトープを発現し、該ＣＤＭＡＢが、該単離されたモノクローナル抗体のその標的抗原への結合を競合的に阻害する能力を特徴とし、前記の哺乳類へ、該モノクローナル抗体又はそのＣＤＭＡＢを、該哺乳類のヒト全身腫瘍組織量が減少する結果となる効果量投与することを含む、使用。
【請求項３４】
前記の単離されたモノクローナル抗体が、細胞傷害性部分と結合する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記の細胞傷害性部分が、放射性同位元素である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記の単離されたモノクローナル抗体、又はそのＣＤＭＡＢが、補体を活性化する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記の単離されたモノクローナル抗体、又はそのＣＤＭＡＢが、抗体依存性細胞傷害性を媒介する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
前記の単離されたモノクローナル抗体が、ヒト化される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
前記の単離されたモノクローナル抗体が、キメラ化される、請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
モノクローナル抗体のヒト全身腫瘍組織量を減少させるための使用であって、ここで、該ヒト腫瘍が、前記のＩＤＡＣに１８０７０６−０３の受託番号で寄託されているハイブリドーマによって産生された、単離されたモノクローナル抗体又はそのＣＤＭＡＢと特異的に結合する少なくとも１個の抗原エピトープを発現し、該ＣＤＭＡＢが、該単離されたモノクローナル抗体のその標的抗原への結合を競合的に阻害する能力を特徴とし、前記の哺乳類へ、該モノクローナル抗体又はそのＣＤＭＡＢを、少なくとも１種類の化学療法薬と組み合わせて、該哺乳類のヒト全身腫瘍組織量が減少する結果となる効果量投与することを含む、使用。
【請求項４１】
前記の単離されたモノクローナル抗体が、細胞傷害性部分と結合する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記の細胞傷害性部分が、放射性同位元素である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記の単離されたモノクローナル抗体、又はそのＣＤＭＡＢが、補体を活性化する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記の単離されたモノクローナル抗体、又はそのＣＤＭＡＢが、抗体依存性細胞傷害性を媒介する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
前記の単離されたモノクローナル抗体が、ヒト化される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
前記の単離されたモノクローナル抗体が、キメラ化される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４７】
ヒト癌性腫瘍に効果的な組成物であって：
請求項１、２、３、６、７、８、又は１７のいずれか１項に記載の抗体又はＣＤＭＡＢと；
該抗体又はその抗原結合断片と、細胞傷害性部分、酵素、放射性化合物、及び造血系細胞から成る群より選択されるメンバーとの複合体と；
必要量の薬理学的に許容される担体と：
を組み合わせて含み、
ここで、該組成物は、該ヒト癌性腫瘍の治療に効果的である、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
共同研究契約に関する説明
ここに示す請求項で定める本発明は、Ａｒｉｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．とＴａｋｅｄａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｌｉｍｉｔｅｄとの間の共同研究契約（「契約」）の当事者により、その契約の範囲内で実施された活動の結果として作製されたものである。この契約は、本発明の日付以前に有効であった。
【０００２】
発明の分野
本発明は、癌性疾患修飾抗体（ｃａｎｃｅｒｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）（ＣＤＭＡＢ）の単離及び作製に関し、並びに、治療及び診断プロセスにおける、任意に１若しくは２種類以上の化学療法薬と組み合わせての、これらのＣＤＭＡＢの使用に関する。本発明はさらに、本発明のＣＤＭＡＢを用いる結合アッセイに関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
癌治療法としてのモノクローナル抗体：癌を発症した個人は、それぞれが独特で、その人の個性のように他の人の癌とは異なる癌を有する。このことにも関わらず、現在の治療法は、同じ種類の同じステージの癌を有する患者は、すべて同じ方法で治療している。このような患者の少なくとも３０％で、一次治療が失敗に終わることになり、従って、さらなる一連の治療が必要となり、治療の失敗、転移、及び最終的には死に至る可能性が高まる。より優れた治療手法としては、特定の個人に合わせた治療法のカスタマイズであろう。現在、カスタマイズに適した唯一の治療法は、手術である。化学療法及び放射線治療は、患者に合わせて設計することができず、手術自体だけでは、治癒をもたらすには不適当である場合がほとんどである。
【０００４】
モノクローナル抗体の出現により、抗体の一つ一つを単一のエピトープへ向けることが可能であることから、カスタマイズ治療のための方法の開発の可能性がより現実的となった。さらに、特定の個人の腫瘍を一意的に決定するエピトープの集団に向けられる抗体の組み合わせを作製することも可能である。
【０００５】
癌性細胞と正常細胞との間の大きな違いが、癌性細胞が形質転換細胞に特異的な抗原を含むことであるという認識のもと、科学者の間では、モノクローナル抗体を、これらの癌抗原に特異的に結合することによって形質転換細胞を特異的に標的とするように設計することが可能であると長い間考えられてきており；このようにして、モノクローナル抗体が癌細胞を消滅させる「特効薬」として使えるという確信が引き起こされた。しかし、現在では、すべての癌の症例に用いることができる単一のモノクローナル抗体というものは存在しないこと、及び、モノクローナル抗体は、分類としては、標的癌治療として採用することができるということが広く認識されている。ここで開示する本発明の教示事項に従って単離されたモノクローナル抗体は、例えば全身腫瘍組織量を減少させる等、患者に有益な方法で癌性疾患プロセスを修飾することが示されており、本明細書において、癌性疾患修飾抗体（ＣＤＭＡＢ）又は「抗癌」抗体として種々に称される。
【０００６】
現時点において、癌患者には、通常、治療の選択肢はほとんどない。癌治療への組織的な取り組みにより、全世界での生存率及び罹患率が改善されてきた。しかし、特定の個人にとっては、このような統計上の改善は、個々の状態の改善と必ずしも相関関係があるわけではない。
【０００７】
従って、医師が、腫瘍の一つ一つを同一のコホートの他の患者とは独立した形で治療することを可能とする方法が提案されれば、その1人だけに合わせた治療法という独特の手法が可能となるであろう。このような治療の方向性により、理想的には、治癒率が上昇し、予後が改善され、それによって、長年にわたる要求が満たされるであろう。
【０００８】
歴史的に、ポリクローナル抗体の使用によるヒトの癌治療の成功例は限られてきた。リンパ腫及び白血病は、ヒト血漿を用いて治療されてきたが、寛解又は反応が長続きすることはほとんどなかった。さらに、再現性に欠けており、化学療法と比較して、追加的な利点もなかった。乳癌、メラノーマ、及び腎細胞癌腫等の固形腫瘍も、ヒト血液、チンパンジー血清、ヒト血漿、及びウマ血清によって治療されてきが、同様に、予測不能の効果的でない結果が得られてきた。
【０００９】
固形腫瘍に対するモノクローナル抗体の臨床試験が数多く行われてきた。１９８０年代には、ヒト乳癌に対して少なくとも４つの臨床試験が行われ、特定の抗原に対する抗体、又は組織選択性に基づいた抗体を用いた少なくとも４７人の患者のうちレスポンダーは1人だけであった。１９９８年になってようやく、ヒト化抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））をシスプラチンと組み合わせて用いることによって臨床試験が成功した。この試験では、３７人の患者の反応が評価され、そのうち約４分の１が部分奏効率を示し、さらなる４分の１では、病勢進行が僅かであるか、又は安定化した。レスポンダーの中で、無増悪期間のメジアン値は８．４ヶ月であり、奏効期間のメジアン値は５．３ヶ月であった。
【００１０】
Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）は、Ｔａｘｏｌ（登録商標）と組み合わせての一次治療での使用が１９９８年に認可された。臨床研究の結果によると、抗体治療プラスＴａｘｏｌ（登録商標）を受けた患者の無増悪期間のメジアン値（６．９ヶ月）が、Ｔａｘｏｌ（登録商標）のみを受けた群（３．０ヶ月）と比較して増加した。生存期間のメジアン値もわずかに上昇し；Ｔａｘｏｌ（登録商標）のみの治療群の１８ヶ月に対して、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）プラスＴａｘｏｌ（登録商標）の治療群では２２ヶ月であった。さらに、抗体プラスＴａｘｏｌ（登録商標）の組み合わせの群をＴａｘｏｌ（登録商標）のみの群と比較して、完全レスポンダー（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）（８パーセント対２パーセント）及び部分レスポンダー（ｐａｒｔｉａｌ  ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）（３４パーセント対１５パーセント）の両方で人数が増加した。しかし、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）とＴａｘｏｌ（登録商標）とによる治療では、Ｔａｘｏｌ（登録商標）のみの治療と比較して、心毒性の発生率が高まった（それぞれ、１３パーセント対１パーセント）。さらに、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）による治療は、現在のところ機能も生物学的に重要なリガンドも知られていない受容体であるヒト上皮増殖因子受容体２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）を過剰発現（免疫組織化学的（ＩＨＣ）分析により測定）する患者にのみ効果的であり；それは、転移性乳癌を有する患者のおよそ２５パーセントであった。従って、乳癌を有する患者の大きな要求は依然として満たされていない。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）による治療から恩恵を受けることのできる患者でさえ、化学治療がさらに必要であり、結果として、この種の治療の副作用に対して、少なくともある程度は、さらに対処していかなければならないであろう。
【００１１】
結腸直腸癌を研究する臨床試験は、糖タンパク質及び糖脂質の両方を標的とする抗体が関与する。腺癌にある程度の特異性を持つ１７−１Ａ等の抗体について、６０人を超す患者に対するフェーズ２の臨床試験が実施され、１人の患者だけが部分寛解を示した。追加のシクロホスファミドを用いたプロトコルによる他の試験では、１７−１Ａを使用した結果は、５２人の患者中、完全寛解がわずかに１人、やや有効（ｍｉｎｏｒ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）が２人であった。現在までのところ、１７−１ＡのフェーズＩＩＩ臨床試験では、ステージＩＩＩの結腸癌のアジュバント治療としての効力の改善は見られていない。最初はイメージング用として認可されたヒト化マウスモノクローナル抗体の使用でも、腫瘍の縮小が見られなかった。
【００１２】
最近になってようやく、モノクローナル抗体を用いた結腸直腸癌の臨床試験から前向きな結果が得られた。２００４年には、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）が、ＥＧＦＲを発現する転移性結腸直腸癌を有し、イリノテカンを主体とする化学療法に耐性を示す患者に対する二次治療として認可された。二群による(two-arm)フェーズＩＩ臨床試験、及び単一群による(single-arm)試験の両方の結果によると、イリノテカンと組み合わせたＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）の奏効率は、それぞれ、２３及び１５パーセント、無増悪期間のメジアン値は、それぞれ、４．１ヶ月及び６．５ヶ月であった。同じ二群によるフェーズＩＩ臨床試験、及び別の単一群による試験では、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）単独による治療の結果は、奏効率が、それぞれ、１１及び９パーセント、無増悪期間のメジアン値が、それぞれ、１．５ヶ月及び４．２ヶ月であった。
【００１３】
結果として、スイス及び米国の両方では、イリノテカンと組み合わせたＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）による治療が、米国ではＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）単独による治療が、イリノテカンによる第一治療で効果のなかった結腸癌患者の第二治療として認可された。従って、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）のように、スイスでは、モノクローナル抗体と化学療法との組み合わせとしての治療のみが認可されている。しかも、スイス及び米国の両方において、第二治療の患者に対する治療のみが認可されている。さらに、２００４年には、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）が、５−フルオロウラシルの静脈内投与を主体とする化学療法と組み合わせた使用による転移性結腸直腸癌の第一治療として認可された。フェーズＩＩＩ臨床試験の結果より、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）プラス５−フルオロウラシルによって治療した患者の生存期間のメジアン値が、５−フルオロウラシルのみで治療した患者と比べて延長されることが示された（それぞれ、２０ヶ月対１６ヶ月）。しかし、ここでも、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）及びＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）のように、治療は、モノクローナル抗体及び化学療法との組み合わせとしてのみ認可されている。
【００１４】
肺癌、脳癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、及び胃癌に対しても、不十分な結果が続いている。非小細胞肺癌に対する最近の最も有望な結果は、細胞殺傷剤であるドキソルビシンと結合したモノクローナル抗体（ＳＧＮ−１５；ｄｏｘ−ＢＲ９６、抗Ｓｉａｌｙｌ−ＬｅＸ）を化学療法薬ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）と組み合わせて治療したフェーズＩＩの臨床試験から得られた。ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）は、肺癌の第二治療に対してＦＤＡが認可した唯一の化学療法薬である。初期のデータは、ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）単独と比較して、全生存期間が改善されていることを示している。この試験に参加した６２人の患者のうち３分の２がＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）と組み合わせてＳＧＮ−１５を受け、残りの３分の１がＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）のみを受けた。ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）と組み合わせてＳＧＮ−１５を受けた患者では、全生存期間のメジアン値が、ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）のみを受けた患者では５．９ヶ月であったのに対し、７．３ヶ月であった。１年及び１８ヶ月での全生存率は、ＳＧＮ−１５プラスＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）を受けた患者では、それぞれ、２９及び１８パーセントであったのに対し、ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）のみを受けた患者では、それぞれ、２４及び８パーセントであった。さらなる臨床試験が計画されている。
【００１５】
臨床前では、メラノーマに対するモノクローナル抗体の使用に関して、いくつかの限定された成功例がある。これらの抗体のほとんどは、臨床試験の段階に到達しておらず、現在までのところ、認可されものも、フェーズＩＩＩ臨床試験において良好な結果を示したものもほとんどない。
【００１６】
疾患を治療する新薬の発見は、疾患の発病に寄与する可能性のある３００００種類の公知の遺伝子の産物の中で、適切な標的の識別が欠けていることが妨げとなっている。腫瘍学の研究では、可能性のある薬物の標的は、単に腫瘍細胞中で過剰発現されているという事実によって選択される場合が多い。このようにして識別された標的は、次に、多くの化合物との相互作用についてスクリーニングされる。抗体療法としての可能性がある場合、このような候補化合物は、通常、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７，Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）によって定められた基本原理に従ったモノクローナル抗体の従来の作製方法から誘導される。脾臓細胞を抗原で免疫されたマウスから採取し（例：細胞全体、細胞分画、精製抗原）、不死化ハイブリドーマパートナーと融合させる。得られたハイブリドーマをスクリーニングし、最も活発に標的と結合する抗体の分泌によって選別を行う。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）及びリツキシマブを含む癌細胞に向けられる多くの治療用及び診断用抗体は、これらの方法を用いて作製され、その親和性に基づいて選別される。この方法の欠点は、二つある。一つ目は、組織特異的な発癌プロセスに関する知識が不足していること、及びその結果として、過剰発現による選別等、標的を識別するための方法が単純化され過ぎていることにより、治療用又は診断用抗体が結合する適切な標的の選択肢が限られていることである。二つ目は、最大の親和性で受容体に結合する薬物分子が、通常、シグナルを開始又は阻害する可能性が最も高いとする仮定が、常に正しいわけではない可能性があることである。
【００１７】
乳癌及び結腸癌治療におけるある程度の進展にもかかわらず、有効な抗体治療の識別及び開発は、単一の薬剤として、又は併用治療として、あらゆる種類の癌に対して不十分である。
【００１８】
先行特許
米国特許第５，７５０，１０２号は、患者の腫瘍由来の細胞を、患者由来の細胞又は組織からクローン化することができるＭＨＣ遺伝子でトランスフェクトするプロセスを開示している。このようなトランスフェクトされた細胞は、次に、患者への接種に用いられる。
【００１９】
米国特許第４，８６１，５８１号は、哺乳類の新生物細胞及び正常細胞の、細胞内成分に特異的だが細胞外成分には特異的ではないモノクローナル抗体を得る工程と、このモノクローナル抗体を標識する工程と、この標識抗体を、新生物細胞を殺傷する治療を受けた哺乳類の組織と接触させる工程と、標識抗体の変性新生物細胞の細胞内成分への結合を測定することによって治療の効果を判定する工程と、を含むプロセスを開示している。この特許権者は、ヒト細胞内抗原に向けられる抗体の作製の際、悪性細胞がそのような抗原源として都合が良いことを認識している。
【００２０】
米国特許第５，１７１，６６５号は、新規な抗体及びその作製方法を提供している。具体的には、この特許は、例えば結腸や肺の腫瘍等のヒト腫瘍に関連するタンパク質抗原とは強力に結合するが、正常細胞との結合はそれよりも遥かに低い度合いである性質を持つモノクローナル抗体の形成を開示している。
【００２１】
米国特許第５，４８４，５９６号は、ヒト癌患者から腫瘍組織を手術によって除去する工程と、その腫瘍組織を処理して腫瘍細胞を得る工程と、この腫瘍細胞に照射を施して、生存しているが非腫瘍形成性とする工程と、この細胞を用いて、この患者の原発性腫瘍の再発を阻害すると同時に転移も阻害することのできるワクチンを作製する工程と、を含む癌治療法を提供している。この特許は、腫瘍細胞の表面抗原に対する反応性を有するモノクローナル抗体の開発を開示している。カラム４の４５行以降に記載のように、この特許権者は、モノクローナル抗体の開発に自己由来の腫瘍細胞を利用しており、ヒト腫瘍形成における能動的で特異的な免疫治療であるとしている。
【００２２】
米国特許第５，６９３，７６３号は、ヒト癌腫に特有で、由来する上皮組織に依存しない糖タンパク質抗原を開示している。
【００２３】
米国特許第５，７８３，１８６号は、Ｈｅｒ２発現細胞のアポトーシスを引き起こす抗Ｈｅｒ２抗体、この抗体を産生するハイブリドーマ細胞系、この抗体を用いた癌の治療方法、及び該抗体を含む医薬組成物に関する。
【００２４】
米国特許第５，８４９，８７６号は、腫瘍組織及び非腫瘍組織から精製したムチン抗原に対するモノクローナル抗体の作製のための新規なハイブリドーマ細胞系について記載している。
【００２５】
米国特許第５，８６９，２６８号は、所望の抗原に特異的な抗体を産生するヒトリンパ球を作製する方法、モノクローナル抗体を作製する方法、並びにこの方法で作製されたモノクローナル抗体に関する。この特許は、特に、癌の診断及び治療に有用である抗ＨＤヒトモノクローナル抗体の作製に関する。
【００２６】
米国特許第５，８６９，０４５号は、ヒト癌腫細胞に対する反応性を有する抗体、抗体断片、抗体複合体、及び一本鎖免疫毒素に関する。これらの抗体が機能するメカニズムは二段階であり、これらの分子が、ヒト癌腫の表面に存在する細胞膜抗原に対して反応性を有すること、及び、さらに、これらの抗体が、結合に続いて癌腫細胞中へ内部移行する能力を有することであり、それによって抗体−薬物及び抗体−毒素複合体の形成にこれらが特に有用となる。これらの抗体は、その未修飾の形態でも、特定の濃度において細胞傷害性を現す。
【００２７】
米国特許第５，７８０，０３３号は、腫瘍の治療及び予防のための自己抗体の使用を開示している。しかし、この抗体は、老齢哺乳類由来の抗核自己抗体である。この場合、この自己抗体は、免疫系で見られる自然抗体の一種であるとしている。この自己抗体が「老齢哺乳類」由来であることから、実際に自己抗体が治療を受けている患者由来である必要性はない。さらに、この特許は、老齢哺乳類由来の自然及びモノクローナル抗核自己抗体、並びにモノクローナル抗核自己抗体を産生するハイブリドーマ細胞系も開示している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２８】
本出願は、癌性疾患修飾モノクローナル抗体をコードするハイブリドーマ細胞系を単離するために、米国特許第６，１８０，３５７号に開示される、患者に特異的な抗癌抗体を作製する方法を利用する。このような抗体は、特に一つの腫瘍に対して作製することができ、従って、癌治療のカスタマイズが可能となる。本出願の中で、細胞殺傷（細胞傷害）特性又は細胞増殖阻害（細胞分裂停止）特性を有する抗癌抗体は、以後、細胞傷害性であると称する。このような抗体は、癌のステージング及び診断の補助として、並びに腫瘍転移の治療に用いることができる。これらの抗体は、さらに、予防的治療という方法による癌の予防に用いることもできる。従来の創薬パラダイムに従って作製された抗体とは異なり、この方法で作製された抗体は、悪性組織の増殖及び／又は生存に不可欠であることが過去に示されていない分子及び経路を標的とすることができる。さらに、これらの抗体の結合親和性は、より強力な親和相互作用には適さない可能性のある細胞傷害事象の阻害に対する要求事項に適している。さらに、本発明のＣＤＭＡＢを、例えば放射性核種等の標準的な化学療法モダリティと結合させることも本発明の範囲内であり、それによって、該化学療法薬の使用が注目される。ＣＤＭＡＢは、毒素、細胞傷害性部分、例えばビオチン結合酵素等の酵素、又は造血系細胞とも結合することができ、それによって、抗体複合体を形成する。
【００２９】
個別に設定される抗癌治療の可能性は、患者を管理する方法に変化をもたらすであろう。考え得る臨床シナリオとしては、受診時に腫瘍サンプルを採取し、保存するというものである。このサンプルに基づき、既存の癌性疾患修飾抗体のパネルから腫瘍の種類を決定することができる。患者のステージングは従来の方法で行なわれるが、入手可能な抗体は、患者のさらなるステージングに有用であり得る。患者は、現存の抗体で直ちに治療することができ、そして、ここで概説する方法を用いて、又はここで開示するスクリーニング法と組み合わせたファージディスプレイライブラリの使用を通して、その腫瘍に特異的な抗体のパネルを作製することができる。他の腫瘍が、治療中のものと同一のエピトープのいくつかを持つ可能性があることから、作製された抗体はすべて抗癌抗体のライブラリに加えられる。この方法に従って作製された抗体は、これらの抗体と結合する癌を有する患者であれば何人でも、その癌性疾患の治療に有用であり得る。
【００３０】
抗癌抗体に加えて、患者は、集学的治療のレジメンの一環として、現在推奨されている治療を受けることを選ぶことができる。本方法によって単離された抗体が非癌性細胞に対して比較的無毒性であるという事実により、単独であっても、又は従来の治療方法と組み合わせても、抗体の組み合わせを高い用量で用いることが可能である。高い治療指数により、治療耐性を持つ細胞の出現の可能性を低下させるはずである短いタイムスケールでの再治療も可能である。
【００３１】
患者が最初の治療の進行に対して耐性を示した場合、又は転移が発生した場合は、再治療のために、その腫瘍に対して特異的である抗体を作製するプロセスを再度行うことができる。さらに、抗癌抗体は、その患者から採取した赤血球と結合させ、これを再注入して転移治療を行うことができる。転移癌を効果的に治療する方法はほとんどなく、通常、転移は死亡をもたらす良くない結果の予兆である。しかし、転移癌は、通常、よく血管新生し、赤血球による抗癌抗体の送達は、腫瘍部位に抗体を集中させる効果を有することができる。転移の前であっても、ほんとんどの癌細胞の生存はホストの血液供給に依存しており、赤血球と結合した抗癌抗体は、ｉｎ  ｓｉｔｕの腫瘍に対しても効果的であり得る。別の選択肢として、この抗体は、例えば、リンパ球、マクロファージ、単球、ナチュラルキラー細胞等、その他の造血系細胞と結合することができる。
【００３２】
抗体には５つの種類があり、それぞれが、その重鎖によって付与される機能と関連している。一般的に、未修飾の（ｎａｋｅｄ）抗体による癌細胞の殺傷は、抗体依存性細胞傷害性、又は補体依存性細胞傷害性によって媒介されると考えられる。例えば、マウスＩｇＭ及びＩｇＧ２ａ抗体は、補体系のＣ−１成分と結合することによってヒト補体を活性化することができ、それによって、腫瘍の溶解を誘導することができる補体活性化の古典的経路が活性化される。ヒト抗体において最も効果的な補体活性化抗体は、一般に、ＩｇＭ及びＩｇＧ１である。ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ３アイソタイプのマウス抗体は、単球、マクロファージ、顆粒球、及び特定のリンパ球による細胞殺傷を誘発するＦｃ受容体を持つ細胞傷害性細胞の動員に効果的である。ＩｇＧ１及びＩｇＧ３の両アイソタイプのヒト抗体は、ＡＤＣＣを媒介する。
【００３３】
抗体の媒介による癌殺傷の別の考えられるメカニズムとしては、細胞膜内、及びそれに付随する糖タンパク質又は糖脂質の種々の化学結合の加水分解を触媒する機能を持つ、いわゆる触媒抗体と呼ばれる抗体の使用によるものであり得る。
【００３４】
抗体の媒介による癌細胞殺傷のメカニズムは、さらに３種類存在する。一つ目は、癌細胞上に位置する推定抗原に対する免疫反応を体に発生させるワクチンとしての抗体の使用である。二つ目は、抗体を用いて、増殖受容体（growth receptor)を標的とし、その機能を阻害するか、又は受容体を下方制御してその機能を実質的に失わせるものである。三つ目は、直接細胞死を誘発することのできる細胞表面部分への直接の連結に対するこのような抗体の効果であり、例えば、ＴＲＡＩＬ  Ｒ１又はＴＲＡＩＬ  Ｒ２等のデスレセプター、又はアルファＶベータ３等のインテグリン分子の連結等である。
【００３５】
癌薬物の臨床的な有用性は、患者に対する許容可能なリスクプロフィール下でのその薬物の恩恵に基づいている。癌治療では、一般に、生存が最も求められる恩恵であるが、生存期間を延ばすことに加えて、他にも十分に認識されている数多くの恩恵がある。これらのその他の恩恵としては、治療が生存に対して逆効果でない場合、症状の緩和、有害事象に対する保護、再発までの期間の延長又は無病生存、及び無増悪期間の延長が挙げられる。これらの基準は一般的に受け入れられており、米国食品薬品局（Ｆ．Ｄ．Ａ）等の監督機関は、これらの恩恵をもたらす薬物を認可している（Ｈｉｒｓｃｈｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ／Ｈｅｍａｔｏｌｇｙ  ４２：１３７−１４３  ２００２）。これらの基準に加えて、これらの種類の恩恵を予測することのできるその他の指標の存在も十分に認識されている。一つには、Ｕ．Ｓ．Ｆ．Ｄ．Ａ．によって認められた迅速化された認可プロセスにより、患者の受ける恩恵を予測する可能性の高い代用項目の存在が確認される。２００３年の年末の時点で、このプロセスの下で認可された薬物は１６種類あり、これらの中で、４種類が完全認可へと進み、すなわち、フォローアップ研究により、代用指標によって予測されたような直接の患者への恩恵が実証された。固形腫瘍における薬物の効果を決定する一つの重要な指標は、治療への反応を測定することによる全身腫瘍組織量の評価である（Ｔｈｅｒａｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ９２（３）：２０５−２１６  ２０００）。このような評価に対する臨床基準（ＲＥＣＩＳＴ基準）は、癌に関する国際的専門家のグループであるＲｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｔｕｍｏｒｓ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐによって普及されたものである。適切なコントロールグループとの比較において、ＲＥＣＩＳＴ基準に従う奏効率によって示される全身腫瘍組織量に対する効果が実証された薬物は、最終的には、患者に対して直接の恩恵をもたらす傾向にある。前臨床設定では、全身腫瘍組織量は、一般に、評価や記録をより行いやすい。前臨床試験を臨床設定へ解釈することができるという点で、前臨床モデルで生存の延長をもたらす薬物は、臨床段階での有用性が最も高いと予測される。臨床治療に対して陽性の反応をもたらすことと類似して、前臨床設定で全身腫瘍組織量を低下させる薬物も、この疾患に対して著しい直接の影響を与える。生存期間の延長が、癌の薬物治療から最も求められている臨床結果であるが、臨床的な有用性を持つその他の恩恵もあり、病勢進行の遅延、生存期間の延長、又はその両方と相関し得る全身腫瘍組織量の低下も、直接の恩恵をもたらし、臨床的な影響を与えることができることは明らかである（Ｅｃｋｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：Ｓｕｃｃｅｓｓｅｓ  ａｎｄ  Ｆａｉｌｕｒｅｓ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌ  Ｄｅｓｉｇｎｓ  ｏｆ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ；ＡＳＣＯ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏｏｋ，３９th  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，２���０３，ｐａｇｅｓ  ２０９−２１９）。
【００３６】
本発明は、細胞傷害性アッセイ及びヒト癌の動物モデルにてその効果が確認されたＡＲ２７Ａ８０７．１４．１の開発と使用について述べる。本発明は、標的分子上に存在する１若しくは複数個のエピトープと特異的に結合し、未修飾の抗体として、悪性腫瘍に対してインビトロでの細胞傷害性も持つが正常細胞に対しては持たず、未修飾の抗体として、腫瘍増殖の阻害を直接媒介もする試薬について述べる。さらなる進歩事項は、同族抗原マーカーを発現する腫瘍を標的としてこのような抗癌抗体を使用し、腫瘍増殖の阻害、及び癌治療のその他の陽性指標（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｅｎｄｐｏｉｎｔ）を達成することに関する。
【００３７】
まとめると、本発明は、治療薬の標的としてのＡＲ２７Ａ８０７．１４．１抗原の使用を開示し、この治療薬は、投与されると、哺乳類中でこの抗原を発現する癌の全身腫瘍組織量を低下させることができる。本発明は、これらの抗原を標的として哺乳類中でこの抗原を発現する癌の全身腫瘍組織量を低下させるための、ＣＤＭＡＢ（ＡＲ２７Ａ８０７．１４．１）及びその誘導体、並びにその抗原結合断片、並びに細胞傷害性を誘発するそのリガンドの使用も開示する。さらに、本発明は、この抗原を発現する腫瘍を持つ哺乳類の診断、治療の予測、及び予後に有用であり得る、癌性細胞内でのＡＲ２７Ａ８０７．１４．１抗原検出の使用についても開示する。
【００３８】
従って、本発明の目的は、特定の個体由来の癌性細胞、又は１若しくは２種類以上の特定の癌細胞系に対して産生された癌性疾患修飾抗体（ＣＤＭＡＢ）を作製する方法であって、このＣＤＭＡＢが、癌細胞に関しては細胞傷害性であるが、同時に非癌性細胞に対しては比較的無毒性である、方法を、ハイブリドーマ細胞系、及び該ハイブリドーマ細胞系がコードされる対応する単離されたモノクローナル抗体及びその抗原結合断片を単離するために用いることである。
【００３９】
本発明のさらなる目的は、癌性疾患修飾抗体、リガンド、及びその抗原結合断片を開示することである。
【００４０】
本発明のさらなる目的は、その細胞傷害性が抗体依存性細胞傷害性によって媒介される癌性疾患修飾抗体を作製することである。
【００４１】
本発明のさらなる目的は、その細胞傷害性が補体依存性細胞傷害性によって媒介される癌性疾患修飾抗体を作製することである。
【００４２】
本発明のさらなる目的は、その細胞傷害性が、細胞の化学結合の加水分解を触媒するその能力の結果である癌性疾患修飾抗体を作製することである。
【００４３】
本発明のさらなる目的は、癌の診断、予後、及びモニタリングのための結合アッセイに有用である癌性疾患修飾抗体を作製することである。
【００４４】
本発明のその他の目的及び利点は、説明及び例示の方法で本発明の特定の態様を明記する以下の説明から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】細胞系ＨＴ−２９、ＳＷ１１１６、Ｌｏｖｏ、及びＣＣＤ−２７ｓｋに対するハイブリドーマ上清の細胞傷害性のパーセント及び結合性レベルの比較を示す図である。
【図２】ＡＲ２７Ａ８０７．１４．１の癌細胞系及び正常細胞系への結合を表す図である。表のデータは、アイソタイプのコントロールに対して何倍の増加であるかを示す。
【図３】予防的ＤＬＤ−１結腸癌モデルにおける、ＡＲ２７Ａ８０７．１４．１の腫瘍増殖に対する影響を示す図である。縦の点線は、抗体が投与された期間を示す。データポイントは、平均の標準誤差を示す。
【図４】予防的ＤＬＤ−１結腸癌モデルにおける、ＡＲ２７Ａ８０７．１４．１の体重に対する影響を示す図である。データポイントは、平均の標準誤差を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
一般に、以下の語又は表現は、要約、説明、例、及び請求項に用いられた場合、示された定義を有する。
【００４７】
「抗体」という用語は、最も広い意味で用いられ、特に含まれるのは、例えば、単独のモノクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニスト、及び中和抗体、非免疫化、マウス、キメラ化、又はヒト化抗体を含む）、多エピトープ特異性（ｐｏｌｙｅｐｉｔｏｐｉｃ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）を有する抗体組成物、一本鎖抗体、免疫複合体、及び抗体断片である（以下を参照のこと）。
【００４８】
本明細書で用いる「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団、すなわち、その集団を形成する個々の抗体が、少量存在し得る天然の変異の可能性を除いて同一である集団から得られた抗体を意味する。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一の抗原部位に対して向けられる。さらに、異なる決定因子（エピトープ）に対して向けられる異なる抗体を含むポリクローナル抗体の製剤とは対照的に、モノクローナル抗体は、各々、抗原上の単一の決定因子に対して向けられる。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体による汚染なしに合成することができるという利点を持つ。「モノクローナル」という修飾語は、抗体の実質的に均一な集団から得られたという抗体の特性を示すものであって、抗体の作製に何らかの特定の方法を必要とするように解釈してはならない。例えば、本発明に従って用いられるモノクローナル抗体は、最初にＫｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）に記載されたハイブリドーマ（マウス又はヒト）法、又は組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）によって作製することができる。「モノクローナル抗体」は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載の方法を用いて、ファージ抗体ライブラリから単離することもできる。
【００４９】
「抗体断片」は、完全な抗体の一部を含み、好ましくは、その抗原結合領域又は可変領域を含む。抗体断片の例としては、完全長未満の抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、及びＦｖ断片；二重特異性抗体；直鎖状抗体；一本鎖抗体分子；一本鎖抗体、単一ドメイン抗体分子、融合タンパク質、組換えタンパク質、及び抗体断片から形成された多特異性抗体が挙げられる。
【００５０】
「完全な（ｉｎｔａｃｔ）」抗体とは、抗原結合可変領域、並びに軽鎖定常ドメイン（ＣL）、及び重鎖定常ドメインであるＣH１、ＣH２、及びＣH３を含む抗体である。この定常ドメインは、天然配列定常ドメイン（例：ヒト天然配列定常ドメイン）であっても、又はそのアミノ酸配列変異体であってもよい。好ましくは、完全な抗体は、１若しくは２個以上のエフェクター機能を有している。
【００５１】
これらの重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、完全な抗体には異なる「クラス」を割り当てることができる。完全な抗体には、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭの５種類の大きなクラスがあり、この中の何種類かは、例えば、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、及びＩｇＡ２等の「サブクラス」（アイソタイプ）にさらに分類することができる。異なるクラスの抗体に対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。クラスの異なる免疫グロブリンのサブユニット構造及び三次元配置は公知である。
【００５２】
抗体の「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域（天然配列のＦｃ領域、又はアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域）に起因する生物学的活性のことである。抗体のエフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合性；補体依存性細胞傷害性；Ｆｃ受容体結合性；抗体依存性細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例：Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方制御、等が挙げられる。
【００５３】
「抗体依存性細胞媒介細胞傷害性」及び「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）（例：ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、マクロファージ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞が、標的細胞上に結合した抗体を認識し、続いて、その標的細胞の溶解を発生させる、細胞が媒介する反応を意味する。ＡＤＣＣを媒介する一次細胞、ＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現し、一方、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上でのＦｃＲの発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２（１９９１）の４６４ページ、表３にまとめられている。対象である分子のＡＤＣＣ活性を評価するには、米国特許第５，５００，３６２号又は第５，８２１，３３７号に記載のもの等のインビトロＡＤＣＣアッセイを実施することができる。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。別の選択肢として、又は追加的に、対象である分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：６５２−６５６（１９９８）に開示のもの等の動物モデルにより、インビボにて評価することができる。
【００５４】
「エフェクター細胞」は、１若しくは２種類以上のＦｃＲを発現し、エフェクター機能を見せる白血球である。好ましくは、この細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を見せる。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例としては、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞、及び好中球が挙げられ；ＰＢＭＣ及びＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞は、例えば、本明細書で述べるように、血液又はＰＢＭＣ等、その天然源から単離することができる。
【００５５】
「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」という用語は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を表すために用いられる。好ましいＦｃＲは、天然配列ヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）と結合するものであり、対立遺伝子変異体を含むＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体、及び別の選択肢として、これらの受容体のスプライスされた形態が含まれる。ＦｃγＲＩＩ受容体は、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）を含み、これらは、主にその細胞質ドメインが異なる類似のアミノ酸配列を有している。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。阻害受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシン阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む（Ｍ．ｉｎ  Ｄａｅｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３−２３４（１９９７）のレビュー参照）。ＦｃＲについては、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２５−３４（１９９４）；及びｄｅ  Ｈａａｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０−４１（１９９５）でレビューされている。今後識別されるはずのものも含むその他のＦｃＲは、本明細書では「ＦｃＲ」という用語に包含される。この用語は、さらに、新生児性受容体ＦｃＲｎも含み、これは、母体ＩｇＧの胎児への移送を担っている（Ｇｕｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）、及びＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４２９（１９９４））。
【００５６】
「補体依存性細胞傷害性」又は「ＣＤＣ」とは、補体の存在下で標的を溶解する分子の能力を意味する。補体活性化経路は、同族抗原と複合体形成した分子（例：抗体）への補体系の第一成分（Ｃ１ｑ）の結合によって開始される。補体活性化の評価には、例えばＧａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３（１９９６）に記載のような、ＣＤＣアッセイを行うことができる。
【００５７】
「可変」という用語は、可変ドメインの特定の部分の配列が、抗体同士で大きく異なっており、各々の特定の抗体のその特定の抗原に対する結合性及び特異性に用いられるということを意味する。しかし、可変性は、抗体の可変ドメイン全体にわたって均一に分布しているわけではない。軽鎖及び重鎖の可変ドメイン両方にある高頻度可変領域と呼ばれる３個のセグメントに集中している。可変領域内のより保存度の高い部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、各々、４個のＦＲを含み、主にβシート配置を取って３個の高頻度可変領域で連結されており、これらは、βシート構造を連結するループ結合を形成し、場合によっては、βシート構造の一部を成している。各鎖の高頻度可変領域は、ＦＲによって互いに非常に近傍に保持されており、他の鎖からの高頻度可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．ｐｐ  １５−１７；４８−５３（１９９１）参照）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与していないが、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）における抗体の関与等、種々のエフェクター機能を示す。
【００５８】
「高頻度可変領域」という用語は、本明細書において用いる場合、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を意味する。高頻度可変領域は、一般に、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（例：軽鎖可変ドメインの残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）、及び８９−９７（Ｌ３）、並びに重鎖可変ドメインの残基３１−３５（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）、及び９５−１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．ｐｐ  １５−１７；４８−５３（１９９１））、及び／又は「高頻度可変ループ（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｏｏｐ）」からの残基（例：軽鎖可変ドメインの残基２６３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、及び９１−９６（Ｌ３）、並びに重鎖可変ドメインの残基２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）、及び９６−１０１（Ｈ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））を含む。「フレームワーク領域」又は「ＦＲ」の残基は、本明細書で定める高頻度可変領域以外の可変ドメインの残基である。抗体のパパイン消化により、各々が単一の抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２個の同一の抗原結合断片、及びその容易に結晶化する能力を反映した名称である、残りの「Ｆｃ」断片が産生される。ペプシン処理により、２個の抗原結合部位を持つＦ（ａｂ’）2断片が得られ、これは、抗原を架橋する能力を依然として有している。
【００５９】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小の抗体断片である。この領域は、１個の重鎖可変ドメインと１個の軽鎖可変ドメインとの、強い非共有結合性の会合による二量体から成る。各可変ドメインの３個の高頻度可変領域が相互作用してＶH−ＶL二量体の表面の抗原結合部位を決定するのはこの配置においてである。合計で６個の高頻度可変領域が、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン（又は、抗原に特異的な３個の高頻度可変領域のみを含むＦｖの半分）であっても、結合部位全体よりは親和性が低いものの、抗原を認識し、これと結合する能力を有する。Ｆａｂ断片も、軽鎖の定常ドメインン、及び重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’断片は、抗体のヒンジ領域からの１若しくは２個以上のシステインを含む、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端での数個の残基の付加により、Ｆａｂ断片と異なっている。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書において、定常ドメインのシステイン残基が少なくとも１個の遊離のチオール基を持つＦａｂ’の名称である。Ｆ（ａｂ’）2抗体断片は、元々は、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として作製されたものである。抗体断片のその他の化学結合も公知である。
【００６０】
いずれの脊椎動物種からの抗体の「軽鎖」も、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて明らかに区別されるカッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２種類の一方に割り当てることができる。
【００６１】
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶH及びＶLドメインを含み、ここで、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖内に存在する。好ましくは、Ｆｖポリペプチドは、さらに、ＶH及びＶLドメイン間にポリペプチドリンカーを含み、これにより、ｓｃＦｖが、抗原結合のために所望の構造を形成することができる。ｓｃＦｖに関するレビューは、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）、を参照のこと。
【００６２】
「二重特異性抗体」という用語は、２個の抗原結合部位を有する低分子量抗体断片を意味し、この断片は、同一のペプチド鎖内に軽鎖可変ドメイン（ＶL）と連結した重鎖可変ドメイン（ＶH）を含む（ＶH−ＶL）。この２個のドメインが同一鎖上で対形成するには小さすぎるリンカーを用いることにより、ドメインは、強制的に別の鎖の相補ドメインと対形成させられ、２個の抗原結合部位が作られる。二重特異性抗体は、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；及び、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）に、より詳細に記載されている。
【００６３】
「単離された」抗体とは、その自然環境の成分から識別され、並びに分離及び／又は回収されたものである。その自然環境の不純物成分は、抗体の診断又は治療での使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及びその他のタンパク質性又は非タンパク質性の溶質を挙げることができる。単離された抗体は、抗体の自然環境の成分の少なくとも１種類が存在しないため、組換え細胞内のｉｎ  ｓｉｔｕの抗体を含む。しかし、通常は、単離された抗体は、少なくとも１回の精製工程によって作製される。
【００６４】
対象である抗原と「結合する」抗体とは、その抗原と十分な親和性をもって結合することができ、それによって、その抗原を発現する細胞を標的とする治療薬又は診断薬としてその抗体が有用となる抗体のことである。抗体が抗原性部分と結合するものである場合、抗体は、通常、他の受容体とは対照的に、その抗原性部分と優先的に結合し、非特異的なＦｃの接触等の偶発的な結合、又は他の抗原と共通の翻訳後修飾部分との結合は含まず、他のタンパク質と著しく交差反応を起こすことのないものであろう。対象である抗原と結合する抗体の検出方法は、本技術分野で公知であり、これらに限定されないが、ＦＡＣＳ、細胞ＥＬＩＳＡ、及びウェスタンブロッティング等のアッセイを挙げることができる。
【００６５】
本明細書で用いる「細胞」、「細胞系」、及び「細胞培養物」という表現は、交換可能に用いられ、そのような名称はすべて後代を含む。さらに、すべての後代は、計画的な又は偶然の変異のために、含まれるＤＮＡが正確に同一でない場合があることも理解される。元の形質転換された細胞内でスクリーニングされたものと同一の機能又は生物学的活性を有する変異後代を含む。別々の名称が意図したものである場合は文脈より明らかであろう。
【００６６】
「治療、又は治療する」は、治療処置、及び予防又は防止策の両方を意味し、ここで、その目的は、標的である病理状態若しくは障害の予防、又はその進行の遅延（軽減）である。治療を必要とするものとしては、既にその障害を有するもの、並びにその障害に罹る傾向にあるもの、又はその障害を予防すべきものが挙げられる。従って、本明細書において治療されるべき哺乳類は、その障害を有すると診断されたものであってよく、又はその障害に罹りやすい、若しくは影響を受けやすいものであってもよい。
【００６７】
「癌」及び「癌性」という用語は、通常、制御されない細胞の増殖又は死を特徴とする哺乳類の生理学的状態を意味するか、又はそれを表す。癌の例としては、これらに限定されないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病又はリンパ系腫瘍が挙げられる。そのような癌のより詳細な例としては、扁平細胞癌 (例：扁平上皮癌)、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、及び肺扁平上皮癌腫を含む肺癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌を含む胃又は腹部の癌、膵癌、神経膠芽腫、子宮頚癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、直腸癌、直腸結腸癌、子宮内膜癌腫又は子宮癌腫、唾液腺癌腫、腎臓癌又は腎癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌腫、肛門癌腫、陰茎癌腫、並びに頭頚部癌が挙げられる。
【００６８】
「化学療法薬」とは、癌の治療に有用である化学化合物のことである。化学療法薬の例としては、チオテバ、及びシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標））等のアルキル化薬；ブスルファン、インプロスルファン、及びピポスルファン等のアルキルスルホネート；ベンゾドパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、及びウレドパ（ｕｒｅｄｏｐａ）等のアジリジン；アルトレタミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド、及びトリメチルロロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含むエチレンイミン並びにメチルアメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）；クロランブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベンビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード等のナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン等のニトロソ尿素；アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリチアマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルノマイシン（ｃａｒｎｏｍｙｃｉｎ）、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン、マルセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、プロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン等の抗生物質；メトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）等の代謝拮抗薬；デノプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、メトトレキサート、プテロプテリン（ｐｔｅｒｏｐｔｅｒｉｎ）、トリメトレキサート等の葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン（ｔｈｉａｍｉｐｒｉｎｅ）、チオグアニン等のプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５−ＦＵ等のピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン等のアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトーテン、トリロスタン等の抗副腎薬（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌ）；フロリニック酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）等の葉酸補充薬（ｆｏｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒ）；アセグラトン；アルドホスファミドグリコ���ド（ａｌｄｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビサントレン；エダトラキサート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デホファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン；ジアジコン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；エルホルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン：シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキサン、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ニュージャージー州）及びドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ａｖｅｎｔｉｓ，Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，フランス）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン及びカルボプラチン等の白金類似体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン；カペシタビン；並びに、上記のいずれかの薬理学的に許容される塩、酸、又は誘導体が挙げられる。この定義にさらに含まれるのは、腫瘍へのホルモンの作用を制御又は阻害する働きを持つ抗ホルモン薬であり、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼを阻害する４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン（ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ），ＬＹ１１７０１８、オナプリストン（ｏｎａｐｒｉｓｔｏｎｅ）、及びトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）を含む抗エストロゲン薬；フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン等の抗アンドロゲン薬；並びに、上記のいずれかの薬理学的に許容される塩、酸、又は誘導体等である。
【００６９】
治療の目的のための「哺乳類」とは、哺乳類として分類されるいかなる動物をも意味し、ヒト、マウス、ＳＣＩＤマウス又はヌードマウス又はマウス系統、家畜用又は農業用動物、及びヒツジ、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ等の動物園用、スポーツ用、又はペット用動物が挙げられる。好ましくは、本明細書における哺乳類はヒトである。
【００７０】
「オリゴヌクレオチド」とは、公知の方法（１９８８年５月４日公開のＥＰ２６６，０３２に記載のもの等の固相法を用いた、リン酸トリエステル、ホスファイト、若しくはホスホラミダイトの化学反応、又はＦｒｏｅｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１４：５３９９−５４０７，１９８６に記載のデオキシヌクレオシドＨ−ホスホネート中間体によるもの等）によって化学的に合成された、短鎖の一本鎖又は二本鎖ポリデオキシヌクレオチドのことである。これらは、次に、ポリアクリルアミドゲル上で精製される。
【００７１】
本発明によれば、非ヒト（例：マウス）免疫グロブリンの「ヒト化した」及び/又は「キメラの」形態とは、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）、ヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）、又はヒト抗ヒト抗体（ＨＡＨＡ）反応が、元の抗体と比較して減少する結果となる特定のキメラの免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、又はその断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、又は抗体のその他の抗原結合配列等）を含み、該非ヒト免疫グロブリン由来で、所望の効果を再現し、同時に、該非ヒト免疫グロブリンと同等の結合特性を保持するのに必要である必須部分（ＣＤＲ、抗原結合領域、可変ドメイン、等）を含む抗体を意味する。ほとんどの部分で、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、ここで、レシピエント抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を持つマウス、ラット、又はラビット等の非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基で置換されている。ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）の残基が、対応する非ヒトＦＲ残基で置換されている場合もある。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも移入されたＣＤＲ又はＦＲ配列にも見られない残基を含んでいてもよい。このような修飾は、抗体の性能をさらに改良し最適化するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１個、通常は２個の可変ドメインの実質的に全てを含み、ここで、全て若しくは実質的に全てのＣＤＲ領域は、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、全て若しくは実質的に全てのＦＲ残基は、ヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列のＦＲ残基である。ヒト化抗体は、最適には、少なくとも免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の一部も含み、通常は、ヒト免疫グロブリンのものを含む。
【００７２】
「非免疫化された」抗体とは、所定の種に対して非免疫原性であるか、又は免疫原性が低い免疫グロブリンである。非免疫化は、抗体の構造を変化させることによって達成することができる。当業者に公知のいずれの非免疫化技術も用いることができる。抗体を非免疫化するのに適する一つの技術は、例えば、２０００年６月１５日公開のＷＯ００／３４３１７に記載されている。
【００７３】
「アポトーシス」を誘発する抗体とは、これらに限定されないが、アネキシンＶの結合、カスパーゼ活性、ＤＮＡの断片化、細胞収縮、小胞体の拡張、細胞の断片化、及び／又は膜小胞の形成（アポトーシス体と称される）等によって例示されるいずれかの手段によってプログラム細胞死を誘発する抗体のことである。
【００７４】
本明細書で用いる「抗体の誘発による細胞傷害性」は、ＩＤＡＣに１８０７０６−０３の受託番号で寄託されているハイブリドーマによって産生されたハイブリドーマ上清又は抗体から誘導される細胞傷害性効果を意味するものと理解され、この効果は、必ずしも結合度と関連するわけではない。
【００７５】
本明細書全体を通して、ハイブリドーマ細胞系、並びにそれから産生された単離されたモノクローナル抗体は、別の選択肢として、その内部名称であるＡＲ２７Ａ８０７．１４．１．、又は受託名称であるＩＤＡＣ１８０７０６−０３と称される。
【００７６】
本明細書で用いる「抗体リガンド」は、標的抗原の少なくとも１個のエピトープに対して結合特異性を示す部分を含み、完全な抗体分子でも、抗体断片でも、少なくとも抗原結合領域若しくはその一部（すなわち、抗体分子の可変部分）を持ついかなる分子でもよく、例えば、Ｆｖ分子、Ｆａｂ分子、Ｆａｂ’分子、Ｆ（ａｂ’）2分子、二重特異性抗体、融合タンパク質、若しくはＩＤＡＣ１８０７０６−０３と称するハイブリドーマ細胞系によって産生され、単離されたモノクローナル抗体が結合した抗原（ＩＤＡＣ１８０７０６−０３抗原）の少なくとも１個のエピトープを特異的に認識し、これと結合する遺伝子改変されたいずれかの分子である。
【００７７】
本明細書で用いる「癌性疾患修飾抗体」（ＣＤＭＡＢ）は、例えば、全身腫瘍組織量の減少又は腫瘍を持つ個体の生存期間の延長等、患者にとって有益である方法で癌性疾患プロセスを修飾するモノクローナル抗体、及びその抗体リガンドを意味する。
【００７８】
本明細書で用いる「抗原結合領域」とは、標的抗原を認識する分子の部分を意味する。
【００７９】
本明細書で用いる「競合的に阻害する」とは、従来の相互的抗体競合アッセイ（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）（Ｂｅｌａｎｇｅｒ  Ｌ．，Ｓｙｌｖｅｓｔｒｅ  Ｃ．ａｎｄ  Ｄｕｆｏｕｒ  Ｄ．（１９７３），Ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ａｌｐｈａ  ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｙ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｓａｎｄｗｉｃｈ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ．Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ４８，１５）を用いて、ＩＤＡＣ１８０７０６−０３と称するハイブリドーマ細胞系によって産生されたモノクローナル抗体（ＩＤＡＣ１８０７０６−０３抗体）が向けられた決定部位を認識し、これと結合することができること意味する。
【００８０】
本明細書で用いる「標的抗原」とは、ＩＤＡＣ１８０７０６−０３抗原、又はその一部分である。
【００８１】
本明細書で用いる「免疫複合体」とは、細胞毒素、放射性剤、酵素、毒素、抗腫瘍薬物、若しくは治療薬と化学的又は生物学的に結合した、抗体等のいずれかの分子又はＣＤＭＡＢを意味する。抗体又はＣＤＭＡＢは、その標的と結合することができる限りにおいて、細胞毒素、放射性剤、抗腫瘍薬物、若しくは治療薬と、分子上のどの部位で結合してもよい。免疫複合体の例としては、抗体−毒素化学複合体、及び抗体−毒素融合タンパク質が挙げられる。
【００８２】
本明細書で用いる「融合タンパク質」とは、抗原結合領域が、例えば、毒素、酵素、又はタンパク質薬物等の生物学的活性分子と結合しているいずれのキメラタンパク質をも意味する。
【００８３】
本明細書で述べる本発明をより十分に理解することができるように、以下の説明を記載する。
【００８４】
本発明は、ＩＤＡＣ１８０７０６−０３抗原を特異的に認識し、これと結合するＣＤＭＡＢ（すなわち、ＩＤＡＣ１８０７０６−０３ＣＤＭＡＢ）を提供する。
【００８５】
ＩＤＡＣに１８０７０６−０３の受託番号で寄託されているハイブリドーマによって産生され、単離されたモノクローナル抗体のＣＤＭＡＢは、ハイブリドーマＩＤＡＣ１８０７０６−０３によって産生され、単離されたそのモノクローナル抗体の標的抗原への免疫特異的な結合を競合的に阻害する抗原結合領域を有する限りにおいて、いかなる形態であってもよい。従って、ＩＤＡＣ１８０７０６−０３抗体と同じ結合特異性を持つ組換えタンパク質（例：抗体が、リンホカイン、又は腫瘍阻害増殖因子（ｔｕｍｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）等の第二のタンパク質と結合している融合タンパク質）はいずれも本発明の範囲内に含まれる。
【００８６】
本発明の一つの態様では、ＣＤＭＡＢは、ＩＤＡＣ１８０７０６−０３抗体である。
【００８７】
別の態様では、ＣＤＭＡＢは、Ｆｖ分子（一本鎖Ｆｖ分子等）、Ｆａｂ分子、Ｆａｂ’分子、Ｆ（ａｂ’）2分子、融合タンパク質、二重特異性抗体、異種抗体、又はＩＤＡＣ１８０７０６−０３抗体の抗原結合領域を有するいかなる組換え分子であってもよい抗原結合断片である。本発明のＣＤＭＡＢは、ＩＤＡＣ１８０７０６−０３モノクローナル抗体が向けられるエピトープへ向けられる。
【００８８】
本発明のＣＤＭＡＢは、修飾、すなわち、分子内のアミノ酸修飾を受けることで誘導体分子を形成してもよい。化学修飾が可能な場合もある。
【００８９】
誘導体分子であっても、ポリペプチドの機能的特性は保持され、すなわち、そのような置換を有する分子でも、依然として、そのポリペプチドとＩＤＡＣ１８０７０６−０３抗原又はその一部分との結合が可能である。
【００９０】
このようなアミノ酸置換は、必ずしもこれに限定されるとは限らないが、本技術分野において「保存的」として知られるアミノ酸置換が挙げられる。
【００９１】
例えば、「保存的アミノ酸置換」と称される特定のアミノ酸置換は、タンパク質のコンフォメーションも機能も変化させることなくタンパク質に頻繁に実施することができるということは、十分に確立されたタンパク質化学の原理である。
【００９２】
そのような変化としては、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、及びロイシン（Ｌ）のいずれかによる、これらの中の他の疎水性アミノ酸のいずれかの置換；アスパラギン酸（Ｄ）によるグルタミン酸（Ｅ）の置換、及びその逆；グルタミン（Ｑ）によるアスパラギン（Ｎ）の置換、及びその逆；並びに、セリン（Ｓ）によるスレオニン（Ｔ）の置換、及びその逆、が挙げられる。その他の置換も、タンパク質の三次元構造における特定のアミノ酸の環境及びその役割に応じて、保存的と見なされる場合がある。例えば、グリシン（Ｇ）及びアラニン（Ａ）は交換可能である場合が多く、アラニンとバリン（Ｖ）も同様である。比較的疎水性であるメチオニン（Ｍ）は、ロイシン及びイソロイシンと、時にはバリンとも交換可能である場合が多い。リジン（Ｋ）及びアルギニン（Ｒ）は、このアミノ酸残基の重要な特徴がその電荷であり、これらの２種類のアミノ酸残基のｐＫの違いが大きくない位置において、交換可能である場合が多い。特定の環境において、さらに他の変化も「保存的」と見なされる場合がある。
【実施例】
【００９３】
実施例１
ハイブリドーマ作製−ハイブリドーマ細胞系ＡＲ２７Ａ８０７．１４．１
ハイブリドーマ細胞系ＡＲ２７Ａ８０７．１４．１は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｎａｄａ（ＩＤＡＣ），Ｂｕｒｅａｕ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｎａｄａ，１０１５  Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｓｔｒｅｅｔ，Ｗｉｎｎｉｐｅｇ，Ｍａｎｉｔｏｂａ，Ｃａｎａｄａ，Ｒ３Ｅ  ３Ｒ２、にブタペスト条約に基づき、２００６年７月１８日に受託番号１８０７０６−０３で寄託された。３７ＣＦＲ１．８０８に従い、寄託者は、寄託された物資の一般による利用の可能性に関して課されたすべての制限が、特許が付与された時点で撤回不能に取り除かれることを保証している。受託者が生存サンプルを分配できなくなった場合は、この寄託は返却されることになる。
【００９４】
抗癌抗体ＡＲ２７Ａ８０７．１４．１を産生するハイブリドーマを作製するために、凍結ヒト結腸腺癌腫瘍組織（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，マサチューセッツ州）の単一細胞懸濁液をＰＢＳ中で調製した。ＩＭＭＵＮＥＡＳＹ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖｅｎｌｏ，オランダ）アジュバントを、ゆっくり混合することで使用できるように調製した。５乃至７週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスに、この抗原−アジュバント５０マイクロリットル中２００万個の細胞を皮下注射して免疫した。最初の免疫の２週間後に、調製したばかりの抗原−アジュバントを用い、７０マイクロリットル中２００万個の細胞を腹腔内投与してこの免疫マウスを追加免疫した。最後の免疫の３日後に、脾臓を用いて融合を行った。ハイブリドーマは、単離された脾細胞をＮＳＯ−１ミエローマパートナーと融合することで作製した。融合物の上清を、ハイブリドーマのサブクローンから試験した。
【００９５】
ハイブリドーマ細胞によって分泌された抗体がＩｇＧアイソタイプかＩｇＭアイソタイプかを判定するために、ＥＬＩＳＡアッセイを用いた。コーティング緩衝液中（０．１Ｍ炭酸塩／炭酸水素塩緩衝液、ｐＨ９．２−９．６）の濃度２．４マイクログラム／ｍＬのヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）を、４℃にて、１００マイクロリットル／ウェルでＥＬＩＳＡプレートに一晩添加した。このプレートを、洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５パーセントＴｗｅｅｎ）で３回洗浄した。１００マイクロリットル／ウェルのブロッキング緩衝液（洗浄緩衝液中５パーセントのミルク）を室温にてプレートに１時間添加し、次に、洗浄緩衝液で３回洗浄した。１００マイクロリットル／ウェルのハイブリドーマ上清を添加し、プレートを室温にて１時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、１／１０００００に希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ又はＩｇＭと西洋ワサビペルオキシダーゼとの複合体（５パーセントミルク含有ＰＢＳで希釈）を、１００マイクロリットル／ウェルで添加した。プレートを室温にて１時間インキュベートした後、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した。１００マイクロリットル／ウェルのＴＭＢ溶液を室温にて１乃至３分間インキュベートした。５０マイクロリットル／ウェルの２Ｍ  Ｈ2ＳＯ4を添加することで発色反応を停止させ、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＨＴＳ７０００プレートリーダーにより、４５０ｎｍでプレートを読み取りに掛けた。図１に示すように、ＡＲ２７Ａ８０７．１４．１ハイブリドーマは、主に、ＩｇＧアイソタイプの抗体を分泌した。
【００９６】
ハイブリドーマ細胞によって分泌された抗体のサブクラスを判定するために、マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｂａｉｅ  ｄ’Ｕｒｆｅ，ケベック）を用いてアイソタイピングの実験を行った。抗体含有ハイブリドーマ上清を（ＴＢＳ−Ｔにより１：１０に希釈）、異なる種類のペプチド鎖に特異的なヤギ抗体を有するアイソタイピング用ストリップと共に試験管に添加した。この試験管を１５分間攪拌した。次に、ストリップを攪拌しながらＴＢＳ−Ｔで５分間、２回洗浄した。ペルオキシダーゼ標識種特異的抗マウス抗体（ＴＢＳ−Ｔにより１：５００に希釈）を試験管に１５分間添加し、スティック上のヤギ抗体と結合したモノクローナル抗体を検出した。再度、ストリップを攪拌しながらＴＢＳ−Ｔで５分間、２回洗浄した。次に、ストリップに結合したペルオキシダーゼ標識抗体を、ペルオキシダーゼ基質系を用いて検出した。４−クロロ−１−ナフトールの３０ｍｇの錠剤を１０ｍＬの冷エタノールに溶解し、過酸化水素溶液（３０パーセントｖ／ｖ）一滴を５０ｍＬのＴＢＳで希釈した。この２種類の溶液を使用する直前に混合し、攪拌しながら、３ｍＬをアイソタイピング用ストリップに１５分間添加した。次に、基質溶液を廃棄し、ストリップを５ｍＬの蒸留水で攪拌しながら３回洗浄した。次にタイピング用スティックを試験管から取り出し、結果を分析した。抗癌抗体ＡＲ２７Ａ８０７．１４．１は、ＩｇＧ１、カッパアイソタイプである。
【００９７】
２回の限界希釈の後、ハイブリドーマ上清を、細胞ＥＬＩＳＡアッセイにより、標的細胞と結合した抗体についての試験に掛けた。３種類のヒト結腸癌細胞系及び１種類の正常皮膚細胞系、それぞれ、ＨＴ−２９、ＳＷ１１１６、Ｌｏｖｏ、及びＣＣＤ−２７ｓｋ、を試験した。細胞系はすべてＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ，バージニア州）から入手した。プレートに播種した細胞は使用前に固定した。プレートを、ＭｇＣｌ2及びＣａＣｌ2を含有するＰＢＳにより、室温にて３回洗浄した。ＰＢＳで希釈した２パーセントのパラホルムアルデヒド１００マイクロリットルを、室温にて各ウェルに１０分間添加し、続いて廃棄した。再度、プレートを、ＭｇＣｌ2及びＣａＣｌ2を含有するＰＢＳにより、室温にて３回洗浄した。洗浄緩衝液中（ＰＢＳ＋０．０５パーセントＴｗｅｅｎ）５パーセントのミルク１００マイクロリットル／ウェルにより、室温にて１時間ブロッキングを行った。プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、ハイブリドーマ上清７５マイクロリットル／ウェルを、室温にて１時間添加した。プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合したヤギ抗マウスＩｇＧ又はＩｇＭ抗体の１／２５０００希釈物（５パーセントミルク含有ＰＢＳで希釈）１００マイクロリットル／ウェルを添加した。室温での１時間のインキュベーションの後、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、１００マイクロリットル／ウェルのＴＭＢ基質を、室温にて１乃至３分間インキュベートした。５０マイクロリットル／ウェルの２Ｍ  Ｈ2ＳＯ4により反応を停止させ、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＨＴＳ７０００プレートリーダーにより、４５０ｎｍでプレートを読み取りに掛けた。図１に表で示す結果は、この試験に用いた細胞系とは結合しないことが既に分かっている社内ＩｇＧアイソタイプコントロールと比較して、バックグラウンド上で何倍であるかという数値で表した。ハイブリドーマＡＲ２７Ａ８０７．１４由来の抗体は、この試験に用いた細胞系に対して検出可能な結合を示さなかった。
【００９８】
抗体結合性の試験と合わせて、ハイブリドーマ上清の細胞傷害性効果（抗体の誘導による細胞傷害性）を、細胞系ＨＴ−２９、ＳＷ１１１６、Ｌｏｖｏ、及びＣＣＤ−２７ｓｋについて試験した。Ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，オレゴン州）から入手し、以下に概説するようにこのアッセイを行った。アッセイの前に、細胞を所定の適切な密度でプレートに播種した。２日後、ハイブリドーマのマイクロタイタープレートから７５マイクロリットルの上清を細胞プレートへ移し、５パーセントＣＯ2のインキュベータ中で５日間インキュベートした。ポジティブコントロールとして用いるウェルを空になるまで吸引し、１００マイクロリットルのナトリウムアジド（ＮａＮ3、０．０１パーセント、Ｓｉｇｍａ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ，オンタリオ）、シクロヘキシミド（ＣＨＸ、０．５マイクロモル、Ｓｉｇｍａ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ，オンタリオ）、又は抗ＥＧＦＲ抗体（ｃ２２５、ＩｇＧ１、カッパ、５マイクログラム／ｍＬ、Ｃｅｄａｒｌａｎｅ，Ｈｏｒｎｂｙ,オンタリオ）を培養液に溶解したものを添加した。処理の５日後、プレートを裏返して空にし、吸い取り乾燥した。ＭｇＣｌ2及びＣａＣｌ2を含有する室温のＤＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水）をマルチチャネルスクイーズボトルから各ウェルに供給し、３回軽くたたいた後、裏返して空にし、吸い取り乾燥した。ＭｇＣｌ2及びＣａＣｌ2を含有するＤＰＢＳで希釈した５０マイクロリットルの蛍光カルセイン染料を各ウェルに添加し、５パーセントＣＯ2のインキュベータ中、３７℃で３０分間インキュベートした。プレートを、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＨＴＳ７０００蛍光プレートリーダーで読み取り、データをＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌで解析した。結果を図１の表に示す。ＡＲ２７Ａ８０７．１４．１ハイブリドーマからの上清は、ＨＴ−２９細胞に対しては３９パーセント、ＳＷ１１１６細胞に対しては２９パーセント、Ｌｏｖｏ細胞に対しては２０パーセントの特異的な細胞傷害性を示した。これは、ポジティブコントロールのナトリウムアジド及びシクロヘキシミドによりＨＴ−２９に対して得られた細胞傷害性のそれぞれ６３及び７５パーセント；シクロヘキシミド及びｃ２２５によりＳＷ１１１６に対して得られた細胞傷害性のそれぞれ６７及び１１２パーセント；そして同様に、シクロヘキシミドによりＬｏｖｏに対して得られた細胞傷害性の５４パーセントであった。正常皮膚細胞系ＣＣＤ−２７ｓｋに対しては観測可能な細胞傷害性は見られなかった。公知の非特異的細胞傷害剤であるシクロヘキシミド及びＮａＮ3は、予想通り、総じて細胞傷害性を示した。抗ＥＧＦＲ抗体ｃ２２５は、予想通り、ＳＷ１１１６に対して細胞傷害性を示した。
【００９９】
図１の結果より、ＡＲ２７Ａ８０７．１４．１の異なる細胞系に対する細胞傷害性効果は、結合のレベルとの相関を示さなかった。これらの条件下において、３種類の結腸細胞系との検出可能な結合は見られなかったが、検出可能なレベルの細胞傷害性は見られた。ＡＲ２７Ａ８０７．１４．１は、ＣＣＤ−２７ｓｋ正常皮膚細胞系に対して細胞傷害性も示さず、結合もしなかった。従って、この抗体は、機能特異性を示し、それは、結合度とは必ずしも関連していなかった。
【０１００】
実施例２
インビトロ結合
ＡＲ２７Ａ８０７．１４．１モノクローナル抗体は、ＣＬ−１０００フラスコ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ，オンタリオ）中、週２回の回収と再播種によってハイブリドーマを培養することにより作製した。続いて、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂａｉｅ  ｄ’Ｕｒｆｅ，ケベック）を用いた標準的な抗体精製の手順を行った。ヒト化、非免疫化、キメラ化、又はマウスのモノクローナル抗体を用いることは、本発明の範囲内である。
【０１０１】
乳癌（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＣＦ−７）、結腸癌（ＨＴ−２９、Ｌｏｖｏ、ＤＬＤ−１、ＳＷ６２０、及びＳＷ１１１６）、前立腺癌（ＰＣ−３）、膵臓癌（ＢｘＰＣ−３）、及び卵巣癌（ＯＶＣＡＲ−３）細胞系、並びに皮膚（ＣＣＤ−２７ｓｋ）及び肺（Ｈｓ８８８．Ｌｕ）からの非癌細胞系とのＡＲ２７Ａ８０７．１４．１の結合について、細胞ＥＬＩＳＡによって評価した。細胞系はすべて、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ，バージニア州）から入手した。ハイブリドーマ上清に対して２０マイクログラム／ｍＬの濃度の精製した抗体を用いた以外は、実施例１で概説したものと同じ手順を用いた。
【０１０２】
図２の表に示した結果は、この試験に用いた細胞系とは結合しないことが既に分かっている社内ＩｇＧアイソタイプコントロールと比較して、バックグラウンド上で何倍であるかという数値で表した。ＡＲ２７Ａ８０７．１４は、結腸癌細胞系ＨＴ−２９に対して最も強い結合を見せ（６．１倍）、卵巣癌細胞系ＯＶＣＡＲ−３（１．８倍）及び正常肺細胞系Ｈｓ８８８．Ｌｕ（１．８倍）に対する結合のレベルは低かった。これらの条件下にて、結腸癌細胞系のＬｏｖｏ及びＳＷ１１１６に対しても、正常皮膚細胞系ＣＣＤ−２７ｓｋに対しても結合は見られなかった。実施例１及び２より、ＡＲ２７Ａ８０７．１４．１の結腸癌細胞系Ｌｏｖｏ及びＳＷ１１１６に対する結合が、細胞ＥＬＩＳＡでは検出されないことは明らかである。しかしながら、この抗体は、これらの細胞系に対して細胞傷害性効果を誘導することができた。この効果は、以下の要因によるものである可能性がある。Ｌｏｖｏ／ＳＷ１１１６結腸癌細胞系による抗原標的の発現が、これらの条件下ではこの方法による検出限界より低いレベルであるが、この低いレベルは、腫瘍の増殖を遅らせるのには十分である、という可能性がある。この抗体のＬｏｖｏ及びＳＷ１１１６結腸癌モデルにおける細胞傷害性効果は、結合に基づいては予想することができなかった明白ではない結果である。実施例１より、ＡＲ２７Ａ８０７．１４．１の結腸細胞系ＨＴ−２９に対する結合は、細胞ＥＬＩＳＡでは検出されなかったが、実施例２では、明らかに結合しており；この理由は、精製された状態で試験されたものに対して、上清中の抗体の濃度が低かったことであり得る。
【０１０３】
実施例３
ＤＬＤ−１細胞によるインビボ腫瘍実験
実施例１では、ＡＲ２７Ａ８０７．１４．１が、いくつかの結腸癌細胞系に対して抗癌特性を有することが示された。図３及び４に関連して、４乃至６週齢の雌ＳＣＩＤマウスに、１００マイクロリットルの生理食塩水中５００万個のヒト結腸癌細胞（ＤＬＤ−１）を、首筋への皮下注射によって移植した。このマウスは５匹ずつの２個の処理グループにランダムに分けた。移植の次の日に、２０ｍｇ／ｋｇのＡＲ２７Ａ８０７．１４．１試験抗体、又はコントロール緩衝液を、２．７ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＫＨ2ＰＯ4、１３７ｍＭのＮａＣｌ、及び２０ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4を含有する希釈剤でストック濃度から希釈後、体積３００マイクロリットルで各コホートへ腹腔内投与した。その後、抗体及びコントロールサンプルを、実験期間中、週１回、同じ方法で投与した。腫瘍の増殖を、約７日目ごとにノギスで測定した。抗体を６回注射した後に、実験を完了した。動物の体重を、実験期間中、週１回記録した。実験終了時に、動物はすべてＣＣＡＣガイドラインに従って安楽死させた。
【０１０４】
ＡＲ２７Ａ８０７．１４．１は、高侵襲性ＤＬＤ−１によるヒト結腸癌のインビボ予防モデルにおいて、腫瘍の増殖を抑制した。図３は、抗体ＡＲ２７Ａ８０７．１４．１で処理したマウスの腫瘍体積を、緩衝液で処理したグループと比較した結果を示す。実験終了時、第３７日に、ＡＲ２７Ａ８０７．１４．１は、緩衝液で処理したコントロールと比較して、腫瘍の増殖を６５パーセント阻害した（ｐ＝０．００３９）。実施例２より、ＡＲ２７Ａ８０７．１４．１のＤＬＤ−１細胞系との結合は、細胞ＥＬＩＳＡでは検出されないことは明らかである。しかしながら、この抗体は、ＤＬＤ−１異種移植モデルにおいて腫瘍の増殖を抑制することができた。ＤＬＤ−１細胞系による抗原標的の発現が、これらの条件下では細胞ＥＬＩＳＡによる検出限界より低いレベルであるが、この低いレベルの発現は、腫瘍の増殖を遅らせるのには十分である、という可能性がある。さらに、抗原の発現は、ＤＬＤ−１細胞がより生理学的なインビボの環境下に置かれた場合に誘導される、という可能性もある。いずれの場合でも、この抗体のＤＬＤ−１結腸癌モデルでの効力は、結合に基づいては予想することができなかった明白ではない結果である。
【０１０５】
実験全体を通して、毒性の臨床徴候はなかった。週１回の間隔で測定した体重は、健康であるか成長できていないかの代替指標であった。図４に示すように、コントロール（ｐ＝０．００３３）及びＡＲ２７Ａ８０７．１４．１処理グループ（ｐ＝０．０４２１）の両方で、第３７日までに平均体重の著しい減少が見られた。しかし、実験終了時には、コントロールと抗体処理グループの間に体重の有意差はなかった。
【０１０６】
まとめると、ＡＲ２７Ａ８０７．１４．１は、このヒト結腸癌異種移植モデルにおいて、耐容性がよく、全身腫瘍組織量を減少させた。
【０１０７】
実施例４
競合結合剤の単離
抗体が与えられれば、当業者であれば、例えば、同じエピトープを認識するものである競合抗体等の競合的に阻害するＣＤＭＡＢを作製することができる（Ｂｅｌａｎｇｅｒ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ４８：１５−１８（１９７３））。一つの方法は、抗体によって認識される抗原を発現する免疫原による免疫化を伴う。サンプルとしては、これらに限定されないが、組織、単離されたタンパク質、又は細胞系を挙げることができる。得られたハイブリドーマは、競合アッセイを用いてスクリーニングすることができ、それは、試験抗体の結合を阻害する抗体を識別するものであり、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ，ウェスタンブロッティング等である。別の方法としては、該抗原の少なくとも１個のエピトープを認識する抗体に対して、ファージディスプレイ抗体ライブラリ及びパニングを利用するものが考えられる（Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ  ＪＬ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３１４：２９４−３００（２００３））。いずれの場合でも、抗体は、元の標識抗体とその標的抗原の少なくとも１個のエピトープとの結合に取って代わる能力に基づいて選別される。そのような抗体は、従って、元の抗体と同様に、抗原の少なくとも１個のエピトープを認識する特性を有することになる。
【０１０８】
実施例５
ＡＲ２７Ａ８０７．１４．１モノクローナル抗体の可変領域のクローン化
ＡＲ２７Ａ８０７．１４．１ハイブリドーマ細胞系によって産生されたモノクローナル抗体の重鎖（Ｖ．Ｈ）及び軽鎖（Ｖ．Ｌ）の可変領域配列を決定することができる。免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖をコードするＲＮＡを、グアニジニウムイソチオシアネートによる細胞の可溶化を含む標準的な方法を用いて、対象のハイブリドーマから抽出することができる（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８：５２９４−５２９９（１９７９））。このｍＲＮＡを用いて、続いてのＶ．Ｈ及びＶ．Ｌ遺伝子の単離のためのｃＤＮＡを、本技術分野で公知のＰＣＲ法によって作製することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））。重鎖及び軽鎖のＮ末端アミノ酸配列を、自動エドマン分解により、独立して決定することができる。ＣＤＲ及び隣接するＦＲのさらなる配列も、Ｖ．Ｈ及びＶ．Ｌ断片のアミノ酸配列決定によって決定することができる。次に、Ｖ．Ｈ及びＶ．Ｌ遺伝子のＡＲ２７Ａ８０７．１４．１モノクローナル抗体からの単離のための合成プライマーを設計することができ、単離された遺伝子は、適切なベクターにつなげて配列決定することができる。キメラ及びヒト化ＩｇＧを作製するためには、この可変軽鎖及び可変重鎖ドメインを適切なベクターへサブクローン化して発現させることができる。
【０１０９】
（ｉ）モノクローナル抗体
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡ（実施例１で概説したように）は、従来の手順を用いて容易に単離され、配列決定される（例：モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）。そのようなＤＮＡの採取源としては、ハイブリドーマ細胞が好ましい。単離した後は、ＤＮＡを発現ベクター内に配置し、次に、これを大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又はミエローマ細胞等のそうでなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞へトランスフェクトし、組換え宿主細胞中にてモノクローナル抗体を合成することができる。ＤＮＡは、例えば、相同マウス配列の代わりに、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列で置換するなどによって修飾することもできる。キメラ又はハイブリッド抗体も、架橋剤が関与するものを含む合成タンパク質化学で公知の方法を用いて、インビトロで作製することができる。例えば、免疫毒素を、ジスルフィド交換反応を用いて、又はチオエーテル結合を形成することによって構築することができる。この目的のための適切な試薬の例としては、イミノチオレート及びメチル−４−メルカプトブチリミデート（ｍｅｔｈｙｌ−４−ｍｅｒｃａｐｔｏｂｕｔｙｒｉｍｉｄａｔｅ）が挙げられる。
【０１１０】
（ｉｉ）ヒト化抗体
ヒト化抗体は、非ヒト源より導入された１若しくは２個以上のアミノ酸残基を有する。このような非ヒトアミノ酸残基は、「インポート（ｉｍｐｏｒｔ）」残基と称されることが多く、これらは、通常、「インポート」可変ドメインから得られる。ヒト化は、Ｗｉｎｔｅｒとその共同研究者による方法により、げっ歯類のＣＤＲ又はＣＤＲ配列でヒト抗体の対応する配列を置換することによって実施することができる（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８）；Ｃｌａｒｋ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ２１：３９７−４０２（２０００）にてレビューされている）。
【０１１１】
ヒト化抗体は、親配列及びヒト化配列の三次元モデルを用い、親配列と種々の構想上のヒト化産物の解析プロセスによって作製することができる。三次元免疫グロブリンモデルは、一般的に利用可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の有望な三次元コンフォメーション構造を図示し、表示するコンピュータプログラムが利用可能である。このような表示を調べることにより、候補免疫グロブリン配列の機能に対する残基の考えられる役割の解析、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原と結合する能力に影響を与える残基の解析が可能となる。この方法により、ＦＲ残基をコンセンサス配列及びインポート配列から選択し、組み合わせることができ、それによって、標的抗原に対する親和性の向上等の所望の抗体特性が達成される。一般に、ＣＤＲ残基が、抗原結合性への影響に直接、そして最も強く関与している。
【０１１２】
（ｉｉｉ）抗体断片
抗体断片の作製のために、種々の技術が開発されてきた。これらの断片は、組換え宿主細胞によって作製することができる（Ｈｕｄｓｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：５４８−５５７（１９９９）；Ｌｉｔｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ２１：３６４−３７０（２０００）、にてレビューされている）。例えば、Ｆａｂ’−ＳＨ断片を、大腸菌から直接採取し、これを化学的に結合させてＦ（ａｂ’）2断片を形成させることができる（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２））。別の態様では、Ｆ（ａｂ’）2は、Ｆ（ａｂ’）2分子の集合を促進するために、ロイシンジッパーＧＣＮ４を用いて形成される。別の手法によれば、Ｆｖ、Ｆａｂ、又はＦ（ａｂ’）2断片は、組換え宿主細胞培養物より直接単離することができる。
【０１１３】
実施例６
本発明の抗体を含む組成物
本発明の抗体は、癌を予防／治療するための組成物として用いることができる。本発明の抗体を含む癌を予防／治療するための組成物は、毒性が低く、液体製剤の形態でそのまま、又は適切な製剤の医薬組成物として、ヒト又は哺乳類（例：ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル等）に、経口又は非経口（例：血管内、腹腔内、皮下、等）投与することができる。本発明の抗体は、それ自体で投与してもよく、又は適切な組成物として投与してもよい。投与に用いる組成物は、本発明の抗体若しくはその塩と共に、薬理学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤を含むことができる。そのような組成物は、経口又は非経口投与に適する医薬製剤の形態で提供される。
【０１１４】
非経口投与のための組成物の例は、注射用製剤、坐薬等である。注射用製剤としては、静脈内、皮下、皮内、及び筋肉内注射剤、点滴剤、関節内注射剤、等の剤形を挙げることができる。これらの注射用製剤は、公知の方法によって作製することができる。例えば、注射用製剤は、本発明の抗体若しくはその塩を、注射剤に従来から用いられている滅菌水性媒体若しくは油性媒体中に溶解、懸濁、又は乳化することによって作製することができる。注射剤用の水性媒体としては、例えば、生理食塩水、グルコース及びその他の補助剤を含む等張液、等があり、これらは、アルコール（例；エタノール）、ポリアルコール（例：プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例：Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０、ＨＣＯ−５０（水素化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０モル）付加体）、等の適切な可溶化剤と組み合わせて用いてもよい。油性媒体としては、例えば、ゴマ油、大豆油、等が用いられ、これらは、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等の可溶化剤と組み合わせて用いてもよい。このようにして作製された注射剤は、通常、適切なアンプルに充填される。直腸内投与に用いられる坐薬は、本発明の抗体又はその塩を従来から用いられている坐薬用基剤と混合することによって作製することができる。経口投与用組成物としては、固形又は液体製剤が含まれ、具体的には、錠剤（糖衣錠及びフィルムコーティング錠を含む）、ピル、顆粒、粉末製剤、カプセル（軟質カプセルを含む）、シロップ、エマルジョン、懸濁液、等である。そのような組成物は、公知の方法によって製造することができ、医薬品製剤の分野で従来から用いられる媒体、希釈剤、又は賦形剤を含んでいてもよい。錠剤用の媒体又は賦形剤の例としては、ラクトース、デンプン、スクロース、ステアリン酸マグネシウム、等である。
【０１１５】
上述の経口用又は非経口用の組成物は、活性成分の一回分の用量を収めるのに適する単位用量を有する医薬製剤として作製することが有利である。そのような単位用量製剤としては、例えば、錠剤、ピル、カプセル、注射剤（アンプル）、坐薬、等が挙げられる。前述の化合物の含有量は、一般的に、単位剤形あたり５乃至５００ｍｇであり；好ましくは、上述の抗体を、特に注射剤の形態の場合、約５乃至約１００ｍｇ含有し、その他の形態の場合は、１０乃至２５０ｍｇ含有する。
【０１１６】
本発明の抗体を含む前述の予防／治療薬又は制御薬の用量は、投与を受ける対象、標的疾患、状態、投与経路、等によって異なるものとなり得る。例えば、成人の乳癌等の治療／予防の目的で用いられる場合、本発明の抗体を、体重に対して約０．０１乃至約２０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、約０．１乃至約１０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは、約０．１乃至約５ｍｇ／ｋｇの用量にて、約１乃至５回／日、好ましくは、約１乃至３回／日、静脈内投与することが有利である。その他の非経口及び経口投与では、薬剤は、上記の用量に対応した用量で投与することができる。状態が特に深刻である場合は、その状態に従って用量を増加してもよい。 
【０１１７】
本発明の抗体は、そのまま投与してもよく、適切な組成物の形態で投与してもよい。投与に用いられる組成物は、前述の抗体若しくはその塩と共に、薬理学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤を含有してもよい。そのような組成物は、経口又は非経口投与（例：血管内注射、皮下注射、等）に適した医薬製剤の形態で提供される。上述の各組成物は、さらに、その他の活性成分を含んでもよい。さらに、本発明の抗体は、例えば、アルキル化薬（例：シクロホスファミド、イホスファミド、等）、代謝拮抗薬（例：メトトレキサート、５−フルオロウラシル、等）、抗腫瘍抗生物質（例：マイトマイシン、アドリアマイシン、等）、植物由来抗腫瘍薬（例：ビンクリスチン、ビンデシン、Ｔａｘｏｌ、等）、シスプラチン、カルボプラチン、エトポシド、イリノテカン、等のその他の薬物と組み合わせて用いてもよい。本発明の抗体及び上述の薬物は、患者へ同時に投与しても、時間をずらして投与してもよい。
【０１１８】
優位な証拠により、ＡＲ２７８０７．１４．１は、癌細胞系に存在するエピトープとの結合を通して抗癌効果を媒介することが示される。さらに、ＦＡＣＳ、細胞ＥＬＩＳＡ、又はＩＨＣで例示されるがこれらに限定されない技術を用いて、ＡＲ２７Ａ８０７．１４．１抗体を、その特異的に結合するエピトープを発現する細胞の検出に使用できる可能性があることも示され得るものである。
【０１１９】
本明細書で述べたすべての特許及び刊行物は、本特許が関連する分野の当業者のレベルを表すものである。すべての特許及び刊行物は、各々個別の刊行物が、明確に、個々に参照することで組み入れられると示されているかのごとく、それと同じ程度に、参照することで本明細書に組み入れられる。
【０１２０】
本発明の特定の形態を例示するが、これは、本明細書で説明し、示した部分の特定の形態又は配置に限定されるものではないことは理解されるべきである。当業者であれば、本発明の範囲から逸脱することなく、種々の変形が可能であること、及び、本発明が、本明細書で示し、説明する内容に限定されないとみなすべきであることは明らかであろう。
【０１２１】
本目的を達成し、既述の、並びに本発明に固有の目的及び利点をもたらすために、本発明が十分に適合されることは、当業者であれば容易に理解されるであろう。本明細書で述べるオリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、生物学的関連化合物、方法、手順、及び技術はいずれも、本発明の代表的な好適な態様であり、典型例であることを意図しており、発明の範囲を限定することを意図したものではない。それらの変形及びその他の使用は、当業者によって想定され、これらは、本発明の趣旨の範囲内に包含され、添付の請求項の範囲によって定められる。本発明は、具体的な好適な態様と関連して説明したが、請求項される本発明はそのような具体的な態様に過度に限定されるべきでないことは理解されるべきである。実際、当業者に自明である本発明を実施するための説明した形態の種々の変更は、以下の請求項の範囲内であることを意図している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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